(57)【要約】本発明は、哺乳動物の循環系において提示される抗原と結合する第１結合ドメインと、Ｃ３ｂ様レセプター（霊長類において補体レセプター１（ＣＲ１）又はＣＤ３５として知られる）と結合する第２結合ドメインとを有することを特徴とする二重特異性分子に関する。かかる二重特異性分子は、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。本発明はまた、二重特異性分子の作製方法、及びその治療的用途、並びに二重特異性分子を含むキットに関する。本発明はさらに、種々の抗原認識特異性を有する二重特異性分子の集団を含む、二重特異性分子のポリクローナル集団を提供する。かかる二重特異性分子のポリクローナル集団は、病原性抗原分子の複数のエピトープ及び／又は病原性抗原分子の複数の変異体をターゲティングするために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性分子であって、
（ａ）病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、
（ｂ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含み、かつ
（ｃ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、
上記二重特異性分子。
【請求項２】
第１結合ドメインが第１イムノグロブリン可変領域であり、かつ第２結合ドメインが第２イムノグロブリン可変領域である、二重特異性イムノグロブリンである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）第１又は第２結合ドメインと、それに結合する
（ｂ）（ｉ）ＣＨ２ドメインとそれに続くＣＨ３ドメイン、又は（ｉｉ）ＣＨ３ドメインとそれに続くＣＨ２ドメイン、からなるポリペプチドと、それに結合する
（ｃ）（ａ）が第１結合ドメインである場合には第２結合ドメイン、又は（ａ）が第２結合ドメインである場合には第１結合ドメイン、
から本質的に構成される分子である、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１イムノグロブリンＦｃドメインのアミノ末端と結合した第１又は第２結合ドメインから本質的に構成される第１分子、及び
（ｂ）第２イムノグロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端と結合した、（ｉ）第１結合ドメインが第１分子に存在する場合には第２結合ドメイン、又は（ｉｉ）第２結合ドメインが第１分子に存在する場合には第１結合ドメイン、から本質的に構成される第２分子、
から構成される二量体分子であり、第１及び第２Ｆｃドメインは互いに相補的であり会合するものである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、イムノグロブリン軽鎖可変ドメイン、イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン、リンカーポリペプチド、イムノグロブリン重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、イムノグロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、から本質的に構成される第１ポリペプチド；並びに
（ｂ）アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、ｓｃＦｖ、ＣＨ１ドメイン、イムノグロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、から本質的に構成される第２ポリペプチド、
からなる群よりそれぞれ独立して選択される２つのポリペプチドを含む二量体分子である、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項６】
アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１ｓｃＦｖ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び第２ｓｃＦｖドメイン、から本質的に構成されるポリペプチドである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項７】
アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１ｓｃＦｖ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及び第２ｓｃＦｖドメイン、から本質的に構成されるポリペプチドである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項８】
アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１イムノグロブリン重鎖可変領域、第１イムノグロブリン軽鎖可変領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第２イムノグロブリン重鎖可変領域、及び第２イムノグロブリン軽鎖可変領域、から本質的に構成されるポリペプチドである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項９】
精製されたものである、請求項１又は２記載の二重特異性分子。
【請求項１０】
病原性抗原分子が感染因子の抗原である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１１】
病原性抗原分子が自己抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１２】
ポリペプチドである、請求項１記載の二重特異性分子。
【請求項１３】
ポリペプチドである、請求項３又は４記載の二重特異性分子。
【請求項１４】
請求項１２記載の二重特異性分子をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項２及び５〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性分子をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１４記載の核酸で形質転換された細胞。
【請求項１７】
単離されたものである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
プラスミド発現ベクター中に存在するものである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１９】
１つ以上の容器中に請求項２記載の二重特異性分子をコードする１つ以上の単離された核酸を含むキット。
【請求項２０】
１つ以上の容器中に請求項２記載の二重特異性分子をコードする１つ以上の核酸で形質転換された細胞を含むキット。
【請求項２１】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法であって、該哺乳動物に対し治療上有効な量の二重特異性分子を投与することを含み、該二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）哺乳動物のＣ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含むものである、上記治療方法。
【請求項２２】
二重特異性分子が、病原性抗原分子と結合する第１可変領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２可変領域を有する二重特異性イムノグロブリンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
病原性抗原分子と結合する第１可変領域及び細胞上で発現されるＣ３ｂ様レセプターと結合する第２可変領域を有する二重特異性イムノグロブリンのフラグメントである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
二重特異性分子が、４８時間以内にその９０％が哺乳動物の循環系から排出される、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
投与が静脈内投与である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトであり、Ｃ３ｂ様レセプターがＣＲ１である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項２８】
病原性抗原分子が病原体のタンパク質である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項２９】
病原性抗原分子が自己免疫性疾患の自己抗体である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項３０】
病原性抗原分子が望ましくない症状を引き起こす感染因子の抗原である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項３１】
病原性抗原分子が望ましくない症状を引き起こす薬物である、請求項２１、２２又は２３記載の方法。
【請求項３２】
感染因子がウイルスである、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
感染因子が細菌である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
感染因子が真菌である、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
感染因子が原生動物である、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
感染因子が寄生生物である、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療に有効な量の、請求項１、２又は３記載の精製された二重特異性分子、及び薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
【請求項３８】
病原性抗原分子が哺乳動物の感染因子である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項３９】
容器中に、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含む、二重特異性分子を含むキット。
【請求項４０】
病原性抗原分子が感染因子の抗原である、請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
感染因子がウイルスである、請求項３９記載のキット。
【請求項４２】
感染因子が細菌である、請求項３９記載のキット。
【請求項４３】
感染因子が真菌である、請求項３９記載のキット。
【請求項４４】
感染因子が原生動物である、請求項３９記載のキット。
【請求項４５】
感染因子が寄生生物である、請求項３９記載のキット。
【請求項４６】
病原性抗原分子が薬物である、請求項３９記載のキット。
【請求項４７】
病原性抗原分子が自己免疫性抗原である、請求項３９記載のキット。
【請求項４８】
病原性抗原分子が低密度リポタンパク質である、請求項３９記載のキット。
【請求項４９】
Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメイン及び病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含む二重特異性分子を細胞で産生させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも第１結合ドメインをコードする１以上の第１ＤＮＡ配列、及び少なくとも第２結合ドメインをコードする１以上の第２ＤＮＡ配列で細胞を形質転換するステップ；並びに
（ｂ）第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列を発現させて、第１及び第２結合ドメインを上記形質転換細胞中で共にアセンブルされる別々の分子として産生させ、それにより（ｉ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｉｉ）Ｃ３ｂ様レセプターに結合し、かつ（ｉｉｉ）病原性抗原分子に結合する二重特異性分子が形成されるステップ；
を含む、上記方法。
【請求項５０】
Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメイン及び病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含む二重特異性分子を細胞で産生させる方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも第１結合ドメインをコードする１以上の第１ＤＮＡ配列で第１細胞を形質転換するステップ；
（ｂ）少なくとも第２結合ドメインをコードする１以上の第２ＤＮＡ配列で第２細胞を形質転換するステップ；
（ｃ）第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列を発現させて、第１及び第２結合ドメインを別々に産生させるステップ；
（ｄ）第１及び第２結合ドメインを単離するステップ；並びに
（ｅ）第１及び第２結合ドメインをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせて、Ｃ３ｂ様レセプターと結合し、病原性抗原分子と結合し、かつＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない二重特異性分子を形成させるステップ；
を含む、上記方法。
【請求項５１】
二重特異性分子が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１イムノグロブリン軽鎖可変ドメインと第１イムノグロブリン重鎖可変ドメインにより形成され、Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメイン、及び
（ｂ）第２イムノグロブリン軽鎖可変ドメインと第２イムノグロブリン重鎖可変ドメインにより形成され、病原性抗原分子と結合する第２結合ドメイン、
を含む、二重特異性イムノグロブリン又はそのフラグメントである、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列が異なるベクター中に存在するものである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列が単一のベクター中に存在するものである、請求項４９、５０又は５１記載の方法
【請求項５４】
各ベクターがプラスミド発現ベクターである、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
第１及び第２結合ドメインの第１及び第２軽鎖可変ドメインと第１及び第２重鎖可変ドメインの全てが、細胞において発現され、共にアセンブルされる別々のイムノグロブリン鎖上に存在し、また該細胞から免疫学的機能を有する分子として分泌されるものである、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
第１結合ドメインが、不溶性形態又は膜結合形態で産生され、可溶化され、溶液中で再度折りたたまれて、免疫学的機能を有する抗原結合分子又はそのフラグメントを形成することが可能となる、請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
第１又は第２ＤＮＡ配列がさらに少なくとも１つの定常ドメインをコードし、該定常ドメインは、結合する可変ドメイン源とは異なる供与源に由来するものである、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
第１又は第２ＤＮＡ配列が、１以上のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマに由来するものである、請求項５１記載の方法。
【請求項５９】
第１結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列及び第２結合ドメインをコードする第２ヌクレオチド配列で形質転換された細胞であって、上記２つの結合ドメインが、細胞での発現時に互いに会合して二重特異性分子を形成するものであり、第１結合ドメインがＣ３ｂ様レセプターに結合し、第２結合ドメインが病原性抗原分子に結合し、該二重特異性分子が、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記細胞。
【請求項６０】
二重特異性イムノグロブリンを分泌する細胞の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合するイムノグロブリンを発現する第１細胞と、病原性抗原分子と結合するイムノグロブリンを発現する第２細胞とを融合するステップ；並びに
（ｂ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメイン及び病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含む二重特異性イムノグロブリンを発現する細胞を選択するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項６１】
請求項１３記載の二重特異性分子をコードする核酸。
【請求項６２】
請求項６１記載の核酸で形質転換された細胞。
【請求項６３】
哺乳動物において病原性抗原分子の存在に関連する望ましくない症状を予防する方法であって、望ましくない症状の発症前に該哺乳動物に対し予防上有効な量の二重特異性分子を投与することを含み、該二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）哺乳動物のＣ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含むものである、上記予防方法。
【請求項６４】
二重特異性分子が二重特異性モノクローナル抗体である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
請求項６１記載の方法により作製された、二重特異性抗体産生細胞。
【請求項６６】
細胞がマウス細胞である、請求項６５記載の二重特異性抗体産生細胞。
【請求項６７】
細胞がヒト細胞である、請求項６５記載の二重特異性抗体産生細胞。
【請求項６８】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法であって、以下のステップ：
（ａ）二重特異性分子とＣ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞とを接触させて、造血細胞／二重特異性分子複合体を形成させるステップであって、該二重特異性分子が、（ｉ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｉｉ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含むものである、上記ステップ；並びに
（ｂ）治療上有効な量の上記造血細胞／二重特異性分子複合体を上記哺乳動物に投与するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項６９】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法であって、治療上有効な量の造血細胞／二重特異性分子複合体を該被験体に投与するステップを含み、該複合体は、Ｃ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞と１以上の二重特異性分子とが結合したものから本質的に構成され、該二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含むものである、上記方法。
【請求項７０】
請求項１又は２記載の二重特異性分子を分泌する細胞。
【請求項７１】
１つ以上の容器中に第１ベクター及び第２ベクターを含むキットであって、第１ベクターは、少なくとも第１イムノグロブリン重鎖可変ドメインをポリペプチドリンカーを介して第１イムノグロブリン軽鎖可変ドメインと融合させたものをコードする第１ＤＮＡ配列を含み、第２ベクターは、少なくとも第２イムノグロブリン重鎖可変ドメインをポリペプチドリンカーを介して第２イムノグロブリン軽鎖可変ドメインと融合させたものをコードする第２ＤＮＡ配列を含み、第１イムノグロブリン重鎖可変ドメイン及び第１イムノグロブリン軽鎖可変ドメインは病原性抗原分子と結合し、第２イムノグロブリン重鎖可変ドメイン及び第２イムノグロブリン軽鎖可変ドメインはＣ３ｂ様レセプターと結合する、上記キット。
【請求項７２】
造血細胞／二重特異性分子複合体の作製方法であって、二重特異性分子とＣ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞とをそれらの結合を促進する条件下で接触させて、１つ以上の二重特異性分子と結合した造血細胞から本質的に構成される複合体を形成させることを含み、該二重特異性分子は、（ａ）造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメインを含み、（ｂ）病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含み、かつ（ｃ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記方法。
【請求項７３】
二重特異性分子が、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）第１又は第２結合ドメインと、それに結合した
（ｂ）（ｉ）ＣＨ２ドメインとそれに続くＣＨ３ドメイン、又は（ｉｉ）ＣＨ３ドメインとそれに続くＣＨ２ドメイン、から構成されるポリペプチドと、それに結合した
（ｃ）（ａ）が第１結合ドメインである場合には第２ドメイン、又は（ａ）が第２結合ドメインである場合には第１結合ドメイン、
から本質的に構成される分子である、請求項２１記載の方法。
【請求項７４】
二重特異性分子が、以下の（ａ）及び（ｂ）
（ａ）第１イムノグロブリンＦｃドメインのアミノ末端と結合した第１又は第２結合ドメインから本質的に構成される第１分子、及び
（ｂ）第２イムノグロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端と結合した、（ｉ）第１結合ドメインが第１分子に存在する場合には第２結合ドメイン、又は（ｉｉ）第２結合ドメインが第１分子に存在する場合には第１結合ドメイン、から本質的に構成される第２分子、
から構成される二量体分子であって、第１及び第２Ｆｃドメインは互いに相補的であり会合しているものである、請求項２１記載の方法。
【請求項７５】
第１及び第２結合ドメインがそれぞれ一本鎖Ｆｖである、請求項２１記載の方法。
【請求項７６】
第１ＤＮＡ配列又は第２ＤＮＡ配列がさらに少なくとも１つの定常ドメインをコードし、該定常ドメインは、結合する可変ドメイン源とは異なる供与源に由来するものである、請求項４９記載の方法。
【請求項７７】
第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列が異なるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマに由来するものである、請求項４９記載の方法。
