(57)【要約】新規キメラＧ−タンパク質共役型受容体を、単離ポリペプチド、かかるキメラ受容体を含有する膜調製物、かかるキメラ受容体をコードする核酸、およびかかる受容体を発現する細胞として提供する。このキメラ受容体は、ＮＰＹ５の第３細胞質ループドメインまたはＣ−末端細胞内ドメインの一方または両方の殆どまたは全てをもう１つのＮＰＹ受容体（好ましくはＮＰＹ１受容体）の対応する（単数または複数の）領域で置き換えたＮＰＹ５レセプターである。
2004500820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の一本のポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、且つ互いにすぐに近接し、且つさらなる介在アミノ酸を含まずに、以下のアミノ酸配列ドメイン：
ａ）　ＮＰＹ５受容体Ｎ−末端細胞外ドメイン、
ｂ）　ＮＰＹ５受容体第１膜貫通ドメイン、
ｃ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞内ループドメイン、
ｄ）　ＮＰＹ５受容体第２膜貫通ドメイン、
ｅ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞外ループドメイン、
ｆ）　ＮＰＹ５受容体第３膜貫通ドメイン、
ｇ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞内ループドメイン、
ｈ）　ＮＰＹ５受容体第４膜貫通ドメイン、
ｉ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞外ループドメイン、
ｊ）　ＮＰＹ受容体第５膜貫通ドメイン、
ｋ）　ＮＰＹ１受容体第３細胞内ループドメイン、
ｌ）　ＮＰＹ受容体第６膜貫通ドメイン、
ｍ）　ＮＰＹ５受容体第３細胞外ループドメイン、
ｎ）　ＮＰＹ５受容体第７膜貫通ドメイン、および
ｏ）　ＮＰＹ５受容体Ｃ−末端細胞内ドメイン
を含む、前記キメラ受容体タンパク質。
【請求項２】
前記第５膜貫通ドメインおよび前記第６膜貫通ドメインのＮＰＹ受容体が、ＮＰＹ１受容体およびＮＰＹ５受容体から選択される、請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項３】
それぞれのドメインが独立して、ヒト、サル、イヌ、マウス、ブタ、モルモットおよびラット受容体から選択される、請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項４】
アミノ酸の一本のポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、且つ互いにすぐに近接し、且つさらなる介在アミノ酸を含まずに、以下のアミノ酸配列ドメイン：
ａ）　ＮＰＹ５受容体Ｎ−末端細胞外ドメイン、
ｂ）　ＮＰＹ５受容体第１膜貫通ドメイン、
ｃ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞内ループドメイン、
ｄ）　ＮＰＹ５受容体第２膜貫通ドメイン、
ｅ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞外ループドメイン、
ｆ）　ＮＰＹ５受容体第３膜貫通ドメイン、
ｇ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞内ループドメイン、
ｈ）　ＮＰＹ５受容体第４膜貫通ドメイン、
ｉ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞外ループドメイン、
ｊ）　ＮＰＹ５受容体第５膜貫通ドメイン、
ｋ）　ＮＰＹ５受容体第３細胞内ループドメイン、
ｌ）　ＮＰＹ５受容体第６膜貫通ドメイン、
ｍ）　ＮＰＹ５受容体第３細胞外ループドメイン、
ｎ）　ＮＰＹ受容体第７膜貫通ドメイン、および
ｏ）　ＮＰＹ１受容体Ｃ−末端細胞内ドメイン
を含む、前記キメラ受容体タンパク質。
【請求項５】
前記第５膜貫通ドメインおよび前記第６膜貫通ドメインのＮＰＹ受容体が、ＮＰＹ１受容体およびＮＰＹ５受容体から選択される、請求項４に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項６】
それぞれのドメインが、独立して、ヒト、サル、イヌ、マウス、ブタ、モルモットおよびラット受容体から選択される、請求項４に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項７】
アミノ酸の一本のポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、且つ互いにすぐに近接し、且つさらなる介在アミノ酸を含まずに、以下のアミノ酸配列ドメイン：
ａ）　ＮＰＹ５受容体Ｎ−末端細胞外ドメイン、
ｂ）　ＮＰＹ５受容体第１膜貫通ドメイン、
ｃ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞内ループドメイン、
ｄ）　ＮＰＹ５受容体第２膜貫通ドメイン、
ｅ）　ＮＰＹ５受容体第１細胞外ループドメイン、
ｆ）　ＮＰＹ５受容体第３膜貫通ドメイン、
ｇ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞内ループドメイン、
ｈ）　ＮＰＹ５受容体第４膜貫通ドメイン、
ｉ）　ＮＰＹ５受容体第２細胞外ループドメイン、
ｊ）　ＮＰＹ受容体第５膜貫通ドメイン、
ｋ）　ＮＰＹ１受容体第３細胞内ループドメイン、
ｌ）　ＮＰＹ受容体第６膜貫通ドメイン、
ｍ）　ＮＰＹ５受容体第３細胞外ループドメイン、
ｎ）　ＮＰＹ受容体第７膜貫通ドメイン、および
ｏ）　ＮＰＹ１受容体Ｃ−末端細胞内ドメイン
を含む、前記キメラ受容体タンパク質。
【請求項８】
前記第５膜貫通ドメインおよび前記第６膜貫通ドメインのＮＰＹ受容体が、ＮＰＹ１受容体およびＮＰＹ５受容体から選択される、請求項７に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項９】
それぞれのドメインが、独立して、ヒト、サル、イヌ、マウス、ブタ、モルモットおよびラット受容体から選択される、請求項７に記載のキメラ受容体タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記受容体タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列、または前記受容体タンパク質のシグナル変換リガンドを結合し得る前記配列のフラグメントからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項４に記載のキメラ受容体タンパク質を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記受容体タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９のアミノ酸配列、または前記受容体タンパク質のシグナル変換リガンドを結合し得る前記配列のフラグメントからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項７に記載のキメラ受容体タンパク質を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記受容体タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０のアミノ酸配列、または前記受容体タンパク質のシグナル変換リガンドを結合し得る前記配列のフラグメントからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項４に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項７に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１に記載のキメラ受容体タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、およびその相同体またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項４に記載のキメラ受容体タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、およびその相同体またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項７に記載のキメラ受容体タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、およびその相同体またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１３の核酸分子を含む、前記ベクター。
【請求項２０】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１４の核酸分子を含む、前記ベクター。
【請求項２１】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１５の核酸分子を含む、前記ベクター。
【請求項２２】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１６のポリヌクレオチドを含む、前記ベクター。
【請求項２３】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１７のポリヌクレオチドを含む、前記ベクター。
【請求項２４】
キメラ受容体タンパク質の組換え体発現用ベクターであって、発現に適切な配向性で少なくとも一つの制御エレメントに機能可能に結合した、請求項１８のポリヌクレオチドを含む、前記ベクター。
【請求項２５】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２６】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２７】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項３０】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項３１】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項３２】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項３３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項３７】
請求項１９に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項３８】
請求項２０に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項３９】
請求項２１に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項４０】
請求項２２に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項４１】
請求項２３に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項４２】
請求項２４に記載のベクターを含む組換え細胞であって、前記ベクターを含有しない宿主細胞に前記ベクターを導入して、前記ベクターを含有するベクター含有細胞を生成することにより前記組換え細胞を製造し、ここで前記組換え細胞が前記ベクター含有細胞またはその子孫である、前記組換え細胞。
【請求項４３】
請求項３７に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４４】
請求項３８に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４５】
請求項３９に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４６】
請求項４０に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４７】
請求項４１に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４８】
請求項４２に記載の組換え細胞であって、前記宿主細胞により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え細胞。
【請求項４９】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４３に記載の組換え細胞。
【請求項５０】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項５１】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４５に記載の組換え細胞。
【請求項５２】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４６に記載の組換え細胞。
【請求項５３】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４７に記載の組換え細胞。
【請求項５４】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項４８に記載の組換え細胞。
【請求項５５】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４３に記載の組換え細胞。
【請求項５６】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項５７】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４５に記載の組換え細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４６に記載の組換え細胞。
【請求項５９】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４７に記載の組換え細胞。
【請求項６０】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４８に記載の組換え細胞。
【請求項６１】
請求項１３に記載の核酸分子であるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６２】
請求項１４に記載の核酸分子であるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６３】
請求項１５に記載の核酸分子であるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６４】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドであるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６５】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドであるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６６】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドであるＲＮＡを含む両生類卵母細胞。
