(57)【要約】改善したチャネル及びレザバー構成を備えたマイクロ流体デバイスを提供する。特に、温度介在反応を行うための効率的なマイクロ流体デバイスを提供する。これらの反応は、使用が容易でかつ複数サンプルの高スループットを可能にすべく効率的な方法にて実行され得る。改善したチャネル及びレザバー構成を備えたマイクロ流体デバイスを用いて温度介在反応を行う方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１電気抵抗を有する反応チャネルであって、その中にプライマーを配置するがポリメラーゼを配置しない前記反応チャネルと、
第２電気抵抗を有し、前記反応チャネルに流動連結された第１及び第２電気的アクセスチャネルであって、前記第１電気抵抗が第２電気抵抗より大きい前記第１及び第２電気的アクセスチャネルと、
第１交差点にて前記反応チャネルに流動連結されたポリメラーゼ酵素の供給源と、
を備えた本体構造を有するマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記第１及び第２電気的アクセスチャネルが、それぞれ第２及び第３交差点にて反応チャネルと交差し、前記第２及び第３交差点が第１交差点の両側にある、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
反応混合物スラッグの供給源が、前記反応チャネルに流動連結されている、請求項１記載のデバイス。
【請求項４】
反応混合物スラッグの供給源がピペットであり、該ピペットが、その中に毛細管チャネルを有する本体を備え、該毛細管チャネルが、反応混合物スラッグに接触するための第１端部と反応チャネルに流動連結された第２端部とを有する、請求項３記載のデバイス。
【請求項５】
物質輸送システムが、前記反応チャネルに作動自在に連結されて温度介在反応の複数の成分を反応チャネルを介して輸送する、請求項１記載のデバイス。
【請求項６】
物質輸送システムが、前記反応チャネルに作動自在に連結されてポリメラーゼ酵素と前記反応混合物スラッグを前記反応チャネル中に送る、請求項１記載のデバイス。
【請求項７】
前記物質輸送システムが、反応チャネルに沿って反応混合物スラッグの連続的な流れを発生し、ＤＮＡポリメラーゼを反応チャネル中に周期的に注入する、請求項６記載のデバイス。
【請求項８】
前記物質輸送システムが、電気泳動、電気浸透又は圧力に基づいたシステムからなる群から選択される、請求項５記載のデバイス。
【請求項９】
エネルギー源が前記反応チャネルに作動自在に連結される、請求項１記載のデバイス。
【請求項１０】
前記エネルギー源が電流を流して反応チャネルの第１領域を加熱する、請求項９記載のデバイス。
【請求項１１】
前記エネルギー源が反応チャネルの前記第１領域に可変電流を流す、請求項９記載のデバイス。
【請求項１２】
前記電流がＡＣ、ＤＣ又はＡＣ／ＤＣの組合せである、請求項１０記載のデバイス。
【請求項１３】
前記本体構造が、前記第１又は第２電気的アクセスチャネルに流動連通した少なくとも１つの充填したレザバーを備える、請求項１記載のデバイス。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの充填したレザバーが、反応チャネルへの流体の流れを制限するようなマトリックスを含む、請求項１４記載のデバイス。
【請求項１５】
前記マトリックスがポリアクリルアミドゲルである、請求項１４記載のデバイス。
【請求項１６】
プライマー、テンプレート分子及びバッファーを含むがポリメラーゼ酵素は含まない反応混合物をマイクロ流体デバイスの反応チャネル中に装填する工程；
電流を流して反応チャネルを加熱する工程；及び
ポリメラーゼ酵素を反応チャネル中に送る工程、
を含むホットスタートポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための方法。
【請求項１７】
前記反応が熱サイクル反応である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記反応混合物が一連の反応混合物スラッグから成り、各反応混合物スラッグは、プライマー、テンプレート分子及びバッファーを含むがポリメラーゼ酵素は含まない、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
第１の反応混合物スラッグを反応チャネル中に送った後にポリメラーゼ酵素を送る、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記反応がテンプレート分子の変性を含み、その際テンプレート分子が変性されて複数の一本鎖テンプレート分子を与える、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
前記変性が塩基（ｂａｓｅ）を有する前記テンプレート分子の温置からなる、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
前記反応がテンプレート分子に対するプライマー分子のハイブリダイゼーションからなる、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
加熱領域を備えた少なくとも１つのマイクロチャネルを含む本体構造；
第１端部と第２端部とを備えた複数の電気的アクセスチャネルであって、第１及び第２交差点にてそれぞれ前記マイクロチャネルと交差する前記電気的アクセスチャネル；及び
前記電気的アクセスチャネルからマイクロチャネル中への流体の移動を制限するため、前記電気的アクセスチャネルに流動連通しかつ充填された複数のレザバー、
を備えたマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
前記充填されたレザバーがマトリックスで充填されている、請求項２３記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
前記マトリックスが、ポリアクリルアミドゲル、寒天又はガラスビーズからなる群から選択される、請求項２４記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
温度介在反応の第１成分をマイクロ流体デバイスの反応チャネルに装填する工程；
電流を流して反応チャネルを加熱する工程；及び
温度介在反応の第２成分を反応チャネル中に送る工程、
を含む温度介在反応を実行するための方法。
【請求項２７】
前記第１成分が、温度介在反応の出発物質を含む反応混合物を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記第１成分が、テンプレート核酸、プライマー配列及びヌクレオチドを含んだＰＣＲ用増幅試薬を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記第２成分が熱安定性のポリメラーゼ酵素を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記第２成分がＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記電流が交流である、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
