(57)【要約】本発明は、ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いる核酸配列の検出に関する。ライゲーションおよび増幅の組み合わせは、複数の核酸配列の検出を可能にする。本発明はまた、核酸配列を検出する際にアドレス可能支持体特異的配列を用いる方法、試薬、およびキットに関する。特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法を提供し、この方法は、検出されるべき各標的配列についてのプローブセットおよび必要に応じてライゲーション反応混合物を形成するためのライゲーション因子と、サンプルを組み合わせる工程を包含する。
2004507226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、以下：
該サンプルを各標的配列に対するプローブセットと合わせてライゲーション反応混合物を形成する工程であって、該プローブセットは（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セット中の該プローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であって、ここで隣接してハイブリダイズする相補的なプローブが互いにライゲーションされて、該５’プライマー特異的部分、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション反応混合物を（ａ）少なくとも１つのプライマーセット、および（ｂ）ポリメラーゼと合わせて、第１増幅反応混合物を形成する工程であって、該プライマーセットは（ｉ）該ライゲーション産物の該５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション産物の該３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つの第２プライマーを含み、ここで、該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがさらにレポーター基を含む、工程；
該第１増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生成する工程；
該第１増幅産物の該アドレス可能支持体特異的部分または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の部分を、支持体に結合された捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；ならびに
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブセットが１つより多い中心的な相補体、前記標的特異的部分の末端ヌクレオチドではない１つの中心的な相補体、またはその両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２１０に記載の方法。
【請求項６】
前記ライゲーション因子が熱安定性リガーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、またはそれらの酵素的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各プローブセットが、前記標的特異的部分と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
各プローブセットが、前記標的特異的部分と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵｌＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼまたはそれらの酵素的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
増幅の前に前記ライゲーション産物を精製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製する工程がハイブリダイゼーションに基づく取り出し工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製する工程がゲル濾過を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製する工程が透析を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
各プローブセットの前記第１プローブが３’末端でホスホロチオエート基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
各プローブセットの前記第２プローブがライゲーションに適切な脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１増幅産物が、少なくとも１つの５’末端ホスフェートを含み；そしてさらに、該方法は、以下：
該第１増幅産物をエキソヌクレアーゼと結合して、消化反応混合物を形成する工程；および
該エキソヌクレアーゼが増幅産物を消化し得る条件下で該消化反応混合物をインキュベートして、１本鎖のアドレス可能支持体特異的部分を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１増幅反応混合物は、各プライマーセットについて少なくとも１つの第１プライマーまたは少なくとも１つの第２プライマーを含むが、プライマーセットの第１プライマーおよび第２プライマーの両方は含まず、そしてここで、プライマーセットの該少なくとも１つの第１プライマーまたは該少なくとも１つの第２プライマーは、レポーター基を含むが、両方は、該レポーター基を含まない、方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記プローブセット中の前記少なくとも１つの第１プローブおよび前記少なくとも１つの第２プローブが、前記プライマー特異的部分と前記標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含み、そして前記少なくとも１つのプライマーセットのうちの少なくとも２つのプライマーがレポーター基を含む、方法。
【請求項２３】
前記第１増幅産物を変成して、該増幅産物の１本鎖部分を生成する工程、をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
変成する工程が、前記増幅産物の融解温度の上の温度まで該増幅産物を加熱して、一本鎖部分を生成する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
変成する工程が、前記増幅産物を化学的に変成して、一本鎖部分を生成する工程を包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの第１プライマーのモル濃度が前記少なくとも１つのプライマーセット中の前記少なくとも１つの第２プライマーのモル濃度とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、以下：
該サンプルを各標的配列に対するプローブセットと合わせて、ライゲーション反応混合物を形成する工程であって、該プローブセットは（ａ）標的特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セット中の該プローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であって、ここで隣接してハイブリダイズする相補的なプローブが互いにライゲーションされて、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション反応混合物を、該ライゲーション産物のプライマー特異的部分に相補的な配列およびレポーター基を含む少なくとも１つのプライマー、ならびにポリメラーゼと合わせて、伸長反応混合物を形成する、工程；
該伸長反応混合物を少なくとも１サイクルのプライマー伸長に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生成する工程；
該第１増幅産物の該アドレス可能支持体特異的部分または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の部分を、支持体に結合された捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；ならびに
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記第１プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２１１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライゲーション因子が熱安定性リガーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記熱安定性リガーゼが、Ｐｆｕリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、またはそれらの酵素的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
各プローブセットが、前記標的特異的部分と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
各プローブセットが、前記標的特異的部分と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵｌＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼまたはそれらの酵素的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
増幅の前に前記ライゲーション産物を精製する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記精製する工程がハイブリダイゼーションに基づく取り出し工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製する工程がゲル濾過を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記精製する工程が透析を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
各プローブセットの前記第１プローブが３’末端でホスホロチオエート基をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
各プローブセットの前記第２プローブがライゲーションに適切な脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、以下：
該サンプルを各標的配列に対するプローブセットと合わせてライゲーション反応混合物を形成する工程であって、該プローブセットは（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セット中の該プローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であって、ここで隣接してハイブリダイズする相補的なプローブが互いにライゲーションされて、該５’プライマー特異的部分、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション反応混合物を（ａ）少なくとも１つのプライマーセット、および（ｂ）ポリメラーゼと合わせて、第１増幅反応混合物を形成する工程であって、該少なくとも１つのプライマーセットは（ｉ）該ライゲーション産物の該５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション産物の該３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つの第２プライマーを含む、工程；
該第１増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供して、第１増幅産物を生成する工程；
該第１増幅産物を、各プライマーセットについて第１プライマーおよび第２プライマーの両方とは合わせず、少なくとも１つの第１プライマー、または少なくとも１つの第２プライマーのいずれかと合わせるが、第２増幅反応混合物を形成する工程であって、ここで、該少なくとも１つの第１プライマーまたは該少なくとも１つの第２プライマーが、レポーター基をさらに含む、工程；
該第２増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第２増幅産物を生成する工程；
該第２増幅産物の該アドレス可能支持体特異的部分または少なくとも１つのレポーター基を含む該第２増幅産物の部分を、支持体に結合された捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；ならびに
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記プローブセット中の前記少なくとも１つの第１プローブおよび前記少なくとも１つの第２プローブが、前記プライマー特異的部分と前記標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含み、そして前記第２増幅反応混合物のプライマーセットのうちの少なくとも２つのプライマーが、レポーター基を含む、方法。
【請求項４７】
ライゲーションに適切なプローブであって、５’末端、３’末端、標的特異的部分、プライマー特異的部分、および該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分を含む、プローブ。
【請求項４８】
前記５’末端に遊離リン酸基をさらに含む、請求項４７に記載のプローブ。
【請求項４９】
前記３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項４７に記載のプローブ。
【請求項５０】
前記５’末端にライゲーションに適切な脱離基を有するチミジン残基をさらに含む、請求項４７に記載のプローブ。
【請求項５１】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項５０に記載のプローブ。
【請求項５２】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するためのキットであって、以下：
検出される各標的配列に対する少なくとも１つのプローブセットであって、ここで、該プローブセットは（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各プローブセット中の該プローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、一緒にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、プローブセット；ならびに必要に応じて、
ライゲーション因子を含む、キット。
【請求項５３】
１セットのヌクレオチドプライマー、およびポリメラーゼをさらに含む、請求項５２に記載のキットであって、
前記プライマーセットは、（ｉ）前記プローブの前記５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つのプライマー、および（ｉｉ）該プローブの前記３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つのプライマーを含み、
ここで該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーが、レポーター基をさらに含む、
キット。
【請求項５４】
支持体をさらに含む請求項５２に記載のキットであって、該支持体は、前記プローブのアドレス可能支持体特異的部分、または該プローブのアドレス可能支持体特異的部分に相補的な配列とハイブリダイズし得る捕獲オリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項５５】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵｌＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、またはＴｔｈポリメラーゼである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５８】
前記リガーゼが熱安定性リガーゼである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記熱安定性リガーゼが、ＴｔｈリガーゼまたはＴａｑリガーゼである、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するためのキットであって、以下：
検出される各標的配列のための少なくとも１つのプローブセットであって、各プローブセットは（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、および（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セットの該プローブは共に、相補的な標的配列に互いに隣接してハイブリダイズされる場合、ライゲーションについて適切であり、そして各セットの少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、プローブセット、
を含む、キット。
【請求項６１】
請求項６０に記載のキットであって、該キットは支持体をさらに含み、該支持体は、前記少なくとも１つのプローブのアドレス可能支持体特異的部分または該少なくとも１つのプローブの該アドレス可能支持体特異的部分に相補的な配列とハイブリダイズし得る捕捉オリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項６２】
請求項６０に記載のキットであって、該キットはプライマーセットをさらに含み、該プライマーセットは、（ｉ）前記第１プローブの前記５’プライマー特異的部分の配列を含む少なくとも１つのプライマー、および（ｉｉ）前記第２プローブの前記３’プライマー特異的部分に相補的な少なくとも１つのプライマー、を含み、そして該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがレポーター基；およびポリメラーゼをさらに含む、キット。
【請求項６３】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
各プローブセットの前記第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
各プローブセットの前記第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６６】
前記５’チミジン脱離基が、トシレートまたはヨウ化物である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
各プローブセットの前記第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含み、そして各プローブセットの前記第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６８】
前記５’チミジン脱離基が、トシレートまたはヨウ化物である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７０】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項７１】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するためのキットであって、以下：
検出される各標的配列のための少なくとも１つのプローブセットであって、該プローブセットは（ａ）標的特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、および（ｂ）標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セットの該プローブは共に、相補的な標的配列に互いに隣接してハイブリダイズされる場合、ライゲーションについて適切であり、そして各セットの少なくとも１つの第２プローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、プローブセット、および必要に応じて、
ライゲーション因子、
を含む、キット。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキットであって、該キットは支持体をさらに含み、該支持体は、前記プローブのアドレス可能支持体特異的部分または該プローブの該アドレス可能支持体特異的部分に相補的な配列とハイブリダイズし得る捕捉オリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項７３】
前記第２プローブの前記プライマー特異的部分に相補的な少なくとも１つのプライマーおよびレポーター基；ならびにポリメラーゼをさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項７４】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項７５】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項７１に記載のキット。
【請求項７６】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、またはＴｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項７１に記載のキット。
【請求項７８】
前記リガーゼが熱安定性リガーゼである、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
前記熱安定性リガーゼが、ＴｔｈリガーゼまたはＴａｑリガーゼである、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
各プローブセットの前記第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項８１】
各プローブセットの前記第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項８２】
前記５’チミジン脱離基が、トシレートまたはヨウ化物である、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
各プローブセットの前記第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含み、そして各プローブセットの前記第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項８４】
前記５’チミジン脱離基が、トシレートまたはヨウ化物である、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項８６】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項８７】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、以下：
ライゲーション反応混合物を形成するために、各標的配列のためのプローブセットと該サンプル合わせる工程であって、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各プローブセットの該プローブは共に、相補的な標的配列に互いに隣接してハイブリダイズされる場合、ライゲーションについて適切であり、そして各セットの少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に配置されるアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であって、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的プローブを互いにライゲーションして、該５’プライマー特異的部分、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する、工程；
第１増幅反応混合物を形成するために、該ライゲーション反応混合物と、以下の（ａ）少なくとも１つのプライマーセットおよび（ｂ）ポリメラーゼを合わせる工程であって：（ａ）少なくとも１つのプライマーセットは、（ｉ）該ライゲーション反応産物の該５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション反応混合物の該３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つの第２プライマー、を含み、ここで、該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがレポーター基をさらに含む、工程；
少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生成するために、該第１増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供する工程；
該第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部分を分離する工程；および
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８８】
分離工程が、電気泳動、ゲル濾過、質量分析、またはＨＰＬＣを包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記第２プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２１６に記載の方法。
【請求項９２】
前記ライゲーション因子が熱安定性リガーゼである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、もしくはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項９２の方法。
【請求項９４】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９７】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
増幅前に前記ライゲーション産物を精製する工程をさらに包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９９】
前記精製工程が、ハイブリダイゼーションに基づく取り出し工程を包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１０１】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、以下：
ライゲーション反応混合物を形成するために、各標的配列のためのプローブセットと該サンプルを合わせる工程であって、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、各セットの該プローブは共に、相補的な標的配列に互いに隣接してハイブリダイズされる場合、ライゲーションについて適切であり、そして各セットの少なくとも１つのプローブは、アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であって、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的プローブを互いにライゲーションして、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する、工程；
伸長反応混合物を形成するために、該ライゲーション反応混合物を、該連産物の該プライマー特異的部分に相補的な配列およびレポーター基を含む、少なくとも１つのプライマーならびにポリメラーゼと合わせる工程；
少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生成するために、該伸長反応混合物を少なくとも１サイクルのプライマー伸長に供する工程；
該第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部分を分離する工程；および
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０２】
分離工程が、電気泳動、ゲル濾過、質量分析、またはＨＰＬＣを包含する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第２プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２１７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ライゲーション因子が熱安定性リガーゼである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項１０６の方法。
