(57)【要約】本発明は、正常妊娠と子宮外妊娠を同時に検出し区別できる、ワンステップ妊娠診断装置及びその製造方法を提供する。本発明に従って、妊産婦の体液に分泌されるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）及びその変型の形態差異を免疫学的に検出することにより、正常妊娠と子宮外妊娠を初期に迅速かつ正確に判断することができる。
2004506220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体結合メンブレンと抗体結合着色微粒子パッドを含む免疫クロマトグラフィ法に基づく妊娠診断装置において、抗体が抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体を組み合わせて構成される妊娠診断装置。
【請求項２】
試料受けパッドと試料吸収パッドをさらに含む、請求項１記載の妊娠診断装置。
【請求項３】
抗体は、抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体をさらに含む、請求項１記載の妊娠診断装置。
【請求項４】
抗体結合メンブレンは、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を含み、かつ抗体結合着色微粒子パッドは、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体、抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体及び着色微粒子を含む、請求項１記載の妊娠診断装置。
【請求項５】
抗体点滴メンブレンは、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体を含み、かつ抗体結合着色微粒子パッドは、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体及び着色微粒子を含む、請求項１記載の妊娠診断装置。
【請求項６】
上記の着色微粒子は、セレニウム、金、及びポリスチレンから選択される１種以上から形成される、請求項４または５記載の妊娠診断装置。
【請求項７】
抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体が、濃度比１：２−１０から構成されたことを特徴とする請求項４または５記載の妊娠診断装置。
【請求項８】
子宮外妊娠線、正常妊娠線、及び試験終了線を含み、
非妊娠の女性由来の試料である場合、試験終了線だけが視覚的に観察でき；
正常妊娠の女性由来の試料である場合、試験終了線、子宮外妊娠線、及び正常妊娠線が同等な強度で視覚的に観察でき；
子宮外妊娠の女性由来の試料である場合、試験終了線及び子宮外妊娠線だけが視覚的に観察できるか、または試験終了線、子宮外妊娠線及び正常妊娠線が視覚的に観察でき、正常妊娠線の強度が際立って低い、妊娠診断装置。
【請求項９】
子宮外妊娠線は抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体から構成され、正常妊娠線は抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体から構成され、かつ試験終了線は抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体から構成される、請求項８記載の妊娠診断装置。
【請求項１０】
子宮外妊娠線は抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体から構成され、正常妊娠線は抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体から構成され、かつ試験終了線は抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体から構成される、請求項８記載の妊娠診断装置。
【請求項１１】
抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体は０．１％〜２％スクロース及び５ｍＭ〜５０ｍＭリン酸緩衝液を含む固定緩衝液に溶かした後、メンブレン上に０．１〜５μｇ／ｃｍになるように固定する、請求項９記載の妊娠診断装置。
【請求項１２】
試料は、尿、血液、及び唾液を含む、請求項８記載の妊娠診断装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、正常妊娠と子宮外妊娠を区別するためのワンステップ妊娠診断装置及びこのような装置の製造方法に関する。特に妊産婦の体液中に分泌されるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）及びその変型の形態上の差異を、免疫学的に検出させることにより、正常妊娠と子宮外妊娠を初期に迅速でかつ正確に判断できる診断装置に関する。
【０００２】
従来の技術
子宮外妊娠とは、受精卵が正常子宮内膜外に着床している妊娠を指し、着床部位に応じて卵管妊娠、子宮頸管妊娠、卵巣妊娠、腹腔妊娠などに分類される。子宮外妊娠のうち卵管妊娠は９５％を超え、卵管妊娠が子宮外妊娠の通称として使用されている。子宮外妊娠の病因には過去の卵管結紮術（避妊法）、ＰＩＤ（骨盤炎）、排卵調節剤の投与、ＳＴＤ（性病）等が含まれ、かつ子宮外妊娠の発生率は妊産婦の約６４人〜２４１人当り１人と非常に高い。
【０００３】
