(57)【要約】本発明は癌の治療および診断に関し、かつ癌の治療に対する薬剤の開発に関する。本発明はＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）により識別されるｍｙｃ癌遺伝子ファミリーの３５０より多い標的のカタログを提供する。本発明により遺伝子発現におけるｍｙｃ誘導変化の全コンテクストの観点においてｍｙｃ下流標的の分析が可能になる。本発明は、成長、浸潤、および拡散をもたらす癌細胞の本質的な腫瘍性特性を支持する現象および本質的に正常な生理学的機構における補充および適用をもたらすのはｍｙｃ癌遺伝子ファミリーそれ自体であるという見識を提供する（図１参照）。前記癌の本質的な腫瘍性特性を支持できるｍｙｃ依存性下流遺伝子を調節することを含む癌の治療法を提供する。本発明はｍｙｃ下流効果に干渉する薬剤を識別するためのスクリーニングアッセイにおける読み取りとしてｍｙｃ下流遺伝子の１つまたはそれ以上の遺伝子生成物を使用する方法をも提供する。本発明のこの見識により、ｍｙｃブースト細胞蛋白質合成機構が組み換え蛋白質合成システムに対する細胞生成システムを最適にするために使用できることが示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長、浸潤、拡散のような癌の腫瘍特性を本質的にサポートできるｍｙｃ依存性下流遺伝子またはその機能的フラグメントを含んで構成される核酸ライブラリー。
【請求項２】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子は、表１または表２に示すタグ配列に本質的に等価な核酸をそれぞれ含んで構成される、請求項１記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子がリボソーム蛋白質をコード化する、請求項１または２記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子が蛋白質合成に関連する蛋白質をコード化する、請求項１または２記載のライブラリー。
【請求項５】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子が転移に関連する蛋白質をコード化する、請求項１または２記載のライブラリー。
【請求項６】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子が解糖酵素をコード化する、請求項１または２記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子がミトコンドリア機能性蛋白質をコード化する、請求項１または２記載のライブラリー。
【請求項８】
前記癌の本質的な腫瘍特性をサポートできるｍｙｃ依存性下流遺伝子を調節することを含んで構成される癌の治療法。
【請求項９】
前記ｍｙｃ依存性下流遺伝子が表１または表２に示されるようなタグ配列に機能的に等価な核酸を含んで構成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記癌がｍｙｃ発現腫瘍細胞を含んで構成される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
ｍｙｃがＮ−ｍｙｃである、請求項８〜１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が神経芽細胞腫を含んで構成される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記癌の本質的な腫瘍特性をサポートできるｍｙｃ依存性下流遺伝子またはそれに由来する遺伝子生成物の相対的な有無を検出することを含んで構成される癌の診断法。
【請求項１４】
内因性または形質移入されたｍｙｃ遺伝子の、高発現性を有する蛋白質生成系を含んで構成される組換え蛋白質の生成を強化する方法。
【請求項１５】
転写物および／または蛋白質のｎ−ｍｙｃまたはｎ−ｍｙｃ誘導モジュレーションに干渉できる物質を識別する方法であって、ｎ−ｍｙｃ活性を有する細胞またはｎ−ｍｙｃ活性をコード化する核酸を供給すること、および前記物質の存在下で前記転写物および／または蛋白質のモジュレーションを決定すること、を含んで構成される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は癌の治療および診断、並びに癌治療のための薬剤開発に関する。
【０００２】
正常な健康的な生物は、体の特別な必要性に応答する注意深く調節された均衡を維持する。特に、新しい細胞の創造または増殖と余剰細胞の死との間の均衡は良好に維持される。しかし、細胞増殖を調節する、優れた制御が破壊し、体がこの種の細胞をさらに必要としていないにもかかわらず、細胞が成長および分裂を開始する場合がある。このような細胞は必然的に、体にとって真に必要性のない新生細胞になる。このような細胞の子孫が調節に応答することなく増殖する性質を受け継ぐ場合、結果は無制限に拡がることのできる細胞のクローンとなる。最後には、望まれない細胞のこのクローンにより、腫瘍と呼ばれる塊が形成され得る。すなわち、この冒された個体は癌の開始を発現する。新生細胞または腫瘍は、特に老いた個体では高い頻度で発生する。しかし、局所化しているので殆どの場合はホストに危険をもたらすことは殆どない。局所化した腫瘍は一般に良性と呼ばれ、腫瘍は全身に拡がると命にかかわるようになる。このような腫瘍は悪性と呼ばれ、癌に発展する。
【０００３】
悪性腫瘍を良性のものから区別する主な特徴は、その侵襲性と拡がりである。悪性腫瘍は局所に留まらず、カプセル化されない。逆に周囲の組織を侵略し、体の循環系に入り、起源の部位から離れて増殖領域を作り上げる。腫瘍細胞の拡がりと成長の第２領域の確立は転移と呼ばれる。増殖し拡がる悪性細胞は転移の可能性を獲得する。
【０００４】
明らかな良性腫瘍が悪性に進行する可能性があり、悪性腫瘍の最も初期段階は確認が困難であるため、病理学は悪性の始まりの程度を確実に捉えることは殆どできない。どんな場合でも、悪性腫瘍の細胞は、分化した特徴を失い、変化した染色体組成を獲得し、必然的に転移するようになる傾向を有しており、侵略的になり、拡がる。
【０００５】
正常に調節されている細胞を制御に対して応答することなく成長する細胞に変化する遺伝的現象についての知識が豊富になった。これらの遺伝的現象は一般に配偶子を介して遺伝されず、むしろ体細胞のＤＮＡが変化する。変化の基本形は先に現存する遺伝子が癌遺伝子へ変化することである。その生成により不適切な細胞成長が引き起こされる。したがって、ＤＮＡの変化は癌誘発の中心にあり、原因となる遺伝的現象を解明する科学的研究に多くの焦点が注がれた。例えば、ｍｙｃ癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を演じる。ヒト癌におけるｍｙｃ遺伝子の遺伝子変化の頻度（Ｄａｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ，１９９５）は、１年あたり米国で約７０．０００人の癌死がｍｙｃ遺伝子またはその発現における変化と関連すると見積もることができる。３つのメンバー、すなわちＮ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、およびＬ−ｍｙｃが再配列され、増幅され、突然変異を起こし、および／または肺癌、乳癌、および結腸癌、白血病、および脳腫瘍等、多くの癌において過大発現される。
【０００６】
ｃ−ｍｙｃ遺伝子は、広範な組織および腫瘍において発現されるが、Ｎ−ｍｙｃ発現は胚組織、プレ−Ｂ細胞、および神経内分泌腫瘍に非常に限定される。Ｎ−ｍｙｃはヒト神経芽細胞腫および小細胞肺癌において増幅され、ウィルムス腫瘍および網膜芽腫において強く発現される。神経芽細胞腫は予後が非常に変化し得る幼児期癌である。神経芽細胞腫の約２０％がＮ−ｍｙｃ増幅を有しており、これらの腫瘍は非常に活動的な経過をたどる（Ｓｃｈｗａｂら， １９８３， Ｓｅｅｇｅｒ ら， １９８５）。神経芽細胞腫細胞株における形質移入されたＮ−ｍｙｃ遺伝子の過剰発現は増殖速度を非常に高めた（Ｂｅｒｎａｒｄｓら， １９８６， Ｌｕｔｚ ら， １９９６）。神経堤誘導組織における遺伝子組み換えマウス過剰発現Ｎ−ｍｙｃにより神経芽細胞腫が頻繁に成長する（Ｗｅｉｓら， １９９７）。多くの比較可能な観察により、多くの他の腫瘍型の病原におけるｃ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃを関係付けられた（Ｃｏｌｅ， １９８６， ｍａｒｃｕ ら， １９９２， Ｈｅｎｒｉｋｓｏｎ およびＬｕｓｃｈｅｒ， １９９６）。
【０００７】
ｍｙｃ−ファミリーメンバーはベーシック／ヘリックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー（ｂＨＬＨｚｉｐ）ドメインを有する転写因子である。ＭＡＸ蛋白質とｍｙｃのヘテロダイマーは、Ｅ−ボックスモーティブＣＡＣＧＴＧに結合し、標的遺伝子転写を活性化する（Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ ら，１９９２，Ａｌｅｘら， １９９２； Ｍａら， １９９３ ）。したがって、少数の識別標的遺伝子によりｍｙｃ下流パスウェイの識別はかなり不可能になった。しかし、多くの実験により、細胞周期コントロール、転位、分化の遮断、アポトーシス、および増殖速度におけるｍｙｃ遺伝子についての役割が示唆された（ＨｅｎｒｉｋｓｓｏｎおよびＬｕｓｃｈｅｒ，１９９６， Ｄａｎｇ，１９９９，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９９）。正常に機能しないｍｙｃ機能を有するショウジョウバエ突然変異体および哺乳類細胞株の表現型分析は細胞成長におけるｍｙｃ遺伝子についての役割を示唆した。ラット線維芽細胞におけるｃ−ｍｙｃ対立遺伝子の両方の不活性化により、２倍から３倍の成長速度の減少となった（Ｍａｔｅｙａｋら， １９９７）。ショウジョウバエｄｍｙｃの正常に機能しないインビボ発現は細胞成長を遅らせ、通常のサイズの半分の大人のハエを結果としてもたらした。さらに、成長調節におけるｍｙｃ遺伝子についての役割は細胞周期におけるその効果に合致している。ラット線維芽細胞におけるｃ−ｍｙｃの不活性化により細胞周期のＧ１およびＧ２期が長くなった。しかし、Ｓ期は長くならなかった。ヒト細胞におけるｃ−ｍｙｃまたはＮ−ｍｙｃの高発現はＧ１期を通過する移行を加速した（Ｓｔｅｉｎｅｒら，１９９５； Ｌｕｔｚら，１９９６）。同様の効果がショウジョウバエで見いだされた。つまり、ｄｍｙｃ活性が減少することにより、Ｇ１期の長さが長くなり、一方、ｄｍｙｃ発現が増加することにより、Ｇ１を通過する移行が高まった（ｊｏｈｎｓｔｏｎら， １９９９）。
【０００８】
多くの研究により、増殖におけるｍｙｃファミリー癌遺伝子の発現が関連付けられた。幾つかの腫瘍系列において、ｍｙｃ遺伝子の発現と増殖の発生との間には関連がある。このことは、例えば乳癌、骨腫瘍および結腸癌におけるｃ−ｍｙｃについて観察された（Ｓｉｅｒｒａら，１９９９， Ｇａｍｂｅｒｉら，１９９８， Ｋａｋｉｓａｋｏら，１９９８）。実験システムにより、ｍｙｃ遺伝子の発現および増殖キャパシティとの間の直接の関連を確認した。例えば、ｃ−ｍｙｃ過剰発現ヒトメラノーマ細胞は、コントロールメラノーマ細胞より転移性であった（Ｓｃｈｌａｇｂａｕｅｒ−Ｗａｄｌら，１９９９）。しかし、ｍｙｃ遺伝子の発現が癌細胞の転移性の可能性を増加するメカニズムは知られていない。