【請求項６７】
請求項４３の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項６８】
請求項４４の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項６９】
請求項４５の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項７０】
請求項４６の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項７１】
請求項４７の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項７２】
請求項４８の多くの組換え細胞から単離した組換え膜調製物であって、前記調製物の組換え膜が、宿主細胞から単離した膜の適合する調製物からなる対照により示されるニューロペプチドＹ結合活性と比較して、少なくとも２倍を超えるニューロペプチドＹ結合活性を示す、前記組換え膜調製物。
【請求項７３】
試験化合物の特性付けアッセイであって、請求項１に記載のキメラ受容体と試験化合物とを接触させ、次いで前記受容体に対して前記試験化合物を結合させた結果を検出することを含む、前記アッセイ。
【請求項７４】
試験化合物の特性付けアッセイであって、請求項４に記載のキメラ受容体と試験化合物とを接触させ、次いで前記受容体に対して前記試験化合物を結合させた結果を検出することを含む、前記アッセイ。
【請求項７５】
試験化合物の特性付けアッセイであって、請求項７に記載のキメラ受容体と試験化合物とを接触させ、次いで前記受容体に対して前記試験化合物を結合させた結果を検出することを含む、前記アッセイ。
【請求項７６】
前記試験化合物が標識化されておらず、前記結果が、前記受容体に対して特異的に結合する標識化化合物の受容体との置換である、請求項７３に記載のアッセイ。
【請求項７７】
前記試験化合物が標識化されておらず、前記結果が、前記受容体に対して特異的に結合する標識化化合物の受容体との置換である、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項７８】
前記試験化合物が標識化されておらず、前記結果が、前記受容体に対して特異的に結合する標識化化合物の受容体との置換である、請求項７５に記載のアッセイ。
【請求項７９】
前記受容体が膜挿入型受容体であり、前記結果が前記受容体の少なくとも一つの細胞内ドメインに関連する応答である、請求項７３に記載のアッセイ。
【請求項８０】
前記受容体が膜挿入型受容体であり、前記結果が前記受容体の少なくとも一つの細胞内ドメインに関連する応答である、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項８１】
前記受容体が膜挿入型受容体であり、前記結果が前記受容体の少なくとも一つの細胞内ドメインに関連する応答である、請求項７５に記載のアッセイ。
【請求項８２】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７３に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８３】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７４に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８４】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７５に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８５】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７６に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８６】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７７に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８７】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７８に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８８】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項７９に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８９】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項８０に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項９０】
摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置する方法であって、請求項８１に記載のアッセイを実施することによりＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を含む治療的有効量の組成物を前記被検体に投与することを含む、前記方法。
【請求項９１】
摂食障害、発作障害、運動障害および不安障害から選択される被検体の症状を処置するための薬剤の製造における、請求項７３〜８１のいずれかに記載のアッセイを実施することによってＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物の使用。
【請求項９２】
請求項７３〜８１のいずれかのアッセイを実施することによってＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物を活性成分として含む、摂食障害、発作障害、運動障害および不安障害から選択される症状を処置するための薬剤。
【請求項９３】
摂食障害、発作障害、運動障害および不安障害から選択される症状を処置するための、請求項７３〜８１のいずれかに記載のアッセイを実施することによって、ＮＰＹ受容体の活性を調節することが同定された化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣ）：ＧＰＣは、ホルモン、神経伝達物質、および他の細胞外シグナル伝達分子（たとえばペプチド類および小さな有機分子）による刺激に応答して、シグナルを細胞内に変換するように作用する一種の膜架橋タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。たとえばＧａｔｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３巻：１７９７９−８２頁、１９９８年を参照されたい。ＧＰＣなどの受容体ポリペプチドは通常、細胞表面では非常に低濃度で見いだされる。細胞応答を媒介する上での重要な役割により、ＧＰＣは薬剤作用の非常に有効なターゲットである。特に単離膜調製物の構成要素としての単離ＧＰＣ、並びにクローン化ＧＰＣＲ遺伝子（好ましくはキャンデー：ｃａｎｄｙ）およびかかる遺伝子を発現する細胞は、創薬および開発アッセイの基礎として医薬業界で用いられている。高レベルの活性受容体によって高感度のアッセイが容易になるにつれて、細胞および膜の中で人為的に高濃度のＧＰＣを得る手段が大いに求められている。
【０００２】
ＧＰＣは、８つの親水性ドメインを相互接続する７つの疎水性ドメインを含む１本の連続したアミノ酸鎖からなる。ＧＰＣＲのアミノ酸配列が決定されると、これらのドメインの正確な配置は、たとえば標準的なＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７巻：１０５〜３２頁、１９８２年）のヒドロパシープロフィールを使用する疎水性または親水性のコンピューター分析によって好都合に計算することができる。疎水性ドメインと親水性ドメインとの遷移境界は、通常、ひとつながりの非荷電且つ非極性（疎水性）残基の開始点または終点に荷電または極性（親水性）アミノ酸残基が存在するという特徴がある。細胞表面ＧＰＣＲのＮ−末端は細胞外空間に伸長し、そのＣ−末端は細胞の細胞質内に伸張する。７つの疎水性ドメインはそれぞれ約２０〜２５アミノ酸長であり、殆どがアルファ・へリックス・コンフォメーションであるとされ、その細胞膜を通して１回横切り、その全長は通常、膜に埋没している。従ってＧＰＣＲの疎水性ドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、膜−架橋アルファ・へリックス・ドメインなどともいわれ、親水性ドメインは、機能的な膜−結合型ＧＰＣＲにおけるその予想位置に依存して、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインといわれる。このＴＭドメインを相互接続する親水性ドメインは、細胞質または細胞外空間内でループを形成し、そして細胞質または細胞外ループドメインといわれる。
【０００３】
ＧＰＣＲは二次および三次構造コンフォメーションに関して構造的にモデル化されてきており、その一次構造内の細胞外ドメイン、ＴＭドメインおよび細胞内ドメインの正確な位置（則ち、そのアミノ酸配列）は公知であり、通常、当業界では意見が一致している（たとえばＢａｌｄｗｉｎ、ＥＮＢＯ Ｊ．１２巻：１６９３−７０３頁、１９９３年、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｓｎａｋｅｓ．ｈｔｍｌも参照されたい）。かくしてこれらの受容体タンパク質は、細胞外Ｎ−末端ドメイン、（３つの細胞外ループドメインと交互になっている３つの細胞内ループドメインにより接続されている）７つの膜−架橋アルファ・へリックス・ドメイン、および細胞内Ｃ−末端ドメインを含む。
【０００４】
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体の種々のドメインの位置は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’ｓ Ｖｉｓｅｕｒソフトウエアによって製作された特定の受容体ポリペプチドに関する「ヴィズールのスネーク様像（Ｖｉｓｅｕｒ’ｓ ｓｎａｋｅ ｌｉｋｅ ｖｉｅｗ）」を精査することによって容易に決定することができる。これらのヴィズールのスネーク様像は、広範な種類のＧＰＣＲポリペプチドに関して電子的に出版されている（種々の哺乳類および非哺乳類脊椎種のＮＰＹ受容体を含む−ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｓｎａｋｅｓ．ｈｔｍｌ）。これらのスネーク様像において、受容体のポリペプチド配列のアミノ酸は、１文字コードを含む円で示されている。ＴＭドメインは、対角線上に積み重ねられた円として表されてｉｎ ｓｉｔｕでこれらのドメイン構造により採用されると考えられるアルファ・へリックス・コンフォメーションを示し、その他のドメインは垂直や水平に配置された配列として表されている。
【０００５】
この細胞外および膜架橋ドメインの正確な構造的特徴（一次構造とこれから生じるものを殆ど含む）が、受容体のリガンド特異性をだいたい決定すると考えられている。特にペプチド結合は一般的に、７つのＴＭドメインの大多数の上部付近（則ち、細胞外ドメインに隣接するＴＭドメイン、一般的に細胞外ドメインから約１０〜１５個のアミノ酸）および受容体の細胞外ドメインにアミノ酸残基を含み、非ヘプチド型リガンドは一般的に、ＴＭドメインの幾つかの間の膜の平面に深く結合しているものと考えられている。
【０００６】
その第３の細胞内ループおよび細胞内Ｃ−末端ドメインの正確な構造は、ＧＰＣＲの重要な機能的特徴を示すものと考えられている。特にこれらは、種々のニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体のいずれかを含む、特定のＧＰＣＲのいずれかと、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質の多くのサブタイプのいずれかとの特異的なＧ−タンパク質共役型相互作用の特徴を決定するのに大きく寄与するものと考えられている。これらのサブタイプはしばしば、機能的にはっきりしているので、結合相互作用におけるこれらの変化は、受容体機能に変化をもたらすと考えられている。これらのドメイン構造は、勿論、それぞれのアミノ酸（一次）配列の相関的要素である。
【０００７】
特定の操作理論のいずれかに縛られるつもりはないが、これらの特異的結合相互作用は、Ｇタンパク質を受容体の他の細胞内ドメイン（７つのＴＭアルファへリックスのうち６つを接続する３つの細胞内ループ）と近接して架橋するのに関与していると考えられ、この作用は受容体のシグナル変換機能を決定する土台をなすと考えられている。従って第３の細胞内ループとＣ−末端ドメインとはいずれも、活性化する際に、ＧＰＣＲによって伝達される細胞内シグナルの型を決定するのに重要な役割を果たしている。
【０００８】
シグナル変換は、受容体にアゴニストリガンドが結合することによって開始する。これによって細胞外ドメインにおいてコンフォメーション変化が導出される。受容体が適切に機能しているときは、これらのコンフォメーション変化はＴＭドメインを通して伝播し、ＧＰＣＲの細胞内部分に協調変化をもたらす。細胞内ドメインがこのように正確に変化すると、結合するＧ−タンパク質複合体を刺激して、細胞内シグナル伝達を調節するように作用する。特に、ＮＰＹ受容体では、この変化が複合体のＧアルファサブユニットにおけるＧＴＰからＧＤＰへの交換を刺激し、受容体からＧ−タンパク質複合体を放出させ、複合体のＧベータおよびＧガンマサブユニットからＧアルファを分離させる。これらの変化の最終的な結果は、細胞内シグナル伝達系の活性化または阻害である。
【０００９】
キメラＧＰＣＲ：種々のＧＰＣＲドメインの受容体機能への具体的な寄与を分析していく上で、組換えＤＮＡ技術を使用して異種のＮ−末端およびＣ−末端ドメインをもつ多くの異なるキメラＧＰＣＲ分子が構築されてきた。これらの努力によって、キメラ受容体に結合している種々のドメイン源に依存して、予測不可能な結果が得られた。たとえばＢｌｏｕｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻：１６３８８−９５頁、１９９３年；Ｌｉｇｇｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．９０巻：３６６５−６９頁、１９９３年を参照されたい。
【００１０】
幾つかのケースでは、（異種ドメインをコードするＤＮＡフラグメントの特定の組合せを含む）キメラＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡを発現させる試みが、細胞表面では殆ど発現しない受容体という結果に終わっている。別のケースでは、発現させたキメラ受容体が、本来の受容体とは異なる膜に局在化している。たとえばＭｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻：１０８０７−１２頁、１９９１年；並びにＭｅｒｙおよびＢｏｕｌａｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９巻：３４５７−６３頁、１９９４年を参照されたい。
