(57)【要約】本発明は乳酸塩を生成するための異種性乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする組換え発現ベクターを含んでなる組換え酵母細胞である生体触媒を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２２で同定されるアミノ酸配列を有する酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２】
配列番号：３０で同定されるアミノ酸配列を有する酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項３】
高ストリンジェント条件下で配列番号：２１で同定される核酸プローブにハイブリダイズする酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
高ストリンジェント条件下で洗浄した後ハイブリダイゼーションが検出される請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
高ストリンジェント条件下で配列番号：２９により同定される核酸プローブにハイブリダイズする酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項６】
高ストリンジェント条件下で洗浄した後ハイブリダイゼーションが検出される請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
請求項１または２に記載の酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸であって、酵母細胞で発現される核酸を含んでなる組換え発現構築物。
【請求項８】
さらに酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする核酸に機能的に連結された酵母プロモーターを含んでなる請求項７に記載の組換え発現構築物。
【請求項９】
さらに酵母乳酸塩脱水素タンパク質をコードする核酸に機能的に連結された酵母転写ターミネーターエレメントを含んでなる請求項７に記載の組換え発現構築物。
【請求項１０】
さらに２−ミクロンサークルプラスミドに由来する酵母複製エレメントを含んでなる請求項７に記載の組換え発現構築物。
【請求項１１】
形質転換された細胞が酵母乳酸塩脱水素タンパク質を発現する、請求項７に記載の組換え発現構築物で形質転換された酵母細胞。
【請求項１２】
酵母細胞がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母である請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
酵母細胞がクラブトリー陰性表現型を発現する請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
酵母細胞がＣ．ソロネンシス（Ｃ．ｓｏｒｏｎｅｎｓｉｓ）及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）からなる群から選択される酵母種である請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
酵母細胞が低減された量の、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲネート及びアセチルＣｏＡシンターゼからなる群から選択される解糖酵素を生成する請求項１１に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
酵母により少なくとも５０％の糖が乳酸に変換される条件下で糖を含有する栄養培地中請求項１１に記載の酵母細胞培養物を発酵する工程からなる乳酸を生成するための方法。
【請求項１７】
酵母細胞が約３５℃から約５５℃の温度で成長する請求項１６の方法。
【請求項１８】
栄養培地が約５．０未満のｐＨを有する請求項１６の方法。
【請求項１９】
実質的に嫌気的な条件下で酵母を成長させる請求項１６の方法。
【請求項２０】
酵母細胞がクラブトリー陰性酵母細胞である請求項１６の方法。
【請求項２１】
酵母細胞がＫ．マルキシアヌスまたはＣ．ソノレンシスである請求項２０の方法。
【請求項２２】
酵母細胞が低減された量の、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲネート及びアセチルＣｏＡシンターゼからなる群から選択される解糖酵素を生成する請求項１６の方法。
【請求項２３】
糖がグルコース、キシロース、リボース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、マルトースまたはリキソースである請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０００年１１月２２日出願の米国仮出願番号６０／２５２５４１に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
１．技術分野
本発明は有機生成物の生成に関与する方法及び材料に関する。
【０００３】
２．背景の情報
有機生成物例えば乳酸は多くの重要な工業用の用途を有している。例えば、有機酸を用いてプラスチック材料及びその他の生成物を合成できる。有機生成物に対する必要性の増加に対応するために、より効率的で費用効率のよい生成方法が開発されつつある。かかる方法の１つは細菌の使用に関与するものである。具体的には、特定の細菌は特定の発酵条件下で多量の特定の有機生成物を生成できる。しかしながら工場としての生きた細菌の使用は、有機生成物が成長培地中に蓄積するので、細菌が成長できないことにより制限される。かかる制限を回避するために、生成物合成の間に種々の生成物精製技術が用いられている。加えて、細菌以外の微生物の使用が試みられている。実際に、酸抵抗性であることが知られているサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）が乳酸を生成する試みで遺伝子修飾されている。具体的には、細胞にウシ乳酸塩デヒドロゲナーゼｃＤＮＡを提供し、内因性ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、及びＰＤＣ６）を破壊することによりサッカロミセス・セレビジエ細胞を修飾した。これらの修飾されたサッカロミセス・セレビジエ細胞はいくらか乳酸を生成するが、細胞成長は抑制され、細胞成長及び乳酸生成の双方が改良に必要であるという結論に至った。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は概して有機生成物を生成するための方法及び材料に関する。具体的には、本発明は酵母細胞、酵母細胞を培養するための方法、酵母細胞を作製するための方法、核酸構築物、及び種々の有機生成物を生成するための方法及び材料を提供する。本発明は特定の微生物（例えば細菌及び菌類微生物）を特定の条件下で成長し、成長及び生成物の生成に種々の炭素源を利用し、並びに販売目的で望ましい有機生成物を生成する能力を有するように遺伝的に操作できるという発見に基づいている。例えば、本発明で提供される酵母細胞は低ｐＨ及び高温で培養したときに成長でき、有機生成物を生成できる。例えば低ｐＨ及び高温条件下で急速に成長し、効率的に有機生成物を生成する能力を有することは特に有利である。具体的には、微生物が低ｐＨに耐える能力により、大規模容量での生成過程では困難で経費がかかり得る中性のｐＨ環境を維持する必要性が回避される。加えて、低ｐＨブロスから望ましい有機生成物を収集するのに必要な方法及び材料は、より中性のｐＨを有するブロスからの同一有機生成物を収集するのに必要な方法及び材料よりもさらに現実的で効率がよい。例えば、特定の有機酸生成物を生成物のｐＫａ値以下でｐＨを急低下させたときに溶液から沈殿させることができ、これにより収集が非常に簡単になる。さらに、微生物が高温に耐える能力により成長及び生成相で低温を維持する必要性が回避される。明らかに、大規模容量での生成過程で大量のバルクタンクの温度を下げる必要性を低減させることにより、方法全体がより効率的でよりあまり経費がかからなくなる。さらに、微生物の低ｐＨ及び高温に耐える能力により、大規模容量での生成過程で別の耐性の低い微生物による夾雑を防御するための便利な方法が提供される。
【０００５】
販売目的で望ましい有機生成物を生成する能力に関する重大な実施形態は、望ましい有機生成物が生成される特異的生産性であることに注目することが重要である。例えば本明細書に記載する方法及び材料を用いて特異的高生産性を提供することにより、微生物は培養条件、例えば低ｐＨ及び高温に暴露された場合、細胞維持に必要なエネルギーを作ることが可能になる。この必要なエネルギーを、呼吸経路を介するエネルギー作製に依存するよりむしろ、実質的に嫌気的条件下で発酵経路を介して作製することができる。本質的に全ての提供される炭素源を用いて望ましい有機生成物を生成できるので、発酵経路を介してエネルギーを得ることは、呼吸経路に必要でない有機生成物を生成する場合にとりわけ有利である。
【０００６】
本発明はまた、特定の遺伝子操作された微生物による炭素供給源の利用を調節し、バイオマスまたは望ましい有機生成物のいずれかの生成に優勢的に志向させることができるという発見に基づいている。概して、本発明は２つの型の培養過程に関係している。一方の培養方法には、微生物及び望まれる結果に依存して、バイオマス生成を促進する特定の培養条件下で微生物を培養することが含まれるが、他方は、これもまた微生物及び望まれる結果に依存して望ましい有機生成物の生成を促進する異なる培養条件のセットに関係する。明らかに、大規模容量の生成過程で炭素供給源の利用を操作する能力を有することにより、そうでない場合に可能であるよりもさらに高い柔軟性及びさらに多くの調節を伴う製造が提供される。
【０００７】
加えて、本発明は、全てでなければほとんどの炭素供給源がバイオマスまたは望ましい有機生成物のいずれかの生成に利用されるように、特定の微生物を遺伝子操作することができるという発見に基づいている。具体的には、本発明は、炭素供給源の利用をバイオマスまたは望ましい有機生成物の生成からそれる生合成経路が不活性化されるように修飾された酵母細胞を提供する。かかる生合成経路の不活性化により、効率的に成長し、望ましい生成物を生成できる微生物が提供される。
【０００８】
概して、本発明は細胞内で酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性の核酸分子を含有する酵母細胞を特徴とする。核酸を細胞のゲノムに組み込むことができる。ある実施形態では、酵素活性により細胞から分泌される有機生成物の形成が導かれる。細胞はさらにクラブトリー陰性表現型を有し、有機生成物を生成する。細胞は例えばクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）またはヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属からのものでよい。有機生成物は例えば発酵生成物、ピルビン酸塩誘導生成物、有機酸、またはカルボン酸塩、例えば乳酸塩でよい。１つの実施形態では、ポリペプチドは乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有してよい。例えば外来性核酸は細菌性乳酸塩デヒドロゲナーゼかまたは菌類乳酸塩デヒドロゲナーゼ、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）菌類乳酸塩デヒドロゲナーゼをコードできる。
【０００９】
別の実施形態では、細胞は４つの外来性核酸分子を含有し、４つの外来性核酸分子の各々は異なるポリペプチドをコードする。例えば４つの外来性核酸分子のうちの第１の核酸分子は乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有する第１のポリペプチドをコードでき、第２核酸分子はＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する第２のポリペプチドをコードでき、第３の核酸分子はラクチルＣｏＡデヒドラターゼ活性を有する第３のポリペプチドをコードでき、及び第４の核酸分子はアクリリルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する第４のポリペプチドをコードできる。かかる細胞はカルボン酸塩生成物としてアクリレートを生成できる。また別に、４つの外来性核酸のうちの第１の核酸分子は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタノエートアルドラーゼ活性を有する第１のポリペプチドをコードでき、第２の核酸分子はキシロネートデヒドラターゼ活性を有する第２のポリペプチドをコードでき、第３の核酸分子はキシロノラクトナーゼ活性を有する第３のポリペプチドをコードでき、及び第４の核酸分子はＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する第４のポリペプチドをコードできる。かかる細胞は有機生成物として炭水化物、例えばＤ−キシロースを生成できる。
【００１０】
さらに別の実施形態では、細胞は６個の外来性核酸分子を含有し、６個の外来性核酸分子の各々は異なるポリペプチドをコードする。例えば、６個の外来性核酸分子のうちの第１の核酸分子は２，５−ジオキシ吉草酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有する第１のポリペプチドをコードでき、第２の核酸分子は５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカル酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有する第２のポリペプチドをコードでき、第３の核酸分子はグルカル酸塩デヒドラターゼ活性を有する第３のポリペプチドをコードでき、第４の核酸分子はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する第４のポリペプチドをコードでき、第５の核酸分子はグルクロノラクトンリダクターゼ活性を有する第５のポリペプチドをコードでき、及び第６の核酸分子はＬ−グロノラクトンオキシダーゼ活性を有する第６のポリペプチドをコードできる。かかる細胞は有機生成物としてビタミン、例えばＬ−アスコルビン酸塩を生成できる。
【００１１】
有機生成物は３つ以上の炭素原子を含有でき、例えばアミノ酸でよい。
【００１２】
別の実施形態では、細胞はペントース炭素、例えばリボース、アラビノース、キシロース及びリキソースを異化できる。
【００１３】
別の実施形態では、細胞はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性が低減されているか、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減されている。例えば細胞は全てのピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性を欠如できる。ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性の低減は、通常ピルビン酸塩デカルボキシラーゼをコードする核酸配列を有している遺伝子座が破壊されることによる。また別に、細胞は外来性核酸配列に対応するアンチセンス分子、例えばリボザイムを含有でき、ここでアンチセンス分子はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性を低減させる。細胞はまたキラープラスミドとして機能する別の外来性核酸分子をもコードできる。
【００１４】
別の実施形態では、外来性核酸分子によりコードされるポリペプチドの酵素活性によりＮＡＤＨ消費様式での有機生成物の形成が導かれる。
【００１５】
別の実施形態では、細胞を有機生成物の生成に最適な条件下で培養した場合に消費されるグルコース１００ｇあたり少なくとも約６０ｇの有機生成物を細胞が生成する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、細胞によるペントース炭素の異化を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する細胞、例えば酵母細胞を特徴とする。ポリペプチドは例えばキシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、またはキシルロキナーゼでよく、ペントース炭素は例えばリボース、アラビノース、キシロース、及びリキソースでよい。細胞はさらにヘキソース炭素を異化でき、望む場合、ヘキソース炭素及びペントース炭素を同時に異化できる。ヘキソース炭素は例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース（ｉｏｄｏｓｅ）、フルクトース、ガラクトース、及びタロースでよい。
【００１７】
別の態様では、本発明は細胞の細胞質におけるアセチルＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸を含有する酵母細胞を特徴とする。
【００１８】
ポリペプチドはクエン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドでよいか、またはミトコンドリア膜を通るアセチルＣｏＡ透過性を促進するミトコンドリア膜ポリペプチドでよい。細胞はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性が低減されているか、またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減されていてよい。また別に、酵母細胞はエタノール生成を欠如でき、エタノール及び酢酸塩を欠如する培養条件下で、エタノール生成を欠如する匹敵する酵母細胞で観察される成長速度よりも早い成長速度を有する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、細胞がクラブトリー陰性表現型を有していて、ミトコンドリアポリペプチドの活性が低減されている酵母細胞を特徴とする。かかる細胞は例えばクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）またはヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属からのものでよい。細胞は完全に活性を欠如できる。細胞は破壊された遺伝子座を含有でき、ここで遺伝子座は通常ミトコンドリアポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ミトコンドリアポリペプチドはクレブスサイクル酵素でよい。さらに細胞はクレブスサイクル生成物を蓄積できる。細胞が有機生成物を生成するように有機生成物を形成させる酵素活性を細胞内で有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を細胞が含むことができる。有機生成物は例えばクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、及びオキザロ酢酸塩でよい。ポリペプチドは乳酸塩または酢酸塩の異化に関与するポリペプチドでよい。
【００２０】
別の態様では、本発明は有機生成物を生成する方法を特徴とする。方法は、細胞がクラブトリー陰性表現型を有し、酵母細胞が、細胞内で酵素活性が有機生成物の形成に至る酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含む、酵母細胞を提供し、有機生成物が生成されるような培養培地で酵母細胞を培養することからなる。酵母細胞はクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）またはヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属からのものでよい。有機生成物は発酵生成物、ピルビン酸塩誘導生成物、３個以上の炭素原子を含有する有機生成物、カルボン酸塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、または脂質生成物でよい。有機生成物はさらに乳酸塩、グリセロール、アクリレート、キシロース、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、サクシニルＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、及びオキザロ酢酸塩でよい。ある実施形態では、有機生成物は細胞により分泌される。方法によりピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性が低減されているか、またはアルコールデヒドロゲナーゼが低減されている細胞に至る。酵素活性はＮＡＤＨ−消費様式での有機生成物の形成を導くことができる。
【００２１】
これらの方法により作られた細胞は、培養工程が有機生成物の生成に最適である場合に消費されるグルコース１００ｇあたり少なくとも約６０ｇの有機生成物を生成できる。培養培地は液体でよく、細胞性呼吸のインヒビター、例えばアンチマイシンＡ、シアン化合物、またはアジドを含むことができる。培養工程は好気性成長条件下で細胞を成長させ、続いて該細胞を細胞性呼吸のインヒビターと接触させることを含むことができる。
【００２２】
また別の実施形態では、培養工程は細胞を嫌気性培養条件下で培養することを含む。さらにまた別の実施形態では、培養工程は細胞を好気性成長条件下で成長させ、続いて細胞を嫌気性培養条件下でインキュベートすることを含む。培養工程はまた約３５℃以上の温度で細胞を培養することをも含むことができる。
【００２３】
１つの実施形態では、培養培地は約３．０未満の有機的ｐＨ値及び／または約３．０未満の無機的ｐＨ値を有する。別の実施形態では、培地はペントース炭素例えばリボース、アラビノース、キシロース、またはリキソースを含有する。培地はまた、例えば約２．０から約６．５の間のｐＨ値を有するトウモロコシ繊維加水分解物を含んでよい。
【００２４】
別の態様では、本発明はａ）細胞によるペントース炭素の異化を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞を提供することであって、ここで細胞は該有機生成物の形成を導く酵素活性を含有する；及びｂ）有機生成物が生成されるような培養培地で細胞を培養することを含む、有機生成物を生成するための方法を特徴とする。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明はａ）細胞の細胞質におけるアセチルＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞を提供することであって、ここで細胞は有機生成物の形成を導く酵素活性を含有する；及びｂ）有機生成物が生成されるような培養培地で細胞を培養することを含む、有機生成物を生成するための方法を特徴とする。
【００２６】
別の態様では、本発明はａ）ミトコンドリア酵素活性が低減されている酵母細胞を提供することであって、ここで活性の低減により有機生成物の蓄積が導かれる；及びｂ）該有機生成物が生成されるような培養培地で該細胞を培養することを含む、有機生成物を生成するための方法を特徴とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、約３．０未満の有機的ｐＨ値及び／または約３．０未満の無機的ｐＨ値を有する培養培地で酵母細胞を培養することを含む、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養する方法を特徴とする。培養工程は細胞を約３５℃以上の温度で培養することを含んでよい。培養培地は細胞性呼吸のインヒビターを含んでよい。培養培地はまたペントース炭素を含んでよい。別の実施形態では、培養培地はトウモロコシ繊維加水分解物を含んでよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、酵母細胞をトウモロコシ繊維加水分解物を含む培養培地と共に培養することを含む、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養する方法を特徴とする。
【００２９】
別の態様では、本発明は、約３５℃以上の温度の培養培地で、約３．０未満の無機的ｐＨ値を有する培養培地で細胞を培養することを含む、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養する方法を特徴とする。
【００３０】
別の態様では、本発明は、約３５℃以上の温度の培養培地で、ペントース炭素を含有する培養培地で細胞を培養することを含む、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養する方法を特徴とする。
【００３１】
別の態様では、本発明は、約３５℃以上の温度の培養培地で、トウモロコシ繊維加水分解物を含有する培養培地で細胞を培養することが含む、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養する方法を特徴とする。
【００３２】
別の態様では、本発明は組換え配列及び選択された配列を含む核酸構築物を特徴とし、ここで組換え配列はクラブトリー陰性表現型を有する細胞のゲノム配列に対応し、ゲノム配列は細胞により発現される酵素をコードし、及び選択された配列は細胞内で有機生成物の形成を導く酵素をコードする。選択された配列が組換え配列により各々の末端でフランキングされているように、選択された配列が組換え配列内にあってよい。
【００３３】
別の態様では、本発明はクラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を提供すること、最終生成物を選択すること、最終生成物を生成するためにどの外来性酵素または複数の酵素を細胞に添加する必要があるかを同定すること、該細胞内で該最終生成物の生成を可能にするために該細胞において活性が低減されているべき外来性酵素または複数の酵素を同定すること、同定された外来性酵素または複数の酵素を提供された酵母細胞に添加すること、及び培養条件下で細胞が最終生成物を生成するように、提供された酵母細胞において同定された外来性酵素または複数の酵素の活性を低減させることを含む組換え酵母細胞を作製する方法を特徴とする。
【００３４】
別の態様では、本発明は約２．０及び約６．５の間のｐＨ値を有するトウモロコシ繊維加水分解物を特徴とする。加水分解物はグルコース、キシロース、及びアラビノースを含んでよい。加水分解物は約４０ｇ／ｌのグルコース、約４０ｇ／ｌのキシロース、及び約２０ｇ／ｌのアラビノースを含んでよい。また別に、加水分解物は約３８．７ｇ／ｌのグルコース、約３９．１ｇ／ｌのキシロース、約２０．７ｇ／ｌのアラビノース及び約１．６ｇ／ｌのフルフラールを含んでよい。
【００３５】
別の態様では、本発明はａ）微生物の酵素活性が低減されている；酵素活性はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアセチルＣｏＡシンターゼ活性でよい；微生物がエタノール及び酢酸塩の不在下では、該酵素活性が低減されていない対応する微生物で観察される成長速度の少なくとも約３０％である成長速度を呈する培養条件下で微生物を培養すること；及びｂ）有機生成物の生成を促進させるために培養条件を変化させることを含む、有機生成物を生成するための方法を特徴とする。
【００３６】
別の態様では、本発明はａ）細胞性呼吸を促進する培養条件下で微生物を培養することであって、ここで微生物は酵素活性が低減されている；酵素活性がピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアセチルＣｏＡシンターゼ活性でよく、微生物はエタノール及び酢酸塩の不在下では、そのような酵素活性が低減されていない対応する微生物で観察される成長速度の少なくとも約３０％である成長速度を呈する；及びｂ）培養条件を変化させて細胞性呼吸を低減させ、それにより有機生成物の生成を促進させることを含む、有機生成物を生成するための方法を特徴とする。
【００３７】
特記しない場合、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術の通常の技術者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて記載するものと類似または等価である方法及び材料を本発明の実施または試験において使用できるが、適当な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において記載した全ての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献はその全てを出展明示により本明細書の一部とする。矛盾する場合、定義を含めて本明細書を調整する。加えて材料、方法及び実施例は説明のためだけのものであり、限定することは意図しない。本発明の別の特徴及び利点は以下の詳細な記載から、及び請求の範囲から明らかになろう。
【００３８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は有機生成物の生成に関する方法及び材料を提供する。具体的には本発明は酵母細胞、酵母細胞を培養する方法、酵母細胞を作製する方法、核酸構築物、並びに種々の有機生成物を生成するための方法及び材料を提供する。
【００３９】
本明細書で提供される酵母細胞を用いて有機生成物を生成することができる。かかる有機生成物を広範な適用において用いることができる。例えば本明細書に記載する酵母細胞により生成された有機生成物を食品の保存剤もしくは添加物、医薬品または化粧用生成物として用いることができ、これを用いてプラスチック及びその他の生成物を作製することができる。
【００４０】
本発明の目的では、有機生成物は炭素原子を含有するいずれかの化合物である。
【００４１】
例えば、カルボン酸塩（例えば乳酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキザロ酢酸塩）、炭水化物（例えばＤ−キシロース）、アルジトール（例えばキシリトール、アラビトール、リビトール）、アミノ酸（例えばグリシン、トリプトファン、グルタミン酸塩）、脂質、エステル、ビタミン（例えばＬ−アスコルビン酸塩）、ポリオール（例えばグリセロール、１，３−プロパンジオール、エリスリトール）アルデヒド、アルケン、アルキン、及びラクトンは有機生成物である。このように、有機生成物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の炭素原子を含有できる。加えて有機生成物は約１０００未満（例えば約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、または１００未満）の分子量を有してよい。例えばＤ−キシロース（Ｃ５Ｈ１０Ｏ５）は分子量１５０の有機生成物である。さらに有機生成物は発酵生成物でよい。本明細書で用いる「発酵生成物」なる用語は発酵方法により生成されるいずれかの有機化合物を意味する。
