(57)【要約】被験者が原発性もしくはバイラテラル乳癌を発生する素因を有するかどうかを決定する該被験者を検査する方法が提供される、該方法は、該被験者のｃＤＮＡサンプル中、該被験者のゲノムＤＮＡサンプル中のＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を検出する工程（該変異は表４および表５で説明される変異から構成される群から選択される）、または該被験者のｍＲＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームに対応するｍＲＮＡに変異を検出する工程（該変異は表４および表５で説明される変異に相補的なＲＮＡから本質的になる群から選択される）を含み、かかる変異の存在が原発性もしくはバイラテラル乳癌を発生する素因を該被験者が有することを示す方法である。また、ポジション ３７８ Ｔ→Ａ， ポジション ３３８３ Ａ→Ｇ， ポジション １６３６ Ｃ→Ｇ， ポジション ２６１４ Ｃ→Ｔ， ポジション ６４３７ Ｇ→Ｃ， ポジション ２９３２ Ｔ→Ｃ， ポジション ２２８９ Ｔ→Ａ， ポジション ６０９６ Ａ→Ｔ， ポジション ６１７６ Ｃ→Ｔ， ポジション ６９１９ Ｃ→Ｔ， ポジション ３９２５ Ｇ→Ａ， ポジション ６０６７ Ｇ→Ａ， ポジション ２１１９ Ｔ→Ｃ， ポジション １８１０ Ｃ→Ｔ， および ポジション ４３８８ Ｔ→Ｇの変異から本質的になる群から選択される変異を含むことで配列番号１に記載された配列と相違するヌクレオチド配列を有する単離ｃＤＮＡも提供される。また、乳癌の素因を決定するマーカーも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が乳癌を発生する素因を有するかを決定するために前記被験者を検査する方法であって、
（ａ）前記被験者のｃＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を検出する工程（該変異は表４および表５に記載される変異からなる群から選択される）、または
（ｂ）前記被験者のゲノムＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異に対応する変異を検出する工程（該変異は表４および表５に記載される変異からなる群から選択される）、
を含み、
かかる変異の存在が乳癌を発生する素因を前記被験者が有することを示す方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記検出する工程が、ポジション ３１６１ Ｃ→Ｇ， ポジション ２５７２ Ｔ→Ｃ， ポジション ６２３５ Ｇ→Ａ， ポジション ３１１８ Ａ→Ｇ， ポジション ３７８ Ｔ→Ａ， ポジション ２６１４ Ｃ → Ｔ， ポジション １４６ Ｃ → Ｇ， および ポジション１６３６ Ｃ → Ｇの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むことを特徴とするＤＮＡを検出することを含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記検出する工程が、ポジション ３１６１ （Ｃ → Ｇ）およびポジション ２５７２ （Ｔ → Ｃ）の２重の変異、並びにポジション ６２５３ （Ｇ → Ａ） および ポジション ３７８ （Ｔ → Ａ）の２重の変異からなる群から選択される少なくとも２つの変異を含むことを特徴とするＤＮＡを検出することを含む方法。
【請求項４】
被験者がバイラテラル乳癌を発生する素因を有するかを決定するための前記被験者（該被験者は既に原発性の乳癌を発生している）を検査する方法であって、
（ａ）前記被験者のｃＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を検出すること（該変異は表４および表５に記載される変異からなる群から選択される）、または
（ｂ）前記被験者のゲノムＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異に対応する変異を検出すること（該変異は表４および表５に記載される変異からなる群から選択される）、
を含み、