【０００９】
ｃ−ｍｙｃの直接的な幾つかの標的および間接的に誘導された遺伝子の系列が確認されたが、これらの遺伝子間の明らかな関連は見いだされていない。これらの観察の付随的なおよび独立的な特徴により、癌におけるｍｙｃ遺伝子の細胞効果の包括的および統合的な観点の確認を妨げられた。例としては、プロサイモシンα（Ｅｉｌｅｒｓら，１９９１）、オルニチンデカルボキシラーゼ（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，１９９３）、胚発現ＥＣＡ３９遺伝子（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙら，１９９２）、翻訳開始因子ｅｌＦ−４ＥおよびｅＩＦ−２−α（Ｊｏｎｅｓら，１９９６； Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら，１９９３）、ＣＡＤ遺伝子（Ｂｏｙｄら，１９９７）、ＤＥＡＤボックス遺伝子ＭｒＤｂ（Ｇｒａｎｄｏｒｉら，１９９６）、および近時におけるヌクレオリン（Ｇｒｅａｓｌｅｙら，２０００）である。サイクリンおよび他の細胞周期調節因子における効果は細胞の型および条件に依存する。サイクリンＤ１またはチロシン蛋白質フォスファターゼｃｄｃ２５Ａの誘導は、幾つかのモデル系でのみ見いだされた（Ｇａｌａｋｔｉｏｎｏｖら，１９９６， Ａｍａｔｉら，１９９８， Ｐｈｉｌｉｐｐら，１９９４； Ｄａｋｓｉｓら，１９９４； Ｓｏｌｏｍｏｎら，１９９５）。サイクリンＥおよびＡ発現誘導が報告された（Ｊａｎｓｅｎ−Ｄｕｒｒら，１９９３； Ｈａｎｓｏｎら，１９９４）。ｃ−ｍｙｃ標的プロサイモシンαおよびオルニチンデカルボキシラーゼもＮ−ｍｙｃにより誘導されるが、ｃ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃがその標的を全て分担するかは知られていない（Ｌｕｔｚら，１９９６）。したがって、ｍｙｃ遺伝子の変更が中心的であり、その多くが確認されマップ化された。
【００１０】
増殖し拡がる癌細胞において裏付ける生理的現象が生じることを明らかにするのに、あまり努力は払われていない。細胞が癌への過程で遺伝的に変化することは充分に理解される。これらの遺伝的に変化した細胞がいかにして通常の生理的メカニズムおよび現象を使って成長、侵略、拡がりに至る本質的な癌特性を立証するかはあまり理解されない。例えば、ｍｙｃ蛋白質は転写因子である。これはＭＡＸ蛋白質とダイマーを形成し、ＤＮＡ配列がＣＡＣＧＴＧであると認める。したがって、ｍｙｃ転写因子の極僅かの標的遺伝子が確認された。確認された標的からはｍｙｃ蛋白質により活性化された経路の明確な理解はできない。したがって、病原におけるこれらの蛋白質の生化学的役割は推測される。ｍｙｃ遺伝子の正常でない発現を有する突然変異体ショウジョウバエ、哺乳類細胞株、および遺伝子組み換えマウスについての表現型の観察により、細胞周期コントロール、転位、アポトーシス、増殖速度、および細胞成長におけるｍｙｃ遺伝子についての役割が示唆された。本発明はｍｙｃ調節遺伝子の少なくとも７つのグループを開示する。
【００１１】
本発明は、成長、侵略、および拡がりに至る癌細胞の本質的な癌の特徴をサポートする、本質的な通常の生理的メカニズムおよび現象の採用および適用を提供するのはｍｙｃ癌遺伝子ファミリーそれ自体であるという見識を提供する。本発明は、成長、侵略、または拡がり等の癌の特徴を本質的に証明できる遺伝子の機能的フラグメントまたはｍｙｃ依存下流遺伝子から構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、核酸ライブラリーは、下流ｍｙｃ−依存遺伝子またはその機能性フラクションである、遺伝子またはその機能性フラグメントから構成される核酸配列のコレクションとして規定される。これらの遺伝子の上方または下方制御は、ｍｙｃファミリーメンバーによりコード化される転写因子の存在に少なくとも依存する。このような核酸配列のコレクションにおいて、配列は、核酸配列のコレクションの容易な取り扱いを提供するベクターにおいて好ましく利用可能である。ｍｙｃ遺伝子の下流遺伝子またはその機能性フラグメントはＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法を適用することにより確認された。初期に、各々はｍＲＮＡ転写を表す約６６，２３３タグを、Ｎ−ｍｙｃトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株において確認した。したがって、我々は、各々が転写を表し、特に誘導された１９７タグおよびＮ−ｍｙｃにより抑制された８５タグを確認した（表１）。７９，１００転写へのこれらの分析の拡張において、我々はＮ−ｍｙｃにより上方または下方制御される転写の付加的な系列を確認した（表２）。
【００１２】
機能性フラグメントは、本発明ではＳＡＧＥ法による確認を提供する、適当なタグ配列を含むｍｙｃ依存下流遺伝子の一部として規定される。
特に、本発明はｍｙｃ依存下流遺伝子の各々が表１または２に示されたタグ配列に本質的に等価な核酸を含んで構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、本質的な等価物は、類似または関連した遺伝子またはそのフラグメントを識別するタグ配列に関連する。より好ましい態様では、前記ｍｙｃ−依存下流遺伝子がリボソーム蛋白質、蛋白質合成に関する蛋白質、転位に関する蛋白質、解糖酵素またはミトコンドリア機能性蛋白質をコード化する、本発明の核酸ライブラリーを提供する。
【００１３】
本発明は、成長、侵略、拡がり等、癌に本質的な特徴を裏付けることのできるｍｙｃ依存下流遺伝子をモジュレーションすることを含んでなる、癌の治療法を提供する。本発明は、前記ｍｙｃ依存下流遺伝子が表１または２に示されたタグ配列の一つに本質的に対応する核酸を含む方法を提供する。 本質的な等価物は類似のまたは関連する遺伝子またはそのフラグメントを確認するタグ配列に関連する。
【００１４】
例えば、本発明は、ヒト神経芽細胞腫におけるＮ−ｍｙｃにより活性化されまたは抑制される下流遺伝子を提供する。６６，２３３転写物より多い発現レベルの分析によりＮ−ｍｙｃ発現細胞における１９９の上方調節および８５の下方調節転写物を識別した（表１）（Ｂｏｏｎら，２００１）。７９，１００転写物へのこれらの分析の拡張によりＮ−ｍｙｃにより上方または下方調節される転写物タグの付加的な系列を識別した（表２）。我々の結果は、リボソーム生合成および蛋白質合成における、並びにミトコンドリア電子伝達およびＡＴＰ合成における遺伝子機能化を刺激することにより、細胞成長、腫瘍形成の容易化のレギュレータとしてＮ−ｍｙｃが機能することを示す。さらに、細胞構造および細胞マトリクス相互作用に含まれる多くの遺伝子は下方調節され、腫瘍形成細胞の浸潤または拡散を容易化する。Ｎ−ｍｙｃ調節遺伝子の系列はｃ−ｍｙｃ調節の標的でもある。  ここで、本発明はＭＹＣファミリー標的遺伝子のリストに、ｍｙｃ−ファミリー遺伝子により誘導されまたは阻害される経路を識別できる多数の識別標的を提供する。しかし、個々の遺伝子の識別は幾つかの他の用途にも提供される。この発見は、例えば、新薬の開発、既知の薬剤の改良された使用、および組換え技術に使用可能である。幾つかの例を以下に示す。
【００１５】
例えば、本発明は、ｍｙｃ蛋白質またはｍｙｃ下流経路蛋白質を特に阻害する薬剤の高い処理能力のスクリーニングのためのアッセイを提供する。個々の癌が幾つかの癌遺伝子および／または腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異により引き起こされることは充分に確立されている。腫瘍や同じ組織は突然変異した癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の異なる組み合わせから起こり得る。遺伝子欠陥の型および組み合わせは腫瘍細胞のバイオロジーをそして腫瘍の臨床的挙動を決定する。将来の腫瘍治療は、個々の患者の腫瘍に対して個別的に行われるであろう。診断に際しては、腫瘍の癌遺伝子活性の型を確立し、治療を選択する指針となる。米国で１年あたり約７０，０００人が癌で死亡することは、ｍｙｃ遺伝子における欠点またはこれらの遺伝子の過剰発現に関係する（Ｄａｎｇ およびＬｅｅ、１９９５年； Ｄａｎｇ、１９９９年）。現在のところ、ｍｙｃ蛋白質の活動を特に阻止する薬剤は存在しない。このような薬剤は、現在、高い処理能力システムにおいて、本発明によって供給される標的遺伝子を使用して識別できる。ここでは、何千の化合物がｍｙｃ蛋白質の特別な阻害効果に対して試験されうる。これらの試験システムは非常に厳密な読み取りシステムが必要である。ＴＰ５３腫瘍サプレッサー蛋白質のインヒビタを識別するために使用されるこのようなシステムの例が、最近公開された（Ｋｏｍａｒｏｖ等、１９９９年）。ｌａｃＺリポータ構成はＴＰ５３により誘導されることが知られている遺伝子のプロモーターのコントロール下にもたらされた。この構成をもつマウス細胞株を使用して１０，０００の合成化学的化合物を試験した。これらの化合物をこれらの細胞と共に組織培養ウェルに添加し、ＴＰ５３を不活性にする僅かの化合物が、ＬａｃＺリポーター遺伝子の発現が低下することから確認された。
【００１６】
ｍｙｃ標的遺伝子の系列を我々が識別したことにより、ｍｙｃ抑制性薬剤を識別するための向上したアプローチが可能になる。現在は、このような薬剤を識別する感受性読み取りシステムはない。ｃ−ｍｙｃおよび／またはＮ−ｍｙｃの幾つかの標的遺伝子が識別されたが、これらの発現レベルはほんの数倍調節されたに過ぎず、読み取りシステムとして本質的に役立たない（Ｃｏｌｅ等により１９９９年に検討された）。ここに、我々は、Ｎ−ｍｙｃおよび／またはｃ−ｍｙｃにより強く誘導または抑制される遺伝子の系列を識別したことを説明する。例えば、我々は、オステオネクチンまたはＳＰＡＲＣ遺伝子の発現が、ＳＨＥＰ−２における１０，０００転写物あたり２８０転写物から、ＳＨＥＰ−２１Ｎにおける１４転写物へＮ−ｍｙｃにより下方調節されることを示した。この２０倍の減少は、ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１ＮからのｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより充分に確認される（データは示さず）。さらに、我々は、蛋白質レベルで、ＳＨＥＰ−２細胞がＳＨＥＰ−２よりもずっと多くのオステオネクチン蛋白質を有することを確認した（データは示さず）。オステオネクチン蛋白質は分泌蛋白質として知られている（Ｌａｎｅ およびＳａｇｅにより１９９４年に検討された。）。これにより、Ｎ−ｍｙｃ阻害性薬剤の試験が非常に実施し易くなる。試験化合物を、Ｎ−ｍｙｃ発現が、例えばテトラサイクリン誘導可能なシステムにより、誘導できるＳＨＥＰ細胞に添加できる。Ｎ−ｍｙｃ発現を誘導する場合、オステオネクチン蛋白質レベルはこれらの細胞において低下するであろう。化合物がＮ−ｍｙｃに対して阻害性である場合、これはオステオネクチンｍＲＡＮ発現の下方モジュレーションを阻止するであろう。これらの細胞は組織培養培地内でオステオネクチン蛋白質の内分泌を継続するであろう。したがって、マルチウェル細胞培養システムにおいて、不活性な化合物を有する全ウェルにおいてオステオネクチンの生成が低いであろう。オステオネクチン濃度が高い稀なウェルは、Ｎ−ｍｙｃ機能化を阻害する化合物を示す。イライザまたは他の蛋白質に基づく検出システムはオステオネクチンの高濃度のウェルを自動的に検出できる。オステオネクチンのみならず、ＩＧＦＢＰ７、コラーゲン型４ａ１およびシンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）２のような多くの他の下方調節遺伝子が、ｍｙｃにより下方調節されることを識別するので、これらはこのようなアッセイにおいても使用できる。類似のアッセイを、読み取りとしてＮ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃにより誘導される遺伝子を使用して設計できる。このような薬剤試験システムの変形において、強くＮ−ｍｙｃ調節された遺伝子のプロモーター素子を使用でき、これらをグリーン蛍光性蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のような容易に検出できる蛋白質のコントロール発現に使用できる。これにより、高い処理能力システムにおけるｍｙｃ阻害性薬剤の検出がさらに単純化されるであろう。