【００４２】
一般に、発酵方法は有機化合物、例えば炭水化物の化合物、例えばエチルアルコールへの嫌気的酵素変換を含み、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態でのエネルギーになる。従って発酵は、酸素分子よりもむしろ有機生成物が電子受容体として用いられる点で細胞性呼吸とは異なる。発酵生成物の実例には、非限定例としては酢酸塩、エタノール、酪酸塩及び乳酸塩などがある。
【００４３】
有機生成物はピルビン酸塩誘導生成物でもよい。本明細書で用いる「ピルビン酸塩誘導生成物」なる用語は、たかだか１５までの酵素的工程でピルビン酸塩から合成されるいずれかの化合物を意味する。酵素的工程は酵素活性を有するポリペプチドにより触媒されるいずれかの化学反応または一連の反応である。本明細書で用いる「酵素活性を有するポリペプチド」なる用語は反応もしくは複数の反応の完了時にそれ自体は破壊されないか、または変化しないで別の物質の化学反応を触媒するいずれかのポリペプチドを意味する。典型的には、酵素性ポリペプチドは１つまたはそれ以上の物質からの１つまたはそれ以上の生成物の形成を触媒する。かかるポリペプチドは、非限定例としては、酵素、例えばアコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケトグルタル酸塩デヒドロゲナーゼ、コハク酸塩チオキナーゼ、コハク酸塩デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、クエン酸塩シンターゼ、２，５−ジオキシ吉草酸塩デヒドロゲナーゼ、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカル酸塩デヒドロゲナーゼ、グルカル酸塩デヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルクロノラクトンリダクターゼ、Ｌ−グルクロノラクトンオキシダーゼ、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタノエートアルドラーゼ、キシロネートデヒドラターゼ、キシロノラクトナーゼ、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ、乳酸塩デヒドロゲナーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ、またはアクリリル−ＣｏＡヒドラターゼなどのいずれかの型の酵素活性を有することができる。
【００４４】
特定の酵素活性を有するポリペプチドが天然発生または非天然発生のいずれかであるポリペプチドでよいことに注目することは重要である。天然発生ポリペプチドは野性型及び多型性ポリペプチドなどの天然に見出されるようなアミノ酸配列を有するいずれかのポリペプチドである。かかる天然発生ポリペプチドを非限定例としては哺乳動物、菌類、及び細菌種などのいずれかの種から入手することができる。非天然発生ポリペプチドは天然には見出されないアミノ酸配列を有するいずれかのポリペプチドである。従って、非天然発生ポリペプチドは天然発生ポリペプチドの変異体かまたは操作されたポリペプチドでよい。例えばクエン酸塩シンターゼ活性を有する非天然発生ポリペプチドはクエン酸塩シンターゼ活性を有する天然発生ポリペプチドの変異体でよく、少なくともいくつかのクエン酸塩シンターゼ活性を有している。ポリペプチドは例えば配列付加、欠失、及び／または置換により変異されていてよい。
【００４５】
有機生成物が１５以上の酵素的工程を必要とするピルビン酸塩から合成される場合、生成物はピルビン酸塩誘導生成物ではない。ピルビン酸塩誘導生成物の実例には、非限定例としてはクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキザロ酢酸塩、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−キシロン酸塩、Ｄ−キシロン酸塩、Ｄ−キシロノラクトン、Ｄ−キシロース、アクリル酸塩、酢酸塩、エタノール、酪酸塩、及び乳酸塩などがある。
【００４６】
本発明の目的では、「遊離酸」または「塩」の形態でよいカルボン酸塩生成物は塩形態命名法を用いて称される。例えば乳酸は乳酸塩と称される。従ってこの場合、「乳酸塩」なる用語には乳酸及び乳酸塩が含まれることは理解されよう。
【００４７】
本明細書で用いる「核酸」なる用語はＲＮＡ並びにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成（化学的に合成された）ＤＮＡなどのＤＮＡの双方を包含する。核酸は二本鎖または一本鎖でよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖でよい。加えて核酸は環状または直線状でよい。核酸分子及び特定の細胞に関して本明細書で用いる「外来性」または「異種性」なる用語は天然に見出されるその特定の細胞に由来しないいずれかの核酸分子を意味する。従って全ての非天然発生核酸分子は、一度細胞に導入されると、細胞に対して外来性であると考えられる。核酸分子が全体として天然に存在しない場合、非天然発生核酸分子が天然に見出される核酸配列または核酸配列のフラグメントを含有できることに注目することが重要である。例えば、発現ベクター内にゲノムＤＮＡ配列を含有する核酸分子は非天然発生核酸分子であると考えられ、従って核酸分子は全体としては（ゲノムＤＮＡプラスベクターＤＮＡ）天然には存在しないので、一度細胞に導入されると、細胞に対してローブ外来性であると考えられる。従って全体としては天然には存在しないいずれかのベクター、自律性複製プラスミド、またはウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）は非天然発生核酸分子であると考えられる。従って、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処置により生成されたゲノムＤＮＡフラグメント及びｃＤＮＡのフラグメントは天然には見出されない別個の分子として存在するので、非天然発生核酸分子であると考えられる。従ってまた、天然には見出されない並びでプロモーター配列及びポリペプチドコード化配列（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含有するいずれかの核酸分子は非天然発生核酸分子であると考えられる。
【００４８】
「内在性」なる用語は外来性ではないゲノム材料を意味する。一般に内在性ゲノム材料は生物、組織または細胞内で発達し、組換え技術により挿入または修飾されない。内在性ゲノム材料はその範囲内に天然発生変種を含む。
【００４９】
天然発生である核酸分子が特定の細胞に対して外来性でよいことに注目することもまた重要である。例えばヒトＸから単離された染色体全体は、一度染色体がヒトＹの細胞に導入されると、ヒトＹの細胞に関して外来性の核酸分子であると考えられる。
【００５０】
本明細書で用いる「遺伝的に修飾された」なる用語はそのゲノムが例えばゲノム材料の付加、置換または欠失により修飾されている生物を意味する。ゲノム材料の付加または欠失の方法は公知であり、非限定例としてはランダム変異誘発、挿入、欠失及び置換などの点変異、ノックアウト技術、並びに安定及び一過性双方の形質転換体などの組換え技術を用いる生物の核酸配列での形質転換などがある。酵母細胞は天然にまたは遺伝的修飾のためのいずれかによりデンプンを異化することもでき、例えば菌類基盤のセルラーゼの付加によりセルロース誘導体を異化するように遺伝的に修飾することさえできる。
【００５１】
１．クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞
本発明はクラブトリー陰性表現型を有する種々の遺伝子操作された酵母細胞を提供する。かかる組換え酵母細胞を用いて有機生成物を生成できる。例えば、本発明はクラブトリー陰性表現型を有し、有機生成物の形成を導く酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞を提供する。かかる酵母細胞が有機生成物を生成する場合は、酵母細胞は本発明の範囲内である。生成された有機生成物は酵母細胞から分泌でき、有機生成物を回収するための細胞膜を破壊する必要性は排除されていることは注目される。典型的には本発明の酵母細胞は、生成物の生成に最適な条件下で培養した場合に消費されるグルコース１００ｇあたり有機生成物の収量が少なくとも約４０ｇ（例えば少なくとも約４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｇ）である有機生成物を生成する。特定の酵母細胞に関して有機生成物生成の収量を決定する場合、いずれかの方法を用いることができる。例えばＫｉｅｒｓら、Ｙｅａｓｔ  １４（５）：４５９−４６９（１９９８）を参照。コードされるポリペプチドの酵素活性がＮＡＤＨ消費様式で有機生成物の形成を導くことができることもまた注目される。換言すれば、有機化合物の生成はエネルギー源としてＮＡＤＨを要求し得る。
【００５２】
「ＮＡＤ」なる用語は特定の酸化・還元反応で電子及び水素キャリヤとして作用するコファクターを意味し、一方「ＮＡＤＨ」なる用語はＮＡＤの還元体を意味する。合成にＮＡＤＨを要求する有機生成物の実例には、非限定例としては乳酸塩、エタノール、酢酸塩、及びアクリル酸塩などがある。典型的には本発明の範囲内にある酵母細胞はヘキソース炭素例えばグルコースを異化することもできる。しかしながら、かかる酵母細胞はまたペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロース、及びリキソース）を異化することもできる。換言すれば、本発明の範囲内にある酵母細胞は天然にペントース炭素を利用できるか、またはペントース炭素を利用するように操作できる。例えば酵母細胞に、キシロースを異化できるように、キシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及び／またはキシルロキナーゼをコードする外来性核酸分子を提供することができる。酵母細胞はまた天然にまたは遺伝子修飾のためにデンプンを異化することもでき、例えば菌類基盤のセルラーゼを付加することによりセルロース誘導体を異化するように遺伝子修飾することさえできる。クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞はクラブトリー効果を呈さないいずれかの酵母細胞である。
【００５３】
「クラブトリー陰性」なる用語は天然発生生物及び遺伝子修飾された生物の双方にあてはまる。簡単には、クラブトリー効果は好気的条件下で培養した場合の、高グルコース濃度（例えば５０ｇ／ｌ  グルコース）の存在のための微生物による酸素消費の阻止として定義される。換言すれば、クラブトリー陽性表現型を有する酵母細胞はグルコースの存在のための酸素利用性に関係なく発酵を続けるが、一方クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞は酸素消費のグルコース媒介阻止を呈さない。典型的にはクラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞の実例には、非限定例としては以下の属からの酵母細胞などがある：クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）またはヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）。
【００５４】
本明細書に記載するように、本発明は幅広い種類の異なる有機生成物を生成できる多くの異なる型の組換え酵母細胞を提供する。例えば、酵母細胞は乳酸塩を生成するように、乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子含有できる。かかるポリペプチドの実例には、非限定例としてはウシ乳酸塩デヒドロゲナーゼ、細菌性乳酸塩デヒドロゲナーゼ、及び菌類乳酸塩デヒドロゲナーゼ（例えばＬ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）またはＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）菌類乳酸塩デヒドロゲナーゼ）などがある。また、酵素活性、例えば乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは天然発生または非天然発生でよい。本明細書で記載する酵母細胞は特定の外来性核酸分子の単一のコピーまたは複数のコピー（例えば約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００または１５０コピー）を含有できることに注目することが重要である。例えば、酵母細胞は約５０コピーの外来性核酸分子Ｘを含有できる。本明細書で記載する酵母細胞は１つ以上の特定の外来性核酸分子を含有できることに注目することも重要である。例えば酵母細胞は約５０コピーの外来性核酸分子Ｘ及び約７５コピーの外来性核酸分子Ｙを含有することができる。これらの場合、各々の異なる核酸分子はその独自の酵素活性を有する異なるポリペプチドをコードできる。例えば、酵母細胞はアクリル酸塩が生成されるように４つの異なる外来性核酸分子を含有することができる。この実例では、かかる酵母細胞は乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外来性核酸分子、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第２の外来性核酸分子、ラクチル−ＣｏＡ−デヒドラターセ活性を有するポリペプチドをコードする第３の外来性核酸分子、及びアクリリル−ＣｏＡ−ヒドラターセ活性を有するポリペプチドをコードする第４の外来性核酸分子を含有できる。
【００５５】
別の実例では、酵母細胞はＤ−キシロースが生成されるように４つの異なる外来性核酸分子を含有することができる。とりわけ、かかる酵母細胞は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタノエートアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外来性核酸分子、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第２の外来性核酸分子、キシロノラクトナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第３の外来性核酸分子、及びＤ−キシロースデヒロドゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第４の外来性核酸分子を含有できる。さらに別の実例では、酵母細胞はビタミン、Ｌ−アスコルビン酸塩が生成されるように６つの異なる外来性核酸分子を含有することができる。とりわけ、かかる酵母細胞は２，５−ジオキシ吉草酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１の外来性核酸分子、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカル酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第２の外来性核酸分子、グルカル酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第３の外来性核酸分子、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第４の外来性核酸分子、グルクロノラクトンリダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする第５の外来性核酸分子、及びグルクロノラクトンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第６の外来性核酸分子を含有できる。
【００５６】
望ましい有機生成物が光学的に純粋であるような（例えば約９０、９５、９９％純粋）酵素性ポリペプチドを用いることができることに注目することが重要である。例えば、（Ｌ）−乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用いて（Ｌ）−乳酸塩を生成できる。
【００５７】
本発明の範囲内である酵母細胞はまた酵素活性、例えば、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減されていてもよい。本明細書で細胞及び特定の酵素活性に関して用いる「低減された」なる用語は同一種の匹敵する酵母細胞において測定される酵素活性よりも低レベルの酵素活性を意味する。従って、全てではないがたいていの匹敵する酵母細胞は少なくともいくつかのピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性を有しているので、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性を欠如した酵母細胞はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性が低減されていると考えられる。このように酵素活性が低減されているのは酵素濃度の低下、酵素の特異活性の低下、またはその組み合わせの結果であり得る。多くの異なる方法を用いて酵素活性が低減されている酵母細胞を作製することができる。例えば、酵母細胞を操作して、一般的な変異誘発またはノックアウト技術を用いて酵素コード化遺伝子座を破壊させることができる。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７年版）Ａｄａｍ、Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ、Ｋａｉｓｅｒ及びＳｔｅｍｓ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９９８）を参照。また別にアンチセンス技術を用いて酵素活性を低減させることができる。例えば酵母細胞を操作して酵素が作製されるのを防御するアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含有させることができる。本明細書で用いる「アンチセンス分子」なる用語は内因性ポリペプチドのコーディング鎖に対応する配列を含有するいずれかの核酸分子を包含する。アンチセンス分子はフランキング配列（例えば制御配列）を有することもできる。従ってアンチセンス分子はリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでよい。分子がＲＮＡを切断する場合、リボザイムは、非限定例としてはヘアピン、ハンマーヘッド、またはアクスヘッド（ａｘｈｅａｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）構造などのいずれかの一般構造を有してよい。
【００５８】
酵素活性が低減されている酵母細胞をいずれかの方法を用いて同定することができる。例えばピルビン酸塩デカルボキシラーゼが低減されている酵母細胞を一般的な方法を用いて容易に同定できる。Ｕｌｈｒｉｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８：１０９−１１５（１９７０）参照。
【００５９】
２．クラブトリー陽性またはクラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞
本発明はまたクラブトリー陰性表現型を有する必要のない種々の遺伝子操作された酵母細胞、すなわちクラブトリー陽性または陰性のいずれかでよい酵母細胞をも提供する。かかる組換え酵母細胞を用いて有機生成物を生成することができる。例えば、本発明は細胞によるペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロース及びリキソース）の異化を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞を提供する。とりわけ、酵母細胞は、キシロースがより効率的な様式で代謝されるように、キシロースリダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、及び／またはキシルロキナーゼをコードする外来性核酸分子を有することができる。加えて、ペントース炭素を異化できる酵母細胞は連続的または同時のいずれかでヘキソース炭素（例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース（ｉｏｄｏｓｅ）、ガラクトース、及びタロース）を異化することもできる。例えばキシロース及びグルコースが同時に異化されるように酵母細胞を操作することができる。ペントース炭素を異化する能力が増強されている酵母細胞を用いてペントース炭素供給源から有機生成物を生成できる酵母細胞を操作することができることが注目される。ペントース炭素供給源例えばキシロースは、一般にヘキソース炭素供給源例えばグルコースほど高価でないので、この特徴は特に有利である。異化できるその他の炭素供給源には、非限定例としてはメリビオース、スクロース、フルクトース、ラフィノース、スタキオース、デンプン（例えばトウモロコシデンプン及び小麦デンプン）、及び加水分解物（例えばトウモロコシ繊維加水分解物及びその他のセルロース誘導体加水分解物）などがある。
【００６０】
加えて、本発明は細胞の細胞質におけるアセチルＣｏ−Ａの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞を提供する。例えば、酵母細胞はクエン酸塩リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を有することができる。また別に、酵母細胞はミトコンドリア膜を通るアセチルＣｏ−Ａ透過性を促進するミトコンドリア膜ポリペプチドをコードする外来性核酸分子を有することができる。エタノールを生成する能力を欠如する多くの酵母細胞がエタノール及び酢酸塩の不在下で成長できないことは注目される。典型的には、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼのいずれかの活性がなんらかの様式で欠如している場合、酵母細胞はエタノールを生成する能力を欠如する。例えばピルビン酸塩デカルボキシラーゼ活性を欠如するクラブトリー陽性酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｏｍｙｃｅｓ））はエタノール及び酢酸塩の不在下はであまり成長しない。
【００６１】
従って、ピルビン酸塩のその他の有機生成物（例えば乳酸塩及びアクリル酸塩）への利用に再志向させるためにエタノール生成を低減させる様式でかかるクラブトリー陽性酵母を操作することにより、エタノール及び酢酸塩の不在の場合、特にグルコースが存在するときにクラブトリー陰性酵母が細胞性呼吸を制限するので、特徴的な低成長に至る。本明細書に記載するように、細胞質酢酸塩濃度及びアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性に依存する様式以外のなんらかの様式で細胞質アセチル−ＣｏＡの蓄積を促進できる酵母細胞は、エタノールを生成できない場合でさえもエタノール及び酢酸塩の不在下で成長できる。エタノールの生成する能力を欠如しているが、エタノール及び酢酸塩の不在下で成長する能力を有する酵母細胞はエタノール以外の有機生成物を生成するためにピルビン酸塩の利用を再志向できることは注目される。
【００６２】
酵母のいずれかの型は細胞の細胞質におけるアセチル−ＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有できる。例えば、クラブトリー陰性またはクラブトリー陽性表現型を有する酵母細胞は、細胞の細胞質におけるアセチル−ＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有できる。典型的には、酵母細胞を（１）細胞がピルビン酸塩デカルボキシラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を欠如するように外来性核酸分子を含有する細胞を操作すること、（２）滴定量の呼吸インヒビター（例えばアンチマイシンＡ、シアン化合物またはアジド）の存在下で培養している間に細胞の成長特性を決定すること、及び（３）これらの成長特性を、外来性核酸分子を含有せず、しかもピルビン酸塩デカルボキシラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を欠如するように操作された匹敵する酵母細胞で観察される成長特性と比較することにより同定できる。かかる比較により外来性の核酸分子の存在のためにより好ましい成長特性を有すると決定された酵母細胞は、細胞の細胞質におけるアセチル−ＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有すると考えられる。
【００６３】
細胞の細胞質におけるアセチル−ＣｏＡの蓄積を促進するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する酵母細胞はまた、酵素活性、例えばピルビン酸塩デカルボキシラーゼ及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性が低減されていてよい。例えば酵母細胞はエタノールを生成する能力を欠如していてよい。典型的には、かかる酵母細胞はエタノール及び酢酸塩を欠如する培養条件下で外来性核酸分子を含有せず、しかも類似の培養条件下（すなわちエタノール及び酢酸塩を欠如する培養条件）で培養された匹敵する酵母細胞（すなわちエタノールを生成する能力を欠如する酵母細胞）で観察される成長速度よりも早い（すなわち約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００％またはそれ以上）成長速度を有する。
【００６４】
本発明はまたポリペプチドの活性が低減されている酵母細胞をも提供する。かかる酵母細胞はクラブトリー陰性またはクラブトリー陽性表現型を有してよい。例えば、本発明の範囲内である酵母細胞は原形質膜ポリペプチド（例えば原形質膜トランスポーター）、細胞質ポリペプチド（例えばピルビン酸塩デカルボキシラーゼ）、及び／またはミトコンドリアポリペプチド（例えばピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ）の活性が低減されていてよい。
【００６５】
「原形質膜トランスポーター」なる用語は原形質膜を通る有機生成物の移動を促進するポリペプチドを意味する。かかるポリペプチドの実例には、非限定例としてはカルボン酸トランスポーター、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＪＥＮ１（ジェンバンク受け入れ番号Ｕ２４１５５）などがある。「ミトコンドリアポリペプチド」なる用語は、非限定例としてはピルビン酸塩デヒドロゲナーゼなどのミトコンドリア内で機能するいずれかのポリペプチド、乳酸塩またはアセチル−ＣｏＡの異化に参与するポリペプチド（例えばチトクロームｂ２ポリペプチド）、及びクレブスサイクル酵素を意味する。クレブスサイクル酵素にはアコニターゼ、イソクエン酸塩デヒドロゲナーゼ、ケトグルタル酸塩デヒドロゲナーゼ、コハク酸塩チオキナーゼ、コハク酸塩デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、及びクエン酸塩シンターゼなどがある。本明細書で記載するように、酵素活性が低減されている酵母細胞には特定の酵素活性を完全に欠如している酵母細胞などがある。酵母細胞及びポリペプチド活性に関して本明細書で用いる「低減された」なる用語は、類似の条件下で同一種の匹敵する酵母細胞で測定された活性レベルよりも低い活性レベルを意味する。従って、匹敵する細胞が少なくともいくつかの輸送活性を有する場合、特定の輸送活性を欠如する酵母細胞は、輸送活性が低減されていると考えられる。かかる低減されたポリペプチド活性はポリペプチド濃度の低下、ポリペプチドの特異活性の低下、またはその組み合わせの結果であり得る。種々の方法のいずれかを用いてポリペプチド活性が低減されている酵母細胞を作製することができる。例えば、ミトコンドリアポリペプチドをコードする核酸配列を有する遺伝子座を、例えば一般的な変異誘発またはノックアウト技術により不活性化することができる。
【００６６】
ミトコンドリア酵素の活性が低減されている酵母細胞はクレブスサイクル生成物（例えばクエン酸塩、イソクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、サクシニル−ＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、及びオキザロ酢酸塩）を蓄積できるということが注目される。例えば、フマラーゼ活性が低減されている酵母細胞はフマル酸塩を蓄積できる。加えて、酵母細胞は細胞が有機生成物を生成するように、有機生成物の形成を導く酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有できる。
【００６７】
いくつかのクレブスサイクル生成物はミトコンドリア膜を透過できないことに注目することが重要である（例えば、アルファ・ケトグルタル酸塩及びサクシニル−ＣｏＡ）。従って、特定のクレブスサイクル酵素の活性の低減により、結果的にミトコンドリア内腔で特定のクレブスサイクル生成物の蓄積に至る。これらの場合、クレブスサイクル酵素の活性が低減されている酵母細胞を、各々が異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の異なる外来性核酸分子を有し、望ましいクレブスサイクル生成物が細胞質内に蓄積されるように操作できる。例えばケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性の低減により、結果的にアルファ・ケトグルタル酸塩の蓄積に至り、今度はイソクエン酸塩の蓄積に至る。アルファ・ケトグルタル酸塩はミトコンドリア膜を透過できず、一方イソクエン酸塩はミトコンドリア膜を透過できる。従って、イソクエン酸塩を細胞の細胞質内に蓄積できる。しかしながら、イソクエン酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子をも含有し、細胞質内に機能的なポリペプチドを発現する酵母細胞は細胞質アルファ・ケトグルタル酸塩を生成できる。従って外来性核酸分子が細胞質内で機能的である同一である（または異なる）クレブスサイクル酵素をコードする場合、特定のクレブスサイクル酵素の活性の低減により、結果的に細胞質内での種々のクレブスサイクル生成物（またはクレブスサイクル生成物に由来する生成物）の生成を導くことができる。
【００６８】
