(57)【要約】現代では、３種の技術を遺伝子発現の分析のために利用する：ハイブリダイゼーションに基づく技術、ＰＣＲに基づく技術、および配列決定に基づく技術。本発明は、固体支持体および標的核酸のある領域に相補的な捕捉プローブを使用する、および標的核酸に相補的な標識伸長物を重合化させる、特定の核酸の存在および／または量を分析するための方法を提供する。本発明は、すべての型の核酸の分析の方法を提供し、そして任意の望まれる組み合わせで混合することのできる異なるクラスのミクロスフェアにコンジュゲートされている異なる捕捉プローブを使用して単一アッセイで多数の遺伝子を研究するために使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；
（ｂ）捕捉プローブおよび標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、該基質を核酸サンプルを接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると該標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；
（ｃ）該基質を、該標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）のに好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が、該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有する、ステップ；および
（ｄ）該標識を分析し、該核酸サンプル中の該標的核酸の存在または不存在を決定する、ステップ；
のステップを含む、核酸サンプルの分析の方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）において該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させるために好適な条件に暴露する、請求項１の方法であって、ここで該伸長物が、該伸長物の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）において該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部または全部に相補的である、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含むプローブ核酸とのハイブリダイゼーションに好適である条件に曝露する、請求項１の方法。
【請求項４】
該固体支持体が、ミクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティビーズ、遺伝子チップ、膜、ミクロタイタープレート、ガラスプレート、およびプラスチックプレートからなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該固体支持体が蛍光ミクロビーズである、請求項４の方法。
【請求項６】
該ミクロビーズが蛍光色素を含む、請求項５の方法。
【請求項７】
該ミクロビーズが、少なくとも２種の異なる蛍光色素を含む、請求項６の方法であって、該異なる蛍光色素が異なる波長の蛍光を放射し、該ミクロビーズの蛍光同一性を指摘する、方法。
【請求項８】
該基質が、少なくとも２種の異なるクラスの複数のミクロビーズを含む、請求項７の方法であって、該クラスが、それぞれのクラス内のミクロビーズの蛍光同一性に基づき、かつミクロビーズの該異なるクラスが異なる標的核酸に対応する、方法。
【請求項９】
該異なる蛍光のそれぞれの蛍光を検出し、ミクロビーズの蛍光同一性を決定するステップ；および
分析した標識を、該ミクロビーズの蛍光同一性と相関させるステップ；
をさらに含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
該基質が、複数の種の捕捉プローブを含み、かつそれぞれの種内のプローブが、すべての他の複数の種のプローブから区別できる配列を有する、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該複数の種の捕捉プローブの少なくとも２種が、単一の標的核酸の異なるセグメントに対応する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該複数の種の捕捉プローブが、異なる標的核酸に対応する、請求項１０の方法。
【請求項１３】
該基質が１０種より多い捕捉プローブを含む、請求項１ないし１２のいすれかの方法。
【請求項１４】
該固体支持体が、遺伝子チップ、膜、ガラスプレート、およびプラスチックプレートからなる群より選択され、捕捉プローブのそれぞれの種が、固体支持体の分離した領域に連結されている、請求項１０ないし１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
該固体支持体が、遺伝子チップ、膜、ガラスプレート、およびプラスチックプレートからなる群より選択され、固体支持体の複数の分離した領域のそれぞれが、種が決定されるそれに連結された（ｌｉｋｅｄ）プローブを有する、請求項１０ないし１３のいずれかの方法。
【請求項１６】
該基質が、複数の固体支持体単位を含む、請求項１０ないし１３のいすれかの方法であって、該固体支持体単位が、ミクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティービーズ、蛍光ビーズ、および放射性標識ビーズからなる群より選択される、請求項１０ないし１３のいずれかの方法。
【請求項１７】
それぞれの固体支持体単位が、該複数の種の内のいずれかのそれらに連結された唯一のプローブを有する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
それぞれの固体支持体単位が、種が決定され、それらに連結されたプローブを有する、請求項１６の方法。
【請求項１９】
分析ステップに基づいて、標的核酸の存在を示す、固体支持体領域または単位を同定するステップ；
同定ステップの固体支持体領域または単位に連結された捕捉プローブのすべての種を決定するステップ；
該決定ステップのプローブ種を含む第２基質を提供するステップであって、ここで該プローブ種が複数の種を含む固体支持体上のそれぞれの種の分離した位置に基づいて、または複数の固体支持体単位のそれぞれ上の単一種のみの存在に基づいて、互いに区別可能である、ステップ；
該第２基質を、該核酸サンプルと、プローブ種と標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると標的核酸の配列の第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；
該基質を、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させるために好適な条件に曝露するステップであって、ここで該伸長物が該伸長物の検出の感度を高めるために適合化された標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ；および
標識を分析し、標的核酸がハイブリダイズしたプローブ種を同定するステップ；
のステップを含む、請求項１０ないし１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
該捕捉プローブが、標的核酸の３’−末端から近似的に１０００と６００の間の塩基の内の領域に相補的である、請求項１ないし１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
該捕捉プローブが１５と１５０の間のヌクレオチドからなる、請求項１ないし２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
該捕捉プローブが、２０と６０の間の塩基からなる、請求項２１の方法。
【請求項２３】
該捕捉プローブが、２２と２５の間の塩基からなる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
該捕捉プローブ内の補足の領域が、試験すべきサンプルのすべての遺伝子の間で独特である、請求項１ないし２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
該核酸サンプルが、植物、動物、真菌、またはウイルスに由来する、請求項１ないし２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
該標的核酸が、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＰＣＲ産物からなる群より選択される、請求項１ないし２５のいずれかの方法。
【請求項２７】
該標的核酸がｍＲＮＡである、請求項２６の方法。
【請求項２８】
該標的核酸がｃＤＮＡである、請求項２６の方法。
【請求項２９】
該標的核酸が生物に由来し、かつ生物の特定の表現型または形質と連関している、請求項１ないし２８のいずれかの方法。
【請求項３０】
該伸長物が、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、およびクレノーフラグメントからなる群より選択される酵素によって、または該群のいずれかのメンバーの突然変異体によって重合化される、請求項１ないし２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
重合化プロセスにおける標識対非標識ヌクレオチドの比率が、１：７と１：２の間、好ましくは１：５と１：２の間、そしてもっとも好ましくは１：３である、請求項１ないし３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
該補足核酸が、１０ないし５０毎、好ましくは１５ないし３５毎、より好ましくは２０ないし２５ヌクレオチド毎の間で、該補足核酸に取りこまれた、約１の修飾または標識ヌクレオチドを含む、請求項１ないし３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
標識プローブ分子の数が、１と１０の間、好ましくは１と５の間、そして最も好ましくは１と３の間のプローブ核酸分子の範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
該標識が放射性核種、蛍光剤、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原、リガンド、および金属イオンからなる群より選択される、請求項１ないし３３のいずれかに記載の、方法。
【請求項３５】
該標識がキサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ５３２、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニン、およびビオチンからなる群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項３６】
該分析ステップが、標的核酸と会合する標識の定量を含む、請求項１ないし３５のいずれかの方法。
【請求項３７】
該分析ステップが、標的核酸と会合する標識の定量を含む、請求項３６の方法。
【請求項３８】
該ミクロビーズがその蛍光色素同一性に基づいて分類される、請求項１ないし３７のいずれかの方法。
【請求項３９】
該分析が、標的核酸中の単一ヌクレオチド多型性を同定するために使用される、請求項１ないし３８のいずれかの方法。
【請求項４０】
（ａ）生物学的系を物質で処理し；または生物学的系を環境条件の変化の対象とする、ステップ；
（ｂ）該生物学的系からの核酸サンプルを抽出するステップ；
（ｃ）固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが、一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；
（ｄ）該基質を、生物学的系から抽出した核酸サンプルと、該捕捉プローブと該標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると該標的核酸の配列の第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；
（ｅ）該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足するのに好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含み、そしてここで、該補足が好ましくは、該標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させることによって達成され、ここで該伸長物が、該伸長物の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ；
（ｆ）該標識を分析し、該核酸サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するステップ；および
（ｇ）該生物学的系中の標的核酸の発現または調節の変化を決定するステップ
のステップを含む、生物学的系における標的核酸の発現または調節の変化をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
