(57)【要約】本発明は、新規化合物であるオシロゲニン（ｏｓｃｉｌｌｏｇｅｎｉｎ）を開示する。オシロゲニンは卵母細胞の精子による受精の助成における、または卵母細胞の単為生殖における活性化剤である。本明細書は、受精を媒介させ、および核輸送にかかわる、またはＩＣＳＩにおける卵母細胞の単為生殖を増強するためのオシロゲニンの単離方法、および精子中のオシロゲニンの量、従って精子受精能力を試験するためのオシロゲニンの使用方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子からオシロゲニンを単離する方法であって、
（Ａ）精子細胞質フラクションを調製し；
（Ｂ）この精子細胞質フラクションを、ＨｉＴｒａｐブルーアフィニティＦＰＬＣクロマトグラフィーカラム、ヒドロキシアパタイトＦＰＬＣカラム、およびスーペローズ１２ＦＰＬＣクロマトグラフィーカラムに通して引き続き処理することによってオシロゲニンを単離し；次いで
（Ｃ）［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を有するフラクションを得る；
ことを包含する上記方法。
【請求項２】
卵母細胞活性を増強する方法であって、
（ａ）精子またはその他の細胞核を卵母細胞に注入するか、または卵母細胞と融合させる前に、または同時的に、または直後に、卵母細胞中にオシロゲニンを導入する工程を包含し、ここで上記卵母細胞はオシロゲニン注入前または注入後に、その外因性核を除去または不活性化するために処理されているものである上記方法。
【請求項３】
卵母細胞が哺乳動物卵母細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物卵母細胞がヒト卵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｃａ２＋含有培地において注入された卵母細胞をインキュベートすることをさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
精子が哺乳動物精子である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物精子が、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の二価カチオン放出をさらに増強させる薬剤またはこのような薬剤の組合せを卵母細胞に注入する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
この薬剤が、カルシウムイオノホア、たんぱく質キナーゼインヒビターおよびホスファターゼからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カルシウムイオノホアが、イオノマイシンおよびＡ２３１８７からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
たんぱく質キナーゼインヒビターが、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、スタウロスポリン、ブチロラクトン、ロスコビチン、ｐ３４（ｃｄｃ２）インヒビター、２−アミノプリンおよびスフィンゴシンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ホスファターゼが、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
上記活性化した卵母細胞を胚に発育させることを可能にすることをさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
上記胚が非ヒトであり、また代理母に移植される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記移植された胚を、生存している非ヒト子孫に発育させることを可能にする，請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記活性化した卵母細胞を培養し、ブラストシストを生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
上記ブラストシストの内部細胞塊の一部または全部をフィーダー層上で培養し、培養された内部細胞塊を生成することをさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記培養された内部細胞塊を相違するフィーダー層上に移動し、上記培養された内部細胞塊の分化を防止する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記培養された内部細胞塊を培養し、培養された内部細胞塊細胞系を生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の増強方法であって、精子または精子核を卵母細胞中に挿入する前または挿入後に、卵母細胞にオシロゲニンを注入する工程を包含する上記方法。
【請求項２１】
注入された卵母細胞をＣａ２＋含有培地においてインキュベートすることをさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
卵母細胞および精子が哺乳動物の卵母細胞および精子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
卵母細胞が、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
精子が、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の二価カチオン放出増強剤を卵母細胞に注入する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
上記増強剤が、カルシウムイオノホア、たんぱく質キナーゼインヒビターおよびホスファターゼからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
カルシウムイオノホアが、イオノマイシンおよびＡ２３１８７からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
たんぱく質キナーゼインヒビターが、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、スタウロスポリン、ブチロラクトン、ロスコビチン、ｐ３４（ｃｄｃ２）インヒビター、２−アミノプリンおよびスフィンゴシンからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ホスファターゼが、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
卵母細胞の単為生殖活性化方法であって、オシロゲニンを卵母細胞中に注入する工程を包含する上記方法。
【請求項３１】
卵母細胞が、哺乳動物卵母細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物卵母細胞が、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギからなる哺乳動物の群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
精子［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を予測する方法であって、精子試料中のオシロゲニン濃度を測定することを包含する上記方法。
【請求項３４】
精子［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を予測するためのキットであって、オシロゲニンまたはオシロゲニンをコードする核酸を認識し及び結合する、標識した薬剤を包含する上記キット。
【請求項３５】
上記薬剤が、抗−オシロゲニン抗体である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
上記薬剤が、オシロゲニンｍＲＮＡに結合する核酸プローブである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３７】
オシロゲニンをコードする核酸。
【請求項３８】
核酸が、配列番号：１を包含する、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
請求項３７に記載の核酸を包含するベクター。
【請求項４０】
オシロゲニンが哺乳動物オシロゲニンである、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４１】
哺乳動物オシロゲニンが、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギからなるリストから選択される、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項３８に記載の核酸によってコードされるオシロゲニンたんぱく質。
【請求項４３】
配列番号：２を包含するオシロゲニンたんぱく質。
【請求項４４】
配列番号：２の少なくとも二十個（２０）の隣接アミノ酸残基を包含するオシロゲニンたんぱく質。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法によって得られる単離オシロゲニン。
【請求項４６】
組換オシロゲニンたんぱく質であって、
（Ａ）請求項３９に記載のベクターを適当なホストに挿入し；
（Ｂ）このホストを適当な条件下にインキュベートし、オシロゲニンを生成させ；次いで
（Ｃ）上記ホストからオシロゲニンたんぱく質を単離する；
ことによって得られる組換オシロゲニンたんぱく質。
【請求項４７】
オシロゲニンたんぱく質および医薬上で許容される担体を含有する卵母細胞活性化用組成物。
【請求項４８】
少なくとも１種のホスファターゼ、カルシウムイオノホアまたはたんぱく質キナーゼインヒビターをさらに含有する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
オシロゲニンを認識し及び結合する抗体またはその免疫原性フラグメント。
【請求項５０】
上記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４８に記載の抗体。
【請求項５１】
上記免疫原性フラグメントが、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’からなる群から選択される、請求項４８に記載の抗体または免疫原性フラグメント。
【請求項５２】
上記抗体または免疫原性フラグメントが、標識された抗体である、請求項４８に記載の抗体または免疫原性フラグメント。
【請求項５３】
抗体または免疫原性フラグメントが、同位元素または蛍光ラベルにより標識されている、請求項５１に記載の抗体または免疫原性フラグメント。
【請求項５４】
蛍光ラベルが、ローダミン、フルオレセインまたはローダミングリーンＯである、請求項５２に記載の抗体。
【請求項５５】
精子受精能力を抑制する方法であって、精子におけるオシロゲニン活性を阻害する薬剤を投与する工程を包含する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦資金）
本発明は、米国農業省（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）からＧｒａｎｔ　Ｎｏ．９９−２３７１により部分的に支持されている。米国政府は本発明の権利を有することができる。
【０００２】
（関連出願に対する継続関係）
本出願は２０００年３月２２日付けで出願された米国仮出願出願番号６０／１９１，０８９の利益を特許請求するものであり、この出願の全体を引用してここに組入れる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は卵母細胞の単為生殖活性化、精子受精能力の調節および精子受精能力の評価にかかわる組成物および方法に関する。組成物の一つは、精子たんぱく質であるオシロゲニン（ｏｓｉｌｌｏｇｅｎｉｎ）を含有する。
【０００４】
（発明の背景）
動物交配および農作物生殖技術（ＡＲＴ）の分野では、現在使用されている方法の効率および成功率を増加させるための改良された核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）技術が求められている。農作物生殖技術から得られる利益は多大である。一例として、胚細胞のクローニングは、クローン化された胚細胞の移植能力とともに、数種の遺伝的に同一の動物の生産を可能にする。核輸送によるクローニングは、別の方法（例えば、胚分割または胚細胞集合による胎児胎盤キメラの形成）に対しては好適である。この理由は、（１）遺伝的に同一の動物の複数の複製の生産；（２）特異的特徴の選択；および（３）試験が完了するまでの胚細胞の極低温保存；が可能であることにある。
【０００５】
Ｉ．核輸送
成熟哺乳動物腺細胞から除核卵母細胞中への最初に成功した核の輸送は、１９９６年に報告された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ，３８０；６４−６（１９９６））。核輸送（ＮＴ）は、受容細胞として細胞質の調製を包含する。大部分の場合、この細胞質は、染色体が分離されている成熟中期ＩＩ卵母細胞から誘導される。ドナー細胞核を次いで、帯（ｚｏｎａ）と細胞質との間に配置する。融合および細胞質活性化を、電気刺激によって開始させる。細胞質によるドナー細胞核の充分な再プログラミングは必須であり、また細胞周期によって影響を受けることがある工程である（Ｗｏｌｆ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０：１９９−２０４（１９９９））。
【０００６】
多くの妊娠がドナー核の供給源として胎児細胞を用いて確立されている。しかしながら、動物クローニングは、トランスジェニック動物を作り出すための細胞系の使用によって加速され、これは核輸送前のインビトロ細胞の遺伝子操作を可能にする（同上刊行物）。初期胚発現を調節するメカニズムは、哺乳動物種の中で保存することができ、例えばウシ卵母細胞細胞質は、ドナー線維芽細胞の染色体数、種類または年齢に関係なく、導入され、分化されたドナー核を維持することができる（Ｄｏｍｉｎｉｋｏ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０：１４９６−１５０２（１９９９））。
【０００７】
活動的に分裂する胎児線維芽細胞は、Ｃｉｂｅｌｌｉ等の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−９（１９９８））に記載の方法に従い、核ドナーとして使用することができる。ドナーの分化した核の核輸送にかかわる受容体卵母細胞のもう一つの調製方法は、国際ＰＣＴ出願Ｎｏ．９９／０５２６６；９９／０１１６４；９９／０１１６３；９８／３９１６；９８／３０６８３；９７／４１２０９；９７／０７６６８；９７／０７６６９；および米国特許Ｎｏ．５，８４３，７５４に記載のとおりに行うことができる。代表的に、移植核は、培養した胚幹（ＥＳ）細胞、胚芽（ＥＧ）細胞またはその他の胚細胞から得られる（例えば、国際ＰＣＴ出願Ｎｏ．９５／１７５００および９５／１０５９９；カナダ国特許Ｎｏ．２，０９２，２５８；英国特許Ｎｏ．２，２６５，９０９；および米国特許Ｎｏ．５，４５３，３６６；５，０５７，４２０；４，９９４，３８４；および４，６６４，０９７参照）。内部細胞塊（ＩＣＭ）細胞はまた、核ドナーとして使用することができる（Ｓｉｍｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６１４３−７（１９９０）；およびＫｅｅｆｅｒ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０：９３５−９（１９９４））。
【０００８】
ＩＩ．卵母細胞および卵母細胞活性化におけるカルシウム誘発
哺乳動物種および他の動物における受精は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）の存在を特徴とし、これは哺乳動物において数時間持続することができる（Ｍｉｙａｚａｋｉ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１８：２５９−６７（１９８６）；Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８）；Ｓｗａｎｎ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２８５：２６７−７５（１９９９））。このようなＣａ２＋振動は、卵子活性化の引き金を引き、胚発現を開始するのに必要であり（同上刊行物）、これは皮質果粒体エキソサイトーシス、二次極性体の減数分裂および駆逐の再開（ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｉｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｐｏｌａｒ　ｂｏｄｙ）、前核の形成、ＤＮＡ合成および一次有糸分裂を包含する一連の事象からなる（Ｋｌｉｎｅ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４９：８０−８９（１９９２）；およびＳｃｈｕｌｔ等、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０：２１−６２（１９９５））。
【０００９】
精子がＣａ２＋放出を開始するメカニズムは不明であるが（同上刊行物）、３つの理論が提案されている（Ｓｗａｎｎ等、１９９９）。第一に、精子は膜融合後、卵子中へのＣａ２＋侵入用の導管として作用する。第二に、精子は卵子内のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を刺激するための血漿膜レセプターに作用し、これによりイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩｎｓＰ３またはＩＰ３）が生成される。最後に、精子はいまだ未確認の精子たんぱく質によってＣａ２＋放出を誘発させることができる。最後の理論以外は、卵母細胞活性化の主な原因ではないことは証明されている（Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））。ＩＰ３はＩＰ３レセプター（ＩＰ３Ｒ）との相互反応によってＣａ２＋放出を媒介する。ＩＰ３は小胞体に局在化しており、またテトラマー複合体を形成（Ｐａｔｅｌ等、Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，２５：２４７−６４（１９９９））。
【００１０】
数種の卵子におけるＧＴＰγ［Ｓ］の注入、Ｇ−たんぱく質の非加水分解性アクチベーター、および引き続くＰＬＣ、誘発された反復性Ｃａ２＋応答は、この経路が哺乳動物の卵子において機能することを証明している（Ｍｉｙａｚａｋｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：３４５−５３（１９８８）；およびＦｉｓｓｏｒｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：７６６−７４（１９９５））。さらにまた、ＩＰ３の注入はまた、哺乳動物卵子におけるＣａ２＋放出を誘発させることが証明されている（Ｍｉｙａｚａｋｉ等、１９９８；Ｓｃｕｌｔｚ等、１９９５）。
【００１１】
哺乳動物卵子で発現されたＩＰ３Ｒには３種の同定されたイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在する（Ｆｉｓｓｏｒｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０：４９−５７（１９９９）；およびＨｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６１：９３５−４３（１９９９））、ＩＰ３Ｒサブタイプ１（ＩＰ３Ｒ−１）は他のイソホームに比較して豊富に、また圧倒的に大量に発現される（Ｐａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：４５１−６１（１９９８）；およびＨｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１２４５−５５（１９９７））。また、ＩＰ３Ｒ−１たんぱく質は、哺乳動物卵子において段階−特異的様相で発現され、このことは受精における重要な役割を示唆している。
【００１２】
一例として、２０個よりも少ないマウスおよびウシ卵子が、ウエスターンブロッティングによるＩＰ３Ｒ−１たんぱく質の検出に必要であり（Ｈｅ等、１９９７；およびＦｉｓｓｏｒｅ等、１９９９）、またＩＰ３Ｒ−１たんぱく質の量は卵母細胞成熟期間中に格別に増加する（Ｍｅｈｌｍａｎｎ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８０：４８９−９８（１９９６）およびＨｅ等、１９９７）。このレセプター密度の増加は、卵母細胞成熟期間中における増加したＩＰ３Ｒ応答をもたらす（Ｆｕｊｉｗａｒａ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５６：６９−７９（１９９３）；およびＭｅｈｌｍａｎｎ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５１：１０８８−９８（１９９４））。さらにまた、マウス卵子において、精液注入（授精）に先立つ阻害性ＩＰ３Ｒ−１モノクローナル抗体１８Ａ１０の注入は、受精付随Ｃａ２＋放出および活性化を投与量依存様相で阻止した（Ｍｉｙａｚａｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２５１−５（１９９２）；およびＸｕ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２０：１８５１−９（１９９４））。
【００１３】
