(57)【要約】本発明は、核抗原、表面抗原、ポリメラーゼ抗原を含めた熱ショック蛋白と結合したＢ型肝炎ウイルス抗原を提供する。本発明は、さらに、Ｂ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白ｇｐ９６とｈｓｐ７８との複合物およびその製造方法を提供し、前記複合物は、ｇｐ９６とｈｓｐ７８を非共有結合で抗原ポリペプチドと結合した複合体と、共有結合で結合した融合蛋白を含む。このような複合物は、Ｂ型肝炎の治療及びＢ型肝炎続発性肝癌の治療性ワクチン製造に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白ｇｐ９６あるいはｈｓｐ７８との複合物。
【請求項２】
上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原におけるアミノ酸の配列が、ＹＶＮＴＮＭＧ、ＹＶＮＶＮＭＧ、ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ、ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ、ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ、ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ及び／または、それらの変異配列であることを特徴とする請求項１記載の複合物。
【請求項３】
前記熱ショック蛋白が、非共有結合でＢ型肝炎ウイルス抗原と結合し、あるいは共有結合でＢ型肝炎ウイルス抗原と結合することにより、融合蛋白を形成することを特徴とする請求項１記載の複合物。
【請求項４】
濃度０．１−０．１５μｍｏｌ／Ｌのｇｐ９６蛋白と濃度２．５−３．５μｍｏｌ／ＬのＢ型肝炎ウイルス抗原を５−１０％（Ｖ／Ｖ）グリセリンが含まれた濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ未満の低塩緩衝液の中で温度３０〜３９℃で１０−３０分間反応させることを含むことを特徴とする請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白ｇｐ９６あるいはｈｓｐ７８との複合物を製造する方法。
【請求項５】
反応温度が３７℃で、反応時間が１５分間であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｇｐ９６蛋白またはｈｓｐ７８の濃度がいずれも０．１２μｍｏｌ／Ｌであり、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の濃度が３．０μｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
Ｂ型肝炎ウイルス抗原の熱ショック蛋白ｇｐ９６あるいはｈｓｐ７８との複合物が、Ｂ型肝炎の治療及び肝炎続発性肝癌の治療性ワクチン製造に応用されることを特徴とする請求項１記載のＢ型肝炎ウイルス抗原と熱ショック蛋白ｇｐ９６あるいはｈｓｐ７８との複合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドと熱ショック蛋白ｇｐ９６およびｈｓｐ７８との複合物及びその応用に関する。
【０００２】
（技術背景）
熱ショック蛋白（ｈｓｐ）ｇｐ９６（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ９６）はｇｒｐ９４（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９４）とも言い、細胞小胞体におけるｈｓｐ９０ファミリーの１つであり、分子量は、約９６ＫＤａで、細胞蛋白の折り畳みと運搬過程において、重要な作用を発揮する。最近の研究によると、これはまたある癌細胞表面に存在していることが発見されている。ｇｐ９６分子は２つの共通部分を含み、Ｃ末端はポリペプチドの結合部位であって５−２５個アミノ酸のポリペプチド配列と結合でき、Ｎ末端はＡＴＰと結合でき、ＡＴＰ酵素活性を持っている。熱ショック蛋白ｈｓｐ７８は、細胞質中のｈｓｐ７０ファミリーの１つで、分子量は約７８ｋＤａであり、細胞蛋白の折り畳みと運搬過程において重要な作用を発揮している。ｈｓｐ７８分子は、ペアの分子として細胞中の各々の短いペプチドと結合できて２つの機能部位を有し、Ｎ末端にはＡＴＰ酵素活性があり、Ｃ末端はポリペプチド基質と結合する。
【０００３】
近年以来の研究により、腫瘍組織あるいはウイルス感染細胞から分離精製されたｇｐ９６とｈｓｐ７８分子により動物を免疫した後、検体は、その腫瘍あるいはウイルスに対して、特異的拒絶反応を起こすことが見出され、更に研究した結果から、ｇｐ９６とｈｓｐ７８は、細胞内に形成された全てのペプチド基と結合することが示された。その中には抗原ポリペプチドも含まれる。この特異的免疫反応は、熱ショック蛋白それ自体の代わりにｇｐ９６分子とｈｓｐ７８分子とが結合したポリペプチドによって決定され、腫瘍あるいはウイルス感染細胞由来のｇｐ９６分子及びｈｓｐ７８分子が一般に腫瘍あるいはウイルス特異性ポリペプチドと結合する。ｇｐ９６分子とｈｓｐ７８分子は、結合した抗原ペプチドを主な組織適合抗原（ＭＨＣ）分子に伝達することによって、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させて検体の細胞免疫反応を引き起こす。ｇｐ９６とｈｓｐ７８は、細胞抗原の伝達過程において、重要な作用を発揮するので、ｇｐ９６−ポリペプチド複合物とｈｓｐ７８−ポリペプチド複合物は、自体が腫瘍とある伝染疾病の予防または治療に用いられる。
【０００４】
アメリカニューヨーク大学のＰｒａｍｏｄ Ｋ． Ｓｒｉｖａｓｔａｖａは自己の研究よりそれぞれ６項のアメリカ特許（特許ＮＯ．６０１７５４４、６０１７５４０、６００７８２１、５８３７２５１、５８３０４６４）を出願した。これらの特許における主な内容は、熱ショック蛋白（ｈｓｐ）と非共有結合抗原分子によって形成された複合物を利用して原発性および転移された伝染疾病を治療し、検体を刺激して、免疫反応を生じさせるものであり、その中には、抗原分子が体内のｈｓｐと結合したポリぺプチドが含まれ、体外でｈｓｐと複合物を形成する複合物の体外抗原あるいは免疫原性フラグメントも含まれる。Ｈｓｐは主にｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０とｇｐ９６蛋白を含む。
