(57)【要約】本発明は、ポリマーに基づく製剤などの粒子状懸濁液を投与するのに適する注射媒体を、付属の医薬製剤、製造品及びキットとともに提供する。本発明の他の側面には、医薬製剤を製造し投与するための方法が含まれる。本発明の注射媒体は、注射性能を改善する偽塑性組成物を含むという点において、従来の注射媒体よりも優れており、所望の投与量の供給を促進する。また、本発明の注射媒体は、 通常ポリマーに基づく製剤を注射するのに必要な針よりも、より小さな孔の注射針の使用を可能ならしめ、そのような製剤の注射に伴う痛みを軽減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸又はその誘導体を約０．０１から約０．８パーセントの容量濃度で含む注射媒体。
【請求項２】
ヒアルロン酸を含んでなる請求項１に記載の注射媒体。
【請求項３】
ヒアルロン酸又はその誘導体が生理食塩中に溶解されている請求項１に記載の注射媒体。
【請求項４】
（ａ）粒状形態の、又は粒子上にコートされ、粒子内部に分散され、又は粒子に付着された有効量の生物学的活性薬剤と；
（ｂ）ヒアルロン酸又はその誘導体を含む注射媒体とを含む医薬製剤。
【請求項５】
生物学的活性薬剤が、生体適合性重合マトリックスを含む粒子内に分散された請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
ヒアルロン酸を含んでなる請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸濃度が約０．０１から約０．８パーセント（ｗ／ｖ）の間である請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸が生理食塩水に溶解されている請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項９】
重合マトリックスが、生物分解性ポリマー、非−生物分解性ポリマー、生物分解性ポリマーと非−生物分解性ポリマーの混合物、及び生物分解性及び非−生物分解性単位を含む共重合体からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
重合マトリックスがブロック化ポリマー、非ブロック化ポリマー及びその混合物からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項６の医薬製剤。
【請求項１１】
重合マトリックスが、ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−グリコリド共重合）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−グリコール酸共重合）；重合無水物；ポリオルトエステル；ポリエーテルエステル；ポリカプロラクトン；ポリエステルアミド；ポリエチレングリコール及びラクチド又はグリコリドのブロック共重合体；及びこれらの混合物又は共重合体からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
ポリマーがポリ（ラクチド−グリコリド共重合）ポリマーである請求項１１に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
生物学的活性薬剤がポリペプチドである請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
ポリペプチドが成長ホルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、抗−血管内皮成長因子Ｆａｂ（抗−ＶＥＧＦ Ｆａｂ）、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）、神経成長因子、及びインシュリン様成長因子からなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
生物学的活性薬剤を含む重合マトリックス濃度が製剤の少なくとも約１ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬの間である請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
生物学的活性薬剤を含む重合マトリックス濃度が製剤の少なくとも約１ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬの間である請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
（ａ）ポリ（ラクチド−グリコリド共重合）ポリマーを含む生体適合性重合マトリックスを包含する粒子と；
（ｂ）重合マトリックス内に分散された有効量の生物学的活性ポリペプチドと；
（ｃ）ヒアルロン酸又はその誘導体を含む注射媒体とを含有する医薬製剤。
【請求項１８】
粒状形態の、又は粒子上にコートされ、粒子内部に分散され、又は粒子に付着された有効量の生物学的活性薬剤を、ヒアルロン酸又はその誘導体を含む注射媒体に添加することを含んでなる医薬製剤を製造する方法。
【請求項１９】
注射媒体がヒアルロン酸を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
２３−ゲージ又はそれより小さい注射針を通して医薬製剤を注射することを含む、請求項１７の医薬製剤を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、例えばポリマーに基づく製剤の粒子状懸濁液のための注射媒体、関連医薬製剤及び方法に関する。特に、本発明は、注射媒体、医薬製剤、及び粒子状懸濁液を注射するためにより小さな内径の針の使用を可能ならしめる方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
治療薬のための徐放性供給システムは、近年、かなりの注目を集めてきた。その例として、放出調節注射及び経口製剤、経皮貼布、及び移植可能な貯蔵製剤が含まれる。このようなシステムは、治療用タンパク質を供給する手段として特に興味深いものである。
治療用タンパク質製剤を製造する場合、物理的、化学的及びタンパク質の生物学的性質を保つことが重要である。より低分子量の薬剤と異なり、典型的に、タンパク質はより大きな球状構造を有し生物学的活性にとって重要な、二次構造、三次構造、場合によっては四次構造的特徴を包含する。さらに、タンパク質は、酸化（メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脱アミド化（アルギニン、グルタミン）又はジスルフィド還元もしくは交換（システイン）を受けやすい側鎖上に不安定な結合及び化学的反応基を有する。生物学的活性を保つことに加え、タンパク質の免疫原性を増加させるタンパク質変性を減少させ、取り除くことが特に重要である。望ましくない免疫反応は、身体の安全関連事象を誘導し、中和抗体反応は続いて行われる処置の有効性を制限しうる。従って、生物学的環境において長期間わたり治療用タンパク質を安定化する必要性が、徐放性タンパク質供給システムの発達にとって障害となっていた。
【０００３】
