(57)【要約】【課題】β−アミラーゼの抽出方法【解決手段】本発明は、セルラーゼの使用による穀物からのβ−アミラーゼの抽出方法に関する。本発明は更に、β−アミラーゼの抽出におけるセルラーゼの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀物を、セルラーゼの存在下において水性媒体中で抽出してβ−アミラーゼを含む抽出物を得ることを特徴とするβ−アミラーゼを抽出する方法。
【請求項２】
β−アミラーゼが、大麦又は小麦から抽出されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
β−アミラーゼが、脱穀した大麦から抽出されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
抽出が、還元条件で実施されることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
脱穀した大麦が、５：８ないし２：３（脱穀した大麦：ＳＯ２を含む水）の比でＳＯ２を含む水で抽出されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
抽出が、２５ないし３３℃、好ましくは２９ないし３１℃の温度において実施されることを特徴とする前記請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抽出時間が４８ないし６６時間、好ましくは５５ないし６２時間であることを特徴とする前記請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
糸状菌のセルラーゼが使用されることを特徴とする前記請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
トリコデルマ糸状菌のセルラーゼが使用されることを特徴とする前記請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
穀物からのβ−アミラーゼの抽出におけるセルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素技術に関する。より厳密には、本発明は、穀物からβ−アミラーゼを抽出するための方法及び前記抽出における酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−アミラーゼは、α−１，４結合を加水分解する澱粉分解酵素である。それは、例えば、細菌及び植物中で見られ、そしてそれは、澱粉鎖の非還元末端で澱粉を主にマルトースへ分解する。β−アミラーゼは、例えば、穀粒中に豊富であり、そしてそれは、必要に応じて、穀物の栄養貯蔵、例えば澱粉を糖へ転換する。穀物中では、澱粉は主にアミロース及びアミロペクチンの形状で貯蔵される。β−アミラーゼは、アミロースは全てマルトースへ転換するのに対し、アミロペクチンの約６０％をマルトースへ転換し、残りはデキシトリンへ転換する。
【０００３】
β−アミラーゼは、例えば、澱粉産業において、マルトースを製造するために使用される産業上重要な酵素である。多量のマルトースを含む製品は、例えば菓子及び食品産業で使用される。β−アミラーゼは細菌及び植物の両方から単離されている。例えば、それは、バシルス菌（ＵＳ４９７０１５８及びＪＰ６０１２６０８０）及び耐熱性のクロストリジウム菌（ＵＳ４６７４５３８）から得られてきた。細菌から誘導されたβ−アミラーゼは、マルトースに加えて、多量のマルトトリオースも製造するのに対し、植物ベースのβ−アミラーゼは、比較的より多くのマルトースを製造するので、それらは、できるだけ甘い及び／又は醗酵性の製品を得ることを目的とした方法にはより適当である。そのうえ、細菌からのβ−アミラーゼの大規模製造は困難である。産業上使用されるβ−アミラーゼは、植物ベースのものであり、そしてその場合には、通常穀物、特に大麦又は小麦が酵素源として使用されるが、大豆もまた使用される。
【特許文献１】米国特許第４９７０１５８号明細書。
【特許文献２】特開昭６０−１２６０８０号公報。
【特許文献３】米国特許第４６７４５３８号明細書。
【０００４】
成長の間に、β−アミラーゼは穀粒中に形成され、貯蔵される。穀粒は、例えば穀粒の胚及び澱粉含有内胚乳から成り、そしてそれは胚盤によって、互いに分離される。内胚乳は、糊粉層に囲まれ、そして穀粒全体は、果皮層、種皮層及び真皮に囲まれている。小麦は、特定の皮はないが、果皮、種皮が硬い外殻を形成する。β−アミラーゼは、主に、内胚乳及び胚盤に貯蔵される。多量のβ−アミラーゼは、糊粉層の直接下の内胚乳の最も外側部分に見られる。
【０００５】
