(57)【要約】本発明は、細胞外シグナル調節キナーゼであるＥｒｋ−５遺伝子における変異に関してヘテロ接合性またはホモ接合性である、トランスジェニック非ヒト動物、トランスジェニック非ヒト胚およびこれらから単離された細胞に関する。このような動物、胚および細胞は、Ｅｒｋ−５を減少したレベルで発現するかまたは全く発現しない。ホモ接合性の胚の分析は、血管系の欠損を示し、このことは、Ｅｒｋ−５が新脈管形成において役割を担うことを示す。従って、本発明はまた、Ｅｒｋ−５発現またはＥｒｋ−５活性を阻害する薬剤を投与することによって、哺乳動物における新脈管形成を一次的に減少するかまたは除去するための方法に関する。そして、本発明はまた、機能的Ｅｒｋ−５遺伝子を投与することによって、哺乳動物における新脈管形成を増加するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、そのゲノムがＥｒｋ−５遺伝子に操作された変異についてヘテロ接合性であり、ホモ接合性状態において、該変異は、該ホモ接合性の胚における血管形成および新脈管形成を欠くことによって特徴付けられる、Ｅｒｋ−５遺伝子の機能的な欠損および胚の死を生じる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離された細胞であって、該細胞は、胚段階または出生後段階で該哺乳動物から単離される、細胞。
【請求項３】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物胚であって、そのゲノムがＥｒｋ−５遺伝子に操作された変異についてホモ接合性であり、該変異は、該ホモ接合性の胚において血管形成および新脈管形成を欠くことによって特徴付けられる、Ｅｒｋ−５遺伝子の機能的な欠損および胚の死を生じる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物胚。
【請求項４】
請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物胚から単離された、細胞。
【請求項５】
Ｅｒｋ−５遺伝子に操作された変異についてヘテロ接合性である、単離された細胞であって、該変異は、Ｅｒｋ−５遺伝子の機能的な欠損を生じ、該細胞は、機能的Ｅｒｋ−５遺伝子を含む細胞に変異Ｅｒｋ−５遺伝子を導入することによって生成される、細胞。
【請求項６】
Ｅｒｋ−５遺伝子に操作された変異についてヘテロ接合性である細胞を含む、キメラ非ヒト哺乳動物であって、ホモ接合性状態において、該変異は、Ｅｒｋ−５遺伝子の機能的な欠損を生じ、そしてそのゲノムが該変異についてホモ接合性である哺乳動物胚は、血管形成および新脈管形成を欠くこと、ならびに出生するまでに生存できないことによって特徴付けられる、キメラ非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
請求項６に記載のキメラ非ヒト哺乳動物から単離された細胞であって、該細胞は、Ｅｒｋ−５遺伝子に操作された欠損についてヘテロ接合性である、細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物はマウスである、請求項１に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項９】
前記胚はマウス胚である、請求項３に記載のトランスジェニック哺乳動物胚。
【請求項１０】
前記哺乳動物はマウスである、請求項６に記載のキメラ哺乳動物。
【請求項１１】
前記細胞はマウス細胞である、請求項２、４、５または７のいずれか１項に記載の単離された細胞。
【請求項１２】
前記細胞は胚性幹細胞である、請求項１１に記載の単離された細胞。
【請求項１３】
動物における新脈管形成によって特徴付けられる状態を処置または予防するための方法であって、該方法は、薬学的に受容可能な組成物を該動物に投与する工程を包含し、該組成物は、Ｅｒｋ−５遺伝子の転写、Ｅｒｋ−５　ｍＲＮＡの翻訳、またはＥｒｋ−５タンパク質の活性のいずれかを阻害する分子、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記分子は、Ｅｒｋ−５に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、機能的Ｅｒｋ−５　ｍＲＮＡの転写を阻止するためにＥｒｋ−５　ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｅｒｋ−５の発現を阻止するためにＥｒｋ−５　ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｅｒｋ−５　ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイム、またはＥｒｋ−５タンパク質の低分子インヒビターもしくはアンタゴニストから選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記状態は、脳の癌、尿生殖器経路の癌、リンパ系の癌、胃癌、喉頭の癌、肺癌、膵癌、乳癌、カポージ肉腫、網膜芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、頭頸部の癌、黒色腫、結腸直腸の癌、白血病、子宮内膜症、良性前立腺肥大、再狭窄、アテローム硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬、増殖性網膜症、脈管形成性網膜症または黄斑変性から選択される、方法。
【請求項１６】
増加した新脈管形成の必要のある患者を処置するための方法であって、該方法は、該患者における機能的Ｅｒｋ−５タンパク質の増加した発現を生じさせる化学物質を該患者に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記患者は、減少したＥｒｋ−５活性によって特徴付けられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の方法であって、前記患者は、糖尿病性神経障害性潰瘍；創傷；他の潰瘍（例えば、皮膚および消化器官の潰瘍）；肢の虚血（例えば、線維筋性形成異常、閉塞性血栓血管炎（バーガー病）、脈管炎、急性動脈閉塞、アテローム塞栓症、レーノー現象もしくはレーノー病；発作；骨折；歯周症；痴呆；頭部損傷または外傷；脱毛；火傷；またはアテローム硬化症に罹患しているか；あるいは、心臓バイパス手術を受けている、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記患者は、糖尿病性神経障害性潰瘍；創傷；他の潰瘍（例えば、皮膚および消化器官の潰瘍）；レーノー現象、レーノー病または脱毛に罹患している、方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法は、前記状態を処置または予防するための単独治療として通常投与されるさらなる治療剤を、前記患者に投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記薬学的に受容可能な組成物は、前記状態を処置または予防するための単独治療として通常投与される治療剤をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、細胞外シグナル調節キナーゼであるＥｒｋ５の遺伝子中の変異についてヘテロ接合性またはホモ接合性である、トランスジェニック非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト胚ならびにこれらから単離された細胞に関する。