(57)【要約】ＳＲＣ−２の発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、ＳＲＣ−２をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＳＲＣ−２発現のモジュレーションおよびＳＲＣ−２の発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＲＣ−２をコードする核酸分子の５’−非翻訳領域、開始コドン、コード領域、停止コドンまたは３’−非翻訳領域を標的とする長さ８〜３０の核塩基のアンチセンス化合物であって、ヒトＳＲＣ−２に特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、前記アンチセンス化合物。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１５、１６、１７、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３２、３８、３９、４０、４１、４２、４７、４８、１２、１３、１８、２０、２２、３６、３７、４３、４４、４５または４６を含む配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１５、１６、１７、２３、２５、３０、３１、３９、４０、４１または４７を含む配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】
修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項５に記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】
修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項７に記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾核塩基を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
修飾核塩基が５−メチルシトシンである、請求項９に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項１３】
コロイド分散システムをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト細胞または組織においてＳＲＣ−２の発現を阻害する方法であって、前記細胞または組織と請求項１に記載のアンチセンス化合物とを接触させ、それによりＳＲＣ−２の発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ＳＲＣ−２と関連する疾患または症状を有するヒトを治療する方法であって、前記動物に対して、治療的または予防的有効量の請求項１に記載のアンチセンス化合物を投与し、それによりＳＲＣ−２の発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項１７】
疾患または症状がホルモン障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
疾患または症状が炎症性障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
疾患または症状が過剰増殖性障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
過剰増殖性障害が癌である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明はＳＲＣ−２発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトＳＲＣ−２をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＳＲＣ−２の発現をモジュレートすることが示された。
【０００２】
発明の背景
ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびレチノイドホルモンは、遺伝子発現を調節することを通じて、様々な一連の生理学的効果を生み出す。細胞内に入る際、これらのホルモンはリガンド依存的転写因子として特徴づけられる細胞内核受容体の独自のグループに対して結合する。ついで、この複合体は核に移動し、そこで、受容体およびその受容体の同種リガンドが、その安定性および究極的には標的遺伝子の転写速度に対して影響を与える転写プレ−イニシエーション複合体と相互作用する。
【０００３】
リガンドが結合した受容体とプロモーター領域の特異的要素との相互作用は、２つのクラスの分子により媒介される；トランス活性化を阻害するコリプレッサーと、トランス活性化を亢進するコアクチベーターである。
【０００４】
ＳＲＣ−２（ステロイド受容体コアクチベーター−２、ＴＩＦ２、ＧＲＩＰ−１およびＮｃｏＡ−２としても知られる）は、転写コアクチベーターの拡大しつつあるファミリーの構成分子である。
【０００５】
ＮＣｏＡ−２（ＳＲＣ−２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実質的に精製された核酸分子がＰＣＴ国際公開ＷＯ ９８／５６８０６中に開示されそして請求項に記載される。本発明の核酸分子に対して結合するヌクレオチド配列であって、例えばｐ／ＣＩＰをコードする核酸分子の発現を阻害することができるプローブまたはアンチセンス分子として有用であるそのようなヌクレオチド配列が、一般的には開示される。ＴＩＦ２（ＳＲＣ−２）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ＴＩＦ２（ＳＲＣ−２）ポリペプチドまたはそのフラグメントと少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドと相補的はヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子が、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／０２４５５中に開示されそして請求項に記載される。
【０００６】
ＳＲＣ−２の特性決定に関する研究により、タンパク質が、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体プロゲステロン受容体を含むステロイド受容体によって（Ｖｏｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊ．， １９９６， １５， ３６６７−３６７５）だけでなく、甲状腺ホルモン受容体、レチノイドホルモン受容体、グルココルチコイドホルモン受容体およびビタミン−Ｄ受容体が含まれる非−ステロイド受容体によっても（Ｖｏｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊ．， １９９８， １７， ５０７−５１９）、転写トランス活性化を媒介することができることが示された。さらに、転写物の発現が、膵臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、脳、および心臓を含むヒト組織において見いだされ、より低いレベルで腎臓で見いだされた（Ｖｏｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊ．， １９９６， １５， ３６６７−３６７５）。
【０００７】
ＳＲＣ−２は最近、急性骨髄性白血病の異なるサブタイプにおける遺伝子転写のモジュレーションの変化と結びつけられた（Ｃａｒａｐｅｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， １９９８， ９１， ３１２７−３１３３）。これらの研究から、染色体転座ｉｎｖ（８）（ｐ１１ｑ１３）の結果、ＭＯＺ（単球白血病ｚｉｎｃフィンガータンパク質；ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＳＲＣ−２に対する融合タンパク質が得られることが示された。得られたタンパク質は、両方のタンパク質のアセチルトランスフェラーゼドメインを維持しており、そしてしたがって、異常なヒストンアセチル化が関連するメカニズムを介して疾患に対して寄与することが考えられた。
【０００８】
現在のところ、ＳＲＣ−２の合成を効率的に阻害する既知の治療剤は存在しない。結果として、ＳＲＣ−２機能を効率的に阻害することができる追加的な薬剤を求める長い間感じられている必要性が存在し続けている。
【０００９】
したがって、ＳＲＣ−２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＲＣ−２発現の効果的かつ特異的なモジュレーションのための多数の治療的、診断的、および研究的用途において、比類なく有用であることが証明されうると、期待される。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＳＲＣ−２をコードする核酸を標的とし、そしてＳＲＣ−２の発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でＳＲＣ−２の発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、ＳＲＣ−２の発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＳＲＣ−２をコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるＳＲＣ−２の量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、ＳＲＣ−２をコードする１またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“ＳＲＣ−２をコードする核酸”は、ＳＲＣ−２をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきＲＮＡの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばＲＮＡのタンパク質翻訳部位への転移（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、ＲＮＡからタンパク質への翻訳、１またはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに含まれる触媒活性またはＲＮＡにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、ＳＲＣ−２の発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてｍＲＮＡは好ましい標的である。
【００１２】
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子（あるいはその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はＳＲＣ−２をコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に１または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、“ＡＵＧコドン”、“スタートコドン”または“ＡＵＧスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧが、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、２またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの１またはそれ以上の配列にかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏで使用して、ＳＲＣ−２をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始する、１またはそれ以上のコドンのことをいう。
【００１３】
遺伝子の翻訳終止コドン（または“停止コドン”）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続するヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡまたは遺伝子の部分のことを言う。
【００１４】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから５’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、そして翻訳終止コドンから３’方向におけるｍＲＮＡの部分、そしてしたがってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップには５’−５’三リン酸結合を介して、ｍＲＮＡの最も５’側の残基と結合するＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドも含むと考えられている。５’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【００１５】
いくつかの真核細胞ｍＲＮＡ転写物は直接的に翻訳されるが、多くは１またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの（そしてしたがって翻訳される）領域は、 “エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
【００１６】
いったん１またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
【００１７】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、２つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％の相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対する化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非−標的配列に対するアンチセンス化合物の非−特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００１８】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究用途として使用された。
【００１９】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合、および同様に機能する非−天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。
【００２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体（しかし、これらのものには限定されない）を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約３０核塩基（すなわち、約８〜約３０の連結したヌクレオシド）を含む。具体的な好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは約１２〜約２５核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合またはバックボーンは、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【００２１】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非−天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００２２】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスホネート、２’−５’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、５’−３’に対して３’−５’または５’−２’に対して２’−５’に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。
【００２３】
上述したリン−含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；および５，６２５，０５０が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００２４】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
【００２５】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；および５，６７７，４３９が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００２６】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）とも呼ばれている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７−１５００）中に見出すことができる。
