(57)【要約】ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又はヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路における調節因子を、Ｔ細胞介在型疾患若しくは障害の治療用薬剤の調製に使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞介在型疾患又は感染症の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項２】
Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項３】
Ｔ細胞活性化を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項４】
Ｔ細胞増殖を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項５】
抹消Ｔ細胞活性化を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項６】
抹消Ｔ細胞増殖を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項７】
Ｔ細胞アポトーシスを修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項８】
抹消Ｔ細胞アポトーシスを修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項９】
Ｔ細胞介在型疾患又は感染症の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用。
【請求項１０】
Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用。
【請求項１１】
Ｔ細胞増殖の亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用。
【請求項１２】
ノッチ（Notch）シグナル伝達経路を調節する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項１３】
免疫細胞におけるノッチシグナル伝達経路を調節する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用。
【請求項１４】
ヘッジホッグシグナル伝達経路が、ソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）シグナル伝達経路、インディアンヘッジホッグ（Indian hedgehog）シグナル伝達経路、又はデザートヘッジホッグ（Desert hedgehog）シグナル伝達経路であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路が、ウイント（Wnt）シグナル伝達経路であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
調節因子が、経路における生物活性の阻害因子又はアップレギュレーション因子であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
阻害因子が、ＨＩＰ、シクロパミン（cyclopamine）、Ｆｒｚｂ、セルベルス（Cerberus）、ＷＩＦ−１、Ｘｎｒ−３、グレムリン（Gremlin）、又はフォリスタチン（Follistatin）、或いはそれらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ又はアナログであることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
阻害因子が、Ｐｔｃ、Ｃｏｓ２若しくはＰＫＡ、又はｃＡＭＰシグナル伝達経路の作用因子であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
調節因子が、ＴＧＦ−β−１及びＴＧＦ−β−２等のＴＧＦ−βファミリーのメンバー、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３等のインターロイキン、ＩＦＮ−γ、ＦＬＴ３リガンド、又はＢＭＰスーパーファミリーのメンバーであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
調節因子が抗体であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
調節因子が小有機化合物（small organic compound）であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
乳癌、前立腺癌及び卵巣癌、並びにリンパ腫及び癌腫、並びに全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、グレーブス病（バセドウ病）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）及び糖尿病等の自己免疫疾患、変形性関節症、クローン病、炎症性腸疾患及び大腸炎等の炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、乾癬、リンパ節症等の増殖性疾患、並びにヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルス等によるウイルス感染症の治療用薬剤の調製における先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
ＡＩＤＳや他の感染性若しくは遺伝性免疫不全症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性症及び小脳変性症等の神経変性疾患、再生不良性貧血等の骨髄異形成症候群、心筋梗塞、脳卒中及び再潅流障害等の虚血性損傷、アルコール性肝障害、肝硬変及びラチルス症（神経性ラチリスム；lathyrism）等の毒物因性疾患、悪液質等の消耗性疾患、Ｂ型及びＣ型肝炎等のウイルス感染症、並びに骨粗鬆症の治療用薬剤の調製における先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫、腫瘍に誘発されるＴ細胞系の異常、並びにマラリヤ病原虫（Plasmodium sp.）、ミクロフィラリア、蠕虫類(Helminths)、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス（Pseudomonas）、トキソプラズマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎又はトキソカラ（toxocara）によって引き起こされる感染性疾患の治療用薬剤の調製における先行請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、又はＳＬＥであることを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含むことを特徴とするＴ細胞介在型疾患の治療に使用する組成物。
【請求項２７】
治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含むことを特徴とするＴ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患の治療に使用する組成物。
【請求項２８】
治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含むことを特徴とするＴ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、抹消Ｔ細胞活性化、抹消Ｔ細胞増殖及びＴ細胞アポトーシスの修飾に伴う疾患の治療に使用する組成物。
【請求項２９】
候補調節因子の存在下及び不在下にて免疫系細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を観察し、該候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法。
【請求項３０】
（ａ）免疫系細胞を候補調節因子と接触させ；
（ｂ）ヘッジホッグシグナル伝達を観察し；また
（ｃ）上記候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する；
工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法。
【請求項３１】
候補調節因子が、有機化合物、無機化合物、ペプチド若しくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体の断片、サイトカイン、及びサイトカインの断片からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヘッジホッグシグナル伝達を観察する工程が、少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを観察する工程を含むことを特徴とする請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの標的遺伝子が、ヘッジホッグシグナル伝達の内因性標的遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの標的遺伝子が、レポーター遺伝子であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの標的遺伝子が、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、放射標識又は蛍光標識を有する遺伝子、及び所定のポリペプチドエピトープをコードする遺伝子からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの標的遺伝子が、ヘッジホッグシグナル伝達に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあることを特徴とする請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの標的遺伝子が、
ｉ）ヘッジホッグシグナル伝達；及び
ii）第２シグナル；及び／又は
iii）第３シグナル
に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあり、第２シグナルと第３シグナルは異なるシグナルであることを特徴とする請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
第２シグナルが、免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路の活性化に起因することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路が、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路が、トール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
第３シグナルが、免疫系細胞に特異的な共刺激であることを特徴とする請求項３７〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
共刺激が、Ｂ７タンパク質Ｂ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＩＭ−１、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜１１等のトール様受容体（ＴＬＲｓ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、増殖因子及び増殖因子受容体作動因子、並びにそれらの変異体、誘導体、アナログ及び断片からなるグループから選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
免疫系細胞が、Ｔ細胞又はＴ細胞前駆体であることを特徴とする請求項２９〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
免疫系細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする請求項２９〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現をプロテインアッセイにより観察することを特徴とする請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現を核酸アッセイにより観察することを特徴とする請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
請求項２９〜４７のいずれかに記載の方法により同定し得る調節因子。
【請求項４９】
（ａ）免疫系細胞を活性化し；
（ｂ）上記細胞を候補調節因子と接触させ；
（ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達を観察し；
（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の工程は順不同に行ってよい）；及び
（ｄ）上記候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法。
【請求項５０】
免疫系細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体の活性化によって活性化されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
Ｔ細胞受容体が、抗原又は抗原決定基によって活性化されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞受容体が、抗ＣＤ３抗体によって活性化されることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
Ｔ細胞が共活性化されることを特徴とする請求項４９〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
Ｔ細胞が、ＣＤ２８の活性化により共活性化されることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞受容体が、抗ＣＤ２８抗体により共活性化されることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞介在型疾患関連の疾患の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物の正常な発達、成長、及び恒常性維持には、全身組織における細胞の産生と破壊との間に細密なバランスが必要とされる。細胞分裂は無数の制御機構を伴う入念に調整されたプロセスである。これらの機構は、ＤＮＡ複製を調整するよう、また不十分な若しくは過剰な増殖を回避するように設計されている。他方、プログラム細胞死は、急性損傷及び壊死をしばしば伴う組織破壊や炎症反応を誘発することなく、不要の若しくは損傷した細胞を消失させるという遺伝的に制御されたプロセスである。
【０００３】
「アポトーシス」なる用語は、プログラム細胞死の途上にある細胞を特徴付ける形態変化を説明するためにKerr JF et al, (1972) Br. J. Cancer 26: 239-257 （非特許文献１）において初めて使われた用語である。アポトーシスにおける調節障害は、ヒト疾患の病原における重要な要因であることが近年認識されつつある。例えば、細胞が不適切に生存し続けることにより、癌、自己免疫疾患、及び炎症性疾患等、多くの疾患を誘起し、又はその一因となり得る。他方、アポトーシスが亢進すると、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、骨髄異形成症候群等の免疫不全疾患が引き起こされる可能性がある。
【０００４】
プログラム細胞死（以下アポトーシスと記す）の調節制御機構が見い出されたことにより、癌、自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性損傷、神経変性疾患、骨粗鬆症、骨髄異形成症候群、毒物因性疾患、悪液質、及びウイルス感染症の検出、予防、及び治療に有用な診断用又は治療用組成物を探索し、提供する手段が実現した。
【０００５】
自己抗原に対する免疫寛容は、生物が自身の免疫系により破壊されることを防御するために必要な機構である。この機構が働かないと自己反応性免疫細胞が増殖し、自己免疫疾患が宿主に発生する。多発性硬化症（ＭＳ；Multiple Sclerosis）、狼蒼（Lupis）、重症筋無力症（ＭＧ；Myathenia Gravis）、関節リウマチ（ＲＡ；Rheumatoid Arthritis）等、数多くの疾患が、Ｔリンパ球において自己寛容が消失するために発症することがこれまでに明らかにされてきた。例えばミエリン反応性Ｔ細胞は、多発性硬化症（ＭＳ）患者で見い出されている。
【０００６】
関節リウマチは、滑膜線維芽細胞の異常増殖、並びにリンパ球、マクロファージ及びプラズマ細胞の侵入に起因する滑膜関節の慢性炎症によって特徴付けられる。これらの細胞が全て異常増殖することにより、炎症性サイトカインの産生量が増加する。本疾患の病態生理学的因果関係の中には、アポトーシスが不十分なために自己反応性Ｔ細胞の生存が促進される結果であるとの説明が可能なものもある。従って、本疾患の治療効果をあげるために、リウマチ関節にアポトーシスを誘導する方法が提案されてきた。
【０００７】
しかし当技術分野においては、アレルギー性疾患や移植拒絶反応や癌同様に、アポトーシスの亢進又は低減が介在する疾患や自己免疫疾患等のＴ細胞介在型疾患の治療に用いるさらなる方法やツールが引き続き必要とされている。
【非特許文献１】
Kerr JF et al, (1972) Br. J. Cancer 26: 239-257
【発明の開示】
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、Ｔ細胞活性化の制御機構の発見に関し、Ｔ細胞が介在する疾患や感染を含む疾患や障害の検出、予防、及び治療に有用な診断用又は治療用組成物を探索し、提供する手段を提供する。本発明では特に、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ；Sonic hedgehog）及びパッチド（Ｐｔｃ；Patched）タンパク質がＴ細胞により発現されること、Ｔ細胞によるＰｔｃの発現をＳｈｈが調節できること、またＳｈｈがＴ細胞遺伝子の発現パターンを調節できることを明らかにした。Bhardwaj et al Nature Immun. (2001) 2: 172-180 は、Ｓｈｈが、始原造血細胞における重要な調節因子であり、下流のＢＭＰシグナルに依存していることを示唆している。また、ヘッジホッグが胸腺細胞におけるＴ細胞の生存に関与していることは知られているものの、哺乳類の抹消免疫系を考察した上で、ヘッジホッグ伝達経路の調節をアポトーシスやＴ細胞に介在される疾患の治療と関連させたのは、本発明者らが初めてであると確信する。
【０００９】
［発明の記載］
本発明は、ヘッジホッグファミリーメンバーのシグナル伝達経路構成因子の調節因子、又はヘッジホッグシグナル伝達の標的となるシグナル伝達経路の構成因子の調節因子を、それを必要とする患者に治療有効量投与することからなる、Ｔ細胞介在型疾患及び／又は正常Ｔ細胞のアポトーシスが阻止又は亢進される疾患の治療方法を提供するものである。
【００１０】
本発明の第１の特徴として、Ｔ細胞介在型の疾患又は感染症の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子（modulator）、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１１】
本発明の第２の特徴として、Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１２】
本発明の第３の特徴として、Ｔ細胞活性化を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１３】
本発明の第４の特徴として、Ｔ細胞増殖を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１４】
本発明の第５の特徴として、抹消Ｔ細胞活性化を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１５】
「抹消」Ｔ細胞なる用語には、「胸腺外」Ｔ細胞を含めることとする。
【００１６】
本発明の第６の特徴として、抹消Ｔ細胞増殖を修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１７】
本発明の第７の特徴として、Ｔ細胞アポトーシスを修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１８】
本発明の第８の特徴として、抹消Ｔ細胞アポトーシスを修飾する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００１９】
本発明の第９の特徴として、Ｔ細胞介在型疾患又は感染症の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用を提供する。
【００２０】
本発明の第１０の特徴として、Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用を提供する。
【００２１】
本発明の第１１の特徴として、Ｔ細胞増殖の亢進又は低減に伴う疾患又は障害の治療用薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子の使用を提供する。
【００２２】
本発明の第１２の特徴として、 ノッチ（Notch）シグナル伝達経路を調節する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００２３】
本発明の第１３の特徴として、免疫細胞におけるノッチシグナル伝達経路を調節する薬剤の調製におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子の使用を提供する。
【００２４】
ヘッジホッグシグナル伝達経路は、ソニックヘッジホッグ伝達経路、インディアンヘッジホッグ（Indian hedgehog）伝達経路、又はデザートヘッジホッグ（Desert hedgehog）伝達経路であることが好ましく、ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路は、ウイント（Wnt）シグナル伝達経路であることが好ましい。
【００２５】
好適実施態様の１つでは、調節因子が、経路における生物活性の阻害因子又はアップレギュレーション因子である。阻害因子が、ＨＩＰ、シクロパミン（cyclopamine）、Ｆｒｚｂ、セルベルス（Cerberus）、ＷＩＦ−１、Ｘｎｒ−３、グレムリン（Gremlin）、又はフォリスタチン（Follistatin）、或いはそれらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ又はアナログであることが好ましい。阻害因子が、Ｐｔｃ、Ｃｏｓ２又はＰＫＡ、或いはｃＡＭＰシグナル伝達経路の作用因子（agent）であることがより一層好ましい。また、調節因子が、ＴＧＦ−β−１やＴＧＦ−β−２等のＴＧＦ−βファミリーのメンバー、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等のインターロイキン、ＩＦＮ−γ、又はＦＬＴ３リガンド、或いはＢＭＰファミリーのメンバーであってもよい。一実施態様において調節因子は抗体である。
【００２６】
好適実施態様の１つとして本発明は、乳癌、前立腺癌及び卵巣癌、並びにリンパ腫及び癌腫、また、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ；systemic lupus erythematosus）、糸球体腎炎、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、グレーブス病（Graves disease）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、糖尿病等の自己免疫疾患、並びに変形性関節症、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎等の炎症性疾患、並びにアテローム性動脈硬化症、再狭窄、乾癬、リンパ節症等の増殖性疾患、並びにヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス等によるウイルス感染症の治療用薬剤の調製に用いられる。
【００２７】
別の好適実施態様では本発明を、ＡＩＤＳや他の感染性若しくは遺伝性免疫不全症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ；amyotrophic lateral sclerosis）、網膜色素変性症、小脳変性症等の神経変性疾患、再生不良性貧血等の骨髄異形成症候群、心筋梗塞、脳卒中、再潅流障害等の虚血性損傷、アルコール性肝障害、肝硬変、ラチルス症（神経性ラチリスム）等の毒物因性疾患、悪液質等の消耗性疾患、Ｂ型及びＣ型肝炎等のウイルス感染症、並びに骨粗鬆症の治療用薬剤の調製に用いる。
【００２８】
別の好適実施態様では本発明を、喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫症、腫瘍を原因とするＴ細胞系の異常、並びにマラリヤ病原虫(Plasmodium sp.)、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、トキソカラ（Toxicara）などによって引き起こされる感染性疾患の治療用薬剤の調製に用いる。本発明は、多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病の治療用薬剤の調製に用いることが好ましい。
【００２９】
本発明の第１４の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、Ｔ細胞の活性化を調節する方法を提供する。
【００３０】
本発明の第１５の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、Ｔ細胞の増殖を調節する方法を提供する。
【００３１】
本発明の第１６の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、抹消Ｔ細胞の増殖を調節する方法を提供する。
【００３２】
本発明の第１７の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、Ｔ細胞のアポトーシスを調節する方法を提供する。
【００３３】
本発明の第１８の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、抹消Ｔ細胞のアポトーシスを調節する方法を提供する。
【００３４】
本発明の第１９の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子を投与することにより、Ｔ細胞介在型の疾患又は感染症を治療する方法を提供する。
【００３５】
本発明の第２０の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子を投与することにより、Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００３６】
本発明の第２１の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の作動因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の作動因子を投与することにより、Ｔ細胞増殖の亢進又は低減に伴う疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００３７】
本発明の第２２の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、ノッチシグナル伝達経路を調節する方法を提供する。
【００３８】
本発明の第２３の特徴として、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子を投与することにより、免疫細胞におけるノッチシグナル伝達経路を調節する方法を提供する。免疫細胞は抹消Ｔ細胞であることが好ましい。
【００３９】
本発明の第２４の特徴として、治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路が標的とする経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含み、Ｔ細胞介在型疾患の治療に使用される組成物を提供する。
【００４０】
本発明の第２５の特徴として、治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含み、Ｔ細胞アポトーシスの亢進又は低減に伴う疾患の治療に使用される組成物を提供する。
【００４１】
本発明の第２６の特徴として、治療有効量のヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の調節因子、並びに薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤を含み、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖、抹消Ｔ細胞活性化、抹消Ｔ細胞増殖及びＴ細胞アポトーシスの修飾に伴う疾患の治療に使用される組成物を提供する。
【００４２】
本発明の第２７の特徴として、候補調節因子の存在下若しくは不在下にて免疫系細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を観察し、該候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法を提供する。
【００４３】
本発明の第２８の特徴として、
（ａ）免疫系細胞を候補調節因子と接触させ；
（ｂ）ヘッジホッグシグナル伝達を観察し；また
（ｃ）上記候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する；
工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法を提供する。
【００４４】
好適実施態様の１つとして、候補調節因子は、有機化合物、無機化合物、ペプチド若しくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体の断片、サイトカイン、及びサイトカインの断片からなるグループから選択される。
【００４５】
ヘッジホッグシグナル伝達を観察する工程が、少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを観察する工程を含むことが好ましい。ある実施態様においては、上記少なくとも１つの標的遺伝子が、ヘッジホッグシグナル伝達の内因性標的遺伝子である。或いは、少なくとも１つの標的遺伝子がレポーター遺伝子であり、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、放射標識又は蛍光標識された遺伝子、及び所定のポリペプチドエピトープをコードする遺伝子からなるグループから選択されることが好ましい。
【００４６】
ある好適実施態様では、少なくとも１つの標的遺伝子が、ヘッジホッグシグナル伝達に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にある。
【００４７】
より一層好ましい実施態様においては、少なくとも１つの標的遺伝子が、
ｉ）ヘッジホッグシグナル伝達；及び
ii）第２シグナル；及び／又は
iii）第３シグナル
に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあり、このとき第２と第３シグナルは異なるシグナルである。
【００４８】
実施態様の１つでは、第２シグナルが免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路の活性化に起因しており、かかる特異的シグナル伝達経路としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路、又はトール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路が好ましい。
【００４９】
第３シグナルは、免疫系細胞に特異的な共刺激であることが好ましい。ある好適実施態様においては、Ｂ７タンパク質のＢ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＩＭ−１、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜１１等のトール様受容体（ＴＬＲｓ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、増殖因子及び増殖因子受容体作動因子、並びにそれらの変異体、誘導体、アナログ及び断片からなるグループから共刺激が選択される。
【００５０】
好適実施態様の１つにおいては、免疫系細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、抹消（すなわち胸腺外）Ｔ細胞を含むＴ細胞又はＴ細胞前駆体であることが好ましい。
【００５１】
別の好適実施態様では、少なくとも１つの標的遺伝子の発現をプロテインアッセイ及び／又は核酸アッセイにより観察する。
【００５２】
本発明の第２９の特徴として、本発明の方法により同定が可能な調節因子を提供する。
【００５３】
本発明の第２５の特徴として、
（ａ）免疫系細胞を活性化し；
（ｂ）上記細胞を候補調節因子と接触させ；
（ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達を観察し；
（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の工程は順不同に行ってよい）、及び
（ｄ）上記候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程からなるヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を検出する方法を提供する。
【００５４】
免疫系細胞はＴ細胞であることが好ましい。一実施態様においては、Ｔ細胞受容体の活性化によってＴ細胞が活性化される。Ｔ細胞受容体は、抗原又は抗原決定基によって活性化される。或いは、Ｔ細胞受容体は、抗ＴＣＲ抗体、好ましくは抗ＣＤ３抗体によって活性化される。
【００５５】
別の実施態様ではＴ細胞は共活性化される。Ｔ細胞が、ＣＤ２８による活性化で共活性化されることが好ましい。Ｔ細胞受容体は、抗ＣＤ２８抗体で共活性化してもよい。
【００５６】
ここにおいて、「調節する」なる用語は、ヘッジホッグシグナル伝達経路又はその標的シグナル伝達経路における生物活性の変化若しくは改変を意味する。実施態様の１つにおいて調節因子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の正常な生物活性を阻害する、少なくともある程度まで阻害する「拮抗因子」又は「阻害因子」である。拮抗因子及び阻害因子には、タンパク質や核酸が含まれ、また抗体が含まれてもよい。別の実施態様で調節因子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路又はその標的シグナル伝達経路の作動因子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明の多岐にわたる好適な特性や実施態様を、それらに限定されることのない例を挙げながら、また添付の図を参照しながら以下に説明する。
【００５８】
便宜上、付属の配列表の概要を以下に記す。
配列番号１は、マウスＳＨＨの推定アミノ酸配列を示し、また配列番号２は、それに対応する核酸配列を示す。
配列番号３は、マウスＤｖｌ−１の推定アミノ酸配列を示し、配列番号４は、それに対応する核酸配列を示す。
配列番号５は、マウスＨＩＰの推定アミノ酸配列を示し、配列番号６は、その対応する核酸配列を示す。また、配列番号７は、マウスＷＩＦ−１の推定アミノ酸配列を示し、配列番号８は、その対応する核酸配列を示す。
【００５９】
引用文献及び登録番号を参考のため本明細書に添付する。
【００６０】
ヘッジホッグファミリータンパク質
全ての多細胞生物は、胚における成長や分化を調節するために細胞間コミュニケーションを必要とする。このための戦略の一つに、細胞増殖及び細胞の運命づけを調和的に制御するシグナルを放出する別々のオーガナイズセンター（organizing centers）を確立することがある。ヘッジホッグ（ｈｈ）遺伝子は、ショウジョウバエでヘッジホッグ遺伝子が変異して生じた体節極性表現型から最初同定された。ｈｈファミリーに属する遺伝子は、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ラット、アフリカツメガエル、ヒトを含む脊椎動物数種でこれまで単離されている。これらの遺伝子は、同種間で、また異種間で高度な構造相同性を有しているだけでなく、多様な胚プロセスにおける機能の仕方に著しい類似点がいくつかあることも示されている。脊椎動物ではソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が、いくつかあるシグナル伝達センターにおいてキーとなるシグナルである。哺乳類ヘッジホッグメンバーとしてはソニックヘッジホッグ以外にも、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）とデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）の２種類がある。
【００６１】
種々のヘッジホッグ遺伝子の概要を以下の表１に示す。
【００６２】
【表１】
2004534743.tif 000002
【００６３】
種が異なる遺伝子は、それらの発現パターンとアミノ酸配列の比較に基づいて分類する。全ての脊椎動物のタンパク質において、ＤＨＨが最もショウジョウバエＨＨに似ている（プロセシングしたタンパク質の全長の５１％が相同性を有する）。マウスとヒトとにおけるＳＨＨのアミノ酸相同性は９３％であり、マウスとニワトリでは８４％であり、マウスとアフリカツメガエルでは７８％であり、またマウスとゼブラフィッシュでは６８％である。マウスの種内比較では、ＳＨＨ、ＩＨＨ及びＤＨＨ相互間における２つ１組の比較を行ったときの同一性は５８〜６３％だった。マウスとアフリカツメガエルの種間比較では、ＩＨＨとＸＢＨＨの相同性（７０％）及びＤＨＨとＸＣＨＨの相同性（６４％）が最も高かった。
【００６４】
種々のヘッジホッグタンパク質は単一のペプチドからなり、高度に保存されたＮ末端領域とより分岐したＣ末端ドメインを有する。生物学的に活性なヘッジホッグペプチドは、さらに大きな前駆タンパク質から形成されることがわかっている。ヘッジホッグ前駆タンパク質は、分泌経路におけるシグナル配列開裂に加え、自動的なタンパク質分解により内部でも開裂が生じる。この自動的開裂により、Ｎ末端ペプチド（約１９ｋＤａ）及びＣ末端ペプチド（約２６〜２８ｋＤａ）が産生される。ショウジョウバエ及び脊椎動物における短期間及び長期間のヘッジホッグシグナル伝達活性に必要とされるのは、このＮ末端ペプチドである。このＮ末端ペプチドは、それ自身が合成される細胞の表面に緊密に結びつくのに対し、Ｃ末端ペプチドは自由な拡散が可能なペプチドである。
【００６５】
シグナル伝達経路
図１は、特に脊椎動物におけるシグナル伝達を例に挙げ、ヘッジホッグシグナル伝達経路の一代表例を示す図である。
【００６６】
上皮細胞はホメオドメイン（高相同性領域）転写因子であるengrailed（Ｅｎ）を発現し、図中では説明用にＳｈｈと表しているヘッジホッグタンパク質を分泌する。本発明者らは、Ｅｎが、抹消免疫系におけるリンパ球の生存維持に重要な役割を担っていることを観察した。
【００６７】
標的細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達は、チャネルタンパク質及びトランスポータータンパク質と類似の構造を有するpatched（Ｐｔｃ）と、Ｇ−タンパク質結合受容体及びWingless受容体のFrizzeledと似ている７回膜貫通型膜タンパク質のSmoothened（Ｓｍｏ）（以下に説明する）との、２種類の膜貫通型タンパク質に介される。Ｓｍｏは、ヘッジホッグ標的遺伝子の構成活性因子である。その活性は通常、Ｐｔｃによって抑制され、かかる抑制は、ヘッジホッグがＰｔｃに結合することにより解除される。従って、ヘッジホッグがＰｔｃに結合することにより、標的細胞の核に局在する転写因子Ｇｌｉの活性化をもたらすシグナルが伝達される。
【００６８】
上記シグナルは、（１）セリン／トレオニンキナーゼのFused（Ｆｕ）、（２）Fusedのサプレッサー（ＳＵ（Ｆｕ））、及び（３）Costal２（Ｃｏｓ２）の間に形成される細胞質複合体を通してＧｌｉに到達する。この複合体を介するシグナル伝達は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によって阻害されることも考えられる（図２を参照）。
【００６９】
Ｇｌｉは、標的遺伝子のWingless（Ｗｎｔ）及びＢＭＰ／アクチビン増殖因子に作用する。ＷｎｔとＢＭＰはいずれも細胞外液に分泌され、それぞれの受容体に結合する。このプロセスを図１に概略図として示す。
【００７０】
ヘッジホッグシグナル伝達経路の構成因子を比較した概要を以下の表２に示す。
【００７１】
【表２】
2004534743.tif 000003
【００７２】
脊椎動物及び無脊椎動物の学名は、本明細書では互換的に使用してもよいこととする。
【００７３】
Ｓｈｈ、ｐｔｃ、及びｓｍｏの転写産物は、始原及び成熟ＣＤ１９+、ＣＤ３３+及びＣＤ３+細胞集団に存在する。Ｓｈｈシグナル伝達経路のメンバーは、Ｔ細胞発達においてダブルネガティブ（ＣＤ４-ＣＤ８-）段階をダブルポジティブ（ＣＤ４+ＣＤ８+）段階へと、Ｔ細胞分化を調節する。
【００７４】
Ｓｈｈは、造血幹細胞を含む種々の細胞型に増殖効果を示す（Fan and Khavari; Bhardwaj et al; Fujita et al; Kenny and Rowitch; and Outram et al）。Ｓｈｈ及びｐｔｃタンパク質は、抹消リンパ組織で発現する。Ｓｈｈシグナル伝達経路の構成因子であるＳｈｈ、ｐｔｃ、ｓｍｏ及びＧｌｉ１は、静止抹消ＣＤ４+Ｔ細胞及び活性化抹消ＣＤ４+Ｔ細胞の両方に存在する。Ｓｈｈシグナル伝達経路のメンバーは胸腺で発現することが明らかになっている（Outram, et al）。Ｓｈｈは、胸腺上皮細胞に存在するが、胸腺細胞には存在しない。他方、受容体であるｓｍｏ及びｐｔｃは、発達の種々の段階において胸腺細胞で認められる（Outram, et al）。さらに、Ｓｈｈ、ｐｔｃ及びｓｍｏの転写産物は、成熟ＣＤ３+Ｔ細胞集団において認められている（Bhardwaj, et al.）。
【００７５】
Ｓｈｈは、補因子として機能し、刺激の生理学的条件下においてＴ細胞のクローン性増殖に貢献すると考えられている。Ｓｈｈは、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞において増殖を亢進させる。Ｓｈｈは、細胞周期のＳ／Ｇ２増殖期へのＣＤ４+Ｔ細胞の移行を促進するように見受けられる。このようなＳｈｈ効果は、他のいくつかの細胞型に対しても報告されている（Fan and Khavari; Kenny and Rowitch）。例えば、細胞周期のＳ／Ｇ２期においてＳｈｈが、不釣合いな数の角化細胞を誘導することが明らかになっている（Fan and Khavari）。Kenny & Rowitch は、ＳｈｈがＳ期に神経前駆細胞数を増加させることを見い出した。
【００７６】
Ｓｈｈは、ｂｃｌ−２の転写産物を著しく増加させる。Ｓｈｈがｂｃｌ−２の発現を誘導することは既に明らかにされている（Fan et al）。Ｂｃｌ−２は、胸腺以降のＴ細胞の生存調節に重要な役割をもつことが知られている（Strasser et al; Katsuma et al; Nakayama et al; and Veis et al）。従ってＳｈｈは、ｂｃｌ−２を誘導することを介して活性化細胞の生存を促進することにより、少なくとも部分的に機能すると考えられる。
【００７７】
細胞周期の進行は調節ネットワークに大きく依存し、かかるネットワークの主要構成因子にはサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋｓ）が含まれる（Lees; Morgan; Sherr; Sherr; and Elledge）。Ｇ１期からＳ期への移行に重要なｃｄｋ２及びｃｄｋ４が、正常な増殖条件下で角化細胞においてその活性を亢進させることに伴い、Ｓｈｈが発現することが既に報告されている（Fan and Khavari）。また、未知のタンパク質中間体の合成によると考えられるが、Ｓｈｈが、サイクリンＤ１、Ｄ２及びＥ等のＧ１期サイクリンの発現を維持することにより、増殖性神経前駆細胞における細胞周期の進行が促進されることがわかっている（Kenny and Rowitch）。
【００７８】
有糸分裂期への移行には、Ｍ期促進因子（ＭＰＦ；M phase promoting factor）の活性化と核転座が必要である（Borgne et al; and Peter et al）。ＭＰＦは、ｃｄｃ２とサイクリンＢ１のタンパク質２種から構成される。Patched１は、サイクリンＢ１との相互作用が可能であり、ＭＰＦの核転座を阻止し、従って細胞周期の進行を阻止する。さらにＳｈｈがｐｔｃと結合することにより、サイクリンＢ１の放出が促進され、その結果、ＭＰＦの核導入や、続く細胞周期の進行が生じることになる（Barnes et al）。しかし、ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞周期に及ぼすＳｈｈの効果はＳ期で認められるので、ＭＰＦ（Ｇ２／Ｍ期の後期を制御する）を抑制することだけに関与しているのではないことが示唆される。細胞周期進行にｐｔｃが抑制効果を示すことにより、ＳｈｈｍＲＮＡやＧｌｉ１ｍＲＮＡの場合と異なり、ｐｔｃｍＲＮＡの転写が増殖過程を通じて増加しない理由が説明できる。
【００７９】
以上をまとめるとＳｈｈシグナル伝達は、抹消ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を持続させ、増強することに重要な役割を果たしている。これは、ＣＤ４+Ｔ細胞の細胞周期Ｓ／Ｇ２期への移行が促進されることによる。さらにＳｈｈは、ＣＤ４+Ｔ細胞自身による自己分泌方式によっても産生され、クローン性増殖の増強や維持に機能する。
【００８０】
ヘッジホッグシグナル伝達に関する情報はさらに以下の文献に収載されている。Ingham; Chuang and McMahon; Pepicelli et al; Hammerschmidt et al; Bhardwaj et al; and Outram et al.
