(57)【要約】本発明は、細菌汚染防止のための食品処理に有用な、新規バクテリオファージ組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージ分離株Ｂ１を含んでなる精製バクテリオファージ組成物。
【請求項２】
バクテリオファージ分離株Ｂ３を含んでなる精製バクテリオファージ組成物。
【請求項３】
バクテリオファージ分離株１１９Ｕを含んでなる精製バクテリオファージ組成物。
【請求項４】
バクテリオファージ分離株１４６Ａを含んでなる精製バクテリオファージ組成物。
【請求項５】
Ｂ１、Ｂ３、１１９Ｕおよび１４６Ａからなる群から選択される少なくとも２つのバクテリオファージ分離株を含んでなるバクテリオファージ組成物。
【請求項６】
食品での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、バクテリオファージ分離株Ｂ１を含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記食品を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項７】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
バクテリオファージ組成物を除去するために食品を水性媒質と接触させる洗浄ステップをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
食品が果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
大腸菌微生物が毒素産生性大腸菌Ｏ１５７である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
食品での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、バクテリオファージ分離株Ｂ３を含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記食品を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項１２】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バクテリオファージ組成物を除去するために食品を水性媒質と接触させる洗浄ステップをさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
食品が果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
大腸菌微生物が毒素産生性大腸菌Ｏ１５７である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
食品での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、バクテリオファージ分離株１１９Ｕを含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記食品を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項１７】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バクテリオファージ組成物を除去するために食品を水性媒質と接触させる洗浄ステップをさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
食品が果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
大腸菌微生物が毒素産生性大腸菌Ｏ１５７である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
食品での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、バクテリオファージ分離株１４６Ａを含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記食品を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項２２】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バクテリオファージ組成物を除去するために食品を水性媒質と接触させる洗浄ステップをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
食品が果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
大腸菌微生物が毒素産生性大腸菌Ｏ１５７である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
食品での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、Ｂ１、Ｂ３、１１９Ｕおよび１４６Ａからなる群から選択された少なくとも２つのバクテリオファージ分離株を含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記食品を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項２７】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
バクテリオファージ組成物を除去するために食品を水性媒質と接触させる洗浄ステップをさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法
【請求項２９】
食品が果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
大腸菌微生物が毒素産生性大腸菌Ｏ１５７である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
食品と接触する表面での大腸菌微生物の増殖を防止する方法であって、微生物の増殖を抑制するのに有効な量の、Ｂ１、Ｂ３、１１９Ｕおよび１４６Ａからなる群から選択された少なくとも２つのバクテリオファージ分離株を含んでなるバクテリオファージ組成物と、前記表面を接触させることを含んでなり、その際、前記バクテリオファージ組成物の適用時間は、食品での微生物の増殖を防止するために少なくとも一瞬間とする、上記方法。
【請求項３２】
