(57)【要約】本発明は、エロンガーゼ遺伝子、それらのポリペプチドおよびそれらの制御領域、ならびに疾患の治療に使用する組成物を決定する際のそのような遺伝子、ポリペプチドおよび制御領域の使用に関する。特定された組成物は、エロンガーゼ遺伝子の発現を制御するか、またはそれらのタンパク質産物の活性を調節する。ＥＬＧ４、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が教示される。ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７の制御配列および機能が教示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４を含む配列と、
（ｂ）配列番号８を含む配列と、
（ｃ）配列番号１１を含む配列と、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｈ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、
（ｉ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｈ）のいずれかとハイブリッド形成する配列とからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ｃＤＮＡである請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
適切なベクター中に請求項１に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列と異種である宿主細胞中に該配列を含む宿主細胞。
【請求項５】
（ａ）請求項１に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を有する配列と、
（ｂ）請求項１に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも３０個の連続した塩基を有する配列と、
（ｃ）請求項１に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも５０個の連続した塩基を有する配列とからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項６】
前記配列と異種であるベクターに含まれた請求項５に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
タグを含むか、またはコードする請求項３または６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保持している、または請求項１に記載のポリヌクレオチドの機能的誘導体であるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記配列を有する対照動物と前記配列を有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を１つの化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記配列の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１０】
前記動物が哺乳類である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類がラットである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列の産物または前記配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項１４】
（ａ）配列番号５を含む配列と、
（ｂ）配列番号９を含む配列と、
（ｃ）配列番号１２を含む配列と、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｈ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列とからなる群から選択される単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【請求項１５】
前記配列と異種である宿主細胞中に請求項１４に記載のポリペプチド配列を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリペプチド配列の生産に十分な条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程からなる、前記ポリペプチドを生産する方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド配列。
【請求項１８】
請求項１４に記載のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記配列を有する対照動物と前記配列を有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記配列の発現産物または前記配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項１９】
前記動物が哺乳類である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類がラットである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列の発現産物または前記配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列の産物または前記配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１を含む配列と、
（ｂ）配列番号２を含む配列と、
（ｃ）配列番号３を含む配列と、
（ｄ）配列番号６を含む配列と、
（ｅ）配列番号７を含む配列と、
（ｆ）配列番号１０を含む配列と、
（ｇ）配列番号１３を含む配列と、
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｉ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｊ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｋ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｌ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、
（ｍ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｌ）のいずれかとハイブリッド形成する配列とからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ゲノムＤＮＡである請求項２３に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項２５】
適切なベクター中に請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２６】
前記配列と異種である宿主細胞中に請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列に作動可能なように連結される遺伝子によりコードされるポリペプチドの生産に十分な条件下で、請求項２６に記載の宿主細胞を培養する工程からなる、前記ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項２３に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を有する配列と、
（ｂ）請求項２３に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも３０個の連続する塩基を有する配列と、
（ｃ）請求項２３に記載の配列のヌクレオチドの少なくとも５０個の連続する塩基を有する配列とからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２９】
前記配列と異種であるベクターに含まれる請求項２８に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３０】
請求項２３に記載の配列とほぼ同じ生物学的機能または活性を有するか、請求項２３に記載の配列の機能的誘導体であるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３１】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記配列を有する対照動物と前記配列を有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記配列に作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３２】
前記動物が哺乳類である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳類がラットである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列に作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記配列に作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３６】
請求項１，１４または２３に記載の配列を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、ＰＵＦＡ障害を治療するための組成物。
【請求項３７】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記化合物が小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項３６に記載の組成物の使用。
【請求項４０】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４１に記載の使用。
【請求項４１】
対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を、該対象における請求項１または２３に記載の配列中の生殖細胞系列における変化を検出することにより診断する方法であって、前記対象の組織試料における請求項１または２３に記載の配列の生殖細胞系列の配列を該配列の野生型の生殖細胞系列の配列と比較することからなり、前記対象の生殖細胞系列の配列における変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法。
【請求項４２】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４１に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項４３】
前記比較が、免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、放射免疫検定法、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項４１〜４２に記載の方法。
【請求項４４】
対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、該対象の組織試料における請求項１４に記載のポリペプチドの配列を前記ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、前記野生型と比較したときの前記対象の配列の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法。
【請求項４５】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４４に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項４６】
前記比較が、ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、放射免疫検定法、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法およびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項４４〜４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを有する対照動物と前記ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項４８】
前記動物が哺乳類である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳類がラットである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項５１】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの産物または前記ポリヌクレオチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５２】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを有する対照動物と前記ポリペプチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ポリペプチドの発現産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５３】
前記動物が哺乳類である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類がラットである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリペプチドの発現産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５６】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリペプチドの産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５７】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを有する対照動物と前記ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項５８】
前記動物が哺乳類である請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記哺乳類がラットである請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項６１】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項６２】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列由来のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、ＰＵＦＡ障害を治療するための組成物。
【請求項６３】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、ＰＵＦＡ障害を治療するための組成物。
【請求項６４】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される制御領域由来のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、ＰＵＦＡ障害を治療するための組成物。
【請求項６５】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記化合物が小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６８】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
対象におけるＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列を表すポリヌクレオチド内の生殖細胞系列における変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料における前記ポリヌクレオチドの生殖細胞系列の配列を前記配列の野生型の生殖細胞系列の配列と比較することからなり、前記対象の生殖細胞系列の配列における変化が前記ＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法。
【請求項７０】
対象におけるＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，およびＥＬＧ５からなる群から選択される制御領域を表すポリヌクレオチド内の生殖細胞系列における変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料における前記ポリヌクレオチドの生殖細胞系列の配列を前記配列の野生型の生殖細胞系列の配列と比較することからなり、前記対象の生殖細胞系列の配列における変化が前記ＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法。
【請求項７１】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項６９〜７０のいずれか１項に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項７２】
前記比較が、免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、放射免疫検定法、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項６９〜７１に記載の方法。
【請求項７３】
対象におけるＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの配列を前記ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、前記野生型と比較したときの前記対象の配列の変化が前記ＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項７４】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項７３に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項７５】
前記比較が、免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、放射免疫検定法、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法およびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項７３〜７４に記載の方法。
【請求項７６】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される２つまたはそれ以上の異なる遺伝子の制御領域である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの全活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項７７】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリヌクレオチドの制御領域由来の２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの全活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項７８】
核酸配列の発現を開始、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結される、ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドと異種である、前記ポリヌクレオチドを有する宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項７９】
核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結される、ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または前記宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項８０】
同じ宿主系内の哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素およびＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結される、哺乳類δ−５−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素をコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、
（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、
（ｃ）δ−５−デサチュラーゼ酵素およびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−５−デサチュラーゼおよびエロンガーゼの少なくともいずれかの酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、
（ｄ）前記能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法。
【請求項８１】
同じ宿主系内の哺乳類δ−６−デサチュラーゼ酵素およびＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、哺乳類δ−６−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素をコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、
（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、
（ｃ）δ−６−デサチュラーゼ酵素およびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−６−デサチュラーゼおよびエロンガーゼの少なくとも一方の酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、
（ｄ）前記能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法。
【請求項８２】
同じ宿主系内の哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼ酵素と、ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素との少なくとも一方の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整するのに有効であるプロモーター領域と作動可能なように連結された哺乳類δ−５−デサチュラーゼ、哺乳類δ−６−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素を同時にコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、
（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、
（ｃ）δ−５−デサチュラーゼ、δ−６−デサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−５およびδ−６の少なくとも一方のデサチュラーゼと、エロンガーゼ酵素との少なくとも一方の活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、
（ｄ）前記能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法。
【請求項８３】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６，ＥＬＧ７，δ−５−デサチュラーゼ、δ−６−デサチュラーゼからなる群から選択される制御領域由来の１つまたは複数のヒトポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物。
【請求項８４】
前記化合物が小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項８４に記載の組成物の使用。
【請求項８６】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項８５に記載の使用。
【請求項８７】
対象におけるＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６，ＥＬＧ７，δ−５−デサチュラーゼ、δ−６−デサチュラーゼからなる群から選択される遺伝子の２つ以上の発現産物の発現のレベルを、予備測定した対照の発現レベルを基準として測定することからなり、前記対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す、ＰＵＦＡ障害の存在または素因を検出する方法。
【請求項８８】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、放射免疫検定法、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される請求項８７〜８８に記載の方法。
【請求項９０】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはその免疫原性の部分に対して免疫反応性の抗体。
【請求項９１】
ＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６，ＥＬＧ７またはそれらの免疫原性の部分からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチドに対して免疫反応性を有する抗体。
【請求項９２】
請求項１４に記載のエロンガーゼポリペプチドまたはＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチド用の媒体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項９０〜９１のいずれか１項に記載の抗体をマーカー分子で標識して結合体を形成させることと、
（ｂ）前記結合体を前記媒体に曝露させることと、
（ｃ）前記結合体と前記媒体中の生体分子との間に、前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することと、からなる方法。
【請求項９３】
請求項１４に記載のエロンガーゼポリペプチドまたはＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３，ＥＬＧ４，ＥＬＧ５，ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチド用の媒体をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項９１〜９２に記載の抗体を前記媒体に曝露させることと、
（ｂ）前記抗体をマーカー分子に曝露させることと、
（ｃ）前記マーカー分子と前記媒体中の生体分子との間に、前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することと、からなる方法。
【請求項９４】
前記化合物が請求項９０に記載の群から選択される請求項３６に記載の組成物。
【請求項９５】
前記化合物がＥＬＧ１，ＥＬＧ２，ＥＬＧ３およびＥＬＧ５に対する抗体からなる群から選択される請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９６】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項９４〜９５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９７】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項９６に記載の使用。
【請求項９８】
請求項９〜１３，１８〜２２，３１〜３５，４７〜６１または７６〜８２のいずれか１項に記載の方法により特定される化合物。
【請求項９９】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項９８に記載の化合物の使用。
【請求項１００】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される、請求項９９に記載の使用。
【請求項１０１】
対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について野生型と比較したときの変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項１０２】
対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について以前の試料と比較したときの変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の発生を監視する方法。
【請求項１０３】
対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について以前の試料と比較したときの変化を評価することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害に対する試験化合物の有効性を評価する方法。
【請求項１０４】
湿疹、心血管障害、炎症、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される疾患の治療のためのペブレートスルホキシドの使用。
【請求項１０５】
ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）選択されたポリペプチドの生物学的活性を測定する検定法を準備する工程と、（ｂ）該検定の化合物により処理する工程と、（ｃ）選択されたポリペプチドの生物学的活性の変化を確認する工程とからなり、処理した検定と対照の検定との差により該化合物が該ポリペプチドのモジュレーターとして特定される方法。
【請求項１０６】
選択されたポリペプチドが、精製タンパク質の検定、再構成タンパク質の検定、細胞抽出物の検定および細胞全体の検定から選択される検定方式に供される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項３７および６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０８】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項４０，６８，８６，９７，１００および１０４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０９】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項４２，４５，７１，７４および８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項３７および６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１１】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項４０，６８，８６，９７，１００および１０４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１２】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項４２，４５，７１，７４および８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項３７および６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１４】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項４０，６８，８６，９７，１００および１０４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１５】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項４２，４５，７１，７４および８８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、脂質代謝に関与する脂肪酸エロンガーゼ酵素の活性を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する、またはエロンガーゼ遺伝子の発現レベルを効果的に調整する化合物の特定、およびそのように特定された化合物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、細胞膜のような広範囲の生体成分に多くの構造特性および機能特性を与えるリン脂質やリポタンパク質などの脂質化合物および複合体の主要な成分である。ＰＵＦＡは、組織の適正な発生、維持および修復に必須である。ＰＵＦＡの他の生物学的機能には、いくつかの遺伝子の発現への関与、重要な生理学的機能を調節する生物学的に活性な代謝物への変換における前駆体分子としての役割が含まれる。したがって、ＰＵＦＡの欠乏あるいはレベルの不均衡は、特定の病理学的状態に帰せられている。
【０００３】
図１、２および３に、それぞれｎ−３、ｎ−６およびｎ−９／ｎ−７　ＰＵＦＡファミリーにおける長鎖脂肪酸の生産に必要な不飽和化段階および伸長段階を示す。脂肪酸鎖伸長系は肝臓、脳、腎臓、肺、副腎、網膜、精巣、小腸および血球、すなわち白血球に見いだされている（シンチら（Ｃｉｎｔｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第３１巻、１〜５１ページ）。
【０００４】
エロンガーゼ遺伝子は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ジェームスら（Ｊａｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、第７巻、３０９〜３１９ページ）およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（国際公開第００／５５３３０号、２０００年９月、ナピヤー　ジェー　エー（Ｎａｐｉｅｒ　Ｊ．Ａ．））において同定された。３つの異なるエロンガーゼ遺伝子、すなわちＥＬＯ１、ＥＬＯ２およびＥＬＯ３が出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から同定された。ＥＬＯ１はミリスチン酸をパルミチン酸に伸長し（トーケ　ディー　エーおよびマーチン　シー　イー（Ｔｏｋｅ　Ｄ．Ａ．ａｎｄ　Ｍａｒｔｉｎ　Ｃ．Ｅ．）、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、１８４１３〜１８４２２ページ）、一方、ＥＬＯ２およびＥＬＯ３は長鎖飽和脂肪酸を伸長する（オーら（Ｏｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、１７３７６〜１７３８４ページ）。
【０００５】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の欠乏は、湿疹、心血管障害、炎症、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群および糖尿病のような多くの疾患に関連づけられている（ホロビン　ディー　エフ（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ　Ｄ．Ｆ．）［編］、１９９０年、Ｏｍｅｇａ−６　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ワイリーリス出版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）［ニューヨーク州］ならびにマッザ　ジーおよびドマー　ビー　ディー（Ｍａｚｚａ　Ｇ．ａｎｄ　Ｄｏｍａｈ　Ｂ．Ｄ．）［編］、２０００年、Ｈｅｒｂｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｔｅａｓ、テクノミックパブリッシャーズ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）［ペンシルバニア州ランカスター］）。ＰＵＦＡを補給した食事がこれらの状態の多くに対する療法として試みられた。そのような適用の成功の程度は著しく異なっていた。
【０００６】
男性の脂肪組織におけるリノール酸（１８：２ｎ−６、ＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６、ＤＧＬＡ）およびアラキドン酸（２０：４ｎ−６、ＡＡ）の低レベルは、冠動脈性心疾患による死亡率の増加と関連づけられている（リーマースマら（Ｒｉｅｍｅｒｓｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．［Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ｅｄ．］、第２９２巻、１４２３〜１４２７ページ）。高血圧に罹患した患者へのＬＡおよびα−リノレン酸（１８：３ｎ−３、ＡＬＡ）の補給により、ＡＡおよびエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３、ＥＰＡ）の組織レベルは増加しなかった。このことは、ｎ−６およびｎ−３脂肪酸系の不飽和化および伸長が欠如していることを示している（シンガーら（Ｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔ．Ｍｅｄ．第１５巻、１５９〜１６５ページ）。プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）類縁体であるミソプロストール（Ｍｉｓｏｐｒｏｓｔｏｌ）は、末梢血管の疾患の治療に用いられて好結果が得られた（ゴスズクツら（Ｇｏｓｚｃｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第２０巻、４３９〜４４５ページ）。ＰＧＥ１は、ＤＧＬＡのシクロオキシゲナーゼ産物である。