【００１１】
適切に膜挿入したにもかかわらず、結合した異種ドメインが正しく機能しないことがある。アゴニストリガンドの結合により刺激された細胞外ドメインのコンフォメーション変化はしばしば、受容体の細胞内部分に十分に伝播せず、それゆえに結合するＧタンパク質の活性化を刺激することができず、細胞内シグナル伝達を十分に調節できないことが多い。キメラ受容体のリガンド結合部分が得られた本来の受容体と比較して、キメラ受容体が改変されたリガンド結合特異性を示すことがある。たとえばＢｌｏｕｎｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻：１６３８８−９５頁、１９９３年およびＢｕｇｇｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０巻：７４７４−７８頁、１９９５年を参照されたい。
【００１２】
本来のＧＰＣＲは、サイトゾルヘテロ三量体Ｇ−タンパク質複合体の媒介作用によって、細胞表面アゴニスト結合現象を細胞内シグナルに変換する。ＧＰＣＲに結合（共役）することが示されたヘテロ三量体Ｇ−タンパク質組合せのリストは増大しつつある。このＧ−タンパク質複合体は、次に、通常、第２メッセンジャー、たとえばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、イノシトール１，４，５−ビスホスフェートまたはアラキドン酸を生成することによって、シグナル変換プロセスを継続する特異的なエフェクタータンパク質を活性化する。ＧＰＣＲによっては複数のシグナル変換経路に共役することもあると示されたが、正常なＧＰＣＲ機能では、特異的なＧ−タンパク質アルファベータおよびガンマ・サブユニットの組合せが、通常、特異的なエフェクタータンパク質を活性化する。
【００１３】
ＧＰＣＲ機能のアッセイ：ＧＰＣＲ機能の感受性があり且つ正確な決定ができるアッセイは、たとえばＧＰＣＲ機能を調節し、それにより薬剤としても作用することができる化合物の効果を分析する有用な研究用ツールであるので、かかるアッセイは非常に求められている。たとえばＧＰＣＲによるアゴニスト誘発ＧＴＰγ３５Ｓ結合により、Ｇ−タンパク質活性化の機能的尺度が得られる。受容体によってはかかるアッセイで最適な結果を与えないこともあるが、このタイプのアッセイは多くのＧＰＣＲに関して広く使用されてきた。たとえばアゴニストとアンタゴニストを識別し、所定のＧＰＣＲに関してアゴニストの効能および有効性を決定するのに使用されてきた（たとえばＴｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｒｅｓ １５巻：１９９−２１１頁、１９９５年を参照されたい）。
【００１４】
強力な機能活性アッセイは、今なおＧ−タンパク質−媒介シグナル伝達経路の限定されたサブセットの測定にしか利用可能でない。強力なアッセイは、四重、より好ましくは三重、最も好ましくは二重サンプル実施からの統計的に有意なデータセットを取得できるシグナル対ノイズ特性を一貫して提供することができる。全てのＧＰＣＲ研究では、特に創薬の分野では、かかる強力なアッセイによって有用且つ情報量の多いデータを取得することが容易になる。
【００１５】
かかるアッセイの強度は、そのアッセイで使用する特定の受容体によって大きく影響を受ける。従って、強力な機能活性アッセイを容易にするために適合させたシグナル伝達特性をもつＧＰＣＲは、特に有用な研究用ツールである。
【００１６】
ＮＰＹおよびＮＰＹ受容体：ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）は３６個のアミノ酸からなり、哺乳類の中枢神経系および末梢神経系に存在する最も豊富なペプチドの一つである。ＮＰＹは、摂食、記憶、血圧、心臓収縮性、および小腸分泌の調節を含む、種々の重要な中枢および末梢作用を示す。従来の薬理学的証拠から、ＮＰＹの作用は多くの種々のＧＰＣＲサブタイプによって媒介されると示唆されている。Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６およびＹ７受容体（あるいはＮＰＹ１、ＮＰＹ２、ＮＰＹ４、ＮＰＹ５、ＮＰＹ６およびＮＰＹ７受容体ともいう）は、すべてクローン化され、組換え発現されてきた。全ての公知ＮＰＹ受容体は、７つの膜架橋ＴＭドメインをもつＧ−タンパク質共役型膜貫通タンパク質である。
【００１７】
ＮＰＹ受容体の中で最もその特性がわかっているものはＹ１であり、これはマウス（Ｅｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１４巻：２８５頁、１９９２年）、ラット（Ｅｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７１巻：８０頁、１９９０年）、およびヒト（Ｌａｒｈａｍｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：１０９３５頁、１９９２年）からクローン化された。これは後シナプス性であり、且つ血管収縮および動脈血圧の上昇を含むＮＰＹの末梢作用の殆どを媒介するとみなされている（Ｌａｒｈａｍｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：１０９３５頁、１９９２年；Ｗｅｓｔｆａｌｌら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．６１１巻：１４５頁，１９９０年）。中枢神経系のＹ１受容体は、その抗不安作用、その摂食行動に対する作用、およびその自発性の歩行活動の減少を含む、種々のＮＰＹの影響に関連していた（たとえばＷａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９巻：５２８頁、１９９３年を参照されたい）。
【００１８】
ＮＰＹ５受容体は、摂食行動の調節で重要な役割を果たすことが示唆されてきた。発作傾向のあるマウス（ｓｅｉｚｕｒｅ−ｐｒｏｎｅ ｍｏｕｓｅ）での研究から、Ｙ５受容体は、辺縁系発作（ｌｉｂｍｉｃ ｓｅｉｚｕｒｅ）の制御において、抗てんかん作用ももち得るという示唆が導かれた。Ｙ５様受容体は、モルヒネ禁断症状の減弱、利尿およびナトリウム排泄増加の促進、血中グルコースの低下、黄体形成ホルモン分泌の阻害、並びに回腸におけるアセチルコリン放出の減少にも関与してきた。たとえばＨｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１巻：２６３１５−１９頁、１９９６年；Ｇｅｒａｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３８２巻：１６８−７１頁、１９９６年；Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら、ＴＩＮＳ，２０巻：２９４−９８頁、１９９７年を参照されたい。ヒト、イヌ、マウス、モルモット、ラットのＹ１およびＹ５受容体の配列、並びにヒツジのＹ１受容体の配列は、全て報告されており、たとえばＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって出版されている。
【００１９】
Ｙ１受容体は、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ１ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ１第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ１第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ１第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ１第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ１第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ１第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ１第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む一本のポリペプチド鎖をもつものとして構造的に特徴付けられる。
【００２０】
Ｙ５受容体は、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ５ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む一本のポリペプチド鎖をもつものとして構造的に特徴付けられる。
【００２１】
ヒトＹ１受容体（ＤＮＡ配列−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、アミノ酸配列−ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）では、第３細胞内ループドメインは、本質的に、この受容体のヴィズールのスネーク様像によって示されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸２３２（Ｐｈｅ）〜２６３（Ｉｌｅ）からなる（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｖｉｓ／ＮＹ１Ｒ ＨＵＭＡＮ／ＮＹ１Ｒ ＨＵＭＡＮ．ｈｔｍｌ参照）。上記のアミノ酸配列残基荷電／極性の考察から、このループの終点は、長いひとつながりの疎水性残基（第５ＴＭドメイン）の終りに配置された荷電残基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のＬｙｓ２３３）と、長いひとつながりの疎水性残基（第６ＴＭドメイン）の始めに配置された荷電残基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のＡｒｇ２６０）の（ドメイン内）存在によって規定されるのが好ましい。
【００２２】
ラットＹ１受容体では、第３細胞内ループドメインは、本質的に、この受容体のヴィズールのスネーク様像によって示されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸２３１（Ｐｈｅ）〜２６２（Ｖａｌ）からなる（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｖｉｓ／ＮＹ１Ｒ ＲＡＴ／ＮＹ１Ｒ ＲＡＴ．ｈｔｍｌ参照）。上記のアミノ酸配列残基荷電／極性の考察から、このループの終点は、長いひとつながりの疎水性残基（第５ＴＭドメイン）の終りに配置された荷電残基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のＬｙｓ２３２）と、長いひとつながりの疎水性残基（第６ＴＭドメイン）の始めに配置された荷電残基（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のＡｒｇ２５９）の（ドメイン内）存在によって規定されるのが好ましい。
【００２３】
ヒトＮＰＹ５ドメインの以下の議論では、この受容体の電子的に利用可能なドメイン構造情報を説明する（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｖｉｓ／ＮＹ５Ｒ ＨＵＭＡＮ／ＮＹ５Ｒ ＨＵＭＡＮ．ｈｔｍｌ参照）。
【００２４】
この情報に従って、好ましいＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１（Ｍｅｔ）〜５０（Ｌｅｕ）からなる。好ましいＹ５の第１ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基５１（Ｇｌｎ）〜７１（Ｌｅｕ）からなる。好ましいＹ５第１細胞内ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基７２（Ｉｌｅ）〜８４（Ｔｈｒ）からなる。好ましいＹ５第２ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基８５（Ｔｈｒ）〜１０５（Ｓｅｒ）からなる。好ましいＹ５第１細胞外ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１０６（Ｐｒｏ）〜１２５（Ｈｉｓ）からなる。好ましいＹ５第３ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１２６（Ｉｌｅ）〜１４６（Ａｌａ）からなる。好ましいＹ５第２細胞内ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１４７（Ｉｌｅ）〜１６７（Ｔｙｒ）からなる。好ましいＹ５第４ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１６８（Ｐｈｅ）〜１８８（Ｈｉｓ）からなる。好ましいＹ５第２細胞外ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基１８８（Ｓｅｒ）〜２２０（Ａｌａ）からなる。好ましいＹ５第５ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基２２１（Ｐｈｅ）〜２４１（Ｈｉｓ）からなる。好ましいＹ５第３細胞内ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基２４２（Ｔｈｒ）〜３７８（Ｔｙｒ）からなる。好ましいＹ５第６ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基３７９（Ａｒｇ）〜４０１（Ｔｈｒ）からなる。好ましいＹ５第３細胞外ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基４０２（Ａｒｇ）〜４１４（Ｌｙｓ）からなる。好ましいＹ５第７ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基４１５（Ｌｅｕ）〜４３８（Ｌｅｕ）からなる。好ましいＹ５ Ｃ−末端細胞内ドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の残基４３９（Ａｓｎ）〜４５５（Ｍｅｔ）からなる。
【００２５】
ヒトＮＰＹ１ドメインの以下の議論では、この受容体に関して電子的に利用可能なドメイン構造情報を説明する（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／７ｔｍ／ｓｅｑ／ｖｉｓ／ＮＹ１Ｒ ＨＵＭＡＮ／ＮＹ１Ｒ ＨＵＭＡＮ．ｈｔｍｌ参照）。このヴィズールのスネーク様像は、ヒトＮＰＹ１に関する変種配列が見いだされたかまたは作られた多くの点も示す。
【００２６】