前記接触が噴霧、霧吹き、ディッピング、もしくはソーキングによる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記表面が、果汁、野菜汁、農産物、鶏肉、牛肉、羊肉および豚肉からなる群から選択される１以上の食品と接触する、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による細菌汚染を防止するための食品処理に有用なバクテリオファージ組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
米国疾病管理・予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ （ＣＤＣ））の推定によると、毎年３３００万人（すなわちアメリカ人のおよそ１０人に１人）もの多数の人が食中毒に罹り、約９，０００人が死亡している。食中毒は、１両日中に治癒するウイルス性胃腸炎、いわゆる「お腹にくる風邪」と間違えられることが多いので、食中毒に罹患した人の実数はおそらくこれより相当多いはずである［Ｃｅｒｒａｔｏ，Ｐ．， “Ｗｈｅｎ ｆｏｏｄ ｉｓ ｔｈｅ ｃｕｌｐｒｉｔ； ｆｏｏｄ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ，” ＲＮ， ６２（６）：５２（Ｊｕｎ． １， １９９９）］。国の食糧供給における食物由来病原体の存在は、地域住民の健康に影響を及ぼすのみならず、その国への来訪者や食品輸入国の消費者に病原体を蔓延させる可能性を示す［Ｂｕｚｂｙら、”Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｃｏｓｔｓ ａｎｄ ｔｒａｄｅ ｉｍｐａｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ ｉｌｌｎｅｓｓ，” Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ． Ｑ．， ５０（１−２）：５７−６６（１９９７）］。
【０００３】
微生物汚染による食中毒を予防することは、食品加工業、監督機関、および消費者にとって重要な関心事である。食品の微生物汚染は、加工設備に入れる前にも、加工環境における二次汚染によっても、発生する。米国農務省食品安全・検査部（Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ （ＦＳＩＳ））は、食物由来病原体の発生および病原体数を減少させるために、新たな危害分析重要管理点（ＨＡＣＣＰ）要件を制定した。食品加工業者はこうした規制を満たさなくてはならない。このような微生物減少を達成する手段は加工業者の自由裁量に任されているが、ＦＳＩＳは抗菌処理がＨＡＣＣＰ計画の重要な構成要素となることを求めている。本発明の処理法は、本発明のバクテリオファージ組成物の製剤を使用するものであり、ＨＡＣＣＰ要件を満たすために有効である。
【０００４】
微生物汚染のない製品を提供するために、家禽肉や獣肉の加工業者は、食品とする予定の家禽肉や獣肉組織を汚染する微生物の除去について重大な困難に直面している。
【０００５】
大腸菌
大腸菌はほとんどの温血動物の正常な腸内細菌叢の一部をなすグラム陰性短桿菌である。この生物は大腸においてもっとも一般的な通性嫌気性菌であり、他の有害微生物の定着に抗して保護を与える。しかしながら、腸疾患を引き起こす５種類の別個の大腸菌群が存在する：（１）腸管組織侵入性大腸菌、（２）腸管病原性大腸菌、（３）腸管毒素原性大腸菌、（４）腸管凝集性大腸菌、（５）腸管出血性大腸菌［Ｐｉｌｏｔら、”Ｔｈｒｅａｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｗｅ ｅａｔ； ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ａｒｔｉｃｌｅｓ； Ｎｅｗ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ， ｐａｒｔ ３，” Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ， ２８：４２（１９９６年４月）］。
【０００６】
１９８２年に初めて報告された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、志賀赤痢菌様毒素（ベロ毒素）１および２を産生する腸管出血性大腸菌に属する［Ｐｉｌｏｔら（１９９６年４月）；および”Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｔｓ Ｕｒｇｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｅｆ ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｄｅａｄｌｙ Ｂａｃｔｅｒｉａ，” Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ， １９９４年７月１４日、Ａ１５頁］。
【０００７】
腸管内で大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７によって産生される毒素は、軽い下痢から重症の出血性大腸炎までいかなることも引き起こしうるが、ここにおいて腸管内層の細胞が損傷を受け、それによって下血に至る。全体の１６％もの症例において、この感染症はより重篤な状態、すなわち溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）へと進行する［Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， Ｄ． Ｌ．， “Ｗｈｅｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｕｒｎｓ ｄｅａｄｌｙ，” ＲＮ， ６２（７）：２８（１９９９年７月１日）］。ＨＵＳは、損傷を受けた腸管壁から細菌毒素が血流中に入り、腎臓に血液を供給する細動脈に移行し、続いてそれらの血管を損傷する場合に発生するが、このＨＵＳは溶血性貧血、血小板減少、および急性腎不全を特徴とする。さらに、ＨＵＳ患者のおよそ１０〜５０％は、心筋症、肺疾患、心膜液貯留、末期腎臓病、慢性高血圧、高血糖、および脳障害を含めた長期にわたる後遺症が現れる［Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， Ｄ． Ｌ． （１９９９年７月１日）］。
