(57)【要約】本発明はレチノイン酸の多糖エステルに関するものである。多糖の単糖単位の水酸基はレチノイン酸により部分的にまたは全面的にエステル化する。これらのエステルを得る方法も記述されている。本発明に従った生成物は医薬分野と化粧分野で使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸の多糖エステルであって、該多糖の単糖単位の水酸基が部分的にまたは全面的にレチノイン酸でエステル化されていることを特徴とする前記多糖エステル。
【請求項２】
該多糖の単糖単位の水酸基が部分的にレチノイン酸でエステル化されている請求項１に記載の多糖エステル。
【請求項３】
レチノイン酸でエステル化された該多糖の単糖単位の水酸基が一次水酸基である請求項１〜２のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項４】
レチノイン酸とのエステル化反応に関与しない水酸基はＣ１〜Ｃ５の鎖状アルキル基を有する酸でエステル化される請求項１〜３のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項５】
該Ｃ１〜Ｃ５の鎖状アルキル基を有する酸が酪酸である請求項４に記載の多糖エステル。
【請求項６】
該レチノイン酸が、全−トランス−レチノイン酸、９−シス−７，１１，１３−トリ−トランス−レチノイン酸および１３−シス−７，９，１１−トランス−レチノイン酸からなる群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項７】
該多糖が中性または陰イオン性である請求項１〜６のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項８】
該多糖が線状であるかまたは分枝状であり、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−およびＬ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、Ｄ−グルロン酸、Ｌ−イズロン酸、およびＤ−フルクトースからなる群から選択される請求項１〜７のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項９】
該単糖単位がβ−（１→３）、β−（１→４）、α−（１→３）、α−（１→４）、α−（１→６）、β−（１→２）で結合している請求項１〜８のいずれかに記載の多糖エステル。
【請求項１０】
前記多糖がβ−Ｄ−グルカンである請求項７に記載の多糖エステル。
【請求項１１】
前記多糖がスクリログルカン、レンチナン、シゾフィラン、パキマラン、クルドランおよびラミナランからなる群より選択される請求項１０に記載の多糖エステル。
【請求項１２】
前記多糖がヒアルロナンまたはその塩である請求項７に記載の多糖エステル。
【請求項１３】
前記多糖が硫酸化多糖である請求項７に記載の多糖エステル。
【請求項１４】
適当な有機溶媒中または有機溶媒の混合物中において、レチノイン酸の酸性基またはその活性化形態の一つと反応性形態をとる多糖の単糖単位の水酸基との間でエステル結合を形成することからなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の多糖エステルの製造方法。
【請求項１５】
該レチノイン酸が反応性形態をとり、該単糖単位の水酸基が活性化形態をとる請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
該レチノイン酸の反応性形態がレチノイン酸のアシルハライドであり、該単糖単位の水酸基がアルコラート化形態をとる請求項１４〜１５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
エステル結合の形成はレチノイン酸と活性化形態にある単糖単位の水酸基との間において生じる請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１８】
該単糖単位の一次水酸基の活性化は該多糖の選択的ハロゲン化反応により行われる請求項１４〜１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
医薬組成物または化粧組成物を製造するに際し、請求項１〜１３のいずれかに記載された多糖エステルの使用。
【請求項２０】
活性化合物が請求項１〜１３のいずれかに記載された多糖エステルであり、かつ、少なくとも１種の適当な賦形剤と混合していることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２１】
多糖エステルが請求項１〜１３のいずれかに記載されたものであり、かつ、少なくとも１種の適当な賦形剤と混合していることを特徴とする化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレチノイン酸の多糖エステルの分野に関する。本発明はそのエステルの製造方法を含む。この化合物は医薬分野と化粧分野で使用できる。
【背景技術】
【０００２】
この背景技術では若干の修飾された多糖が記述されている。例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基のような、多糖鎖上に存在する基の化学修飾により修飾された多糖が得られた。そのことは、例えば、新規なエステルやアミド誘導体の形成に通じる。アプリケーションの候補はいくつか存在し、食物、ワニス、化学分析ワニス、化粧品、および調剤のような、若干の工業部門に及んでいる。医薬の領域では、多糖は、医薬組成物、生物材料および薬物の制御放出系の調製に適した化合物と見なされている。いくつかの多糖およびそのオリゴマーは、上記の分野で、重要な生物学的役割を果たすので、実際、生物はその多糖にかなりよい耐性を示す。薬理学的に活性な分子の制御放出系を調製するために多糖を用いる場合、その多糖はその活性な分子といっしょに混合物中に存在するかまたは、例えば、エステル結合もしくはアミド結合という手段を介してその活性な分子に共有結合する。
【０００３】