薬剤を安定化する一つの方法は、生物分解可能な重合体の微小粒子中にそれらを包埋させることである（Ｍａｕｌｄｉｎｇ（１９８７）， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６：１６７−１７６；Ｓｍｉｔｈ等、（１９９０）， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：３４３−３５７；Ｈｏｌｌａｎｄ等、（１９８６）， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ４：１５５−１８０；Ｌｅｗｉｓ等、（１９９０）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ｐｐ． １−４１， Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。乳酸及びグリコール酸のホモ重合体及び共重合体（ＰＬＧＡポリマー）から作られた微小粒子を用いた研究により、これらのポリマーが酸単体に加水分解し（Ｍａｕｌｄｉｎｇ（１９８７）， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６：１６７−１７６；Ｓｍｉｔｈ等、（１９９０）， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：３４３−３５７；Ｃｏｗｅｒ等、（１９８５）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１２：１０１−１１６）、微小粒子を調製するために用いられた条件下では化学的に不活性であることが示された。このようなポリマーは、特定の処理に応じた薬剤放出速度の調整を可能にする分子量及びモノマー比の範囲において製造することができる。ＰＬＧＡポリマーは、非免疫原性及び無毒性である。これらの特徴により、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストであるリュプロリド（ｌｕｐｒｏｌｉｄｅ）の貯留製剤についての使用に対してＰＬＧＡポリマーの選択に至った（Ｓａｎｄｅｒｓ等、（１９８６）， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ７５：３５６−３６０；Ｏｇａｗａ等、（１９８８）， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ５：１０９５−１１０３；Ｏｇａｗａ等、（１９８８）， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３６：２５７６−２５８１）。Ｊｏｈｎｓｏｎ等、（１９９７）（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：７３０−７３５）は、組換体ヒト成長ホルモンを亜鉛−タンパク質複合体を形成させることにより安定化させ、その複合体を固体状態でＰＬＧＡ微小粒子中にカプセル化させた（ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５５１１、国際公開第ＷＯ９５／２９６６４号も参照のこと）。
【０００４】
タンパク質を安定化することに対して利点を有していたにも拘わらず、ポリマーに基づく薬物製剤の投与には問題がある。例えば、容易に懸濁し注射し得る製剤の量により、投与量が制限される。粒子を含む製剤中で、凝集体又は膨張体が注射針に目詰まりし、意図する投与量を投与することを困難にしている。凝集作用を減少させるために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デキストラン、又はソルビトールのような賦形剤が、注射媒体中に含められた。また、界面活性剤及び塩が粒子状流動性を変えるために添加された。ＣＭＣ、ツイーンＴＭ、及びリン酸塩緩衝液が、リュプロン貯留製剤を供給するための媒体中に使用された。しかし、この製剤の投与量は、比較的少量である：微小粒子あたり３０−６０ ｍｇである。通常、２１−又は２３−ゲージの注射針を通して、微小粒子当たり２００ ｍｇ／ｍＬ以上の投与量を注射することは困難である。１ ｍＬの最大皮下投与量を想定すると、最大微小粒子投与量は２００ ｍｇとなる。このように大内径の注射針の使用は、注射の痛みを増大させるが、より小さな内径の注射針の使用は一回の注射で供給し得る投与量をさらに制限する。
【０００５】
通常、粒子状懸濁液及び／又はポリマーに基づく薬物製剤の注射性能を促進する注射媒体は、薬物の高投与量の供給を可能にし、及び／又はより小さな内径の注射針の使用を可能ならしめる。このような利点により、より広範にわたる治療適用に対して、ポリマーに基づく製剤の可能性を増加することになるであろう。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、注射により粒子状懸濁液を投与することにおいて使用に適した液体を含む。当該注射媒体には、食塩水のような生理的なバッファーに溶解されたヒアルロン酸又はその誘導体のような可動性に富む分子が含まれる。本発明の注射媒体は、通常の注射媒体を用いる場合に可能である内径より小さい内径の針を使用し、ポリマーに基づく製剤などの粒子状懸濁液のより高投与量の注射を可能にする。
また、本発明は、当該発明の注射媒体中に生物学的活性薬剤の有効量を含む医薬製剤を提供する。生物学的活性薬剤は、注射媒体中において、粒子状の形態で、粒子上にコートされ、粒子内に分散され、又は粒子に付着した形態をとり得る。このような製剤は、予防的、治療的、又は診断的な処置に対する生物学的活性薬剤を投与するために用いられ得る。
【０００７】
好まし実施態様において、生物学的活性薬剤はポリペプチドの持続放出を提供する粒子内に分散されたポリペプチドである。好ましくは、粒子は、ポリ（ラクチド−グリコリド共重合）基質などの生体適合性ポリマー基質から構成される。好ましい製剤には、生物学的活性薬剤として、例えば、成長ホルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ，グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）、神経成長因子、又はインシュリン様成長因子が含まれる。
また、本発明は、ここで記述される医薬製剤を製造し投与する方法を含む。好ましい実施態様において、本発明による医薬製剤が２３−ゲージ又はより小さな内径の注射針を通した注射により投与される。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
定義
明細書及び特許請求の範囲において用いられる用語は、他に明記されない限り下記に示すように定義される。
「注射媒体」という用語は、注射（例えば、皮下、筋肉、静脈など）により薬剤を投与するのに使用するために適する液体を意味する。
「偽塑性組成物」という用語は、剪断速度の増加に伴い減少する粘性を有する組成物を意味する。剪断とは、あるプレートが他のプレートに相対してプレート間の溶液と共に動かされる場合に生じる摩擦を意味する。剪断速度とは、プレートが動かされる速度のことである。また、剪断は、粘性物質が注射針を通って流動するときに生じ、従って、偽塑性は、このような物質が注射され得る容易性に影響を与える。
【０００９】
「ヒアルロン酸」は、交互性のあるβ（１−３）グルクロニド及びβ（１−４）グルコサミド結合を持つ大きな分岐ムコ多糖類分子である。ここで用いられるように、「ヒアルロン酸」という用語は、脊椎動物の結合組織の細胞外マトリックス中に見い出される天然に生じる分子と同じ構造を有する形態を意味する。