さらに本発明はバイオマスまたは望ましい有機生成物いずれかの生成から炭素供給源の利用をそらす酵素の活性を低減させた酵母細胞を提供する。例えばグリセロールまたは特定の経路内の酵素を破壊することができ、バイオマスまたは望ましい有機生成物の生成のために培養培地中の炭素供給源が優先的に利用される。グリセロール経路の実例には、非限定例としてはジヒドロキシアセトンリン酸塩リダクターゼなどがある。特定の経路酵素の実例には、非限定例としてはアルファ・アセト乳酸塩シンターゼ及びアルファ・アセト乳酸塩デカルボキシラーゼなどがある。またいずれかの方法を用いて酵素の活性を低減されることができる。
【００６９】
さらに、本発明で提供されるいずれかの酵母細胞はキラープラスミドとして機能する外来性核酸分子を含有することができる。本明細書で用いる「キラープラスミド」なる用語は、別の種の酵母を殺す能力を有するある種の酵母を提供する核酸分子を意味する。例えばキラープラスミドを含有するクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母細胞はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｏｍｙｃｅｓ）属の酵母の成長を防御できる。従って、キラープラスミドを有する酵母細胞を用いて大規模容量の生成過程で生じる夾雑の問題を防ぐことができる。加えて、いずれかの型のキラープラスミドを酵母細胞に与えることができる。例えばＫ．テチス（Ｋ．ｔｈｅｔｉｓ）から単離されたキラープラスミドをＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）酵母細胞に与えることができる。キラープラスミドを含有する酵母細胞を一般的な方法を用いて容易に同定できる。例えばＧｕｎｇｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：３８２−３９０（１９８１）；Ｇｕｎｇｅ及びＫｉｔａｄａ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｏｌ．４：４０９−４１４（１９８８）；及びＷｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌら、Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌａｕｓ  Ｗｏｌｆ編、スプリンガー・フェアラーグ、ベルリン、１３８−２０１頁（１９９６）参照。
【００７０】
同様に、本発明で提供されるいずれかの酵母細胞は、酵母細胞が低ｐＨ環境に対してさらに耐性になるように修飾されたＡＴＰアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有することができる。例えば、細胞外プロトン濃度が高い場合に低い細胞質プロトン濃度を効果的に維持するＡＴＰアーゼを酵母細胞に与えることができる。かかるポリペプチドをＭｏｒｓｏｍｍｅら（ＥＭＢＯＪ．１５：５５１３−５５２６（１９９６））に記載されるように操作できる。
【００７１】
本明細書で記載される組換え酵母細胞のいずれかが望ましい遺伝子操作のいずれかの組み合わせを含有できることに注目することが重要である。例えば、クラブトリー陽性表現型を有する酵母細胞は、クエン酸塩リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子及び有機生成物の形成を導く酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有できる。
【００７２】
３．適当な生物
種々の生物が本発明による使用に適している。クラブトリー陰性及びクラブトリー陽性酵母微生物、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＳ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）例えばＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）例えばＹ．スティプチック（Ｙ．ｓｔｙｐｔｉｃ）、またはトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）などの広範な微生物種からの生物を乳酸生成のための宿主として提供することもできる。例えば天然に乳酸を生成する生物、例えばリゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を酸耐性、収率改善、及び光学的に純粋な乳酸のために遺伝的に修飾することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種もまた種々の有機酸、例えばクエン酸を生成し、低ｐＨに耐性があることが知られている。乳酸を生成するためにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種を遺伝的に修飾する方法を利用できる。さらに菌類例えばリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種は、炭素供給源として使用するためにデンプン及びその他の炭水化物を単量体炭水化物に分解することができる酵素を生成する。
【００７３】
原核生物、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は乳酸生成のために遺伝的に修飾されているか、または修飾され得る。バシラス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）として同定されている微生物もまた天然に乳酸を生成し、低ｐＨ乳酸生成を改善するためにさらに遺伝的に修飾され得る。加えて、アーキア（Ａｒｃｈｅａ）ファミリーからの高極限性生物は極端な低ｐＨ及び高温に耐えることができる。このファミリーから選択された種の遺伝的修飾により乳酸生成株を提供できる。
【００７４】
４．遺伝的実施形態
酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいずれかの方法を用いて同定及び入手することができる。例えば標準的な核酸シークエンシング技術及び遺伝子コードに基づいて核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するソフトウェアを用いて特定の核酸が公知の酵素性ポリペプチドといずれかの配列相同性を有するかどうかを決定することができる。配列アラインメントソフトウェア、例えばＭＥＧＡＬＩＧＮ（登録商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ、マディソン、ウィスコンシン州、１９９７）を用いて種々の配列と比較することができる。加えて、公知の酵素性ポリペプチドをコードする核酸分子を一般的な分子クローニング技術（例えば位置指定変異誘発）を用いて変異させることができる。可能な変異には、非限定例としては欠失、挿入及び塩基置換、並びに欠失、挿入及び塩基置換の組み合わせなどがある。さらに核酸及びアミノ酸データベース（例えばジェンバンク（登録商標））を用いて酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を同定することができる。簡単には、酵素活性を有するポリペプチドになんらかの相同性を有するいずれかのアミノ酸配列をクエリー（ｑｕｅｒｙ）として用いてジェンバンク（登録商標）を検索することができる。次いで同定されたポリペプチドを分析してこれらが酵素活性を呈するかどうかを決定することができる。
【００７５】
ＰＣＲなどの一般的な分子クローニングまたは化学的核酸合成手順及び技術を用いて酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を同定し、入手することができる。ＰＣＲとは目標の核酸を米国特許第４６８３１９５号に記載される方法に類似の方法で増幅する手順または技術、並びにそこに記載されたそれに続く修飾の手順を意味する。一般に、目的の領域の末端からのまたはそれを越えて配列情報を用いて、増幅される可能性のある鋳型の反対の鎖に同一または類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを用いてＲＮＡまたはＤＮＡから核酸配列を増幅することができる。例えば、ＰＣＲ増幅により全細胞性ＲＮＡ、全ゲノムＤＮＡ、及びｃＤＮＡから、並びにバクテリオファージ配列、プラスミド配列、ウイルス配列等から核酸配列を単離することができる。ＲＮＡを鋳型の供給源として用いる場合、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ鎖を合成することができる。
【００７６】
さらに核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を同定及び入手することができる。簡単には、公知の酵素性ポリペプチドをコードするいずれかの核酸分子またはそのフラグメントをプローブとして用いて中程度から高度なストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションにより類似の核酸分子を同定することができる。次いでかかる類似の核酸分子を単離、シークエンシング、及び分析してコードされたポリペプチドが酵素活性を有するかどうかを決定することができる。サザンまたはノーザン分析によりハイブリダイゼーションを行い、プローブにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を各々同定することができる。プローブを放射性同位元素、例えば３２Ｐ、酵素、ジゴキシゲニンで、またはビオチン化により標識することができる。技術分野で公知の標準的な技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、プレインビュー、ニューヨーク州のセクション７．３９−７．５２に記載された技術を用いて、分析すべきＤＮＡまたはＲＮＡを電気泳動によりアガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜、ナイロンまたはその他の適当な膜に写し、プローブでハイブリダイズすることができる。典型的には、プローブは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。例えば、哺乳動物クエン酸塩リアーゼをコードする２０ヌクレオチド配列に相当するプローブを用いてクエン酸リアーゼ活性を有する菌類ポリペプチドをコードする核酸分子を同定することができる。加えて、２０ヌクレオチドよりも長いかまたは短いプローブを用いることができる。
【００７７】
いずれかの方法を用いて外来性核酸分子を細胞に導入することができる。実際に、核酸を酵母細胞に導入するための多くの方法が技術分野の技術者に公知である。例えば、形質転換、エレクトロポレーション、抱合、及びプロトプラストの融合が核酸を酵母細胞に導入するための一般的な方法である。例えばＩｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１５３：１６３−１６８（１９８３）；Ｄｕｒｒｅｎｓら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：７−１２（１９９０）；及びＢｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７（１９９１）を参照。
【００７８】
本発明の酵母細胞内に含まれる外来性核酸分子がいずれかの形態でその細胞内で保持され得るということに注目することが重要である。例えば、外来性核酸分子を細胞のゲノムに組み込むか、またはエピソーム状態で維持することができる。換言すると、本発明の細胞は安定したまたは一過性の形質転換体でよい。加えて、本明細書に記載する酵母細胞は前記した特定の外来性核酸分子の単一のコピーまたは複数のコピー（例えば約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００または１５０コピー）を含有できる。外来性核酸分子からのアミノ酸配列を発現する方法は技術分野の技術者に公知である。かかる方法には、非限定例としては制御エレメントがポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進するように核酸を構築することなどがある。典型的には制御エレメントは転写のレベルで別のＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列である。従って、制御エレメントには、非限定例としてはプロモーター、エンハンサー等がある。さらに酵母細胞において外来性核酸分子からのポリペプチドを発現する方法は技術分野の技術者に公知である。例えばクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）内で外来性ポリペプチドを発現できる核酸構築物は公知である。例えば米国特許第４８５９５９６号及び第４９４３５２９号を参照。
【００７９】
本明細書で記載した、本発明の範囲内である酵母細胞は、例えば有機生成物の形成を導く酵素活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を含有する。外来性核酸分子を含有する細胞を同定する方法は技術分野の技術者に公知である。かかる方法には、非限定例としてはＰＣＲ及び核酸ハイブリダイゼーション技術、例えばノーザン及びサザン分析などがある。免疫組織化学的及び生化学的技術を用いて特定の核酸分子によりコードされる、コードされた酵素性ポリペプチドの発現を検出することにより細胞がその特定の核酸を含有するかどうかを決定できる場合もある。例えばコードされた酵素に特異性を有する抗体を用いて特定の酵母細胞がそのコードされた酵素を含有するかどうかを決定することができる。さらに、生化学的技術を用いて酵素性ポリペプチドの発現の結果として生成された有機生成物を検出することにより、細胞が酵素性ポリペプチドをコードする特定の核酸分子を含有するかどうかを決定することができる。
【００８０】
例えば乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性核酸分子を、通常かかるポリペプチドを発現しない酵母細胞へ導入した後の乳酸塩の検出により、酵母細胞が導入された外来性核酸分子を含有するのみならず、その導入された外来性核酸分子からコードされた酵素性ポリペプチドを発現することを示すことができる。特異的酵素活性または特定の有機生成物の存在を検出する方法は技術分野の技術者に公知である。例えば乳酸塩の存在を他の場合に記載されるように決定することができる。Ｗｉｔｔｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：７０７−７１６（１９８９）参照。
【００８１】
本発明はまた組換え配列及び選択された配列を含有する核酸構築物をも提供する。本明細書で用いる「組換え配列」なる用語は、細胞内で見出されるゲノム配列に対応するいずれかの核酸配列を意味する。本明細書で記載する組換え配列を用いてノックアウト生物の作製の間に組換え事象を志向することができる。換言すると、組換え配列を用いて特定の酵素をコードする核酸配列を含有する遺伝子座を特異的に破壊することができる。
【００８２】
本明細書で用いる「選択された配列」なる用語にはいずれかの核酸配列が含まれる。典型的には選択された配列は、細胞内で有機生成物の形成を導く酵素活性を有するポリペプチドをコードする。従って、本発明の核酸構築物を用いて、単一工程で内因性酵素活性をノックアウトし、外来性酵素活性を付加することができる。たいていの場合、選択された配列は組換え配列により各々の末端でフランキングされるように組換え配列内にある。
【００８３】
５．有機生成物及び培養方法
本発明は、本発明で提供されるいずれかの酵母細胞またはその他の微生物細胞を用いて有機生成物を生成する方法を提供する。かかる方法には、酵母細胞を提供すること、及び有機生成物（例えばグリセロール、アクリレート、キシロース、アスコルビン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、アルファ・ケトグルタル酸塩、サクシニル−ＣｏＡ、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、及びオキザロ酢酸塩）が生成されるように、培養培地で提供された酵母細胞を培養することが含まれる。一般的には培養培地及び／または培養条件を２つのカテゴリーに分類することができる：細胞性呼吸及び／またはバイオマスの生成を促進するもの、並びに細胞性呼吸を低下させるもの。典型的には、細胞性呼吸を促進する培養培地及び／または培養条件を、急速な成長が必要であるか、または生成すべき有機生成物を細胞性呼吸なしには生成できない状況で用いる。かかる有機生成物は、非限定例としてはクレブスサイクル生成物などでよい。一方、細胞性呼吸を低下させる培養培地及び培養条件を、急速な成長が必要でないかもしくは望ましくない、または生成されるべき有機生成物を細胞性呼吸なしに生成できる状況で用いる。かかる有機生成物には、非限定例としては乳酸塩、アクリル酸塩、及びキシロースなどがある。
【００８４】
本明細書で用いる「細胞性呼吸を促進する」または「バイオマス生成を促進する」なる表現は、培養条件に関する場合、培養培地中で炭素供給源が酸化的呼吸によるかまたはバイオマスを生成するために優先的に代謝されるように、細胞培養条件が維持されることを意味する。本明細書で用いる「バイオマス」なる用語は生物の乾燥重量を意味する。本明細書で用いる「バイオマスを生成するために優先的に代謝される」なる表現は、消費される炭素供給源（炭水化物の形態で）のグラムあたり少なくとも約０．３ｇのバイオマスが生成される（例えば、少なくとも約０．４、０．４５、０．５または０．５ｇのバイオマス）ことを意味する。一般に、炭素供給源のグラムあたり約０．３から約０．６ｇのバイオマスが生成される。培養物中のバイオマスの量（細胞乾燥重量）を決定する方法は公知であり、例えばＰｏｓｔｍａら、「サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のグルコース制限ケモスタット培養におけるクラブトリー効果の酵素分析」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：４６８−４７７（１９８９）；及びＫｌｉｅｒｓら、「クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＣＢＳ  ２３５９のバッチ及びケモスタット培養におけるアルコール性発酵の制御」Ｙｅａｓｔ  １４：４５９−４６９（１９９８）に記載される方法などがある。消費される炭素供給源の量の決定方法は公知であり、例えばＨＰＬＣ法などがある。
【００８５】
炭素供給源利用の効率は炭素供給源及び生物に依存し得ることに注目することが重要である。従って、炭水化物以外の炭素供給源を含む複合成長培地を用いることができるが、炭素供給源のグラムあたり生成されるバイオマスの量は消費される炭素供給源のグラムあたり生成されるバイオマスの量のみを意味する。
【００８６】
一般に細胞性呼吸のインヒビターを含有する培養培地（例えばアンチマイシンＡ、シアン化合物、及びアジド）は細胞性呼吸を低下させることができるが、一方かかるインヒビターの不在により細胞性呼吸を促進させることができる。同様に、嫌気的培養条件は細胞性呼吸を低下させることができるが、一方好気的培養条件は細胞性呼吸を促進させることができる。好気的条件は酸素が導入されるかまたは天然に発生し、呼吸経路の基質として提供されるいずれかの条件である。一般に、「好気的」なる用語は培養培地が少なくとも０．１ＶＶＭ（空気容量／液体容量／分）（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５または２．０ＶＶＭ以上）の空気流のもとで維持されている培養条件を意味する。
【００８７】
空気以外の気体を用いる場合、次いで名目ＶＶＭが気体の酸素含量に基づいて等価である空気に調整する。また別に、「好気的」を大気圧下、空気で飽和された条件で存在する量に相対して少なくとも２％の酸素含量（例えば少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５または８０％）が溶解した培養培地として定義することができる。嫌気的条件は酸素が故意にまたは天然に、本質的に呼吸経路に利用できないようにされているいずれかの条件であり、例えばエタノールの生成の低減に至る。一般に、培養培地が約２．０％未満（例えば約１．５、１．０、または０．５％未満かまたは約０％に等しい）の溶解酸素（ＤＯ）含量を有する条件は嫌気的条件であると考えられる。同様に、約０．１未満（約０．０５未満かまたは約０％に等しい）のＶＶＭ（空気容量／液体容量／分）を有する条件は嫌気的条件であると考えられる。典型的には、ＶＶＭに関して本明細書で用いる「空気」なる用語は大気中に存在するような空気を意味する。細胞呼吸に影響し得るその他の培養条件には、非限定例としてはｐＨ、温度、及び特定の炭素供給源の存在（例えばグルコース）などがある。１つの種の酵母内で細胞呼吸を促進するいくつかの培養培地及び／または培養条件は別の種内の細胞性呼吸を低下させ得ることに注目することは重要である。例えば、培養培地内のグルコースの存在はクラブトリー陽性表現型を有する酵母細胞における細胞性呼吸を低下させるが、クラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞における細胞性呼吸にはほとんどまたは全く影響しない。
【００８８】
商業生産中の培養条件の指示された操作は、本明細書に記載する望ましい有機生成物の最適レベルの達成における重要な工程であり得る。典型的には、本発明の範囲内である酵母細胞を、細胞呼吸を促進させる培養条件下で成長させて、有意な細胞密度にする。例えば酵母細胞を培養容器内に入れて、豊富なグルコース及び酸素を供給する。典型的には、細胞呼吸を促進する条件下で本発明で提供される微生物の倍化時間は約１０時間未満（例えば約８、５または３時間未満）である。一度細胞が有意な密度に到達すると、培養条件を、細胞呼吸を必要としない有機生成物が生成されるように細胞呼吸を低下させる条件に切り替えることができる。例えば、酵母細胞を培養容器に移して豊富なグルコースを供給するが、酸素を供給しないでよい。この場合、これらが好気的から嫌気的に切り替わるように培養条件を直接操作することにより、最適レベルの望ましい有機生成物が生成される。また別に、細胞性呼吸を必要とする有機生成物が生成されるように、細胞性呼吸が促進される条件下で細胞を単独で培養することができる場合もある。生成容器内の細胞マスは典型的には約２ｇ／ｌ以上（例えば約４、６、または８ｇ／ｌ以上）であることは注目される。
【００８９】
培養中の温度を約３５℃以上（例えば３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３，４４または４５℃以上）にできる。加えて、培養培地は液体でよい。培養培地は典型的には炭素供給源を含有する。一般に、炭素供給源は原材料を含有する炭水化物を含む。典型的には栄養培地は窒素供給源をも含有する。好ましくは、窒素供給源は有機及び無機窒素化合物の組み合わせを含む。１つの操作様式では、バイオマス生成及び望ましい生成物の生成の双方に十分な、必要とされる栄養の全て及び炭水化物の全てを含む培養培地で大きな発酵容器を満たすのが望ましい。例えば好気的条件を提供することにより、バイオマス生成が最初に促進されるような条件下で容器を操作し、次いで代替の操作様式で望ましい生成物の生成のために嫌気的条件に切替えることができ、例えば約１００ｇ／ｌのバイオマスを生成するために高レベルの栄養及び十分な炭水化物を含む小さい容器をバイオマス生成に用いる。次いでこの容器を、水中で少ない栄養、例えば炭素供給源としてグルコースのみ、または別の炭水化物炭素供給源を含有する第２の培養培地を含有する大きな容器に移すことができる。バイオマス成長は栄養レベルの低下及び嫌気的条件のために低下する。
【００９０】
好ましい実施形態では、望ましい生成物の収集を簡単にするために栄養培地を必要な材料のみに保つ。好気的成長を用いることにより使用される培地を、嫌気的条件下での成長が必要とされた場合に必要とされるものよりも簡単にできる。本明細書で記載する多くの酵母を好気的条件下で、糖、無機窒素供給源、微量のミネラル及び数種のビタミンのみからなる培地上で成長させることができる。発酵またはその他の過程の結果として培養培地に有機生成物が添加される前は、培養培地は約一般に５．０から７．０の間のｐＨを有する。しかしながら、有機生成物例えば有機酸は微生物により培養培地に分泌されるので、培養培地のｐＨは低下する傾向がある。本明細書で用いる「有機的ｐＨ」とは培地に存在する有機化合物、例えばカルボン酸塩、例えば乳酸に起因する培養２０培地のｐＨを意味する。本明細書で用いる「無機的ｐＨ」とは無機化合物、例えばＨＣｌ及びＨ２ＳＯ４に起因するｐＨを意味する。培養培地は約３．０未満（例えば約２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、または１．５未満）の有機的ｐＨ値を有し得るか、または約３．０未満（例えば約２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、または１．５未満）の無機的ｐＨ値を有し得る。培養過程中にいずれかの炭素供給源を用いることができる。例えばペントース炭素（例えばリボース、アラビノース、キシロース、及びリキソース）を含有する培地を用いることができる。加えて、トウモロコシ繊維加水分解物を含有する培地を用いることができる。トウモロコシ繊維加水分解物は２．０から６．５の間のｐＨ値を有し得る。典型的にはトウモロコシ繊維加水分解物はグルコース、キシロース及びアラビノースを含有する。例えばトウモロコシ繊維加水分解物は約４０ｇ／ｌのグルコース、約４０ｇ／ｌのキシロース及び約２０ｇ／ｌのアラビノースを含有できる。大規模容量の生成方法では、以下の方法を用いることができる。
【００９１】
第１は、例えばヘキソース及び／またはペントース炭素を伴う適当な培養培地を含有する大きなタンク（例えば５０、１００、２００、またはそれ以上のガロンタンク）を特定の微生物と共にインキュベートする。接種後、炭素供給源を優先的に用いてバイオマスを生成するように培養条件を操作できる。例えば、培養培地を操作して、約７．０のｐＨ値、約３５℃の温度、及びタンク全体で好気的環境を作る溶解酸素含量を有するようにする。このバイオマス生成相の間に望ましい有機生成物を生成できることは注目される。一度十分なバイオマスに到達すると、微生物を含有するブロスを第２のタンクに移すことができる。この第２のタンクはいずれの大きさでもよい。例えば第２のタンクは第１のタンクよりも大きい、小さい、または同じ大きさでよい。典型的には、第１のタンクからのブロスにさらなる培養培地を添加できるように、第２のタンクは第１のタンクよりも大きい。加えて、この第２のタンク内の培養培地は第１のタンクで用いたものと同一かまたは異なっていてよい。例えば、第１のタンクはキシロース及びアラビノースを含有できるが、一方第２のタンクはグルコースを含む培地を含有する。
【００９２】
一度移すと、炭素供給源が優先的に用いられて有機生成物を生成するように第２のタンク内の培養条件を操作でき、ここで「有機生成物」にはとりわけ、ピルビン酸塩誘導体生成物及び二酸化炭素（ＣＯ）などがあるが、バイオマス（すなわち細胞乾燥重量）は含まない。本明細書で用いる「「選択された有機生成物」または「選択されたピルビン酸塩誘導生成物」を優先的に生成する」なる表現は、培養条件に関する場合、典型的には発酵方法（必要ではないが）により培養培地内の炭素供給源が代謝され、消費される炭素供給源のグラムあたり少なくとも０．５ｇの有機生成物を形成することを意味する（例えば少なくとも０．６、０．７５または０．８ｇの有機生成物）。生成された有機生成物及び／または消費された炭素供給源の量を決定する方法は公知であり、例えばＨＰＬＣなどがある。
【００９３】
前記したように、炭素供給源利用の効率は基質及び生物に依存して変化し得る。従って、炭水化物以外の炭素供給源（例えばアミノ酸）を含む複合成長培地を使用することができるが、炭素供給源のグラムあたりの生成された有機生成物またはピルビン酸塩生成物の量は、消費された炭素供給源のグラムあたりの生成された有機生成物またはピルビン酸塩生成物の量のみを意味する。好ましくはこの段階で炭素供給源グラムあたりたかだか０．３ｇのバイオマスしか生成されない（例えばたかだか０．２、０．１または０．５ｇのバイオマス）。
【００９４】
例えば培養培地を操作して、タンク全体で嫌気的環境を作る溶解酸素含量にするか、または細胞呼吸のインヒビターを含めることができる。加えて、特定のｐＨ値（例えば酸性、中性または塩基性ｐＨ値１０）を維持するように培養培地を操作することができる。また別に、培養物のｐＨを、いずれかの特定のｐＨ値を維持せずに定期的に調整することができる。典型的には、有機酸を生成する場合、培養培地のｐＨ値は少なくとも約１．５以上（例えば少なくとも約２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、または７．０）を維持する。さらに、微生物は提供された炭素供給源を異化するので、タンク内の温度は上昇する。従って培養培地を特定の温度が維持されるように操作できる。また別に、培養培地の温度をいずれかの特定の温度を維持しないで定期的に調整することができる。典型的には、熱感受性微生物を用いる場合、約３５℃未満の温度（例えば約３４、３３、３２、３１または３０℃）が維持されるが、一方熱非感受性微生物を用いる場合、約４５℃未満の温度（例えば約４４、４３、４２、４１または４０、３９、３８、３７、３６または３５℃）が維持される。この有機生成物生成相ではバイオマスが生成され得ることが注目される。加えて、第２のタンク内の培養条件を、生成物生成を促進する条件からバイオマス生成を促進する条件に１回またはそれ以上切替えることができ、逆も同様である。例えば第２のタンク内の培養条件を、好気的条件が定期的に存在するように溶解酸素の短いパルスを伴って大部分の時間を嫌気的にすることができる。
【００９５】
別の方法では嫌気的条件を修飾して、例えば末端電子受容体の付加により培養された微生物の代謝エネルギーを高めることができる。本明細書で用いる「代謝エネルギー」なる用語はエネルギー供給源（例えば炭素供給源）から生物により誘導されるエネルギー（ＡＴＰに関して）を意味する。ある条件下で生物による炭素供給源の代謝から得られる代謝エネルギーの量は、異なる条件下で同一の炭素供給源から得られるエネルギーの量よりも多い。
【００９６】
