(57)【要約】本発明は、癌の治療に関し、および特に、排他的にではないが膵癌の治療に関係している。より詳細には、本発明は患者における癌の治療および／または防止のための薬物調製におけるＴｒｋＡｌｇ２の使用に関する。
2004506694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌の治療および／または防止のための薬物調製における、ＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体の使用。
【請求項２】
患者の癌を治療および／または防止する方法であって、該患者にＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体を含む組成物を供給することを含む方法。
【請求項３】
前記ＴｒｋＡＩｇ２または類似体が、経口摂取、静脈内注射、皮内の、腹腔内の、脳室内によるか、または腫瘍部位への直接の投与により供給される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞をＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体と接触させることを含む、腫瘍細胞の成長を阻害する方法。
【請求項５】
ＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体を薬学的に許容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせて含む、患者の癌を治療および／または防止するための薬学的組成物。
【請求項６】
前記癌が膵癌である、請求項１に記載のＴｒｋＡＩｇ２もしくはその類似体の使用、または請求項２もしくは３に記載の方法、または請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記癌が乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、皮膚癌または肺癌から選択される、請求項１に記載のＴｒｋＡＩｇ２もしくはその類似体の使用、または請求項２もしくは３に記載の方法、または請求項４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、癌の治療に関し、より詳細には、本発明は、膵癌の治療に関する。
【０００２】
神経成長因子（ＮＧＦ）およびその高親和性チロシンキナーゼ受容体Ａ（ＴｒｋＡ）は一般に、神経の発生ならびに中枢および末梢神経の生存および成長に関与していると思われる。
【０００３】
ＮＧＦは、様々な供給源から、最も特には雄のネズミ唾液腺から単離され得る。初めて単離されたＮＧＦは、恐らく７ＳＮＧＦ（これはβ−ＮＧＦおよびγＮＧＦの複合体である）であり、その沈降係数から名付けられた。２．５ＳＮＧＦはこれから得られ得る。２．５ＳＮＧＦは、複合体の神経栄養性生物活性を担うことが知られている。２．５ＳＮＧＦは、βＮＧＦであるが、しばしばアミノおよびカルボキシ末端で部分的にタンパク質分解されている。ＮＧＦは、関連するタンパク質であるニューロトロフィンのファミリーの一員である。他の成員として、例えばＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４が挙げられる。全てのニューロトロフィンは、共通の受容体ｐ７５ＮＧＦＲに結合する。各々はまた、チロシンキナーゼ受容体の相同ファミリーの一つに結合する：ＮＧＦはＴｒｋＡに結合し、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４はＴｒｋＢに結合し、ＮＴ−３はＴｒｋＣに結合する。ＮＴ−３はまた、減少した親和性でＴｒｋＡおよびＴｒｋＢにも結合し得る。
【０００４】
最近では、Ｔｒｋ受容体のＩｇ様ドメインがニューロトロフィンリガンドの結合および受容体活性化に重要な役割を果たしていることを２つのグループが示している。Ｐｅｒｅｚ Ｐ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６： ９７−１０５ （１９９５））は、Ｉｇ様ドメインの両方がＮＧＦのＴｒｋＡへの結合に重要であると結論づけた。現在、ＮＧＦホモ二量体およびＴｒｋＡＩｇ２の共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ）構造が解析されている（Ｗｅｉｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４０１， ｐ１８４−１８８ （１９９９））。
