(57)【要約】本発明は、哺乳動物核酸分子及びその断片を提供する。本発明はまた、この哺乳動物核酸分子を用いた、アルツハイマー病やダウン症関連する症状や疾患、または障害の特徴付け・診断・評価・治療・予防方法を提供する。更に、本発明は、この哺乳動物核酸分子によってコードされるタンパク質を産生させるための発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
2004500811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列と比較した時のＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＸ（バージョン ２．０．４）を用いて計算されたＢＬＡＳＴスコアが少なくとも２５０ビットである天然のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、
および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列の免疫学的に活性な断片から選択されることを特徴とするＡＳＰ（アスパルチルプロテアーゼ）をコードする実質的に精製された哺乳動物核酸分子およびその断片、変異体、およびその一部。
【請求項２】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−５、７−２９、３１−３３、３７、および４３の核酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４３の配列と比較した時のＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＮ（バージョン ２．０．４）を用いて計算されたＢＬＡＳＴスコアが少なくとも２００ビットである天然の核酸配列、
および（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の配列と比較した時のＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＮ（バージョン ２．０．４）を用いて計算されたＢＬＡＳＴスコアが少なくとも２００〜４００ビットの範囲である天然の核酸配列から選択されることを特徴とする単離され精製された哺乳動物核酸分子またはその相補配列。
【請求項３】
請求項２の（ａ）の哺乳動物核酸配列の断片。
【請求項４】
高いストリンジェンシーの条件下で、請求項２の哺乳動物核酸分子、相補配列、またはその断片とハイブリダイズする少なくとも１６の連続する核酸を含むプローブ。
【請求項５】
請求項２の哺乳動物核酸分子に機能的に結合したプロモーターを含む組換え核酸分子。
【請求項６】
請求項５の組換え核酸分子で形質転換された細胞。
【請求項７】
ポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドが発現する条件下で、請求項６の細胞を培養するステップと、
（ｂ）発現した前記ポリペプチドを回収するステップとを含むポリペプチド生産方法。
【請求項８】
請求項５の組換え核酸分子を含む遺伝子組換え生物。
【請求項９】
サンプルにおいて哺乳動物核酸分子を検出するための方法であって、
（ａ）請求項２のプローブを前記サンプルとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、
前記ハイブリダイゼーション複合体が、前記サンプルにおける前記哺乳動物核酸分子の存在を示すことを特徴とする哺乳動物核酸分子の検出方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記核酸分子またはその断片を増幅するステップを更に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物核酸分子またはその断片を用いて分子のライブラリをスクリーニングし、前記哺乳動物核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項２の哺乳動物核酸分子を前記分子のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記哺乳動物核酸分子と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とするリガンド同定方法。
【請求項１２】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、およびタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物核酸分子またはその断片を用いて、サンプルから前記哺乳動物核酸分子と特異的に結合するリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項２の哺乳動物核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、
（ｂ）結合した前記哺乳動物核酸分子を回収するステップと、
（ｃ）前記リガンドから前記哺乳動物核酸分子を分離して、精製したリガンドを得るステップとを含むことを特徴とするリガンド精製方法。
【請求項１４】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列と比較した時のＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＸ（バージョン ２．０．４）を用いて計算されたＢＬＡＳＴスコアが少なくとも２５０ビットである天然のアミノ酸配列、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列の生物学的に活性な断片、
および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列の免疫学的に活性な断片から選択されることを特徴とする実質的に精製されたタンパク質またはその一部。
【請求項１５】
タンパク質またはその一部を用いて分子のライブラリをスクリーニングし、前記タンパク質と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質またはその一部を前記分子のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記タンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とするリガンド同定方法。
【請求項１６】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、および医薬品から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質またはその一部を用いて分子のライブラリをスクリーニングし、サンプルから前記タンパク質と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、
（ｂ）結合した前記タンパク質を回収するステップと、
（ｃ）前記リガンドから前記タンパク質を分離して、精製したリガンドを得るステップとを含むことを特徴とするリガンド精製方法。
【請求項１８】
効果的な量の請求項１４のタンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１９】
ＡＳＰの発現の変化に関連する疾患や症状を治療する方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１８の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
前記疾患や症状がアルツハイマー病およびダウン症から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願はＰＣＴ出願であり、１９９９年１２月２２日に出願の米国非仮出願第０９／４７０，９５４号（整理番号ＰＣ−０００８ ＵＳ）の恩典を請求するものである。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、新規の哺乳動物タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、およびその核酸配列変異体、並びにこれらの配列を用いたアルツハイマー病及びダウン症の特徴付け・診断・予防・治療に関連する。
【０００３】
（発明の背景）
生物間の系統発生的な関連が何度も実証され、様々な原核生物及び真核生物の研究によって、生化学的及び生理学的な機構や代謝経路の実質的に漸進的な進化が示された。異なった進化の圧力にもかかわらず、酵母及び線虫、ハエ、ラット及びヒトにおける細胞周期を調節するタンパク質が、共通の化学的または構造的特徴を有し、同一の一般的な細胞活性を調節する。ヒト遺伝子配列を、構造及び／または機能が既知である他の生物の遺伝子配列と比較することによって、研究者は類似性を引き出し、仮説を検証するためのモデル系を作製することができる。モデル系は、ヒトの症状、疾患、及び障害の診断薬及び治療薬の開発に極めて重要である。
【０００４】
死後の検査におけるアルツハイマー病の神経病理学的なシグネチャである老人性神経プラーク（ｓｅｎｉｌｅ ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）が、脳の海馬および新皮質領域で見つかっている。海馬は、大脳辺縁系の一部であって、学習および記憶に重要な役割を果たす。アルツハイマー病では、プラークの蓄積が海馬の神経構造に損傷を与え、最終的に記憶プロセスを不全にする。この疾患は家族性あるいは散発性であって、４０歳の人が感染するなど早期に発症することがある。家族性アルツハイマー病は、遺伝性の強い常染色体の優勢形質であると考えられてきた。しかしながら、より多くの遺伝的決定基が単離されるにつれこの考えが変わってきた。例えば、老人性プラークに見られるタンパク質である、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の或る正常なアレル変異体が、この疾患の発症リスクを抑制するか或いは高めるかの何れかに作用する（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０： １９７７−１９８）。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン１、およびプレセニリン２の３種類の別の遺伝子の突然変異も、人がアルツハイマー病を発症する素因であることが分かった（Ｓｅｌｋｏｅ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ３９９： Ａ２３−Ａ３１）。
【０００５】
βアミロイドタンパク質（Ａβ）が老人性プラークの主な成分であって、通常はβセクレターゼおよびγセクレターゼがＡＰＰを切断して形成される。アルツハイマー病の患者では、多量のＡβが生成され、細胞外のこれらの神経病理学的なプラークに蓄積されている。Ａβが蓄積するメカニズムを究明するために、２種類の酵母アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）がｉｎ ｖｉｔｒｏでＡＰＰを処理することが見出されたため、ＡＰＰ切断セクレターゼに焦点を絞った（Ｚｈａｎｇ ら （１９９７） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３５９： １１０−１２２）。ペプチド様プローブを用いた近年の研究により、これらのセクレターゼが膜内切断アスパルチルプロテアーゼであることが分かった（Ｗｏｌｆｅ ら （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８： ４７２０−４７２７）。
【０００６】
プレセニリン１遺伝子は、ＡＰＰカルボキシル末端を切断するγセレクターゼの候補である。この疾患プロセスにおけるプレセニリンの関与を支持する幾つかの証拠がある。その証拠の中には、プレセニリンおよびＡＰＰの免疫共沈降、並びにプレセニリン遺伝子におけるミスセンス点突然変異が、アルツハイマー病の特に攻撃性の早期発症を引き起こすことなどがある（Ｈａａｓ および Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ９１６−９１９）。プレセニリンは、ｎｏｔｃｈタンパク質を切断すると考えられている。ＡＰＰがαセレクターゼおよびβセレクターゼによってその外部ドメインに切断されるのと同様に、プレセニリンがこのｎｏｔｃｈタンパク質を切断して、γセレクターゼの基質であるカルボキシル末端断片を生成する（Ｈａａｓ および Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，前出）。
【０００７】
アスパラギン酸プロテアーゼはリソソームプロテアーゼのカテプシンファミリーのメンバーであって、ペプシンＡ、ガストリクシン、キモシン、レニン、およびカテプシンＤおよびＥを含む。アスパラギン酸プロテアーゼは活性部位における２つのアスパラギン酸残基を含み、ｐＨ２〜３の範囲で最も活性であって、その状態では一方のアスパラギン酸がイオン化し、他方はイオン化していない。アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）活性部位の触媒アスパラギン酸残基は、アミノ酸残基配列Ｄ−Ｔ／Ｓ−Ｇ−Ｔ／Ｓ−Ｔ／Ｓ（アスパルチルプロテアーゼシグネチャＰＳ００１４１；ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ００１２８）によって特徴付けられる。ヘキサペプチドペプスタチンはアスパラギン酸プロテアーゼの強力なプロモーターであって、遷移状態にある時は通常の基質に類似している。またアスパラギン酸プロテアーゼには、細菌ペニシロペプシン、哺乳動物ペプシンおよびキモシン、および或る種の真菌プロテアーゼが含まれる。カテプシンの異常な調節および発現は、関節炎などの様々な炎症性疾患の症状を示すものである。
【０００８】
本発明は、アスパルチルプロテアーゼをコードする更なる核酸配列およびその核酸配列変異体の発見に基づき、アルツハイマー病およびダウン症の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供する。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、アスパルチルプロテアーゼ（ＡＳＰ）をコードする哺乳動物核酸分子、およびその核酸配列変異体の発見に基づき、アルツハイマー病およびダウン症など症状の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供することで当分野の要求に応える。
【００１０】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列またはそれらの一部、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の生物学的に活性な断片、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の免疫学的に活性な断片を含む本哺乳動物タンパク質をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４３またはそれらの断片を含む単離され精製されたヒト、サル、およびラットの核酸分子を提供する。
【００１１】
本発明はまた、高いストリンジェンシーの条件下で、本哺乳動物核酸分子またはその断片とハイブリダイズするプローブを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４３の核酸分子に相補的な単離され精製された核酸分子を提供する。一実施態様では、このプローブは、一本鎖の相補的なＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。
【００１２】
本発明は更に、サンプルにおいて核酸分子を検出する方法であって、プローブをそのサンプルの少なくとも１つの核酸分子とハイブリダイズするステップと、ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、そのハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在がそのサンプルに核酸分子存在することと相関する方法を提供する。一実施態様では、この方法は、ハイブリダイゼーションの前にその核酸分子を増幅するステップを更に含む。この核酸分子若しくはその断片を、マイクロアレイ上のエレメント若しくは標的として用いることができる。
【００１３】
本発明はまた、核酸配分子しくはその断片を用いて、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するべく、分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、その核酸分子をその分子のライブラリと結合させるステップと、その特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むスクリーニング方法を提供する。このようなライブラリには、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、ペプチド、ＰＮＡ、タンパク質等が含まれる。類似の方法で、核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製することができる。
【００１４】