【００８１】
Wingless／Ｗｎｔシグナル伝達経路
本発明者らは、間質性肺疾患におけるＷｎｔシグナル伝達経路の調節障害に関する役割を調べた。Ｗｎｔ遺伝子はヘッジホッグ経路の標的であり、Ｗｎｔタンパク質は、上皮細胞増殖の調節や、胚発達過程での肺における分化に関与する増殖因子を分泌する。本発明者らは、肺における上皮細胞の修復過程においてもＷｎｔシグナル伝達がアップレギュレートされる可能性を提言する。
【００８２】
Dishevelled−１（Ｄｖｌ−１）は、ハエＤｓｈ遺伝子のマウスにおけるホモログであり、Ｗｎｔ受容体Frizzledのシグナルを細胞質に伝達する機能を有し、Frizzledは細胞質で、広く知られているセリン／トレオニンキナーゼＧＳＫ−３ｂのキナーゼ活性を調節する。ハエ上皮細胞でＤｓｈが過剰発現するとＷｎｔシグナル伝達が増大し、それにより上皮細胞に発癌活性が生じる。
【００８３】
かかる経路の代表例を図３に示す。ショウジョウバエのWingless（Ｗｇ）、及びその脊椎動物におけるホモログであるＷｎｔのシグナル伝達経路は、細胞増殖を調節する。Ｗｇ及びＷｎｔは、細胞決定を惹起することに関与する増殖因子を分泌する。Ｗｇ／ＷｎｔリガンドがFrizzled（Ｆｚ）ファミリーの受容体分子に結合することにより、細胞質タンパク質Dishevelled（Ｄｖｌ）を含むシグナル伝達カスケードが開始する（Sussman DJ et al）。Ｄｖｌ−１ｃＤＮＡのGenBank登録番号は、Ｕ１０１１５である。図３に示す複合体は、標的細胞の細胞質に存在するものである。一般的にＡＰＣはシグナル伝達を阻止する。しかし、Ｗｎｔからのシグナル伝達存在下ではβ−cateninが放出されてＬｅｆ−１／ＴＣＦ−１という２種類の転写因子と相互作用し、その結果、標的遺伝子が発現する。Ｗｎｔの標的遺伝子にはＥｎが含まれる。つまり間接的にヘッジホッグ、ｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１が含まれる。
【００８４】
調節因子（Modulators）
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達を阻害又は阻止（拮抗）する化合物の使用に関する。このような化合物は、ヘッジホッグの発現をダウンレギュレーションする効果を有するものと考えてよい。同様に本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的となるシグナル伝達経路を阻害又は阻止（拮抗）する化合物の使用にも関する。このような化合物を本明細書においては便宜上、阻害因子（inhibitors）又は拮抗因子（antagonists）と称する。
【００８５】
本発明はまた、ヘッジホッグシグナル伝達を亢進（作動）する化合物の使用に関する。同様に本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的となるシグナル伝達経路を亢進（作動）する化合物の使用にも関する。このような化合物を本明細書においては便宜上、アップレギュレーション因子又は作動因子と称する。
【００８６】
リンパ球浸潤又は細胞周期チェックポイントの機能不全が関与するヒトの疾患では、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子、又はヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の調節因子の正常な機能の消失が変異に起因していると本発明者らは考える。かかる疾患の治療法としてそのような調節活性を修復する遺伝子療法が示唆される。或いは、これらのシグナル伝達経路の発現を阻止することや、その活性を阻害することが上記疾患症状の治療に有用であると考えられる。上記のシグナル伝達経路を負に調節するためにアンチセンス療法又は遺伝子療法を用いることが考慮される。
【００８７】
シグナル伝達経路における各構成因子に対する拮抗因子が同定されている。それら拮抗因子を下記の表３にまとめた。
【００８８】
【表３】
2004534743.tif 000004
【００８９】
ＨＩＰ（ヘッジホッグと相互作用するタンパク質）は、哺乳類ヘッジホッグタンパク質の少なくとも全３種類に、Ｐｔｃの親和力と匹敵する親和力をもって結合する膜糖タンパク質である。ＨＩＰは、ヘッジホッグタンパク質に結合することにより、ヘッジホッグのシグナル伝達を減弱させると考えられる。かかる負の調節フィードバックループは、あらゆるヘッジホッグシグナルに対する応答を調節する機能も有している。ＨＩＰのGenBank登録番号は、ＡＦ１１６８６５である。
【００９０】
シュロソウ（Veratrum）アルカロイド及びコレステロール生合成の末梢性阻害因子（distal inhibitor）は、単眼症や他の奇形を誘導し得る潜在的催奇形物質（teratogen）として３０年以上にわたり研究されてきた。これら化合物が、Ｓｈｈシグナル伝達経路を特異的に阻止することも解明されている（Cooper et al）。シュロソウアルカロイドの一例として、砂漠植物のスカンクキャベツ（Veratrum californicum）から単離されたステロイドであるシクロパミン（１１−デオキソジェルビン）が挙げられる（Coventry et al）。
【００９１】
Ｆｒｚｂ（Frezzled）は、Ｗｎｔシグナル伝達における分泌型拮抗因子である。Ｆｒｚｂは、膜透過性受容体のFrizzledファミリーの推定Ｗｎｔ結合領域に類似したドメインを有するが、膜透過性ドメインが全くないために推定分泌型Ｗｎｔ結合タンパク質となる。アフリカツメガエル、マウス、ヒトのＦｒｚｂｃＤＮＡのGenBank登録番号は、それぞれＵ６８０５９、Ｕ６８０５８、Ｕ６８０５７である。
【００９２】
セルベルスは分泌型タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の拮抗因子であることが見い出されている。アフリカツメガエルのセルベルスｃＤＮＡのGenBank登録番号は、Ｕ６４８３１である。
【００９３】
ＷＩＦ−１（Ｗｎｔ−阻害因子−１）はＷｎｔタンパク質に結合してその活性を阻害する分泌型タンパク質である。ＷＩＦ−１のGenBank登録番号は、ヒト、ＡＦ１２２９２２；マウス、ＡＦ１２２９２３；アフリカツメガエル、ＡＦ１２２９２４；ゼブラフィッシュ、ＡＦ１２２９２５である。
【００９４】
グレムリンは分泌型タンパク質であり、Ｗｎｔシグナル伝達経路の拮抗因子であることが解明されている。グレムリンｃＤＮＡのGenBank登録番号は、アフリカツメガエル、ＡＦ０４５７９８；ニワトリ、ＡＦ０４５７９９；ヒト、ＡＦ０４５８００；マウス、ＡＦ０４５８０１である。
【００９５】
拮抗因子又は作動因子は、それら自体もヘッジホッグシグナル伝達経路の構成因子、或いはヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路の構成因子である。かかる拮抗因子には、ヘッジホッグシグナル伝達の負の調節因子Ｐｔｃ、Ｃｏｓ２及びＰＫＡが含まれる。かかる作動因子には、ヘッジホッグシグナル伝達の正の調節因子Ｓｍｏ及びＧｌｉが含まれる。
【００９６】
特に好適な実施態様においてはＰＫＡを使用する。ＰＫＡは、Ｃｉを発現する成虫原基細胞においてヘッジホッグ標的遺伝子に対する抑制機能を発揮するので、ヘッジホッグシグナル伝達機構に関与している。転写抑制因子又は活性因子としてのＣｉの機能は、ヘッジホッグに調節され、かつＰＫＡに依存するタンパク質分解プロセシングに左右される。
【００９７】
サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、細胞表面受容体に対するホルモン刺激に応答してＡＴＰで産生されるヌクレオチドである。ｃＡＭＰは、Ａ−キナーゼを活性化することによりシグナル伝達分子として機能し、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により加水分解されてＡＭＰとなる。ｃＡＭＰレベルは肘脈開裂（cubitus cleavage）レベル及びＴＧＦ−βレベルに影響する。特に、ｃＡＭＰレベルが上昇すると、ＴＧＦ−βレベルが減少する。本発明の別の実施態様では、治療にｃＡＭＰ修飾因子を用いる。かかる修飾因子には、ＰＤＥ阻害因子、及びβ−アドレナリン作動因子等のβ−作動因子が含まれる。例えばｐｔｃ１の転写は、ｃＡＭＰシグナル伝達経路を活性化する作用因子によって惹起されることが明らかになっている。細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる作用因子は当技術分野において十分公知であり、それらの作用因子におけるＴＧＦ−βの産生を減少させた上で本発明で使用できることを本発明者らは示すものである。
【００９８】
免疫抑制サイトカインもヘッジホッグシグナル伝達経路の調節にも用いることができる。かかるサイトカインとしては、ＴＧＦ−β−１及びＴＧＦ−β−２等のＴＧＦ−βファミリーメンバーや、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３等のインターロイキンや、ＦＬＴ３リガンドが例示される。
【００９９】
発現制御配列に特異的に結合する能力をもつアンチセンス核酸（１０〜２０ｂｐのオリゴヌクレオチドが好ましい）又はＲＮＡを、細胞に導入する（例えば、ウイルスベクターや、リポソーム等のコロイド分散系により）。アンチセンス核酸は、細胞内で標的配列に結合し、かかる標的配列の転写や翻訳を阻止する。本発明においては特にホスホチオ酸及びメチルリン酸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療に用いることを検討する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５´側において、ポリ−Ｌ−リシン、トランスフェリンポリリシン又はコレステロール成分によってさらに修飾してもよい。
【０１００】
抗体産物（例；モノクローナル及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）を導入した抗体及びそれらの抗原結合断片）や、他の結合タンパク質（上述のアッセイで同定されたタンパク質）もまた本発明に含まれる。結合タンパク質は、単離された天然型又は組換え酵素を用いて展開できる。その反対に結合タンパク質は、組換え酵素及び天然型酵素を精製し、そのような酵素を産生する細胞を同定することに有用である。細胞中又は液中のタンパク質を検出、定量するアッセイとしては、「サンドイッチ」アッセイフォーマットにおいて単一の抗体物質又は複数の抗体物質を用い、ヘッジホッグタンパク質レベルの細胞学的分析を行うものが含まれる。結合タンパク質はまた、相互作用を調節（すなわち阻止、阻害又は刺激）する上で極めて有用である。
【０１０１】
抗体は、動物に、通常ウサギに、常法によりポリペプチドやエピトープ含有断片を投与して作製する。かかる手法の例には、Kohler and Milsteinのものが含まれる。
【０１０２】
実施態様の１つについてより詳細に述べると、ヘッジホッグシグナル伝達の調節因子としては、例えば、ヘッジホッグタンパク質又はポリペプチド又はその断片と、種々の免疫グロブリンサブクラス（例；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）のＨ鎖又はＬ鎖定常領域における種々の部分のうちのいずれかを有する遺伝子工学的処理を施した可溶性融合タンパク質でよい。かかる融合タンパク質における免疫グロブリン因子として好ましいのは、融合がヒンジ領域で生じるヒトＩｇＧ（とりわけＩｇＧ１）のＨ鎖定常領域である。ある実施態様では、血液凝固因子Ｘａによる開裂が可能な開裂配列を導入するだけでＦｃ部分を除去できる。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願ＷＯ９４／２９４５８号及び同９４／２２９１４号に記載されている。
【０１０３】
調節因子は、ポリペプチド若しくはその断片、線状ペプチド、環状ペプチド、低分子量の有機又は無機化合物を含む合成及び天然化合物から選択されることがより一般的である。調節因子は、細胞外マトリックスの構成要素などの生物材料に由来していてもよい。
ポリペプチド物質は、適当な宿主細胞で組換え発現させて得た哺乳類細胞、又は市販の哺乳類細胞から精製してよい。或いは、標準的な手法を用いたトランスフェクション、又はウイルス感染／形質導入法によりポリペプチドをコードする核酸構築物を導入してもよい。
【０１０４】
本発明に用いる調節因子は、便宜的なスクリーニング法によって、都合よく同定される。
【０１０５】
上記調節因子を同定するアッセイの１つは、適切な経路の構成因子（例えばヘッジホッグや試験タンパク質）を固定化し、固定化しない結合パートナーを検出用に標識し、この結合パートナー同士を共インキュベーションし、結合した標識物を定量する工程からなる。結合標識物は、試験タンパク質が上記構成因子と相互作用したことを示すものである。
【０１０６】
調節因子を同定する別のアッセイ法は、経路の構成因子（例；ヘッジホッグ）若しくはその断片を、蛍光物質をコーティングした（又は染み込ませた）固体支持体上で固定化し、上記蛍光物質を励起させる化合物で試験タンパク質を標識し、固定化した構成因子を標識化試験化合物と接触させ、蛍光物質による光放出を検出し、蛍光物質により光を放出した試験タンパク質として相互作用タンパク質を同定する工程からなる。或いはこのアッセイでは、推定相互作用タンパク質を固定化し、構成因子を標識してもよい。
【０１０７】
さらに、調節因子を同定するアッセイは、次の工程からなる。つまり、ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下において、レポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を用いて適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトさせ；経路構成因子（例；ヘッジホッグ又はＷｎｔ）の部分又は全体と、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン若しくは活性化ドメインとの第１融合物をコードする第１ハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞で発現させ；上記構成因子と相互作用するタンパク質の部分若しくは全体と、第１融合物に取り込まれなかった転写因子のＤＮＡ結合ドメイン若しくは活性化ドメインをコードする第２ハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞で発現させ；試験化合物の存在下又は不在下で宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の産生量を測定して、所与の宿主細胞における相互作用タンパク質の上記構成因子への結合を検出することにより、上記構成因子と相互作用タンパク質との間の相互作用に対する試験化合物の効果を評価し；調節化合物不在下におけるレポーター遺伝子産物の産出量と比較して、レポーター遺伝子産物の産出量を変化させる試験化合物としての調節化合物を同定する工程からなる。かかるアッセイに用いるのに現在好適とされているのは、レポーター遺伝子の発現を誘導するｌｅｘＡプロモーター、ｌａｃＺレポーター遺伝子、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン及びＧＡＬ４転写促進ドメインを有する転写因子、及び酵母宿主細胞である。
【０１０８】
特にヘッジホッグシグナル伝達に関して説明する実施態様では、レポーター遺伝子を有するＤＮＡ構築物を用い、好適な宿主細胞をＰｔｃプロモーターの制御下において形質転換又はトランスフェクトさせ；ヘッジホッグをコードするＤＮＡ配列を上記細胞で発現させ；所定の宿主細胞におけるヘッジホッグとＰｔｃプロモーターとの間の相互作用に試験化合物が及ぼす効果を、上記試験化合物の存在下及び不在下での宿主細胞におけるレポーター遺伝子産物の産生量を測定することにより評価し；試験化合物不在下におけるレポーター遺伝子産物の産生量と比較することにより、レポーター遺伝子産物の産生量を減少させる試験化合物として調節因子を同定する。
【０１０９】
ヘッジホッグシグナル伝達の標的経路の調節因子にも類似のアッセイが採用できる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路については、ＷｎｔとＦｚとの相互作用を調節する化合物の能力を測定する。
【０１１０】
コンビナトリアルライブラリー、ペプチド及びペプチド模倣体、定義された化学物質、オリゴヌクレオチド、及び天然産物ライブラリーを上述のアッセイでスクリーニングし、調節因子としての活性を調べてもよい。
【０１１１】
本発明はまた、アッセイで同定可能なものを含む上記調節因子の誘導体、変異体、断片、アナログ、ホモログ及び模倣体の使用にも関する。本発明のアッセイについては以下に詳細に述べる。
【０１１２】
本発明のポリペプチドとの関連において用いる「誘導体」なる用語には、配列におけるアミノ酸残基１個（若しくは２個以上）の置換、変異、修飾、交換、欠失、付加を含むものとするが、但し、それらの結果として得られるタンパク質等がシグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する限りにおいてのこととする。
【０１１３】
本発明のポリペプチドとの関連において用いる「変異体」なる用語には、配列におけるアミノ酸残基１個（若しくは２個以上）の置換、変異、修飾、交換、欠失、付加を含むものとするが、但し、それらの結果として得られるタンパク質等がシグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する限りにおいてのこととする。
【０１１４】
本発明のポリペプチドとの関連において用いる「断片」なる用語には、上述のポリペプチドのアミノ酸配列と部分的に完全に一致するが、全体としては一致しないアミノ酸配列を有し、シグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する変異ポリペプチドを含むものとする。
【０１１５】
本発明のポリペプチドとの関連において用いる「アナログ」なる用語には、あらゆる模倣構造ペプチド（peptidomimetic）、すなわち、親ポリペプチドと同様な形でシグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する化学化合物を含むものとする。
【０１１６】
本発明のポリペプチドとの関連において用いる「ホモログ」なる用語には、シグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する限りにおいて、対象ポリペプチドと進化論的に同起源であるポリペプチドが含まれる。
【０１１７】
本発明の阻害因子との関連において用いる「模倣体（mimetic）」なる用語には、やはり親化合物と同様な形でシグナル伝達経路の作用に対して作動する又は拮抗する能力を有する化合物が含まれる。
【０１１８】
より具体的には、「ホモログ」なる用語は、結果として得られるヌクレオチド配列の発現産物に阻害活性又はアップレギュレーション活性があるという条件の下での構造及び／又は機能の同一性を包含する。配列同一性（すなわち類似性）に関しては、配列同一性が少なくとも７５％あることが好ましく、少なくとも８５％あることがより好ましく、少なくとも９０％あることがなお好ましい。一層好ましいのは、少なくとも９５％の配列同一性があることで、少なくとも９８％の配列同一性があることがより好ましい。これらの用語はまた、配列の対立変異体をも包含する。
【０１１９】
上記配列における配列同一性は、１若しくは２以上の配列と別の配列において、かかる別の配列が、上記１若しくは２以上の配列と例えば少なくとも７５％の配列同一性を有しているか否かをみる単純な「目視」比較（すなわち厳格な比較）により決定される。
【０１２０】
相対的な配列同一性はまた、同一性を決定するのに適切なアルゴリズム、例えばデフォルトパラメーターを使用して、２若しくは３以上の配列間における同一性の割合（％）を計算できる市販のコンピュータープログラムによって決定することもできる。このようなコンピュータープログラムの典型例としてはCLUSTALがある。パラメーターをデフォルト値に設定したBLASTアルゴリズムを利用することが好都合である。BLASTアルゴリズムについては、 HYPERLINK http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html に詳細があり、参考のため本明細書に添付した。検索パラメーターは以下のとおりに定義し、定義したデフォルトパラメーターに設定することが有利である。
【０１２１】
BLASTを用いて評価した「実質的な同一性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０以上のEXPECT値に一致する配列と同じであることが好都合である。BLAST検索におけるEXPECTのデフォルト閾値は、通常１０である。
【０１２２】
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、blastp、blastn、blastx、tblastn、及びtblastx に採用されている発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムの意義は、Karlin and Altschul の統計方法（ HYPERLINK http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html  を参照）を若干強化して得た検索結果にある。BLASTプログラムは、例えば照会配列のホモログを同定するなど、配列類似性の検索用に開発された。配列データベースにおける類似性検索法の基本的な問題に関する論点については、Altschul et al (1994) Nature Genetics 6: 119-129 を参照のこと。
【０１２３】
HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov から入手可能な５種類のBLASTプログラムは以下の作業を行う。
blastp  −  照会アミノ酸配列をタンパク質配列データベースと比較する。
blastn  −  照会ヌクレオチド配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
blastx  −  照会ヌクレオチド配列（両方の鎖）の６個のリーディングフレームから得られる理論的翻訳産物を、タンパク質配列データベースと比較する。
tblastn  −  照会タンパク質配列を、リーディングフレーム６個全て（両方の鎖）において動的に翻訳したヌクレオチド配列データベースと比較する。
tblastx  −  照会ヌクレオチド配列のリーディングフレーム６個から得られる翻訳産物を、ヌクレオチド配列データベースにおいてリーディングフレーム６個から得られる翻訳産物と比較する。
【０１２４】
BLASTは、以下の検索パラメーターを使用している。
HISTOGRAM  −  各検索におけるヒストグラムを表示する。デフォルトはyesとなる（BLASTマニュアルのパラメーターＨの項参照）。
DESCRIPTIONS  −  特定の番号について報告された適合配列の短縮形（short descriptions）の数を制限する。デフォルト限度は１００短縮形である（マニュアルページのパラメーターＶの項を参照）。
【０１２５】
EXPECT  −  データベース配列に対する適合性を報告する際の統計的有意性閾値である。Karlin and Altschul (1990) の確率モデルに従い、１０箇所の適合が単に偶然から見い出されるとしてデフォルト値は１０である。適合性の統計的有意性が、EXPECT閾値より大きい場合、その適合性は報告されない。EXPECT閾値が低くなると厳密さが増し、報告される適合性は減少する。端数値は許容される（BLASTマニュアルのパラメーターＥの項参照）。
【０１２６】
CUTOFF  −  ハイスコアリングセグメントペア（ＨＳＰ）を報告するカットオフスコア。デフォルト値は、EXPECT値から計算する（上記を参照）。ＨＳＰは、その統計的有意性が、カットオフ値と同スコアをもつＨＳＰ単独における統計的有意性と少なくとも同程度であるデータベース配列についてのみ報告される。CUTOFF値が高いとより厳密になり、報告される適合性は減少する（BLASTマニュアルのパラメーターＳの項参照）。通常、有意閾値は、EXPECTを用いることにより、より直感的に処理される。
【０１２７】
ALIGNMENTS  −  データベース配列を、ハイスコアリングセグメントペア（ＨＳＰ）が報告される特定の番号に限定する。デフォルト限界は５０である。これより多くのデータベース配列が、報告するための統計的な有意閾値を満足させる場合は（EXPECT及びCUTOFFの項目を参照）、最大の統計的有意性を有する適合性だけが報告される（BLASTマニュアルのパラメーターＢの項参照）。
【０１２８】
MATRIX  −  BLASTP、BLASTX、TBLASTN、及びTBLASTXの代替スコアリングマトリックスを特定する。デフォルトマトリックスは、BLOSUM62（Henikoff & Henikoff, 1992）である。有効な代替的選択肢には、PAM40、PAM120、PAM250、及びIDENTITYが含まれる。BLASTNには代替が可能なスコアリングマトリックスはない。BLASTNリクエストにおいて指示的なMATRIXを特定すると、エラー応答が返される。
【０１２９】
STRAND  −  TBLASTN検索を、データベース配列のトップ又はボトムの鎖だけに限定する。或いは、BLASTN、BLASTX、又はTBLASTX検索を、照会配列のトップ若しくはボトムの鎖のリーディングフレームのみに限定する。
【０１３０】
FILTER  −  Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163 のSEGプログラムで定められた組成複合性が低い照会配列のセグメント、或いは、Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17: 191-201 のXNUプログラム、又はBLASTN の場合はTatusov and Lipman のDUSTプログラムで定められた短い周期の内部反復からなるセグメントをマスクオフする（http:www.ncbi.nlm.nih.gov）。フィルター処理により、統計的に有意だが生物学的関心に欠ける報告をblastのアウトプットから除外できるので（例えば一般的な酸性領域、塩基性領域、又はプロリンリッチ領域についてのヒットなど）、照会配列における生物学的により興味深い領域に関してデータベース配列との特異的適合性を調べることができる。
【０１３１】
フィルタープログラムにより見い出された低複合性配列は、ヌクレオチド配列においては文字「Ｎ」で（例；NNNNNNNNNNNNN）、タンパク質配列においては文字「Ｘ」で（例；XXXXXXXXX）置き換える。
【０１３２】
フィルター処理は、照会配列（又はその翻訳産物）にのみ適用し、データベース配列には行わない。デフォルトフィルター処理は、BLASTNにDUSTを用い、それ以外のプログラムにはSEGを用いる。SWISS-PROTにおける配列にフィルター処理を適用すると、SEG、XNU、又はその両方によってマスクされることは決して珍しくはない。従って、フィルター処理によって常に効果が得られる訳ではない。さらに場合によっては、配列がその全体にわたってマスクされるため、フィルター処理を施さない照会配列に対して報告された適合性の統計的有意性に疑問が生じることが示唆される。
【０１３３】
NCBI-gi  −  登録及び／又は遺伝子座名の他に、NCBI gi による識別名をアウトプットに表示させる。
【０１３４】
HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST で提供を受けられる単純なBLAST検索アルゴリズムを用いて配列比較を行うことが最も好ましい。
【０１３５】
２の配列間の同一性や類似性を決定する他のコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12: 387）や、FASTA（Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410）があるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本発明の特徴のいくつかにおいては、配列同一性を決定する際にギャップペナルティを採用していない。
【０１３７】
ここに用いるタンパク質やポリペプチドやペプチドなる用語は、同義と考えてよい。タンパク質は、ポリペプチドのものより相対的に長いアミノ酸配列を指す一般的な意味のみに用いられ、またポリペプチドは、ペプチドのものより相対的に長いアミノ酸配列を指す一般的な意味のみに用いられる。記述を平易にするために、通常はポリペプチドという用語だけを使用することとする。
【０１３８】
本発明はまた、本明細書に示す配列と相補的であるヌクレオチド配列又はその断片若しくは誘導体の使用も範囲に含む。配列がその断片と相補的である場合、かかる配列を、他の生物における類似のプロモーター配列を同定するためのプローブとして用いることができる。
【０１３９】
本発明はまた、本明細書に示す配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列又はその断片若しくは誘導体の使用も範囲に含む。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションは、Dieffenbach CW and GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) に記載されているポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる増幅過程を意味すると同様に、「塩基ペアリングにより核酸鎖が相補鎖と結合する過程」（Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）を意味する。
【０１４１】
やはり本発明の範疇に含まれるものとして、中程度から最大限のストリンジェンシー条件下において本明細書記載のヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列の使用がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel の教示（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）にあるように核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいて、下記に説明するように定義付けられた「ストリンジェンシー」を用いる。
【０１４２】
最大限のストリンジェンシーは通常、おおよそＴｍ−５℃（プローブの融点より５℃低い）で生じ、高度なストリンジェンシーは融点より約５℃〜１０℃低い温度下で生じ、中程度のストリンジェンシーは融点より約１０℃〜２０℃低い温度下で生じ、低度のストリンジェンシーは融点より約２０℃〜２５℃低い温度下で生じる。当業者には明らかであるが、最大限のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、一致するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられ、中程度（又は低度）のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似の若しくは関連するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられる。
【０１４３】
好適な特徴として本発明は、ストリンジェントな条件下（例；６５℃、０．１×ＳＳＣ）で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用を含む。
【０１４４】
本発明はまた、本明細書記載の配列の相補配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列又はその断片若しくは誘導体の使用も包含する。同様に、本発明は、本発明の配列とのハイブリダイズ能を有する配列と相補的なヌクレオチド配列の使用も包含する。これらの型のヌクレオチド配列は、変異型ヌクレオチド配列の例である。
【０１４５】
上記に関し「変異型」なる用語は、本明細書記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列と相補的な配列を包含する。しかし、「変異型」なる用語が、ストリンジェントな条件下（例；６５℃、０．１×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｎａ3クエン酸ｐＨ７．０]）において本明細書記載のヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列と相補的な配列を包含することが好ましい。
【０１４６】
実施態様の１つにおいて、例えばヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、実質的に完全長型又は生物活性をもつ断片型のいずれかの型のヘッジホッグタンパク質であってよい。
【０１４７】
ＷＯ０１６４２３８号（Curis）に報告されているように、ヘッジホッグポリペプチドにおいて生物活性をもつ断片の例が、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／１８８５６号及び同９６／１７９２４号に収載されている。
【０１４８】
ＷＯ０１６４２３８号に報告されているように、所望する場合にヘッジホッグポリペプチドを誘導体化することができる脂質親和性成分若しくは脂質親和性基は多数ある。ヘッジホッグポリペプチドとの接着性に関して「脂質親和性基」なる用語は、炭化水素を高量に含有し、その結果脂質相に対する高親和性が付与される基に言及するものである。脂質親和性基は、例えば炭素数が７〜３０の比較的長鎖のアルキル基又はシクロアルキル基（好ましくはｎ−アルキル基）である。アルキル基は、ヒドロキシ又は一級アミンの「尾部」によって完結する。さらに説明すると、脂質親和性分子には、脂肪酸、ステロール、エステル、アルコール等の天然型及び合成の芳香族及び非芳香族成分、他の脂質分子、アダマンタンやブックミンステルフラーレネス等の面心立方格子構造、並びにベンゼン、ペリレン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン、ナフタセン等の芳香族炭化水素が含まれる。
【０１４９】
実施態様の１つにおいて、ヘッジホッグポリペプチドは、例えばコレステロール（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１７９２４号を参照）等、１若しくは２以上のステロール成分によって修飾されていてもよい。いくつかの実施態様においては、ヘッジホッグポリペプチドが天然型のＮ末端タンパク質分解性断片に相当する場合、Ｃ末端グリシンにコレステロールを付加することが好ましい。別の実施態様では、ヘッジホッグポリペプチドを、ミロストイル、パルミトイル、ステアリル、アラキドイル等の脂肪酸成分で修飾することができる（例としてPepinsky et al. (1998) J Biol. Chem 273: 14037を参照）。
【０１５０】
ヘッジホッグタンパク質の細胞外断片におけるＣ末端へのコレステロール付加、又はＮ末端への脂肪酸付加による効果に加え、上記以外の部位で脂質親和性成分により、及び／又はコレステロール又は脂肪酸以外の成分によりヘッジホッグタンパク質を誘導体化する結果、ヘッジホッグ遺伝子産物における少なくとも何らかの生物活性が予想外に増強される。本発明の特徴のいくつかは、天然にプロセシングされたヘッジホッグタンパク質のＮ末端残基又はＣ末端残基以外の部位で修飾された、及び／又は上記末端残基において、Ｃ末端ではステロール以外の脂質親和性成分、Ｎ末端では脂肪酸により修飾されたヘッジホッグポリペプチド調製物の使用を意図するものである。
【０１５１】
脂質親和性成分として特に有用なのは、脂環式炭化水素、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸、他の脂質やリン脂質成分、ワックス、コレステロール、イソプレノイド、テルペン、アダマンタンやブックミンステルフラーレネスを含む多脂環式炭化水素、ビタミン、ポリエチレングリコール又はオリゴエチレングリコール、（Ｃ1−Ｃ18）−リン酸アルキルジエステル、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12−Ｃ18）−アルキル、とりわけピレン誘導体との共役体である。脂質親和性成分は、本発明での使用に好適な脂質親和性染料でもよく、それら染料には、ジフェニルヘキサトリエン、ナイルレッド、Ｎ−フェニル−１ナフチルアミン、Prodan、Laurodan、Pyrene、ローダミン、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、スルホローダミン、１，１´−ジドデシル−３，３、３´，３´−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、オクタデシルローダミンＢ、及び Molecular Probes Inc.から市販されているBODIPY染料が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