【０００５】
ＴｒｋＡおよびその単離されたドメインはさらに国際公開第９９／５３０５５号に記載されており、その開示は参照により援用される。添付の図１は、その構造を図式的に例示する。塗りつぶした円は、コンセンサスグリコシル化部位を表す。ＴｒｋＡＩｇ２は、Ｉｇ様サブドメイン２およびプロリンリッチ領域を含むものとして定義される。ＴｒｋＡＩｇ２の配列を図２に示し、６×Ｈｉｓタグを含むＴｒｋＡＩｇ２のヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配列を示す。ヒトＴｒｋＡからの配列は太字であり、６個のアミノ酸挿入変異体は下線が引かれている。この配列は、ヒトＴｒｋＡ配列（アミノ酸２２〜１５０）およびｐＥＴ１５ｂベクターからのフランキング配列（アミノ酸１〜２１）（これもまたＮ末端６×Ｈｉｓタグをコードする）を含む。ベクター配列（コドン４５２〜４６８、図２）はまた、停止コドンも提供する。
【０００６】
ヒトＴｒｋＡの推定上の細胞外ドメインは、６個のアミノ酸挿入ＶＳＦＳＰＶが存在するかどうかに依存して、３７５または３８１アミノ酸長のいずれかであると見られる。本発明者らは、最近、２つの免疫グロブリン様ドメインおよびプロリンリッチ領域を含むタンパク質（図１に、Ｉｇ様サブドメイン１、Ｉｇ様サブドメイン２、およびプロリンリッチ領域として示される）が、単独で、完全な細胞外ドメインの親和性と同様の親和性でＮＧＦに結合することができることを示した（Ｈｏｌｄｅｎ， Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ６６８−６７２）。この領域を、本明細書中ＴｒｋＡＩｇ１、２として定義する。さらに、本発明者らは、ＴｒｋＡＩｇ２と呼ばれるＴｒｋＡのさらに小さなドメイン（図２に、アミノ酸２２〜１５０として示される）も、完全な細胞外ドメインまたはＴｒｋＡＩｇ１，２領域と同様の親和性でＮＧＦに結合することができ、したがってそれらは主にその結合特性を担うことを見いだした。ＴｒｋＡＩｇ２は、本明細書中において、図２で規定されるようにアミノ酸２２〜１５０にまたがり、ＴｒｋＡＩｇ様サブドメイン２をプロリンリッチ領域とともに含むものとして定義され、アミノ酸１〜２１をまた含んでいてもよく、さらに図２でアミノ酸１３０〜１３５として示されるように６個のアミノ酸挿入ＶＳＦＳＰＶを含んでも含まなくてもよい。
【０００７】
膵臓は、食物の消化のための膵酵素を作る腺である。これらは胆管および十二指腸につながる管中に放出される。膵臓はまた、インスリンを含む複数のホルモンも産生する。
【０００８】
膵臓癌は、西洋世界における癌に関わる死亡の５番目に高い原因である。これは毎年米国で新たに診断される癌の２％を占めるが、総癌死亡のうち５％であり、主要な悪性腫瘍全てのうち最低生存率を有する。米国で２６，０００人を越える人間が毎年膵臓癌を発症している。男性は女性よりも膵癌の発生率およびその結果の死亡率が高い。アフリカ・カリブ系の膵臓癌は白色人種の発症および死亡率よりも約５０％高い率を有し、一方ラテンアメリカ系およびアジア系アメリカ人グループに対する率は一般に低い。
【０００９】
大抵の膵癌は、管から生じる腺癌である。この疾患は、しばしば症状が現れた時点より進行し、治療が成功することがまれであるので、５年後に生存している患者は５％未満である。膵癌の２％は島細胞癌である（すなわち、インスリンおよび他のホルモンを産生するランゲルハンス島の癌）。これらは予後が良い。膵癌が成長すると、腫瘍は膵臓を取り巻く組織（胃または小腸など）に浸潤し得る。膵癌細胞はまた、転移し身体の他の部分へ蔓延する可能性があり、しばしばリンパ節、肝臓、および時として肺または骨に新しい腫瘍を形成する。
【００１０】
症状が現れる場合、それらは腫瘍の位置および大きさに依存する。例えば、腫瘍が、胆汁が腸内へ入らないように総胆管を阻止している場合、皮膚および白目が黄色くなり、尿が黒くなる（すなわち、黄疸）。
【００１１】
癌が成長して蔓延すると、痛みはしばしば上腹部でひどくなり、時として背中まで広まる。その人が食事を取るかまたは横になると痛みがひどくなることがある。膵臓癌はまた、吐き気、食欲減退、体重減少、または脱力感を引き起こし得る。
【００１２】