【０００７】
ＰＵＦＡは、糖尿病性神経障害の症状の一部を軽減し、矯正する可能性があることが認められている（ダインスら（Ｄｉｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第３６巻、１１３２〜１１３８ページおよびコッターら（Ｃｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、エルセビアサイエンスビーヴイ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂ．Ｖ．［アムステルダム所在］、１１５〜１２０ページ）。研究者らは、ｎ−３およびｎ−６脂肪酸族のシクロオキシゲナーゼおよびリポキシゲナーゼ代謝物の産生または調節がこれらの有益な効果の原因の一部であると推測した。
【０００８】
ほとんどの脂質代謝障害は、必須脂肪酸の欠乏を特徴としている。この欠乏は、ＰＵＦＡ生合成におけるδ−６−不飽和化（Ｄ６Ｄ）および／またはδ−５−不飽和化（Ｄ５Ｄ）の律速段階の変化に帰せられている。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、（ａ）配列番号４（ＥＬＧ４）を含む配列と、（ｂ）配列番号８（ＥＬＧ６）を含む配列と、（ｃ）配列番号１１（ＥＬＧ７）を含む配列と、（ｄ）（ａ ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、（ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、（ｈ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、（ｉ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｈ）のいずれかとハイブリッド形成する配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列の部分を教示している。単離ポリヌクレオチド配列はｃＤＮＡであってもよい。
【００１０】
本発明はまた、（ａ）配列番号５（ＥＬＧ４）を含む配列と、（ｂ）配列番号９（ＥＬＧ６）を含む配列と、（ｃ）配列番号１２（ＥＬＧ７）を含む配列と、（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、（ｇ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、（ｈ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列からなる群から選択される単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチドを教示している。
【００１１】
本発明は、（ａ）配列番号１（ＥＬＧ１の制御領域）を含む配列、（ｂ）配列番号２（ＥＬＧ２の制御領域）を含む配列、（ｃ）配列番号３（ＥＬＧ３の制御領域）を含む配列、（ｄ）配列番号６（ＥＬＧ４の制御領域）を含む配列、（ｅ）配列番号７（ＥＬＧ５の制御領域）を含む配列、（ｆ）配列番号１０（ＥＬＧ６の制御領域）を含む配列、（ｇ）配列番号１３（ＥＬＧ７の制御領域）を含む配列、（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの配列と少なくとも８０％相同である配列、（ｉ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの配列と少なくとも９０％相同である配列、（ｊ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの配列と少なくとも９５％相同である配列、（ｋ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの配列と少なくとも９８％相同である配列、（ｌ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの配列と少なくとも９９％相同である配列、および（ｍ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｌ）のいずれかとハイブリッド形成する配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列を教示している。
【００１２】
本発明は、（ａ）本発明の配列のヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を有する配列、（ｂ）本発明の配列のヌクレオチドの少なくとも３０個の連続した塩基を有する配列および（ｃ）本発明の配列のヌクレオチドの少なくとも５０個の連続した塩基を有する配列からなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメントを含む。本発明は、本発明のポリペプチド配列とほぼ同じ生物学的機能または活性を保持している、あるいはその機能的誘導体であるポリペプチド配列を含む。
【００１３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列とほぼ同じ生物学的機能または活性を保持している、あるいはその機能的誘導体であるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本発明はまた、適切なベクター中に本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターも教示している。該ベクターは、該配列と異種であってよい。該ベクターは、タグを含むか、コードしていてよい。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列と異種である宿主細胞中に該配列を含む宿主細胞も教示している。
【００１５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該配列を有する対照動物と該配列を有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該配列の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００１６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該配列の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示している。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該配列の産物または該配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００１８】
本発明は、ポリペプチドの生産に十分な条件下で本発明の宿主細胞を培養する方法を含む、本発明のポリペプチド配列を生産する方法を教示している。
本発明は、本発明のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該配列を有する対照動物および該配列を有する試験動物を選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該配列の発現産物または該配列の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００１９】
本発明はまた、本発明のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該配列の発現産物または該配列の相対量または相対活性を測定する工程からなる方法も教示している。
【００２０】
本発明は、本発明のポリペプチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該配列の産物または該配列の相対量または相対活性を測定する工程からなる方法を含む。
【００２１】
本発明は、本発明のポリペプチド配列の生物学的活性を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明のポリペプチド配列の生物学的活性を測定する検定法を準備する工程と、（ｂ）該検定の化合物により処理する工程と、（ｃ）ポリペプチドの生物学的活性の変化を確認する工程とからなり、処理した検定と対照の検定との差により該化合物が該ポリペプチドのモジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）として特定される方法を含む。この方法におけるポリペプチドは、問題の生物学的活性を検定するのに必要な、精製された状態での検定、再構成された状態での検定、細胞抽出物の状態での検定または細胞全体での検定方式に供することができる。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該配列と作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示している。
【００２２】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞またはその一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該配列と作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示している。
【００２３】
本発明は、本発明の配列を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物を含む。本発明は、ＰＵＦＡ障害を治療するための本発明の組成物の使用を含む。
【００２４】
本発明は、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を、対象における本発明の配列中の生殖細胞系列における変化を検出することにより診断する方法であって、対象の組織試料における本発明の配列の生殖細胞系列の配列を該配列の野生型の生殖細胞系列の配列と比較することからなり、対象の生殖細胞系列の配列における変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法を含む。本発明は、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料における本発明のポリペプチドの配列を該ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、野生型と比較したときの対象の配列の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法を教示している。
【００２５】
本発明はまた、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを有する対照動物と該ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示している。
【００２６】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００２７】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または該宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの産物または該ポリヌクレオチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００２８】
本発明は、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリペプチドを有する対照動物と該ポリペプチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリペプチドの発現産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００２９】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリペプチドを含み、該ポリペプチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリペプチドの発現産物または該ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００３０】
本発明はまた、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの活性を調節する化合物を特定することからなる、ＰＵＦＡ障害を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリペプチドの産物または該ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００３１】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを有する対照動物と該ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００３２】
本発明の動物は哺乳類であってよい。哺乳類はラットであってよい。
本発明はまた、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示している。
【００３３】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される遺伝子の制御領域であるポリヌクレオチドの活性を調節する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または該宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００３４】
本発明は、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列由来のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物を含む。
【００３５】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物を教示している。
【００３６】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される制御領域由来のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物を教示している。
【００３７】
化合物を、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３およびＥＬＧ５に対する抗体からなる群から選択してもよい。
本発明は、対象におけるＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列を表すポリヌクレオチド内の生殖細胞系列における変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料における該ポリヌクレオチドの生殖細胞系列における配列を該配列の野生型の生殖細胞系列における配列と比較することからなり、対象の生殖細胞系列における配列の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法を含む。
【００３８】
本発明はまた、対象におけるＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、およびＥＬＧ５からなる群から選択される制御領域を表すポリヌクレオチド内の生殖細胞系列における変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料における該ポリヌクレオチドの生殖細胞系列における配列を該配列の野生型の生殖細胞系列における配列と比較することからなり、対象の生殖細胞系列における配列の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す方法も教示している。
【００３９】
本発明はまた、対象におけるＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリペプチドの配列を該ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、野生型と比較したときの対象の配列の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法も教示している。
【００４０】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択される２つまたはそれ以上の異なる遺伝子の制御領域である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの全活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドと異種である、該ポリヌクレオチドを有する宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００４１】
本発明はさらに、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるポリヌクレオチドの制御領域由来の２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの全活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００４２】
本発明は、核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドと異種である、該ポリヌクレオチドを有する宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００４３】
本発明はさらに、核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるコード配列である２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞または宿主細胞の一部を有する試験群を選択し、適切な対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００４４】
本発明は、同じ宿主系内の哺乳類δ−５−デサチュラーゼ酵素およびＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、哺乳類δ−５−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素をコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、（ｃ）δ−５−デサチュラーゼ酵素およびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−５−デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、（ｄ）該能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法を含む。
【００４５】
本発明はさらに、同じ宿主系内の哺乳類δ−６−デサチュラーゼ酵素およびＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、哺乳類δ−６−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素をコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、（ｃ）δ−６−デサチュラーゼ酵素およびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−６−デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、（ｄ）該能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法を教示している。
【００４６】
本発明は、同じ宿主系内の哺乳類δ−５およびδ−６−デサチュラーゼ酵素および／またはＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の酵素の活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）核酸配列の発現を開始し、終結し、またはその発現レベルを調整する作用を有するプロモーター領域と作動可能なように連結された、哺乳類δ−５−デサチュラーゼ、哺乳類δ−６−デサチュラーゼおよびＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７からなる群から選択される１つまたは複数の哺乳類エロンガーゼ酵素を同時にコードする核酸配列を含む宿主系を得る工程と、（ｂ）宿主系を試験成分と接触させる工程と、（ｃ）δ−５−デサチュラーゼ酵素、δ−６−デサチュラーゼ酵素およびエロンガーゼ酵素の酵素活性を同時に評価する（試験成分が存在しないこと以外は同じ条件下にある対照と比較した場合の試験成分存在下の脂質代謝物または関連する補因子のレベルの測定し得る差がδ−５−および／またはδ−６−デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ酵素活性を調節する試験成分の能力の指標である）工程と、（ｄ）該能力を示す試験成分を前記化合物として特定する工程とからなる方法を教示している。
【００４７】
本発明は、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６、ＥＬＧ７、δ−５−デサチュラーゼ、δ−６−デサチュラーゼからなる群から選択される制御領域由来の２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含むＰＵＦＡ障害を治療するための組成物を教示している。
【００４８】
本発明は、対象におけるＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６、ＥＬＧ７、δ−５−デサチュラーゼ、δ−６−デサチュラーゼからなる群から選択される遺伝子の２つまたはそれ以上の発現産物の発現のレベルを予備測定した対照の発現レベルを基準として測定することからなり、前記対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化がＰＵＦＡ障害の存在または素因を示す、ＰＵＦＡ障害の存在または素因を検出する方法を含む。
【００４９】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたはその免疫原性の部分に対して免疫反応性を有する抗体を含む。本発明は、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６、ＥＬＧ７またはそれらの免疫原性の部分からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチドに対して免疫反応性を有する抗体を含む。
【００５０】
本発明は、本発明の、またはＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチド用の媒体をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の抗体をマーカー分子で標識して結合体を形成させることと、（ｂ）結合体を該媒体に曝露させることと、（ｃ）結合体と媒体中の生体分子との間に、前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することと、からなる方法を教示している。
【００５１】
本発明は、本発明の、またはＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７からなる群から選択されるエロンガーゼポリペプチド用の媒体をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の抗体を該媒体に曝露させることと、（ｂ）抗体をマーカー分子に曝露させることと、（ｃ）該マーカー分子と媒体中の生体分子との間に、前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することと、からなる方法を教示している。
【００５２】
本発明は、本発明の方法により特定される化合物を含む。
本発明はさらに、対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の存在または素因を診断する方法を含む。本発明は、対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について変化を検出することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害の発生を監視する方法を含む。本発明はさらに、対象から得られた末梢血白血球中のＰＵＦＡの伸長について変化を評価することにより、対象におけるＰＵＦＡ障害に対する試験化合物の有効性を評価する方法を教示している。
【００５３】
本発明の化合物は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸およびそれらの誘導体からなる群から選択することができる。
【００５４】
本発明は、本発明の障害の治療のためのペブレートスルホキシド（ｐｅｂｕｌａｔｅ　ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）の使用を教示している。
本発明の障害は、末梢心血管疾患、冠動脈性心疾患、高血圧、アトピー性湿疹、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、精神障害、月経前症候群、子宮内膜症、嚢胞性線維症、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、癌、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択されてよい。本発明の障害は、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患性高血圧および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、シェーグレン症候群、胃腸障害、ウイルス疾患およびウイルス後疲労、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、子宮内膜症、月経前症候群、アルコール症、先天性肝疾患、アルツハイマー症候群、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択されてよい。
【００５５】
以下の記述において、本発明を、本発明の好ましい実施形態を例示する添付図を利用して詳細に説明する。
（発明の詳細な説明）
上述のように、研究により、ＬＡまたはＤＧＬＡのレベルの増加はδ−６およびδ−５−デサチュラーゼ酵素活性の低下によることが示された。本発明者らは、ＰＵＦＡ関連障害においては両デサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性に影響があるという証拠を見いだした。
【００５６】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性糖尿病ラットの肝ミクロソームにおけるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素活性を誘発後２および７週目に検定した。表１に、実験中に認められた対照と比較したときの活性の低下を示す。ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットにおける伸長活性の同等の低下は以前に報告されている（スネジャら（Ｓｕｎｅｊａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１０４２巻、８１〜８５ページ）。
【００５７】
【表１】
2004513662.tif 000002
このデータは、ＰＵＦＡと疾患との関係に関する既知事項（上記）を考慮するとき、エロンガーゼ遺伝子が、炎症、高コレステロール血症、自己免疫障害、アトピー性障害、嚢胞性線維症、精神障害、癌、急性呼吸促迫症候群、関節軟骨退化、関節炎、糖尿病および糖尿病合併症のような脂質関連疾患の発生および調節に関与していることを示している。ＰＵＦＡが多くの細胞調節の過程に関与していることから、エロンガーゼ遺伝子および遺伝子産物は、脂肪酸関連疾患の治療または予防に関する実際的な薬物標的である。
【００５８】
本発明者らは、生物情報学的手法（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いて７種のヒトエロンガーゼ遺伝子（ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７）を特定し解析した。７種のヒトエロンガーゼのアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（トンプソンら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．第２２巻、４６７３〜４６８０ページ）を用いて比較した。多数の膜結合デサチュラーゼにおいても認められる１つの高度に保存されたモチーフ、３ヒスチジン残基を含むヒスチジンボックスが７種の配列すべてに共通している。エロンガーゼの触媒活性と構造とにおいて極めて重要であることが示唆される他の２５の非変異残基は、多重アライメントにおいて特定される（アステリスクで示す）（図４を参照）。
【００５９】
表２に７種のヒトエロンガーゼ間の同一性の割合を示す。同一性の割合は、低い１７％（ＥＬＧ３／ＥＬＧ５およびＥＬＧ３／ＥＬＧ６）から高い５５％（ＥＬＧ１／ＥＬＧ４）までの範囲にある。
【表２】
2004513662.tif 000003
【００６０】
膜貫通領域予測のための隠れマルコフモデル（ソンハンマーら（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｉｎ　Ｐｒｏｃ．ｏｆ　Ｓｉｘｔｈ　Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、エーエーエーアイプレス（ＡＡＡＩ　Ｐｒｅｓｓ）［カリフォルニア州］、１７５〜１８２ページ）に基づくと、７種のエロンガーゼのファミリーは７つの膜貫通領域を有する（図５）。これらの領域は、７種のエロンガーゼのアミノ酸配列中の位置に関して高度に保存されている。非変異ヒスチジンボックスは、第４の膜貫通領域に埋め込まれていると予測される。これは、３つの保存されたヒスチジンボックスが細胞質側のループに存在すると予測される膜結合デサチュラーゼのそれと異なっている（シャンクリンら（Ｓｈａｎｋｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、１２７８７〜１２７９４ページ）。ヒトエロンガーゼに関する本モデルは、脂肪アシル鎖の挿入のための内部触媒孔を囲む膜貫通ドメインのリングを含む。小胞体（ＥＲ）に埋め込まれているエロンガーゼについて提示されたトポロジカルモデルを図６に示す。
【００６１】
本発明者らは、各タンパク質がカルボキシル末端にＥＲ残留シグナルを有することを発見した（ジャクソンら（Ｊａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、ＥＭＢＯ　Ｊ．第９巻、３１５３〜３１６２ページならびにニルッソン　ティー．およびワレン　ジー．（Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｔ．ａｎｄ　Ｗａｒｒｅｎ　Ｇ．）、１９９４年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第６巻、５１７〜５２１ページ）。Ｉ型トポロジー（アミノ末端が内腔内）を有するＥＲ常在性タンパク質では、シグナルは、細胞質にむき出しになったそれらの尾部のカルボキシル末端に対して−３および−４／−５位にある２つの重要なリシンからなっていることが示された（Ｋ［Ｘ］ＫＸＸ、ここでＸは任意のアミノ酸）。エロンガーゼのそれぞれがそのような保持シグナルを有している。しかし、ＥＬＧ２とＥＬＧ５は、２つの重要なリシンがそれぞれ部位−２および−５ならびに−３および−６に認められる、修飾型のシグナルを有している（図４）。
【００６２】
ＥＬＧ１遺伝子およびポリペプチド
酵母ＥＬＯ１に関するＧｅｎＢａｎｋ　ＮＲデータベースのＢＬＡＳＴＰにより、未知の機能を有するタンパク質ＣＧＩ−８８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ３４０８３）はエロンガーゼの可能性ありと確認された。最初のクローニングで、このタンパク質の推定のもととなったｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１５１８４６）がＣＤＳの部位５６６に１塩基の欠失を有していることが示された。本発明者らのクローンはＣＤＳの部位５６６に余分なＣ残基を有し、その結果ＣＧＩ−８８と異なりより長いＣ末端を有する、本発明者らによりＥＬＧ１と称されているタンパク質を生じる。その後、ＥＬＧ１と１アミノ酸が異なっている、機能の対応づけがなされていないタンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＫ００１６５３）がＧｅｎＢａｎｋに提出された（登録番号ＢＡＡ９１８１３）。ＥＬＧ１の推定アミノ酸配列は、Ｆ６８Ｓ置換を含んでいる。
【００６３】
ＥＬＧ１をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１００９．１と称した（図７）。
【００６４】
ｐＴｈ１００９．１で形質転換され、ＥＬＧ１を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に、２０：４ｎ−６を２２：４ｎ−６と２４：４ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に、そして２０：５ｎ−３を２２：５ｎ−３に変換することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ１遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。このタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼであることを示す公表データは存在しない。ムカージら（Ｍｕｋｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ．）（特許協力条約出願国際公開第００／１２７２０号）は、ＨＳ２と称されたこのタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼである可能性があることを示している。彼らは、コード配列をクローニングせず、機能も測定しなかった。
【００６５】
ヒトＥＬＧ１のマウスオルソログであるＳｓｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１７０９０７）は、酵母のＥＬＯ突然変異体を相補する能力があるため、脂肪酸伸長と密接な関連性があるとされた。さらに、Ｓｓｃ１遺伝子の発現は、ミエリン欠失マウス突然変異体の脳におけるエロンガーゼ活性と相関している（トバディクら（Ｔｖｒｄｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１４９巻、７０７〜７１７ページ）。マウスＳｓｃ１は、ヒトＥＬＧ１と９２％同一で、９７％類似している。
【００６６】
ＥＬＧ１のエキソンはヒト第１染色体のゲノムＤＮＡ上にマッピングされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３９２８９）。この遺伝子は、１．７ｋｂに及ぶ７個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００６７】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ１遺伝子の制御領域を特定し、詳細に解析した。ＥＬＧ１遺伝子のゲノムＤＮＡおよびＣＤＳについてＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、該遺伝子の５’ＵＴＲを含む多数の異なるＥＳＴが特定された。そのうち、５’ＵＴＲのみを含む別々の上流エキソンからそれぞれ生ずる２つのＥＳＴｓのファミリーが存在していた。第１のエキソンは−２３０６にその３’部位を有しているのに対して、第２のエキソンは翻訳開始コドンＡＴＧから−１８７７にその３’部位を有している。他のＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ３７３５３０）の１２８ｂｐフラグメントもＡＴＧの上流約２．９ｋｂに特定された。翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−１８７７と−２８６５との間にある制御領域を図８に示す。−３６００の上流に反復エレメントがさらに特定されている。
【００６８】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、約１．３ｋｂのＥＬＧ１転写物が検査したすべての組織で発現し、腎臓、脳、心臓および胎盤で最高レベルで発現することが示された（図２７）。
【００６９】
ＥＬＧ２遺伝子およびポリペプチド
酵母ＥＬＯ１に関するＧｅｎＢａｎｋ　ＮＲデータベースのＢＬＡＳＴＰにより、機能未知のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ４１２９３、以後取下げ）はエロンガーゼの可能性ありと確認された。このタンパク質の配列は、ゲノムｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０３４３７４）から推測されたものであり、部分配列のみを表している。本発明者らによりＥＬＧ２と命名されたこのタンパク質の全コード配列をＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）技術（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてクローニングし、ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により決定した。その後、ＥＬＧ２コード配列および推定タンパク質配列がＧｅｎＢａｎｋに提出された（それぞれ登録番号ＡＦ２３１９８１およびＡＡＦ７０６３１）。
【００７０】
ＥＬＧ２をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０１４．１と称した。
【００７１】
