(57)【要約】【課題】顕微鏡結像の際の濃淡コントラストを高めるための方法【解決手段】顕微鏡の照明視野絞り平面内に存在する格子構造が、顕微鏡の物体平面およびＴＶ中間像平面と「共焦点」に配置され、この配置によって、格子構造が顕微鏡の物体平面内に射影され、このように構造化された物体が後続の光学系を通じて顕微鏡のＴＶ中間像平面内に結像され、この構造化された物体の変調濃度を計算することによって、光学断面が作り出され、物体の３次元把握が、その物体がいくつかの鮮明面内で観察方向に垂直に結像され、アレー検出器（たとえばＣＣＤカメラ）を介して検出されることによって実現される、構造化された照明の方法および実現は反射顕微鏡法および蛍光顕微鏡法において使用することができる。【選択図】図３
2004506234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角　ψｎ＝ｎ・２π／Ｎ，　ｎ＝投射された構造の　０．．．Ｎ−１　を有する物体の　Ｎ＞＝３　構造化された像の検出、
・　式５ｂによってＮ個のさまざまな位相角を有する像を評価することによる光学的断面の生成
【式５ｂ】2004506234.tif 000029
【請求項２】
光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　投射された構造の３位相角　０°，１２０°，２４０°を有する物体の３個の構造化された像の検出、
・　式１０によってさまざまな位相角を有する３個の像を評価することによる光学的断面の生成
【式１０】2004506234.tif 000030
【請求項３】
光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　投射された構造の４位相角　０°，９０°，１８０°，２７０°を有する物体の４個の構造化された像の検出、
・　式１１によってさまざまな位相角を有する４個の像を評価することによる光学的断面の生成
【式１１】2004506234.tif 000031
【請求項４】
物体内への周期的構造の投射による、光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角　ψｎ＝ｎ・２π／Ｎ，　ｎ＝投射された構造の　０．．．Ｎ−１　を有する物体の　Ｎ＞＝３　構造化された像の検出、
・　これによって計算された物体の像が増大されていない濃淡弁別を有し、式７による構造のない像の計算
【式７】2004506234.tif 000032
【請求項５】
物体内への周期的構造の投射による、光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角０°および１８０°を有する物体の２個の構造化された像の検出、
・　これによって計算された物体の像が増大されていない濃淡弁別を有し、式１２ｃによる合成の像の計算
【式１２ｃ】2004506234.tif 000033
【請求項６】
物体内への周期的構造の投射による、光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角０°，９０°，１８０°および２７０°を有する物体の４個の構造化された像の検出、
・　これによって計算された物体の像が増大されていない濃淡弁別を有し、式７による合成の像の計算。
【式７】2004506234.tif 000034
【請求項７】
物体内への周期的構造の投射による、光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角０°，１２０°および２４０°を有する物体の３個の構造化された像の検出、
・　これによって計算された物体の像が増大されていない濃淡弁別を有し、式１２ａによる合成の像の計算
【式１２ａ】2004506234.tif 000035
【請求項８】
物体内への周期的構造の投射による、光学的結像システムの濃淡弁別を増大させるための、以下による配置；
・　物体内への周期的構造の投射、
・　位相角０°，９０°，１８０°および２７０°を有する物体の４個の構造化された像の検出、
・　これによって計算された物体の像が増大されていない濃淡弁別を有し、式１２ｂによる合成の像の計算
【式１２ｂ】2004506234.tif 000036
【請求項９】
光学的に結像するシステムの濃淡弁別を増大させるための配置であって、投射された構造の場所の位相が、光軸に垂直な１本の軸のまわりに回転可能な平行平面板によって調節される、請求項１から９の１項に記載の配置
【請求項１０】
場所の位相が、ガルヴァーニ・スキャナによって調節される、請求項９に記載の配置
【請求項１１】
付加的に構造を軸方向に動かすことができる、請求項１から１０の１項に記載の配置
【請求項１２】
付加的に「照明側円筒レンズ」を軸方向に動かすことができる、請求項１から１０の１項に記載の配置
【請求項１３】
モータ移動を有する、請求項１１または１２に記載の配置
【請求項１４】
図７ａ，７ｂに対応するモータ移動を有する、請求項１１に記載の配置