【００２７】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許５，４８９，６７７の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−〔メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーン〕、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−〔ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として示される〕そして上述の米国特許５，６０２，２４０のアミドバックボーンである。上述した米国特許５，０３４，５０６のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【００２８】
修飾オリゴヌクレオチドは、１またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位で以下のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでありうる。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２、ここでｎおよびｍは１から約１０である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載する場合、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、そして２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、本明細書中の以下の実施例において２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２とも記載される、が含まれる。
【００２９】
その他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；および５，７００，９２０が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【００３０】
オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる）修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、そしてピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、たとえば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれる。さらなる核塩基には、米国特許Ｎｏ． ３，６８７，８０８に開示されたもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されたもの、そしてＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ． ， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３により開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６−２７８）、そして現在は好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【００３１】
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上述したＵ．Ｓ． ３，６８７，８０８、およびＵ．Ｓ．： ４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；および５，６８１，９４１が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許５，７５０，６９２が含まれ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献として本明細書中に援用する。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する１またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分には、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４， １０５３−１０６０）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３−５３８）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０， １１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９−５４）、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ， １９９５， １４， ９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３−９３７）が含まれるが、これらには限定されない。
【００３３】
この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７， ５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１， ５，３９１，７２３；５，４１６，２０３， ５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８および５，６８８，９４１が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用される。
【００３４】
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、２つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化により、したがって、結果としてＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。
【００３５】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；および５，７００，９２２が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。
【００３６】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。
【００３７】
本発明のアンチセンス化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を指向するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００３８】
本発明の化合物を、取り込み、分布および／または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、Ｕ．Ｓ．： ５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；および５，５９５，７５６が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
【００３９】
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を（直接的にまたは間接的に）提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
【００４０】
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および／または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型（すなわち、薬物）に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、ＧｏｓｓｅｌｉｎらのＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日に発行）またはＩｍｂａｃｈらのＷＯ ９４／２６７６４に開示された方法に従うＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【００４１】
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
【００４２】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカイン（たとえば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．， １９７７， ６６， １−１９を参照）である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など；有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはＮ−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸；そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する２０個のα−アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれ���。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
【００４３】
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩；（ｂ）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；そして（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩；が含まれるが、これらには限定されない。
【００４４】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療薬として、ＳＲＣ−２の発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは遅延させるためにも有用である場合がある。
【００４５】
これらの化合物がＳＲＣ−２をコードする核酸に対してハイブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他のアッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＳＲＣ−２をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サンプル中のＳＲＣ−２のレベルを検出するためのこの様な検出手段を使用するキットもまた、調製することができる。
【００４６】
本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤が含まれる。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどうか、そして治療すべき領域に依存して、多数の方法により投与することができる。投与は、局所（眼を含み、および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、肺、たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹き込みによるもの；気管内、鼻内、表皮、および経皮）、経口または非経口により行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入；または頭蓋内、たとえば、くも膜下投与または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている。
【００４７】
局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤が含まれうる。従来からの医薬的な担体、液体、粉末または油状基材、増粘剤などは、必要とされるかまたは所望される場合がある。コートしたコンドーム、手袋などもまた有用である。
【００４８】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、懸濁剤または水溶液または非水性媒体中溶液、カプセル、サシェ、または錠剤などが含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が好ましい場合がある。
【００４９】
非経口投与、くも膜下投与または脳室内投与のための組成物および製剤には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加物、たとえば浸透亢進剤、担体化合物、およびその他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤もまた含有しうる、滅菌水溶液が含まれうる。
【００５０】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することができるが、これらには限定されない。
【００５１】
単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性有効成分と１または複数の医薬的担体または１または複数の医薬的賦形剤とを組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【００５２】
本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有してもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【００５３】
本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用することができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのものには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【００５４】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる。エマルジョンは、通常は直径０．１μｍを超える液滴の形状で、一つの液体を別の液体中に分散させた典型的には不均質の系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９；Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ． ３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された２種の不混和性の液体相を含む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種（ｗ／ｏ）または水中油型の種（ｏ／ｗ）のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあるいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加えて、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような、２種以上の相を含む、マルチエマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる２成分のエマルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
【００５５】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さないことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン−型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく４つのカテゴリーに分類される場合がある：合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００５６】
合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョンの製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５； Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、そして製剤の調製においてサーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５）。
【００５７】
エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸収して、ｗ／ｏエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンがある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水酸化物；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、カオリン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー；色素；および炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体；などの極性の無機固体が含まれる。