ＩＰ３Ｒ系を経るＣａ２＋放出は、数種の別のメカニズムに加えて、ＩＰ３Ｒ−１たんぱく質のレベルの調整によって調節することができる。体細胞系における試験は、ＩＰ３Ｒダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が、ＰＬＣに結合した細胞表面レセプターの活性化により誘発されるＩＰ３産生の持続的刺激の結果として起こることは証明されている（Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７９６３−９（１９９４）；Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１６７８−８３（１９９５）；およびＳｉｐｍａ等、Ｃｅｌｌ．ｃａｌｃｉｕｍ　２３：１１−２１（１９９８））。
【００１４】
このＩＰ３Ｒの下落（分解、ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）（これは、ＩＰ３に対する減少された細胞応答を導く）は、一般たんぱく質の分解を付随せず（Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６６５２−５（１９９６）；およびＢｏｋｋａｌａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２４５４−６１（１９９７））、ＩＰ３Ｒに対するＩＰ３結合を付随し（Ｚｈｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３４７６−８４（１９９９）、またユビキネート化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）たんぱく質の分解に包含されるプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）、多種たんぱく質細胞複合体（ｍｕｌｔｉ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）により媒介される（Ｂｏｋｋａｌａ等、１９９７；Ｏｂｅｒｄｏｒｆ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：４５３−６１（１９９９）ことから、特異的であることが証明された。
【００１５】
受精期間中、哺乳動物の卵子はまた、これらが前核段階に進行するに従い、減少したＩＰ３Ｒ応答を示し（Ｆｉｓｓｏｒｅ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：６３４−４２（１９９４）；Ｊｏｎｅｓ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１：３２５９−６６（１９９５）；およびＭａｃｈａｔｙ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５６：９２１−３０（１９９７））、またこれは、ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを伴うことは明白である（Ｐａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、１９９８；Ｈｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６１：９３５−４３（１９９９））。しかしながら、哺乳動物卵子における、ＩＰ３Ｒ−１の活動停止を制御するメカニズム（１種または２種以上）は、未知である。さらにまた、哺乳動物の卵子の単為生殖活性化（この使用は、クローニング技術の出現とともに広く流布している）は、単次または複次Ｃａ２＋上昇を刺激する数種のアゴニストにより誘発させることができるが、それらのＩＰ３Ｒ−１数に対する効果は測定されていない。従って、我々は、プロテアソーム経路の包含可能性を包含するマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを制御するシグナル発信メカニズムを研究した。
【００１６】
精子細胞質ゾル因子は、卵母細胞活性化に必要である（Ｓｔｉｃｅ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．２５：２７２−８０（１９９０）およびＳｗａｎｎ等、Ｄｅｖｅｌ．１１０：１２９５−３０２（１９９０））。哺乳動物卵母細胞の活性化は、二次卵母細胞による減数分裂からの退去、有糸分裂細胞周期への入場、および細胞内における前核の形成および移動を包含する。従って、卵母細胞活性化は、細胞周期の移行を必要とする。受精（米国特許Ｎｏ．５，４９６，７２０）および精子の細胞質フラクション（Ｓｗａｎｎ等、１９９０）は、Ｃａ２＋振動を誘発させることができるが、活性化はまた、単次または複次Ｃａ２＋振動を誘発する単為生殖処置により誘発させることもできる。単為生殖活性化を使用し、卵母細胞を核移動用に調製することができる。
【００１７】
単為生殖は、成熟動物への不意の発育を伴うかまたは伴うことなく、雄の配偶子からのいずれの関与も存在しない状態における雌の配偶子からの胚細胞の生成である（米国特許Ｎｏ．５，４９６，７２０）。哺乳動物の卵母細胞の単為生殖活性化は、（１）電気衝撃、エレクトロポレーションまたは電気刺激；（２）イオノマイシンと６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）との組合せ処置；（３）カルシウムイオノホアＡ２３１８７と６−ＤＭＡＰとの組合せ処置；によって行うことができる（Ｓｕｓｋｏ−ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：７２９−３９（１９９４）；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０：８２１−７（１９９９）；Ｌｉｕ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６１：１−７（１９９９）；および米国特許Ｎｏ．５，４９６，７２０）。後者の二つの方法は、たんぱく質キナーゼインヒビターと組合せてカルシウムイオノホアを使用し、これはたんぱく質キナーゼインヒビター放出の誘発にとって重要である（Ｍａｙｅｓ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：２７０−５（１９９５））。
【００１８】
卵母細胞活性化に利用されるその他の二価カチオンは、例えばイオノホアの形態のマグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウムを包含する。二価カチオンレベルはまた、電気衝撃、エタノールによる卵母細胞の処置、およびケージ化キレート形成剤（ｃａｇｅｄ　ｃｈｅｌａｔｏｒｓ）による処理によって増大させることができる。卵母細胞におけるホスホリル化は、キナーゼインヒビター［例えば、６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）およびスフィンゴシンなどのセリン−スレオニンキナーゼインヒビター］の追加によって減少させることができる（米国特許Ｎｏ．５，９４５，５７７）。別法として、卵母細胞たんぱく質ホスホリル化は、卵母細胞中にホスファターゼ（例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂ）を導入することによって抑制することができる（同上刊行物）。
【００１９】
別法として、活性化は、公知活性化剤の施用によって達成することができる。一例として、受精期間中における精子の卵母細胞への浸透は、より多数の生育可能な妊娠を生じ、核移動後の複数の遺伝的に同一なウシを生成することが証明されている。また、電気衝撃および化学衝撃による処置は、融合後のＮＴ胚の活性化に使用することができる。適当な卵母細胞活性化法は、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ等に対する米国特許Ｎｏ．５，４９６，７２０の主題であり、この特許の全体を引用してここに組入れる。
【００２０】
オシリン（ｏｓｃｉｌｌｉｎ）：数グループは、精子がＣａ２＋振動を誘発させるたんぱく質を介して卵母細胞を活性化するものと仮定した。この仮定たんぱく質はオシロゲン（ｏｓｃｉｌｌｏｇｅｎ）と称されている（Ｐａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３７９：３６４−８（１９９６））。オシリンは、最初に同定されたオシロゲンであり、卵母細胞において細胞内カルシウム放出を誘発するものと信じられていた（同上刊行物）。実際に、オシリンはグルコサミン６−ホスフェートデアミナーゼである（Ｗｏｌｏｓｋｅｒ等、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１２：９１−９（１９９８））。しかしながら、オシロゲンが精子細胞核の卵子細胞中への注入と同一程度にまで卵母細胞活性化を誘発させることを仮定的に証明する実験を除いて（Ｓａｓａｇａｗａ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５８：２００６−８（１９９７）；Ｗｏｌｎｙ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．＆Ｄｅｖ．５２：２７７−８７（１９９９））、後になって、オシリンは卵母細胞におけるＣａ２＋放出に応答する精子たんぱく質ではないことが証明された（Ｗｏｌｏｓｋｅｒ等、（１９９８）；およびＷｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））。その結果として、卵母細胞活性化を招くことができる精子因子は、未知のまま残されている（Ｗｏｌｎｙ等、１９９９）。
【００２１】
ＩＩＩ．核移植または核輸送用の体細胞の調製
動物交配の目的で、核輸送は胚幹細胞（ＥＳ）、内部細胞塊細胞（ＩＣＭｓ）および体細胞とともに使用することができる。
胚幹細胞：形質転換した動物を生産するもう一つの方式は、ＥＳ細胞を用いて開発された。マウスにおいて、ＥＳ細胞は、形質転換細胞を選択し、遺伝子ターゲティングを行うことを研究者に可能にしている。この方法は別の形質転換技術により可能である以上に、遺伝子操作を可能にする。一例として、ＥＳ細胞はインビトロでコロニイとして比較的容易に成長し、標準的方法によってトランスフェクションすることができ、またこの形質転換細胞は抗生物質耐性によって遺伝的に同一に選択することができる［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ、「胚幹細胞における遺伝子輸送」（Ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、ＩＮ　ＴＲＡＮＳＧＥＮＩＣ　ＡＮＩＭＡＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＨＡＮＤＢＯＯＫ　１１５−１４６（Ｃ．Ｐｉｎｋｅｒｔ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４）］。
【００２２】
さらにまた、この方法の効率は、充分の形質転換コロニイ（１００から１０００）を生成し、相同組換え体の二次選択を可能にすることができるものである（同上刊行物）。ＥＳ細胞は次いで、正常ホスト胚と組合わせることができ、またこれらはそれらの能力を保有していることから、生殖細胞を包含する生成するキメラ動物における全部の組織に発現することができる。従って、この形質転換的修飾は引続く世代に伝達することができる。
【００２３】
初期移殖前マウス胚からインビトロで胚幹（ＥＳ）細胞系を誘導する方法は公知である（Ｅｖａｎｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，２９：１５４−６（１９８１）；およびＭａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７６３４−８（１９８１））。ＥＳ細胞は、線維芽細胞のフィーダー層（ｆｅｅｄｅｒ　ｌａｙｅｒ）（Ｅｖａｎｓ等、１９８１）または分化抑制源（Ｓｍｉｔｈ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１−９（１９８７））が存在するかぎり、未分化状態で通過させることができる。
【００２４】
それらのゲノムを次の世代に伝達する、それらの能力の観点から、ＥＳ細胞は家畜動物の生殖細胞系列操作に潜在的能力を有する。或る研究グループは、多分化能性胚細胞系の単離を報告している。一例として、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ等は、ブタおよびヒツジ芽細胞から安定な多分化能性細胞系の確立を報告している（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．４３：５５−２６０（１９９１））。この細胞系はヒツジ芽細胞から免疫手術的に（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ）単離された内部細胞塊（ＩＣＭｓ）の一次培養における細胞のものに類似する或る種の形態学的特徴および成長特徴を示す。また、Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ等は、ブタ芽細胞から推定上の多分化能性胚細胞系の培養にかかわる維持および分化を報告している（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｓｕｐｐｌ．４１：５１−５６（１９９０））。Ｇｅｒｆｅｎ等は、ブタ芽細胞からの胚細胞系単離を報告しており（Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：１−１４（１９９５））、これはマウス胚線維芽フィーダー層を必要とせず、また培養期間中に数種の相違する細胞タイプに分化されるものと報告されている。
【００２５】
さらにまた、Ｓａｉｔｏ等は培養したウシ胚幹細胞様細胞系を報告しており（Ｒｏｕｘ’ｓ　Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０１：１３４−４１（１９９２））、これは三世代生存したが、四世代目に消失した。Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ等は、マウスＩＣＭｓから誘導されたマウスＥＳ細胞系の単離を可能にする条件下において免疫手術的に単離されたヒツジ胚ＩＣＭｓの培養を開示している（Ｒｏｕｘ‘ｓ　Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９６：１８５−９０（１９８７））。
【００２６】
Ｃａｍｐｂｅｌｌ等は、マウスにおいてＥＳ細胞系の単離を促進する条件下に培養された９日齢ヒツジ胚からの培養した胚ディスク（ＥＤ）の核輸送後の生きている仔ヒツジの生産を開示している（Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６（１９９６））。
推定的に、動物幹細胞が形質転換動物の獲得に用いるために、単離され、選択され、また増殖されている（Ｅｖａｎｓ等、ＷＯ９０／０３４３２；Ｓｍｉｔｈ等、ＷＯ９４／２４２７４；およびＷｈｅｅｌｅｒ等、ＷＯ９４／２６８８４参照）。Ｅｖａｎｓ等はまた、ブタおよびウシ動物種からの推定上の多分化能性ＥＳ細胞の誘導を報告しており、これは形質転換動物の生産に有用であると推定される。
【００２７】
形質転換胚からのＥＳ細胞は、核移植に使用することができる。核移植に対する有蹄類ＩＣＭ細胞の使用がまた、報告されている。家畜動物（例えば、有蹄類）の場合、同様の移殖前家畜類動物胚からの核は、除核された卵母細胞の発現を期限まで支持する（Ｋｅｅｆｅｒ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０：９３５−３９（１９９４）；Ｓｍｉｔｈ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４０：１０２７−１０３５（１９８９））。これに対して、マウス胚からの核は、輸送後、８細胞段階を越えては、除核卵母細胞の発現を支持しない（Ｃｈｅｏｎｇ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４８：９５８−６３（１９９３））。従って、家畜動物からのＥＳ細胞は、これらが核輸送処置のために遺伝子操作されているか、または別様に操作されている分化全能性ドナー核の可能な供給源を提供することができることから、格別に望ましいものである。
【００２８】
ＩＣＭ細胞の使用：Ｃｏｌｌａｓ等は、溶解したドナー細胞を除核成熟卵母細胞中に微量注入することによるウシＩＣＭｓの核移植を開示している（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８：２６４−７（１９９４）。７日間にわたる胚の培養は１５の芽細胞を産生し、この芽細胞は、ウシ受容体に輸送されると、４匹の妊娠および２匹の誕生をもたらした。また、Ｋｅｅｆｅｒ等（１９９４）は、核輸送処置におけるドナー核としてウシＩＣＭ細胞を使用し、芽細胞を生成することを開示しており、これにより数匹の生存仔ウシを得ている。さらにまた、Ｓｉｍｓ等は、短期間インビトロ培養されたウシＩＣＭ細胞を除核成熟卵母細胞に輸送することによるウシの生産を開示している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６１４３−７（１９９３）。
【００２９】
ＩＶ．細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）
精子は微細手術による副睾丸精子吸入法（ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ　ｅｐｉｄｉｙｍａｌ　ｓｐｅｒｍ　ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）（ＭＥＳＡ）および睾丸精子抽出法（ＴＥＳＥ）を包含する数種の方法の一つによって得ることができる。成熟副睾丸精子および睾丸精子の場合、成熟マウス卵母細胞中に挿入すると、正常胚が発現し、マウスの生産が生じる（Ｓａｓａｇａｗａ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５８：２００６−８（１９９７）。しかしながら、球形精子細胞は、卵母細胞を活性化することはできない（同上刊行物）。従って、動物交配および農業生産技術の目的の場合、未成熟精子または球形精子細胞を使用する際には、オシロゲニンの卵母細胞中への同時的注入を使用することにより正常胚発現を開始させることができる。
【００３０】
ＩＣＳＩは、人工生産およびＡＲＴ分野におけるインビトロ受精において精子欠乏症の男性を助けるために開発された技術である。正常な受精は重篤に影響を受けた精子細胞によっては達成することができないので、この方法が男性不妊の処置として革命的であることが示唆されている（Ｔａｒｌａｔｚｉｓ等、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１３Ｓ：１６５−７７（１９９８））。一例として、嚢胞性繊維症は、精子の質を低下させる、輸精管の先天性発育不全を発症させることが示唆されている（Ｊａｋｕｂｉｃｚｋａ等、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１４：１８３３−４（１９９９））。男性不妊症の別の原因には、精子発生障害および核型異常を導くＹ−染色体微少欠損が包含される（Ｋｉｍ等、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１８：１３４９−６５（１９９８））。精子有効性はまた、プロタミンへの曝露の結果として減少させることができる（Ａｈｍａｄｉ等、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．１６：１２８−３２（１９９９））。ＩＣＳＩはまた、動物交配に関連する（例えば、Ｌｉ等、Ｚｙｇｏｔｅ，７：２３３−７（１９９９）参照）。
【００３１】
Ｇｏｍｅｚ等は、培地におけるカルシウムの存在がＩＣＳＩ後の受精率を高めることを示唆した（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．１０：１９７−２０５（１９９８））。このことは、可溶性精子因子（ＳＳＦ）がＩＣＳＩ後の卵母細胞活性化を推進するＣａ２＋振動の原因であるらしいことをＳｏｕｓａ等が示唆したことから（Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２：８５３−７（１９９６）、予想外のことではなかった。Ｃａ２＋波は受精を伴う応答の全部を発生するのに充分に大きいものであることができる（Ｕｒａｎｇａ等、Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０：５１５−９（１９９６））。さらにまた、精子細胞を注入した卵母細胞における典型的振動性Ｃａ２＋応答が存在しないことは、注入された卵母細胞の応答不全または卵母細胞細胞質中へのＳＳＦ放出不全によるものよりもむしろ、精子細胞におけるＳＳＦの実際の欠陥によるものと予測される（Ｓｏｕｓａ等、（１９９６））。さらにまた、このカルシウム応答は精子細胞受胎後の正常な胚の発現にとって重要であることがある（同上刊行物）。Ｔｅｓａｒｉｋ等は、Ｃａ２＋振動がＩＣＳＩ受精卵母細胞に見出されるが、これは格別に遅延した後にのみ生じることを報告している（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５１：３８５−９１（１９９４））。
【００３２】
ＩＣＳＩはまた、精子の貧弱な受精能力を有する核型ヒト精子細胞に対する技術として用いられる。一例として、Ｇｏｕｄ等は、ヒト精子細胞を微量注入されたシリアンゴールデンハムスター卵母細胞の単為生殖活性化のための技術および条件を開示している（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１３：１３３６−４５（１９９８））。
【００３３】