【請求項１５】
図９に対応する光学楔のモータ移動を有する、請求項１１に記載の配置
【請求項１６】
光に鋭敏な検出器による光強度の測定を有する、請求項１から１５の１項に記載の配置
【請求項１７】
光に鋭敏な検出器による光強度の測定を有する配置であって、光に鋭敏な検出器としてフォトダイオードが使用されている請求項１６に記載の配置
【請求項１８】
光に鋭敏な検出器のデジタル化された信号が、像の輝度を正規化するために使用される、請求項１６または１７に記載の配置
【請求項１９】
光に鋭敏な検出器のデジタル化された信号が、
【式１７】2004506234.tif 000037
を用いて像の輝度を正規化するために使用される、請求項１８に記載の配置
【請求項２０】
濃淡弁別された像の計算が、以下の式によって与えられる方程式系の解によって得られる、請求項１から１９の１項に記載の配置
【式２０】2004506234.tif 000038
【式２１】2004506234.tif 000039
【式２２】2004506234.tif 000040
【請求項２１】
露光時間を制御するために駆動可能なロックが配置されている、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２２】
人工構造の最小化が
【式２４】2004506234.tif 000041
に記載の平均化利用によって行われる、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２３】
周期的な構造が押し込み可能なモジュール内に配置されている、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２４】
周期的な構造が交換可能な、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２５】
自動認識のために線コードを有する周期的構造のコード化が配置されている、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２６】
顕微鏡法内での利用により特徴付けられる、先行請求項の１項に記載の配置
【請求項２７】
照明内の顕微鏡法内での利用により特徴付けられる、請求項２６に記載の配置
【請求項２８】
照明・明視野内の顕微鏡法内での利用により特徴付けられる、請求項２７に記載の配置
【請求項２９】
透過光内の顕微鏡法内での利用により特徴付けられる、請求項２７に記載の配置
【請求項３０】
照明蛍光顕微鏡法内での利用により特徴付けられる、請求項２７に記載の配置
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡結像の際の濃淡コントラストを高めるための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
＜特許＞
［１］　グレーブラー他
ＵＳ特許５，４９３，４００「検査すべき表面上にテストパターンを投影するための配置」　優先権　１９９３年６月７日
［２］　Ｇ．シェッぺ他
ＤＥ出願「光学的投影格子」　優先権　１９９３年１０月２６日
［３］　Ｇ．シェッぺ
顕微鏡像の濃淡選択をするための方法および装置
ＤＥ整理番号１９９　３０　８１６．０，１９９９年７月９日
［４］　ベン・レヴィ他
ＵＳ特許５，８６７，６０４「像測定システム」０８／５１０，６３２の一部継続、優先権　１９９５年８月３日ＵＳ
［５］　ベン・レヴィ他
ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０６５０９「像測定システム」　優先権　１９９５年８月３日
【０００３】
＜学術文献＞
［６］　Ｔ．ウィルソン他
「在来型顕微鏡において構造化された光を用いて光学的断面を得る方法、」Ｏｐｔｉｃｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２（２４）１９９７
［７］　Ｔ．ウィルソン他、
「巨視的構造の実時間３次元撮像」Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　１９１（２）１９９８
［８］　Ｍ．Ａ．Ａ．ネイル他、
「２ビーム干渉照明による実時間３次元蛍光顕微鏡法」Ｏｐｔｉｃｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　１５３，１９９８
［９］　Ｆ．ランニ他、
雑誌「像ニューロン・実験室マニュアル」に発表、「細胞、組織、小有機体の光学的断面蛍光顕微鏡法のための格子像システム」、編集Ｒ．ユステ、Ｆ．ランニ、Ａ．コナース、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版（２０００）
［１０］　Ｑ．Ｓ．ハンリー、Ｐ．Ｊ．ヴァーヴィヤー、Ｔ．Ｍ．ジョーヴィン
「プログラム可能なアレー顕微鏡における光学的断面蛍光分光計」，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ５２（６）７８３（１９９８）
