(57)【要約】骨髄内での血液細胞生成を支持する間質細胞は、前脂肪細胞であり、そして、骨髄脂肪細胞との機能的相互作用が、長く疑われている。アジポネクチンは、脂肪細胞生成物として近年単離され、そして、ＣｌｑならびにＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと構造類似性を有すると示されている。このアジポネクチンは、短期間の骨髄培養において骨髄分化を抑制し、そしてまた、マクロファージ機能を阻害する。ＰＣＲ分析によって、ＣＯＸ−２がアジポネクチンへのクローン化されたプレ脂肪細胞の曝露の際に誘導され、プロスタグランジンの放出を生じることが、明らかになった。これは、脂肪生成の阻害について重要である。なぜならば、ＣＯＸ−２インヒビターであるＤＵＰ−６９７は、アジポネクチンに対するプレ脂肪細胞の応答を遮断したからである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞における脂肪または脂肪細胞の数を減少させる方法であって、該方法が、有効量のアジポネクチンを脂肪細胞または脂肪細胞を含む組織に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記アジポネクチンが、患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アジポネクチンが、アジポネクチンのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アジポネクチンが、食欲を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アジポネクチンが、腸内送達のための処方物において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アジポネクチンが、非経口送達のための処方物において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記処方物が、肺送達のためである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アジポネクチンが、ヒトアジポネクチンであり、そして、前記脂肪細胞が、ヒト脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪細胞が、糖尿病を有する患者中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂肪細胞中の脂肪または脂肪細胞の数を減少させるのに有効な量のアジポネクチン投与のための、アジポネクチンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記アジポネクチンが、腸内投与のために処方される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アジポネクチンが、非経口投与のために処方される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アジポネクチンが、肺送達のために処方される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
制御性放出処方または持続性放出処方における、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アジポネクチンが、フラグメントである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アジポネクチンが、ヒトアジポネクチンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
脂肪細胞中の脂肪または脂肪細胞の数を減少させるための処方物を作製する方法であって、該方法は、薬学的キャリアを添加する工程を包含し、該処方物は、脂肪細胞または脂肪細胞を含む組織への有効量のアジポネクチンの非経口投与または腸内投与のためのものである、方法。
【請求項１８】
前記アジポネクチンが、ヒトアジポネクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジポネクチンが、アジポネクチンのフラグメントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
制御性放出処方または持続性放出処方としての処方物を作製する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、特に、アジポネクチンの投与によって、体重減少を引き起こす分野である。
【０００２】
米国政府は、Ｐａｕｌ  Ｋｉｎｃａｄｅに対する国立衛生研究所からの助成金ＡＩ４５８６４、ＡＩ３３０８５およびＡＩ２００６９に起因して、本出願の権利を有する。
【０００３】
肥満の罹患率は、大部分の先進国において流行的な割合に達しており、そして、驚くべきほどの死亡率および罹患率の統計値を有する。肥満は、潜在的に生活を脅かす多数の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病、発作、肺塞栓症および癌）に対する十分に確立された危険因子である（Ｍｅｉｓｌｅｒ  Ｊ．，Ｓｔ．Ｊｅｏｒ  Ｓ．１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．６３：４０９Ｓ〜４１１Ｓ；Ｂｒａｙ  Ｇ．１９９６．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．２５：９０７〜９１９）。さらに、肥満は、多数の慢性状態（例えば、呼吸疾患、変形性関節症、骨粗しょう症、胆嚢疾患、および異常脂肪症）を悪化させる。この問題の大きさは、体重の増加に伴い死亡率が上昇するという事実において最も反映される。アメリカ人の３５００万人に見られるように、一旦、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０ｋｇ／ｍ２を超えると、５０％よりも高い全死亡率が、肥満関連状態に起因する（ＬｅｅＬ，Ｐａｆｆｅｎｂａｒｇｅｒ  Ｒ．１９９２．ＪＡＭＡ．２６８：２０４５〜２０４９）。年間あたり３００，０００人以上の死者に起因することで、肥満は、潜在的に予防可能な死の最も一般的な原因として、喫煙に続いて第２位にランクする（ＭｃＧｉｎｎｉｓ  Ｊ．，Ｆｏｅｇｅ  Ｗ．１９９３．ＭＡ．２７０：２２０７〜２２１２）。
【０００４】
この問題に付随する衝撃的な医学的重要性は、米国における保健医療システムに対しての厳しい財政負担である。医療費および所得喪失からの肥満およびその関連疾患についての推定の経済的影響は、６８０億ドル／年を超えると報告されている（Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９２．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．５５：５０３Ｓ〜５０７Ｓ；Ｗｏｌｆ  Ａ．，Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９６．Ａｍ  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．６３：４６６Ｓ〜４６９Ｓ；Ｗｏｌｆ  Ａ．，Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９４．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ．５：３４〜３７）。これは、体重減少食品、体重減少製品および体重減少プログラムに費やされる、年間３００億ドルより多い金額を含まない（Ｗｏｌｆ  Ａ．，Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９４．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ．５：３４〜３７；Ｅｚｚａｔｉら、１９９２．Ｖｉｔａｌ  ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ［２］．１１３）。
【０００５】