多糖の中には、担体としての機能の他に、独自の生体活性を有するものがあり、生物の成分になることがある。例えば、ヘパリンは抗凝固剤であり、ヒアルロナンはガラス体および関節液の主成分である。さらにそれらの多糖は骨関節炎および関節症の治療のために診療所で使用される。他の多糖、つまりスクリログルカンはある種の腫瘍の治療においてまたは免疫刺激治療において他の薬物と組み合わせて使用される。バクテリア由来の、若干数の硫酸化多糖は慢性関節リウマチ、網膜症および乾癬の治療に有効である。さらに、多糖の中には、細胞レセプターを認識する能力を有するものがある。従って、特殊な部位に放出される薬物が必要であるかまたは望ましい場合、その使用が極めて興味深いものとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新規な部類の、レチノイン酸の多糖エステルである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
多糖の単糖単位の水酸基は部分的にまたは全面的にレチノイン酸でエステル化されている。
【発明の効果】
【０００６】
この医薬組成物は系統的かつ局所的投与に適している。この化粧組成物は局所投与に適している。これらの組成物が液状形態をとる場合、両者とも水性媒体または非水性媒体中において、溶液または懸濁液の形態をとりうる。代わりに、これらの組成物を固体状形態において製剤化する。その際に、凍結乾燥または乾燥生成物は、投与直前に、適当な液状溶媒を添加して溶解するかまたは懸濁させる。固体状または半固体状の形態をとる組成物は、挿入物、ゲル、クリーム、軟膏、泡沫、顆粒、粉末、錠剤、丸薬、カプセルまたは微小カプセル化製剤である。他の種類の組成物は専門家に公知の技術により提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
レチノイン酸と多糖との間のエステル化反応は、レチノイン酸のカルボキシル基と多糖の単糖単位の水酸基との間に発生する。この反応には一次水酸基または二次水酸基または両者の水酸基が関与する。
【０００８】
これらの多糖エステルのエステル化度は１×１０−６〜３×１０−１、最も好ましくは０．２〜０．０２の範囲にわたる。”エステル化度（ＤＥ）”の用語は、多糖１モル当たり、レチノイン酸のモル数を指し示す。
【０００９】
レチノイン酸、すなわち、中性の形態をとる、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエン酸は、すべての二重結合がトランス形（全−トランス）であることを示す。本発明で用いられる”レチノイン酸”という用語にはすべての存在しうる異性体が含まれる。従って、トランス異性体の他に、他の存在しうるシス−トランス形も含まれる。本発明の化合物を調製するために好まれる形態は、全−トランス−レチノイン酸および１３−シス−７，９，１１−トリートランス−レチノイン酸である。レチノイン酸およびさらに一般的なレチノイドは生物内で基本となる生体機能を演じる。特にその役割は視覚、胚芽の成長においておよび通常の健康な皮膚の状態の維持に際して重要である。
【００１０】
本発明に従ってエステルを調製するために用いる多糖は、天然の供給源からくる多糖である。多糖は、例えば、動物供給源、なかんずく人間、植物および微生物のような、天然の供給源から単離する。多糖は好ましくは８０００〜３００００００の範囲の重量平均分子量を有する（ＭＷ、高性能寸法排他クロマトグラフィー及び／又は分子寸法検出器、例えば光散乱と結び付けての測定）。本発明の目的である誘導体を得るために、３００００〜１５０００００の範囲にある重量平均分子量の多糖が好ましい。多糖は線状構造または分枝状構造を有する。多糖の重要要素が少なくとも一つの単糖単位またはオリゴ糖単位から構成される側鎖を保有する場合、その多糖は分枝状であるという。
【００１１】
多糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−およびＬ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−フコース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、Ｌ−グルロン酸、Ｌ−イズロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースのような単糖単位から構成される。さらに、これらの単糖は必要に応じて硫酸化した基、アセチル基またはスクシニル基を含有することがある。多糖の重要要素では、単糖はβ−（１→３）、β−（１→２）、β−（１→４）、α−（１→３）、α−（１→４）、α−（１→６）結合で連結され、β−形が好ましい。側鎖は好ましくはさらに好ましくはβ−（１→２）、β−（１→３）、β−（１→４）、β−（１→６）、β−（１→４）、β−（１→６）結合で連結され、β−（１→６）がさらに好ましい。
【００１２】
その多糖が中性である場合、好ましくは真菌、植物、藻、バクテリア、酵母から単離されるグルカン（グルコース多糖）から構成される群より選択される。好ましい（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、β−Ｄ−グルカンという。）は、（１→３）−β−Ｄ−グルコースの残基から構成される多糖である。好ましい例はスクリログルカン、レンチナン、シゾフィラン、パチマラン、ラミナランおよびクルドランである。
【００１３】
陰イオン性多糖の中で、ヒアルロナン（ヒアルロン酸とも呼ぶ）のような、カルボキシル化多糖またはその塩は有利に使用できる。ヒアルロナンは繰り返し単位：（１→３）−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−（１→４）−β−Ｄ−グルクロン酸から構成される。
【００１４】
本発明のエステルを調製するために関係のある陰イオン多糖は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の陽イオンで、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキルアンモニウム陽イオンで塩化する。前記カルボキシル化多糖も、そのカルボキシル基が脂肪族系、アルキル脂肪族系、シクロ脂肪族系、ヘテロ環系のアルコールでエステル化される形態で使用できる。
【００１５】
他の種類の陰イオン多糖は、例えば、ヘパリンまたはクロンドロイチン硫酸塩またはデルマタン硫酸塩のような、硫酸化多糖のたぐいである。
【００１６】
