(57)【要約】本発明は、問題の分子をｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１１ｂ発現細胞に対し特異的にターゲティングするためのベクター製造におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の新規使用に関する。本発明は同様に、免疫応答をプライミングする免疫原性組成物、薬学組成物及びＣＤ１１ｂ発現細胞に対する分子送達のための新しいベクターにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対し特異的に問題の分子をターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼの使用。
【請求項２】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対する問題の分子のターゲティングのための組成物の調製を目的とした、前記問題の分子の挿入により修飾されているＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの使用。
【請求項３】
前記Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼがＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の１フラグメントであり、前記フラグメントがＣＤ１１ｂレセプタに結合する能力をもつ、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ１１ｂレセプタに結合する能力をもつＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の前記フラグメントは、そのＮ末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＣＤ１１ｂレセプタに結合する能力をもつＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素は、残基１〜３７３の全て又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼ毒素である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記問題の分子のターゲティングがｉｎ ｖｉｖｏで有効である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
問題の分子が、ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾルの中で特異的にターゲティングされ転座させられている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が好中球である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
アデニルシクラーゼが遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種のアデニルシクラーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
アデニルシクラーゼが非毒性形態である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
アデニルシクラーゼがＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
問題の分子が抗原である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
問題の分子がエピトープを含んで成る、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
問題の分子が、そのＮ末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如した遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基１−３７３が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ アデニルシクラーゼのＮ末端に融合された異種ペプチドである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗原が細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択されている、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記抗原が、ポリオウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルスエピトープ、腫瘍抗原から成るグループの中から選択されている、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
問題の分子が、アデニルシクラーゼ毒素に化学的又は遺伝学的にカップリングされた薬物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬物が、前記アデニルシクラーゼの触媒ドメイン内にある遺伝学的に挿入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて化学的にカップリングされている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
薬物が抗炎症性薬物である請求項１９又は２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
触媒ドメイン内に挿入された抗原を含むＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼを含むことを特徴とする、動物又はヒトの宿主において投与するように処方された免疫原性組成物。
【請求項２３】
問題の分子がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼにカップリングされていることを特徴とする、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするように処方されたヒト又は動物における投与のための薬学組成物。
【請求項２４】
アデニルシクラーゼが、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである、請求項２２又は２３に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項２５】
遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼがＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を転座させることができる、請求項２４に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項２６】
前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、その触媒Ｎ末端ドメインの全て又は一部分の欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼである、請求項２５に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項２７】
前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、残基１〜３７３の欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼである、請求項２５に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項２８】
前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、許容部位において触媒ドメイン内に挿入された単数又は複数のシステイン残基を含んで成る、請求項２４又は２５のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項２９】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項３０】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が、好中球である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項３１】
問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項２２〜３０に記載の薬学又は免疫原性組成物。
【請求項３２】
問題の分子にカップリングされたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニル酸シクラーゼをコードする核酸構成を含んで成る、請求項２２〜２９に記載の薬学又は免疫原性組成物。
【請求項３３】
問題の分子が薬物である、請求項３１に記載の薬学又は免疫原性組成物。
【請求項３４】
薬物が抗炎症薬である、請求項３３に記載の薬学組成物。
【請求項３５】
問題の分子が抗原である、請求項２２〜３１に記載の薬学又は免疫原性組成物。
【請求項３６】
前記抗原が細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択されている、請求項３５に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項３７】
抗原が、ポリオウイルス抗原、ＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルス抗原、腫瘍抗原から成るグループの中から選択されている、請求項３６に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項３８】
前記抗原が、そのＮ末端触媒ドメインの欠如した遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼのＮ末端部分に融合されている、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項３９】
前記抗原が、残基１−３７３の欠如した遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ１ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼに融合されている、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項４０】
静脈内投与ために処方され、特にプライミングアジュバンドが欠けている、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物。
【請求項４１】
特異的に樹状細胞が関与する免疫応答を誘発又は刺激する能力をもつ、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
ワクチン又は免疫療法組成物の調製のための請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の免疫原性又は薬学組成物の使用。
【請求項４３】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターにおいて、前記問題の分子にカップリングされた組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼを含んで成ることを特徴とするタンパク様ベクター。
【請求項４４】
ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を送達することもできる、請求項４３に記載のタンパク様ベクター。
【請求項４５】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が樹状細胞、より好ましくは骨髄性樹状細胞である、請求項４３又は４４に記載のタンパク様ベクター。
【請求項４６】
前記ＣＤ１１ｂ発現細胞が好中球である、請求項４３又は４４に記載のタンパク様ベクター。
【請求項４７】
アデニルシクラーゼが遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【請求項４８】
前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼには未変性システイン残基が欠けているが、触媒ドメイン内の１又は複数の許容部位に遺伝学的を挿入された１又は複数のシステイン残基が含まれている、請求項４７に記載のタンパク様ベクター。
【請求項４９】
アデニルシクラーゼが非毒性アデニルシクラーゼである、請求項４７又は４８のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５０】
遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが、そのＮ末端触媒ドメインの全て又は一部分の欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５１】
アデニルシクラーゼがＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のものである、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５２】
前記組換え型アデニルシクラーゼが、残基１〜３７３の欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼである、請求項５１に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５３】
問題の分子が、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される、請求項４３〜５２に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５４】
前記問題の分子が、前記アデニルシクラーゼに化学的又は遺伝学的にカップリングされた薬物である、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５５】
問題の分子がエピトープである、請求項５４に記載のタンパク様ベクター。
【請求項５６】
前記問題の分子は、未変性システイン残基が欠けているもののその触媒ドメイン内で１又は複数の許容部位に遺伝学的に挿入された１又は複数のシステイン残基を含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに化学的にカップリングされたエピトープである、請求項５４又は５５のいずれか１項に記載のタンパク様ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対し特異的に問題の分子をｉｎ ｖｉｖｏでターゲティングするためのベクターの製造におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の新規使用に関する。本発明は同様に、免疫応答をプライミングする免疫原性組成物、ＣＤ１１ｂ発現細胞への分子送達のための薬学組成物及び新しいベクターに関する。
【０００２】
百日咳の原因物質であるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、周知のｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）及びアデニル酸シクラーゼ毒素（ＣｙａＡ）又同様にアデニルシクラーゼをも含めた複数の毒素を分泌する。ＣｙａＡは、肺のコロニー化の早期段階に必要とされるマウスの呼吸器モデルにおけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのきわめて重要な毒性因子である。実際、この毒素の遺伝学的欠失は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染の病理的効果を劇的に減少させ、肺から回収される細菌数を減少させ、感染後に見られる炎症性細胞動員及び肺病巣をほぼ一掃する［Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９８４；Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｇｕｅｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８］．その上、ＣｙａＡは、マウスの呼吸器モデルにおけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染に対し保護する抗原である［Ｇｕｉｓｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９；Ｇｕｉｓｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１］．
当初Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養上清中でＨｅｗｌｅｔｔ ｅｔ ａｌにより発見された［Ｈｅｗｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９７６］アデニルシクラーゼは、後に真核性カルモジュリンにより活性化されることが発見された［Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９８０］。この特筆すべき特長はまもなく、アデニルシクラーゼが真核細胞内に入りそこでカルモジュリンにより活性化された時に標的細胞内でｃＡＭＰの大幅な増加をひき起こすことができるということがＣｏｎｆｅｒ及びＥａｔｏｎによって示された時点で１つの理論的根拠を見い出した［Ｃｏｎｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２］。
【０００３】
アデニルシクラーゼは、ＣｙａＡ遺伝子によりコードされ、その発現は、Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのその他の毒性遺伝子の発現と同様、環境シグナルにより協調的に調節される。ＣｙａＡ 遺伝子は、同じくＣｙａＡの分泌に必要とされる遺伝子ｃｙａＢ、Ｄ及びＥをも含むオペロンの一部である［Ｌａｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。
【０００４】
ＣｙａＡ毒素は、４００個のアミノ酸のＮ末端触媒ドメイン及び、標的細胞に対する毒素の結合及びその後の細胞の細胞質ゾル内への触媒半分の送達を担当する１３０６個の残基のＣ末端部分から成る１７０６個の残基の２機能性タンパク質である［Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２］［Ｌａｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。この部分は同様に、生体膜内でカチオン選択的チャンネルを形成するその能力に起因して弱い溶血活性を示す［Ｂｅｎｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４］［Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８］。この領域は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉヘモリシン及び細菌毒素のＲＴＸ（Ｔｏｘｉｎ中の反復）のその他の成員と相同性をもつ。特に、それは、カルシウム結合に関与する一連のグリシン及びアスパラギン酸塩富有ノナペプチド反復を含有する［Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５］［Ｃｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２］。
【０００５】
ＣｙａＡポリペプチドは、２つの内部リシン（リシン８５６及び９６３）の翻訳後パルミトイル化により活性毒素に変換される不活性プロトキシンとして合成される。この修飾には、Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色体上のＣｙａＡの近くにあるアクセサリー遺伝子 ｃｙａＣの産物が必要である。
【０００６】
ＣｙａＡは、哺乳動物の赤血球のような膜輸送が欠如した細胞を含めたさまざまな細胞型に結合し、これに侵入することが示されてきた［Ｒｏｇｅｌ ｅｔｌ ａｌ．， １９９２］。このことは、ＣｙａＡの触媒ドメインが、標的細胞の原形質膜を横切って直接転座させられることを示唆していた。細胞の細胞質ゾル内への触媒ドメインの内在化は、カルシウム及び温度に依存し、原形質膜の電位によって左右される［Ｒｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２］［Ｋａｒｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９８］［Ｏｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５］。しかしながら、毒素が膜を横断してそのＮ末端触媒ドメインを輸送する分子メカニズムは、大部分が今日までなお未知のままである。その上、ＣｙａＡ結合については、いかなる特異的レセプタも報告されていない。