該生物学的系が細胞または細胞培養物、組織、器官、個々の生物、単一分類の個体の集団、および細胞、組織、器官または異なる分類の個体の組み合わせからなる群より選択される、請求項４０の方法。
【請求項４２】
該系が植物、動物、真菌、ウイルスまたは植物、動物、ウイルスまたは真菌の一部を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
該物質が、有機物質、イオン、ミネラル、ビタミン、ホルモン、気体、ウイルス、細菌、および真菌からなる群より選択される、１または２以上の構成要素を含む、請求項４０の方法。
【請求項４４】
該分析ステップが、標的核酸と会合している標識の定量を含む、請求項４０ないし４３のいずれかの方法。
【請求項４５】
該固体支持体がミクロビーズである、請求項４０ないし４４のいずれかの方法。
【請求項４６】
該ミクロビーズが少なくとも２種の異なる蛍光色素を含む請求項４５の方法であって、該異なる蛍光色素が、異なる波長の蛍光を放射しミクロビーズの蛍光色素同一性を指摘する、方法。
【請求項４７】
異なる蛍光色素のそれぞれの蛍光を検出し、ミクロビーズの蛍光同一性を決定するステップ；および
分析した標識を、ミクロビーズの蛍光同一性と相関させるステップ；
のステップをさらに含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
該標的核酸が、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＰＣＲ産物からなる群より選択される、請求項４０ないし４７のいずれかの方法。
【請求項４９】
該標的核酸が生物に由来し、かつ該生物の特定の表現型または形質と連関している、請求項４０ないし４８のいずれかの方法。
【請求項５０】
遺伝子発現分析の系であって、該系が少なくとも２種の異なる蛍光色素を有するミクロビーズを含み、該系がさらに該ミクロビーズと連結された少なくとも１種の捕捉プローブを含み、該捕捉プローブが標的核酸の配列の第１のセグメントに相補的な配列を有し、該系がまた標的核酸の配列の第２セグメントに相補的な標識されたプローブを含み、ここで、該標識されたプローブがその検出の感度を高めることのできる標識を含む、系。
【請求項５１】
該標識されたプローブが、該複合体内の核酸重合化の産物である、請求項５０の系であって、該第２セグメントを、重合化のためのテンプレートとして使用する、系。
【請求項５２】
該標識されたプローブが、標的核酸の第２セグメントに相補的な第１領域およびシグナル増強剤と相互作用することのできる第２領域を含む、請求項５０の系。
【請求項５３】
該第２領域が複数の末端を有する分枝構造である請求項５２の系であって、該末端の少なくとも２種が、シグナル増強剤と相互作用することのできる、系。
【請求項５４】
該シグナル増強剤が、標識されたプローブ、放射性核種、蛍光色素、化学発光剤、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原リガンド、および金属イオンからなる群より選択される請求項５２または５３の系。
【請求項５５】
固体支持体および固体支持体に連結された捕捉プローブを含む、生物の特定の生理学的状態の診断のために適する診断キットであって、ここで該捕捉プローブが該生理学的状態に連関する標的核酸の第１セグメントに相補的である、診断キット。
【請求項５６】
標的核酸の第２セグメントにハイブリダイズすることのできるプローブをさらに含む、請求項５５のキット。
【請求項５７】
該プローブが標識の検出の感度を高めることのできる、標識をさらに含む、請求項５６のキット。
【請求項５８】
標的核酸の第２セグメントに相補的なプローブの伸長に必要な構成要素をさらに含む、請求項５５のキット。
【請求項５９】
固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップであって、ここで、該標的核酸が育種計画における所望の形質と相関がある、ステップ；
該基質を、捕捉プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、育種計画における個体または集団に由来する核酸サンプルと接触させるステップ；
標的核酸の第２セグメントを探索し、標的核酸の存在または不存在を検出するステップ；および
該標的核酸の存在または不存在に基づいて、該育種計画のため個体または集団の望ましさを決定し、それによって該個体をマーカー援助育種のために使用するステップ
のステップを含む、マーカー援助育種のための方法。
【請求項６０】
該探索ステップが、重合化のためのテンプレートとして第２セグメントを使用してプローブの重合化を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
該固体支持体が、少なくとも２種の異なる蛍光色素を有するミクロビーズを含む、請求項５９の方法。
【請求項６２】
該形質が複数の標的核酸と相関し、そしてここで該基質が標的核酸の少なくとも２種に相補的な捕捉プローブを含む、請求項５９ないし６１のいずれかの方法。
【請求項６３】
該方法が、育種のための候補をスクリーニングするために使用される請求項５９ないし６２のいずかの方法。
【請求項６４】
該方法が、末端使用のためまたは次の育種ステップのための育種計画の後代のスクリーニングのために使用される、請求項５９ないし６３のいずれかの方法。
【請求項６５】
固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；
該基質を、捕捉プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、核酸サンプルと接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると、該標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；
該基質を、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させるために好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該伸長物が該伸長物の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ；および
該標識を定量的に分析し、該標的核酸を捕捉する捕捉プローブの有効性を決定するステップ；
のステップを含む、捕捉プローブの有効性を決定する方法。
【請求項６６】
固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップ；
少なくとも第１セグメント、第２セグメント、および第３セグメントを含む、一本鎖標的核酸サンプルを探索するステップであって、ここで該捕捉プローブが該セグメントのいずれかの一部に相補的な配列を有する、ステップ；
該基質を、捕捉プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、核酸サンプルと接−触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると、該核酸サンプルの少なくとも２種のセグメントが一本鎖のままである、ステップ；
該基質を、標識されたプローブと該核酸サンプルの一本鎖セグメントの一部の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、少なくとも１種の標識されたプローブと接触させるステップであって、ここで、該標識されたプローブが該核酸サンプルの一本鎖セグメントの少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む、ステップ；および
該標識を定量的に分析し、核酸サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定するステップ；
のステップを含む、核酸サンプルの分析の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸の分析の方法に関する。より具体的には、本発明は、標的核酸を捕捉し、典型的には次いで該標的核酸に相補的な伸長物の重合化のための、固体支持体／捕捉プローブ系を使用して、１または２以上の特定の核酸の存在および量を分析するための方法を提供する。
【０００２】
遺伝子発現の分析は現在３種の基本的技術を使用する：ハイブリダイゼーションに基づく技術（ノーザンブロッティング、差し引きクローニングおよびＤＮＡマイクロアレイ）、ＰＣＲに基づく技術（ディファレンシャルディスプレイ）および配列決定に基づく技術（ＳＡＧＥ、ＭＡＳＳスクペクトロメトリシーケンシング、ＥＳＴ）。これらのアプローチのなかで、ノーザンブロティングおよびマイクロアレイは、遺伝子発現研究のために最も広く使用され、一方他の方法は、多かれ少なかれ、遺伝子発見、遺伝子クローニング、またはライブラリー構築の目的のために適用される。上記技術は、多くの固有の問題を有する。ノーザンブロッティングは、多重サンプルまたはプローブの評価のためにあまり適さない、遅い、面倒な過程である。スクリーニング手段として、ノーザンブロティングは特に不適当である。ハイブリダイゼーションに基づく技術、例えば遺伝子チップは、非常に高価であり、そして多量の特殊装置を必要とする。加えて、遺伝子チップは、長いハイブリダイゼーション時間を要し、そしてこうして多数の異なるサンプルのスクリーニングに適さない。具体的数の遺伝子を、チップ上に誘導するが、これらはプローブのわずかな数でスクリーニングすることができるのみであり、そして該チップは通常予め作成され、遺伝子または所望の他の核酸の選択された群に指向化されたスクリーニングプロトコールを設計および修飾するフレキシビリティを使用者は有しない。
【０００３】
本発明の視点は、核酸サンプルの分析の方法を提供する。ある実施態様では、該方法は以下のステップを含む：固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；捕捉プローブおよび標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、該基質を核酸サンプルを接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると該標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；該基質を、該標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）のに好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が、該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有する、ステップ。
【０００４】
本発明の好ましい実施態様では、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させ得、ここで、該伸長物は、該伸長物の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含み；そして該標識を分析し、該核酸サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定する。
【０００５】
本発明のさらなる実施態様では、基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部または全部に相補的である、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる修飾または標識を有する、１または２以上のヌクレオチドを含むプローブ分子とのハイブリダイゼーションをもたらす条件に曝露する。
【０００６】
本発明のこの視点によると、分析ステップは、標的核酸と会合する標識の定量を含むことができる。固体支持体は、例えば、ミクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティビーズ、遺伝子チップ、膜、ミクロタイタープレート、ガラスプレート、プラスチックプレート等であることができる。固体支持体は、蛍光ミクロビーズであることができ、そして１、２、またはより多い蛍光色素；好ましくは、ミクロビーズの蛍光色素同一性を指摘する異なる波長の蛍光を放射する異なる蛍光色素を含むことができる。該基質は、少なくとも２種の異なるクラスの複数のミクロビーズを含むことができ、ここで、該クラスは、それぞれのクラス間のミクロビーズの蛍光同一性に基づき、そしてここで、該異なるクラスのミクロビーズは、異なる標的核酸に対応する。
【０００７】
本発明のこの視点の方法は、さらに、以下のステップを含む：異なる蛍光色素のそれぞれの蛍光を検出し、ミクロビーズの蛍光同一性を検出するステップ；および分析した標識を、ミクロビーズの蛍光同一性と相関させるステップ。該分析ステップは、標的核酸と会合している標識の定量を含むことができる。同様に該ミクロビーズは、その蛍光色素同一性に基づき分類することができる。標的核酸は例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ，ＰＣＲ産物等であることができ、そして好ましくは、植物、動物、ウイルスまたは真菌に由来することができる。
【０００８】