島細胞癌は、膵臓にインスリンまたは他のホルモンの産生過多を引き起こし得る。これが生じた場合、その人は脱力感またはめまいを感じることがあり、また寒気、筋痙攣、または下痢を起こすことがある。
【００１３】
膵臓の進行を制御することは難しい。この疾患は、現在、初期段階で診断された場合に限り治癒することができる。膵管で始まる癌は、外科、放射線治療、または化学療法、あるいは組合せで治療され得る。島細胞癌は、通常、外科または化学療法で治療される。全膵切除、すなわち膵臓丸ごとならびに十二指腸、総胆管、胆嚢、脾臓、および隣接するリンパ節の除去が必要なこともある。
【００１４】
痛みは共通の問題であり、痛み止めまたは他の治療（痛みを止めるために神経周囲の領域にアルコールを注入する、または手術の間、腹部の神経を遮断するなど）により部分的に緩和されるに過ぎない。膵臓癌およびその治療は、膵酵素およびインスリンの産生に影響を及ぼし得る。結果として、患者は食物の消化および適切な血糖レベルの維持に問題を生じ得る。
【００１５】
膵癌に高い頻度の神経周囲浸潤および痛みがあることの理由は明らかではない。ＮＧＦは上皮癌細胞成長および神経周囲浸潤の刺激ならびに慢性的な良性疾患の痛みの発生に関係している。ＮＧＦおよびＴｒｋＡは、正常および膵組織サンプルで、ノーザンブロット解析、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学により検査された（Ｚｈｕ， ＺＷ， ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １７， Ｎｏ． ８， ｐｐ． ２４１９−２４２８）。ノーザンブロット解析は、ＮＧＦおよびＴｒｋＡｍＲＮＡレベルが膵癌組織において顕著に増加したことを示した。ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学は、膵癌細胞の細胞質中のＮＧＦの強力な存在を示し、ＴｒｋＡは、膵神経の神経周膜に強く現れた。膵癌における内因性ＮＧＦのレベルが神経周囲浸潤および痛みの程度と関連していることもまた示されている。従って、ＮＧＦ／ＴｒｋＡシステムの増強された発現は神経周囲浸潤に影響し得る（Ｚｈｕ， ＺＷ， ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １７， Ｎｏ． ８， ｐｐ． ２４１９−２４２８）。
【００１６】
国際特許出願の国際公開第９９／１１２９１号は、細胞に全ＴｒｋＡ受容体をコードする遺伝子をトランスフェクトすることを含むヒト脳腫瘍細胞の治療方法を開示する。ＮＧＦを添加すると、トランスフェクトされた細胞の死をもたらす。この開示は、本発明と明らかに異なっている。なぜなら、細胞は全ＴｒｋＡ受容体をコードする遺伝子でトランスフェクトされており、ＮＧＦを添加する必要があるからである。
【００１７】
本発明者らは、期せずして、少なくとも２種の膵癌細胞系の成長速度は、ＴｒｋＡＩｇ２の存在により阻害されること、およびある高濃度で細胞死が誘導されることを示した。
【００１８】
本発明者らは、期せずして、ＴｒｋＡＩｇ２は、癌細胞成長阻害および細胞死の媒介が可能であることを発見した。
【００１９】
従って、本発明の第一の態様は、患者の癌を治療および／または防止するための薬物調製におけるＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体の使用を提供する。
【００２０】
本発明の第二の態様は、患者の癌を治療および／または防止する方法を提供し、この方法は患者にＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体を包む組成物を供給することを含む。
【００２１】
組成物は、例えば、経口摂取、静脈内注射、皮内の、腹腔内の、脳室内によるか、または腫瘍部位への直接の投与により供給され得る。
【００２２】
本発明の第三の態様は、患者の癌を治療および／または防止するための薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物はＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体および薬学的に許容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含む。
【００２３】
本発明の上記の態様全てにおいて、癌は膵癌であってもよく、または乳癌、前立腺癌、グリア芽細胞腫のような脳腫瘍、神経芽細胞腫、皮膚癌、および肺癌などの他の癌から選択されてもよい。好ましくは、癌は膵癌である。