【請求項７８】
Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメイン及び病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含む二重特異性イムノグロブリンであって、以下のステップ：
（ａ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合するイムノグロブリンを発現する第１細胞と、病原性抗原分子と結合するイムノグロブリンを発現する第２細胞とを接触させるステップ；
（ｂ）（ｉ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合し、かつ（ｉｉ）病原性抗原分子と結合する、二重特異性イムノグロブリンを発現する細胞を選択するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）において選択された細胞を培養するステップ；並びに
（ｄ）上記培養細胞により発現される二重特異性イムノグロブリンを回収するステップ、
を含む方法により産生されるものである、上記二重特異性イムノグロブリン。
【請求項７９】
造血細胞と１つ以上の二重特異性分子とが結合したものから本質的に構成される造血細胞／二重特異性分子であって、二重特異性分子の各々が、（ａ）造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメインを含み、（ｂ）病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインを含み、かつ（ｃ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記造血細胞／二重特異性分子。
【請求項８０】
二重特異性分子の作製方法であって、請求項１６記載の細胞を、コードされる二重特異性分子が該細胞により発現される条件下にて培養するステップ、及び発現された二重特異性分子を回収するステップ、を含む上記方法。
【請求項８１】
複数の二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団であって、二重特異性分子の各々が、（ａ）異なる結合特異性を有する異なる第１抗原認識領域、及び（ｂ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を含み、該複数の二重特異性分子の各々は第１のモノクローナル抗体とＣＲ１に対する第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記ポリクローナル集団。
【請求項８２】
複数の精製された二重特異性分子を含む組成物であって、該複数の精製された二重特異性分子の各二重特異性分子はＣ３ｂ様レセプターと結合する第１抗原認識領域及び病原性抗原分子と結合する第２抗原認識領域を含み、該複数の精製された二重特異性分子の各々が異なる結合特異性を有する異なる第２の抗原認識部分を含み、該複数の二重特異性分子の各々は第１のモノクローナル抗体とＣＲ１に対する第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記組成物。
【請求項８３】
複数の二重特異性分子の各々が、以下の（ａ）〜（ｃ）：（ａ）第１又は第２抗原認識領域と、それに結合した
（ｂ）（ｉ）ＣＨ２ドメインとそれに続くＣＨ３ドメイン、又は（ｉｉ）ＣＨ３ドメインとそれに続くＣＨ２ドメイン、から構成されるポリペプチドと、それに結合した
（ｃ）（ａ）が第１抗原認識領域である場合には第２抗原認識領域、又は（ａ）が第２抗原認識領域である場合には第１抗原認識領域、
から本質的に構成されるものである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８４】
複数の二重特異性分子の各々が、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１イムノグロブリンＦｃドメインのアミノ末端に結合した第１又は第２結合ドメインから本質的に構成される第１分子、及び
（ｂ）第２イムノグロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端に結合した、（ｉ）第１結合ドメインが第１分子に存在する場合には第２結合ドメイン、又は（ｉｉ）第２結合ドメインが第１分子に存在する場合には第１結合ドメイン、から本質的に構成される第２分子、
から構成される二量体分子であり、第１及び第２Ｆｃドメインは互いに相補的であり会合するものである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団
【請求項８５】
複数の二重特異性分子の各々が、以下の（ａ）並びに（ｂ）：
（ａ）アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、イムノグロブリン軽鎖可変ドメイン、イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン、リンカーポリペプチド、イムノグロブリン重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、イムノグロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインから本質的に構成される第１ポリペプチド；並びに
（ｂ）アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、ｓｃＦｖ、ＣＨ１ドメイン、イムノグロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインから本質的に構成される第２ポリペプチド、
からなる群より独立して選択される２つのポリペプチドを含む二量体分子である、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８６】
複数の二重特異性分子の各々が、アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１ｓｃＦｖ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及び第２ｓｃＦｖドメインから本質的に構成されるポリペプチドである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８７】
複数の二重特異性分子の各々が、アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１ｓｃＦｖ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及び第２ｓｃＦｖドメインから本質的に構成されるポリペプチドである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８８】
複数の二重特異性分子の各々が、アミノ末端からカルボキシ末端へ順に、第１イムノグロブリン重鎖可変領域、第１イムノグロブリン軽鎖可変領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、第２イムノグロブリン重鎖可変領域、及び第２イムノグロブリン軽鎖可変領域から本質的に構成されるポリペプチドである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項８９】
病原性抗原分子が感染因子の抗原である、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９０】
病原性抗原分子が自己抗体である、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９１】
複数の二重特異性分子の各々がポリペプチドである、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団。
【請求項９２】
請求項９１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団をコードする核酸集団。
【請求項９３】
請求項９２記載の核酸集団で形質転換された細胞集団。
【請求項９４】
精製された集団である、請求項９２記載の核酸集団。
【請求項９５】
真核生物発現ベクター集団中に存在するものである、請求項９２記載の核酸集団。
【請求項９６】
１つ以上の容器中に請求項９２記載の核酸集団を含むキット。
【請求項９７】
１つ以上の容器中に、請求項９２記載の核酸集団で形質転換した細胞集団を含むキット。
【請求項９８】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法であって、該哺乳動物に対し治療上有効な量の二重特異性分子のポリクローナル集団を投与することを含み、該ポリクローナル集団は、複数の二重特異性分子を含み、該複数の二重特異性分子の各々は、（ａ）異なる結合特異性を有する異なる第１抗原認識領域、及び（ｂ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を含み、該複数の二重特異性分子の各々が第１のモノクローナル抗体とＣＲ１に対する第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない、上記治療方法。
【請求項９９】
投与が静脈内投与である、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
哺乳動物がヒトであり、Ｃ３ｂ様レセプターがＣＲ１である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０１】
哺乳動物が非ヒト哺乳動物である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０２】
病原性抗原分子が病原体のタンパク質である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０３】
病原性抗原分子が自己免疫性疾患の自己抗体である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０４】
病原性抗原分子が望ましくない症状を引き起こす感染因子の抗原である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０５】
病原性抗原分子が望ましくない症状を引き起こす薬物である、請求項９８記載の方法。
【請求項１０６】
感染因子がウイルスである、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０７】
感染因子が細菌である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０８】
感染因子が真菌である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０９】
感染因子が原生動物である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１１０】
感染因子が寄生生物である、請求項１０４記載の方法。
【請求項１１１】
病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療に有効な量の、請求項８１記載の二重特異性分子のポリクローナル集団、及び薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
【請求項１１２】
複数の精製された二重特異性分子が、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療に有効な量で存在する、請求項８２記載の組成物であって、該組成物がさらに薬学的に許容される担体を含むものである、上記組成物。
【請求項１１３】
病原性抗原分子が哺乳動物の感染因子である、請求項１１１記載の組成物。
【請求項１１４】
病原性抗原分子が哺乳動物の感染因子である、請求項１１２記載の組成物。
【請求項１１５】
二重特異性分子の集団の作製方法であって、異なる抗原分子と結合するイムノグロブリン集団の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する真核生物発現ベクター集団で、Ｃ３ｂ様レセプターと結合するイムノグロブリンを発現するハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトするステップ、並びに上記トランスフェクトしたハイブリドーマ細胞系を、上記ヌクレオチド配列が発現されて、二重特異性分子の集団がトランスフェクトハイブリドーマ細胞系により産生されるような条件下に供するステップを含み、上記集団の各二重特異性分子が病原性抗原分子と結合する第１抗原認識領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を有するものである、上記方法。
【請求項１１６】
重鎖及び軽鎖可変領域を各々コードするヌクレオチド配列の対が、その頭と頭とが連結して二方向性ベクターを形成するものである、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
二重特異性分子の集団を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ファージ提示ライブラリーから、アフィニティースクリーニングを利用して各々がそれぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを提示する複数のファージを選択するステップ；
（ｂ）複数の抗原認識ポリペプチドを各々コードする複数の核酸を得るステップ；
（ｃ）上記複数の核酸の各々の核酸をイムノグロブリン定常ドメイン配列をコードする核酸と融合させて、それぞれがイムノグロブリン定常ドメインと融合された抗原認識ポリペプチドを含む複数の融合タンパク質をコードする複数の融合核酸を生成するステップ；並びに
（ｄ）上記複数の融合核酸を宿主細胞において共発現させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生させるステップ；
を含み、上記集団の各メンバーが病原性抗原分子と結合する第１抗原認識領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を有するものである、上記方法。
【請求項１１８】
二重特異性分子のポリクローナル集団を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ファージ提示ライブラリーから、アフィニティースクリーニングを利用して各々がそれぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを提示する複数のファージを選択するステップ；
（ｂ）複数の抗原認識ポリペプチドを各々コードする複数の核酸を得るステップ；
（ｃ）上記複数の核酸の各々の核酸をイムノグロブリン定常ドメイン配列をコードする核酸と融合させて、それぞれがイムノグロブリン定常ドメインと融合された抗原認識ポリペプチドを含む複数の融合タンパク質をコードする複数の融合核酸を生成するステップ；
（ｄ）上記複数の融合核酸を第１の宿主細胞群において発現させて、複数の融合タンパク質を産生させるステップ；
（ｅ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する抗原認識領域をコードする核酸を第２の宿主細胞群において発現させて、該抗原認識領域を産生させるステップ；並びに
（ｆ）上記産生された融合タンパク質と上記産生されたＣ３ｂ様レセプターと結合する抗原認識領域とを接触させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を作製するステップ；
を含み、ポリクローナル集団の各メンバーが病原性抗原分子と結合する第１抗原認識領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を有するものである、上記方法。
【請求項１１９】
二重特異性分子のポリクローナル集団の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）ファージ提示ライブラリーから、アフィニティースクリーニングを利用して各々がそれぞれ異なる結合特異性を有する抗原認識ポリペプチドを提示する複数のファージを選択するステップ；
（ｂ）複数の抗原認識ポリペプチドを各々コードする複数の核酸を得るステップ；
（ｃ）上記複数の核酸の各々の核酸をＣ３ｂ様レセプターと結合する抗原認識領域をコードする核酸と融合させて、それぞれがＣ３ｂ様レセプターと結合する抗原認識領域と融合された抗原認識ポリペプチドを含む複数の融合タンパク質をコードする複数の融合核酸を生成するステップ；並びに
（ｄ）上記複数の融合核酸を宿主において発現させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生させるステップ；
を含み、ポリクローナル集団の各メンバーが、一本鎖ポリペプチドであり、かつ病原性抗原分子と結合する第１抗原認識領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２抗原認識領域を有するものである、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、哺乳動物の循環系において提示される抗原と結合する第１結合ドメインと、Ｃ３ｂ様レセプター（霊長類において補体レセプター１（ＣＲ１）又はＣＤ３５として知られる）と結合する第２結合ドメインとを有することを特徴とする二重特異性分子に関する。本発明はまた、二重特異性分子の作製方法、及びその治療的用途、並びに二重特異性分子を含むキットに関する。本発明はさらに、二重特異性分子のポリクローナル集団に関する。
【０００２】
２．発明の背景
抗体は、２つの基本的な機能を有する。１番目は抗原をオプソニン化する、つまり抗原を認識してこれに結合する機能であり、２番目は、抗原を破壊するために免疫系の他のエレメントを動員する機能である。循環系中の病原性抗原分子は、肝臓及び脾臓中の固定組織マクロファージ（すなわち網内皮細胞系ＲＥＳ）によって排除される（ｃｌｅａｒｅｄ）と考えられている。抗体は、抗原の認識及びそのＲＥＳへの送達を強化するが、排除するための食細胞への標的抗原の送達は、前記抗原に特異的な抗体（すなわち特異的イムノグロブリン）によって、その抗原を迅速かつ効率的に排除するのに十分な程度に常に強化されるとは限らない。
【０００３】
固定組織食細胞により排除される循環中の病原性抗原分子には、あらゆる抗原性成分が含まれる。免疫系が哺乳動物の循環から病原体及び／又は毒素を効率良く除去できなければ、外傷性及び循環血液量減少性ショックを引き起こす可能性がある（Ａｌｔｕｒａ及びＨｅｒｓｈｅｙ， １９６８， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２１５：１４１４−９）。
【０００４】
循環からの抗原の排除は、食細胞上のレセプターに抗原が結合した後、循環からこの抗原が除去されることにより行われる。抗原は、食細胞によって取り込まれた後、その食細胞内で化学分解及び／又はタンパク質加水分解によって破壊される。
【０００５】
循環から抗原が除去される速度（ｒａｔｅ）及び効率は、その生物中に存在する固定組織食細胞の数、固定組織食細胞上の適切なレセプターの数、オプソニンの血清濃度、病原体に対するレセプターの親和性、及び病原体の濃度等などの多数の要因によって異なる（Ｒｅｉｃｈａｒｄ及びＦｉｌｋｉｎｓ， １９８４， Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍ； Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， ｐｐ． ７３−１０１（Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ））。
【０００６】
抗体や補体等の血清オプソニンは、食細胞上のレセプターが病原体に結合し易くなるように病原体に結合しこれを被覆することにより、病原体の排除を促進する。例えば霊長類において、補体因子Ｃ３ｂは、免疫複合体に結合することにより病原体を排除する。次にＣ３ｂ／免疫複合体は、造血細胞の表面上（例えば霊長類の赤血球上）に発現されるＣ３ｂレセプターに、免疫複合体に結合したＣ３ｂ分子を会して結合する。次にこの複合体は造血細胞に伴われてＲＥＳに運ばれ、排除される。この排除メカニズムを示すために、Ｊｏｈｎｓｏｎらは、アガロースビーズをＣ３ｂで予めコーティングし、この予めコーティングされたビーズがコーティングされていないビーズよりも速く循環から排除されたことを示した（１９８３， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７：４０３）。
【０００７】
抗原に結合することができかつそれ自身に免疫細胞が結合する成分は、オプソニンとして機能することができる。循環からの病原体の排除速度を大きく制限するのは、血清中のオプソニンの濃度の低さである。血流中に存在する病原体の数に比べてオプソニンの数が少ないと、多くの病原体は迅速かつ効率的な排除を逃れることができる（Ｒｅｉｃｈａｒｄ及びＦｉｌｋｉｎｓ， １９８４， Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍ； Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， ｐｐ．７３−１０１ （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ））。
【０００８】
病原体に結合する能力のある成分（すなわちオプソニン）を同定する数多くの技法が、これらの結合成分が病原体に対する治療薬として有用であろうという期待のもとに開発されている。例えば、治療的用途に使える可能性のある結合成分を同定するためにコビナトリアル・ケミストリー又はファージ提示ライブラリーがさかんに用いられている。
【０００９】
ファージ提示及びコンビナトリアル・ケミストリー技法の大きな弱点は、同定された結合ドメインが病原体と相互作用しても、その結合ドメインが治療上の有効性を有しない場合があることである。例えば上記技法により得た結合成分は、抗体や補体等の天然のオプソニンのように病原体を攻撃して循環から排除するよう免疫系に指令することは滅多に無い。同定された結合ドメインの他の限界は、循環中の病原体の正常な複製と相互作用することによりその病原体の成長又は永続化（ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｏｎ）を防ぐことによって被験者を治療的に処置するという見込みの正当な根拠がないことである。
【００１０】
モノクローナル抗体技術の開発（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７により最初に開示された）によって、正確かつ再現性のある特異性を有する抗体のほぼ無限の供給源を作製することが可能となった。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの手法は、免疫化した動物から得た脾臓細胞を不死化骨髄腫細胞系と融合して、所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを含むハイブリドーマ細胞の集団を作製するものである。次に、このハイブリドーマ集団から、固相酵素免疫検定法（エライザ：ＥＬＩＳＡ）等の従来技法を用いて、必要な特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択、すなわち「クローニング」する。
【００１１】