本発明のこの視点の方法を使用し、標的核酸の単一ヌクレオチド多型性を同定することができる。そのような実施態様では、該核酸は、生物に由来することができ、そして生物の特定の表現型または形質と連関する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ことができる。該伸長物は、酵素、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、クレノーフラグメント、によって、または任意のそのような酵素の突然変異体形態によって重合化することができる。該標識は例えば、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原、リガンド、および金属イオンであることができる；特に、該標識は、例えば、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ５３２、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニン、ビオチン等であることができる。該基質は、複数の種の捕捉プローブを含むことができ、そしてそれぞれの種内のプローブは、すべての他の複数の種のプローブから明瞭な配列であることができる。ある実施態様では、複数の種の内少なくとも２種の捕捉プローブが、単一標的核酸の異なるセグメントに対応することができ、または複数の種の捕捉プローブは、異なる標的核酸に対応することができる。
【０００９】
同様に、ある実施態様では、基質は、１０種より多い捕捉プローブを含むことができる。固体支持体は、例えば、遺伝子チップ、膜、ガラスプレート、プラスチックプレート等であることができ、そして捕捉プローブの種のそれぞれは、固体支持体の分離した領域に連結することができる。代替的に、該固体支持体の複数の分離した領域のそれぞれは、複数の種のそれらに連結されたプローブを有することができる。他の実施態様では、基質は、複数の固体支持体単位を含むことができ、ここで、該固体支持体単位は、例えば、ミクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティービーズ、蛍光ビーズ、放射性標識ビーズ等である。そのような固体支持体単位のそれぞれは、複数の種のうちのいずれかのそれらに連結された唯一のプローブを有することができる。代替的に、それぞれの固体支持体単位は、複数の種のそれらに連結されたプローブを有することができる。
【００１０】
ある実施態様では、本方法は、以下の追加的ステップを含むことができる：分析ステップに基づいて、標的核酸の存在を示す、固体支持体領域または単位を同定するステップ；同定ステップの固体支持体領域または単位に連結された捕捉プローブのすべての種を決定するステップ；該決定ステップのプローブ種を含む第２基質を提供するステップであって、ここで該プローブ種が複数の種を含む固体支持体上のそれぞれの種の分離した位置に基づいて、または複数の固体支持体単位のそれぞれ上の単一種のみの存在に基づいて、互いに区別可能である、ステップ；該第２基質を、該核酸サンプルと、プローブ種と標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足するために好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させ得、ここで、該伸長物が該伸長物の検出の感度を高めるために適合化された標識を有するヌクレオチドを含み；そして該標識を分析し、標的核酸にハイブリダイズしたプローブ種を同定する。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様では、該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部または全部に相補的である、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる修飾または標識を有する１または２以上のヌクレオチドを含むプローブ分子とのハイブリダイゼーションをもたらす条件に曝露する。
【００１３】
本発明のさらなる視点では、物質または環境条件の変化が、生物学的系における標的核酸の発現または調節に及ぼす影響をスクリーニングする方法を提供し、以下のステップを含む；生物学的系を該物質で処理し、またはそれを環境条件の変化の対象とする、ステップ；該生物学的系からの核酸サンプルを抽出するステップ；固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが、一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；該基質を生物学的系から抽出した核酸サンプルと、該捕捉プローブと該標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると該標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足するのに好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ。
【００１４】
本発明の好ましい実施態様では、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させ、ここで、該伸長物は、該伸長物の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含み；該標識を分析し、該核酸サンプル中の標的核酸の存在または不存在を決定し；そして該物質が該生物学的系中の標的核酸の発現または調節に及ぼす影響を決定し得る。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様では、基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部または全部に相補的ある、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる修飾または標識を有する１または２以上のヌクレオチドを含むプローブ分子とのハイブリダイゼーションをもたらす条件に曝露する。
【００１６】
生物学的系は例えば、細胞または細胞培養物、組織、器官、個々の生物、単一分類の個体の集団、細胞、組織、器官、または異なる分類の個体の組み合わせ等であることができる。該系は好ましくは、植物、動物、真菌、または植物、動物、または真菌の一部を含む。該物質は、１または２以上の構成要素、例えば、有機物質、イオン、ミネラル、ビタミン、ホルモン、気体、ウイルス、細菌、真菌等を含むことができる。該環境条件は、塩濃度、ｐＨ、温度、集団密度の変化、またはこれらの変化の対象となると、該生物学的系の生理学的状態に影響を及ぼす可能性を有するその他のファクターによって変化し得る。
【００１７】
該物質または環境条件の変化が、標的核酸の発現または調節に及ぼす影響は、完全な発現の抑制、発現の率の減少、または、他の実施態様では、発現の率の増加を含み得る。
【００１８】
本発明のもう１つの視点は、遺伝子発現分析の系を提供する。好ましい実施態様では、該系は、少なくとも２種の異なる蛍光色素を有するミクロビーズを含み、そしてさらにミクロビーズに連結された少なくとも１種の捕捉プローブであって、該捕捉プローブが標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する捕捉プローブを含み、該系はまた標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントに相補的な標識されているプローブを含み、ここで、該標識されているプローブは、その検出の感度を高めることのできる標識を含む。
【００１９】
該標識されているプローブは、重合化産物のためのテンプレートとして第２セグメントを使用する、複合体内の核酸重合化産物であることができる。標識されているプローブは、標的核酸の第２セグメントに相補的な第１領域、およびシグナル増強剤（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ）と相互作用することのできる第２領域を含むことができる。該第２領域は、複数の端を有する分枝構造であることができ、該端の少なくとも２つはシグナル増強剤と相互作用することが可能である。該シグナル増強剤は例えば、標識されたプローブ、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原、リガンド、金属イオン等であることができる。
【００２０】
本発明のさらなる側面は、固体支持体および固体支持体に連結された捕捉プローブを含む、生物の特定の生理学的状態の診断に好適な診断キットを提供し、ここで、該捕捉プローブは、生理学的状態に連関する標的核酸の第１セグメントに相補的である。該キットはさらに、標的核酸の少なくとも第２セグメントにハイブリダイズすることの可能であるプローブを含むことができ；該プローブは、その検出の感度を高めることのできる標識を含むことができる。該キットは、さらに、標的核酸の少なくとも第２セグメントに相補的な、プローブまたは１または２以上の標識されたプローブ分子の伸長に必要な構成要素を含むことができる。
【００２１】
さらなる視点では、本発明は、以下のステップを含むマーカー援助育種の方法を提供する：固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップであって、ここで、該標的核酸が育種計画における所望の形質と相関がある、ステップ；該基質を、捕捉プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、育種計画における個体または集団に由来する核酸サンプルと接触させるステップ；標的確酸の第２セグメントを探索し、標的核酸の存在または不存在を検出するステップ；そして該標的核酸の存在または不存在に基づいて、該育種計画のため個体または集団の望ましさを決定するステップ。探索ステップは好ましくは、重合化のためのテンプレートとして第２セグメントを使用するプローブの重合化を含む。該固体支持体は、少なくとも２種の異なる蛍光色素を有するミクロビーズであることができる。該形質を、複数の標的核酸と相関させることができ、そしてここで該基質は、標的核酸のうち少なくとも２に相補的な捕捉プローブを含む。該方法を使用し、育種のための候補物をスクリーニングし、および／または末端使用のためまたはその後の育種ステップのため育種計画の後代をスクリーニングすることができる。
【００２２】
さらなる視点では、本発明は、捕捉プローブの有効性を決定する方法を提供し、以下のステップを含む：固体支持体およびそれに連結された捕捉プローブを含む基質を提供するステップであって、該捕捉プローブが一本鎖標的核酸の配列の第１セグメントに相補的な配列を有する、ステップ；該基質を、捕捉プローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で、核酸サンプルと接触させるステップであって、ここで、ハイブリダイゼーションすると、該標的核酸の配列の少なくとも第２セグメントが一本鎖のままである、ステップ；該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足するのに好適な条件に曝露するステップであって、ここで、該補足核酸が該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む、ステップ。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、標的核酸の第２セグメントに相補的な伸長物を重合化させ、ここで、該伸長物は該伸長物の検出の感度を高めることの可能な標識を有するヌクレオチドを含み；そして該標識を定量的に分析し、該標的核酸を捕捉する捕捉プローブの有効性を決定し得る。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様では、該基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部または全部に相補的である、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる修飾または標識を有する１または２以上のヌクレオチドを含むプローブ分子とのハイブリダイゼーションをもたらす条件に曝露する。
【００２５】
低廉、迅速、フレキシブルおよびハイスループット技術に適用可能な核酸分析のための方法をここで開示する。該方法は典型的に、好ましい実施態様では複数のミクロビーズを含む、基質を使用し、それぞれのビーズは、ビーズと会合された蛍光色素に基づく「クラス」に属する。該蛍光色素は、それぞれのビーズクラスの同定を可能とする。ビーズのそれぞれの別個のクラスは、特定の捕捉プローブまたは捕捉プローブの群と会合し得る。該捕捉プローブは所望の標的核酸に対応する一本鎖核酸分子であり得る。
【００２６】
捕捉プローブの好ましい長さは、２２と２５塩基の間である。しかし、またより小さいまたは大きいサイズの捕捉プローブを、本発明に従う方法で好適に使用し得る。より低い側では、１５と１８塩基の間の捕捉プローブのサイズが好ましく、一方、より高い側では、好ましいサイズは６０と１５０塩基の間である。
【００２７】
所望の遺伝子以外の遺伝子とのクロスハイブリダイゼーションを回避するために、捕捉プローブを設計し、その結果、それは所望の遺伝子ないの独特な配列に相補的である。捕捉プローブ配列内のミスマッチは、捕捉プローブの特異性を妨げない限り許容し得る。捕捉プローブの長さを増加させると、許容可能なミスマッチの量はまた増加する。
【００２８】