本発明はまた、本核酸分子の少なくともある断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれている。本発明は更に、タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと、そのタンパク質をその宿主細胞から回収するステップとを含むタンパク質生産方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、実質的に精製され哺乳動物ＡＳＰまたはその一部を提供する。更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の生物学的に活性な断片、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の免疫学的に活性な断片を有する単離され精製されたタンパク質を提供する。本発明はまた、医薬用担体と共に実質的に精製された哺乳動物タンパク質またはその一部を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明は更に、その哺乳動物タンパク質の一部を用いて抗体を産生させる方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物タンパク質若しくはその一部を用いて、そのタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するべく、分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、そのタンパク質を分子のライブラリと結合させるステップと、その特異的な結合を検出して、そのタンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するスクリーニング方法を提供する。このようなライブラリには、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、薬剤、医薬品、その他のリガンドが含まれる。一実施態様では、この方法で同定されたリガンドがその哺乳動物タンパク質の活性を調節する。類似の方法で、そのタンパク質若しくはその一部を用いてリガンドを精製する。本発明はまた、特異的な結合が許容される条件下で、その哺乳動物タンパク質またはその一部をサンプルと結合させて、そのタンパク質とリガンドとの特異的な結合を検出して、その結合したタンパク質を回収し、そのリガンドからそのタンパク質を分離して、精製されたリガンドを得る方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物のゲノムＤＮＡの中にマーカー遺伝子を挿入して、その天然の哺乳動物核酸分子の発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、その哺乳動物核酸分子を用いて哺乳動物モデル系を作製する方法であって、その哺乳動物核酸分子を含むベクターを作製するステップと、そのベクターを全能性哺乳動物胚性幹細胞の中に導入するステップと、ゲノムＤＮＡの中にそのベクターが組み込まれた胚性幹細胞を選択するステップと、この選択した細胞を哺乳動物胚盤胞の中に微量注入して、キメラ胚盤胞を形成するステップと、偽妊娠メスにキメラ胚盤胞を移植するステップと、このメスが、生殖細胞系の中に少なくとも１つの哺乳動物核酸分子の別の複製を含むキメラ哺乳動物を出産し、そのキメラ哺乳動物を交配して同型接合哺乳動物モデル系を作製するステップとを含む哺乳動物モデル系作製方法を提供する。
【００１８】
（本発明の実施方法について）
本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いるものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は当業者には周知の複数の宿主細胞を含む。
【００１９】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００２０】
（定義）
「アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）」または「ＡＳＰ」は、天然、合成、半合成或いは組み換え体などの全ての種（マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、齧歯類、イヌ、サルを含むが好ましくはヒトである哺乳動物）から得られる、実質的に精製されたタンパク質を指す。
【００２１】
「遺伝子発現の変化」および「発現の変化」は、サンプルにおける遺伝子発現の増大および減少、並びに転写されたメッセンジャーＲＮＡ転写産物の存在または不在を指す。
【００２２】
「生物学的に活性」は、構造的または免疫学的、調節的、化学的な機能を有する、天然或いは組み換え、または合成分子であるタンパク質を指す。
【００２３】
「相補的な」は、プリン塩基とピリミジン塩基との自然な水素結合による塩基対形成を指す。例えば、配列Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔは、その相補配列Ｔ−Ｇ−Ｃ−ＡまたはＵ−Ｇ−Ｃ−Ａと水素結合する。２つの一本鎖分子の相補性は、ヌクレオチドの幾つかのみが結合する部分的な相補性と、ヌクレオチドの殆ど全てが結合する完全な相補性とがある。核酸鎖間の相補性の程度は、ハイブリダイゼーション及び増幅反応の効率及び強度に影響する。
【００２４】
「誘導体」は、化学修飾された核酸分子やタンパク質配列を指す。化学修飾には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、アルキル基またはアシル基、アミノ基による水素の置換や、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、または類似の任意のプロセスが含まれる。
【００２５】
「断片」は、有用な機能的特性を維持する核酸分子の任意の一部またはインサイト社クローンを指す。有用な断片には、ハイブリダイゼーションや増幅技術、または複製や転写、翻訳の調節に有用なオリゴヌクレオチドを含む。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による２つの核酸分子の複合体を指す。
【００２７】
「リガンド」は、核酸分子やタンパク質の相補部位に特異的に結合する任意の分子や物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、核酸及びタンパク質、炭水化物、脂肪、脂質を含む無機及び有機物質の少なくとも１つからなり、本発明の核酸分子やタンパク質の活性を安定化させたり、調節したりする。
【００２８】
「調節する」は、分子と核酸分子かタンパク質の何れかとの特異的な結合によって、寿命や活性（生物学的または化学的、免疫学的）を変化させることを指す。
【００２９】
「核酸分子」は、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの任意の断片を指す。また、「核酸分子」は、ゲノム若しくは合成起源の二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ或いはＲＮＡであり、炭水化物または脂質、タンパク質、その他の物質と結合して、形質転換などの特殊な作用を起こしたり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の有用な成分を形成する。「オリゴヌクレオチド」は、アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）及びプライマー、オリゴマー、エレメント、標的、プローブと実質的に同一であり、好ましくは一本鎖である。核酸分子は別の核酸分子のスプライスバリアントであり得る。
【００３０】
「タンパク質」は、天然或いは合成のアミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの一部を指す。
【００３１】
ここで用いる「一部」は、あらゆる目的に用いられるタンパク質の任意の一部を指すが、特に、その一部と特異的に結合する分子のライブラリのスクリーニングや抗体の生産に用いられる。「一部」の典型的な例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の初めの４０の連続するアミノ酸である。
【００３２】
ポリヌクレオチド配列に用いる「類似性」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つの配列間の一致する残基数から求められる。このようなプログラムは、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、標準的かつ再現性のある方法で比較する配列内にギャップを挿入可能なため、２つの配列間のより有意な比較を達成することが可能である。
【００３３】
広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム一式が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）、（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって提供される。Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６： ２９０−３００）は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）および幾つかのほかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐの両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．０９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【００３４】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
類似性は、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【００３５】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。核酸分子を含むサンプルは、体液や、細胞抽出物、細胞から単離された染色体、細胞小器官、膜や、溶液中に遊離している或いは基板に結合されたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント等を含み得る。
【００３６】
「実質的に精製された」は、その自然環境から切り離されてから分離或いは単離された、自然環境では結合しているその他の成分が少なくとも約６０％、好適には約７５％、最も好適には、約９０％取り除かれた核酸分子またはタンパク質を指す。
【００３７】
「基板」は、核酸分子またはタンパク質が結合した任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【００３８】
「変異体」、「核酸分子変異体」または「核酸配列変異体」は、ＡＳＰをコードする核酸分子のスプライスバリアントであって、少なくとも１００最も好ましくは４００以上のＢＬＡＳＴスコアによって決定され得る核酸分子を指す。
【００３９】
（発明）
本発明は、ＡＳＰｓをコードする新規の哺乳動物核酸分子およびその核酸分子変異体の発見に基づき、アルツハイマー病およびダウン症などの病態の特徴付け・診断・治療・予防においてその核酸分子やその断片、またはそのタンパク質やその一部を用いることに関連する。
【００４０】
本発明のＡＳＰ１をコードする核酸分子は、アミノ酸配列アライメント用のコンピュータ検索を用いて結腸組織ｃＤＮＡライブラリ（ＣＯＬＮＴＵＴ０６）からのインサイトクローン１６１１５６５Ｈ１において初めに同定された。コンセンサス配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３は、インサイトクローン１８６３９２０Ｘ３２１Ｆ１ （ＰＲＯＳＮＯＴ１９）、２２３３９０１Ｈ１ （ＰＡＮＣＴＵＴ０２）、１６１１５６５Ｔ１ （ＣＯＬＮＴＵＴ０６）、３３６５４１Ｈ１ （ＥＯＳＩＨＥＴ０２）、およびショットガン配列ＳＢＡＡ０３９０２Ｆ１に由来する。
【００４１】
ＡＳＰ２をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメント用のコンピュータ検索を用いて皮膚組織ｃＤＮＡライブラリ（ＳＫＩＮＢＩＴ０１）からのインサイトクローン１８６９８６９Ｈ１において初めに同定された。コンセンサス配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４は、インサイトクローン１８６９８６９Ｆ６ （ＳＫＩＮＢＩＴ０１）、２５４９５６２Ｆ６ （ＬＵＮＧＴＵＴ０６）、３３３８６０３Ｈ１ （ＳＰＬＮＮＯＴ１０）、およびショットガン配列７０３１７９２５Ｄ１、７０３１７５７０Ｄ１、および７０３１９２１４Ｄ１に由来する。
【００４２】
本発明の哺乳動物アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）をコードする核酸分子およびその核酸分子変異体は、本発明のＡＳＰ１およびＡＳＰ２をコードする核酸配列およびアミノ酸配列をＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよびＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）における核酸配列と比較して初めに同定した。
【００４３】
ＡＳＰは、４２３のアミノ酸からなるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のアミノ酸配列および３２２のアミノ酸からなるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含む。次に示すＡＳＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）の化学的および構造的な特徴付けは、図３Ａ−図３Ｄに示されている絶対位置（１列につき３０残基）に基づいて行われた。
【００４４】
ヒトＡＳＰ１タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）は、Ｎ７５およびＮ２７１残基における２つの潜在的なＮグリコシル化部位と、Ｋ１０２残基におけるロイシンジッパー、Ａ２９、Ｈ３３、Ｌ８４、Ｌ１１４、Ｓ １１８、Ｑ２５１、Ｌ３１５、Ｉ３５４、およびＣ３６７残基における９箇所のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位と、Ｄ３７、Ｔ４２、Ｋ５１、Ｌ２７２、およびＥ２７５残基における５箇所のプロテインキナーゼＣリン酸化部位とを有する。加えて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６は、Ｐ１２残基におよびＹ２０５残基における２つの真核およびウイルスアスパルチルプロテアーゼを有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７とは４３．５％の類似性、ヒトガストリクシン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ４８ ； ＧＩ １６５８２８６）とは１８．８％の類似性、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ４９； ＧＩ １０３９４４５）とは１４．１％の類似性とを有する。類似性のパーセントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて計算した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のＴ３５残基からＧ４７残基までの抗体の生産に有用であるアミノ酸は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＰＲＯＴＥＡＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）で選択した。ＢＬＯＣＫＳ分析（ｐ ＜ １０−１２）によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のＬ４０からＧ５５、Ｇ１２９からＴ１３７、Ｇ１８７からＧ１９６、Ａ２３５からＬ２４４、およびＶ３４１からＡ３６４のアミノ酸配列同一性に基づいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６がアスパルチルプロテアーゼと同定された。更に、ＰＲＩＮＴＳ分析（ｐ ＜ １０−８）によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６のＩ３３からＶ５３、Ｇ１８２からＫ１９５、Ａ２３５からＬ２４４、およびＶ２４０からＤ３５４の残基から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６において２つのアスパルチルプロテアーゼシグネチャが同定された。
【００４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を用いて、インサイトＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）においてヒトＡＳＰ２核酸分子変異体が同定された。１４９９２１８Ｈ１ （ＳＩＮＴＢＳＴ０１）（インサイトクローン番号（ライブラリ））、１４３８７１９Ｔ６ （ＰＡＮＣＮＯＴ０８）、３６４２８５３Ｔ６ （ＬＵＮＧＮＯＴ３４）、１４９９２１８Ｆ６ （ＳＩＮＴＢＳＴ０１）、１３７７１７８Ｈ１および１３７７１７８Ｆ１ （ＬＵＮＧＮＯＴ１０）、３６４２８５３Ｆ６ （ＬＵＮＧＮＯＴ３４）、５５７７５１３Ｈ１ （ＢＲＡＰＮＯＴ０４）、５０９４６３３Ｈ１ （ＥＰＩＭＮＯＮ０５）、２２９３３９３Ｈ１ （ＢＲＡＩＮＯＮ０１）、２９０８５９４Ｈ１ （ＴＨＹＭＮＯＴ０５）、２００７２６９Ｈ１ （ＴＥＳＴＮＯＴ０３）、１４３８６１３Ｆ１ （ＰＡＮＣＮＯＴ０８）、３４８４８１９Ｈ１ （ＫＩＤＮＮＯＴ３１）、２７５７８７０Ｈ１ （ＴＨＰ１ＡＺＳ０８）、２９０００６３Ｈ１ （ＤＲＧＣＮＯＴ０１）、２１２３４１１Ｈ１ （ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、１４３８７１９Ｈ１ （ＰＡＮＣＮＯＴ０８）、および１４３８６１３Ｈ１ （ＰＡＮＣＮＯＴ０８）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７−２８はそれぞれ、コンセンサス配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の変異体である（図４Ａ−図４Ｈ）。推定上のスプライス部位は記号Δで示した。これらのクローンは、生殖（３／１５）、心血管（２／１５）、消化系（４／１５）、神経（３／１５）、造血（２／１５）、および泌尿器（１／１５）の組織、臓器、または関連する系に由来するライブライで発現した。
【００４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３を用いて、インサイトＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）においてヒトＡＳＰ１核酸分子変異体が同定された。５１５７１７９Ｆ６ （ＢＲＳＴＴＭＴ０２）（インサイトクローン番号（ライブラリ））、３９８５７５８Ｈ１ （ＵＴＲＳＴＵＴ０５）、２８４６６０４Ｈ１ （ＤＲＧＬＮＯＴ０１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＬＵＮＧＮＯＮ０３）、３７５１９０７Ｈ１ （ＵＴＲＳＮＯＴ１８）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＩＮＩＴＵＴ０４）、１８５５２２６Ｈ１および１８５５４２０Ｈ１ （ＨＮＴ３ＡＺＴ０１）、５１１４５５８Ｈ１ （ＥＮＤＩＴＸＴ０１）、８３９５３８Ｒ１ （ＰＲＯＳＴＵＴ０５）、５５８８４９０Ｈ１ （ＥＮＤＩＮＯＴ０２）、４９９９６６２Ｈ１ （ＭＹＥＰＴＸＴ０２）、３６３００５４Ｈ１ （ＣＯＬＮＮＯＴ３８）、および４１０８２６４Ｈ１ （ＰＲＯＳＢＰＴ０７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９−４２はそれぞれ、コンセンサス配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３の変異体である（図５Ａ−図５Ｇ）。推定上のスプライス部位は記号Δで示した。これらのクローンは、生殖（５／１５）、心血管（４／１５）、消化系（２／１５）、胸部神経節（１／１５）、造血（２／１５）、および奇形癌細胞系（２／１５）の細胞、組織、臓器、または関連する系に由来するライブライで発現した。