広範にわたるヒアルロン酸の化学修飾が可能である。「ヒアルロン酸誘導体」という用語は、ヒアルロン酸「背骨」（即ち、交換性のグルクロニド及びグルコサミド結合のこと）及び天然に生じるヒアルロン酸中には存在しない一又は複数の化学基を有する分子のことを意味する。議論を簡略にするため、ヒアルロン酸及びその多様な誘導体は、「ヒアルロン酸」と総称される。ヒアルロン酸の例には、エステル、アミド及びラクチドの誘導体が含まれる。ヒアルロン酸に特異的なアシル誘導体の形成は、米国特許第５，５２７，８９３号中に記載されている。さらに、水溶性ヒアルロン酸誘導体は、米国特許第５，０１７，２２９号及び４，９３７，２７０号に記載されている。ヒアルロン酸は、ポリエチレングリコールに結合され、このような「ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）」形態も、この用語をここで用いるときには、「ヒアルロン酸」である。エステル又は塩の形態のヒアルロン酸、「ヒアルロン酸塩」と称されるが、本発明おいて都合に合わせて用いられる。
【００１０】
ヒアルロン酸の分子量は変動し、従って、ヒアルロン酸の分子量に対するここでの言及は、平均分子量を意味する。
「パーセント　バイ　ボリューム」又は「％（ｖ／ｖ）」で表現される濃度とは、組成物の総容量で構成成分の容量を除することにより計算される値である。
「パーセント　バイ　ウェイト」又は「％（ｗ／ｗ）」で表現される濃度とは、組成物の総重量で構成成分の重量を除することにより計算される値である。
「パーセント　ウェイト　パー　ボリューム」又は「％（ｗ／ｖ）」で表現される濃度とは、重量（例えば、グラム）を容量（例えば、リットル）で除することにより計算される値である。
「粘性」とは、流れに対する溶液の抵抗力の目安であり、典型的にはセンチストーク（ｃＳｔ又はｃｓ）の単位である。
「生理食塩水」とは、０．９ ％（重量／容量）の水中の塩化ナトリウムとして定義される。
「ポリマーに基づく製剤」とは、生物学的に活性のある薬剤が重合マトリックス中に分散されている製剤として定義される。
「重合マトリックス」とは、一又は複数の他の物質及び／又は全体に分散された空間を持つ不連続な重合体構造を意味する。
「生体適合性」とは、毒性又は免疫原性のような重大かつ有害な影響を及ぼすことなく、ここで論じられる量でヒト生体内に導入され得る物質を意味する。また、この用語は、その物質がインヴィボで分解される場合、インヴィボでの分解産物が重大かつ有害な影響を引き起こさない物質も示す。
「生物分解性」とは、より小さな単位を形成するために、インヴィボにおいて分解又は腐食する組成物を意味する。分解は、酵素学的、化学的及び物理的なプロセスを含むインヴィボで生じる何れかの過程より生じ得る。
【００１１】
「ブロック化ポリマー」は、ブロックされたカルボキシル末端基を有する。通常、ブロック化基は重合開始因子に由来し、典型的にはアルキルラジカルである。「非ブロック化ポリマー」は、フリーのカルボキシル末端基を有する。
「微小粒子」とは、最大約１ｍｍの以下の寸法（即ち、長さ又は直径）を持つ粒子を意味するのに用いられる。実質的に球状及び／又は楕円体である微小粒子は「微粒子」と名付ける。
「生物学的活性薬剤」とは、インヴィボでの活性であって、典型的には治療的、予防的、及び／又は診断上の利用を与える活性を有する薬剤として定義される。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」はここでは相互に変更し得るものとして用いられる。
「有効量」という用語は、インヴィボで活性のある活性薬剤の生物学的量を意味する。
「無菌的処理工程」という用語は、工程や製品に使用される個々の構成成分の滅菌に関連する滅菌工程を意味し、その後、無菌的な条件下においてカード記入される活性を処理し包装する。多くの通常の方法は、無菌的過程において使用され、製品、その容器、及び閉止法の物理的特徴に依存する。実施例には、ろ過滅菌（液体）、乾熱滅菌（ガラス製品）、高圧滅菌（ラバー製品）、及び放射線及び／又はエチレンオキシド（プラスチック製品）処理を含む。
「最終滅菌」という用語は、予備滅菌されるか又はされていない薬物が、容器に充填され密封され、その後最終滅菌にかけられる過程を意味する。多くの技術が末端滅菌において使用可能であり、例えば、放射線及びオートクレーブが使用可能である。
【００１２】
注射媒体
本発明は、偽塑性組成物を含む注射媒体を提供する。偽塑性組成物は、通常の注射媒体と比較して改善された注射可能性を提供し、例えば、ポリマーに基づく組成物のような粒子の懸濁液を注射するのに特に有用である。本発明に従う偽塑性組成物は、通常、剪断力に曝した場合に楕円体高次構造へ変形する可動性分子の溶液であり、剪断速度の増加とともに流動方向に整列される傾向にある。本発明において使用するのに適した可動性分子は典型的には大きな分岐した重合分子である。例示的な可動性分子には、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体及びそれらの組合せが含まれる。ヒアルロン酸が好ましく、ヒアルロン酸ナトリウムの形態で都合よく用いられる。
【００１３】
偽塑性組成物の選択に影響を及ぼすことにおいて考慮すべき事には、粘性、分子量及びｐＨが含まれる。通常、本発明の使用に適した偽塑性組成物は、十分粘性があるため、注射の間、ポリマーに基づく製剤のポリマー成分を注射媒体中に懸濁させた状態にできる。動力学的粘度は、２５℃、１／秒の剪断速度において約１，０００から約５００，０００センチストーク（ｃＳｔ）の範囲であり得、好ましくは、約１，０００から約１００，０００ｃＳｔの範囲、及びより好ましくは、約２，０００から約６５，０００ｃＳｔの範囲であり得る。
可動性分子を含む溶液の粘性は、温度及び用いられ溶媒のみならず分子量及び分子濃度の複合機能である。特に、粘性は分子量及び濃度が増大するにつれて増加する。本発明の偽塑性組成物への使用に適する可動性分子は、通常、約０．５ ｘ １０５から約５ ｘ １０６ダルトンの範囲に平均分子量を持つが、より高い平均分子量又はより低い平均分子量の分子を用いることが可能である。本発明において有用なヒアルロン酸に対するより好ましい平均分子量は、約２ ｘ １０５と約５ ｘ １０６ダルトンの間である。
【００１４】
可動性分子の濃度は、通常、約０．０１から約１０．０％（ｗ／ｖ）の間であるが、当業者は、平均分子量が増加するにつれて、特定の粘性を達成するのに必要な濃度は減少することを理解することができる。上述の好ましいサイズのヒアルロン酸は、約０．０１％から約３％（ｗ／ｖ）の濃度で都合よく用いられ、好ましくは約０．１％から約１％（ｗ／ｖ）の間であり、より好ましくは、０．８％（ｗ／ｖ）以下である。
偽塑性組成物のｐＨは、通常、おおよそ７．０の生理的基準に近い値である。好ましくは、偽塑性組成物は約５．０から７．８の範囲のｐＨである。
偽塑性組成物は、上述したような可動性分子を溶解させることが可能ないずれかの溶媒を含み、調製された溶液は本発明に適した粘性及びｐＨを持つ。当業者は、特定の可動性分子に適した溶媒を容易に選択できる。水性溶媒が好ましく、その例として、生理的緩衝液（生理的リン酸緩衝液などの）及び生理食塩水が含まれる。
【００１５】
通常、本発明の偽塑性組成物は、受容者において有害な反応を引き起こすエンドトキシン、エクソトキシン、真菌、沈殿物のようなものを実質的に含まない。組成物の滅菌は、組成物に適する通常の滅菌技術のいずれかを使用して、アセティック処理過程（ａｃｅｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）又は最終滅菌により達成され得る。当業者は、任意の組成物に適する滅菌技術を容易に同定することができる。
【００１６】
医薬製剤