【０００８】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、米国におけるＨＵＳの主原因であり、また、小児の急性腎不全の主原因でもある。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７感染の発生全体は不明であるが、シアトル地区における１９９４年の発生に基づく推計から、米国では毎年２０，０００例以上発生し、そのうち２５０例が死に至ることが示唆される［Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， Ｄ． Ｌ． （１９９９年７月１日）；および”Ｂａｎ ｔｈｅ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｂｏｍｂ，” Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ａｃｔｉｏｎ Ｈｅａｌｔｈｌｅｔｔｅｒ， ２２：３（１９９５年１月／１９９５年２月）］。幼児、高齢者、および免疫系の弱まった人は、もっとも感染しやすく、さらに合併症を併発しやすい。
【０００９】
大腸菌Ｏ１５７感染症の治療法はまったく知られていない［Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ａｃｔｉｏｎ Ｈｅａｌｔｈｌｅｔｔｅｒ， ２２：３（１９９５年１月／１９９５年２月）］。抗生物質は感染を阻止するためにはほとんど役に立たない［”Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｔｓ Ｕｒｇｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｅｆ ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｄｅａｄｌｙ Ｂａｃｔｅｒｉａ，” Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ， １９９４年７月１４日、Ａ１５頁；およびＣｅｒｒａｔｏ， Ｐ． （１９９９年６月１日）］。
【００１０】
大腸菌の上記菌株がこれほど危険である理由の１つは、この菌株が、コレラの原因となる細菌が病気を引き起こす前に菌数１０，０００，０００以上も必要であるのと比較して、非常に小量、すなわち１，０００以下の摂取で、病気を発症させることができるためである［Ｃｅｒｒａｔｏ， Ｐ． （１９９９年６月１日）］。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は６９程度に少ない菌数で病気を発症させることができるとの報告がいくつかある［Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ， １９９４年７月１４日、Ａ１５頁］。大腸菌で汚染されたサイダー半カップほどで、腹痛、出血性下痢、嘔吐、発熱を引きおこすことがある［”Ｒｏａｄｓｉｄｅ ｃｉｄｅｒ ｍａｙ ｂｅ ｒｉｓｋｙ； ｍａｙ ｂｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅ． ｃｏｌｉ，” Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １６：８（１９９０年９月）］。そのような少量の病原菌は通常の食肉検査法では検出不能であり、また、汚染食品の存在は視覚、味覚、臭覚によっても識別不能である［Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｔｉｍｅｓ， １９９４年７月１４日、Ａ１５頁］。同様に、この病原菌の酸耐性は他の病原菌に比して有利である。食物起因性疾患を防御する胃腸管の最初のラインの一つである胃酸は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対してほとんど効果を示さない［Ｃｅｒｒａｔｏ， Ｐ． （１９９９年６月１日）］。
【００１１】
大腸菌Ｏ１５７は恒常的に健康な牛の糞便中に見いだされ、汚染された食物、水、および感染した人または動物との接触によって、人に感染する［Ｍｅａｄら、”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，” Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ， ３５２（９１３５）：１２０７−１２１２（１９９８年１０月１０日）］。感染症の伝染は、主として加熱が不十分な牛挽肉、汚染された飲料水、殺菌されていない牛乳の摂取に関連している。ハンバーガーは食品を介した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７感染発生の主要な媒介物である［Ｋｏｕｔｋｉａら、”Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ， ５６：８５３（１９９７年９月１日）］。
【００１２】
屠殺処理中に、感染牛の腸液または糞便が肉の表面にこぼれ落ち、肉を汚染する可能性がある。生肉の表面についた有害細菌は肉挽き加工の間に肉全体に混ぜ込まれることとなり、その場合、調理の加熱を凌いで生き残る可能性が高まる。１つのハンバーガーパティは多数の牛の肉を含む。
【００１３】
現在、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７はベロ毒素産生性大腸菌血清型のなかで最も多く見られる。様々な情報源が示唆するところでは、この菌はすべての毒素産生性分離株の約６０〜９０％以上を占め、食物源が関与している場合の発生の大半の原因となっていた［Ｐｉｌｏｔら、（１９９６年４月）］。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の分布はおそらく全世界にわたるであろう；症例の大部分は北米およびヨーロッパで報告されている［Ｐｉｌｏｔら、（１９９６年４月）］。
【００１４】
細菌汚染を排除するための現行の食品処理法
Ａ．　放射線照射
食品の放射線照射は、食品に電離放射線（イオン化エネルギーとも称する）を当てることによる食品の処理法である。この処理に用いられる放射線は、コバルトもしくはセシウムのいずれかの放射性同位体から、または制御された量の高エネルギー電子線、ガンマ線、もしくはＸ線を生じる装置から発せられる。こうした処理で、食品が放射能を有することはなく、またあり得ない［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、”Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｆｏｏｄ，” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｕｎｓｉｌ ｏｎ Ｓｃｉ． ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｂｏｏｋｌｅｔｓ， １−２８（１９９６年４月３０日）］。
【００１５】