子宮外妊娠は、産婦人科で最も頻繁な緊急事態であって、その発生頻度は毎年増加している。また、 子宮外妊娠による卵管破裂時の観察できる症状には、下腹部痛症、無月経または膣出血、血圧低下によるめまい、胃腸管症状による吐き気と嘔吐が含まれる。子宮外妊娠を放置すると、妊娠初期における妊産婦の最大の死因として現れる腹腔内出血につながる可能性がある。このように子宮外妊娠が初期に発見されない場合には、卵管破裂に続いて出血によるショック状態に進展し、患者の死亡に至る。しかし、未だに子宮外妊娠に特異的に適用されうる特異的な症状と診断法がないため、早期診断は困難に直面してきた。このような状況下で、本発明者等は子宮外妊娠を早期に判断することにより母性死亡率を減少させることができ、正常妊産婦の子宮外妊娠に対する不安感を解消させることができるという仮定について、鋭意研究を重ねた結果、子宮外妊娠を早期に診断するための方法及び装置を見出した。
【０００４】
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ； 以下、ｈＣＧと称する）は、胎盤の合胞体栄養細胞層（ｓｙｎｃｙｔｉｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）で生成され、妊娠初期にプロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）の常時生産を誘導し、胎盤機能が完成される妊娠１０週まで着床を維持する。また、このホルモンは胎児精巣にてテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）の生成を促進して、雄性胚の内部生殖器分化に重要な役割を果たし、母体甲状腺の刺激など多様な機能を有する。このホルモンは妊娠（または受精）後、約８日になると、血液及び尿から約２５ｍＩＵ／ｍｌの濃度で検出される。そして、妊娠５週から一定の速度で急速に増加して、妊娠６週には約１ＩＵ／ｍｌ、そして妊娠１０週には約１００〜１２０ＩＵ／ｍｌまで増加する。この時点から妊娠１０〜１８週の間に減少して、妊娠２０週では約２０ＩＵ／ｍｌになり、一定の濃度が維持される。ｈＣＧはαとβの２つのサブユニットから構成された糖タンパク質であって炭水化物が３０％であり、分子量は約３６，７００ダルトンである。α−サブユニットは９２個のアミノ酸から構成され、黄体形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンのα−サブユニットと同様な構造からなっており、β−サブユニットは１４５個のアミノ酸から構成（構造的にｈＣＧに特徴的）されている（Ｌａｐｔｈｏｒｎ等． Ｎａｔｕｒｅ． １９９４． Ｖｏｌ．３６９： ４５５〜４６１）。
【０００５】
一般的に、ｈＣＧはヒトの体液で多様な形態で存在する完全なｈＣＧ（ｉｎｔａｃｔ−ｈＣＧ； Ｉ−ｈＣＧ）、ならびにニックが入ったｈＣＧ（ｎｉｃｋｅｄ ｈＣＧ； Ｎ−ｈＣＧ）、多糖鎖ｈＣＧ（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈＣＧ）、遊離βｈＣＧ（ｆｒｅｅ β−ｈＣＧ）、及び遊離βコア断片（ｆｒｅｅ β−ｃｏｒｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む変型されたｈＣＧが公知である。このように、多様な形態のｈＣＧは妊娠、脳下垂体、絨毛性疾患（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）及び絨毛癌（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の事象で生成される。正常妊娠の妊産婦体液では完全なｈＣＧが全ｈＣＧの約９０％程度を構成し、多様な変型ｈＣＧは約１０％以下の量で検出される。
【０００６】
これに反して子宮外妊娠は、一定比率のニックが入ったｈＣＧと遊離βｈＣＧが検出される正常妊娠と対照的に、完全なｈＣＧがほとんどを占め、変型ｈＣＧはほとんど存在しない。また、全ｈＣＧ分泌量と増加幅が正常妊娠より非常に少ない。つまり、ｈＣＧの分泌量は妊娠６週には正常妊娠の約１／５に達し、妊娠８週では正常妊娠の約１／５０に減少し、すなわち約１５ＩＵ／ｍｌに減少する。
【０００７】
米国特許第５，７８６，２２０号には、正常妊娠と異常妊娠を区別するワンステップ診断試薬の製造方法を開示しているが、ヒト女性体液中のプロゲステロン濃度とｈＣＧの濃度を同時に測定することにより、正常妊娠、自然流産、子宮外妊娠、癌などが診断できると開示している。具体的には、血液中のプロゲステロンの濃度が２５ｎｇ／ｍｌ以下である同時にｈＣＧの濃度が２５〜２，５００ｍＩＵ／ｍｌである場合には、自然流産及び子宮外妊娠を示し、プロゲステロンの濃度が２５ｎｇ／ｍｌを超え、ｈＣＧの濃度が２、５００ｍＩＵ／ｍｌを超える場合には、正常子宮内妊娠を示す方法を開示している。デニール等（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ＆ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ． １９９９． Ｖｏｌ． ７２： １０１３〜１０１７）は、遊離βｈＣＧの濃度が正常妊娠では３０〜１７０ＩＵ／ｍｌであり、異常子宮内妊娠は１〜７０ＩＵ／ｍｌであり、子宮外妊娠の場合に０．０５９〜２９ＩＵ／ｍｌであることを開示し、子宮外妊娠においてｈＣＧ分解産物が正常妊娠より非常に低い濃度で分泌されることを示した。
【０００８】
上記のように、ｈＣＧは妊娠の診断に最も重要なホルモンであって、妊娠初期のｈＣＧ濃度は超音波所見と共に考慮して、妊娠、流産、及び子宮外妊娠の識別に使用されている。妊娠診断においてｈＣＧは、初期に妊娠を確認するために使用できる。低い濃度のｈＣＧと倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）は、妊娠５〜９週の間にｈＣＧの血中濃度が１．４〜２日毎に倍加されることを指し、流産及び子宮外妊娠を示す。正常より高い数値のｈＣＧ濃度は、多胎妊娠及び胞状奇胎を示すと解釈される。子宮外妊娠は、妊産婦血清及び尿のｈＣＧ濃度の測定に加えて、超音波撮影、診断的腹腔鏡などによっても診断される。特に、超音波検査はｈＣＧ濃度測定と組み合わせた診断のために行う、超音波検査の所見で胎嚢が見えながらｈＣＧ濃度が１，０００ｍＩＵ／ｍｌを下回る場合には、妊娠の可能性が希薄であることを示す。４８時間毎にｈＣＧ濃度が定量的に少なくとも６５％増加しないと、その妊娠の予後は非常に不良であると判断される。