かかる変異の存在がバイラテラル乳癌を発生する素因を前記被験者が有することを示す方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記検出する工程が、ポジション ３１６１ Ｃ → Ｇ， ポジション ２５７２ Ｔ → Ｃ， ポジション ６２３５ Ｇ → Ａ， ポジション ３１１８ Ａ → Ｇ， ポジション ３７８ Ｔ → Ａ， ポジション ２６１４ Ｃ → Ｔ， ポジション １４６ Ｃ → Ｇ， および ポジション １６３６ Ｃ → Ｇの変異から本質的になる群から選択される少なくとも１つの変異を含むことを特徴とするＤＮＡを検出することを含む方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記検出する工程が、ポジション ３１６１ （Ｃ → Ｇ）およびポジション ２５７２ （Ｔ → Ｃ）の２重の変異、並びにポジション ６２５３ （Ｇ → Ａ） および ポジション ３７８ （Ｔ → Ａ）の２重の変異からなる群から選択された少なくとも２つの変異を含むことを特徴とするＤＮＡを検出することを含む方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列を有する単離ｃＤＮＡであって、該配列が配列番号１に記載の配列とポジション ３７８ Ｔ → Ａ， ポジション ３３８３ Ａ → Ｇ， ポジション １６３６ Ｃ → Ｇ， ポジション ２６１４ Ｃ → Ｔ， ポジション ６４３７ Ｇ → Ｃ， ポジション ２９３２ Ｔ → Ｃ， ポジション ２２８９ Ｔ → Ａ， ポジション ６０９６ Ａ → Ｔ， ポジション ６１７６ Ｃ → Ｔ， ポジション ６９１９ Ｃ → Ｔ， ポジション ２４４２ Ｃ → Ａ， ポジション ３９２５ Ｇ → Ａ， ポジション ６０６７ Ｇ → Ａ， ポジション ２１１９ Ｔ → Ｃ， ポジション １８１０ Ｃ → Ｔ， および ポジション ４３８８ Ｔ → Ｇの変異からなる群から選択される変異において異なるｃＤＮＡ。
【請求項８】
乳癌の素因を決定するためのマーカーであって、該マーカーがＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を含むマーカー。
【請求項９】
請求項８に記載のマーカーであって、前記変異が表４および表５に記載の変異からなる群から選択されるマーカー。
【請求項１０】
請求項９に記載のマーカーであって、前記変異が、ポジション ３７８ Ｔ → Ａ， ポジション ３３８３ Ａ → Ｇ， ポジション ６３６ Ｃ → Ｇ， ポジション ２６１４ Ｃ → Ｔ， ポジション ６４３７ Ｇ → Ｃ， ポジション ２９３２ Ｔ → Ｃ， ポジション ２２８９ Ｔ → Ａ， ポジション ６０９６ Ａ → Ｔ， ポジション ６１７６ Ｃ → Ｔ， ポジション ６９１９ Ｃ → Ｔ， ポジション ３９２５ Ｇ → Ａ， ポジション ６０６７ Ｇ → Ａ， ポジション ２１１９ Ｔ → Ｃ， ポジション １８１０ Ｃ → Ｔ， および ポジション ４３８８ Ｔ → Ｇの変異からなる群から選択されるマーカー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
＜１．発明の属する技術分野＞
本発明は一般的にＡＴＭ変異と乳癌の関連性に関する。より具体的には、本発明は巨大腫瘍成長の前の癌の検出における前記関連性の使用に関する。
【０００２】
＜２． 関連技術の説明＞
毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）は、神経変性、癌、免疫不全、放射線感受性及び遺伝的不安定性により特徴づけられる多形質発現性の遺伝的疾患である。Ａ−Ｔの原因遺伝子はＡＴＭと呼ばれ、１９９５にＳｈｉｌｏｈ等により発見された（Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ｋ． 等， １９９５）。ＡＴＭ遺伝子はゲノムＤＮＡの１５０ｋｂに渡っており （Ｕｚｉｅｌ， Ｔ． 等．， １９９６）、６６エクソンに相当する約１３ｋｂの大きな転写物に転写される（Ｕｚｉｅｌ， Ｔ． 等， １９９６， Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ｋ． 等， １９９５， Ｓａｖｉｔｓｋｙ， Ｋ． 等， １９９７）。この転写物のオープンリーディングフレームは、３，０５６アミノ酸から構成される３７０ｋＤａ蛋白質を予想する。ＡＴＭ産物は他の生物のいくつかの細胞周期チェックポイント蛋白質と相同性があり、ＤＮＡダメージに対する細胞周期チェックポイント、遺伝子組換え、アポトーシスおよび他の細胞応答を調整する情報伝達ネットワークにおいて、決定的な役割を演ずると考えられている（Ｍｅｙｎ． Ｍ． Ｓ．， １９９９）。