反応チャネル内の温度を反復的に循環させて温度介在反応における変性、アニール及び伸長反応を実行する工程をさらに含み、前記温度を循環させる工程が可変的に電流を流すことを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
温度介在反応の第１成分をマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルに装填する工程；
温度介在反応の第２成分をマイクロチャネル中に導入する工程；及び
電流を流してマイクロチャネルの一領域を加熱する工程、
を含む蛋白質結合アッセイを行うための方法。
【請求項３４】
前記装填工程が、毛細管を用いて前記第１成分をマイクロチャネル中に移すことを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記第１成分がターゲット分子である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲット分子が蛋白質である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記第１成分が蛋白質と染料の複合体である、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記第２成分がリガンドである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
マイクロチャネルの前記領域の温度を事前に決めた設定点に維持することをさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
マイクロチャネルの前記領域に可変電流を流してマイクロチャネルの前記領域の温度を徐々に上げる工程をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
第１電気抵抗を有する少なくとも１つの反応チャネルであって、その中にプライマーを配置しているがポリメラーゼは配置していない前記反応チャネル；
第２電気抵抗を有し、前記少なくとも１つの反応チャネルに流動連結されている少なくとも第１及び第２電気的アクセスチャネルであって、前記第１電気抵抗が第２電気抵抗より大きい前記少なくとも第１及び第２電気的アクセスチャネル；及び
第１交差点にて前記反応チャネルに流動連結されたポリメラーゼ酵素の供給源、
を備えた本体構造を有するマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０００年９月１４日提出の仮特許出願第６０／２３２，３４９号の優先権を主張し、そのすべてをあらゆる目的のためにここで援用する。
【０００２】
発明の背景
化学的又は生化学的な情報を取得するためのマイクロ流体システムの製造及び使用についての関心が増大してきた。フォトリソグラフィ、湿式化学エッチングなどのような半導体エレクトロニクス産業に共通に関連する技術が、これらのマイクロ流体システムの製造に用いられている。用語「マイクロ流体」は、一般にミクロン又はサブミクロン規模（例えば約０．１μｍ〜約５００μｍの範囲の少なくとも１つの断面寸法を有す）にて製造されるチャネル及びチャンバーを備えたシステム又はデバイス又は「チップ」を示す。マイクロ流体システムを製造するための平面チップ技術の使用に関する初期の説明が、Ｍａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９０） １０（５）：１４４−１４９ 及びＭａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． （１９９３）３３：１−６６ に掲載されており、これらはシリコン及びガラス基板中でのこのようなマイクロ流体デバイス（特にマイクロ毛細管デバイス）の製造について記載している。
【０００３】
マイクロ流体システムの出願は数多い。例えば、国際出願第ＷＯ９６／０４５４７号には、毛細管電気泳動、液体クロマトグラフィー、フローインジェクション分析、及び化学的な反応と合成のためのマイクロ流体システムの使用が記載されている。米国特許第５，９４２，４４３号（名称“ＨＩＧＨ ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ ＤＥＶＩＣＥＳ ”、１９９９年８月２４日発行）は、多数の化合物を素早くアッセイして化学的（好ましくは生化学的）なシステムへのそれらの効果を調べる上でのマイクロ流体システムの幅広い用途を開示する。生化学的なシステムには、酵素反応、結合反応、シグナリング反応及びその他の反応を含めて生体システムにおいて発生する総ての範囲の異化及び同化反応が含まれる。特に関心のある生化学システムには、レセプター−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、細胞シグナリング経路、生物学的利用性スクリーニング用モデル障壁システム（例えば細胞又は膜フラクション）を含んだ輸送反応、及び他の種々の一般的なシステムが含まれる。
【０００４】
最近の大きな進歩の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び他のサイクリックなポリメラーゼ介在反応の実行に対するマイクロ流体デバイスの適応であった。しかしながら、実験で直面する重要な問題は、温度、試薬濃度、バッファ、塩、他の物質などのようなプロセスパラメータの制御であった。特に、ＰＣＲは、正確に制御された温度にて実行されるべきである。例えば、一般にＰＣＲは３つの別々の複数反復工程、すなわち、ＤＮＡテンプレートの変性、変性したＤＮＡテンプレートへのプライマーのアニール、及びポリメラーゼによりプライマーを伸長してテンプレートに相補的な核酸を作成することに基づいている。これらの工程を実行する際の条件は、当該技術において十分に確立されている。一般に各々の工程は、以下の個別の温度及び時間が要求される。
変性　　　　　　　　　　　９６℃、１５秒
プライマーのアニール　　　５５℃、３０秒
プライマーの伸長　　　　　７２℃、１．５分
【０００５】
Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．； １９９０） を参照せよ。一般に、マイクロ流体システムは、温度を速く変化させることができ各工程での正しい温度に素早くすることができるので、ＰＣＲの実行によく適する。また、マイクロ流体要素は、それらが製造されている基板の質量に比べて極端に小さいので、熱を高度に局所化でき、例えばそれがデバイス内の他の流体要素に影響する前に基板中に及び基板から放散する。
【０００６】