ヘッジホッグポリペプチド又は生物活性を有する断片は、化学結合法や遺伝子工学的手法等の適当な手段により疎水性成分に結合させてもよい。
【０１５３】
ＷＯ０１／９８３４４号（Amgen）には、ヘッジホッグシグナル伝達経路のタンパク質系、核酸系、及び抗体系の調節因子が作動因子と拮抗因子の両方の形態で多数収載されている。その例を以下に挙げる。
【０１５４】
断片及びアナログの作製
ＷＯ０１／９８３４４号に記載がみられるように、ヘッジホッグシグナル伝達タンパク質の断片は、当業者には公知の手法を用い、組換え法により、タンパク質分解消化法により、或いは化学的合成法により効率よく作製できる。組換え法では、単離したヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の一端（末端断片を得るため）又は両端（内部断片を得るため）から１若しくは２以上のヌクレオチドを取り除くことにより、ポリペプチドの内部又は末端断片を作製することができる。この突然変異を起こしたＤＮＡを発現させることにより、ポリペプチド断片を作製する。「末端をかじりとる（end nibbling）」エンドヌクレアーゼによる消化作用も断片のアレイをコードするＤＮＡの作製に利用される。タンパク質断片をコードするＤＮＡは、例えばランダムな剪断、制限酵素消化、又はそれらを併用することにより作製される。タンパク質断片は、無処理のタンパク質から直接作製することもできる。ペプチドはタンパク質分解酵素によって特異的に開裂する。かかるタンパク質分解酵素にはプラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、又はペプシンが含まれるが、これらに限定はされない。これらの酵素は、それぞれが攻撃するペプチド結合の形態に対して特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸（通常はアルギニン又はリシン）に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシン及びキモトリプシンは、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。タンパク質分解酵素に敏感な部位における開裂を回避することにより、別の組合せで開裂タンパク質断片を作製することができる。例えば、リシンのＥアミノ酸基を、弱塩基性溶液中でエチルトリフルオロチオ酢酸と反応させると遮断されたアミノ酸残基が得られるが、その残基に隣接するペプチド結合は、トリプシンが惹起する加水分解への感受性を既に消失している。タンパク質分解酵素に敏感なペプチド結合を作出するためにタンパク質を修飾することができる。
【０１５５】
一例を挙げると、システイン残基を３−ハロエチルアミンでアルキル化すると、トリプシンで加水分解されるペプチド結合が生じる（Lindley, (1956) Nature 178, 647）。さらに、特異的な残基においてペプチド鎖を開裂させる化学試薬を用いることも可能である。例えば臭化シアンは、メチオニン残基部位においてペプチドを開裂する（Gross and Witkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 1510）。従って、種々の組合せの修飾物質、タンパク質分解酵素及び／又は化学試薬を用いてタンパク質を処理することにより、所望の長さで重複のない断片に、或いは所望の長さで重複のある断片にタンパク質を分割することができる。
【０１５６】
Merrifield 固相Ｆ−ｍｏｃ又はt−Ｂｏｃ化学法（the Merrifield solid phase F-moc or t-Boc chemistry）（例；Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967)）などの当技術分野で公知の方法により、断片を化学的に合成することも可能である。
【０１５７】
改変ＤＮＡ及びペプチド配列の作製：ランダム法
ＷＯ０１／９８３４４号で説明されているように、タンパク質の変異アミノ酸配列は、例えばタンパク質又はその特定部分をコードするＤＮＡをランダムに突然変異を誘発させることにより調製できる。有用な方法には、ＰＣＲ突然変異誘発及び飽和突然変異誘発などがある。ランダム変異アミノ酸配列のライブラリーもまた一群の変性オリゴヌクレオチド配列を合成することにより作製できる。かかる方法としては、ＰＣＲ突然変異誘発（例としてLeung et al., (1989) Technique 1, 11-15を参照）、飽和突然変異誘発（１つの方法がMayers et al., (1989) Science 229-242に総括的に記載されている）、及び変性オリゴヌクレオチド突然変異誘発（例としてHarang, S. A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 and Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A. G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981）などが例示される。
【０１５８】
改変ＤＮＡ及びペプチド配列の作製：直接法
非ランダムな、すなわち有向性の突然変異誘発により、単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特異的部分において特異的な配列や突然変異体がもたらされ、上記単離ポリペプチドの既知アミノ酸配列において残基の欠失、挿入、又は置換を含む変異配列が得られる。かかる突然変異部位は個別に又は連続して、例えば、（１）まず保存されたアミノ酸で置換し、次に、得られた結果次第でよりラジカルな選択肢で置換する、（２）標的残基を除去する、又は（３）局在部位の隣接部位に、同じ若しくは異なるクラスの残基を挿入する、或いは（１）〜（３）のオプションを組み合わせることにより、修飾される。
【０１５９】
このような特定部位法により、Ｎ末端のシステイン（又は機能性等価物）を所定のポリペプチド配列に導入して疎水性成分に対する接合部位を得るという1つの方法がもたらされる。好適な手法としては、
アラニン走査突然変異誘発法（Alanine scanning Mutagenesis: Cunningham and Wells, (1989) Science 244, 1081-1085を参照）、
オリゴヌクレオチド媒介突然変異法（例としてAdelman et al., (1983) DNA 2, 183を参照）、
カセット突然変異誘発法（例としてWells et al., (1985) Gene 34, 315を参照）、及び
コンビナトリアル突然変異誘発法（例としてLadner et al.,  ＷＯ８８／０６６３０号を参照）が列挙される。
【０１６０】
単離したポリペプチドの他の変異体
ＷＯ０１／９８３４４号に記載されているように、ヘッジホッグタンパク質は、同タンパク質が生来有する配列の他に、細胞外マトリックス構成因子と結合し、アナログの細胞表面への局在化を増強する成分を有するように作製できる。例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分同士を結合させることによってキメラ分子の細胞への接着を支えるために、テトラペプチド配列Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｓ（Pierschbacher et al. (1984) Nature 309: 30-3; and Kornblihtt et al. (1985) EMBO 4: 1755-9）などのフィブロネクチン「III型繰返し配列」に由来する配列をヘッジホッグポリペプチドに付加することができる（Ruoslahti et al. (1987) Science 238: 491-497; Pierschbacheret et al. (1987) J Biol. Chem. 262: 17294-8.; Hynes (1987) Cell 48: 549-54; and Hynes (1992) Cell 69: 11-25）。
【０１６１】
Ｎ末端に修飾のある拮抗因子としてのヘッジホッグポリペプチド
Ｎ末端に修飾のあるヘッジホッグ変異体の中には、ヘッジホッグ依存性応答を惹起させる能力を欠いているが、ヘッジホッグ受容体patched−１への結合能が保持されているために、ヘッジホッグの機能を阻止することができるものがある。例えば、Ｎ末端システインを完全に消失しているか、又は修飾された形態で（例；化学修飾されているか、Ｎ末端伸張成分の一部として含まれる）Ｎ末端システインを有するヘッジホッグポリペプチドがヘッジホッグ拮抗因子として作用し得ることが報告されている。
【０１６２】
このようにしてＮ末端で修飾されているヘッジホッグタンパク質拮抗因子の例を以下に挙げる。
【０１６３】
Ｎ末端伸張
本発明で用いるのに好適な拮抗ポリペプチドには、Ｎ末端システインがＮ末端伸張成分に結合しているヘッジホッグポリペプチド配列が含まれる。
【０１６４】
従って、単離した拮抗ポリペプチドは、例えば（ａ）ヘッジホッグポリペプチド自体の５´部分でもよく、ヘッジホッグとは無関係な要素（例；アミノ酸残基）を少なくとも１つ有し（ｂ）に結合させた第１Ｎ末端ポリペプチド部分、（ｂ）本発明のヘッジホッグ拮抗因子の一部であるソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システイン又はヘッジホッグ拮抗因子の部分、を有する組換え融合タンパク質である。このＮ末端伸張成分（例；第１Ｎ末端ポリペプチド部分）としては、例えばヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、又はポリメラーゼ活性化ドメインが可能である。機能性拮抗因子には、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１と、又は成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインに取って代わるエレメントを有するＮ末端伸張成分が含まれる。
【０１６５】
Ｎ末端における欠失
別の機能性拮抗因子としては、上述の成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインから始まり、ほぼ１２個を超えないアミノ酸が欠失しているヘッジホッグタンパク質が例示される。例えば、連続する１０個ほどのアミノ酸が欠失すると、好適な機能性拮抗因子を得ることができ、また連続する１０個未満の残基が欠失しても拮抗機能は維持される。さらに、好ましくは全体として少なくとも３残基ほどの欠失がありさえすれば、種々の組合せで不連続残基を欠失させることができることも報告されている。
【０１６６】
Ｎ末端における突然変異
機能性拮抗因子のさらに別の例では、Ｎ末端システインが別のアミノ酸残基に変異する。非疎水性アミノ酸残基であればどれでもよく、当技術分野における平均的な専門家であれば、本明細書記載の教示に従って変異を誘発し、その変異の効果を検定することが可能である。Ｎ末端システインがセリン残基に置換されたＳｈｈが一例である。アスパラギン酸、アラニン、ヒスチジンで置換されたものも拮抗因子として機能することが報告されている。
【０１６７】
Ｎ末端システインの修飾
ヘッジホッグの一次アミノ酸配列には、生物活性に重要なＣｙｓ−１が含まれているため、他の種々の形態で修飾を施すことにより、ヘッジホッグタンパク質の不活化拮抗因子変異体が生じることになる。例えば他にも報告されている拮抗因子は、システインが修飾型であることを除けば成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインを含むヘッジホッグポリペプチドを有する、ヘッジホッグポリペプチドの単離機能性拮抗因子である。ヘッジホッグの拮抗性ポリペプチドには、アセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、又はカルボキシル化により考えられる変化同様に、そのＮ末端システインにおけるインビボ又はインビトロでの化学的誘導体化を含む非配列的な修飾を施してもよい。例えば機能性拮抗因子は、酸化された形態でＮ末端システインを有することができる。従って、機能性拮抗因子は、Ｎ末端伸張成分の一部として含めることによって効率よく修飾されるＮ末端システインを有することができる。
【０１６８】
調節因子としての抗体ホモログ
さらなる実施態様では、本発明の方法に用いる調節因子は細胞表面のヘッジホッグ（脊椎動物のソニック、インディアン又はデザート等）に結合する（阻止する又は覆うことを含む）抗体であり、及び／又は上記ヘッジホッグタンパク質の細胞表面リガンド（パッチド等）は、抗ヘッジホッグ及び／又は抗パッチドモノクローナル抗体又は抗体ホモログである。治療、特にヒトに対する治療に好適な抗体やホモログには例えば、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ｖ）抗体断片、抗体のＨ鎖若しくはＬ鎖のモノマー又はダイマー或いはそれらの組合せが含まれる。
【０１６９】
モノクローナル抗体の作製法はよく知られている。本発明で検討される好適な抗体ホモログは、無処理又は切断処理したゲノム又はｃＤＮＡにおいて、或いは原核又は真核宿主細胞における合成ＤＮＡにおいて発現させることができる。ダイマータンパク質は培養培地から単離でき、及び／又はインビトロで再び折りたたまれ、ダイマー化されて生物学的に活性な組成物へと形成される。独立した別個のポリペプチド鎖を結合させることにより、ヘテロダイマーをインビトロで形成することができる。或いは、独立した別個のポリペプチド鎖をそれぞれコードする核酸を共発現させることにより、単一細胞においてヘテロダイマーを形成することも可能である（組換えヘテロダイマータンパク質作製法として、ＷＯ９３／０９２２９号、又は米国特許第５４１１９４１号にいくつかの例がある）。
【０１７０】
抗ヘッジホッグ抗体は、例えばフローサイトメトリーによって、例えばヘッジホッグタンパク質を認識すると考えられる抗体の共存下でインキュベーションした細胞の蛍光染色を測定することによって同定できる。通常、ハイブリドーマ細胞を作出するのに使用するリンパ球は、血清を調べて抗ヘッジホッグ抗体が陽性であることが既に判明している免疫化哺乳動物からスクリーニングアッセイにより単離する。
【０１７１】
不死化細胞株（例；ミエローマ細胞株）は、リンパ球と同種の哺乳動物由来であるのが一般的である。好適な不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アルニノプテリン、チミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対し敏感なマウスミエローマ細胞株である。一般的には、分子量１５００のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ１５００」）を用いて、ＨＡＴ感受性マウスのミエローマ細胞をマウス脾臓細胞と融合させる。次に、上記の細胞融合から得られたハイブリドーマ細胞の中から、融合しない若しくは非生産的に融合したミエローマ細胞を殺すものを、ＨＡＴ培地を用いて選択する（融合しなかった脾臓細胞は形質転換を行わないために数日後に死ぬ）。
【０１７２】
所望の抗体を産生するハイブリドーマは、そのハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出できる。例えば、抗ヘッジホッグ抗体又は抗パッチド抗体を産生すべく調製されたハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養上清における組換えヘッジホッグ発現細胞株又は組換えパッチド発現細胞株との結合能を有する分泌抗体の存在を試験することによってスクリーニングする。
【０１７３】
無処理の免疫グロブリンである抗体ホモログを作製するには、上記スクリーニングアッセイにおいて陽性だったハイブリドーマ細胞を、該ハイブリドーマ細胞が培養培地中にモノクローナル抗体を分泌するのに十分な条件及び期間をもって栄養培地で培養する。組織培養法やハイブリドーマ細胞に好適な培養培地は広く知られている。順化ハイブリドーマ培養上清を回収し、抗ヘッジホッグ抗体又は抗パッチド抗体を任意で十分公知の手法によりさらに精製する。
【０１７４】
或いは、非免疫化マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を注入することにより、所望の抗体を作製してもよい。注入したハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、腹水として蓄積する抗体を分泌する。腹水をシリンジで腹腔内から抜水することにより、かかる抗体を回収する。数種の抗ヘッジホッグモノクローナル抗体又は抗パッチドモノクローナル抗体については既に文献に記載がある。これらの抗ヘッジホッグモノクローナル抗体又は抗パッチドモノクローナル抗体などは、本発明を実施するに際し有用である。
【０１７５】
ヘッジホッグ又はパッチドに対する完全ヒトモノクローナル抗体ホモログは、本発明の実施に際し、ヘッジホッグリガンドを阻止し、又は覆う結合因子のもう１つの好適例である。これらのホモログは無処理の状態で、例えばBoerner et al., 1991, J. Immunol., 14, 8695に記載されているように、インビトロで初回免疫（プライム）したヒト脾臓細胞を用いて調製してよい。また、Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436、又はHuang and Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236、又は米国特許第５７９８２３０号の記載に従い、レパートリークローニング（repertoire cloning）により調製してもよい。
【０１７６】
実施態様の1つにおいては、本発明での使用に好適な抗体は、例えば抗ヘッジホッグ又は抗パッチド特異性を有するヒト化組換え抗体ホモログである。このような抗体は、例えば欧州特許第０２３９４００号（Winter et al.）に記載されているように、その相補性決定領域（ＣＤＲ）をある種のものから別の種のものに置換することにより抗体を改変して作製してよい。この方法は例えば、ヒトＨ鎖及びＬ鎖のＩｇ可変領域ドメインにおけるＣＤＲを、マウス可変領域ドメインにおける代替ＣＤＲと置換するために用いられる。これら改変されたＩｇ可変領域を次にヒトＩｇ定常領域と結合させて、置換されたマウスＣＤＲ以外の組成が完全にヒトのものである抗体を作出する。ＣＤＲの「移植」により、モノクローナル抗体をヒト化する方法は「再構築（reshaping）」と名付けられた（Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536）。
【０１７７】
マウス抗体において特異的抗原に結合する領域は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）（抗体Ｈ鎖に３つ、Ｌ鎖に３つ）であることから、通常、マウス抗体ＣＤＲｓをヒト抗体において相当する領域に移植する。ＣＤＲの移植は遺伝子工学的手法により行われるが、まずマウスＨ鎖及びＬ鎖可変（Ｖ）領域遺伝子セグメントをクローニングすることによりＣＤＲのＤＮＡ配列を決定し、次にこの配列を特定部位の突然変異誘発により相当するヒトＶ領域に導入する。所望のアイソタイプ（通常ＣＨにはγＩ、ＣＬにはκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加し、ヒト化Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子を哺乳類細胞で共発現させ、可溶性ヒト化抗体を作製する。
【０１７８】
ＣＤＲをヒト抗体に導入することにより、元のマウス抗体がもつ抗原結合性がヒト抗体に付与されることになる。マウス抗体の６個のＣＤＲは、Ｖ領域の「フレームワーク」領域に構造的に配置されている。従って、例えばヒト化抗体ホモログは、Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; and Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad.に例示されているようにして調製すればよい。また、Sci. USA 86, 3833. Queen et al., 1989 (Supra) 及びＷＯ９０／０７８６１（Protein Design Labs）には、マウスモノクローナル抗体（抗Ｔａｃ抗体）のＣＤＲをヒト免疫グロブリンにおけるフレームワーク領域及び定常領域と結合させることにより、受容抗体のフレームワーク領域に修飾残基を有するヒト化抗体を調製する方法が記載されている（米国特許第５６９３７６２号、同５６９３７６１号、同５５８５０８９号、同５５３０１０１号（Protein Design Labs）も参照）。
【０１７９】
Patchedタンパク質に特異的に結合する抗体の具体例は、例えば米国特許第６１７２２００号（The Board of Trustees of the Leland Stanford University）に記載されており、またSmoothenedタンパク質に特異的に結合する抗体の例は、例えば米国特許第６１３６９５８号（Genentech）に記載されている。
【０１８０】
小分子調節因子
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は所謂「小分子」の作用因子であってよく、通常は分子量が２０００Ｄａ未満、好ましくは１０００Ｄａ未満、好適には５００Ｄａ未満の有機分子である。このような化合物の例は当技術分野では公知であり、以下に例示する。
【０１８１】
実施態様の１つにおいて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）に記載され、例えば一般式VIIIで表される化合物でもよい。
【０１８２】
【化１】
2004534743.tif 000005
［式中、Ｕは、含窒素環に融合させた置換又は非置換のアリール又はヘテロアリール環を表し、
Ｖは、低級アルキレン基を表し、
Ｗは、Ｓ又はＯ、好ましくはＯを表し、
Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、又はＳＯXを表し、
Ｒ3は、置換又は非置換のアリール、ヘテロアリール、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、アラルキル、又はへテロアラルキルを表し、
Ｒ4は、置換又は非置換のアラルキル又は低級アルキルを表し、及び
Ｒ5は、多環式芳香族基又は複素式芳香族基を含む置換又は非置換のアリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はへテロアラルキルを表す。
【０１８３】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）に記載され、例えば一般式（Ｉ）で表される化合物でもよい。
【０１８４】
【化２】
2004534743.tif 000006
［式中、Ａｒ及びＡｒ´は、それぞれ独立して置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表し、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、並びに、低級アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選択される１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ及びＣｙ´は、それぞれ独立して置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｎは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表す。］
【０１８５】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）に記載され、例えば一般式（II）で表される化合物でもよい。
【０１８６】
【化３】
2004534743.tif 000007
［式中、Ａｒ及びＡｒ´は、それぞれ独立して置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表し、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、並びに、低級アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選択される１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、その際、Ｍｊのうち数個若しくは全てのＭが全体的若しくは部分的に環構造を形成し、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ´は、置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
ｊは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｎは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表す。］
【０１８７】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）に記載され、例えば一般式（III）で表される化合物でもよい。
【０１８８】
【化４】
2004534743.tif 000008
［式中、Ａｒ及びＡｒ´は、それぞれ独立して置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表し、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、並びに、低級アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基から選択される１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、その際、Ｍｊのうち数個若しくは全てのＭが全体的若しくは部分的に環構造を形成し、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ及びＣｙ´は、それぞれ独立して置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｎは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表す。］
【０１８９】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）に記載され、例えば一般式（IX）で表される化合物でもよい。
【０１９０】
上記式中、Ａｒは、置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｚは、存在しない、或いは置換若しくは非置換のアリール環、カルボシクリル環、ヘテロシクリル環又はヘテロアリール環、又はニトロ置換基、シアノ置換基若しくはハロゲン置換基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表すが、但しＺが非環式のときはＺに結合するＹは存在せず、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、及び１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリルアルキル、カルボシクリルアルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ及びＣｙ´は、それぞれ独立して、多環式基を含む置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｋは、０〜３の整数を表す。
【０１９１】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）の公報に記載され、例えば一般式（Ｘ）で表される化合物でもよい。
【０１９２】
上記式中、Ａｒは、置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｚは、存在しない、或いは置換若しくは非置換のアリール環、カルボシクリル環、ヘテロシクリル環又はヘテロアリール環、又はニトロ置換基、シアノ置換基若しくはハロゲン置換基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表すが、但しＺが非環式のときはＺに結合するＹは存在せず、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、及び１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリルアルキル、カルボシクリルアルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ´は、多環式基を含む置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、その際、Ｍｊのうち数個若しくは全てのＭが全体的若しくは部分的に環構造を形成し、
ｊは、それぞれ独立して２〜１０の整数を表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｋは、０〜３の整数を表す。
【０１９３】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／７４３４４号（Curis）の公報に記載され、例えば一般式（XI）で表される化合物でもよい。
【０１９４】
上記式中、Ａｒは、置換又は非置換のアリール環又はヘテロアリール環を表し、
Ｚは、存在しない、或いは置換若しくは非置換のアリール環、カルボシクリル環、ヘテロシクリル環又はヘテロアリール環、又はニトロ置換基、シアノ置換基若しくはハロゲン置換基を表し、
Ｙは、それぞれ独立して、存在しない、或いは−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−、−Ｓ−又は−Ｓｅ−を表すが、但しＺが非環式のときはＺに結合するＹは存在せず、
Ｘは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）−、及び１〜２の基と任意に置換されていてもよいメチレン基から選択され、
Ｍは、それぞれ独立して、置換又は非置換のメチレン基、或いは２個のＭが共に置換又は非置換のエテン又はエチンを表し、
Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、又は置換若しくは非置換のアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリルアルキル、カルボシクリルアルキル、アルキニル、アルケニル、又はアルキルを表し、或いは２個のＲが共に４〜８員環を構成してもよく、
Ｃｙ及びＣｙ´は、それぞれ独立して多環式基を含む置換又は非置換のアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はシクロアルキルを表し、
ｉは、それぞれ独立して０〜５の整数を表し、また
ｋは、０〜３の整数を表す。
【０１９５】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／１９８００号（Curis）に記載され、例えば一般式（Ｉ）で表される化合物でもよい。
【０１９６】
【化５】
2004534743.tif 000009
［式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、低級アルキル、−（ＣＨ2）n−アリール（置換又は非置換）、又は−（ＣＨ2）n−へテロアリール（置換又は非置換）を表し、
Ｌは、それぞれ独立して、存在しない、又は−（ＣＨ2）ｎ−アルキル、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ2）n−アルケニル−、−（ＣＨ2）n−アルキニル−、−（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nＮＲ2（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nＳ（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）n−アルケニル（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）n−アルキニル（ＣＨ2）p−、−Ｏ（ＣＨ2）n−、−ＮＲ2（ＣＨ2）n−、又は−Ｓ（ＣＨ2）n−を表し、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、−Ｎ（Ｒ8）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＮ＝ＣＨ−、−（Ｒ8）Ｎ−Ｎ（Ｒ8）−、−ＯＮ（Ｒ8）−、複素環、或いはＬとＹ1又はＬとＹ2が直接結合したものから選択され、
Ｙ1及びＹ2は、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ２）−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ2）−、複素環式芳香族基、或いはＸ1とＺ1又はＸ2とＺ2がそれぞれ直接結合したものから選択され、
Ｚ1及びＺ2は、それぞれ独立して、−Ｎ（Ｒ8）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＮ＝ＣＨ−、−Ｒ8Ｎ−ＮＲ8−ＯＮＲ8−、複素環、或いはＹ1とＬ又はＹ2とＬがそれぞれ直接結合したものから選択され、
Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル、−（ＣＨ2）n−アリール（置換又は非置換）、−（ＣＨ2）n−へテロアリール（置換又は非置換）を表し、或いは２個のＲ8が共に、Ｒ8自身が結合している原子と共に４〜８員環を形成（この環には１若しくは２以上のカルボニルが含まれていてもよい）し、
ｐは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表し、また
ｎは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表す。］
【０１９７】
或いは又はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子は、例えばＷＯ０１／１９８００号（Curis）に記載され、例えば一般式（II）で表される化合物でもよい。
【０１９８】
【化６】
2004534743.tif 000010
［式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、低級アルキル、アリール（置換又は非置換）、アラルキル（置換又は非置換）、へテロアリール（置換又は非置換）、又はへテロアラルキル（置換又は非置換）を表し、
Ｌは、それぞれ独立して、存在しない、又は−（ＣＨ2）n−アルキル、−アルケニル−、−アルキニル−、−（ＣＨ2）nアルケニル−、−（ＣＨ2）nアルキニル−、−（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nＮＲ2（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nＳ（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nアルケニル（ＣＨ2）p−、−（ＣＨ2）nアルキニル（ＣＨ2）p−、−Ｏ（ＣＨ2）n−、−ＮＲ2（ＣＨ2）n−、又はＳ（ＣＨ2）n−を表し、
Ｘは、−Ｎ（Ｒ8）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＮ＝ＣＨ−、−（Ｒ8）−Ｎ−Ｎ−（Ｒ8）−、−ＯＮ−（Ｒ8）−、複素環、又はＬとＹとの直接結合から選択され、