Ｎ−ｍｙｃ標的の多くはｃ−ｍｙｃの標的でもあることを、我々は示したので、我々の発見は、ｍｙｃ癌遺伝子ファミリーの他のメンバーに対して薬剤の識別のためのアッセイに使用できる。誘導性ｃ−ｍｙｃ構成は多くの細胞システムにおいてｎ−ｍｙｃと同じ遺伝子を標的にするであろう。したがって、Ｎ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｃについての標的遺伝子の記載されたリストにより、数千の薬剤候補のうち数百について半自動的試験を可能にし、ｍｙｃ蛋白質および／またはそれらの下流経路に対して活性な化合物の選択を可能にする。
【００１７】
さらに、本発明は、Ｎ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ活性化腫瘍を有する患者の特別な治療に対する現在の薬剤の用途およびさらなる開発を、例えばｍｙｃが関連する癌の治療法において提供する。説明したように、将来の癌治療は特定の患者の腫瘍において実際に活性化されたこれらの癌遺伝子を特に阻害するように設計されるであろう。我々の発見は、ｍｙｃ遺伝子の活性により引き起こされた腫瘍を有する患者において現在知られた細胞増殖抑制性または細胞障害性薬剤の幾つかの使用の検討を提供する。いくつかの例を挙げる。例えば、本発明はヌクレオホスミンに干渉する薬剤を使用することを含む治療法を提供する。
我々は、Ｎ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｃ誘導の主な標的としてヌクレオホスミン（Ｂ２３）を識別した。ヒト腫瘍および細胞株の大きな系列の分析は、インビボでヌクレオホスミンｍＲＮＡレベルがＮ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ発現に関連することを示した。ヌクレオホスミンはリボソーム生合成およびプレリボソーム粒子の核小体の細胞質内輸送において機能する。前記蛋白質は、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、マイトマイシン、トヨカマイシン（ｔｏｙｏｃａｍｙｃｉｎ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、サンギバマイシン（ｓａｎｇｉｖａｍｙｃｉｎ）、およびマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）のような幾つかの細胞障害性薬剤により核小体から核質に転位することが知られている（Ｙｕｎｇ等、１９９５年、１９９０年； Ｃｈａｎ等、１９８７年；Ｃｈａｎ，１９８８年、１９９２年； Ｃｏｈｅｎ およびＧｌａｚｅｒ、１９８５年、Ｐｅｒｌａｋｙ等、１９９７年）。これらの薬剤を用いた細胞の処理はリボソームＲＮＡのプロセッシングおよび蛋白質合成を阻害し、細胞死に至る。これらの薬剤の幾つかは、癌患者の治療に臨床的に試験および／または適用される。
【００１８】
ｍｙｃ癌遺伝子ファミリーのメンバーがヌクレオホスミンｍＲＮＡおよび蛋白質発現を誘導するという我々の発見により、ｍｙｃファミリーメンバーの過剰発現を有する腫瘍に対する治療における関心のある標的としてこの蛋白質は注目される。このことから、上記薬剤およびこれらの類似物に対する基本的な新規な機会が開かれる。これらの薬剤は、ｍｙｃ活性化腫瘍について特別の効果の可能性の知識を持たずに、非選択的な患者系列に対して臨床的に試験されまたは使用された。この患者系列は、おそらく腫瘍にｍｙｃ遺伝子を有する患者持たない患者からなると考えられる。アクチノマイシンＤは例えばウィルム（Ｗｉｌｍ）の腫瘍および横紋筋肉腫の治療に使用される。幾人かの患者は他の患者より良好な治療反応を示す。ウィルムの腫瘍および横紋筋肉腫の患者は高いＮ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ発現を有する（Ｎｉｓｅｎ等、１９８６年）。アクチノマイシンＤが腫瘍を発現するＮ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃに対して特に効果的であるかどうかを今や試験でき、この場合、アクチノマイシンＤはｍｙｃ活性を持たない腫瘍に対して非効果的である。これらの発見により、アクチノマイシンＤのより特別な使用がもたらされる。幾つかの他の薬剤がヌクレオホスミンに対して効果的である（上記参照）。より特別な抗ヌクレオホスミン効果を有する低毒性類似物の開発によるこれらの薬剤の改良は、特別の抗ｍｙｃ薬剤を設計するために提供される興味ある戦略である。例えば、トヨカマイシンは高毒性であるが（Ｗｉｌｓｏｎ１９６８年）、類似物は試験されてさらにｍｙｃ活性化腫瘍を有する患者に対する特別な使用について開発できる。
【００１９】
本発明は細胞外および膜貫通型蛋白質のインヒビタの使用をもたらす。Ｎ−ｍｙｃおよび／またはｃ−ｍｙｃにより誘導される遺伝子のリストは分泌性または細胞表面蛋白質に対してコード化する多くの遺伝子を含む。このような蛋白質は、容易に受け入れられるので、薬剤に対する優れた標的である。これらにより、ｍｙｃファミリーメンバーの活性を有する腫瘍細胞の成長および転移を特別に阻害するための標的がもたらされる。標的の可能性のある例としては、バシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型１（ＰＡＩ）である（表１、Ｎｏ．１１２）。バシジン（またはＥＭＭＰＲＩＮ、細胞外マトリクスメタロプロテイナーゼインデューサ）（表１，Ｎｏ．９７）は腫瘍細胞の表面に存在し、側の線維芽細胞を刺激するイムノグロブリンファミリーのメンバーである（Ｇｕｏ等１９９８年）。メタロプロテイナーゼはマトリックスの分解および転移を促進することが知られているので、バシジンを阻害する薬剤は、ｍｙｃファミリー遺伝子の高発現を有する腫瘍の転移を防止可能であるであろう。メタロプロテイナーゼを阻害する薬剤は既知であり、ｍｙｃファミリーメンバーの活性を有する腫瘍の特別な治療に対して適用できるであろう。
【００２０】
プラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型１（ＰＡＩ−１）は、線維素溶解およびマトリックス代謝回転の主な生理学的インヒビタである。ここに記載の、Ｎ−ｍｙｃによるＰＡＩ−１の下方調節はマトリックス代謝回転を増加させ、細胞運動性および転移を促進する。多くの化合物をＰＡＩの調節に対して臨床的に実験的に試験する。例えば、１５−デオキシ−デルタ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）、転写因子ＰＰＡＲｇに対する活性化リガンドはＰＡＩ−１ｍＲＮＡおよび蛋白質発現を強化した（Ｍａｒｘ等、１９９９年）。したがって、これらの薬剤は腫瘍を発現するＮ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃの転移を防止するために特に使用されるということがもたらされる。さらに、Ｎ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ蛋白質により誘導される膜貫通型蛋白質は、細胞障害性薬剤に結合できる抗体のような治療薬剤の標的として使用できる。
【００２１】
さらに、本発明は腫瘍の分子診断をさらに提供する。ｍｙｃファミリー癌遺伝子の標的遺伝子について第１の完全な記述を提供する。幾つかの基本的なカテゴリが提供される。しかし、Ｎ−ｍｙｃ活性を有するフレッシュな腫瘍の分析において、我々は、これらの全てではない遺伝子または全てのカテゴリが全腫瘍において上方調節されることを観察した。これにより、付加的な欠点または要因が個々の腫瘍においてｍｙｃ癌遺伝子により誘導または抑制される遺伝子の範囲に影響することが示唆される。このことは、腫瘍の生態に対して重要であると考えられる。したがって、ｍｙｃファミリーメンバーの活性を有する腫瘍における上方調節／抑制される遺伝子の詳細な分析が臨床的に関連する。蛋白質合成に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍は、酸化的リン酸に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍とは異なるかもしれない。この情報は腫瘍に対する適当な治療法を選択するのに重要である。したがって、Ｎ−ｍｙｃおよび／またはｃ−ｍｙｃ下流標的の完全なリストにより、最適な治療に対する腫瘍を分類するための重要な手段をもたらす。ここに記載の発見は、ｍｙｃファミリー癌遺伝子のキー下流標的の活性化または不活性化を測定する診断キットを開発するのに適用される。このような診断ツールは、最適な治療をガイドするために提供される。
【００２２】
さらに、本発明は腫瘍の非侵略的な診断を提供する。特別な癌遺伝子の活性は現在では外科的に除去した腫瘍試験片の分析により確立されるのみである。外科手術は患者に負担であるので、腫瘍の癌遺伝子状態を監視するための高価で危険がなく、非浸潤的な方法が望まれる。Ｎ−ｍｙｃにより誘導または抑制される分泌性蛋白質に対する遺伝子のインベントリが血清マーカーの分析によりｍｙｃ発現の状態を決定するのに使用できる。さらに、これらの遺伝子の血清レベルは、腫瘍成長、治療に対する反応および再発の発生を監視するのに使用できる。我々の結果は、例えば、オステオネクチン（１０，０００タグあたり２８０から１４タグに減少される）、マクロファージ移行阻害因子（表１、Ｎｏ．９２）（１０，０００タグあたり１．１から１４．４タグに誘導される）、およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型１（ＰＡＩ−１）等多くの候補蛋白質が腫瘍マーカーとして腫瘍の生物学的分類に役立つことを示す。最近、ＰＡＩ−１の血清レベルを一連の頭頚部腫瘍において分析し、腫瘍ステージに関連することがわたかった（Ｓｔｒｏａｎ等１９９８年）。したがって、我々の発見は、ＰＡＩ−１およびｍｙｃファミリーメンバーにより影響される他の分泌性蛋白質を、腫瘍におけるｍｙｃ遺伝子の状態を監視しかつｍｙｃ誘導性腫瘍の治療に対する成長および応答を追跡する良好な候補として識別する。
