(57)【要約】第二高調波発生、和周波数発生などの表面選択的非線形光学技法を使用して、表面に付着したプローブと標識されたターゲットとの間の反応を検出し、または表面の画像化を実行する。表面選択的光学技法によって、サンプル・バルク中に存在するターゲット成分は無視して、界面の近くのターゲット成分だけを検出することができる。さらに、表面からの非線形光の方向が明確に規定された方向に散乱し、そのため、表面から離れた距離にある検出器への非線形光の入射を、表面の特定の既知の位置に容易にマップすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着したプローブと標識されたターゲットとの間の界面での相互作用を測定するための方法であって、前記付着したプローブと前記標識されたターゲットとの間の前記界面での前記相互作用の影響を、表面選択的非線形光学技法を使用して測定することを含む方法。
【請求項２】
前記付着したプローブが、基板または固体表面にｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合またはコンジュゲートされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、生物細胞、リポソーム、小胞、ビーズおよび粒子から成る群から選択される表面を含むか、またはこのような表面の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、基板または固体表面上にパターニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、基板または固体表面上にアレイ形式でパターニングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブがＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから成り、前記オリゴヌクレオチドが特定の塩基対配列を持ち、前記配列が固体表面または基板上の特定の領域位置に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの配列がマイクロアレイ形式でパターニングされている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、ナノメートルからミクロン・サイズの寸法の表面上の領域に付着されている、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記付着したプローブが特定のアミノ酸配列を持つタンパク質から成り、前記タンパク質が固体表面または基板上の特定の領域に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、マイクロアレイ形式でパターニングされたタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが、核酸、タンパク質、小分子、有機分子、生物細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、リガンド、抗原、卵母細胞、ホルモン、タンパク質、ペプチド、受容体、薬物、酵素、ヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、毒素、核酸類似体およびイオン・チャネル受容体から成る群から選択され、前記プローブが基板または固体表面上にアレイ形式でパターニングされており、前記プローブの特性または化学的アイデンティティが、前記アレイを構成する領域間で一定であるか、または異なっている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
所与の塩基対配列から成る前記プローブが、ナノメートル・サイズの寸法の表面上の領域に付着されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、ナノメートル・サイズの寸法の表面上の領域に付着されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記付着したプローブが、アレイまたはマイクロアレイを構成する既知の複数の領域に付着されている、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
非線形光学技法が、第二高調波、和周波数または差周波数発生から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
非線形光放射の発生、収集または検出モードが、反射、透過、エバネッセント波、多重内部反射、近視野光学技法、共焦点、光共振器、平面導波路、光ファイバおよび誘電体スラブ導波路および近視野技法から成る群から選択される１つまたは複数のモードを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記技法が、前記界面から放出された非線形光放射の変化を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記技法が、前記界面から放出された非線形光放射の変化を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
非線形光放射の前記変化が、界面の標識されたターゲットの増加または減少に起因する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
付着したプローブと標識されたターゲットの界面での結合の程度を、前記界面の前記標識されたターゲットに対する前記結合の影響を測定することを含む表面選択的非線形光学技法を利用して調査する方法。
【請求項２１】
表面選択的非線形光学技法を使用する方法であって、標識に結合されたターゲットまたはデコレータを使用してプローブ−ターゲット結合反応を検出し、トリガとして作用する作用物質または光ビームによって、前記標識の非線形光学特性または超分極率を変化させることができる方法。
【請求項２２】
前記標識がケージ化されているか、または分子ビーコンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
紫外線が、前記標識の非線形活性部分と第２の部分との間の結合を切断する働きをする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記光学技法が、１つまたは複数の領域の非線形光の強度をある時間にわたって測定することによって非線形光の強度を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学技法が、１つまたは複数の領域の非線形光の強度をターゲット濃度を変化させて測定することによって非線形光の強度を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブが、金属表面、半導体表面、ガラス表面、ラテックス表面、固体表面、基板、ゲル基板、光ファイバ表面、シリカ表面またはビーズ表面に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
表面が化学的に誘導体化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面が、自己集合単分子層または有機シランで誘導体化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブが平面または非平面表面に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
付着したプローブと標識されたターゲットとの間の前記反応が、核酸、リガンド、タンパク質、小分子、有機分子、生物細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、アゴニスト、阻害剤、抗体、抗原、ペプチド、卵母細胞、ホルモン、薬物、酵素、リガンド、炭水化物、ハプテン、ヌクレオシド、オリゴ糖、有機分子、毒素、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ホルモン、核酸類似体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ｃＤＮＡおよびイオン・チャネル受容体から成る群から選択される１種または複数種の生物学的成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識されたターゲットが、以下の成分：核酸、タンパク質、小分子、有機分子、生物細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ハプテン、リガンド、抗原、卵母細胞、ホルモン、タンパク質、ペプチド、受容体、薬物、酵素、ヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、毒素、核酸類似体、イオン・チャネル受容体、のうちの１種または複数種の成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記付着したプローブが、以下の成分：核酸、タンパク質、小分子、有機分子、生物細胞、卵母細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ハプテン、リガンド、抗原、ホルモン、タンパク質、ペプチド、受容体、薬物、酵素、ヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、毒素、核酸類似体、イオン・チャネル受容体、のうちの１種または複数種の成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブが固体表面に付着されているか、または前記プローブが固体表面で培養された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
１つまたは複数の表面領域で同じ期間または多くの期間にわたって起こる反応において、１種または複数種のプローブおよびターゲットを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
プローブがイオン・チャネル受容体であり、ターゲットが、チャネル動作を誘導または調節するシグナリング分子、アンタゴニスト、アゴニスト、ゲーティング分子、薬物、神経ペプチドまたは他の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記プローブおよびターゲットとともに、１種または複数種のターゲット、アゴニスト、アンタゴニスト、薬物または小分子が使用され、これらを、プローブ−ターゲット相互作用が起こる前、起こっている最中、または起こった後にサンプルに導入することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
プローブがイオン・チャネル受容体であり、ターゲットが、前記チャネル受容体の開閉を誘導または調節するシグナリング分子、アンタゴニスト、アゴニスト、ゲーティング分子、薬物、神経ペプチドまたは他の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記プローブとターゲットの間の前記反応がプローブ−ターゲット結合反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記反応が、小分子、薬物、アゴニスト、遮断剤または他の成分を含む群から選択される阻害剤の存在下で実施され、前記阻害剤がプローブ−ターゲット結合プロセスに影響を及ぼす、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記プローブが、共有または非共有結合によって表面に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブが、自己集合単分子層に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
自己集合単分子層が、シランまたは末端官能性シランの化学ファミリーのうちの１つである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記付着したプローブが生物学的成分であり、前記付着したプローブを前記ターゲットと反応させて相互作用を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ターゲット−プローブ反応の熱力学的または速度論的特性を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
相互作用が、化学結合、静電気力、物理吸着、化学親和力、化学吸着、分子識別、物理化学的結合、水素結合またはハイブリッド形成プロセスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記基板または固体表面が、リン脂質または人工二重層膜を支持する、請求項２に記載の方法。
【請求項４７】
前記リン脂質または人工二重層が膜タンパク質を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プローブが、以下の群：シリカ、ポリスチレン、金属、半導体、ガラス、ケイ素、窒化ケイ素、ナイロン、石英およびこれらの混合のうちの１種または複数種の材料を含む表面に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
プローブ、ターゲット、生物学的成分または試薬を、前記界面、固体表面、表面上のアレイまたは前記アレイ内の特定の要素に、マイクロ流体チャネル、電気泳動またはキャピラリ電気泳動を使用して送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
付着したプローブとターゲットの間の界面での生物学的結合プロセスを検出する方法であって、前記プローブと前記ターゲットが結合している期間中に前記界面の近くの標識されたターゲットの量または配向の変化を測定することを含んでなり、前記測定が、
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｃ．任意に、前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階と
を含む方法。
【請求項５１】
付着したプローブとターゲットの間の界面での生物学的結合プロセスを検出する方法であって、前記プローブと前記ターゲットが結合している期間中に前記界面の近くの標識されたターゲットの量または配向の変化を測定することを含んでなり、前記測定が、
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記プローブが前記ターゲットに結合した後に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｃ．任意に、前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階と
を含む方法。
【請求項５２】
潜在的な阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、薬物が、付着したプローブと標識されたターゲットの間の界面での生物学的結合プロセスに対して有する影響を検出する方法であって、前記プローブと前記ターゲットが結合している期間中に、前記界面の近くの標識されたターゲットの量または配向の変化を測定することを含んでなり、前記測定が、
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記阻害剤、前記アゴニスト、前記薬物または前記アンタゴニストが存在しない条件で、前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｃ．前記阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストまたは他の化合物が存在する条件で、前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｄ．任意に、前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階と
を含む方法。
【請求項５３】
前記ターゲット、または前記アゴニスト、前記アンタゴニスト、前記薬物もしくは前記阻害剤の濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階をさらに含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
界面でのプローブ、ターゲット、水分子またはインジケータの異なる配向性の部分母集団を測定するために、基本波、第二高調波、和周波または差周波の放射ビームの偏光を調整することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
基本波または非線形放射が円偏光である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
界面が、細胞、リポソームもしくは小胞表面、または固体表面または基板を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
付着したプローブとターゲットの間の界面での反応、または前記反応によって引き起こされる二次反応を検出するための装置であって、
所定の周波数または波長帯の電磁波または放射ビームを発生させる光源と、
付着した前記プローブを有する基板と、
前記光源と前記基板の間にあって、光放射ビームを前記基板上へ所定の角度で導き、走査するための任意選択の第１の光学部品と、
光学センサと、
前記基板と前記センサの間に位置する任意選択の第２の光学部品と
を備え、
前記第２の光学部品が、前記ターゲットおよびこれに付着したプローブから、前記基板に関して第２の角度で放出された所定の周波数の放射を受け取るものであり、前記角度は予め決められており、前記放射が、前記レーザ放射ビームに応答して前記界面によって放出され、前記第２の光学部品が前記センサに非線形放射を導く
装置。
【請求項５８】
付着したプローブとターゲットの間の界面での反応、または前記反応によって引き起こされる二次反応を検出するための装置であって、
付着した前記プローブを有する基板と、
光放射源と、
光放射源と前記基板の間にあって、光放射ビームを前記基板上へ所定の角度で導き、走査する任意選択の第１の光学部品と、
光学検出器と、
前記基板と前記センサの間に位置する任意選択の第２の光学部品と
を備え、
前記第２の光学部品が、前記ターゲットおよびこれに付着したプローブから、前記基板に関して第２の角度で放出された放射を受け取るものであり、前記角度は予め決められており、前記第２の光学部品が前記センサに放射を導く
装置。
【請求項５９】
前記第２の光学部品が、前記プローブおよび前記ターゲットから受け取った放射の中の所定の周波数を分離する周波数選択部品を含む、請求項５７または５８に記載の装置。
【請求項６０】
前記光源がパルス列を発生させるレーザであり、それぞれのパルスの持続時間がフェムト秒からナノ秒である、請求項５７に記載の装置。
【請求項６１】
前記第２の光学部品が、前記第１の所定の周波数の約２倍の所定の周波数の放射を選択する部品を含む、請求項５７または５８に記載の装置。
【請求項６２】
前記所定の周波数が第１の所定の周波数であり、前記光源が第１のレーザ源である請求項５７に記載の装置であって、第２の所定の周波数の電磁波を発生させる第２のレーザ源をさらに備えてなり、前記第１の光学部品が、前記第２の所定の周波数の追加のレーザ放射ビームを導きかつ前記追加ビームを前記基板上の前記プローブおよび前記ターゲットに導く部品を含む、装置。
【請求項６３】
前記プローブおよび前記ターゲットから放出される放射が非線形応答に起因し、前記所定の周波数が、前記プローブおよび前記ターゲットからの非線形放射の放出を誘導するように選択される、請求項５７または５８に記載の装置。
【請求項６４】
前記所定の周波数の前記放射ビームに応答して前記プローブおよび前記ターゲットによって放出されるほとんどまたは全ての放射が、前記第２の所定の角度で放出される、請求項５７または５８に記載の装置。
【請求項６５】
前記第２の光学部品が、以下の技法：多重内部反射、近視野光学技法、共焦点、光共振器、平面導波路、光ファイバおよび誘電体スラブ導波路、近視野技法のうちの１つまたは複数の技法を使用して前記界面への前記放射の送達または収集を可能にする、請求項５７または５８に記載の装置。
【請求項６６】
１つまたは複数の領域を含む界面での、付着したプローブと標識されたターゲットとの間の相互作用を測定するための方法であって、前記付着したプローブと前記標識されたターゲットとの間の前記界面での前記相互作用の影響を、表面選択的非線形光学技法を使用して測定することを含む方法。
【請求項６７】
プローブ−ターゲット反応がイオン・チャネルまたは受容体を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
影響が、イオン・チャネルの開放、閉鎖または調節を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
プローブとターゲットの界面での結合の程度を、デコレータ分子または粒子の存在下で表面選択的非線形光学技法を利用して調査する方法であって、前記デコレータ分子または粒子に対する前記結合の影響を測定することを含む方法。
【請求項７０】
デコレータが、超分極率を持つ分子または粒子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記界面が表面から成り、前記プローブが、前記表面のアレイの１つまたは複数の領域に付着されている、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
デコレータが、ターゲット、プローブ、ターゲット−プローブ複合体または他の種に対する特異的な結合親和性を有し、前記種が、前記ターゲット、前記プローブまたは前記ターゲット−プローブ複合体に対する結合親和性を有する、請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