【００５８】
非常に様々な非−乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００５９】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム（ｇｕａｒ ｇｕｍ）、インドゴム（ｋａｒａｙａ ｇｕｍ）、そしてトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、そして合成ポリマー（たとえば、カルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。これらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【００６０】
エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第４アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル（ａｌｋｙｌ ｇａｌｌａｔｅｓ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【００６１】
外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およびそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効率的であるため、非常に幅広く使用されてきた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。ミネラル油−ベースの緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、ｏ／ｗエマルジョンとして経口的に投与される物質に含まれる。
【００６２】
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、のシステムとして定義されうる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アルコールである十分量の第４の構成要素を添加して、透明なシステムを形成することにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムにより安定化される２種の不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む、３〜５種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるかあるいは水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファクタント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ２７１）。
【００６３】
相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイクロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な知識が得られた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水−不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【００６４】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非−イオン性サーファクタント、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉ ｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）、が、単独であるいはコサーファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファクタントは、通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的にはサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製することができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中間鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【００６５】
マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度および膜透過性におけるサーファクタント−誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向上、および毒性の低減といった利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８−１４３）。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性（熱不安定性）薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方において、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔（ｂｕｃｃａｌ ｃａｖｉｔｙ）およびその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込みを向上させることができる。
【００６６】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾル（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するものとして分類することができる：サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、および非−キレート非−サーファクタント（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ． ９２）。これらのクラスのそれぞれは、上述した。
【００６７】
リポソーム
マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用された、多くの有機（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）サーファクタント構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大きな興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語は、球状の１または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【００６８】
リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非−カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することができないものの、マクロファージによりｉｎ ｖｉｖｏにおいて取り込まれる。
【００６９】
無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響のもと、それぞれが直径５０ ｎｍ未満であるような一連の微細な孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過することができるリポソームを使用することが好ましい。
【００７０】
リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる；天然のリン脂質から得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである；リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる；リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【００７１】
リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソームと細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用することができる細胞中へ移る。
【００７２】
リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与された薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に投与する能力、が含まれる。
【００７３】
いくつかの報告は、リポソームが高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中に送達する能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とした。
【００７４】
リポソームは、２つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、マイナス（−）に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プラス（＋）に荷電したリポソームである。プラスに荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化される。エンドソーム中の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １４７， ９８０−９８５）。
【００７５】
ｐＨ−感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するというよりは、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複合体の形成ではなく反発（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）が生じる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。ｐＨ−感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９９２， １９， ２６９−２７４）。
【００７６】
リポソーム組成物の１つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン性フソジェニックな（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびタマゴＰＣなどのＰＣから形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００７７】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段（たとえば溶液またはエマルジョン）を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， １９９２， ２， ４０５−４１０）。さらに、別の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９２， １８， ２５９−２６５）．
薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非−イオン性リポソームシステム、特に、非−イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含むシステムを調べた。ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非−イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非−イオン性リポソームシステムは、シクロスポリン−Ａが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効果的であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， １９９４， ４， ６， ４６６）。
【００７８】
リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語は本明細書中で使用される場合、１またはそれ以上の特殊な（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）脂質であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まないリポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームのことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞−形成性脂質部分の一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１またはそれ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いずれかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野においては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７， ２２３， ４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ５３， ３７６５）。１またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７，  ５０７， ６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９）により述べられた。米国特許Ｎｏ． ４，８３７，０２８およびＷＯ ８８／０４９２４は、両方ともＡｌｌｅｎらによるものであるが、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米国特許Ｎｏ． ５，５４３，１５２（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）中に開示されている。
【００７９】
１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇ、を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９８４， １６７， ７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキレングリコール（たとえば、ＰＥＧ）のカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）基の結合により修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓにより記載されている（米国特許Ｎｏｓ． ４，４２６，３３０および４，５３４，８９９）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２６８， ２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１）は、そのような知見をその他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ、に拡張した。共有結合したＰＥＧ部分をその外側表面に有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４４５ １３１ Ｂ１およびＷＯ ９０／０４３８４中に記載される。ＰＥＧにより誘導体化された１〜２０モル％のＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許Ｎｏｓ． ５，０１３，５５６および５，３５６，６３３）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許Ｎｏ． ５，２１３，８０４および欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１）により記載される。多数のその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームは、ＷＯ ９１／０５５４５および米国特許Ｎｏ． ５，２２５，２１２（両方ともＭａｒｔｉｎら）およびＷＯ ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）において記載される。ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許Ｎｏｓ． ５，５４０，９３５（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および５，５５６，９４８（Ｔａｇａｗａら）は、その表面に対して官能基部分をさらに誘導体化することができる、ＰＥＧ−含有リポソームを記載する。
【００８０】