【請求項１０８】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
増幅前に前記ライゲーション産物を精製する工程をさらに包含する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記精製工程が、ハイブリダイゼーションに基づく取り出し工程を包含する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記アドレス可能支持体特異的部分が１００ヌクレオチド長以下である、請求項８７に記載の方法。
【請求項１１６】
前記アドレス可能支持体特異的部分が４０ヌクレオチド長以下である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記アドレス可能支持体特異的部分が２〜３６ヌクレオチド長である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記分離工程が、少なくとも１つの移動性依存的分析技術（ＭＤＡＴ）を包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＭＤＡＴが、電気泳動。クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分析、沈降、作用場流動分画、または多段分画のうちの少なくとも１つを包含する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＭＤＡＴが、ゲル濾過またはキャピラリー電気泳動を包含する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記第１プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記第２プローブが、前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記プローブセットが、１つより多い中心的な相補体、前記標的特異的部分の末端ヌクレオチドではない中心的な相補体、またはその両方をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ライゲーション反応混合物がリガーゼをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記リガーゼが熱安定性である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項１２５の方法。
【請求項１２７】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２８】
各プローブセットが、前記標的特異的部分において少なくとも１つのヌクレオチドにより異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項８７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、またはＴｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの酵素的に活性な変異体または改変体である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
増幅前に前記ライゲーション産物を精製する工程をさらに包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記精製工程が、ハイブリダイゼーションに基づく取り出し工程を包含する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記精製工程がゲル濾過を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記精製工程が透析を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１３６】
各プローブの前記第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１３７】
前記各プローブセットの第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項１３８】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
請求項８７に記載の方法であって、ここで第１増幅産物は、少なくとも１つの５’末端ホスフェートを含み；そして該方法は、以下：
該第１増幅産物をエキソヌクレアーゼと合わせて、消化反応混合物を形成する工程；
該エキソヌクレアーゼが該増幅産物を消化することが可能な条件下で、該消化反応混合物をインキュベートして、少なくとも１つのレポーター基を含む単鎖のアドレス可能支持体特異的部分を生成する工程；
該消化した増幅産物を分離する工程；および、
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１４０】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、該方法は以下：
該サンプルを各標的配列についてのプローブセットと合わせて、ライゲーション反応混合物を形成する工程であり、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、該各セットのプローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、一緒にライゲーションするのに適しており、そしてここで、各プローブセットの少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に位置するアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であり、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的なプローブは、互いに結合して該５’プライマー特異的部分、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する、工程；
該ライゲーション反応混合物を、（ａ）（ｉ）該ライゲーション産物の５’プライマー特異的部分の配列およびレポーター基を含む、少なくとも１つの第１プライマー、または（ｉｉ）該ライゲーション産物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列およびレポーター基を含む、少なくとも１つの第２プライマーを含むが、少なくとも１つの第１プライマーと少なくとも１つの第２プライマーとの両方は含まない、少なくとも１つのプライマーセット、ならびに（ｂ）ポリメラーゼ、と合わせて、第１増幅反応混合物を形成する工程；
該第１増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生成する工程；
該第１増幅産物または該少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物の一部を分離する工程；ならびに、
該レポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４１】
請求項８７に記載の方法であって、ここで、前記プローブセットの少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブが、前記プライマー特異的部分と前記標的特異的部分との間に位置するアドレス可能支持体特異的部分をさらに含み、そして前記少なくとも１つのプライマーセットの少なくとも２つのプライマーがレポーター基を含む、方法。
【請求項１４２】
前記第１増幅産物を変性させて、前記第１増幅産物の単鎖部分を生成する工程をさらに包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記変成させる工程が、前記増幅産物の融解温度より高い温度まで該増幅産物を加熱して、単鎖部分を生成する工程を包含する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記変成させる工程が、前記増幅産物を化学的に変成させて単鎖部分を生成する工程を包含する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記少なくとも１つの第１プライマーのモル濃度が、前記少なくとも１つのプライマーセットの少なくとも１つの第２プライマーのモル濃度と異なる、請求項８７に記載の方法。
【請求項１４６】
請求項８７に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分が、移動性変更因子として働く特定の配列に相補的であり、該配列が、（ｉ）前記増幅産物の少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分に選択的に結合するためのタグ補体、および（ｉｉ）ＭＤＡＴにおいて特定の移動性をもたらすためのテールを含む、方法。
【請求項１４７】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１４８】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、０〜４０ヌクレオチド長である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、２〜３６ヌクレオチド長である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記分離工程がＭＤＡＴを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＭＤＡＴが、電気泳動、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分光法、沈降、作用場流動分画または多段分画の少なくとも１つを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＭＤＡＴがゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第１プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記第２プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５５】
前記プローブセットが、１つより多い中心的な相補体、前記標的特異的部分の末端ヌクレオチドではない中心的な相補体、または両方をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ライゲーション反応混合物がリガーゼをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１５７】
前記リガーゼが、熱安定性である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、またはその酵素学的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
各プローブセットが、少なくとも１つのヌクレオチドだけ前記標的特異的部分が異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６０】
各プローブセットが、少なくとも１つのヌクレオチドだけ前記標的特異的部分が異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６２】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼまたはその酵素学的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記ライゲーション産物を増幅前に精製する工程をさらに包含する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６４】
前記精製工程がハイブリダイゼーションに基づく引き抜きを含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記精製工程がゲル濾過を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記精製工程が透析を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６８】
前記各プローブセットの第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１６９】
前記各プローブセットの第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１７０】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
請求項１０１に記載の方法であって、ここで、前記第１増幅産物は、少なくとも１つの５’末端にホスフェートを含み；そして該方法は、以下：
該第１増幅産物をエキソヌクレアーゼと合わせて、消化反応混合物を形成する工程；
該エキソヌクレアーゼが該増幅産物を消化することが可能な条件下で、該消化反応混合物をインキュベートして、少なくとも１つのレポーター基を含む単鎖のアドレス可能支持体特異的部分を生成する工程；
該消化した増幅産物を分離する工程；および、
該少なくとも１つのレポーター基を検出する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１７２】
前記第１増幅産物を変性させて、該増幅産物の単鎖部分を生成する工程をさらに包含する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記変成させる工程が、前記増幅産物の融解温度より高い温度まで該増幅産物を加熱して、単鎖部分を生成する工程を包含する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記変成させる工程が、前記増幅産物を化学的に変成させて単鎖部分を生成する工程を包含する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７５】
請求項１０１に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分が、移動性変更因子として働く特定の配列に相補的であり、該配列が、（ｉ）前記増幅産物のアドレス可能支持体特異的部分に選択的に結合するためのタグ補体、および（ｉｉ）ＭＤＡＴにおいて特定の移動性をもたらすためのテールを含む、方法。
【請求項１７６】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法であって、該方法は以下：
該サンプルを各標的配列についてのプローブセットと合わせて、ライゲーション反応混合物を形成する工程であり、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２プローブを含み、ここで、該各セットのプローブは、相補的な標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合、一緒にライゲーションするのに適しており、そしてここで、各プローブセットの少なくとも１つのプローブは、該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に位置するアドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、工程；
該ライゲーション反応混合物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供する工程であり、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的なプローブは、互いに結合して５’該プライマー特異的部分、該標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分、および該３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物を形成する、工程；
該ライゲーション反応混合物を、（ａ）（ｉ）該ライゲーション産物の５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション産物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つの第２プライマーを含む、少なくとも１つのプライマーセット、ならびに（ｂ）ポリメラーゼ、と合わせて、第１増幅反応混合物を形成する工程；
該第１増幅反応混合物を少なくとも１サイクルの増幅に供して、第１増幅産物を生成する工程；
該第１増幅産物を、各プライマーセットについて少なくとも１つの第三プライマー、または少なくとも１つの第四プライマーを含むが、第１プライマーおよび第２プライマーの両方は含まない、少なくとも１つの第２プライマーセットと合わせて、第２増幅反応混合物を形成する工程であり、ここで、該少なくとも１つの第１プライマーまたは該少なくとも１つの第２プライマーが、レポーター基をさらに含む、工程；
該第２増幅反応混合物を、少なくとも１サイクルの増幅に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第２増幅産物を生成する工程；
該第２増幅産物または該少なくとも１つのレポーター基を含む第２増幅産物の一部を分離する工程；ならびに、
該レポーター基を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７７】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、０〜１００ヌクレオチド長である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、０〜４０ヌクレオチド長である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記アドレス可能支持体特異的部分が、２〜３６ヌクレオチド長である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記分離工程が少なくとも１つのＭＤＡＴを含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ＭＤＡＴが、電気泳動、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分光法、沈降、作用場流動分画または多段分画の少なくとも１つを含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記ＭＤＡＴがゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
請求項１７６に記載の方法であって、ここで、前記プローブセットの少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブが、前記プライマー特異的部分と前記標的特異的部分との間に位置するアドレス可能支持体特異的部分をさらに含み、そしてここで、前記第２プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがレポーター基を含む、方法。
【請求項１８４】
前記ライゲーション反応混合物がリガーゼをさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８５】
前記リガーゼが熱安定性である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記熱安定性リガーゼが、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、またはその酵素学的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記第１プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記第２プローブが前記アドレス可能支持体特異的部分をさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８９】
前記プローブセットが、１つより多い中心的な相補体、前記標的特異的部分の末端ヌクレオチドではない中心的な相補体、または両方をさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９０】
各プローブセットが、少なくとも１つのヌクレオチドだけ前記標的特異的部分が異なる少なくとも２つの第１プローブをさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９１】
各プローブセットが、少なくとも１つのヌクレオチドだけ前記標的特異的部分が異なる少なくとも２つの第２プローブをさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９３】
前記熱安定性ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＵＩＴｍａポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、またはその酵素学的に活性な変異体もしくは改変体である、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記ライゲーション産物を増幅前に精製する工程をさらに包含する、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９５】
前記精製工程がハイブリダイゼーションに基づく引き抜きを含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記精製工程がゲル濾過を含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９７】
前記精製工程が透析を含む、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９８】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９９】
前記各プローブセットの第１プローブが、３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項２００】
前記各プローブセットの第２プローブが、ライゲーションに適した脱離基を有する５’チミジン残基をさらに含む、請求項１７６に記載の方法。
【請求項２０１】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
請求項１７６に記載の方法であって、ここで、前記プローブセットの少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブが、前記プライマー特異的部分と前記標的特異的部分との間に位置するアドレス可能支持体特異的部分をさらに含み、そして、前記少なくとも１つの第２プライマーセットの少なくとも１つのプライマーが、少なくとも１つのレポーター基を含む、方法。
【請求項２０３】
請求項１７６に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部分が、移動性変更因子として働く特定の配列に相補的であり、該配列が、（ｉ）前記増幅産物のアドレス可能支持体特異的部分に選択的に結合するためのタグ補体、および（ｉｉ）移動性依存性分析技術において特定の移動性をもたらすためのテールを含む、方法。
【請求項２０４】
ライゲーションに適したプローブであって、以下：５’末端、３’末端、標的特異的部分、プライマー特異的部分、および該プライマー特異的部分と該標的特異的部分との間に位置する移動性変更因子配列を含む、プローブ。
【請求項２０５】
前記５’末端に遊離ホスフェート基をさらに含む、請求項２０４に記載のプローブ。
【請求項２０６】
前記３’末端にホスホロチオエート基をさらに含む、請求項２０４に記載のプローブ。
【請求項２０７】
前記５’末端にライゲーションに適した脱離基を有するチミジン残基をさらに含む、請求項２０４に記載のプローブ。
【請求項２０８】
前記５’チミジン脱離基がトシレートまたはヨウ化物である、請求項２０７に記載のプローブ。
【請求項２０９】
請求項２０４に記載の前記プローブを備えたキット。
【請求項２１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応混合物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２１１】
請求項２７に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応混合物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２１２】
請求項４５に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応混合物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２１３】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記ライゲーション因子が熱安定性リガーゼである、請求項２１３の方法。
【請求項２１５】
請求項２１４に記載の方法であって、ここで前記熱安定性リガーゼが、Ｐｆｕリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼまたはこれらの酵素的に活性な変異体もしくは改変体である、方法。
【請求項２１６】
請求項８７に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応混合物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２１７】
請求項１０１に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応混合物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２１８】
サンプル中の、少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定する方法であって、以下：
少なくとも１つの標的核酸配列を各標的核酸配列に対するプローブセットと合わせ、ライゲーション反応組成物を形成する工程であって、ここで該プローブセットは、（ａ）標的特異的部位および５’プライマー特異的部位を含む、少なくとも１つの第１プローブ、ならびに（ｂ）各第２プローブが３’プライマー特異的部位および複数のスプライス特異的部位の１つを含む複数の第２プローブ、を含み、ここで各プローブセット中の該プローブが、該少なくとも１つの標的核酸配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、各プローブセット中の該プローブが、共にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブがさらに少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位を、該プライマー特異的部位と該標的特異的部位との間に含むか、または該プライマー特異的部位と該スプライス特異的部位との間に含む工程；
前記ライゲーション反応組成物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供し、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは、互いにライゲーションし、該５’プライマー特異的部位、該標的特異的部位、該スプライス特異的部位、該少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位、および該３’プライマー特異的部位を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション産物を、以下：（ａ）少なくとも１つのプライマーセットであって、該プライマーセットが以下：（ｉ）該ライゲーション産物の５’プライマー特異的部位の配列を含む少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション産物の３’プライマー特異的部位に相補的な配列を含む少なくとも１つの第２プライマーを含み、ここで該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがさらに少なくとも１つのレポーター基を含む、プライマーセット；および（ｂ）ポリメラーゼと合わせ、第１増幅反応組成物を形成する工程；
該第１増幅反応組成物を、少なくとも１つの増幅サイクルに対して供して、該少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生じる工程；
