(57)【要約】本発明は、有効成分ＰＡ（例えばインスリン）を送達するナノ粒子ＰＶの、生理的媒質中で安定な水性懸濁液に関する。このＰＶは、三元ブロック共重合体、ポリエチレングリコール／親水性ポリアミノ酸／疎水性ポリアミノ酸をベースにしている。三元ブロック共重合体粒子は、ＰＡを変性させることなく、これと会合することができ、生体内では制御しながら非常に長時間にわたってＰＡを放出する。その結果、非常に長時間にわたる作用持続時間がＰＡに付与される。また、本発明は、ＰＶが誘導される三元共重合体をベースとする粉末固体にとどまらず、この粉末固体およびこのＰＶ懸濁液の製造にも関する。本発明は、有効成分を保持する前記送達粒子から得ることができる医薬専門品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分（ＰＡ）を送達するために特に使用することができ、個別化された超分子配置をとっている、サブミクロンサイズの粒子のコロイド状懸濁液であって、前記粒子は、
ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの親水性重合体の少なくとも一つのブロックと、
αペプチド鎖を有する少なくとも一つの線状両親媒性コポリアミノ酸（ＰＡＡ）と
を含む少なくとも一つの両親媒性共重合体をベースにしており、かつ、
非溶解状態のコロイド懸濁液中で少なくとも一つのＰＡと会合し、特に生体内で長時間および／または徐々に放出することができる
ことを特徴とするコロイド状懸濁液。
【請求項２】
前記粒子を構成する両親媒性コポリアミノ酸（ＰＡＡ）のアミノ酸は、
少なくとも一つの親水性アミノ酸（ＡＡＩ）、好ましくは少なくとも部分的にイオン化したイオン化しうる鎖を持つアミノ酸、好ましくは、Ｇｌｕおよび／またはＡｓｐおよびその塩および／またはＬｙｓおよびこれらの混合物の群から選択される第一のタイプと、
少なくとも一つの疎水性アミノ酸（ＡＡＯ）、好ましくは天然の中性アミノ酸、有利にはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅおよびこれらの混合物のサブグループのもの、希少なまたは合成の中性アミノ酸、有利にはノルロイシン、ノルバリンおよびこれらの混合物、極性アミノ酸誘導体、有利にはグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、Ｎ−アセチルリシンおよびこれらの混合物のサブグループのもの、およびこれらの混合物の群から選択される第二のタイプとの
少なくとも二つのタイプであることを特徴とする、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記粒子を構成する前記両親媒性コポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、全体として親水性の少なくとも一つの配列と、全体として疎水性の少なくとも一つの配列とを包含することを特徴とする、請求項１または２に記載の懸濁液。
【請求項４】
前記粒子を構成する前記両親媒性コポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、ランダム構造を成すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項５】
前記粒子を構成する前記両親媒性コポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、ブロック構造を成すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項６】
前記両親媒性ＰＡＡブロックは有利には、
アミノ酸ＡＡＩから本質的に成り、かつ、絶対長さがＡＡＩモノマー５個以上、好ましくはＡＡＩモノマー２００個以上、さらに好ましくはＡＡＩモノマー１０〜５０個の、全体として親水性である、少なくとも一つの配列と、
アミノ酸ＡＡＯから本質的に成り、かつ、絶対長さがＡＡＯモノマー５個以上、好ましくはＡＡＯモノマー１０個以上、さらに好ましくはＡＡＯモノマー１０〜５０個の、全体として親水性である、少なくとも一つの配列と
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の懸濁液。
【請求項７】
前記親水性ＰＡＧ−好ましくはＰＥＧ−は、その絶対長さがモノマー５個以上の長さ、好ましくはモノマー５〜１２０個の長さ、さらに好ましくはモノマー５〜５０個の長さであるブロックの形態であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項８】
前記粒子は、線状三元ブロック共重合体ＰＥＧ／ＡＡＩ／ＡＡＯの鎖から成り、その構造は、好ましくは次式：
【化１】
2004525939.tif 000007
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、炭素数が１〜２０の直鎖または分枝アルキル基（置換または非置換）、アリール基好ましくはベンジル基（置換または非置換）；
Ｒ２は、ＮＨ、ＣＯ−ＮＨ、ＣＳ−ＮＨ、Ｒ８−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ９（ここでＲ８およびＲ９は、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ、ＣＯＯ、ＮＨ、ＣＯの群から互いに独立に選択される；ｔ＝１〜６、［ＮＨＣＨ（Ｒ１）ＣＯ−］ｘ）；
Ｒ３は、イオン化しうる親水性アミノ酸（天然または合成誘導体）を規定する基の中から選択される鎖長が同じか、または異なる基であって、好ましくは（ＣＨ２）ｐＣ６Ｈ４ＯＭ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｍ、（ＣＨ２）ｐＮ（ＨｃＲ１ｄ）３Ｘ（式中ｐ≧１であるが、好ましくは１または２）；ａおよびｂは、０〜３の値であって、かつａ＋ｂ＝３）；ｘは、好ましくは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸水素イオン、酢酸イオン、乳酸イオンである；
Ｒ４は、Ｈ、Ｍｅの群から選択される鎖長が同じか、または異なる基；
Ｒ５は、疎水性アミノ酸（天然または合成誘導体）を規定する基の群から選択される鎖長が同じか、または異なる基であって、好ましくはＨ、Ｒ１、（ＣＨ２）ｑＣ６Ｈ５、（ＣＨ２）ｑＣ６Ｈ４ＯＲ１、（ＣＨ２）ｑＯＲ１、（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｒ１、（ＣＨ２）ｑＣＯＮ（Ｒ１）２（式中ｑ≧１であるが、好ましくは１または２）；
Ｒ６＝Ｒ４；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ１ＣＯ、ここでＲ１は上の定義と同様、炭素数が１〜２０の直鎖または分枝アルキル基（置換または非置換）、アリール基好ましくはベンジル基（置換または非置換）、炭素数が１〜６のヒドロキシアルキル基、Ｈ、−（ＣＨ２）ｗＯＨ、−（ＣＨ２）ｗＣＯ２Ｍ、−（ＣＨ２）ｗ（ＣＨＲ１）ｚＯＨ、−（ＣＨ２）ｗＮＨ２、−（ＣＨ２）ｙＣ６Ｈ４ＯＨ、−（ＣＨ２）ｙＣＯＮ（Ｒ１）２；Ｒ１０＝Ｈ、Ｍｅ、（ＣＨ２）ｖＯＨ（ここでｗ，ｚおよびｖ≧１）、そしてＭは金属または陽イオンであるが、典型的にはＮａ、Ｌｉ、Ｋなどのアルカリ金属またはＮＨ４、Ｒ１ＮＨ３；
ｍ＞１；ｎ＞３；ｙ≧０）
で表されることを特徴とする、請求項１〜３および請求項５〜７のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項９】
前記送達粒子（ＰＶ）の平均サイズは、１０〜５００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項１０】
前記送達粒子（ＰＶ）は、少なくとも一つの有効成分を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項１１】
水性かつ安定であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の懸濁液から得られることを特徴とする粉末固体。
