(57)【要約】【課題】インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因分析方法、実施に適した装置およびかかる方法に適した増幅プライマの組。【解決手段】疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも一つのプローブ、前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも一つのプローブ、と前記疾患に対する前記患者の中立に固有の少なくとも一つのプローブ、のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも一つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも一つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけ、また実現された交雑を発現させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法において、
・疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも１つのプローブ、
・前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも１つのプローブ、と
・前記疾患に対する前記患者の中立性に固有の少なくとも１つのプローブ、
のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも１つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも１つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけることをもってなり、
また実現された交雑を明らかにすることをもってなる方法。
【請求項２】
自己免疫疾患がインスリン依存糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブが次のように定義される：
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてインスリン依存糖尿病に関連する他の対立遺伝子に固有な少なくとも１つのプローブ、であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４】
インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブが次のように定義される：
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２と、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊００６１２対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有のプローブであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５（ＴＣＴＴｇＴｇＡｇＣＡｇＡＡｇＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６（ＣＣｇＣＣＴｇＣＣｇＣＣｇＡ）、
であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有のプローブ、
であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７（ＡｇｇｇｇＡＣＣＣｇｇｇＣｇｇＡ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８（ｇＡＣｇＴｇｇＡｇｇＴｇＴＡＣＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９（ｇＣＣｇＣＣＴｇＡＣｇＣＣｇ）、
であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２対立遺伝子に固有のプローブ、
であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０（ｇｇｇｇＣＣＣｇｇｇＣｇＴＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１１（ＡｇｇＡｇｇＡＣｇＴｇＣｇＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１２（ＴＣＴＴｇＴＡＡＣＣＡｇＡＴＡＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３（ｇｇＴｇｇＡＣＡＣＣｇＴＡＴｇＣＡｇ）、
であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
すべてのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の検出を可能にするために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子全体と交雑することができる、少なくとも１つの正の対照プローブが使用されることを特徴とする、請求項４から１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
同一のプローブの塩基の最大３８．８９％、好適には最大２０％がイノシンなどの、少なくとも１つの類似の塩基によって置換されることを特徴とする、請求項６、８、１０または１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
予め、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に関連する１つまたは複数の対象多形領域の少なくとも１つの増幅が実施されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
アンプリコンも同じくビオチン化されるように、増幅プライマはビオチン化されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
増幅に先立って、好適にはかさぶた班の形で、採取された生物標本は核酸を抽出するために処理されることを特徴とする、請求項１３または１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
核酸の抽出が、続く増幅の前に使用されるトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）をすでに含んでいる反応混合物内で実施され、その後保温されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
反応混合物の中にトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）を添加し、それが後に増幅の際にも使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
固有プローブのそれぞれのタイプが、他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイ（ｐｕｉｔｓ）などの、独立した室内に固定されることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１つに記載の方法を実施するための装置。
【請求項１９】
インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性を検出するために使用されるそれぞれのタイプのプローブがこの感受性とこの防御性を検出するために使用される他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定され、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用異なるタイプのプローブのすべてまたは一部が微小滴定プレートの少なくとも１つのプイ内に固定されることを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
少なくとも２つのタイプの異なる固有プローブが、その間に相互作用なしに、微小滴定プレートの同じプイなどの、独立した同じ室内に固定されることを特徴とする、請求項１８または１９のいずれか１つに記載の装置。
【請求項２１】
インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性または中立性を検出するために使用されるプローブのタイプの全体が微小滴定プレートのプイなどの、唯一かつ同一の室内に固定されることを特徴とする、請求項１８または１９のいずれか１つに記載の装置。
【請求項２２】
例えば、ペルオキシダーゼによって、酵素反応を利用する非局所的比色発現であることを特徴とする、請求項１８または１９のいずれか１つに記載の装置で実現される交雑発現方法。
【請求項２３】
例えば、蛍光または放射能による、それぞれのタイプのプローブとアンプリコンの間に実現された交雑の局所的発現であることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれか１つに記載の装置で実現される交雑発現方法。
【請求項２４】
プライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２と組み合わせてプライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１を使用することをもってなる、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析方法において使用するためのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の増幅を可能にするプライマ。
【請求項２５】
５’のビオチン化物であることを特徴とする、請求項２５に記載のプライマ。
【請求項２６】
インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析のために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の交雑を可能にする捕捉プローブであって、プローブの５’に位置するアミノまたはビオチン分岐を介して微小滴定プレートのプイの底、またはビードの上に固定されることを特徴とする、プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はインスリン依存糖尿病と呼ばれる少なくとも１つの疾患に対する患者の遺伝的素因の分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
タイプ１の糖尿病（またはインスリン依存糖尿病）は遺伝的素因のある個体において発生する自己免疫過程の所産として、膵臓内でインスリンを生産するランゲルハンスβ細胞の消失を特徴とする疾患である。環境要因と並んで、素因の遺伝的成分が認められる。
【０００３】
【従来の技術】
それぞれの個体は祖先から受け継いだ、固有の全遺伝形質を有する。この特定の遺伝的背景が時として一部の疾患の発現および／または進展に活発に関与することがある：病原要因による感染（例えば、ＡＩＤＳウィルス）、自己免疫疾患（例えば、リューマチ）。ＨＬＡ抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ）を暗号化する遺伝子をはじめとする組織適合性大複合体（ＣＭＨ）の遺伝子は下記のような自己免疫病理の進展に主要な役割を果たす：