食品を処理するために使用される放射線は「電離放射線」と称されるが、これはイオン、すなわち電荷を帯びた粒子、を生じるためである。Ｘ線、ガンマ線、および電子加速器によって発生する高エネルギー電子線を含む電離放射線は、可視光線、テレビ波、電波およびマイクロ波といった、他の非電離放射線よりも高いエネルギーを有する［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９９６年４月３０日）］。
【００１６】
食品の放射線照射は、食品の安全性問題に対する１つの解決法として提案された。食品の放射線照射は、小麦粉中の昆虫防除のために１９６３年にＦＤＡによってはじめて認可され、ジャガイモの発芽防止のために１９６４年に再度認可された。後に、香辛料、農産物、および家禽肉に使用するために認可され、１９９８年１２月３日には、病原微生物を制御するために牛肉、羊肉および豚肉について認められた［Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ａ．，”Ｆｏｏｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ： Ｗｅ Ｍａｙ Ｂｅ Ｚａｐｐｉｎｇ Ｕｐ Ｔｈｅ Ｗｒｏｎｇ Ｔｒｅｅ，” Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １７（１２）： １（１９９４年１２月３１日）］。
【００１７】
食品処理には２つの放射線源が実用的である。第１は、ガンマ線を発する放射性元素−−コバルト６０またはセシウム１３７−−の入った厳重に密閉された金属容器である。ガンマ線は照射されるべき食品の方に向けられているが、食品それ自体はコバルトにもセシウムにも決して触れることはない。第２のタイプの放射線源は、Ｘ線および高エネルギー電子線を発生させる機械装置である。これらの線源はいずれも、照射された食品が放射性となるほどのエネルギーは有していない［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９９６年４月３０日）］。
【００１８】
放射線照射処理時に、食品はコンベヤーベルトに載せて密閉されたチャンバー内に運ばれ、そこで放射線源から高エネルギー線量の照射を受ける（通常は、放射性コバルトからのガンマ線）。このエネルギーは食品中の分子を破壊し、損傷の原因となる昆虫、カビ、真菌および細菌、ならびに食物起因性疾患を引き起こす病原体を死滅させる［Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ａ． （１９９４年１２月３１日）］。
【００１９】
消費者保護団体は、食品への放射線照射が万能の解決策ではないと警告する。事実、照射はそれ自体安全上の危険性をもたらすと彼らは主張する。たとえば、食品照射反対論者は、こうした処理が栄養素（ビタミンＡ、Ｃ、およびビタミンＢ群の１つであるチアミン）を激減させることを示す研究を引き合いに出す。放射線量が多ければ多いほど、損失も大きくなる。その上、照射された食品はさらに、栄養素が激減する通常の加工処理を受けねばならず、損失が倍加する［Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ａ． （１９９４年１２月３１日）］。
【００２０】
食品照射は、いずれも発ガン物質として知られるベンゼンおよびホルムアルデヒドといった残留物質を生成する。また、放射線分解生成物と称されるフリーラジカルおよび化学変化した食品成分を発生させるが、これらの長期的な健康への影響は不明である［Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ａ． （１９９４年１２月３１日）］。こうした食品照射による変化が、ガンの増加につながる可能性があるとの仮説が取り上げられる（同上）。さらに、消費者受容に関する報告は様々である。Ｔｈｅ Ｅｃｏｎｏｍｉｓｔ に初めて報告された、放射線照射された牛肉の味覚検査は、消費者が「焦げた髪の毛」の味と評したため、無惨にも失敗した［Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ａ． （１９９４年１２月３１日）］。
【００２１】
細菌防除法としての放射線照射のもう１つの欠点は、加熱処理と同様に、放射線照射が未包装の食品中に、再蔓延から食品を守る活性物質を何も残さないことである［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９９６年４月３０日）］。
【００２２】
Ｂ． 肉の化学的処理
食肉製品中の微生物を減らすために、いくつかの化学的および物理的方法が提案された。たとえば、塩素もしくは二酸化塩素、オゾン、過酸化水素、乳酸、炭酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、および電気的刺激を利用することである。概して、これらの方法は微生物汚染の低減に関して限定的な効果しか示さなかったが、食肉製品の外見には影響を及ぼすと考えられる。加えて、こうした研究が示すところでは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のような病原体を死滅させるためには、しばしば容認しがたいほど高レベルの化学薬品を必要とする（同上）。
【００２３】
たとえば、参考として本明細書に援用される米国特許第５，３６６，９８３号は、有効量の第４アンモニウム陽イオン界面活性剤、たとえばアルキルピリジニウム、特に塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）および臭化セチルピリジニウム（ＣＰＢ）の水溶液を用いた処理によって、食肉製品のサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）汚染を除去または防止する方法を開示している。
【００２４】
放射線照射による駆除は、現在では禁止されている燻蒸剤、二臭化エチレン（ＥＤＢ）のかつての用途を一部代替することができる。こうした代替可能性が、米国における放射線照射への新たな関心の主要な理由の１つであるが、それは、現在ＥＤＢの代わりに用いられる化学燻蒸剤が、それを使用しなければならない労働者への危険を高めることを含めて、重大な欠点を抱えているためである［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９９６年４月３０日）］。
【００２５】
化学的消毒剤の他の欠点は、こうした化学薬品の残留物が必ず食品に残ることである［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９９６年４月３０日）］。
【００２６】