デコレータ分子または粒子が、濃度約１ピコモルから約５００ミリモルのターゲット成分を含む相に溶解または懸濁される、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記界面が、固体基板、固体表面、細胞表面またはリポソーム表面から成る、請求項６９〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記界面が、ガラス表面、ラテックス表面、光ファイバ表面、シリカ表面、ケイ素表面、多孔質ケイ素表面、プラスチック表面、ビーズ表面、細胞表面またはリポソーム表面を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記表面が化学的に誘導体化されている、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記基板が、自己集合単分子層または有機シランで化学的に誘導体化されている、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記界面が平面または非平面の表面を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
前記プローブまたは前記ターゲットが、核酸、タンパク質、小分子、有機分子、生物細胞、卵母細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ハプテン、リガンド、抗原、ホルモン、タンパク質、ペプチド、受容体、薬物、酵素、ヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、毒素、核酸類似体およびイオン・チャネル受容体を含む群から選択される生物学的成分である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
前記プローブ、前記ターゲットまたは前記デコレータが、小分子、薬物および遮断剤から成る群から選択されるモジュレータである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
前記プローブが、共有または非共有結合によって表面に付着されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
前記プローブが、自己集合単分子層によって前記表面に共有結合で付着されている、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
自己集合単分子層が、シランまたは末端官能性シランの化学ファミリーのうちの１つである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
相互作用を調査する目的で、付着した生物学的成分をターゲットと反応させる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
結合が、測定対象の熱力学的または速度論的特性を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記プローブと前記ターゲットの前記結合が、化学結合、静電気力、物理化学的結合、水素結合またはハイブリッド形成プロセスによって起こる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記ターゲットが、核酸、タンパク質、小分子、生物細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ホルモン、抗体、抗原、ペプチド、受容体、薬物、酵素、リガンド、ヌクレオシド、ポリヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、ホルモン、アレルゲン、ｃＤＮＡ、ハプテン、オリゴヌクレオチド、ビオチン、ストレプトアビジン、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および核酸類似体から成る群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８８】
非線形光波の発生、収集または検出モードが、反射、透過、エバネッセント波、多重内部反射、近視野光学技法、共焦点、光共振器、平面導波路、光ファイバおよび誘電体スラブ導波路、近視野技法から成る群から選択される１つまたは複数のモードを使用する、請求項６９に記載の方法。
【請求項８９】
前記固体基板が、固体平面支持体またはナノメートルもしくはミクロン・サイズのビーズである、請求項７４に記載の方法。
【請求項９０】
前記プローブまたは前記ターゲットが、基板または固体表面に付着されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項９１】
前記プローブまたはターゲットが、前記基板または固体表面上に２次元アレイとしてパターニングされている、請求項６９に記載の方法。
【請求項９２】
前記プローブまたは前記ターゲットが、固体表面、表面上のアレイまたは前記アレイ内の特定の要素に、マイクロ流体チャネルまたはキャピラリ電気泳動を使用して送達される、請求項６９に記載の方法。
【請求項９３】
前記表面がリン脂質二重層を支持する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
生物細胞が、基板または固体基板に付着されているか、または基板または固体基板上にパターニングされている、請求項６９に記載の方法。
【請求項９５】
前記ターゲットが薬物または遮断剤である、請求項６９に記載の方法。
【請求項９６】
界面または固体表面への標識されたターゲットの吸着プロセスを測定するための方法であって、表面選択的非線形光学技法を使用して前記吸着の影響を測定することを含む方法。
【請求項９７】
前記結合が核酸ハイブリッド形成であり、前記プローブおよびターゲット成分が核酸、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項９８】
前記プローブおよびターゲットがペプチドまたはタンパク質である、請求項６９に記載の方法。
【請求項９９】
前記プローブが細胞表面であり、前記ターゲットが前記細胞表面に結合するウイルスである、請求項６９に記載の方法。
【請求項１００】
タンパク質またはペプチドが、デコレータ分子または粒子と結合するように遺伝子操作されているか、または選択されている、請求項６９に記載の方法。
【請求項１０１】
プローブと標識されたターゲットとの間の界面での反応を検出する方法であって、デコレータ分子または粒子によって生成される非線形信号に対する前記ターゲットの前記結合の影響を測定することを含んでなり、前記デコレータが、前記ターゲット、前記プローブまたはターゲット−プローブ複合体に対して選択的親和性を有し、前記測定が、
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と
を含む方法。
【請求項１０２】
付着したプローブとターゲットの間の界面での反応を検出する方法であって、デコレータ分子または粒子によって生成される非線形信号の量に対するターゲットの前記結合の影響を測定することを含んでなり、前記デコレータが、前記ターゲット、前記プローブ、または前記結合プロセスの結果生じるターゲット−プローブ複合体に対して選択的親和性を有し、前記測定が
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記プローブが前記ターゲットに結合した後に前記界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｃ．任意に、前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階と
を含む方法。
【請求項１０３】
潜在的な阻害剤、アゴニスト、薬物またはアンタゴニストが、付着したプローブとターゲットの間の界面での反応に対して有する影響を検出する方法であって、デコレータ分子または粒子によって生成される非線形信号の量に対するターゲットの前記結合の影響を測定することを含んでなり、前記デコレータが前記ターゲット、前記プローブまたは前記結合プロセスから生じるターゲット−プローブ複合体に対する選択的親和性を有し、前記測定が、
ａ．任意に、結合前に前記界面のバックグラウンド非線形信号を測定する段階と、
ｂ．前記阻害剤、前記アンタゴニスト、前記アゴニストまたは前記薬物が存在しない条件で、前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｃ．前記阻害剤、前記アンタゴニスト、前記アゴニストまたは前記薬物が存在する条件で、前記プローブと前記ターゲットが結合プロセスにある期間中に界面で生成される非線形信号を測定する段階と、
ｄ．任意に、前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階と
を含む方法。
【請求項１０４】
前記ターゲットの濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階をさらに含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ターゲット、または前記アゴニスト、前記アンタゴニスト、前記薬物もしくは前記阻害剤の濃度を増大させ、生成される非線形信号を測定して、プローブ／ターゲット結合に対する濃度の影響を決定する段階をさらに含む、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記プローブ成分もしくは前記ターゲット成分、または前記プローブと前記ターゲットの両方が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または他の核酸類似体である、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
プローブ−ターゲット結合反応中にデコレータ分子または粒子が存在するか、または前記結合が起こった後でデコレータ分子または粒子が加えられる、請求項１０１〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記デコレータ分子または粒子が、前記ターゲット、前記プローブまたは前記ターゲット−プローブ複合体に対する結合親和性を有する、請求項１０１〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
デコレータ分子または粒子が、生物学的成分、核酸、タンパク質、小分子、生物細胞、ウイルス、リポソーム、受容体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、ホルモン、抗体、抗原、ペプチド、受容体、薬物、酵素、リガンド、ヌクレオシド、ポリヌクレオシド、炭水化物、ｃＤＮＡ、ホルモン、アレルゲン、ｃＤＮＡ、ハプテン、オリゴヌクレオチド、ビオチン、ストレプトアビジン、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、核酸類似体を含む、請求項１０１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記結合が、１つまたは複数の領域の非線形光の強度をある時間にわたって測定することによって決定される、請求項１０１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記結合が、１つまたは複数の領域の非線形光の強度をターゲット濃度を変化させて測定することによって決定される、請求項１０１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記プローブおよびターゲットが核酸または核酸類似体であり、前記デコレータが、プローブ、ターゲットまたはこれらが結合した複合体に対する選択的親和性を持つ、請求項１０１〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記親和性が、インターカレーション・プロセス、水素結合、静電的相互作用またはこれらのある組合せに起因する、請求項４５に記載の方法。
【請求項１１４】
前記デコレータが、ソラレン、臭化エチジウム、メタンホスホナート、ホスホルアミデート、ヨウ化プロピジウム、アクリジン、９−アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、クロロキン、ピリン、エキノマイシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール・二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、スクシンイミジルアクリジン−９−カルボキシラート、クロロキン、ピリン、エキノマイシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール・二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、トリピロールペプチド、フラボピリドール、ピロニンＹから成るファミリー中の成分を含むか、またはこれらを含めた成分を含む、請求項１０１〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記界面が、固体基板、細胞表面またはリポソーム表面から成る、請求項１０１〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記生物学的成分または試薬が、固体表面、表面上のアレイまたは前記アレイ内の特定の要素に、マイクロ流体チャネルまたはキャピラリ電気泳動を使用して送達される、請求項１０１〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記表面がリン脂質二重層を支持する、請求項１０１〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記プローブが、前記固体基板に付着させたウイルスである、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記結合が、前記固体基板への前記ターゲットの吸着プロセスである、請求項１０１〜１０１に記載の方法。
【請求項１２０】
前記結合が核酸ハイブリッド形成であり、前記プローブおよびターゲット成分が核酸、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記プローブが細胞表面であり、前記ターゲットが、前記細胞表面に結合するウイルスである、請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
表面選択的非線形光学技法を使用して表面を光学的に画像化するための方法であって、前記表面を照明し、前記表面からの放射を収集することを含み、前記表面または前記表面に付着させた成分が非線形光学活性部分で標識されている方法。
【請求項１２３】
前記表面が付着したプローブを含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記表面が、ｉｎ  ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物組織である、請求項１２２に記載の方法および装置。
【請求項１２５】
前記画像化が一種の内視鏡法を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記照明および放射の収集が、光ファイバ線を使用して達成される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２７】
付着したプローブと標識されたターゲットとの間の界面での相互作用を測定するための方法であって、前記ターゲットが、細胞、リポソーム、またはイオン・チャネルを有する支持された二重層の表面にて生物学的成分で標識されており、前記標識の非線形特性の変化につながるイオン特性の変化を測定することを含んでなり、前記標識の前記非線形特性の前記変化が、表面選択的非線形光学技法を使用して検出される方法。
【請求項１２８】
前記標識の非線形特性の前記変化が、前記標識の超分極率または波長の変化を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
イオン・チャネル特性の前記変化がリガンド−受容体結合を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
イオン・チャネル特性の前記変化が、前記細胞、リポソームまたは支持された二重層の表面の電位または電荷密度の変化につながる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
前記影響が、以下の特性のうちの１つまたは複数の特性を含む１つまたは複数の特性によって測定される、請求項１に記載の方法：
ｉ）非線形光または基本光の強度、
ｉｉ）非線形光または基本光の波長またはスペクトル、
ｉｉｉ）表面または基板上の基本光の入射位置。
ｉｖ）  ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の時間経過。
【請求項１３２】
前記生物細胞、リポソーム、小胞、ビーズ、粒子が液体に懸濁または溶解されている、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、表面選択的非線形光学技法を使用して生物学的成分間の相互作用を検出する方法および装置に関する。詳細には本発明は、生物学的プローブと標識された非線形活性ターゲットとの間の結合の検出に関する。
【０００２】
発明の背景
生体分子間の結合などの相互作用の検出および定量化は、現代の分子生物学および医学の中心的な関心事である。ゲノミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）研究の関心もますます、さまざまな生物学的相互作用の高スループット分析が求められるこの問題に向けられている。これを達成するための多くのスキームは、分子、しばしばオリゴヌクレオチドまたはタンパク質の固体表面への固定に依存している。具体的には、マイクロアレイ形式のサンプルを使用して、情報を、高度並行プロセスで得ることができる。例えば、Ｆｏｄｏｒ他（１９９１年。この文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）は、光誘導合成（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって形成された高密度アレイを開示している。この事例では、表面に付着したプローブがオリゴヌクレオチドであり、プローブのターゲットに対する結合（ハイブリッド形成）を試験する。溶液中を自由に拡散するターゲットは蛍光標識されたオリゴヌクレオチドであり、プローブのヌクレオチド配列がターゲットの配列と整合した場所で結合が生じる。表面のそれぞれの位置のプローブの配列は予め分かっており、ターゲットとプローブは、ハイブリッドを形成するために整合した相補配列を有しているはずなので、結合しなかったターゲットを洗浄によって除去すれば、表面を走査してその蛍光を調べることによって、残ったターゲットの配列を決定することができる。この方法にはいくつかのバリエーションが導入されており、これには、配列間の結合の強さ、したがって蛍光強度が一塩基対分だけ異なるＳＮＰ（一塩基多型）の調査；１つのタンパク質（プローブ）を表面に固定し、プローブとさまざまなターゲットとの結合を試験するタンパク質−タンパク質相互作用の検出；薬物を存在させることによってタンパク質−タンパク質相互作用を調節するタンパク質−薬物相互作用などが含まれる。
【０００３】
これらの全てのケースでリードアウト（読出し）段階が蛍光に基づく検出を含む。しかし、蛍光を用いた検出にはいくつかの欠点がある。すなわち、（バックグラウンドの蛍光、すなわちバルク中の結合していないターゲットを除去するために）サンプルは一般に乾燥しており、したがって、平衡状態（自由エネルギー、解離定数など）の測定は、バルクからの蛍光バックグラウンドのため一般に不可能である。まず最初に、結合していないターゲットを洗浄段階によってサンプルから除去しなければならず、この洗浄段階は、平衡または速度論的測定を不可能にし、さらに、所与のサンプルに多くの走査を実施しなければならないとき、または多くのサンプルを調査しなければならないときには、非常に時間のかかる作業となる。さらに蛍光励起源がバックグラウンド信号の一因となる。これは、これが基板によって検出光学部品中に散乱する可能性があり、これをフィルタによって蛍光から完全に除去することが難しいためである。さらに、バックグラウンド自発蛍光、あるいは例えば共焦点ベースの検出スキームでは走査が画素ごとのデータ取得を必要とするので「リードアウト」または検出段階のボトルネックが生じる可能性がある。さらに、走査のそれぞれの段階の自動焦点ルーチンによって、画像取得がかなりスローダウンする可能性もある。
【０００４】