【００４７】
本発明の哺乳動物アスパルチルプロテアーゼをコードする更なる核酸分子は、ＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９３４０２）を用い、ＺＯＯＳＥＱ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）においてラットおよびサルクローンをヒトアスパルチルプロテアーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３および４４）とアラインメントして同定された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１６の配列表に存在するクローン（様々なライブライに由来する）：７００２５１５６７Ｈ１ （ＲＡＢＭＮＯＴ０１）、７０１４３２２２８Ｔ１ （ＲＡＬＩＴＸＴ０６）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＲＡＨＹＮＯＴ０２）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＲＡＨＹＮＯＴ０２）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＲＡＣＯＮＯＮ０２）、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＲＡＢＹＵＮＳ０３）、７００９２１５６６Ｈ１ （ＲＡＮＰＮＯＴ０２）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＲＡＢＣＮＯＴ０１）、７００８８５４３２Ｈ１ （ＲＡＶＡＮＯＴ０１）、７０１９０１７０８Ｈ１ （ＲＡＢＹＵＮＳ０９）、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＲＡＢＹＵＮＳ０３）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＲＡＫＩＴＸＴ０８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＲＡＬＩＴＸＴ２６）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＲＡＣＯＮＯＴ０１）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＲＡＢＭＮＯＮ０２）、７００３７６８７０Ｈ１ （ＲＡＬＡＮＯＴ０１）、および７００７０９０３２Ｈ１ （ＭＮＢＦＮＯＴ０１）は、ＡＳＰｓをコードする核酸分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３および４４の非ヒト変異体である（図６Ａ−図６Ｅおよび図７Ａ−図７Ｇ）。推定上のスプライス部位は記号Δで示した。これらのクローンは、神経（１０／１６）、消化系（４／１６）、心血管（１／１６）、および泌尿器系（１／１６）の組織、臓器、または関連する系に由来するライブライで発現した。
【００４８】
核酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７−４２は、サンプルにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３および４４または類似の分子の同定および区別をするためのハイブリダイゼーションおよび増幅技術に用いることができる。この分子を用いて遺伝子組換えによりヒトの症状、疾患、または障害を模した疾患動物モデルを作製したり、動物毒素研究、臨床検査、および被験動物／患者の治療プロファイルをモニタリングすることが可能である。
【００４９】
（本発明の特徴及び使用）
ｃＤＮＡライブラリ
ここに開示する特定の実施例では、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物の細胞及び組織からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡライブラリを作製する。上記したインサイト社クローンは、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリから単離された。本発明の代表的な少なくとも１つのライブラリの作製方法を以降に記載する実施例に示す。コンセンサス哺乳動物配列は、Ｐｈｒａｐ （Ｐ． Ｇｒｅｅｎ， 前出）及びＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、ＡＵＴＯＡＳＳＥＭＢＬＥＲアプリケーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）などのコンピュータプログラムを用いて、インサイト社クローンを含む断片、伸長、及び／またはショットガン配列から化学的かつ／または電子的に構築した。クローン、伸長配列および／またはショットガン配列は、クラスターおよび／または主クラスターの中にに電子的に組み入れられた。
【００５０】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当分野で周知であり、そのような方法を用いて本発明の任意の実施例を実施することができる。これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩであるクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび熱耐性Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （ＡＰＢ）， Ｐｉｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）に用いられるような校正エクソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせを用いることができる。配列の準備は、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、及びＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）などの装置を用いて自動的に行うのが望ましい。シークエンシングに用いる装置には、ＡＢＩ ３７００、３７７または３７３ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＡＰＢ）等がある。当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて、シークエンシングした配列を解析することができる。これらのアルゴリズムは、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９７； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７） 及びＭｅｙｅｒｓ（１９９５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３）に記載されている。
【００５１】
ショットガンシークエンシングを用いて、多数の生物に由来するクローニング挿入断片からより多くの配列を作り出す。ショットガンシークエンシング方法は当分野で周知であり、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ類や非熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ類、及び目的の核酸分子に隣接する代表的な領域から選択されたプライマーを用いる。当分野で周知のＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：１９５−２０２）などの様々なアルゴリズムやプログラムを用いて、組み立てが不完全な配列を調べる。ベクターやキメラ配列、または欠失配列を含む汚染配列を除去して、組み立てが不完全な配列を完全な配列に組み立てる。
【００５２】
核酸配列の伸長
本発明の配列は、当分野で周知の様々なＰＣＲ法を用いた方法で伸長することができる。例えば、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）、市販のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ用いてヌクレオチド配列を伸長することが可能である。全てのＰＣＲ系の方法に用いることができるように、プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）等の市販のソフトウェアを用いて、ヌクレオチドの長さが約２２〜３０個、ＧＣ含量が約５０％以上、約５５〜６８℃の温度で標的配列とアニールするように設計することが可能である。調節エレメントを復活させるために配列を伸長する場合は、ｃＤＮＡライブラリよりゲノムライブラリを用いる方が良い。
【００５３】
（本哺乳動物核酸分子の使用）
ハイブリダイゼーション
本哺乳動物核酸分子及びその断片は、様々な目的のための様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。プローブは、５’調節領域やアスパルチルプロテアーゼグネチャなどの保存されたモチーフから作製可能であり、これらのプローブを、この哺乳動物タンパク質やアレル変位配列、または関連分子をコードする天然の分子を同定するためのプロトコルに用いることができる。通常は一本鎖であるＤＮＡ若しくはＲＮＡからなるこのプローブは、任意のこの核酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが望ましい。ハイブリダイゼーションプローブは、標識されたヌクレオチドの存在下でのＰＣＲ増幅、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、または末端標識化を利用して作製することができる。この核酸分子またはその断片を含むベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えてｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを作製することができる。これらの方法はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ）社が販売するキットを用いて行うことができる。
【００５４】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（厳密性）は、プローブのＧＣ含量、塩濃度、及び温度によって決まる。特に、塩濃度を下げる、またはハイブリダイゼーションの温度を上げて、ストリンジェンシーを高めることができる。ある膜系のハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシーの緩衝液（５ｘＳＳＣ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、６０℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体の形成を許容し得る。続く洗浄は、４５℃（中程度のストリンジェンシー）或いは６８℃（高いストリンジェンシー）の何れかの温度、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳなどの高いストリンジェンシーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的な核酸分子部分のみが安定して保持される。ある膜系のハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％、最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げたり、または、ＳａｒｋｏｓｙｌやＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）などの界面活性剤及び変性したサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを低減することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件や要素の選択については当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ（ｓｕｐｒａ） 及びＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ．に記載されている。
【００５５】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して分析することができる。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイのプローブや標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多数の遺伝子の発現レベルをモニタリングし、遺伝子変異体、突然変異及びＳＮＰ（一塩基多型）を同定することができる。このようなデータを用いて、遺伝子機能の解明や、症状及び疾患、または障害における遺伝子原理の解明や、症状及び疾患、障害の診断または治療、治療薬の開発、並びにこれらの治療薬の活性のモニタリングが可能である（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ他（１９９５） ＵＳＰＮ ５，４７４，７９６； Ｓｃｈｅｎａ他（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ他（１９９５） ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ他（１９９５） ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） ＵＳＰＮ ５，６０５，６６２を参照）。
【００５６】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用である。このプローブは、（１）特定の染色体、（２）染色体の特定の領域、（３）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）や酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１作製物、または単一の染色体、（５）これらの試料の任意のものから作製されたＤＮＡライブラリなどの人工染色体作製物、にハイブリダイズすること可能である。
【００５７】
発現
ＡＳＰをコードする多数の核酸分子をベクターにクローニングして、このタンパク質若しくはその一部を宿主細胞で発現させることができる。この核酸配列を、ＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ （１９９６） ＵＳＰＮ５，８３０，７２１）や部位特異的変異誘発などの方法によって、新規の制限部位を作り出したり、グリコシル化パターンを変えたり、優先コドンを変えて特定の宿主における発現を増大させたり、スプライスバリアントを作り出したり、半減期を延長する等の操作が可能である。この発現ベクターは、特定の宿主における各要素の効率に基づいて選択された様々なサンプルに由来する転写及び翻訳調節エレメント（プロモーター及びエンハンサー、特定の開始シグナル、ポリアデニル化３’配列）を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換え技術を組み合わせて、このベクターに核酸配列と調節エレメントをつなぐことができる。このような技術は、当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出、ｃｈ． ４， ８， １６ ａｎｄ １７）に記載されている。
【００５８】
様々な宿主系を発現ベクターで形質転換することができる。以下に限定するものではないが、これらの中には組み換えバクテリオファージやプラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌と、酵母発現ベクターで形質転換された酵母と、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞系と、ウイルスエレメント及び／または細菌エレメントを含む発現ベクターで形質転換された植物細胞系や動物細胞系が含まれる（Ａｕｓｕｂｅｌ前出、ｕｎｉｔ １６）。例えば、アデノウイルス転写／翻訳複合体を哺乳動物細胞に用いることができる。配列をウイルスのゲノムのＥ１若しくはＥ３領域に結合させた後、この感染ウイルスを用いて形質転換させ、宿主細胞でタンパク質を発現させることができる。また、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーやＳＶ４０、またはＥＢＶ系のベクターを用いてタンパク質を高発現させることができる。
【００５９】
核酸配列のルーチンのクローニング及びサブクローニング、増殖は、多機能ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行うことができる。核酸配列をこれらのベクターの多数のクローニング部位に導入すると、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、形質転換された細菌を確認するための比色法によるスクリーニングが可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写及びジデオキシ法によるシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の調整、入れ子状欠失の作製において有用である。
【００６０】