効率的な温度制御に加えて、ＰＣＲを実行しようとする実験者は第２の問題を克服しなければならない。しばしば、増幅反応の効率性は、非効率的な反応条件ゆえに生じるより大きな非特異的な（ｎｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）副反応生成物のみならず、プライマー自己アニール（「プライマー二量体」）により低下させられる。このような非特異フラクションは、反応における特異ターゲットとの競合により所望の特異フラクションの収率に悪影響を与える。また、特異生成物とほぼ同じ大きさの非特異フラクションは、結果の解釈に誤りを生じさせ得る。研究者は、これらの非特異的な副反応生成物によって周囲温度条件下にてプライマーの部分アニールされた３’端がＤＮＡポリメラーゼで触媒されて伸長して、複合ＤＮＡ内で非特異サイトを生じると結論付けた。従って、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼの効率は、より高い温度でのそれらのピーク効率に比べて、周囲温度にて大いに低減するようである。
【０００７】
「ホットスタート」ＰＣＲ法が、非特異生成物の増幅を低減する手段として開発された。例えば、Ｄ’Ａｑｕｉｌａ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ３７−４９を参照せよ。初期の方法では、反応混合物がアニール温度より高い温度まで加熱されるまで、反応成分の一つは反応させずにおかれ、それから欠損した成分が追加される。このアプローチにより、部分的にアニールされた３’プライマー端部が伸長され得る前に非特異サイトから溶融してしまう。従って、ホットスタートＰＣＲは生成物の収率と特異性を改善する。「ホットスタート」ＰＣＲへのもっと最近のアプローチは、溶融して高温での水性成分の混合を可能にする熱不安定性のワックス又はゼリー障壁の使用を伴う。Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０： １７１７−１７２３を参照せよ。第３の方法は、周囲温度にてＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを不活性にするモノクローナル抗体を利用する。反応混合物が変性温度に加熱されると、ポリメラーゼの不活性が転換され、それにより特異ターゲットの増幅が容易になる。Ｋｅｌｌｏｇｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６： １１３４−１１３７を参照せよ。上述した方法すべてが単純なＰＣＲに対する相当な改善ではあるが、これらすべての方法に関連した共通の問題は、複数のサンプルを用いた場合に使用するのが厄介であり時間もかかるということである。
【０００８】
上記理由により、複数のサンプルターゲットについてホットスタートＰＣＲのような温度に依存した反応を行うための効率的な方法、デバイス及びシステムが必要とされる。本発明はこの要求及びその他の要求を満足させる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、正確で効率的な方法にて温度介在反応を実行するための、方法及びデバイスを含めたマイクロ流体システムに関する。
【００１０】
一般に、本発明は、マイクロ流体デバイス及び該デバイスを用いる方法に関し、このデバイスは、温度介在反応の反応成分がデバイスの領域内で加熱される一方で追加の反応成分が別の供給源から例えばサイドチャネルを介して加熱された反応混合物中に添加されるように構成された改善されたチャネル及びレザバーを組み込んでいる。
【００１１】
第１の態様では、本発明は、加熱領域を備えた少なくとも１つのマイクロチャネルを有する本体構造を含むマイクロ流体デバイスを提供する。第１及び第２端部を有する複数の電気的アクセスチャネルが、第１端部にてその少なくとも１つのマイクロチャネルと交差する。電気的アクセスチャネルは、第２端部にて部分的に充填されたレザバーに流動連結される。
【００１２】
関連の態様では、本発明は、加熱領域を備えたマイクロチャネルを有する本体構造を含んだマイクロ流体デバイスを提供し、この加熱領域は、その中に第２反応成分ではなく第１反応成分（単数又は複数）を有する。第１電気抵抗より小さい第２電気抵抗を有する２つの電気的アクセスチャネルが、マイクロチャネルに流動連結される。第２反応成分の供給源が、第１交差点にてマイクロチャネルの加熱領域と交差して流動連結されている。電気的アクセスチャネルは、第１交差点とは異なる側にて反応チャネルと交差する。例えば、ホットスタートＰＣＲで使用されるデバイスでは、デバイスの加熱領域は、その中にポリメラーゼではなくプライマーを有し、ポリメラーゼ酵素は、第１交差点にてマイクロチャネルと交差するサイドチャネルを介して反応混合物に導入される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、反応チャネルに流動連結した反応混合物スラッグの供給源を含んだ点のみ異なる上述のマイクロ流体デバイスを提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、ポリメラーゼ酵素と反応混合物を反応チャネル中に送るための物質輸送システムを用いる。
【００１５】
本発明は、ここに記載のデバイスを用いて温度介在反応を実行するための方法をも提供し、この方法は、デバイスの反応チャネルの加熱領域中に温度介在反応の第１成分を装填することを含み、この反応チャネルは、電流を流すことで加熱し、温度介在反応の第２成分を反応チャネル中に送る。
【００１６】
関連の態様では、本発明は、温度介在反応の第１成分を含む一連の反応混合物スラッグに対して上述の温度介在反応を実行する方法をも提供する。
【００１７】
詳細な説明
Ｉ．一般
一般に、本発明は、資源について使用が容易でかつ効率的な消費を伴って複数のサンプルに温度介在反応を実行するため、改善されたチャネル構成及び反応チャネルを組み込んだデバイスを含んだマイクロ流体システムと、これらのデバイスを使用するための方法とを提供する。一般に、本発明は、高温（例えば所望の反応に最適又は有利な温度）にて反応混合物を与えることにより温度介在反応を実行するためのデバイス、システム及びこれらの使用方法を提供する。１以上の追加の反応物質が、加熱された反応混合物に加えられ、所望の反応がすぐに開始できるようにする。このような反応の例としては、ＰＣＲのような環状ポリメラーゼ反応、温度依存の蛋白質結合アッセイなどが挙げられる。ここに記載の方法を実行する際、本発明はまた、改善されたチャネル及びレザバー構成を有する新規なデバイス、例えばマイクロ流体デバイスと、このようなデバイスを組み込んだシステムとを提供する。特に、本発明は、デバイスのチャネル内に配置された流体成分の電気伝導性を高める一方で、レザバーから反応チャネルへの流体の流れを好ましくは制限するような改善されたチャネル及びレザバー構成を組み込んだマイクロ流体デバイスを提供する。
【００１８】
本発明のデバイスを用いて温度介在反応を実行するための典型的な技術の概略は次の通りである。
１．　温度介在反応の第１成分をデバイスの反応チャネル中に与える。
２．　反応チャネルのある領域の温度を第１温度まで上げる。
３．　第２成分を反応チャネル中に送り、第１成分と混合する。
４．　反応混合物の温度を第２温度に循環させる。
又は
５．　反応チャネルの温度を第１温度に維持する。
【００１９】
用語「生化学的システム」とは、特に生体内で見られる種類の分子を含む化学的相互作用を一般にいう。
【００２０】
「温度介在反応」とは、成分のいつくかの反応性が温度に依存し、例えば昇温により減少又は増大するような化学的又は生化学的な反応をいう。
【００２１】