・臓器に固有でない病理、例えば、リューマチ性多発関節炎（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，１９７０；Ｓｔａｓｔｎｙ，１９７８；Ｋｈａｎ，１９７９；Ｓｔａｓｔｎｙ，１９８３；Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ，１９８６；Ｇｅｇｅｒｓｅｎ，１９８７；Ｓｔａｓｔｎｙ，１９８８；Ｔｏｄｄ，１９８８；Ｗｏｒｄｓｗｏｒｔｈ，１９８９；Ｎｅｐｏｍ，１９８９；Ｈｉｒａｉｗａ，１９９０；Ｎｅｐｏｍ，１９９１）または強直性脊椎炎（Ｂｒｅｗｅｒｔｏｎ，１９７３；Ｓｃｈｌｏｓｓｔｅｉｎ，１９７３；Ｂｅｎｊａｍｉｎ，１９９０）、または
・臓器固有、より詳細にはインスリン依存糖尿病に組み合わされた膵臓などの内分泌腺（Ｋｏｍｕｌａｉｎｅｎ，１９９９；Ｋｕｌｍａｌａ，２０００）。
【０００４】
インスリン依存糖尿病になりやすい遺伝成分の大きな部分はＨＬＡ遺伝子座（ＩＤＤＭ１）、そしてもっと詳細にはＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に結合された主要なマーカに結びつけることができる。文献のデータは現在、感受性対立遺伝子（Ｓ対立遺伝子）、保護対立遺伝子（Ｐ対立遺伝子）、中立対立遺伝子（Ｎ対立遺伝子）などの国際命名法に記載の（４５）のＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の中でもっとも一般的なものの考察を可能にする（ｗｗｗ．ａｎｔｈｏｎｙｎｏｌａｎ．ｃｏｍ／ＨＩＧ／ｓｅｑ／ｎｕｃ；２０００年１０月）。これは主として白人の母の集団について有効性が確認されたデータである。今のところ、分子レベルの説明はＨＬＡ−ＤＱタンパク質のβ鎖のアミノ酸５７の領域に見られる多形現象にある（Ｔｏｄｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８）。後述の表１は位置５７にあるこのアミノ酸の種類に応じたインスリン依存糖尿病の状態をまとめたものである：
【表１】
2004513651.tif 000002
表１：位置５７のアミノ酸の種類に応じたインスリン依存糖尿病の状態
【０００５】
それぞれの遺伝子型は２つの対立遺伝子の組み合わせに対応する。したがって、それぞれの標本にタイプ１の糖尿病の素因の遺伝子型が対応する：ＳＳ、ＰＰ、ＮＮ、ＳＰ、ＳＮまたはＮＰ。この分子レベルの説明は遺伝子型が、一般的に効果用量と呼ばれるゼロ、１つ、または２つの感受性対立遺伝子を含んでいるとき病気の段階的重さの所見とも整合する。
【０００６】
現在、インスリン依存糖尿病に関して、Ｃｉｎｅｋらの論文がある、“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＩＤＤＭ　ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ａ　ｒａｐｉｄ　ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅ　ｍｔｅｈｏｄ　ｕｎｓｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ａｓ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ＤＮＡ”，Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ，２０００，５６，４，３４４−３４９。この刊行物はインスリン依存糖尿病への遺伝的素因尾分析試験開発の利益を強調している。このチームは関係する対立遺伝子に関して完全な技法によって血清から開始する手法を選択した（いくつかのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子だけでなくいくつかのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子といくつかのＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子）。
【０００７】
血清の使用はかさぶた班から開始する手順よりも便利ではない。くわえて、彼らの技法は下記の点で複雑である：
・彼らはＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子とＨＬＡ−ＤＱＡ対立遺伝子の、ついでＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４対立遺伝子の２段階で分析を実施している、
・彼らは６３℃の交雑温度、６３℃ついで１８から２５℃の洗浄温度での捕捉プローブ固定およびストレプタビジン・ペルオキシダーゼ、（ＳＰＤＯ）による２段階の発見のための複雑な技術を使用している。
同様に、この技法は用量効果の検出が全く不可能であるが、それはインスリン依存糖尿病への患者の遺伝的素因に大きな影響をもっている。
【０００８】
最後に、これらの試験は輸血センターや特定の専門病院などのＨＬＡ遺伝子研究を専門とするセンターでしか実施できない。したがって、この同定には標本の輸送と、かなり重い技術の使用が必要である。したがって、次のようなマイナスの結果が数多くある：
・標本紛失のおそれ
・この同定に時間がかかる
・前記同定のコストが比較的高い
・役務供与に対する依頼者の監視がない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
請求された分析方法は実施面でもっと簡易化され、アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）の調製後、２時間未満と、もっと迅速で、コストが低い。
このため、本発明は自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法において、
・疾患に対する患者の感受性に固有の少なくとも１つのプローブ、
・前記疾患に対する前記患者の防御性に固有の少なくとも１つのプローブ、と
・前記疾患に対する前記患者の中立に固有の少なくとも１つのプローブ、
のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも１つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも１つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患に関連づけることをもってなり、
また実現された交雑を明らかにすることをもってなる方法に関するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
有利には、この方法はインスリン依存糖尿病への患者の遺伝的素因の分析を可能にする。
変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブは次のように定義される：
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてインスリン依存糖尿病に関連する他の対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ。
【００１１】
変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブは次のように定義される：
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ｈｌ０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、」ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２と、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊００６１２対立遺伝子に固有の少なくともつのプローブ。
【００１２】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５（ＴＣＴＴｇＴｇＡｇＣＡｇＡＡｇＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６（ＣＣｇＣＣＴｇＣＣｇＣＣｇＡ）。
【００１３】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７（ＡｇｇｇｇＡＣＣＣｇｇｇＣｇｇＡ）
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８（ｇＡＣｇＴｇｇＡｇｇＴｇＡＣＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９（ｇＣＣｇＣＣＴｇＡＣｇＣＣｇ）。
【００１４】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３対立遺伝子に固有のプローブ、
および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０（ｇｇｇｇＣＣＣｇｇｇＣｇＴＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１１（ＡｇｇＡｇｇＡＣｇＴｇＣｇＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１２（ＴＣＴＴｇＴＡＡＣＣＡｇＡＴＡＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３（ｇｇＴｇｇＡＣＡＣＣｇＴＡＴｇＣＡｇ）。
【００１５】
すべての例において、すべてのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の検出を可能にするために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子全体と交雑することができる、少なくとも１つの正の対照プローブが使用された。
くわえて、同一のプローブの塩基の最大３８．８９％、好適には最大２０％がイノシンなどの、少なくとも１つの類似の塩基によって置換される。かかる数値は、１９９９年６月２０日と２０００年１２月６日付けの優先権の下に番号ＰＣＴＦＲ００／０１３８５で出願人が出願した、先立つ特許出願から演繹できる。類似の塩基の定義は明細書の続きに記載されている。
【００１６】
上述のような、自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法に先立って、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に関連する１つまたは複数の対象多形領域の少なくとも増幅が実施される。
好適には、アンプリコンも同じくビオチン化されるように、増幅プライマはビオチン化される。増幅に先立って、好適にはかさぶた班の形で、採取された生物標本は核酸を抽出するために処理される。
この核酸の抽出は、続いて増幅の前に使用されるトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）をすでに含んでいる反応混合物内で実施され、その後保温される。
この最後の場合、保温の後、反応混合物の中にトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）を添加し、これは後に増幅の際にも使用される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明は、その第１の変型実施態様によれば、固有プローブのそれぞれのタイプが、他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定される、上述のような方法の実施を可能にする装置にも関するものである。
【００１８】
第２の変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性を検出するために使用されるそれぞれのタイプのプローブはこの感受性とこの防御性を検出するために使用される他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定され、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用異なるタイプのプローブのすべてまたは一部は微小滴定プレートの少なくとも１つのプイ内に固定される。
【００１９】