生存細胞は高度に秩序だっており、生存し成長するためにそれ自体の中に秩序を作らなければならない。生物内で秩序を維持するために、数千の異なる化学反応がいかなる瞬間にも生じている。例えば生合成反応、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質重合化反応及び代謝生成物の形成に細胞はエネルギーを必要とする。細胞はまた細胞に基質を運ぶため、細胞内の代謝を保つため、適切な膨圧及び内部ｐＨを維持するため、並びに運動性のためのエネルギーをも必要とする。エネルギーを作るまたは破壊することができないので、細胞は秩序を維持するために環境からのエネルギーの投入を必要とする。一般にエネルギーは電磁放射または化学エネルギーの形態で環境から供給される。環境から得られたエネルギーは１つまたは２つの一般的な生化学的メカニズム：基質レベルのリン酸化及び電子伝達により用いられる細胞に利用される。一般に、嫌気的条件下では、ＡＴＰ（エネルギーに関する「細胞電流」）は基質レベルのリン酸化により生成される。基質レベルのリン酸化では、化学結合からエネルギーが放出され、主にＡＴＰの形態で蓄えられる。基質レベル形成の実例は、解糖によるグルコースのピルビン酸塩への変換である：
グルコース＝２ピルビン酸塩＋２ＡＴＰ＋２Ｈ２
次いでピルビン酸塩を乳酸に変換できる：
ピルビン酸塩＋２Ｈ＝乳酸塩
前記の変換により生成された正味エネルギーは２ＡＴＰに等価である。
【００９７】
ピルビン酸塩はトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルにさらに処理され、さらなるエネルギー及び水素原子を生じる：
ピルビン酸塩−−−３Ｈ２Ｏ＝３ＣＯ２＋ＡＴＰ＋５Ｈ２
グルコース呼吸作用のための正味反応：
グルコース＋６Ｈ２Ｏ＝６ＣＯ２−−−４ＡＴＰ＋１２Ｈ
従って、基質レベルのリン酸化によりグルコースのＣＯ２への完全な呼吸作用が４ＡＴＰ及び２４水素原子に等価の正味エネルギーを提供する。「電子伝達」では、「電子伝達系」の構成メンバーである化合物の酸化・還元ポテンシャルは、各メンバーが先行のメンバーの還元体により還元され得るように釣り合っている。従って、還元力は電子としてキャリヤ分子の連鎖を経て末端電子受容体、例えば酸素（Ｏ２）、硝酸塩（ＮＯ３）及びフマル酸塩まで流れ得る。末端電子受容体、例えば酸素、硝酸塩及びフマル酸塩の培養培地への添加により微生物の代謝エネルギーを増強させることができる（例えば同一量の消費された炭素供給源に関してＡＴＰ生成の増加）。
【００９８】
酸素は最も好ましい末端電子受容体である。例えば酸素を末端電子受容体として用いる場合、水素は電子伝達系を経て処理され、さらに水素原子あたり１．５ＡＴＰ及び酸素原子あたり３ＡＴＰを細胞に提供することができる。一般に、代謝エネルギーの量は、消費されたグルコースの量に対する消費された酸素の量の比率を測定することにより決定できる。表１は、生成中に酸素を加えた場合のエネルギー収量の予測される最大及び最小改善を、ＴＣＡサイクルへの（及び結果的に呼吸への）ピルビン酸塩の損失のために低下する生成物収量の関数として表す。Ｐ／Ｏ比を３と仮定して最大改善％を算出し、一方Ｐ／Ｏ比を０．５と仮定して最低改善％を算出した。表２は消費グルコースのモルあたりの予測される最大消費酸素量を示す。酸素の添加により、呼吸に利用（従って酸素利用）できる炭素の少量を残して炭素を生合成に取っておく最小成長を促進できる。
【表１】
2004521619.tif 000002
【表２】
2004521619.tif 000003
従って、細胞培養における微生物の代謝エネルギーを改善するために、末端電子受容体として酸素を細胞培養に添加することができる。グルコースからの乳酸の最大モル収量はグルコースモルのあたり乳酸塩２モルであり、グルコースからのＡＴＰのモル収量はグルコースのモルあたりＡＴＰ２モルであるが、末端電子受容体としての酸素の添加によりピルビン酸塩のいくつかをクエン酸（ＴＣＡ）サイクルに向けさせて、そこでＣＯ２及びエネルギーに変換させることができる。このように、末端電子受容体の供給により微生物の「代謝エネルギーが高められる」。
【００９９】
ピルビン酸塩のＴＣＡサイクルへの誘導により、生成される別のピルビン酸誘導生成物（例えば乳酸）の量が低減する傾向がある。例えば収量の１０％低減により結果的に微生物の代謝エネルギーが２．６倍発生し、収量の２０％低減により結果的に微生物の代謝エネルギーが４．２から５倍発生し、及び収量の５０％低減により結果的に微生物の代謝エネルギーが９倍発生し得る。
【０１００】
方法の後期段階で、高レベルの乳酸が存在する場合、細胞が機能を維持するためにより多くの代謝エネルギーを必要とし得ると予測される。
【０１０１】
従って、嫌気的培養培地中の微生物を溶解酸素の短いパルスに暴露するのが望ましい。好ましくは、溶解酸素の短いパルスにより、培養培地の溶解酸素濃度がたかだか０．５％、好ましくは約０．１から０．５％の間になる。また別に、別の末端電子受容体、例えば硝酸塩またはフマル酸塩の添加により嫌気的発酵中の微生物の成長速度及び細胞維持を増強させることができる。微生物の代謝エネルギーを高めるのにちょうど十分であるが、望ましいレベルの生産性を維持するレベルで酸素を添加する。過剰の収量損失を避けるために注意を払わなければならない。この技術を用いて残余糖を消費し、それによりさらに収集過程を単純化するのを助けることもできる。
【０１０２】
６．有機生成物精製方法
一度生成すると、いずれかの方法を用いて望ましい生成物を単離することができる。例えば、一般的な分離技術を用いてブロスからバイオマスを除去することができ、一般的な単離手順（例えば抽出、蒸留、及びイオン交換手順）を用いて微生物不含ブロスから有機生成物を得ることができる。米国特許第４２７５２３４号；米国特許第５５１０５２６号；米国特許第５８３１１２２号；米国特許第５６４１４０６号；及び国際特許出願第ＷＯ９３／００４４０号を参照。加えて、望ましい生成物を、それが生成されている間に単離することができるか、または生成物生成相が終止した後にブロスから単離することができる。第２タンク内の培養条件を、単離方法が改善されるように操作することができることに注目することが重要である。例えば、第２タンク内のｐＨ及び温度を、望ましい有機生成物が溶液から沈殿するか、より単離しやすい形態であるように操作することができる。とりわけ、ブロスのｐＨが有機酸のｐＫａ未満である場合、有機酸のｐＨ値は溶液から沈殿できる。例えば、グルタミン酸を生成している間の培養条件はｐＨが２．１９未満であるようにでき、これはグルタミン酸のｐＫａ値である。このようにｐＨ、温度及びブロスの含量を操作することにより有機生成物の単離を促進することができる。加えて、特定の遺伝的に操作された酵母を選択でき、及び／または特定の培養条件を、いずれかのブロス中の副産物が望ましい有機生成物の収集に干渉しないように操作することができる。
【０１０３】
本明細書に記載した方法及び材料を、非限定例としては一般に「連続発酵」及び「バッチ発酵」法と称される方法などのいずれかの型の培養方法に適合させ、及び使用することができる。加えて、１つの生成方法中に用いられる微生物を収集し、及び次の生成方法において再利用することができる。例えば、微生物を複数回再利用し、望ましい有機生成物を生成することができる。さらに、いずれかの炭素供給源を使用することができる。例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イオドース（ｉｏｄｏｓｅ）、ガラクトース、タロース、メリビオース、スクロース、フルクトース、ラフィノース、スタキオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、デンプン例えばトウモロコシデンプン及び小麦デンプン、並びに加水分解物例えばトウモロコシ繊維加水分解物、及びその他のセルロース誘導体加水分解物を炭素供給源としてバイオマスまたは望ましい有機生成物の生成に使用することができる。さらに、いずれかの培地を用いることができる。例えば標準的な培養培地（例えば酵母最小培地及びＹＰ培地（１０ｇ／ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／ｌ  プロトンブロス））及び例えばコーンスティープ水及びコーンスティープ液のごとき培地を用いることができる。
【０１０４】
本発明の著明な利点は好ましい微生物が特に好気的条件下で成長する場合に最小培地を利用できるという点である。嫌気的生成は典型的にはさらなる栄養を必要としないので、種々の分離技術のいずれかを用いて比較的きれいな発酵ブロスから最終生成物を単離することができる。液体・液体抽出は発酵ブロスから有機酸を分離するための公知の技術であり、結果的にかなり精製される。本発明ではより簡単で安価で、エネルギー消費の少ない系もまた有用であると考えられる。
【０１０５】
１つの実施形態では、本発明は、臨界細胞密度に到達した後、代謝経路で「切替え」を誘導し、そのとき望ましい有機生成物の特異的生産性が劇的に増加するのが望ましいトレイン型方法でクラブトリー陰性表現型を有する遺伝的に修飾された酵母を使用する。代謝経路切替えを誘導するための典型的な方法はバイオマスを高度に好気的な容器から実質的に嫌気的な容器に移動させ、酸素枯渇を引き起こすことによる。成長相及び生成相の間に一般的な炭水化物（例えばグルコースまたはキシロース）を炭素供給源として使用することに注目される。クラブトリー陰性表現型を有する遺伝的に修飾された酵母細胞の使用がこの実施形態の成功に非常に重要であり得る。加えて、望ましい有機生成物の特異的生産性が成功に非常に重要であり得る。本明細書で用いる「特異的生産性」なる用語は生成された生成物の量を意味し、時間あたりのバイオマス（乾燥重量）のグラムあたりの生成された有機生成物のグラム数、すなわちｇ／（ｇ＊時間）として表される。典型的には、有機生成物、例えば乳酸塩及びアクリル酸塩の特異的生産性は約０．１ｇ／（ｇ＊時間）以上であり、例えば約０．２ｇ／（ｇ＊時間）以上または約０．５ｇ／（ｇ＊時間）以上である。本明細書で記載するような高度に特異的な生産性を提供することにより、細胞維持に必要とされるエネルギーを、通気に依存するよりむしろ、実質的に嫌気的条件下での発酵生成経路を介して得て、呼吸経路を経て高量のエネルギーを作ることができる。
【０１０６】
実施的に嫌気的容器を約０．１ＶＶＭ未満の速度で通気することに注目される。特定の生成状況下では、通気を用いない。加えて、この実施形態での収率（すなわち有機生成物のｇ／消費される炭素供給源のｇ）は典型的には約７０重量％以上であり、炭素供給源、例えばエタノール及び酢酸塩の添加なしに生成される。細胞の維持に必要なエネルギーを作るのに必要とされる特異的生産性を達成するために、望ましい生成物を生成するために必要な酵素を提供するのに加えて、グルコースからピルビン酸塩への経路を増強する必要がある場合もある。
【０１０７】
別の実施形態では、高度に好気的な成長容器にのみ殺菌能力を備えるようにトレイン型の方法を設計することができる。嫌気的生成容器は典型的には約３５℃以上の温度（例えば約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５℃以上）で操作する。野生型酵母は、特に細胞維持のためのエネルギーを作ることができる発酵経路が増強されないので、生成物生成中のｐＨの急低下のような温度で生存し、遺伝的に修飾された酵母に匹敵する野生型酵母はわずかであり、加えて酵母を本明細書で前記した、別の種の酵母の生存を妨げることができる「キラープラスミド」を含有するように操作できる。本発明はまた酵母細胞を培養するための種々の方法をも提供する。例えば、約３．０未満の有機的ｐＨ値を有するか、またはトウモロコシ繊維加水分解物を含有する培養培地でクラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養することができる。酵母細胞を培養するための別の方法には、非限定例としては約３５℃以上の温度で約３．０未満の無機的ｐＨ値を有するか、またはペントース炭素もしくはトウモロコシ繊維加水分解物を含有する培養培地でクラブトリー陰性表現型を有する酵母細胞を培養することなどがある。
【０１０８】
さらに本発明は有機生成物を作製するための方法を提供する。この方法には培養条件下で微生物を成長させること、及び有機生成物の生成を促進するために培養条件を変化させることが含まれる。この方法では、微生物はピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び／またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性が低減されており、エタノール及び酢酸塩の不在下で、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、及び／またはアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性が低減されていない対応する微生物で観察される成長率の少なくとも約３０％（例えば約３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００％またはそれ以上）である成長率を呈する。典型的には、細胞性呼吸を促進する培養条件を、急速な成長を必要とするか、または生成すべき有機生成物を細胞性呼吸なしに生成することができない状況下で用い、一方、細胞性呼吸を低下させる培養条件を、急速な成長を必要としないか、または生成すべき有機生成物を細胞性呼吸なしに生成することができる状況下で用いる。
【０１０９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、請求の範囲で記載される発明の範囲を限定するものではない。
【０１１０】
実施例
（実施例１）
組換えプラスミドｐＨＥＳ／ｐＳＥＨ
Ｃｈｅｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：９５７８−９５８２（１９９１））に記載されるプラスミドｐＧＡＤ４２４  ０．５μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化した混合物を０．８％  アガロースゲル上でＴＢＥバッファーを用いてゲル電気泳動により分離した。次いでＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるようにゲルから５．０ｋｂｐフラグメントを精製した。複数の制限酵素認識部位を有する９２ｂｐの合成オリゴマーの相補対を消化した。第１のものはｆｗｄ  ＨＥＳオリゴと称し、以下の配列を有する：
【化１】
2004521619.tif 000004
第２のものはｃａｍｐＨｅｓオリゴと称し、以下の配列を有する：
【化２】
2004521619.tif 000005
２つの相補性オリゴマー５００ナノモルを１０分間沸騰し、徐々に室温まで冷却することにより互いにアニーリングさせた。二本鎖９２ｂｐ  ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した５．９ｋｂｐ  ｇＧＡＤ４２４にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるようにエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ（エレクトロマックスセル、ライグ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド州）を形質転換した。組換え大腸菌をルリア・ベルターニ・ブロスプレートにプレートし、１００μｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリンを用いてプラスミドを含有する細胞を選択した。アンピシリン抵抗性大腸菌クローンからのプラスミドＤＮＡをスクリーニングし、２つのプラスミド、ｐＨＥＳ及びｐＳＥＨを得た（図１及び２）。２つのプラスミドはベクターのアルコールデヒドロゲナーゼ−ＡＤＨＩプロモーターに関して合成オリゴマーの配向が異なる。
【０１１１】
（実施例２）
ラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びペディオコッカス・アシディラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からの乳酸塩デヒドロゲナーゼをコードする核酸のＰＣＲ増幅
ピュアジーン（登録商標）ゲノムＤＮＡ単離キット（ゲントラ・システムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いてラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １０７９７）及びペディオコッカス・アシディラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）（ＡＴＣＣ  ２５７４１）の一晩培養物からゲノムＤＮＡを単離した。Ｌ．ヘルベチカス（ｌｈ−ｌｄｈオリゴ）及びＰ．アシディラクチシ（ｐａ−ｌｄｈオリゴ）ゲノムＤＮＡから乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化核酸を単離するためにＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーはジェンバンクデータベースで利用可能な乳酸塩デヒドロゲナーゼの遺伝子配列に基づいて設計され、以下の配列を有する：
【化３】
2004521619.tif 000006
Ｓｃｉ−ｅｄソフトウェア（ダルハム、ノースキャロライナ州）から入手されるプライマー・デザイナー・ソフトウェアを用いてプライマーを最適化した。ゲノムＤＮＡ  １マイクロモルをプライマー  １００ナノモルと共に用いた。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ）を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるように乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸をＰＣＲ増幅した。
【０１１２】
類似の実験計画を用いて、微生物例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えばバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ  ６４５８）もしくはリゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＡＴＣＣ  ７６２７５）もしくはいずれかの別の乳酸塩生成生物（微生物、例えば菌類及び細菌並びに多細胞生物、例えば哺乳類）から、または乳酸塩生成生物の組織からのゲノムＤＮＡからＬ−乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化核酸を単離する。ピュアジーン（登録商標）ゲノムＤＮＡ単離キット（ゲントラ・システムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて生物の成長培地からゲノムＤＮＡを単離する。ジェンバンクから入手可能なこれらの種のＬＤＨ遺伝子配列に基づいて乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化核酸を単離するために適当なＰＣＲプライマーを設計する。一般に、ゲノムＤＮＡ  １マイクロモルを適当なプライマー  １００ナノモルと共に用いる。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ）またはいずれかのその他の適当なＤＮＡポリメラーゼを用いて、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるように、ＰＣＲ技術を用いて各々のゲノムＤＮＡから乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸を増幅する。
【０１１３】
また別に、以下の方法のいずれかを用いてクルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５２７０９）、トリコデナ・レスシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｎａ  ｒｅｅｓｃｉ）（ＡＴＣＣ  １３６３１）、トルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３６２４５）またはいずれかその他の乳酸塩デヒドロゲナーゼ生成生物から乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化核酸を単離する。
【０１１４】
１）標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出））を用いてこれらの生物の１つのゲノムｃＤＮＡライブラリーを標準的な大腸菌発現ベクター、例えばｐＵＣ１９にクローン化する。大腸菌（ｌｄｈ  ｐｆｉ）変異株ＮＺＮＩ  １１（Ｂｕｎｃｈら、「大腸菌の発酵性乳酸塩デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ遺伝子」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：１８７−１９５（１９９７））をこのライブラリーで形質転換し、カザアミノ酸を補充したＭ９培地中嫌気的条件下で細胞を成長させる。これらの条件下で成長するいずれかの大腸菌は乳酸塩デヒドロゲナーゼをコードするか、またはｌｄｈもしくはｐｆｌの復帰変異体である。（Ｌ）−ＬＤＨ及び（Ｄ）−ＬＤＨを区別できる乳酸特異的軟寒天重層（ＬＡＳＳＯ）の比色アッセイを用いて陽性のもの（嫌気的成長条件下で形成するコロニー）をＬＤＨ活性に関してスクリーニングする（Ｗｉｔｔｅら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：７０７−７１６（１９８９））。ｌ−乳酸塩デヒドロゲナーゼの発現が予測されるクローンからのプラスミドＤＮＡを次いで単離し、シークエンシングする。
【０１１５】
２）Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５２７０９）、Ｔ．レスシ（Ｔ．ｒｅｅｓｃｉ）（ＡＴＣＣ  １３６３１）及びトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３６２４５）は全て嫌気的条件下で培養された場合にＬ−乳酸を生成する真核細胞である（Ｗｉｎｅら、（Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：７０７−７１６（１９８９）））。従って本発明によれば、これらの株の少なくとも１つは嫌気的条件下で成長して乳酸塩デヒドロゲナーゼ酵素活性を誘導する。次いで標準的な方法を用いて細胞不含の抽出物が得られ、公知のタンパク質精製試験計画に供し、乳酸塩デヒドロゲナーゼ酵素を単離する。乳酸塩デヒドロゲナーゼを精製する方法は公知である（Ｋｅｌｌｙら「細菌性乳酸塩デヒドロゲナーゼのアフィニティクロマトグラフィー」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７１：５４３−５４７（１９７８））。タンパク質を精製した後、部分的に切断し、シークエンシングしてアミノ酸配列を決定する。次いでこのアミノ酸配列を用いてゲノムＤＮＡから乳酸塩デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離するために縮重プライマーを設計する。
【０１１６】
真核細胞ＬＤＨ、例えばＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）またはトリコデナ・レスシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｎｎａ  ｒｅｅｓｃｉ）またはトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）から単離されたものは酵母Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）において、細菌供給源、例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からのＬＤＨと比較してよりよく機能できる（１５の転写効率、翻訳効率及び／またはタンパク質活性に関して）。
【０１１７】
３）ジェンバンクから公知の入手可能な真核細胞乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子配列を用いて、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５２７０９）、Ｔ．レスシ（Ｔ．ｒｅｅｓｃｉ）（ＡＴＣＣ  １３６３１）またはトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３６２４５）のゲノムＤＮＡから乳酸塩デヒドロゲナーゼの遺伝子を単離するために縮重プライマーを設計する。ＬＤＨ遺伝子配列内の保存されたＮＡＤ＋結合部位及びピルビン酸塩結合部位を用いて縮重プライマーを設計する。ゲノムＤＮＡ  １マイクロモルをプライマー  １００ナノモルと共に用いる。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ）またはいずれかのその他の適当なＤＮＡポリメラーゼを用いて、公知のＰＣＲ法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される方法によりＬ−乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）核酸のフラグメントを増幅する。
【０１１８】
（実施例３）
Ｌ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びＰ．アシディラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＬＤＨ遺伝子のｐＣＲＩＩベクターへのクローニング
インビトローゲン（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手したＴＡクローニングキットを用いてＰＣＲ増幅したＬＤＨ  ＤＮＡ生成物をｐＣＰＩＩベクター（図３及び４）にライゲートした。次いでＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載された方法を用いて、ライゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。キットで供給されたｐＣＲＩＩベクターにより製造者の指示書によるＰＣＲ生成の迅速なクローニングが可能になった。Ｌ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びＰ．アシディラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からのＬＤＨ遺伝子を有するｐＣＲＩＩベクターを図４に表す。
【０１１９】
（実施例４）
ｐＨＥＳベクターにＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びＰ．アシディラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＬＤＨ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＬｈ  ｌｄｈ−ＨＥＳ／ｐＰａ  ｌｄｈ−ＨＥＳ
Ｌ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びＰ．アシディラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からのＬＤＨ遺伝子を含有するｐＣＲＩＩベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｐＨＥＳベクターを同一の制限エンドヌクレアーゼで同様に消化した。次いでＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるように、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてｐＣＲＩＩベクターからのＬＤＨを含有する１ｋｂｐのインサートを６．０ｋｂｐ  ｐＨＥＳベクターにライゲートした。ライゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂ（エレクトロマックス・セルズ、ライフ・テクノロジーズ、ロックビル、メリーランド州）を形質転換し、アンピシリン抵抗性に関して組換えクローンを選択した。組換えクローンから単離されたＤＮＡを分析してｐＬｈ  ｌｄｈ−ＨＥＳ及びｐＰａ  ｌｄｈ−ＨＥＳベクターを確認した（図５）。これらのベクターは酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１）の調節下、ｐＨＥＳベクターのＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）及びＰ．アシディラクチシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）からのＬＤＨをコードする遺伝子を含有する。
【０１２０】
（実施例５）
サッカロミセスＰＤＣ１遺伝子プロモーターを用いる発現のためのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）ＬＤＨ遺伝子のクローニング
リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）で見出された乳酸塩デヒドロゲナーゼプロモーターを用いてＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）においてクローニングされた乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を調節することができるが、サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ１プロモーターを用いて単離された乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を調節することができる。サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）解糖プロモーターを用いてクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株において遺伝子を発現することに成功している。（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、「遺伝子発現研究における酵母の適用：サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ）及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）の比較−−概説」Ｇｅｎｅ  １９０：８７−９７（１９９７））