【請求項１３】
１）少なくとも一つのアルキレングリコールモノマーを含むＰＡＧブロックを、少なくとも一つの親水性アミノ酸モノマーＡＡＩを含むＰＡＡの少なくとも一つの親水性配列および少なくとも一つの疎水性アミノ酸モノマーＡＡＯを含むＰＡＡの少なくとも一つの疎水性配列と反応させ、前記ＰＡＧのブロックと前記親水性および疎水性配列は、両親媒性「ブロック」共重合体ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯを得るために、それぞれが少なくとも一つの反応性基を有すること；
２）工程１で得られた両親媒性ブロック共重合体ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯを両親媒性共重合体の疎水性画分の非溶媒の媒質−好ましくは水−に移して、ＰＡ送達粒子を自発的に形成させること；
３）任意に、構造化した粒子の水性懸濁液を精製するために反応媒質を透析すること；
４）任意に、工程３の懸濁液を濃縮すること；
５）任意に、少なくとも一つの有効成分ＰＡを工程２、３または４の粒子と会合させること；
６）保持しているか、あるいは保持していない粒子を含む粉末固体を収集するために液体媒質を除去すること
を特徴とする、請求項１〜３および請求項５〜１１のいずれかに記載の懸濁液から得られる粉末固体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の粉末固体および／または請求項１３に記載の製造方法によって得られる粉末固体を、両親媒性共重合体の疎水性画分に対して非溶媒である水性媒質と接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の懸濁液の製造方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の製造方法の工程１、２、３、４および、任意に工程５をも含むことを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載の懸濁液の製造方法。
【請求項１６】
前記親水性ＰＡを含む液相と粒子のコロイド状懸濁液とを接触させて、ＰＡと粒子との会合を行うことを特徴とする、請求項１０に記載の懸濁液の製造方法。
【請求項１７】
前記固体状ＰＡと粒子のコロイド状懸濁液とを接触させて、ＰＡと粒子との会合を行うことを特徴とする、請求項１１に記載の懸濁液の製造方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の粉末固体および／または請求項１３に記載の製造方法によって得られる粉末固体を、前記ＰＡを含む液相と接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の懸濁液の製造方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の粉末固体および／または請求項１３に記載の製造方法によって得られる粉末固体を、固体状前記ＰＡと接触させ、そしてこの固体混合物を液相、好ましくは水溶液中に分散させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の懸濁液の製造方法。
【請求項２０】
粒子の前駆体である「ブロック」型両親媒性ＰＡＡ共重合体、ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯ、好ましくはＰＥＧ／ポリＧｌｕまたはＡｓｐ／ポリＡＡＮＯから成ることを特徴とする、請求項１３に記載の製造方法の中間体。
【請求項２１】
ワクチン単独、または少なくとも一つの抗原と会合させたワクチン；
タンパク質および／またはペプチド、中でもより好ましくはヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インスリン、成長ホルモン、因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、インターロイキンまたはその混合物、造血刺激因子が選択される；
多糖類、とりわけヘパリンが選択される；
核酸および、好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡのオリゴヌクレオチド；
抗癌剤のいくつかの異なる種類に属する非ペプチド−タンパク質分子、特にアントラサイクリンおよびタキソイド；および
これらの混合物
から好ましくは選択される少なくとも一つの有効成分を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の懸濁液および／または請求項１３に記載の製造方法によって得られる懸濁液および／または請求項１２に記載の粉末固体。
【請求項２２】
請求項１から１１のいずれかに記載の懸濁液および／または請求項１３に記載の製造方法によって得られる懸濁液および／または請求項１２に記載の粉末固体を含むことを特徴とする、医薬、栄養物、植物防護剤または化粧品専門品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分（ＰＡ）の投与に有用な送達ナノ粒子（Nanoparticles de Vectorisation; ＰＶ）の分野に関する。前記ＰＡは、好ましくは口または鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内または脳内などを経由して動物またはヒトに投与する医薬または栄養物である。本発明に特に関係するＰＡは、化学的な点では、親水性であり、例えばタンパク質、糖タンパク、ペプチド、多糖類、リポ多糖類またはポリヌクレオチドなどである。
【０００２】
本発明は、さらに詳細には、ポリアミノ酸のブロックと、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプの親水ポリマーのブロックをベースとする送達ナノ粒子（ＰＶ）のコロイド懸濁液に関する。
【０００３】
本発明は、ＰＶそれ自体、およびＰＡを保持させた(chargees)ＰＶから成るＰＡ送達システム(Systemes vecteurs)をも対象とする。
本発明は、前記ＰＶを含む粉末固体にも関する。
本発明は、前記ＰＡを保持させた粒子コロイド懸濁液の製造法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
ＰＡとＰＶとの会合(association)は、特に、それらの作用時間を変更すること、および／または処置の場所にそれらを向かわせること、および／または前記ＰＡのバイオアベイラビリティを向上させることを目的とする。会合技術に関してはすでに多くの技術が提案されている。こうした技術は、一方で生体の攻撃（加水分解、酵素による消化など）から保護しながら、ＰＡを治療部位まで移送することを可能にすることを目的とし、他方で生体が利用できる量を所望レベルに維持するために、ＰＡの作用部位への放出を制御することを目的としている。こうした生体内の輸送および滞在の変化に関係するＰＡは、例えばタンパク質であるが、全く異なる物質、すなわち合成または天然由来の有機分子であってもよい。Ｍ．Ｊ．ＨＵＭＰＨＲＥＹによる総説記事（Ｓ．ＤＡＶＩＳおよびＬ．ＩＬＬＵＭ編、「ペプチド医薬のための送達システム（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇｓ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．，１９８６）は、ＰＡのバイオアベイラビリティの改善ならびに送達システムおよび放出制御に関する興味ある問題を論じている。
【０００５】
実際には、ＰＡの送達システムおよび放出制御は、次に挙げるＰＡとＰＶの会合方式によって特徴付けられる２つのタイプに分けられる：
・添付の図１に示す、吸着による会合、
・添付の図２に示す、カプセル化（内包化）による会合。