Ｙは、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ2）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＣＮ）−、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ2）−、複素環式芳香族基、又はＸとＺとの直接結合から選択され、
Ｚは、−Ｎ（Ｒ8）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＯＮ＝ＣＨ−、−Ｒ8−Ｎ−Ｎ−Ｒ8−、−ＯＮＲ8−、複素環、又はＹとＬとの直接結合から選択され、
Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子、低級アルキル、アリール（置換又は非置換）、アラルキル（置換又は非置換）、へテロアリール（置換又は非置換）、又はへテロアラルキル（置換又は非置換）を表し、或いは２個のＲ8が共に、Ｒ8自身が結合している原子と共に４〜８員環を形成し（この環には１若しくは２以上のカルボニルを含んでいてもよい）、
Ｗは、ピリミドン環に融合させた置換又は非置換のアリール環又はへテロアリール環を表し、ｐは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表し、また
ｎは、それぞれ独立して０〜１０の整数を表す。］
【０１９９】
ここに用いる「脂肪族基」なる用語は、直鎖状、分枝鎖状、又は環状の脂肪族炭化水素基のことであり、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基等の飽和及び不飽和脂肪族基を含む。
【０２００】
ここに用いる「アルケニル」及び「アルキニル」なる用語は、上述のアルキルと長さが似ており、アルキルを置換する可能性を有する不飽和脂肪族基を意味するが、それぞれ二重又は三重結合を少なくとも１つ有するものとする。
【０２０１】
ここに用いる「アルコキシル」又は「アルコキシ」なる用語は、上記に定義したように酸素ラジカルが結合したアルキル基を意味する。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。「エーテル」は、酸素によって共有結合している２個の炭化水素である。従って、アルキルにエーテルを付与するところの該アルキルの置換基はアルコキシルであり、或いは−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ8（ｍ及びＲ8は本明細書に記載のとおり）のいずれかに代表されるアルコキシル類似の基である。
【０２０２】
「アルキル」なる用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキルで置換されたシクロアルキル基、及びシクロアルキルで置換されたアルキル基を含む飽和脂肪族基のラジカルを意味する。好適実施態様においては、直鎖状又は分枝鎖状アルキルは、そのバックボーンに３０個以下（例；直鎖でＣ1〜Ｃ30、分枝鎖でＣ3〜Ｃ30）、より好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好適なシクロアルキルは、その環構造に３〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくはその環構造に５、６又は７個の炭素を有する。
【０２０３】
さらに、本明細書、実施例及び請求項をとおして使用される「アルキル」（又は「低級アルキル」）なる用語は、「非置換のアルキル」と「置換アルキル」の両方を含むものとし、後者は、炭化水素バックボーンにおける１若しくは２以上の炭素上の水素原子に代わる置換基を有するアルキル成分に言及するものである。かかる置換基の例としては、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、アシル等）、チオカルボニル（チオエステル、チオ酢酸、チオギ酸等）、アルコキシル、ホスホリル、リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、硫酸、スルホン酸、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、芳香族若しくは複素環式芳香族成分などが挙げられる。当業者であれば、炭化水素鎖上における置換成分は、必要に応じてそれ自体が置換される。例えば、置換アルキルの置換基には、置換若しくは非置換のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホン酸及びホスフィン酸を含む）、スルホニル（硫酸、スルホンアミド、スルファモイル、スルホン酸を含む）並びにシリル基、またエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステルを含む）、−ＣＦ3、−ＣＮなどが含まれる。置換アルキルについては後述する。シクロアルキルはさらに、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ3、−ＣＮ等によって置換できる。
【０２０４】
ここに用いる「低級アルキル」は上記定義によるアルキル基を意味するが、別途炭素原子数を特定しない限り、その炭素原子数は１〜１０であり、より好ましくはそのバックボーン構造に１〜６の炭素原子を有するものとする。同様に「低級アルケニル」と「低級アルキニル」は、鎖の長さが似ている。本出願全体をとおして好ましいアルキル基は低級アルキルである。好適実施態様においてアルキルと指定する置換基は、低級アルキルのことである。
【０２０５】
「アルキルチオ」なる用語は、上記定義によるアルキル基に硫黄ラジカルが結合したものを指す。好適実施態様において「アルキルチオ」成分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、及び−Ｓ−（ＣＨ2）m−Ｒ8のいずれか１つで表され、ｍとＲ8は本明細書に定義するとおりである。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオなどが含まれる。
【０２０６】
ここに用いる「アラルキル」なる用語は、アリール基（例；芳香族基、又は複素環式芳香族基）で置換されたアルキル基のことである。
【０２０７】
ここに用いる「アリール」なる用語には、０〜４の複素原子を有していてもよい５、６及び７員単環芳香族基が含まれ、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジンなどが列挙される。環構造に複素原子を有するアリール基は、「ヘテロアリール」基、「アリール複素環」又は「複素環式芳香族」とも呼ばれる。芳香族環は、環上の１若しくは２以上の位置において上記置換基で置換することができる。かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又は複素環式芳香族成分、−ＣＦ3、−ＣＮ等が挙げられる。「アリール」なる用語には、２個若しくは３個以上の炭素が２つの隣接する環（これらの環は「融合環」である）によって共有されている環式を２若しくは３以上有する多環式系も含まれるものとし、ここで２つの隣接する環の少なくとも一方が芳香族環であり、もう一方の環は、例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／又はヘテロシクリルが可能である。
【０２０８】
ここに用いる「炭素環」なる用語は、環における各原子が炭素である芳香族環又は非芳香族環のことである。
【０２０９】
ここに用いる「複素原子」なる用語は、炭素又は水素以外の元素の原子を意味する。複素原子として好ましいのは、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びセレンである。
【０２１０】
「ヘテロシクリル」又は「複素環基」なる用語は、３〜１０員環構造、より好ましくは３〜７員環のことであり、その環構造には１〜４個の複素原子が含まれる。複素環は多環であることも可能である。ヘテロシクリル基には、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンやピロリジノン等のラクタム、スルタム、スルトンなどが含まれる。複素環は、１若しくは２以上の位置において上記置換基で置換することも可能である。上記置換基とは、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又は複素環式芳香族成分、−ＣＦ3、−ＣＮなどである。
【０２１１】
ここに用いる「ハロゲン」なる用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉを指す。
【０２１２】
「ポリシクリル」又は「多環基」なる用語は、２個若しくは３個以上の炭素が２つの隣接する環（これらの環は「融合環」である）によって共有されている２若しくは３以上の環（例；シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／又はヘテロシクリル）のことである。隣り合わない原子を介して結合する環は、「架橋」環と呼ばれる。多環式中の各環は、上記置換基で置換することができる。上記置換基とは例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又は複素環式芳香族成分、−ＣＦ3、−ＣＮなどである。
【０２１３】
ここに用いる「置換する」なる用語は、有機化合物において許容される置換基を全て含むこととする。広義には、有機化合物における非環式及び環式、分枝状及び非分枝状、炭素環式及び複素環式、並びに芳香族及び非芳香族である置換基が、許容される置換基に含まれる。具体的な置換基としては、例えば上記に記載したものが含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物に対して１若しくは２以上であってよく、また同じ若しくは異なっていてもよい。本発明の目的に鑑みて窒素等の複素原子は、水素置換基及び／又は複素原子の価数を満たしつつ本明細書に収載されている有機化合物許容置換基のいずれを有していてもよい。本発明は、有機化合物において許容される置換基によって何ら制限されるものではない。
【０２１４】
「置換」又は「〜で置換する」とは、かかる置換が、置換原子及び置換基の許容価数に基づいて行われるということ、また置換により安定な化合物、例えば再構成、環化、除去等により自然に転換されることのない化合物が得られるということを暗黙の了解とする。
【０２１５】
リード化合物の発見／ハイスループット（高処理能力）スクリーニングアッセイ
ヘッジホッグシグナル伝達の調節因子の活性を試験又は確認するのに好適なハイスループットスクリーニングについてＷＯ０１１９８００号（Curis）に以下のように記載されている。
【０２１６】
試験する化合物を１０ｍM濃度となるようにＤＭＳＯに溶解し、−２０℃で保存する。アッセイを行う細胞におけるヘッジホッグ経路を活性化するために、ソニックヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片をオクチル化（脂質で修飾）した形態（ＯＣＴ−ＳＨＨ）で使用する。このＮ末端ＳＨＨ断片は細菌を用いて作製する。
【０２１７】
化合物は、以下に述べる「Ｇｌｉ−Ｌｕｃ」アッセイにより、細胞株１０Ｔ（ｓ１２）を用いて試験してよい。この細胞は、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として利用するヘッジホッグ反応性レポーター構築物を含んでいる。このようにして、ヘッジホッグ経路におけるシグナル伝達活性の亢進又は低下をＧｌｉ−Ｌｕｃ反応から測定することができる。
【０２１８】
完全培地（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ）中、９６ウエルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に、１ウエルあたり２００００個の割合で１０ｔ１／２（ｓ１２）細胞を播く。次にプレートをインキュベーターに設置し、５％ＣＯ2下にて３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）インキュベーションする。２４時間後に培地をルシフェラーゼアッセイ用培地（０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ）と交換する。化合物を解凍し、アッセイ培地で３：１０００（約３００倍）に希釈して開始濃度を３０ＩｌＭとする。その後、３０ｉＭの試料から各々１５０１を最初のウエルに加える（３ウエルずつ）。次に、これらＭＴＰ試料を７ウエル分の３倍希釈液へと希釈し、最終的に７個の希釈物を３組有するグループを各化合物について得る。次いで、タンパク質リガンドＯＣＴ−ＳＨＨをルシフェラーゼアッセイ培地で希釈し、最終濃度が０．３ｐｇ／ｍｌとなるように各ウエルに添加する。次にプレートをインキュベーターに戻し、５％ＣＯ2下にて３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）さらにインキュベーションする。約２４時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引・廃棄する。ウエルをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍＭ Ｍｇ２+及び１ｍＭ Ｃａ２+）で１回洗浄する。次に各ウエルにアッセイ緩衝液５０ｌを加える。vendor（LucLite kit、Packard社製）の説明に従ってルシフェラーゼアッセイ試薬を調製し、各ウエルに５０ｕｌを加える。室温（ＲＴ）で約３０分間プレートをインキュベーションし、その後再び室温で、Topcount（Packard社製）を用いてシグナルを読み取り、ヘッジホッグシグナル伝達を測定する。
【０２１９】
所定の化合物の有無に基づくシグナル伝達レベルを比較することにより、シグナル伝達活性を亢進又は低下させる上記化合物の活性を容易に評価できる。
【０２２０】
トランスジェニック動物
本発明はまた、本発明に有用な調節因子の少なくとも１つを発現若しくは過剰発現させる能力をもつトランスジェニック動物にも関する。かかるトランスジェニック動物が、ＨＩＰ、Ｆｒｚｂ−１及び／又はＷＩＦ−１を発現又は過剰発現させることが好ましい。
【０２２１】
本発明はさらに、ヘッジホッグシグナル伝達経路の構成因子であるポリペプチド、又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路（Ｗｎｔシグナル伝達経路等）の構成因子であるポリペプチドの少なくとも１つを発現若しくは過剰発現させる能力をもつトランスジェニック動物に関する。かかるトランスジェニック動物が、ＨＨ（ヘッジホッグ；より好ましくはＳｈｈ）、及び／又はＤｖｌ−１を発現若しくは過剰発現させることが好ましい。
【０２２２】
トランスジェニック動物は通常脊椎動物であり、ラット若しくはマウス等の齧歯動物であることがより好ましいが、ヒト、ヤギ、ブタ又はウシなどその他の動物も含まれる。
【０２２３】
このようなトランスジェニック動物は、疾患に対する動物モデルとして、また新規有用化合物に対するスクリーニングアッセイにおいて有用である。１若しくは２以上の上記ポリペプチドを特異的に発現させることにより、かかるポリペプチドが疾患発生に及ぼす効果を研究することが可能となる。さらに遺伝子療法を含む療法及び種々の薬剤を、トランスジェニック動物を用いて試験することが可能になる。トランスジェニック動物の作製法は当技術分野において広く知られている。例えば、遺伝子を胚に導入する経路としては複数が可能である。かかる経路には、（ｉ）胚幹細胞に直接トランスフェクトし、或いは胚幹細胞をレトロウイルスに感染させ、その後これらの細胞を発生の胚盤胞段階にある胚に導入する、（ii）初期胚をレトロウイルスに感染させる、及び（iii）接合体又は初期胚細胞にＤＮＡを直接マイクロインジェクションする、ことが含まれる。
【０２２４】
本発明にはまた、試験又は治療用の疾患モデルとして使用する安定な細胞株が含まれる。
【０２２５】
安定な細胞株は、ヘッジホッグシグナル伝達経路又はヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路における１若しくは２以上の阻害因子又は構成因子をコードする組換え遺伝子又は組換え遺伝子類を有する。かかる組換え遺伝子のことを本明細書ではトランスジーンとも呼ぶ。
【０２２６】
トランスジーンが、ＨＨ（より好ましくはＳｈｈ）、ＨＩＰ、ＷＩＦ−１、Ｆｒｚｂ−１、Ｎｇｇ及び／又はＤｖｌ−１であることが好ましい。本明細書記載のトランスジーンを有する細胞株は、外来遺伝子の細胞への導入法として当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかを用い、選択した細胞株にトランスジーンを導入して作製する。
【０２２７】
やはり後述するように、本明細書記載のシグナル伝達経路の調節因子及び構成因子をコードする配列を、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列にオペラブルに結合させる。
【０２２８】
プロモーターとしては、原核細胞のプロモーターや他の真核細胞において機能するプロモーターを用いてもよいが、哺乳類細胞において機能するプロモーターから選択することが一般的である。プロモーターは通常、ウイルス遺伝子又は真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、発現を起こさせる細胞のゲノムに由来するプロモーターでもよい。真核細胞のプロモーターに関しては、ユビキタスに機能するプロモーター（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターなど）でもよく、或いは、組織特異的に機能するプロモーター（ピルベートキナーゼ遺伝子のプロモーターなど）でもよい。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、眼内上皮細胞のそれぞれに特異的な組織特異的プロモーターが特に好ましく、これら組織それぞれに対して、ＣＤ２プロモーター、ＣＤ１１ｃプロモーター、ケラチン１４プロモーター、Ｗｎｔ−１プロモーター、ロドプシンプロモーターが例示される。上皮細胞プロモーターのＳＰＣが好ましく用いられる。真核細胞のプロモーターとしてはまた、例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターなど、特異的な刺激に反応するプロモーターでもよい。ウイルス性プロモーターもまた用いられ、マウス白血病ウイルスにおける末端での長い反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ；Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat）を有するプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、又はヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターが例示される。
【０２２９】
また、プロモーターが誘発性であることが、細胞生存期間にわたり異種遺伝子の発現レベルが調節できる点で有利である。誘発性とは、そのプロモーターを用いて得られた発現レベルが調節可能であることを意味する。
【０２３０】
さらに、これらのプロモーターはいずれも、例えばエンハンサー配列等の調節配列をさらに付加することにより修飾してもよい。２若しくは３以上の異なる上記プロモーターから得られる配列エレメントを有するキメラプロモーターを用いてもよい。
【０２３１】
アッセイ
１若しくは２以上の標的遺伝子の発現を観察するアッセイ、及びヘッジホッグシグナル伝達における調節を検出する他の方法について以下に述べる。
【０２３２】
本発明は、化合物のヘッジホッグシグナル伝達調節能を調べるスクリーニングに用いるセルベースアッセイ（cell-based assay）を提供することを好ましくする。一実施態様において本発明は、以下の工程からなるアッセイを提供する。
（ａ）免疫細胞培養物を提供し；
（ｂ）上記細胞に任意にレポーター構築物をトランスフェクトし；
（ｃ）上記細胞に任意にヘッジホッグ遺伝子をトランスフェクトし；
（ｄ）上記細胞を１若しくは２以上の試験化合物に露出し；及び
（ｅ）試験化合物に露出した細胞と、未露出の細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達の違いを測定する。
【０２３３】
本発明のアッセイは、免疫系細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達に対する候補調節因子による阻害又は増強のいずれかを検出するように設定されている。その方法は、必要に応じて合成レポーター遺伝子で形質転換やトランスフェクションなどを行った免疫系細胞を、適切な緩衝液中で十分量の候補調節因子と混合し、ヘッジホッグシグナル伝達を観察するというものである。調節因子としては、小分子、タンパク質、抗体、又は上述したように他のリガンドでもよい。標準的なアッセイ技術及び適切な対照を用いることにより、標的遺伝子（これについても上述した）の活性量を各試験化合物について測定する。検出したシグナルを基準シグナルと比較し、基準シグナルからみて何らかの調節が生じていればそれを測定することが好ましい。
【０２３４】
本アッセイは、ヘッジホッグシグナルを救済する能力をもつ化合物を同定するため、ヘッジホッグシグナル伝達経路における既知の拮抗因子の存在下において実施してもよい。
【０２３５】
種々多様な薬剤スクリーニング法のいずれかを用いて、免疫系細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の調節能を有する化合物を同定する際に、好適標的（アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）の１若しくは２以上を使用してよい。そのような試験に供する標的は、溶液中で遊離の状態、固体支持体に固定させた状態、細胞表面に担持されている状態、又は細胞内に局在する状態のいずれであってもよい。本発明のアッセイは、セルベースアッセイである。
【０２３６】
本発明のアッセイは、多数の作用因子を試験するスクリーニング法である。特徴の１つとして、本発明のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングである。
【０２３７】
薬剤のスクリーニング法は、Geysen（欧州特許第０１３８８５５号、１９８４年９月１３日発行）に記載の方法に基づいたものでもよい。概略を述べると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子を、プラスチックピン又は他の物の表面などの固体基質上で合成する。これらのペプチド試験化合物を好適な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、当技術分野で公知の方法を適切に実施するなどして、結合した物質を検出する。精製した標的もまた、プレートに直接コーティングして薬剤スクリーニング法に用いることができる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ；高処理能力スクリーニング）に用いるプレートは、マルチウエルプレートであり、１プレートあたり９６個、３８４個、若しくは３８４個を超えるウエルがあることが好ましい。細胞は「芝生」として播種できる。或いは、非中和抗体を使用してペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定することができる。合成化合物のスクリーニングに用いる上述のハイスループットスクリーニングはまた、有機候補調節因子の同定にも用いることができる。
【０２３８】
本発明はまた、標的への結合能を有する中和抗体が標的に特異的に結合する際に、かかる結合に関して試験化合物と競合するという競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図するものである。
【０２３９】
本発明によるアッセイ方法は定量アッセイにおけると同様に、試験化合物の小規模及び大規模いずれのスクリーニングにも適していると期待される。
【０２４０】
種々の核酸アッセイもまた知られている。公知の、又は後に開示されている従来法であればどれを採用してもよい。好適な核酸アッセイとしては以下に説明する増幅法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション法、ブロット法、分光分析、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ法、またこれら以外のハイブリダイゼーション法などが列挙される。
【０２４１】
標的遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来式サザンブロッティング、標的ｍＲＮＡの転写量を測定するノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイチューハイブリダイゼーションにより試料から直接測定される。当技術分野の専門家であれば、所望する場合、これらの方法に如何なる変更を加えればよいかを容易に構想できる。
【０２４２】
分析を行うために試料から核酸を作製するには、通常核酸増幅を行うことが必要となる。多くの増幅法が、酵素鎖反応（ポリメラーゼ鎖反応、リガーゼ鎖反応、又は自己維持的配列複製）、又はベクター自身がクローニングされたベクターの全体又は部分の複製に依存している。本発明における増幅法は、ポリメラーゼ鎖反応に例示される指数関数的増幅であることが好ましい。
【０２４３】
多くの標的及びシグナル増幅法が文献に記載されており、例えば、Landegren, U., et al., Science 242: 229-237 (1988) 及びLewis, R., Genetic Engineering News 10: 1, 54-55 (1990) に、それらの方法についての概説が見い出せる。これらの増幅法を本発明の方法に用いてもよく、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、インサイチューでのＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ；ligase amplification reaction）、リガーゼハイブリダイゼーション、Qbetaバクテリオファージレプリカーゼ法、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；transcription-based amplification system）、転写産物配列決定によるゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ；genomic amplification with transcript sequencing）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence-based amplification）、インサイチューでのハイブリダイゼーションが含まれる。種々の増幅法に用いるのに適したプライマーは、当技術分野で公知の方法により調製できる。
【０２４４】
ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼが創出するプライマー伸張反応の反復サイクルからなり、特に米国特許第４６８３１９５号及び同４６８３２０２号で説明されている核酸増幅法である。ＰＣＲは元々、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技術は反応液を繰り返し熱したり冷却したりの温度サイクルを基礎とし、それによりプライマーを標的配列にアニーリングさせ、これらプライマーを伸張することにより、娘鎖の複製を形成するものである。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製する際にＲＮＡ鋳型を使用する。次にこのｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコールに則って増幅する。合成と変性のサイクルを反復して行うことにより、作製する標的ＤＮＡの複製数が指数関数的に増加する。しかし反応成分が限られてくるに従って増幅速度が低下し、やがて停滞期に達し、ＰＣＲ産物における純増加は殆ど或いは全く認められなくなる。反応開始時点における核酸標的の複製数が多いほど、かかる「終点」に早く到達する。ＰＣＲは、診断分野において、あらゆる既知の核酸の増幅に用いることができる（Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252）。
【０２４５】
自己維持的配列複製（３ＳＲ）はＴＡＳの変化型であり、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーに促進されて逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼの各活性が連続的に繰り返し展開する核酸鋳型の等温下での増幅が含まれる（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874）。ＲＮＡ／ＤＮＡの異種２本鎖におけるＲＮＡの酵素分解を熱変性の代わりに利用する。RNnase H及び他の全酵素を反応に加え、全工程が単一温度の下で行われ、さらに試薬を加えることもしない。この方法に従えば、４２℃１時間で１０6〜１０9の増幅が行われる。
【０２４６】
ライゲーション（連結）増幅反応又はライゲーション増幅系では、ＤＮＡリガーゼ及びオリゴヌクレオチド４個（標的鎖について２個ずつ）を用いる。この技術に関しては、Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4: 560 に記載がある。上記４個のオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ上の隣接配列とハイブリダイズしリガーゼによって結合する。この反応は、熱変性及びサイクル反復によって行われる。
【０２４７】
本発明では、他の増幅技術も利用する。例えば、ローリングサークル増幅法（Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19: 225）は市販の増幅技術（ＲＣＡＴTM）であり、ＤＮＡポリメラーゼによって実行され、線状又は幾何学状キネティックスのいずれかを有する環状オリゴヌクレオチドプローブを等温条件下で複製できる。
【０２４８】
好適に設計されたプライマー２本の存在下においてＤＮＡ鎖置換及び大量分枝化（hyperbranching）によって幾何学的増幅が生じ、１時間で各環の複製を１０12以上作製する。
【０２４９】
１本のプライマーを使用する場合、ＲＣＡＴでは、標的に共有結合して何千個もがタンデムに結合する、該標的のＤＮＡ複製の線状鎖が数分間のうちに作製される。
【０２５０】
さらに、鎖置換増幅法（ＳＤＡ；strand displacement amplification、Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80: 392）という技術は、特定標的に独特な、特異的に定義された配列から開始する。しかし温度サイクルに依拠する他の方法と異なり、ＳＤＡは、一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を使用することにより、上述の独特な核酸配列を指数関数的に増幅させる等温法である。
【０２５１】
ＳＤＡは、標的作製期と指数関数的増幅期の両方を有する。
【０２５２】
標的作製においては、２本鎖ＤＮＡを熱変性させて１本鎖の複製を２本得る。特別に作出した一連のプライマー（塩基配列を複製する増幅プライマー及び新たに作成した鎖を置換するバンパープライマー）がＤＮＡポリメラーゼと結び付くことにより、指数関数的増幅が可能な改変型標的が形成される。
【０２５３】
指数関数的増幅の過程は、標的作製期から改変型標的（制限酵素認識部位を有する１本鎖部分ＤＮＡ鎖）により開始する。
【０２５４】
増幅プライマーは、その相補ＤＮＡ配列において各鎖に結合する。次にＤＮＡポリメラーゼは、改変型標的を個々のヌクレオチドを付加するための鋳型として使用し、プライマーをその３´側から伸張させる位置を決める。従って伸張したプライマーは、両末端に完全な制限酵素認識部位を有する２本鎖ＤＮＡセグメントを形成する。
【０２５５】
次に、制限酵素を上記２本鎖ＤＮＡセグメントに、その制限酵素認識部位で結合させる。制限酵素は、上記２重鎖（double-sided）セグメントの一方の鎖だけを開裂してニックを形成した後に上記認識部位から解離する。ＤＮＡポリメラーゼはニックを認識してその部位から鎖を伸張し、既に作製済の鎖を置換する。認識部位はこのように繰り返しニックされ、制限酵素とＤＮＡポリメラーゼとにより標的セグメントを有するＤＮＡ鎖を繰り返し置換しながら修復される。
【０２５６】
次に、置換された各鎖は、上述のように増幅プライマーとのアニーリングに供される。このプロセスは新しいＤＮＡ鎖においてニック形成、伸張及び置換を繰り返しながら連続し、その結果、元のＤＮＡ標的が指数関数的に増幅される。
【０２５７】
別の実施態様で本発明は、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の検出法を提供する。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する一般的なアッセイフォーマットには、核ラン−オン（run-on）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12: 7035）が含まれる。採用可能な検出法には、放射活性標識、酵素標識、化学発光（ケミルミネセンス）標識、蛍光標識、また他の適切な標識法が含まれる。
【０２５８】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光染色で標識したプローブを使用し、サイクルを規定回数行った後の産物蓄積量の測定というよりむしろ蓄積していくＰＣＲ産物の検出に用いられるという点で、定量アッセイに用いる終点ＰＣＲとは異なる。蛍光が有意な増加を示すことに基づいて標的配列の増幅が最初に検出されたのが、サイクル中のどの時点であるかによって反応が特徴付けられる。
【０２５９】
リボ核酸プロテクション（ＲＮａｓｅプロテクション）アッセイは、溶液中の特異的ＲＮＡの定量法として非常に高感度な方法である。リボ核酸プロテクションアッセイは、標的としての全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択性ｍＲＮＡで行うことができる。リボ核酸プロテクションアッセイの感度は、高度に特異的な活性に対して放射標識された相補的インビトロ転写プローブを使用することに基づいている。かかるプローブと標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズさせた後、この混合物をリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で希釈し、処理し、残存する１本鎖ＲＮＡを全て分解する。プローブのハイブリダイズした部分は分解から保護され、上記混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル上における電気泳動後さらにオートラジオグラフィーにかけることにより、ハイブリダイズした部分を視覚化できる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボ核酸プロテクションアッセイはｍＲＮＡの特性を正確にマッピングするために採用できる。標的ＲＮＡに対して過剰なモル下でプローブがハイブリダイズされる場合、得られるシグナルは試料中の相補ＲＮＡ量と正比例する。
【０２６０】
例えば、Sambrook et al., 1989 の第１４章に記載されているように、ＰＣＲ技術では、標的核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用することが必要とされる。オリゴヌクレオチドを選択するストラテジーについて以下に記載する。
【０２６１】
本明細書においてプローブは、例えば、１０〜５０個、好ましくは１５〜３０個、最も好ましくは少なくとも２０個ほどで、均等物と同一の（又は相補の）連続塩基又はそれより多くの連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。プローブとして選択される核酸配列は、擬陽性の結果が出ることを最小限にするために十分な長さを有し、十分に明瞭でなければならない。ヌクレオチド配列は通常、保存された又は高度な相同性を有するヌクレオチド配列又はポリペプチド領域に基づいている。プローブとして用いる核酸は、１若しくは２以上の位置において変性していてもよい。
【０２６２】