【０００７】
ＣｙａＡにより細胞中毒の生理学的帰結は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで食作用において特徴づけされた。Ｃｏｎｆｅｒ及びＥａｔｏｎは、Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから抽出されたＣｙａＡが好中球又はマクロファージ内の細胞内ｃＡＭＰレベルを増大させ、化学定性及びスーパーオキサイド生成及び食作用能力といったような殺菌機能の阻害を導くことを初めて示した［Ｃｏｎｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２］。これらの活性はその後、精製された毒素又はＣｙａＡを遺伝学的に欠失させた細菌突然変異体について確認された［Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７；Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７］［Ｎｊａｍｋｅｐｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００］。反対に、そのｃＡＭＰ含有量の有意な変化にも関わらず、非造血性由来の細胞系統の生存度は、ＣｙａＡ中毒による影響を受けないように思われた［Ｂａｓｓｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００］。その上、本発明人は、Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＣｙａＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．， １９９３；Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．， １９９５］及びｉｎ ｖｉｖｏ［Ｇｕｅｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８］でマクロファージアポプトーシスを引き起こし得るということを以前に実証した。これらのモデルでは、ＣｙａＡの遺伝学的欠失が、マクロファージアポプトーシスを一掃したものの好中球の死は一掃せず、このことは、ＣｙａＡがｉ）主としてマクロファージアポプトーシスの原因であり、ｉｉ）好中球のアポプトーシスの原因である可能性もあるものの、もう１つの因子も同様にその原因でありうるということを示唆している。
【０００８】
そのほかに、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ感染（そのＣｙａＡが密接に関係するＢ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの動物相同体）のマウスモデルで実施されたｉｎ ｖｉｖｏ研究は、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａＣｙａＡ毒性の主要な標的が早期感染段階を制御するＧＭ−ＣＳＦ依存性でかつシクロホスファミド感応性の個体群であることを実証した［Ｈａｒｖｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。これらの基準は、好中球そして場合によってはマクロファージ又は樹状細胞を含めたその他の細胞を同定したが、ＣＤ１１ｂレセプタがＣｙａＡによるターゲティングに関与しているというデータは全く開示又は示唆されていない。ＣｙａＡについての標的細胞のこれらの個体群は、早期感染段階を制限しかつ後期感染段階を制御する適応性免疫応答の発達に有利に作用するものと同じである［Ｈａｒｖｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。
【０００９】
その他の毒素とは異なり、ＣｙａＡは、長い間、いかなるレセプタ結合とも無関係であるとみなされてきた。これは、ｉ）ＣｙａＡが由来の異なる多様なモデル細胞系統を中毒させることができる［Ｌａｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９］；ｉｉ）ＣｙａＡは飽和不能な形でジャーカット細胞及びヒツジ赤血球に結合する［Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９］、という観察事実に基づいている。しかしながら、ＣｙａＡによる感染を受けた細胞に関し、幾分かの特異性がみられた。実際、ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種でのマウス呼吸器感染の間に、ＣｙａＡが、上皮細胞に劇的に損傷を加えることなく白血球（特にマクロファージ）を特異的に破壊するということを示した［Ｇｕｅｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｈａｒｖｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。
【００１０】
特許出願ＷＯ９３／２１３２４においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するために組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼを使用することが提案された。しかしながら、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼについての特異的レセプタは全く同定されなかったことから、ｎｏｎ−ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（外来の）提示細胞による摂取とそれに続く樹状細胞による交叉プライミング及び提示に抗原提示が関係しているか否か、又は抗原がｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（本来の）抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）にターゲティングされるか否かはわからなかった。
【００１１】
その表面表現型と一致して、樹状細胞（ＭＨＣＩ及びＩＩ、同時刺激及び粘着分子）は、ナイーブＴ細胞のプライミングについて数多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定において最も潜在能の高いＡＰＣを表わす［Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ｖｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９９］。例えば、その他のＡＰＣ様の休止ナイーブＢ細胞は、休止雄Ｂ細胞を雌の宿主に注入すると雄特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的寛容化が導かれることから、寛容原性でさえあり得る［Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２］。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ナイーブＢ細胞は、Ｆａｂ依存性メカニズムを介して、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を欠失し得る［Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８］。その上、ＣＤによるＡｇ提示は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞応答の誘発と相関関係をもつ。このことは、ＭＨＣＩＩ制限されたＡｇ提示について立証されてきた。静脈内（ｉｖ）経路を介してのアジュバントを含まないＡｇの注射は、通常Ｔ細胞のプライミングを誘発せず［Ｋｙｂｕｒｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ａｉｃｈｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ａｉｃｈｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５］、非特異的Ｂ細胞［Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７］［Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，１９９９］そして場合によっては樹状細胞［Ｃｒｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０］［Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，１９９９］によるＡｇの提示を導く。
【００１２】
これとは対照的に、アジュバントの存在下での皮下（ｓｃ）免疫化のような局所的免疫化戦略は、通常、Ｔ細胞のプライミング及び、皮ふから免疫化部位にドレンするＬＮまで移動するランゲルハンス細胞によるターゲティングされたＡｇの提示を誘発する。この場合、Ｂ細胞及びマクロファージは関与しない［Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６］。ＭＨＣＩＩ及びＭＨＣＩペプチド複合体についてのＳＣ又は皮内（ｉｄ）ＤＮＡ免疫化の後にも、類似の結果が得られた：　樹状細胞は、局所的注入部位で直接トランスフェクトされ得、その後、輸入リンパ管を介して輸入ＬＮまで移動することができる［Ｃｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃａｓａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８］。輸入リンパ管の機械的分断は、皮ふの感作物質又は皮ふ移植片に対するＴ細胞応答を排除することから、移動は免疫性の主要な事象として知られている［Ｚｉｎｋｅｍａｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７］。
【００１３】
従って、樹状細胞に対するターゲティングは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激にとって不可欠である。大部分の抗体応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプに依存していることから、樹状細胞に対し抗原をターゲティングすることは、ワクチン接種の主要な最終目的である。
【００１４】
出願人らは、Ｔ細胞によるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種のアデニルシクラーゼの提示を研究することに興味をもち、ＣｙａＡと相互作用し問題の分子のためのタンパク様ベクターとしてのＣｙａＡの使用についての新たな可能性を開く、特異的細胞上に存在する特異的レセプタ分子を同定した。
【００１５】
遺伝学的に解毒された細胞毒素は、真核細胞に侵入するその能力に起因して、特にＴエピトープについてのワクチンベクターとしての候補である（Ｌａｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬ応答をプライミングすることが示されたタンパク様ベクターはほとんどない（Ｂａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６、Ｃａｂｏｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。その上、数多くのｉｎ ｖｉｔｒｏでの将来有望な研究にもかかわらず、ｐＡＰＣ、特に樹状細胞、そしてより特定的には骨髄性樹状細胞に対し排他的にターゲティングされるものとして示されたベクターは全くない。
【００１６】
発明人らは、その他の細胞、特に好中球が本発明のベクターによりターゲティングされ得るということを示した。
【００１７】
本発明は、少なくとも部分的にこれらのニーズを満たすことのできる手段を提供し、例えば免疫応答の刺激を可能にするべくｐＡＰＣの規定の集団に対し分子を特異的にターゲティングするような新規のベクターを提案している。
【００１８】
その上、ｐＡＰＣ及びその特異的白血球にターゲティングされた分子は、これらの細胞の近位環境に生物学的に活性な分子を送達するのに有用な新しいベクターの製造を可能にすることになる。これらの分子は、例えば、ターゲティングされた細胞又は免疫応答又は炎症性応答に関与する細胞の機能的特性を変調させることができる。
【００１９】
実際、発明人らは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼ毒素が細胞レセプタが指定した（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）αＭ／β２レセプタと特異的に結合すること、そしてこの相互作用が、細胞の細胞質ゾルに対するアデニルシクラーゼドメインの細胞内送達のため、そしてその後細胞死のために必要とされることを発見した。αＭ／β２（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）インテグリンは、β２インテグリン系統群の２量体であり、これらのインテグリンの発現は、白血球に制限されている。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αＭ／βは、好中球／顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＢ及びＴＣＤ８＋リンパ球のサブセットに制限されているマウス及びヒトにおける発現パターンを表示する（Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００、Ａｍａｏｕｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【００２０】
従って、このレセプタは、特にＴエピトープ免疫化のために設計された新しいベクターのための理想的な標的を表わすものとなるだろう。
【００２１】
出願人らは、本発明においてＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的にｉｎ ｖｉｖｏで分子をターゲティングするためにＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼを使用することができるということを示した。
【００２２】
特に、出願人らは本発明において、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼ毒素の中に含まれるペプチド抗原が、効率良く、樹状細胞の表面に特異的にターゲティングされ、前記樹状細胞の細胞質ゾル内に転座され、ＣＴＬ応答プライミングすることができる、ということを示した。
【００２３】
特定の実施形態においては、前記応答は、アジュバント必要条件及びＣＤ４＋Ｔ−細胞ヘルプを迂回して得られる。
【００２４】
同様に、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼを問題のペプチドに化学的にカップリングさせて、このペプチドをＣＤ１１ｂ発現細胞、特に樹状細胞の細胞質ゾルにターゲティングすることができるということも示された。
【００２５】
本発明はかくして、新しく効率の良い免疫原性組成物ならびに、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対する新しい薬物送達ベクターを提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの使用に関する。
【００２６】
本発明は同様に、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対し特異的に問題のペプチド又は分子をターゲティングするための組成物の調製を目的とした、抗原で組換えされ特に該ペプチドの挿入により修飾されるか又は該分子の挿入によって修飾されているＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの使用にも関する。
【００２７】
「特異的」という語は、本発明では、アデニルシクラーゼが問題の分子のためのベクターとして使用される場合、好ましくはＣＤ１１ｂ発現細胞に向けられ、かくして、前記細胞の表面又は前記細胞の内部で、その他の細胞との関係において選択的に問題の分子をターゲティングするための手段を提供することを意味している。
【００２８】
発明の一実施形態においては、問題の分子は、基本的にＣＤ１１ｂ発現細胞に向けられている。
【００２９】
本書で使用されているように、ＣＤ１１ｂ発現細胞という語は、その表面上でＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ αｍβ２レセプタを発現する細胞に関する。特に、これらの細胞は、顆粒球／好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＴＣＤ８＋及びＢ細胞及び骨髄性樹状細胞である。
【００３０】
ＣＤ１１ｂ発現細胞そしてより特定的には骨髄性樹状細胞、好中球及びマクロファージは免疫及び生得的防御系の基本的機能、特に炎症性及び特異的免疫応答に関与することから、本発明は、これらのＣＤ１１ｂ発現細胞特に骨髄性樹状細胞、好中球又はマクロファージに対し問題の分子又はペプチドをターゲティングする能力をもつタンパク様ベクター又は組成物の製造に関する。
【００３１】
特に、１つの実施形態においては、前記分子又はペプチドのターゲティングはｉｎ ｖｉｖｏで有効である。
【００３２】
かくして、本発明は、或る種の白血球特に骨髄性樹状細胞、好中球又はマクロファージのターゲティングを必要とする動物又はヒト宿主に対する投与にとって適当な組成物の設計のために適切な手段を提供する。
【００３３】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種の中で分泌されるカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ又はそのフラグメントであり、該フラグメントは、肺の中の細菌コロニー化の初期段階にとって必須の主要毒性因子であるアデニルシクラーゼの機能特性を保持する。アデニルシクラーゼは、１７０６個のアミノ酸のポリペプチドの形で合成され分泌される。カルモジュリン依存性触媒活性は、最初の４００個のアミノ酸中に局在化されている。活性であるために、前記アデニルシクラーゼ毒素には、ＣｙａＣ遺伝子産物の同時発現によって翻訳後修飾された時点で侵襲性かつ溶血性が付与される。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の以下の特異的特長は、この毒素が、問題の分子をｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１１ｂ発現細胞にターゲティングするためのタンパク様ベクターの製造に使用できるものであることを表わしている：
ａ）このアデニルシクラーゼは、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に結合する：
ｂ）Ｎ末端触媒ドメインは、これらのＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内に転座させられる。
【００３４】
ｃ）Ｃ末端ドメインは、ＣＤ１１ｂ発現細胞の膜に結合し、環内経路によって内在化され得る。
【００３５】
ｄ）遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに化学的に結合されたエピトープが、ｉｎ ｖｉｖｏ特異的ＣＴＬ応答を惹起することができる。
【００３６】
「アデニルシクラーゼ」という表現は、本発明の中では、結果として得られる産物が問題の分子をＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的にターゲティングすることができるということを条件として、遺伝学的に又は化学的に修飾されたアデニルシクラーゼを含めた天然の又は修飾されたアデニルシクラーゼを包含する。
【００３７】
かくして、本発明は、上述の通りのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの使用、そしてより特定的には、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするための修飾された又は組換え型アデニルシクラーゼの使用に関する。
【００３８】
より特定的には、組換え型アデニルシクラーゼには、触媒ドメイン内に挿入されたペプチド配列又はシステイン残基を伴うアデニルシクラーゼか又はその触媒ドメインの全て又は一部分が欠如した切形アデニルシクラーゼのいずれかを提供するように遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼが含まれる。