本発明に従って生成物を得るのに興味深い、天然の硫酸化多糖は、ＷＯ  ９８／２３６４８号パンフレットに記述されている、グラテロピアセ属(Grateloupiaceae family)の、Grateloupia doryphora または G. filicinaのような、海藻から単離できる多糖の種類に属する。グラテロピアセ属またはコデアセ属の藻または微生物から単離できる、その他の硫酸化多糖を用いることもできる。
【００１７】
最後に、硫酸基、燐酸基またはカルボキシル基で塩化された基を有する分子を用いて誘導体化された、中性のまたは陰イオン天然多糖のいずれも使用できる。
【００１８】
多糖の単糖単位の水酸基がレチノイン酸で部分的にエステル化される場合、レチノイン酸とのエステル結合に関与しない単糖単位の遊離水酸基はさらにＣ１〜Ｃ５の鎖状アルキル基を有する酸とのエステル化反応により置換される。好ましい酸は、例えば、酢酸、プロピオン酸、および酪酸のようなＣ１〜Ｃ６の炭素原子を有するカルボキシル酸である。これらの中で、酪酸は好ましい酸である。
【００１９】
本発明の他の目的は、本発明のエステルを製造する方法である。
【００２０】
この方法により、レチノイン酸の酸基（カルボキシル基）と多糖の単糖単位の水酸基との間でエステル結合が形成される。この反応は酸基そのものの上でまたはその反応性形態の一つの上で生じる。その反応は水酸基そのものの上でまたはその活性化形態の一つの上で生じる。
【００２１】
レチノイン酸が反応性形態で使用される場合、酸基を活性化することにより、無水物、エステル（例えば、ＣＦ３ＣＨ２Ｏのような基を取り除くことができるアルコールとのエステル）、アシルハライド（例えば、塩酸、Ｎ−ハロコハク酸アミド、トリ−またはペンタ−燐酸ハライドとのハライド）の形成を伴って、調合剤が得られる。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様の一つは、レチノイン酸のハロゲン化反応によって実施される、レチノイン酸のアシルハライドの調製を必要とする。その反応は、ハロゲン化剤、例えば、オキサリルハライドの存在下に、有機溶媒または有機溶媒の混合物の存在下に、室温で、５〜３０分の範囲の時間枠内で行われる。好ましい溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンであり、おそらくはエチルエーテルのような他の溶媒との混合物の形態をとることになろう。
【００２３】
レチノイン酸の他の反応性形態は、レチノイン酸と、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−メチルホルムアミドのような有機溶媒中で、レチノイン酸と縮合剤とを混合して得られる縮合剤との間の付加物によって表される。その縮合剤とは、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−メチル−２−ハロ−ピリジニウムハライド、２−ハロ−ピリジニウムハライドから構成される群から選択されるものである。
【００２４】
そのエステル化反応が、活性化形態をとる、その多糖の単糖単位の水酸基上で生じる場合、その活性化は選択的または非選択的のいずれかである。その選択的活性化はもっぱら単糖単位の一次水酸基のみ対象とするかまたはもっぱら二次水酸基のみ対象とする。一方、非選択的活性化は同時に一次水酸基と二次水酸基を対象とする。
【００２５】
その多糖の単糖単位の水酸基の非選択的活性化は、その基をさらに反応性にする方法である。そのことは水酸基を脱離基で置換することで達成される。その残りの基は、例えば、その多糖をトリフルオロスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、蟻酸の誘導体またはカルボン酸と反応させて得られる。代わりの方法として、その活性化は、塩、アルコラートを形成して実行されるものであり、それらのものは水酸基の求核置換性を増すものである。
【００２６】
本発明の好ましい態様の一つでは、その活性化はアルコラートの形成を通じて実行される。このような方法で活性化された多糖は、適当な有機溶媒中でまたは有機溶媒の混合物中で懸濁される。その場合、その有機溶媒は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンから構成される群から選択される。レチノイン酸またはその反応形態とのエステル化反応を実施する前に、一定の攪拌条件で、数時間（１〜５時間）保持する。この非活性化形態を使用して、最終エステル化生成物を入手できる。その生成物の特徴は、レチノイン酸でエステル化された多糖の単糖単位の水酸基が一次水酸基と二次水酸基の双方であることにある。
【００２７】
本発明に従った好ましい活性化方法は一次水酸基の選択的活性化である。この選択的活性化の好ましい活性化法は、選択的ハロゲン化反応により水酸基をハロゲン原子で置換することである。その反応は以下のステップを必要とする：攪拌条件下、１〜５時間、２５〜１００℃でその多糖を有機溶媒中に懸濁させるステップ、一定の攪拌条件下、１〜２０時間かけて−２０℃〜１００℃まで変化する温度で、ハロゲン化剤を添加するステップ、およびｐＨ９〜１１の範囲内で反応混合物を適当にアルカリ化するステップ。反応の終点では、その混合物を中和し、活性化された多糖は従来法に従って回収される。
【００２８】
そのハロゲン化剤はメタンスルホニルブロマイド、メタンスルホニルクロライド、ｐ−トルエンスルホニルブロマイド、ｐ−トルエンスルホニルクロライド、チオニルクロライド、チオニルブロマイドから構成される群より選択される。代わりになるものとして、オキサリルブロマイド、オキサリルクロライド、ホスゲン、ビス−トリクロロメチルカルボネートおよびこれらの混合物を用いることができる。好ましいハロゲン化剤はメタンスルホニルブロマイド、メタンスルホニルクロライドから構成される群より選択される。
【００２９】
使用できる溶媒はジアルキルスルホキシド、ジアルキルカルボキサミドのような中性溶媒、特に、例えば、ジメチルスルホキシドのようなＣ１〜Ｃ６−ジアルキルスルホキシド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミドのようなＣ１〜Ｃ６脂肪酸のＣ１〜Ｃ６−ジアルキルアミドである。好ましい溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンである。
【００３０】