プローブを構築する領域として好ましいものには、５´及び／又は３´コード配列、リガンド結合部位をコードすることが予測される配列などが含まれる。例えば、本発明で開示している完全長ｃＤＮＡクローンやその断片のいずれもプローブとして使用できる。本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション後に容易に検出できるように適切な標識手段により標識されていることが好ましい。例えば適切な標識手段としては放射標識がある。ＤＮＡ断片を標識する好適な方法は、当技術分野では十分公知のように、ランダムプライム反応においてＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片とともに32Ｐ ｄＡＴＰを取り込むことによる方法である。通常オリゴヌクレオチドは、32Ｐ標識ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識されている。しかし、断片又はオリゴヌクレオチドの標識には他の方法（例；非放射標識）も用いられ、酵素標識、適切な蛍光体による蛍光標識、ビオチン化がそれに含まれる。好ましいのは、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列やプローブである。
【０２６３】
遺伝子発現はレポーター系を使用して検出してもよい。かかるレポーター系には、発現系（例えば観察を行っている遺伝子の発現系）の制御下にあって容易に同定できるマーカーが含まれる。ＦＡＣＳによる検出及びソーティングが可能な蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰとルシフェラーゼである。好ましいレポーターとしては他にも細胞表面マーカー、すなわち細胞表面で発現するので容易に同定できるタンパク質がある。従ってセルベーススクリーニングアッセイは、レポータータンパク質（すなわちβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はルシフェラーゼなどの容易にアッセイ可能なタンパク質）の発現がヘッジホッグ活性に依存する細胞株を構築することにより設計できる。例えば、上記各種ポリペプチドのいずれか１つをコードするレポーター遺伝子を、ヘッジホッグシグナル伝達により特異的に活性化される応答エレメントの制御下に置いてもよい。これ以外のアッセイフォーマットには、生物系における反応を直接評価するアッセイが含まれる。セルベースアッセイを採用する場合は、同定した試験化合物（１若しくは２以上）をさらにインビボで試験して、ヘッジホッグシグナル伝達経路に及ぼすその効果を測定する。
【０２６４】
一般的に、レポーター遺伝子を発現させてヘッジホッグシグナル伝達を測定する上で有用なレポーター構築物は、Sambrook et al (1989) の一般的教示に従って構築してよい。本発明における構築物は通常、目的とする遺伝子の（すなわち内因性標的遺伝子の）プロモーター、並びにＧＦＰやルシフェラーゼなどの所望のレポーター構築物をコードするコーディング配列を有している。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードするベクターは当技術分野では公知であり市販もされている。レポーター遺伝子については以下に詳述する。
【０２６５】
標的遺伝子の発現を検出することによる細胞ソーティングは、当技術分野で公知の上記いずれの手法で実施してもよい。例えば細胞をフローサイトメトリーすなわちＦＡＣＳでソーティングしてもよい。全般的な内容に関しては、Flow Cytometry and Cell Sorting: A Laboratory Manual (1992) A. Radbruch (Ed.), Springer Laboratory, New York を参照のこと。
【０２６６】
フローサイトメトリーは、細胞の研究及び精製において強力な手法である。フローサイトメトリーは広範に、特に免疫学や細胞生物学の分野において利用されているが、ＦＡＣＳの能力は、生物学の他の多くの分野において利用できる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．は、Fluorescence Activated Cell Sorting を表し、「フローサイトメトリー」と互換性のある用語である。ＦＡＣＳの原理は、液体の細い流れに保持された個別の細胞を１若しくは２以上のレーザービームに通すことにより光を散乱させ、種々の頻度で蛍光染色を発光させるというものである。光電子増倍管（ＰＭＴ）は光を電子シグナルに転換し、この電子シグナルをソフトウエアで解析して細胞のデータを作成する。定義付けされた特徴を有する細胞サブ集団が同定され、極めて高純度（〜１００％）にて懸濁液から自動的にソーティングされる。
【０２６７】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現を測定するのに用いられる。これは、かかるタンパク質産物を標識することにより直接、或いは構築物中のレポーター遺伝子を使用して間接的に行うことができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が例示される。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシダーゼ（ＦＤＧ）等の蛍光基質を用いるＦＡＣＳによる検出が可能である。ＦＤＧは、低張性ショックを与えることによって細胞内に導入され、酵素によって開裂して蛍光産物を作り出す。この蛍光産物は細胞内に留め置かれる。従って１種の酵素で大量の蛍光産物を産出できるのである。ＧＦＰ構築物を発現する細胞は、基質を加えることなく蛍光発色する。励起頻度が異なっても同一チャネルで蛍光発色するＧＦＰ変異体は利用可能である。Two-laserＦＡＣＳ機器では、異なるレーザー光線によって励起される細胞の識別が可能であり、よってトランスフェクション２種類のアッセイを同時に行うことができる。
【０２６８】
別のセルソーティング法を利用してもよい。例えば、本発明には、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用も含まれる。かかるプローブは、別々にポリペプチドを発現する細胞を同定することに用いられ、それらの細胞はその後マニュアルソーティング法又はＦＡＣＳソーティング法によりソーティングされる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Sambrook et al (1989) の一般的なプロトコールを用いる上述の教示に従って調製する。
【０２６９】
好適実施態様において本発明には、ＦＡＣＳセルソーティング法で用いる蛍光体に結合させ、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用も含まれる。
【０２７０】
所謂遺伝子チップアレイや高密度ＤＮＡアレイを使用して、遺伝子の発現や同一性に関する情報を得る各種方法についての記載もある（Chee）。これらの高密度アレイは、診断及び予防の目的で特に有用である。In Vivo Expression Technology（ＩＶＥＴ）（Camilli）も使用してもよい。ＩＶＥＴでは、例えば治療や疾患の過程において実験培養の場合と比較してアップレギュレートされた標的遺伝子を同定する。
【０２７１】
本発明はまた、ポリペプチドの検出法を提供するものである。プロテインアッセイ（タンパク質測定法）を使用することの利点は、ヘッジホッグの活性を直接測定できることである。ポリペプチドレベルを測定するために利用可能なアッセイ技術は、当技術分野の専門家には十分公知である。そのようなアッセイ法には、放射免疫測定法、競合結合測定法、タンパク質ゲル測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出法、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡが含まれる。例えばポリペプチドは、タンパク質ゲル上における微分型電気移動度から、或いは質量分光法等の他のサイズ分析法により検出できる。検出法は配列特異的であってよい。例えば、ポリペプチドを特異的に認識するポリペプチド又はＲＮＡ分子をインビボ又はインビトロで展開させることができる。
【０２７２】
例えばＳＥＬＥＸによりＲＮＡアプタマーを作製できる。ＳＥＬＥＸは、標的分子への高度に特異的な結合性を有する核酸分子をインビトロで進化させる方法である。この方法については例えば、米国特許第５６５４１５１号、同５５０３９７８号、同５５６７５８８号、同５２７０１６３号、またＰＣＴ公報ＷＯ９６／３８５７９号に記載されている。
【０２７３】
本発明はいくつかの実施態様において、ポリペプチドを特異的に認識して結合する抗体を含むものである。
【０２７４】
抗体は免疫した動物の血清から回収できる。モノクローナル抗体は従来法に従い、免疫化動物の細胞から調製したものでよい。
【０２７５】
本発明の抗体は、観察対象の遺伝子を発現させる細胞を同定するのに有用である。
【０２７６】
本発明による抗体は、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体等の天然型に分類される全抗体でよいが、ＩｇＧ抗体が好ましい。さらに本発明には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ等の抗体断片が含まれる。Ｆｖ及びＳｃＦｖ等の小断片は、そのサイズの小ささ故に組織における分布性に優れており、診断及び治療への適用に好都合である。
【０２７７】
抗体は標識を含んでいてもよい。特に好適なのは、インビボの神経細胞における抗体の画像化を可能にする標識である。このような標識としては、組織内で容易に視覚化できる放射活性標識又は金属粒子等の放射オペーク（redioopaque）標識を採用してよい。さらに蛍光標識や、組織内における視覚化が可能でセルソーティングに用いられる他の標識でもよい。
【０２７８】
より詳細に述べると、本発明に用いる抗体は標識等のエフェクタータンパク質を含む改変抗体であってもよい。特に好適なのは、インビボでの抗体分布を画像化できる標識である。かかる標識としては、患者の体内で容易に視覚化できる放射活性標識又は金属粒子等の放射オペーク標識がある。さらに蛍光標識や、組織上での視覚化が可能な他の標識でもよい。
【０２７９】
本明細書記載の抗体は、細胞培養から作製することができる。細菌培養や好ましくは哺乳類細胞の培養による抗体の作製には、確立した手法に基づいた組換えＤＮＡ技術が利用できる。抗体産物は非分泌細胞から単離できるが、選択した細胞培養系は任意に抗体産物を分泌する。
【０２８０】
ハイブリドーマ細胞又は哺乳類宿主細胞のインビトロでの増殖は、好適な培養培地で行う。かかる培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０培地を例とする通常の標準培養培地であり、それらは哺乳類血清（例えばウシ胎児血清）又は微量元素及び増殖維持補助剤（例えば、正常マウス腹膜滲出細胞等の支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を任意に補充されている。細菌細胞や酵母細胞である宿主細胞の増殖も同様に当技術分野で公知の好適培養培地で行われる。細菌の場合は、ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Terrific Broth、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、又はＭ９最小培地等の培地が例示され、酵母の場合は、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、又は完全最小Dropout培地等の培地が例示される。
【０２８１】
インビトロで作製すると、比較的純粋な抗体調製物が得られ、所望の抗体を大量に得るためのスケールアップが可能となる。細菌細胞、酵母又は哺乳類細胞の培養技術は当技術分野では公知であり、均一浮遊培養（例；エアリフトリアクター又は連続攪拌リアクターにおいて）、或いは固定化又は封込み（entrapped）細胞培養（例；中空糸やマイクロカプセル中で、アガロースマイクロビーズやセラミックカートリッジ上で）などがある。
【０２８２】
哺乳類細胞をインビボで増殖させることによっても所望の抗体を大量に得ることができる。そのために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注入して抗体産生腫瘍の増殖を惹起する。この注入に先立ち、任意でこれらの動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）等の鉱物油でプライムしてもよい。１〜３週間後に上記哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、好適骨髄腫細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの抗体産生脾臓細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞、又は所望の抗体を産生するハイブリドーマＳｐ２／０細胞株由来のトランスフェクト細胞を、プリスタンで任意に前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、１〜２週間後にそれらの動物から腹水を回収する。
【０２８３】
前述の、或いは他の方法について、例えばKohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495-497; 米国特許第４３７６１１０号; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor で検討されており、それらを参考のため本明細書に添付する。組換え抗体分子の調製法は上記参考文献に収載されており、また例えば、欧州特許第０６２３６７９号、同０３６８６８４号、同０４３６５９７号にも記載があり、これらも本明細書に添付する。
【０２８４】
細胞培養上清を、好ましくは、例えばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ等の酵素免疫測定法、或いは放射免疫測定法によってスクリーニングし、所望の抗体を得る。
【０２８５】
抗体を単離するには、培養上清中又は腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムと共沈させたり、ポリエチレングリコール等の吸湿性材料に対して透析したり、選択性膜で濾過したりなどして濃縮する。必要に応じて、及び／又は所望する場合には、例えばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、及び／又は標的抗原やプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の（免疫）アフィニティークロマトグラフィーなどの通常のクロマトグラフィー法により抗体を精製する。
【０２８６】
抗体は、抗体の検出法と共に提供されることが好ましく、かかる方法としては酵素法、蛍光法、放射性同位体法や他の手法が可能である。抗体及びその検出法は、同時に、同時かつ別々に、又は連続して用いるようなキットとして提供できる。
【０２８７】
当技術分野で公知のいずれかの手法により、本発明における抗体の免疫特異的結合性のアッセイを行う。採用される免疫測定法には、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降反応法、ゲル分散沈降反応、免疫分散測定法、凝集測定法、補体固定測定法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法等の技術を用いる競合的及び非競合的アッセイ系を含むが、これらに限定はされない。これらのアッセイは当技術分野ではルーティンである（本明細書にその全容を添付したAusubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York を例として参照）。免疫測定法の典型例を簡潔に下述する。
【０２８８】
免疫沈降プロトコールは通常以下の工程で行われる。すなわち、プロテインホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例；ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を加えたＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はTritonＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％トラジロール（Trasylol））等の溶解緩衝液に細胞集団を溶解し、この細胞溶解液に目的抗体を加え、一定時間（例えば１〜４時間）４℃でインキュベーションし、プロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に加え、およそ１時間強４℃でインキュベーションし、これらビーズを溶解緩衝液中で洗浄してＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁することからなる工程である。目的抗体が、特定抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析により評価できる。
【０２８９】
ウエスタンブロット分析は通常以下の工程で行われる。すなわち、タンパク質試料を調製し、ポリアクリルアミドゲル（例；抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において上記タンパク質試料を電気泳動に付し、これらタンパク質試料をポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロン等の膜上に移し、該膜を、ブロッキング溶液（例；３％ＢＳＡ又は無脂肪乳を添加したＰＢＳ）中でブロックし、洗浄緩衝液（例；ＰＢＳ−Tween２０）で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（目的抗体）に露出し、洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例；ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）や放射活性分子（例；32Ｐ又は125Ｉ）で標識した二次抗体（例えば抗ヒト抗体などの一次抗体を認識するもの）に露出し、洗浄緩衝液で洗浄した後に抗原の存在を検出することからなる工程である。
【０２９０】
ＥＬＩＳＡは通常、抗原を調製し、この抗原で９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルをコーティングし、酵素基質（例；ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物で標識した目的抗体をウエルに加え、一定時間インキュベーションし、抗原の存在を検出する工程からなる方法である。ＥＬＩＳＡでは、目的抗体は必ずしも検出可能な化合物と共役していなくてもよく、代わりに二次抗体（目的抗体を認識するもの）を検出可能な化合物と共役させてウエルに加えることができる。さらに抗原でウエルをコーティングする代わりに、抗体をウエルにコーティングしてもよい。この場合、コーティング済みのウエルに目的抗原を加えた後に、検出可能な化合物と共役させた二次抗体を加えることができる。
【０２９１】
アッセイを行う際に１若しくは２以上の反応物質を固定化しておくことが好都合である。本発明の場合は、候補調節因子、ヘッジホッグリガンド、免疫細胞活性化因子、又は免疫細胞共刺激因子（costimulus）のいずれか１若しくは２以上を固定化することが好都合である。固定化する手法には、アミン結合、表面チオール結合、リガンドチオール結合、アルデヒド結合等を用いる共有固定化、或いは固定化した捕捉分子に対するリガンドの高親和結合力に依拠する高親和性捕捉化が含まれる。捕捉分子としては、ストレプトアビジン、抗マウスＩｇ抗体、リガンド特異的抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、タグ特異的捕捉剤が列挙される。一実施態様においては支持体、とりわけビーズ状であることを好ましくする特定の支持体に結合させることにより固定化を図っている。
【０２９２】
臨床適用するための寛容Ｔ細胞の観察又は検出に関係するアッセイでは、細胞内ドメインの開裂により発生するシグナルの検出工程に先立って試料を患者から取り出すことが一般に行われている。
【０２９３】
本発明さらに、ヘッジホッグシグナル伝達の候補調節因子を得るためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、その開裂を観察するために検出手段で好適に標識された適量のヘッジホッグを緩衝液中で候補リガンドの試料と混合し、ヘッジホッグにみられる開裂を観察するものである。
【０２９４】
ここに用いる「試料」なる用語は、天然に見い出された（例；生物標本又は他の標本から）、或いは人工的に構築された（実験室で見い出された及び／又は作製された因子）集団における、無機分子、有機分子又は生化学分子を指す。生物試料は生物全体を意味すると捉えてもよいが、より一般的な概念としては、その生物の組織、細胞又は構成部分（例；血液、粘液、唾液、尿を含むがそれらに限定はされない体液）のサブセットを意味する。
【０２９５】
本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達の新規調節因子の検出方法を提供する。同定した調節因子は治療用薬剤として使用される。すなわち治療に適用される。
【０２９６】
免疫系細胞
本発明で使用する細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路を変換する能力を有する免疫系細胞である。
【０２９７】
本発明に用いるのに最適なのはＴ細胞である。Ｔ細胞には、ＣＤ４+及びＣＤ８+成熟Ｔ細胞、末端及び胸腺由来の幼若Ｔ細胞、並びにＮＫ−Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９８】
或いは、上記免疫系細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）でもよい。ＡＰＣには、指間状（interdigiting）樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等の樹状細胞（ＤＣ）、或いは上皮細胞や線維芽細胞や内皮細胞のようにその表面にＭＨＣクラスII分子を連続的に発現させる又は発現させるための活性を有する他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４+細胞、単球、線維芽細胞、内皮細胞が含まれる。培養条件を利用してＡＰＣ又は前駆体を修飾してもよく、或いは１若しくは２以上の遺伝子をトランスフェクトさせるなどの遺伝子修飾を施してもよい。
【０２９９】
Ｔ細胞及びＡＰＣは患者から単離してもよく、又はドナー個体若しくは別の個体から単離してもよい。ヒト細胞やマウス細胞等の哺乳類細胞が好ましい。ヒト由来の細胞であることが好ましい。ＡＰＣ又はＡＰＣ前駆体は、樹立細胞株又は初代細胞培養物等の培養による細胞増殖から得られる。例としてハイブリドーマ細胞株、Ｌ細胞、及びＭＲＣ−５等のヒト線維芽細胞が挙げられる。本発明で用いるのに好適な細胞株には、Jurkat、Ｈ９、ＣＥＭ、ＥＬ４の各Ｔ細胞、ヒトＨＡ１．７やマウスＤ１０細胞等の長期Ｔ細胞クローン、ＤＯ１１．１０細胞等のＴ細胞ハイブリドーマ、Ｕ９３７やＴＨＰ１細胞等のマクロファージ様細胞、Raji、Ａ２０及びＭ１細胞などのＥＢＶ形質転換細胞等のＢ細胞株が含まれる。
【０３００】
樹状細胞（ＤＣ）は、多様な手法で単離・精製することができ、かかる手法としては、例えばＤＣ細胞を抹消血から直接精製するもの、ＧＭ−ＣＳＦで処理して抹消血に動員した後にＣＤ３４+前駆細胞から作出するもの、或いは骨髄から直接作出するものがある。抹消血から作出する場合は、接着性前駆体をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物（Inaba (1992) J Exp Med 175: 1157-1167）で処理することができ、又は骨髄から作出する場合は、非接着性ＣＤ３４+細胞をＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αで処理することができる（Caux et al (1992) Nature 360: 258-261）。ＤＣはまた、Sallusto and Lanzavecchia J Exp Med (1994) 179(4) 1109-18 の方法にそのまま習い、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて接着性Ｔ細胞をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で２時間処理することにより、ヒトボランティアの末梢血からルーティンで調製できる。必要に応じて、磁気ビーズを用いてＣＤ１９+Ｂ細胞及びＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ２+Ｔ細胞を上記から除去してもよい（Coffin et al (1998) Gene Therapy 5: 718-722）。培養条件としては、維持のためにＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−４等の他のサイトカインが、及び／又は樹状細胞や他の抗原提示細胞の活性が含まれる。
【０３０１】
本発明に用いるＴ細胞及びＢ細胞は、リンパ腫又は白血病細胞株等の細胞株、Ｔ細胞ハイブリドーマやＢ細胞ハイブリドーマから得ることが好ましいが、免疫系疾患の患者若しくは移植手術の被移植者から、又は関係のある若しくは無関係のドナー個体から単離してもよい。Ｔ細胞及びＢ細胞は、血液若しくは他の材料（リンパ節、脾臓又は骨髄など）から得てもよく、標準的な手法により増強若しくは精製してよい。
【０３０２】
或いは、全血液を使用してもよく、白血球を増強した血液若しくはＴ細胞の材料としての精製白血球や、他の細胞型を用いてもよい。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+）を使用することが特に好ましい。或いは、ＣＤ８+Ｔ細胞等の他のＴ細胞を用いてもよい。
【０３０３】
本発明で用いる候補調節因子を上述のとおり免疫系細胞と接触させる。その後の段階で、候補調節因子に誘起されるヘッジホッグシグナル伝達調節を検出する。ヘッジホッグシグナル伝達における調節を検出するアッセイについて以下に説明する。これらアッセイの多くは、「標的遺伝子」の発現を観察することを含む。
【０３０４】
刺激シグナル
本発明で使用する標的遺伝子（内因性又はレポーター遺伝子）の発現又は抑制はヘッジホッグシグナル伝達に依存する。好適実施態様では、標的遺伝子の発現若しくは抑制はさらに、補助シグナル（又は「共刺激」）の存在下又は不在下で、免疫細胞に特異的な第２刺激に依存する。
【０３０５】
実施態様の１つにおいて第２刺激は、免疫細胞受容体の活性化により生じる。免疫細胞受容体には、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、トール様受容体（ＴＬＲ）などがある。ＴＣＲ又はＢＣＲシグナルを誘発する能力を有する分子としては、上記各受容体に対する特異的抗原、ＴＳＳ１、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥ等のスーパー抗原、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2断片、ファージ提示ペプチド及びＳｃＦＶを含むＴＣＲαβ鎖に対する抗体、或いはζ及びε鎖を含むＣＤ３タンパク質に対する抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＢＣＲ抗体、ＬＰＳや他の細菌産物、Ｆｃ受容体、補体受容体、マンノース受容体や他のスカベンジャー受容体等の食作用に関与する細胞受容体、ＣＤ３６及びαｖβ５等のアポトーシスを起こした細胞の浄化に関与する受容体、ＤＥＣ２０５及びＤＣ−light等の樹状細胞受容体、並びにＰＭＡ、イオノマイシン又はキナーゼ阻害剤等のＴＣＲ及び／又はＢＣＲシグナル伝達経路の活性剤が列挙される。これらの分子は単独で又は併用して使用してよく、抗原提示細胞上に提示される。
【０３０６】
本発明の実施態様の１つにおいて、以下の工程からなるヘッジホッグシグナル伝達調節因子の検出法を提供する。
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞を候補調節因子と接触させ、
（ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達を観察し、（工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はどの順番で行ってもよい）、また
（ｄ）上記候補調節因子がヘッジホッグシグナル伝達を調節しているかどうかを測定する。
【０３０７】
上記活性化剤は、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２８抗体であることが好ましい。より詳細に述べるとＴ細胞活性化には、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体に端を発する複数の細胞内シグナル伝達イベントが含まれる。抗ＣＤ３抗体によりＴＣＲ／ＣＤ３複合体が交差結合するとＴ細胞の活性化が誘導され、その結果、ＩＬ−２等のサイトカインが産生される。ＩＬ−２は、その高親和性受容体に結合して細胞増殖を促進する。さらに、ＣＤ２８等の共刺激表面分子は、Ｔ細胞活性化に補助シグナルをもたらし、例えば抗ＣＤ３抗体と結合した場合にＩＬ−２産生を増強する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞表面で発現する抗原であり、Ｔ細胞の活性化にも関与している。
【０３０８】
免疫細胞受容体シグナル伝達における補助又は共刺激シグナルには、Ｂ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２等のＢ７タンパク質、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜９等のトール様受容体（ＴＬＲ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体作動因子、並びにこれらの変異体、誘導体、アナログ及びそれらの断片が含まれる。
【０３０９】
実施態様の１つにおいて第２刺激は共刺激である。別の実施態様では、標的遺伝子の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達、免疫細胞シグナル伝達及び共刺激という３種類の異なる刺激に依存している。これらの刺激については上述した。これらのシグナルは全て同時に、或いは決められた間隔をおいて（数時間ずらして、或いは数日間ずらしてもよい）伝達してもよい。シグナルは実質的に同時に伝達されることが好ましい。
【０３１０】
細胞活性化
免疫細胞の活性化は、当業者に公知の好適な方法であればいずれの方法で観察してもよい。例えば細胞毒性活性を観察する方法がある。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においては、活性化後４時間以内に細胞毒性活性が増強される。かかる細胞毒性活性は１８時間後に最大となる。
【０３１１】
一旦活性化された白血球は、新たに種々の細胞表面抗原を発現させる。例えばＮＫ細胞は活性化後に、トランスフェリン受容体ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５ＩＬ−２受容体を発現させる。従って、これらの抗原の発現を観察することにより活性化のアッセイを行うことができる。
【０３１２】
Hara et al.の「ヒトＴ細胞活性化：III,１２−０−ホルボール−１３−酢酸テトラデカノイルによるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋＤジスルフィド結合早期活性化抗原（ＥＡ−１）の迅速な誘導、マイトジェン及び抗原(Human T-cell Activation: III, Rapid Induction of a Phosphorylated 28kD/32kD Disulfidelinked Early Activation Antigen (EA-1) by 12-0-tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate, Mitogens and Antigens)」（J. Exp. Med., 164: 1988 (1986)）、及び Cosulich et al.の「Ｔ細胞活性化初期に関与する抗原（ＭＬＲ３）の機能の特徴化(Functional Characterization of an Antigen (MLR3) Involved in an Early Step of T-Cell Activation)」（PNAS, 84: 4205 (1987)）は、活性化後まもなくＴ細胞上で発現される細胞表面抗原について説明している。これらの抗原ＥＡ−１及びＭＬＲ３は、それぞれ２８ｋＤ及び３２ｋＤの主要構成要素を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１とＭＬＲ３はＨＬＡクラスII抗原ではなく、ＭＬＲ３モノクローナル抗体はＩＬ−１との結合を阻止する。これらの抗原は、活性化後１８時間以内に活性化Ｔ細胞上に出現し、４８時間後においても依然として出現が継続している。
【０３１３】
上記の抗原は、白血球の活性化を検出する上でも有用である。白血球活性化はさらに、欧州特許第０３２５４８９号（参考のため本明細書に添付）の記載に従って観察してもよい。この方法の概略は、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−９６２７と命名されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体が認識する細胞抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「抗Ｌｅｕ２３抗体」）を用いる方法である。
【０３１４】
抗Ｌｅｕ２３抗体は、活性化され、かつ抗原で刺激された白血球の細胞表面抗原を認識する。Ｌｅｕ２３抗原は、活性化後４時間以内に活性化ＮＫ細胞上で発現し、活性化から７２時間経過してもなお発現が継続している。Ｌｅｕ２３は、Ｎ−結合型糖鎖を少なくとも２つ有し、２４ｋＤのサブユニットからなるジスルフィド結合二量体である。
【０３１５】
ＮＫ細胞上におけるＬｅｕ２３の出現が、細胞毒性の発生と相関していること、また数種のＴ細胞上におけるＬｅｕ２３の出現が、Ｔ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関していることから、抗Ｌｅｕ２３抗体は白血球における活性や刺激を観察する上で有用である。
免疫細胞の活性を観察する方法の詳細についてはさらに、'The Natural Killer Cell' Lewis C. E. and J. O'D. McGee 1992. Oxford University Press; Trinchieri G. 'Biology of Natural Killer Cells' Adv. Immunol. 1989 vol 47 pp187-376; 'Cytokines of the Immune Response' Chapter 7 in "Handbook of Immune Response Genes". Mak T. W. and J. J. L. Simard 1998 に記載されており、参考のため本明細書に添付する。
【０３１６】
標的遺伝子
本発明で使用する標的遺伝子は、内因性標的遺伝子（すなわちヘッジホッグシグナル伝達経路の内因性標的遺伝子）又は合成レポーター遺伝子であってよい。ヘッジホッグシグナル伝達経路における内因性標的遺伝子の好適例については上述のシグナル伝達経路の項で説明した。
【０３１７】
本発明の他の実施態様では、標的遺伝子はレポーター遺伝子である。好適実施態様においてレポーター遺伝子は、ヘッジホッグシグナル伝達に感受性のプロモーター領域又は応答エレメント（１又は２以上）の転写制御下にある。
【０３１８】
本発明のアッセイ法には種々多様なレポーターを用いることができるが（スクリーニング法同様に）、好都合に検出可能な（例えば分光法により）シグナルを発するものが好ましい。例を挙げると、レポーター遺伝子は、吸光性を変化させる反応を触媒する酵素をコードするものでもよい。
【０３１９】