１９９０年代、米国政府は、主要な国民健康の目標として、２０００年までに人口の２０％まで、肥満の罹患率を減少させることを制定することで、危機に応答した（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ．Ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｅｏｐｌｅ  ２０００：ｎａｔｉｏｎａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ．１９９０；ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＨＳ  ９０−５０２１２）。この目標にもかかわらず、米国における体重超過の罹患率は、着実に増加しており、最近のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ（１９８８〜１９９１）では、驚くべきことに３３．０％に達した（Ｋｕｃｚｍａｒｓｋｉら、１９９４．ＪＡＭＡ．２７２：２０５〜２１１）。さらに、ＢＭＩの平均はまた、この期間にわたり０．９ｋｇ／ｍ２増加した。この憂慮すべき傾向は、努力の欠如の結果として生じていない。対照的に、推定された、男性の２５％、女性の５０％および青年の４４％が、任意の所定の時間で、体重を減少させようとしている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃ．９３：４４５〜４４９）。むしろ、過去１０年にわたる３１％の比率の増加、および超過体重罹患率の８％の増加は、肥満が、現今の処置に対して周知なほどに耐性であるという事実の証明である（ＮＩＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ．１９９３．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１９：７６４〜７７０）。
【０００６】
確立されたアプローチの長期間の失敗についての主な原因は、このアプローチの誤解に基づき、そして、肥満の機構についての乏しい理解である。従来の知見は、肥満が、暴食癖の自ら招いた疾患であるということを維持していた。従って、総合的な処置プログラムは、慢性的な摂食を減少させ、そして、無数のシステムを使用して身体活性を増加させるための行動改変に焦点をあてた。これらの方法は、効力を制限し、そして、９５％を超える常習率に関連している。
【０００７】
短期間のアプローチの失敗は、肥満の病態生理学の解明の際になされた近年の進歩とともに、潜在的な長期間のアジュバント処置のような薬理学的治療の再評価を導いている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．１９９６．ＪＡＭＡ．２７６：１９０７〜１９１５；Ｒｙａｎ，Ｄ．１９９６．Ｅｎｄｏ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍｅｒ．２５：９８９〜１００４）。この仮定は、体重が、血圧と類似の生理学的に制御されたパラメーターであり、そして、肥満が、高血圧と類似の慢性疾患であるということである。長期（恐らく、生涯）の内科療法の目標は、体重減少と、続く健康食および運動と組合せた体重維持の両方を容易にすることである。このアプローチを評価するために、現在利用可能な薬物の長期間の効力は、非薬理学的処置単独の効力に対して判断されなければならない。後者のアプローチは、処置の２１週目で、８．５ｋｇの平均体重減少を生じ、そして、患者の１０％〜３０％において、４年で体重減少の５０％を維持するだけである（Ｗａｄｄｅｎ  Ｔ．１９９３．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１９：６８８〜６９３；Ｋｒａｍｅｒら、１９８９．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．１３：１２３〜１３６）。長期間（６ヶ月よりも長い）の単一薬物（Ｇｕｙ−Ｇｒａｎら、１９８９．Ｌａｎｃｅｔ．２：１１４２〜１１４４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９４  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．１８：１２９〜１３５；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９３．Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．２：９２〜９８）または組合せ治療（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｍ．１９９２．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５１：５８１〜５８５）を評価した研究のほとんどは、体重の減少におけるプラシーボと比較した場合、適度な効力を示さない。
【０００８】
脂肪代謝は、複雑である。脂肪組織に寄与する複数の機能としては、体温調節、エネルギー貯蔵、エストロゲン合成およびサイトカイン生成が挙げられる。脂肪細胞およびそれらの前駆体は、肥満に関する多くの研究の焦点であるが、これらはまた、骨髄の正常成分を構成する。実際に、脂肪細胞、造血支持間質細胞、骨芽細胞および筋細胞は、それらの組織中の共通の間葉幹細胞由来であると思われる。培養において分化の可能性を有するクローニングされた前脂肪細胞株は、分化の分子調節を理解するために、非常に価値がある。これらの前駆体から脂肪細胞形成を誘導する因子としては、インスリン、ヒドロコルチゾン、メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＢＸ）およびペルオキソーム増殖因子アクチベーターレセプター（ＰＰＡＲ）に対するリガンドが挙げられる。一方、多くの発見は、脂肪生成がまた、負のフィードバック機構を介して制御されることを示す。例えば、脂肪組織は、レプチン、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター１型（ＰＡＩ−１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β型（ＴＧＦ−β）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（脂肪細胞形成をブロックすると考えられる因子）を生成する。
【０００９】
脂肪細胞は、正常な骨髄中で顕著であり、そして造血に影響力を有することが長い間疑われている。確かに、脂肪生成は、骨髄における細胞外マトリクスおよびサイトカインの発現を変更し、直接的および間接的の両方で造血に影響する。プレ脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）は、培養物中で血液細胞の形成を支持し、そして完全に分化した脂肪細胞は、その前駆体よりも少ないＣＳＦ−１を産生する。幹細胞因子、インターロイキン−６および白血病阻害因子の発現、ならびに造血支持活性は、間質系統由来の胚の最終的な脂肪細胞の分化と共に減少した。脂肪生成を阻害する一方で、脂肪細胞産物であるレプチンは、骨芽細胞形成および造血を促進する。
【００１０】
肥満を処置または予防するために現在使用されている全ての医薬は、組織の脂肪細胞画分に指向され、そしてエネルギー利用性を減少すること、またはエネルギー出力を増加することのいずれかによって、作用する。これらの薬剤は、機構に基づいて３つのカテゴリーに分けられ得る（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．１９９６．ＪＡＭＡ．２７６：１９０７〜１９１５）。
【００１１】
（エネルギー摂取の減少）
このアプローチは、食欲を減少すること、または満腹感を増進することによって、食物摂取を減少することに関する。これらの「食欲抑制」薬物は、カテコールアミン作動性の系（アンフェタミン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン、フェンテルミン、マチンドール、ジエチルプロピオン、およびフェニルプロパノールアミン）またはセロトニン作動性の系（フェンフルラミン、デキスフェンフルラミン、フルオキセチン、セルトラリン、および他の抗鬱選択的セロトニン再取り込みインヒビター［ＳＳＲＩ］）のいずれかに対して作用することによって、神経伝達物質活性に影響する。
【００１２】
（栄養吸収の減少）
このカテゴリー中の薬物は、栄養素の消化酵素または吸収の作用を遮断する。この型の薬物の例としては、オルリスタト（ｏｒｌｉｓｔａｔ）があり、これは胃および膵臓のリパーゼ活性を阻害する（Ｄｒｅｎｔ  Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ  Ｅ．１９９５．Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．３（補遺４）：６２３Ｓ〜６２５Ｓ）。これらの医薬は、米国において実験的であり、そして肥満の処理には利用不可能である。
【００１３】
（エネルギー支出の増加）