従って、ジェンバンクで利用可能なサッカロミセス・セレビジアゲノム配列を用いて適当なオリゴマープライマーを設計することによりサッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からＰＤＣ１プロモーターが得られる。ＰＤＣ１遺伝子配列及びＰＤＣ１遺伝子を取り囲む１ｋｂの領域をＰＣＲ技術により増幅する。得られた４ｋｂのＤＮＡフラグメントは、ＰＤＣＩ遺伝子発現を調節するプロモーター及びターミネーターの双方を含有する。複数の制限酵素部位は、種々のＬＤＡ遺伝子をＰＤＣＩプロモーター及びターミネーターの調節下に挿入できるように、ＰＤＣＩ遺伝子発現を調節するプロモーター及びターミネーターの間に含まれる。適当なベクター、例えばサッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターに基づくｐＵＣ  １９に４ｋｂのフラグメントを挿入する。次いでＬＤＨ遺伝子を、乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子発現がＰＤＣ１プロモーター及びターミネーターにより調節されるように、プロモーター及びターミネーターの調節下の複数のクローニング部位の１つでベクターに導入する。（図１４）。
【０１２１】
また別に、別のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）解糖プロモーター、例えばサッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセロアルデヒド−３リン酸塩デヒドロゲナーゼまたはホスホグリセレートキナーゼ遺伝子の発現を調節するものを同様に用いて、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）にクローニングされたＬＤＨ遺伝子を発現することができる。
【０１２２】
（実施例６）
ピルビン酸塩デカルボキシラーゼの遺伝子分解のための相同性ＤＮＡの直線性フラグメントの増幅
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）からのピルビン酸塩デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の５’末端に同一な５１ｂｐ及びｐＨＥＳベクターからのＡＤＨ１プロモーターの５’末端に同一な３０ｂｐを含有するように８２ｂｐオリゴマープライマー（５’ｋｍＰＤＣ１Ｋｏ）を設計した。５’ＫｍＰＤＣ１Ｋｏは以下のとおりである：
【化４】
2004521619.tif 000007
酵母（Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＹ．スチピチス（Ｙ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）またはＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ））からのＰＤＣ遺伝子の配列は提示されたジェンバンク配列から得られた。同様に、逆７９ｂｐオリゴマー（３’ｋｍＰＤＣｌＫｏ）をＰＤＣ遺伝子の３’末端と同一である５４ｂｐ及びＡＤＨＩターミネーターの３’末端に同一である２２ｂｐを含有するように設計した。３’ｋｍＰＤＣｌＫｏの配列は以下のとおりである：
【化５】
2004521619.tif 000008
フラグメントがＡＤＨ１プロモーター及びターミネーターと共に全乳酸塩デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する、ｐＬｈ−ｌｄｈ−ＨＥＳ及びｐＰａ−ｌｄｈ−ＨＥＳプラスミドからの直線状ＤＮＡフラグメントを増幅するためにプライマーを設計した（図６）。ＰＣＲ増幅された生成物はまたＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＰＤＣ１、ヤマダザイマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＰＤＣ１及びＯＤＣ２、並びにハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ）ＰＤＣＩ及びＰＤＣ２からの配列に相同であった末端をも含有する。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブズ、メリーランド）を用いて増幅反応を実施した。ｐＬｈ−ｌｄｈ−ＨＥＳまたは５ｐＰａ−ｌｄｈ−ＨＥＳ  １００ｎｇをポリメラーゼ５単位及びオリゴマー１００ナノモルと共に反応で用いた。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されたプロトコルに従って反応を実施した。図６は記載された相同性を有する直線状の最終生成物を表す。
【０１２３】
また別の構築物を調製してＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）のｐｄｃ陰性株を得る可能性を改善した。これらの構築物を調製するために、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１．７ｋｂ  ＰＤＣ１遺伝子を取り囲む５．５ｋｂｐフラグメントをＰＣＲおよびゲノムウォーキング技術（クロンテック）を用いて単離した（図６ｂ）。次いで標準的な方法を用いて５．５ｋｂｐフラグメントをｐＣＲＩＩ  ＴＡクローニングベクター（インビトローゲン）にクローニングした。ＰＤＣＩの１．７ｋｂｐコーディング領域のほぼ中央のおよそ３７０ｂｐの部分を制限消化によりＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）５．５ｋｂｐフラグメントから除去した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出））。除去されたフラグメントは以下の配列を有する：
【化６】
2004521619.tif 000009
次いで標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、参照）を用いてカナマイシン抵抗性遺伝子及びそのプロモーターをｐＰＩＣ９Ｋベクター（インビトローゲン）から単離し、前記で同定されたフラグメントが除去された５．５ｋｂｐの部位にクローニングした。ｐＰＩＣ９Ｋベクター（インビトローゲン）カナマイシン抵抗性遺伝子及びそのプロモーターを挿入し、挿入された領域の配列は以下のとおりであった：
【化７】
2004521619.tif 000010
2004521619.tif 000011
得られた構築物は図６ｃで示されるおよそ５ｋｂｐのｐｄｃ領域に取り囲まれたＧ４１８抵抗性遺伝子を含有する。図６ｄに示すｐＣＲＩＩベクター中にＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＰＤＣ１の２．３ｋｂｐに取り囲まれた内部Ｇ４１８遺伝子を含有する類似のＤＮＡ構築物を作製した。
【０１２４】
（実施例７）
内因性ＰＤＣコーディング配列を破壊し、同時にＬＤＨコーディング配列を挿入するための直線状ＤＮＡフラグメントの使用
実施例５で記載したＰＣＲにより生じた直線状ＤＮＡフラグメントを用いてＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤマダザイマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐＨａ）を形質転換する。Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌら（Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌａｕｒ  Ｗｏｌｆ編、スプリンガー・フェアラーグ、ベルリン、１３８−２０１頁（１９９６））に記載されているようなプロトコルを形質転換に用いる。簡単には一晩培養物５ｍｌを遠沈し、エレクトロポレーションバッファー（１０ｎＭ  トリスＨＣｌ、２７０ｍＭ  スクロース、１ｎＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）で洗浄する。次いで洗浄した細胞をインキュベーションバッファー（５ｇ／ｌ  酵母抽出物、１０ｇ／ｌ  ペプトンブロス、１０ｇ／ｌ  グルコース、２５ｎＭ  ＤＴＴ、２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）中３０℃で３０分間インキュベートする。この期間の終わりに細胞を再度洗浄し、インキュベーションバッファー４００μｌに再懸濁する。ＤＮＡ（２００ｎｇ）をこれらの細胞に加え、バイオ・ラッド・ジーン・パルサーを用いて１８００ボルト、１０００Ｃｌ及び０．４ｃｍキュベット中２５μＦで細胞をパルス化する。
【０１２５】
細胞を標準のＹＰＤ（１０μｇ／ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／ｌ  ペプトンブロス、２０ｇ／ｌ  グルコース、１５％  寒天プレート）にプレートし、コロニーを７２時間以上再生させる。コロニーを有する各プレートを新鮮ＹＰＤプレートにレプリカ培養し、４８時間インキュベートする。次いでコロニーを６．５％  軟寒天（３００ｍＭ  トリスＨＣｌ中０．５％  寒天、１８７ｍＭ  グルタミン酸塩、ｐＨ８．３）に積層する。染色混合物（１％  寒天  ３．２ｍｌ、１２０ｍＭ  トリス  １．６ｍｌ、７５ｍＭ  グルタミン酸塩、ｐＨ８．３、２ｍｇ／ｍｌ  メト硫酸フェナジン０．４ｍｌ、グルタミン酸塩ピルビン酸塩トランスアミナーゼ  ７単位、及びＬ−（＋）−ブタ筋肉乳酸塩デヒドロゲナーゼ）を積層したプレートに添加する。
【０１２６】
高Ｌ（＋）を有する酵母株は１０から１２０分以内に青色輪を形成する。この方法はＳｕｂｄｅｎら（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：８８３−８８６（１９８２））に示唆、Ｗｉｔｔｅら（Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２９：７０７−７１６（１９８９））に修飾された方法に類似している。コロニーを選択し、コロニーから単離されたＤＮＡをＰＣＲ分析により試験し、シークエンシングして破壊されたピルビン酸塩デカルボキシラーゼ遺伝子を検出する。
【０１２７】
別の実施形態では、前記の実施例６で記載し、図６ｃ及び６ｄで表されたコロニーを２つの制限酵素で消化し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）参照）、配列中央に挿入されたカナマイシン抵抗性遺伝子を含む相同性ＰＤＣ領域を含有するおよそ３μｇのＤＮＡフラグメントを生じる。公知の技術、例えばエレクトロポレーションを用いてＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）をフラグメントで形質転換し、Ｋ．マルキシアヌスのｐｄｃを破壊する。
【０１２８】
一般に、以下のようにエレクトロポレーションを実施する：ａ）ＹＰＡＤ中２０ｍｌの容量で一晩（〜１５時間）微生物の培養物を成長させる；ｂ）培養物から５００μｌをマイクロフュージチューブに移し、＠４Ｌ  ４ｍｍで回転させ、上澄を捨てる；ｃ）冷ＥＢ（ＥＢ＝エレクトロポレーションバッファー：１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；２７０ｍＭ  スクロース；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１ｍｌでペレットを洗浄する；ｄ）ＩＢ（ＩＢ＝インキュベーションバッファー：ＹＰＤ；２５ｍＭ  ＤＴＴ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）１ｍｌに再懸濁する；ｅ）＠８００ｒｐｍ、３０℃で３０分間エッペンドルフ・サーモミキサーで振盪する；ｆ）遠沈（ｓｐｉｎ  ｄｏｕｗｎ）し、ＥＢで１回洗浄し、ＥＢ  ４００μｌに再懸濁する；ｇ）３μｇ  ＤＮＡフラグメントを添加し（水中１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）、氷上３０ｍｍインキュベートする；ｈ）０．４ｃｍ  エレクトロポレーションキュベットに移す。バイオラッド・ジーン・パルスター設定：１０００Ｖ、１０００Ｃｌ、５０ＴＦ。パルス後は時間一定：〜２０ミリ秒；ｉ）３ｍｌモルトン・クロシュア・チューブに移し、振盪せずに３０℃で１時間インキュベートする。液体ＹＰＡＤ培地（ＹＰＡＤ：酵母抽出物  １０ｇ；ペプトン  ２０ｇ；グルコース  ２０ｇ；ヘミ硫酸アデニン  １００ｍｇ、容量＝１ｌ、ｐＨ調整なし）４００μｌを添加し、＠８００ｒｐｍ、３０℃で１時間エッペンドルフ・サーモミキサーで振盪する。液体ＹＰＡＤ  ４００μｌを加え、４−６時間回収する；ｊ）マイクロフュージチューブ４Ｋ、４ｍｍで遠沈し、上澄を捨て、１Ｍ  ソルビトール  ４００μｌに再懸濁する；ｋ）２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８選択プレートにプレートする；及び３０℃で３から５日間インキュベートする。
【０１２９】
最初にコロニーを３００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８への第２のパッチングによりスクリーニングする。標準的なゲノム調製（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）により第２の酵母パッチよりゲノムＤＮＡを単離する。次いでこれらを１）適当なプライマー及び条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を用いてカナマイシンフラグメントの存在に関して、及び２）適当なプライマー及び条件を用いて破壊されたｐｄｃ領域の不在に関してＰＣＲによりスクリーニングする。
【０１３０】
次いで選択マーカーに関して陽性のコロニー及びｐｄｃ破壊領域に関して陰性のコロニーを成長させ、ＨＰＬＣにより生理学に関して分析した。これらの株からのゲノムＤＮＡをさらにサザンハイブリダイゼーション分析により分析した。
【０１３１】
（実施例８）
細胞の成長特性
１．低ｐＨ／高温度
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の一晩培養物をＫｉｅｒｓら（Ｙｅａｓｔ  １４（５）：４５９−４６９（１９９８））による酵母最小培地５０ｍｌに接種した。グルコース（１００ｇ／ｌ）を炭素供給源として使用した。一晩培養物を４０℃に維持し、これもまた４０℃に維持した培地に接種した。接種物の添加により培地のｐＨが５．５から２．５に変化した。実験中、ｐＨは２．５のままであった。ＹＳＩ膜によりグルコース濃度を測定し、分光光度計により光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０１３２】
グルコースは７２時間で利用され、これは期間中代謝活性が低ｐＨ及び高温培養条件で生じていることを示している（図７）。加えて、バイオマスは４８から７２時間の間わずかに低減され、これは細胞異化が細胞同化に勝っていることを示している（図７）。
【０１３３】
２．ペントース炭素供給源
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の一晩培養物をＫｉｅｒｓら（Ｙｅａｓｔ  １４（５）：４５９−４６９（１９９８））による酵母最小培地が入った３つの５０ｍｌフラスコに接種した。３つのフラスコの各々には異なる炭素供給源が入っていた。第１のフラスコには１０％  グルコース、第２のフラスコには１０％  Ｄ−キシロース、及び第３のフラスコには１０％  Ｌ−アラビノースが入っていた。フラスコを３０℃でインキュベートし、定期的にＯＤを測定した。
【０１３４】
４０時間後、グルコースまたはキシロースで培養した酵母に関するバイオマス収量は類似していたが、アラビノースで培養した酵母に関するバイオマス収量は低かった（図８）。グルコースで培養した酵母の成長のキシロースまたはアラビノースで培養したものとの比較により、成長における最初の遅延時間が示された。アラビノースで培養された酵母は数時間の遅延時間を呈し、一方キシロースで培養された酵母の遅延時間はさらにより顕著であった（図８）。この遅延の存在は、酵母細胞にはキシロース及びアラビノース炭素供給源に適合する時間が必要であることを示している。恐らく、この時間は正常には発現されないポリペプチドの合成を誘起するのに必要である。
【０１３５】
３．低ＰＨでのトウモロコシ繊維加水分解物
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の一晩培養物をＫｉｅｒｓら（Ｙｅａｓｔ  １４（５）：４５９−４６９（１９９８））による酵母最小培地が入ったフラスコに接種した。各々のフラスコには炭素供給源として３０％  トウモロコシ繊維加水分解物が入っている。簡単には、トウモロコシ繊維を１４５℃で２５分間１．２％  硫酸と反応させることによりトウモロコシ繊維加水分解物を作製した。反応中に、ヘミセルロースが単量体生成物アラビノース、キシロース、及びグルコースに分解された。反応中の高温のために、アラビノース及びキシロースがいくらかフルフラールに分解されたが、グルコースはいくらかヒドロキシメチルフルフラールに分解された。加水分解物のＨＰＬＣ分析により、３８．７ｇ／ｌ  グルコース、３９．１ｇ／ｌ  キシロース、２０．７ｇ／ｌ  アラビノース、及び１．６ｇ／ｌ  フルフラールの存在が示された。加えて、加水分解物は１．５１のｐＨを有した。酵母を培養する前にトウモロコシ繊維加水分解物のｐＨを３．０に調整した。培養実験中、ＯＤ測定を定期的に行った。
【０１３６】
酵母細胞は、トウモロコシ繊維加水分解物と共に培養した場合、バイオマスを生成することができる（図９）。
【０１３７】
４．種々のｐＨ条件
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の一晩培養物を酵母ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／ｌ  ペプトンブロス、２０ｇ／ｌ  グルコース）５０ｍｌが入った４つのフラスコに接種した。各々のフラスコのｐＨは異なっており、これをＨＣｌを用いて調整した。培養実験中、温度は３０℃を維持し、定期的にＯＤを測定した。各フラスコで成長が観察された（図１０）。
【０１３８】
５．種々ｐＨ条件／乳酸
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の一晩培養物を酵母ＹＰＤ培地（１０ｇ／ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／ｌ  ペプトンブロス、２０ｇ／ｌ  グルコース）５０ｍｌ及び４０ｇ／ｌ  乳酸が入った４つのフラスコに接種した。乳酸の添加によりｐＨが２．８になった。従って、３つのフラスコ内のｐＨをＮａＯＨを用いて指示されたｐＨに調整した。培養実験中、温度は３０℃を維持し、定期的にＯＤを測定した。各フラスコで成長が観察された（図１１）。
【０１３９】
（実施例９）
アクリリル−ＣｏＡを生成できる組換え細胞
炭素供給源としてアクリル酸塩を利用できない生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））をクロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）ゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換する。Ｃ．プロピオニクム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）ゲノムライブラリーを、ｐＨＥＳプラスミドを用いて作製し、それによりＣ．プロピオニクムゲノムの１０ｋｂｐフラグメントを発現する。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、唯一の炭素供給源としてアクリル酸を含む選択培地にプレートする。アクリル酸塩を同化する能力を有するこれらの細胞のみが成長する。アクリル酸塩は通常その酵素媒介変換により乳酸塩に同化される。今度は乳酸塩がピルビン酸塩に変換され、クレブスサイクルを経て細胞に利用され得る。
【０１４０】
一度形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が選択されると、ゲノムライブラリーからＤＮＡプラスミド単離され、挿入されたフラグメントがシークエンシングされる。一度シークエンシングされると、フラグメントがオープン・リーディング・フレームに関して走査され、乳酸塩及びアクリル酸塩間の変換に関与する酵素のコーディング配列を決定する（例えばラクトイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼ）。
【０１４１】
これらの酵素のコーディング配列を含有する単離されたクローンを実施例６に記載する、乳酸塩デヒドロゲナーゼを含有し、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼを欠く酵母細胞に導入する。導入された核酸を含有する組換え酵母細胞の選択はＧ４１８（３００ｇ／ｌ）を用いて行う。一度単離すると、組換え酵母細胞をグルコースで好気的に成長させ、次いで嫌気的条件に切替える。次いでブロスを収集し、Ｄａｎｎｅｒらにより記載されるような標準的なＨＰＬＣ法を用いてアクリル酸塩に対して検定する（「アクリル酸のバイオマスからのバイオテクノロジーによる生成」Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０−７２巻（１９９８））。
【０１４２】
（実施例１０）
アスコルビン酸塩を生成できる組換え細胞
以下のポリペプチドが発現されるように発現ベクターを操作する：２，５−ジオキシ吉草酸塩デヒドロゲナーゼ、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカル酸塩デヒドラターゼ、グルカル酸塩デヒドラターゼ、アルデヒドデヒドラターゼ、グルクロノラクトンリダクターゼ、及びＬ−グルオノラクトンオキシダーゼ。これらのポリペプチドをコードする核酸配列を種々微生物から単離する。一度操作すると、エレクトロポレーションにより発現ベクターを酵母細胞に形質転換する。一度形質転換すると、酵母細胞を分析して、これらがＬ−アスコルビン酸塩を生成するかどうかを決定する。
【０１４３】
（実施例１１）
Ｄ−キシロースを生成できる組換え細胞
以下のポリペプチドが発現されるように発現ベクターを操作する：２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタン酸塩アルドラーゼ、キシロン酸塩デヒドラターゼ、キシロノタクトナーゼ（ｘｙｌｏｎｏｔａｃｔｏｎａｓｅ）、及びＤ−キシロースデヒドロゲナーゼ。これらのポリペプチドをコードする核酸配列をシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種から単離する。一度操作すると、エレクトロポレーションにより発現ベクターを酵母細胞に形質転換する。一度形質転換すると、酵母細胞を分析して、これらがＤ−キシロースまたはその他のペントース炭素化合物を生成するかどうかを決定する。
【０１４４】
（実施例１２）
クエン酸塩を生成できる組換え細胞
Ｓ．セレビジエ・アコニターゼ（ＡＣＯ１、ジェンバンク受け入れ番号Ｍ３３  １３ｔ）核酸配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計する。これらのプライマーを用いてクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）またはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種からアコニターゼコード化配列をクローン化する。一度シークエンシングすると、実施例５に記載するように直線状構築物が作製され、これを用いて酵母細胞内のアコニターゼコード化核酸を破壊する。使用する選択マーカーは実施例５に記載する乳酸塩生成の代わりに抗生物質Ｇ４１８である。抗生物質Ｇ４１８に対して抵抗性を提供する核酸はネオマイシン／カナマイシン遺伝子である。この遺伝子はｐＰＩＣ９Ｋベクター（インビトローゲン）から得られ、ｐＨＥＳベクターに挿入される。酵母細胞を前記したＡＣＯ１に相同である末端を有するように操作したＰＣＲ生成直線状フラグメントで形質転換する。直線状フラグメントはＧ４１８抵抗性遺伝子をコードするように設計する。アコニターゼコード化配列の位置に直線状フラグメントが組み込まれている細胞のみが抗生物質に抵抗する。ＰＣＲを用いてこれらの細胞を適当な組み込みに関して分析する。この方法により得られた酵母細胞は部分的に機能的なＴＣＡサイクルを有し、従ってクエン酸塩を過剰生成する。
【０１４５】
クエン酸塩はミトコンドリア膜を通ってブロスへ輸送される。加えて、これらの酵母細胞には酵素、例えばＡＴＰクエン酸塩リアーゼをコードする外来性核酸分子が供給され、細胞が蓄積されたクエン酸塩のオキサロ酢酸塩への変換を触媒できるようになる（実施例１３参照）。
【０１４６】
（実施例１３）
サイトゾルにクエン酸塩リアーゼを発現できる組換え細胞
クラブトリー陽性酵母細胞を、ＡＴＰクエン酸塩リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含有するｐＨＥＳプラスミドで形質転換する。この核酸を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｒｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク受け入れ番号Ｘ７９８１７）またはその他の公開されている供給源から単離する。一度形質転換されると、酵母細胞を分析して、これらが糖を利用して大量の脂質蓄積物を生成できるかどうかを決定する。加えて、酵母細胞を分析して、これらがＨｏｌｄｓｗｏｒｔｈら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：２９０７−２９１５（１９９８））に記載されるようなＡＴＰクエン酸塩リアーゼ活性を呈するかどうかを決定する。ＡＴＰクエン酸塩リアーゼ活性を有する酵母細胞は、好気的条件下で、アルデヒドデヒドロゲナーゼを介するアルデヒドの酢酸塩への分解以外の経路によりサイトゾル酢酸塩を提供できる。加えて、かかる酵母がピルビン酸塩デカルボキシラーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を欠く場合、これらはクレブスサイクルを介する生合成のために酢酸塩を提供できるはずである。
【０１４７】
（実施例１４）
炭素供給源として乳酸塩を利用できる組換え細胞
Ｓ．セレビジエ  ＪＥＮＩポリペプチドに類似するカルボン酸トランスポーターの活性が低下するように酵母細胞を操作する。かかる酵母細胞は乳酸塩を輸送する能力が低下し、従って乳酸塩の利用効率が低くなる。酵母細胞内のカルボン酸トランスポーターの活性は、このポリペプチドのコーディング配列を含有する遺伝子座を破壊することにより低下する。第１にＪＥＮ１に関する利用可能な配列（ジェンバンク受け入れ番号  Ｕ２４  １５５）に基づいて設計された縮重プライマーを用いて宿主からＪＥＮ１ポリペプチドの相同体を単離する。一度核酸が宿主細胞から単離されると、それをシークエンシングする。このポリペプチドに関するコーディング配列の破壊を実施例１１に記載する手順を用いて行う。ＪＥＮ１配列及び全Ｇ４１８抵抗生遺伝子に対する相同性領域をコードする直線状フラグメントを作製する。この直線状フラグメントをＪＥＮ１ゲノム配列に組み込み、活性の崩壊を引き起こす。カルボン酸トランスポーター活性を欠く細胞を、カルボン酸の輸送不能、従って乳酸塩で培養した場合の成長不能により同定する。
【０１４８】
加えてＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  チトクロームｂ２ポリペプチドの機能的等価物の活性が低減されるように細胞を修飾する。チトクロームｂ２ポリペプチドによりＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞はミトコンドリア内で乳酸塩を代謝できるようになる。第１にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）チトクロームｂ２配列（ジェンバンク受け入れ番号Ｚ４６７２９）から重複プライマーを設計する。一度単離すると、クローンをシークエンシングする。チトクロームｂ２の酵母宿主相同体の破壊はＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ａｌｉｓｏｎら編、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９９７））に記載される方法を用いて行う。この組換え酵母細胞は炭素供給源として乳酸塩を利用できない。
【０１４９】
（実施例１５）
乳酸塩の大規模容量生成
複数の変種のＰＤＣ活性が低減されているＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）細胞を生成し、単離する。ＬＤＨ活性を有するポリペプチドをコードする異なるコピー数の外来性核酸分子を含有するように各々の変種を操作する。ＬＤＨポリペプチドは複数の異なる供給源に由来する。かかる変種細胞は４０℃で乳酸に関して異なる特異的生産性を有し得る。
【０１５０】
各々の変種を１．５ＶＶＭの空気流及び溶解酸素含量３０％を伴う好気的条件下で容器中で成長させ、乾燥ベースで約６０ｇ／ｌの細胞密度に至る。一度密度が十分になると、空気流を止め、容器内の条件を嫌気的条件に切替える。基剤は加えない。
【０１５１】
嫌気相で最高の特異的生産性を有する変種が、より低い特異的生産性を有する変種よりも乳酸をより早く生成するのみならず、低ｐＨでより高濃度に到達できることが見出される。
【０１５２】
生成相でのグルコースでの生成収量は９０％を超過することができる。特定の変種を選択し、空気流を完全に止めるよりむしろ０．１ＶＶＭに低下させる以外は同一の培養方法に供する。かかる条件下では、容器内の最終ｐＨを低くし、乳酸塩濃度を空気流がない条件よりも高くすることができる。グルコースでの生成収量を低下させるが、約９０％に保つことができる。０．５ＶＶＭの空気流で試験を繰り返す場合、グルコースでの生成収量は８０％未満にまで低減され得る。
【０１５３】
（実施例１６）
一連のバッチ発酵を用いる乳酸塩の大規模容量生成
ＰＤＣ活性を欠き、ＬＤＨ活性を有するＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の培養物を一連のバッチ発酵の接種物として用いる。各々の発酵を漸増的に大きな容器で実施し、その各々を使用の直前に滅菌する。加えて、各容器に１．５ＶＹＭの空気流を提供し、十分攪拌して溶解酸素含量が１０％以上を維持するようにする。最終容器は６０００ｌの容量を有する。また容器は４５℃の温度を維持し、遺伝的に修飾されたＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）細胞の生存性を野生型酵母及びその他の微生物以上に高める。各々の容器を最適な成長のために標準的な培養培地で充填する。
【０１５４】
