(57)【要約】新規スブチリシン相同体（核酸及びタンパク質の両者）が提供される。新規タンパク質を含む組成物、組換え細胞、新規相同体を包含するシャフリング方法、新規相同体に対する抗体、及び相同体の使用方法が又は提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性中から選択された改良されたエンドプロテアーゼ活性を有する単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９６％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９７％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９８％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、少なくとも３０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、少なくとも５０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、少なくとも１００個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１〜配列番号１３０のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれかから選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；及び
（ｃ）上記ポリヌクレオチド配列（ａ）又は（ｂ）の実質的に完全な長さに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
から成る群から選択されたコードポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る請求項１期記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記同一性が、７０％の同一性を測定するよう設定されたデフォールトパラメーターを有するＢＬＡＳＴＰを用いて行われる配列の一列整列により決定される請求項１記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１７】
少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、ｐＨ依存性、温度依存性、イオン強度に対する依存性、リガンド結合による活性化及びリガンド結合による不活性化の中から選択された条件性質を含んで成るエンドプロテアーゼ活性を有する単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有する請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、少なくとも３０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、少なくとも５０個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、少なくとも１００個の連続したアミノ酸の比較窓にわたって、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１〜配列番号１３０のいずれかから選択されたポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれかから選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；及び
（ｃ）上記ポリヌクレオチド配列（ａ）又は（ｂ）の実質的に完全な長さに対して、緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
から成る群から選択されたコードポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基を含んで成る請求項１７記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２８】
（ａ）配列番号１〜配列番号１３０から選択されたポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３１〜配列番号２６０から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列；
（ｃ）上記ポリヌクレオチド配列（ａ）又は（ｂ）の実質的に完全な長さに対して、高い緊縮条件下でハイブリダイズし、又は成熟Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）ポリペプチドの位置７１〜９５， ８６〜１１０， １１１〜１３５又は１９６〜２２０に対応する、少なくとも２５個のアミノ酸をコードするその副配列に対してハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
（ｄ）エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の全体もしくはフラグメントを含んで成るポリヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つの完全な長さに対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；
（ｆ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性中から選択された改良されたエンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；及び
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）の１又は複数のポリヌクレオチド配列を突然変異誘発するか又は組換えることによって生成される、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性中から選択された改良されたエンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列から成る核酸によりコードされる単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号１３１〜２６０のいずれか１つのアミノ酸配列を含んで成る請求項２８記載の単離された又は組換えポリペプチド。
【請求項３０】
エンドプロテアーゼを含んで成る請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性から選択された少なくとも１つの性質を有するエンドプロテアーゼを含んで成る請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記エンドプロテアーゼが、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性から選択された複数の性質を含んで成る請求項３１記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、少なくとも約１５０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３４】
エンドプロテアーゼ活性を有するペプチドを含んで成る請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３５】
コードされるタンパク質の少なくとも２５０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３６】
エンドヌクレアーゼ活性を有する成熟タンパク質である、コードされるタンパク質の約２６９個のアミノ酸を含んで成る請求項３５記載のポリペプチド。
【請求項３７】
コードされるタンパク質の少なくとも３５０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項３３記載のポリペプチド。
【請求項３８】
プレ−プロペプチドであるコードされるタンパク質の約３８０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項３７記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つのポリペプチド配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４０】
分泌／局在化配列を含んで成る請求項１， １７， ２８又は３９のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ポリペプチド精製副配列をさらに含んで成る請求項１， １７， ２８又は３９のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチド精製配列が、エピトープ標識、ＦＬＡＧ標識、ポリヒスチジン標識及びＧＳＴ融合体から成る群から選択される請求項４１記載のポリペプチド。
【請求項４３】
Ｎ−末端でＭｅｔをさらに含んで成る請求項１， １７， ２８又は３９のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４４】
修飾されたアミノ酸を含んで成る請求項１， １７， ２８又は３９のいずれか１項記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記修飾されたアミノ酸が、グルコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸及びビオチニル化されたアミノ酸から成る群から選択される請求項４４記載のポリペプチド。
【請求項４６】
請求項１， １７， ２８又は３９のいずれか１項記載のポリペプチド、及び界面活性剤を含んで成る組成物。
【請求項４７】
Ｐ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６のいずれかに対応するポリペプチドに比較して、ユニークである、配列番号１３１〜配列番号２６０から選択されたポチペプチドにおけるユニーク副配列を含んで成るポリペプチド。
【請求項４８】
天然に存在するスブチリシンポリペプチド、又はＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６の１つ又は複数のポリペプチドに対応するスブチリシンポリペプチドにより控除される、配列番号１３１〜配列番号２６０の配列又はそのフラグメントを含んで成る１又は複数の抗原に対して生ぜしめられたポリクローナル抗血清により特異的に結合されるポリペプチド。
【請求項４９】
天然に存在するスブチリシンポリペプチド、又はＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６の１つ又は複数のポリペプチドに対して特異的に結合しない、配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つ又はそのサブフラグメントを含んで成る１又は複数の抗原を投与することにより生成される抗体又は抗血清。
【請求項５０】
天然に存在するスブチリシンポリペプチド、又はＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６の１つ又は複数のポリペプチドに対して特異的に結合しない、配列番号１３１〜配列番号２６０から成る群から選択された配列を含んで成るポリペプチドを特異的に結合する抗体又は抗血清。
【請求項５１】
（ａ）配列番号１〜配列番号１３０の１又は複数の配列を含んで成るポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１３１〜配列番号２６０から成るポリペプチド配列の群から選択されたポリペプチド配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的なポリヌクレオチド配列；
（ｃ）上記ポリヌクレオチド配列（ａ）又は（ｂ）の実質的に完全な長さに対して、高い緊縮条件下でハイブリダイズし、又は成熟Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）ポリペプチドのアミノ酸７１〜９５， ８６〜１１０， １１１〜１３５又は１９６〜２２０をコードする位置に対応する、少なくとも７５個のヌクレオチドを含んで成るその副配列に対してハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；及び
（ｄ）エンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフラグメントを含んで成るポリヌクレオチドから成る群から選択されたポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された又は組換え核酸。
【請求項５２】
下記式：
ＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴ−Ｘ７０−ＡＡＬ−Ｘ７４−Ｎ−Ｘ７６Ｘ７７−ＧＶ−Ｘ８０−ＧＶＡＰ−Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７−ＬＹ−Ｘ９０−ＶＫＶＬ−Ｘ９５−Ａ−Ｘ９７−Ｇ−Ｘ９９−ＧＳ−Ｘ１０２−Ｓ−Ｘ１０４−ＩＡ−Ｘ１０７−ＧＬ−Ｘ１１０−Ｗ−Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４−Ｎ−Ｘ１１６−Ｍ−Ｘ１１８−ＩＡＮ−Ｘ１２２−ＳＬＧ−Ｘ１２６Ｘ１２７Ｘ１２８−ＰＳ−Ｘ１３１−ＴＬ−Ｘ１３４Ｘ１３５−ＡＶＮ−Ｘ１３９−ＡＴＳ−Ｘ１４３Ｘ１４４−ＶＬＶＩＡＡ−Ｘ１５１−ＧＮ−Ｘ１５４−Ｇ−Ｘ１５６−ＧＳＶＧＹＰＡＲＹＡＮＡ−ＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮ−Ｘ１７９−ＲＡ−Ｘ１８２−ＦＳＱＹＧ−Ｘ１８８−Ｇ−Ｘ１９０−ＤＩＶＡＰＧＶ−Ｘ１９８Ｘ１９９Ｘ２００−ＳＴＹＰＧ−Ｘ２０６Ｘ２０７−Ｙ−Ｘ２０９Ｘ２１０Ｘ２１１Ｘ２１２−ＧＴＳＭＡ−Ｘ２１８−ＰＨＶＡＧ−Ｘ２２４−ＡＡＬ，
［式中、Ｘ７０はＩ又はＶであり；Ｘ７４はＤ又はＮであり；Ｘ７６はＤ， Ｓ又はＮであり；Ｘ７７はＩ， Ｖ又はＥであり；Ｘ８０はＩ， Ｖ又はＬであり；Ｘ８５はＮ、Ｅ又はＳであり； Ｘ８６はＡ又はＶであり；Ｘ８７はＤ又はＥであり；Ｘ９０はＡ又はＧであり；Ｘ９５はＧ， Ｓ又はＲであり；Ｘ９７はＳ又はＮであり；Ｘ９９はＳ， Ａ又はＲであり；Ｘ１０２はＩ又はＶであり；Ｘ１０４はＧ又はＳであり；Ｘ１０７はＲ又はＱであり；Ｘ１１０はＥ又はＱであり；Ｓ１１２はＡ又はＳであり；Ｘ１１３はＧ又はＡであり；Ｘ１１４はＥ， Ａ， Ｔ又はＮであり；Ｘ１１６はＧ又はＮであり；Ｘ１１８はＤ又はＨであり；Ｘ１２２はＬ又はＭであり；Ｘ１２６はＳ又はＴであり；Ｘ１２７はＳ又はＤであり、Ｘ１２８はＡ又はＦであり；Ｘ１３１はＡ， Ｔ又はＳでもあり；Ｘ１３４はＥ、Ｋ又はＧであり；Ｘ１３５はＱ又はＲであり；Ｘ１３９はＡ又はＹであり；Ｘ１４３はＲ又はＱであり；Ｘ１４４はＤ又はＧであり；Ｘ１５１はＳ又はＴであり、Ｘ１５４はＳ又はＮであり；Ｘ１５６はＡ又はＳであり；Ｘ１７９はＮ又はＲであり；Ｘ１８２はＳ又はＮであり；Ｘ１８８はＡ又はＴであり；Ｘ１９０はＬ又はＩであり；Ｘ１９８はＧ， Ｒ又はＮであり；Ｘ１９９はＶ又はＬであり；Ｘ２００はＱ又はＲであり；Ｘ２０６はＧ， Ｎ， Ｓ又はＴであり；Ｘ２０７はＲ， Ｓ， Ｔ又はＱであり；Ｘ２０９はＶ， Ａ又はＤであり；Ｘ２１０はＥ， Ｒ又はＳであり；Ｘ２１１はＬ又はＭであり；Ｘ２１２はＮ， Ｓ又はＲであり；Ｘ２１８はＳ又はＴであり；そしてＸ２２４はＡ又はＶである］で表されるアミノ酸配列、又はその置換された変異体を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項５３】
前記核酸が、エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項５４】
前記核酸が、周囲温度で活性的であるエンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項５５】
前記核酸が、耐熱性エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項５６】
前記核酸が、配列番号３， ７， ８， １０， １２， １４， １５， １６， １８， ２１及び２５から選択されたポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項５５記載の核酸。
【請求項５７】
前記核酸が、アルカリ性ｐＨで活性的なエンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項５８】
前記核酸が、配列番号１， １７， １９， ２２， ２３， ２４， ２５， ２６， ２７及び３２から選択されたポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項５７記載の核酸。
【請求項５９】
前記核酸が、有機溶媒において活性的なエンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項６０】
前記有機溶媒が、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含んで成る請求項５９記載の核酸。
【請求項６１】
前記核酸が、配列番号２， ４， ５， ６， １１， １３， ２０， ２９， ３０及び３３から選択されたポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項５９記載の核酸。
【請求項６２】
前記核酸が、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性から選択された複数の性質を有するエンドペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドを含んで成る請求項５１記載の核酸。
【請求項６３】
配列番号１３１〜２６０のいずれか１つの配列の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された又は組換え核酸。
【請求項６４】
前記コードされるポリペプチドが、配列番号１３１〜２６０のいずれか１つの配列の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項６３記載の核酸。
【請求項６５】
前記コードされるポリペプチドが、配列番号１３１〜２６０のいずれか１つの配列の少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項６３記載の核酸。
【請求項６６】
前記コードされるポリペプチドが、配列番号１３１〜２６０のいずれか１つの配列の少なくとも約１５０個の連続したアミノ酸を含んで成る請求項６３記載の核酸。
【請求項６７】
前記コードされるポリペプチドが、約２６９個の長さのアミノ酸である請求項６３記載の核酸。
【請求項６８】
前記コードされるポリペプチドが、約３８０個の長さのアミノ酸である請求項６３記載の核酸。
【請求項６９】
前記コードされるポリペプチドが、プレ−プロペプチドである請求項６８記載の核酸。
【請求項７０】
成熟スブチリシンタンパク質のアミノ酸５５〜アミノ酸２２７からの配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つの置換を含んで成るスブチリシンをコードする単離された又は組換え核酸。
【請求項７１】
前記成熟スブチリシンタンパク質が、成熟Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）タンパク質である請求項７０記載の核酸。
【請求項７２】
請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の複数の核酸を含んで成る組成物。
【請求項７３】
前記組成物が、少なくとも１０個の核酸を含んで成るライブラリーを含んで成る請求項７２記載の組成物。
【請求項７４】
制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ又はＤＮアーゼにより請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の１又は複数の核酸を消化することにより生成される組成物。
【請求項７５】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下で請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の１又は複数の核酸をインキュベートすることにより生成される組成物。
【請求項７６】
前記核酸ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼである請求項７５記載の組成物。
【請求項７７】
請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の少なくとも１つの核酸を含んで成る細胞。
【請求項７８】
前記細胞が、前記核酸によりコードされるポリペプチドを発現する請求項７７記載の細胞。
【請求項７９】
請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項８０】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ又はウィルスを含んで成る請求項７９記載のベクター。
【請求項８１】
前記ベクターが、発現ベクターである請求項７９記載のベクター。
【請求項８２】
請求項７９記載のベクターにより形質導入された細胞。
【請求項８３】
スブチリシン相同ポリペプチドをコードする核酸の生成方法であって、
スブチリシン相同体又はその副配列をコードする１又は複数の追加の核酸により、請求項５１， ６３又は７０のいずれか１項記載の１又は複数の核酸を組換えるか又は突然変異誘発することを含んで成る方法。
【請求項８４】
前記組換えが、前記１又は複数の核酸を反復して組換えることを含んで成る請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
前記反復しての組換えが、インビトロで行なわれる請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
前記反復組換えが、インビボで行なわれる請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
前記反復組換えが、組換えスブチリシン相同核酸の少なくとも１つのライブラリーを生成する請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
請求項８６記載の方法により生成される核酸ライブラリー。
【請求項８９】
請求項８８記載のライブラリーを含んで成る細胞集団。
【請求項９０】
請求項８３記載の方法により生成される組換えスブチリシン相同核酸。
【請求項９１】
請求項９０記載の核酸を含んで成る細胞。
【請求項９２】
請求項５１又は６３記載の核酸を突然変異誘発することを含んで成る、修飾されたスブチリシン核酸の生成方法。
【請求項９３】
請求項９２記載の方法により生成される修飾されたスブチリシン核酸相同体。
【請求項９４】
Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかに対応する核酸に比較してユニークである、配列番号１〜配列番号１３０から選択された核酸におけるユニーク副配列を含んで成る核酸。
【請求項９５】
Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかに対応するポリペプチドに比較してユニークである、配列番号１３１〜配列番号２６０から選択されたポリペプチドにおけるユニーク副配列をコードするユニークコードオリゴヌクレオチドに対して、緊縮条件下でハイブリダイズする標的核酸。
【請求項９６】
ポリペプチドの生成方法であて、
（ｉ）コードされたポリペプチドの発現を方向付ける調節配列に操作可能的に結合される、請求項５１， ６３又は７０記載の核酸を細胞集団中に導入し；
（ｉｉ）前記ポリペプチドを生成するために培養培地において細胞培養し；そして
（ｉｉｉ）前記細胞又は前記培養された培地からポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項９７】
前記培養が大きな発酵容器において行なわれる請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
ポリペプチドの生成方法であって、
（ｉ）請求項５１， ６３又は７０記載の核酸を含んで成る組換え発現ベクターを細胞集団中に導入し；
（ｉｉ）前記発現ベクターによりコードされるポリペプチドを生成するために培養培地において前記細胞を培養し；そして
（ｉｉｉ）前記細胞又は前記培養培地からポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
【請求項９９】
前記培養が大きな発酵容器において行なわれる請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
配列番号１〜２６０から選択された核酸又はタンパク質配列に対応する１又は複数の特徴群を含んで成る配列記録を含んで成るデータベースを含んで成るコンピューター又はコンピューター読み取り媒体。
【請求項１０１】
配列番号１〜２６０から選択された核酸又はタンパク質配列に対応する１又は複数の特徴群をそれぞれ含んで成る配列記録を含んで成るデータベースを含んで成るコンピューター又はコンピューター読み取り媒体を含んで成る、１又は複数の配列記録の使用者による選択的調査を可能にする使用者入力インターフェースをさらに含んで成る集積システム。
【請求項１０２】
前記コンピューター又はコンピューター読み取り媒体が、核酸又はタンパク質配列に対応する１又は複数の追加の特徴群と共に前記特徴群を整列する整列教示セットを含んで成る請求項１０１記載の集積システム。
【請求項１０３】
前記整列教示セットにより生成セル整列を表示する使用者読み取り出力要素をさらに含んで成る請求項１０２記載の集積システム。
【請求項１０４】
前記コンピューター又はコンピューター読み取り媒体が、配列番号１〜配列番号１３０から選択された配列を含んで成る１又は複数の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳する教示セットをさらに含んで成る請求項１０１記載の集積システム。
【請求項１０５】
コンピューター又はコンピューター読み取り媒体が、配列番号１３１〜２６０から選択された配列を含んで成る１又は複数のアミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳するための教示セットをさらに含んで成る請求項１０６記載の集成システム。
【請求項１０６】
前記教示セットが、コドン使用教示セット、又は配列同一性を決定する教示セットを、試験核酸配列に適用することによって、核酸配列を選択する請求項１０５記載の集成システム。
【請求項１０７】
配列番号１〜配列番号２６０から選択された核酸又はタンパク質配列に対応する１又は複数の特徴群をそれぞれ含んで成る、データベースに貯蔵される多くの配列記録の少なくとも１つに関連する現在の情報へのコンピューターシステムの使用方法であって、
（ｉ）配列番号１〜配列番号２６０の１又は複数の配列又はその副配列に対応する１又は複数の特徴群のリストを決定し；
（ｉｉ）使用者により選択される前記リストの特徴群を決定し；そして
（ｉｉｉ）前記選択された特徴群を表示し、又は追加の特徴群と共に前記選択された特徴群を整列することを含んで成る方法。
【請求項１０８】
前記追加の群と共に前記選択された特徴群の整列をさらに表示することを含んで成る請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
前記リストをさらに表示することを含んで成る請求項１０９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景：
セリンプロテアーゼスブチリシンの販売は、毎年３億ドルを越え、産業用酵素市場の約４０％を占める。３０年以上の間、プロテアーゼ、例えばスブチリシンは、洗濯及び他の洗剤における添加剤として使用されて来た。スブチリシンは、通常、布を汚すタンパク質、例えば血液、草、土壌及び多くの食品に見出されるタンパク質に対して広い特異性を有する。
【０００２】
最初に、細菌バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から単離されて以来、スブチリシンは、最も集中的に研究され、そして広範囲に構築された、現在まで知られているタンパク質の１つになって来た。広範囲の種類のスブチリシンが同定されており、そして多数のそれらのスブチリシンのアミノ酸配列が決定されている。さらに、１００種以上の結晶構造を包含する構造研究は、スブチリシンが他のセリンプロテアーゼと共通する活性部位、すなわち、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ触媒三元素を共有することを示している。
そのような研究にもかかわらず、特定の機能性質と相互関連する構造特徴が解明されるべきまま存続する。実際、構造予測能力の欠乏及び複数の特徴を同時に最適化する必要性のために、タンパク質構築の仕事は困難のまま存続する。
【０００３】
例えば、洗剤の用途においては、スブチリシンは、種々の洗浄条件下で活性的であるのみならず、それらはまた、他の洗剤成分及び添加剤の存在下で安定している。そのような添加剤は、中でも、他の酵素、例えばセルラーゼ、リパーゼ及び同様のものを包含する。スブチリシンは、有効濃度のそのような酵素の存在下で安定すべきであり、そして同時に、それらの酵素の分解（タンパク質加水分解）をもたらすべきではない。そのような用途のために選択されるスブチリシンはまた、種々の特定の条件、例えば高又は低温度、酸性、中性又はアルカリ性ｐＨ下で、又は漂白剤のような添加剤の存在下で活性的であるべきである。それらの有益性を提供する、ヌクレオチド又はアミノ酸配列における突然変異又は変更は、予測するために困難であり、そして従って構築するには困難である。
【０００４】
それにもかかわらず、ランダム突然変異誘発及び標的化された突然変異誘発の両アプローチは、改良されたスブチリシン相同体の生成に適用されて来た。しかしながら、複数の性質について改良されるプロテアーゼ開発する試みは、ランダム突然変異誘発がしばしば有害であり、そして酵素の１つの性質を合理的に変更する試みがしばしば、他の重要な存在する特徴を破壊する事実により妨げられる（Ｐａｔｋａｒなど．， （１９９８） Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐｉｄｓ ９３： ９５； Ｓｈｏｉｃｈｅｔなど．， （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２： ４５２）。
【０００５】