【０００３】
Ａ−Ｔ細胞は、放射線で誘導されたＤＮＡダメージに異常に反応し、著しく電離放射線に感受性がある。Ｍ． Ｓｗｉｆｔおよび他の著者（Ｍｏｒｒｅｌｌ， 等， １９９０， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ．， 等， １９８７， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ．， 等， １９９１， Ｅａｓｔｏｎ， Ｄ． Ｆ．， １９９４）は、非キャリアよりもＡ−Ｔキャリアで放射線への暴露が癌の発生を生じうることを示唆している（Ｍｏｒｒｅｌｌ， 等， １９９０， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ．， 等， １９８７， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ．， 等， １９９１， Ｅａｓｔｏｎ， Ｄ． Ｆ．， １９９４）。Ａ−Ｔ患者の血縁者の調査は、女性のＡ−Ｔヘテロ接合体における乳癌のリスク増大を一貫して支持している（Ｍｅｙｎ， Ｍ． Ｓ．， １９９９）。Ａ−Ｔホモ接合体は稀であるが、このようにＡＴＭ遺伝子は癌に何らかの役割を持ち得る （Ｍｏｒｒｅｌｌ 等， １９９０， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ． 等， １９８７， Ｓｗｉｆｔ， Ｍ． 等， １９９１， Ｅａｓｔｏｎ， Ｄ． Ｆ．， １９９４）。
【０００４】
いくつかの研究は、ホジキン病（ＨＤ）のために放射線治療を以前に受けた女性の乳癌の発生のリスク増大を示した（Ｈａｎｃｏｃｋ 等， １９９３， Ｙａｈａｌｏｍ， Ｊ． 等， １９９２， Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｃ． 等， １９９７）。従って、ＡＴＭの生殖系列（遺伝した）配列バリエーションが：１．乳癌リスク、２．バイラテラル乳癌リスク、および３．放射線治療（放射線感受性）に対する反応、に影響するかどうかを決定することは有用であろう。
【０００５】
【発明の概要】
本発明によると、被験者が原発性もしくはバイラテラル（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）の乳癌を発生する素因を有するかどうかを決定するために、該被験者を検査する方法が提供される。該方法は、該被験者のｃＤＮＡサンプル中、該被験者のゲノムＤＮＡサンプル中のＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を検出する工程（該変異は表４および表５で説明される変異から構成される群から選択される）、または該被験者のｍＲＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームに対応するｍＲＮＡに変異を検出する工程（該変異は表４および表５で説明される変異に相補的なＲＮＡから本質的になる群から選択される）を含み、かかる変異の存在が原発性もしくはバイラテラルの乳癌を発生する素因を該被験者が有することを示す方法である。また、ポジション ３７８ Ｔ→Ａ， ポジション ３３８３ Ａ→Ｇ， ポジション １６３６ Ｃ→Ｇ， ポジション ２６１４ Ｃ→Ｔ， ポジション ６４３７ Ｇ→Ｃ， ポジション ２９３２ Ｔ→Ｃ， ポジション ２２８９ Ｔ→Ａ， ポジション ６０９６ Ａ→Ｔ， ポジション ６１７６ Ｃ→Ｔ， ポジション ６９１９ Ｃ→Ｔ， ポジション ３９２５ Ｇ→Ａ， ポジション ６０６７ Ｇ→Ａ， ポジション ２１１９ Ｔ→Ｃ， ポジション １８１０ Ｃ→Ｔ， および ポジション ４３８８ Ｔ→Ｇの変異から本質的になる群から選択される変異を含むことにより、配列番号１に記載された配列と相違するヌクレオチド配列を有する単離ｃＤＮＡも提供される。また、乳癌の素因を決定するマーカーも提供される。
【０００６】
本発明の他の利点は、本願の図面との関連で考慮すれば以下に記載する発明の詳細な記載を参照することによってより良く理解されるであろうから、容易に評価することができる。
【０００７】
【発明の詳細な記載】
一般に、本発明は被験者が原発性もしくはバイラテラル（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）の乳癌を発生する素因を有するかどうかを決定するために、該被験者を検査する方法を提供する。
【０００８】