当該発明の医薬製剤は、本発明の注射媒体、粒子、及び生物学的活性薬剤の注射媒体を含む。粒子及び生物学的活性薬剤は、単一の構成成分（即ち、生物学的活性薬剤が粒子状形態であってよい）であってもよく、又は２つの異なる構成成分であってもよい。後者の例には、生物学的活性薬剤が粒子上にコートされ、粒子内に分散される実施態様が含まれる。好ましい実施態様では、分散された生物学的活性薬剤を有する重合性マトリックスから調製される微小粒子を用いる。微粒子／生物学的活性薬剤構成成分の濃度は、注射され得る構成成分の所望の投与量及び最大量に依存する。例えば、分散された生物学的活性薬剤を含む重合性の微小粒子は、通常約１ ｍｇ／ｍＬと約５００ ｍｇ／ｍＬの間の濃度、より好ましくは約５０ ｍｇ／ｍＬと１５０ ｍｇ／ｍＬの間の濃度が用いられる。
【００１７】
ポリマーに基づく製剤において、重合性マトリックスを形成するポリマーは、生物分解性又は非生物分解性、生物分解性及び非生物分解性ポリマーの混合物、又は生物分解性及び非生物分解性単位を含む共重合体である生体適合性ポリマーである。適当な生体適合性、生物分解性ポリマーには、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−グリコリド共重合）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合）、重合無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリエチレングリコール及びラクチド又はグリコリドのブロック共重合体、及びこれらの混合物及び共重合体が含まれる。
本発明の医薬品組成物に適する生体適合性、非生体適合性ポリマーには、例えば、非生体適合性ポリアクリル酸、エチレン−ビニル酢酸のポリマー及び他のセルロースアセテートのアシル置換体、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、フッ化ポリビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン酸ポリオレフィン、ポリエチレン酸化物、及びこれらの混合物及び共重合体が含まれる。
ポリマーは、ブロック化、非ブロック化、又はブロック化と非ブロック化されたポリマーの混合物であり得る。
【００１８】
本発明において用いられるポリマーに適する分子量は、所望のポリマー分解速度などの要因と、機械的強度のような物理的性質を考慮にいれ、当業者により決定され得る。典型的には、ポリマーの分子量は、約２，０００ダルトンから約２，０００，０００ダルトンの範囲である。
好ましい実施態様において、ポリマーは生物分解性ポリマー又は共重合体である。より好ましい実施態様において、ポリマーは、ラクチド：グリコリドの割合が約１：１であり、約５，０００ダルトンから約７０，０００ダルトンの分子量を持つ、ポリ（ラクチド−グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）である。さらにより好ましい実施態様において、本発明において使用されるＰＬＧＡは、約５，０００ダルトンから約４２，０００ダルトンの分子量を持つ。
本発明での使用に適する治療的及び／又は予防的な生物学的活性薬剤の例には、ホルモン、抗原、成長因子などのポリペプチド；発現されるＤＮＡ又はＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド；及び抗体、ステロイド、消炎剤、神経活性化剤、麻酔薬、鎮静薬などが含まれる。診断及び／又は治療用生物学的活性薬剤の例には、放射活性同位体及び放射線不透過性薬が含まれる。
【００１９】
本発明による医薬製剤において用いられ得る特異的ポリペプチドの例には、例えば、腫瘍壊死因子α及びβ、それらのレセプター（ＴＮＦＲ−１；Ｇｒａｙ等（１９９０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：７３８０−７３８４；及びＴＮＦＲ−２；Ｋｏｈｎｏ等（１９９０），　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８３３１−８３３５）、及びその誘導体；レニン；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；組織型プラスミノーゲン活性化因子及びウロキナーゼなどのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ；発現及び分泌された正常Ｔ細胞の活性化において制御される）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなど血清アルブミン；ミュラー阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；抗ＶＥＧＦＦａｂ、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）；ホルモン又は成長因子；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ様因子；骨由来神経栄養因子などの神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）；ニュートロフィン−３，−４，−５，又は−６（ＮＴ−３，ＮＴ−４，ＮＴ−５，又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの繊維芽細胞成長因子；上皮成長因子−（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及び、ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，ＴＧＦ−β３，ＴＧＦ−β４，又はＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３，ＣＤ−４，ＣＤ−８，及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γなどのインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、などのコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；ＩＬ−１からＩＬ１０などのインターロイキン（ＩＬｓ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；膜表面タンパク質；腐敗促進因子；ＨＩＶ−１外被糖タンパク質、ｇｐ１２０，ｇｐ−１６０又はそれらの断片などのウィルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシ���；制御タンパク質；抗体及びＦａｂ断片などその一部分；及びイムノアドヘシンなどキメラタンパク質；など、サイトカイン及びそれらのレセプターの他サイトカイン又はそれらのレセプターのキメラタンパク質が含まれる。
【００２０】
また、本発明による医薬製剤は、一以上の生物学的活性薬剤例えば２つの異なるポリペプチドを含む。
先に述べたように、生物学的活性薬剤は、粒子の形態で用いられる。このような粒子には、例えば、クリスタリン粒子、非−クリスタリン粒子、フリーズドライ粒子、凍結乾燥粒子、及びこれらの組合せが含まれる。粒子には、唯一生物学的活性薬剤のみを含むか、又は安定化剤及び／又は他の賦形剤を含んでもよい。粒子は、医薬製剤中に分散され、又は好ましい実施態様においてはポリマーに基づく製剤中の重合マトリックス中に分散された遊離粒子として用いられ得る。