【０００９】
ｈＣＧ濃度の倍加時間を測定する公知の方法と妊産婦体液中の遊離βｈＣＧ濃度を測定する方法のような診断法は、採血が繰り返し必要という短所を有する。米国特許第５，７８６，２２０号に開示される妊娠診断法は、ｈＣＧ濃度測定と並行してプロゲステロンの濃度測定を行う点で、本発明とは異なる診断原理に基づく。また正常妊娠と異常妊娠の区別は可能であるが、妊産婦に非常に危険な事象である子宮外妊娠と一般的な自然流産を初期段階で効果的に区別するのは困難である。
【００１０】
このために、本発明者等は早期妊娠診断において、正常妊娠診断および子宮外妊娠を同時に診断できる、ワンステップ同時診断キットの製造方法に関して鋭意研究を重ねた。その結果、正常妊娠を２５ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧ濃度の検出によって判断することができ、子宮外妊娠はＩ−ｈＣＧと変型−ｈＣＧの濃度比較により判断できる、ワンステップ同時診断キットを提供する。
【００１１】
発明の開示
本発明は、正常妊娠と子宮外妊娠をワンステップで妊娠初期に同時診断できる診断装置及びこのような装置の製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
また本発明は、妊産婦の体液（血液、尿、唾液等）中に存在するＩ−ｈＣＧと変型−ｈＣＧを各々検出するために、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体を抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と組合せて使用し、抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体を抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体と組合せて使用することを特徴とする。
【００１３】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）方法と呼ばれる免疫学的分析方法に基づく。このような分析方法に使用される抗体は、分析しようとする試料の感受性及び特異性を決定するため、抗体の選別が非常に重要である。サンドイッチ分析法には主に２種のモノクローナル抗体を使用するが、この２種の抗体の結合位置は、分析の感受性を維持するために、関連する抗原の違う所に存在する。例えば、妊婦の体液（血液、尿、唾液等）中に分泌されるｈＣＧを調べるためには、２種のモノクローナル抗体が必要であり、この２種の抗体の抗原（ｈＣＧ）上の結合部位は明確に離れて位置するべきである。もし、使用される２つの抗体の抗原（ｈＣＧ）上の結合部位が同じであったり近接した所にあれば、構造的妨害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）により分析の感受性が低下する。本発明は、免疫学的分析方法のうちサンドイッチ分析法を基本とした免疫クロマトグラフィ法を利用したものである。特に、以前に特徴付けたモノクローナル抗体を、有色の微細な粒子（着色微粒子）に共有または非共有結合で結合させ、生じた微粒子を移動相で使用する。次に以前に特徴付けたモノクローナル抗体をニトロセルロースメンブレンに分配して固定させ、固定相として使用する。分析しようとする試料を移動相と混合して、固定相であるメンブレンを通じて、毛細管現象により展開させる。この際、試料中に関連抗原が含まれていると抗原を媒介として固定相と移動相が結合して、固定相部位に着色微粒子線が観察される。このような観察できる線の出現有無により試料中の関連抗原の存在有無を視覚的に判断する。本発明に使用されるモノクローナル抗体は、商品化されているモノクローナル抗体として購入するか、または公知の細胞融合プロトコールに従って製造することができる。実施例で使用される抗体は、公知のモノクローナル抗体の製造方法に従って製造し、その製造過程でＩ−ｈＣＧに反応を示す抗体及び変型−ｈＣＧに反応を示す抗体を選別する。抗α−ｈＣＧ抗体及び抗β−ｈＣＧ抗体に関して、標準ｈＣＧで調べた時に、感受性が良好に維持されるモノクローナル抗体を選別して使用した。
【００１４】
上述したように、妊娠初期では正常妊娠及び子宮外妊娠の女性の尿には、ｈＣＧが多様な形態で存在する。特に子宮外妊娠の場合に発見されるｈＣＧのほとんどは完全なｈＣＧ（Ｉ−ｈＣＧ）であり、変型−ｈＣＧはほとんど存在しない。正常妊娠時にはＩ−ｈＣＧが存在する全ｈＣＧの約９０％を構成し、多様な変型−ｈＣＧが約１０％を構成する。本発明は、このような差異を利用して、Ｉ−ｈＣＧと変型−ｈＣＧを別個に検出して視覚的に比較することにより、正常妊娠と子宮外妊娠の区別と同時に妊娠を確認することができる。本発明の診断装置の構造は、試料中にＩ−ｈＣＧが存在する時に有色の線が出現する子宮外妊娠（ＥＰ）部位と、試料中に変型−ｈＣＧが存在する時に有色の線が出現する正常妊娠（ＮＰ）部位を用いる診断装置を、別々に提供することによって完成した。子宮外妊娠である場合に、ほとんどのｈＣＧはＩ−ｈＣＧ型として存在する。したがってＩ−ｈＣＧの反応によりＥＰ部位のみで有色の線が出現するか、またはＮＰ線が現れてもよりはるかに強いＥＰ線が出現する。正常妊娠である場合、体液中にはＩ−ｈＣＧだけでなく１０％程度の変型−ｈＣＧが存在する。従って、本発明の診断装置では変型−ｈＣＧに反応性のある抗体を結合させた着色微粒子の濃度を２〜１０倍増大させるか、または変形ｈＣＧによる反応感受性を高めるように結合抗体の濃度をそれに応じて増大させる。２つの部位（ＥＰ、ＮＰ）に出現する有色線の強度を同様にして、正常妊娠の診断を補助する。