本発明の方法は、健常女性および／またはリスク女性（原発性乳癌の後）が組織サンプルもしくは血液（通常は血液）などの様々な患者由来物質を採取することでスクリーニングされ、そして当業者に既知の方法を用いて前記変異の存在を検査することを提供するものである。前記組織サンプルは、血液、歯磨き中の分泌物（ｍｏｕｔｈ ｂｒｕｓｈ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、他の分泌物、および他の組織を含み得るが、それらに限定されない。
【０００９】
前記変異の存在を検出するために使用される方法は、以下で議論される方法を含むが、それに限定されない。点突然変異を含むＤＮＡの変異を検査するための当業者に既知の方法は多数存在する。前記変異の検査に使用し得る方法は、本明細書に記載したプライマーの使用を必要とする方法を含む。使用される変異検出法は、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）― 制限酵素アッセイ （Ｓｕｅｏｋａ， Ｈ． 等， ２０００）、ＰＣＲおよびライト・サイクラー技術（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （Ｆｕｎａｙｏ， Ｔ． 等， ２０００， Ｐａｉｓ， Ｇ． 等， ２００１）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ （ＭａｃＬｅｏｄ， ＳＬ 等， ２０００）、制限酵素消化（Ｈｏ， Ｌ． Ｌ． 等， ２００１）、変性高性能液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の迅速且つ高感度の分析（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ， Ｊ． 等， ２００１）、制限エンドヌクレアーゼ・フィンガープリンティング  単鎖コンフォメーション多形（ＲＥＦ−ＳＳＣＰ） （Ｊｕｇｅｓｓｕｒ， Ａ． 等， ２０００， Ｌｉｕ， Ｑ． 等， １９９５）、およびヘテロ二本鎖多形のような単一塩基置換の検出（Ｗｈｉｔｅ， Ｂ． Ｍ． 等， １９９１）を含みことができるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
より具体的には、本発明の方法は前記被験者のｃＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームの変異を検出する工程を含み、該変異は表４および表５に説明した変異から本質的になる群から選択される。
【００１１】
前記「検出する工程」は、任意の上記の開示された方法、またはｃＤＮＡサンプルの変異の検出に有用な当業者に既知の任意の他の方法を使用できる。かかる変異の存在は、前記被験者が原発性もしくはバイラテラルの乳癌の素因を有することを示す。また、本発明は前記被験者のｍＲＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームに相当するｍＲＮＡの変異を検出することを含み、該変異は表４および表５に記載する変異に相補的なＲＮＡから本質的になる群から選択される。
【００１２】
本発明の別の態様において、本発明の方法は前記被験者のゲノムＤＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレーム（ＡＴＭ転写物）の変異に対応する変異を検出する工程を含み得るものであり、該変異は表４および表５で説明される該変異から本質的になる群から選択される。前記「検出する工程」は、任意の上記の開示された方法、またはゲノムＤＮＡサンプルの変異の検出に有用な当業者に既知の他の任意の方法を使用し得る。かかる変異の存在は、前記被験者が原発性もしくはバイラテラルの乳癌を発生する素因を有することを示すものである。
【００１３】
また、本発明の方法は、前記被験者のｍＲＮＡサンプルのＡＴＭ遺伝子（配列番号１）のオープンリーディングフレームに対応するｍＲＮＡに変異を検出する工程を含み得るものであり、該変異は表４および表５で説明される変異に相補的なＲＮＡから本質的になる群から選択される。前記「検出する工程」は、任意の上記の開示された方法、またはＲＮＡサンプルの変異の検出に有用な当業者に既知の他の任意の方法を使用し得る。かかる変異の存在は、前記被験者が原発性もしくはバイラテラルの乳癌を発生する素因を有することを示すものである。
【００１４】