この情報に従って、好ましいＹ１第５ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残基２１１（Ｔｙｒ）〜２３１（Ｔｙｒ）からなる。好ましいＹ１第３細胞内ループドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残基２３２（Ｐｈｅ）〜２６３（Ｉｌｅ）からなる。好ましいＹ１第６ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残基２６４（Ｍｅｔ）〜２８６（Ｐｈｅ）からなる。好ましいＹ１第７ＴＭドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残基３００（Ｌｅｕ）〜３２３（Ｌｅｕ）からなる。好ましいＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインは、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の残基３２４（Ａｓｎ）〜３８４（Ｉｌｅ）からなる。
【００２７】
ＮＰＹ、ＧＰＣＲ、およびＮＰＹ−受容体構造、生理学並びに薬理学（ＮＰＹ−受容体および他のＧＰＣＲドメイン構造および用語を含む）の議論は、本明細書中、参照として含まれる、１９９９年１２月１４日発行の米国特許第６，００１，９７０号（Ｍａｒｇａｒｅｔ Ａ．Ｃａｓｃｉｅｒｉ、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｊｏｈｎ ＭａｃＮｅｉｌおよびＣａｔｈｅｒｉｎｅ Ｄ．Ｓｔｒａｄｅｒ）、第１〜５、６欄（１〜１２行、３０〜４５行、および６４〜６７行）、第７〜８、および９欄（１行〜３５行）、並びに図１〜３の示唆に示されている。
【００２８】
Ｙ１およびＹ５受容体に関するさらなる議論は、ＮＰＹ受容体構造および機能に関して、本明細書中、その知見が参照として含まれる、１９９６年１１月５日発行の米国特許第５５７１６９５号（Ｌｉｓａ Ｓｅｌｂｉｅ、Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｈｅｒｚｏｇ、およびＪｏｈｎ Ｓｈｉｎｅ）；１９９９年１０月１２日発行の米国特許第５，９６５，３９２号（Ｙｉｎｇｈｅ Ｈｕ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．ＭｃＣａｌｅｂ、Ｂｒｉａｎ Ｔ．Ｂｌｏｏｍｑｕｉｓｔ、Ｊａｉｍｅ Ｒ．Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｉｖｅｒｏｓ、およびＬｉｎｄａ Ｊ Ｃｏｒｎｆｉｅｌｄ）；１９９９年１０月１９日発行の米国特許第５，９６８，８１９号（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ Ｐ．Ｇ．Ｇｅｒａｌｄ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｌ．Ｗｅｉｎｓｈａｎｋ、Ｍａｒｙ Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ、およびＴｈｅｒｅｓａ Ｂｒａｎｃｈｅｋ）；並びに１９９９年１１月１６日発行の米国特許第５，９８５，６１６号（Ｅｒｉｃ ＭｃＦｅｅ Ｐａｒｋｅｒ、Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｄｅｖｉｎｅ ＳｔｒａｄｅｒおよびＭａｒｋ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｒｕｄｉｎｓｋｉ）に示されている。
【００２９】
配列表の記載
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １　ヒトＹ１受容体ＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２　ヒトＹ１受容体アミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３　ラットＹ１受容体アミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４　ヒトＹ５受容体ＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３キメラＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３キメラアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴキメラＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹ１ＣＴキメラＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴキメラアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０　ヒトＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹ１ＣＴキメラアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１　Ｈｉｓ６Ｘエピトープのアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２　ＦＬＡＧエピトープのアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３　ヒトＹ５受容体アミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４　５’Ｙ５プライマー。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５　３’Ｙ５プライマー。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６　ＨＹ１Ｌ３Ｓセンスオリゴ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７　ＨＹ１Ｌ３ＡＳアンチセンスオリゴ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８　ＨＹ１Ｒ１フォワードプライマー（ＥｃｏＲ１部位を作る）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９　ＨＹ５Ｒ１リバースプライマー（ＥｃｏＲ１部位を作る）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０　イヌＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３キメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１　イヌＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹ１ＣＴキメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２　マウスＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴキメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３　ラットＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３キメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４　ラットＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴキメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５　ラットＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／Ｙ１ＣＴキメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６　ブタＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３キメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７　ブタＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹ１ＣＴキメラ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８　ＮＰＹ５フォワードプライマーｈＹ５−４５Ｆ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９　ＮＰＹ５リバースプライマーｈＹ５−１４５０Ｒ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０　アフリカミドリザルＮＰＹ５ ＤＮＡ配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１　アフリカミドリザルＮＰＹ５アミノ酸配列。
【００３０】
発明の概要
本発明の目的は、新規キメラＮＰＹ受容体を提供することである。好ましくは、これらの受容体はＹ５受容体に典型的なリガンド結合薬理的特性を示し、同時にＹ１受容体に典型的なシグナル変換効果を媒介する（好ましくはＹ１受容体に典型的なＧ−タンパク質共役を含む）。さらに本発明の目的は、かかるキメラＮＰＹ受容体を発現する細胞を提供することである。好ましくはこれらのキメラ受容体−発現細胞は、受容体結合および受容体機能（たとえば受容体Ｇ−タンパク質サブユニット結合または受容体シグナル変換）のいずれかまたは両方の強力なアッセイで使用するために適合させた（通常、細胞自体の形態のまたは単離した膜調製物の形態の）キメラ受容体源を提供することである。特に好ましい受容体は、本来の（非キメラ、非変異性）Ｙ５受容体よりも高いレベルで発現することができ、特に好ましい細胞はそのように高いレベルでかかる受容体を発現する。
【００３１】
さらに本発明の目的は、ＮＰＹ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するためのアッセイを提供することである。かかるアッセイは、試験すべき化合物と本発明の細胞または単離膜とを接触させ、次いで細胞へのこの化合物の結合を検出することを含む。
【００３２】
本発明は、その症状がたとえば、摂食障害、発作障害、血圧障害、運動障害または不安障害である被検体の、前記症状を処置する方法も取り扱う。この方法は、上記アッセイによって同定された化合物を含む組成物の有効量を前記患者に投与することを含む。
【００３３】
これらの目的を達成するために、本発明は、最初に、少なくとも一つのドメイン置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を含むレシピエントＮＰＹ５受容体を含むキメラＮＰＹ受容体タンパク質であって、前記置換が第３細胞内ループドメインとＣ−末端細胞内ドメインの一方または両方での交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む、前記キメラＮＰＹ受容体タンパク質を提供する。この置換ドナードメインは、レシピエントＮＰＹ５受容体とは異なるタイプのＮＰＹ受容体（たとえばＹ１受容体、Ｙ２受容体またはＹ４受容体、「ドナー受容体」）から誘導する。それぞれのドナーＮＰＹ受容体は、好ましくはレシピエントＮＰＹ５受容体を得る動物と同綱の動物、好ましくは同目の動物、より好ましくは同科の動物、もっと好ましくは同属の動物、最も好ましくは同種の動物由来である。少なくとも２つのドメインを置換する場合、それぞれの置換ドナードメインは、他方と同一または異なる種の動物から得ることができ、好ましくは全ては同種の動物および同じ型のドナーＮＰＹ受容体由来である。
【００３４】
この態様では、レシピエントＹ５受容体の置換レシピエントドメインのそれぞれのフラグメントは、置換が起きる全レシピエントＹ５受容体ドメインの長さの少なくとも約５０％の連続長から本質的になる細胞内ドメインである。この態様では、このＮＰＹ５フラグメントは、対応するフラグメント、則ち、それぞれの近接ドナーＮＰＹ受容体ＴＭドメインの近接端（たとえば第５および第６ＴＭドメインまたは第７ＴＭドメイン）と大体同数のアミノ酸残基（たとえば、対応する全ドナードメインのアミノ酸残基の数のプラスまたはマイナス１０％以内、好ましくはプラスまたはマイナス５％以内、最も好ましくはプラスまたはマイナス２％以内）に配置された末端をもつフラグメント、だけ欠失されて交換される。レシピエントＹ５受容体の欠失および置換（レシピエント）フラグメントのそれぞれの末端が、その最も近い（近接）レシピエントＮＰＹ５受容体ＴＭドメインから配置されるためである。好ましくは、得られたキメラ受容体のドメインは、
１）対応するドナーＮＰＹ受容体ドメインと同数のアミノ酸、または
２）対応するレシピエントＮＰＹ５受容体ドメインと同数のアミノ酸、または
３）１）と２）との中間の数のアミノ酸
をもつ。かかるドメインフラグメントは、（勿論Ｃ−末端細胞内ドメインフラグメントのＣ−末端を除く）近接ＴＭドメイン内、または置換ドメイン内に（他の末端のいずれかとは独立して）それぞれ末端をもつことができる。
【００３５】
好ましくは、置換ドメイン以外のキメラ受容体の全てのドメインは、完全で且つ互いに隣接しているので、得られたキメラ受容体は、レシピエント受容体のＮ−末端から第２細胞外ドメインのＣ−末端までのレシピエント受容体および第３細胞外ドメインのＮ−末端から第７ＴＭドメインのＮ−末端までのレシピエント受容体と同一配列（キメラ受容体のＮ−末端から開始する）をもつ。
【００３６】
第一の側面では、本発明は、Ｙ５受容体レシピエントの第３細胞内ループドメインフラグメントがもう１つの（ドナー）ＮＰＹ受容体の第３細胞内ループドメインフラグメントで置き換わっている以外、ＮＰＹ５受容体タンパク質のアミノ酸配列をもつキメラＮＰＹ受容体タンパク質を提供する。
【００３７】
もう１つの側面では、本発明は、このタンパク質のＣ−末端細胞内（親水性）ドメインがもう１つの（ドナー）ＮＰＹ受容体の対応するドメインの対応するフラグメントで置き換わっている以外には、ＮＰＹ５受容体タンパク質のアミノ酸配列を持つキメラＮＰＹ受容体タンパク質を提供する。
【００３８】
第三の側面では、本発明は、キメラ受容体が先の二つの段落に記載されたＮＰＹ受容体タンパク質フラグメント置換の両方を含むこと以外には、ＮＰＹ５受容体タンパク質のアミノ酸配列をもつキメラＮＰＹ受容体を提供する。
【００３９】
追加の側面では、本発明は、本発明のキメラＮＰＹ受容体をコードする核酸分子（好ましくは単離核酸分子）並びに、かかる核酸分子を含む発現ベクターを含み、これにより本発明のキメラＮＰＹ受容体を発現する細胞（好ましくは動物細胞、好ましくは培養細胞）を提供する。好ましくはこれらの細胞は、適合対照発現ベクターを含み、これにより適合する本来の（非キメラ、非変異性）ＮＰＹ５受容体を発現する適合対照細胞よりも、ＮＰＹリガンド（たとえばＮＰＹまたはＰＹＹ）を細胞当たり高いレベルで結合する。本発明はさらに、新規サルＮＰＹ５受容体およびこのサル受容体のＮＰＹ５ドメインを含むキメラを提供する。
【００４０】
発明の詳細な説明
発明の態様
核酸分子