乾燥ベースで細胞１００ｇ／ｌの細胞密度の最終容器の内容物を、３０００００ｌの容量を有する、蒸気にあてたばかりの生成容器に移す。場合によっては前記の生成方法の濾過から得られたさらなる細胞を加えてもよい。生成容器中の細胞密度は乾燥ベースで細胞６ｇ／ｌである。グルコースを８０ｇ／ｌのレベルまで加える。容器内の条件を４２℃の温度で２５時間、嫌気的である。特異的生産性は、生産性が低下し始める方法の終末近くまでは乳酸塩０．５ｇ／（バイオマスｇ＊時間）以上である。一度生産性が低下し始めると、細胞を除去し、再使用のために取っておく。乳酸塩の最終濃度は、ｐＨ２．８で７５ｇ／ｌにできる。バイオマスを除去した後、溶液を蒸発により乳酸塩５０％濃度まで濃縮する。遊離酸（全乳酸塩の約８６％）を有機物への液体抽出により抽出し、高温で水に逆抽出する。乳酸塩を含有するラフィネートを浄化し、成長容器のバッファーに再利用するか、または例えば硫酸で酸性にし、精製する。
【０１５５】
（実施例１７）
クラブトリー陰性（Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ））及びクラブトリー陽性（Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ））生物の好気的生成の比較
クラブトリー陰性（Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ））及びクラブトリー陽性（Ｓ．ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ））生物を各々好気的及び嫌気的バッチ発酵で成長させた。バッチ培養は作業容量１．５ｌの実験用発酵槽中３０℃で実施した。２モル／Ｌ  水酸化カリウム（ＫＯＨ）の自動添加によりｐＨを５．０±０．１を維持した。発酵槽に空気（好気的培養）または窒素ガス（嫌気的培養）を流速０．８Ｌ／分で流入させ、８００ｒｐｍで攪拌した。溶解酸素濃度を酸素電極（インゴールド、３４  １００  ３００２型）で継続的にモニター観察し、好気的培養では溶解酸素濃度は６０％以上を維持した。サンプル１０ｍｌを適当な間隔で回収し、乾燥重量及び代謝物濃度を測定した。トゥイーン８０及びエルゴステロールを嫌気的培養物に加え、脂肪酸合成に必要な化合物を供給した。
【０１５６】
指数関数的成長の間、酵母培養物の乾燥重量及びＯＤ６６０、並びに上澄のグルコース及びエタノール濃度を適当な間隔で測定した。特異的エタノール生成速度（ｑエタノールミリモル／ｇ＊時間）を線形回帰分析を用いて以下の等式により算出した：
ｑエタノール＝（ｄＥ／ｄＣｘ）＊μｍａｘ
ここでｄＥ／ｄｔ（培養物中のエタノール濃度の増加率；ミリモル／１８時間）及びはｄＣｘ／ｄｔ（バイオマス濃度の増加率；ｇ／ｌ＊時間）を、エタノール濃度及びバイオマス濃度対時間、μｍａｘ（ｈ−１）のプロットの微分を用いて算出した。グルコースでの最高特異的成長速度をＣｘ対時間のプロットの指数部分から推測した。特異的グルコース消費速度（ｑグルコースミリモル／ｇ＊時間）を算出するために、ｄＥをｄＧ（時間あたりのグルコース消費量）で置き換えた。
【０１５７】
好気的バッチ培養では、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株は各々グルコースで０．４時間−１及び０．２８時間−１の最大特異的成長速度を呈した。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）培養の高グルコース濃度及び得られた高特異的成長速度は高速の好気的アルコール性発酵に至る（表３、図１）。グルコース消費の特異的速度は、活発なアルコール性発酵のためにクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）株に比較してサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株で約２倍高かった。エネルギーの観点から、アルコール発酵は細胞がＡＴＰを生成するためには効率があまりよくない。グルコースで生じるバイオマスはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）で０．３８ｇ／ｇ、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）で０．１４ｇ／ｇであった。グルコースで生じるエタノールは、クラブトリー陰性表現型クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）株ではゼロであり、クラブトリー陽性表現型であるサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）培養物では１．８３ミリモル／ミリモルであった。
【表３】
2004521619.tif 000012
嫌気的バッチ培養では、ブロス株に関する特異的成長速度及びバイオマス収量は好気的条件下で見出されるものに比較して非常に低かった（表３、図１及び２）。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｂｅｒｏｍｙｃｅｓ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株ではバイオマス収量が各々０．０７及び０．０９ｇ／ｇであった。双方の株は嫌気的条件下でのアルコール性発酵の特異的速度に関して等しく良好であった。これはＣＯ２生成データを用いて確認された。
【０１５８】
一般にこの実施例はバイオマスの好気的生成が嫌気的よりもより速く、好気的条件下でのバイオマスの収量はクラブトリー陰性生物ではより高いことを示している（なぜならクラブトリー陽性生物ではいくらかアルコール性発酵が起こり、グルコースを消耗する）。この実施例はまた嫌気的条件下でクラブトリー陽性及び陰性生物の双方が同じ速度で発酵生成物（この場合、エタノール）を生成物することをも示している。従って、好気的成長段階により高いバイオマス収量が提供され、続く嫌気的発酵段階が代謝エネルギーを（成長よりむしろ）生成物形成に向ける。全体では、生成が成長から切り離されている方法により、より大きな方法順応性が提供され、方法全体の収量よりもよりよく調節される。
【０１５９】
（実施例１８）
天然にＬ−乳酸を作製する宿主株における乳酸塩の生成の改善；ピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子破壊のための相同性ＤＮＡの直線状フラグメントの増幅
酵母クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）は天然にＬ−乳酸を生成する（Ｋｕｒｔｚｍａｎ及びＦｅｌｌ、「酵母、分類研究」２４０−２４１頁；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．；アムステルダム、オランダ）。Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）はＬ−乳酸生成を可能にする天然発生乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を有する。嫌気的条件下で生成された乳酸の量は利用されるグルコースのおよそ４％ｇ／ｇであり、一方残りのグルコースは本質的にエタノールに変換される（グルコース消費の４２．５ｇ／ｇ％  ）、グリセロール（グルコース消費の３ｇ／ｇ％）及び酢酸塩（グルコース消費の０．３ｇ／ｇ％）。
【表４】
2004521619.tif 000013
Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ｋａｒａｎｏＰＤＣ１遺伝子配列を比較することにより誘導された配列から構築されたコンセンサスプライマーを用いてＰＤＣ１の６００ｂｐ領域をＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）から単離した。次いでＰＤＣ１フラグメントをシークエンシング（サンガー）し、これを用いて、ＰＣＲ及びゲノムウォーキング技術（クロンテック）を使用して、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ｐｄｃｌ（図６ｅ）を取り囲む７．４ｋｂｐフラグメントを単離する。次いで７．５ｋｂｐフラグメントをｐＣＲＩＩ  ＴＡクローニングベクター（インビトローゲン）にクローン化した。ＰＤＣＩのコーディング領域の中央近くのおよそ７３０ｂｐの部分をＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）７．５ｋｂｐフラグメントから除去した。制限消化（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）により除去されたＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ｐｄｃｌの部分は以下の配列を含有した：
【化８】
2004521619.tif 000014
そのプロモーターを含むカナマイシン抵抗性をコードする遺伝子をｐＰＴＣ９Ｋベクター（インビトローゲン）から制限消化（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）により単離し、７．５ｋｂｐの部位にクローン化し、そこから７３０ｂｐフラグメントを除去した。ｐＰＴＣ９Ｋ（インビトローゲン）からのカナマイシン抵抗性遺伝子の配列及びそのプロモーター以下のとおりであった：
【化９】
2004521619.tif 000015
2004521619.tif 000016
得られた構築物は図６ｆに示すようにおよそ６．８ｋｂｐのＰＤＣ領域で取り囲まれたカナマイシン抵抗性遺伝子（Ｇ４１８）を含む。図６ｆで表される構築物を２つの制限酵素で消化して（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、相同性ＰＤＣ領域及び配列中央に挿入されたカナマイシン抵抗性遺伝子を含有するおよそ３μｇのＤＮＡフラグメントを生成する。
【０１６０】
公知の形質転換技術、例えばエレクトロポレーションを用いてＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）をフラグメントで形質転換し、Ｋ．サーモトレランスのＰＤＣを破壊する。エレクトロポレーションの方法は以下のとおりである：ａ）ＹＰＡＤ中２０ｍｌの容量で培養物を一晩（から１５時間）成長させる；ｂ）培養物５００μｌをマイクロフュージチューブに移し、＠４Ｋ、４ｍｍで回転させ、上澄を捨てる；ｃ）冷ＥＢ（ＥＢ  エレクトロポレーションバッファー：１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；２７０ｍＭ  スクロース；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１ｍｌで洗浄する；ｄ）ＩＢ（ＩＢ＝インキュベーションバッファー：ＹＰＤ；２５ｍＭ  ＤＴＴ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０）１ｍｌに再懸濁する；ｅ）＠８００ｒｐｍ、３０℃で３０分間エッペンドルフ・サーモミキサーで振盪する；ｆ）遠沈（ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）し、ＥＢで１回洗浄し、ＥＢ  ４００μｌに再懸濁する；ｇ）３μｇ  ＤＮＡフラグメントを添加し（水中１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）、氷上３０ｍｍインキュベートする；ｈ）０．４ｃｍ  エレクトロポレーションキュベットに移す。バイオラッド・ジーン・パルスター設定：１０００Ｖ、１０００Ａ、５０ＴＦ。パルス後は時間一定：〜２０ミリ秒；ｉ）３ｍｌモルトン・クロシュア・チューブに移し、振盪せずに３０℃で１時間インキュベートする；ｊ）液体ＹＰＡＤ培地（ＹＰＡＤ：酵母抽出物  １０ｇ；ペプトン  ２０ｇ；グルコース  ２０ｇ；ヘミ硫酸アデニン  １００ｍｇ、容量＝１ｌ、ｐＨ調整なし）４００μｌを添加し、８００ｒｐｍ、３０℃で１時間エッペンドルフ・サーモミキサーで振盪する；ｋ）液体ＹＰＡＤ  ４００μｌを加え、４−６時間回収する；ｌ）マイクロフュージチューブ＠４Ｋ、４ｍｍで遠沈し、上澄を捨て、１Ｍ  ソルビトール  ４００μｌに再懸濁し、１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８選択プレートにプレートする；及びｍ）３０℃で３から５日間インキュベートする。
【０１６１】
最初にコロニーを２００μｇ／ｍｌ  ０４１８を含有する培養皿への第２のパッチングによりスクリーニングする。標準的なゲノム調製（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）により第２の酵母パッチよりゲノムＤＮＡを単離する。次いで単離したゲノムを１）適当なプライマー及び条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）を用いてカナマイシンフラグメントの存在に関して、及び２）適当なプライマー及び条件を用いて破壊されたｐｄｃ領域の不在に関してＰＣＲによりスクリーニングする。次いで選択マーカーに関して陽性のコロニー及びＰＤＣ破壊領域に関して陰性のコロニーを別の研究のために成長させ、例えばこれらの株からのゲノムＤＮＡをさらにサザンハイブリダイゼーション分析により分析する。
【０１６２】
（実施例１９）
酵母、菌類及び細菌ＬＤＨ遺伝子のクローニング
２種の酵母、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びトルラスポラ・プレトリエンシス（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）からＬＤＨコード化遺伝子を単離した。これらの種は乳酸を生成することが解っている（Ｗｉｔｔｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：７０７−７１６（１９８９））。全ての慣用される手順を特記する以外はＳａｍｂｒｏｏｋら、前出で示される手順に従って実施した。
【０１６３】
クルイベロミセス・サーモトレランス  ＬＤＨ
Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ  受け入れ番号＃５２７０９）から入手し、標準的な条件下で成長させた。インビトローゲン「イージーＤＮＡ」キットを用いて製造者のプロトコルに従ってこれらの細胞からゲノムＤＮＡを精製した。リゾパス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（ＤｒｏｓｏｐＨｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アルビドプシス・タリアナ（Ａｒｉｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）及びラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）からのＬ−ＬＤＨコード化遺伝子のアラインメントにおいて同定された保存領域を逆翻訳することにより縮重増幅プライマーを設計した。２つの縮重オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に成功した。これらのオリゴヌクレオチドは：
【化１０】
2004521619.tif 000017
であった。パーキン・エルマーバッファーＩＩ（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）及びアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。各々の反応物はＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ゲノムＤＮＡを６ｎｇ／μｌの濃度で、４ｄＮＴＰの各々を０．２ｍＭの濃度で、及びＥＪＰ４及びＥＪＰ５プライマーの各々を１μＭで含有した。以下のサイクリング条件従って反応を実施した：最初のインキュベーションは９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５２℃で４０秒、７２℃で４０秒からなる３５サイクル。１１６塩基対（ｂｐ）のわずかな生成フラグメントを慣用される手段を用いて精製し、本明細書に開示した同一条件及び増幅条件を用いて再増幅し、クローン化し、シークエンシングした。
【０１６４】
得られた配列を、公知のＬ−ＬＤＨコード化遺伝子に優れた相同性を呈するポリペプチドに翻訳できる２つの非縮重プライマーＥＪＰ８及びＥＪＰ９をこの配列に基づいて設計した：
【化１１】
2004521619.tif 000018
ＤＮＡの部分Ｓａｕ３Ａ消化により生じたランダムフラグメントをプラスミドＹｅｐ９Ｔ（ｒｅｆ）のＢａｍＨ１部位に挿入することにより、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。プライマーＥＪＰ８及びＥＪＰ９をベクターアームのプライマーと組み合わせて用いるＰＣＲにより完全なＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコード化遺伝子を単離した。これらのベクターは：
【化１２】
2004521619.tif 000019
であった。
【０１６５】
これらの増幅反応では、伸長時間を２分まで延長し、アニーリング温度を５８℃まで高めた以外は上述した条件であった。増幅生成物をクローン化し、シークエンシングして公知の配列に対する相同性に基づいてＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコード化遺伝子の残りを含有することが示された。
【０１６６】
最後に、プライマーＥＪＰ１２及びＥＪＰ１３：
【化１３】
2004521619.tif 000020
を用いるＰＣＲ増幅反応において高適合性ポリメラーゼ（Ｐｆｕ）を用いて全長遺伝子を直接Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ゲノムＤＮＡから再単離した。これらの増幅反応を前記したように実施した。この別個に生成されたＰＣＲ産物のコーディング配列はアンプリタック・ゴールド生成配列に完全に一致した。Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコード化遺伝子のコーディング領域の核酸配列を配列番号：２０として以下に提示する。
【０１６７】
完全なコーディング配列の翻訳により、とりわけスキゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂ）（４９．５％）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（４５．１％）、ラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（３６．８％）、ウシ（３５．３％）、及びリゾパス・オリエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙａｅ）（３２．６％）からのＬ−ＬＤＨコード化遺伝子に対する著明な配列同一性が示された。
【化１４】
2004521619.tif 000021
2004521619.tif 000022
【化１５】
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トルラスポラ・プレトリエンシスＬＤＨ
Ｔ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）のＬ−ＬＤＨコード化遺伝子をＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）遺伝子に類似の様式で単離した。実験計画は再度、縮重プライマーを用いるＴ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を用いて遺伝子のセグメントを単離し、ＰＣＲ基盤の染色体ウォーキングにより残りの遺伝子を単離することであった。Ｔ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ  受け入れ番号＿＿＿＿＿）から入手した。インビトローゲン「イージーＤＮＡ」キットを用いて製造者のプロトコルに従って、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から精製した。前記した保存配列に基づいて縮重プライマーを設計した。２つの縮重オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に成功した：
【化１６】
2004521619.tif 000026
熱サイクリングパラメーター及び反応条件は、Ｔ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）ゲノムＤＮＡを２０ｎｇ／μｌの濃度で使用した以外は前記したとおりであった。強力な生成物である５０８ｂｐのＤＮＡフラグメントをクローン化し、シークエンシングした。得られた１６９個のアミノ酸翻訳生成物は公知のＬ−ＬＤＨコード化遺伝子に対して優れた相同性を呈した。
【０１６８】
遺伝子の残りは公知の配列から双方向の「ウォーキング」により単離した。これはゲノム・ウォーカー・キット（クロンテック＃Ｋ１８０７−１）及びアドバンテージ・ゲノミック・ポリメラーゼ・ミックス（クロンテック＃８４１８−１）を用いて製造者の指示書に従って達成した。キットにより提供されるアダプタープライマーに加えて、４つの、遺伝子特異的な入れ子状態のプライマーを使用した。遺伝子特異的プライマーは：
【化１７】
2004521619.tif 000027
であった。生成物をクローン化し、シークエンシングし、公知の配列に対する相同性に基づいて、Ｔ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）からのＬＤＨコード化遺伝子の残りを含有することが見出された。完全なコーディング配列の翻訳により、とりわけスキゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂ）（４８．８％）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（４２％）、ラクトバシラス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（３８．２％）、ウシ（３４．９％）、及びリゾパス・オリエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙａｅ）（３２．２％）からのＬ−ＬＤＨコード化遺伝子に対する著明な配列同一性が示された。Ｔ．プレトリエンシス（Ｔ．ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）ＬＤＨコード化遺伝子を配列番号：２８として以下に提示し、そこでコード化されるＬＤＨタンパク質の予測されるアミノ酸配列を配列番号：２９として同定する。
【化１８】
2004521619.tif 000028
【化１９】
2004521619.tif 000029
2004521619.tif 000030
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨ
ＬＤＨ遺伝子をコードするＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＮＡを以下のように単離した。Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ  受け入れ番号＃６４５８）から入手し、標準的な条件下で成長させた。インビトローゲン「イージーＤＮＡ」キットを用いて製造者のプロトコルに従ってこれらの細胞からゲノムＤＮＡを精製した。Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からのＬ−ＬＤＨに関するジェンバンクで入手可能な配列（ジェンバンク受け入れ番号＃Ｍ２２３０５）に基づいてプライマーを設計した。パーキン・エルマーバッファーＩＩ（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）及びアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。各々の反応物はＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ゲノムＤＮＡを６ｎｇ／μｌの濃度で、４ｄＮＴＰの各々を０．２ｍＭの濃度で、及び２つの増幅プライマーＢＭ１２７０及びＢＭ１７９の各々を１μＭの濃度で含有し、ここでこれらのプライマーは配列：
【化２０】
2004521619.tif 000031
を有する。以下の熱サイクリング条件に従って反応を実施した：最初のインキュベーションは９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、５０℃で６０秒、７２℃で６０秒からなる３５サイクル。１１００塩基対（ｂｐ）の強い生成フラグメントを慣用される手段を用いてゲル精製し、クローン化し、シークエンシングした。得られた配列は、公知のＬ−ＬＤＨコード化遺伝子に優れた相同性を呈するポリペプチドに翻訳できた。
【０１６９】
本明細書で開示されるＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨコード化配列（配列番号：３２）のコーディング配列は、双方共にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するホスホグリセリン酸塩キナーゼ遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに機能的に連結された。この構築物を作製する場合に、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、これを用いて配列番号：２９として同定される配列を有するインサートを含有するプラスミドからコーディング配列を増幅する。２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｂｍｅｇ５’及びＢｍｅｇ３’をこの配列に基づいて設計し、遺伝子のコーディング配列の末端で制限部位を導入した：
【化２１】
2004521619.tif 000032
ｄＮＴＰ及び前記したプライマー濃縮物を用いて、製造者により供給されたバッファー中Ｐｆｕターボポリメラーゼ（ストラッタジーン）を用いてこの増幅反応を実施した。最初に反応混合物を９５℃で３分間インキュベートし、次いで９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒の２０サイクルにより、続いて７２℃で９分間の最終インキュベーションにより熱サイクリングを行った。生成物を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いでプラスミドｐＮＣ１０１（ＮＲＥＬ）のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位にライゲートした。このライゲーションの結果、ＰＧＫプロモーター及びＧＡＬ１０ターミネーターがＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨコーディング配列に機能的に連結されるようになった（すなわち酵母細胞において転写的に活性である）。一度Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨがこれらの転写調節配列に機能的に連結されると、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントが切除され、クルイベロミセス種（プラスミドｐＮＣ００３、ＮＲＥＬ）で複製できるベクターに再クローン化された。得られたプラスミドはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）プラスミドｐＫＤ１からのＳｐＨＩ部位の間にＬＤＨ含有ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメント及び４７５６ｂｐ配列を含有した。
【０１７０】
これらのプラスミドを図１７に示す。
【０１７１】
リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＬＤＨ
Ｌ−ＬＤＨを以下のようにリゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）から単離した。リゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ  受け入れ番号＃９３６３）から入手し、標準的な条件下で成長させた。インビトローゲン「イージーＤＮＡ」キットを用いて製造者のプロトコルに従ってこれらの細胞からゲノムＤＮＡを精製した。Ｒ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）からのＬ−ＬＤＨに関するジェンバンクで入手可能な配列（ジェンバンク受け入れ番号＃ＡＦ２２６１５４）に基づいてプライマーを設計した。パーキン・エルマーバッファーＩＩ（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）及びアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。各々の反応物はＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）ゲノムＤＮＡを６ｎｇ／μｌの濃度で、４ｄＮＴＰの各々を０．２ｍＭの濃度で、及び増幅プライマーＲａｌ−５’及びＲａｌ−３’の各々を１μＭの濃度で含有した。増幅プライマーは配列：
【化２２】
2004521619.tif 000033
を有した。以下のサイクリング条件に従って反応を実施した：最初のインキュベーションは９５℃で１０分、続いて９５℃で３０秒、４１℃で３０秒、７２℃で６０秒からなる３５サイクル。１１００塩基対（ｂｐ）の強い生成フラグメントを慣用される手段を用いてゲル精製し、ＴＡベクター（インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローン化し、シークエンシングした。得られた配列は、ジェンバンクの公知のリゾパス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）Ｌ−ＬＤＨコード化遺伝子配列（受け入れ番号＃ＡＦ２２６１５４）に優れた相同性を呈するポリペプチドに翻訳できた。
【０１７２】