また、変異により配列番号１に記載の配列と異なるヌクレオチド配列を有する単離ｃＤＮＡも提供される。本明細書中で使用される「変異」という用語は、点突然変異、ミスセンス、多形、および他のかかる変異を含むと理解されるが、それらに限定されない。好適な態様において、前記変異は、 ポジション ３７８ Ｔ → Ａ， ポジション ３３８３ Ａ → Ｇ， ポジション １６３６ Ｃ → Ｇ， ポジション ２６１４ Ｃ → Ｔ， ポジション ６４３７ Ｇ → Ｃ， ポジション ２９３２ Ｔ → Ｃ， ポジション ２２８９ Ｔ → Ａ， ポジション ６０９６ Ａ → Ｔ， ポジション ６１７６ Ｃ → Ｔ， ポジション ６９１９ Ｃ → Ｔ， ポジション ２４４２ Ｃ → Ａ， ポジション ３９２５ Ｇ → Ａ， ポジション ６０６７ Ｇ → Ａ， ポジション ２１１９ Ｔ → Ｃ， ポジション １８１０ Ｃ → Ｔ， および ポジション ４３８８ Ｔ → Ｇの変異から選択される。
【００１５】
上記変異を少なくとも１つ有する単離ｃＤＮＡは、乳癌の素因を決定するマーカーとしても使用され得る。前記ｃＤＮＡの変異の存在は、乳癌の素因を暗示するものである。従って、本発明の方法は癌の出現の前にそれらの変異の存在を決定することができる。個体で癌が出現する前に乳癌などの癌の素因が存在するかどうかをも決定することができる。
【００１６】
上記の議論は、本発明のマーカーおよび方法の使用のための事実に基づいた基礎を提供する。本発明で使用される方法および本発明の効用は、以下に記載する限定されない実施例と付随する図面により示される。
【００１７】
【実施例】
＜方法＞
［分子生物学の一般的な方法］  当該技術分野で既知で特に記載していない標準の分子生物学的技術は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）、および Ａｕｓｕｂｅｌ等のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）、および ＰｅｒｂａｌのＡ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、および Ｗａｔｓｏｎ 等のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 および Ｂｉｒｒｅｎ等の Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌｓ． １−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）、および合衆国特許番号 ４，６６６，８２８ ； ４，６８３，２０２ ； ４，８０１，５３１ ； ５，１９２，６５９ および ５，２７２，０５７に説明されている方法論に従った。これらは本明細書の一部として本願に援用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をＰＣＲプロトコール：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）に従って実行した。フローサイトメトリーとの組み合わせたイン  サイチュ（イン  セル）ＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む細胞の検出に使用し得る（Ｔｅｓｔｏｎｉ 等， １９９６， Ｂｌｏｏｄ ８７ ： ３８２２．）。
【００１８】
＜実施例１＞
現行の実験はＡＴＭの生殖系列（遺伝性）配列バリエーションが：１．乳癌リスク、２．バイラテラル乳癌リスクおよび３．放射線治療への反応に影響するかどうかを決定するために設計された。実験集団は３つのグループ、１．コントララテラル（Ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）乳癌患者（ＢＣ−ＢＣ）（放射線照射処理の実施もしくは未実施）、２．原発性乳癌患者、および３．年齢が一致する健常女性から構成された。
【００１９】
前記変異の同定のための戦略は、全ｃＤＮＡ配列のシークエンシングに基づくものであった。前記変異の確認は、対応するゲノムＤＮＡ領域のｃＤＮＡ上で同定された。この全シークエンシング戦略は、全てのタイプの変異の同定のために最適な処理であり、本明細書中でより完全に開示される。
【００２０】
［材料および方法］
《血液サンプルからの全ＲＮＡの分離》