「熱サイクル反応」は、異なる温度にて少なくとも２つの工程を実行する複数工程反応である。
【００２２】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応であり、これは熱循環的でありポリメラーゼが介在するＤＮＡ増幅反応である。一般に、ＰＣＲは、テンプレート分子、テンプレート分子の各鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチドを含み、また複数回繰り返して元の核酸の増幅を行う３つの別々のプロセスを伴う。これら３つのプロセス（変性、ハイブリダイゼーション及びプライマー伸長）は、２又は３の別々の温度及び時間的工程にて実行される。
【００２３】
「ホットスタート」ＰＣＲは、反応に必要な試薬の添加の前に、ＰＣＲ反応混合物を予熱して所望の反応温度にするものであり、一般に、このことは、反応混合物が加熱された後でのみポリメラーゼを反応成分と混合することを意味し、このことがミスプライムされた（ｍｉｓｐｒｉｍｅｄ）又はミスアニールされた（ｍｉｓａｎｎｅａｌｅｄ）反応成分の伸長を最小にする。
【００２４】
「テンプレート分子」とは、相補的な分子の合成のためのテンプレートとして機能し得る特異識別性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の分子をいう。しばしば、「テンプレート分子」はポリマー分子である。「ＰＣＲ」に則して言えば、「テンプレート分子」は、反応に加えられた核酸のフラグメント又はフラクションを表し得る。特に、「テンプレート分子」とは、２つのプライマーを含めてそれらの間の配列をいう。
【００２５】
「ポリメラーゼ」は、モノマー単位を順に追加してポリマー鎖にするのを触媒し、又は２以上のモノマー単位を結合してポリマー鎖を開始させる酵素である。本発明の好ましい実施態様では、「ポリメラーゼ」は、特異配列のテンプレート分子により決定され且つそれとは相補的な識別性を有するモノマー単位を加えることにより作用する。例えば、ＤＮＡ　ｐｏｌ１やＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼは、テンプレートに依存した方法にてデオキシリボヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖の３’端に加え、それによりテンプレート分子に相補的な核酸を合成する。
【００２６】
ターゲット分子の「変性」とは、ターゲットについての展開又は他の構造的な変更をいう。例えば、蛋白質の変性とは、第二、第三又は第四構造の除去をいう。核酸の場合、変性された核酸は、折り畳まれてなく、巻きが解かれた、捻られていない又は一本鎖の形に変えられたものである。特に、ＤＮＡの場合、「変性」とは、二重螺旋の相補的な二本鎖の分離をいい、それにより２つの相補的な一本鎖のテンプレート分子が作られる。
【００２７】
２つの核酸の「ハイブリダイゼーション」とは、２つの相補的な一本鎖の核酸を結合して二本鎖の核酸を形成することをいう。
【００２８】
「プライマー分子の伸長」とは、ヌクレオチドをプライマー分子に加えてテンプレート分子に相補的な核酸を合成することをいう。
【００２９】
ここで用いられている「反応混合物スラッグ」とは、一般にミクロ規模のチャネル中における離散的な流体領域であり、これは化学的又は生化学的な反応の１以上の成分を含んだ反応混合物を含む。本発明により、反応混合物スラッグは、反応混合物の所望の成分との反応性が温度に依存する第２成分を欠き得る。ＰＣＲに則して言えば、「反応混合物スラッグ」は、プライマー、テンプレート分子、バッファー、ヌクレオチドを含み得るが、ＤＮＡポリメラーゼを欠く。
【００３０】
ＩＩ．　改善されたレザバー構成を組み込んだマイクロ流体デバイス：
少なくとも第１の態様によると、本発明は、独自のチャネル及びレザバーの構成を組み込んで、チャネル中に含まれる流体の電気伝導性を高める一方で電極チャネルから反応チャネル中へのこれらの流体の移動を制限するマイクロ流体デバイスを提供する。本発明のマイクロ流体デバイスは、種々のマイクロ流体要素が配置された中央本体構造を備える。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスの本体構造は、一般に平面構造である、すなわち実質的に平坦又は少なくとも一つの平坦な表面を有している固体又は半固体基板を一般に用いる。
【００３１】
一般に、マイクロ流体デバイスのチャネル及び／又はチャンバーは、上述したマイクロ製造技術を用いて、ミクロ規模の溝又はくぼみとして底部基板又は部分１２の上面に製造される。頂部又は基板１８もまた、第１平坦表面２０と、第１平坦表面２０の反対側の第２表面２２とを備える。ここに記載の方法により作られたマイクロ流体デバイスでは、頂部は、例えば第１平坦表面２０からこの第１平坦表面の反対側の第２表面２２までそれを貫通して配置された複数のアパーチャ、穴又はポート２４をも含む。（図１参照）
【００３２】
頂部基板１８の第１平坦表面は、底部基板１２の平坦表面１４と係合し、例えばそれと接触して配置され、それに固着され、底部基板の表面の溝及び／又はくぼみを覆って密封し、デバイスのチャネル及び／又はチャンバー（すなわち内部部分）を形成し、また、底部基板内の溝又はくぼみからデバイスの内部部分に形成されたチャネル及び／又はチャンバーの少なくとも１つと通じるように配置される。完成したデバイスでは、これらの穴は、デバイス内の流体に接触させるように電極を配置するポートを設けてデバイスのチャネルに沿って電流を流してデバイス内の流体を制御可能に加熱し輸送するのみならず、デバイスの内部部分のチャネル又はチャンバー中への流体又は物質の導入を容易にするためのレザバーとして機能する。
【００３３】
一方の基板のチャネルともう一方の基板のレザバーの製造に関して記載したが、チャネルを覆って密封する平らな基板層を有する単一の基板内に両方とも製造できることが分かるであろう。
【００３４】
種々の物質のいずれか一つ又は物質の組合せから、適当な基板を製造できる。しばしば、基板は、ミクロ製造分野では通常の固体基板、例えばシリカ、シリコン又はヒ化ガリウムを用いて製造される。これらの基板の場合、例えばフォトリソグラフィ技術、湿式化学的エッチング、マイクロマシーニング、すなわち穴あけやフライス削りなどのような通常のミクロ製造技術が、マイクロ流体デバイス及び基板の製造に容易に適用できる。別法として、ポリマー基板物質が、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネートなどを含めて、本発明のデバイスを製造するのに使用できる。このようなポリマー物質の場合、射出成形又はエンボシング方法が、ここに記載のチャネル寸法及び構成を有する基板を形成するのに使用できる。
【００３５】
