(57)【要約】イースト、寄生虫及び細菌の迅速な型分類方法が提供された。それは次の段階を含んでいる：ａ）緩衝液、界面活性剤、金属キレート剤及び水素結合を破壊する試薬のみを含む試薬キットを含む方法により５から６０分間で固定化完全ＤＮＡを調製し、ｂ）ＣＨＥＦ（Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｃｌａｍｐｅｄ Ｈｏｎｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ）及びＴＡＦＥ（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）のシステムのパルスフィールドゲル電気泳動用ミニ装置中において完全ＤＮＡ分子またはその制限フラグメントを２．５及び７時間の間に含まれる時間で分離し、ｃ）電気泳動パターンのシミュレーション方法によりミニＣＨＥＦにセットすべき最良条件を選択し、ｄ）サイズマーカーを使用せずに移動距離を分析する方法によりリオリエンテーション時間、移動速度及び分子のサイズを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階：
（ｉ）ゲル製ミニプラグ中に包埋された微生物の完全ＤＮＡ分子を調製する、その調製は関連試薬キットを使用する非酵素的方法によって行われる、
（ｉｉ）ミニプラグに含まれるＤＮＡ分子を分離するためのパルスフィールドゲル電気泳動ミニ容器を使用する、該ミニ容器はＴＡＦＥまたはＣＨＥＦである、
（ｉｉｉ）容器にセットした電場及び温度に従ってパルスランプ及び電気泳動時間の適切な値を選択する方法を使用する、ＤＮＡフラグメントまたは完全ＤＮＡ分子の最良の分離をもたらすはずのパルスランプ及び電気泳動時間の適切な値、
（ｉｖ）ＤＮＡ分子の混合物を分離するために段階（ｉｉｉ）で算出した温度、電場強度及びパルスランプ持続時間をミニ容器にセットする、
（ｖ）ＣＨＥＦミニゲルにおける電気泳動が実施されたら、ミニゲル中の線状ＤＮＡ分子の移動距離を分析する方法を使用する、
より成るパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項２】
下記段階：
（ｉ）ブロスまたは固形培地で増殖した微生物の細胞を採取し、
（ｉｉ）界面活性剤、キレート剤及び水素結合を破壊する薬物を含む緩衝液中で細胞をインキュベートし、
（ｉｉｉ）該インキュベーションの前にまたはその後にミニプラグ中に細胞を固定する、いずれにするかの選択は目的とする微生物による、
に従ってミニプラグ中に包埋した完全ＤＮＡ分子の調製が行われる請求項１に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項３】
その表面にミニプラグの大きさを決める多数の窪みをつけた、シリコーン、ゴムまたはその他の柔軟な材料で作られている柔軟なシートである鋳型を使用してミニプラグの中に細胞を固定する請求項１及び２に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項４】
該鋳型の窪みはいずれかの幅、長さ０．３ ｃｍ及び深さ０．０３から０．１ ｃｍであり、そしてそれによって作られるミニプラグ中に選択した微生物によって１０６から１０８細胞が固定される請求項３に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項５】
界面活性剤、キレート剤及び水素結合を破壊する薬物を含む緩衝液中で細胞をインキュベートするのに必要な時間が５から６０分の間に含まれ、この時のインキュベーション容量（ｍｌ）はｃ・ｖ・２０；ｖはミニプラグ容量（ｍｌ）、及びｃはインキュベートするミニプラグの数、である請求項１及び２に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項６】
非酵素的方法によりイースト細胞の固定化ＤＮＡ検体を調製するために、１％サルコシル、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ、４ Ｍ尿素、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．５を含む溶液、追加的に適当な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液中で１０分間インキュベートして制限エンドヌクレアーゼで消化することができる固定化完全ＤＮＡをもたらすために該固定細胞を４５℃で３０から６０分インキュベートするための溶液を必要とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非酵素的方法により細菌細胞の固定化ＤＮＡ検体を調製するために、１％サルコシル、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ、４ Ｍ尿素、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ９．５を含む溶液、追加的に適当な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液中で１０分間インキュベートして制限エンドヌクレアーゼで消化することができる固定化完全ＤＮＡをもたらすために該固定細胞を５０℃で３０から６０分インキュベートするための溶液を必要とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非酵素的方法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞の固定化ＤＮＡ検体を調製するために固定化細胞を続けてインキュベートするのに２つの異なる溶液を必要とする；第一は、１％サルコシル、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、３７℃でｐＨ ８．０を含む溶液、この溶液で該固定化細胞を１０分間インキュベートし、そして第二の液、１％サルコシル、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１００ ｍＭ ＥＤＴＡ、４ Ｍ尿素、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、５０℃でｐＨ ９．５を含む溶液、これと固定化細胞を３０分間インキュベートし、その調製方法は追加的に適当な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液中で１０分間インキュベートして制限エンドヌクレアーゼで消化することができる固定化完全ＤＮＡをもたらす請求項１に記載の方法。
【請求項９】
非酵素的方法によるＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ細胞の固定化ＤＮＡの調製のために非固定トロフォゾイトを最初に０．５ Ｍ ＮａＣｌ， １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， 及び１００ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ７．０を含む高張溶液中氷浴で１５分間インキュベートし、次いで細胞をミニプラグ中に固定し、そして該ミニプラグを１％サルコシル、４ Ｍ尿素、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１００ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ９．５を含む溶液中４５℃１時間インキュベートすることを必要とし、その調製は追加的に適当な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液で１０分間インキュベートした後制限エンドヌクレアーゼで消化することができる完全そして固定化ＤＮＡをもたらす請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
非酵素的方法によるイーストＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞の固定化ＤＮＡの調製を以下のように行なわれ得る：非固定化細胞が１％サルコシル、０．５ Ｍ ＮａＣｌ， ４ Ｍ尿素、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１００ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ９．５を含む溶液中５０℃５から３０分間インキュベートし、さらに該細胞をミニプラグ中に固定化する、その調製は追加的に適当な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液で１０分間インキュベートした後制限エンドヌクレアーゼで消化することができる完全そして固定化ＤＮＡをもたらす請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
株の間の区別または単離微生物の型分類がミニ装置のミニゲル中でそれらがパルスフィールド電気泳動によって分離された時に完全ＤＮＡ分子またはその制限フラグメントによって示されるバンドパターンに含まれる情報によって行われ、そのミニ装置が：
（ｉ）ミニＣＨＥＦ、その容器は対極の電極間の最大距離が１１．６ ｃｍでありミニゲルは７ ｃｍまで許容され、
（ｉｉ）ミニＴＡＦＥ（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、その容器は対極の電極間の最大距離が７．８ ｃｍでありミニゲルは７ ｃｍまで許容される、である
請求項１に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類方法。
【請求項１２】
微生物の単離体または株を区別または型分類するためにＤＮＡ分子の分離を０．５から１．５％アガロースゲル、電気泳動緩衝液として１×ＴＢＥ（１×ＴＢＥは８９ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ８９ ｍＭホウ酸、２ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．３）、またはその濃度の半分または４分の１の同じ緩衝液を使用するＣＨＥＦまたはＴＡＦＥシステムのパルスフィールド電気泳動のミニ装置中で行ない、その分離は計算方法または経験的方法またはその他のいずれかによりユーザーにより選択された緩衝液温度、電場及びパルスランプで行われ、これらの実験変数はいずれかの電気パルス持続時間に対して４−３０℃、ミニＣＨＥＦでは１−２０ Ｖ／ｃｍ、ミニＴＡＦＥでは１−２５ Ｖ／ｃｍ、のなかに含まれる請求項１１に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１３】
下記式：
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式中ｔｒは線状ＤＮＡ分子のリオリエンテーション時間（秒）、ｖｒ及びｖｍはそれぞれＤＮＡリオリエンテーション中及び後の移動速度（ｃｍ／秒）、Ｑは１ｅ−×ｂｐとして計算したＤＮＡネット電荷（スタットクーロン）、ｅ−は電荷そしてｂｐは塩基対、Ｌは０．３４ ｎｍ×ｂｐとして計算したＤＮＡ境界長（ｃｍ）、Ｅは電場強度（スタットボルト／ｃｍ）、ηは実験温度（℃）と水の粘土の関係を示す多項式に実験温度を代入して計算した緩衝液の粘土（ポアズ）、
としてミニＣＨＥＦのミニゲル中における線状ＤＮＡ分子のパルス当たりの移動ｄ（ｃｍ）を記述するために予め与えられた計算式を使用し、
その方法において該式に基づく計算方法が提供され使用され、方法はそれらがｎパルス回ランプを適用するミニＣＨＥＦのミニゲル中において分離されるならば線状ＤＮＡ分子が示すバンドパターンを予測することができ、その方法はまたｎパルス回ランプを適用した電気泳動終了時に得られるバンドパターンを分析することができ、その方法はｎ、電場及び温度がそれぞれ１から１０００、１から２０ Ｖ／ｃｍ及び４から３０℃の範囲である場合に適用することができ、そして電気泳動が１．５％アガロース及び４４．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ４４．５ ｍＭホウ酸、１ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．４で実施される請求項１に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１４】
その方法は最良のパルス回ランプを決定することができそしてｎパルス回ランプによって得られたバンドパターンを分析でき、該方法においてパルスのｎランプが適用された時のミニゲル中の線状ＤＮＡ分子の移動Ｄを予測することにより計算を実施し、各分子の移動Ｄの計算は次式によって行われ：
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式中Ｎｐｒはランプｒにおいて適用されたパルスの数、ｔｐｒはランプｒにおけるパルスの持続時間（秒）及びｄｒは各ランプｒにおいて所与分子のパルス当たりの移動であり、ｄｒは次式によって与えられる：
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計算方法が提供される請求項１及び１３に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１５】
パルスの最良ランプを決定する方法が下記の段階：
（ｉ）式に電場及び実験に適用する温度の値並びに分析する分子のサイズを代入する、
（ｉｉ）そのランプに使用するパルス持続時間を計算する、
（ｉｉｉ）総電気泳動実施時間を計算する、計算はミニゲル中を最小分子が移動する距離に基づいて行なう、
（ｉｖ）全分子のミニゲル中を移動する距離を計算し、次いで選択した電場及び温度、段階（ｉｉｉ）で算出した実施時間及び各ランプにおける電気パルスの持続時間及びパルス数に対するＣＨＥＦミニ装置のミニゲル中の該分子により示されるバンドパターンを予測し、
（ｖ）ミニＣＨＥＦにセットする条件を選択する、その条件はシミュレートしたパターンにおける線状ＤＮＡ分子により示されるバンドの最適分離をするものである、
を含む請求項１４に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１６】
総電気泳動実施時間がミニＣＨＥＦのミニゲル中で行なわれる最小線状ＤＮＡ分子の移動の計算に基づいて行われ；実施時間の計算がミニＣＨＥＦにおける線状ＤＮＡ分子の移動を記述する式に電場、温度及びランプｎにおけるパルスの持続時間（ｔｐｒ）：次いで各ランプにおける電気パルスの初期数（Ｎｐｒ）を固定し、１から開始することが勧められる全てのＮｐｒを定め、次いで全てのｒ、Ｎｐｒを１ずつ増加して、最小分子の移動Ｄを
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として計算する；
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により計算した値を総実施時間として該分子がミニゲルの末端から０．１または１ ｃｍ離れた位置に達したことをＤ値が示した時にＮｐｒの増加を終了する；
請求項１５に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１７】
下記段階：
（ｉ）ミニＣＨＥＦミニゲル中における線状ＤＮＡ分子のパルス当たりの移動を記述する式に電場、温度及び分析する最小（Ａ）及び最大（Ｂ）分子のサイズを代入し、
（ｉｉ）両線状ＤＮＡ分子のリオリエンテーション時間（それぞれ、ｔｒＡ及びｔｒＢ）を該式を使用して計算する、