【００１５】
以下、本発明による妊娠診断装置の構成をさらに詳細に説明する。
【００１６】
子宮外妊娠の際過剰過発現される、Ｉ−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を公知の方法で製造した後、着色微粒子と結合させる。この微粒子をガラス繊維パッドに組み込んだ後、乾燥させて着色微粒子パッドを製造した。もう一方で、変型−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を公知の方法で製造し、着色微粒子と結合させる。この微粒子をガラス繊維パッドに組み込んだ後、乾燥させて着色微粒子パッドを製造した。ポリスチレン粒子、コロイド金等を含む様々な着色微粒子を本発明に使用できる。これらの中ではコロイド金が好ましく、２０〜６０ｎｍの大きさのコロイド金がさらに好ましい。
【００１７】
診断装置の感受性を維持するために、着色微粒子に固定された抗体の結合部位とは異なる抗原（ｈＣＧ）上の結合部位に結合するモノクローナル抗体を、メンブレンの固定相で使用した。この目的で使用されたモノクローナル抗体は抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体と抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体である。この２種の抗体をそれぞれ異なるニトロセルロースメンブレンに直線になるように分配することによって固定するか（図１）、または１つのメンブレン内に交差線または２つの別々の線になるように分配することによって固定した（図２）。そして、モノクローナル抗体結合部位下方のメンブレン末端には、試験の終了線が現れるように抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体を分配した。
【００１８】
上記のように製造された抗体固定化メンブレンは、接着剤が塗布されているポリエステル支持盤に接合させて、その上に縦にモノクローナル抗体−着色微粒子パッドを接合させた。そして、妊産婦の体液が直接点滴される試料受けパッド及び余分の体液が吸収される試料吸収パッドを、互いに重なるように縦に接合させて、正常妊娠及び子宮外妊娠の同時診断キットの内部ストリップを提供した（図３）。
【００１９】
上記のように製造された同時診断装置を使用して、正常妊娠及び子宮外妊娠を早期診断する方法は、次の通りである。
【００２０】
試料受けパッドに妊産婦の体液（血液、尿、唾液など）を加えると、試料が吸収され毛細管現象によって移動して、着色微粒子パッドに組み込まれているモノクローナル抗体結合着色微粒子と反応する。正常妊娠である場合には、試料中に存在するＩ−ｈＣＧ及び変型−ｈＣＧが各々着色微粒子に結合したモノクローナル抗体と結合して、ニトロセルロースメンブレン相を移動する。メンブレン上に２種類のモノクローナル抗体が固定されている部位で、抗原−抗体複合体は各々サンドイッチ形態で結合して、メンブレン上に同様の強度で出現している着色微粒子により２つの結果線（ＮＰ／ＥＰ）が現れる。
【００２１】
子宮外妊娠である場合、体液に存在するｈＣＧのほとんどはＩ−ｈＣＧからなる。従って、Ｉ−ｈＣＧと着色微粒子の複合体は、メンブレン相に沿って移動して抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と結合し、強いＥＰバンドを生じる。対照的に、変型−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体が結合された着色微粒子は、試料中のＩ−ｈＣＧと反応せず、従ってメンブレン上に固定された抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体に結合せずに移動する。微粒子はまた、試料中に存在するごく少量の変型−ｈＣＧと反応して、非常に弱い強度のＮＰバンドを生じうる。結局、子宮外妊娠である場合には、１つのＥＰバンドが現れるか、または２つのバンドが異なる線強度で（ＮＰバンドよりＥＰバンドが強く）現れる。
【００２２】
被験者の女性が妊娠していない場合は、試料中にｈＣＧが存在しないので、モノクローナル抗体−着色微粒子複合体が、メンブレンの結果線（ＮＰ、ＥＰ）に固定された抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合せず移動する。従って抗マウス−免疫グロブリンポリクローナル抗体が固定された試験終了線（Ｃ）のみに、着色微粒子バンドが現れる。
【００２３】
本発明の正常妊娠及び子宮外妊娠の同時診断装置の形態及び構造例は、図１ａから図２ｂに示す。
【００２４】
同様の結果は、着色微粒子パッドとメンブレンに結合した抗体を相互交換して使用しても得られる。抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を各々着色微粒子に結合させ、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体、抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗マウス−免疫グロブリンポリクローナル抗体を、上記のようにニトロセルロースメンブレンに固定させて、診断キットを提供する。