精子受精能力はまた、ヘパリン結合性たんぱく質に向けられる抗体を使用し、精子膜のヘパリン結合性たんぱく質を用いて測定することによって評価することができる（米国特許Ｎｏ．５，９６２，２４１）。精子因子、すなわち本明細書に記載のオシロゲニンを用いて、遺伝子刷り込みにより多分生じる（Ｍｏｏｒｅ等、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．１：７３−７（１９９６）、または再構成された胚の高度の致死性を多分に減少させる、移植前胚のインビトロ操作から生じることがある或る種の成長異常の克服を補助することができる。遺伝子刷り込みは、たんぱく質キナーゼ活性に関連し、これは次いで、部分的に成熟卵母細胞の正常精子誘発受精に際して見出されるカルシウムイオン振動により制御することができる。このような発現的異常は苦しみを受けている動物に対して有害であり、また致死的でさえあることがある。精子受精能力のもう一つの測定方法は、米国特許Ｎｏ．５，７７０，３６３；５，７６３，２０６；５，４３４，０５７；および５，３５８，８４７で検討されている。
【００３４】
従って、刊行物に従来何が報告されているかにかかわらず、卵母細胞活性化のため、特に核輸送およびＩＣＳＩおよびその他の関連人工生産技術に使用するための、卵母細胞Ｃａ２＋振動の改良された誘発方法に対する要求が存在している。さらにまた、オシロゲニンおよびオシロゲニン調節剤の製造方法および使用方法は、クローン化家畜類の生産、健康なヒトの誕生および避妊に対するＡＲＴの使用を大いに手助けするものになると見做される。
【００３５】
（本発明の目的および要旨）
本発明の目的は、精子からオシロゲニンを単離する新規方法であって、（Ａ）精子細胞質フラクションを調製し；（Ｂ）この精子細胞質フラクションをＨｉＴｒａｐブルーアフィニティＦＰＬＣクロマトグラフィーカラム、ヒドロキシアパタイトＦＰＬＣカラム、およびサーペローズ（ｓｕｒｐｅｒｏｓｅ）１２ＦＰＬＣクロマトグラフィーカラムを通して引き続き処理することによってオシロゲニンを単離し；次いで（Ｃ）［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を有するフラクションを得る；ことを包含する上記方法を提供することにある。
【００３６】
本発明のもう一つの目的は、卵母細胞の卵母細胞活性を増強させる方法であって、精子またはその他の細胞核を卵母細胞に注入するか、または卵母細胞と融合させる前に、または同時的に、または直後に、卵母細胞中にオシロゲニンを導入する工程を包含し、ここで上記卵母細胞はオシロゲニン注入前または注入後に、その外因性核を除去または不活性化するために処理されている上記方法を提供することにある。この卵母細胞は哺乳動物卵母細胞（例えば、霊長類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ネズミまたはイヌ）であることができ、また好ましくはヒト卵母細胞である。この方法はまた、二価カチオン放出をさらに増強する少なくとも１種の薬剤またはこのような薬剤の組合せを卵母細胞に注入する工程をさらに包含することができる。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの目的は、活性化された卵母細胞を胚に発育させることを可能にすることにあり、或る状況において、この胚は代理母に移植することができ、また非ヒト動物を懐胎させることができる。
本発明のさらにもう一つの目的は、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）の増強方法であって、精子または精子核を卵母細胞中に挿入する前または挿入後に、卵母細胞にオシロゲニンを注入する工程を包含する上記方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、卵母細胞の単為生殖活性化の増強方法であって、卵母細胞にオシロゲニンを注入する工程を包含する上記方法を提供することにある。
【００３８】
本発明のもう一つの目的は、精子［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を予測する方法であって、精子試料中のオシロゲニン濃度を測定することを包含する上記方法を提供することにある。さらに特定の目的として、本発明は、精子［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を予測するためのキットであって、オシロゲニンまたはオシロゲニンをコードする核酸を認識し、次いで結合する標識剤を包含する上記キットを提供する。
【００３９】
本発明のもう一つの目的は、オシロゲニンをコードする核酸、およびその対応するアミノ酸配列を提供することにある。このオシロゲニン配列はヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミおよびヤギであることができる。
本発明のもう一つの目的は、オシロゲニンを認識し、次いで結合する抗体またはその免疫学的フラグメントを提供することにある。好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体であり、またこの免疫学的フラグメントは：Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’からなる。
【００４０】
（図面の簡単な説明）
図１：パネルＡは精子因子（ＳＦ）たんぱく質に富んだ溶出液を得るために使用されるクロマトグラフィーカラムの段階的使用を示している。精子フラクションを先ず、ＨｉＴｒａｐ青色染料カラムに通して処理し、次いでヒドロキシアパタイトカラムに通し、最後にスーペローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２カラムに通す。パネルＢは各種クロマトグラフィーカラムに通して処理した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離された各種フラクション（Ｆ１−Ｆ５）におけるたんぱく質の分布を示している。パネルＣは多数のカラムからの各フラクションの［Ｃａ２＋］ｉ放出活性を示している。見出された最大活性はＦ４−１フラクションにある。
【００４１】
図２：インビトロ加齢（ＡおよびＢ）またはインビトロ受精後（ＣおよびＤ）のマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析および定量。各列毎に、２０個の卵子（ｅ）を使用した。「ＵＦ」は未受精を表わし、また「Ｆ」は受精した卵子を表わす。ＭＩＩ卵子は常時、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（“ｈＣＧ”）後１６時間であり、また示されている時間はｈＣＧ後の時間（ｐｈＣＧ）（ｈｒ　ｐｏｓｔ　ｈＣＧ）を表わす。データは平均値±ＳＥＭで示されている。共通の上付き文字を共有する横棒の下の処置は有意の差異ではない（ｐ＞０．０５）。数値は、相違するバッチの卵子で行われた４回のウエスターンブロット試験の平均値である。
【００４２】
図３：７％エタノール（Ｅｔ；ＡおよびＢ）またはイオノマイシン／ＤＭＡＰ（Ｉｏ／Ｄ；ＣおよびＤ）に曝露することによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析および定量。活性化は１６時間ｐｈＣＧで出発した。Ｅｔ−２４時間−１−細胞は、２４時間ｐｈＣＧにおいて、エタノール曝露後に前核形成を示した卵子の細胞であり、またＥｔ−２４時間−２細胞は、曝露して４時間以内に２個の細胞に分裂した細胞である。全部の処理にかかわり、２４時間ｐｈＣＧ（活性化後８時間）の卵子の全部が前核形成を示した。各列毎に、２０個の卵子（ｅ）を使用した。異なる上付き文字を有する横棒の下の処置は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。数値は、相違するバッチの卵子で行われた３回のウエスターンブロット試験の平均値である。
【００４３】
図４：ＳＦの注入（ＡおよびＢ）またはアデノホスチンＡ注入（Ａｄ；ＣおよびＤ）により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析および定量。注入は１６時間ｐｈＣＧで行い、試料は注入後１時間、２時間、４時間および８時間以内に採取した。異なる上付き文字を有する横棒の下の処置は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。数値は、相違するバッチの卵子で行われた３回のウエスターンブロット試験の平均値である。
【００４４】
図５：ＳｒＣｌ２（ＡおよびＢ）またはチメロザール（「Ｔｈ」；ＣおよびＤ）によって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析および定量。活性化は１６時間ｐｈＣＧで行い、各列毎に、１５個の卵子を使用した。「Ｃ」は対照を表わし、これらの卵子は同一長さの時間をかけて培養したが、ＳｒＣｌ２には曝露しなかった。共通の上付き文字を共有しない横棒の下の処置は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。数値は、相違するバッチの卵子で行われた５回のウエスターンブロット試験の平均値である。
【００４５】
図６：この試験に用いられた数種のアゴニストにより誘発されたマウス卵子における［Ｃａ２＋］ｉ振動様相。ＳＦの注入（〜１０ｎｇ／μｌ細胞内濃度）は、アデノホスチンＡ（Ｂ；〜１００ｎＭ細胞内濃度）の注入により誘発されたものと同様の高度の反復上昇（Ａ）を誘発させた。ＳｒＣｌ２は、延長された上昇を、またより遅い頻度で誘発させた（Ｃ）。卵子内で３０分かけてインキュベートしたチメロザールは、反復上昇を誘発させた（Ｄ）。提示されたＣａ２＋読み取りは、３つの分離した試験で行い、振動の停止は振動の中断というよりもむしろ記録の停止によるものであった。
【００４６】
図７：ラクタサイスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）（「Ｌａｃ」）の存在または不存在下においてＳＦによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析および定量。ＳＦの注入は１６時間ｐｈＣＧで行った。卵子はＳＦ注入に先立ち、インヒビター（１００μＭ）とともに３０分間かけて予備インキュベートし、次いで注入後、Ｌａｃ中で２時間にわたり培養した。各列毎に１５個の卵子（ｅ）を使用した。共通の上付き文字を共有しない横棒の下の処置は有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。数値は、相違するバッチの卵子で行われた３回のウエスターンブロット試験の平均値である。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、精子からオシロゲニンを単離する方法およびオシロゲニンの組換え製造方法に関する。このたんぱく質は次いで、卵母細胞の単為生殖活性化の増強および精子受精能力の増強に使用することができる。このたんぱく質またはこのたんぱく質をコードする核酸の検出を使用して、精子受精能力を推定することができる。本発明はまた、オシロゲニン活性を調節し、これにより受精の調節を考慮するものである。
【００４８】
Ｉ．定義
「オシロゲニン」（ｏｓｃｉｌｌｏｇｅｎｉｎ）の用語は、未活性化卵母細胞中に注入された場合、Ｃａ２＋振動の原因となるたんぱく質を意味する。精子細胞抽出物から精製されたオシロゲニンの場合、この「精製オシロゲニン」は、少なくとも３種のクロマトグラフィーカラムを通すオシロゲニンの引き続く処理および［Ｃａ２＋］ｉ放出性フラクションの採取によって得られる。このフラクションは銀染色によって評価して、オシロゲニンおよび約５種の別種のたんぱく質を含有するものと見做される。さらに好適な精製オシロゲニン組成物は、銀染色によって測定して、オシロゲニンおよび約３種の別種のたんぱく質を含有するものと見做される。使用される好適順次的クロマトグラフィーカラムは、例１に記載されているとおりである。
【００４９】
「順次的処理」の用語は、例１に記載の順序で使用すると好ましいカラムを意味する。
「核酸」または「核酸分子」の用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは組換えＤＮＡまたはＲＮＡを包含する意味を有する。
「動物」の用語は、脊椎動物門（例えば、カエル類、サンショウウオ類、ニワトリ類、またはウマ類）および非脊椎動物門（例えば、ぜん虫類等）を包含する動物世界の全員を意味する。好適動物は哺乳動物である。好適哺乳動物は家畜動物（例えば、ウシ、バファロー、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギのような有蹄動物）、およびげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラットおよびモルモット）、イヌ、ネコおよび霊長目動物を包含する。「非ヒト」の用語は、全部の動物、特に哺乳動物を意味し、特にヒト霊長類以外の霊長類を包含する。
【００５０】
「代理母」（Ｆｅｍａｌｅ　ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）の用語は、本発明の胚が妊娠のために挿入される雌の動物を意味する。代表的に、代理母は、胚と同一種の動物種であるが、この代理母は相違する動物種であることもできる。本明細書で使用されているものとして、胚は２個または３個以上の細胞を包含することができる。
「細胞質」の用語は、核が除去された残りの細胞部分を意味する。
「単為生殖活性化」（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の用語は、その核が雄の核または雄細胞との融合を伴うことなく、接合体（受精卵）を形成する卵子または卵母細胞の発現を意味する。
【００５１】
「卵母細胞」の用語は、Ｃａ２＋振動を受けなかった有核または除核動物卵子を意味する。
「活性化卵母細胞」の用語は、単為生殖活性化されたように、または受精されたように作用する卵母細胞を意味する。
「除核卵母細胞」の用語は、その内因性の核が除去または不活性化された動物卵子を意味する。
「精子」、「精液」、「精子試料」、および「精液試料」の用語は、精子を含有する雄動物からの射出液を意味する。成熟精液細胞は、「精子」であり、他方、その先駆体は「精子細胞」である。精子細胞は精子形成において二次減数分裂による分裂の単相体（ハプロイド）生成物であり、これは精子に分化する。
【００５２】
「精子受精能力」の用語は、卵子を受精させ、胚を創出させる精子の能力を意味する。「精子［Ｃａ２＋］ｉ放出活性」の用語は、卵母細胞（いずれかの動物の）を活性化する精子の能力を意味し、この能力は卵母細胞におけるＣａ２＋振動の誘発によって測定することができる。
「精子細胞質フラクション」の用語は、核および遺伝物質の大部分が欠落している細胞の部分を意味する。好ましくは、細胞質フラクションは、核およびその遺伝物質を除き、血漿膜内に含有されている物質を包含する。
「誘発」、「増加」、「増強」または「アップレギュレーション」（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）の用語は、オシロゲニン活性のレベルを上昇させる能力を意味する。「活性化を増強する」の用語は、卵母細胞活性化を増加する方法または薬剤を意味する。
【００５３】
「調節」または「調整」の用語は、各生物に見出されるオシロゲニン活性度の野生型レベルからの薬剤の変更能力（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション能力）を意味する。オシロゲニン活性は転写、翻訳、核酸またはたんぱく質安定性、またはたんぱく質活性のレベルであることができる。
「抗体フラグメント」および「免疫原性フラグメント」の用語は、オシロゲニンまたはその断片を認識し、次いで結合することができる免疫原性たんぱく質ペプチドを意味する。これには、抗−オシロゲニン抗体またはそのポリペプチドフラグメントが包含される。
「細胞質内精子注入」（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐｅｒｍ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または「ＩＣＳＩ」の用語は、精子または精子の少なくとも遺伝的内容物を卵母細胞に注入することを意味する。
【００５４】
「核輸送」または「核移植」の用語は、その内因性核の除去前または除去後にドナー細胞核を細胞中に移植する、クローニング方法を表わす。細胞質は、除核卵母細胞、除核ＥＳ細胞、除核ＥＧ細胞、除核胚細胞または除核体細胞からのものであることができる。核輸送技術または核移植技術は刊行物から公知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）；Ｃｏｌｌａｓ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｃ．３８：２６４−２６７（１９９４）；Ｋｅｅｆｅｒ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５０：９３５−９３９（１９９４）；Ｓｉｍｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）；Ｅｖａｎｓ等、ＷＯ９０／０３４３２；Ｓｍｉｔｈ等、ＷＯ９４／２４２７４；およびＷｈｅｅｌｅｒ等、ＷＯ９４／２６８８４）。また、米国特許Ｎｏ．４，９９４，３８４および同５，０５７，４２０には、ウシ核移植にかかわる方法が記載されている。本明細書において、「核輸送」または「核移植」または「ＮＴ」は、相互変換的に使用されている。
【００５５】
「核輸送単位」および「ＮＴ単位」の用語は、体細胞または細胞核と除核細胞質（例えば、除核卵母細胞）間の融合または注入による生成物を表わし、これらは時に、融合ＮＴ単位とも称される。
「体細胞」の用語は、多細胞生物、好ましくは動物の配偶子にならない細胞を意味する。
「単離」または「精製」オシロゲニンの用語は、別種の非オシロゲニンたんぱく質、ペプチドまたは核酸からオシロゲニンたんぱく質またはペプチドを組換え方法によって調製するために用いられる細胞から、あるいは、それが単離される精子から、実質的に精製されているＣａ２＋活性たんぱく質を意味する。
【００５６】
「たんぱく質キナーゼインヒビター」の用語は、たんぱく質上の、ＡＴＰからヒドロキシル側鎖へのホスフェートの輸送を触媒し、これによりたんぱく質の機能の変化を生じさせる酵素を阻害する薬剤を意味する。本発明の好適たんぱく質キナーゼインヒビターは、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ブチロラクトン、ロスコビチン（ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、ｐ３４（ｃｄｃ２）インヒビター、２−アミノプリンおよびスフィンゴシン（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）である。
「ホスファターゼ」の用語は、ホスホモノエステルを加水分解する酵素を意味する。本明細書に記載の好適ホスファターゼは、ホスファターゼ２Ａおよび２Ｂである。
「カルシウムイオノホア」の用語は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）が脂質二重層を横断することを可能にする薬剤を意味する。好適カルシウムイオノホアは、イオノマイシンおよびＡ２３１８７を包含する。
【００５７】
「分化する」または「分化」の用語は、細胞が特定のフラクションに特殊化される生物の発生におけるプロセスを表わす意味を有する。分化はゲノムの部分の選択的発現が存在することを要する。
「内部細胞塊」（ｉｎｎｅｒ　ｃｅｌｌ　ｍａｓｓ）または「ＩＣＭ」の用語は、胚を生じさせ、また栄養芽層を除く、全部の組織、胚および胚体外部を潜在的に形成することができる哺乳動物線維芽細胞に見出される細胞グループを意味する。
「フィーダー層」（ｆｅｅｄｅｒ　ｌａｙｅｒ）の用語は、別の細胞を培養するために、特に低密度またはクローナル密度でこれらの細胞を培養するために、培地を条件調節する細胞層を意味する。
「媒質」または「培地」の用語は、細胞および組織を成長させる栄養溶液を意味する。
【００５８】
「医薬上で許容される担体」の用語は、本明細書で用いられているものとして、化学物質の運搬または輸送に含まれる医薬上で許容される物質、組成物またはベヒクル、例えば液体または固体充填剤，稀釈剤，賦形剤、溶媒またはカプセル封入物質を意味する。稀釈剤または担体成分は、活性化合物（１種または２種以上）の治療効果を減少させないものでなければならない。
本明細書で用いられているものとして、「組成物」の用語は、１種以上の要素または成分の混合物または組合せから得られる生成物を意味する。
【００５９】
ＩＩ．精子からのオシロゲニンの単離方法
オシロゲニンを含有する精子フラクションは、Ｗｕ等により開示されたとおりに細胞質ゾル精子抽出液を先ず調製することによって、動物精子から得ることができる（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｏｌ．４６：１７６−８９（１９９７）及び同刊行物４９：３７−４７（１９９８））。簡単に言えば、精液試料をＴＬ−ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）媒質により２回洗浄し、この精子ペレットを７５ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭヘペス、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭグリセロホスフェート、１ｍＭ　ＤＴＴ、２００μＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する溶液（ｐＨ７．０）に再懸濁する。この精子懸濁液を、４℃で約２０〜３５分かけて音波処理する［ＸＬ２０２０、Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ］。この溶解物（ライゼート）を次いで、１００００ｘｇで２回、回転させ、次いで上清を採取する。得られた上清を次いで、１０００００ｘｇで４℃において１時間かけて遠心処理する。この清明な上清は精子の細胞質ゾルのフラクションを表わす。活性精子フラクションは、例えば凍結防止剤（低温保護剤）の不存在下に精子を凍結および解凍する処理を２回行うことによってブタ精子から得ることもできる。
【００６０】