化学的消毒剤による処理は、耐性菌を生じる可能性もある［”Ｇｒｏｗｉｎｇ Ｍｅｎａｃｅ： Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ’Ｓｕｐｅｒｇｅｒｍｓ’，” Ｔｈｅ Ｉｎｔ’ｌ． Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ， ＩＩ（３−４）：１８ （１９９８年、秋）； Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｃ．， “Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ，” Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｑ．， ２０（３）：２１（１９９７年、１１月）］。
【００２７】
Ｃ． パルス光
細菌汚染を除去するために食品を処理するさらに別の方法が、パルスパワー励起法（ＰＰＥＴ）によって発生する高輝度発光による処理である［ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、”Ｌｉｇｈｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｕｌｓｅｄ ｐｏｗｅｒ ｓｏｕｒｃｅ，” Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２７（２）：６７−７０（１９９８年）］。この方法は、光源において、数メガワット（ＭＷ）ものピーク電力を、極めて短い通電時間（約１（ｍｕ）ｓ）に放散させることを含んでなる。光源を、従来の持続的な通電操作のもとで達成されるよりも強い電場にさらすと、殺菌作用のある、より短い波長の光が一層多く発生することとなる。
【００２８】
パルス光放射は露出表面上の細菌汚染を顕著に減少させることしかできないため、上記方法の有用性は限られる。こうした方法は例えば挽肉ハンバーガーの処理には役に立たない。このことが重要であるのは、最近の研究が、例えばリンゴのような食材の内部に大腸菌が存在する可能性を示しているためであり、これらの食材はパルス光の方法によって処理できないと考えられる［Ｂｕｃｈａｎａｎら、”Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ａｐｐｌｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，” Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．， ６２（５）：４４４−５０（１９９９年５月）］。
【００２９】
当技術分野においては、大腸菌、特に毒素産生性大腸菌、による細菌汚染を除去するために食品を処理する優れた組成物および方法が必要とされている。本発明はこうした必要性を満たすものである。
【００３０】
発明の概要
本発明は、大腸菌、特に毒素産生性大腸菌、による細菌汚染を最小限に抑え、もしくは除去するための食品処理に有用な新規ファージ組成物に関する。このファージ組成物は、適当な担体を用いて製剤化することができる。
【００３１】
また、食肉（家禽肉、牛肉、羊肉および豚肉を包含するがこれに限定されない）、ジュース、香辛料および農産物といった食品を処理する方法も本発明に含まれる。
【００３２】
前記の一般的説明と以下の詳細な説明はいずれも、例証的かつ説明的なものであって、特許請求の範囲に記載された発明をさらに説明することを意図している。その他の目的、効果、および新たな特徴は、以下の発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００３３】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、大腸菌、特に毒素産生性大腸菌、による細菌汚染を最小限に抑え、もしくは除去するための食品処理に有用な新規ファージ組成物に関する。このファージ組成物は、適当な担体を用いて製剤化することができる。
【００３４】
バクテリオファージＢ１およびＢ３は、宿主として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株を用いて、生下水から分離された。ファージ１４６Ａおよび１１９Ｕは尿路感染（ＵＴＩ）分離株から分離された。ファージＢ１およびＢ３は、１９９８年６月２４日に受託番号２０３０００および２０９９９９としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）に寄託された。ファージ１４６Ａは１９９７年４月１４日に受託番号５５９５０として、また、ファージ１１９Ｕは１９９８年６月２４日に受託番号２０９９９８として、いずれもＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。バクテリオファージ組成物は水性または非水性媒質中に存在することができる。
【００３５】
本発明は、食品での大腸菌の増殖を防止するために、微生物の増殖を抑制するのに有効な量のバクテリオファージ組成物と食品を接触させることを含んでなる、食品での微生物の増殖を妨げる方法を提供する。ここで上記組成物は、バクテリオファージ分離株Ｂ１、Ｂ３、１１９Ｕ、１４６Ａ、もしくはそれらの混合物を含んでなる。食品での微生物の増殖防止は、ヒトや動物において病気を引き起こす、あるいは摂取前に食品の腐敗を引き起こす可能性のある生存微生物が全くない、またはこれを最低数含有する食品を提供することを目的としている。
【００３６】
食品での微生物の増殖防止は、以下の機序を包含することを意図するものであるが、それに限定されない：（１）付着している微生物の食品からの除去；（２）食品への微生物の付着の防止；（３）食品に付着した微生物の殺菌もしくは不活性化；ならびに（４）食品には付着していないが、加工処理時に、例えば冷却槽内で、食品に関わる液体中に存在するか、または食品調理に関わる表面、そうした表面（たとえば調理台、まな板およびシンク）上に残存する液体、ならびに食品調理および食品の消毒に使用された道具に存在する微生物の死滅もしくは不活性化。
【００３７】
本発明は、食品加工業において重要な用途を有するが、家庭や施設での食品調理についても同様である。本発明のバクテリオファージ組成物は簡単に入手可能であり、本発明の方法を実施するコストは、既存の抗菌処理と比較して高くない。たとえばリン酸三ナトリウムを用いた既存の処理とは異なり、本発明のバクテリオファージ組成物の使用は、食品の外観、色、味、もしくは食感を変化させない。その上、本発明のバクテリオファージ組成物は毒性がない。
【００３８】
バクテリオファージ組成物は、食品に存在する大腸菌を殺すために十分な時間、適用される。バクテリオファージ組成物の適用時間は、結果的に食品での大腸菌の増殖を顕著に防止するのに十分な時間とすることが重要である。