【００３９】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素とＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αｍβ２レセプタの間の特異的相互作用に起因して、問題の分子は、少なくともＣＤ１１ｂ発現細胞の表面に特異的にターゲティングされる。本発明の特定の１実施形態においては、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素は、ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内、ＣＤ１１ｂ発現細胞の表面、又はＣＤ１１ｂ発現細胞の環内経路内へのいずれかに問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターの製造において使用される。
【００４０】
組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの調製のための発現ベクターは、特許出願ＷＯ９３／２１３２４（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）の中で記述されている。問題の分子の化学的カップリングのために適切な遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの調製のための新規の発現ベクターも同様に、以下の実験の部で記述されている。より特定的には、ＣｙａＡ遺伝子及びＣｙａＣ遺伝子の両方の発現を導く発現ベクターを構築することができる（Ｓｅｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。これと並行して、例えばＭｅｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５の中で記述されているようなｈｌｙＢ及びｈｌｙＤといったＥ． ｃｏｌｉ内の細胞毒性アデニルシクラーゼの分泌に必要な遺伝子を担持する二次的プラスミドを構築することが可能である。特に、ＷＯ９３／２１３２４において記述されている発現プラスミドを使用することができる。このプラスミドを使用すると、アデニルシクラーゼをＥ． ｃｏｌｉ内で発現させ、場合によってはこの細菌内で大量に分泌させることができる。又、それは、例えば、ＣａＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ樹脂上の親和性クロマトグラフィを用いて、又はＤＥ ＡＥ−セファロース及びフェニル−セファロースを用いたもののようなその他の公表された手順によって、容易に精製される（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００４１】
本発明の一実施形態においては、アデニルシクラーゼは、組換え型の遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである。特に、ＣＤ１１ｂ発現細胞に結合するためそして任意には細胞質ゾル内の転座のために必要なドメインがなお機能的であることを条件として、通常の部位特異的又は無作為突然変異誘発技術を用いて、点突然変異、欠失又は挿入といったような突然変異を得ることができる。ＣＤ１１ｂ発現細胞に対する組換え型毒素及びそのフラグメントの特異的結合そして任意にはその後の触媒ドメインの転座を評価するための検定については、以下の実験の部で記述されている。
【００４２】
本発明のもう１つの実施形態においては、組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼは、未変性、修飾済み又は組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼ毒素のフラグメントであり、ここでこのフラグメントは、ＣＤ１１ｂレセプタを結合する能力をもつ。特に、本発明では、残基３７３〜１７０６（ＣｙａＡ３７３−１７０６）を包含するフラグメントがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタとの相互作用のために基本的に必要とされる構造を含有することが発見された。かくしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼ毒素の好ましいフラグメントは、Ｎ末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素、そしてより特定的には、残基１−３７３の全て又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼである。
【００４３】
ＣＤ１１ｂに対する特異的結合は、例中に例示されているように抗−ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体でｉｎ ｖｉｔｒｏで査定できる。
【００４４】
タンパク様ベクターの製造又は組成物の調製において使用されるためには、アデニルシクラーゼは好ましくは非毒性である。アデニルシクラーゼ毒素の非毒性突然変異体は、当該技術分野において充分記述されている（Ｂｅｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３：Ｂｅｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから分離される。
【００４６】
特定の実施形態においては、問題の分子は、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中で選択される。
【００４７】
特定的実施形態においては、問題の分子は、異種抗原である。本書に使用されている「異種」という語は、ベクター自体の中で使用されるアデニルシクラーゼ以外の抗原を意味する。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、タンパク様ベクターの製造は異種分子特にペプチドを許容部位にてアデニルシクラーゼの触媒ドメイン内に挿入する段階を含んで成る。
【００４９】
本書で使用されている、「許容部位」という語は、異種分子特にペプチドが、アデニルシクラーゼ毒素の望ましい機能的特性に実質的な影響を及ぼすことなくすなわちＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタに対する特異的結合に必要なドメインに影響を及ぼすことなくそして有利には、触媒ドメインの転座のプロセスに影響を及ぼすことなく挿入され得る１つの部位に関係する。好ましい実施形態においては、ターゲティングされた細胞内でｃＡＭＰの合成を促進するためのＣｙａＡ毒素の能力はさらに維持されている。
【００５０】
許容部位のための選択方法は、例えば、ＷＯ９３／２１３２４内及びＬａｎｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２内に紹介されている。特に、２重選択（抗生物質に対する耐性及びα−相補による皿上の測熱試験）を用いた方法により、毒素のＮ末端触媒ドメインについてコードする遺伝子の部分における（読取り枠を保存する）オリゴヌクレオチド挿入を直ちに同定することが可能となる。毒素の触媒活性に対するこれらの突然変異の機能的帰結は、遺伝学的（Ｅ． ｃｏｌｉ ｃｙａ−菌株の機能的相補）及び生化学的（修飾されたアデニルシクラーゼの安全性、その酵素活性、ｃａＭとのその相互作用などの特徴づけ）の両方の形で容易に分析可能である。この方法論により、抗原決定因子の挿入にとって潜在的に有利な部位を同定するために多数の突然変異をスクリーニングすることが可能になった。
【００５１】
本発明の特定の実施形態においては、許容部位が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼの残基１３７〜１３８、残基２２４〜２２５、残基２２８〜２２９、残基２３５〜２３６、残基３１７〜３１８そして残基３３５〜３３６から成るグループの中から選択されている。
【００５２】
しかしながら、本発明においては、例えば、上述の方法論を使用することによって同定され得るその他の許容部位、特に残基４００〜１７００の間の部位を同定することができる。
【００５３】
タンパク様ベクターの製造には同様に、そのＮ末端触媒ドメインの全部又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基１〜３７３が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼのＮ末端において例えば異種ペプチドといった問題の分子を融合する段階を含まれる可能性もある。
【００５４】
発明の好ましい１実施形態においては、上述の定義の１つに従ったアデニルシクラーゼは、タンパク様ベクターの製造又はＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞応答（ＣＴＬ応答）をプライミングするために特異的に設計された組成物の調製において使用され、ここでその応答は、ＣＤ１１ｂ発現細胞に対する問題の分子で修飾（特に組換え又は接合）されたアデニルシクラーゼのターゲティングとその後の問題の分子の前記ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル特に骨髄性樹状細胞に対する転座に追従している。この状況下で、問題の分子は、好ましくはエピトープ又は抗原であるか又はこれを含んで成る。
【００５５】
本書で使用する「エピトープ」という語は、免疫応答を誘発できる異種分子そして特に異種ペプチドを意味する。
【００５６】
特定の実施形態においては、抗原は、細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原から成るグループの中から選択される。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態においては、上述の定義づけの１つに従ったアデニルシクラーゼ、すなわち天然、修飾済み又は組換え型アデニルシクラーゼは、タンパク様ベクターの製造又はＣＤ４＋細胞の応答をプライミングするために特異的に設計された組成物の調製において使用され、ここでこの応答は、特に骨髄性樹状細胞におけるＣＤ１１ｂ発現細胞に対する問題の分子で修飾（特に組換え又は接合）されたアデニルシクラーゼのターゲティングに追従している。この状況下で、問題の分子は、好ましくはエピトープ又は抗原であるか又はこれを含んで成る。
【００５８】
問題の分子は、特に、ポリオウイルス抗原、ＨＩＶウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルスエピトープ、腫瘍抗原から成るグループの中から選択された抗原であり得る。
【００５９】
ＣＤ１１ｂ発現細胞の機能的特性は、これらの特異的細胞をターゲティングする薬物のためのタンパク様ベクターの製造におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の新規使用を画定する。この状況下で、本発明の１つの特定的実施形態においては、いわゆる問題の分子は薬物である。前記薬物は、アデニルシクラーゼに対し化学的又は遺伝学的にカップリングされ得る。ポリペプチドに対する薬物のカップリング方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＮ−ピリジルスルフォニル活性化スルフヒドリルを用いることによるジスルフィドリンケージを含む。
【００６０】
有利には、問題の分子は、アデニルシクラーゼ毒素にカップリングされた時点で、好中球といったような炎症性応答に関与する細胞の表面に対し特異的にターゲティングされる抗炎症薬である。
【００６１】
特に、「実験の部」では、ＣＤ１１ｂ＋抗原提示細胞特にＣＤ１１Ｂ＋抗原提示細胞の細胞質ゾルにｉｎ ｖｉｖｏ ターゲティングするため化学的リンケージ又は遺伝学的挿入によりＣｙａＡに分子を移植できるということが初めて示されている。実際、ジスルフィド結合又は遺伝学的挿入のいずれかを用いて、解毒済みＣｙａＡの触媒ドメインに対し一定の与えられたＣＤ８＋Ｔ−細胞エピトープに対する分子をカップリングする場合、工学処理された分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ特異的ＣＴＬ応答を惹起できかくして、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内に転座させられていることを示す、ということがわかった。
【００６２】
より特定的には、選択的なＣＤ８＋細胞毒性細胞プライミングのための抗原提示は、主として骨髄性樹状細胞によって実施される。
【００６３】
従って、特定の実施形態においては、タンパク様ベクターの製造のために用いられる組換え型アデニルシクラーゼは、前記アデニルシクラーゼの触媒ドメイン内にある遺伝学的に挿入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて化学的に結合された単数又は複数の分子を含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼである。
【００６４】
実際、触媒ドメイン内のさまざまな許容部位にある異なるシステイン残基に対するジスルフィド結合を用いて多数の分子をアデニルシクラーゼに化学的に結合させることができる。
【００６５】
出願人らは同様に、ベクター化された抗原に特異的なＣＴＬを、特に異種アジュバントを提供する必要なく、組換え型毒素の一回だけの静脈内注射の後に ｉｎ ｖｉｖｏでプライミングすることができる、ということをも示した。実験の部で示したこれらの結果そして特に骨髄性樹状細胞に対するエピトープの特異的ターゲティングにより、アジュバント及びＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプを迂回する新たな免疫化戦略が可能となる。
【００６６】
従って、本発明は同様に、異種アジュバントを含まない、静脈内投与のために処方されｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を可能にする組成物の調製のための、問題の分子特にペプチドで組換えられたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ毒素の使用に関する。本発明は同様に、かかる状態のままのこの組成物にも関する。
【００６７】
本発明は特に、同様に、触媒ドメイン内に挿入された抗原を含む組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼを含むことを特徴とする、動物又はヒトの宿主において特に静脈内投与により投与するように処方された新しい免疫原性組成物にも関する。
【００６８】
本発明はさらに、問題の分子がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼにカップリングされていることを特徴とする、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子をターゲティングするように処方されたヒト又は動物における投与のための薬学組成物にも関する。
【００６９】
１つの好ましい実施形態においては、問題の分子は、ペプチド、グリコペプチド、リポペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、脂質及び化学物質を含むグループの中から選択される。
【００７０】
もう１つの好ましい実施形態においては、問題の分子は抗原である。
【００７１】
もう１つの特定的な実施形態においては、薬学又は免疫原性組成物は、問題の分子にカップリングされた組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼを含む組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼをコードする核酸構成を含んで成る。
【００７２】
特定の実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素由来のものである。
【００７３】
その他の特定的実施形態においては、アデニルシクラーゼ毒素は、遺伝学的に修飾された毒素である。１つの好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、非毒性アデニルシクラーゼ、特に解毒されたアデニルシクラーゼである。
【００７４】
１つの好ましい実施形態においては、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内に特異的に問題の分子を転座させることができる。
【００７５】
特に、前記遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、その触媒Ｎ末端ドメインの全て又は一部が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ、そしてより特定的には、残基１〜３７３が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼである。
【００７６】
有利には、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、許容部位において触媒ドメイン内に挿入された単数又は複数のシステイン残基を含んで成る。かかる遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼは、挿入されたシステイン残基にてジスルフィド結合（単複）を用いて単数又は複数の問題の分子にカップリングされ得る。
【００７７】
好ましい一実施形態においては、分子特に抗原は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼの残基１３７〜１３８、残基２２４〜２２５、残基２２８〜２２９、残基２３５〜２３６及び残基３１７〜３１８及び残基３３５〜３３６から成るグループの中から選択された許容部位の中に挿入されるか、そうでなければ分子は、そのＮ末端触媒ドメインの全て又は一部分が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼのＮ末端部分、そしてより特定的には、残基１〜３７３が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニルシクラーゼのＮ末端部分に融合される。
【００７８】
特定的１実施形態においては、分子は、細胞内細菌細胞抗原、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、真菌抗原又は寄生虫細胞抗原である抗原である。
【００７９】
好ましい実施形態においては、問題の分子は、ポリオウイルスエピトープ、ＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス抗原、脈絡髄膜炎ウイルス抗原、腫瘍抗原から成るグループの中から選択された抗原である。
【００８０】
もう１つの実施形態においては、遺伝学的に修飾された毒素は、ＣＤ１１ｂ発現細胞の表面内で又は環内経路内に、特異的に問題の分子を送達することができる。
【００８１】
出願人は、アジュバント無しで本発明において定義づけされたような動物又はヒト宿主内に免疫原性組成物をｉｎ ｖｉｖｏ静脈内投与するだけで、該動物又はヒト宿主内の免疫応答を効率よく促進するのに充分であるということを示した。
【００８２】
特に、本発明の免疫原性組成物は、特異的に樹状細胞が関与する免疫細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発又は刺激する能力をもつ。
【００８３】
その結果として、特定の１実施形態においては、免疫原性又は薬学組成物には、有利にも、水酸化アルミニウムといったような当該技術分野において一般に使用されるプライミングアジュバントが全く無い。
【００８４】
１つの特定的実施形態においては、問題の分子は薬物、好ましくは抗炎症薬である。
【００８５】
さらに、本発明は同様に、動物又はヒト宿主に対する投与のためのワクチン又は免疫療法用組成物の調製のための前述の通りの免疫原性組成物の使用にも関する。
【００８６】
本書で使用されている「免疫療法用組成物」という語は、免疫学的応答を導きかつ、ガン、ウイルス感染、寄生虫感染又は細菌感染に対する治療といったような治療的処置に結びつけられる組成物に関係する。
【００８７】
本発明はさらに、
ａ）上述のとおりの免疫原性組成物を提供する段階；
ｂ）免疫応答を促進するために前記宿主に対し、好ましくは静脈内経路を介して前記免疫原性組成物を投与する段階、
を含む、動物又はヒト宿主を免疫化するための方法に関する。
【００８８】
本発明は、最後に、ＣＤ１１ｂ発現細胞に特異的に問題の分子を送達するためのタンパク様ベクターにおいて、前記問題の分子にカップリングされたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼ、そしてより好ましくは組換え型又は修正されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種アデニルシクラーゼを含んで成ることを特徴とするタンパク様ベクターに関する。
【００８９】
タンパク様ベクターは、特定の細胞の表面に存在するＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８αｍβ２とＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼの特異的結合を介してＣＤ１１ｂ発現細胞に対して問題の分子をターゲティングすることができる。１つの特定の実施形態においては、該ベクターは同様に、ＣＤ１１ｂ発現細胞の細胞質ゾル内で特異的に問題の分子を送達することもできる。