このような動物、胚および細胞は、Ｅｒｋ５を減少したレベルで発現するかまたは全く発現しない。ホモ接合性胚の分析は、脈管構造の欠損を示し、このことは、Ｅｒｋ５が新脈管形成において役割を担うことを示す。従って、本発明はまた、Ｅｒｋ５発現またはＥｒｋ５活性を阻害する薬剤の投与によって、患者における新脈管形成を一次的に減少するかまたは排除するための方法に関する。本発明はまた、機能的Ｅｒｋ５発現を増加させる分子の投与によって、患者における新脈管形成を増加するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）カスケードは、種々の細胞外刺激によって活性化される細胞内シグナル伝達経路を調節する。３つの別々のＭＡＰキナーゼカスケード（Ｅｒｋ、ＪＮＫおよびｐ３８）が、哺乳動物細胞において広範に研究されている。各カスケードにおいて、３つの連続的に活性化されるキナーゼ（ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼおよびＭＡＰキナーゼ）が、ＭＡＰキナーゼモジュールの核をなす（Ｍ．Ｈ．Ｃｏｂｂ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７１，ｐｐ．４７９−５００（１９９９））。
【０００３】
Ｅｒｋ５タンパク質は、哺乳動物ＭＡＰキナーゼファミリーの最新のメンバーを示す。ヒトＥｒｋ５は、８１５アミノ酸からなり、そして全ての公知のＭＡＰキナーゼのサイズのほぼ２倍である（米国特許第５，４５９，０３６号および同６，０３０，８２２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２１７８１；Ｊ．Ｄ．Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１３，ｐｐ．７１５−２４（１９９５）；およびＧ．Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，ｐｐ．１２６６５−６９（１９９５））。
【０００４】
Ｅｒｋ５は、酸化および高浸透圧のようなストレスによって強く活性化される。これらの刺激による活性化は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼであるＭＥＫＫ３、およびＭＡＰキナーゼキナーゼであるＭＥＫ５によって媒介される（Ｔ．Ｈ．Ｃｈａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，ｐｐ．３６０３５−３８（１９９９））。Ｅｒｋ５は、上皮増殖因子によって開始されるシグナル伝達経路に関連付けられている（Ｙ．Ｋａｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３９５，ｐｐ．７１３−１６（１９９８）；Ｊ．Ａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，ｐｐ．１６５８６−９０（１９９６）；Ｙ．Ｋａｔｏら．，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１６，ｐｐ．７０５４−６６（１９９７））。Ｅｒｋ５はまた、筋細胞増強因子２ｃ（「ＭＥＦ２ｃ」）をリン酸化することが公知であり、そしてｐ３８依存性機構を介する神経のアポトーシスにおいて役割を担うようである（Ｚ．Ｍａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，ｐｐ．７８５−９０（１９９９））。これはまた、糖尿病、骨格筋疾患、アルツハイマー病および末梢神経障害においてＥｒｋ５が役割を担うことを示唆する（ＷＯ９４／２１７８１）。ＭＥＫＫ３は、キナーゼｐ３８の調節を介するがその調節だけを介するのではなく、初期胚性心血管発生に関連付けられている（Ｊ．Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，ｐｐ．３０９−３１３（２０００））。
【０００５】
生存する生物におけるＥｒｋ５の本当の役割を研究するための最良の方法は、Ｅｒｋ５を発現しない生物を作製することである。これは、ノックアウト技術を使用して達成され得、これによって、正常なＥｒｋ５遺伝子が、初期段階の胚性幹細胞に導入された非機能的Ｅｒｋ５遺伝子との相同組換えを介してインビボで変異される。これまで、このようなＥｒｋ５ノックアウトは作製されていない。従って、Ｅｒｋ５ノックアウトを作製および分析する必要がある。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、Ｅｒｋ５発現を欠損する非ヒト動物および非ヒト胚を提供することによって上記の問題を解決する。本発明はまた、これらＥｒｋ５欠損動物およびＥｒｋ５欠損胚から単離された細胞に関する。
【０００７】
ゲノム中のＥｒｋ５における変異についてホモ接合性である本発明の胚は、出生するまで生存できない。ほとんどが、ほぼＥ９．５（胚着床の９．５日後）で死に、そして発生における全体的な遅延および卵黄嚢脈管構造の発達における驚くべきかつ予期せぬ異常を示す。これらＥｒｋ５欠損胚はまた、胚自身において脈管構造を欠くようである。このことは、Ｅｒｋ５が新脈管形成において役割を担うことを示す。従って、本発明は、Ｅｒｋ５をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで阻害することによる、患者における新脈管形成を阻害するための方法を提供する。これは、Ｅｒｋ５遺伝子もしくはＥｒｋ５　ｍＲＮＡを特異的に標的化するアンチセンスヌクレオチド、またはＥｒｋ５　ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイムに似たおあつらえ向きの酵素的ヌクレオチドを患者に投与することによって達成され得る。タンパク質レベルでの阻害は、Ｅｒｋ５に特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはＥｒｋ５の活性を阻害する化合物を投与することによって（代表的には、Ｅｒｋ５活性部位または酵素的に重要な補助的結合部位への競合的結合を介して）達成され得る。
【０００８】
新脈管形成の阻害は、癌、過形成、血管疾患、自己免疫疾患および特定の眼の状態の、処置および予防に有用である。
【０００９】
本発明はまた、遺伝子治療技術を介して機能的Ｅｒｋ５タンパク質の発現に増加を生じるヌクレオチド配列を患者に投与することによって、この患者の新脈管形成を増加するため方法に関する。増加した新脈管形成は、糖尿病性神経障害性潰瘍、他の潰瘍、肢の虚血、発作、骨折、痴呆、頭部損傷または外傷、脱毛、火傷、歯周症を処置するために、創傷治癒において、アテローム硬化症および側副血管形成を増加するための心臓バイパス手術において、有用である。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