このようにして得られた細胞質ゾルフラクションを次いで、硫酸アンモニウム沈殿（５０％）に付し、沈殿させる。この沈殿は次いで、遠心処理することによってペレット化し、延長された期間にわたり−２０〜−８０℃において保存することができる。このペレットは再構成することができ、またオシロゲニンの単離および／または精製のために下記クロマトグラフィー方法に付すことができる。再構成されたペレットを先ず、ヒドロキシアパタイトＦＰＬＣクロマトグラフィーカラムに付し、次いでクロマトホーカッシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）カラムに付し、次いでスーペローズ１２ＦＰＬＣクロマトグラフィーカラムに付す。ほぼ３０〜約６８ｋＤａの分子量で溶出するフラクションは、［Ｃａ２＋］ｉ誘発剤、オシロゲニンを含有する。これらのクロマトグラフィーカラムの条件は、Ｗｕ等（１９９８）により使用された各クロマトグラフィーカラムについて記載されているとおりに使用することができる。Ｗｕ等（１９９８）は、本明細書に記載されているとおりのクロマトグラフィーカラムの特定の順次使用を開示しておらず、また活性化要因（１種または２種以上）を含有する特定のフラクションを使用すべきであることを開示していない。
【００６１】
ＩＩＩ．オシロゲニンの特徴確認
オシロゲニンを精子から単離したならば、ペプチド配列決定することができる。このようにして同定されたペプチド配列を使用し、オシロゲニンをコードする遺伝子を同定するためのライブラリィのスクリーニングに用いることができる、変質したプローブ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｏｂｅｓ）を創出することができる。
【００６２】
本発明はさらにまた、好ましくは単離形態で、オシロゲニンおよび関連たんぱく質をコードする核酸分子を提供する。本明細書で使用されているものとして、「核酸」は、オシロゲニンまたはそのポリペプチド断片をコードするか、またはオシロゲニンまたはそのポリペプチド断片をコードする核酸配列に対して相補的であるか、またはこのような核酸とハイブリッド形成し、適切な厳格条件下にそれと安定に結合したまま残されているか、または当該ペプチド配列と少なくとも７５％の同一配列、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、もっとも好ましくは少なくとも９０〜９５％の同一配列を共有するポリペプチドをコードするＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｒＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であると定義される。
【００６３】
詳細に見れば、これはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに別の幹鎖に基づく核酸であり、あるいは天然源または合成されたものから誘導されたどちらかの塩基を包含する核酸である。しかしながら、このようなハイブリッド形成性または相補性核酸はまた、適切な厳格条件下にコードし、ハイブリッド形成する核酸、あるいは、本発明に従いオシロゲニンをコードする核酸に対して相補的である核酸を含有する、いずれかの従来技術の核酸全般に対して新規であって非自明性を有するものとして定義される。
【００６４】
「厳格な条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温を使用する条件であり、例えば５０℃において０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、０．１％　ＳＤＳを使用する；または（２）ハイブリッド形成期間中、ホルムアミドのような変性剤を使用し、例えば０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．１％ポリビニルピロリドン、および７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．５）とともに、５０％（容積／容積）ホルムアミドを４２℃で使用する。もう一つの例では、５０％ホルムアミド、５Ｘ　ＳＳＣ（０．７５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘデンハード（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃において使用し、４２℃で０．２Ｘ　ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中における洗浄を伴う。当業者は、明確で検出可能なハイブリッド形成シグナルを得るために、またはＭＡＮＴＡＴＩＳ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）に記載の材料および方法を使用するために、適する厳格な条件を容易に決定し、また変更することができる。
【００６５】
本明細書で用いられているものとして、核酸分子は、当該核酸分子が別種のポリペプチドをコードする夾雑核酸から実質的に分離されている場合、「単離」または「精製」されているものと言う。
本発明はまた、コード核酸分子の断片を提供する。本明細書で用いられているものとして、「コード核酸分子の断片」の用語は、核酸配列をコードする完全たんぱく質の小部分を表わす。この断片のサイズは意図する用途に応じて決定される。一例として、たんぱく質の活性部分をコードする断片を選択する場合、この断片は当該たんぱく質の１つまたは２つ以上の生物学的に活性な領域（１または２以上）をコードするために充分に大きいものであることを要する。この断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用される場合、この断片の長さは、プロービング／プライミング中に比較的少ない数の偽陽性を示すように選択する。
【００６６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用、または本発明のたんぱく質をコードする遺伝子配列の合成用にプローブまたは特異プライマーとして用いられる本発明のコード核酸分子の断片（すなわち、合成オリゴヌクレオチド）は、化学技術、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉ等のホスホトリエステル法により（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１０３：３１８５−９１（１９８１））または自動式合成方法を用いて容易に合成することができる。さらに、より長いＤＮＡセグメントは、周知の技術、例えば遺伝子の種々の修正セグメントを定める一群のオリゴヌクレオチドを合成し、次いでオリゴヌクレオチドをリゲート（連結反応）し、完全修正遺伝子を構築することによって容易に調製することができる。
【００６７】
本発明のコード核酸分子はまた、診断およびプローブの目的に対して検出可能な標識を含有するように修飾することができる。種々のこのような標識は当技術で公知であり、本明細書に記載のコード分子とともに容易に使用することができる。適当な標識には、これらに制限されないものとして、ビオチン、放射標識付けヌクレオチド等が包含される。標識した核酸分子を得るためには、当業者は公知標識技術のいずれかを使用することができる。
【００６８】
翻訳中にたんぱく質配列中に挿入されたアミノ酸の削除、付加または変更による一次構造それ自体に対する修飾は、たんぱく質の活性を破壊することなく達成することができる。このような置換またはその他の変更は、本発明の意図する範囲内に包含される核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するたんぱく質をもたらす。
【００６９】
基本的に、当業者はオシロゲニンのアミノ酸配列を容易に使用し、適切な細胞から調製された発現ライブラリィをスクリーニングするための抗体プローブを生成することができる。代表的に、精製たんぱく質（以下に記載する）またはモノクローナル抗体により免疫付与されたウサギなどの哺乳動物からのポリクローナル抗血清を使用し、哺乳動物ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリィ、例えばλｇｔｌｌを探索することができ、たんぱく質一族の別のメンバーに対する相当するコード配列を得ることができる。このクローン化されたｃＤＮＡ配列は、それ自体の制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を直接に用いて発現されるか、または酵素の発現に用いられる特定のホストに対応する制御配列を用いた構築によって発現される、融合たんぱく質として発現させることができる。
【００７０】
別様に、本明細書に記載されているコード配列の部分は、合成することができ、いずれかの生物からのたんぱく質のオシロゲニン一族のメンバーをコードするＤＮＡを補うプローブとして使用することができる。約１８〜２０個のヌクレオチドを含有するオリゴマー（約６〜７個のアミノ酸鎖をコードする）を調製し、厳格な条件下または偽陽性の適当ではないレベルを減少させるのに充分厳格な条件下におけるハイブリッド形成を達成し、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリィのスクリーニングに使用する。オシロゲニンの約８個、９個、１０個、１５個またはそれ以上の連続アミノ酸をコードするオリゴマーを調製することもできる。
【００７１】
さらにまた、対になっているオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し、コード核酸分子を調製し、これを選択的クローン化することもできる。このようなＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ変性／アニーリング／延長サイクルは当技術で周知であり、また別のオシロゲニンをコードする核酸分子の単離に使用するために、またはＮＥＷＴＯＮ等、ＰＣＲ（１９９７）に記載されているとおりに使用するために、容易に適応させることができる。
【００７２】
組換えオシロゲニン：本発明はまた、コード配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡｓ）を提供する。本明細書で使用するものとして、ｒＤＮＡ分子は、分子操作にその場で付されるＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は当業者に周知であり、例えばＳＡＭＢＲＯＯＫ等、ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）を参照することができる。好適なｒＤＮＡ分子の場合、コードＤＮＡ配列は発現制御配列および／またはベクター配列に操作可能に結合される。
【００７３】
オシロゲニンコード配列が操作可能な状態で結合されるベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当業者にとって周知のように、所望される機能的性質、例えばたんぱく質発現および形質転換されるホスト細胞に直接に依存する。本発明が意図するベクターは、少なくともホスト染色体における複製または挿入に向けることができ、好ましくはまた、ｒＤＮＡ分子に包含される構造遺伝子の発現にも向けることができるものである。
【００７４】
操作可能に結合されているたんぱく質コード配列の発現を調整するために用いられる発現制御要素は、当技術で公知であり、これらに制限されないものとして、誘発性プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、およびその他の調節要素を包含する。好ましくは、誘発性プロモーターは、例えばホスト細胞媒質中の栄養物質に応答するように、容易に制御されるものである。
【００７５】
一態様において、コード核酸分子を含有するベクターは、原核レプリコン（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｒｅｐｌｉｃｏｎ）、すなわちそこで形質転換される細菌ホスト細胞などの原核ホスト細胞中の組換えＤＮＡ分子を染色体外的に直接自動的複製し、また管理する能力を有するＤＮＡ配列、を包含する。このようなレプリコンは当業者にとって周知である。さらに、原核レプリコンを包含するベクターはまた、その発現が薬剤耐性などの検出可能なマーカーを付与する遺伝子を包含することができる。代表的細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）またはテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）に対する耐性を付与する遺伝子である。
【００７６】
原核レプリコンを包含するベクターはまた、細菌ホスト細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）に向けることができる原核またはバクテリオファージプロモーターを包含することができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の生起を可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。細菌ホストに適応するプロモーター配列は代表的に、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合がよい制限部位を含有するプラスミドベクターに備えられている。このようなプラスミドベクターの代表例には、Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）がある。
【００７７】
真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターはまた、コード配列を含有するｒＤＮＡ分子の形成に使用することができる。真核細胞発現ベクターは当業者に周知であり、数件の市場供給源から入手することができる。代表的に、これらのベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に都合がよい制限部位を含有して提供される。このようなベクターの代表例には、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、およびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ，＃３１２５５）などの真核発現ベクターがある。
【００７８】
本発明のｒＤＮＡ分子の構築に用いられる真核細胞発現ベクターはまた、真核細胞で有効である選択性マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを包含することができる。好適な薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｍ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１（１９８２））。別様に、この選択性マーカーは、別のプラスミドに存在させることができ、これら２種のベクターをホスト細胞の同時トランスフェクションにより導入し、この選択性マーカーに適する薬剤とともに細胞を培養することによって選択する。
【００７９】
本発明はさらにまた、本発明のたんぱく質をコードする核酸分子により形質転換されたホスト細胞を提供する。このホスト細胞は原核または真核のいずれかであることができる。本発明のたんぱく質の発現に有用な真核細胞には、当該細胞系が細胞培養方法に適応し、また発現ベクターの増殖および遺伝子生成物の発現に適合する限り、制限はない。好適真核ホスト細胞は、これらに制限されないものとして、酵母菌、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト細胞系からの細胞を包含する。好適真核ホスト細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１６５８）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、線維芽細胞および類似の真核組織培養細胞系を包含する。
本発明のたんぱく質をコードするｒＤＮＡ分子の発現には、いずれかの原核ホストを使用することができる。好適原核ホストは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００８０】
適当な細胞ホストの本発明によるｒＤＮＡ分子による形質転換またはトランスフェクションは、代表的に使用されるベクターのタイプおよび使用されるホスト系に依存する周知の方法によって行われる。原核ホスト細胞の形質転換に関して、電気泳動および塩処理方法が代表的に用いられる、例えばＣｏｈｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）およびＭＡＮＩＡＴＩＳ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）およびＳＡＭＢＲＯＯＫ等、（１９８９）を参照することができる。ｒＤＮＡを含有するベクターを用いる脊椎動物細胞の形質転換に関しては、電気泳動、カチオン性脂質または塩処理法を代表的に用いることができ、例えばＧｒａｈａｍ等、Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１３７３−７６（１９７９）を参照することができる。
【００８１】
好結果を得て形質転換された細胞、すなわち本発明の新規核酸分子（例えば、ｒＤＮＡ）を含有する細胞は、選択可能なマーカーによる選択を包含する周知の技術によって同定することができる。一例として、本発明のｒＤＮＡの導入から得られる細胞は、クローン化し、単一コロニイを生成することができる。これらのコロニイからの細胞を繁殖させ、ライゼーションし、次いでそれらのＤＮＡまたはＲＮＡ含有量を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−１７（１９７５）またはＢｅｒｅｎｔ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８（１９８５）に記載のとおりの方法を用いてオシロゲニン核酸の存在のために調査するか、または当該細胞から生成されたたんぱく質を免疫学的検出方法により評価することができる。
【００８２】
組換えオシロゲニンたんぱく質：本発明はさらにまた、本明細書に記載の組換え核酸分子を用いて、本発明のたんぱく質を製造する方法を提供する。一般的に言えば、このたんぱく質の組換え形態の製造は代表的に、下記工程を包含する：
最初に、本発明のオシロゲニンたんぱく質をコードする核酸分子を得る。このコード配列、好ましくはイントロンに欠くコード配列はいずれかのホストにおける発現に直接に適している。この配列はホスト細胞、例えば真核細胞または原核細胞中にトランスフェクトすることができる。真核細胞ホストには、哺乳動物細胞、および組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）がある。別法として、オシロゲニンの一部のみをコードする断片を単独で、または融合たんぱく質の形態で発現させることができる。この融合たんぱく質は精製することができ、次いでポリクローナル抗体の生成に使用することができる。
【００８３】
この核酸分子は次いで、好ましくは上記のとおりの適当な制御配列と操作可能状態での結合に付し、オシロゲニンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する発現ユニットを形成する。この発現ユニットを使用し、適当なホストを形質転換し、次いでこの形質転換された細胞を組換えたんぱく質の産生を可能にする条件下に培養する。場合により、この組換えたんぱく質を培地から単離するか、または細胞から単離する。たんぱく質の回収および精製は、数種の不純物が許容されうる場合などのいくつかの場合、不必要であることもある。
【００８４】
前記工程はそれぞれ、種々の方法で行うことができる。一例として、所望のコード配列はゲノム断片から得ることができ、また適当なホストで直接に使用することができる。種々のホストにおいて操作可能である発現ベクターの構築は、相当するレプリコンおよび制限配列を用いて、例えば上記のとおりに行うことができる。制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、当該遺伝子の発現に用いられるホスト細胞の種類に依存する。適当な制限部位は、正常では利用できない場合、これらのベクター中に挿入する削除可能な遺伝子が得られるようにコード配列の末端に付加することができる。当業者は本発明の核酸分子とともに用いられる公知のいずれかのホスト／発現系に適合させて、所望の組換えたんぱく質またはポリペプチドを生成することができる。
【００８５】
ＩＶ．核輸送にオシロゲニンを用いる卵母細胞の単為生殖活性化方法
本発明の重要な態様は、卵母細胞の単為生殖活性化にオシロゲニンを用いることにある。このような活性化は、（１）オシロゲニンを単独で、または別のＣａ２＋振動化剤と組合わせて投与する、および（２）オシロゲニンを精子または体細胞と組合わせて投与することによって生じさせることができる。オシロゲニンは細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、精子受精能力試験（例えば、オシロゲニン増加の効率）、およびインビトロ受精（ＩＶＦ）に、精子と組合わせて使用することができる。
【００８６】
インビトロ受精方法：受精方法としては、Ｌｏｎｇ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６：２３−３２（１９９３）；Ａｌａｎ　Ｏ．Ｔｒｏｕｎｓｏｎ等、ＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＩＮ　ＶＩＴＲＯ　ＦＥＲＩＴＩＬＩＺＡＴＩＯＮ（１９９９）；およびＢｒｉｇｉｄ　Ｈｏｇａｎ等、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９９４）に記載の方法を使用することができる。代表的に、例えば集めた精液（これは低温保存することさえできる）を、パーコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）法（Ｈｏｓｓａｉｎ等、Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．３７：１８９−９５（１９９６））を用いて処理する。分離された運動能力を有する精子を、５００，０００精子／ｍｌの最終濃度で添加する。この受精メディウム（培地）にヘパリン（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を添加し、精子受精能力を誘発させる（Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３８：１１７１−８０（１９８８））。卵子を精子とともに少なくとも４時間インキュベートした後、監視を始める。引き続いて［Ｃａ２＋］ｉ振動を示す卵子を固定し、次いで染色し、受精を確認する。この固定方法および染色方法、ならびに接合体の受精段階の分類に用いられる臨界条件は、Ｆｉｓｓｏｒｅ等（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４７：９６０−９（１９９２）およびＬｏｎｇ等（１９９３）により開示されたとおりである。