長期に渡って組み換えタンパク質を産生させるために、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子或いは可視マーカー遺伝子と共にこのベクターを持続的に細胞株に形質転換することができる。形質転換後、細胞を強化培地で約１〜２日間増殖させてから選択培地に移す。代謝拮抗物質、抗生物質、除草剤耐性遺伝子を含む選択マーカーは、適正な選択薬剤に対する抵抗性を与え、導入配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの可視マーカーの発現によって同定された、或いは選択培地に生存することによって同定された耐性クローンを、培養技術を用いて増殖することができる。また、可視マーカーを用いて、導入された遺伝子によって発現するタンパク質を定量することができる。宿主細胞が目的の哺乳動物核酸分子を含むか否かの決定は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、或いはＰＣＲ増幅技術に基づいて行うことができる。
【００６１】
宿主細胞は、組み換えタンパク質を目的の形に修飾する能力に基づいて選択することができる。このような修飾には、アセチル化及びカルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化等が含まれる。「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲッティング、折り畳み及び／または活性を特定することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有する異なった宿主細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を選択して、組み換えタンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にすることが可能である。
【００６２】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするために、ベクターに導入する異種部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等を含む。ＧＳＴ及びＣＢＰ、６−Ｈｉｓはそれぞれ、グルタチオン及びカルモジュリン、金属キレート樹脂が結合した市販のアフィニティーマトリックスを用いて精製される。ＦＬＡＧ及びＭＹＣは、市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて精製される。目的のタンパク質配列と異種部分との間にタンパク分解切断部位を設けて、生成の後の分離が容易にすることができる。組み換えタンパク質の発現及び精製の方法はＡｕｓｕｂｅｌ（前出、ｕｎｉｔ １６）に記載され市販されている。
【００６３】
ペプチドの化学合成
タンパク質若しくはその一部は、組み換え方法以外の当分野で周知の化学的方法によって合成することもできる。固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Ｂｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法若しくは塩基不安定Ｆｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法によって保護されたＮ−α−である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Ｂｏｃ若しくはＦｍｏｃを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び／またはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １９９７／９８ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ｐｐ． Ｓ１−Ｓ２０）。ＡＢＩ ４３１ Ａ ペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。タンパク質またはその一部は調整用の高性能液体クロマトグラフィーによって実質的に精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【００６４】
抗体の準備及びスクリーニング
ヤギ及びウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む様々な宿主は、ＡＳＰ若しくはその任意の一部を注入して免疫することができる。フロイントなどのアジュバント及びミネラルゲルと、リゾレシチン及びｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの表面活性物質とを用いて免疫反応を高めることができる。オリゴペプチドやペプチド、またはタンパク質の一部を用いて、少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは１０個の天然のタンパク質の一部と同一のアミノ酸を含む抗体を誘発させる。キメラ分子に対する抗体を産生させるために、オリゴヌクレオチドをＫＬＨなどのタンパク質と融合させることができる。
【００６５】
モノクローナル抗体は、培地の連続細胞株によって抗体を産生させる任意の技術を用いて準備する。以下に限定するものではないが、このような技術には、ハイブリドーマ技術及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２： Ｃｏｔｅ他（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； ａｎｄ Ｃｏｌｅ他（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０．を参照）。
【００６６】
別法では、当分野で周知の方法を用いる上記した一本鎖抗体を生産する技術で、エピトープ特異的一本鎖抗体を生産する。本哺乳動物タンパク質のエピトープに対して特異的に結合する部位を含む抗体断片を生産することが可能である。限定するものではないが、このような断片には、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製されたＦ（ａｂ’）２断片及びこのＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させて作製したＦａｂ断片が含まれる。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製して、目的の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の高速かつ容易に同定できるようにする（例えば、Ｈｕｓｅ他（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【００６７】
本哺乳動物タンパク質若しくはその一部を用いて、ファージミドまたはＢリンパ球免疫グロブリン・ライブラリをスクリーニングして、目的の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか一方を用いる、競合的結合またはイムノアッセイの様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイムノアッセイは通常、このタンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を行う。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合によるアッセイを用いることもできる（Ｐｏｕｎｄ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【００６８】
アッセイのための分子の標識化
多様な標識化及び接合技術は当分野で周知であり、様々な核酸やアミノ酸、及び抗体のアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、３２Ｐ−ｄＣＴＰまたはＣｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰなどの標識したヌクレオチドや３５Ｓメチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈキットまたはＰｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて行うことができる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＢＩＯＤＩＰＹまたはＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）などの試薬を用いて分子中に存在するアミン及びチオール基または他の基に化学的に結合させることで、様々な物質（蛍光剤または化学発光剤、色素産生剤など）で直接標識することができる。
【００６９】
（診断）
本核酸分子、断片、オリゴヌクレオチド、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、ＰＮＡを用いて、遺伝子発現の変化やｍＲＮＡの過剰な発現の不在／存在を検出及び定量、または治療期間中のｍＲＮＡレベルのモニタリングを行うことができる。発現の変化に関連する症状や疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性の感情の障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病、進行性核上性麻痺、皮質基底変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、家族性前頭側頭痴呆、プロラクチンの産生異常、卵管病及び排卵異常、子宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含む不妊症、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症、精子形成異常、生理学上の精子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房及び女性化乳房癌、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、���癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、遺伝子発現の変化を検出するべく、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【００７０】
例えば、本核酸分子またはプローブを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションの後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識（シグナル）の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または異常症の存在が示唆される。
【００７１】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または異常症の診断のための基準を設けるために、正常或いは標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、動物かヒトの正常な被験体から採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、プローブと結合させることによって確立することができる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験体から得た値と、実質的に生成された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって定量することができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または異常症を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【００７２】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、患者個人の治療をモニタリングすることができる。病態が確認されると治療プロトコルを開始し、通常ベースで診断アッセイを繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたか否かを調べることが可能である。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に渡る期間の治療効果を調べることができる。
【００７３】
免疫学的方法
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いるタンパク質の検出及び定量は当分野で周知である。このような技術には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター法（ＦＡＣＳ）が含まれる。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； ａｎｄ Ｐｏｕｎｄを参照）。
【００７４】
（治療）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、その他のＡＳＰｓであるヒトガストリクシン（ｇ１６５８２８６）、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼＡ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅＡ） （ｇ１０３９４４５）のそれぞれの所定の領域間に、例えば配列及びモチーフの文脈において、化学的及び構造的類似性が存在する。更に、遺伝子の発現は、消化系、生殖組織、および脳組織に密接に関連し、アルツハイマー病およびダウン症などの症状にある役割を果たすと考えられる。発現若しくは活性の増大に関連する症状の治療においては、発現またはタンパク質の活性を低下させることが望ましい。また、発現または活性の低下に関連する症状の治療においては、発現またはタンパク質の活性を増大させることが望ましい。
【００７５】
核酸分子変異体であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６および４７の所定の領域間に、配列の文脈における化学的および構造的な類似性が存在する。更に、核酸分子変異体の遺伝子発現が、消化系組織、生殖組織、脳組織、および心血管組織に密接に関連し、アルツハイマー病およびダウン症などの症状にある役割を果たすと考えられる。
【００７６】
一実施例において、本哺乳動物タンパク質の発現または活性の変化に関連する症状の治療または予防のために、本哺乳動物タンパク質、その一部、またはその誘導体を患者に投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、季節性の感情の障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病、進行性核上性麻痺、皮質基底変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、家族性前頭側頭痴呆、プロラクチンの産生異常、卵管病及び排卵異常、子宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含む不妊症、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症、精子形成異常、生理学上の精子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房及び女性化乳房癌、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、���娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれる。
【００７７】
別の実施例では、医薬用担体と共に実質的に精製された哺乳動物タンパク質を含む医薬組成物を患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこの内在性タンパク質の活性、または発現の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００７８】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質の活性を調節するリガンドを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。一実施態様では、この哺乳動物タンパク質に特異的に結合する抗体を、この哺乳動物タンパク質を発現する組織や細胞に薬剤を送達するためのターゲッティング或いは送達機構として用いることもできる。
【００７９】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質またはその一部や誘導体を発現可能なベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００８０】
更なる実施例では、この核酸分子やその断片の相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００８１】
本核酸分子、またはそれに相補的な分子やその一部、そのタンパク質やその一部の内の任意のもの、これらの核酸分子やタンパク質を運ぶベクター、及びそれらのリガンドをその他の薬剤と共に投与することが可能である。併用療法に用いる薬剤の選択は、当業者が従来の薬学原理に従って行うことができる。薬剤を併用することによって、少量の各薬剤で特定の症状の予防または治療において相乗的な効果をあげることが可能である。
【００８２】
核酸を用いる遺伝子発現の調節
遺伝子の発現は、哺乳動物遺伝子の５’または３’調節領域、或いは他の調節領域に対して相補的或いはアンチセンス分子を設計することで調節することが可能である。転写開始部位に対して設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合を阻止する三重螺旋塩基対合で遺伝子発現を阻止することができる（Ｇｅｅ 他 Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｒ （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ， ｐｐ． １６３−１７７）。また、リボソームとｍＲＮＡとの結合を阻止して翻訳が行われないように、相補的な分子を設計することも可能である。或るいは、核酸分子またはその断片のライブラリをスクリーニングして、翻訳されない調節配列に特異的に結合する核酸分子または断片を同定することも可能である。
【００８３】