【０００４】
【課題を解決するための手段】
従来の上記方法および実現（［１］［２］［３］［４］［５］［６］［７］［８］［９］［１０］）は、準共焦点光学断面を作り出すために構造化された照明として特徴づけることができる。本方法を実現する際に、顕微鏡の照明視野絞り平面内に存在する格子構造が、顕微鏡の物体平面およびＴＶ中間像平面と「共焦点」に配置される（［４］［５］［６］［７］［９］）。「共焦点」という概念は、格子、物体および中間像平面が光学的共役面内に存在するという事実を考慮に入れている。この配置によって、格子構造が顕微鏡の物体平面内に射影され、このように構造化された物体が、後続の光学系を通じて顕微鏡のＴＶ中間像平面内に結像される。構造化された物体の変調濃度を計算することによって、光学断面が作り出される。
【０００５】
物体の３次元把握が、その物体がいくつかの鮮明面内で観察方向に垂直に結像され、アレー検出器（たとえばＣＣＤカメラ）を介して検出されることによって実現される。優先的に、ここに呈示する構造化された照明の方法および実現は反射顕微鏡法および蛍光顕微鏡法において使用することができる。原理的に本方法の利用は、光と物質との線型相互作用すべてにおいて可能である。同時に本方法は、顕微鏡法における利用に限定されるものではない。
【０００６】
【発明の実施の形態】
図１に、構造化された照明の単純化された光学スキームを示す。記入されているのは像を作る光路（ハッチ光路）である。呈示されている光学配置の鮮明面内に存在する１次元透過格子（３）が、光源（１）および後置のコレクタ光学系（２）によって照明されている。透過格子は軸方向に（システムの光軸に平行に）動くことができる。可能な動きは記入した矢印によって示す。格子に続いて光の方向に平行平面ガラス板（４）がある。平行平面板が光軸となす角は定義どおり調節することができる。
【０００７】
後続する照明側の「レンズ（５＋６）」（レンズの名で、ここでは一般に複雑なレンズ系と理解すべきである：円筒レンズおよび対物レンズもしくはコンデンサ）によって構造がプレパラート平面（７）内に結像される。矢印で示した可能なレンズ（５）（円筒レンズ）の動きは、円筒レンズの軸方向の変移が本質的に鮮明面の軸方向の変移に等しいから、格子（３）の動きに代わる別の解決法として使用できる。）
プレパラートから出て行く光は、またレンズ対（８＋９）（対物レンズおよび円筒レンズ）を通じて、それに続く鮮明面（１０）内に結像される。
【０００８】
図２に、一般に現れる図１の光学配置の軸方向色収差を図示する。記入されているのは２つの異なる波長についてのハッチ光路である。組み合わせレンズの軸方向色収差によって、鮮明面は異なる波長について軸上異なる場所にある。格子（もしくは円筒レンズ（５））を軸上変移させることによって、この軸方向色収差は補正することができる。このことは格子位置（３ａ）および（３ｂ）によって示唆されている。
【０００９】
そのほか、両波長について試料内の軸上同一でない場所が鮮明に結像される。このことは鮮明面（７ａ）および（７ｂ）によって示されている。鮮明面（７ａ）もしくは（７ｂ）の位置における差異は、たとえば多重蛍光の際に誤りのある物体の把握を可能とさせる。物体内における鮮明面の色変移は、軸上位置をソフトウェア補正することを通じて考慮することができる。
【００１０】
図３に、顕微鏡法において照明蛍光検出するための図１もしくは図２による光学配置の実施例を示す。ランプ（１）および後続のレンズ（２）を介して、構造３（正弦格子または２進透過格子）が照明されている。構造の位置はたとえばモータで駆動される偏心動を通じて軸方向に変化することができる（図７参照）。駆動するために、偏心モータはケーブルを通じて制御エレクトロニクスと結合している。これに続く平行平面の透明なガラス板（４）（材質たとえばＢＫ７または石英ガラス）を、たとえばスキャナ（図７）を介して、光軸に相対的にさまざまな角位置に置き換えることができる。駆動するために、スキャナはケーブルを通じてエレクトロニクス・ボックスと結合している。板を平行移動させることによって、構造の場所の位相は変化することができる（図５）。後続の（照明側の）円筒レンズ（５）は、構造を顕微鏡のＩＣＳ光学系の無限遠空間に結像させる。
【００１１】
励起フィルタ（７）、ダイクロイック・ビームスプリッタ（１１）および対物レンズ（１０）によって、構造はプレパラート平面内に結像する。プレパラート（９）は高さ調節可能な対象テーブル（８）上に存在する。テーブル（８）の高さはドライブ（６）によって矢印方向に調節することができる。そのためドライブはケーブルを通じて電子制御（１５）と結合している。試料によって得られた蛍光は、ダイクロイック・ビームスプリッタおよび後続の放射フィルタ（１２）を通じて励起光から分離される。
【００１２】