自発的な吸着によるＰＡとＰＶの会合が、本発明の対象となる。一般に、自発的吸着技術はカプセル化技術と比べてＰＡに対する攻撃が少ない(moins agressives)。カプセル化では、溶媒および／または界面活性剤を使用することが多く、ＰＡ、特に対象となる通常のＰＡの大部分を構成するタンパク質特性（本来の二次構造の保存）のＰＡの変性を招くおそれのある方法工程（乳化、蒸発、蒸留)を使用することが多い。吸着による会合の場合、放出は脱吸着によって行われる。
【０００６】
ＰＶに対するＰＡの会合／放出の方式のいかんを問わず、ＰＶを構成する材料は、特定の使用に合った性質を備えていなければならない。最後に、ＰＶのための入手することが望ましい仕様書は、要求事項が特に多く、具体的には次に挙げる要求事項を含んでいる。
【０００７】
１．ＰＶのために求める第一の仕様書は：
○一方では、ＰＶとＰＡが会合してＰＶ−ＰＡ系を容易に形成し、かつＰＡが生体内で放出され長時間にわたる作用を発揮すること（例えば、ＰＡ＝インスリンの作用持続時間が少なくとも２４時間）、
○他方では、前記ＰＶ（ＰＡを保持していても、保持していなくても）が、有機溶媒および／または界面活性剤の助けを借りなくても安定した（例えば、少なくとも数か月間）水性懸濁液を形成すること。すなわち、ＰＶが懸濁状態を維持し、凝集しないこと。
【０００８】
２．ＰＶは、生体に適合し、生体に対して毒性を示さず、速やかに体外へ排除（排泄）され、および／または迅速に生分解される（共）重合体で構成されていなければならない。
【０００９】
３．ＰＶの大きさは、液体に懸濁した状態で、孔径が０．２μｍ以下のフィルターで滅菌濾過することができる十分小さいものでなければならない。
【００１０】
４．ＰＶおよびＰＶ−ＰＡシステムは、ＰＡを変性させない方法で得ることが望ましい。
【００１１】
５．ＰＶは、有利には、ＰＡの放出速度を制御できるものでなければならない。
【００１２】
６．ＰＶ−ＰＡシステムが、注射可能な優れた医薬を構成しうることも別の重要な仕様書である。注射、例えば静脈内注射または筋肉内注射による投与における改善点、すなわわち「注射可能性」は：
（ｉ）（所定薬用量に対する）減少した注射容量、
（ｉｉ）低い粘度、
によって特徴づけられる。
【００１３】
治療用量のＰＡが最小量のＰＶと会合する場合にこれら２つの性質が満たされる。すなわち、ＰＶはＰＡの大きな装填率(fort taux de chargement)を有することが必要である。
【００１４】
７．注射製剤に占めるＰＶ自体のコストが安いばかりでなく、ＰＶはＰＡの大きな保持率を持たなければならない。要するに、ＰＶに求められる重要な仕様は、サイズが小さいことと保持率が大きいことである。
【００１５】
８．ＰＶを構成するポリマーが免疫応答を誘発しないことも有利である。
【００１６】
９．最後に、生体内におけるＰＶの寿命は、ＰＡに求められる放出時間と少なくとも同じ長さであれば有利である。
【００１７】
これまでに提案された次に挙げる技術（ａ）〜（ｇ）は、前記の仕様全体を満たそうと試みているが成功していない。
【００１８】
（ａ）米国特許公報第５，２８６，４９５号は、反対電荷を持つ物質、すなわち、アルギネート（陰電荷）およびポリリシン（陽電荷）の力を借りて水相中のタンパク質を蒸発によってカプセル化する方法に関する。この製造法は３５μｍより大きな粒子を製造することができる。
【００１９】
（ｂ）更に、ＰＡを保持させた微粒子を製造するためにエマルジョン技術が一般に利用されている。例えば、特許出願明細書、ＷＯ９１／０６２８６号、ＷＯ９１／０６２８７号およびＷＯ８９／０８４４９号には、ポリマーを可溶化させるために有機溶媒を使用するエマルジョン技術が開示されている。しかしこの技術は、有機溶媒が、特にペプチド系またはポリペプチド系ＰＡを変性させる可能性があることは明らかである。
【００２０】
（ｃ）同様に、Ｘ．ＦＯＸおよびＫ．ＤＯＳＥ（「分子進化と生命の起源（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）」、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  ＤＥＫＫＥＲ  Ｉｎｃ．）刊（１９７７））によって１９７０年代に記載されたプロテイノイドと呼ばれる生体適合性ＰＶも知られている。さらに、ＷＯ８８／０１２１３号には、溶解性がｐＨに依存する合成ポリペプチド混合物をベースとする系が提案されている。この発明にしたがってマトリクス微粒子を得るには、ポリペプチド混合物を可溶化させ、それからｐＨを変化させてプロテイノイド粒子を析出させる。析出をＰＡの存在下で行うと、ＰＡは粒子内にカプセル化される。
【００２１】
（ｄ）本発明に属する送達システムの分野と異なる分野を記載する米国特許第４，３５１，３３７号を参考として挙げておこう。この特許には、生体の好適部位に正確に置かれ、固定されるインプラントが開示されている。このインプラントは、アミノ酸のＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）モノマーの共重合によって得られるコポリ（アミノ酸）、例えばポリ（グルタミン酸−ロイシン）またはポリ（ベンジルグルタメート−ロイシン）で構成される顕微鏡サイズ（１６０μｍ、長さ２０００μｍ）の管または中空のカプセルである。ＰＡの取り込みは、ポリマーとＰＡとの混合物から溶媒を蒸発させる技術によって行われる。米国特許第４，４５０，１５０号は、前記米国特許第４，３５１，３３７号と同じファミリーに属し、本質的に同じ目的を持つ。構成体であるＰＡＡは、ポリ（グルタミン酸−グルタミン酸エチル）である。
【００２２】
（ｅ）特許出願明細書ＰＣＴ／ＦＲ  ＷＯ９７／０２８１号は、少なくとも一部が結晶性（乳酸ポリマー）である生分解性のポリマー複数個のラメラ状粒子と前記粒子上に吸着されたＰＡとを含み、有効成分を放出制御する組成物を開示している。この例では、有効成分の放出は、脱着によって行われる。
【００２３】
（ｆ）特許出願明細書ＰＣＴ  ＷＯ９６／２９９９１号は、インスリンなどのＰＡの送達に有用なポリアミノ酸粒子を目的としている。この粒子の大きさは１０ｎｍ〜５０ｎｍである。
特許出願明細書ＰＣＴ／ＦＲ  ＷＯ第９６／２９９９１号には、ＰＡＡを水溶液と接触させることによって自発的に形成される。ＰＡＡは、中性および疎水性アミノ酸モノマーによって形成される疎水性ブロックＡＡＯ（ポリＬｅｕ）と、イオン化性および親水性モノマーによって形成される親水性ブロックＡＡＩ（ポリＧｌｕ）とを含む。
【００２４】
（ｇ）欧州特許第０  ５８３  ９５５号には疎水性ＰＡを物理的に取り込みうるポリマーミセルを開示している。このミセルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって構成される親水性ブロックと、ポリアミノ酸によって構成される疎水性ブロックとを含むブロック共重合体、例えばＰＥＧ／ポリＡＡＮＯ（ＡＡＮＯ＝疎水性中性アミノ酸）から成る。
【００２５】
ここでＡＡＮＯは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｂｚ−Ｏ−Ｇｌｕ、Ｂｚ−Ｏ−Ａｓｐであり得るが、Ｂｚ−Ｏ−Ａｓｐが好ましい。このＰＥＧ／ポリＡＡＮＯミセルに取り込まれる疎水性有効成分ＰＡは、例えばアドリアマイシン、インドメタシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ミトマイシンである。
【００２６】
この特許出願明細書にはＰＥＧ／ポリＧｌｕ−Ｏ−Ｂｚをベースとするミセルのみが例示されている。ところが、これらのエステルＧｌｕ−Ｏ−Ｂｚは、水溶液中で加水分解に対して安定ではないことに注目すべきである。しかも、この生成物は酵素加水分解によって潜在的に有毒なベンゼンの非天然誘導体を形成する。そのうえ、中心部が疎水性中性ポリアミノ酸によって形成され、外側にＰＥＧをベースにした毛髪様構造を含む粒子であって、親水性ＰＡと会合するが、生体内ではこれを放出するのに好適な、ＰＥＧ／ポリＡＡＮＯブロック共重合体で構成される粒子は、この文書の中では全く問題にされていない。
【００２７】
さらに、ＰＥＧは生分解性ではなく、ＰＶを酵素分解から守ることができるため、本発明の範囲内で求められる重要な特徴の一つである生体内でのＰＶの生分解性にとて有害であることが知られている。
【００２８】