ｐＴｈ１０１４．１で形質転換され、ＥＬＧ２を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６と２２：３ｎ−６に、２０：４ｎ−６を２２：４ｎ−６と２４：４ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に、そして２０：５ｎ−３を２２：５ｎ−３に伸長することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ２遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。ＨＥＬＯまたはＨＳＥＬＯと称されるこの遺伝子が１８：３ｎ−６、２０：４ｎ−６、１８：４ｎ−３、２０：５ｎ−３および１８：３ｎ−３などの様々なＰＵＦＡの伸長に関与していることが報告されている（レオナードら（Ｌｅｏｎａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３５０巻、７６５〜７７０ページおよびムカージら（Ｍｕｋｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ．）（特許協力条約出願国際公開第００／１２７２０号）。
【００７２】
ＥＬＧ２のエキソンはヒト第６染色体のゲノムＤＮＡ上にマップされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０３４３７４）。この遺伝子は、２６．５ｋｂに及ぶ７個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００７３】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ２遺伝子の制御領域を特定し、詳細を解析した。ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）技術により得られた本発明者らのクローンの配列データを用いて、５’ＵＴＲをＡＴＧの約５３ｋｂ上流のエキソン内に特定した。この所見は、ＥＬＧ２のＣＤＳについてＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより確認された。２つのＥＳＴが特定され（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２８２３９６およびＢＥ７７９５７６）、同じ上流エキソンにマップされた。翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−５３１１８〜−５３６２６にある制御領域を図９に示す。ＥＳＴが得られた配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ５５７３４１）は、この領域のすぐ上流にある。反復エレメントが、この５’ＵＴＲを含むエキソンの３’末端からさらに約１．４ｋｂ上流に特定されている。
【００７４】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、約２．８ｋｂのＥＬＧ２転写物が検査したすべての組織で発現し、脳、心臓および腎臓において最高レベルで、肝臓で中程度のレベルで発現することが示された（図２７）。
【００７５】
ＥＬＧ３遺伝子およびポリペプチド
酵母ＥＬＯ１に関するＧｅｎＢａｎｋ　ＮＲデータベースのＢＬＡＳＴＰにより、機能未知のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ９１０９６）がエロンガーゼの可能性ありと確認された。このタンパク質は、ゲノムｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＫ０００３４１）から推測されたものであり、本発明者らによりＥＬＧ３と命名されている。
【００７６】
ＥＬＧ３をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０１５．１と称した。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ９１０９６と比較すると、ＥＬＧ３遺伝子によりコードされるタンパク質は２つのアミノ酸置換Ｔ３１ＭおよびＶ１７９Ｉを含む。
【００７７】
ｐＴｈ１０１５．１で形質転換され、ＥＬＧ３を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に、２０：４ｎ−６を２２：４ｎ−６と２４：４ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に、そして２０：５ｎ−３を２２：５ｎ−３と２４：５ｎ−３に伸長することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ３遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。このタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼであることを示す公表データは存在しない。しかし、ムカージら（Ｍｕｋｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ．）（特許協力条約出願国際公開第００／１２７２０号）は、ＥＬＧ３のＣＤＳの一部であると本発明者らにより見いだされたＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ８１５９６０）がＰＵＦＡエロンガーゼの一部をコードしている可能性があることを示している。彼らは、このＥＳＴから得られるコード配列をクローニングせず、その機能も測定しなかった。
【００７８】
ヒトＥＬＧ３のマウスオルソログであるＳｓｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１７０９０８）は、脂肪酸伸長に関与していると推定された。しかし、酵素機能は確認されなかった（トバディクら（Ｔｖｒｄｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１４９巻、７０７〜７１７ページ）。マウスＳｓｃ２は、ヒトＥＬＧ３と８８％同一で、９４％類似している。
【００７９】
ＥＬＧ３のエキソンはヒト第６染色体のゲノムＤＮＡ上にマップされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１２１９５５）。この遺伝子は、６０．５ｋｂに及ぶ８個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００８０】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ３遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＥＬＧ３遺伝子のゲノムＤＮＡおよびＣＤＳについてＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋを検索することにより、開始コドンＡＴＧのすぐ上流の８４ｂｐの５’ＵＴＲを含む２つの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＥ７７８０３５およびＡＫ０００３４１）が特定された。翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−３７〜−１３８１にある制御領域をクローニングした（実施例１１を参照）が、これを図１０に示す。
【００８１】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、約４．４ｋｂのＥＬＧ３転写物が脳で中程度に発現し、心臓、肝臓および胎盤で低レベルで発現することが示された（図２７）。この転写物は、検査した他のいずれの組織においても検出されなかった。
【００８２】
ＥＬＧ４遺伝子およびポリペプチド
酵母ＥＬＯ１に関するＧｅｎＢａｎｋ　ＮＲデータベースのＢＬＡＳＴＰにより、機能未知のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ７０７７７）がエロンガーゼの可能性ありと確認された。このタンパク質の配列は、ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３７５０６）から推測されたものであり、部分配列のみを表している。ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）技術（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）およびＰＣＲ増幅を用いて、本発明者らによりＥＬＧ４と命名されたこのタンパク質の全コード配列をクローニングした。ｃＤＮＡの配列をＤＮＡ配列決定により決定した。ＥＬＧ４のコード配列とアミノ酸配列とを図１１に示す。その後、カワカミと共同研究者らは、ＥＬＧ４に類似したｃＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＡＫ０２７２１６）に提出した。しかし、ＥＬＧ４と比較してその配列はコード配列の最初の３１ヌクレオチドを含んでおらず、いくつかのヌクレオチド置換を有し、１つのヌクレオチド挿入を有している。
【００８３】
ＥＬＧ４をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０２１．１と称した。
【００８４】
ｐＴｈ１０２１．１で形質転換され、ＥＬＧ４発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６と２２：３ｎ−６に、２０：４ｎ−６を２２：４ｎ−６と２４：４ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３と２２：３ｎ−３に、そして２０：５ｎ−３を２２：５ｎ−３と２４：５ｎ−３に伸長することが示された（実施例１９における表３および図２１を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ４遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。　ＥＬＧ４のエキソンはヒト第５染色体のゲノムＤＮＡ上にマップされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０２１６０１）。この遺伝子は、少なくとも３２ｋｂに及ぶ７個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００８５】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ４遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）技術により得られた本発明者らのクローンの配列データを用いて、５’ＵＴＲを、開始コドンＡＴＧを含むエキソンから上流の３つの連続した、交互にスプライスされたエキソン内に特定した。最も近い上流エキソンはＡＴＧから約１２ｋｂ上流にあり、次のエキソンは１３ｋｂ以上上流にあり、最も遠い上流エキソンは少なくとも１９ｋｂ上流にある。この最初の（最も上流の）エキソンの３’末端にその末端を有する２４５６ｋｂのフラグメントを含む制御領域を図１２に示す。これは、その５’末端において反復エレメントに隣接している。
【００８６】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、約４．３ｋｂのＥＬＧ４転写物が腎臓で高度に発現し、脳および心臓で中程度に発現していることが示された。骨格筋、結腸、胸腺、肝臓、小腸および胎盤では低レベルの転写物が検出された（図２７）。脾臓および末梢血白血球には転写物は検出されなかった。
【００８７】
ＥＬＧ５遺伝子およびポリペプチド
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているｃＤＮＡ配列（登録番号ＡＫ０２７０３１）は他のエロンガーゼの可能性のある配列をコードしている。推測されるタンパク質の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＢ１５６３２）は、本発明者らによりＥＬＧ５と命名されている。
【００８８】
ＥＬＧ５をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０１８．１と称した。
【００８９】
ｐＴｈ１０１８．１で形質転換され、ＥＬＧ５を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に変換することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ５遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。このタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼであることを示す公表データは存在しない。ムカージら（Ｍｕｋｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ．）（特許協力条約出願国際公開第００／１２７２０号）は、ＥＬＧ５と同一であるＨＳ３がＰＵＦＡエロンガーゼである可能性があることを示している。彼らは、コード配列をクローニングしたが、酵素機能は測定しなかった。
【００９０】
ＥＬＧ５のエキソンはヒト第４染色体のゲノムＤＮＡ上にマップされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００４０５０、ＡＣ０２２９５２およびＡＰ００２０８０）。この遺伝子は、少なくとも８８ｋｂに及ぶ４個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００９１】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ５遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＥＬＧ５遺伝子のゲノムＤＮＡおよびＣＤＳについてのＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、該遺伝子の５’ＵＴＲを含む多数の異なるＥＳＴｓが特定された。ＡＴＧからの部位−１〜−１４１１にある制御領域を図１３に示す。この領域は、その５’末端において反復エレメントに隣接している。
【００９２】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、ＥＬＧ５の２つの転写物が示された（図２７）。約３．０ｋｂの転写物が肝臓で高度に発現し、脳、結腸および腎臓で中程度に発現し、心臓、胸腺、小腸、胎盤および骨格筋で低いレベルで発現する。約７．６ｋｂの転写物が脳で中程度のレベルで、結腸、腎臓および肝臓で低いレベルで発現する。
【００９３】
ＥＬＧ６遺伝子およびポリペプチド
ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４およびＥＬＧ５のコード配列についてＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳ部門におけるホモ・サピエンスの配列をＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて検索することにより、ＥＬＧ６を特定した。１つの配列がヒトエロンガーゼに類似した配列を含むものとして特定された（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１６００１１）。しかしこの方法では、翻訳開始部位を含む遺伝子の開始部分を特定することができなかった。したがって、ＥＬＧ６と類似していることが認められたタンパク質であるマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＣｉｇ３０（寒冷誘導性膜糖タンパク質３０）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９７１０７）を鋳型として用いて、ＥＬＧ６コード配列をさらにマッピングし特定した。開始コドンＡＴＧを含むＥＬＧ６の最初のコーディングエキソンがこの方法で特定された。
【００９４】
ＥＬＧ６をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０４１．１と称した。ＥＬＧ６のコード配列とアミノ酸配列を図１４に示す。
【００９５】
ｐＴｈ１０４１．１で形質転換され、ＥＬＧ６を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に伸長することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換された酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ６遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。
【００９６】
ヒトＥＬＧ６のマウスオルソログであるＣｉｇ３０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９７１０７）は、酵母ＥＬＯ２突然変異体を相補する能力があるため、脂肪酸伸長と密接な関連性があるとされた。さらに、Ｃｉｇ３０遺伝子の発現は、マウスにおける褐色脂肪の動員の際のエロンガーゼ活性と相関している（トバディクら（Ｔｖｒｄｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、３１７３８〜３１７４６ページおよびトバディクら（Ｔｖｒｄｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１４９巻、７０７〜７１７ページ）。マウスＣｉｇ３０は、ヒトＥＬＧ６と６９％同一で、８１％類似している。
【００９７】
発明者らによるＥＬＧ６の発見後、ホモ・サピエンスＣｉｇ３０オルソログのゲノムｃＤＮＡおよび部分ＣＤＳを含む別の登録がＧｅｎＢａｎｋに提出された（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２９２３８７）。しかし、配列アノテーションは最初のコーディングエキソンの存在を示していない。
【００９８】
ＥＬＧ６のエキソンはヒト第１０染色体のゲノムＤＮＡ上にマップされた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１６００１１）。この遺伝子は、約２．７ｋｂに及ぶ４個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００９９】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ６遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＡＴＧからの部位−１〜−１９３７にある制御領域を図１５に示す。
標準的なノーザンブロット分析において、ＥＬＧ６の転写物は検査したいずれの組織においても検出されなかった（図２７）。
【０１００】
ＥＬＧ７遺伝子およびポリペプチド
ＥＬＧ７は、ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４およびＥＬＧ５のコード配列についてＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳ部門におけるホモ・サピエンスの配列をＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて検索することにより特定した。ヒトエロンガーゼに類似した配列を有するエキソンを含む多数の配列が特定された。長さが１６４ｋｂのそのような配列の１つ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３２８７５）は、本発明者らにより、約３０．５ｋｂのゲノムＤＮＡにわたって存在する６個のコーディングエキソン中の、以前に特定されていない遺伝子（ＥＬＧ７と命名）を含むことが見いだされた。
【０１０１】
ＥＬＧ７をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。ヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定により検証し、得られたプラスミドをｐＴｈ１０４４．１と称した。ＥＬＧ７のコード配列とアミノ酸配列を図１６に示す。
【０１０２】
ｐＴｈ１０４４．１で形質転換され、ＥＬＧ７を発現する酵母細胞は、１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に変換することが示された（実施例１９における表３を参照）。ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターで形質転換した酵母細胞は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった。このことから、ＥＬＧ７遺伝子はＰＵＦＡエロンガーゼをコードすることが立証された。
【０１０３】
生物情報学的手法を用いて、ＥＬＧ７遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＥＬＧ７遺伝子のゲノムＤＮＡについてＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、該遺伝子の１１８ｂｐの５’ＵＴＲを含むヒトＥＳＴが開始コドンＡＴＧのすぐ上流に特定された（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＥ８７８６４８）。ＡＴＧからの部位−１〜−２０００にある制御領域を図１７に示す。反復エレメントが−２７００の上流にさらに特定された。
【０１０４】
組織分布を評価するノーザンブロット試験により、約３．０ｋｂのＥＬＧ７転写物が脳、胸腺および胎盤で発現していることが示された（図２７）。この転写物は、検査した他の組織のいずれにおいても検出されなかった。
【０１０５】
対象ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
対象ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書でさらに考察するように、疾患、特にヒト疾患の治療法および診断法の発見のための研究試薬および研究材料として用いることができる。
【０１０６】
ヌクレオチドプローブ
本発明の核酸分子により、当業者は生体材料中のヌクレオチド配列の検出に用いるヌクレオチドプローブを構築することが可能である。本明細書に記載のように、制限酵素の多くの特有の制限配列が、対象ポリヌクレオチドの配列一覧に特定される核酸分子内に組み込まれており、これらによって、本発明の対象ポリヌクレオチドに特有なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列へのアクセスが可能となる。対象ポリヌクレオチドに特有なヌクレオチド配列またはそのイソ型は、当技術分野で周知の手順により実施される化学合成および酵素的連結反応によって構築することも可能である。
【０１０７】
ヌクレオチドプローブは、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ等のような十分なシグナルを提供しかつ十分な半減期を有する放射性標識を始めとする検出可能なマーカーで標識することができる。使用できる他の検出可能なマーカーとしては、特異的標識抗体により認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に対して特異的な抗体および化学発光化合物などがある。適切な標識は、検出すべきヌクレオチドへのプローブのハイブリッド形成および結合の速度と、ハイブリッド形成に利用可能なヌクレオチドの量とを考慮して選択可能である。ヌクレオチドプローブは、本発明の対象ポリヌクレオチドと関連または類似の遺伝子を検出するために用いることができる。
【０１０８】
したがって、本発明はまた、ハイブリッド形成条件下で試料を検出可能なマーカーで標識した本発明の１つまたは複数のヌクレオチドプローブと接触させることと、試料中の核酸分子とヌクレオチドプローブとの間のハイブリッド形成の程度を測定することとから成る、試料中の対象ポリヌクレオチドに関連するかまたは類似のポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法も提供する。
【０１０９】
本発明の方法に用いることができるハイブリッド形成条件は、当技術分野で知られており、例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｕｒ）に所在］に記載されている。ハイブリッド形成産物は、当技術分野で知られている技術を用いて分析することができる。ヌクレオチドプローブは、本明細書に記載のように検出可能なマーカーで標識することができ、ハイブリッド形成産物は、検出可能なマーカーまたは検出可能なマーカーによってもたらされる検出可能な変化を検出することにより、分析することができる。
【０１１０】
プライマー
本発明の核酸分子の同定は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において本発明のポリヌクレオチド分子を増幅するためのプライマーとして用いることができるヌクレオチド配列の同定および単離または合成も可能にする。ＰＣＲに用いるプライマーの長さと塩基とは、一方のプライマーから合成される伸長産物がその鋳型から分離されたとき、他方のプライマーが伸長して規定の長さの核酸となるための鋳型として働き得るように、両プライマーが所望の配列の別々の鎖でかつその配列上の相対的な位置にハイブリッド形成するように選択する。
【０１１１】
本発明において用いることができるプライマーは、精製された制限エンドヌクレアーゼ消化物中にあるように天然に存在する、あるいは、例えばホスホトリエステルおよびホスホジエステル法または自動化法（コノリー　ビー　エー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ　Ｂ．Ａ．）、１９８７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．第１５巻、３１３１〜３１３９ページ）のような当技術分野で知られている技術を用いて合成により生産されるオリゴヌクレオチド、すなわち、本発明の核酸分子の２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む分子である。プライマーは、本発明のＤＮＡ配列と相補的であるプライマー伸長産物の合成を可能とする条件下、例えば、ヌクレオチド基質、ＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下で適切な温度およびｐＨのもとに置いたとき、合成の開始点として作用することができる。プライマーは、他のプライマーコピーとの塩基対合により２次構造を形成しない配列またはヘアピン構造を形成する配列であることが好ましい。プライマーは、１本鎖または２本鎖であってよい。プライマーが２本鎖である場合、増幅産物を調製するためにプライマーを使用する前に、鎖を分離するべく処理すればよい。プライマーは、約７〜２５ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【０１１２】
プライマーは、増幅産物の検出を可能にする検出可能なマーカーで標識することができる。適切な検出可能なマーカーは、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉおよび３Ｈのような放射性マーカー、化学発光マーカーのような発光マーカー（好ましくはルミノール）、および蛍光マーカー（好ましくは、ダンシルクロライド、フルオレセイン−５−イソチオシアネートおよび４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３ジアゾール）ならびにビオチンのような補因子である。十分な量のプライマーが増幅すべき本発明の核酸またはそのオリゴヌクレオチド配列と相補的な配列を含んでいるならば、プライマーは非相補的配列を含んでいてよいことは理解できよう。制限部位のリンカーも、増幅産物のクローニングと配列決定とを容易にする適切な制限酵素による増幅産物の消化を可能にしつつ、プライマーに組み込まれていてもよい。
【０１１３】
検定−配列の増幅
したがって、ポリメラーゼ連鎖反応において核酸分子またはその核酸分子の所定のオリゴヌクレオチドフラグメントを増幅可能なプライマーを用いて、増幅配列を生成させるべく増幅配列の生成が可能な条件下で試料を処理することと、増幅配列を検定することとを含む、試料中の対象ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドの所定のオリゴヌクレオチドフラグメントをコードする配列を有する核酸分子の存在を確定する方法が提供される。
【０１１４】
ポリメラーゼ連鎖反応は、引用により本願に組み込まれる、イニス　エム　エーおよびゲルファント　ディー　エイチ（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．ａｎｄ　Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．）、１９８９年、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、イニス　エム　エー、ゲルファント　ディー　エイチ、シンスキー　ジェー　ジェーおよびホワイト　ティー　ジェー（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｉｎｓｋｙ　Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ．Ｊ．）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］、３〜１２ページに一般的に記載されているように、標的核酸配列を増幅する方法を指す。
【０１１５】
増幅産物は、当技術分野で知られている技術を用いて、それらの各サイズに基づいて単離し、区別することが可能である。例えば、増幅後、ＤＮＡ試料をアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した後に紫外（ＵＶ）光下で可視化することが可能である。ＤＮＡは所望のレベルに増幅することができ、放射性標識またはビオチン標識されたヌクレオシド三リン酸のような検出可能なマーカーを有するヌクレオチド誘導体を組み込むためにさらなる伸長反応を行うことができる。プライマーを検出可能なマーカーで標識してもよい。検出可能なマーカーは、制限酵素および電気泳動による分離または当技術分野で知られている技術により分析することができる。
【０１１６】
ＰＣＲを用いる本発明の方法において用いることができる条件は、ハイブリッド形成および増幅反応が試料中のＤＮＡおよび適切な相補的ハイブリッド形成プライマーの存在下で進行することを可能にする条件である。ポリメラーゼ連鎖反応に適した条件は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、本願明細書に援用する、イニス　エム　エーおよびゲルファント　ディー　エイチ（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．ａｎｄ　Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．）、１９８９年、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、イニス　エム　エー、ゲルファント　ディー　エイチ、シンスキー　ジェー　ジェーおよびホワイト　ティー　ジェー（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｉｎｓｋｙ　Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ．Ｊ．）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］、３〜１２ページを参照のこと。好ましくは、ＰＣＲには好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られるポリメラーゼ（ＧｅｎｅＡｍｐキットのＴａｑポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いるか、あるいは、他の熱安定性ポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型鎖を増幅してもよい。
【０１１７】
本発明の核酸を増幅するのにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅法（Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）のような他の技術を用いることができることは理解されよう。ＬＣＲにおいては、標的鎖上に互いに隣接してハイブリッド形成する２つのプライマーが標的鎖の存在下で連結されて相補鎖を形成する（バックマン（Ｂａｃｋｍａｎ）、１９９１年、および１９８９年６月１４日公表の欧州公告出願第０３２０３０８号）。ＮＡＳＢＡは２つのプライマーを用いる連続増幅法であり、一方のプライマーはＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を組み込んでおり、第２のプライマーは標的配列の第１のプライマーに対して相補的な配列から得られるものである（マレク（Ｍａｌｅｋ）への米国特許第５，１３０，２３８号）。
【０１１８】
ベクター
本発明はまた、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に改変される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリヌクレオチドの生産を教示している。
【０１１９】
本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファージベクター、あるいは１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであってよい。これに関する特定の実施形態において、ベクターは特異的発現を可能にする。そのような特異的発現は、誘導性発現または特定の種類の細胞のみにおける発現または誘導性かつ細胞特異的発現である。誘導性ベクターのうちの特定のものは、温度および栄養添加物のような操作しやすい環境因子により発現誘導可能なベクターである。原核生物の宿主および真核生物の宿主に用いるための構成を有し誘導可能な発現ベクターを含む、本発明のこの態様に適した様々なベクターは、当業者に良く知られており、また日常的に用いられている。そのようなベクターとしては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母エピソームから、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントから、ウイルス（バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス）から得られるベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのようなプラスミド遺伝因子とバクテリオファージ遺伝因子とから得られるようなそれらの組合せに由来するベクターなどがある。これらのすべてが、本発明のこの態様による発現のために用いることができる。
【０１２０】
市販されている以下のベクターを、例として記載する。細菌用のベクターの主なものは、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−５０およびｐＱＥ−６０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＴｒｃＨｉｓおよびｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＥＴ−５（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＢＳファージミドベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＣＡＬ、ｐＥＴ−３およびｐＳＰＵＴＫ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３２−８およびｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））およびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）である。真核ベクターの主なものは、ｐＧＡＰＺ、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２／ＣＴおよびｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＣＡＴ３およびｐＧＬ３（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＸＴ１、ｐＤｕａｌ、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＥＳＣ、ＨｙｂｒｉＺＡＰ２．１、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰおよびｐＲＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ならびにｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））である。これらのベクターは、本発明のこの態様に従って当業者が使用可能な多くの市販かつよく知られたベクターの単なる例として列挙する。例えば、宿主における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適した他のプラスミドまたはベクターを、本発明のこの態様に用いることができることは理解されよう。一般的に、宿主においてポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現させるためにポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するのに適した任意のベクターが、この点で発現に用いることができる。
【０１２１】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写を誘導するプロモーターなどの適切な発現制御配列と作動可能なように連結されている。プロモーター領域は、制限部位または候補プロモーター・フラグメント、すなわちプロモーターを含む可能性があるフラグメントを導入するための部位の下流のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのようなプロモーター領域を欠くリポーター転写ユニットを備えたベクターを用いて所望の遺伝子から選択することが可能である。よく知られているように、プロモーターを含むフラグメントをベクターのＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位に導入することにより、標準的なＣＡＴ検定により検出可能なＣＡＴ活性が生じる。この目的に適したベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＡＴ３のように、よく知られており、容易に入手できる。本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターには、よく知られ、かつ容易に入手できるプロモーターだけでなく、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に得られるプロモーターも含まれる。本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知の原核プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲおよびＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターなどである。この点について適した既知の真核プロモーターは、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターのようなレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーターおよびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターなどである。