本発明の医薬製剤には生物学的活性薬剤の有効量が含まれる。生物学的活性薬剤の有効量は、治療上、予防上又は診断上有効な量であり、投与経路；体重；年齢；身体的状態；治療上、予防上又は診断上の目標；及び生物学的活性薬剤のタイプを考慮して当業者により決定される。
ポリマーに基づく製剤の場合、使用されるポリマーのタイプ、最初の破裂及び続いて生じる所望の放出レベル、及び放出速度も、所望の効果を産み出す生物学的活性製剤の量に影響を与える。最初及び続く放出レベル並びに放出速度は多くのポリマーマトリックスに対して知られている。また、これらの変数は、一又は複数の異なる濃度の生物学的活性製剤を含むポリマーマトリックスのインヴィトロにおける比較テストにより、経験的に決定することができる。典型的には、生物学的活性製剤の放出を調節することを目的とされるポリマーマトリックスは、約０．０１％（ｗ／ｗ）から約５０％（ｗ／ｗ）の生物学的活性製剤を含む。
【００２１】
生物学的活性製剤がポリペプチドの場合、本発明の好ましい医薬製剤は金属カチオン成分を包含する。ポリマーに基づく製剤において、金属カチオン成分は、好ましくは重合マトリックスへの添加の前に薬剤と混合される。金属カチオン成分は、重合マトリックスからのポリペプチドの放出を調節するように選択される。適当な金属カチオン成分は、非解離状態、解離状態、又は非解離及び解離を組合わせた状態において、少なくとも１種類の多価金属カチオン（＋２又はそれ以上の原子価を持つ）を持つ。適当な金属カチオン成分は、例えば、金属塩、金属水酸化物、及び弱い酸の塩基性塩（ｐＨ約７．０又はそれ以上）であってその塩が金属カチオンを含むもの等を含む。例示的な金属カチオン成分は酢酸亜鉛由来の亜鉛である（実施例１参照）。
本発明に係る医薬製剤は、微粒子／生物学的活性薬剤成分を本発明に係る注射媒体へ加えることにより製造される。ポリマーに基づく製剤のため、生物学的活性薬剤を含むポリマー状微小粒子が注射媒体へ添加される。
このようなポリマー状微小粒子を形成するために、適するポリマーがポリマー溶液を形成するために溶媒中に溶解される。適する溶媒の例には、例えば、塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、及びヘキサフルオロイソプロパノールなどの極性有機溶媒が含まれる。通常、適するポリマー溶液は約５％から約３０％のポリマー（ｗ／ｖ）を包含する。さらに好ましい実施態様においては、ポリマー溶液は約５から約１５％のポリマー（ｗ／ｖ）を包含する。
【００２２】
少なくとも一つの生物学的活性薬剤が、ポリマー溶液内に分散される。生物学的活性薬剤は、比較的均一な懸濁液又は溶液を生成するような、超音波処理、撹拌、及びホモゲナイズを含むいずれか適当な方法により分散され得る。生物学的活性薬剤は、固体状態で、好ましくは粒子形態にてポリマー溶液へ直接添加され得る。後者の場合、典型的には生物学的活性薬剤がポリマー溶液中に分散された固体粒子として懸濁されることになる。ある実施態様において、ポリマー溶液への添加前に、生物学的活性薬剤は第二の溶液中へ固体粒子として容易に懸濁又は溶解され、その結果得られる溶液がポリマー溶液に添加される。第二の溶媒は第一の溶媒（即ち、ポリマーを溶解するために使用される）と同一であり得、或いは、もし第二の溶媒が第一の溶媒と混和され、ポリマーが第二の溶媒に可溶ならば、異なる溶媒も可能である。適当な第二の溶媒の例はアセトンである。当業者は、生物学的活性薬剤は溶媒に懸濁又は溶解され、その後適当なポリマー又はポリマー溶液が生物学的活性薬剤懸濁液又は溶液へ添加されることについて理解する。
好ましい実施態様において、金属カチオン成分がポリマー溶液へ添加される。金属カチオン成分及び生物学的活性薬剤は、逆の順番若しくは間欠的に、又は別々のもしくは同時的な添加を通じて、引き続きポリマー溶液へ添加することができる。一実施態様において、金属カチオン成分は溶媒に溶解され、その溶媒はポリマーに対しても適当である結果、ポリマー溶液と混合される。あるいは、生物学的活性薬剤は金属カチオン成分懸濁液又は溶液（逆もまた同様）へ添加され、その後ポリマーが添加される。
【００２３】
金属カチオン成分は、生物学的活性製剤の放出を調節する濃度で用いられる。選択される濃度は、用いられるポリマー、金属カチオン成分、及び生物学的活性薬剤に依存する。一実施態様において、金属カチオン成分は、約０．５％から約３０％（ｗ／ｗ）の濃度にて重合マトリックス中に分散される。好ましい実施態様において、金属カチオン成分濃度は、約１％（ｗ／ｗ）から約１０％（ｗ／ｗ）の間の濃度である。
本発明の重合マトリックスは、微小粒子など注射に適するいずれかの形に成形することができる。微小粒子は、球状（即ちほぼ丸い）、非球状、又は不規則な形を持ち得る。しかし、好ましい微小粒子の形は球状である。好ましい微小粒子は平均約５から約２００ミクロンの平均直径を持つ。
微小粒子は、上述のポリマー状溶液から多くの有用な何れかの方法により生成することができる。ポリマー溶液から微小粒子を形成するのに適する方法は、Ｇｏｍｂｏｔｚ等に対して発行された米国特許第５，０１９，４００号；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０５５１１号、国際公開番号ＷＯ９５／２９６６４号及び実施例１において記載されている。他の実施態様において、微小粒子は、Ｓｃｈｎｏｒｉｎｇ等に対して発行された米国特許第３，７３７，３３７号；Ｖｒａｎｃｈｅｎ等に対して発行された米国特許第３，５２３，９０６号；Ｋｉｔａｊｉｍａ等に対して発行された米国特許第３，６９１，０９０号；又はＴｉｃｅ等に対して発行された米国特許第４，３８９，３３０号中に記載される溶媒蒸発法により調製される。微小粒子を形成するための他の例示的方法は、Ｃｌｅｌａｎｄ等に対して発行された米国特許第５，６４３，６０５号中に記載されている。
【００２４】
溶媒蒸発法では、ポリマー溶液であって、分散された生物学的活性薬剤及び随意に分散された金属カチオン成分を含む溶液は、連続的な相であって、その中でポリマー溶液が実質的に不混和性であるようなエマルジョンを形成するように混合される。連続相は通常は水性溶媒である。エマルジョンを安定化させるために連続相に乳化剤を含有させることがよくある。その後、ポリマーの溶媒は数時間又はそれ以上かけて蒸発させ、重合マトリックスを微小粒子形態に成形するためにするポリマーを固化させる。
本発明に係る医薬製剤は、生理的に受容可能な賦形剤又は安定化剤などの他の成分を包含することも可能である。本発明における生理的に受容可能な賦形剤又は使用に適した安定化剤は、受容者に対し使用投与量において非毒性であり、抗酸化物（例えば、アスコルビン酸）、低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、及びイムノグロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、及びリジンなど）、単糖類、二糖類、多糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、デキストラン、セルロース、及びメチルセルロース）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）、糖アルコール（マンニトール及びソルビトールなど）、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、金属カチオン（例えば、亜鉛）、アニオン性界面活性剤（ＴｗｅｅｎＴＭ、ＰｉｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、及びＰＥＧ）及び／又は保存剤（例えば、塩化ベンゼトニウムなどの四級アンモニウム塩を含むもの）を含み得る。