【００８７】
培地、カルシウムイオノホア、リン酸塩およびたんぱく質キナーゼインヒビター：除核卵母細胞または有核（核形成）卵母細胞へのオシロゲニンの注入に加えて、微量注入された卵母細胞、別の細胞からの核などの、これらの細胞はまた、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）に富む培地中でインキュベートすることができる。別法として、またはＣａ２＋に富む培地中での培養に加えて、卵母細胞をカルシウムイオノホアと結合させるか、またはカルシウムイオノホア（例えば、イオノマイシンおよびＡ２３１８７）、たんぱく質キナーゼインヒビター（例えば、６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、ブチロラクトン、ロスコビチン、ｐ３４（ｃｄｃ２）インヒビター、スタウロスポリン、２−アミノプリンおよびスフィンゴシンまたはその他のセリン−スレオニンキナーゼインヒビター）またはホスファターゼ（例えば、ホスファターゼ２Ａまたはホスファターゼ２Ｂ）に曝露し、細胞（例えば、卵母細胞）におけるカルシウム振動を増強させることができる。カルシウムイオンに富む培地中におけるインキュベーションは、Ｗａｎｇ等により開示されたとおりに行うことができる（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５３：９９−１０７（１９９９））。また、別の二価カチオン、例えばマグネシウム、ストロンチウムおよびバリウムを利用し、少なくともげっ歯類卵母細胞を活性化することができる。二価カチオンレベルはまた、電気衝撃、エタノールによる卵母細胞の処理、およびケージ化キレート形成剤による卵母細胞の処理を用いて増加させることができる。
【００８８】
カルシウムイオノホアは代表的に、たんぱく質キナーゼインヒビターと組合わせて使用する。本発明の態様は、イオノホアおよびオシロゲニンまたはたんぱく質キナーゼインヒビターおよびオシロゲニンのどちらか、またはこれら３種の全部の使用を意図する。たんぱく質キナーゼインヒビターは、米国特許Ｎｏ．５，９４５，５７７に記載のとおりに使用することができる。たんぱく質キナーゼインヒビターと組合されているカルシウムイオノホアは、下記刊行物に記載のとおりに使用することができる：Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：７２９−３９（１９９４）；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０：８２１−７（１９９９）；Ｌｉｕ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６１：１−７（１９９９）；Ｍａｙｅｓ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：２７０−５（１９９５）；および米国特許Ｎｏ．５，４９６，７２０。代表的に、卵母細胞は短時間（例えば、ほぼ５分間）にわたりイオノホアに曝露する。ホスファターゼはまた、米国特許Ｎｏ．５，９４５，５７７に記載されているように、カルシウムレベルの増加に使用することができる。
【００８９】
卵母細胞の単為生殖活性化：卵母細胞の単為生殖活性化は、下記方法を包含する数種の方法により誘発させることができる：（１）シクロヘキシイミドと組合されているサイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）ＤおよびＣａ−イオノホアによる基本的処理；（２）電気衝撃；（３）シクロヘキシイミドおよび電気パルス処理（Ｂｏｄｏ等、Ａｃｔａ　Ｖｅｔ．Ｈｕｎｇ，４６：４９３−５００（１９９８）参照）；（４）カルシウムイオノホア（例えば、Ａ２３１８７）とたんぱく質キナーゼＣ刺激剤（例えば、ホルボールエステル）（Ｕｒａｎｇａ等、Ｉｎｔ‘ｌ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０：５１５−９（１９９６））の組合せ使用；（５）７％（ｖ／ｖ）エタノール溶液への卵母細胞の曝露（Ｌａｉ等、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：７７１−５（１９９４））；（６）プロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を用いる誘発（Ｄｅ　Ｓｕｔｔｅｒ等、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．９：３２８−３７（１９９２））；
【００９０】
（７）ストロンチウムイオンに富む培地中における卵母細胞のインキュベーション（Ｏ’Ｎｅｌｌ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：２１４−９（１９９１）；および（８）２００μｍチメロゾール（これはブタ卵母細胞におけるＣａ２＋振動を誘発させることが見出されている）（Ｍａｃｈａｔｙ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１１２３−７（１９９７））。単為生殖活性化誘発方法に加えて、この活性化の効率は卵母細胞の低温保存によって影響を受けることがある（例えば、Ｌａｉ等、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖ．６：７７１−５（１９９４）参照）。従って、本発明の別の態様は、低温保存により誘発される単為生殖効率の低下を補償すること、および新しく収穫された細胞を用いて卵母細胞の単為生殖活性化の総合効率を改良する新規材料を提供することにある。
【００９１】
Ｖ．ＩＣＳＩ増強方法
本出願のもう一つの態様は、動物交配およびインビトロ受精（ＩＶＦ）におけるＩＣＳＩ効率を増加させるためにオシロゲニンを用いることにある。上記したように、オシロゲニンは単独でＩＣＳＩ技術に使用するか、または１種または２種以上のカルシウムイオノホア、たんぱく質キナーゼインヒビター、ホスファターゼまたはカルシウムに富む培地と組合わせて、ＩＣＳＩ技術に使用することができる。精子−卵母細胞融合をさらに増強させるために、電気的刺激をＹａｎａｇｉｄａ等により開示されたとおりに利用することができる（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１４：１３０７−１１（１９９９））。
【００９２】
上記に挙げた方法と組合わせて使用することができるもう一つの方法は、Ｔｅｓａｒｉｋ等により開示されたように（Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６４：７７０−６（１９９５）、卵母細胞の細胞質を激しく吸引し、ＩＣＳＩ結果を改良することにある。
【００９３】
キナーゼ分析：キナーゼ分析は、オシロゲニン誘発［Ｃａ２＋］ｉ振動が卵母細胞の活性化を生起させることができることを測定するために使用することができ、これにより上記技術および組成物の組合せのそれぞれの効率を測定することができる。適当なキナーゼ分析は、ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）Ｈ１およびミトゲン活性化たんぱく質（ＭＡＰ）キナーゼ分析を包含し、これはＦｉｓｓｏｒｅ等により記載されたとおりに行うことができる（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：１２６１−７０（１９９６））。従来示されているように（同上刊行物）、ミエリン塩基性たんぱく質（ＭＢＰ）は、大部分のＭＡＰキナーゼ活性の測定するものと予測される。一群５個の卵子を、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５００ｎＭたんぱく質キナーゼＡインヒビター、８０ｍＭ　β−グリセロホスフェート、２０ｍＭ　ＥＧＴＡ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌおよび１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有Ｈ１キナーゼ緩衝溶液５μｌ中に移す（これはＣｏｌｌａｓ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３４：２２４−２３１（１９９３）に記載されている）。卵子は、凍結および解凍反復サイクルによってライゼートし、次いでキナーゼ分析が行われるまで−８０℃で保存する。
【００９４】
キナーゼ反応は、２ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１（タイプＩＩＩ−Ｓ、Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌ　ＭＢＰ（Ｓｉｇｍａ）、０．７ｍＭ　ＡＴＰ、および［γ−３２Ｐ］（Ａｍｅｒａｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）５０μＣｉを含有する溶液５μｌを、粗製卵子ライゼート５μｌに添加することによって開始させる。この反応は、３０℃において３０分間かけて行い、ＳＤＳ試料緩衝液５μｌの添加によって停止させる（Ｌａｅｍｍｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５（１９７０））。試料は３分間にわたり沸騰させ、次いで約１２または１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に付加する。対照試料は代表的に、卵母細胞を除く反応用の全成分を含有する。ヒストンＨ１およびＭＢＰのホスホリル化は、−７０℃においてＤｕＰｏｎｔ’ｓ　Ｃｒｏｎｅｘ増感スクリーンまたは別の類似装置を用いるオートラジオグラフイによって可視化される。このようなキナーゼ分析を使用し、精子試料受精能力を評価することができ、また技術および／または組成物の特定の組合せの効率を評価することができる。キナーゼ分析を行うための他の条件は当業者にとって公知である。
【００９５】
少なくともげっ歯類において、卵母細胞が受精経路に誘導されたかを測定するための追加の方法は、二次極性体（ｓｅｃｏｎｄ　ｐｏｌａｒ　ｂｏｄｙ）が駆逐（ｅｘｔｒｕｄｅ）されたかによって測定することができる。二次極性体の駆逐（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）は、顕微鏡により見ることができる。また、イノシトールトリホスフェートレセプター（ＩＰ３Ｒ）のダウンレギュレーションは、受精、ＳＦ注入およびイノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）注入が生じた後にのみ明白になるが、卵母細胞がエタノール、カルシウムイオノホアまたはストロンチウムクロライドに曝露された場合には生じない。ＩＰ３Ｒのダウンレギュレーションは、ＲＮＡ転写のレベルまたはタンパク質合成レベルの両方で評価することができる。このような方法は当技術で一般的に公知であり、例えば下記刊行物を参照することができる：ＥＤ　ＨＡＲＬＯＷ等、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８８）；およびＳＡＭＢＲＯＯＫ等、ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）。
【００９６】
ＶＩ．精子受精能力を評価する方法およびキット
本発明の追加の態様は、精子受精能力の測定手段として精子のオシロゲニン含有量を測定することにある。この含有量は、精子中のオシロゲニンの濃度および／または局在化を検出することによって測定することができる。オシロゲニンは、オシロゲニンを認識し、そこに結合する抗体またはその免疫原性断片を用いて評価することができる。別法として、オシロゲニンはまた、ｍＲＮＡ類を検出する核酸プローブを用いて評価することもできる。これらの方法は、下記技術のいずれかを使用し、または例に記載のとおりに行うことができる。
【００９７】
一態様において、本発明は試験される動物精子中のオシロゲニンの存在および濃度を測定することによって受精能力を測定する方法を提供する。この方法において、精子試料中のオシロゲニンの存在または不存在は、存在する場合、抗−オシロゲニン抗体に結合する試料からの精子中のオシロゲニンの量を測定することによって評価される。抗−オシロゲニン抗体は、ポリクローナルであるが、好ましくはモノクローナルである。オシロゲニンはまた、本発明のモノクローナル抗体を同定することもできる。
【００９８】
代表的に、家畜動物において、約１ｘ１０９精子／ｍｌが射出される。動物の受精能力は次いで、採取試料をオシロゲニンの存在および濃度について分別することによって測定することができる。抗体を使用する試験は、ウエスターンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析法、ＥＬＩＳＡ法および当業者にとって公知の他の免疫分析法を使用して行うことができる。
【００９９】
酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）：オシロゲニンの好適免疫学的検出手段は、ＥＬＩＳＡ法である。たんぱく質試料を次いで、これらのプレートと接触させる。試料は好ましくは、インキュベーション適応緩衝液中の既知数の精子から分離したオシロゲニンを稀釈することによって調製する。この試料をウェルに入れ、約２５℃〜約３７℃の温度範囲、好ましくは約３７℃において約１時間〜約４時間の期間にわたり、好ましくは１時間にわたりインキュベートする。この試料含有ウェルは、検出抗体（例えば、抗−オシロゲニン抗体）をウェル中に導入する前に、充分に洗浄する。
【０１００】
抗体は、第二の抗体を用いて直接に標識付けまたは検出することができ、または検出することができる。この標識は適当には、免疫分析で使用するためのモノクローナル抗体または抗体断片に常習的に結合するいずれか、例えば酵素（例えば、ホースラディッシユペルオキシダーゼ）、発色団、蛍光団（例えば、緑色蛍光たんぱく質、青色蛍光たんぱく質、またはルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））、または放射性標識（例えば、１２５Ｉ）であることができる。標識は、慣用の架橋剤を経る方法を包含するいずれか慣用の方法によって、モノクローナル抗体に結合させることができる。ＥＤ　ＨＡＲＬＯＷ等、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８８）を参照することができる。
【０１０１】
ウエスターンブロットおよび免疫沈澱法：不動状態のたんぱく質濃度を分析する場合、ウエスターンブロット法を用いることができる。ウエスターンブロットの場合、典型的方法は下記のとおりに行うことができる：例えば２００μｌの精液中に含有されている等しい数の精子を、ツイーン（ＴＷＥＥＮ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびプロテアーゼインヒビターを含有するリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１ｍｌを含有する１．５ｍｌ微量遠心分離管に加え、次いで４０００ｒｐｍで遠心処理し、精液を分離する。精子は、試料緩衝液に添加する前に２〜３回洗浄することができ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）、また１０〜１５％、好ましくは１２％ポリアクリルアミドゲルに適用する前の５分間にわたり沸騰させることができ、次いで移し、ウエスターンブロットに付すことができる。
【０１０２】
免疫沈澱法の場合、典型的方法はモノクローナル抗体をＨＺビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）または類似のビーズに結合させることによって行うことができる。洗浄した精子の膜を洗剤により、または機械的手段により溶解し、次いで遠心分離により分離する。これらのビーズを、上清に添加し、次いでたんぱく質を抗体に結合させる（〜１０分間）。これらのビーズを次いで、３回洗浄し、試料緩衝液中で沸騰させ、この試料緩衝液を１０〜１５％、好ましくは１２％ＰＥＧＥに適用する。たんぱく質の存在は、ゲルのコマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色、ＥＬＩＳＡまたはウエスターンブロットによるなどのいずれか適当なたんぱく質分析技術を用いて直接に測定することができる。別の免疫検出法は、ＨＡＲＬＯＷ等（１９８８）に記載されている。
【０１０３】
免疫蛍光法：オシロゲニンを認識し、結合する抗体を、蛍光標識を有する第二の抗体とともに使用することができる。この蛍光標識は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ローダミンＧＲＥＥＮＯおよびその他類似の蛍光標識であることができる。
電子顕微鏡分析：本発明のもう一つの態様において、電子顕微鏡を用いて、精子中のオシロゲニンの濃度および場所を分析することができる。精子は、Ｒ．Ｃ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．１９３：１４５−１４９（１９７３）に記載の方法によって電子顕微鏡用に固定することができる。
【０１０４】
ＶＩＩ．オシロゲニン活性を調整する方法および組成物
本発明の態様は、オシロゲニン活性を調整し、これにより精子受精能力および／または卵母細胞活性化を調整する組成物および方法を包含する。
一例として、オシロゲニンは、単独で、または（１）精子または遺伝的物質または（２）体細胞またはその遺伝的物質と組合わせて、標的卵母細胞中に投与することができる。オシロゲニンを、例えば精子と組合わせて投与する場合、オシロゲニンは、例えば精子の注入前、注入と同時に、または注入後に投与することができる。オシロゲニンはまた、カルシウムイオン振動を調節するいずれかの薬剤とともに投与することもできる。
【０１０５】
ＶＩＩ．抗体
本発明のもう一つの態様は、オシロゲニンを認識し、次いで結合する抗体または免疫原性断片にある。抗オシロゲニン抗体は、適当な免疫化方法およびオシロゲニンまたはその免疫原性ペプチドを用い、適当な哺乳動物ホストを免疫化することによって調製することができる。これらのペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０個の連続アミノ酸長さであることができ、または完全オシロゲニンたんぱく質であることができる。オシロゲニンまたはその免疫原性断片は適当な担体に結合させることができる。
【０１０６】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キイホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、または別種の担体たんぱく質などの担体との免疫原性結合体の製造方法は、当技術で周知である。或る場合、例えばカルボジイミド試薬を用いる直接結合が効果的であることもあるし；別の場合、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給されているもののような結合剤がハプテンへの接近可能性を提供するのに望ましいこともある。ハプテンプペチド（例えば、上記の長さを有する）は、Ｃｙｓ残基を備えたアミノまたはカルボキシ末端に伸長することもでき、またはシステイン残基で中断されて存在することもでき、例えばこれにより担体への結合が容易にされる。
【０１０７】
この免疫原の投与は、適当な長さの時間をかけて、また適当なアジュバントの使用を伴い一般に行われ、このことは当技術で一般的に理解されている。この免疫化計画の期間中、抗体力価を測定し、抗体形成の妥当性を決定する。
抗ペプチド抗体は、例えばオシロゲニンのアミノまたはカルボキシ末端１５〜２０アミノ酸に相当する合成ペプチドを用いて生成させることができる。合成ペプチドは、２〜３個の短い長さのアミノ酸であることができるが、好ましくは少なくとも約４〜約２０個、またはそれ以上の長さのアミノ酸残基を有する。このようなペプチドを、標準的方法を用いてＫＬＨに結合させ、ウサギなどの動物を免疫化することができる。げっ歯類（例えば、マウス）、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびその他の有蹄類などの別種動物を使用することもできる。ポリクローナル抗オシロゲニン抗体またはペプチド抗体は次いで、例えば共有結合したペプチドまたはたんぱく質を含有するアクチゲル（Ａｃｔｉｇｅｌ）ビーズを用いて精製することができる。
【０１０８】
この方法で生成されたポリクローナル抗血清は或る種の用途には充分なものであるが、医薬組成物の場合、モノクローナル（ｍＡｂ）調製物の使用が好ましい。不死化された細胞系（これは所望のモノクローナル抗体を分泌する）は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の標準的方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７（１９７５））を用いるか、または一般に公知であるように（例えば、Ｈａｒｌｏｗ等、１９８８参照）、リンパ球または脾臓細胞の不死化に有効である修正法を用いて製造することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞系は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドまたはたんぱく質である免疫分析法により選別することができる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養物を同定する場合、これらの細胞はインビトロで、または腹水液体中での産生により培養することができる。
