(57)【要約】本発明は、インスリン耐性を有する個体を診断し、そして処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン耐性の処置に有用な物質をスクリーニングする方法であって、
P20を発現している哺乳類細胞と当該物質を接触させ、そして
当該物質がP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを抑制するか否かを決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
哺乳類細胞がインスリン耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類細胞がラット又はヒト由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳類細胞が筋芽細胞、脂肪細胞、又は骨格筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
物質が単離された骨格筋と接触される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
接触が、動物に対する試験物質の投与によって生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
動物が遺伝的又は実験的に誘導されたインスリン耐性を有するげっ歯類である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞と試験物質との接触の間、又はその前、又はその後に、当該細胞が、P20のリン酸化を誘導するのに十分な量のアミリン、CGRP1、CGRP2、エピネフリン又はノルエピネフリンに曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞が、当該細胞と試験物質との接触の間、その前、又はその後に、非インスリン耐性細胞内でのP20のアミリン誘導型のリン酸化を低下させるのに十分な量のインスリンに曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞がex vivoでインスリンに曝露される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インスリン耐性の処置に有用な物質をスクリーニングするための方法であって、
(a)P20を発現しているインスリン耐性哺乳類細胞と当該物質を接触させ；
(b)前記細胞内のP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し；そして
(c)S2及び／又はS3の発現レベルをS2又はS3の参照発現レベルと比較する段階を含んで成り、前記参照発現レベルが(i)前記物質に曝露されていない類似の細胞における発現又は(ii)インスリン耐性でない細胞における発現、に特徴的なものであり、そして(i)より低い、又は(ii)と類似の発現レベルが、前記物質がインスリン耐性の処置に有用であることを示す、方法。
【請求項１２】
哺乳類細胞がラット又はヒト由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類細胞が、筋細胞、脂肪細胞、又は骨格筋細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記物質が、単離された骨格筋と接触される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
接触が、動物に対する試験物質の投与によって生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
動物が遺伝的又は実験的に誘導されたインスリン耐性を有するげっ歯類である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体由来の生物学的試料を入手し、そしてP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを決定することを含んで成る、個体のインスリン耐性を診断する方法であって、S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルが、インスリン耐性に苦しんでいない個体に特徴的な参照レベルよりも高い場合、前記個体がインスリン耐性であると診断される、方法。
【請求項１８】
生物学的試料中の細胞が、ex vivoでインスリンと接触される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
S2及びS3両方のレベルが決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
S2及びS3両方のレベルが、インスリン耐性に苦しんでいない個体に特徴的な参照レベルよりも高い、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
個体のインスリン耐性又はインスリン耐性の性向を診断する方法であって、
個体の細胞におけるP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し、そして
当該レベルをインスリン耐性又は肥満に苦しんでいない個体の同一の型の細胞に特徴的な参照レベルと比較することを含んで成り、前記参照レベルよりも高い発現レベルが、個体のインスリン耐性又はインスリン耐性の性向と診断される、方法。
【請求項２２】
S2及びS3両方のレベルが決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
S2及びS3両方のレベルが前記参照レベルよりも高い、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
S2及び／又はS3の発現レベルが、インスリン耐性を有する個体に特徴的な第二参照レベルより大きいものとほぼ同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
個体のインスリン耐性の処置の有効性を評価する方法であって、当該処置が投与されている個体のS2及びS3のおうちの少なくとも１つのレベルをモニタリングすることを含んで成る方法。
【請求項２６】
個体のインスリン耐性を処置する方法であって、個体のP20のイソ型S2及びS3のレベルを低下させる処置又は物質を投与することを含んで成る方法。
【請求項２７】
前記物質が、請求項１に記載の方法によって同定される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００１年３月３０日に出願されたU. S.仮特許出願60/280,584の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、プロテオミクスの分野に関する。更に具体的には、本発明はインスリン及びそのアンタゴニストに応じて、且つある病状において明確なリン酸化パターンを示すリンタンパク質標的に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書における引用番号によって引用される刊行物は、本明細書の末尾の引用文献のリストに相当する。
【０００４】
インスリン耐性は、標的組織、例えば肝臓、骨格筋及び脂肪細胞のインスリン感受性の低下を特徴とする（１）。それは、II型糖尿病の病原における重要な因子であり、そして他の生理学的状態、例えば肥満、異脂肪血症、高インスリン血症、高血圧及び心血管疾患とも関連している。これらの代謝障害の集合は、「X症候群」又は「インスリン耐性症候群」と称されている（２）。
【０００５】
インスリン耐性の分子的基盤は極度に複雑であり、そして多因子性である。インスリン作用の複数の段階、例えばインスリン受容体の活性化、受容体後のシグナル伝達、及びグルコース輸送エフェクターシステムおける欠損は、この疾患と関連している（３，４）。インスリン受容体キナーゼ活性の欠損、IRS-1チロシンのリン酸化の減少及びPI-3キナーゼ活性の低下は、ヒトのII型糖尿病患者及び動物モデル、例えば0b/0bマウスのいずれにおいても観察された（５，６）。
【０００６】
インスリン受容体の及び受容体後のシグナル伝達の構成要素の固有の欠損に加えて、他の循環因子、例えばTNF-α、レプチン、遊離脂肪酸(FFA)及びアミリンもインスリン耐性の病原に寄与しているようである（７−１１）。例えば、膵島のβ−細胞からインスリンと一緒に分泌されるホルモンであるアミリンは、インスリンの代謝作用をin vivo及びin vitroの両方で拮抗することが示されている（１２−１６）。それはインスリン刺激型のグルコースの取り込み及びグリコーゲンの合成を阻害することができる。アミリンのin vivoでの投与は高血糖をもたらし、そしてインスリン耐性を誘導し、これはII型糖尿病で観察されるものと類似している。いくつかの初期の研究は、燃料代謝に対するアミリンの生物学的効果が薬理学的にのみ注目されるものであると示唆していたが、アミリン選択的アンタゴニストを用いる更に最近のin vivoでの研究は、その生理学的関連を強力に支持している（１７）。更に、アミリン欠損マウスは、インスリン応答性の増大及びグルコース負荷後の更に迅速なグルコース排出を示し、更に、インスリン耐性の因果関係におけるアミリンの役割が確認された（１８）。事実、循環しているアミリンのレベルの上昇（高アミリン血症(hyperamylinemia)）及びインスリンに対するアミリンの比の増大は、II型糖尿病及びインスリン耐性と関連している他の疾患、例えば肥満及びグルコース不耐性を有する患者において観察された（１９）。
【０００７】