また、酵素活性をもつＲＮＡ分子であるリボザイムを用いて、ＲＮＡの特異的な切断を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムは、まずリボザイム分子と相補的な標的ＲＮＡとの配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、次にＧＵＡおよびＧＵＵ、ＧＵＣなどの部位においてヌクレオチド鎖が切断される。このような部位が一旦同定されたら、オリゴヌクレオチドを機能不全にしうる二次構造特性について、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを評価することができる。また、候補標的としての適合性は、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査して評価することができる。
【００８４】
本発明の相補的な核酸およびリボザイムは、固相ホスホラミダイト化学合成法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換え発現によって調製することが可能である。更に、ＲＮＡ分子は、その５’および／または３’末端に隣接配列を付加して、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏ−メチルを用いて、細胞内の安定性および半減期が増大するように改変することができる。この改変はＰＮＡの作製に固有であるが、他の核酸分子にも適用することができる。例えばイノシン、ｑｕｅｏｓｉｎｅ、ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅなどの伝統的でない塩基を含めて、またはアセチル基、メチル基、チオ基でウリジン、アデニン、シチジン、グアニン、およびチミンを修飾して、内在性エンドヌクレアーゼに対する分子の有効性を低くする。
【００８５】
スクリーニングアッセイ
本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を用いて、分子または化合物のライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を調べることが可能である。このライブラリは、生物系の核酸分子の活性、複製、転写、または翻訳を調節するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、およびその他のリガンドを含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、哺乳動物核酸分子またはその断片を分子のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つの分子を同定するステップとを含む。
【００８６】
同様に、本哺乳動物タンパク質またはその一部を用いて、任意の様々なスクリーニングアッセイで分子または化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに用いるタンパク質の一部は、溶液中に遊離している、非生物的若しくは生物的な基板に固定されている、または細胞内に位置していてもよい。そのタンパク質と分子との特異的な結合を測定することが可能である。スクリーニングするライブラリの種類によって、アッセイでそのタンパク質に特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、タンパク質、薬剤、または他の任意のリガンドを同定することが可能である。極めて少ないアッセイ容量および極少量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第５，８７６，９４６号に記載されており、言及することを以って本明細書の一部とする。この方法は、酵素阻害または受容体結合を調べるために多数の分子をスクリーニングする。
【００８７】
リガンドの精製
本核酸分子またはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でその核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、特異的結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適な試薬を用いて精製されたリガンドから核酸分子を分離するステップとを含む。
【００８８】
同様に、本タンパク質またはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でそのタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、そのタンパク質をリガンドとの間の特異的な結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドからタンパク質を分離するステップとを含む。
【００８９】
薬理学
医薬組成物とは、所望の目的を達成するのに効果的な量の活性成分を含んでいる物質である。効果的な薬用量の決定は、当分野の技術者の能力による部分が大きい。どんな化合物であっても、初めは細胞培養アッセイ或いは動物モデルの何れかによって治療効果のある薬用量を推定する。また、動物モデルを使って、好適な濃度範囲および投与経路を決定する。次に、このような情報を用いて、ヒトへの効果的な投与経路および薬用量を決定する。
【００９０】
治療効果のある薬用量とは、症状または病態を改善するタンパク質またはインヒビターの量である。このような薬剤の薬用効果および毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に医薬的効果がある投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致命的である投与量）などの細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。或る投与量における毒性効果と治療効果との比率が治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトへ適用する薬用量の範囲を決定する。
【００９１】
モデル系
動物モデルを用いて、ヒトに相当する暴露条件で動物モデルがヒトに類似の毒物反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的なモデルである。大抵の毒物研究は、低コストで入手が容易であり、かつ参照できる中毒学が豊富であることから、ラットやマウスなどの齧歯類を用いて行われる。齧歯類近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断および治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する（例えば、乳汁中に分泌される）同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【００９２】
中毒学
中毒学とは、生物系における物質の影響を研究する学問である。殆どの毒物研究はラットまたはマウスを用いて、物質がヒトの健康に与える影響を推定する。生理機能及び行動、恒常性プロセス、致死率における質的及び量的変化を観察して、毒性プロフィールを作成し、その物質に曝露された後のヒトの健康状態を評価する。
【００９３】
遺伝子毒物学は、物質が遺伝子の突然変異を引き起こす能力を同定し分析する。遺伝毒性物質は通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的或いは物理的特性を有し、突然変異した染色体が子孫に受け継がれるのが最大の害である。毒物研究によって、受胎前の両親のどちらか一方、または妊娠中の母、発生段階の生物に投与された場合の、子孫における構造的或いは機能的な異常の頻度を増加させる物質を同定することが可能である。マウス及びラットは生殖周期が短く、統計的必要性を満たす多数の子を出産する能力から、これらの試験にはマウス及びラットが用いられる場合が最も多い。
【００９４】
急性毒物の検査は、被験体への物質の一回の投与に基づき、その物質による症状または致死率を決定する。この検査では、１）初めの投与量の範囲を決定する実験と、２）有効な投与量の範囲を狭める実験と、３）用量応答曲線を確立する実験の３つの実験が行われる。
【００９５】
長期に渡る毒性検査では繰り返し物質を投与する。このような検査には、ラットやイヌが一般的に用いられ、分類学上異なった種からデータを収集する。物質を高い投与濃度で３〜４ヶ月間、毎日投与することで、発癌を除く、成体動物における殆どの毒性の種類が明らかになるという研究結果が多数報告されている。
【００９６】
一年或いはそれ以上の長期に渡る慢性毒性検査は、物質に毒性がないこと、或いは物質の発癌の可能性の何れかを実証するために行われる。ラットで検査が行われる場合、少なくとも３つの検査グループと１つの対照グループが用いられ、最初から最後まである間隔で検査及びモニタリングが行われる。
【００９７】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過小に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、同第５，１７５，３８３号、および同第５，７６７，３３７号を参照）。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型や組織特異的なｍＲＮＡの発現の分析からモニタリングすることができる。
【００９８】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚を形成する可能性を維持している。ＥＳ細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の全ての組織の一部を担うことになる。ＥＳ細胞は、実験用のノックアウトおよびノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。ノックアウト系に用いるベクターには、マーカー遺伝子配列を含むように破壊された疾患候補遺伝子が含まれる。このマーカー遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでその転写および／または翻訳を阻害する。このベクターが、当分野で周知の電気穿孔法およびリポソーム法、マイクロインジェクション等の形質転換方法によってＥＳ細胞に導入される。齧歯類の内在性遺伝子が、細胞分裂の際の相同組換えや組み込みによって、破壊された疾患遺伝子に置換される。
☆
形質転換されたＥＳ細胞が、所定の条件下で選択されて同定され、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系などからのマウス細胞胚盤胞に微量注入されるのが好ましい。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入すると、生まれるキメラ子孫がそれぞれ、その遺伝子型を有し、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【００９９】
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞および造血系、心筋細胞などの様々な細胞型や組織の分化の研究に、ＥＳ細胞が用いられている（Ｂａｉｎ 他 （１９９５） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６８：３４２−３５７； Ｗｉｌｅｓ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ （１９９１） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：２５９−２６７； ａｎｄ Ｋｌｕｇ 他 （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２１６−２２４）。近年の研究により、ヒト胚盤胞由来ＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで操作して、内胚葉および中胚葉、外胚葉性の細胞型を含む８つの別の細胞系譜に分化可能であることが実証された（Ｔｈｏｍｓｏｎら （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１００】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、ヒト疾患遺伝子候補のある領域が、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素によって改変される（ｎｅｏ ； Ｃａｐｅｃｃｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。挿入されたコード配列は、標的遺伝子の転写および翻訳を阻害して疾患候補タンパク質の生化学的な合成を阻止する。この改変した遺伝子を培養胚性幹細胞（上記）に形質転換し、この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、ホモ接合近交系を作り出す。
【０１０１】
ノックイン分析
胚発達の初期段階に現われる分化全能性ＥＳ細胞を用いてノックインヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル（マウスまたはラット）を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、そのヒト配列が組換えによって動物細胞ゲノムの中に組み込まれるようにする。ヒト遺伝子が組み込まれた全能性ＥＳ細胞を上記したように操作する。ヒトの症状に類似の情報を収集するべく、この近交系動物の研究および処置を行う。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す（例えば、Ｌｅｅ 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５：１１３７１−１１３７６；Ｂａｕｄｏｉｎ 他 （１９９８） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２：１２０２−１２１６； ａｎｄ Ｚｈｕａｎｇ 他 （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：３３４０−３３４９）。
【０１０２】
非ヒト霊長類モデル
動物実験の分野は、生理学および遺伝学、化学、薬理学、統計学等の基本科学から得たデータおよび方法論を利用する。このようなデータは、非ヒト霊長類がヒトの健康に関連し得るため、非ヒト霊長類における治療薬の効果の評価に重要である。ヒトの代わりにサルをワクチンおよび薬剤の評価に用いる。サルの反応は、類似の条件下でのヒトへの暴露に相当する。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、および一般的なマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）は、このような実験に用いられる最も一般的な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。ＮＨＰの群体作りおよび維持には多大な費用が掛かるため、初期の研究および毒物学的検査は、通常は齧歯類モデルで行われる。薬物嗜癖などの行動を調べる研究では、ＮＨＰは最良の実験動物である。更に、個々のＮＨＰおよびヒトは、多くの薬剤および毒物に対して異なった感受性を示すため、これらの物質を「高代謝型」および「低代謝型」に分類することができる。
【０１０３】
更なる実施例では、限定するものではないが、トリプレット遺伝子コードおよび特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られている核酸配列の特性に新しい技術が依存する場合は、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を、開発中のあらゆる分子生物学技術に用いることが可能である。
【０１０４】
【実施例】
本発明は、記載した特定の装置及び物質、方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例について説明するが、同等の実施例を用いて本発明を具現することも可能である。本発明の範囲は、前記請求の範囲によってのみ限定されるものであって、記載した実施例によって限定されるものではない。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。例示目的で、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリＢＲＡＩＮＯＮ０１の作製方法を記載する。
【０１０５】
１　代表的なｃＤＮＡ配列の調整
ＢＲＡＩＮＯＮ０１標準化ｃＤＮＡライブラリは、２６歳の白人男性が脳の右前頭頭頂部にグレード４のオリゴ星状細胞腫（ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）があると診断された後、大脳髄膜の切除術の際に採取された癌性脳組織（標本番号０００３）から作製された。患者は手術の前に、片側麻痺、てんかん、眼瞼の下垂症、および一般的な片頭痛の症状があった。
【０１０６】
凍結組織をＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＰＴ−３０００； Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、グアニジニウムイソチオシアネート溶液中でホモジナイズして溶解した。この溶解物をＲＮＡ 単離プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って酸性フェノール（ｐＨ ７．４）で抽出した。このＲＮＡを等倍量の酸性フェノールで抽出し、０．３ Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍量のエタノールで沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水で再懸濁し、３７℃で２５分間ＤＮアーゼで処置した。このＲＮＡの抽出および沈殿を初回と同様の方法で行った。このｍＲＮＡをＯＬＩＧＯＴＥＸキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）で単離し、ｃＤＮＡライブラリを作製した。
【０１０７】