エネルギー支出の増加は、代謝速度を増加すること（例えば、交感神経系の調子における変化または酸化的リン酸化のアンカップリングを介して）によって、達成され得る。熱生成代謝に影響する薬物としては、エフェドリン単独またはカフェインおよび／もしくはアスピリンとの組み合わせ（Ｐａｓｓｑｕａｌｉ  Ｒ．，Ｃａｓｉｍｉｒｒｉ  Ｆ．１９９３  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．１７（補遺１）：Ｓ６５〜Ｓ６８）ならびにＢＲＬ２６８３０Ａ（アドレナリン受容体アゴニスト）（Ｃｏｎｎａｃｈｅｒら、１９９２．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．５５：２５８Ｓ〜２６１Ｓ）が挙げられる。体重制御のためのこのクラスの医薬は、ＦＤＡに認可されていない。
【００１４】
現在、体重損失の促進または持続のいずれかに優れた単独の薬物レジメンは出現していない。外科的介入（例えば、胃の分割手順、空腸回腸バイパス、および迷走神経切断）もまた、重篤な肥満を処置するために開発されている（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  Ｆ．１９９６．Ｅｎｄｏ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍｅｒ．２５：１００５〜１０２７）。長期間の実施における利点にも関わらず、急性の危険性利益率（ｒｉｓｋ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｒａｔｉｏ）は、肥満手術におけるＮＩＨ意見協議による病的な肥満患者（ＢＭＩが４０ｋｇ／ｍ２よりも高い）のために、これらの侵襲性手順を留保した（ＮＩＨ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．１９９１．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１５：９５６〜９６１）。故に、彼らが深刻な肥満になり、そして付随する合併症に罹患しない限り、そして罹患するまで、外科的介入は過体重の患者の大半について代替的ではない。
【００１５】
組織の脈管の画分に指向される肥満のための医学的処置または外科的処置は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
故に、本発明の目的は、肥満を減少するための代替の処置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
近年、脂肪細胞産物として単離され、そしてＣｌｑおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーに対する構造的類似性を有することが示されたアジポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は、短期間の骨髄培養における骨髄系の分化を抑制し、そしてまたマクロファージの機能を阻害する。アジポネクチンは、培養物中の脂肪生成を劇的に阻害し、アジポネクチンが、このプロセスの通常のフィードバックインヒビターであり得ることを示唆する。ＰＣＲ分析によって、ＣＯＸ−２がアジポネクチンへのクローン化されたプレ脂肪細胞の曝露の際に誘導され、プロスタグランジンの放出を生じることが、明らかになった。これは、脂肪生成の阻害について重要である。なぜならば、ＣＯＸ−２インヒビターであるＤＵＰ−６９７は、アジポネクチンに対するプレ脂肪細胞の応答を遮断したからである。さらに、アジポネクチンに応答した脂肪細胞形成は、ＣＯＸ−２遺伝子破壊マウスにおいて欠損していた。対照的に、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、インターフェロンおよびリミチン（ｌｉｍｉｔｉｎ）として公知のインターフェロン様サイトカインの発現は、アジポネクチンによってアップレギュレートされない。アジポネクチンは、正常な骨髄内に存在し、そしてＣＯＸ−２依存性の機構を介して骨髄由来間質細胞によって、脂肪細胞の形成を阻害し得ることが示されている。これらの知見は、プレ脂肪細胞分化を調節するための新しい機構、および造血組織における脂肪の潜在的な役割を示唆する。
【００１８】
これらの結果は、脂肪細胞および関連する脂肪組織において脂肪を減少するためのアジポネクチンの使用を支持する。３２ＫＤのタンパク質もしくはその三量体、または機能的に等価なそのフラグメントのようなアジポネクチンは、脂肪の減少を達成するために、当業者に公知の方法を用いて、投与され得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．アジポネクチン処方物）
アジポネクチンは、脂肪細胞特異的分泌タンパク質であり、造血および免疫応答における可溶性防御コラーゲンのファミリーの新メンバーである。アジポネクチンは、脂肪細胞から独占的に分泌される血漿タンパク質である。健康なヒト由来の血漿において、アジポネクチンは、１．９〜１７．０μｇ／ｍＬの濃度範囲で存在する。独立して発見されたこのタンパク質の４つの群は、Ａｃｒｐ３０、ａｄｉｐｏＱ、またはマウスおよびヒトにおいて主要な脂肪細胞制限産物を表すアジポネクチンを示した（Ｓｃｈｅｒｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７４６〜２６７４９（１９９５）；Ｈｕら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０６９７〜１０７０３；Ｍａｅｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１：２８６〜２８９（１９９６）；Ｎａｋａｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）．１２０：８０３〜８１２（１９９６））。これはまた、ヒト血清から単離され、そしてＧＢＰ２８といわれる。アジポネクチンの産生は、脂肪細胞へのプレ脂肪細胞の分化と共に増加し、そしてＴＮＦ−αによって阻害される。脂肪細胞は、このタンパク質を放出するために、特別な分泌区画を利用する（Ｂｏｇａｎ，Ｊ．Ｓ．，およびＬｏｄｉｓｈ，Ｈ．Ｆ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４６：６０９〜６２０（１９９９））。
【００２０】
アジポネクチンは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）−顆粒球マクロファージ、ＣＦＵ−マクロファージ、およびＣＦＵ−顆粒球からのコロニー形成を抑制するが、バースト形成単位−赤血球または混合された赤血球−骨髄ＣＦＵのコロニー形成には影響しない。アジポネクチンはまた、９株中４株の骨髄細胞株の増殖を阻害するが、１つの細胞株を除く赤血球細胞株またはリンパ球細胞株の増殖を抑制しない。これらの結果は、アジポネクチンが、骨髄単球系統の細胞の増殖を優先的に阻害することを示唆する。少なくとも１つの増殖阻害の機構が、アポトーシスを誘導する。なぜならば、アジポネクチンでの急性骨髄単球性白血病株の処置は、二倍体未満の（ａｕｂｄｉｐｏｌｄ）ピークの出現およびオリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメント化を誘導するからである。骨髄単球の前駆体の増殖を阻害することは別として、アジポネクチンは、成熟マクロファージ機能を抑制する。アジポネクチンでの培養されたマクロファージの処理は、その食作用活性およびその腫瘍壊死因子−αのリポ多糖誘導性の生成を有意に阻害する。アジポネクチンによる食作用の抑制は、補体Ｃｌｑレセプター（ＣｌｑＲｐ）の１つによって媒介される。なぜならば、この機能は、抗ＣｌｑＲｐモノクローナル抗体の添加によって完全に抑制されるからである（Ｙｏｋｏｔａ，Ｂｌｏｏｄ．９６：１７２３〜１７３２（２０００））。これらの観察は、アジポネクチンが造血系および免疫系において重要なネガティブレギュレーターであること、ならびにアジポネクチンがその阻害機能を介して炎症応答を終了させることに関することを示唆する。
【００２１】