【０１０９】
所望のモノクローナル抗体は次いで、培養上清から、または腹水上清から採取する。モノクローナルまたはポリクローナル抗血清のフラグメント（これはオシロゲニンを認識し、結合する区分を含有する）を使用し、オシロゲニンおよびオシロゲニンの潜在的レギュレーターを標識付けすることができる。免疫学的反応性断片、例えばＦａｂ、ＳＣＦＶ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片は、特に治療用途で好適であり、これらの断片は一般に、完全免疫グロブリンに比較して、小さい免疫原性を有する。
【０１１０】
（例）
例１
オシロゲニン濃縮化方法
下記方法を使用し、順次的クロマトグラフィーにより精子因子（ｓｐｅｒｍ　ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）、Ｃａ２＋放出活性化たんぱく質を濃縮化し、競合性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりエフェクターポリペプチドを同定することができる。
順次的クロマトグラフィーによるテンジクネズミ精子因子（ＳＦ）を分別し、次いで候補ポリペプチドを同定するために、下記方法を使用する：
【０１１１】
ａ）硫酸アンモニウムによる沈殿
活性物質は５０％飽和溶液で沈殿し、［Ｃａ２＋］ｉ−放出活性の２倍濃縮物を得る。
ｂ）ＨｉＴｒａｐ青色染料におけるアフィニティクロマトグラフィー
活性ポリペプチドは１Ｍ　ＫＣｌによりピークＮｏ．３として溶出される。これは４倍濃縮物をもたらす。
ｃ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
このカラムからの溶出は、増加する濃度のリン酸塩緩衝液を用いて達成される。活性たんぱく質はピークＮｏ．３（１８５ｍＭリン酸カリウム）で溶出され、活性の４倍濃縮化（肥沃化）を与える。
ｄ）スーペローズ１２（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２）におけるサイズ排除クロマトグラフィー
活性たんぱく質はピーク４で溶出し４３ｋＤａのＭＷを有する。これは、活性の４倍濃縮化をもたらす。
【０１１２】
これらの操作をそれぞれ独立して行う場合、組合わせ使用した場合に予測される濃縮（肥沃化）は、ほぼ１２８倍である。４種の操作は相違する生化学的性質に基づいていたが、それぞれが相違する群のテンジクネズミＳＦたんぱく質を枯渇させる（使い尽くす）点で格別に類似している。５０％硫酸アンモニウムペレットが１２匹の別々のテンジクネズミ精液から蓄積された。等量の一匹のテンジクネズミ精液を可溶化し、青色アフィニティカラムに通して処理した。ピークＮｏ．３たんぱく質を採取し、活性を充分に保存するために−８０℃で保存した。この操作を１２回、反復した。１２実験からのピークＮｏ．３フラクションを集め、ヒドロキシアパタイトカラム上に装填した。このヒドロキシアパタイトカラムからのピークＮｏ．３を採取し、濃縮し、次いで直ちにスーペローズ１２上に注入した。このカラムの活性ピーク（ピークＮｏ．４）中の各フラクション（２５０μｌ）をそれぞれ、別々に濃縮し、［Ｃａ２＋］ｉ放出活性について試験した。
【０１１３】
我々の結果は、フラクション４−２内の、３５〜８０ｋＤａの分子量を示す数種のたんぱく質がＣａ２＋放出の引き金となるＳＦの能力に含まれることを示した。
硫酸アンモニウム沈殿：粗製精子抽出液を５０％飽和度まで飽和硫酸アンモニウムと混合した。沈殿を遠心処理（１０，０００ｘｇ、１５分間、４℃）によって採取し、このペレットを使用時まで−２０℃で保存した。これらのペレットを注入用緩衝液（７５ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０）の中に再懸濁させ、同一緩衝液中で洗浄し、次いでセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−３０限外濾過膜を用いて濃縮し、その後、Ｃａ２＋放出活性について分析した。
【０１１４】
クロマトグラフィー：高速たんぱく質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による単離操作に用いられたカラム（全部がＰｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｔｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから）を、Ｒｅｄｕｔｈ等、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：９５−１０３（１９９４）；Ｍｏｒｇａｎ等、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５７：２４１−５２（１９９３）；Ｍｕｒａｎｊａｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３８０６−１４（１９９７）；Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８）に従い使用した。このクロマトグラフィー装置で使用するポンプおよび試験管は、無水エタノールで、次いで無菌ＰＢＳで浄化し、その後に全部の分別を行った。これらのカラムは無菌であり、汚染を防止するために、アジドとともに保存した。使用前に、緩衝液の全部をオートクレーブ処理し、次いで濾過した。採取管は無菌であり、たんぱく質の非特異的損失を減少させるために、シリコンにより被覆した。ＦＰＬＣ、フラクション採取器および全部の緩衝液は、細菌増殖および酵素活性をさらに減少させるために、４℃の室内に置いた。
【０１１５】
ＨｉＴｒａｐブルーアフィニティーＦＰＬＣクロマトグラフィー：硫酸アンモニウムペレットを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．０）中に稀釈し、４℃においてＦＰＬＣ装置を使用することによって、５ｍｌのＨｉＴｒａｐブルーアフィニティカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に装填した。１５ｍｌを緩衝液Ａで洗浄した後、０〜５００ｍＭ　ＫＣＬの２０−ｍｌ直線状勾配により、次いで最後に、２０ｍｌ　１Ｍ　ＫＣｌにより溶出した。活性はピークＮｏ．３に見出された（図１Ａ参照）。このフラクションを濃縮し（１２ピークが蓄積するものと見做される）、洗浄し、次いでヒドロキシアパタイトカラム上に注ぎ入れた。
【０１１６】
ヒドロキシアパタイトＦＰＬＣクロマトグラフィー：ＨｉＴｒａｐブルーアフィニティＦＰＬＣクロマトグラフィーカラムを用いて得られたピークＮｏ．３からのたんぱく質を、２００μＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６．８）に稀釈し、次いで４℃においてＦＰＬＣ装置を用いて５ｍｌヒドロキシアパタイトカラム上に０．４ｍｌ／分で添加した。１０ｍＭリン酸緩衝液で１０ｍｌ洗浄後、たんぱく質を、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２、２００μＭ　ＰＭＳＦ含有）のモル濃度を段階的様相で増加しながら同一流速で溶出した。各工程におけるリン酸カリウムの濃度は、次のとおりであった：８８ｍＭ、１２７ｍＭ、１８５ｍＭ、２４４ｍＭ、３０２ｍＭおよび４００ｍＭ。ピークＮｏ．３のフラクション（Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））を採取し、洗浄し、濃縮し、次いでスーペローズ１２カラム上に注ぎ入れた。
【０１１７】
スーペローズ１２ＦＰＬＣクロマトグラフィー：ヒドロキシアパタイトカラムからの活性フラクション（２５０μｌ未満の総容積まで濃縮されたピークＮｏ．３）を、４℃においてＦＰＬＣ装置に連結されているスーペローズ１２ＨＲ１０／３０カラムに充填した。たんぱく質は２００μＭ　ＰＭＳＦ含有緩衝液（７５ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．０）により０．１ｍｌ／分の流速で溶出し、次いでＵＶ−ＭモニターによりＯＤ２８０で検出した。各フラクション（０．２５ｍｌ）を個別に採取し、濃縮した後、Ｃａ２＋放出活性について試験した。スーペローズ１２ＨＲ１０／３０カラムは、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６８ｋＤａ）およびカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて基準設定した。
【０１１８】
例２
オシロゲニンたんぱく質の特徴
本例はＳＦ抽出液の活性の特徴を確認するものである。
卵子採取および培養
マウス卵子または最近に受精した接合子（卵子）は、前記したように、８〜２０週齢成熟ＣＤ−１雌マウスの卵管から採取した（Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））。マウスは、５　Ｉ．Ｕ．の妊娠した雌馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；別段の記載がない限り、全部の試薬はＳｉｇｍａから入手）の注入によって過剰刺激し、４０〜４８時間後、５　Ｉ．Ｕ．のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ、Ｓｉｇｍａ）の注入によって排卵を誘発させた。
【０１１９】
受精卵を得るために、ｈＣＧ注入後、雌を雄とともに一夜にわたり一緒にした。ｈＣＧ注入後（ｐｈＣＧ）１４時間の時点で卵子を、５％熱処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補強したＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ＴＬ−ヘペス）中に採取した。顆粒膜細胞を、ウシ精巣ヒアルロニダーゼとともに５〜１０分間かけてインキュベートすることによって分離した。分解および一次極性体の駆遂（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）の兆しを示さない卵母細胞を、これらの試験用に選別した。卵子をＫＳＯＭ５０μｌ滴（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｍｅｄｉａ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）に移し、ここで、空気中７％ＣＯ２含有湿潤雰囲気中で３６．５℃においてパラフィン油下に種々の活性化経過時間の前および後、インキュベートした。
【０１２０】
微量注入技術
微量注入操作は、従来開示されているとおりに行った（Ｗｕ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））。簡単に言えば、卵子を２．５％スクロースおよび２０％ＦＣＳを補給したＴＬ−ヘペス５０μｌ微細滴にパラフィン油下に入れ、次いでニコン−ダイアホット（Ｎｉｃｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ）マイクロスコープ（Ｎｉｃｏｎ，Ｉｎｔ．，Ｇａｒｄｅｎ　Ｃｉｔｙ，ＮＹ）上に設置したマニピュレーター（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ，ＮＹ）を用いて注入した。注入ピペットには、下記化合物の一つを含有する２〜３μｌ滴からの吸入によって充填した：０．５ｍＭ　ｆｕｒａ−２デキストラン（ｆｕｒａ−２Ｄ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、１ｍｇ／ｍｌたんぱく質濃度のテンジクネズミ精子因子（ＳＦ）、または１０μＭアデノホスチンＡ、強力ＩＰ３Ｒアゴニスト（Ｄｒ．Ｋ．Ｔａｎｚａｗａ，Ｓａｎｋｙｏ　ＣＯ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。全部の試薬は、７５ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．０）含有緩衝液で稀釈し、ＰＬＩ−１００ピコインジェクター（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ．）を用いる空気圧により卵質中に供給した。注入容積は約５〜１０ｐｌであり、これはＳＦについて約１０ｎｇ／μｌの、およびアデノホスチンＡについて１００ｎＭの細胞内濃度をもたらした。
【０１２１】
ＳＦ調製
細胞質ゾルＳＦ抽出物を、Ｓｗａｎｎ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１０；１２９５−１３０２（１９９０））およびＷｕ等（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：３６９−８１（１９９８））により開示されたとおりにテンジクネズミ精液から調製した。簡単に言えば、精液試料を先ず、ＴＬ−ヘペスにより２回、洗浄し、このペレットを７５ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１０ｍＭグリセロホスフェート、１ｍＭ　ＤＴＴ、２００μＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌぺプスタチン、および１０μｇ／ｍｌロイペプチン含有溶液（ＰＨ７．０）中に再懸濁した。この精子上清を、音波処理（ＸＬ−２０２０，Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）により４℃において１５〜２５分間の３回の設定で小型プローブを用いて溶解させた。この音波処理した懸濁液を１０，０００ｘｇで２回回転させ、上清を両時点で採取し、次いで４℃において４５分間かけて１００，０００ｘｇで遠心処理した。生成する清明な懸濁液を、細胞質ゾルフラクションとして採取した。限外濾過膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０，Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて、上清を洗浄した（７５ｍＭ　ＫＣｌおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０）。この抽出液を次いで、硫酸アンモニウムの飽和溶液（５０％最終濃度）にさらし、次いで４℃において１５分間かけて１０，０００ｇで遠心処理することによって沈殿させた。この沈殿を採取し、使用時まで、−８０℃で保存した。
【０１２２】
単為生殖活性化
数種の慣用の単為生殖剤を、これらの試験にわたり使用した。これらには、エタノールおよびイオノマイシン（これらは単一の［Ｃａ２＋］ｉ上昇を誘発させる）（Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２２６：３１１−１４（１９８３）；およびＳｈｉｉｎａ等、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ　９７：１４３−５０（１９９３））、およびその他の薬剤、例えばアデノホスチンＡ、ＳＦ、チメロザール、およびＳｒＣｌ２（［Ｃａ２＋］ｉ振動を惹起させる）が包含される（Ｋｌｉｎｅ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４９：８０−９（１９９２）；Ｓｗａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：７９−８４（１９９２）；およびＳａｔｏ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：８６７−７３（１９９８））。
【０１２３】
これらの活性化化合物を、卵子中に注入するか（例えば、アデノホスチンＡおよびＳＦの場合、詳細は微量注入操作参照）、または卵子培養培地に添加した（例えば、チメロザール、ＳｒＣｌ２の場合）。活性化は全部の場合、ｈＣＧ投与後（ｐｈＣＧ）１６時間の時点で開始し、次いで卵子は二次極性体駆逐を観察することによって２時間後に（１８時間ｐｈＣＧ）、目で見て評価し、また処置後５時間の時点で前核形成を評価した。この活性化操作および指定インキュベーション期間後（１、２、４または８時間）、卵子を５μｌダルベッコのリン酸塩緩衝溶液（ＤＰＢＳ）／ポリビニルピロリドン（３ｍｇ／ｍｌ、ＰＶＰ）中に採取し、次いで−８０℃において保存した。チメロザールにより処理されたものを除いて、処置後８時間の時点で採取された卵子の大部分は、前核形成を示した。
【０１２４】
エタノール活性化は、ＴＬ−ヘペス＋３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中の７％エタノール溶液に３７℃において５分間の間、卵子をさらすことによって行った。処理後、卵子をＴＬ−ヘペスにより数回、洗浄し、次いで８時間かけて培養した（２４時間ｐｈＣＧ）。イオノマイシンおよび６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ）、キナーゼインヒビター（Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：７２９−３９（１９９４））による活性化は、Ｃａ２＋を含有していないＤＰＢＳ＋３ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中で５分間かけて５μＭイオノマイシンとともに卵子をインキュベートすることによって行った。卵子を次いで、ＴＬ−ヘペス／１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中で洗浄し、ＤＭＡＰ／ＫＳＯＭ（２ｍＭ）中に４時間、入れておき、次いでＤＭＡＰを含有していないように注意深く洗浄した後、４時間かけて培養した。
【０１２５】
ＳｒＣｌ２により活性化された卵子は、１０ｍＭ　ＳｒＣｌ２を補給したＣａ２＋を含有していないＭ−１６様培地において２〜４時間かけてインキュベートした。処理された卵子を次いで、５％ＦＣＳ補給ＴＬ−ヘペス中で洗浄し、次いで試験に応じて、２時間、４時間または６時間にわたり培養した。チメロザール活性化の場合、卵子は、ＫＳＯＭ中の２００μＭチメロザールの新しく調製した溶液に３０分間にわたりさらした。チメロザール処理卵子は、５％ＦＣＳ補給ＴＬ−ヘペスを用いて試薬が含まれないように洗浄し、次いで３０分間、１．５時間、３．５時間または７．５時間かけてインキュベートした。
【０１２６】
蛍光記録および［Ｃａ２＋］ｉ測定
ｆｕｒａ−２Ｄ添加卵子を用いる［Ｃａ２＋］ｉレベルの監視は、従来開示されているように行った（Ｗｕ等、１９９８）。７５ワットキセノンアーク灯によりＵＶ照射線を用意し、３４０および３８０ｎｍ励起波長を使用した。このＵＶ光の強度を中性光学濃度フィルターにより３２倍に弱め、光電子増倍管は５００ｎｍバリヤーフィルターを通過した後、発射される光を定量化した。蛍光シグナルは全部の卵子について平均化した。修正ホスカン（Ｐｈｏｓｃａｎ）３．０ソフトウエアプログラムは、フィルターホイールの回転および遮断装置を制御して波長を変更する４８６ＩＢＭ−コンパーチブル装置で駆動させた。遊離［Ｃａ２＋］ｉを、３４０ｎｍ／３８０ｎｍ比の蛍光から測定した。
【０１２７】
ＲｍｉｎおよびＲｍａｘを、細胞内粘度を補正するために２ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｒｍｉｎ）または２ｍＭ　ＣａＣｌ２（Ｒｍａｘ）および６０％スクロースを補給したＣａ２＋を含有していないＤＰＢＳ中で１０μＭ　ｆｕｒａ−２　Ｄを用いて計算した（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０−５０（１９８５）；およびＰｏｅｎｉｅ等、Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　１１：８５−９１（１９９０））。バックグラウンドを差し引くため、同一溶液をまた単独で使用した。細胞外ＳｒＣｌ２の存在下に行われたＣａ２＋測定は、３４０ｎｍ／３８０ｎｍ励起波長の蛍光比として示される。［Ｃａ２＋］ｉ濃度の計算は、この場合、ｆｕｒａ−２がまたＳｒ２＋に対して若干のアフィニティを有することから、行わなかった。従って、細胞内Ｓｒ２＋の存在は干渉的であり、正確なＣａ２＋および／またはＳｒ２＋細胞内濃度の獲得を妨害する（Ｈａｊｎｏｃｚｋｙ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：３５３３−４３（１９９７））。
【０１２８】
卵子はそれぞれ、パラフィン油下のプラスティック培養皿底部上のガラス製カバースリップ上に配置されているＴＬ−ヘペス培地３５μｌ滴中で測定した。蛍光比は、６秒毎に測定し、読み取りは各波長で１秒間、行った。卵母細胞は先ず、１０〜１２０秒間にわたり監視され、ベースライン［Ｃａ２＋］ｉ値を確立した。その後、読み取りを２〜６分間にわたり停止し、試薬の微量注入または添加を可能にした。読み取りを次いで、再開し、１０〜３０分間にわたり継続した。
【０１２９】
インヒビター調製
ラクタシスチン（Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）（１００μＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、プロテアゾームインヒビター（Ｍｅｌｌｇｒｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９８９９−９０３（１９９７）；およびＦｅｎｔｅａｎｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８５４５−４８（１９９８））を使用し、当該プロテアゾームがＳＦによるＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションに含まれるかを測定した。卵子は、注入以前に３０分間かけてインヒビター中でインキュベートし、次いでＳＦの注入をインヒビターの存在下に行った。この卵子を、ラクタシスチンを新しく補給したＫＳＯＭの新滴中で２時間かけて培養した。