このｍＲＮＡを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて推奨プロトコルに従って処置した。ｃＤＮＡの合成は、ＮｏｔＩ−オリゴｄ （Ｔ）プライマーを用いて開始した。二本鎖ｃＤＮＡを平滑化してＳａｌＩアダプターに結合し、ＮｏｔＩで消化してから、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラム （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で分画し、４００ ｂｐを超えるｃＤＮＡは、ＰＳＰＯＲＴ Ｉプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＮｏｔＩおよびＳａｌＩ部位に結合させた。この組み換えプラスミドをＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
【０１０８】
２　ｃＤＮＡライブラリの標準化
大腸菌系ＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を電気穿孔法で形質転換した後、カルベニシリン （２５ｍｇ／Ｌ）およびメチシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた選択培養液で、ＢＲＡＩＮＯＴ０１プラスミドライブラリの独立した４．９×１０６個の独立したクローンを増殖させた。ライブラリの存在量に応じて過剰なｃＤＮＡの複製を減らすために、次の変更点を除いてＳｏａｒｅｓら（１９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１ ： ９９２８−９９３２）の手順に従って１回標準化した。その変更点は、（１）プライマー伸長反応におけるプライマー：鋳型の割合を２：１から１０：１，２に下げ、（２）４００〜１０００ヌクレオチドの長いプライマー伸長生成物が生成されるように、反応液の各ｄｄＮＴＰの濃度をそれぞれ１５０ μＭに下げ、（３）ハイブリダイゼーションのアニーリング時間を１３時間から４８時間に延長した。標準化されたライブラリの一本鎖環状ＤＮＡをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで精製し、ランダムプライミングにより部分的な二本鎖にしてから、このｃＤＮＡを電気穿孔法でＤＨ１０Ｂ コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
【０１０９】
プラスミドＤＮＡを細胞から遊離させ、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６ プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。以下の変更点を除いて推奨プロトコルに従った。その変更点は、（１）細菌を、２５ ｍｇ／Ｌのカルベニシリンと０．４％のグリセロールを含む１ ｍｌの滅菌ＴＥＲＲＩＦＩＣ ＢＲＯＴＨ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養し、（２）接種した後、１９時間インキュベートし、インキュベーションの最後に０．３ ｍｌの溶解緩衝液で溶解し、（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ ｍｌの蒸留水に懸濁した。プロトコルのステップを終了した後、サンプルを９６ウェルブロックに移し４℃で保管した。
【０１１０】
このｃＤＮＡは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ） と共にＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）を用いて調製した。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ （１９７５ ； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４ ： ４４１ｆ）の方法によってシークエンシングし、リーディングフレームを決定した。
【０１１１】
３　同定及び伸長、構築、解析
コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）は、ヒトｃＤＮＡ配列のＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のインサイトクローン番号：１８６３９２０Ｘ３２１Ｆ１ （ライブラリ名：ＰＲＯＳＮＯＴ１９）、２２３３９０１Ｈ１ （ＰＡＮＣＴＵＴ０２）、１６１１５６５Ｔ１ （ＣＯＬＮＴＵＴ０６）、３３６５４１Ｈ１ （ＥＯＳＩＨＥＴ０２）、およびショットガン配列ＳＢＡＡ０３９０２Ｆ１から組み立て、これを用いて更なるＡＳＰ関連配列を同定するためにＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよびＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を検索した。ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の翻訳によって、翻訳領域であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を解明した。この核酸配列及びアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、ＰＦＡＭのデータベースに対して問い合わせた。機能解析は、ＭＯＴＩＦＳ及びＨＭＭアルゴリズムを用いて行い、抗原性指数（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析）はＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて決定した。
【０１１２】
４　配列類似性
配列類似性は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）のクラスター法を用いて、少なくとも２つの核酸分子間或いはアミノ酸配列間の比較に基づいて同一性（％）として計算した。このクラスター法は、全ての対間の距離を調べて配列をクラスターに分類するアルゴリズムを用いる。クラスターを対に並べた後、再びグループに分ける。配列Ａ及びＢの２つの配列間の配列類似性は、配列ＡとＢの一致する残基の合計数を、配列Ａの合計残基数から配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを減じたもので除して求める。２つの配列間の類似性が０或いは０に近いところのギャップは含めていない。
【０１１３】
５　核酸変異体の同定
哺乳動物アスパルチルプロテアーゼをコードする核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及び４４）のスプライスバリアントである核酸分子をＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， 前出； デフォルトパラメータを備えたＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．４）を用いて同定し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３及び４４とアラインメントするクローンをＬＩＦＥＳＥＱデータベースまたはＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）において見出した。哺乳動物核酸分子変異体は、ＢＬＡＳＴスコアによって選択した。ＢＬＡＳＴスコアは、核酸の一致が高スコア対（ＨＳＰ）の各対には＋５のスコアを与え、不一致の対には−４のスコアを与えて計算した。ＢＬＡＳＴアラインメントは視覚的に検査でき、ＢＬＡＳＴスコアが１００を超えるクローンは、Ｐｈｒａｐ （Ｇｒｅｅｎ， 前出）を用いて互いにアラインメントした。タンパク質をコードする核酸配列のスプライスバリアントのスプライス部位に隣接する核酸配列の例が当分野で周知である。スプライスバリアント核酸分子として同定されたものは、核酸配列の或る部分が１００％の同一性であって、その核酸配列の残りの部分が１００％未満の同一性であり、かつ推定スプライス部位に対する開始ヌクレオチド３’がグアニン塩基である。パブリックドメインにおけるＥＳＴｓの類似の分析により、ヒトアスパルチルプロテアーゼの核酸配列とアラインメントするクローンが同定され、推定スプライス部位の位置が決定された。
【０１１４】
６　ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いる実験用技術であり、標識したプローブを特定の細胞型或いは組織から抽出したＲＮＡを固定した膜にハイブリダイズさせることが含まれる。
【０１１５】
ＢＬＡＳＴに用いられる類似性コンピュータ技術を用いて、ＬＩＦＥＳＥＱデータベースまたはＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのヌクレオチドデータベースにおいて、同一或いは関連する分子を検索する。この配列に基づいた解析は、多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を調節して、任意の特定の一致を、同一または類似と分類することができる。ＢＬＡＳＴ検索の基準は、（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００と定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコアが４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０以上であればその一致は正確であろう。類似する分子或いは関連する分子は通常、８〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定される。
【０１１６】
ノーザン分析の結果は、この哺乳動物タンパク質をコードする転写物が発生したライブラリの分布割合（パーセント）として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経が含まれる。カテゴリー別に、目的の配列を発現するライブラリ数をカウントし、この数をこの哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子の核酸分子変異体を含むと同定された全てのライブラリ数で除した。
【０１１７】
７　核酸分子の伸長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４築に用いた核酸分子の少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてインサイト社ｃＤＮＡクローンを伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、約２２〜約３０個のヌクレオチドの長さ、約５０％以上のＧＣ含量で、約５５〜６８℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じる断片は排除した。選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの分子を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは組みになった入れ子のプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を設計する。
【０１１８】
ＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６ウェルプレートでＰＣＲ法を実施し、高い忠実度の増幅を達成した。反応混合液には、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、反応緩衝液（Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、β−メルカプトエタノールを含む）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含まれている。プラスミドから選択したプライマーの組みに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０１１９】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）の各ウェルに分注して、ＤＮＡがその試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を測定してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上で電気泳動させて解析し、何れの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定する。
【０１２０】
伸長した配列を脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理または切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化した断片を０．６〜０．８％の濃度のアガロースゲル上に分離させ、ＵＶ光で視認できるように断片を切断し、寒天をＡＧＡＲＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化／除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長した断片をｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してから、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換細胞が抗生物質を含む培地で選択され、それぞれのコロニーを切りとって、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の入った３８４ウェルプレートの中で、３７℃で一晩培養した。
【０１２１】
この細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡを増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー移動シークエンシングプライマー及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０１２２】
同様に上述の手順で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド配列を利用し、外側に伸長するように設計したオリゴヌクレオチドとゲノムＤＮＡライブラリを用いて調節配列を得た。
【０１２３】
８プローブの標識化及びハイブリダイゼーション分析
以下に示す任意の方法によって、核酸を生体サンプルから単離し、標準的なハイブリダイゼーションプロトコル用の基板にその単離した核酸配列を固定する。標的核酸（ゲノムＤＮＡの制限酵素断片）の混合液を、１ｘ ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−アセテート−エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含む）緩衝液において、０．７％アガロースゲルで電気泳動して分画し、２０ｘクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いて毛管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、標的核酸を個別にベクターに結合させ、細菌宿主細胞に挿入してライブラリを作製する。標的核酸を以下の任意の方法によって基板上に並べる。第１の方法では、個々のクローンを含む細菌細胞を機械的に選んでナイロン膜上に並べる。細菌増殖培地（カルベニシリンを含むＬＢ寒天）にこのナイロン膜を置き、３７℃で１６時間インキュべートする。細菌コロニーをプロテインキナーゼＫで変性及び中和、消化する。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）において、ナイロン膜をＵＶ照射してＤＮＡをその膜に架橋結合させる。
【０１２４】
第２の方法では、挿入物に近接するベクター配列に相補的なプライマーを用いてＰＣＲのサイクルを３０回繰り返し、標的核酸を細菌ベクターから増幅する。増幅した標的核酸をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。精製した標的核酸をガラス製の顕微鏡スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ， Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）上に機械的に並べる。このスライドは、０．０５％のアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で予めコーティングしてから１１０℃で硬化したものである。ガラススライドのアレイ（マイクロアレイ）を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてＵＶ照射する。
【０１２５】
ｃＤＮＡプローブは、鋳型ｍＲＮＡから作製する。５μｇのｍＲＮＡを１μｇのランダムプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、７０℃で１０分間インキュべートしてから凍結乾燥する。この凍結乾燥したサンプルを、ｄＮＴＰ混合物及び［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ジチオスレイトール、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む５０μｌの１×第１鎖緩衝液（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、４２℃で１〜２時間インキュべートする。インキュべートした後、プローブを４２μｌの蒸留水で希釈して９５℃で３分間加熱し、その後氷上で冷却する。プローブに含まれるｍＲＮＡをアルカリ分解によって除去する。このプローブを中和し、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、変性したｍＲＮＡや組み込まれなかったヌクレオチドを除去する。プローブは、放射性ヌクレオチド［３２Ｐ］ｄＣＴＰの代わりに標識マーカーＣｙ３−ｄＣＴＰ或いはＣｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識することもできる。
【０１２６】