（ｉｉｉ）サイズの比較を行なう最小及び最大のＤＮＡ分子を一つのパターンの中に含めたいなら、最小および最大分子のリオリエンテーション時間の平均値（０．５・［ｔｒＡ＋ｔｒＢ］）を持続時間とする１パルスを使用するランプとして計算する、
（ｉｖ）ｎのパルスランプはその持続は最小分子のリオリエンテーション時間より１．５倍少ない値から開始しそして最大分子のリオリエンテーション時間の１．５倍大きい値で終了する数式の項であり、直線的に増加する数式は：
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であり式中
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ｔｅは泳動時間である、
（ｖ）段階（ｉｉｉ）または（ｉｖ）において計算された値を実験に使用する電気パルスの持続として選択する、
を含む線状ＤＮＡ分子を分離するためのパルス回ランプに使用する電気パルス持続時間を計算する請求項１５に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１８】
下記段階：
（ｉ）電気泳動を１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥ緩衝液中で行なうと仮定し、
（ｉｉ）電気泳動に使用する電場値及び緩衝液温度、並びに仮想的電気泳動において分離する分子のサイズを規定し、
（ｉｉｉ）ランプの数ｎ、各ランプにおいて適用するパルスの数（Ｎｐｒ）及び分析する分子のサイズを規定し、
（ｉｖ）特定した電気泳動条件下に移動する該分子の距離を計算し：計算は
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によって行われ、
（ｖ）数字またはグラフにより結果を示し、
（ｖｉ）予想パターンがＤＮＡ分子間の最適分離を示すまで（ｉ）から（ｖ）の段階を繰り返す、
を含むミニＣＨＥＦのミニゲル中において線状ＤＮＡ分子の移動の計算、並びに該ミニゲル中における該ＤＮＡ分子のバンドパターンを予測する請求項１５に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項１９】
ミニＣＨＥＦミニゲル中における電気泳動終了後線状ＤＮＡ分子の移動距離を分析する方法が提供される、その方法において移動の出発点からの各バンドを分離する距離Ｄは式
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への代入による；そして代入により、計算は逆内挿により行われ、各バンドに含まれる分子のサイズ、該分子の移動速度及びリオリエンテーション時間をもたらし、その方法はもし電気泳動が電場強度１及び２０ Ｖ／ｃｍ、温度４及び３０℃の間で、１．５％アガロースゲル、０．５×ＴＢＥ緩衝液そしてｎパルス回ランプ、ｎは１から１０００、で実施されるならば適用され、その計算方法は下記段階を含む：
（ｉ）電気泳動の終了後移動出発点からバンドが分離した距離を測定し、
（ｉｉ）移動出発点からバンドを分離した式
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、電場の値（Ｅ）、緩衝液温度、パルス回ランプの数（ｎ）、各ランプにおいて適用したパルスの数（Ｎｐｒ）、各ランプにおけるパルス時間（ｔｐｒ）及び移動出発点から各バンドが分離した距離（Ｄ）を規定する、
（ｉｉｉ）ゲルの各バンドに含まれる分子のサイズを計算する；この段階の計算は次の段階を含む：（ａ）１０００ ｂｐのＤＮＡ分子が特定した電気泳動条件下に移動するはずの仮説的移動（Ｄｔ）を計算する（ｂ）計算した仮説的移動（Ｄｔ）がゲル中を移動した分子の実際の移動距離（Ｄ）より大であれば、すなわち（Ｄｔ＞Ｄ）、１０００ ｂｐのＤＮＡ分子サイズを増加させる、（ｃ）ＤＮＡ分子の仮説的移動が実際に測定された距離より少ないか同じになる（Ｄｔ＜Ｄ）まで（ａ）及び（ｂ）の段階を反復する（ｄ）該バンドに含まれるＤＮＡ分子は（ｃ）に示した条件を充たすＤＮＡ分子のサイズと同じサイズであることを考慮する、（ｅ）ミニゲル中で測定されたバンド全てについて全操作を反復する、
（ｉｖ）サイズが計算されたら、各分析されたバンドに含まれる分子のリオリエンテーション時間及び移動速度は段階（ｉｉｉ）において
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のｄｒ値を提供したものであり、
（ｖ）結果は数値形式で示される、
請求項１及び１３に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項２０】
特定された電気泳動の条件下に線状ＤＮＡ移動のグラフ表示が提供され、該グラフ表示が下記を含む：
（ｉ）実際のミニゲルに比例した大きさの長方形を描き、該長方形の内部にＤＮＡ検体が仮説的に適用されるスロットを示す多数の小さな矩形を描く、
（ｉｉ）各小さな矩形またはスロットの下に線を描く、その線はミニゲル中で分離される各サイズの分子のバンドを示し、実際のミニゲル中を移動する各サイズの分子の距離に比例してスロットから離れており、
（ｉｉｉ）各線を色分けし、該色はＤＮＡ分子のサイズにより、線として描かれたバンドに仮説的に含まれる分子のサイズを同定するためにカラーコードを使用している、
請求項１８に記載の迅速微生物型分類方法。
【請求項２１】
（ａ）細胞懸濁を注ぎそしてゲル中に包埋した細胞を得るための鋳型；
（ｂ）細胞洗浄用の溶液；
（ｃ）細胞包埋用の溶液；
（ｄ）ＤＮＡ脱タンパク用の溶液；
（ｅ）検体保存用の溶液；および
（ｆ）ミニプラグ洗浄用の溶液、
を含む請求項１に記載のパルスフィールドゲル電気泳動による迅速微生物型分類法の部分としてＤＮＡ検体調製の非酵素的方法を実施するための試薬キット。
【請求項２２】
イースト細胞の洗浄溶液が０．０５ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ７．５を含む請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓまたは Ｅｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞の洗浄溶液が０．１５ Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０を含む 請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞の洗浄液が０．１５ Ｍ ＮａＣｌを含む請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２５】
Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ細胞の洗浄用に２溶液が使用され、その一つはＰＢＳ，ｐＨ ７．４、及びもう一つは０．５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓおよび ０．０５ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ７．０を含む高張溶液である請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２６】
該微生物の細胞包埋用の溶液が該細胞の洗浄用溶液中に調製されている１．５から２．０％の低融点アガロースを含む請求項２１〜２５に記載の試薬キット。
【請求項２７】
ＤＮＡ脱タンパク用の溶液が緩衝液、金属キレート剤、界面活性剤および水素結合破壊試薬を含む請求項２１から２５に記載の試薬キット。
【請求項２８】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたはＥ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのＤＮＡ分子の脱タンパク用の溶液が１％サルコシル、４ Ｍ尿素、０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓおよび０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ９．５を含む請求項２７に記載の試薬キット。
【請求項２９】
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ， Ｅ． ｃｏｌｉまたは Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＤＮＡ分子の脱タンパク用の溶液が１％サルコシル、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ、４ Ｍ尿素、０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓおよび０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ９．５を含む請求項２７に記載の試薬キット。
【請求項３０】
脱タンパク溶液で処理した後にミニプラグを洗浄するために使用する溶液が１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １００ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０を含む請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項３１】
制限エンドヌクレアーゼＤＮＡ消化をする前にミニプラグを洗浄するために使用する溶液が１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０を含む請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項３２】
固定化ＤＮＡ分子を含むミニプラグを保存するために使用する溶液が０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０である請求項２１に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
備考
国際特許分類：Ｃ１２Ｎ １／００
【０００２】
関連出願の引用
本発明は分子生物学に関するものである。特に、方法が提供される。該方法は迅速に微生物を型分類するための方法及び手順並びに試薬キットの使用を含んでいる。型分類される微生物はイースト、寄生虫及びグラム陽性及びグラム陰性細菌である。微生物型分類はＣＨＥＦまたはＴＡＦＥシステムのミニ装置で行なうパルスフィールドミニゲル電気泳動により実施される。
【０００３】
発明の背景
この数年間に、感染症は増加しそして多剤耐性微生物が出現してきた（Ａｃａｒ Ｊ ａｎｄ Ｃｏｕｒｖａｌｅｉｎ Ｐ ｐｐ５０−５３；Ａｕｂｒｙ−Ｄａｍｏｎ Ｈ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｍｏｔ Ａ， ｐｐ５４−５５；Ｔｒｉｅｕ−Ｃｏｕｔ Ｐ ａｎｄ Ｐｏｙａｒｔ Ｃ， ｐｐ６２−６６， ｉｎ ’Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ’， ｖｏｌ ３１４， １９９８）。
【０００４】
感染症の多発により原因微生物の型分類の必要性を生じた。型分類は所与の属の微生物の種々の種類をそれぞれの亜群または亜型に分類する方法である（Ｂｕｓｃｈ Ｕ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈｋｏ Ｈ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ， １９９９， ７２２：２６３−２７８）。型分類は疫学的観点から、感染の発生を認識し、医療機関における病原菌の伝染経路を探りそして感染源を検出するために重要である。新しい毒性株を同定しまた予防接種計画を監視するのにも有用である。型分類法は以下の基準を充たす場合に適すると見なされている（Ｍａｓｌｏｗ ＪＮ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９９３， １７：１５３−１６４）：
１．分離したものそれぞれに対して紛らわしくない結果を示す。
２．再現性のある結果を示す。
３．種内の関係の無い株を分別する。
【０００５】
いくつかの型分類法がある。その一部は表現型特徴の分析に基づいており（表現型法）、またその他は遺伝子型特徴の分析に基づいている（遺伝子型法）。表現型法は微生物によって発現される特徴を検出するが、他方遺伝子型法は微生物のＤＮＡの相違を立証する。表現型法は遺伝的背景の変化を間接的に示すと言う欠点を持っている。該欠点は遺伝子型法を使用する場合には生じない。
【０００６】
最も広く使用されている遺伝子型型分類法の一つはパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）である。この方法は微生物の分子的型分類に対しては金本位制と考えられている。ＰＦＧＥ型分類は、２つの異なる方向に電気パルスの作用を受けたＤＮＡ分子がゲル中において分離することによって行なわれる。電気泳動の後、単離した微生物のＤＮＡ分子によって示されるバンドパターンは極めて再現性良く、特異的でありそして明確にそのＤＮＡを示す（Ｏｌｉｖｅｒ ＤＭ ａｎｄ Ｂｅａｎ Ｐ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ３７（６）：１６６１−１６６９）。さらに、多数の単離体の全ゲノムを１枚のゲル上で比較することが可能である。このように、ＰＦＧＥは理想的型分類法と言われている（Ｍａｓｌｏｗ ＪＮ， Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＭＥ ａｎｄ Ａｒｂｅｉｔ ＲＤ， Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， １９９３（１７）：１５３−１６４；Ｂｕｓｃｈ Ｕ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈｋｏ Ｈ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ， １９９９（７２２）：２６３−２７８）。ＰＦＧＥにより得られる結果は、ＤＮＡ分離に使用した実験条件及び試験に使用する微生物の属及び種に影響される。一例として、
ａ）　微生物が１０ Ｍｂ（１メガ塩基＝１ ０００ ０００塩基対）よりも小さな数個の線状染色体を持つ場合には、その染色体により示されるバンドパターンが得られる。該バンドパターンは「電気泳動核型」と言われる。例えば、このような微生物にはイースト、単細胞寄生虫などがある。
ｂ）　微生物が１つの大きな環状染色体を持つ場合には、該環状ＤＮＡのマクロ制限フラグメントにより示されるバンドパターンが得られる。それは特別な実験条件において得られるので、そのパターンはパルス型と呼ばれる。例えば、そのような微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどのような細菌である。
【０００７】
異なる株の電気泳動核型を比較することによりその特徴づけ及び区別をすることができる。細菌ＤＮＡの制限フラグメントについても同じことが生じる。したがって、分子核型及びパルス型の両者共に菌、細菌及び寄生虫の比較試験に使用される。医療細菌学においてＰＦＧＥを日常的に使用することから検体調製法の改良の必要性を生じた。また分子を適切に分離し、そして得られた電気泳動パターンを分析するための実施条件を先験的に設計する必要を生じた。
【０００８】
一般的に、ＰＦＧＥによる微生物型分類法の操作は以下の段階及び手順からなる：
１）　検体調製：栄養ブロス中で微生物を増殖し、細胞をゲル中に包埋し、固定化し、脱タンパクした完全なＤＮＡ分子を得る。
２）　電気泳動条件の設定：分子間の分離を最良に行なうためのＰＦＧＥ装置にセットすべき実験条件の選択。
