(57)【要約】本発明は、増大するサイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性による細胞遊走を抑制する並びに心臓血管疾患および腫瘍転移を治療する方法、並びにかかる治療に使用する化学的化合物を同定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性を増加させることによって細胞の遊走を抑制する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞が、平滑筋細胞または腫瘍細胞である方法。
【請求項３】
被験者の心臓血管疾患を治療する方法であって、前記被験者に、細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより前記被験者の心臓血管疾患を緩和することと、を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術もしくは冠状動脈ステント留置の後の再狭窄である方法。
【請求項５】
被験者の腫瘍転移を阻害する方法であって、前記被験者に細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより腫瘍転移を阻害することと、を含む方法。
【請求項６】
請求項１、３または５の何れか１項に記載の方法であって、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性が、Ｃ３外酵素活性の増加により増加する方法。
【請求項７】
細胞遊走を阻害する化学的化合物を同定する方法であって、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性の増加に適切な条件下で前記化学的化合物と、細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと、および細胞遊走を阻害する化合物としての前記化学的化合物を同定するために、前記化学的化合物の存在下でｐ２７活性の増加を検出することと、を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記化学的化合物が、細胞遊走を阻害することが以前に知られていない方法。
【請求項９】
細胞遊走を阻害する化学的化合物を同定するために細胞遊走を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性の増加に適切な条件下で前記複数の化学的化合物と、細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと；
（ｂ）前記複数の 化学的化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを決定することと；そしてもしそうであるならば
（ｃ）前記複数の化学的化合物に細胞遊走を阻害する化合物として含まれる任意の化合物を同定するために、前記複数の化学的化合物に含まれる各化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを別々に決定することと；
を含む方法。
【請求項１０】
請求項７または９に記載の方法であって、前記細胞が、平滑筋細胞または腫瘍細胞である方法。
【請求項１１】
請求項７または９に記載の方法であって、前記細胞が、脊椎動物細胞である方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記脊椎動物細胞が、哺乳類細胞である方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である方法。
【請求項１４】
請求項７または９に記載の方法により同定された化学的化合物。
【請求項１５】
薬学的組成物であって、（ａ）細胞膜を介して通過でき且つ細胞内サイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２７活性の増加に効果的な、請求項７または９に記載の方法を用いて同定した化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのホモログまたはアナログの一定量、並びに（ｂ）前記細胞膜を介して通過できる薬学的に許容される担体、を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的組成物であって、請求項７または９に記載の方法を用いて同定した細胞遊走の阻害に効果的な化学的化合物並びに薬学的に許容される担体の一定量を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
組成物を調製する方法であって、担体と、請求項７または９に記載の方法により同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの薬学的な効果量とを混合すること、を含む方法。
【請求項１８】
細胞遊走を阻害する組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）を作出する方法であって、請求項７または９に記載の方法を用いて化学的化合物を同定することと、並びに、次に前記化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログを合成することと、を含む方法。
【請求項１９】
心臓血管疾患を有する被験者を治療する方法であって、前記被験者に、請求項７または９に記載の方法により同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術もしくは冠状動脈ステント 留置の後の再狭窄である方法。
【請求項２１】
被験者における腫瘍転移を阻害する方法であって、前記被験者に、請求項７または９に記載の方法により同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む方法。
【請求項２２】
異常性（該異常性は、細胞遊走を阻害することにより緩和される）を治療する薬学的組成物を調製する目的における、請求項７または９に記載の方法により同定された化学的化合物の使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載の使用であって、前記異常性が、心臓血管疾患または腫瘍転移である使用。
【請求項２４】
請求項２３に記載の使用であって、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術もしくは冠状動脈ステント 留置の後の再狭窄である使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書中に開示される本発明は、米国国立衛生研究所、米国保健社会福祉省の助成金番号ＲＯ１ＨＬ５６１８０， ＲＯ１Ａ１３９７９４， およびＲＯ３ＴＷ００９４９による政府の助成のもとになされた。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有している。
【０００２】
【発明の背景】
本出願の全体において、様々な文献が括弧内の著者名及び出版年により参照される。これら文献の完全なる書誌的事項は、本明細書の「参考文献」に記載される。これら公開文献の開示の全体は、本明細書中に引用することにより本出願に援用され、当該発明が属する技術の状況をより完全に記載する。
【０００３】
血管平滑筋細胞（ＳＭＣ；ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）遊走は、経皮経管的動脈形成術（ＰＴＣＡ；ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ） および 冠状動脈ステント術の双方の術後におけるアテローム性動脈硬化症 および 再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）などの多くの血管疾患の病因に多大に関与していると信じられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ， １９９７）。正常な血管において、ＳＭＣの大部分は、管の中膜（ｍｅｄｉａ）若しくは中間層（ｍｉｄｄｌｅ ｃｏａｔ）に常在しており、そこで彼等は静止状態で且つ「収縮（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ）」表現形を呈しており、この状態はアクチンおよびミオシンを含有する線維が豊富であるとの特徴を有する。疾患状況において、ＳＭＣｓは、血管の中膜から脈管内膜（ｉｎｔｉｍａ）もしくは内部層（ｉｎｎｅｒ ｃｏａｔ）へと遊走（ｍｉｇｒａｔｅ）する。病理学的状況におけるＳＭＣ 遊走のプロセスは、細胞外マトリックス、プロテアーゼ酵素、血小板由来成長因子 （ＰＤＧＦ）および塩基性線維芽細胞 成長因子 （ｂＦＧＦ）などの成長因子、並びに更に増殖および遊走に寄与するサイトカインの合成を伴う（Ｃｌｏｗｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ， １９８５； Ｆｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ｉｈｎａｔｏｗｙｃｚ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ｊａｗｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。線維芽細胞 成長因子−２ （ＦＧＦ−２）は、細胞外マトリックス （ＥＣＭ）−  １ インテグリン 相互作用を変化させることによりＳＭＣ 遊走を調節するように思われる（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＦＧＦ−２は、２  １， ３  １およびｖ  １ インテグリンのＳＭＣ表面発現を増大させ、これにより−アクチン・ストレスファイバーネットワークの脱会合（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）を介して細胞運動性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｔｉｌｉｔｙ）の増強に至る（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００４】