【０００５】
現在、ｇｐ９６とｈｓｐ７０分子は、水疱性口内炎ウイルス抗原部位ペプチド、鼠Ｈ−２Ｋｂ制限卵アルブミン蛋白抗原エピトープペプチドとＬｄ制限白血病ＣＴＬエピトープペプチドなどの抗原ポリペプチドと結合することが実証された。ところが今まで、ウイルス感染の患者の組織からの分離検定により、ｈｓｐと結合した抗原ポリペプチドは見つけられていない。
【０００６】
全世界では、３．５億の人がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染し、中国では、約１．２億が感染し、ＨＢＶは慢性肝炎、肝硬変と肝癌を引き起こす第一原因となるため、これは中国国民の生命健康を損なう重大な伝染病である。Ｂ型肝炎から続発する肝癌の確率もかなり高く、Ｂ型肝炎ウイルス核抗原（ＨＢｃＡｇ）の肝癌内と肝癌周囲組織における陽性率はそれぞれ６２．５％と２９．２％である。ＣＴＬより引き起こされた細胞免疫反応は検体のウイルス除去とＢ型肝炎治療の主な経路であり、Ｂ型肝炎に感染した患者の体内ＨＢＶ抗原ポリペプチドは、肝細胞において加工されてから、Ｉ類ＭＨＣ分子に伝達され、特異的ＣＴＬを活性化させ、細胞免疫反応を引き起こす。現在、すでにヒトのある程度のＨＢＶ核蛋白におけるＣＴＬエピトープを検定し、これにはＨＬＡ−Ａ２制限のＨＢｃＡｇ１８−２７、ＨＬＡ−Ａ１１制限のＨＢｃＡｇ８８−９６などが含まれる。したがって、Ｂ型肝炎とＢ型肝炎続発性肝癌の予防と治療の新しい型の薬物の研究では、特に、主動的に検体を刺激し、ＣＴＬ免疫反応を引き起こす薬物は、非常に重要な意味がある。
【０００７】
（発明の公開）
本発明の一つの目的として、ｇｐ９６およびｈｓｐ７８と結合するＢ型肝炎ウイルス抗原の複合物を提供する。Ｂ型肝炎ウイルス抗原とは、それぞれ、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第８８から９４までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＹＶＮＴＮＭＧあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第８８から９６までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＹＶＮＴＮＭＧＬＫあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第１４１から１５１までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス核蛋白における第１８から２７までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面蛋白における第３１３から３２１までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＩＰＩＰＳＳＷＡＦあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面蛋白における第３５５から３６３までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＷＬＳＬＬＶＰＦＶあるいはその変異配列であり、Ｂ型肝炎ウイルスポリメラーゼにおける第５７５から５８３までのアミノ酸配列であって、その配列は、ＦＬＬＳＬＧＩＨＬあるいはその変異配列である。
【０００８】
上記変異配列とは、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原が、１個或いはあるいは多数個のアミノ酸の入れ替わり、欠損、増加、あるいは側鎖の修飾により得られ、同時に、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原の配列を持っていることを指す。
【０００９】
本発明の複合物は、熱ショック蛋白が非共有結合でポリペプチドと結合されたものも含み、共有結合でポリペプチドと結合されたものも含む。
【００１０】
本発明のまた１つの目的は、上記Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドと熱ショック蛋白ｇｐ９６とｈｓｐ７８との複合物を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた１つの目的は、本発明におけるこれらの複合物のＢ型肝炎及びＢ型肝炎続発性肝癌の治療と薬物の製造への応用を提供することである。
【００１２】
本実験室では、初めて、６例のＨＢＶ感染者の肝癌組織において、熱ショック蛋白ｇｐ９６と結合したポリペプチドより、特異７ペプチドを分離して、アミノ酸配列分析により「ＹＶＮＴＮＭＧ、あるいはＹＶＮＶＮＭＧ」であること、調査によりこの配列が、ＨＢＶ核蛋白８８−９４位（ＨＢｃＡｇ８８−９４）に位置することを発見した。この配列は、人工合成されて体外で発現されたｇｐ９６蛋白と組立てられ、体外でｇｐ９６−７ペプチド複合物を合成し、７ペプチドとｇｐ９６−７ペプチド複合物でマウスを免疫することによりマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を産生できる。ｇｐ９６−７ペプチド複合物の免疫原性は、単独のペプチドを使用するより２００倍以上高い。実験結果より、ｇｐ９６−７ペプチド複合物は、一種のＢ型肝炎及びその続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００１３】
人工合成された７ペプチド「ＹＶＮＴＮＭＧあるいはＹＶＮＶＮＭＧ」とＮ端に蛍光物質で標識された７ペプチドを使用して、体外でｇｐ９６蛋白と蛍光物質標識の７ペプチドとの結合の反応系を構築した。反応公式により、
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である。
【００１４】
このうち、Ｇはｇｐ９６蛋白、Ｐは７ペプチド、ＧＰはｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物を表し、ｋ１、ｋ２は反応正方向の速度常数である。その結合反応の平衡常数ｋは、次の関係式より得られる。
【００１５】
ｋ＝ｋ１／ｋ２＝［ＧＰ］／［Ｇ］［Ｐ］