３）　ゲルに検体を乗せて、ＤＮＡ分子を分離するためにパルスフィールドゲル電気泳動を実施する。
４）　電気泳動により得られたバンドパターンを分析し、そして他の微生物分離体によって得られた成績と比較する。
【０００９】
ＰＦＧＥによる微生物型分類に現在使用されている装置と手順を分析する。
【００１０】
パルスフィールドゲル電気泳動。
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ（Ｃｅｌｌ， ３７， ６７−７５， １９８４；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，４７３，４５２）がアガロースゲル中においてある角度をもつ方向に電気パルスを周期的に変えることにより大きな完全なＤＮＡ分子がバンドパターンとして分離することを観察した１９８４年に始まる。
【００１１】
その著者等はまた、分子の分離は本質的に電気パルスの持続に依存することも認めていた。後に、場力線の角度、電場強度、実験温度、緩衝液のイオン強度、アガロースゲルの濃度及び検体を包埋するアガロースプラグの厚さ、がＤＮＡ分子の分離に影響する最も重要な因子であることが判明した（Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ． ａｎｄ Ｌａｉ Ｅ． Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３， ｐ １０７， １１１， １２９， １３１，１３５；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， １９９８， ８０６， １２３−１３９；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， １９９８， ８０６， １８７−１９７）。
【００１２】
ＰＦＧＥを実施する別のシステムが開発された。それらは異なる配置に電極を収めた特徴的な容器を有している。その中にはＯＦＡＧＥ（直交場変換ゲル電気泳動、Ｃａｒｌｅ Ｃ．Ｆ． ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ Ｍ．Ｖ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８４， １２， ５６４７−５６６４）、ＣＨＥＦ（「等高線固定均一電場」、Ｃｈｕ Ｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４， １９８６， １５８２−１５８５）、ＴＡＦＥ「交差変換場電気泳動」、米国特許Ｎｏ． ４，７４０，２８３）、ＦＩＧＥ（「場反転電気泳動」、Ｃａｒｌｅ Ｇ．Ｆ． ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ Ｍ．Ｖ．の米国特許 Ｎｏ． ４，７３７，２５１） 電極配置、及びＭｉｎｉＴＡＦＥ及びＭｉｎｉＣＨＥＦのミニ容器（Ｒｉｖｅｒｏｎ， Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ， １９９５， ２８， １９７３−１９９１；欧州特許申請ＥＰ ０ ７４５ ８４４， Ｂｕｌａ， １９９６／４９；米国特許申請０８／６８８，６０７， １９９５；キューバ特許ＲＰＩ Ｎｒｏ． ０２／９５， １９９５）がある。
【００１３】
ＰＦＧＥによる微生物型分類に一般的に使用されているシステム
ＰＦＧＥによるＤＮＡ分析に基づく微生物型分類にもっとも良く使用されているシステムはＣＨＥＦ及びＴＡＦＥである。それらはゲルの各レーンに直列的なバンドパターンを示し、そのため１回の電気泳動の中であるいは異なる電気泳動の間で結果の比較が可能である。
【００１４】
ＣＨＥＦシステムの電極はゲルの周囲に６角形に配置されそしてゲル全体に均一な電場を保証するために電圧は固定されている。容器内全体に均一な電場を生じるためにゲルのレーンの中に直線的なバンド及び再現性の良い移動を得ることができる。対極の電極はＣＨＥＦ容器中３３．５ ｃｍ離れている。幅と長さ２１×１４ ｃｍまでのサブマリンゲルを使用する。ゲルは水平に置く（ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． 説明マニュアル及び応用案内。カタログ番号１７０−３６７０から１７０−３６７３、ＢｉｏＲａｄ，ｐｐ １１， １９９５）。言及したように、ＣＨＥＦシステムは微生物型分類に非常に良く使用されている。例えば、細菌（Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｓ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９８９， １７７：１１０−１１４；Ｄｉｎｇｗａｌｌ Ａ ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ Ｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８９， ８６：１１９−１２３；Ｆｅｒｄｏｗｓ ＭＳ ａｎｄ Ｂａｒｂｏｕｒ ＡＧ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９８９， ８６：５９６０−５９７３；Ｋｏｈａｒａ Ｙ， Ａｋｉｙｍａ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｏｎｏ Ｋ， Ｃｅｌｌ， １９８７， ５０：４９５−５０８；Ｏｈｋｉ Ｍ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ ＣＩ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９８９， １７：３４７９−３４９０；Ｓｃｈｏｅｎｌｉｎｅ ＰＶ， Ｇａｌｌｍａｎ ＬＭ ａｎｄ Ｅｌｙ Ｂ， Ｇｅｎｅ， １９８９， ７０：３２１−３２９；Ｖｅｎｔｒａ Ｌ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ ＡＳ， Ｇｅｎｅ， １９８９， ７８：２９−３６）， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ （Ｂａｕｔｓｃｈ Ｗ， Ｇｒｏｔｈｕｅｓ Ｄ ａｎｄ　Ｔｕｍｍｌｅｒ Ｂ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １９８８， ５２：２５５−２５８；Ｒｏｍｌｉｎｇ Ｕ ａｎｄ Ｔｕｍｍｌｅｒ Ｂ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０００， ３８（１）：４６４−４６５）， Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ａｌｂｉｇ Ｗ ａｎｄ Ｅｎｔｉａｎ ＫＤ， Ｇｅｎｅ， １９８８， ７３：１４１−１５２；Ｚｅｒｖａ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６， ３４（１２）：３０３１−３０３４）， Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ （Ｐｅｔｔｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９３， ６１（８）：３５７４−３５７７）， Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （ＭｃＥｌｌｉｓｔｒｅｍ ＭＣ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０００， ３８（１）：３５１−３５３）， Ｓ． ａｕｒｅｕｓ （Ｗｉｃｈｅｌｈａｕｓ ＴＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ３７（３）：６９０−６９３）， Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ （Ｓｉｎｇｈ ＳＰ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ３７（６）：１９２７−１９３１）， Ｐ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ （Ｋｏｄｊｏ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ３７（２）：３８０−３８５）など。
【００１５】
ＣＨＥＦ容器が大きいために、電極台を被う緩衝液は大量に必要となる。そのために弱い電場を適用したとしても、容器内の電流は大きくなってしまう。したがって、ＣＨＥＦ実験は高出力の電源を必要とする。その上、電場の増加による泳動時間短縮を妨げている大量の熱が容器内に発生する。ＣＨＥＦ容器はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体（１．６ Ｍｂより小さな分子、１ Ｍｂ＝１０６塩基対）を１１バンドの特徴的なパターンに分離し、そしてこのイーストの異なる株を型分類するために少なくとも２０時間の電気泳動を必要とする（Ｚｅｒｖａ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６， ３４（１２）：３０３１−３０３４）。ＣＨＥＦ容器は細菌ＤＮＡ分子のマクロ制限フラグメントを分離するために長時間を要し、２０時間かそれ以上必要である（ｖａｎ Ｂｅｌｋｕｍ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９８， ３６（６）：１６５３−１６５９；Ｍａｒｃｈａｄｉｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２０００， ４４（１）：２１３−２１６；Ｒｏｍｌｉｎｇ Ｕ ａｎｄ Ｔｕｍｍｌｅｒ Ｂ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０００， ３８（１）：４６４−４６５）。同様に、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのような寄生虫の試験にも長い実施時間が必要である。その染色体を分離するために少なくとも２４時間は必要である（Ｐｅｔｔｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９３， ６１（８）：３５７４−３５７７）。
【００１６】
現在使用されているＣＨＥＦ装置の利点は１回の泳動で４０検体の分析ができることである。この高い検体処理能力が多数の単離検体の電気泳動パターンの比較分析を容易にしてきた。
【００１７】
ＴＡＦＥシステムはＫＪ Ｇａｒｄｉｎｅｒ， Ｗ Ｌａａｓ ａｎｄ Ｄ ＰａｔｔｅｒｓｏｎによりＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ， １９８６（１２）：１８５に発表した論文中において提案された。彼らは最初このシステムを「垂直パルスフィールド電気泳動」（ＶＰＦＥ）と呼び、そして１９８８年４月２６日の米国特許４，７４０，２８３により保護された装置を開発した。
【００１８】
ＴＡＦＥシステムにおいては、２対の電極は、容器中に垂直に置かれたサブマリンゲル（１０×７．６×０．６４ ｃｍ， 長さ×幅×厚さ）の両辺に平行して設置される。該電極配置はゲル上で交差する電場力線を生じ、各パルス毎にゲルの中で分子を移動させる。ＴＡＦＥでは、同じサイズの分子は同じ距離移動し、ゲルの中の（検体を入れた）ウエルの位置に関係なく、直線進路から外れてゲル上の同じ高さに移動する。この様に、多数の単離体検体の電気泳動パターンの比較分析を容易にするので、微生物型分類には有用である。
【００１９】
このような原理に基づいて、ベックマン機器会社は、ＴＡＦＥとしても知られている「Ｇｅｎｅｌｉｎｅ Ｉ，または交差変換場電気泳動（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）」を製造した（Ｂｅｃｋｍａｎ， Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｌｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ， ｅｄ． Ｓｐｉｎｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， １９８８）。このシステムは２０検体を適用できるゲル（１１×７．２×０．６ ｃｍ，長さ×幅×厚さ）を使用している。しかし、ＴＡＦＥはやはり大量の緩衝液（３．５リッター）及び生物検体を必要とする。装置はＥ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａの染色体を分離するのに少なくとも２０時間を要する（Ｂａｅｚ−Ｃａｍａｒｇｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９６， ２５３：２８９−２９６）。したがって、ＴＡＦＥは微生物型分類においてＣＨＥＦと同じ欠点を抱えている。
【００２０】
結論として、微生物及び寄生虫のゲノムを分析するために最も頻繁に使用される市販装置は、そのバンドパターン中で大きなＤＮＡ分子を分離するには長時間の泳動、及び大量の試薬及び生物検体を必要とする。
【００２１】
ＦＩＧＥシステムは細菌の迅速型分類に使用されてきた（Ｇｏｅｒｉｎｇ ＲＶ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒｓ ＭＡ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ３０（３）：５７７−５８０， １９９２；Ｇｒｏｔｈｕｅｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２６（１０）：１９７３−１９７７， １９８８）。しかし、ＦＩＧＥ実験においてＤＮＡの電気泳動移動性の逆転が報告された。ＤＮＡの移動性逆転は正しいサイズ測定をできなくし、また多数の検体から得られるパターンの解明と比較を困難にする。ＤＮＡ移動性逆転が発生する時を予測できないことが該現象による問題の一つである（Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ａｎｄ Ｌａｉ Ｅ． Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ， ｐｐ １０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， １９９３）。移動性逆転の主な欠点は得られたバンド中に存在する分子を明確に同定できないことである。そうするには、バンドを転移して、特別なプローブとハイブリッド形成しなければならない。ハイブリッド形成は特に検定費用を増加させそして時間もかかるので、型分類操作はさらに高額となりまた時間も要するであろう。
【００２２】
ＧｅｎｅＮａｖｉｇａｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９９８， ｐｐ ７７−７９）， ＣＨＥＦ ＤＲＩＩ及びＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ （ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｕｉｄｅ． Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒｓ １７０−３６７０ ｔｏ １７０−３６７３． Ｂｉｏ−Ｒａｄ， ｐｐ １１， １９９５）のように電極にかける電圧を高くすることにより現行のＣＨＥＦ装置の電気泳動時間を短縮する試みは殆ど不可能である。電力供給能力及び冷却システムに限界があるからである。したがって、製造会社は該装置に適用する最大電場としては９ Ｖ／ｃｍを勧めている（ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｕｉｄｅ． Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒｓ １７０−３６７０ ｔｏ １７０−３６７３． Ｂｉｏ−Ｒａｄ， ｐｐ ２， １９９５）。したがって、電場強度を増加することによる電気泳動時間の短縮はＣＨＥＦシステムではできない。現行のＴＡＦＥ装置も同じ問題を抱えている。