ラパマイシン（マクロライド抗生物質）は、第一ギャップ （Ｇ１） および ＤＮＡ合成（Ｓ） 期の間の細胞周期進行をブロックすることによりインビトロ および インビボ双方のＳＭＣ 増殖を阻害する（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。細胞の増殖の阻害は、インビトロ （Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．， １９９５） および インビボ （Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）における細胞周期依存性キナーゼ活性 および 網膜芽細胞腫 蛋白質リン酸化の著しい減退と関連している。マイトジェンによるサイクリン依存性キナーゼ阻害因子 （ＣＤＫＩ） ｐ２７ｋｉｐ１のダウンレギュレーションは、ラパマイシンによってブロックされる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｏｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ラパマイシン （２ ｎＭ）によるラットおよびヒト ＳＭＣの４８時間の前処理は、修正したボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ）においてＰＤＧＦで誘導したＳＭＣ 遊走を阻害した。しかしながら、ラットおよびヒト ＳＭＣの急性（ａｃｕｔｅ）ラパマイシン処理（６時間）は遊走に効果を示さず、このことはラパマイシンに対する長期暴露がその抗遊走作用に必須であることを示唆している。これらの知見を支持して、ＳＭＣ および Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞の双方のラパマイシン （１−１００ ｎＭ）， ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ） および ＬＹ２９４００２による急性６時間処理は、ＰＤＧＦ誘導ケモタクシスの阻害に失敗した（Ｈｉｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ラパマイシンが、抗増殖および抗遊走の双方に関するＳＭＣ特性を有しているとの知見によって、ラパマイシンが移植した心臓で生じる加速した動脈症（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）並びに経皮経管的動脈形成術および冠状動脈ステントの留置の後の再狭窄などの傷害の治療に重要な適用を有しているだろうとの提案を提起するに至った（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｍａｒｘ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ， １９９９； Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ラパマイシンは、ブタの血管形成術モデル（Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９） における新脈管内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）の増殖を顕著に阻害し、並びにげっ歯類の同種移植モデル（Ｐｏｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）における慢性の移植片血管疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｆｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）を逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）させた。最近の臨床試験は、ステント再狭窄（ｓｔｅｎｔ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）の治療におけるラパマイシンの重要性を示している（Ｓｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【０００５】
ｐ２７ｋｉｐ１（−／−） ノックアウトマウスにおいて、相対的なラパマイシン耐性が示された。そしてラパマイシン耐性の筋原細胞（ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）において、恒常的に低レベルのｐ２７ｋｉｐ１が観察され、これは血清退薬（ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）およびラパマイシンで増加しなかった （Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。これらの知見は、ｐ２７ｋｉｐ１ダウンレギュレーションをブロックする能力がラパマイシンの成長阻害効果の一因となることを示唆していた。サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２１ｃｉｐ１のトランスフェクションは、細胞外マトリックスへのＳＭＣの伝播（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）および付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の阻害並びに修正したボイデンチャンバー アッセイにおける遊走の阻害を示した。ｐ２１ｃｉｐ１がアクチン 線維の会合および接着分子のトランスロケーションを抑制したので、これらの知見はｐ２１ｃｉｐ１がおそらく接着阻害物質であることを示唆していた（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００６】
本出願は、ラパマイシンが、野生型 および ｐ２７ｋｉｐ１ （＋／−）マウスのＳＭＣ 遊走の強力な阻害効果を有しているが、ｐ２７ｋｉｐ１ （−／−） ノックアウトマウスにおいては有していないことを開示するものである、この事実はサイクリン依存性キナーゼ阻害因子 （ＣＤＫＩ） ｐ２７ｋｉｐ１が、ラパマイシンの抗遊走 特性およびＳＭＣ 遊走を制御するシグナル伝達経路において決定的な役割を担っていることを示している。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増大させることにより細胞の遊走を抑制する方法に関する。
【０００８】
本発明は、被験者の心臓血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）を治療する方法を提供する。この方法は、前記被験者に細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより前記被験者の心臓血管疾患を緩和することと、を含む。
【０００９】
本発明は、被験者の腫瘍転移を阻害する方法を提供する。この方法は、前記被験者に、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより腫瘍転移を阻害することと、を含む。
【００１０】
本発明は、細胞遊走を阻害する化学的化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を同定する方法を提供する。この方法は、ｐ２７活性の増加に適切な条件下で前記化学的化合物と、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと、および細胞遊走を阻害する化合物としての前記化学的化合物を同定するために、前記化学的化合物の存在下でｐ２７活性の増加を検出することと、を含む。
【００１１】
本発明は、細胞遊走を阻害する化学的化合物を同定するために細胞遊走を阻害することが知られていない複数の 化学的化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、