［ＧＰ］、［Ｇ］と［Ｐ］はそれぞれ反応生成物ＧＰと基質Ｇ、Ｐの濃度を表す。結合反応系における最適温度、塩濃度、ｐＨ値、添加剤と触媒、ｇｐ９６蛋白と７ペプチドの最適反応濃度比等の因子を確定して、反応常数を測定し、最適反応系を構成する。
【００１６】
最適反応条件のもとに体外でｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物を合成する。
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原である７ペプチドと熱ショック蛋白ｇｐ９６との複合物の製造方法、即ち濃度０．１−０．１５μｍｏｌ／Ｌのｇｐ９６蛋白と濃度２．５−３．５μｍｏｌ／ＬのＢ型肝炎ウイルス抗原を５−１０％（ｖ／ｖ）グリセリン含有の濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の低塩緩衝液中で、温度３０−３９℃で、１０−３０分間反応させることを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法において、最適反応温度は３７℃で、最適反応時間は１５分である。
本発明の方法において、ｇｐ９６蛋白の最適濃度は０．１２μｍｏｌ／Ｌ、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の最適濃度は３．０μｍｏｌ／Ｌである。
【００１８】
本発明は、またそのＢ型肝炎ウイルス抗原である７ペプチドと熱ショック蛋白ｇｐ９６との共有結合で形成した融合蛋白を提供した。人工合成はそのペプチドの核酸配列に対応し、分子生物学で常用される方法により行ない、その配列をｇｐ９６遺伝子５’端と連結して、大腸菌中で融合発現させる。例えば、制限酵素切断部位ＢｇｌＩＩを導入し、その７ペプチドの核酸配列をリガーゼＴ４によりｇｐ９６遺伝子５’端と連結させ、連結生成物の５’と３’端に２つの制限酵素切断部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩを導入し、発現担体ｐＥＴ３０ａ中に連結させて、大腸菌において発現させる。発現生成物は、ｇｐ９６と７ペプチドとの融合蛋白である。
【００１９】
本発明におけるｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物は、上記ｇｐ９６が非共有結合で７ペプチドと体外で結合して形成された複合物と、上記ｇｐ９６が共有結合で７ペプチドと体外で結合して形成された融合蛋白を含み、いずれの公知の免疫方式を使用しても免疫を行うことができ、例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等がある。ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、０．０１ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１０ｎｍｏｌ、または０．５０ｎｍｏｌ等でもよい。７ペプチドが単独で免疫に用いられる場合、その免疫剤量は、０．２ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌでもよい。
【００２０】
ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物と７ペプチドを免疫に用いる場合は、アジュバントは使用しなくてもよく、あるいは、いずれの公知のアジュバンドを使ってもよい。例えば、ＦＲＥＵＮＤアジュバンド、クロムミョウバン（ｃｈｒｏｍｉｕｍ ａｌｕｍ）等がある。
【００２１】
本実験室では、また９ペプチド「ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ」を人工合成して、上記の最適反応系により、体外でｇｐ９６蛋白−９ペプチド複合物を合成した。いずれの公知の免疫方式によっても免疫を行うことができ、例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等があり、ｇｐ９６蛋白−９ペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、０．０１ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１０ｎｍｏｌ、または０．５０ｎｍｏｌ等でもよい。９ペプチドが単独で用いられる場合の免疫剤量は、０．２ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌである。免疫時にアジュバントを使用しなくてもよく、あるいはいずれかの公知アジュバント、例えばＦＲＥＵＮＤアジュバント、クロムミョウバン等を使用する。ｇｐ９６−９ペプチド複合物と９ペプチドをマウス免疫に用いると、いずれもマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生じさせる。ｇｐ９６−９ペプチド複合物の免疫原性は、単独のペプチドを使用するより３００倍以上高くなる。実験結果よりｇｐ９６−９ペプチド複合物は、新規なＢ型肝炎とＢ肝続発性肝癌の治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２２】
本実験室において、また１１ペプチド「ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ」、１０ペプチド「ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ」、９ペプチド「ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ」、９ペプチド「ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ」、９ペプチド「ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ」等を人工合成した。上記最適反応系により、体外でｇｐ９６蛋白−ポリペプチド複合物を合成して、いずれかの一種の公知の免疫方式により、それぞれ免疫を行う。例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等であり、ｇｐ９６蛋白−ポリペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、０．