アジポネクチンは、コラーゲン様配列が続く短い非コラーゲン性Ｎ末端セグメントを含む２４４個のアミノ酸残基からなる。Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１（２），２８６〜２８９（１９９６）ＭＥＤＬＩＩＮＥ  ９６２２４１７１。アジポネクチンは、サイズおよび全体の構造が、補体タンパク質Ｃｌｑに類似し、得にＣ末端の球状ドメインで相同性が高いホモ三量体である。アジポネクチンの結晶構造は、同じドメインとＴＮＦ−αとの間のさらに高い類似性を明らかにした。これらの構造的特徴は、アジポネクチンが、可溶性防御コラーゲンとして同定されたタンパク質のファミリーに属することを示唆し、そして補体Ｃｌｑならびに、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、肺界面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）、肺界面活性タンパク質Ｄ、およびコングルチニンの集合体を含む。コレクチン（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ）は、生得的な体液性免疫系において重要な役割を果たす。これらのタンパク質は、微生物上に特有に存在する特定の糖質構造を検出することによって外来性の病原体を同定し得、その後、食作用細胞、または抗体の関与なしに標的の殺傷およびクリアランスをもたらす補体系と相互作用する。コレクチン発現の欠損または低レベルのコレクチン発現は、特に、種々の病原体に対する特異的な免疫系が完全に発達していない乳幼児において、感染に対する感受性を増加する。
【００２２】
グルコース代謝および脂質代謝に対するその影響のために、アジポネクチンは、糖尿病および肥満に適用される。以下に記載されるように、正常なヒト骨髄における褐色脂肪がこのタンパク質を含むことが、見出されている。組換えアジポネクチンは、長期間の骨髄培養物における脂肪細胞形成を遮断し、そしてクローン化間質プレ脂肪細胞の分化を阻害した。アジポネクチンはまた、これらの間質細胞によってシクロオキシゲナーゼ−２の発現を上昇させ、そしてプロスタグランジンＥ２の放出を誘導した。シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターであるＤｕｐ−６９７は、プレ脂肪細胞の分化に対するアジポネクチンの阻害作用を妨げ、間質細胞由来のプロステノイドの関与を示唆した。さらに、骨髄細胞が、Ｂ６、１２９Ｓ−Ｐｔｇｓ２ｔｍ１Ｊｅｄ（シクロオキシゲナーゼ−２＋／−）マウス由来の場合、アジポネクチンは、脂肪細胞生成を遮断し損なう。これらの観察は、プレ脂肪細胞がアジポネクチン作用についての直接的な標的を表し、脂肪調節のためのパラクリンネガティブフィードバックループを確立することを示す。これらはまた、アジポネクチンを、このプロセスにおいて重要なシクロオキシゲナーゼ−２依存性プロスタグランジンに連結させる。
【００２３】
アジポネクチンの正常な生物学的活性は、ほとんど理解されていないが、知見は、肥満、心血管疾患および糖尿病に潜在的に関与することを示唆する。産生および循環するタンパク質濃度は、肥満のマウスおよびヒトにおいて抑制されている（Ｈｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０６９７−１０７０３２（１９９６）；Ａｒｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７：７９−８３（１９９９））。低い血漿レベルは、冠状動脈性心疾患における危険因子であり得、濃度はまた、２型糖尿病において有意に減少される（Ｏｕｃｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１００：２４７３−２４７６（１９９９）；Ｈｏｔｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５０：１１２６−１１３３（２００１））。グルコースを低減させそしてインスリン耐性を逆転させるアジポネクチンの能力は、糖尿病薬物としての適用を有し得ることを示唆する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：９４１−９４６（２００１）；Ｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：９４７−９５３（２００１））。さらに、タンパク質分解性により切断されたアジポネクチンのフラグメントは、肥満動物における体重減少を引き起こすことが示されている（Ｆｒｕｅｂｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８：２００５−２０１０（２００１））。このタンパク質は、少なくとも４つの細胞型を直接的にかまたは間接的に影響を及ぼす。アジポネクチンは、単球に対するその接着性が減少したことにおそらく起因して、ヒト動脈内皮細胞におけるＮＦ−κＢ媒介性シグナルを調節する（Ｏｕｃｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０２：１２９６−１３０１（２０００））。このタンパク質は、骨髄前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の分化を抑制し、そして２つの単球細胞株に対する別々の効果を有する（Ｙｏｋｏｔａ、Ｂｌｏｏｄ．９６：１７２３−１７３２（２０００））。アジポネクチンは、これらの細胞の生存を低減させ、そしてＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−α産生をブロックする。これは、正常なマクロファージ上のＣ１ｑＲｐレセプターを利用し、食作用粒子に対するそれらの能力をブロックするようである（Ｙｏｋｏｔａ  ２０００）。アジポネクチンのインタクトな形態または切断された形態は、処置されたマウスにおける筋肉細胞による脂肪酸酸化の増加を生じる（Ｆｒｕｅｂｉｓ  ２００１）。このタンパク質はまた、肝細胞において代謝変化を誘導する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００１；Ｂｅｒｇら、２００１）。さらに、アジポネクチンは、肝細胞前駆体のクローニングアッセイにおいて骨髄造血をブロックすることが見出された（Ｙｏｋｏｔａ  ２０００）。実施例は、組換えアジポネクチンが、複合体化した長期骨髄培養物（ＬＴＢＭＣ）における脂肪細胞形成をブロックすることを実証する。この応答は、プレ脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）におけるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２およびプロスタグランジン（ＰＧ）の誘導により生じるようである。
【００２４】
マクロファージは、炎症性サイトカインの分泌、食作用活性および抗原提示による免疫応答において重要な役割を担う。これらの結果は、アジポネクチンが、成熟マクロファージの食作用およびＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α発現を阻害することを示し、そしてアジポネクチンが、抗炎症性効果を有し得ることを示唆する。アジポネクチンのマクロファージ機能に対するこれらの阻害効果は、マクロファージ細胞を殺傷することに起因するのではない。なぜなら、成熟マクロファージの生存性は変化しなかったからである。アジポネクチンが、ＬＰＳで刺激されたマクロファージにおけるＴＮＦ−α産生およびＴＮＦ−α遺伝子発現を取り消す機構は、明らかでないままである。動力学研究は、アジポネクチンがＬＰＳを直接中和したりＬＰＳレセプターをブロックしたりするのではないようであることを示す。ＬＰＳによって誘導されるＩＬ−１β遺伝子およびＩＬ−６遺伝子の発現は、アジポネクチンでの処置によって影響を受けず、このことは、マクロファージに対するアジポネクチンレセプターからのシグナルが、ＬＰＳ刺激によって引き起こされるＴＮＦ−α遺伝子転写を減弱することを示唆する。いくつかのサイトカインは、マクロファージにおけるＴＮＦ−α合成を抑制することが見出され、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、ＬＰＳ刺激されたヒトマクロファージにおけるＴＮＦ−α合成を阻害し得る炎症性応答を抑制する。アジポネクチンとは対照的に、ＩＬ−４およびＩＬ−１０はまた、ＩＬ−１およびＩＬ−６の合成を阻害する。ＴＧＦ−βは、マクロファージにおいてプロ炎症性サイトカイン産生を阻害することが知られているが、ＴＮＦ−α分泌のその阻害は、転写後に生じる。よって、アジポネクチンは、ＴＮＦ−α転写の特異的阻害に起因して、炎症性応答の独特なサプレッサーであるようである。
【００２５】
炎症に関連する生理的物質の中で、Ｅ型プロスタグランジン（ＰＧＥ）は、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−Ｍ由来のコロニー形成を阻害するが、ＢＦＵ−Ｅ由来のコロニー形成は阻害しないことが示された。さらに、ＰＧＥ２は、ＴＮＦ−α産生を阻害するが、ＩＬ−１αまたはＩＬ−２βの産生を阻害しないことが報告された。アジポネクチンの標的細胞および機能は、ＰＧＥのものと類似し、そして現在、アジポネクチンが、少なくとも１つの細胞型において、ＣＯＸ２のアップレギュレートを介するＰＧＥ合成を誘導し得ることが、明らかである（以下を参照のこと）。よって、アジポネクチンは、ＰＧＥを含む機構による造血、脂質生成および免疫応答に影響し得る。