（ａ）ｐ２７活性の増大に適切な条件下で前記複数の化学的化合物と、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと；
（ｂ）前記複数の 化学的化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを決定することと；そしてもしそうであるならば
（ｃ）前記複数の 化学的化合物に細胞遊走を阻害する化合物として含まれる任意の化合物を同定するために、前記複数の 化学的化合物に含まれる各化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを別々に決定することと；を含む。
【００１２】
本発明は、本明細書中に記載される方法のうち任意の方法により同定される化学的化合物を提供する。
【００１３】
本発明は、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、（ａ）細胞膜を介して通過でき且つ細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性の増加に効果的な、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて同定した化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのホモログまたはアナログの一定量、並びに（ｂ）前記細胞膜を介して通過できる薬学的に許容される担体、を含む。
【００１４】
本発明は、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて同定した細胞遊走の阻害に効果的な化学的化合物および薬学的に許容される担体の一定量、を含む。
【００１５】
本発明は、組成物を調製する方法を提供する。この方法は、担体と、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの薬学的な効果量とを混合すること、を含む。
【００１６】
本発明は、細胞遊走を阻害する組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）を作出する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて化学的化合物を同定することと、並びに、次に前記化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログを合成することと、を含む。
【００１７】
本発明は、心臓血管疾患を有する被験者を治療する方法を提供する。この方法は、前記被験者に、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む。
【００１８】
本発明は、被験者における腫瘍転移を阻害する方法を提供する。この方法は、前記被験者に、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む。
【００１９】
本発明は、異常性（ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ）（該異常性は、細胞遊走を阻害することにより緩和される）を治療する薬学的組成物を調製する目的における、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物の使用を提供する。
【００２０】
【発明の詳細記載】
本発明は、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増大させることによって、細胞の遊走を抑制する方法に関する。前記方法の異なる態様において、前記細胞は、平滑筋細胞または腫瘍細胞である。
【００２１】
本発明は、被験者の心臓血管疾患を治療する方法を提供する。この方法は、前記被験者に細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより前記被験者の心臓血管疾患を緩和することと、を含む。異なる態様において、前記心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）もしくは冠状動脈ステント 留置（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｔｅｎｔ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の後の再狭窄である。
【００２２】
本発明は、被験者における腫瘍転移を阻害する方法を提供する。この方法は、前記被験者に細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性を増加させる化合物を投与することと、これにより腫瘍転移を阻害することと、を含む。
【００２３】
本明細書中に記載される方法の一態様において、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性は、Ｃ３ 外酵素活性の増加により増加する。
【００２４】
異なる態様において、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性は、薬理学的技術によって、組換え技術によって、または遺伝子治療によって増加する。薬理学的技術、組換え技術、および遺伝子治療は、当該技術分野において周知である。
【００２５】
本発明は、細胞遊走を阻害する化学的化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｐ２７活性の増大に適切な条件下で前記化学的化合物と、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと、および細胞遊走を阻害する化合物としての前記化学的化合物を同定するために、前記化学的化合物の存在下でｐ２７活性の増加を検出することと、を含む。一態様において、前記化学的化合物は、細胞遊走を阻害することが以前に知られていない。
【００２６】
本発明は、細胞遊走を阻害する化学的化合物を同定するために、細胞遊走を阻害することが知られていない複数の 化学的化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、
（ａ）ｐ２７活性の増大に適切な条件下で前記複数の化学的化合物と、細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性が増加する場合に遊走が阻害される細胞とを接触させることと、または前記細胞の抽出物とを接触させることと；
（ｂ）前記複数の 化学的化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを決定することと；そしてもしそうであるならば
（ｃ）前記複数の 化学的化合物に細胞遊走を阻害する化合物として含まれる任意の化合物を同定するために、前記複数の 化学的化合物に含まれる各化合物の存在下でｐ２７活性が増加するかどうかを別々に決定することと；を含む。
【００２７】
本明細書中に記載される方法の異なる態様において、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性は、イムノブロットを用いて検出される。
【００２８】
本明細書中に記載される方法の異なる態様において、前記細胞は、平滑筋細胞または腫瘍細胞である。一態様において、前記細胞は、脊椎動物細胞である。更なる一態様において、前記脊椎動物細胞は、哺乳類細胞である。なお更なる一態様において、前記哺乳類細胞は、ヒト細胞である。
【００２９】
本発明は、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物を提供する。
【００３０】
本発明は、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、（ａ）細胞膜を介して通過でき且つ細胞内 サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 ｐ２７活性の増加に効果的な、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて同定した化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのホモログまたはアナログの一定量、並びに（ｂ）前記細胞膜を介して通過できる薬学的に許容される担体、を含む。
【００３１】
本発明は、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて同定した細胞遊走の阻害に効果的な化学的化合物および薬学的に許容される担体の一定量を含む。
【００３２】
本発明は、組成物を調製する方法を提供する。この方法は、担体と、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの薬学的な効果量とを混合すること、を含む。
【００３３】