０１ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１０ｎｍｏｌ、または０．５０ｎｍｏｌ等である。ポリペプチドが単独で使用される場合は、免疫剤量は、０．２ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌである。免疫時、アジュバントを使わなくてもよく、あるいはいずれの公知のアジュバントを使ってもよい。例えば、ＦＲＥＵＮＤアジュバント、クロムミョウバン等がある。ｇｐ９６−ポリペプチド複合物とポリペプチドをマウス免疫に用いると、いずれもマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生じさせる。ｇｐ９６−ポリペプチド複合物免疫原性は、ペプチドを単独で使用するよりいずれも１５０倍以上高い。実験結果より、ｇｐ９６−ポリペプチド複合物は、Ｂ型肝炎とＢ型肝炎続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２３】
本実験室において、また上記で合成された多種ポリペプチドには、「ＹＶＮＴＮＭＧ」、「ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ」、「ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ」、「ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ」、「ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ」、「ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ」、「ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ」等が含まれる。上記の最適反応系により、ｈｓｐ７８蛋白−ポリペプチド複合物を体外で合成し、いずれの公知の免疫方式によっても免疫できる。例えば、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射等がある。ｈｓｐ７８蛋白−ポリペプチド複合物の免疫剤量は、例えば、０．０１ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１０ｎｍｏｌ、または０．５０ｎｍｏｌ等である。７ペプチドが免疫に単独で使用される場合、免疫剤量は、０．２ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌ、２０ｎｍｏｌでもよい。免疫の際、アジュバントを使わなくてもよく、あるいはいずれの公知アジュバントも使用できる。例えば、ＦＲＥＵＮＤアジュバント、クロムミョウバン等がある。ｈｓｐ７８−ポリペプチド複合物とポリペプチドをマウス免疫に用いると、マウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）生じさせる。ｈｓｐ７８−ポリペプチド複合物の免疫原性は、ペプチドを単独で使用するよりいずれも１５０倍以上高い。ｈｓｐ７８−ポリペプチド複合物は、Ｂ型肝炎とＢ肝続発性肝癌の新規な治療性薬物として開発できることが分かる。
【００２４】
（発明を実施するための最良の形態）
実施例１　肝組織中からのｇｐ９６蛋白の精製
ＨＢＶ感染腫瘍組織３部と未感染の正常組織１部をホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）してから遠心分離し、５０％−７０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４により沈澱させて、沈澱溶解後、ＣｏｎＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ会社）でアフィニティクロマトグラフィーを行い、結合された蛋白を１０％α−メチルグルコシドで溶離し、溶離液はＰＯＲＯＳ ２０ＱＥ柱（ＰＥ会社ＢｉｏＣＡＤ液体クロマトグラフシステム）でアニオンクロマトグラフィーを行い、この３段階の精製により＞９５％純度のｇｐ９６蛋白が得られた。ｇｐ９６蛋白は、ｇｐ９６／ｇｒｐ９４モノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ会社）によりウエスタン検定された。その純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色及び逆相ＨＰＬＣにより検定された。
【００２５】
実施例２　ｇｐ９６蛋白からの非共有結合のポリペプチドの放出
精製されたｇｐ９６蛋白をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に加え、その最終的な濃度を０．２％（ｐＨ約２．０）までにしてから、グラドコル法（分子横断面１０ＫＤａ、Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ会社）によりポリペプチドを分離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススぺクトロメータ（ＰＥ会社Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ系）によりポリペプチド混合物を分析した。ポリペプチド分子量は、ほとんど６００−１１００Ｄａの間であった。
【００２６】
実施例３　逆相ＨＰＬＣによるポリペプチド分析
ポリペプチド混合物を凍結乾燥した後、溶液Ａ（０．０６５％ＴＦＡ、２％アセトニトリル）に溶解させ、Ｃ１８逆相カラム（Ｓｅｐｈａｓｉｌ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８、５ｎｍ粒度、４．６Ｘ２５０ｎｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ会社）に入れて、０％から６５％までの溶液Ｂ（０．０５％ＴＦＡ、１００％アセトニトリル）で勾配溶離を行い、流速を１ｍｌ／ｍｉｎとして、２１４ｎｍ波長でセンサした。癌組織と正常組織のＨＰＬＣ図を比較すると、３部の肝癌組織は、正常組織にはないペプチドのピークをともに有していることが分かった。
【００２７】