核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許Ｎｏ． ５，２６４，２２１は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスＲＮＡが含まれうることを明らかにしている。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許Ｎｏ． ５，６６５，７１０は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【００８１】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、リポソームのさらに別の型であり、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、たとえばそれらは、自己−最適性（皮膚の孔の形状に適応する）であり、自己−修復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしばしば自己−負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するため、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター（ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファーソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンのトランスファーソーム−媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【００８２】
サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプのサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファクタントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（“ヘッド”としても知られる）の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴリー化に対して最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【００８３】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いｐＨ値にわたって使用することができる。一般的には、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【００８４】
サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負（−）の荷電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サーファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅｓ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅｓ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅｓ）およびスルホコハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石けんである。
【００８５】
サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正（＋）の荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【００８６】
サーファクタント分子が正（＋）の荷電または負（−）の荷電のいずれをも有する能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、Ｎ−アルキルベタイン類およびホスファチド類が含まれる。
【００８７】
薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下にレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【００８８】
浸透亢進剤
一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。非−親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には、細胞膜を通過することができることを見出した。非−親油性薬物の細胞膜を通じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向上させる。
【００８９】
浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非−キレート非−サーファクタント、の一つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。浸透亢進剤の上述したクラスのそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【００９０】
サーファクタント：本発明に関連して、サーファクタント（あるいは“表面−活性剤”）は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）；およびＦＣ−４３などのパーフルオロ化学物質エマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８８， ４０， ２５２）が含まれる。
【００９１】
脂肪酸：浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（たとえば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４， ６５１−６５４）。
【００９２】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散および吸収を促進することが含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ． ９３４−９３５）。様々な天然の胆汁酸塩、およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸（あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ）ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９２， ２６３， ２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， ７９， ５７９−５８３）。
【００９３】
キレート剤：本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は、最も特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するという追加の利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １９９３， ６１８， ３１５−３３９）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（たとえば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらには限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．， １９９０， １４， ４３−５１）。
【００９４】
非−キレート非−サーファクタント：本明細書中で使用する場合、非−キレート非−サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３）。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非−ステロイド性抗炎症性薬剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９， ６２１−６２６）が含まれる。
【００９５】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ， 米国特許Ｎｏ． ５，７０５，１８８）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／３０７３１）も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを亢進することが知られている。
【００９６】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン（ａｚｏｎｅ）、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することができる。
【００９７】
担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である（すなわち、それ自体生物学的活性を有さない）が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより、核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物（典型的には担体化合物を過剰量）の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少することができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５， １１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６， １７７−１８３）。
【００９８】
賦形剤
担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して１またはそれ以上の核酸を送達するためのいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合剤（たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらには限定されない。
【００９９】
核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１００】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非−滅菌水溶液、アルコールなどの一般的溶媒中での非−水溶液、または液体または固体油状基剤中の核酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することができる。
【０１０１】
適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０２】
その他の構成要素
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の（１またはそれ以上の）核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、着香料および／または芳香性物質などと混合することができる。
【０１０３】
水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【０１０４】
本発明の特定の態様は、（ａ）１またはそれ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）非−アンチセンスメカニズムにより機能する１またはそれ以上のその他の化学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗ガン薬物を含むが、これらには限定されない（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐａｇｅｓ １２０６−１２２８を参照）。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを含む抗炎症性薬物（しかしこれらには限定されない）、およびリビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、アシクロビルおよびガンシクロバーを含む抗ウィルス性薬物（しかしこれらには限定されない）を、本発明の組成物中に組み合わせることができる（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐａｇｅｓ ２４９９−２５０６ ａｎｄ ４６−４９， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙを参照）。その他の非−アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲に含まれる。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１０５】
別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、１またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする１またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野で知られている。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１０６】
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるＥＣ５０に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、０．０１ ｕｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重であり、そして１日、１週間、１ヶ月、あるいは１年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは２〜２０年ごとに１度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、１日に１回またはそれ以上〜２０年間ごとに１回で、０．０１ ｕｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重の範囲で、維持用量で投与する。
【０１０７】
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
【０１０８】
【実施例】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）より購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０６，３５１に記載の通り調製する。２’−アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を３６０秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
【０１０９】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡまたはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）を用いて公表された方法〔Ｓａｎｇｈｖｉ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ２１， ３１９７−３２０３〕に従って合成した。
【０１１０】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Ｋａｗａｓａｋｉら、 Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９３， ３６， ８３１−８４１〕、及び、アメリカ合衆国特許５，６７０，６３３に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンは、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換により導入することより、合成した。このようにＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として選択的に保護した。ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイト中間体を得た。
【０１１１】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）で保護した９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。ＴＰＤＳ基の脱保護に続いて水酸基のＴＨＰによる保護によりジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後ＴＨＰ基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイトを得た。