【００９０】
特定の実施形態においては、タンパク様ベクターは、樹状細胞特に骨髄性樹状細胞又は好中球に対して問題の分子をターゲティングすることができる。
【００９１】
問題の分子は、アデニルシクラーゼ、より好ましくは組換え型アデニルシクラーゼ毒素に対し化学的又は遺伝学的にカップリングされる。１つの分子をポリペプチドにカップリングする方法は、当該技術分野において周知である。一例としては、発明人は、ビオチン誘導体、ビオチンＨＤＰＤが触媒ドメイン内に遺伝学的に挿入された唯一のシステイン残基上に選択的にカップリングされ得ることを示した。システイン含有アデニルシクラーゼ毒素又は、未変性システイン残基が欠けているものの唯一の遺伝学的に挿入されたシステインを含有する遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼに対し、合成ペプチドが同様にカップリングされてきた。
【００９２】
もう１つの特定の実施形態においては、アデニルシクラーゼにカップリングされた問題の分子は、未変性システイン残基が欠けているもののその触媒ドメイン内で許容部位（単複）に遺伝学的に挿入されたシステイン残基（単複）を含有する遺伝学的に挿入されたアデニルシクラーゼに化学的にカップリングされたエピトープである。
【００９３】
特定の１実施形態においては、タンパク様ベクターは、遺伝学的に修飾されたアデニルシクラーゼを含んで成る。１つの好ましい実施形態においては、アデニルシクラーゼは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の組換え型非毒性アデニルシクラーゼである。
【００９４】
本発明は、より特定的には、Ｎ末端触媒ドメインの全部又は一部分が欠如した組換え型Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼ、より好ましくは残基１〜３７３が欠如したＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから成るタンパク様ベクターに関する。
【００９５】
本発明のもう１つの好ましいタンパク様ベクターは、未変性システイン残基が欠けているものの、触媒ドメイン内で許容部位に遺伝学的挿入されたシステイン残基（単複）を含有する遺伝学的に修飾されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニルシクラーゼである。
【００９６】
有利には、本発明の１つの特定の実施形態において、送達されるべき薬物は、アデニルシクラーゼ毒素にカップリングされた時点で、好中球といったような炎症性反応に関与する細胞の細胞質ゾル又は表面にターゲティングされる抗炎症薬である。
【００９７】
以下の例は、請求されている発明の範囲を制限することなく、本発明を例示するものである。より特定的には、Ａ部では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタに対するアデニルシクラーゼ毒素の特異的結合、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ１１ｂ発現細胞に対するアデニルシクラーゼ毒素の特異的結合を顕示する実験データが示されている。Ｂ部では、実験結果は、遺伝学的にカップリングされた分子、より特定的には抗原をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１１ｂ発現細胞特に骨髄性樹状細胞の細胞質ゾル特に特異的にターゲティングする可能性を示している。その上、結果は、ターゲティングがＣＤ１１ｂレセプタにより媒介されること及び、ＣＴＬプライミングがアジュバントの不在下での全身的免疫化の後に観察されることを示している。Ｃ部では、ＣｙａＡフラグメント上のジスルフィド結合を用いたエピトープペプチドの特異的カップリングを実施して新しいタンパク様ベクターを得ることができるということが示されている。Ｄ部では、ＣＤ１１ｂレセプタとの相互作用のためにはＣｙａＡのＣ末端部分のみで必要かつ充分であることが示されている。
【００９８】
最後に、結果は、交叉プライミング抗原に対して発生させられたもののようなその他の数多くのＣＴＬ反応とは異なり、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプが、ＣＴＬ応答のプライミングにとって不可欠でなかったということを示している。
実施例
Ａ．Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニル酸シクラーゼ毒素は、αＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）と特異的に相互作用する。
【００９９】
Ａ．１　材料及び方法
Ａ．１．１　組換え型毒素及び抗体
ＣｙａＡ産生のためのプロトコルは、すでに他の文献で記述されてきた〔Ｋａｒｉｍｏｖａ， ｅｔ ａｌ．， １９９８〕。ＣｙａＡ毒素は、プロトキシンの活性化に必要とされるＣｙａＣアクセサリー遺伝子及びｌａｃＵＶ５プロモータの下でｃｙａＡ構造遺伝子ＣｙａＡを担持する発現プラスミドを内包するＥ． ｃｏｌｉ菌株の中で産生された。８Ｍの尿素、Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ２０ｍＭ、ｐＨ７．５の中での可溶化の後、ＣｙａＡを、逐次的ＤＥＡＥ−セファロース及びフェニル−セファロースにより９５％（ＳＤＳゲル分析によって判断されるもの、図示せず）を超える均質性に至るまで精製した。遺伝学的に不活性化された触媒ドメイン内に挿入された唯一のシステインを内包する解毒された組換え型ＣｙａＡ毒素ＣＡＣＴＥ５−Ｃｙｓ−Ｏｖａを、ｐＣＡＣＴ−Ｏｖａ−Ｅ５のＢｓｉｗｌ及びＫｐｎｌ部位の間に適切な２本鎖オリゴヌクレオチドを挿入することによって構築した〔Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００〕。結果としてもたらされたタンパク質ＣＡＣＴＥ５−Ｃｙｓ−Ｏｖａの中で、ＣｙａＡの残基２２４及び２２５の間にアミノ酸配列ＡＳＣＧＳＩＩＮＦＥＫＬＧＴを挿入する。組換え型毒素を、以前に記述された通りに発現させ精製した。精製されたタンパク質を、メーカーの指示に従がい、特異性の高いスルフヒドリル試薬Ｎ−（６−（ビオチンアミド）ヘキシル）−３′−（２′−ピリジルチオ）プロピオンアミド（ビオチン−ＨＰＤＰ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いてその唯一のＣｙｓ上で標識づけした。ビオチニル化されたＣｙａＡをＤＥＡＥ−セファロース上で再度精製して、未反応のビオチン−ＨＰＤＰ試薬を除去した。毒素濃度は、１４２Ｍ−１×ｃｍ−１の分子消散係数（結合研究）を用いて、又はＢｉｏｒａｄタンパク質検定システム（ｃＡＭＰの蓄積及び細胞死の研究）を用いて、２８０ｎｍでの吸着から分光光度計により決定した。
【０１００】
マウスＣＤ１１（２Ｄ７、ラットＩｇＧ２ａ　κ）、マウス及びヒトＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ラットＩｇＧ２ｂ、κ）、マウスＣＤ１１ｃ（ＨＬ３、ハムスタ１、λ）、マウスＣＤ１８（Ｃ７１／１６、ラットＩｇＧ２ａ、κ）、対照（Ａ９５−１、又は抗−ＣＤ１６／３２、２．４Ｇ２、ラットＩｇＧ２ａ　ｋ）に特異的な精製済みｍＡｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）から入手した。抗ヒトＣＤ１１ｂ（４４、マウスＩｇＧ２ａ、κ）、及び抗ヒトＣＤ１８（ＴＳ／１８、マウスＩｇＧｌ、κ）ハイブリドーマからの上清は、寄贈されたものであり、遮断実験においてこれを１／２希釈で使用した。抗マウスＣＤ１１ｂ（５Ｃ６、ラットＩｇＧ２ｂ、κ）から上清は、Ｇ． Ｍｉｌｏｎ （Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｐａｒｉｓ）から寄贈されたものであり、結合阻害検定において１／２の最終希釈で使用された。精製済みＣｙａＡで皮下で免疫化したウサギから抗−ＣｙａＡポリクローナル抗体を得た。硫酸アンモニウム（３３％）により免疫血清から血清を沈殿させた。遠心分離後に、ペレット化されたタンパク質を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ｃ）内で再度懸濁させ、同じ緩衝液に対し広範に透析した。その後、抗体を、室温で１３０分間、ビオテン−アミドカプロン酸塩Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＳＩＧＭＡ、ジメチルスルホキシド中に溶解）とのインキュベーションによりビオチニル化した。その後、１００ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ９．０を添加し、３０分間さらにインキュベートした後、混合物を４℃で緩衝液Ｃに対して広範に透析させた。ビオチニル化した抗体を−２０℃で保存した。
【０１０１】
Ａ．１．２　細胞及び培地
米国菌培養収集機関（ＡＴＣＣ）から、ＥＬ４、Ｊ７７４Ａ．１、ＬＢ２７．４、ＴＨＰ−１を入手し、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを伴うか又は伴なわず、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補足したＲＰＭＩ１６４０（完全培地）の中で培養した。完全培地中でＦＳＤＣ（Ｇｒｏｌｏｍｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を培養した。ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８又はＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８についてトランスフェクションを受けた又はベクターのみでトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞を、Ｄ． Ｇｏｌｅｎ ｂｏｃｋ（Ｂｏｓｔｏｎ， ＵＳＡ）から入手し、以前に記述された通りに〔Ｉｎｇａｌｌｓ ｅｔ ａｌ， １９９８〕ネオマイシンの存在下で培養した。ヒト好中球を前述の通りに精製した〔Ｒｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２〕。
【０１０２】
Ａ．１．３　ＣｙａＡ結合検定
９６ウェルの培養平板（Ｃｏｓｔａｒ）中で血清無しで全ての結合検定をＤＭＥＭ４．５ｍｇ／ｍｌグルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で実施した。２×１０５個／ウェルの細胞を２０分間（実験に応じて４℃又は３７℃で）２００μｌの最終体積中でインキュベートした。一部の実験においては、１００μｌの最終体積中で遮断用ｍＡｂの存在下で４℃で２０分間、細胞を予備インキュベートした。４℃で２００μｌの合計体積でｍＡｂの連続的存在下でウェルに対し、毒素溶液を添加した。その後、平板を５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去した。飽和剤としての対照（非免疫又は免疫前）ウサギ血清の存在下で（１／５０）、ビオチニル化された抗−ＣｙａＡウサギポリクローナル抗体（ＤＭＥＭ中１／４００、５０μｌ／ウェル）と共に２５分間４℃で、細胞をインキュベートした。
【０１０３】
遠心分離及び上清除去の後、１／３００の希釈度（５０μｌ／ウェル）で、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で細胞を染色した。洗浄後、細胞を、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの存在下で、ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＵＳＡ）上でのフローサイトメトリーにより細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム排除により細胞凝集物及び死枯細胞を排除するため、ゲートを行なった。プリズムソフトウェアを用いて、Ｂｍａｘ＝最大結合％で、双曲線モデル△ＭＦＩ＝Ｂｍａｘ＊〔ＣｙａＡ〕／Ｋｄ＋〔ＣｙａＡ〕）に、実験点を適合させた。
【０１０４】
Ａ．１．４　ｃＡＭＰ検定
４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース及び２０Ｕ／ｍｌのヘキソキナーゼを含有するものの血清は含まないＤＭＥＭでインキュベーション培地が構成されている抗原競合免疫検定〔Ｋａｒｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９８〕により、ｃＡＭＰ蓄積を測定した。グルコースのＡＴＰ依存性リン酸化反応の触媒として作用するヘキソキナーゼを添加して、ＡＴＰのあらゆる痕跡について細胞外培地を涸渇させ、かくしてｃＡＭＰの細胞外合成を防止した。従って、測定されたｃＡＭＰの量は、厳密に細胞内のｃＡＭＰの蓄積を表わしている。４℃で１時間、１０μｌ／ｍｌの特異的ｍＡｂを伴う又は伴わない１００μｌ／ウェルの中で、９６ウェル付き平板内で５×１０５個の細胞を予備インキュベートし、次に２０分間３７℃で０．０５、０．５又は５ｇ／ｍｌのＣｙａＡと共に、又予備インキュベーションの間に存在する場合には１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂと共に、インキュベートした。ＣｙａＡの用量応答効果のためには、細胞を３７℃で２０分間毒素と共に直接インキュベートした。中毒の後、５分間２５００ｒｐｍで細胞を遠心分離した。１００μｌのＨＣｌ ０．１Ｎで、標本を溶解させ、１２０℃で５分間煮沸し、１００μｌのトリス０．１２５Ｍ、ＮａＣｌ ０．２Ｍで中和した。Ｎａ２ＣＯ３ ０．１Ｍ ｐＨ９．５中１／４、０００で希釈した。ＡＭＰ−ＢＳＡ接合体でマイクロタイタープレートをコーティングした。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％中で２回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中で１時間飽和し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％で５回洗浄した。ｃＡＭＰ−ＢＳＡ接合体をコーティングした平板に直接、標本及びｃＡＭＰ標本（Ｓｉｇｍａ）を添加し、ＨＣｌ ０．１Ｎ及びトリス０．１２５Ｍ−ＮａＣｌ ０．２Ｍの１／１混合物で階段希釈した。ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中に１／２、５００で抗−ｃＡＭＰウサギ抗体を添加し、３時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％で５回平板を洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にカップリングした抗ウサギ抗体を、ＰＢＳ−ＢＳＡ２％中に１／２５００で添加し、１時間３７℃でインキュベートし、従来のペルオキシダーゼ反応を用いて顕示させた。プリズムソフトウェアを用いて、Ｓ字状モデルに対し標準曲線の実験点を適合させた。
【０１０５】
Ａ．１．５　毒性検定
以前に記述された通りに〔Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｋｈｅｌｅｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５〕、細胞死を評価した。簡単に言うと、安全培地中で９６ウェルの平板内で２４時間１０５個の細胞をインキュベートし、血清を含まない培地で一回洗浄した。全ての細胞培養をさらに血清無しの培地で実施した。４時間３７℃でＣＨＯ細胞にさまざまな濃度のＣｙａＡを直接適用することにより、用量応答効果を評価した。細胞毒性阻害については、１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂを伴って又は伴わずに、１時間４℃で細胞を予備インキュベートし、その後、Ｊ７７４Ａ．１Ａ．１細胞については２時間０．５μｇ／ｍｌで、ＣＨＯ細胞については４時間５μｇ／ｍｌでそして、予備インキュベーション中に存在する場合には１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂで、３７℃でインキュベートした。死にかかっている細胞により培地内に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量を定量化するＣｙｔｏｔｏｘ９６ＴＭ検定（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞溶解を評価した。
【０１０６】
Ａ．２．結果
Ａ．２．１　ＣｙａＡの可飽和結合は、標的細胞の表面でのＣＤ１１ｂの存在と相関関係をもつ。
【０１０７】
白血球の集団に向かってのＣｙａＡ細胞特異性を特徴づけするため、我々は、β２インテグリンのさまざまな組合せを発現する３つの代表的なマウス細胞系統、すなわち、腫瘍マクロファージであるＪ７７４Ａ．１；Ｔ細胞胸腺腫であるＥＬ４；及びＢ細胞リンパ腫であるＬＢ２７．４を選択した。３７℃でＣｙａＡで２０分間インキュベートした後、ビオチニル化された抗−ＣｙａＡ抗体及びストレプトアビジン−ＰＥを用いてフローサイトメトリーにより、これらの細胞の細胞表面に対するＣｙａＡの結合を監視した。これらの条件下で、我々は、Ｊ７７４Ａ．１細胞系統上でのＣｙａＡの効率の良い用量依存性の可飽和結合を観察した。見かけのＫｄはそれぞれ９．２±４．５ｎＭ及び３．２±１．９ｎＭであったため、Ｊ７７４Ａ．１細胞に対するＣｙａＡの親和力は高いものであった。ＥＬ４及びＬＢ２７．４細胞に対するＣｙａＡの低い結合が観察されたが、これはテストされた濃度では飽和可能でなかった。
【０１０８】
Ｊ７７４細胞系統に対するＣｙａＡの結合が、β２インテグリン系統群の成員の１つの発現と相関関係をもつか否かを見極めるため、我々は、充分に特徴づけされたβ２インテグリン（ＣＤ１１ａ、Ｃｄ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ）の３つのα鎖及び共通のβ鎖（ＣＤ１８）について特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞の表現型分析を実施した（図１ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。Ｊ７７４Ａ．１細胞はほとんどＣＤ１１ｂ及びＣＤ１８を発現したが、ＣＤ１１ａについても陽性であった。ＥＬ４細胞及びＬＢ２７．４細胞は、ほとんどＣＤ１１ａ及びＣＤ１８を発現した。合わせて考慮すると、これらのデータは、Ｊ７７４Ａ．１に対するＣｙａＡの効率の良い不飽和結合が、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の存在と相関関係をもっていたということを示している。
【０１０９】
Ａ．２．２　ＣｙａＡ可飽和結合は、抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂにより特異的に遮断される
我々は次に、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が、このインテグリンを発現する細胞に対するＣｙａＡの結合に直接関与できるか否かを見極めた。我々は、ＣｙａＡの固定された又は変動する濃度でｍＡｂの不在下で平均蛍光値の百分率を計算することにより、抗ＣＤ１１ｂＭ１／７０ｍＡｂで得られた阻害の定量分析を行なった（図２）。Ｍ１／７０抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂで得られたＣｙａＡ結合の阻害は、テストされた大部分のＣｙａＡ濃度でほぼ完全であった（図２ａ、ｂ）。この阻害は、抗−ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８又は対照ｍＡｂがＣｙａＡ結合を阻害しなかったことから、特異的であった。第２の抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂ（クローン５ｃ６）も同様に、ＣｙａＡを阻害した（図２ｃ、ｄ）。ＣＤ１１ｂを発現する未成熟樹状細胞であるＦＳＤＣ（図２ａ、ｃ）及びマクロファージ細胞系統Ｊ７７４Ａ．１（図２ｂ、ｄ）でも類似の結果が得られた。
【０１１０】
ＣｙａＡがヒトＣＤ１１ｂとも類似の要領で相互作用できるか否かを検査するため、その高いＣＤ１１ｂ発現が充分に立証されているヒト好中球について、ＣｙａＡ結合研究を実施した。抗−ＣｙａＡウサギ抗体を用いたヒト骨髄性細胞のインキュベーションの後に高いバックグラウンド蛍光が得られたことから（データ示さず）、我々は、交互結合検査をセットアップした。その触媒ドメイン内に遺伝学的に導入された唯一のシステイン残基上で、ＣｙａＡの解毒された形態を特異的にビオチニル化した。このシステムを用いて、我々は好中球に対するＣｙａＡ結合を検出することができた（図３）。４４又はＭ１／７０ 抗−ＣＤ１１ｂ ｍＡｂを用いた好中球の予備インキュベーションは、ＣｙａＡの結合のそれぞれ完全な又は部分的な阻害を導いた（図３ａ及びｂ）。マウス細胞に対するＣｙａＡ結合を遮断しなかった抗マウスＣＤ１８ｍＡｂであるＣ７１／１６とは異なり、ヒト抗−ＣＤ１８ＴＳ／１８ｍＡｂでの予備インキュベーションは、ヒト好中球に対するＣｙａＡ結合の完全な阻害を導いた（図３ｂ）。ヒト単球ＴＨＰ−１細胞系統でも類似の結果が得られた（データ示さず）。