該第１増幅産物または該少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部を、該少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位の少なくとも一部を用いて分析する工程；ならびに
該少なくとも１つの標的核酸配列中のスプライス改変体を、該少なくとも１つのレポーター基を検出することによって同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２１９】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１つの標的核酸配列がＲＮＡから生じる少なくとも１つの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む、方法。
【請求項２２０】
前記少なくとも１つのｃＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から生じる、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１つの標的核酸配列が、前記サンプル中に存在する少なくとも１つのＲＮＡ標的を含む、方法。
【請求項２２２】
前記ライゲーション反応組成物がさらにＴ４　ＤＮＡリガーゼを含む、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記ポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２４】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記分析する工程が、前記第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部の前記アドレス可能支持体特異的部位を、直接的または間接的に支持体にハイブリダイズする工程を包含する、方法。
【請求項２２５】
請求項２２４に記載の方法であって、該方法がさらに、前記第１増幅産物を変性して、前記増幅産物の一本鎖部位を生じる工程を包含する、方法。
【請求項２２６】
請求項２２５に記載の方法であって、ここで前記変性する工程が、前記増幅産物を該増幅産物の融点温度を超える温度まで加熱して、一本鎖部位を生じる工程を包含する、方法。
【請求項２２７】
請求項２２５に記載の方法であって、ここで前記変性する工程が、前記増幅産物を化学的に変性して、一本鎖部位を生じる工程を包含する、方法。
【請求項２２８】
前記第１プローブがさらに前記アドレス可能支持体特異的部位を含む、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２９】
前記第２プローブがさらに前記アドレス可能支持体特異的部位を含む、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２３０】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記アドレス可能支持体特異的部位が、移動性配列を含み、該移動性配列が、前記第１増幅産物または前記少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部に特定の移動性を与える、方法。
【請求項２３１】
前記移動性配列が１０１ヌクレオチド長未満である、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
前記移動性配列が４１ヌクレオチド長未満である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
前記移動性配列が２〜３６ヌクレオチド長である、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３４】
前記第１プローブがさらに前記移動性配列を含む、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３５】
前記第２プローブがさらに前記移動性配列を含む、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３６】
請求項２３０に記載の方法であって、ここで前記分析する工程が、前記第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部を、核酸配列を分子量または長さに基づいて分離する手順に供する工程を包含する、方法。
【請求項２３７】
前記分離する工程が、少なくとも１つの移動性依存的分析技術（ＭＤＡＴ）を含む、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
請求項２３７に記載の方法であって、ここで前記ＭＤＡＴが電気泳動、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分析法、沈殿法、作用場流動分画、または多段階分画のうち少なくとも１つを含む、方法。
【請求項２３９】
請求項２３８に記載の方法であって、ここで前記ＭＤＡＴがゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を含む、方法。
【請求項２４０】
請求項２３６に記載の方法であって、ここで前記分離する工程が、前記第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部を、透析する工程を包含する、方法。
【請求項２４１】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記ライゲーション反応組成物がさらにライゲーション因子を含む、方法。
【請求項２４２】
前記ライゲーション因子がリガーゼである、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
前記リガーゼが熱安定性リガーゼである、請求項２４２に記載の方法。
【請求項２４４】
請求項２４３に記載の方法であって、ここで前記熱安定性リガーゼがＴｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｓｃリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼの少なくとも１つから選択される、方法。
【請求項２４５】
前記ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２４６】
請求項２４５に記載の方法であって、ここで前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、およびＴｔｈポリメラーゼの少なくとも１つから選択される、方法。
【請求項２４７】
前記レポーター基が蛍光部分を含む、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２４８】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１つの第１プライマーのモル濃度が、前記少なくとも１つのプライマーセット中の前記少なくとも１つの第２プライマーのモル濃度と異なる、方法。
【請求項２４９】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記少なくとも１つの第１プライマーの融解温度が、少なくとも１つのプライマーセット中の前記少なくとも１つの第２プライマーの融解温度と、少なくとも約４℃異なる、方法。
【請求項２５０】
請求項２１８に記載の方法であって、ここで前記第１増幅産物が少なくとも１つの５’末端リン酸を含み；そして該方法がさらに、以下：
該第１増幅産物をエキソヌクレアーゼと合わせて、消化反応組成物を形成する工程；および
該消化反応組成物を、該エキソヌクレアーゼが該増幅産物を消化することが可能な条件下でインキュベートして、少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部を生じる工程
を包含する、方法。
【請求項２５１】
サンプル中の、少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定する方法であって、以下：
少なくとも１つの標的核酸配列を各標的核酸配列に対するプローブセットと合わせる工程であって、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部位を含む、少なくとも１つの第１プローブ、および（ｂ）各第２プローブが３’プライマー特異的部位および複数のスプライス特異的部位の１つを含む複数の第２プローブ、を含み、ここで各プローブセット中の該プローブが、少なくとも１つの該標的核酸配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、各プローブセット中の該プローブが、共にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブがさらに少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位を含む工程；
前記ライゲーション反応組成物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供し、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは、互いにライゲーションし、該標的特異的部位、該スプライス特異的部位、該少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位、および該３’プライマー特異的部位を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション産物を、レポーター基および該ライゲーション産物の３’プライマー特異的部位に相補的な配列を含む、少なくとも１つのプライマー、ならびにポリメラーゼと合わせ、伸長反応組成物を形成する工程；
該伸長反応組成物を、少なくとも１つのサイクルのプライマー伸長に供して、少なくとも１つのレポーター基を含む第１増幅産物を生じる工程；
該第１増幅産物または少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部を、該少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位の少なくとも一部を用いて分析する工程；ならびに
該少なくとも１つの標的核酸配列中のスプライス改変体を、該少なくとも１つのレポーター基を検出することによって同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２５２】
サンプル中の、少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定する方法であって、以下：
少なくとも１つの標的核酸配列を各標的核酸配列に対するプローブセットと合わせてライゲーション反応組成物を形成する工程であって、該プローブセットは、（ａ）第１標的特異的部位および５’プライマー特異的部位を含む、第１プローブ、および（ｂ）各第２プローブが３’プライマー特異的部位および複数のスプライス特異的部位の１つを含む複数の第２プローブ、を含み、ここで各プローブセット中の該プローブが、少なくとも１つの該標的核酸配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、各プローブセット中の該プローブが、共にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブがさらに少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位を、該プライマー特異的部位と該標的特異的部位間に含むか、または該プライマー特異的部位と該スプライス特異的部位間に含む、工程；
前記ライゲーション反応組成物を少なくとも１サイクルのライゲーションに供し、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは、互いにライゲーションし、該５’プライマー特異的部位、該標的特異的部位、該スプライス特異的部位、該少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位、および該３’プライマー特異的部位を含むライゲーション産物を形成する工程；
該ライゲーション産物を、以下：（ａ）少なくとも１つのプライマーセットであって、該プライマーセットが以下：（ｉ）該ライゲーション産物の５’プライマー特異的部位の配列を含む少なくとも１つの第１プライマー、および（ｉｉ）該ライゲーション産物の３’プライマー特異的部位に相補的な配列を含む少なくとも１つの第２プライマーを含み、ここで該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがさらに少なくとも１つのレポーター基を含む、プライマーセット；および（ｂ）ポリメラーゼと合わせて、第１増幅反応組成物を形成する工程；
該第１増幅反応組成物を、少なくとも１サイクルの増幅に供して、第１増幅産物を生じる工程；
該第１増幅産物を、各プライマーセットについての少なくとも１つの第１プライマーまたは少なくとも１つの第２プライマーのいずれかと合わせるが、第１プライマーおよび第２プライマーの両方とは合わせずに、第２増幅反応組成物を形成する工程であって、ここで該少なくとも１つの第１プライマーまたは該少なくとも１つの第２プライマーがさらに、レポーター基を含む工程；
該第２増幅反応組成物を、少なくとも１サイクルの増幅に供して、該レポーター基を含む第２増幅産物を生じる工程；
該第２増幅産物または該レポーター基を含む該第２増幅産物の一部を、該アドレス可能支持体特異的部位の少なくとも一部を用いて分析する工程；ならびに
該少なくとも１つの標的核酸配列中のスプライス改変体を、該少なくとも１つのレポーター基を検出することによって同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２５３】
少なくとも１つの標的核酸配列中のスプライス改変体を同定するためのキットであって、該キットは、以下：
検出されるべき各標的核酸配列に対する少なくとも１つのプローブセットであって、該プローブセットは、（ａ）標的特異的部位および５’プライマー特異的部位を含む、少なくとも１つの第１プローブ、および（ｂ）各第２プローブが３’プライマー特異的部位および複数のスプライス特異的部位の１つを含む複数の第２プローブ、を含み、ここで核酸配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、各プローブセット中の該プローブが、共にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブがさらに少なくともアドレス可能支持体特異的検出部位を、該プライマー特異的部位と該標的特異的部位との間に含むか、または該プライマー特異的部位と該スプライス特異的部位との間に含む、プライマーセット
を備えた、キット。
【請求項２５４】
さらにポリメラーゼを備えた、請求項２５３に記載のキット。
【請求項２５５】
該ポリメラーゼが熱安定性である、請求項２５４に記載のキット。
【請求項２５６】
請求項２５５に記載のキットであって、ここで前記熱安定性ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、およびＴｔｈポリメラーゼの少なくとも１つから選択される、キット。
【請求項２５７】
請求項２５３に記載のキットであって、該キットがさらにプライマーセットを含み、該プライマーセットが、以下：（ｉ）該第１プローブの５’プライマー特異的部位の配列を含む少なくとも１つのプライマー、および（ｉｉ）該第２プローブの３’プライマーに相補的な配列を含む少なくとも１つのプライマーを含み、ここで該プライマーセットの少なくとも１つのプライマーがさらにレポーター基を含む、プライマーセットである、キット。
【請求項２５８】
さらにポリメラーゼを備えた、請求項２５７に記載のキット。
【請求項２５９】
該ポリメラーゼが熱安定性である、請求項２５８に記載のキット。
【請求項２６０】
請求項２５９に記載のキットであって、ここで前記熱安定性ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、およびＴｔｈポリメラーゼの少なくとも１つから選択される、キット。
【請求項２６１】
請求項２５３に記載のキットであって、ここで少なくとも１つのプローブのアドレス可能支持体特異的部位が移動性配列を含み、該移動性配列が前記第１増幅産物または前記少なくとも１つのレポーター基を含む該第１増幅産物の一部に特定の移動性を与える、キット。
【請求項２６２】
請求項２５３に記載のキットであって、該キットがさらに支持体を含み、該支持体が、少なくとも１つのプローブのアドレス可能支持体特異的配列とハイブリダイズし得るかまたは該少なくとも１つのプローブの該アドレス可能支持体特異的配列に対して相補的な配列とハイブリダイズし得る、捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体
を備えた、キット。
【請求項２６３】
さらにリガーゼを含む、請求項２５３に記載のキット。
【請求項２６４】
前記リガーゼがＴ４　ＤＮＡリガーゼである、請求項２６３に記載のキット。
【請求項２６５】
前記リガーゼが熱安定性リガーゼである、請求項２６３に記載のキット。
【請求項２６６】
前記熱安定性リガーゼがＴｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼの少なくとも１つから選択される、請求項２６５に記載のキット。
【請求項２６７】
少なくとも１つの標的核酸配列中のスプライス改変体を同定するためのキットであって、該キットが、以下：
検出されるべき各標的核酸配列に対する少なくとも１つのプローブセットであって、各プローブセットが、以下：（ａ）標的特異的部位を含む、少なくとも１つの第１プローブ、および（ｂ）各第２プローブが３’プライマー特異的部位および複数のスプライス特異的部位の１つを含む複数の第２プローブ、を含み、ここで各プローブセット中の該プローブが、核酸配列上で互いに隣接してハイブリダイズする場合に、各プローブセット中の該プローブが、共にライゲーションするのに適切であり、そしてここで、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブがさらに少なくとも１つのアドレス可能支持体特異的部位を含む、プローブセット
を備えた、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国出願番号０９／５８４，９０５（２０００年５月３０日出願）、および０９／７２４，７５５（２０００年１１月２８日出願）（これらは共に本明細書中で任意の目的について参考として援用される）の一部継続出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、ライゲーションおよび増幅反応の組み合わせを使用する核酸配列の検出に関する。本発明はまた、核酸配列を検出するための方法、試薬、およびキットに関する。
【０００３】
（発明の背景）
１つ以上の配列を含むサンプル中の核酸配列の検出は、分子生物学において十分に確立された技術である。ヒトゲノムの配列全体は、すぐに公知になり、多数の遺伝的疾患の同定および検出、ならびに遺伝的疾患に対する素因について個体をスクリーニングすることが可能となる。さらに、癌および多数の感染性疾患（例えば、ＡＩＤＳおよび肝炎）の検出は、診断用核酸配列の存在および非存在について生物学的サンプルをスクリーニングする工程を慣例的に包含する。核酸配列を検出することはまた、法医科学、親子鑑定、遺伝的カウンセリング、および臓器移植において重要である。
【０００４】
頻繁に、配列検出は、低い標的コピー数に起因して阻まれる。標的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような従来の技術を使用して増幅され得、その後、ブロッティングまたはマイクロアレイ検出のような標準的な検出手順が続く。例えば、マイクロアレイを使用して、アレイ特異的配列を含むプローブを用いて作製されるＬＤＲ産物を検出する（Ｂａｒａｎｙら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３１２５６，１９９７年８月２８日公開）。これらの従来の増幅技術の記載は、とりわけ、Ｈ．Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−５０（１９９１）、Ｍ．Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０），Ｒ．Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１８：５６１−６４（２０００）、およびＨ．Ｆ．Ｒａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　２８：９７−１０２（２０００）において見出され得る。
【０００５】
これらの基本的な増幅技術の１つのバリエーションは、多発性ＰＣＲであり、ここで、複数の標的配列が、プライマーの複数のセットを使用して同時に増幅される（例えば、Ｈ．Ｇｅａｄａら、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．１０８：３１−３７（２０００）およびＤ．Ｇ．Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８０：１０７７−８２（１９９８）を参照のこと）。別のバリエーションは、核酸配列差異を検出するためにＬＤＲをＰＣＲと組み合わせることを包含する（例えば、Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７，１９９６；米国特許第６，０２７，８８９号を参照のこと）。
【０００６】
しかし、従来の核酸検出方法は、例えば、ハイスループットスクリーニングについて、特に標的配列がまず増幅されなければならない場合、わずらわしく、時間浪費であるか、または非実用的であり得る。高度に多重化可能であるサンプル中の複数の標的配列の同時検出のための、正確で、効率的なかつ低コストの方法、試薬およびキットについての増加する必要性が存在する。このような必要性が適用する分野には、遺伝子検査、疾患検出、および法医学が挙げられる。本明細書中に記載される発明を使用して、タイムリーで、確実な、かつ費用効率的な様式で、１つ以上の標的配列を検出し得る。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ライゲーションおよび増幅反応の組み合わせを使用する、サンプル中の１つ以上の核酸配列を検出するための方法、試薬およびキットに関する。サンプル中の標的配列の存在および非存在についての診断である、増幅されたライゲーション産物は、特定の核酸配列を検出するように設計されたアドレス可能な支持体にハイブリダイズされる。あるいは、サンプル中の標的配列の存在および非存在についての診断である、特定の長さまたは分子量を含む増幅されたライゲーション産物は、特定の核酸配列を検出するために、分子量または長さまたは移動性に基づいて分離される。
【０００８】
特定の実施形態において、サンプルは、好ましくはゲノムＤＮＡを含む。例えば、複数の多形座位を含むがこれらに限定されないサンプル中で、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列（標的配列）の大規模な多発性分析は、本発明の範囲内である。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法を提供し、この方法は、検出されるべき各標的配列についてのプローブセットおよび必要に応じてライゲーション反応混合物を形成するためのライゲーション因子と、サンプルを組み合わせる工程を包含する。プローブセットは、（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２のプローブを含む。各セットにおけるプローブは、相補的な標的配列上で、お互いに隣接してハイブリダイズする場合に、共にライゲーションに適している。さらに、各プローブセットにおける少なくとも１つのプローブは、プライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的部分をさらに含む。このライゲーション反応混合物は、少なくとも１サイクルのライゲーションに供され、ここで、適切な条件下で、隣接してハイブリダイズする相補的なプローブは、ライゲーション産物を形成するようにお互いに連結される。従って、ライゲーション産物は、５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分、および３’プライマー特異的部分を含む。
【００１０】
ライゲーション反応混合物は、少なくとも１つのプライマーセットおよびポリメラーゼと組み合わせられ、第１の増幅反応混合物を形成する。このプライマーセットは、（ｉ）ライゲーション産物の５’プライマー特異的部分の配列を含む、少なくとも１つの第１のプライマー、および（ｉｉ）ライゲーション産物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む、少なくとも１つの第２のプライマーを含む。プライマーセットの少なくとも１つのプライマーはさらに、レポーター基を含む。第１の増幅反応混合物は、少なくとも１つのレポーター基を含む第１の増幅産物を作成するために、少なくとも１サイクルの増幅に供される。第１の増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分は、適切な条件下で、支持体結合捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。ハイブリダイズした産物のレポーター基は検出され、サンプル中の標的配列の存在を示す。
【００１１】
他の実施形態において、サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するための方法が提供され、この方法は、各標的配列についてのプローブセットおよび必要に応じて、ライゲーション因子と、サンプルとを組み合わせて、ライゲーション反応混合物を形成する工程を包含する。プローブセットは、（ａ）標的特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２のプローブを含む。各プローブセットにおける少なくとも１つのプローブは、アドレス可能な支持体特異的部分をさらに含む。各セットにおけるプローブは、相補的な標的配列上でお互いに隣接してハイブリダイズする場合、ライゲーションに共に適している。
【００１２】
ライゲーション反応混合物は、少なくとも１サイクルのライゲーションに供され、ここで、隣接してハイブリダイズする相補的なプローブは、ライゲーション産物を形成するようにお互いに連結される。このライゲーション産物は、標的特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分、およびプライマー特異的部分を含む。このライゲーション反応混合物は、少なくとも１つのプライマーと組み合わせられ、伸長反応混合物を形成する。このプライマーは、ライゲーション産物およびレポーター基のプライマー特異的部分に相補的な配列ならびにポリメラーゼを含む。
【００１３】
少なくとも１つのレポーター基を含む第１の増幅産物は、少なくとも１サイクルのプライマー伸長に伸長反応混合物を供することによって作製される。第１の増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分は、支持体結合捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。レポーター基の検出は、サンプル中の対応する標的配列の存在を示す。
【００１４】
他の実施形態において、プローブセットの第１または第２のプローブは、支持体上の捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするのを可能にするか、あるいは固有の分子量もしくは長さ、または移動性（例えば、限定されないが、電気泳動移動性）を提供するように設計されたアドレス可能な支持体特異的部分をさらに含む。
【００１５】
なお他の実施形態において、ライゲーションは、非酵素学的に行なわれる。限定されないが、非酵素学的ライゲーションは、化学的ライゲーション（「活性化」剤および／または還元剤の存在下での自己ライゲーションおよびライゲーション）を含む。非酵素学的ライゲーションは、結合されるべきプローブのそれぞれの３’末端および５’末端で、特異的な反応基を利用し得る。
【００１６】