【００２３】
ＰＦＧＥミニ装置
ミニＰＦＧＥ装置、ミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥ改良型、は１９９５年に報告された（Ｒｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９５， ｖｏｌ． ２８， ｐｐ １９７３−１９９１；欧州特許出願ＥＰ ０ ７４５ ８４４， Ｂｕｌｌ． １９９６／４９；米国特許出願０８／６８８，６０７， １９９５；キューバ特許ＲＰＩ ０２／９５， １９９５）。ミニ装置はＰＦＧＥ装置の上記欠点のほとんどを解決する。パルスフィールド電気泳動実験は７検体を適用したミニゲル（４×４×０．５ ｃｍ；長さ×幅×厚さ）中で４から６時間で行われる。ミニＣＨＥＦでは１６ Ｖ／ｃｍに達する電場強度を適用することができるので、２．７時間で電気泳動バンドパターンの良好な分離を行なうことができる。対応電極間の距離が短いので容器を小さくし、電極を被う緩衝液を少量にすることができる。ミニＣＨＥＦ及びＣＨＥＦ容器に指定されている電圧（電場強度値Ｅ）を適用することにより、ミニ容器内に発生する熱は市販ＣＨＥＦで発生する熱より常に少ない（Ｒｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９５ ｖｏｌ． ２８， ｐｐ． １９７３−１９９１）。
【００２４】
ミニＴＡＦＥ装置は２２ Ｖ／ｃｍを許容して、バンド間の分離を達成する（Ｒｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９５ ｖｏｌ． ２８， ｐｐ． １９７３−１９９１）。ミニＴＡＦＥではＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ電気泳動核型を５時間で得ることができる。対極間の距離が短い（７．８ ｃｍ）ミニＴＡＦＥ容器は小さく、緩衝液の使用量も少ない。しかし、０．１ ｃｍ以上の厚さの検体をミニゲルに適用した場合には、良好な分離の電気泳動パターンを得るにはさらに時間を要す。既報のように、検体の厚さは電気泳動実施時間に影響する（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， １９９８， ８０６， ｐｐ． １８７−１９７）。検体が厚くなるに従って、同じバンドパターンを得るには長いゲルが必要になる。しかし、報告されているミニＣＨＥＦミニゲルは７検体しか適用できないのに対して、ミニＴＡＦＥは１３検体を処理する。これらは臨床検査において微生物単離体型分類のための低処理検体数形式である。
【００２５】
ミニＰＦＧＥ装置は現行システムよりも利点があるにもかかわらず、ミニＣＨＥＦもミニＴＡＦＥも微生物型分類に使用されていない。多分、従来のゲルに使用したのと同じ厚さの検体の使用を試みている。さらに、ミニ装置の実行パラメータを選択する簡便な手順が調っていない。
【００２６】
固定化ＤＮＡの調製
完全なＤＮＡ分子の調製法は現行装置またはミニ装置におけるＰＦＧＥによる微生物型分類にとって絶対必要なことである。以前に報告された溶液中のＤＮＡ単離及び精製方法は該分子の切断を引き起こしている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＣ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ， Ｃｅｌｌ， １９８４， ３７， ｐｐ． ６６−７５）。Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ ＣａｎｔｏｒはＰＦＧＥ用の検体調製の方法を提案し、そして１ Ｍｂ（１０６塩基対）を下回る大きさの分子のみを除去した。方法は培養細胞を採取し、細胞を洗い、アガロースプラグ中に包埋することからなる。その後の段階は、（もしも細胞壁が存在すれば）「ｉｎ ｓｉｔｕ」でスフェロプラストを形成し、さらに該プラグ中で分解する。最後に、固定化ＤＮＡ分子をタンパク分解酵素Ｋを使用して脱タンパクする。この方法は種々の属、種及び起源の微生物から検体を調製するのに有効であった。しかし、該微生物が細胞壁を有している場合には、スフェロプラストを形成させる必要があり、スフェロプラストを形成させるのに必要な酵素並びにタンパク分解酵素は高価である。報告されている手順は検体調製に３２時間かかる終夜インキュベーションを２回必要としている（米国特許Ｎｏ． ４，４７３，４５２， １９８４年９月２５日）。
【００２７】
さらに最近、Ｇａｒｄｎｅｒ（Ｇａｒｄｎｅｒ ＤＣＪ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ， １９９３， ９， １０５３−１０５５）はスフェロプラストを形成しない細胞からＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体のバンドパターンを得た。平行して、Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９４， ２７：７， １２５５−１２６４）はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＮＡはタンパク分解酵素Ｋの代わりに８ Ｍ尿素を使用して脱タンパクすることができることを示した。しかし、Ｇａｒｄｎｅｒにより記述された方法は、ＤＮＡの脱タンパクにタンパク分解酵素を使用しているために、依然として高価であり、一方Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎにより記述された方法は安価であるが、しかし７２時間のインキュベーションのため長時間を要する。後にＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ検体が調製され、酵素を使用しなかった：プラグは続けてＬＥＴＫ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５００ ｍＭ ＥＤＴＡ， ６００ ｍＭ ＫＣｌ， ｐＨ ７．５ ）で４時間、ＮＤＳ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ５００ ｍＭ ＥＤＴＡ， １％サルコシル， ｐＨ ９．５）で２時間、そして４ Ｍ尿素を加えたＮＤＳ（ＮＤＳＵ）で２時間インキュベートした。この方法は検体調製に１０時間を要した（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ， １９９６， ２９：１２， ２０７９−２０８４）。固定化ＤＮＡ調製の迅速方法も記述されているが、酵素を使用している（例えば、Ｇｕｉｄｅｔ Ｆ　ａｎｄ Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ Ｐ， Ｂｉｏｔｅｃｈ， １９９２， １２：２， ２２２−２２３）。
【００２８】
原則として、ＰＦＧＥ実験用の固定化ＤＮＡは、スフェロプラストの形成及びタンパク分解酵素を使用するＤＮＡの脱タンパクを必要とする。これらの要件は試験する細胞型（細菌、イーストなど）とは無関係である（Ｍａｕｌｅ Ｊ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９８， ９：１０７−１２６；Ｏｌｉｖｅ ＤＭ ａｎｄ Ｂｅａｎ Ｐ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６， ３７：６， １６６１−１６６９）。例えば、固定化Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡは細胞をリゾスタフィンで固定化し、プラグを界面活性剤とインキュベートすることにより２時間で調製され、そして他方Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｃａｌｉｓ細胞は固定化の前にリゾチーム及びムタノリシンとインキュベートすることが必要である、と報告されている（Ｇｏｅｒｉｎｇ ＲＶ． ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ ＭＡ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９２， ３０：３， ５７７−５８０）。上記研究において、著者らは検体をタンパク分解酵素Ｋとインキュベートしなかった。しかし、Ｍａｔｕｓｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｔｕｓｈｅｋ ＭＧ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９６， ３４：１０， ２５９８−２６００）は検体をタンパク分解酵素Ｋとインキュベートしない場合にはバンドパターンを得ることができなかったと報告した。その代わりに、彼らはタンパク分解酵素Ｋを使用して固定化ＤＮＡ検体を調製する迅速方法を提案した。最近、ＭｃＥｌｌｉｓｔｒｅｍ ｅｔ ａｌ．（ＭｃＥｌｌｉｓｔｒｅｍ ＭＣ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０００， ３８：１， ３５１−３５３）はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの固定化ＤＮＡを調製する完全非酵素的方法を報告した。しかし、この方法には６時間を要し、そして著者らはこの方法の成功はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのオートリシンの活性化によると考えている。現在、スフェロプラスト形成酵素およびタンパク分解酵素はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの完全ＤＮＡ分子調製操作からのみ削除されたが、これらの調製を完結するのに要する時間はそれぞれ１０時間と６時間であり、これは長時間である。微生物の検体調製においてプロトプラスト形成酵素およびタンパク分解酵素を除去することの実現可能性について意見は一致していない。したがって、現行方法は高価でありそして長時間を要する。
【００２９】
これらの方法の殆どは酵素処理に先立って細胞壁を持つ微生物を固定しなければならないと言う前提に立っている。例外がＧｏｅｒｉｎｇ及びＷｉｎｔｅｒ（Ｇｏｅｒｉｎｇ ＲＶ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ ＭＡ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９２， ３０：３ ５７７−５８０）により発表された論文中に存在する。著者らは固定化に先立ってリゾチーム及びムタノリシン（スフェロプラストを形成するための２酵素）を含む溶液中に細胞を懸濁した。しかし、アガロースゲルに包埋する前に細胞壁を有する微生物を処理する一般的非酵素的方法はこれまで示されていない。そのような方法は検体調製において現行方法より安価で、簡便であろう。
【００３０】
微生物細胞壁の透過性を高める試薬の存在下に細胞を加熱することから開始して、溶液中の核酸を単離する方法は報告されている（欧州特許０，６５７，５３０， １９９４， ｂｕｌｌｅｔｉｎ ９５／２４；米国特許１５８，９４０， １９９３）。この方法は全体の細胞壁を物理的に破壊せずに微生物から分解していない核酸の大きなフラグメントを遊離させる。この方法は溶菌酵素を必要としない。しかし、ＤＮＡは溶液中に遊離されるため、完全なＤＮＡ分子は得られない。そのため、著者らは上記微生物の分子核型またはパルス型を得る方法としては勧めていない。著者らは、得られたＤＮＡはハイブリッド形成に適していると報告しているが、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ制限の可能性につては注目していない。結局、該方法は完全なＤＮＡ分子を得ることを保証しておらず、また制限酵素によるそれらの消化の可能性については不明のままである。
【００３１】
したがって、イースト、グラム陽性及びグラム陰性細菌及び寄生虫の固定化完全ＤＮＡを非酵素的に短時間で調製する一般的方法は未だ提案されていない。
【００３２】
固定化ＤＮＡ検体を調製するには該検体を形成する鋳型を必要とする。この鋳型は再使用できるかあるいは使い捨てである。再使用型の鋳型は滅菌できるものでなければならない。これは病原性微生物の検体を扱う場合には重要である。使い捨ての鋳型を使用するには継続的に供給される必要があり、これは少ない予算の試験室においては制約因子になり得る。
【００３３】
既知鋳型は以下のものである：
ａ）　独立しそして同種のプラグを形成する鋳型（米国特許４，４７３，４５２， １９８４年９月２５日）；
ｂ）　切って独立したプラグを作ることができる長いリボンを形成する鋳型；
ｃ）　切って独立したプラグを作ることができる長い角形の「ヌードル」または長いアガロースの棒を形成する鋳型（Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ａｎｄ Ｌａｉ Ｅ． Ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， １９９３， ｐｐ ２９−３０）。
【００３４】
一般的に、ゲルの溝より大きな検体が該鋳型で作られる。このような理由から、溝の大きさと同様の大きさのプラグを得るためにリボン、ヌードルなどをかみそり刃などで切る必要がある（ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ ｐｐ ４０， Ｓｅｃｔｉｏｎ ７． Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒｓ １７０−３６７０ ｔｏ １７０−３６７３． Ｂｉｏ−Ｒａｄ． １９９５）。しかし、リボンまたはヌードルを切ることは一定しない大きさのプラグを生じ、これは電気泳動パターンの質に影響する。ゲル中におけるＤＮＡ分子の分離は検体の厚さに依存する。したがって、ゲル上の異なるレーンで得られたパターンの比較は困難である。バンドパターンの比較が困難であることは微生物型分類においては欠点となる。
【００３５】
アガロースゲル中に細胞を包埋しそしてプラグを処理するための鋳型が１９９５年１０月１０日の米国特許５，４５７，０５０に開示された。この鋳型は、それを作るのに使用された材質により、使い捨てまたは再使用できる。該鋳型の中で検体を形成し、処理することができる便利な鋳型であることが主張されている。しかし、これは欠点である。つまり、インキュベーションの間プラグが鋳型の内部に保持されているならば、ＰＦＧＥ分析に適した検体を得るために必要な時間は非常に長くなってしまう。プラグとインキュベーション溶液の間の接触面積は少なくとも半分に減少してしまうので、分解及び脱タンパク溶液の作用分子は細胞内の標的分子にわずかしか到達できない。
【００３６】
ＰＦＧＥ実験条件の選択
実験条件の選択は複雑である。ＰＦＧＥ実施条件を選択する方法は報告されている。
【００３７】