それゆえ、これまでに提案されてきた前記先行技術は、上記仕様書に記載された要求項目を完全に満たすものではなく、とりわけ１（放出持続時間および長時間にわたる作用持続時間ならびに水性懸濁液中でのＰＶの安定性）、２（生分解性であること）、４（変性を受けないで得られること）、５（放出速度を制御できること）、８（免疫応答がないこと）の各項目を満たしていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
こうした現状の中で、重要な目的の一つは、界面活性剤および有機溶媒を使用することなく、安定かつＰＡの送達に好適であって、特に、放出持続時間および生体内でのＰＡ作用持続時間が、先行技術において公知の上述した（ａ〜ｇ項を参照）送達システムに比べて、大きく向上した水性懸濁液を自発的に形成する（吸着／脱着タイプの）新規ＰＶを提供しうることである。
【００３０】
本発明のさらに別の目的は、安定な（特に加水分解に対して）コロイド状水性懸濁液または粉末の形で、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）／ポリアミノ酸（ＰＡＡ）ブロック共重合体をベースにした新規ＰＶを提供することであり、これら新規ＰＶは、上記仕様書の要求項目の第１項〜第９項を最大限に満たさなければならない。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、出願明細書ＥＰ第０  ５８３  ９５５号に開示されている粒子を改良することである。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、外部にＰＥＧのクラウン構造を有し、かつ容易に生分解されるＰＶ懸濁液を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに別の目的は、特にＰＡ充填率およびＰＡ放出動態の制御の点でその特徴を完全に制御した新規ＰＶ懸濁液を提供することである。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、安定で、かつ例えば経口または非経口で、ヒトまたは動物に投与が可能な医薬ＰＶ懸濁液を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、上記仕様を満たし、かつ有効成分送達粒子を含み、かつ例えば経口でヒトまたは動物に投与するのに好適なガレン形態(forme galenique)を成すコロイド状水性懸濁液または粉末固体を提供することである。
【００３６】
本発明のさらに別の目的は、特に有効成分（特にインスリンのようなタンパク質）のベクターとして有用なＰＡＡ粒子（乾燥粒子または液中に懸濁状態の粒子）を製造する方法を提供することであり、前記方法は、簡単に適用することができ、かつ有効成分を変性させることなく、かつ得られる粒子の平均粒径を常に細かく制御できなければならない。
【００３７】
本発明のさらに別の目的は、特に、口、鼻、膣、眼球、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内または脳内を経由して投与するための医薬品（例えば、ワクチン）を製造するために水性懸濁液または固体の形で前記粒子を使用することであり、これら医薬品の親水性有効成分には、具体的には、タンパク質、糖タンパク、ペプチド、多糖類、リポ多糖類、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが可能である。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、有効成分が持続的に放出されるシステムタイプの医薬を提供することであり、容易かつ安価に製造することができ、しかも生体適合性を有し、かつＰＡについてきわめて高いバイオアベイラビリティを実現することに好適な医薬を提供することである。
【００３９】
本発明のさらに別の目的は、それ自体も、そして１種類以上の抗原との組み合わせにおいても免疫原とならない、ワクチン送達システムを提供することである。
【発明を解決するための手段】
【００４０】
これらの目的は（とりわけ）、まず、有効成分（ＰＡ）の送達のために特に使用することができるナノ粒子のコロイド状懸濁液に関する本発明によって実現され、前記粒子は個別化された超分子配置(arrangements superamoleculaires individualises)をとっている。この懸濁液は、前記粒子が：
・ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タイプの親水性重合体の少なくとも一つのブロックと、
・αペプチド鎖を有する少なくとも一つの線状両親媒性(amphiphilile)コポリアミノ酸（ＰＡＡ）とを含む；
・少なくとも一つの両親媒性共重合体をベースにしており、かつ、
・非溶解状態のコロイド懸濁液中で少なくとも一つのＰＡと会合し、特に生体内で長時間にわたり、および／または徐々に、これを放出することができるという特徴を有する。
【００４１】
安定した水性コロイド状懸濁液または粉末固体状態の新規送達粒子ＰＶの発明の基礎の一つは、両親媒性共重合体ＰＡＧ／ＰＡＡ、例えば［親水性重合体／親水性ポリアミノ酸／疎水性ポリアミノ酸］三元ブロック重合体を独創的に選択したことにあり、この三元ブロック重合体を選択したことによって、界面活性剤および／または溶媒がなくても、加水分解に対しても、凝集に対しても安定な水性コロイド状懸濁液を形成し、吸着によってＰＡと結合し、脱着によって結合したこれらのＰＡを放出することができるナノメートルサイズ（１０〜５００ｎｍ）の粒子を得ることが可能になる。本発明の場合、コロイド粒子とＰＡとを水性媒質中で接触させると、自然に、そして自発的に吸着が起こる。この吸着は支持体（ＰＶ）の性質とＰＡに接近できる支持体の量に左右される。
【００４２】
本発明の大きな興味の一つは、公知のシステム、具体的には特許出願明細書ＷＯ第９６／２９９９１号に記載されているＰＶ、ポリ（Ｇｌｕ）／ポリＬｅｕを含むシステムと比べて、生体内での作用持続時間を大幅（例えばＰＡ＝インスリンの場合、１０時間）に引き延ばすＰＶ−ＰＡシステムを提供することである。
【００４３】
また、ＰＶは部分的に親水性ポリアミノ酸で構成されているため、酵素加水分解によって容易に分解され、その結果ＰＶは生体から容易に排泄されうるという利点がある。
【００４４】
粒子を構成する両親媒性共重合体ポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、少なくとも次に挙げる二つのタイプ：
・少なくとも一つの親水性アミノ酸（ＡＡＩ）を含む第一のタイプ
・少なくとも一つの疎水性アミノ酸（ＡＡ０）を含む第二のタイプ
であることが好ましい。
【００４５】
実際には、粒子を構成する両親媒性共重合体ポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、全体として親水性の少なくとも一つの配列と、全体として疎水性の少なくとも一つの配列とを有利に含む。
【００４６】
本発明によれば、両親媒性共重合体の構造と、アミノ酸ＡＡＩおよびＡＡＯの種類とは、次に挙げる項目が実現されるように選択される：
・重合体の鎖が自発的に構造化して小さいサイズの粒子（ＰＶ）の形をとる、
・粒子は水および生理的媒質中で安定したコロイド状懸濁液を形成する、
・ＰＶは（有機溶媒および／または界面活性剤不在下でも）水性媒質中で自発的、かつＰＡを変性させない機構でタンパク質または他のＰＡと会合する、
・ＰＶは、生理的条件、より具体的には生体内で、医薬として使用するのに適する薬物力学的よび薬物動態学的な経過をたどりながらＰＡ−ＰＶ複合体からＰＡを放出し；放出の動力学は、ＰＶの前駆体共重合体ＰＡＧ／ＰＡＡ（＝ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯ）の種類に依存する。
【００４７】
このように、共重合体の個々のブロック構造を利用しながら動態および定量的な構想の基にＰＡの会合および放出の現象を制御することができる。
【００４８】
疎水性部分のポリＡＡＯは重合体鎖の凝集に関与し、ＰＶ形成の核心を成す。