【０１３０】
ウエスターンブロット技法
１５〜２０個のマウス卵子からの等量の粗製ライゼート（ｌｙｓａｔｅ）および二倍強度の試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｉｌ，Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−５（１９７０））を、従来開示されているとおりに組合わせた（Ｈｅ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１２４５−５５（１９９７））。試料は３分間沸騰させ、次いで４％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。分離したたんぱく質を、４℃において２時間かけてミニトランスブロットセル（Ｍｉｎｉ　Ｔｒａｎｓ　Ｂｌｏｔ　Ｃｅｌｌ）を使用してニトロセルロース膜（Ｍｉｃｒｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）上に移した。この膜を先ず、ＰＢＳおよび０．０５％ツイーン（ＰＢＡ−Ｔ）により洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ中の６％無脂肪乾燥ミルク中で１時間かけてブロックした。
【０１３１】
ＰＢＳ−Ｔ中で数回洗浄した後、この膜をＩＰ３Ｒ−１サブタイプ（Ｒｂｔ０４）のＣ−末端の１５ペプチド配列に対して生成され、ＰＢＳ−Ｔ中で１：３，０００に稀釈されているウサギポリクローナル抗体とともに一夜にわたりインキュベートした（Ｐａｒｙｓ等、Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，１７：２３９−４９（１９９５））。数回洗浄した後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させ、ＰＢＳ−Ｔ中で１：３，０００に稀釈されている第二抗体とともに１時間にわたりインキュベートした。この膜をウエスターンブロット化学発光剤（ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて現像し、次いで最高感度フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に１〜３分間、さらした。広範囲予備染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、平行操作し、免疫反応バンドの分子量を評価した。
【０１３２】
ＩＰ３Ｒ−１バンドの強度を、Ｃａｍｅｒｏｎ等により基本的に開示されているとおりに（Ｃｅｌｌ，８３：４６３−７２（１９９５）、Ａｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて定量し、次いでシグマプロットソフトウエア（Ｊａｎｄｅｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を用いてグラフに書き入れた。各ＩＰ３Ｒ−１バンドを含む選択されたセット領域内の平均画素強度を得た。次いで同一セット領域を特定のフィルムについて全部のレーンに適用した。同一セット領域をまた、フィルムのバンドが存在しない領域に置き、バックグラウンド数を採取した。このバックグラウンド数を次いで、対象フィルムについて全部のＩＰ３Ｒ−１密度から差し引いた。
【０１３３】
中期ＩＩ（ＭＩＩ）卵子からのバンドを参照として使用し、１の評価値を当てた。数種の相違する単為生殖剤で処理した後の卵子からのＩＰ３Ｒ−１のバンド強度を、この１に対して計算し、次いで統計学的に比較した。この定量システムの可能な極限（飽和）を回避し、またこの定量が線状範囲で行われることを確実にするために、それぞれ４回、または５回露光したフィルムを得て、次いで定量した。不十分な露光および過剰露光は廃棄した。ウエスターンブロット操作は、少なくとも３回、反復し、数種の相違する日に卵子を採取した。
【０１３４】
統計学的分析
ＩＰ３Ｒ−１バンドおよびＣａ２＋パラメーター強度の統計学的比較は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。各群間に差が見出された場合、処理間の比較は、ＪＭＰ　ＩＮソフトウエア（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いるターキィ−クラマー（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）法を適用することによって達成した。有意差は、ｐ＜０．０５であった。
【０１３５】
結果
卵子の加齢と受精とはＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションに対して相違する効果を有する：
卵子の加齢またはそれらの受精は、ＩＰ３注入に対する卵子のＣａ２＋応答の格別の減少を誘発させることが証明されている（Ｊｏｎｅｓ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１：３２５９−６６（１９９５）；およびＪｏｎｅｓ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７８：２２９−３７（１９９６））。このＩＰ３Ｒ−系の減少された応答性がＩＰ３Ｒ−１の数の減少によるものであるのかを証明するために、マウス卵子を、排卵後に採取しインビトロで加齢させるか、または受精後すぐに採取し、種々の経過時間にわたりインビトロで培養した。
【０１３６】
未受精卵子は、１０時間（２４時間ｐｈＣＧ）または１６時間（３０時間ｐｈＣＧ）にわたり培養し、また受精卵（接合体）は、前核段階（２４時間ｐｈＣＧ）まで、前期有糸分裂の直前（３０時間ｐｈＣＧ）まで、または２−細胞段階（４０時間ｐｈＣＧ）まで培養した。これらの卵子におけるＩＰ３Ｒ−２の存在および量を、ウエスターンブロットによって分析した。図２Ａ及びＢに示されているように、卵子のインビトロ加齢は、ＩＰ３Ｒ−１の量に対して格別の効果を有していなかった。これに対して、受精は、前核形成の時間によってＩＰ３Ｒ−１の格別のダウンレギュレーションを誘発した（図２Ｃ，Ｄ）。この時点後、レセプターの有意の追加のダウンレギュレーションは見出されなかった（図２Ｃ，Ｄ）。
【０１３７】
エタノールおよびイオノマイシンによって誘発される単独の［Ｃａ２＋］ｉ上昇はＩＰ３Ｒ−１をダウンレギュレーションしない：
ＩＰ３Ｒ−１が受精中にダウンレギュレーションされるメカニズム（１種または２種以上）を理解するために、我々は単独［Ｃａ２＋］ｉ上昇の誘発がＩＰ３Ｒ−１下落（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対して影響を与えるかどうかを研究した。単独Ｃａ２＋応答が、エタノールおよびイオノマイシンによって誘発される応答と同様に、加齢した卵子の発育の開始および高率の活性化の引き金になることは充分に確立されている（Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２２６：３１１−１４（１９８３）；Ｓｈｉｉｎａ等、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９７：１４３−５０（１９９３）；およびＳｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：７２９−３９（１９９４））。
【０１３８】
さらに、ＤＭＡＰ、キナーゼインヒビターを添加し、振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ）の不存在下で追加のキナーゼ活性ダウンレギュレーションがＩＰ３Ｒ−１下落（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を刺激することができる可能性を試験した。すなわち、我々は７０％エタノールまたは５μＭイオノマイシン＋２ｍＭ　ＤＭＡＰに曝露し、次いで前核段階（２４時間ｐｈＣＧ）で採取したマウス卵子がＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションを示すかを試験した。これらの薬剤への曝露は、ＩＰ３Ｒ−１下落をシグナルすることはできなかったが（図３）、これらは高率の活性化を誘発した。しかしながら、受精およびＳＦの注入は、レセプターのダウンレギュレーションを誘発した（図３Ｃ，Ｄ）。これらの結果は、［Ｃａ２＋］ｉ振動が受精様ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションの誘発を必要とすることがあることを示唆している。
【０１３９】
ＳＦおよびアデノホスチンＡの注入により誘発されるが、ＳｒＣｌ２への曝露によっては誘発されない［Ｃａ２＋］ｉ振動は、ＩＰ３Ｒ−１下落を誘発する：
多数の［Ｃａ２＋］ｉ上昇がＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションに必要であるという考え方を試験するために、Ｃａ２＋シグナル（信号）発生経路の相違する分子標的に対して作用する３種の相違する化合物により、マウス卵子で振動を開始させた。ＳＦの注入（これはＩＰ３の産生を多分に刺激することによって受精様振動を引き起こす）（Ｊｏｎｅｓ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４３７：２９７−３００（１９９８））は、ＩＰ３Ｒ−１の格別のダウンレギュレーションを誘発した（図４Ａ，Ｂ）。ＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションは持続性であるが、有意の低化は、注入１時間後以内に見出された（図４Ａ，Ｂ）。
【０１４０】
アデノホスチンＡの注入（アデノホスチンＡはＩＰ３Ｒ−１の非加水分解性アゴニストである）はまた、レセプターの有意のダウンレギュレーションを誘発した（図４Ｃ，Ｄ）。興味深いことは、このダウンレギュレーションが受精により（ｐ＜０．０５）またはＳＦの注入により誘発された下落に比較して一貫してより大きいことである（図４Ｃ，Ｄ）。最後に、卵子をＳｒＣｌ２に２時間または４時間にわたり曝露すると、ＩＰ３Ｒ−１の量に対するいずれかの変化の誘発はおこらなかった。これらの結果は一緒になって、マウス卵子受精期間中におけるＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションは、多数の［Ｃａ２＋］ｉ上昇の存在に独占的に依るものではなく、ホスホイノシチド経路の活性化により開始される［Ｃａ２＋］ｉ振動に伴うものであることを示唆している。
【０１４１】
チメロザールはＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを誘発する：
チオール酸化剤であるチメロザールは、ＩＰ３の産生を刺激することなく［Ｃａ２＋］ｉ上昇を誘発することが証明されている（Ｈｅｃｋｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５９：９６１−６８（１９８９）；Ｂｏｏｔｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１１４−９（１９９２）；およびＭｉｓｓｉａｅｎ等、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｏｎｄｏｎ　４５５：６２３−４０（１９９２）。従って、我々はこの化合物と卵子との共−インキュベーションにより開始される振動がＩＰ３Ｒ−１下落を誘発するかについて試験した。チメロザール媒介Ｃａ２＋応答は、当該レセプターのダウンレギュレーションを迅速に誘発し、また持続させた（図５Ｃ，Ｄ）。これらのデータは、マウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションがホスホイノシチド経路の活性化により独占的に指示されないものであることを示唆している。
【０１４２】
［Ｃａ２＋］ｉ振動パターンはアゴニスト特異性である：
試験された相違するアゴニストによるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションに対する効果が相違することから、我々はこれらのアゴニストのそれぞれによって引き起こされるＣａ２＋応答を試験した。予想されるように、ＳＦ（ｎ＝４卵子）およびアデノホスチンＡ（ｎ＝６卵子）の注入は、受精により開始されるものに類似した［Ｃａ２＋］ｉ上昇を誘発したが、頻度は大きいものであった（ｐ＜０．０５；それぞれ図６Ａ，Ｂ）。これに対して、ＳｒＣｌ２に曝露された卵子（ｎ＝５卵子）は、低頻度をもって振動を示し、これらの上昇は、最初に上昇し、次いで上昇が非常に長期間である別種のアゴニストにより開始されるものとは相違していた（表１：ｐ＜０．０５；図６Ｃ）。チメロザールにより刺激された卵子（ｎ＝９卵子）は、低頻度をもってＣａ２＋応答を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
しかしながら、チメロザール誘発スパイク（ｓｐｉｋｅｓ）の幅は、ＳＦおよびアデノホスチンにより誘発されたものに比較して匹敵する振幅を有していたが、最初の上昇の振幅は、より小さかった（表１：ｐ＜０．０５）。ＳｒＣｌ２−誘発上昇の幅は、他のアゴニストにより誘発されたものに匹敵していなかった。この理由は、この試験において、ｆｕｒａ−２Ｄが細胞内Ｃａ２＋レベルを報告するためにキャリブレートされたからであり、また、見出された蛍光上の変化が両方のカチオンの濃度における変化を表わすようであるからである（Ｈａｊｎｏｃｚｋｙ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．１６：３５３３−４３（１９９７））。相違するＣａ２＋様相が相違するにもかかわらず、全部のアゴニスト（チメロザールは除く）によって誘発されるＣａ２＋応答は、卵子の９０％以上が活性化され、前核形成を示すものとして生理学的に現れる（データは示されていない）。
【０１４４】
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【０１４５】
＊振動の頻度は、第一次上昇がベースライン値（アデノホスチンＡまたはＳＦ）にまで戻った直後の５分間、またはＳｒＣｌ２またはチメロザール添加後の５分間、監視した。全タイプは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。第三次上昇を全部の処置においていずれかの引き続くスパイクとして表わすために、任意に選択した。
＊＊コラム内の共通上付きを共有していない数値は有意の差（ｐ＜０．０５）である。
＊＊＊Ｓｒ２＋がｆｕｒａ−２Ｄに結合することができ、細胞内Ｃａ２＋値の正しい報告に潜在的に干渉することから、測定されなかった（“ＮＤ”）。
【０１４６】
ＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションはプロテアゾーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）により媒介される：
体細胞におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションは、プロテアゾームによって媒介されることが証明されている（Ｂｏｋｋａｌａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２４５４−６１（１９９７）；およびＯｂｅｒｄｏｒｆ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：４５３−６１（１９９９））。プロテアゾームはまた、受精した哺乳動物卵子がＭＩＩ阻止から逃れることを可能にする特異たんぱく質のダウンレギュレーションに包含される（Ｋｕｂｉａｋ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．１２：３７７３−８（１９９３）。この点については、Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　１：１２７−１３５（１９９６）を参照することができる。）従って、我々は、ＳＦ注入によって誘発されるＩＰ３Ｒ−１下落が類似経路に含まれるかについて調べた。これを達成するためには、卵子を予備インキュベートし、次いでラクタシスチン（プロテアゾーム阻害剤）の存在下にＳＦを注入した。
【０１４７】
活性化は２時間にわたり進行させ、この時点で注入した卵子を取り出し、ウエスターンブロット用に調製した。２時間という時間は、注入後１時間で、ＩＰ３Ｒ−１の有意のダウンレギュレーションがすでに見出されたことから選択された（図４Ａ，Ｂ）。ラクタシスチン中でインキュベートされたＳＦ注入卵子におけるレセプターの下落は格別に阻止された（図７）。さらにまた、このインヒビターのプロテアゾーム活性に対する効果はまた、極性体の駆遂（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）により評価される細胞周期進行が、予備処理され、インヒビターとともにインキュベートされたＳＦ注入卵子で明白に遅延されたという発見により推論することができる（データは示していない）。
【０１４８】
検討
マウス卵子におけるこの研究の結果は、ａ）エタノールまたはイオノマイシン／ＤＭＡＰに曝露することによって開始された単独［Ｃａ２＋］ｉ上昇により誘発される単為生殖活性化は、ＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションを誘発しない；ｂ）ＳＦ、アデノホシンＡの注入、またはチメロザールへの曝露による振動の開始は、受精中に見出されるものと類似するＩＰ３Ｒ−１レベルの格別の減少を惹起した；ｃ）ＳｒＣｌ２への曝露による［Ｃａ２＋］ｉ振動の開始は、ＩＰ３Ｒ−１を下落させるシグナルを発しなかった；およびｄ）ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションは、ダウンレギュレーションがプロテアゾーム阻害剤であるラクタシスチンによって防止されたことから、プロテアゾームによって媒介されるらしい；ことを示している。これらのデータは一緒になって、受精後のマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションが、ホスホイオノシチド／ＩＰ３Ｒ系の活性化に付随し、またこの研究における受精中の精子によって、またはＳＦ注入によって誘発される永続的ＩＰ３産生が、ＩＰ３Ｒ−１の下落を調節することができることを示唆している。
【０１４９】
哺乳動物卵母細胞および卵子は、受精前および受精後、ＩＰ３Ｒ−１数を厳密に制御する。卵母細胞成熟期間中、ＩＰ３Ｒ−１たんぱく質の増加および再分布は、精子侵入後のＣａ２＋放出の量および空間的分布を最大にするものと見なされる（Ｆｕｊｉｗａｒａ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５６：６９−７９）１９９３）；Ｍｅｈｌｍａｎｎ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５１：１０８８−９８（１９９４）；およびＳｈｉｒａｉｓｈｉ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７０：５９４−６０６（１９９５））。しかしながら、受精後におけるＩＰ３Ｒ−１数の減少の役割および調節は、未受精加齢卵子において（Ｐａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：４５１−６１（１９９８）及び提示したデータ）、またはエタノールまたはイオノマイシンに曝露されることによって活性化された卵子においては見出されないことから、この減少は特異的であるという事実にもかかわらず、充分に説明されていない。これらの結果は、ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションが卵子活性化それ自体に作用しないが、振動が開始されるメカニズムによって、または［Ｃａ２＋］ｉ上昇数とさらに密接に関連することがあることを示しており、この両方をこの研究で試験した。
【０１５０】
体細胞におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションの研究は、レセプターの下落はＰＣＬ−結合細胞表面レセプターの永続的刺激を必要とすることを示した。この理由は、ＩＰ３の短時間産生をもたらす、これらのレセプターの活性化がレセプター下落を誘発することができないからである（Ｏｂｅｒｄｏｒｆ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：４５３−４６１（１９９１））。我々の研究において長時間刺激を得るため、マウス卵子にＳＦを注入した。ＳＦが受精によって開始される［Ｃａ２＋］ｉ振動に密接に類似する延長された［Ｃａ２＋］ｉ振動を誘発することは従来示されている（Ｓｗａｎｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１０：１２９５−１３０２（１９９０）；Ｗｕ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｄ．＆Ｄｅｖ．４６：１７６−８９（１９９７）；および概略については、Ｓｗａｎｎ等、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ　１９：７９−８４（１９９７）参照）。
【０１５１】
Ｃａ２＋応答がＩＰ３Ｒ−１ブロックモノクローナル抗体１８Ａ１０の注入によって抑制されたことから、これらの振動は、ＩＰ３Ｒ−１により媒介される（Ｏｄａ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０９：１７２−８５（１９９９））。現在の研究において、ＳＦは受精後に見出されるものに類似するＩＰ３Ｒ−１の格別で、永続的な減少を誘発した。ＳＦは最近になって、ウニ卵子からの細胞を含有していない抽出液においてＩＰ３の産生を刺激することが証明された（Ｊｏｎｅｓ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ．４３７：２９７−３００（１９９８））。すなわち、ＩＰ３の長期間産生を刺激することによってＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを誘発することができるものとすることができる。