【００２５】
そのような賦形剤又は安定化剤の何れもが、重合マトリックス形成を著しく妨げなければ、随意的な金属カチオン成分として、上述のように重合マトリックス内に分散させることが可能である。また、賦形剤又は安定化剤は注射媒体に添加することもできる。
ポリペプチドのための好ましい持続性放出製剤には、典型的にはε−アミノグループを介してポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］）に付着されるポリペプチドを包含し得る。タンパク質へのＰＥＧの付着は、抗原性を減少させ、インヴィボにおける半減期を延長させる周知の方法である（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ｊ．，等、（１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：３５８２−８６を参照のこと）。もし、「ペグ化」されたポリペプチドが少なくとも一の生物活性を保持するのならば、通常の「ペグ化」の何れかの方法を用いることが可能である。
本発明の医薬製剤は、何れかの標準的な形態で保存可能であり、例えば、水溶液又は凍結乾燥塊（ｃａｋｅ）を含む。このような製剤は、受容者に投与される際典型的には滅菌状態である。水溶液の滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実施することができる。製剤が凍結乾燥形態で保存されるならば、製剤は、凍結乾燥及び再構成前に濾過され得る。
【００２６】
また、本発明は、関連キットと共に本発明に係る注射媒体及び注射製剤を含む製造品も提供する。本発明は、発明の注射媒体又は製剤を含む如何なるタイプの製品をも包含するが、典型的に、製造品は容器であって、好ましくは包含される注射媒体又は注射製剤を同定するラベルが貼付されて容器である。当該容器は内包される注射媒体又は医薬製剤と反応しない任意の物質から形成され、意図される使用に対する注射媒体又は医薬製剤の使用を促進する任意の形又は他の特徴を持ち得る。通常、本発明の注射媒体又は医薬製剤に対する容器は、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射用の注射針で貫通できるストッパーを具備したバイアルなどの滅菌アクセスポートを持つ。
本発明のキットは、通常、一又は複数の製造品などを含み、好ましくは使用説明書を含む。
【００２７】
ポリマー状製剤の投与
本発明の製剤は、注射により動物に投与することが可能で、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。投与に適する経路には、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、硝子体内、動脈内、皮下、又は病巣内経路を含む。本発明の医薬製剤は、輸液又は大量静脈内投与又は特別な調製に適する何れかの注射方法により連続的に投与することができる。
注射に使用される針は、医薬製剤の所望投与量の注射を可能にする内径サイズを有していなければならない。通常、２３ゲージ注射針はポリマーに基づく製剤の良好な注射可能性を提供するが、それより小さな（例えば、２４、２５、２６、２７、及び２８ゲージ）注射針は、注射時の痛みを軽減するのに好ましい。
本発明に係る医薬製剤の投与量は、治療目的、投与経路、受容者の状態及び注射により投与し得る最大投与量などの様々な考慮すべき事項に依存する。従って、臨床医にとって、投与量を滴定し、最適な治療効果を得るのに必要とされる投与経路の修正を行うことが必要である。典型的な毎日の投与量は、体重あたり約１μｇ／ｋｇから約１００ ｍｇ／ｋｇまでの範囲内又は一日にそれ以上が可能であるが、典型的には約１０μｇ／ｋｇ／ｄａｙから約１０ ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの間である。通常、臨床医は低投与量の医薬製剤から始めて、所望の治療効果が得られるまで投与量を増加させる。
【００２８】
本発明の医薬製剤の投与は、他の治療法と組み合わせることができる。癌治療に対しては、放射線及び／又は化学治療製薬が本発明の医薬製剤と同時に投与され得る。化学治療薬として適する調製及び投与計画は、製品により推奨されるものであり、又は臨床医によって経験的に決定されるものである。標準的な化学治療薬の調製及び投与計画は、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｐｅｒｒｙ編（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９２））中に見いだすことができる。化学療法薬は、医薬製剤の投与前、投与後、同時投与が可能である。ＥＧＦＲ， ＥｒｂＢ−２， ＥｒｂＢ−３又はＥｒｂＢ−４受容体に結合するような抗体など癌関連抗原に対する抗体、又は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、医薬製剤と共に投与することが可能であり一又は複数のサイトカインも可能である。
【００２９】
実施例
実施例１
組換体ヒト成長ホルモンを含むポリマー状微粒子の調製
組換体ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）は、１９９１年発行のＧｏｍｂｏｔｚ等、米国特許第５，０１９，４００号に記述された極低温性、不含水処理により、ＰＬＧＡ微粒子中へカプセル化された。ｒｈＧＨを安定化するために、当該タンパク質は、やや溶けにくいＺｎ：ｒｈＧＨ複合体を生成させるように、酢酸亜鉛と共に製剤化された。組織学的証拠により、ｈＧＨは亜鉛との複合体として下垂体に貯蔵されることが示されたため、亜鉛が選択された。さらに、亜鉛とｒｈＧＨとの複合体は、複合体を形成しないｒｈＧＨよりもグアニジン塩酸による変性に対して耐性を示すことが知られていた。
１１の異なる微粒子製剤が、初期の選定評価のために作成された。詳細に調べられる可変量は、ポリマー分子量（１０ｋＤ、８ｋＤ、及び３１ｋＤ）、ポリマーの末端基（キャップされているか又はされていないか）、及び賦形剤として添加される炭酸亜鉛の量（０，１，３，及び６％）であった。炭酸亜鉛賦形剤は、ｒｈＧＨを亜鉛と複合体化させたままにするために亜鉛イオンに対する補給所として作用するために包含された。全ポリマー中のグリコリドに対するラクチドの分子比率は、５０：５０の一定値に保たれ、全微粒子製剤中の調べられたＺｎ：ｒｈＧＨの分子比率は、６：１であった。全ての微粒子製剤は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ （Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ；＃１１５−５６−１；０．２ｄＬ／ｇ， １０ｋＤ， ドデカニル末端基［即ちキャップされた状態］）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ （Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ； ＲＧ５０２Ｈ；０．２ｄＬ／ｇ， ８ｋＤ；及びＲＧ５０３Ｈ；０．４ｄＬ／ｇ， ３１ｋＤ， 両方ともにカルボン酸及び酸末端基を持つ）から得られたＤ，Ｌ−ＰＬＡＧを用いて調製された。
【００３０】