１つの実施形態に従って、本発明は、Ｅｒｋ５遺伝子における変異についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、トランスジェニック非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト胚ならびにこれらから単離された細胞を提供する。好ましくは、このトランスジェニック動物およびトランスジェニック胚は、マウスである。
【００１１】
Ｅｒｋ５遺伝子における変異についてヘテロ接合性である非ヒト動物細胞を作製するために、まず同一種由来のＥｒｋ５ゲノムクローンが提供されなければならない。これは、所望の種由来の単離されたゲノムＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、Ｅｒｋ５特異的プローブでプローブすることによって達成され得る。このようなプローブは、Ｅｒｋ５特異的プライマーであり得る。これは、周知のＰＣＲ技術と組合わせて利用された場合に、Ｅｒｋ５特異的ゲノムＤＮＡを増幅する。あるいは、このプローブは、Ｅｒｋ５　ｃＤＮＡまたはそのフラグメントであり得る。このようなｃＤＮＡはまた、ｃＤＮＡライブラリーをＥｒｋ５特異的プライマーでプローブし、次いでＰＣＲすることによって取得され得る。あるいは、このｃＤＮＡは、Ｅｒｋ５特異的プライマーの使用を介して、Ｅｒｋ５をコードするｍＲＮＡを特異的に逆転写することによって作製され得る。Ｅｒｋ５特異的プライマーは、以下の実施例中に示され、そしてまたヒトＥｒｋ５の公知のｃＤＮＡ配列（その開示が本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２１７８１に示されるような）に基づいて設計され得る。
【００１２】
一旦、Ｅｒｋ５ゲノムクローンが単離されると、そのＤＮＡは、機能的Ｅｒｋ５タンパク質をコードすることができないように変異されなければならない。これは、当該分野において周知の種々の方法（例えば、部位特異的変異誘発、または遺伝子コード領域を一部切除し、切除されたＤＮＡを代替のＤＮＡで付随的に置換するかまたは置換しないことによって達成され得る。
【００１３】
好ましくは、Ｅｒｋ５をコードする遺伝子の一部は、マーカー遺伝子をコードするＤＮＡで置換される。その結果、生じたＤＮＡで形質転換された細胞は、容易に同定されそして選択され得る。より好ましくは、Ｅｒｋ５をコードするゲノムクローンの領域は、ｎｅｏ遺伝子をコードするＤＮＡによって置換される。このｎｅｏ遺伝子は、形質転換体についてのマーカーとして後に機能し得る。非機能的Ｅｒｋ５をコードするＤＮＡが第二の異なるマーカー遺伝子（例えば、ｔｋ）もまた含む場合は、最も好ましい。
【００１４】
次いで、非機能的Ｅｒｋ５遺伝子を含む最終構築物は、線状化されそして細胞を形質転換するために使用される。好ましくは、この細胞は、胚性幹細胞である。究極的目標は、細胞の染色体における野生型Ｅｒｋ５遺伝子と、この線状化構築物における変異Ｅｒｋ５遺伝子との間に相同組換えを生じさせることである。この変異されたＥｒｋ５遺伝子を含む細胞は、これらのマーカー遺伝子の１つまたは両方について選択的な培地中で増殖させることによって同定される。
【００１５】
ｎｅｏマーカー遺伝子およびｔｋマーカー遺伝子の場合、本発明者らは、Ｇ４１８およびガンシクロビル（登録商標）に耐性である細胞を探した。相同組換えは、Ｅｒｋ５遺伝子に特異的なプローブを用いて、形質転換された細胞から単離されたＤＮＡに対するサザンブロッティングすることによって確認される。Ｅｒｋ５遺伝子中の変異についてヘテロ接合性である、生じた細胞は、本発明の１つの局面である。
【００１６】
一旦、組換え細胞が同定されそしてＥｒｋ５遺伝子における変異を有することが確認されると、次いで、この細胞は、同一種由来の胚盤胞に注入される。次いで、生じたキメラ動物は、ヘテロ接合性子孫を生成するために正常動物と交配させられる。Ｅｒｋ５遺伝子における変異についてヘテロ接合性である、これらのトランスジェニック子孫は、本発明の別の局面である。
【００１７】
このキメラ動物は、機能的Ｅｒｋ５遺伝子についてヘテロ接合性である、単離された細胞の供給源として使用され得る。これは、このようなマウスにおけるＥｒｋ５変異についてヘテロ接合性である細胞がＧ４１８およびガンシクロビル（登録商標）に耐性であるという事実を利用することによって、達成され得る。このキメラ動物由来の組織は単離され、そして個々の細胞は、周知の技術によって分散される。次いで、個々の細胞は、ヘテロ接合性Ｅｒｋ５変異を含むものを選択するために、Ｇ４１８および／またはガンシクロビル（登録商標）の存在下で増殖させられる。このような単離された細胞もまた、本発明の一部であり、そして、Ｅｒｋ５遺伝子における変異についてヘテロ接合性である細胞の細胞培養物を作製するために使用され得る。
【００１８】
個々の細胞はまた、キメラ／正常動物交雑種のヘテロ接合性子孫から、胚段階または出生後段階のいずれかで、単離され得る。このような単離された細胞もまた、本発明の一部であり、そしてＥｒｋ５遺伝子における変異についてヘテロ接合性である細胞の細胞培養物を作製するために使用され得る。このような細胞培養物は、細胞の表現型および生理機能に対する、Ｅｒｋ５の減少した発現の効果を研究するために有用である。これらの同一の細胞培養物はまた、Ｅｒｋ５変異を強力にレスキューする化合物についてのアッセイ、および本発明の遺伝子治療法の効果を評価するためのアッセイに有用である。
【００１９】
次いで、生じたヘテロ接合性動物は、非機能的Ｅｒｋ５遺伝子についてホモ接合性である胚を得るために、同系交配させられる。機能的に欠損したＥｒｋ５遺伝子を生じる変異についてホモ接合性である動物の特徴的特性は、これらの動物が胚段階で死に、そして卵黄嚢およびその胚自身において脈管形成が顕著に減少するかまたは存在しない、ということである。
【００２０】
このような胚およびこれらから単離された細胞は、本発明の局面である。Ｅｒｋ５遺伝子における変異についてホモ接合性であるトランスジェニック胚から単離された細胞は、Ｅｒｋ５の発現の欠失の効果を研究する際に有用である、細胞培養物を作製するために使用され得る。このような細胞培養物はまた、機能的Ｅｒｋ５発現における欠損をレスキューもしくは補い得る化合物をスクリーニングするため、および本発明の遺伝子治療法の効果を評価するために、有用である。
【００２１】
Ｅｒｋ５産生を欠損する、遺伝的に変更された胚を生成したことの確認は、その胚のｍＲＮＡまたは発現されたタンパク質をＥｒｋ５に対応する分子（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の非存在について分析することによって達成され得る。
【００２２】