上記の面倒な免疫手法の代わりに、治療に役立つ抗体を産生する他の手法が開発された。１つの手法は、抗体をコードする遺伝子のサブライブラリーをファージの構造タンパク質にフレームをあわせてクローニングした後に、これらの組換え遺伝子をバクテリオファージ中に挿入し、このバクテリオファージがそのウイルス表面上に抗体−構造融合タンパク質を発現する、というものである（Ｃｌａｃｋｓｏｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５２： ６２４； Ｍａｒｋｓら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１； Ｚｅｂｅｄｅｅら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ３９：３１７５； Ｇｒａｍら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ３５７６に記載）。しかし、目的の病原体に結合する抗体を産生しても、必ずしも治療に有効な抗体が得られるとは限らない。
【００１２】
抗体だけでは一般に治療薬として不適当であるため、モノクローナル抗体技術をさらに改良して、２つの可変領域が異なる抗原結合特性を有する抗体が作製された。この二重特異性抗体はモノクローナル抗体に比べてより有用である可能性がある。例えば、二重特異性抗体は２つの別々の抗原を標的とし、治療薬を標的病原体の近くに運ぶことができる。しかしこれらの二重特異性抗体もまた親抗体と同様に、特別な治療的特性を持たないという本質的な限界を有する（概説についてはＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ及びＬａｃｈｍａｎｎ， １９９０， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７９：３１５−３２１；及びＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ及びＬａｃｈｍａｎｎ， １９９５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １２１−１４１を参照されたい）。
【００１３】
治療用分子が病原性抗原分子と接触するとその病原性抗原分子が循環から効率的に排除されるような治療用分子を用いて被験者を治療する方法が必要とされている。この目的のために、Ｔａｙｌｏｒらは、病原性抗原に特異的な第１モノクローナル抗体を霊長類Ｃ３ｂレセプターに特異的な第２モノクローナル抗体と細胞外で化学的に架橋することにより、病原性抗原分子に迅速かつ効率的に結合してこれを霊長類の循環から排除することができる二重特異性ヘテロポリマー型（ｈｅｔｅｒｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）抗体が作製されることを示した（米国特許第５，４８７，８９０号及び第５，４７０，５７０号：図１のパネルＢ）。
【００１４】
本発明は、Ｃ３ｂ様レセプター若しくはその機能的等価物、及び循環から排除すべき抗原の両方に結合する二重特異性分子を用いて疾患を治療又は予防するための組成物及び方法を提供する。本発明の二重特異性免疫結合体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎａｄｈｅｓｉｎ）がＣ３ｂ様レセプターに結合して造血細胞に抗原を繋ぎ止めると、これがこの抗原を網内皮細胞系に運び、破壊する。
【００１５】
３．発明の概要
本発明は、哺乳動物の循環において提示される抗原と結合する第１結合ドメインと、Ｃ３ｂ様レセプター若しくはその機能的等価物（霊長類において補体レセプター１（ＣＲ１）又はＣＤ３５として知られる）と結合する第２結合ドメインとを有することを特徴とする二重特異性分子に関する。本発明はまた、二重特異性分子の作製方法、その治療的／予防的用途、二重特異性分子を含むキット、ポリペプチドである二重特異性分子をコードする核酸、かかる核酸で形質転換した細胞、及び二重特異性分子の組換え作製法に関する。
【００１６】
本発明は、前述の技法の限界が大きく改善されたものである。特に、本発明者は、Ｃ３ｂ様レセプター及び循環から排除すべき抗原の両方に特異的な二重特異性抗体が、哺乳動物の循環から迅速かつ効率的に排除され得ることを示した。二重特異性分子には、Ｃ３ｂ様レセプターに特異的な第１結合ドメインと目的の抗原に特異的な第２結合ドメインとを有する、あらゆる単一のポリペプチド又は多重サブユニット型ポリペプチドが含まれる。本発明の二重特異性分子は、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。このように、かかる多重サブユニット型ポリペプチドは、好ましくは化学的に架橋されて二重特異性分子を形成するものではないので、かかる分子の抗原性は低くなる。
【００１７】
本明細書において用いる「Ｃ３ｂ様レセプター」という用語は、霊長類Ｃ３ｂレセプターと類似した機能を有するあらゆる哺乳動物循環分子（例えばＣＲ１）を意味するものと理解されたい。
【００１８】
好適な実施形態において、二重特異性分子は、第１可変領域が循環から排除すべき抗原分子と結合し、第２可変領域がＣ３ｂ様レセプターと結合することを特徴とする、二重特異性イムノグロブリンである。より好ましくは、Ｃ３ｂ様レセプターは霊長類のＣ３ｂレセプターである（図１のパネルＣを参照されたい）。特定の実施形態において、このようなイムノグロブリンは、ヒト定常領域を有するという点でキメラである及び／又はヒト化されたものである。
【００１９】
ヒト化二重特異性抗体は、ヒト免疫系により外来タンパク質であると認識され難い。つまり、これらの抗体は免疫原性が低いため、ヒトにおける治療的又は診断的用途に好ましいものとなっている。特に、反復治療（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関しては、ヒト免疫反応は二重特異性抗体の治療的効力を低減させうる。更に、二重特異性抗体は、好ましくは細胞外架橋物質（抗体を変性させて二重特異性分子の収量を低下させる可能性があり、また免疫原性ハプテンとして働いてヒト化二重特異性抗体の反復投与の効用を低下させ得る）を用いて生成されるものではない。
【００２０】
特定の実施形態において、プロモーター（例えば異種プロモーター）に機能的に連結された本発明の二重特異性分子をコードする配列（１若しくは複数）を含む核酸が提供される。かかる核酸は、染色体核酸（ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であってもベクター（例えばプラスミドベクター、特にプラスミド発現ベクターなど）であってもよい。コードされた二重特異性分子が発現されるように、そして二重特異性分子が別々のポリペプチドで構成されるポリペプチド多量体である場合は当該分子が細胞内でアセンブルされるように、上記核酸で形質転換した宿主細胞を培養するステップ、及び発現された二重特異性分子を回収するステップを含む、組換作製法も提供される。あるいは、二重特異性分子がポリペプチド多量体（例えばイムノグロブリン等）である場合、そのモノマー成分を同じ宿主細胞若しくは異なる宿主細胞中で発現させ、精製した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせて二重特異性分子を形成することができる。
【００２１】
１つの実施形態において、二重特異性分子は、イムノグロブリン重鎖のＦｃドメイン（つまりヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）のアミノ末端に第１結合ドメイン（ＢＤ１）（抗体の可変ドメイン又はレセプターリガンド等）が融合され、そのカルボキシ末端に第２結合ドメイン（ＢＤ２）が融合されたものである、単一ポリペプチドである。或いは、二重特異性分子は、２つの別々のポリペプチドが会合した融合ポリペプチドとして構成され、第１のポリペプチドは、イムノグロブリン重鎖のＣＨ２／ＣＨ３部分のアミノ末端にＢＤ１を有し、第２のポリペプチドはイムノグロブリン重鎖のＣＨ２／ＣＨ３部分のカルボキシ末端にＢＤ２が融合されたものを含む。或いは、それぞれのＦｃドメインのカルボキシ末端又はアミノ末端の結合ドメインが逆になったものでもよい。これらの２つのポリペプチドは同じ細胞内で発現される場合は重鎖ドメインの相互作用により二量体を形成する。あるいは各ポリペプチドを別々の細胞中で発現させた後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで結合することもできる（以下に説明する）。
【００２２】
他の実施形態において、本発明の二重特異性分子は、２つのポリペプチドが会合したものとして構成され、この結合ドメインが一本鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）であることを特徴とするものである。ｓｃＦｖは、軽鎖可変部分が連結ペプチドを介して重鎖可変部分に融合されたものを含む。第１ポリペプチドは、Ｃ３ｂ様レセプターに対して特異的なｓｃＦｖがイムノグロブリンのＦｃドメインのアミノ末端に融合されたものとして本質的に構成される。第２ポリペプチドは、病原性抗原分子に対して特異的なｓｃＦｖがイムノグロブリンのＦｃドメインのカルボキシ末端に融合されたものとして本質的に構成される。また本発明は、ｓｃＦｖドメインがＦｃドメインのカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれかにある場合も想定する。これら２つのポリペプチドは、同じ細胞内で発現させると重鎖ドメインの相互作用により二量体を形成する。あるいはこれら２つのポリペプチドは、別々の細胞内で発現させた後にｉｎ ｖｉｔｒｏで共にアセンブルされる（以下に説明する）。
【００２３】
他の実施形態において、二重特異性分子は、第１重鎖可変部分、第１軽鎖可変部分、ＣＨ２、ＣＨ３、第２重鎖可変部分、及び第２軽鎖可変部分を含む単一の組換えポリペプチドである。第１の重鎖可変部分及び軽鎖可変部分はＣ３ｂ様レセプターに対して特異的であり、第２の重鎖可変部分及び軽鎖可変部分は病原性抗原分子に対して特異的である。
【００２４】
好適な実施形態において、本発明は、哺乳動物に治療上有効な量の二重特異性分子を投与することを含む、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法を提供する。この二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体が、第２のモノクローナル抗体と化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）前記病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）哺乳動物のＣ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含む。
【００２５】
様々な実施形態において、本発明は、１以上の容器の中に、二重特異性分子、二重特異性分子をコードする核酸（１若しくは複数）、及びこのような核酸で形質転換された細胞を含むキットを提供する。特定の実施形態において、本発明は、１以上の容器の中に第１ベクターと第２ベクターとを含むキットを提供する。ここで、第１ベクターは、ポリペプチドリンカーを介して第１のイムノグロブリン軽鎖可変ドメインと融合された第１のイムノグロブリン重鎖可変ドメインを少なくともコードする第１のＤＮＡ配列を含み、第２ベクターは、ポリペプチドリンカーを介して第２のイムノグロブリン軽鎖可変ドメインと融合された第２のイムノグロブリン重鎖可変ドメインを少なくともコードする第２のＤＮＡ配列を含み、第１のイムノグロブリン重鎖可変ドメイン及び第１のイムノグロブリン軽鎖可変ドメインは病原性抗原分子と結合し、第２のイムノグロブリン重鎖可変ドメイン及び第２のイムノグロブリン軽鎖可変ドメインはＣ３ｂ様レセプターと結合する。
【００２６】
他の実施形態において、本発明は、二重特異性分子をコードする１以上の組換えベクターで形質転換された細胞を提供する。より具体的な実施形態において、この細胞は、Ｃ３ｂ様レセプター及び病原性分子の両方に対する結合特異性を有するポリペプチドを発現する１つの組換え核酸を含み、かつ網内皮細胞系によって排除され得るものである。他の特定の実施形態において、形質転換細胞は２以上の核酸を含み、そのうち１つの核酸はＣ３ｂ様レセプターに対して特異的な第１結合ドメインをコードし、第２の核酸は病原性抗原分子に対して特異的な第２結合ドメインをコードし、これら２つのポリペプチドは例えば抗体の重鎖の会合を仲介するヒンジ領域を介して会合することができ、また各々の結合ドメインを介してＣ３ｂ様レセプター及び病原性抗原分子に結合することができる。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１抗原認識領域と病原性抗原分子と結合する第２抗原認識領域とを有する二重特異性イムノグロブリンを分泌する細胞を作製する方法を提供し、該方法は、Ｃ３ｂ様レセプターと結合するイムノグロブリンを発現する第１細胞を病原性抗原分子と結合するイムノグロブリンを発現する第２細胞とを融合するステップ、及び二重特異性イムノグロブリンを発現する細胞を選択するステップ、を含むものである。
【００２８】
他の実施形態において、本発明は、少なくとも２つのベクターを含む形質転換細胞を提供する。前記ベクターのうち少なくとも１つは、少なくとも第１の重鎖可変部分及び軽鎖可変部分をコードする第１のＤＮＡ配列を含み、前記ベクターのうち少なくとも他の１つは、少なくとも第２の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをコードする第２のＤＮＡ配列を含み、第１の重鎖及び第１の軽鎖は病原性分子と結合することができ、そして第２の重鎖及び第２の軽鎖は細胞上に発現されるＣ３ｂ様レセプターと結合することができる。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物において病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状（例えば疾患又は障害等）を予防する方法を提供し、該方法は、望ましくない症状が発症する前に哺乳動物に予防上有効な量の二重特異性分子を投与することを含むものである。この二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）前記病原性抗原分子と結合する第１結合ドメインを含み、かつ（ｃ）哺乳動物のＣ３ｂ様レセプターと結合する第２結合ドメインを含む。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法を提供し、該方法は、２つのモノクローナル抗体又はそのフラグメントが互いに化学的に架橋されたものではない、Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１抗原認識ドメインと病原性抗原分子と結合する第２抗原認識ドメインとを有する二重特異性分子と、哺乳動物に由来する造血細胞とを接触させて、造血細胞／二重特異性分子複合体を形成させるステップ、及びこの造血細胞／二重特異性分子複合体を治療上有効な量で被験者に投与するステップを含むものである。
【００３１】
他の実施形態において、本発明は、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法を提供し、２つのモノクローナル抗体又はそのフラグメントが互いに化学的に架橋されたものではない、造血細胞／二重特異性分子複合体を、治療上有効な量で被験者に投与するステップを含むものであり、前記複合体は造血細胞が１以上の二重特異性分子に結合されたものとして本質的に構成され、前記二重特異性分子は造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターと結合する第１抗原認識ドメインと病原性抗原分子と結合する第２抗原認識ドメインとを有し、前記二重特異性分子は２つのモノクローナル抗体又はそのフラグメントが互いに化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、少なくともＣ３ｂ様レセプターに結合する第１抗原認識領域と病原性抗原分子若しくはそのフラグメントに結合する第２抗原認識領域とを含む二重特異性分子を作製する方法を提供し、該方法は、少なくとも第１抗原認識領域をコードする第１のＤＮＡ配列と少なくとも第２抗原認識領域をコードする第２のＤＮＡ配列とで細胞を形質転換するステップ、並びに、第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列を別々に発現させて、第１及び第２抗原認識領域が別々の分子として産生させ、前記形質転換された単一の細胞中でこれらの別々の分子を一緒にアセンブルするステップ、を含むものである。こうすることにより、化学的に互いに架橋された２つの別々のモノクローナル抗体ではなく、第１抗原認識領域でＣ３ｂ様レセプターに結合することができ、かつ第２抗原認識領域で循環から排除すべき抗原に結合することができる、二重特異性分子が形成される。
【００３３】
また本発明は、複数の異なる二重特異性分子を含むポリクローナル集団、並びにその作製及び用途にも関する。好ましくはポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、ある抗原分子の異なるエピトープ及び／又はある抗原分子の異なる変異体に対する特異性を含む。より好ましくは、ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、ある抗原分子の天然に存在する変異体の大部分に対する特異性を含む。ある病原体の複数の変異体又は複数の病原体を標的とする二重特異性分子のポリクローナル集団も想定される。好適な実施形態において、そのポリクローナル集団中の二重特異性分子の少なくとも９０％、７５％、５０％、２０％、１０％、５％又は１％は、所望の単数及び／又は複数の抗原分子を標的とする。他の好適な実施形態において、そのポリクローナル集団中の任意の単一種の二重特異性分子の割合は、その集団の９０％、５０％又は１０％を超えない。ポリクローナル集団は異なる特異性を有する少なくとも２種類の異なる二重特異性分子を含む。より好ましくは、ポリクローナル集団は、異なる特異性を有する少なくとも１０種類の異なる二重特異性分子を含む。最も好ましくは、ポリクローナル集団は異なる特異性を有する少なくとも１００種類の異なる二重特異性分子を含む。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態において、二重特異性分子の集団は、Ｃ３ｂ様セレプターに結合するイムノグロブリンを発現するハイブリドーマ細胞系を、異なる結合特異性を有するイムノグロブリンのポリクローナル集団の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含む真核生物発現ベクター集団でトランスフェクトすることによって作製される。好適な実施形態において、まずアフィニティークロマトグラフィーを利用してファージ提示ライブラリーをスクリーニングして、目的の単数又は複数の抗原分子に対して結合特異性を有するポリクローナルサブライブラリーを選択する。次に重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸を頭と頭を合わせて連結し、二方向性ファージ提示ベクターのライブラリーを作製する。次に、二方向性ファージ提示ベクターをまとめて（ｉｎ ｍａｓｓ）二方向性哺乳動物発現ベクターに移し、これらのベクターでハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトする。
【００３５】
他の好適な実施形態において、複数のエピトープを有する抗原分子を用いて、十分に大量の特異性レパートリーを有するファージ提示ライブラリーを、好ましくは複数の抗体を提示する提示されたライブラリーメンバーを富化した後に、アフィニティースクリーニングにかけることによって、二重特異性分子のポリクローナル集団を得る。選択された提示抗体をコードする核酸を切り出し、好適なＰＣＲプライマーを用いて増幅する。全長核酸が単離されるように、ゲル電気泳動によって核酸を精製することができる。次に、異なるインサートを有する発現ベクター集団が得られるように、各核酸を好適な発現ベクター中に挿入する。次にこの発現ベクター集団を、好適な宿主中で、抗−ＣＲ１結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと共発現させる。あるいは、この発現ベクター集団及び抗−ＣＲ１結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを別々の宿主中で発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの抗原結合ドメインと抗−ＣＲ１結合ドメインとを組み合わせて二重特異性分子のポリクローナル集団を形成する。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、二重特異性分子のポリクローナル集団を組換え手法により作製する。この組換え法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインをコードするヌクレオチドのポリクローナル集団を、イムノグロブリン定常ドメイン配列をコードするヌクレオチドと融合させ、好適な宿主中で発現させる。好ましくは、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインと融合させる。また、ハイブリドーマ内でタンパク質が翻訳されている過程で可変ドメインと重鎖との間にジスルフィド結合が形成されるように、遊離チオール基を有するアミノ酸残基を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。
【００３７】
単一ポリペプチドの二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団は、組換え手法により作製することができる。選択された抗原認識領域のポリクローナル集団をコードする核酸のポリクローナル集団を、Ｃ３ｂ様レセプターに結合する抗原認識領域をコードする核酸と融合して、二重特異性分子の集団をコードする核酸集団を得る。次に二重特異性分子の集団を好適な宿主中で発現させ、二重特異性分子のポリクローナル集団を産生させる。
【００３８】
二重特異性抗体は抗原と結合しない場合は循環からゆっくり排除されるという付加的特性を有すると考えられる（例えばＣｒａｉｇら， １９９９， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ９２： １７０−１８０を参照されたい）。この特性は、二重特異性抗体が予防的用途で使用される場合に特に有用である。
【００３９】
５．発明の詳細な説明
本発明は、被験者から排除すべき抗原分子（病原性抗原分子）と結合する第１抗原認識領域と、Ｃ３ｂ様レセプター又はその機能的等価物と結合する第２抗原認識領域とを有することを特徴とする、二重特異性分子（特に二重特異性抗体）に関する。Ｃ３ｂレセプターは霊長類において補体レセプター１（ＣＲ１）又はＣＤ３５として知られている。本明細書中で使用される「Ｃ３ｂ様レセプター」という用語は、霊長類Ｃ３ｂレセプターと類似した機能を有する任意の哺乳動物循環分子（例えばＣＲ１）を意味するものと理解されたい。
【００４０】