捕捉プローブは、所望の遺伝子内の本質的に任意の領域に、この領域が試験されるすべての遺伝子の間で独特である限り、相補的であり得る。好ましい領域は、所望の遺伝子の３’−末端から近似的に１０００塩基、所望の遺伝子の３’−末端から好ましくは近似的に８００塩基、そしてなおより好ましくは近似的に６００塩基を含む領域である。
【００２９】
実際上、核酸サンプルを基質に添加し、そして基質と合わせる前または後に変成し得る。一本鎖標的核酸は、対応する捕捉プローブに結合する。捕捉プローブを設計し、その結果、それは標的核酸のセグメントに結合し、標的一本鎖の少なくとも一の他のセグメントを残す。混合物を標的核酸の少なくとも第２セグメントを補足することをもたらす条件に暴露し、ここで、該補足核酸は該補足核酸の検出の感度を高めることのできる標識を有するヌクレオチドを含む。本発明の好ましい実施態様では、捕捉プローブにハイブリダイズしない標的の少なくとも１種のセグメントに相補的である伸長物を重合化する。補足核酸のより低いサイズの限度は、好ましくは１２と１５ヌクレオチドの間であり、一方、より高い側では、好ましい範囲は１５０と２００ヌクレオチドの間である。１８と２５ヌクレオチドの間のサイズ範囲が特に好ましい。
【００３０】
重合化の間、標識を伸長物に取り込ませる。これは、例えば、重合化段階で１または２以上の修飾または標識されるヌクレオチドを提供することによって達成し得る。該標識は例えば、放射性核種、蛍光色素、化学発光剤、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原、リガンド、および金属イオンであることができ；特に該標識は、例えば、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ５３２、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニン、ビオチン等であることができる。
【００３１】
反応混合物中の修飾／標識対非修飾／非標識ヌクレオチドの全体比率は、好ましくは約１：８と：１：２の間、より好ましくは１：５と１：２の間、最も好ましくは該比率は約１：３である。修飾塩基、例えば、ビオチニル化またはフルオレセイン化ヌクレオチドを取りこまれているヌクレオチドが好ましい。特に、４塩基、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの少なくとも１種を標識形態として提供し得る。例えば、ビオチン−１６−ｄＵＴＰまたは、ビオチン−１４−ｄＣＴＰを好ましくは、重合化反応中に、伸長したＤＮＡに取りこませる。得られる伸長物は次いで、そこにすべての１０ないし５０の、好ましくはすべての１５ないし３５、より好ましくはすべての２０ないし２５ヌクレオチドの内の約１の修飾または標識ヌクレオチドの間を含み得る。この標識を次いで定量的および／または定性的に分析し、標的核酸の存在および／または相対量を決定し得る。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、基質を、標的核酸の少なくとも第２セグメントの一部またはすべてに相補的である、プローブ分子の検出の感度を高めることのできる、修飾または標識を有する１または２以上のヌクレオチドを含むプローブ分子とのハイブリダイゼーションをもたらす条件に曝露する。該標識は、４種の塩基Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかにある。例えば、ビオチン−１６−ｄＵＴＰまたはビオチン−１４−ｄＣＴＰを好ましくは、重合化反応中に伸長されるＤＮＡに取りこませ得る。該プローブ分子を５’−または３’−末端で末端標識し得、そしてヌクレオチドストレッチにそって追加的修飾または標識ヌクレオチド、例えば、放射性標識、ビオチニル化またはフルオレセイン化ヌクレオチドを含ませ得る。得られるプローブ分子は次いで、１０ないし５０毎、好ましくは１５ないし３５毎、より好ましくは２０ないし２５ヌクレオチド毎の間で、そこに取りこまれた、約１の修飾または標識ヌクレオチドを含み得る。
【００３３】
検出の感度は、２または３以上の標識プローブ分子を、反応混合物に添加することによってさらに増加させ得、これらは所望の遺伝子の少なくとも第２セグメントの種々の部分に相補的であり、これは補足プローブに結合せず、そしてなお追加的プローブ分子とのハイブリダイゼーションに接近可能である。約１と１０の間、好ましくは約１と５の間、そして最も好ましくは約１と３プローブ分子の間の範囲の数の標識プローブ分子が好ましい。
【００３４】
本発明は特に、遺伝子発現のマルチプレックス分析に良く適する。多数のクラスのミクロビーズであって、単一標的核酸または選択された標的核酸のプールのいずれかに指向化されたそれぞれを同時に使用できるから、１回の実験で何百または何千の遺伝子の発現または存在を、定性的または定量的に検出することが、本方法によって可能である。本方法の実施態様を使用して、化学物質、病原体、ストレス条件および他の環境の混乱、発達段階等に及ぼす影響に接近することが可能である。本方法の実施態様を使用して、個体または集団を、望ましいまたは望ましくない形質または表現型と連関するマーカー配列についてスクリーニングし、植物、動物、または他の経済的または研究意義のある生物のマーカー援助育種の効率を大きく高めることがまた可能である。さらに、ここで開示した方法は、標的核酸の発現に及ぼす影響について薬物およびその他の物質のハイスループットスクリーニングのために有用である。
【００３５】
鎖伸長反応を介する標識の取りこみのために、標的核酸を、極端に小量、顕著に高い感度および標的の検出の範囲において検出できる。この範囲の顕著な部分内で、取りこんだ標識を使用して、遺伝子発現の定量的力学に接近し、いくつかの遺伝子座についてヘテロ接合性およびホモ接合性個体の間を同時的に区別し、および表現型または形質と連関する１または２以上の対立遺伝子またはマーカーの望ましく高いまたは低い頻度で集団を同定することができる。
【００３６】
本発明のある種の実施態様は、商業的に利用可能なルミネックス・ミクロフルイディックス・アナライザー（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎａｌｙｚｅｒ）およびカラーコード化ミクロスフェア（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｅｘａｓ）を使用し、遺伝子発現のための迅速、高感度、およびマルチプレックス化アッセイを提供する。標的遺伝子に由来するオリゴヌクレオチド捕捉プローブを合成し、そして簡単な化学的カップリング反応を介してミクロスフェアに固定化する。ミクロフルイディックス／蛍光技術は、多くの種々のクラスのミクロスフェアを区別することを可能とする。
【００３７】
本方法のマルチプレックス化能力は、検出可能に異なるミクロスフェアのクラスの数の関数である。例えば２５の異なるミクロビーズクラスを使用して（ここでそれぞれのクラスがそれに連結された独特な捕捉プローブを有する）、２５の異なる標的を１回の実験で分析することができる。しかし、より多い数の捕捉プローブをプールすることによってまたはより多い数のクラスのビーズを使用することによって、何百または何千もの標的核酸分子を一回の実験でスクリーニングすることが可能である。例えば、１００の異なるミクロビーズクラスを使用することによって、および２０の異なる選択された捕捉プローブをビーズのそれぞれのクラスに連結することによって、当初捕捉／鎖伸長反応物を、２０００標的配列まで検出することができる。これに、第２捕捉／鎖伸長反応が、例えば、２０の異なるミクロビーズクラスであって、それぞれが１種のみの捕捉プローブを有するものを使用して続き（単一ミクロビーズクラスに当初に連結された２０のプローブのプールから）、第１反応で１のミクロビーズクラスによって実際に捕捉されたすべての標的核酸の正確な決定をもたらす。
【００３８】
ミクロビーズを使用する、プール性スクリーニングの代替として、多重捕捉プローブを、非ビーズ固体支持体、例えば、遺伝子チップ、膜、ガラススライド等の特定の分離した領域に連結することができ、そしてハイブリダイゼーションの第１ラウンドを実施し、どの分離した領域が、サンプル中の標的核酸に対応する捕捉プローブを有し得るか、同定することができる。これに次いで、プール性捕捉プローブのサブセットを有する異なる固体支持体へのハイブリダイゼーションの１または２以上のその後のラウンドが続き、もとのプール中でどの個々の捕捉プローブ（複数もある）が、サンプル中の標的核酸へハイブリダイズしたか同定する。
【００３９】
このプール性スクリーニングプロセスでは、標的核酸の標識を、例えば、標識されたヌクレオチドを取りこむインサイチュ鎖伸長、または標的核酸の領域ヘ相補的な未結合標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む種々の手段によって達成することができる。プローブをプールし、それから個々の標的を同定する他の技術をまた、本方法に従って使用することができる；種々のそのような技術は当業界で知られ、そしてそれらの新規マルチプレックス方法への適用は、当業者に自明である。
【００４０】
蛍光ミクロスフェアのそれぞれのクラスの蛍光サインに基づいて、ミクロフルイディックス・アナライザーは、それぞれのミクロスフェアクラスをすべての他のクラスから正確に区別し、そしてビーズの表面の総蛍光を、それぞれのクラスについて測定し、標識された標的、例えば、ビーズに特異的に会合したＲＮＡまたはｃＤＮＡの量を定量する。単一のアッセイで多数の遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ）を研究するために、それぞれの遺伝子を表す異なる捕捉プローブを、ミクロスフェアの異なるクラスにコンジュゲートさせ、そして所望の遺伝子の特定のプローブとカップリングしたミクロスフェアを、任意の望まれる組み合わせで混合する。それぞれのビーズの蛍光同一性は、したがって、その独特の捕捉プローブまたは捕捉プローブの組み合わせと相関し、そしてまた独特な標的または標的の組み合わせと相関する。こうして、該アッセイは高度にフレキシブルであり、分析のための遺伝子の数の追加または減少が容易である。この方法の他の利点は、高い値ごろ感、迅速な処理およびハイスループット形式を含む。該方法は、臨床的サンプルの診断的検出のため、および作物、育種、およびスクリーニングのマーカー遺伝子の同定のため非常に良く好適である。
【００４１】
本発明は、ノーザンブロッティングおよび遺伝子チップのように、遺伝子発現分析のために特に有用である。遺伝子発現分析のための本発明の利点は、古典的ノーザンブロッティングおよび現代的遺伝子チップと比較して、以下に議論する。
【００４２】
２０年以上前に発明されたが、ノーザンブロッティングはなおその重要性を失わず、そしてしばしば、転写物発現において検出される相違を確認するために使用される。しかし、伝統的ノーザンブロッティング法は、結果を得るために１週間またはそれ以上必要であり得、そしてそれぞれの時にすこしのサンプルを研究することのみ可能である。加えて、ノーザンブロッティングの力は、使用されるＲＮＡの質に高度に依存し得る。本発明は、アッセイ当たり約１時間かかり、そして実験当たり何百ものサンプルおよび多数の遺伝子を容易に分析できる、ノーザンブロッティングの代替方法を提供する。典型的には、ノーザンブロッティングはそれぞれのときに１遺伝子のみ分析する。
【００４３】
労働消費的および時間消費的処理、例えば、電気泳動、染色、及び洗浄は、ノーザンブロッティングに必要であり、ノーザンブロットのハイスループット使用の開発は不可能でないにしても、見込みがない。本発明の簡単な方法は、ハイスループット形式のために非常に容易に適用可能である。本発明のための典型的な単一アッセイの材料コストは、単一のノーザンブロットの材料コストにおおまかに匹敵する。しかし、多数の遺伝子を本発明の単一アッセイにおいて試験できるから、コストは、ノーザンブロティングのコストよりもデータポイントあたり顕著により低い。労働コストを考慮すると、データポイントあたりの新規方法の相対的コストは、ノーザンブロッティングと比較してなおより低い。本発明を使用して、１ないし１０μｇの総ＲＮＡは、豊富におよび温和に発現された遺伝子についての検出可能なシグナルを取得するために典型的に十分である。ノーザンブロッティングは、通常５ないし３０□ｇの総ＲＮＡを要する。
【００４４】
遺伝子チップの導入は、遺伝子発現プロファイルおよびゲノム組成の研究を驚異的に前進させた。該技術は、プローブ、例えば、ＥＳＴ、ＰＣＲ産物、またはクローン化ｃＤＮＡに由来するオリゴヌクレオチドをナイロンフィルター、ガラススライドまたはシリコンチップの表面に高密度で付着させることに関係する。遺伝子発現レベルを決定するために、標識したｃＤＮＡをアレイ上のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイズしたシグナルを遺伝子捕捉部位上の蛍光プローブを介して走査または測定する。アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）遺伝子チップは、１アレイで、酵母の完全ゲノムに相当する、約７０００遺伝子の検出を可能とする。遺伝子チップはこうしてゲノムプロファイリングのための強力な手段である。しかし、遺伝子チップについて、ある種の応用のためにそれらを使用するとき、限界が存在する。例えば、遺伝子チップは、非常に多数のサンプルについて、少数の遺伝子を研究するために適さない。任意のスクリーニング系における臨床診断、薬物スクリーニング、およびマーカー遺伝子同定のために、幾つかの特定の遺伝子を多数のサンプルから検出することがしばしば必要である。他方、本発明はこの目的に非常に良く供する。それは診断およびスクリーニング応用に優れている。