【００４９】
本発明の注目すべき様式によれば：
・親水性アミノ酸（ＡＡＩ）は：
・イオン化しうる鎖、少なくとも部分的にイオン化した鎖を持つアミノ酸、好ましくはＧｌｕおよび／またはＡｓｐおよびその塩および／またはＬｙｓ；天然および非天然アミノ酸と、
・前記アミノ酸の混合物
の群から選択され、
・疎水性アミノ酸（ＡＡＯ）は：
・天然の中性アミノ酸、その中でも有利なのは：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅおよびこれらの混合物、
・希少なまたは合成の中性アミノ酸、その中でも有利なのは：ノルロイシン、ノルバリンおよびそれらの混合物、
・極性アミノ酸誘導体、その中でも有利なのは：グルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、Ｎ−アセチルリシンおよびそれらの混合物、および
・前記物質の混合物
の群から選択される。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態によれば、粒子を構成する両親媒性共重合体を構成する両親媒性共重合ポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、「ブロック」構造を有する。
【００５１】
一変形例によれば、この両親媒性共重合ポリアミノ酸（ＰＡＡ）は、この両親媒性共重合アミノ酸は、それが必ず少なくとも全体として親水性の配列と、少なくとも全体として疎水性の配列を含んでいて、その共重合体に両親媒性を付与する限りは、「統計的な(statistiques)」（すなわち「偶然の」または「ランダム」）構造を持つことができる。
【００５２】
好ましい両親媒性「ブロック」ＰＡＡには、有利には：
・基本的にＡＡＩアミノ酸で構成され、絶対長さがＡＡＩモノマー５個以上、好ましくはＡＡＩモノマー２００個以上、その中でも特に好ましくはＡＡＩモノマー１０〜５０個から成る全体として親水性の少なくとも１の配列と、
・基本的にＡＡＯアミノ酸で構成され、絶対長さがＡＡＯモノマー５個以上、好ましくはＡＡＯモノマー１０個以上、さらに好ましくは、ＡＡＯモノマー１０〜５０個から成る全体として疎水性の少なくとも１の配列、
が含まれる。
【００５３】
親水性ＰＡＧ−そして好ましくはＰＥＧ−の場合、その絶対長さはモノマー５個以上、好ましくはモノマー５ないし１２０個、その中でも特に好ましくはモノマー５〜５０個であるブロックの形で存在することが有利である。ＰＡＧ（例えばＰＥＧ）のブロックは単（ホモ）重合体であってもよいし共重合体でもよいが、単重合体の方が好ましい。
【００５４】
さらに好ましい点は、本出願人が、ＰＶ構成物質として特別な三元ブロック重合体、すなわち両親媒性で電荷を有する「親水性重合体／親水性ポリアミノ酸／疎水性ポリアミノ酸」を選択したことである。この両親媒性により、新規で予想を超えた特性、すなわち上で述べてきたような特性を発現させることが可能となる。かくして、本発明によるＰＶは界面活性剤および有機溶媒が存在していなくても生理学的なｐＨにおいて安定した水性懸濁液を形成する。さらに、三元ブロック構造を選択して、ＰＡＧ構造と疎水性構造との間にアミノ酸をベースにした親水性の配列を導入することにより、ＰＶは、生体内で酵素加水分解によって容易に分解可能である。これは、本発明の好ましい実施形態による三元系のカギになる点の一つである。
【００５５】
さらに、ＰＶ−ＰＡの会合は自発的に起こり、生体内ではきわめて持続的に放出されるため、長時間効果がつづくことになる（例えば、インスリンのようなタンパク質では３０時間以上）。このように、生体内でのＰＡの作用時間が延長されることによって有効時間が大幅に延びるため患者の安堵感が改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明の具体的な実施例によれば、粒子は次式で表される両親媒性「線状三元ブロック」共重合体ＰＥＧ／ＡＡＩ／ＡＡＯ鎖から成る：
【化１】
2004525939.tif 000002
式中、
Ｒ１は、Ｈ、炭素数が１〜２０の直鎖または分枝アルキル基（置換または非置換）、アリール基好ましくはベンジル基（置換または非置換）；
Ｒ２は、ＮＨ、ＣＯ−ＮＨ、ＣＳ−ＮＨ、Ｒ８−（ＣＨ２）ｔ−Ｒ９（ここでＲ８およびＲ９は、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ、ＣＯＯ、ＮＨ、ＣＯの中から互いに独立に選択される；ｔ＝１〜６、［ＮＨＣＨ（Ｒ１）ＣＯ−］ｘ）；
Ｒ３は、イオン化しうる親水性アミノ酸（天然または合成誘導体）を規定する群から選択される鎖長が同じか、または異なる基であって、好ましくは（ＣＨ２）ｐＣ６Ｈ４ＯＭ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｍ、（ＣＨ２）ｐＮ（ＨｃＲ１ｄ）３Ｘ（式中ｐ≧１であるが、好ましくは１または２）；ａおよびｂは、０〜３の値であって、かつａ＋ｂ＝３）；ｘは、好ましくは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸水素イオン、酢酸イオン、乳酸イオンである；
Ｒ４は、Ｈ、Ｍｅの群から選択される鎖長が同じか、または異なる基；
Ｒ５は、疎水性アミノ酸（天然または合成誘導体）を規定する基の中から選択される鎖長が同じか、または異なる基であって、好ましくはＨ、Ｒ１、（ＣＨ２）ｑＣ６Ｈ５、（ＣＨ２）ｑＣ６Ｈ４ＯＲ１、（ＣＨ２）ｑＯＲ１、（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｒ１、（ＣＨ２）ｑＣＯＮ（Ｒ１）２（式中ｑ≧１であるが、好ましくは１または２）；
Ｒ６＝Ｒ４；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ１ＣＯ、ここでＲ１は上の定義と同様、炭素数が１〜２０の直鎖または分枝アルキル基（置換または非置換）、アリール基好ましくはベンジル基（置換または非置換）、炭素数が１〜６のヒドロキシアルキル基、Ｈ、−（ＣＨ２）ｗＯＨ、−（ＣＨ２）ｗＣＯ２Ｍ、−（ＣＨ２）ｗ（ＣＨＲ１）ｚＯＨ、−（ＣＨ２）ｗＮＨ２、−（ＣＨ２）ｙＣ６Ｈ４ＯＨ、−（ＣＨ２）ｙＣＯＮ（Ｒ１）２；Ｒ１０＝Ｈ、Ｍｅ、（ＣＨ２）ｖＯＨ（ここでｗ，ｚおよびｖ≧１）、そしてＭは金属または陽イオンであるが、典型的にはＮａ、Ｌｉ、Ｋなどのアルカリ金属またはＮＨ４、Ｒ１ａＮＨｂ；
ｍ＞１；ｎ＞３；ｙ≧０；ａ＋ｂ＝４。
【００５７】
本発明にしたがって、ＰＶを構成する共重合体に親水性ポリアミノ酸配列（ポリＡＡＩ）を持つことは、ＰＶの生分解性を改善する利点を持つ。この配列ポリＡＡＩは、親水性重合体ブロックと疎水性ポリアミノ酸配列（ポリＡＡＯ）との間に配列することが好ましい。
【００５８】
本発明によるＰＶ粒子の平均サイズは、１０〜５００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍである。本発明で使用される平均サイズまたは平均粒径という用語は、水力学的平均直径（diametre hydrodynamique moyen）を意味する。
【００５９】
本発明の利点の一つは、これらの実在種の平均粒径および粒径分布を非常にうまく制御することができることである。重合体鎖の自己会合の制御、すなわちＰＶサイズの制御は、ポリアミノ酸の組成を介して行われるが、組成が同じ場合、ブロック構造および製造法の選択によっても行われる。このように粒子のサイズは、非常に小さくて数ナノメートルないし数１０ナノメートルである。
【００６０】
本発明による懸濁液は水性であって、かつ安定している。
【００６１】
本発明は、上で定義した裸の粒子の懸濁液を対象とするばかりでなく、少なくとも一つの有効成分ＰＡを含む粒子の懸濁液をも対象としている。
【００６２】
この粒子は、ＰＡと会合しているか否かを問わず、水性の液に分散した形態にあることが有利であるが、上で規定したようなＰＶ懸濁液から得られる粉末固体状であることも同様に可能である。
【００６３】
したがって、本発明は、ＰＶの水性コロイド状懸濁液以外に、ＰＶを含み、かつ本発明によって懸濁液から得られる粉末固体にも関する。
【００６４】