大麦のβ−アミラーゼは、十分に研究されている。このβ−アミラーゼ及びその製造は例えば以下の刊行物に記載されている：Ｄ．Ｅ．ブリッグス，Ｂａｒｌｅｙ，チャップマン＆ホール，ロンドン，１９７８年；クック，Ｂａｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｔ，アカデミックプレス，ロンドン，１９６２年；Ｊ．Ｒ．Ａ．ポロック，Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，アカデミックプレス，ロンドン，１９７９年。酵素分類名は、１，４−α−Ｄ−グルカンマルトハイドロラーゼ（ＥＣスペック３．３．１．２）である。これまでは、穀物のβ−アミラーゼは、まず穀粒を粉砕又は製粉し、続いて水又は緩衝液でβ−アミラーゼを抽出することによって分離されてきた。この種の抽出物からの酵素の精製は、酵素自身に加えて、抽出物が、穀粒の、多くの他の可溶性成分を含むため、元来困難かつ面倒である。それを含む溶液からのβ−アミラーゼの分離を改善するための試みが、例えば、硫酸アンモニウムの存在下においてポリマーで酵素を吸着することによって行なわれてきた（ＵＳ５２９４３４１）。グルテンからのβ−アミラーゼの解離はプロテアーゼで実験されている（ＪＰ６３０７９５９０）。
【非特許文献１】Ｄ．Ｅ．ブリッグス，Ｂａｒｌｅｙ，チャップマン＆ホール，ロンドン，１９７８年。
【非特許文献２】クック，Ｂａｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｔ，アカデミックプレス，ロンドン，１９６２年。
【非特許文献３】Ｊ．Ｒ．Ａ．ポロック，Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，アカデミックプレス，ロンドン，１９７９年。
【特許文献４】米国特許第５２９４３４１号明細書
【特許文献５】特開昭６３−０７９５９０号公報
【０００６】
β−アミラーゼは、アルギン酸ナトリウムを添加し、凝固した酵素を回収すること（ＪＰ６００２７３８３）又はリン酸カルシウムゲルを形成し、酵素を吸着させ、続いてそこから酵素を回収すること（ＪＰ６３２４８３８９）によって、小麦澱粉製造の廃液から単離されている。澱粉製造の廃液は、それは非常に薄くかつ多量の他の成分を含んでいるので、精製及び濃縮が困難なので、結果として収率は低いので、良好なβ−アミラーゼ源ではない。
【特許文献６】特開昭６０−０２７３８３号公報
【特許文献７】特開昭６３−２４８３８９号公報
【０００７】
より純粋な粗抽出物を得、かつ困難な下流加工を避けるために、完全に又は部分的に脱穀された穀粒からβ−アミラーゼを抽出することが示唆されている。例えば、大麦の穀粒が、それらの内胚乳が壊れないような方法で脱穀された場合、内胚乳の最も外側の層は、浸漬水への不溶性物質の出入りを防止し、かつ可溶性物質の出入りを制限するフィルター類のように機能する。穀粒の他のタンパク質からβ−アミラーゼを解離する還元物質の存在下において抽出を実施することが好ましい（ＦＩ６１５６及びＵＳ４６７５２９６）。
【特許文献８】フィンランド国特許第６１５６号明細書
【特許文献９】米国特許第４６７５２９６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
穀物抽出時間を減少させかつ酵素の収率を改善する、穀物からのβ−アミラーゼ抽出法が、今や発明された。方法は簡単に実施でき、かつ脱穀した穀物を加工するために特に適しており、そしてそれは、酵素の更なる精製も容易にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従ったβ−アミラーゼを抽出するための方法は、穀物を、セルラーゼの存在下において水性媒体中で抽出してβ−アミラーゼを含む抽出物を得ることを特徴とする。本発明は、更に穀物からのβ−アミラーゼの抽出におけるセルラーゼの使用に関する。
【００１０】
セルラーゼは、例えば製粉した穀物からの澱粉製造において、スラリーの粘度を減少させ、タンパク質から澱粉を分離するために使用される。β−アミラーゼの抽出水へのセルラーゼの添加が、β−アミラーゼの収率を改善し、かつ抽出時間を減少させることが、驚くべきことに今や発見された。本発明の好ましい態様は、従属請求項中に開示されている。
【００１１】