欠損Ｅｒｋ５遺伝子についてホモ接合性である細胞を作製する別の方法は、Ｅｒｋ５変異についてヘテロ接合性である細胞の第二の形質転換を実施することである。この第二の形質転換は、異なる選択マーカーが使用されることを除いて、第一の形質転換と同一である。変異Ｅｒｋ５遺伝子についてホモ接合性である細胞を作製するなお別の方法は、非常に高濃度の選択可能な薬物中で最初の形質転換体を増殖させることである。その結果、２コピーのマーカー遺伝子を含む細胞（変異遺伝子およびマーカーについてホモ接合性）のみが、増殖し得る。この方法は、Ｒ．Ｍ．Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２，ｐｐ．２３９１−９５（１９９２）において詳細に記載され，この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００２３】
別の実施形態に従って、本発明は、新脈管形成に関連する疾患または状態を、処置または予防するための方法を提供する。特に本発明は、以下を処置または予防するための方法を提供する：癌（例えば、脳の癌、尿生殖器経路の癌、リンパ系の癌、胃癌、喉頭の癌、肺癌、膵癌、乳癌、カポージ肉腫、網膜芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、頭頸部の癌、黒色腫、結腸直腸の癌および白血病）；子宮内膜症、良性前立腺肥大；血管疾患（例えば、再狭窄およびアテローム硬化症）；自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび乾癬）；ならびに眼の状態（例えば、増殖性網膜症および脈管形成性網膜症ならびに黄斑変性）。
【００２４】
本発明の上記の方法は、これらの疾患または状態に罹患した患者に、Ｅｒｋ５の発現もしくはＥｒｋ５の活性のいずれかを阻害する分子または薬学的に受容可能なその塩と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的に受容可能な組成物を投与する工程を包含する。このような分子としては、Ｅｒｋ５またはそのエピトープに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、Ｅｒｋ５　ＤＮＡに特異的にハイブリダイズして機能的Ｅｒｋ５　ｍＲＮＡの転写を阻止するオリゴヌクレオチド、Ｅｒｋ５　ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズしてＥｒｋ５の発現を阻止するオリゴヌクレオチド；Ｅｒｋ５　ｍＲＮＡを特異的に切断するリボザイム様分子；ならびにＥｒｋ５の低分子インヒビターまたは低分子アンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」は、ヒトを含む任意の動物をいう。
【００２６】
インヒビターをスクリーニングするために、Ｅｒｋ５のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、ならびに単離されたＥｒｋ５を利用する方法が既知である、上記の（ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでの）種々のＥｒｋ５インヒビターの同定および／または作製は、十分に当業者の範囲内である。
【００２７】
例えば、本発明の方法において使用される抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルであり得るか、あるいはその抗体の結合フラグメントまたはヒト化抗体もしくはフラグメントを単に含み得る。これらの抗体は、インタクトな野生型Ｅｒｋ５に対して、ならびにＥｒｋ５のフラグメントに対して、惹起され得る。ヒト化抗体は、当該分野において周知の手順の１つ（例えば、キメラ化またはＣＤＲグラフティング）を使用して生成され得る。好ましくは、抗体またはその結合フラグメントは、Ｅｒｋ５に結合するが、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、Ｅｒｋ３、Ｅｒｋ４またはＥｒｋ７のいずれにも結合しない。
【００２８】
モノクローナル抗体を調製するための技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；およびＳｔ．Ｇｒｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，ｐｐ．１−２１（１９８０）を参照のこと）。免疫された動物由来の脾細胞は、取り出され、そして骨髄腫細胞と融合されてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成する。所望の特徴を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング分析または放射免疫アッセイのような標準的技術を介して達成される。次いで、選択されたハイブリドーマ細胞は、クローニングされ、そしてそれによって産生されたモノクローナル抗体のクラスおよびサブクラスは、Ｃａｍｐｂｅｌｌ（上述）に示される手順を使用して決定される。
【００２９】
ポリクローナル抗体を生成するための技術はまた、当該分野において周知である。任意の動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジなど）は、Ｅｒｋ５またはそのフラグメントで免疫化され得、そして本発明において有用な抗体を産生する。免疫化に続いて、抗血清が、Ｅｒｋ５特異的抗体の存在および力価を決定するために、種々の時点で免疫化された動物から単離される。特に、クラスおよびサブクラスの分類は、上記のように決定される。
【００３０】
本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドまたは上記の任意の組み合わせからなり得る。このようなオリゴヌクレオチドは、Ｅｒｋ５遺伝子またはそれから転写されたｍＲＮＡ中に存在する配列に相補的である。好ましくは、本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドは、Ｅｒｋ５中に存在するヌクレオチド配列に１００％相補性を有する。しかし、１００％未満の相補性であるオリゴヌクレオチド配列もまた、Ｅｒｋ５　ＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的に結合する（そして生理学的条件下で非Ｅｒｋ５　ＤＮＡまたはｍＲＮＡに対して有意な非特異的な結合を示さない）オリゴヌクレオチドでありかつＤＮＡまたはｍＲＮＡの正常な機能を干渉して有用性の欠如を引き起こすオリゴヌクレオチドである限り使用され得る。
【００３１】
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されないＥｒｋ５　ＤＮＡまたはｍＲＮＡの任意の部分を標的化し得る：遺伝子またはｍＲＮＡの５’非翻訳領域、遺伝子の調節領域、遺伝子のプロモーター領域、遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドン、遺伝子中に存在するイントロン、遺伝子またはｍＲＮＡのコード配列の任意の部分、遺伝子またはｍＲＮＡの終止コドン、または遺伝子またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域。本発明において利用されるオリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチドより長い任意の長さであり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約８塩基長と約３０塩基長との間である。改変された塩基を含むものは、本発明において有用なオリゴヌクレオチドの範囲内である。このような改変は、当該分野において周知であり、そしてＷＯ００／３１２９６およびその中に列挙される参考文献中に開示される。