相互作用の平衡特性と速度論的特性の両方を測定することができる生体分子の結合相互作用を定量化する他の方法が、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）である。ＳＰＲでは、基板（一般にガラス）とこの基板が浸漬された溶液との間に導電または半導電層（一般に金）が必要である。入射光が、プリズムまたは格子によって導電層に結合され、特定の波長または入射角で共鳴が起こり、その結果、反射率の鋭い極小化または低下が生じる。一般に、導電層の上に１層または数層の生物適合層が構築される。一例では、（しばしばデキストラン・ベースの）生物適合層にタンパク質を固定し、ターゲット・タンパク質をこの層と接触させる。共鳴波長または共鳴角は基板の近くの溶液の屈折率によって決まり、溶液の屈折率は、導電層から１エバネッセント波長以内で吸着した生体分子の量および質量に依存する。固定されたタンパク質にターゲット・タンパク質が結合すると、共鳴波長または共鳴角が変化する。しかし、それぞれのアレイ要素に励起光を別々に結合することが難しいため、ＳＰＲ技法は、アレイ形式のサンプルの検出には不便である。さらに、検出感度が低い場合があり、この技法では、特異的な結合と非特異的な結合を区別することができず、ＳＰＲでは一般に、生体分子が導電層と接触した場合に起こりうる破壊的な相互作用を防ぐため、追加の生物適合層が必要である。しかし、この生物適合層が常に安定であるとは限らないか、または金表面との破壊的な相互作用を防ぐとは限らず、また、生物適合層に結合させるのに適したものにするために、固定したタンパク質をしばしばトランケートしなければならず、したがって、固定したタンパク質の特性が変化する可能性が生じる。膜タンパク質に関しては特に深刻な問題が生じる。膜タンパク質は、ガラス表面で調製することができる側方流動リン脂質膜などの自然に近い環境で最もよく調査することができる。しかし、金と脂質の間の破壊的な相互作用のためにこのような膜を金の表面に調製することは不可能である。
【０００５】
第二高調波発生（ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＳＨＧ）などの表面選択的非線形光学（ｓｕｒｆａｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｏｐｔｉｃａｌ：ＳＳＮＬＯ）技法では、バルク種が存在する条件で、界面（界面は非中心対称でなければならない）の分子または粒子を検出することができる。強いレーザ・ビーム（基本波）をあるサンプルの界面に導く。界面が非中心対称である場合、サンプルは非線形光、すなわち基本波の調波を発生させることができる。ストークス・シフトによって励起および放射光をより困難に分離する蛍光技法の典型的なケースとは異なり、基本波または第二高調波ビームを互いから容易に分離することができる。１）分子または粒子が非線形活性であり（超分極率（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）を持ち）、かつ２）分子または粒子が表面に近く、（化学力または電気力を介した）表面の影響によって非ランダムに配向する場合には、個々の分子または粒子を検出することができる。種のこの正味の配向および固有のＳＨＧ活性が、ＳＨＧによって可能になる界面での効果を担う。例えば、空気−水界面での平らな固体表面（ガラスおよびシリカ）、リポソームおよび固体ビーズ（シリカおよびポリスチレン）への染料分子の吸着プロセスが測定されている。この技法は、界面での電子伝達、溶媒和動力学などのプロセスを追跡するのにも使用されている。
【０００６】
本来的に非線形活性である生物サンプルが比較的に少ないので、ＳＨＧなどの非線形ＳＳＮＬＯ技法はこれまで、主に物理学および化学分野に限定されてきた。この例には、生物細胞を画像化するのに使用される光学的に非線形活性の染料の使用（Ｃａｍｐａｇｎｏｌａ他，Ｐｅｌｅｇ，１９９９）が含まれる。この技法では、非線形活性染料を膜の中に固定し、これらの染料を使用して細胞表面を画像化する。しかし、染料は「上」または「下」のいずれかの方向に膜にインターカレートし、したがって弱め合う干渉によって全体の非線形信号を低減させる。非線形光学活性染料はさらに、リポソーム中の脂質二重層を横切る染料の反応速度を測定するのにも使用されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ）。最近も、任意の非線形活性分子または粒子を非線形活性にすることができる第二高調波活性（ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ）標識（「ＳＨＧ標識」）の概念および技法が導入された。その最初の例は、タンパク質シトクロムｃをオキサゾール染料で標識し、第二高調波発生を用いて空気−水界面のタンパク質複合体を検出することによって実証された。
【０００７】
発明の説明
本発明は、非線形活性標識の使用、第二高調波（または和／差周波数）発生の表面選択性、および非線形ビームが、界面から明確に規定された予測可能な方向に散乱されること（これは、蛍光がいくぶんランダムに発射される蛍光検出とは対照的である）に基づく。表面選択的非線形光学技法はコヒ―レントな技法であり、これは、基本波ビームと非線形ビームが明確に規定された相関係を有し、（コヒーレンス長の範囲内の）巨視的サンプル中の非線形ビームの波面が同位相であることを意味する。これらの特性は、単一の表面またはマイクロアレイ表面を調査する、表面または高スループット調査に有用ないくつかの利点を提供する。第二高調波発生などを用いた表面選択的非線形光学技法に基づく検出を使用した装置では、非線形光の発生が界面でしか起こらず、したがって極めて高い深度識別および高速走査が原理的に可能なので、収集光学部品が最小限で済む。本発明を用いると、プローブ−ターゲット相互作用を、例えば以下のような測定可能な情報に関連づけることができる：
ｉ）非線形光または基本光の強度
ｉｉ）非線形光または基本光の波長またはスペクトル
ｉｉｉ）（例えば画像化用の）表面または基板上の基本光の入射位置
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の時間経過
ｖ）  ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の１つまたは複数の組合せ。
【０００８】
例えば、表面に付着したプローブを有する基板上のある位置で非線形光学光（例えば第二高調波光）の強度を検出することによって、プローブ−ターゲット結合を測定することができる。標識されたターゲット（超分極率を持つ第二高調波活性標識で標識されたターゲット）が表面のプローブに結合し、この結合によってターゲットが部分的に配向し、したがって界面で第二高調波光が発生する非中心対称条件が満たされると、第二高調波光の強度は変化する。界面のプローブ−ターゲット結合複合体の濃度によるこの光強度のモデル化は、さまざまな方法を使用して、例えば放射標識または蛍光タグを使用して所与のプローブ−ターゲット相互作用に対してこの技法を較正することによって達成することができる。
【０００９】
本発明の利点を挙げれば以下のとおりである。
【００１０】
ｉ）バルク種の存在下での界面種のリアルタイム検出。この特性は、結合プロセスの検出にバルク種の存在が不可欠であるとき（例えば、例えばターゲット濃度を変更することによる、平衡またはリアルタイム反応速度データが必要な場合）、または結合していない材料を除去するための洗浄除去段階が、時間消費的であり、除去が不完全であり、またはアーチファクトを含む結果を与えるときに、特に有用である。
【００１１】
ｉｉ）ＳＳＮＬＯが非中心対称表面でしか発生しないことによる、蛍光ベースの検出よりも高い信号対雑音比（より低いバックグラウンド）。ＳＳＮＬＯ技法はしたがって、非常に幅の狭い「被写界深度」を有する。蛍光ベースの検出スキームにおける蛍光源は、焦点面ではなく、視野にある材料からの蛍光源、自発蛍光、および迷励起光による放出された蛍光の汚染を含む。これらは、バックグラウンド非線形光放射源ではない。
【００１２】
ｉｉｉ）この技法は、測定に溶液の存在が不可欠なとき、すなわち洗浄除去段階によって結合プロセスが排除されまたは乱される恐れがある場合に有用である。本発明のこの態様は、バルク種の存在が必要な平衡測定（自由エネルギー、結合定数など）、またはある時間にわたって測定を実施する速度論的測定に有用である。
【００１３】
ｉｖ）ＳＳＮＬＯ技法で非線形効果を担う散乱プロセスでは、標識の不可逆的なブリーチングが蛍光標識ほど速くない。二光子吸収断面は分子の一光子断面よりもはるかに低く、ＮＬＯ技法は散乱を含み、吸収を含まない。
【００１４】
ｉｖ）基本波および非線形ビーム（すなわち第二高調波）は、界面に関して明確に規定された入射または出射方向を有するので、収集光学部品が最小限で済み、より高い信号対雑音比が期待される。このことは、蛍光が等方的に発射され、関心の平面（例えばプローブを含んだ界面）以外に大きな自発蛍光バックグラウンドがある可能性がある蛍光ベースの検出に比べて有利である。
【００１５】
ｖ）その表面が支持媒質、溶液などと界面を作るビーズ、細胞または他の粒子との使用が容易である。
【００１６】
本発明の使用例
本発明は、多くの科学的な分析分野、特に化学的および生物学的技術分野で使用することができるが、本発明は、超高スループット検出の速度および容易さが非常に重要なゲノミクスまたはプロテオミクスにおいて特に有用である。バルク種の存在下で表面種を検出できることは有利であり、例えばＤＮＡハイブリッド形成またはタンパク質−タンパク質検出では、結合していない分子の洗浄除去段階は必要ないと考えられ、このことは、洗浄除去段階が所望の信号に対するアーチファクトの一因となる可能性がある場合に有用である。さらに、蛍光ベースの検出などの多くの技法では、界面または界面付近ではない場所（すなわちバルク）に存在するサンプルの大きな部分が望ましくない影響を及ぼし、または測定を妨害する可能性がある。したがって、界面に対してのみ感度を有する第二高調波発生、和周波数発生などの表面選択的技法の使用は有利であろう。
【００１７】
ＳＳＮＬＯ技法は、ある表面のアレイ形式（固体表面上のサンプルの２次元配列）のタンパク質、細胞または他の分子の調査に使用されるときに、従来技術に優る他の重要な利点を有する。この技法は散乱プロセス（反射に似たプロセス）に依存しているので、非線形ビームは明確に規定された方向を有する。蛍光ベースの検出では、放射が等方的であり、幅狭い被写界深度からの放射だけが求められるので、収集光学部品が複雑かつ広範囲にわたる可能性がある。しかし、非線形光学技法を使用すると、この技法は本質的に表面選択性であり、「被写界深度（ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｆｉｅｌｄ）」は、技法の性質によって界面の近くの極めて薄い層に限定される。さらに、表面から散乱した光は明確に規定された方向を持ち、そのため、検出器の散乱光の入射位置を、アレイ表面の位置に直接にマップすることができる。
【００１８】
マイクロアレイの走査には、共焦点ベースのスキームと非共焦点ベースのスキームが含まれる。米国特許第５８３４７５８号（Ｔｒｕｌｓｏｎ他。この特許の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）には、蛍光検出を使用してマイクロアレイを画像化する非共焦点ベースのスキームが記載されている。しかし、単一の焦点面の範囲内だけで画像化してアウト・オブ・プレーン（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）識別を良好にするために、サンプルは非常に平らでなければならない。したがって、この目的のために、特殊な構成部品を必要とする、非常に細密に調整可能な並進ステージを使用しなければならず、機器のコスト、およびことによると寿命のコストが追加される。このタイプの装置の画像品質は機械的振動の影響を受けやすいことがある。さらに、アウト・オブ・プレーン（非表面結合）蛍光団の識別はこの技法の感度を制限する。米国特許第６１３４００２号（Ｓｔｉｍｓｏｎ他。この特許の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）は、サンプル平面、すなわちマイクロアレイを画像化する共焦点走査顕微鏡装置の例である。共焦点ベースの技法は良好な深度識別を有するが、デスキャニング（ｄｅｓｃａｎｎｉｎｇ）要件のため走査速度が遅い場合があり、光スループットは低く、この技法の全体的な信号対雑音比および感度は低くなる可能性がある。
【００１９】
核酸ハイブリッド形成（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡなど）での使用では、ターゲット・オリゴヌクレオチドを表面全体と反応させることができる。配列相補的ハイブリッド形成が起こる（既知の位置に対応する）アレイ内のプローブ・オリゴヌクレオチド配列のところで、基本光は非線形光学信号を生じさせ、またはこのような信号のバックグラウンドの変化を生じさせるだろう。これを検出し、これを、アレイ要素の空間位置、したがってオリゴヌクレオチド配列の空間位置と関連づけることができる。
【００２０】
例えば、核酸マイクロアレイの主要な２つの応用は、１）配列（遺伝子または遺伝子突然変異）の識別、例えばＤＮＡ変異のモニタリング、および２）遺伝子の発現レベル（存在量）の決定である。アレイを調製する多くの形式がある。例えば、１つのケースでは、プローブｃＤＮＡ（長さ５００〜５０００塩基対）をロボット・スポッティングを使用してガラスなどの固体表面に固定し、別々のまたは混合物の状態の一組のターゲットに暴露することができる（Ｅｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｕ参照）。他の形式は、オリゴヌクレオチド（２０〜２５量体）またはペプチド核酸プローブを、ｉｎ  ｓｉｔｕで（固体基板上、Ｆｏｄｏｒ他）、または従来の合成およびその後のオンチップ固定によって、合成することを含む。次いでアレイをターゲットＤＮＡに暴露し、ハイブリッドを形成させ、相補的配列のアイデンティティまたは存在量を決定する。タンパク質アレイを調製して（例えばＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００参照）、所与のターゲット・タンパク質が、表面に固定されたプローブ・タンパク質に結合しているかどうかを判定することができる。さらに、プローブ・タンパク質への小分子の結合を調査する目的にこれらのアレイが使用された。当技術分野には、マイクロアレイ技術および応用を概説した多くの文献がある。例えば、Ｒａｍｓａｙ（１９９８。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｆｏｄｏｒ（１９９７。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｄｕｇｇａｎ他（１９９９。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｓｃｈｅｎａ他（１９９５。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｂｒｏｗｎ他（１９９９。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ他（１９９７）およびＢｌａｎｃｈａｒｄ他（１９９６。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）などである。
【００２１】
本発明を使用して、他の生物学的成分間の結合プロセス、例えば、細胞とウイルス、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−リガンド、細胞−リガンド、タンパク質−薬物、核酸−薬物、細胞−小分子、細胞−核酸、ペプチド−細胞、オリゴまたはポリヌクレオチド、ウイルス−細胞、タンパク質−小分子などの結合プロセスを調査することができる。リン脂質支持二重層（例えば卵ホスファチジルコリン）などの生物模倣膜（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用することもでき、これは、その調査が膜タンパク質をプローブとして含むときに特に有用である。
【００２２】
本発明は、候補薬物のプローブ−ターゲット結合に対する効果、すなわちプローブ−ターゲット結合を低減しまたは増強する効果を試験する薬物スクリーニングまたは高スループット・スクリーニングに使用することができる。他のケースでは例えば、生物細胞の表面の受容体または他の分子に結合する能力によって、薬物の効力を試験することができる。
【００２３】
アレイを用いたこの技法の他の使用例には、細胞アレイ、膜または付着したタンパク質を含む、または含まない支持脂質二重層アレイなどが含まれる。当技術分野には、生体分子（例えば核酸、タンパク質および細胞）をアレイ形式の固体支持体に結合させる多くの方法がある。アレイを作製する手段の提供にあたってはかなりの融通性をもたせることができる。この手段には例えば、基板、化学的に誘導体化された基板、およびある種の中間層（例えば当技術分野で周知の自己集合単分子層、ヒドロゲルまたは他の生物適合層）への共有または非共有結合が含まれる。プローブのアイデンティティ（例えばタンパク質構造またはオリゴヌクレオチド配列）を、固体表面全体にわたって場所ごとに変更することもでき、または同じプローブで表面を均一に覆うこともできる。ターゲットは、単一のアイデンティティとし、または異なるアイデンティティを有するターゲットの組合せとすることができる。アレイは、インクジェット印刷、フォトリソグラフィ、マイクロコンタクト印刷、またはアレイ製造分野における当業者に周知の他の任意の方法を含むさまざまな方法で調製することができる。ただしこれらの方法に限定されるわけではない。
【００２４】
非線形光学技法の表面選択性によって、結合プロセスをバルク生物学的成分の存在下でリアルタイムに測定できるので、平衡結合曲線および反応速度を測定することができ、成分のバルク濃度を変更することができ、蛍光ベースの検出で使用される結合していない成分を除去するための「洗浄除去」段階が不要になる可能性がある。
【００２５】
本発明の他の態様では、例えば第二高調波活性分子または粒子としてのＳＨＧ標識を、第二高調波（または和／差周波数）顕微鏡法、共焦点顕微鏡法などの技法を含む細胞、膜、組織の画像化の研究で、特定のプローブ、細胞膜、表面などをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで標識するのに使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ応用では、画像化用または追跡用の蛍光染料と例えば内視鏡とを使用する周知の技法によって、関心のサンプルに標識を送達することができる。
【００２６】
基本波の光源；基本波および非線形光ビームを制御し、集束し、または導くのに必要な光学縦列（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｉｎ）；アレイの設計；検出システム；ならびに格子またはフィルタおよび収集光学部品の使用（ただしこれらに限定されるわけではない）などを含む装置の設計では、幅広い融通性が期待される。発生（照射）または収集モードを変更することができ、これには例えば、エバネッセント波（全反射）の使用、平面導波路、反射または透過型の幾何形状、光ファイバ、近視野照明、共焦点技法、あるいはマイクロキャビティまたは積分検出システムの使用が含まれる。固体表面上のマイクロアレイを走査するいくつかの方法が記述されている。その例には、Ｔｒｕｌｓｏｎ他（１９９８）、Ｔｒｕｌｓｏｎ他（２０００）、Ｓｔｅｒｎ他（１９９７）およびＳａｍｐａｓ（２０００）の米国特許が含まれる。これらの特許の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
第二高調波光ビームは、表面に対して明確に規定された角度をなすので、検出器またはサンプルを機械的に並進させる必要なしに、かつ大規模な収集光学部品なしに、非線形光放射の特性を（例えば２次元アレイ形式上の基本波の入射位置の関数として）読み出すことができる。「ビーム走査」実施形態では、サンプル表面または検出器の機械的並進は必要なく、（固定されたサンプルおよび検出器に対して）サンプルへの基本波の入射方向および／または角度の変更だけが必要であり、装置は、はるかに高速な走査能力、より高い製造平易性およびより長い寿命を提供する。
【００２８】
界面は、シリカ、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、金属、半導体または絶縁体表面、または生物学的成分が吸着または付着することができる任意の表面を含むことができる。界面はさらに、生物細胞およびリポソーム表面を含むことができる。付着または固定は、当技術分野で周知のさまざまな技法によって実施することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９８に記載の技法によって調製することができる。この文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる。例えばタンパク質では、生体分子の表面のアミンに結合するアルデヒドシランで表面を誘導体化することができる（ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０００。その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）。まず最初にＢＳＡ分子層を表面に付着させ、次いでこれをＮ，Ｎ−ジスクシンイミジルカルボナートで活性化することによって、ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）表面を使用することもできる。ＢＳＡ上の活性化されたリシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基は、タンパク質の表面アミンと反応する。
【００２９】
例えば、Ｓａｌａｆｓｋｙ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６（その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）、「ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、Ｇｅｎｎｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｋａｌｂ他，１９９２およびＢｒｉａｎ他，１９８４（その関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているように、膜タンパク質または他の膜会合成分を含む、または含まない支持されたリン脂質二重層を使用することもできる。支持されたリン脂質二重層は当技術分野ではよく知られており、会合膜タンパク質の有無にかかわらずその製造に使用可能な数多くの技法がある。これらの支持された二重層は一般に、空気に触れて破壊されないように水性溶液中に沈めておかなければならない。