特定の実施形態において、一本鎖増幅産物（アドレス可能な支持体を用いるハイブリダイゼーションに適切である）は、限定されないが、非対称性ＰＣＲ、非対称性再増幅、ヌクレアーゼ消化、および化学的変性を含むいくつかの代替的な方法によって作製され得る。このようなプロセスの詳細な説明は、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９５年および補遺），Ｎｏｖａｇｅｎ　ＳｔｒａｎｄａｓｅＴＭ　Ｋｉｔ　ｉｎｓｅｒｔ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９），およびＬｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２：６７２（１９６７）において見出され得る。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼ消化を使用して、増幅産物から一本鎖配列を生成するための方法が提供される。少なくとも１つの５’末端リン酸を含む増幅産物は、エキソヌクレアーゼと組み合わされて、消化反応混合物を形成する。消化反応混合物を、エキソヌクレアーゼが増幅産物の一本鎖を消化するのを可能にする条件下でインキュベートして、一本鎖のアドレス可能な支持体特異的部分を生成する。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、非対称性の再増幅についての工程を組み込むことによって、増幅産物から一本鎖配列を生成するための方法が提供される。第１の増幅産物は、両方ではないが、各プライマーセット由来の少なくとも１つの第１のプライマーまたは少なくとも１つの第２のプライマーのいずれかと組み合わされて、第２の増幅反応混合物を生成する。
【００１９】
当業者は、これらの非対称性再増幅方法において、レポーター基が、第１の増幅反応混合物ではなく、第２の増幅反応混合物中のプライマーの成分であることを理解する。当業者はまた、さらなるポリメラーゼもまた、第２の増幅反応混合物の成分であり得ることを理解する。あるいは、第１の増幅混合物からの残りのポリメラーゼは、第２の増幅産物を合成するのに十分であり得る。
【００２０】
次いで、第２の増幅反応混合物は、少なくとも１サイクルの増幅に供される。代表的に、一本鎖アンプリコンのみが、生成される。なぜなら、第２の増幅反応混合物は、各プライマーセット由来の第１または第２のプライマーのみを含むためである。レポーター基を含む一本鎖の第２の増幅産物は、支持体結合捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。レポーター基の検出は、サンプル中の対応する標的配列の存在を示す。
【００２１】
支持体結合捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得るか、または分子量または長さまたは移動性によって分離され得る一本鎖配列を生成するためのプライマー伸長の使用は、本発明の方法の範囲内である。これらの方法に従って、第１の増幅反応混合物は、プライマーセット由来の少なくとも１つの第２のプライマーを含むが、第１のプライマーは含まない。従って、単一の増幅産物（ライゲーション産物の相補鎖）のみが生成される。ライゲーション産物のアドレス可能な支持体特異的部分の成分を含む増幅産物は、支持体結合捕獲オリゴヌクレオチドと直接ハイブリダイズする。あるいは、この増幅産物は、分子量または長さまたは移動性によって分離される。
【００２２】
当業者は、一本鎖増幅産物がまた、非対称性ＰＣＲを使用して生成され得、ここで、各プライマーセットについての第１および第２のプライマーの両方が、一方のプライマーが他方のプライマーと比較して過剰な状態で提供されることを理解する。従って、上記のプライマー伸長プロセスとは異なり、二本鎖ライゲーション産物のいずれかの鎖は、どのプライマーが過剰に供給されるかに依存して、一本鎖産物を生成するために増幅され得る。
【００２３】
他の実施形態において、以下を含む、ライゲーションに適切なプローブが提供される：５’末端、３’末端、標的特異的部分、プライマー特異的部分、およびプライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的部分。特定の実施形態において、非酵素学的ライゲーションについての適切な反応基をさらに含むライゲーションに適切なプローブが提供される。
【００２４】
サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するためのキットがまた、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の少なくとも１つの標的配列を検出するためのキットを提供し、このキットは、検出されるべき各標的配列についての少なくとも１つのプローブセットおよび必要に応じてライゲーション因子を備える。各プローブセットは、（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ、および（ｂ）標的特異的部分および３’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第２のプローブを含む。各セットにおける第１および第２のプローブは、相補的な標的配列上で、お互いに隣接してハイブリダイズする場合に、共にライゲーションに適している。各プローブセットにおける少なくとも１つのプローブは、プライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的部分をさらに含む。
【００２５】
他の実施形態において、ヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼのセットをさらに備えるキットが提供される。このプライマーセットは、（ｉ）プローブの３’プライマー特異的部分に相補的な少なくとも１つのプライマーおよび必要に応じて（ｉｉ）プローブの５’プライマー特異的部分の配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む。このプライマーセットの少なくとも１つのプライマーはさらに、レポーター基を含む。
【００２６】
方法およびキットの他の実施形態において、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼであり、これには、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ、Ｐｗｏ、ＵＩＴｍａ、およびＴｔｈポリメラーゼおよび酵素学的に活性なこれらの変異体ならびに改変体が挙げられるがこれらに限定されない。これらのポリメラーゼの記載は、とりわけ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅ−ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｙｒ１９９８／ｊａｎ／ｐｒｏｆｉｌｅ１　９８０１０５．ｈｔｍｌにおいて見出され得る。
【００２７】
特定の実施形態において、ライゲーション因子は、バクテリオファージＴ４またはＥ．ｃｏｌｉリガーゼを含むがこれらに限定されない、リガーゼである。他の実施形態において、このリガーゼは、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、およびＴｈｔリガーゼを含むがこれらに限定されない、熱耐性リガーゼである。当業者は、熱安定性または超熱安定性の原核生物、真核生物、または考古学的生物（ａｒｃｈａｅｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）から単離されたものを含む、多数の他のポリメラーゼおよびリガーゼのいずれかが使用され得ることを理解する。本発明の方法およびキットのなお他の実施形態において、ライゲーション因子は、「活性化」剤または還元剤である。
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のためのみであって、記載される内容を限定するとして解釈されない。本願において引用される全ての参考文献は、あたかも各参考文献が参考として詳細にそして個々に援用されるように、同程度に任意の目的のために参考として明確に援用される。同様に、配列表（明細書と共に最初に出願された）は、参考として援用される。
【００２９】
（定義）
用語「ヌクレオシド」は、１’位のペントースに結合されている、プリン、デアザプリン、またはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンなど）を含む化合物をいう。ヌクレオシド塩基が、プリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースは、プリンまたはデアザプリンの９位の核酸塩基に結合され、そして核酸塩基がピリミジンである場合、ペントースは、ピリミジンの１位の核酸塩基に結合される（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２））。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、ここで、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合した水酸基である。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む化合物のセットをいう。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」は、このようなポリマーのアナログ（二本鎖および一本鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−芳香族形態など）を含むヌクレオチドモノマーのポリマーを意味する。モノマーは、「ヌクレオチド間結合」（例えば、リン酸ジエステル結合）によって結合され、ここで、本明細書中で使用される場合、用語「リン酸ジエステル結合」は、このような対イオンが存在する場合、関連対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）を含む、リン酸ジエステル結合またはそのリン酸アナログを含む結合をいう。ポリヌクレオチドが、文字の配列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）によって示される場合はいつでも、他に示されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ５’から３’で存在すること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、デオキシチミジンを示すことが理解される。オリゴヌクレオチドを合成する方法の記載は、とりわけ、米国特許第４，３７３，０７１号；同第４，４０１，７９６号；同第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；同第４，５００，７０７号；同第４，６６８，７７７号；同第４，９７３，６７９号；同第５，０４７，５２４号；同第５，１３２，４１８号；同第５，１５３，３１９号；および同第５，２６２，５３０号において見出され得る。オリゴヌクレオチドは、任意の長さであり得るが、好ましくは１２〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜３５ヌクレオチド長、そして最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長であり得る。
【００３１】
ヌクレオシドおよび／またはポリヌクレオチドに関する「アナログ」は、改変された核酸塩基部分、改変された五炭糖部分および／または改変されたリン酸部分を有する合成アナログを含み、そして、ポリヌクレオチドの場合、他に一般に記載されるような（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８０）；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３−２９（１９９１）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、改変されたヌクレオチド間結合を有する合成アナログを含む。一般に、改変されたリン酸部分は、リン酸のアナログを含み、ここで、このリン原子は、＋５の酸化状態にあり、そして１以上の酸素原子は、非酸素部分（例えば、硫黄）と共に配置される。例示的なリン酸アナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニオチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、ボロノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されず、対イオンが存在する場合には、対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）と結合したものを含む。例示的な改変された核酸塩基部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンなどのアナログ。特に好ましい核酸塩基アナログは、Ｓｕｌｆｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬから入手可能なイソ−Ｃおよびイソ−Ｇ核酸塩基アナログ（例えば、Ｂｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号）、またはＬＮＡアナログ（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　５４：３６０７−３０（１９９８））である。例示的な改変された五炭糖部分としては、２’−改変または３’−改変が挙げられるが、これらに限定されず、ここで、この２’−位または３’−位は、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリールオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、ブロモなどである。改変されたヌクレオチド間結合としては、リン酸アナログ、アキラルかつ非荷電のサブユニット間結合を有するアナログ（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍ、５２：４２０２（１９８７））、そしてアキラルなサブユニット間結合を有する非荷電のモルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号）が挙げられる。好ましいヌクレオチド間結合アナログとしては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリデート、アセタールおよびポリアミド結合複素環が挙げられる。従来の糖およびヌクレオチド間結合が２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されている、特に好ましいクラスのポリヌクレオチドアナログは、ＰＮＡである（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７−１５００（１９９１）；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１８９５−１８９７（１９９２））。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「レポーター基」は、任意のタグ、標識または同定可能な部分をいう。当業者は、多くのレポーター基が本発明において試用され得ることを理解する。例えば、レポーター基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：蛍光団、放射性同位体、色素原、酵素、抗原、重金属、色素、磁性プローブ、燐光基、化学発光基および電気化学的検出部分。レポーター基はまた、多要素の間接レポーター系（例えば、ビオチン／アビジン、抗体／抗原、リガンド／レセプター、酵素／基質など）の要素を含み、ここで、この要素は、検出可能なシグナルをもたらすために、系の他の要素と相互作用する。１つの例示的な多要素レポーターシステムは、プライマーに付着したビオチンレポーター基および蛍光標識と結合体化したアビジンを含む。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにレポーター基を付着させる方法についての詳細なプロトコールは、とりわけ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９６）およびＳ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ（２０００）において見出され得る。
【００３３】
本発明に従う「標的」または「標的配列」は、特定の核酸配列、検出されるべき配列の存在または非存在を含む。当業者は、標的配列が一般には一本鎖分子として記載されるが、二重鎖分子の反対の鎖が標的としてまた使用され得る相補的配列を含むことを理解する。特定の実施形態において、標的配列は、上流または５’領域、下流または３’領域、および上流領域と下流領域との間に位置する「中心的なヌクレオチド」を含む（例えば、図１を参照のこと）。中心的なヌクレオチドは、プローブセットによって検出されるヌクレオチドであり、そして、例えば、限定ではなく、多対立遺伝子標的遺伝子座において単一ヌクレオチド多型を示し得る。
【００３４】
（試薬）
本発明に従うプローブは、選択された標的配列上の相補的な領域に、配列特異的な様式でハイブリダイズするように設計される、標的特異的部分を含むオリゴヌクレオチドである。（例えば、図１を参照のこと）。プローブはさらに、プライマー特異的部分およびアドレス可能な支持体特異的部分を含み得る。
【００３５】
プローブセットの少なくとも１つのプローブにおいて、このアドレス可能な支持体特異的部分は、標的特異的部分とプライマー特異的部分との間に位置する（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。このアドレス可能な支持体特異的部分は、標的特異的部分またはプライマー特異的部分、あるいはこれらの両方と重複し得る。プローブのアドレス可能な支持体特異的部分は、アドレス可能な支持体上に位置する捕捉オリゴヌクレオチド配列の一部と同じかまたは相補的な配列を含む。あるいは、プローブのアドレス可能な支持体特異的部分は、移動性検出プロセス（例えば、限定でなく、電気泳動）に起因して、特定の移動性アドレスでの位置に基づいてライゲーション産物または増幅産物の検出を可能にする、移動性変更因子を含む。１つのバリエーションにおいて、各アドレス可能な支持体特異的部分は、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分に選択的に結合するタグ相補体、および移動性依存的な分析技術（例えば、電気泳動については、１９９９年３月１５日に出願された米国特許出願番号０９／５２２，６４０を参照のこと）において特定の移動性をもたらすための尾部を含む、特定の移動性変更因子に対して、相補的である。好ましくは、プローブのアドレス可能な支持体特異的部分は、標的配列にもプライマー配列にも相補的でない。
【００３６】
プローブの配列特異的部分は、プライマーおよび標的における相補的な配列との特異的なアニーリングを可能にするために十分な長さのものである。アドレス可能な支持体特異的部分および標的特異的部分の好ましい長さは、１２〜３５ヌクレオチドである。配列特異的なアニーリングを提供する、プローブ設計の詳細な記載は、とりわけ、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、１９９５、ならびにＫｗｏｋら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５、１９９０）において見出され得る。
【００３７】
本発明に従うプローブセットは、同じ標的配列に隣接してハイブリダイズする少なくとも１つの第一のプローブおよび少なくとも１つの第二のプローブを含む。各プローブセットの第一のプローブは、標的配列の下流領域に、配列特異的な様式でハイブリダイズするように設計される（例えば、図１のプローブＡを参照のこと）。このプローブセットの第二のプローブは、標的配列の上流領域に、配列特異的な様式でハイブリダイズするように設計される（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。プローブの配列特異的部分は、必要に応じて、標的およびプライマー中の相補的な配列との特異的なアニーリングを可能にするために十分な長さのものである。本発明の特定の実施形態において、プローブセットの少なくとも１つの第一のプローブおよび少なくとも１つの第二のプローブの両方はさらに、アドレス可能な支持体特異的部分を含む。好ましくは、これらのアドレス可能な支持体特異的部分は、互いに相補的でない。
【００３８】
適切な条件下で、隣接してハイブリダイズするプローブは一緒にライゲーションされてライゲーション産物を形成し得るが、ただし、これらは、適切な反応性基（例えば、限定ではなく、遊離３’−ヒドロキシル基または５’−リン酸基）を含む。いくつかのプローブセットは、１以上の第一のプローブまたは１以上の第二のプローブを含んで、１以上のヌクレオチドが異なる標的配列間の配列識別を可能にし得る（例えば、図２を参照のこと）。
【００３９】
本発明の特定の実施形態に従って、標的特異的プローブセットは、第一のプローブの標的特異的部分が下流の標的領域にハイブリダイズするように設計され（例えば、図１のプローブＡを参照のこと）、そして第二のプローブの標的特異的部分が上流の標的領域にハイブリダイズするように設計される（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。中心的なヌクレオチドに相補的なヌクレオチド塩基である、「中心的な相補体」は、標的特異的プローブセットの第一のプローブまたは第二のプローブのいずれかの遠位末端に存在する（例えば、図１のＡの３’末端を参照のこと）。
【００４０】
このプローブセットの第一および第二のプローブが、標的領域の適切な上流および下流にハイブリダイズし、そして中心的な相補体が標的配列上の中心的なヌクレオチドと塩基対形成する場合、ハイブリダイズした第一のプローブおよび第二のプローブは、一緒にライゲーションされてライゲーション産物を形成し得る（例えば、図２（ｂ）〜（ｃ）を参照のこと）。しかし、中心的なヌクレオチドでミスマッチした塩基は、両方のプローブがそれぞれの標的領域に別なやり方で完全にハイブリダイズする場合にさえ、ライゲーションを妨害する。従って、単一ヌクレオチド程少しだけ異なる、高度に関連する配列は、識別され得る。
【００４１】
例えば、特定の実施形態に従って、以下のように、二対立遺伝子遺伝子座の２つの潜在的な対立遺伝子を識別し得る。プライマー特異的部分およびこれらの中心的な相補体において異なる２つの第一のプローブ（例えば、図２（ａ）のプローブＡおよびＢを参照のこと）、１つの第二のプローブ（例えば、図２（ａ）のプローブＺを参照のこと）を含むプローブセット、ならびに標的を含むサンプルを組み合わせ得る。３つ全てのプローブが、適切な条件下で標的配列とハイブリダイズする（例えば、図２（ｂ）を参照のこと）。しかし、ハイブリダイズした中心的な相補体を有する第一のプローブのみが、ハイブリダイズした第二のプローブとライゲーションされる（例えば、図２（ｃ）を参照のこと）。従って、サンプル中に１つの対立遺伝子のみが存在する場合、その標的についてのライゲーション産物が１つだけ生成される（例えば、図２（ｄ）のライゲーション産物Ａ−Ｚを参照のこと）。両方のライゲーション産物は、異型接合体の個体由来のサンプルにおいて形成される。
【００４２】
さらに、特定の実施形態において、プローブセットは第一または第二のプローブの末端で中心的な相補体を含まない。むしろ、標的ヌクレオチドまたは検出されるべきヌクレオチドは、５’標的領域または３’標的領域のいずれかの内に位置する。それぞれの標的領域に完全に相補的な標的特異的部分を有するプローブは、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。対照的に、標的特異的部分において１以上のミスマッチ塩基を有するプローブは、それぞれの標的領域にハイブリダイズしない。第一のプローブおよび第二のプローブの両方は、ライゲーション産物が生成されるように、標的にハイブリダイズしなければならない。検出されるべきヌクレオチドは、中心的または内部の両方であり得る。
【００４３】
特定の実施形態において、プローブセットの第一のプローブおよび第二のプローブは、類似の融点（Ｔｍ）を有するように設計される。プローブが中心的な相補体を含む場合、好ましくは、探索される標的の中心的なヌクレオチドの中心的な相補体を含むプローブについてのＴｍは、このプローブセットの中心的な相補体を含まない他のプローブよりも、約４〜６℃低い。中心的な相補体を含むプローブはまた、好ましくは、ライゲーション温度に近いＴｍを有するように設計される。従って、ミスマッチヌクレオチドを有するプローブは、ライゲーション温度で、より容易に標的から乖離する。従って、このライゲーション温度は、例えば、標的中の複数の潜在的な対立遺伝子の間を識別するための別の方法を提供する。
【００４４】
本発明に従うプライマーは、プローブ、ライゲーション産物、または増幅産物のプライマー特異的部分に、配列特異的な様式でハイブリダイズするように設計され、そして増幅反応のためのプライマーとして働くオリゴヌクレオチドをいう。
【００４５】
配列特異的なプライマーおよびプローブを設計するための基準は、当業者に周知である。配列特異的なアニーリングを提供するプライマー設計の詳細な記載は、とりわけ、ＤｉｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、１９９５、ならびにＫｗｏｋら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１８：９９９−１００５、１９９０）において見出され得る。プライマーの配列特異的部分は、必要に応じて、ライゲーション産物および増幅産物中の相補的な配列に特異的にアニーリングすることを可能にするために十分な長さのものである。
【００４６】
特定の実施形態に従って、本発明に従うプライマーセットは、少なくとも１つの第一のプライマーおよび少なくとも１つの第二のプライマーを含む（例えば、図３（ｄ）〜（ｇ）を参照のこと）。プライマーセットの第一のプライマーは、配列特異的な様式で、ライゲーション産物または増幅産物の５’プライマー特異的部分の相補体とハイブリダイズするように設計される（例えば、図３（ｇ）のプライマーＰＡを参照のこと）。このプライマーセットの第二のプライマーは、配列特異的な様式で、同じライゲーション産物または増幅産物の３’プライマー特異的部分の相補体とハイブリダイズするように設計される（例えば、図３（ｄ）および（ｇ）のプライマーＰＺを参照のこと）。特定の実施形態において、このプライマーセットの少なくとも１つのプライマーは、レポーター基をさらに含む。好ましいレポーター基は、プライマーのヌクレオチドに付着した蛍光色素である（例えば、Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９２）を参照のこと）。好ましくは、このレポーター基は、配列特異的なハイブリダイゼーションまたは増幅を妨害しないような方法でプライマーに付着される。
【００４７】
本発明に従うライゲーション因子は、任意の数の酵素的薬剤または化学的（すなわち、非化学的）薬剤を含み得る。例えば、リガーゼは、適切な条件下で、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはハイブリッド中の隣接ヌクレオチドの３’−ＯＨおよび５’−リン酸の間のリン酸ジエステル結合を形成する、酵素的ライゲーション因子である。温度感受性リガーゼとしては、バクテリオファージＴ４リガーゼおよびＥ．Ｃｏｌｉリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。温度安定性リガーゼとしては、Ｔａｑリガーゼ、ＴｔｈリガーゼおよびＰｆｕリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。温度安定性リガーゼは、好熱生物または超好熱生物から獲得され得る。
【００４８】
化学的ライゲーション因子としては、限定でなく、活性化剤、濃縮剤および還元剤（例えば、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および紫外線光）が挙げられる。ライゲーション因子非存在下での自己ライゲーション、すなわち、自然ライゲーションはまた、本発明の範囲内である。化学的ライゲーション法についての詳細なプロトコールおよび適切な反応性基の記載は、とりわけ、Ｘｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２７：８７５−８１（１９９９）；ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９（１９９４）；ＫａｎａｙａおよびＹａｍａｇａｔａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：７４２３−３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅおよびＤａｒｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：３００５−０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓおよびｖｏｎ　Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ　３６９：２２１−２４（１９９４）；ＬｉｕおよびＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：３３００−０４（１９９９）；ＷａｎｇおよびＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３（１９９４）；Ｐｕｒｍａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９（１９９２）；ＡｓｈｌｅｙおよびＫｕｓｈｌａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：２９２７−３３（１９９１）；ＣｈｕおよびＯｒｇｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１（１９８８）；Ｓｏｋｏｌｏｖａら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２３２：１５３−５５（１９８８）；ＮａｙｌｏｒおよびＧｉｌｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５：２７２２−２８（１９６６）；ならびに米国特許第５，４７２，９３０号において見出され得る。