本発明は、細胞遊走を阻害する組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｔｅｒ）を作出する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載される方法の何れかを用いて化学的化合物を同定することと、並びに、次に前記化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログを合成することと、を含む。
【００３４】
本発明は、心臓血管疾患を有する被験者を治療する方法を提供する。この方法は、前記被験者に、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む。異なる態様において、前記心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術もしくは冠状動脈ステント 留置の後の再狭窄である。
【００３５】
本発明は、被験者における腫瘍転移を阻害する方法を提供する。この方法は、前記被験者に、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物或いは新規の構造的および機能的なそのアナログまたはホモログの治療的な効果量を投与すること、を含む。
【００３６】
本発明は、異常性（該異常性は、細胞遊走を阻害することにより緩和される）を治療する薬学的組成物を調製する目的における、本明細書中に記載される方法の何れかによって同定された化学的化合物の使用を提供する。異なる態様において、前記異常性は、心臓血管疾患または腫瘍転移である。異なる態様において、前記心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、心臓移植後の動脈症、または血管形成術もしくは冠状動脈ステント 留置の後の再狭窄である。
【００３７】
対象発明において、「薬学的な効果量」は、化合物が有効な疾患を罹患した被験者に投与した場合に前記疾患の減退（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、寛解（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、または後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を生じる前記化合物の量である。更に、本明細書中に使用される、「薬学的に許容される担体」という成句は、標準の薬学的に許容される担体の何れかを意味する。実例として、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水、およびオイル／水エマルジョンなどのエマルジョンが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
化学的化合物の「構造的および機能的なアナログ」は、前記化合物の構造と類似する構造を有するが、ある部分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）もしくは部分群に関しては異なっている。化学的化合物の「構造的および機能的なホモログ」は、その各々が一定の要素（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）の付加によって、その前の形態（ｔｈｅ ｏｎｅ ｂｅｆｏｒｅ ｉｔ）から形成される一連の化合物のうちの１つである。「アナログ」という用語は、「ホモログ」という用語よりも広く且つこの用語を含む用語である。
【００３９】
本発明は、以下の実施例の記載からよりよく理解されるであろう。しかしながら、当業者は、以下に議論される特定の方法および結果が本発明の単なる例示であり、本発明は本願の特許請求の範囲の請求項により完全に記載されることを容易に理解するであろう。
【００４０】
【実施例】
［材料および方法］
試薬：ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびトリプシンは、ＧＩＢＣＯ （Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）から入手した。組換え型ｂＦＧＦは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手した。そしてパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）は、シグマ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手した。ラパマイシンは、Ｓｕｒｅｎ Ｓｅｈｇａｌ博士（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）から供与された。
【００４１】
Ｃ３ 外酵素の発現：Ｃ３ 外酵素を、以前に記載されたように調製した（Ｄｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｆｅｉｇ， １９９５）。グルタチオン  Ｓ  トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）―Ｃ３ 外酵素  ｃＤＮＡ（ペンシルバニア大学のＪｕｄｙ Ｍｅｉｎｋｏｔｈ博士から供与された）をＢＬ２１コンピテント細胞に形質転換した。蛋白質の発現を、２００  Ｍ  イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、３２℃で３時間誘導した。溶解物を調製し、そしてＧＳＴ−セファロースビーズと４℃で１時間インキュベーションした。前記ビーズを洗浄し、そして３ユニット／ｍｌ  トロンビン（ＧＳＴ融合蛋白質からのＣ３ 外酵素の切断の目的で）と４℃で一晩インキュベーションした。トロンビンを、上清と抗トロンビン・セファロースビーズとを４℃で１時間インキュベーションすることによって除去した。この上清を、セントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）で濃縮した。蛋白質濃度をブラッドフォードアッセイで決定し、そしてこの上清を等分し、そして液体窒素注で凍結した。使用前に試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、そしてクマシーで染色して正常なＧＳＴ 融合蛋白質の発現およびＣ３ 外酵素の切断／精製を確認した。
【００４２】
細胞培養：マウスの大動脈のＳＭＣｓを、以下の外植遊走（ｅｘｐｌａｎｔ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）実験から取得し、そして２０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２の空気中で継代培養した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。増殖培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）を、８０％コンフルエントに達するまで隔日交換した。実験に使用した細胞は、継代＃３−６に由来する。ＳＭＣ表現型の確認は、−アクチンに対する陽性蛍光染色およびファクターＶＩＩＩ抗原に対する陰性染色により決定した。細胞の生存度は、各実験の終了時にトリパンブルー排除法により決定した際に９５％以上であった。
【００４３】
ＳＭＣ 接着アッセイ：この接着アッセイは、以前の記載のように実施した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。マウス ＳＭＣｓを、ラパマイシンまたはビヒクルで４８時間処理した。ＳＭＣｓ 〔０．２％ ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中に５ｘ１０５／ｍｌ〕を、ラミニンまたはフィブロネクチンでプレコートした１２−ウェルのプレート上に配置した。３時間後、非接着細胞を含む培地を除去し、そして細胞数をコールターカウンター（Ｍｏｄｅｌ Ｚ１， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ， Ｂｅｄｓ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて３回計数して決定した。
【００４４】