【００２４】
本発明の第四の態様は、腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、細胞をＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体と接触させることを含む。
【００２５】
用語「ＴｒｋＡＩｇ２」は、本明細書中で使用されるとおり、好ましくはプロリンリッチ配列とともにＩｇ様サブドメイン２を意味し、これは図２においてアミノ酸２２〜１５０として示される。好ましくは、ＴｒｋＡＩｇ２はまた、６×Ｈｉｓタグを含む。ＴｒｋＡＩｇ２がベクターｐＥＴ１５ｂからのフランキング配列（これは６×Ｈｉｓタグを包含し、図２においてアミノ酸１〜２１として示される）を含むことが特に好ましい。
【００２６】
ＴｒｋＡＩｇ２に関連して使用される用語「類似体」は、天然のＴｒｋＡＩｇ２配列の機能部分および誘導体を示す。機能部分および誘導体は、全ＴｒｋＡＩｇ２配列の機能を持ち続けなければならず、すなわちそれらは癌細胞の成長を防止することが可能でなければならない。ＴｒｋＡＩｇ２の部分および誘導体の機能を試験するための方法は、以下の実施例において記載される。ＴｒｋＡＩｇ２誘導体の例は、図２において下線を引かれている６個のアミノ酸（アミノ酸１３０〜１３５）が挿入されていないＴｒｋＡＩｇ２のスプライス変異体である。ＴｒｋＡＩｇ２のスプライス変異体（すなわち、６個のアミノ酸挿入なし）は、通常、肥満細胞または非神経細胞ではなくニューロンに関連する。ＴｒｋＡＩｇ２の誘導体は、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）、昆虫類、爬虫類、または両生類などの他の生物学的供給源からの配列を含む。誘導体は、遺伝暗号の縮重、ならびに挿入、欠失、および置換変異体の結果として、前記の配列の変異体を含む。好ましくは、図２に示されるＴｒｋＡＩｇ２配列に対して、誘導体は少なくとも８０％の、より好ましくは少なくとも９０％の、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。相同性は、好ましくはＢＬＡＳＴを使用して決定される。好ましくは、誘導体は図２に与えられるＴｒｋＡＩｇ２配列からの１〜１０個のアミノ酸のみ異なっている。どのアミノ酸変更も保存的であることがさらに好ましい。保存的変更は、１つのアミノ酸を、その側鎖において関連するアミノ酸ファミリーからの１つで置換する変更のことである。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで単独に置換すること、あるいはアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸で同様に保存的に置換することは、タンパク質の生物活性に主要な影響を及ぼさないだろうと予想することは理にかなっている。タンパク質中の他のアミノ酸とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸の数を増加させる突然変異もまた、タンパク質の安定性を増加させるためになされ得る。タンパク質の所望の機能を増加させる他の突然変異もまたなされ得る。
【００２７】
本発明の薬学的組成物は、ＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体を、任意の薬学的に許容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルとともに含む。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に許容可能なキャリア、アジュバント、およびビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