本発明は、キメラＮＰＹ受容体タンパク質、好ましくはキメラＹ５／Ｙ１受容体タンパク質をコードする、（たとえばＰＣＲ産生物または制限フラグメントなどのフラグメントを含む）核酸（ＮＡ）分子を提供する。好ましくはこのＮＡ分子はクローンであり、単離ＮＡ分子である。本発明により、これらのＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびかかるＮＡ分子の修飾類似体、たとえばホスホルチオエート誘導体などを含む。
【００４１】
第一の側面では、本発明は、このタンパク質の細胞外ループ３がＮＰＹ１受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ１受容体タンパク質）の細胞内ループ３で置き換わった以外には、ＮＰＹ５受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ５受容体タンパク質）のアミノ酸配列を持つキメラＮＰＹ受容体タンパク質をコードするＮＡ分子（たとえばクローン）を提供する。言い換えれば、コードされたキメラタンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ５ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む、一本のポリペプチド鎖を含むものとして構造的に特徴付けられる。好ましくは、このキメラ受容体の第３細胞内ループドメインの位置のドナーＹ１部分は、ドナーＹ１受容体のすぐに近接するＴＭドメインの一方または両方に部分的または完全に少なくとも一つの伸張部を含み、レシピエントＹ５受容体の対応する（単数または複数の）配列を置き換える、連続Ｙ１配列である。特定の好ましい態様では、この第３細胞内ループドメインの位置のＹ１部分は、第３細胞内ループドメイン全体は含まないが、ドナーＹ１第３細胞内ループドメイン全体の実質的な（少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約２０、最も好ましくは少なくとも２１アミノ酸長の）連続部分だけは含む。かかる態様では、レシピエントＹ５受容体の細胞内ループ３の置き換わった部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド７５２〜１１２９によってコードされるアミノ酸を含む。従って、好ましい態様では、本発明は、ＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３と参照される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を含む単離ＮＡ分子（たとえば単離クローン）を提供する。関連する態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＮＡ分子は、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド７５２〜１１２９からなるフラグメントの欠失と、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド９０２〜９６４からなるフラグメントによる（同一インフレームコード配向での）置換によって改変される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、レシピエントＮＰＹ５受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ５受容体タンパク質）のＮ−末端ドメイン、細胞内ループ、細胞外ループおよびＴＭドメイン並びにドナーＮＰＹ１受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ１受容体タンパク質）のＣ−末端細胞内ドメインのアミノ酸配列を含むキメラＮＰＹ受容体タンパク質を提供する。言い換えれば、コードされたキメラタンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第７ＴＭドメインの少なくとも一部、およびＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む一本のポリペプチド鎖を含むものとして構造的に特徴付けられる。
【００４３】
本発明の特定の側面では、このＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインは、Ｙ１にすぐ近接するＴＭドメインに一部または完全に伸張し、Ｙ５受容体の対応する配列を置き換える、連続Ｙ１配列である。特定の好ましい態様では、Ｃ−末端細胞内ドメインの位置にあるＹ１部分は、Ｃ−末端細胞内ドメイン全体は含まないが、Ｙ１ Ｃ−末端細胞内ドメイン全体の実質的な（少なくとも約４０個、好ましくは少なくとも約５０個、最も好ましくは少なくとも５７個のアミノ酸長さ）の連続部分だけは含み、好ましくはこのＹ１部分はＹ１のＣ−末端アミノ酸（則ちＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインのＣ−末端）に伸張しこれを含む。もう１つの好ましい態様では、キメラ受容体のドナーＣ−末端ドメインは、ドナー第７ＴＭドメインのＣ−末端の終わりからドナー受容体のＣ−末端のアミノ酸全てを含む。
【００４４】
より好ましくは、置換Ｙ５レシピエントＣ−末端ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド１３４３〜１３８４によりコードされるアミノ酸を含む。好ましい態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のｃＤＮＡ配列を含む単離ＮＡ分子（ＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴ）を提供する。関連する態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＮＡ分子は、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド１３４３〜１３８４からなるフラグメントの欠失と、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド１１７８〜１３５１からなるフラグメントによる（同一インフレームコード配向での）置換によって変更される。
【００４５】
もう１つの態様では、本発明は、レシピエントＮＰＹ５受容体タンパク質の細胞内ループ３がＮＰＹ１受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ１受容体タンパク質）の細胞内ループ３で置き換わっており、且つこのタンパク質のＣ−末端細胞内ドメインがＮＰＹ１受容体タンパク質（好ましくは第３細胞内ループドメインを提供するのと同一Ｙ１受容体タンパク質、好ましくはヒトＹ１受容体タンパク質）のＣ−末端細胞内ドメインで置き換わっている以外には、レシピエントＮＰＹ５受容体タンパク質（好ましくはヒトＹ５受容体タンパク質）のアミノ酸配列をコードする単離ＮＡ分子を提供する。言い換えれば、コードされたキメラタンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第５ＴＭドメインの少なくとも一部、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第６ＴＭドメインの少なくとも一部、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第７ＴＭドメインの少なくとも一部、およびＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む、一本のポリペプチド鎖を含むものとして構造的に特徴付けられる。
【００４６】
このキメラ受容体タンパク質の細胞内ループ３およびＣ−末端ドメインは上記の如きである。好ましい態様では、本発明は、（ＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹ１ＣＴをコードする）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８のｃＤＮＡ配列を含むＮＡ分子を提供する。関連する態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＮＡ分子は、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド７５２〜１１２９からなるフラグメントの欠失および、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド９０２〜９６４からなるフラグメントの（同一インフレームコード配向での）置換によって改変され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＮＡ分子はさらに、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヌクレオチド１３４３〜１３８４からなるフラグメントの欠失および、本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド１１７８〜１３５１からなるフラグメントの（同一インフレームコード配向での）置換によって改変された。
【００４７】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするＮＡ分子（好ましくは単離した、好ましくはそのクローン）、並びに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０からなる群から選択される核酸配列を含むＮＡ分子（好ましくは単離した、好ましくはそのクローン）をも含む。
【００４８】
遺伝子コードの縮重のため、１つ以上の冗長性コドンの置換によって、コードされたタンパク質産生物のアミノ酸配列を変化させずに記載のＮＡ分子の種々の変異体を作り出すことができることは、当業者には明らかである。さらに、コードされたタンパク質産生物のアミノ酸配列を改変させることなく、ＮＡ配列の非コード領域で配列を変化させることができる。
【００４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０、配列番号２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７のキメラＮＰＹ受容体タンパク質をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列への特定の変化も、本発明の範囲内である。これらの例としては、抗体認識（タグ）配列として有用な短いアミノ酸配列をコードするＮＡ配列のインフレーム付加が挙げられる。かかるアミノ酸配列は当業界で公知であり、ニッケルなどの金属をキレート化し（金属キレート化クロマトグラフィーによるタンパク質精製を容易にする）、モノクローナル抗−ポリヒスチジンクローンＨＩＳ−１抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ，Ｈ１０２９）により特異的に結合されるＨｉｓ−６ｘ（ヘキサ−ヒスチジンまたはＨｉｓタグ）エピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）、およびＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ．Ｆ３１６５）により特異的に結合されるＦＬＡＧエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる修飾を作成する方法は当業界で公知であり、ルーチン方法によって、または調製キット、たとえばＳｉｇｍａ製哺乳類ＦＬＡＧ発現キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、たとえばＮｏ．ＦＬ−ＭＡおよびＦＬ−ＭＣ）を使用して、容易に実施することができる。好ましくは、インフレームアミノ−（Ｎ−）またはカルボキシ−（Ｃ−）末端融合物として融合物を作成する。一般的に、融合タンパク質の効率的な膜挿入を妨害する傾向が低いので、Ｃ−末端融合物が好ましい。
【００５０】
タグ化融合タンパク質は、たとえばアフィニティクロマトグラフィーによって、タグに特異的な抗体を使用して精製することができる。精製すべきタンパク質が膜内に挿入されない場合以外は、かかる精製方法では、通常、界面活性剤による抽出が必要である。かかる精製タンパク質は、受容体−特異的抗体の製造用の抗原として有用であり、その場合、受容体シグナル変換機能の保持は通常、重要ではない。本発明のＮＡ分子の追加の態様は、以下に記載する本発明のポリペプチドをコードするようなもの［特に、本明細書中、先に記載しなかったもの、たとえばＡ）、Ｂ）、およびＣ）参照］である。
【００５１】
ポリペプチド類
本発明は、上記ＮＡ分子によりコードされたキメラＮＰＹ受容体ポリペプチド類（好ましくは単離ポリペプチド類）を提供する。特定の好ましい態様では、本発明のキメラポリペプチド類は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０のアミノ酸配列をもつ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５によりコードされたタンパク質産生物であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７によりコードされたタンパク質産生物であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８によりコードされたタンパク質産生物である。特定のさらに好ましい態様では、本発明のキメラポリペプチド類は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７のアミノ酸配列をもつ。本発明は、ＮＡ分子の議論で上記したような、これらとは異なるアミノ酸配列を持つキメラＮＰＹ受容体タンパク質をも包含する。
【００５２】
さらなる態様では、本発明は、以下のＡ）、Ｂ）およびＣ）を提供する。