本発明は、種々の特徴の性質、例えば熱安定性、低温での活性、アルカリ性安定性及び他の所望する性質及び性質の組み合わせについて改良される新規スブチリシン相同体を提供する。それらのスブチリシンは、種々の洗剤及び他の産業用及び商業用用途において有用である。
【０００６】
発明の要約：
本発明は、改良された特性及び特性の組み合わせ、例えば耐熱性（熱安定性）、アルカリ性、酸性及び／又は中性ｐＨでの活性、周囲温度での活性及び有機溶媒における活性を有する新規スブチリシン相同体を提供する。１つの観点においては、本発明は、新規スブチリシン相同体であり、新規スブチリシンタンパク質をコードし、そのような新規スブチリシン相同体、又は新規スブチリシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して高い緊縮条件下でハイブリダイズし、又はエンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするそのフラグメントであるポリヌクレオチドに対応する単離された及び組換え核酸に関する。
【０００７】
本発明の態様は、配列番号１〜配列番号１３０から選択された１又は複数の配列に対応する配列番号１３１〜配列番号２６０の配列要素を組み込む新規スブチリシンであるポリペプチドをコードする。配列番号１３１〜配列番号２６０の２０個又はそれ以上の連続したアミノ酸をコードする、配列番号１〜配列番号１３０を含んで成る核酸のフラグメントは、本発明の態様である。
【０００８】
いくつかの態様においては、コードされるポリペプチドは、配列番号１３１〜配列番号２６０から選択された配列の少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、又は少なくとも約１５０個の連続したアミノ酸を含んで成る。他の好ましい態様においては、コードされるポリペプチドは、約３８０個のアミノ酸残基のプレ−プロペプチドである。
いくつかの態様においては、そのようなポリヌクレオチドは、成熟スブチリシンタンパク質に関して、アミノ酸位置５５〜２２７の多様化された領域を有するポリペプチドをコードし、ここで前記ポリペプチドは、下記式：
【０００９】
ＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴ−Ｘ７０−ＡＡＬ−Ｘ７４−Ｎ−Ｘ７６Ｘ７７−ＧＶ−Ｘ８０−ＧＶＡＰ−Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７−ＬＹ−Ｘ９０−ＶＫＶＬ−Ｘ９５−Ａ−Ｘ９７−Ｇ−Ｘ９９−ＧＳ−Ｘ１０２−Ｓ−Ｘ１０４−ＩＡ−Ｘ１０７−ＧＬ−Ｘ１１０−Ｗ−Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４−Ｎ−Ｘ１１６−Ｍ−Ｘ１１８−ＩＡＮ−Ｘ１２２−ＳＬＧ−Ｘ１２６Ｘ１２７Ｘ１２８−ＰＳ−Ｘ１３１−ＴＬ−Ｘ１３４Ｘ１３５−ＡＶＮ−Ｘ１３９−ＡＴＳ−Ｘ１４３Ｘ１４４−ＶＬＶＩＡＡ−Ｘ１５１−ＧＮ−Ｘ１５４−Ｇ−Ｘ１５６−ＧＳＶＧＹＰＡＲＹＡＮＡ−ＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮ−Ｘ１７９−ＲＡ−Ｘ１８２−ＦＳＱＹＧ−Ｘ１８８−Ｇ−Ｘ１９０−ＤＩＶＡＰＧＶ−Ｘ１９８Ｘ１９９Ｘ２００−ＳＴＹＰＧ−Ｘ２０６Ｘ２０７−Ｙ−Ｘ２０９Ｘ２１０Ｘ２１１Ｘ２１２−ＧＴＳＭＡ−Ｘ２１８−ＰＨＶＡＧ−Ｘ２２４−ＡＡＬ，
【００１０】
［式中、Ｘ７０はＩ又はＶであり；Ｘ７４はＤ又はＮであり；Ｘ７６はＤ， Ｓ又はＮであり；Ｘ７７はＩ， Ｖ又はＥであり；Ｘ８０はＩ， Ｖ又はＬであり；Ｘ８５はＮ、Ｅ又はＳであり； Ｘ８６はＡ又はＶであり；Ｘ８７はＤ又はＥであり；Ｘ９０はＡ又はＧであり；Ｘ９５はＧ， Ｓ又はＲであり；Ｘ９７はＳ又はＮであり；Ｘ９９はＳ， Ａ又はＲであり；Ｘ１０２はＩ又はＶであり；Ｘ１０４はＧ又はＳであり；Ｘ１０７はＲ又はＱであり；Ｘ１１０はＥ又はＱであり；Ｓ１１２はＡ又はＳであり；Ｘ１１３はＧ又はＡであり；Ｘ１１４はＥ， Ａ， Ｔ又はＮであり；Ｘ１１６はＧ又はＮであり；Ｘ１１８はＤ又はＨであり；Ｘ１２２はＬ又はＭであり；Ｘ１２６はＳ又はＴであり；Ｘ１２７はＳ又はＤであり、Ｘ１２８はＡ又はＦであり；Ｘ１３１はＡ， Ｔ又はＳでもあり；Ｘ１３４はＥ、Ｋ又はＧであり；Ｘ１３５はＱ又はＲであり；Ｘ１３９はＡ又はＹであり；Ｘ１４３はＲ又はＱであり；Ｘ１４４はＤ又はＧであり；Ｘ１５１はＳ又はＴであり、Ｘ１５４はＳ又はＮであり；Ｘ１５６はＡ又はＳであり；Ｘ１７９はＮ又はＲであり；Ｘ１８２はＳ又はＮであり；Ｘ１８８はＡ又はＴであり；Ｘ１９０はＬ又はＩであり；Ｘ１９８はＧ， Ｒ又はＮであり；Ｘ１９９はＶ又はＬであり；Ｘ２００はＱ又はＲであり；Ｘ２０６はＧ， Ｎ， Ｓ又はＴであり；Ｘ２０７はＲ， Ｓ， Ｔ又はＱであり；Ｘ２０９はＶ， Ａ又はＤであり；Ｘ２１０はＥ， Ｒ又はＳであり；Ｘ２１１はＬ又はＭであり；Ｘ２１２はＮ， Ｓ又はＲであり；Ｘ２１８はＳ又はＴであり；そしてＸ２２４はＡ又はＶである］で表されるアミノ酸配列又はその置換された変異体を有する。
【００１１】
本発明の核酸は、新規エンドプロテアーゼ、例えば周囲の、低い又は高い温度で活性的であり、耐熱性（熱安定性）であり、高い、低い又は中性のｐＨで安定し、そいて活性的であり、又は有機溶媒において活性的であるエンドプロテアーゼをコードする。そのような所望する性質の組み合わせを有するエンドプロテアーゼをコードする核酸もまた、本発明の態様である。
【００１２】
配列番号３， ７， ８， １０， １２， １４， １５， １６， １８， ２１及び２５を組み込む耐熱性エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、本発明の態様である。同様に、配列番号１， １７， １９， ２２， ２３， ２４， ２５， ２６， ２７及び３２を組み込むアルカリ活性エンドプロテアーゼをコードする核酸は、本発明の態様である。配列番号２， ４， ５， ６， １１， ３， ２０， ２９， ３０及び３３を組み込む、有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）において活性的であるエンドプロテアーゼをコードする核酸もまた本発明の態様である。
【００１３】
複数のそのような核酸又はコードされるポリペプチドを含む組成物は、本発明の特徴である。いくつかの場合、それらの組成物は、好ましくは、少なくとも１０個のそのような核酸を含む、核酸のライブラリーである。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼにより本発明の核酸を消化することによって生成される組成物はまた、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び核酸ポリメラーゼ、例えば熱安定性核酸ポリメラーゼと共に本発明の核酸をインキュベートすることによって生成される組成物と同じように、本発明の特徴である。
【００１４】
本発明のもう１つの観点は、本発明の核酸を組み込むベクターである。そのようなベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、及び染色体組み込みベクターを包含する。好ましい態様においては、ベクターは発現ベクターである。そのようなベクターにより形質導入された、又は本発明の核酸を組み込む細胞は、本発明の観点である。好ましい態様においては、細胞は核酸によりコードされるポリペプチドを発現する。
【００１５】
本発明の核酸によりコードされる単離された又は組換えポリペプチドは、本発明のもう１つの観点である。同様に、配列番号１３１〜配列番号２６０の配列要素を含んで成るポリペプチドは、本発明の観点である。好ましい態様は、周囲温度での活性、好冷性活性、耐熱性又は熱安定性、アルカリ性、酸性及び／又は中性ｐＨでの活性、及び有機溶剤、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下での活性から選択された１又は複数の性質を有有するエンドプロテアーゼである。１つの態様は、所望する性質の組み合わせを有するエンドプロテアーゼである。他の態様は、所望する条件性質、例えばｐＨ依存性、温度依存性、イオン強度に対する依存性、リガンド結合による活性化、及びリガンド結合による不活性化を有するエンドプロテアーゼポリペプチドである。
【００１６】
いくつかの態様においては、ポリペプチドは、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓に比較して、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つの配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。他の態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。他の態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号１３１〜配列番号２６０の１又は複数の配列の少なくとも３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、又は少なくとも約１５０個のアミノ酸の比較窓に比較して、配列同一性を維持する。
【００１７】
いくつかの態様においては、ポリペプチドは、少なくとも２０個の連続したアミノ酸の比較窓に比較して、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、配列番号２６１に対応するスブチリシン相同ポリペプチドに対して、高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められた活性、及び有機溶媒の存在下での高められた活性中から選択された改良されたエンドプロテアーゼ活性を有する。
【００１８】
いくつかの態様においては、ポリペプチドは、配列番号１３１〜配列番号２６０の少なくとも１つの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様においては、前記ポリペプチドは、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個又はそれ以上のアミノ酸の比較窓に対して配列同一性を維持する。１つの態様においては、改良されたエンドプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１３１〜配列番号２６０から選択された配列要素を含んで成る。
【００１９】
配列番号１〜配列番号１３０を含んで成るポリヌクレオチド、配列番号１３１〜配列番号２６０をコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドに対して高い緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされる１５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸のポリペプチドは、本発明の態様である。そのようなポリペプチドは、エンドプロテアーゼ活性を示す。いくつかの態様においては、そのようなポリペプチドは、少なくとも約２５０個の長さのアミノ酸、例えば約２６９個の長さのアミノ酸である。他方では、そのようなポリペプチドは、少なくとも約３５０個の長さのアミノ酸、例えば約３８０個の長さのアミノ酸のプレ−プロペプチドである。
【００２０】
さらに、分泌及び／又は局在化配列を有する本発明のポリペプチドは、精製配列、例えばエピトープ標識、ＦＬＡＧ標識、ポリヒスチジン標識及びＧＳＴ融合を有するポリペプチドと同じように、本発明の特徴である。同様に、Ｎ−末端でメチオニンを担持するか、又は１又は複数の修飾されたアミノ酸、例えばグリコシル化された、ＰＥＧ化された、ファルネシル化された、アセチル化された又はビオチニル化されたアミノ酸を有する本発明のポリペプチドは、本発明の特徴である。
【００２１】
１又は複数の本発明のポリペプチド及び界面活性剤を含む組成物は、本発明の１つの観点である。
本発明のポリペプチドをコードする核酸を細胞中に導入し、そして次に、それらを発現し、そしてそれらを細胞又は培養培地から回収することによって本発明のポリペプチドを生成する方法は、本発明の１つの特徴である。好ましい態様においては、本発明のポリペプチドを発現する細胞は、大きな発酵容器において増殖される。
【００２２】
配列番号１３１〜配列番号２６０に由来する抗原と反応するが、しかしＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６により例示されるように、天然に存在するスブチリシンポリペプチド又は２０００年４月３日現在、ＧｅｎＢａｎｋから入手できるこれまで記載されて来た配列に対しては反応しないポリクローナル抗体、及び配列番号１３１〜配列番号２６０のいずれか１つに由来する抗原を投与することによって生成され、
【００２３】
そして／又はそのような抗原に対して特異的に結合し、そして天然に存在するスブチリシンポリペプチド、又はＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６の１つ又は複数のポリペプチドに対応するスブチリシンポリペプチドに対して特異的に結合しない抗体により特異的に結合されるポリペプチドは、本発明の特徴である。
【００２４】
本発明のもう１つの観点は、本発明の核酸をインビトロ又はインビボで突然変異誘発するか又は組換えることにより、例えば反復して組換えることにより、新規スブチリシン相同体を生成する方法に関する。１つの態様においては、反復組換えは、組換えスブチリシン相同核酸の少なくとも１つのライブラリーを生成する。そのようにして生成されるライブラリーは、ライブラリーを含んで成る細胞のように、本発明の態様である。さらに、本発明の核酸を突然変異誘発することにより、修飾されたスブチリシン核酸相同体を生成するための方法は、本発明の態様である。本発明の方法により生成される組換え及び変異体スブチリシン相同核酸はまた、本発明の態様である。
【００２５】
さらに、配列番号１〜配列番号１３０のユニーク副配列であり（例えば、Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７により例示されるように、２０００年４月３日現在、ＧｅｎＢａｎｋから入手できるいずれかのスブチリシン核酸配列に比較して）、又は配列番号１３１〜配列番号２６０から選択されたポリペプチドのユニーク副配列であり（Ｐ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６により例示されるように、２００年４月３日現在、ＧｅｎＢａｎｋから入手できるいずれかのスブチリシンタンパク質配列に比較して）、
【００２６】
又は配列番号１３１〜配列番号２６０から選択されたポリペプチドにおけるユニーク副配列をコードするユニークコードオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズし、そして２０００年４月３日現在、ＧｅｎＢａｎｋとから入手でき、そしてＭ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７により例示される配列によりコードされるポリペプチドに比較して、ユニークである標的核酸である核酸は、すべて本発明の態様である。
【００２７】
本発明はまた、配列番号１〜２６０に対応する特徴群を包含する配列記録から構成されるデータベースを包含する、コンピューター、コンピューター読み取り媒体及び集成システムを提供する。そのような集成システムは任意には、それぞれ他の及び／又はいずれかの追加の核酸又はアミノ酸配列と共に、配列番号１〜２６０に対応するいずれかの１又は複数の特性群を選択し、整列し、翻訳し、逆翻訳し、又は調べるための１又は複数の教示セットを包含する。
【００２８】
特定の論議：
スブチリシン（Ｂｏｔｔなど． （１９９６） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７９： ２７７； Ｒａｏなど． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｄｙｎ． １５： １０５３）は、商業的に重要なセリンエンドプロテアーゼであり、ペプチド結合に対するこの広い特異性及び生成の比較的容易性が、食品及び革加工を包含する広範囲の用途のために、及びしみの加水分解及び溶解のための洗濯洗剤への添加物として、それらを高い価値あるものにする。それらの高い価値のために、スブチリシンは広範囲に研究されており、そして１００以上の結晶構造が解明されている（Ｓｉｅｚｅｎなど． （１９９１） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ４：７１９）。
【００２９】
本発明は、改良された性質及びそれらの性質の組み合わせを有する新規スブチリシン相同体を提供する。それらの性質の中には、高又は低温での増強された熱安定性、高又は低ｐＨでの安定性及び活性、及び有機溶媒における安定性が存在する。
【００３０】
定義：
“ポリヌクレオチド配列”とは、内容に依存して、核酸、例えばＤＮＡ， ＲＮＡ （ヌクレオチド（Ａ， Ｃ， Ｔ， Ｕ， Ｇ等）のポリマー又は天然に存在するか又は人工的なヌクレオチド類似体である）、又は核酸を表す特性群である。所定の核酸又は相補的核酸のいずれかは、特定されるポリヌクレオチド配列から決定され得る。
同様に、“アミノ酸配列”とは、内容に依存して、アミノ酸のポリマー（タンパク質、ポリペプチド、等）、又はアミノ酸ポリマーを表す特性群である。
【００３１】
核酸、タンパク質又は他の成分は、それが通常、結合される成分（他のタンパク質、核酸、細胞、合成試薬、等）から部分的に又は完全に分離される場合、“単離される”。核酸又はポリペプチドは、それが人工的であるか、又は構築され、又は人工的な又は構築されたタンパク質又は核酸に由来する場合、“組換え体”である。
“副配列”又は“フラグメント”とは、完全な配列（までの及びそれ自体）を包含する全配列のいずれかの部分である。
【００３２】
アミノ酸又はヌクレオチドポリマーの番号付けは、ポリマーの所定のモノマー成分（アミノ酸残基、組み込まれたヌクレオチド、等）の位置が選択された参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドにおける同じ残基位置に対する場合、選択されたアミノ酸ポリマー又は核酸の番号付けに対応する。特にことわらない限り、番号付けは、図１に提供されるように、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）の配列に関して与えられる。
【００３３】
ベクターは、選択された核酸による細胞トランスダクション、及び／又は細胞における核酸の発現を促進するための組成物である。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウィルス、ＹＡＣ、細菌、ポリリシン、染色体集成ベクター、エピソームベクター、等を包含する。
“ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の実質的に全体の長さ”とは、配列の少なくとも７０％、一般的に少なくとも８０％、又は典型的に９０％又はそれ以上を言及する。
【００３４】
本発明において使用される場合、“抗体”とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的に又は部分的にコードされる１又は複数のポリペプチドを含んで成るタンパク質を言及する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ不変領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含する。Ｌ鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。Ｈ鎖は、γ、μ、α、δ又はεとして分類され、それらは、それぞれ免疫グロブリン種類ＩｇＧ， ＩｇＡ， ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含んで成る。
【００３５】
個々のテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、個々の対は１つの“Ｌ”鎖（約２５ｋＤ）及び１つの“Ｈ”鎖（約５０−７０ｋＤ）を有する。個々の鎖のＮ−末端は、抗原認識を主に担当する約１００又は１１０、もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語、可変Ｌ鎖（ＶＬ）及び可変Ｈ鎖（ＶＨ）は、それぞれ、それらのＬ及びＨ鎖を言及する。抗体は、損なわれていない免疫グロブリンとして、又は種々のペプチダーゼによる消化により生成される多くの十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。
【００３６】
従って、例えばペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合以下の抗体を消化し、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に連結されるＬ鎖であるＦａｂのダイマーであるＦ（ａｂ）’ａが生成される。Ｆ（ａｂ）’ａは温和な条件下で還元され、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合が分解され、それにより、（Ｆａｂ’）２ ダイマーがＦａｂ’モノマーに転換される。Ｆａｂ’モノマーは実質的に、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明に関しては、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ （ｅｄ．）， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９８） を参照のこと）。
【００３７】
種々の抗体フラグメントは損なわれていない抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、そのようなＦａｂ’フラグメントが化学的に、又は組換えＤＮＡ方法を用いることにより新たに合成され得ることを理解するであろう。従って、用語、抗体とは、本明細書において使用される場合、完全な抗体の修飾により生成されるか、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新たに合成される抗体フラグメントを包含する。抗体は、一本鎖抗体、例えば可変Ｈ鎖及び可変Ｌ鎖が連続ポリペプチドを形成するために一緒に連結されている（直接的に、又はペプチドリンカーを通して）一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ） 抗体を包含する。
種々の追加の用語が、本明細書において、定義されるか又は他方では、特徴づけられる。
【００３８】
ポリヌクレオチド：
スブチリシン相同配列：
本発明は、単離された又は組換えスブチリシン相同ポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離された又は組換えポリヌクレオチドを提供する。便利さのために、比較は、スブチリシンＳａｖｉｎａｓｅ（商標）及びそれをコードするポリヌクレオチドに対して行なわれる。３８０個のアミノ酸のＳａｖｉｎａｓｅ（商標）ポリペプチドは、１１１個のアミノ酸プレ−プロペプチド、及び分泌及び折りたたみに続いて自己溶菌分解により放たれる、２６９個のアミノ酸の成熟スブチリシンから成る。Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）ポリペプチド［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２９６００号］の一次構造は、図１（及び配列列挙２６１）に示される。
【００３９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、スブチリシン関連配列のライブラリーにおいて発現された。ＤＮＡフラグメントが、成熟タンパク質のアミノ酸５５〜２２７（太字で図１に示されるような）に対応する、“多様化された”領域クローンのライブラリーを生成するために、バチルス発現ベクター中にクローン化された。ライブラリーメンバーが、プロテアーゼ活性についてスクリーンされ、そして種々の所望する特性、例えば熱安定性、アルカリ性安定性及び有機溶媒における活性についてアッセイされた。
【００４０】
手短には、例えば１つの典型的な試験における６５４個の活性クローンの小さなライブラリーが次の４種の性質について試験された：２３℃での活性、熱安定性、溶媒安定性及びｐＨ依存性。ライブラリーを特徴づけるために、クローンがカゼインプレート上で増殖され、そしてプロテアーゼ活性が透明な円光の生成により評価された。活性コロニーがＬＢ培地において定常期まで増殖され、そして分泌されるプロテアーゼが培地から回収され、そしてアッセイ方法のために１００〜２００倍に希釈された。プロテアーゼサンプルが、次の５種の異なった条件下でアッセイされた：ｐＨ１０；ｐＨ５．５， ｐＨ７．５； ３５％ＤＭＦにおけるｐＨ７．５；及び熱処理に続いてｐＨ１０。
【００４１】
試験される個々の条件下で、市販のスブチリシンＳａｖｉｎａｓｅ（商標）より性能がすぐれているクローンが得られる。合計活性における最も劇的な上昇がｐＨ５．５で存在し、ここでＳａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも２〜４倍高い活性を有する子孫が得られた。しかしながら、本発明のプロテアーゼにより提供される所望する性質の組み合わせは、単一の性質における改良点よりもより有意である。
【００４２】
１つのアッセイ組みにおいては、さらに実施されるか、又は２３℃及びｐＨ１０でのＳａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも良好な７７個のクローンが、有機溶媒における残留活性及び熱処理に対する安定性の追加の性質についてアッセイされた。熱処理の後、３倍まで以上の残留活性又は３５％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）における５０％までの高い残留活性を有するプロテアーゼをコードする核酸が得られた。さらに、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも熱安定性であり、且つ有機溶媒においてよりも熱安定性であるプロテアーゼを生成する多くのクローンがまた得られた。上記性質の他に、所望する性質、例えば好冷性活性（すなわち、低温での活性）、化合物、例えば次亜塩素酸塩、超臨界二酸化炭素の存在下での活性、等が、本発明のライブラリーから単離され得ることは理解されるであろう。
【００４３】
従って、本発明は、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）に対して１又は複数の所望する性質、例えば高められた耐熱性、周囲温度での高められた活性、アルカリ性ｐＨでの高められた活性、酸性ｐＨでの高められた活性、中性ｐＨでの高められたｐＨ、有機溶媒の存在下での高められた活性、及び同様のものを有するスブチリシン相同体をコードするポリヌクレオチド配列及びその相同体に対応するポリペプチド配列を提供する。いくつかの場合、改良された性質は、条件活性又は条件性質である。例えば、大規模な調製及び／又は精製を促進する性質が、条件活性として記載され得る。
【００４４】
ｐＨ７に対してｐＨ１０で高い活性を有するが、又はｐＨ１０に対してｐＨ７で高い活性を有するスブチリシン相同体が、不活性ｐＨで精製され、そして次に、調製工程において自動タンパク質加水分解を低める高い活性のｐＨ許容性を有する組成物、例えば洗剤、清浄液体に提供され得る。同様に、活性化された又は低温活性化されたスブチリシン相同体、及び例えば低められたイオン強度により（スブチリシン相同体を含む高いイオン強度の組成物の希釈により）、又はリガンド、例えば洗剤、清浄溶液又は化粧品の成分の結合により活性化されたスブチリシン相同体が、本明細書に記載される配列から単離され、又は本明細書に記載される方法に従って、それから誘導され得る。
【００４５】
所望する性質又は性質の組み合わせを有するスブチリシン相同ポリペプチドの多様化された領域をコードするか、又はそれらの又は他の所望する性質を有する追加のスブチリシン相同体を提供するためにスクリーンされ得る、典型的な組換え、例えばシャフリングされた核酸が、配列番号１３１〜配列番号２６０として本明細書において同定される多様化された領域ポリペプチドをコードする、配列番号１〜配列番号１３０において提供される。本明細書において記載される発現及びスクリーニング方法を包含する多くの環境下で、配列列挙に示される多様化された領域が、成熟スブチリシン又はプレ−プロペプチドに関連して発現される。成熟スブチリシンタンパク質に関連して発現される場合、配列番号１３１〜配列番号２６０はアミノ酸５５〜２２７に対応する。
【００４６】
ポリヌクレオチドの製造：
本発明のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、知られている合成方法に従って、標準の固相方法により調製され得る。典型的には、約１００個までの塩基のフラグメントが個々に合成され、次に、連結され（例えば、酵素的又は化学的連結方法、又はポリメラーゼ介在性組換え方法により）、実質的にいずれかの所望する連続配列が形成される。
【００４７】
例えば、本発明のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、例えばＢｅａｎｃａｇｅなど． （１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２： １８５９−６９により記載される従来のホスホラミジド方法、又はＭａｔｔｈｅｓなど． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： ８０１−０５により記載される方法、たとえば典型的には自動合成方法において実施されるような方法を用いて、化学的合成により調製され得る。ホスホラミジット方法によれば、オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにおいてクローン化される。
【００４８】