【０１１２】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジン（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１１３】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１１４】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ．（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）の方法に従って調製した。
【０１１５】
２，２’−アンヒドロ〔１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン〕
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ， Ｃｈｏｓｈｉ， Ｊａｐａｎにより市販され入手可能な、リボシルチミン）（７２．０ ｇ、０．２７９ Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ ｇ、０．４２０ Ｍ）及び炭酸水素ナトリウム（２．０ ｇ、０．０２４ Ｍ）をＤＭＦ（３００ ｍＬ）に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。１時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（２．５ Ｌ）中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール（約４００ ｍＬ）に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル（２．５ Ｌ）に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ（６０℃、１ ｍｍ Ｈｇで２４時間）、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした（５７ ｇ、８５％粗収率）。ＮＭＲスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった（約５％）構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた（あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配（１０−２５％）を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点２２２−４℃の白色の固体を得ることができる）。
【０１１６】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ ｇ、０．８１ Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸（２３１ ｇ、０．９８ Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２ Ｌ）を、２ Ｌステンレススチール圧力容器に加え、１６０℃に予熱した油浴中に設置した。１５５−１６０℃で４８時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣を熱したアセトン（１ Ｌ）中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン（１５０ ｍＬ）で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を（２８０ ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ ｍＬ）に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ ｋｇ）を０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中に充填した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ ｍＬ）中に溶解し、そして、シリカ（１５０ ｇ）に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、１６０ ｇ（６３％）の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【０１１７】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ ｇ、０．５０６ Ｍ）をピリジン（２５０ ｍＬ）と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン（１．３ Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、混合液を室温で１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、反応液をさらに１時間攪拌した。メタノール（１７０ ｍＬ）を次に加え、反応を停止した。ＨＰＬＣにより、約７０％の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、ＣＨ３ＣＮ（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣をＣＨＣｌ３（１．５ Ｌ）に溶解し、次に、２×５００ ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び２×５００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。２７５ ｇの残渣が得られた。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、１６４ ｇの生成物を得た。さらに約２０ ｇが不純な分画より得られ、全収量１８３ ｇ（５７％）を得た。
【０１１８】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ ｇ、０．１６７ Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ ｍＬのＤＭＦと１８８ ｍＬのピリジンから調製された３：１の混合液７５０ ｍＬ）、及び、無水酢酸（２４．３８ ｍＬ、０．２５８ Ｍ）を混合し、そして、室温で２４時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ試料にＭｅＯＨを添加し初めに急冷すること（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）によりＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断した反応の終了時に、ＭｅＯＨ（５０ ｍＬ）を加え、混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、２×２００ ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム及び２×２００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。水層を２００ ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、１２２ ｇ（約９０％生成物）の残渣を得た。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、そして、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、９６ ｇ（８４％）を得た。後の分画より追加の１．５ ｇを回収した。
【０１１９】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ ｇ、０．１４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ ｍＬ）に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン（１８９ ｍＬ、１．４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（１ Ｌ）中トリアゾール（９０ ｇ、１．３ Ｍ）溶液に加えて、−５℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して０．５時間攪拌した。０−１０℃に維持した攪拌溶液に、３０分間、ＰＯＣｌ３を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに２時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、４５分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１ Ｌ）に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を１×３００ ｍＬのＮａＨＣＯ３及び２×３００ ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中で磨砕し、表題の化合物を得た。
【０１２０】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
ジオキサン（５００ ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（３０ ｍＬ）中３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ ｇ、０．１４１ Ｍ）溶液を、室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２×２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ ｍＬ）に溶解し、２リットルステンレススチール圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ ｍＬ）を加え、その容器を１００℃、２時間熱した（完全な変換がＴＬＣにより示された）。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ ｍＬ）に溶解し、次に、飽和ＮａＣｌ（２００ ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて８５ ｇ（９５％）の表題の化合物を得た。
【０１２１】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ ｇ、０．１３４ Ｍ）をＤＭＦ（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、無水安息香酸（３７．２ ｇ、０．１６５ Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌後、反応が約９５％終了したことをＴＬＣが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をＭｅＯＨ（２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ３（７００ ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２×３００ ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣（９６ ｇ）を得た。残渣を、溶出溶媒として０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ ｇ（９０％）の表題化合物を得た。
【０１２２】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ ｇ、０．１０ Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ−（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ ｍＬ、０．１２３ Ｍ）を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間攪拌した（反応が９５％終了したことをＴＬＣが示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ ｍＬ）で抽出した。水層洗浄液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ ｍＬ）で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、９０．６ ｇ（８７％）の表題化合物を得た。
【０１２３】
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野において２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブチリルにより保護されることを除いては、チミジン（５−メチルウリジン）と同様に調製される。
【０１２４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ． Ｂｉｏ． Ｓｉｎｔ．， Ｖａｒｅｓｅ， Ｉｔａｌｙ， １００．０ ｇ、０．４１６ ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ ｇ、０．０１３ ｅｑ、０．００５４ ｍｍｏｌ）を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水ピリジン（５００ ｍｌ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ ｇ、１１９．０ ｍＬ、１．１ ｅｑ、０．４５８ ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物は周囲温度で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２２、酢酸エチル）により反応が終了したことが示された。溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン（１ Ｌ）、及び、飽和炭酸水素ナトリウム（２×１ Ｌ）及びブライン（１ Ｌ）間で分配させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの１：１の混合液（６００ ｍＬ）に溶解し、次に、溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、エチルエーテル（３×２００ ｍＬ）で洗浄し、さらに、乾燥して（４０℃、１ ｍｍ Ｈｇ，、２４ 時間）、１４９ ｇ（７４．８％）の白色の固体にした。ＴＬＣ及びＮＭＲは純粋な生成物と一致した。
【０１２５】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２ Ｌステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン（１．０ Ｍ、２．０ ｅｑ、６２２ ｍＬ）を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエチレングリコール（３５０ ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじめは注意深く加えた。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ ｇ、０．３１１ ｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（０．０７４ ｇ、０．００３ ｅｑ）を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が１６０℃に達するまで油浴中で熱し、そして次に１６時間維持した（圧力＜ １００ ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。ＴＬＣ（望ましい生成物はＲｆ ０．６７ 及びａｒａ−Ｔ副生成物はＲｆ ０．８２、酢酸エチル）は約７０％が生成物に変換したことを示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下（１０から１ ｍｍ Ｈｇ）、湯浴中（４０−１００℃）で、エチレングリコールを除くために使われるより極度の条件で、濃縮した。［あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう。］残渣をカラムクロマトグラフィー（２ ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１から４：１）により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥させて、白色のカリカリ（ｃｒｉｓｐ）した泡状物（８４ ｇ、５０％）、混在した出発物質（１７．４ ｇ）、及び、純粋な再利用できる出発物質２０ ｇを得た。出発物質、純度の低い回収した出発物質をもとにした収率は５８％だった。ＴＬＣ及びＮＭＲは、９９％の純度の生成物と一致した。
【０１２６】