ＳＭＣ 遊走 アッセイ：遊走を、８   ｍの孔を有するポリカーボネートフィルターを内蔵する、４８ウェルの修正したボイデンチャンバーを用いて以前に記載されたように測定した（Ｂｏｒｎｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。各アッセイ前に各膜を、０．１ ｍｇ／ｍｌ コラーゲン（０．２ Ｍ  酢酸中）で２４時間コートした。各アッセイごとに、５０ ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＤＭＥＭ中）を底部チャンバー中の４重ウェル（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ ｗｅｌｌｓ）に配置した。ＢＳＡ （ｂＦＧＦを含有しないＤＭＥＭ中に０．２％）を、陰性コントロールとして使用した。細胞をトリプシン処理し、そして血球計算器で計数する４８ 時間 （ラパマイシン および ＦＫ５０６） または １６ 時間 （Ｃ３ 外酵素）前にラパマイシン、ＦＫ５０６もしくはＣ３ 外酵素を直接増殖培地に添加した。５０   ｌ中の等数の細胞（２ｘ１０５／ｍｌ）を、各ウェルのトップチャンバーに配置した。６ 時間後、非遊走細胞をフィルターの上部表面から剥がした。下部表面上の細胞を、メタノールで固定し、そしてギムザ染色で染色した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｎ．Ｙ．）。フィルターの下部表面上のＳＭＣの数は、ウェル毎に定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｒｅａ）の４つのハイパワー（ｘ２００）領域（ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ）を計数することにより決定された。値を、陰性コントロール （ＤＭＥＭ＋ＢＳＡ）を差し引いた後に、ｂＦＧＦに応答して遊走する細胞の割合として表現する。実験を、４重ウェルを用いて少なくとも２回実施した。
【００４５】
大動脈の ＳＭＣ 外植 遊走：野生型 Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ジャクソン研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍａｉｎｅ）から入手した。ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスは、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｎｄｒｅｗ Ｋｏｆｆ博士から提供された（Ｋｉｙｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。マウスは、腹腔内（ＩＰ）注射によるラパマイシンの３つの異なる処理プロトコール（９ ｍｇ／ｋｇ／日を７ 日間、４ ｍｇ／ｋｇ／日を５ 日間、または２ ｍｇ／ｋｇ／日を２ 日間）のうちの１つで処理された。コントロール群を、ビヒクル単独（０．２％ ＣＭＣ  ナトリウム、ポリソルベート  ０．２５％； シグマ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）で処理した。処理プロトコールの終わりに、マウスを１００ ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで安楽死させ、大動脈を摘出し、そして外膜（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａ）および周囲の結合組織を除去した。次にこの大動脈を縦方向に切開して開き、そして脈管内膜に加えて基礎部の（ｓｕｂｊａｃｅｎｔ）中膜の薄い部分を除去した。この中膜を、２ ｍｍ  ｘ  ２ ｍｍ の断片に分断し、そしてＤＭＥＭ（２０％ ＦＢＳ を添加した）を含有する６ ウェル 組織培養プレート（３５ ｍｍ， ２２．６ ｍｍ 直径， Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）に配置した。培養培地を、隔日交換した。外植片から外へのＳＭＣの遊走を、外植後に顕微鏡下で毎日観察した。外植した細胞の総数を、各動物の外植片に関して日を基準に（ｄａｉｌｙ ｂａｓｉｓ）決定した。図５の結果は、各群の少なくとも４動物に対して得られた遊走の阻害〔ラパマイシンまたはタクソール（ｔａｘｏｌ）〕の平均割合（±ＳＤ）としてコントロール（未処理）と比較して表示される。ＳＭＣ表現型を、以前に記載したように確認した（Ｓｐｅｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００４６】
イムノブロット：イムノブロットをＬｕｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６）に以前記載された処理を用いて調製した。対数増殖期のＳＭＣもしくはラパマイシン （１００ ｎＭ で４８ 時間）で処理したＳＭＣを、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして溶解物を以前に記載されたように修正ＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製した（Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。溶解物を、１４，０００ ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して清澄した。蛋白質濃度を、ブラッドフォードアッセイによりＢＳＡを標準物質として決定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， １９７６）。蛋白質抽出物 （３０   ｇ）を、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、そしてニトロセルロースに転写した。フィルタを、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ および ５％ ドライミルクで１時間室温でブロックし、続いてマウス モノクローナル ｐ２７ｋｉｐ１抗体 （Ｆ８ 抗体， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）で２時間インキュベーションした。フィルターを、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、次にペルオキシダーゼを結合させた二次抗体で１ 時間インキュベーションした。フィルターを、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、；シグナルを、化学発光検出システム（ＥＣＬ）を用い、コダックＸＡＲフィルムに暴露して検出した。
【００４７】
統計：データを、独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として表示する。統計的な有意差を、分散分析の片側検定（ＡＮＯＶＡ）およびフィッシャーのＰＬＳＤ検定で決定した（ＳｔａｔＶｉｅｗ ４．０１； Ｂｒａｉｎ Ｐｏｗｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｃａｌａｂａｓａｓ， Ｃａｌｉｆ．）。ペアのｔ検定（ＳｔａｔＶｉｅｗ ４．０１）を、全てのデータの分析に使用した。＜０．０５のｐ値を、統計的に有意であると考えた。
【００４８】
［結果］
野生型 および ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスから分離したＳＭＣｓの遊走におけるラパマイシンの阻害効果が、決定された。野生型 マウス ＳＭＣにおいて、４８ 時間のラパマイシン 処理は、ｂＦＧＦ誘導 ＳＭＣ 遊走の有意な阻害効果を示した（図１Ａ、オープンバー）。阻害は、１ ｎＭ および １００ ｎＭの間で濃度依存性があり、ＩＣ５０ は〜２ ｎＭであった。対照的に、ラパマイシンによる遊走の有意な阻害（１ ｎＭ から １０ ｎＭ）は、ｐ２７ （−／−） ＳＭＣにおいて観察されなかった（図１Ｂ、オープンバー）。高濃度（１００ ｎＭ）において、約３５％ 阻害が観察された；ｐ２７ （−／−） 細胞におけるＩＣ５０は、〜２００ ｎＭであり、野生型 ＳＭＣと比較して１００倍に増加したＩＣ５０を示していた。インキュベーションの直前の上部もしくは下部のチャンバーの何れかへのラパマイシンの添加は、ＳＭＣ 遊走に効果なかった。ＦＫ５０６〔ラパマイシンと同一の細胞質レセプター （ＦＫＢＰ１２）に結合する薬剤〕は、マウス ＳＭＣ 遊走に効果なかった（図１Ａ および １Ｂ、黒塗りバー）。ラパマイシン （１０ ｎＭ）による野生型 マウス ＳＭＣの遊走の阻害は、ＦＫ５０６の１００倍モル過剰により競争的に阻害された（図１Ｃ）。ｐ２７ （−／−） ＳＭＣにおけるラパマイシン誘導性の遊走の阻害 （１００ ｎＭ）も、ＦＫ５０６の２０倍モル過剰により競争的に阻害された（図１Ｄ）。遊走の阻害が、ＦＫＢＰ１２に対するラパマイシンの結合を介して媒介されたことを、これらのデータは示している。ラパマイシンによる野生型 マウス ＳＭＣの処理（１００ ｎＭ で ４８ 時間）は、ｐ２７ｋｉｐ１蛋白質 レベルの顕著な増加を生じた（図１Ａ、挿入図）；対照的に、ｐ２７ （−／−） ＳＭＣ ではｐ２７ｋｉｐ１ は検出されなかった（図１Ｂ、挿入図）。ラパマイシンは、ＳＭＣ 増殖を阻害するが、遊走の差異は増殖を反映したものではない（等数の細胞がボイデンチャンバーに配置されたので）。このことの確認として、６ 時間 インキュベーション後の上部および下部チャンバーにおける細胞の数は、非処理および処理の野生型 および ｐ２７ （−／−） ＳＭＣにおいて同等（ｅｑｕａｌ）であった。加えて、細胞の生存度における差異は、野生型 および ｐ２７ （−／−） 動物から得られた非処理 および ラパマイシン処理したＳＭＣの間で認められなかった。如何なる形態学的な 差異も、野生型マウス および ｐ２７ （−／−）マウスから分離された非処理 および ラパマイシン （１００ ｎＭ で ４８ 時間） 処理した ＳＭＣの間で観察されなかった。