【００４５】
通常は、遺伝子チップのそれぞれの遺伝子の位置は固定されている。顧客は、ほとんどの状況下で自らの興味で遺伝子を選択する自由があまりない。遺伝子チップ技術についてあつらえたアレイを持つことは、実際上きわめて困難である。例えば、遺伝子の位置または遺伝子の組成を遺伝子チップのなかで変化させるならば、それにしたがって関連ソフトウェアをリライトしなければならず、これはコンピューター専門家および生物学者の両方からの驚くべき量の仕事を要する。対照的に、本発明は、あつらえたアレイを創出するために非常にフレキシブルである。好ましい実施態様では、特定のプローブとカップリングさせたミクロスフェアを、所望の任意の遺伝子の検出のために任意の望まれる組み合わせで容易に混合することができる。
【００４６】
アフィメトリックス遺伝子チップ技術は、高価な予め作成した遺伝子チップを使用し、およびまた高価な装置を要する。正確な分析のため必要な莫大な量のデータを、高価なソフトウェアによって分析しなければならない。予め作成されたアフィメトリックス遺伝子チップを購入する代替として、自己設計ｃＤＮＡマイクロアレイを作成することは、高価なスポッターおよび高質なスキャンナーを要する。ほとんどの実験室は遺伝子チップまたはそれを分析および／または作成するために使用される機械を費やすことができない。遺伝子発現分析のための本発明の低コストは、こうして特に魅力的である。好ましい実施態様で蛍光ミクロスフェアを分析するために使用されるミクロフルイディックス・アナライザーは比較的高価であるが、分析のために必要なミクロスフェアはデータポイントあたりあまり高価でない。全体として、本発明の方法の費用は、遺伝子チップ技術よりも実験当たりずっと低い。
【００４７】
遺伝子チップのためにハイブリダイゼーションステップは、少なくとも１６時間のインキュベーションを要し、そしてｃＤＮＡチップは、４時間のインキュベーションを要する。新しい方法では、ハイブリダイゼーションインキュベーションは、典型的に、約１０ないし３０分続く。したがって、遺伝子発現分析を研究するために本発明を利用して多くの時間を節約する。高コストおよび長ハイブリダイゼーション時間のために、遺伝子チップ技術は、多量のサンプルをスクリーニングするために適さない。対照的に、本発明は、多数のサンプルのハイスループットスクリーニングについて遺伝子チップより、ずっとはやく、より低廉で、そしてよりフレキシブルである。
【００４８】
本発明は、好ましい実施態様では複数のミクロビーズである固体支持体を使用する核酸サンプルの分析のための方法を企図し、それぞれのビーズは、それと会合した蛍光色素（複数もある）に基づく「クラス」に属する。これは、ビーズクラスの同定を可能とする。ビーズのそれぞれの別個のクラスは、それに付着された特定の種の捕捉プローブを有する。該捕捉プローブは、検出または定量すべき所望の核酸に対応する一本鎖核酸分子である。核酸サンプルを基質に添加し、そして標的核酸は捕捉プローブに結合する。結合標的を有する基質を、標的核酸の一本鎖セグメントに相補的な、重合化すべき伸長物をもたらす条件に曝露し、その結果標識は該伸長物に取りこまれる。この標識を次いで分析し、標的核酸の存在または不存在を決定し、または量を定量する。
【００４９】
固体支持体は例えば、ミクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティービーズ、遺伝子チップ、膜、ミクロタイタープレート、ガラスプレート、またはプラスチックプレートであり得る。カラーコート性ミクロスフェアは、好ましい実施態様であり、そして特に有利な固体支持体であり、なぜならそれらをミクロフルイディックス・アナライザーと使用して、特定の捕捉プローブに対応する特定のミクロビーズを同定することができるからである。ルミネックスビーズは容易に同定することのできる２の蛍光色素の特定のサインに典型的には対応する。これにより、同時の多重分析が可能となる。
【００５０】
ルミネックスミクロビーズは、１９９９年１月２２日に出願され、そしてＷＯ００／３７８１４として１９９９年７月２９日に公開された、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１３１５に詳細に考察されている。簡単には、該ミクロビーズは、１または２以上の蛍光色素で染色されたポリマー性ナノ粒子を取りこんでいる微粒子である。所定の集団中のナノ粒子のすべては、同じ濃度の色素で染色されており、そして、異なる色素で染色された既知の量のその他のナノ粒子とともに、既知の量のこれらのナノ粒子をミクロスフェアに取り込むことによって、ミクロ蛍光ミクロスフェアを生じる。ナノ粒子の異なる集団の量および比率を確認することによって、独特な放射性スペクトルでミクロスフェアの多数の分離した集団を確立および区別することが可能である。
【００５１】
使用される蛍光色素は、５５０ｎｍと９００ｎｍの間の放射波長を有する、シアニン色素として知られる一般的なクラスである。これらの色素は、メチン基を含み得る；メチン基の数は、色素のスペクトル特性に影響する。ピリジンであるモノメチン色素は典型的には、青ないし青緑蛍光放射を有し、一方キノリンは緑乃至黄緑蛍光放射を有する。トリメチン色素アナログは、実質的に赤色波長にシフトし、そしてペンタミチン色素は、なおさらにシフトし、しばしば赤外線蛍光放射を示す。しかし、ビーズの組成と両立する任意の色素を使用することができる。
【００５２】
本発明において、多数の異なるミクロビーズを同じアッセイで使用するとき、色素は同じまたは重なる励起スペクトルを有するが、区別可能な放射スペクトルを保有するのが好ましい。多重クラスまたは集団の粒子を、ちょうど２種の色素から生産することができる。赤／オレンジ色素を有するナノ粒子集団の比率は、集団中の十分な増分によって変化し、その結果得られる比率は、前者の比率と光学的に重ならない。この方法では、多数の異なって蛍光するミクロビーズクラスを生産する。
【００５３】
２種の色素の間の示差を目視検査によって達成するとき、該２種の色素は好ましくは知覚的に異なる色の放射波長を有し、可視的識別性を高める。機器的方法を使用して、２種の色素の間で区別することが望まれるとき、種々のフィルターおよび回折格子によって、独立的に検出されるべきそれぞれの放射最大値が可能となる。好ましい実施態様では、ミクロフルイディックス・アナライザーを使用し、蛍光ミクロビーズを区別する。ミクロフルイディックス・アナライザーの使用の代替として、本発明の種々の実施態様はまた、蛍光活性化細胞ソーターとの使用のために好適であり、ここで、混合物中の該異なるクラスのビーズを、それぞれのクラスのビーズの蛍光同一性に基づいて互いから物理的に分離することが可能であり、そして標的核酸および／またはそれに会合する標識は、特定クラスのビーズを含むそれぞれの分類されるプールについて定性的または定量的に区別できる。
【００５４】
好ましい実施態様では、基質は有利には、それぞれのクラスの別個の同定を可能とする少なくとも２種の異なるクラスの、複数のミクロビーズを含み得る。基質はまた例えば、複数のクロマトグラフィービーズまたはアフィニティービーズ、または遺伝子チップ、膜、または種々のプレート−ミクロタイター、ガラス、またはプラスチック−を含み得る。本発明はこうして、捕捉プローブを連結できる任意の固体支持体の使用を企図する。
【００５５】
標的核酸並びに捕捉プローブは任意の型の一本鎖核酸であり得る。二本鎖核酸をまた、次に固体支持体に連結され、またはサンプルとして使用することのできる、少なくとも短時間少なくとも何らかのセグメントである一本鎖である核酸を、生産するようなやり方で加工（または変成）し得る。該核酸の例は：ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＰＣＲ産物を含むがこれらに限定されない。核酸は、植物、動物、真菌、ウイルスまたは微生物に由来する。臨床サンプルの分析のために、核酸は有利には、ヒト細胞、組織、または器官に由来し得る。
【００５６】
標的核酸は、生物の特定の表現型、疾患状態、または形質と連関し得る。これは特に、ヒトの感染の同定および定量、および処置後の癌−特に残留癌（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｃａｎｃｅｒ）の同定において有用である。この方法は、広範囲の種々の疾患、遺伝的特性、リスクファクターのスクリーニング、および、遺伝子、多型性、突然変異、対立遺伝子、および外来ＤＮＡの存在の同定のための調査配置において有用である。植物育種および調査の分野で、該方法は、作物の望ましいまたは望ましくない特性と連関し得るマーカー遺伝子または配列を同定または定量するために有用であり、そしてまた他の生物学的生物に適用することができる。本発明はまた、多数の候補化合物がある種の標的遺伝子の発現に及ぼす影響をスクリーニングするために有用である。
【００５７】
該方法は、核酸の定量のためにすでに使用される多くの技術と組み合わせて有用である。例えば、一組のプローブ（ａ ｂａｔｔｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｂｅｓ）を同時的に試験し、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ノーザンブロット、または他の応用においてそのようなプローブの使用の前に、特に有効または非有効プローブを同定することができる。
【００５８】
本方法に従って、捕捉プローブを固体支持体に付着させる。例は、カルボジイミドカップリングを使用する、ミクロスフェアに対する核酸の付着である。この手法では、ポリマー性粒子は外部表面上の吊り下げ（ｐｅｎｄａｎｔ）カルボキシル基を有する。該粒子は、ポリ（スチレン−コメタクリル酸）（９０：１０モル比率）からなる。ポリマー性粒子のサンプルを、カルボジイミド、および酸性バッファー中のアミノ置換オリゴヌクレオチドと混合する；インキュベーションを次いで約１時間継続する。反応混合物を遠心分離し、上清を廃棄し、そしてペレットを１または２以上の洗浄剤溶液で洗浄し、それから酸性溶液中に再懸濁する。
【００５９】
種々の型のミクロビーズに対する共有結合を、当業界で既知である、類似カップリング方法を使用して達成する。膜、ミクロタイタープレート、ガラス、およびプラスチックプレートに対する付着は、ＵＶ架橋、乾燥、熱、およびＮａＯＨでの処理のような工程に関係する。核酸プローブを固体支持体に付着させるためのカップリングおよび架橋方法は、当業界で既知である；所定の応用に最も適当な技術は、当業者に自明である。例えば、プレートをアガロース含有ストレプトアビジンで被覆することができ、そしてビオチニル化オリゴヌクレオチドをプレート上に固定する。代替として、オリゴヌクレオチドを、固体支持体にそれ上の固相合成によって付着させることができる。同様に、核酸例えば、ｃＤＮＡをポリスチレン処理ガラススライドに付着させることができる。
【００６０】
捕捉プローブを設計し、その結果それを標的核酸の一部に結合させ、該標的一本鎖のその他の部分を残す。該一本鎖部分を次いで、重合化ステップ中に鎖伸長のためのテンプレートとして使用する。伸長ステップは酵素を使用する核酸の重合化に関係し、そして有利には標識を新しく合成される核酸に取りこませる。種々の酵素をこの目的のために使用することができ、それは当業者に認識される通りである。好適な酵素の例は：逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、これらの酵素のフラグメント、例えば、クレーノーフラグメント、および核酸重合化活性を保持しているが、修飾ヌクレオチド、例えば、ビオチン化またはフルオレセイン化ヌクレオチドを取りこんでいることのできる突然変異性酵素を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
ポリマー化核酸に取りこまれている標識は、応用に基づいて選択し得る。そのような標識の例は、放射性核種、蛍光剤、化学発光剤、色素、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、酵素サブユニット、抗原、リガンド、および金属イオン、特に：キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、Ｃｙａｎｉｎ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ５３２、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニン、およびビオチンを含む。同様に、ある種の実施態様では、該核酸は、挿入色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅｓ）例えばＹＯＹＯ、ＴＯＴＯ、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、臭化エチジウム等を使用して標識することができる。
【００６２】