励起フィルタ、ダイクロイック・ビームスプリッタおよび放射フィルタが、グループ（１８）に統合され示されている。構造化された蛍光放射は、最後に円筒レンズ（１３）を通じてカメラ中間像平面上に焦点を結ぶ。カメラ（１４）のＣＣＤチップは、このようにして構造化された蛍光放射を検出する。カメラデータはＰＣ（１６）へ伝送される。ＰＣによって制御エレクトロニクスへの電子インタフェースを通じて、構造（格子）の軸上位置および光軸に相対的な平行平面板の角度を調節することができる。
【００１３】
そのため制御エレクトロニクスは、たとえばガルヴァーニ・スキャナ（たとえばＭ２Ｔ、ジェネラル・スキャニング社製、０２４７２マサチューセッツ州ウォータータウン、アーセナル街５００）と結合している。最終的にはこれによって格子の場所の位相を設定することができる（図６）。
【００１４】
このほか、格子の軸上位置が調節可能である。これを用いて色の波長誤差を最小にすることができる（図２）。これによって、構造化された像を場所の位相に依存して検出し算出することが、さまざまな色の条件の下で光学的断面像を計算するために可能となる。計算の結果はモニタ１７上で示される。照明強度を測定するために、たとえば平行平面板（２０）を通じて励起光のわずかな部分を結合から外し、レンズを通じてフォトダイオード（１９）上に焦点を結ばせる。フォトダイオードの電圧は制御エレクトロニクスへのケーブル結合を通じて導かれる。アナログ・デジタル変換後、デジタル値が光源の不安定を補正するために使用される。
格子を軸上変移させることおよび平行平面板の角度を調節することを実現する可能な方法は、図７から知れる。
【００１５】
図４に、反射する試料の場合についての対応する配置を示す。そのため、図３で枠で囲んだ構成グループ（１８）は、５０：５０ビームスプリッタ（２１）（たとえば半透明鏡）によって置き換えられる。
【００１６】
図５に、カメラ検出用露光サイクルを制御するための電子ロック（「シャッタ」）を有する、拡大されたシステムを示す。ここに示したシャッタは、光軸との角度をたとえばガルヴァーニ・スキャナを介して調節することができる平面鏡（２２）、後続のプリズム（２１）および固定鏡（２３）から成る。ここに示した、光軸との調節可能な角度を有する平面鏡、プリズムおよび固定平面鏡の組み合わせによって、光学配置の「開」位置（通り抜けられる線を有する光路）および「閉」位置（破線の光路）を実現することができる。
【００１７】
本配置は迅速な光源の「入りおよび切り」を可能とする。実際の切り換え時間が約１ないし１０ｍｓの範囲にある。最小閉鎖時間は、典型的な鏡の直径の場合スキャナの反応時間によって約２０ｍｓに制限される。
ここで本質的な長所が、速い本配置の切り換え時間、および通常のロックに比較して無視できる配置の磨耗である。図６に格子の位置の位相を調節するためのスキームを示す。ここに示した方形格子１は、平行平面ガラス板２を通じて結像される。板の角度に依存して、格子像３は変移させることができる。これによって格子の位相を調節することがそれの機械的な動きなしに可能である。
【００１８】
図７ａ）に、格子の軸上位置を調節するための、および平行平面板の角度を調節するための動作の側面図を示す。モータ（４）で駆動される偏心（３）を通じて、構造（２）の軸上位置（高さ）を調節することができる。ガルヴァーニ・スキャナ（５）が回転運動を通じて平行平面板（１）の角度を調節することを許す。図７ｂ）にこれの配置を平面図で示す。
【００１９】
図８に、２つの絞り開口が配置されているモジュール全体の実施例を示す。位置１で示す開口は、可変の虹彩絞り（顕微鏡の視野絞り）を有する、構造のない光学的通路である。位置２は、上に詳細に述べた光路内にある構造および平行平面板から成る光学配置を含む。前記した配置によって、容易にたとえば通常の照明顕微鏡法から構造照明へ変更することが可能である。そのため、モジュール全体を光軸に垂直にそれぞれ希望の位置に動かさなければならない。
【００２０】
図９に、色収差をＬＦＢ平面内で補正するための可能性を示す。そのため２個の光学的ガラス楔（１），（２）が使用され、ここで両方の楔のうち１個をリニアモータによって矢印で示した方向に変移することができる。示した配置は光学的行程の変化を許す。
図１０に、光学システムの実施例において、光学楔（図９）を介して色による距離誤差を補正するための光学行程変更を、組み込み形で示す。図示は楔配置（２１）以外は図３に対応する。
【００２１】
図１１に、顕微鏡システムおよび電子部品の概観を図示した。
図１２に、図７の格子（２）の支持具を、コード化した実施例を示す。示された５個の電子接触は、同様に示されている導体ピンによって、実行された格子支持を自動的に認識するために希望の２進情報を実現するのに使用される。特に機械的に交換可能な格子の場合、自動的に認識することによって、たとえば断面像を計算するための場所の位相を誤って調節することによる利用者の過失を避けるために、格子のコード化は有意義である。
【００２２】
図１３に機械的モジュールを自動的に認識するための実現法を示す。矢印によって示唆した両境界面の相対的な動きがあると、受光器はカバーが外され、すなわち開かれる。これによって自動的な位置認識が実現可能である。