【００３２】
リボザイムは、ＲＮＡ中の特定部位で切断する酵素的ＲＮＡ分子である。Ｅｒｋ５　ｍＲＮＡの切断に特異的なリボザイムは、ＷＯ９３／２３５６９に示されるような周知の方法に従って設計され得る。
【００３３】
Ｅｒｋ５の低分子インヒビターは、ＷＯ９４／２１７８１に開示される方法のいずれかによって同定され得る。あるいは、Ｙ．Ｋａｔｏら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，１６，ｐｐ．７０５４−６６（１９９７）（その開示が本明細書中に参考として援用される）に開示されるような、Ｅｒｋ５についてのインビトロキナーゼアッセイがセットアップされ得る。このようなアッセイは、Ｅｒｋ５活性を阻害する化合物を同定することをもくろんで、コンビナトリアルライブラリーまたは他の化学的ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００３４】
これらの薬学的組成物中に使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝化物質（例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム）、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、糖（例えば、乳糖、蔗糖、マンニトール、シクロデキストリンおよびその誘導体）ならびに羊毛脂。
【００３５】
記載された化合物の薬学的に受容可能な塩が使用される場合、これらの塩は、好ましくは、無機または有機の酸または塩基由来である。このような酸の塩としては、以下が挙げられる：アセテート、アジペート、アルギネート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、重炭酸塩、ブチレート、シトレート、カンホレート（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンファースルホネート（ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルスルホネート、エタンスルホネート、フマレート、グルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホネート、ラクテート、マレアート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、オキザレート、パルモエート、ペクチネート、ペルスルフェート、３−フェニル−プロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、スクシネート、タータレート、チオシアネート、トシレートおよびウンデカノエート。塩基の塩としては、以下が挙げられる：アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩およびカルシウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ならびにアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン）との塩など。また、塩基性窒素含有基は、以下のような因子で四級化され得る：低級ハロゲン化アルキル（例えば、塩化メチル、臭化メチル、ヨウ化メチル、塩化エチル、臭化エチル、ヨウ化エチル、塩化プロピル、臭化プロピル、ヨウ化プロピル、塩化ブチル、臭化ブチルおよびヨウ化ブチル）；硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチルおよび硫酸ジアミル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化デシル、塩化ラウリル、塩化ミリスチル、塩化ステアリル、臭化デシル、臭化ラウリル、臭化ミリスチル、臭化ステアリル、ヨウ化デシル、ヨウ化ラウリル、ヨウ化ミリスチルおよびヨウ化ステアリル）、ハロゲン化アラルキル（例えば、臭化ベンジルおよび臭化フェネチル（ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）など。水または油に可溶性または分散可能な生成物は、これによって得られる。
【００３６】
本発明の方法において利用される滅菌した注入可能な形態の組成物は、水性懸濁物または油性懸濁物であり得る。これらの懸濁物は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する当該分野において公知の技術に従って、処方され得る。滅菌した注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口に受容可能な希釈剤または溶媒中の、滅菌した注入可能な溶液または懸濁物（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。特に、使用される受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無味の不揮発性油が、使用される。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、特にこれらのポリオキシエチレート型において天然の薬学的に受容可能な油（オリーブ油またはヒマシ油）と同様に、注入可能物の調製に有用である。これらの油調製物または懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈物または分散物（例えば、Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似のアルコール）を含み得る。また、シクロデキストリンおよびこれらの誘導体、ならびにはリン脂質は、安定性を増加するために使用され得る。
【００３７】
本発明の方法において使用される薬学的組成物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない、任意の経口的に受容可能な形態で経口的に投与され得る：カプセル、錠剤、水性懸濁物または水性溶液。経口的使用のための錠剤の場合、一般的に使用されるキャリアとしては、乳糖、コーンスターチ、セルロースおよびセルロース誘導体が挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、代表的に添加される。カプセル形態での経口投与について、有用な希釈剤としては、乳糖、乾燥コーンスターチ、セルロースおよびセルロース誘導体が挙げられる。水性懸濁物が経口的使用に必要とされる場合、活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組合わせられる。所望される場合、特定の甘味剤、香味料または着色料もまた、添加され得る。