これらの進展にも関わらず、インスリン耐性の詳細な細胞機構は明らかになっておらず、そしてこの症状のための新規な治療的且つ診断的な療法についての必要性が存在している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１つの観点において、インスリン耐性の処置に有用な物質をスクリーニングする方法であって、P20を発現している哺乳類細胞と前記物質を接触させ、そして当該物質がP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを抑制するか否かを決定することによってスクリーニングする方法、を提供し、ここで、S2及びS3のレベルの抑制は、インスリン耐性の処置に有用な物質を示すものである。１つの態様において、哺乳類細胞はラット又はヒト由来である。別の態様において、哺乳類細胞は、筋細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞である。別の態様において、前記物質は単離された骨格筋と接触される。別の態様において、接触は、動物（例えば遺伝的又は実験的に誘導されたインスリン耐性を有するげっ歯類）に対する試験物質の投与によって生じる。別の態様において、細胞は、細胞と試験物質の接触の間、その前、又はその後にP20のリン酸化を誘導するのに十分な量のアミリン、CGRP1、CGRP2、エピネフリン又はノルエピネフリンに曝露される。
別の態様において、細胞は、細胞と試験物質の接触の間、その前、又はその後にP20のリン酸化を誘導するのに十分な量のインスリンに曝露される。別の態様において、細胞はex vivoでインスリンに曝露される。
【０００９】
別の観点において、本発明は、インスリン耐性の処置に有用な物質をスクリーニングする方法であって、(a)P20を発現しているインスリン耐性哺乳類細胞と前記物質を接触させ；(b)前記細胞内のP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し；そして(c)S2及び／又はS3の発現レベルをS2又はS3の参照発現レベルと比較することによってスクリーニングする方法を提供し、ここで、前記参照発現レベルは(i)前記物質に曝露されていない類似の細胞における発現又は(ii)インスリン耐性でない細胞における発現、に特徴的なものであり、そして(i)より低い、又は(ii)と類似の発現レベルは、前記物質がインスリン耐性の処置に有用であることを示唆している。１つの態様において、哺乳類細胞は、筋細胞、脂肪細胞、又は骨格筋細胞である。別の態様において、前記物質は、単離された骨格筋と接触される。別の態様において、接触は、哺乳類（例えば遺伝的又は実験的に誘導されたインスリン耐性を有するげっ歯類）に対する試験物質の投与によって生じる。
【００１０】
別の観点において、本発明は、個体由来の生物学的試料を入手し、そしてP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを決定することによって、個体のインスリン耐性を診断する方法を提供し、ここで、前記個体は、S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルが、インスリン耐性に苦しんでいない個体に特徴的な参照レベルよりも高い場合、インスリン耐性であると診断される。１つの態様において、生物学的試料中の細胞は、ex vivoでインスリンと接触される。別の態様において、S2及びS3両方のレベルが決定される。別の態様において、S2及びS3両方のレベルが、インスリン耐性に苦しんでいない個体に特徴的な参照レベルよりも高い。
【００１１】
別の観点において、本発明は、個体のインスリン耐性を処置する方法であって、個体におけるP20のイソ型S2及びS3のレベルを減少させる処置又は物質を投与することを含んで成る方法を提供する。１つの態様において、前記物質は上述のスクリーニング方法によって同定される。
【００１２】
別の観点において、本発明は、インスリン耐性の処置のための薬物の調製における、細胞内のS2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを低下させる物質の使用を提供する。
【００１３】
別の観点において、本発明は、個体のインスリン耐性のための処置の有効性を評価する方法であって、当該処置が投与されている個体のS2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルをモニタリングすることによって評価する方法を提供する。
【００１４】
別の観点において、本発明は、個体のインスリン耐性又はインスリン耐性の性向を診断する方法であって、個体の細胞におけるP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し、そして当該レベルをインスリン耐性又は肥満に苦しんでいない個体の同一の型の細胞に特徴的な参照レベルと比較することによって診断する方法を提供し、ここで、前記参照レベルよりも高い発現レベルは、個体のインスリン耐性又はインスリン耐性の性向と診断される。１つの態様において、S2及びS3両方のレベルが決定される。別の態様において、S2及びS3両方のレベルは、前記参照レベルよりも高い。別の態様において、S2及び／又はS3の発現レベルは、インスリン耐性を有する個体に特徴的な第二参照レベルより大きいものとほぼ同一である。
【００１５】
別の観点において、本発明は、個体のインスリン耐性の処置の有効性を評価する方法であって、当該処置が投与されている個体のS2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルをモニタリングすることによって評価する方法を提供する。
【００１６】
別の観点において、本発明は、個体のインスリン耐性を処置する方法であって、個体のP20のイソ型S2及びS3のレベルを低下させる処置又は物質を投与することによって評価する方法を提供する。１つの態様において、前記物質は、上述のスクリーニング方法によって同定される。
【００１７】
別の観点において、本発明は、インスリン耐性の処置のための薬物の調製における、細胞のS2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを低下させる物質の使用を提供する。
【００１８】
本発明の詳細な説明
I.一般的技術
本発明の実施は、特に断らない限り、当業界の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の常用の技術を利用する。そのような技術は、文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (本明細書では併せて「Sambrook」として引用する); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, 及び Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (本明細書では併せて「Harlow and Lane」として引用する), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000).において完全に説明されている。
【００１９】
II.序論
我々は近年、ラット骨格筋においてインスリン及びそのアンタゴニストによって引き起こされるリン酸化カスケードを体系的に研究するために、比較プロテオミクス解析を使用ており、そしてこれらのホルモンの共通の細胞内標的として新規のリンタンパク質P20を発見した（２３，２４）。インスリン及びそのアンタゴニストホルモンであるアミリン、エピネフリン及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、異なるシグナル伝達経路を介して、異なるセリン残基でP20をリン酸化し、このタンパク質の多数のホスホイソ型を産生する。後の実施例において、我々は、インスリン耐性を有する糖尿病のラットに由来する骨格筋中のP20が、このタンパク質の発現レベルは変化しないが、異常なリン酸化パターンを有することを示す。更に、インスリン及びアミリンに対するP20の応答性は、インスリン耐性動物においても変化する。
【００２０】
我々の結果は、骨格筋におけるインスリン耐性が、２つのP20のホスホイソ型S2及びS3の出現と関連しており、そして更にこれらの２つのイソ型S2及びS3のアミリン媒介型のリン酸化を抑制することができないインスリンの能力とも関連していることを示す。このように、P20の２つのイソ型のリン酸化の増大は、通常のインスリン耐性状態と関連している。ホルモン刺激の不在下において、S2及びS3のリン酸化は、非糖尿病細胞又は動物、例えば筋肉試料中においてめったに検出されないが、２つのホスホイソ型は、インスリン耐性動物由来の細胞中に豊富である（例えば、非インスリン耐性動物よりも約５倍高い）。
【００２１】
更に、インスリン耐性細胞におけるインスリンの添加は、S2のアミリン誘導型のリン酸化を減少させ、そしてS3は、正常な（非インスリン耐性）細胞又は動物と比較して大きく弱められる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「P20」は、Inayuma, Y. et al Gene 178 (1-2): 145-50 (1996)においてクローニングされたタンパク質及び哺乳類種のその相同体を意味する。Wang et al., 1999, FEBS Lett 457 : 49-52, and Wang et al., 1999, FEBS Lett 462: 25-30,1999も参照のこと。P20は、S1, S2及びS3と称される、３つのリン酸化された等電点の変異体で存在する。ラットにおいては、S1(pI=6.0)は１５７位のセリンでリン酸化され；S2(pI=5.9)は１６位のセリンでリン酸化され、そしてS3(pI=5.6)は、１６位のセリンを含む、多数の部位でリン酸化される。S2及びS3の相同体は、げっ歯類の組織においてこれらのホスホイソ型を同定するために利用された方法と類似の、ウェスタンブロッティング及び二次元電気泳動によって、ヒト骨格筋中で同定された。他の哺乳類の相同体は、本明細書に記載の方法を用いて特徴付けることができる。
【００２３】
III.薬物スクリーニング法