【００３０】
固体表面（例えば平らな基板、ビーズなど）を使用する場合には、プローブ−ターゲット相互作用（例えばハイブリッド形成プロセス）の検出を最適化するために、その正味の表面電荷密度を低減しまたは増強させるさまざまな化学反応によってこの表面を誘導体化することができる。
【００３１】
結合プロセスは、小分子、薬物、遮断剤、または結合プロセスを調節する他の成分の存在下で実施することができる。
【００３２】
表面アレイは、当技術分野で知られている複数の方法に従って構築することができる。ＤＮＡマイクロアレイでは、大部分が、３つの非標準方法のうちの１つを使用して調製される（Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎ，１９９８）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のプローブ・アレイは、パターニングされた光誘導コンビナトリアル化学合成を使用して調製され（Ｆｏｄｏｒ，１９９７）、点状アレイは、Ｄｕｇｇａｎ（１９９９）、Ｓｃｈｅｍａ（１９９５）、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９９９）およびＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ（１９９７）に従って製作することができ、インクジェット技法を使用して、適当な基板上での溶液ベースの順次反応によってオリゴヌクレオチドを塩基ごとに合成することができる（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，１９９６）。これらの参照文献の関連部分は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３３】
例えば、核酸、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド・アレイは、米国特許第６１１０４２６号、その関連部分が参照によって本明細書に組み込まれる５，１４３，８５４６，１１０，４２６号、その関連部分が参照によって本明細書に組み込まれる特許第５１４３８５４号、またはＦｏｄｏｒ（１９９１）に従って構築することができる。可溶性タンパク質アレイは、Ｅｋｉｎｓ（１９９９）に従って構築することができる。この文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる。膜タンパク質アレイは、例えばＧｒｏｖｅｓ他（１９９７。この文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）の方法に基づく流動性の脂質膜のマイクロパターニングによって構築することができる。アレイ基板は、ガラス、シリコン、インジウムスズ酸化物、または当技術分野で周知の他の任意の基板から成ることができる。研究中の表面アレイは、化学反応段階の間、要素（およびその生体分子）が互いから分離されたままでいることができるように、要素間に物理障壁を含むことができる。アレイ位置は、異なるプローブ、全て同じプローブ、またはこれらの何らかの組合せから成ることができる。さらに、アレイをプリズムの下面に構築して、ビームの全反射および非線形光のエバネッセント発生を可能にすることができる。あるいは、アレイ基板をプリズムと接触させることができ、この場合にも同じ結果を得ることができる。
【００３４】
さらに、表面アレイとともに電気泳動システムを使用して、例えば、１つまたは複数の位置に試薬または生物学的成分を、フロー・チャネルまたはマイクロキャピラリを使用して提供することができる。例えば、サンプルは、それぞれ互いに異なり、それぞれにターゲット−プローブ反応を起こさせることができる、マイクロキャピラリ・チャネルのアレイを含むことができ、その場合、画像化技法は、それぞれがマイクロキャピラリ・チャネルまたはチャネルによって供給、排出される反応室であるアレイ要素から成るであろう。
【００３５】
基本波および非線形ビームの偏光を偏光光学部品を用いて選択することができる。非線形ビームの強度を基本波および非線形偏光の関数として分析することによって、プローブ−ターゲット複合体についてのより多くの情報（例えばより高い信号対雑音比）を得ることができる。さらに、基本波または非線形光放射の偏光を選択、分析することによって、バックグラウンド放射を低減することができる。
【００３６】
検出は、基本波ビームがアレイ表面と複数の点で接触することを可能にし、これによって発生する非線形光の強度を増大させる複数の内部反射プレートを使用して実施することができる（Ｎ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｃｋ。この文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）。他の代替方法は、一方の面にアレイ表面を有し、一方の端部に非線形光の出力結合を可能にする損失カプラ（ｌｏｓｓｙ  ｃｏｕｐｌｅｒ）有する光学キャビティ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｃａｖｉｔｙ）を構築して、共鳴下で非常に高い強度を蓄積することを可能にするであろう光学マイクロキャビティを作り出し、これによって発生する非線形光の量を増大させる方法である。
【００３７】
非線形活性標識となりうる分子をオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に付着させる多くのリンカー部分および方法があり、これらは以下の参照文献に例示されている：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）（オリゴヌクレオチドの３’チオール基）；Ｓｈａｒｍａ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９（１９９１）（３’スルフヒドリル）；Ｇｉｕｓｔｉ他，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）およびＦｕｎｇ他の米国特許第４７５７１４１号（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）から販売されているＡｍｉｎｏｌｉｎｋ（商標）ＩＩを介した５’ホスホアミノ基）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙの米国特許第４７３９０４４号（３’アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）（アミドリン酸結合を介した付着）；Ｓｐｒｏａｔ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５’メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３’アミノ基）など。これらの文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３８】
合成時にオリゴヌクレオチドに付着させることができる市販のリンカー部分、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）から販売されているものを使用することが好ましい。ローダミンおよびフルオレセイン染料も、ホスホルアミダイト部分で誘導体化した染料を経由した固相合成法の終わりにオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基に都合よく付着する（例えばＷｏｏ他の米国特許第５２３１１９１号およびＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．の米国特許第４９９７９２８号。これらの特許の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
タンパク質アレイを使用して、表面に固定されたプローブ・タンパク質に所与のターゲット・タンパク質が結合するかどうかを判定することができる。これらのアレイは、プローブ・タンパク質に結合する小分子の研究にも使用された。表面に固定されたプローブ・タンパク質に所与のターゲット・タンパク質が結合するかどうかを判定するためのタンパク質アレイは、例えばＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）の方法によって調整することができる。
【００４０】
その上に配列を形成させる支持体は、広範囲の材料、すなわち粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、切片、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物、非生物、有機、無機材料、またはこれらの任意の組合せから構成することができる、基板は、円板、正方形、球、円など、都合のよい任意の形状を有することができる。基板は平らであることが好ましいが、さまざまな代替表面構成をとることができる。例えば、基板は、その上にサンプルを配置する高くなった領域または低くなった領域を含むことができる。基板およびその表面は、その上にサンプルを形成することができる堅い支持体を形成することが好ましい。基板およびその表面はさらに、適当な吸光特性を提供するように選択される。例えば、基板は、重合ラングミュア−ブロジェット膜、官能化されたガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾されたケイ素、あるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、これらの組合せなどの多種多様なゲルまたはポリマーのうちの１つとすることができる。この開示を検討すれば他の基板材料は当業者には明白であろう。好ましい実施形態では、基板は平らなガラスまたはシリカである。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、基板の表面を周知の技法を使用してエッチングして、所望の表面機構を提供する。例えば、トレンチ、ｖ字溝、メサ構造などを形成することによって、入射光の焦点の中に合成領域をより密接に配置することができる。表面はさらに、表面から集めた放射を最大化するために反射「ミラー」構造を備えることができる。
【００４２】
プローブのアイデンティティ（例えばタンパク質構造またはオリゴヌクレオチド配列）を、固体表面全体にわたって場所ごとに変更することができ、または同じプローブで表面を均一に覆うこともできる。ターゲットは、単一のアイデンティティとしてもよく、または異なるアイデンティティを有するターゲットの組合せとしてもよい。
【００４３】
本発明の他の態様では、イオン・チャネル・タンパク質を含む細胞またはリポソームの表面に標識を付着させることができる。標識の非線形特性（例えば超分極率）は細胞またはリポソームの表面電位に敏感である。イオン・チャネルが開き、または閉じ、あるいは他の方法でイオン・チャネルの特性が変化すると、細胞またはリポソームの表面電位は変化することができ、これによって標識の非線形特性が変化し、さらにこれによって検出される非線形放射が変化する。したがって、本発明のこの態様を使用して、例えば、イオン・チャネル受容体（またはイオン・チャネル動作をトリガする他の受容体）へのリガンドの結合を検出することができる。この結合は、薬物、アゴニスト、アンタゴニストなどの存在下で、希望するならばリアルタイムで監視することができる。
【００４４】
固体表面にタンパク質を固定することができる。タンパク質は例えば、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００）の方法を使用して付着させることができる。例えば、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒの方法によってＧタンパク質分子を、誘導体化された表面に固定することができる。このＧタンパク質分子はプローブである。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）タンパク質がターゲットとして使用され、ＩｇＧの溶液をＧタンパク質の表面と接触させる。できればＧタンパク質分子は界面で正味の配向を持つべきである。デコレータは、「ＳＨＧ標識」で予め標識した抗ＩｇＧタンパク質である。「ＳＨＧ標識」は、第二高調波発生を介してデコレータを検出可能にする。標識はオキサゾール染料（Ｓａｌａｆｓｋｙ他、，２０００）、または長いリンカーを有する非中心対称Ａｕ粒子とすることができる。ＩｇＧターゲットがＧタンパク質プローブに結合すると、界面のＩｇＧの量が増大し、界面のＳＨＧ標識の数が増大するので、ＳＨＧ信号の強度も増大する。抗ＩｇＧタンパク質のＳＨＧ標識をリンカーを介して付着させて、ターゲットに結合したときにそれらの配向を最大化することができる。ターゲットが、表面のターゲット−プローブ複合体の集団の中でランダムに配向していたとしても、標識は、リンカーまたはスペーサ分子を使用して非ランダムに配向することができ、これによって、第二高調波発生を介した標識の検出が保証される。界面ターゲットに結びついていないデコレータは等方的に配向し、第二高調波信号を生み出さない。ラングミュア吸着曲線を使用してこの信号を定量的にモデル化して、Ｓａｌａｆｓｋｙ（２０００）がシトクロムｃのシリカへの吸着に関して記述しているように、プローブ−ターゲット複合体の濃度をソフトウェアおよびＰＣを使用して決定することができる。以上の参照文献の関連部分は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
標識の応用には、例えば二光子吸収研究、二光子顕微鏡法、非線形光学顕微鏡法（例えばＳＨＧ顕微鏡法）、非線形光学技法を使用した細胞選別、薬物−受容体相互作用の研究を用いた、界面でのタンパク質−タンパク質結合、細胞表面へのタンパク質またはウイルスの結合、マイクロアレイなどの固体界面でのオリゴヌクレオチド・ハイブリッド形成などが含まれる。
【００４６】
特定の分子または粒子が、非線形活性標識として使用する候補であるかどうかを判定する１つの手段は、空気−水界面での第二高調波発生を使用して分子または粒子を調べることである。例えば粒子の場合、空気−水界面で粒子が、（コヒーレンス長の長さスケールで）粒子の正味の配向を与える方法で集合するのであれば、この粒子の層は第二高調波光を発生させる。これを実施する他の手段は、粒子の懸濁液のサンプルを測定し、超レイリー散乱を検出することである。他の手段はＥＦＩＳＨ（電場誘導性第二高調波発生：ｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｆｉｅｌｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の使用を含む。ＥＦＩＳＨを使用して、候補分子または粒子が非線形活性かどうかを判定することができる。電場誘導性第二高調波（ＥＦＩＳＨ）は非線形光学の分野ではよく知られている。これは、３次の非線形光学効果であり、分極源はＰ（２）（ω３）＝χ（２）（−ω３；ω１，ω２）：Ｅω１Ｅω２と書かれる。この効果を使用し、ｄｃ場を使用して媒質の整列を誘導することによって、溶液中の分子の超分極率を測定することができ、ＳＨＧの観察が可能になる。このタイプの測定では、界面で粒子自体を整列させる必要はないが、粒子が非線形活性であり、したがって非中心対称である必要がある。
【００４７】
標識の使用が有効となりうるサンプルの例には、固定されたタンパク質、オリゴヌクレオチドまたは細胞を有する固体表面、および支持されたリン脂質二重層が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。さまざまな表面幾何形状を使用することができ、実際、球形ビーズおよび他の非平面幾何形状は一般に非線形光学技法を用いてアクセス可能である。
【００４８】
本発明の重要な一態様では、界面での（すなわちプローブに結合したときの）ターゲットの配向が標識の配向にあまり影響しないように、標識をターゲットに結合するリンカーの使用を十分に長くすることができる。発生する非線形光の強度は界面の標識の正味の配向によって決まり、また、界面のターゲットの配向は制御が難しいことがある（ターゲットが界面でランダムに配向する可能性さえある）ので、ターゲットの配向が標識の配向を必ずしも決定しないように、リンカーの使用によって標識をターゲットから十分に離すことができる。これがあまり重要でない場合、例えば、ターゲットに提示される膜タンパク質の配向が一般に均一となる、ガラス上に支持された脂質二重層中の必須膜タンパク質では、リンカーのこの態様はあまり重要でない。とはいえ、ほとんどの場合に、標識をターゲットに結合するためにリンカーは依然として必要である。
【００４９】
さらに、基板に結合させた細胞を使用して、タンパク質−細胞結合、ウイルス−細胞結合などを判定することができる。この場合、細胞がプローブ成分であり、タンパク質、ウイルスなどがターゲット成分である。次のセクションでは、固体基板に細胞を結合させる周知の技術について論じる。
【００５０】
表面選択的非線形光学技法の使用を含まないさまざまな技術が本発明にとって関連のある部分を含み、以下の例示的なリストおよびそれらの参照文献は本明細書で参照される：走査および走査の分析に関するＫｉｎｇ他の米国特許第５６３３７２４号；走査に適したレーザ・アレイを生み出すためのレーザの多重化に関するＦｏｒｋ他の米国特許第６１２１９８３号；Ｆｏｓｔｅｒの米国特許第５４８５２７７号；付着したプローブのアレイを含む基板、ならびにプローブとターゲットの間の結合反応の速度論的特性および平衡特性を決定するための走査の分析に関するＦｏｄｏｒ他の米国特許第５３２４６３３号およびＦｏｄｏｒ他の米国特許第６１２４１０２号；基板のレーザ走査に関するＫａｉｎ他の米国特許第５８４７４００号；出力増強用の光学共振キャビティ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃａｖｉｔｙ、光共振器）に関するＫｉｎｇ他の米国特許第５４３２６１０号；光ファイバ・ベースの装置に関するＷａｌｔ他の米国特許第５３２０８１４号、Ｗａｌｔ他の米国特許第５２５０２６４号、Ｗａｌｔ他の米国特許第５２９８７４１号、Ｗａｌｔ他の米国特許第５２５２４９４号、Ｗａｌｔ他の米国特許第６０２３５４０号、Ｗａｌｔ他の米国特許第５８１４５２４号、Ｗａｌｔ他の米国特許第５２４４８１３号；画像化およびソフトウェア・ベースの画像分析に関するＦｉｅｋｏｗｓｋｙ他の米国特許第６０９５５５５号；データ取得に関するＳｔｅｒｎ他の米国特許第５６３１７３４号；共焦点画像化技法に関するＳｔｉｍｓｏｎ他の米国特許第６１３４００２号；ＣＣＤベースの画像化技法に関するＳａｍｐａｓの米国特許第６０８４９９１号；表面に付着したプローブのフォトリソグラフィ調製に関するＳｔｅｒｎ他の米国特許第５６３１７３４号；表面に付着したプローブを生み出す方法および装置に関するＳｈａｌｏｎ他の米国特許第６１１０４２６号；位置ベースの走査技法に関するＳｌｅｔｔｎｅｓの米国特許第６０４０５８６号；表面のプローブ−ターゲット結合を画像化する方法に関するＴｒｕｌｓｏｎ他の米国特許第６０２５６０１号。
【００５１】
細胞マイクロアレイ
このセクションでは、本発明を使用した研究になじみやすいアレイの一タイプである生物細胞のアレイを表面に製作することに関係する方法のいくつかを概観する。他の応用向けのマイクロパターニングされた均一な細胞アレイを、例えば光化学レジスト−フォトリソグラフィを使用して製作する多くの方法が記載されている（Ｍｒｋｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２５：５５−７８，１９９６）。このフォトレジスト法によれば、ガラス・プレートにフォトレジストを均一にコーティングし、このフォトレジスト・コーティングの上にフォト・マスクを置いて、所望の「アレイ」またはパターンを画定する。露光後、マスクをしなかった領域のフォトレジストを除去する。フォトリソグラフィによって画定した表面全体に、露出したガラスの領域とフォトレジストで覆われた領域の両方に結合する有機シランなどの疎水性物質を均一にコーティングする。次いでガラス表面からフォトレジストを剥ぎ取り、露出したガラス・スポットから成るアレイを露出させる。次いで、末端親水基またはアミノ基などの化学反応可能な基を有する有機シランでガラス・プレートを洗浄する。疎水性有機シランは露出したガラスのスポットに結合し、結果として生じるガラス・プレートは、疎水性表面の全体に（最初のフォトレジストの領域に位置する）親水性または反応可能なスポットのアレイを有する。親水基から成るスポットのアレイは、ニューロン起源の細胞を含むある種の細胞を非特異的に非共有結合させる基板を提供する（Ｋｌｉｅｎｆｅｌｄ他，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：４０９８−４１２０，１９８８）。同様に、２つの異なるタイプの組織を有するパターニングされる表面を生み出すために、シリコン・ウェーハの表面で反応性イオン・エッチングが使用された（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ他，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３７：６５３，１９８０；Ｃｒａｉｇｈｅａｄ他，Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：３１６，１９８２；Ｓｕｈ他，Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ  ３８２：１９９，１９８３）。
【００５２】