【００２３】
さらに、本発明は生成目的のための細胞蛋白質合成機構の強化を提供する。真核生物の細胞を使用して、例えば薬剤の組換え蛋白質を生成する。Ｎ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｃが蛋白質合成機構の本質的な成分を誘導するという発見は、細胞システムの組換え蛋白質のブースト生成に適用され得る。本発明は、治療または市販価値を有する抗体、ホルモン、または他の蛋白質のような組換え蛋白質の生成を最適にする内因性または形質移入性ｍｙｃ遺伝子の高発現を有する細胞の使用を提供する。
さらに、本発明は、転写物および／または蛋白質のｎ−ｍｙｃまたはｎ−ｍｙｃ誘導調節に干渉できる物質を識別する方法であって、ｎ−ｍｙｃ活性を有する細胞を提供し、前記物質の存在下で前記転写物および／または蛋白質のモジュレーションを決定することを含む方法を提供する。本発明で記載したように、ｎ−ｍｙｃによる転写物および／または蛋白質のモジュレーションは上方または下方調節できる。
【００２４】
ｍｙｃ癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を担う。ヒト癌のｍｙｃ遺伝子の遺伝的変化の頻発（Ｄａｎｇ およびＬｅｅ、１９９５）により、１年あたり米国で約７０，０００人が癌で死亡することがｍｙｃ遺伝子におけるまたはその発現における変化に関連するという予想が可能になった。３つのメンバー、すなわちＮ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃおよびＬ−ｍｙｃが、例えば肺、乳房および大腸の多くの癌においておよび白血病および脳腫瘍において、再配列され、増幅され、突然変異し、および／または過剰発現する。ｍｙｃ蛋白質は転写因子である。これらはＭＡＸ蛋白質とダイマーを形成し、ＤＮＡ配列ＣＡＣＧＴＧを認識する。ｍｙｃ転写因子の標的遺伝子は殆ど識別されていない。識別された標的によっては、ｍｙｃ蛋白質により活性化されるパスウェイの理解を明確にすることができない。したがって、これらの蛋白質の病因論における生物化学的な役割は推論の域をでない。ｍｙｃ遺伝子の異常発現を有する、哺乳類の細胞株、遺伝子組換えマウスおよび突然変異ドロゾフィラについての表現型の観察により、細胞サイクル制御、転移、アポトーシス、増殖速度および細胞成長におけるｍｙｃ遺伝子に対する役割を提案した。
【００２５】
ｍｙｃ遺伝子の下流パスウェイを識別するために、我々はＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法を利用した。初期に、我々は約６６，２３３タグを識別した。これらの各々は、１対の、Ｎ−ｍｙｃトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株における、ｍＲＮＡ転写物を表す。このようにして、我々は、各々が転写物を表し、特に誘導される１９７タグおよびＮ−ｍｙｃにより抑圧される８５タグを識別した（表１）。７９，１００転写物に対するこれらの解析の拡張において、Ｎ−ｍｙｃにより上方制御または下方制御された転写物の付加的なシリーズを識別した（表２）。Ｎ−ｍｙｃは多くのリボソーム蛋白質遺伝子、リボソームＲＮＡ合成およびリボソーム生合成に伴われる遺伝子、および翻訳および蛋白質成熟に伴われる遺伝子の発現を誘導することが明らかである。このことは、Ｎ−ｍｙｃの主な機能が細胞の蛋白質合成機構の増強であることを示している。さらに、ミトコンドリア内における電子伝達およびＡＴＰ合成、および解糖に伴われる遺伝子の著しい誘導がもたらされる。このことは、細胞エネルギー生成機構が高い容量を有していることを示している。Ｎ−ｍｙｃ標的の別のセットは細胞粘着、マトリクス形成、侵略的キャパシティおよび細胞骨格構築に伴われる。これらのデータによりｍｙｃ発現腫瘍細胞に関連する転移可能性が高いことが説明される。さらに、遺伝子のセットは、転写、染色体縮合および情報伝達における役割について誘導されまたは抑制される。最終的に、短いｃＤＮＡ配列のみが既知である（Ｅｓｔｓ）一連の遺伝子が識別され、幾つかのＳＡＧＥ転写物タグを、遺伝子を遺伝子割り当てすることなく識別した。これらの遺伝子はＮ−ｍｙｃ下流パスウェイの重要な成分であり得る。Ｎ−ｍｙｃのこれらの下流標的の多くはｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の標的でもあることが明らかである。したがって、これらのデータはｍｙｃ癌遺伝子ファミリーの標的遺伝子のインベントリを示す。これらの遺伝子はｍｙｃファミリー癌遺伝子の腫瘍形成効果を仲介するので、これらはｍｙｃ蛋白質またはｍｙｃ下流パスウェイを阻害する新薬を識別する機会を提供する。さらに、癌遺伝子のｍｙｃファミリーのメンバーを発現する腫瘍細胞を阻害または殺す潜在的な標的遺伝子の範囲を示す。
【００２６】
結果
Ｎ−ｍｙｃでトランスフェクトされた神経芽細胞腫細胞株のＳＡＧＥライブラリ  Ｎ−ｍｙｃの下流標的遺伝子を識別するために、我々はＮ−ｍｙｃトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株についてＳＡＧＥ法を適用した。ＳＨＥＰ細胞株はＮ−ｍｙｃ増幅および発現がなく、さらにｃ−ｍｙｃ発現もない。テトラサイクリン依存Ｎ−ｍｙｃ発現ベクターはこれらの細胞中に誘導され、ＳＨＥＰ−２１Ｎクローンをもたらす（Ｌｕｔｚ等、１９９６年）。ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞はテトラサイクリンによってスイッチオフされ得る構成性外因性Ｎ−ｍｙｃ発現を有する。ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞におけるＮ−ｍｙｃ発現は細胞分裂の速度を高め、細胞周期のＧ１期を短くし、細胞にアポトーシスのトリガに対する感受性をより高めることを示した（Ｌｕｔｚ等、１９９６年；Ｆｕｌｄａ等１９９９年）。２つのＳＡＧＥライブラリを構成した。Ｎ−ｍｙｃを発現するＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞からのものと、ＳＨＥＰ−２コントロール細胞からのものである。ＳＨＥＰ−２クローンをエンプティ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。ＳＨＥＰ−２から我々は約４４，６７４の転写物タグを配列決定し、ＳＨＥＰ−２１Ｎからは２１，５５９転写物タグを配列決定した。２つのＳＡＧＥライブラリーを比較することにより、Ｎ−ｍｙｃ発現細胞において１９９の有意に（ｐ＜０．０１）上方制御されたタグを４７倍までの誘導レベルで得た（表１、セクション１）。別の８５タグは有意に下方制御された。さらに、２１，５５９タグから３４，４２６タグまでのＳＨＥＰ−２１Ｎライブラリーの配列決定により、Ｎ−ｍｙｃ（ｐ＜０．０１）により上方または下方制御された転写物タグの別のシリーズを得た（表２）。我々はこれらのタグと現在作ることのできる最も可能性のある遺伝子割当を本明細書に記載する。これらのタグに相当する転写物を我々が開発したコンピュータープログラムおよびＣＧＡＰ／ＮＣＢＩ（Ｌａｌ等、１９９９年）からのＳＡＧＥマップデータベースを使用して識別した。Ｎ−ｍｙｃ制御遺伝子の７つのグループを記載する。
【００２７】
Ｎ−ｍｙｃ標的１：リボソーム蛋白質遺伝子
第１の機能的グループは６１のリボソーム蛋白質遺伝子からなり、それらは４７倍まで誘導される（ｐ＜０．０１、表１、セクション１）。これらの６１の蛋白質はヒトのリボソーム蛋白質の約７５％を表す（Ｗｏｏｌ等、１９９６年）。誘導された遺伝子の幾つかをさらに解析するために選択した。ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞からの全ＲＮＡの等量を用いたノーザンブロッティングを、リボソーム蛋白質Ｓ１２、Ｓ２７、Ｆａｕ−Ｓ３０、Ｌ８、Ｓ６、Ｓ１９およびリボソームリン蛋白質Ｐ０（ＰＰＡＲＰ０）に対するプローブを用いてハイブリッドした（図１）。７つの遺伝子全てをＮ−ｍｙｃにより誘導した。リボソーム蛋白質ｍＲＮＡに対して発見されたタグの残量は、ＳＨＥＰ−２において全タグの約４％を構成する。このフラクションはＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて１０％に増加した。個々のリボソーム蛋白質遺伝子のレベルはＳＨＥＰ−２における基礎発現レベルのフラクションである。高発現遺伝子は、ＳＨＥＰ−２において低基礎発現を有する遺伝子より低く誘導される（図２）。これらの結果より、Ｎ−ｍｙｃが、直接的にまたは間接的に、大多数のリボソーム蛋白質のｍＲＮＡ発現レベルを誘導することを示している。
【００２８】
Ｎ−ｍｙｃ標的２：リボソーム生合成および蛋白質合成における遺伝子機能化
２６タグの第２の機能的グループは蛋白質合成および代謝回転、特別なリボソームバイオジェネシス、ｍＲＮＡ翻訳、蛋白質成熟および分解における明確な役割を有する遺伝子に相当する。
【００２９】
ヌクレオホスミン（Ｂ２３）（表１、Ｎｏ．６７および８３）の誘導に高い関心がある。ノーザンブロット解析により、この誘導が、タグ頻度により推定されるよりもかなり強いレベルであることを確認した（図１）。ヌクレオホスミンは、５．８Ｓのプレ−ｒＲＮＡの５’末端の切断によるリボソームＲＮＡをプロセスする、非常に豊富な核小体蛋白質である（Ｓａｖｋｕｒ等、１９９８年）。さらに、これはプレリボソーム粒子の核−細胞シャトリングおよび集合において機能する（Ｂｏｒｅｒ等、１９８９年；Ｏｌｓｏｎ等、１９９１年；Ｓｚｅｂｅｎｉ等、１９９９年）。ヌクレオホスミンはリンパ腫および白血病における再発性染色体転座の標的である（Ｍｏｒｒｉｓ等、１９９４年、Ｒｅｄｎｅｒ等、１９９６年、Ｐａｎｄｏｌｆｉ、１９９６年）。リボソームバイオジェネシスにおけるヌクレオホスフィンの主要な役割のために、我々はこのプロセスに関連した他の遺伝子に対するＳＡＧＥライブラリーを解析することを急いだ。第二の転写物のために２つのタグを有するヌクレオリン（表１、Ｎｏ．８７および８８）は、合計で１０，０００あたり２．５から５．６タグを誘導する（ｐ＝０．０４４）。この誘導はノーザンブロット解析により確認された（図１）。また、ヌクレオリンは非常に豊富な核小体蛋白質であり、ヌクレオホスミンに結合する（修正ＴｕｊｅｔａおよびＴｕｊｅｔａ、１９９８年；Ｇｉｎｉｓｔｙ等、１９９９年）。１８ＳｒＲＮＡを成熟させることは恐らくプレリボソームＲＮＡのプロセシングにおける第１段階に対する律速酵素である（Ｇｉｓｔｉｎｙ等、１９９８年）。さらに、ヌクレオリンはプレリボソーム粒子の集合およびそれらの核−細胞輸送に伴われる。それは１８リボソーム蛋白質と相互作用し（Ｂｏｕｖｅｔ等、１９９８年）、それの１６はＮ−ｍｙｃにより誘導される。Ｎ−ｍｙｃによるヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの誘導は、さらにリボソーム蛋白質、リボソームＲＮＡおよびリボソーム生合成はＮ−ｍｙｃ刺激の標的であることを示唆する。