【０１２２】
増殖および発現用のベクターは一般的に、例えば、前記のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）に記載されているような選択可能なマーカーおよび増幅領域を備える。
【０１２３】
宿主細胞
本明細書で前述したように、本発明は、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に改変される宿主細胞をも教示している。
宿主細胞中のポリヌクレオチド構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するために通常の方法で用いることが可能である。対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチド産物またはそのイソ型またはその一部は、当技術分野で知られている技術を用いて適切な宿主細胞中で発現させることにより得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物または細胞株、例えば、細菌、哺乳類、酵母または他の菌類、ウイルス、植物または昆虫の細胞などがある。外来ＤＮＡを発現させるために細胞を形質転換またはトランスフェクションする方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，７０４，３６２号、マライら（Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，８０１，５４２号、マックナイトら（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，９３５，３４９号、ハーゲンら（Ｈａｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）米国特許第４，７８４，９５０号、アクセルら（Ａｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，３９９，２１６号、ゲッダルら（Ｇｏｅｄｄａｌ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，７６６，０７５号およびサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ）に所在］（すべてを本願明細書に援用する）を参照）。適切な宿主の代表的な例としては、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセスおよび枯草菌のような細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス細胞のような菌類の細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ−１、ＺＲ−７５−１、チャン（Ｃｈａｎｇ）、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞などがある。
【０１２４】
宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリヌクレオチドを発現するべく遺伝子工学的に改変することが可能である。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプ・ローディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染またはその他の方法により行うことが可能である。そのような方法は、デービスら（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）［ニューヨーク所在］およびサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ）に所在］のような多くの標準的な実験手引き書に記載されている。
【０１２５】
対象ポリペプチドの生産
本明細書において前述したように、本発明は組換え技術による本発明のポリヌクレオチドの生産についても教示している。
対象ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に付加的なアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸を加えた、または成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸を加えた（例えば、成熟型が２つ以上のポリペプチド鎖を有している場合）ポリペプチドをコードする。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を延長または短縮し、検定または生産のためのタンパク質の操作を容易にすると思われる。一般的にｉｎ　ｖｉｖｏの場合と同様に、付加的アミノ酸は細胞の酵素により処理されて成熟タンパク質から離れうる。
【０１２６】
１つまたは複数のプロ配列と融合した成熟型のポリペプチドを有する前駆体タンパク質は、不活性型のポリペプチドである可能性がある。プロ配列が除去されるとき、一般にそのような不活性な前駆体は活性化される。活性化の前にプロ配列の一部またはすべてが除去されうる。一般的に、そのような前駆体はプロタンパク質と呼ばれている。
【０１２７】
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リーダー配列（プレタンパク質と呼ばれることがある）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１つまたは複数のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、または、活性型および成熟型のポリペプチドを生産するプロセシング段階で通常除去されるリーダー配列および１つまたは複数のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードする。
【０１２８】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドを発現させるために、上記の宿主／ベクター系を培養することにより調製可能である。組換え生産される対象タンパク質またはその一部は、市販のタンパク質濃縮システムのような当技術分野で知られている技術を用い、タンパク質を塩析した後透析することにより、アフィニティクロマトグラフィーにより、あるいは陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を用いてさらに精製することができる。
【０１２９】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において哺乳類細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させることが可能である。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＤＮＡを用いてそのようなタンパク質を生産するために用いることが可能である。原核および真核宿主とともに用いるための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、前記のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）によって記載されている。
【０１３０】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般的に、発現のためのプロモーターと作動可能なように連結するべく標準的な技術を用いてベクターに挿入する。ポリヌクレオチドを、転写開始部位がリボソーム結合部位に対して５’に適切に配されるように位置づけする。リボソーム結合部位は、発現されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’に位置することになる。一般的に、開始コドン（通常ＡＵＧ）で始まりリボソーム結合部位と開始コドンとの間に位置する他の読み取り枠は存在しない。また、一般的に、発現ポリヌクレオチドの末端に翻訳停止コドンが存在し、真核宿主に用いるための構成物にポリアデニル化シグナルが存在する。転写領域の３’末端に適切に配置された転写終結シグナルもポリヌクレオチド構成物に含まれうる。
【０１３１】
翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、ペリプラズム空間または細胞外の環境へ分泌するために、適切な分泌シグナルを発現ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリヌクレオチドに対して内因性であってよく、あるいは異種のシグナルであってもよい。タンパク質の発現に用いられる微生物の細胞は、凍結−融解の繰り返し、音波処理、機械的破砕または細胞溶解剤の使用などの任意の手頃な方法、または当業者に知られている他のそのような方法により破砕することが可能である。対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸による抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーなどの既知の方法により、組換え細胞の培養物から回収し、精製することが可能である。精製には高速液体クロマトグラフィーを用いることが最も好ましい。単離および／または精製時にポリヌクレオチドが変性する場合、活性な構造を再生するためにタンパク質をリフォールディングするための良く知られた技術を用いることができる。
【０１３２】
本発明の核酸分子は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システム、例えば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のｐＧＥＸ−１Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘにクローニングすることができる。融合遺伝子は、ＩＰＴＧにより高レベルの発現を誘導し得る強力なｌａｃプロモーターを調節要素として含むことができる。融合産物から所望のポリペプチドをタンパク質分解により切断することを可能にするトロンビンまたはＸａ因子切断部位が存在してもよい。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−対象ポリペプチド融合タンパク質は、例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製のグルタチオン・セファロース４Ｂカラムを用いて容易に精製することができる。２６ｋＤａのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを、トロンビン（ｐＧＥＸ−１ＴまたはｐＧＥＸ−２Ｔ）またはＸａ因子（ｐＧＥＸ−３Ｘ）により切断し、同じアフィニティカラムを用いてポリペプチドから分離することが可能である。必要ならば、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、登録商標）またはＤＥＡＥセルロースを用いた追加のクロマトグラフ工程を含めることが可能である。２つの酵素をタンパク質および酵素検定法によりモニターし、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認することができる。
【０１３３】
対象タンパク質またはその一部を、固相合成（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９６４年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．第８５巻、２１４９〜２１５４ページ）または均一溶液中の合成（ホウベンウェイルら（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ワンシュ　イー（Ｗａｎｓｃｈ　Ｅ．）（編）、第１５巻、ＩおよびＩＩ、ティーム（Ｔｈｉｅｍｅ）［ドイツ所在］）のようなタンパク質の化学においてよく知られている技術を用いて化学合成によって調製することもできる。
【０１３４】
本発明の背景において、対象ポリペプチドは生物学的活性を有する様々な構造型の一次タンパク質を含む。例えば、対象ポリペプチドは酸性塩または塩基性塩の形もしくは中性の形であってよい。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化または還元により修飾されていてよい。さらに、最終的な効果としては対象ポリペプチドの生物学的活性が保持されるようにしつつ、様々な置換、削除または付加をアミノ酸または核酸配列に対して行うことができる。コードの縮重のため、例えば、同じアミノ酸をコードするヌクレオチド配列中にかなりの変動が存在しうる。
【０１３５】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような修飾された形態で発現可能であり、また分泌シグナルだけでなく付加的な異種の機能領域も備えることができる。したがって、精製時またはその後の取扱いおよび保存時の宿主細胞中の安定性および持続性を改善するために、例えば、付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端に付加してもよい。また、精製を容易にするために、融合タンパク質をポリヌクレオチドまたはポリペプチドに付加してもよい。そのような領域は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。とりわけ、分泌または排出を誘発するため、安定性を改善するため、または精製を容易にするために、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当技術分野では通常かつ常用の技術である。例えば、薬物の発見において、アンタゴニストを特定するためのハイスループットスクリーニング検定を目的としてタンパク質が抗体のＦｃ部分と融合されている（ベネットら（Ｂｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．第８巻、５２〜５８ページおよびジョハンソンら（Ｊｏｈａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻、９４５９〜９４７１ページ）。
【０１３６】
抗体
タンパク質を用いる検査に関して、エロンガーゼ遺伝子産物に対する抗体を標準的な免疫学的技術、本明細書に記載した融合タンパク質または合成ペプチドを用いて生成させることが可能である。モノクローナル抗体を、ワルドマン　ティー　エー（Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｔ．Ａ．）、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、１６５７〜１６６２ページおよびハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］に記載されているような現在では通常の技術を用いて生産することも可能である。抗体フラグメント、すなわちＦａｂ’フラグメントを同様に用いることが可能であることも理解できよう。免疫検定法、例えば、被検試料を抗体と接触させ遺伝子産物への結合を検出するエライザ（ＥＬＩＳＡ）は、エロンガーゼ遺伝子産物の存在および量を測定する迅速かつ効率のよい方法を提供し得る。例えば、抗体を用いて、臨床試験に登録された被験者における医薬品の効果を試験することが可能である。
【０１３７】
したがって、本発明はまた、対象ポリペプチドおよびそのフラグメントに、もしくは対象ポリヌクレオチド領域、特に対象ポリペプチドの遺伝子座またはその一部のポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントならびにそれらの免疫学的な結合性を有する同等物も提供する。「抗体」という用語は、均質な分子の実体または複数の異なる分子の実体からなる血清製剤のような混合物の両方を称するのに用いられる。ポリペプチドをペプチド合成機で合成により調製し、担体分子（例えば、カサガイヘモシアニン）と結合させ、ウサギに数カ月にわたり注射してもよい。ウサギ血清を対象ポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体は、該タンパク質のポリペプチド、融合タンパク質またはそれらのフラグメントをマウスに注射することにより生産することができる。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、対象ポリペプチドまたはそのフラグメントとの特異的な免疫反応性について試験する（ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］）。これらの抗体は、検定だけでなく医薬品においても有用である。
【０１３８】
十分な量の所望のポリペプチドが得られたならば、様々な目的に用いることができる。一般的な用途は、特異的に結合する抗体の生産である。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよく、当技術分野でよく知られているｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏの手法により生産することができる。ポリクローナル抗体を生産するために、適切な標的免疫系、一般的にマウスまたはウサギを選択する。実質的に精製された抗原を、該動物に適した方法および免疫学者によく知られている他のパラメーターによって決まる仕方で免疫系に与える。一般的な注射の経路は、足蹠、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、他の動物種をマウスまたはウサギの代わりに用いてもよい。次いで、ポリクローナル抗体を当技術分野において知られている手法を用いて精製し、所望の特性が得られるように調整する。
【０１３９】
免疫学的反応は通常免疫検定法により検定する。通常、そのような免疫検定法は、例えば抗原と同じ細胞により同じ方法で産生された、抗原の供給源のある程度の精製を必要とする。ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］またはゴーディング　ジェー　ダブリュー（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ［米国ニューヨーク所在］に記載されているような、様々な免疫検定法が当技術分野においてよく知られている。
【０１４０】
１０８Ｍ−１または好ましくは１０９から１０１０Ｍ−１の、またはより強い親和性を有するモノクローナル抗体は一般的に、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］またはゴーディング　ジェー　ダブリュー（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ［米国ニューヨーク所在］に記載されているような標準的方法により調製されるであろう。その概要を述べると、適切な動物を選択し、望ましい免疫化プロトコールに従う。適切な期間の後に、その動物の脾臓を切除し、個々の脾臓細胞を適切な選択条件下で一般に不死化骨髄腫細胞に融合させる。その後、細胞をクローニングにより分離し、各クローンの上清を、抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体の産生について試験する。
【０１４１】
他の適切な手法は、リンパ球を抗原性ポリペプチドにｉｎ　ｖｉｔｒｏで曝露させること、あるいはファージまたは類似のベクター中の抗体ライブラリーのを選択することを伴う（フーセら（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１ページ）。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾を施して、あるいは施さずに用いることができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合させることにより標識されるであろう。様々な標識および複合の手法が知られており、科学および特許文献のいずれにも広範に報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害物質、蛍光物質、化学発光体、磁気粒子等がある。そのような標識の使用を教示している特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号などである。また、組換え免疫グロブリンを生産してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【０１４２】
対象ポリヌクレオチドに対するポリクローナル抗体の生成
対象ポリヌクレオチドコード配列の配列を大腸菌内で融合タンパク質として発現させる。過剰発現したタンパク質をゲル溶離により精製し、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］により記載された方法に類似の方法を用いてウサギおよびマウスを免疫する。この方法は、他の様々なタンパク質に対する抗体を発生させることが示されている（例えば、クレマーら（Ｋｒａｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．、第３４巻、６６３〜６７１ページ）。
【０１４３】
概要を示すと、対象ポリヌクレオチドから選択した一続きのコード配列をプラスミドｐＥＴ５Ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州）またはｐＭＡＬシステム（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）に融合タンパク質としてクローニングする。ＩＰＴＧによる誘導の後、予想された分子量を有する融合タンパク質が過剰発現していることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより立証する。融合タンパク質を電気溶出によりゲルから精製する。対象ポリペプチド融合産物としてのタンパク質の同定は、Ｎ末端におけるタンパク質配列決定により立証することが可能である。次に、精製タンパク質をウサギにおいて免疫原として用いる。ウサギを完全フロイント・アジュバント中の１００μｇタンパク質で免疫し、３週間間隔で２回、最初は不完全フロイント・アジュバント中の１００μｇの免疫原を、その後ＰＢＳ中の１００μｇの免疫原を追加投与する。その２週間後に抗体を含む血清を採取する。
【０１４４】
この手順を繰り返して、対象ポリペプチドの突然変異型に対する抗体を生成させる。これらの抗体を野生型の対象ポリペプチドに対する抗体とともに用いて、種々の組織および体液中の突然変異型の存在および相対レベルを検出する。
【０１４５】
対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の生成
以下のプロトコールに従ってモノクローナル抗体を生成させる。マウスを、よく知られているようにグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてカサガイヘモシアニンに結合させた完全な対象ポリペプチドまたはそのペプチド（野生型または突然変異体）からなる免疫原で免疫する。
【０１４６】
免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに１０から１００μｇの免疫原を４回注射し、４回目の注射後に、血清が免疫原に対する抗体を含んでいるかどうかを調べるためマウスから血液試料を採取する。血清の力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清を有するマウスをハイブリドーマの生産のために選択する。
【０１４７】
免疫マウスから脾臓を摘出し、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］に記載されているように、単一細胞懸濁液を調製する。細胞融合は、本質的にコーラー　ジーおよびミルスタイン　シー（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．）、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページにより記載されているように実施する。その概要を記載すると、Ｐ３．６５．３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））をハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨークコールドハーバー所在］により記載されているようにポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を９６ウエル組織培養プレートを用いて２×１０５細胞／ウエルの密度に蒔く。個々のウエルを生育について調べ、生育の見られるウエルの上清を対象ポリペプチド特異抗体の存在について、野生型または突然変異型の標的タンパク質を用いてＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検査する。陽性ウエル中の細胞を、確立してモノクローン性を確認するべく増殖させ、サブクローニングする。
【０１４８】
特徴付けおよび検定法開発用の十分な量の抗体を生産するため、所望の特性を有するクローンをマウスの腹水症として、または中空ファイバーシステム中で拡大かつ増殖させる。
【０１４９】
対象ポリペプチドのサンドイッチ検定法
モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のような固体表面に付着させる。抗体を９６ウエルのエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートのウエル表面に付着させることが好ましい。対象ポリペプチド／タンパク質（野生型または突然変異体）を含む１００μｌの試料（例えば、血清、尿、組織の細胞質ゾル）を固相抗体に加える。試料を室温で２時間インキュベートする。次に、容器を傾けて試料液を除き、結合していない物質を除去するために固相を緩衝液で洗浄する。１００μｌの第２のモノクローナル抗体（対象ポリペプチド／タンパク質上の異なる決定基に対する抗体）を固相に加える。この抗体を検出用分子または原子（例えば、１２５Ｉ、酵素、蛍光団または発色団）で標識し、第２抗体の結合した固相を室温で２時間インキュベートする。容器を傾けて第２抗体を除き、結合していない物質を除去するために固相を緩衝液で洗浄する。
【０１５０】
試料中に存在する対象ポリペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の量を定量する。野生型対象ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体ならびに対象ポリペプチドにおいて同定された突然変異のそれぞれに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて別個の検定を行う。
【０１５１】
脂質代謝の影響を受ける疾患の存在または素因の検出およびその治療のモニタリング
先に論述したように、疾患においては脂質代謝が無調節であることが多い。エロンガーゼ遺伝子における遺伝的多形が疾患感受性に寄与している可能性がある。
【０１５２】
本明細書に開示する対象ポリヌクレオチドは、診断ツールとして、対象ポリヌクレオチドの遺伝的多形の検出または対象ポリヌクレオチドの発現レベルの変動の検出に有用である。真核生物、詳細には哺乳類、特にヒトにおける対象ポリヌクレオチドの異常な型、あるいは対象ポリヌクレオチドの発現レベルの減少または増加を検出することにより、疾患の診断の方法が提供されるであろう。対象ポリヌクレオチドの遺伝的多形または対象ポリヌクレオチドの発現の変化を示す真核生物（本明細書では「個体」でもある）、詳細には哺乳類、特にヒトは、種々の技術により検出することができる。
【０１５３】
エロンガーゼ遺伝子は広く発現しているので、対象の被検試料は、血液を含む様々な組織から得ることが可能である。エロンガーゼ遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質は羊水においても評価することが可能であるので、エロンガーゼ遺伝子の試験を出生前検査のパネルに含めることも可能である。したがって、エロンガーゼ遺伝子転写物および遺伝子産物の定量的検査も本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１５４】
エロンガーゼ遺伝子における遺伝的多形をスクリーニングする核酸およびタンパク質に基づく方法はすべて、本発明の教示内容の範囲内にある。例えば、エロンガーゼ遺伝子の配列を知れば、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを構築し、通常の技術を用いて血液のような組織中のゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成によりエロンガーゼ遺伝子の突然変異を検出するために用いることが可能である。エロンガーゼ遺伝子の突然変異または発現の量的変化をスクリーニングするために、ＲＮＡプローブまたはｃＤＮＡプローブを同様に検索することが可能である。異なるプローブの混合物、すなわち「プローブカクテル」も複数の突然変異の検査に用いることが可能である。
【０１５５】
核酸に基づく検査に関しては、ゲノムＤＮＡを、特定の配列の検出に直接に用いることができ、または、分析の前にＰＣＲを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで酵素的に増幅することができる（サイキら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１３５０〜１３５３ページおよびサイキら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、１６３〜１６６ページ）。この主題の総説は、カスキー　シー　ティー（Ｃａｓｋｅｙ　Ｃ．Ｔ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３６巻、１２２３〜１２２８ページにより、またランデグレンら（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、２２９〜２３７ページにより公開されている。特定のＤＮＡ配列の検出は、特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリッド形成（ワラスら（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第５１巻、２５７〜２６１ページ）、ダイレクトＤＮＡシーケンシング（チャーチら（Ｃｈｕｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８１巻、１９９１〜１９９５ページ）、制限酵素の使用（フラベルら（Ｆｌａｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７８年、Ｃｅｌｌ、第１５巻、２５〜４１ページ、ギーバーら（Ｇｅｅｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７８巻、５０８１〜５０８５ページ）、変性剤を含むゲル中の電気泳動の移動度に基づく識別（マイヤーズら（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第５１巻、２７５〜２８４ページ）、ＲＮａｓｅプロテクション（マイヤーズら（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１２４２〜１２４６ページ）、化学的切断（コットンら（Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８５巻、４３９７〜４４０１ページ）およびリガーゼ媒介検出法（ランデグレンら（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４１巻、１０７７〜１０８０ページ）のような方法により実現することができる。ＰＣＲを用いて、個体に存在する対象ポリヌクレオチドのレベルまたは状態の特徴付けを比較分析により行うことができる。
【０１５６】
タンパク質に基づく検査に関しては、本明細書に記載のように標準的な免疫学的技術、融合タンパク質または合成タンパク質を用いて、エロンガーゼ遺伝子産物に対して抗体を生成させることが可能である。
【０１５７】
エロンガーゼ遺伝子産物およびその機能の特徴づけを用いて、エロンガーゼ遺伝子の診断およびスクリーニングならびに治療のモニターに、機能検定を用いることも可能である。例えば、エロンガーゼ遺伝子または産物の直接的なスクリーニングではなく、遺伝子機能のレベルを調べる酵素学的検査を用いることが可能である。この種の検査は、テイ−サックス病におけるように他の疾患および状態に用いられている。
【０１５８】
したがって、本発明は、対象ポリヌクレオチドの発現の変化または突然変異を検出するための当技術分野で知られている方法および本明細書に記載の方法を用いることにより疾患を検出する方法を提供する。例えば、対象ポリヌクレオチドの発現の低下を、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロット法および他のハイブリッド形成法などのポリヌクレオチドの定量のための当技術分野で知られている方法のいずれか１つを用いて測定することが可能である。したがって、本発明は、脂質代謝の影響を受ける疾患を検出する方法、ならびに湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症などの疾患の遺伝的素因を検出する方法を提供する。
【０１５９】
薬物スクリーニング検定
本明細書の教示により、脂肪酸結合性分子との相互作用のような対象ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増大する化合物（アゴニスト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）を特定するための化合物のスクリーニング方法が提供される。遺伝性の脂肪酸の障害における対象ポリヌクレオチドの特定は、遺伝子組換え法（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ）の分野における進歩と相まって、ヒトの疾患をさらに研究するのに必要な情報を提供するものである。これは、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症を含む、家族性の脂肪酸障害および脂肪酸代謝の他の疾患をモデル化するうえで極めて有用である。薬物スクリーニング検定は、酵母を用いるＤＮＡ−タンパク質相互作用検定（酵母ワン・ハイブリッド）における本発明で述べている遺伝子の制御領域またはその一部の使用により有効になる。薬物スクリーニングのための酵母タンパク質−タンパク質相互作用（ツー・ハイブリッド）またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用検定における本明細書に記載の遺伝子もしくはその一部または転写ＲＮＡの使用も、有効な薬物スクリーニング法を提供する。そのような相互作用する分子を、薬物スクリーニングの目的で、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで再構成することも可能である。
【０１６０】
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのために、合成反応の混合物、膜、細胞包膜もしくは細胞壁のような細胞画分、またはそのいずれかの調製物を、対象ポリヌクレオチドに結合する分子を発現する細胞から調製することができる。調製物を、アゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある候補分子の非存在下または存在下で標識ポリヌクレオチドとともにインキュベートする。候補分子が結合性分子に結合する能力は、標識リガンドの結合性の低下に反映される。
【０１６１】
潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストの作用は、例えば、候補分子と細胞または適切な細胞調製物との相互作用の後にリポーターシステムの活性を測定し、作用をベースライン（対照）測定結果と比較することにより、測定することができる。この点で有用と思われるリポーターシステムは、産物に変換される比色定量用標識基質、エロンガーゼ酵素活性の変化に応答するリポーター遺伝子および当技術分野で知られている結合試験を含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
アンタゴニストの検定の他の例は、競合的阻害試験用の適切な条件下で、対象ポリペプチドおよび潜在的なアンタゴニストを、膜に結合した対象ポリペプチド結合性分子、組換えの対象ポリペプチド結合性分子、天然の基質またはリガンド、もしくは基質またはリガンドの擬態物と組み合わせる競合試験である。潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために、結合性分子に結合または産物に変換される対象ポリペプチド分子の数を正確に測定することができるように、対象ポリペプチドを放射能または比色定量用化合物などで標識することが可能である。
【０１６３】
潜在的アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消失させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などである。潜在的アンタゴニストは、対象ポリペプチドによって誘導される活性を誘導することなく、結合性分子上の同じ部位に結合し、その結果、対象ポリペプチドの結合を遮断することにより対象ポリペプチドの作用を妨げる、密接に関連するタンパク質または抗体のような小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。潜在的アンタゴニストとして、アンチセンス分子（オカノら（Ｏｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、ＥＭＢＯ　Ｊ．第７巻、３４０７〜３４１２ページ）などが挙げられる。潜在的アンタゴニストは、対象ポリペプチドに関連する化合物およびその誘導体などである。
【０１６４】