リンタンパク質P20及びそのイソ型又はイソ変異体(isovariant)（例えば、ホスホイソ型S1, S2, 又はS3）は、薬物スクリーニングの目的のための標的となりうる。したがって、潜在的な薬物である化合物をスクリーニングする方法が提供される（例えば、インスリン耐性又はX症候群に関連する症状の処置に有用な物質をスクリーニングするための方法）。１つの態様において、リンタンパク質P20及びそのイソ型（例えば、S1, S2及び／又はS3のイソ型）と相互作用し。そして／あるいはそれと結合する潜在的な薬物である化合物を同定する方法が提供される。関連する観点において、本発明は、P20又はそのイソ型と関連するタンパク質又は受容体（例えば、グルコース輸送体）と相互作用し、そして／あるいは結合する薬物をスクリーニングする方法を提供する。
【００２４】
予備的なスクリーニングは、結果として同定される化合物のうちの少なくともいくつかが、恐らくはS2及びS3部位でのP20のリン酸化の調節物質であるように、P20と結合することができる化合物をスクリーニングすることによって実施されうる。結合は、標準的技術、例えば限定しないが、共沈、非変性SDSポリアクリルアミドゲル上での共遊走、及びウェスタンブロット上での共遊走を測定する方法を含むようなアッセイを用いて検出されうる。そのようなアッセイで利用されるP20タンパク質は、自然に発現され、クローニングされ、又は合成されうる。上記結合は、精製したP20、無細胞系、又は無処理の細胞（例えば、P20を発現する組換え細胞）を用いて評価されうる。アッセイにおいて、P20及び／又は推定される薬物は、検出可能なマーカー（例えば、放射性標識又は非同位体標識、例えばビオチン又は蛍光マーカー）で標識されうる。薬物候補は、親和性、好ましくは高親和性で、細胞内で発現したリンタンパク質P20及びそのイソ型と結合する化合物を、当業界で周知の技術を用いて選択することによって同定されうる。薬物候補はまた、リンタンパク質P20及びそのイソ型と結合するが、その他の受容体又は受容体部位と結合しない化合物を同定することによって、選択性についてスクリーニングされうる。別の態様において、薬物候補は、P20又はそのイソ型と関連するタンパク質（例えば、グルコース輸送体又は受容体）に結合し、そしてその効果を発揮する化合物を同定するためにスクリーニングされる。したがって、薬物のスクリーニング法は、P20又はそのイソ型を発現している哺乳類細胞を１又は多数の薬物に曝露し、続いて、当該哺乳類細胞で発現したリンタンパク質P20又はそのイソ型と結合するそれらの薬物を決定し、そして、それによってリンタンパク質P20及びそのイソ型と相互作用し、そして／あるいはそれと結合する薬物を同定すること、を包含する。P20又はP20関連タンパク質と結合する化合物は、それらの治療活性を決定するために、追加のアッセイにかけられることもある。好ましい化合物は、P20に結合し、そしてS2及び／又はS3のリン酸化を調整するものである。
【００２５】
薬物スクリーニングに使用されうる１つの方法は、P20（又はそのイソ型）を発現する哺乳類細胞を用い、当該細胞を１又は複数の試験化合物と接触させ、そして当該細胞上での当該化合物の効果をモニタリングすること、を包含する。モニタリングされ、又は測定されうる、１つのそのような効果は、グルコース又はグルコース変異体の取り込み（例えば、図７に示すような、２−デオキシグルコースの取り込み）である。モニタリングされうる別の効果は、P20のリン酸化及び／又はイソ型、例えばS1, S2, 及び／又はS3の発生である。リン酸化のパターンは、当業界で知られた方法によって、そして本明細書に記載のアッセイによって評価されうる。
【００２６】
１つの観点において、本発明は、P20を発現する哺乳類細胞を試験物質と接触させ、そして当該物質がP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを抑制するか否か（例えば、当該試験物質の不在下での発現と比較して）を決定することによって、インスリン耐性の処置に有用な物質を同定する方法を提供する。物質によるS2及び／又はS3のレベルの抑制は、当該物質がインスリン耐性及び関連の症状（例えば、X症候群関連のもの）に有用であることを示唆する。抑制は、当該試験物質と接触されていない同一細胞型と比較して、S2及び／又はS3のより低いレベル又は低下したレベルを意味する。好ましくは、インスリン耐性の処置に有用な試験化合物は、コントロールの細胞と比較して、少なくとも約２０％、しばしば少なくとも約４０％、非常にしばしば少なくとも約５０％、そして時には少なくとも約６０％、S2及び／又はS3のレベルを低下させるものである。
【００２７】
ある態様において、哺乳類細胞はげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）又は霊長類（例えば、ヒト又はヒト以外の霊長類）である。哺乳類細胞は、単離された１又は複数の細胞（例えば、in vitroの細胞培養物中のもの）組織（例えば、生検組織）中の細胞、試験動物中の細胞又はそれ以外の細胞であってもよい。例えば、当該細胞は、筋細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋、ヒラメ筋、長指伸筋、心筋、又は平滑筋）、脂肪細胞、又は血液細胞であってもよい。このように、例えば、単離された組織、例えば単離された骨格筋組が使用されうる(例えば、実施例に記載のように）。適当な哺乳類細胞の型の例は、図７に表した実験において使用したようなL6細胞である。
【００２８】
P20を発現している細胞は、このタンパク質を天然に発現する細胞であってもよい。あるいは、それらは組換え細胞であってもよい。リンタンパク質P20（例えば、P20のイソ型）は、リンタンパク質P20（例えば、P20のイソ型）をコードする遺伝子配列（例えば、DNA配列）を含んで成るプラスミド又は発現ベクターを用いることによって、哺乳類細胞中で発現されうる。
【００２９】
ある態様において、当該細胞はインスリン耐性細胞である。「インスリン耐性」とは、インスリンで処理された場合に、インスリン反応性の過程又は経路で、又は、例えばインスリン反応性の酵素の活性又は阻害で、亜正常の用量反応を示す細胞を意味し、そして／あるいはインスリン耐性である動物から単離された細胞又は組織を意味する。インスリン耐性である動物は、限定しないが、インスリン耐性又はII型糖尿病と診断されたヒト、遺伝的にインスリン耐性である動物（例えば、ob/obマウス）、又はインスリン耐性又は糖尿病が実験的に誘導された動物（例えば、デキサメタゾンの投与、高脂肪食での維持等による）、を含む。
【００３０】
ex vivoで培養された細胞又は組織のインスリン耐性は、アミリンによる処置によって生じうるが、これはそのような準備を達成する唯一の方法ではない。細胞又は組織のin vitroでの処理の後にインスリン耐性を生じさせることができる他の分子には、CGRP1又はCGRP2；エピネフリン；又はノルエピネフリンが含まれる。尚、インスリン耐性細胞又は組織は、in vivoでのみ、且つ間接的にin vitroでインスリン耐性を生じさせることができる他のホルモンで、動物、例えばげっ歯類を最初に処理することによって産生することができる。このホルモンの第二カテゴリーの例には、糖質コルチコイドアゴニスト（例えば、コルチゾール、コルチコステロン、プレドニゾン又はデキサメタゾン）及び他のホルモン（例えば、成長ホルモン及び成長ホルモンアゴニスト）が含まれ；これら両方のクラスのホルモンは、in vivoでインスリン耐性を誘起することができる。細胞又は組織、例えば肝臓、脂肪組織、骨格筋又は心筋のex vivoの培養物は、これらのホルモンによる素y離によって、インスリン耐性となった動物から調製され、そして当該アッセイにおいて利用される。遺伝子に基づいてインスリン耐性及び肥満である動物から調製された細胞又は組織もアッセイで利用されうる。有用なげっ歯類の系統の例は、ob/obマウス、db/dbマウス、fa/faラット及びLAN-cpラットである。前記アッセイにおいて有用に利用されうる細胞又は組織のそれ以外の供給源は、栄養の操作によってインスリン耐性となった動物又はインスリン耐性のヒトから導かれるものである。げっ歯類に有用な栄養の操作の例には、他の点では正常のげっ歯類に対する、生理学的な量以上の脂肪又は生理学的な量以下のタンパク質を含む食餌の給餌が含まれる。インスリン耐性の細胞又は細胞系はまた、American Type Culture Collection (ATCC, P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108) からも得ることができる。細胞（系）又は動物のインスリン耐性は、慣習的な方法を用いて、in vitro又はin vivoのいずれかで決定されうる。例えば、in vitroの試験は、インスリンと一緒に、そしてインスリン無しに哺乳類細胞をインキュベートし、そしてグリコーゲン合成及び／又はグルコースの取り込みに対するインスリンの効果を決定することを包含することがある。in vivoでの試験は、絶食時のグルコース試験において哺乳類にインスリンを投与し、そして続いてグリコーゲン合成及び／又はグルコースの取り込みを測定することを包含することができる。ヒトにおいては、インスリン耐性は、当業界で既知の様々な方法のいずれかによって評価することができる（例えば、Bergman et al., 1985, Endocrine Review 6: 45-86; Reaven et al., 1979, Diabetologia 16: 17- 24を参照のこと）。
【００３１】
既に述べたように、物質によるS2及び／又はS3のレベルの抑制は、インスリン耐性及び関連の症状（例えば、X症候群に関連する症状）の処置にとって有用な物質を示唆する。細胞中のS2及び／又はS3のレベル（時折、「発現レベル」として言及される）は、限定しないが、二次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー的方法（例えば、HPLC）、免疫学的方法（例えば、S2又はS3に特異的な抗体を用いる免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ウェスタンブロッティング等）等を含むあらゆる方法であって、特異的なタンパク質（例えば、特異的なリン酸化タンパク質のレベルの定量のための種々の画像化及び解析方法の使用を含むもの、によって決定されうる。簡便的には、細胞中のP20のリン酸化は、リンの放射性同位体を用いて、例えば下記の実施例に記載されているようにモニタリングされうる。