【００４９】
本発明に従う支持体またはアドレス可能な支持体は、マイクロアレイ、マイクロタイタープレート、膜、ビーズ（限定ではなく、被覆粒子または非被覆粒子（磁性および常磁性材料、ポリアクリルアミド、多糖、プラスチックなどを含む）を含む）のような支持体を含み、これらはさらに、空間的にアドレス可能なオリゴヌクレオチド捕捉配列、特定のリガンドなどを結合または固定化したものを含む。
【００５０】
このような支持体は、広範な種々の幾何学および構造を有し得、そして多数の異なる公知の製造技術のうちの任意の１つを使用して製造され得る。例示的な製造技術としては、インサイチュ合成技術（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ米国特許第５，４３６，３２７号および関連特許）；光指向性インサイチュ合成技術（例えば、Ｆｏｄｏｒら、米国特許第５，７４４，３０５号および関連特許）；ロボットスポッティング技術（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１：１５−１９（１９９９）、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号、Ｃａｎｔｏｒ、米国特許第５，６３１，１３４号、もしくはＤｒｍａｎａｃ、米国特許第６，０２５，１３６号）；またはそれに付着したオリゴヌクレオチドを有するビーズのアレイ（例えば、Ｗａｌｔ、米国特許第６，０２３，５４０号）が挙げられるが、これらに限定されない。支持体を用いて使用されるハイブリダイゼーションプロセスを実施するために使用される方法は、周知であり、そして支持体結合捕捉核酸および溶液中の核酸の性質に依存して異なる（例えば、Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１：２５−３２（１９９９）；ＢｒｏｗｎおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１：３３−３７（１９９９））。
【００５１】
（方法）
本発明と共に使用するための標的核酸配列は、生きた生物、またはかつて生きていた生物（原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルスが挙げられるがこれらに限定されない）のいずれかに由来し得る。この標的核酸配列は、細胞核に由来し得るか（例えば、ゲノムＤＮＡ）、または核外核酸（例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸、ウイルスＲＮＡなど）であり得る。この標的核酸がＲＮＡである場合、この標的核酸配列は、最初に、ｃＤＮＡに逆転写され得る。さらに、この標的核酸配列は、二本鎖形態または一本鎖形態で存在し得る。
【００５２】
種々の方法が、本発明の組成物および方法と共に使用するための標的核酸配列を獲得するために利用可能である。この標的核酸配列が生物学的マトリックスからの単離を介して獲得される場合、好ましい単離技術は、以下を包含する：（１）例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬を使用する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、第２章、第Ｉ節、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３））、好ましくは、自動化ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能なＭｏｄｅｌ　３４１　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を使用する、エタノール沈殿の前の有機抽出；（２）定常期吸着法（例えば、Ｂｏｏｍら、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１０（４）：５０６−５１３（１９９１））；ならびに（３）塩誘導ＤＮＡ沈殿法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６（３）：９−１０（１９８８））、このような沈殿法は、代表的に、「塩析」法といわれている。必要に応じて、上記の単離方法の各々の後に、サンプル由来の所望でないタンパク質を排除するための酵素消化工程が続く（例えば、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼを用いた消化）。
【００５３】
本発明に従うライゲーションは、任意の酵素的プロセスまたは化学的プロセスを含み、ここで、ヌクレオチド間結合は、テンプレートに隣接してハイブリダイズされる核酸配列の反対の末端の間で形成される。従って、アニーリングした核酸配列の反対の末端は、ライゲーションに適切であるはずである（ライゲーションに対する適切性は、使用されるライゲーション方法の関数である）。ヌクレオチド間結合は、リン酸ジエステル結合の形成を含み得るが、これに限定されない。このような結合の形成は、限定ではなく、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼ（例えば、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕｑｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）リガーゼ、またはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）リガーゼ）によって酵素的に作製されるものを含み得る。他のヌクレオチド間結合は、限定ではなく、適切な反応性基の間の（例えば、α−ハロアシル基と、チオホスホリルアセチルアミノ基を形成するための、ホスホチオエート基との間の、５’−ホスホロチオエステル結合、およびピロホスフェート結合を形成するための、ホスホロチオエート基、トシラート基、またはヨード基との間の）共有結合の形成を含む。
【００５４】
化学的ライゲーションは、適切な条件下で、例えば、自己ライゲーションによって自然に生じ得る。あるいは、「活性化」剤または還元剤が使用され得る。活性化剤および還元剤の例としては、限定ではなく、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および紫外線光が挙げられる。
【００５５】
ライゲーションは一般に、少なくとも１サイクルのライゲーション、すなわち、以下の一連の手順を含む：第一のプローブおよび第二のプローブの標的特異的部分にハイブリダイズする工程（これらのプローブは、それぞれの相補的な標的領域に対するライゲーションのために適切である）；第一のプローブの３’末端を、第二のプローブの５’末端にライゲーションさせて、ライゲーション産物を形成する工程；ならびに核酸二重鎖を変性させて、ライゲーション産物を標的鎖から分離させる工程。このサイクルは、反復されてもよいし、されなくてもよい。例えば、限定ではなく、ライゲーション反応を熱サイクルさせることによって、ライゲーション産物の量は、直線的に増加する。
【００５６】
本発明の範囲内であるものはまた、ライゲーション技術（例えば、ギャップ−充填（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）ライゲーション（限定ではなく、ギャップ−充填ＯＬＡおよびＬＣＲを含む）、架橋オリゴヌクレオチドライゲーションおよび補正ライゲーション）である。これらの技術の記載は、とりわけ、米国特許第５，１８５，２４３号、公開欧州特許出願ＥＰ　３２０３０８および同ＥＰ　４３９１８２、ならびにＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０１０６９において見出され得る。
【００５７】
本発明に関して使用される場合、「ライゲーションのために適切」とは、少なくとも１つの第一のプローブおよび少なくとも１つの第二のプローブをいい、これらの各々は、適切な反応性基を含む。例示的な反応性基としては、第一のプローブの３’末端の遊離ヒドロキシル基、および第二のプローブの５’末端の遊離リン酸基、ホスホロチオエートおよびトシラートまたはヨード、エステルおよびヒドラジン、ＲＣ（Ｏ）Ｓ−、ハロアルキル、ＲＣＨ２Ｓおよびα−ハロアシル、チオホスホリルおよびブロモアセトアミド基、ならびにＳ−ピバロイルオキシメチル−４−チオチミジンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、好ましい実施形態において、第一および第二のプローブは、標的にハイブリダイズして、その結果、第一のプローブの３’末端および第二のプローブの５’末端は、直接隣接してライゲーションを可能にする。
【００５８】
本発明に従うライゲーション産物を精製する工程は、少なくとも１サイクルのライゲーション後の、ライゲーション反応混合物由来の少なくともいくつかの未ライゲーションプローブ、標的ＤＮＡ、酵素または修飾剤を除去する任意のプロセスを含む。このようなプロセスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分子量／サイズ排除プロセス（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは透析）、配列特異的なハイブリダイゼーションベースの引き抜き（ｐｕｌｌｏｕｔ）方法、親和性捕捉技術、沈殿、吸着または他の核酸精製技術。当業者は、増幅の前にライゲーション産物を精製する工程がライゲーション産物を増幅するために必要なプライマーの量を減少させ、従って、標的配列の検出のコストを減少させることを理解する。また、増幅の前にライゲーション産物を精製する工程は、増幅の間の潜在的な副反応を減少させ、そしてハイブリダイゼーションの間の未ライゲーションプローブからの競合を減少させる。
【００５９】
本発明に従うハイブリダイゼーションベースの引き抜き（ＨＢＰ）は、１つのプローブの少なくとも一部、好ましくはプライマー特異的部分に対する、ヌクレオチド配列相補体が、固体または粒子的な引き抜き支持体に結合または固定化されるプロセスを含む（例えば、１９９７年６月１２日に出願された、Ｏ’Ｎｅｉｌｌらに対する米国特許出願番号０８／８７３，４３７を参照のこと）。ライゲーション産物、標的配列、および未ライゲーションプローブならびに緩衝剤成分を含むライゲーション反応混合物は、この引き抜き支持体に曝露される。適切な条件下で、このライゲーション産物は、支持体結合配列とハイブリダイズする。ライゲーション反応混合物の未結合成分は、除去され、引き抜き支持体上の配列に相補的な配列を含まないライゲーション反応混合物からライゲーション産物を精製する。続いて、支持体からライゲーション産物を精製し、そして第一の増幅反応混合物を形成するために、少なくとも１つのプライマーセットと組み合わせ得る。当業者は、引き抜き支持体上の異なる相補的な配列を使用するＨＢＰのさらなるサイクルが、全て、または実質的に全ての未ライゲーションプローブを除去し、ライゲーション産物をさらに精製することを理解する。
【００６０】
本発明に従う増幅は、直線的、または指数関数的にかのいずれかで核酸配列を増幅するための、広範な技術を包含する。このような技術の例としては、ＰＣＲまたはプライマー伸長工程を使用する任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。増幅方法は、熱サイクル工程を含み得るか、または等温で実行され得る。
【００６１】
増幅方法は、一般に、少なくとも１サイクルの増幅、すなわち、以下の一連の手順を含む：ライゲーション産物またはテンプレートのプライマー特異的部分にプライマーをハイブリダイズさせる工程；ポリメラーゼを使用してテンプレート依存的な様式でヌクレオチド鎖を合成する工程；および新たに形成された核酸二重鎖を変性させてこれらの鎖を分離させる工程。このサイクルは、反復されてもよいし、されなくてもよい。
【００６２】
本発明に従うプライマー伸長は、増幅プロセスであり、このプロセスは、温度依存的なポリメラーゼを使用して、テンプレートにアニーリングしたプライマーを５’から３’の方向で伸長させる工程を包含する。特定の実施形態に従って、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度およびヌクレオチド三リン酸（そのアナログおよび誘導体を含む）を用いて、温度依存的なポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの３’末端で開始するテンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを取り込んで、相補鎖を生成する。
【００６３】
本発明に従って、検出する工程は、アドレス可能な支持体にハイブリダイズするまたは特定の移動性アドレスを占める特定の増幅されたライゲーション産物の存在または非存在を同定するため、ためのプロセスを含む。例えば、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分またはその相補体が、アドレス可能な支持体の捕捉配列に特異的にハイブリダイズする場合、ハイブリダイズされた配列は、レポーター基が、存在するという条件で検出され得る。典型的には、レポーター基は、検出工程において検出可能な、または同定可能である発光を提供する。使用される検出プロセスの型は、検出されるレポーター基の性質に依存する。蛍光レポーター基と組み合わせて使用される特定の好ましい検出工程における蛍光レポーター基は、レーザー励起蛍光検出を使用して検出される。
【００６４】
本発明に従うハイブリダイゼーションのための一本鎖配列を作製する工程は、アドレス可能な支持体における一本鎖捕捉配列とのハイブリダイゼーションを容易にするために、一本鎖の核酸分子または分子内の領域を作製するためのプロセスを含む。ハイブリダイゼーションのための一本鎖配列を作製するためのプロセスは、加熱または化学的変性剤を使用すること；二本鎖核酸分子の限定エキソヌクレアーゼ消化；非対称性ＰＣＲ；および単一プライマー増幅またはプライマー伸長によって二本鎖核酸配列を変性すること（これらは、限定しない）を含む。このようなプロセスの詳細な説明は、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９５および補遺），Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見出され得る。
【００６５】
本発明に従う非対称性ＰＣＲは、過剰の１プライマー（プライマーセットにおける他のプライマーに関連して）を用いる増幅反応混合物を含む。結果的に、ライゲーション産物が、増幅される場合、過剰の１つの鎖の増幅産物（その相補体に関連して）が、産生される。次いで、一本鎖増幅産物は、支持体結合捕捉オリゴヌクレオチドに直接的にハイブリダイズされ得る。
【００６６】
本発明に従う非対称性再増幅は、第２の増幅プロセスにおける一本鎖増幅産物を作製する工程を包含する。一般に、第１の増幅プロセスの二本鎖増幅産物は、非対称性再増幅プロセスにおける増幅標的として役立つ。しかし、第１の増幅プロセスとは異なり、第２の増幅反応混合物は、プライマーセットの少なくとも１つの第１のプライマーのみか、または少なくとも１つの第２のプライマーのみを含む（両方ではない）。第２の増幅反応混合物おけるプライマーは、一本鎖の第２の増幅産物が、標識されるようにレポーター基を含み、そしてアドレス可能な支持体における捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする場合または特定の移動性アドレスを占める場合、検出され得る。
【００６７】
本発明に従って分子量または長さまたは移動性によって分離する工程は、広範囲の意味において使用される。２以上の核酸配列の混合物を、特定の配列の移動性、分子量またはヌクレオチド長に基づいて分離することを可能する任意の方法は、本発明の範囲内にある。例示的な方法としては、限定しないが、電気泳動、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む質量分析およびゲル濾過が挙げられる。
【００６８】
（本発明の例示的な実施形態）
本発明は、ライゲーションおよび増幅反応の組み合わせを使用して、サンプル中の標的核酸配列を検出するための方法、試薬およびキットに関する。ここで（ｉ）増幅された産物の一本鎖のアドレス可能な支持体特異的領域が、アドレス可能な支持体とのハイブリダイゼーションによって検出されるか、または（ｉｉ）増幅産物は、特定の移動性アドレスにおいて検出される。
【００６９】
特定の実施形態において、検出される各標的核酸配列に関して、少なくとも１つの第１のプローブおよび少なくとも１つの第２のプローブを含むプローブセットは、サンプルおよび必要に応じて、ライゲーション因子を合わせて、ライゲーション反応混合物を形成する。各プローブセットにおける第１および第２のプローブは、標的配列の中心的なヌクレオチドに直に隣接する配列に相補的であるように設計される（例えば、図３（ａ）のプローブＡ、ＢおよびＺを参照のこと）。プローブセットの少なくとも１つの第１のプローブまたは少なくとも１つの第２のプローブのいずれか（両方ではない）は、中心的な相補体を含む（例えば、図３（ａ）のプローブＡを参照のこと）。標的配列が、サンプル中に存在する場合、第１および第２のプローブは、適切な条件下において、標的における隣接領域にハイブリダイズする（例えば、図３（ｂ）を参照のこと）。中心的な相補体が、適切なライゲーション因子の存在下で塩基対である場合、２つの隣接的にハイブリダイズしたプローブは、一緒にライゲーションして、ライゲーション産物を形成する（例えば、図Ｚ（ｃ）を参照のこと）。
【００７０】
次いで、ライゲーション混合物（適切な塩、緩衝液およびヌクレオチド三リン酸中の）は、少なくとも１つのプライマーセットおよびポリメラーゼと合わせられ、第１の増幅反応混合物を形成する（例えば、図３（ｄ）を参照のこと）。第１の増幅サイクルにおいて、ライゲーション産物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む第２のプライマーは、ライゲーション産物とハイブリダイズし、そしてテンプレート依存様式において伸長され、ライゲーション産物およびその相補体を含む二本鎖分子を作製する（例えば、図３（ｄ）−（ｅ）を参照のこと）。ライゲーション産物が、二本鎖分子として存在する場合、次の増幅サイクルは、この分子を指数関数的に増幅し得る（例えば、図３（ｄ）−（ｈ）を参照のこと）。図３において、例えば、プライマーＰＡ＊およびＰＢ＊は、異なるレポーター基を含む。従って、これらのプライマーの取り込みによって生じた増幅産物は、もとの標的配列に含まれる特定の中心的なヌクレオチドに特異的なレセプター基を含む。本発明の特定の実施形態は、第２の増幅手順をさらに含む。
【００７１】
少なくとも１つの増幅サイクルに従って、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分は、アドレス可能な支持体のおける捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされる（例えば、図３（ｉ）−（ｊ）を参照こと）。サンプル中の特定の標的配列の存在が、支持体におけるハイブリダイズされた増幅産物を検出することによって決定される（例えば、図３（ｋ）を参照のこと）。図３に示されるように、例えば、特定の実施形態に従って、支持体において検出されるレポーター基に依存する特定の中心的なヌクレオチドの存在は、検出され得る。
【００７２】
増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分は、アドレス可能な支持体において捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするために、典型的には、一本鎖である。特定の実施形態において、一本鎖増幅産物は、例えば、限定されないが、非称性ＰＣＲ、プライマー伸長および非対称再増幅によって合成される。
【００７３】
非対称性ＰＣＲの例示的な実施形態において、増幅反応混合物は、各プライマーセットに関して、プライマーセットの少なくとも１つの第１のプライマーかまたは少なくとも１つの第２のプライマーのいずれか（両方ではない）が、過剰に添加されることを除いて、以下の実施例１Ｄに記載されるように調製される。従って、過剰なプライマー対限定プライマー比は、それぞれ約１００：１である。プライマーの理想的な量は、経験的に決定されるべきであるが、一般的には、限定プライマーについて約０．２〜１ｐｍｏｌの範囲であり、そして過度のプライマーに対して１０〜３０ｐｍｏｌの範囲である。経験的に、プライマーセットにおける１つのプライマーの濃度は、典型的には、１００μｌの増幅反応混合物あたり１ｐｍｏｌ以下で維持される。
【００７４】
両方のプライマーは、最初、ＰＣＲ反応の最初に、実質的に過度に存在しているので、両方の鎖は、指数関数的に増幅される。しかし、増幅サイクルの全てのサイクルを完了する前に、限定プライマーは、消費される。増幅の次のサイクル間、１つの鎖のみが、増幅される。
【００７５】
約４０〜４５サイクルの増幅が実施された後、増幅プロセスは、長い伸長工程を用いて完了する。限定プライマーは、典型的には、２５回のサイクルの増幅によって消費される。次のサイクルの増幅の間、増幅産物の１つの鎖のみが、プライマーセットの１つのプライマーのみの存在に起因して生成される。増幅プロセスの完了において、反応混合物は、アドレス可能な支持体における捕捉オリゴヌクレオチドに直接的にハイブリダイズし得る、相当な量の一本鎖増幅産物を含む。
【００７６】
１つの例示的な非対称性再増幅プロトコルにおいて、以下の実施例１Ｄからの二本鎖増幅産物を含む、風乾した第１の増幅混合物は、３０μｌの０．１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁される。第２の増幅反応混合物は、９μｌの滅菌濾過脱イオン水、１８μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および１μｌの１×ＴＥ緩衝液中に懸濁された２０〜４０ｐｍｏｌの少なくとも１つの第１のプライマーかまたは少なくとも１つの第２のプライマーのいずれかと０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ中の２マイクロリットルの再懸濁された増幅反応物を合わせることによって調製される。少なくとも１つの第１のプライマー、少なくとも１つの第２のプライマーいずれかまたはその両方は、標識される。
【００７７】
チューブを、９５℃で１２分間加熱し、次いで、（９４℃で１５秒間、６０℃で１５秒間および７２℃で３０秒間）の１０サイクル、その後（８９℃で１５秒間、５３℃で１５秒間および７２℃で３０秒間）の２５サイクル、次いで６０℃で４５分間サイクルする。次いで、一本鎖増幅産物を含む、第２の増幅反応混合物を、４℃に冷却した。
【００７８】
組み込まれていないＰＣＲプライマーは、以下のように反応混合物から除去される。各３０μｌの増幅反応混合物に、０．３４μｌのグリコゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）、３．０９μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）および２０．６μｌの無水イソプロパノールを添加する。このチューブを、ボルテックスによって混合し、そして室温で１０分間インキュベート後、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　１８　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅにおいて１４、０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離する。
【００７９】
上清を、標識化増幅産物ペレットから除去する。各ペレットを、ボルテックスを用いて５０μｌの７０％のエタノールで洗浄する。この洗浄された増幅産物を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　１８　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅにおいて１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を、除去する。ペレットを、５０μｌの無水エタノールを使用して再び洗浄し、ボルテックスし、そして前のように、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。このペレットを、風乾する。この乾燥したペレットを、ハイブリダイゼーションの前に４℃で保存し得る。
【００８０】
他の実施形態において、二本鎖増幅産物を産生し、そして次に、一本鎖配列に変換する。二本鎖核酸を、一本鎖配列に変換するためのプロセスとしては、限定されないが、熱変性、化学変性、およびエキソヌクレアーゼ消化が挙げられる。一本鎖核酸分子を合成するための詳細なプロトコルまたは二本鎖核酸を一本鎖配列に変換するための詳細なプロトコルは、とりわけ、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５および補遺）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；およびＮｏｖａｇｅｎ　ＳｔｒａｎｄａｓｅＴＭ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｉｎｓｅｔに見出され得る。
【００８１】
しかし、当業者は、一本鎖配列が、二本鎖配列を変性することによって作製される場合、相補的な一本鎖配列は、支持ハイブリダイゼーションプロセスの間、再変性され得ることを理解する。従って、支持体結合化捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖配列の数を減少する。
【００８２】
例示的なヌクレアーゼ消化プロトコルは、以下のようである。以下の実施例１Ｄからの風乾した第１の増幅産物を、１０μｌの滅菌水に再懸濁する。８マイクロリットルの再懸濁した増幅産物を、０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブにおいて１μｌのＳｔｒａｎｄａｓｅ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および１μｌのエキソヌクレアーゼ（５ユニット／μｌ）と合わせる。このチューブを、３７℃で２０分間インキュベートし、そして反応を、さらに７５℃で１０分間加熱することによって止める。ヌクレアーゼ消化混合物は、アドレス可能な支持体における捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズに適する一本鎖または、実質的に一本鎖の第１の増幅産物を含む。
【００８３】
当業者は、エキソヌクレアーゼ（例えば、限定しないが、λエキソヌクレアーゼ）は、５’リン酸化末端から二本鎖分子の１つの鎖を消化することを理解する。従って、第１の増幅産物は、典型的には、ヌクレアーゼ消化のために適切なテンプレートを含む。適切なテンプレートは、適切な場合、リン酸化プライマーを使用して第１の増幅プロセスの間に生成され得る。すなわち、支持体にハイブリダイズする増幅産物の鎖は、５’末端でリン酸化されるプライマーを含まないが、相補鎖は、５’リン酸化プライマーを含む。従って、増幅産物の相補鎖は、エキソヌクレアーゼによって消化され、ハイブリダイゼーションに適する一本鎖増幅産物を生成する。
【００８４】
特定の実施形態に従って、本発明の新規のプローブは、標的特異的部分、アドレス可能な支持体特異的部分およびプライマー特異的部分を含む（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。プローブの標的特異的部分は、標的配列の相補的な領域に特異的にハイブリダイズするように設計される。アドレス可能な支持体特異的部分は、プライマー特異的部分と標的特異的部分の間に位置する（例えば、図１のプローブＺを参照のこと）。好ましくは、プローブのアドレス可能な支持体特異的部分は、標的またはプライマー配列に相補的でない。アドレス可能な支持体特異的部分またはその相補体は、アドレス可能な支持体における固有の捕捉オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにか、または適切な手順（例えば、電気泳動）の間または後で、特定の移動性アドレスに位置するような移動性を有するように設計される。
【００８５】