特異的であるが非共有結合性の相互作用に基づく他の方法では、フォトレジスト・スタンピングを使用して、タンパク質吸着性アルカンチオールでコーティングされた金表面を生み出す（Ｓｉｎｇｈｖｉ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：６９６−６９８，１９９４）。次いで、むきだしの金表面を、タンパク質の吸着に抵抗するポリエチレン末端アルカンチオールでコーティングする。表面全体を、細胞外基質に見られる細胞結合性タンパク質であるラミニンに暴露した後に、ラミニンがコーティングされた島状領域に生きた肝細胞を均一に付着させ、そこで増殖させる（Ｓｉｎｇｈｖｉ他，１９９４）。強い非共有結合性の金属キレート化を含む加工を使用して、特定のタンパク質のパターンで金表面をコーティングした（Ｓｉｇａｌ他，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：４９０−４９７，１９９６）。この場合には、金表面を、ニトリロ酢酸を末端に持つアルカンチオールでパターニングする。むきだしの金の領域をトリ（エチレングリコール）でコーティングして、タンパク質吸着を低減させる。Ｎｉ２＋を追加した後、ヒスチジン・タグを付けた５つのタンパク質の特異吸着が速度論的に安定であることが分かった。
【００５３】
パターニングされた基板上の反応可能な位置にタンパク質などの特定の分子を化学的に架橋することによって、より特異的な均一な細胞結合を達成することができる（Ａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：１４４−１４８，１９８１）。別の基板パターニング加工によって、反応可能なスポットのアレイを光学的に生み出す。ガラスに化学吸着する有機シランでガラス・プレートを洗浄してガラスをコーティングする。この有機シラン・コーティングに深ＵＶ光を、アレイのパターンを画定する光学マスクを通して照射する。この照射によってＳｉ−Ｃ結合が切断され、反応性のＳｉラジカルが形成される。水と反応させるとＳｉラジカルは極性のシラノール基を形成する。極性のシラノール基がアレイ上のスポットを構成し、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５３２４５９１号の開示のように、これをさらに修飾して、反応可能な他の分子をスポットに結合させる。例えば、遊離のアミノ部分などの生物学的に官能性の基を含むシランを、シラノール基と反応させることができる。この遊離のアミノ基を次いで、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質などの生体分子の共有結合性付着部位として使用することができる。表面の自己集合単分子層を使用して、哺乳動物細胞の表面への接着をパターニングする他の方法には、Ｌｏｐｅｚ他，１９９３およびＳｔｅｎｇｅｒ他，１９９２が含まれる。
【００５４】
細胞の表面と相互作用することが知られているレクチンの、反応性アミノ基を介したガラス基板への非パターニング共有結合性付着が示されている（Ａｐｌｉｎ  ＆  Ｈｕｇｈｅｓ，１９８１）。均一な細胞アレイを支持体上に形成するこの光学的方法では、フォトレジスト法よりも方法段階が少なくて済み、要する時間も短い（２段階のみ）が、高価な光源による高強度の紫外線の使用が必要となる。
【００５５】
これらの全ての方法では、生化学的に特異的な分子をマイクロパターニングされた化学的アレイに均一に結合させるため、結果として生じる細胞アレイが均一である。フォトレジスト法では、細胞が、親水性スポットおよび／またはスポットに付着した特定の分子のアレイに結合し、これらが細胞に結合する。したがって細胞はアレイの全てのスポットに同じように結合する。光学的方法では、細胞が、遊離アミノ基のスポットのアレイに接着によって結合する。さまざまな細胞タイプを同じ基板に付着させて、これらの細胞タイプに対して同時に結合を実施する方法も存在する。
【００５６】
ペプチド核酸
代替実施形態では、例えばペプチドに似た主鎖が荷電してない主鎖で置き換えられた、核酸の類似体であるペプチド核酸またはオリゴマーを、本発明で使用することができる。ＰＮＡは当技術分野でよく知られている。下記の参照文献は、ＰＮＡを表面に付着させ、これと配列相補的なＤＮＡまたはＲＮＡと結合させる表面およびアレイ・ベースのハイブリッド形成を含む広範囲の応用におけるこれらの核酸類似体の使用の広範な概説を与える。
【００５７】
例えば、ＤＮＡオリゴマーの代わりにＰＮＡオリゴマーを、表面に付着したプローブ成分として使用することができる。ＰＮＡを使用する主な利点は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡなどのハイブリッド形成で見られるよりも電荷斥力がずっと小さいため、例えば（荷電したリン酸基を含む）ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリッド形成反応がイオン強度に強く依存しない（例えば融解温度）ことである。したがって、表面選択的非線形光学技法を使用して、所望のイオン強度でのプローブ−ターゲット・ハイブリッド形成を追跡することができる。
【００５８】
ＰＮＡは市販されており（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、または他のＤＮＡ類似体を合成し使用することもできる。
【００５９】
以下の参照文献はＰＮＡの使用の幅広い概説である。
【００６０】
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Ｗａｎｇ ”ＤＮＡ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （ＰＮＡ） ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｌａｙｅｒｓ． Ａ ｒｅｖｉｅｗ” Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １３ （１９９８） ７５７−６２；
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Ｌａｚｕｒｋｉｎ， Ｙ．Ｓ． ”Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ” Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３ （１９９９） ７９−８３；
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【００６１】
以下の参照文献は、ＰＮＡプローブを固体表面に付着させる手段を含む、アレイ・ベースの検出におけるＰＮＡの使用法の説明である。
【００６２】
Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． ”Ｌｏｗ ｓｃａｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｒｒａｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ” Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｃ． Ａｍ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ．， １５ｔｈ （１９９９） ２３３−２３４；
Ｍａｔｙｓｉａｋ， Ｓ．， Ｈａｕｓｅｒ， Ｎ．Ｃ．， Ｗｕｒｔｚ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｏｈｅｉｓｅｌ， Ｊ．Ｄ． ”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ａｎｄ ｓｐａｃｅｒ／ｌｉｎｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ＰＮＡ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８ （１９９９） １２８９−１２９１。
【００６３】
デコレータ
本発明の他の態様では、「デコレータ」分子または粒子を使用して、プローブ−ターゲット結合反応を検出する。デコレータ分子または粒子は超分極率を持ち、これらを使用して、プローブ−ターゲット結合相互作用を、表面選択的非線形光学技法（例えば第二高調波発生）によって、ターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体、あるいはターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体を識別する他の種に対してデコレータが持つ特異的な結合親和性を通して、明らかにすることができる。この技法は、プローブまたはターゲットがあまり非線形光学活性でない（例えば超分極率を持たない）ときに有用である。デコレータは超分極率を本来的に持つことができるか、または非線形光学活性（例えば第二高調波活性）である部分でそれ自体を標識することができる。デコレータは、プローブ−ターゲット結合プロセス中に存在させることができ、または結合が生じた位置を明らかにするために後になって加えることができる。デコレータ分子または粒子は、ターゲット成分を含む溶液または水相中に溶解または懸濁させることができる。ただしデコレータ分子または粒子は、ターゲット−プローブ反応を大幅に変化させてはならず、またはターゲット−プローブ反応に大きく関与してはならない。
【００６４】
本発明の一例は、マイクロアレイとして、すなわちパターニングされた形態で固体基板に固定され、または固体基板の表面全体に均一に固定されたタンパク質のケースである。タンパク質組成は表面の位置ごとに異なるか、またはどの位置でも同じである。所与の位置、位置Ａにタンパク質Ｐ（プローブ）を固定する。タンパク質Ｋ（ターゲット）はタンパク質Ｐに結合して、複合体ＫＰを形成する。さらに、「ＳＨＧ」標識が付着したデコレータ・タンパク質Ｑは、タンパク質Ｋに対する特異的結合親和性を有する。固定されたタンパク質Ｐを有する基板を、ターゲット（Ｋ）を含む溶液に導入する。Ｋが表面に結合していないときには小さなバックグラウンドＳＨＧ信号が存在する。ＫがＰに結合すると、固体表面のデコレータＱ（およびＳＨＧ標識）は（それによって部分的に配向し）、その量が増大し、それによってＳＨＧ光学信号の強度が増大する。さらに、Ｋ−Ｐ結合反応（例えば平衡定数）を調節する薬物、アンタゴニスト、アゴニストまたは他の任意の化合物の存在下で、同じタイプの測定を実施することができる。この測定は必要ならばリアルタイムで実施することができる。さらに、デコレータＱは、プローブＰを含む表面にＫを導入した後に溶液に加えることができる。
【００６５】
本発明の重要な他の使用法は、ＤＮＡまたは他の核酸あるいは核酸類似体の結合の検出である。表面、例えば光ファイバの遠位端のミクロスフェア・ビーズに１本鎖プローブを固定する。未知または既知のターゲット鎖のプール中の、所与のプローブ配列に配列相補的なターゲットの量を調べることは興味深い。プローブおよびターゲット鎖は１本鎖であり、それらの結合複合体は２本鎖である。このケースでは、ＤＮＡの内部にインターカレートし、または主鎖リン酸に静電的に結合し、あるいはその両方を実行する非線形活性（例えば第二高調波活性）デコレータを使用することができる。例えば、１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡの間のインターカレーション結合を識別することができるＳＨ活性インターカレータは所望の影響を生み出し、相補ターゲットがプローブに結合すると、固体表面のＳＨ活性インターカレータの量が増大し、それによって光学ＳＨ信号も増大する。他の例では、ＳＨ活性デコレータが、１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡに静電的に結合する。結合した複合体に対する表面のデコレータの数は、１本鎖プローブに対するデコレータの数よりも多くなる。これは、２本鎖プローブ−ターゲット複合体と結合したデコレータとの相互作用に使用可能なリン酸基がおよそ２倍あるからである。デコレータは、第二高調波活性であるなど非線形光学活性を持ち、同時に、例えばインターカレーション、静電的相互作用などによって核酸と特異的に相互作用することができる（親和性を有する）単一の部分から成ることができる。デコレータはあるいは、１つの部分がＳＨ活性であり、他の部分が核酸に対する親和性を持つ、３つ以上の部分から成ることができる。
【００６６】
例えば、ＤＮＡにインタカレートし、またはＤＮＡに静電的に結合し、あるいはその両方を実行することができる周知の分子は以下のとおりである。
【００６７】
ソラレン
臭化エチジウム
メタンホスホナート
ホスホルアミダイト
ヨー化プロピジウム
アクリジン
アクリジンオレンジ
９−アミノアクリジン
スクシンイミジルアクリジン−９−カルボキシラート
クロロキン
ピリン
エキノマイシン
４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール・二塩化水素化物（ＤＡＰＩ）
一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）
トリピロールペプチド
フラボピリドール
ピロニンＹ
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８
ビスベンゾイミド。
【００６８】
このリストは例示的なものであり、範囲を限定しようとするものではない。ＳＨ活性部分は、合成有機化学分野における当業者が使用可能な周知の手段によって、上に挙げた任意の化合物に連結し、共有結合し、または他の方法で結合して、核酸に対する特異性と非線形光学活性の両方を有するデコレータ化合物を生み出すことができる。ＳＨ活性部分または核酸親和性部分のために本来的に蛍光デコレータでないデコレータを使用することも望ましい。
【００６９】
定義
本明細書の全体を通じて使用される以下の用語は、以下の一般的な定義を有する。
【００７０】
１．相補的：２種の生物学的成分の相互作用表面間のトポロジー的および化学的適合性、例えばリガンド分子とその受容体の間のそれについて言う（当技術分野では時に「分子識別」とも呼ばれる）。したがって、受容体とそのリガンドは相補的であると言うことができ、さらに、これらの接触体の表面特性は互いに相補的である。
【００７１】
２．生物学的（成分）：この用語は、生物学で遭遇する天然に生じる、または修飾された任意の粒子または分子、あるいはプローブおよびターゲットを含む、生物学研究で使用される分子および粒子を含む。これらの例には、生物細胞、タンパク質、核酸、抗体、受容体、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、リポソーム、ポリヌクレオチド、および他の成分、例えば薬物、毒素、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチドなどが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００７２】
３．リガンド：リガンドは、特定の受容体によって識別される分子である。本発明とともに使用することができるリガンドの例には、細胞膜受容体のアンタゴニストまたはアゴニスト、毒素および毒液、ウイルスのエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物（例えばアヘン剤、ステロイドなど）、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質およびモノクローナル抗体が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００７３】
４．受容体：所与のリガンドに対して化学親和性を有する分子。受容体は天然に生じる分子、または人造分子であることができる。さらに、これらは変更されていない状態で、または他の生物学的成分との集合体として使用することができる。受容体は、共有または非共有結合によって、直接にまたは特異的な結合物質を介して、結合相手に付着することができる。本発明で使用することができる受容体の例には、特異的な抗原決定基（例えばウイルス、細胞または他の物質の表面の抗原決定基）、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜および細胞小器官と反応する、抗体、細胞膜受容体、モノクローナル抗体および抗血清が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。当技術分野では受容体が時にアンチリガンド（ａｎｔｉ−ｌｉｇａｎｄ）と呼ばれる。本明細書で用語「受容体」を使用するとき、その意味に違いはない。２つの巨大分子が分子識別を介して結合して複合体を形成するときには「リガンド受容体対」が形成される。
【００７４】
本発明が調べることができる受容体の他の例には以下のものが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。
【００７５】
ａ）微生物受容体：受容体に結合する、特異的な輸送タンパク質、酵素などの微生物の生存に不可欠なリガンドの決定は、新しい種類の抗生物質の開発に有用である。特に、日和見性の真菌類、原生動物、および現在使用されている抗生物質に耐性を有する細菌に対する抗生物質は有益であろう。
【００７６】
ｂ）酵素：例えば、神経伝達物質の開裂を司る酵素などの酵素の結合部位も受容体の１種である。ある種の受容体に結合して、さまざまな神経伝達物質を開裂させる酵素の作用を調節するリガンドの決定は、神経伝達障害の治療に使用することができる薬物の開発に有用である。
【００７７】
ｃ）抗体：例えば、本発明は、関心の抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位を調べるのに有用である。抗原エピトープをまねた配列の決定は、免疫原がこのような配列のうちの１つまたは複数に基づくワクチンの開発につながり、または、自己免疫疾患などの治療（例えば「自己」抗体の結合の阻止）に有用な関連診断薬または化合物の開発につながる可能性がある。
【００７８】
ｄ）核酸：核酸配列を合成して、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合配列を確立することができる。
【００７９】
ｅ）触媒性ポリペプチド：１種または数種の反応物の１種または数種の生成物への変換を含む化学反応を促進する能力を有するポリマー、好ましくはポリペプチド。このようなポリペプチドは一般に、少なくとも１種の反応物または反応中間体に特異的な結合部位、および結合部位のすぐ近くにあって、結合した反応物を化学的に修飾する能力を有する活性な官能基を含む。触媒性ポリペプチドは例えば米国特許第５２１５８９９号に記載されている。この特許は、あらゆる目的に関して参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８０】
ｆ）ホルモン受容体：ホルモン受容体の例には例えば、インスリンおよび成長ホルモンの受容体が含まれる。高い親和性で受容体に結合するリガンドの決定は、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を和らげるために実施しなければならない毎日の注射を経口投与に置き換える方法、および他のケースでは、死体から、または組換えＤＮＡ技術によってしか得ることができない不足しがちなヒト成長ホルモンを置換する方法の開発に有用である。他の例は、血管収縮ホルモンの受容体である。受容体に結合するリガンドの決定は、血圧をコントロールする薬物の開発につながる可能性が高い。
【００８１】
ｇ）アヘン剤受容体：脳内のアヘン剤受容体に結合するリガンドの決定は、モルヒネおよび関連薬物をより常習性の低い薬物に置換する方法の開発に有用である。
【００８２】
ｈ）イオン・チャネル・タンパク質または受容体、あるいはイオン・チャネル受容体を含む細胞。
【００８３】
５．表面選択的：この用語は、（アレイ、基板、溶液、生物学的成分などを含む）非中心対称表面だけが、対称性によって、非線形光を発生させることができる、第二高調波発生、和／差周波数発生などの非線形光学技法を指して言う語である。
【００８４】
６．アレイまたはマイクロアレイ：その上の１つまたは複数の既知の位置に、１種または数種の生物学的成分が構築された基板または固体支持体を指す。これには、２次元マイクロアレイおよびパターニングされた他のサンプルが含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。しばしば用語「アレイ」と相互交換可能に使用される当技術分野の他の用語には、遺伝子チップ、遺伝子アレイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ、タンパク質チップ、マイクロアレイなどが含まれる。マイクロアレイとは、アレイの要素（付着したプローブを含むパターニングされた領域）の寸法がミクロン程度であるアレイのことである。
【００８５】
７．標識：分子、粒子または相（例えば脂質二重層）をより非線形光学活性にするためにこれらに（共有結合または非共有結合によって）付着させることができる非線形活性の部分、粒子または分子を指す。標識は、分子または粒子に予め付着され、結合または反応しなかった標識は、測定を実施する前に標識された実体から分離される。ＥＦＩＳＨ（電場誘導性第二高調波発生：ｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｆｉｅｌｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）または超レイリー散乱を使用して、候補分子または粒子が非線形活性であるかどうかを判定することができる。電場誘導性第二高調波（ＥＦＩＳＨ）は非線形光学の分野ではよく知られている。これは、３次の非線形光学効果であり、分極源はＰ（２）（ω３）＝χ（２）（−ω３；ω１，ω２）：Ｅω１Ｅω２と書かれる。この効果を使用し、ｄｃ場を使用して媒質の整列を誘導することによって、溶液中の分子の超分極率を測定することができ、ＳＨＧの観察が可能になる。これは時に再配向機構と呼ばれる。
【００８６】