【００３２】
本発明は更に、P20を発現している哺乳類細胞と物質を接触させ、P20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し；そしてP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つのレベルを参照レベルと比較することによって、インスリン耐性の処置に有用な物質をスクリーニングする方法を提供する。複数の態様において、参照発現レベルは、(i)上記物質に曝露されていない類似の細胞における発現又は(ii)インスリン耐性ではない細胞における発現に特徴的なものである。物質は、当該物質の存在下での発現レベルが(i)よりも低いか、又は(ii)と類似である場合に、インスリン耐性の処置にとって潜在的に有用である。これに関連して、「より低い」とは、 (i)より少なくとも約２０％、しばしば少なくとも約４０％、しばしば少なくとも約５０％、そして時々少なくとも約６０％低いS2及び／又はS3の発現レベルを意味する。これに関連して、「類似」は、(ii)の２倍以内、好ましくは(ii)の１．５倍以内の発現レベルを意味する。
【００３３】
実施例で論じるように、アミリン及びインスリンは、S2及びS3のレベルに対して対抗する効果を有する。アミリン（並びにCGRP1、CGRP2、エピネフリン又はノルエピネフリン）の様な物質が、前記細胞と前記物質とが接触している間、その前、又はその後に、P20のリン酸化を誘導するために使用されうる。インスリン（又は他のインスリンアゴニスト）は、前記組織中の１又は複数の過程のインスリン用量反応（及びそれ故に、細胞又は組織のインスリン反応性）を測定するために、細胞と接触されうる。このように、インスリンアゴニストによる処理及び変化しうる指標の測定は、細胞又は組織におけるインスリン耐性を証明することができるプローブである。
【００３４】
骨格筋におけるインスリン耐性は、２つのP20ホスホイソ型S2及びS3の出現、そしてこれら２つのイソ型のアミリン媒介型のリン酸化を抑制することができないインスリンの能力と関連している。本発明の１つの観点において、試験物質は、S2及びS3のリン酸化を抑制するインスリンの能力を回復する能力についてアッセイされる。
【００３５】
当然のことながら、本発明のスクリーニングアッセイは、インスリン（又はインスリン代替物、例えばインスリン受容体アゴニスト）の存在下で実施されうる。このように、１つの態様において、スクリーニングアッセイはインスリンの存在下で実施され、そして／あるいは、細胞は試験化合物との接触時、その前、又はその後、インスリン又はインスリン類似体に曝露される。インスリンは、天然、合成、組換え、霊長類（例えば、ヒト）、又はげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）のものであってもよい。インスリンアゴニストの例には、限定しないが、１又は複数のアミノ酸残基が、インスリン様活性（例えば、in  vivo又はin vitroでのインスリン様の用量反応関係）を有する変換された分子を生成するために置換されている任意な構造のインスリンが含まれる。上記圧制において利用されうるインスリンアゴニストの例には、ヒトインスリン、[LysPro]ヒトインスリン（ヒトインスリンの合成類似対）、及びラットインスリンI又はラットインスリンIIが含まれ、これらはヒトインスリンの天然の相同体である。使用するインスリンの量は、通常、1pM〜1μM、しばしば30nM〜100nM（例えば50nM）の範囲、すなわち、組織の相対的なインスリン感受性に関して情報価値のある組織の過程又は経路の濃度反応に及ぶ範囲内である。そのような過程の例には、骨格筋で情報価値のあるグルコース輸送又はグリコーゲン内へのグルコースの組込み；又は、肝臓上の情報を提供する、肝細胞又は単離されて灌流された肝臓からの基底の又はグルカゴン刺激型のグルコース産出の抑制、が含まれる。インスリン耐性又は糖尿病の動物又は組織において、アミリン誘起型のS2及びS3のリン酸化は、インスリンの投与によって大きく減少しないが、正常な動物又は組織においては、インスリンは、S2及びS3のリン酸化を有意に減少させる（例えば、典型的には少なくとも約３０％、更に頻繁には少なくとも約５０％）。細胞とインスリンの接触は、in vivo又はin vitroで行われうる。
【００３６】
別の態様において、試験化合物との接触時、その前、又はその後、スクリーニングアッセイにおいて使用した細胞（例えば、組織）は、S2及び／又はS3のリン酸化を誘導する物質に曝露される。例示的な物質は、ホルモン、例えばアミリン、CGRP1、CGRP2、エピネフリン又はノルエピネフリン（それぞれの類似体を含む）である。上記ホルモン、例えばアミリンは、天然、合成、組換え、霊長類（例えば、ヒト）、又はげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）のものであってもよい。投与されるホルモンの量は、情報価値のある経路又は過程、例えば骨格筋で情報価値のあるグルコース輸送又はグリコーゲン内へのグルコースの組込みにおいてインスリン耐性を誘導するのに十分な量であり、例えば（アミリンの場合）、約10nM〜100nM（例えば、50nM）である。細胞とホルモンの接触は、in vivo又はin vitroで行われうる。
【００３７】
潜在的な薬物として考えられる化合物又は物質には、限定しないが、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ等）、合成分子、小分子（例えば、小有機分子）、ペプチド、核酸を含んで成る化合物、及びタンパク質が含まれる。潜在的な薬物の１つの供給源は、天然又は合成化合物のライブラリーである。合成分子の巨大なライブラリーの作成及び同時スクリーニングは、コンビナトリアルケミストリーにおいて周知の技術を用いて実施することができ、例えば、van Breemen (1997) Anal Chem 69: 2159-64; Lam (1997) Anticancer Drug Des 12: 145167 (1997); Gold (1995) J. Biol. Chem. 270: 13581- 13584を参照のこと。尚、多数の潜在的に有用な活性を修飾する化合物が、供給材料として、天然産物由来の抽出物中でスクリーニングされうる。そのような抽出物の供給源は、多数の種の真菌、放線菌、藻類、昆虫、原生動物、植物、及び細菌に由来することがある。活性を示すそれらの抽出物は、続いて、活性分子を単離するために解析されうる。例えば、Turner (1996) J. Ethnopharmacol 51 (13) : 3943; Suh (1995) Anticancer Res. 15: 233239を参照のこと。自動にアッセイする複数の方法が近年開発されており、その結果短期間に何万もの化合物をスクリーニングをすることができる。例えば、Fodor et al., 1991, Science 251: 767-73、及び多数の化合物による結合親和性を試験するための手段を記載している化学的多様性ライブラリーの他の記載を参照のこと。
【００３８】
IV.診断方法
本発明は、個体の細胞中のP20のイソ型S2及びS3のうちの少なくとも１つの発現レベルを決定し、そして当該レベルを、(i)インスリン耐性又は糖尿病に苦しんでいないか、あるいは(ii)インスリン耐性又は糖尿病と診断された、個体又は個体群の同一の型の細胞に特徴的な参照レベルと比較することによって、個体のインスリン耐性を診断する方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「個体」は、哺乳類、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、商業的に価値のある動物、ペット、及び実験動物（例えば、マウス及びラットを含むげっ歯類）を含む。簡便的には、当該方法は、少なくとも１つ、そして好ましくは多数のP20発現細胞を含む個体から生物学的試料を得ることによって実施されうる。そのような細胞の例は、筋細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋、ヒラメ筋、長指伸筋、心筋、又は平滑筋）、血液細胞、及び脂肪細胞を含む。生物学的試料は、組織（生検によって得られた組織を含む)又は組織培養物又はそれらに由来する細胞、及びそれらの子孫、血液由来の細胞、細胞全体、細胞の画分、細胞抽出物、及び培養細胞又は細胞系）、体液（例えば、尿、痰、羊水、滑液）等の形態であってもよい。生物学的試料はまた、個体からの除去後に、例えばインスリン、アミリン、CGRP又はエピネフリンに対する曝露、あるいは特定の細胞型（例えば、筋細胞又は脂肪細胞）の増大、によって操作された細胞を含む。
【００３９】
１つの態様において、参照レベルは、インスリン耐性又は糖尿病に苦しんでいない個体又は個体群における同一の型の細胞に特徴的な発現レベルである。別の態様において、参照レベルは、インスリン耐性又は糖尿病と診断された個体又は個体群における同一の型の細胞に特徴的な発現レベルである。１つの態様において、S2及びS3のいずれかのレベルが決定される。１つの態様において、S2及びS3両方のレベルが決定される。１つの態様において、インスリン耐性の診断は、S2及び／又はS3のレベルが、インスリン耐性又は糖尿病に苦しんでいない個体に特徴的なレベルより高く（例えば、統計的に有意により高い）、そして／あるいはインスリン耐性又は糖尿病と診断された個体に特徴的なレベルよりも低い（例えば、統計的に有意により低い）場合になされる。
【００４０】