第３の変型実施態様によれば、少なくとも２つのタイプの異なる固有プローブが、その間に相互作用なしに、微小滴定プレートの同じプイなどの、独立した同じ室内に固定される。
【００２０】
第四の変型実施態様によれば、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性または中立性を検出するために使用されるプローブのタイプの全体が微小滴定プレートのプイなどの、唯一かつ同一の室内に固定される。
微小滴定プレートの同じプイなどの１つの室が、感受性または防御性の検出に使用されるプローブのタイプを１つしか含んでいない場合、装置によって実現された交雑を明らかにする方法は、酵素反応を利用する非局所的比色検出によって実施される。例えば、これはそれぞれのタイプのプローブとペロキシダーゼの間に実現された交雑の検出とすることができる。
微小滴定プレートの同じプイなどの１つの室が、感受性または防御性の検出に使用される少なくとも２つのプローブのタイプを含んでいる場合、装置によって実現された交雑を明らかにする方法は、局所的比色検出によって実施される。例えば、これは蛍光または放射能によるそれぞれのタイプのプローブとアンプリコンの間に実現された交雑の検出とすることができる。
【００２１】
本発明は最後に、プライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２と組み合わせてプライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１を使用することをもってなる、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析方法において使用するためのＨＬＡＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の増幅を可能にするプライマの組に関するものである。
好適にはプライマは５’のビオチン化物である。
くわえて、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析のために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の交雑を可能にする捕捉プローブはプローブ５’に位置するアミノまたはビオチン分岐を介して微小滴定プレートのプイの底、またはビードの上に固定される。
上述の例は説明のための例としてあげたものであり、非制限的である。それらは本発明の理解を助けるものである。
【００２２】
本発明は迅速で安価な遺伝疾患検出方法に関するものである。この新規な技術はすべての遺伝病に、とくにリューマチ性多発関節炎、関節強直脊椎関節炎、インスリン依存糖尿病およびその他の自己免疫疾患、例えば、リュウマチの診察の際に認められる膠原病（狼瘡、硬皮、・・・）にも使用できる。
これは少なくとも１つの遺伝子の同時分析を可能にする分子生物学の技法による、特定の疾患に対する個体の遺伝的素因の分析のための方法である。この方法は、１つまたは複数の遺伝子に結びつけられる、１つの疾患あるいは関連がある疾患全体についての個体の遺伝的素因の分析に有利に適用することができる。この方法は特定の自己免疫疾患、すなわち１つの臓器、この場合には膵臓に関連がある、インスリン依存糖尿病に対する個体の遺伝的素因の分析に応用できる。
【００２３】
この方法の利点は、（診断、予測および治療方針などの）臨床的に意味のある関連情報の完全な全体を、多重であるが単一の試験によって、一段階で得られることにある。この方法は複数の過程に分けられる：
１）個体の生物学的採取標本から核酸を抽出、
２）病理に対する遺伝的素因に関連する多形性が指摘された対象領域の増幅、および
３）所与の対立遺伝子または対立遺伝子群の正確な分析を可能にする分子プローブの組を使用する交雑反応全体を用いる、アンプリコンの同時分析。
【Ｉ−定義】
【００２４】
「室」とは：
・第１の場合、その液体、または存在する場合、隣接する１つまたは複数の室の領域に存在する別の液体の、他の分画との相互作用なしにある液体のある量、
・第２の場合、その、あるいはそれらの液体のそれぞれがその液体、または存在する場合、隣接する１つまたは複数の室の領域に存在する別の液体の、他の分画との相互作用なしに同じ液体の、あるいは異なる液体の、複数の同一または相互に異なる量、
の受納を可能にする、平坦または凹型の、すなわち陥凹を形成するいっさいの個体の媒体を意味するものとする。
【００２５】
第１の場合の数百マイクロリットルから第２の場合の０．５ナノリットルに至ることがある液体の量のこれらの保持を実現を可能にする装置、ならびにかかる装置が利用する方法と装置によって方法と共に実現される媒体は番号ＦＲ００／１４６９１で、出願人によって２０００年１１月１５日出願された特許出願にすでに詳しく記載されている。
【００２６】
第２の場合、単一の室に配分された液体の異なる量はきわめて少量で、一般的に１マイクロリットル未満で、前記室の表面にスポットを形成する。１滴当たりの溶液の量は０．５ナノリットルから１マイクロリットルの間に、好適には１ナノリットルから２００ナノリットルの間に含まれる。
【００２７】
上述の定義に用いられた、「固体媒体」という用語は、分析物、この場合には核酸をその上に固定できるすべての材料を含む。化学的修飾の有無を問わず天然、合成材料を固体媒体として用いることができる、とくに高分子、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリル、ポリアミドあるいは芳香族ビニルモノマー系のコポリマー、α−不飽和またはβ−不飽和酸のアルキルエステル、不飽和カルボキシル酸エステル、塩化ビニリデン、ジエンまたはニトリル基内に存在する化合物（アクリロニトリル）；塩化ビニルとプロピレンのポリマー、塩化ビニルと酢酸ビニルのポリマー、スチレンまたはスチレン置換誘導体系のコポリマー；ナイロン、ニトロセルローズなどの合成繊維；珪素、ガラス、セラミック、石英などの無機材料；ラテックス；磁気粒子；金属誘導体、などを使用することができる。
【００２８】
本発明による媒体は、非限定的に、微小滴定プレート、ホイル、管、プイ、粒子あるいはシリカまたは珪素の、通常「ウェハ」と呼ばれる、タブレットなどの平坦な媒体の形を取ることができる。好適には媒体の少なくとも一部は珪素のウェハあるいは微小滴定プレートのプイの底のように平坦である。好適には、この室は微小滴定プレートのプイで構成される。
【００２９】
固体媒体は用途分野と１つまたは複数の分析物を含む溶液の種類に応じて親水性および／または疎水性とする。例えば、貯蔵には親水性区域が用いられ、前記親水性区域は疎水性区域で限定して、スポットの直径を管理しやすくする。
【００３０】
「交雑検出」はマーキング反応体よって標識をつけたポリヌクレオチドの使用を意味するものとする。マーキング反応体とは、検出可能な信号を直接または間接に発生するトレーサーを意味する。これらのトレーサーには次のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
・酵素、例えば、比色、蛍光、発光によって、付加された、適切な基質の存在の元に検出可能な信号を発生する西洋わさびのペロキシダーゼ、アルカリン・フォスフェターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−フォスフェート・デジドロゲナーゼ、あるいは
・発色団、例えば、蛍光、発光、着色化合物、あるいは
・電子顕微鏡で、あるいは伝導性、電流、電圧あるいはインピーダンス測定などのそれらの電気特性によって検出できる電子密度の基、あるいは
・回折、表面プラスモン共鳴、接触角度変動などの光学的方法または原子力の分光測光、トンネル効果などの物理的方法によって検出可能な基、または
・放射性分子、例えば、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ。
好適には、トレーサーは立体化学的占有空間が小さい蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、ダンシル、ＩＲ（Ｌｉ−ＣＯＲ　Ｉｎｃ，Ｌｉｎｃｏｌｎ　ＮＥ，ＵＳＡ）、Ｃｙ５とＣｙ３（Ｒａｎｄｏｌｐｈ　Ｊ．Ｂ．ａｎｄ　ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５（１４），ｐ２９２３−２９２９，１９９７）型の発色団およびそれらの誘導体である。立体化学的占有空間が小さいとは、分子量が１０００ｇ／モル未満であることを意味する。
【００３１】
必要ならば前処理した、標的核酸と、さらに官能化したポリヌクレオチドを発生し、マーキング反応体でこのポリヌクレオチドを標識付けし、ついで前記標識付けしたポリヌクレオチドを検出するように官能化したヌクレオチドとの接触が行われる標的内のこの標的核酸の検出方法。
前処理とは標的核酸に手を食われることを可能にする標本処理の異なる過程、例えば、溶解、流動化、濃縮を意味する。
【００３２】
「中立性についてインスリン依存糖尿病に関連づけられた他の対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ」はＨＬＡ−ＤＱＢ１を構成する対立遺伝子、インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性の対立遺伝子を構成すると定義されなかった対立遺伝子の全体または一部に固有の少なくとも１つのプローブを意味するものとする。一般的に、認識された対立遺伝子の有病率に応じてプローブを選択する；したがって、ある対立遺伝子が優勢であるほど、それは中立性の固有プローブの領域に含められる。
それはまた、単独に、あるいは先述のプローブの少なくとも１つとの組み合わせにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ３および／またはＨＬＡ−ＤＲ４を構成する対立遺伝子の全体または一部の少なくとも１つの固有プローブとすることができる。したがって、数多くの論文が影響を持ち得るこれらのハロータイプを明らかにしている。
・Ｐａｒｋ　Ｙ．Ｓ．，Ｓｈｅ　Ｊ．Ｘ．，Ｎｏｂｌｅ　Ｊ．Ａ．，Ｅｒｌｉｃｈ　Ｈ．Ａ．＆Ｅｉｎｓｅｎｂａｒｔｈ　Ｇ．Ｓ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　２００１：５７：１８５−１９１：“Ｔｒａｎｓｃｒａｃｉａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ＨＬＡ　ＤＲ−ＤＱ　ｈａｐｌｏｔｙｐｅ　ｏｎ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＨＬＡ　ＤＲ４　ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ　ｔｏ　ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｃｈｉｌｄｒｅｎ”，
・Ｋｏｃｋｕｍ　Ｉ．，Ｓａｎｊｅｅｖｉ　Ｃ．Ｂ．，Ｅａｓｔｍａｎ　Ｓ．，Ｌａｎｄｉｎ−Ｏｌｓｓｏｎ　Ｍ．，Ｄａｈｌｑｕｉｓｔ　Ｇ．，Ｌｅｒｎｍａｒｋ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２６，３６１−３７２：“Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＨＬＡ　ＤＲ　ａｎｄ　ＤＱ　ｉｎ　ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ　ｒｉｓｋ　ｆｏｒ　ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　ｔｙｐｅ　１　ｄｉａｂｅｔｅｓ”，
・Ｕｎｄｌｉｅｎ　Ｄ．Ｅ．，Ｋｏｃｋｕｍ　Ｉ．，Ｒｏｎｎｉｎｇｅｎ　Ｋ．Ｓ．，Ｌｏｗｅ　Ｒ．，Ｓａｎｊｅｅｖｉ　Ｃ．Ｂ．，Ｇｒａｈａｍ　Ｊ．，Ｌｉｅ　Ｂ．Ａ．，Ａｋｓｅｌｓｅｎ　Ｈ．Ｅ．，Ｌｅｒｎｍａｒｋ　Ａ．ａｎｄ　Ｔｈｏｒｓｂｙ　Ｅ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　１９９９：５４，５４３−５５１：“ＨＬＡ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｙｐｅ　Ａ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｎｏｔ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ　ＤＲ３−ＤＱ２　ｏｒ　ＤＲ４−ＤＱ８　ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ”，