薬学的組成物は、滅菌した注入可能調製物、例えば滅菌した注入可能水性または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、当該技術分野で既知の技術にしたがって、適した分散または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）および沈殿防止剤を使用して配合され得る。滅菌した注入可能調製物はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌した注入可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液として）であってもよい。許容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、マンニトール、水、リンゲル溶液、および塩化ナトリウム等張液が用いられ得る。さらに、滅菌不揮発性油が、溶媒または懸濁媒質として一般に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油が用いられ得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸（オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチレン化版など）は、天然の薬学的に許容可能な油として、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似のアルコールなど）を含んでいてもよい。
【００２９】
ここでは、本発明の実施形態を、例示としてのみ、添付の図を参照して記載する。
【００３０】
実施例１
膵癌細胞におけるＴｒｋＡＩｇ２の阻害作用
１．膵癌細胞系ＭＩＡ−Ｐａ−Ｃａ−２（ＥＣＡＣＣ　第８５０６２８０６号）
ＴｒｋＡＩｇ２を、国際公開第９９／５３０５５号に開示されるように調製した。
【００３１】
ヒト膵癌細胞系ＭＩＡ−Ｐａ−Ｃａ−２　ＥＣＡＣＣ　第８５０６２８０６号（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）
６５歳の白人男性の膵臓の腫瘍組織から細胞を樹立した。細胞は、軟寒天でクローン化することが可能であり、アスパラギナーゼ感受性であり、継代数１３５で取り出すと上皮性形態を有する。
【００３２】
液体窒素から細胞を取り出し、３７℃で解凍し、３週間培養液に維持した。ＭＩＡ−Ｐａ−Ｃａ−２細胞を引き離し、２×ＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンで再懸濁させ、１００μｌを９６ウェルプレート中で４×１０３細胞／ウェルの密度で蒔いた。ＴｒｋＡＩｇ２の順次希釈物（１：２）を、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ７．４で作成し、等体積を３．２５μＭ〜０．０１μＭの範囲の最終濃度で直ちに添加した。「緩衝液のみ」のコントロールが含まれた。リフィーディングなしで４８時間後、細胞代謝活性を、プロメガ社製ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ９６（登録商標）細胞増殖アッセイを使用して測定した。
【００３３】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アッセイは、生細胞の代謝活性を測定するための、非放射性比色アッセイである。このアッセイは、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；　ＭＴＳ）および電子カップリング試薬（フェナジンメトスルフェート；ＰＭＳ）の溶液から成る。ＭＴＳ（Ｏｗｅｎ’ｓ試薬）は、組織培地に溶解性であるホルマザンへ、細胞により生物分解（ｂｉｏｒｅｄｕｃｅｄ）される。ＭＴＳの水溶性ホルマザンへの変換は、代謝的に活性な細胞中に見いだされるデヒドロゲナーゼ酵素により達成される。４９０ｎｍの吸光度量により測定されるホルマザン生成物の量は、生きている細胞数に比例する。
【００３４】
結果を図３に示す。これはＴｒｋＡＩｇ２の濃度増加（μＭ）に伴い観測された代謝率の減少のグラフである。二つ組みのウェルを、倒立位相差顕微鏡を使用して可視化した。図４Ａは、Ｉｇ２の存在なしのＭｉａ　Ｐａ　Ｃａ２細胞を示す。
【００３５】
２．膵癌細胞系ＰＡＮＣ１ ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ８７０９２８０２
５６歳の白人男性の膵臓の腺管腫瘍組織から細胞を樹立した。
【００３６】
液体窒素から細胞を取り出し、３７℃で解凍し、３週間培養液に維持した。ＭＩＡ−Ｐａ−Ｃａ−２細胞を引き離し、２×ＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンで再懸濁させ、１００μｌを９６ウェルプレート中で５×１０３細胞／ウェルの密度で蒔いた。ＴｒｋＡＩｇ２の順次希釈物（１：２）を、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ７．４で作成し、等体積を２×ＤＭＥＭ無血清培地に希釈し（１：１）、１×ＤＭＥＭ培地中の最初の濃度に対して４．７μＭ〜０．０２μＭの範囲の最終濃度で添加した。