【００４９】
遊走はボイデンチャンバー膜へのＳＭＣの接着に依存するため、接着アッセイをフィブロネクチン および ラミニンでコートしたプレートを用いて実施した。ｐ２７ （−／−） 動物から得られたＳＭＣは、フィブロネクチン および ラミニンでコートしたプレートの双方における接着に関して、野生型 動物から得られたＳＭＣと比較して如何なる差異も示さなかった。更に、ラパマイシン 処理 （１００ ｎＭ で ４８ 時間）は、野生型またはｐ２７ （−／−）のＳＭＣの何れの細胞 接着にも影響しなかった（図２）。
【００５０】
ｐ２７ （−／−） 動物のＳＭＣ 遊走におけるラパマイシンのインビボ効果を見積もるため、マウス 大動脈の 外植片および樹立細胞培養から外へ遊走するＳＭＣの能力を検査した。ラパマイシンは、大動脈の外植後に培養培地に添加されなかった。大動脈の ＳＭＣの外植遊走を、野生型 Ｃ５７ＢＬ／６， ｐ２７ （＋／−）， または ｐ２７ （−／−）マウスを用いて実施した。野生型， ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−）のＳＭＣは、２日目（ｄａｙ ＃２）付近で大動脈の 外植片から外に遊走した。ラパマイシン （４ ｍｇ／ｋｇ／日 を ５ 日間）で処理した動物において、遊走の〜８５％阻害（非処理 動物と比較して）が、野生型 および ｐ２７ （＋／−） 群で観察された （ｐ＜０．０５）。対照的に、ラパマイシン媒介性の遊走の阻害は、ｐ２７ （−／−） 群で観察されず （ｐ＜０．０５， 図３Ａ）、このことはｐ２７ｋｉｐ１がラパマイシン媒介性のＳＭＣ 遊走の阻害に決定的な役割を担うことを示している。高用量（９ ｍｇ／ｋｇ／日 で ７ 日間）で、ラパマイシン媒介性の遊走阻害に関して同等の阻害レベルが、野生型， ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−） 細胞において観察された（図３Ｂ）。低用量（２ ｍｇ／ｋｇ／日 で ２ 日間）では、ラパマイシン媒介性の遊走の阻害は観察されなかった。これらの結果は、ｐ２７ （−／−） 細胞を修正したボイデンチャンバーで検査した際に得られた知見と一致しており、そしてラパマイシンのＳＭＣ 抗遊走作用を媒介するｐ２７ｋｉｐ１依存性 および ｐ２７ｋｉｐ１非依存性の両経路の存在を示唆する。ｐ２７ｋｉｐ１経路を撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂ）しなかった薬剤がｐ２７ （−／−） 動物の遊走を阻害できなかったことを示すために、野生型 および ｐ２７ （−／−） 動物をタクソール （２０ ｍｇ／ｋｇ／日 で ７ 日間）で処理した（Ｓｏｌｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。タクソール誘導性の阻害における如何なる差異も、２つの群で観察されなかった（図３Ｃ）。
【００５１】
最近のデータは、Ｒａｓ／ＲｈｏＡの分裂促進的な経路がｐ２７ｋｉｐ１の破壊を制御することを示唆している。Ｃ３ 外酵素〔アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）リボシル化し、ＲｈｏＡを不活性化する〕は、ＰＤＧＦ誘導性のｐ２７ｋｉｐ１分解を阻害した。これらの知見は、マイトジェンによるＲｈｏＡの活性化がｐ２７ｋｉｐ１の分解に必要であることを示唆している（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。加えて、トロンビン誘導性の血管ＳＭＣのＤＮＡ合成 および 遊走は、Ｃ３ 外酵素により阻害された（Ｓｅａｓｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。我々は、この遊走の阻害が部分的にｐ２７ｋｉｐ１レベルを制御することにより媒介されるかどうかを決定した。野生型 および ｐ２７ （−／−） 動物のＳＭＣを、２   ｇ／ｍｌまたは２０   ｇ／ｍｌ 何れかのＣ３ 外酵素に１６ 時間暴露し、トリプシン処理し、そしてボイデンチャンバーの上部チャンバーに配置した。Ｃ３ 外酵素は、野生型 細胞におけるｂＦＧＦ誘導性のＳＭＣ 遊走を有意に 阻害した（図４、オープンバー）。ｐ２７ （−／−） 動物のＳＭＣは、Ｃ３ 外酵素に対して２５％相対耐性（２５％ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示した（図４、黒塗りバー）。急性的にＣ３ 外酵素に暴露されたＳＭＣは、遊走の阻害を示さなかった。これらの結果は、ラパマイシン および Ｃ３ 外酵素の双方が媒介するＳＭＣ 遊走の阻害のレギュレーター（部分的な）として、ｐ２７ｋｉｐ１を関係付けている。
【００５２】
［考  察］
ラパマイシンがラット、ブタ、および ヒトのＳＭＣ 遊走を阻害することは以前から示されている（Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。加えて、ラパマイシンは、ブタモデルの冠動脈血管形成術後に５０％付近まで脈管内膜の肥厚（ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）を減少させる（Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ラパマイシンの抗再狭窄効果は、冠状動脈損傷に対するＳＭＣの反応の阻害で特徴付けられ、付随する網膜芽細胞腫蛋白質 （ｐＲｂ） リン酸化の減少に加えてｐ２７ｋｉｐ１レベルの増加を伴い、これにより細胞周期アレストを生じる（Ｇａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。サイクリン依存性キナーゼ阻害因子 （ＣＤＫＩ） ｐ２７ｋｉｐ１は、サイクリンＥ／ＣＤＫ２を含むサイクリン／ＣＤＫ複合体の制御的活性をそれらに直接的に結合することにより阻害し、そして次には網膜芽細胞腫蛋白質 （ｐＲｂ）のリン酸化をブロックする（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｏｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。このように、ｐ２７ｋｉｐ１は、細胞 増殖の制御因子であり；後期Ｇ１期の間のｐ２７ｋｉｐ１蛋白質 レベルの減退が、ある種の細胞株のサイクリン／ＣＤＫ複合体 活性化 および 細胞周期進行に必要とされる。ＣＤＫＩ  ｐ２７ｋｉｐ１は、静止細胞で高レベルに存在しており、そして分裂促進的な刺激に際してダウンレギュレートされる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｏｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。マイトジェンによるｐ２７ｋｉｐ１のダウンレギュレーションは、免疫抑制剤 ラパマイシンによりブロックできる（Ｎｏｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００５３】
ｐ２７ｋｉｐ１の機能は、臨床的に関連性のあるものである。このことは結腸直腸， 胃， 胸部， および 肺の小細胞の癌における、ｐ２７ｋｉｐ１のダウンレギュレーション と 分解の増強との間にみいだされた関係性から理由付けされる。更に、ＣＤＫＩ  ｐ２７ｋｉｐ１の制御は、インビボのＳＭＣ 増殖の制御に決定的な役割を担っている。管壁のｐ２７ｋｉｐ１のレベルの減少は、経皮経管的動脈形成術 （ＰＴＣＡ）後の新脈管内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）の反応性の増加と関連している（Ｂｒａｕｎ−Ｄｕｌｌａｅｕｓ ａｎｄ ａｌ．， １９９７； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ｐ２７ｋｉｐ１レベルが高い静止状態の血管ＳＭＣをアンギオテンシンＩＩ刺激すると、ＳＭＣ 肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を生じるが、ｐ２７ｋｉｐ１のレベルが低い場合（マイトジェンの存在下で生じるような）にはＳＭＣ 過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を誘導する（Ｂｒａｕｎ−Ｄｕｌｌａｅｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。本出願に開示される知見は、インビボでｐ２７ｋｉｐ１レベルを増加させる薬剤が抗増殖 および 抗遊走の両効果を有するだろうことを示唆している。
【００５４】