【００３８】
あるいは、本発明の方法において使用され得る薬学的組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。これらは、室温で固体であるが直腸温では液体でありよって直腸で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と、薬剤とを混合することによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３９】
本発明の方法において使用される薬学的組成物はまた、局所的に投与され得、これは、特に、処置の標的が局所適用によって容易にアクセス可能である領域または器官を含む場合であり、これらは、眼、皮膚または下行腸路の疾患を含む。適切な局所処方物は、これらの領域または器官の各々について容易に調製される。
【００４０】
下行腸路について局所適用は、直腸坐剤処方物（上記を参照のこと）においてかまたは適切な浣腸処方物においてもたらされ得る。局所的な経皮パッチもまた、使用され得る。
【００４１】
局所適用について、薬学的組成物は、活性成分を含有する適切な軟膏において処方され得、その活性成分は、１以上のキャリア中に溶解または懸濁されている。本発明において使用されるＥＲＫ５インヒビターの局所投与のためのキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。あるいは、薬学的組成物は、１以上の薬学的に受容可能なキャリアに懸濁または溶解された活性成分を含有する、適切なローション剤またはクリームにおいて処方され得る。適切なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鉱油、ソルビタンモノステアリン酸、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリール（ｃｅｔｅａｒｙｌ）アルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【００４２】
眼の使用について、薬学的組成物は、等張性のｐＨ調整した滅菌生理食塩水中の微粉化した懸濁物として、好ましくは、塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙａｌｋｏｎｉｕｍ）のような防腐剤のありなしいずれかで、等張性のｐＨ調整した滅菌生理食塩水中の溶液として処方され得る。あるいは、眼の使用について、薬学的組成物は、ワセリンのような軟膏において処方され得る。
【００４３】
本発明の方法において使用される薬学的組成物はまた、鼻のエアロゾルまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、薬学的処方物の分野において周知の技術に従って調製され、そして、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収プロモーター、フッ化炭素、および／または他の慣用的可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中に溶液として調製され得る。
【００４４】
処置または予防されるべき特定の状態、または疾患に依存して、この状態または疾患を処置または予防するための単一治療として通常には投与される１以上のさらなる治療剤は、本発明の方法において利用されるＥＲＫ５阻害性薬学的組成物を受ける患者に投与され得る。さらなる薬剤は、複数の投薬レジメンの一部としてＥＲＫ５インヒビター含有組成物とは別々に投与され得る。複数の投薬レジメン形態において、さらなる薬剤は、ＥＲＫ５インヒビターと同時にか、またはＥＲＫ５インヒビター含有組成物の投与前もしくは投与後のある時期において投与され得る。あるいは、さらなる薬剤は、単一投薬形態の一部であり得、ＥＲＫ５インヒビターとともに単一の組成物中に混合され得る。
【００４５】
例えば、化学療法剤または他の抗増殖剤を、ＥＲＫ５インヒビターとともに投与して、増殖性疾患および癌を処置し得る。公知の化学療法剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アドリアマイシン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、タキソール、インターフェロン、および白金誘導体。
【００４６】
ＥＲＫ５インヒビターとともに投与され得る薬剤の他の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、ＴＮＦブロッカー、ＩＬ−１　ＲＡ、アザチオプリン、シクロホスファミドおよびスルファサラジン；免疫調節剤ならびに免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル（ｍｏｆｅｔｉｌ）、インターフェロン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリンおよびスルファサラジン）；神経栄養因子（例えば、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、ＭＡＯインヒビター、インターフェロン、抗痙攣薬、イオンチャネルブロッカー、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、および抗パーキンソン症候群の薬剤；心血管疾患を処置するための薬剤（例えば、β−ブロッカー、ＡＣＥインヒビター、利尿剤、ニトレート、カルシウムチャネルブロッカーおよびスタチン；肝疾患を処置するための薬剤（例えば、コルチコステロイド、コレスチラミン、インターフェロンおよび抗ウイルス剤）；血液障害を処置するための薬剤（例えば、コルチコステロイド、抗白血病剤および増殖因子）；糖尿病を処置するための薬剤（例えば、インスリン、インスリンアナログ、αグルコシダーゼインヒビター、ビグアナイドおよびインスリン増感剤）；ならびに免疫欠損障害を処置するための薬剤（例えば、γグロブリン）。
【００４７】
他の実施形態に従って、本発明は、新脈管形成の必要のある患者において新脈管形成を増加させるための方法を提供する。好ましくは、この患者は、Ｅｒｋ５遺伝子の過小発現またはＥｒｋ５遺伝子における変異に起因する増加した新脈管形成、減少したネイティブなＥｒｋ５　ｍＲＮＡ安定性、減少したネイティブなＥｒｋ５タンパク質安定性および／または減少したネイティブなＥｒｋ５タンパク質活性を必要とする。このような方法は、機能的Ｅｒｋ５タンパク質の増加した発現を引き起こす化学物質（ｅｎｔｉｔｙ）をこの患者に投与する工程を包含する。このような化学物質としては、以下が挙げられる：Ｅｒｋ５コード配列を含むＤＮＡ配列、Ｅｒｋ５遺伝子に標的化され得るプロモーターをコードするＤＮＡ配列、Ｅｒｋ５の特定の標的化および増加した発現を可能にするＤＮＡ配列（例えば、その開示が本明細書中に参考として援用される米国特許第６，０６３，６３０号に記載される）；Ｅｒｋ５プロモーターとの転写活性化ドメインのリガンド依存性結合および解離を可能にしてＥｒｋ５の発現を増加する、ホモ二量体またはヘテロ二量体化合成リガンド（例えば、その開示が本明細書中に参考として援用される、Ｓ．Ｎ．Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３８２，ｐｐ．８２２−２６（１９９６）に記載される）。