【００３７】
Ｍｉａ　Ｐａ　Ｃａ２細胞をエセックス−ヘンリー（Ｅｓｓｅｘ−Ｈｅｎｌｅｙ）スライド上で成長させ、ＴｒｋＡＩｇ２（ｍｎｕＡ２）またはｐ７５（ＨＢ８７３７　ｍｅ２０．４）に対する抗体、続いて、それぞれ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体または抗マウスＦＩＴＣ複合体とともにインキュベートした。細胞を、蛍光モジュールを備えたライツ（Ｌｅｉｔｚ）顕微鏡を使用して可視化した。細胞は、ＴｒｋＡ受容体（図６）を発現するが、ｐ７５（図７ｂ）を発現しないことを示した。対照的に、ポジティブコントロールの、ｐ７５ＮＧＦＲ受容体を発現するＡ８７５細胞は、この抗体で染色された（図７ａ）。
【００３８】
結果を図５に示す。４．７〜０．０３μＭのＴｒｋＡＩｇ２は、細胞死を引き起こし、０．３０〜０．０２μＭで、ＴｒｋＡＩｇ２は細胞の成長を阻害した。
【００３９】
研究は、他の型の癌もまた、成長および増殖に関してＮＧＦの存在に依存し得ることを示唆する（Ｓｏｒｔｉｎｏ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １４ （Ｎｏ． １） ： １２４−１３６； Ｗａｌｃｈ， Ｅ． Ｔ． ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｖｏｌ． １７ （ＮＯ． ４） ： ３０７−３１４； Ｄｅｓｃａｍｐｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２７３ （Ｎｏ． ２７）： １６６５９−１６６６２）。
【００４０】
前立腺癌
ＮＧＦは、ある前立腺癌においても役割を担い得る。アンドロゲン依存性前立腺の腺癌ＬＮＣａＰ細胞系における研究（Ｓｏｒｔｉｎｏ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １４ （Ｎｏ． １） ： １２４−１３６）は、ＮＧＦの投与が、増殖の濃度依存性増加をもたらすことを示している。これには、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）発現の増強が付随し、ジヒドロテストステロンの増殖性効果が加わる。ＮＧＦの増殖性効果は、ＴｒｋＡにより媒介されるようであった。ＴｒｋＡはＬＮＣａＰ細胞で発現したが、ｐ７５（ＮＧＦＲ）はしなかった。しかしながら、ＮＧＦ治療に際して増殖応答およびＴｒｋＡのリン酸化の両方が、チロシンキナーゼインヒビターＫ２５２ａにより阻止された。ｐ７５（ＮＧＦＲ）をコードするｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞は、ＮＧＦに対してより敏感なようであり、７２時間ＮＧＦに晒した場合、野生ＬＮＣａＰ培養物と比較して数が増加した。その上、Ｗａｌｃｈらは、この同じヒト前立腺癌細胞系（ＬＮＣａＰ）、およびＰＣ−３およびＤＵ１４５もまた使用して、ＮＧＦおよびＮＴ−４がｉｎ　ｖｉｔｒｏ浸潤を増加させることを実証した（Ｗａｌｃｈ， Ｅ． Ｔ． ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｖｏｌ． １７ （ＮＯ． ４）： ３０７−３１４）。さらに、腫瘍転移の分子決定因子であるヘパリナーゼの発現が誘導されることが見いだされた。この効果は、ＤＵ１４５細胞で最も顕著だった。ＴｒｋＢは、試験された３種の前立腺腫瘍細胞系全てにおいて発現したものの、これらの株はＴｒｋＡおよびＴｒｋＣの無視できる発現を有することが報告されている。ＤＵ１４５細胞はまた、ｐ７５（ＮＧＦＲ）に対して陽性であった。研究により、ＮＧＦおよびＮＴ４が転移において重要であること、およびそれらの発現が神経周囲の空間に沿って浸潤可能な悪性表現型への形質転換および遠位部位への関節外転移と同時に起こることを示した。
【００４１】
これらの事実は、特定の前立腺腫瘍が内因性ＮＧＦを隔絶するＴｒｋＡＩｇ２での治療によく反応し得るということを非常に有望にしている。
【００４２】
乳癌