潜在的アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それにより、その活性を阻害または消失させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などである。潜在的アンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸ならびにそれらの化学的および機能的誘導体からなる群から選択することができる。
【０１６５】
特定のエロンガーゼの生物学的活性のモジュレーターの開発には、個々の検定用調製物に存在するエロンガーゼイソ酵素を区別する必要がある。天然の組織供給源からエロンガーゼを単離し、各々の新規なイソ酵素を研究するという古典的アプローチを用いてもよい。他のアプローチは、１つのイソ酵素の寄与に有利で、調製物中の他のイソ酵素の寄与を最小限にするような検定条件を特定することである。さらに他のアプローチは、免疫学的手段によるエロンガーゼの分離である。エロンガーゼイソ酵素を区別する前記のアプローチは、時間がかかるものである。そのため、複数のイソ酵素を含む調製物を用いて、選択的なエロンガーゼ・モジュレーターを開発する多くの試みが行われた。さらに、天然の組織供給源からのエロンガーゼ調製物は限定的タンパク質分解を受けやすく、完全長のエロンガーゼと異なる速度論的特性、調節特性および生理学的特性を有する活性のあるタンパク質分解産物の混合物を含んでいる可能性がある。
【０１６６】
本発明の組換え対象ポリペプチド産物は、新規かつ特異的なモジュレーターの開発を著しく促進する。内因性エロンガーゼ活性を欠く宿主細胞中でイソ酵素を組換えにより発現させることによって、イソ酵素を精製する必要を回避可能である。エロンガーゼの活性を調節する化合物が発見されたならば、特定の対象酵素に対するその活性を他のエロンガーゼイソ酵素に対するその活性と比較することにより、その選択性を評価することが可能である。したがって、一連の独立した検定における本発明の組換え対象ポリペプチド産物と他の組換えエロンガーゼ産物との組合せが、特定のエロンガーゼの選択的モジュレーターを開発するためのシステムを提供する。選択的モジュレーターとしては、例えば、対象ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体および他のタンパク質またはペプチド、対象ポリペプチド（標的生体分子に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する方法を記載している特許協力条約国際公開第ＷＯ９３／０５１８２号を参照）または対象ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的に結合する他の非ペプチド性の天然または合成化合物などがある。対象ポリペプチドの酵素活性または細胞内のその局在性を変化させる対象ポリヌクレオチドの突然変異型も考えられる。単独およびモジュレーターと結合した組換え対象ポリペプチドの結晶化、Ｘ線結晶学による原子構造の解析およびそれらの構造のコンピュータモデリングは、非ペプチド性の選択的モジュレーターの設計と最適化とに有用な方法である。構造に基づく薬物設計の一般的総説については、例えば、エリクソンら（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第２７巻、２７１〜２８９ページを参照のこと。
【０１６７】
選択的モジュレーターの開発の標的は、例えば（１）他のタンパク質に接触かつ／または対象エロンガーゼを細胞内に局在化する、対象エロンガーゼの領域、（２）基質に結合する対象エロンガーゼの領域、および（３）対象ポリペプチドのリン酸化部位などである。
【０１６８】
したがって、本発明は、脂質により影響を受ける障害を促進する化合物をスクリーニングし、選択する方法を提供する。また、本発明は、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症などの脂質代謝に関連する疾患ならびに脂質代謝に必ずしも関連しない他の疾患を治療またはその進行を抑制する化合物をスクリーニングし、選択する方法を提供する。
【０１６９】
エロンガーゼ遺伝子のＤＮＡ制御領域、ＣＤＳおよびＲＮＡに関するタンパク質相互作用検定
タンパク質相互作用は、細胞内の事実上あらゆる生物学的プロセス、例えば、代謝、輸送、シグナル伝達および疾患に密接に関連している。酵母ツー・ハイブリッドおよびワン・ハイブリッド・システムの開発により、ｉｎ　ｖｉｖｏでのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用を研究し、特定することが可能になった（フィールズ　エスおよびソング　オー（Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ａｎｄ　Ｓｏｎｇ　Ｏ．）、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページ、ウルマソフら（Ｕｌｍａｓｏｖ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７６巻、１８６５〜１８６８ページ、フルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ、およびギウリスら（Ｇｙｕｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｃｅｌｌ、第７５巻、７９１〜８０３ページ）。これらの相互作用は細胞の機能にとって重要なものであるので、相互作用するパートナーを特定することが、機能および病態への関与の解明に向けての第１段階である。そのような相互作用を調節する（阻害または活性化する）新規な化学物質は、ヒト、動物ならびに植物の疾患において著しい製薬上および治療上の利益をもたらすと思われる。鉄芽球性貧血患者において、スクシニルＣｏＡシンテターゼとヘム生合成酵素δ−アミノレブリン酸シンターゼ−Ｅ（ＡＬＡＳ−Ｅ）との間の相互作用が阻害されていることが現在知られている（フルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ）。小分子−ＲＮＡ相互作用によるヒト細胞における遺伝子発現の阻害が最近説明された（ファンら（Ｈｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９６巻、１２９９７〜１３００２ページ）。タンパク質−ＲＮＡ阻害技術の使用は、抗ＨＩＶ療法の開発への有望なアプローチである（ハミーら（Ｈａｍｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９４巻、３５４８〜３５５３ページおよびメイら（Ｍｅｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、１４２０４〜１４２１２ページ）。
【０１７０】
薬物デザイン
本発明のアンタゴニストおよびアゴニストならびにその他の化合物は、単独または治療用化合物のような他の化合物とともに用いることができる。医薬組成物は、例えば、罹患部位に直接マイクロインジェクションすることにより、または静脈内もしくは他の経路により投与するなどの任意の効果的で都合のよい方法で投与可能である。本発明の組成物を、対象者に投与するのに適した医薬の担体のような、細胞、組織もしくは生物とともに使用するための非滅菌または滅菌済の１つまたは複数の担体と組み合わせて使用してもよい。そのような組成物は、例えば、媒体添加物または治療上有効な量の本発明のアンタゴニストもしくはアゴニストおよび医薬として許容可能な担体もしくは賦形剤からなる。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せがあるがこれらに限定されない。製剤は投与方法に適するように調製される。
【０１７１】
エロンガーゼ遺伝子機能の調節は、エロンガーゼの構造または機能の様々な側面と相互作用するようにデザインし得る治療薬または薬物を使用することにより達成することが可能である。例えば、薬物または抗体は、タンパク質の折りたたみ構造に結合して、欠陥のある構造を是正し得る。あるいは、薬物は特定の機能残基に結合して、基質または補因子に対するその親和力を増加させ得る。薬物または作用物質の有効性は、欠陥のあるエロンガーゼが発現する細胞系中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで調節をモニターするスクリーニングプログラムにより確認することが可能である。
【０１７２】
あるいは、そのようなタンパク質の構造と機能との相関についての知見、および様々な突然変異タンパク質における特異的欠陥についての知見から、エロンガーゼ遺伝子のタンパク質の活性を調節するように薬物をデザインすることが可能である（コプゼイら（Ｃｏｐｓｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇｓ、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク）。
【０１７３】
遺伝子治療
対象ポリヌクレオチドの発現をｉｎ　ｖｉｖｏで調節するために、本発明による種々の遺伝子治療法を用いることができる。例えば、アンチセンスＤＮＡ分子を工学設計し、対象ポリヌクレオチドのｍＲＮＡの翻訳をｉｎ　ｖｉｖｏで遮断するために用いることができる。代替案としては、対象ポリヌクレオチドのｍＲＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏで切断し破壊するためにリボザイム分子を設計することができる。別の選択肢では、対象ポリヌクレオチドの５’領域（コード配列の上流の領域を含む）とハイブリッド形成し、３重らせん構造を形成するように設計したオリゴヌクレオチドを用いて、対象ポリヌクレオチドの転写を阻害または減少させることができる。さらに別の選択肢では、完全長の野生型対象ポリヌクレオチドをコードする核酸を、さもなければ野生型対象ポリヌクレオチド産物を十分な量であるいは全く産生することができない細胞にｉｎ　ｖｉｖｏで導入することができる。
【０１７４】
例えば、従来の置換療法では、遺伝子産物またはその機能上の同等物を治療上有効な量で患者に投与する。エロンガーゼは、ドイチャー　エム（Ｄｅｕｔｃｈｅｒ　Ｍ．）（編）１９９０年、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１８２巻に記載されているような通常の手法を用いて精製することが可能である。治療用の十分な量の遺伝子産物またはタンパク質は、例えば、培養細胞系または合成による製造により得ることが可能である。遺伝子産物を刺激または置換する薬物療法も用いることが可能である。送達媒体およびスキームを、特定の標的遺伝子に合わせて特別に調整することが可能である。
【０１７５】
遺伝子を患者の細胞またはベクター（患者に遺伝子産物をｉｎ　ｖｉｖｏで供給する）に送達するための組換え技術を用いる遺伝子治療も、本発明の範囲内である。レトロウイルスは、体細胞遺伝子治療における実験用の好ましいベクターとみなされており、感染効率が高く、安定な組込みと発現を示す（オーキンら（Ｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．第７巻、１３０〜１４２ページ）。例えば、エロンガーゼｃＤＮＡをレトロウイルスベクターにクローニングし、その内因性プロモーターから、またはレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列）から駆動することができる。使用可能な他の送達系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（マクラウフリンら（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６２巻、１９６３〜１９７３ページ）、ワクシニアウイルス（モスら（Ｍｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５巻、３０５〜３２４ページ）、ウシパピローマウイルス（ラスムッセンら（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１３９巻、６４２〜６５４ページ）またはエプスタインバーウイルスのようなヘルペスウイルス群のメンバー（マルゴルスキーら（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第８巻、２８３７〜２８４７ページ）などである。
【０１７６】
アンチセンス、リボザイムおよび３重らせんヌクレオチドを、対象ポリヌクレオチドの翻訳または転写を阻害するようにデザインする。これを実現するためには、使用するオリゴヌクレオチドを、対象ポリヌクレオチドに特有の適切な配列に基づいてデザインすべきである。例えば、限定の意図はないが、オリゴヌクレオチドは、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が他のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とほぼ相同である領域（本明細書では「固有領域」と称する）の中にあるべきでない。
【０１７７】
アンチセンス分子の場合、配列を固有領域から選択することが好ましい。また、配列の翻訳を防ぐべく標的ｍＲＮＡ配列との十分に強いアニーリングを実現するために、配列の長さが少なくとも１８ヌクレオチドであることも好ましい（イザント　ジェー　ジーおよびワイントラウプ　エッチ（Ｉｚａｎｔ　Ｊ．Ｇ．ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ．）、１９８４年、Ｃｅｌｌ、第３６巻、１００７〜１０１５ページおよびローゼンブルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１３巻、７０３〜７０６ページ）。
【０１７８】
「ハンマーヘッド」タイプのリボザイムの場合、リボザイムの標的配列を固有領域から選択することも好ましい。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡの少なくとも一部とヌクレオチド配列が相補的であるハイブリッド形成領域と標的ＲＮＡを切断するように構成された触媒領域とからなる。ハイブリッド形成領域は、９個またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいる。したがって、該ハンマーヘッドリボザイムは、上記の配列と相補的であり、長さが少なくとも９ヌクレオチドであるハイブリッド形成領域を有する。そのようなリボザイムの構成と生産は当該技術分野においてよく知られており、ハーゼロフ　ジェーおよびゲルラヒ　ダブリュ　エル（Ｈａｓｅｌｏｆｆ　Ｊ．ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ　Ｗ．Ｌ．）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５８５〜５９１ページにより十分に記載されている。
【０１７９】
リボザイムには、天然にＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡとして知られている）、トーマス　セヒ（Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｅｃｈ）および共同研究者らにより広範に記載されている（ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２４巻、５７４〜５７８ページ、ザウ　エー　ジェーおよびセヒ　ティー　アール（Ｚａｕｇ　Ａ．Ｊ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、４７０〜４７５ページ、ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、４２９〜４３３ページ、特許公開条約国際特許出願公開第ＷＯ８８／０４３００号、ビーン　エム　ディーおよびセヒ　ティー　アール（Ｂｅｅｎ　Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｃｅｌｌ、第４７巻、２０７〜２１６ページ）ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈタイプリボザイム」と称する）も含まれる。Ｃｅｃｈエンドリボヌクレアーゼは、標的ＲＮＡ配列とハイブリッド形成し、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対の活性部位を有する。Ｃｅｃｈタイプリボザイムの標的である８塩基対の活性部位配列は、対象ポリヌクレオチドに存在するが、エロンガーゼの他のポリヌクレオチドには存在しない。
【０１８０】
化合物は、送達媒体としてのリポソームの使用を含むがこれに限定されない、当技術分野において知られている様々な方法により投与することが可能である。裸のＤＮＡまたはＲＮＡも、末端の修飾、環状分子の形成、もしくはホスホチオネートおよびチオホスホリル修飾された結合などの別の結合の使用により、分解に対して抵抗性のある形態である場合には使用することができる。さらに、核酸の送達は、核酸分子がポリリシンまたはトランスフェリンに結合している促進輸送によってもよい。核酸を、レトロウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むがこれらに限定されない様々なウイルス担体のいずれかにより細胞内に輸送することもできる。
【０１８１】
代替案として、そのようなアンチセンス、リボザイム、３重らせんもしくは対象ポリヌクレオチド分子をコードするかまたはこれらのいずれかである組換え核酸分子を構築することが可能である。核酸分子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。仮に核酸がＲＮＡをコードしている場合、所望のＲＮＡ産物が十分なコピー数生産されるように、その配列を調節要素に作動可能なように連結させることが好ましい。調節要素により、配列の恒常的または制御された転写が可能にする。１つまたは複数のＲＮＡをコードする細菌プラスミドまたはウイルスＲＮＡもしくはウイルスＤＮＡのような転移ベクターを、細胞または生物の細胞内にトランスフェクションすることができる（レウェリンら（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９５巻、１１５〜１２３ページ、ハナハンら（Ｈａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻、５５７〜５８０ページ）。ひとたび細胞内に入れば、転移ベクターは複製することができ、細胞内のポリメラーゼにより転写されてＲＮＡを生産するか、または宿主細胞のゲノムに組み込まれることもある。あるいは、転移ベクターまたはその一部が宿主細胞のゲノムに組み込まれるように、１つまたは複数のＲＮＡをコードする配列を含む転移ベクターをマイクロインジェクションのようなマイクロマニュピュレーション法により細胞にトランスフェクションするか、細胞に導入することができる。
【０１８２】
医薬組成物の組成、製剤および投与
本発明の医薬組成物は、それ自体知られている方法、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣丸調製、研和、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程により製造することができる。
【０１８３】
したがって、本発明に従って使用する医薬組成物は、医薬として使用し得る製剤への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容できる担体を用いて通常の方法で調合することができる。適切な製剤は、選択する投与経路によって決まる。
【０１８４】
注射の場合、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液を用いて調合することができる。経粘膜投与の場合、透過すべきバリアに適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般的に知られている。
【０１８５】
経口投与の場合、活性化合物を当分野でよく知られた医薬として許容できる担体と混合することにより、該化合物を容易に調合することが可能である。そのような担体は、本発明の化合物を、治療を受ける患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等に調合することを可能にする。経口投与用の医薬製剤は、望ましければ錠剤または糖衣丸コアを得るために適切な補助剤を添加した後に、固体賦形剤を用いて（任意選択で得られた混合物を粉砕し、粒剤の混合物を処理して）得ることが可能である。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖またはセルロース調製物（例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）のような、増量剤である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムを始めとするその塩のような崩壊剤を加えてもよい。
【０１８６】
糖衣丸コアには、適切なコーティングを施す。この目的のために、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含みうる高濃度の糖溶液を用いることができる。識別または活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、染料または色素を錠剤または糖衣丸コーティングに加えてもよい。
【０１８７】
経口で使用し得る医薬製剤には、ゼラチン製の押込みばめカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤とで調製した軟性封入カプセルなどがある。押込みばめカプセルには、ラクトースのような増量剤、デンプンのような結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、および任意選択で安定剤との混合物の形で有効成分を含めることが可能である。軟性カプセルにおいては、活性化合物は脂肪油、流動パラフィンもしくは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した用量のものであるべきである。
【０１８８】
口腔内投与の場合、組成物は通常の方法で調合した錠剤またはトローチ剤の形態とすることができる。
吸入投与の場合、本発明に従って使用する化合物を、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスを用いた加圧容器または噴霧器からのエアゾール噴霧の形で適宜送達する。加圧エアゾールの場合、用量単位は一定量を送達する弁を設けることにより決定することができる。吸入器または吹き入れ器において使用するカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン）を、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含めて製剤化することができる。
【０１８９】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存料を加えて単位用量の剤形（例えばアンプルまたは複数回分容器入り）とすることができる。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁剤、溶液または乳剤のような形態とすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような調合助剤を含んでいてよい。
【０１９０】
非経口投与用医薬製剤としては、水溶性の形態の活性化合物の水溶液などがある。さらに、活性化合物の懸濁剤を適切な油性懸濁注射剤として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどがある。水性懸濁注射剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁剤の粘度を高める物質を含んでもよい。任意選択で、懸濁剤は、適切な安定化剤や、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を高める作用物質を含んでもよい。
【０１９１】
あるいは、有効成分は、使用前に適切な媒体（例えば発熱物質非含有滅菌水）で構成するために粉末状でもよい。
化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸剤のような直腸内組成物として製剤化してもよい。
【０１９２】
前述の製剤に加えて、化合物をデポ製剤として調合してもよい。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば化合物を適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば許容し得る油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として製剤化してもよい。
【０１９３】
本発明の疎水性化合物用の医薬用担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子および水相からなる共溶媒系である。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特性を失うことなく、大幅に変えてもよい。さらに、共溶媒成分の実体を変えてもよい。
【０１９４】
あるいは、疎水性医薬化合物の他の送達系を用いることができる。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物の送達媒体または担体のよく知られている例である。通常毒性がより大きいという犠牲を払うが、ジメチルスルホキシドのような特定の有機溶媒も用いることができる。さらに、化合物は、治療薬を含む疎水性固体高分子の半透過性マトリックスのような徐放性システムを用いて送達することができる。様々な徐放性材料が確立されており、当業者によく知られている。徐放性カプセル剤は、それらの化学的性質によって、化合物を数週間から最長１００日間にわたり放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性によっては、タンパク質の安定化のために追加の戦略を用いてもよい。
【０１９５】
医薬組成物は、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのような高分子などがあるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本発明の化合物の多くは、医薬として適合しうる対イオンを有する塩として提供されうる。医薬として適合しうる塩は、塩化水素、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがこれらに限定されない多くの酸を用いて形成可能である。塩は、対応する遊離塩基形よりも、水性または他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。
【０１９７】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸内、経粘膜、経皮または腸内投与、または筋肉内注射、皮下注射、脊髄内注射、ならびに髄膜内注射、脳室内への直接注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射もしくは眼内注射などの非経口的送達である。
【０１９８】
あるいは、化合物を全身的でなく局所的に、例えば、罹患部位への化合物の直接注射により、しばしばデポ製剤または徐放性製剤として投与することができる。
【０１９９】
さらに、薬剤を標的指向型薬物送達系、例えば、罹患細胞に特異的な抗体で被覆したリポソームに入れて投与することができる。そのリポソームは、その細胞を標的とし、その細胞によって選択的に取り込まれるであろう。
【０２００】
医薬組成物は一般的に、特定の１つまたは複数の適応症の治療または予防に有効な量で投与する。最適用量は、各治療様式および適応症ごとの標準的方法により、徴候、その重症度、投与経路、合併症状等を考慮に入れて決定することは理解される。治療においてまたは予防として、活性物質を注射用組成物として、例えば好ましくは等張性の無菌の水性分散剤として個体に投与することができる。治療上有効な用量は、そのような疾患に伴う症状の改善をもたらすのに有効な化合物の量をさらに表す。本出願の化合物の製剤化および投与の技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．）、ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、最新版に見いだすことができる。哺乳類、特にヒトへの投与の場合、活性物質の１日投与量レベルは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇであると予想される。いずれにしても医師は、個体にとって最も適切で、かつ年齢、体重およびその個体の反応により異なる実際の投与量を決定することになる。上記の用量は平均的な場合の例示である。もちろんより高いまたはより低い用量範囲が正当である個別の例があり得るが、そのようなものは本発明の範囲内である。
【０２０１】
本発明の化合物は動物（特に哺乳類）の障害（獣医による適用）において特に有用な可能性がある。
本発明はさらに、１つまたは複数の本発明の上記組成物を詰めた１つまたは複数の容器からなる診断用または医薬としての包装物およびキットを提供する。そのような容器には、医薬品もしくは生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた書式の、ヒトに投与するための該製品の製造、使用または販売についての該政府機関による承認を示す注意書きを添付することができる。
【０２０２】
定義
本発明の完全な理解を容易にするために、以下で定義する用語は以下の意味を有している。
「アゴニスト」は、他の分子の活性を増大させる薬物またはホルモンのような任意の分子または医薬作用物質を指す。
「アンタゴニスト」は、他の分子の活性を阻害または消失させる薬物またはホルモンのような任意の分子または医薬作用物質を指す。
【０２０３】
「化学的誘導体」。本明細書では、ある分子が別の分子の「化学的誘導体」であると言う場合は、その分子が通常その別の分子の一部ではない付加的で化学的な部分を有するときである。そのような部分により、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などが改善される可能性がある。あるいはその部分により分子の毒性が低減され、分子の何らかの望ましくない副作用が除去または軽減されるなどの可能性がある。そのような作用をもたらし得る部分は、マック　イー　ダブリュ（Ｍａｃｋ　Ｅ．Ｗ．）、１９９０年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、第１３版に開示されている。そのような部分を分子に連結する手順は当技術分野においてよく知られている。
【０２０４】
「組成物」には遺伝子、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、化合物、薬物および薬理学的作用物質が含まれる。
「制御領域」は、遺伝子の転写の開始、終結を支援もしくは阻害、さもなければ調節することができる、またはそうするのに必要とされる核酸配列を指す。制御領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよび／または他の調節要素を含み得る。制御領域は、単独でまたは独占的に転写を十分に開始、終結あるいは調節し得るか、またはし得ないが、他の核酸配列と協力してそのような調節に作用し得る核酸配列をも含む。
【０２０５】
「デサチュラーゼ」は、脂肪酸分子の炭化水素領域に二重結合を生成させることができる酵素である脂肪酸デサチュラーゼを指す。
本明細書における「障害」とは、構造または機能の混乱または異常を指す。障害は疾患を含む
【０２０６】
「薬物」。薬物にはタンパク質、ペプチド、変性ペプチド、条件設定された細胞培養液から精製された物質、有機分子、無機分子、抗体またはオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。薬物は天然に存在または合成的もしくは組換えにより生産しうる。
【０２０７】
「エンハンサー」は、特定の１つまたは複数の転写因子により結合されたときに、転写を促進または増大させるＤＮＡ調節要素からなる核酸配列である。さらに、エンハンサーは、特定の因子により結合されたとき遺伝子発現レベルの増大を誘発かつ達成するために、（プロモーターに対して上流または下流の）いずれかの方向に任意の位置で機能しうる。さらに、本発明によれば、エンハンサーはエロンガーゼ遺伝子の酵素活性を増大または促進し、および／または該遺伝子の転写を増大または促進する化合物（すなわち、試験化合物）も指す。
【０２０８】
「脂肪酸」は、長い飽和炭化水素鎖または１価もしくは多価不飽和炭化水素鎖と末端カルボキシル基とからなる化合物の種類である。
「脂肪酸δ−５−デサチュラーゼ（Ｄ５Ｄ）」は、脂肪酸分子におけるカルボキシル基から数えて炭素５と炭素６との間に二重結合を生成させることができる酵素である。
【０２０９】
「脂肪酸δ−６−デサチュラーゼ」は、脂肪酸分子におけるカルボキシル基から数えて炭素６と炭素７との間に二重結合を生成させることができる酵素である。
【０２１０】
「脂肪酸エロンガーゼ」は、脂肪酸のカルボキシル末端にアセチル基または２−炭素鎖を付加するのに必要な酵素である。
本明細書で用いている「機能酵素」は、既知の酵素活性を有する生物学的に活性または不活性のタンパク質を指す。
【０２１１】
「機能的誘導体」。配列（タンパク質または核酸のいずれか）の「機能的誘導体」は、そのタンパク質配列または核酸配列の生物学的活性と本質的に類似した（機能上または構造上のいずれかの）生物学的活性を有する分子である。タンパク質の機能的誘導体は、特異的機能の発揮についての修飾の必要性に応じ、共有結合される糖質のような翻訳後修飾を含み得る。「機能的誘導体」という用語は分子の「フラグメント」、「配列」、「変異体」、「類縁体」、または「化学的誘導体」を含むことを意味する。
【０２１２】
「遺伝子」は、その配列が特定のタンパク質またはポリペプチド鎖の生産に必要な情報を含む核酸分子またはその一部を指す。ポリペプチドは、そのタンパク質の機能的活性が保持される限りはそのコード配列の全配列または任意の部分によりコードされ得る。遺伝子は、コード領域の前後の領域だけでなく個々のコード配列（エキソン）の間に介入する配列（イントロン）も含みうる。核酸構築物の「異種（の）」領域（すなわち、異種遺伝子）は、本来は該構築物の他の遺伝子成分に関連して認められない、より大きい核酸構築物内の識別可能なＤＮＡ部分である。したがって、異種遺伝子が哺乳類のエロンガーゼ遺伝子をコードしているとき、該遺伝子には通常、供給源の生物体のゲノム内で構造ゲノムＤＮＡに隣接していないプロモーターが隣接することになる。
【０２１３】
「宿主系」は、転写および／または転写を許容しまたは可能にする環境または条件を提供する細胞、組織、器官、生物体またはそれらの一部からなればよい。
「同一性」、「類似性」または「相同性または相同（な）」は、配列を比較することによって判定される２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当技術分野では、同一性とは、状況に応じてそのような配列の文字列間の一致によって判定される、ポリヌクレオチド配列間の配列の類似性の程度も意味する。同一性と類似性はいずれも容易に計算し得る（レスク　エー　エム（Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｍ．）編、１９８８年、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オックスフォードユニバーシティプレス（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、スミス　ディー　ダブリュ（Ｓｍｉｔｈ　Ｄ．Ｗ．）編、１９９３年、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、グリフィン　エー　エムおよびグリフィン　エッチ　ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ａ．Ｍ．ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ｈ．Ｇ．）編、１９９４年、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ　１、フマナプレス（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニュージャージー）、フォンヘイネ　ジー（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）およびグリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性と類似性とを測定する多くの方法が存在するが、両用語は当業者によく知られている（フォンハイネ　ジー（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク；グリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク；およびカリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３ページ）。配列間の同一性または類似性を測定するのに一般的に用いられている方法としては、カリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３ページに記載されている方法があるが、これに限定されない。同一性と類似性とを測定する方法は、コンピュータプログラムに組み込まれている。２つの配列間の同一性と類似性とを測定するコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（デベラウフら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．、第１２巻、３８７〜３９５ページ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０ページ）などがあるが、これらに限定されない。
【０２１４】
「単離（された）」は、その自然状態から「人に手により」変化した、すなわち、天然に存在するものの場合、変化した、もしくはその元の環境から除去された、またはその両方であることを意味する。例えば、その生来の状態で生きている生物体に自然に存在する天然のポリヌクレオチドは「単離されて」いないが、その生来の状態で共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドは、この用語が本明細書において用いられているように「単離されて」いる。単離の一環として、または単離後に、そのようなポリヌクレオチドを例えば突然変異誘発のため、融合タンパク質を形成するため、また宿主内での増殖または発現のためにＤＮＡのような他のポリヌクレオチドに結合することが可能である。単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドに結合した単離ポリヌクレオチドは、培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入可能である。培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入されたとき、そのようなＤＮＡは天然に存在する状態や環境中にはないため、この用語が本明細書で用いられているように、そのようなＤＮＡは単離されていることになる。同様に、ポリヌクレオチドは、例えば培地製剤、ポリヌクレオチドを例えば細胞へ導入するための溶液、天然に存在しない組成物である化学反応または酵素反応用の組成物または溶液のような、組成物中に存在しうるが、この場合にも単離ポリヌクレオチドは本明細書で用いられているようなこの用語の意味の範囲内にある。