本発明の二重特異性分子は、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。ポリペプチドの細胞外での化学的架橋は、大きな欠点を有する。第１に、化学的架橋プロセスは、ポリペプチドを変性させる可能性があり、これは効果的な治療に必要な用量を増加させ得る。第２に架橋試薬は免疫原性ハプテンとして機能し得る。二重特異性分子と共有結合した架橋剤の免疫認識（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）は、二重特異性分子及び同じ架橋剤を用いる他の治療用分子の反復投与の有用性を大きく低下させ得る。したがって、本発明の二重特異性分子の作製において、（ジスルフィド結合の形成以外の）細胞外での化学的な架橋（特にヘテロ機能性試薬を用いるもの）を避けるのが好ましい。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、二重特異性分子の中の抗原分子と結合する第１の抗原認識領域及びＣ３ｂ様レセプターと結合する第２の抗原認識領域のいずれも、２以上の重鎖／軽鎖対を含まない。
【００４２】
補体成分Ｃ３ｂは、Ｃ３ｂレセプターのリガンドであり、活性化されると細胞又は免疫複合体（ＩＣ）に結合し、この結合体は免疫系による排除の標的となる。Ｃ３ｂ成分は、標的細胞又はＩＣに結合した後、Ｃ３ｂレセプターに結合することにより、抗原（例えば細胞又はＩＣ）を循環中の赤血球に複合体として繋ぎ止める。次にこの赤血球／抗原複合体は循環系を通って肝臓若しくは脾臓に運ばれ、その後この複合体は網内皮細胞系によって認識され排除されると考えられる。次に抗原は、網内皮細胞系中のマクロファージによって捕食され、赤血球細胞は循環中に放出されて戻される（Ｃｏｒｎａｃｏｆｆ， Ｊ．ら， １９８３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７１：２３６−４７）。
【００４３】
本発明の二重特異性分子は、造血細胞の表面上に発現されるＣ３ｂ様レセプター（例えばヒトの赤血球上のＣＲ１等）の独特な特性を利用して、循環中の抗原を排除する。特に、本発明の組成物は、循環から抗原を迅速かつ効率的に排除するために有用である。
【００４４】
本発明の組成物及び方法は、循環からの抗原分子の除去が望まれる（すなわち抗原分子がその状態の原因物質又はその一部である）疾患、障害又は他の状態を治療するため、並びにこのような状態の症状及び徴候の発症（ｏｎｓｅｔ）を予防するため、又はこれらの状態の進行において症状又は徴候を遅らせるために、有用である。本発明の方法は、例えば、このような状態を治療するため（例えばこのような状態の症状及び徴候の改善又は緩和、このような状態の病理学的又は実験的知見の改良（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）、このような状態の進行の遅延、このような状態の症状及び徴候の発症の遅延等）、並びにこのような状態の再発の予防、及びこのような状態の症状及び徴候の発症の予防に有用である。
【００４５】
治療目的又は予防目的で本発明の二重特異性抗体を投与するのに好適な被験者は哺乳動物であり、例えば非ヒト動物（例えばウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット等）が挙げられるがこれに限定されない。好適な実施形態において、このような被験者はヒト又は非ヒト霊長類である。
【００４６】
本発明の方法及び組成物で治療される哺乳動物の好ましい特徴としては、病原性抗原分子を迅速かつ効率的に排除するために肝臓に十分な量の血流があること、並びに肝臓及び脾臓中に固定組織マクロファージ（例えばクッパー細胞等）が存在すること等が挙げられる。抗原の排除は、動物の種とはあまり関係が無く、むしろ抗原の排除は動物のサイズ、マクロファージの総細胞数、及び治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の用量に依存する。
【００４７】
本明細書中に開示される実施例は、以下に記載するようにマウスｍＡｂを用いて行われるが（第６節〜６．２節）、現在利用可能な技術によって、これらのマウスｍＡｂを「ヒト化」することが可能である。これは、ヒトにおいて、二重特異性抗体に対する免疫応答によりヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の反復投与の有効性が低下する可能性を低くしうる。より好ましくは、本発明の二重特異性抗体を作製するためにヒト抗体が用いられる（第５．１．１．２節を参照されたい）。
【００４８】
５．１．二重特異性抗体
以下に説明する好適な実施形態（第５．１．２節）において、二重特異性分子は、２つのハイブリドーマ細胞系の融合物（ハイブリッドハイブリドーマ）によって産生される二重特異性抗体である。２つのハイブリドーマを融合させると、最多で１０種の異なる抗体産物ができる。この１０種の異なる抗体は、生成された異なる重鎖及び軽鎖遺伝子の会合により得られる。しかし、二重特異性抗体は、標準カラムクロマトグラフィー、細胞選別又は免疫精製スキーム（以下第５．２節に記載）を用いて、免疫治療薬（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として使用するのに十分な量で簡単に精製される。
【００４９】
更に他の実施形態において、二重特異性抗体は、二重特異性抗体を組換え発現する系の中にトランスフェクトすることにより、抗体遺伝子を例えば繊維芽細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫細胞、昆虫細胞又は任意のタンパク質発現系の中に導入することによって、作製される。
【００５０】
更に他の実施形態において、二重特異性抗体は、個々のモノクローナル抗体を単離し、各特異的抗体のジスルフィド結合を破壊した後、抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えすることにより、作製される（例えばＡｒａｔｈｏｏｎら，国際特許出願公開第ＷＯ９８／５０４３１号を参照されたい）。
【００５１】
５．１．１　抗体
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子を指す。また、本発明は、抗原（例えば本発明の抗原等）に特異的に結合する抗原結合部位を含む抗体フラグメントの使用も想定する。イムノグロブリン分子の免疫学的活性を有するフラグメントの例としては、ペプシンやパパイン等の酵素で抗体を処理することにより作製することができるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。抗体の免疫学的活性を有するフラグメントを作製及び発現する方法の例は、米国特許第５，６４８，２３７号（本明細書中に参考として全て組み込まれる）に記載されている。
【００５２】
イムノグロブリン分子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域並びに無数のイムノグロブリン可変領域などの遺伝子によってコードされる。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。軽鎖は軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含む（図２）。重鎖はγ、μ、α、δ又はεとして分類され、これらはイムノグロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ画定する。重鎖は、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、重鎖定常１（ＣＨ１ドメイン）、ヒンジ、重鎖定常２（ＣＨ２）ドメイン、及び重鎖定常３（ＣＨ３）ドメインを含む（図２）。ＩｇＧ重鎖は、その配列のバリエーションに基づいて更にサブクラスに分類され、サブクラスはそれぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と称される。
【００５３】
さらに抗体は２対の軽／重ドメインに分けることができる。これらのＶＬ／ＶＨドメイン対の各々は、以下の連続的な７つのサブドメインを含む：フレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、フレームワーク領域４（ＦＲ４）。これらの領域は抗体／抗原認識ドメインを構成する（図２）。
【００５４】
キメラ抗体は、適当な抗原特異性を有するモノクローナル抗体から得た遺伝子を、適当な生物学的活性を有する第２のヒト抗体から得た遺伝子と一緒にスプライシングすることによって作製することができる。より具体的には、キメラ抗体は、抗体の可変領域をコードする遺伝子を、第２の抗体分子から得た定常領域の遺伝子と一緒にスプライシングすることによって作製することができる。この方法は、相補性決定領域がマウス由来でありフレームワーク領域がヒト由来であるヒト化モノクローナル抗体の作製において用いられる。これにより、その抗体で治療したヒト患者において免疫応答が生じる可能性が低下する（米国特許第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、第５，５６５，３３２号及び第５，８２１，３３７号。これらは本明細書中に参考として全て組み込まれる）。
【００５５】
本発明での使用に適した二重特異性抗体は、天然源から得てもよいし、又はハイブリドーマ、組換え若しくはキメラ合成法（遺伝子操作法による定常領域機能の改変など（米国特許第５，６２４，８２１号））によって作製してもよい。本発明の二重特異性抗体は、任意のアイソタイプであってもよいが、好ましくはヒトＩｇＧ１である。
【００５６】
抗体は、例えば無傷のイムノグロブリンとして存在するものか、又はパパインやペプシン等の様々なペプチダーゼを用いた消化により生成される一群の十分に特性決定されたフラグメントへと切断することができる（図２）。ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化切断して、その抗体のＦ（ａｂ）’２フラグメントを生成する。このフラグメントは、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖からなるＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ）’２を、穏かな条件下で還元して、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊し、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’一量体へと変換することができる。Ｆａｂ’一量体は本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（図２）。エピトープ、抗体及び抗体フラグメントの詳細な説明についてはＰａｕｌ編， １９９３， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第３版（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。当業者であれば、このようなＦａｂ’フラグメントを、化学的に又は組換えＤＮＡ技術を用いて新規に合成することができることが分かるであろう。このように、本明細書中で使用される「抗体フラグメント」という用語は、抗体全体を修飾して作製された抗体フラグメント又は新規に合成されたフラグメントを含む。
【００５７】
また、本明細書中で使用される「抗体」とは、ポリペプチドリンカーを介して重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインとが融合されたものとして構成される融合ポリペプチドを一般に含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であっても良い。
【００５８】
本明細書中で使用される「エピトープ」とは、抗原決定基、すなわち宿主中で免疫学的応答を誘発する分子領域又は抗体が結合する分子領域を指す。ただし、この領域は連続的なアミノ酸である必要はない。「エピトープ」という用語は、当分野において「抗原決定基」としても知られている。エピトープは、その宿主の免疫系に独特な空間的コンホメーション中にほんの３つのアミノ酸しか含まない場合がある。一般に、エピトープは少なくとも５つのアミノ酸からなり、より一般的には少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。このようなアミノ酸の空間的コンホメーションを決定するための方法は当分野において公知である。
【００５９】
５．１．１．１　免疫原の作製
免疫原（典型的には被験者から排除すべき抗原）を用いて好適な被験者（例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物）を免疫感作することにより、抗体を作製する。適当な免疫原性調製物は、例えば組換え手法により発現させた又は化学的に合成された抗原を含み得る。調製物は更に、アジュバント、例えばフロイントの完全アジュバント若しくは不完全アジュバント等のアジュバント、又は同様の免疫刺激物質を含み得る。
【００６０】
免疫原として使用するために単離された抗原、並びに単離された抗原フラグメントは、抗原に対する抗体を生じさせるための免疫原として使用するのに適している。免疫原として使用するのに適した単離抗原フラグメントは、抗原の少なくとも一部（８アミノ酸長、より好ましくは１０アミノ酸長、及び更に好ましくは１５アミノ酸長）を含む。
【００６１】
他の実施形態において、免疫原として使用する抗原は、標準的な精製技法を用いた適当な精製スキームによって細胞又は組織源から単離することができる。他の実施形態において、免疫原性抗原は、組換えＤＮＡ技法によって作製される。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成技法を用いて抗原を化学的に合成してもよい。
【００６２】
「単離された」抗原は、そのタンパク質が由来する細胞若しくは組織源からの細胞物質又は他の汚染物質を実質的に含まない、或いは化学合成した場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないものである。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、その抗原を単離した若しくは組換え生成した細胞の細胞成分からその抗原が分離されている抗原の調製物を含む。このように、細胞物質を実質的に含まない抗原は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（本明細書中において「汚染タンパク質」とも呼ばれる）を有する抗原調製物を含む。タンパク質又はその生物学的活性を有する部分が組換え手法により生成される場合も、これらは好ましくは培地を実質的に含まない。すなわち、培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％又は５％未満を占める。タンパク質が化学合成により生成される場合、タンパク質は好ましくは化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、タンパク質は、その抗原の合成に関わった化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。従って、このような抗原の調製物は、目的のポリペプチド以外に、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体又は化合物を有する。
【００６３】
また本発明は、免疫原として使用するキメラ若しくは融合抗原も提供する。本明細書中で使用する「キメラ抗原」又は「融合抗原」は、本発明で使用する抗原の全て又は一部が異種ポリペプチドと機能的に連結されたものを含む。融合抗原において、「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、抗原及び異種ポリペプチドが互いにフレームを合わせた状態で融合されていることを示すものとする。異種ポリペプチドは抗原のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。
【００６４】
１つの有用な融合抗原は、抗原がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合抗原である。このような融合抗原は、組換え抗原を精製し易くすることができる。
【００６５】
他の実施形態において、親和性の高い抗体を作製するために、抗原を分泌させて均質性が高くなるまで精製することができるように、融合抗原は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。例えば、免疫原の天然のシグナル配列を取り除き、他のタンパク質に由来するシグナル配列に置き換えることができる。例えば、バキュロウイルスのエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を異種シグナル配列として使用することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２）。真核生物の異種シグナル配列の他の例としては、メリチン及びヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が挙げられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。更に他の例において、有用な原核生物の異種シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル及びプロテインＡ分泌シグナルが挙げられる（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００６６】
更に他の実施形態において、融合抗原は、抗原の全て又は一部がイムノグロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されているイムノグロブリン融合タンパク質である。このイムノグロブリン融合タンパク質を免疫原として用いることによって、被験者の体内の抗原に対する抗体を作製したり、可能性としては他の抗原を精製することができる。
【００６７】
キメラ及び融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。１つの実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む通常の技法によって合成することができる。或いは、２つの連続的な遺伝子フラグメントの間に相補的な突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じさせるアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる。次にこれら２つの連続的な遺伝子フラグメントをアニーリングし、再び増幅させて、キメラ遺伝子配列を作製することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前掲）。さらに、融合ドメイン（例えばＧＳＴポリペプチド等）を予めコードする多くの発現ベクターが市販されている。融合ドメインがフレームを合わせた状態でポリペプチドに連結されるように、免疫原をコードする核酸をこのような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００６８】
５．１．１．２　抗体の作製
免疫原として抗原を用いて好適な被験者を免疫感作することにより、抗体を調製することができる。免疫された被験者の体内の抗体力価を、標準的な技法（例えば固定化したポリペプチドを用いた固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等）によって経時的にモニターすることができる。望ましい場合、抗体分子は、哺乳動物から（例えば血液から）単離し、周知の技法（例えばＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー等）により更に精製することができる。
【００６９】
免疫後の適当な時点で、例えば特異的抗体の力価が最も高くなった時に、被験者から抗体産生細胞を得、これを用いて標準的な技法、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより初めて記載されたハイブリドーマ法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７）、ＫｏｚｂｏｒらによるヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＣｏｌｅらによるＥＢＶ−ハイブリドーマ法（１９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６）、又はトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法等により、モノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを作製する技術は周知である（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清中の目的ポリペプチドに結合する抗体をスクリーニングすることによって検出される。
【００７０】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団（すなわちその集団を構成する個々の抗体が、稀に起こり得る自然突然変異を除いて全く同じである）から得られる。このように、「モノクローナル」という修飾語は、その抗体が別々の抗体の混合物ではないという特性を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒらにより最初に記載されたハイブリドーマ法（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５）を用いて、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により、作製することができる。また本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、その抗体がイムノグロブリンであることも意味する。
【００７１】
モノクローナル抗体を作製するためのハイブリドーマ法において、マウス又は他の適当な宿主動物（例えばハムスター等）を上記のように免疫して、この免疫感作に使用したタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発する（一般には、米国特許第５，９１４，１１２号を参照されたい。当該特許は本明細書中に参考として全て組み込まれる）。
【００７２】
あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次に、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。このように調製したハイブリドーマ細胞を好適な培地（好ましくは融合されていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１以上の物質を含む）に播種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を妨げる。
【００７３】
好ましい骨髄腫細胞は、選択された抗体産生細胞と効率的に融合しその抗体産生細胞による抗体の安定かつ高レベルな抗体産生を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性である骨髄腫細胞である。これらの中でも好ましい骨髄腫細胞系は、ネズミ骨髄腫細胞系（例えばｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ， Ｃａｌｉｆ． ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたもの及びｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞等）である。