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ ｇ、３６．９８ ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）と混ぜた。その後、強い減圧条件下、４０℃、２日間、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。反応混合液をアルゴンをフラッシュし（ｆｌｕｓｈｅｄ）そして、無水ＴＨＦ（３６９．８ ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、確実に密閉させた瓶）を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩（６．９８ ｍＬ、４４．３６ ｍｍｏｌ）を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、反応物を４時間攪拌した。その頃までに、ＴＬＣにより反応の終了が示された（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出し、２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色の泡状物（２１．８１９ ｇ、８６％）として得た。
【０１２７】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ ｇ、４．５ ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ ｍＬ）に溶解し、そして、メチルヒドラジン（３００ ｍＬ、４．６４ ｍｍｏｌ）を−１０℃から０℃において滴下して加えた。１時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、そして、合わせた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、それを次にＭｅＯＨ（６７．５ ｍＬ）に溶解した。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１ ｅｑ．）を加え、そして、得られた混合物を１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き；残渣をクロマトグラフィーで分離して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡（１．９５ ｇ、７８％）として得た。
【０１２８】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン（１．７７ ｇ、３．１２ ｍｍｏｌ）を１ Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を、１０℃、不活性気体条件下で、この溶液に加えた。反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温で２時間攪拌し、反応をＴＬＣでモニターした（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ ｍＬ）を加え、そして、酢酸エチルで抽出した（２×２０ ｍＬ）。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした。残渣を、ＭｅＯＨ（３０．６ ｍＬ）中の１ Ｍ ＰＰＴＳ溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ、３０ ｍＬ、３．３７ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を氷浴中で１０℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。１０分後、反応混合液を氷浴から取り出し、そして、室温で２時間攪拌した。反応混合液に５％ＮａＨＣＯ３（２５ ｍＬ）溶液を加え、そして、酢酸エチル（２×２５ ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨで溶出し、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡状物（１４．６ ｇ、８０％）として得た。
【０１２９】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ ｍＬ、２４．０ ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ ｍＬ、１２ ｍｍｏｌ、無水ＫＯＨで維持）に溶解した。このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物を、次に、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン（１．４０ ｇ、２．４ ｍｍｏｌ）に加えて、そして、室温で２４時間攪拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ ｍｇ、９２．５％）を得た。
【０１３０】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ ｍｇ、２．１７ ｍｍｏｌ）を、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、無水ピリジン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン（１１ ｍＬ）に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）を混合液に加え、そして、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ（ピリジンを数滴含む）で溶出し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ ｇ、８０％）を得た。
【０１３１】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させる。残渣にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）を加えて、次に、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ ｍＬ）に溶解し、そして、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホールアミダイト（２．１２ ｍＬ、６．０８ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で４時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル（７０ ｍＬ）に溶解し、そして、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより分離し（溶出溶媒としては酢酸エチル）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕（１．０４ ｇ、７４．９％）を泡状物として得た。
【０１３２】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野において、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【０１３３】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリボシドは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入することが可能であり、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを、少量の３’−Ｏ−異性体と共に提供する。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼ処理により分解され、そして、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換され得る（ＭｃＧｅｅ， Ｄ． Ｐ． Ｃ．， Ｃｏｏｋ， Ｐ． Ｄ．， Ｇｕｉｎｏｓｓｏ， Ｃ． Ｊ．， ＷＯ ９４／０２５０１ Ａ１ ９４０２０３．）。標準的な保護の手法は２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを与えるに違いなく、それは、還元され、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオシドは通常通り、ホスフィチル（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌ）化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得ることができる。
【０１３４】
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２、あるいは２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても知られる）は、以下のように調製される。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製される。
【０１３５】
２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
１００ ｍＬボンベ中で、テトラヒドロフラン中のボラン（１ Ｍ、１０ ｍＬ、１０ ｍｍｏｌ）の溶液に、２〔２−（ジメチルアミノ）エトキシ〕エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ、６．６６ ｇ、５０ ｍｍｏｌ）を攪拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生する。Ｏ２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ ｇ、５ ｍｍｏｌ）、及び、炭酸水素ナトリウム（２．５ ｍｇ）を加え、そして、ボンベを密閉し、油浴中に入れ、そして、１５５℃にて、２６時間加熱する。ボンベは室温まで冷却し、そして、開封する。粗溶液を濃縮し、そして、残渣を水（２００ ｍＬ）およびヘキサン（２００ ｍＬ）の間で分配した。過剰量のフェノールを、ヘキサン層中で抽出した。水層を酢酸エチル（３×２００ ｍＬ）により抽出し、そして合わせた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、濃縮する。残渣を、溶出溶媒としてメタノール／塩化メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを含む）を使用したシリカゲルカラムにかける。カラム分画が濃縮されるにつれて、無色の固体が形成され、集められて、表題の化合物を白色の固体として得る。
【０１３６】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン
無水ピリジン（８ ｍＬ）中０．５ ｇ（１．３ ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン溶液に、トリエチルアミン（０．３６ ｍＬ）及びジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ ｇ、２ ｅｑ．）を加えて、そして、１時間攪拌する。反応混合物を水（２００ ｍＬ）に注ぎいれ、そして、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ２Ｃｌ２層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、続いて飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続いて、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１、ｖ／ｖ、１％トリエチルアミンを含む）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【０１３７】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホールアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ ｇ）及び２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト（１．１ ｍＬ、２ ｅｑ．）を、アルゴン気体条件下、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−〔２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）〕−５−メチルウリジン（２．１７ ｇ、３ ｍｍｏｌ）に加える。反応混合液を一晩攪拌し、そして、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出溶媒として用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、表題の化合物を得る。
【０１３８】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【０１３９】
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中０．２ Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を６８秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムからの分離、及び、５５℃で（１８時間）濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、２．５倍量のエタノールで２回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを０．５ Ｍ ＮａＣｌ溶液から精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０８，２７０に記載の通り、調製する。
【０１４０】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許４，４６９，８６３に記載の通り、調製する。
【０１４１】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，６１０，２８９あるいは５，６２５，０５０に記載の通り、調製する。
【０１４２】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２５６，７７５あるいはアメリカ合衆国特許５，３６６，８７８に記載の通り、調製する。
【０１４３】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ ９４／１７０９３及びＷＯ ９４／０２４９９として公開）に記載の通り、調製する。
【０１４４】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，０２３，２４３に記載の通り、調製する。
【０１４５】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許５，０２３，２３４に記載の通り、調製する。
【０１４６】
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，１３０，３０２及び５，１７７，１９８に記載の通り、調製する。
【０１４７】
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−３結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−４結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、ＭＭＩとＰ＝ＯあるいはＰ＝Ｓ結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０及び５，６１０，２８９，に記載の通り、調製する。
【０１４８】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２６４，５６２及び５，２６４，５６４に記載の通り、調製する。
【０１４９】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２２３，６１８に記載の通り、調製する。
【０１５０】
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する様々な方法：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ４， ５−２３のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５３９，０８２、５，７００，９２２，、及び、５，７１９，２６２に従ってもまた、調製され得る。
【０１５１】
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの５’あるいは３’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の３’あるいは５’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
【０１５２】
〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−Ｍｅ〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡシンセサイザーＭｏｄｅｌ ３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、ＤＮＡ部分には２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホールアミダイトを、そして、５’及び３’ウィングには５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を６００秒に増加することにより修正し、ＲＮＡについては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、３：１アンモニア／エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で２４時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをＴＨＦ中１ Ｍ ＴＢＡＦに、室温で２４時間懸濁し、２’位を脱保護する。次に、反応を１ Ｍ ＴＥＡＡで停止し、そして次に試料をｒｏｔｏｖａｃにより１／２量に減少させ、Ｇ２５サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
【０１５３】
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）〕−−〔２’−デオキシ〕−−〔２’−Ｏ−（メトキシエチル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２’−Ｏ−メチルアミダイトに置き換えた２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
【０１５４】
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕−−〔２’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕−−〔２’−デオキシホスホロチオエート〕−−〔２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２’−Ｏ−メチルアミダイトに置き換えた、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用する硫化に従って、調製する。
【０１５５】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，６２３，０６５に従って合成される。
【０１５６】
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、５５℃、１８時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、０．５ Ｍ ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールを用いた２回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも８５％の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に３１Ｐ核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １８１６２−１８１７１）により記載の通り、ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製産物を用いて得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製産物から得られたものと同様だった。
【０１５７】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホールアミダイト化学により、標準的な９６ウェル型に同時に９６配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡまたはＰｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
【０１５８】
オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度（５５−６０℃）にて、１２−１６時間、濃縮ＮＨ４ＯＨにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。
【０１５９】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びＵＶ吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により、９６ウェル型（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ＭＤＱ）で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のＣＥ器具（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｐ／ＡＣＥＴＭ ５０００， ＡＢＩ ２７０）で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも８５％が、少なくとも全長の８５％であれば、許容可能であると判断した。
【０１６０】
実施例９
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、ＰＣＲあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の４つの細胞タイプは説明するために提供されるが、標的が選択された細胞タイプ中において発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはＲＴ−ＰＣＲ、により容易に確認することができる。
【０１６１】
Ｔ−２４細胞：
移行上皮細胞（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ）膀胱癌細胞株Ｔ−２４細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手した。Ｔ−２４細胞は、日常的に、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、１００ ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加えた、完全ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で、培養した。細胞は、日常的に、それが９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析において使用するため、細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に７０００細胞／ウェルの濃度でまいた。
【０１６２】
ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を１００ ｍｍあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。
【０１６３】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手した。Ａ５４９は、日常的に、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、１００ ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を加えた、ＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で培養した。細胞は、日常的に、それが９０％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
【０１６４】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）より入手した。ＮＨＤＦは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、１０継代まで維持した。
【０１６５】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児ケラチノサイト（ＨＥＫ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）より入手した。ＨＥＫ細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ ＭＤ）で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、１０継代まで維持した。
【０１６６】
アンチセンス化合物の処理：
細胞が８０％コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。９６ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で一度洗浄し、次に３．７５μｇ／ｍＬ ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含む、１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ −１で処理した。４〜７時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間後に細胞を回収した。
【０１６７】
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓを標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示した）である、ＩＳＩＳ １３９２０、
【０１６８】
【化１】
2004517630.tif 000002
【０１６９】
である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスｃ−ｒａｆおよびラットｃ−ｒａｆの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示した）である、ＩＳＩＳ １５７７０、
【０１７０】
【化２】
2004517630.tif 000003
【０１７１】
である。ｃ−Ｈａ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ １３９２０）ｍＲＮＡまたはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ １５７７０）ｍＲＮＡの８０％の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。８０％の阻害が達成されない場合、ｃ−Ｈａ−ｒａｓまたはｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの６０％の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。６０％の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。
【０１７２】
実施例１０
ＳＲＣ−２発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ＳＲＣ−２発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、ＳＲＣ−２ ｍＲＮＡレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいは、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、定量され得る。リアルタイム定量ＰＣＲが現在のところ好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞内ＲＮＡ、あるいは、ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡについて行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．１．１−４．２．９ 及び４．５．１−４．５．３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９３）に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．２．１−４．２．９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９６）に教示される。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）から入手可能な、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。定量的ＰＣＲ解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライマー−プローブセットを、ＧＡＰＤＨ増幅反応とともに“多重化される”能力について評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方を、単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離されるｍＲＮＡは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、ＧＡＰＤＨのみまたは標的遺伝子のみに特異的なプライマー−プローブセットの存在下（“単一反応性（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）”）、もしくは両方に特異的なプライマー−プローブセットの存在下（多重性）において増幅させる。ＰＣＲ増幅の後、ＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を、希釈の関数として単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方から作成する。多重反応性サンプルから作成されたＧＡＰＤＨシグナルおよび標的シグナルの傾きおよび相関係数が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対応する値の１０％以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマー−プローブセットは、多重性であるとみなされる。ＰＣＲの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
【０１７３】
ＳＲＣ−２タンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析（イムノブロット）、ＥＬＩＳＡ、あるいは、蛍光活性化細胞分取器（ＦＡＣＳ）といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。ＳＲＣ−２に対する抗体は同定され、そして、ＭＳＲＳの抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＭＩ）といった、様々な供給者から入手することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．１２．１−１１．１２．９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７）に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．４．１−１１．１１．５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７）に教示される。
【０１７４】
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １０．１６．１−１０．１６．１１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９８）において見いだすことができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １０．８．１−１０．８．２１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９８）において見いだすことができる。酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐｐ． １１．２．１−１１．２．２２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９１）において見つけることができる。
【０１７５】
実施例１１