【０２１５】
「変異」は遺伝物質中の何らかの検出可能な変化である。変異は、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドの化学的もしくは生理学的構成、易変性、複製、表現型上の機能、または組換えに影響を与える何らかの検出可能で不自然な変化（またはその組合せ）でありうる；ヌクレオチドは付加され、欠失し、置換され、逆位となり、または逆位を伴ったり伴わずに新しい部位に転移されうる。変異は自然に起こり得るものであり、突然変異原の適用により、または部位特異的変異により実験的に誘発され得る。変異ポリペプチドは変異核酸分子から生じうる。
【０２１６】
「核酸構築物」は、ポリヌクレオチド配列を組み込むプラスミドまたはベクター（これらに限定されない）を含む遺伝要素を指す。例えば、核酸構築物は、異種遺伝子に作動可能なように連結されるプロモーターまたは制御領域からなるベクターであってよい。
【０２１７】
本明細書で用いられている「作動可能なように連結される」とは、プロモーターまたは制御領域の存在または変調がリポーター配列遺伝子などの異種遺伝子の転写に影響を及ぼすような、核酸構築物のプロモーターまたは制御領域と該異種遺伝子との連結を示す。作動可能なように連結された配列は、同じＲＮＡ転写物上で転写される２つの部分を含むこともある。したがって、プロモーターおよび「リポーター配列」のような２つの配列は、プロモーターにおいて開始する転写がリポーター配列のＲＮＡ転写物を生成させるならば、作動可能なように連結されている。
【０２１８】
「プラスミド」。本明細書で開示された開始プラスミドは、市販されているか、公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知の公開された手順の通常の使用により構築可能であるかのいずれかである。本発明に従って使用可能な多くのプラスミドならびにその他のクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者によく知られ容易に使用できる。さらに、当業者は本発明における使用に適した他のプラスミドをいくらでも容易に構築しうる。
【０２１９】
本発明の「ポリヌクレオチド」はｍＲＮＡのようなＲＮＡのかたち、または、例えばクローニングにより得られ、もしくは化学的合成技術かそれらの組合せによりにより生産されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡのかたちでありうる。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖でありうる。一本鎖のポリヌクレオチドは、センス鎖としても知られるコード鎖でも、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。ポリヌクレオチドは一般に、非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。従って、例えば本明細書において用いられるポリヌクレオチドは、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとからなり、一本鎖もしくはより一般には二本鎖もしくは三本鎖であるか、または一本鎖と二本鎖の領域の混合物であるハイブリッド分子を表す。さらに、本明細書において用いられるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三本鎖の領域について言及する。そのような領域の鎖は同じ分子由来でも異なる分子由来でもよい。該領域には１つまたは複数の分子の全てが含まれうるが、より一般的にはいくつかの分子の一領域のみを意味する。三重らせん領域の分子の１つはオリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書において用いられるように、ポリヌクレオチドという用語はＤＮＡまたは１つもしくは複数の修飾塩基を含むＤＮＡも含む。従って、ＤＮＡまたは安定性もしくはその他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡは、本明細書中でその用語が意味するように「ポリヌクレオチド」である。さらに、ＤＮＡまたは（ちょうど２例を挙げると）イノシンのような例外的な塩基もしくはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡは、本明細書中でその用語が用いられているように「ポリヌクレオチド」である。当業者に知られた多くの有用な目的に役立つ、非常に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに施されてきたことは理解されるであろう。本明細書中で用いられているように、ポリヌクレオチドという用語は、そのような化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態だけでなく、ＤＮＡの化学的形態ならびにウイルス、および単純な細胞と特に複雑な細胞などの細胞のＲＮＡの特性も含む。ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ばれることの多い短いポリヌクレオチドを含む。この二本鎖ヌクレオチド配列の転写により生じたＲＮＡと、本発明の核酸分子のアンチセンス鎖または該核酸分子のオリゴヌクレオチドフラグメントとは、本発明の範囲内にあると考えられることも理解されるであろう。アンチセンス配列は、本発明の核酸分子の配列をその転写に関して正常な状態に対して反転することにより構築される。アンチセンス配列は開始コドンの前の領域または非保存領域を反転することにより構築されることが好ましい。アンチセンス配列は当技術分野で知られた手順を用いて化学合成および酵素的連結反応により構築可能である。
【０２２０】
「プロモーター」は、下流（３’方向）の遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを直接または間接的に結合することが可能なＤＮＡ調節要素からなる核酸配列を指す。本発明によれば、プロモーターの誘導が異種遺伝子の転写に影響を及ぼすように異種遺伝子に連結されうるヌクレオチド配列を含む、核酸構築物のプロモーターである。
【０２２１】
「精製（された）」。「精製された」タンパク質または核酸とは、組換えにより生産されたか、化学的に合成されたか、天然の供給源から精製されたかのいずれかの、一般に夾雑物を含まないタンパク質または核酸の調製物である。
【０２２２】
「組換え」は、組換えＤＮＡ技術により生成され、天然に存在する核酸配列とは異なる再結合された核酸配列、遺伝子もしくはそれらの断片（フラグメント）、またはそれらの新たな組合せを指す。
【０２２３】
「調節要素」は、異種遺伝子などの連結された１つまたは複数の遺伝子の発現を転写を介して調節するために、活性化転写調節タンパク質または１つもしくは複数の活性化転写調節タンパク質からなる複合体が結合する核酸配列の全体または一部からなるデオキシリボヌクレオチド配列を指す。
【０２２４】
「リポーター遺伝子」は、その産物が、宿主細胞または宿主系により他の状況では生産されないか、あるいは宿主細胞または宿主系において最小限または無視し得る量で生産され、宿主細胞または宿主系における転写活性のレベルを分析するためにリポーター遺伝子産物を定量的に測定できる様々な既知の方法により検出可能なポリペプチドまたはタンパク質である、核酸コード配列である。例としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、分泌性胎盤アルカリホスファターゼおよび他の分泌性酵素の遺伝子などがある。
【０２２５】
「サイレンサー」は、標的遺伝子の制御領域内のサイレンサー配列の存在が、プロモーターにおける標的遺伝子の転写を、分離したＤＮＡ部分としてのその作用により、あるいは、これらの遺伝要素に結合し、その結果標的遺伝子の発現に対して負の制御をもたらすトランス作用因子の作用により抑制するようなＤＮＡ制御領域の核酸配列または部分を指す。
【０２２６】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、特異性を与えるために十分に厳密で、ミスマッチの数を低減し、許容できる速度で安定なハイブリッドの形成を可能にするために十分に融通の利く条件である。そのような条件は当業者に知られ、例えばサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、またはオースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年−、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン　ワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、に記載されている。単なる例として、短いヌクレオチドを用いたストリンジェントなハイブリッド形成は、０．０１〜０．１ｐｍｏｌ／ｍｌのような高濃度のプローブを用いてＴＭより５〜１０℃低い温度で実施することができる。「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは９７％の同一性が存在する場合に限りハイブリッド形成が起こることを意味することが好ましい。
【０２２７】
「タグ」は、例えば、市販の抗体により認識されるｃ−ｍｙｃエピトープおよび／または６ヒスチジン残基の列を構成またはコードする、特定の短いアミノ酸配列またはそれをコードするオリゴヌクレオチド配列を指す。実際には、タグはタグ付きタンパク質のその後の識別および精製を容易にする。
【０２２８】
本明細書で用いている「タグ付きタンパク質」は、連結されたタグ配列を備えるタンパク質を指す。例えば、タグ付きタンパク質には、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端でｃ−ｍｙｃエピトープと６ヒスチジン残基とに連結された哺乳類のエロンガーゼポリペプチドがある。
【０２２９】
本明細書で用いている「試験化合物」は、小分子（例えば、小有機分子）、薬理化合物または薬理作用物質、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、ならびにＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列などの核酸配列を含む。
【０２３０】
「トランスフェクション」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエント真核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、真核細胞においては、宿主細胞に外来ＤＮＡが獲得されることをトランスフェクションと称する。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのような染色体外因子上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる可能性がある。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞とは、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれる細胞である。この安定性は、導入ＤＮＡを含んだ娘細胞集団からなる細胞株または細胞クローンを、その真核細胞が樹立できることによって示される。
【０２３１】
「形質転換」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエント原核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、原核細胞においては、宿主細胞に外来ＤＮＡが獲得されることを形質転換と称する。真核細胞における形質転換は、腫瘍化状態と類似した、真核細胞の培養中の無制限増殖状態への変化または形質転換を指す。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのような染色体外因子上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる。原核細胞に関しては、安定に形質転換された細菌細胞とは、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれるものである。この安定性は、導入ＤＮＡを含んだ娘細胞集団からなる細胞株または細胞クローンを、その原核細胞が樹立できることによって示される。
【０２３２】
本明細書で用いている「トランスフェクション／形質転換」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）が真核もしくは原核宿主細胞または宿主系に導入された過程を指す。
【０２３３】
ポリヌクレオチドの「変異体」は、他の基準となるポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドである。タンパク質または核酸の「変異体」は、そのタンパク質または核酸と構造および生物学的活性が実質的に同様な分子を指すことを意味する。したがって、２つの分子が共通の活性を有し、互いに置換し得るならば、一方の分子の組成や２次、３次または４次構造が他方の分子に認められるものと同一でないとしても、あるいはアミノ酸またはヌクレオチド配列が同一でないとしても、それらは、その用語が本明細書において用いられているとおりに変異体とみなされる。一般的に、その差異は限定されており、その結果基準の分子と変異体のヌクレオチド配列が全体的に非常に類似しており、かつ多くの領域において同一である。変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化は該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよい。変化がこの種のサイレントな変化に限られる場合、変異体は基準の分子と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードすることになる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることがある。そのようなヌクレオチドの変化は、基準の配列によりコードされるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断をもたらすことがある。
【０２３４】
「ベクター」。クローニングするためにＤＮＡを挿入することが可能なプラスミドもしくはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。ベクターは、宿主細胞内で自律的に複製することが可能であり、そのようなＤＮＡ配列を特定できる方法で切断可能な部位であって、かつそこにＤＮＡを挿入し得る１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によってさらに特徴づけることが可能である。ベクターはさらに、ベクターで形質転換された細胞の識別における使用に適したマーカーを含めることが可能である。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。「クローニングベクター」という語が時には「ベクター」の代わりに使用される。
【０２３５】
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【０２３６】
本発明は、以下に示す実施例を参照することによってさらに説明され、かつより十分に理解されるであろう。これらの非限定的な実施例は、本発明の原理を例示するものにすぎないものと考えるべきである。当業者には、多くの修正形態や変更形態が容易に思い浮かべられるので、図示および説明した正確な構成および操作に本発明を限定することは望ましくない。したがって、すべての適切な修正形態および同等の形態は使用可能であり、かつ本発明の範囲および添付の特許請求の範囲に入るものである。
【０２３７】
（実施例）
本発明を以下の実施例によりさらに記述する。これらの実施例は、本発明の特定の態様を例示するものであるが、開示される発明の限界を描写するものでも、範囲を定めるものでもない。
【０２３８】
実施例１−ＥＬＧ１のクローニング
ＰＣＲを用いてＥＬＧ１をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端のタグを有するＥＬＧ１タンパク質（ＥＬＧ１／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ１タンパク質（ＥＬＧ１）を生産するために、２つのプラスミド構成体を調製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＡＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＫｐｎＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ１およびＥＬＧ１／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ１のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ１／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２３９】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）をＥＬＧ１のクローニング用のＤＮＡ鋳型として用いた。ｐＴｈ１００９．１（以下で定義）をＥＬＧ１／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用の鋳型として用いた。
【０２４０】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＩＮＶαＦ’（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ１およびＥＬＧ１／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１００９．１（図７）およびｐＴｈ１００９．２（図１８）と称した。
【０２４１】
実施例２−ＥＬＧ２のクローニング
（ＥＬＧ２の完全コード配列の入手）
ＥＬＧ２の完全コード配列を含むクローンは、製造業者の指示に従って、ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）から得た。ライブラリーを探査し、捕捉されたｃＤＮＡ標的を修復するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＧＴＡＡＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＧＣＡ−３’であった。修復されたＤＮＡを用いて、ＵｌｔｒａＭａｘ（登録商標）ＤＨ５α（登録商標）−ＦＴ細胞（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を形質転換した。ＥＬＧ２を含むクローンは、遺伝子特異的プライマーとして５’−ＴＴＧＧＡＣＴＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴ−３’および５’−ＧＴＧＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＧ−３’ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてコロニーＰＣＲにより同定した。プラスミドＤＮＡを選択したコロニーから単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。得られたヌクレオチド配列を用いて、ＥＬＧ２の読み取り枠を特定し、酵素発現ベクターへのＥＬＧ２のクローニング用のプライマーを設計した。完全ＥＬＧ２コード配列を含むプラスミドをｐＳｈ１０１０．１と称した。
【０２４２】
（発現ベクターへのＥＬＧ２のクローニング）
ＰＣＲを用いてＥＬＧ２をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ２タンパク質（ＥＬＧ２／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ２タンパク質（ＥＬＧ２）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ２およびＥＬＧ２／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ２のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ２／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２４３】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ｐＳｈ１０１０．１をＥＬＧ２のクローニング用のＤＮＡ鋳型として用いた。ｐＭｒ１０１４．１（以下で定義）をＥＬＧ２／Ｖ５−ＨｉｓのＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２４４】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ２およびＥＬＧ２／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０１４．１およびｐＴｈ１０１４．２と称した。
【０２４５】
実施例３−ＥＬＧ３のクローニング
ＰＣＲを用いてＥＬＧ３をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ３タンパク質（ＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ３タンパク質（ＥＬＧ３）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＧＧＣＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ３およびＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ３のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２４６】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＺＲ−７５−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５００）から調製したｃＤＮＡをＤＮＡ鋳型として用いた。このｃＤＮＡは、製造業者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてＺＲ−７５−１細胞からＲＮＡを単離し、次いでＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ　ＰＣＲキット（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）について記載されているようにＭｕＬＶ逆転写酵素とランダムな６量体とを用いてＲＮＡを逆転写することにより調製した。
【０２４７】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ３およびＥＬＧ３／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０１５．１およびｐＴｈ１０１７．１と称した。
【０２４８】
ＥＬＧ３を、恒常的に発現するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの調節下でｐＢＥＶＹ−Ｌ酵母発現ベクターへもクローニングした（ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．第２６巻、３５７７〜３５８３ページ）。ｐＴｈ１０１５．１をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで制限切断し、約０．９ｋｂのフラグメントをゲル精製することによりＥＬＧ３コード配列を得た。ｐＢＥＶＹベクターをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ、またはＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで制限切断し、それぞれ約１ｋｂ、約６ｋｂのフラグメントをゲル精製した。３つのフラグメントを連結し、連結反応産物を用いて大腸菌株ＩＮＶαＦ’（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。ＥＬＧ３遺伝子を含むプラスミドを単離し、制限酵素分析により同定した。挿入ＤＮＡをＤＮＡ配列決定により確認し、プラスミドをｐＬｈ５０１５．１と称した（図１９）。
【０２４９】
実施例４−ＥＬＧ４のクローニング
（ＥＬＧ４の完全コード配列の入手）
ＥＬＧ４の不完全なコード配列を含むｃＤＮＡクローンを、製造業者の指示に従って、ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）から得た。ライブラリーを探査し、捕捉されたｃＤＮＡ標的を修復するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴＧ−３’であった。修復されたＤＮＡを用いて、ＵｌｔｒａＭａｘ（登録商標）ＤＨ５α（登録商標）−ＦＴ細胞（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を形質転換した。ＥＬＧ４を含むクローンは、遺伝子特異的プライマーとしての５’−ＧＣＧＣＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＡＧ−３’および５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＡＧＡＣＴＧ−３’ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてコロニーＰＣＲにより同定した。プラスミドＤＮＡを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。プラスミドをｐＳｈ１０２６．１と称した。ＥＬＧ４の完全コード配列を決定することはできなかったが、ＥＬＧ４タンパク質のＣ末端を含む読み取り枠は特定された。その後のクローニング（下記）から、ｐＳｈ１０２６．１がコード配列のヌクレオチド２１０〜２５５の内部欠失を有するＥＬＧ４変異体を含んでいることが示された。
【０２５０】
ｐＳｈ１０２６．１から得られたヌクレオチド配列を用いて、ＰＣＲによるＥＬＧ４のクローニング用のフォワード（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＧＧ−３’）およびリバース（５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣ−３’）プライマーを設計した。これらのプライマーは、それぞれＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位を含む（下線部分）。フォワード・プライマーは、ｐＳｈ１０２６．１内に特定された最初の翻訳開始コドンと推定されるコドンを含む。リバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。
【０２５１】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）をＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２５２】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ４の完全コード配列ならびに５’−ＵＴＲの１０８ヌクレオチドを含むプラスミドをｐＴｈ１０３０．１と称した。
【０２５３】
（発現ベクターへのＥＬＧ４のクローニング）
ＰＣＲを用いてＥＬＧ４をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクターにクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ４タンパク質（ＥＬＧ４／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ４タンパク質（ＥＬＧ４）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ４およびＥＬＧ４／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ４のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ４／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２５４】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ｐＴｈ１０３０．１をＥＬＧ４のＤＮＡ鋳型として用い、ｐＴｈ１０２１．１（下記）をＥＬＧ４／Ｖ５−ＨｉｓのＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２５５】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ４およびＥＬＧ４／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０２１．１およびｐＴｈ１０２１．２と称した。
【０２５６】
実施例５−ＥＬＧ５のクローニング
ＰＣＲを用いてＥＬＧ５をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ５タンパク質（ＥＬＧ５／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ５タンパク質（ＥＬＧ５）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＣＴＴＴＡＣＡＡＧ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ５およびＥＬＧ５／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ５のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ５／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２５７】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＰｒｏＱｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））をＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２５８】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ５およびＥＬＧ５／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０１８．１およびｐＴｈ１０１９．１と称した。
【０２５９】
実施例６−ＥＬＧ６のクローニング
ＰＣＲを用いてＥＬＧ６をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ６タンパク質（ＥＬＧ６／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ６タンパク質（ＥＬＧ６）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＴＣＴＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ６およびＥＬＧ６／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ６のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ６／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２６０】
ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）をＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２６１】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ６およびＥＬＧ６／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０４１．１およびｐＴｈ１０４２．１と称した。
【０２６２】
実施例７−ＥＬＧ７のクローニング
ＰＣＲを用いてＥＬＧ７をｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。Ｖ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＥＬＧ７タンパク質（ＥＬＧ７／Ｖ５−Ｈｉｓ）またはタグを持たないＥＬＧ７タンパク質（ＥＬＧ７）を生産するために、２つのプラスミド構築物を作製した。フォワード・プライマー（５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣ−３’）は、翻訳開始コドンおよびＢａｍＨＩ部位（下線部分）を含む。それぞれＥＬＧ７およびＥＬＧ７／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマー、５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣ−３’および５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣ−３’は、ＮｏｔＩ部位（下線部分）を含む。ＥＬＧ７のクローニング用のリバース・プライマーは、翻訳終止コドンを備えている。ＥＬＧ７／Ｖ５−Ｈｉｓのクローニング用のリバース・プライマーは、終止コドンの３塩基のうちの２塩基しか含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０２６３】
ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて製造業者の指示に従って実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）をＤＮＡ鋳型として用いた。
【０２６４】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐＹＥＳ２／ＣＴに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、それらの挿入フラグメントの配列を決定した。ＥＬＧ７およびＥＬＧ７／Ｖ５−ＨｉｓをコードするプラスミドをそれぞれｐＴｈ１０４４．１およびｐＴｈ１０４５．１と称した。
【０２６５】
実施例８−ノーザンブロット分析による組織分布の測定
１２種の様々なヒト組織（脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血白血球）由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含むメンブレンをクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した（ヒト１２レーンＭＴＮ（登録商標）ブロット）。ノーザンブロット分析を、標準的な手順を用いて実施した（オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）［ニューヨーク所在］）。ハイブリダイゼーション溶液には、１０％デキストラン硫酸を含ませた。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびＲｅｄｉｐｒｉｍ（登録商標）ＩＩ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを標識してプローブを調製した。ＥＬＧ１、ＥＬＧ３、ＥＬＧ５およびＥＬＧ６のｃＤＮＡプローブは、遺伝子の完全ＣＤＳに対応していた。ＥＬＧ２、ＥＬＧ４およびＥＬＧ７のｃＤＮＡプローブは、それぞれＣＤＳの塩基２０９〜５１４、４０８〜７２６および１１３〜５６６に対応していた。メンブレンを０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い５５℃で、高度にストリンジェントな条件で洗浄した。ノーザンブロットを図２７に示す。
【０２６６】
実施例９−ヒトＥＬＧ１制御領域のクローニング
ＥＬＧ１制御領域（９８９ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングした。翻訳開始コドンＡＴＧから上流の部位−２８６５ｂｐおよび−１８７７ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅によりヒトＥＬＧ１制御領域をクローニングするのに用いたフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ、５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＧＧＣＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＧ−３’および５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴ−３’である。クローニングを容易にするために、ＢｇｌＩＩ認識配列（下線部分）が含められている。
【０２６７】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器で行う。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積中で実施する。
【０２６８】
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いで、ヒトＥＬＧ１制御領域をｐＣＲＩＩ／ＥＬＧ１制御領域からルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＥＬＧ１制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２６９】
実施例１０−ヒトＥＬＧ２制御領域のクローニング