例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄのＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒには自動アルゴリスムの選択ともう一つ相互作用アルゴリスムの選択がある（ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ． Ｐｐ ３１− ４０ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒｓ １７０−３６７０ ｔｏ １７０−３６７３． Ｂｉｏ−Ｒａｄ． １９９５）。いずれの選択も、パルス時間、パルスランプ持続、リオリエンテーション角度、電場及び所与検体のＤＮＡ分子を分離するための最適実施時間を計算することができる。固定実験条件が設定されている自動アルゴリスムに対して、相互作用アルゴリスムでは緩衝液の型、温度及び濃度、及びアガロースの型及び濃度を入力値として変更することができる。両者のアルゴリスムは、５年間の経験中に集められた実験的データ及び理論的データに基づいて作動している（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ｐｐ １８５． １９９８／９９）。しかし、製造会社は検体分子の予想される大きよりも小さな及び大きなＤＮＡサイズをアルゴリスムに入力するよう勧めている。さらに、もしも極めて幅広いサイズ範囲を自動アルゴリスム、同様に相互作用アルゴリスムに入力すると、ゲルの中間範囲におけるバンド逆転のような誤った結果を生じかねない。
【００３８】
定められた値とそれより高い値の間に入る大きさの分子群を分離する電気パルス間隔を示すＲＳＬ（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ）と呼ばれる経験的表現が提案されている（Ｓｍｉｔｈ ＤＲ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉ， １９９０， １９５−２０３）。しかし、該表現は特殊な実験条件にのみ有効であり、いずれの２分子間の分離でも予測するものではない。その他の機能が提案されている。それは与えられた分子群を分離するのに必要な電場とパルス時間のおおよその条件を提供する（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ ａｎｄ Ｃｈｕ Ｇ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９１， １１：３３４８−３３５４）。しかし、該機能は上記２変数の粗い推定をさせるに過ぎず、また全ての実験条件における分子の移動度を示すものでもない。
【００３９】
ＰＦＧＥ中にＤＮＡ分子を移動させるための種々な理論的研究がなされているが（Ｎｏｏｌａｎｄｉ Ｊ， Ａｄｖ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９９２， ５：１−５７；Ｍａｕｌｅ Ｊ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９８， ９：１０７−１２６）、該研究からは未だ試験室において実用的そして有用な成果は得られていない。それらはＰＦＧＥ利用者に分析する分子を分離するのに必要な実験条件を選択させセットさせる方法を生み出していない。
【００４０】
ＰＦＧＥにおけるＤＮＡ分子の移動を記述するためのＬｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ ｅｔ ａｌ． （Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， １９９８， ８０６：１２３−１３９）により提案されている数式は、パルス回ランプ、電場、温度及び実施時間を変更した時に得られるバンドパターンを予測するためにはこれまで使用されなかった。
【００４１】
ＰＦＧＥバンドパターン分析
ＰＦＧＥゲルのイメージデータ取り込みのコンピューターシステムをバンドパターン分析に使用することができる（Ｇｅｒｎｅｒ−Ｓｍｉｄｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９８， ３７（３）：８７６−８７７；Ｔｅｎｏｖｅｒ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９５， ３３（９）：２２３３−２２３９；ｖａｎ Ｂｅｌｋｕｍ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９８， ３６（６）：１６５３−１６５９）。しかし、制限パターンの比較は個人の操作に残されており、そして完全にしっかりとしたアルゴリスムには出来上がっていない（Ｔｅｎｏｖｅｒ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９５， ３３（９）：２２３３−２２３９）。コンピューターを使用した分析は行なわれているが、パターンの最終的解釈は過去の視覚的検査に従わざるを得ない。
【００４２】
自動的及び非自動的バンドパターン分析は結果としてバンドの数及びバンド中の分子のサイズを示す。これは通常未知ＤＮＡ移動を分子量マーカーの移動と比較することにより行なわれる。しかし、ＰＦＧＥは比較的新しいので、広範囲のＤＮＡサイズ範囲のサイズマーカーが常に入手できるとは限らない。したがって、ＰＦＧＥバンドパターンの解釈に基づく細菌型分類に使用される基準は、比較している微生物のＤＮＡを消化した時に生じる種々の制限フラグメントの数を測定することにある。
【００４３】
一つのパルスランプ、異なる電場強度、及び異なる温度におけるＤＮＡ移動を記述する式は、１．５％アガロース、Ｌａｃｈｅｍａ及び０．５×ＴＢＥ、１×ＴＢＥ：８９ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ８９ ｍＭホウ酸、２ ｍＭ ＥＤＴＡ中で行われた実験において集積した電気泳動データに基づいて提案されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， １９９８， ８０６：１２３−１３９）。しかし、該式をパルスランプを適用したバンドパターンの分析に拡張及び応用する方法は存在しない。パルスランプの適用は微生物の比較試験では通常行なわれている。
【００４４】
ＰＦＧＥによる微生物型分類のための現行方法
微生物型分類の全操作は長時間と多くの資源を必要とする。電気泳動は２０時間、製造会社の推奨あるいは文献に報告されているところによると検体調製方法は、大量の酵素（例えば、８０ ｍｇ／ｍｌタンパク分解酵素Ｋ）及び長いインキュベーション時間を必要とする（ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＸＡ Ｐｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ． ｐｐ ４０−４３ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒｓ １７０−３６７０ ｔｏ １７０−３６７３． Ｂｉｏ−Ｒａｄ． １９９５）。微生物型分類のためのＰＦＧＥの使用を制約している要因は単離体の分析を完結するのに必要な時間であり（これは２から３日である）、したがって、多数の検体を分析する試験室の能力を低下させている（Ｏｌｉｖｅ ＤＭ ａｎｄ Ｂｅａｎ Ｐ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９， ３７：６， １６６１−１６６９）。
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は１作業日（７から１３時間の間）に微生物の単離体を型分類するための方法及び試薬キットを提供するものである。型分類はミニ装置内でパルスフィールド電気泳動を行なうことによりＤＮＡ分子を分離して典型的なバンドパターンを得ることにより実施される。特に、
ｉ）　最大６０分で、ゲルのミニプラグ中に包埋した完全なＤＮＡ検体を調製する方法及び試薬キットがここに提供される。この方法は溶菌酵素を含まない溶液で細胞を処理することに基づいている。該処理はその細胞をゲル中に包埋する前あるいはその後に行なうことができる。その細胞はイースト、寄生虫、グラム陽性及びグラム陰性細菌が可能である。細胞は滅菌することができる柔軟な材料で作られた鋳型によって包埋される。それによって均一な大きさのミニプラグが供給される。ミニプラグの厚さは使用した鋳型の寸法によって０．０３から０．１ ｃｍに変動する。
ｉｉ）　線状ＤＮＡ移動度を予測する方法が提供される。この方法は、ＣＨＥＦシステムにおける電場、温度、パルス持続ランプ及び電気泳動時間がどのような条件であっても線状ＤＮＡ分子の移動を計算することができる理論式に基づいている。この方法によりゲルに適用する最適の電気泳動条件を選択することができ、同様に電気泳動を実施した後に得られるバンドパターンを分析することができる。
ｉｉｉ）　微生物のＤＮＡ分子を分離して分析する方法が提供される。その分離はパルスフィールド電気泳動用ミニ装置中で行われる。ミニＣＨＥＦミニ装置は２．５から５時間でバンドパターンを提供し、ミニＴＡＦＥでは５から７時間である。この方法では微生物の固定化ＤＮＡの２７検体まで試験することができる。該検体はａ）非酵素的方法で調製され、ｂ）予測方法の支援により選択した最適電気泳動条件においてミニ装置中のミニゲルで分離され、ｃ）ＤＮＡ分子サイズを測定するために分析される。測定は線状ＤＮＡ移動分析の方法を用いて行ない、そしてミニゲルのウエル中に入れ、そしてミニ装置中の２つの電場の作用を受けたＤＮＡ分子全てについて行なう。分析に先立って、ＤＮＡ分子はいずれかの染色法によりゲル中に検出される。
【００４６】
この発明が提供されている検体調製方法に要する時間は最大でも６０分であり、しかも簡便で安価である。微生物細胞をインキュベートしそして完全なＤＮＡを固定化する溶液中に溶菌酵素もタンパク分解酵素も必要としない。完全ＤＮＡ分子は制限酵素で消化することができ、そしてパルスフィールド電気泳動を行なった時に、完全ＤＮＡ分子またはその制限フラグメントはミニゲル中を移動し、微生物の分子核型またはパルス型に相当するバンドパターンを形成する。
【００４７】
この方法は、微生物を分解させるための細菌壁の化学的修飾、または細胞中の標的分子に対する小さな作用分子の拡散に基づいている。細胞内の好ましくない成分は透析による調製の間に除去される。結果として、細胞が包埋されたミニプラグ中に完全なＤＮＡ分子が得られる。
【００４８】
この方法は下記の一般的な段階を含んでいる：
１）　微生物の細胞は最初に入院患者の体液から、あるいはバイオテクノロジー産物からあるいは、分子生物学、遺伝学などの通常の研究室で行われた実験から単離される。
２）　細胞はそれぞれの微生物に適した組成のブロスまたは固形培地で増殖する。
３）　細胞を遠心分離で集め、洗う。
４）　細胞はａ）ゲル中に包埋され非酵素溶液とインキュベートするか、ｂ）該溶液とインキュベートしそしてゲル中に包埋する。ａの場合は、固定化細胞を含むミニプラグは最初に非酵素的溶液中で５から３０分５０℃でインキュベートする。ｂの場合は、細胞は非酵素的溶液中で５から３０分５０℃でインキュベートした後、細胞をアガロースミニプラグ中に包埋する。
５）　もし電気泳動を行なおうとするならば、細胞を含むミニプラグを電気泳動用緩衝液に対して透析を行なう。あるいはもしミニプラグを保存しようとするならば、保存用緩衝液に対して透析を行なう。あるいはもしＤＮＡ分子を消化しようとするならば、制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に対して透析を行なう。
【００４９】
固定化に先立って非酵素的溶液中でインキュベートできる微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及び Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａは最初に固定化し、次いで非酵素溶液中でインキュベートすべきである。最も効果的な細胞の洗浄液を表Ｉに示す。
2004513375.tif 000003
【００５０】
細胞をインキュベートする非酵素溶液、または細胞を含むミニプラグは陰イオン性界面活性剤、金属キレート剤、水素結合形成に競合し得る薬剤及びＴｒｉｓ緩衝液を含有している。最も有効な組成は、１％サルコシル、０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、４ Ｍ尿素で、そのｐＨは ９．５（ＮＤＳＵ）である。グラム陽性及びグラム陰性細菌の細胞をインキュベートするためにはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０が添加される（ＮＤＳＵＰｌｕｓ）。
【００５１】
一部の微生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は最初に非酵素分解液中で１０分間３７℃でインキュベートすべきである。それは１％サルコシル、１％ ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０， ０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基を含み、そしてそのｐＨは８．０である。次いでそれらはＮＤＳＵＰｌｕｓ溶液中で３０分間インキュベートする。
【００５２】
固定化ＤＮＡを含むミニプラグの保存用緩衝液はＴＥ−１００（０．０１ Ｔｒｉｓ−塩基、０．１ Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０）。
【００５３】
アガロースミニプラグ中に細胞を包埋する方法は、滅菌し得る柔軟な材質で作られた鋳型を使用することからなる。鋳型はシリコン、ゴムまたはその他の柔軟な物質の０．５ ｃｍまでの幅のシートである（例中の例１参照）。数個の角型の窪みをそのシートの中に付ける。窪みは幅０．３ ｃｍまで及び深さ０．０３から０．１ ｃｍが可能である。アガロース−細胞懸濁液を注入するために、この温度に温めた表面上に鋳型をおいて鋳型を４２℃に予熱し、その後懸濁液を鋳型中に注ぎ、スパーテルを使用して窪み中に均一に分布させる。次いで鋳型に蓋をし（ガラス、アクリル、プラスチックまたはその他の材料で作ることができる）、ミニプラグが固化するまで４−１５℃でインキュベートする。そしてミニプラグ処理用の非酵素溶液の入った容器のなかで周辺部をつまんで鋳型を曲げることにより柔軟な鋳型から均一なサイズのミニプラグを取出す。懸濁は、０．１２から３×１０８細菌細胞、８×１０７イースト細胞または６×１０４ Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのトロホゾイトをそれぞれ０．３×０．０７ ｃｍの大きさのミニプラグに包埋するという方法で調整する。言及した全ての微生物はこのタイプの鋳型を使用して調製することができる。要するに、このタイプの鋳型はその他のいずれの細胞を含むミニプラグの調製にも使用することができる。
【００５４】
本発明において、ミニ装置に適用する最適電気泳動条件の選択方法は線状ＤＮＡ分子の移動度の計算に基づいている。計算は、ミニＣＨＥＦミニゲル中の線状ＤＮＡ分子の移動度、リオリエンテーション時間及び移動速度を記述する一群の理論式を使用することにより行われる。式には電場と温度の値を入力するが、それらはそれぞれ１−２０ Ｖ／ｃｍ及び４−３０℃の間でなければならない。式を適用するために、電気泳動が１．５％アガロース中で実施されたと仮定しそして電気泳動緩衝液は４４．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ４４．５ ｍＭホウ酸、１ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．３ （ＴＢＥ ０．５Ｘ）でなければならない。ＤＮＡ移動度を記述する理論式は以下である：
2004513375.tif 000004
式中：
ｔｒ：リオリエンテーション時間（ｓ）
ｖｒ：新方向の間の移動速度（ｃｍ／ｓ）
ｖｍ：新方向の後の移動速度（ｃｍ／ｓ）