本方法の特に有利な実施態様は、同じサンプル内で多数の異なる標的核酸を同定することにおけるその使用である。これは、それぞれの特異的固体支持体単位、例えば、ミクロビーズであってそれと会合した特定の捕捉プローブを有するものの別個の同定によって達成する。好ましい実施態様では、特異的蛍光色素同一性を有するミクロビーズへの特異的捕捉プローブの付着は、そのような同定を可能とする。こうして該特異的捕捉プローブを、ビーズ「色」によって同定することができる。別の実施態様は、多くの他の固体支持体、例えば、ミクロタイタープレート、遺伝子チップ、クロマトグラフィービーズ等を使用することができる。ある種の実施態様は、同じ標的核酸の異なるセグメントに対応する２または３以上の捕捉プローブを使用し得、任意の所定の標的のための該捕捉プローブは同じ固体支持体単位に好ましくはカップリングされている。
【００６３】
本方法の分析ステップは、使用される標識に従って実施する。ハイスループットスクリーニングのために、ビーズ上の蛍光色素を、特異的捕捉プローブに対応する蛍光色素を同定することによってミクロフルイディックス・アナライザーを使用して同定および定量することができる。緑色標識はまたこのやり方で同定および定量されることができ、そして陽性結果に対応する。使用する標識の型に依存して標識の量を分析することができる。例えば、標識がビオチンであれば、それをフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンの添加によって検出することができる。実際上は、増幅ステップを含む検出方法が特に有利である。
本発明にしたがう遺伝子発現の分析のためのいくつかの好ましい実施態様を、例示のための以下の実施例を使用して記載する。
【００６４】
実施例１：ＲＮＡレベルで遺伝子発現を検出する
遺伝子転写物を、ミクロスフェアとカップリングした捕捉プローブを使用して総ＲＮＡから直接的に検出することができる。この特定のアプローチでは、捕捉プローブは、標的ＲＮＡの第１領域に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。該捕捉プローブは、ミクロスフェアとカップリングする。遺伝子を表している（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）標的は、ＲＮＡ転写物であり、そして標識を、標的ＲＮＡの第２領域にそって相補鎖を伸張させることによって付加する。
【００６５】
標的核酸の３’−末端に近い領域に相補的な２２塩基の独特な配列を、捕捉プローブオリゴヌクレオチドとして選択する。該捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、５’−アミノユニリンカー（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）で合成し、それから古典的カルボジイミドカップリング手法にしたがって、カルボキシル化蛍光色素ミクロスフェアに共有結合させる（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから材料は入手可能である）。
【００６６】
サンプルから抽出した総ＲＮＡをフラグメント化し、それから１００℃で１０分間、１ｘＴＭＡＣのハイブリダイゼーションバッファー中でインキュベーションすることによって変成する。捕捉プローブとカップリングしたミクロスフェアを次いで、変成したＲＮＡに添加し、そして５５℃で１０分間インキュベートする。標的遺伝子をミクロスフェア上のそれらのプローブに選択的にハイブリダイズさせ、それによって固定する。鎖伸長を、テンプレートとして捕捉したＲＮＡの一本鎖領域を使用して、標識または修飾ヌクレオチドを取りこませることのできる逆転写酵素の添加によって実施する。鎖伸長反応は、通常のプロトコールに従い、そして典型的には、酵素を供給したバッファー中で約４５℃ないし６０℃で実行する。標識ヌクレオチドをこうして、伸長する鎖に取り込ませ、蛍光ビーズ／捕捉プローブ／標的ＲＮＡ／標識伸長鎖の、検出可能複合体を創出する。混合物をミクロフルイディックスアナライザーを通過させ、そしてある種の標的ＲＮＡの存在を、選択された蛍光同一性を有するビーズ上の標識の存在によって指摘する。このプロトコールはフェムトモルレベルでの標的配列の検出を可能とする。
【００６７】
実施例２：ｃＤＮＡレベルで遺伝子発現を検出する
前記の様に直接的にＲＮＡ配列を捕捉する代わりに、遺伝子発現をまた、ｃＤＮＡから分析できる。この方法では、捕捉プローブはセンス配列オリゴヌクレオチドであり、遺伝子を表している標的はｃＤＮＡであり、そして標識はｃＤＮＡにまたは伸長した第２鎖ｃＤＮＡのいずれかに、またはその両方に取りこまれている。
【００６８】
組織または細胞株から抽出した総ＲＮＡを、逆転写の対象とする。一般に１０μｇの総ＲＮＡをアッセイあたり使用する。５’−末端にビオチンを含むポリ−（ｄＴ）２０をこの反応にプローブとして供する。該アッセイの感度は、ビオチニル化デオキシヌクレオチド、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｆｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の、新しく合成されるｃＤＮＡへの取りこみによって高める。代替として、ビオチンの１より多い分子を含むポリ（ｄＴ）２０のプライマーを使用し、このアッセイの感度を増加させることができる。
【００６９】
別の標識方法は、プライマーとしてＣｙ３標識ポリ−（ｄＴ）２０を使用することである。Ｃｙ３−ｄＵＴＰを反応に添加し、そして逆転写中にｃＤＮＡへ取りこませる。多くの場合では、Ｃｙ３−ｄＵＴＰを、ビオチニル化デオキシヌクレオチドよりもより有効にｃＤＮＡに取りこませる。再び、所望の遺伝子の３’−末端に近い２２塩基の独特な配列を捕捉プローブとして選択する。該捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、５’−末端アミノユニ−リンカーで合成し、そしてその後に、カルボジイミドカップリング方法によってカルボキシル化ミクロスフェアにカップリングする。
【００７０】
標識されたｃＤＮＡを、１ｘＴＭＡＣバッファー中で１００℃で１０分間インキュベートすることによって変成する。プローブとカップリングしたミクロスフェアを、変成ｃＤＮＡに添加し、そして５５℃で１０分間インキュベートする。捕捉プローブに相補的な配列を有する標的遺伝子は、インキュベーション中にそれらの対応するミクロスフェアと特異的に会合する。該最終ステップでは、第２鎖ｃＤＮＡを、捕捉された標的ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、合成する。Ｃｙ３−ｄＵＴＰを第２鎖ｃＤＮＡに取り込ませ、そして該反応ミックスをミクロフルイディックス・アナライザーにおいて直接的に分析することができる。
【００７１】
実施例３：第２鎖ｃＤＮＡによってアラビドプシスにおける遺伝子発現を検出する
１．伸長
ビーズ上のｃＤＮＡの第２鎖を伸長させることを実行し、アラビドプシスの遺伝子発現をアッセイした。このアプローチを使用して、ＵＢＱ５（ユビキチン５）およびＵＢＱ１１（ユビキチン１１）の種々の量のアラビドプシス総ＲＮＡからの検出を実施した。ＵＢＱ５およびＵＢＱ１１はアラビドプシスで構成的におよび豊富に発現される。シグナルと使用したＲＮＡの量の間の線形関連性をこのアッセイで観察した。別個のマルチプレックスアッセイでは、３種の防御遺伝子およびＵＢＱ５（ＵＢＱ１１）を同時に検出した。これらの結果をこのセクションで後に議論する。
【００７２】
アラビドプシスから抽出した総ＲＮＡを逆転写のためのテンプレートとして使用し、そしてポリ−（ｄＴ）２０をプライマーとして使用した。この実験では、ｃＤＮＡを何らの標識なく合成した。ミクロスフェアにカップリングした捕捉プローブを前記の様に設計し、これらは以下のヌクレオチド配列を示すＵＢＱ遺伝子の３’−末端に近い、それぞれ、２２、２５および６０塩基の独特な配列を含み、ここで、Ｘ＊はユニ−リンカーであって、実施例１に記載のようにオリゴ合成中に該５’−末端に付加され、捕捉プローブをカルボキシル化蛍光色素ミクロスフェアに共有結合させるものを表す：
ＵＢＱ５：Ｘ＊ａａａｇａａｇｇａｇｔｔｇａａｇｃｔｔｇａｔ（配列番号１）
ＵＢＱ１１ａ：Ｘ＊ｇｃｃｇａｃｔａｃｇａｃａｔｃｃａｇａａｇｇａｇｔ（配列番号２）
ＵＢＱ１１ｂ：Ｘ＊ｃａａｃｇｔｃａａｇｇｃｃａａｇａｔｃｃａｇｇａｔａａｇｇａａｇｇｔａｔｃｃｃｔｃｃｇｇａｃｃａｇｃａｇａｇｇｔｔｇａｔ（配列番号３）
【００７３】
標的ｃＤＮＡを次いで、ミクロスフェア上の捕捉プローブにハイブリダイズさせた。該ミクロスフェアを次いで遠心分離し、そして上清を除去した。ＤＮＡ伸長バッファー中のミクロスフェアの再懸濁に続いて、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を該ミックスに添加し、捕捉プローブをプライマーとしておよびｃＤＮＡの第１鎖をテンプレートとして使用して、第２鎖ｃＤＮＡを伸張させた。標識のために、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を、反応中に伸長ＤＮＡに取りこませた。代替的に、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を合成中に取りこませた。他のポリメラーゼ、例えば、クレノーフラグメント（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）およびＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）をまた試験した。試験した酵素の中で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩが使用した条件下の伸長のための最良の成績であった。
【００７４】
第２鎖ＤＮＡ伸長反応後、ミクロスフェアを再び遠心分離し、遊離のビオチン−１６−ｄＵＴＰを含む上清を除去した。該ミクロスフェアをハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁し、そしてストレプトアビジンにコンジュゲートされたフィコエリトリンを該溶液に添加し、そして５分間インキュベートし、取りこまれたビオチン−１６−ｄＵＴＰへの結合を確保した。
【００７５】
それぞれＵＢＱ５およびＵＢＱ１１を、野生型アラビドプシス葉（表１のＵＢＱ５についての結果参照）から抽出した、１μｇ、３μｇおよび８μｇの総ＲＮＡから検出し得る。強い線形関連性を、シグナルと使用したＲＮＡサンプルの量の間に観察した。この結果は遺伝子発現分析のための本アッセイの応用を確認した。それは本方法が、それぞれＵＢＱ５およびＵＢＱ１１のような高コピー遺伝子を検出するのに十分な感度であることを指摘した。意義深いシグナルを、たった１μｇの総ＲＮＡを含むサンプルから取得した；こうして、もし温和に発現された遺伝子をこのアプローチによって試験するならば、有用な結果を取得できる。それぞれ、ＵＢＱ５およびＵＢＱ１１のものより１００倍より低い発現レベルである希薄に（ｒａｒｅｌｙ）発現される遺伝子のために、より多いＲＮＡの当初量、またはさらなる増幅されたシグナルを要し得る。
【００７６】
表１は、野生型アラビドプシス葉から抽出された総ＲＮＡの１μｇ、３μｇおよび８μｇからのＵＢＱ５の検出を示す。強い線形関連性を、シグナルと使用したＲＮＡサンプルの量の間に観察した。
【表１】
2004506409.tif 000002
【００７７】
４種の遺伝子の検出のためのマルチプレックスアッセイを表２に示す。野生型（ＷＴ）および感染を有する野生型（ＷＴ．Ｉ）のアラビドプシス葉から、総ＲＮＡを別個に抽出した。１０μｇのそれぞれのＲＮＡサンプルをこのアッセイに使用した。野生型サンプルでは、防御遺伝子ＰＡＤ４、ＰＤＦ１．２およびＰＲ１がすべて検出できなかった。ＵＢＱ５を実験で内部コントロールとして供した。すべての発現シグナルを、ＵＢＱ５を１００として標準化した。予測されたように、ＰＡＤ４、ＰＤＦ１．２およびＰＲ１の発現を、野生型における感染によって約７ないし１０倍に誘導し、一方ＵＢＱ５の発現は維持されている。
【００７８】
【表２】
2004506409.tif 000003
【００７９】
実施例４：インビトロ転写物、ｃＲＮＡ、または定量的ＰＣＲ産物から遺伝子発現を検出する
ミクロフルイディックス／蛍光色素系を使用して、低コピー遺伝子を検出するために、低コピー遺伝子の線形増幅が必要であり得る。インビトロ転写および定量的ＰＣＲは、線形範囲で遺伝子を増幅するための確立されたアプローチの２つである。
【００８０】
インビトロ転写
サンプルから精製した総ＲＮＡを、逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によってＴ７−ポリ−（ｄＴ）をプライマーとして使用して、ｃＤＮＡへと転写する。該ｃＤＮＡをｃＲＮＡに転写する（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）。ビオチン−ＵＴＰを、合成中にｃＲＮＡに取りこませる。一般に、総ＲＮＡにおけるすべての遺伝子転写物を、ｃＲＮＡへのインビトロ転写後５０ないし１００倍に線形に増幅する。こうして、低コピー遺伝子のレベルを、もとのレベルおよび高まったレベルに対して比例的に高め、本発明の技術によって希薄な（ｒａｒｅ）遺伝子の首尾よい検出を可能とする。
【００８１】
定量的ＰＣＲ
希薄に発現される遺伝子をｃＤＮＡから、それらに特異的なプライマーを使用してＰＣＲによって増幅する。通常は、低コピー遺伝子の増幅はＰＣＲの２０サイクル以内で安定水準に達せず、もっとも、それぞれの遺伝子の個々の増幅カーブはことなる。該増幅カーブを、定量的ＰＣＲ機器（リアルタイムＰＣＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）によって容易に取得することができる。標識のために、蛍光（ビオチニル化）プライマーまたは蛍光（ビオチニル化）デオキシヌクレオチドのいずれかをＰＣＲ反応において使用する。標識ＰＣＲ産物を、この技術による分析のために利用する。