さらに、実質的にいずれかの核酸は、種々の商業源のいずれか、例えばＴｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ （ｍａｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）， Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）， ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ． （ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）， Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． （Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ） 及び多くの他のものから注文され得る。同様に、ペプチド及び抗体は、種々ね源のいずれか、例えばＰｅｐｔｉｄｅＧｅｎｉｃ （ｐｋｉｎ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）， ＨＴＩ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ， ｉｎｃ． （ｈｔｔｐ： ／／ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）， ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｌｔｄ （Ｕ．Ｋ．）， Ｂｉｏ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｉｎｃ．， 及び多くの他のものから注文され得る。
【００４９】
本発明の一定のポリヌクレオチドはまた、スブチリシン相同ポリペプチド及びそれらのポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるか、又はＰＣＲ−増幅できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリー（例えば、典型的なシャフリング方法におけるように相同核酸を組みかえることによって生成されるライブラリー）をスクリーニングすることによっても得られる。ｃＤＮＡクローンをスクリーニングし、そして単離するための方法は、当業者に良く知られている。
【００５０】
そのような技法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋなど． （１９８９） 前記、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭなど． （１９８９； ｓａｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ １９９９） 前記に記載される。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、天然に存在する主鎖を、例えば突然変異誘発又はオリゴヌクレオチドシャフリングにより変更することにより得られる。他の場合、そのようなオリゴヌクレオチドは、下記に引用される引例に記載されるように、シリコ又はオリゴヌクレオチドシャフリング方法により製造され得る。
【００５１】
本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、新規成熟スブチリシン相同体をコードする配列、及び前記コード配列に対して相補的な配列、並びにコード配列の新規フラグメント及びその補体を包含する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形又はＤＮＡの形で存在することができ、そしてｍＲＮＡ， ｃＲＮＡ， 合成ＲＮＡ及びＤＮＡ、及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖であり得、そして一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス、相補的）鎖であり得る。
【００５２】
ポリヌクレオチドは任意には、（ｉ）単離において、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質、プレ−タンパク質、プレプロ−タンパク質又は同様のものをコードするために、追加のコード配列と組合して、（ｉｉｉ）非コード配列、例えばイントロン、制御要素、例えばプロモーター、ターミネーター要素、又は適切な宿主におけるコード配列の発現のために効果的な５’及び／又は３’未翻訳領域と組合して、及び／又は（ｉｖ）スブチリシン相同体コード配列が異種遺伝子であるベクター又は宿主環境において、スブチリシン相同体のコード配列を包含する。配列はまた、キャリヤー、緩衝液、アジュバント、賦形剤及び同様のものの存在下で、核酸の典型的な構成配合物と組合して見出され得る。
【００５３】
ポリヌクレオチドの使用：
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のスブチリシン相同ポリペプチドの組換え生成（すなわち、発現）において、洗剤成分として；食品加工において；免疫原として；相補的又は部分的相補的核酸の存在のための（例えば、天然のスブチリシンコード核酸の検出のための）診断用プローブとして；新規及び／又は改良されたスブチリシン相同体、及び同様のものを生成するために、追加の多様性生成、例えば多様性生成反応、例えばシャフリング反応又は突然変異誘発反応のための基質として、種々の用途を有する。
【００５４】
ポリペプチドの発現：
本発明によれば、集合的には、“スブチリシン相同ポリペプチド”、又は単純に、“スブチリシン相同体”として本明細書において言及される、新規成熟スブチリシン相同体、スブチリシンタンパク質のフラグメント、関連する融合タンパク質又はその機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞、例えば細菌細胞においてスブチリシン相同ポリペプチドの発現を方向づける組換えＤＮＡ分子において使用される。遺伝子コードの固有の縮重のために、実質的に同じか又は機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列がまた、スブチリシン相同体をクローン化し、そして発現するために使用される。
【００５５】
修飾されたコード配列：
当業者により理解されるように、特定の宿主においてコード配列の発現を増強するためにそのコード配列を修飾することは好都合である。遺伝子コードは６４の可能なコドンと冗長性を有するが、しかしほとんどの生物はそれらのコドンのサブセットを選択的に使用する。種において最もしばしば使用されるコドンが、最適コドンと呼ばれ、そしてほとんど使用されないそれらのコドンは、希な又は低−使用コドンとして分類される（例えば、Ｚｈａｎｇ ＳＰなど． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０５： ６１−７２を参照のこと）。コドンは、宿主の好ましいコドン使用法、すなわち“コドン最適化”又は“種コドン偏向のための制御”として時々呼ばれる工程に影響を及ぼすために置換され得る。
【００５６】
特定の原核又は真核宿主により好まれるコドンを含む最適化されたコード配列（Ｍｕｒｒａｙ， Ｅ． など． （１９８９） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ４７７−５０８をまた参照のこと）が、最適化されていない配列から生成された転写体と比較して、翻訳の速度を速めるか、又は所望する性質、例えばより長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写体を生成するために調製され得る。翻訳停止コドンがまた、宿主の選択に影響を及ぼすよう修飾され得る。例えば、Ｓ． セレビシアエ及び哺乳類のための好ましい停止コドンは、それぞれＵＡＡ及びＵＧＡである。単子葉植物のための好ましい停止コドンはＵＧＡであり、そして昆虫及びＥ．コリは停止コドンとしてＵＡＡを用いることを好む（Ｄａｌｐｈｉｎ ＭＥ など． （１９９６） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ２１６−２１８）。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由、例えば遺伝子生成物のクローニング、プロセッシング及び／又は発現を修飾する変更のために、スブチリシン相同コード配列を変更するために構築され得る。例えば、変更は、新規制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変え、スプライス部位を導入し、等のために、当業界において良く知られている技法、例えば特定部位の突然誘発を用いて導入され得る。
【００５８】
ベクター、プロモーター及び発現システム：
本発明はまた、上記に広く記載されたように、１又は複数の核酸配列を含んで成る組換え構造体も包含する。前記構造体は、本発明の核酸配列が前方向又は逆方向の配向で挿入されている、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又は同様のものを含んで成る。この態様の好ましい観点においては、構造体はさらに、配列に操作可能的に連結される調節配列、例えばプロモーターを含んで成る。多数の適切なベクター及びプロモーターは、当業者に知られており、そして市販されている。
【００５９】
本明細書において有用な分子生物学的技法、例えばベクター、プロモーター及び多くの他の適切なトピックの使用を記載する一般的なテキストは、次のものを包含する：Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）： Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９ （“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”） 及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌなど．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ Ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ １９９９） （“Ａｕｓｕｂｅｌ”）。
【００６０】
本発明の相同核酸の生成のために、インビトロ増幅方法、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のＲＮＡポリメラーゼ介在性技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を通して当業者を方向付づけるのに十分なプロトコールの例は、次のものに見出される：Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ， ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ Ｍｕｌｌｉｓ など． （１９８７） アメリカ特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ など．， ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）； Ａｍｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ （Ｏｃｔｏｂｅｒ １， １９９０） Ｃ＆ＥＮ ３６−４７； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９１） ３：８１−９４； Ｋｗｏｈ など． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １１７３； Ｇｕａｔｅｌｌｉ など． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７： １８７４； Ｌｏｍｅｌｌ など． （１９８９） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ ３５： １８２６； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ など． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０７７−１０８０； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ （１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ２９１−２９４； Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ （１９８９） Ｇｅｎｅ ４：５６０； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ など． （１９９０） Ｇｅｎｅ ８９： １１７， 及びＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： ５６３−５６４。
【００６１】
インビトロ増幅された核酸におけるクローニングのための改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅなど．， アメリカ特許第５，４２６，０３９号に記載される。ＰＣＲにより大きな核酸を増幅するための改良された方法は、Ｃｈｅｎｇなど． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３９６： ６８４−６８５及びそこに引用例（ここで４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが生成される）に要約される。当業者は、実質的にいずれかのＲＮＡが、制限消化し、ＰＣＲ延長、及び逆転転写酵素及びポリメラーゼを用いての配列決定のために適切な二本鎖ＤＮＡに転換され得ることを理解するであろう。例えばＡｕｓｕｂｅｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ 及びＢｅｒｇｅｒ（すべて前記）を参照のこと。
【００６２】
本発明はまた、本発明のベクター（例えば、本発明のクローニングベクター又は本発明の発現ベクター）により形質導入される（形質転換されるか又はトランスフェクトされる）、構築された宿主細胞、及び組換え技法による技法による本発明のポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例えばプラスミド、ウィルス粒子、ファーシ、等、又は複製しないベクター、例えばリポソーム、裸又は接合されたＤＮＡ， ＤＮＡ−微粒子、等であり得る。
【００６３】
構築された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、又はスブチリシン相同遺伝子を増幅するために適切なように変性された従来の栄養培地において培養され得る。培養条件、例えば温度、ｐＨ及び同様のものは、発現のために選択された宿主細胞によりこれまで使用されて来たそれらの条件であり、そして当業者及び本明細書に引用される引例、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ａｕｓｕｂｅｌ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ， 及びＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びそこに引用される引例において明らかであろう。
【００６４】
本発明のスブチリシン相同タンパク質は、非動物細胞、例えば植物、酵母、菌類、細菌及び同様のものにおいて生成される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｂｅｒｇｅｒ 及びＡｕｓｕｂｅｌ の他に、非動物細胞培養に関する詳細は次のものに見出され得る：Ｐａｙｎｅ など． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （ｅｄｓ） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｘｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （Ｇｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） 及びＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するために適切な種々の発現ベクターのいずれか１つのベクター中に組み込まれ得る。適切なベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラスミド及びファージＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウィルス、家禽ポックスウィルス、仮性狂犬病、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス及び多くの他のものの組み合わせから誘導されるベクターを包含する。遺伝子材料を細胞中に形質導入し、そして複製が所望される場合、適切な宿主において複製でき、そして生存性であるいずれかのベクターが使用され得る。
【００６６】
発現ベクター中に組み込まれる場合、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ合成を指図するために、適切な転写制御配列（プロモーター）に操作可能的に連結される。そのような転写制御配列の例は、次のものを包含する：ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．コリｌａｃ又はＴｒｐプロモーター、ファージλＰＬプロモーター、及び原核又は真核細胞又はそれらのウィルスにおける遺伝子の発現制御することが知られている他のプロモーター。
【００６７】
本発明の発現ベクターは任意には、転写開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、任意には、発現を増幅するための適切な配列、例えばエンハンサーを包含する。さらに、本発明の発現ベクターは任意には、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質、例えば真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、又は例えばＥ．コリにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を提供するために、１又は複数の選択マーカー遺伝子を含む。
【００６８】
本発明のベクターは、本発明のタンパク質又はポリペプチドの宿主における発現を可能にするために、適切な宿主を形質転換するために使用され得る。適切な発現宿主の例は、次のものを包含する：細菌細胞、例えばＥ．コリ、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｕｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ・チピムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）； 菌類細胞、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ、及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；哺乳類細胞、例えばＣＨＯ， ＣＯＳ， ＢＨＫ， ＨＥＫ ２９３又はＢｏｗｅｓメラノーマ；植物細胞、等。すべての細胞又は細胞系が十分に機能的なスブチリシン相同体を生成できる必要はないことは理解されており；例えばスブチリシン相同体の抗原性フラグメントが生成され得る。本発明は、使用される宿主細胞によって制限されない。
【００６９】
細菌系においては、多くの発現ベクターが、スブチリシン相同体のために意図された使用に依存して選択され得る。例えば、多量のスブチリシン相同体又はそのフラグメントが商業的製造のために、又は抗体の誘発のために必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指図するベクターが所望される。そのようなベクターは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：多官能性Ｅ．コリクローニング及び発現ベクター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでスブチリシン相同体コード配列が、ハイブリッドタンパク質が生成されるよう、β−カラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔ及び続く７個の残基のための配列と整合してベクター中に連結され；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５５０３−５５０９）； ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）；及び同様のもの。
【００７０】
同様に、酵母サッカロミセス・セレビシアエにおいては、構成又は誘発性プロモーター、例えばα因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨを含む多くのベクターが、本発明のスブチリシン相同ポリペプチドの生成のために使用され得る。再考のためには、Ａｕｓｕｂｅｌなど． （前記）及びＧｒａｎｔなど． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３： ５１６−５４４を参照のこと。
【００７１】
哺乳類宿主においては、ウィルス基材のシステムを含む種々の発現システムが使用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、例えばスブチリシン相同ポリペプチドのコード配列が、後期プロモーター及び三元リーダー配列から成るアデノウィルス転写／翻訳複合体中に任意に連結される。スブチリシンポリペプチドコード領域のウィルスゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域中への挿入は、感染された宿主細胞においてスブチリシン相同体を発現できる生存ウィルスをもたらすであろう（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサーが、哺乳類宿主細胞における発現を高めるために使用され得る。
【００７２】
追加の発現要素：
特定の開始シグナルは、本発明のスブチリシン相同コード配列の効果的な翻訳を助けることができる。それらのシグナルは、例えばＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含むことができる。スブチリシン相同コード配列、その開始コドン及び上流の配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の翻訳制限シグナルは必要とされ得ない。しかしながら、コード配列（例えば、成熟タンパク質コード配列）又はその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性転写制御シグナルが供給されるべきである。
【００７３】
さらに、開始コドンは、完全な挿入体の転写を確保するために正しい読み取り枠に存在すべきである。外因性転写要素及び開始コドンは、種々の起源、例えば天然及び合成源のものであり得る。発現の効率は、用いられる細胞システムに適切なエンハンサーの包含により増強され得る（Ｓｃｈａｒｆなど． （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０： １２５−６２； Ｂｉｔｔｎｅｒなど． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３： ５１６−５４４）。
【００７４】
分泌／局在化配列：
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば哺乳類細胞の所望する細胞企画、膜又はオルガネラにポリペプチド発現を標的化するために、又は細胞周辺腔又は細胞培養培地にポリペプチド分泌を指図するために、分泌／局在化配列をコードする核酸に整合して融合され得る。そのような配列は、当業者に知られており、そして分泌リーダーペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、クロロプラスト輸送配列）、膜局在化／アンカー配列（例えば、停止トランスファー配列、ＧＰＩアンカー配列）、及び同様のものを包含する。
【００７５】
発現宿主：
さらなる態様においては、本発明は上記構造体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、酵母細胞又は植物細胞であり得、又は宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞であり得る。宿主細胞中への構造体の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ介在性トランスフェクション、エレクトロポリ−ション又は他の通常の技法によりもたらされ得る（Ｄａｖｉｓなど． （１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｓｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００７６】
宿主細胞株は任意には、挿入された配列の発現を調製し、又は所望する態様で発現タンパク質をプロセッシングするその能力について選択される。タンパク質のそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシルを包含するが、但しそれらだけには限定されない。タンパク質から“プレ”又はプレプロ“を切断する後−翻訳プロセッシングはまた、正しい挿入、折りたたみ及び／又は機能のために重要である。異なった宿主細胞、例えばＥ．コリ、バチルスｓｐ．，酵母又は哺乳類細胞、例えばＣＨＯ， ＨｅＬａ， ＢＨＫ， ＭＤＣＫ， ２９３， ＷＩ３８，等は、例えば後−翻訳活性のために特定の細胞機構及び特徴的機構を有し、そして導入された外来性タンパク質の所望する修飾及びプロセッシングを確保するために選択され得る。
【００７７】
組換えタンパク質の長期の高収率の生成のために、安定した発現システムが使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドを安定して発現する細胞系は、複数のウィルス起点又は内因性発現要素及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質導入される。ベクターの導入に続いて、細胞は、細胞型のために適切であることが決定されている期間、例えば哺乳類細胞に関しては１〜２日間、又は細菌細胞に関しては１又は数時間、それらが選択培地に交換される前、富化された培地において増殖せしめられ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、そしてその存在は、導入された配列を都合良く発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。例えば、安定して形質転換された細胞の耐性凝集塊が、細胞型に対して適切な組織培養技法を用いて、増殖され得る。
【００７８】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換された宿主細胞は任意には、細胞培養物からコードされたタンパク質の発現及び回収のために適切な条件下で培養される。組換え細胞により生成されるタンパク質又はそのフラグメントは、使用される配列及び／又はベクターに依存して、分泌され、膜結合され、そして／又は細胞内に含まれ得る。当業者により理解されるように、本発明の成熟スブチリシン相同体をコードするポリペプチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜を通しての成熟ポリペプチドの分泌を指図するシグナル配列により企画され得る。
【００７９】
追加のポリペプチド配列：
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えばコードされたポリペプチドの精製を促進するマーカー配列に整合して融合されるコード配列を含んで成ることができる。そのような精製促進ドメインは、次のものを包含するが、但し、それらだけには限定されない：金属キレート化ペプチド、例えば固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオン（例えばＧＳＴ）を結合する配列、赤血球凝集素（ＨＡ）標識（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎなど． （１９８４） Ｃｅｌｌ ３７： ７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ延長／親和性精製システムに使用されるＦＬＡＧＩエピトープ（Ｉｍｍｕｎｅｔ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）、及び同様のもの。
【００８０】
精製ドメインとスブチリシン相同配列との間でのプロテアーゼ−切断性ポリペプチドリンカー配列の包含は、精製を促進するために有用である。本明細書に記載される組成物及び方法への使用のために企画された１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ分解部位によりポリヒスチジン領域に融合される本発明のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Ｐｏｒａｔｈなど． （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３： ２６３−２８１に記載のような、固定された金属イオン親和性クロマトグラフィー）上での精製を促進し、そしてエンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からスブチリシン相同ポリペプチドを分離するための手段を提供する。
【００８１】
ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ； Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）はまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現するためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてリガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合の場合、グルタチオン−アガロース）への吸着により、続いて遊離リガンドの存在下での溶出により、溶解された細胞から容易に精製され得る。
【００８２】
ポリペプチド生成及び回収：
最適な宿主株のトランスダクション及び宿主株の適切な細胞密度への増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフト又は化学的誘発）により誘発され、そして細胞は追加の期間、培養される。細胞は典型的には、遠心分離により収穫され、物理的又は化学的手段により破壊され、そしてその得られる組抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に使用される微生物の細胞は、いずれかの従来の方法、例えば凍結−融解サイクル、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用、又は当業者に知られている他の方法により破壊され得る。