他の手法には、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などがある。互いに干渉しない２つのエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位（two-site）におけるモノクローナル抗体をベースとする免疫測定法を利用してもよい。これらのアッセイ法、或いは他のアッセイ法に関する記載は種々の文献にみられるが、中でもHampton R et al (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) 及びMaddox DE et al (1983) J Exp Med 15(8): 121-1 によく収載されている。
【０３２０】
当技術分野の専門家であれば、特異的レポーター遺伝子のアイデンティティーは、当然種々に異なることを認識している。当技術分野でこれまで使用されてきたレポーター遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ（invertase）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、エキソグルカナーゼ（exo-glucanase）、グルコアミラーゼ、又はアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されることはない。或いはレポーター遺伝子は、放射標識、又はＦＩＴＣ、ローダミン、ランタンナイドホスホル（lanthanide phosphor）、グリーン蛍光融合タンパク質等の蛍光標識を有していてもよい（Stauber et al (1995) Virol. 213: 439-449を参照）。或いはレポーター遺伝子は、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン又はエピトープタグのように二次レポーターによって認識され得る規定のポリペプチドエピトープを有していてもよい。当技術分野の専門家であれば、本発明で開示する方法に用いる特異的レポーター遺伝子（１若しくは複数）には色々な種類があり、また採用する個々のモデル系によっても異なるので、本発明で開示する方法は何ら特定のレポーター遺伝子（１若しくは複数）に限定されるものではないことは十分理解するところである。
【０３２１】
さらに例を挙げると、Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison,WI)、US Biochemical Corp (Cleveland, OH) 等、数多くの企業がアッセイ用としてキットやプロトコールを市販している。好適なレポーター分子又は標識としては、基質、補因子、阻害剤、磁気ビーズなどと同様に、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は発色剤が含まれる。このような標識の使用については、米国特許Ａ３８１７８３７号、同Ａ３８５０７５２号、同Ａ３９３９３５０号、同Ａ３９９６３４５号、同Ａ４２７７４３７号、同Ａ４２７５１４９号、同Ａ４３６６２４１号などに教示がある。
【０３２２】
本発明の方法に用いるレポーター遺伝子は、ヘッジホッグシグナル伝達に敏感なプロモーター領域及び／又は応答エレメントの内少なくとも１つの転写制御下にある。ヘッジホッグシグナル伝達に敏感なプロモーター領域及び／又は応答エレメントには、ＨＥＳプロモーター、Deltexプロモーター、ヘッジホッグプロモーター、ヘッジホッグリガンドプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター等、内因性ヘッジホッグ標的遺伝子の調節エレメントが含まれる。本発明に用いる調節エレメントにはまた、単一の又は複数のＣＢＦ１部位、ＣＴＬＡ４プロモーター及びＡＩＲＥプロモーターが含まれる。かかる調節エレメントは、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化によりレポーター遺伝子の発現が増加するように配置する。
【０３２３】
当技術分野で公知の手法により、レポーター遺伝子の１若しくは２以上の複製を宿主細胞に挿入してもよい。本発明において「宿主細胞」なる用語は、本発明における作用因子の標的を有することができる細胞を全て含むものである。ポリヌクレオチドを原核細胞、又は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核細胞に導入してもよい。宿主細胞が上述の免疫系細胞であることが好ましい。
【０３２４】
トランスフェクション、形質転換、電気泳動等の当技術分野で公知の種々の方法を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入してもよい。本発明のポリヌクレオチドを動物に投与する場合は、例えばレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス等の組換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入、或いは遺伝子銃を用いた形質転換などいくつかの方法が当技術分野で知られている。
【０３２５】
本発明では、宿主細胞は哺乳類細胞であることが好ましく、またポリペプチドは、細胞内において細胞膜上で発現させるか、或いは適切なリーダー配列に先導されるのであれば培養培地中に分泌させる。
【０３２６】
標的遺伝子（内因性であれ、合成レポーター遺伝子であれ）の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達単独に、又はヘッジホッグシグナル伝達と１若しくは２以上のさらなる刺激シグナルとの組合せに依存する。
【０３２７】
治療における使用
本発明は、疾患の治療及び／又は予防に有用である。一般的に本発明は、治療及び／又は例えば不十分な若しくは過剰なＴ細胞応答によって樹立する若しくは維持される疾患のようにＴ細胞が介在する疾患において有用である。
【０３２８】
Ｔ細胞介在型であると説明される疾患や感染症状には、喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫、腫瘍が誘発するＴ細胞系の異常、或いはマラリヤ病原虫、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコックス、ヘモフィルスインフルエンザＢ型、麻疹、Ｃ型肝炎、トキソカラによって引き起こされる感染症のいずれか１若しくは２以上が含まれるが、それらに限定されることはない。Ｔ細胞介在型で、治療や予防を行う具体的な病気にはＭＳ、ＲＡ、糖尿病が含まれる。本発明は臓器移植又は骨髄移植にも使用される。
【０３２９】
本発明は、過敏症疾患の治療に特に有用であると考えられる。過敏症反応とは、
（ｉ）無害の外来物質に対する反応が不適切なために引き起こされるアレルギー、
（ii）自己組織抗原に対して反応するために生じる自己免疫疾患、また、
（iii）移植に対して反応する移植片拒絶反応
などである。
【０３３０】
アレルギー症には、花粉症、外因性喘息、虫刺されによるアレルギー、食物や薬剤に対するアレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性気管支炎、アナフィラキシー症候群、蕁麻疹、血管浮腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多型滲出性紅斑、スティーブンス・ジョンソン症候群（皮膚粘膜眼症候群）、鼻炎・結膜炎、皮膚壊死性細静脈炎、炎症性肺疾患、水泡性皮膚疾患が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０３３１】
自己免疫疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーブス病（バセドウ病）、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性筋炎及びいくつかの糖尿病型、全身性脈管炎、多発性筋炎・皮膚筋炎、全身性硬化症（強皮症）、シェーグレン症候群（Sjogren's Syndrome）、強直性脊椎炎とそれに関連する脊椎関節炎、リウマチ熱、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、無機粉塵によるじん肺、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、免疫性血小板障害、クリオフィブリノゲン血症や自己免疫性多腺性内分泌不全症等の寒冷症が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０３３２】
臨床医学においては、腎臓、肝臓、心肺、皮膚、角膜、骨髄を含む種々の組織の移植が一般的に行われている。角膜及びある種の骨髄移植を除く全ての移植において、現在一般的に免疫抑制剤の長期投与が必要とされている。
【０３３３】
本発明の上記特徴についての一実施態様では、糖尿病の治療及び／又は予防にペプチドを使用する。
【０３３４】
「自己免疫性疾患」は、当分野における通常の意味、つまり、免疫系が「自己」標的を攻撃するという破壊的な機能を行使してしまう疾患若しくは疾患要素と同義に用いられる。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節炎、炎症性腸疾患が例示される。
【０３３５】
臓器移植拒絶反応や自己免疫疾患等の免疫関連疾患の治療が大きな目的の1つである。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症など）から関節リウマチやエリテマトーデス等の全身性疾患に及ぶ。他の疾患には、アレルギー反応、特にヒスタミン産生に伴う反応、及び喘息等の免疫性過敏症が含まれる。
【０３３６】
本発明における選択性抗体又はその結合タンパク質は一般的に、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌若しくはウイルス感染症、及び自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、クローン病及び重症筋無力症を含むがこれらに限定されない）を予防、抑制又は治療することにその使途を見い出すものである。
【０３３７】
本発明の上記特徴に関するさらなる実施態様では、多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び／又は予防にペプチドを使用する。多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の白質全体に広がり、部位的・時間的に多発する複数の脱髄病巣によって特徴付けられる慢性炎症性疾患である（McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 and 1246-1251）。ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞に介在されると考えられている。
【０３３８】
ヘッジホッグシグナル伝達経路は、アポトーシスの低減及び亢進に関連する疾患の発生に何らかの役割を担っているようである。アポトーシスの低減に起因する疾患には、リンパ腫や悪性腫瘍に加え乳癌、前立腺癌、卵巣癌、また全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、グレーブス病、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病等の自己免疫疾患や、変形性関節症、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎等の炎症性疾患や、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、乾癬、リンパ節症等の増殖性疾患や、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス等のウイルス感染症が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３９】
アポトーシスの亢進に起因する疾患には、ＡＩＤＳ及び他の感染性若しくは遺伝性免疫不全症や、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性症、小脳変性症等の神経変性疾患や、再生不良性貧血等の骨髄異形成症候群や、心筋梗塞、脳卒中、再潅流障害等の虚血性損傷や、アルコール性肝障害、肝硬変、ラチルス症（神経性ラチリスム）等の毒物因性疾患や、悪液質等の消耗性疾患や、Ｂ型及びＣ型肝炎等のウイルス感染症や骨粗鬆症が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４０】
ここに用いる「アポトーシス」なる用語は、生物の一生を通して調節されている遺伝的にプログラムされた細胞死を意味する。アポトーシスでは、細胞の内外いずれかからの誘発因子が「細胞自殺」遺伝子を生じさせ、細胞骨格及び核の崩壊を含む何通りかの方法で細胞を損傷する酵素が産生される。その結果、細胞が縮小し、隣接細胞から引き離されていく。細胞膜は無傷であっても核内のＤＮＡは断片化し、細胞質が縮小する。その後、周囲の食細胞が死細胞を摂取する。アポトーシスは、正常な形態の細胞死と考えられ、組織の損傷に端を発する病理学的形態としての細胞死である壊死とは対照的である。アポトーシスは、出生前の発達段階において不要な細胞を除去する。出生後もアポトーシスは引き続き発生し、組織中の細胞数を調節し、癌細胞のように潜在的に危険な細胞を排除するのである。
【０３４１】
例えば、神経におけるアポトーシスを制御することは、以下の疾患を含む多くの疾患の治療に有用であると考えられる。すなわち、アテローム性動脈硬化症、炎症疾患、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、神経変性疾患、網膜疾患、癌転移、アルツハイマー及びパーキンソン病、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と他の関連疾患、脳卒中、心筋梗塞、化学療法や放射線照射後に生じる骨髄抑制、並びに細胞死がその病理の主要特徴である多数の疾患が含まれるが、これら疾患に限定はされない。
【０３４２】
治療が奏功するためには、癌治療における免疫療法は種々の要因に左右される。かかる要因には、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘発する能力、抗体反応を誘発する能力、また重要なこととして被験者における免疫寛容を破壊する能力などがある。本発明は、免疫療法における抗腫瘍反応を誘起する点で有用である。かかる反応は、被験者における腫瘍の発達を阻害し、停止させ、又は逆行させることに有効な免疫療法に対する抗腫瘍反応である点で有利である。
【０３４３】
本発明は、被験者の５Ｔ４に対する免疫寛容を破壊する能力を有する点で有利である。
【０３４４】
本発明は従って癌療法にも有用であり、例えば本発明は、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、直腸癌、乳癌等の腺癌に有用である。
【０３４５】
アポトーシスの調節障害及びＴ細胞による介在の両方に関係している疾患又は障害でもよい。
【０３４６】
本発明者らは、ヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を用いることにより、上述の疾患を予防し、及び／又は疾患の後退が促進されることを見い出した。
【０３４７】
本発明者らはまた、ヘッジホッグシグナル伝達経路又は該ヘッジホッグシグナル伝達経路の標的経路を調節することにより、以下の疾患・障害を治療する方法を提供する。
【０３４８】
本発明は、自己免疫疾患等の免疫障害、又は同種移植拒絶反応等の移植片拒絶反応の治療においても有用である。
【０３４９】
治療可能な疾患例には、一般に自己免疫疾患と呼ばれる疾患群が含まれる。自己免疫疾患の範囲は臓器特異的疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症など）から、関節リウマチ又はエリテマトーデス等の全身性疾患に及ぶ。他の疾患には、アレルギー反応等の免疫性過敏症が含まれる。
【０３５０】
より詳細には臓器特異的自己免疫疾患には、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、数タイプの貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
【０３５１】
全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合織症候群、抗リン脂質抗体症候群、各種形態の脈管炎（結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲネル肉芽腫症、川崎病、過敏性脈管炎、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病（Henoch-Schoenlein purpura）、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬、及び乾癬性関節炎、好酸球性若しくは非好酸球性の広汎性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪組織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫、結節性紅斑、強直性脊髄炎、ライター症候群（Reiter's syndrome）、種々の病型の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０３５２】
障害をさらに詳細に以下列挙する。関節炎（関節リウマチを含む）を含む望ましくない免疫反応及び炎症、過敏症を伴う炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患や他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症を伴う炎症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心疾患、再潅流障害、心停止、心筋梗塞、血管性炎症疾患、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化器潰瘍を伴う炎症、潰瘍性大腸炎や他の消化管疾患、肝硬変や他の肝疾患、甲状腺炎や他の腺疾患、糸球体腎炎や他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎や他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎や他の皮膚疾患、歯周病や他の歯疾患、精巣炎又は副睾丸炎（精巣上体炎）、不妊症、睾丸外傷並びに他の免疫性精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症並びに他の免疫及び／又は炎症性婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、網脈絡膜炎、ブドウ膜炎（uveoretinitis）、視神経炎、眼内炎（例；網膜炎又は嚢胞様黄斑腫）、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼圧（fundos）疾患の免疫及び炎症構成要素、眼外傷の炎症構成要素、感染性眼炎症、増殖性硝子網膜症、急性虚血性視神経障害、過剰形成瘢痕（例；緑内障濾過手術後の）、眼組織移植に対する免疫及び／又は炎症反応、並びに他の免疫関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の臓器の両方において免疫及び／又は炎症を抑制することが有効である自己免疫疾患若しくは症状若しくは障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ痴呆症候群、ＨＩＶ脳症、デビック病（Devic's disease）、シデナム舞踏病（Sydenham's chorea）、アルツハイマー病並びに他の変性疾患、中枢神経系の疾患又は障害、脳卒中（stoke）による炎症構成要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫及び炎症構成要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、Guillaim-Barre症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、中枢神経系圧迫又は中枢神経系外傷又は中枢神経系感染による炎症構成要素、筋萎縮症又は筋ジストロフィーによる炎症構成要素、さらに中枢及び末梢神経系における免疫及び炎症疾患又は症状又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術又は臓器移植後の炎症性合併症又は副作用、遺伝子療法による炎症性及び／又は免疫性合併症及び副作用（例；ウイルス担体による感染のため）、或いはＡＩＤＳに伴う炎症、液性及び／又は細胞性免疫反応の抑制又は阻害、単球又はリンパ球を減少させることにより単球又は白血球増殖性疾患（例；白血病）を治療若しくは軽減すること、天然若しくは人工の細胞や、角膜、骨髄、臓器、水晶体、ペースメーカー、天然若しくは人工の皮膚組織等の組織や臓器を移植する場合の移植片拒絶反応の予防及び／又は治療。
【０３５３】
本発明者らは、ヘッジホッグシグナル伝達の拮抗因子が、さらには作動因子が上述の疾患を予防し、及び／又は疾患の後退を促進することを見い出した。
【０３５４】
アポトーシスの調節障害及びＴ細胞の介在の両方が関係している疾患又は障害でもよい。
【０３５５】
本発明らは、ヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を使用することにより、上述の疾患の予防、及び／又は後退促進が図れることを明らかにした。
【０３５６】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明はまた、本発明に有用なポリヌクレオチドを有するベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的手法で作製した宿主細胞、及び本発明に有用なポリペプチドをかかる手法により作製することに関する。
【０３５７】
組換え作製法では宿主細胞に、本発明の発現系又はポリヌクレオチドを取り込むように遺伝子工学に基づく操作を施すことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入法としては、Davis et al and Sambrook et al等、多くの標準的実験室マニュアルに記載されている例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic intruduction）、感染等の方法が有効である。
【０３５８】
好適な宿主の代表的な例としては、レンサ球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞や、酵母細胞、アスペルギルス細胞等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ２９３、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞が挙げられる。
【０３５９】
本発明に有用なポリペプチドの作製には極めて多様な発現系が使用できる。このようなベクターとしては例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、またバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドやファージミドのようにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものが含まれる。この発現系構築物は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。宿主内でポリヌクレオチドを保持、増殖又は発現させる、及び／又は宿主内でポリペプチドを発現させるのに適していれば通常いかなる系又はベクターでも使用してよい。例えば、Sambrook et al の方法等、十分公知のルーティンな方法に従って適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入してよい。
【０３６０】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、ペリプラズム空間に、又は細胞外環境に分泌するためには、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを取り込めばよい。かかるシグナルは、ポリペプチドに対し内因性でも異種シグナルでもよい。
【０３６１】
本発明のポリペプチドは、広く公知の方法を用いることにより、組換え細胞培養物から回収・精製することができる。これらの方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどがある。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離及び／又は精製の過程で変性した場合は、十分公知の方法によりタンパク質の再折りたたみを行って活性構造を再生する。
【０３６２】
伝達方法
本発明においては、好適な遺伝子伝達ビークル（ＧＤＶ；Gene Delivery Vehicle）を用いて、ポリヌクレオチドをエックスビボ又はインビボのいずれかにおいて標的細胞集団に伝達できる。
【０３６３】
このようなＧＤＶとしては、ＤＮＡ（脂質複合体又はタンパク質複合体内に処方するか、注入又は弾丸導入法により裸のＤＮＡとして投与する）や、ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス等）があるが、これらに限定されない。ＧＤＶは、組換えＤＮＡ法や遺伝子発現の専門家であれば、適切レベルの融合タンパク質を発現させ、かつ具体的な適用に要求される細胞特異性を有するように設計することが可能である。
【０３６４】
当技術分野では広く知られているように、ベクターとは、ある環境から別の環境へと物質の移動を可能ならしめる、或いは容易ならしめるツールである。本発明に従って例を挙げると、組換えＤＮＡ法で用いるベクターの中には、ＤＮＡセグメント（異種ＤＮＡセグメントなど、異種ｃＤＮＡセグメントなど）等の物質の標的細胞への輸送を可能にするものがある。任意で一旦標的細胞に導入されるとベクターは細胞内の異種ＤＮＡを保存するために、或いはＤＮＡ複製の単位として機能する。組換えＤＮＡ法で用いられるベクターの例には、プラスミド、染色体、人工染色体又はウイルスが含まれる。
【０３６５】
ベクターは、ウイルス法又は非ウイルス法による伝達が可能である。
【０３６６】
非ウイルス法には、ＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これに限定されない。本発明でトランスフェクション法とは、遺伝子を標的哺乳類細胞に送達する非ウイルスベクターを使用する方法を含むものである。
【０３６７】
一般的なトランスフェクション法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ弾丸導入、脂質媒介トランスフェクション、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクション、またリポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性因子媒介、カチオン性界面両親媒性物質（ＣＦＡ）（Nature Biotechnology 1996 14; 556）、スペルミン（spermine）等の多価カチオン、カチオン性脂質又はポリリシン、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロール錯体（Wolff and Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16: 421）を用いるトランスフェクション、及びこれらを組合せた方法が含まれる。
【０３６８】
ウイルス伝達系としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６９】
レトロウイルスとしては、マウス白血球ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、Abelsonマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）などが列挙されるが、これらに限定されることはない。
【０３７０】
Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763) にレトロウイルスの詳細なリストが収載されている。
【０３７１】
上皮細胞に対して良好な特異性をもつアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスが特に好ましい。
【０３７２】
上記以外のベクターの例としてエックスビボにおける伝達系があり、これにはエレクトロポレーション、ＤＮＡ弾丸導入、脂質媒介トランスフェクション、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクションなどのＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７３】
従って本発明による核酸ベクターは、標的細胞に対して優先的な伝達能力を有していてよい。例えばレトロウイルスベクターの場合、レトロウイルス性エンベロープタンパク質はベクターを特定の細胞型又は特定複数の細胞型に誘導する能力を有していてよい。エンベロープタンパク質はかかる目的のため、特異的標的能をもつように適応させた修飾エンベロープタンパク質でもよく、又は異なるウイルス又はレトロウイルス源に由来し所望の標的能を有する選択性エンベロープタンパク質でもよい。
【０３７４】
本発明のベクターにおける核酸は、標的細胞で優先的に融合タンパク質を発現させる能力をもつ発現制御配列にオペラブルに結合していることが好ましい。発現制御配列としては例えば、標的細胞を含むいくつかの細胞型において優先的に活性を示すプロモーター又はエンハンサー、或いはいくつかの条件下で優先的に活性を示すプロモーター又はエンハンサーでよい。
【０３７５】
「プロモーター」なる用語は、当技術分野における通常の意味で用い、遺伝子発現に関するJacob-Monod 理論におけるＲＮＡポリメラーゼ結合部位が例示される。
【０３７６】
「エンハンサー」なる用語には、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合するＤＮＡ配列が含まれ、従ってそれが結合するプロモーターに誘導される転写の開始を促進する。
【０３７７】
本発明におけるプロモーターは組織特異的であることを好ましくする。これは、プロモーターがある組織において核酸の転写誘導能を示す一方、他の組織型においては概して「静止（silent）」状態を維持していることを意味する。特に好ましいプロモーターは上皮細胞プロモーターである。
【０３７８】
「組織特異的」なる用語は、その活性が単一の細胞型に限定されはしないが、それでもなお、ある組織集団においては活性だが、別の組織集団においては活性が低下するか静止しているという点で選択性を示すプロモーターを意味する。
【０３７９】
投与
ヘッジホッグファミリーシグナル伝達経路又はその標的経路の構成因子に影響を及ぼすことができる治療用の化合物は、薬学上許容される担体又は希釈剤と共に医薬組成物に処方して患者に投与することが一般的である。処方は同定した化合物の性質や投与経路によって異なるが、局部、全身性、経口、局所、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔吸入、肺吸入、粘膜、皮内、又は関節内に投与する処方が一般的である。化合物は注入可能な剤型で用いてもよい。従って、注入可能処方とするため、全身性の投与でもよいが好ましくは治療部位に直接注入するため、薬学上許容される媒体を化合物と混合してもよい。
【０３８０】
薬学上許容される担体若しくは希釈剤は、例えば、無菌の等張生理食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液でよい。本発明化合物は、好適な結合剤（１又は複数）、潤滑剤（１又は複数）、懸濁剤（１又は複数）、コーティング剤（１又は複数）、可溶化剤（１又は複数）と混合してもよい。化合物を経口で活性な剤型に処方することも好ましい。
【０３８１】
一般的に、式[１]で表される化合物及びその塩を含む本発明化合物を経口又は静脈内投与する場合の治療上有効な１日用量は、治療対象者の体重換算で０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇが好ましい。式[１]で表される化合物及びその塩も、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲の投与量で静脈内投与してよい。
【０３８２】
化合物の錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて同時に１個若しくは２個若しくは３個以上投与してよい。また、化合物を徐放性の処方として投与することも可能である。
【０３８３】
通常医師は、個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個別の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上述の投与量は、平均的なケースを挙げたものである。個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、それらもまた本発明の範囲に該当する。
【０３８４】
或いは本発明化合物を吸入により、又は座剤やペッサリーの剤型で、又はローション、液剤、クリーム、軟膏、又は粉剤の剤型で局所的に塗布することにより投与してもよい。経皮投与の別の方法としては、スキンパッチを用いる方法がある。例えば、ポリエチレングリコール水性乳剤又は液体パラフィンからなるクリームに化合物を含有させることができる。また、白ワックス又は白色軟パラフィン基剤からなる軟膏に化合物を重量濃度１〜１０％の範囲で、必要に応じて安定剤や保存料と共に含有させることもできる。
【０３８５】
適用例によっては組成物を、澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤の剤型で、カプセル剤若しくは胚珠（ovule）剤を単独で又は賦形剤と混合して、或いは香料又は色素を含有するエリキシル剤、液剤又は懸濁剤の剤型で、経口投与することが好ましい。
【０３８６】
組成物（化合物単独の場合同様に）は非経口に注入することも可能であり、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内、又は皮下への注入が例示できる。注入する場合、組成物は適切な担体又は希釈剤を有する。
【０３８７】
非経口投与の場合は、組成物を無菌水性溶液の剤型で使用することが最適であり、かかる溶液を血液と等張とするために例えば十分量の塩又は単糖類など、他の物質を含んでいてもよい。
【０３８８】
口腔内又は舌下に投与する場合、常法により処方可能な錠剤又はトローチ剤の剤型で組成物を投与してよい。
【０３８９】
対象（患者など）に経口、非経口、口腔内又は舌下投与する場合、本発明化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物の１日用量は、通常１０〜５００ｍｇ（１回又は複数回に分けて）である。従って錠剤やカプセル剤には、例えば一度に１、２又は３錠以上を適宜に投与するため、活性化合物を５〜１００ｍｇ含有させてよい。上述したように、医師は個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個々の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上記の投与量は平均的なケースであり、個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、そのような投与量の範囲もまた本発明の範囲に該当することに留意されたい。
【０３９０】
専門家であれば個々の患者にとって、例えば年齢、体重及び症状に応じて最適な投与経路や投与量を容易に決めることができるので、これまでに説明した投与経路及び投与量は単に指針としてのものである。
【０３９１】
ここに用いる治療や療法という用語は、診断及び予防をも含意するものと理解される。
【０３９２】