【００３９】
また本発明は、本発明のバクテリオファージ組成物を食品と接触させる方法を包含する。その方法は、組成物を食品上に噴霧もしくは霧吹きすること、または本発明の１以上のバクテリオファージを含んでなる組成物中に食品を浸すことを包含するが、これに限定されない。
【００４０】
本発明は、噴霧、霧吹き、ディッピング（ｄｉｐｐｉｎｇ）、ソーキング（ｓｏａｋｉｎｇ）を含めた何らかの直接的な手段によってバクテリオファージ組成物を食品と接触させる、あらゆる方法を包含することを意図するものである。ただし、本発明は、例えば加工、調理、保存、および／または包装の間に食品が接触する道具や食品加工調理表面を本発明のバクテリオファージ組成物で処理するといった、本発明のバクテリオファージ組成物と食品との間接的な手段による接触を包含することも意図する。
【００４１】
バクテリオファージ組成物と食品とを接触させるいかなるタイプの方法も、適用時間を短くすることが可能である限り、本発明の方法として有用である。食品の噴霧または霧吹きを提供するキャビネットを利用する方法は、本発明に有用である。食品加工プラントにおける加工ライン上のこうしたキャビネット内で用いる機械類は、食品に関する有効な抗菌効果を達成する一方で、適用時間を最小限にまで短くするように適応させることができる。
【００４２】
本発明の方法は、例えば、冷水の入った冷却槽に浸漬されていた冷蔵後の鶏肉を処理する家禽肉加工プラントで役立つ。鶏肉を冷却槽から取り出し、鶏肉において微生物の増殖を顕著に阻止するのに十分な適用時間のあいだ、本発明のバクテリオファージ組成物を用いて処理する。処理された鶏肉は、その後、さらに洗浄やすすぎをすることなく包装される。しかしながら、必要と判断されれば、前記方法は、包装前に最低１回の鶏肉の洗浄ステップを包含してもよい。任意の洗浄ステップは、食品に水を噴霧もしくは霧吹きすること、または水の入った容器もしくは水槽に食品を浸すことを包含する。
【００４３】
さらに、本発明の方法は、食品を本発明のバクテリオファージ組成物と接触させる前に、処理前の食品における微生物の存在を判定するための判定ステップを包含してもよい。微生物の存在を迅速に判定するあらゆる従来法を判定ステップとして使用することができるが、これには例えば、ＰＣＲおよびイムノアッセイがある。
【００４４】
さらに、本発明の方法は、バクテリオファージ組成物と接触した後の食品表面に本発明のバクテリオファージ組成物が存在することを判定するステップを含んでいてもよい。この判定は、接触ステップの直後に、もしくは数回の洗浄ステップの直後に行われる。たとえば、本発明のバクテリオファージ組成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に適した状態で食品の組織から抽出される。
【００４５】
家庭、レストランまたは施設の食品調理はもとより食品加工業は、多数の異なる食品において、および／または、食品やジュースもしくは食品由来の液体が接触する表面において、広範な汚染微生物の増殖を防止するための、より有効な製品および処理法を必要としている。このことは、食品の表面に付着している微生物について特に当てはまる。食品由来の病原微生物によって引き起こされる病気の数が次第に増加しているために、食品加工業は現在、より広範囲の微生物を除去および阻止する、より有効な方法を必要としている。さらに特に食品汚染の結果として重大なヒト疾病を引き起こすことで知られている、例えば大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のような毒素産生性大腸菌といった病原微生物に対する、より有効な方法を必要としている。本発明は、少なくとも１つの本発明のバクテリオファージを含んでなる組成物を提供し、また、食品の表面および内部で、さらに食品およびその調理に関わる液体中および表面上でも同様に、微生物の増殖を防止する方法を提供する。このような防止方法は、汚染された食品からの二次汚染を防ぐ；付着している微生物を食品から除去する；微生物の食品への付着を阻止する；および、食品に付着したままの微生物の増殖を防止するうえで重要な目標である。さらに、本発明の方法は、食品加工プラントでの使用に容易に適合させることができる。
【００４６】
以下の実施例は、本発明を例証するために示される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に記載された特定の条件もしくは詳細事項に限定されないことを理解すべきである。明細書全体を通じて、米国特許を含めた、公に利用できる文書に対するいかなる言及も、すべて、特に参考として含めるものとする。
【００４７】
実施例１
この実施例の目的は、新規バクテリオファージＢ１、Ｂ３、および１１９Ｕの分離および特徴づけについて説明することである。
【００４８】
バクテリオファージＢ１、Ｂ３、および１１９Ｕは、宿主として大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株を用いて生下水から分離された。これらの株は米国特許第６，１２１，０３６号に記載の方法に従って分離された。この特許は特に参考として含めるものとする。
【００４９】
その方法は下記のステップを含んでなる。（ａ）ブドウ球菌、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、連鎖球菌、ナイセリア属、クレブシェラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、バクテロイデス属、シュードモナス属、ボレリア属、シトロバクター属、エシェリキア属、サルモネラ属、プロピオニバクテリウム属、トレポネーマ属、赤痢菌、腸球菌、およびレプトスピラ菌からなる群から選択される少なくとも１つの細菌に対するバクテリオファージを含有するサンプルを取得する；（ｂ）該サンプルをリン酸緩衝生理食塩水中に分散させる；（ｃ）細菌を保持するがバクテリオファージは通過させるフィルターを通して、分散サンプルを濾過する；（ｄ）フィルターを通過したバクテリオファージを精製する；（ｅ）少なくとも１つの細菌を含有する培地中でバクテリオファージを増殖させる；（ｆ）約８時間後にプラーク当たり約１０８〜１０９バクテリオファージより高い力価を達成するバクテリオファージ調製物を選択し分離することにより、分離されたバクテリオファージを得る；（ｇ）分離されたバクテリオファージを精製する；そして（ｈ）ステップ（ｇ）で精製された分離バクテリオファージをステップ（ｅ）に使用して、ステップ（ｅ）〜（ｇ）を少なくとも５回繰り返すことにより、バクテリオファージ調製物を取得する。
【００５０】