図１は、時間関数に対するβ−アミラーゼの収率における温度の影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、種々のβ−アミラーゼ含有穀物の抽出、例えば、小麦、大麦、ライ麦及び大豆の加工に適用可能である。それは、好ましくは、小麦及びライ麦の、特に好ましくは大麦のβ−アミラーゼを抽出するために使用される。発芽していない穀粒は、β−アミラーゼ以外の酵素を多量に含まないので、このような穀粒からβ−アミラーゼを抽出することは価値がある。酵素は、脱穀されていない穀粒からも抽出され得るが、好ましくは脱穀、製粉、粉砕又は研磨された穀粒から抽出される。ライ麦及び大麦を脱穀することが望ましい。最良の結果は、脱穀した大麦の穀粒を抽出することによって得られる。
【００１３】
穀粒の内胚乳から抽出物への澱粉の出入りを防止するために、脱穀は、実際の生きている穀粒を粉砕しないように実施される必要がある。しかしながら、実際の穀は、できるだけ注意深く取り除かれなければならない。これは、穀がβ−アミラーゼの浸透を妨げるほど稠密なためである。従って、脱穀された大麦とは、穀粒の実際の殻は取り除かれているが、内胚乳はそのまま残されている大麦を意味する。実際には、これは、脱穀されていない穀粒の重量の最大約２０％が、脱穀によって取り除かれることを意味する。通常１０ないし２０％が、殻物質として取り除かれる。その場合は、内胚乳の最も外側の層（果皮層、種皮層及び糊粉層）は、抽出水への不溶性物質の出入り及び本質的には、可溶性物質の出入りも防止する限外フィルター類のように機能する。この方法によって加工された穀粒から得られた抽出物は。比較的純粋であり、そしてそれは、酵素の精製及び濃縮のような更なる加工を促進する。加圧濾過及び限外濾過のような酵素産業において一般的に知られている方法が、更なる加工において使用され得る。
【００１４】
穀物は、水のような水性媒体中、又は緩衝溶液中で抽出される。抽出の間、ｐＨは通常、６．０から６．５の間である。抽出は、好ましくは還元条件で実施される。穀粒の構造タンパク質に結合しているβ−アミラーゼが解離される程の還元活性が使用される。還元条件は、本質的に既知の方法において、実際には、たいていＳＯ２を用いて、例えばメタ重亜硫酸ナトリウム及び／又は亜硫酸ナトリウムを添加することによって調整される。脱穀した穀粒と水性媒体の比は、好ましくは５：８から２：３の間である（重量／体積）。本発明の方法は、工業規模の方法として適しており、抽出は、スチールサイロ中で実施され、そしてそこへ、例えば脱穀された大麦１９トン及びメタ重亜硫酸ナトリウムを０．５％及び亜硫酸ナトリウムを０．５％含む水２９ｍ３が添加される。
【００１５】
上記の方法で大麦を抽出することにより、大麦の総β−アミラーゼ含有量の約４５％ないし５０％を含む抽出収量が、穀粒内部に残っている水を分離することなく得られ得る。その場合における、抽出時間は約７２時間である。セルラーゼが抽出水へ添加される場合、穀物中のβ−アミラーゼの総量の６５％ほどが抽出され得ると同時に、抽出時間が約６０時間まで減少する。
【００１６】
セルロースは、グルコース単位がβ−１，４−グルコシド結合によって結合している直鎖グルコース多糖である。それは、植物の細胞壁中で見られ、そこに通常、リグニン及びヘミセルロースと共に存在する。セルロースの分解反応に関係する酵素は、セルラーゼだと考えられている。セルラーゼは、産業上、例えば澱粉製造、紙素材加工、布加工、醸造所におけるβ−グルカンの分解、及び製パン所における穀粉の質の改善に使用される。本発明に従った方法において、セルラーゼは、生きている穀粒のいかなる殻の下にある表面構造を分解する。
【００１７】
市販で入手可能なセルラーゼ製品は、バシラス属等の細菌、又は酵母菌（例えば、サッカロミセス）もしくは糸状菌等の菌類から誘導される。特に、多量のセルラーゼは、糸状菌から単離される。最も一般的に使用されるセルラーゼ産生菌は、フミコラ、フサリウム、ミセリオプトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）、アスペルギルス、ペニシリウム及びトリコデルマ属に属する。産生菌株のいくつかは、遺伝子変性される。本発明では、好ましくは糸状菌、特にトリコデルマ糸状菌から誘導されたセルラーゼを使用する。
【００１８】
市販の酵素配合物は、種々の酵素活性を有し、それらの量及び割合は、製造業者によってわずかに変化し得る。製品が少なくともセルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びβ−グルカナーゼ活性を有することが、本発明にとって必須である。これに関連して言い換えれば、セルラーゼは、少なくともセルロース、ヘミセルロース及びβ−グルカンを分解する酵素配合物として言及される。出願者によって試験された全ての市販のセルラーゼ製品（ジーンコア  インターナショナル（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ローム  エンザイマー  ゲーエムベーハー（Ｒｏｈｍ  Ｅｎｚｙｍｅｒ  ＧｍｂＨ）及びノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）社製）は、β−アミラーゼの収率を改善した。セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びβ−グルカナーゼ活性は、例えば、ノボ社の実用生物工学手引き書，１９８６年に記載されている。