・Ｄｏｎｎｅｒ　Ｈ．，Ｓｅｉｄｌ　Ｃ．，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ａｕｗｅｒａ　Ｂ．，Ｂｒａｕｎ　Ｊ．，　Ｓｉｅｇｍｕｎｄ　Ｔ．，Ｈｅｒｗｉｇ　Ｊ．，Ｗｅｅｔｓ　Ｉ．，Ｔｈｅ　Ｂｅｌｇｉａｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，Ｕｓａｄｅｌ　Ｋ．Ｈ．＆Ｂａｄｅｎｈｏｏｐ　Ｋ．，Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　２０００：５５：２７１−２７４：“ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４　ａｎｄ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｔｙｐｅ　１　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ　ｉｎ　ａ　Ｇｅｒｍａｎ／Ｂｅｌｇｉａｎ　ｆａｍｉｌｙ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍａｎ　ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｔｕｄｙ”，
・Ｒｅｄｏｎｄｏ　Ｍ．Ｊ．，Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｅ．，Ｍｕｌｇｒｅｗ　Ｃ．Ｌ．，Ｎｏｂｌｅ　Ｊ．Ａ．，Ｅｒｌｉｃｈ　Ｈ．Ａ．，Ｆｒｅｅｄ　Ｂ．Ｍ．，Ｌｉｅ　Ｂ．Ａ．，Ｔｈｏｒｓｂｙ　Ｅ．，Ｅｉｎｓｅｎｂａｒｔｈ　Ｇ．Ｓ．，Ｕｎｄｌｉｅｎ　Ｄ．Ｅ．，Ｋｏｃｋｕｍ　Ｉ．＆Ｒｏｎｎｉｎｇｅｎ　Ｋ．Ｓ．，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０００：Ｖｏｌ．５５，　Ｎｏ　１０：３７９３−３７９７：“ＤＲ−ａｎｄ　ＤＱ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｙｐｅ　１Ａ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｃｏｍｐｒａｉｓｏｎ　ｏｆ　ＤＲＢ１＊１４０１　ａｎｄ　ＤＱＡ１＊０１０２−ＤＱＢ１＊０６０２”。
【００３３】
「増幅」は母体の役割を果たす標的核酸に作用する酵素増幅反応によって官能基化したポリヌクレオチドが発生することを意味する。一方ではＬｅｗｉｓの論文（１９９２．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ，１２，ｐ．１−９）、他方ではＡｂｒａｍｓｏｎ＆Ｍｙｅｒｓ　の論文（１９９３．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，ｐ．４１−４７）が標的増幅の実例を示している。酵素増幅技法は例えば、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｔｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｎ），ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ），ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）あるいはＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技法の中から選択することができる。
【００３４】
「類似塩基」とは一般的にポリヌクレオチド内に組み込まれた修飾されたヌクレオチドを意味するものとする。ポリヌクレオチドは、場合によって、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ボウロモ−５−デオキシウリジン、ネブラリンあるいは交雑を可能にする他のいっさいの修飾塩基などの、修飾塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む少なくとも２つのデオシキリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの連鎖で構成される。これらのポリヌクレオチドは下記の領域で修飾することもできる：
・ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート、アルキル−ホスホネート、あるいは
・骨格、例えば、α−オリゴヌクレオチド（ＦＲ−Ａ−２．６０７．５０７）あるいはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，ｐ１８９５−１８９７，１９９２）あるいは２’−アルキル・リボース。
これらの修飾のそれぞれは組み合わせることもできる。ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド、天然核酸またはその断片の１つ、例えば、ＤＮＡ、ロボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、転位ＲＮＡ、酵素増幅技法によって得られた核酸とすることができる。
【ＩＩ−標本の配分】
【００３５】
１）デオシキリボ核酸（ＤＮＡ）抽出：
Ａ−全血液標本から
ＥＤＴＡ（テトラ酢酸エチレン・ジアミン）、クエン酸塩またはヘパリンなどの抗凝血剤上に採取した全血液標本からのＤＮＡ抽出の従来の様々な手順を使用することができる。例えば、フェノール抽出過程による、あるいは赤色細胞の、ついで白色細胞の溶解の過程（Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）による手順とすることができる。
実際には、１つの実施態様によれば、この抽出は全く従来通りに実現される。事実、あとからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅法によって増幅できる試料を得ることができる任意のＤＮＡ抽出手法を用いることができる。細胞を溶解、核酸を抽出ついで精製するこれらの技法は通常遺伝子分析に推奨されるもの、あるいはＱＩＡＮＧＥＮ　Ｓ．Ａ．の　ＱＩＡｍｐ　Ｂｌｏｏｄ　Ｋｉｔ（登録商標）などの市販の物質を使用する迅速な技法である。
【００３６】
Ｂ−乾燥血液班から
乾燥血液班からの様々なＤＮＡ抽出手法は文献に記載されている。
まず第１の技法は　Ｊｉｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８９，８１：３６３−３６６のものである。これはＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ　ｎｏ．９０３の紙の上に血液を付着させることから成る。血液班は数時間の間１８から２５℃の間の温度で乾燥される。直径３ｍｍ４つのタブレットを打ち抜き、１．５ｍｌの管内に置いて、３０μｌのメタノールを加えて固定し、ついで蒸発を実施する。つづいて６０μｌの水を加え、１５分間煮沸する。１５分間１０，０００ｇで遠心分離する。最後に、次の過程、ＰＣＲによる増幅のために上澄みを採取する。
【００３７】
第２の技法はＨｅｚａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，８８，１，５９−６６のものである。ＥＤＴＡ（テトラ酢酸エチレン・ジアミン）、クエン酸塩またはヘパリンの上に血液を採集し、濾紙（Ｇｕｔｈｒｉｅ）上にそれを付着させる。直径１ミリのタブレットを５０μｌの反応混合物内に直接置いて、つぎに増幅する。９４℃で１５分間保温する。そして最後にＴａｑポリメラーゼを添加し、ＰＣＲで増幅する。
【００３８】
最後に、２０００年から、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．社は、第３の技法として、増幅管の内部自体に位置づけられる、ＤＮＡ抽出システムを市販している（Ｘｔｒａ　Ａｍｐ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．Ｒｅｆ．６６０）。血液班からＤＮＡを抽出するために、この製品を評価した。血液はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ紙　ｒｅｆ．３２２１８７の上に付着させたＥＤＴＡまたはＡＣＤから採取した。直径３ｍｍタブレットを７５μｌのＬｙｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒを含む１．５ｍｌのマイクロ管内に置いた。１８から２５℃の温度で１０分間保温する。ついで、１２，０００ｇで５分間遠心分離する。ついで上澄みを採取し、Ｘｔｒａ　Ａｍｐ（登録商標）内にそれを移す。数回吸引、吐出し、ついで上澄みを取り除く。２００μｌのＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで３回線上する。その後、ＰＣＲによる増幅のための４５μｌの反応混合物と５μｌのＡｍｐ　Ｅｎｈａｎｃｅ　Ｂｕｆｆｅｒを添加する。最後に、通常の増幅プログラムに３サイクルを加えて増幅する。
【００３９】
上述の３つの手順で、ＨＬＡ−ＤＱＢ１の増幅ともに、およそ５０％のケースについて、本発明に従って開発されたＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）試験で利用可能な優れた結果が認められた。このＥＬＯＳ技法は出願人の特許ＥＰ−Ｂ−０，４８６，６６１および論文Ｆ．Ｍａｌｌｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ　１９９３，ｐ．１４４４−１４４９に記載されている。
【００４０】
それにもかかわらず、血液班からの抽出手順、堅牢で日常的な分析用途のために不可欠な手順を開発した方がよい。したがって、下記を以て成る第４の技法が出願人によって開発された：
・Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ紙Ｎｏ．９０３（ｒｅｆ．３２２１８７）の上に付着させたＥＤＴＡ上の血液採集
・Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌパンチによる血液班の打ち抜き（直径３ミリのタブレット）
・血液班の都度、５分間ＨＣｌ　０．２５Ｎによるパンチの除染（ＤＮＡ除去）
・タブレットを０．５ｍｌのＰＣＲ管内に置く
・１０倍に濃縮した（１０×）増幅緩衝液５μｌ、０．５μｌのｄＮＴＰ（２００ｍＭ）混合物とＨ２Ｏｑｓｑ５０μｌを含む反応混合物５０μｌを添加
・１００℃で１５分間保温（サーモサイクラーの使用が推奨される）
・タブレット取り出し
・従来の水切り遠心分離器による１，０００ｇで短時間遠心分離
・増幅反応のために２５μｌの上澄みを採取
【００４１】
意外なことに、それぞれのタブレットの上に存在する血液を取り込んだ反応媒質はデオシキリボヌクレオチド・トリフォスフェート（ｄＮＴＰ）、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰとｄＴＴＰを含んでいる。これは当業者が高温からむしろ保護しようとする生物分子である。しかるに、出願人によって開発された手順では、前記反応媒質はつぎに１５分間１００℃の温度にかけられる。出願人の技法によって抽出された核酸でつぎに得られた増幅結果は先に述べた３つの技法で得られたものよりはるかに効果的である。
【００４２】
２）ＨＬＡ−ＤＱＢ１アンプリコンの調製