Ｑ：１ｅ−×ｂｐ（ＤＮＡネット電荷、ｅ−：電荷、スタットクーロン）
Ｌ：０．３４ ｎｍ×ｂｐ（ＤＮＡ輪郭長、ｃｍ）
Ｅ：電場強度、スタットボルト／ｃｍ
η：緩衝液の粘度、ポアズ、そしてηは水の粘度と温度を関係づける多項式関数中に実験温度（℃）を内挿して計算した。
Ｄ：ＣＨＥＦのミニゲル中のＤＮＡ分子の総移動度（ｃｍ）
ｄ：パルス当たりの移動（ｃｍ）
ｎ：パルス時間ランプの数
Ｎｐｒ：ランプｒにおけるパルスの数
ｔｐｒ：ランプｒにおけるパルス持続時間
【００５５】
最適電気泳動条件の選択方法は以下の段階を含んでいる。
Ｉ．　ランプに使用するパルス（ｔｐｒ）の持続時間の計算。それを行なうために、
１）式に選択した電場及び温度の値を代入する。最小と最大の線状ＤＮＡ分子のサイズも代入しなければならない。
２）式４を使用することにより、最小及び最大の線状ＤＮＡ分子のリオリエンテーション時間が計算される。
３）もし最大及び最小分子の間に含まれるサイズのＤＮＡ分子を一つのパターンの中に含まれるようにしたいのであれば、両リオリエンテーション時間の平均（一つのｔｐｒまたはｔｐ１）を計算する。
４）パルス持続時間の数式を計算する（ｔｐｒ）。最小分子のリオリエンテーション時間よりも１．５倍少ないパルス持続時間で開始し、最大分子のリオリエンテーション時間よりも１．５倍大きい所で終了する。パルス持続時間の直線的増加をｔｐｒ計算の数式に使用する。
５）電気泳動を実施するには段階（３）で計算したｔｐを使用し得るが、その他には、段階（４）で計算したｔｐｒの数式を使用する。
【００５６】
ＩＩ．　総実施時間の計算。総電気泳動実施時間は最小線状ＤＮＡ分子の移動度の計算に基づいて算出される。これは以下のように行われる。
１）式２及び３に電場及び電気泳動緩衝液の温度の値を代入する。
２）リオリエンテーション時間及び最小分子の移動速度を計算する。式１に段階Ｉにおいて求めた電気パルスの持続時間（ｔｐｒ）を代入する。パルス数の初期値は固定する。
３）各ランプｒのパルス数を一つずつ増加し、そして毎回式１及び５を使用して最小分子の移動度を算出する。分子がミニゲルの下辺から０．１から１ ｃｍ離れた位置に達するまで繰り返し行なう。
【００５７】
ＩＩＩ．　式１−５を使用して、分離しようとしている分子の移動度をｎランプについて計算し、次いで電場、温度、ランプｒの数、電気パルスの持続及びパルスの数（Ｎｐｒ）について選択した条件におけるミニＣＨＥＦのミニゲル中のこれらの分子により生じるバンドパターンを推定する。この計算は以下の段階を含む。
１）電気泳動は１．５％アガロースゲル及び０．５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中で実施されることを前提とする。
２）電場及び温度の値（これは実際の実験で使用されることになる）は式２及び３に使用される。
３）前段階において計算された値に従って、ランプの総数（ｎ）、各ランプに適用するパルスの数（Ｎｐｒ）、及び各ランプにおけるパルスの持続時間（ｔｐｒ）を式１に使用する。
４）分析する分子のサイズを特定する。
５）式１−５を使用して、（分析しようとする）ＤＮＡ分子の移動距離を特定した電気泳動条件に対して計算する。
６）線状ＤＮＡ分子に対して計算した移動を数値またはグラフ形式で示す。
７）予測パターンが線状ＤＮＡ分子間の最適分離を示すまで、段階２−６を繰り返す。
【００５８】
ＩＶ．　上記結果に基づいて、線状ＤＮＡ分子間の最適分離をもたらす実験条件が選択される。次いで、電源、電気泳動調節装置及び冷却システムにこれらのデータを入力する。
【００５９】
この方法を実行する望ましい手段は、ミニＣＨＥＦにおける種々のサイズのＤＮＡ分子の分離のシミュレーションを容易にするコンピュータープログラムであろう。このプログラムはＤＮＡ分離のための最適実験条件を計算するであろう。またこのプログラムは本発明のこの部分を実施するために必要な計算を行なうための迅速手段となるであろう。
【００６０】
バンドパターンをシミュレートするためのプログラムが創り出された。このプログラムではユーザーは以下の変数を変えることができる。
１−　ゲル中で分離しようとするＤＮＡフラグメントまたは完全ＤＮＡ分子のサイズ。
２−　緩衝液温度。
３−　電圧。
４−　各ランプにおいて適用したパルス時間及び電気パルスの数。
５−　パルス時間ランプの数。それは１から１０００ランプの間に含まれる。
【００６１】
上記値を入力して、プログラムは以下の結果を与える：
１−　ＤＮＡリオリエンテーション中及びその後のＤＮＡ分子速度（ｃｍ／ｓ）。
２−　各ＤＮＡ分子のリオリエンテーション時間（秒）
３−　選択した実施時間に対する各分子のゲル中移動度。
４−　各分子の移動度及び電気泳動パターンの図。
【００６２】
特定した電気泳動条件において線状ＤＮＡ分子が移動する距離のグラフ表示は以下のように行なわれる。
ｉ）　実際のミニゲルと同じ大きさでミニゲルを描き、そして検体を置くと仮定する場所にウエルを描く。
ｉｉ）　各ウエルの下に線をひく。それは分離後に異なるサイズのＤＮＡ分子によって作られるバンドを示す。各線はウエルの幅を持っている。これらの線は、実際のミニゲル中でＤＮＡ分子が移動する距離ウエルから離れて描かれる。
ｉｉｉ）　各線または仮定的バンドは色で区別する。色はバンドに含まれる分子のサイズにより変える。すなわち、所定のサイズの分子を同定するカラーコードを使用する。
【００６３】
このプログラムはミニＣＨＥＦにおけるパルスフィールドゲル電気泳動による完全染色体サイズのＤＮＡ分子または大きなＤＮＡフラグメントを分離するための適切な実験条件を選定する方法である。プログラムに実験条件の変数の異なる値を入力した場合には、異なる電気泳動パターンが得られるので、ＣＨＥＦ及びミニＣＨＥＦにおいて関心の分子を分離する実験条件を見出すことができる。この方法は試薬及び生物検体を消費しない。それはミニＣＨＥＦにおける線状ＤＮＡの移動を記述する理論式に基づいている。該式は実際のミニＣＨＥＦ実験において得られた線状ＤＮＡの移動データを使用して調整されている。したがって、電気泳動を行なった時に、該分子の移動を正しく示す。さらに、ゲルの中央における移動性逆転の異常な結果をもたらさない。
【００６４】
本発明において、ミニ装置ミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥにおけるＤＮＡの電気泳動分離による迅速微生物型分類が提案されている。非酵素法を使用して調製した、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及び Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ細胞の検体をミニゲルに適用した。従来の酵素法により調製したこれらの検体またはその他の微生物も適用することができる。
【００６５】
ミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥミニ容器が核型またはパルス型を得るために使用される。対極の電極間の距離はミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥにおいてそれぞれ約１１．６ ｃｍ及び７．８ ｃｍである。電場強度はミニＣＨＥＦでは２０ Ｖ／ｃｍ及びミニＴＡＦＥでは２２ Ｖ／ｃｍまで適用することができる。
【００６６】
本発明のこの部分を実施するために選択した電気泳動装置は、Ｒｉｖｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９５によって既に記述されているミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥミニ容器を含み（Ｒｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９５， ２８：１９７３−１９９１；欧州特許申請ＥＰ ０，７４５，８４４， Ｂｕｌｌ． １９９６／４９；米国特許申請０８／６８８，６０７， １９９５；キューバ特許ＲＰＩ Ｎｒｏ． ０２／９５， １９９５）、その開示を引用して全てをここに取り入れた。４から７ ｃｍ幅のアガロースミニゲルを支持するためにミニＣＨＥＦ容器の床は若干修正した。ミニゲルには１２から２７検体を適用することができる。ミニＴＡＦＥ容器は７ ｃｍ幅のミニゲルを支持するために若干広くなっていた。ミニＴＡＦＥミニゲルには２７検体を適用することができる。
【００６７】
ミニゲルのアガロース濃度は０．８から１．５％まで変えることができるが、望ましい値は１．５％である。１×ＴＢＥ緩衝液は０．０８９ Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、０．０８９ Ｍホウ酸及び０．００２ Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンヂアミンテトラ酢酸のナトリウム塩）であり、０．２５から１×の範囲の濃度で使用し得るが、望ましいのは０．５×である。緩衝液温度は４から３０℃の間で変えることができる。１×ＴＡＥ緩衝液（０．０４ Ｍ Ｔｒｉｓ−酢酸塩及び０．００１ Ｍ ＥＤＴＡ）も使用することができる。ミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥ容器においてミニＣＨＥＦ電極の電圧を固定し、そして電場方向を変えるために、Ｒｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ， １９９５， ２８（５）：８４５−８６０；及びＲｉｖｅｒｏｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９５， ２８（１１）：１９７３−１９９１により記述されている装置を含めて、目的に合わせて作られた装置であればいずれでも使用できる。
【００６８】
電極に電気を供給するために、最大出力３００ワットの電源であればいずれでも使用することができる。
【００６９】
アガロースミニプラグはミニゲルのウエルに挿入される。ミニゲルを挿入するためのウエルは櫛の歯で形成される。幅広いあるいは細いミニプラグを挿入するために異なる櫛が使われる。それは挿入するミニプラグの大きさによる。
【００７０】
ミニゲルの各バンド中に存在する分子の染色には臭化エチジウムが使用される。ミニゲルを紫外線（ＵＶトランスイルミネーター）で発光させ、その画像を５５０ ｎｍフィルターを使用して写真に撮る。その他の染色方法も使用することができる。
【００７１】
電場強度、緩衝液温度、パルス時間ランプ、電気泳動時間及び各ランプにおける電気パルスセットの数はシミュレーターの結果（または分子を分離するための最適条件の選択方法）から、あるいは実験的経験を含めてユーザーが採用するその他の方法の結果から得られる。シミュレーターを使用する場合には、緩衝液濃度は０．５×ＴＢＥ、アガロース（Ｌａｃｈｅｍａ）ゲルは１．５％、電場は２０ Ｖ／ｃｍまで、温度は４から３０℃の間そして容器はミニＣＨＥＦでなければならない。シミュレーターを使用するがミニＴＡＦＥの使用を希望する場合には、シミュレーターによって与えられる同じ電場及び温度の条件を使用し得るが、各ランプにおけるパルスの数は１．５倍に増加し、そしてパルスの持続時間を１．２倍に増加する必要がある。
【００７２】
電場強度及び温度の他の条件の下でも、分離しようとしている検体中に含まれる分子の典型的なバンドパターンをミニ装置中で得ることができる。
【００７３】
本発明において電気泳動の後に得られたバンドパターンを分析する望ましい方法はミニゲル中で線状ＤＮＡ分子が移動した距離を測定し、そして分子のサイズを計算するために式１−５を使用することに基づいている。その方法は、ミニＣＨＥＦ装置のミニゲル中で１から２０ Ｖ／ｃｍの間に含まれる電場、４から３０℃の間の温度、１．５％アガロース（Ｌａｃｈｅｍａ）、０．５×ＴＢＥ緩衝液及びパルス時間ランプのいずれかの数ｎ（１−１０００の間）及び電気泳動時間における電気泳動によりバンドパターンが得られることを必要とする。
【００７４】
この方法は下記からなる：
ｉ）　ミニゲル中において電気泳動及びバンドの染色後、ミニゲル中の線状ＤＮＡの移動距離を測定する。
ｉｉ）　式１−５に電場、緩衝液温度、ランプの数（ｎ）、各ランプにおいて適用したパルスの数（Ｎｐｒ）及び各ランプにおけるパルスの持続時間（ｔｐｒ）の値を代入する。
ｉｉｉ）　電気泳動後のバンドから実際の移動距離（Ｄ，ｃｍ）をプログラムに入力する。
ｉｖ）　移動距離から各バンドの分子サイズを計算する。これは以下に従って行なう。
１）　初期サイズ１０００塩基対の仮定ＤＮＡ分子を設定する。
２）　その仮定ＤＮＡ分子のｖｒ，ｖｍ及びｔｒをそれぞれ計算するために式２，３及び４を使用する。
３）　式１及び５を使用して、仮定ＤＮＡ分子の理論的移動（Ｄｔ，ｃｍ）を実験に使用した電気泳動条件に対して計算する。
４）　Ｄ及びＤｔを比較する。もしＤｔがＤより大きければ、仮定分子のサイズを１０００ ｂｐに増加する。
５）　仮定ＤＮＡ分子に対して計算した移動がミニゲル中の実際の分子による移動距離（Ｄ）より少ないか同じになるまで、段階２）から４）を繰り返す。
６）　バンド中のＤＮＡ分子は４）に示した条件を充たす仮定ＤＮＡ分子のサイズと同じサイズを持つと仮定する。また、仮定分子に対して計算したｔｒ，ｖｒ，及びｖｍ値を実際の分子のものと仮定する。
７）　全てのバンドに対して測定された距離について段階１）から６）を繰り返す。すなわちミニゲル中で分離された全ての分子に対して。
【００７５】
電気泳動の記述は電気泳動パターン及びマトリックスにより行なうことができる。横列には各フラグメントまたは分離した分子の序列、一方、縦行には分離した分子のサイズ、リオリエンテーション時間及び移動速度が含まれる。
【００７６】
コンピュータープログラムは本発明のこの部分を実行する望ましい方法を提供することができる。そのプログラムは電気泳動において分離されるフラグメントまたは完全ＤＮＡ分子のサイズ及び動力学的パラメーターを推定するための計算を実行する迅速な手段を提供するであろう。ユーザーが以下の変数を変えることができるプログラムが創り出された。
１−　ゲル中のパターンの各バンドの位置を示す分子の移動距離。
２−　緩衝液温度。
３−　電気泳動容器中に設定される電圧。
４−　各ランプに設定されるパルス時間及び電気パルスの数。
５−　ランプの数（１−１０００に制限）。
【００７７】
プログラムに上記値を入力すると、以下の結果が得られる。
１−　リオリエンテーションの間の及びその後のＤＮＡ速度（ｃｍ／ｓ）。
２−　各分子のリオリエンテーション時間（ｓ）。
３−　キロベースで示した分子サイズ（ｋｂ）。
【００７８】
ミニＣＨＥＦにおける電気泳動条件及びその結果得られた分子の移動距離をプログラムに入力すると、プログラムはゲル中の各バンドに存在する分子のサイズ及び動力学的パラメーターを計算することができる。一般的に、バンドの分子を同定するために分子量マーカーを必要としない。この分析によりその動態特性にしたがってＤＮＡフラグメントまたは分子を分類することができる。電気泳動の結果はこの他の通常使用されている方法によっても記述することができる。
【００７９】
例
例１．検体ミニプラグの調製用の滅菌可能な鋳型。
滅菌可能でありそして柔軟な材料（シリコン、ゴムあるいはその他の材料）から作られた鋳型の例は図１に図示する。鋳型はアガロースに包埋されたＤＮＡ検体を調製するために使用される。シート（１）には４９個の窪み（２）がある。アガロース−細胞懸濁液を鋳型またはシートに注ぎ、そして特別なスパーテル（４）で鋳型に分配する。その後、シート（１）を蓋（３）で被い、包埋した細胞を含むミニプラグ（５）を作製する。実際の鋳型のシートは熔融シリコンで作製した。それをシート（１）を作るために別の鋳型に注いだ。例では、ミニプラグの大きさは３×３×０．７ ｍｍ（長さ、幅×厚さ）である。シート（１）からミニプラグ（５）を取出すために、該シートの端を持ちそして溶液の入った容器内で曲げる。その結果、ミニプラグはシートから離れて、溶液内に落ちる。