ハイブリダイゼーションは、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び７％ＳＤＳ、１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液において６５℃で行う。ハイブリダイゼーション緩衝液において、基板を少なくとも２時間、６５℃でインキュべートした後、この緩衝液をプローブ配列を含む新しい緩衝液１０ ｍｌに取り替える。６５℃で１８時間インキュべートした後、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、最大で４０ ｍＭ リン酸ナトリウム及び１％ＳＤＳ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、６５℃の条件になるまで徐々にストリンジェンシーを増しながら、連続的に基板を洗浄する。膜にハイブリダイズした放射線標識したプローブによって生成されるシグナルを検出するために、この基板をＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲカセット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に曝露し、そのイメージをＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴデータ解析ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて解析する。マイクロアレイにハイブリダイズした蛍光プローブによって生成されるシグナルを検出するために、この基板を共焦点レーザ顕微鏡検査によって検査し、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現解析ソフトウェア（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてイメージを収集して解析する。
【０１２７】
９相補的な核酸配列
本核酸分子に相補的な配列、或いはその断片を用いて、遺伝子の発現を検出したり、低下させたり、阻害することができる。約１５〜約３０個の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体（ＰＮＡ）の場合でも同じ方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４３いて、Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で設計する。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、相補的なヌクレオチドを、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約１０個のヌクレオチドである最もユニークな５′配列に結合するように設計する。翻訳を阻害するために、相補的なオリゴヌクレオチドを、本哺乳動物タンパク質をコードするｍＲＮＡにリボソームが結合するのを阻害するように設計する。
【０１２８】
１０哺乳動物タンパク質の発現
本哺乳動物タンパク質の発現及び精製は、細菌若しくはウイルス系の発現系を用いて行うことができる。細菌で発現させるために、抗生物質耐性遺伝子とｃＤＮＡを高レベルで転写させる誘導性プロモーターとを含むベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、以下に限定するものではないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれる。組み換えベクターを、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導されると、抗生物質耐性細菌がこの哺乳動物タンパク質を発現する。真核細胞での発現は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）という組み換えバキュロウイスルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染させて行う。バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、相同組み換え或いは転移プラスミド中間体が関係する細菌媒介遺伝子転移の何れかによって、この哺乳動物ｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高いレベルでｃＤＮＡが転写される。
【０１２９】
大抵の発現系では、この哺乳動物タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはペプチドエピトープタグ（ＦＬＡＧ）などとの融合タンパク質として合成されるため、未精製の細胞溶解物から親和性を用いた迅速な一段階の組み換え融合タンパク質の精製を行うことができる。ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持する条件下で、固定されたグルタチオンでの融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分をこの哺乳動物タンパク質から蛋白分解的に遺伝子操作された特定部位で切断できる。アミノ酸８個のペプチドからなるＦＬＡＧによって、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いたイムノアフィニティー精製が可能となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）での精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したこの哺乳動物タンパク質を直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０１３０】
１１　機能のアッセイ
ＡＳＰのセリンプロテアーゼ活性は、様々なペプチドチオベンジルエーテル（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｉｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ）基質の加水分解によて測定する。基質を選択して、異なった種類のＳＰ（チマーゼ、ｔｒｙｐａｓｅ、ａｓｐａｓなど）を表す。アッセイは室温（〜２５℃）で行い、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ ７．５、０．０１Ｍ ＣａＣｌ２、および８％ジメチルスルホキシド）はＡＳＰのアリコットおよび好適な基質を含む。反応液はまた、加水分解の際に遊離してチオピリドン（ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｏｎｅ）に変換するチオベンジル基と反応する０．３４ ｍＭ ジチオピリジン（ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を含む。この反応は蛍光キュベットで行い、生成されたチオピリドンを分光光度計を用いて３２４ ｎｍの波長における吸光度によって測定する。反応で生成されたチオピリドンがＡＳＰの活性に比例する。
【０１３１】
別法では、タンパク質の機能は、哺乳動物細胞培養でＡＳＰをコードする配列を生理学的に高レベルで発現させてアッセイする。この核酸配列を、強力なサイトメガロウイルスプロモーターを含むＰＣＭＶ ＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）にサブクローニングし、この組み換えベクター５〜１０μｇを、当分野で周知の形質転換法方によってヒトの内皮細胞株或いは造血細胞株に形質転換する。更に、蛍光マーカーとなるＣＤ６４−ＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）をコードする配列を含むプラスミド１〜２μｇを同時に形質転換して、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で形質転換細胞を同定できるようにする。
【０１３２】
発現における導入された遺伝子の影響は、精製されたこれらの形質転換細胞集団を用いて評価することができる。形質転換細胞の表面で発現されるＣＤ６４−ＧＦＰが、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合するため、この形質転換細胞を、ヒトＩｇＧか抗ＣＤ６４抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡを細胞から単離して、ハイブリダイゼーション技術で分析することができる。
【０１３３】
１２　ＡＳＰに特異的な抗体の生産
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法でＡＳＰを精製し、これを用いてマウスやウサギを免疫する。以下の標準的なプロトコルを用いて抗体を生産する。別法では、ＡＳＰのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析し、免疫原性の高い領域を決定する。通常はＣ末端付近或いは親水性領域内に存在する免疫原性エピトープを選択して合成し、これを用いて抗体を増大させる。通常は１５残基程度の長さのエピトープを、Ｆｍｏｃ法でＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、これをＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応でＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合させて免疫原性を高める。
【０１３４】
エピトープ−ＫＬＨ複合体をフロイントの完全アジュバントと共に投与してウサギを免疫する。その後、間隔を置いてフロイントの不完全アジュバントで免疫化を繰り返す。マウスの場合は少なくとも７週間、ウサギの場合は少なくとも１２週間が経過した後、抗血清を採取して抗ペプチド活性を検査する。この検査には、このペプチドをプラスチックに結合し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。当分野で周知の方法を用いて抗体力価及び形成された複合体の収量を測定する。
【０１３５】
１３　特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組み換えの哺乳動物タンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度緩衝液でそのカラムを洗浄する。結合後、緩衝液（ｐＨ ２〜３）或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【０１３６】
１４　本核酸分子若しくはタンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本核酸分子やその断片、或いは本タンパク質やその断片を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはＢＩＯＤＩＰＹやＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した候補分子のライブラリを、標識した核酸分子またはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸分子或いはアミノ酸配列の何れかが存在する条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄し、特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分をアッセイし、結合している分子を同定する。様々な濃度の核酸若しくはタンパク質で得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合した分子との親和性を計算する。
【０１３７】
１５　タンパク質の活性の実証
ＡＳＰ若しくは生物学的活性を有するその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（Ｂｏｌｔｏｎ 他 （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９）で標識する。マルチウェルプレートのウェルにおいて、候補リガンド分子を標識したＡＳＰと共にインキュベートし、次に洗浄してから、標識した複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々な濃度のＡＳＰで得られたデータを用いて、ＡＳＰと結合した候補リガンド分子の関連性、数量、親和性を計算する。
【０１３８】
（表の簡単な説明）
本明細書の開示の一部には、著作権が保護されるべき資料が含まれている。この著作権の所有権者は、特許庁のファイルや記録にある本発明の開示に関する任意の明細書部分をファクシミリで複写することについての異議はないが、その他の場合は著作権を留保する。
【０１３９】
配列表は核酸分子およびタンパク質分子を含む。具体的には本発明の哺乳動物核酸分子であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４５と、本発明の哺乳動物タンパク質分子であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６−４９を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｂ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｃ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｄ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｅ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｆ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図２Ａ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｂ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｃ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｄ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｅ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｆ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図３Ａ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ヒトＡＳＰ１、クローンＩＤ １６１１５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ヒトガクトリクシン、ＧＩ １６５８２８６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、およびＧＩ １０３９４４５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。保存されたアスパラギン酸プロテアーゼ活性部位（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ）には二重のアンダーラインを引いた。
【図３Ｂ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ヒトＡＳＰ１、クローンＩＤ １６１１５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ヒトガクトリクシン、ＧＩ １６５８２８６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、およびＧＩ １０３９４４５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。保存されたアスパラギン酸プロテアーゼ活性部位（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ）には二重のアンダーラインを引いた。
【図３Ｃ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ヒトＡＳＰ１、クローンＩＤ １６１１５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ヒトガクトリクシン、ＧＩ １６５８２８６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、およびＧＩ １０３９４４５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。保存されたアスパラギン酸プロテアーゼ活性部位（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ）には二重のアンダーラインを引いた。
【図３Ｄ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ヒトＡＳＰ１、クローンＩＤ １６１１５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ヒトガクトリクシン、ＧＩ １６５８２８６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ空胞プロテアーゼ（ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、およびＧＩ １０３９４４５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。保存されたアスパラギン酸プロテアーゼ活性部位（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ）には二重のアンダーラインを引いた。