【００３０】
３つの翻訳開始因子および５つの翻訳延長因子に相当するタグが誘導された。開始因子は、真核生物翻訳開始因子３サブユニト８（ｅＩＦ３ｓ８）（表１、Ｎｏ．８１）およびサブユニット３（表１、Ｎｏ．７８）、真核生物翻訳開始因子４Ｂ（表１、Ｎｏ．７２）である。延長因子１（ＥＥＦ１）は、リボソームへのアミノアシル−ｔＲＮＡのデリバリに起因し、サブユニットα／β／γまたはα／β／γからなるヘテロトリマーである。サブユニットα、βおよびγに対するタグは、ＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて９〜１１．４倍に誘導される（表１、Ｎｏ．６９、６６および７０）。延長因子２はリボソームのＡからＰ部位に新生ポリペプチド鎖の転座を促進し、誘導もされる（表１、Ｎｏ．７９）。ミトコンドリアの延長因子Ｔｕ（ｔｕＦＭ）はアミノアシルｔＲＮＡをミトコンドリアリボソームにデリバリし、１２．４倍上方制御される（表１、Ｎｏ．６４）。ＳＨＥＰ−２１ＮおよびＳＨＥＰ−２のノーザンブロット解析はｅＩＦ３ｓ８、ＥＥＦ１ａ１およびｔｕＦＭの誘導を確認した（図１）。さらに、これらのデータは蛋白質合成のレギュレータとしてのＮ−ｍｙｃに対する役割を支持する。
【００３１】
蛋白質合成の次の段階は成熟およびルーティングである。新生ポリペプチド結合錯体（ＮＡＣ）αｍＲＮＡをＮ−ｍｙｃ発現細胞において誘導した（表１、Ｎｏ．７７）。ＮＡＣは細胞基質蛋白質の新生ポリペプチド鎖を不適当な転座から小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）へ保護する（Ｗｉｅｄｍａｎｎ等、１９９４年）。シャペロンＨＳＰ６０およびＨＳＰ９０の誘導は蛋白質フォールディングおよび成熟についての細胞能力が高まることを示唆した（表１、Ｎｏ．６５、６８、８０および８２）。ＨＳＰ６０はミトコンドリアの蛋白質取り込みおよび高分子集合に関連する。ＨＳＰ９０は、ステロイドホルモン受容体を含むシグナル分子のフォールディングおよびミスフォールディング蛋白質の再フォールディングに関連する。ノーザンブロット解析はＨＳＰ６０の誘導を確認した（図１）。蛋白質分解に対する細胞能力も誘導できた。このことは、３つのユビキチンパスウェイ蛋白質（表１、Ｎｏ．６２、７３および７６）および５つのプロテアソームサブユニット（表１、Ｎｏ．６３、７１、７４、７５および８４）に対するタグ頻度が増加することにより示唆された。ノーザンブロット解析はＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞におけるプロテアソームサブユニットｂタイプ６の発現レベルがより高いことを確認した（図１）。
【００３２】
Ｎ−ｍｙｃ標的３：解糖遺伝子
Ｎ−ｍｙｃ誘導遺伝子の第３グループは解糖経路における鍵酵素をコード化した（表１、セクション４）。アルドラーゼＡフルクトースビホスフェート（ＡＬＤＯＡ）、トリオースホスフェートイソメラーゼ１（ＴＰＩ１）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびピルベートキナーゼに対するタグは全て増加した（表１、Ｎｏ．１３３，１３５および１３２）。他の誘導ｍＲＮＡは、セリンの合成に関連する代謝酵素３−ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼおよびソルビトールをフルクトースに酸化するソルビトールデヒドロゲナーゼに対してコード化する。アルデヒドデヒドロゲナーゼ１はメタノール代謝において機能する。ノーザンブロット解析はＡＬＤＯＡ、ぴるべートキナゼ、ＴＰＩ１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ誘導を確認した（図１）。これらのデータはＮ−ｍｙｃ刺激の標的として解糖に関連している。
【００３３】
Ｎ−ｍｙｃ標的４：ミトコンドリア電子運搬およびＡＴＰ合成
ＳＨＥＰ−２１Ｎは、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化における役割を有する遺伝子に相当する一連のタグの誘導を示す（表１、セクション５）。１７のタグを有意に誘導する。誘導した遺伝子の５つがミトコンドリアについてコード化される（参照：ミトコンドリアタグ解析Ｗｅｌｌｅ等、１９９９年）。
Ｏ２への電子移動によるＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２の酸化は、呼吸鎖、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ユビキノールシトクロームｃレダクターゼおよびシトクロームｃオキシダーゼにより行われる。これらの大きい錯体はミトコンドリア内膜を横切ってプロトン勾配を確立する。このプロトン勾配はＦタイプＡＴＰシンターゼ錯体によるＡＴＰの合成を駆動する。Ｎ−ｍｙｃは、４つの酵素錯体全ての一連のサブユニットを増加する。
【００３４】
４つのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット、サブコンプレックス４（表１、Ｎｏ．１３６、ＮＤＵＦＢ４）、サブコンプレックス７（表１、Ｎｏ．１３８）、およびミトコンドリアについてコード化したサブユニット４／４１および３（表１、Ｎｏ．１５０および１５１）を誘導する。ＮＤＵＦＢ４の誘導をノーザンブロット解析により確認した（図１）。
ユビキノール−シトクロームｃレダクターゼ複合体のサブユニットを誘導した（表１、Ｎｏ．１３６）。さらに、シトクロームｃオキシダーゼのサブユニットＩＩ、 ＩＩＩおよび ＶＩＩＩをＮ−ｍｙｃ発現細胞において誘導した。サブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸＶＩＩＩ、表１、Ｎｏ．１４９）の誘導をノーザンブロット解析により確認した。
最終的に、Ｎ−ｍｙｃはＦ０セグメントのサブユニット６／８およびＦタイプＡＴＰシンターゼのストークのＦ０セグメントのサブユニット９（またはｃ）の２つのイソ型の転写を誘導する（表１、Ｎｏ．１３７、１４８および１５２）。ＡＴＰアーゼサブユニット６および８を、オーバーラップミトコンドリア転写についてコード化する。
【００３５】
さらに、ミトコンドリア機能における役割を有する幾つかの他の蛋白質は上方制御される（表１、セクション５）。電圧依存性陰イオンチャンネル（ＶＤＡＣ、表１、Ｎｏ．１４３）を５倍誘導し、ノーザンブロット解析で確認した（図１）。ＶＤＡＣは親水性分子が拡散できるミトコンドリア外膜チャンネルを形成する。これは、シトクロームｃを細胞質に伝達できるので、アポトーシスにおいて主な役割を果たし、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）９活性をもたらす。
さらに、グルタチオンペルオキシダーゼ４およびグルタチオンＳトランスフェラーゼｐは強く誘導される（表１、Ｎｏ．１３９および１４４）。グルタチオンは容易に電子を受容し、過酸化水素および有機過酸化物に対するスッキャベンジャとして作用し得る。ミトコンドリアの電子伝達系により不可避のアーチファクトが生じる。この反応はグルタチオンペルオキシダーゼにより触媒される。
【００３６】
Ｎ−ｍｙｃ標的５：細胞運動および転移における役割を有する遺伝子：
Ｎ−ｍｙｃによって誘導または抑制される、大きいグループのタグは、細胞運動および細胞マトリックス相互作用における役割を有する遺伝子に属する（表１、セクション３）。これらの遺伝子は細胞骨格蛋白質、細胞表面蛋白質、接着分子、および細胞マトリックス構築および代謝回転における役割を有する細胞外保護蛋白質に対してコード化する。この範疇における遺伝子に対するタグを有意に誘導した。この範疇における別の２９のタグを有意に下方制御する。下方制御の例としては、コラーゲンタイプＩａ１（表１、Ｎｏ．１００、１０８、および１０９）、タイプＩＶａ１（表１、Ｎｏ．１１５）およびタイプＸＶＩＩＩａ１（表１、Ｎｏ．１１６）、フィブリリン（表１、Ｎｏ．１２１）、シンデカン２（表１、Ｎｏ．１２６）、フィブロネクチン（表１、Ｎｏ．１２２）およびオステオネクチン（ＳＰＡＲＣ）（表１、Ｎｏ．１１８、１２３および１２５）である。後者は興味のある遺伝子であり、１０，０００タグあたり２８０から１４タグに下方制御される。我々はノーザンブロット解析により、オステオネクチン、シンデカン２およびコラーゲンＩＶａ１およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタタイプ１を確認した（表１、Ｎｏ．１１２）（データは示さず）。これらの遺伝子の下方制御は、Ｎ−ｍｙｃが細胞マトリックスに対する細胞粘着を下げることができ、したがって、細胞運動性を誘導することを示唆する。これは、ｍｙｃ発現腫瘍細胞の転移可能性が高められた株である。
【００３７】
Ｎ−ｍｙｃ標的６：他の遺伝子
Ｎ−ｍｙｃによって影響される遺伝子の別のグループは、情報伝達蛋白質、転写因子、クロマチン因子、サイクリンおよび他の調節蛋白質によって形成される。このグループは６６の有意に誘導された転写を数える（表１、セクション６）。例としてはＮＭ２３Ａ，ＮＭ２３Ｂ，ＨＭＧＩ−Ｙ，ジンクフィンガー蛋白質６および（表１、Ｎｏ．１７１、２１４、１６２、２１８）である。ＨＭＧＩ−Ｙ，ＮＭ２３Ａ，およびＮＭ２３Ｂの誘導をノーザンブロット解析により確認した（データは示さず）。調節蛋白質または酵素に対する遺伝子の別のグループをＮ−ｍｙｃにより下方制御した（表１、セクション６）。例としては、インスリン様成長因子結合蛋白質７（ＩＧＦＢＰ７）（表１、Ｎｏ．２５２）およびジンクフィンガー蛋白質２１６（表１、Ｎｏ．２４８）である。ノーザンブロット解析はＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞に比較したＳＨＥＰ−２細胞におけるＩＧＦＢＰ７の下方制御を確認した（データは示さず）。
【００３８】
Ｎ−ｍｙｃ標的７：アノニマス遺伝子（Ｅｓｔｓ）
部分的ｃＤＮＡ配列のみが知られている（発現配列タグまたはＥｓｔｓ）一連のアノニマス遺伝子はＮ−ｍｙｃにより誘導または下方制御される（表１、セクション７）。これらの遺伝子の機能は未だ知られていないが、癌における役割を有する可能性のある重要な遺伝子として、ｍｙｃ制御マークの標的であることはわかった。
Ｎ−ｍｙｃの未識別標的のタグ
ＳＨＥＰ−２ｂおよびＳＨＥＰ−２１Ｎライブラリーにおいて別々に表示された幾つかのタグに対して、我々は対応する遺伝子を未だ識別していない（表１、セクション８）。これらは両方ともＮ−ｍｙｃにより誘導または抑制される遺伝子である。
【００３９】
Ｎ−ｍｙｃは４時間以内に下流標的を活性化する