微粒子はＪｏｈｎｓｏｎ， Ｏ等によるＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，”Ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎｔｏ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，” １４巻、６号（１９９７）の記載により生成された。概要を説明すると、最初にｒｈＧＨが凍結乾燥粉に製剤化され、凍結乾燥粉は微粒子中へカプセル化された。凍結乾燥粉は、酢酸亜鉛：ｒｈＧＨが６：１の分子比になるように、亜鉛とｒｈＧＨ（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ， Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ）溶液を混合することにより調製された。亜鉛：ｒｈＧＨの分散は、超音波ノズルを通して液体窒素中に微粒子化させ、凍結液滴は凍結乾燥された。
ポリマー懸濁液は、超音波処理ノズルを通して液体窒素が重層された凍結エタノールを含む容器中に分散された。その後、容器は−８０℃へ移され、エタノールは溶解し微粒子は、ジクロロメタンがエタノールによって抽出されるにつれて硬化した。３日後、微粒子は濾過により回収され、減圧下で乾燥され、１０６μｍのメッシュのスクリーンを通して濾過された。
【００３１】
実施例２
ｒｈＧＨ微粒子の分析
実施例１における１１の微粒子製剤は、種々の技術を用いることにより分析された。微粒子は、アルミニウムのスタッブ（ｓｔｕｂ）又は炭素もしくは金の層でコートされたスパッタ（ｓｐｕｔｔｅｒ）上に静置され、ＪＥＯＬ ｍｏｄｅｌ ６４００走査電子顕微鏡を用いて画像化された。微粒子の平均粒子直径分布は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒを用いて決定された。微粒子のｒｈＧＨ積載量は窒素分析により決定された。
およそ９５％のタンパク質は、微粒子中へカプセル化され、約５０ミクロンの平均容量直径を有していた。
さらに、微粒子から回復されるｒｈＧＨの物理的及び生物的整合性は、サイズ排除（ＳＥＣ）、逆相、及びアニオン交換クロマトグラフィー分析された。これらの技術は、凝集され、酸化され、脱アミド化されたｒｈＧＨを各々検出するために用いられた。これらの分析のために、２つの異なる方法をを用いて微粒子からｒｈＧＨが回復された。最初に、微粒子は、塩化メチレン及びアセトン中に溶解された後、タンパク質の沈殿物が回収された。次に、当該タンパク質は、微粒子をＨＥＰＥＳバッファー中でインキュベートすることにより回復された。
【００３２】
クロマトグラフィーは、発表された方法に従って行われた（Ｔｅｓｈｉｍａ， Ｇ．，及びＣａｎｏｖａｌ−Ｄａｖｉｓ， Ｅ． （１９９１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１３５４４−４７；Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ， Ｊ．Ｅ．，等、（１９９２）， Ｊ． ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ６２５：２００７−１５；Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ， Ｊ．Ｅ．， 等、（１９９５）Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．６７：４４７−５５；Ｃａｎｏｖａ−Ｄａｖｉｓ， Ｅ．等（１９９０）， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３５：１７−２４）。概略すると、ＳＥＣは移動相としてリン酸バッファーを用い、Ｇ２０００ＳＷ ＸＬ ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎを用いて実施した。ｒｈＧＨは２１４ ｎｍの紫外線吸収により検出された。逆相クロマトグラフィーは、ポリマー性逆相カラムにより、５０℃にてアセトニトリル濃度勾配溶出を用いて行った。イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥ−ＳＰＷ ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎによりリン酸及びアセトニトリル濃度勾配溶出を用いて実施した。逆相及びイオン交換法については、ｒｈＧＨは、２８６ ｎｍの励起波長及び３３５ ｎｍの吸収波長の蛍光により検出された。最後に、ｒｈＧＨの生物活性は、ｈＧＨに対するレセプターを発現し、ｈＧＨの存在下で増殖する株化細胞を用いた細胞増殖アッセイにおいて検出された（Ｒｏｓｗａｌｌ， ＥＣ．等、（１９９６）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２４：２５−３９を参照）。細胞増殖は、細胞内の還元酵素によるＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ色素から蛍光色素産物への変換により測定された。蛍光は、細胞数に比例し、ｒｈＧＨを含む試料は３７℃において７２時間細胞とインキュベートされ、その後蛍光は消光させた。
【００３３】
各製剤から回収したｒｈＧＨは、実質的には単体であり、このことは、タンパク質凝集に関しテストされた製剤の計量値に影響を与えなかったことを示す。ｒｈＧＨの整合性の分析により、カプセル化される前後間で顕著な相違は存在しなかったことが示された。さらに、分析された全ての製剤から放出されたタンパク質の特異的生物活性は、カプセル化されない標準試料の活性と同一であった。さらに、製剤の一つをトリプシン分解することによるＳＤＳ還元ゲル電気泳動及びＨＰＬＣ分析は、カプセル化されないタンパク質に匹敵し得る結果だった。総じると、これらのデータは、生理的な温度下における延長されたインキュベーション後の微粒子からの抽出又は放出の後においても、ｒｈＧＨは本質的には変化しないことを示す。
【００３４】
実施例３
ヒアルロン酸ナトリウム（ＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓ）を含む抗ｒｈＧＨ Ｆａｂのポリマーに基づく製剤に関する注射性能研究
注射媒体は、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中でＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ， ＵＳＡ）により希釈して調製された。
ＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓは、生理食塩水中で０．４ｍＬ又は０．８ｍＬの１．６％ヒアルロン酸ナトリウム（ｗ／ｖ）を供する使い捨てのガラス注射筒中にて供給される。
各ｍＬのＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓは、注射用の滅菌水（ＳＷＦＩ ＵＳＰ）に溶解された１６ｍｇのヒアルロン酸ナトリウムと、９ｍｇのＮａＣｌを含む。ＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓは、０．０５％、０．１％、０．２％、０．４％、０．６％、及び０．８％（即ち、０．５、１、２、４、６及び８ｍｇ／ｍｌ）に希釈された。
１００ｍｇ／ｍＬの抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＰＬＧＡ微粒子（ｌｏｔ ９６−２２−１９５−１）を含む製剤を生産するために、注射媒体は、実施例１において記載されたように調製された抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＰＬＧＡ微粒子と混合された。