一態様では、本発明のデバイスは、加熱領域を備えた水平なマイクロチャネルを含む。大きな電気的アクセスチャネルが、第１及び第２交差点にてそれぞれ水平マイクロチャネルと交差し、それと流動連通する。第１及び第２交差点間のマイクロチャネルの領域が、加熱領域を構成する。特定の実施態様では、大きな電気的アクセスチャネルに対する、マイクロチャネルの断面積の比は１：２である。好ましくは、この比は１：５である。より好ましくは、この比は１：１０である。チャネルの構造的な特徴により、通常はこれらのデバイスは、流体の流れと電流の流れの両方に対して低い抵抗の経路を有する。しかしながら、本発明の一つの特徴は、電流を流体成分に流す一方で同時に流体の流れが電気的アクセスチャネルからマイクロチャネルに入るのを防止することにより、マイクロチャネルの加熱領域内で流体成分を局所的に加熱できることである。これは、電気的アクセスチャネル内に高い流体抵抗を作ることにより適宜実現される。特定の一例では、電気的アクセスチャネルの両端が、試薬ウエル又はレザバーに流動連結している。電気伝導性のゲルが、レザバーの底部に導入される。好都合には、これは、ポリアクリルアミドゲルマトリックスを液体状にてレザバーに加え、続いてそれを重合して流体の流れに対する適合ゲル障壁を形成することにより実現される。次に、重合したゲルにバッファーが乗せられる。電極は、試薬ウエル又はレザバーの各々の中に配置される。エネルギー源が作動自在にレザバーに連結され、水平チャネル内の流体成分の温度を上昇させる。（図３参照）
【００３６】
十分に高い流れ抵抗を有するチャネル（例えばより狭い又はより浅いチャネル）を製造すること、又は種々の障壁（例えばフリット）などを組み込むことを含めて、アクセスチャネル内の流体の流れを防止するために、他の様々な方法及び構成が利用できる。
【００３７】
ＩＩＩ．　ホットスタートＰＣＲを実行するためのマイクロ流体デバイス：
本発明のマイクロ流体デバイス及び方法は、例えばホットスタートＰＣＲのために温度介在反応を実行するのに特に有効である。ホットスタートＰＣＲは、サイクリックなポリメラーゼ反応であり、この反応では、ＰＣＲの反応成分の一つは、残りの成分を含む反応混合物が所望の温度まで加熱されるまで与えられない。一般に、ＤＮＡポリメラーゼは与えられず、温度が所望の温度に達した後に反応混合物に加えられ、それにより、ミスプライミング及びプライマーオリゴマー化を原因とした非特異ＰＣＲ生成物の形成を最小にする。本発明のマイクロ流体デバイスの新規なチャネル及びレザバーの構成により、使用が容易で効率的に複数のターゲットに対して「ホットスタート」ＰＣＲを実行するためにこれらのデバイスを使用することが可能となった。
【００３８】
一般に、本発明のデバイスは、加熱領域中に配置されたポリメラーゼではなく、ＰＣＲ反応成分を有する加熱領域を備える。ポリメラーゼ供給源は、加熱領域と流動連結されている。ポリメラーゼは、予熱された反応成分中に稀釈され、それによりミスプライミング又はオリゴマー化を原因とした望ましくない副反応生成物の形成を防止する。加熱領域の温度は、ターゲット分子の変性、アニール及び伸長からなる反復サイクルのために循環的に変えられる。
【００３９】
特に、ここに記載のマイクロ流体デバイスでは、反応チャネル又は加熱チャネルとも称される少なくとも１つのマイクロチャネルが、基板内に配置され、そこでポリメラーゼではなくＰＣＲ反応成分が添加され加熱される。反応チャネルの電気抵抗より低い電気抵抗を有する２以上の大チャネルが、反応チャネルに流動連結されかつ交差する。反応チャネルの加熱領域中にポリメラーゼを送るための横チャネルが、反応チャネルと大チャネルとの交差点間のある地点にて反応チャネルと交差するように配置される。サンプルの装填された供給源が、反応チャネルに流動連結される。反応混合物スラッグは、サンプルの装填された供給源を介して反応チャネル中に順次導入される。一般に、サンプル供給源は、一方の端部にて反応チャネルに流動連結され、反対の端部にて反応混合物スラッグの供給源（例えばマルチウエルプレートの１つ又は複数のウエル）に流動連結されたピペットを含み得る。別法として、サンプルの装填された供給源は、例えばデバイス内に配置され且つ反応チャネルに流動連結された１又は複数のウエルとして、デバイス中に集積化され得る。
【００４０】
適宜、本発明のデバイスは、複数の反応チャネルを備えることができ、それにより反応混合物をいくつかのより小さなスラッグに分割し、分割した各々は、向きを変えられて別々の反応チャネルに入れられる。これらのデバイスでは、反応チャネルの各々に加熱領域を設けるために、複数の電気的アクセスチャネルが存在し得る。一実施態様では、デバイスのマイクロチャネル網は、複数の並列の反応チャネルを含み、また当該方法は、サンプルの装填された供給源から複数の並列チャネル中に又はこれら複数の並列反応チャネルに流動連結された１以上のポート中に反応混合物スラッグを流し込むことをさらに含む。例えば、複数の並列反応チャネルは、少なくとも６、１２、２４、４８、９６又はそれより多くの並列マイクロチャネルを適宜含む。また本方法は、反応チャネルの各々にＰＣＲ反応成分を与えること、及び少なくとも１つのサイドチャネルから各反応チャネルの加熱領域中にポリメラーゼを同時に流し込むことをも含む。並列チャネル中の混合物の同時の反応については、例えば係属中の共有の出願第６０／２８３，５２７号（２００１年４月１２日提出）に記載されており、その全体をあらゆる目的のためにここで援用する。
【００４１】
例えばテンプレート分子、バッファー、プライマー分子及びヌクレオチドを含んだ反応混合物スラッグが、それぞれの供給源から反応チャネル中に輸送される。反応チャネルの加熱領域の温度は、循環的に連続して変えられ、反応混合物中の反応物質の熱サイクルを実現する。まず最初に、反応チャネル中への輸送に際し、反応混合物中に含まれるターゲット分子が変性を受けるように、反応混合物が加熱される。ＤＮＡポリメラーゼは、横チャネルから反応チャネル中に稀釈され、そこで反応混合物と混合される。２以上の別個の温度期間を含んだ反応チャネル中での熱サイクルにより、上述した変性、アニール及び伸長工程を通って進行する反応が可能となる。一般に、変性、アニール及び伸長工程に対応した３つの別個の期間は、それぞれ約９５℃の第１期間、約５０℃〜６５℃の第２期間及び約７２℃の第３期間を含む。変性、アニール及び伸長のサイクルは数回繰り返され、それによりターゲット生成物の所望の収率が得られる。反応物質を反応チャネル中へ及びそれに沿って輸送することは、電気泳動輸送、電気浸透流又は圧力ベース流を含めていくつかの方法により実現され得る。最後のサイクルが完了した後に本体から試薬を輸送するように反応チャネルが製造され、その際に試薬又は生成物が収集されて検出され得る。別法として、試薬又は生成物がチャネル中において直接検出され得る。
【００４２】
本発明による複数のターゲット分子に対するホットスタートＰＣＲの技術を、短く要約すると以下の通りである。
（１）反応チャネル中に反応混合物スラッグを与え；
（２）流体に電流を流して反応成分の温度を第１温度まで上げ；
（３）ＤＮＡポリメラーゼを横チャネルを介して反応チャネルの加熱領域中に送り；
（４）流体への電流を停止して反応成分及び生成物の温度を第２温度まで下げ；そして
（５）電流を流して反応成分の温度を第３温度まで上げ；
（６）完了するまで工程２、４及び５を続けて反復する。
【００４３】
Ａ．　改善されたチャネル構成：