いくつかの場合において、S2及び／又はS3レベルについての正常な又は基準の値（又は範囲）を確立することが望ましいであろう。正常な（例えば、低い）レベルは、任意な特定の集団、亜集団、又は当業者に周知の標準的方法に従う生物の群について決定されうる。一般的に、健康な個体についてのS2及び／又はS3の基準（正常）レベルは、インスリン耐性又は糖尿病に苦しんでいない正常（健康）な対象者から得られた生物学的試料中のレベルを定量することによって決定される。ある試料及び目的のために、試料中のP20タンパク質の全量に関して、そして／あるいは細胞当たりで、S2及び／又はS3の量を定量することが望ましいこともある。試料の細胞性を決定するために、構成的に発現した遺伝子産物又は試料が採取された型の細胞において既知のレベルで発現した他の遺伝子産物のレベルが測定されることもある。正常（基準）値が、異なる細胞型間で、又は患者の年齢、性別、若しくは体調（インスリン耐性の存在以外）に従い、やや異なることがある。このように、例えば、アッセイが、インスリン耐性と関連するS2及び／又はS3レベルの変化を決定するために使用される場合、発現の正常範囲を決定するために使用される細胞は、調査の性質に依存して、同一の又は異なる年齢の人々に由来する細胞であってもよい。標準的な統計法の適用は、発現の基準レベルの決定を可能にし、同様にそのような基準レベルからの有意な偏差の同定を可能にする。当該アッセイ方法が、所望でない限り、S2及び／又はS3の絶対値の測定を必ずしも必要としないのは、本発明の方法の多数の利用にとって、相対的な値で十分であるためである。
【００４１】
異なる態様において、本発明は、インスリン耐性の処置の効果を評価する方法を提供する。本発明のアッセイはまた、動物の研究、臨床試験、又は個々の患者の処置のモニタリングにおいて、特定の治療的処置方法の効果を評価するためにも使用されうる。これらの場合において、治療を開始する前に患者についての基準線を確立し、且つ処置の過程を通じて１又は複数回当該アッセイを繰り返し、通常定期的に、S2及び／又はS3のレベルが処置の結果として所望の終点（例えば、S2及び／又はS3の発現の低下）に向かっているか否かを評価することが望ましいことがある。
【００４２】
V.処置方法
任意な特定の機構に拘束されることを意図せずに、下記の実施例で述べる通り、インスリン耐性に特徴的なS2及びS3のリン酸化の増大は、P20の発現の増大よるものではないが、恐らくは、リン酸化したそのイソ型の発生に至る細胞内シグナル伝達経路中の欠損に起因している。これらの結果は、P20のリン酸化の変化が、インスリン耐性の発症に寄与することを示唆している。個体のP20のイソ型S2及び／又はS2のレベルを低下させる組成物及び治療は、その結果、インスリン耐性及び関連の症状の処置に有用である。このことにより、本発明は、個体の少なくとも１つの細胞中のP20のイソ型S2及び／又はS3のレベルを低下させる処置（例えば、化合物）を投与することによって個体のインスリン耐性を処置する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「処置」は、有益な又は所望の結果、例えば、そして好ましくは臨床的結果を得るためのアプローチである。有益な又は臨床的な結果は、限定しないが、インスリンに感作を受ける個体の能力の向上及び個体のインスリン耐性の低下を含む。処置計画はある期間にわたって実施されることがあり、そして多数の製剤、多数の投与、及び／又は治療剤の異なる投与経路を包含することがある。
【００４３】
１つの態様において、前記物質は本明細書に開示したスクリーニング方法によって同定される。処置又は物質は、医薬組成物として投与されうる。医薬組成物は、上述の方法によって同定される薬物及び医薬として許容される担体を含むことがある。いくつかの態様において、本発明の医薬組成物は、注射による投与（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等）のための調製される。本明細書で使用する場合、用語「医薬として許容される担体」は、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水、水、及び乳濁液、例えば、油／水又は水／油の乳濁液、及び種々の型の湿潤剤を包含する。非経口及び経口の薬物送達のための賦形剤及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences 19th Ed. Mack Publishing (1995)に記載されている。一旦候補薬が、特定の投与経路に従い、例えば経口的に又は注射によって適切に生物学的利用能があることが証明され、そして適当な疾患のモデルにおいて毒性がなく、且つ治療的に有効であると証明されると、当該薬は、所望の治療的利益を得るために、適当な固体又は溶液の製剤中で、当該薬を生物学的に利用可能にすることが決定されたその投与経路によって患者に投与されうる。
【００４４】
実施例
実施例１
材料と方法
雄性のウィスターラットは、標準的なラットの餌(NMR Diet 88, Auckland, New Zealand)を水と一緒に自由に与えられた。[32P]-オルトリン酸塩及び[14C (U)]-D-グルコースをICNから購入した。2-デオキシ-D-[3H] グルコース (1 mCi/ml)はNEMから購入し、そしてヨウ素−１２５はAmersham Pharmaciaから購入した。ヒトインスリンは、Novo NordiskのActrapidを利用した。ラットアミリン及びCGRPはBachem (Torrance, CA)から購入し；エピネフリンはDavid Bull Laboratoriesから購入し；そしてデキサメタゾンはSigmaから購入した。２次元ゲル電気泳動(2-DE)システム及び試薬はPharmaciaから購入した。抗P20ポリクローナル抗体は、Kanefusa Kato博士からの親切な贈り物である(25)。抗GLUT4(H-61)はSanta Cruzから購入した。高感度ケミルミネッセンス(ECL)検出システムはBoehringerから購入した。全細胞のRNA抽出試薬(TRIZOL(商標)), G418, Lipofectamine Plus試薬及びランダムプライミング標識キットはLife Technologyから購入した。哺乳類細胞中でmycタグ付きGLUT4を発現するpCXN2-GLUT4mycは、親切にもDavid James博士(The University of Queensland, Australia)から提供された。
【００４５】
インスリン耐性を有するデキサメタゾン又は高脂肪誘導型ラットの確立
全ての実験プロトコールがInstitutional Animal Ethics Committeeによって承認された。雄性のウィスターラットがデキサメタゾン(3.1 mg/kg/日、腹腔内)を７日間注射された。コントロールとデキサメタゾンで処理した群両方のラットの日々の体重をモニタリングした。処理期間の終わりまでに、コントロール群の平均体重は12±1%増大し、一方、糖質コルチコイドで処理した群のものは16±2%（n=3回の実験で、それぞれ１群当たり３匹のラット）鋭く低下した。ラットは、各実験の前に１８時間絶食され、そして頚椎脱臼によって殺された。血液は、麻酔した動物から心臓の穿刺によって入手した。平均血糖値は、YSI 2300STAT グルコース／乳酸塩解析機(Yellow Springs Instruments)で解析した場合、コントロールとデキサメタゾンで処理したラットそれぞれにおいて、5.4±0.2mMと10.8±0.6mMであった。骨格筋のインスリン耐性状態は、in vitroでの[14C (U)]-D-グルコース組込みアッセイを用いて更に確認され、これはデキサメタゾンで処理したラットにおけるインスリン刺激型のグリコーゲン合成の速度の９５％超の低下を示した（結果は示さない）正常なラット及びインスリン耐性ラットの血液中のインスリン及びアミリン濃度は、既述のように決定された（１７）。慢性の高脂肪の給餌によって誘導されたインスリン耐性を有するラットは、既述のように産生された（２６）。
【００４６】
ラット骨格筋の横紋の解剖及び代謝性の放射性標識
ラットの長指伸(EDL)筋の横紋が１８時間絶食したラットから調製された。筋肉の解剖及び単離は、既述のように（２３）、ペントバルビタール(5-7mg/100gの体重、腹腔内）による麻酔のもとで実施された。各筋肉は３つの1mm未満の幅の横紋に分けられた。筋肉の横紋は、振とうインキュベーターにおいて、リン酸ナトリウムを含まない5mlのダルベッコ改変イーグル培地中、３０℃で１時間プレインキュベートされた。全てのインキュベーション培地は、95% O2と5% CO2を混合したガスを充填された。筋肉の横紋は、その後、同一の培地及び.25 mCi/ml [32P]-オルトリン酸塩を含む類似のフラスコに移され、そして内部ATPプールを平衡化するために更に４時間インキュベートされた（２３，２４）。ヒトインスリン、ラットアミリン、エピネフリン又はCGRPは、続いて、既定の終濃度で３０分間インキュベーション培地に添加された。反応は、インキュベーション直後に液体窒素中で筋肉の横紋を凍結することによって終了させた。筋肉の横紋を続いて計量し、そして次の解析まで−８０℃で保存した。
【００４７】
筋肉の抽出及び二次元ゲル電気泳動
筋肉の横紋を、2-DE溶解緩衝液(9M 尿素, 2% v/v triton X-100,2% v/v pharmalyte pH 3-10,200 mM DTT, 8 mM PMSF)中、氷上で５分間ホモジェナイズした。溶解液を簡単に超音波処理し、そして細片を除去するために12,000rpmで５分間微量遠心機にかけた。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法によって決定し、そして放射能は液体シンチレーションカウンターによって測定した。同程度の放射能を有する、32Pで標識した溶解液が、IPG Drystrip pH 4〜7及びpH 3〜10のリニアゲル上で、multiphor RII電気泳動システムを取扱説明書に従い用いることによって、等電点電気泳動にかけられた。二次元SDS-PAGEが、ExcelGel(商標)プレキャスト12〜14%アクリルアミドグラジエントゲルを用いて実施された。電気泳動後、ゲルを10%氷酢酸、40%エタノール中で固定し、そしてタンパク質をホスホイメージング又はオートラジオグラフィーによって可視化した。全ての図において、ゲルは、等電点電気泳動の次元の酸性側の末端を右に示し、そしてSDS-PAGEの方向を上から下に示した。
【００４８】