ＥＬＧ２制御領域（５０９ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングする。翻訳開始コドンＡＴＧから上流の部位−５３６２６ｂｐおよび−５３１１８ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲによりヒトＥＬＧ２制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ、５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣ−３’である。クローニングを容易にするために、ＢｇｌＩＩ認識配列（下線部分）を含められている。
ＰＣＲ増幅およびクローニングを、実施例９に記載のように行う。
得られたヒトＥＬＧ２制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７０】
実施例１１−ヒトＥＬＧ３制御領域のクローニング
ヒトＥＬＧ３制御領域をネスティドＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングした。血液を本発明者らの研究室のボランティアから採取し、鋳型とするゲノムＤＮＡの調製に用いた。最初のＰＣＲ反応では、ＥＬＧ３遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧからそれぞれ上流の部位−２０２５ｂｐおよび−１ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いた。フォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＴＣＴＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＧ−３’であった。クローニングを容易にするために、ＢｇｌＩＩ認識配列（下線部分）を含めた。
【０２７１】
ＰＣＲ増幅は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器で、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１Ｘ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積中で行った。
【０２７２】
ＰＣＲ反応条件は、
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
であった。
アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分析から、約２ｋｂの少なくとも２つのプライマー特異的なバンドが増幅されたことが示された。この結果から、ＥＬＧ３制御領域に対応する固有のプライマー特異的なバンドを得るために、２回目のＰＣＲ反応ではＰＣＲ産物を鋳型として使用し、新たなセットの内部プライマーの使用を余儀なくされた。内部フォワードおよびリバース・プライマーは、それぞれ翻訳開始コドンＡＴＧから上流の部位−１３８１ｂｐおよび−３７ｂｐで始まる。用いた内部フォワードおよびリバース・プライマーは、５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＧＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＴＧＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡ−３’であった。
【０２７３】
以下の修正を除いて、本明細書に記載するＰＣＲ反応の条件を２回目のＰＣＲ反応に用いた。すなわち、第２の温度サイクルを３２サイクルから２２サイクルに減らし、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼをｃＤＮＡポリメラーゼの代わりに用い、製造業者の指示に従ってＱ溶液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いた。
【０２７４】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲル精製した。精製したＰＣＲ産物およびリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃを別個にＢｇｌＩＩ制限酵素で消化して、ＰＣＲ産物をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのルシフェラーゼ遺伝子へインフレームに連結するのに適した適合末端を生成させた。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。得られたプラスミドｐＧｈ３０２０．１（図２０）を制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認した。得られたヒトＥＬＧ３制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７５】
実施例１２−ヒトＥＬＧ４制御領域のクローニング
ＥＬＧ４制御領域（２４５６ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングする。制御領域を合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＥＬＧ４制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ、５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＧＣ−３’である。クローニングを容易にするために、それぞれＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩ認識配列（下線部分）が含められている。
ＰＣＲ増幅およびクローニングを、実施例９に記載のように行う。
得られたヒトＥＬＧ４制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７６】
実施例１３−ヒトＥＬＧ５制御領域のクローニング
ＥＬＧ５制御領域（１４１１ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングした。翻訳開始コドンＡＴＧの上流の部位−１４１１ｂｐおよび−１ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲによりヒトＥＬＧ５制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣ−３’および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＧＴＣＧＣ−３’である。クローニングを容易にするために、ＸｈｏＩ認識配列（下線部分）が含められている。
ＰＣＲ増幅およびクローニングを、実施例９に記載のように行う。
得られたヒトＥＬＧ５制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７７】
実施例１４−ヒトＥＬＧ６制御領域のクローニング
ＥＬＧ６制御領域（１９３７ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングする。翻訳開始コドンＡＴＧから上流の部位−１９３７ｂｐおよび−１ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＥＬＧ６制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣ−３’および５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＧＣ−３’である。クローニングを容易にするために、ＳａｃＩ認識配列（下線部分）が含められている。
ＰＣＲ増幅およびクローニングを、実施例９に記載のように行う。
得られたヒトＥＬＧ６制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７８】
実施例１５−ヒトＥＬＧ７制御領域のクローニング
ＥＬＧ７制御領域（２０００ｂｐ）をＰＣＲによりヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングする。翻訳開始コドンＡＴＧから上流の部位−２０００ｂｐおよび−１ｂｐで始まる合成のフォワードおよびリバース・プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＥＬＧ７制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバース・プライマーはそれぞれ５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＣ−３’および５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣ−３’である。クローニングを容易にするために、ＳａｃＩ認識配列（下線部分）が含められている。
ＰＣＲ増幅およびクローニングを、実施例９に記載のように行う。
得られたヒトＥＬＧ７制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０２７９】
実施例１６−ＥＬＧ３制御領域を用いる薬物スクリーニング検定
ＥＬＧ３制御領域を含むプラスミドｐＧｈ３０２０．１（図２０）を用いて、ＥＬＧ３プロモーター活性を調節する試験化合物をスクリーニングする。当業者に知られている技術を用いて、ＥＬＧ３制御領域の機能を評価するために一過性トランスフェクションを実施する。
【０２８０】
あるいは、製造業者による記載のように、６０ｍｍの組織培養用ディッシュ中で１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞を１０μｇのｐＧｈ３０２０．１および１μｇのベクターｐＲＳＶ−ＮＥＯ（ＡＴＣＣ）で安定にトランスフェクションする。２４時間インキュベートした後、細胞を２つの１５０ｍｍ組織培養用ディッシュに１：２の希釈率で継代し、さらに２４時間生育させた。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を８００μｇ／ｍｌの濃度で培地に加える。抗生物質の選択圧下で３〜４週間生育させた後、耐性クローンを単離し、それらのルシフェラーゼ活性について特徴づけを行う。
【０２８１】
製造業者の推奨事項に従って、ルシフェラーゼ酵素検定システム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｔｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて薬物スクリーニングを行う。その概要を述べると、９６ウエルプレート内で生育させたトランスフェクション済み細胞を試験化合物に曝露させる。適切なインキュベーション時間の後に、細胞をＭｇ２＋およびＣａ２＋非含有ＰＢＳで洗浄する。細胞を２０μｌの１×ルシフェラーゼ細胞培養物溶解試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＣＣＬＲ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて溶解する。プレートを自動インジェクタを備えたルミノメータに入れる。各ウエルについて、インジェクタにより１００μｌのルシフェラーゼ検定試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、２秒間の遅延の後に反応による発光を１０秒間読み取る。試験化合物を含まない細胞培養物を対照（コントロール）として用いる。ルシフェラーゼ活性の有意な差は、試験化合物がＥＬＧ３プロモーター活性を調節していることを示している。
【０２８２】
この検定法または他のリポーター検定法は、エロンガーゼ遺伝子の制御領域を用いる薬物スクリーニングに好適である。
【０２８３】
実施例１７−酵母ワン・ハイブリッド・システムを用いる薬物スクリーニング検定
酵母ワン・ハイブリッド検定の方法は当業者により知られている（フィールズ　エスおよびソング　オー（Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ａｎｄ　Ｓｏｎｇ　Ｏ．）、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページ、ウルマソフら（Ｕｌｍａｓｏｖ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７６巻、１８６５〜１８６８ページ）。検定用の試薬および／またはキット、例えば、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））が市販されている。
【０２８４】
この検定法は、本明細書に記載されているエロンガーゼ制御領域のすべてに対して適切なものである。
既知の標的要素またはエロンガーゼ制御領域「ベイト」をリポーター遺伝子（例えば、ＨＩＳ３）の上流に挿入し、酵母ゲノムに組み込んで、新規リポーター株を作製する。この酵母株を活性化ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーで形質転換して、ベイトＤＮＡ配列と相互作用するＤＮＡ結合タンパク質をスクリーニングする。標的配列へのＡＤ／ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ハイブリッドタンパク質の結合により、リポーター遺伝子の転写の活性化とその後の選択がもたらされる。例えば、ＨＩＳ３の発現はヒスチジン欠損最少培地上でのコロニーの生育を可能にする。ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするｃＤＮＡを単離し、特性を検討する。試験化合物の存在下で標的要素またはエロンガーゼ制御領域をＤＢＰに曝露させることにより試験化合物をスクリーニングするために、該相互作用をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで再現させる。当業者によく知られている、ＤＮＡ／タンパク質結合相互作用を測定する検定法により、試験化合物の作用を評価する。
【０２８５】
実施例１８−酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いる薬物スクリーニング検定
酵母ツー・ハイブリッド検定の方法は当業者により知られている（フィールズ　エスおよびソング　オー（Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ａｎｄ　Ｓｏｎｇ　Ｏ．）、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページ、およびフルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ）。検定用の試薬またはキット、例えば、Ｈｙｂｒｉｄ　Ｈｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｙｅａｓｔ　Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＨｙｂｒｉＺＡＰ（登録商標）Ｔｗｏ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が市販されている。
【０２８６】
この検定法は、本明細書に開示されているエロンガーゼ遺伝子のすべてに対して適切なものである。
２つの物理的に異なるドメイン、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および活性化ドメイン（ＡＤ）を必要とする。問題のエロンガーゼポリペプチドを「ベイト」ベクターにクローニングし、ＤＢＤとのハイブリッドタンパク質として発現させる。相互作用する可能性のあるタンパク質をコードするｃＤＮＡのライブラリーを「プレイ」ベクターのＡＤを含む枠にクローニングする。該ベイトおよびプレイ・ベクター融合構築物でいくつかの遺伝子工学的に改変された酵母株の１つを形質転換する。ベイトハイブリッドタンパク質とプレイハイブリッドタンパク質との間の相互作用が起きると、プレイのＡＤがＤＢＤと緊密に接触し、リポーター遺伝子の転写が活性化される。正方向に相互作用するタンパク質は、栄養欠損培地上で平板培養し、リポーター活性の有無をスクリーニングすることにより容易に確認することができる。
【０２８７】
試験化合物に２つに相互作用するタンパク質を曝露させることにより試験化合物をスクリーニングするために、これらの２つのタンパク質の間の相互作用をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで再現する。当業者によく知られている、タンパク質／タンパク質結合相互作用を測定する検定法により、試験化合物の作用を評価する。
【０２８８】
実施例１９−出芽酵母におけるヒトエロンガーゼの機能分析
本明細書に示す実施例により、本発明者らによりクローニングされたヒトエロンガーゼ遺伝子ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７がｎ−３および／またはｎ−６脂肪酸基質を少なくとも炭素２つ分伸長することができる酵素をコードすることが明示される。
【０２８９】
（材料）
リチウム［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６および［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３（放射化学的純度９９％、比放射能４８〜５８μＣｉ／μｍｏｌ）をＮＥＮ［マサチューセッツ州ボストン所在］）から購入した。すべての不飽和脂肪酸を０．１Ｍ　ＬｉＯＨでけん化し、１％テルギトールを含むウラシル欠損合成最少培地（ＳＣ−Ｕ）に溶解した。
【０２９０】
脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、テルギトール、トリス−ＨＣｌ、糖質、アミノ酸および脂肪酸は、シグマアルドリッチカナダ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｎａｄａ）［カナダ国オンタリオ州所在］から入手した。アミノ酸を含まない酵母窒素ベースは、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））から購入した。すべての有機溶媒（ＨＰＬＣ用）をフィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）［ニュージャージー州フェアローン（Ｆａｉｒ　Ｌａｗｎ）所在］から入手した。
【０２９１】
（酵母の形質転換）
出芽酵母株ＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）により提供されたように酢酸リチウム法を用いて、前述したエロンガーゼ構築物（実施例１〜７）またはｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換した。ＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６またはＥＬＧ７の発現用に、酵母をそれぞれｐＴｈ１００９．１、ｐＴｈ１０１４．１、ｐＴｈ１０１５．１、ｐＴｈ１０２１．１、ｐＴｈ１０１８．１、ｐＴｈ１０４１．１またはｐＴｈ１０４４．１で形質転換した。ＥＬＧ１／Ｖ５−Ｈｉｓ、ＥＬＧ２／Ｖ５−Ｈｉｓ、ＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓ、ＥＬＧ４／Ｖ５−Ｈｉｓ、ＥＬＧ５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ＥＬＧ６／Ｖ５−ＨｉｓまたはＥＬＧ７／Ｖ５−Ｈｉｓの発現用に、酵母をそれぞれｐＴｈ１００９．２、ｐＴｈ１０１４．２、ｐＴｈ１０１７．１、ｐＴｈ１０２１．２、ｐＴｈ１０１９．１、ｐＴｈ１０４２．１またはｐＴｈ１０４５．１で形質転換した。組換え酵母細胞をＳＣ−Ｕ培地上で選択した。
【０２９２】
（インキュベーション）
形質転換した酵母（約３．２×１０６細胞／ｍｌ、Ｏ．Ｄ．６０００．４）を、１％ラフィノース、１％テルギトールおよび［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３（１μＣｉ）、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６（１μＣｉ）、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６（２μＣｉ）または［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３（２μＣｉ）のいずれかのリチウム塩２５μＭを含む１０ｍｌのＳＣ−Ｕ培地の入った１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。回転式インキュベータ中で２７０ｒｐｍ、３０℃で４時間インキュベートした後、細胞が対数増殖期に達し、ガラクトース（終濃度２％）で導入遺伝子の発現を誘導した。該酵母をさらに１９時間インキュベートし、次いで４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離してハーベストした。
【０２９３】
細胞を０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、下記のように総脂質を抽出した。インキュベーション培地、上清および細胞の試料の一部の放射能をＬＳ６５００−シンチレーションシステム（ＬＳ６５００−Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））を用いて液体シンチレーション計数法により測定した。
ｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換した宿主酵母を陰性対照とした。
【０２９４】
（脂質の抽出）
フォルフら（Ｆｏｌｃｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９５７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２２６巻、４９７〜５０９ページの方法に従って、クロロホルム／メタノール（２：１容積比）で細胞から総脂質を抽出した。あるいは、細胞を１．５ｍｌの水に再懸濁し、２ｍｌの１０％ＫＯＨエタノール溶液でけん化した。けん化した試料からの総脂質抽出物または遊離脂肪酸を三フッ化ホウ素を用いてメタノール中９０℃で３０分間メチル化した。得られたメチルエステル（ＦＡＭＥ）を下記のように分析した。
【０２９５】
（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析）
２０５ｎｍに設定したダイオード・アレイ検出器、固体シンチレーション・カートリッジ（１４Ｃ検出効率９７％）を備えた放射性同位体検出器（１７１型、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）［カリフォルニア州所在］）およびμＢｏｎｄａｐａｋ（登録商標）Ｃ−１８（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））インサートを含むプレカラムに取り付けた逆相ＯＤＳ（Ｃ−１８）ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）カラム（内径２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒子径５μｍ）を装着したヒューレットパッカード（Ｈａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０、シリーズＩＩクロマトグラフ装置を用いて、放射性標識されたＦＡＭＥの分析を実施した。ＦＡＭＥを流速１ｍｌ／分でアセトニトリル／水（９５：５容積比）を用いてアイソクラティックで分離し、真正標準品との比較により同定した。あるいは溶離したＦＡＭＥを収集し、溶媒を蒸発させた。ＦＡＭＥをガスクロマトグラフィーによりさらに分析するためヘキサンに再溶解した。
【０２９６】
（ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析）
インターフェイス付きＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、フレームイオン化検出器および３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）溶融シリカカラム（ＨＰ−ワックス、架橋ポリエチレングリコール、フィルム厚０．２５μｍ）を装着し、Ｈｅをガスキャリヤーとしたヒューレットパッカードガスクロマトグラフ（Ｈａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｇａｓ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）を用いて、ＦＡＭＥのプロファイルを測定した。注入器および検出器の温度をそれぞれ２２５℃および２５０℃に維持した。１８０℃で１分間の最初の保持の後、カラム温度を４℃／分で１９０℃（７分間保持）まで、次いで１０℃／分で２００℃（５分間保持）まで、最後に２５℃／分で２１５℃まで上昇させた。この温度を１７．９分間維持した。真正標準品との比較によりＦＡＭＥを同定した。
【０２９７】
（結果）
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、外から加えた放射性標識多価不飽和脂肪酸がヒトエロンガーゼ遺伝子で形質転換された酵母において少なくとも炭素２つ分伸長されることが明らかにされた（表３）。ＥＬＧ４を発現する酵母では、１８：３ｎ−６が２０：３ｎ−６に変換され、次いでこれが２２：３ｎ−６に伸長され、２０：４ｎ−６が２２：４ｎ−６に変換され、これがさらに２４：４ｎ−６に伸長され、そして１８：３ｎ−３が２０：３ｎ−３および２２：３ｎ−３に変換された（図２１）。ｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換された酵母は、これらの基質のいずれをも伸長しなかった（図２２）。
【０２９８】
Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するエロンガーゼを発現する酵母では、選択された基質の伸長の割合はタグを持たない酵素を含む酵母において検出された伸長の割合と同様であった（表４）。
【０２９９】
（結論）
ヒトＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７遺伝子の機能分析から、各遺伝子が、種々のＰＵＦＡに対して活性を有する脂肪酸エロンガーゼをコードすることが確認された。
【表３】
2004513662.tif 000004
【表４】
2004513662.tif 000005
【０３００】
実施例２０−酵母を用いたエロンガーゼに関する薬物スクリーニング検定
本実施例は、出芽酵母の全細胞およびスフェロプラストにおける、組換えエロンガーゼの活性を調節する試験化合物をスクリーニングするのに適した方法論を提供する。酵母スフェロプラストでは細胞壁を欠いているため試験化合物の取り込みが増大する可能性がある。したがって、これは低濃度の試験化合物のエロンガーゼ活性に対する効果を評価するのに適したモデルである。
【０３０１】
（スフェロプラストの調製）
ヒトエロンガーゼ遺伝子のいずれに対しても異種である出芽酵母を、導入遺伝子の発現を誘導するために１％ラフィノースと２％ガラクトースとを含むＳＣ−Ｕ培地中で生育させる。１６時間のインキュベーションの後、細胞を４℃、２０６０×ｇで５分間遠心分離し、蒸留水で１回洗浄し、再び遠心分離する。細胞ペレットの容積と重量とを測定する。細胞を０．１Ｍトリス−ＳＯ４（ｐＨ９．４）、１０ｍＭ　ＤＴＴに懸濁し（１：２重量／容積）、３０℃でインキュベートする。他所に記載のように（ダウムら（Ｄａｕｍ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５７巻、１３０２８〜１３０３３ページ）、１０分間のインキュベーションの後に、遠心分離により細胞ペレットを得て、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄し（１：２０重量／容積）、１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁する（１：１重量／容積）。ライティケース（ｌｙｔｉｃａｓｅ）の１５，８００×ｇ（１分間）の上清を２０００Ｕ／ｍｌの濃度で細胞懸濁液に加え、懸濁液を５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートする。スフェロプラストへの変換を、４０分間のインキュベーションの後に、懸濁液を蒸留水で希釈した後顕微鏡下で観察して確認する（シャツ　ジーおよびコバク　エル（Ｓｃｈａｔｚ　Ｇ．ａｎｄ　Ｋｏｖａｃ　Ｌ．）、１９７４年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第３１Ａ巻、６２７〜６３２ページ）。７０分間のインキュベーションの後では、約９０％の細胞がスフェロプラストに変換される。
【０３０２】
（スフェロプラストの試験化合物とのインキュベーション）
スフェロプラストを４℃、２０６０×ｇで５分間遠心分離してハーベストし、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄する。誘導条件を維持し、約２．５〜３．０のＯ．Ｄ．６００の読み取り値を得るように、スフェロプラストを１％ラフィノース、１％テルギトール、１．２Ｍソルビトールおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ培地に再懸濁する。スフェロプラスト懸濁液の試料の一部１０ｍｌを１２５ｍｌ三角フラスコに移し、２００μｌのエタノール中の試験化合物（例えば、終濃度０．０１〜１００μＭの範囲のペブレートスルホキシド）とともに回転式インキュベータで２７０ｒｐｍ、３０℃でインキュベートする。３０分間のインキュベーション後に、１μＣｉの選択したエロンガーゼ基質（すなわち、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３または［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３のリチウム塩）を２〜２００μＭの終濃度で培養物に加え、さらに１２０分間インキュベートする。細胞密度を測定しＯ．Ｄ．６００）、スフェロプラストを遠心分離によりハーベストし、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄する。実施例１９に記載のように、総脂質を抽出し、分析する。
【０３０３】
（全酵母細胞の試験化合物とのインキュベーション）
ヒトエロンガーゼ遺伝子のいずれに対しても異種である出芽酵母を、１％ラフィノース、１％テルギトールおよび２００μｌのエタノール中試験化合物（例えば、培養物中の終濃度０．１〜５ｍＭの範囲のペブレートスルホキシド）を含んだ９ｍｌのＳＣ−Ｕ培地（Ｏ．Ｄ．６０００．４、約３．２×１０６細胞／ｍｌ）の入った１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートする。回転式インキュベータ中で２７０ｒｐｍ、３０℃で１時間インキュベートした後、１μＣｉの選択したエロンガーゼ基質（すなわち、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３または［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３のリチウム塩）を２〜２００μＭの終濃度で培養物に加える。阻害物質とともに４時間インキュベートした後、細胞は対数増殖期に達するので、１ｍｌのガラクトースを加えて終濃度２％とし導入遺伝子の発現を誘導する。酵母をさらに１９時間インキュベートし、次いで４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離してハーベストする。細胞を０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、実施例１９に記載のように総脂質を抽出し分析する。
【０３０４】
（計算）
放射性標識された１８：３ｎ−６の２０：３ｎ−６および２２：３ｎ−６への、２０：４ｎ−６の２２：４ｎ−６および２４：４ｎ−６への、１８：３ｎ−３の２０：３ｎ−３および２２：３ｎ−３への、または２０：５ｎ−３の２２：５ｎ−３および２４：５ｎ−３への変換を測定することにより、エロンガーゼ活性を求める。阻害の割合を他所に記載のように（カワシマら（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６０巻、１６７２〜１６７６ページ）計算する。
阻害の割合（％）＝１００（阻害物質を加えない場合の活性−阻害物質を加えた場合の活性）／阻害物質を加えない場合の活性
【０３０５】
実施例２１−酵母ミクロソームを用いる薬物スクリーニング検定
本実施例は、エロンガーゼ導入遺伝子を有する酵母のミクロソームが、特定の組換え脂肪酸エロンガーゼの活性に対する試験化合物の効果を試験するために必要なすべての酵素を備えていることを教示している。
【０３０６】
（材料）
Ｓ−プロピルブチルエチルチオカルバミン酸のスルホキシド誘導体（ペブレートスルホキシド）は、ゼネカアグロケミカルズ（Ｚｅｎｅｃａ　Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）［英国］から入手し、濃度５ｍＭでエタノールに溶解した。
【０３０７】
（酵母ミクロソームの調製）
ＥＬＧ３／Ｖ５−ＨｉｓをコードするｐＴｈ１０１７．１で形質転換した出芽酵母の５ｌ培養を、１％ラフィノースを含むＳＣ−Ｕ培地を用いて約３．２×１０５細胞／ｍｌの細胞密度（Ｏ．Ｄ．６０００．４）で開始した。２７０ｒｐｍの回転式振とう器で３０℃で８時間インキュベートした後、ガラクトースを終濃度２％となるように加えた。酵母をさらに１２時間インキュベートし、４℃、２０６０×ｇで１０分間の遠心分離によりハーベストし、水で洗浄した。細胞ペレットをその容積の１／３に、ｐＨ７．２の単離緩衝液（８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１０ｍＭ　ＫＣｌ、３２０ｍＭスクロース、２ｍＭ　ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビター混合物）に再懸濁した。細胞懸濁液を液体Ｎ２の入った乳鉢に注ぎ、セラミック乳棒を用いて砂とともに粉砕した。酵母粉末をコニカル試験管に移し、ペレットの容積の２／３の量の単離緩衝液を加えた。砂を２２８×ｇで１分間遠心分離することにより除去し、懸濁液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞破片、核およびミトコンドリアを分離した。上清を１０６，０００×ｇで１．５時間遠心分離して、ミクロソームペレットを得、それを保存緩衝液（８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１０ｍＭ　ＫＣｌ、３２０ｍＭスクロース、１ｍＭ　ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビター混合物）に再懸濁して最終タンパク質濃度２０μｇ／μｌとした。タンパク質濃度をローリーら（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ．）（１９５１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第１９３巻、２６５〜２７５ページ）の方法によりウシ血清アルブミンを標準として測定した。
【０３０８】
（酵母ミクロソームのペブレートスルホキシドとのインキュベーション）
［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３の［１−１４Ｃ］２２：５ｎ−３および［１−１４Ｃ］２４：５ｎ−３への変換を測定することにより、ＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓの活性を求めた。４３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ　ＡＴＰ、５００μＭ　ＮＡＤＰＨ、１０μＭ補酵素Ａ、１００μＭマロニルＣｏＡ（リチウム塩としての）および１〜１００μＭの濃度範囲のペブレートスルホキシドを含む０．２５ｍｌの８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）中に終濃度７．２μＭの０．２０μＣｉの基質脂肪酸を入れたプレインキュベート済み試験管に、５００μｇの酵母ミクロソームタンパク質を加えることにより反応を開始させた。試験管を激しく渦攪拌し、振とう水浴中３７℃で３０分間インキュベートした後、２ｍｌの１０％（重量／容積）ＫＯＨエタノール溶液を加えて、反応を停止させた。インキュベーション混合物中の脂質をＮ２雰囲気中８０℃で４５分間けん化した。次いで試料を氷中５分間放置した後７５０μｌの濃ＨＣｌで酸性化した。脂肪酸をヘキサンで抽出し、メタノール中ＢＦ３で９０℃で３０分間エステル化した。脂肪酸メチルエステルを実施例１９に記載のようにＨＰＬＣにより分析した。
【０３０９】
（結果）
酵素活性を放射性標識２０：５ｎ−３のその伸長産物への変換率で表した。あるいは、１分間にミクロソームタンパク質１ｍｇあたり生成した脂肪酸のピコモル数で表すことが可能である。
【０３１０】
表５に、２０：５ｎ−３を基質としたときのＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓの活性に対するチオカルバミン酸誘導体（ペブレートスルホキシド）の効果を示す。１００μＭのペブレートスルホキシドは伸長を約２７％実質的に低下させた。この効果は、２２：５ｎ−３の代謝物２４：５ｎ−３の生成よりも、主として２２：５ｎ−３の合成の低下に起因したものであった。
【表５】
2004513662.tif 000006
【０３１１】
実施例２２−酵母からの組換えエロンガーゼの単離
本実施例は、酵母ホモジネートまたはミクロソームからの組換えエロンガーゼの単離の方法論を提供する。精製酵素は、薬物スクリーニングや抗体生産に有用である。
【０３１２】
（酵母ホモジネートおよびミクロソームの調製）
酵母細胞の分画は、ＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓを発現する酵母を用いて実施例２１に記載のように行った。
（エロンガーゼの可溶化）
酵母細胞ホモジネートまたは酵母ミクロソームを、可溶化緩衝液（８０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ　ｐＨ７．２、１０ｍＭ　ＫＣｌ、３２０ｍＭスクロース、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、プロテアーゼインヒビター混合物および０．５Ｍ　ＮａＣｌ）にそれぞれ１．３または４ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、ｎ−オクチル−β−グルコピラノシドまたはｎ−オクチル−β−チオグルコピラノシド（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）［カリフォルニア州所在］）を、界面活性剤：タンパク質比１５：１で終濃度２％となるように加えた。混合物を４℃でかき混ぜながら２時間インキュベートし、次いで、１０６，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を除去し、使用時まで−８０℃で保存した。ペレットを、可溶化緩衝液を用いて上清の１／４容に再懸濁した。下記のように、各界面活性剤がエロンガーゼを可溶化する効率をウェスタンブロット分析により測定した。