すべての例において、使用されたプライマは文献に記載のプライマである（ＸＩｔｈ　ＨＬＡ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　Ｐｒｉｍｅｒｓ；Ｋｉｍｕｒａ，１９９２）。下の表２はＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する対象遺伝子座の増幅を可能にする２つのプライマを示している。したがって、これら２つのプライマはこの遺伝子を縁取っている。
【表２】
2004513651.tif 000003
表２：ＨＬＡ−ＤＱＢ１の増幅のためのプライマ
【００４３】
Ａ−全血液標本から
反応混合物は下記の各種の成分を含んでいる：
・緩衝液１０Ｘ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，ｒｅｆ．Ｎ８０８−０１７１）　　　　　　　５μｌ
・ｄＮＴＰｓ２００ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ｒｅｆ．２７−２０９４）　　　　 ０．５μｌ（最終０．２ｍＭ）
・プライマ混合物（それぞれ３０μＭ）　　　　　　　　　　０．５μｌ（最終０．３ｍＭ）
・Ｔａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ，
Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，ｒｅｆ．Ｎ８０８−０１７１、５Ｕ／μｌ）　　　　　０．３μｌ（１．５Ｕ）
・ＤＮＡ（約１００ｎｇ／μｌ）　　　　　　　　　　　　　５μｌ（約５００ｎｇ）、および
・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｑ．ｓ．ｐ．５０μｌ
くわえて、増幅プログラムは下記の通りである：
・９５℃で２分、ついで
・連続３５サイクル、各サイクルごとに次の過程：
９５℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で３０秒
・７２℃で７分
ついで、反応生成物を保存したいときは、得られたばかりのアンプリコンを含む管を９℃の温度に維持する。
【００４４】
Ｂ−乾燥血液班から
反応混合物は下記の各種の成分を含んでいる：
・緩衝液１０Ｘ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，ｒｅｆ．２７−２０９４）　　　　　 ５μｌ
・ｄＮＴＰｓ２００ｍＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ｒｅｆ．Ｎ８０８−０１７１）　　　　　　０．５μｌ
・プライマ混合物（それぞれ３０μＭ）　　　　　　　　　　０．５μｌ（最終０．３ｍＭ）
・Ｔａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ，
Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，ｒｅｆ．Ｎ８０８−０１７１、５Ｕ／μｌ）　　　　　０．３μｌ（１．５Ｕ）
・ＤＮＡ（約１００ｎｇ／μｌ）　　　　　　　　　　　　　２５μｌ、および
・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ｑ．ｓ．ｐ．５０μｌ
くわえて、増幅プログラムは下記の通りである：
・９５℃で２分、ついで
・連続３５サイクル、各サイクルごとに次の過程：
９５℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で３０秒
・７２℃で７分
ついで、反応生成物を保存したいときは、得られたばかりのアンプリコンを含む管を９℃の温度に維持する。
【ＩＩＩ−本発明によって得られたアンプリコンの分析】
【００４５】
１゜）インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析装置
ＥＬＯＳＡ試験の原理にもとづく装置は比色検出のためにペロキシダーゼ（ＰＯＤ）に結合された検出プローブを備えた、微小滴定プレートから延伸した８つのプイのバレッタの形で、ＨＬＡ−ＤＱＢ１マーカの分析のために実現された。
Ａ−捕捉プローブ
これら８つのプイのそれぞれの中に、捕捉の固有プローブを使用した。これらのプローブは実際は、出願人によって出願された特許ＵＳ−Ａ−５，５１０，０８４およびＥＰ−Ｂ−０．５４９．７７６に記載のような、５’でアミン化された分岐を有する合成オリゴヌクレオチドである。特殊な構造のこの５’でアミン化された分岐がプレートの底でプローブの固定を可能にする。したがって、以下に指定しない場合でも、使用したプローブの５’末端が、この分岐を有するものとする。
【００４６】
プイの部位での捕捉プローブの配分は表３に示した、他方で表３のそれぞれの捕捉プローブについて可能な標的対立遺伝子は下記の表４に示した。
【表３】
2004513651.tif 000004
表３：プイの部位での捕捉プローブの配分
【表４】
2004513651.tif 000005
表４：それぞれの捕捉プローブについて可能な標的対立遺伝子
【００４７】
表３において、プイＣ＋はＨＬＡ−ＤＱＢ１＊遺伝子のすべての対立遺伝子の検出を可能にする正の対照（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３）を含んでいて、そのため増幅が表１に記載のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２プライマの間に含まれる対象領域に正しく関わるように制御することが可能になる。負の対照（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４）は診断目標がなく、特定の規格を満たすためだけに存在する。この配列はＨＬＡに全く固有ではなく、ＨＬＡ遺伝子に見つけられない偶然的配列に対応する。
【００４８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３の間に含まれる他のプローブは、反対に、病気に対する、もっと正確にはインスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の診断目的を有する。
ここで分かるように、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５のプローブは病気に対する、すなわちインスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの感受性の重要な対立遺伝子、すなわちＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２対立遺伝子に固有である。これらの重要な対立遺伝子は表４では太字で示した。
同様に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６プローブもインスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの感受性の重要な対立遺伝子、すなわちＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２対立遺伝子に固有である。
【００４９】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７プローブは病気に対する、すなわちインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの防御性の重要な対立遺伝子、すなわちＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３対立遺伝子に固有である。
同様に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８プローブもインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである。それはこの疾患に対するこの防御性の重要な対立遺伝子、すなわちその形ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２とを問わず、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１対立遺伝子に固有である。
【００５０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９プローブもインスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するプローブである、なぜならそれも、その形ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２とを問わず、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１対立遺伝子の検出を可能にするからである。このプローブの利点は、かなり頻繁で、位置５７の領域でのその配列に関して防御性的でなければならないＨＬＡ−ＤＱＢ１＊ＨＬＡ−ＤＱＢ１：０３０３２遺伝子の検出を可能にすることである。
ここで、一方がインスリン依存糖尿病に対する感受性で他方が防御性である、２つのプローブＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７はＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子の検出を可能にする。なお、この対立遺伝子はきわめてまれである。したがって、それを見つける確率はきわめて小さく、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８同型接合体とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８にぶつかる確率はほとんどゼロである。同様に、同じ推論を一方のインスリン依存糖尿病に対する感受性で他方が防御性である、２つのプローブＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８に適用することができる。それらは両者共にＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４対立遺伝子の検出を可能にする。
この２つの場合において、２つのプローブが、一方が感受性を他方が防御性を、検出するのに何の問題もない、なぜなら有病率があまりにも低いからである。
【００５１】
Ｂ−検出プローブ
これはペロキシダーゼ（ＰＯＤ）に結合された、５’にアミン化された分岐を備えたオリゴヌクレオチドである。表５はその構造を明らかにしている。
【表５】
2004513651.tif 000006
表５：使用した捕捉プローブに適合した検出プローブ
もちろん、この検出プローブは表３と４に示したＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５からＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３の捕捉プローブに掛かる可能性のある標的アンプリコン全体と相補的になるように選択される。
【００５２】
Ｃ−操作法：
第１に、標的調製は次の過程から成る：
・アンプリコン全体（５０μｌ）を１．５ｍｌのマイクロ管内に移す
・試薬Ｒ２（ＮａＯＨ　２Ｎ）５μｌを添加
・十分均質化する
・１８℃から２５℃の間に含まれる温度で５分間保温する
・後述の成分の交雑緩衝液１ｍｌを添加
・後述の成分の、検出プローブ５０μｌを添加、そして
・十分均質化する。
交雑緩衝液の成分は：
・ｐＨ６．８の燐酸ナトリウム０．１Ｍ
・０．５Ｍ　ＮａＣｌ，２％（ｐ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００
・０．６５％（ｐ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｐ／ｖ）ゼラチン
・サケの精子の音波処理ＤＮＡ０．１４ｇ／Ｌ
・ＢＮＤ（農薬またはブロモ・ニトロ・ジオクサン）０．２ｇ／Ｌ、および