Ａ）　Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ１第５ＴＭドメインの連続する対応Ｃ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＣ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第５ＴＭドメイン（そのように置換した場合には、そのような場合により置換されたＴＭドメインは、「ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメイン」という）、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの少なくとも実質的に連続する部分を含む第３細胞内ループドメイン、ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインを生成するために、ＮＰＹ１第６ＴＭドメインの連続する対応Ｎ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＮ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ５ Ｃ−末端細胞内ドメインを含む一本の連続するポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、但し、前記第５または第６ＴＭドメインがハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインであるとき、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの前記部分は本来のＮＰＹ１の対応ＴＭドメインと隣接する部分であり、且つ前記第５および第６ＴＭドメインが両方ともハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインであるとき、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの部分はＮＰＹ１第３細胞内ループドメイン全体である、前記キメラ受容体タンパク質。好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約３３５〜３６５個のアミノ酸からなる。より好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加して場合により伸張させた、３４１〜３５２個のアミノ酸からなる。最も好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加してそれぞれ場合により伸張させた、３４１、３５０、または３５２個のアミノ酸からなる。
【００５３】
Ｂ）　Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインを生成するために、ＮＰＹ１第７ＴＭドメインの連続する対応Ｃ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＣ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインの少なくとも実質的な部分を含む、一本の連続するポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、但し、前記第７ＴＭドメインがハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインであるとき、ＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインの部分は第７ＴＭドメインと隣接する部分（本来のＮＰＹ１ドナー受容体でも、得られたキメラ受容体でも）である、前記キメラ受容体タンパク質。好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約４８５〜５１６個のアミノ酸からなる。より好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加して場合により伸張させた、４８８〜５０８個のアミノ酸からなる。最も好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加してそれぞれ場合により伸張させた、４８８、４９９または５０８個のアミノ酸からなる。
【００５４】
Ｃ）　Ｎ−末端からＣ−末端の順で、ＮＰＹ５ Ｎ−末端細胞外ドメイン、ＮＰＹ５第１ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第２ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第１細胞外ループドメイン、ＮＰＹ５第３ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞内ループドメイン、ＮＰＹ５第４ＴＭドメイン、ＮＰＹ５第２細胞外ループドメイン、ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインを生成するためにＮＰＹ１第５ＴＭドメインの連続する対応Ｃ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＣ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第５ＴＭドメイン、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの少なくとも実質的に連続部分を含む第３細胞内ループドメイン、ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインを生成するためにＮＰＹ１第６ＴＭドメインの連続する対応Ｎ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＮ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第６ＴＭドメイン、ＭＰＹ５第３細胞外ループドメイン、ハイブリッドＹ５／Ｙ１ ＴＭドメインを生成するためにＮＰＹ１第７ＴＭドメインの連続する対応Ｃ−末端部分の２０個以下のアミノ酸でそのドメインのＣ−末端の終わりで場合により置換されたＮＰＹ５第７ＴＭドメイン、およびＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインの少なくとも実質的な部分を含む、一本の連続したポリペプチド鎖を含むキメラ受容体タンパク質であって、但し、前記第５または第６ＴＭドメインが場合によりそのように置換されているとき、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの前記部分は、本来のＮＰＹ１において場合により置換されたＴＭドメインと隣接している部分であり、且つ前記第５および第６ＴＭドメインのいずれもが場合によりそのように結合しているとき、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメインの前記部分は、ＮＰＹ１第３細胞内ループドメイン全体であり、且つ前記第７ＴＭドメインが場合によりそのように置換されているとき、ＮＰＹ１ Ｃ−末端細胞内ドメインの前記部分は、（本来のＮＰＹ１ドナー受容体でも、得られたキメラ受容体でも）第７ＴＭドメインと隣接する部分である、前記キメラ受容体タンパク質。好ましくはこのキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約３８０〜４０５個のアミノ酸からなる。より好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加することによって場合により伸張させた３８３〜３９５個のアミノ酸からなる。最も好ましくは、このキメラ受容体タンパク質ポリペプチド鎖は、約６〜８個のアミノ酸のタグ配列を付加することによってそれぞれ場合により伸張させた、３８３、３９４、または３９５個のアミノ酸からなる。
【００５５】
発現系
本発明の特定の側面を実施する際に使用し得る発現系としては、これらに限定されないが、本発明のＮＡ分子を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系、および本発明のＮＡ分子を含む組換え発現構築物を保持（ｈａｒｂｏｒ）している哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞）が挙げられる。かかる哺乳類ベクターは、好ましくは哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含まなければならない。かかるプロモーターは、本発明のＮＡフラグメントと機能可能に連結しなければならない。
【００５６】
もう１つの好ましい発現系は、本発明の発現ベクターを使用して、好ましくはｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写系によって作成した本発明のＲＮＡ分子を含む両生類卵母細胞である。好ましくは、この両生類はカエルであり、最も好ましくはアフリカツメガエル、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｖｅｉｓである。
【００５７】
本発明の発現ベクターは、本発明のキメラ受容体タンパク質の組換え発現用のベクターであり、ここで本発明の核酸は、発現に適切な配向で、少なくとも一つの調節エレメント（調節エレメントは隣接連結したコード配列の発現を駆動する核酸配列である）に機能可能に連結されている。かかるベクターは、好ましくはプラスミドベクターまたはウイルスベクターである。
【００５８】
本発明の細胞は、本発明の発現ベクターを含み、そしてこれにより本発明の少なくとも一つのキメラＮＰＹ受容体を発現させる細胞である。
Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核多角体病（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウイルスを使用する昆虫系を使用して、本発明の組換え受容体を発現させることができる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（たとえばＳｆ９）などの昆虫細胞で成長する。本発明のキメラＮＰＹ受容体をコードするコード配列は、通常、ウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）に挿入され、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下で配置される。好ましくは、うまく挿入物を導入できると、ウイルス遺伝子を不活化させることができる。たとえば、ポリヘドリン遺伝子に標的化するとき、挿入物をうまく導入すると、その遺伝子を不活化し、非閉塞組換えウイルス（則ち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質コートを欠失したウイルス）を産生できる。次いで、得られた組換えウイルスを使用して昆虫細胞、好ましくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、ここで挿入したコード配列が発現される（たとえば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６巻：５８４頁、１９８３年を参照されたい）。
【００５９】
哺乳類宿主細胞では、ウイルス−ベースの発現系を含む多くの発現系を使用することができる。本発明のキメラ受容体をコードする挿入物を含む細胞を含み、それによりその動物の細胞が本発明のキメラ受容体を発現する、則ち本発明のトランスジェニック動物に関する本発明の側面では、非ウイルス発現系が一般的に好ましい。
【００６０】
アデノウイルスベクターを発現ベクターとして使用する場合、本発明の核酸分子は、後期プロモーターおよび三連リーダー配列などのアデノウイルス転写／翻訳制御複合体にライゲーションさせることができる。次いで、この組換え遺伝子を、ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）への挿入によって、生存可能で且つ感染した宿主で本発明のキメラＮＰＹ受容体遺伝子産生物を発現させ得る組換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１巻：３６５５−３６５９頁、１９８４年を参照されたい）。挿入した核酸分子の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要であろう。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよびリボソーム結合部位などの隣接配列が挙げられ、このシグナルおよびその使用は当業者には公知である。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを導入することによって高めることができる（たとえば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照されたい）。好ましい哺乳類発現ベクターは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製のＰＣＤＮＡ３．１ベクターである。
【００６１】
両生類卵母細胞で発現させるための本発明の核酸フラグメントの挿入用の好ましい発現ベクターは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製のＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ−ベクターである。通常、かかるベクターを使用してｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写系でキメラ−受容体をコードするＲＮＡを生成し、次いでこのＲＮＡを卵母細胞に注入して、本発明のキメラ受容体の発現を誘導させる。
【００６２】
一過性発現系は本発明の範囲内であるが、特に培養した哺乳類細胞における組換えタンパク質の長期発現も本発明の範囲内である。（高レベル発現に適合させるのが好ましい）かかる長期発現安定発現が好ましい。宿主細胞は、発現に適切な配向で、適切な発現制御エレメント（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、およびポリアデニル化シグナル）、並びに（好ましくは発現エレメントへの機能的結合において）選択可能なマーカーを含むベクターで形質転換することができる。このベクターを導入した後（非選択的培地でインキュベーションしてベクター導入のストレスから回復させた後のことが多い）、処理細胞を選択的培地で成長させることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーにより、選択物に耐性が与えられ、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込ませて、増殖させて増殖巣を形成させて、クローン化し細胞系中で増殖させることができる。多くの選択系を使用することができる。たとえばヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．４８巻：２０２６頁、１９６２年）、アデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２巻：８１７頁、１９８０年）および単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１巻：２２３頁、１９７７年）遺伝子は、それぞれｈｇｐｒｔ−、ａｐｒｔ−またはｔｋ−細胞で使用することができる。また、抗代謝物耐性は、たとえば：メトトレキセートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓａｃｉ．ＵＳＡ．７７巻：３５６７頁、１９８０年；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８巻：１５２７頁、１９８１年）；マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）に対する耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８巻：２０７２頁、１９８１年）；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０巻：１頁、１９８１年）；ハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ，３０巻：１４７頁、１９８４年）；およびピューロマイシンに対する耐性を与えるｐｕｒｏ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９年）などの遺伝子に関する選択ベースとして使用することができる。