【０１１１】
結論としては、マウス及びヒトの両方に由来する３つの骨髄性細胞系統（Ｊ７７４Ａ．１、ＦＳＤＣ、ＴＨＰ−１）ならびに精製されたばかりのヒト好中球の表面に対するＣｙａＡ結合は、主としてＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンを通して媒介されると思われる。
Ａ．２．３　ＣｙａＡを媒介とするｃＡＭＰの増加及び毒性は、抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂにより特異的に遮断される。
【０１１２】
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８−依存性ＣｙａＡ結合の生理学的関連性を評価するため、我々は、ＣｙａＡの細胞毒性に対する遮断ｍＡｂの効果を研究した。我々は、まず最初に、さまざまなｍＡｂの存在下でＣｙａＡに露呈されたＪ７７４Ａ．１細胞内で産生されたｃＡＭＰの量を測定した。図４ａに示されているように、ＣｙａＡにより誘発された細胞内ｃＡＭＰ含有量の増大は、細胞をＭ１／７０抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂと共に予備インキュベートした場合、完全に廃止された。ＣｙａＡ細胞結合を遮断しなかったＣ１７／１６抗マウスＣＤ１８ｍＡｂ（図２）は、ＣｙａＡで処理された細胞の細胞内ｃＡＭＰ含有量に対し全く効果を与えなかった。かくして、これらのデータは、ＣｙａＡによって誘発された細胞内ｃＡＭＰの増大が、ＣＤ１１ｂと毒素の相互作用に依存するものであることを強く示唆している。ＣｙａＡの毒性についてのこの分子の必要条件をさらに分析するため、我々は、ＣｙａＡで媒介された細胞死に対するβ２インテグリン系統群の異なる鎖に特異的ｍＡｂの効果を評価した。図４ｂは、抗−ＣＤ１１ｂ ｍＡｂ Ｊ７７４Ａ．１がＣｙａＡによって誘発される細胞死を劇的に低減させたということを示している（８８％の阻害）。ＣｙａＡにより誘発される細胞死は、Ｊ７７４Ａ．１が細胞に対する毒素の結合を遮断しなかったｍＡｂ（抗ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ又はＣＤ１８又は対照ｍＡｂ）で予備インキュベートされた場合に、影響を受けなかった。
【０１１３】
合わせて考慮した場合、これらのデータは、ＣＤ１１ｂを通したＣｙａＡ結合がＪ７７４Ａ．１細胞内でのＣｙａＡで媒介された毒性にとって厳密に必要なものである、ということを示している。
Ａ．２．４　ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、ＣｙａＡに対する感受性を付与する
ＣｙａＡ結合におけるＣＤ１１ｂの役割を確認するため、我々は、ヒトインテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８又はＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８によるトランスフェクションを受けた又はモックトランスフェクション（ベクター単独）を受けたＣＨＯ細胞を使用した。図５ａに示されているように、ＣｙａＡは、３７℃でこれらの細胞系統に結合できた。しかしながら、ＣｙａＡ結合は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を発現するＣＨＯ細胞内では効率が良くかつ可飽和であったが、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８又はモックトランスフェクションを受けた細胞においてはそうでなかった。ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けた細胞についてのＣｙａＡの親和力は、ｎＭ範囲（Ｋｄ＝０．７±０．０９ｎＭ）内にあった。４℃で、ＣｙａＡ結合の効率は、３７℃での結合に比べ低減した（図５ｂ）。この温度では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けた細胞とその他の２つの細胞系統の間の差はより顕著であった。
【０１１４】
我々は、Ｊ７７４Ａ．１におけるＣｙａＡ媒介毒性にとってＣＤ１１ｂが必要であることを発見したことから、このとき、ＣＤ１１ｂ発現が、ＣＨＯでのトランスフェクションを受けた細胞に対してＣｙａＡ感受性表現型を付与するのに充分なものであるか否かを見極めた。さまざまな報告〔Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８〕と一致して、ＣｙａＡは、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ 細胞内又は対照のモックトランスフェクションを受けた細胞中で注目に値する量の細胞内ｃＡＭＰを、ただし高い毒素濃度でのみ（５μｇ／ｍｌ、図５Ｃ）誘発した。これとは対照的に、ＣｙａＡは、研究された最低の濃度（０．０５μｇ／ｍｌ）でさえ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞内のＣＡＭＰの細胞内レベルを増大させた。その上、５μｇ／ｍｌのＣｙａＡに応答したｃＡＭＰの産生は、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８又はモックトランスフェクションを受けた細胞に比較して、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けた細胞においては４〜５倍高いものであった。
【０１１５】
我々は同様に、ＣｙａＡで媒介された細胞死内のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の役割も評価した。図５ｄに示されているように、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けたＣＨＯの５０％以上が、５μｇ／ｍｌのＣｙａＡでの４時間のインキュベーションの後に死滅し、一方ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクション又はモックトランスフェクションを受けた細胞は、この処理により影響を受けなかった。
【０１１６】
要するに、これらの結果はかくしてヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンの発現がＣＨＯ 細胞内のＣｙａＡについての高親和力レセプタを作り出すのに充分なものであることを明確に立証した。
Ａ．３　論述： ＣｙａＡのためのレセプタ
その他の毒素とは異なり、ＣｙａＡは、長い間、あらゆるレセプタ結合から独立したものと考えられてきた。これは、ｉ）ＣｙａＡがさまざまな由来の多様なモデル細胞系統をｉｎ ｖｉｔｒｏで中毒させることができること〔Ｌａｄａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９〕、ｉｉ）ＣｙａＡがジャーカット細胞及びヒツジ赤血球に、非可飽和的に結合すること〔Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９〕という観察事実に基づいている。実際、これらの観察事実は、脂質膜へのＣｙａＡの非特異的吸着が、細胞質ゾル内への触媒ドメインの幾分かの転座を導くということを立証した。しかしながら、これらの観察事実は、特異的レセプタの存在を度外視したわけではない。我々は、骨髄性細胞系統についてのこの研究において、ＣｙａＡの結合及び毒性特性が、インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とのその相互作用に依存していることを示した。効率が良くかつ可飽和の結合は、ＣＤ１１ｂの発現と相関関係をもち、抗ＣＤ１１ｂ ｍＡｂにより完全かつ特異的に遮断される。その上、ＣＨＯ細胞内でのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の発現は、ＣｙａＡの結合を劇的に増強させ、その結果、この毒素による中毒に対する感受性を増大させる。我々の結果は、白血球の上で特異的に発現される細胞表面分子とＣｙａＡの相互作用を裏づける最初の証拠である。抗−ＣＤ１１ｂ ｍＡｂによるＣｙａＡ結合のほぼ完全な遮断は、ＣＤ１１ｂがテストされた細胞系統内のＣｙａＡのための主要レセプタであることを示唆している。ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８トランスフェクタント、又はＥＬ４又はＬＢ２７．４といったようなＣＤ１１ａ／ＣＤ１８発現細胞に対する効率の良い結合の欠如は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８が、標的細胞に対するＣｙａＡの結合に関与するβ２系統群の唯一のインテグリンであることを示唆している。
【０１１７】
以前の研究と一致して、我々は、テスト対象の全ての細胞系統に対するＣｙａＡの検出可能な結合を観察した。さらに、ＣｙａＡは高濃度で、細胞死に結びつけられない、モックトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞内のわずかではあるものの検出可能なｃＡＭＰ増加を誘発した。かくして、高い濃度では、ＣｙａＡは、多様な細胞系統を結合させそこまで転座することができるが、効率が良くかつ可飽和の結合、転座及び死滅は、ＣＤ１１ｂ発現細胞の顕著な特徴である。
【０１１８】
β２インテグリン系統群の成員に対するＣｙａＡの結合は、これらの分子と相互作用することが近年発見されたその他のＲＴＸ毒素の挙動を連想させるものである〔Ｌａｌｌｙ ｅｔ ａｌ， １９９７：Ｌｉ ｅｔ ａｌ， １９９９；Ａｍｂａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００〕。ＣｙａＡと強い相同性を共有するＥ． ｃｏｌｉ　ＨｌｙＡは、血漿膜でカチオン孔を形成する。ＨｌｙＡは、低濃度においてのみであるが、白血球に対する特異性を示す［Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１］。この相対的特異性は、インテグリンＣＤ１１ａ／ＣＤ１８とのその相互作用によって媒介されることが示された［Ｌａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７］。同様にして、それぞれヒト及びウシの白血球に特異的な比較的混交度の低いＲＴＸ毒素であるＡ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ及びＰ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ白血球毒素（それぞれＬｔｘＡ及びＬｋｔＡ）も又、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８と相互作用する〔Ｌａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９；Ａｍｂａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９； Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ ｅｔ ａｌ， ２０００〕。ＨｌｙＡと強い相同性をもつにも関わらず、ＣｙａＡは、その細胞分布が異なるもう１つのβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を認識する。実際、ＣＤ１１ｂは、たいていはマクロファージ、好中球及び樹状細胞上で発現されるが、Ｔ及びＢ細胞の大部分の上で発現されず、一方、ＣＤ１１ａは、Ｔ及びＢリンパ球を含むすべての白血球上で発現される。
【０１１９】
ＣＤ１１ｂ発現細胞に対するＣｙａＡのこの特異的ターゲティングは、本発明において、この特定の細胞サブセットを特異的にターゲティングするために活用されている。侵襲性であり続けているＣｙａＡの解毒された突然変異体を、その他の細胞型に顕著な影響を及ぼすことなく、ＣＤ１１ｂ陽性細胞に対する薬理学的に活性な分子の送達のために使用することが可能であろう。
Ｂ．骨髄性樹状細胞の細胞質ゾルに至るターゲティング対象抗原の送達及び選択的ＣＴＬプライミング
Ｂ．１　材料及び方法
Ｂ．１．１　組換え型アデニル酸シクラーゼ毒素及びペプチド
ｐＯＶＡ合成ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）はＮＥＯＳＹＳＴＥＭに由来し、これをＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌで希釈させた。
Ｂ．１．２　細胞毒性Ｔ細胞の検出のための免疫化及び検定
６〜８週の週令のＩｆｆａ Ｃｒｅｄｏ（Ｌ’ａｒｂｒｅｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）からの雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド上で育種されたＴＡＰ１−／−（Ｖａｎ Ｋａｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２），ＣＤ４−／−（Ｋｉｌｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３），ＣＤ４０−／−（Ｋａｗａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）及びＢ細胞欠損μ突然変異（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）は、ＣＤＴＡ施設（ＣＮＲＳ、Ｏｒｌｅａｎｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に由来し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒの施設内で育種された。動物を、ＰＢＳ中のＡｇで静脈内免疫化した。注射から７日後に、動物を屠殺し、脾臓を除去した。脾細胞の単一細胞懸濁液（２．５×１０７個の細胞）を、１０ｍｌのＣＭ（以下参照）中で照射済み脾細胞（２．５×１０７個）で５日間、１μｇ／ｍｌのｐＯＶＡの存在下で再度刺激した。正に前述の通りに、細胞毒性検定を実施した（Ｆａｙｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
Ｂ．１．３　細胞系統
Ｈ−２Ｋｂの状況下でＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）について特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚ（Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）は、Ｎ． Ｓｈａｓｔｒｉ博士（ＵＳＡ，バークレイ、カリファルニア大学）から寄贈されたものであった。
Ｂ．１．４　抗原提示検定
全ての抗原提示検定は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（完全培地、ＣＭ）で補足されたＲＰＭＩ１６４０中で、９６ウェルの培養マイクロプレート（０．２ｍｌの最終体積）内でのＢ３ＺとＡＰＣの同時培養によって実施された。Ｂ３Ｚ細胞（１０５細胞／ウェル）の刺激を、ＡＰＣの存在下での１８〜２４時間の培養の上清中でのＩＬ−２放出によって監視した。以前に記述された通り（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９），ＣＴＬＬ検定中でＩＬ−２を測定した。一部の実験（図の説明参照）では、ＮＦ−ＡＴｌａｃＺリポータ検定を用いて、Ｂ３Ｚの刺激を査定した。細胞リゼイト中のＬａｃＺ活性を、以前に記述された通りに（Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）ＣＰＲＧ基板で査定した。次のような２つの抗原提示検定を実施した。すなわち、ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定：　ナイーブマウスに由来するＡＰＣをさまざまな濃度のＡｇの存在下でＢ３Ｚと同時培養（１０５／ウェル）した。一部の実験では、ＡＰＣを、４℃で４０分間１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを伴って又は伴わずに予備インキュベートし、その後、ｍＡｂの連続的存在下で１００μｌの最終体積内で細胞に対しＡｇを添加した。４時間のパルスの後、ＡＰＣを２回洗浄し、Ｂ３Ｚとの同時培養に付した。使用した精製済みｍＡｂは、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０ ｒａｔｉｇＧ２ｂ，Ｋ）又はイソ型整合した対照に対するものであり、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＵＳＡ）に由来していた。ｉｉ）Ｅｘ ｖｉｖｏ検定：ＡＰＣは、１ウェルあたりのさまざまなＡＰＣ数で０．２ｍｌの最終体験でＢ３Ｚとの培養に付した。
Ｂ．１．５　抗原提示細胞及び選別
Ｖｒｅｍｅｃ ｅｔ ａｌにより修正されたＳｔｅｉｎｍａｎのプロトコル（Ｖｒｅｍｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）に従って、合計脾細胞（ＴＳＣ）、低密度（ＬＤＦ）及び高密度（ＨＤＦ）画分を調製した。簡単に言うと、３７℃で４０分間、コラゲナーゼで脾臓を消化し、その後切裂し、ＥＤＴＡ ５ｍＭの連続的存在下で前処理した。細胞を、高密度のＢＳＡ溶液上で遠心分離した。上清及びペレット細胞を別個に収集し、低密度画分及び高密度画分と呼称した。フィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にカップリングされているか又はビオチニル化されたハムスタのＨＬ３ ｍＡｂと共に２ｍＭのＥＤＴＡ（ＰＢＳ−ＦＡＣＳ）及び５％のウシ胎児血清で補足されたＰＢＳ中で４℃でＣＤ１１ｃ染色を実施し、その後、ストレプトアビジン−ＰＥにより顕示させた。ＰＥにカップリングされた５３−６．７ｍＡｂで、ＣＤ８α染色を実施した。ＰＥ又はＦＩＴＣにカップリングされたＭ１／７０ｍＡｂを用いて、ＣＤ１１ｂ染色を行なった。ＰＥにカップリングされるか又はビオチニル化されたＢ２２０ｍＡｂで、ＣＤ５４染色を実施し、ストレプトアビジン−ＰＥにより顕示させた。全てのｍＡｂはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎに由来するものであった。２回の洗浄後、ＦＡＣ Ｓｔａｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＵＳＡ）を用いて細胞を選別した。ＣＭ中で細胞を、無菌状態で回収した。選択された細胞の純度を、ＦＡＣＳ Ｃａｎ装置（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＵＳＡ）上で分析された選別済み細胞のアリコート上で検査した。選別済み細胞の純度は、標準的に８０〜９８％の間であった。その他の実施形態においては（図の説明に記載の通り）、供給業者のプロトコル（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｋ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＣＤ１１ｃ Ｍｉｃｒｏ Ｂｅａｄｓ及びＭａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ技術を用いて、脾臓コラゲナーゼ消化物から直接、ＣＤ１１ｃ＋細胞を選別した。この技術では、選別済み細胞の純度は８０％前後の範囲内であった。
Ｂ．２　結果
Ｂ．２．１　アジュバント不在下でのＣｙａＡＯＶＡによる全身的免疫化の後の、ＣＤ４及びＣＤ４０とは独立したＣＴＬプライミング
実験モデルエピトープとして、ニワトリオバルブミン、Ｈ−２Ｋｂ制限、ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープを使用した。これを、解毒されたなおも侵襲性の突然変異体ＣｙａＡの触媒ドメインの中に遺伝学的に挿入した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを、５０μｇの組換え型毒素又は対照食塩水溶液で１回ｉｖで免疫化した。免疫化から７日後に、ｐＯＶＡに特異的なＣＴＬ活性をＣｙａＡＯＶＡで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞内で検出したが、食塩水又は対照ＣｙａＡの注射を受けたマウスの体内ではこれは検出されなかった（図６ａ）。ＣＤ４又はＣＤ４０欠損マウスでも類似の結果が得られ、これは、他の数多くのＣＴＬ応答と異なり（交叉プライミング用Ａｇに対し発生させたものなど（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７；１９９８；Ｓｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）），ＣｙａＡＯＶＡによるＣＴＬ応答のプライミングのために、ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプが不可欠でなかったことを示している（図６ｂ，Ｃ）。その上、Ｂ細胞欠損マウスの中でもＣＴＬ応答が得られたことから、Ｂ細胞は必要とされなかった（ＩｇＭ−／−，図６ｄ）。場合によってアジュバントとして作用する汚染物質ＬＰＳは、Ｃ５７ＢＬ １０ＳｃＳｎ及びＬＰＳ−低応答性マウスＣ５７ＢＬ１０ＳｃＣｒがＣｙａＡＯＶＡ注射（図示せず）の後に類似のＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を示したことから、ＣＴＬ応答ＣｙａＡＯＶＡの刺激に関与しない。