【００２６】
アジポネクチンが脂肪細胞の産生を阻害することを示すデータに基づいて、アジポネクチンは、体重減少をもたらすに有用であり、抗炎症剤として有用である。アジポネクチンは、全体で２４４アミノ酸のタンパク質、または本明細書中に記載されたアッセイにおいて実証されたその活性を残すフラグメントとして投与され得る。機能的分析に基づいて、各サブユニット、およびトリマー形態が効果的であることが予想される。機能的ドメインを含むフラグメントもまた有用である。アミノ酸の保存的置換がまた、生物学的活性を優位に変化させることなくなされ得る。本明細書中で使用される場合、保存的置換とは、あるアミノ酸を同様のサイズおよび／または電荷を有する別のアミノ酸へ置換させることをいう。
【００２７】
（Ｂ．投与のためのキャリア／経路／手段）
薬物は、非経口的または経腸的に投与され得る。好ましい実施形態において、薬物は、必要ならば、胃を通過する間その薬物を保護するための腸溶性キャリア中で、経口的に投与され得る。送達の代替法としては、静脈内送達、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｔｏｎｅａｌ）送達、肺の送達、鼻の送達、経口腔送達または他の経膜（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）送達、および徐放性処方物が挙げられる。
【００２８】
アジポネクチンは、例えば、任意の医薬調製物中で別々の粒子または微粒子の形態をとり得るような様式で吸収されたか、吸収されてそこに接着されたか、分散されたかまたは懸濁された特定の物質、ならびに／あるいは、キャリア（例えば、軟膏、ゲル、ペースト、ローションまたはスプレー）中に懸濁または溶解された特定の物質と、任意の物理的形態で「結合」され得る。
【００２９】
アジポネクチンは、通常薬学的に受容可能なキャリアと組合わせて投与される。薬学的キャリアは、当業者に公知である。適切なキャリアは、典型的には、投与の様式に基づいて選択される。薬学的組成物はまた、１つ以上の活性成分（例えば、抗微生物剤、抗炎症性剤および鎮痛剤）を含み得る。
【００３０】
非経口投与または注射による投与のための調製物は、滅菌した水溶液または非水溶液、懸濁物およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注入可能な有機エステル（例えば、エチルオレアート）が挙げられる。水性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁物（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。好ましい非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム水溶液、デキストロースリンガー液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養素の補充物（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）ならびに電解質の補充物（例えば、デキストロースリンガー液に基づくもの）が挙げられる。
【００３１】
局所（口、肺、鼻、膣または直腸を含む粘膜表面への適用を含む）投与のための処方物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末を含み得る。これらの適用のための処方物は、公知である。例えば、薬物またはポリマーもしくは界面活性剤と組合わせた薬物から構成される、１〜３ミクロンの空力（ａｅｒｏｄｙｎａｎｍｉｃ）直径を有する粒子を有する粉末を処方するためにスプレー乾燥を典型的に使用して、多くの肺処方物が、開発されている。
【００３２】
経口投与のための組成物としては、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁物もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が挙げられる。シックナー、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が、好ましい。
【００３３】
本明細書中で記載される場合、ペプチドがまた、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸）と有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）と有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミンおよびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応、によって形成される薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として、投与され得る。
【００３４】
徐放性または持続性（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）のための多くの処方物が公知であり、そして市販されている。これらは、典型的には、薬物の徐放性を提供するために作製される生分解性ポリマー材料またはポリマー材料で構成される。徐放性組成物は、好ましくは、微粒子処方物である。微粒子は、好ましくは、加水分解によって分解する生分解性、生体適合性のポリマー（例えば、ポリラクチド）を含む。微粒子系に加えて、他の徐放性の注入可能または移植可能な処方物が使用され得る。分解可能な賦形剤または分解不可能な賦形剤が、注入可能または移植可能な徐放性処方物の処方において使用され得るが、分解可能な賦形剤が好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「微粒子」は、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルを含む。微粒子は、好ましくは、生分解性および生体適合性であり、そして必要に応じて、化合物の送達について制御された速度で生分解され得る。この粒子は、種々のポリマー性材料および非ポリマー性材料で作製され得る。
【００３５】
微粒子は、任意の生体適合性のポリマー、コポリマー、または混合物、好ましくは、生分解性のポリマー、コポリマー、または混合物を含み得る。適切なポリマーとしては、ポリヒドロキシ酸、ポリオルソエステル、ポリラクトン、ポリカーボネート、ポリホスファゼン、ポリサッカリド、タンパク質、ポリアンヒドリド、これらのコポリマーおよびこれらの混合物が挙げられる。適切なポリ（ヒドロキシ酸）としては、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびこれらのコポリマーが挙げられる。好ましくは、微粒子は、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）および／またはポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）を含む。好ましい材料は、ポリラクチドである。
【００３６】
微粒子は、単一または二重のエマルジョン溶媒蒸発、スプレー乾燥、溶媒抽出、溶媒蒸発、相分離、単一および複合体のコアセルベーション、界面重合、および当業者に周知の他の方法を使用して、調製され得る。薬物送達のためのミクロスフェアを作製するために開発された方法は、文献（例えば、Ｄｏｕｂｒｏｗ，Ｍ．編、「Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２）に記載されている。ミクロスフェアを作製する方法について、Ｔｉｃｅらに対する米国特許第５，４０７，６０９号、およびＨｅｒｂｅｒｔらに対する米国特許第５，６５４，００８号もまた参照のこと。
【００３７】
微粒子系に加えて、偽妊娠を誘導する化合物を送達するために適切な他の制御された放出をする注射可能処方物または移植可能処方物は、使用され得る。分解可能な賦形剤および分解不能な賦形剤の両方は、注射可能または移植可能な制御された放出をする処方物の処方において使用され得るが、分解可能な賦形剤が、好ましい。
【００３８】
注射可能な処方物の例としては、油状賦形剤およびろう状賦形剤を用いて調製された典型的なデポー（ｄｅｐｏｔ）処方物（例えば、Ｄｅｐｏｔ  ＰｒｏｖｅｒａＴＭに類似）および酢酸スクロースイソブチレートまたは生分解性ポリマーを用いて調製されたインサイチュゲル化系のようなものが挙げられる。移植可能な処方物の例としては、ウシにおける増殖プロモーターの制御された放出について使用される処方物のような圧縮錠剤処方物（例えば、ＳｙｎｏｖｅｘＴＭ）、およびＣｏｍｐｕｄｏｓｅＴＭ（エストラジオールを含有する薬物を添加したシリコーンゴムの薄層で被覆されたシリコーンゴムコア）が挙げられる。１つの実施形態において、生分解性ゲルおよび／または生分解性移植物が、使用され得る。