【００８３】
示されるように、多くの細胞、例えば細菌、植物、動物（特に、哺乳類）及び始原細胞起源の細胞の培養及び生成についての多くの文献が入手できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ａｕｓｕｂｅｌ， ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ （ａｌｌ ｓｕｐｒａ）， 及びＦｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 及びそこに引用される引例；Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ （１９９７） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｈｕｍａｓｏｎ （１９７９） Ａｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ； 及びＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉ， など． （１９８９） ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２５： １０１６−１０２４を参照のこと。
【００８４】
植物細胞培養及び再生に関しては、Ｐａｙｎｅ など． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （ｅｄｓ） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｇｙ （１９９３） ＲＲ．Ｒ．Ｄ． Ｃｒｏｙ， Ｅｄ． Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ． ＩＳＢＮ ０ １２ １９８３７０ ６を参照のこと。
【００８５】
細胞培養培地は一般的に、Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （ｅｄｓ．） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬに示される。細胞培養についての追加の情報は、入手できる文献、例えばＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ （１９９８）， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ） （“Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ”）， 及びｐｌａｎｔ Ｃａｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （１９９７）， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ． （Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ） （“Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ”） に見出される。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、当業界において良く知られている多くの方法のいずれか、例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース　クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（例えば、本明細書に示される標的化システムのいずれかを用いる）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養から回収され、そして精製され得る。タンパク質折りたたみ段階は、所望には、成熟タンパク質の配置の完結において使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終精製段階において使用され得る。上記に示される文献の他に、種々の精製方法、例えば次の文献に示されるそれらの方法は、当業界において良く知られている：
【００８７】
Ｓａｎｄａｎａ （１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．； ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ など． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ＮＹ： Ｗａｌｋｅｒ （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ， Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ； Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ； Ｓｃｏｐｅｓ （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ； Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ． Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， ＮＹ： 及びＷａｌｋｅｒ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ。
【００８８】
いくつかの場合、産業的及び／又は商業的用途のために適切な大規模での本発明のスブチリシン相同体を生成することが所望される。そのような場合、多量発酵方法が使用される。手短には、配列番号１〜配列番号１３０のいずれか１つの配列を含んで成るポリヌクレオチド、又は本発明のスブチリシン相同体をコードする他の核酸が、発現ベクター中にクローン化され得る。例えば、アメリカ特許第５，９５５，３１０号（Ｗｉｄｎｅｒなど “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｅｌｌ”）は、タンデムプロモーターを有するベクター、及びポリペプチドコードの配列に操作可能的に連結される配列の安定化を記載する。
【００８９】
ベクター中への興味あるポリヌクレオチドの挿入の後、ベクターを用いて、細菌、例えばバチルス・スブチリス株ＰＬ１８０１ ＩＩＥ（ａｍｙＥ， ａｐｒ， ｎｐｒ， ｓｐｏＩＩＥ：： Ｔｎ ９１７）宿主が形質転換される。バチルス株中への発現ベクターの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ （１９７９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８： １１１ を参照のこと）により、コンピテント細胞の使用（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｉｎ （１９６１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１： ８２３， 又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ （１９７１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５６： ２０９ を参照のこと）により、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ７４２を参照のこと）により、又は接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｍｅ （１９８７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６７： ５２７１， 及び又は、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ， 前記を参照のこと）によりもたらされ得る。
【００９０】
形質転換された細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、適切な培地において、及びポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で行なわれる実験室又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は固体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において生じる。適切な培地は、市販されており、又は公開された組成（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ のカタログにおける）に従って調製され得る。
【００９１】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により単離され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿により栄養培地から単離され得る。次に、単離されたポリペプチドはさらに、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（例えば、Ｂｏｌｌａｇなど． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ＮＹ； Ｗａｌｋｅｒ （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ． Ｂｏｌｌａｇ など． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， ＮＹ； Ｗａｌｋｅｒ （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＮＪ）により精製され得る。
【００９２】
インビトロ発現システム：
細胞遊離転写／翻訳システムはまた、本発明のＤＮＡ又はＲＮＡを用いてポリペプチドを生成するためにも使用され得る。いくつかのそのようなシステムは市販されている。インビトロ転写及び翻訳プロトコールの一般的な説明は、Ｔｙｍｍｓ （１９９５） Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３７， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＮＹに見出される。
【００９３】
修飾されたアミノ酸：
本発明のポリペプチドは、１又は複数の修飾されたアミノ酸を含むことができる修飾されたアミノ酸の存在は、例えば（ａ）ポリペプチド血清半減期を高めることにおいて、（ｂ）ポリペプチド抗原性を低めることにおいて、（ｃ）ポリペプチド貯蔵安定性を高めることにおいて好都合である。アミノ酸は、例えば組換え方法の間、同時翻訳に又は後−翻訳的に修飾され（例えば、哺乳類細胞における発現の間、Ｎ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ−結合されたグリコシル化）、又は合成手段により修飾される。
【００９４】
修飾されたアミノ酸の非制限的例は、グリコシル化されたアミノ酸、硫酸化されたアミノ酸、プレニレート化された（例えば、ファルネシル化された、ゲラニルゲラニル化された）アミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、アシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ビオチニル化されたアミノ酸、カルボキシル化されたアミノ酸、リン酸化されたアミノ酸、及び同様のものを包含する。アミノ酸の修飾において当業者を指導するのに適切な引例は、文献において十分に供給される。典型的なプロトコールは、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ， ＮＪ に見出される。
【００９５】
プローブの使用：
上記スブチリシン相同ポリヌクレオチドに対して高い緊縮条件下でハイブリダイズする、少なくとも１２個の塩基、好ましくは少なくとも１５個の塩基、より好ましくは少なくとも２０， ３０又は５０個又はそれ以上の塩基を典型的には有するオリゴヌクレオチドとして本明細書において言及されるポリヌクレオチドの使用がまた企画される。ポリヌクレオチドは、上記方法に従って、プローブ、プライマー、センス及びアンチセンス剤として使用され得る。
【００９６】
配列変動：
サイレント変動：
遺伝子コードの縮重のために、本発明のスブチリシン相同ポリペプチドをコードする多数の核酸配列が生成され、そのいくつかは本明細書に明白に開示される核酸配列に対して実質的な同一性を担持することは、当業者により理解されるであろう。
【００９７】
【表１】
2004508011.tif 000002
【００９８】
例えば、コドン表（表１）の調査は、コドンＡＧＡ， ＡＧＧ， ＣＧＡ， ＣＧＣ， ＣＧＧ及びＣＧＵすべてがアミノ酸アルギニンをコードすることを示す。従って、アルギニンがコドンにより特定される本発明の核酸におけるあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更しないで、上記対応するコドンのいずれかに変更され得る。ＲＮＡ配列におけるＵが、ＤＮＡ配列におけるＴに対応することは理解されている。
配列番号１のヌクレオチド２−１６に対応する核酸配列ＴＣＧ ＡＣＴ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＧＧを、例として用いる場合、この配列のサイレント変動は、ＡＧＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＧＡを包含し、ここで両配列は、配列番号１３１のアミノ酸１−５に対応するアミノ酸配列ＳＴＱＤＧをコードする。
【００９９】
そのような“サイレント変動”は、下記に論じられる“保存的に修飾された変動”の１つの種類である。当業者は、核酸における個々のコドン（通常、メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が、機能的に同一のポリペプチドをコードするよう標準技法により修飾され得ることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変動は、いずれかの記載される配列において明白である。
【０１００】
本発明は、可能性あるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって製造され得る、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の個々の及びあらゆる可能な変動を提供する。それらの組み合わせは、本発明のスブチリシン相同ポリペプチドをコードする核酸配列に適用されるように、標準のトリプレット遺伝子コード（例えば、表１に示されるような）に従って行なわれる。本明細書におけるあらゆる核酸のすべてのそのような変動は、特異的に提供され、そして遺伝子コードと組合せての配列の考慮により記載される。いずれの変異体でも、本明細書に示されるようにして生成され得る。
【０１０１】
保存性変動：
特定の核酸配列の“保存的に修飾された変動”、又は単純に、“保存性変動”とは、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一の配列を言及する。当業者は、コードされる配列において単一のアミノ酸又は少ない％のアミノ酸（典型的には、約５％、より典型的には約４％、約２％又は約１％以下）を、変更し、付加し、又は欠失する、個々の置換、欠失又は付加が、“保存的に修飾された変動”であり、ここで変更は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似するアミノ酸による１つのアミノ酸の置換をもたらす。
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存性置換表は、当業界において良く知られている。表２は、お互い“保存性置換”であるアミノ酸を含む６種のグループを示す。
【０１０２】
【表２】
2004508011.tif 000003
【０１０３】
従って、本発明の列挙されるポリペプチド配列の“保存的に置換された変動”は、少数％、典型的には約５％以下、より典型的には約２％以下及びしばしば約１％以下のポリペプチド配列のアミノ酸の、同じ保存性置換グループの保存的に選択されたアミノ酸による置換を包含する。
例えば、配列番号１３１として本明細書において同定されるポリペプチドの保存的に置換された変動は、１６９個のアミノ酸のポリペプチドにおける８個までの残基（すなわち、約５％のアミノ酸）における、上記で定義される６個のグループに従って、“保存性置換”を含むであろう。
【０１０４】
さらなる例においては、４個の保存性置換が配列番号１３１のアミノ酸２５〜３５に対応する領域に局在化する場合、下記に示されるように、この領域の保存的に置換された変動の例は、表２に列挙される保存性置換に従えば次の通りである：
ＡＡＬ ＮＮＳ ＩＧＶ Ｌ
ＡＡＬ ＱＮＡ ＬＧＶ Ｖ
ＡＡＬ ＱＮＴ ＶＧＶ Ｍ 及び同様のもの（上記例においては、保存性置換は下線が引かれている）。本明細書におけるタンパク質配列の列挙は、上記置換表に関連して、すべての保存的に置換されたタンパク質の明白な列挙を提供する。
最終的に、核酸分子のコードされた活性を変更しない配列の付加、例えば非機能的又は非コード配列の付加は、塩基性核酸の保存性変動である。
【０１０５】
当業者は、開示される核酸構造体の多くの保存性変動が機能的に同一の構造体を生成することを理解するであろう。例えば、上記で論じられるように、遺伝子コードの縮重のために、“サイレント置換”（すなわち、コードされたポリペプチドにおける変更をもたらさない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列の包含される特徴である。同様に、アミノ酸配列における１又は数個のアミノ酸における“保存性アミノ酸置換”はまた、開示される構造体に高く類似する場合、容易に同定される。個々の開示される配列のそのような保存性変動は、本発明の特徴である。
【０１０６】
非保存性変動：
特定の核酸の非保存性修飾は、保存性置換として特徴づけられないいずれかのアミノ酸を置換する修飾である。例えば、表２に示される６種のグループの結合を妨げるいずれかの置換が例である。それらは、中性アミノ酸による塩基性又は酸性アミノ酸（例えば、Ｖａｌ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ又はＭｅｔによるＡｓｐ， Ｇｌｕ， Ａｓｎ又はＧｌｎ）、塩基性又は酸性アミノ酸による芳香族アミン酸（例えば、Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ又はＧｌｎによるＰｈｅ， Ｔｙｒ又はＴｒｐ）の置換、又は同様のアミノ酸によりアミノ酸を置換しないいずれか他の置換を包含する。
【０１０７】
％配列同一性−配列類似性：
上記に示されるように、本発明に使用されるポリペプチド及び核酸は、スブチリシン相同分子又は関連する分子のその対応する配列に対して、同一である必要はないが、しかし実質的に同一（又は実質的に類似する）であり得る。ポリペプチド（及びペプチド）は、種々の変化、例えば保存的又は非保存的な挿入、欠失及び置換を受けることができ、ここでそのような変化はそれらの使用において一定の利点を提供する。本発明のポリペプチドは、それらがスブチリシン相同分子における配列に対して実質的に類似するか、又は実質的に同一である（下記で定義されるように）配列を含んで成る限り、多くの手段で修飾され得る。
【０１０８】
比較的短いアミノ酸配列（約３０個以下の残基）の一列整列及び比較は典型的には、直接的である。より長い配列の比較は、２種の配列の最適な一列整列を達成するためにより洗練された方法を必要とする。比較窓を整列するための配列の最適な一列整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２の局部相同アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３の相同一列整列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４の類似性方法についての調査により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｐｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＴＴ， ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ；及びＢＬＡＳＴ、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌなど． （１９７７） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２， 及びＡｌｔｓｃｈｕｌなど．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０を参照のこと）、又は選択される種々の方法により生成される最良の一列整列（すなわち、比較窓に対して最高の％の配列類似性をもたらす）による調査により行なわれる。
【０１０９】
用語“配列同一性”とは、２種のポリヌクレオチド配列が、比較窓に対して同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。用語“配列同一性の％”又は“配列類似性の％”は、比較窓に対して最適に整列された２種の配列を比較し、同一の残基が、適合する位置の数を得るために、両ヌクレオチド配列において存在する位置の数を決定し、比較窓（すなわち、窓サイズ）における位置の合計数により適合する位置の数を割り算し、そして配列同一性の％（又は配列類似性の％）を得るために１００により前記結果を掛け算することによって計算される。
【０１１０】
ポリペプチド配列に関して、用語、配列同一性とは同様に、２種のポリペプチド配列が、比較窓に対して同一であり（アミン酸対アミノ酸に基づいて）、そしてアミノ酸残基配列同一性の％（又はアミノ酸残基類似性の％）がまた計算され得ることを意味する。最大の応答は、本明細書に記載される配列アルゴリズムの１つ、又は当業者に入手できる他のアルゴリズムを用いることにより、又は、視覚調査により決定され得る。
【０１１１】
ポリペプチドに適用される場合、用語、実質的な同一性又は実質的な類似性とは、２種のペプチド配列が、例えばデフォールトギャップ重量（下記に詳細に記載される）を用いてのプログラムＢＬＡＳＴ， ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＴＴにより、又は視覚的調査により最適に整理される場合、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％の％配列同一性又は配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列同一性又は配列類似性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性又は配列類似性、又はそれ以上の同一性又は類似性（例えば、約９６， ９７， ９８， ９８．５， ９９， ９９．５又はそれ以上の％アミノ酸残基配列同一性又は配列類似性を包含する）を共有することを意味する。
【０１１２】
同様に、２種の核酸に適用される場合、用語、実施的な同一性又は実質的な類似性とは、２種の核酸配列が、例えばデフォールトギャップ重量（下記に詳細に記載される）を用いてのプログラムＢＬＡＳＴ， ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＴＴにより、又は視覚的調査により最適に整理される場合、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％の％配列同一性又は配列類似性、好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列同一性又は配列類似性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性又は配列類似性、又はそれ以上の同一性又は類似性（例えば、約９６， ９７， ９８， ９８．５， ９９， ９９．５又はそれ以上の％ヌクレオチド配列同一性又は配列類似性を包含する）を共有することを意味する。
【０１１３】
１つの観点においては、本発明は、配列番号１−１３０のいずれかの核酸配列、又はそのフラグメントと少なくとも約７０， ８０， ８５， ９０， ９５， ９６， ９７， ９８， ９８．５， ９９， ９９．５％又はそれ以上の％配列同一性又は配列類似性を有するスブチリシン相同核酸を提供する。もう１つの観点においては、本発明は、配列番号１−１３０のいずれかの核酸配列、又はエンドプロテアーゼ活性を示すそのフラグメントと少なくとも約７０， ８０， ８５， ９０， ９５， ９６， ９７， ９８， ９８．５， ９９， ９９．５％又はそれ以上の％配列同一性又は配列類似性を有するスブチリシン相同ポリペプチドを提供する。
【０１１４】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、配列番号１３１−２６０の少なくとも１つの配列の少なくとも約２０個（又は約３０， ４０， ６０， ８０， １００個又はそれ以上）の連続したアミノ酸に対して実質的に同一であるか又は実質的に類似するスブチリシン相同ポリペプチドを提供し；いくつかのそのようなポリペプチドは、改良された性質、例えば熱安定性、低又は中性ｐＨでの活性又は有機溶媒における活性、及び同様の活性を示すことができる。
【０１１５】
他方では、本発明の１又は複数の配列が配列番号１−１３０から選択された問題配列に対する一列整列により同定されるが、しかし関連しないポリペプチドに対応する配列、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号、Ｍ６５０８６，Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７により表される核酸配列によりコードされるそれらの配列は同定されないようにパラメーターが設定される。
【０１１６】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。保存性アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の相互交換能力を言及する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギニン及びヒスチジンであり；そして硫黄包含側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸置換グループは次のものである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミン。
【０１１７】
％配列同一性又は配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの好ましい例は、Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｗ．Ｒ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．， （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４に記載されるＦＡＳＴＡアルゴリズムである。例えば、Ｗ．Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ， （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ２２７−２５８も参照のこと。％同一性又は％類似性を計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡ−列整列に使用される好ましいパラメーターが最適化される：ＢＬ５０マトリックス　１５；−５， ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２； 連結ペナルティー＝４０；最適化＝２８；ギャップペナルティー＝１２；ギャップ長ペナルティー＝−２；及び幅＝１６。
【０１１８】
％配列同一性又は配列類似性を決定するために適切であるアルゴリズムの他の好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌなど．， （１９７７） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２， 及びＡｌｔｓｃｈｕｌなど．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０、並びに本明細書に記載されるパラメーターが、本発明の核酸、ポリペプチド及びタンパク質についての％配列同一性又は％配列類似性を決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ−ｇｏｖ／） から入手できる。
【０１１９】
このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと共に整列される場合、いくらかの正の値の限界評点を適合するか又は満たす、問題配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高い評点の配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを包含する。Ｔは、隣接ワード評点として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．，前記）。それらの初期隣接ワードヒットは、それらを含む長いＨＳＰを見出すために調査を開始するための種として作用する。そのワードヒットは、累積整列評点が高められ得る限り、個々の配列に沿って両方に延長される。累積評点は、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（１対の適合残基のためのリワード評点；単に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティー評点）を用いて計算される。
【０１２０】
アミノ酸配列に関しては、評点マトリックスが、累積評点を計算するために使用される。個々の方向におけるワードヒットの延長は、累世整列評点がその最大の達成された値から量Ｘだけ低下する場合；累積評点が、１又は複数の負の評点残基整列の累積のために、ゼロ又はそれ以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合、休止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ， Ｔ及びＸは、一列整列の感受性及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較をデフォールトとして用いる。