疎水基が高分子鎖上にどのように分布するかは、選択される合成法によって制御することが可能である。この観点からは、本発明によってＰＶを製造するための出発物質として選択される重合体は、多くの反応スキームによって製造することができる。
【００６５】
以下では、本発明にしたがってＰＶおよびＰＶ懸濁液を製造する具体的な方法を説明する。
【００６６】
このように、本発明の重要な別の目的は、（上に記載したような）選択した粒子をコロイド状懸濁液および粉末固体の形で製造する方法に関する。取り上げる製造法は、本質的には：
＊ＰＶの前駆体である共重合体ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯを合成し、それを構造化したＰＶ粒子に変換すること；
＊任意に、このようにして製造された粒子を精製すること；
＊任意に、これらの粒子を、好ましくは濃縮、凍結乾燥、濾過または乾燥によって単離すること、
からなる。
【００６７】
さらに具体的には、まず有効成分を送達するために使用することができる構造化したナノメートル程度の粒子によって形成される粉末固体を製造する方法に関する。ここで、上記粒子は：
・αペプチド鎖に線状ポリアミノ酸（ＰＡＡ）の少なくとも一つの疎水性配列（このＰＡＡブロックを構成する疎水性アミノ酸ＡＡＯは、互いに同じであっても異なっていてもよい）と、
・αペプチド鎖に線状ポリアミノ酸（ＰＡＡ）の少なくとも一つの親水性配列（このＰＡＡブロックを構成する疎水性アミノ酸ＡＡＩは、互いに同じであっても異なっていてもよい）と、
・ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）タイプの、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の少なくとも一つの親水性重合体ブロックとを含む
・少なくとも一つの両親媒性共重合体をベースにしており、かつ
・特に生体内では長時間にわたり、および／または徐々にこれを放出するように、非溶解状態のコロイド状懸濁液中で少なくとも一つのＰＡを会合することができる、個別化された超分子配置をとっている。
【００６８】
この方法は：
１）少なくとも一つのアルキレングリコールモノマーを含むＰＡＧブロックを、少なくとも一つの親水性アミノ酸モノマーＡＡＩを含むＰＡＡの少なくとも一つの親水性配列および少なくとも一つの疎水性アミノ酸モノマーＡＡＯを含むＰＡＡの少なくとも一つの疎水性配列と反応させることを特徴とし、前記ＰＡＧのブロックと、前記親水性および疎水性配列は、両親媒性「ブロック」共重合体、ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯを得るために、それぞれが少なくとも一つの反応性基を有する；
２）工程１で得られた両親媒性ブロック共重合体、ＰＡＧ／ポリＡＡＩ／ポリＡＡＯを、両親媒性共重合体の疎水性画分に対して非溶媒の媒質−好ましくは水−に移して、送達粒子（ＰＶ）を自発的に形成させる；
３）任意に、構造化した粒子の水性懸濁液を精製するために反応媒質を透析する；
４）任意に、工程３の懸濁液を濃縮する；
５）任意に、少なくとも一つの有効成分ＰＡを工程２、３または４の粒子と会合させる；
６）保持する粒子、あるいは保持してない粒子を含む粉末固体を収集するために液体媒質を除去する
ことを特徴とする。
【００６９】
本発明で使用される「非溶媒」という表現は、問題の両親媒性共重合体の画分の溶解度が、２５℃で、問題の非溶媒に対して例えば１ｇ／Ｌ未満であることを意味する。
【００７０】
工程２の終了時に、液体媒質は均一溶液を形成せず、分散相（ＰＶ）と、両親媒性「ブロック」共重合体をほとんど含まない相とに分離する。
【００７１】
工程１のＰＡＧブロックと、ポリＡＡＯおよびポリＡＡＩ配列の反応性基としては、アミノ基かまたはカルボン酸基が可能である。ＰＡＧ−ポリＡＡＩおよび／またはＰＡＧ−ポリＡＡＯおよび／またはポリＡＡＩ−ポリＡＡＯの結合を形成させる前、形成中または形成させた後に、ＰＡＧブロックおよび／または親水性配列ポリＡＡＩおよび／または疎水性配列ポリＡＡＯを形成させる重合を行うことを想定することが可能である。
【００７２】
これらのすべての変形例は当業者であれば理解することができよう。
【００７３】
好ましくは、工程１で：
１．１）Ｎ−カルボキシアミノ酸（ＮＣＡ）無水物によって形成される少なくとも２つの異なるタイプのモノマー、すなわちＮＣＡ−ｐＡＡＩ（「ｐＡＡＩ」はＡＡＩの前駆体を表す）とＮＣＡ−ＡＡＯとの共重合を：
−少なくとも一つの極性溶媒、好ましくはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセタミド（ＤＭＡｃ）、ピロリドンの群から選択される極性溶媒、そして特に好ましくはＮＭＰと、
−任意に、非プロトン性溶媒（好ましくは１，４−ジオキサン）および／またはプロトン性溶媒（好ましくはピロリドン）および／または水および／またはアルコール、特に好ましくはメタノールの中から選択される少なくとも一つの共溶媒との存在下に行い、
−前記有機媒質に水性相を加え、粒子の前駆体ｐＡＡ共重合体のくり返し単位ｐＡＡＩを、加水分解、好ましくは酸加水分解して、くり返し単位ＡＡＩに変換する。
【００７４】
１．２）ポリアルキレングリコール（好ましくはＰＥＧまたはＰＰＧ）の少なくとも一つのＰＡＧ重合体ブロックを使用するか、アルキレンモノマー（好ましくはエチレングリコールまたはプロピレングリコール）の重合によって製造する。このＰＡＧ共重合体ブロックは、好ましくはアミン（特に一級または二級アミン）、アルコールまたはチオール、（予めジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールまたは当業者に知られている他の反応剤と反応させて）活性化したカルボン酸を含む群から選択される反応性基によって官能化される（ＰＡＧ末端のうちの一方だけを官能化することが好ましい）。
【００７５】
１．３）工程２の官能化ＰＡＧを親水性配列ポリＡＡＩおよび疎水性配列ポリＡＡＯの重合媒質に、重合の前、重合中または重合の後で添加する。
【００７６】
この方法の１．１工程は、例えばＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒ、１５，１８６９（１９７６）に報告されている論文およびＨ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆの著作「α−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ−無水物および関連するヘテロ環化合物（α−Ａｍｉｎｏａｃｉｄ−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ−Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）に記載されているＮ−カルボキシ−α−アミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合で知られている技術から着想を得ている。
【００７７】
一つの変形例によれば、工程１．１において、得られた共重合体ポリ（ＡＡＯ）−ポリ（ＡＡＩ）を−好ましくは水中で−析出させ、沈殿を集める。この変形例は、粒子のバッチ式製造法に相当し、安定した中間生成物を成す沈殿の形で共重合体ポリ（ＡＡＯ）−ポリ（ＡＡＩ）を分離する。この沈殿は例えば濾過し、洗浄し、乾燥させることができる。
【００７８】
さらに好ましくは、ＮＣＡ−ｐＡＡＩは、グルタミン酸またはＯ-アルキル化アスパラギン酸のＮＣＡ、例えば、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−ＥｔまたはＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｂｚ（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル）である。
【００７９】