【００２３】
【発明の実施の態様】
以下に、構造化された照明の原理を示す。顕微鏡の照明視野絞り（ＬＦＢ）の平面内に一つの構造が存在する。構造によって、以下のように１次元または２次元の周期的な構造が問題となろう。１次元または２次元の周期的構造（格子）は、たとえば石版で製造された透過格子または反射格子であり得る。格子は２進の形態（方形格子）も、または正弦形の形態（正弦格子）をも取り得る。
【００２４】
格子は適合した光学素子（照明側の円筒レンズ、およびたとえば対物レンズ）を通じて物体平面内に結像する。物体平面内に存在するのはたとえば：反射させるまたは蛍光化させる物体である。照明強度の水平構造は、線型の交換作用によって構造化された物体へ導く。構造化された物体は、ここでも対物レンズおよびＴＶ側の円筒レンズを通じて後続の中間像平面内に結像し、アレー検出器を介して登録される（図参照）。検出器のセンサ表面は、そのため中間像平面（顕微鏡のＴＶ出力）内に存在する。
【００２５】
構造化された照明を用いた顕微鏡での撮像の際に濃淡コントラストを増大させることは、結局、在来の顕微鏡での結像の際に平均値（またはＤＣ成分）のみが焦点を外れて消えないことに帰せられる。これに反して物体が、場所の周波数が０に等しくない構造によって照明されるならば、および続いて構成されて結像した像情報成分のみを評価するならば、ＤＣ成分（ゼロ周波数）は数値的に取り除くことができる。これによって濃淡コントラストは増大する。照明の構造は、光学系の焦点内に存在する物体の部分を「標識付け」する。
【００２６】
光学的断面の計算を行うためには、本質的に、構造化された物体の変調濃淡（＝ＡＣ成分）を画素ごとに決定しなければならない。単純な１次元周期的正弦型構造の場合、線型相互作用によって、場所の変数ｘ，ｙ、周期構造の場所の位相角についてのパラメタφとするとき、像側の強度Ｉ＝Ｉ（ｘ，ｙ，φ）は、式１により与えられる。ここで局所依存する変調濃淡ｍｘ，ｙ＝ｍ（ｘ，ｙ）である。
【式１】
2004506234.tif 000003
【００２７】
変調濃淡は、この場合一方では、格子周波数、結像光学系および観察される物体に依存する。
加法定理を使用して、これは式２と書ける。
【式２】
2004506234.tif 000004
【００２８】
この場合φは、正弦型に構造化された照明の位相角、ａ０ｘ，ｙはＤＣ成分（＝平均値）であり、
【式３】
2004506234.tif 000005
【式４】
2004506234.tif 000006
【００２９】
これから直ちに正弦周波数の局所変調濃淡について、
【式５ａ】
2004506234.tif 000007
となる。光学的断面像が、ちょうど像強度（＝ＤＣ成分）を乗じた変調濃淡である。
【式５ｂ】
2004506234.tif 000008
加えて位相角は、式６で計算できる。
【式６】
2004506234.tif 000009
【００３０】
最初に変調周波数に依存する係数ａ１ｘ，ｙおよびｂ１ｘ，ｙ、および局所依存する平均値は、他方位相を変えることによって、以下のように離散フーリエ変換を用いて書くことができる。
【式７】
2004506234.tif 000010
【式８】
2004506234.tif 000011
【式９】
2004506234.tif 000012
ここでＮは位相ステップ数である。
式７〜９を式５に代入することによって、局所変調濃淡ｍｘ，ｙは計算することができる。
【００３１】
３もしくは４位相ステップ用に、今求めた光学的断面についての公式は簡略化される。
３位相ステップ（０，２π／３，４π／３）用に、
【式１０】
2004506234.tif 000013
【００３２】
もしくは４位相ステップ（０，π／２，π，３π／２）用に、
【式１１】
2004506234.tif 000014
ＤＣ成分を計算するために、位相像を通じて「平均値」を計算することができる（式７）。
【００３３】
３位相角用に、
【式１２ａ】
2004506234.tif 000015
の結果となり、４位相に対応して、
【式１２ｂ】
2004506234.tif 000016
最も単純な場合、平均値の計算は２位相ステップによる。
【００３４】
【式１２ｃ】
2004506234.tif 000017
三角関数についての変移則に基き、計算の際に最後の式１２ｃの助けにより変調周波数が消去される。特にこの単純なアルゴリズムの有利な点は、方形格子（下記参照）を使用しても方形格子の全高調波が抑制されることにある。ｎを自然数とするとき、Ｎ＝２ｎについて、これは常に成り立つ。一般には２位相ステップより大きい位相ステップを使用する場合、これは成り立たない。たとえば３位相ステップの場合（式１２ａ）、第３高調波は平均値を算出する際に帯状の人工構造に導く。
【００３５】