【００８０】
その他の変形鋳型では、窪みの幅を１．５ ｍｍからミニゲルの幅まで変えることができ、一方厚さは０．５ ｍｍから１．５ ｍｍまで変えることができる。シートにつけた窪みの数もやはり変えることができる。
【００８１】
例２．ブロス培地で培養された細胞から出発するアガロース包埋完全イーストＤＮＡの非酵素的調製。
イースト（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａまたはＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ）を液体ＹＰＧ培地（ＹＰＧ：１０ ｇイースト抽出物、２０ ｇグルコース及び１０ ｇペプトンを１リッターの蒸留水に溶解）中３０℃で振とうしつつ対数期後期まで増殖した。細胞を遠心分離により採取し、０．０５ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ７．５（洗浄溶液、表１）で洗った。アガロース包埋完全ＤＮＡを次の方法のいずれかを行なって得た：
変法１：細胞をアガロースミニプラグに包埋する前にインキュベートする。
変法２：細胞をアガロースミニプラグに包埋し、次いでミニプラグをインキュベートする。
【００８２】
両変法いずれにおいても細胞は最初に０．１２５ Ｍ ＥＤＴＡに溶解した１．５％低融点アガロースに１．３×１０１０細胞／ｍｌの細胞懸濁を調製することにより包埋する。この細胞懸濁を図１に示した鋳型のシートに注ぎ、そして鋳型を蓋（３）で被い、そしてアガロースを固化させて検体ミニプラグを形成する。
【００８３】
変法１において、１００ ｍｌのブロス培養から得た細胞ペレットを５ ｍｌのＮＤＳＵに再懸濁し、そして５分間５０℃でインキュベートした。さらに、懸濁をＴＥ−１００で５倍に希釈した。細胞を遠心分離により採取し、そして上記のようにアガロースミニプラグに包埋する。
【００８４】
変法２では、細胞を採取し、洗い、次いでアガロースミニプラグに包埋する（表１参照）。細胞を含んだミニプラグをＮＤＳＵ中３０分間４５℃でインキュベートする。
【００８５】
ミニプラグを２回ＴＥ−１００（０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０）中５分間洗い、そして新鮮ＴＥ−１００中４℃で保存する。２つの変法のいずれかでミニプラグを処理した後、電気泳動の前に、ミニプラグをＴＢＥ中１０分間実施温度でインキュベートする。
【００８６】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体（１２）及びミトコンドリア（１３）のＤＮＡがバンドパターンに分離しているミニゲル（１０）の写真を図２に示す。検体はミニプラグ中に細胞を包埋して調製し、ＮＤＳＵ中でインキュベートした（変法２）。最大２７検体を適用できる７ ｃｍ幅のミニゲル（１１）をミニＣＨＥＦに使用した。電気泳動実施条件は１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃、１．５％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥ， パルス時間５０秒及び４時間の電気泳動であった。
【００８７】
Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの染色体（１７）及びミトコンドリア（１８）のＤＮＡがバンドパターンに分離しているミニＣＨＥＦミニゲルのレーン（１６）の写真も図２に示す。Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの染色体は変法２に従って調製した。１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃、１．５％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥ， パルス時間１２０秒及び４時間の電気泳動のミニＣＨＥＦにおいて分離した。
【００８８】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体は図２に示すミニＴＡＦＥミニゲル（２０）においてやはり分離された。染色体（２１）及びミトコンドリア（２２）のＤＮＡバンドパターンも示す。検体は変法１を使用して調製した、すなわち、アガロースに包埋する前に細胞をインキュベートした。該検体を櫛で形成した１３穴（２３）に適用した。ミニゲルは７ ｃｍ幅であった。ミニＴＡＦＥには１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃、１．５％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥ， パルス時間６０秒及び６時間の電気泳動を適用した。
【００８９】
例３．ブロス培地及び固形培地で増殖したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの完全ＤＮＡのアガロース包埋の非酵素的調製。
Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの２コロニーを血液寒天プレートから単離した。その一つを５ ｍｌのＬＢ培地（１０ ｇイースト抽出物、５ ｇ塩化ナトリウム及び１０ ｇバクトトリプトン、水１リッター）に接種し、もう一つをＬＢプレートに画線した。
【００９０】
両培養を３７℃で終夜インキュベートした。ブロス培養は振とうしてインキュベートし、プレートは静置した。ブロスで増殖した細胞を遠心分離により採取し、一方プレートは適当な洗浄液（表１に示す）で洗い、次いで遠心分離により採取した。
【００９１】
ブロスまたは固形培地で増殖した細胞を表１に示す溶液で洗い、遠心分離により集め、０．１５ Ｍ ＮａＣｌに溶解した１．５％低融点アガロースに２×１０９細胞／ｌ濃度に再懸濁した。アガロース−細胞混合物を図１に示した鋳型のシート（１）に注ぎ、次いでシートを蓋（３）で被い、プラグ（５）が形成されるまで静置した。ミニプラグをＮＤＳＵＰｌｕｓと３０分間５０℃でインキュベートした。その後、ミニプラグを２回ＴＥ−１００中５０℃１０分間洗い、そして新鮮ＴＥ−１００中４℃で保存した。制限酵素消化を行なう前に、ミニプラグを１０分間Ｘｂａ Ｉ制限酵素用緩衝液でインキュベートした。各ミニプラグを２０ＵのＸｂａ Ｉで２時間３７℃で消化した。制限フラクションをミニＣＨＥＦにおいて１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃、１．５％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥ， ２０，１５，１０，５及び３秒のパルスランプ及び５，１５，３２０、１０２０及び１００パルスで分離した。
【００９２】
ミニＣＨＥＦミニゲル（２５）において分離したバンドパターン（２６）を図３に示す。Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａミニプラグ（２７）は液状ＬＢ培地の培養から調製し、一方ミニプラグ（２８）はＬＢプレート上で行なった培養から調製した。分離されたＤＮＡフラグメントのサイズも図に示す。
【００９３】
例４．固形培地で増殖したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのアガロース包埋完全ＤＮＡの非酵素的調製。
Ｓ． ａｕｒｅｕｓのコロニーを血液−寒天培地から単離し、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎプレート（Ｏｘｏｉｄ）上に画線した。プレートを終夜３７℃でインキュベートした。プレート表面を洗浄液（０．１５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０表１）、そして細胞を遠心分離により採取した。
【００９４】
アガロース包埋完全ＤＮＡを次の２つの変法のいずれかを行なって調製した：
変法１：細胞をアガロースミニプラグに包埋する前にインキュベートする。
変法２：細胞をミニプラグに包埋し、次いでミニプラグをインキュベートする。
【００９５】
両変法いずれにおいても細胞は洗浄液（表１）に溶解した１．５％低融点アガロースに４×１０１０細胞／ｍｌの細胞懸濁を調製することにより包埋した。この細胞懸濁を図１に示した鋳型のシート（１）に注ぎ、そして鋳型を蓋（３）で被い、そしてアガロースを固化させて検体ミニプラグ（５）を形成した。
【００９６】
変法１において、細胞ペレットを３ ｍｌのＮＤＳＵＰｌｕｓに再懸濁し、そして３０分間５０℃でインキュベートした。その後、懸濁をＴＥ−１００で５倍に希釈した。細胞を遠心分離により採取し、そして上記のようにアガロースミニプラグに包埋する。
【００９７】
変法２では、細胞を採取し、洗い、次いでアガロースミニプラグに包埋した。アガロースミニプラグをＮＤＳＵＰｌｕｓ中１時間５０℃でインキュベートした。
【００９８】
２つの変法のいずれかで処理した後、ミニプラグは２回それぞれ１０分間５０℃ＴＥ−１００で洗った。制限酵素消化の前に、ミニプラグを洗い、Ｓｍａ Ｉ制限酵素用緩衝液と１０分間インキュベートし氷上に置いた。各ミニプラグを２０ＵのＳｍａ Ｉにより２時間３７℃で消化した。ミニゲル（３０）中のバンドパターン（３１）中で分離したＳ． ａｕｒｅｕｓ ＤＮＡマクロ制限フラグメントを図４に示す。ミニプラグ（３２）は変法２に従って調製し、一方ミニプラグ（３３）は変法１に従った。実施条件は１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃、１．５％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥ， パルスランプ １，５，９，１３、１７及び２１秒であった。全てのランプに１３０パルスを適用した。分離したＤＮＡフラグメントのサイズも図に示す。
【００９９】
例５．Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａの完全ＤＮＡアガロース包埋の非酵素的調製。
Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（クローンＡ）トロフォゾイトをＴＹＩ−Ｓ−３３培地中対数期まで増殖した。培養フラスコを冷却して採取し、遠心分離によりペレットにした。ペレットを冷ＰＢＳで洗浄し、冷高張液（０．５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５ Ｍ ＥＤＴＡ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．０）と１５分間２．５×１０６トロフォゾイト／ｍｌ溶液の割合でインキュベートした。さらに、１０８トロフォゾイトを高張液に溶解した２％低融点アガロースの１ ｍに再懸濁した。この懸濁を図１に示す柔軟シリコン鋳型に注ぎ、ミニプラグを４℃で固化させた。ミニプラグをＮＤＳＵ（０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， １％サルコシル（ｗ／ｖ），４ Ｍ尿素、ｐＨ ９．５）と４５℃１時間インキュベートした。電気泳動の前に、ミニプラグを０．５×ＴＢＥを１０分間実施温度でインキュベートした。ミニプラグを保存するために、ＴＥ−１００（０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基、０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０）で２回各回５分間洗い、新鮮ＴＥ−１００中４℃で保存した。
【０１００】
Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（３８）、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（３７）及びラムダ−ＤＮＡ（３９）のＤＮＡバンドパターンを図５に示す。電気泳動は９．３ Ｖ／ｃｍ電場、１２０秒のパルス時間、２０℃、１％アガロース（Ｓｅａｋｅｍ）、０．５×ＴＢＥ緩衝液及び電気泳動６時間で実施した。０．１ ｃｍの厚さのミニプラグを適用した。
【０１０１】
例６．ミニＣＨＥＦにおける電気泳動実施条件の設計。
シミュレーターを使用する実験条件の設定（ＤＮＡ分離のための追加条件の選択方法）。
対極の電極間１１．６ ｃｍのミニＣＨＥＦ容器におけるＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体を分離するために必要なパルスランプをシミュレートした。この目的はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体によって形成される１１バンドを示すパターンを得ることである。電気泳動は１．５％アガロースゲル及び泳動緩衝液として０．５×ＴＢＥ中で行なうと仮定した。Ｇｏｆｆｅａｕにより報告されているＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体のサイズ値を採用した（Ｇｏｆｆｅａｕ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６， ２７４：５４６）：２３０ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． Ｉ）， ２７０ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ．ＶＩ）， ３１５ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＩＩＩ）， ４４０ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＩＸ）， ５８９ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＶＩＩＩ）， ５７７ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． Ｖ）， ６６７ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＸＩ）， ７４５ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． Ｘ）， ７８４ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ ＸＩＶ）， ８１３ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＩＩ）， ９２４ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＸＩＩＩ）， ９４８ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＸＶＩ）， １０９１ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＶＩＩ及びｃｈｒｏｍ． ＸＶ）， １５５４ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＩＶ） 及び２３５２ ｋｂ （ｃｈｒｏｍ． ＸＩＩ）。
【０１０２】
シミュレーターは、１０ Ｖ／ｃｍ電場強度及び２０℃に対する一つのパターンにおいてＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体の最適分離を達成するために、５，４０，７５及び１１０秒のパルス時間の４パルスランプ及び各ランプにおける４２パルスを予測した。移動、リオリエンテーション時間、移動速度及び各染色体を同定するカラーコードの結果を表ＩＩに示す。
2004513375.tif 000005
Ｄ実験値：図６のミニゲル（４０）において分子が移動した距離。