【０１５２】
アデノホスチンＡの注入がＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを引き起こすという我々の発見は、この仮設を支持する。ペニシリウム　ブレビコムパクタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）からの生産物であるアデノホスチンＡは、ＩＰ３よりも約１００倍強い能力がある完全ＩＰ３Ｒ−１アゴニストである。さらにまた、アデノホスチンＡは、ＩＰ３Ｒ−１に対してより大きいアフィニティを有し、ＩＰ３代謝性酵素によって分解されない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３６９−７２（１９９３））。これらの性質は（これは、このアゴニストをより長い時間にわたりレセプターに結合して残ることを可能にすることができる）、アデノホスチンＡ注入卵子で見出されるＩＰ３Ｒ−１のほぼ総合的ダウンレギュレーションの原因となることができる。
【０１５３】
チメロザールがまた、ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを誘発するという発見は、ホスホイノシチド経路の刺激が哺乳動物卵子におけるＩＰ３Ｒ−１下落を合図する唯一のメカニズムではないことを示唆している。ＩＰ３産生を引き起こさない酸化剤であるチメロザールは、ＩＰ３に対するＩＰ３Ｒ−１のアフィニティを増大させることが証明されており（Ｐｏｉｔｒａｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４０７８−８２（１９９３）；Ｋａｐｌｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２８９７２−８（１９９４）；およびＶａｎｌｉｎｇｅｎ等、Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　２５：１０７−１４（１９９９））、このメカニズムによってＩＰ３Ｒ−１の下落を誘発することができることを可能にする。
【０１５４】
別様に、チメロザールは、ＩＰ３Ｒの形態的な状態の変化を誘発するのに決定的なレセプター内のシステイン残基を参加することが証明されており（Ｓａｙｅｒｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８９：８８３−７（１９９３））、またこの様相で、ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションを誘発することができる。形態的な変化はＩＰ３の結合後のＩＰ３Ｒで生じ、このチャンネルの開放が生じる（Ｍｉｇｎｅｒｙ等、ＥＭＢＯ　Ｊ．９：３８９３−９（１９９０））。この構造変化はまた、当該レセプター下落に必要であることがある（Ｚｈｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３４７６−８４（１９９９））。従って、チメロザールはＩＰ３産生を刺激しないが、レセプターの類似の修飾を誘発することによってシグナルＩＰ３Ｒ−１の下落を示すことができる。
【０１５５】
これに対して、ＳｒＣｌ２は、永続的振動を誘発するにもかかわらず、ＩＰ３Ｒ−１のダウンレギュレーションの誘発することはできなかった。ＳｒＣｌ２は、Ｃａ２＋誘発Ｃａ２＋放出（ＣＩＣＲ）メカニズムを敏感にすることによって［Ｃａ２＋］ｉ振動を誘発することが示唆されているが、正確なメカニズムは未知である（Ｃｈｅｅｋ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１９：１７９−８９（１９９３））。ＩＰ３Ｒ−１下落に対するＳｒＣｌ２誘発応答の作用の欠落は、このアゴニストによって誘発される高率の卵子活性化と格別に相違している。このことは、ＳｒＣｌ２−誘発振動が、その減少はＭＩＩ排出に必要であることが知られている特定の卵子たんぱく質の分解シグナルを発することができることを証明している（Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　１：１２７−３５（１９９６））。このことは、別の卵子たんぱく質の場合とは相違して、［Ｃａ２＋］ｉ振動の存在および生じる卵子活性化は、ＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションの誘発にとって充分ではないことを明白に示している。
【０１５６】
そのレセプターに対するＩＰ３の結合によって誘発される形態的変化は、ＩＰ３Ｒの偏在（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を強化することによってＩＰ３Ｒ下落信号を発し、従ってプロテアゾームによる下落の信号を発することを示唆している（Ｂｏｋｋａｌａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２４５４−６１（１９９７）；およびＯｂｅｒｄｏｒｆ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３９：４５３−６１（１９９９））。体細胞において、ホスホイノシチド経路の永続的刺激は、ＩＰ３Ｒ−１の多偏在（ｐｏｌｙ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）をもたらすことが示されており（Ｂｏｋｋａｌａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２４５４−６１（１９９７）；およびＯｂｅｒｄｏｒｆ等（１９９９））、またＩＰ３を結合することができない変性ＩＰ３Ｒｓ−１を発現する細胞を用いた研究は、これらのレセプターが分解または偏在しないことが示された（Ｚｈｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３４７６−８４（１９９９））。
【０１５７】
これらの研究はまた、偏在ＩＰ３Ｒｓが、両方ともに当該レセプターの分解を阻害する、システインプロテアーゼおよびプロテアゾームインヒビターであるＮ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシナル、およびラクタシスチン（これはプロテアゾームの高度に特異性のインヒビターである）の添加と同様に、プロテアゾームによって分解されることを証明した（Ｗｏｊｃｉｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６６５２−５（１９９６）；（Ｂｏｋｋａｌａ等（１９９７）；およびＯｂｅｒｄｏｒｆ等（１９９９））。ＳＦの注入によって誘発されるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションをラクタシスチンが阻止したことを示すマウス卵子における我々の結果は、プロテアゾーム経路が卵子におけるＩＰ３Ｒ−１数の減少に包含されることを証明する。そのレセプターに対するＩＰ３結合が卵子におけるレセプターの分解にかかわる独占的シグナルであるのか否かは、未知である。
【０１５８】
Ｃａ２＋またはたんぱく質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（これらは両方ともに、活性化において役割を演じる）（Ｇａｌｌｉｃａｎｏ等、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ　１９：２９−３６（１９９７））はまた、ＩＰ３Ｒ−１下落のシグナルを発するものと予測することができる。ホスホイノシチド経路を刺激しないチメロザールがＩＰ３Ｒ下落の引き金を引き、またレセプター分解に影響を及ぼすことなく振動を誘発するＳｒＣｌ２は、Ｃａ２＋もＣａ２＋依存性ＰＫＣも、マウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１消滅にとって臨界的であるか、または充分であることを示唆している。
【０１５９】
ＩＰ３Ｒ−１数の減少が、［Ｃａ２＋］ｉ振動の頻度および持続時間に対してどのように影響するのかについては、調査が残されている。しかしながら、受精／アゴニスト誘発［Ｃａ２＋］ｉ振動（これは活性化された卵子が前核段階に進行するに従い見出される）の中断または頻度／増幅の減少にまた、含まれることがありうることは大いに考えられることである（Ｆｉｓｓｏｒｅ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：６３４−４２（１９９４）；Ｊｏｎｅｓ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２１：３２５９−６６（１９９５）；およびＰａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３：４５１−６１（１９９８））。
【０１６０】
ＩＰ３Ｒ−１におけるこれらの変化の付随して、２種の重要なキナーゼ活性、すなわち、成熟促進因子およびマイトゲン活性化されたたんぱく質キナーゼの活性、をまた、卵子において減少させることに留意することは重要である（Ｍｏｏｓ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：６９２−９（１９９５））。従って、振動の調整／中断において、これらの変化の一方が他方よりも重要であるか、または両方が均等に関与するかを決定する必要がある。相違する数のＩＰ３Ｒ−１ｓを有するが、類似の細胞周期段階／キナーゼレベルを有する卵子／受精卵（これはこの試験で報告されている相違するアゴニストを用いて発生させることができる）の使用は、哺乳動物卵子における振動パターンに対するＩＰ３Ｒ数と細胞周期段階の作用との識別を可能にするものと見なされる。
【０１６１】
要約して、本明細書に示されているデータは、マウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１ダウンレギュレーションが受精によって、およびホスホイノシチド経路／ＩＰ３Ｒシステムを永続的に刺激するアゴニストによって誘発されることを示している。このデータはまた、プロテアゾーム経路がまた、ＩＰ３Ｒ−１下落を媒介することを示している。
【０１６２】
例３
オシロゲニンを用いる卵母細胞の単為生殖活性化の誘発方法
卵子は、妊娠している雌馬血清性腺刺激ホルモン５ＩＵ（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の腹腔内注入によって一度に多数の卵を産んだ（過剰排卵した）ＣＤ−１雌マウス（６〜１２週齢）または別の動物の卵管から入手し、次いで４８時間後、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン５ＩＵ（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）を注入し、排卵を誘発させる。卵子は１４時間ｈＣＧ後に、１０％の熱処理したウシ血清（ＣＳ；Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補給したヘペス緩衝溶液（ＴＬ−Ｈｅｐｅｓ；Ｐａｒｒｉｓｈ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３８：１１７１−８０（１９８８））中に採取する。卵丘細胞はウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて分離する。
【０１６３】
微量注入法を、Ｗｕ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６：１７６−８９（１９９７）およびＷｕ等、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４９：３７−４７（１９９８）に記載のとおりに使用する。簡単に言えば、卵子は、ニコンジプホット顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｇａｒｄｅｎ　Ｃｉｔｙ，ＮＹ）に据え付けたナリシゲ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）マニピュレーター（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ．；Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ，ＮＹ）を用いて微量注入する。ガラスマイクロピペットに、０．５ｍＭ　ｆｕｒａ−２デキストラン（ｆｕｒａ−２Ｄ、デキストラン１０ｋＤａ、分子プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）または精子抽出液（１−２０ｍｇ／ｍｌたんぱく質濃度）を含有する微小滴を吸入によって充填する。溶液は、空気圧（ＰＬＩ−１００、ピコインジェクター；Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ．，ＮＹ）によって卵子の細胞質中に射出する。この注入容積は約５〜約１０ｐｌであり、注入ピペット濃度の約１％である注入化合物の最終細胞内濃度を得る。精子因子（ＳＦ）の注入は、Ｃａ２＋振動を生じさせ、卵母細胞発育の活性化を完了する。
【０１６４】
ｆｕｒａ−２Ｄ蛍光は、Ｗｕ等（上記１９９７および１９９８）により以前に開示されたとおりに監視し、これはＣａ２＋振動を監視するものである。簡単に言えば、励起波長は３４０ｎｍおよび３８０ｎｍであり、発射光は光電子増倍管により５００ｎｍバリヤーフィルターを通した後、定量する。励起光強度は中性密度フィルターによって弱め、次いで蛍光シグナルを全卵について平均化する。［Ｃａ２＋］ｉ濃度（ＲｍｉｎおよびＲｍａｘ）は、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｋｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０−５０（１９８５）；Ｐｏｅｎｉｅ，Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ　１１：８５−９１（１９９０）；Ｆｉｓｓｏｒｅ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：１２２−３０（１９９３）；およびＷｕ等（１９９７および１９９８）に従い計算する。単為生殖活性化の測定は、細胞が前核を形成するか、または一次分裂事象を受けるかを可視化することによって行うことができる。単為生殖活性化はまた、ヒストンＨ１がダウンレギュレーションされるか、ＤＮＡ合成が上向き調整されるかを評価することによって、または当業者に公知である別の方法によって、生化学的に評価することができる。
【０１６５】
マウス卵子の単為生殖活性化を測定するための［Ｃａ２＋］ｉ監視は、ｆｕｒａ−２Ｄ注入後、３０〜４５分の時点（この時点は、ｈＣＧ投与後約１５時間の時点である）に開始する。卵子は、パラフィン油で覆った培養皿底部上のガラスカバースリップ上の５０μｌ培地において個別に監視する。１５〜３０分間の間に４秒毎に、蛍光比を得る。オシロゲニン注入以前における蛍光を読み取り、ベースライン値を確立する。各波長について１秒の読み取りを行う。［Ｃａ２＋］ｉ監視は、卵子がｈＣＧ後２２時間に達する前に完了する。全部の精子抽出フラクションを、１ｍｇ／ｍｌたんぱく質濃度で試験する。
【０１６６】
例４
抗オシロゲニン抗体
オシロゲニンｃＤＮＡを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−遺伝子ベース発現ベクターｐＧＥＸ３系中にサブクローン形成することによって、抗体をまた調製することができる。オシロゲニン挿入の正確な配向および位置は、転写開始部位におけるヌクレオチド配列決定によって確認する。この構築物を次いで、エスケリッチャコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株中に形質転換し、次いでＧＳＴ−オシロゲニン融合たんぱく質発現を、ＩＰＴＧ添加によって刺激する。発現したＧＳＴ融合たんぱく質を、アフィニテイクロマトグラフィーによって精製し、次いでプロテアーゼファクターＸａ（Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による分裂によって、そのＧＳＴ融合相手から分離する。次いで、ファクターＸａを、この調製物からベンズアミジンセファロース６Ｂ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ）ビーズによって分離する。ウサギに注入する前のたんぱく質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色を用いて検査する。
【０１６７】
精製した組換え体または抽出したオシロゲニンをウサギ中に注入し、ポリクローナル抗体を生成させる。この免疫操作は、初期注入（４０μｇオシロゲニン）、引き続く３または４週間の間隔におけるたんぱく質２０μｇの２回の増量注入を包含する。
このようにして生成されたポリクローナル抗体は、アフィニテイ精製し、ｐＨ勾配を用いて溶出し、次いでホウ酸塩緩衝液中で保存することができる。
【０１６８】
本発明を上記例の引用により詳細に説明したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の修正をなすことができることは理解される。本明細書に引用されている全部の引用刊行物および特許は、それらの全体を引用することによってここに組入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、精子因子たんぱく質に富んだ溶出液を得るために使用されるクロマトグラフィーカラムの段階的使用による各種クロマトグラフィーの溶出フラクションピークを示すグラフである。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、図１Ａに記載されている各種クロマトグラフィーカラムに通して処理した後のポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離された各種フラクション（Ｆ１−Ｆ５）におけるたんぱく質の分布を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、インビトロ加齢されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、インビトロ加齢されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、インビトロ受精後のマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、インビトロ受精後のマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図３Ａ】
図３Ａは、７％エタノールに曝露することによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、７％エタノールに曝露することによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、イオノマイシン／ＤＭＡＰに曝露することによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図３Ｄ】
図３Ｄは、イオノマイシン／ＤＭＡＰに曝露することによって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図４Ａ】
図４Ａは、精子因子の注入により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、精子因子の注入により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】
図４Ｃは、アデノホスチンＡ注入により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図４Ｄ】
図４Ｄは、アデノホスチンＡ注入により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＳｒＣｌ２により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＳｒＣｌ２により活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】
図５Ｃは、チメロザールにより活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図５Ｄ】
図５Ｄは、チメロザールにより活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図６Ａ】
図６Ａは、精子因子の注入後に誘発されたマウス卵子における［Ｃａ２＋］ｉ振動様相を示すグラフである。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、アデノホスチンＡの注入後に誘発されたマウス卵子における［Ｃａ２＋］ｉ振動様相を示すグラフである。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、ＳｒＣｌ２注入後に誘発されたマウス卵子における［Ｃａ２＋］ｉ振動様相を示すグラフである。
【図６Ｄ】
図６Ｄは、チメロザール注入後に誘発されたマウス卵子における［Ｃａ２＋］ｉ振動様相を示すグラフである。
【図７Ａ】
図７Ａは、ラクタサイスチンの存在または不存在下において精子因子によって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析結果を示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ラクタサイスチンの存在または不存在下において精子因子によって活性化されたマウス卵子におけるＩＰ３Ｒ−１免疫反応性のウエスターンブロット分析による定量結果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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