８．リンカー：２つの異なる対象を（通常は共有結合を介して）化学的に連結する働きをする分子。リンカーを使用して、例えばターゲットを非線形活性粒子または部分に、ターゲットを誘導体化された非線形活性粒子に、表面層をターゲットに、表面層を非線形活性粒子または部分に、結合することができる。リンカーは例えば、同種二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）または異種二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋分子、ビオチン−ストレプトアビジン結合などである。ビオチン−ストレプトアビジン結合ではビオチンが２つの対象の一方に付着し、ストレプトアビジンが他方に付着する。例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｆｌｕｋａ社などから、多くのリンカーが市販されている。技術分野によっては、同じ意味を持つ「テザー（ｔｅｔｈｅｒ）」、「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）」または「架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）」という用語も使用されている。
【００８７】
９．要素：「アレイ」または「マイクロアレイ」とともに使用されるとき、この用語は、アレイ表面の複数の位置のうちの特定の位置を意味する。それぞれの要素は、固体支持体または基板の表面に形成された有限の面積を持つ分離された領域である。
【００８８】
１０．非線形：本明細書では、（基本波と呼ばれる）入射光ビームの周波数を変換することができる光学技法について言う。非線形ビームは、このような変換によって生じる高次周波数ビーム、例えば第二高調波などである。第二高調波発生、あるいは和または差周波数発生では、非線形ビームがコヒーレントに生成される。第二高調波発生（ＳＨＧ）では、基本ビームの２つの光子が界面によって事実上散乱して、第二高調波の１つの光子を生み出す。本明細書ではこれを、非線形光学または表面選択的非線形（光学）とも言い、あるいはこれらのさまざまな組合せを使用する。
【００８９】
１１．プローブ：本明細書では、表面（例えば固体基板、細胞表面、リポソーム表面など）に付着し、あるいは例えばサンプル・セル中のある媒質に遊離して懸濁した表面を有する細胞、リポソーム、粒子、ビーズまたは他の成分である、生物学的成分（例えば細胞、タンパク質、ウイルス、リガンド、小分子、薬物、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）を指す。（当技術分野のいくつかの文献ではこの用語が、プローブに対する結合を試験する遊離の成分を指す）。
【００９０】
１２．ターゲット：本明細書では、プローブの表面または付着したプローブを含む表面に結合しておらず、プローブに結合することができる生物学的成分を指す。
【００９１】
１３．付着：本明細書では、例えば、固体基板、細胞表面、リポソーム表面、ゲル基板などに対するリンカー分子の使用を含む共有または非共有結合手段を介して、ある表面に付着するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製され、または操作された生物学的成分について言う。あるいは、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの）細胞膜、組織、器官に埋め込まれた天然の膜受容体の例のように、表面に自然に「付着」したプローブが見いだされている。本明細書のいくつかの例では、語「付着」が、ターゲットまたはデコレータへの標識の化学的または物理的付着についても使用される。本明細書ではさらに「表面に付着した」のようにも使用される。
【００９２】
１４．中心対称：全ての原子の反転（ｘ，ｙ，ｚ）→（−ｘ，−ｙ，−ｚ）を実行しても分子または物質が変化しない点（「中心」または「反転中心」）が空間内に存在する場合、その分子または物質相は中心対称である。非中心対称分子または物質はこの反転中心を欠いている。例えば、分子が均一な組成を有し、形状が球体または立方体である場合、それは中心対称である。中心対称分子または物質は、第二高調波、和周波数および差周波数発生に必要な非線形感受率または超分極率を持たない。
【００９３】
１５．核酸類似体：なんらかの方法で天然の核酸として機能することができる非天然核酸。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、天然核酸のリン酸主鎖ではなくペプチド様の主鎖を有するので、非天然核酸である。ＰＮＡは、塩基対の相互作用を介して、天然の核酸とハイブリッドを形成することができる。核酸類似体の他の例は、塩基対がある方法で非天然である類似体である。
【００９４】
１６．デコレータ：ターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体の検出およびこれらの間の識別を可能にするために、ターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体に結合することができる（超分極率を有する）非線形活性の分子または粒子を指す。デコレータは、ターゲット−プローブ反応自体をあまり変化させてはならず、またはターゲット−プローブ反応自体に関与してはならない。デコレータは、ターゲット成分を含む溶液または水相中に溶解または懸濁させることができる。ターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体に対するその特異的な結合親和性によって、デコレータはＳＨ活性標識から区別される（Ｊ．Ｓ．Ｓａｌａｆｓｋｙの「ＳＨ−ｌａｂｅｌｓ．．．」という名称の同時係属出願）。当技術分野では（Ｊ．Ｓ．Ｓａｌａｆｓｋｙ  Ｋ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌの「ＳＨＧ  ｌａｂｅｌｓ．．．」という名称の同時係属出願）、特異的な化学結合または非特異的な（例えば静電的）手段によってＳＨＧ標識を生物学的成分に付着させ、次いでこれを使用して、その成分を界面まで追跡する。デコレータを使用して、ターゲット、プローブまたはターゲット−プローブ複合体に対するその特異的な結合親和性（他の技術では「分子識別」と言う）によって、プローブ−ターゲット複合体を検出することができる。
【００９５】
１７．結合親和性または親和性：プローブとターゲットなどの結合相手間の結合複合体（親和性）の形成につながる、結合相手との間の特異的な物理化学的相互作用。結合反応は、結合相手との間の結合エネルギー強度の尺度である平衡定数によって特性づけられる。結合反応における特異性とは、プローブ−ターゲット結合がランダムにどの物質とも生じるのではなく、相当程度に特定の結合相手とだけ生じることを意味する。例えば、タンパク質免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はＧタンパク質に関して特異的な結合親和性を有し、他のタンパク質に対する親和性はそれよりも小さいか、または全くない。ある技術分野では、成分間の結合親和性を記述するのに用語「分子識別」が使用される。
【００９６】
１８．荷電または電荷：本明細書では、電場中で粒子または分子に移動性（速度）を与える前記粒子または分子の正味の電荷と定義される。正味の電荷は、核酸主鎖のリン酸基、タンパク質のアミノ酸残基の側鎖、膜脂質または細胞膜中の脂質頭基などの分子部分の一部であることができる。電荷は正または負であり、電荷は、粒子または分子が所与の向き（正電位から負電位への方向）の電場中に置かれた場合に前記粒子または分子の移動性の方向を決定するであろう。当業者には周知のとおり、電荷は、電荷の基本単位（ｑ≒１．６×１０−１９Ｃ）の非整数倍、または電荷の基本単位の分数、いわゆる「部分電荷」であることができる。
【００９７】
１９．双極：本明細書では、粒子または分子上に電気双極子または「双極子モーメント」を持つことと定義され、これは、当業者に周知の標準の定義をとる：全てのベクトルの和μ＝Ｑ・Ｒ。上式で、Ｑは、粒子または分子内の特定の空間位置（直角座標ｘ，ｙ，ｚ）での電荷（正電荷または負電荷）の量であり、Ｒは、基準原点（ｘ，ｙ，ｚ）から正味の電荷Ｑを指すベクトルである。これらのベクトルの和が非ゼロ・トレース（得られるベクトルのｘ、ｙ、ｚ成分の和）を有するベクトルである場合、粒子または分子は双極子モーメントを持ち、電気的に双極である。
【００９８】
２０．電気的中性：本明細書では、粒子または分子の正味の電荷（正電荷と負電荷の和）がゼロであることと定義され、その結果、電場中での前記粒子または分子の移動性（速度）はあまりないと考えられる。
【００９９】
２１．超分極率または非線形感受率：非線形光の発生を可能にする分子、粒子、界面または相の特性。第二高調波発生の非線形相互作用を記述する一般式は、α（２）（２ω）＝β：Ｅ（ω）・Ｅ（ω）またはＰ（２）（２ω）＝χ（２）：Ｅ（ω）・Ｅ（ω）である。上式で、αおよびＰはそれぞれ、周波数２ωで振動している誘導された分子および巨視的双極子であり、βおよびχ（２）はそれぞれ、超分極率および第二高調波（非線形）感受性テンソルであり、Ｅ（ω）は、周波数ωで振動している入射放射の電界成分である。巨視的非線形感受率χ（２）は、顕微的な超分極率βの配向平均によって関係づけられる。和または差周波数発生では、駆動電場（基本波）が異なる周波数（すなわちω１およびω２）で振動し、非線形放射は、和または差周波数（ω１±ω２）で振動する。超分極率、２次非線形分極率および非線形感受率という用語は時に相互交換可能に使用されるが、非線形感受率は一般に、物質あるいは化学相または界面の巨視的非線形活性を指す。本明細書で使用される用語「非線形活性」も、１つまたは複数の入射放射ビームによって駆動されたときに非線形光放射を生成する分子、粒子、界面または相の能力の一般的な特性を指す。
【０１００】
２２．分極：空間領域内の単位体積（または面積）あたりの正味の双極子。分極は時間依存または時間固定であることができる。分極は∫μ（Ｒ）ｄＲで定義され、界面に近い空間ｄＲ内の全ての体積要素について正味の双極子の積分が実施される。
【０１０１】
２３．放射：本明細書では、非線形光学効果の発生に使用する基本波ビーム、基本波によって生み出される非線形光学ビームを含む、電磁放射または光を指す。本明細書では「波」、「信号」または「非線形信号」、「ビーム」、「光」と言うこともある。
【０１０２】
２４．近視野（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ）技法：回折限界距離またはそれよりも短い距離で、横方向の解像度で表面または基板上の光放射を測定し、または画像化することができることが当技術分野で知られている技法。近視野技法（または近視野画像化）の例には、（蛍光、第二高調波発生などからの）光放射が表面に非常に近い点に集められるＮＳＯＭ（近視野走査光学顕微鏡法：ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が含まれる。
【０１０３】
２５．検出：本明細書で非線形光学方法に言及するときに、これは、表面選択的非線形光放射の特性を使用し、非線形光学光の特性（例えば強度、波長、分極または電磁放射に共通の他の特性）を用いて、プローブ−ターゲット相互作用の特性または影響を検出し、測定し、または関連づけることができる技法について言う。
【０１０４】
２６．界面：本発明の目的上、界面は、非線形光学信号が発生する領域、または正味の配向を持った標識された非線形活性ターゲットが存在する、表面近くの領域と定義することができる。界面はさらに、２つの表面、すなわち異なる媒質と接触した表面（例えば水性溶液と接触したガラス表面、緩衝液と接触した細胞表面）、異なる物理的または化学的特性の２つの媒質間の接触に近い領域などから成ることができる。
【０１０５】
２７．コンジュゲート、結合：本明細書では、ある粒子、部分または分子が、第２の粒子部分、分子、表面または基板に化学的に結合し、共有または非共有結合によって連結し、あるいはなんらかの手段によって付着した状態を指す。これらの付着手段は、静電気力、共有結合、非共有結合、物理吸着、化学吸着、水素結合、ファンデルワールス力、または結合エネルギーでプローブを基板に保持する他の任意の力によるものとすることができる（この定義に対する推論（ｃｏｒａｌｌｅｒｙ）は、基板によって保持されたプローブを基板から分離するのに何らかの力が必要であることである）。
【０１０６】
２８．反応：本明細書では、プローブ、ターゲット、阻害剤、小分子、薬物、アンタゴニスト、抗体などを含む化学的、物理的または生物学的反応を指す。ただしこれらに限定されるわけではない。本明細書では用語「反応の影響」または「前記反応の影響」が、プローブ−ターゲット反応の物理的または化学的影響を指す。例えば、プローブ−ターゲット反応は、イオン・チャネルの開放および細胞の表面電荷密度の変化につながるリガンド−受容体結合反応を含むことができ、細胞の表面電荷密度の変化が次いで非線形光学技法によって検出される。プローブ−ターゲット反応の影響、またはプローブ−ターゲット反応自体を、ある技術分野では「第２のメッセンジャー」反応と呼ぶことがある。本明細書では「相互作用」とも言う。
【０１０７】
２９．表面層：本明細書では、固体支持体の表面を官能基によって誘導体化する化学層を言う。例えば、表面化学基を、誘導体化層によって、誘導体化剤の特定の化学官能基に従って変更することができる。パワー非線形活性標識（下記参照）を生み出す「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」として使用される固体の場合、固体表面を誘導体化して、非線形活性部分または粒子、あるいはターゲットに提示することができる異なる化学官能基を生み出すことができる。例えば、負に荷電したシラノール基を表面に有するシリカ・ビーズを、有機シラン試薬によって、アミン反応性表面、アミン含有表面などに変換することができる。
【０１０８】
３０．送達、照明、収集：光放射（例えば光ビーム）の操作の文脈において、送達および照明は、界面または界面の関心領域に基本波ビームを誘導することを指し、収集は、界面で生み出された非線形光（例えば第二高調波光）の光学的収集を指す。
【０１０９】
３１．阻害剤、阻害：本明細書では、ターゲットと競合してプローブに結合する部分、分子、化合物または粒子を指す。阻害化合物、分子または粒子の存在下でプローブ−ターゲット相互作用は低減され、または妨げられる。本明細書では、用語「遮断剤」が、プローブ−ターゲット相互作用（例えばプローブとターゲットの間の結合反応）を妨げる化合物、分子、部分または粒子を指す。
【０１１０】
３２．アゴニスト：本明細書では、受容体に結合したときに細胞内応答を活性化する部分、分子、化合物または粒子を指す。
【０１１１】
３３．アンタゴニスト：本明細書では、細胞表面のアゴニストと同じ部位の受容体に競合的に結合するが、（例えばアゴニストの結合によって）活性化された受容体によって開始される細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストまたは部分アゴニストの細胞内応答を阻害することができる部分、分子、化合物または粒子と定義される。アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストが存在しない条件でのベースライン細胞内応答を減弱させない。
【０１１２】
３４．部分アゴニスト：本明細書では、細胞表面の受容体に結合したときに細胞内応答を、アゴニストがするよりも小規模に活性化する部分、分子、化合物または粒子と定義される。
【０１１３】
３５．相互作用：本明細書では、サンプル内の成分間のある物理的または化学的反応、あるいは相互作用と定義される。相互作用は例えば、プローブとターゲットの間の物理化学的結合反応、２つの分子間の双極子−双極子引力または斥力、２つの原子または分子種間のファンデルワールス相互作用、化学親和性相互作用、分子間の共有結合、分子間の非共有結合、静電的相互作用（斥力または引力）、水素結合などである。
【０１１４】
３６．影響：本明細書では、プローブ−ターゲット相互作用の測定可能な特性、または相互作用の結果（例えば二次反応、イオン・チャネルの開閉など）と定義される。これには例えば以下のような特性が含まれる。
【０１１５】
ｉ）非線形光または基本光の強度
ｉｉ）非線形光または基本光の波長またはスペクトル
ｉｉｉ）（例えば画像化用の）表面または基板上の基本光の入射位置
ｉｖ）  ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の時間経過
ｖ）  ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）またはｉｖ）の１つまたは複数の組合せ。
【０１１６】
３７．時間経過：本明細書では、光の強度、光の波長などのある測定可能な実験的特性の時間変化を言う。また、例えばあるプローブ−ターゲット相互作用またはあるプローブ−ターゲット−他成分相互作用の「速度論」を指す。
【０１１７】
３８．明確に規定された：「明確に規定された方向」の文脈では、基板からの光（基本または非線形ビーム）の画定的な（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ）散乱を指す。対照的に、例えば蛍光放射はいくぶんランダムな方向に発射される。
【０１１８】
３９．サンプル：サンプルは、本発明によって研究中のプローブ、ターゲット、あるいは他の分子、粒子または部分をその中に含む。サンプルは、非線形光学光を発生させる能力を有する少なくとも１つの界面を含み、前記界面は、付着したプローブを含む少なくとも１つの表面から成る。サンプルの構成要素の例には、プリズム、ウェル、マイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、基板、ターゲットを含む緩衝液、緩衝液中の薬物、プローブが付着した表面が含まれる。本明細書では用語「基板」と用語「表面」がしばしば相互交換可能に使用される。いくつかのケースでは、用語「支持体」が「表面」を意味すると解釈することができる。
【０１１９】
４０．モジュレータ、調節：本明細書ではこの用語が、プローブ−ターゲット相互作用（例えば結合反応）の速度論的特性または平衡特性に影響を与える任意の物質、部分、分子、生物学的成分または化合物を指す。モジュレータは、プローブ−ターゲット結合の速度およびプローブ−ターゲット結合の平衡定数を変化させ、あるいは一般に、プローブ−ターゲット相互作用を強化しまたは低減させる。モジュレータの例は以下のようなものである：阻害剤、薬物、小分子、アゴニストおよびアンタゴニスト。
【０１２０】
全体スキーム
本発明を使用してプローブ−ターゲット相互作用またはその影響を測定する全体スキームは以下のとおりである。
【０１２１】
ｉ）第二高調波光の発生を経験することができる光でサンプルを照明する。プローブまたはターゲット、あるいはその両方が存在しない状況では、第二高調波光の強度および／またはスペクトル、ならびに／あるいは第二高調波光の強度またはスペクトル、あるいはその両方の時間経過が、バックグラウンドまたはベースラインの働きをすることができる。
【０１２２】
ｉｉ）プローブ、ターゲット、プローブおよびターゲット、薬物など、またはプローブ−ターゲット相互作用またはその影響を調節することができる他の成分を（同時にまたは別々に）混合し、その結果生じる第二高調波光の強度および／またはスペクトルを測定する（または時間の関数として、すなわち時間経過として測定する）。この測定された情報は、所望の相互作用の信号の働きをする。
【０１２３】
ｉｉｉ）測定された情報の直接光学リードアウトを実施し、または任意選択で測定された情報をモデル化して、例えばプローブ−ターゲット相互作用の速度論的特性または平衡特性を、遮断剤、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストなどの有無に関わらず決定することができる。
【０１２４】
好ましい実施形態
本発明の好ましい一実施形態では、アミン反応性オキサゾール染料（ＳＥ）１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−イル）ピリジニウムブロミド（ＰｙＭＰＯ，ＳＥ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を、モル比１：１のエチレンジアミンと、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の指示に指定された条件下で反応させ、反応を完了させる。オキサゾール・ベースのこの染料は単一のアミン基を含む。この生成物を次いで、オリゴヌクレオチドの５’−リン酸末端と、架橋剤ＥＤＡＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のプロトコルに従って反応させ、染料とオリゴヌクレオチドの間にアミドリン酸結合を形成させる。あるいは、オリゴヌクレオチドを化学合成する場合には、アミン基を５’−末端に組み込み、これを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社が公表しているプロトコルに従ってＰｙＭＰＯ，ＳＥと直接に反応させることができる。
【０１２５】
ＤＮＡマイクロアレイは市販品を購入し、または公開文献（例えばｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って構築することができる。使用する界面化学は、Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）に出ているものであり、この中では、融解石英スライド上の自己集合単分子層シラン・フィルムにオリゴヌクレオチドを付着させている。シラン化は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを介して実施する。標識されたターゲットに対するハイブリッド形成は、従来技術、例えばＲａｍｓａｙ，Ｇ．ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ−ｓｔａｔｅｓ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６（１），４０−４４；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．；Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ−ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６（１），２７−３１；Ｓ．Ａ．Ｆｏｄｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（１９９７），３９３；Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（１９９５），４６７、およびこれらの中に含まれる参考文献に出ている標準プロトコルを使用して達成する。