【００３９】
適切な処方物は、上記の任意のアプローチおよび代表的な薬学的賦形剤を使用して当業者によって開発され得る。
【００４０】
（Ｃ．投薬：）
アジポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は、脂肪細胞もしくはそれに関連した組織の大きさおよび／または増殖を調節するために有効な量で投与される。この有効量は、代表的には、脂肪細胞の脂肪含量もしくは脂肪細胞の生存度もしくは細胞形成もしくは増殖を制限するか、または脂肪組織を減少させるのに効果的な量である。本明細書中において使用される組成物は、患者を処置するために有効量のアジポネクチンを含み、実質的に全身毒性もなく所望の調節を達成する。
【００４１】
（ＩＩ．処置の方法）
（Ａ．提案される処置スケジュール）
アジポネクチンインヒビターは、脂肪含量および／または脂肪細胞の数の減少をもたらす量ならびに期間で投与される。この後者は、アポトーシス、それ程分化していない細胞の分化の減少、および／または増殖の減少によって減少され得る。肥満症の処置についての好ましい実施形態において、患者は、体重を維持レベルまで減少させるのに効果的な投薬で１日に１度薬物を受ける。
【００４２】
（Ｂ．患者のタイプ）
処置方法は、正常な過体重の個体および遺伝的欠陥を有する個体の両方に適用可能であるべきである。この方法はまた、ホルモン性欠陥もしくは代謝性欠陥または薬物の副作用に起因する体重増加に関わるほとんどの場合において有用である。体脂肪の減少の促進に加えて、除脂肪体重の維持および長期投与の間に体重減少を持続し得るが、処置の他の利点は、肥満関連糖尿病において血中グルコースレベルの正常化を含み、そしてまた食欲を減少させるために（すなわち、食欲抑制剤として）使用され得る。
【００４３】
本発明は、さらに、以下の非限定的な例に対する参照によって理解される。
【実施例】
【００４４】
（実施例１：アジポネクチンは、ＬＴＢＭＣにおいて脂肪細胞形成を阻害する）
（方法および材料）
（組換えアジポネクチンの作製および特徴付け）
ヒト組換えアジポネクチンは、Ａｒｉｔａら、１９９９によって記載されるように調製された。簡単には、ペプチドリーダー欠損タンパク質をコードする６９３−ｂｐのアジポネクチンｃＤＮＡを、ｐＥＴ３ｃ発現ベクター中にサブクローン化し、そして宿主Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）を形質転換するために使用した。組換えアジポネクチンの合成を、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドによって誘導した。細菌細胞を、ペレット化し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度０．２％）で１時間懸濁し、そして超音波処理した。懸濁した緩衝液を、遠心分離し、次いでペレットを、同じ溶液で洗浄した。このペレットを、沈澱させ、そして７ＭグアニジンＨＣｌおよび１％  β−メルカプトエタノールを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で可溶化した。可溶化したタンパク質を、２００容量の２Ｍ尿素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の存在下で、４℃で３日間リフォールディングさせた。リフォールドしたタンパク質を、遠心濾過により濃縮し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で透析し、そして２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で平衡化し、ＮａＣｌ（０〜１Ｍ）の線形勾配を用いるＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏ，Ｊａｐａｎ）によって精製した。アジポネクチンの純度を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアジポネクチン特異性モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングを使用した。アジポネクチンの多量化形態およびそれらの式量の分布を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって試験した。組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をまた、Ｅ．ｃｏｌｉから調製し、そしてコントロールとして用いた。このタンパク質を、ＰＢＳで透析し、そして培養物中１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。細胞の超音波処理工程の後、全ての手順を、エンドトキシンのない緩衝液中で実施し、そして最終のエンドトキシン濃度を、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｐｙｒｏｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって調べ、０．０７ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００４５】
（試薬）
ヒトインスリンを、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＭＩＢＸを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＰＧＥ２およびＤｕｐ−６９７を、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入し、１×１０−６Ｍ濃度で使用した。
【００４６】
（組織、細胞およびマウス）
正常ヒト骨髄を、インフォームドコンセントとともに健康な若年ボランティアの後腸骨稜からの生検によって収集し、アジポネクチンの免疫組織化学分析のために使用した。ＢＭＳ２細胞および３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を補充したＤ−ＭＥＭ（高グルコース）中で維持した。ＭＳ５細胞を、１０％ＦＣＳを補充したα−ＭＥＭ培地中で維持した。３〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＥ）から入手した。Ｂ６，１２９Ｓ−Ｐｔｇｓ２ｔｍ１Ｊｅｄ（ＣＯＸ−２＋／−）マウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（３〜５週齢）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。これらの実験において、高い死亡率および入手困難性が、ホモ接合のＣＯＸ＋／−動物の使用を不可能にしたが、単一の標的化対立遺伝子は、アジポネクチンに対する前脂肪細胞の応答を抑制した。
【００４７】
（骨髄におけるアジポネクチン発現）
アジポネクチンタンパク質の発現を、９１０８モノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光法によって正常ヒト骨髄検体において試験した。ＲＴ−ＰＣＲを、総ヒト骨髄ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したｃＤＮＡ中のアジポネクチン転写物を検出するために使用した。このオリゴヌクレオチドプライマーは、アジポネクチンについて、５’−ＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＡＴＧＴＣＴＣＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号２）、ならびにβ−アクチンについて、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧ−３’（配列番号３）および５’−ＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号４）であった。
【００４８】
（ＬＴＢＭＣ）