妊産婦の体液を試料受けパッドに添加した場合、１）正常妊娠である場合には、試料中に存在するＩ−ｈＣＧ及びその他の変型−ｈＣＧが、着色微粒子に固定された抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体にそれぞれ結合し、ニトロセルロースメンブレンに沿って移動し、メンブレン上に固定されている抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体に各々サンドイッチ形態で結合して、メンブレン上には類似の感受性を持った２つの結果線（ＮＰ、ＥＰ）が現れ；２）子宮外妊娠である場合には、体液に存在するＩ−ｈＣＧが着色微粒子パッドに結合している抗α−ｈＣＧと結合してメンブレン相を移動して、メンブレン上の抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体と結合して強いＥＰバンドのみ生じたり、試料中に存在するごく少量の変型−ｈＣＧにより、非常に弱い強度のＮＰバンドが現れ；３）被験者の女性が妊娠していない場合は、試料中にｈＣＧが存在しないので、モノクローナル抗体−着色微粒子複合体が、メンブレンの結果線（ＮＰ、ＥＰ）に固定された抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合せずに移動する。従って抗マウス−免疫グロブリンポリクローナル抗体が固定された終了線（Ｃ）のみに、着色微粒子バンドが現れる。
【００２５】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。これら実施例は本発明を具体的に説明するだけであり、これら実施例により本発明の範囲が制限されないことは、当業者にとって認識されるべきである。
【００２６】
実施例１：抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体の製造及び精製
Ａ． 免疫及び細胞融合
Ｉ−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を製造するために、公知の細胞融合（ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）方法（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ等 １９８１， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３：３−４６）を使用した。まず、８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに、Ｉ−ｈＣＧ（Ｚｙｍｅｄ、米国）２０μｇ／１００μｌをフロインドの完全アジュバント１００μｌを完全に乳化させて腹腔内注射した。３週後、フロインドの不完全アジュバント１００μｌを乳化に用いた以外は同様な方法で２次腹腔内注射した。１週間後、マウスから採血して抗体形成をＥＬＩＳＡ法で確認した後、２０μｇのｈＣＧを尾に静脈注射した。３日後、マウスの脾臓細胞を回収して、予め培養したＳｐ２／Ｏ細胞とＰＥＧを利用して細胞融合させた。融合細胞をＨＡＴ培地を添加した９６ウェルで培養した。次に、Ｉ−ｈＣＧと反応する抗体を分泌する細胞、およびα−ｈＣＧと反応する抗体を分泌する細胞を選別して、大量培養に供した。
【００２７】
Ｂ． モノクローナル抗体の精製
大量培養された培養液を遠心分離して、沈澱物を除去した。上層液を集めてプロテインＡ−セファロース（ＦＦ）カラムにのせ、リン酸緩衝液で洗浄した後、０．１Ｍグリシン緩衝液で溶出させた。溶出液は、リン酸緩衝液に対して透析して濃度を調整し、診断キットの製造に使用した。
【００２８】
実施例２：抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体の製造及び精製
実施例１のＡと同様な方法で、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）から購入したβ−ｈＣＧ抗原で３回免疫させたマウスから、脾臓細胞を得た。Ｓｐ２／Ｏ細胞と混合して、ＰＥＧを利用して細胞融合を実施した。融合した細胞をＨＡＴ培地を添加した９６ウェルで培養した。β−ｈＣＧと反応する抗体を分泌する細胞、及び完全なｈＣＧとは反応性がなく、変型−ｈＣＧと反応性のある抗体を分泌する細胞を選別して、大量培養を実施した。続いて大量培養された培養液から、実施例１のＢと同様な精製方法でモノクローナル抗体を精製し、リン酸緩衝液に対して透析した後、濃度を調整し、次に診断キットの製造に使用した。
【００２９】
実施例３：コロイド金（着色微粒子）の製造
着色微粒子は、２０〜６０ｎｍの大きさのコロイド金（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｇｏｌｄ）を使用した。コロイド金を製造するために、５００ｍｌ丸底フラスコに二重蒸留水２２０ｍｌを添加した。その後、フラスコをホットプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）に位置させ、水蒸気の蒸発を防ぐために還流装置（Ｐｙｒｅｘ社、米国）を設置した。ホットプレートを作動させ懸濁させながら、フラスコを１００℃に加熱した。蒸留水の温度が１００℃を超えた時に、２％塩化金（Ｓｉｇｍａ社、米国）１．０ｍｌを加えて完全に混合した後、１％クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社、米国）２．０ｍｌを加えた。その後、３０分間続けて加熱してコロイド金の生成を誘導した。このように製造されたコロイド金は不純物及び凝集体を除去するために、０．４５μｍろ紙でろ過して診断装置製造に使用した。
【００３０】
実施例４：モノクローナル抗体が結合した着色微粒子が組み込まれた着色微粒子パッドの製造
モノクローナル抗体が結合した着色微粒子を製造するために、実施例３で製造された着色微粒子５０ｍｌずつをそれぞれビーカーに入れた。実施例１及び２で製造されたモノクローナル抗体を、それぞれ着色微粒子１ｍｌ当り１μｇ〜１５μｇになるように、攪拌しながらフラスコに添加して、２分〜３０分間反応させた。反応が終わった後、１％〜１０％ウシ血清アルブミンを含む遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液を、最終濃度０．１〜１％のアルブミン濃度になるよう各ビーカーに添加して、２分〜３０分間反応させた。