実施例４　ポリペプチドの微量配列測定と配列分析
上記の特異のペプチドピークを収集して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススぺクトロメータ（ＰＥ会社Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ系）によりその純度を検定したが、分子量７９８Ｄａの単一ピークしか見られなかった。そのペプチドに対して微量配列測定（ＰｒｏｃｉｓｅＴＭ４９１蛋白配列測定器、ＰＥ会社）したところ、そのアミノ酸配列は、「ＹＶＮＴＮＭＧ、あるいはＹＶＮＶＮＭＧ」であり、３部の癌組織から得られた配列と一致している。その配列は、ＰｕｂＭｅｄネットワーク蛋白データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で調べたところＨＢＶ核心蛋白８８−９４の位置であることが分かった。
【００２８】
実施例５　ｇｐ９６遺伝子クローン
宝生物工程（大連）有限公司のＲＮＡ抽出試薬キット（Ｃａｔｒｉｍｏｘ−１４ＴＭ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１１）を用いて、４２℃、２時間熱刺激された人間の血液０．５ｍＬからイソチオシアン酸グアニジン法により、試薬キットの説明通り総ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
逆転写−ポリメラーゼ鎖式反応（ＲＴ−ＰＣＲ）でヒトｇｐ９６遺伝子をクローンし、宝生物（大連）有限公司のＲＴ−ＰＣＲ試薬キット（ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ ＴＭ Ｋｉｔ ＡＭＶ Ｖｅｒ．１．１）により試薬キットの説明通り行なった。用いたプライマーは、
プライマー１：５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡ ３’
プライマー２：５’ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＣ ３’
である。
【００３０】
ＰＣＲ反応条件は次のようであり、９４℃４分、９４℃５０秒，５５℃５０秒，７２℃３分を全部で３０サイクル、７２℃５分間である。
【００３１】
ＰＣＲ生成物は、約２．４Ｋｄのフラグメントであり、フラグメント５’端と３’端には人為的に２つの酵素切断部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩを導入し、増幅したフラグメントの配列を測定する。ｇｐ９６遺伝子は２３４３ｂｐを含み、塩基配列は、文献の記載（Ｍａｋｉ， ＲＧ， ｅｔ ａｌ， ＧｅｎｅＢａｎｋ， Ｎｏ：００３２９９）と一致している。
【００３２】
実施例６　ｇｐ９６遺伝子、ｇｐ９６遺伝子とＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドヌクレオチドの接続フラグメントとの大腸菌における発現及び蛋白精製
増幅されたフラグメントは、ＢａｍＨＩとＳａｃＩの酵素により切断し、発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）に連結させ、大腸菌ＢＬ２１中で形質転換を行い、同時に、次のポリペプチドに対応する核酸配列を人工合成する。即ち、「ＹＶＮＴＮＭＧ」、「ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ」、「ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ」、「 ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ」、「ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ」「ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ」、「 ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ」である。また上記核酸配列の両端に制限酵素切断部位ＢｇｌＩＩを導入して、ｇｐ９６遺伝子を含むｐＥＴ３０ａ（＋）に挿入する。
【００３３】
構成されたベクターは、１ｍＭのＩＰＴＧにより４時間誘導した後、その生成物を発現させた。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動とクマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）により発現した生成物の分子量は約１００Ｋｄａであり、理論値と基本的に一致している。
【００３４】
ｇｐ９６蛋白とｇｐ９６蛋白のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとの融合蛋白はＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ会社）によりアフィニティークロマトグラフィーを行い、ＰＯＲＯＳ ２ＯＱＥカラム（ＰＥ会社ＢｉｏＣＡＤ液体クロマトグラフシステム）によりアニオンクロマトグラフィーを行い、精製した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動と銀染色により純度を鑑定し、９５％以上の純度のｇｐ９６蛋白およびその融合蛋白が得られた。発現されたｇｐ９６蛋白生成物とｇｐ９６蛋白のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとの融合蛋白は、ｇｐ９６／ｇｒｐ９４モノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ会社）でウエスタン検定した。
【００３５】
実施例７　ｇｐ９６蛋白と人工合成のポリペプチドの体外における組立て条件試験
Ｎ端にフルオレセイン標識を持っている７ペプチド「ＹＶＮＴＮＭＧ、あるいはＹＶＮＶＮＭＧ」（寶百盛生物工程公司に委託）を人工合成した。ｇｐ９６蛋白とポリペプチドを体外で組立て、以下の一連の試験によって、最適反応条件を確立した。
【００３６】
反応系における温度試験：５５℃、３９℃、３７℃、３０℃、あるいは２８℃