本発明の治療には、ヒトと動物の両方への適用が含まれる。
【０３９３】
一実施態様では、ヘッジホッグシグナル伝達の調節因子を作動因子として用いており、例えば免疫刺激又はアジュバント型効果を達成するために用いている。
【０３９４】
ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子をアジュバントとして用いる場合、例えば、経口、口腔内、腸内、膣内、直腸内、鼻腔内の経路からのワクチン投与により、疾患に敏感な又は罹患している哺乳動物を防御又は治療するためのワクチン組成物や調製物として用いてよい。
【０３９５】
従ってさらなる実施態様で本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の調節因子を含むワクチン組成物を提供する。
【０３９６】
また、例えば皮内に、又は経皮的に（transdermal,transcutaneous）送達して皮膚に適用した抗原の免疫原性を増強するためにヘッジホッグ調節因子を用いてもよい。さらに、例えば筋肉内や皮下投与を経てアジュバントを非経口送達してもよい。
【０３９７】
ワクチン処方の中には、他のワクチン成分を処方に含めてもよいものがある。例えば、本発明におけるアジュバント処方には胆汁酸やコール酸誘導体を含めてもよい。コール酸の誘導体としては、その塩、例えばそのナトリウム塩であることが好適である。胆汁酸としては、コール酸自体、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、タウロデオキシコール酸ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、並びにグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−、プロパンスルホン酸−、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸−等の上記胆汁酸の誘導体、或いは  Ｎ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドが列挙される。
【０３９８】
本発明のアジュバント処方として好適なのは、非水泡状の水性溶液又は懸濁液の形態である。このような処方は製造に好都合であり、また無菌化するにも都合がよい（例えば、４５０又は２２０ｎｍ孔径のメンブランを通す終点（terminal）濾過法により）。
【０３９９】
宿主への投与経路としては、経皮膚、筋肉内、鼻腔粘膜などの経粘膜表面が好適である。混合剤を鼻腔粘膜に投与する場合は、かかる混合剤を例えばスプレーとして投与してよい。免疫反応を増強する方法は、ワクチンのプライム（初回免疫）投与又はブースター（追加免疫）投与のいずれでもよい。
【０４００】
ここに用いる「アジュバント」なる用語は、被験脊椎動物の免疫系における抗原に対する免疫反応を増強する能力を有する薬剤を含む。
【０４０１】
「免疫反応」なる用語には、抗原や抗原決定基に対して被験対象の免疫系によって生じる反応が全て含まれる。免疫反応には、例えば液性免疫反応（例；抗原特異的抗体の産生）や、細胞媒介免疫反応（例；リンパ球増殖）が含まれる。
【０４０２】
「細胞媒介免疫反応」なる用語には、Ｔ細胞リンパ球がその犠牲となる細胞の至近距離にきたときに発揮する防御性など、リンパ球による免疫防御が含まれる。
【０４０３】
「リンパ球増殖」を測定する場合、特異的抗原に対するリンパ球の増殖能を測定してよい。リンパ球増殖には、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、ＣＴＬ細胞の増殖が含まれる。
【０４０４】
本発明の組成物は、種々の供給源に由来する抗原を含有するワクチンを処方することに用いてもよい。抗原としては、ヒト核酸、細菌核酸、ウイルス核酸、病原体由来抗原や抗原調製物、ＧｎＲＨやＩｇＥペプチドを含む宿主由来抗原、組換え作製されたタンパク質又はペプチド、キメラ融合タンパク質などが例挙できる。
【０４０５】
本発明のワクチン処方には、ヒト病原体に対する免疫反応を惹起させる能力を有する抗原又は抗原組成物が含まれることが好ましい。かかる抗原又は抗原類は、例えばペプチド／タンパク質、多糖類、脂質であってよく、以下に記すウイルス、細菌、寄生虫／真菌に由来するものであってよい。
【０４０６】
ウイルス抗原
ウイルス抗原としては例えば以下のウイルス由来のものが挙げられる。
サイトメガロウイルス（ｇＢ又はその誘導体などの特にヒトウイルス）；Epstein-Barr ウイルス（ｇｐ３５０等）；フラビウイルス（例；黄熱ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）；Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、欧州特許出願公開第４１４３７４号、同０３０４５７８号、同１９８４７４号記載のＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２ Ｓ抗原等のＢ型肝炎表面抗原）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス；ＨＩＶ−１（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０等）；ｇＤ又はその誘導体や、ＨＳＶ１若しくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７等の即時型タンパク質（Immediate-Early protein）などのヒトヘルペスウイルス；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８）；インフルエンザウイルス（卵又はＭＤＣＫ細胞内で増殖させた全生ウイルス又は不活化ウイルスやスプリットインフルエンザウイルス、又はベロ細胞や全インフルエンザヴィロソーム（whole flu virosome）（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載）又はＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、Ｍタンパク質等その精製若しくは組換えタンパク質）；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；パラインフルエンザウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（Ｆタンパク質やＧタンパク質等）；ロタウイルス（生弱毒化ウイルスを含む）；水痘帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、II及びＩＥ６３等）；生殖器疣の原因ウイルスとされるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１その他）や、子宮頸癌の原因ウイルスであるＨＰＶウイルス各種（例；早期タンパク質のＥ６又はＥ７がタンパク質Ｄ担体と融合し、ＨＰＶ１６からＤ−Ｅ６又はＤ−Ｅ７融合タンパク質を形成する）又はそれらの組合せ；或いはＥ６若しくはＥ７とＬ２との組合せ（ＷＯ９６／２６２７７を例として参照）。
【０４０７】
細菌抗原
細菌抗原としては例えば以下のウイルス由来が挙げられる。
炭素菌（例；ボツリヌス毒素）を含むバチルス属菌（Bacillus spp.）；百日咳菌（例；パータクチン（pertactin）、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛（fimbriae））を含むボルデテラ属菌（Bordetella spp.）；B. burgdorferi（例；ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. garinii（例；ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. afzelii（例；ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. andersonii（例；ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. hermsii を含むボレリア属菌（Borrelia spp.）；C. jejuni（例えば毒素、付着因子、侵入因子）及び C. coli を含むカンピロバクター属菌（Campylobacter spp.）；C. trachomatis（例；ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、C. pneumonie（例；ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、C. Psittaci を含むクラジミア属菌（Chlamydia spp.）；C. tetani （破傷風毒素など）、C.botulinum（例えばボツリヌス毒素）、C. difficile（例；クロストリジウム毒素Ａ又はＢ）を含むクロストリジウム属菌（Clostridium spp.）；C. diphtheriae（例；ジフテリア毒素）を含むコリネ菌属（Corynebacterium spp.）；E. equi及びヒト顆粒球エールリキア症の因子を含むエールリキア属菌（Ehrlichia spp.）；R. rickettsiiを含むリケッチア属菌（Rickettsia spp.）；E. faecalis及びE.faeciumを含むエンテロコッカス属菌（Enterococcus spp.）；腸管毒性大腸菌（例えば定着因子、易熱性毒素又はその誘導体、或いは耐熱性毒素）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば志賀毒素様毒素）を含む大腸菌（Escherichia spp.）；Ｂ型インフルエンザ(例；ＰＲＰ)、非型インフルエンザ（例えばＯＭＰ２６、高分子量付着因子、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄ及びリポタンパク質Ｄ、綿毛ペプチド及び綿毛由来ペプチド（米国特許第５８４３４６４号を参照））を含むヘモフィルス属菌（Haemophilus spp.）；H. pylori（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター属菌（Helicobacter spp.）；P. aeruginosaを含むシュードモナス属菌（Pseudomonas spp.）；L. pneumophilaを含むレジオネラ属菌（Legionella spp.）；L. interrogansを含むレプトスピラ属菌（Leptospira spp.）；L. monocytogenesを含むリステリア属菌（Listeria spp.）；Branhamella catarrhalisとしても知られるM. catarrhalis（例えば高分子量及び低分子量の付着因子及び侵入因子）を含むモラクセラ属菌（Moraxella spp.）；Morexella catarrhalis（その外膜小胞や、ＯＭＰ１０６（ＷＯ９７／４１７３１号に例示）を含む）；M. tuberculosis（例；ＥＳＡＴ６、８５Ａ抗原、８５Ｂ抗原、８５Ｃ抗原）、M. bovis、M. Ieprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatisを含むマイコバクテリア属（Mycobacterium spp.）；N. gonorrhea及びN. meningitidis（例えば被膜多糖類及びその共役体、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、付着因子）を含むネイセリア属菌（Neisseria spp.）；Neisseria mengitidis B（その外膜小胞や、ＮｓｐＡ（ＷＯ９６／２９４１２号に例示）を含む）；S. typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisを含むサルモネラ属菌（Salmonella spp.）；S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiを含むシゲラ属菌（Shigella spp.）；S. aureus、S. epidermidisを含むスタフィロコッカス属菌（Staphylococcus spp.）；S. pneumonie（例；被膜多糖類及びその共役体、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）及びタンパク質抗原Pneumolysin（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）並びにその解毒化変異誘導体（ＷＯ９０／０６９５１号、ＷＯ９９／０３８８４号を参照）を含むストレプトコッカス属菌（Streptococcus spp.）；T. pallidum（例；外膜タンパク質）、T. denticola、T. hyodysenteriaeを含むトレポネマ属菌（Treponema spp.）；V. cholera（例えばコレラ毒素）を含むビブリオ属菌（Vibrio spp.）；Y. enterocolitica（例えばＹｏｐタンパク質）、Y. pesits、Y. pseudotuberculosisを含むエルシニア属菌（Yersinia spp.）。
【０４０８】
寄生虫・真菌抗原
寄生虫・真菌抗原としては例えば以下のもの由来であってよい。
B. microtiを含むバベシア属（Babesia spp.）；C. albicansを含むカンジダ属菌（Candida spp.）；C.neoformansを含むクリプトコッカス属菌（Cryptococcus spp.）；E. histolyticaを含むエンタモエバ属（Entamoeba spp.）；G. lambliaを含むジアルジア属（Giardia spp.）；L. major を含むリーシュマニア属（Leishmania spp.）；Plasmodium. faciparum（ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Sequestrin、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、及びPlasmodium属におけるそれらのアナログ）；P. cariniiを含むニューモシスチス属菌（Pneumocystis spp.）；S. mansoniを含む住血吸虫属（Schistosoma spp.）；T. vaginalisを含むトリコモナス属菌（Trichomonas spp.）；T. gondii（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属（Toxoplasma spp.）、T. cruziを含むトリパノソーマ属（Trypanosoma spp.）。
【０４０９】
各々のワクチン投与におけるタンパク質用量は、一般的な患者に有意の副作用を起こすことなく免疫防御反応を誘起する量として選択する。かかる用量は、採用する特異的免疫原の種類や、その免疫原をどのように提示するかで異なってくる。通常は１投与量に対し、１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、最も好ましくは１〜５０μｇのタンパク質を含有する。初回ワクチン接種後、適切な間隔をおいて１回又は複数回の追加免疫を被験者に行ってもよい。
【０４１０】
本発明のワクチンは経口経路で投与してもよい。その場合、薬学上許容される賦形剤としては、アルカリ緩衝液、腸溶カプセル、又は細粒も含まれる。本発明のワクチンは経膣経路で投与してもよい。その場合、薬学上許容される賦形剤としては、乳化剤、CARBOPOL等のポリマー、膣用クリームや膣座剤に用いる他の公知の安定剤も含まれる。本発明のワクチンは直腸経路で投与してもよい。その場合、賦形剤には、直腸座剤を形成する上で当業者に公知のワックスやポリマーも含まれる。
【０４１１】
本発明の処方は、予防と治療目的のいずれに使用してもよい。本発明のさらなる特徴として、薬剤に用いるアジュバントの組合せとワクチンを提供する。ワクチン調製物に関しては、New Trends and Developments in Vaccines（edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978）に総括されている。
【０４１２】
本発明のアジュバントをさらに他のアジュバントと混合することが推奨される。他のアジュバントとは例えば、コレラ毒素及びそのＢサブユニット、大腸菌易熱性エンテロトキシンＬＴや、そのＢサブユニットＬＴＢや、ｍＬＴのようにそれを解毒化したもの、また例えば南米産樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮由来のQuil A及びその派生物（例えば米国特許第５０５７５４０号記載のＱＳ２１）のような免疫学的に活性なサポニン画分、オリゴヌクレオチドアジュバント系ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５に記載）の中でも特に5'TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT3（配列番号１）、或いはMonophosphoryl Lipid A及びその無毒化誘導体３−Ｏ−脱アシル化Monophosphoryl Lipid A（英国特許第２２２０２１１号記載の３Ｄ−ＭＰＬ）である。
【０４１３】
免疫抑制
或いは、例えば免疫抑制効果を得るために調節因子を拮抗因子として使用してもよい。このように用いる場合、さらに、免疫系及び／又は特異的免疫反応を抑制する能力を有する薬物を含む免疫抑制剤を追加投与することが好都合である。かかる薬物としては、メトトレキサート（methotrexate）、アザチオプリン（azathioprine）、シクロフォスファミド（cyclophosphamide）、シクロスポリン（cyclosporin）、ラパマイシン（rapamycin、別名；sirolimus）、ＦＫ５０６（tacrolimus）、並びにそれらの薬学上許容される塩又は誘導体が例示される。
【０４１４】
以下に実施例を挙げながら本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【０４１５】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Harlan Orlac（Bicester、UK）から購入し、エジンバラ大学のMFAA Animal Unitで維持した。全ての実験は、英国内務省の定める動物倫理規制法に則って実施した。
【実施例２】
【０４１６】
抗体
Functional grade 抗ＣＤ３ｅ抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、Insight Biotechnology Ltd, Wembley, UK から購入した。中和抗Ｓｈｈ抗体５Ｅ１（Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, USA）とＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（細胞名；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、ＥＣＡＣＣ、Wiltshire, UK）は、Protein G columns（Amersham Pharmacia Biotech社製、Bucks, UK）を用いてハイブリドーマ上清から精製した。ウエスタンブロッティングの結果、５Ｅ１はＳｈｈペプチドに結合したが、アイソタイプ対照抗体は結合しなかったことが判明した（データは示さず）。抗ＣＤ４FITC抗体（BD Biosciences社製、Heidelberg, Germany）を１００倍に希釈してＦＡＣＳ染色に用いた。免疫細胞化学法で使用した抗ＳｈｈＮ−１９抗体（４０倍希釈）及び抗ＰｔｃＣ−２０抗体（６０倍希釈）はいずれもヤギポリクローナル抗体（Autogen Bioclear社製、Wiltshire, UK）を用いた。抗Ｓｈｈ抗体及び抗Ｐｔｃ抗体はいずれも適切なペプチドを用いて完全に寛容化した（データは示さず）。免疫細胞化学法（ＩＣＣ）における二次抗体としては、ビオチン標識ウサギ抗ヤギ抗体（Dako Ltd製、Cambridgeshire, UK）を４００倍に希釈して使用した。
【実施例３】
【０４１７】
ＣＤ４+Ｔ細胞の単離
プールしたＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓から得た単一細胞浮遊物を、製造者マニュアルに従い、負の選択性ＣＤ４+Ｔ細胞カラム（R&D systems Europe Ltd製、Abingdon, UK）に導通した。抗ＣＤ４FITC抗体を用いたＦＡＣＳ染色により純度を調べたところ、８８〜９３％の範囲だった。
【実施例４】
【０４１８】
ＣＤ４+Ｔ細胞の培養
１０％ＦＣＳ（Life Technologies社製）、２ｍM Ｌ−グルタミン（Sigma社製、Dorset, UK）、２０μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies社製）、５０ｍM ２−メルカプトエタノール（Sigma社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Life Technologies社製、Paisley, UK）でＣＤ４+Ｔ細胞を培養した。抗ＣＤ３／２８抗体の活性化は２種類の濃度で行った。すなわち「準最適」濃度（抗ＣＤ３抗体は０．２５μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体は０．１μｇ／ｍｌ）及び「最適」濃度（抗ＣＤ３抗体は１μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体は５μｇ／ｍｌ）である。ＣＤ４+Ｔ細胞を加える前に、組織培養プレート（Corning Inc.製、NY, USA）を抗ＣＤ３抗体で３７℃下９０分間コーティングした。組換えマウスＳｈｈアミノ末端ペプチド（R&D systems Europe Ltd製、Abingdon, UK）を５００ｎｇ／ｍｌの濃度で培養に加えた。５Ｅ１抗体を２０μｇ／ｍｌか５０μｇ／ｍｌのいずれかで用い、アイソタイプ対照は２０μｇ／ｍｌで使用した。採用した上記各濃度は用量反応曲線の結果（データは示さず）に基づいたものである。
【実施例５】
【０４１９】
Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＤ４+Ｔ細胞は、外因性Ｓｈｈ又は５Ｅ１の存在下及び不在下で９６ウエルプレートを使用して上記同様に培養した。抗ＣＤ３／２８抗体による活性化の４８時間後に２０μｌの3Ｈ−ＴｄＲ（５０μＣｉ／ｍｌ）（Amersham社製）を用いて上記細胞をパルス化し、７２時間後に回収してベータプレートシンチレーションカウンター（Wallac UK社製、Milton Keynes, UK）で読取りを行った。
【実施例６】
【０４２０】
免疫細胞化学法
マウスリンパ節及び脾臓のパラフィン切片をキシレンで脱ワックスし、アルコール分を除去しながら（through descending）再水和した。抗原の回収は、Vector Antigen Retrieval solution（Vector Laboratories Inc.製、Burlingame, CA, USA）を用いてマイクロウエーブ中で行った。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素でブロックした後、切片をSequenza（Shandon Scientific Ltd製、 Cheshire, UK）に載せた。非特異的結合を正常ウサギ血清で阻止し、Vector blocking kit を製造者マニュアルに従って使用して内因性ビオチンをブロックした。一次及び二次抗体を室温で３０分間切片と接触させた。洗浄後、基質のジアミノベンジジン（Sigma社製）を添加する前に、Vectastain Eliteアビジン・ビオチン複合体（Vector社製）をキットの説明書に従い適用した。
【実施例７】
【０４２１】
細胞周期分析
ＣＤ４+Ｔ細胞を外因性Ｓｈｈ又は５Ｅ１を添加し或いは非添加で上記同様にして４８ウエルプレートで培養した。活性化の７２時間後、細胞に１３０００ｒｐｍで７分間回転をかけ、クエン酸緩衝液に再懸濁した。細胞周期分析は、Vindelov法（Vindelov et al., 1990）によって行った。その概要は、ヨウ化プロピジウム（Sigma社製）染色を行う前に細胞をトリプシン（Sigma社製）処理し、核を露出させた。次にEpicsc XL flow cytometer（Beckman Coulter UK Ltd製、Bucks, UK）により細胞周期分析を行った。この機器は各試料につき３００００個の核を計数し、ソフトウエアは、細胞周期の各段階、ｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ期及びＧ２／Ｍ期における細胞の割合（％）を解析した。これらの数字から生細胞（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ）の割合を計算し、その結果からＧ１及びＳ／Ｇ２期における生細胞の割合を計算した。この細胞周期分析の結果を図１３、１６、２０及び２４に示す。
【０４２２】
図１３は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体、Ｓｈｈ、抗Ｓｈｈ中和抗体の細胞周期進行に及ぼす効果を示す図である。７２時間後のデータは、活性化した細胞について、抗Ｓｈｈ中和抗体がＧ１期における細胞の割合を減少させ、Ｇ２＋Ｍ期における細胞の割合を増加させることを示している。このことは、Ｓｈｈタンパク質が活性化Ｔ細胞によって産生され、Ｔ細胞集団における細胞周期進行量を制限していることを示唆している。抗Ｓｈｈ抗体によるかかる効果は、Ｓｈｈを同様に培養に添加することによって反転する。ＳｈｈをＳｈｈ自体に添加すると、逆方向の効果が僅かに認められた。
【０４２３】
図１６は、Ｓｈｈが、Ｇｌｉ２-及びＧｌｉ３-マウスにおいて生存よりアポトーシスを促進する（生細胞が減少し、ｓｕｂ−Ｇ１画分での細胞数が多い）ことを示している。Ｓｈｈがそれでもシグナルを発することができるのは明らかであるが、上記Ｇｌｉタンパク質２種が一部消失する結果、Ｓｈｈのシグナルが生存促進から細胞死誘導へと変化するとの結論が得られる。このことは、Ｓｈｈが適切なシグナル伝達経路を介して機能するとの結論を補強するものである（つまり結果がＧｌｉレベルに左右される）。
【実施例８】
【０４２４】
統計分析
片側ｐ値を用いる対応のあるＴ検定（paired T test）により、3Ｈ−ＴｄＲの取込みや、増殖Ｓ／Ｇ２期におけるＣＤ４+Ｔ細胞の割合における違いの有意性を、Ｓｈｈ又は抗Ｓｈｈ抗体を添加して又は非添加で調べた。ｐ値が０．０５未満の場合を有意と認めた。
【実施例９】
【０４２５】
ＲＮＡ単離
ＣＤ４+Ｔ細胞を、外因性Ｓｈｈ又は５Ｅ１を添加して又は非添加で上記同様にして４８ウエルプレートで培養した。活性化後のいくつかの時点（２４時間後、４８時間後、７２時間後）においてＣＤ４+Ｔ細胞に３００ｇで７分間回転をかけ、ＲＮＡ単離用のRNeasy kit（Qiagen Ltd製、Crawley, UK）の一部として供給される溶解緩衝液に再懸濁した。製造者マニュアルに従ってDnaseI（Life Technologies社製）でＲＮＡを処理することにより汚染ＤＮＡを消化した。汚染されたＤＮＡが残存していないことを確認するため、ゲノムβ−アクチンプライマー（フォワードプライマー 5'-CCACCAACTGGGACACATG-3' 、及びリバースプライマー   5'-GTCTCAAACATGATCTGGGTCATC-3'）（MWG-Biotech AG製）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲのプログラムは以下のとおり。
９４℃で３０秒のサイクルを３５回、５８℃で１分、７２℃で２分、さらに７２℃で５分間伸張反応を行い、４℃で停止させた。この反応には、PTC-200 Peltier thermal cycler（MJ Research Inc.製、Massachusetts, USA）を用いた。
【実施例１０】
【０４２６】
逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
M-MLV reverse transcriptase（全てPromega社製、 Southampton, UK）を用いてＲＮＡの逆転写を行った。チューブをまず３７℃で４５分間、続いて９５℃で５分間インキュベーションして逆転写を起こさせた。このＰＣＲ反応には以下のプライマーを使用した。
Shh fp AGGGGGTTTGGAAAGAGG
Shh rp GGATTCATAGTAGACCCAGTCG
ptc fp ATCGGAGTGGAGTTCACC
ptc rp CTGCTGTGCTTCGTATTGCC
smo fp CATCAAGTTCAACAGTTCAGGA
smo rp ATAGGTGAGGACCACGAACCACACTACTCC
Gli1 fp GAGAAGCCACACAAGTGC
Gli1 rp AACAGTCAGTCTGCTCTCTTCC
【０４２７】
ＰＣＲ条件は以下のとおり。
９４℃で１分のサイクルを３５回、６５℃（ＳｈｈとＧｌｉ１では６０℃）で１分、７２℃で２分、さらに７２℃で５分間伸張反応を行い、４℃で停止させた。
【実施例１１】
【０４２８】
リアルタイムＰＣＲ
別途特記しない限り、リアルタイムＰＣＲの材料は全てApplied Biosystems UK（Cheshire, UK）社製である。Multiscribe RT kitを用いて、ＲＮＡ４００ｎｇの逆転写を行った。試料を、２５℃で１０分間、４８℃で４０分間、さらに９５℃で５分間インキュベーションし、逆転写を起こさせた。次にｃＤＮＡ試料を無ヌクレアーゼ水（Promega社製）で５倍に希釈した。このＰＣＲ工程は、Taqman Universal PCR Mastermix と、目的遺伝子に特異的なプライマー／プローブ混合物と、１８ｓのｒＲＮＡ対照試薬に特異的なプライマー／プローブ混合物を使用して行った。以下のプライマー／プローブ配列を用いた。
Shh fp TGACCCCTTTAGCCTACAAGCA
Shh rp TTCTTGTGATCTTCCCTTCATATCTG
Shh probe TTTATTCCCAACGTAGCCGAGAAGACCC
ptc fp CTCCAAGTGTCGTCCGGTTT
ptc rp TGTACTCCGAGTCGGAGGAATC
ptc probe CGTGCCTCCTGGTCACACGAACAA
Gli1 fp GGCTGTCGGAAGTCCTATTCAC
Gli1 rp CAACCTTCTTGCTCACACATGTAAG
Gli1 probe CGCACCTTCGGTCGCACACG
Bcl-2 fp GCCCTGTGCCACCATGTG
Bcl-2 rp CGGTAGCGACGAGAGAAGTCA
Bcl-2 probe CCATCTGACCCTCCGCCGGG
【０４２９】
以上のプローブは全て、蛍光染色料ｆａｍ（６−カルボキシ−フルオロセイン）で標識した。１８Ｓのプライマー／プローブ混合物は、Applied Biosystems社製のもので、蛍光染料ｖｉｃTMで標識されている。蓋付きの９６ウエル光学反応用プレートに、各ｃＤＮＡ試料をそれぞれウエル２個に２５μｌずつ注ぎ込んだ。このプレートを、ＳＤＳソフトウエアを用いるABI Prism 7700 sequence detectorに搭載した。ＰＣＲ条件は次のとおり。５０℃で２分、９５℃で１０分、その後９５℃で１５秒のサイクルを４０回、さらに６０℃で１分。次に上記ソフトウエアによりデータを解析し、各試料について一対の「ｃｔ」値を出した。「ｃｔ」は、シグナルが設定閾値を超えるのに必要なサイクル数である。各試料につき、目的遺伝子のものと１８Ｓハウスキーピング対照のものとで、ｃｔ値を２つ得た。かかるｃｔ値を次にMicrosoft Excel spreadsheet に移し、製造者マニュアルに従って解析し、目的遺伝子における直線的な相対的ｍＲＮＡレベルを表す値を得た。
【実施例１２】
【０４３０】
静止抹消ＣＤ４+Ｔ細胞、活性化抹消ＣＤ４+Ｔ細胞、並びに二次リンパ組織におけるヘッジホッグシグナル伝達経路構成因子の発現
Ｓｈｈ、Ｐｔｃ、Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１をコードするｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより考察した。成熟胸腺から得たＲＮＡを正の対照として用い、静止（ｔ＝０）ＣＤ４+Ｔ細胞と、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化した（ｔ＝７２）ＣＤ４+Ｔ細胞の両方における上記各遺伝子の発現と比較した。これらの静止及び活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の両方で、Ｓｈｈ、Ｐｔｃ、Ｓｍｏ及びＧｌｉ１の特異的転写産物が認められた（図１８）。
【０４３１】
Ｓｈｈシグナル伝達経路のメンバーは胸腺で発現する（Outram et al）。特にＳｈｈは、胸腺上皮細胞で認められるが、胸腺細胞では認められない。他方、受容体であるＳｍｏ及びＰｃｔは、発達の種々の段階において胸腺細胞で認められる（Outram et al）。さらにＳｈｈ、ｐｔｃ及びｓｍｏの転写産物は成熟ＣＤ３+Ｔ細胞集団から検出され（１５）、本発明の知見と一致する結果となっている。
【０４３２】
抹消免疫系にヘッジホッグシグナル伝達経路の構成因子が存在することを証明するため、Ｓｈｈ及びＰｔｃタンパク質の発現を免疫細胞化学法により脾臓及びリンパ節で調べた。ＰｔｃとＳｈｈの両方を発現する細胞が、脾臓（図１８Ｂ−Ｄ）及びリンパ節（データは示さず）で認められた。
【０４３３】
同様の実験を行い、Ｓｈｈ（図４）及びＰｔｃ（図５）のＴ細胞における発現、並びにヘッジホッグシグナル伝達経路構成因子のリンパ組織における発現（図６）を調べた。図１４は、Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｈｉｐ、Ｐｔｃの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示すものである。Ｔ細胞を活性化したことにより、ＳｈｈｍＲＮＡレベルが持続的かつ顕著（約８０倍）に増加し、４４時間後及び７２時間後にピークに達した。Ｐｔｃは、Ｔ細胞活性化の結果ダウンレギュレーションを示した。２４時間後では、Ｓｈｈの添加によりＳｈｈｍＲＮＡの発現がダウンレギュレートしたと考えられる。これは、ＰＣＲを４０サイクル（アッセイの限界）行っても何らシグナルが認められなかったからである。ＳｈｈはＰｔｃのダウンレギュレーションに影響しないとみられる。活性化Ｔ細胞培養にＳｈｈを添加したところ、Ｉｈｈはダウンレギュレートされ、Ｈｉｐはアップレギュレートされた。
【０４３４】
これら遺伝子の発現はまたサイトカインによっても調節される（図１５及び１７）。ＩＦＮｇは、活性化Ｔ細胞におけるＳｈｈの発現を調節する（２４時間後にダウンレギュレーションが観察され（早期）、４８時間後にアップレギュレーションが観察される）。Ｈｉｐは、２４及び４８時間後にアップレギュレートされるが、７２時間後にはダウンレギュレートされる。従ってＳｈｈ経路は、Ｔ細胞活性化及びサイトカインへの反応性を調節することができると考えられる。
【実施例１３】
【０４３５】
Ｓｈｈペプチドが抹消ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を促進する
精製抹消ＣＤ４+Ｔ細胞を、生物活性を有するアミノ末端Ｓｈｈペプチドを添加して或いは非添加で培養した。初期滴定曲線から、Ｓｈｈペプチドが抹消ＣＤ４+Ｔ細胞増殖を増強するには、５００ｎｇ／ｍｌが最適投与量であることが確定し（データは示さず）、この濃度をその後の全実験で採用した。静止ＣＤ４+Ｔ細胞、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）で最大限に刺激したＣＤ４+Ｔ細胞、抗ＣＤ３抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌ）で準最適化したＣＤ４+Ｔ細胞のそれぞれに、Ｓｈｈを添加した。
【０４３６】
静止ＣＤ４+Ｔ細胞にＳｈｈペプチドを添加しても増殖の程度に有意の違いは認められなかった（図１９Ａ）。最大限に刺激したＴ細胞では、Ｓｈｈペプチドを２回、すなわち抗ＣＤ３／２８抗体による活性化の２４時間前に（ｔ＝−２４）又は同活性化と同時に（ｔ＝０）添加した。しかしいずれの時点においても、3［Ｈ］−ＴｄＲの取込み量から測定した増殖レベルに有意の差はなかった（図１９Ａ）。