骨髄性細胞の形成を支持するＬＴＢＭＣ（Ｄｅｘｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を、公開された方法によって惹起し、そして維持した（Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．およびＴｅｓｔａ，Ｎ．Ｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：３８７〜４０５（１９７６））。正常Ｂａｌｂ／ｃマウスの骨髄細胞（１２×１０６）を、２５ｃｍ２フラスコにおいて５％  ＣＯ２中３３℃で培養した。α−ＭＥＭから構成される培地を、１００ｎＭヒドロコルチゾンおよび２０％ウマ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）で補充した。培養物を、培養物の惹起の始めおよびその後６週間にわたって毎週、アジポネクチンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理した。いくつかの実施形態において、アジポネクチンを、培養６週間後の培地から取り除き、そして培地のみでさらに６週間維持した。
【００４９】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて種々の期間アジポネクチンで処理したＭＳ５細胞またはＢＭＳ２細胞から単離し、そしてＤＥＰＣで処理した水中に懸濁させた。総ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で処理した後、ｃＤＮＡを、ランダムな６量体およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて作製した。ＰＣＲについて、上記の１０μｌのＲＴ混合物を、ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、ならびに関連するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含有する）に添加した。ＰＣＲ反応混合物中のＤＮＡを、２５〜３５サイクル（９４℃で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で３分間）を用いて増幅させた。これらの反応について使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＯＸ−２について、５’−ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴ−３’（配列番号６）、ならびにＣＯＸ−１について、５’−ＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＧＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号７）および５’−ＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号８）であった。ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α／β／γ、およびリミチン（ｌｉｍｉｔｉｎ）についてのプライマーもまた、調製し、そしてこの研究において使用した。
【００５０】
（ノザンブロット分析）
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて望ましいサンプルから調製した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡのアリコート（２μｇ）を、ホルムアミドおよびホルムアルデヒド中６５℃で変性させ、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で電気泳動した。ナイロン膜（ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｕｒｏｕｇｈ，ＭＡ）への毛細管移動の後、ＲＮＡを、ＵＶ曝露によって架橋した。ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質−α（Ｃ／ＥＢＰ−α）および脂肪細胞Ｐ２（ａＰ２）についてのｃＤＮＡプローブを、それぞれＲｅｓＧｅｎＴＭ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＰＰＡＲ−γ、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２に対応するサイズを有するプローブを、ＰＣＲ産物として調製し、そして全てのプローブを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入したランダムプライム標識化システム（Ｒｅｄｉ  ＰｒｉｍｅＴＭ  ＩＩ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで放射標識した。
【００５１】
（ＰＧＥ２についての酵素−イムノアッセイ）
２４ウェルプレート中で調製したコンフルーエントなＭＳ５細胞またはＢＭＳ２細胞を、アジポネクチンがあるかなしかの５００μｌの培地中でインキュベートした。これらの培養物由来の上清を、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した酵素−イムノアッセイキットを用いてＰＧＥ２の存在について試験した。
【００５２】
（脂肪細胞分化）
ＢＭＳ２細胞の脂肪細胞への分化を、５μｇ／ｍｌのインスリンおよび０．５ｍＭのＭＩＢＸで１０日間処理することによって達成した。ＭＳ５細胞の脂肪細胞への分化を、５μｇ／ｍｌのインスリンのみで１５日間処理することによって達成した。培養物を、培養開始時からアジポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、ＰＧＥ２、またはＤｕｐ−６９７で処理した。この段階の終わりに、培養物を撮影し、次いで脂肪細胞分化の脂肪蓄積表示を検出するために、ナイルレッドで染色した。分化の程度を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって推定した。
【００５３】
（接着性骨髄細胞培養物）
接着性骨髄細胞培養物を、ヘテロ接合性ノックアウトＣＯＸ−２＋／−マウスまたは正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて設定した。ＢＭ細胞を、６ｍｌのデクスター培養培地あたり２×１０５個懸濁させ、そして２５ｃｍ２のフラスコに播種した。この細胞濃度によって、骨髄製細胞の増殖なしに、接着性間質層が生じる。培養物を、培養開始時およびその後６週間、毎週、アジポネクチンまたはＢＳＡで処理した。
【００５４】
（結果）
成人骨髄（胎児組織および新生児組織に類似）は、褐色脂肪を含む。アジポネクチンは、もともと皮下脂肪（ｓｕｂｃｕｔａｎｏｕｓ  ｗｈｉｔｅ  ｆａｔ）の産物として発見され、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、成人骨髄においても発現するかを決定した。このアジポネクチン特異的プライマーは、正常な成人骨髄ｃＤＮＡからの増幅産物を生じた。増幅の特異性をＰＣＲ産物の配列決定によって確認した。アジポネクチン特異的モノクローナル抗体をまた使用して、タンパク質が、ヒト骨髄に存在するかを決定した。この組織中の大量の脂肪細胞に関連する特異的な染色が、見出された。
【００５５】
単量体組換えアジポネクチンは、３２ｋＤの見かけの分子量を有する。非還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる６４ｋＤのバンドおよびかすかな９６ｋＤのバンドがまた、観察され、これらは、それぞれ二量体アジポネクチンおよび三量体アジポネクチンに対応した。１０２ｋＤのマーカー上では、バンドは検出されなかった。６４ｋＤおよび９６ｋＤのバンドは、還元性条件下において消失し、３２ｋＤのバンドのみが残った。アジポネクチン特異的モノクローナル抗体は、ウェスタンブロットによって両条件において全てのバンドを認識した。三量体よりも大きい多量体構造は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されなかったが、ゲル濾過クロマトグラフィーは、三量体を超える式量を有する組換えアジポネクチンの広範な分布を示した。この多量体特徴は、ヒト血漿中のネイティブのアジポネクチンと一致し（Ａｒｉｔａ  １９９９）、そしてネイティブのＡＣＲＰ３０もしくは組換えＡＣＲＰ３０、アジポネクチンのマウスホモログと一致した（Ｓｃｈｅｒｅｒら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６７４６−２６７４９（１９９５）；Ｆｒｕｅｂｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８：２００５−２０１０（２００１））。
【００５６】