【００１９】
セルラーゼは、例えば、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ及びセルビアーゼに分類され得る。エンドセルラーゼ、とりわけ、１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼは、分子内部のセルロースのβ−１，４結合をランダムに開裂し、オリゴ糖を形成する。エキソセルラーゼ、とりわけ、１，４−β−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼは、分子末端のβ−１，４結合を開裂し、グルコースを解離する。セルビオースに対するそれらの効果は遅い。エキソセロビオヒドロラーゼ、とりわけ、１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼは、分子の非還元末端で、上記結合を開裂し、セルビオースを形成し、そしてセルビアーゼ、とりわけ、β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼは、セルビオースをグルコースへ開裂する。グルコースへのセルロースの加水分解は、分子の内部及び置換基質も開裂するが、結晶化セルロースは分解しないエンドグルカナーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ，ＥＣ３．２．１．４）、結晶化セルロースを開列するセロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ，Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）及びセルビオース及びセル−オリゴ糖をグルコースへ開裂するセルビアーゼであるβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ，Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を必要とする。
【００２０】
ヘミセルロース、とりわけ自然に存在するような多糖を分解し、ペントース、例えば、アラビナン、ガラクタン、マンナン及びキシランを含む酵素群は、ヘミセルラーゼと呼ばれる。β−グルカナーゼは、β−Ｄ−グルカン、とりわけ、枝分かれされ得り、かつβ−１，３及びβ−１，４結合の両方を含むグルコースポリマーを分解する。β−グルカンは、例えば、穀粒の内胚乳細胞の細胞壁中で見られる。リケナーゼは、β−１，３及びβ−１，４結合を含むβ−グルカンのβ−１，４結合を開裂するエンド−β−グルカナーゼ（１，３、１，４−β−Ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ）である。ラミナリナーゼ（１，３−β−Ｄ−グルカン−３−グルカノヒドロラーゼ）は、ラミナリン型炭水化物のβ−１，３結合のような、β−１，３結合のみを含むβ−グルカンを開裂し、そしてエキソグルカナーゼ（１，３−β−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、β−１，３−グルカンのβ−１，３結合を開裂し、主にグルコースを形成する。
【００２１】
β−アミラーゼの抽出において、所望の結果、例えば、ジーンコア  インターナショナル（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製のセルラーゼ配合物、スペザイムＣＥ（Ｓｐｅｚｙｍｅ  ＣＥ）及びＧＣ４４０を用いて達成される。最後に言及したものは、遺伝子変性されたトリコデルマ  ロンギブラチアタム菌株から誘導され、そしてそれは、セルロース、ヘミセルロース及びβ−グルカンを、特に効果的に分解する。その活性は、カルボキシメチルセルロース（ＲＢＢ−ＣＭＣ）上の効果として表され、すなわち、ＲＢＢ−ＣＭＣ活性は、少なくとも１４００ｌＵ／ｇである。ＧＣ４４０は、セルラーゼ活性に加えて、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びアセチルエステラーゼ活性を有する。