【０１２１】
アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）及び１０の予測（Ｅ）デフォールトとして用い、そしてＢＬＯＳＵＭ６２評点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５を参照のこと）は、５０の一列整列（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。再び、他の適切なアルゴリズムに関しては、比較の精度は、そのプログラムが、他の類似する配列により密接に関連する配列、例えばＧｅｎＢＡｎｋ受託番号Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７により表されるそれらの核酸配列、又は例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて見出される他の類似する分子によりむしろ、本明細書における配列列挙（すなわち、配列番号１−１３０又は他方では、配列番号１３１−２６０）におけるそれらの配列により密接に関連する配列のみを同定するまで、高められ得る。
【０１２２】
言及すれば、アルゴリズムの比較の精度は高められ得、素の結果、すべての既知の従来技術（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５０８６，Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９５８８及び２８５３７により表される配列、又は例えばＧｅｎＢａｎｋにおいて見出される他の類似する分子、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６により表される配列）は排除される。
【０１２３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２種の配列間の類似性又は同一性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性又は同一性の１つの基準は、２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が偶然に生じる確立の表示を提供する最小合計確立（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、対照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確立が約０．２以下、より好ましくは約０．０１以下、及び最も好ましくは約０．００１以下である場合、対照配列に類似すると見なされる。
【０１２４】
有用なアルゴリズムのもう１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係、及び％配列同一性又は％配列類似性を示すために、前進性対様一列整列を用いて、関連する配列群から複数の配列一列整列を創造する。それはまた、一列整列を創造するために使用されるクラスター関係を示す樹形曲線又は樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ． ３５： ３５１−３６０の前進性一列整列方法の単純化を用いる。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３により記載される方法に類似する。
【０１２５】
そのプログラムは、３００個までの配列を整列することができ、それぞれは最大長５，０００個のヌクレオチド又はアミノ酸である。複数の一列整列方法は、２種の整列された配列のクラスターを生成する、２種の最も類似する配列の対様一列整列により開始する。次に、このクラスターが、次の最も関連する配列又は整列された配列クラスターに対して一列整列される。２種の配列クラスターは、２種の個々の配列の対様一列整列の単純な延長により一列整列される。最終一列整列は、一連の進行性対様一列整列により達成される。
【０１２６】
プログラムは、配列比較の領域のための特定の整列及びそれらのアミノ酸又はヌクレオチド座標を表し、そしてプログラムパラメーターを表すことによって運転される。ＰＩＬＥＵＰを用いる場合、対照配列は、次のパラメーター：デフォールトギャップ重量（３．００）、デフォールトギャップ長重量（０．１０）及び加重された末端ギャップを用いて、％配列同一性（又は％配列類似性）関係を決定するために他の試験配列に比較される。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＡＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン７．０から得られる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘなど．， （１９８４） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７−３９５）。
【０１２７】
複数のＤＮＡ及びアミノ酸配列一列整列のために適切であるアルゴリズムのもう１つの好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．Ｄ． など．， （１９９４） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ４６７３−４６８０）。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、配列グループの間の複数の対様比較を行い、そしてそれらを、相同性に基づいての複数の一列整列をアセンブルする。ギャップ開放及びギャップ延長ペナルティーは、それぞれ１０及び０．０５であった。アミノ酸一列整列に関しては、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムは、タンパク質重量マトリックスとして使用され得る（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５−１０９１９）。
【０１２８】
調査及び一列整列アルゴリズムの上記論議がまた、ポリヌクレオチド配列の同定及び評価、及びヌクレオチド配列を含む問題配列の置換、並びに適切な場合、核酸データベースの選択にも適用されることは、当業者により理解されるであろう。
【０１２９】
核酸ハイブリダイゼーション：
核酸は、それらが典型的には、溶液において会合する場合、“ハイブリダイズする”。核酸は、種々の十分に特徴づけられた物理−化学力、例えば水素結合、溶媒排除、塩基の積み重ね及び同様のもののためにハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２， “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”， （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， 及びＡｕｓｕｂｅｌ， 前記に見出される。Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， （Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ １）， 及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ （１９９５） Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ （Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ２） は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えばオリゴヌクレオチドの合成、ラベリング、検出及び定量化についての詳細を提供する。
【０１３０】
核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザン及びノザンハイブリダイゼーションにおける“縮重ハイブリダイゼーション洗浄条件”は、配列依存性であり、そして異なった環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３）， 前記及びＨａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， １及び２に見出される。
【０１３１】
本発明に関して、一般的に“高い緊縮”のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、定義されるイオン強度及びｐＨで特定の配列についての熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、試験配列の５０％が、完全に適合されるプローブにハイブリダイズする温度（定義されるイオン強度及びｐＨ下で）。非常に緊縮性の条件は、特定のプローブに関して、Ｔｍに等しく選択される。
【０１３２】
サザン又はノザンブロットにおけるフィルター上に１００以上の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについての緊縮ハイブリダイゼーションの条件の例は、４２℃で５０％ホルマリン及び１ｍｇのヘパリンであり、そしてハイブリダイゼーションは一晩、行なわれる。緊縮洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ， 前記を参照のこと）。しばしば、高い緊縮洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低い緊縮洗浄により先行される。低い緊縮洗浄の例は、４０℃で１５分間の２×ＳＳＣである。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける適合しないプローブ（例えば、本発明の出願の前、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて見出される配列を有する公的に入手できるスブチリシンコードの核酸）について観察される比の５倍（又は５倍高い）のシグナル：ノイズ比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
【０１３３】
比較ハイブリダイゼーションが本発明の核酸を同定するために使用され、そしてこの比較ハイブリダイゼーション方法は、本発明の核酸を区別する好ましい方法である。
【０１３４】
特に、本発明における高い緊縮性のハイブリダイゼーションの検出は、例えば本明細書における配列列挙に提供される核酸に対する強い構造的同一性を示す。例えば、緊縮条件下で本明細書における典型的核酸に対してハイブリダイズする試験核酸を同定することが所望される。緊縮ハイブリダイゼーションの１つの基準は、高い緊縮条件下で、列挙される核酸（例えば、核酸配列配列番号１〜１３０）、及びその相補的ポリヌクレオチド配列又はその副配列（例えば、アミノ酸位置７１−９５， ８６−１１０， １１１−１３５及び／又は１９６−２３０をコードする副配列）の１つに対してハイブリダイズする能力である。緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、いずれかの試験核酸について経験的に容易に決定され得る。
【０１３５】
例えば、高い緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の決定においては、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件が、選択される基準が満たされるまで、徐々に高められる（例えば、温度を高め、塩濃度を低め、界面活性剤濃度を高め、そして／又はハイブリダイゼーション又は洗浄下での有機溶媒、例えばホルマリンの濃度を高めることにより）。
【０１３６】
例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、配列番号１〜１３０から選択された１又は複数の核酸配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含んで成るプローブが、適合しない標的物へのプローブのハイブリダイゼーションに関して観察されるシグナル：ノイズ比よりも少なくとも５倍高く、そして時々、所望する識別に依存して、１０倍、２０倍、５０倍又はそれ以上高いシグナル：ノイズ比を伴なって、完全に適合する相補的標的物（再び、配列番号１〜１３０から選択された１又は複数の核酸配列を含んで成る核酸、及びその相補的ポリヌクレオチド配列）に結合するまで、徐々に高められる。
【０１３７】
この場合、適合しない標的物は、既知のスブチリシン相同体に対応する核酸、例えば本明細書の出願の時点で、公的なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋＴＭ に存在するスブチリシン相同核酸（付随する配列列挙における核酸以外）である。そのような適合しない標的核酸の例は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７を有する核酸を包含する。追加のそのような配列は、当業者によりＧｅｎＢａｎｋにおいて同定され得る。
【０１３８】
試験核酸は、それが、完全に適合する相補的標的物に対しての少なくとも１／２、プローブ核酸に対して、完全に適合するプローブが、適合しない標的核酸Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかへのハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル：ノイズ比よりも少なくとも約５〜１０倍、及び時おり、２０倍、５０倍又はそれ以上であるシグナル：ノイズ比を伴なって、完全に適合する相補的標的物に結合する条件下で、標的物へのプローブのハイブリダイゼーションの少なくとも１／２ほどのシグナル：ノイズ比を伴なって、ハイブリダイズする場合、プローブ核酸に特異的にハイブリダイズすると言われる。
【０１３９】
超高緊縮ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の緊縮性が、完全に適合する相補的標的核酸へのプローブの結合のためのシグナル：ノイズ比が、適合しない標的核酸Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかへのハイブリダイゼーションについて観察される比の少なくとも１０倍、時々２０倍、及び時おり５０倍になるまで、高められる条件である。完全に適合する相補的標的核酸のシグナル：ノイズ比の少なくとも１／２のその比を伴なって、そのような条件下でプローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高緊縮条件下でプローブに結合すると言われる。
【０１４０】
同様に、さらに高レベルの緊縮性は、適切なハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に高めることによって決定され得る。例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の緊縮性が、完全に適合する相補的標的核酸へのプローブの結合についてのシグナル：ノイズ比が、適合しない標的核酸Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかへのハイブリダイゼーションについて観察される比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又は５００倍、又はそれ以上になるまで高められるそれらが固定され得る。完全に適合する相補的標的核酸のシグナル：ノイズ比の少なくとも１／２のシグナル：ノイズ比を伴なって、その条件下でプローブに対してハイブリダイズする標的核酸は、超高緊縮条件下でプローブに結合すると言われる。例えば、出願日現在ＧｅｎＢａｎｋから入手できるそれらの配列から選択された最も類似する配列は、制御配列として使用され得る。
【０１４１】
高、超高及び超−超高緊縮条件下で、配列番号１−１３０により表される核酸にハイブリダイズする標的核酸は、本発明の特徴である。そのような核酸の例は、所定の核酸配列に比較して、１又は少数のサイレント又は保存性核酸置換を有するそれらを包含する。
【０１４２】
緊縮条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許容されル最大コドン縮重を用いて創造される場合、又は配列番号１３１−２６０の１又は複数の配列に対して生成される抗血清がＧｅｎＢａｎｋにおける次のスブチリシン配列、すなわちＭ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７によりコードされるポリペプチドを用いて控除される場合、生じる。本発明のポリペプチドの免疫学的同定に対するさらなる詳細は、下記に見出される。
【０１４３】
１つの観点においては、本発明は、配列番号１〜１３０から選択された核酸にユニーク副配列を含んで成る核酸を提供する。ユニーク副配列は、Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７のいずれかに対応する核酸に比較してユニークである。そのようなユニーク副配列は、Ｍ６５０８６， Ｄ１３１５７， Ｓ４８７５４， ＡＢ００５７９２， Ｄ２９６８８及びＭ２８５３７に対応する完全組の核酸に対して、配列番号１−１３０のいずれかを整列することによって決定され得る。一列整列は、デフォールトパラメーターに対するＢＬＡＳＴアルゴリズム組を用いて行なわれ得る。いずれかのユニーク副配列が、本発明の核酸を同定するためにプローブとして有用である。
【０１４４】
同様に、本発明は、配列番号１３１−２６０から選択されたポリペプチドにユニーク副配列を含んで成るポリペプチドを包含する。ここで、ユニーク副配列は、Ｐ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号）のいずれかに対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１４５】
ここで再び、前記ポリペプチドは、Ｐ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６に対応する完全な組のポリペプチドに対して整列される（配列が非翻訳配列、例えば偽遺伝子に対応する場合、その対応するポリペプチドは、核酸配列のアミノ酸配列へのイン　シリコ翻訳により単純に生成され、ここで読み取り枠は相同スブチリシン核酸の読み取り枠に対応するよう選択されることを注目すること）。
【０１４６】
本発明はまた、配列番号１３１−２６０から選択されポリペプチドにおけるユニーク副配列をコードするユニークコードオリゴヌクレオチドに、緊縮条件下でハイブリダイズする標的核酸を提供し、ここで前記ユニーク副配列は対照ポリペプチドのいずれかに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は、上記のようにして決定される。
【０１４７】
１つの例においては、緊縮条件は、コードオリゴヌクレオチドに対する完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、対照ポリペプチドのいずれかに対応する対照核酸への完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションよりも少なくとも約５−１０倍高いシグナル：ノイズ比を有するコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするよう選択される。条件は、例えば約１５倍、２０倍、３０倍、５０倍又はそれ以上の高いシグナル：ノイズ比が、使用される特定のアッセイいおいて観察されるよう選択され得る。
【０１４８】
この例においては、標的核酸は、コードオリゴヌクレオチドへの対照核酸のハイブリダイゼーションに比較して、少なくとも２倍高いシグナル：ノイズ比を有するユニークコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。再び、例えば、約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍又はそれ以上の高いシグナル：ノイズ比が選択される。特定のシグナルは、適切なアッセイに使用されるラベル、例えば蛍光ラベル、比色ラベル、放射性ラベル又は同様のものに依存するであろう。
【０１４９】
配列組換えのための基質及び形式：
本発明のポリヌクレオチドは任意には、種々の多様性生成方法、例えば組換え及び反復組換え（例えば、ＤＮＡシャフリング）反応のための、すなわち所望する性質を有する追加のスブチリシン相同体を生成するための基質として使用される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ａｕｓｕｂｅｌ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ， （前記） において示されるような標準のクローニング方法の他に、種々の多様性生成方法が入手でき、そして文献において記載されている。前記方法は、核酸又は核酸の１または複数の変異体、及びコードされるタンパク質の変異体を生成するために、別々に及び／又は組合せて使用され得る。個々に及び集合的に、それらの方法は、新規及び／又は改良された特性を有する、核酸、タンパク質、経路、細胞及び／又は生物の構築又は急速な進化のために有用な、多様化された核酸及び核酸組（例えば、核酸ライブラリーを包含する）を生成する広範囲に適用できる手段を提供する。
【０１５０】
識別及び分類は、明瞭性のための確実な論議において行なわれ得るが、その技術はしばしば、相互的に排他的ではない。実際、種々の方法が、種々の配列変異体に近づくために、同時に又は連続的に、単独で又は組合せて使用され得る。
【０１５１】
本明細書に記載される多様性生成方法のいずれかの結果は、所望する性質を有するか、又はそれを付与する核酸について選択されるか又はスクリーンされ得るか、又は所望する性質を有するか、又はそれを付与するタンパク質をコードする、１又は複数の核酸の生成であり得る。本明細書におけるか、又は他方では、当業者に入手できる１又は複数の方法による多様化に続いて、生成されるいずれかの核酸が、所望する活性又は性質、例えば改良された熱安定性、中性又は低ｐＨでの高められた活性、有機溶媒における高められた活性、及び同様の活性を有するスブチリシン相同体について選択され得る。これは、本明細書に記載され、そして当業界において知られている、プロテアーゼ活性を評価するための種々の方法を包含する、当業界におけるいずれかのアッセイにより、自動化された又は自動形式で検出され得るいずれかの活性を同定することを包含する。種々の関連する（又は関連しない）性質が、実施者の意志で、連続的に又は同時に評価され得る。
【０１５２】
所望する性質を有するスブチリシン相同体をコードする修飾された核酸配列を生成するために適切な種々の多様性生成方法の記載は、次の出版物及びそこに引用される引例に見出される：Ｓｏｏｎｇ， Ｎ． など．， （２０００） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ” Ｎｅｔ Ｇｅｎｅｔ ２５ （４）： ４３６−４３９； Ｓｔｅｍｍｅｒ， など． （１９９９） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ” Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１−４； Ｎｅｓｓ など． （１９９９） “ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ８９３−８９６； Ｃｈａｎｇ など． （１９９９） “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ７９３−７９７； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９９） “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２８４−２９０； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ など． （１９９９） “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ２５９−２６４；
【０１５３】
Ｃｒａｍｅｒｉ など． （１９９８） “ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ２８８−２９１； Ｃｒａｍｅｒｉ など． （１９９７） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂａｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ４３６−４３８； Ｘｈａｎｇ など． （１９９７） “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ４５０４−４５０９； Ｐａｔｔｅｎ など． （１９９７） “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：７２４−７３３； Ｃｒａｍｅｒｉなど． （１９９６） “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：１００−１０３； Ｃｒａｍｅｒｉ など． （１９９６） “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ３１５−３１９； Ｇａｔｅｓ など． （１９９６） “Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ａ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ “ｈｅａｄｐｉｅｃｅ ｄｉｍｅｒ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５５： ３７３−３８６； Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９６） “Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ” Ｉｎ； Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４４７−４５７；
【０１５４】
Ｃｒａｍｅｒｉ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９５） “ｘｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｒｅａｔｅｓ ａｌｌ ｔｈｅ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ” Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８： １９４−１９５； Ｓｔｅｍｍｅｒ など．， （１９９５） “Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ” Ｇｅｎｅ， １６４： ４９−５３； Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９５） “Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： １５１０； Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９５） “Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ” Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： ５４９−５５３； Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） “Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−３９１； ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） “ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｓｅｍｂｌｙ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−１０７５１。
【０１５５】
多様性を生成するための突然変異誘発方法は例えば、次のものを包含する：特定部位の突然変異誘発（Ｌｉｎｇ など． （１９９７） “Ａｐｐｒｏｚｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｎｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ” Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５４（２）； １５７−１７８； Ｄａｌｅ など． （１９９６） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５７： ３６９−３７４； Ｓｍｉｔｈ （１９８５） “Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９： ４２３−４６２； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ （１９８５） “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １１９３−１２０１； Ｃａｒｔｅｒ （１９８６） “Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２３７：１−７； ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ （１９８７） “Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｘｋｓｔｅｉｎ， ｆ． ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ， Ｄ．Ｍ．Ｊ． ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ））；
【０１５６】
ウラシル含有鋳型を用いての突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ （１９８５） “Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ４８８−４９２； Ｋｕｎｋｅｌ など． （１９８７） “Ｒａｐｉｄ ｎａｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３６７−３８２； ａｎｄ Ｂａｓｓ など． （１９８８） “Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ２４０−２４５）；