反応系における塩濃度試験：低塩緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２０，１００あるいは５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）、高塩緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．５，１．０あるいは２．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２）
反応系におけるｐＨ値試験：ｐＨ６．０、７．０、７．９あるいは９．０
反応系における添加剤と触媒：１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＤＰ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＴＰと１０％（Ｖ／Ｖ ）グリセリン
ｇｐ９６蛋白と７ペプチドの最適反応濃度およびその濃度比率：反応系における７ペプチド濃度はそれぞれ０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５μｍｏｌ／Ｌであり、反応系におけるｇｐ９６蛋白濃度はそれぞれ０．０６、０．０９、０．１２、０．１５、０．１８、０．２１μｍｏｌ／Ｌである。反応常数ｋを測定した。ｇｐ９６蛋白の含有量は次の公式、ｃ＝１．４５Ａ２８０−０．７４Ａ２６０、により計算できる。ｃは蛋白濃度であり、Ａ２８０とＡ２６０はそれぞれ２８０ｎｍと２６０ｎｍの光の吸収値である。フルオレセイン標識した７ペプチドの含有量は、３７８ｎｍにおける吸収値で計算した。結合反応後グラドコル法（分子横断面１０ＫＤａ，Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ会社）により未結合の７ペプチドを除去し、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物の含有量を、３７８ｎｍにおける吸収値で計算した。
【００３７】
実施例８　ｇｐ９６蛋白と人工合成したポリペプチドとの体外組立て最適反応系の構成
多成分差異分析により反応条件を最適化し、最適反応条件を確定した。
【００３８】
７ペプチド「ＹＶＮＴＮＭＧ、あるいはＹＶＮＶＮＭＧ」（寶百盛生物工程公司に委託）を人工合成して形成された最適な体外結合反応条件系：２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣ１、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、３．０μｍｏｌ／Ｌ　７ペプチド、０．１２μｍｏｌ／Ｌ ｇｐ９６蛋白、３７℃反応１５分間、グラドコル法（分子横断面１０ＫＤａ，Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ会社）により未結合のポリペプチドを除去した。分析測定により、ｇｐ９６蛋白と７ペプチドは体外においてかなり高い親和力があることが認められた。この結合反応の平衡常数ｋは、約５−１０である。
【００３９】
実施例９　ｇｐ９６蛋白−７ペプチドの安定性の分析
体外組立てのｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中において、４℃、−２０℃、−７０℃での保存ではいずれも不安定であり、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動と銀染色による検定では、３０日後にｇｐ９６蛋白は二量体またはポリマを形成し始めた。冷凍乾燥後４ ℃で保存すると、複合物の安定性は良好であり、９０日後の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動と銀染色及び逆相ＨＰＬＣによる測定では、その分解率は５％未満であった。
【００４０】
実施例１０　免疫マウス
１２−１６週間成長したＢＡＬＢ／ｃＪマウス（Ｈ−２ｄ）を選んで、本試験に用いた。
【００４１】
免疫方式としては、サンプルをＰＢＳ１００μｌに溶解してから、頸脊皮下に注射した。皮内注射は、必要な免疫剤量は低いが、操作が難しいため採用しなかった。腹部の注射に必要な免疫剤量は大きく、約０．５ｎｍｏｌでなければ効かないため採用しなかった。
【００４２】
ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物の最適免疫剤量は、０．１ｎｍｏｌである。
免疫時間は、第１回の免疫をして１週間後、第２回目の免疫を行う方が、１回に免疫するより効果がが良好である。
【００４３】
免疫アジュバントを使用した試験の結果では、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物は、ＦＲＥＵＮＤ不完全アジュバント（ＦＩＡ）、ＦＲＥＵＮＤ完全アジュバント、クロムミョウバン等を使用するため、免疫を増加させる作用がないだけでなく、その免疫原性を低下させるようになる。その原因として、アジュバントは、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物構造に対して破壊作用を持つ可能性がある。７ペプチドに対してＦＲＥＵＮＤアジュバント、クロムミョウバンを使用することにより、その免疫活性を著しく向上させることができ、ＦＲＥＵＮＤアジュバントの効果は、クロムミョウバンより優れている。
【００４４】
そこで、皮下注射免疫を採用し、７ペプチドを緩衝液（９０％ＰＢＳ、１０％ＤＭＳＯ／０．１％ＴＦＡ）に溶解し、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物はＰＢＳ中に溶解し、注射の前に１分間激しく振動させ、マウス１匹毎の免疫剤量を７ペプチドでそれぞれ０．２ｎｍｏｌ、２ｎｍｏｌ及び２０ｎｍｏｌとし、ペプチドとＦＲＥＵＮＤアジュバントを乳化してから、マウスを免疫した。ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物の免疫剤量はそれぞれ０．０１ｎｍｏｌ、０．０５ｎｍｏｌ、０．１０ｎｍｏｌ及び０．５０ｎｍｏｌであり、頸脊皮下注射で、第１回の免疫をしてから１週間後に第２回目の免疫をさらに加え、７日後に細胞毒性の分析を行なった。マウスは処理群ごとに１０匹使用した。
【００４５】
実施例１１　細胞毒性（ＣＴＬ）の分析