上述のように、本発明のデバイスは、ミスプライミングによる非特異的な副反応生成物の形成を防止するために反応混合物が高温に加熱されるまで必要な試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ）を反応混合物から分離することによりホットスタートＰＣＲを実行するのに使用される。従って、本発明のデバイスは、種々のチャネル間の流動連結は維持しつつポリメラーゼを分離するよう設計されたチャネル構成を使用する。特に、このシステムは、その中に配置された少なくとも第１ミクロ規模チャネルを備えた基板を含み、このチャネルは加熱領域を有する。流体反応成分は、ミクロ規模チャネルの加熱領域に事前に配置される。第１ミクロ規模チャネルの断面積より相当大きな断面積を有する複数の大チャネルが、チャネルの加熱領域のどちらの側にもミクロ規模チャネルに流動連結される。これらの大チャネルの各々の両端は、試薬ウエル又はレザバーに流動連通している。一般に、電極も、試薬ウエル又はレザバーの各々内に配置される。
【００４４】
エネルギー源が、試薬ウエル又はレザバーに作動自在に連結され、チャネルを通して第１電流を流すことにより、チャネルの加熱領域内の反応成分の温度を上げる。マイクロチャネルのより狭い断面により、流体成分の電気抵抗がより大きくなり、それにより電流がそれを通過するにつれて流体の温度が上がる。センサーがチャネルに作動自在に連結され、マイクロチャネルの加熱領域内の反応成分の温度を検出する。温度は、流体の伝導度により検出され得る。測定された流体伝導率は、流体の温度に相関する。測定された温度は、所望の設定地点と比較される。センサー及びエネルギー源に連結されたコントローラが、所望の設定地点の温度に基づいてマイクロチャネル中の温度を制御する。
【００４５】
図２は、本発明のデバイスの実施態様の一つを示す。図示されているように、反応チャネル１１０が、２つの電気的アクセス大チャネル（それぞれ１５０及び１６０）と交差点１７０及び１８０にて交差し、それらと流動連通している。ポリメラーゼを導入するための横チャネル１４０が、反応チャネル１１０と流動連通しており、交差点１９０にてそれと交差する。電気的アクセスチャネル１５０及び１６０は、充填されたレザバー２００と流動連通しており、交差点１７０及び１８０間にて反応チャネル中に電流を流す。各レザバー２００は、マトリックスで部分的に充填される。電気的アクセスチャネル１５０及び１６０の電気抵抗は、反応チャネル１１０の電気抵抗より小さい。反応チャネルの加熱領域は、交差点１７０及び１８０により定められ、一般に長さが２０ｍｍで深さが１５μｍである。反応混合物スラッグは、サンプルの装填された供給源を介して反応チャネル中に導入される。加熱領域１００に入ると、各々の反応混合物スラッグは、この領域を通過しながら一連の増幅サイクルを受ける。
【００４６】
Ｂ．　反応混合物の供給源
例えばＤＮＡポリメラーゼではなくＰＣＲ反応成分を含んだ反応混合物スラッグは、マイクロチャネルに流動連結されたウエル中に反応混合物を配置することにより、デバイスのマイクロチャネル中に装填され得る。次に、反応混合物は、例えば圧力又はエレクトロカイネシス（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）によりマイクロチャネルに流される。
【００４７】
別法として、反応混合物は、マイクロ流体デバイスの外部にてウエル、プレートシステム内に貯蔵され得る、又は表面上に貯蔵された乾燥成分としてでさえ貯蔵され得る。反応混合物にアクセスするため、又は乾燥貯蔵媒質から可溶性又は懸濁性の乾燥成分を元に戻すため、圧力ベースのピペット又は電子ピペットが使用できる。電子ピペットの例は、例えば米国特許出願第０８／６７１，９８６号（１９９６年６月２８日提出）に記載されており、その全体をあらゆる目的のためにここで援用する。試薬貯蔵器とマイクロ流体システムを連結するための種々のアクセスシステムもまた、Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．の“Ｃｌｏｓｅｄ Ｌｏｏｐ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ ”、ＷＯ９８／４５４８１に記載されている。
【００４８】
ＩＶ．　マイクロチャネルにおける温度制御
反応チャネルの加熱領域における流体の制御された加熱は、いくつかの方法により実現し得る。好ましい実施態様では、ＰＣＲのための熱サイクル及び他の熱サイクルの適用が、ジュール加熱を用いて行われ得る。例えば、米国特許第５，９６５，４１０号（その全体をあらゆる目的のためにここに援用する）を参照せよ。要するに、エネルギーが使用され、電流が、反応チャネルの加熱領域内に配置された流体成分を通過し、制御され、局所化された方法にて、すなわち反応物質内に局所化されてそれらの成分を加熱する。これは、変性、アニール及び伸長にそれぞれ要求される異なる温度範囲の熱サイクルにて反応混合物を加熱するＰＣＲ中において、特に有効である。マイクロチャネルの加熱領域内の流体の温度を選択的に制御するために、エネルギー源がマイクロチャネルの加熱領域中に電流を流す。好ましい態様では、例えば流体の移動を伴って又は伴わずに流体を加熱するため、交流の電流、電圧及び／又は周波数が調整され得る。別法として、エネルギー源が電流及び／又は電圧のパルス又はインパルスを適用し、これがマイクロチャネルの加熱領域を通過して所与の瞬間に流体を加熱する。動電的な流体移動を用いる実施態様では、エネルギー源は、大チャネルを介してマイクロチャネルに直流電流（ＤＣ）を流し得る。この直流電流は、その大きさを選択的に調整して、マイクロチャネルに適用してマイクロチャネルの加熱領域の中に及びそれから外に物質を移動させ得るいかなる電圧又は電場も補完することができる。
【００４９】
一般に、チャネル中の流体を通過する電流は、流体の電気抵抗によりエネルギーを放散することにより熱を作る。パワーは、電流が流体を通過する際に放散し、流体を加熱する時間の関数としてエネルギーとして流体中に入る。一般に、次の数学的な表式は、パワー、電流及び流体抵抗の間の関係を記載する。
Ｐ＝Ｉ２ Ｒ
ここで、Ｐ＝流体中で放散したパワー、
Ｉ＝流体を通過する電流、
Ｒ＝流体の電気抵抗
である。本発明の好ましい実施態様では、反応チャネルの加熱領域は、大きな電気的アクセスチャネルに流動連通している。反応チャネルの断面積は、電気的アクセスチャネルの断面積よりも小さい。一実施態様では、電気的アクセスチャネルに対する反応チャネルの断面積の比は、少なくとも１：２である。好ましくは、断面積のこの比は、少なくとも１：５である。さらに好もしくは、電気的アクセスチャネルに対する反応チャネルの断面積の比は、少なくとも１：１０である。従って、反応成分の加熱は容易に実現される。というのは、反応チャネルのより小さい断面により、より大きな抵抗が与えられることで、電流が通過する際に流体中に放散するパワーを増加させ、それにより流体の温度を上昇させるからである。別法として、チャネル長の両端の電流は、増加した電圧により増大され、これによっても流体中に放散したパワー量が増加し、それに対応して流体温度が上昇する。
【００５０】