特定の実施形態において、少なくとも２つの異なるライゲーション産物の５’プライマー特異的部分は、反応混合物中の１つの第１のプライマーの少なくとも一部と同じである配列を含む（図４（ａ）のＰＡを参照のこと）。同様に、反応混合物中の少なくとも２つの異なるライゲーション産物は、１つの第２のプライマーの少なくとも一部に相補的である３’プライマー特異的部分を含む（特定の実施形態において、図４（ａ）のＰＺを参照のこと）。さらに好ましくは、反応混合物中の大部分のライゲーション産物の５’プライマー特異的部分は、少なくとも１つの第１のプライマーと同じである配列を含み、そして反応混合物中の大部分のライゲーション産物の３’プライマー特異的部分は、少なくとも１つの第２のプライマーに相補的である配列を含む（例えば、図４（ｂ）のプライマーＰＡおよびＰＺを参照のこと）。最も好ましくは、反応混合物中の全てのライゲーション産物の５’プライマー特異的部分は、少なくとも１つの第１のプライマーと同じである配列を含み、そして反応混合物中の全てのライゲーション産物の３’プライマー特異的部分は、少なくとも１つの第２のプライマーに相補的である配列を含む（例えば、図４（ｃ）のプライマーＰＡおよびＰＺを参照のこと）。
【００８６】
このようなライゲーション産物は、例えば、限定ではなく、多重反応を使用して、複数の標的配列、または多対立遺伝子遺伝子座おける複数の潜在的な対立遺伝子またはその両方の組み合わせを検出する。特定の実施形態に従って、多重反応は、例えば、限定ではなく、異なる標的配列また対立遺伝子あるいはその両方の組み合わせに対応する固有のアドレス可能な支持体特異的部分をそれぞれが含む、６個のライゲーション産物を含み得る（例えば、図４を参照のこと）。図４（ａ）において、２つのライゲーション産物（Ａ−Ｚ）の５’プライマー特異的部分は、反応混合物中の１つの第１のプライマー（ＰＡ）の少なくとも一部と同じ配列を含む。同じ２つのライゲーション産物の３’プライマー特異的部分は、反応混合物中の１つの第２のプライマーの少なくとも一部に相補的である配列を含む。従って、これらの６個のライゲーション産物を指数関数的に増幅するために、５個のプライマーセット（ＰＡ−ＰＺ、ＰＣ−ＰＸ、ＰＤ−ＰＷ、ＰＥ−ＰＶおよびＰＦ−ＰＵ）を使用する。
【００８７】
図４（ｂ）は、同じ６個のライゲーション産物を示す（大部分のライゲーション産物の５’プライマー特異的部分が、反応混合物中の１つの第１のプライマーの少なくとも一部と同じ配列を含むことを除く）。大部分のライゲーション産物の３’プライマー特異的部分は、反応混合物中の１つの第２のプライマーの少なくとも一部に相補的な配列を含む。これらの６個のライゲーション産物を指数関数的に増幅するために、３つのプライマーセットを使用する（ＰＡ−ＰＺ、ＰＥ−ＰＶおよびＰＦ−ＰＵ）。
【００８８】
図４（ｃ）は、同じ６個のライゲーション産物を示す（全てのライゲーション産物の５’プライマー特異的部分が、反応混合物中の１つの第１のプライマーの少なくとも一部と同じ配列を含むことを除いて）。全てのライゲーション産物の３’プライマー特異的部分は、反応混合物中の１つの第２のプライマーの少なくとも一部に相補的な配列を含む。これらの６個のライゲーション産物を指数関数的に増幅するために、１つのプライマーセットのみが、使用される（ＰＡ−ＰＺ）。
【００８９】
従って、同じプライマーセットは、反応混合物中の少なくとも２つのライゲーション産物のために使用される（例えば、図４（ａ）のプライマーＰＡおよびＰＺを参照のこと）。好ましくは、反応混合物中の大部分のライゲーション産物は、同じプライマーセットを使用する（例えば、図４（ｂ）のプライマーＰＡおよびＰＺを参照のこと）。最も好ましくは、反応混合物中の全てのライゲーション産物は、同じプライマーセットを使用する（例えば、図４（ｃ）のプライマーＰＡおよびＰＺを参照のこと）。
【００９０】
従って、本発明の方法は、反応混合物に添加しなければならない異なるプライマーの数を減らし、標的配列の検出の費用および時間を減少する。例えば、限定ではなく、１００個の標的配列を検出するために設計された多重反応において、１００個の異なるプライマーセットは、特定の従来の方法を使用することを必要とする。本発明の方法は、少なくとも２つの増幅産物および最も好ましくは、全ての増幅産物が、同じプライマー特異的部分を含み得るので、９９個以下の異なるプライマーセット（最も好ましくは、１個のみ）を、必要とする。
【００９１】
限定された数のプライマーのみが、増幅に必要なので、本明細書中で提供される新規な方法は、ゲノムＤＮＡを、直接使用することを可能にし、そしてサンプル中の既知の配列を検出する従来の方法よりも、より費用が効率的であり、そして時間の消費が少ない。限定数のプライマーの使用はまた、増幅効率におけるバリエーションおよびプライマーの交差反応性を減少し得る。
【００９２】
しかし、当業者は、特定の実施形態（限定ではなく、複数の対立遺伝子を検出することを含む）において、ライゲーション反応混合物が、多対立遺伝子標的遺伝子座における各潜在的な対立遺伝子について、１より多い第１のプローブまたは１より多い第２のプローブを含み得ること理解する。好ましくは、これらの方法は、反応混合物における１より多い第１のプライマーまたは１より多い第２のプライマーを使用する。例えば、検出されるべき全ての第１の対立遺伝子に対する１つの第１のプライマー、検出されるべき全ての第２の対立遺伝子に対する異なる第１のプライマー、検出されるべき全ての第３の対立遺伝子に対する別の第１のプライマーなど。
【００９３】
プライマーの数、従って、必要とされる費用および操作の数の減少の有意性は、大量の多対立遺伝子遺伝子座について個体の遺伝的なスクリーニングを実施する場合、容易に明白である。特定の実施形態において、例えば、限定ではなく、３つのプローブセットを使用して個体における３つの二対立遺伝子遺伝子座（例えば、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）の存在を検出するための単純なスクリーニングアッセイを使用し得る。例えば、以下の表１を参照のこと。
【００９４】
【表１】
2004507226.tif 000003
例示の目的のために、３つの各プローブセットのそれぞれは、２つの第１のプローブ（例えば、ＡおよびＢ）ならびに１つの第２のプローブ（Ｚ）を含む。第１のプローブ（ＡおよびＢ）の両方は、同じ上流の標的特異的配列を含むが、中心的な相補体において異なる。しかし、当業者は、プローブは、第１のプローブまたは第２のプローブのいずれかにおいて任意の位置で中心的な相補体を用いて設計され得ることを理解する。さらに、複数の中心的な相補体を含むプローブは、本発明の範囲内にある。
【００９５】
各二対立遺伝子遺伝子座において２つの可能な対立遺伝子座間を区別するために、プローブＡおよびＢは、異なる５’プライマー特異的配列を含む。従って、２つの異なる第１のプライマー（ＰＡおよびＰＢ）は、それぞれプローブＡおよびプローブＢのプライマー特異的部分の相補体にハイブリダイズする。第３のプライマー（ＰＺ）は、プローブＺのプライマー特異的部分にハイブリダイズする。異なる第１のプライマーが、異なるレポーター基を含む場合、このレポーター基を、使用して、対立遺伝子特異的なライゲーション産物間を区別し得る。従って、これらの実施形態において、３つのプローブＡ１、Ｂ１およびＺ１を使用して、２つの可能なＬ１ライゲーション産物を形成する。ここで、Ａ１Ｚ１は、第１のＬ１対立遺伝子のライゲーション産物であり、そしてＢ１Ｚ１は、第２のＬ１対立遺伝子のライゲーション産物である。同様に、プローブＡ２、Ｂ２およびＺ２を、使用して２つの可能なＬ２ライゲーション産物を形成する。プローブＡ２は、プローブＡ１と同じプライマー特異的部分を含み、プローブＢ２のプライマー特異的部分は、プローブＢ１と同じである、以下同様。従って、３つ程の少ないプライマーＰＡ、ＰＢおよびＰＺは、これらの実施形態において使用され得る。これらの実施形態に従って、捕捉オリゴヌクレオチドまたは特定の移動性位置における１のみの標識の検出は、サンプルが、ホモ接合性の個体から得られたことを示す。サンプルが、ヘテロ接合性の個体から得られた場合、両方の標識は、捕捉オリゴヌクレオチドまたは移動性位置において検出される。
【００９６】
これらの実施形態において、従って、標的配列の任意の数を検出するのに必要とされるプローブの数は、検出される標的の数かける標的あたり検出される対立遺伝子の数＋１の産物の積である（すなわち、標的配列の数×［対立遺伝子の数＋１］）。従って、例えば、３つの二対立遺伝子配列を検出するために、９個のプローブを、必要とする（３×［２＋１］）（すなわち、表１に示されるように、（Ａ１、Ｂ１、Ｚ１、Ａ２、Ｂ２、Ｚ２、Ａ３、Ｂ３およびＺ３））。４つの三対立遺伝子配列を検出するために、１６個のプローブを必要とする（４×［３＋１］）、以下同様。
【００９７】
これらの実施形態において、標的配列Ｌ１のライゲーション産物を増幅するために、３つのプライマーは、二対立遺伝子遺伝子座にアドレスするために必要である（それぞれ、ＰＡ、Ａ１の５’プライマー特異的部分に相補的である；ＰＢ、Ｂ１の５’プライマー特異的部分に相補的である；そしてＰＺ、Ｚ１の３’プライマー特異的部分に相補的である）。標的配列Ｌ２のライゲーション産物を増幅するために、特定の従来の方法を使用して、３つのさらなるプライマーを、必要とする（例えば、ＰＡ２、ＰＢ２およびＰＺ２）；同様に、標的配列Ｌ３を増幅するために、なお３つのさらなるプライマーを必要とする（ＰＡ３、ＰＢ３およびＰＺ３）。従って、特定の従来の方法論を使用する個体に潜在的に存在する３つの二対立遺伝子遺伝子座のためのライゲーション産物を増幅することは、９個の（３ｎ、ここでｎ＝３）プライマーを必要とする。
【００９８】
対照的に、本発明の方法は、この例において、３つ程の少ない増幅プライマーまでこの数を効果的に減らし得る。本発明を使用して、同じ５’プライマー特異的配列を含む少なくとも２つの異なるＡプローブを使用し得る。さらに好ましくは、大部分の異なるＡプローブが、同じ５’プライマー特異的配列を含む。最も好ましくは、全ての異なるＡプローブが、同じ５’プライマー特異的配列を含む。同様に、少なくとも２、より好ましくは、大部分、そして最も好ましくは、全ての異なるＢプローブが、同じ５’プライマー特異的配列を含む。最後に、少なくとも２、より好ましくは、大部分そして最も好ましくは、全ての異なるＺプローブが、同じ３つのプライマー特異的配列を含む。従って、１つ程の少ないＡプライマー、１つ程の少ないＢプライマー、および１つ程の少ないＺプライマーを使用して、全てのライゲーション産物（表１中のＰＡ、ＰＢおよびＰＺ）を増幅し得る。
【００９９】
他の実施形態において、異なるアドレス可能な支持体特異的配列を使用して、対立遺伝子特異的なライゲーション産物間を区別し得る。従って、二対立遺伝子について、例えば、限定ではなく、同じ第１の標識化プライマーを使用して、プローブＡまたはプローブＢのいずれかの相補体にハイブリダイズし得る。第２のプライマー（ＰＺ）は、プローブＺのプライマー特異的部分にハイブリダイズする。従って、２つほど少ないプライマーは、これらの実施形態において使用され得る。これらの実施形態に従って、それぞれの捕捉オリゴヌクレオチドまたは移動性位置にハイブリダイズされる単一の標識化増幅産物のみの検出は、サンプルが、ホモ接合性の個体から得られたことを示す。サンプルが、ヘテロ接合性の個体から得られた場合、両方の増幅産物は、それぞれの捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするかまたは、適切な移動性位置において検出される。
【０１００】
本発明に従って、わずか２つまたは３つの「ユニバーサルな」プライマーを使用して、無数のライゲーション産物または増幅産物を増幅し得る。なぜなら、このプローブは、プライマー特異的な部分を共有するが、異なるアドレス可能な支持体特異的部分（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ　ｓｕｐｐｏｒｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｏｒｔｉｏｎ）を含むように設計され得るからである。
【０１０１】
特定の従来の方法を使用して、３つの二重対立遺伝子遺伝子座における全ての可能性のある対立遺伝子を検出するために必要とされる９つのプライマー（例えば、ＰＡ１、ＰＢ１、ＰＺ１、ＰＡ２、ＰＢ２、ＰＺ２、ＰＡ３、ＰＢ３、およびＰＺ３）よりもむしろ、本発明の方法は、わずか３つのプライマー（表１に示されるように、ＰＡ、ＰＢ、およびＰＺ）を使用し得る。可能性のある１００の二重対立遺伝子の遺伝子座を含むサンプルは、特定の従来の検出方法においては２００のプライマーを必要とするが、本方法においては３つのユニバーサルプライマーのみが使用され得る。必要とされる多数の増幅プライマーの数におけるこの劇的な減少は、それぞれのプローブセットにおける少なくとも１つのプローブが、プライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的配列を有することに起因して、可能である。
【０１０２】
特定の実施形態において、複数対立遺伝子の遺伝子座における異なる対立遺伝子は、異なるレポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）を有するプライマーを使用して区別される。例えば、限定しないが、第１の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、ライゲーション産物はプライマー特異的な部分Ａを含む。第２の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、連結産物はプライマー特異的な部分Ｂを含む。特定の実施形態において、プライマーＰＡ（部分Ａに相補的である）は、グリーンレポーター基（ｇｒｅｅｎ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）を含み、一方、プライマーＰＢ（部分Ｂに相補的である）は、レッドレポーター基（ｒｅｄ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）を含む。この２つの対立遺伝子は、アドレス可能な支持体特異的部分を介して、空間的にアドレス可能な部分もしくは可動性の位置で支持体にハイブリダイズする、グリーンレポーター基またはレッドレポーター基のいずれかを検出することによって区別される。グリーンレポーター基およびレッドレポーター基の両方は、個体が二重対立遺伝子標的遺伝子座についてヘテロ接合体である場合、検出される。
【０１０３】
他の実施形態において、複数対立遺伝子の遺伝子座における異なる対立遺伝子は、異なるアドレス可能な支持体特異的部分を有するプローブを使用して区別される。例えば、限定しないが、第１の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、ライゲーション産物は、アドレス可能な支持体特異的部分Ａを含む。第２の対立遺伝子がサンプル中に存在する場合、ライゲーション産物は、アドレス可能な支持体特異的部分Ｂを含む。それぞれのライゲーション産物のための少なくとも１つのプライマーは、レッドレポーター基を含む。２つの対立遺伝子は、２つの空間的にアドレス可能な部分または可動性の位置のうちの１つで支持体とハイブリダイズするレッドレポーター基を検出することによって、区別される。当業者は、複数対立遺伝子の遺伝子座での３つ以上の対立遺伝子がまた、これらの方法を使用して区別され得ることを理解する。
【０１０４】
特定の実施形態において、異なるレポーター基および異なるアドレス可能な支持体特異的配列を組み合わせて、異なる標的および／または異なる対立遺伝子を区別する。
【０１０５】
さらに他の実施形態において、プローブセットにおける、少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブは、異なるレポーター基を含む。
【０１０６】
さらに他の実施形態において、異なる標的および／または異なる対立遺伝子は、支持体上の捕獲オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションよりもむしろ分離技術（例えば、電気泳動、質量分析法またはクロマトグラフィー）を使用する移動度の区別によって検出される。これらの実施形態において、プローブは、識別可能な固有の長さまたは分子量の、アドレス可能な支持体特異的部分を含み得る。あるいは、それぞれのアドレス可能な支持体特異的な部分は、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分に選択的に結合するためのタグ相補体、および移動度依存性の分析技術（例えば、電気泳動（例えば、米国特許出願０９／５２２，６４０、１９９９年３月１５日出願））において特定の移動度をもたらすためのテールを含む、特定の移動性変更因子（ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ）に対して相補的である。従って、この増幅産物は、分子量または分子の長さによって分離されて、個々の増幅配列を区別し得る。特定の分子量または分子の長さのビン（ｂｉｎ）における増幅産物の検出は、サンプル中の標的配列の存在を示す。移動度識別技術の記載は、とりわけ、米国特許第５，４７０，７０５号、同第５，５１４，５４３号、同第５，５８０，７３２号、同第５，６２４，８００号、および５，８０７，６８２号中に見出され得る。
【０１０７】
例示的なプロトコルにおいて、以下の実施例１Ｄの風乾した増幅ペレット（これは、識別可能な固有の分子量の増幅産物を含む）を、緩衝液または脱イオンホルムアミド中に再懸濁する。この再懸濁したサンプルおよび分子量マーカー（例えば、ＧＳ　５００サイズ標準、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、電気泳動プラットフォーム（例えば、ＡＢＩ　ＰｒｉｓｍＴＭ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上にロードし、そして電気泳動する（ＰＯＰ−４ポリマー中、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；５０μｌキャピラリーを使用して１５ｋＶで）。このバンドを検出し、そしてマーカーに対して相対的なその位置を決定する。このバンドを、その相対的な電気泳動移動度に基づいて同定し、サンプルにおけるそれぞれの標的配列の存在を示す。
【０１０８】
あるいは、それぞれのアドレス可能な支持体特異的部分は、移動度依存性の分析技術（例えば、電気泳動）において、その増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分に相補的なタグ相補体および特定の移動度をもたらすためのテールを含む移動性変更因子に相補的な配列を含み、その結果、タグ相補体およびアドレス可能な支持体特異的部分に接触する場合、安定な複合体が形成される（例えば、米国特許出願０９／５２２，６４０（１９９９年３月１５日出願）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、「移動度依存性分析技術」とは、異なる分析物種間で異なる移動速度に基づく分析技術を意味する。例示的な移動度依存性分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析法、沈殿（例えば、勾配遠心分離）、作用場流動分画（ｆｉｅｌｆ−ｆｌｏｗ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、多段抽出技術などが挙げられる。
【０１０９】
本発明の実施形態に従って、好ましいアドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体は、（１）核酸分析方法において代表的に使用される条件（例えば、室温で、緩衝化水溶液）下で安定であり；（２）穏やかな核酸変性条件下で安定であり；そして（３）プローブの標的特異的部分の、標的核酸配列との配列特異的結合に悪い影響を与えない、複合体を形成するべきである。さらに、本発明のアドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体は、複数の異なる増幅産物および結合する移動性変更因子が、アドレス可能な支持体特異的部分、タグ相補体、標的核酸配列およびプローブの標的特異的部分の間で交差相互作用を起こさずに、同じ反応量で存在し得るように、アドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体の識別可能なセットを適合されるべきである。最小限に交差ハイブリダイズするタグ配列のセットを選択するための方法は、他の所で記載されている（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＡｌｂｒｅｃｈｔ、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／４１０１１）。
【０１１０】
好ましい実施形態において、アドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体は、それぞれポリヌクレオチドを含む。好ましいポリヌクレオチドタグ相補体において、このタグ相補体は、例えば、３’−リン酸、３’−アセチル、２’−３’−ジデオキシ、３’−アミノおよび２’−３’−デヒドロのような糖修飾を含むことによって、ポリメラーゼによって伸長不可能になる。
【０１１１】
特に好ましいアドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体対は、従来の合成ポリヌクレオチドであるアドレス可能な支持体特異的部分、およびＰＮＡであるタグ相補体を含む。ＰＮＡタグ相補体がタグと三重鎖構造を形成するように設計される場合、このタグ相補体は、タグとタグ相補体との間の三重鎖結合を容易にするために、「ヒンジ」領域を含み得る。より好ましい実施形態において、アドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体配列は、反復配列を含む。アドレス可能な支持体特異的部分およびタグ相補体におけるこのような反復配列は、その（１）高い結合親和性、（２）高い結合特異性、および（３）高い可溶性に起因して、好ましい。二重鎖形成アドレス可能な支持体特異的部分またはタグ相補体配列として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＣＡＧ）ｎであり、ここで、この３塩基配列は、約１〜１０回反復される（例えば、Ｂｏｆｆａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９２：１９０１〜０５（１９９５）；Ｗｉｔｔｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：７９７３〜７９（１９９７）を参照のこと）。三重鎖形成アドレス可能な支持体特異的部分またはタグ相補体配列として使用するための特に好ましい反復配列は、（ＴＣＣ）ｎである。
【０１１２】
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ分子は、市販の試薬を用いて、市販の自動合成機による周知の方法を使用して合成され得る（例えば、Ｄｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５９：５７６７〜７３（１９９４）；Ｖｉｎａｙａｋら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１６：１６５３〜５６（１９９７））。
【０１１３】
アドレス可能な支持体特異的部分は、プローブの標的特異的部分の全てもしくは一部を含んでも良いし、または全く含まなくても良い。本発明のいくつかの実施形態において、アドレス可能な支持体特異的部分は、プローブの標的特異的部分のいくつかまたは全てから構成され得る。本発明の他の実施形態において、アドレス可能な支持体特異的部分は、プローブの標的特異的部分をいずれも含まない。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明の移動性変更因子は、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分に結合するためのタグ相補体部分、および移動度依存性分析技術において特定の移動度をもたらすためのテールを含む。
【０１１５】
移動性変更因子のテール部分は、移動度依存性分析技術において、増幅産物／移動性変更因子複合体の特定の移動度をもたらし得る任意の存在である。好ましくは、本発明の移動性変更因子のテール部分は、（１）十分に規定され、かつ容易に決定される移動度をもたらすために、低い多分散性を有し（例えば、Ｍｗ／Ｍｎが１．０５未満）；（２）水性媒質中に可溶性であり；（３）プローブ−標的ハイブリダイゼーションまたはアドレス可能な支持体特異的部分／タグ相補体結合に不利に影響せず；そして（４）異なるセットのメンバーが、その結合複合体に識別可能な移動度を付与するように、セットにおいて利用可能であるべきである。
【０１１６】
本発明の特に好ましい実施形態において、移動性変更因子のテール部分は、ポリマーを含む。詳細には、テールを形成するポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー、またはブロックコポリマーであり得る。さらに、このポリマーは、直鎖状、櫛状、分枝状または樹状の構造を有し得る。さらに、本発明は結合した移動性変更因子に単一の点で結合した単一のポリマー鎖に関して本明細書中に記載されているが、本発明はまた、１つよりも多いポリマー鎖エレメントを含む修飾因子も意図し、ここでこのエレメントは、テール部分を集合的に形成している。
【０１１７】
本発明において使用するために好ましいポリマーは、親水性であるか、または、タグ相補体に結合する場合、水性媒質においてタグ相補体が容易に可溶化することを確実にするために少なくとも十分に親水性である。移動度依存性分析技術が電気泳動の場合、ポリマーは、好ましくは非荷電であるか、または増幅産物の荷電／サブユニット密度よりも実質的に低い密度を有する。
【０１１８】
１つの好ましい実施形態において、ポリマーは、例えば、１つ以上の酸化ヘキサエチレン（ＨＥＯ）ユニットから形成される、酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）であり、ここで、このＨＥＯユニットは、末端同士で（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）結合して酸化エチレンサブユニットの壊れない鎖を形成する。他の例示的な実施形態としては、Ｎ個の１２マーＰＥＯユニットからなる鎖、およびＮ個のテトラペプチドユニットからなる鎖を含み、ここでＮは、調節可能な整数値である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。
【０１１９】
明らかに、本発明の移動性変更因子のテール部分として有用なポリマーの合成は、ポリマーの性質に依存する。適切なポリマーを調製するための方法は一般に、周知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択された長さのＰＥＯ鎖を形成するための方法は、以下で議論される。これらの方法（規定されたサイズの複数サブユニットポリマーユニットが、直接的か、または荷電しているかもしくは荷電していない結合基を介してかのいずれかで互いに結合する工程を包含する）は、一般に、広範な種々のポリマー（例えば、酸化ポリエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリウレタンポリマー、ポリペプチド、およびオリゴ糖）に適用される。ポリマーユニット結合のこのような方法はまた、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリプロピレンユニットで変更される酸化ポリエチレンユニットのコポリマー）を合成するために適する。選択された長さのポリペプチドおよびアミノ酸組成物（ホモポリマーまたは混合ポリマーのいずれか）は、標準的な固相方法によって合成され得る（例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．、３５：１６１〜２１４（１９９０））。
【０１２０】
選択された数のＨＥＯユニットを有するＰＥＯポリマー鎖を調製するための１つの好ましい方法において、ＨＥＯユニットを、一方の末端で、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）で保護し、そしてもう一方の末端で硫酸メタンで活性化する。次いで、この活性化ＨＥＯを、第２のＤＭＴ保護化ＨＥＯ基と反応させ、ＤＭＴ保護化ＨＥＯダイマーを形成する。次いでこのユニット付加を、所望のＰＥＯ鎖長が達成されるまで連続的に実行する（例えば、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、米国特許第４，９１４，２１０号）。
【０１２１】
テール部分として使用するための別の特に好ましいポリマーは、ＰＮＡである。ＰＮＡの利点、特徴および合成が上に記載されている。特に、遊離溶液中での電気泳動分離を包含する移動度依存性分析技術に関して使用される場合、ＰＮＡは、必然的に非荷電であるという有利な特徴を有する。
【０１２２】
ポリマーテールをポリヌクレオチドタグ相補体に結合させることは、従来のホスホラミダイトポリヌクレオチド合成方法の拡張によって実行され得るか、または他の標準的な結合方法によって実行され得る（例えば、ビス−ウレタントリル結合ポリマー鎖ホスホラミダイト結合を介して固相支持体上のポリヌクレオチドに結合され得る）。あるいは、ポリマー鎖を、ポリマー鎖ユニットをポリヌクレオチドに段階的に添加することによって、例えば、標準的な固相ポリマー合成方法を使用して、ポリヌクレオチド（または他のタグタンパク質）上に形成し得る。