ＧＣ４４０の典型的なバッチは、平均約７０００ないし９０００Ｕ／ｍＬのＤＮＳ−ＣＭＣ、約６０００ないし８０００Ｕ／ｍＬのβ−グルカナーゼ、約８０ないし９０Ｕ／ｍＬのβ−グルコシダーゼ、約５００ないし６００ｎＫａｔ／ｍＬのβ−キシロシダーゼ、約１７００ないし２０００ｎＫａｔ／ｍＬのアセチルエステラーゼ、約７００ないし１４００Ｕ／ｍＬのＲＢＢキシラナーゼ及び約１９００ないし２１００Ｕ／ｍＬのＤＮＳキシラナーゼを含む。非常に良好な結果は、ローム  エンザイム  ゲーエムベーハー（Ｒｏｈｍ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＧｍｂＨ）社製のセルラーゼを使用しても達成され、そしてそれは、商標名ロハラーゼセプ（登録商標：Ｒｏｈａｌａｓｅ）として売られている。配合物は、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株から誘導され、そしてそれは多量のβ−１，４−エンドグルカナーゼ活性（少なくとも４７００ＣＵ／ｇ）及びキシラナーゼ（少なくとも３０００ＸｙｌＨ／ｇ）及び、少量のセロビオヒドロラーゼ活性を含む。それは、β−１，３−グルカナーゼ活性、とりわけラミナリナーゼも含む。上記酵素配合物を使用する場合、セルラーゼの適当量は、穀物の重量の、少なくとも０．０１５％、好ましくは、少なくとも０．０２０％、例えば、０．０１８ないし０．０４０％及び特には、０．０２４ないし０．０３０％である。
【００２２】
β−アミラーゼは、セルラーゼの存在下において、２０ないし４５℃の温度において抽出され得る。温度は、好ましくは２５ないし３２℃、例えば２９ないし３１℃である。抽出時間は、３０ないし７２時間であり得り、通常、少なくとも４８時間、例えば４８ないし６６時間及び特には、５５ないし６２時間である。３０℃においての適当な抽出時間は、約６０時間である。抽出が完了した後、穀粒、ひき割り小麦又は穀粉を、例えば篩を用いて、抽出水から分離し、そしてβ−アミラーゼを抽出水から回収し、そして、所望により、それを精製及び／又は濃縮する。
【００２３】
抽出後、この方法で抽出及び分離された穀物は、例えば、澱粉を製造するために使用され得る。本発明に従って、β−アミラーゼが抽出され及び抽出物は、澱粉が分画され、穀物から分離される前に、穀物から分離される。もしも、破壊されていない穀粒から、酵素が抽出された場合、抽出された穀粒は、まず製粉され、その後、澱粉製造加工が、本質的に既知の方法、とりわけ、製粉した穀粒を水へ混合し、穀物を、篩いかけ及び遠心力を利用して画分化することによって実施される。製粉の間、粘度を減少させ、タンパク質から澱粉を分離するために、通常、セルラーゼをβ−グルカナーゼと一緒に添加する。
【００２４】
以下の実施例は、そこに開示された態様に制限することなく、本発明を説明する。
【実施例１】
【００２５】
β−アミラーゼの決定
穀物からのβ−アミラーゼの総量を決定する前に、いかなる殻も取り除き、乾燥して微細な穀粉になる場合には、分析される穀物を製粉し、そしてその１０ｇを１００ｍＬ三角ボトル中に入れる。０．５％（重量／体積）亜硫酸ナトリウム溶液１００ｍＬを添加し、その物質を、適当に混合した。混合物は、ボトル内に２４時間放置されるが、それは時々、振とうされる。この後、それを適当に混合し、薄い濾紙（ＭＷ６４０Ｗ）を通して、濾過した。濾液を、蒸留水を用いて１：５０の比で希釈し、その活性を下記の方法によって決定した。この酵素検定は、下記の実施例において、抽出溶液のβ−アミラーゼ含有量を決定するため等にも使用される。
【００２６】
原則として、β−アミラーゼは、食物化学処方集  第４巻，一般試験及び装置，４８５頁に記載された通りに決定された。
【００２７】
ここで、ＤＰ（糖化力）は、２０℃において、１時間に、基質１００ｍＬからフェーリング溶液５ｍＬを還元するのに十分な量の還元糖を生ずる５％試料希釈溶液０．１ｍＬ中の酵素の量として定義される（決定方法は、ＤＰの定義に相当しない。）。
【００２８】
酵素活性は、２０℃、ｐＨ４．６において、３０分間、澱粉を加水分解することによって決定された。結果として生じた還元糖は、アルカリ性フェリシアン化物を用いた滴定によって決定された。澱粉基質を製造するために、澱粉（ベーカー（Ｂａｋｅｒ）１１３０）２０ｇ（乾燥物質）を水約５０ｍＬと共に混合した。熱湯約５００ｍＬを添加し、その混合物を厳密に２時間煮沸した。酢酸緩衝液２０ｍＬ（０．５Ｍ、ｐＨ４．６）を冷却した澱粉溶液へ添加し、蒸留水で１Ｌまで希釈した。２０℃に調節した澱粉基質２００ｍＬを、２５０ｍＬメスフラスコ中へピペットで移し、希釈した酵素試料１０ｍＬを添加し、物質を十分に混合した。試料を、厳密に３０分間、水浴中で２０℃において保温し、０．５ＮのＮａＯＨ２０ｍＬを添加した。物質を十分に混合し、２５０ｍＬまで希釈した。酵素希釈液１０ｍＬ及び０．５ＮのＮａＯＨ２０ｍＬを、０−試料として、２５０ｍＬメスフラスコ中へピペットで移した。物質を十分に混合し、澱粉基質２００ｍＬを添加し、そして２５０ｍＬまで希釈した。