ｐ２７ｋｉｐ１の制御はｍＲＮＡ レベルで生じ得るが（Ｈｅｎｇｓｔ ａｎｄ Ｒｅｅｄ， １９９６）、大抵の研究は、ｐ２７ｋｉｐ１が転写後に制御され、ユビキチン （Ｕｂ）−プロテオソーム依存性 分解を必要とするとの考えを支持している（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ユビキチンに対してのｐ２７ｋｉｐ１のターゲッティングは、サイクリン Ｅ−ｃｄｋ２ 複合体によるｐ２７ｋｉｐ１のリン酸化を伴うと信じられている（Ｓｈｅａｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｖｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。最近、ユビキチン―プロテオソーム 非依存性 経路が記載され、これはサイクリン結合ドメインを急速に切除（ｃｌｉｐｓ ｏｆｆ）する蛋白質分解プロセスを伴うものである。このユビキチン 非依存性 プロセッシングは、ＡＴＰ依存性であり並びにプロテオソーム特異性及びキモトリプシンインヒビターに感受性である（Ｓｈｉｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００５５】
加えて、ｐ２７ｋｉｐ１レベルが、Ｒａｓ／ＲｈｏＡ による分裂促進的な経路により制御されることが示されている。ドミナントネガティブなＲａｓまたはＲｈｏＡの過剰発現は、血小板由来成長因子 （ＰＤＧＦ）誘導性のｐ２７ｋｉｐ１の分解を阻害した。Ｃ３ 外酵素（ＲｈｏＡをＡＤＰリボシル化し不活性化する）は、ＰＤＧＦ誘導性のｐ２７ｋｉｐ１分解を阻害し （Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、及びトロンビン誘導性の血管ＳＭＣの増殖 および 遊走を阻害した （Ｓｅａｓｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３ 線維芽細胞において、Ｒｈｏが細胞外 リガンド（リゾホスファチジン酸）により活性化されること並びにＲｈｏ 活性化が収縮性（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ）のアクチン−ミオシン 線維と焦点結合複合体（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）との会合に至ることが示されている（Ｈａｌｌ， １９９８）。Ｒａｃ（Ｒｈｏサブファミリーのメンバー）は、アクチンに富む表面の突出〔糸状偽足（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）〕を誘導することが示されており；ＲａｃはＲｈｏを活性化できる（しかし、線維芽細胞においては、この相互作用は弱く且つ遅効性である）（Ｈａｌｌ， １９９８）。ＰＩ ３キナーゼ活性によるホスファチジルイノシトール−３，４，５−３リン酸 （ＰＩＰ３）の生成は、哺乳類細胞においてＲａｃによるレセプターが媒介する活性化に必須であり及びＰＩ３ キナーゼホモログ〔ＴＯＲ２（ラパマイシン ２の標的）〕は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｈｏ１ｐ 活性化をコントロールする（Ｈａｌｌ， １９９８； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。これらの観察は、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅファミリーが、表面レセプターをアクチン 細胞骨格の組織に対して連結させる重要な制御分子の１つであることを示唆している。ラパマイシンは、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ ファミリーと相互作用すると示されていないが、Ｒｈｏ （Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７） および ｍＴＯＲ （Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｎｏｕｒｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｓａｂａｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）の双方の阻害が、ＣＤＫＩ， ｐ２７ｋｉｐ１のレベルの増加に関連することは興味深い。
【００５６】
細胞外マトリックス （ＥＣＭ）は、細胞 増殖の制御において必須の役割を担っている。伝播（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を阻止された（機械的に又はサイトカラシンもしくはアクトミオシンにより薬理学的に）ヒト 毛細血管内皮細胞は、マイトジェン活性化キナーゼの正常な活性化を呈したが、Ｇ１期を介して進行できなかった（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。細胞周期におけるこの形状依存性のブロックは、ｐ２７ｋｉｐ１のダウンレギュレート、サイクリン Ｄ１のアップレギュレート、およびｐＲｂのリン酸化の不全と相関していた（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。それ故、伝播を抑制された細胞におけるｐ２７ｋｉｐ１の蓄積は、ｐ２７ｋｉｐ１が細胞転回（ｃｅｌｌ ｒｏｕｎｄｉｎｇ）により生み出される形状依存性の細胞周期アレストに役割を果たし得たことを示唆している。ｐ２７ｋｉｐ１蓄積の伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）を担うシグナル伝達経路の構成因子は、Ｒｈｏ（インテグリンが媒介する細胞骨格の張力 および 形状の変化に関与する）およびインテグリン関連キナーゼ（ｐ２７ｋｉｐ１の阻害作用を減少すること及び足場非依存性の成長を促進することが示されている）を含む（Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋａ−Ｗｏｄｎｉｃｋａ ａｎｄ Ｂｕｒｒｉｄｇｅ， １９９６； Ｈｏｔｃｈｉｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ， １９９５； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｒａｄｅｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００５７】
ｐ２１ ＣＤＫＩ （Ｃｉｐ１）は、インビトロのＳＭＣ 遊走を阻害することが示されている（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への、ｐ２１Ｃｉｐ１をトランスフェクトした ウサギ 大動脈の ＳＭＣの伝播および付着が、コントロール ベクターをトランスフェクトした 細胞におけるものと比較して阻害された。Ｃｉｐ１をトランスフェクトした ＳＭＣは、フィブロネクチン上で円形コンフォメーション（ｒｏｕｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持した。更に、ｐ２１Ｃｉｐ１をトランスフェクトした ＳＭＣでは、修正したボイデンチャンバー（フィブロネクチンでコートした膜を有する）においてＰＤＧＦ−ＢＢが媒介する遊走が顕著に減退していることが示された。それ故、おそらくｐ２１Ｃｉｐ１は、接着阻害因子として作用する。なぜならそれはアクチン 線維の会合および接着分子のトランスロケーションを抑制するからである（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。興味深いことに、我々の研究は、ラパマイシンによるｐ２７ｋｉｐ１の誘導が、野生型またはｐ２７ （−／−） 細胞の何れのコラーゲンへの接着にも影響しなかったことを示している。
【００５８】
ホメオボックス転写因子 Ｇａｘは、静止状態の 血管ＳＭＣに発現しており、そしてＳＭＣ 増殖 および 血管損傷が生じている期間にダウンレギュレートされる（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｇａｘは、ｐ２１Ｃｉｐ１をアップレギュレートし、そして血管ＳＭＣ 増殖 および 遊走を阻害する（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ｐ２１Ｃｉｐ１は、Ｇａｘの成長阻害作用を媒介する；Ｇａｘの過剰発現は、ｐ２１ （−／−）マウスに由来する細胞において抗増殖または抗遊走を有していない（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｇａｘは、ｐ２１Ｃｉｐ１を欠如する線維芽細胞の遊走を阻害することができなかった（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｇａｘ ｃＤＮＡのトランスフェクションは、ＰＤＧＦ−， ｂＦＧＦ−， および 肝細胞 成長因子が誘導する血管ＳＭＣの遊走を阻害した（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ｐ１６またはｐ２１の何れかによる細胞周期アレストは、Ｇａｘ誘導性の遊走の阻害に必須である。興味深いことに、Ｇａｘ ｃＤＮＡの過剰発現（ｐ２１Ｃｉｐ１を増加させる）は、コラーゲン および ビトロネクチンをコートしたプレートに対する細胞の接着に効果がなかった。それ故、ｐ２１Ｃｉｐ１をトランスフェクトした細胞において示されたフィブロネクチン接着欠陥とは対照的に、Ｇａｘ ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、如何なるコラーゲン／ビトロネクチン 接着欠陥も提示しなかった。しかしながら、いくつかの研究は、ＳＭＣ 遊走におけるｐ２１Ｃｉｐ１の過剰発現の効果に関して矛盾する情報を報告した；ウサギ 血管ＳＭＣのｐ２１Ｃｉｐ１トランスフェクションは、フィブロネクチンをコートしたボイデンチャンバーにおいて遊走を阻害したが（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、ラット血管ＳＭＣにおけるｐ２１Ｃｉｐ１トランスフェクションは、コラーゲン／ビトロネクチン ボイデンチャンバーにおいて如何なる効果も有していなかった（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００５９】