【０１２３】
上記のように、移動性変更因子のテールタンパク質は、それぞれ異なるプローブ／移動性変更因子複合体について識別する移動度を、増幅産物／移動性変更因子複合体に付与する。複合体の移動度に対するこのテールの寄与は、一般に、テールのサイズに依存する。しかし、荷電した基（例えば、ＰＥＯ鎖における荷電した連結基、またはポリペプチド鎖における荷電したアミノ酸）をテールに付加することをまた使用して、プローブ／移動性変更因子複合体における選択された移動度の特徴を達成し得る。複合体の移動度は、例えば、シービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）媒質中の電気泳動において、増幅産物そのものの特徴によって影響され得、より大きなプローブは、プローブ／移動性変更因子複合体の電気泳動移動度を減少することがまた、理解される。
【０１２４】
本発明に従う移動性変更因子のタグ相補体部分は、増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分に結合し得、そして増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分と複合体を形成し得る、任意の存在であり得る。さらに、移動性変更因子のタグ相補体部分は、従来の手段を使用してテール部分に結合し得る。
【０１２５】
タグ相補体が、ポリヌクレオチド（例えば、ＰＮＡ）である場合、このタグ相補体は、移動性変更因子のテール部分の全てまたは一部を含んでも良いし、または移動性変更因子のテール部分を全く含まなくても良い。本発明のいくつかの実施形態において、タグ相補体は、移動性変更因子のテール部分のいくつかまたは全てから構成され得る。本発明の他の実施形態において、タグ相補体は、移動性変更因子のテールのいずれの部分も含まない。例えば、ＰＮＡは非荷電であるので、特に移動度依存性分析技術として遊離溶液電気泳動を使用する場合、同じＰＮＡオリゴマーは、タグ相補体および移動性変更因子のテール部分の両方として作用し得る。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態において、タグ相補体はハイブリダイゼーションエンハンサーを含む。本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーションエンハンサー」とは、２つのポリヌクレオチド（例えば、挿入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ））の間のハイブリダイゼーションを増強、安定化、またはさもなければ正に影響するように働く部分（例えば、米国特許第４，８３５，２６３号）、小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）（たとえば、米国特許第５，８０１，１５５号）および架橋官能基を意味する。このハイブリダイゼーションエンハンサーは、アドレス可能な支持体特異的部分／タグ複合体二重鎖との相互作用を可能にするような方法で移動性変更因子に結合している限り、移動性変更因子の任意の部分に結合し得る。しかし、好ましくは、ハイブリダイゼーションエンハンサーは、二成分組成物の移動性変更因子に共有結合する。本発明における使用のための特に好ましいハイブリダイゼーションエンハンサーは、小溝結合剤（例えば、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｓｉｎ）など）である。
【０１２７】
本発明の重要な特徴に従って、複数の増幅産物／移動性変更因子複合体は、移動度依存性分析技術を介して分解される。
【０１２８】
本発明の１つの実施形態において、増幅産物／移動性変更因子複合体は、液体クロマトグラフィーによって分解（分離）される。この方法における使用のための例示的な固定相媒質としては、逆相媒質（例えば、Ｃ−１８固相またはＣ８固相）、イオン交換媒質（特に陰イオン交換媒質）、および疎水性相互作用媒質が挙げられる。関連する実施形態において、増幅産物／移動性変更因子複合体は、ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）によって分離され得る。
【０１２９】
逆相クロマトグラフィーは、平等な（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶媒勾配、またはより代表的には、直線的、曲線的もしくは段階的溶媒勾配を使用して実行され、ここで、水性溶媒における非極性溶媒（例えば、アセトニトリルまたはイソプロパノール）のレベルは、クロマトグラフィーを実行する間に上昇し、それぞれの分析物の固相に対する親和性に従って、順次に分析物の溶出を引き起こす。ポリヌクレオチドを分離するために、イオン対形成剤（ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（例えば、テトラ−アルキルアンモニウム）が、リン酸の荷電をマスクするために溶液中に代表的に含まれる。
【０１３０】
増幅産物／移動性変更因子複合体の移動度は、固相または固定相に対するプローブの親和性を変更するポリマー鎖を含む移動性変更因子を使用することによって、改変され得る。従って、逆相クロマトグラフィーを用いて、固定相に対する増幅産物／移動性変更因子複合体の増加した親和性は、移動性変更因子に対して中程度に疎水性のテール（例えば、ＰＥＯ含有ポリマー、短いポリペプチドなど）の添加によって達成され得る。テールがより長くなるほど、固相に対する親和性がより大きくなり、従って、溶出されるべきプローブについて非極性溶媒のより高い濃度（およびより長い溶出時間）を必要とする。
【０１３１】
本発明の特に好ましい実施形態に従って、増幅産物／移動性変更因子複合体は、シービングマトリクスまたは非シービングマトリクスにおける電気泳動によって分解される。好ましくは、電気泳動分離は、キャピラリー電気泳動によってキャリラリーチューブ中で実行される（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。使用され得る好ましいシービングマトリクスとしては、共有結合的に架橋したマトリクス（例えば、ビス−アクリルアミドと共有結合的に架橋したポリアクリルアミド）；直鎖状ポリマーで形成されるゲルマトリクス（例えば、Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉら、米国特許第５，５５２，０２８号）；ならびにゲルを含まないシービング媒質（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，６２４，８００号；ＨｕｂｅｒｔおよびＳｌａｔｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１６：２１３７〜２１４２（１９９５）：Ｍａｙｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６６（１０）：１７７７〜１７８０（１９９４））が挙げられる。電気泳動媒質は、単鎖形態のポリヌクレオチドを維持するために、核酸変性剤（例えば、７Ｍ　ホルムアミド）を含み得る。適切なキャピラリー電気泳動計測器は、市販されている（例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。
【０１３２】
当業者は、増幅産物がまた、例えば、限定されないが、ゲル濾過、質量分析法、またはＨＰＬＣによって、分子量および分子の長さもしくは移動度に基づいて分離され得、そして適切な方法を使用して検出され得ることを理解する。
【０１３３】
検出されるべきそれぞれの標的配列について、少なくとも１つの第１プローブおよび少なくとも１つの第２プローブを含むプローブセットは、サンプルおよび必要に応じてライゲーション剤と組み合されて、ライゲーション反応混合物を形成する。少なくとも１つの第１プローブまたは少なくとも１つの第２プローブのいずれかは、プライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的部分を含み、これは分子量もしくは分子の長さによって同定可能であるか、または特定の移動性変更因子に相補的である。例えば、限定されないが、１つの標的配列に対応するアドレス可能な支持体特異的部分は、２ヌクレオチド長であり、第２の標的配列に対応するアドレス可能な支持体特異的部分は４ヌクレオチド長であり、第３の標的配列に対応するアドレス可能な支持体特異的部分は６ヌクレオチド長であり、等々である。好ましくは、これらの実施形態におけるアドレス可能な支持体特異的部分は、０〜１００ヌクレオチド長であり、より好ましくは、０〜４０ヌクレオチド長であり、そしてもっとも好ましくは、２〜３６ヌクレオチド長である。好ましくは、特定の標的配列に対応するアドレス可能な支持体特異的部分は、異なる標的配列に対応するアドレス可能な支持体特異的部分とは長さにおいて少なくとも２ヌクレオチド異なる。
【０１３４】
それぞれのプローブセットにおける第１プローブおよび第２プローブは、標的配列の中心的な（ｐｉｖｏｔａｌ）ヌクレオチドにすぐに隣接する配列に相補的であるように設計される。プローブセットの少なくとも１つの第１プローブまたは少なくとも１つの第２プローブのいずれかは、両方ではないが、中心的な相補体を含む。標的配列がサンプル中に存在する場合、この第１プローブおよび第２プローブは、適切な条件下で、標的上の領域に隣接してハイブリダイズする。中心的相補体が、適切なライゲーション剤の存在下で塩基対形成している場合、２つの隣接してハイブリダイズするプローブが互いにライゲーションしてライゲーション産物を形成し得る。あるいは、適切な条件下で、自己ライゲーション（ａｕｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ）が生じ得る。当業者は、中心的ヌクレオチドは、標的配列のどこにでも位置し得、そして同様に、中心的相補体は、プローブの標的特異的部分のどこにでも位置し得ることを理解する。
【０１３５】
次いで、（適切な塩、緩衝液およびヌクレオチド三リン酸中の）ライゲーション反応混合物は、少なくとも１つのプライマーセットおよびポリメラーゼと組み合わされて、第１増幅反応混合物を形成する。第１の増幅サイクルにおいて、ライゲーション産物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む第２プライマーは、このライゲーション産物とハイブリダイズし、そしてテンプレート依存性様式で伸長して、ライゲーション産物およびその相補体を含む二重鎖分子を作製する。ライゲーション産物が二本鎖分子として存在する場合、続く増幅サイクルは、この分子を指数関数的に増幅し得る。
【０１３６】
プライマーセットは、これらのプライマーの組み込みから生じる増幅産物が、元の標的配列に含まれる特定の中心的ヌクレオチドに特異的なレポーター基を含むように、少なくとも１つのレポーター基を含む。
【０１３７】
少なくとも１つの増幅サイクルに続いて、この増幅産物は、例えば、限定されないが、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ゲル濾過または質量分析法によって、分子量もしくは分子の長さまたは分子の移動度に基づいて分離される。特定の移動度アドレスでの、標識された配列の検出は、このサンプルが、関連する標的配列を含むことを示す。
【０１３８】
特定の実施形態に従って、本発明を使用して、標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定し得る。例えば、遺伝子、タンパク質をコードするＤＮＡ、またはタンパク質は、一連のコード領域（エキソンと称される）を含み、イントロンと称される非コード領域によって分散され得る。スプライシングプロセスにおいて、イントロンは除去され、そしてエキソンは、最終的なＲＮＡ分子（代表的にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））が連続するコード配列を含むように、並列される。いくつかの遺伝子が単一のタンパク質またはポリペプチドをコードするが、他の遺伝子は、選択的スプライシングに起因して複数のタンパク質またはポリペプチドをコードし得る。
【０１３９】
例えば、遺伝子は、各々が少なくとも１つのイントロンよって他のエキソンから分離されている５つのエキソンを含み得る。図５を参照のこと。一次転写産物をコードする仮想遺伝子が図５の上端に示され、これは、各々が３つの成熟ｍＲＮＡ（図５下端）のうちの１つによってコードされる３つの異なるタンパク質をコードする。選択的スプライシングに起因して，エキソン１は、（ａ）エキソン２ａ−エキソン３，（ｂ）エキソン２ｂ−エキソン３、または（ｃ）エキソン２ｃ−エキソン３と近接し得、図５に示されるこの３つのスプライシングの選択肢によって、３つの異なった種類の成熟ｍＲＮＡを生じる。
【０１４０】
このラット筋肉タンパク質であるトロポニンＴは、選択的なスプライシングのほんの１例である。トロポニンＴをコードする遺伝子は、５つのエキソン（Ｗ、Ｘ、α、β、およびＺ）を含み、これらの各々は最終的なタンパク質のドメインをコードする。この５つのエキソンは、イントロンによって分離されている。２つの異なるタンパク質であるα形態およびβ形態が、トロポニンＴ遺伝子の選択的スプライシングによって産生される。このα形態は、エキソンＷ、エキソンＸ、エキソンαおよびエキソンＺを含むｍＲＮＡから翻訳される。このβ形態は、エキソンＷ、エキソンＸ、エキソンβおよびエキソンＺを含むｍＲＮＡから翻訳される。
【０１４１】
特定の実施形態において、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定するための方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの標的核酸配列と各標的核酸配列がライゲーション反応組成物を形成するためのプローブセットとを一体化する工程を包含する。特定の実施形態において、このプローブセットは以下を含む：（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ；および（ｂ）複数の第２のプローブであって、ここで、第２のプローブの各々が３’プライマー特異的部分および複数のスプライス特異的部分のうちの１つを含む、プローブ。特定の実施形態において、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部をさらに含み、ここで、この支持体特異的部分は、このプライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するか、またはこのプライマー特異的部分とスプライス特異的部分との間に位置する。各プローブセット中のプローブは、標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズした場合において、一緒にライゲーションするために適切である。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、ライゲーション因子をさらに含む。
【０１４２】
特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は少なくとも１サイクルのライゲーションに供され、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは共にライゲーションされ、以下を含むライゲーション生成物を形成する：５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、スプライス特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分、および３’プライマー特異的部分。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、少なくとも１つの第１のプライマーおよび少なくとも１つの第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマーセットと一体化され、ここで、第１のプライマーはライゲーション生成物の５’プライマー特異的部分の配列を含み、そして第２のプライマーは、ライゲーション生成物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含み、ここで、プライマーセットの少なくとも１つのプライマーは、第１の増幅反応組成物を形成するためのレポーター基およびポリメラーゼをさらに含む。
【０１４３】
特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター基を含む第１の増幅生成物は、第１の増幅反応組成物を少なくとも１回の増幅サイクルに供することによって生成される。少なくとも１つのレポーター基を含む、この第１の増幅生成物または第１の増幅生成物の１部分は、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分の少なくとも１部分を使用して分析される。特定の実施形態において、スプライス改変体の同一性は、少なくとも１つのレポーター基を検出することによって決定され、このレポーター基は、アドレス可能支持体上の特定のアドレスに対してハイブリダイズするか、または特定の移動性アドレスで位置付けられる。
【０１４４】
特定の実施形態において、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定するための方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの標的核酸配列と各標的核酸配列がライゲーション反応組成物を形成するためのプローブセットとを一体化する工程を包含する。特定の実施形態において、このプローブセットは以下を含む：（ａ）標的特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ；および（ｂ）複数の第２のプローブであって、ここで、第２のプローブの各々が３’プライマー特異的部分および複数のスプライス特異的部分のうちの１つを含む、プローブ。各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部をさらに含む。各プローブセット中のプローブは、標的配列上で互いに隣接してハイブリダイズした場合において、一緒にライゲーションするために適切である。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、ライゲーション因子をさらに含む。
【０１４５】
特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は少なくとも１サイクルのライゲーションに供され、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは共にライゲーションされ、以下を含むライゲーション生成物を形成する：標的特異的部分、スプライス特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分、および３’プライマー特異的部分。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、少なくとも１つのプライマーを含む少なくとも１つのプライマーセットと一体化され、このプライマーはライゲーション生成物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含み、ここで、プライマーセットの少なくとも１つのプライマーは、伸長反応組成物を形成するためのレポーター基およびポリメラーゼをさらに含む。
【０１４６】
特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター基を含む第１の増幅生成物が、第１の増幅反応組成物を少なくとも１つのプライマー伸長サイクルに供することによって生成される。少なくとも１つのレポーター基を含む、この第１の増幅生成物または第１の増幅生成物の１部分は、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分の少なくとも１部分を使用して分析される。特定の実施形態において、スプライス改変体の同一性は、少なくとも１つのレポーター基を検出することによって決定され、このレポーター基は、アドレス可能支持体上の特定のアドレスに対してハイブリダイズするか、または特定の移動性アドレスで位置付けられる。
【０１４７】
特定の実施形態において、サンプル中の少なくとも１つの標的核酸配列におけるスプライス改変体を同定するための方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの標的核酸配列と、各標的核酸配列がライゲーション反応組成物を形成するためのプローブセットとを一体化する工程を包含する。特定の実施形態において、このプローブセットは以下を含む：（ａ）標的特異的部分および５’プライマー特異的部分を含む、少なくとも１つの第１のプローブ；および（ｂ）複数の第２のプローブであって、ここで、第２のプローブの各々が３’プライマー特異的部分および複数のスプライス特異的部分のうちの１つを含む、プローブ。特定の実施形態において、各プローブセット中の少なくとも１つのプローブは、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部をさらに含み、ここで、この支持体特異的部分は、このプライマー特異的部分と標的特異的部分との間に位置するか、またはこのプライマー特異的部分とスプライス特異的部分との間に位置する。各プローブセット中のプローブは、標的配列上でお互いに隣接してハイブリダイズした場合において、一緒にライゲーションするために適切である。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、ライゲーション因子をさらに含む。
【０１４８】
特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は少なくとも１サイクルのライゲーションに供され、ここで隣接してハイブリダイズしたプローブは共にライゲーションされ、以下を含むライゲーション生成物を形成する：５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、スプライス特異的部分、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分、および３’プライマー特異的部分。特定の実施形態において、このライゲーション反応組成物は、少なくとも１つの第１のプライマーおよび少なくとも１つの第２のプライマーを含む少なくとも１つのプライマーセット、ならびに第１の増幅反応組成物を形成するためのポリメラーゼと一体化され、ここで、第１のプライマーはライゲーション生成物の５’プライマー特異的部分の配列を含み、そして第２のプライマーは、ライゲーション生成物の３’プライマー特異的部分に相補的な配列を含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、第１の増幅生成物が、第１の増幅反応組成物を少なくとも１回の増幅サイクルに供することによって生成される。特定の実施形態において、第１の増幅生成物と、少なくとも１つの第１のプライマーまたは各プライマーセットについての少なくとも１つの第２のプライマーのいずれか（第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方ではない）とを一体化することによって第２の増幅反応組成物が形成され、ここで少なくとも１つの第１のプライマーまたは各プライマーセットについての少なくとも１つの第２のプライマーは、レポーター基をさらに含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター基を含む第２の増幅生成物が、第２の増幅反応組成物を少なくとも１回の増幅サイクルに供することによって生成される。
【０１５０】
少なくとも１つのレポーター基を含む、第２の増幅生成物または第２の増幅生成物の一部分は、少なくとも１つのアドレス可能な支持体特異的部分の少なくとも一部分を使用して分析される。特定の実施形態において、アドレス可能支持体上の特定のアドレスにハイブリダイズするか、特定の移動性アドレスで位置付けられる、少なくとも１つのレポーター基を検出することによって、スプライス改変体の同一性は決定される。
【０１５１】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸配列は、ＲＮＡから生じた少なくとも１つの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのｃＤＮＡが、少なくとも１つの伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から生じる。特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸配列は、このサンプル中に存在する少なくとも１つのＲＮＡ標的配列を含む。
【０１５２】
特定の実施形態において、ライゲーション反応組成物は、ライゲーション因子（例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼであるがこれに限定されない）または熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｓｃリガーゼ、またはＰｆｕリガーゼであるがこれに限定されない）をさらに含む。特定の実施形態において、増幅反応組成物のポリメラーゼは、ＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態において、このＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＴＭポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、またはＴｔｈポリメラーゼであるがこれらに限定されない）。
【０１５３】
特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター基は蛍光部分を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの第１のプライマーのモル濃度は、少なくとも１つのプライマーセット中の少なくとも１つの第２のプライマーのモル濃度と異なる。特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマーセットにおいて、少なくとも１つの第１のプライマーの融解温度（Ｔｍ５０）は、少なくとも約４℃、少なくとも約８℃、少なくとも約１０℃または少なくとも約１２℃だけ、少なくとも１つの第２のプライマーの融解温度と異なる。
【０１５４】
スプライス改変体を同定するための様々な実施形態において、本出願で開示されるアドレス可能支持体特異的部分を使用する様々な実施形態のいずれかを使用し得る。スプライス改変体を同定するための様々な実施形態において、本出願で開示されたプライマー特異的部分を使用する様々な実施形態のいずれかを使用し得る。また、１つのスプライス改変体のみを同定することを所望する場合、（その１つのスプライス改変体に特異的な）スプライス特異的部分を含む１つの第２のプローブのみを使用し得る。
【０１５５】
スプライス改変体同定するための特定の非限定的な実施形態は、図６によって例示される。このような実施形態は、２つの異なるスプライス改変体を同定することを可能にする。一方のスプライス改変体は、エキソン１、エキソン２、およびエキソン４を含む。他方のスプライス改変体は、エキソン１、エキソン３、およびエキソン４を含む。このような実施形態において、同じアドレス可能支持体特異的部分を両方の改変体のために使用し得、そしてこの改変体はカラーシグナルに基づいて区別され得る。標的特異的部分は、エキソン１の少なくとも１部分に対応する。このスプライス特異的部分は、特定のエキソンの少なくとも一部分（エキソン２またはエキソン３）に対応する。当業者は、ＰＳＰａ，ＰＳＰｂ、またはＰＳＰｃが、標的配列の方向に依存する５’プライマー特異的部分または３’プライマー特異的部分であり得ることを理解する。
【０１５６】
本発明はまた、目的の方法を実施の効率を上げるために設計されたキットを提供するキットは、本方法の実施に必要とされる２つ以上構成成分をアセンブルすることによって目的の方法の効率を上げるように働く。好ましくは、キットは、エンドユーザによる測定の必要を最小限にするために事前に測定された単位量の構成要素を含む。好ましくは、キットは、本発明の１つ以上の方法を実施するための指示書を含む。好ましくは、このキットの構成要素は、お互いに結合して操作するために最適化される。
【０１５７】
本発明のキットを、隣接するハイブリダイズしたプローブをライゲーションするため、ライゲーション生成物を増幅するため、１本鎖核酸を２本鎖分子から生成するため、またはこれらのプロセスの組み合わせのため、使用し得る。本発明のキットは、さらなる構成要素（例えば、オリゴヌクレオチドトリホスフェート、ヌクレオチドアナログ、反応緩衝液、塩、イオン、安定化剤、またはこれらの構成成分の組み合わせ）をさらに含み得る。本発明の特定のキットは、ライゲーション生成物（以下を含むがこれらに限定されない：透析膜，クロマトグラフ化合物、支持体、オリゴヌクレオチドまたはこれらの試薬の組み合わせ）を精製する為の試薬を含む。
【０１５８】