【０１５７】
オリゴヌクレオチド−使図された突然変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００： ４６８−５００ （１９８３）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３２９−３５０ （１９８７）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ （１９８２） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ； ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７−６５００； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ （１９８３） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００： ４６８−５００； ａｎｄ Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ （１９８７） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ； ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３２９−３５０）；
【０１５８】
ホスホロチオエート−修飾されたＤＮＡ突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒなど． （１９８５） “Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｓｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３； ８７４９−８７６４； Ｔａｙｌｏｒ など． （１９８５） “Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔｏ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ８７６５−８７８７ （１９８５）； Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ （１９８６） “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ９６７９−９６９８； Ｓａｙｅｒｓ など． （１９８８） “Ｙ−Ｔ Ｅｘｏｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ７９１−８０２； ａｎｄ Ｓａｙｅｒｓ など． （１９８８） “Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ８０３−８１４）；
【０１５９】
ギャップ付与された二本鎖ＤＮＡを用いての突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ など． （１９８４） “Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ９４４１−９４５６； Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｓ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ” １５４： ３５０−３６７； Ｋｒａｍｅｒ など． （１９８８） “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６； ７２０７； ａｎｄ Ｆｒｅｔｚ など． （１９８８） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ； ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｒｏ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ６９８７−６９９９）。
【０１６０】
追加の適切な方法は、次のものを包含する：点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ など． （１９８４） “Ｐｏｉｎｔ ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ” Ｃｅｌｌ ３８： ８７９−８８７）， 修復欠失宿主株を用いての突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ など． （１９８５） “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １３： ４４３１； ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ （１９８７） “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３８２−４０３）， 欠失 突然変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｎｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８６） “Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ５１１５）， 制限−選択及び制限−精製 （Ｗｅｌｌｓ など． （１９８６） “Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ” Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ａ３１７： ４１５−４２３），
【０１６１】
合計の遺伝子合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ など． （１９８４） “Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３： １２９９−１３０１； Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ （１９８８） “Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｔｒａｎｄｕｃｉｎ）” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６３６１−６３７２； Ｗｅｌｌｓ など． （１９８５） “Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ； ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ” Ｇｅｎｅ ３４： ３１５−３２３； ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ など． （１９８５） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ “ｓｈｏｔ−ｇｕｎ” ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｅｓｉｓ” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ３３０５−３３１６），
【０１６２】
二本鎖分解修復 （Ｍａｎｄｅｃｌａ （１９８６） “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８３： ７１７７−７１８１； ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （１９９３） “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： ４５０−４５５）。多くの上記方法についての追加の詳細は、種々の突然変異誘発方法に関する問題を処理するための有用な調節法を記載する、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｒｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ１５４に見出され得る。
【０１６３】
種々の多様性生成方法、例えばＤＮＡシャフリング方法に関する追加の詳細は、次のアメリカ特許、ＰＣＴ公開及び出願に見出され得る：アメリカ特許第５，６０５，７９３号（Ｓｔｅｍｍｅｒ）（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２５， １９９７）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ” ；アメリカ特許第５，８１１，２３８号（Ｓｔｅｍｍｅｒなど．）（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２２， １９９８） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ” ；アメリカ特許第５，８３０，７２１号（Ｓｔｅｍｍｅｒなど．）（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ３， １９９８）， “ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｓｅｍｂｌｙ” ；アメリカ特許第５，８３４，２５２（Ｓｔｅｍｍｅｒなど．）（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０， １９９８） “Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ” ；アメリカ特許第５，８３７，４５８号（Ｍｉｎｓｈｕｌｌなど．）（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７， １９９８）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”；
【０１６４】
ＷＯ９５／２２６２５号（Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ）， “Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ ｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｓｅｍｂｌｙ” ； ＷＯ９６／３３２０７号 （Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｌｉｐｓｃｈｕｔｚ） “Ｅｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”； ＷＯ９７／２００７８号 （Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｂｙ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”； ＷＯ９７／３５９６６号 （Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”； ＷＯ９９／４１４０２号 （Ｐｕｎｎｏｎｅｎなど．） “Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ”； ＷＯ９９／４１３８３号（Ｐｕｎｎｏｎｅｎなど．）”Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”； ＷＯ９９／４１３６９号（Ｐｕｎｎｏｎｅｎなど．） “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”； ＷＯ９９／４１３６８号 （Ｐｕｎｎｏｎｅｎなど．） “Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”；
【０１６５】
ＥＰ７５２００８号 （Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ）， “ＤＮＡ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ”； ＥＰ０９３２６７０号 （Ｓｔｅｍｍｅｒ） “Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ Ｕｐｔａｋｅ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”； ＷＯ９９／２３１０７号 （Ｓｔｅｍｍｅｒ など．）， “Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ ｂｙ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”； ＷＯ９９／２１９７９号 （Ａｐｔなど．）， “Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ”； ＷＯ９８／３１８３７号 （ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅなど．） “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”； ＷＯ９８／２７２３０号 （Ｐａｔｔｅｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”； ＷＯ９８／２７２３０号 （Ｓｔｅｍｍｅｒなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， ＷＯ００／００６３２号， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”；
【０１６６】
ＷＯ９８／４２８３２号 （Ａｒｎｏｌｄなど．）， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｎｄｏｍ ｏｒ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｐｒｉｍｅｒｓ”， ＷＯ９８／２９９０２号 （Ａｒｎｏｌｄなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”， ＷＯ９８／４１６５３号 （Ｖｉｎｄ）， “Ａｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ”， ＷＯ９８／４１６２２号 （Ｂｏｒｃｈｅｒｔなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”， 及びＷＯ９８／４２７２７号 （Ｐａｔｉ ａｎｄ Ｚａｒｉｎｇ）， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”， ＷＯ００／１８９０６号 （Ｐａｔｔｅｎなど．）， “Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ Ｇｅｎｅｓ”， ＷＯ００／０４１９０号 （ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅなど．） “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”， ＷＯ００／４２５６１号 （Ｃｒａｍｅｒｉなど．）， “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”；
【０１６７】
ＷＯ００／４２５５９号 （Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ”； ＷＯ００／４２５６０号 （Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”； ＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８号 （Ｗｅｌｃｈなど．）， “Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−ＶａｒｉｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”； 及びＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７６号 “Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉｚｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ” （ Ａｆｆｈｏｌｔｅｒ）。
【０１６８】
手短には、いくつかの異なった一般的種類の配列修飾方法、例えば突然変異、組換え、等は、本発明に適用でき、そして例えば、上記文献に示される。すなわち、上記引用されるいずれかの方法が、改良された性質を有する新規エンドプロテアーゼを生成する本明細書において論じられるスブチリシン相同体を得るために本発明に適合され得る。そのようなスブチリシンの製造方法及びそれらの方法により生成されるスブチリシンは、本発明の特徴である。
次のものは、いくつかの異なった型の本発明における多様性生成のための好ましい形式、例えば一定の組換えに基づく多様性生成形式を例示する。
【０１６９】
核酸は、上記引例において論じられる種々の技法のいずれか、例えば組換えられるべき核酸のＤＮアーゼ消化、続いて、核酸の連結及び／又はＰＣＲアッセンブリーによりインビトロで組換えられ得る。例えば、ＤＮＡ分子のランダム（又は偽ランダム又は非ランダム）断片化、続いて、異なっているが、しかし関連するＤＮＡ配列によるＤＮＡ分子間での配列類似性に基づくインビトロ組換え、続いて、ポリメラーゼ鎖反応にいける延長による交差の固定化を伴なう性的ＰＣＲ突然変異誘発が使用され得る。この方法及び多くの変異体は、いくつかの上記引例、例えばＳｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−１０７５１に記載されている。従って、本明細書に記載されるスブチリシン相同核酸のいずれかが、所望する性質を有する追加のスブチリシン相同体を生成するために、インビトロ組換えされ得る。
【０１７０】
同様に、核酸は、例えば細胞における核酸間での組換えの発生を可能にすることによって、インビボで反復して組換えられ得る。多くのそのようなインビボ組換え形式は、上記引例に示される。そのような形式は任意には、興味ある核酸間での直接的な組換えを提供し、又は興味ある核酸を含んで成るベクター、ウィルス、プラスミド、等間での組換え、及び他の形成を提供する。そのような方法に関する詳細は、上記引例に見出される。従って、スブチリシン相同体コードのいずれかの核酸が、所望する性質を有する新規スブチリシン相同体を生成するために、インビボで組換えられ得る。
【０１７１】
所望するライブラリー成分（例えば、本発明の経路に応答する遺伝子）によるゲノム組換え混合物のスパイキングを任意に包含する、細胞又は他の生物の全ゲノムが組換えられる全ゲノム組換え方法がまた、使用され得る。それらの方法は、標的遺伝子の正体が知られていない方法を包含するそれらの方法は多くの用途を有する。そのような方法に対する詳細は、例えばＷＯ９８／３１８３７号（ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅなど．）， “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”； 及び例えばＰＣＴ／ＵＡ９９／１５９７２号（ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅなど．）， “Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ” に見出される。従って、本発明のスブチリシン相同核酸のいずれかが、好都合な特性を有する追加のスブチリシン相同体を生成するために、全ゲノム組換え方法を用いて組換えされ得る。
【０１７２】
興味ある標的物、例えば本明細書に提供されるスブチリシン相同体に対応するオリゴヌクレオチドが、例えば１よりも多くの親核酸に対応するオリゴヌクレオチド、多くの親核酸のためのコンセンサス配列に対応するオリゴヌクレオチド（任意には、１又は複数の種類のヌクレオチド位置を組み込む）、確証された又は推定上の機能的モチーフを組み込むオリゴヌクレオチド、等を包含するＰＣＲ又は連結反応において合成され、そして再アセンブリーされ、それにより新規の組換えられた核酸が生成される合成組換え方法がまた使用され得る。オリゴヌクレオチドは、標準のヌクレオチド付加方法により製造され、又は例えばトリ−ヌクレオチド合成アプローチにより製造され得る。
【０１７３】
そのようなアプローチに関する詳細は、上記引例、例えば次のものに見出される：ＷＯ００／４２５６１号 （Ｃｒａｍｅｎなど．） “Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”； ＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８号 （Ｗｅｌｃｈなど．） “Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”， ＷＯ００／４２５６０号 （Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”； 及びＷＯ００／４２５５９号 （Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ”。
【０１７４】
遺伝的アルゴリズムが、相同（又は非相同）核酸に対応する配列群を組換えるためにコンピューターに使用されるインシリコ組換え方法がもたらされ得る。得られる組換えられた配列群は、例えばオリゴヌクレオチド合成／遺伝子アセンブリー技法と協力しての、組換えられた配列に対応する核酸の合成により核酸に任意に転換される。このアプローチは、ランダム、部分的ランダム又は消化された変異体を生成することができる。対応する核酸（及び／又はタンパク質）の生成を組合される、コンピューターシステムへの遺伝的アルゴリズム、遺伝子的オペレーター及び同様のものの使用、及び企画された核酸及び／又はタンパク質（例えば、クロスオーバー部位選択に基づいて）及び企画された偽ランダム又はランダム組換え方法の組合せを包含する。
【０１７５】
インシリコ組換えに関する多くの詳細は、ＷＯ００／４２５６０号（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖなど．）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ Ｓｔｒｉｎｇｓ， Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”， 及びＷＯ００／４２５５９号 （Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ）， “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ” に記載される。インシリコ組換え方法に関する多数の詳細は、それらの出願において見出される。この方法論は一般的に、スブチリシン相同体のインシリコ組換え又は対応する核酸又はタンパク質の生成の提供において本発明に適用できる。
【０１７６】
一本鎖鋳型への種々の核酸又は核酸フラグメントのハイブリダイゼーション、十分な長さの配列を再生するための続く重合及び／又は連結、任意には、続いて、鋳型の変性及び得られる修飾された核酸の回収により、天然の多様性に近づく多くの方法が同様に使用され得る。一本鎖鋳型を使用する１つの方法位においては、ゲノムライブラリーに由来するフラグメント集団は、反対鎖に対応する、部分的又はしばしばおおよそ十分な長さのｓｓＤＮＡ又はＲＮＡによりアリーニングされる。次に、この集団からの複合キメラ遺伝子のアセンブリーは、ハイブリダイズしていないフラグメント末端のヌクレアーゼ塩基除去、そのようなフラグメント間のキャップを満たすための重合、及び続く一本鎖連結により介在される。
【０１７７】
親ポリヌクレオチド鎖は、消化（例えば、ＲＮＡ又はウラシル−含有の場合）、変性条件（そのような分離の助けとなる態様でラベルされる場合）下での磁気分離、及び他の入手できる分離／精製方法により除去され得る。他方では、親鎖は任意には、キメラ鎖と共に同時精製され、そして続くクリーニング及びプロセッシング段階の間、除去される。このアプローチに関する追加の詳細は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５号 （Ａｆｆｈｏｌｔｅｒ）， “Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｏ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ” に見出される。
【０１７８】
もう１つのアプローチにおいては、一本鎖分子は、二本鎖ＤＮＡ （ｄｓＤＮＡ）に転換され、そしてｄｓＤＮＡ分子は、リガンド介在性結合により固体支持体に結合される。結合されないＤＮＡの分離の後、選択されたＤＮＡ分子が支持体から開放され、そして適切な宿主細胞中に導入され、プローブにハイブリダイズするライブラリー富化された配列が生成される。この態様での生成されるライブラリーは、本明細書に記載されるいずれかの方法を用いて、追加の多様性のための所望する基質を提供する。
前述の一般的組換え形式のいずれかが、種々の組換え核酸組みを生成するために、反復態様（例えば、突然変異／組換え又は他の多様性生成方法の１つの複数サイクル、任意には、続く１又は複数の選択方法）で行なわれ得る。
【０１７９】
ポリヌクレオチド鎖終結方法を用いる突然変異誘発がまた提案されており（例えば、アメリカ特許第５，９６５，４０８号 （Ｓｈｏｒｔ）， “Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， 及び上記引例を参照のこと）、そして本発明に適用できる。このアプローチにおいては、配列類似性の１又は複数の遺伝子シャフリング領域に対応する二本鎖ＤＮＡは、その遺伝子に対して特異的なプライマーの存在下で又は不在下で、組合され、そして変性される。
【０１８０】
次に、一本鎖ポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ及び鎖終結試薬（例えば、紫外線、γ又はＸ−線照射；臭化エチジウム又は他の挿入体；ＤＮＡ結合タンパク質、例えば一本鎖結合タンパク質、転写活性化因子、又はヒストン；多環式芳香族炭化水素；三価クロム又は三価クロム塩；又は急速な熱サイクリングにより介在される短縮された重合；及び同様のもの）の存在下でインキュベートされ、そして部分二本鎖分子の生成がもたらされる。
【０１８１】
次に、例えば部分的に延長された鎖を含む部分二本鎖分子は、続く複製又は部分複製の段階で変性され、そして再アニーリングされ、種々の程度の配列類似性を共有し、そしてＤＮＡ分子の開始集団に関して多様化されるポリヌクレオチドがもたらされる。任意には、生成物、又は生成物の一部のプールは、前記工程における１又は複数の段階で増幅され得る。上記鎖終結方法により生成されるポリヌクレオチドは、いずれか他の記載される組換え形式のための適切な基質である。
【０１８２】
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒなど． （１９９９） “Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７： １２０５に記載される、“ハイブリッド酵素の創造のためのインクレメント切断”（”ＩＴＣＨＹ”）と称する組換え方法を用いて、核酸又は核酸の集団において創造され得る。このアプローチは、１又は複数のインビトロ又はインビボ組換え方法のための基質として任意に作用することができる変異体の初期ライブラリーを生成するために使用され得る。また、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ など． （１９９９） “Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６： ３５６２−６７； Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ など． （１９９９）， “Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ”， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７： ２１３９−４４を参照のこと。
【０１８３】
個々のヌクレオチド、又は連続又は非連続ヌクレオチオドグループの変更をもたらす突然変異誘発方法が、１又は複数の親スブチリシン相同体中にヌクレオチド多様性を導入するために好ましくは使用され得る。多くの突然変異誘発方法は、上記に引用された文献に見出され；突然変異誘発方法に関する追加の詳細は、本発明にも適用され得る次のものに見出され得る。
【０１８４】
例えば、エラー傾向ＰＣＲは、核酸変異体を生成するために使用され得る。この技法を用いれば、ＰＣＲは、高い割合の点突然変異がＰＣＲ生成物の全長にそって得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのコピー複製が低い条件下で行なわれる。そのような技法の例は、上記文献、及び、例えば、Ｌｅｕｎｇなど． （１９８９） Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５及びＣａｌｄｗｅｌｌなど． （１９９２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２： ２８−３３に見出される。同様に、アセンブリーＰＣＲは、小ＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ生成物のアセンブリーを包含する工程において使用され得る。多数の異なったＰＣＲ反応は、同じ反応混合物において同時に生じることができ、そして１つの反応の生成物がもう１つの反応の生成物をプライミングする。
【０１８５】
オリゴヌクレオチドにより指図される突然変異誘発は、興味ある核酸配列に特定部位の突然変異を導入するために使用され得る。そのような技法の例は、上記文献、及び例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎなど． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： ５３−５７に見出される。同様に、カセット突然変異誘発は、生来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットにより、二本鎖のＤＮＡ分子の小さな領域を置換する工程において使用され得る。オリゴヌクレオチドは例えば、完全に及び／又は部分的にランダム化された配列を含むことができる。