【００７４】
ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞及びマウス−ヒト・ヘテロ骨髄腫細胞系も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ， １９８４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１； Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。ハイブリドーマ細胞を増殖させている培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎらのスキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）（１９８０， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０）により測定することができる。
【００７５】
所望の特異性、親和性及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））によって増殖させる。この目的に適した培地としては、例えばＤ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。更にハイブリドーマ細胞を、動物中で腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させてもよい。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水又は血清から、慣例的なイムノグロブリン精製法（例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等）によって適宜分離される。
【００７６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、目的の抗原を用いて組換えコンビナトリアル・イムノグロブリン・ライブラリー（例えば抗体ファージ提示ライブラリー等）をスクリーニングすることによって、病原体又は本発明の病原性抗原分子ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージ提示ライブラリーを作製及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｕｒｆＺＡＰ（商品名） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ， カタログ番号２４０６１２等）。更に、抗体提示ライブラリーを作製及びスクリーニングする際に使用するのに特に適した方法及び試薬の例は、例えば米国特許第５，２２３，４０９号及び第５，５１４，５４８号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／１８６１９号；国際特許出願公開第ＷＯ９１／１７２７１号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／２０７９１号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／１５６７９号；国際特許出願公開第ＷＯ９３／０１２８８号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０４７号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／０９６９０号；国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら， １９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２； Ｈａｙら， １９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５； Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４に記載されている。
【００７７】
更に、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることにより「キメラ抗体」の作製のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８１， ６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２， ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４， ４５２−４５４）を用いることができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えばネズミｍＡｂに由来する可変領域とヒトイムノグロブリン定常領域とを有する分子等）である（例えばＣａｂｉｌｌｙら， 米国特許第４，８１６，５６７号、及びＢｏｓｓら， 米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい。これらの特許は本明細書中に参考として全て組み込まれる）。
【００７８】
ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒトイムノグロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する、非ヒト種に由来する抗体分子である（例えば米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい。当該特許は本明細書中に参考として全て組み込まれる）。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当分野で公知の組換えＤＮＡ技法により、例えば国際特許出願公開第ＷＯ８７／０２６７１号、欧州特許出願第１８４，１８７号、欧州特許出願第１７１，４９６号、欧州特許出願第１７３，４９４号、国際特許出願公開第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６， ５６７号及び第５，２２５， ５３９号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら， １９８７， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら， １９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら， １９８６， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４； Ｊｏｎｅｓら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５； Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；並びにＢｅｉｄｌｅｒら， １９８８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０に記載された方法を用いて、作製することができる。
【００７９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の融合（連結）は、抗体をヒト化するための他の方法である。この方法は、全抗原特異性及び結合親和性をヒトフレームワーク領域に移すためにネズミ抗体を再形成するものである（Ｗｉｎｔｅｒら， 米国特許第５，２２５，５３９号）。これまでに様々な抗原に対するＣＤＲ融合型（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の構築に成功している。例えばＱｕｅｅｎら， １９８９ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９）に記載されたＩＬ−２レセプターに対する抗体、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３）に記載された細胞表面レセプター−ＣＡＭＰＡＴＨに対する抗体、Ｃｏｌｅら（１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９）に記載されたＢ型肝炎に対する抗体、並びにＴｅｍｐｅｓｔら（１９９１， Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６７）に記載されたウイルス抗原−ＲＳウイルスに対する抗体等が挙げられる。ネズミモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体中に融合（連結）されたＣＤＲ融合型抗体を作製する。融合の後、多くの抗体は、親和性を維持するために更にフレームワーク領域内のアミノ酸を変更すると良い。これは恐らく、フレームワーク領域の残基がＣＤＲのコンホメーションを維持するのに必要であるからであろう。また、幾つかのフレームワーク領域の残基は、抗原結合部位の一部であることが示された。しかし、抗原性部位が導入されないようにフレームワーク領域を保存するために、当該配列を確立された生殖細胞系配列と比較した後、コンピュータモデリングを行う。
【００８０】
ヒト患者の治療的処置には、完全なヒト抗体が特に望ましい。このような抗体は、内因性イムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することはできないがヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えばある免疫原の全て又は一部）を用いて通常の方法で免疫される。
【００８１】
抗原に対するモノクローナル抗体は、慣例的なハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒトイムノグロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅ）した後、クラススイッチ及び体細胞突然変異を経る。このように、このような技法を用いて、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体を作製することが可能である。このヒト抗体作製技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ（１９９５， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３）を参照されたい。このヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体の作製技術並びにこのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な説明については、例えば米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、及び米国特許第５，５４５，８０６号を参照されたい。更に、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ． （Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ（例えば米国特許第５，９８５，６１５号を参照されたい））及びＭｅｄａｒｅｘ， Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）等の会社は、先に記載した技術と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体の提供を請け負っている。
【００８２】
選択されたエピトープを認識しこれに結合する完全ヒト抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を用いて作製することができる。この手法では、同じエピトープを認識する完全ヒト由来抗体の選択をガイド（補助）するために、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体等）を用いる（Ｊｅｓｐｅｒｓら， （１９９４） ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）。
【００８３】
ある病原体に対する既存の抗体を用いて、標準的技法（例えばアフィニティークロマトグラフィーや免疫沈降法等）により、その病原体の他の抗原を単離して免疫原として使用することができる。更に、その病原体の存在量及び発現パターンを評価するために、このような抗体を用いて（例えば細胞溶解物や細胞上清等の中の）タンパク質を検出することができる。また、例えば所与の治療計画の効力を確認するために、臨床試験手順の一部として組織中の病原体レベルをモニターするために、抗体を診断的用途で用いることもできる。抗体を検出可能な物質に結合させることにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、接合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な接合団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。
【００８４】
市販されている抗体を、例えばＡＴＣＣから購入し使用して、二重特異性抗体を作製することができる。本発明の好適な実施形態において、抗体は、市販されているハイブリドーマ細胞系によって産生される。より好適な実施形態において、ハイブリドーマはヒト抗体を分泌する。
【００８５】
５．１．２　二重特異性抗体の作製及び精製
全長二重特異性抗体の作製は、単一のハイブリドーマ細胞系における２つのイムノグロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく。ここで、２セットの抗体コード遺伝子は、異なる抗原特異性を有する抗体をコードする（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５： ５３７−５３９；図１のパネルＡ）。イムノグロブリンの重鎖及び軽鎖の無作為な組合せにより、これらのハイブリドーマ（すなわち「クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）」）は、可能性として１０種の異なる抗体分子の混合物を生成する（図３）。これらの抗体分子のうち１つだけが正しい二重特異性構造（図３のＬ１Ｈ１Ｈ２Ｌ２；図１のパネルＣ）を有する。正しい分子の精製（通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる）はやや面倒であり、生成物の収率は低い。他の精製手法は１９９３年５月１３日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０：３６５５−３６５９に開示されている。
【００８６】
このように、本発明は、（ａ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合するイムノグロブリンを発現する第１の細胞と、病原性抗原分子に結合するイムノグロブリンを発現する第２の細胞とを融合させるステップ、及び（ｂ）Ｃ３ｂ様レセプターと結合する第１結合ドメインと病原性抗原分子と結合する第２結合ドメインとを含む二重特異性イムノグロブリンを発現する細胞を選択するステップを含む、二重特異性イムノグロブ　リン分泌細胞の作成方法を提供する。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の二重特異性イムノグロブリンは組換え手法により作製される（例えばＢｏｓｓによる米国特許第４，８１６，３９７号（１９８９年３月２８日）を参照されたい）。
【００８８】
このように、本発明は、Ｃ３ｂ様レセプターに結合する第１結合ドメインと病原性抗原分子に結合する第２結合ドメインとを含む二重特異性分子を細胞内で産生するための方法を提供し、該方法は以下のステップを含むものである：（ａ）少なくとも第１結合ドメインをコードする１以上の第１ＤＮＡ配列及び少なくとも第２結合ドメインをコードする１以上の第２ＤＮＡ配列で細胞を形質転換するステップ、並びに（ｂ）第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列を発現させて、第１及び第２結合ドメインを上記形質転換細胞中で共にアセンブルされる別々の分子として産生させ、それにより、（ｉ）ＣＲ１に対する第１モノクローナル抗体と、第２モノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｉｉ）Ｃ３ｂ様レセプターに結合し、及び（ｉｉｉ）病原性抗原分子に結合する、二重特異性分子が形成される。
【００８９】
また本発明は、Ｃ３ｂ様レセプターに結合する第１結合ドメインと病原性抗原分子に結合する第２結合ドメインとを含む二重特異性分子を細胞内で産生するための方法を提供し、該方法は以下のステップを含むものである：（ａ）少なくとも第１結合ドメインをコードする１以上の第１ＤＮＡ配列で第１細胞を形質転換するステップ、（ｂ）少なくとも第２結合ドメインをコードする１以上の第２ＤＮＡ配列で第２細胞を形質転換するステップ、（ｃ）第１ＤＮＡ配列及び第２ＤＮＡ配列を発現させて、第１及び第２結合ドメインを別々に産生させるステップ、（ｄ）第１及び第２結合ドメインを単離するステップ、並びに（ｅ）第１及び第２結合ドメインを接触させることにより第１及び第２結合ドメインをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせて、Ｃ３ｂ様レセプターに結合しかつ病原性抗原分子に結合する二重特異性分子を形成するステップ。この方法において、二重特異性分子は、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。本明細書中で使用される「接触」という用語は、２以上の反応体分子がぶつかり合って反応することができるように、反応緩衝液（例えば液状溶液）中に２以上の反応体分子を入れる又はこれらを混合することを指す。
【００９０】
本発明は更に、第１結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列及び第２結合ドメインをコードする第２ヌクレオチド配列で形質転換された細胞を提供する。これら２つの結合ドメインは、この形質転換細胞中で発現されると、互いに会合して二重特異性分子を形成し、第１結合ドメインはＣ３ｂ様レセプターに結合し、第２結合ドメインは病原性抗原分子に結合する。この二重特異性分子は、ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と、第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。
【００９１】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は組換え手法により作製される。これにより、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体／抗原結合部位）をコードするヌクレオチドを、イムノグロブリン定常ドメイン配列をコードするヌクレオチドと融合する。好ましくは、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインと融合する。また、ハイブリドーマ中でタンパク質が翻訳されている間に可変ドメインと重鎖との間にジスルフィド結合が形成されるように、遊離チオール基を有するアミノ酸残基を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい（Ａｒａｔｈｏｏｎら，国際特許出願公開第ＷＯ９８／５０４３１号）。
【００９２】
これらのイムノグロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び所望によりイムノグロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主生物中に共トランスフェクトする。これにより、３つのポリペプチド鎖の比率が不均等である場合に、これら３つの各ポリペプチドフラグメントの比率を調節する能力が備わり、最適な収率が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖を同じ比率で発現させると高い収率がもたらされる場合、又はこの比率が特に重要でない場合、３つのポリペプチド鎖のうちの２つ又は全てのコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【００９３】
この手法の好適な実施形態において、二重特異性抗体は、定常ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合された一方のアームが第１結合特異性を有するハイブリッドイムノグロブリン重鎖であり、他方のアームがハイブリッドイムノグロブリン重鎖／軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）であるものとして構成される。この非対称的構造は、二重特異性分子の半分のみにイムノグロブリン軽鎖が存在することにより分離が簡単となるので、望ましくないイムノグロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物を分離し易くすることが分かった。この手法は、国際特許出願公開第ＷＯ９４／０４６９０号（１９９４年３月３日公開）に開示されている。
【００９４】
単一のポリペプチドを含む二重特異性分子は、当分野で公知である任意の標準的方法を用いて組換え手法により作製することができる。１つの実施形態では、抗原認識領域（例えばｓｃＦｖ等）をコードする核酸をＣ３ｂ様レセプターに結合する抗原認識領域をコードする核酸と融合させて、単一のポリペプチド二重特異性分子をコードする融合核酸を得る。次にこの核酸を適当な宿主中で発現させて、二重特異性分子を産生する。
【００９５】
二重特異性抗体の作製の更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０を参照されたい。このような技法を用いて、本明細書中に定義される疾患の治療において使用するための、抗Ｃ３ｂ様レセプター抗体（Ｎｉｃｋｅｌｌｓら， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１２：２７−３３）と抗原に特異的な抗体とを組み合せた二重特異性抗体を調製することができる（図１のパネルＡ及びＣを参照されたい）。
【００９６】
他の好適な実施形態において、以下の非限定的な例のうちのいずれかによって、二重特異性抗体フラグメントを調製することができる。例えば、大腸菌から回収したＦａｂ’フラグメントをｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に結合させて、抗体を作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら， １９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５を参照されたい）。組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製及び単離するための種々の技法が存在する。例えば、ロイシンジッパーを用いてヘテロ二量体が作製された（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質から得たロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。この抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成した後、再び酸化して、抗体ヘテロ二量体を形成した。