cDNAクローニング、発現ベクターの構築及びトランスフェクション
野生型のラットP20をコードする完全長のcDNAが、フォワードプライマー5'GCCCGCGGATCCATGGAGATCCGGGTGCCTGTG3' （配列番号１）及びリバースプライマー5'GCCCGGGATCCCTACTTGGCAGCAGGTGGTGAC3' （配列番号２）をそれぞれ用いる、RT-PCRによってクローニングされた。生じたクローンは、DNA配列決定によって確認され、そしてサイトメガロウイルスプロモーターによって駆動される真核生物の発現ベクターpcDNA3.1（pcDNA.P20と称する）のマルチクローニング部位内に挿入された。
【００４９】
L6筋芽細胞を、リポフェクタミンプラス試薬を取り扱い説明書に従って用いて、pCXN2-GLUT4myc (27)でトランスフェクションし、又はpCXN2-GLUT4myc及びpcDNA. P20で同時にトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントを、ネオマイシンアナログG418を400 μg/mlで含む培地中で選択した。トランスフェクションから１０日目に、クローンが、滅菌したスチールの環を用いて選択され、そしてG418の存在下で別々に広げられた。P20及びmycタグ付きGLUT4を発現するクローンが、ウェスタンブロットによって選択され、そして更なる実験に使用された。
【００５０】
ウェスタンブロット
１８時間絶食した雄性のウィスターラットから得られた肝臓、心臓、精巣上の脂肪塊、大動脈の平滑筋、EDL筋、ヒラメ筋の組織及び全血に由来する約50μgのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、そして次にニトロセルロース膜に移した。当該膜を４℃で一晩ブロッキングし、そしてウサギ抗P20ポリクローナル抗体（１：１０００）と一緒に、室温で２時間インキュベートした。更に１時間室温でストレプトアビジンビオチン化セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合二次抗体と一緒にインキュベーションした後、１次抗体に免疫反応性のあるタンパク質が、高感度ケミルミネッセンス(ECL)検出により、取扱説明書に従い可視化された。
【００５１】
ノーザンブロット解析
全細胞のRNAを、トリゾール試薬を用いて、１８時間絶食したコントロール及びデキサメタゾンで処理したラットのEDL筋から単離した。各試料由来の15μgのRNAを1.5%アガロース−ホルムアミドゲル電気泳動によって分離し、そして次に20xSSC中でのキャピラリーブロッティングによってHybond N+-ナイロン膜に移した。P20のcDNAプローブを、ランダムプライマー標識システムを用いて32P-dCTPで標識した。膜をハイブリダイゼーション緩衝液(0.5 M Na2HPO4, pH 7.2,10 mM EDTA, 7% SDS)で３時間６５℃でプレインキュベートした。続いて膜を洗浄し、ホスホイメージャーで解析し、そしてMacBAS v2.5ソフトウェアによって定量した。比較のために、50nMのアミリンで処理した、又は未処理のEDL筋の横紋由来のRNA試料も同時に解析した。
【００５２】
グルコースの取り込みアッセイ
mycタグ付きGLUT4、又はmycタグ付きGLUT4+P20を安定に過剰発現するL6細胞を６穴プレート中で増殖し、そして2%ウシ胎児血清を含むDMEM中で筋芽細胞へと７日間で分化させた。細胞は、実験の１６時間前に血清を除去された。グルコースの取り込みアッセイのために、L6筋管をKrebs-Henseleit緩衝液(KHB)で３回すすぎ、そして指定濃度のホルモン（インスリン又はインスリン+アミリン）を含むか、又は含まないKHB中で１５分間３７℃でインキュベートした。上記溶液中での10μMの2-デオキシ-D-[3H]グルコースの担体媒介型のグルコースの取り込みは３７℃で１５分間測定された。これは、細胞を氷冷したPBSで３回すすぎ、そして0.1M NaOHで破壊した後に行った。関連する放射能は、液体シンチレーションカウンターによって決定した。タンパク質濃度をBCAタンパク質定量キット(PIERCE)で測定した。非特異的な取り込みは、10μMのサイトカラシンBの存在下で決定し、そして各値から差し引いた。
【００５３】
データ解析
オートラジオグラフィーフィルムをスキャンし、そしてSharp JX-325スキャナーを用いてスキャンし、そしてデジタル化し、そしてタンパク質のスポットを検出し、そしてMelanie IIソフトウェアパッケージのver.2.2(Biorad)を用いて解析した。検出パラメーターは；smooth 2, Laplacian threshold 3, partials threshold 1, saturation 90, peakedness increase 100 及び minimum perimeter 10、であった。１つの特徴に対する多数の特徴の適合は許容されなかった。ピクセル値は光学密度(OD)である。特徴はゲル上の全ての特徴についてVOL（特徴のボリューム、すなわち、特徴領域上のODの積分）の合計のパーセンテージとして計算した。タンパク質スポットの放射能はまた、ホスホイメージャーによって検出し、そして光輝尽性発光(PSL)の単位の観点で示した。提示した結果は全て、少なくとも３つの独立した実験に基づいている。統計解析は、t-検定（対応のある２つの試料）を用いて実施した。
【００５４】
実施例２
P20は、2-DEによって検出されたラットEDL筋内の主要なインスリン反応性のリンタンパク質である。
P20は、低分子量熱ショックタンパク質HSP27/28及びαB-クリスタリンの生成の間の副産物としてラットの骨格筋から最初に単離された（２５）。正常な生理学的条件のもと、それは巨大な凝集物として存在する。P20が熱ショックタンパク質であると考えられているのは、それが、αB-クリスタリン(47%)及びHSP27/28(35%)と有意なアミノ酸配列の類似性を有するためである（２５，２８）。しかしながら、他の低分子量熱ショックタンパク質とは異なり、熱処理又は化学的ストレスはP20の発現を誘導しない。複数の最近の研究は、P20が、ラット平滑筋の環状ヌクレオチド媒介型の血管拡張及び弛緩、又はウシ頚動脈平滑筋のヒスタミン−及びホルボールエステル−誘導型の収縮に関与するアクチン結合タンパク質でありうることを示唆している（２９−３１）。興味深いことに、このタンパク質はまた、血管の疾患を有する患者内で循環している全血中に高濃度で存在する。それは、恐らくは血小板中の受容体媒介型のカルシウム流入によって、in vitro及びex vivoでの血小板の凝集を強力に抑制しうる（３２）。しかしながら、P20の正確な生理学的機能は未だに不確定である。
【００５５】
ウェスタンブロットによるP20のタンパク質含量の解析は、このタンパク質がラットのヒラメ筋、EDL筋及び心筋組織において主に発現し、これらは、試験した全ての組織中でそれぞれ35.1%±3.2 %, 29.6±2.7% 及び23.3±2.5 %の全P20であることを説明している(n=3, 平均±S. D.として表した)（図１）。少量のこのタンパク質はまた、平滑筋(4.9±0.6%)、脂肪組織(1.9±0.3%)及び血液(5.2±0.6%)中で検出された。32Pで放射性標識されたラットEDL筋の2-DE解析は、インスリン刺激後に標識されたリンタンパク質が約１５０個であることを明らかにした（図２）。Melanine IIソフトウェアによる定量解析は、P20が、検出した全特徴に関して2%超の全VOLを表して、インスリン刺激したラットEDL筋中で二番目に最も豊富なリンタンパク質であることを明らかにした。更に、P20は、プロテオームアプローチによって解析した場合に、インスリン及びそのアンタゴニストの両方に対して反応性のあるとして検出された唯一のリンタンパク質である。
【００５６】
実施例３
P20のリン酸化に対するインスリンとアミリンとの間の相互作用
我々の以前の研究は、インスリン及びそのアンタゴニスト、エピネフリン、アミリン及びCGRPがP20の異なる部位上で異なるリン酸化を誘発し、その結果P20の３つのリン酸化された等電点の変異体（6.0のpI値を有するS1; 5.9のpI値を有するS2; 及び5.6のpI値を有するS3と称される）を産生することを証明した（２３，２４）。S1のリン酸化は、P20のセリン１５７で生じ、そしてインスリンは、PI-3キナーゼ媒介型の経路を介して、そのリン酸化を増大することができる。アミリン、CGRP及びエピネフリンは、cAMP媒介型の経路を介して、P20のSer16のリン酸化を誘起し、ホスホイソ型S3へと導く。尚、これらの異化ホルモンはまた、別の２つの未同定の部位におけるP20のリン酸化を誘導してホスホイソ型S3を産生する。
【００５７】
ここで、我々は更に、P20のリン酸化に対するインスリンとその複数のアンタゴニストとの間の相互作用を研究した。興味深いことに、我々は、インスリン及びアミリンが、このタンパク質のリン酸化上でのそれぞれの他の作用を拮抗しうることを発見した（図３）。一方、S1のインスリン誘導型のリン酸化は、アミリンの存在下で有意に減少した。50nMインスリン＋50nMアミリンで処理した試料中のS1のリン酸化は、50nMインスリン単独で刺激した資料中のものより４９％低かった。他方では、インスリンは、S2及びS3のアミリン誘起型リン酸化を阻止した。インスリンの存在下でのS2及びS3のリン酸化は、アミリン単独で処理した筋肉中のものと比較して、それぞれ約７２％及び７４％低下した。しかしながら、インスリンは、他の２つの異化ホルモンであるエピネフリン及びCGRPによって誘導されたS2及びS3のリン酸化に対して全く効果を有さず、そしてこれは逆もまた同様である。この結果は、「架橋」がインスリン−とアミリン−誘起型のシグナル伝達経路の間でのみ生じていることを示唆しているが、これら全ての異化ホルモンは、Gタンパク質共役受容体を介して作用し、そして類似の異化効果を有すると考えられる。アミリンは、S1のインスリン誘起型PI-3キナーゼカスケード媒介型のリン酸化を阻害する。反対に、インスリンは、S2及びS3のアミリン誘起型cAMP経路媒介型のリン酸化を抑制する。アミリンの生理作用に対するそのようなインスリンの阻害効果は、生理学的な量の外因性のアミリンの投与が、幾つかの実験系において高血糖及びインスリン耐性をなぜ誘導しないかについての理にかなった説明を提供することができる。