【０１８６】
反復性全体突然変異誘発は、タンパク質突然変異誘発のためのアルゴリズムが、表現型的に関連する変異体の種々の集団（このメンバーはアミノ酸配列において異なる）を生成するために使用される方法である。この方法は、連続期の結合カセット突然変異誘発をモニターするためにフィードバック機構を使用する。このアプローチの例は、Ａｒｋｉｎ ＆ Ｙｏｕｖａｎ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ７８１１−７８１５に見出される。
【０１８７】
指数的全体突然変異誘発は、高い％のユニーク機能的変異体を有する結合ライブラリーを生成するために使用され得る。興味ある配列における小グループの残基が、個々の変更された位置で、機能的タンパク質を導くアミノ酸を同定するために同時にランダム化される。そのような方法の例は、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ ＆ Ｙｏｕｖａｎ （１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１： １５４８−１５５２に見出される。
【０１８８】
インビボ突然変異誘発は、１又は複数のＤＮＡ修復経路において突然変異を担持するＥ．コリ株においてＤＮＡを増殖することによって、興味あるいずれかのクローン化されたＤＮＡにおいてランダム突然変異を生成するために使用され得る。それらの“変異体”株は、野生型親の突然変異割合よりも高いランダム突然変異割合を有する。それらの株の１つにおけるＤＮＡの増殖は結果的に、ＤＮＡ内にランダム突然変異を生成するであろう。そのような方法は、上記文献に記載される。
【０１８９】
ゲノム、例えば細菌、菌類、動物又は植物ゲノム中に多様性を導入するための他の方法は、上記及び／又は引用される方法に関連して使用され得る。例えば、上記方法の他に、種々の種の形質転換のために適切な核酸マルチマーを生成する技術が提案されている（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ， アメリカ特許第５，７５６，３１６号及び上記文献を参照のこと）。お互いに関してお互い異なる遺伝子（例えば、天然の多様性から、又は特定部位の突然変異誘発、エラー傾向ＰＣＲ、突然変異誘発細菌株を通しての通過、及び同様の工程の適用を通して誘発される）から成るそのようなマルチマーによる適切な宿主の形質転換は、例えば上記のようなインビボ組換え方法によるＤＮＡ多様化のための核酸多様性の源を提供する。
【０１９０】
他方では、部分的配列類似性の領域を供給する多数のモノマーポリヌクレオチドは、宿主種中に形質転換され、そして宿主細胞によりインビボで組換えされ得る。続く細胞分裂段階は、ライブラリーを生成するために使用され得、そのライブラリーのメンバーは、モノマーポリヌクレオチドの単一の相同集団又はプールを包含する。他方では、モノマー核酸は、標準の技法、例えばＰＣＲ及び／又はクローニングにより回収され、そして上記に記載される反復組換え形式を包含する組換え形式のいずれかにより組換えられ得る。
【０１９１】
多種発現ライブラリーを生成するための方法は、記載されており（上記に示される文献の他に、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎなど． （１９９８） アメリカ特許第５，７８３，４３１号 ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙｓ” 及びＴｈｏｍｐｓｏｎなど． （１９９８） アメリカ特許第５，８２４，４８５号 “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙｓ を参照のこと）、そして興味あるタンパク質活性を同定するためへのそれらの使用は提案されている（上記に示される文献の他に、Ｓｈｏｒｔ （１９９９） アメリカ特許第５，９５８，６７２号”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｓ Ｈａｖｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ” を参照のこと）。
【０１９２】
多種発現ライブラリーは一般的に、発現カセットにおいて適切な調節配列に操作可能的に連結される、多くの種又は株からのｃＤＮＡ又はゲノム配列を含んで成るライブラリーを包含する。ｃＤＮＡ及び／又はゲノム配列は、任意には、多様性をさらに増強するためにランダムに連結される。ベクターは、１種以上の宿主生物、例えば細菌種、真核細胞における形質転換及び発現のために適切なシャトルベクターであり得る。いくつかの場合、ライブラリーは、興味あるタンパク質をコードし、又は興味ある核酸にハイブリダイズする配列を予備選択することによって偏向される。いずれかのそのようなライブラリーは、本明細書に記載される方法のいずれかのための基質として供給され得る。
【０１９３】
上記方法は、核酸及び／又はコードされるタンパク質多様性を高めることに多く方向づけらられて来た。しかしながら、多くの場合、すべての多様性が有用であり、例えば機能的であるのではなく、そして少数の好ましい変異体を同定するためにスクリーンされるか又は選択されるべきである変異体のバックグラウンドを高めることに単に寄与するのみである。いくつかの用途においては、例えば、組換えに基づく突然変異誘発方法により、多様化の前、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、標準化されたライブラリー、等）又は他の基質核酸を予備選択し、又はプレスクリーニングし、又は他方では、機能的生成物をコードする核酸に対して基質を偏向することが所望される。
【０１９４】
例えば、抗体構築の場合、記載される方法のいずれかによる操作の前、インビボ組換え現像を利用することにより、機能的抗原結合部位を有する抗体に多様性生成工程を偏向することが可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーから誘導される組換えられたＣＤＲは、本明細書に記載される方法のいずれかに従って多様化の前、増幅され、そして骨格領域中にアセンブリーされ得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔなど． （１９９８） “Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ： ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒｍｅｄ ｃｏｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ａ ｍａｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ” Ｇｅｎｅ ２１５： ４７１）。
【０１９５】
ライブラリーは、所望する酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に対して偏向され得る。例えば、特定された活性を示すライブラリーからのクローンを同定した後、クローンは、ＤＮＡ変更を導入するためのいずれかの既知方法を用いて突然変異誘発され得る。次に、突然変異誘発された相同体を含んで成るライブラリーは、最初に特定された活性と同じか又は異なる所望する活性についてスクリーンされる。そのような方法の例は、Ｓｈｏｒｔ （１９９９） アメリカ特許第５，９３９，２５０号、”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” に提案されている。
【０１９６】
例えば、ＷＯ９９／１０５３９号は、遺伝子ライブラリーが、代謝的に富化された細胞から得られた成分と遺伝子ライブラリーからの抽出物とを組合し、そして所望する活性を示す組み合わせを同定することによってスクリーンされ得ることを示唆する。所望する活性を有するクローンが、生活性基質をライブラリーのサンプル中に挿入し、そして蛍光分析機、例えば流動細胞計測装置、ＣＣＤ、蛍光計又は分光計を用いて、所望する活性の生成物に対応する生活性蛍光を検出することによって同定され得ることが提案されている（例えば、９８／５８０８５号）。
【０１９７】
ライブラリーはまた、特定された特性、例えば選択されたプローブへのハイブリダイゼーションを有する核酸に偏向され得る。例えば、ＷＯ９９／１０５３９号は、所望する活性（例えば、酵素活性、例えばリパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ又はアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドが、次の態様でゲノムＤＮＡ配列間から同定され得ることを示唆する。ゲノムＤＮＡ集団からの一本鎖ＤＮＡ分子は、リガンド接合されたプローブにハイブリダイズされる。
【０１９８】
ゲノムＤＮＡは、培養された又は培養されていない微生物から、又は環境サンプルから誘導され得る。他方では、ゲノムＤＮＡは、多細胞生物又はそれに由来する組織から誘導され得る。第二鎖合成は、捕獲培地からの前もっての開放を伴なって又はそれを伴わないで、又は当業界において知られている広範囲の種類の他の方法により、捕獲に使用されるハイブリダイゼーションプローブから直接に行なわれ得る。他方では、単離された一本鎖ゲノムＤＮＡ集団は、さらにクローニングしないでフラグメント化され得、そして上記のように、一本鎖鋳型を用いる、組換えに基づくアプローチにおいて直接的に使用され得る。
【０１９９】
核酸及びポリペプチドを生成するための“非推計学的”方法が、ＷＯ００／４６３４４号（Ｓｈｏｒｔ）”Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ” において主張されている。提案された非推計学的ポリヌクレオチド再アセンブリー及び部位−飽和突然変異誘発方法を包含するそれらの方法もまた、本発明に適用され得る。
【０２００】
ドーピングされた又は変性オリゴヌクレオチドを用いてのランダム又は半ランダム突然変異誘発がまた、例えばＡｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ （１９９２） “Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００； Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ など． （１９９１） “Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０８：５６４−８６； Ｌｉｍ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （１９９１） “Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｄｅｔｅｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１９： ３５９−７６； Ｂｒｅｙｅｒ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （１９８９） “Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５１Ｆ ｔｏ ｌａｍｂｄａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： １３３５５−６０）； 及び “Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ” （Ｃｒｅａ， Ｒ； ＵＳ Ｐａｔｅｎｔｓ ５，８３０，６５０ ａｎｄ ５，７９８，２０８， ａｎｄ ＥＰ Ｐａｔｅｎｔ ０５２７８０９ Ｂ１に記載されている。
【０２０１】
多様化の前、ライブラリーを富化するために適切な上記技法のいずれかがまた、多様性生成方法により生成される、生成物又は生成物のライブラリーをスクリーンするために使用され得る。
【０２０２】
突然変異誘発のためのキット、ライブラリー構成及び他の多様性生成方法もまた市販されている。例えば、キットは、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ 例えば， ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ 特定部位の 突然変異誘発キット； 及びＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ 二本鎖特定部位の 突然変異誘発キット）， Ｂｉｏ／Ｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ （例えば， 上記Ｋｕｎｋｅｌ方法を用いる）， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．， Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （例えば、５プライム３プライムキット）； Ｇｅｎｐａｋ Ｉｎｃ， Ｌｅｍａｒｇｏ Ｉｎｃ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ （例えば， 上記Ｅｃｋｓｔｅｉｎ方法を用いる）， 及び Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ （例えば， 上記 Ｃａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ 方法を用いる） から入手できる。
【０２０３】
上記文献は、多くの突然変異形式、例えば組換え、反復組換え、反復性突然変異、及び突然変異誘発の他の形式との組合せ又は組換え、並びにそれらの形式の多くの修飾を提供する。使用される多様性生成形式にもかかわらず、本発明の核酸は、種々の組の組換え核酸、例えば相同核酸組、及び対応するポリペプチドを生成するために、組合され得る（お互いと又は関連する（又は関連しない）配列と）。
【０２０４】
他のポリヌクレオチド組成物：
本発明はまた、本発明の複数のポリヌクレオチド（例えば、組換えのための基質として）を含んで成る組成物も包含する。組成物は、組換え核酸のライブラリーを含むことができ、ここで前記ライブラリーは少なくとも２，３， ５， １０， ２０又は５０又はそれ以上、例えば少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００又はそれ以上の核酸を含む。核酸は任意には、発現ベクター中にクローン化され、発現ライブラリーを供給する。
【０２０５】
本発明はまた、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ又はＤＮアーゼにより消化することにより（例えば、上記に示される組換え形式において行われるようにして）生成される組成物；及び上記方法における組換えのための基質を供給するためにもまた使用され得る、機械的手段（例えば、音波処理、かきまぜ、及び同様のもの）により本発明の１又は複数のポリヌクレオチドをフラグメント化し又は剪断することにより生成する組成物を包含する。同様に、本発明の１以上の核酸に対応するオリゴヌクレオチド組みを含んで成る組成物は、組換え基質として有用であり、そして本発明の特徴である。便利さのために、それらのフラグメント化され、剪断され、又はオリゴヌクレオチド合成された混合物は、フラグメント化された核酸組として言及される。
【０２０６】
リボヌクレオチド−又はデオキシリボヌクレオチド三リン酸及び核酸ポリメラーゼの存在下で１又は複数のフラグメント化された核酸組をインキュベートすることによって生成される組成物もまた、本発明に包含される。この得られる組成物は、上記に示される多くの組換え形式のための組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、又はＲＮＡ−指図されたＤＮＡポリメラーゼ（例えば、“逆転写酵素”）であり得る；前記ポリメラーゼは、例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ，ＴＡＱ又は同様のもの）であり得る。
【０２０７】
スブチリシン相同ポリペプチド：
本発明は、“スブチリシン相同ポリペプチド”又は単純に“スブチリシン相同体”として本明細書において言及される。単離された又は組換えスブチリシン相同ポリペプチドを提供する。本発明の単離された又は組換えスブチリシン相同ポリペプチドは、配列番号１３１−２６０、及び保存的に修飾されたその変異体から選択された配列を含んで成るポリペプチドを包含する。
【０２０８】
いくつかの結論が、スブチリシン相同体、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）への所望する機能特性を示す典型的な配列の比較から引き出され得る。置換されたアミノ酸は一定量の変異性を示し、そしてその同じアミノ酸は機能的特性を共有するすべての相同体においては普遍的に置換されないが、機能的特性に対応する置換のパターン又はモチーフは識別され得る。例えば、個別であるが、しかしオーバーラップするアミノ酸置換は、熱安定性、アルカリ安定性、及び有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）における安定性の選択された性質と相互関係する。典型的な配列一列整列は、図２Ａ−Ｃに示される。
【０２０９】
熱安定性：
典型的なスブチリシン相同体と増強された熱安定性との比較は、多くの種々のアミン酸位置を表す。Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）に比較する場合、いくつかの特徴が注目すべきである（図２Ａ）。増強された熱安定性を有する大多数の新規スブチリシン相同体は、Ｓｅｒ９９の代わりにＡｒｇ（すべてのアミノ酸比較は、成熟Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）タンパク質に対して行なわれる）、Ａｓｎ１１４の代わりにＡｌａ， Ｓｅｒ２０６の代わりにＡｓｎ，及びＴｈｒ２０７の代わりにＡｒｇを用いている。さらに、種々の残基群が、位置２０９−２１２で観察される。特に、位置９９， １１４， ２０６ 及び２０７でのアミノ酸置換は、非保存性置換である。
【０２１０】
ＰＨ移行：
再び、多くの種々の位置が、移行されたｐＨで、活性を有する典型的なスブチリシン相同体間で観察され、そしてそれらの間で、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）に対する著しい置換が存在する（図２Ｂ）。例えばＡｓｎ７２に代わるＡｓｐ， Ｉｌｅ７７に代わるＧｌｕ， Ｓｅｒ８５に代わるＡｓｎ， Ｇｌｕ８７に代わるＡｓｐ， Ｐｒｏ１２７に代わるＳｅｒ又はＡｓｐ， Ｓｅｒ１３９に代わるＡｌａ又はＴｙｒ及びＡｓｎ１９８に代わるＧｌｙが、変更されたｐＨで活性を有する大多数のスブチリシン相同体において見出される。アミノ酸位置７４， ７７， ８５， １２７及び１９８での置換は、非保存性置換である。
【０２１１】
有機溶媒における活性：
有機溶媒、すなわちジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）において改良された残留活性を示す典型的なスブチリシンはまた、典型的には、多数の著しいアミノ酸置換を有する（図２Ｃ）。例えば、Ｇｌｕ１３２に代わるＡｓｐ， Ｓｅｒ９７に代わるＡｓｎ， Ｇｌｙ１１３に代わるＡｌａ， Ａｓｎ１１４に代わるＡｌａ又はＴｈｒ， Ｇｌｙ１１６に代わるＡｓｎ， Ｐｒｏ１２７に代わるＡｓｐ又はＳｅｒ， Ｓｅｒ１２８に代わるＡｌａ， Ｓｅｒ１３９に代わるＴｙｒ， Ｓｅｒ１５４に代わるＡｓｎ及びＡｌａ１５６に代わるＳｅｒが存在する。
アミノ酸比較、例えば上記に列挙されるそれらは、スブチリシン相同体のタンパク質工学での続く試みのための合理的な基礎を提供する。
【０２１２】
ポリペプチドの製造：
本発明のスブチリシン相同ポリペプチドを生成し、そして単離するための組換え方法が上記に記載される。組換え生成の他に、ポリペプチドは、固相技法を用いて、直接的なペプチド合成により生成され得る（Ｓｔｅｗａｒｔなど． （１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｓｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９−２１５４）。ペプチド合成は、手動技法を用いて、又は自動技法により行なわれ得る。自動合成は、例えば、製造業者により提供される説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．） を用いて達成され得る。例えば、副配列は、十分な長さのスブチリシン相同体を供給するために、別々に化学的に合成され、そして化学的方法を用いて組合され得る。ペプチドはまた、種々の源から注文され得る。
【０２１３】
ポリペプチドの使用：
抗体：
本発明のもう１つの観点においては、本発明のスブチリシン相同ポリペプチドが、例えばスブチリシン相同体の活性、分布及び発現に関連する診断用途を有する抗体を生成するために使用される。
本発明のスブチリシン相同体に対する抗体は、当業界において良く知られている方法により生成され得る。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト適合された、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２１４】
抗体誘発のためのスブチリシン相同ポリペプチドは生物学的活性を必要をしないが、しかしながら、そのポリペプチド又はオリゴペプチドは抗原性であるべきである。特異的抗体を誘発するために使用されるペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１５又は２０個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有することができる。短い長さのスブチリシン相同ポリペプチドは、もう１つのタンパク質、例えばカサガイヘモシアニン、及びキメラ分子に対して生成される抗体により融合され得る。
【０２１５】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成するための方法は、当業者に知られており、そして多くの抗体は入手できる。例えば、次のものを参照のこと：Ｃｏｌｉｇａｎ （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ； ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８９） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｓｔｉｔｅｓ など． （ｅｄｓ．） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｘ， ＣＡ， ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ； Ｇｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 及びＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７。
【０２１６】
抗体調製のための他の適切な技法は、ファージ又は類似するベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を包含する。Ｈｕｓｅなど． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１； 及びＷａｒｄなど． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６を参照のこと。特異的モノクローナル及びポリクローナル抗体及び抗血清は通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも約０．０１μＭ又はそれ以上、及び最も典型的には及び好ましくは、０．００１μＭ又はそれ以上のＫＤで結合するであろう。
【０２１７】
抗体生成及び構築技法の追加の詳細は、次のものに見出され得る：Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ （ｅｄ） （１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ （Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ など． （１９９６） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ （ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）， 及びＰａｕｌ （１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｗａｔａ， ＮＪ （Ｐａｕｌ）。
【０２１８】
配列変異：
保存的に修飾された変異：
本発明のスブチリシン相同ポリペプチドは、配列番号１３１−２６０として本明細書において開示される配列の保存的に修飾された変異を包含する。そのような保存的に修飾された変異は、配列番号１３１−２６０のいずれかにおける単一のアミノ酸又は少％のアミノ酸（典型的には、約５％以下、より典型的には約４％以下、約２％又は約１％）を変更し、付加し又は欠失する、置換、付加又は欠失を含んで成る。
【０２１９】
例えば、配列番号１３１として本明細書において同定される１７３個のアミノ酸ポリペプチドの保存的に修飾された変異（例えば、欠失）は、ポリペプチド配列の約５％以下、約４％、約２％又は約１％又はそれ以下の欠失に対応する、少なくとも１６４個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１６６個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１７０個のアミノ酸、及びさらにより好ましくは少なくとも１７１個のアミノ酸の長さを有するであろう。
配列番号１３１として本明細書において同定されるポリペプチドの保存的に修飾された変異（例えば、“保存的に置換された変異”）のもう１つの例は、１７３個のアミノ酸ポリペプチドの約９個までの残基（すなわち、約５％以下）における、表２（上記）に示される６個の置換基に従っての“保存性置換”を含むであろう。
【０２２０】
保存的に置換された配列を包含する本発明のスブチリシンポリペプチド配列相同体は、大きなポリペプチド配列の一部として存在し、例えば成熟スブチリシンプロテアーゼにおいて、プレ−プロスブチリシンペプチドにおいて、又はタンパク質（例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）セグメント、ＦＬＡＧ標識セグメント、等）の精製のための１又は複数のドメインの付加に基づいて生じることができる。後者の場合、追加の機能的ドメインは、タンパク質のスブチリシン部分の活性にほとんどか又はまったく影響を及ぼさず、又は追加のドメインが、後合成プロセッシング段階により、例えばプロテアーゼによる処理により除去され得る。
【０２２１】
免疫反応性によるポリペプチドの定義：
本発明のポリペプチドは、他のスブチリシン相同体に比較して、種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドはまた、例えば免疫学的アッセイにおいて認識され得る新規構造特性を提供する。本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗血清、及びそのような抗血清により結合されるポリペプチドの生成は本発明の特徴である。
【０２２２】
本発明は、配列番号１３１−２６０の１又は複数の配列から選択されたアミン酸配列を含んで成る免疫原に対して生成される抗体又は抗血清に対して特異的に結合するか、又はそれと特異的に免疫反応するスブチリシン相同タンパク質を包含する。他のスブチリシン相同体との交差反応性を排除するために、抗体又は抗血清は、入手できるスブチリシン、例えば２０００年４月３日現在入手でき、そしてＰ２９６００， Ｐ４１３６２， Ｐ２９５９９， Ｐ２７６９３， Ｐ２０７２４， Ｐ４１３６３， Ｐ００７８０， Ｐ００７８１， ０３５８３５， Ｐ００７８３， Ｐ２９１４２， Ｐ０４１８９， Ｐ０７５１８， Ｐ００７８２， Ｐ０４０７２， Ｐ１６３９６， Ｐ２９１４０， Ｐ２９１３９， Ｐ０８５９４， Ｐ１６５８８， Ｐ１１０１８， Ｐ５４４２３， Ｐ４０９０３， Ｐ２３３１４， Ｐ２３６５３， Ｐ３３２９５， Ｐ４２７８０， 及びＰ８０１４６により例示されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応するタンパク質又はペプチドにより表されるそれらにより控除される。その受託番号が核酸に対応する場合、その核酸によりコードされるポリペプチドか生成され、そして抗体／抗血清控除目的のために使用される。
【０２２３】
１つの典型的な形式においては、イムノアッセイは、配列番号１３１−２６０の１又は複数の配列に対応する１又は複数の配列、又はその実質的な副配列（すなわち、供給される十分な長さの配列の少なくとも約３０％）を含んで成る１又は複数のポリペプチドに対して生じめられたポリクローナル抗血清を使用する。配列番号１３１−２６０に由来する、十分な組みの可能性あるポリペプチド免疫原は、集合的には、“免疫原性ポリペプチド”として下記に言及される。得られる抗血清は任意には、対照スブチリシン相同体、すなわち他の既知スブチリシン相同体に対して低い交差反応性を有するよう選択され、そしていずれかのそのような交差反応性は、イムノアッセイにおけるポリクローナル抗血清の使用の前、１又は複数の対照スブチリシン相同体による免疫吸着により除去される。
【０２２４】
イムノアッセイへの使用のための抗血清を生成するために、１又は複数の免疫原性ポリペプチドが、本明細書に記載されるように生成され、そして精製される。例えば、組換えタンパク質は、細菌細胞系において生成され得る。マウスの近交系（結果がマウスの実質的な遺伝子同一性のためにより再現できるので、このアッセイに使用される）は、標準のアジュバント、例えばフロイントアジュバントと組合して、免疫原性タンパク質により、標準のマウス免疫化プロトコールに従って免疫化される（例えば、抗体生成、イムノアッセイ形式、及び特定の免疫反応性を決定するために使用され得る条件の標準の記載については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｍｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ を参照のこと）。他方では、本明細書に開示される配列に由来する１又は複数の合成又は組換えポリペプチドは、キャリヤータンパク質に接合され、そして免疫原として使用される。
【０２２５】