【０４３７】
抗ＣＤ３／２８抗体による処理で最大限に刺激したＣＤ４+Ｔ細胞に対し、Ｓｈｈは調節効果を有しないと考えられることから（注．インビトロで抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を飽和量投与することによって媒介されるレベルの活性化をもたらすような環境化でインビボ抗原が出現するとは考えられない。）、準最適化した抗ＣＤ３抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌ）による刺激下でこれらの実験を繰り返した。前述したように、Ｓｈｈペプチドを活性化に対してｔ＝−２４及びｔ＝０の時点で培養に加えた。ｔ＝０でＳｈｈペプチドを添加したところ、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖は、７６．２〜１２８％の範囲で有意に亢進した（平均＝１０１．６％；ｐ＜０．０１；図１９Ｂ）。3［Ｈ］−ＴｄＲの取込みから増殖を測定し、７２時間後に確定した。準最適化抗ＣＤ３／２８抗体による活性化の２４時間前にＳｈｈペプチドを添加した場合も、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖が１６〜６３％の範囲で有意に亢進した（平均＝４６％；ｎ＝３；ｐ＜０．０４；図１９Ｂ）。
【０４３８】
図７及び図８に同様の実験から得た結果を示す。図７は活性化ＣＤ４+Ｔ細胞において
、図８はＣＤ８+Ｔ細胞において、３Ｈ−チミジン取込みがＳｈｈ添加によって添加量依存で有意に増強される様子をそれぞれ示している。これは増殖亢進又は生存率増大のいずれか（又はその両方をあわせたもの）を反映している。
【０４３９】
細胞増殖はTrypan細胞染色によっても分析が可能である（図１１及び図１２）。図１２から、培養中のマウス脾臓細胞及び精製ＣＤ４+Ｔ細胞にＳｈｈを添加すると４日間の期間にわたって、それらの生存率が増大することがわかる。
【実施例１４】
【０４４０】
ＳｈｈペプチドがＳ／Ｇ２期への細胞の移行を促進する
細胞周期分析により、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖に及ぼすＳｈｈの効果をさらに調べ、Ｓｈｈが細胞生存率に影響を与えたか、若しくは細胞周期におけるＳ／Ｇ２増殖期への移行を促進したかという点につき考察を加えた。3［Ｈ］−ＴｄＲ取込みに関する考察同様に、静止ＣＤ４+Ｔ細胞、並びに最適及び準最適に活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞について分析した。外因性Ｓｈｈを、抗ＣＤ３／２８抗体による活性化と同時に（ｔ＝０）、又はその２４時間前に（ｔ＝−２４）添加し、７２時間後にこれらのＴ細胞を分析した。静止ＣＤ４+Ｔ細胞の場合は、Ｓｈｈペプチドをｔ＝０で添加し、２４、４８、７２時間後に細胞の分析を行った。細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２期に分布する細胞の割合を分析し、その結果からＧ１及びＳ／Ｇ２期における生細胞の割合を計算した。図２０Ａ及び図２０Ｂは、細胞周期分析の方法を説明するために、Ｓｈｈ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下における細胞周期分布の代表的なプロットを示す図である。
【０４４１】
細胞生存率に対する効果は、静止ＣＤ４+Ｔ細胞にＳｈｈを添加したときが最小だった。活性化されなかった生存ＣＤ４+Ｔ細胞の割合は、Ｓｈｈ添加培養と非添加培養とで極似していた（図２０Ｂ）。Ｓ／Ｇ２期における細胞割合における違いは無視できる程度のものだった。
【０４４２】
最適活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞（抗ＣＤ３抗体＝１μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８抗体＝５μｇ／ｍｌ）の場合は、ｔ＝０でのＳｈｈ添加により、細胞周期のＳ／Ｇ２増殖期へのＣＤ４+Ｔ細胞の移行が促進された。生細胞の割合は、Ｓｈｈ添加、非添加の場合で極似していたが、外因性Ｓｈｈの添加により、Ｓ／Ｇ２期への移行をとおして上記生細胞における増殖は促進された（図２０Ｄ）。しかしこのようにＳ／Ｇ２期にみられる生細胞の割合増加は、９％〜１４４％（平均＝６３．７％；ｎ＝３）の範囲で変動し、統計的有意性を満たさなかった。最適活性化の２４時間前にＳｈｈを添加することによっても、細胞周期におけるＳ／Ｇ２増殖期へのＣＤ４+Ｔ細胞の移行が促進された。この場合も、生細胞の割合はＳｈｈ添加、非添加で極似していたが、Ｓｈｈを添加することにより、Ｓ／Ｇ２期における細胞増加が認められ、その範囲は５３．１〜９７．１％（平均＝７１．５％；ｎ＝３；ｐ＜０．０１）だった。
【０４４３】
外因性Ｓｈｈに反応して亢進するＣＤ４+Ｔ細胞増殖が、抗ＣＤ３／２８抗体で最大限に処理しなくても、さらに増強されるかどうかを考察するために、準最適に活性化したＣＤ４+Ｔ細胞についても細胞周期分析を行った。これらのＣＤ４+Ｔ細胞では、ｔ＝０でＳｈｈペプチドを添加したところ、やはり増殖が亢進した（図２０Ｄ）。前述と同様に、最適活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の生細胞の割合は、Ｓｈｈを添加したときと非添加の場合で似ていたが、それら生細胞においてはｔ＝０でＳｈｈを添加した場合にＳ／Ｇ２増殖期への細胞の移行が促進され、Ｓ／Ｇ２期における生細胞の増加率は２７．８％〜７７．８％（平均＝５５．８％；ｎ＝３；ｐ＜０．０２）だった。準最適活性化の２４時間前にＳｈｈペプチドを添加したところ、生存ＣＤ４+Ｔ細胞の割合が増加した（ｐ＜０．０２）。しかしながら図２０Ｄに示されるように外因性Ｓｈｈの添加に伴い、３４．６％〜１１０％の範囲（平均＝６１．５％；ｎ＝３；ｐ＜０．０３）で、有意に、より高率の生細胞がＳ／Ｇ２増殖期へと移行しており、上記実験におけると同様のパターンが繰り返された。さらなる実験結果を図１３に示す。
【実施例１５】
【０４４４】
抗Ｓｈｈ抗体が、ＴＣＲに介在されるＣＤ４+Ｔ細胞のインビトロでの増殖を阻害する
外因性Ｓｈｈが活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を促進することが明らかになったことから、ＴＣＲ介在シグナル伝達を受けてＣＤ４+Ｔ細胞がＳｈｈを産生するかどうかを調べてみた。中和抗Ｓｈｈ抗体（５Ｅ１）の存在下において、ＣＤ４+Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化した。この一連の実験では準最適に活性化したＣＤ４+Ｔ細胞を使用した。これは、3［Ｈ］−ＴｄＲ取込みと細胞周期Ｓ／Ｇ２期への移行増加の両側面から測定したところ、かかる条件下では準最適に活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の増殖が亢進したからである。活性化と同時に抗Ｓｈｈ抗体を添加したところ、添加量依存で増殖が阻害された。その減少率は、抗Ｓｈｈ抗体５０μｇ／ｍｌの存在下で７１．３％〜８５．１％（ｎ＝３；ｐ＜０．０３；図２１）の範囲だった。アイソタイプ対照抗体存在下においては増殖の阻害は認められなかった。これらの結果は、中和抗体がＳｈｈには結合するが受容体ｐｔｃには結合しないことから、内因性Ｓｈｈが活性化ＣＤ４+Ｔ細胞によって産生されることを明らかにするものである。
【実施例１６】
【０４４５】
抗Ｓｈｈ抗体がＳ／Ｇ２期への細胞の移行を阻止する
細胞周期に対する抗Ｓｈｈ抗体の効果も調べてみた（図２４）。Ｓｈｈペプチドに関する考察と同様に、抗Ｓｈｈ抗体も培養における生細胞の割合を変化させることはなかったが、細胞周期Ｓ／Ｇ２増殖期へのＣＤ４+Ｔ細胞の移行を阻止するという効果を表した。抗Ｓｈｈ抗体（５０μｇ／ｍｌ）添加に伴うＳ／Ｇ２期のＣＤ４+Ｔ細胞比率の減少率は、６６．２％〜８１．６％の範囲だった（平均＝７３．４％；ｎ＝３；ｐ＜０．０２）。アイソタイプ対照抗体を用いた場合、かかる効果は認められなかった。
【実施例１７】
【０４４６】
刺激した外因性Ｓｈｈの存在下及び不在下での活性化ＣＤ４+Ｔ細胞におけるＳｈｈ、ｐｔｃ、Ｇｌｉ１、ｂｃｌ−２の発現に関するキネティック分析
ＴＣＲに介在されるＣＤ４+Ｔ細胞活性化におけるＳｈｈ増幅機構を分析するため、Ｓｈｈシグナル伝達経路の構成因子及びｂｃｌ−２の発現のキネティック分析を、外因性Ｓｈｈの存在下及び不在下において活性化ＣＤ４+Ｔ細胞で行った。前述のようにＣＤ４+Ｔ細胞培養物を準備し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で準最適に活性化し、ｔ＝０でＳｈｈを添加した。活性化後、２４、４８、７２時間後にＲＮＡを抽出した。少なくとも２つの時点で遺伝子の転写が２倍以上に増加する場合を有意とすることが報告されている（Chtanova et al and Granucci et al）。上記のＣＤ４+Ｔ細胞培養においてＳｈｈペプチドの増殖が増強されることを確認するために、増殖アッセイ及び細胞周期アッセイも同時に行った。
【０４４７】
２４時間後のＲＮＡ試料（値を１とする）に対し、４８及び７２時間後の試料を正規化して経時的分析を行った。Ｓｈｈ不在下で、準最適化した抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＣＤ４+Ｔ細胞において、ＳｈｈとＧｌｉ１の転写量が有意に増加していることを本発明者らは見い出したが、ｐｔｃ又はｂｃｌ−２について行った実験ではいずれも有意の変化は測定されなかった（図２２Ａ）。外因性Ｓｈｈ存在下では、４８時間後及び７２時間後のいずれにおいてもＳｈｈの転写量が増加していた。Ｇｌｉ１の転写量は４８時間後に増加し、７２時間後にも維持されていた。ｂｃｌ−２転写産物は、４８時間後と７２時間後の両方で増加していた。しかし、ｐｔｃの転写量は７２時間後に僅かな増加を示したものの、有意の増加量ではなかった（図２２Ｂ）。
【０４４８】
種々の遺伝子の転写にＳｈｈペプチドが及ぼす効果を調べるために、Ｓｈｈペプチドを添加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞培養物から得たＲＮＡ試料を、それぞれ対応する時点において（２４時間後、４８時間後、７２時間後）、培地単独で活性化された培養物に対して正規化した。外因性Ｓｈｈペプチドを添加した或いは非添加の活性化ＣＤ４+Ｔ細胞間におけるｐｔｃとＧｌｉ１の転写レベルの違いは、時間的経過を通じてみられなかった。Ｓｈｈの転写は、培地単独で活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の場合と比べ、外因性Ｓｈｈペプチドを添加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞では２４時間後に著しく減少していた（図２３Ａ）。ｂｃｌ−２の転写は、培地単独で活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の場合と比べ、外因性Ｓｈｈペプチドを添加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞では７２時間後に大幅に増加していた（図２３Ｂ）。
【実施例１８】
【０４４９】
ＦＡＣＳ分析
図９は、ＣＤ３+Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体単独で７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（活性化処理のみ）におけるＣＤ６９発現、また、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体に加え、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈを添加して７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現のツーカラーＦＡＣＳ分析プロフィールを示す図である。Ｓｈｈ処理により、ＣＤ６９の発現が３３．８７％から７０．５７％に増加していることが図９からわかる。
【０４５０】
図１０は、ＣＤ３+Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体単独で７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（活性化処理のみ）におけるＣＤ２５発現、また、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体に加え、１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈを添加して７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現のツーカラーＦＡＣＳ分析プロフィールを示している。Ｓｈｈ処理により、ＣＤ２５の発現が３１．６４％から８０．４６％に増加していることが図１０からわかる。
【０４５１】
ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βによってもＳｈｈ発現がダウンレギュレーションされたことを本発明で明らかにした。
【０４５２】
要約すれば本発明者らは、ヒト及びマウスを用いた研究の結果、以下に示すＴ細胞に対するＳｈｈの効果を意外にも見い出した。
−  静止Ｔ細胞の生存を促進する。
−  活性化Ｔ細胞の細胞周期への移行を調節する。
−  活性化Ｔ細胞において抗体が阻止されることにより、細胞周期への移行が調節されるが、このことからＴ細胞もまたＳｈｈタンパク質を産生することがわかる。
−  ＣＤ６９やＣＤ２５等のＴ細胞活性化マーカーをアップレギュレートする。
−  ＰＣＲの結果から示されるように、Ｓｈｈや他のシグナル伝達構成因子の発現を調節する。
−  Ｇｌｉ２／３へテロ接合体ノックアウトマウスにおいてはＴ細胞に対するＳｈｈの効果が変化しているが、このことからＳｈｈが古典的なシグナル伝達経路を介して機能することが示される。
−  活性化Ｔ細胞によるＳｈｈ産生がＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γによってダウンレギュレーションする。
−  抗体染色による免疫化学法の結果から、Ｓｈｈ及びＰｔｃタンパク質がＴ細胞によって発現されることが示される。
−  Ｓｈｈは、Ｔ細胞によるＰｔｃの発現を調節できる。
−  Ｓｈｈは、Ｔ細胞遺伝子の発現パターンを調節できる。
【０４５３】
2004534743.tif 000011
2004534743.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０４５４】
【図１】図１は、ヘッジホッグシグナル伝達を表す概略図である。
【図２】図２は、ヘッジホッグシグナル伝達の構成因子を示す概略図であり、また、
【図３】図３は、Ｗｎｔシグナル伝達を表す概略図である。
【図４】図４は、ヒトＴ細胞におけるＳｈｈ発現を示す図である。図４（Ａ）は、刺激されなかったＴ細胞における抗Ｓｈｈ抗体の免疫染色の結果を示す図である。図４（Ｂ）は、ＣＤ４+及びＣＤ８+ヒトＴ細胞によるＳｈｈの発現をＰＣＲ分析で調べた結果を示す図である。ｐＳＨＨ＝Ｓｈｈプラスミド対照。
【図５】図５は、ヒトＴ細胞におけるＰｔｃの発現を示す図である。図５（Ａ）は、Ｓｈｈ濃度の上昇が、２４時間後に不活化ヒトＣＤ４+Ｔ細胞においてＰｔｃ ｍＲＮＡレベルに与える効果をTaqman分析法により分析した結果を示す図である。図５（Ｃ）は、抗ヒトＰｔｃ抗体を用いてヒトＴ細胞を抗体染色した結果を示す図である。図５（Ｄ）は、それぞれヒトのＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、及びＢ細胞におけるＰｔｃの発現をＰＣＲ分析によって調べた結果を示す図である。
【図６】図６は、抹消リンパ組織におけるヘッジホッグ経路構成因子の発現に関するＰＣＲ分析結果を示す図である。脾臓（Ｓ）、リンパ節（ＬＮ）、胸腺（Ｔ）で表す。水（Ｈ2Ｏ）を負の対照とした。
【図７】図７は、ＳｈｈのＮ末端活性ペプチド（ａＣＤ３／ａＣＤ２８）共存下で培養したヒトＣＤ４Ｔ細胞の増殖を示す図である（３Ｈチミジンの取込みから測定）。
【図８】図８は、ＳｈｈのＮ末端活性ペプチド共存下で培養したヒトＣＤ８Ｔ細胞の増殖を示す図である（３Ｈチミジンの取込みから測定）。
【図９】図９は、ＣＤ３+Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体単独で７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（活性化処理のみ）におけるＣＤ６９発現、この条件にさらに１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈを添加したＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現のツーカラーＦＡＣＳ分析による発現プロフィールを示す図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ３+Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現、及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体単独で７２時間活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（活性化処理のみ）におけるＣＤ２５発現、この条件にさらに１００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈを添加した場合のＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現のツーカラーＦＡＣＳ分析による発現プロフィールを示す図である。
【図１１】図１１は、Ｓｈｈ単独で刺激したヒトＣＤ４+Ｔ細胞のインビトロでの生存率に及ぼすＳｈｈの効果を示す図である。生存率は、培養下の死細胞と生細胞にTrypanブルー染色を施して測定した。
【図１２】図１２は、培養下のマウス脾臓細胞及び精製ＣＤ４+Ｔ細胞（活性化処理なし）に対するＳｈｈ（１０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す図である。対照として、Ｓｈｈ無添加培地で培養した細胞を用いた。
【図１３】図１３は、培地単独下、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体の共存下、並びに抗Ｓｈｈ中和モノクローナル抗体の存在下若しくは不在下においてそれぞれ培養したＣＤ４+Ｔ細胞における細胞周期の進行に対するＳｈｈ（１０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す図である。
【図１４】図１４は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下及び不在下、及び／又はＳｈｈの存在下及び不在下におけるＣＤ４+Ｔ細胞でのＳｈｈ、Ｉｈｈ、ＨＩＰ及びＰｔｃの発現を調べるTaqmanリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下、ＩＦＮ−ｇサイトカインの存在下又は不在下で、ＣＤ４+Ｔ細胞におけるＳｈｈ、Ｉｈｈ、ＨＩＰ及びＰｔｃの発現を調べるリアルタイムＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｓｈｈに誘導されるＴ細胞の生存にはＧｌｉシグナル伝達が必要であることを示す図である。細胞生存率の測定は、Ｓｈｈの存在下（１０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌ）及び不在下で、Ｇｌｉ２-／Ｇｌｉ３-マウス細胞（すなわち、ゲノムからＧｌｉ２とＧｌｉ３の対立遺伝子が１つずつ欠失しているマウスの細胞）で行った。
【図１７】図１７は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体存在下でのＣＤ４+Ｔ細胞におけるＳｈｈ、Ｉｈｈ、Ｐｔｃ、及びＨｉｐの発現分析結果を示す図である。５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０含有培地、及び５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ含有培地での発現を、静止ＣＤ４+Ｔ細胞における発現と比較した。
【図１８】図１８は、抹消ＣＤ４+Ｔ細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の構成因子の発現を示す図である。図１８（Ａ）は、成熟マウスの正常胸腺（ａ；正の対照として）、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞（ｂ）、及び静止ＣＤ４+Ｔ細胞（ｃ）におけるｓｈｈ（Ｓ）、Ｇｌｉ１（Ｇ）、ｓｍｏ（Ｓｍ）及びｐｔｃ（Ｐ）の発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す図である。産物のサイズも表示した（ｂｐ＝塩基対）。水（Ｈ2Ｏ）を負の対照として用いた。図１８（Ｂ−Ｄ）は、脾臓におけるＳｈｈ（Ｃ）及びｐｔｃ（Ｄ）タンパク質の発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す図である。対照アイソタイプも示した（Ｂ）。原倍率は×４００。
【図１９】図１９は、準最適に活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞の増殖を外因性Ｓｈｈが増強する様子を示す図である。１９（Ａ）は、培地単独で培養した静止Ｔ細胞（白抜きのバー）、又はＳｈｈペプチド添加培地で培養した静止Ｔ細胞（５００ｎｇ／ｍｌ；網掛けのバー）、抗ＣＤ３抗体（１．０μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）単独で最適活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（白抜きのバー）、又は活性化処理の０時間又は２４時間前にＳｈｈを添加して最適活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（網掛けのバー）のそれぞれにおける増殖を示す図である。図１９（Ｂ）は、抗ＣＤ３抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌ）単独で準最適活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（白抜きのバー）、又は活性化処理の０時間及び２４時間前に添加した５００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈペプチド存在下で活性化したＣＤ４+Ｔ細胞（網掛けのバー）のそれぞれにおける増殖を示す図である。データは個別に３回行った実験から得た結果の平均ｃｐｍ値で表した。*Ｓｈｈ不在下での増殖より有意に高値ｐ＝＜０．０１、**ｐ＝＜０．０４．
【図２０】図２０は、Ｓｈｈが活性化ＣＤ４+Ｔ細胞のＳ／Ｇ２期への移行を促進するが、静止ＣＤ４+Ｔ細胞におけるＳ／Ｇ２期への移行は促進しないことを示す図である。図２０（Ａ及びＢ）は、Ｓｈｈ不在下（Ａ）又はＳｈｈ存在下（Ｂ）において、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）で活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の細胞周期分析の代表的なプロットを示す図である。図２０（Ｃ）は、２４、４８又は７２時間後におけるＳｈｈペプチド（５００ｎｇ／ｍｌ）の不在下又は存在下における静止ＣＤ４+Ｔ細胞の代表的な細胞周期分析のデータを示す図である。図２０（Ｄ）は、Ｓｈｈ不在下、又は活性化処理の０又は２４時間前に添加した５００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈペプチド存在下で、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）で最適活性化したＣＤ４+Ｔ細胞、或いは抗ＣＤ３抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）で準最適活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の代表的な細胞周期分析のデータを示す図である。
【図２１】図２１は、抗Ｓｈｈ抗体を中和することにより、ＴＣＲに介在されるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖が阻害される様子を示す図である。ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖は3Ｈ−ＴｄＲの取込みにより測定することとし、７２時間後に測定した。ＣＤ４+Ｔ細胞は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で準最適活性化し、中和抗Ｓｈｈ抗体（５Ｅ１）又はアイソタイプ対照を活性化の時点で添加した。
【図２２】図２２は、外因性Ｓｈｈ添加及び非添加における活性化ＣＤ４+Ｔ細胞でのＳｈｈ、ｐｔｃ、Ｇｌｉ１及びｂｃｌ−２遺伝子発現のキネティック分析の結果を示す図である。培地単独（Ａ）、又は活性化の時点で外因性Ｓｈｈを添加した培地（Ｂ）において準最適濃度の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によりＣＤ４+Ｔ細胞を活性化した。２４、４８及び７２時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを単離してリアルタイムＰＣＲにより転写産物を測定した。
【図２３】図２３は、外因性Ｓｈｈ添加及び非添加における活性化ＣＤ４+Ｔ細胞でのＳｈｈ及びｂｃｌ−２遺伝子の相対的発現レベルを示す図である。培地単独、又は活性化の時点で外因性Ｓｈｈを添加した培地において準最適濃度の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によりＣＤ４+Ｔ細胞を活性化した。２４、４８及び７２時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを単離してリアルタイムＰＣＲにより転写産物を測定した。Ｓｈｈ（Ａ）及びｂｃｌ−２（Ｂ）の転写に対する外因性Ｓｈｈペプチドの効果を調べるために、Ｓｈｈペプチドを添加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞培養物から得たＲＮＡ試料を、同時点における培地単独で活性化した培養物に対して正規化した。
【図２４】図２４は、中和抗Ｓｈｈ抗体が細胞周期におけるＣＤ４+Ｔ細胞のＳ／Ｇ２期への移行を阻害することを示す図である。詳細には、中和抗Ｓｈｈ抗体（５Ｅ１）の不在下又は存在下で、抗ＣＤ３抗体（０．２５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を用いてＣＤ４+Ｔ細胞を準最適活性化した場合の代表的な実験における細胞周期分析を示すものである。
【図１】
2004534743.tif 000013
【図２】
2004534743.tif 000014
【図３】
2004534743.tif 000015
【図４】
2004534743.tif 000016
【図５】
2004534743.tif 000017
【図６】
2004534743.tif 000018
【図７】
2004534743.tif 000019
【図８】
2004534743.tif 000020
【図９】
2004534743.tif 000021
【図１０】
2004534743.tif 000022
【図１１】
2004534743.tif 000023
【図１２】
2004534743.tif 000024
【図１３】
2004534743.tif 000025
【図１４】
2004534743.tif 000026
【図１５】
2004534743.tif 000027
【図１６】
2004534743.tif 000028
【図１７】
2004534743.tif 000029
【図１８】
2004534743.tif 000030
【図１９】
2004534743.tif 000031
【図２０】
2004534743.tif 000032
【図２１】
2004534743.tif 000033
【図２２】
2004534743.tif 000034
【図２３】
2004534743.tif 000035
【図２４】
2004534743.tif 000036
【国際公開パンフレット】
2004534743.tif 000037
2004534743.tif 000038
2004534743.tif 000039
2004534743.tif 000040
2004534743.tif 000041
2004534743.tif 000042
2004534743.tif 000043
2004534743.tif 000044
2004534743.tif 000045
2004534743.tif 000046
2004534743.tif 000047
2004534743.tif 000048
2004534743.tif 000049
2004534743.tif 000050
2004534743.tif 000051
2004534743.tif 000052
2004534743.tif 000053
2004534743.tif 000054
2004534743.tif 000055
2004534743.tif 000056
2004534743.tif 000057
2004534743.tif 000058
2004534743.tif 000059
2004534743.tif 000060
2004534743.tif 000061
2004534743.tif 000062
2004534743.tif 000063
2004534743.tif 000064
2004534743.tif 000065
2004534743.tif 000066
2004534743.tif 000067
2004534743.tif 000068
2004534743.tif 000069
2004534743.tif 000070
2004534743.tif 000071
2004534743.tif 000072
2004534743.tif 000073
2004534743.tif 000074
2004534743.tif 000075
2004534743.tif 000076
2004534743.tif 000077
2004534743.tif 000078
2004534743.tif 000079
2004534743.tif 000080
2004534743.tif 000081
2004534743.tif 000082
2004534743.tif 000083
2004534743.tif 000084
2004534743.tif 000085
2004534743.tif 000086
2004534743.tif 000087
2004534743.tif 000088
2004534743.tif 000089
2004534743.tif 000090
2004534743.tif 000091
2004534743.tif 000092
2004534743.tif 000093
2004534743.tif 000094
2004534743.tif 000095
2004534743.tif 000096
2004534743.tif 000097
2004534743.tif 000098
2004534743.tif 000099
2004534743.tif 000100
2004534743.tif 000101
2004534743.tif 000102
2004534743.tif 000103
2004534743.tif 000104
2004534743.tif 000105
2004534743.tif 000106
2004534743.tif 000107
2004534743.tif 000108
2004534743.tif 000109
2004534743.tif 000110
2004534743.tif 000111
2004534743.tif 000112
2004534743.tif 000113
2004534743.tif 000114
2004534743.tif 000115
2004534743.tif 000116
2004534743.tif 000117
2004534743.tif 000118
2004534743.tif 000119
2004534743.tif 000120
2004534743.tif 000121
2004534743.tif 000122
2004534743.tif 000123
2004534743.tif 000124
2004534743.tif 000125
2004534743.tif 000126
2004534743.tif 000127
2004534743.tif 000128
2004534743.tif 000129
2004534743.tif 000130
2004534743.tif 000131
2004534743.tif 000132
2004534743.tif 000133
2004534743.tif 000134
2004534743.tif 000135
2004534743.tif 000136
2004534743.tif 000137
2004534743.tif 000138
2004534743.tif 000139
2004534743.tif 000140
2004534743.tif 000141
2004534743.tif 000142
2004534743.tif 000143
2004534743.tif 000144
2004534743.tif 000145
2004534743.tif 000146
2004534743.tif 000147
2004534743.tif 000148
2004534743.tif 000149
2004534743.tif 000150
2004534743.tif 000151
2004534743.tif 000152
2004534743.tif 000153
2004534743.tif 000154
2004534743.tif 000155
2004534743.tif 000156
2004534743.tif 000157
2004534743.tif 000158
2004534743.tif 000159
2004534743.tif 000160
2004534743.tif 000161
2004534743.tif 000162
2004534743.tif 000163
2004534743.tif 000164
2004534743.tif 000165
2004534743.tif 000166
2004534743.tif 000167
2004534743.tif 000168
2004534743.tif 000169
2004534743.tif 000170
2004534743.tif 000171
2004534743.tif 000172
2004534743.tif 000173
2004534743.tif 000174
2004534743.tif 000175
2004534743.tif 000176
2004534743.tif 000177
2004534743.tif 000178
2004534743.tif 000179
2004534743.tif 000180
2004534743.tif 000181
2004534743.tif 000182
2004534743.tif 000183
2004534743.tif 000184
2004534743.tif 000185
2004534743.tif 000186
2004534743.tif 000187
2004534743.tif 000188
2004534743.tif 000189
2004534743.tif 000190
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534743.tif 000191
【国際調査報告】
2004534743.tif 000192
2004534743.tif 000193
2004534743.tif 000194
2004534743.tif 000195
2004534743.tif 000196
2004534743.tif 000197
2004534743.tif 000198