別の実施態様では、流体成分の温度循環は、例えばチップ上に組み込まれた加熱及び冷却コイル又は外部の加熱／冷却要素からの伝導により達成し得る。図４に示すように、加熱コイル３００が、領域３０１から３０２に、又はその逆方向に高温流体を与える。一般に、加熱コイルは、流体試薬の加熱が望まれるマイクロチャネルの領域の上又は下の層に隣接して又はその層中に配置される。熱エネルギーは、基板を通ってマイクロチャネルに伝導される。好ましくは、電源は、コイル３０１及び３０２の二端間の差電圧を供給する。この差電圧は、領域３０１及び３０２におけるコイル中の流体に接触している一対の電極を用いて流体に適用される。好ましくは、コイル３００は、マイクロチャネル３０５に十分に近いか又は接触し、コイル中の流体からの熱エネルギーをマイクロチャネル３０５中の流体に移す。コイル中の流体は、上述した種々の技術を用いて移動し得る。
【００５１】
反応混合物の冷却は、コイルを通過してマイクロチャネル３０５中の流体から熱形式の熱エネルギーを運び去る冷却流体を用いることにより、又はマイクロ流体システムにおいて利用できる急速な熱放散を可能にすることにより達成される。マイクロチャネル中の流体からの熱は、必要なら伝導及び対流の組合せを用いて除去される。
【００５２】
コントローラ又はコンピュータ（例えばパーソナルコンピュータ）が、マイクロチャネルの加熱領域内の流体の温度をモニターする。コントローラ又はコンピュータが、例えばエネルギー源から電流及び電圧情報を受け取り、加熱領域における流体の温度を識別又は検出する。加熱領域における流体の所望の温度に基づいて、コントローラ又はコンピュータは、電圧及び／又は電流を調節し、温度センサーによりチャネル内で感知された温度に応じる様にして所望の流体温度に合わせる。
【００５３】
Ｖ．　マイクロチャネルにおける物質輸送
本発明のマイクロ流体デバイスにおける流体の制御及び輸送は、様々な制御器具の使用により実現され得る。例えば、多くの場合、流体の輸送及び方向付けは、流体流を駆動する外部又は内部の圧力源を組み込んだ圧力ベースのフローシステムを用いて、全体的又は部分的に制御され得る。内部圧力源としては、ミクロ製造されたポンプ、例えばダイヤフラムポンプ、熱ポンプなどが挙げられ、これらは当該技術において記載されている。例えば、米国特許第５，２７１，７２４号、第５，２７７，５５６号及び第５，３７５，９７９号、並びに公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０５４１４号及び第ＷＯ９７／０２３５７号を参照せよ。ここに記載のデバイスは、動電的な物質方向付け及び輸送システムをも利用できる。好ましくは、外部の圧力源が使用され、チャネル端に配置されたデバイスのポートに適用される。単一又は複数ポートの圧力源が好ましい。一般に、圧力源は、主チャネルの下流端に適用される真空源である。これら適用される圧力又は真空が、チャネル長の両端に圧力差を発生し、それらを通る流体の流れを駆動する。ここに記載の相互連結されたチャネル網では、体積に関して異なる流量が、複数のポートに異なる圧力又は真空を適用することにより適宜実現される。複数ポート及び単一ポートの圧力システムは、米国特許出願第６０／１８４，３９０号（２０００年２月２３日提出）及び第６０／１５９，０１４号（１９９９年１０月２日提出）にそれぞれ記載されており、それらの開示の全体をあらゆる目的のためにここに援用する。
【００５４】
本発明のデバイスの目的の一つは、反応チャネル中での流体の流れを可能にし、反応混合物スラッグとＤＮＡポリメラーゼを反応チャネル中に入れてそれを通って輸送する一方、電極チャネルから反応チャネル中への流体の流れを制限することである。圧力ベースの流れを組み込んだデバイスにおいて、このことを実現する方法の一つは、大きなチャネルの両端のレザバーにゲルマトリックスを部分的に充填することによる。別法として、電極チャネルが、反応チャネルと交差する領域においてチャネル断面積が下に狭まって拡散効果を最小にするように構成される。（図５参照）
【００５５】
本デバイスは圧力ベースの物質輸送システムを利用するものとして記載してきたが、ここに記載のデバイスは動電的な物質方向付け及び輸送システムを利用できることが分かるであろう。ここで使用している「動電的な物質輸送システム」としては、物質への電場の適用によりマイクロチャネル内の物質を輸送及び方向付けするシステムが挙げられ、これによりチャネルを通ってそれに沿って物質を移動させる。特に、ここに記載の好ましいマイクロ流体デバイスは、少なくとも３つの交差チャネルを備えた本体構造を含み、これらのチャネルは、交差していない少なくとも４つの端を含む。反応チャネルの加熱領域を通って、例えば大チャネルを含んだ横チャネルとの交差点を横切って左から右に物質を流すことが望ましい。反応混合物スラッグの単純な動電的な物質流は、反応チャネル長の両端に電圧勾配を加えることにより、すなわちこのチャネルの左端に第１電圧を加え、チャネルの右端により低い第２電圧を加えることにより、又は右端をフロートにする（電圧をかけない）ことにより実現し得る。しかしながら、交差点を通るこの種の物質流は、反応チャネルと横チャネルの交差点にて実質的な量の拡散を生じる。これは、交差点での対流効果のみならず、使用される媒質中で輸送される物質の自然な拡散特性の両方を原因とする。制御された動電的な物質輸送では、交差点を横切って輸送されている物質は、物質流の経路に沿って例えば横チャネルの頂部端又は底部端から反応チャネルの右端に向けてわずかな電圧勾配を加えることにより強制される。これにより、交差点にて物質流の「挟み付け」が生じ、これにより反応混合物が横チャネル中に拡散するのが妨げられる。一般に、このようなものとして本発明のマイクロ流体デバイスと共に使用するためのコントローラシステムは、これらのマイクロ流体デバイス内に含まれる流体に電気的に接触して配置された複数の電極に対して適当な電圧を同時に加えるための電源及び回路を含む。制御された動電的な物質輸送は、米国特許第５，８５８，１９５号（１９９９年１月１２日発行）に記載されており、その全体をあらゆる目的のためにここに援用する。特に好ましい電気コントローラの例として、例えば米国特許第５，９６５，００１号（１９９９年１０月１２日）及びＷＯ９８／００７０７に記載のものが挙げられ、それらの開示の総てをあらゆる目的のためにここで援用する。
【００５６】
ＶＩ．　検出
本発明のデバイスは、反応からの信号が検出される検出窓を含み得る。一般に、検出窓は、チャネル又はチャンバーを覆う透明カバー、又は反応生成物の観測及び検出（例えば蛍光性応答の観測）を可能にする本体構造の透明領域を含む。不透明な基板から製造されたデバイスにおいては、ガラス、石英又は透明ポリマーから製造された透明な検出窓が、デバイス中に別々に作られ得る。しかしながら、一般にデバイスがガラス又は透明ポリマーから製造されるとき、光学的な検出窓は、単に透明なカバー層の領域とすることができ、その際例えばカバー層は、例えばＰＭＭＡポリカーボネートに対してガラス、石英又は透明なポリマー物質である。複数の反応チャネルを備えたデバイスでは、本方法は、検出器を共通の検出領域において複数の並列反応チャネル内又はそれらに近接して用いることにより、複数の並列反応チャネルの共通検出領域において検出可能な特性を検出する工程を適宜含む。本方法は、複数の並列反応チャネルの各々において検出可能な信号を検出する工程をも適宜含む。
【００５７】