経時的実験において、我々は推定Ｎ−ｍｙｃ標的がＳＨＥＰ−２１Ｎ系におけるＮ−調節の後誘導されるかどうかを解析した。Ｎ−ｍｙｃ発現はテトラサイクリンによりＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞において可逆的にスイッチオフできる。ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞をテトラサイクリンで２４時間処理し、充分に洗浄し、テトラサイクリンなしでさらに２〜３６時間成長させた。ノーザンブロット解析は、Ｎ−ｍｙｃｍＲＮＡの発現がテトラサイクリン処理の８時間以内にスイッチオフされることを示した（図３Ａ，レーン１−２）。テトラサイクリン除去後、Ｎ−ｍｙｃｍＲＮＡ発現は２〜４時間回復される（図３Ａ、レーン５−６）。Ｎ−ｍｙｃ蛋白質発現は並列的な経時的実験においてウェスタンブロッティングおよび直後のＮ−ｍｙｃｍＲＮＡ発現により解析した（図３Ｂ）。ノーザンブロットフィルタを、Ｎ−ｍｙｃ下流タグヌクレオリン、ヌクレオホスミンおよびリボソーム蛋白質遺伝子ＲＰＳ６およびＲＰＳ１２に対するプローブでハイブリッドした（図３Ａ）。テトラサイクリンによるＮ−ｍｙｃの抑圧後、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは０および８時間にて影響がないが、それらの発現は２４時間で低い基本的なレベルに下がった。重要なことは、Ｎ−ｍｙｃｍＲＮＡおよび蛋白質の再発現の後２〜４時間の間、４つの遺伝子全ての発現が強く再誘導されることである（図３Ｂ、レーン６〜７）。類似の結果が、ＥＥＦ１Ａ１，ＴＰＩ１，ｅＩＦ３ｓ８，およびＶＤＡＣに対して得られた（データを示さず）。我々がコントロールとして使用したコフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）の発現レベルは時間経過の間有意には変化しない。ヌクレオリンまたはヌクレオホスミン発現におけるテトラサイクリンの直接の効果を排除するために、我々はＳＨＥＰ−２細胞を使用した同じ実験を行ったが、遺伝子発現について影響は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果により、ここで識別された遺伝子はＮ−ｍｙｃにより誘導されることが先ず確認される。第２に、必ずしもＮ−ｍｙｃの直接の標的ではないが、Ｎ−ｍｙｃ下流パスウェイにおける早期の標的であることを示す。したがって、これらは、Ｎ−ｍｙｃパスウェイの本質的な成分を表す。さらに、データは、Ｎ−ｍｙｃによる誘導が多方面にわたることを示している。つまり、Ｎ−ｍｙｃ除去後発現が低下し、Ｎ−ｍｙｃ再発現後素早く回復する。
【００４０】
Ｎ−ｍｙｃはリボソームＲＮＡ合成を誘導する
ｒＲＮＡプロセシングおよびリボソーム生合成における重量な役割を有する２つの遺伝子の誘導により、我々はそれらの蛋白質発現およびそれらの潜在的な機能活性を解析した。ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの蛋白質発現を、Ｎ−ｍｙｃ増幅のあるおよびこれの無い２つのコントロール細胞株およびＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞において解析した。ウェスタンブロット解析により、ＳＨＥＰ−２に比較してＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて（図４、レーン３および４）、およびＮ−ｍｙｃシングルコピー細胞株ＳＫ−Ｎ−ＦＩに比較してＮ−ｍｙｃ増幅ＩＭＲ３２細胞株において（図４、レーン１および２）、より高いヌクレオリンおよびヌクレオホスミン発現が示された。リボソームＲＮＡプロセシングにおけるこれらの蛋白質機能として、我々はＳＨＥＰ−２１ＮがＳＨＥＰ−２細胞より高いｒＲＮＡ含量を有するかどうかを解析した。我々は各細胞株の１０６の指数関数的に成長する１０のサンプルから全ＲＮＡを単離した。分光光度解析により、ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞はＳＨＥＰ−２細胞より全ＲＮＡについて平均で４５％高い収率であることがわかった（ｐ＜０．００１、独立したサンプルに対してスチューデントのｔ検定）（図４Ｂ）。独立的に培養した細胞についての重複した実験からは同じ結果が得られた。アガロースゲル電気泳動により分画した１８Ｓおよび２４ＳｒＲＮＡバンドの濃度測定定量化により、この増加がリボソームＲＮＡにより引き起こされることが確認された（データ示さず）。
【００４１】
ｒＲＮＡにおけるこの強い増加により、全体的な蛋白質合成およびリボソーム機能の増加がもたらされることを解析するために、我々はＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞における蛋白質合成の速度および蛋白質量を測定した。１０６ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞のライセートは等量の蛋白質を含有した（データは示さず）。蛋白質合成速度を３５Ｓメチオニンインコーポレーションにより解析した。ＳＨＥＰ−２およびＮ−ｍｙｃ発現ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞間で差異は観察されなかった。また、経時的実験におけるＳＨＥＰ−２１ＮについてのＮ−ｍｙｃ発現操作によって、蛋白質合成速度の違いは明らかにならなかった（データは示さず）。このことから、ＳＨＥＰ−２１Ｎにおける蛋白質合成速度がＮ−ｍｙｃにより誘導されない因子によって制限されるか、または蛋白質合成がＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株において既に最大値であり、Ｎ−ｍｙｃによりブーストされ得るレベルを超えていることを示唆する。
【００４２】
内因性Ｎ−ｍｙｃの増幅を有するまたは有しない神経芽細胞腫のＳＡＧＥライブラリー
ＳＨＥＰ神経芽細胞腫細胞株は内因性Ｎ−ｍｙｃ発現がなく、したがって、Ｎ−ｍｙｃトランスフェクト細胞は必ずしもＮ−ｍｙｃ増幅神経芽細胞腫に対する遺伝的バックグラウンドを代表するものではない。例えば、９０％のＮ−ｍｙｃ増幅神経芽細胞腫は染色体領域１ｐ３５−３６の欠損が見られず（Ｃａｒｏｎ等、１９９３年）、ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞は染色体１の２つの明らかなインタクトｐアームを有する（データは示さず）。Ｎ−ｍｙｃの識別下流パスウェイがインビボで活性化されるかという問いに取り組むために、我々は２つの神経芽細胞腫のＳＡＧＥライブラリーを生成した。神経芽細胞腫腫瘍Ｎ１５９はＮ−ｍｙｃ増幅および発現があり、神経芽細胞腫Ｎ５２はＮ−ｍｙｃ発現のないＮ−ｍｙｃシングルコピー腫瘍である（図５Ｂ，レーン９および１０）。我々は２つのライブラリーの３９．５９８タグを配列決定した。タグ頻度を２０，０００タグにつき標準化し、比較した。Ｎ−ｍｙｃをＮ１５９における１６タグおよびＮ５２における０タグにより表した。ライブラリーに差異を付けて発現された（ｐ＜０．０１）５２のタグがある。２つの腫瘍がより多くの観点において恐らく異なっているので、これらの差異はＮ−ｍｙｃによりおそらく単に部分的に引き起こされる。我々は、ＳＨＥＰ細胞において識別されたＮ−ｍｙｃ標的遺伝子について２つの腫瘍におけるＮ−ｍｙｃとの関連を解析した。
【００４３】
ＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて検出された５６の有意に（ｐ＜０．０１）誘導されたリボソーム蛋白質遺伝子が（２０，０００タグについて）Ｎ５２における９８８タグおよびＮ１５９における１６００タグの合計を生成する。したがって、Ｎ−ｍｙｃ増幅Ｎ１５９腫瘍は６２％高いリボソーム蛋白質遺伝子発現を有する。Ｎ５２と比較してＮ１５９において少なくとも５０％の増加を有する３６のタグおよび少なくとも１００％の増加を有する２２タグがある（図２Ｂ）。これらの増加はＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞におけるよりもより穏やかである（図２Ａおよび２Ｂを比較）が、Ｎ−ｍｙｃがインビボでのリボソーム蛋白質遺伝子発現を誘導することを強く示唆する。蛋白質合成において機能する他の遺伝子はＮ１５９において情報制御される。Ｎ５２と比べてＮ１５９において発現が増加することは、ヌクレオホスミン（４〜１９．２タグ）、ヌクレオリン（３〜９タグ）、真核生物の翻訳開始因子４Ａ、イソ型１（４〜９タグ）、および翻訳延長因子ＥＥＦ１ａ１（５０〜９６タグ）およびＥＥＦ１ｇ（１８．４〜３２．８タグ）について見られる。解糖および酸化的リン酸化に伴われる遺伝子の誘導は殆どない。５つの代表的な遺伝子の発現レベルを、Ｎ１５９およびＮ５９からの合計ＲＮＡを使用したノーザンブロットのハイブリダイゼーションにより確認した（図５Ｂおよびデータは示さず）。これらの結果から、ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞において識別したＮ−ｍｙｃ標的遺伝子の多くの発現レベルがインビボにおけるＮ−ｍｙｃ増幅および過剰発現に関連することが示される。しかし、このことは全遺伝子については当てはまらず、他の因子がＮ−ｍｙｃ標的遺伝子の活性を調節することを示唆する。
【００４４】
神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおいて解析されるＮ−ｍｙｃ標的遺伝子発現
神経芽細胞腫のＮ−ｍｙｃ下流遺伝子の誘導をさらに解析するために、我々は神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおける発現を調べた。２１の神経芽細胞腫細胞株からの全ＲＮＡのノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、Ｎ−ｍｙｃ、ヌクレオリン、ヌクレオホスミン、およびリボソーム蛋白質ＰＰＡＲＰ０の発現間の不完全ながらもはっきりとした関係を示した（図５Ａ）。細胞株ＳＪＮＢ１２はＮ−ｍｙｃ発現がないが、Ｎ−ｍｙｃ標的遺伝子の非常に高い発現を有する。しかし、この細胞株はｃ−ｍｙｃ増幅および過剰発現を有し（図５Ａ、レーン７およびＣｈｅｎｇ等１９９５年）、ｃ−ｍｙｃがＮ−ｍｙｃと同じ標的遺伝子を誘導し得ることを示唆する（以下参照）。
【００４５】
細胞株がインビボで神経芽細胞腫腫瘍について完全には代表的ではないので、我々は、アグレシブステージ３および４、およびより弱いアグレシブステージ１、２および４ｓを有する１６の新鮮な神経芽細胞腫を解析した。ノーザンブロット解析により、Ｎ−ｍｙｃ、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの発現間の公正な総合的な関連が示された（図５Ｂ）。幾つかの例外はあるが、総合的な結果は、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンがＮ−ｍｙｃ誘導のインビボにおける標的であることを示唆している。リボソーム蛋白質Ｓ６（ＲＰＳ６）発現は、Ｎ−ｍｙｃとの一貫した関連性が少なく、Ｎ−ｍｙｃおよび他の因子がその発現を調節することを示した。
【００４６】