・０．０１ｇ／Ｌのシプロフロクサシン。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１４（Ｄ４−ＰＯＤ）検出プローブは０．５％（ｐ／ｖ）ウシの血清アルブミンと０．５％（ｐ／ｖ）フェノールの存在の元でｐＨ７．０の５ｍＭホスフェート緩衝液に希釈される。
【００５３】
第２に、標的の交雑は次のように実現される：
・バレットＲ１の８つのプイのそれぞれの中に、混合物１００μｌを配分する
・自己接着ホイルで覆う、そして
・３７℃（３７±１℃）で１時間保温
【００５４】
第３に、交雑しなかった標的がある場合にそれを除去することを可能にし、Ｈ２Ｏで１／２０に希釈したＣｏｌｏｒ０洗浄緩衝液５００μｌで３回洗浄することをもってなる洗浄。＜＜Ｃｏｌｏｒ０＞＞は１％（ｐ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを２０倍濃縮した溶液を意味するものとする。
【００５５】
第４に、検出はどの捕捉プローブが標的オリゴヌクレオチドを交雑したかを決定することを目的とする。それは次の仕方で実現される：
・プイのそれぞれの中に、即時調合した基質の溶液１００μｌを添加−５μｌのＣｏｌｏｒ２内にＣｏｌｏｒ１の１タブレット
・暗闇で、１８℃から２５℃の温度で２０分間保温
・Ｃｏｌｏｒ１を５０μｌ添加、そして
・４９２ｎｍでの吸収を読み取る。
＜＜Ｃｏｌｏｒ１＞＞はＯ−フェニレンジアミン・ジヒドロクロライド（ＯＰＤ）を意味するものとする；＜＜Ｃｏｌｏｒ２＞＞は０．１Ｍ燐酸ナトリウム、０．０５Ｍコハク酸、０．０３％Ｈ２Ｏ２を意味するものとする、また＜＜Ｃｏｌｏｒ３＞＞は１．８Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を意味するものとする。
【００５６】
第５に、解釈は前章で確立された検出に応じてインスリン依存糖尿病に対する患者の真の遺伝的素因の決定を可能にする。この検証は：
・一方では、光学密度（Ｄ．Ｏ．）が０．８を超えなければならない、正の対照ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３（Ｃ＋）の陽性を検証し、Ｄ．Ｏ．が０．０５未満でなければならない負の対照ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４（Ｃ−）の陰性を検証し）、
・他方で、プローブＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５からＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３によって同定された２つの対立遺伝子に対応する遺伝子型を決定する、
ことを提案している。
【００５７】
上述の場合、ペロキシダーゼは適切な基質、例えば、ＯＰＤが存在するときにオリゴヌクレオチドとの交雑が実現されたかをそれぞれのプローブについて明らかにすることができる酵素である。この基質は可溶性なので、信号の延長があるだろう。この場合、ある患者が同型接合体であるか異型接合体であるかを、あるいはその対立遺伝子がインスリン依存糖尿病に対して感受性、防御性および／または中立性であるかを決定できるためには、室によって、あるいはもっと容易には、プイによって捕捉プローブを埋め込まなければならない。これはインスリン依存糖尿病に対して感受性（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５と６）あるいは防御（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７，８と９）が関わるプローブについて言える。一方、この疾患に対して中性（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０，１１，１２と１３）が関与するプローブについて、それらをまとめることは全く可能である。
これが当てはまらないのは、使用した基質が沈殿性であるか、検出プローブ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１４）が蛍光性である場合である。これらの場合、感受性（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５と６）あるいは防御（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７，８と９）のプローブであっても、同一の室内またはプイ内に複数個のプローブを埋め込むことができる。実際、もっともコンパクトな配置において、感受性、防御または中立のすべてのプローブは同一の室またはプイ内にあってもよく、それは捕捉オリゴヌクレオチドのプロットの重なりなしに異なるタイプのプローブをまとめることができる操作員の容易さだけに依存する。先に明らかにしたごとく、かかる媒体を実現することができる、かかる装置は番号ＦＲ００／１４６９１で出願人が２０００年１１月１５日に出願した特許出願にすでに詳しく記載されている。
【００５８】
２゜）本発明による分析実例：
Ａ−第１の標本：
以下の表６はそれぞれのプイに第１の被験患者の標本の分画を入れたバレットＲ１で得られた結果を示している。
【表６】
2004513651.tif 000007
表６：第１の標本についてバレットＲ１で得られた結果
【００５９】
分析は下記の通りである：
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子は存在する、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の２つの対立遺伝子を有する確率が高い。高い確率とは感受性のＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２対立遺伝子の罹患率が中立性の対立遺伝子であるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子のそれよりはるかに高いことを意味するものとする。
これら２つのＨＬＡ−ＤＱＢ１は遺伝子レベルで同定された、この第１の標本のＨＬＡ類型化は実際：
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、および
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、である。
【００６０】
Ｂ−第２の標本
以下の表７はそれぞれのプイに第２の被験患者の標本の分画を入れたバレットＲ１で得られた結果を示している。
【表７】
2004513651.tif 000008
表７：第２の標本についてバレットＲ１で得られた結果
【００６１】
分析は下記の通りである：
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子は存在する、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の対立遺伝子と防御対立遺伝子を有する確率が高い。高い確率とは感受性のＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２対立遺伝子の罹患率が中立性の対立遺伝子であるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子のそれよりはるかに高いことを意味するものとする。
これら２つのＨＬＡ−ＤＱＢ１は遺伝子レベルで同定された、この第一の標本のＨＬＡ類型化は実際：
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、および
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、である。
【００６２】
Ｃ−第３の標本
以下の表８はそれぞれのプイに第２の被験患者の標本の分画を入れたバレットＲ１で得られた結果を示している。
【表８】
2004513651.tif 000009
表８：第３の標本についてバレットＲ１で得られた結果
【００６３】
分析は下記の通りである：
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子の増幅と交雑試験は正確に機能した、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子は存在する、
−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０から１３プローブは陽性である：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２対立遺伝子は存在する、および
−他のプローブは陰性である。
結論として、この患者はインスリン依存糖尿病に対する感受性の対立遺伝子と中立性対立遺伝子を有する確率が高い。中立性対立遺伝子があると分かった時点から、本発明による分析の枠内でより正確にそれを決定する重要性はわずかしかない。
これら２つのＨＬＡ−ＤＱＢ１は遺伝子レベルで同定された、この第一の｛ママ｝標本のＨＬＡ類型化は実際：
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２、および
−ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１、である。
【００６４】
【ＩＶ−本発明を改善するための他の非制限的手法】
１゜）ビオチン化プライマとのＰＣＲアンプリコンの使用：
Ａ−ビオチン化プライマ：
５’へのビオチン化プライマの組み込みによってビオチン化ＰＣＲアンプリコンと共にインスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析装置（第ＩＩＩ章、１゜））のために使用した捕捉固有プローブの組を利用することも可能である、下記の表９参照。
【表９】
2004513651.tif 000010
表９：ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子増幅のためのビオチン化プライマ
増幅条件は上述のものと同一であるが、操作法は異なっている。
【００６５】
Ｂ−ビオチン化プライマでの操作法
第１に、標的調製は次の過程から成る：
・アンプリコン全体（５０μｌ）を１．５ｍｌのマイクロ管内に移す
・試薬ＮａＯＨ　２Ｎの５μｌを添加
・十分均質化する
・１８℃から２５℃の間に含まれる温度で５分間保温する
・上述の成分の交雑緩衝液１ｍｌを添加、そして
・十分均質化する。
交雑緩衝液の成分は：
・ｐＨ６．８の燐酸ナトリウム０．１Ｍ
・０．５Ｍ　ＮａＣｌ，２％（ｐ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００
・０．６５％（ｐ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｐ／ｖ）ゼラチン
・サケの精子の音波処理ＤＮＡ０．１４ｇ／Ｌ
・ＢＮＤ（農薬またはブロモ・ニトロ・ジオクサン）０．２ｇ／Ｌ、および
・０．０１ｇ／Ｌのシプロフロクサシン。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１４（Ｄ４−ＰＯＤ）検出プローブは０．５％（ｐ／ｖ）ウシの血清アルブミンと０．５％（ｐ／ｖ）フェノールの存在の元でｐＨ７．６の５ｍＭホスフェート緩衝液に希釈される。
【００６６】
第２に、標的の交雑は次のように実現される：
・バレットＲ１の８つのプイのそれぞれの中に、混合物１００μｌを配分する
・自己接着ホイルで覆う、そして
・３７℃（３７±１℃）で１時間保温
【００６７】
第３に、交雑しなかった標的がある場合にそれを除去することを可能にし、Ｈ２Ｏで１／２０に希釈したＣｏｌｏｒ　０洗浄緩衝液５００μｌで３回洗浄することをもってなる洗浄。
【００６８】
第４に、検出はどの捕捉プローブが標的オリゴヌクレオチドを交雑したかを決定することを目的とする。それは次の仕方で実現される：
・７．２のｐＨで、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％ウシの血清アルブミンとともにＰＢＳ緩衝液内に１／１０，０００に希釈したペロキシダーゼ（ＳＰＯＤ、Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１０８９１５３）に結合したストレプタビヂン結合溶液１００μｌを添加