これらもまた、乳癌におけるＮＧＦの役割を支持する良い証拠であると思われる。Ｄｅｓｃａｍｐｓら（Ｄｅｓｃａｍｐｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２７３ （Ｎｏ． ２７）： １６６５９−１６６６２）は、ＮＧＦが、正常な乳房上皮細胞の成長を刺激することはできないが、乳癌細胞（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系）の増殖を刺激することができることを示している。この異常刺激は、Ｇ（０）期にある細胞を細胞周期に再び戻すように、ならびに細胞周期の期間を短くするように誘導する。２種の癌細胞系および正常な乳房細胞系は、ＴｒｋＡおよびｐ７５（ＮＧＦＲ）受容体を発現する。分裂促進因子で活性化されるプロテインキナーゼの活性化は、乳癌細胞において、ＮＧＦ刺激の１０分後に検出可能であるが、正常な乳房細胞においては変化は検出されなかった。
【００４３】
もちろん、このことが全ての乳癌細胞系に当てはまるわけではない。しかしながら、Ｔａｇｌｉａｂｕｅらは、ヒト乳癌の検体１４個のうち１２個、および４種の細胞系のうち３種にＴｒｋＡｍＲＮＡを示している（Ｔａｇｌｉａｂｕｅ， Ｅ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２７５ （Ｎｏ． ８）： ５３８８−５３９４）。ＮＧＦは、３種のＴｒｋＡ発現細胞系のうち２種を刺激した。重要なことに、ＴｒｋＡの細胞外ドメインに対する抗体による（ＴｒｋＡリン酸化のみのインヒビターによるのではなく）ＮＧＦ誘導性活性化の阻害は、ＭＡＰＫ活性化のＴｒｋＡキナーゼ活性ではなくＮＧＦ結合の必要性を実証し、このことは分裂促進シグナル伝達のために別のキナーゼが動員されることを示唆している。これは、これらの細胞においてＮＧＦ誘導型刺激を停止するために、ＴｒｋＡ受容体の細胞外領域においてＮＧＦの影響を除去または阻害する必要があることを意味する。
【００４４】
それ故、ＴｒｋＡＩｇ２での治療が乳癌の患者に有益であるということが有力に思われる。
【００４５】
脳腫瘍
脳における転移性腫瘍細胞（内皮細胞に付着し、脳由来浸潤因子に応答する）は、血液脳関門に浸潤し得る。応答性腫瘍細胞において、ニューロトロフィンは、ゼラチナーゼおよびヘパリナーゼのような基底膜分解性酵素（これは血液脳関門の局所的破壊を引き起こす）の産生を増強することにより浸潤を促進する。Ｍｅｎｔｅｒら（Ｍｅｎｔｅｒ Ｄ． Ｇ． ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｖａｓｉｏｎ ＆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｖｏｌ． １４ （Ｎｏ． １−６） ： ３７２−３８４）は、脳におけるヒトメラノーマ腫瘍の浸潤面（ｉｎｖａｓｉｏｎ ｆｒｏｎｔ）で、腫瘍隣接組織におけるＮＧＦレベルの増加を見いだした。さらに、グリア芽細胞腫細胞系（８７ＨＧ３１）の増殖が、ＮＧＦにより刺激され得た（Ｄｅｌｍａｎ Ｎ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ５５ （Ｎｏ． １０）： ２２１２−２２１９）。ＴｒｋＡＩｇ２のこれらの組織への添加は、腫瘍増殖の減少をもたらすことが予期される。
【００４６】
肺癌
３種の肺癌細胞系（ＨＴＢ１１９、ＨＴＢ１２０、ＣＣＬ１８５）のクローン成長が、用量−応答関連性（０．５〜５００ｎｇ／ｍｌ）で、ＮＧＦにより３倍まで刺激され得た（Ｏｅｌｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ５５ （Ｎｏ． １０） ： ２２１２−２２１９）。この効果は、抗ＮＧＦ抗体によりおよびチロシンキナーゼインヒビターゲニステインにより完全に可逆的であった。
【００４７】
上皮癌
ＮＧＦは、ヒト上皮細胞の細胞増殖の強力な調節因子であることが示唆されてきた（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｅｔ ａｌ （１９９３）． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６８，２２８３８−２２８４６）。正常なヒトケラチノサイトは、成長調整様式で生物学的に活性なＮＧＦを合成しかつ分泌する（ＤｉＭａｒｃｏ Ｅ．， ｅｔ ａｌ （１９９１） Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６６， ２１７１８−２１７２２）。