結論として、ラパマイシンおよびＣ３ 外酵素は、ｐ２７ｋｉｐ１依存性 および 非依存性の経路を介した平滑筋細胞の遊走を阻害する（図５）。この魅力的な知見は、ＳＭＣの増殖 および 遊走の双方を制御するシグナル伝達経路におけるｐ２７ｋｉｐ１の関与を示している。ｐ２７ｋｉｐ１の増大を目的とする技術（例えば、薬理学的技術、組換え技術および／または遺伝子治療）は、血管形成術もしくはステント留置の後の再狭窄の寛解において、または心臓に関する移植後の加速性の動脈症（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）において、同様に細胞遊走が腫瘍転移の重要な要因である癌治療において、劇的な効果を具備することが期待される。
【００６０】
【参考文献】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１（１Ａ−Ｄ）は、ラパマイシンが、野生型の平滑筋細胞の遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスのものを阻害しないことを示す図である。
（Ａ）野生型マウスから分離したＳＭＣｓの遊走を、ラパマイシン および ＦＫ５０６の処理に続いて修正したボイデンチャンバーで決定した。ラパマイシン（オープンバー； １， １０ および １００ ｎＭ）はＳＭＣ 遊走を有意に阻害したが、ＦＫ５０６は効果がなかった（黒塗りバー）。＊ｐ＜０．０５（コントロールと比較して）。挿入図は、増殖している非処理のＳＭＣ （レーン １）と比較したラパマイシン （１００ ｎＭ で ４８ 時間） 処理 （レーン ２）後のｐ２７ｋｉｐ１レベルの増加を示すイムノブロットである。
【図１Ｂ】
図１（１Ａ−Ｄ）は、ラパマイシンが、野生型の平滑筋細胞の遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスのものを阻害しないことを示す図である。
（Ｂ）ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスから分離したＳＭＣｓの遊走を、ラパマイシン および ＦＫ５０６の処理に続いて修正したボイデンチャンバーで決定した。高濃度においてのみラパマイシン（オープンバー； １００ および １０００ ｎＭ）は、ＳＭＣ 遊走を有意に阻害したが、ＦＫ５０６は効果がなかった（黒塗りバー）。＊ｐ＜０．０５（コントロールと比較して）。挿入図は、ｐ２７ｋｉｐ１が存在しないことを示すイムノブロットである。
【図１Ｃ】
図１（１Ａ−Ｄ）は、ラパマイシンが、野生型の平滑筋細胞の遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスのものを阻害しないことを示す図である。
（Ｃ） ＦＫ５０６はＦＫＢＰ１２との結合に関してラパマイシンと競合し及び野生型 のＳＭＣ 遊走においてラパマイシンの効果を阻害する。
【図１Ｄ】
図１（１Ａ−Ｄ）は、ラパマイシンが、野生型の平滑筋細胞の遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスのものを阻害しないことを示す図である。
（Ｄ） ＦＫ５０６はＦＫＢＰ１２との結合に関してラパマイシンと競合し及びｐ２７ （−／−） のＳＭＣ 遊走においてラパマイシンの効果を阻害する。
【図２Ａ】
図２（２Ａ−Ｂ）は、マウス ＳＭＣ 接着におけるラパマイシンの効果の欠如を示す図である。
野生型 （オープンバー） および ｐ２７ （−／−） （黒塗りバー）のＳＭＣを、フィブロネクチン コートしたプレートの何れかで３ 時間プレーティングする前にラパマイシンと４８ 時間インキュベーションした。接着細胞の数はコールターカウンターで３回決定し、そして非処理の野生型 細胞の数に対して正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。如何なる有意差も処理および非処理の細胞間で認められなかった。
【図２Ｂ】
図２（２Ａ−Ｂ）は、マウス ＳＭＣ 接着におけるラパマイシンの効果の欠如を示す図である。
野生型 （オープンバー） および ｐ２７ （−／−） （黒塗りバー）のＳＭＣを、ラミニン コートしたプレートの何れかで３ 時間プレーティングする前にラパマイシンと４８ 時間インキュベーションした。接着細胞の数はコールターカウンターで３回決定し、そして非処理の野生型 細胞の数に対して正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）した。如何なる有意差も処理および非処理の細胞間で認められなかった。
【図３Ａ】
図３（３Ａ−Ｃ）は、ラパマイシンのインビボ投与が、野生型のＳＭＣの外植 遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウト動物のものを阻害しないことを示す図である。
（Ａ）ｐ２７ （＋／＋）， ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−）マウスに、ラパマイシン （４ ｍｇ／ｋｇ／日） を５ 日間注射した。大動脈を外植した。そしてＳＭＣの遊走を、定量し、そしてラパマイシン媒介性の遊走の阻害としてコントロールの％で記載する。ラパマイシンは、ｐ２７ （＋／＋） および ｐ２７ （＋／−）のＳＭＣの双方における遊走を有意に 阻害した；ラパマイシンはｐ２７ （−／−） のＳＭＣ 外植 遊走に効果がなかった。
【図３Ｂ】
図３（３Ａ−Ｃ）は、ラパマイシンのインビボ投与が、野生型のＳＭＣの外植 遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウト動物のものを阻害しないことを示す図である。
（Ｂ）ｐ２７ （＋／＋）， ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−）マウスに、ラパマイシン （９ ｍｇ／ｋｇ／日） を７ 日間注射した。ラパマイシンは、ｐ２７ （＋／＋）， ｐ２７ （＋／−） および ｐ２７ （−／−）のＳＭＣ 外植における遊走を阻害した。
【図３Ｃ】
図３（３Ａ−Ｃ）は、ラパマイシンのインビボ投与が、野生型のＳＭＣの外植 遊走を強力に阻害するが、ｐ２７ （−／−） ノックアウト動物のものを阻害しないことを示す図である。
（Ｃ）ｐ２７ （＋／＋） および ｐ２７ （−／−）マウスに、タクソール （２０ ｍｇ／ｋｇ／日） を ７ 日間注射した。タクソールは、ｐ２７ （＋／＋） および ｐ２７ （−／−）のＳＭＣの遊走を阻害した。
【図４】
図４は、ｐ２７ （−／−） ノックアウトマウスに由来するＳＭＣのＣ３ 外酵素に応答する遊走障害  ―  阻害応答を示す図である。
野生型マウス （オープンバー） および ｐ２７ （−／−）マウス （黒塗りバー）から分離したＳＭＣの遊走を、１６ 時間のＣ３ 外酵素 （２ および ２０ ｇ／ｍｌ） 処理後に修正したボイデンチャンバー内で決定した。ｐ２７ （−／−）マウスに由来するＳＭＣは、Ｃ３ 外酵素に対して２５％相対遊走耐性（２５％ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示した。＊ｐ＜０．０５（コントロールと比較して）。
【図５】
図５は、ラパマイシン および Ｃ３ 外酵素が、ｐ２７ｋｉｐ１に依存性 および 非依存性の経路を介してＳＭＣ 遊走を阻害することを示す図である。
ラパマイシン （Ｒａｐａ）−ＦＫＢＰ１２は、蛋白質翻訳調節因子４Ｅ−ＢＰ１（翻訳開始因子） および ｐ７０ Ｓ６ キナーゼ （Ｓ６ はリボゾーム蛋白質である）の活性化／リン酸化〔ラパマイシンの標的（ＴＯＲ）が誘導する〕を阻害し（Ｍａｒｘ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ， １９９９）且つ未知の機構によるｐ２７ｋｉｐ１のマイトジェン誘導 ダウンレギュレーションを抑制する（点線）。ラパマイシンは、ｐ２７ｋｉｐ１に依存性 および 非依存性の機構によりＳＭＣ 遊走を阻害する。Ｃ３ 外酵素（特異的にＡＤＰリボシル化してＲｈｏＡを阻害する）は、ｐ２７ｋｉｐ１に依存性 および 非依存性 （細胞骨格変化）の経路を介してＳＭＣ 遊走を阻害する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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