【００４８】
機能的Ｅｒｋ５タンパク質の発現を増加する化学物質の、患者への首尾よい投与は、周知の遺伝子治療技術および送達システムのいずれかを使用することによって達成され得る。
【００４９】
上記の方法は、以下の処置に有用である：糖尿病性神経障害性潰瘍；創傷；他の潰瘍（例えば、皮膚および消化器官の潰瘍）；肢の虚血（例えば、線維筋性形成異常、閉塞性血栓血管炎（バーガー病）、脈管炎、急性動脈閉塞、アテローム塞栓症、レーノー現象もしくはレーノー病；発作；骨折；歯周症；痴呆；頭部損傷または外傷；脱毛；火傷；アテローム硬化症；ならびに、側副血管形成を増加するための心臓バイパス手術の間。
【００５０】
好ましくは、遺伝子治療法を使用して、糖尿病性神経障害性潰瘍、創傷、他の潰瘍を処置する。
【００５１】
本発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみの目的であり、決して本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００５２】
（実施例１：Ｅｒｋ５欠損マウスの作製）
以下のＥｒｋ５特異的プライマー対を使用して、単離されたマウスゲノムＤＮＡをプローブした：５’−ＣＡＧＣＣＡＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＣＡＣＧＣＴＡ−３’（配列番号１）および５’−ＴＡＴＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＧＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番号２）。
【００５３】
上記のプライマーを使用して、１．４ｋｂ　ＰＣＲ産物をクローニングした。この産物の一部の５’（配列番号３）および３’（配列番号４）の配列決定は、１．２ｋｂ　イントロン（イントロン２）によって隔てられた、予想したｃＤＮＡセグメント（エクソン２およびエクソン３）（配列番号３のヌクレオチド１〜３８；および配列番号４の５４７〜７９４）の存在を確認した。
【００５４】
生じたＰＣＲ産物を放射標識し、そしてファージλ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡより得た）中のマウスゲノムＤＮＡライブラリー（１２９／ＳＶ系統）をスクリーニングするために使用した。この手順により、１６ｋｂ　Ｅｒｋ５挿入物を含むクローンを得た。次いで、ファージクローンを、制限酵素分析に供した。生じた制限マップおよび引き続く配列決定分析は、４．６ｋｂのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントおよび４．５ｋｂ　ＳａｃＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントがエクソン２の一部およびエクソン３の一部を含むことを示した。
【００５５】
次いで、これら２つのフラグメントを、ファージクローンから生成し、そしてそれぞれＦｓｅＩリンカーおよびＡｓｃＩリンカーに連結した。４．６ｋｂ　ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（配列番号６）を、ベクターｐＵＸ／Ｎｅｏ／ＴｋのＦｓｅＩ部位にサブクローニングした；このベクターは、ｎｅｏ遺伝子およびｔｋ遺伝子を含む。４．５ｋｂ　ＳａｃＩ−ＡｖｒＩＩフラグメントを、同一ベクターのＡｃｓＩ部位に挿入して、Ｅｒｋ５遺伝子に対する遺伝子標的化ベクターの構築を完了した。標的化遺伝子とこのベクターとの間の相同組換えは、エクソン２およびエクソン３の一部の欠失、ならびにＥｒｋ５遺伝子のイントロン２全体の欠失が生じることを予想させた。
【００５６】
ＴＣ１胚性幹（「ＥＳ」）細胞（Ｈａｒｖａｒｄ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＰｈｉｌｉｐ　Ｌｅｄｅｒより得た）を、エレクトロポレーションによって２５μｇの線状化した標的化ベクターで形質転換し、そしてＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびガンシクロビル（登録商標）を用いる薬物選択に供した。両方の薬物に対して耐性であるＥＳ細胞クローン由来のゲノムＤＮＡを、慣用的ＤＮＡ単離技術によって単離し、そしてＸｈｏＩで消化した。ゲル電気泳動の後に、ＤＮＡを、ナイロンフィルターに転写した。次いで、このフィルターを、ゲノムファージクローン（配列番号５（部分配列））の３’末端から単離した、放射標識した２ｋｂのＸｂａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを用いるサザンハイブリダイゼーションに供した。
【００５７】
１０ｋｂの野生型バンドまたは６ｋｂ変異体バンドのいずれかを、プローブによって検出した。２５０個のコロニー中、５つを、サザン分析によって、所望の相同組換え事象が行われたことを見出し、そしてこれらのうち２つ（＃１２５クローンおよび＃１４５クローン）を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、２つのマウス系統を作製した。
【００５８】
（実施例２：Ｅｒｋ−５ノックアウトマウスの遺伝子型分析）
変異についてのマウスヘテロ接合性は、表現型として正常であった。Ｅｒｋ５ヘテロ接合性マウスの異種交配は、出生するまでに生存したホモ接合性マウスを全く作製しなかった（表１）。
【００５９】
（表１：ヘテロ接合性育種により作製された成体マウスの遺伝子型）
【００６０】
【表１】
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さらなる分析は、ホモ接合性変異体胚がＥ９．５で死に始め、そしてＥ１２．５で完全に吸収されたことを示した（表２）。胚外の組織を含むホモ接合性胚は、これらの段階で薄く見えた。
【００６１】
（表２：種々のＥｒｋ５遺伝子型を有するマウスの胚の生存期間）
【００６２】
【表２−１】
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【００６３】
【表２−２】
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（実施例３：Ｅｒｋ５ノックアウトマウスの表現型分析）
（Ａ．胚卵黄嚢（Ｙｏｌｋ　Ｓａｃ）に対する効果）
正常マウス胚の卵黄嚢は、脈管形成の初期徴候を示す。しかし、Ｅｒｋ５変異体胚は、胚年齢（Ｅ）９．５での卵黄嚢脈管構造の顕著な欠失を示した。さらに、造血細胞を含む血島を、組織学的分析によって、野生型の胚で認識したが、変異体卵黄嚢では認識しなかった。
【００６４】
（Ｂ．胚発達に対する効果）
Ｅ１０．５変異体胚は、胚の成長を支持する新脈管形成の欠失に起因して、発生における全体的遅延を示した。
【００６５】
（Ｃ．胎盤および脈管複雑性に対する効果）