一般に式７もしくは式１２によって計算されるＤＣ成分は、在来の顕微鏡撮像に対応している。濃淡コントラストはこれでは増大しない。利点は、この過程によって、光路から構造を機械的に取り除くことを必要とせず、光学的断面から在来の撮像へ「切り替える」ことが可能となるから、式７（１２）による「明視野情報」は特に有用であるということである。
【００３６】
ＤＣ成分ばかりでなく光学的断面（ＡＣ成分）も計算するなら、（適切な較正後）差像（ＤＣ−ＡＣ）による「アウト・オブ・フォーカス」情報も決定することができる。
方形格子を使用するとき、以下の級数展開を記述に使用することができる。
【式１３】
2004506234.tif 000018
たとえば試料として鏡に焦点を結ばせる際の格子周波数の変調濃淡は、非コヒーレント照明および照明露光の場合、変調伝達関数によって記述される［Ｔ．ウィルソン］。
【００３７】
【式１４】
2004506234.tif 000019
ここで、
ＮＡ＝開口数
λ＝波長
ｋ＝場所の周波数
上の公式は円形の瞳孔について成り立つ。焦点はずれの際、収差が複素数の位相因数として瞳孔関数を乗じられる。
【００３８】
式１０に基づき、３位相公式は内在的に方形格子のフーリエ展開（式１３，ｉ＝１）の第３高調波を抑制することがわかる。初めて第５高調波（ｉ＝２）が乱れ項に導き、これによって残留変調（人口構造）に導く。第５高調波が「光学的低域通過フィルタ」によって伝達されることができないよう、１次元格子の大きさが決められる、すなわち光学的境界周波数
【式１５】
2004506234.tif 000020
より大きく選択されるならば、人工構造はより高調波によって完全に抑制することができる。
【００３９】
式１１を利用する際、すなわち（局所的）変調濃淡を計算するため４位相ステップを使用する際、これは成立しない。式１１はこれによって、方形格子との関連において制限された形でのみ、たとえば、フーリエ展開においてすでに第３高調波が光学系によって伝達されない場合に使用することができる。利点は、式１１においてこの付加的な前提条件の下で、格子の第２高調波を内在的にアルゴリズムによって抑制することができるということである。
【００４０】
【実施例】
技術的実施例は、図３および図４に、およびさらに詳細な実施例について図５−８に示す。
結像システム内で蛍光顕微鏡法（図３）および反射顕微鏡法（図４）中で利用することについて利用されるべき実施例の、以下の項で述べる詳細を、ここで一度取り上げておく。
【００４１】
ここで以下の重要な実施例が問題となる。
・　平行平面板による位相設定（平面板マイクロメータ）
・　色距離誤差を補正するための格子の軸方向への（モータによる）動き（焦点補正）
・　光検出器（典型的にはフォトダイオード）を介して光強度を測定することによる光源不安定の補正、およびそれに続く、把握された個々の位相像をスカラー化することによる数値的補正
・　最適平均法による蛍光顕微鏡法における色素のたとえば色あせの補正
・　図５に対応するスキャナを介する速いシャッタの実現
・　格子の場所の位相がたとえば統計的に変化することの、方程式系を解くことによる補正
・　直交する２基の平面板マイクロメータ使用の下で２次元格子を使用するためのシステムの実現
【００４２】
平行平面板による位相変移
格子の位相位置の調節は、平行変移によって有利に実現することができる（平面板マイクロメータ）。原理は図６に示す。平行平面ガラス板（材質たとえばＢＫ７）が格子に続いて配置され、たとえばガルヴァーニ・スキャナによって正しく定義された角度が調節される。スキャナの使用は、正確かつ迅速な角度調節を行う上で特に有利となる。技術的に、これによって典型的な調節角度約＋／−１５°範囲、調節精度＜５０μｒａｄ、調節時間＜５ｍｓで可能である。
【００４３】
検出器に同期したデータ撮像は、２つの様式で実現することができる：
・　平行平面板の連続的な動きおよびカメラとの同期による
・　スキャン位置のステップごと、連続する移行
連続する位置決めは、構造化された物体のより高い変調濃淡（＝コントラスト）、もしくはコントラストがカメラの露光／読出し比に依存しないことの点で有利となる。
【００４４】
一方では励起側伝達を最適化するため、他方では平行平面板で多重反射を最小にするため、有利に全光学部品での反射を、特に構造（もしくは基板）および平行平面板での反射を抗反射層によって最小とすることができる。加えて有利となるのは、平行平面板を小さい角（ほぼ０°）で光路内にはめ込むことである。これによって迷反射光を絞ることができる。
【００４５】
焦点補正、色収差の均衡
たとえば蛍光を発する物体の結像と反射する物体の結像とはいくつかの点で同一ではあるが、たとえば蛍光を発する物体に存在する励起波長から放射波長への差（ストークス変位）によって、いくつかの本質的な観察すべき点が生じる。
通常は色補正された対物レンズもまた色距離誤差を有するから、格子、物体およびＴＶ中間像平面がそれぞれ励起・放射波長についてのみ光学的共役平面内にある。スペクトル比率を変更する（フィルタ交換）か、または対物レンズを交換するとき、一度調節した物体、格子およびカメラの鮮明位置はもはや与えられていない。このことは一方では構造化された像内でコントラストを減少させることとなり、他方ではより大きい色距離誤差によって、算出された光学的断面における帯状の人工構造へ導く。