【００５８】
インスリンがアミリン及びCGRPの生理学的作用の阻害に対して別個の効果を有するという事実は、これら２つのペプチドホルモンは、カルシトニン関連ポリペプチドファミリーであるが、アミリンがCGRP受容体を介して単独で作用する可能性を更に排除する（３３）。アミリン特異的受容体は、まだ同定されていない。しかしながら、複数の最近の研究は、アミリン選択的受容体の同定が、受容体活性修飾タンパク質(RAMP)によって部分的に決定されうることを示唆している（３４）。
【００５９】
実施例４
P20の発現ではなく、P20のリン酸化の変化がインスリン耐性と関連している。
我々は次に、インスリン耐性を有するデキサメタゾン誘導型の糖尿病ラットにおけるP20のリン酸化パターン並びにこのタンパク質に対するインスリン及びアミリンの効果を研究した。これらのラットの糖尿病の状態は、体重の減少、高血糖及びグリコーゲン内へのグルコースのインスリン刺激型の組込みの証明によって確認した（結果は示さない）。デキサメタゾンで処理したラットにおいて、インスリンの絶食中の基底の血漿濃度(789±94 pmol/L対203±28 pmol/L（コントロールラット）) 及びアミリンの絶食中の基底の血漿濃度(144±17 pmol/L対22.7±5.9 pmol/L（コントロールラット）)の両方が有意に上昇した（それぞれの場合においてp＜0.01）。
【００６０】
これらのラットに由来するEDL筋の横紋は、インスリン及びアミリンを用いて、又は用いずに32Pで処理され、続いてP20のリン酸化は2-DE及びホスホイメージングによって解析された（図４）。ホルモン刺激をしないインキュベーション条件下で、S2及びS3のリン酸化は、非糖尿病のコントロールラットにおいてはほとんど検出されなかった（図４Ａ）。対照的に、これら２つのホスホイソ型は、インスリン耐性ラット由来に筋肉中ではっきりと可視化された（図４Ｂ）。ホスホイメージャー及びMacBASソフトウェアによる定量的解析は、デキサメタゾンで処理したラットにおけるS2 及びS3の両方に関連するシグナルが約５倍より高かったことを示した（表１）。この現象は、高脂肪誘導型インスリン耐性ラットモデルにおいても観察され（図５）、P20のイソ型S2及びS3のリン酸化の増大が、一般的にインスリン耐性状態と関連しうることを示唆している。P20の発現解析は、P20のmRNAレベル及びタンパク質の存在量が、糖尿病ラット又はアミリン処理した筋肉の横紋のいずれにおいても変化しなかったことを明らかにした（図６）。
【００６１】
【表１】
2004533225.tif 000002
【００６２】
コントロール及びデキサメタゾンで処理したラット由来の放射性標識したEDL筋の横紋は、ホルモンの不在下（基底状態）、インスリン(50nM)、アミリン(50nM)又は両ホルモンの存在下でインキュベートされた。P20の32P標識したイソ型(S1, S2及びS3)は、図４の通り分離され、ホスホイメージャーを用いて検出され、そしてMacBASソフトウェアによって解析された。異なる処理のもとでの各イソ型の放射能は、平均PSL値±標準偏差として表す。*は、コントロールラット(n=4)における相当する値から有意に異なる(P＜0.01)値を示す。
【００６３】
これらの結果は、S2及びS3のリン酸化の増大が、P20の発現の増大に起因するものではなく、むしろそのリン酸化したイソ型の産生をもたらす細胞内シグナル伝達経路における欠損の可能性に起因していることを示唆している。
【００６４】
インスリン耐性ラットにおける別の主要な変化は、S2及びS3のアミリン誘起型のリン酸化を阻害するインスリンの能力の有意な変化である。正常なラットにおいて、50nMインスリンは、S2及びS3のリン酸化を、50nMアミリン単独で処理された試料中のものと比較して、７１．６％及び７３％にそれぞれ低下させた（図４Ｅ及びＧ）。他方で、糖尿病のラットにおいては、S2及びS3のアミリン誘起型のリン酸化は、インスリンによって多少影響された（図４Ｆ及びＨ）。この条件下で、S2及びS3の放射能は、非糖尿病のコントロールラットのものよりも約３．３倍高かった（表１）。
【００６５】
インスリン耐性は、糖質コルチコイドの周知の効果であるが、その機構は未だ不確定である（３５）。筋肉は、インスリンに応じてのグルコース処理(disposal)にとって定量的に最も重要な組織であるが、この組織における糖質コルチコイドの効果に対するいくつかの研究が存在している。デキサメタゾンの投与は、骨格筋内のインスリン受容体の数又は親和性に影響を及ぼさなかったが、インスリン受容体のチロシンの自己リン酸化を減少させ、そして更にPI-3キナーゼのIRS-1活性化を低下させ、受容体後欠損の存在を示唆した（３６）。近年、デキサメタゾン処理が、細胞内プールから原形質膜へのGLUT4のインスリン刺激型の転移を有意に阻害したが、この輸送体の発現は逆説的に若干増大した（３７）。
【００６６】
Pieberとその共同研究者は、糖尿病がデキサメタゾンで処理したラットにおい発症した場合はいつでも、アミリンのレベル及びアミリン／インスリン比(A/I)が有意に増大したことを観察した（３８）。A/Iの増大は、プロインスリンmRNAと比較したプロアミリンmRNAの含量の上昇と関連していた。この研究は、アミリンが更に、デキサメタゾン誘導型のインスリン耐性の発症に寄与する重要な物質でありうることを暗示している。我々の本発明の研究結果は、アミリンのそのような役割を支持している。健康なラットにおいてほとんど検出されないが、アミリンによって誘導されうるホスホイソ型S2及びS3は、糖尿病のラットにおいてはっきりと存在している（図４Ｂ）。このことは、アミリンレベル又はA/I比の増大に起因していると思われる。興味深いことには、正常なラットにおいて、インスリンはP20のリン酸化及びcAMPレベルの上昇に対するアミリンの作用を特異的に抑制するが、２つのほかの異化ホルモンであるエピネフリン及びCGRPの作用に対して検出可能な効果を有さない（図３）。インスリンのそのような作用は、デキサメタゾン誘導型の糖尿病ラットにおいて有意に弱められた（図４Ｆ及びＨ）。これらの結果に基くと、生理学的な条件下では、インスリン刺激型のグルコース処理のアミリンの拮抗がインスリン自身によって阻害されると推測したくなる。インスリンのこの作用の欠陥は、アミリンの異化作用の増強を招き、そしてその結果デキサメタゾン誘導型の糖尿病ラットにおけるインスリン耐性の原因に部分的に寄与することがある。
【００６７】
実施例５
P20は、L6筋芽細胞におけるグルコース取り込み過程の制御に関与する。
P20の生理学的役割は不明であるが、このタンパク質が非常に豊富であること、並びにインスリン及びそのアンタゴニストに対するその多様な反応性は、それがこれらの代謝性のホルモンの生理学的作用に関連するメディエーターでありうることを示唆している。特に、P20は、アクチン結合タンパク質であることが最近になって証明されている（３１）。骨格筋のアクチンフィラメント及びアクチン結合タンパク質は共に、細胞膜に対するグルコース輸送体の配向性の輸送における役割を果たすことが示唆されている（３９，４０）。興味深いことに、発現の増大がII型糖尿病におけるインスリン耐性に寄与しうる別の２つのタンパク質Pad及びPED/PEA-15も、グルコース輸送の制御に関与する細胞骨格関連タンパク質である（４１，４２）。従って、代謝性ホルモン、例えばインスリン及びアミリンが、P20のリン酸化状態を調節することによってグルコース輸送を制御しうると推定することに興味がそそられる。
【００６８】
この仮説を立証するために、我々は、P20を過剰発現するL6細胞の安定なトランスフェクタントを確立した（図７Ａ）。Mycタグ付きGLUT4(GLUT4myc)も、こインスリン感受性を増大させるために、これらのトランスフェクタントにおいて同時に発現させられた（２７）。GLUT4myc単独を過剰発現する筋管細胞において、50nMインスリンは２−デオキシグルコースの取り込みを基底レベルの２．９４±０．３１倍に増大させた（図７Ｂ）。このインスリン刺激型のグルコースの取り込みは有意に４１±３％低下し(n=4, p＜0.05)、一方、アミリンの阻害効果は有意に２４±２％増大した(n=4, p＜0.05)。この結果は、P20の過剰発現がインスリン刺激型のグルコースの取り込みを抑制し、そしてL6筋芽細胞内のインスリンの作用を阻害するアミリンの能力を増大させることを証明し、グルコース代謝の制御におけるこのタンパク質の直接的役割を示唆した。
【００６９】
実施例６
まとめ
要約すると、我々は、インスリン及び複数のそのアンタゴニスト、例えばアミリン、エピネフリン及びカルシトニン関連ペプチド(CGRP)の共通の細胞内標的として低分子のリンタンパク質P20を最近になって同定した。これらのホルモンは、異なる部位でのP20のリン酸化を誘起し、３つのリン酸化されたイソ型を産生する（6.0のpI値を有するS1; 5.9のpI値を有するS2; 及び5.6のpI値を有するS3）(FEBS Letters 457: 149-152 and 462: 25-30,1999)。ここで、我々は、P20がラットEDL筋において最も豊富なリンタンパク質の１つであることを証明した。膵島のβ細胞から共に分泌される２つのホルモン、インスリン及びアミリンは、ラットEDL筋におけるこのタンパク質のリン酸化に対する互いの作用を拮抗する。インスリンはS2及びS3のアミリン誘起型のリン酸化を阻害したが、アミリンはS1のインスリン誘導型のリン酸化を減少させた。デキサメタゾン処理によりインスリン耐性となったラットにおいて、ホルモン刺激無しで健康なラットにおいてかろうじて検出されたホスホイソ型S2及びS3は、有意に増大した。更に、これらの２つのイソ型のアミリン誘起型のリン酸化を阻害するインスリンの能力は、大きく減衰した。これらの結果は、P20のリン酸化の変化が、インスリン耐性の発症に寄与しうることを示唆する。
【表２】
2004533225.tif 000003
【表３】
2004533225.tif 000004