【０１２６】
ＤＮＡマイクロアレイ・チップをｘ−ｙ並進ステージに載せ、これを、パーソナル・コンピュータによって（ＰＣ制御）、モータ付並進装置（Ｏｒｉｅｌ社から入手）、または当技術分野の多くの手順の１つ（例えばＶ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を使用して駆動する。
【０１２７】
図１に本発明の非線形光学装置を示す。例えば８００ｎｍ、８０ＭＨｚ、サブ１００ｆｓパルス、平均電力＞０．５Ｗで動作するフェムト秒パルス・レーザ（５）（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社）を基本光源として使用する［あるいは、１０Ｗアルゴン・イオン・レーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ社）を使用して、Ｔｉ：サファイヤ発振器（Ｌｅｘｅｌ社）をポンピングし、フェムト秒またはピコ秒の光パルスを生み出すことができる］。任意選択で、二分の一波長板（１０）（Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ社、１６ＭＬＢ７５１）を使用して基本波の偏光を選択し、レンズ（１５）によって、基本光は通過させるが、非線形光（例えば第二高調波）は遮断するように設計されたカラー・フィルタ（２０）（ＣＶＩ社、ＬＰ７８０）上に焦点をぴったりと合わせる。このパス・フィルタは、干渉フィルタ、カラー・フィルタなどとすることができ、その目的は、第二高調波光がレーザ空胴に入って、レイジング特性の外乱を引き起こさないようにすることである。次いで基本波をミラー（２５）で反射させ、サンプル表面（３０）の特定の位置に特定の角度で入射させる。基板表面でのビームの直径は約１００ミクロンである。ミラー（２５）は、検流計制御のミラー・スキャナ、回転ポリゴン・ミラー・スキャナ、ブラッグ回折器、音響光学デフレクタ、またはミラーの位置を制御できる当技術分野で周知の他の手段を使用して走査する。例えば、サンプル表面への基本光の入射角および方向を、調整可能な精密ミラー・マウントおよびポリゴン・ミラーの使用によって、圧電ミラー・マウント１７ＡＳＭ００１（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ社）およびミラー０２ＭＬＱ０１１／００３（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ社）を使用し、ステッパ駆動モータ（１７ＰＣＳ００１および１７ＰＣＣ００１Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ）およびＰＣ制御によってそれを駆動して、周知の方法で変化させることができる。検流計ミラーまたはＰＣ制御が可能な他の任意のビーム偏向光学部品を使用することができる。例えば、閉ループ・サーボ制御システムを使用して正確な位置合せ制御を達成する１６ビット・ガルボ・ポジショナ（ｇａｌｖｏ  ｐｏｓｉｔｏｎｅｒ）が、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ社およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から販売されている。
【０１２８】
シリカ・サンプル表面（３０）は、第二高調波ビームを発生させる表面上の特定の位置を選択するために、（スタック型直線ステージ（Ｎｅｗｐｏｒｔ社ＰＭ５００−Ｌ）から作られたコンピュータ制御の）ｘ−ｙ並進ステージ（３５）上に載せられている。図１には乾燥サンプルが示されているが、サンプル表面は、液体または緩衝液と接触した封入表面とすることもできる。第二高調波ビームの強度は、パルスの時間幅に関係する基本波のピーク電界強度を含む、いくつかの因子に依存する。したがって、「高速」ミラーまたはレンズを使用してパルスの分散を最小化することが重要である。基本波および第二高調波ビームはシリカ表面から、明確に規定された方向に散乱する。そのため、蛍光が等方的に発射される蛍光検出を用いる場合とは違って、第二高調波光を集める光学部品が最小限で済む。カラー・フィルタを使用して基本光を除去して、第二高調波光だけを残す。
【０１２９】
第二高調波をミラー（４０）（例えばＭｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ社の０１ＭＦＧ０３３／０２３）で反射させ、パス・フィルタ（４５）（ＣＶＩ社のＢＧ３９）に送って第二高調波を通過させ、基本波を遮断し、必要ならば偏光光学部品（５０）によってその偏光を選択し、レンズ（５５）を使用して、モノクロメータ（ＣＶＩ  Ｌａｓｅｒ社のＣＭ１１０）および光電子増倍管（ＰＭＴ）（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ９２８ＰまたはＲ２６５８Ｐ、電源Ｃ３８３０）（６０）にビームを集束させる。ＰＭＴ光電流を、光子計数ユニット（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｃ３８６６）に供給する。このユニットは信号を識別し、ＰＭＴからの光電子パルスを５Ｖディジタル信号に変換する。この信号は、ＰＣ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｍ７８２４）の光子計数ボードに供給され、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェアおよびドライバを使用して制御される。ビームの直径はマイクロアレイの１つの要素と同じ程度であり、走査ミラーの位置および制御ＰＣへのフィードバック・ループからビームのＸＹ位置を決定することができ、非線形光の強度対マイクロアレイ表面位置のマップを決定することができる。同じ方法で、アレイ内の単一の領域のリアルタイム・データを得、または領域間の前後走査によってある時間にわたって同じ領域をサンプリングすることもできる。このようにして、マイクロアレイ内の任意の領域または全ての領域の強度画像およびその時間依存性を得ることができる。検出器が固定され、入射角および方向、ならびにステージ位置が与えられると、非線形ビームは表面に関して明確に規定された方向を有するので、反射ミラーの位置を使用して、照明されているアレイの領域を決定することができる。あるいは、ＣＣＤアレイ検出器を使用することもできる。並進ステージまたはミラー・スキャナ、あるいはその両方を制御し、それらの位置を、ＣＣＤアレイのフォトダイオード要素の測定された信号に関連づけることが、米国特許第６０８４９９１号に開示されている。
【０１３０】
ステージを並進させ、または基本光の入射位置を変化させ、あるいはこれらを組み合わせることによって、アレイ表面全体の第二高調波強度の画像を構築する、すなわちＬａｂｖｉｅｗ（Ｌａｂｖｉｅｗ社）などの標準ソフトウェア・プログラムを使用してアレイ内の異なる領域または要素に第二高調波光の強度を割り当てることができる。第二高調波強度の平方根は、プローブとハイブリッドを形成した標識されたターゲットの濃度に比例する。
【０１３１】
代替実施形態
代替実施形態では、マイクロアレイを、プローブを含む界面での全反射を可能にするプリズムと接触させ、このようなプリズムに付着させ、またはこのようなプリズム上に直接にパターニングすることができる。したがって、このモードでは、基本波ビームがプローブを含む界面で全反射を受け、そのエバネッセント波を使用して非線形光を発生させる。図２にこのタイプの実施形態を示す。図２では、屈折率整合材料または液体（７５）を使用して、ターゲット（８５）を含む溶液と接触したマイクロアレイ（８０）を含む基板にプリズム（７０）を結合させる。全反射は、材料（８０）と溶液（８５）の界面で起こる。プリズムの材料は例えばＢＫ７型のガラス（Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ社）とすることができ、屈折率整合材料はＣｏｒｎｉｎｇ社またはＮｙｅ社から市販されている。
【０１３２】
代替実施形態では、実験装置が、Ｓａｌａｆｓｋｙ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，２０００およびその参考文献に記載されたとおりである。フェムト秒パルス・レーザ（Ｍａｉｌ−Ｔａｉ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を、８０ＭＨｚ、＜２００ｆｓパルス、平均パワー１Ｗで動作する８００ｎｍの基本光源として使用する。テフロン・ホルダの中に装着され、溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）または蒸留水と接触したドーブ・プリズム（Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、ＢＫ−７）の入口開口に、凹レンズ（Ｏｒｉｅｌ社）（スポット・サイズ〜１ｍｍ２）を用いてレーザ・ビームを集束させる。ビームは、プリズムの中で全反射（エバネッセント波の発生）を経験し、基本波ビームと第二高調波ビームはほぼ共線的（ｃｏｌｌｉｎｅａｒｌｙ）に出口開口から出てくる。カラー・フィルタを使用して、基本光を遮断し、第二高調波をモノクロメータ（２ｎｍバンド幅のスリット）に通過させる。モノクロメータを３８０〜５００ｎｍから走査して、第二高調波スペクトルを検出する。必要ならば、基本光の波長も同様に調整することができる。単光子計数検出器および光電子増倍管を使用してモノクロメータの出力を検出し、ＰＣおよびソフトウェアを使用して、データを記録し、モノクロメータの波長を制御する。バックグラウンドの第二高調波信号を測定する。
【０１３３】
代替実施形態では、固体基板に平らな導波路構造１１０を使用する（図３）。この実施形態では、ＴｉＯ２、Ｔａ２Ｏ５などの薄い高屈折率材料層１１５（導波路）を、基板１１０（一般にガラス）の上面に付着させる。細い回折格子１１５をこの導波路にけがき、レーザ１００からの光をこの格子を使用して導波路に結合する。第二高調波光は、レンズおよびフィルタを使用して集め、ＰＭＴ型の装置またはＣＣＤカメラを用いて検出することができる。
【０１３４】
図４ａ〜４ｃに、プローブ−ターゲット反応を実施するフロー・セルの一実施形態を示す。フロー・セル３２２０が詳細に示されている。図４ａは正面図、図４ｂは断面図、図４ｃはキャビティの背面図である。図４ａを参照する。フロー・セル３２２０はその表面４２０２にキャビティ３２３５を含む。キャビティの深さは例えば約１０から１５００μｍの間とすることができるが、他の深さを使用することもできる。キャビティの表面積は一般にプローブ・サンプルのサイズよりも大きく、例えば約１３×１３ｍｍとすることができる。入口ポート４２２０および出口ポート４２３０がキャビティと連絡している。いくつかの実施形態では、これらのポートが約３００から４００μｍの直径を有し、キャビティ内の温度を制御するために、それぞれ管４２２１および４２３１を介して冷却循環浴に結合される。冷却浴は、指定された温度の水をキャビティ内に／で循環させる。
【０１３５】
キャビティを残りのフロー・セル本体から熱的に分離するためにキャビティの周囲に複数のスロット４２０８を形成することができる。フロー・セルの熱質量が低減するので、キャビティ内の温度はより効率的かつ正確に制御される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、実質的に平らな表面を有するパネル４２０５が、キャビティを２つのサブキャビティに分割する。パネル４２０５は例えば、ＲＧ１０００ｎｍロング・パス・フィルタなどの吸光ガラスである。可視スペクトル全体にまたがるＲＧ１０００ガラスの高い吸光度（７００ｎｍ未満の波長でＲＧ１０００の表面放射率は検出できない）は、入射波長によって励起される可能性があるバックグラウンドルミネセンスを実質的に抑制する。吸光ガラスの磨かれた平らな表面はさらに、入射光の散乱を低減し、入射波長の迷光をフィルタリングする負担を軽減する。ＤＮＡハイブリッド形成実験または他の化学反応で一般的な高塩類環境での腐食を比較的に受けにくいので、このガラスはさらに、キャビティの再分割用の耐久性のある媒質を提供する。
【０１３７】
パネル４２０５は、複数のねじ、クリップ、ＲＴＶシリコーン・セメントまたは他の接着剤によってフロー・セルに装着することができる。図４ｂを参照すると、入口ポート４２２０および出口ポート４２３０を含むサブキャビティ４２６０が、パネル４２０５によって密封されいる。したがって、冷却浴からの水はキャビティ３２３５から分離されている。この設計によって、化学反応を実施するキャビティと温度制御用のキャビティとが分離される。温度制御用のキャビティは反応キャビティのすぐ下にあるので、反応の温度パラメータがより効果的に制御される。
【０１３８】
基板１３０は表面４２０２と対合し、キャビティ３２３５を密封する。基板をフロー・セルに対合させたときに、基板上のプローブ・アレイがキャビティ３２３５の中に含まれることが好ましい。いくつかの実施形態では、基板とフロー・セルの間の対合を改善するために、Ｏリング４４８０または他の密封材料を提供する。より大きな密封断面積の使用によってキャビティの容積を増大させることなく対合を改良できるように、任意選択で、パネル４２０５の縁４２０６を面取りする。いくつかの例では、温度、化学物質の濃度などの反応パラメータをより正確に制御するために、キャビティ容積をできるだけ小さく維持することが望ましい。さらに、容積が小さいほど実験を実施するのに必要な材料の量が少なくて済むので、廃棄物を減らすことができる。
【０１３９】
再び図４ａを参照する。任意選択で表面４２０２に溝４２１１を形成する。溝は例えば、深さ約２ｍｍ、幅２ｍｍとすることができる。一実施形態では、基板を表面４２０２に装着したときに、溝４２１１が基板によって覆われる。溝は、チャネル４２１３と、真空ポンプに接続された真空管継手４２１２とに連絡している。真空ポンプは溝の中に真空を生み出し、それによって基板が表面４２０２に接着する。フロー・セルと基板の間の密封を改良するために、任意選択で、１つまたは複数のガスケットを取り付けることができる。
【０１４０】
図４ｄに、フロー・セルに基板を対合させる代替技法を示す。パネル４２９０をフロー・セルに装着すると、パネル４２９０は、これらの間に位置する基板１３０を固定する十分な力を発揮する。パネル４２９０は例えば、複数のねじ４２９１、クリップ、クランプ、ピンまたは他の装着装置によって装着することができる。いくつかの実施形態ではパネル４２９０が、サンプルを入射光に対して露出する開口４２９５を含む。任意選択で開口４２９５を、ガラスあるいは他の実質的に透明または半透明の材料で覆うことができる。あるいはパネル４２９０を、実質的に透明または半透明の材料から構成することもできる。
【０１４１】
図４ａを参照すると、パネル４２０５が、サブキャビティ３２３５と連絡したポート４２７０および４２８０を含む。ポート４２７０には管４２７１が接続され、ポート４２８０には管４２８１が接続されている。管４２７１および４２８１は、コネクタ４２２２によってそれぞれ管４２２１および４２３１の中に挿入されている。コネクタ４２２２は例えば、それぞれの開口４２２３にシール４２２５が配置されたＴコネクタとすることができる。シール４２２５は、冷却浴の水がコネクタから漏れることを防ぐ。ポート４２２０および４２３０に類似した追加のポートを提供するなど、他の構成を使用できることを理解されたい。
【０１４２】
管４２７１および４２８１は、選択された流体をキャビティに導入し、またはキャビティの中で循環させることを可能にする。いくつかの実施形態では、管４２７１および４２８１をポンプに接続して、キャビティの中の流体を循環させることができる。一実施形態では、管４２７１および４２８１が、キャビティの中の流体を攪拌し循環させる撹拌システムに接続される。
【０１４３】
図４ｃを参照する。任意選択で、フロー・セルの表面４２０３に溝４２１５を形成する。溝の寸法は例えば深さ約２ｍｍ、幅２ｍｍとすることができる。一実施形態によれば、表面４２０３を並進ステージに対合させる。フロー・セルが並進ステージに対合すると、溝４２１１は並進ステージによって覆われる。溝４２１５は、チャネル４２１７と、真空ポンプに接続された真空管継手４２１６とに連絡している。ポンプが溝４２１５の中に真空を生み出し、それによって表面４２０３が並進ステージに接着する。対合力を増大させるために、任意選択で、追加の溝を形成することができる。あるいは、フロー・セルを、ねじ、クリップ、ピン、さまざまなタイプの接着剤または他の固定技法によって並進ステージに装着することができる。
【０１４４】
他の代替実施形態では、図５に示すように、ビーズ、細胞、リポソームまたは他の物体の懸濁液がプローブ（１３０）であり、またはこのような懸濁液がそれに付着したプローブを含む。このようなサンプル、例えばそれぞれの個々のビーズまたは他の物体がほぼコヒーレンス長であるか、またはそれよりも離れている等方性サンプルからの非線形散乱光は、ある強度分布を持ってあらゆる方向に生成される。基本光は懸濁液（１３０）を透過し、非線形放射が集められる。非線形散乱光を集めるいくつかのモードが使用可能である。例えば、第二高調波の収集は、前進方向で（図５Ａ）、基本光に直角に（図５Ｂ）、または積分球法を使用して（図５Ｃ）実施することができる。図５Ｃに、サンプル１５０が内側に置かれた積分球１６５を示す。基本光（１４５）は入口ポート（１７０）から中に入り、サンプル（１５０）を通過し、球壁で反射され、バッフル（１７５）によって止められる。散乱した第二高調波光は球面から出口ポート（１５５）を通して集められ、光ファイバ線（１６０）によって球の外部に結合される。ビーズは、（例えば膜タンパク質を含む）リン脂質二重層を支持することができ、またはタンパク質、核酸などのプローブをビーズの表面に付着させることができる。ビーズは、サンプル中に分散した大量の表面積を提供し、基本光および非線形光を透過モードで使用するときには特に、平面幾何形状に代わる有用な代替表面となりうる。
【０１４５】
代替実施形態（図６）では、さまざまな光学部品を使用して、励起光が、点のような形状からある別の形状に変形される。例えば、点のような形の基本波ビームを、サンプル表面の走査に有用な線の形に変形することができる。しかし、非線形ビームの強度は主として基本波の強度に依存する（一般に基本波強度に対する二次依存）ため、この変換によって、所与の位置で発生する非線形光の強度が低下する。基本波（一般に直径〜２ｍｍの丸い点とすることができる）の形状を線の形にするためには、従来技術において周知のとおりに、また米国特許第５８３４７５８号に詳細に開示されているように、基本波ビームを、倍率約１０倍の顕微鏡対物レンズ、続いて１５０ｍｍアクロマートに導いて、ビームを平行にする。図６に示すように、基本光１８０は一般に直径２〜３ｍｍのビームである。このビームを顕微鏡対物レンズ１８５に導く。この対物レンズは１０倍の倍率を有し、ビームを約３０ｍｍまで拡大する。ビームは次いでレンズ１９０を通過する。このレンズは１５０ｍｍアクロマートとすることができ、このレンズがビームを平行にする。拡大された平行ビームの半径方向の強度は一般にガウス・プロファイルを有する。ビーム強度の変動を最小化するため、レンズ１９０の後に、ビームの上部および下部をマスクし、それによってビームの中心部分だけを通過させるマスク１９５を挿入することができる。一実施形態では、このマスクが約７．５ｍｍの水平バンドを通過させる。その後、ビームを、水平円柱軸を有する円柱レンズ２００に通す。このレンズは、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ社製の１００ｍｍｆ．ｌ．とすることができる。円柱レンズはビーム・スポットを垂直に拡大する。あるいは、双曲面レンズを使用してビームを垂直に拡大し、平坦化された半径方向の強度分布を得ることもできる。円柱レンズからの光はレンズ２０５を通過する。レンズ２０５に向かって励起光を反射させるため、任意選択で、円柱レンズの後ろに平面ミラーを挿入することができる。ビーム高約１５ｍｍを達成するため、円柱レンズ２００とレンズ２０５の焦点距離の比はおよそ１：２であり、これによってビームは約１５ｍｍに拡大される。いくつかの実施形態では８０ｍｍアクロマートであるレンズ２０５は、励起光を、サンプル表面２１０で約１５ｍｍ×５０ミクロンの線に集束する。
【０１４６】
図７に示す代替実施形態では、２次元アレイの形態にパターニングされたプローブ（図７Ａ、表面のアレイの上面図）および標識されたターゲットを使用して結合を検出する。表面のアレイのそれぞれの領域、この例では｛１，３５｝は、異なるオリゴヌクレオチドまたはタンパク質配列（あるいは同じ配列および異なる配列の組合せ）とすることができる。図７Ｂに、ターゲット（２２５）を含むウェル（２１５）の中のサンプル表面（２２０）の側面図を示す。ここではターゲットが、第二高調波活性標識（Ｘ）を付着させたタンパク質として示されている。ウェルは液体または緩衝液を保持することができ、基板の他の部分または基板アレイ中の他の要素からウェルの内容物を物理的に分離する働きをする。基本光を多重化し、その結果得られるそれぞれのビームを個々のミラーによって誘導して、アレイ内の異なる列または領域を同時に走査することができ、これによって高スループット研究に対するこの技法の可能性をよりいっそう高めることができる。
【０１４７】