【００４６】
カメラＺＢ上への物体の鮮明位置は、追焦点合わせすることによって実現することができる。しかしそれに加えて、物体平面に相対的な格子位置の補正が必要である。本特許願では、格子を物体上に鮮明位置決めするための手動またはモータによる調節可能性を有利に使用する方法を提供する。これはＩＣＳ光学系を使用し、２つの異なる方式に変形することができる：
ａ）図１の「円筒レンズ」を変移させる
ｂ）図２の格子位置を変移させる
【００４７】
励起および検出について実質的に同一の波長による場合も（反射顕微鏡法）、色収差によって、補正するために構造もしくは照明側の円筒レンズを軸上動かすことが必要となり得る。特に、これはたとえば可視スペクトル領域からＵＶへ変わる際に当てはまる。
格子位置の適応はたとえば偏心的な動きによって実現することができる（図７ａ，７ｂ）。十分な場所の振る舞い（すなわち十分小さい必要な焦点補正）のとき、光学楔を使用することも、またそれによって光学的行程を使用することも可能である（図９，１０）。
【００４８】
光源の時間的強度不安定性の補正
上の公式導出の中で時間的に一定な光源を前提としているため、一般にＮ＞＝３「位相像」を検出している間、光源の時間的強度変化が、計算された光学的断面像において帯状の人工構造に導く。この像品質に関して悪化させる照明の時間依存変化の影響を除くかもしくは最小にするよう、以下の通り処置することができる。第１ステップとして、光源強度を、たとえば受光器―たとえば普通に市販されているフォトダイオード―上に結像することによって、照明強度について測定値が得られる（図３，４，５に示す）。
【００４９】
積分の時間間隔はこの場合、カメラのＣＣＤチップの露光についての時間間隔に同調させる。フォトダイオード回路の電圧信号は、続いてＡＤ変換器を通じてデジタル化される。Ｎ個の個別像を場所の位相　φｎ＝２πｎ／Ｎ　で測定した後、これはたとえば以下のように正規化することができる。
【式１７】
2004506234.tif 000021
【００５０】
ここで位相像を通じて平均されたデジタル化されたフォトダイオード信号
【式１８】
2004506234.tif 000022
および補正因子
【式１９】
2004506234.tif 000023
である。
【００５１】
位相不安定性、位相調節速度
位相不安定性を最小にするため、温度安定化されたガルヴァーニ・スキャナ（たとえばＭ２Ｔ、ジェネラル・スキャニング社製）を使用するのが有利であり、このようなスキャナは数ミリ秒という短い位相調節時間をも許容する。位相安定性を最適化するため、スキャナは閉じた制御ループを通じて電子的に駆動される。
加えて、位相不安定性のＳＷ補正を、位相の測定およびそれに続く正弦関数による近似により、下記の方法に従って実施例することができる。
強度が３個以上のほとんど任意の位置で受入れられるならば、式７〜９において、射影された構造がそれぞれＮ分の１周期だけ正確に変移することによって出力される間に、変調濃淡も得られる。この場合まず式１において位相角φを構造の全位置について測定しなければならない。
【００５２】
これはさまざまな方法で行うことができる：
１．　構造の変移に責任のある機械的操作部（たとえばスキャナ）での測定による。
２．　受け入れられた像からの決定による、たとえばフーリエ変換による、または受け入れられた強度値を正弦関数で近似することによる。
３．　２．のように決定するが、ただし投影された構造が直接受け入れられるセンサを用いる。これは、光学素子を光路内に配置することにより得ることができ、光学素子は、試料からの強度を受け入れるためにも使用される検出器の部分領域上で構造を直接結像する。
構造の変移を決定する際、十分に変移をその最初の位置に相対的に決定することができる。
【００５３】
変調濃淡を決定するために、構造のＮ個の位置で受け入れられたＮ個の強度値を観測し、式２において第ｎ位置に引数ｎを与える。
【式２０】
2004506234.tif 000024
測定された強度Ｍｘ，ｙ（φｎ）は期待されるべき強度Ｉｘ，ｙ（φｎ）からは逸脱し得る。近似値としては本方法は最小平方誤差で使用することができる。
【００５４】
【式２１】
2004506234.tif 000025
ａ０ｘ，ｙ，ａ１ｘ，ｙおよびｂ１ｘ，ｙの導出は、線型方程式系
【式２２】
2004506234.tif 000026
を産出する。
【００５５】
本方程式系は、Ｎ＞２について解がある。本行列は位置のみに依存し、方程式系を解くために、一連の像当たり１回転置を要するのみである。変調濃淡はａ１ｘ，ｙおよびｂ１ｘ，ｙから式５を用いて得られる。
本方法は、他の関数により近似することによって、射影された構造が正弦型でない場合にも同様の方法で拡張することができる。
【００５６】
蛍光利用による色素の色あせの最小化