本明細書で開示されるＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）ＬＤＨコード化配列のコーディング配列は、双方共にＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するホスホグリセリン酸塩キナーゼ遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに機能的に連結された。この構築物を作製する場合に、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、これを用いてリゾパス（Ｒｙｚｏｐｕｓ）ＬＤＨインサートを含有するプラスミドからコーディング配列を増幅した。２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｒａｐｇｋ５及びＰａｐｇｋ３’をこの配列に基づいて設計し、遺伝子のコーディング配列の末端で制限部位を導入した。
【化２３】
2004521619.tif 000034
ｄＮＴＰ及び前記したプライマー濃縮物を用いて、製造者により供給されたバッファー中Ｐｆｕターボポリメラーゼ（ストラッタジーン）を用いてこの増幅反応を実施した。最初に反応混合物を９５℃で３分間インキュベートし、次いで９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で６０秒の２０サイクルにより、続いて７２℃で９分間の最終インキュベーションにより熱サイクリングを行った。生成物を制限酵素ＸｂａＩで消化し、次いでプラスミドｐＮＣ１０１（ＮＲＥＬ）のＸｂａＩ部位にライゲートした。
【０１７３】
このライゲーションの結果、ＰＧＫプロモーター及びＧＡＬ１０ターミネーターがＲ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）ＬＤＨコーディング配列に機能的に連結されるようになった。一度Ｒ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）ＬＤＨがこれらの転写調節配列に機能的に連結されると、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントが切除され、クルイベロミセス種（プラスミドｐＮＣ００３、ＮＲＥＬ）で複製できるベクターに再クローン化された。得られたプラスミドはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）プラスミドｐＫＤ１からのＳｐＨＩ部位の間にＬＤＨ含有ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメント及び４７５６ｂｐ配列を含有した。
【０１７４】
Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｒ．オリゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）またはＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から単離されたＬＤＨ遺伝子をコードするＧ４１８抵抗性マーカーベクター
インビトローゲン（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手したＧ４１８抗生物質選択マーカーを修飾し、双方共にＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するピルビン酸塩デカルボキシラーゼ遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに機能的に連結された。この構築物を作製する場合に、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、これを用いてＧ４１８抵抗性遺伝子インサートを含有するプラスミドからコーディング配列を増幅した。２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｇ５’及びＧ３’をこの配列に基づいて設計し、遺伝子のコーディング配列の末端で制限部位を導入した。
【化２４】
2004521619.tif 000035
これらのオリゴヌクレオチドを用いてｐＰＩＣ９Ｋベクター（インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）からＧ４１８遺伝子を増幅した。ｄＮＴＰ及び前記したプライマー濃縮物を用いて、製造者により供給されたバッファー中Ｐｆｕターボポリメラーゼ（ストラッタジーン）を用いてこの増幅反応を実施した。最初に反応混合物を９５℃で３分間インキュベートし、次いで９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で６０秒の２０サイクルにより、続いて７２℃で９分間の最終インキュベーションにより熱サイクリングを行った。生成物を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いでプラスミドｐＮＣ１０１（ＮＲＥＬ）のＸｂａＩ部位及びＢａｍＨＩにライゲートした。
【０１７５】
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からのＬＤＨ遺伝子は、双方共に酵母Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するホスホグリセリン酸塩キナーゼ遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに機能的に連結され、Ｇ４１８遺伝子のＧａｌ１０ターミネーターの３’末端のＳｐＨＩ部位にこのベクターを導入した。これは本質的にＧ４１８選択マーカー遺伝子及びＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨ遺伝子に結合してプラスミドｐＣＡ５が得られる。プラスミドｐＣＡ５を制限消化して、Ｇ４１８選択マーカー遺伝子及びＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＬＤＨ遺伝子からなる４キロ塩基対（ｋｂｐ）フラグメントを切除した。本明細書にて論じた化学的及びエレクトロポレーション方法を用いて、この４ｋｂｐフラグメントを用いてＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を形質転換した。
【０１７６】
（実施例２０）
新規ＬＤＨでの酵母の形質転換
本明細書で開示したＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコード化遺伝子（配列番号：２０）のコーディング配列は、双方共に酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するホスホグリセリン酸塩キナーゼ遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに機能的に連結された。この構築物を作製する場合に、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、これを用いてインサート：
【化２５】
2004521619.tif 000036
を含有するプラスミドからコーディング配列を増幅した。ｄＮＴＰ及び前記したプライマー濃縮物を用いて、製造者により供給されたバッファー中Ｐｆｕターボポリメラーゼ（ストラッタジーン）を用いてこの増幅反応を実施した。最初に反応混合物を９５℃で３分間インキュベートし、次いで９５℃で３０秒、６０℃で４０秒、７２℃で６０秒の２０サイクルにより、続いて７２℃で９分間の最終インキュベーションにより熱サイクリングを行った。生成物を制限酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次いでプラスミドｐＮＣ１０１（ＮＲＥＬ）のＸｂａＩ部位及びＥｃｏＲＩにライゲートした。このライゲーションの結果、ＰＧＫプロモーター及びＧＡＬ１０ターミネーターがＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコーディング配列に機能的に連結されるようになった（すなわち酵母細胞において転写的に活性である）。プロモーター、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨコーディング配列及びターミネーターを含有するこのプラスミドのＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントが本明細書にて開示され、配列番号：４３として同定された。
【化２６】
2004521619.tif 000037
2004521619.tif 000038
2004521619.tif 000039
一度Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨが機能的にこれらの転写調節配列に連結されると、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントが切除され、クルイベロミセス種（プラスミドｐＮＣ００３、インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）で複製できるベクターに再クローン化された。得られたプラスミドはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）プラスミドｐＫＤ１からのＳｐＨＩ部位の間にＬＤＨ含有ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメント（配列番号：４３）及び４７５６ｂｐ配列を含有した（Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４４７１−４４８１（１９８６））。加えて、ｐＮＣ００３は酵母ＴＥＦプロモーターの調節下でゼオシン抵抗性遺伝子を担持する（Ｈｗａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２３３７−２３４８（１９９３））。双方の配向のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントが得られ、ｐＮＣ１０２及びｐＮＣ１０３と称した。
【０１７７】
これらのプラスミドを実質的に以下に記載するようにＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）に導入した。化学的形質転換法によりプラスミドｐＮＣ１０２及びｐＮＣ１０３を酵母細胞に導入した。ＬＤＨコード化遺伝子を含有しないプラスミドｐＮＣ００３を対照として酵母細胞に導入した。形質転換体を、２００μｇ／ｍｌ  ゼオシンを含有するＹＰＤプレートで選択し、３０℃で２日後まで成長させた。Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）形質転換培養物に関しては、ｐＮＣ００３の１つ及びｐＮＣ１０３の１つの形質転換体のみが得られた。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）形質転換培養物に関しては、各々のプラスミドの複数の形質転換体が得られた。
【０１７８】
次いで形質転換体をＬ−乳酸を生成する能力に関して分析した。２０ｇ／ｌ  グルコース及び３００μｇ／ｌ  ゼオシンを含有するＹＰＤブロスの培養物（２ｍｌ）をコロニーから形質転換プレートに直接接種した。培養物を振盪せずに３０℃で５２時間インキュベートした。その期間の終わりには、遠心により細胞を除去し、ＹＳＩを用いてグルコース及びＬ−乳酸に関して培養上澄を検定した。これらのアッセイの結果を以下の表５に示す。Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨプラスミドを含有するＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）細胞の双方は著明なレベルまでＬ−乳酸を生成することができ、一方空のベクターを含有する対照細胞は検出可能なＬ−乳酸を生成しない。従って、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨは明らかに酵母の別の種で炭素を乳酸生成に向けるように機能することができる。
【表５】
2004521619.tif 000040
（実施例２１）
クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）におけるＤ−キシロースからの乳酸生成
グルコース以外の糖を用いて乳酸を生成できることを示すために、２５０ｍｌ  バッフルド・シェーク・フラスコ中クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１に由来するＫ．マルキシアヌスの遺伝子操作された株（ＡＴＣＣ受け入れ番号５２４８６）によるキシロースの乳酸への発酵を行った。さらに具体的には、この実施例で用いた３つの株は以下の通りである：（ｉ）ＮＣ３９：プラスミドｐＮＣ３にゼオシン選択マーカー及び以下に記載するホスホグリセリン酸塩キナーゼプロモーターの調節下にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を含有する多コピープラスミドｐＮＣ７を担持するＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１；（ｉｉ）ＮＣ１０３：プラスミドｐＮＣ００３にゼオシン選択マーカー及び前記したようにホスホグリセリン酸塩プロモーターの調節下にクルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＬＤＨを含有する多コピープラスミドｐＮＣ１０３を担持するＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１；及び（ｉｉｉ）ＮＣ１０２：ｐＫＤ１ベクターにゼオシンマーカーを含有する多コピープラスミドｐＮＣ１０２を担持するＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１。後者の株を対照として使用した。培地中のゼオシンの存在によりプラスミドの損失が最低になった。
【０１７９】
単一のコロニーを３００μｇ／ｍｌ  ゼオシンを補充した合成完全培地３ｍｌを含有する１０ｍｌチューブに移すことにより接種物を調製した。全実験で用いた培地は（リットルあたり）：酵母窒素ベース（ＹＮＢ；アミノ酸及び硫酸アンモニウム不含）６．７ｇ、尿素３ｇ及びゼオシン０．３ｇを含有した。炭素及びエネルギー供給源としてＤ−グルコースまたはＤ−キシロースを添加した。最初のｐＨを水酸化カリウムで５．０に調整した。回転式振盪培養機で２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩成長させ、次いで前記したＹＮＢ培地１００ｍｌを含有する２５０ｍｌバッフルド・シェーク・フラスコに移した。細胞を再度ｐＨ５．０及び３０℃で一晩成長させ、続いて１５（重量／容量）％  グリセロール中−８０℃で貯蔵した。これらの貯蔵培養物を以下で記載する実験の接種物として使用した。
【０１８０】
ＮＣ３９及びＮＣ１０３でのグルコース上での乳酸生成
ＮＣ１０２、ＮＣ１０３及びＮＣ３９株の培養物を前記したＹＮＢ培地中２（重量／容量）％  グルコース上で、２５０ｒｐｍ及び３０℃で静止期まで成長させた。この後、細胞をペレット化し、最初のＯＤ６００が２０で２（重量／容量）％  グルコースを補充したＹＮＢ培地に移した。細胞を１００ｒｐｍ及び３０℃でインキュベートし、培養物への酸素供給を低減させた。培養物から液体サンプルを時間間隔で取り、（ＯＤ６００を用いて）成長、代謝物及びｐＨを測定した。ウォーターズ４１０屈折率検出器に接続したアミネックスＨＰＸ−８７Ｈカラム（可動相として１０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４を用いて５５℃で流速０．５ｍｌ／分で操作）を用いるＨＰＬＣにより代謝物分析を実施した。ｐＨが３．５以下に低下した場合、滅菌ＣａＣＯ３  ２ｇを添加し、ｐＨを約５．５まで上昇させた。
【０１８１】
細胞を新鮮培地に移した２４時間後に実験した全ての株のグルコースを十分に枯渇させた。ＮＣ３９及びＮＣ１０３株では、各々６．４ｇ／ｌ（収率３２％）及び３．８ｇ／ｌ（収率１９％）の乳酸が生成された。対照株ＮＣ１０２では乳酸生成を検出できなかった。ＮＣ３９及びＮＣ１０３株はまた各々２．３及び２．９ｇ／ｌのエタノールを生成し；対照株ＮＣ１０２は５．８ｇ／ｌのエタノールを生成した。その他の典型的な発酵生成物（ピルビン酸塩、コハク酸、グリセロール及び酢酸塩）は全培養物で＞１．０ｇ／ｌで検出できなかった。
【０１８２】
これらの結果により、異種性ＬＤＨ（Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）のいずれかに由来）を発現するクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）（クラブトリー陰性酵母株）を用いてグルコースから乳酸を生成できることが確立された。
【０１８３】
ＮＣ３９及びＮＣ１０３からのキシロース上での乳酸生成
培養培地中のグルコースがＤ−キシロースと置き換えたこと以外は実質的に前記した培養及び発酵条件を用いて、炭素供給源としてキシロースを用いる乳酸生成が示された。ＮＣ３９株では７２時間の発酵の後、キシロース２０ｇから最大４．８ｇの乳酸が生成された（すなわち収率０．２３ｇ／ｇ）。ＮＣ１０３株または対照株ＮＣ１０２では乳酸は生成されなかった。加えて、その他の発酵生成物（ピルビン酸塩、コハク酸、グリセロール及びエタノール）は全培養物で＞１．０ｇ／ｌで検出できなかった。
【０１８４】
これらの結果により、異種性ＬＤＨ（Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはＫ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）のいずれかに由来）を発現するクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）（クラブトリー陰性酵母株）を用いて、グルコースでの場合よりもゆっくりした速度ではあったが、キシロースから乳酸を生成できることが確立された。
【０１８５】
これらの結果もまた図１５に示す。
【０１８６】
（実施例２２）
酵母におけるペントース糖からのＬ−乳酸生成
カンジダ種を、ペントース糖を用いて乳酸を生成するように遺伝子操作した。ベクター及びその他の構築物を図１６に示す。
【０１８７】
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のゼオシン抵抗生成ベクター
Ｓ．セルビジエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓａｉｅ）ＴＦＦ１プロモーターの調節下でゼオシン抵抗生成マーカーを含有するプラスミドｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ（インビトローゲン）をＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ｒＤＮＡフラグメントを付加することにより修飾し、相同体組換えの標的を提供した。Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）２６ｒＤＮＡ（ジェンバンク受け入れ番号Ｕ７０１８５）に対応する以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２７】
2004521619.tif 000041
を用いてＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ゲノムＤＮＡを増幅して２６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを提供した。得られたＰＣＲ生成物フラグメントを制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩで消化したｐＴＥＦ／Ｚｅｓｏプラスミドにライゲートした。得られたプラスミドｐＭ２０３を図１６に示す。
【０１８８】
ｐＭ２０３に含まれるＴＥＦ１プロモーターは別のカンジダ種、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＰＧＫ１プロモーターからの遺伝子のプロモーターにより置換された。入手可能なＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＰＧＫ１配列（ジェンバンク受け入れ番号Ｕ２５１８０）に基づいて設計された配列以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
【化２８】
2004521619.tif 000042
を用い、Ｃ．アルビカンスゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｃ．アルビカンス  ＰＧＫ１プロモーターオープン・リーディグ・フレームの上流の領域から７００ｂｐのフラグメントを増幅した。制限部位ＸｂａＩ及びＳｐｅＩ（前記の下線部）をプライマーに加えてフラグメントのクローン化を促進した。増幅後、フラグメントを単離し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化し、次いでＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２０３にライゲートした。得られたプラスミド、ｐＭＩ２０５を図１６に示す。
【０１８９】
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）遺伝子の単離
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）に関する適当な遺伝的手段を開発するために、この種からゲノムライブラリーを構築した。関連する酵母からの遺伝子の公知のアミノ酸及び核酸配列に基づくライブラリーから目的の遺伝子を単離した。構成的に強く発現される遺伝子、例えばＰＧＫ１及びＴＤＨ１のプロモーター及びターミネーターを単離し、これを用いて相同遺伝子を発現させた。対応する酵素が乳酸生成と競合する反応を行うので、ＰＤＣ遺伝子を単離した。従って、乳酸生成に用いられる株からＰＤＣ遺伝子を欠失させるのが望ましい。
【０１９０】
イージーＤＮＡキット（インビトローゲン）を用いてＹＰＤで一晩成長させた細胞からＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ受け入れ番号３２１０９）を単離した。ＤＮＡを部分的にＳａｕ３Ａで消化させ、スクロースグラジエント遠心により大きさで分画化し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールド。スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（１９８９））、約２２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩ消化し、ホスファターゼ処理したラムダＤＡＳＨ（商標）ベクターアーム（ストラッタジーン）にライゲートし、ギガパックＩＩゴールド・パッケージング・エクストラクト（ストラッタジーン）を用いてライゲーション混合物をラムダ粒子にパッケージングした。ラムダ粒子を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＲＡ  Ｐ２を感染させた。
【０１９１】
ダイナザイム・ＥＸＴポリメラーゼ（フィンザイムズ、エスポー、フィンランド）を用いてＰＣＲ増幅によりライブラリーからのＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）遺伝子の単離に用いるプローブを調製し、鋳型としてのＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）またはＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の配列特異的プライマー及びゲノムＤＮＡは以下のとおりである：
・Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＤＨ１遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド
【化２９】
2004521619.tif 000043
を用いて、ゲノム  Ｓ．セレビジエ  ＤＮＡからＴＤＨ遺伝子のフラグメントを増幅した。
【０１９２】
・Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＰＧＫ１遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド
【化３０】
2004521619.tif 000044
を用いてゲノム  Ｃ．アルビカンスからＰＧＫ１遺伝子のフラグメントを増幅した。
【０１９３】
・Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）２６Ｓ  ｒＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチド
【化３１】
2004521619.tif 000045
を用いてＣ．ソノレンシス  ゲノムＤＮＡから２６Ｓ  ｒＤＮＡのフラグメントを増幅した。
【０１９４】
・オリゴヌクレオチド
【化３２】
2004521619.tif 000046
を、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＤＣ１及びピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ＰＤＣ１及びＰＤＣ２並びにカンジダ・アルビカンスＰＤＣ１及びＰＤＣ３の不完全配列間で保存されているピルビン酸塩デカルボキシラーゼアミノ酸配列
【化３３】
2004521619.tif 000047
の部分に基づいて設計した。
【０１９５】
・菌類アルコールデヒドロゲナーゼ配列に見出される保存領域に基づいてオリゴヌクレオチド
【化３４】
2004521619.tif 000048
を設計した。これらのプライマーを用いてＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ゲノムＤＮＡから（複数の）ＡＤＨ遺伝子のフラグメントを増幅した。これらのプライマーを用いるＰＣＲ反応からＡＤＨ１、ＡＤＨ２及びＡＤＨ３と称する異なるヌクレオチド配列の３つのフラグメントを生成した。
【０１９６】
前記したように生成したＰＣＲフラグメントでライブラリーをスクリーニングし、ランダム・プライムド・ラベリング・キット（ベーリンガー・マンハイム）を用いて生成物を３２Ｐ  α−ｄＣＴＰで標識した。５０％  ホルムアミド、５ｘ  デンハート、５ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡ、１μｇ／ｍｌ  ポリＡ  ＤＮＡを含有する溶液中４２℃で一晩インキュベートすることにより、放射活性プローブでのハイブリダイゼーションを実施した。ＴＤＨ１、ＰＧＫ１及びＰＤＣ１プローブに関しては、２ｘ  ＳＳＣ溶液中室温で５分間のハイブリダイゼーションの後フィルターを洗浄し、これを繰り返した後に、１ｘ  ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳの溶液中６８℃で３０分間の洗浄を２回行った。ｒＤＮＡ及びＰＤＣ２プローブに関するハイブリダイゼーション後洗浄を、２ｘ  ＳＳＣ中室温で５分間を２回、続いて０．１ｘ  ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳ中６８℃で３０分間を２回行った。
【０１９７】
製造者の指示書に従って陽性のプラークを単離し、精製した（ストラッタジーン）。慣用される方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら。前出）を用いてバクテリオファージを精製し、ＤＮＡｓｅＩ処置を排除し、ＰＥＧ６０００を用いて溶解された宿主細胞から放出されたファージ粒子を沈殿させることにより修飾し、このファージ粒子を次いでＳＭバッファーに溶解し、クロロホルムで抽出し、コントロンＴＳＴ４１．１４ローターで２５０００ｒｐｍで２時間遠心することによりペレット化し、再度ＳＭバッファーに溶解した。プロテイナーゼＫでファージ粒子を消化し、続いてフェノール抽出し、エタノール沈殿することによりラムダＤＮＡを単離した。
【０１９８】
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ゲノムＤＮＡインサートを配列特異的プライマーを用いて部分的にシークエンシングした。ヌクレオチド配列及びそこから推定されるアミノ酸配列を配列データベースと比較し、公知遺伝子またはタンパク質に対する相同性により、ファージインサートによりコードされる遺伝子全体または部分を同定した。得られた配列は、単離する各々のクローンに関して用いられるプローブに依存して、菌類ｒＤＮＡ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、またはピルビン酸塩デカルボキシラーゼに対して著明な類似性を有した。Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＰＧＫ１、ＰＤＣ１及びＴＤＨ１のオープン・リーディグ・フレームコード化配列の出発点及び終点をそれにより同定した。
【０１９９】
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）形質転換体を選択するためのＭＥＬ５遺伝子選択の使用
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）形質転換体の陽性選択を開き発するために、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥＬ５遺伝子（Ｎａｕｍｏｖら、ＭＧＧ  ２２４：１１９−１２８（１９９０）；Ｔｕｒａｋａｉｎｅｎら、Ｙｅａｓｔ  １０：１５５９−１５６８（１９９４）；ジェンバンク受け入れ番号Ｚ３７５１１）をプラスミドｐＭＥＬ５−３９から２１６０ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして得て、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩカットで消化したｐＶｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（−）（ストラッタジーン）にライゲートした。ＭＥＬ５遺伝子のＥｃｏＲＩ部位はイニシエーターＡＴＧの５１０ｂｐ上流に位置し、ＳｐｅＩ部位はＭＥＬ５の停止コドンの２５０ｂｐ下流に位置する。得られたプラスミドをｐＭＩ２３３で消化し、図１６に示す。
【０２００】
前記で単離したＰＧＫ１ラムダクローンからのＤＮＡを鋳型として用いて、Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の１５００ｂｐのＰＧＫ１プロモーターをプライマー：