幾つかのＮ−ｍｙｃ標的遺伝子はｃ−ｍｙｃにより誘導されるかまたは抑圧され、さらにＮ−ｍｙｃはｃ−ｍｙｃと同じプロト−癌遺伝子のファミリーに属する。両方の癌遺伝子は類似の表現型効果を誘導し、幾つかの標的遺伝子を共有するので、我々は、この研究で識別されたＮ−ｍｙｃ下流標的がｃ−ｍｙｃの標的でもあることを解析する。したがって、我々はメラノーマ細胞株ＩＧＲ３９Ｄおよびこの細胞株のｃ−ｍｙｃトランスフェクトクローンを解析した（クローン３、Ｖｅｒｓｔｅｅｇ等、１９８８年）。これらの細胞株の全ＲＮＡを有するノーザンブロットをＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞について試験した２６のプローブをハイブリッドした。さらに、９つの２３Ｎ−ｍｙｃ誘導標的は、ｃ−ｍｙｃにより誘導されることがわかる（図６）。これらは、リボゾーム蛋白質遺伝子Ｓ１２、Ｓ２７、Ｓ１９、Ｓ６およびヌクレオリン、ヌクレオホスミン、ユビキチン、ＧＡＰＤＨおよびＮＤＵＦＢ４である。Ｎ−ｍｙｃ抑制標的の３つについて試験し、ｃ−ｍｙｃにより抑制されることを見いだした。これらは、オステオネクチン（表１、Ｎｏ．１１８／１２３／１２５）、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター型１（表１、Ｎｏ．１１２）、および結合組織成長因子（表１、Ｎｏ．１２７）であった。したがって、ｃ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃはここで試験した細胞系においてそれらの標的遺伝子の約４６％を共有する。ヌクレオホスミン、ヌクレオリンおよび殆どのリボソーム蛋白質遺伝子がそれらに含まれる。
【００４７】
我々は、リボソーム生合成、ｍＲＮＡ翻訳、蛋白質成熟、および蛋白質代謝回転に寄与する８６の転写の誘導を発見し、蛋白質合成の増強がＮ−ｍｙｃの主な機能であることを示した。我々は、ＳＨＥＰ−２におけるよりもＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて著しく４５％高いｒＲＮＡ含量を見いだした。ＳＨＥＰ−２１Ｎにおいて蛋白質合成の速度の総合的な増加はない。蛋白質合成の仕組みの幾つかの律速成分がＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞においては誘導されないという１つの解釈がある。Ｎ−ｍｙｃシングルコピー神経芽差異簿腫Ｎ５２およびＮ−ｍｙｃ増幅腫瘍Ｎ１５９のＳＡＧＥライブラリーは、リボソーム蛋白質遺伝子、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンおよび５つの翻訳開始および延長因子がインビボでＮ−ｍｙｃ増幅神経芽細胞腫において過剰発現される。３７の神経芽細胞腫および神経芽細胞腫細胞株のノーザンブロット解析は、Ｎ−ｍｙｃ増幅神経芽細胞腫におけるこれらの遺伝子の誘導をさらに確認した。これらの結果から、ｍｙｃ遺伝子が蛋白質合成の主なレギュレータとして機能することがわかる。このことは、ｃ−ｍｙｃのホモ接合性不活性化線維芽細胞における蛋白質合成の速度の低下（Ｍａｔｅｙａｋ等、１９９７年）、およびｃ−ｍｙｃの活性化の後の線維芽細胞における蛋白質合成の増加（Ｓｃｍｉｄｔ等、１９９９年）と合致する。
【００４８】
エネルギー生成、ミトコンドリアおよびアポトーシス
Ｎ−ｍｙｃ下流標的遺伝子の２つの他の包括的なセットは、解糖およびミトコンドリア電子伝達およびＡＴＰ合成経路において関連する。Ｎ−ｍｙｃ誘導の主な標的として電子伝達およびＡＴＰ合成経路の識別は、ミトコンドリア膜貫通型ポテンシャルおよびアポトーシス間の関係に関係する。ミトコンドリアは２つの面を有する：すなわち、これらはファーストサイクリング細胞に対してエネルギーを与え、かつ細胞をアポトーシスに駆り立てることである。同様に、ｍｙｃ癌遺伝子は活発な細胞増殖および大規模なアポトーシスを誘導できる。Ｎ−ｍｙｃ発現によりＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞はアポトーシストリガーに対して感受性となる（Ｆｕｌｄａ等，１９９９年；Ｌｕｔｚ等、１９９８年）。アポトーシスにおける多くの重要な出来事はミトコンドリアの膜ポテンシャルに重点をおいている（参照：ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、１９９８年）。例としては、シトクロームｃ放出、内膜の過分極、透過性遷移ポアの開口、および反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成である。ミトコンドリア膜における通常の電子伝達の間、１〜５％の電子はさまよって、ＲＯＳを生成する。電子伝達経路の中断により、細胞に有害なＲＯＳの生成は非常に高められる（Ｋｒｏｅｍｅｒ等、１９９７年）。Ｎ−ｍｙｃによる電子流れの増強により、電子伝達鎖ブーストＲＯＳ生成の中断は高まるであろう。さらに、ＶＤＡＣの適度な上方制御（図１）はシトクロームｃ放出およびアポトーシスを刺激した。したがって、電子伝達遺伝子のＮ−ｍｙｃ誘導は細胞増殖に対して必要なエネルギーを必然的に供給する。また、これは、ミトコンドリアの死の可能性を増加し、アポトーシスの実行に向かうスケールを起動する。
【００４９】
酸化的リン酸化経路に対するタグはＮ−ｍｙｃ増幅Ｎ１５９腫瘍において過剰発現される。この腫瘍は、Ｎ−ｍｙｃ下流経路の一部を妨げる付加的な欠点に対してインビボで選択される。Ｎ−ｍｙｃを発現するＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞はアポトーシストリガに感受性であり（Ｌｕｔｚ等、１９９８年）、内因性Ｎ−ｍｙｃの過剰発現を有する神経芽細胞腫細胞株はこのようなトリガに不応性である。このことは、これらの細胞株がＮ−ｍｙｃ下流経路のプロアポトーシスアームに欠点を有することを示す。これがミトコンドリア蛋白質遺伝子の誘導の欠損に関連するかどうかを解析することは興味深い。
【００５０】
Ｎ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｃが標的遺伝子を共有する
今日までに、Ｎ−ｍｙｃの２つの標的遺伝子のみが公表され、これらはｃ−ｍｙｃの標的でもある（Ｌｕｔｚ等、１９９６年；Ｅｉｌｅｒｓ等、１９９１年；Ｂｅｌｌｏ−ｆｅｒｎａｄｅｚ等、１９９３年）。我々がノーザンブロットについて試験したＮ−ｍｙｃの２３の上方制御標的のうち、９つがトランスフェクトメラノーマ細胞でｃ−ｍｙｃにより誘導される。我々が試験した下方制御Ｎ−ｍｙｃ標的の両方がｃ−ｍｙｃによっても下方制御される。Ｎ−ｍｙｃ誘導下方制御経路遺伝子は遺伝子の非常に簡単な機能的グループを形成するので、我々はＮ−ｍｙｃが蛋白質合成の一般的なスティミュレーターとして機能すると仮定した。ｃ−ｍｙｃはＮ−ｍｙｃのように等しく強力な成長誘導およびトランスフォーミング効果を有するので、ｃ−ｍｙｃが蛋白質およびＡＴＰ合成の仕組みをブーストするのに必要な遺伝子のサブセットを単に誘導することを認識するのは困難である。Ｎ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｃが同じ基本的な細胞機能を活性化することはあり得ることである。ｃ−ｍｙｃは線維芽細胞株の蛋白質合成の誘導に関連する（上記参照）。我々はＮ−ｍｙｃによる遺伝子の誘導がその基本的な発現レベルに強く依存することを観察した（図２）。したがって、オリジナルのメラノーマ細胞株における潜在的な標的遺伝子の高発現がｃ−ｍｙｃによる誘導を防止したことは可能性がある。
【００５１】
これまでに識別された標的遺伝子は非常に少ないので、ｍｙｃ遺伝子の生理学的な役割は謎である。我々は、Ｎ−ｍｙｃまたはＮ−ｍｙｃの潜在的な標的（その幾つかはｃ−ｍｙｃの標的でもある）である単一遺伝子（ｕｎｉｇｅｎｅ）により規定された３３５遺伝子を識別する３５１転写タグを説明する。これらの結果から、ｍｙｃ遺伝子は蛋白質合成および細胞エネルギー生成の主なレギュレターとして機能する。この誘導は、正常な増殖細胞においておよび生理学的刺激物より増殖を誘導された細胞において、細胞サイクルのＧ１期からの遷移強化を媒介することは可能性がある。蛋白質合成についての効果は限定されたセットの標的遺伝子の識別に基づいて先の仮定を確認する（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９９９年、Ｍａｔｅｙａｋ等、１９９７年、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等、１９９９年）。電子伝達およびＡＴＰ合成経路における遺伝子についての刺激性効果は期待されず、強化された蛋白質生成およびＧ１遷移に対するエネルギー要求に非常に適合し、ｍｙｃ遺伝子の充分に確立されたアポトーシス効果に関係し得る。
【００５２】
Ｎ−ｍｙｃにより誘導されまたは抑制されたタグおよび遺伝子のリスト
表１は、我々が、ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ  ＳＡＧＥライブラリーの比較においてＮ−ｍｙｃにより有意に（ｐ＜０．０１）誘導または抑制されたことを発見したタグの全てである。この比較は、ＳＨＥＰ−２４４，６７４タグおよびＳＨＥＰ−２１Ｎの２１，５５９タグに基づく。示されたタグ頻度は１０，０００タグについて標準化される（コラムＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ）。「オン：オフ比」の欄は、Ｎ−ｍｙｃによるフォールド誘導（正の値）または抑制（負の値）を示す。タグがライブラリーのうち１つにおいてゼロ発現を有する場合は、我々は、タグが完全なライブラリーにおいて一時期存在したことを比の計算に対して仮定する。バイオテクノロジーインフォメーションに対するナショナルセンターの単一遺伝子数（ＮＣＢＩ：ＵＳＡ、ベテスダ）を、「単一遺伝子」の欄に示す。この数は２９−３−２０００による、ＮＣＢＩ単一遺伝子データベースに基づく。次の欄は、単一遺伝子の記載を示す。さらに、各単一遺伝子クラスターについて、１つまたは２つの遺伝子バンク受入れ番号を示す。幾つかのタグに対して、我々は、２つの可能性のある対応遺伝子を識別した。このことはタグの次の欄におけるアスタリクスにより示す。
【００５３】
表２：この表は２１，５５９タグから３４，４２６タグのＳＨＥＰ−２１Ｎライブラリーの配列を延長した後、ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１ＮのＳＡＧＥライブラリー間で有意に（ｐ＜０．０１）異なることを識別したタグを示す。表は２０，０００の転写タグについて発現された両方のライブラリーにおける発現レベル（「ＳＨＥＰ−２」および「ＳＨＥＰ−２１Ｎ」の欄）、Ｃａｒｏｎ等（２００１年）により記載されたコンピュータープログラムにより識別された単一遺伝子数、および幾つかの場合には単一遺伝子クラスターに相当するクローンの遺伝子バンク受入れ番号を示す
【００５４】
実験手順
細胞株
神経芽細胞腫細胞株および培養条件は前述の通りである（Ｃｈｅｎｇ等、１９９５年）。メラノーマ細胞株ＩＧＲ３９Ｄおよびクローン３はＶｅｒｓｔｅｅｇ等（１９８８年）により記載されている。ＳＨＥＰ細胞株を、１０％ウシ胎児血清、４ｍＭＬのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に保存した（Ｌｕｔｚ等、１９９６年）。テトラサイクリン（シグマ）を１０ｎｇ／ｍｌの培地濃度で使用し、Ｎ−ｍｙｃ発現を阻害した。
【００５５】
ＳＡＧＥライブラリーの生成