上述した本発明は、実施例を参照することによってより良く理解され得る。以下の実施例は、例示の目的のみを意図し、かつ、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５９】
（実施例１：）
（ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いたＳＮＰ検出）
（Ａ．ゲノム標的ＤＮＡの調製）
ゲノムＤＮＡ由来の標的核酸を、以下のようにＤＮＡｓｅＩ消化によって調製した。１．６μｌの５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６．４μｌの２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、６．０μｌのゲノムＤＮＡ（３００ｎｇ／ｍｌ）、および２．０μｌの０．０１２５ｕ／μｌのＤＮＡｓｅＩ（５０％グリセロール、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の中）を含むゲノムＤＮＡのアリコートを、２５℃にて２０分間インキュベートした。この酵素を、９９℃にて１５分間熱不活性化し、そして２μｌの１×ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を添加して、最終ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに調節した。これらのフラグメント化したゲノムＤＮＡのアリコートを、−２０℃で保存し得る。
【０１６０】
（Ｂ．標的特異的プローブセットのライゲーション）
表２に示される１３の標的特異的プローブセットを設計して、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）反応において１３の異なる二対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）遺伝子座またはこれらの相補体を検出した。このプローブセットを、製造者の指示書に従った標準的なホスホルアミダイト化学（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用してＡＢＩ　３９４８　ＤＮＡシンセサイザー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で調製した。第２のプローブを、ホスホリンク（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋ）化学を使用して合成の間にリン酸化した（例えば、Ｈ．Ｇｕｚａｅｖら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　５１：９３７５−８４（１９９５）を参照のこと）。
【０１６１】
このプローブセットを、以下のように共にライゲーションした。２μｌのフラグメント化したゲノムＤＮＡ、４．５μｌの滅菌濾過し、脱イオン化した水、１μｌの１００ｍＭ　ＫＣｌ、１μｌの１０×リガーゼ緩衝液（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ７．６、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、０．１Ｍ　ＤＴＴ、０．０１Ｍニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、および１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）、および０．５μｌのリガーゼミックス（９．５μｌの１×リガーゼ緩衝液および０．５μｌのＴａｑ　ＤＮＡリガーゼ、４０ｕ／μｌ）を、０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で合せた。この混合物をボルテックスし、そして室温にて３分間インキュベートした。１μｌの標的特異的プローブミックス（１×ＴＥ中の２４ｎＭの各プローブ）をライゲーション反応混合物に添加し、そしてこの反応混合物をボルテックスによって混合した。
【０１６２】
このチューブをサーマルサイクラー中に配置し、そして以下のように複数サイクルのライゲーションに供した。このチューブを９０℃にて５秒間と４６．５℃にて４．５分間の間で１５サイクル行い、次いで、９９℃にて１０分間インキュベートし、次いで４℃でインキュベートした。隣接してハイブリダイズした標的特異的プローブの反対の末端を、共にライゲーションして、ライゲーション生成物をライゲーション反応混合物中に形成した。ライゲーション温度は、第１のプローブおよびプローブセット中の第２のプローブのＴｍに依存して上昇され得るか、または下降され得、そしてサイクル時間はまた、これに従って調節し得ることを、当業者は理解する。
【０１６３】
（Ｃ．ハイブリダイゼーションに基づく引き出し（Ｐｕｌｌｏｕｔ）を使用したライゲーション生成物の精製）
このライゲーション生成物を以下のように精製した。５μｌのライゲーション反応混合物、５μｌの１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）、および１０μｌの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．８Ｍのテトラメチルアンモニウムクロリド、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．００３Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０）を、マイクロピペットを使用して混合した。この混合物を、ライゲーション生成物の１つの第１のプライマー部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のマイクロタイタープレートに添加し、そして４１℃にて１０分間インキュベートした。
【０１６４】
第１のマイクロタイタープレートを、ライゲーション生成物の他の第１のプライマー部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のマイクロタイタープレートの上端に直接配置した。このスタックしたマイクロタイタープレートを、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ａｌｌｅｇｒａ　６ＫＲ遠心機中で１４８０〜１６００×ｇにて５分間遠心分離し、ハイブリダイズしてない反応混合物を第２のマイクロタイタープレートに移した。
【０１６５】
この第２のマイクロタイタープレートを、４１℃にて１０分間インキュベートし、次いで、収集プレートの上端に直接的に配置した。このスタックした第２のマイクロタイタープレートおよび収集プレートを、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ａｌｌｅｇｒａ　６ＫＲ　遠心機中で１４８０〜１６００×ｇにて５分間遠心分離した。第１および第２のマイクロタイタープレートの各々を、５０μｌの７５％イソプロパノールで２回洗浄し、各洗浄後１４８０〜１６００×ｇにて５分間遠心分離した。次いで、このマイクロタイタープレートを、５０μｌの無水イソプロパノールで洗浄し、そして前回のようにて１４８０〜１６００×ｇで５分間遠心分離した。このマイクロタイタープレートを、３７℃にて１５分間インキュベートして、任意の残余イソプロパノールを乾燥した。
【０１６６】
この洗浄した第１のマイクロタイタープレートおよび第２のマイクロタイタープレートを収集プレートの上端に直接スタックし、３０μｌの新たに調製した水酸化アンモニウム溶液（滅菌濾過し、脱イオン化した水中で７０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム）を、各ウェルに添加した。このスタックしたプレートを前回のように１４８０〜１６００×ｇにて５分間遠心分離した。精製したライゲーション生成物を含む、この溶出液を０．５ｍｌのｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅチューブ中で合せ、そして減圧下で空気乾燥した。
【０１６７】
（Ｄ．ＰＣＲを使用する精製したライゲーション生成物の増幅）
この精製したライゲーション生成物を、以下のようにＰＣＲで増幅した。空気乾燥した精製したライゲーション生成物を２μｌの水で再水和した。２μｌの再水和した精製したライゲーション生成物と２８μｌのＰＣＲ緩衝液（９μｌの滅菌濾過し、脱イオン化した水、１８μｌのＴｒｕｅ　Ａｌｌｅｌｅ　ＰＣＲ　ｐｒｅ　ｍｉｘ（Ｐ／Ｎ　４０３０６１，ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および１μｌの一般的なプライマーミックス（１×ＴＥ緩衝液中の、３０μＭの各プライマー））とを合せることによってこの増幅反応混合物を調製した。
【０１６８】
１つの第１のプライマー（５’−ＡＡＣＴＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＧＣＧＡ；Ｔｍ５３．７℃）（配列番号：６６）をＢｅｎ　Ｊｏｄａ（３−（４−カルボキシベンジル）−１３−（３−スルホプロピル）−１，２，３，１３，１４，１５−ヘキサヒドロ−１，１，１５，１５テトラメチルジベンゾ［ｇ，ｇ’］ピラノ［２，３−ｅ：６，５−ｅ’］ジインドール−１６−イウム、内塩（ｉｎｎｅｒ　ｓａｌｔ）、カルボキシＮＨＳエステル）で５’−末端標識した。他の第１のプライマー（５’−ＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡＡＡＣＧＧＧ；Ｔｍ５３．７℃）（配列番号６７）を、製造者（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のプロトコルに従ってＶＩＣ（２’−フェニル−７’−クロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン）で５’−末端標識した。第２のプライマー（５’−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ；Ｔｍ５３．７℃）（配列番号６８）は標識しなかった。
【０１６９】
次いで、この増幅反応混合物を、以下のように、サーマルサイクラー中で増幅サイクルに供した。このチューブを９５℃まで１２分間加熱し、次いで（９４℃にて１５秒間，６０℃にて１５秒間、そして７２℃にて３０秒間）を１０サイクルで、その後の（８９℃にて１５秒間、５３℃にて１５秒間、そして７２℃にて３０秒間）を２５サイクルで、次いで、６０℃にて４５分間で加熱した。次いで、二本鎖増幅生成物を含む増幅反応混合物を４℃まで冷却した。
【０１７０】
組み込まれなかったＰＣＲプライマーを、以下のように反応混合物から取り除いた。各３０μｌの増幅反応混合物に対して、０．３４μｌのグリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）、３．０９μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、および２０．６μｌの無水イソプロパノールを添加した。このチューブを、ボルテックスによって混合し、そして室温で１０分間インキュベートし、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　１８　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中でその後１４，０００ｒｐｍにて１０〜１５分間遠心分離した。
【０１７１】
上清を、標識した増幅生成物ペレットから除去した。各ペレットを、ボルテックスしながら（水中の）５０μｌの７０％エタノールで洗浄した。洗浄した増幅生成物を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　１８　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で１４，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離しそしてこの上清を除去した。このペレットを、５０μｌの無水エタノールを使用して再度洗浄し、ボルテックスし、そしてＢｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　１８　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で１４，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。これらのペレットを空気乾燥した。これらの空気乾燥したペレットは、ハイブリダイゼーション前まで４℃で保存し得る。
【０１７２】
（Ｅ．ＤＮＡマイクロアレイを使用する支持体ハイブリダイゼーション）
空気乾燥した増幅生成物ペレットを１０μｌの１×ＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして３０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド、０．５Ｍ　ＭＥＳ−ナトリウム塩、ｐＨ　６．７、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１０ｍｇ／ｍｌ剪断されたニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）と合せた。このチューブを９４℃にて１０分間インキュベートし、反応混合物中に１本鎖増幅生成物を生成し、次いで４℃でクエンチした。
【０１７３】
１本鎖増幅生成物を含む１５μｌの反応混合物を、ＤＮＡマイクロアレイ（Ｈｙｓｅｑ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のチャンバの中へ添加した。このアレイをハイブリダイゼーションチャンバに配置し、そして６０℃にて３時間インキュベートし、１本鎖増幅生成物のアドレス可能支持体特異的部分が支持体結合捕捉オリゴヌクレオチド（ＭＡＸＩ　１４，Ｈｙｂａｉｄ，Ａｓｈｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）にハイブリダイズすることを可能にした。このアレイを洗浄緩衝液（３００ｍＭ　Ｂｉｃｉｎｅ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、および０．１％　ＳＤＳ）で洗浄し、６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ，０．０６Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４，０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ）でリンスし、洗浄緩衝液を除去し、そして空気乾燥した。
【０１７４】
（Ｆ．ハイブリダイズした増幅生成物の検出）
乾燥したアレイを、アレイスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ　４０００Ａ，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中に配置し、５３２ｎｍおよび６３５ｎｍでスキャンし、そしてこのアレイ上の特定の位置でハイブリダイズした標識した増幅生成物の存在を検出した。特定のアレイ位置（アドレス）で特定の捕捉プローブに対してハイブリダイズした標識された増幅生成物の検出によって、対応する標的配列がサンプル中に存在することが示される。特定の実施形態において、この増幅生成物が、アレイアドレスでの検出可能標識の単なる存在によってではなく、検出される特定の標識または標識の組み合わせによって区別される。
【０１７５】
当業者は、開示した、プローブ配列、標的配列およびプライマー配列、またはこれらの組み合わせの相補体を、本発明の方法に使用し得ることを理解する。例えば、これに制限されないが、ゲノムＤＮＡサンプル標的配列およびその相補体の両方を含む。従って、ゲノムサンプルを変性させた場合に、標的配列およびその相補体の両方が１本鎖配列としてサンプルに存在する。本明細書中に記載のプローブは、適切な配列（標的またはその相補体のいずれか）に特異的にハイブリダイズする。
【０１７６】
本発明を様々な適用、方法および組成物を参照して記載してきたが、様々な変化および改変を、本発明から逸脱することなく行い得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の特定の実施形態に従う、プローブセットを示す概略図である。
各プローブは、標的に相補的または実質的に相補的である部分（「標的特異的部分」Ｔ−ＳＰ）およびプライマーとしての同じ配列に相補的であるかまたはそれを有する部分（「プライマー特異的部分」Ｐ−ＳＰ）を含む。各プローブセットにおける少なくとも１つのプローブは、標的特異的部分とプライマー特異的部分との間に位置するアドレス可能な支持体特異的部分（ＡＳ−ＳＰ）をさらに含む（ここで、プローブＺ）。
各プローブセットは、第１のプローブ（ここで、プローブＡ）の３’末端が第２のプローブの５’末端に直ぐに隣接しそしてこれに対立する状態で、標的とハイブリダイズするように設計された、少なくとも１つの第１のプローブおよび少なくとも１つの第２のプローブ（ここで、プローブＺ）を含む。
【図２】
図２は、本発明の特定の実施形態を使用して、標的座位における２つの潜在的な対立遺伝子間を区別するための方法を示す。
図２（ａ）は、以下を示す：（ｉ）これらのプライマー特異的部分およびこれらの中心的区画（Ａプローブ上のＴおよびＢプローブ上のＣ）において異なる２つの第１のプローブＡおよびＢ、ならびにアドレス可能な支持体特異的部分およびプライマー特異的部分を含む１つの第２のプローブＺ、を含む標的特異的プローブセット、そして（ｉｉ）中心的ヌクレオチドＡを含む標的配列。
図２（ｂ）は、標的にアニールされた３つのプローブを示す。プローブＡの標的特異的部分は、中心的ヌクレオチドを含む３’標的領域と完全に相補的である。プローブＢの中心的成分は、３’標的領域と相補的ではない。従って、プローブＢの標的特異的部分は、３’末端において塩基対不一致を含む。プローブＺの標的特異的部分は、５’標的領域に完全に相補的である。
図２（ｃ）は、ライゲーション産物Ａ−Ｚを形成するためのプローブＡおよびＺのライゲーションを示す。プローブＢおよびＺは、プローブＢ上の不一致の中心的相補体に起因して、ライゲーション産物を形成するように共に連結しない。
図２（ｄ）は、Ａ−Ｚのライゲーション産物および未連結プローブＢおよびＺを放出するために、二本鎖分子を変成することを示す。
【図３】
図３は、本発明の方法の特定の実施形態を示す概略図である。
図３（ａ）は、標的配列、ならびにこれらのプライマー特異的部分およびこれらの中心的相補体（ここで、３’末端プローブＡにおけるＴおよび３’末端プローブＢにおけるＧ）において異なる２つの第１のプローブ（ＡおよびＢ）を含むプローブセット、ならびにアドレス可能な支持体特異的部分を含む１つの第２のプローブＺ（プライマー特異的部分Ｚから上流に波線−ｖｖｖｖｖ−で示される）を示す。
図３（ｂ）は、アニーリング条件下で標的配列にハイブリダイズしたＡおよびＺプローブを示す。
図３（ｃ）は、ライゲーション産物Ａ−Ｚを形成するためのライゲーション因子の存在下での第１および第２のプローブのライゲーションを示す。
図３（ｄ）は、一本鎖ライゲーション産物を放出するためにライゲーション産物：標的複合体を変成すること；プライマーセット（ＰＡ＊、ＰＢ＊、およびＰＺ）を添加すること（ここで、ＰＡおよびＰＢプライマーは、レポーター基（＊）を含む）；プライマーＰＺをライゲーション産物にアニーリングすることを示す。
図３（ｅ）は、ポリメラーゼを用いるテンプレート依存性様式で、ＰＺプライマーを伸長することによる、二本鎖核酸産物の形成を示す。
図３（ｆ）は、２つの一本鎖分子を放出するために、二本鎖核酸産物を変成することを示す。
図３（ｇ）は、これらのそれぞれの一本鎖分子にアニールしたＰＡ＊およびＰＺプライマーを示す。
図３（ｈ）は、両方の二本鎖増幅産物を示す。
図３（ｉ）レポーター基ＰＡ＊を含む一本鎖分子を含む４つの一本鎖分子を放出するために変性される両方の増幅産物を示す。
図３（ｊ）は、一本鎖ＰＡ＊増幅産物のアドレス可能な支持体特異的部分を、支持体の１位にアニールすることを示す。
図３（ｋ）は、支持体の１位にハイブリダイズしたレポーター基を検出することを示す。
【図４】
図４は、同じプライマー特異的部分およびこれらのそれぞれのプライマーセットを含む２つ以上のライゲーション産物を示す。
図４（ａ）は、６つのライゲーション産物およびこれらのそれぞれのプライマーを示す。ライゲーション産物の各々は、固有のアドレス可能な支持体特異的部分（ＡＳ−ＳＰ）を含む。６つのライゲーション産物のうち２つは、同じ５’プライマー特異的部分および同じ３’プライマー特異的部分（それぞれＡおよびＺ）を含む。結果として、５つのプライマーセット（ＰＡおよびＰＺ；ＰＣおよびＰＸ；ＰＤおよびＰＷ；ＰＥおよびＰＶ；ならびにＰＦおよびＰＵ）のみが、６つのライゲーション産物を増幅するために必要とされる。
図４（ｂ）は、６つのライゲーション産物およびこれらのそれぞれのプライマーを示す。ここで、大部分のライゲーション産物（６つのうちの４つ）が、同じ５’プライマー特異的部分および同じ３’プライマー特異的部分（それぞれＡおよびＺ）を含む。結果として、３つのプライマーセット（ＰＡおよびＰＺ；ＰＥおよびＰＶ；ならびにＰＦおよびＰＵ）のみが６つのライゲーション産物を増幅するために必要とされる。
図４（ｃ）は、６つのライゲーション産物およびこれらのそれぞれのプライマーを示す。６つのライゲーション産物の各々は、固有のアドレス可能な支持体特異的部分を含む。６つ全てのライゲーション産物は、同じ５’プライマー特異的部分および同じ３’プライマー特異的部分（それぞれＡおよびＺ）を含む。結果として、１つのプライマーセット（ＰＡおよびＰＺ）のみが、６つ全てのライゲーション産物を増幅するために必要とされる。
【図５】
図５は、例示的な選択的スプライシングを示す。
【図６】
図６は、スプライス改変体を同定するための特定の実施形態を示す。
エキソン１、エキソン２、およびエキソン４を含むスプライス改変体を同定するために、２つのプローブを含むプローブセットを使用する。一方のプローブは、ＰＳＰａ、ＡＳＳＰおよびＴＳＰを含み、そして他方のプローブは、ＰＳＰｂおよびＳＳＰ（エキソン２の少なくとも一部に対応する）を含む。
エキソン１、エキソン３、およびエキソン４を含むスプライス改変体を同定するために、２つのプローブを含むプローブセットを使用する。一方のプローブは、ＰＳＰａ、ＡＳＳＰおよびＴＳＰを含み、そして他方のプローブは、ＰＳＰｃおよびＳＳＰ（エキソン３の少なくとも一部に対応する）を含む。
【図１】
2004507226.tif 000004
【図２】
2004507226.tif 000005
【図３】
2004507226.tif 000006
2004507226.tif 000007
【図５】
2004507226.tif 000008
【図６】
2004507226.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2004507226.tif 000010
2004507226.tif 000011
2004507226.tif 000012
2004507226.tif 000013
2004507226.tif 000014
2004507226.tif 000015
2004507226.tif 000016
2004507226.tif 000017
2004507226.tif 000018
2004507226.tif 000019
2004507226.tif 000020
2004507226.tif 000021
2004507226.tif 000022
2004507226.tif 000023
2004507226.tif 000024
2004507226.tif 000025
2004507226.tif 000026
2004507226.tif 000027
2004507226.tif 000028
2004507226.tif 000029
2004507226.tif 000030
2004507226.tif 000031
2004507226.tif 000032
2004507226.tif 000033
2004507226.tif 000034
2004507226.tif 000035
2004507226.tif 000036
2004507226.tif 000037
2004507226.tif 000038
2004507226.tif 000039
2004507226.tif 000040
2004507226.tif 000041
2004507226.tif 000042
2004507226.tif 000043
2004507226.tif 000044
2004507226.tif 000045
2004507226.tif 000046
2004507226.tif 000047
2004507226.tif 000048
2004507226.tif 000049
2004507226.tif 000050
2004507226.tif 000051
2004507226.tif 000052
2004507226.tif 000053
2004507226.tif 000054
2004507226.tif 000055
2004507226.tif 000056
2004507226.tif 000057
2004507226.tif 000058
2004507226.tif 000059
2004507226.tif 000060
2004507226.tif 000061
2004507226.tif 000062
2004507226.tif 000063
2004507226.tif 000064
2004507226.tif 000065
2004507226.tif 000066
2004507226.tif 000067
2004507226.tif 000068
2004507226.tif 000069
2004507226.tif 000070
2004507226.tif 000071
2004507226.tif 000072
2004507226.tif 000073
2004507226.tif 000074
2004507226.tif 000075
2004507226.tif 000076
2004507226.tif 000077
2004507226.tif 000078
2004507226.tif 000079
2004507226.tif 000080
2004507226.tif 000081
2004507226.tif 000082
2004507226.tif 000083
2004507226.tif 000084
2004507226.tif 000085
2004507226.tif 000086
2004507226.tif 000087
2004507226.tif 000088
2004507226.tif 000089
2004507226.tif 000090
2004507226.tif 000091
2004507226.tif 000092
2004507226.tif 000093
2004507226.tif 000094
2004507226.tif 000095
2004507226.tif 000096
2004507226.tif 000097
2004507226.tif 000098
2004507226.tif 000099
2004507226.tif 000100
2004507226.tif 000101
2004507226.tif 000102
2004507226.tif 000103
2004507226.tif 000104
2004507226.tif 000105
2004507226.tif 000106
2004507226.tif 000107
2004507226.tif 000108
2004507226.tif 000109
2004507226.tif 000110
2004507226.tif 000111
2004507226.tif 000112
2004507226.tif 000113
2004507226.tif 000114
2004507226.tif 000115
2004507226.tif 000116
2004507226.tif 000117
2004507226.tif 000118
2004507226.tif 000119
2004507226.tif 000120
2004507226.tif 000121
2004507226.tif 000122
2004507226.tif 000123
2004507226.tif 000124
2004507226.tif 000125
2004507226.tif 000126
2004507226.tif 000127
2004507226.tif 000128
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507226.tif 000129
2004507226.tif 000130
【国際調査報告】
2004507226.tif 000131
2004507226.tif 000132
2004507226.tif 000133
2004507226.tif 000134
2004507226.tif 000135
2004507226.tif 000136
2004507226.tif 000137