・暗闇で、１８℃から２５℃の温度で３０分間保温
・洗浄緩衝液５００μｌで３回洗浄−Ｃｏｌｏｒ０，Ｈ２Ｏ内に１／２０に希釈、
・プイのそれぞれの中に、即時調合した基質１００μｌを添加−５ｍｌのＣｏｌｏｒ２内にＣｏｌｏｒ１の１タブレット
・暗闇で、１８℃から２５℃の温度で２０分間保温
・Ｃｏｌｏｒ１を５０μｌ添加、そして
・４９２ｎｍでの吸収を読み取る。
＜＜Ｃｏｌｏｒ０，＞＞、＜＜Ｃｏｌｏｒ１＞＞、＜＜Ｃｏｌｏｒ２＞＞と＜＜Ｃｏｌｏｒ３＞＞は前節に記載のものと同一である。
【００６９】
第５に、解釈は前章で確立された検出に応じてインスリン依存糖尿病に対する患者の真の遺伝的素因の決定を可能にする。この検証は：
・一方では、光学密度（Ｄ．Ｏ．）が０．８を超えなければならない、正の対照ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　３（Ｃ＋）の陽性を検証し、Ｄ．Ｏ．が０．０５未満でなければならない負の対照ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ４（Ｃ−）の陰性を検証し）、
・他方で、プローブＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５からＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３によって同定された２つの対立遺伝子に対応する遺伝子型を決定する、
ことを提案している。
この手順は追加の過程があるので、長く、やや複雑であるが弱いプローブ、とくにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６についてより強い信号が認められる。
【００７０】
ところで、以下の表１０はビオチン化および非ビオチン化アンプリコンの間に認められる結果の差を示している。
【表１０】
2004513651.tif 000011
表１０：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２／０６０５異型接合体系列で得られたＤＯ（×１０００）の値
ここで、先述のごとく、プレートの底で検出プローブの固定を可能にする、５’でアミン化された分岐は、ビオチン化アンプリコンについてはもはや使用されていないが、それは捕捉されたアンプリコンの上に存在するビオチンに固定できるようになるペロキシダーゼに組み合わされたストレプタビヂン共役溶液が用いられるからである。
【００７１】
２゜）ビード上に吸収された捕捉プローブの使用
例えば、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６のプローブが存在するプイに固有の信号を増加させるために、直径０．１ｍｍのポリスチレンのビード１００μｌの懸濁によって、＜コーティング＞とも呼ばれる被覆を用いることが可能である。これらのビードはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＰＡ）ＵＳＡ−ｒｅｆ．：００８７６）からのものであり、５’にビオチニル化された形で調製されたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６の捕捉の固有オリゴヌクレオチドによって感作されたＳｉｇｍａ社（Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ（ＭＯ）ＵＳＡ−ｒｅｆ．：Ａ９２７５）によって製造されたアビジン分子によって被覆されている。この場合、ビオチンが存在するので、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６捕捉固有オリゴヌクレオチドは連結分岐を持たない。
【００７２】
Ａ−ビードの調製
１−アビジン被覆ビードの調製
適切な仕方として：
・９．３のｐＨで５０ｍＭホウ酸塩緩衝液１００μｌ内に、５ｍｇ／ｍｌの濃度にアビジン溶液２．５μｌを希釈、
・ビードの懸濁７．４μｌを添加、そして
・３７℃の温度で３０分間保温する。
２−アビジンで被覆され、捕捉プローブを担持するビードの調製
さらに：
・ビオチニル化ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６プローブの５．１０１５分子を添加、
・３７℃の温度で３０分間保温、しなければならない。
【００７３】
Ｂ−アビジンで被覆され、捕捉プローブを担持するビードによる被覆
被覆緩衝液（３Ｘ　ＰＢＳ）内で１／１０の、感作されたビードの懸濁の希釈は、つぎにプイ当たり１００μｌの割合で使用される。アミン化されたプローブに使用された被覆条件、すなわち温度３７℃で２時間または１８から２５℃の間に含まれる温度で１５時間は、プイの底への固定に対しても変わらないままである。
この方法は、特定のプイ、例えば、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６のプローブが存在するプイ内の信号を増加させること、したがって、当該プイの分析を容易にすることも可能にする。さらに、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２異型体系列で、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６プローブについて得られたＤ．Ｏ．（×１０００）の値が与える結果は次の通りである：
・ビードなし：１７２、および
・ビードあり：６８９
【００７４】
３゜）インスリン依存糖尿病に対して中立の対立遺伝子の固有捕捉プローブのための単独のプイの使用
捕捉のオリゴヌクレオチドに対する標的オリゴヌクレオチド交雑の検出を実施するためのペロキシダーゼの使用の場合、インスリン依存糖尿病に対する＜＜対立遺伝子の中立性＞＞の決定のために単独のプイを用いることができる。このときは、それぞれが個別に、優れた特異性を有する４つの捕捉の固有プローブ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０から１３）全体が含まれる。
先に述べたごとく、例えば、９６プイ形式の、微小滴定プレートの同じプイの底への多重貯蔵法の開発は、単独各唯一のプイ内への上述の４つのプローブのための別個の貯蔵を実現することを可能にする。
【００７５】
４゜）インスリン依存糖尿病に関係する対立遺伝子全体に固有の捕捉プローブのための単独のプイの使用
微小滴定プレートの１つのプイの底の多重貯蔵法の開発は、同一のプイ内に、表３と４に先に述べた、捕捉非固有（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ３と４）と固有（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５と１３）の１１のプローブの貯蔵を可能にする。単一のプイ内でのアンプリコンの交雑過程の実現は、様々な長所がある：
・試験の安全性の長所、１１個のプローブが誤った陰性のリスクなしに標本のすべてのアンプリコンに同時に出会うことができるから、
・試験感受性の長所、なぜなら１１個のプローブが標本のアンプリコン全体に出会うから
・大規模な試験を実施できる長所、ならびにプレート当たり９６も標本を処理できる長所、これは追跡用途分野にはとくに有利である。
上述のごとく、他方でこの手法はプイの底の特異的交雑の局部的な発現を必要とする。例として、蛍光性の、あるいは蛍光マーカで発現できる分子を取り込んだアンプリコン検出のために蛍光を用いることが可能である。
同じ１つのプイ内の複数の貯蔵の利用の実施可能性試験も、比色発現によって、実施した。
【００７６】
Ａ−貯蔵：
被覆緩衝液またはコーティング（ＰＢＳ　３Ｘ）ｎａｉｎｏ　４００−１０００ｐモル／ｍｌで、１および５μｌの貯蔵で、捕捉の固有プローブ（アミン化バージョンの場合、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０から１３）の４つの手動貯蔵試験。３７℃で１５分から２時間の間、あるいは１８から２５℃の間に含まれる温度で１５時間保温する。
Ｂ−洗浄：
希釈Ｃｏｌｏｒ０で実施する。
Ｃ−標的の調製：
ＰＣＲアンプリコンは前節（ＩＩＩ−１゜）−Ｃ）に記載のごとく調製した。
増幅管内で、次の過程を実施する：
・１μｌの２Ｎ　ＮａＯＨを展開してアンプリコン５０μｌの変性、
・１８から２５℃の間に含まれる温度で５分間保温、
・交雑緩衝液４０μｌの添加（ＳＳＰＥ　１５Ｘ，２％　ＰＥＧ　４０００、１．５％ｔｗｅｅｎ２０，０．２２％ゼラチン、０．０３２％音波処理ＤＮＡ、農薬）
・共役溶液Ｄ４−ＰＯＤを６μｌ添加（５０ｐモル／ｍｌ；燐酸緩衝液５ｍＭ　ｐＨ７．０−０．５％（ｐ／ｖ）ＡＳＢ−０．５％（ｐ／ｖ）フェノール）。
Ｄ−交雑：
反応混合物全量を４つの貯蔵で感作したプイ内に移し、３７℃から±１℃の温度で１時間保温する。
Ｅ−洗浄：
希釈Ｃｏｌｏｒ０で実施する。
Ｆ−発現：
下記の過程を実施する：
・基質溶液１００μｌ（Ｃｏｌｏｒ２内に希釈したＣｏｌｏｒ１）を添加
・暗闇で、１８と２５℃の間に含まれる温度で２０分間、攪拌せずに現像
・陽性のプローブの場所の発色出現を観察、
・Ｃｏｌｏｒ３を５０μｌ添加して信号を定量化
・静かに攪拌して均質化、そして
・４９２ｎｍで読み取る。
必要に応じて本明細書に組み込まれる参考文献
Ｂｅｎｊａｍｉｎ，１９９０：
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月27日(2002.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の患者の遺伝的素因の分析方法において、
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３対立遺伝子に固有な少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてインスリン依存糖尿病に関連する他の対立遺伝子に固有の少なくとも一つのプローブ、
のように選択されたプローブを同時に存在させて、対象の少なくとも１つの多形性領域の増幅から得られた、少なくとも１つのアンプリコン型を含む液体標本を所望の疾患、すなわちインスリン依存糖尿病に関連づけることをもってなる方法。
【請求項２】
インスリン依存糖尿病の検出に用いたプローブが次のように定義される：
・感受性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３，ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、
・防御性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブ、および
・中立性についてＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２と、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊００６１２対立遺伝子に固有の少なくとも１つのプローブであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有のプローブであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５（ＴＣＴＴｇＴｇＡｇＣＡｇＡＡｇＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６（ＣＣｇＣＣＴｇＣＣｇＣＣｇＡ）、
であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有のプローブ、
であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７（ＡｇｇｇｇＡＣＣＣｇｇｇＣｇｇＡ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８（ｇＡＣｇＴｇｇＡｇｇＴｇＴＡＣＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９（ｇＣＣｇＣＣＴｇＡＣｇＣＣｇ）、
であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２対立遺伝子に固有のプローブ、
であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブが下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）アミノ酸で構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０（ｇｇｇｇＣＣＣｇｇｇＣｇＴＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１１（ＡｇｇＡｇｇＡＣｇＴｇＣｇＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１２（ＴＣＴＴｇＴＡＡＣＣＡｇＡＴＡＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３（ｇｇＴｇｇＡＣＡＣＣｇＴＡＴｇＣＡｇ）、
であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
すべてのＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子の検出を可能にするために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子全体と交雑することができる、少なくとも１つの正の対照プローブが使用されることを特徴とする、請求項２から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
同一のプローブの塩基の最大３８．８９％、好適には最大２０％がイノシンなどの、少なくとも１つの類似の塩基によって置換されることを特徴とする、請求項４、６、８または９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
予め、ＨＬＡ−ＤＱＢ１に関連する１つまたは複数の対象多形領域の少なくとも１つの増幅が実施されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
アンプリコンも同じくビオチン化されるように、増幅プライマはビオチン化されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅に先立って、好適にはかさぶた班の形で、採取された生物標本は核酸を抽出するために処理されることを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
核酸の抽出が、続く増幅の前に使用されるトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）をすでに含んでいる反応混合物内で実施され、その後保温されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
反応混合物の中にトリホスフィト・デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＰＴ）を添加し、それが後に増幅の際にも使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固有プローブのそれぞれのタイプが、他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイ（ｐｕｉｔｓ）などの、独立した室内に固定されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか１つに記載の方法を実施するための装置。
【請求項１７】
インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性を検出するために使用されるそれぞれのタイプのプローブがこの感受性とこの防御性を検出するために使用される他のプローブとは独立して、微小滴定プレートのプイなどの、独立した室内に固定され、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用異なるタイプのプローブのすべてまたは一部が微小滴定プレートの少なくとも１つのプイ内に固定されることを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
少なくとも２つのタイプの異なる固有プローブが、その間に相互作用なしに、微小滴定プレートの同じプイなどの、独立した同じ室内に固定されることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の装置。
【請求項１９】
インスリン依存糖尿病に対する感受性または防御性または中立性を検出するために使用されるプローブのタイプの全体が微小滴定プレートのプイなどの、唯一かつ同一の室内に固定されることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の装置。
【請求項２０】
例えば、ペルオキシダーゼによって、酵素反応を利用する非局所的比色発現であることを特徴とする、請求項１６または１８に記載の装置で実現される交雑発現方法。
【請求項２１】
例えば、蛍光または放射能による、それぞれのタイプのプローブとアンプリコンの間に実現された交雑の局所的発現であることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれか１つに記載の装置で実現される交雑発現方法。
【請求項２２】
プライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ２と組み合わせてプライマＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１を使用することをもってなる、インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析方法において使用するためのＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の増幅を可能にするプライマ。
【請求項２３】
５’のビオチン化物であることを特徴とする、請求項２２に記載のプライマ。
【請求項２４】
インスリン依存糖尿病に対する患者の遺伝的素因の分析のために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子に対応する配列の交雑を可能にする捕捉プローブであって、プローブの５’に位置するアミノまたはビオチン分岐を介して微小滴定プレートのプイの底、またはビードの上に固定されることを特徴とする、プローブ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０３対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０５、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０７とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する感受性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）ヌクレオチドで構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ５（ＴＣＴＴｇＴｇＡｇＣＡｇＡＡｇＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ６（ＣＣｇＣＣＴｇＣＣｇＣＣｇＡ）。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０９とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３１０対立遺伝子に固有のプローブ、および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０８、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１０、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１４とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１６対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する防御性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）ヌクレオチドで構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ７（ＡｇｇｇｇＡＣＣＣｇｇｇＣｇｇＡ）
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ８（ｇＡＣｇＴｇｇＡｇｇＴｇＡＣＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ９（ｇＣＣｇＣＣＴｇＡＣｇＣＣｇ）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
より詳細には、上述のすべての変型において、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは次のように定義される：
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０４０２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３１とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０３２対立遺伝子に固有のプローブ、
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１３対立遺伝子に固有のプローブ、
および
・ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０５２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０６、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０９、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１１２とＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６１２対立遺伝子に固有のプローブ。
この最後の場合について、インスリン依存糖尿病に対する中立性を検出するために使用されたプローブは下記の配列から取られた連続する少なくとも１０個の（１０）ヌクレオチドで構成される：
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１０（ｇｇｇｇＣＣＣｇｇｇＣｇＴＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１１（ＡｇｇＡｇｇＡＣｇＴｇＣｇＣ）、
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１２（ＴＣＴＴｇＴＡＡＣＣＡｇＡＴＡＣ）、および
・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ１３（ｇｇＴｇｇＡＣＡＣＣｇＴＡＴｇＣＡｇ）。




【国際調査報告】
2004513651.tif 000061
2004513651.tif 000062
2004513651.tif 000063
2004513651.tif 000064
2004513651.tif 000065
2004513651.tif 000066
2004513651.tif 000067
2004513651.tif 000068