胚外組織における異常が胚性致死の原因であるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｅ１０．５胚の胎盤を試験した。変異体の迷路性領域は、非常に緻密であるようであり、そして胚の血管をほとんど有さなかった。さらに、野生型のものよりもＥｒｋ５−／−胎盤において母からの血管と胚の血管とがほとんど混ざりあわなかった。野生型の胎盤において、迷路性トロホブラストおよび血管内皮細胞は、混ざり合ったが、Ｅｒｋ５−／−胎盤においては、血管内皮細胞はほとんど漿尿膜領域に制限された。血管内皮細胞は、Ｅｒｋ５−／−胚に存在したが、迷路性領域を効率的に浸入し得ないようであった。このことは、新脈管形成における欠損を示唆する。内皮性マーカー（ＰＥＣＡＭ）に対する抗体で染色することによって示されるように、血管の複雑性（特に頭部領域での毛細血管において）は、野生型のものよりも変異体胚において非常に単純であった。従って、Ｅｒｋ５発現の欠損は、発生における新脈管形成プロセスに影響した。
【００６６】
（Ｄ．胚の心血管系に対する効果）
胚の心血管系は、発生する第一の器官系であり、そしてＥ９．５を超える胎生生存に重要となる（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＯｌｓｅｎ，２０００）。線状の心臓管段階（Ｅ８．０）において、Ｅｒｋ５−／−の心臓は、表現型的および組織学的の両方で正常なようである。しかし、Ｅ９．５では、顕微鏡分析は、変異体の心臓が正常な右方向へのループ化を行うことに失敗したことを示した。さらに、変異体の胚における心臓周囲の流体蓄積が存在した。このことは、正常な卵黄嚢脈管構造の不全を反映する。これらの観察はまた、引き続く組織学的分析によって確認された。変異体心臓において将来右心室になる形跡は存在しなかったが、正常な心臓は、将来の左心室および右心室についての境界をはっきりと有した。さらに、心臓周囲における大きな空間は、Ｅｒｋ５−／−胚において顕著であった。この段階で、胚の心臓は、内部心筋に沿って、最終的に肉柱を形成する指様の隆起を発達させた。５３Ｋｄａの中間径フィラメントタンパク質であるデスミンの免疫組織学染色は、筋細胞に豊富にあり、これは、野生型心臓においてよく組織化した肉柱を示した。対照的に、変異体心臓の壁は、正常よりも薄く、そして肉柱化は、明白ではなかった。これらの結果は、初期心臓発生におけるＥｒｋ５の必須の役割を示した。
【００６７】
（実施例４：胚組織および成体組織中のＥｒｋ５の発現）
Ｅｒｋ５の発現は、初めは細胞株で研究されていた（Ａｂｅら、１９９６）。発達する胎児の組織および成体の組織におけるＥｒｋ５の発現パターンは、報告されていなかった。従って、本発明者らは、マウス胚の組織および成体の組織の両方におけるノーザンブロット分析、ならびに胚におけるインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。
【００６８】
（Ａ．方法）
マウスの複数の組織および胚の複数の組織のノーザンブロット膜を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ＥＳＴクローン（Ｗ９８５０７）を使用して、そのフラグメントの５’および３’にそれぞれ付加されたＴ７プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列を有する、＃６７８〜＃８５５のアミノ酸配列に対応するＥｒｋ５の５３０ｂｐフラグメントをＰＣＲ増幅した。Ｅｒｋ５　ｃＤＮＡクローンの両鎖を、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼおよびＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼの使用によって別々に転写し、そしてそのｍＲＮＡ配列に非相補的である産物を、ネガティブコントロールにおけるプローブとして使用した。ハイブリダイゼーションを、製造業者による手引書に従って実施した。同一の膜は、Ｅｒｋ５プローブをはがし、そして製造業者によって提供されるβ−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
【００６９】
インサイチュハイブリダイゼーションによるＥｒｋ５メッセージの検出を、Ｔ３／Ｔ７インビトロ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）の使用によって調製された３５Ｓ−Ｕ標識化ＲＮＡプローブを用いて、Ｓｉｍｍｏｎｓら（１９８９）に従って実施した。ＲＮＡプローブの調製のためのＥｒｋ５　ｃＤＮＡクローンの供給源は、ノーザンブロット分析に使用されるものと同一であった。ハイブリダイゼーションは、記載されるように６５℃で一晩であった。
【００７０】
（Ｂ．結果）
放射標識されたＥｒｋ５プローブを使用する種々の成体マウスの組織のノーザンブロット分析は、３．２ｋｂの単一の転写物の遍存を示す。この転写物は低レベルで成体組織に見られたが、ｅｒｋ５の発現は、種々の発生段階で高かった。アンチセンスＥｒｋ５　ＲＮＡで最初にプローブした後に、このブロットを洗浄し、そしてＲＮＡロードの均一性を示すために、β−アクチンで再度ハイブリダイズした。
【００７１】
アンチセンスＥｒｋ５　ＲＮＡプローブの特異性を、任意の検出可能なシグナルを示さないセンスＥｒｋ５　ＲＮＡを用いる、両方のブロットのハイブリダイゼーションによって確認した。Ｅ９．５胚において、アンチセンスＥｒｋ５　ＲＮＡプローブでのインサイチュハイブリダイゼーションは、Ｅｒｋ５転写物が心臓、および発達する脈管構造に隣接する間葉において最高のレベルで発現されたことを示した。Ｅｒｋ５の血管発現は、共通の主静脈の壁、発達する鰓弓および心流出路において特に明らかであった。Ｅｒｋ５の発現はまた、この段階で胚外組織において、胎盤において著しく明らかであった。最高の発現は、絨毛膜、および栄養膜円錐（ｅｃ）中の二倍体トロホブラストにおいて見られた。ｅｃ領域を取り囲むトロホブラスト巨細胞においてもまた発現があった。これらのデータは、ｅｒｋ５の発現が発生における心血管系に主に限局されることを示した。このことは、血管発生におけるその重要な役割を示唆する。
【００７２】
新脈管形成におけるＥｒｋ５の役割は、驚くべきことでありかつ予想外であった。Ｅｒｋ５の以前の記述は、このタンパク質がストレスにおいて役割を担い、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）によって活性されることを示唆した。Ｅｒｋ５が内皮細胞発生または新脈管形成について何かしら応答可能であることは示唆されていなかった。
【００７３】
本発明者らは本発明の多くの実施形態を記載してきたが、本発明者らの基本的構築物を変更して本発明の生産物、プロセスおよび方法を利用する他の実施形態を提供し得ることは、明らかである。従って、本発明の範囲は、例示の目的で示されている特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきであることが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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