【図４Ａ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｂ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｃ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｄ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｅ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｆ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｇ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図４Ｈ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ２、クローンＩＤ １８６９８６９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、および核酸配列変異体、１４３８６１３Ｆ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、１４３８７１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、１４３８６１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、５０９４６３３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、２９０００６３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、３４８４８１９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、２７５７８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、２１２３４１１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、５５７７５１３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、２９０８５９４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、２００７２６９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、および２２９３３９３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ａ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｂ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｃ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｄ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｅ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｆ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図５Ｇ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＳＥＱＭＡＮ ＩＩプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒトＡＳＰ１、１６１１５６５ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、および核酸配列変異体、５１５７１７９Ｆ６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、３９８５７５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、２８４６６０４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、５７４３０２８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、４１４８７４９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、１８５５２２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、１８５５４２０Ｈ１ （ＳＥＱＩＤ ＮＯ：３６）、５１１４５５８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、８３９５３８Ｒ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、４９９９６６２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、５５８８４９０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、３６３００５４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、４１０８２６４Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、および３７５１９０７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図６Ａ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、
１６１１５６５．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；およびラット、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および７００９２１５６６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。
【図６Ｂ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、
１６１１５６５．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；およびラット、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および７００９２１５６６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。
【図６Ｃ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、
１６１１５６５．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；およびラット、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および７００９２１５６６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。
【図６Ｄ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、
１６１１５６５．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；およびラット、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および７００９２１５６６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。
【図６Ｅ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、
１６１１５６５．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；およびラット、７０１９１８５７５Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および７００９２１５６６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。
【図７Ａ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｂ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｃ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｄ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｅ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｆ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図７Ｇ】
Ｐｈｒａｐソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト、１８６９５６９．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ラット、７０１９１１７５２Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、７０１９０７０８Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、７００４９４８４１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、７０１５９６１５０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、７０１０３１３８９Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、７０１８２３６８７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、７０１１８８３５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、７００７６９２５７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、７００７６９８７１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、７００２５１５６７Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、７０１４３２２２８Ｔ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、７００５４２１７６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、および７００３７６８７０Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびサル、７００７０９０３２Ｈ１．ｃｏｍｐ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、核酸配列との間の化学的および構造的類似性を実証する。推定上のスプライス部位は（Δ）で示した。
【図１Ａ】
2004500811.tif 000003
【図１Ｂ】
2004500811.tif 000004
【図１Ｃ】
2004500811.tif 000005
【図１Ｄ】
2004500811.tif 000006
【図１Ｅ】
2004500811.tif 000007
【図１Ｆ】
2004500811.tif 000008
【図２Ａ】
2004500811.tif 000009
【図２Ｂ】
2004500811.tif 000010
【図２Ｃ】
2004500811.tif 000011
【図２Ｄ】
2004500811.tif 000012
【図２Ｅ】
2004500811.tif 000013
【図２Ｆ】
2004500811.tif 000014
【図３Ａ】
2004500811.tif 000015
【図３Ｂ】
2004500811.tif 000016
【図３Ｃ】
2004500811.tif 000017
【図３Ｄ】
2004500811.tif 000018
【図４Ａ】
2004500811.tif 000019
【図４Ｂ】
2004500811.tif 000020
【図４Ｃ】
2004500811.tif 000021
【図４Ｄ】
2004500811.tif 000022
【図４Ｅ】
2004500811.tif 000023
【図４Ｆ】
2004500811.tif 000024
【図４Ｇ】
2004500811.tif 000025
【図４Ｈ】
2004500811.tif 000026
【図５Ａ】
2004500811.tif 000027
【図５Ｂ】
2004500811.tif 000028
【図５Ｃ】
2004500811.tif 000029
【図５Ｄ】
2004500811.tif 000030
【図５Ｅ】
2004500811.tif 000031
【図５Ｆ】
2004500811.tif 000032
【図５Ｇ】
2004500811.tif 000033
【図６Ａ】
2004500811.tif 000034
【図６Ｂ】
2004500811.tif 000035
【図６Ｃ】
2004500811.tif 000036
【図６Ｄ】
2004500811.tif 000037
【図６Ｅ】
2004500811.tif 000038
【図７Ａ】
2004500811.tif 000039
【図７Ｂ】
2004500811.tif 000040
【図７Ｃ】
2004500811.tif 000041
【図７Ｄ】
2004500811.tif 000042
【図７Ｅ】
2004500811.tif 000043
【図７Ｆ】
2004500811.tif 000044
【図７Ｇ】
2004500811.tif 000045
【国際公開パンフレット】
2004500811.tif 000046
2004500811.tif 000047
2004500811.tif 000048
2004500811.tif 000049
2004500811.tif 000050
2004500811.tif 000051
2004500811.tif 000052
2004500811.tif 000053
2004500811.tif 000054
2004500811.tif 000055
2004500811.tif 000056
2004500811.tif 000057
2004500811.tif 000058
2004500811.tif 000059
2004500811.tif 000060
2004500811.tif 000061
2004500811.tif 000062
2004500811.tif 000063
2004500811.tif 000064
2004500811.tif 000065
2004500811.tif 000066
2004500811.tif 000067
2004500811.tif 000068
2004500811.tif 000069
2004500811.tif 000070
2004500811.tif 000071
2004500811.tif 000072
2004500811.tif 000073
2004500811.tif 000074
2004500811.tif 000075
2004500811.tif 000076
2004500811.tif 000077
2004500811.tif 000078
2004500811.tif 000079
2004500811.tif 000080
2004500811.tif 000081
2004500811.tif 000082
2004500811.tif 000083
2004500811.tif 000084
2004500811.tif 000085
2004500811.tif 000086
2004500811.tif 000087
2004500811.tif 000088
2004500811.tif 000089
2004500811.tif 000090
2004500811.tif 000091
2004500811.tif 000092
2004500811.tif 000093
2004500811.tif 000094
2004500811.tif 000095
2004500811.tif 000096
2004500811.tif 000097
2004500811.tif 000098
2004500811.tif 000099
2004500811.tif 000100
2004500811.tif 000101
2004500811.tif 000102
2004500811.tif 000103
2004500811.tif 000104
2004500811.tif 000105
2004500811.tif 000106
2004500811.tif 000107
2004500811.tif 000108
2004500811.tif 000109
2004500811.tif 000110
2004500811.tif 000111
2004500811.tif 000112
2004500811.tif 000113
2004500811.tif 000114
2004500811.tif 000115
2004500811.tif 000116
2004500811.tif 000117
2004500811.tif 000118
2004500811.tif 000119
2004500811.tif 000120
2004500811.tif 000121
2004500811.tif 000122
2004500811.tif 000123
2004500811.tif 000124
2004500811.tif 000125
2004500811.tif 000126
2004500811.tif 000127
2004500811.tif 000128
2004500811.tif 000129
2004500811.tif 000130
2004500811.tif 000131
2004500811.tif 000132
2004500811.tif 000133
2004500811.tif 000134
2004500811.tif 000135
2004500811.tif 000136
2004500811.tif 000137
2004500811.tif 000138
2004500811.tif 000139
2004500811.tif 000140
2004500811.tif 000141
2004500811.tif 000142
2004500811.tif 000143
2004500811.tif 000144
2004500811.tif 000145
2004500811.tif 000146
2004500811.tif 000147
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500811.tif 000148
2004500811.tif 000149
【国際調査報告】
2004500811.tif 000150
2004500811.tif 000151
2004500811.tif 000152
2004500811.tif 000153
2004500811.tif 000154