ＳＡＧＥを、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等（１９９５年）の記載に若干の変更を加えて実施した。全ＲＮＡをグアニジンチオシアネートにより抽出した（ＣｈｒｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７年）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、製造者の指示書にしたがって、メッセージメーカー（ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒ）キット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して単離した。ＳＡＧＥライブラリーを、最小限４μｇポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用して生成した。ｃＤＮＡをスーパースクリプトチョイスシステム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に準じて合成し、ＮｌａＩＩＩで消化し、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に結合した。ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有するリンカーをｃＤＮＡに結合した。ｃＤＮＡタグを含むリンカータグをＢｓｍＦＩ消化により遊離し、互いに結合し、増幅した。ＰＣＲ生成物を５分６５℃で加熱した後、ポリアクリルアミドゲルで調製的分析（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）をした。コンカテマーへの結合の後、第２加熱段階を含み（１５分で６５℃）、８００ｂｐ〜１５００ｂｐのフラグメントを精製し、ｐＺｅｒｏ−１（インビトロゲン）でクローン化した。コロニーをＰＣＲでＭ１３フォワードアンドリバースプライマーを使用してスクリーニングした。３００ｂｐより大きいインサートをＢｉｇＤｙｅターミネイターキットで配列決定し、３７７ＡＢＩ自動化シーケンサーで解析した（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【００５６】
解析ＳＡＧＥデータベース
ＳＡＧＥライブラリーを、ＳＡＧＥ３００プログラムソフトウェアパッケージを使用して解析した（Ｖｅｌｓｃｕｌｅｓｃｕ等、１９９７年）。Ｐ値をモンテカルロシミュレーションを使用して計算した。転写を、ＮＣＢＩでキャンサーゲノムアナトミープロジェクトからの「遺伝子マップへのタグ」（ＳＡＧＥマップ）を有するデータベースにおいてタグの比較により識別した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ）。このデータベースは単一遺伝子クラスターとＳＡＧＥタグを繋ぐ（Ｌａｌ等、１９９９年）。次に、遺伝子のアサインメントを人手によって不正なタグを生じる配列エラーについておよびハイブリッド単一遺伝子クラスターに基づいて誤った遺伝子アサインメントについてチェックした。他のデータベース解析および特定のプライマー生成については、ウィスコンシンＧＣＧパッケージソフトウェアを使用した。
【００５７】
ノーザンブロット解析
全ＲＮＡ（レーン当たり２０μｇ）を６．７％のホルムアルデヒドの存在下で０．８％のアガロースゲルにより電気泳動し、１０×ＳＳＣ中で（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ膜においてブロットした。ハイブリダイゼーションを一晩０．５ＭのＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．０、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、６５℃にて行った。フィルタを４０ｍＭのＮａＨＰＯ４、１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄した。プローブを配列証明されたＰＣＲ生成物のランダムプライミングによりラベル化した。ＲＴ−ＰＣＲ反応において使用された全プライマーの完全なリストは請求することにより利用可能である。
【００５８】
全蛋白質含量
指数関数的に成長する細胞をハーベストし、細胞数をクールターカウンターを使用して決定した。細胞（１×１０６）を２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１％のＮＰ４０およびプロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼカクテル、ロシュ）溶解した。サンプルをバイオラド蛋白質アッセイで検定した。アッセイを少なくとも２回行った。
【００５９】
ウェスタンブロット
細胞溶解物をＳＤＳポリアクリルアミドで分離し、イモビロン−Ｐトランスファ膜でエレクトロブロットした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。膜のブロッキングおよび抗体とのインキュベーションは標準的な手順を伴った。蛋白質を、ＥＣＬ検出シツテムを使用して可視化した（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。抗−ヌクレオホスミンモノクローナル抗体はＰ．Ｋ．Ｃｈａｎ博士から贈呈を受けた（ベイラー医科大学）。ヌクレオリンに抗する抗体はＰ．Ｂｏｕｖｅｔ博士から贈呈された（フランス、ツールーズ、ＣＮＲＳ，ＩＰＢＳ）。抗−Ｎ−ｍｙｃをＰｈａｒｍＩｎｇｅｎから得た（クローンＢ８．４．Ｂ）。
【００６０】
全ｒＲＮＡ含量
１×１０６の指数関数的に成長する細胞の全ｒＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（ＣｈｒｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７年）により抽出し、分光光度計で定量した。細胞株ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎのそれぞれの１０の単離の結果は、スチューデントｔ検定で独立したサンプルについて統計的に解析した。パーセルベースについてのアリコートをアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色した。ｒＲＮＡバンドの関連する蛍光をコダックデジタルサイエンス１Ｄイメージ解析ソフトウェアパッケージを使用して定量した（ＥＤＡＳ１２０）。
【００６１】
リファレンス
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【００６２】
【表１】
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【００６３】
【表２】
2004500846.tif 000046
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ−ｍｙｃ下流標的遺伝子のノーザンブロット分析。指数関数的に成長するＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞からの全ＲＮＡの等量をロードした。ノーザンブロットを２３の指示Ｎ−ｍｙｃ標的についてのプローブと共にハイブリッドした。
【図２】ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞におけるＮ−ｍｙｃ標的（ｐ＜０．０１）として指示された５６のリボソーム蛋白質遺伝子の誘導レベル。Ａ．ＳＨＥＰ−２における基本発現レベルのファンクションとしてのＳＨＥＰ−２１ＮにおけるＮ−ｍｙｃによるフォールド誘導。Ｘ−座標：１０，０００タグあたり標準化されたＳＨＥＰ−２における基本発現レベル。Ｙ−座標：ＳＨＥＰ−２１Ｎにおけるフォールド誘導。Ｂ．Ｎ−ｍｙｃシングルコピー神経芽線維細胞腫Ｎ５２における基本発現レベルのファンクションと同じＮ−ｍｙｃ増幅神経芽細胞腫Ｎ１５９における５６のリボゾーム蛋白質遺伝子の増加。Ｘ座標：１０，０００タグあたり標準化されたＮ５２における発現レベル。Ｙ座標：Ｎ５２に対比したＮ１５９におけるフォールド増加。
【図３】ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞におけるＮ−ｍｙｃおよび下流標的遺伝子誘導の経時的解析。ＳＨＥＰ−２１Ｎ細胞を２４時間１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンで処理し、洗浄し、テトラサイクリンの不存在下でさらに３６時間成長させた。細胞を、テトラサイクリン処理の０時間、８時間、２４時間にてハーベストした。次のサンプルを前記抗生物質除去後、１時間、２時間、４時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、３６時間にて採取した。Ａ：示された時間ポイントにおける全ＲＮＡのノーザンブロット解析。Ｂ：示された時間ポイントにおけるＮ−ｍｙｃ蛋白質のウェスタンブロット解析。経時的実験の全蛋白質サンプルのうち１０ｍｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分画し、イモビロン膜でブロットし、モノクローナル抗−Ｎ−ｍｙｃ抗体でプローブした。
【図４】ヌクレオリンおよびヌクレオホスミン蛋白質発現並びにＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎの全ＲＮＡ量。Ａ：ヌクレオリン、Ｎ−ＭＹＣおよびヌクレオホスミン蛋白質発現のウェスタンブロット解析。全細胞抽出物（１０μｇ）をアクリルアミドゲルで分画し、ブロットし、ヌクレオリンに対するポリクローナル抗体（上方のパネル）およびＮ−ｍｙｃに対するモノクローナル抗体（中間のパネル）およびヌクレオホスミン（下方パネル）でプローブした。コントロール細胞株ＩＭＲ３２およびＳＫ−Ｎ−ＦＩはＮ−ｍｙｃ、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンのそれぞれ高い発現と低い発現を有する。Ｂ：ＳＨＥＰ−２およびＳＨＥＰ−２１Ｎの全ＲＮＡ量。ＲＡＮを、各細胞株１０６細胞の１０のサンプルから単離し、分光写真で分析した。エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。
【図５】神経芽細胞腫細胞株および腫瘍からの全ＲＮＡのノーザンブロット解析。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。ＲＮＡ定量化を臭化エチジウム染色により確認した。２８Ｓバンドを示した。Ａ：２１の神経芽細胞腫細胞株のパネル。Ｂ：フレッシュな腫瘍のパネル。レーン１−９における腫瘍は増幅されたＮ−ｍｙｃである。
【図６】ｃ−ｍｙｃ形質移入メラノーマ細胞株におけるＮ−ｍｙｃ標的遺伝子の誘導のノーザンブロット解析。クローン３はＩＧＲ３９Ｄメラノーマ細胞株のｃ−ｍｙｃ形質移入クローンである。ＩＧＲ３９Ｄおよびクローン３の全ＲＮＡの等量をロードした。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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