これらの製剤は、２３，２４，２５，２７及び２８ゲージの注射針を用いて各１ｍＬの注射媒体を管へ注入することにより、注射性能についてテストされた。各１ｍＬの注射媒体は、テストされた全ての注射針を通過して容易に注射できた。
注射媒体として、３．０％（ｗ／ｖ）の直鎖状糖質カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液を用いた同様のポリマーに基づく製剤は、１００ｍｇ／ｍＬの投与量を注射するのに２１ゲージの注射針が必要であった。
【００３５】
実施例４
ヒアルロン酸ナトリウム（ＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓ）を含む種々のポリマーに基づく製剤の注射性能研究
注射媒体は、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中で、ＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ， ＵＳＡ）を０．０５％、０．１％、０．１５％及び０．２％（ｗ／ｖ）に希釈することにより調製された。
ポリマーに基づく製剤を生産するために、注射媒体はＮｕｔｒｏｐｉｎ ＤｅｐｏｔＲ、ＶＥＧＦ微粒子、ＶＥＧＦ／ヘパリン微粒子、ＮＧＦ微粒子と混合された。これらの微粒子調製品は、実施例１で記述されたように調製された。微粒子濃度は、表１に示される。
これらの製剤は、２３，２４，２５，２７及び２８ゲージの注射針を用いて１ｍＬの各製剤を管へ注入することにより注射性能に関してテストされた。
本研究結果は、表１に示されており、各製剤１ｍＬを注射するのに使用される最小ゲージの注射針を示す。
【００３６】
2004513872.tif 000002
【００３７】
実施例５
ヒアルロン酸ナトリウム（ＨｙｌｕｍｅｄＲ）を含む種々のポリマーに基づく製剤の注射性能研究
ヒアルロン酸ナトリウムを含む注射媒体は、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中で、ＨｙｌｕｍｅｄＲ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）を０．０１％及び０．１０％に希釈することにより調製された。これに比して、０．９％塩化ナトリウムＵＳＰ中で、３％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む第二の製剤も調製された。
注射媒体は、表２に示される微粒子調製品と混合され、実施例１に記述されているように調製された。微粒子濃度は、表２に示される。
これらの製剤は、２１，２２，２３，２４，２５，２６及び２７ゲージの注射針を用いて１ｍＬの各製剤を管へ注入することにより注射性能に関してテストされた。本研究結果は表２及び表３に示され、これは各製剤を注射するために使用される最小ゲージの針を示す。表３は、微粒子濃度が０．１０％ＨｙｌｕｍｅｄＲを含む製剤において２倍にになると、小（２４Ｇ）ゲージの注射針を注射に用いることができる。従って、より小さいゲージの注射針は、通常のＣＭＣに基づく注射媒体と同量の１回当たりの投与量を、２回注射することが可能である。
【００３８】
2004513872.tif 000003
【００３９】
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【００４０】
実施例６
ポリマーに基づく微粒子のための注射媒体の使用に対する種々の高分子の適正
０．９％塩化ナトリウム　ＵＳＰ中で以下に示す高分子溶液が、ポリマーに基づく微粒子のための注射媒体として調製された：アルギン酸ナトリウム（Ｋｅｌｃｏ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、デキストラン ７０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、ジェファミンＭ−６００（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓ．， Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ジェファミン ＥＤ−２００１（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓ．， Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ケレタン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、キサンタンガム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）及びゲランガム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）。
テストされた濃度は、０．０１％−０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であった。Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＤｅｐｏｔＲ微粒子は、実施例１に記述されたように調製され、最終濃度１２５ｍｇ／ｍＬになるように添加された。
これらの製剤は、２１，２２，２３，２４，２５，２６及び２７ゲージの注射針を用いて１ｍＬの各製剤を管へ注入することにより注射性能に関してテストされた。本研究結果は、２１Ｇ注射針が、１ｍＬの各製剤を注射するのに使用され得る最小ゲージの注射針であることを示すものであった。従って、テストされた媒体の中には、従来のＣＭＣに基づく媒体よりも優れたものは存在しなかった。
【００４１】
実施例７
抗−ＶＥＧＦ Ｆａｂをヒアルロン酸ナトリウム中に含むポリマーに基づく製剤の硝子体内への注射性能研究
２つの注射媒体が、第一にＡｍｖｉｓｃＲ Ｐｌｕｓ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ， ＵＳＡ）、第二にシグマケミカル社から（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）より入手したヒアルロン酸ナトリウムから調製された。両製剤は、０．９％塩化ナトリウム ＵＳＰ中０．１％（ｗ／ｖ）のヒアルロン酸ナトリウムに希釈された。
ポリマーに基づく製剤を生産するために、各注射媒体は抗−ＶＥＧＦ Ｆａｂ微粒子（１００ｍｇ／ｍＬ）と混合された。微粒子は実施例１に記述されたように調製された。
これらの製剤は、ウサギの眼の硝子体内への注射性能についてテストされた。５０μＬの各製剤は、３０ゲージの注射針を用いて容易に注射可能であった。注射２４時間後においてウサギの眼には重大な炎症は観察されなかった。
【００４２】
本発明は、ある特定の方法及び材料に言及することにより必然的に論じられてきた。これら特定の方法及び材料に関する議論は、当該発明の範囲に対して何らかの限定を構成するものでは決してなく、当該発明の目標を達成するために適する何れか及び全ての置換可能な材料、方法へ広げ得るものであるということが理解される。
ここに引用された全ての引例は、出典明示により明確に取り込まれる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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