【００３１】
この反応液を５０ｍｌの遠心分離チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）に入れて、超遠心分離機（Ｂａｃｋｍａｎ社、米国）で１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去して沈澱物を回収し、安定化緩衝液（０．５％〜２％ウシ血清アルブミン、１％〜５％スクロース、５０ｍＭ〜１００ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５〜９．０））に再懸濁した。このような懸濁液を適切な濃度に調整して、着色微粒子パッドを懸濁液に浸漬して乾燥させた。実施例２で獲得した抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体を結合させた着色微粒子は、実施例１で獲得した抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体を結合させた着色微粒子の濃度より２〜１０倍高くなるよう添加して製造した。抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体を２〜１０倍高い濃度で使用することにより、検査試料に相対的に少量（１０％）含まれる変型−ｈＣＧを確実に検出できるようにした。
【００３２】
実施例２で獲得した抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体及び実施例１で獲得した抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を着色微粒子パッドで製造する場合には、メンブレンに結合される抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体の濃度を、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体の濃度より２〜１０倍高く調節して、変型−ｈＣＧを確実に検出できるようにした。
【００３３】
実施例５：抗体固定メンブレンの製造（読出し板）
抗体が固定された部位で正常妊娠及び子宮外妊娠に反応する結果線を作るために、α−ｈＣＧを認識して結合するモノクローナル抗体及びβ−ｈＣＧを認識して結合するモノクローナル抗体を、ニトロセルロースメンブレンに各々一直線になるように点滴した。抗体は１〜４．０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、最終濃度が０．１μｇ−５μｇ／ｃｍになるようにメンブレン上に点滴して固定し、０．１％〜２％のスクロースを含んだ５ｍＭ〜５０ｍＭリン酸緩衝液を固定化溶液として使用した。モノクローナル抗体の点滴部位の下方には０．５〜２ｍｇ／ｍｌ濃度のウサギ抗−マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）ポリクローナル抗体を使用して反応終了線（図１ａ及び図２ａのＣ）を提供したが、０．１％〜２％のスクロースを含んだ５ｍＭ〜５０ｍＭリン酸緩衝液を固定化溶液として使用した。抗体固定が完了したメンブレンを、室温で２時間乾燥させた。示そうとする結果線の形態に応じて、固定化する抗体と点滴パターンを変更することができる。図１に示した診断キットは、それぞれ異なるメンブレンに抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を点滴し固定させて製造した。図２に示した診断キットは、結果線が１つのメンブレンに表示されるようにするために、２つの抗体を２つの直線状に１つのメンブレンに点滴し固定させて製造した。特に、図１のような診断キットの場合、望ましい結果を得るためには、メンブレンに固定された抗体と着色微粒子に結合された抗体の選別が非常に重要である。つまり、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定されたメンブレンを使用する場合には、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子パッドを使用することが好ましい。抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定されたメンブレンを使用する場合には、変型−ｈＣＧを検出できるように、抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子パッドを使用することが好ましい。抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定されたメンブレンを使用する場合には、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子パッドを使用し、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定されたメンブレンを使用する場合には、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子パッドを使用することが好ましい。
【００３４】
実施例６：試料受けパッド及び試料吸収パッド
試料受けパッドには、ガラス繊維（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国）またはセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ社、英国）を使用した。試料吸収パッドにはセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ社、英国）を使用した。
【００３５】
実施例７：妊娠及び子宮外妊娠の同時診断ストリップの製造