活性化された多糖が陰イオン性である場合、遊離酸形態およびその塩化形態またはカルボキシル基のエステル化形態が使用できる。塩化形態は好ましい形態である。ハロゲン化による活性化法に係る詳細はＷＯ９９／１８１３３号パンフレットにそれよりも詳しく述べられている。
【００３１】
上記のごとき、選択的に活性化された形態をとるこの多糖を使用して、最終エステル化生成物を入手できる。その生成物の特徴は、レチノイン酸でエステル化した多糖の単糖単位の水酸基が一次水酸基であることにある。
【００３２】
良好な脱離基で置換して一次水酸基を選択的に活性化できる、他の反応は、原則として、本発明のエステルを調製するために適用できる。例えば、多糖のＣ６  Ｏ−アルキルスルホネートまたはＣ６  Ｏ−アリールスルホネートは、有機溶媒中で、所望量の反応物および触媒の存在下に、低温（例えば室温よりも低い温度）で、多糖を処理して生産できる。
【００３３】
レチノイン酸の酸基またはその反応性形態の一つと、活性化形態をとる多糖の単糖単位の水酸基との間でのエステル結合の形成ステップは、機械的攪拌条件下、多糖溶液のレチノイン酸溶液への添加により生じる。その反応は５〜２０時間かけて実行され、その生成物は従来法に従って回収される。好ましい方法は生成物を溶液から沈殿させること、溶媒の除去、生成物の乾燥を必要とする。
【００３４】
本発明の第一の好ましい態様では、レチノイン酸の反応性形態は、活性化形態をとる水酸基を有する多糖と反応する。特に、レチノイン酸のアシルハライドは多糖のアルコラート化水酸基と反応する。
【００３５】
第二の好ましい態様では、レチノイン酸そのものは活性化された一次水酸基を有する多糖と反応する。特に、レチノイン酸そのものは選択的にハロゲン化された多糖と反応する。
【００３６】
本発明の中で記述されたレチノイン酸の多糖エステルは、医薬分野でも化粧分野でも使用できる。本発明の中で記述されたレチノイン酸の多糖エステルにより、レチノイン酸の欠点、主として高い毒性と活性化合物の不安定性による欠点を克服できる。事実知られているのは、局所アプリケーションにおいて治療薬量で使用されるレチノイン酸とレチノイドは、治療を著しく束縛し制限する皮膚刺激を引き起こす。この活性化合物の脂肪特性により医薬製剤の調製が困難になり、特に、局所用途と異なる用途のために考案された製剤の調製が困難になる。レチノイン酸を含有する、新規な多糖誘導体は、活性化合物それ自体よりも高い安定性と少ない毒性を示し、種々の型の製剤の調製に適している。それゆえにその誘導体は薬物の調製に使用される。その理由は、その誘導体により若干の組織パラメーターが改良されることにある。そのパラメーターとは、例えば、”顆粒層”を含む肥大表皮、”乳頭間隆起”の増加厚み、腸詰における乳頭突起数、年齢に応じて蓄積したエラスチンをコラーゲンやペプチドグリカンにより徐々に置換すること、メラニン形成機能の規格化および繊維芽細胞の数の増加である。それゆえにその化合物は特に皮膚科学、皮膚病理学、とりわけ乾癬の治療、皮膚老化による病理学の治療において有用である。さらに観察されたのは、本発明の化合物が腫瘍細胞分化を誘発することである。それゆえにその化合物は従来型の毒性療法に代わるポテンシャルを提供する。それゆえにその化合物は前癌性上皮病変や腫瘍の治療において興味深く、なかんずく胸部、頸部、前立腺、膀胱、結腸、食道、胃、喉頭、および口腔の腫瘍のような上皮腫瘍の治療において興味深い。その化合物は、眼、心血管、炎症、神経変性および肺の病の治療に用いる際に興味深いことがわかる。
【００３７】
本発明の他の目的は活性成分として本発明の多糖エステルを含有する医薬組成物である。
【００３８】
本発明の他の目的はこの多糖エステルを含有する化粧組成物にある。
【００３９】
本発明を例示するために、以下の実施例を示す。
【実施例１】
【００４０】
ヒアルロナンの重量平均分子量（ＭＷ）の測定方法
その重量平均分子量はＨＰ−ＳＥＣ（高性能寸法排他クロマトグラフィー）により測定する。その分析条件は以下のとおりである。
クロマトグラフ：リオジン９１２５注射器を具備するＨＰＬＣ  Ｊａｓｃｏ  ＰＵ−８８０
カラム：ＴＳＫ  ＰＷｘｌ  Ｇ６０００＋Ｇ５０００＋Ｇ３０００  （ＴｏｓｏＨａａｓ）  ３００  ｍｍ  ×  ７．８  ｍｍ  ＩＤ、１３、１０、６  μｍ粒子寸法；温度  ４０℃
移動相：ＮａＣｌ  ０．１５  Ｍ  流れ：  ０．８  ｍｌ／ｍｉｎ
検知器：ＬＡＬＬＳ  ＣＭＸ−１００  （ＴＳＰ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｘ）、Ｐｏ＝３００〜４００  ｍＶ；分別屈折指数：４１０（水）、感度  １２８×；温度  ３２℃
注入容積：１００μｌ
その生成物は約１．０  ｍｇ／ｍｌの濃度で０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解させ、攪拌条件下、１２時間だけ保持する。その溶液は０．４５  μｍ（ミリポア）のフィルターで濾過し、次いでこのクロマトグラフに注入する。分析により、ＭＷ（重量平均分子量）、Ｍｎ（数平均分子量）およびＰＩ（多分散度）の分析ができる。多糖溶液の濃度は屈折係数を積分して調べた。テトラブチルアンモニウムヒアルロナンはテトラブチルアンモニウムとナトリウムとの間のイオン交換の後で分析し、それゆえにそのもののＭＷの測定は対応するナトリウム塩について行った。
【実施例２】
【００４１】
ヒアルロナンとトランス−レチノイン酸とのエステル
２．１  活性化された水酸基を有するヒアルロナンの調製
２５０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を丸底フラスコに入れ、４０％テトラブチルアンモニウム溶液１．１  ｍＬを添加し、磁石攪拌条件下に、室温で保持し、溶解を完了させた。次にその溶液を凍結させ、凍結乾燥した。
２．２  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌条件下に、室温で、光を遮り、窒素流下に、三口フラスコ中で、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５  ｍＬ中で、６０５  ｍｇの全−トランス−レチノイン酸を溶解する。磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、１５分かけて、個別に、三口フラスコの中に、エチルエーテル３  ｍＬ、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３００  μｌおよびオキサリルクロライド２０８  μｌを注ぎ込む。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のレチノイン酸の溶液をこのようにして得た固体の上に滴下する。この系を、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま１時間だけ保持する。