Ｂ．２．２　ＣＤ１１ｂ−発現細胞に対するＣｙａＡＯＶＡ提示のｉｎ ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏ ターゲティング
ＣｙａＡＯＶＡの免疫原性をより良く理解するため、我々は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するその提示に関与するＡＰＣを決定しようとした。刺激の読み出しとしてＩＬ−２分泌を用いて、我々は、Ｈ−２Ｋｂ 制限された抗ＯＶＡ ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚを、ＣｙａＡＯＶＡの存在下、ただしＣｙａＡＬＣＭＶの不在下で、バルク脾細胞によりｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激する（図７ａ）。我々は、３つの明確な脾臓ＡＰＣすなわちＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋），Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋）及びマクロファージ／顆粒球（ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−）のＡＰＣ能力を分析することを意図していた。合計脾細胞内のＣＤ１１ｃ＋の百分率が低いもの（＜１％）であったため、我々は密度分画を実施し、フローサイトメトリーによりＤＣ富有（４〜１０％）低密度集団からＣＤ１１ｃ＋を選別した。高密度画分は、微量のＣＤ１１ｃ＋細胞しか含有していなかった。これとは対照的に、両方の画分内のＣＤ４５Ｒ＋及びＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−（顆粒球／マクロファージから成る）細胞の分布により、これらのマーカーについての全集団に関する選別が可能となった。図７Ｃに示されているように、ＣｙａＡＯＶＡは、ＤＣにより最も効率良く提示され、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−及びＢ細胞による効率はこれより低いものであった。このことは、脾細胞の低密度画分内での抗原提示能力のほぼ排他的な分画と相関関係をもつ（図７ａ）。これとは好対照に、高及び低画分の両方共が、ｐＯＶＡに応答してＢ３Ｚを刺激することができた（図示せず）。
【０１２０】
免疫化の後ｉｎ ｖｉｖｏで形成されたＫｂ−ＯＶＡ複合体を検出するために、５０μｇのＣｙａＡＯＶＡで８〜１５時間前にｉｖで免疫化されたマウスから調製されたＡＰＣを、Ａｇの添加無しでｉｎ ｖｉｔｒｏでＢ３Ｚと同時培養した（ｅｘ ｖｉｖｏ検定）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定については、ＣｙａＡＯＶＡ提示を担当するＡＰＣは、ＤＣ富化された低密度の脾細胞画分の中のみに排他的に存在した（図７ｂ）。検定の特異性は、Ｂ３Ｚを刺激しなかったＣｙａＡＬＣＭＶ免疫化されたマウスからのＡＰＣを用いて検査した（図７ｂ）。ＣｙａＡＯＶＡ提示に関与する低密度ＡＰＣをさらに特徴づけするために、我々は、細胞選別を実施した。図７ｄに示された結果は、ＤＣ（ＣＤ１１Ｃ＋）画分が、より効率の良いＡＰＣであったことを示している。同じ画分から選別マクロファージ／顆粒球（ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−）及びＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋）は、Ｂ３Ｚの刺激についてきわめて効率の低いものであった。
【０１２１】
ＣｙａＡＯＶＡに関与するＡＰＣをさらに特徴づけするため、我々は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−骨髄性サブセット及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋リンパ球サブセット内の脾臓の低密度ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの亜分画を実施した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ検定（それぞれ図７ｅ及びｆ）は、ＣｙａＡＯＶＡについての抗原提示能力が、低レベルしかＣＤ１１ｂ＋を発現しないリンパ球系サブセットとは異なり、このインテグリンをも発現する骨髄性サブセットにより保持されるということを示した（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｖｒｅｍｅｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋リンパ球系サブセットがＣｙａＡＯＶＡを提示できないのは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−がＢ３Ｚに対しｐＯＶＡ合成ペプチドを同等に良く提示することから、ＣｙａＡＯＶＡに特異的なことであった。
【０１２２】
対照（Ｃ５７ＢＬ／６）又はＢ細胞欠損マウス（ＩｇＭ−／−）からの脾細胞で実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ検定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＣｙａＡＯＶＡの提示に対するＢ細胞の貢献の低さを確認した（図７ｇ及びｈ）。これらの結果と一致して、ＣｙａＡＯＶＡによって誘発されたＣＴＬ応答は、対照マウスに比べてＢ細胞欠損マウスでは有意な影響を受けなかった（図５ｄ）。
Ｂ．２．３　樹状細胞によるＣｙａＡＯＶＡのＭＨＣＩ制限された提示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方における組換え型毒素の細胞質ゾル送達に左右される。
【０１２３】
ＣｙａＡＯＶＡ提示が、ＯＶＡエピトープの細胞質ゾル送達又は細胞外投入に左右されるか否かを見極めるために、我々は、ナイーブ動物（ｉｎ ｖｉｔｒｏ，図８ａ）又はＣｙａＡＯＶＡでｉｖ免疫化された動物（ｅｘ ｖｉｖｏ，図８ｂ）から精製された対照の脾臓ＴＡＰ＋／＋又はＴＡＰ−／−由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣ又は全脾細胞を用いて、Ａｇ提示検定を実施した。結果は、樹状細胞によるＣｙａＡＯＶＡ提示が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでＴＡＰに完全に依存していることを示している。ｐＯＶＡ提示はＴＡＰに依存しない現象であることから、我々は、ｐＯＶＡペプチド（図示せず）でｉｎ ｖｉｔｒｏで投入したこれらの細胞でＢ３Ｋを刺激することによって、ＣｙａＡＯＶＡで免疫化されたマウスから選別されたＴＡＰ−／−ＤＣの機能性を検査した。これらの結果は、ＣｙａＡＯＶＡのｉｎ ｖｉｖｏ提示がその細胞質ゾル送達により左右されることを示している。
Ｂ．２．４　ＣＤ１１ｂでのＣｙａＡの相互作用は、ＭＨＣＩによる抗原提示のための細胞質ゾル経路に対する挿入された抗原の送達及び細胞結合に必要とされる。
【０１２４】
我々は、Ａ部で、ＣＤ１１＋細胞に対するＣｙａＡＷＴの可飽和かつ効率の良い結合が、抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂにより特異的に遮断され得ることを示した。さらに、ＣＤ１１ｂトランスフェクションは特異的に、そうでなければＣｙａＡ ＷＴに対する耐性をもつＣＤ１１ｂ−細胞である細胞に対して可飽和結合及びＣｙａＡＷＴに対する感受性を付与した。抗ＣＤ１１ｂｍＡｂによる細胞結合の遮断は、その後の触媒アデニル酸シクラーゼドメインの細胞内送達、ｃＡＭＰ上昇及びＣｙａＡＷＴにより誘発される細胞死を阻害した。この結果は細胞系統について得られたものであるため、ＣｙａＡが脾細胞に結合するか否かを決定することが残されていた。我々は、フィコエリスリンにカップリングされたストレプトアビジンでの全脾細胞懸濁液に対するＯＶＡペプチドを担持するビオチニル化され、解毒された形態のＣｙａＡ（ＣｙａＡＯＶＡビオチン）の固定を検出するためにフローサイトメトリーをセットアップした。この検定を用いて、我々は、ＣｙａＡＯＶＡが、全脾細胞懸濁液（５〜７％）内の白血球のサブセットに結合することを視察した。抗−ＣＤ１１ｂＭ１／７０ｍＡｂでの予備インキュベーションがこの結合を排除したが、対照ｍＡｂではそうならなかった（図９ａ）。その上、ＣＤ１１ｂの発現と低密度細胞へのＣｙａＡＯＶＡの結合の間には相関関係がある：ＣｙａＡＯＶＡは、高レベルのＣＤ１１ｂを発現するＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−に対し効率良く結合し、低レベルのＣＤ１１ｂしか発現しないＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋に対してはその効率は比較的低く、ＣＤ１１ｂを発現しないＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α＋Ｔ細胞に対しては非常にわずかしか結合しない（図９ｂ）。このＣＤ１１ｃ−集団内へのＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋の存在と相関して、ＣｙａＯＶＡが低い百分率のＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α−細胞と効率良く結合することは、注目に値する。かくしてＣｙａＯＶＡビオチンの結合は、ＣＤ１１ｂにより媒介され（ＣｙａＡ ＷＴの場合と同様）、ＣｙａＯＶＡを提示する一定の与えられた細胞型の能力を予測させる。
【０１２５】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで、我々は、抗体ＣＤ１１ｂｍ ＡｂＭ１／７０がＢ３Ｚに対するＴＳＣ細胞によるＣｙａＡＯＶＡの提示を遮断することを示した（図１０ａ）。この遮断は、ｉ）その他のβ２インテグリン系統群の成員（抗ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｃ）に特異的な対照ｍＡｂ（単複）がほとんど又は全く効果をもたなかったこと（図１０ａ，データは示さず）；ｉｉ）ｐＯＶＡの提示が抗−ＣＤ１１ｂ又はこれらのｍＡｂのうちのいずれかによっても影響されなかったこと（図１０ｂ，データは示さず）；から特異的である。このことは、ＣＤ１１ｂが少なくとも脾臓の中でＣｙａＡＯＶＡについての主たるレセプタであることそしてＣｙａＡＯＶＡ−ＣＤ１１ｂの相互作用が挿入されたエピトープの提示によって不可欠であることを確認している。
【０１２６】
最後に、ＣｙａＡＯＶＡ提示におけるＣＤ１１ｂ発現細胞の役割を確認するために、我々は、ＣｙａＡＯＶＡ又はｐＯＶＡで免疫化したマウスからの全脾細胞についての選別実験を行なった。ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ−画分の中で全脾細胞を選別した。ｐＯＶＡのｉｖ免疫化の後に２つの亜集団がＢ３Ｚを刺激した一方で（図１０ｄ），ＣＤ１１ｂ＋亜集団のみが、ＣｙａＡＯＶＡのｉｖ免疫化の後にＢ３Ｚを刺激した（図１０ｃ）。
【０１２７】
これらの結果を考え合わせると、ＣｙａＯＶＡからのＯＶＡペプチドの提示が、細胞結合ひいてはＣＤ１１ｂとの相互作用により左右されるということが明らかに立証されている。
Ｂ．３　論述
本研究においては、エピトープ送達ベクターとしてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの解毒されたアデニル酸シクラーゼを用いて、我々は、アジュバント必要条件に対するニーズを迂回しながら、唯一回の注入後にＣＴＬ応答をプライミングする免疫化のための戦略を確立した。我々は、ベクターとしての解毒されたＣｙａＡの高い効率に寄与するメカニズムを識別した。
Ｂ．３．１　ＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂインテグリンとの相互作用を通して骨髄性樹状細胞をターゲティングする
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はＩｎ ｖｉｖｏで投入されたＡＰＣを用いた特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマに対する抗原提示検定（それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ検定）は、ＣｙａＡＯＶＡのための最も効率の良いＡＰＣがＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈｔ＋ＤＣであることを立証した。実際、ＣｙａＡＯＶＡについてのＡｇ提示能力は全て、ＤＣを保持する脾細胞の低密度画分に属していた。規定の細胞型の細胞選別は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈｔ＋ＤＣ細胞がＣＤ１１ｃ−ＣＤ１１ｂｈｉｇｈｔ＋細胞に比べてＣｙａＡＯＶＡを提示する上ではるかに効率が良いということを顕示した。Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋）について観察されたわずかな貢献は、ＣｙａＡＯＶＡの効率の良い提示（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ）及びＢ細胞欠損マウス内のＣＴＬ応答によって確認された。
Ｂ．３．２　ＣｙａＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＨＣクラスＩ提示のための細胞質ゾル経路に対しＡｇを送達する
ここで、我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの全脾細胞に対するＣｙａＡＯＶＡの提示の依存性を示している。驚くべきことに、我々は同様にＣｙａＡＯＶＡのｉｎ ｖｉｖｏ提示が、ＴＡＰ依存性経路に従っても起こるということをも示している。こうして、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣｙａＡＯＶＡ提示が、事実上、場合によって起こる細胞外劣化からではなく細胞質ゾル送達の結果としてもたらされるという結論が導かれた。
Ｂ．３．３　ＣＴＬプライミングはＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルプを迂回し、ＣＤ４０シグナリングには依存しない
未成熟段階から成熟段階に向かっての成熟は、ｉ）Ａｇ捕捉能力の低下；ｉｉ）Ｔ細胞プライミング能力の増加；ｉｉｉ）Ａｇ標本採取部位（脾臓内の周辺帯）から、それらがＡｇ特異的Ｔ細胞と出会う確率を最大にしているＴ細胞部域（脾臓内の細動脈周囲シーツ）までの移動によって特徴づけられる（Ｄｅ ｓｍｅｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＤＣによるＡｇ提示に加えて、成熟期は現在、Ｔ細胞プライミングのための前提条件として広く仮定されている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究が、特にＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を介しての、樹状細胞成熟のシグナリングにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の役割を強調した（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。細胞Ａｇの交叉プライミングの後のＣＤ８＋Ｔ細胞プライミングの場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０−依存性メカニズムにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそのヘルプを免除する（Ｓｃｈｕｕｒｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＣｙａＡＯＶＡはＣＤ４及びＣＤ４０と独立した形でＣＴＬをプライミングすることから、解毒されたＣｙａＡには固有のアジュバント活性が付与されている可能性があると推測したくなる。
Ｂ．３．４　結論
当該研究は、ベクター化されたＡｇのｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（本来の）ＡＰＣ細胞質、ゾル送達に対するターゲティング及びアジュバント無しのＣＴＬプライミングの両方に適合するタンパク質ワクチンベクターの我々の知るかぎりにおいて初めての特徴づけを表わしている。さらに、我々は、Ａｇ提示が、ＣｙａＡとそのレセプタであるＣＤ１１ｂの間の相互作用に依存していることを実証することによって細胞ターゲティングのメカニズムを解明した。従って、ＣｙａＡの細胞特異性は、思いがけないことにＡｇ送達目的に適合されている。最後に、ＣｙａＡ又はその他の細菌毒素の細胞特異性は、その効果を制限された１組の細胞にターゲティングすべきである広範な１組の薬学的に関連性ある分子の細胞質ゾル送達に役立つ可能性がある。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏで樹状細胞に対し化学的にカップリングされた抗原を送達するためのアデニルシクラーゼの使用
Ｃ．１　ＣｙａＡ由来のベクターに対する問題の分子のカップリング方法
ジスルフィド結合を用いてＣｙａＡに問題の分子を移植することによる組換え型ＣｙａＡ毒素を作り出すための一般的方法論がここで記述されている。
【０１２８】
一つの例示として、オバルブミンからのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対応する１２個のアミノ酸長さをもつ合成ペプチドを、２３５の位置でＣｙａＡ触媒ドメイン内に遺伝学的に導入されたシステイン残基に対するジスルフィド結合を通して化学的に架橋させた（野生型ＣｙａＡはシステイン残基を全く有していない）。この新規のアーキテクチャの期待される利点は、以下の通りである：
（ｉ）　汎用性：　単一のＣｙａＡ担体を、所望のあらゆる合成ペプチドに容易にカップリングできる。
（ｉｉ）　免疫原性：　ＡＰＣ細胞質ゾル内への送達の時点で、ＣｙａＡに化学的にカップリングされたエピトープは、（細胞内還元条件に起因して）ベクターから放出され、ＭＨＣクラスＩ提示経路内に直接導入されるはずであり、かくして、プロテアソームによるタンパク質分解処理の潜在的に制限ある段階を迂回させる。
【０１２９】
ジスルフィド結合によりＣｙａＡに合成ペプチドをカップリングする一般的手順は、図１１の中に概略的に示されている。
【０１３０】
第１段階では、一般にＣｙａＡの触媒ドメイン内に遺伝学的に挿入された単一のシステイン残基を含有する組換え型ＣｙａＡ毒素（野生型ＣｙａＡはシステイン残基を全く有していない）が産生される。
【０１３１】
組換え型ＣｙａＡ毒素、ＡＣＴＭ２３５は、以前に特徴づけされた（Ｈｅｖｅｋｅｒ及びＬａｄａｎｔ， １９９７）。特に、ＡＣＴＭ２３５は、アミノ酸２３５と２３６の間に挿入されたＣｙｓ−Ｓｅｒジペプチドを内包し、完全に細胞毒性である。この毒素は、Ａ．１．１．で前述した通り、均質性に至るまで発現、精製された。
【０１３２】
第２段階では、オバルブミンからのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対応する合成ペプチドが設計された。精確なエピトープ配列であるＳＩＩＮＦＥＫＬ（アミノ酸のための１文字コード）配列に加えて、化学合成中にペプチドのＮ末端で、活性化されたニトロ−ピリジン−スルフォニルチオール基（Ｃｙｓ−ＮＰｙｓ）を伴うシステイン残基が付加された。活性化されたＮｐｙｓシステインは、ＡＰＣ内でのペプチドのさらなるタンパク質分解処理を容易にするため、可とう性ＧＧＡモチーフによりＳＩＩＮＦＥＫＬ配列から分離された。ペプチド（Ｃｙｓ−Ｎｐｙｓ−ＯＶＡ、分子量：１４０５ｄａ）は、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ， Ｆｒａｎｃｅ）によって合成された。
【０１３３】
第３段階でＣｙｓ−Ｎｐｙｓ−ＯＶＡペプチドは以下の手順を用いてＡＣＴＭ２３５にカップリングされた。
【０１３４】