【００２９】
０．０５Ｎのフェリシアン化試薬を、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）１６．５ｇ及び炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）２２ｇを水中に溶解させ、１Ｌまでそれを希釈することによって調製した。Ａ−Ｐ−Ｚ溶液は、塩化カリウム（ＫＣｌ）７０ｇ及び硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）２０ｇを蒸留水７００ｍＬ中に溶解させ、濃酢酸２００ｍＬを添加し、１Ｌまでそれを希釈することによって調製した。ヨウ化カリウム溶液を、ヨウ化カリウム（ＫＪ）５０ｇを蒸留水１００ｍＬ中に溶解させ、５０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を２滴添加することによって調製した。フェリシアン化試薬１０ｍＬ及び試料５ｍＬを、２５０ｍＬメスフラスコ中へピペットで移した。これらを十分に混合し、熱湯浴中で、厳密に２０分間加熱した。溶液を冷まし、Ａ−Ｐ−Ｚ試薬２５ｍＬ及びＫＪ溶液１ｍＬを添加した。青色が消えるまで（紺青色＞白色）、混合物を、０．０５Ｎ硫酸ナトリウム溶液で滴定した。
【００３０】
β−アミラーゼ活性は、次式
活性＝（Ｖ０−Ｖ１）×２３×Ｋ／１００    ＤＰ°／ｍＬ
Ｖ０＝０−試料での滴定による消費量（ｍＬ）
Ｖ１＝試料での滴定による消費量（ｍＬ）
Ｋ＝希釈率
から計算した。
【実施例２】
【００３１】
β−アミラーゼの抽出時間におけるセルラーゼの効果を研究した。β−アミラーゼを、セルラーゼなし及びセルラーゼ有りで大麦から抽出した。脱穀機で脱穀した大麦１０ｋｇを、メタ重亜硫酸ナトリウム０．５％及び亜硫酸ナトリウム０．５％を含む水１５Ｌ中で抽出した。更に、ジーンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）社製のセルラーゼ、ＧＣ４４０を第二バッチへ添加したが、セルラーゼの量は、脱穀した大麦の重量の０．０２９％に相当する。抽出を３０℃において実施した。抽出に使用された穀粒の活性は、実施例１に従って決定し、１５５ＤＰ°／ｇであった。結果を表１及び２に示す。
表１：セルラーゼなしでの抽出
【表１】
2004520830.tif 000002
表２：セルラーゼ有りでの抽出
【表２】
2004520830.tif 000003
【００３２】
結果は、抽出水へのセルラーゼの添加がβ−アミラーゼの抽出時間を減少させることを示している。
【実施例３】
【００３３】
抽出収率におけるセルラーゼの影響を研究した。１５５ＤＰ°／ｇのβ−アミラーゼ活性を有する脱穀した大麦１０ｋｇを、メタ重亜硫酸ナトリウム０．５％及び亜硫酸ナトリウム０．５％を含む水１５Ｌ中で抽出した。抽出を、セルラーゼなし又はセルラーゼ存在下のどちらかにおいて、３０℃で実施した。
【００３４】
セルラーゼなしのものの抽出時間は、７２時間であった。使用した大麦の総量の総活性は、１５５０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、９５°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を８１７５ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、７７６．６ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、５０．１％であった。
【００３５】
相当する抽出を、脱穀した大麦の重量の０．０２５％に相当する量のＧＣ４４０を添加することによって、セルラーゼの存在下において実施した。抽出時間は６０時間であった。使用した大麦の総量の総活性は、１５５０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、１０２°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を９８２５ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、１００２．２ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、６４．７％であった。
【００３６】