より一般的には、粒子の製造は、例えば、三元重合体の合成に引き続いて、疎水性画分に対する非溶媒を、溶媒に溶解した両親媒性共重合体溶液に加えることにより有利に行うことができる。この方法の変形では、三元重合体溶液を疎水性画分に対する非溶媒に加える。操作は、好ましくは疎水性画分の溶解度を引き下げて、これを凝集させ、ＰＶを形成させることにある。当業者であれば、重合体の疎水性画分の溶解度を引き下げるために、例えば温度、溶媒および非溶媒の種類あるいはさまざまな技術を組み合わせるなど、別の方法を考えつくことができよう。
【００８０】
例えば、コロイド状懸濁液を製造するには、工程１の両親媒性共重合体ＰＡＧ−ポリ（ＡＡＩ）−ポリ（ＡＡＯ）を、ＰＡＧの少なくとも一部が溶解し、ＡＡＯの少なくとも一部が溶解しない水性媒質に入れる。共重合体ＰＡＧ−ポリＡＡＩ−ポリＡＡＯはこの水性媒質中でナノ粒子の形で存在する。
【００８１】
本発明によるＰＶ懸濁液を製造する別の方法は、生成物として上に記述し、その製造方法によって作られる粉末固体を、水性媒質、特に、両親媒性重合体の疎水性画分に対する非溶媒である水と接触させる方法である。
【００８２】
このようにして溶媒も界面活性剤も存在しないで水の中にＰＶを得ることができる。
【００８３】
好ましくは、官能化ＰＡＧブロックは、重合の前および／または開始時に入れ、重合は、好ましくは２０〜１２０℃の温度および大気圧で行う。
【００８４】
好ましくは、工程１．２のＰＡＧは市販品（例えばＰＥＧ）であり、またはエチレンオキシドの重合により公知の方法で得られる。
【００８５】
重合体濃度、反応混合物の温度、親水性重合体の添加方法、減圧の使用、反応時間などの他の変数は、所望の効果に合わせて調節されるが、当業者にはよく知られている。
【００８６】
粒子の説明の中ですでに述べた重合体の特性に関する記述は、そっくりそのまま、方法に関する記述にも適用することができる。それゆえ、本発明による方法に従えば反復アミノ酸の種類と量を選択することができるばかりでなく、上記特性を有する各種タイプの重合体を得るための操作条件も選択することができる。
【００８７】
一つまたは複数個のＰＡを粒子と会合（工程３）させるために、本発明による複数の方法を適用することができる。そのいくつかの例を挙げるが、もちろんこれらの例だけに限定されるものではない：
第１の方法によれば、ＰＡと粒子との会合は、ＰＡを含む液相（水性または非水性）と粒子のコロイド状懸濁液とを接触させることにより行われる。
【００８８】
第２の方法によれば、ＰＡと粒子との会合は、固体状ＰＡと粒子のコロイド状懸濁液とを接触させることにより行われる。固体ＰＡは、例えば凍結乾燥物、沈殿、粉末およびその他の形が可能である。
【００８９】
第３の方法によれば、生成物として、また製造特性によって上に記載した粉末固体（ＰＡＡ）と、ＰＡを含む液相（水性または非水性）とを接触させる。
【００９０】
第４の方法によれば、生成物として、また製造特性によって上に記載した粉末固体（ＰＡＡ）と、固体状のＰＡとを接触させる。それから、この固体混合物を液相、好ましくは水溶液に分散させる。
【００９１】
上記いずれの方法においても、使用するＰＡは、純粋な形態でも、予め配合した形態でもよい。
【００９２】
ＰＶの製造は、当業者に公知の技術を使用して、精製工程が続くのが有利である。この随意に行われる精製段階のあとは、直接利用できるＰＶコロイド状懸濁液を使用するか、あるいはそれ自体公知の好適な物理的手段、例えば濾過、濃縮、限外濾過、密度勾配分離、遠心分離、沈殿、場合により塩の添加、または凍結乾燥によって分離し、または集めることが考えられる。
【００９３】
随意の工程５に従って、不純物（塩）および溶媒が、適当な任意の物理的分離処理、例えばダイアフィルトレーション（透析）（工程４）、濾過、ｐＨの変更、クロマトグラフィ、蒸留によって除去される。このような方法によって望ましくない塩または溶媒を除去することができる。
【００９４】
かくして得られる構造化粒子を懸濁液の媒質から濃縮（工程６）または分離（工程７）するには、必要に応じて、水相を、例えば蒸留、乾燥（例えば乾燥機）、凍結乾燥または適当な物理的手段、例えば限外濾過、遠心分離によって除去する。この工程７を行った後には、白色の粉末固体が回収される。
【００９５】
粒子サイズがナノメートル程度であることを考えると、懸濁液は滅菌濾過法によって濾過することができ、そうすることによって、容易かつ安いコストで滅菌済み注射用液剤医薬を得ることができる。本発明によって、粒子の大きさを制御することができ、水力学的直径（Ｄｈ）が２５〜１００ｎｍの粒子を作ることができることは大きな利点である。
【００９６】
さらに、本発明は、上記方法の新規中間生成物を目的とし、それらが、粒子の共重合体ＰＡＧ−ポリＡＡＩ−ポリＡＡＯ前駆体によって構成されることを特徴とする。
【００９７】
本発明の別の実施態様によれば、本発明は、上で規定され、および／または上記の方法で得られるような懸濁液および／または粉末固体に関し、そして前記懸濁液および固体は好ましくは次に挙げる有効成分：すなわち、
・ワクチン単独、または少なくとも一つの抗原と会合させたワクチン；
・タンパク質および／またはペプチド、その中でも、より好ましくはヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インスリン、成長ホルモン、因子ＶＩＩＩおよびＩＸ、インターロイキンまたはその混合物、造血刺激因子が選択される；
・多糖類、とりわけヘパリンが選択される；
・核酸、好ましくはＲＮＡおよび／またはＤＮＡオリゴヌクレオチド；
・いくつかの異なる種類の抗癌剤(divers classes de chimiotherapie anticancereuses)に属する非ペプチド−タンパク質分子、特にアントラサイクリンおよびタキソイド(taxoides)；
・上記の混合物
の中から選択される少なくとも一つの有効成分を含む。
【００９８】
最後に、本発明は、医薬、栄養物、植物防護剤または化粧品専門品に関係し、その専門品は、ＰＡおよび上に規定したものを保持する懸濁液および／または粉末固体を含むことを特徴とする。
【００９９】
本発明の別の目的によれば、本発明は、ＰＡを放出制御するシステムを適用した医薬を製造するためにＰＡを保持するＰＶの使用（懸濁液または固体の形で）を想定している。
【０１００】
ここでは、例えば投与可能な医薬、好ましくは口、鼻、膣、眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮膚、腹腔または脳を経由して投与可能な医薬を対象とすることができよう。
【０１０１】
想定しうる化粧品への適用は、例えば、本発明によるＰＶと会合するＰＡを含み、かつ経皮によって適用できる組成物であろう。
【実施例】
【０１０２】
次に挙げる例は、インスリンで形成される親水性ＰＡに関し、生成物／方法／適用の各態様において、本発明をよりよく理解することができる。これらの例は、ＰＡを保持させたポリアミノ酸粒子またはＰＡを保持していないポリアミノ酸粒子の製造について説明し、これら粒子の構造上の特徴および性質についても開示する。
【０１０３】
例１
ポリ（ロイシン）１２−ブロック−ポリ（グルタメート）３５−（ポリエチレングリコール）１１３の製造
ＮＣＡをブロック構造またはランダム構造に重合するために使用される技術は、当業者に知られており、その詳細はＨ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆの著作「α−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ−無水物および関連するヘテロ環化合物（α−Ａｍｉｎｏａｃｉｄ−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）に記載されている。具体的に述べる次の合成法はその中の一つである。
【０１０４】
アミノエチル−ＰＥＧ（分子量５０００；重合度（ＤＰ）１１３）４．９６ｇをＮＭＰ１２０ｍｌに４０℃で溶解する。これにＭｅＯＨ１．４ｍｌ、つづいてＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ６．４ｇを一度に加える。３０分後にＮＣＡ−Ｌｅｕ１．８ｇを加え、さらに反応を２時間続ける。次に、希塩酸を反応媒質に加え、８０℃で２４時間加熱する。５０℃で、６Ｎのソーダで反応媒質を中和する。得られた中間生成物を水に対して透析し、サイズの小さい可溶性残留物（溶媒、塩）を除去する。精製した溶液を凍結乾燥して白色粉末を得る。収率８０％。