２．３  エステルの調製
丸底フラスコの中で、室温で、磁石攪拌条件下に、４時間かけて、（２．１）で調製した多糖をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解する。このようにして得た溶液は、（２．２）で調製したレチノイン酸溶液中へ流速２  ｍＬ／分で滴下漏斗を用いて添加する。その反応混合物は、室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。その後、その溶液を減圧下に濃縮し、５倍容積のアセトンで沈殿させた生成物を濾過して回収、数回水洗し、最後に乾燥した。生成物９０  ｍｇが得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ−ＮＭＲ）にあった。そのスペクトルが示すものは、多糖のプロトンとレチノイン酸のすべてのプロトンに基づくシグナルである。レチノイン酸に基づくシグナルに関連する化学シフトの評価から、レチノイン酸が全−トランス−異性体形態を保持することが確認できる。レチノイン酸の標準溶液の、３５５  ｎｍにおける、最大吸光度におけるＵＶ吸収スペクトルと、その生成物の既知の濃度における溶液のＵＶ吸収スペクトルとの比から、測定した置換度は０．２である。
【実施例３】
【００４２】
ヒアルロナンとトランス−レチノイン酸とのエステル
３．１  活性化された水酸基を有するヒアルロナンの調製
２５０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を丸底フラスコに注ぎ込む。テトラブチルアンモニウム溶液３００  μｌとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４００  μｌを添加し、その混合物を、磁石攪拌条件下に、室温で保持し、溶解を完了させる。次にその溶液を凍結しまた凍結乾燥する。
３．２  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、光を遮ったまま、３時間かけて、三口フラスコ中で、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２  ｍＬ中で、２４２  ｍｇのレチノイン酸を溶解させる。個別に、三口フラスコ中に、エチルエーテル２  ｍＬ、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００  μｌおよびオキサリルクロライド８３  μｌを添加する。磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、１５分間だけ、その混合物を保持する。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のレチノイン酸の溶液を、このようにして得た固体の上に滴下する。この系を、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま１時間だけ保持する。
３．３  エステルの調製
丸底フラスコの中で、室温で、磁石攪拌条件下に、４時間かけて、（３．１）で調製した多糖サンプルをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１４  ｍＬ中に溶解する。このようにして得た溶液は、（３．２）で調製したレチノイン酸溶液中へ流速２  ｍＬ／分で滴下漏斗を用いて添加する。その反応混合物は、磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。その後、その溶液を濃縮し、５倍容積のアセトンでその生成物を沈殿させ、濾過して回収、数回水洗し、最後に乾燥した。生成物が１０  ｍｇ得られる。その生成物の特徴は実施例２と同様な方法で特定した。置換度は０．０５である。
【実施例４】
【００４３】
ヒアルロナンとトランス−レチノイン酸とのエステル
４．１  活性化された水酸基を有するヒアルロナンの調製
２５０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を丸底フラスコに注ぎ込む。テトラブチルアンモニウム溶液５００  μｌを添加し、その混合物を、磁石攪拌条件下に保持し、溶解を完了させる。次にその溶液を凍結しまた凍結乾燥する。
４．２  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、光を遮ったまま、４時間かけて、三口フラスコ中で、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３  ｍＬ中で、１２１  ｍｇのレチノイン酸を溶解させる。個別に、三口フラスコ中に、エチルエーテル２  ｍＬ、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１００  μｌおよびオキサリルクロライド８３  μｌを添加する。磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、１５分間だけ、その混合物を保持する。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のレチノイン酸の溶液をこのようにして得た固体の上に滴下する。この系を、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま１時間だけ保持する。
４．３  エステルの調製
丸底フラスコの中で、室温で、磁石攪拌条件下に、３時間かけて、（４．１）の多糖をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０  ｍＬ中に溶解する。このようにして得た溶液は、（４．２）のレチノイン酸溶液中へ流速２  ｍＬ／分で滴下漏斗を用いて添加する。その反応混合物は、室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。その溶液を濃縮し、５倍容積のアセトンでその生成物を沈殿させ、濾過して回収、数回水洗し、最後に乾燥した。生成物が１５０  ｍｇ得られる。その生成物の特徴は実施例２と同様な方法で特定した。置換度は０．０６である。