１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で１２時間インキュベートすることによって、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５中の精製されたＡＣＴＭ２３５が１０ｍｇ還元された。還元効率は、非還元性条件下でのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析によって検査された。基本的に全てのＡＣＴＭ２３５タンパク質が、二量体種（約４００ｋＤａの分子量）の証拠が全く無い状態で、単量体種に対応する２００ｋＤａの単一バンドとして移動した。還元されたタンパク質をその後、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５中で平衡化されたＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラム（５ｍｌの樹脂パック）上に投入した。ＡＣＴＭ２３５タンパク質をＤＥＡＥ−セファロース樹脂上に充分保持し、その後この樹脂を、微量のＤＴＴをことごとく除去するべく８Ｍの尿素、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５，０．１Ｍ，ＮａＣｌ（＞１００ｍｌ）で広範に洗浄した（残留ＤＴＴの不在は、５，５′−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＮＢを用いて検査された）。その後、還元されたＡＣＴＭ２３５タンパク質を次に、７ｍｌの８Ｍ尿素、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５，０．５ＭのＮａＣｌの中でＤＥＡＥ−セファロース樹脂から溶出させた。次に、還元したＡＣＴＭ２３５タンパク質（８ｍｇ，約４５ｎｍｏｌ）に対して３ｍｇ（約２μｍｏｌ）のＣｙｓ−Ｎｐｙｓ−ＯＶＡペプチドを添加し、混合物を室温で１６時間インキュベートした。その後、２５ｍｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５及び８ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加し、この希釈混合物を次に、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５，１ＭのＮａＣｌ内で平衡化されたフェニルセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラム（１０ｍｌの樹脂パック）上に投入した。フェニル−セファロース樹脂を、５０ｍｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５，１ＭのＮａＣｌで洗浄し、その後５０ｍｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５で洗浄した。その後、誘導体化したＡＣＴＭ２３５タンパク質を、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−Ｎａ，ｐＨ７．５中で溶出させた。１４２，０００Ｍ−１．ｃｍ−１という分子消散係数を用いて、２８０ｎｍでの吸収から分光光度法により毒素濃度を決定した。
【０１３５】
Ｃｙｓ−Ｎｐｙｓ−ＯＶＡペプチドを、同じ手順を用いて、解毒された変異体である第２の組換え型ＣｙａＡ毒素、ＣｙａＡＥ５−ＬＣＭＶａｐ（すなわち残基１８８と１８９の間の２つのアミノ酸ＬＱの遺伝学的挿入の結果として酵素活性が欠如している）に対し、カップリングさせた。この毒素は同様に、ＣｙａＡの残基２２４と２２５の間に挿入され単一のＣｙｓ残基を含有する１５個のアミノ酸という長さのポリペプチド配列（ＰＡＳＡＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＴ）も含有している。この組換え型毒素をコードするプラスミドは、ＰＡＳＡＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＴ配列をコードする適切な合成２本鎖オリゴヌクレオチドのＳｔｕＩ及びＫｐｎＩ制限部位の間での挿入によって修飾されたｐＣＡＣＴ−ｏｖａ−Ｅ５の誘導体である（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。Ｃｙａ ＡＥ５−ＬＣＭＶｇｐタンパク質は、Ａ．１．１で前述したとおりに、発現され精製された。
【０１３６】
表１に示されているペプチドは、同様に、触媒部位内の同じＬＱジペプチド挿入及びＣｙａＡの残基２２４と２２５の間に挿入された１４個のアミノ酸の配列を含有するもう１つの解毒された組換え型ＣｙａＡ毒素ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡに、類似の形でカップリングされた。このインサートは、図１２に示されているようなＯＶＡエピトープに隣接するＣｙｓ残基を含有している。この組換え型毒素をコードするプラスミドは、ＡＳＣＧＳＩＩＮＦＥＫＬＧＴ配列をコードする適切な合成２本鎖オリゴヌクレオチドをＢｓｉＷＩ及びＫｐｎＩ制限部位の間に挿入することにより修飾されたｐＣＡＣＴ−ｏｖａ−Ｅ５の誘導体である。ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡタンパク質は、Ａ．１．１に記述された通りに発現され精製された。
【０１３７】
ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡは、ジスルフィド架橋によるＣＴＬエピトープの化学的カップリングのための一般的な解毒済みベクターとみなすことができる。ＣｙａＡＥ５−ＣｙｓＯＶＡ内部のＯＶＡエピトープの存在は、Ｂ．１．４において前述した通り、特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに対するＯＶＡエピトープの提示を測定することによる、エピトープ送達における機能性についての容易なｉｎ ｖｉｔｒｏ検定を可能にする。
【０１３８】
【表１】
2004508065.tif 000002
【０１３９】
代替的には、組換え型ＣｙａＡ毒素のチオール基を、２，２′−ジチオジピリジン（Ｓｉｇｍａ）で活性化し、還元されたシステインを含むペプチドで誘導体化することができる（合成ペプチド内のＣｙｓを還元するための手順はメーカーにより提供される）。これは、所望のペプチドが内部システイン残基を含有する場合に特に適していると思われる。
Ｃ．２　ＣｙａＡに化学的にカップリングされたＯＶＡエピトープのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性の分析
化学的（ＣｙａＡ−ｇｐ−Ｓ−Ｓ−ＯＶＡ Ｅ５）又は遺伝学的カップリング（ＣｙａＡ−ＯＶＡ Ｅ５）の後のＣｙａＡによるＭＨＣクラス１分子に対するＯＶＡエピトープのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達をまず最初に、脾細胞による抗ＯＶＡ Ｂ３Ｚ ＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマに対するこれらの分子の提示を研究することによって分析した。さまざまな濃度の組換え型ＣｙａＡの存在下で１０５個のＢ３Ｚ細胞と１８時間、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの３・１０５個の脾細胞を同時培養した。Ｂ３ＺによるＩＬ−２放出を、ＣＴＬＬ増殖検定において測定した。
【０１４０】
図１３に示されているように、Ｂ３ＺがＣｙａＡ−ｇｐ−Ｓ−Ｓ−ＯＶＡ　Ｅ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ Ｅ５のいずれかで刺激された時点で、高いＩＬ−２分泌が観察され、かくして、ＣｙａＡに対し化学的にリンクされたＯＶＡエピトープが、遺伝学的カップリングの後と同じ位効率良く抗原提示細胞の細胞質ゾル経路に対して送達されたことが実証された。Ｂ３Ｚが、ＯＶＡエピトープの欠如したＣｙａＡ分子で刺激された時点でいかなるＩＬ−２産生も観察されず、かくしてＩＬ−２産生の特異性が示された。
【０１４１】
第２段階では、次に、ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を誘発するこれらの分子のｉｎ ｖｉｖｏ能力が分析された。５０μｇのさまざまなＣｙａＡをｉｖで注射することによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１グループにつき２匹）を免疫化した。７日後、個々のマウスの２５・１０６個の脾細胞を５日間、照射を受けた同系の２５・１０６個の脾臓細胞の存在下で０．１μｇのＯＶＡペプチドで再度刺激した。
【０１４２】
エフェクタ細胞の細胞毒性活性を、５０μＭのＯＶＡペプチドでのパルス処理を受けた又は受けていない５１Ｃｒ標識づけされたＥＬ４標的細胞上で測定した。
【０１４３】
図１４で示されているように、ＣｙａＡ−ｇｐ−Ｓ−Ｓ−ＯＶＡ Ｅ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ Ｅ５のいずれかにより免疫化されたマウスの中で高いＣＴＬ反応が誘発され、かくして、ＯＶＡエピトープの化学的又は遺伝学的カップリングの比較可能な効率が実証された。ＯＶＡエピトープが欠如した対照ＣｙａＡ分子で免疫化されたマウスにおいて、又はコーティングされていないＥＬ４が標的細胞として使用された場合には、いかなるＣＴＬ応答も観察されず、観察されたＣＴＬ応答の特異性が示された。
【０１４４】
結論としては、これらの結果は明らかに、ＣｙａＡ由来のタンパク様ベクターに化学的にリンクされたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩ提示のための細胞質ゾル経路に対し非常に効率良く送達され、ｉｎ ｖｉｖｏで強いＣＴＬ応答を誘発するということを実証している。
Ｄ．ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合し効率の良い分子送達ベクターとして使用されうるＣｙａＡ由来のフラグメントの同定
ＣｙａＡとＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタの間の相互作用に関与する領域をマッピングしようという１つの試みとして、ＣｙａＡのさまざまなサブフラグメントが構築され、段落Ａにおいて前述した方法を用いて、トランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞の表面上でＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に結合するためビオチニル化ＣｙａＡ毒素と競合するそれらの能力についてテストされた。
Ｄ．１　ＣｙａＡ３７３−１７０６の発現
新しい発現ベクターｐＴＲＡＣ−３７３−１７０６（図１６）を使用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉの中でＣｙａＡ３７３−１７０６タンパク質を産生させた。これは、（ＣｙａＡのＬｙｓ８６０及び９８３の翻訳後パルミトイル化による活性毒素へのｐｒｏＣｙａＡの変換に関与するＣｙａＣをコードする）ＣｙａＣ遺伝子及びＣｙａＡのＣ末端ドメイン−コドン３７３から１７０６をコードするＣｙａＡ遺伝子の３′部分によってプラスミドｐＤＬ１３１２のニューロカルシン遺伝子を置換することで構築されたプラスミドｐＤＬ１３１２（Ｌａｄａｎｔ １９９５）の誘導体である（図１６参照）。ｃｙａＣ及び ’ｃｙａＡの両方の遺伝子共、λファージＰｒプロモータの制御下で同じ転写単位内に置かれる。ｃｙａＣ遺伝子の３′末端は、その停止コドンの前に、下流側の ’ｃｙａＡ遺伝子の翻訳開始を増強するためにリボソーム結合部位を導入するように修正された（図１６）。結果としてのＣｙａＣポリペプチドの修飾（ＣｙａＣのＮ末端における最後の３つのアミノ酸Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａは、Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ配列によって置換された）は、ＣｙａＡをアシル化するその能力に対しいかなる効果ももたらさなかった。（ｃｙａＡの唯一のＢａｓＢＩ部位の上流側の）毒素の触媒ドメインについてコードする）ＣｙａＡ遺伝子の５′末端は、欠失させられ、ＭＧＣＧＮ配列をコードする適切な合成２本鎖オリゴヌクレオチドで置換された（図１６）。
【０１４５】
ｐＴＲＡＣ−３７３−１７０６は同様に、３２℃未満の温度でλＰｒプロモータにおける遺伝子転写を強く抑制する感熱性λリプレッサＣＩ８５７、ｃｏｌＥ１の複製起点及びアンビシリン耐性を付与するベーターラクタマーゼ遺伝子をコードする。
【０１４６】
ＣｙａＡ３７３−１７０６タンパク質の発現は、Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＢＬＲ内で行なわれた。ｐＴＲＡＣ−３７３−１７０６で形質転換された細胞を、中間対数期まで１５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地内で３０℃で成長させ、次に、４２℃まで成長温度を上昇させることによってＣｙａＣ及び切形ＣｙａＡ合成を誘発した。４２℃でさらに３〜４時間成長させた後、細菌を収獲した。その後、野生型ＣｙａＡについて記述された通りに（Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００），ＣｙａＡ３７３−１７０６タンパク質を精製した。ＣｙａＡ３７３−１７０６にはｃＡＭＰ合成活性が欠如し、これはヒツジ赤血球の溶血活性を示し、又そのＭＧＣＧＮＮ末端配列内に唯一のシステイン残基をも含有している。
Ｄ．２　ＣｙａＡ−Ｅ５及びＣｙａＡフラグメント：１〜３８３（触媒ドメイン）及び３７３−１７０６（疎水性及び反復ドメイン）によるＣＤ１１ｂに対するＣｙａＡ−Ｅ５結合の阻害
図１５に示されているように、トランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞をＣｙａＡ−Ｅ５と共にインキュベートした後に、ビオチニル化されたＣｙａＡ−Ｅ５結合の強い阻害が達成された。フラグメントＣｙａＡ−３７３−１７０６と共にこれらの細胞をインキュベートした後に類似の阻害が得られたが、一方、ＣｙａＡ１−３８３は、ビオチニル化されたＣｙａＡ−Ｅ５の結合に対し著しい効果を全くもたなかった。
【０１４７】
かくして、これらの結果は明らかに、残基３７３〜１７０６を包含するＣｙａＡのフラグメント，ＣｙａＡ３７３〜１７０６が、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタとの相互作用に基本的に必要とされる構造を含有しているということを実証している。
Ｅ．結論
ＭＨＣクラスＩ分子は通常、内因的に合成されたタンパク質から誘発されたペプチドを提示することから、ＣＴＬ応答を惹起するためには抗原提示細胞の細胞質ゾルに対しエピトープが送達されなくてはならない。組換え型ＡＣＴタンパク質のＣＴＬプライミング活性が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾル内にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを送達するその能力に少なくとも１部分依存しているということは、以前に実証されてきた。１つのアプローチでは、野生型毒素についてはポリペプチドのその部分が、その毒性効果を及ぼす標的細胞の細胞質ゾルに到達すること（すなわちｃＡＭＰ合成）がわかっているという理由で、ＣｙａＡの触媒ドメイン内にエピトープが遺伝学的に挿入された。細胞に入った後、エピトープインサートを包含するＣｙａＡ 触媒ドメインは、成熟したＣＤ＋Ｔ細胞エピトープを放出するためタンパク質分解によって処理されなくてはならず、このエピトープは次に小胞体に転座してＭＨＣクラスＩ分子と会合することになる。
【０１４８】
プロテアソームによって実施されたこのタンパク質分解処理は、数多くのケースにおいて制限的な段階であり得（Ｐａｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ， １９８８；Ｃａｓｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１），成熟エピトープの全体的収率の有意な減少を導く。ジスルフィド結合を用いてＣｙａＡの触媒ドメインにエピトープをリンクさせることから成るここで記述されている代替的アプローチは、この設計では、（Ｎ末端トリミングのみを必要とする）成熟エピトープがＡＰＣの細胞質ゾルの内部でＣｙａＡから適量で放出されることになるという点において、著しい利点を提供する。さらに、単一のＣｙａＡ担体タンパク質は、所望のあらゆる合成ペプチドに対し容易にかつ急速にカップリングされうることから、これは非常に汎用的なシステムであるはずである。その上、同じＣｙａＡ分子上に多数のペプチドをカップリングできるように、組換え型の解毒されたＣｙａＡ毒素の触媒ドメイン内（例えば以前にマッピングされた許容部位内ＷＯ９３／２１３２４（ＩＮＳＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲ）に複数のシステイン残基を遺伝子工学によって導入することも容易になる。これは、全体的なエピトープ送達及び組換え型タンパク質の免疫原性を増大させるはずである。
【０１４９】
欠失マッピングは、毒素とそのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプタの相互作用に関与する領域としてＣｙａＡのＣ末端部分（ａａ３７３−１７０６）を同定することを可能にした。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ１１ｂ＋細胞をターゲティングするためのタンパク質モジュールとして切形タンパク質ＣｙａＡ３７３−１７０６を使用することができる。特に、特異的免疫応答を惹起するために樹状細胞まで送達されるべきＣｙａＡ３７３−１７０６に、問題の抗原に対応するポリペプチド又はタンパク質を遺伝学的に融合させることができる。そのＮ末端として同じく唯一のシステインを含む組換え型ＣｙａＡ３７３−１７０６タンパク質上で、類似のカップリングを実施することも可能である。
【０１５０】
【表２】
2004508065.tif 000003
【０１５１】
【表３】
2004508065.tif 000004
【０１５２】
【表４】
2004508065.tif 000005
【０１５３】
【表５】
2004508065.tif 000006
【０１５４】
【表６】
2004508065.tif 000007
【０１５５】
【表７】
2004508065.tif 000008
【０１５６】
【表８】
2004508065.tif 000009
【０１５７】
【表９】
2004508065.tif 000010
【０１５８】
【表１０】
2004508065.tif 000011
【０１５９】
【表１１】
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【０１６０】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１：　ＣｙａＡの飽和可能結合は、ＣＤ１１ｂの発現と相関関係をもつ。
ａ；　マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）、Ｂ細胞（ＬＢ２７．４）及びＴ細胞（ＥＬ４）の表面におけるＣｙａＡ結合を２０分間３７℃で実施した。表面結合したＣｙａＡを、材料及び方法の節で記述されているように、ビオチニル化した抗−ＣｙａＡポリクローナル抗体で検出し、ストレプトアビジン−ＰＥで顕示させ、生きた細胞上のフローサイトメトリにより検出した。結合は、△ＭＦＩ＝（ＣｙａＡでインキュベートされた細胞の平均蛍光強度値）−（ＣｙａＡ無しの細胞の平均蛍光強度）として表現されている。
【図１Ｂ】
図１Ａの続き。
ｂ．ｃ．ｄ．ｅ　：　Ｊ７７４Ａ．１、ＬＢ２７．４及びＥＬ４細胞上のβ２インテグリンの表面発現。ＰＥにカップリングされた特異的ｍＡｂを用いてフローサイトメトリによりＣＤ１１ａ（ｂ）、ＣＤ１１ｂ（ｃ）、ＣＤ１１ｃ（ｄ）及びＣＤ１８（ｅ）発現を決定した。インテグリン発現は、△ＭＦＩ＝（特異的ｍＡｂで染色された細胞の平均蛍光強度値）−（イソ型対照ｍＡｂで染色された細胞の平均蛍光強度）、として表現される。
【図２】
図２：　マウス細胞系統に対するＣｙａＡ結合は抗ＣＤ１１ｂｍＡｂによって遮断される。
２０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂと共に又はこれを伴わずに１５分間４℃で細胞を予備インキュベートし、次に５μｇ／ｍｌのＣｙａＡそして予備インキュベーションの間に存在した場合には１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂと共に２０分間４℃でインキュベートした。表面結合したＣｙａＡを、材料及び方法の節で記述されているように、ビオチニル化された抗ＣｙａＡポリクローナルで検出し、ストレプトアビジン−ＰＥにより顕示させ、生きた細胞上のフローサイトメトリにより検出した。
ａ．ｂ．：　さまざまな用量のＣｙａＡの結合に対するＭ１／７０抗ＣＤ１１ｂｍＡｂの効果。ＦＳ樹状細胞樹状細胞（ａ）又はＪ７７４Ａ．１マクロファージ（ｂ）を、培地単独（○）で又はＭ１／７０抗ＣＤ１１ｂｍＡｂと共に（●）予備インキュベートし、次にＭ１／７０抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂを伴って又は伴わずにインキュベートした。ｍＡｂ無しで行なわれた実験から得た実験点を△ＭＦＩ＝Ｂｍａｘ＊（〔ＣｙａＡ〕／Ｋｄ＋〔ＣｙａＡ〕）に適合させることによってＢｍａｘを決定した。
ｃ．ｄ．：　定用量のＣｙａＡ結合に対する特異的ｍＡｂの効果。ＦＳＤＣ（ｃ）又はＪ７７４Ａ．１−（ｄ）細胞を特異的ｍＡｂ（抗ＣＤ１１ａ、２Ｄ７、抗ＣＤ１１ｂ、Ｍ１／７０及び５Ｃ６、抗−ＣＤ１１ｃ、ＨＬ３、抗−ＣＤ１８、Ｃ１７／１６、対照Ａ９５−１）を伴って又は伴わずに予備インキュベートし、５μｇ／ｍｌの定濃度でＣｙａＡと共にインキュベートした。ｍＡｂ無しのＣｙａＡ結合について得られた△ＭＦＩ値として、特異的ｍＡｂ、特異的ｍＡｂで処理した細胞上のＣｙａＡ結合について得た△ＭＦＩの値を正規化した。