図３のように、実施例５で製造された抗体固定化メンブレンを接着性ポリエステル支持盤に接着させた後、その上に実施例４で製造した抗体結合着色微粒子パッドを１〜３ｍｍ重なるように接着させた。その後、試料受けパッドを縦に１ｍｍ〜１０ｍｍ重なるように接着させ、試料吸収パッドを１〜５ｍｍ重なるように接着させて同時診断ストリップを製造した。このように製造された同時診断ストリップは、図１ａ及び図２ａに示されるようなプラスチックハウジング（ｐｌａｓｔｉｃ ｈｏｕｓｉｎｇ）に組立て、正常妊娠及び子宮外妊娠の同時診断キットを製造した。
【００３６】
試験的実施例１：ｈＣＧ標準液を利用した同時診断キットの評価
上記の実施例にしたがって製造された診断キットの特異性を評価するために、ザイメッドで市販しているＩ−ｈＣＧ（カタログ番号１４−１４０１）および超音波所見で正常妊娠と判定された初期妊産婦の尿から、ｈＣＧ標準溶液を製造した。評価するキットの着色微粒子パッドは、Ｉ−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体及び変型−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を、各々実施例４のような着色微粒子に結合させて製造した。抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を、各々実施例５のようにニトロセルロースメンブレンに点滴することによって、抗体固定メンブレンを製造した。このように製造された２種の抗体固定メンブレン、および２種の着色微粒子パッドを組立て、メンブレンとパットのそれぞれ可能な組み合わせを提供する。試料受けパッド及び試料吸収パッドを各々接着させて組立て、同時診断ストリップを製造した。
【００３７】
標準溶液としては、陰性標準液と陽性標準液を調製し、試験に使用した。
陰性標準液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
陽性標準液１：Ｉ−ｈＣＧ ５０ｍＩＵ／ｍｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）
陽性標準液２：超音波所見で正常子宮内胎嚢が確認され、胎児の心拍が検出された、初期妊産婦の尿
【００３８】
上記の標準溶液をキットの試料受け口に約５００μｌを投入した後、３分間観察した。結果線の出現有無により、「陰性」と「陽性」の結果を判定した。
【００３９】
試験結果は、下記表１に示す。。
【００４０】
【表１】同時診断キットに使用されたモノクローナル抗体の認識特性比較（１）
2004506220.tif 000003
記号：−（反応なし）、＋（非常に小さな反応）、＋＋（有意な反応）、＋＋＋（強い反応）
【００４１】
表１に示されたように、ｈＣＧが含まれていない陰性標準液では抗体１と２が固定されているメンブレン上の部位に線が現れないため、「陰性」と判断する。Ｉ−ｈＣＧを含む陽性標準液１では、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子及び抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定された部位で強い相互作用を示し、その他のモノクローナル抗体を利用したキットでは弱い反応性を示した。正常妊娠の尿を使用した陽性標準液２では、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合された着色微粒子及び抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定された部位で強い相互作用を示した。また抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合した着色微粒子および抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定された部位で、強い相互作用を示した。このような結果から、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体を抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と組合せることにより、Ｉ−ｈＣＧを検出することができる一方、変型−ｈＣＧの検出は抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体と抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を利用することによってなし得ることが分かる。
【００４２】
同様の結果は、着色微粒子とメンブレンに結合される抗体を相互に交換しても得られ、分析に使用する抗体の組合せの重要性を明確に示す。表２は、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を着色微粒子に結合させ、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体及び抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体をメンブレンに固定させて、同時診断キットを製造する。標準ｈＣＧ溶液を用いる試験の結果を表す。
【００４３】
【表２】同時診断キットに使用されたモノクローナル抗体の認識特性比較（２）
2004506220.tif 000004
記号：−（反応なし）、＋（非常に小さな反応）、＋＋（有意な反応）、＋＋＋（強い反応）
【００４４】
上記の試験例にみられるように、結局、試料中に含まれているｈＣＧの形態に応じて、出現する線の位置と強度が異なったため、正常妊娠と子宮外妊娠の結果を肉眼で判定することができた。
【００４５】