【実施例５】
【００４４】
ヒアルロナンとトランス−レチノイン酸とのエステル
５．１  活性化された水酸基を有するヒアルロナンの調製
２６０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を丸底フラスコに注ぎ込む。４０％テトラブチルアンモニウム溶液１．２  ｍＬを添加し、その混合物を、磁石攪拌条件下に、溶解を完了させる。次にその溶液を凍結しまた凍結乾燥する。
５．２  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、光を遮ったまま、４時間かけて、三口フラスコ中で、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３  ｍＬ中で、１２６  ｍｇのレチノイン酸を溶解する。個別に、三口フラスコ中に、エチルエーテル２  ｍＬを注ぎ込み、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０  μｌおよびオキサリルクロライド４３  μｌを添加する。磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、１５分間だけ、その混合物を保持する。このようにして得た、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のレチノイン酸の溶液をその固体の上に滴下する。この系を、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま１時間だけ保持する。
５．３  エステルの調製
丸底フラスコの中で、室温で、磁石攪拌条件下に、４時間かけて、（５．１）の多糖をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０  ｍＬ中に溶解する。このようにして得た溶液は、（５．２）のレチノイン酸溶液中へ流速２  ｍＬ／分で滴下漏斗を用いて添加する。その反応混合物は、室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。その後、その溶液を濃縮し、５倍容積のアセトンでその生成物を沈殿させ、濾過して回収、数回水洗し、最後に乾燥した。生成物が８０  ｍｇ得られる。その生成物の特徴は実施例２と同様な方法で特定した。置換度は０．０３である。
【実施例６】
【００４５】
ヒアルロナンとトランス−レチノイン酸とのエステル
６．１  活性化された一次水酸基を有するヒアルロナンの調製
１５  ｍｌのテトラブチルアンモニウムヒアルロナンを、８０℃で、三口フラスコ中で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、加熱する。３４０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を添加し、その系を攪拌条件下に保持し、溶解を完了させる。このようにして得た溶液を室温まで冷却し、次いで０℃まで冷却し、８７０  ｍｇのメタンスルホニルブロマイドを添加する。この反応混合物を攪拌条件下に２０分間放置し、次いで１６時間かけて８０℃まで加熱した。この系は、次に室温まで冷却し、その反応は１０ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水を添加して阻止した。この系は次に塩基で中和し、減圧下に、その容積が１／３になるまで濃縮し、１００  ｍＬアセトン中で沈殿させる。次いでそのサンプルを濾過により回収し、アセトンで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水２０  ｍＬ中に、ｐＨ１０で分散させる。そのものはＨＣｌで中和し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水を考慮して透析する。２１０  ｍｇの生成物が得られる。その生成物の特徴は、核磁気共鳴スペクトロスコピー（１３Ｃ−ＮＭＲ）で特定する。そのスペクトロスコピーにより、一次水酸基（ｐｐｍ  ３４．５）のハロゲン化反応が明らかになり、９０％という臭化度の計算が可能になった。
６．２  エステルの調製
１００  ｍｇのブロモヒアルロナン（６．１）を、８  ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、８０℃で、三口フラスコの中で、分散させる。３時間後、その系を室温まで冷却し、２  ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解したレチノイン酸２５０  ｍｇを添加する。その反応混合物は、室温で、塩基の存在下に、窒素流下に、光を遮ったまま、４８時間だけ保持する。その後、その溶液を濃縮する。その生成物は、５０  ｍＬのアセトン中で沈殿させ、濾過して回収、数回水洗し、最後に乾燥した。生成物が７０  ｍｇ得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１３Ｃ−ＮＭＲ）で特定する。そのスペクトロスコピーにより、シグナルの存在が明らかになる。そのシグナルはレチノイン酸と呼ばれる。レチノイン酸に関連する化学シフトの評価から、レチノイン酸は全−トランス−異性体形態を有することが確認できる。置換度は実施例２と同様な方法で測定され、１０−２〜１０−６の範囲内にある。
【実施例７】
【００４６】
ヒアルロナンと酪酸およびレチノイン酸との混合エステル
７．１  活性化された水酸基を有するヒアルロナンの調製
２５０  ｍｇのテトラブチルアンモニウムヒアルロナン（そのナトリウム塩のＭＷは１０００００である）を丸底フラスコに注ぎ込む。１．１  ｍＬの４０％テトラブチルアンモニウム溶液を添加し、その混合物を、磁石攪拌条件下に室温で保持し、溶解を完了させる。次にその溶液を凍結しまた凍結乾燥する。
７．２  酪酸でエステル化したヒアルロナンの調製