【００９７】
Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらにより記載された「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術（１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８）には、二重特異性抗体フラグメントを作製する他のメカニズムについて報告されている。これらのフラグメントは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とがリンカーにより連結されたものであるが、このリンカーは非常に短いため、同じ鎖上のこれら２つのドメインは対になることができない。従って、１つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインと、もう一方のフラグメントの相補的なＶＬ及びＶＨドメインとをペアリングさせて、２つの抗原結合部位（すなわち二重特異性）を形成させる。同じようなプロトコールで、Ｇｒｕｂｅｒらは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体のみを用いた二重特異性抗体フラグメントの作製について報告している（１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８）。
【００９８】
５．２．二重特異性抗体の精製／単離
好適な実施形態では、抗体分泌細胞から分泌される二重特異性抗体を、イオン交換クロマトグラフィーによって単離する（第６．２節を参照されたい）。本発明の二重特異性抗体の単離に適したカラムの非限定的な例としては、ＤＥＡＥ、ヒドロキシルアパタイト、リン酸カルシウム等が挙げられる（Ｓｔａｅｒｚ及びＢｅｖａｎ， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８３：１４５３−１４５７）。
【００９９】
他の好適な実施形態において、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、適正に融合された細胞（ハイブリッド・ハイブリドーマ）を選択する。例えば、融合前に、各ハイブリドーマを、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の標識と一緒に培地中で増殖させる。第１のハイブリドーマを、第２のハイブリドーマとは異なるマーカーと一緒に増殖させる。次に従来法により細胞を融合し、ＦＡＣＳを用いて細胞の蛍光色を測定することにより、二重特異性抗体を産生する細胞を同定し、選択する（Ｋｏｏｌｗｉｊｋら， １９８８， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７：２１７−２２５；又はＫａｒａｗａｊｅｗら， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ９６：２６５−２７０を参照されたい）。
【０１００】
他の実施形態において、抗体分泌細胞から分泌された二重特異性抗体は、３段階連続アフィニティークロマトグラフィーによって単離される（Ｃｏｒｖａｌａｎ及びＳｍｉｔｈ， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ２４：１２７−１３２）。第１のカラムは固相基質（ｓｏｌｉｄ ｍａｔｒｉｘ）に結合させたプロテインＡで構成される。ここで、抗体のＦｃ部分はプロテインＡに結合し、抗体はカラムに結合する。次に、固相基質に結合するＣ３ｂ様レセプターを利用して第１可変ドメインを介したＣ３ｂ様レセプターの結合を分析する第２カラムがあり、次に、第２可変ドメインが結合した目的の抗原の特異的結合を利用する第３カラムがある。
【０１０１】
更に他の実施形態では、抗体分泌細胞から分泌される二重特異性抗体を、抗体の等電点電気泳動によって単離する。当業者であれば、サイズ又は親和性を利用したタンパク質精製法が本発明に適していることが分かるであろう。
【０１０２】
５．２．１　他の二重特異性分子
他の二重特異性分子も本発明の範囲内に含まれ、分子生物学の分野で周知である技法を用いて作製することができる。特に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２に教示されているように、ＤＮＡのクローニングを行うことができる。組換えタンパク質の発現も当分野では周知である。
【０１０３】
１つの実施形態において、本発明の二重特異性分子は、イムノグロブリンの重鎖（Ｆｃ）のＣＨ２及びＣＨ３部分のアミノ末端に第１結合ドメイン（ＢＤ１）が結合し、Ｆｃドメインのカルボキシ末端に第２結合ドメイン（ＢＤ２）が結合したものとして本質的に構成されるか、あるいはそれらを含む単一の分子（好適にはポリペプチド）である（図４のパネルＡ）。他の実施形態において、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン部分は、逆の順序で存在する。一方の結合ドメインはＣ３ｂ様レセプターに結合し、他方の結合ドメインは病原性抗原分子に結合する。結合ドメインはそれぞれ独立して、所望の特異性を有するｓｃＦｖ（すなわちポリペプチドリンカーを介してＶＨと融合されたＶＬ）であるか、レセプター若しくはリガンド又はその結合ドメインであるか、或いは他の結合パートナーである。例えば、病原性抗原分子に結合する結合ドメインは、ウイルスに対する細胞レセプター（例えばＨＩＶに結合するＣＤ４及び／又はケモカインレセプター等）、細菌に対するレセプター（例えばグラム陰性細菌に結合するポリミキシン又はその多量体等）、薬物又は他の分子に対する細胞レセプター（例えばアレルギー反応を治療又は予防するためにＩｇＥに結合するＩｇＥレセプターのαドメイン等）、或いは自己抗体に対するレセプター（例えば重症筋無力症を治療又は予防するためのアセチルコリンレセプター等）であってもよい。
【０１０４】
結合ドメインがポリペプチドではない又は二重特異性分子の他の部分との融合タンパク質として簡単には発現されない実施形態では、このような結合ドメインを二重特異性分子の他の部分に架橋させることができる。例えば、ＣＨ２ＣＨ３とＣ３ｂ様レセプターに結合する結合ドメインとを含む融合ポリペプチドにポリミキシンを架橋することができる。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明の二重特異性分子は、イムノグロブリンのＦｃドメイン（ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）のアミノ末端にＢＤ１が結合したものとして本質的に構成されるか又はそれを含む第１分子（好ましくはポリペプチド）と、Ｆｃドメインのカルボキシ末端にＢＤ２ドメインが結合したものとして本質的に構成されるか又はそれを含む第２分子（好ましくはポリペプチド）と、からなる二量体分子であり（図４のパネルＢ）、第１及び第２のポリペプチドのＦｃドメインは互いに相補的であって会合することができる。ＢＤ１及びＢＤ２は上記に説明した通りである。
【０１０６】
特定の実施形態において、図４Ｂに表された二重特異性分子の一量体のうちの一方又は両方は、図４Ｃに表される構造を有する。図４Ｃは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の後に（任意の構造／配列の）リンカー分子があり、このリンカーは重鎖可変ドメインのアミノ末端に結合しており、その後にＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから本質的に構成されるか又はこれを含む分子（好ましくはポリペプチド）を表す（図４のパネルＣ）。
【０１０７】
他の特定の実施形態において、図４Ｂに表された一量体のうちの一方又は両方は、図４Ｄに表される構造を有する。図４Ｄは、ＣＨ１ドメインのアミノ末端にｓｃＦｖが結合されており、その後に、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから本質的に構成されるか又はこれを含む分子（好ましくはポリペプチド）を表す（図４のパネルＤ）。
【０１０８】
他の実施形態において、本発明の二重様特異性分子は、２つの別々の抗原（一方はＣ３ｂ様レセプターであり他方は病原性抗原分子である）に対して特異性を有する２つの別個のｓｃＦｖを含む分子である。この分子（好ましくはポリペプチド）は、第１ｓｃＦｖドメインがＣＨ２ドメインに結合され、その後にＣＨ３ドメイン及び第２ｓｃＦｖドメインから本質的に構成されるか又はこれを含むものである（図４のパネルＥ）。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明の二重特異性分子は、２つの別々の抗原に対して特異性を有する２つの可変領域から本質的に構成されるか又はこれを含む分子である。この分子（好ましくはポリペプチド）は、第１重鎖可変ドメインが軽鎖可変ドメインに結合され、その後に、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから本質的に構成されるか又はこれを含む（図４のパネルＦ）。
【０１１０】
更に本発明は、二重特異性分子の個々の成分のうちの任意の成分の位置が入れ替わったものであって、かつその二重特異性分子が循環系から病原性抗原分子を排除する能力を保持しているものも包含する。例えば、図４のパネルＢ、Ｅ及びＦに表された二重特異性分子の２つの結合ドメイン（ＢＤ１及びＢＤ２）の位置を入れ替えても良い。或いは、図４Ａ〜４Ｆに表されたＣＨ２及びＣＨ３ドメインの位置を入れ替えても良い。更に、本発明は、ドメインが互いに対して更に異なる位置に入れ替えられかつその機能的特性（すなわちＣ３ｂ様レセプターへの結合、病原性抗原分子への結合、及びマクロファージにより循環系から排除され得ること）を維持しているものも想定する。更に、上記説明から明らかなように、上記結合ドメインは好ましくはポリペプチド（ペプチドを含む）であるが、そうである必要はない。更に結合ドメインは、結合を仲介する適当な構造との共有結合若しくは非共有結合による結合によって所望の結合特異性を提供することができる。例えば、結合ドメインは、非共有結合によりビオチン化分子（これは後に病原性抗原分子に結合する）に結合するアビジン又はストレプトアビジンを含み得る。
【０１１１】
上記二重特異性分子は、好ましくは二重特異性分子をコードする遺伝子操作された核酸構築物（当分野で周知の方法、及び／又は上記第５．１．１節及びそのサブセクションに記載された方法、及び／又は細胞外架橋法を用いて作製することができる）の組換え発現により得ることができる。
【０１１２】
５．３．二重特異性分子のポリクローナル集団
本明細書中で使用される、本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団とは、各々の二重特異性分子が病原性抗原分子に結合する第１抗原認識領域とＣ３ｂ様レセプターに結合する第２抗原認識領域とを有する複数の異なる二重特異性分子を含む二重特異性分子の集団であって、このような複数の異なる二重特異性分子の中の第１抗原認識領域がそれぞれ異なり、また各々が異なる結合特異性を有し、また前記二重特異性分子の各々は、第１のモノクローナル抗体と、ＣＲ１に対する第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではないことを特徴とする。幾つかの実施形態において、ポリクローナル集団中の各二重特異性分子の第１及び第２の抗原認識領域は、２以上の重鎖／軽鎖対を含まない。好ましくは、ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、ある抗原性分子の異なるエピトープに対する特異性及び／又はある抗原性分子の異なる変異体に対する特異性を含む。より好ましくは、ポリクローナル集団中の複数の二重特異性分子は、ある抗原性分子の天然のエピトープの大部分に対する特異性及び／又はある抗原性分子の全ての変異体に対する特異性を含む。また、ポリクローナル集団は、異なる抗原分子の混合物に対する特異性も含み得る。好適な実施形態において、ポリクローナル集団中の二重特異性分子の少なくとも９０％、７５％、５０％、２０％、１０％、５％又は１％は、単数及び／又は複数の所望の抗原分子を標的とする。他の好適な実施形態において、ポリクローナル集団中の任意の単一の二重特異性分子の割合は、その集団の９０％、５０％又は１０％を超えない。ポリクローナル集団は、異なる特異性を有する少なくとも２種類の異なる二重特異性分子を含む。より好ましくは、ポリクローナル集団は、異なる特異性を有する少なくとも１０種の二重特異性分子を含む。最も好ましくは、ポリクローナル集団は、異なる特異性を有する少なくとも１００種の異なる二重特異性分子を含む。
【０１１３】
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団を用いて、単一の特異性を有するモノクローナル抗体によって通常は効率的にターゲッティング及び排除することができない複数のエピトープを有する病原体及び／又は複数の変異体若しくは突然変異体を有する病原体をより効率的に排除することができる。２以上のエピトープにおいて同時に突然変異が起こる頻度は非常に低いので、二重特異性分子のポリクローナル集団は、ある病原体の複数のエピトープ及び／又は複数の変異体を標的とすることにより、突然変異率の高い病原体の排除において有利である。
【０１１４】
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団は、第５．１節及び第５．２節で先に説明した二重特異性分子の任意のタイプを含むことができる。二重特異性分子のポリクローナル集団は、第５．１節及び第５．２節で記載した任意の方法を適用することによって作製される。
【０１１５】
本発明の二重特異性分子のポリクローナル集団は、Ｃ３ｂ様レセプターに結合するイムノグロブリンを発現するハイブリドーマ細胞系を、異なる抗原分子に結合するイムノグロブリンのポリクローナル集団の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含む真核生物発現ベクターの集団でトランスフェクトすることによって、作製することができる。次に、病原性抗原分子に結合する第１結合ドメインとＣ３ｂ様レセプターに結合する第２結合ドメインとを含む二重特異性イムノグロブリンを発現する細胞を、当分野で公知である標準的な方法を用いて選択する。イムノグロブリンのポリクローナル集団は、当分野で公知である任意の方法によって、例えばファージ提示ライブラリーから得ることができる。ファージ提示ライブラリーを用いる場合、このようなファージ提示ライブラリーの特異性の数は、好ましくは、リンパ球によって１度に発現される異なる特異性の数に近い。より好ましくは、ファージ提示ライブラリーの特異性の数は、リンパ球によって１度に発現される異なる特異性の数よりも多い。最も好ましくは、ファージ提示ライブラリーは、リンパ球によって発現され得る異なる特異性の完全なセットを含む。ファージ提示ライブラリーを作製及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ， カタログ番号２７−９４００−０１；及びｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｕｒｆＺＡＰ （商品名） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ， カタログ番号２４０６１２）。更に、抗体提示ライブラリーの作製及びスクリーニングで使用するのに特に適した方法及び試薬の例は、例えば米国特許第５，２２３，４０９号及び第５，５１４，５４８号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／１８６１９号；国際特許出願公開第ＷＯ９１／１７２７１号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／２０７９１号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／１５６７９号；国際特許出願公開第ＷＯ９３／０１２８８号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／０１０４７号；国際特許出願公開第ＷＯ９２／０９６９０号；国際特許出願公開第ＷＯ９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓら， １９９１， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２； Ｈａｙら， １９９２， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄ． Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５； Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら， １９９３， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：７２５−７３４に記載されている。
【０１１６】
好適な実施形態において、真核生物発現ベクターのポリクローナル集団は、Ｄｅｎら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２２２：４５−５７に従って、ファージ提示ライブラリーから作製される。アフィニティークロマトグラフィーにより、ファージ提示ライブラリーをスクリーニングして、単数又は複数の目的の抗原分子に対する結合特異性を有するポリクローナルサブライブラリーを選択する（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ２４８：５５２； Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら， １９９１， Ｇｅｎｅ １０４：１４７；及びＨａｗｋｉｎｓら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２６：８８９）。次に、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸を頭と頭を合わせて連結し、二方向性ファージ提示ベクターのライブラリーを作製する。次に、二方向性ファージ提示ベクターをまとめて二方向性哺乳動物発現ベクターに移し（Ｓａｒａｎｔｏｐｏｕｌｏｓら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３４４）、これらのベクターでハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトする。
【０１１７】
他の好適な実施形態において、二重特異性分子のポリクローナル集団は、米国特許第６，０５７，０９８号（本明細書中に参考として全て組み込まれる）に記載されたように個々のメンバーのクローン単離（ｃｌｏｎａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を行わずに選択された提示抗体の全コレクションを用いる方法によって作製される。ポリクローナル抗体は、十分に多様な特異性レパートリーを有するファージ提示ライブラリーを、好ましくは複数の抗体を提示する提示ライブラリーメンバーを富化した後に、複数のエピトープを有する抗原分子を用いてアフィニティースクリーニングにかけることよって得られる。選択された提示抗体をコードする核酸を切り出し、適当なＰＣＲプライマーを用いて増幅する。全長核酸が単離されるように、核酸をゲル電気泳動によって精製することができる。次に、異なるインサートを有する発現ベクターの集団が得られるように、各核酸を、適当な発現ベクター中に挿入する。１つの実施形態において、次に、発現ベクターの集団を、抗ＣＲ１結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと共に、適当な宿主において共発現させる。他の実施形態において、発現ベクターの集団及び抗ＣＲ１結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを別々の宿主において発現させ、抗原結合ドメインと抗ＣＲ１結合ドメインとをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせて、二重特異性分子のポリクローナル集団を形成する。
【０１１８】
更に他の実施形態では、二重特異性抗体のポリクローナル集団を組換え手法により作製して、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）をコードする核酸のポリクローナル集団を、イムノグロブリン定常ドメイン配列をコードするヌクレオチドと融合させる。好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインと融合させる。また、ハイブリドーマ中でタンパク質が翻訳されている間に可変ドメインと重鎖との間にジスルフィド結合が形成されるように、遊離チオール基を有するアミノ酸残基を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい（Ａｒａｔｈｏｏｎら，国際特許出願公開第ＷＯ９８／５０４３１号を参照されたい）。
【０１１９】
これらのイムノグロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び所望によりイムノグロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ、を別々の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物中に共トランスフェクトする。これにより、３つのポリペプチド鎖の比率が不均等である場合に、これら３つの各ポリペプチドフラグメントの比率を調節する能力が備わることで、最適な収率が得られる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖を同じ比率で発現させると高い収率が得られる場合、又はこの比率が特に重要でない場合には、３つのポリペプチド鎖のうちの２つ又は全てのコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０１２０】
この手法の好適な実施形態において、ポリクローナル集団中の各二重特異性分子は、定常ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合された一方のアームが異なる第１結合特異性を有するハイブリッドイムノグロブリン重鎖であり、他方のアームがハイブリッドイムノグロブリン重鎖／軽鎖対（第２結合特異性を提供する）であるものとして構成される。この非対称的構造は、二重特異性分子の半分のみにイムノグロブリン軽鎖が存在することにより分離が容易になるので、望ましくないイムノグロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物を分離し易くすることが分かった。この手法は、国際特許出願公開第ＷＯ９４／０４６９０号（１９９４年３月３日公開）に開示されている。
【０１２１】
単一ポリペプチド二重特異性分子を含む二重特異性分子のポリクローナル集団は、組換え手法により作製することができる。選択された抗原認識領域のポリクローナル集団をコードする核酸のポリクローナル集団を、Ｃ３ｂ様レセプターに結合する抗原認識領域をコードする核酸と融合して、二重特異性分子の集団をコードする融合核酸の集団を得る。次に、この核酸集団を適当な宿主の中で発現させて、二重特異性分子のポリクローナル集団を作製する。好適な実施形態において、米国特許第６，０５７，０９８号に記載された方法に従って、選択された抗原認識領域のポリクローナルライブラリーをコードする核酸のポリクローナル集団を得る。