マウスを免疫して７日後、マウス１匹毎に３×１０７脾臓細胞を得て、それらを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む緩衝液、５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール、抗生物質及び１０％（Ｖ／Ｖ）のＦＣＳを有する培養液中に浮遊させ、培養瓶において、放射線照射（４５００ Ｒａｄ）された同じ起源のＬＰＳ−刺激のＢリンパ細胞（３：１）と１μｇ／ｍ１のペプチドを完全培地中、３７ ℃で培養した。６日後、脾臓細胞を収集して、４時間の５１Ｃｒ放出標準試験（具体方法は、Ｋｕｈｒｏｂｅｒ， Ａ， ｅｔ．ａｌ．１９９７．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ９（８）：１２０３−１２１２を参考）を行って、細胞の毒性活性を測定した。簡単に言えば、ターゲット細胞を１０μｇ／ｍｌペプチドに３７℃、３０分間で感作させた後、異なる数量のエフェクター細胞を入れる。反応系は、１００μｌの完全培地である。３７℃で共培養を４時間行なった後、上澄みを収集して、特異裂解率を測定する。
【００４６】
５１Ｃｒ放出試験の結果より、７ペプチドまたはｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物がいずれもマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させることが分かった。但し、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物の免疫原性は、７ペプチドの２００倍以上であり、各々のマウスが０．１ｎｍｏｌ（約１０μｇ）のｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物で免疫された場合、ただちに検体を誘発して、強烈な細胞免疫反応を引き起こし、細胞毒性より測定したターゲット細胞の裂解率は、６０％以上となる。実験結果より、ｇｐ９６蛋白−７ペプチド複合物により抗ＨＢＶ感染とＨＢＶ感染の肝癌の新規な治療薬物の開発が可能であることが分かる。
【００４７】
実施例１２　その他のｇｐ９６−ポリペプチド複合物の免疫活性の測定
上記抗原７ペプチドの他、さらに他の６種のＢ型肝炎ウイルスの抗原ポリプチドを選んでｇｐ９６と体外で組立て、その免疫活性を測定した。６種の抗原ポリペプチドはそれぞれ、（１）核抗原ポリペプチド「ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ」（核蛋白アミノ酸配列８８−９６に位置する）、（２）核抗原ポリペプチド「ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ」（核蛋白アミノ酸配列１４１−１５１に位置する） 、（３）核抗原ポリペプチド「ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ」（核蛋白アミノ酸配列１８−２７に位置する）、（４）表面抗原ポリペプチド「ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ」（表面蛋白アミノ酸配列３１３−３２１に位置する）、（５）表面抗原ポリペプチド「ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ」（表面蛋白アミノ酸配列３５５−３４３に位置する）、（６）ポリメラーゼ抗原ポリペプチド「ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ」（表面蛋白アミノ酸配列５７５−５８３に位置する）、である。この６種のポリペプチドは、それぞれ人工合成されたものであり、実施例８に述べられた最適反応系により体外でｇｐ９６と結合させた。この６種のポリペプチドは、すべてｇｐ９６と比較して高い親和力を持っている。結合反応の平衡常数Ｋの測定によると、この６種のポリペプチドのｇｐ９６との結合反応において、いずれもＫ値は５以上であった。
【００４８】
実施例１０における方法を用いて、上記６種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとｇｐ９６から形成された複合物と、上記ｇｐ９６と７種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの融合蛋白でそれぞれマウスを免疫した。また実施例１１における方法によって、この６種の複合物をＣＴＬ分析した。５１Ｃｒ放出実験から、この６種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドとｇｐ９６より形成された複合物は、いずれもマウスを刺激して特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させることが分かる。６種のポリペプチドとｇｐ９６から形成された複合物における免疫活性は、単独のポリペプチドより１５０−３００倍高い。マウス１匹毎の免疫剤量が０．１ｎｍｏｌ（約１０μｇ）の時には、ただちに検体を誘発して、強烈な細胞免疫反応を引き起こす。この６種のポリペプチドとｇｐ９６から形成された複合物の毒性の測定より、ターゲット細胞の裂解率は、６０％−８５％の間であることが分かった。
【００４９】
以上の実験結果より、ｇｐ９６とＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの体外での組立てにより合成された複合物は、抗ＨＢＶ感染とＨＢＶ感染の肝癌の新規な治療薬物として開発できることが明らかとなった。実験条件に限られた本出願特許では、すべての種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの体外での組立て及びその免疫活性を測定することは不可能であるが、７種の代表的なＢ型肝炎ウイルス核抗原、表面抗原及びポリメラーゼ抗原を研究対象として、体外において、ｇｐ９６と結合させて、免疫活性を測定した。大量の実験の結果より、ｇｐ９６とこれらのＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドから形成された複合物は、いずれもマウスを刺激して、強烈な免疫反応を引き起こすことが分かった。ｇｐ９６は、Ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの新しい良好なアジュバントとして、新規な治療ワクチンとして開発されることができる。したがって上記７種のＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドの他、いずれのＢ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドのｇｐ９６との結合も、新しい型のワクチンとして、本発明の請求範囲に含まれる。