【００８２】
実施例５：臨床サンプルのための診断研究
特異的疾患のための遺伝子の同定後、本発明の方法を使用し、患者サンプル中の疾患遺伝子の正常または異常発現レベルを検出する。捕捉プローブを、疾患と連関するとして同定される遺伝子の一部として選択する。捕捉プローブん選択は、転写物のあいまいでない同定に対して最も通導性の（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）遺伝子の領域の選択に関係する。他の遺伝子に対し相同性をほとんど示さない領域が最も有用である。
【００８３】
ここで記載の方法を診断核酸の検出のために使用することができる。しかし、以下の実施例では、ＲＮＡレベルでの検出を実施する。この特定のアプローチでは、捕捉プローブはミクロスフェアとカップリングしたオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列であり、遺伝子を表す標的はＲＮＡ転写物であり、そしてレポートは蛍光色素で標識した標的ＲＮＡの異なるセグメントに対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００８４】
所望の遺伝子の３’−末端に近い２２塩基の独特な配列を、捕捉プローブオリゴヌクレオチドとして選択する。該捕捉プローブオリゴヌクレオチドを、５’−アミノユニ−リンカーと合成し、それからカルボジイミドカップリング手法によってカルボキシル化ミクロスフェアに共有結合させる。蛍光標識レポーターオリゴヌクレオチドを設計および合成し、ビーズ上に捕捉されたＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせる。捕捉プローブのオリゴヌクレオチドに隣接する２２塩基の配列を、この目的のために選択する。検出の感度を増加させるために、捕捉プローブに隣接する２種のオリゴヌクレオチドを選択し、一方は捕捉プローブの上流および他方は下流である。蛍光色素は上流レポーターオリゴヌクレオチドの５’−末端に、そして下流レポーターの３’−末端に存在する。２種のレポーターオリゴヌクレオチドの蛍光色素の異なる位置を選択し、標的ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションへの立体的障害を最小化する。
【００８５】
臨床サンプルから抽出した総ＲＮＡをフラグメント化し、それから１ｘＴＭＡＣのハイブリダイゼーションバッファー中の１００℃で１０分間のインキュベーションによって変成する。捕捉プローブとカップリングしたミクロスフェアおよびビオチン（または蛍光色素）で標識したレポーターオリゴヌクレオチドを次いで、変成ＲＮＡに添加し、そして５５℃で１０分間インキュベートする。標的遺伝子をミクロスフェア上のプローブに、およびレポーターオリゴヌクレオチドに選択的にハイブリダイズさせる。よって、ミクロスフェア上のプローブ、レポーターおよび標的遺伝子を含む複合体を形成する。該混合物を次いで、ミクロフルイディックス・アナライザーにおける分析の対象とする。
【００８６】
このプロトコールは疾患と連関のある遺伝子を定量または検出するための多くの応用において有用である。しばしば単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）またはわずかな数のそのようなＳＮＰは、疾患と連関している。それぞれの既知のＳＮＰを、上記実施例で捕捉プローブとして選択する。プロトコールのための条件を選択し、その結果、該多型性を有するこれらの遺伝子のみがハイブリダイズする。研究される核酸フラグメントの長さおよび組成を考慮に入れ、ハイブリダイゼーション温度を選択し、その結果、フラグメントの単一点突然変異を完全にマッチする配列から区別することができる。好ましい核酸フラグメントを使用して、そのような温度は典型的には、３５℃と７５℃の間、好ましくは４０℃と７０℃の間、より好ましくは４５℃と６５℃の間、そして最も好ましくは約５０℃、５５℃、または６０℃である。
【００８７】
異なる数の捕捉プローブを同じアッセイで使用することができるから、多くの異なる多型性を同時的に同定することができる。そのような多型性の同定は、遺伝病についてのスクリーニングを大いに容易化する。そのような疾患と連関する遺伝子の１例は、ヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子である。ＭＢＰは４つの明瞭な構造対立遺伝子を有する。ＭＢＰの変異体形態のいずれかの遺伝は、免疫学的欠陥という結果となる。他の例は、嚢胞性線維症であり、ここで、単一ヌクレオチド変化は子供における重度な障害を引き起こす。同様に、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２対立遺伝子は、乳癌と連関する。こうして、ある種の対立遺伝子の定性的または定量的検出は、本発明の技術の特に有利な使用である。
【００８８】
癌関連遺伝子産物の遺伝子発現レベルの定量を使用し、疾患の段階を同定することができる。例えば、卵巣癌マーカー遺伝子、例えば、ＨＥ４プロテアーゼインヒビター、Ｍ２型ピルビン酸キナーゼ、およびメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は、卵巣癌で過剰発現されていると示され、そしてそのような過剰発現の早期検出のためのスクリーニングは、本発明の重要な応用である。
【００８９】
実施例６：疾患スクリーニング
ユーイング肉腫について特異的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブを、第１の蛍光同一性によって同定することのできる、第１クラスのミクロビーズに連結する。横紋筋肉腫特異的捕捉プローブを、第２の蛍光同一性と第２クラスのミクロビーズに連結する。患者の腫瘍からのＤＮＡのサンプルを単離および変成し、そして一本鎖核酸を、混合ビーズ／捕捉プローブ組み合わせからなる基質と混合する。クレノーフラグメントを添加し、そして鎖伸長物は緑色蛍光標識を有するヌクレオチドを取りこむ。もし第１クラスのビーズが緑色標識を含むならば、腫瘍はユーイング肉腫として同定できる。もし両方のクラスのビーズが緑色標識を含むならば、それは混合された腫瘍である。もし第２クラスのビーズが緑色標識を有するならば、該腫瘍は横紋筋肉腫である。該患者を次いで、妥当な診断と矛盾なく処置することができる。同じ技術は、特異的標的核酸の量を定量することによって癌の多くの型のステージングを可能とする。
【００９０】
実施例７：候補遺伝子評価
ゲノム幅遺伝子発現をプロファイリングルため多くのプロトコールが存在する。そのようなプロトコールのいずれかから、多くの候補遺伝子を、特定の形質、特に量的形質（多数の遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ，多重遺伝子）の組み合わせ作用または相互作用と連関するもの）と連関すると見出すことができる。よって、本発明の方法を使用し候補遺伝子を監視することができる。
【００９１】
ゲノム幅遺伝子発現を高オイル含量を有するがそのほかは非常に異なる遺伝的バックグラウンドを有するトウモロコシの幾つかの変種間で比較する。種々の高オイル変種の研究から、遺伝子のあるセットを高オイル含量と連関するべきであると示唆されると同定する。これらの遺伝子を次いで評価し、そしてオイル含量とのそれらの相関について確認する。
【００９２】
１または両方の親が高オイルの変種である交雑を次いで実行する。該交雑の後代を本発明の方法を使用してスクリーニングし、特定の個体が所望の遺伝子を有するかについて定量的に同定する。同様に、個体を定量的に評価し、１または２以上の所望の遺伝子の発現の程度を評価することができる。それぞれの個体についてこうしてスクリーニングしたオイル含量を、候補遺伝子がオイル含量と最も強く相関している確認についてアッセイする。こうして確認された遺伝子を使用し、高オイルトウモロコシの新しい変種の開発においてその後の交雑の後代をスクリーニングする。
【００９３】
実施例８：発現マーカー援助育種
特異的な望ましいまたは望ましくない形質と連関するマーカーまたは遺伝子が知られ、そしてマーカー援助育種計画において使用する。多くの数のマーカーおよび多く数の候補親植物または後代植物をスクリーニングできることは特に有利である。本発明の方法は、多くの個体から同時に多数のマーカーをスクリーニングするため、高容量、マルチプレックススクリーニングを可能とする。本方法に従って、３種の異なる病原体に対する抵抗性を、病原体のうちの少なくとも１種に対する種々の抵抗性のレベルを有する親植物を含む放任授粉交雑からの後代の大集団においてスクリーニングする。第１病原体に対する抵抗性は質的なものである：３種の異なるマーカーを有する植物は抵抗性であり、そして３種すべては有さない植物は抵抗性でない。第２および第３病原体に対する抵抗性は、連関遺伝子の種々の発現性のために量的である：関連遺伝子の発現レベルがより高いほど、病原体に対するその植物の抵抗性はより大きい。
【００９４】
マルチプレックスアッセイを設計し、所望の５種のマーカーのそれぞれに対して特異的な捕捉プローブを提供する。該捕捉プローブを、５種の異なるクラスのビーズに連結する。関連マーカーのすべては発現遺伝子であり、だからＲＮＡまたはｃＤＮＡ技術が適当である。ＲＮＡを１０００の異なる個体植物の葉組織から抽出し、そして５種の異なるクラスのビーズとのパラレル反応においてハイブリダイズさせる。ビーズのそれぞれのクラスを、ミクロフルイディックス・アナライザーを使用してそれぞれのサンプルについて分析する。量的形質に対応する３種のクラスのビーズのために、標的遺伝子の存在または不存在の定量的測定を記録する。量的形質に対応するビーズの２種のクラスのために、遺伝子活性の定量的測定を記録する。量的遺伝子のすべての活性および２種の量的形質の最高発現レベルを示す個体を、さらなる育種ステップのために選択する。ここですべての５種の測定した遺伝子について望ましい結果を有する個体はない処理において、最も望ましい、および望ましくないのが最も少ない、結果を有する個体を、さらなる育種ステップのために選択する。それぞれの場合に、後代をスクリーニングし、該量的形質の発現の高い量的レベルを有するホモ接合体のためにさらに選択する。
【００９５】
単一遺伝子の機能と連関する形質は以下のものを含む：多くの病害抵抗性形質、例えば、細菌、ウイルス、真菌、ネマトーダ、および害虫に対する抵抗性；多くの除草剤抵抗性；多くの果実または花色形質；および雄性不稔性に関連する種々の形質。同様に、多数の遺伝子または量的遺伝と連関する形質は以下のものを含む：多くの病害抵抗性、例えば、細菌、ウイルス、真菌、ネマトーダ、および害虫に対する抵抗性；多くの収量または生産性形質；多くの果実品質形質；ストレス、例えば、熱、多湿、旱ばつ、塩類等に対する耐性と連関する形質；実生出芽および開花および／または結実の斉一性と連関する形質。
【００９６】
実施例９：化学化合物の植物に及ぼす影響の試験
マーカー遺伝子を、本発明にによって検出し、化学化合物の作物に及ぼす影響を評価する。該スクリーニング過程をハイスループット形式に容易に開発することができる。多量のサンプルを、任意の慣行方法によって適合しない高速でスクリーニングできる。それぞれの捕捉プローブはマーカー遺伝子の領域に対して相補的である。多くの捕捉プローブを選択し、そして特異的に同定可能なマイクロビーズに連結し、その結果マーカー遺伝子のすべての分析を単一アッセイで実施できる。
【００９７】
例えば、幾つかの化学化合物を、根生産および生理学へのそれらの影響について試験する。これらの化合物の植物に及ぼす影響を、根形成に関係する既知の遺伝子、並びに根でディファレンシャルに発現されると知られる遺伝子の発現レベルによって評価する。ＲＮＡを根組織から抽出し、そして逆転写しｃＤＮＡを生産する。該スクリーニングを第２鎖ｃＤＮＡについて前記のように実施し、そして根に連関する遺伝子発現に顕著な影響を有する化合物を、さらなる研究のために選択する。代替として、該スクリーニングプロトコールを、選択された遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズする捕捉プローブを使用して設計し、そしてさらにこれらの配列に相補的な標識プローブを使用する。こうして、本発明のある実施態様では、鎖伸長を介する標的核酸のインサイチュ標識化を、未結合標識済プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションによって置き換え、ミクロフルイディックス・アナライザーにおける定量的または定性的分析に好適なミクロビーズ／捕捉プローブ／標的／標識プローブ複合体を形成し得る。そのような実施態様は、例えば、放射性核種、色素、蛍光剤等を取りこんでいるプローブ、ならびに１または２以上の分枝で他の標識プローブまたはシグナル増強剤とのさらなるハイブリダイゼーションまたは相互作用のできる分枝性プローブを含む、任意の好適な標識性プローブの使用を企図する。よって、本発明の方法を使用する検出の感度を、標的の相対量およびシグナル強度に影響する他のファクターに依存して、種々の標識ストラテジーおよびシグナル増強剤を使用して適合化することができる。
【００９８】