【０１２２】
更に他の好適な実施形態において、二重特異性分子のポリクローナル集団は、抗原のセット（例えば、ある病原体の変異体のセット及び／又は様々な病原体の混合物等があるが、これに限定されない）を用いたアフィニティースクリーニングにより得た、提示された抗体の集団から作製される。このような二重特異性分子のポリクローナル集団を用いて、抗原のセットをターゲッティング及び排除することができる。
【０１２３】
二重特異性分子のポリクローナル集団は、当分野で公知である任意の方法を用いて精製することができる。二重特異性分子のポリクローナル集団の含有量は、当分野で公知である標準的な方法を用いて決定することができる。
【０１２４】
ファージ提示ライブラリーから作製した二重特異性分子のポリクローナル集団について説明するが、当業者であれば、集団の作製で使用される複数の第２抗原認識部分は、適当な抗原認識部分（ｍｏｉｅｔｙ）の任意の集団から得ることができることが分かるであろう。このような抗原認識成分の集団から作製された二重特異性分子の集団は、本発明の範囲内に含まれるものとする。
【０１２５】
５．４．二重特異性分子のカクテル
様々な精製二重特異性分子を組み合わせて、二重特異性分子の「カクテル」とすることができる。本明細書中で用いられる「本発明の二重特異性分子のカクテル」とは、１つの抗原又は抗原の混合物をターゲッティングするための精製された二重特異性分子の混合物を指す。特に、二重特異性分子のカクテルとは、異なる若しくは同じ抗原分子を標的とする混合タイプの複数の第１抗原結合ドメインを有する精製された二重特異性分子の混合物を指す。例えば、第１抗原結合ドメインの混合物は、ペプチド、核酸、及び／又は有機小分子の混合物であってもよい。二重特異性分子のカクテルは、一般に、様々な精製二重特異性分子を混合することにより調製される。このような二重特異性分子カクテルは、とりわけ、個々の患者の必要に応じて処方されたテーラーメード薬剤として有用である。
【０１２６】
５．５．病原性抗原分子のターゲッティング
本発明は、病原性抗原分子の存在に関係する疾患若しくは障害を治療又は予防する方法を提供する。病原性抗原分子とは、治療対象となる被験者にとって有害である可能性がある又は望ましくない、循環系に存在するあらゆる物質であり、例えばタンパク質、薬物若しくは毒素、自己抗体若しくは自己抗原、又は任意の感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）の分子若しくはその産物が挙げられるが、これらに限定されない。病原性抗原分子は、疾患、障害若しくは他の望ましくない症状の原因となる物質（例えば病原体等）又はその一部である抗原決定基を含む任意の分子（又は結合ドメインが結合することができる分子）である。
【０１２７】
固定組織食細胞により排除される循環中の病原性抗原分子には、被験者にとって有害であるあらゆる抗原性成分が含まれる。有害な病原性抗原分子の例としては、寄生生物、真菌、原生動物、細菌又はウイルスに関係するあらゆる病原性抗原が挙げられる。更に、循環中の病原性抗原分子には、毒素、免疫複合体、自己抗体、薬物、過剰投与された（バルビツール酸塩等の）物質、又は循環中に存在する宿主哺乳動物の健康にとって望ましくない若しくは有害な物質も含まれる。免疫系が哺乳動物の循環系から病原性抗原分子を効率良く除去できなければ、外傷性及び循環血液量減少性ショックを引き起こす可能性がある（Ａｌｔｕｒａ及びＨｅｒｓｈｅｙ， １９６８， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２１５：１４１４−９）。
【０１２８】
その上、非病原性抗原（例えば移植抗原等）は、宿主にとって有害であると誤って知覚され、それらがまるで病原性抗原分子であるかのように、宿主の免疫系によって攻撃される。本発明は更に、免疫細胞又は移植の拒絶反応に関わる因子に結合しこれを除去するような二重特異性抗体（例えば移植抗原特異的抗体等）を有効量で被験者に投与することを含む、移植拒絶反応を治療するための実施形態も提供する。
【０１２９】
５．５．１　自己免疫抗原
１つの実施形態において、循環系から排除すべき病原性抗原分子としては、自己免疫抗原を含む。これらの抗原には、自己抗体または自己免疫疾患に関係する天然分子が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３０】
本発明の二重特異性抗体を用いて、霊長類の循環系から多くの異なる自己抗体を排除することができる。非限定的な例において、ＩｇＥ（イムノグロブリンＥ）抗体は、本発明の二重特異性抗体により循環系から排除される。より具体的には、二重特異性抗体は、ＩｇＥに特異的な１つの可変領域と、Ｃ３ｂ様レセプターに特異的な第２可変領域とを含む。この二重特異性抗体を用いて循環中のＩｇＥ抗体を減少させることにより、喘息等のアレルギー反応を低下又は抑制することができる。
【０１３１】
他の例において、ある種のヒト血友病患者は、第ＶＩＩＩ因子に欠陥があることが分かっている。組換えによる第ＶＩＩＩ因子の置換によって、この血友病を治療する。しかし、最終的には一部の患者は第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を発現させて、治療を妨げる。抗−抗−第ＶＩＩＩ因子抗体を用いて調製された本発明の二重特異性抗体は、この問題に対して治療的解決を提供する。特に、抗第ＶＩＩＩ因子自己抗体に対して特異的な第一可変領域とＣ３ｂ様レセプターに対して特異的な第２可変領域とを有する二重特異性抗体は、循環系から自己抗体を排除して疾患を改善するのに治療上有用である。
【０１３２】
本発明の二重特異性抗体により排除することができる自己抗体の他の例としては、以下の抗原に対する自己抗体が挙げられるが、これらに限定されない：筋肉アセチルコリンレセプター（重症筋無力症に関係する抗体）；カルジオリピン（狼瘡に関係する）；血小板結合タンパク質（特発性血小板減少性紫斑病に関係する）；シェーグレン症候群に関係する多重抗原；組織移植自己免疫反応の症例に関わる抗原；心筋上に見られる抗原（自己免疫心筋炎に関係する）；免疫複合体により媒介される腎臓病に関係する抗原；ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ抗原（ループス腎炎に関係する）；デスモグレイン及びデスモプラキン（ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎｓ）（天疱瘡及び類天疱瘡に関係する）；又は病理発生に関係する特性決定された他の抗原。
【０１３３】
上記二重特異性抗体をヒト若しくは非ヒト霊長類の循環中に注入すると、二重特異性抗体は、赤血球上のＣ３ｂ様レセプター部位の数に応じて高いパーセンテージで、ヒト若しくは霊長類Ｃ３ｂレセプターの可変ドメイン認識部位を介して赤血球に結合する。二重特異性抗体は、抗原（これはモノクローナル抗体に結合する）を介して間接的に自己抗体に同時に会合する。すると、その表面に二重特異性抗体／自己抗体複合体を有する赤血球は、結合した病原性自己抗体の循環系からの中和及び排除を促進する。
【０１３４】
本発明において、二重特異性抗体は、その表面にＣ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞に対する病原性抗原又は自己抗体の結合を促進し、その後、造血細胞を排除することなく、この病原性抗原または自己抗体を循環系から排除する。
【０１３５】
５．５．２　感染性疾患
特定の実施形態において、感染性疾患は、感染性疾患の感染因子の抗原及びＣ３ｂ様レセプターの両方に結合する二重特異性分子の投与によって治療又は予防される。従って、このような実施形態において、病原性抗原分子は、感染性疾患の感染因子の抗原である。
【０１３６】
このような抗原は、以下のものであってもよいが、これらに限定されない：インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ヘマグルチニンともいう）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０２１３２；Ａｉｒ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：７６３９−７６４３； Ｎｅｗｔｏｎら， １９８３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２８： ４９５−５０１）、ヒトＲＳウイルスＧ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｚ３３４２９；Ｇａｒｃｉａら， １９９４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．； Ｃｏｌｌｉｎｓら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：７６８３）、デング熱ウイルスのコアタンパク質、マトリックスタンパク質又は他のタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１９１９７；Ｈａｈｎら， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：１６７−１８０）、麻疹ウイルス赤血球凝集素（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ８１８９９；Ｒｏｔａら， １９９２， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：１３５−１４２）、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１４９２３；Ｂｚｉｋら， １９８６， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５：３２２−３３３）、ポリオウイルスＩ型ＶＰ１（Ｅｍｉｎｉら， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０４：６９９）、ＨＩＶ Ｉ型のエンベロープ糖タンパク質（Ｐｕｔｎｅｙら， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４： １３９２−１３９５）、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｉｔｏｈら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１９； Ｎｅｕｒａｔｈら， １９８６， Ｖａｃｃｉｎｅ ４：３４）、ジフテリア毒素（Ａｕｄｉｂｅｒｔら， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２８９：５４３）、連鎖球菌２４Ｍエピトープ（Ｂｅａｃｈｅｙ， １９８５， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １８５：１９３）、淋菌ピリン（Ｒｏｔｈｂａｒｄ及びＳｃｈｏｏｌｎｉｋ， １９８５， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １８５：２４７）、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク質、豚赤痢菌（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）防御抗原、ウシウイルス下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタｆｌｕ赤血球凝集素、ブタｆｌｕノイラミニダーゼ、口蹄病ウイルス、豚コレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（例えば感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅ又は糖タンパク質Ｇ）、又は感染性喉頭気管炎ウイルス（例えば感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇ又は糖タンパク質Ｉ）、ラクロス−ウイルスの糖タンパク質（Ｇｏｎｚａｌｅｓ−Ｓｃａｒａｎｏら， １９８２， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２０：４２）、新生子ウシ下痢ウイルス（Ｍａｔｓｕｎｏ及びＩｎｏｕｙｅ， １９８３， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１５５）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｍａｔｈｅｗｓ及びＲｏｅｈｒｉｇ， １９８２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２９： ２７６３）、プンタトロ（ｐｕｎｔａ ｔｏｒｏ）ウイルス（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅら， １９８１， Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｂｉｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｓ （編）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹ， ｐ．１６７）、ネズミ白血病ウイルス（Ｓｔｅｅｖｅｓら， １９７４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １４：１８７）、マウス乳腺癌ウイルス（Ｍａｓｓｅｙ及びＳｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ， １９８１， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１５：２０）、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質及び／又はＢ型肝炎ウイルスの表面抗原或いはこれらのフラグメント又は誘導体（例えば英国特許出願公開第ＧＢ２０３４３２３Ａ（１９８０年６月４日公開）；Ｇａｎｅｍ及びＶａｒｍｕｓ， １９８７， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：６５１−６９３； Ｔｉｏｌｌａｉｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４８９−４９５を参照されたい）、ウマインフルエンザウイルス又はウマヘルペスウイルスのもの（例えばウマＡ型インフルエンザウイルス／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマＡ型インフルエンザウイルス／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマＡ型インフルエンザウイルス／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、及びウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ等）、ウシＲＳウイルス若しくはウシパラインフルエンザウイルスの抗原（例えばウシＲＳウイルス付着性タンパク質（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＲＳＶ Ｇ））、ウシＲＳウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシＲＳウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ等）、ウシウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質４８又は糖タンパク質５３。
【０１３７】
本発明の二重特異性分子を用いて治療又は予防することができる他の疾患又は障害には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、あらゆるピコルナウイルス科、エンテロウイルス属、カリチウイルス科、ノーウォーク属のウイルス、トガウイルス科ウイルス（例えばデング熱ウイルス等）、アルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルクウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、オナガザルヘルペスウイルス１（Ｂウイルス）、及びポックスウイルスにより引き起こされるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の二重特異性分子を用いて治療又は予防することができる細菌性の疾患又は障害には、マイコバクテリア・リケッチア属、マイコプラスマ属、ナイセリア属に属する種（例えば髄膜炎菌や淋菌等）、レジオネラ属、コレラ菌、連鎖球菌（例えば肺炎球菌等）、コリネバクテリア属ジフテリア、破傷風菌、百日咳菌、ヘモフィルス属に属する種（例えばインフルエンザ等）、クラミジア属に属する種、腸毒性大腸菌及び炭疽菌（炭疽）等により引き起こされるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３９】
本発明の二重特異性分子を用いて治療又は予防することができる原生生物疾患又は障害には、プラズモディウム、アイメリア、リーシュマニア属及びトリパノソーマ等により引き起こされるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４０】
５．５．３　他の病原性抗原分子
１つの実施形態において、本発明の方法及び組成物によって循環系から排除すべき病原性抗原分子は、バルビツレート、三環系抗うつ薬、及びジギタリス等を含む（ただしこれらに限定されない）血清薬を包含する。
【０１４１】
他の実施形態において、排除対象となる病原性抗原分子には、過剰に存在して被験者に対する一時的若しくは永久的な障害又は害となり得る血清抗原が含まれる。この実施形態は特に薬物の過剰投与（ｏｖｅｒｄｏｓｅ）に関係する。
【０１４２】
他の実施形態において、循環系から排除する病原性抗原分子には、天然の物質が含まれる。本発明の方法及び組成物によって除去することができる天然の病原性抗原分子の例としては、低密度リポタンパク質、インターロイキン又は他の免疫調節化学物質及びホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
５．６．二重特異性抗体の用量
用量は、医師が常套実験を行うことによって決定することができる。ヒトに投与する前に、好ましくは動物モデルにおいて効力が証明される。当分野において公知である循環器系疾患の任意の動物モデルを使用することができる。
【０１４４】
より具体的には、二重特性抗体の用量は、造血細胞の濃度、及び抗Ｃ３ｂ様レセプターモノクローナル抗体が結合する造血細胞１つ当りのＣ３ｂ様レセプターエピトープ部位の数によって決定することができる。二重特異性抗体が過剰に投与される場合、二重特異性抗体の一部は造血細胞に結合せずに、病原性抗原が造血細胞に結合するのを阻害する。その理由は、遊離二重特異性抗体が溶液中にある場合、結合可能な病原性抗原に対して、造血細胞に結合した二重特性抗体と競合するからである。このように、投入した二重特異性抗体濃度の関数として結合を検証した場合に、二重特異性抗体が介在する造血細胞への病原性抗原の結合は、ベル形の曲線に沿う。
【０１４５】
ウイルス血症は、最高で１０８〜１０９ウイルス粒子／血液ｍｌ（ＨＩＶは１０６／ｍｌ；（Ｈｏ， １９９７， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９９：２５６５−２５６７））にもなる場合がある。治療用二重特異性抗体の用量は好ましくは最低で血液中の抗原数の約１０倍である。
【０１４６】
一般に、抗体の場合、好適な用量は、０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇ（一般には１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳内で機能する場合、通常は５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量が適当である。一般に、一部がヒト由来である抗体及び完全にヒト由来である抗体は、ヒトの体内において、他の抗体と比べて半減期が長い。従って、低用量かつ低頻度の投与が可能であることが多い。リピド化等の修飾を利用して、抗体を安定化し、吸収及び組織浸透（例えば脳内への浸透）を促進することができる。抗体のリピド化方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら（（１９９７） Ｊ． Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：１９３）により記載されている。
【０１４７】
本明細書において定義される二重特異性抗体の治療上有効な量（すなわち有効量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／体重ｋｇ、及び更に好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、又は５〜６ｍｇ／体重ｋｇである。
【０１４８】
当業者であれば、疾患又は障害の重篤度、過去の治療、被験者の健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患等を含む（ただしこれらに限定されない）一定の要因が、被験者の効果的治療に必要とされる用量に影響を及ぼし得ることが分かるであろう。さらに、治療上有効な量の二重特異性抗体を用いた被験者の治療は、単回治療であってもよいし、又は好ましくは連続治療であってもよい。好適な例において、約０．１〜２０ｍｇ／体重ｋｇの二重特異性抗体を用いて、週１回のペースで約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらに好ましくは約４、５若しくは６週間にわたり被験者を治療する。また、治療で使用される二重特異性抗体の有効量は、具体的な治療過程において増減させうることが理解されている。用量の変更は、本明細書中に記載される診断アッセイの結果から得られ、明らかとなる。
【０１４９】
二重特異性抗体剤の適当な用量は、通常の知識を有する医師、獣医若しくは研究者が理解する範囲内の様々な要因によって異なることを理解されたい。二重特異性抗体の用量は、例えば、治療対象となる被験者又はサンプルが何であるか、そのサイズ及び状態によって、更には組成物を投与する経路によって、また当てはまる場合であれば、現場の医師が、病原性抗原分子又は自己抗体に対して二重特異性抗体がどのような効果を及ぼすことを望んでいるかによっても異なる。
【０１５０】
また、二重特異性抗体の適当な用量は、排除しようとする抗原に対する二重特異性抗体の効力によって異なることを理解されたい。このような適当な用量は、本明細書中に記載されるアッセイを用いて決定することができる。抗原を排除するためにこれらの二重特異性抗体の１以上を動物（例えばヒト）に投与する場合、医師、獣医又は研究者は、例えばまずはじめに比較的低い用量を処方し、後に適度な反応が得られるまで用量を増加していくことができる。更に、ある特定の被験動物に対する具体的な用量レベルは、使用される二重特異性抗体の活性、被験者の年齢、体重、健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、排除率、薬物の組み合せ、並びに排除対象の抗原の濃度等を含む様々な要因によって異なることを理解されたい。