ファージ分離株はすべて、純粋培養物を得るために最低３回はプラーク精製を行った。大規模調製は、ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心法を用いて実施した［Ｇｉｌａｋｊａｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８１： ７２２１−７（１９９９）］。
【００５１】
バクテリオファージは主に６つの科に分けられるが、そのうちの１つがマイオウイルス科であって、Ｔ−偶数ファージとして知られている（米国特許第６，０９０，５４１号）。ファージＢ１およびＢ３は形態がＴ−偶数ファージ（すなわち、Ｔ２、Ｔ４およびＴ６）に類似しており、このＴ−偶数ファージには十分に特徴づけられているＴ４が含まれる。
【００５２】
ファージ１１９Ｕは、そのゲノム（配列）、宿主域、および毒性において独特である；これはＫ１株およびＫ５株抗原の両方のリアーゼ遺伝子を有する；毒性はなく、所期の効果を奏する。ファージ１１９Ｕは、４４ ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、非常に毒性の強い大腸菌Ｋ１株およびＫ５株に対して極めて有効であるが、これはその配列がＫ１−およびＫ５−特異的タンパク質をコードしているためである。図１はファージ１１９Ｕのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の説明を示す。ファージ１１９Ｕには、溶原性、水平遺伝子伝播、ビルレンス遺伝子（細菌宿主に対する毒性を賦与する）、または毒素遺伝子（細菌宿主に対する毒性を賦与する）の証拠がない。
【００５３】
実施例２
この実施例の目的は、バクテリオファージ１４６Ａを分離して、特徴づけることである。
【００５４】
ファージ１４６Ａは、尿路感染（ＵＴＩ）分離株に対して、実施例１に記載の方法を用いて分離された。
【００５５】
ファージ１４６Ａは、やはりＴ−偶数ファージに類似しているが、他のものよりやや小さい頭部構造を有すると思われる［Ａｅｂｉら、”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｉａｎｔ Ｔ−ｅｖｅｎ Ｐｈａｇｅ Ｈｅａｄｓ，” Ｊ． Ｓｕｐｒａｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ．， ５（４）：４７５−４９５（１９７７）； Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｒ． Ｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ Ｅｖｅｎ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ，” Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ７８（４）：９６７−９８８（１９７８）； およびＫｕｔｔｅｒら、”Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｈａｇｅｓ，” Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ， １１（２−３）：２８５−２９７（１９９５）］。
【００５６】
実施例３
この実施例の目的は、バクテリオファージＢ１およびＢ３の特徴をさらに明らかにするために、それらの制限酵素消化物および部分配列を調製することである。
【００５７】
制限酵素消化物
フェノール／クロロホルム抽出法によって、ＣｓＣｌストックからＢ１およびＢ３のＤＮＡ調製物を作製した［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２：１５６−１５９（１９８７）］。
【００５８】
ファージＢ１およびＢ３の制限酵素消化を行った。消化したＤＮＡを０．６〜０．７％ ＴＡＥ［トリス−酢酸−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］泳動バッファー、アガロースゲルで、λＨｉｎＤ ＩＩＩマーカーとともに泳動した。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩはいずれもＢ１およびＢ３ ＤＮＡのどちらも切断することができなかった。切断した酵素はＤｒａＩおよびＶｓｐＩの２つのみであった。
【００５９】
上記はＴ−偶数ファージに典型的な結果である；Ｔ−偶数ファージのＤＮＡは、シチジンの代わりにＤ−グルコシルヒドロキシメチルシチジンを含有し、これがほとんどの制限酵素の切断を阻止する。ＤｒａＩおよびＶｓｐＩは、その認識配列にＧ−Ｃ塩基対が存在しないために、切断可能となる。Ｂ１、Ｂ３およびＴ４のＤｒａＩおよびＶｓｐＩ消化物の制限パターンはすべて異なっている。
【００６０】
ファージＢ１およびＢ３の制限酵素地図を作成したが、得られた地図は他の公表されたＤＮＡ制限酵素地図のすべてと比較して、独特であった。
【００６１】
部分配列決定
ファージＢ１の頭部および尾部のＤＮＡ配列をそれぞれ図２および図３に示し、ファージＢ１の尾部のアミノ酸配列を図４に示す。さらに、ファージＢ３の頭部および尾部のＤＮＡ配列をそれぞれ図５および図６に示し、ファージＢ３の尾部のアミノ酸配列を図７に示す。ファージＢ１およびＢ３は、約１５０，０００ ｂｐのゲノムを有すると推定される。
【００６２】
実施例４
この実施例の目的は、多数の尿路感染（ＵＴＩ）大腸菌分離株に対するバクテリオファージＢ１、Ｂ３、１４６Ａおよび１１９Ｕの宿主域を決定することである。バクテリオファージ１１９Ｕは大腸菌Ｋ１株に対して特異的であり、さらにおそらく大腸菌Ｋ５株に対しても特異的である。
【００６３】
Ｂ１、Ｂ３、１４６Ａおよび１１９Ｕの宿主域
ＵＴＩ細菌分離株のそれぞれの菌叢上に１０４ ｐｆｕの各ファージをスポットし、そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラス（＋）は完全な透明化を示し、プラス（ｔ）（＋（ｔ））は濁りのあるスポットを示す。プラス（ｐ）（＋（ｐ））は、小さな個別のプラークのあるスポットを表し、マイナス（−）はファージが細菌分離株にまったく影響を与えなかったことを示す。
【００６４】
４種のファージのすべてが、かなり広範な宿主域を示した。４種のファージ調製物の宿主域は、個別には３０から６０％であり、全体としては８４％であった。図８に示すように、それぞれのファージ分離株は、大腸菌分離株の少なくとも４０％を溶菌した。さらに、これらのファージは、細菌分離株を溶菌して透明化する能力において重複するので、相互に補完しあう。
【００６５】
具体的には、ファージＢ１およびＢ３は、６１の大腸菌ＵＴＩ分離株のうち、それぞれ５７％および４９％を溶菌し、それに加えて大腸菌Ｋ１２株を溶菌した；さらにファージ１４６Ａおよび１１９Ｕは、６１の大腸菌ＵＴＩ分離株のうち、それぞれ３１％および３０％を溶菌した。図８を参照されたい。