末梢血からの全ＲＮＡの分離は、製造者のプロトコールに従ってＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ ＢＤ （ＭＲＣ， ＩＮＣ）により実施した。ＯＤの検査およびアガロースゲル電気泳動をＲＮＡの品質および収量の分析の目的で実施した。
【００２１】
《逆転写》
第一鎖ｃＤＮＡを全ＲＮＡの２μｇから調製した。最終容量５ｍｌ中のＲＮＡを８５℃で２分間温め、氷上にもう２分間維持して冷却した。２μｌの５ｘバッファー （ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、０．５μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ１５ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、１μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、０．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む混合物を添加し、前記コンビネーションを４２℃で温めた。４２℃で５分間インキュベーション後、０．５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ （ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加した。４２℃で更に一時間インキュベーション後、混合物全体を８５℃で２分間熱した。
【００２２】
《ＡＴＭ  ＰＣＲ》
ＡＴＭ転写物９３５５ｂｐの増幅をプライマーＡＴＭＦおよびＡＴＭＲ（表１）用いて１μｌのＲＴ産物、１μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ＢｉｏＬａｂｓ）、１μｌの２５ｐＭの各プライマー、５μｌの１０ｘバッファー３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、２．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、０．７５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） および ０．１μｌのＡｎｔｉ−Ｔａｑ（Ｃｈｉｍｅｒｘ）を含む５０μｌの最終容量中で行った。前記増幅をＰＥ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ９７００で実施した。最初の工程は９３℃で５分間、続いて９３℃で３０秒間および６８℃で９分間を２０サイクルする熱処理を含む。第三の工程は、前のように開始され９３℃で３０秒間および６８℃で９分間の１０サイクルを含むが、各サイクルを１０秒間増加し、該工程は６８℃、１０分間で完了した。
【００２３】
《ＲＡおよびＲＢ  ＰＣＲ》
２つのオーバーラップする断片であるＲＡ（４９６４ ｂｐ） およびＲＢ（５０６２ ｂｐ）は、テンプレートとしてＡＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲの産物を使用して増幅された（表１）。ＡＴＭ  ＰＣＲのために上記で記載したものと同一の混合物をそれぞれ２つの断片の各々のＰＣＲに使用した。増幅を３．３０分間の伸長時間を除いて同じ条件下で実行した。
【００２４】
《シークエンシング》
ＲＡおよびＲＢ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、そして各々の断片２００ｎｇを表１に記載のプライマーでＢｉｇ  Ｄｙｅｓ，  ＰＥ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７によりシークエンスした。
【００２５】
《サンプル分析》
クロマトグラムの分析にＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅ Ｃｏ．）ソフトウェアを使用した。
【００２６】
《変異の確認》
各々の変異の確認のために、ゲノムＤＮＡの増幅を実施し、関連する領域をシークエンスした。
【００２７】
《コントロール  サンプル》
コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを増幅し、表２に示したようにチェックした。
【００２８】
【表１】
2004521601.tif 000002
2004521601.tif 000003
【表２】
2004521601.tif 000004
【００２９】
【表２ｂ】