【化３５】
2004521619.tif 000049
で増幅した。３’プライマー（配列番号：６１）がオープン・リーディグ・フレームのすぐ上流のＰＧＫ１プロモーターに存在するヌクレオチド及びＭＥＬ５オープン・リーディグ・フレームの５’末端に対応するヌクレオチドに対応するので、それがＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＰＧＫ１プロモーター及びＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥＬ５間で融合体を作ることができる。得られた増幅フラグメントを制限酵素ＳｐＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＳｐＨＩ及びＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２３３にライゲートした。得られたプラスミドの構築物は、ＭＥＬ５オープン・リーディグ・フレームの上流で、これに機能的に連結されたＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＰＧＫ１プロモーターを含有し、図１６にてｐＭＩ２３４として同定される。
【０２０１】
類似の様式で、前記で単離したＴＤＨ１ラムダクローンからのＤＮＡを鋳型として用いて、６５０ｂｐのＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＴＤＨ１プロモーターをプライマー
【化３６】
2004521619.tif 000050
で増幅した。３’プライマー（配列番号：６３）がオープン・リーディグ・フレームのすぐ上流のＴＤＨ１プロモーターに存在するヌクレオチド及びＭＥＬ５オープン・リーディグ・フレームの５’末端に対応するヌクレオチドに対応するので、それがＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＥＬ５間で融合体を作ることができる。得られた増幅フラグメントを制限酵素ＳｐＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＳｐＨＩ及びＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２３３にライゲートした。得られたプラスミドの構築物は図１６にてｐＭＩ２３８として同定され、ＭＥＬ５オープン・リーディグ・フレームの上流で、これに機能的に連結されたＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＴＤＨ１プロモーターを含有する。
【０２０２】
ＭＥＬ５発現カセットをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩでの制限酵素消化によりベクター配列から放出させ、直線状ＤＮＡ  １μｇをＢａｃｋｅｒら（Ｙｅａｓｔ  １５：１６０９−１６１８（１９９９））の方法に従ってエレクトロポレーションによりＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）に形質転換した。ＹＰＤ  ５０ｍｌ中で一晩成長させた後、遠心により収穫し、０．１Ｍ  ＬｉＡｃ／１０ｍＭ  ＤＴＴ／１０ｍＭ  トリスＨＣｌの溶液中に再懸濁した後、室温で１時間インキュベートした。遠心により細胞を収集し、冷水及び１Ｍ  ソルビトールで洗浄し、１Ｍ  冷ソルビトールに再懸濁した。ＤＮＡ（１から３μｇ）を細胞懸濁液  ４０μｌに加え、混合物を０．２ｃｍ  エレクトロポレーションキュベットにピペッティングした。エレクトロポレーションに関して１．５ｋＶ、２５Ｆ、２００Ωの設定でバイオ・ラッド・ジーン・パルサーを使用した。電気パルスの後、１Ｍ  冷ソリビトール  １ｍｌを細胞に添加した。次いで細胞を振盪せずに３０℃で１時間インキュベートした；また別に、ＹＰＤ  ２ｍｌを加え、３０℃で２から３時間インキュベーションを続けた。細胞を適当な寒天プレート上にプレートして再生させた。
【０２０３】
さらにまた別に、細胞をＧｉｅｔｚら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１４２５（１９９２））のプロトコルに従って形質転換した。形質転換体をα−ガラクトシダーゼ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピアノシド（Ｘ−ｇａｌ；ＩＣＮバイオケミカルズ）を４０μｇ／ｍｌの濃度で補充したＹＰＤ寒天プレート（１０ｇ／ｌ  酵母抽出物、２０ｇ／ｌ  ペプトン、２０ｇ／ｌ  グルコース及び２％寒天からなる）上で成長させた。プレートを３０℃で１から３日間インキュベートし、次いで４℃に移した。Ｘ−ｇａｌの存在下、機能的ＭＥＬ５発現カセットで形質転換された酵母コロニーは青色になるが、一方形質転換されなかったコロニーは白色であった。これらの実験で得られた形質転換頻度は２から２０形質転換体／ＤＮＡμｇであった。青色コロニーは、これらを新鮮インディケーター培地上で再度画線培養することにより精製した。
【０２０４】
形質転換体はまた単独の炭素供給源としてメリビオース上で成長する能力をも獲得した。これは培地に分泌されたＭＥＬ５コード化α−ガラクトシダーゼによりメリビオースがグルコース及びガラクトースに加水分解されたことを示している。
【０２０５】
Ｘ−ｇａｌ含有培地上で形質転換体をスクリーニングするための類似の実験計画は、単独の炭素供給源としてメリビオースを含有する培地上でこれらを選択することである。形質転換の後、０．６７％  酵母窒素ベース（ディフコ）及び２％  メリビオースを含有する寒天培地上に細胞を広げ、プレートを３０℃で５から１０日間インキュベートする。これらの条件下で形質転換されなかった細胞は可視的なコロニーにまで成長できないが、一方ＭＥＬ５形質転換体はコロニーを形成する。
【０２０６】
Ｌ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ発現カセット及びＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のＭＥＬ５マーカーを含有するベクター
プラスミドｐＭＩ２０５を用いて選択マーカーとしてＭＥＬ５遺伝子及びＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）で乳酸の生成を可能にするためのＬＤＨ遺伝子を含有するプラスミドを生成した。得られたプラスミドでは、ｐＭＩ２０５におけるゼオシン抵抗性遺伝子がＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子と置換された。
【０２０７】
ＬＤＨ遺伝子及びＣＹＣ１ターミネーターを含有するｐＶＲ１の１３２９ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＰＧＫ１プロモーターの調節下でＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を担持するｐＭＩ２０５の３４１３ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントにライゲートした；得られたプラスミドをｐＭＩ２１４と称し、図１６に示す。第２工程では、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＰＧＫ１プロモーターをＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＰＧＫ１プロモーターと置換した。プライマー：
【化３７】
2004521619.tif 000051
を用いて前記した単離されたラムダクローンから増幅することによりＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ＰＧＫ１プロモーターを単離し、ＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化し、ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化したｐＭＩ２１４にライゲートした。このプラスミドをｐＭＩ２７７と称し、図１６に示す。
【０２０８】
ｐＭＩ２２７の３３７７ｂｐのＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化したｐＭＩ２３４とライゲートすることにより、ｐＭＩ２２７からのＬＤＨ発現カセット及びｐＭＩ２３４からのＭＥＬ５マーカーカセットを同一のベクターに組み合わせた。得られたプラスミドをｐＭＩ２４６と称し、図１６に示す。
【０２０９】
ｐＭＩ２２７の３３７７ｂｐのＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化したｐＭＩ２３８とライゲートすることにより、ＭＩ２２７からのＬＤＨ発現カセット及びｐＭＩ２３８からのＭＥＬ５マーカーカセットを同一のベクターに組み合わせた。得られたプラスミドをｐＭＩ２４７と称し、図１６に示す。
【０２１０】
乳酸生成のためのＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の形質転換
別の酵母種のために技術分野で開発された形質転換法を用いてＬＤＨコード化ベクターをＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞に導入した。形質転換の前に、ｒＤＮＡ配列内で切断し、従ってｒＤＮＡ位置への組み込みを標的化する酵素であるＢｓｔＢＩでの制限酵素消化により、ｐＭＩ２４６及びｐＭＩ２４７を直線化した。また別に、形質転換プラスミドをＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、続いてアガロースゲルから精製し、それによりベクター配列からマーカー及びＬＤＨカセットを放出し、ゲノムでのランダムな組み込みを促進した。
【０２１１】
リチウム酢酸塩法（Ｇｉｅｔｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１４２５（１９９２））によるか、または前記したエレクトロポレーションによりＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）をｐＭＩ２４６及びｐＭＩ２４７で形質転換し、形質転換体をスクリーニングし、Ｘ−ｇａｌを補充したＹＰＤプレート上で形成された青色コロニーに基づいて精製した。
【０２１２】
アルファ・ガラクトシダーゼ生成コロニーを乳酸の生成に関して試験した。形質転換をＹＰＤ液体培地中３０℃で一晩成長させ、培養培地のアリコートを取り、Ｌ−乳酸測定キット（ベーリンガー・マンハイム）を用いて乳酸の存在を酵素的に分析した。宿主株よりも少なくとも１０倍以上の乳酸が培地上澄中で検出された。
【０２１３】
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のＢｓｔＢＩ切断ｐＭＩ２４６での形質転換に由来する形質転換体を２４６−１から２４６−９と称した。Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のＢｓｔＢＩ切断ｐＭＩ２４７での形質転換に由来する形質転換体を２４７−１から２４７−４と称した。Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ切断ｐＭＩ２４６での形質転換に由来する形質転換体を２４６−１０から２４６−１５と称した。Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）のＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ切断ｐＭＩ２４７での形質転換に由来する形質転換体を２４７−５から２４７−１０と称した。
【０２１４】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による富化培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記で開示した形質転換体（２４６−１、２４６−２、２４６−３、２４７−２、２４７−３及び２４７−４）をＹＰＤ培地中で培養した。前培養物をＹＰＤ培地中ＯＤ６００が１１から１７になるまで成長させ、次いで培養実験のためにＹＰＤ５０ｍｌにＯＤ６００が０．５になるまで再懸濁した。培養の始めに酵母細胞を２５０ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中２５０ｒｐｍで振盪しながら培養した。４時間の培養の後、酵母細胞を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコに移し、さらにグルコース（最終濃度２０ｇ／ｌに相当する）を添加し、４０ｒｐｍで振盪しながら培養を続けた。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びグルコースに関して分析した（Ｌ−乳酸ＵＶ法及びベーリンガー・マンハイムのグルコース／ＧＯＤ−過ヨウ素酸塩法を用いる）。
【０２１５】
２４時間の培養の後、形質転換体はグルコースより２．４から３．３ｇ／ｌの乳酸（収率１１から６３％と等価）を生成したが、一方対照株は０．００５ｇ／ｌの乳酸を生成した（収率０．１％）。
【０２１６】
この実施例により、Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞のＬＤＨの過剰発現がグルコース含有培地上でのＬ−乳酸生成を増強させることが示された。
【０２１７】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小グルコース培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記で開示した形質転換体（２４６−１、２４６−３、２４７−２）をＹＤ培地（２％  グルコースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）中で培養した。前培養物をＹＤ培地中ＯＤ６００が１０から１３になるまで成長させ、遠心により細胞を収集し、ＹＤ培地で１回洗浄し、次いで培養実験のためにＹＤ５０ｍｌにＯＤ６００が０．４になるまで再懸濁した。酵母を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中４０ｒｐｍで振盪しながら培養した（微好気的条件）。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びグルコースに関して分析した。ウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ７１７＋自動サンプラー並びに屈折率検出器（ウォーターズ４１０示差屈折率検出器）及びＵＶ検出器（ウォーターズ２４８７デュアルλＵＶ検出器）を伴うウォーターシステム・インターフェース・モジュール・液体クロマトグラフィー複合機でＨＰＬＣ分析を実施した。使用するアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、バイオ・ラッド）を３５℃で水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で平衡にし、水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で流速０．６ｍｌ／分でサンプルを溶出した。データ収集及び対照をウォーターズ・ミレニウム・ソフトウェアで行った。
【０２１８】
７０時間の培養の後、形質転換体はグルコースより２．２から２．５ｇ／ｌの乳酸（収率１０から１３％と等価）を生成したが、一方対照株は検出可能な乳酸を生成しなかった。
【０２１９】
この実施例により、相同性ＬＤＨ遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞はグルコースから乳酸を生成できることが示された。
【０２２０】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小グルコース培地中嫌気的条件下でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記で開示した形質転換体（２４６−１）を嫌気的振盪フラスコ中ＹＤ培地（２％  グルコースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）で培養した。前培養物をＹＤ培地中ＯＤ６００が２２から２４になるまで成長させ、遠心により細胞を収集し、ＹＤ培地で１回洗浄し、次いで培養実験のためにＹＤ１００ｍｌにＯＤ６００が０．７５になるまで再懸濁した。ウォーターロックを装着した１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中酵母を４０ｒｐｍで振盪しながら培養した（嫌気的条件）。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びグルコースに関して分析した。ウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ７１７＋自動サンプラー並びに屈折率検出器（ウォーターズ４１０示差屈折率検出器）及びＵＶ検出器（ウォーターズ２４８７デュアルλＵＶ検出器）を伴うウォーターシステム・インターフェース・モジュール・液体クロマトグラフィー複合機でＨＰＬＣ分析を実施した。使用するアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、バイオ・ラッド）を３５℃で水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で平衡にし、水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で流速０．６ｍｌ／分でサンプルを溶出した。データ収集及び対照をウォーターズ・ミレニウム・ソフトウェアで行った。
【０２２１】
１６０時間の培養の後、２４６−１株はグルコースから１．１ｇ／Ｌの乳酸（収率１６％と等価）を生成したが、一方対照株は０．０３ｇ／ｌの乳酸を生成した（収率０．１％）。
【０２２２】
この実施例により、相同性ＬＤＨ遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞は嫌気的条件下でグルコースから乳酸を生成できることが示された。
【０２２３】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小キシロース培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記した形質転換体（２４６−１、２４６−３、２４７−２）をＹＸ培地（２％  キシロースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）中で培養した。前培養物をＹＰＤ培地中ＯＤ６００が１０から１３になるまで成長させ、その後遠心により細胞を収集し、ＹＸ培地で１回洗浄し、培養実験のためにＹＸ培地５０ｍｌにＯＤ６００が０．７５になるまで再懸濁した。酵母培養物を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中４０ｒｐｍで振盪しながら培養した。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びキシロースに関して分析した。ウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ７１７＋自動サンプラー並びに屈折率検出器（ウォーターズ４１０示差屈折率検出器）及びＵＶ検出器（ウォーターズ２４８７デュアルλＵＶ検出器）を伴うウォーターシステム・インターフェース・モジュール・液体クロマトグラフィー複合機でＨＰＬＣ分析を実施した。使用するアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、バイオ・ラッド）を３５℃で水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で平衡にし、水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で流速０．６ｍｌ／分でサンプルを溶出した。データ収集及び対照をウォーターズ・ミレニウム・ソフトウェアで行った。
【０２２４】
７０時間の培養の後、形質転換体はキシロースから０．１ｇ／ｌの乳酸（収率９から１７％と等価）を生成したが、一方対照株は０．００３ｇ／ｌの乳酸を生成した（収率０．２％）。
【０２２５】
この実施例により、相同性乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）はキシロースから乳酸を生成できることが示された。
【０２２６】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小キシロース培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記した形質転換体（２４６−１、２４６−３、２４７−２）をＹＸ培地（２％  キシロースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）中で培養した。前培養物をＹＰＤ培地中ＯＤ６００が１２から１８になるまで成長させ、その後遠心により細胞を収集し、ＹＸ培地で１回洗浄し、培養実験のためにＹＸ培地５０ｍｌにＯＤ６００が２．０になるまで再懸濁した。酵母培養物を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中４０ｒｐｍで振盪しながら培養した（微好気的条件）。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びキシロースに関して分析した。ウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ７１７＋自動サンプラー並びに屈折率検出器（ウォーターズ４１０示差屈折率検出器）及びＵＶ検出器（ウォーターズ２４８７デュアルλＵＶ検出器）を伴うウォーターシステム・インターフェース・モジュール・液体クロマトグラフィー複合機でＨＰＬＣ分析を実施した。使用するアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、バイオ・ラッド）を３５℃で水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で平衡にし、水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で流速０．６ｍｌ／分でサンプルを溶出した。データ収集及び対照をウォーターズ・ミレニウム・ソフトウェアで行った。ベーリンガー・マンハイムのＬ−乳酸ＵＶ法によりＬ−乳酸を分析した。
【０２２７】
１６５時間の培養の後、形質転換体はキシロースから０．２ｇ／Ｌの乳酸（収率５から６％と等価）を生成したが、一方対照株は検出可能な乳酸を生成しなかった。
【０２２８】
この実施例により、相同性乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）はキシロースから乳酸を生成できることが示された。
【０２２９】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小アラビノース培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記した形質転換体（２４６−１、２４６−３、２４７−２）をＹＡ培地（２％  Ｌ−アラビノースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）中で培養した。前培養物をＹＰＤ培地中ＯＤ６００が１２から１８になるまで成長させ、その後遠心により細胞を収集し、ＹＡ培地で１回洗浄し、培養実験のためにＹＡ培地５０ｍｌにＯＤ６００が２．０になるまで再懸濁した。酵母培養物を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中４０ｒｐｍで振盪しながら培養した（微好気的条件）。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸及びアラビノースに関して分析した。ウォーターズ５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ７１７＋自動サンプラー並びに屈折率検出器（ウォーターズ４１０示差屈折率検出器）及びＵＶ検出器（ウォーターズ２４８７デュアルλＵＶ検出器）を伴うウォーターシステム・インターフェース・モジュール・液体クロマトグラフィー複合機でＨＰＬＣ分析を実施した。使用するアミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、バイオ・ラッド）を３５℃で水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で平衡にし、水中５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で流速０．６ｍｌ／分でサンプルを溶出した。データ収集及び対照をウォーターズ・ミレニウム・ソフトウェアで行った。
【０２３０】
１６５時間の培養の後、形質転換体はアラビノースより０．０４から０．０５ｇ／ｌの乳酸（収率２から３％と等価）を生成したが、一方対照株は０．００７ｇ／ｌの乳酸（収率０．５％）を生成した。
【０２３１】
この実施例により、相同性乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）はアラビノースから乳酸を生成できることが示された。
【０２３２】
ゲノムに組み込まれたＬ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子を宿すＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）による最小メリビオース培地中でのＬ−乳酸の生成
Ｃ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞及び前記した形質転換体（２４６−１、２４６−１０、２４７−２、２４７−５）をＹＭ培地（２％  Ｌ−メリビオースを補充したアミノ酸不含酵母窒素ベース）中で培養した。前培養物をＹＰＤ培地中ＯＤ６００が１８から２５になるまで成長させ、その後遠心により細胞を収集し、ＹＭ培地で１回洗浄し、培養実験のためにＹＭ培地５０ｍｌにＯＤ６００が１．５になるまで再懸濁した。酵母を１００ｍｌ  エルレンマイヤー・フラスコ中４０ｒｐｍで振盪しながら培養した（微好気的条件）。培養中にサンプルを取り、ＯＤ６００を測定し、遠心により細胞を収穫し、成長培地をＨＰＬＣにより乳酸に関して分析した（ベーリンガー・マンハイムのＬ−乳酸ＵＶ法による）。
【０２３３】
１６５時間の培養の後、形質転換体は０．８から２．６ｇ／ｌの乳酸を生成した。
【０２３４】
この実施例により、相同性乳酸塩デヒドロゲナーゼコード化遺伝子を過剰発現するＣ．ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）細胞はメリビオースから乳酸を生成できることが示された。
【０２３５】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と組み合わせて記載してきたが、前記の説明は説明を目的とするものであって、添付の請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。その他の態様、利点及び修飾は以下の請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】図１はｐＨＥＳプラスミドを表す図である。
【図２】図２はｐＳＥＨプラスミドを表す図である。
【図３】図３はＬｈ−ＬＤＨまたはＰａ−ＬＤＨのいずれかを含有するｐＣＲＩＩプラスミドの作製を表す図である。
【図４】図４はＬＤＨ／ｐＣＲＩＩプラスミドを表す図である。
【図５】図５はＬｈ−ＬＤＨまたはＰａ−ＬＤＨを含有するｐＨＥＳプラスミドの作製を表す図である。
【図６】図６ａはピルビン酸塩デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）ノックアウトフラグメントの作製を表す図である。図６ｂはＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）１．７ｋｂｐ  ＰＤＣ１を取り囲む５．５ｋｂｐフラグメントを表す図である。図６ｃは５．５ｋｂｐ  ＰＤＣ相同性領域の４００ｂｐの欠失及びカナマイシン抵抗性のための遺伝子の挿入を表す図である。図６ｄはカナマイシン抵抗性遺伝子及びそれを囲むＰＤＣ１の２．３ｋｂｐを含有する４ｋｂ領域を表す図である。図６ｅは７．５ｋｂｐ  Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＰＤＣ１及びそれを囲む領域を表す図である。図６ｆは１．７ｋｂｐ  ＰＤＣ１遺伝子からの７５０ｂｐの欠失及びカナマイシン抵抗性遺伝子の挿入を表す図である。
【図７】図７は低ｐＨ（ｐＨ２．５）及び高温（４０℃）条件下で培養されたクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の成長（光学密度：ＯＤ）対時間（時）をプロットしたグラフである。
【図８】図８は３０℃でグルコース、キシロースまたはアラビノースと共に培養したＫ．マルキシアヌスの成長（ＯＤ）対時間（時）をプロットしたグラフである。
【図９】図９は３０℃でトウモロコシ加水分解物と共に培養したＫ．マルキシアヌスの成長（ＯＤ）対時間（時）をプロットしたグラフである。
【図１０】図１０は３０℃で指示されたｐＨで培養したＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）の成長（ＯＤ）対時間（時）をプロットしたグラフである。
【図１１】図１１は３０℃で指示されたｐＨで、乳酸４０ｇの存在下で培養したＫ．マルキシアヌスの成長（ＯＤ）対時間（時）をプロットしたグラフである。
【図１２】図１２は好気的条件下２％グルコースを伴う無機質培地で培養したときのＳ．ウバルム及びＫ．マルキシアヌスの（Ａ）バイオマス生成；（Ｂ）グルコース消費；及び（Ｃ）エタノール生成をプロットした３つのグラフを示す。
【図１３】図１３は嫌気的条件下２％  グルコースを伴う無機培地で培養したときのＳ．ウバルム及びＫ．マルキシアヌスの（Ａ）バイオマス生成；（Ｂ）グルコース消費；及び（Ｃ）エタノール生成をプロットした３つのグラフを示す。
【図１４】図１４はＰＤＣＩプロモーターベクターのプラスミドマップである。
【図１５】図１５は
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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