【０３１３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析）
上清（６０μｌ）またはペレット懸濁液（２０μｌ）をそれぞれ１５μｌまたは５μｌの５×試料ローディング緩衝液（１×濃度：５０ｍＭトルス−ＨＣｌ　ｐＨ８．０、２％ＳＤＳ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）と混合し、１００℃で５分間煮沸した。分子量標準（サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）［カリフォルニア州所在］）、対照、２５μｌの上清および１２．５μｌのペレットを１２％プレキャストＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードした。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））上に電気的に転写した。膜をブロッキング溶液とともにインキュベートし、その後、製造業者（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により推奨されているように抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体で探査した。膜を洗浄し、抗体を増強化学発光試薬ＥＣＬ（アマシャム−ファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃ．））で検出した。膜をオートラジオグラフィーフィルム（ラブサイエンティフィック（Ｌａｂｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）［ニュージャージ洲所在］）に露光させた。
【０３１４】
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４がＥＬＧ３／Ｖ５−Ｈｉｓの可溶化に最も有効な界面活性剤であり、タグ付きタンパク質の大部分が１０６，０００×ｇ上清中に検出された。
【０３１５】
（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ））
可溶化酵素を含む上清を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー・システム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に取り付けた予備平衡化済みＨｉＴｒａｐ（登録商標）キレート（Ｎｉ２＋固定イミノジアセテート）カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にのせる。カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０で洗浄する。タグ付きタンパク質を０〜５００ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶離させ、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））濃縮器を用いて限外ろ過によりさらに濃縮する。
【０３１６】
あるいは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）セラミックヒドロキシアパタイト（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）［カリフォルニア州所在］）、ＴＡＬＯＮ（登録商標）金属親和性樹脂（コバルト基ＩＭＡＣ樹脂、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［カリフォルニア州所在］）、Ｎｉ−ニトリロ酢酸樹脂（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）［ウィスコンシン州所在］）または他の同様な樹脂を用いる。
【０３１７】
実施例２３−精製酵素を用いるエロンガーゼに関する薬物スクリーニング検定　濃縮酵素（実施例２２）を、６ｍＭの卵ホスファチジルコリン、２％トリトンＸ−１００、０．４％デオキシコール酸ナトリウム、４３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ　ＡＴＰ、５００μＭ　ＮＡＤＰＨ、１０μＭ補酵素Ａ、１００μＭマロニルＣｏＡ（リチウム塩として）、終濃度７．２μＭの０．２μＣｉ基質脂肪酸（すなわち、放射性標識エイコサペンタエノイルＣｏＡ）および０．０１〜１００μＭの濃度範囲の試験化合物（例えば、ペブレートスルホキシド）を含む０．２５ｍｌの８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）中で３０〜３７℃でインキュベートする。試験管を激しく渦攪拌し、振とう水浴中３７℃で３０分間インキュベートした後、２ｍｌの１０％（重量／容積）ＫＯＨエタノール溶液を加えて、反応を停止させる。
実施例１９に記載のように、総脂質を抽出し、メチルエステルを分析する。
【０３１８】
実施例２４−実施例２０，２１，２３に記載の薬物スクリーニング検定のラット肝ミクロソームを用いたバリデーション
（ラット肝ミクロソームの調製）
酵素活性の高い時期に、軽ハロタン（鉱油中１５％）麻酔したウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを放血により屠殺した。肝臓をただちに０．９％冷ＮａＣｌ溶液ですすぎ、重量を測定し、はさみで細切した。別途指定しない限り、すべての操作は４℃で行った。０．２５Ｍスクロース、６２ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　Ｎ−アセチルシステイン、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液中（１：３重量／容積）で４ストロークのポッター−エルベージェム（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ）組織ホモジナイザーを用いて肝臓をホモジナイズした。ホモジネートを１０，４００×ｇで２０分間遠心分離して、ミトコンドリアと細胞破片をペレットにした。上清を３層チーズクロスでろ過し、１０５，０００×ｇで６０分間遠心分離した。ミクロソーム・ペレットを小型のガラス／テフロンホモジナイザーで同じホモジナイゼーション溶液に緩やかに再懸濁し、−８０℃で保存した。他所に記載のように（キルバーグ　エム　エスおよびクリステンセン　エイチ　エヌ（Ｋｉｌｂｅｒｇ　Ｍ．Ｓ．ａｎｄ　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　Ｈ．Ｎ．）、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１８巻、１５２５〜１５３０ページ）、ミトコンドリアの混入がないことを酵素的に評価した。タンパク質濃度をローリーら（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ．）（１９５１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第１９３巻、２６５〜２７５ページ）の方法によりウシ血清アルブミンを標準として測定した。
【０３１９】
（ラット肝ミクロソームの試験化合物とのインキュベーション）
実施例２１に記載されているのと同じ濃度のペブレートスルホキシド、同じ放射性標識脂肪酸、同じ条件および手順を用いて、５００μｇのラット肝ミクロソームのタンパク質を用いて反応を実施した。
【０３２０】
（結果）
酵素活性は、放射性標識された２０：５ｎ−３の、その伸長産物および最終δ−６−不飽和化産物（すなわち、２２：５ｎ−３、２４：５ｎ−３および２４：６ｎ−３）への変換率で表した。インキュベーションを窒素雰囲気中で実施したとき、不飽和化反応は起こらなかった。
【０３２１】
表６に、２０：５ｎ−３を基質として用いた場合のラット肝エロンガーゼ活性に対するチオカルバミン酸誘導体（ペブレートスルホキシド）の効果を示す。ペブレートスルホキシド（１００μＭ）は伸長を約３０％低下させた。この効果は、２２：５ｎ−３の合成の低下よりも主として２４：５ｎ−３の合成の低下に起因するものであった。
【０３２２】
【表６】
2004513662.tif 000007
ラット肝ミクロソームエロンガーゼおよび組換えヒトエロンガーゼ（実施例２１）の活性がペブレートスルホキシドにより同じように影響を受けたことから、ラット肝ミクロソームは薬物スクリーニング検定のバリデーションでの使用に適していると考えられる。
【０３２３】
実施例２５−ＥＬＧ３およびＤ６Ｄを共発現する酵母における組換え脂肪酸エロンガーゼおよびデサチュラーゼの機能の特徴づけ
本実施例では、ヒト脂肪酸エロンガーゼ遺伝子およびデサチュラーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母のような異種宿主におけるｎ−３およびｎ−６多価不飽和脂肪酸生合成経路の部分的再構成を示す。
【０３２４】
（材料）
［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３および［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６（放射化学的純度９９％、比放射能５１〜５６μＣｉ／μｍｏｌ）をＮＥＮ［マサチューセッツ州ボストン所在］）から購入した。脂肪酸を０．１Ｍ　ＬｉＯＨでけん化し、ロイシンを欠く（ＳＣ−Ｌｅｕ）か、またはウラシルおよびロイシンを欠く（ＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ）かいずれかの、１％テルギトールを含む合成最少培地に溶解した。
【０３２５】
（酵母の形質転換）
出芽酵母株ＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）により提供されたように酢酸リチウム法を用いて形質転換した。ヒトδ−６−デサチュラーゼのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２６７９９）を、カナダ特許出願第２，３０１，１５８号、２０００年３月、ウィンサーら（Ｗｉｎｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）に記載のようにＶ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するタンパク質（Ｄ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ）の生産のためにあらかじめｐＹＥＳ２／ＣＴベクターにクローニングした（ｐＴｈ５００２．１と称されるプラスミド）。ＥＬＧ３とＤ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓの共発現のために、酵母を最初にｐＴｈ５００２．１で形質転換した。組換え酵母細胞をＳＣ−Ｕ培地上で選択し、次いで、ｐＬｈ５０１５．１（実施例３）で形質転換した。ｐＴｈ５００２．１とｐＬｈ５０１５．１の両方を含む２重組換え酵母細胞をＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地上で選択した。ＥＬＧ３のクローニングベクターであるｐＢＥＶＹ−Ｌのみで形質転換した酵母細胞は、ＳＣ−Ｌｅｕ培地上で選択した。
【０３２６】
（インキュベーション）
形質転換した酵母の培養物（約３．２×１０６細胞／ｍｌ、Ｏ．Ｄ．６０００．４）を２つの実験群に分けた。第１群を、２％ラフィノース、１％テルギトールおよび２５μＭ［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６リチウム（１μＣｉ）を含む１０ｍｌのＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地の入った１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。第２群の酵母は、１％ラフィノース、２％ガラクトース（Ｄ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓの発現を誘導するため）および１％テルギトールを含む１０ｍｌのＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地中でインキュベートした。［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３または［１−１４Ｃ］１８：２ｎ−６のいずれかのリチウム塩（１μＣｉ）を両実験群に２５μＭの終濃度で加えた。回転式インキュベータ中で２７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間インキュベートした後、４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞をハーベストした。
【０３２７】
細胞ペレットを０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、実施例１９に記載のように、総脂質を抽出し、放射性標識脂肪酸を分析した。
ｐＢＥＶＹ−Ｌで形質転換した宿主酵母を陰性対照として用いた。
【０３２８】
（結果）
図２３および２４には、ガラクトースが培地に存在しない場合、Ｄ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓの発現が誘導されないため、ＥＬＧ３のＰＵＦＡ基質の伸長産物のみが検出されたことが示されている。恒常的に発現されたＥＬＧ３は、２０：４ｎ−６を２２：４ｎ−６と２４：４ｎ−６に、２０：５ｎ−３を２２：５ｎ−３と２４：５ｎ−３に伸長し、程度はより低いが１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に伸長することができた。これらの所見は、実施例１９で述べた所見と一致している。ＥＬＧ３は１８：２ｎ−６を伸長しなかった。
【０３２９】
ガラクトースを培地に添加した場合には、ＥＬＧ３のＰＵＦＡ基質の伸長産物がＤ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓにより不飽和化された（図２４）。これに関しては、２４：５ｎ−６および２４：６ｎ−３がそれぞれ２４：４ｎ−６および２４：５ｎ−３から生成した。
【０３３０】
ガラクトースの存在下では、形質転換した酵母は１８：２ｎ−６および１８：３ｎ−３をそれぞれ１８：３ｎ−６および１８：４ｎ−３にδ−６−不飽和化することもできた。次いで、これらの生成物はこれらをそれぞれ２０：３ｎ−６および２０：４ｎ−３に伸長するＥＬＧ３の基質となった。
【０３３１】
ＥＬＧ３とＤ６Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓは両方とも、ｎ−６脂肪酸基質に対するよりもｎ−３脂肪酸基質に対して活性が高いと思われた。
ヒトエロンガーゼＥＬＧ３およびヒトＤ６Ｄについて形質転換した酵母は、いわゆる「スプレッヒャー経路」（スプレッヒャー　エイチ（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ　Ｈ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１４８６巻、２１９〜２３１ページ）の多価不飽和脂肪酸を発生させることができた。本発明は、ヒトＥＬＧ３の産物である２４：４ｎ−６および２４：５ｎ−３が、１８：２ｎ−６および１８：３ｎ−３に対しても活性であるヒトＤ６Ｄの基質であることを報告する最初のものである。
【０３３２】
実施例２６−ＥＬＧ３およびＤ５Ｄを共発現する酵母における組換え脂肪酸エロンガーゼおよびデサチュラーゼの機能の特徴づけ
本実施例は、実施例２５で述べた発明者らの所見を拡張する。ヒトの脂肪酸エロンガーゼ遺伝子およびＤ５Ｄ遺伝子を共発現する異種宿主におけるｎ−３およびｎ−６　ＰＵＦＡの連続した伸長と不飽和化とが示される。
【０３３３】
（材料）
［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３、［１−１４Ｃ］２０：３ｎ−６および［１−１４Ｃ］１８：２ｎ−６（放射化学的純度９９％、比放射能５０〜５２μＣｉ／μｍｏｌ）を、ＮＥＮ［マサチューセッツ州ボストン所在］）から購入した。［１−１４Ｃ］−△８，１１，１４，１７エイコサテトラエン酸２０：４ｎ−３（放射化学的純度９９％、比放射能５５μＣｉ／μｍｏｌ）を、ＡＲＣ［ミズーリ州セントルイス所在］　から購入した。脂肪酸を０．１Ｍ　ＬｉＯＨでけん化し、１％テルギトールを含むＳＣ−ＬｅｕまたはＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地に溶解した。
【０３３４】
（酵母の形質転換）
出芽酵母株ＩＮＶＳｃ１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）により提供されたように酢酸リチウム法を用いて形質転換した。ヒトδ−５−デサチュラーゼのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１９９５９６）を、カナダ国特許出願第２，３０１，１５８号、２０００年３月、ウィンサーら（Ｗｉｎｔｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）に記載のようにＶ−５エピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するタンパク質（Ｄ５Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ）の生産のためにあらかじめｐＹＥＳ２／ＣＴベクターにクローニングした（ｐＴｈ５００９．１と称されるプラスミド）。ＥＬＧ３とＤ５Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓの共発現のために、酵母を最初にｐＴｈ５００９．１で形質転換した。組換え酵母細胞をＳＣ−Ｕ培地上で選択し、次いで、ｐＬｈ５０１５．１で形質転換した（実施例３に記載）。ｐＴｈ５００９．１とｐＬｈ５０１５．１とを含む２重組換え酵母細胞をＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地上で選択した。ＥＬＧ３のクローニングベクターであるｐＢＥＶＹ−Ｌのみで形質転換した酵母細胞は、ＳＣ−Ｌｅｕ培地上で選択した。
【０３３５】
（インキュベーション）
形質転換した酵母の培養物（約３．２×１０６細胞／ｍｌ、Ｏ．Ｄ．６０００．４）を２つの実験群に分けた。第１群においては、細胞を、２％ラフィノースおよび１％テルギトールを添加した１０ｍｌのＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地を含む１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートした。第２群においては、酵母を、１％ラフィノース、２％ガラクトース（Ｄ５Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓの発現を誘導するため）および１％テルギトールを含む１０ｍｌのＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地中でインキュベートした。［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３、［１−１４Ｃ］２０：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］１８：２ｎ−６または［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−３のリチウム塩（１μＣｉ）を両実験群に２５μＭの終濃度で加えた。回転式インキュベータ中で２７０ｒｐｍ、３０℃で２４時間インキュベートした後、４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞をハーベストした。
【０３３６】
細胞ペレットを０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、実施例１９に記載のように、総脂質を抽出し、放射性標識脂肪酸を分析した。
ｐＢＥＶＹ−Ｌで形質転換した宿主酵母を陰性対照として用いた。
【０３３７】
（結果）
図２５に、酵母がガラクトースの存在下で両遺伝子を共発現した場合に、２０：３ｎ−６が２０：４ｎ−６に不飽和化され、これがさらに２２：４ｎ−６および２４：４ｎ−６に伸長されたことが示されている。ガラクトースを培地に加えなかった場合には、２０：３ｎ−６が２２：３ｎ−６に伸長されたのみであった。同様に、Ｄ５Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓは２０：４ｎ−３を不飽和化して２０：５ｎ−３を生産し、次いで、これが２２：５ｎ−３および２４：５ｎ−３に伸長された。２０：４ｎ−３の２２：４ｎ−３および２４：４ｎ−３への伸長も検出された。
【０３３８】
これらの実験条件下では、両遺伝子を共発現する酵母は１８：２ｎ−６を伸長してさらに不飽和化することができなかった。Ｄ５Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓは、ＥＬＧ３により生成された１８：３ｎ−３の直接の伸長産物である２０：３ｎ−３に対して活性はなかった（図２６）。
【０３３９】
（結論）
いずれも発明者らによりクローニングされたＥＬＧ３およびヒトＤ５Ｄを共発現する酵母は、いわゆる「スプレッヒャー経路」（スプレッヒャー　エイチ（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ　Ｈ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１４８６巻、２１９〜２３１ページ）の基質（すなわち、２４：４ｎ−６および２４：５ｎ−３）を発生させることができた。
【０３４０】
実施例２７−ＥＬＧ３と、ヒトＤ６ＤまたはＤ５Ｄのいずれかとを共発現する酵母の全細胞、スフェロプラストまたはミクロソームを用いる薬物スクリーニング検定
【０３４１】
１宿主系またはその任意の一部を用いてヒトエロンガーゼＥＬＧ３および／またはヒトデサチュラーゼに作用する化合物を特定するために、以下の検定法をデザインする。
【０３４２】
（スフェロプラストおよびミクロソームの調製）
形質転換した出芽酵母の細胞を１％ラフィノースおよび２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地中で生育させて、デサチュラーゼ導入遺伝子の発現を誘導する。実施例２０に記載のように、１６時間のインキュベーションの後にスフェロプラストを得る。
【０３４３】
エロンガーゼ遺伝子およびデサチュラーゼ遺伝子の両方を発現する宿主細胞のミクロソームを、実施例２１に記載の液体Ｎ２および分画遠心法を用いて調製する。
【０３４４】
（全酵母細胞、スフェロプラストまたはミクロソームの試験化合物とのインキュベーション）
エロンガーゼおよびデサチュラーゼの導入遺伝子を含む酵母細胞を用いるこれらの検定では、選択圧を維持するためにＳＣ−Ｕ−Ｌｅｕ培地の使用が必要である。ＥＬＧ３およびデサチュラーゼまたはエロンガーゼ単独に対する試験化合物の効果を評価するために、形質転換した酵母をそれぞれガラクトースの存在下または非存在下でインキュベートする。ＥＬＧ３およびＤ５ＤまたはＥＬＧ３およびＤ６Ｄを発現する酵母に対する最適の基質は、それぞれ２０：３ｎ−６または２０：５ｎ−６である。試験化合物との全酵母細胞、スフェロプラストまたはミクロソームのインキュベーション条件は、実施例２０および２１に記載の条件と同じである。用いる宿主系にかかわりなく、組換え酵素の活性に対する試験化合物の効果は、実施例１９に記載のように、ＥＬＧ３および／またはデサチュラーゼにより生産されるＦＡＭＥの相対量のＲＰ−ＨＰＬＣまたはＧＣ分析により測定される。
【０３４５】
実施例２８−対照およびＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの白血球の初代培養におけるＰＵＦＡの伸長
本実施例では、ＰＵＦＡを伸長するが不飽和化しない白血球の能力について記述する。本実施例では、ＳＴＺ誘発性糖尿病のラットにおいて１８：３ｎ−６および１８：２ｎ−６の伸長がどのように影響を受けるかの詳細についても記述する。
【０３４６】
（材料）
ＲＰＭＩ　１６４０培地をギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬから入手した。ストレプトゾトシン（２−デスオキシ−２−メチルニトロソアミノカルボニルアミノ−Ｄ−グルコピラノース）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から供給された。
【０３４７】
（動物）
雌のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットをチャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ）［ケベック州セントコンスタント（Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ）所在］から入手した。動物を、２２±２℃、１時間当たり１５回の換気を伴う目標相対湿度５０±１０％の、１２時間明／暗サイクルのバリア維持の室内に収容した。水および通常の飼料を自由に摂取させた。
【０３４８】
すべての動物を動物実験に関するカナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｒｅ）のガイドラインに適合した標準手順書に従って毎日モニターした。１５匹の無作為に選択したラットに体重１ｋｇ当たり５０ｍｇのＳＴＺを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射した。９日後に動物にＳＴＺ（７５ｍｇ／体重ｋｇ）の２回目の投与を行った。０．９％ＮａＣｌを模擬注射した１２匹のラットからなる第２群を対照とした。最終Ｉ．Ｐ．注射の２および７週後に対照およびＳＴＺ投与ラット（血糖値２１〜＞３３ミリモル／ｌ）を軽ハロタン（鉱油中１５％）麻酔下におき、放血により屠殺した。血液を、２００μｌの５％ＥＤＴＡ溶液を抗凝固剤として含む１０ｍｌ注射器に採取した。
【０３４９】
（白血球の単離）
１容の全血と５容の滅菌赤血球溶解緩衝液（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）［カリフォルニア州所在］）とを混合して、白血球を得た。細胞懸濁液を氷上で２０分間インキュベートし、４℃、４００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、白血球ペレットを洗浄し、５５０μｌの０．９％生理食塩水に再懸濁した。試料の一部を取り、細胞の計数に供した。細胞タンパク質含量をローリーら（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ）（１９５１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第１９３巻、２６５〜２７５ページ）の方法を用い、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。
【０３５０】
（インキュベーション）
ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットから単離した白血球を用いた本発明者らの予備試験により、白血球は１８：２ｎ−６、１８：３ｎ−３、１８：３ｎ−６、２０：３ｎ−６および２０：４ｎ−６を伸長することが可能であり、１８：２ｎ−６および１８：３ｎ−６の伸長は２４時間以内にそれぞれ６％および６６％であることが示された。これらの結果に基づき、また糖尿病ではＤ６Ｄに障害があるため、それぞれＤ６Ｄの基質および産物である１８：２ｎ−６および１８：３ｎ−６を、対照およびＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの白血球のインキュベーション用に選択した。１８：２ｎ−６、１８：３ｎ−３についてはδ−６−不飽和化が、２０：３ｎ−６についてはδ−５−不飽和化が検出されなかった。
【０３５１】
２，７週目の対照群および２，７週目のＳＴＺ処理ラット群の白血球を、グルタミン、１０％ウシ胎児血清および抗生物質（５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で５μＭ［ｌ−１４Ｃ］１８：３ｎ−６（０．６μＣｉ）とともに１０分間〜２４時間または５μＭ［ｌ−１４Ｃ］１８：２ｎ−６（０．６μＣｉ）とともに２４時間インキュベートした。
【０３５２】
各インキュベーションの終了時に、４℃、４００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞ペレットを得た。細胞を０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで洗浄した。クロロホルム：メタノール（２：１容積比）で細胞の総脂質を抽出した。実施例１９に記載のように脂肪酸をＢＦ３でメチル化し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。あるいは、ＦＡＭＥを実施例１９に記載のようにＧＣにより分析することが可能である。
【０３５３】
（結果）
表７にＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの白血球が１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に速やかに変換したことを示す。最後のＳＴＺのＩ．Ｐ．注射後の時間に関わらず、ＳＴＺ群では伸長系の活性に有意な増加があった。逆に、ＳＴＺ注射２週間後に得られた白血球では１８：２ｎ−６の２０：２ｎ−６への伸長において約５０％の低下があった（表８）。ＳＴＺ処理７週間後に屠殺した動物の白血球では１８：２ｎ−６の２０：２ｎ−６への伸長に有意な変化はなかった。
【０３５４】
【表７】
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【表８】
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ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットの白血球においてはＰＵＦＡ代謝が変化する。したがって、白血球は、疾患（例えば、糖尿病）における伸長系の調節または制御を評価するのに適切なモデルである。
【０３５５】
実施例２９−ヒトの白血球の初代培養におけるＰＵＦＡの伸長
本実施例は、ヒト白血球が１８：３ｎ−６に対するエロンガーゼ活性を評価するのに適切なモデルであることを示す。この検定法は、糖尿病のような疾患における伸長系の変化を測定するために臨床試験に用いることができる。
【０３５６】
絶食した健常ボランティア（３０〜５０歳）の末梢静脈血を、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含む１０ｍｌ容バキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（バキュテイナシステムズ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）［ニュージャージー州所在］）を用いて得た。実施例２８に記載の技術を用いて白血球を単離した。白血球の５μＭ［ｌ−１４Ｃ］１８：３ｎ−６（０．６μＣｉ）との１０〜６０分間のインキュベーションを実施例２８に記載されているのと同じ条件下で実施した。
【０３５７】
（結果）
表９に、ラット白血球（実施例２８）において認められたのと同様にヒト白血球が１８：３ｎ−６を２０：３ｎ−６に速やかに伸長する能力を有することが示されている。２０：３ｎ−６に対してはδ−５不飽和化活性が検出されなかった。
【０３５８】
【表９】
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【０３５９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｎ−３脂肪酸の代謝経路の概略図。
【図２】ｎ−６脂肪酸の代謝経路の概略図。
【図３】ｎ−９およびｎ−７脂肪酸の代謝経路の概略図。
【図４】非変異残基（アステリスクを付けた）、ヒスチジンボックス（枠で示した）およびＥＲ保持シグナル（枠で示した）を強調した、７種のヒトエロンガーゼ間の多重アライメントを示す図。
【図５】ＥＬＧ７の膜貫通領域に関する膜貫通隠れマルコフモデル（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎ　Ｈｉｄｄｅｎ　Ｍａｒｋｏｖ　Ｍｏｄｅｌ、ＴＭＨＭＭ）を示すグラフ。
【図６】小胞体に埋め込まれたヒトエロンガーゼのトポロジカルモデルを示す図。
【図７】プラスミドｐＴｈ１００９．１（６７４４ｂｐ）の模式図。ヒトエロンガーゼ（ＥＬＧ１）コード配列がＫｐｎＩおよびＮｏｔＩの制限部位間に示されている。
【図８】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−１８７７と−２８６５との間のＥＬＧ１の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号１に相当する。
【図９】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−５３１１８と−５３６２６との間のＥＬＧ２の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号２に相当する。
【図１０】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−３７と−１３８１との間のＥＬＧ３の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号３に相当する。
【図１１】ＥＬＧ４遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。この図は配列番号４，５に相当する。
【図１２】ＥＬＧ４の制御領域のヌクレオチド配列のうち２４５６ｂｐのフラグメントを示す図。この図は配列番号６に相当する。
【図１３】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−１と−１４１１との間のＥＬＧ５の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号７に相当する。
【図１４】ＥＬＧ６遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。この図は配列番号８，９に相当する。
【図１５】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−１と−１９３７との間のＥＬＧ６の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号１０に相当する。
【図１６】ＥＬＧ７遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。この図は配列番号１１，１２に相当する。
【図１７】翻訳開始コドンＡＴＧからの部位−１と−２０００との間のＥＬＧ７の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。この図は配列番号１３に相当する。
【図１８】プラスミドｐＴｈ１００９．２（６７４３ｂｐ）の模式図。ヒトエロンガーゼ（ＥＬＧ１）コード配列がＫｐｎＩおよびＮｏｔＩの制限部位間に示されている。
【図１９】プラスミドｐＬｈ５０１５．１（７９２７ｂｐ）の模式図。ヒトエロンガーゼ（ＥＬＧ３）コード配列がＢａｍＨＩおよびＸｂａＩの制限部位間に示されている。
【図２０】プラスミドｐＧｈ３０２０．１（６１６８ｂｐ）の模式図。ヒトエロンガーゼ（ＥＬＧ３）の制御領域が２つのＢｇｌＩＩ制限部位間に示されている。
【図２１】［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３および［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３とともにインキュベートした、ｐＴｈ１０２１．１で形質転換した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２２】［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−６、［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６、［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３および［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３とともにインキュベートした、ｐＹＥＳ２／ＣＴで形質転換した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２３】［１−１４Ｃ］１８：２ｎ−６または［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３とともにガラクトースの存在下または非存在下でインキュベートした、Ｄ６Ｄ／Ｖ５−ＨｉｓおよびＥＬＧ３を同時発現した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２４】［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−６または［１−１４Ｃ］２０：５ｎ−３とともにガラクトースの存在下または非存在下でインキュベートした、Ｄ６Ｄ／Ｖ５−ＨｉｓおよびＥＬＧ３を同時発現した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２５】［１−１４Ｃ］２０：４ｎ−３または［１−１４Ｃ］２０：３ｎ−６とともにガラクトースの存在下または非存在下でインキュベートした、Ｄ５Ｄ／Ｖ５−ＨｉｓおよびＥＬＧ３を同時発現した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２６】［１−１４Ｃ］１８：２ｎ−６または［１−１４Ｃ］１８：３ｎ−３とともにガラクトースの存在下または非存在下でインキュベートした、Ｄ５Ｄ／Ｖ５−ＨｉｓおよびＥＬＧ３を同時発現した酵母からの脂肪酸の放射標識メチルエステルのＨＰＬＣ分析を示す図。
【図２７】様々なヒト組織におけるＥＬＧ１、ＥＬＧ２、ＥＬＧ３、ＥＬＧ４、ＥＬＧ５、ＥＬＧ６およびＥＬＧ７転写物のノーザンブロット分析を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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