試験例２：正常妊娠及び子宮外妊娠の同時診断キットを使用した妊産婦尿の分析　正常妊娠及び子宮外妊娠で特異的に発見される変型−ｈＣＧ及びＩ−ｈＣＧを分析するために、非妊婦尿、正常妊婦尿、および子宮外妊婦尿を各々本発明の同時診断キットに適用した結果を、表３に示す。正常妊婦の尿試料は、超音波所見で子宮内で胎嚢が確認され胎児の心拍が検出された妊産婦から得られた。子宮外妊婦の尿試料は、子宮外妊娠所見が外科的手術を通じて確認された妊産婦の尿から得られた。この実施例に使用された診断キットは、図１ａに示された形態であった。
【００４６】
表３にみられるように、非妊婦の尿試料ではＮＰ及びＥＰの結果線に何の線も出現しなかった。正常妊婦の尿試料ではＮＰ及びＥＰの結果線が類似の強度で出現した。特に、子宮外妊婦の尿試料では、ＮＰよりＥＰの結果線ではるかに強い線が出現して、正常妊娠と子宮外妊娠を読出しにより明確にできることを意味する。
【００４７】
【表３】同時診断キットの臨床正確度測定
2004506220.tif 000005
記号：−（反応なし）、＋（非常に小さな反応）、＋＋（有意な反応）、＋＋＋（強い反応）
【００４８】
産業上の利用可能性
本発明は、正常妊娠と子宮外妊娠を同時に検出できる、ワンステップ妊娠診断装置及びそのような装置の製造方法を提供する。妊産婦の体液は、妊娠の形態に応じて異なる形態のｈＣＧを含み、本発明は体液中に存在するｈＣＧの形態を免疫学的に検出することにより、正常妊娠と子宮外妊娠を妊娠初期に、迅速かつ正確に判断することを可能にする。特に本発明は、妊産婦の体液（尿、血液、唾液など）中に存在するＩ−ｈＣＧと変型−ｈＣＧを個別に検出するために、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体は抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体と組み合わせ、抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体は抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体と組み合わせる。従って、本発明は子宮外妊娠を早期に発見することにより母性死亡率が減少させるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明による正常妊娠及び子宮外妊娠に関する同時診断装置の模型図である。１と４は診断キットの判読窓を表し、２と５は試験の終了を表す指標（Ｃ）である。また、３は子宮外妊娠線（Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ； 以下、ＥＰ）を表わし、６は正常妊娠線（Ｎｏｒｍａｌ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ； 以下、ＮＰ）を表す。そして、７は妊産婦の体液を投入する試料受け口を表す。
【図１Ｂ】図１（ａ）の内部ストリップに使用された抗体固定化メンブレン上の結果線（ＮＰ、ＥＰ）と終了線（Ｃ）を示す模式図である。１１はニトロセルロースメンブレンであり、８と１２はウサギ抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体が固定された試験終了線を表す。９は抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定された試験結果線を表し、１３は抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体が固定された試験結果線を表す。１０は抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合した着色微粒子パッドを表し、１４は抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合した着色微粒子パッドを表示している。
【図２Ａ】本発明による正常妊娠及び子宮外妊娠に関する同時診断装置の別の模型図である。１５は試験の終了を表す指標（Ｃ）であり、１６は子宮外妊娠線（ＥＰ）を、１７は正常妊娠線（ＮＰ）を表す。１８は診断装置の判読窓を表わし、１９は妊産婦の体液を投入する試料受け口を表示している。
【図２Ｂ】図２（ａ）の内部ストリップに使用される抗体固定メンブレンの結果線（ＮＰ、ＥＰ）と終了線（Ｃ）を示す模式図である。２０はニトロセルロースメンブレンであり、２１はウサギ抗−マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体が固定された試験終了線を表す。そして、２２は抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定した子宮外妊娠（ＥＰ）線を表し、２３は抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定した正常妊娠（ＮＰ）線である。２４は抗変型−ｈＣＧモノクローナル抗体と、抗Ｉ−ｈＣＧモノクローナル抗体が結合した着色微粒子を混合したパッドを表す。
【図３】本発明の正常妊娠及び子宮外妊娠に関する同時診断装置の内部ストリップの構成を表す。２５は体液吸収パッドを表し、２６は抗体点滴ニトロセルロースメンブレンを、２７は着色微粒子パッドを表し、２８は試料受けパッドを表し、これらパッドは一部重なるように順に組み合わされる。
【図１Ａ】
2004506220.tif 000006
【図１Ｂ】
2004506220.tif 000007
【図２Ａ】
2004506220.tif 000008
【図２Ｂ】
2004506220.tif 000009
【図３】
2004506220.tif 000010
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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