結果は、抽出水へのセルラーゼの添加がβ−アミラーゼの収率を非常に増加させることを示している。
【実施例４】
【００３７】
β−アミラーゼの抽出における温度の効果を研究した。脱穀した大麦を、セルラーゼの存在下で異なる温度において、上記実施例に記載した方法で抽出した。セルラーゼ、ＧＣ４４０の用量は、脱穀した大麦の重量の０．０２７％に相当し、そして抽出温度は、２０℃、２５℃、３０℃又は４０℃であった。結果を図１に示す。最良の結果は、３０℃において得られた。
【実施例５】
【００３８】
小麦からのβ−アミラーゼ収率におけるセルラーゼの効果を研究した。１２８ＤＰ°／ｇのβ−アミラーゼ活性を有する粉砕した小麦１０ｋｇを、メタ重亜硫酸ナトリウム０．５％及び亜硫酸ナトリウム０．５％を含む水１５Ｌ中で抽出した。抽出を、セルラーゼなし又はセルラーゼ存在下のどちらかにおいて、３０℃で実施した。
【００３９】
セルラーゼなしのものの抽出時間は、７２時間であった。使用した小麦の総活性は、１２８０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、５５°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を９１７５ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、５０４．６ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、３９．４％であった。
【００４０】
相当する抽出を、粉砕した小麦に相当するひき割り小麦の重量の０．０３６％に相当する量のセルラーゼ、ＧＣ４４０を添加することによって、セルラーゼの存在下において実施した。抽出時間は６０時間であった。使用した小麦の総活性は、１２８０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、７２°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を１００８０ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、７２５．８ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、５６．７％であった。
【００４１】
結果は、抽出水へのセルラーゼの添加がβ−アミラーゼの収率を非常に増加させることを示している。
【実施例６】
【００４２】
研磨した小麦からのβ−アミラーゼ収率におけるセルラーゼの効果を研究した。精米機を用いて、表面を壊し、最外部を取り除くことによって、言い換えれば、果皮の大部分を取り除きかつ種皮を少ししか傷つけずに小麦を研磨した。１２８ＤＰ°／ｇのβ−アミラーゼ活性を有する研磨した小麦１０ｋｇを、メタ重亜硫酸ナトリウム０．５％及び亜硫酸ナトリウム０．５％を含む水１５Ｌ中で抽出した。抽出を、セルラーゼなし又はセルラーゼ存在下のどちらかにおいて、３０℃で実施した。
【００４３】
セルラーゼなしのものの抽出時間は、７２時間であった。使用した小麦の総活性は、１２８０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、１５°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を９７８０ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、１４６．７ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、１１．５％であった。
【００４４】
相当する抽出を、粉砕した小麦に相当する研磨した小麦の重量の０．０３６％に相当する量のセルラーゼ、ＧＣ４４０を添加することによって、セルラーゼの存在下において実施した。抽出時間は６０時間であった。使用した小麦の総活性は、１２８０ｋＤＰ°であった。篩を用いて抽出物を分離することにより、３５°ＤＰ／ｍＬの活性を有する抽出物を９２５０ｍＬ得た。従って、得られた抽出物の総活性は、３２３．８ｋＤＰ°／ｍＬであり、抽出物収率は、２５．３％であった。
【００４５】
結果は、抽出水へのセルラーゼの添加がβ−アミラーゼの収率を非常に増加させることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】時間関数に対するβ−アミラーゼの収率への温度の影響。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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