2004521601.tif 000005
【表３】
2004521601.tif 000006
2004521601.tif 000007
2004521601.tif 000008
【表４】
2004521601.tif 000009
2004521601.tif 000010
【表５】
2004521601.tif 000011
2004521601.tif 000012
【表６】
2004521601.tif 000013
ＢＣ−ＢＣ患者でのこれらの変異のキャリアの頻度は、全てのＢＣ−ＢＣ患者の間で２１．４％である。健常者コントロールでの頻度は１／６３＝３．２％である。２つの組み合わせはＢＣ−ＢＣ患者にユニークである： （ｉ） ポジション ３１６１ （Ｃ → Ｇ） ＋ ポジション ２５７２ （Ｔ → Ｃ） （３／７０） ； および （ｉｉ） ポジション ６２３５ （Ｇ → Ａ） ＋ ポジション ３７８ （Ｔ → Ａ） （２／７０）。ＢＣ−ＢＣ患者においてトータル ５／７０ ＝７％、  正常健常者コントロールにおいて ０／６３＝０％。
【００３０】
１６（１６）の新規変異が発見され、そのうち９つが患者のコホート（ｃｏｈｏｒｔ）（表４）で、７を超える変異が健常者コントロールのコホート（表５）で発見された。これらの新規変異は、雄および雌の癌、特に乳癌の素因に関連するものである。
【００３１】
ＢＣ−ＢＣ患者の間の全キャリアは、２８／７０（もしくは ４０％）であり、一方、健常者コントロールの間の全キャリアは１８／６３（もしくは２９％）である。ポジション ５５５７の変異（おそらく多形である）に関して、ＢＣ−ＢＣ患者の間の全キャリアは１４／７０（もしくは２０％）であり、一方、健常者コントロールのコホートの間の全キャリアは８／６３（もしくは１３％）である。この実験で同定された配列バリエーションのほとんど全ては（９８％、４３／４４に相当する）、ミスセンス変異（点突然変異）であった。このパターンは毛細血管拡張性運動失調患者（Ａｔａｘｉａ Ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ）で報告されたものと顕著に異なったものであり、その中の優勢な配列バリエーションは蛋白質のトランケーションを生じる。
【００３２】
ＡＴＭ配列で同定されたバリエーションは、そのＯＲＦのほとんどに沿って均等に分布しているが、配列バリエーションの何れもが遺伝子のカルボキシ末端側のＰＩ−３キナーゼドメイン内に発見されなかった。ＰＩ−３キナーゼの触媒部位上に位置する変異が毛細血管拡張性運動失調などの重篤な表現型を生じることはもっともらしいことである。
【００３３】
健常者コントロールで優位に同定された変異は、如何なる局在の嗜好性も示さず、それらの全ては低頻度で生じた。
【００３４】
《結論》
概略すると変異の３グループが発見され、それは以下のようなものであった。１）この変異は原発性ＢＣで優位に生じる：ポジション １４６ （Ｃ → Ｇ）， および ポジション １６３６ （Ｃ → Ｇ） ；  ２）原発性ＢＣおよびＢＣ−ＢＣに同様のレベルの出現がある：ポジション ３７８ （Ｔ → Ａ）， ポジション ２５７２ （Ｔ → Ｃ）， ポジション ２６１４ （Ｃ → Ｔ）， ポジション ３１１８ （Ａ → Ｇ）， および ポジション ３１６１ （Ｃ → Ｇ） 並びに；  ３）ＢＣ−ＢＣで優位に生じる変異 ： ポジション ６２３５ （Ｇ → Ａ）。ポジション ３７８ （Ｔ → Ａ）の変異は、ポジション ６２３５ （Ｇ → Ａ）との組み合わせでのみＢＣ−ＢＣで生じる。
【００３５】
乳癌と本明細書中で開示される特定の配列の間に重要な相関関係が存在する。発見された変異は、癌（特に乳癌）の素因の診断に重要である。
【００３６】
＜実施例２＞
《ＤＮＡの変異のスクリーニングアッセイ》
本発明はＡＴＭ遺伝子の変異に対するものであり、女性に見つけられた際には原発性乳癌および／または原発性乳癌に続くバイラテラル乳癌を生じるより大きなリスクに至らせる。
【００３７】