この方法によるスクリーニングはまた、細胞または細胞培養物、組織、器官、個々の生物、単一分類の個体の集団、または細胞、組織、器官、または異なる分類の個体の組み合わせのような、生物系について好適であり得る。本方法はこうして、植物、動物、真菌、または微生物について有利である。遺伝子調節または発現に影響することのできる任意の物質は、例えば有機物質、イオン、ミネラル、ビタミン、ホルモン、気体、ウイルス、細菌、真菌、等を含むそのようなスクリーニング方法のために好適であり得る。
【００９９】
実施例１０：マイクロアレイのためのサンプル調製を試験する
遺伝子チップにおける実験のために、分析すべきサンプルは特別試験チップ上で予備試験すべきである。該予備試験はサンプルおよび標識の効率を、それをより高価な分析チップに適用する前に、確認する。該試験チップは実際の分析チップよりもより低廉であるが、それぞれの試験チップはなお比較的高価である。もし該試験を、遺伝子チップ供給者によって示唆されるような試験チップを使用する代わりに、本発明によって実施するならば、多量の時間および金を節約する。
【０１００】
該捕捉プローブを、試験核酸サンプル中に存在すべきである既知の遺伝子に相補的なように選択する。例えば、高度に発現された群、温和に発現された群、および希薄に発現された群から選択された種々のコントロール遺伝子を選択する。分析されるサンプルを以下のように生産する：総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを２種の細胞株すなわち、ＨＥＬＡ単独（コントロール）およびＢＣＲ／ＡＢＬ構築物を発現しているＨＥＬＡから単離する。オリゴｄＴ　Ｔ７プライマーを使用して、ｄｓ　ｃＤＮＡコピーをＲＮＡから作成する。ｃＲＮＡを次いで、ビオチニル化ｄＵＴＰの存在下で転写し、標識されたｃＲＮＡを生産する。ｃＲＮＡを次いで使用し、該チップにハイブリダイズさせる。しかし、本発明での使用のために、ｃＲＮＡを以下のように分析する：
【０１０１】
異なるコントロールメッセージに対応する捕捉プローブを、５５℃で１０分間ｃＲＮＡとインキュベートする。ビオチン標識した標的遺伝子を次いで、ミクロスフェア上のそれらのプローブに選択的にハイブリダイズさせる。ゆえに、ミクロスフェア上の捕捉プローブおよび標識した標的遺伝子を含む複合体を形成する。最後のステップで、ＰＥコンジュゲート性ストレプトアビジンを反応に添加し、そしてビオチニル化ｃＲＮＡと到達するに任せる。該混合物を、ミクロフルイディックス・アナライザーにおける分析の対象とする。もしコントロール遺伝子が予測されたように検出されるならば、該サンプルは高質であるものと判断する。ｃＤＮＡライブラリーまたは他の型のライブラリーの質をまた、このように試験することができる。
【０１０２】
実施例１１：ディファレンシャルディスプレイ実験からの結果の明確化
本方法をディファレンシャルディスプレイからの結果の明確化および確認のために使用し、誤りのデータの可能性を最小化または評価する。
例えば、ディファレンシャルに発現される遺伝子を、ディファレンシャルディスプレイによって同定し、該捕捉プローブをあいまいでない結果に対して最も通導性である（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）、ディファレンシャルに発現された遺伝子の領域（他の既知の遺伝子に対してほとんど相同性のない領域）に対応するように選択する。ディファレンシャルディスプレイを実行し、細胞株、例えば、所望の遺伝子（例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子産物）を発現している、ＨＥＬＡ細胞を分析する。該アッセイを、２種の核酸を使用して実施する：１つはＨＥＬＡ単独からおよび、１つはＨＥＬＡ／ＢＣＲ／ＡＢＬから。本発明の方法に従い、同定遺伝子のレベルを次いで、ノーザンブロットの使用または定量的ＰＣＲの開発なくして迅速かつ容易に確認する。ＲＮＡをそれぞれの細胞株（ＨＥＬＡおよびＨＥＬＡ／ＢＣＲ／ＡＢＬ）から抽出し、そして直接的に捕捉プローブ−基質複合体に添加するか、または対応するｃＤＮＡを添加するか、または該発現を第２鎖ｃＤＮＡのレベルで検出する。代替的に、所望の遺伝子が低コピー遺伝子であるならば、前記の様に、二次的標識を介する過剰増幅を実施できる。反応からのミクロビーズのマイクロフルイディックス・分析を次いで実行し、そして関連遺伝子のディファレンシャル発現をあいまいでなく決定する。
【０１０３】
実施例１２：プロモーターの効率を試験する
種々のプロモーターによって調節される遺伝子発現レベルを本発明によって試験する。それは、植物、動物または微生物で同定された新規プロモーターの効率を試験するために有用である。プロモーターの力または組織でのそのディファレンシャル発現を、本発明を使用して分析する。捕捉プローブを、該プロモーターによって発現される遺伝子産物に相補的であるべく選択する。サンプルは、プロモーター活性が試験されるところの組織または細胞株である。
【０１０４】
代替的に、突然変異または変化したプロモーターを、本発明を使用して分析する。標的プローブを、該プロモーターによって発現される遺伝子産物であるべく選択する。ベクターにおいて発現されるプロモーター構築物を、形質転換される細胞から抽出される核酸を使用することによってこのように分析し、該プロモーターによって制御される発現を分析する。組織、細胞株または細胞の他の型中に形質転換されたプロモーター構築物を、テスター核酸として組織、細胞株、または細胞の他の型からの核酸を使用して同じように分析する。
【０１０５】
ＲＮＡをそれぞれの細胞株または組織から抽出し、そして以下のうちのいずれかを行う：前記の様に、ＲＮＡを直接的に、捕捉プローブ−基質に添加するか、または対応するｃＤＮＡを添加するか、または発現を第２鎖ｃＤＮＡのレベルで検出する。代替的に、所望の遺伝子が低コピー遺伝子であるならば、更なるシグナル増幅を使用することができる。
【０１０６】
実施例１３：ハイスループット形式の一般遺伝子発現分析
現代、大学および機関のほとんどの実験室は、遺伝子発現分析のため高価な遺伝子チップ装置およびチップに費用を負担することができない。本発明の低コストは、これらの実験室に、任意の系の遺伝子発現研究を可能とする。本発明は特に、ハイスループット分析に適合可能である。したがって、任意の型の遺伝子発現分析を、本発明に従う使用のために適合させることができる。例えば、任意の重要な分子標的、例えば、プロテアーゼ、プロテインキナーゼ、転写因子、およびフォスファターゼをコードする遺伝子を、本技術を使用して莫大なサンプル中でスクリーニングすることができる。
【０１０７】
実施例１４：オリゴヌクレオチドプローブの設計を改良する
ハイブリダイゼーション実験のオリゴヌクレオチドプローブの効率を、本発明によって試験する。これはプローブの使用に先立ち特に重要である。特定のプローブ、プローブ変異体、および所望の遺伝子の種々の部分に対応するプローブをシグナルの質について試験する。プローブの質は「類似」配列に対するクロスハイブリダイゼーションに依存して非常に変化しうることができることが良く知られている。したがって、本発明を使用して、ハイブリダイゼーション型実験のための最良の質のプローブを選択することができる。例えば、もし新規マウス遺伝子のヒト相同物を単離する実験を意図するならば、よい質のプローブを持つことが重要である。そのようなプローブを、捕捉プローブとして種々の候補プローブのそれぞれおよび試験すべき核酸としてヒトＲＮＡまたはＤＮＡを使用することによって、本発明で試験する。該プローブはＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。多くの異なるプローブを、所望の遺伝子の新規マウス遺伝子に相補的であるべく選択する。それぞれのプローブを、単一アッセイで独特な固体支持体に連結する。異なるプローブを、それぞれの固体支持体単位の同一性に基づいて同定することができる。該アッセイを、ここでの１または２以上の先行する実施例に開示のように実施する。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを、温度の変化によってまたは濃度またはストリンジェンシーまたはＴＭＡＣバッファーを変化させることによって変化させる。異なるストリンジェンシー下での最大の親和性および特異性を示すこれらのプローブを次いで、ヒトライブラリーをスクリーニングするために使用し、新規マウス遺伝子のヒト相同物を同定する。
【０１０８】
実施例１５：薬物をスクリーニングする
薬物ライブラリーの、ある種の標的遺伝子の発現レベルに及ぼす影響を、ハイスループット形式で本発明によってスクリーニングする。該捕捉プローブは、薬物スクリーニングプロトコールにおける所望の標的遺伝子に相補的である。核酸サンプルを、薬物に対する曝露後に細胞または組織から単離する。このように、薬物の、これらの遺伝子に及ぼす影響を定量する。該アッセイをハイスループット形式で容易に実行できるという事実は、それを候補薬物のライブラリーをスクリーニングするために特に有用とする。
【０１０９】
実施例１６：総ＲＮＡから直接的に遺伝子転写物を検出する
遺伝子転写物を、ミクロスフェアとカップリングした捕捉プローブを使用して、１または２以上の核酸分子を含む混合物、例えば、総ＲＮＡから直接的に検出する。混合物中の核酸分子は例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物等、またはそれらの混合物を含み、そして好ましくは、植物、動物、ウイルスまたは真菌に由来する。ＲＮＡレベルで遺伝子発現を検出するために、ｍＲＮＡは核酸分子である。
【０１１０】
あるアッセイ方法では、固体表面、例えば、ミクロスフェアまたはビーズに付着されている捕捉プローブは、標的核酸分子、例えばｍＲＮＡの第１領域に対応する、相補的な（またはアンチセンス）オリゴヌクレオチド分子である。標的核酸分子は選択的に、ミクロスフェア上のその対応するプローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、標的核酸分子の５’末端上で、標的核酸分子の３’末端上で、またはさもなくばその間で起こる。ハイブリダイゼーションに続いて、標的核酸分子の別の領域に相補的な配列を有する少なくとも１の追加的標識済プローブを、該核酸分子にハイブリダイズさせる。標識済プローブは当業者に既知の標識であって、放射性標識、ビオチン−アビジン標識および蛍光標識を含むがこれらに限定されないもののいずれかで標識することができる。同じ標的核酸分子に追加的標識済プローブをハイブリダイズさせることによって、検出感度を増加させる。
【０１１１】
実施例１７：逆転写されたｃＤＮＡの検出
遺伝子転写物を、ミクロスフェア上にカップリングした捕捉プローブを使用して、核酸分子から直接的に検出する。核酸分子は例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物等、であり、そして植物、動物または真菌に由来する。ｃＤＮＡレベルで遺伝子発現を検出するために、ｃＤＮＡは核酸分子である。
【０１１２】
あるアッセイ方法では、遺伝子発現を逆転写したｃＤＮＡから分析する。アッセイの感度を、新しく合成されるｃＤＮＡに標識を取りこませることによって高めることができる。標識のある例は、ビオチニル化デオキシヌクレオチドである。このアッセイでは、捕捉プローブはｃＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドのセンス配列である。ｃＤＮＡ分子の、５’末端および３’末端またはそのほかその間に位置する標的遺伝子は、ミクロスフェアとカップリングした捕捉プローブに選択的にハイブリダイズする。加えて、捕捉されるｃＤＮＡの一本鎖領域を使用する鎖伸長を、テンプレートとして捕捉される標的ｃＮＡを使用して実施する。ＤＮＡ合成中に、標識または修飾ヌクレオチドを第２鎖ｃＤＮＡに取りこませる。
【０１１３】
実施例１８：第２鎖ｃＤＮＡの検出
遺伝子転写物を、ミクロスフェアとカップリングした捕捉プローブを使用して核酸分子から直接的に検出する。該核酸は例えば、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、等であり、そして好ましくは植物、動物、または真菌に由来する。
【０１１４】
あるアッセイ方法では、遺伝子発現を第２鎖ｃＤＮＡ伸長によって検出する。該アッセイの感度を、標識の、新しく合成されるｃＤＮＡへの取りこみによって高める。標識のある例は、ビオチニル化デオキシヌクレオチドである。このアッセイでは、捕捉プローブは、ｃＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドのセンス配列である。ｃＤＮＡの５’末端、間、または３’末端に位置する標的遺伝子は、ミクロスフェアとカップリングした捕捉プローブに選択的にハイブリダイズする。第２鎖ｃＤＮＡの検出は、ｃＤＮＡからの遺伝子発現を検出するのに類似する方法を使用するが、ミクロスフェアにカップリングした第２鎖ｃＤＮＡを伸長させる追加的ステップを含む。次いでＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩを使用して、プライマーとして該捕捉プローブを使用して、およびテンプレートとして第１鎖ｃＤＮＡを使用して第２鎖ｃＤＮＡを伸長させる。該伸長物は該伸長物の検出の感度を高めるために適合させた標識を有するヌクレオチドを含む。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506409.tif 000047
【国際調査報告】
2004506409.tif 000048
2004506409.tif 000049