【００６６】
Ｔ４ファージはＵＴＩ分離株をまったく溶菌しなかったが、大腸菌Ｋ１２株（ＡＴＣＣ寄託番号２９４２５）のみには増殖した（データは記載せず）。
【００６７】
実施例５
この実施例の目的は、尿中で増殖した感受性細菌を溶菌するファージの最小量を決定することによって、ファージ１１９ＵおよびＢ３の効力を検討することである。
【００６８】
使用した尿は、健康な成人男性から採取し、０．４５μＭフィルターを通して滅菌した。尿を入れた５０ｍｌフラスコに、大腸菌１１９ＵのＬＢ一晩培養液１００μｌを接種した。接種菌液は遠心沈澱して、尿中で洗浄し、残存するＬＢ培地を完全に除去した。１０２、１０４および１０６ ｐｆｕのファージ１１９ＵもしくはＢ３を初めに添加したが、１つのフラスコにはファージを加えなかった。培養液は３７℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋインキュベーターにおいて、２００ ｒｐｍ）。細菌の増殖をモニターするためにＯＤ ６００を測定した。
【００６９】
その結果、ファージ１１９Ｕは１０２ ｐｆｕ程度の少数で培養物を溶菌することが分かった。時間経過に伴う細菌の増殖をファージ濃度と対比して示す、図９（ファージ１１９Ｕ）および１０（ファージＢ３）を参照されたい。ファージの不在下では、細菌の増殖（吸光度に相関する）は劇的に増加するが、ファージの存在下では、細菌の増殖は０付近にまで急速に減少した。
【００７０】
実施例６
この実施例の目的は、ファージ１１９ＵおよびＢ１の毒性を調べることである。
【００７１】
マウスにファージ１１９Ｕを大量に（有効レベルの最大で１０６倍）注射した後、急性毒性はまったく見られず、一方ファージＢ１は動物においてまったく毒性を示さなかった。
【００７２】
ファージ１１９ＵおよびＢ１の毒性を試験するために、３．４ ｘ １０１１ ｐｆｕ／ｍｌ（ファージ１１９Ｕ）および３．２ ｘ １０１２ ｐｆｕ／ｍｌ（ファージＢ１）の各ファージのアリコートが急性毒性試験に備えて用意され、ＰＢＳでサンプルを希釈することによって最終力価を１０１０および１０６ ｐｆｕ／ｍｌとした。各ファージの１０６ ｐｆｕ／ｍｌストックについてカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）によるリムルス試験を行った。ファージＢ１および１１９Ｕのサンプルに関する内毒素レベルは、それぞれ約６ ＥＵ／ｍｌおよび＜６ ＥＵ／ｍｌであると測定された。
【００７３】
急性毒性試験は、３０匹のＣＤ−１雌マウス（１９〜２１ ｇ）を用いて実施された。マウスは５匹ずつ６群に分け、以下のように処理した：
グループ １：注射なし
グループ ２：１００μｌの滅菌生理食塩水を腹腔内注射する
グループ ３：１００μｌのファージＢ１（１０９ ｐｆｕ）を腹腔内注射する
グループ ４：１００μｌのファージＢ１（１０５ ｐｆｕ）を腹腔内注射する
グループ ５：１００μｌのファージ１１９Ｕ（１０９ ｐｆｕ）を腹腔内注射する
グループ ６：１００μｌのファージ１１９Ｕ（１０５ ｐｆｕ）を腹腔内注射する
【００７４】
注射後３日にわたって、マウスをモニターした（目視観察、無作為抽出体温）。実験群のすべてのマウスが活発で、しかも健康であり、対照群と同じであるように見えた。このことから、本発明に従って得られたファージには毒性がないことが実証される。
【００７５】
実施例７
この実施例の目的は、毒素産生性大腸菌Ｏ１５７を含めた、ヒトおよびブタ大腸菌の３３の異なる菌株および１５の異なる血清型に対して、ファージＢ１およびＢ３の宿主域を決定することである。菌株はリサーチ・コレクションから得られた。
【００７６】
１０４ ｐｆｕの各ファージを各細菌分離株の菌叢上にスポットし、そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラス（＋）は完全な透明化を示し、マイナス（−）はファージが細菌分離株に何の影響も与えなかったことを表す。さらにプラス／マイナス（＋／−）は、バクテリオファージが大腸菌分離株に対して、部分的に有効であったことを示す。
【００７７】
ファージＢ１およびＢ３はいずれも、毒素産生性大腸菌Ｏ１５７株に対するものも含めて、広範な宿主域を示した。図１１を参照されたい。ファージＢ１は、３３菌株のうち２６を溶解する、すなわち、それらに対する活性を有しており（７９％）、さらに、大腸菌の１５の血清型のうち１０を溶解する、すなわち、それらに対する活性を有していた（６７％）。ファージＢ３は、３３菌株のうち２７を溶解する、すなわち、それらに対する活性を有しており（８２％）、さらに、大腸菌の１５の血清型のうち１１を溶解する、すなわち、それらに対する活性を有していた（７３％）。
【００７８】
上記の結果は、有毒および無毒の大腸菌株による食品汚染を防止し、もしくは処理するための、本発明のバクテリオファージ組成物の有用性を実証する。
【００７９】
本発明の方法および組成物において、本発明の精神または範囲から逸脱することなく様々な改変および変更を行うことができることは当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明は、この発明の改変および変更が添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にあるならば、それらを包含することを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ファージ１１９Ｕのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の説明を示す。
【図２】
ファージＢ１の頭部のＤＮＡ配列を示す。
【図３】
ファージＢ１の尾部のＤＮＡ配列を示す。
【図４】
ファージＢ１の尾部のアミノ酸配列を示す。
【図５】
ファージＢ３の頭部のＤＮＡ配列を示す。
【図６】
ファージＢ３の尾部のＤＮＡ配列を示す。
【図７】
ファージＢ３の尾部のアミノ酸配列を示す。
【図８】
多数の大腸菌分離株に対するバクテリオファージＢ１、Ｂ３、１４６Ａおよび１１９Ｕの宿主域を示す。
【図９】
ファージ１１９Ｕの濃度に対する細菌増殖の経時変化を示す。
【図１０】
ファージＢ３の濃度に対する細菌増殖の経時変化を示す。
【図１１】
毒素産生性大腸菌Ｏ１５７を含めた、ヒトおよびブタ大腸菌の３３の異なる菌株、および１５の異なる血清型に対するファージＢ１およびＢ３の宿主域を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004514443.tif 000048
2004514443.tif 000049
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