【図３Ａ】
図３：　ヒト好中球に結合するＣｙａＡは、抗ＣＤ１１ｂ及び抗−ＣＤ１８ｍＡｂによって遮断される。
ａ．ｂ．ｃ．：　精製されたばかりの好中球の蛍光ヒストグラムを、培地単独（ａ）、４４抗−ＣＤ−１１ｂ　ｍＡｂ（ｂ）又はイソ型−整合した対照マウスｍＡｂ（ｃ）で予備インキュベートし、その後、ビオチニル化ＣｙａＡを伴って（灰色）又は伴わずに（白抜き）インキュベートし、ストレプトアビジン−ＰＥにより顕示させた。
【図３Ｂ】
図３Ａの続き。
ｄ：　好中球へのＣｙａＡ結合に対する特異的ｍＡｂの効果（抗ＣＤ１１ｂ、４４、Ｍ１／７０、抗−ＣＤ１８、ＴＳ／１８、対照マウスＩｇＧ２ａ、対照ラットＩｇＧ２ｂ、Ａ９５−１）。
精製したばかりの好中球を、特異的ｍＡｂを伴って又は伴わずに予備インキュベートし、ＣｙａＡと共にインキュベートした。ｍＡｂ無しのＣｙａＡ結合について得た△ＭＦＩ値のａ％として、特異的ｍＡｂで処理した細胞に対するＣｙａＡ結合について得た△ＭＦＩの値を正規化した。
【図４Ａ】
図４：　ＣｙａＡにより媒介される細胞内ｃＡＭＰの増大及び細胞死は、Ｊ７７４Ａ．１細胞内の抗−ＣＤ１１ｂｍＡｂにより特異的に遮断される。
ａ．：　細胞内ｃＡＭＰ蓄積に対する特異的ｍＡｂの効果。Ｊ７７４Ａ．１細胞を１時間４℃で、１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂ（抗−ＣＤ１１ｂ、Ｍ１／７０、抗ＣＤ−１８、Ｃ１７／１６）を伴って又は伴わずに予備インキュベートし、その後２０分間３７℃で、５μｇ／ｍｌのＣｙａＡを、予備インキュベーション中に存在した場合には１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを伴ってインキュベートした。細胞内ｃＡＭＰ含有量を、材料及び方法の節で記述されている通りに決定した。
【図４Ｂ】
図４Ａの続き。
ｂ：　ＣｙａＡが媒介した細胞死に対する特異的ｍＡｂの効果。Ｊ７７４Ａ．１ 細胞を１時間４℃で培地単独で又は１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂ（抗−ＣＤ１１ａ、２Ｄ７抗−ＣＤ１１ｂ、Ｍ１／７０、抗−ＣＤ１１Ｃ、ＨＬ３、抗−ＣＤ１８、Ｃ７１／１６、対照、２．４Ｇ２）と共に予備インキュベートした。その後、これらを０．５μｇ／ｍｌのＣｙａＡそして予備インキュベーション中存在している場合には１０μｇ／ｍｌの特異的ｍＡｂと共に２時間３７℃でインキュベーションした。Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ＴＭ検定を用いてＬＤＨ放出により細胞溶解を決定した。
【図５Ａ】
図５：　ＣＨＯ細胞は、ＣＤ１１ｃではなくＣＤ１１ｂでのトランスフェクションを受けた時点でＣｙａＡを結合させＣｙａＡに対する感応性をもつ状態となる。
ａ．ｂ．：　ＣＨＯトランスフェクタントの表面で結合するＣｙａＡ、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（●）、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８（○）でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞又はモックトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞（黒丸半円）を２０分間３７℃（ａ）又は４℃（ｂ）で２０分間、さまざまな用量のＣｙａＡでインキュベートした。材料及び方法の節で記述される通りに、表面結合したＣｙａＡをビオチニル化された抗ＣｙａＡポリクローナル抗体で検出し、ストレプトアビジン−ＰＥで顕示させ、生きた細胞上でのフローサイトメトリーにより検出した。結合は、△ＭＦＩ＝（ＣｙａＡと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度値）−（ＣｙａＡ無しの細胞の平均蛍光強度）として表現されている。
【図５Ｂ】
図５Ａの続き。
ｃ：　ＣＨＯトランスフェクタント内での細胞内ｃＡＭＰの蓄積。ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（●）、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８（○）でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞又はモックトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞（黒丸半円）を２０分間３７℃でＣｙａＡと共に又はＣｙａＡを伴わずにインキュベートした。材料及び方法の節で記述される通りに、細胞内ｃＡＭＰ含有量を決定した。
ｄ：　ＣＨＯトランスフェクタント内での細胞溶解。ヒトＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞又はモックトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞を３７℃で４時間５μｇ／ｍｌのＣｙａＡでインキュベートした。Ｃｙｔｏｔｏｘ９６ＴＭ検定を用いてＬＤＨ放出により細胞溶解を決定した。
【図６Ａ】
図６：　Ｃｙａ　ＡＯＶＡでの静脈内免疫化が、Ｂ細胞、ＣＤ４及びＣＤ４０に依存しない形で抗ＯＶＡＣＴＬ応答をプライミングする。
Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ＋／＋（ａ）、ＣＤ４−／−（ｂ）、ＣＤ４０−／−（ｃ）又はＩｇＭ−／−（ｄ）マウスを、ＯＶＡからのＨ−２Ｋｂ制限されたＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープを担持するＣｙａＡの遺伝学的に解毒された形態であるＣｙａＡＯＶＡ５０μｇを用いて、（●、○）又はＯＶＡエピトープ無しの対照の解毒された毒素であるＣｙａＡＥ５を用いて（黒三角、△）、静脈内で免疫化した。７日後、動物を屠殺し、脾細胞を、照射を受けたＣ５７ＢＬ／６脾細胞の存在下で１０μｇ／ｍｌのｐＯＶＡ合成ペプチドを用いて５日間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。１０μｇ／ｍｌでｐＯＶＡを用い予めパルス処理した（●、黒三角）又はしない（○、△）Ｈ−２Ｋ２ｂＥＬ４細胞に対する４時間のクロム５１放出検定内で、ＣＴＬ活性を査定した。
【図６Ｂ】
図６Ａの続き。
【図７Ａ】
図７：　静脈内免疫化の後の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｓｉｔｕでのＣｙａＡＯＶＡ提示に関与する脾細胞抗原提示細胞の同定。
脾細胞の低密度画分は、特異的抗−ＯＶＡＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマ（ａ、ｂ）に対しＣｙａＡＯＶＡを提示する：
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（ａ）：ナイーブマウス（ＴＳＣ、黒四角、□）由来の低（ＬＤＦ、●）及び高密度（ＨＤＦ、黒三角）画分又は未分画合計脾細胞を、Ｈ−２Ｋｂの状況下で、ｐＯＶＡペプチドに対し特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚで培養した。ＯＶＡペプチド（ＣｙａＡＯＶＡ、●、黒三角、黒四角）又は対照ペプチド（ＣｙａＡＬＣＭＶ、□）をさまざまな濃度で担持する組換え型解毒済みＣｙａＡの存在下での１８時間の同時培養の後、上清中で放出されたＩＬ−２をＣＴＬＬ増殖検定において測定した。結果は、△ｃｐｍ単位で表現され、検定中のＣｙａＡ濃度に対してプロットされている（△ｃｐｍ＝［ｃｐｍ＋ＣｙａＡ］−［ｃｐｍ−ＣｙａＡ］）。
Ｅｘ ｖｉｖｏ検定（ｂ）：　前もって５０μｇのＣｙａＡＯＶＡ（●、黒三角、黒四角）又はＣｙａＡＬＣＭＶ（○）で静脈内（ｉｖ）で免疫化した（６〜１２時間）マウスから脾細胞を得、ＬＤＦ及びＨＤＦにおいて分画した。ＴＳＣ（黒四角）、ＬＤＦ（●、○）、又はＨＤＦ（黒三角）から回収したさまざまな数の細胞又は未分画脾細胞（黒四角）を、組換え型ＣｙａＡを添加すること無く直接Ｂ３Ｚでの培養に付した。前述のように１８時間培養した後ＩＬ−２の放出を査定した。ｃｐｍ単位で表わした結果は、各ウェル内に存在するＡＰＣの数に対しプロットされている。
樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）はＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−細胞又はＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋）（ｃ、ｄ）よりもさらに効率の良いＡＰＣである：
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（ｃ）：　ＬＤＦからのＣＤ１１ｃ＋（●）選別細胞、ＴＳＣからのＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−（○）及びＣＤ４５Ｒ＋（黒四角）選別細胞を、さまざまな濃度のＣｙａＡＯＶＡの存在下で１８時間Ｂ３Ｚと共に培養に付した。ＩＬ−２を上述のように査定した。
Ｅｘ ｖｉｖｏ検定（ｄ）：　５０μｇのＣｙａＡＯＶＡで予め（６〜１２時間）免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスからフローサイトメトリーにより選別した細胞を、ＡＰＣとして使用した。低密度脾細胞からのＣＤ１１ｃ＋（●）、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ＋ＣＤ１１ｃ−（○）、ＣＤ４５Ｒ＋（黒四角）選別細胞を、ＣｙａＡＯＶＡの添加なくウェル１つあたりさまざまな細胞数でＢ３Ｚと共に直接１８時間培養させた。上述のとおり、ＩＬ−２を査定した。
ＣＤ８α−骨髄性樹状細胞は、ＣＤ８α＋リンパ樹状細胞サブセット（ｅ、ｆ）よりもさらにＣｙａＡについて効率の良いＡＰＣである：
ナイーブマウス（ｅ）又は予め（６〜１２時間）５０μｇのＣｙａＡＯＶＡでｉｖで免疫化されたマウス（ｆ）からのＣＤ１１ｃ＋低密度細胞を、骨髄性樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋Ｄ８α−、●）及びリンパ樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋Ｄ８α＋、○）内でフローサイトメトリーにより分画し、Ｂ３Ｚ刺激について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅ）及びｅｘ ｖｉｖｏ（ｆ）検定においてＡＰＣとして使用した。ＩＬ−２を上述の通り査定した。
Ｂ細胞遺伝学的枯渇は、脾細胞（ｇ、ｈ）によるＣｙａＡＯＶＡ提示を損なわない：
Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウス（黒四角、●、黒三角）又はＢ細胞欠損マウス（□、○、△）からのＴＳＣ（黒四角、□）、ＬＤＦ（●、○）又はＨＤＦ（黒三角、△）を、ａの場合と同様に、Ｂ３Ｚについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（ｇ、黒四角、□）又はｅｘ ｖｉｖｏ検定（ｈ、黒四角、●、黒三角、□、○、△）においてＡＰＣとして使用した。マウスは、ナイーブ（ｇ）のもの又は予め（１．５時間）ｉｖで５０μｇのＣｙａＡＯＶＡで免疫化されたもの（ｈ）のいずれかに由来していた。上述の通りＩＬ−２を査定した。
【図７Ｂ】
図７Ａの続き。
【図８】
図８：　樹状細胞によるＣｙａＡＯＶＡの提示は、静脈内免疫化の後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＴＡＰ輸送体を必要とする。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（ａ）：　対照Ｃ５７ＢＬ６　ＴＡＰ＋／＋（黒三角、●）又はＴＡＰ−／−マウス（△、○）からのＴＳＣ（黒三角、△）又はＣＤ１１ｃ＋（●、○）選別細胞を、さまざまな用量のＣｙａＡＯＶＡの存在下又は不在下でＢ３Ｚを用いて培養した。図６ａに描かれている通り、ＩＬ−２を査定した。結果は、抗原濃度に対しプロットされ、ｃｐｍ単位で表わされている。
Ｅｘ ｖｉｖｏ検定（ｂ）：対照Ｃ５７ＢＬ６ＴＡＰ＋／＋（黒三角、●）又は予めｉｖで５０μｇのＣｙａＡＯＶＡで免疫化されたＴＡＰ−／−マウス（△、○）からのＴＳＣ（黒三角、△）又はＣＤ１１ｃ＋（●、○）選別細胞を、１８時間Ｂ３Ｚで培養した。図６ａに描かれている通り、ＩＬ−２を査定した。結果は、同時培養された細胞の数に対してプロットされ、ｃｐｍ単位で表わされている。
【図９ａ】
図９：　細胞に対するＣｙａＡＯＶＡ結合におけるαＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ）の役割
ＴＳＣに対するＣｙａＡＯＶＡビオチンの結合は、抗−ＣＤ１１ｂ（ａ）によって遮断される：　ＴＳＣ懸濁液を、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１１ｂＭ１／７０ｍＡｂ又はイソ型対照ｍＡｂと共に、又は全く何も無く、４℃でインキュベートした。その後、２μｇ／ｍｌ（左図版）又はさまざまな濃度（右図版）のＣｙａＡＯＶＡ−ビオチンを４℃で３０分間細胞に添加した。洗浄の後、３０分間ストレプトアビジン−ＰＥでＣｙａＡＯＶＡ−ビオチンを顕示させた（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ）。その後、洗浄後、細胞を、ヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ中で細胞を再懸濁させた。ヨウ化プロピジウム排除によりゲートされた生きた細胞のサイズ（ＦＳＣ）を、Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ蛍光に対しプロットした。染色中のＣｙａＡＯＶＡ−ビオチン濃度に対し、ＣｙａＡＯＶＡ−ビオチンについて陽性のリンパ球の百分率をプロットした。
【図９ｂ１】
図９ａの続き。
低密度細胞に対するＣｙａＡＯＶＡ−ビオチンの結合は、ＣＤ１１ｂ（ｂ）の発現と相関関係を有する：ＬＤＦを、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８α及びＣｙａＯＶＡ−ビオチン（又は培地）について３重染色するか、又は別の実験においては、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８α及びＣＤ１１ｂ（又は対照ｍＡｂ）で染色した。洗浄後、細胞をＳｔｒｅｐ−ＰＥで３０分間染色してＣｙａＡＯＶＡ−ビオチン、抗−ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ及び抗−ＣＤ８α−ＡＰＣを顕示した。リンパＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋）、骨髄性ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α＋）及びその他の細胞（ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α−）についてゲートを行なった。各ゲートについて、ＣｙａＡＯＶＡ−ビオチン染色又はＣＤ１１ｂ染色が、別々のヒストグラム内で細胞数に対しプロットされている。左側ヒストグラム：ＬＤＦ懸濁液を０μｇ／ｍｌ（灰色で満たされたヒストグラム）、２．５μｇ／ｍｌ（狭く、開放したヒストグラム）又は１０μｇ／ｍｌ（厚く、開放したヒストグラム）のＣｙａＡＯＶＡ−ビオチンと共に３０分間室温でインキュベートした。右側ヒストグラム：イソ型対照−ＰＥ（灰色で満たされたヒトスグラム）、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（薄く、開放したヒストグラム）。
【図９ｂ２】
図９ｂ１の続き。
【図１０】
図１０：　ＭＨＣＩによるＣｙａＡＯＶＡ提示におけるαＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂの役割
ＴＳＣ（ａ、ｂ）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原提示検定：ａ、ｂの場合と同じ実験を、ＡＰＣとしてナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからのＴＳＣを用いて実施した。Ｂ３Ｚの刺激を、ＣＴＬＬ増殖検定で測定された同時培養上清中のＩＬ−２放出により査定した。ＣｙａＡＯＶＡ又はｐＯＶＡ濃度に対し、ｃｐｍ単位で結果がプロットされている。
ＴＳＣ又はＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ−画分（ｃ、ｄ）でのｅｘ ｖｉｖｏ抗原提示検定：　Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５０μｇのＣｙａＡＯＶＡ（ｃ）又は１０μｇのｐＯＶＡ（ｄ）で静脈内免疫化した。ＴＳＣ（△）からフローサイトメトリーによってＣＤ１１ｂ＋（●）及びＣＤ１１ｂ−（○）細胞を選別し、Ｂ３Ｚで１ウェルあたりさまざまな細胞数で培養に付した。１８時間の同時培養の後、Ｂ３Ｚの刺激をＩＬ−２放出により査定した。ｃｐｍ単位で表わした結果は、各ウェル内に存在する免疫化された動物からのＡＰＣ数に対しプロットされている。
【図１１】
図１１：　ジスルフィド結合を通した組換え型ＣｙａＡに対するエピトープの化学的カップリング方法のまとめ。
【図１２】
図１２：　ＣＴＬエピトープの化学的カップリングのためのベクターのダイヤグラム
【図１３】
図１３：　ＣＴＬＬ増殖検定において測定されたＢ３ＺによるＩＬ−２放出を示すグラフ。
Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの３・１０５個の脾細胞を、さまざまな濃度のシクラーゼの存在下で１０５個のＢ３Ｚ細胞と１８時間同時培養した。Ｂ３ＺによるＩＬ２放出をＣＴＬＬ増殖検定において測定した。
【図１４Ａ】
図１４：　５０μＭのＯＶＡペプチドでパルス処理された（Ａ）又はされていない（Ｂ）５１Ｃｒ標識づけされたＥＬ４標的細胞上で測定された細胞毒性活性を示すグラフ
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをさまざまなＣｙａＡ５０μｇで静脈内注射した。７日後、脾細胞をＯＶＡペプチドでｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。５１Ｃｒで標識づけされた標的細胞上で、細胞毒性活性を測定した。
図１４は、ＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答を誘発する本発明のタンパク様ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ能力を示す。
【図１４Ｂ】
図１４Ａ続き。
【図１５】
図１５：　ＣｙａＡ−Ｅ５及びＣｙａＡフラグメントによるＣＤ１１ｂに対するＣｙａＡ結合の阻害
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８でのトランスフェクションを受けたＣＨＯ細胞を、異なる濃度のＣｙａＡ−Ｅ５（黒色三角形）、ＣｙａＡｌ−３８３（黒色四角形）又はＣｙａＡ−３７３−１７０６（黒色菱形）と共に１時間氷上で予備インキュベートし、次に、５μｇ／ｍｌのビオチニル化されたＣｙａＡ−Ｅ５で３０分間氷上でインキュベートした。表面結合したシクラーゼをストレプトアビジン−ＰＥを用いて顕示させ、生きた細胞上でフローサイトメトリーにより分析した。結果は平均蛍光強度（Ａ）、陽性細胞百分率（Ｂ）及び阻害百分率（Ｃ）として示されている。
【図１６】
図１６：　ｐＴＲＡＣ−３７３−１７０６発現ベクターの概略的表示
大きい矢印は、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、ファージラムダの感熱性リプレッサｃｌ８５７（λｃｌ８５７）、ＣｙａＣ遺伝子及び切形 ’ＣｙａＡ遺伝子の読取り枠を表わす（矢印は、対応する遺伝子の翻訳方向を指している）。ＣｏｌＥ１起点（Ｏｒｉ）、Ｐｒプロモータ（λＰｒ）及びいくつかの関連制限部位も同様に表示されている。ｃｙａＣと切形 ’ｃｙａＡ 遺伝子の間の遺伝子間領域は、下部に詳しく示されている。これは、ｃｙａＣの新しいＣ末端拡張（野生型ＣｙａＣのＡｒｇ１８２の下流側）、停止コドン（下線付き）、ＣｙａＡ３７３−１７０６のイニシエータＭｅｔ及び第１のコドン（野生型Ｃｙａ−Ａの上流側）を示している。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９ａ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508065.tif 000129
【国際調査報告】
2004508065.tif 000130
2004508065.tif 000131
2004508065.tif 000132
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