ケラチノサイトは、低（ｐ７５（ＮＧＦＲ））および高親和性（ＴｒｋＡ）ＮＧＦ受容体の両方を発現する。ＮＧＦは、ＮＧＦｍＲＮＡの発現を上向き調節する（Ｐｉｎｃｅｌｌｉ， Ｃ． ａｎｄ Ｍａｒｃｏｎｉ， Ａ． （２０００） Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＶＯＬ． ２２ （ＮＯ． ２） ： ７１−７９）。ｔｒｋリン酸化を阻害するＫ２５２は、ＮＧＦ誘導型ケラチノサイト増殖を阻止し、正常なケラチノサイトのアポトーシスを誘導する。その上、ＴｒｋＡまたはＮＧＦのいずれかを過剰発現する正常なケラチノサイトは、コントロールよりも良好に増殖する（上記Ｐｉｎｃｅｌｌｉ， Ｃ． ａｎｄ Ｍａｒｃｏｎｉ， Ａ． （２０００））。
【００４８】
それ故、発明者らが実施した先のＮＧＦ研究の観点から、特に腫瘍性細胞を参照して、ＮＧＦが細胞増殖に関与しているということが可能である。これらの細胞型の多くにおいて、ＮＧＦ隔絶剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）ＴｒｋＡＩｇ２の添加が増殖を阻害し、膵臓の腫瘍の細胞系におけると同様に、投与で実際の細胞死を引き起こし得るということが有力に思われる。しかしながら、この理論はこれまで一度も表明または試験されてなかった。
【００４９】
上記に記載される全ての文書は、本明細書中で参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴｒｋＡの構造を図式的に示す。
【図２】図２は、６Ｈｉｓタグを持つＴｒｋＡＩｇ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、Ｍｉａ　Ｐａ　Ｃａ２膵癌細胞系中のＴｒｋＡＩｇ２濃度増加に伴う細胞代謝率の減少を示すグラフである。
【図４】図４は、劇的な細胞死を示すＴｒｋＡＩｇ２なし（ａ）およびあり（ｂ）のＭｉａ　Ｐａ　Ｃａ２　膵癌細胞系の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ヒト膵臓細胞系ＰＡＮＣ−１にＴｒｋＡＩｇ２を添加したときの、［Ａ］２４時間［Ｂ］４８時間［Ｃ］７２時間［Ｄ］９６時間インキュベーション後の細胞生存度における影響を示す。ネガティブコントロールは、０時間の時点での細胞の代謝活性とみなされる。
【図６】図６は、ＴｒｋＡＩｇ２に対する抗体［ｍｎｕＡ２］で染色したＭｉａ　Ｐａ　Ｃａ２細胞の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ｐ７５受容体に対する抗体［ｐ７５ＮＧＦＲ　Ｍｅ２０．４］での染色顕微鏡写真である。［ａ］大量のｐ７５ＮＧＦＲを発現するＡ８７５細胞［ｂ］Ｍｉａ　Ｐａ　Ｃａ２細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月16日(2002.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌の治療および／または防止のための薬物調製における、ＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体の使用。
【請求項２】
患者の癌を治療および／または防止する方法であって、該患者にＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体を含む組成物を供給することを含む方法。
【請求項３】
前記ＴｒｋＡＩｇ２または類似体が、経口摂取、静脈内注射、皮内の、腹腔内の、脳室内によるか、または腫瘍部位への直接の投与により供給される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞をＴｒｋＡＩｇ２またはその類似体と接触させることを含む、腫瘍細胞の成長を阻害する方法。
【請求項５】
前記癌が膵癌である、請求項１に記載の使用、または請求項２ないし４の任意の一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、皮膚癌または肺癌から選択される、請求項１に記載の使用、または請求項２ないし４の任意の一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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