Ｄ予測値：図６の実験において使用された実施条件に対するシミュレーター予測による分子の移動距離。
ｖｒ：リオリエンテーション中の分子の移動速度。
ｖｍ：リオリエンテーション後の分子の移動速度。
ｔｒ：分子のリオリエンテーション時間。
【０１０３】
シミュレーターによって予測された条件におけるミニＣＨＥＦ中に得られたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １９０６−２（４１）の染色体のバンドパターンを示すミニゲル（４０）の写真を図６に示す。仮想的ミニゲル（４２）にシミュレートされ、そしてシミュレーターによって描かれたバンドパターンも示す。両パターンは同じである。実際の実験において分離されたアガロース包埋Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １９０６−２の完全ＤＮＡ分子は本発明に開示されている非酵素的方法により調製した。
【０１０４】
本発明に開示したシミュレーターの部分のフローチャートを図７に示す。移動データまたは既知のサイズデータに基づいてパルスランプを推定する計算方法はフローチャートに示されている。
【０１０５】
ユーザーが移動データを方法に入力すると、シミュレーターは最初該データから分子のサイズを推定する、次いで直線的パルスランプのセットを推定する。ユーザーがサイズデータを方法に入力すると、シミュレーターは直接パルスランプを推定する。パルス数の増加を打ち切る条件は最小分子を２．５ ｃｍ移動させるパルス数である。
【０１０６】
最後に、シミュレーターはプログラムにより計算されそしてユーザーにより特定された分子群に適用されるパルスランプに対してゲル中に観察されるはずである結果（図６のミニゲル４３における実際のバンドパターン及び仮説的ミニゲル４２におけるシミュレートパターンを参照）を提供する。プログラムは定量的データも提供する。その回答は極く当たり前のことであるのでこの部分の図は示さない。
【０１０７】
例７：電気泳動核型またはパルス型の分析。
１．５％アガロース、０．５×ＴＢＥ、１０ Ｖ／ｃｍ、２０℃、２．９５秒及び４５３パルス及び２１．５６秒及び４５３パルス、の分離条件におけるミニＣＨＥＦにおいて得られたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの電気泳動核型（６１）を図８に示す。各バンド（６２−６６）の移動は該核型中で測定された。
【０１０８】
移動を分析する方法に各バンドの移動データ、電場強度、パルスの持続時間及び数及び泳動緩衝液の温度を入力した。
【０１０９】
ここに開示した方法によりサイズ、リオリエンテーション時間及び各バンドに分離した分子の移動速度を計算することができる。これらの結果を表ＩＩＩに示す。これは本発明のこの部分に開示された移動を分析する手順によって与えられる結果の型である。
2004513375.tif 000006
Ｄ ｅｘｐ：図８のミニゲル中の分子の移動距離。
Ｄ ｔｈｅｏｒ：各サイズの実際の分子が図８の実験条件において移動するはずである距離。
ｖｒ：リオリエンテーションの間の移動速度。
ｖｍ：リオリエンテーション後の分子の移動速度。
ｔｒ：リオリエンテーション時間。
【０１１０】
ＤＮＡ移動の分析方法のフローチャートを図９に示す。図は１サイズの分子を処理するために描かれており、この段階を分析する全ての分子について繰り返す。
【０１１１】
例７に記述した方法に移動データを入力すると、該方法はこの例に記述したように分子のサイズを推定する。
【０１１２】
例８．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ単離体のミニＣＨＥＦ型分類。
表現型レベルでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉと分析された、各単離体（ＩＮＮ３及びＩＮＮ７）の１コロニーを血液寒天プレートから採取した。次いで、５ ｍｌのＬＢ培地（１０ ｇのイースト抽出物、５ ｇの塩化ナトリウム、１０ ｇのバクト−トリプトン／蒸留水１リッター）中で継代培養した。各培養は終夜３７℃で振とうしてインキュベートした。
【０１１３】
各培養の細胞を洗い（表Ｉの洗浄液を参照）、遠心分離し、ペレットを０．１５ Ｍ ＮａＣｌに溶解した１．５％低融点アガロースに２×１０９細胞／ｍｌの割合で再懸濁した。各アガロース−細胞混合物を図１に示した鋳型のシート（１）に注いだ。シートを蓋（３）で被い、そしてアガロースを固化させてミニプラグを形成させた（５）。両群のミニプラグをＮＤＳＵＰｌｕｓと３０分５０℃でインキュベートした。その後、ミニプラグを洗い、そして１０分間Ｘｂａ Ｉ制限酵素用緩衝液とインキュベートし、それぞれ２０ＵのＸｂａ Ｉで２時間３７℃において消化した。
【０１１４】
ミニＣＨＥＦのミニゲル（８６）中で分離されたバンドパターン（８７）を図１０に示す。ＩＮＮ３（８８）及びＩＮＮ７（８９）Ｅ． ｃｏｌｉ単離体のＸｂａ Ｉ−消化総ＤＮＡのミニＣＨＥＦで行われた分離により、それらに共通の６フラグメント（９０）を同定することができた。次いで、Ｔｅｎｏｖｅｒ（Ｔｅｎｏｖｅｒ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９９５， ３３：９， ２２３３−２２３９）に従い、それらを２つの異なるＥ． ｃｏｌｉ亜型に分類した。ＤＮＡ制限フラグメントは１０ Ｖ／ｃｍ、２０℃、１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥにおいて、２５，２０，１５，及び５秒のパルスランプ及び３５，４０，５０，１４０，及び８００パルスをそれぞれ適用したミニＣＨＥＦ中で分離した。
【０１１５】
開示した解決策の利点
１−　いずれかのゲルの薄いミニプラグ中に包埋された微生物の完全ＤＮＡ分子の調製は５分から１時間の間で行われる。調製には酵素の使用の必要はなく、したがって迅速に安価に行われる。
２−　ＰＦＧＥ用のＤＮＡ検体の非酵素的調製法は液体培地または固形培地で増殖した細胞に使用して有効である。ある型の細胞はそれを包埋する前に非酵素溶液中でインキュベートすることができる。この改良により検体調製に要する時間を短縮される。
３−　開示した方法により調製されるゲル包埋ＤＮＡ分子は制限エンドヌクレアーゼを阻害しない。これらの分子は２時間で制限酵素により消化され、ミニ装置で実施されるパルスフィールドゲル電気泳動実験において典型的なバンドパターンを示す。
４−　微生物の固定化ＤＮＡを含む均一な大きさのミニプラグが得られるので、電気泳動に適用する前に切り揃える必要はない。一定のミニプラグは結果の再現性を保証する。
５−　多数の検体（２７まで）の分子核型またはパルス型が２．５から７時間の泳動時間で得られる。分離用の緩衝液及びマトリックスの消費が少ない。分離に必要な時間は、試験する微生物及び使用する装置、並びに電場、実施温度及び使用するパルスランプに依存する。
６−　ミニ装置中のパルスフィールドミニゲル電気泳動により微生物のゲノムを分析するために使用される装置は実験室空間を少ししか必要としない。
７−　バンドパターンは実験を実施する前に、必要に応じて何度でも、コンピュータにおいてシミュレートすることができる。このシミュレーションにより、試薬及び生物検体を消費することなく、分子間の最良の分離を生じる電場、温度及びパルスランプを選択することができる。
８−　パルスランプの選択は、ミニＣＨＥＦミニゲル中のＤＮＡ分子を記述する式に基づく方法により行われる。次いで、ランプを選択するこの方法は分子間の分離の最適パターンを図示する。
９−　ＤＮＡ分子のサイズ、リオリエンテーション時間及び移動速度を推定するのにサイズマーカーは必要ない。ここに開示したこれらのパラメーターを推定する方法はゲル中の分子の移動距離に基づいてこれらの情報を提供する。どのようなパルスランプ及び１−２０ Ｖ／ｃｍの電場強度、４−３０℃の間の温度の条件が電気泳動に使用されても、この方法を適用することができるが、実験は１．５％アガロースゲル及び０．５×ＴＢＥ中で行われることが前提である。
１０−　電気泳動パターン中で分離したバンドは各バンドに移動した分子のサイズ、該分子のリオリエンテーション時間及びその移動速度について分析される。　１１−　ここに開示した方法は時間、化学試薬及び生物検体を節約する。
１２−　ＤＮＡ検体調製及び２７微生物のゲノムの分析を含めて、この方法は１作業日を要する。
１３−　微生物の完全ＤＮＡ調製を簡便化する試薬のキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ミニプラグを鋳造するための鋳型の図。アガロース−細胞懸濁を注ぐための窪みを着けたシートを図の下側に示す。上には鋳型の蓋及びミニプラグを示す。アガロース−細胞懸濁を分配するスパーテルを右に示す。
【図２】
ミニＣＨＥＦ及びミニＴＡＦＥ中で分離されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＨ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの染色体バンドパターンの写真。図の上：７ ｃｍ幅のミニＣＨＥＦミニゲル、その２７穴及びＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体のバンドパターン。図の中央に４ ｃｍ幅のミニゲル、及びＨ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ染色体のバンドパターンを示す。検体は固定化細胞を含むミニプラグをＮＤＳＵでインキュベートする非酵素的方法により調製した。泳動条件：１０ Ｖ／ｃｍ， ２０℃，１．５％アガロース，０．５×ＴＢＥ，５０秒のパルス時間及び４時間の電気泳動。図の下に、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体のバンドパターンを乗せたミニＴＡＦＥを示す。ミニＴＡＦＥにおいて１０ Ｖ／ｃｍ， １．５％アガロース，０．５×ＴＢＥ，６０秒のパルス時間及び６時間の電気泳動を使用した。検体はＮＤＳＵで細胞をインキュベートして調製し、次いでアガロースミニプラグに包埋した。
【図３】
Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＸｂａ Ｉマクロ制限ＤＮＡフラグメントのミニＣＨＥＦ中において得られたバンドパターン。左側、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａミニプラグを液体ＬＢ培地中で増殖した細胞から調製した、一方右側、ミニプラグをＬＢプレートで増殖した細胞から調製した。ミニＣＨＥＦを１０ Ｖ／ｃｍ、２０℃、１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥにおいて使用し、２０，１５，１０，５及び３秒のパルスランプ及び５，１５，３２０，１０２０及び１００パルスをそれぞれ適用した。
【図４】
Ｓ． ａｕｒｅｕｓのＳｍａ Ｉマクロ制限ＤＮＡフラグメントのミニＣＨＥＦにより得られたバンドパターン。細胞を含むミニプラグをＮＤＳＵＰｌｕｓとインキュベートする非酵素的方法により調製された検体のバンドパターンを左に示す。細胞をＮＤＳＵＰｌｕｓでインキュベートし次いでアガロースミニプラグに包埋して作製した検体のバンドパターンを右に示す。泳動条件は、１０ Ｖ／ｃｍ、２０℃、１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥにおいて使用し、パルス時間は１，５，９，１３，１７及び２１。各ランプに１３０パルスを適用した。
【図５】
Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ， Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びλ−ファージコンカテマーのＤＮＡバンドパターンの写真。電気泳動はミニＴＡＦＥのミニゲル中１０ Ｖ／ｃｍ、１２０ ｓパルス時間、２０℃、１％アガロース（ＳｅａＫｅｍ）、０．５×ＴＢＥ緩衝液及び６時間の電気泳動により実施した。厚さ０．１ ｃｍの検体を適用した。左から右へ、レーン１：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １９６−２のミニプラグ；レーン２，３，４，及び５：ＮＤＳＵＰｌｕｓと４５℃で０．５，１，２及び１６時間、それぞれインキュベートしたＥ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａトロフォゾイトを含むミニプラグ；レーン６：λＤＮＡラダー。
【図６】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １９６−２染色体のバンドパターンを得るために使用した実際のミニＣＨＥＦミニゲル（４０）の写真（左）及びシミュレーターで予測した仮説的ミニゲル（４２）のグラフ（右）。実際の電気泳動はシミュレーターで予測した条件で実施した。この電気泳動で分析されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ １９６−２の固定化完全ＤＮＡ分子は本発明において開示した非酵素的方法により調製した。１０ Ｖ／ｃｍ電場強度、２０℃緩衝液温度に対して、シミュレーターが予測した実施条件は５，４０，７５及び１１０秒の４パルスランプ及び各ランプ４２パルスであった。移動データ及び分子のサイズを同定するために使用するカラーコードを表ＩＩに示す。
【図７】
ミニＣＨＥＦのミニゲル中のＤＮＡバンドパターンをシミュレートする方法のフローチャート。以下のパラメータ及び変数が図の中で使用される：ＤＮＡサイズ（ｋｂ）、ＤＮＡ新方向時間（ｔｒ）、リオリエンテーションの間（ｖｒ）の及びリオリエンテーションの後（ｖｍ）のＤＮＡ移動速度。さらに、ｔｐｒ：各ランプにおけるパルス時間、Ｎｐｒ：各ランプにおけるパルス数、実験温度（Ｔ）の関数として粘度（η）を記述するために求めたｇ０，ｇ１，ｇ２，ｇ３，ｇ４係数、Ｄｔ：この方法により予測される理論的距離、ｎ：ランプの数、Ｅ：電場、Ｌ：ＤＮＡ境界長、ｂｐ：塩基対、Ｑ：ＤＮＡネット電荷。
【図８】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体のミニＣＨＥＦ中で得られる電気泳動核型（６１）。電気泳動条件：１０ Ｖ／ｃｍ、１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥ、２０℃、２．９５秒と４５３パルス及び２１．５６秒と４５３パルス。
【図９】
移動距離を入力してミニＣＨＥＦで分離した分子のサイズ（ｋｂ）、リオリエンテーション時間（ｔｒ）、リオリエンテーションの間の移動速度（ｖｒ）、及びリオリエンテーションの後の移動速度（ｖｍ）を推定するために必要な方法のフローチャート。ｔｐｒ：各ランプにおけるパルス時間、Ｎｐｒ：各ランプにおけるパルス数、実験温度（Ｔ）の関数として粘度（η）を記述するために求めたｇ０，ｇ１，ｇ２，ｇ３，ｇ４係数、Ｄ：ＤＮＡ分子がゲル中を移動した距離、Ｄｔ：この方法により予測される理論的距離、ｎ：ランプの数、Ｅ：電場、Ｌ：ＤＮＡ境界長、ｂｐ：塩基対、Ｑ：ＤＮＡネット電荷。
【図１０】
そのＤＮＡ分子のＸｂａ Ｉ制限消化した後のＩＮＮ３及びＩＮＮ７ Ｅ． ｃｏｌｉ単離体のミニＣＨＥＦ型分類。検体調製に非酵素的方法を使用した。実施条件は：１０ Ｖ／ｃｍ、２０℃、１．５％アガロース及び０．５×ＴＢＥにおいて使用し、パルス時間は２５，２０，１５，１０及び５秒及び３５，４０，５０，１４０及び８００パルスを適用した。黒丸印（９０）は両単離体が共通して持つ制限フラグメントを示す。
【図７】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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