【表４】
2004533225.tif 000005
【表５】
2004533225.tif 000006
【００７０】
本出願を通じて、括弧内の部分的な引用により種々の刊行物が引用される。これらの刊行物についての完全な引用は、本明細書の最後で見つけることができる。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術水準を更に完全に説明するために、それらの全体が、引用によって本出願に組み入れられる。
【００７１】
本明細書に記載の実施例及び態様は単に例示目的であって、それらを考慮して種々の改良又は変更が問う業者に示唆され、そして本出願及び特許請求の範囲の精神及び範囲の中に含まれることが理解される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの刊行物。特許又は特許出願が引用によってそのように組み入れられることが具体的且つ個別に示されているように同程度まで、全ての目的のために、それらの全体が引用によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、複数の異なるラット組織中でのP20の発現のイムノブロッティング解析を示す。指定の各ラット組織に由来する50μgのタンパク質が、12.5%のSDS-PAGEによって分離され、そして実施例に記載のようにP20を検出するためにイムノブロットされた。結果は、３つの独立した観察の典型的な代表のものである。
【図２】図２は、インスリン刺激したラットの長指伸(「EDL」)筋の２次元電気泳動のリンタンパク質の地図を示す。EDL筋の横紋は、32Pで放射性標識され、50nMインスリンで３０分間処理され、続いて、各試料由来の100μgのタンパク質が２次元電気泳動によって分離され、そしてオートラジオグラフィーによって検出された。示したタンパク質は、アミノ酸配列決定又はウェスタンブロット解析のいずれかによって同定された。P20(S1)が6.0のpIを有するP20のイソ型を言及することに留意すること。当該実験は４回実施され、そして示した図は１つの代表的な実験に由来している。
【図３】図３は、P20のリン酸化に対するインスリンとそのアンタゴニストとの間の相互作用を示す。32Pで標識したEDL筋の横紋は、３０分間、以下の濃度の異なるホルモンを用いずに、又は用いて処理された：インスリン、50nM；アミリン、50nM；エピネフリン、50nM；及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド（「CGRP」）、50nM。P20のリン酸化は、２次元ゲル電気泳動（「2-DE」）によって解析し、そしてホスホイメージングソフトウェアを用いて定量した。下段の表は、P20の３つのホスホイソ型についての定量的なデータを示す。結果は、４つの独立した観察についての、平均の光輝尽性発光(「PSL」)として表す。†は、インスリンで処理した試料とインスリン＋アミリンで処理した試料との有意差(p＜0.05)を示す。‡は、アミリンで処理した試料とインスリン＋アミリンで処理した試料との有意差(p＜0.05)を示す。類似の結果が、これらのアゴニストを順次添加した場合に（すなわち、インスリンとの１５分間のプレインキュベーション、続く、アミリン、CGRP又はエピネフリンの更に１５分間の添加、あるいはその反対も同様）観察されたことに留意すること。
【図４】図４は、インスリン耐性を有するデキサメタゾン処理したラットにおけるP20のリン酸化並びにインスリン及びアミリンに対するその反応性の変化を示す。非糖尿病のコントロールラット（左側）又はインスリン耐性を有するラット（右側）に由来するEDL筋の横紋は、32Pで放射性標識され、緩衝液のみ（Ａ及びＢ）；50nMインスリン（Ｃ及びＤ）；50nMアミリン（Ｅ及びＦ）；又は50nMインスリン＋50nMアミリン（Ｇ及びＨ）で３０分間処理された。P20のリン酸化は、2-DE及びホスホイメージングによって解析した。結果は、４つの独立した観察の典型的な代表のものである。
【図５】図５は、S2及びS3のリン酸化の増大が、高脂肪の給餌によって誘導されたインスリン耐性ラットと関連していることを示す。健康なラット又は高脂肪が誘導された糖尿病のラットに由来する100μgのタンパク質が2-DEによって分離され、そしてP20の３つのホスホイソ型(S1, S2及びS3)が図１に記載のように抗P20抗体で探索することによって可視化された。下段の表は、非糖尿病のコントロールラット及び高脂肪が誘導された糖尿病ラットにおけるP20の各ホスホイソ型の存在量についての定量的な解析を示す。各イソ型の存在量は、平均PSL値±S.D.として表す。*は、コントロールラット(n=4)における相当する値に由来する有意差を示す。
【図６】図６は、P20のmRNAの存在量及びタンパク質濃度がデキサメタゾンで処理したラットにおいて変化しないことを示す。パネルI：ノーザンブロット解析。RNAは、生理食塩水を注射したラット（Ａ）又はデキサメタゾンを注射したラット（Ｂ）のEDL筋、及び未処理（Ｃ）又は50nMアミリン（Ｄ）で３０分間in vitroで処理したEDL筋の横紋から調製され、ブロッティングされ、そして標識されたP20のcDNAでプローブされた。各レーンに流した、臭化エチジウムで染色したRNAも示す。パネルII：P20のウェスタンブロット解析。パネルIのように処理したEDL筋由来の30μgの全タンパク質を12.5%SDS-PAGEで分離し、図１のように抗P20抗体でプローブした。パネルIIIの表は、生理的食塩水で処理したコントロールラットと比較した、各処理のもとでのP20のmRNA及びタンパク質レベルの増大／減少の倍数を表す。結果は、３つの個々の実験に由来する、平均±S.D.である。
【図７】図７は、L6筋管内のグルコースの取り込みに対するP20の過剰発現の効果を示す。Ａ：L6細胞をpCXN2-GLUT4myc、又はpCXN2-GLUT4myc及びpcDNA.P20でトランスフェクションした。400μg/mlのG418による選別の後、mycタグ付きGLUT4のみを発現しているクローン(GLUT4myc)及びmycタグ付きGLUT4及びP20の両方を発現しているクローン(GLUT4myc+P20)が広げられ、そして６穴プレート内で分化された。L6筋管由来の30μgの細胞溶解液を10%SDS-PAGEによって分離した。P20及びmycタグ付きGLUT4の発現レベルは、それぞれ特異的な抗P20抗体及び抗GLUT4抗体を用いるウェスタンブロットによって解析された。Ｂ：Ａで選択した細胞系が、６穴プレート内で分化され、そして方法の項目で記載したように、インスリン又はインスリン＋アミリンに応じての２−デオキシグルコースの取り込みについてアッセイされた(n=4, 平均±S.D.で表した)。当該図面が典型的な実験結果を示し、そしてmycタグ付きGLUT4、又はmycタグ付きGLUT4＋P20を発現する別の２つの独立したトランスフェクタントからも類似の結果が得られたことに留意すること。*は、GLUT4myc単独を過剰発現している細胞における相当する値からの有意差(P＜0.01)である値を示す。
【図１】
2004533225.tif 000007
【図２】
2004533225.tif 000008
【図３】
2004533225.tif 000009
【図４】
2004533225.tif 000010
【図５】
2004533225.tif 000011
【図６】
2004533225.tif 000012
【図７】
2004533225.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004533225.tif 000014
2004533225.tif 000015
2004533225.tif 000016
2004533225.tif 000017
2004533225.tif 000018
2004533225.tif 000019
2004533225.tif 000020
2004533225.tif 000021
2004533225.tif 000022
2004533225.tif 000023
2004533225.tif 000024
2004533225.tif 000025
2004533225.tif 000026
2004533225.tif 000027
2004533225.tif 000028
2004533225.tif 000029
2004533225.tif 000030
2004533225.tif 000031
2004533225.tif 000032
2004533225.tif 000033
2004533225.tif 000034
2004533225.tif 000035
2004533225.tif 000036
2004533225.tif 000037
2004533225.tif 000038
2004533225.tif 000039
2004533225.tif 000040
2004533225.tif 000041
2004533225.tif 000042
2004533225.tif 000043
2004533225.tif 000044
2004533225.tif 000045
2004533225.tif 000046
2004533225.tif 000047
2004533225.tif 000048
2004533225.tif 000049
2004533225.tif 000050
2004533225.tif 000051
2004533225.tif 000052
2004533225.tif 000053
2004533225.tif 000054
2004533225.tif 000055
2004533225.tif 000056
2004533225.tif 000057
2004533225.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533225.tif 000059
【国際調査報告】
2004533225.tif 000060
2004533225.tif 000061
2004533225.tif 000062
2004533225.tif 000063