【００６３】
組換え細胞の単離膜
ある側面において、本発明は、本発明の組換え細胞の単離膜を含む調製物（本明細書および請求の範囲において組換え膜の調製物ともいう）を提供する。好ましくは、この単離膜は、対照宿主細胞（たとえば、ベクターを含まないか、またＮＰＹ受容体をコードしない対照ベクターを含む本発明の組換え細胞を製造するために使用した細胞系と同一細胞系の細胞）から単離した対照膜の、少なくとも２倍を超え、好ましくは１０倍を超え、より好ましくは少なくとも２０倍を超える、ニューロペプチドＹ結合活性を示さなければならない。好ましい膜は、全膜タンパク質１ｍｇ当たりキメラＮＰＹ受容体タンパク質を少なくとも０．１ｐｍｏｌ、より好ましくは少なくとも１ｐｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも５ｐｍｏｌ含む。膜は、好適な方法のいずれか、たとえば当業界で日常的に使用される膜調製法のいずれか、を使用しても単離することができる。
【００６４】
アッセイ
本発明のアッセイは、本発明の細胞または単離膜と試験すべき化合物とを接触させ、次いで細胞または膜に対する化合物の結合を検出することを含む。これらのアッセイは、たとえば受容体マッピング用ツールとしておよび薬剤として有用な、ＮＰＹ５受容体に特異的に結合する化合物の同定またはキャラクタリゼーションに有用である。
【００６５】
ＮＰＹ受容体と相互作用する化合物を検出するためのアッセイは、当業界で公知であり、当業界で既に公知のものよりも、（受容体結合用基質として）本発明の細胞または膜を使用することによって、本発明のアッセイに容易に適合させることができる。かかるアッセイは通常、試験すべき化合物と接触させる受容体の応答の測定（機能アッセイ）、または試験すべき化合物の、かかる受容体と結合することが公知の標識化（たとえば放射線標識化）化合物の受容体結合性の置換能力の測定（結合アッセイ）を含む。本発明の典型的な結合アッセイは、実施例５に説明する。本発明のかかるアッセイにおいて、試験すべき化合物はコールドのディスプレーサーとして使用する。本発明の典型的な機能アッセイは、実施例６に説明する。本発明のかかるアッセイにおいて、試験すべき化合物は、実施例６ではアゴニストとして使用されているものである。本発明の他の機能的アッセイでは、基質として本発明の細胞を使用し、試験すべき化合物と接触させる細胞応答を測定する。
【００６６】
キメラ受容体と相互作用し、細胞内シグナル伝達を調節する試験化合物を同定する上記アッセイは、肥満、高／低血圧、不安、てんかん、ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病を含むが、これらに限定されない、症状の診断または処置に使用することができる。
【００６７】
スクリーニングアッセイから同定された、キメラ受容体活性のモジュレーターを含む医薬的に有用な組成物を配合することができる。かかる治療組成物または診断組成物を、疾患の処置または診断に有効な量で患者に投与することができる。
【００６８】
【実施例】
実施例１
ＮＰＹ受容体をコードするＤＮＡクローン
ヒトＹ５受容体を、５’プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）ＴＴＴＴＧＧＴＴＧＣ ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴ Ｃおよび３’プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）ＣＣＴＴＧＧＴＡＡＡ ＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴ ＴＡＴＴＡＣを使用してゲノムＤＮＡからクローン化した。全長ＰＣＲ産生物をベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に最初にクローン化し、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫマイナス（ｐＢＳＳＫＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクローン化して、クローンｐＮＮ３２を得た。Ｙ５受容体の５’短縮型をコードするｐＢＳＳＫＭクローンをつくり、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の約５０８〜５１３残基に位置した）ＮｃｏＩ部位に対するコード領域の５’末端を除去した。これをｐＮＮ３９と名付けた。
【００６９】
ヒトＹ１受容体をコードするｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ８８４６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）をＣｌａｅｓ Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）から入手し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の塩基１９７〜１４３３を一連のルーチンステップでｐＢＳＳＫＭにサブクローン化し、得られたクローンをｐＮＮ２２と名付けた。
【００７０】
ＮＰＹ５／Ｙ１ ＩＣループ３キメラに関しては、ｐＮＮ３９をＰｓｔＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の約７４８〜７５３残基に位置）およびＢｇｌ ＩＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の約１１３０〜１１３５残基に位置）で消化して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の塩基７５３〜１１３０を除去した。
【００７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸２３６〜２５６（ＩＲＬＫＲＲＮＮＭＭＤＫＭＲＤＮＫＹＲＳＳ）に対応する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の塩基９０３〜９６４（ＴＡＣＧＣＣＴＡＡＡ ＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣ ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧ ＡＣＡＡＧＡＴＧＡＧ ＡＧＡＣＡＡＴＡＡＧ ＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡ ＧＴ）由来のＩＣループ３の部分を、ＨＹ１Ｌ３Ｓセンスオリゴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）と、ＨＹ１Ｌ３ＡＳアンチセンスオリゴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）を使用してＹ５に挿入した。二つのオリゴを含有する反応混合物を１００℃に加熱し、ゆっくりと放冷してオリゴをアニールした。次いで２本鎖アニール産生物を、ＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ消化ｐＮＮ３９にライゲーションさせてプラスミドｐＰＢ１を得た。このｐＰＢ１挿入物を完全長ヒトＹ５遺伝子（ｐＮＮ３２）のＣｅｌ２部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の約６１９〜６２５残基に位置）に再導入し、得られたプラスミドｐＮＮ４２と名付けた。このベクターの挿入物のコード領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、ｈＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３に見いだされ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列をコードする。
【００７２】
Ｙ５にＹ１ Ｃ−末端を付加させるために、それぞれの遺伝子にＥｃｏＲＩ部位を付加した。Ｙ１に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の１１７３〜１１７８塩基（ＡＣＴＴＣＣ）を変異させて、フォワードプライマーＨＹ１Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）からＴ３プライマー（ｐＢＳＳＫＭのマルチクローニング部位−“ＭＣＳ”−からプライマー形成）に、ＰＣＲでＥｃｏＲＩ部位を作った。次いでＹ１ ３’尾部を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化させて単離した（後者の酵素はｐＢＳＳＫＭのＭＣＳのＹ１ ３’尾部を切り出す）。Ｙ５に関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の１３３８〜１３４３の塩基（ＧＧＡＴＴＡ）を、ＰＣＲリバースプライマーＨＹ５Ｒ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）を使用して変異させた。このプライマーをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の５２７〜５５１塩基（ＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴ ＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧ ＴＴＴＴＧ）に対応するフォワードプライマーと対合させ、鋳型としてｐＮＮ３２を使用してＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲバンドを、ＰＣＲ産生物中の唯一のＰｓｔＩ位置から導入されたＥｃｏＲＩ部位まで切断した。
【００７３】
次いでｐＮＮ３９をｐＢＳＳＫＭのＭＣＳ由来のＰｓｔＩからＸｂａまでを開環し、変異Ｙ５セグメントＰｓｔＩからＥｃｏＲＩを、ＭＣＳ由来の変異Ｙ１ ３’フラグメントＥｃｏＲＩからＸｂａと混合して三種類のライゲーションをセットアップした。次いで、得られた変異遺伝子フラグメントを、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、ＢｇｌＩＩ部位で完全長Ｙ５遺伝子に導入して、構築物ｐＮＮ４３を得た。この構築物の挿入物のコード領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、ＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴに見いだされ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９のアミノ酸配列をコードする。
【００７４】
ＩＣループ３＋ＣＴ尾部交換は、以下の方法で、上記２種類の変異遺伝子を結合させることにより得られた。完全長ｈＹ５（ｐＮＮ３２）を、ベクターＭＣＳ中で、Ｃｅｌ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の約６１９〜６２５塩基に位置）およびＸｂａで消化した。ループ３変異ｐＮＮ４２フラグメントＣｅｌＩＩからＢｇｌＩＩを、ＣＴ変異ｐＮＮ４３フラグメントＢｇｌＩＩからＸｂａ（ＸｂａはＭＣＳにある）と結合させると、ｐＮＮ４４が得られた。このベクターの挿入物のコード領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、ｈＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３／ΔＹＣＴに見いだされ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０のアミノ酸配列をコードする。
【００７５】
次いでこの三種類のキメラＮＰＹ５／ＮＰＹ１受容体をそれぞれ、Ｋｐｎ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化して、哺乳類細胞で発現させるために市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と、ＳＦ９細胞で発現させるために市販の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９（ＣＬＯＮＴＥＣＫ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に別々にサブクローン化した。
【００７６】
実施例２
追加のＮＰＹ受容体
本発明のキメラＮＰＹ受容体の追加の例を、以下の配列表に示す。イヌＮＰＹ受容体キメラｃＮＰＹ５ΔｃＹ１ＩＣ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）およびｃＮＰＹ５ΔｃＹ１ＩＣ３／ΔｃＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）。マウスＮＰＹ受容体キメラｍＮＰＹ５ΔｍＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）。ラットＮＰＹ受容体キメラｒＮＰＹ５ΔｒＹ１ＩＣ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３）、ｒＮＰＹ５ΔｒＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）およびｒＮＰＹ５ΔｒＹ１ＩＣ３ΔｒＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）。ブタＮＰＹ受容体キメラｐＮＰＹ５ΔｐＹ１ＩＣ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）およびｐＮＰＹ５ΔｐＹ１ＣＴΔｐＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）。
【００７７】
新規アフリカミドリザル（ＡＧＭ）ＮＰＹ５受容体を、フォワードプライマーｈＹ５−４５Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）とリバースプライマーｈＹ５−１４５０Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）を使用してＣＯＳ細胞ＤＮＡからＰＣＲでクローン化した。いずれのプライマーもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のヒトＮＰＹ５ ＤＮＡ配列を使用して設計した。フォワードプライマーｈＹ５−４５Ｆは、ヒトＮＰＹ５の最初の２個のアミノ酸をコードする５個の塩基を含む（３’末端で６個の塩基を付加）。ＡＧＭ ＮＰＹ５ ＰＣＲ産生物の完全な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示され、それによってコードされたアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１として示されている。このアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１）は、２７３の位置でリジンの代わりにアルギニン、２７５の位置でセリンの代わりにイソロイシン、および４４７の位置でバリンの代わりにメチオニンをもつという点で、ヒトＹ５のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）とは異なっている。