（７．１）で調製した多糖を、１０  ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、丸底フラスコ中で、室温で、磁石攪拌条件下に、溶解する。このようにして得た溶液を、滴下漏斗で、１６  μＬの無水酪酸と２  ｍLのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの溶液中へ添加する。その反応混合物は室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に２．５時間だけ保持する。
７．３  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌が行われる三口フラスコ中に、４  ｍＬのエチルエーテル、７５  μＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび８３  μＬのオキサリルクロライドを注ぎ込む。磁石攪拌条件下に、室温で、窒素流下に、１５分間だけ、その混合物を保持する。４  ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のレチノイン酸２４２  ｍｇの溶液を、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま１時間だけ保持する。
７．４  エステルの調製
三口フラスコの中に、（７．３）のレチノイン酸溶液を、滴下漏斗を用いて、（７．２）の多糖溶液に対して流速２  ｍＬ／分で添加する。その反応混合物は、室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。その後、その溶液を濃縮し、その生成物を沈殿させ、濾過して回収、数回水洗し、それから乾燥した。生成物が１００  ｍｇ得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ−ＮＭＲ）で特定される。そのスペクトロスコピーによりシグナルの存在が明らかになる。そのシグナルは、実施例６に記載のごとく、レチノイン酸の残基と呼ばれる。酪酸の存在（０．９０、  １．６２、２．３９  ｐｐｍ）を確認するシグナルが検知される。そのシグナルのおかげで、０．２４という酪酸化度の定量が可能になる。置換度は実施例２と同様に定量され、０．０６である。
【実施例８】
【００４７】
スクリログルカンとトランス−レチノイン酸とのエステル
８．１  活性化された水酸基を有するスクリログルカンの調製
１５０  ｍｇのスクリログルカン（重量平均分子量：ＭＷ：２４０００００）を丸底フラスコに注ぎ込む。９８０  μＬのテトラブチルアンモニウム溶液を添加し、その混合物を、磁石攪拌条件下に保持し、溶解を完了させる。次にその溶液を凍結しまた凍結乾燥する。
８．２  レチノイン酸の反応性形態の調製
磁石攪拌が行われる三口フラスコ中に、２８０  ｍｇのレチノイン酸を注ぎ込む。４  ｍＬのジメチルスルホキシドを添加し、磁石攪拌条件下に、５０℃で、窒素流下に、２時間だけ、その混合物を保持する。このようにして得られた溶液中に、４５０  ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと３８０  ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを、磁石攪拌条件下に、窒素流下に添加し、光を遮ったまま４時間３５分間だけ保持する。
８．３  エステルの調製
丸底フラスコの中において、（８．１）の多糖を、８  ｍＬの無水ジメチルスルホキシド中で、室温で、磁石攪拌条件下に溶解する。このようにして得られた溶液は、滴下漏斗を用いて、（８．２）のレチノイン酸溶液に対して、流速２  ｍＬ／分で添加する。その反応混合物は、室温で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、光を遮ったまま、１６時間だけ保持する。次いでその生成物は、５０  ｍＬのエチルエーテルを３回用いてその反応系を洗浄し、回収する。その沈殿物を洗浄し、濾過して回収、数回洗浄し、最後に乾燥する。１６０  ｍｇの生成物が得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ−ＮＭＲ）で特定される。そのスペクトロスコピーによりレチノイン酸の存在が明らかになる。その酸は、実施例６に記載のごとく、多糖に結合するものである。
【実施例９】
【００４８】
スクリログルカンとトランス−レチノイン酸とのエステル
９．１  活性化された一次水酸基を有するスクリログルカンの調製
三口フラスコ中において、１２０  ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、磁石攪拌条件下に、窒素流下に、８０℃まで加熱する。６００  ｍｇのスクリログルカン（重量平均分子量：ＭＷ：２８０００００）が添加され、その系は攪拌条件下に４時間だけ保持される。このようにして得た系を先ず室温まで冷却し、次に０℃まで冷却する。２．９４  ｇのメタンスルホニルブロマイドを添加する。その混合物は攪拌条件下にさらに２０分間だけ保持する。次に１６時間かけて８０℃まで加熱する。その混合物は室温まで冷却する。その反応は３０  ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水を添加して阻止する。次にその系は水酸化ナトリウムで中和し、濃縮する。次にその生成物を３００  ｍＬのアセトン中で沈殿させ、濾過して回収する。次にその生成物を３００  ｍＬのアセトン中で沈殿させ、濾過して回収する。その生成物は１５０  ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水中で分散させ、いくらかの塩基を添加し、攪拌条件下に、５０℃まで加熱し、溶解を完了させる。そのものは最後にＨＣｌで中和し、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水を考慮して透析する。そのサンプルは凍結乾燥により回収する。５７０  ｍｇの生成物が得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ−ＮＭＲ）で特定される。そのスペクトロスコピーにより、実施例６に記載のごとく、臭化度５５％が明らかになった。
９．２  エステルの調製