一般に、ここに記載の方法、デバイス及びシステム内に検出工程又は機能を統合するのが望ましい。検出は、反応混合物の光学的、化学的、電気化学的、熱的又は他の特性に基づき得る。好ましい態様では、検出窓での信号の検出は、光学的な検出システムを用いて実現される。蛍光性反応生成物の場合、一般に検出器は、蛍光性生成物を活性化するのに適当な波長の光を発生する光源と、検出窓を通してチャネル中に含まれる生成物に向けて光源を方向付けるための光学系とを含む。この光源は、レーザー、レーザーダイオード及びＬＥＤを含めて、適当な波長を与える任意数の光源とし得る。例えば、システム内の蛍光指示薬を活性化するのに適当な波長のレーザー光源を用いるレーザー活性化された蛍光検出システムは、蛍光信号をモニターするのに使用し得る。次に、適当な検出器要素、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて蛍光が検出される。検出可能な信号を放出する反応生成物は、検出器を通り過ぎるように流され得、又は別法として検出器が、複数の反応生成物に対して移動し得る。
【００５８】
ＶＩＩ．　温度介在反応を行う方法
マイクロ流体デバイスに加えて、本発明は、温度介在反応を実行するためのこれらのデバイスを用いる方法をも提供する。一般に、温度介在反応は、１以上の成分の反応性が温度に依存する化学的又は生化学的な反応である。それらの柔軟性、オートメイタビリティ（ａｕｔｏｍａｔａｂｉｌｉｔｙ）及びミクロ規模の体積により、ここに記載のデバイスは、広範囲の温度介在反応、特に一定の試薬を予熱するのが望ましい反応（例えばホットスタートＰＣＲ）を実行するのに用いることができる。
【００５９】
本発明のデバイス上で実行され得る温度介在反応の典型例は、一連の異なる分子、すなわちターゲット分子に対するリガンド、すなわち熱変化による変性が可能な蛋白質の親和力をランク付けるための熱シフトアッセイである。その目的は、リガンドがターゲット蛋白質に結合しているか否かを決めることである。蛋白質の熱変性プロファイルにシフトが生じるリガンド結合が観測された。蛋白質の熱変性プロファイルは、ターゲット蛋白質に非共有的に関連した染料の蛍光を測定することにより測定される。蛋白質が変性すると、染料の蛍光強度が変わる。蛋白質の熱変性プロファイルは、リガンドの不存在又は存在下にて測定される。蛋白質が５０％変性される温度たる中点温度（Ｔｍ ）のシフトは、蛋白質がリガンドに結合していることを示す。
【００６０】
本方法は、ターゲット蛋白質を蛍光性染料に接触させる工程を含む。一連のリガンドが、サンプル供給源から反応チャネル中に導入される。ターゲット蛋白質と染料の組合せは、リガンドの入力と一致するようにサイドチャネルから反応チャネル中に導入される。スペーサーバッファープラグもまた、蛋白質−染料複合体の入力とリガンドスラッグの入力とが一致するように、反応チャネル中に導入される。蛋白質の熱変性プロファイルを測定する２つの異なる方法は次の通りである。
ｉ．　反応チャネルの加熱領域に電流を流す。時間の関数として溶融する蛋白質を原因とした蛍光変化を測定することにより、単一温度での蛋白質−染料−リガンド複合体の変性を測定する。
ｉｉ．　反応チャネルの加熱領域に可変電流を流し、加熱領域内の温度を上昇させる。蛋白質−染料−リガンド複合体の変性温度を測定する。
【００６１】
例
本発明の実施を説明するために、以下の例を示す。これは本発明の全体範囲を制限又は規定するものではない。
【００６２】
例１：リガンド誘導熱シフトアッセイ
図６は、リガンド誘導熱シフトアッセイを提示し、ストレプトアビジンすなわち、ｐＨ７．５にて２０ｍＭのＡＮＳ、８５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１７０ｍＭのＮａＣｌにて結合しているビオチンに対する熱変性プロファイルを示す。
【００６３】
ストレプトアビジンとビオチンの水溶液が、次の比、すなわち１：０、２：１及び１：３にて作られる。これらの溶液を５分間温置できるようにする。１−アニリノナフタレン−８スルホン酸（１，８ＡＮＳ）とＨＥＰＥＳバッファーが各々の溶液に加えられる。３つの溶液の最終的な濃度は次の通りである。
１．　３２μＭのストレプトアビジンのサブユニット、０ｍＭの１，８ＡＮＳ、８５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７０ｍＭのＮａＣｌ。
２．　３２μＭのストレプトアビジンのサブユニット、１６μＭのサブユニットビオチン、２０ｍＭの１，８ＡＮＳ、８５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７０ｍＭのＮａＣｌ。
３．　３２μＭのストレプトアビジンのサブユニット、９６μＭのサブユニットビオチン、２０ｍＭの１，８ＡＮＳ、８５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１７０ｍＭのＮａＣｌ。
【００６４】
各溶液の１０μＬのアリコートが、圧力誘導フローを用いて平面マイクロ流体チップ上に加えられる。露出溶液は、鉱油で覆われて蒸発を防止する。ジュール加熱を用いて、１秒当たり１℃温度が上げられる。蛍光の変化がモニターされる。（図６参照）
【００６５】
上述の発明は明確さと理解のためにある程度詳細に記載してきたが、当業者ならばこの開示を読めば、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態及び詳細における種々の変更を行うことができることは明らかであろう。この出願において引用された総ての刊行物及び特許書類は、あたかも個々の刊行物又は特許書類の各々がそのように個別に示されたように、それら総てをあらゆる目的のために同程度まで援用される。
【００６６】
あたかも個別の刊行物又は特許出願の各々が特定的かつ個別に援用されるべく指示されたように、すべての刊行物及び特許出願が同程度にここで援用される。本発明は、明確さ及び理解のために説明及び例によりある程度詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲内で一定の変更及び修正を行うことができることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
マイクロ流体デバイスの略示図である。
【図２】
本発明のデバイスにおいて用いられる改善されたチャネル構成と、温度介在反応におけるそれらの動作を示す。
【図３】
流体の流れを妨げるための栓のされたレザバーを示す。
【図４】
本発明による熱サイクル用の加熱及び冷却コイルを備えたマイクロ流体デバイスの略示図である。
【図５】
流体の拡散を防止するための狭いチャネル領域を組み込んだ本発明のマイクロ流体デバイスを示す。
【図６】
マイクロ流体デバイス上でのリガンド誘導熱シフトアッセイを示す。
【符号の説明】
１２　　底部基板
１４　　平坦表面
１８　　頂部基板
２０　　第１平坦表面
２２　　第２平坦表面
２４　　穴（ポート）
１００　　加熱領域
１１０　　反応チャネル
１４０　　横チャネル
１５０、１６０　　電気的アクセス大チャネル
１７０、１８０、１９０　　交差点
２００　　レザバー
３００　　加熱コイル
３０５　　マイクロチャネル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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