本発明の方法は、健常女性および／またはリスク女性が組織サンプルもしくは血液（通常は血液）などの様々な患者由来物質を採取することによりスクリーニングされ、そして変異の存在に対して当該技術分野で既知の方法により検査される方法を提供する。これらの方法は実施例１でより詳細に記載された。かかる方法は以下に議論される方法を含むが、それらに限定されることはない。本明細書中に記載された点突然変異を含む変異に対して、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを検査する当該技術分野の既知の方法が多く存在することに留意すべきである。ゲノムＤＮＡの検査に使用できる方法は、本明細書に記載されたプライマーの使用を必要とする。使用されるＤＮＡ方法は、特に以下に記載されるものを含むが、それらに限定されない：ａ． ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）―制限酵素アッセイ（Ｓｕｅｏｋａ， Ｈ． 等， ２０００）、 ｂ． ＰＣＲ及びライトサイクラー技術（Ｆｕｎａｙｏ， Ｔ． 等， ２０００， Ｐａｉｓ， Ｇ． 等， ２００１）、 ｃ． 対立遺伝子特異的ＰＣＲ （ＭａｃＬｅｏｄ， ＳＬ 等， ２０００）、 ｄ． 制限酵素消化（Ｈｏ， Ｌ． Ｌ． 等， ２００１）、 ｅ． ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の迅速および高感度分析のための変性高性能液体クロマトグラフィ（ｄＨＰＬＣ）（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ， Ｊ． 等， ２００１）、 ｆ． 制限エンドヌクレアーゼ・フィンガープリンティング一本鎖コンフォメーション多型（ＲＥＦ−ＳＳＣＰ）（Ｊｕｇｅｓｓｕｒ， Ａ． 等， ２０００， Ｌｉｕ， Ｑ． 等， １９９５）、 並びにｇ．ヘテロ二重鎖多形としての単一塩基置換の検出（Ｗｈｉｔｅ， Ｂ． Ｍ．等、１９９１）。
【００３８】
様々な遺伝的状況の生物学的サンプルからＤＮＡをスクリーニングすることは当業者に公知である。このことはとりわけ以下の疾患：フェニルケトン尿症 （ＰＫＵ） （Ｓｕｅｏｋａ， Ｈ． 等， ２０００） ； ＡＰＲＴ 欠損症 （Ｆｕｎａｙｏ， Ｔ． 等， ２０００） ； Ｘ−連鎖血小板減少症（ＸＬＴ） （Ｈｏ， Ｌ． Ｌ． 等， ２００１） ； 血友病 Ａ （Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ， Ｊ． 等， ２００１） ； 嚢胞性線維症（ＣＦ） ； ゴーシェ病 ； ぜい弱Ｘ症候群 ： およびカナバン病において達成されている。同様な方法は、開示された様々な変異の存在に対して女性をスクリーニングする課題の発明に使用される。
【００３９】
この出願の全体にわたって、種々の刊行物がその著者および発行年により参照される。刊行物の書誌的事項の全てを以下に示す。これらの刊行物に開示される内容の全体は、本発明が係わる最高水準の技術をより完全に記述するために本出願に援用される。
【００４０】
本発明は例示的に記載され、使用された用語は限定的なものというよりむしろ記述する単語の本質を示すことを意図したものと理解されるべきである。
【００４１】
明らかに多くの本発明の修飾および変形が上記の教示を考慮して実施可能である。従って、特許請求の範囲に記載した請求項の範囲内において、本発明は上記で具体的に記載した以外の態様で実施できることが理解されるべきである。
【００４２】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１−１】
図１はＡＴＭ遺伝子（配列番号１）の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を示す図である。最初のコドンはＡＴＧ（Ｍｅｔ）で最後は停止コドン（ＴＧＡ）で、変異の全ての名称はこの配列を参照している、転写物の全体はアクセッション番号Ｕ３３８４１において見つけることができる。
【図１−２】
図１はＡＴＭ遺伝子（配列番号１）の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を示す図である。最初のコドンはＡＴＧ（Ｍｅｔ）で最後は停止コドン（ＴＧＡ）で、変異の全ての名称はこの配列を参照している、転写物の全体はアクセッション番号Ｕ３３８４１において見つけることができる。
【図１−３】
図１はＡＴＭ遺伝子（配列番号１）の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を示す図である。最初のコドンはＡＴＧ（Ｍｅｔ）で最後は停止コドン（ＴＧＡ）で、変異の全ての名称はこの配列を参照している、転写物の全体はアクセッション番号Ｕ３３８４１において見つけることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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