三口フラスコの中において、（９．１）のブロモスクリログルカン２００  ｍｇを、１５  ｍＬのジメチルスルホキシド中で、８０℃で、磁石攪拌条件下に、窒素流下に溶解させる。３時間後、このようにして得た溶液は、室温まで冷却し、５  ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解したレチノイン酸溶液３７０  ｍｇを、塩基の存在下に、その溶液に添加する。その反応混合物は、室温で、窒素流下に、光を遮ったまま、４８時間だけ保持する。次いでその系を１００  ｍＬのアセトン中で沈殿処理し、そのサンプルは濾過して回収、数回洗浄し、最後に乾燥する。６０  ｍｇの生成物が得られる。その生成物の特徴は核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ−ＮＭＲ）で特定される。そのスペクトロスコピーによりシグナルの存在が明らかになる。そのシグナルは、実施例６に記載のごとく、レチノイン酸と呼ばれる。置換度は、実施例２に記載のごとく、定量され、その範囲は１０−２〜１０−６である。
【実施例１０】
【００４９】
実施例３、４、５の多糖エステルによる、胎芽多能性マウステラトカルシノーマ細胞の心分別の誘発
上記の実験はＰ１９細胞、胎芽多能性マウス奇形癌細胞系（細胞培養組織の欧州コレクション、ＵＫ）について実施した。これらの培養細胞は未分化のまま増殖するが、分化剤の存在下に、変態し、数種類の細胞表現形になる。これらの細胞はかくして、胎芽成長期に生じる第一分子事象の概要をなす。特にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下に、Ｐ１９は、レチノイン酸の存在下に、自発的な収縮性運動を備えた心筋細胞に変化する（マックバーネイ、ネーチャー２９９：１６５−１６７、１９８２）。
【００５０】
Ｐ１９細胞は、本発明のヒアルロナンの不存在下にまたは存在下に、６０  ｍｍのペトリ皿において、アルファー−要素（ａｌｐｈａ−ｍｅｍ）媒体中で、懸濁状態で培養する。４日間の処理の後で、チョメジンスキー（Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｙ）とサッチー（Ｓａｃｃｈｉ）の手で記述された方法に従って、全ＲＮＡを抽出した（Ｐ．チョメジンスキー、Ｎ．サッチー、相似生化学１６２：１５６−１５９、１９８７）。特定の転写の表現はＲＴ−ＰＣＲやＲＮａｓｅ保護により評価した。実施例３、４、５に従って調製された、このＰ１９未分化細胞暴露により、プロジノルフィン（ｐｒｏｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）遺伝子表現の著しい増加をもたらした。その表現は多能性細胞における心筋形成の誘導物質である（Ｃ．ベンツラ、Ｍ．マイオリ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．  ８７：１８９−１９４、２０００）。続いて組織−特定の転写因子を分類するＧＡＴＡ−４およびＮｋｘ−２．５遺伝子の遺伝子誘導が起こる。これらの因子は、ショウジョウバエからマウス、ヒトに至るまで、数種類の動物種における、心臓発生法を招くものである（Ｃ．  Ｃｒeｐｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：４０９５−４１０２、１９９５；Ｉ．  Ｓｋｅｒｊａｎｃら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：３４９０４−３４９１０、１９９８）。ＲＴ−ＰＣＲやＲＮａｓｅ保護による、ｍＲＮＡの定量分析により、Ｐ１９細胞のヒアルロナンエステルへの暴露後、プロジノルフィン遺伝子やＧＡＴＡ−４やＮｋｘ−２．５心筋形成遺伝子が発現され、心筋形成のさなかに、心筋分化のマーカーにあたる、アルファー−ミオシン重鎖とミオシン軽鎖−２Ｖ転写が発現されることが略述された（Ｃ．  ベンツラ、Ｍ．  マイオリ；Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ８７：１８９−１９４、２０００）。核流出転写技術により分離核上で実行される、ＧＡＴＡ−４やＮｋｘ−２．５遺伝子の転写速度やプロジノルフィン遺伝子の転写速度の分析（Ｃ．  ベンツラら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ，  Ｃｈｅｍ．  ２７０：３０１１５−３０１２０、１９９５）から立証されたのは、本発明の化合物により誘発される応答は遺伝子転写レベルで生じ、かくしてメッセンジャー安定性レベルでのささいな影響が排除されるというものである。これらの結果が示すものは、胎芽多能性癌細胞の心筋分化を招く遺伝子発現プログラムが、”遺伝子分娩”へのアプローチなしに誘発されることである。さらに、これらのデータが示すものは、Ｐ１９細胞上で発揮される分化という影響が、いかにして神経形成という意味における正常な進化から心筋構築の誘発に至るまで、再転化されうるかということである。
【国際公開パンフレット】
2004536911.tif 000002
2004536911.tif 000003
2004536911.tif 000004
2004536911.tif 000005
2004536911.tif 000006
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2004536911.tif 000008
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2004536911.tif 000010
2004536911.tif 000011
2004536911.tif 000012
2004536911.tif 000013
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2004536911.tif 000016
2004536911.tif 000017
2004536911.tif 000018
2004536911.tif 000019
2004536911.tif 000020
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536911.tif 000021
【国際調査報告】
2004536911.tif 000022
2004536911.tif 000023