【００７８】
実施例３
バキュロウイルス調製
それぞれのバキュロウイルス発現ベクターをＳｆ９昆虫細胞にＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ ＤＮＡ（ＢＤ ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と一緒にコトランスフェクトした。トランスフェクション後３日で、Ｓｆ９細胞培地上清を回収した。組換えウイルス含有上清を、Ｇｒａｃｅ塩と、４．１ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、３．３ｇ／Ｌ ＬＡＨ、３．３ｇ／Ｌ限外濾過イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）および１０％熱−不活化ウシ胎児血清を補ったＨｉｎｋのＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ）（以後、「昆虫培地」という）で階段希釈し、組換えプラークに関してプラークアッセイした。４日後、組換えプラークを選択し、増幅用昆虫培地１ｍｌに回収した。組換えバキュロウイルスそれぞれ１ｍｌ容積（継代０）を使用して、昆虫培地５ｍｌ中２×１０６個のＳｆ９細胞を含有する別のＴ２５フラスコを感染させた。２７℃で培養後５日で、継代１接種材料として使用するためにＴ２５感染物から上清培地を回収した。次いで７つの組換えバキュロウイルスクローンのうち２つを、２回目の増幅用に選択し、継代１のストック１ｍｌを使用して、２つのＴ１７５フラスコに分けた昆虫培地１００ｍｌ中の１×１０８個の細胞に感染させた。感染後４８時間で、それぞれ１００ｍｌプレップから継代２培地を回収し、力価に関してプラークアッセイにかけた。２回目の増幅由来の細胞ペレットを、以下の実施例５に記載の親和性結合によりアッセイして、組換え受容体発現を確認した。次いで、感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）０．１を使用して、３回目の増幅を開始し、Ｓｆ９細胞１リットルを感染させた。感染後４０時間で、上清培地を回収して継代３バキュロウイルスストックを生成し、細胞ペレットを親和性結合にかけた。継代３バキュロウイルスストックの力価を、プラークアッセイおよびＭ．Ｏ．Ｉ．で決定し、培養時間経過実験（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ Ｃｏｕｒｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を実施して、最適受容体発現条件を決定した。受容体最適化実験の結果から、Ｍ．Ｏ．Ｉ．が０．１で７２時間の培養が、１リットル以下のＳｆ９細胞感染培養物の最適Ｙ５受容体発現を実現するのに、理想的な感染パラメーターであったことが判明した。
【００７９】
対数期Ｓｆ９細胞を、ＮＰＹ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）、ＮＰＹ５ Ｙ１ＩＣ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）またはＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）のいずれかをコードする組換えバキュロウイルス（上記Ｙ５に関して記載の如く製造）のストックで感染させ、昆虫培地中、２７℃で培養した。感染後７２時間で、細胞懸濁液のサンプルを、トリパンブルー染色排除法により生存率に関して分析し、残存Ｓｆ９細胞を遠心分離（３０００ｒｐｍ／１０分／４℃）により回収した。
【００８０】
実施例４
精製膜
実施例３で製造したＳｆ９細胞ペレットを、ホモジナイゼーションバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ蔗糖、０．５μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２００μＭ ＰＭＳＦ、および２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（３０秒間、５に設定）によりホモジナイズした。このホモジネートを遠心分離（５３６×ｇ／１０分／４℃）して、核をペレット化した。単離膜を含有する上清をデカンテーションして清浄な遠心分離管に入れ、遠心分離（４８，０００×ｇ／３０分、４℃）して、３０ｍｌホモジナイゼーションバッファ中に再懸濁させた。この遠心分離と再懸濁段階を２回繰り返した。最終ペレットを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する氷冷ダルベッコＰＢＳに再懸濁させ、使用するまでアリコート中、−８０℃で貯蔵した。得られた膜調製物のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して測定した。この測定により、細胞の１リットル培養物は、通常、全膜タンパク質１００〜１２５ｍｇを産生した。
【００８１】
実施例５
キメラ受容体のモジュレーターの放射線リガンド結合アッセイ
実施例４の上記方法により製造した精製Ｐ２膜を、結合バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイゼーションに（気密乳棒：ｔｉｇｈｔ ｐｅｓｔｌｅ）より再懸濁した。
【００８２】
飽和結合分析用に、膜（５〜５０μｇ）を０．０１０〜０．５００ｎＭ［１２５Ｉ］ＰＹＹ（ブタ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ２０００−２００１；Ｎｏ．Ｐ５８０１）を含有するポリプロピレン管に添加した。受容体親和性に対するグアニンヌクレオチドの効果を評価するために、ＧＴＰγＳを終濃度５０μＭで２つに分け、管に添加した。表Ｉは、示されたそれぞれの受容体構築物に関する、ＰＹＹ結合速度論および受容体発現レベルに関する［１２５Ｉ］−ＰＹＹ飽和の要約を示す。
【００８３】
表Ｉのデータは、キメラ構築物がいずれも、等価または低いＫｄを示し、本来のＮＰＹ５受容体と比較して、ＰＹＹに関して等価または高い受容体親和性であることを示唆している。このデータはまた、細胞膜上でキメラ受容体がいずれも高く発現していることを示している。
【００８４】
競合分析（表ＩＩ）に関しては、膜（５〜５０μｇ）を０．０５０ｎＭ［１２５Ｉ］ＰＹＹ（ブタ）を含有するポリプロピレン管に添加した。コールドのディスプレーサー（ｃｏｌｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）（“ペプチド”）具体的にはヒトＮＰＹ１−３６、ヒトＮＰＹ３−３６、ヒトＮＰＹ１３−３６、ヒトＤ−Ｔｒｐ３２ＮＰＹおよびヒト膵臓ポリペプチド−“ｈＰＰ”（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ製）を、１０−１２Ｍ〜１０−６Ｍの濃度で別々のアッセイに添加して、終容積０．２５０ｍＬとした。これらのペプチドは特異的ＮＰＹ受容体薬理プロフィールの識別を可能にする。非特異的結合は、１μＭ ＮＰＹ（ヒト、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）の存在下で測定し、全結合の１０％未満を占めていた。室温で２時間インキュベーション後、迅速に減圧濾過して反応を停止させた。（使用前に２時間、１．０％ポリエチレンイミン中で）予備湿潤しておいたＧＦ／Ｃ ＷＨＡＴＭＡＮ濾紙上でサンプルを濾過し、ＢＳＡを含まない５ｍＬ冷結合バッファで２回濯いだ。残存する結合放射活性を、ガンマ計測により定量した。ＫｉおよびＨｉｌｌ係数（“ｎＨ”）を、ＳＩＧＭＡＰＬＯＴソフトウエア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ）を用いて測定値をＨｉｌｌ等式に合わせて決定した。
【００８５】
表ＩＩのデータから、本来のＮＰＹ５由来の受容体ドメインのアミノ酸配列における変化は、リガンド結合時において受容体の構造コンフォメーションを変化させ、［１２５Ｉ］ＰＹＹに関する受容体親和性に影響を与えることが理論付けられた。
【００８６】
【表１】
2004500820.tif 000003
【００８７】
【表２】
2004500820.tif 000004
【００８８】
実施例６
キメラＮＰＹ受容体の機能的アッセイ
ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイを、ＷｉｅｌａｎｄおよびＪａｃｏｂｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２３７巻：３〜１３頁、１９９４年の方法を変形して測定した。結果を図１に示す。
【００８９】
試験したそれぞれの受容体構築物に関して、４種類のバキュロウイルス発現ベクターストックを使用して、ＭＯＩ１：１：１：１で（実施例３に記載の如く）Ｓｆ９細胞の培養物を感染させた。これらの４種類は、（上記の如く製造した）試験されるＮＰＹ受容体構築物をコードする１つのベクターと、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質の３つのサブユニットのそれぞれをコードする商業的に入手した異なるバキュロウイルス発現ベクターストックからなっていた。
【００９０】
特に、図１に示されたようなＮＰＹ発現ベクター構築物は、発現の適切な配向で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のＹ１受容体ｃＤＮＡ（塗りつぶし）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＹ５受容体ＤＮＡ（白抜き）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のキメラＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴ受容体ｃＤＮＡ（縦線）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のキメラＮＰＹ５ΔＹ１ＩＣ３受容体ｃＤＮＡ（横線）を含むものである。Ｇ−タンパク質をコードするウイルスストックは、ＢＩＯＳＩＧＮＡＬ Ｉｎｃ．， Ｍｏｎｔｒｅａｌから入手し、
１）　図１で、Ｘ軸より下に示されるＧαＧ−タンパク質サブユニットをコードするウイルスストック（ここでｉ２はラットＧαｉ２Ｇ−タンパク質をコードするウイルスストックＢＩＯＳＩＧＮＡＬ ＃Ｖ５Ｊ００８であり、ＯはラットＧαｏＧ−タンパク質をコードするウイルスストックＢＩＯＳＩＧＮＡＬ ＃Ｖ５Ｈ０１０である）；
２）　ウシβ１Ｇ−タンパク質をコードするウイルスストック（ＢＩＯＳＩＧＮＡＬ ＃Ｖ５Ｈ０１２）；および
３）　ヒトγ２Ｇ−タンパク質をコードするウイルスストック（ＢＩＯＳＩＧＮＡＬ ＃Ｖ６Ｂ００３）
であった。どの（単数または複数の）受容体／Ｇαβγの組合せがＧＴＰγ３５Ｓ結合により測定して最大の機能的活性を与えるかを確認するために、アゴニストとしてｈＮＰＹ１−３６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、精製膜におけるアゴニスト−刺激ＧＴＰγ３５Ｓ結合を評価した。
【００９１】
実施例４に記載の方法により製造した精製膜を、ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭバシトラシン、１００ＫＩＵ／ｍＬアプロチニン、５μＭ ＧＤＰ）中、ダウンス・ホモジネーション（気密乳棒）により再懸濁させ、濃度３０μｇ／反応管で反応管に添加した。増加量のアゴニストｈＮＰＹ１−３６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を添加した後、１００ｐＭ ＧＴＰγ３５Ｓを添加して反応を開始した。室温で３０分間インキュベーションした後、ＧＦ／Ｃ濾紙（洗浄用バッファ、０．１％ＢＳＡで予備湿潤させた）で減圧濾過し、次いで氷冷洗浄用バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、１２０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄して反応を停止させた。
【００９２】
結合したＧＴＰγ３５Ｓを、洗浄した濾紙の液体シンチレーション分光法により測定した。非特異的結合は、１０ｍＭ ＧＴＰγＳを使用して決定し、全結合の５％未満であることが示された。データは、％最大応答で表され、それぞれの受容体型に関して上記基底刺激を超える最大アゴニスト刺激％を検出し、最大値（１００％）に対して受容体型内の他の全てのデータをノーマライズすることにより誘導した。これらのＧＴＰγ３５Ｓ結合実験の結果は、ＳＩＧＭＡＰＬＯＴソフトウエア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ）を使用して分析した。
【００９３】
結果を図１に示し、図面の簡単な説明にて議論した。
このデータは、Ｇタンパク質サブタイプが機能的に区別可能であり、受容体／Ｇαβγ結合相互作用、従ってＧ−タンパク質複合体のＧアルファサブユニットにおけるＧＴＰからＧＤＰへの交換により測定されるように本来の受容体およびキメラ受容体の最大機能的活性に影響することを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【図１】キメラＮＰＹ受容体は改変機能的Ｇ−タンパク質共役型特性−リガンド−誘発応答のＧ−タンパク質アルファ・サブユニット・ランク・オーダーを示す。データは％最大応答として表し、それぞれの受容体型に関して上記基底刺激を超える最大アゴニスト刺激％を検出し、その受容体型の他の全てのデータを最大（１００％）値に対してノーマライズすることにより誘導した。示されたＮＰＹ発現ベクター構築物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のＹ１受容体ｃＤＮＡ（塗りつぶし）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のＹ５受容体ＤＮＡ（白抜き）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のキメラＮＰＹ５ΔＹ１ＣＴ受容体ｃＤＮＡ（縦線）、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のキメラＮＰＹ１ΔＹ１ＩＣ３受容体ｃＤＮＡ（横線）の発現をもたらすものであった。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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