【０１５１】
５．７．　医薬製剤及び投与
本発明の二重特異性抗体は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は典型的には二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合した、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等のいずれか及び全てを含むものとする。医薬活性物質のためのこのような媒体及び作用物質の使用は当分野において周知である。あらゆる従来の媒体又は作用物質は、それが二重特性抗体に適合しないのでない限り、組成物中におけるその使用が想定される。また補助的な二重特異性抗体も、組成物の中に組み込むことができる。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。好適な投与経路は静脈内投与である。投与経路の他の例としては、非経口、皮内、皮下、経皮（局所）、及び経粘膜経路が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶剤又は懸濁剤は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコールやメチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌ ｐａｒａｂｅｎｓ）等の抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の等張性調節剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基を用いて調節することができる。非経口用調製物は、ガラス製若しくはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、又は複数回投与用バイアル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ ｖｉａｌｓ）の中に封入することができる。
【０１５３】
注射用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（ここでは水溶性）又は分散液、及び滅菌注射溶液若しくは分散液の即時調合剤用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌作用水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商品名）（ＢＡＳＦ； Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。あらゆる場合において、組成物は、無菌でなければならず、かつ粘度が低く二重特異性抗体を注入することが可能な程度の流体でなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１５４】
担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適当な混合物等を含む溶媒又は分散媒体としうる。例えば、レシチン等のコーティング剤を用いることにより、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、及び界面活性剤を用いることにより、適度な流動度を維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）により防ぐことができる。多くの場合、等張剤（例えば糖、マンニトールやソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウム等）を組成物中に配合することが好ましい。注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等）を組成物の中に配合することによって行うことができる。
【０１５５】
滅菌注射溶液は、先に列記した成分のうち１種又は複数種の組合せと一緒に、必要量の二重特異性抗体（例えば１以上の二重特異性抗体）を適当な溶媒中に配合した後、必要に応じて滅菌濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体及び上記成分のうち他の必要な成分を含む滅菌ビヒクルの中に二重特異性抗体を配合することによって、調製される。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥法であり、有効成分と、予め滅菌濾過しておいたその溶液から得た所望の他の成分とからなる粉末を生成する。
【０１５６】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、体内から化合物が急速に排除されるのを防ぐ担体（例えばインプラントやマイクロカプセル送達系等の制御放出製剤等）を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の調製法は当業者には自明である。また、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から市販されている材料を用いることもできる。また薬学的に許容される担体として、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを含む）を使用することもできる。これらは、当業者に公知である方法（例えば米国特許第４，５２２，８１１号（本明細書中に参考として全て組み込まれる）に記載された方法など）に従って調製することができる。
【０１５７】
投与を簡単にするため及び投薬量を均等にするために、非経口組成物を単位投与剤形として製剤化することが有利である。本明細書中で使用される単位投与剤形とは、治療すべき被験者の服用量単位として適した物理的に分離した単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の二重特異性抗体を含む。本発明の単位投与剤形の仕様は、その二重特異性抗体独自の特性及び達成したい具体的な治療効果、並びに個体を治療するための二重特異性抗体の合成技術に付随する制限事項によって直接左右される。
【０１５８】
医薬組成物は、投薬説明書と一緒にキット、容器、パック、又はディスペンサーの中に含めることができる。
【０１５９】
５．８．キット
また、本発明は、本発明の二重特異性分子、本発明のポリペプチド二重特異性分子をコードする１以上の核酸、又はこのような核酸で形質転換された細胞を、１以上の容器に含むキットも提供する。核酸は染色体の中に組み込まれるものであってもよいし、ベクター（例えばプラスミド、特にプラスミド発現ベクター）として存在するものであってもよい。また、本発明の医薬組成物を含むキットも提供される。
【０１６０】
５．９．二重特異性分子の生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）調製
他の実施形態においては、二重特異性抗体等の二重特性分子を、投与する前に、被験者の造血細胞に生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で予め結合させておく。例えば、治療しようとする個体から造血細胞を採取し（又は適合する血液型の非自己ドナーから造血細胞を採取し）、適当な用量の治療用二重特異性抗体と一緒に、その抗体を造血細胞表面上のＣ３ｂ様レセプターに結合させるのに十分な時間にわたりインキュベートする。次に、造血細胞／二重特異性抗体混合物を適当な用量で、治療対象の被験者に投与する（例えばＴａｙｌｏｒら，米国特許第５，４８７，８９０号を参照されたい）。
【０１６１】
造血細胞は好ましくは血球であり、最も好ましくは赤血球である。
【０１６２】
従って、特定の実施形態において、本発明は、造血細胞／二重特異性分子複合体を治療上有効な量で被験者に投与するステップを含む、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法を提供し、前記複合体は、Ｃ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞が１以上の二重特異性分子に結合したものとして本質的に構成され、前記二重特異性分子は、（ａ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｂ）造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターに結合する第１の結合ドメインを含み、かつ（ｃ）病原性抗原分子に結合する第２の結合ドメインを含むものである。或いは、この方法は、病原性抗原分子の存在と関連する望ましくない症状を示す哺乳動物の治療方法であって、（ａ）Ｃ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞と二重特異性分子とを接触させて造血細胞／二重特異性分子複合体を形成するステップと、（ｂ）治療上有効な量の造血細胞／二重特異性分子複合体を哺乳動物に投与するステップとを含み、前記二重特異性分子は、（ｉ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではなく、（ｉｉ）Ｃ３ｂ様レセプターに結合する第１の結合ドメインを含み、かつ（ｉｉｉ）病原性抗原分子に結合する第２の結合ドメインを含むものである、。
【０１６３】
また本発明は、造血細胞／二重特異性分子複合体の作製方法であって、二重特異性分子とＣ３ｂ様レセプターを発現する造血細胞とをそれらの結合を促進する条件下で接触させて、１つ以上の二重特異性分子と結合した造血細胞から本質的に構成される複合体を形成させるステップを含み、前記二重特異性分子は、（ａ）造血細胞上のＣ３ｂ様レセプターに結合する第１の結合ドメインを含み、（ｂ）病原性抗原分子に結合する第２の結合ドメインを含み、かつ（ｃ）ＣＲ１に対する第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体とが化学的に架橋されたものとして構成されるものではない。
【０１６４】
Ｔａｙｌｏｒら（米国特許第５，８７９，６７９号。以下「第６７９号特許」と称す）は、幾つかの事例において、血漿中の自己抗体（又は他の病原性抗原）の濃度が非常に高いために、二重特異性抗体を最適量で投入した場合でも、標準的な条件下では全ての自己抗体が造血細胞に結合することができるわけではないので、この系が飽和することを示した。例えば、非常に力価の高い自己抗体血清の場合、その高濃度ゆえに自己抗体の一部は造血細胞に結合しない。
【０１６５】
しかしこの飽和は、Ｃ３ｂ様レセプター上の異なる部位に結合するモノクローナル抗体を含む二重特異性抗体の組合せを用いて解決することができる。例えば、モノクローナル抗体７Ｇ９及び１Ｂ４は、霊長類Ｃ３ｂレセプター上の別々の競合しない部位に結合する。従って、各々がＣ３ｂ様レセプターに対する異なるモノクローナル抗体を用いて作製された２つの二重特異性抗体からなる混合物を含む「カクテル」は、赤血球への抗体の結合をはるかに増加させ得る。また本発明の二重特異性抗体は、静脈内注入で使用されるある特定の流体と組み合せて使用することもできる。
【０１６６】
更に他の実施形態において、少なくとも２つの異なる二重特異性抗体を含む「カクテル」を用いて、上記のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで二重特異性分子（二重特異性抗体等）を赤血球に予め結合させる。この実施形態において、これら２つの異なる二重特異性抗体は同じ抗原に結合するが、Ｃ３ｂ様レセプター上の異なる重複しない認識部位にも結合する。Ｃ３ｂ様レセプターに結合させる少なくとも２つの重複しない二重特異性抗体を用いることにより、１つの赤血球に結合することができる二重特異性抗体／抗原複合体の数が増加する。このように、２以上の二重特異性抗体を１つのＣ３ｂ様レセプターに結合させることにより、特に抗原が非常に高い濃度で存在する場合に、抗原排除が促進される（例えば第６７９号特許のカラム６、第４１〜６４行を参照されたい）。
【０１６７】
６．実施例
以下の実施例は、二重特異性抗体を産生する具体的なハイブリッド・ハイブリドーマの作製について記載する。関連分野において通常の知識を有する者であれば、ある抗原に対して特異的な抗体を分泌する任意のハイブリドーマを本発明において使用することができることが分かるであろう。更に、以下の実施例は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及び等電点電気泳動を行う抗体精製スキームを用いるが、関連分野において通常の知識を有する者であれば、本発明に従ってどのような精製スキームが適しているかが分かるであろう。
【０１６８】
アメリカ合衆国の人口の約２５％がアトピー性疾患を患っている。遺伝的及び環境的要因により、個体は、親和性の高いレセプターを介して循環中の好塩基球及び組織肥満細胞に結合するアレルゲン特異的ＩｇＥを合成するようになる。ＩｇＥがレセプターに結合すると、ヒスタミンや他のアレルギー反応媒介物質等の予め形成された作用物質の放出を誘導する。続いて起こるアレルギー反応は、気道の慢性炎症をもたらし、最終的には、他の症状の中でも特に鼻炎及び喘息を引き起こし得る。従って、ＩｇＥ濃度の制御またはＩｇＥの除去は、アレルギー性疾患を和らげる可能性のある方法を提供する（Ｓａｉｎｉら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６２：５６２４−５６３０）。
【０１６９】
６．１．　２つのハイブリドーマの融合
霊長類Ｃ３ｂ様レセプター及びＩｇＥの両方に対して特異性を有する抗体を分泌するハイブリッド・ハイブリドーマを得るために、２つのハイブリドーマを融合する。ハイブリドーマ７Ｇ９は、ヒトＣ３ｂレセプターに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を分泌する（第６７９号特許を参照されたい）。ハイブリドーマＭＡＥ１１は、ＩｇＥに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を分泌する（Ｊａｒｄｉｅｕ及びＦｉｃｋ， １９９９， Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．， １１８：１１２−１１５）。これら２つのハイブリドーマ細胞系を通常の培地中で増殖させた後、融合する。
【０１７０】
２つの７Ｇ９及びＭＡＥ１１ハイブリドーマを対数増殖期になるまでダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた後に、融合を行う。融合するため、５０ｍｌのＤＭＥＭに入れた同数のこれらの細胞（すなわち５×１０７細胞）を、１ｍｌの４５％ポリエチレングリコール及び１０％ジメチルスルホキシドと混合する。所定時間が経過した後、細胞を低速にて遠心分離し、ＤＭＥＭを含まない融合試薬中に再び懸濁する。同じ日に、４倍希釈の軟アガロース上で、アリコートをクローニングする。１０％ＤＭＥＭを入れた２４ウェルプレート上で、約１００個のクローンを増殖させる。上清を抗体産生についてアッセイし、最も良い抗体産生細胞を再びクローニングし、通常の組織培養手法を用いて増殖させる。
【０１７１】
抗体産生についてアッセイするには、ニトロセルロースの１ｃｍ×１ｃｍシート（以下「スクエア」）上に、その抗原（最初のケースではＣ３ｂレセプター）約１００μｇをスポッティングする必要がある。スクエアを約５分間乾燥し、５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で少なくとも１０分間ブロッキングする。約２〜５μｌのハイブリドーマ分泌物をスクエア上にスポッティングする。２〜５分後、スクエアをＰＢＳで洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体（１〜５０００倍希釈、２〜５μｌ）と一緒にインキュベートする。２〜５分後、スクエアをＰＢＳで３回（各回につき少なくとも５分間）洗浄し、（０．０３％ Ｈ２Ｏ２ １ｍｌあたり）０．４ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを用いて発色させる。
【０１７２】
呈色反応は、抗原への結合を示し、またクローニングされたハイブリドーマが抗Ｃ３ｂレセプター抗体の分泌について陽性であることを示す。次に、ＩｇＥを試験抗原として同じプロトコールを用い、陽性クローンを、抗ＩｇＥ抗体の発現について試験する。両方の抗原に対して同時に陽性であるハイブリドーマを液体培地中で増殖させ、ストックを冷凍する。
【０１７３】
６．２．二重特異性抗体の精製
以下のプロトコールは、腹水から二重特異性抗体を精製するための方法について説明するが、これは、組織培養上清を用いることもできる。イオン交換クロマトグラフィー（Ｓｕｒｅｓｈ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０）を用いて、二重特異性抗体を、分泌された非特異性抗体及び分泌されたタンパク質から精製する。
【０１７４】
ベックマンのマイクロゾーン電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ ｍｉｃｒｏｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて０．０４Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ８．６）中で酢酸セルロース電気泳動により腹水又は濃縮培養上清の分析を行うと、典型的には３つの顕著なイムノグロブリンバンドが得られる。真中のバンドは二重特異性抗体であり、他の２つのバンドは親抗体を表す。
【０１７５】
まず腹水を採取し、遠心分離により澄明化して、細胞及び他の粒状物質を除去する。生理食塩水で腹水を１：１に希釈する。同体積の飽和硫酸アンモニウムを、１時間かけてかき混ぜながら５０％塩飽和状態になるまで徐々に加える。沈殿物を最少量のＰＢＳ中に溶解し、１００倍量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）と２度取り替えて徹底的に透析する。
【０１７６】
次に、透析した粗抗体をＤＥＡＥカラムで分画し、比較的純粋な二重特異性抗体を得る。８〜１０ｍｌの腹水又は２リットルの血清を含まない上清を処理するために、寸法２×９ｃｍのＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ， 微粒子形状）カラムを用意する。５０ベッド体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄してカラムを平衡化する。粗抗体を入れ、画分を回収する。流出液の吸光度をＵＶモニターで連続的に記録し、１ベッド体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄する。
【０１７７】
最後に、１０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の一次勾配にカラムを接続して抗体を溶出する。理論上は、３つのピークが得られ、真中のピークが二重特異性抗体である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により画分の純度を分析する。上記第６．１節に記載したように、抗原結合活性を試験する。
【０１７８】
本発明の範囲は、本明細書中に記載した具体的な実施形態によって限定されるものではない。実際に、これまでの説明及び添付の図面を参照すれば、本明細書中に記載したもの以外にも本発明の様々な変更が当業者には自明となろう。このような変更は、特許請求の範囲の中に含まれるものとする。
【０１７９】
これまでに様々な参考文献（特許出願、特許及び特許公開公報を含む）が引用されたが、これらは本明細書中に参考として全て組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、二重特異性抗体の作製を表す。パネルＡは、別々のハイブリドーマにより産生された２つの別々のモノクローナル抗体を表す。ｍＡｂ１はｃ３ｂレセプターに結合し、ｍＡｂ２はＡｇ２に結合する。パネルＢは、モノクローナル抗体を細胞外で化学的に架橋してヘテロポリマーを作製する伝統的な方法を表す。波線は細胞外化学架橋物質を表す。パネルＣは、本発明の二重特異性分子、つまりパネルＡに示した抗体を産生するハイブリドーマの融合によって作製された二重特異性イムノグロブリンを表す。抗体の左側のアームがｃ３ｂレセプターに結合し、右側のアームがＡｇ２に結合するものとして描かれている。
【図２】図２は、イムノグロブリン分子のドメイン及びパパイン若しくはペプシンを用いたプロテアーゼ消化時のイムノグロブリン中の切断部位を図形で表す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体を分泌する２つの異なるハイブリドーマを融合して形成されたイムノグロブリン抗体の１０通りの可能な組合せを表す。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、本発明の二重特異性分子の実施形態を示す。左から右（図４Ｃ及び図４Ｄでは上から下）に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端の順で示す。パネルＡは、イムノグロブリン重鎖のＣＨ２／ＣＨ３部分のアミノ末端に融合された第１結合ドメイン（ＢＤ１）、及びそのカルボキシ末端に融合された第２結合ドメイン（ＢＤ２）から本質的に構成される単一のポリペプチドである二重特異性分子を表す。パネルＢは、抗体のＦｃドメイン（ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）のアミノ末端に融合されたＢＤ１から本質的に構成される第１のポリペプチドと、Ｆｃドメインのカルボキシ末端に融合されたＢＤ２ドメインから本質的に構成される第２のポリペプチドと、から構成される二量体を示す。パネルＣは、パネルＢの二量体のポリペプチドの一方又は両方の具体的な実施形態における構造を表す。パネルＣは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）がリンカー分子を介してＶＨドメインのアミノ末端に融合されており、その後にＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが続くものとして本質的に構成されているポリペプチドを表す。パネルＤは、パネルＢの二量体のポリペプチドの一方又は両方の具体的な実施形態における構造を表す。パネルＤは、ＣＨ１ドメインのアミノ末端に融合されたｓｃＦｖ、その後にヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを表す。パネルＥは、２つの別々の抗原に対して特異性を有する２つの別々のｓｃＦｖを含むポリペプチドを表し、このポリペプチドは、ＣＨ２ドメインに融合された第１ｓｃＦｖドメイン、その後にＣＨ３ドメイン及び第２ｓｃＦｖドメインから本質的に構成されている。「α」は、「・・と結合する」ということを示す。パネルＦは、２つの別々の抗原に対して特異性を有する２つの可変領域を含むポリペプチドを表し、このポリペプチドは、軽鎖可変部分に融合された第１重鎖可変部分、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、重鎖可変部分及び軽鎖可変部分から本質的に構成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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