ポリクローナル血清は、イムノアッセイ、例えば固体支持体上に固定される１又は複数の免疫原性タンパク質による固相イムノアッセイにおいて、免疫原性ポリペプチドに対して集められ、そして力価される。１０６又はそれ以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、プールされ、そして対照スブチリシンポリペプチド、例えば示されるようなＧｅｎＢａｎｋから同定されるそれらにより控除され、プールされ、力価されたポリクローナル抗血清が生成される。
【０２２６】
前記控除され、プールされ、力価されたポリクローナル抗血清は、対照スブチリシン相同体に対する交差反応性について試験される。好ましくは少なくとも２種の免疫原性スブチリシンが、免疫原性タンパク質により特異的に結合される抗体を同定するために、好ましくは、少なくとも２種の対照スブチリシン相同体と共に、この決定に使用される。
【０２２７】
この比較アッセイにおいては、差別的結合条件は、対照スブチリシン相同体への結合に比較して、免疫原性スブチリシン相同体への力価されたポリクローナル抗血清の結合に関して、少なくとも約５−１０倍高いシグナル：ノイズ比をもたらす、控除され、力価されたポリクローナル抗血清のために決定される。すなわち、結合反応の緊縮性は、非特異的競争体、例えばアルブミン又は脱脂粉乳の添加により、又は塩条件、温度又は同様のものの調節により調節される。
【０２２８】
それらの結合条件は、試験ポリペプチドがプールされ、控除されたポリクローナル抗血清により特異的に結合されるかどうかを決定するために続くアッセイに使用される。特に、差別的結合条件下で対象ポリペプチドよりも少なくとも２−５倍高いシグナル：ノイズ比、及び免疫原性ポリペプチドに比較して少なくとも約１／２のシグナル：ノイズ比を示す試験ポリペプチドは、既知のスブチリシンに比較して、免疫原性ポリペプチドとの実質的な構造類似性を共有し、そして従って、本発明のポリペプチドである。
【０２２９】
もう１つの例においては、競争結合形式でのイムノアッセイは、試験ポリペプチドの検出のために使用される。例えば、示されるように、交差反応性抗体は、対照のスブチリシンポリペプチドによる免疫吸着により、プールされた抗血清混合物から除去される。次に、免疫原性ポリペプチドは、控除され、プールされた抗血清に暴露される固体支持体に固定される。試験タンパク質が、プールされ、控除された抗血清への結合に対して競争するようアッセイに添加される。固定されたタンパク質に比較して、プールされ、控除された抗血清への結合に対して競争する試験タンパク質の能力が、結合に対して競争するアッセイに添加される免疫原性ポリペプチドの能力と比較される（免疫原性ポリペプチドは、プールされた抗血清への結合に対して固定された免疫原性ポリペプチドと効果的に競争する）。試験タンパク質についての％交差反応性は、標準の計算を用いて計算される。
【０２３０】
同様のアッセイにおいては、プールされ、控除された抗血清への結合に対して競争する対照タンパク質の能力は、抗血清への結合に対して競争する免疫原性ポリペプチドの能力に比較して決定される。再び、対照ポリペプチドについての％交差反応性は、標準の計算を用いて計算される。％交差反応性が試験ポリペプチドに関して、少なくとも５−１０倍高い場合、その試験ポリペプチドはプールされ、控除された抗血清を特異的に結合すると言われる。
【０２３１】
一般的に、免疫吸着され、そしてプールされた抗血清は、いずれかの試験ポリペプチドを免疫原性ポリペプチドに比較するために、本明細書に記載のようにして、競争結合イムノアッセイに使用され得る。この比較を行うために、２種のポリペプチドが、広範囲の濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定されたタンパク質への控除された抗血清の結合の５０％を阻害するのに必要とされる個々のポリペプチドの量が標準の技法を用いて決定される。必要とされる試験ポリペプチドの量が必要とされる免疫原性ポリペプチドの量の２倍以下である場合、試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質に対して生成される抗体に対して特異的に結合すると言われ、但し、その量は対照ポリペプチドの少なくとも約５−１０倍高い。
【０２３２】
特異性の最終決定として、プールされた抗血清は任意には、免疫吸着に使用される免疫原性ポリペプチドへのその得られる免疫原性ポリペプチド控除され、プールされた抗血清の結合がほとんどか又はまったく検出できなくなるまで、免疫原性ポリペプチド（対照ポリペプチドよりもむしろ）により十分に免疫吸着される。次に、この十分に免疫吸着された抗血清は、試験ポリペプチドとの反応性について試験される。反応性がほとんどか又はまったく観察されない場合（すなわち、免疫原性ポリペプチドへの十分に免疫吸着された抗血清の結合について観察されるシグナル：ノイズ比の２倍以下）、試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質により誘発される抗血清により特異的に結合される。
【０２３３】
清浄溶液：
本発明のスブチリシン相同体は、広範囲の種類の用途、例えば中でも洗濯洗剤、コンタクトレンズ清浄溶液及びドライクリーニングにおける清浄溶液として作用する組成物に都合良く使用される。
例えば、本発明は、清浄及び洗剤組織物への本発明の新規スブチリシン相同体の使用、及び変異体スブチリシン酵素を含む組成物を提供する。そのような清浄及び洗剤組成物は、原則として、いずれの物理学的形でも有するが、しかしスブチリシン相同体は好ましくは、改良された酵素安定性又は性能を示す、直接的な適用のための棒状、錠剤、及び同様のものの形で液体洗剤組成物又は洗剤組成物に組み込まれる。
【０２３４】
中でも、本発明の液体組成物は、例えば均質の物理学的特性を有する水性液体洗剤であり、例えばそれらは、連続水性相、いわゆる等張液体中、界面活性剤のミセル溶液からなることができる。他方では、それらは不均質の物理学的相を有し、そしてそれらは懸濁された固体粒子、例えば下記に示される種類のビルダー材料の粒子を含んで構築され得る。さらに、本発明の液体洗剤は、カルシウムイオン、硼酸プロピレングリコール及び／又は短鎖カルボン酸を含んで成る酵素安定化システムを含むことができる。任意には、洗剤は、セルラーゼ、リパーゼ又はプロテアーゼを包含する追加の酵素成分を含む。
【０２３５】
さらに、粉末洗剤組成物は、本明細書に記載されるような本発明の１又は複数のいずれかのスブチリシン相同体の他に、ビルダー（例えば、ホスフェート又はゼオライトビルダー）、界面活性剤（例えば、アニオン性、カチオン性、非イオン性又は両性イオン型界面活性剤）、ポリマー（例えば、アクリル酸又は同等のポリマー）、漂白剤システム（例えば、過硼酸塩又はアミノ−含有漂白剤前駆体又は活性剤）、構造体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｎｔｓ）（例えば、シリケート構造体）、ｐＨを調節するためのアルカリ又は酸、保湿剤及び／又は中性無機塩のような成分を含むことができる。さらに、多数の他の成分、例えば補界面活性剤、タルトレートスクシネートビルダー、中性化システム、泡抑制剤、他の酵素並びに他の任意の成分が通常、本発明の組成物に存在する。
【０２３６】
集積システム：
本発明は、本明細書におけるポリペプチド及び核酸、例えば本明細書に列挙されるそれらの配列、及びその種々のサイレント置換及び保存性置換についての配列情報に対応する特性群を含んで成る、コンピューター、コンピューター読み取り媒体及び集積システムを提供する。
当業界において知られている種々の方法及び遺伝子アルゴリズム（ＧＯ）は、異なった特性群間の相同性又は類似性を検出するために使用され得、又は他の所望する機能を実施し、例えば出力ファイルを制御し、配列を包含する情報の保存を行うための基礎を提供し、そして同様のことを行うために使用され得る。例としては、上記で論じられたＢＬＡＳＴが包含される。
【０２３７】
従って、種々の緊縮性及び長さの種々の型の相同性及び類似性が、本明細書における集積システムにおいて検出され、そして認識され得る。例えば、多くの相同性決定方法が、生ポリマーの配列の比較分析のために、ワードプロセッシングによるスペル−チェッキングのために、及び種々のデータベースからのデータ検索のために企画されて来た。
【０２３８】
天然のポリヌクレオチドにおける４種の主要ヌクレオ塩基間での二重鎖対様補体相互作用の理解により、相補的相同ポリヌクレオチド群のアニーリングをシュミレートするモデルがまた、本明細書における配列に対応する特性群（例えば、ワードプロセッシング操作、配列又は副配列特性群を含んで成る図形の構成、出力表、等）に対して典型的には行われる配列一列整列又は他の操作の基礎としても使用され得る。配列類似性を計算するためのＧＯを有するソフトフェアパッケージの例は、本明細書における配列に対応する特性群を入力することによって本発明に適合され得るＢＬＡＳＴである。
【０２３９】
同様に、標準のデスクトップアプリケーション、例えばワードプロセッシングソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＷｏｒｄＴＭ 又はＣｏｒｅｌ ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔＴＭ）及びデータベースソフトウェア（例えば、スプレッドシートソフトウェア、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌＴＭ， Ｃｏｒｅｌ Ｑｕａｔｔｒｏ ＰｒｏＴＭ 又はデータベースプログラム、例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＡｃｃｅｓｓＴＭ 又はＰａｒａｄｏｘＴＭ）は、本発明のスブチリシン相同体に対応する特性群（核酸又はタンパク質、又は両者）を入力することによって、本発明に適合され得る。
【０２４０】
例えば、集積システムは、特性群を操作するために、ユーザーインターフェース（例えば、標準操作システム、例えばＷｉｎｄｏｗｓ， Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ 又はＬＩＮＵＸシステムにおけるＧＵＩ）と共に使用される適切な特性群情報を有する上記ソフトフェアを包含することができる。示されるように、特殊化された一列整列プログラム、例えばＢＬＡＳＴはまた、核酸又はタンパク質（又は対応する特性群）の一列整列のために本発明のシステム中に導入され得る。
【０２４１】
本発明における分析のための集積システムは典型的には、配列を整列するためのＧＯソフトウェア、及び本明細書における配列のいずれかを含んで成るソフトウェアシステム中に入力されるデータ組みを有するデジタルコンピューターを包含する。コンピューターは、例えばＰＣ（Ｉｎｔｅｌ×８６又はＰｅｎｔｉｕｍチップ−互換性ＤＯＳＴＭ， ＯＳ２ＴＭ， ＷＩＮＤＯＷＳＴＭ， ＷＩＮＤＯＷＳ ＮＴＴＭ， ＷＩＮＤＯＷＳ９６ＴＭ， ＷＩＮＤＯＷＳ９８ＴＭ， ＬＩＮＵＸベースマシン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ， Ｐｏｗｅｒ ＰＣ又はＵＮＩＸベース（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）マシン）、又は当業者に知られている他の市販のコンピューターであり得る。配列を整列するか又は他方では、操作するためのソフトウェアは、入手できるか、又は標準のプログラムランゲージ、例えばＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ， Ｆｏｒｔｒａｎ， Ｂａｓｉｃ， Ｊａｖａ又は同様のものを用いて、当業者により容易に構成され得る。
【０２４２】
いずれかのコントローラー又はコンピューターは任意には、ブラウン管（“ＣＲＴ”）ディスプレー、フラットパネルディスプレー（例えば、活性マトリックス液晶ディスプレー、液晶ディスプレー）、又は他のものであるモニターを包含する。コンピューター回路はしばしば、多くの集積回路チップ、例えばマイクロプロセッサー、メモリー、インターフェース回路及び他のものを含むボックスに配置される。ボックスはまた任意には、ハードディスクドライブ、フロッピーディスクドライブ、高能力脱着可能ドライブ、例えば読み取りＤＣ−ＲＯＭ及び他の通常の端末要素を包含する。入力装置、例えばキーボード又はマウスは任意には、ユーザーからの入力、及び適切なコンピューターシステムにおいて比較されるか又は他方では、操作されるべき配列のユーザー選択を提供する。
【０２４３】
コンピューターは典型的には、セットパラメーターフィールド中へのユーザー入力の形、例えばＧＵＩ、又は例えば種々の異なった特定の操作のために予備プログラムされた、予備プログラムされた命令の形で、ユーザー命令を受けるための適切なソフトフェアを含む。次に、ソフトウェアは、所望する操作を行うために流体方向及び転送コントローラーの操作に命令するための適切なランゲージにそれらの命令を転換する。
【０２４４】
ソフトウェアはまた、核酸合成（例えば、本明細書における配列又は配列の一列整列に基づいて）、又は一列整列から下流に存在する他の操作又は本明細書における配列に対応する特性群を用いて行なわれる他の操作を調整するための出力要素を包含することができる。
【０２４５】
さらなる観点においては、本発明は、本明細書における方法、組成物、システム及び装置を具体化するキットを提供する。本発明のキットは任意には、１又は複数の次のものを含んで成る：（１）本明細書に記載されるような装置、システム、システム成分又は装置成分：（２）本明細書に記載される方法を行うための、及び／又は本明細書における装置又は装置成分を操作するための、及び／又は本明細書における組成物を用いるための説明書；（３）１又は複数のスブチリシン組成物又は成分；（４）成分又は組成物を保持するための容器；及び（５）パッケージング材料。
【０２４６】
さらなる観点においては、本発明は、本明細書におけるいずれかの装置、装置成分、組成物又はキットの使用、本明細書におけるいずれかの方法又はアッセイの実施、本明細書におけるいずれかのアッセイ又は方法を実施するためのいずれかの装置又はキットの使用を提供する。
【０２４７】
実施例
発現ベクターにおける、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）プロテアーゼに関する多様化された領域（アミノ酸５５−２２７）に対応する組換え（例えば、シャフル化された）ライブラリー配列を、発現及びスクリーニングのために、バチルス１６８ ａｐｒ ｒｐｒＢ株（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ （１９９０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ｎａｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中にクローン化した。遺伝子を、製造業者の説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて配列決定した。
【０２４８】
カゼインプレート上に透明な円光を生成するライブラリーを含んで成るバチルスコロニーを、ＬＢ培地において定常期まで増殖した。この培地からの上清液は、分泌されたプロテアーゼを含み、そしてそれを、反応混合物中に１００倍（ｐＨ５．５及びｐＨ１０の反応のための）又は２００倍（ｐＨ７．５の反応のための）に希釈した。培養上清液におけるプロテアーゼ活性を、基質としてＢＯＤＩＰＹ ＦＬカゼインを用いてアッセイした（Ｊｏｎｅｓ など． （１９９７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５１： １４４）。
【０２４９】
この多蛍光団カゼイン誘導体の蛍光を、タンパク質が損なわれていない場合、内部的に消光される。タンパク質加水分解は、隣接する蛍光団の分離を引き起こし、消光を解消し、その結果、活性は、時間と共に蛍光の上昇として測定される。反応混合物は、５μｇ／ｍｌのＢＯＤＩＰＹ ＦＬカゼイン、１ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭの硼酸ナトリウム（ｐＨ１０）、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）又は５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）のいずれかを含んだ。すべての反応は、室温で４０〜７０分間、行なわれた。蛍光を、４８５ｎｍの励起波長を用いて、５３５ｎｍでモニターした（ＢＭＧ Ｆｌｕｏｓｔａｒ）。Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）株による独立した決定のために観察されるｃｖ（％）は、すべての条件下で≦１５であった。すべての活性は、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）の活性に対して表される。
【０２５０】
典型的なくローンのｐＨ依存性を、ｐＨ５．５， ７．５及び１０での活性を測定することにより決定した。熱安定性を、７０℃での５分間のインキュベーションの後、ｐＨ１０での残留活性として測定した。有機溶媒における機能を、ｐＨ７．５で３５％ＤＭＦにおける活性としてアッセイした。代表的な値は、表３に与えられる。追加のクローンについて得られるアッセイ値は、表４に提供される。
活性の最も劇的な上昇がｐＨ５．５で存在し、ここでＳａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも２〜４倍高い活性を有するスブチリシン相同体をコードするクローンが得られた。
【０２５１】
性質の組合せを、数対の性質について、回収されたクローンの活性を同時に比較することによって評価した。２３℃及びｐＨ１０での最高の活性を示す７７個のクローンを、有機溶媒における残留活性及び熱処理に対する安定性の追加の性質について評価した。ｐＨ１０で高い活性を有した７７個のクローンは、それらの２種の追加の反応条件下での性質の広い分布を示す。熱処理の後、ほぼ４倍までの高い残留活性又は３５％ＤＭＦ（ｐＨ７．５で）において５０％までの高い残留活性を有する酵素を得た。Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）又は天然に存在するいずれかのスブチリシンによりも高い熱安定性であり、且つ有機溶媒においてより活性的であった多くの個々酵素を得た。
【０２５２】
スブチリシン相同ライブラリーを、数対の性質について多数の（すなわち、６５０以上）活性クローンの活性をプロットすることにより性質の組合せについて試験した。活性は、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）に対して表される。あらゆる場合、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも高い活性を有するプロテアーゼを得た。例えば、クローン３Ａ３、３Ｂ３及び４Ｃ６は、熱安定性を維持しながら、ｐＨ１０でＳａｖｉｎａｓｅ（商標）よりも有意に高い活性レベルを有する。他のクローンは新規活性を示し；７Ｃ６はｐＨ１０及びｐＨ５．５の両者で活性的であり；６Ａ４， ７Ａ２， ４Ｄ７及び５Ｅ１はすべて、Ｓｕｖｉｎａｓｅ（商標）と比較して、ｐＨ１０でよりもｐＨ５．５でより高い活性を示した。
【０２５３】
前述の発明は明瞭性及び理解のためにいくらか詳細に記載されて来たが、種々の変更が本発明の範囲内で行なわれ得ることが、この開示から当業者に明白であろう。例えば、上記に記載されるすべての技法、方法、組成物、装置及びシステムは種々の組み合わせで使用され得る。本出願に引用されるすべての出版物、特許、特許出願又は記録は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２５４】
【表３】
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【０２５５】
【表４】
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【０２５６】
【表５】
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【０２５７】
【表６】
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【０２５８】
【配列表】
配列表
示されるコード配列は、サビナーゼ（商標）をコードするヌクレオチドに関して、ｂｐ４９５から始まりそしてｂｐ１０１１で終わる。示されるアミノ酸配列は、サビナーゼ（商標）のａａ１６６から始まりそしてａａ３３８で終わる。サビナーゼ（商標）のアミノ酸配列は配列番号：２６１に示される。
【表７】
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【０２５９】
【表８】
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【０２６０】
【表９】
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【０２６１】
【表１０】
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【０２６２】
【表１１】
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【０２６３】
【表１２】
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【０２６４】
【表１３】
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【０２６５】
【表１４】
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【０２６６】
【表１５】
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【０２６７】
【表１６】
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【０２６８】
【表１７】
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【０２６９】
【表１８】
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【０２７０】
【表１９】
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【０２７１】
【表２０】
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【０２７２】
【表２１】
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【０２７３】
【表２２】
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【０２７４】
【表２３】
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【０２７５】
【表２４】
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【０２７６】
【表２５】
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【０２７７】
【表２６】
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【０２７８】
【表２７】
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【０２７９】
【表２８】
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【０２８０】
【表２９】
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【０２８１】
【表３０】
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【０２８２】
【表３１】
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【０２８３】
【表３２】
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【０２８４】
【表３３】
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【０２８５】
【表３４】
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【０２８６】
【表３５】
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【０２８７】
【表３６】
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【０２８８】
【表３７】
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【０２８９】
【表３８】
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【０２９０】
【表３９】
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【０２９１】
【表４０】
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【０２９２】
【表４１】
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【０２９３】
【表４２】
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【０２９４】
【表４３】
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【０２９５】
【表４４】
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【表４５】
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【０２９７】
【表４６】
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【０２９８】
【表４７】
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【０２９９】
【表４８】
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【０３００】
【表４９】
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【０３０１】
【表５０】
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【０３０２】
【表５１】
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【０３０３】
【表５２】
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【０３０４】
【表５３】
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【０３０５】
【表５４】
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【０３０６】
【表５５】
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【０３０７】
【表５６】
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【０３０８】
【表５７】
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【０３０９】
【表５８】
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【０３１０】
【表５９】
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【０３１１】
【表６０】
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【０３１２】
【表６１】
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【０３１３】
【表６２】
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【０３１４】
【表６３】
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【０３１５】
【表６４】
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【０３１６】
【表６５】
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【０３１７】
【表６６】
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【０３１８】
【表６７】
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【０３１９】
【表６８】
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【０３２０】
【表６９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）（商標）のアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、スブチリシンの構造と機能との関係（熱安定性モチーフ）を示す図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、スブチリシンの構造と機能との関係（ｐＨシフトモチーフ）を示す図である。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、スブチリシンの構造と機能との関係（ＤＭＦモチーフにおける活性）を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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2004508011.tif 000208
2004508011.tif 000209
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508011.tif 000210
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508011.tif 000211
【国際調査報告】
2004508011.tif 000212
2004508011.tif 000213
2004508011.tif 000214
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