アジポネクチンが、血球形成に影響したか否かを決定するために、ＬＴＢＭＣを、この因子の存在下および非存在下において設定した。典型的には、脂肪細胞が接着層ではっきりと見える、骨髄細胞生成に好ましい条件を選択した。骨髄造血に対する影響は見られなったが、培地中のアジポネクチンの封入は、完全に脂肪細胞形成を阻害した。タンパク質を除去する場合に、このタンパク質のネガティブな影響は、可逆的であり、そして正常な数の脂肪細胞が産生された。どの細胞がアジポネクチンによって影響を受けるかを決定し、潜在的な調節機構を探索するためにさらなる研究を行った。
【００５７】
骨髄培養物は、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージおよび内皮細胞からなる接着性間質層との相互作用によって成熟する造血細胞の複合混合物を提示する。３回の前脂肪細胞株での実験は、前脂肪細胞が骨髄培養物中のアジポネクチンの１つの標的であり得ることを示唆した。インスリンを脂肪生成誘導化薬剤として加えた場合、３Ｔ３−Ｌ１細胞株は、脂肪細胞を急速に産生し、そしてこの応答は、アジポネクチンによってごくわずか阻害された。しかし、実質的な抑制を、ＭＳ５クローンおよびＢＭＳ２クローンによって見出した（以下を参照のこと）。これらの実験は、前脂肪細胞が、この脂肪細胞生成の直接的な標的であり得ることを示す。
【００５８】
（実施例２：アジポネクチンは、シクロオキシゲナーゼ−２およびＰＧＥ２の合成を誘導する）
ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、インターフェロンおよびＰＧＥ２は、脂肪細胞生成を阻害することが以前に示された、脂肪細胞産物である。従って、これらの誘導をＲＴ−ＰＣＲ分析によって、アジポネクチン処理した前脂肪細胞についてスクリーニングした。ＴＮＦ−αまたはインターフェロンβに対応する転写は、アジポネクチンを培養物に加えた場合でさえもＭＳ５細胞中で検出不可能であった。決められた範囲内のＴＧＦ−β、インターフェロンα／β／γ、および新規のインターフェロン様サイトカインの基底発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能であったが、明らかにアジポネクチンに影響されなかった。対照的に、ＣＯＸ−１ではなく、ＣＯＸ−２の転写物は、ＭＳ５またはＢＭＳ２間質細胞クローンのいずれかのアジポネクチン処理によって上方制御されたことが、一貫して見出された。これらの知見を、ノーザンブロット分析によって確認した。ＰＧＥ２は、脂肪生成を阻害することが知られており、そしてその産生のためのＣＯＸ−２に依存する基質である。従って、ＢＭＳ２細胞またはＭＳ５細胞を、アジポネクチンまたはＢＳＡのいずれかを加える前に、コンフルーエンスさせた。これらの培養物の上清中のＰＧＥ２濃度を、指定時間において、ＥＬＩＳＡによって評価した。アジポネクチンは、一貫して、ＰＧＥ２分泌の約２倍の増加を引き起こした。従って、プロスタグランジン合成は、アジポネクチンによる脂肪合成の阻害についての潜在的な機構を示す。
【００５９】
（アジポネクチンに対する前脂肪細胞の応答は、ＣＯＸ−２を必要とする）
２つの実験アプローチを使用して、アジポネクチンによる脂肪細胞形成の阻害についてのＣＯＸ−２の重要性を評価した。ＢＭＳ２細胞をＭＩＢＸおよびインスリンと共に培養して強力な脂肪細胞形成を誘導し、そしてこの応答を、培地中へのＰＧＥ２の封入によって予想されるようにブロックした。アジポネクチンはまた、脂肪生成をブロックしたが、その一方、コントロールＧＳＴ融合タンパク質は、影響を受けなかった。アジポネクチンによる阻害は、特異的ＣＯＸ−２インヒビターであるＤｕｐ−６９７が存在する場合、観察されなかった。Ｄｕｐ−６９７のみの封入は、脂肪細胞形成に影響を及ぼさなかった。目に見える脂肪の液滴の蓄積は、ＰＧＥ２またはアジポネクチンによってブロックされたが、インスリンとＭＩＢＸの組み合わせはなお、培地のみでの培養物中の形態学変化と比較して、接着層における形態学変化を引き起こす。従って、同じ培養物のフローサイトメトリーおよびナイルレッド染色を使用して、顕微分析を延長した。インスリンおよびＭＩＢＸに誘導された脂肪蓄積は、ＰＧＥ２またはアジポネクチンのいずれかによって完全にブロックされた。アジポネクチンに対する応答を、ＣＯＸ−２インヒビターの封入によって実質的にブロックした。脂肪細胞遺伝子発現分析によって細胞形態学および脂肪蓄積結果を確認した。脂肪形成のために重大なＣ／ＥＢＰ−αおよびＰＰＡＲ−γの２つの転写因子は、ＢＭＳ２前脂肪細胞においては、弱く発現されただけであったが、インスリンおよびＭＩＢＸによって激しく誘導された。ＰＧＥ２またはアジポネクチンのいずれかは、これらの増加を強力に阻害し、そしてＤｕｐ−６９７はさらに、アジポネクチンによる誘導を抑止した。この結果は、脂肪細胞選択性脂肪酸結合タンパク質ａＰ２の転写物と非常に類似であった。
【００６０】
次いで、接着性骨髄細胞培養物を、野生型マウスまたはヘテロ接合性ノックアウトＣＯＸ−２＋／−マウスを用いて、大量の脂肪細胞の形成に好ましい条件下で調製した。アジポネクチンは、正常Ｃ５７ＢＬ／６骨髄の培養物中で脂肪生成をブロックしたが、ＣＯＸ−２＋／−動物由来の細胞に対しては最小限度の効果が存在した。これらの結果は、アジポネクチンが、ＣＯＸ−２の誘導を必要とする機構を介して、脂肪細胞前駆体からの脂肪細胞の形成を直接的にブロックすることの強い証拠を提供する。
【００６１】
このデータは、ＣＯＸ−２依存性プロスタノイド経路が、脂肪細胞形成におけるアジポネクチンの抑制性活性に重要であることを示す。アジポネクチンに対するＣＯＸ−２＋／−マウスからの前脂肪細胞の応答は、無視できた。生存性の乏しいホモ接合性ＣＯＸ−２＋／−マウスは、実験中にそれらの使用が不可能となり、そしてヘテロ接合体のアジポネクチン無応答性は、実質的な遺伝子線量効果を示唆する。さらに、ＣＯＸ−２阻害性化合物は、クローン化された前脂肪細胞の培養物中の脂肪細胞形成の阻害をブロックした。ＣＯＸ−２は、炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインまたはホルモン応答して中で誘導され、そしてＰＧの生合成における律速酵素である。これは、アラキドン酸のＰＧＨ２への変換を媒介し、続いて、特定の合成によって種々のＰＧに転換される。ＰＧは、複雑な方法で脂肪細胞形成に寄与するようである。例えば、２つの主用なＰＧ（ＰＧＥ２およびプロスタサイクリン（ＰＧＩ２））は、脂肪細胞によって合成され、脂肪生成と反対の作用を有するようである。ＰＧＥ２は、ｃＡＭＰ産生を減少することによって、脂肪細胞の発達をネガティブに調節することが示された。逆に、ＰＧＩ２は、脂肪細胞アゴニストとして提案される。このデータは、骨髄脂肪細胞分化に対するＰＧＥ２の抑制効果を確認し、そしてさらに、アジポネクチンが有する脂肪生成に対する抑制作用への重要な寄与を示す。脂肪細胞の発達に影響を及ぼす他のＰＧとしては、ＰＧＪ２が挙げられ、これは、脂肪生成転写因子ＰＰＡＲ−γについての重要なリガンドである。このプロスタグランジンは、脂肪細胞分化を促進する。対照的に、ＰＧＦ２は、３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪生成分化を阻害する。さらに、逆の作用を有するＰＧが、ＰＧＨ２（ＣＯＸ−２産物）から合成される。この３Ｔ３−Ｌ１株は、インスリンが唯一の誘導因子である標準的な培養培地中で脂肪細胞を産生し、そしてこの分化は、アジポネクチンまたはＰＧＥ２のいずれかを加えることによって最小限に影響を受けた。３Ｔ３−Ｌ１細胞のアジポネクチン感応性前脂肪細胞との比較は、誘導性遺伝子について参考になるべきであり、そして正常組織中の脂肪細胞における機能的異質性を明らかにすることができた。
【００６２】
他の２つの脂肪細胞産物であるアグーチおよびアンジオテンシンＩＩ（ＡＧＴ  ＩＩ）は、肥満に、ポジティブに寄与することが知られている。アグーチは、カルシウム流入依存性様式（ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｆｌｕｘ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）において培養された脂肪細胞中で、脂肪酸およびトリグリセリド合成を誘導する。ＡＧＴ  ＩＩ発現は、栄養的に調節され、高脂肪食および多量の脂肪を併せ持つ脂肪酸に伴って増加する。アジポネクチン発現はまた、食事制限によって影響を受けるが、その傾向は、ＡＧＴ  ＩＩの発現に関しては反対である（Ｙａｍａｕｃｈｉら  ２００１）。ＡＧＴ  ＩＩは、成熟脂肪細胞からのＰＧＩ２の放出を刺激することによって、脂肪細胞分化を促進する。従って、ＰＧ合成は、脂肪細胞分化における脂肪細胞産物のパラ分泌作用に不可欠な役割を担うようである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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