【００５０】
実施例１３　熱ショック蛋白ｈｓｐ７０遺伝子クローンとその発現
宝生物工程（大連）有限公司のＲＮＡ抽出試薬キット（Ｃａｔｌｉｍｏｘ−１４ＴＭ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１１）を採用して、２００ｍｇのヒトの肝癌組織から、イソチオシアン酸法を用いて試薬キットの説明通り、総ＲＮＡを抽出した。
【００５１】
逆転写−ポリメラーゼ鎖式反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を採用して、ヒトｈｓｐ７０ファミリー中のｈｓｐ７８をクローンした。宝生物工程（大連）有限公司のＲＴ−ＰＣＲ試薬キットを使用し、試薬キットの説明通り行なった。用いたプライマーは：
プライマー１：ＧＧ ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ
プライマー２：ＧＧ ＧＴＣＧＡＣ ＣＴＡ ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＧＡ ＴＧＴ
である。
【００５２】
ＰＣＲ反応条件は、９４℃４分、９４℃５０秒，５５℃５０秒，７２℃２分の３０回サイクル、７２℃５分等である。
【００５３】
ＰＣＲの生成物は、約２．０ｋｂの断片であり、断片の５’端と３’端に２つの酵素切断部位ＢａｍＨＩとＳａｌＩを導入し、増幅した断片に対して、配列を測定した。ｈｓｐ７８の遺伝子は、１９６５ｂｐを含み、塩基配列は文献報告（Ｍｅｃｈ． Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１９９８， １０４（２）：１４９−１５８）と一致している。
【００５４】
増幅された断片は、ＢａｍＨＩとＳａｌＩ酵素の切断により発現ベクターＰＥＴ３０ａ（＋）転化大腸菌ＢＬ２１に連結され、同時に、次のポリペプチドに対応する核酸配列を人工合成する。即ち「ＹＶＮＴＮＭＧ」、「ＹＶＮＴＮＭＧＬＫ」、「ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲ」、「ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ」、「ＩＰＩＰＳＳＷＡＦ」、「ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ」、「ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ」である。上記の核酸配列の両端に制限性酵素切断部位ＢｇｌＩＩを導入してｈｓｐ７８遺伝子を含むｐＥＴ３０ａ（＋）中に挿入した。
【００５５】
構成されたベクターは、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導４時間後に発現させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動とクマシーブルーでの染色により測定した。発現産物の分子量は、約８０ｋＤａで、理論値と基本的に一致している。
【００５６】
発現産物は、ＡＤＰ−Ａｇａｒｏｓｅのアフィニティクロマトグラフィ（Ｓｉｇｍａ）とＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオンクロマトグラフィにより精製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動とクマシーブルーでの染色（電気泳動に使用するサンプル量は約５μｇ）により純度を検定して、９５％以上の純度の蛋白を得た。発現させたｈｓｐ７８及びその融合蛋白はｈｓｐ７０モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）によりウエスタン検定を行なった。
【００５７】
実施例１４　ｈｓｐ７８−ポリペチド免疫原性の測定
ｈｓｐ７８と７種のポリペプチドの体外での組立てにより形成された複合物の最適反応系は、ｇｐ９６（実施例８を参考）と同じであり、体外で合成された複合物、ｈｓｐ７８と７ポリペプチドとの融合蛋白でマウスを免疫した。マウスの免疫方式、免疫剤量及び免疫プログラムは、ｇｐ９６（実施例１０を参考）と同じである。細胞毒性（ＣＴＬ）分析方法は、ｇｐ９６（実施例１１を参考）と同じである。５１Ｃｒの放出実験の結果から、ｈｓｐ７８−７ペプチド複合物はマウスを刺激して、特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成させ、ｈｓｐ７８−７ペプチド複合物の免疫原性は、単独の７ペプチドの１５０倍以上であり、マウス１匹毎の免疫が０．１ｎｍｏｌ（約１０μｇ）では、検体を誘発して強烈な細胞免疫反応を引き起こし、細胞毒性測定よりターゲット細胞の裂解率は５０％以上であることが分かった。実験の結果からｈｓｐ７８−７ペプチド複合物は、新規な抗ＨＢＶ感染の肝癌の治療薬物として開発できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は７ペプチドとｇｐ９６−７ペプチド複合物でマウスＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２ｄ）を７日免疫した後、引き起こされた特異的ＣＴＬ反応を示す図である。特異的ターゲット細胞に対するエフェクター細胞ＣＴＬの裂解百分率を、４時間の標準５１Ｃｒの放出により測定した。エフェクター細胞とターゲット細胞の比はそれぞれ４、８、１２、２５、５０、１００であり、図における裂解百分率は、１０匹のマウスの平均値である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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