【０１０５】
例２
ポリ（ロイシン）１２−ブロック−ポリ（グルタメート）１８−（ポリエチレングリコール）１７の製造
アミノエチル−ＰＥＧ（分子量７５０；ＤＰ１７）２．０１ｇをＮＭＰ４５ｍｌに４０℃で溶解する。これにＭｅＯＨ１．５ｍｌ、つづいてＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ９ｇを一度に加える。３０分後にＮＣＡ−Ｌｅｕ５ｇを加え、さらに反応を２時間つづける。次に、希塩酸を反応媒質に加え、８０℃で２４時間加熱する。５０℃で、６Ｎのソーダで反応媒質を中和する。得られた中間生成物を水に対して透析し、サイズの小さい可溶性残留物（溶媒、塩）を除去する。精製した溶液を凍結乾燥して白色粉末を得る。収率８０％。
【０１０６】
例３
光回折（ＤＤＬ）法および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるナノ粒子の確認
実施例１または２で得られた共重合体１０ｍｇを水または塩水溶液１０ｍｌに懸濁させる。つづいて、この溶液をＣｏｕｌｔｅｒ社製粒度分析測定装置（またはレーザー回折装置）にかける。異なる生成物について試験した粒度分析結果を次の表１に示す。
【表１】
2004525939.tif 000003
さらに、例２の両親媒性共重合体を水に懸濁させて製造したＰＶ送達粒子を透過型電子顕微鏡で写真撮影した（図４）。
【０１０７】
例４
タンパク質（インスリン）とナノ粒子との会合試験
ｐＨ７．４の等張リン酸塩緩衝液を使用して、４０ＵＩ（国際単位）／ｍｌに相当する力価１．４ｍｇ／ｍｌのヒトインスリン溶液を製造する。このインスリン溶液１ｍｌに例１または２による両親媒性共重合体１０ｍｇを分散させる。環境温度で１５時間インキュベートしたのち、ＰＶ送達粒子に会合しているインスリンと遊離インスリンとを遠心分離法（６０，０００ｇ、１時間）および限外濾過法（濾過限界３００，０００Ｄ）によって分離する。高性能液体クロマトグラフィまたはＥＬＩＳＡ法によって濾液中に回収された遊離インスリンを定量し、差から会合インスリンの量を求める。
【０１０８】
次の表２は異なるＰＶについて行った会合率測定結果をまとめたものである。会合率は、標定力価が１．４ｍｇ／ｍｌのインスリンとＰＶ１０ｍｇ／ｍｌからなる製造物中に含まれるインスリンに対する会合インスリンの百分率で表される。この値は、ＰＶ１００ｍｇ当たり会合可能なインスリンの最大ｍｇ量を表す充填率に変換される。
【表２】
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例５
絶食した健常なイヌを使ったＰＶ保持インスリンの薬物動態および薬力学
例４で製造したインスリン保持ＰＶ懸濁液を、膵臓の全摘によって糖尿病にした２匹のイヌに前日の晩の絶食時に注射した。午前１１時の投与は、動物の生存時の体重１ｋｇ当たりインシュリンを０．５国際単位／ｋｇの用量で胸部皮下を通して行った。投与量は０．１８〜０．２４ｍｌとする。−４、−２、０、１、２、４、６、８、１２、１６、２０、２０、２４、２８、３２、３６、４、４４および４８時に頸部に穿刺して、血液１ｍｌをヘパリンナトリウム管に吸引採取する。全血３０μｌを使用してすぐに血糖値を測定する。つづいて、インスリンを定量するため、採取管を遠心分離にかけ、デカントし、血漿を−２０℃で保存する。後記の図３の結果は、注射後少なくとも２４時間は持続する大きな血糖降下作用（２匹の動物に対して）を示している。
【表３】
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この例は、本発明によるＰＶの存在でインスリンが変性しないことを証明している。
【０１０９】
さらにこの実施例は、配合されていないインスリンと比べて作用持続時間が３０時間を上回って延びることを明らかにしており、インシュリンを制御しながら放出する徐放システムとしてのＰＶの有用性を証明している。疎水基を適切に選択すれば、いかに作用持続時間を抑制することができるかも示している。
【０１１０】
例６
比較実験：重合体−ポリ（ロイシン）４０−ブロック−（ポリエチレングリコール）１１３の製造
ポリ（Ｌｅｕ）４０−ＰＥＧの合成：ＮＣＡ−Ｌｅｕ１０ｇを６０℃でＮＭＰ１５０ｍｌに溶解する。アミノエチル−ＰＥＧ（分子量５０００）２ｇをＮＭＰ５０ｍｌに溶かした溶液５ｍｌをモノマーに一度に加える。２時間経過したら反応媒質を水１Ｌ中に注入する。形成する沈殿を濾過し、洗浄し、乾燥する。収率＞９５％。
【０１１１】
沈殿をトリフルオロ酢酸１００ｍｌに溶解し、それから、これに水４０ｍｌを１時間かけて加える。つづいて懸濁液を炭酸ナトリウムで中和し、生成した塩を除去するため、水に対して透析し、それから凍結乾燥して固体生成物を得る。
【０１１２】
例７
比較実験：絶食した健常なイヌを使ったＰＶ会合インスリンの薬物動態および薬力学
例６のＰＶを配合し、それから例５で述べたプロトコルに従って動物に注射する。後記の図５に示した結果は、注射後２０時間持続する血糖降下作用（２匹の動物に対して）を示している。
【０１１３】
例８
配合物の安定性の比較
例６のＰＶ、ＰＥＧ−Ｌｅｕ２５を例７に従って配合する。＋４℃で１か月間保存した後、配合物(formulation)は３５℃でも溶解しない沈殿物を生成する。このことはＰＶのこの配合物が不安定であることを示している。
【０１１４】
例１のＰＶ、ポリ（ロイシン）１２−ブロック−ポリ（グルタメート）３５−ポリ（エチレングリコール）１１３を例７に従って配合する。配合物は、＋４℃で１か月間保存した後でも透明で、沈殿物の生成は認められない。このことは、ＰＶのこの配合物が安定であることを示しており、二元ブロック共重合体ＰＥＧ−ポリＡＡＯよりも三元ブロック重合体ＰＥＧ−ポリＡＡＩ−ポリＡＡＯが優れていることがわかる。
【０１１５】
例９
比較実験：重合体、ポリ（ロイシン）１２−ブロック−（グルタミン酸ナトリウム）３５の製造とその薬力学的分析
標記重合体は、例１に次のような変更を加えて合成する。すなわち、分子量５０００、ＤＰ＝１１３のアミノエチル−ＰＥＧの代わりに当モル量のアンモニアを使用する。ＰＶは、前の実施例（実施例２および５）に従って単離し、インスリン１００国際単位当たりＰＶ５０ｍｇの割合で配合し、注射する。後記の図６に示した結果は血糖降下作用(２匹の動物に対して）を示し、注射後２０時間持続する。
【０１１６】
注釈
【表４】
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本発明によるシステム（例２）は、先行技術（ＷＯ第９６／２９９９１号）のシステム：例６および８よりずっと優れた生体内作用持続時間を有する（２０時間に対して３０時間以上）ことが上記の表からわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ＰＡを吸着したタイプの送達粒子の模式図。
【図２】ＰＡをカプセル化したタイプの送達粒子の模式図。
【図３】インスリンを０．６国際単位／ｋｇの割合で保持させたＰＶ調剤を注射した（例５）あとの血糖値Ｇ（基礎値に対する百分率平均値）の経過時間ｔ（単位：時間）に対する変化を示す図。
【図４】透過型電子顕微鏡によるＰＶ（例２）の写真の図。
【図５】インスリンを保持させたＰＶ調剤を０．６国際単位／ｋｇの割合でイヌに注射した（例６）あとに観察された血糖値（基礎値に対する百分率平均値）および平均インスリン（insulinemie）値Ｉ（ｍＵ／Ｌ）の経過時間ｔ（単位：時間）に対する変化を示す図。
【図６】インスリンを保持させたＰＶ調剤を０．６国際単位／ｋｇの割合でイヌに注射した（例９）あとに観察された血糖値Ｇ（基礎値に対する百分率平均値）および平均インスリン値Ｉ（ｍＵ／Ｌ）の経過時間ｔ（単位：時間）に対する変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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