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡは、Ｍｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， １９９６， ４２， １７５８−１７６４）に従って、単離された。ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐｐ． ４．５．１−４．５．３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９３）に教示される。簡潔には、９６ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬ溶解バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．６、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で５分間インキュベートした。溶解物５５μＬをオリゴｄ（Ｔ）をコートした９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）に移した。プレートを、６０分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ Ｍ ＮａＣｌ）２００μＬで３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、５分間風乾した。７０℃に前もって熱した、溶出バッファー（５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６）６０μＬを、各ウェルに加え、プレートを９０℃ホットプレートで５分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０１７６】
１００ ｍｍあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。
【０１７７】
実施例１２
全ＲＮＡ単離
全ｍＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）より購入したＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、９６ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。１００μＬのバッファーＲＬＴを各ウェルに加え、そして、プレートを２０秒間激しく揺り動かした。７０％エタノール１００μＬを次に各ウェルに加え、内容物を３回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、ＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭウェルプレートに移した。減圧は１５秒間行われた。１ ｍＬのバッファーＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を１５秒間行った。その後、１ ｍＬのバッファーＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ ９６ＴＭプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を１５秒間行った。バッファーＲＰＥ洗浄を次に繰り返し、さらに１０分間減圧を行った。プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、１．２ ｍＬ回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドにもう一度取り付けた。ＲＮＡを次に各ウェル中の６０μＬの水をピペッティングすることにより溶出し、１分間インキュベートし、そして次に、３０秒間減圧を行った。さらに６０μＬの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
【０１７８】
繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、ＱＩＡＧＥＮ Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を用いて、自動化することができる。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペッティング、ＤＮａｓｅ処理、及び、溶出段階が実行される。
【０１７９】
実施例１３
ＳＲＣ−２ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＳＲＣ−２ ｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量ＰＣＲにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。ＰＣＲが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なＰＣＲとは対照的に、リアルタイム定量ＰＣＲ産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、ＰＣＲ反応にフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの間に特異的にアニールし、そして２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡのどちらかから入手可能なＪＯＥ、ＦＡＭあるいはＶＩＣ）は、プローブの５’端に結合し、そして、クエンチャー色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡのどちらかから入手可能なＴＡＭＲＡ）は、プローブの３’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は３’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはＴａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長相の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから（そしてつまりクエンチャー部分から）レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに組み込まれるレーザー光により、一定のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来ｍＲＮＡの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
【０１８０】
ＰＣＲ試薬はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）より入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５μＬポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含む９６ウェルプレートに、２５μＬ ＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮＴＭ バッファーＡ、５．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを、６００μＭのｄＵＴＰ、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プローブを各１００ ｎＭ、２０ Ｕ ＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５ Ｕ ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭ及び１２．５ Ｕ ＭｕＬＶ逆転写酵素）を加えることにより実行した。ＲＴ反応は４８℃で３０分のインキュベーションにより実行された。ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭを活性化するために９５℃にて１０分間のインキュベーションした後、４０サイクルの２段階ＰＣＲプロトコールを実行した：９５℃１５秒間（変性）続いて６０℃１．５分間（アニーリング／伸長）。
【０１８１】
刊行物に記載された配列情報（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７６７４）を使用して、ＳＲＣ−２に対するプローブおよびプライマーを、ヒトＳＲＣ−２配列にハイブリダイズするように設計した。
【０１８２】
ＳＲＣ−２について、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、
リバースプライマー：ＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、および
ＰＣＲプローブ：ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）、
であり、ここでＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【０１８３】
ＧＡＰＤＨ用のＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）であり、及び
ＰＣＲプローブは：５’ ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ− ＴＡＭＲＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）であり、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）は蛍光レポーター色素であり、そして、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）はクエンチャー色素である。
【０１８４】
実施例１４
ＳＲＣ−２ ｍＲＮＡレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の１８時間後、単層の細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして、１ ｍＬ ＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）に溶解した。全ＲＮＡは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。ＭＯＰＳバッファーシステム（ＡＭＲＥＳＣＯ， Ｉｎｃ． Ｓｏｌｏｎ， ＯＨ）を用い、１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルによる電気泳動により、２０マイクログラムの全ＲＮＡを分離した。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒバッファーシステム（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ “Ｂ” Ｉｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、ＲＮＡをゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に移した。ＲＮＡのトランスファーは、ＵＶ可視化により確認した。メンブレンをＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭ ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｉｎｃ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、ＵＶ架橋により固定した。
【０１８５】
メンブレンは、ＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用し、フォワードプライマーＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）およびリバースプライマーＣＡＣＧＡＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を使用したＰＣＲにより調製したＳＲＣ−２特異的プローブを用いて、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）についてプローブ化した。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして、定量した。データは未処理対照におけるＧＡＰＤＨレベルに標準化した。
【０１８６】
実施例１５
ＳＲＣ−２発現のアンチセンス阻害〜ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７６７４）を用いて、ヒトＳＲＣ−２ ＲＮＡの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは表１に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源参照（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７６７４）として与えられるヌクレオチド番号により示される。表１中のすべての化合物は、全体にわたりホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、ＳＲＣ−２ ｍＲＮＡレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。データは２回の実験からの平均である。存在する場合、“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を示す。
【０１８７】
【表１】
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【０１８８】
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【０１８９】
表１に示されるように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１５、１６、１７、２３、２５、２７、２９、３０、３１、３２、３８、３９、４０、４１、４２、４７および４８は、このアッセイにおいて、少なくとも２５％のＳＲＣ−２の発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【０１９０】
実施例１６
ＳＲＣ−２発現のアンチセンス阻害〜ホスホロチオエート２’−ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明に従って、ヒトＳＲＣ−２を標的とする、２番目の一連のオリゴヌクレオチドが合成された。オリゴヌクレオチドの配列は表２に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源参照（本明細書中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３として援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７６７４）として与えられるヌクレオチド番号により示される。
【０１９１】
表２中のすべての化合物は、両方の端（５’及び３’方向）を４−ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが１８ヌクレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１９２】
データは、本明細書中の他の実施例に記載の通り、リアルタイム定量的ＰＣＲにより得、２つの実験からの平均である。存在する場合、“Ｎ．Ｄ．”は“データなし”を示す。
【０１９３】
【表２】
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【０１９４】
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【０１９５】
表２に示されるとおり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２５、３０、３１、３６、３７、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６および４７は、この実験において、少なくとも３０％のＳＲＣ−２の発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【０１９６】
実施例１７
ＳＲＣ−２タンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット（イムノブロット分析）は標準的な方法を用いて行われる。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６−２０時間後に回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００ ｕｌ／ｗｅｌｌ）に懸濁し、５分間煮沸し、そして、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。ゲルを１．５時間、１５０ Ｖで泳動し、そして、ウエスタンブロットのために、メンブレンにトランスファーする。ＳＲＣ−２に対する適する第一抗体を、第一抗体の種に対する放射ラベルした、あるいは、蛍光ラベルした第二抗体とともに使用する。バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を使用して、可視化する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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