色素の色あせ効果を最小にするため、検査すべき試料を理想的にカメラ露光時のみ照明する。光学的断面を生成するために、たとえば３枚の個別位相像を受け入れるとき、継続露光の影響は、露光時間がデータ伝送時間（カメラからＰＣまで）に比較して短く選択できるほど、また露光強度が高く選択されるほど、大きい。デジタルＣＣＤカメラの典型的なデータ伝送時間は今日、分解能約５１２×５１２画素／像のとき約１０〜１００ｍｓの範囲にある。この時間範囲の露光時間のとき、すでに試料は、データ伝送を利用すべき時間に蛍光放射をせず、場合によってははっきり損傷している。
【００５７】
試料を可能な限り大切に取り扱うため、照明側に速いロック（シャッタ）を構築することが望ましい。容易な解決法が、電磁「ユニブリッツ」シャッタ、（ヴァンサン・アソシエーツ社製、１４６０７ニューヨーク州ロチェスター、ユニヴァシティ街１２５５）を使用することから成る。これに代わる解決法が図５に示した配置から成る。ここに示したシャッタは、光軸との角がたとえばスキャナを介して調節できる平面鏡（２２）、後続のプリズム（２１）および固定鏡（２３）から成る。この組み合わせによって、「開」すなわち通過位置（通り抜ける線の光路）および「閉」すなわちロック位置（破線の光路）を実現することができる。可能なスイッチング時間は使用されているスキャナおよび平面鏡の大きさに依存し、鏡の直径約２５ｍｍの典型的なスイッチング時間は約１ｍｓほどである。
【００５８】
蛍光利用において色素の色あせによる人工構造を最小化するためのアルゴリズム
色素の色あせを補償するよう、位相像受け入れについての下記の数列を線型結合において使用することができる。
【式２３】
2004506234.tif 000027
上記一連の数列は、この場合位相像を得るための時間的数列について成り立つ。
【００５９】
各３位相像から、
Ｉｘ，ｙ（０），Ｉｘ，ｙ（２π／３），Ｉｘ，ｙ（４π／３）および
Ｉｘ，ｙ（０），Ｉｘ，ｙ（４π／３），Ｉｘ，ｙ（２π／３），Ｉｘ，ｙ（０）
は、たとえばそれぞれ式１０使用の下に光学的断面を計算し、平均値を算出するためのものである。
【００６０】
【式２４】
2004506234.tif 000028
これによって、色あせ過程に線型で迫る方法において、光学的断面を計算する際の人工構造が最小となる。
【００６１】
格子認識、モジュール認識
在来の顕微鏡受け入れから構造化された照明へ容易に機械的切り替えを行い、逆に戻ることを可能とするため、光視野絞りを有する自由な位置と格子とを組み合わせるのが有利である。この状況は図８に示す。
構造化された照明の場合、濃淡弁別が、特に効果的な格子周波数に依存して再び照明側の全拡大（円筒レンズ＋コンデンサもしくは対物レンズ）によって決定されるから、投射を使用して格子を交換することができるよう、容易な可能性を生成するのが有利である。
誤った格子を装入した際の誤差を避けるため、たとえば機械的に把握した格子をコード化するのが有利である。このため、図１２に示したコーディングを使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】構造化された照明の単純化された光学スキーム
【図２】一般に現れる図１の光学配置の軸方向色収差
【図３】顕微鏡法において照明蛍光検出するための図１もしくは図２による光学配置
【図４】反射する試料の場合についての対応する配置
【図５】カメラ検出用露光サイクルを制御するための電子ロック（「シャッタ」）を有する、拡大されたシステム
【図６】格子の位置の位相を調節するためのスキーム
【図７】ａ）格子の軸上位置の調節および平行平面板の角度を調節するための動作の側図、ｂ）その配置の平面図
【図８】２つの絞り開口が配置されているモジュール全体の実施例
【図９】色収差をＬＦＢ平面内で補正するための可能性
【図１０】光学システムの実施例
【図１１】顕微鏡システムおよび電子部品の概観
【図１２】図７の格子（２）の支持具を、コード化した実施例
【図１３】機械的モジュールを自動的に認識するための実現法
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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2004506234.tif 000078
2004506234.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506234.tif 000080
2004506234.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506234.tif 000082
2004506234.tif 000083
【国際調査報告】
2004506234.tif 000084
2004506234.tif 000085
2004506234.tif 000086
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