代替実施形態では、Ｌｅｖｉｃｋｙ他の方法またはＬ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ他の方法を使用して、プローブＤＮＡを基板に付着させる。図８に示したＣｈｒｉｓｅｙの方法では、融解石英または酸化ケイ素基板（２３０）を使用し、これを、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＥＤＡ）（２３５）で誘導体化する。一実施形態では、ＥＤＡで修飾したこの表面を、次いで、異種二官能性架橋剤（ＳＭＰＢ）で処理する。ＳＭＰＢは、そのスクシンイミド・エステル部分がＥＤＡ（２４０）の第一アミノ基と反応する。続いて、塩基対配列（ｘｚｚｙ）（「ｘｚｚｙ」は配列全体を表す）のチオール−ＤＮＡオリゴマー（２４５）がＳＭＰＢ架橋剤のマレイミド部分と反応して、共有結合した図示の種（２５０）を与える。
【０１４８】
代替実施形態では、表面アレイの要素が図９に示すように物理的に分離され、異なるターゲット、ターゲット溶液などを、任意の要素または全ての要素に選択的に追加することができる。図９Ａは、異なるウェル領域、この例では１６個のウェルを分離する仕切りまたは壁（２６０）を有する基板（２５５）の上面図である。図９Ｂは、プローブ（２７０）が付着したウェル（２６５）の側面図を示す。このようなアレイは、９６ウェル・プレートなど、当技術分野でも一般に見られ、市販されている（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社など）。
【０１４９】
代替実施形態では、ガラス基板表面を銀などの反射性金属の層でコーティングすることができる。この金属層は、非線形光の発生および収集量を増大させる。金属層の表面に構築した誘導体化された層に生体分子または他の粒子を付着させることができる。例えば、この金属層を、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の層、次いで３−アミノ−オクチル−トリメトキシシランなどのアミノシランの層でコーティングすることができる。次いで、このアミノシラン層に、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端をアミノ基に接続するリンカーを使用して付着させることができる。あるいは、オリゴまたはポリヌクレオチドをアミノシラン層に吸着させることもできる。図１０に、ガラス基板（２７５）がＡｇ層（２８０）で誘導体化された、このタイプの一実施形態を示す。続いて、銀層（２８５）の表面に薄いＳｉＯ２層を付着させ、アミノシラン（２９０）で誘導体化する。
【０１５０】
代替実施形態では、光ビーム（例えば基本波および第二高調波）が全反射を経てファイバの経路に沿って伝わる、ビーズ・ベースの光ファイバ・アレイを使用することができる（参照文献３４）。基本光を光ファイバ束または個々の光ファイバに結合し、先端の表面で第二高調波光を発生させ、発生した第二高調波光を再びファイバを通して集める。この実施形態では、ＤＮＡプローブを遠位の先端に付着させ（参照文献１７，１８）、または光ファイバのクラッドを取り除き、コアの外側にＤＮＡプローブを付着させる（参照文献１９〜２２）ことによって、個々の光ファイバをＤＮＡセンサに変えることができる。複数のファイバを物理的に束ねることによって、このような光ファイバから単純なＤＮＡアレイを作ることができる（参照文献２３）。このテーマには数多くの変形があり、例えば、遠位端のクラッドを選択的にエッチングして、ファイバの遠位端にさまざまな深さのウェルを形成する（参照文献２４）。この場合には、ファイバの先端がウェルの底を構成する。次いで、ラテックス・ビーズまたはシリカ・ビーズをウェルに装てんすることができる（参照文献２５）。ＤＮＡプローブをミクロスフェアに付着させ、次いで、異なるＤＮＡプローブを担持したミクロスフェアをそれぞれのウェルに充てんすることによって、光ファイバ・オリゴヌクレオチド・アレイを調製することができる。プローブを付着させる前または後に、異なるそれぞれのタイプのミクロスフェアに、蛍光染料またはＤＮＡプローブの一意の組合せの標識を付ける（参照文献２６、２７）。さらに、汎用製造用の「ジップ・コード（Ｚｉｐ  ｃｏｄｅ）」（参照文献２９）および無標識検出用の分子ビーコン（参照文献２８、３０）を、光センサ・ビーズ・アレイとともに使用することができる。図１１に光ファイバ束アレイを示す。図１１Ａは、ビーズ（３００）を配置するためのウェルを遠位端に有する光ファイバ・ケーブル束（２９５）を示す。図１１Ｂは１本の光ファイバの拡大図を示す。基本光（ｗ）は、ビーズ（３０５）を有する遠位端に向かって伝わる。一部の基本光は、第二高調波光（２ｗ）とともにビーズから後方へ散乱し、再びファイバを通って近位端まで伝わり、そこで、光学縦列／検出システム（図示せず）が基本波放射を第二高調波放射から分離する。ビーズ（３１０）は付着したプローブで覆われている。
【０１５１】
代替実施形態では、図１の非線形放射の検出器（６５）が、単光子計数モードで動作する光電子増倍管である。光電流パルスは、モデルＳＲ４４５高速前置増幅器およびモデルＳＲ４００識別器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社供給）を使用して電圧変換し、増幅し、識別にかけ、次いで計数器（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社供給のモデル３６１５  Ｈｅｘ  Ｓｃａｌｅｒ）に送ることができる。光子計数器のゲーティングとＤＡＣ出力（モデル３１１２、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社によって供給されている１２ビットＤＡＣ）を介した検流計制御とを、ディジタル遅延／パルス発生器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社供給のモデルＤＧ５３５）を使用して同期させることができる。ＰＣコンピュータ２９との通信は、パラレル・レジスタ（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社供給のモデルＰＲ−６０４）、ＣＡＭＡＣコントローラ・カード（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社供給のモデル６００２）、およびＰＣアダプタ・カード（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社供給のモデルＰＣ−００４）を使用して実施することができる。
【０１５２】
代替実施形態では、バンドパス、ノッチまたはカラー・フィルタをいずれかのビーム経路または全てのビーム経路（例えば基本波、第二高調波など）に配置して、例えば、より広いスペクトル幅またはより大きな光スループットを可能にする。
【０１５３】
代替実施形態では、基本波または非線形光学ビームを通過させ、または遮断するために、干渉、ノッチパス、バンドパス、反射またはアブソーバント（ａｂｓｏｒｂａｎｔ）フィルタを、図のフィルタの代わりに使用することができる。
【０１５４】
他の実施形態によれば、光電子増倍管または他の光電検出器の代わりに電荷結合検出器（ＣＣＤ）を使用して、非線形光学光の検出を達成する。ＣＣＤサブシステムは、コンピュータに取り付けられたデータ取得ボードと通信し、これによって制御される。データ取得ボードは、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｂｏａｒｄｓ社によって製造されているＣＩＯ−ＤＡＳ１６／Ｊｒなど、当技術分野で周知のタイプのボードとすることができる。データ取得ボードおよびＣＣＤサブシステムは例えば以下のように動作する。ＣＣＤサブシステムにクロック信号を送ることによって、データ取得ボードがＣＣＤの積分周期を制御する。一実施形態では、ＣＣＤサブシステムがＣＣＤの積分周期を４０９６クロック周期にセットする。クロック・レートを変更することによって、ＣＣＤがデータを積分する実際の時間を操作することができる。
【０１５５】
積分周期の間に、それぞれのフォトダイオードが、到達した光の量に比例した電荷を蓄積する。積分周期の終わりに、電荷はＣＣＤのシフト・レジスタへ移され、新しい積分周期が始まる。シフト・レジスタは電荷を、ＣＣＤアレイに入射した光パターンを表す電圧として蓄積する。この電圧は次いで、クロック・レートでデータ取得ボードに伝送され、そこでディジタル化されてコンピュータの記憶装置に記憶される。このようにして、それぞれの積分周期の間にサンプル・ストリップが画像化される。その後、サンプルの走査が完了するまで次の列が積分される。
【０１５６】
代替実施形態では、プローブとターゲットとの結合を遮断しまたは低減する薬物、アンタゴニスト、アゴニストまたは他の種の発見に関心が寄せられる。これらの化合物は「阻害剤」と呼ばれることがある。この応用では、標識されたターゲットを界面でプローブに結合させる。サンプルに阻害剤を加え、試験中のこの特定の種が、プローブ−ターゲット結合の遮断または低減に成功した場合には、測定される非線形光学光が変化する。この実施形態のバックグラウンド放射はターゲット−プローブ結合によるものであり、阻害剤によって界面のプローブからターゲットが追い出されると、測定される非線形光学光が、例えば界面によって生み出された非線形放射の強度の低下、または非線形放射スペクトルの波長シフトとして変化する。
【０１５７】
代替実施形態では、これを実施するために、モノクロメータ、フィルタまたは他の波長選択装置を使用して非線形放射（例えば第二高調波放射）を２つ以上のスペクトル点または帯で測定することによって、サンプルの非線形スペクトルを測定する。
【０１５８】
代替実施形態では、非線形光放射をスペクトル分解するため、装置の検出部品の前にモノクロメータ（６０）を配置することができる（図１）。
【０１５９】
代替実施形態では、核酸またはＰＮＡマイクロアレイは市販品を購入し、または公開文献（例えばｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って構築することができる。使用する界面化学は、Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．他（１９９６）に出ているものであり、この中では、融解石英スライド上の自己集合単分子層シラン・フィルムにオリゴヌクレオチドを付着させている。シラン化は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランを介して実施する。
【０１６０】
他の実施形態では、光誘導合成（Ｆｏｄｏｒ他，１９９７）または化学合成（例えばＣｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．，１９９６）によって、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡを固体基板に付着させることができる。
【０１６１】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡの表面またはマイクロアレイ・マイクロアレイは市販品を購入し、または公開文献（例えばｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って構築することができる。
【０１６２】
ＤＮＡマイクロアレイは市販品を購入し、または公開文献（例えばｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に従って構築することができる。使用する界面化学は、Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．他（１９９６）に出ているものであり、この中では、融解石英スライド上の自己集合単分子層シラン・フィルムにオリゴヌクレオチドを付着させている。シラン化は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびＨｏｈｅｉｓｅｌ，Ｊ．Ｄ．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａｎｄ  ｓｐａｃｅｒ／ｌｉｎｋｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ＰＮＡ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８（１９９９）１２８９−１２９１によって、ガラスまたはシリカ上で実施する。ＰＮＡオリゴヌクレオチドと接触する緩衝液または溶液は、当技術分野で周知のものの中から選択することができる。ハイブリッド形成および洗浄液は当技術分野で知られている。例えばウェブ・サイト：ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓには、プローブ−ターゲット・ハイブリッド形成の詳細な説明が出ている。
【０１６３】
マイクロアレイをｘ−ｙ並進ステージに載せ、これを、パーソナル・コンピュータによって（ＰＣ制御）、モータ付並進装置（Ｏｒｉｅｌ社から入手）、または当技術分野の多くの手順の１つ（例えばＶ．Ｇ．Ｃｈｅｕｎｇ他，１９９９）を使用して駆動することができる。
【０１６４】
代替実施形態では、従来技術で使用されている膜インターカレーション染料の代わりにＳＨＧ標識された成分（標識されたリガンド、受容体など）を使用して、従来技術で記載されている画像化技法（Ｐｅｌｅｇ，１９９９またはＣａｍｐａｇｎｏｌａ他）を実施することができる。これらの画像化技法およびＳＨＧ標識された成分を使用して、固体表面、細胞表面または他の界面を画像化することができる。
【０１６５】
代替実施形態では、プローブが付着した基板と接触した溶液、液体または緩衝液中に標識されたターゲットが存在する状態で、非線形光学測定を実施することができる（例えば結合していない標識されたターゲットを除去する洗浄段階が必要ない）。
【０１６６】
代替実施形態では、チャネル（またはマイクロ流体チャネル）を使用し、容積式、ポンピング、電気泳動手段、または反応室内へおよび反応室から外部への成分の流れを操作する当技術分野で周知の他の手段を介して、サンプル・セルに成分を導入することができる。
【０１６７】
代替実施形態では、あるプローブ−ターゲット結合反応の反応速度を、あるターゲット濃度で測定する。この実施形態では、非線形光学光の強度および／またはスペクトルの時間経過を測定する。測定した情報を、結合したターゲットの濃度の時間経過（例えばｍＭ／秒またはμＭ／秒で表したプローブ−ターゲット濃度）に変換することができる。薬物、あるいは例えばプローブ−ターゲット結合形成の平衡または反応速度に対するその他のエンハンサまたは減力剤を使用して、プローブ−ターゲット反応に対する追加した物質の影響を比較することができる。
【０１６８】
代替実施形態では、装置を、プローブが付着した使い捨て可能な基板（例えばバイオチップ）を挿入し、取り外すオプションを有するユーザ制御のインタフェース（例えばＬＥＤパネルまたはＰＣベースのソフトウェア）を有するユーザ・クローズド製品に組み込むことができる。
【０１６９】
代替実施形態では、サンプルに光ビームを照射すると標識が非線形光学活性（または多少なりとも非線形光学活性）になるように、光ビーム（例えば非基本波）を用いて標識を光活性化（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）するか、または光調節（ｐｈｏｔｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）することができる。光ビームは例えば、（例えばＵＶ光を使用して）当技術分野では「ケージ化」化合物としてよく知られている化学結合を切断することができる。
【０１７０】
代替実施形態では、図１のフォトダイオード、アバランシェ・フォトダイオードまたは他の光電検出器（６５）を光検出手段として使用する。
【０１７１】
代替実施形態では、表面アレイの位置を固定し、検流計ミラー、ポリゴン・ミラーなどの当技術分野で周知の方法を使用して表面全体にわたって入射光ビームを走査させることができる。
【０１７２】
代替実施形態では、走査方法を、ステージの並進（ｘ−ｙ）とビーム走査との組合せとすることができ、ビーム走査によってアレイ表面の基本波ビームの入射位置を制御する。
【０１７３】
代替実施形態では、ストップ・フロー混合室を使用して、サンプル・セル中の成分を素早く混合する。
【０１７４】
代替実施形態では、標識されたターゲットを用いてプローブ−ターゲット相互作用を、組織表面、表面上のパターニングされたセル、表面に付着したプローブ（例えばＤＮＡ、タンパク質などのマイクロアレイまたはアレイ）などの表面で画像化することができ、画像化はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化の場合には、内視鏡またはｉｎ  ｖｉｖｏで光を導入し、集光する当技術分野で周知の他の機器を使用して画像化を実施することができる。
【０１７５】
代替実施形態では、生物学的プローブ−ターゲット結合反応を、前記プローブ−ターゲット結合反応の結合の強さ（例えば平衡定数）を調節することができるアゴニスト、アンタゴニスト、薬物または小分子の存在下で測定することができる。この実施形態は、医療または基礎研究のため、あるプローブ−ターゲット反応を遮断することができる薬物の効力を知りたいときなど、多くの場合に有用となりうる。
【０１７６】
代替実施形態では、比例定数（第二高調波光の強度と付着したプローブに結合したターゲットの濃度との較正曲線）を、ターゲットの放射標識、蛍光標識などの他の方法を使用してターゲットの濃度を測定することによって決定する。所与のプローブ／ターゲット・タイプ（例えばｃＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドのサイズなど）に対する較正曲線を得たら、この関係および測定された第二高調波の強度を使用して、結合したターゲットの濃度を決定する。
【０１７７】
代替実施形態では、表面選択的非線形光学装置が、光励起源を持たないユニット（例えばサンプル区画、フィルタ、検出器、モノクロメータ、コンピュータ・インタフェース、ソフトウェア、または他の部品を持つユニット）を含み、そのため、ユーザが自身の励起源を供給し、その使用を本明細書に記載の方法に適合させることができる。
【０１７８】
代替実施形態では、測定可能情報をリアル・タイムで記録することができる。
【０１７９】
代替実施形態では、相互作用を調節するあるモジュレータの存在下で、ターゲット−プローブ相互作用を測定することができる。このモジュレータは例えば、ターゲット−プローブ相互作用をなんらかの方法（例えば遮断、阻害など）で変化させる小分子、薬物、あるいは他の部分、分子または粒子である。モジュレータは、プローブ−ターゲット相互作用が起こる前、起こっている最中、または起こった後に加えることができる。
【０１８０】
表面選択的非線形光学技法を使用してプローブ−ターゲット反応を検出する装置のさまざまな構成
プローブ−ターゲット反応またはその影響を検出する装置はさまざまな構成をとることができる。その最も単純な形態では、装置が以下のものを備える：
ｉ）基本光源
ｉｉ）表面にプローブが付着した基板またはサンプル
ｉｉｉ）第二高調波または他の非線形光学ビームの強度を測定する検出器。
【０１８１】
より精巧な構成では、例えば、モノクロメータ（波長選択用）、パス・フィルタ、カラー・フィルタ、干渉フィルタまたは他のスペクトル・フィルタ（波長選択用、または基本波を高調波から分離するためのもの）、１つまたは複数の偏光光学部品、ビームを導き集束させるための１つまたは複数のミラーまたはレンズ、コンピュータ制御、ソフトウェアなどが使用される。
【０１８２】
非線形光学光の送達または発生モード（例えばＳＨＧ）は、以下の手段のうちの１つまたは複数の手段に基づくことができる：ＴＩＲ（全反射）、光ファイバ（ビーズの付着有り、または無し）、透過（基本波がサンプルを通過する）、反射（基本波がサンプルで反射される）、走査画像化（サンプルを走査することを可能にする）、共焦点画像化または走査、出力増強用の共振キャビティ（共振器）、多重パス構成。
【０１８３】
測定された情報はベクトルの形態をとることができ、このベクトルは、以下のパラメータのうちの１つまたは複数のパラメータを含むことができる：｛光の強度（一般にＰＭＴまたはフォトダイオードによって光電圧に変換される）、光の波長（モノクロメータおよび／またはフィルタを用いて決定する）、時間、基板位置（例えばアレイ・サンプルの基板位置。異なるサブサンプルが基板位置の関数としてコード化され、基本波がさまざまな（ｘ，ｙ）位置に導かれる）｝。装置の一般的な２つの構成は、画像走査（基板の画像化。強度、波長などのｘ，ｙ座標の関数としての画像化）と、分光（ある平らな表面、あるいは細胞、リポソームまたは他の粒子の懸濁液に対する強度、波長などの測定）である。
【０１８４】
基本波ビームはさまざまな方法でサンプルに送達することができる。図１２〜１６は、基本波を送達し第二高調波ビームを発生させるさまざまなモードの概略図である。和または差周波数構成では、基本波ビームが２つ以上のビームから成り、界面で、差または和周波数ビームを発生させることを理解されたい。説明の目的上、ここでは第二高調波発生の場合だけを詳細に記載した。さらに、界面相互作用容積の正確な位置を選択するため、サンプル・セル３は全ての場合に、並進ステージ（自由度は１、２または３次元）に載せることができることを理解されたい。サンプル・セルには全ての場合に、分子、粒子、細胞などの成分を導入する（または排出する）働きをすることができるフロー・ポートおよび管を取り付けることができる。
【０１８５】
透過
図１２Ａは、基本波および第二高調波ビームの透過に依存した一構成の概略図である。基本波３２０（ω）はサンプル・セル３３０を通過し、第二高調波ビーム３２５（２ω）を発生させることができる１つまたは複数の界面を含んだ体積要素（円で示す）の中で相互作用する。基本波ビームと第二高調波ビームは、ビーム３２５によって示すように実質的に共線関係にある。サンプル・セルは、ある媒質に懸濁したビーズ、粒子、リポソーム、生物細胞などを含むことができ、これによって、基本波ビームに応答して第二高調波を発生させることができる界面領域を提供する。図示のとおり、第二高調波は、基本波の方向の共線方向に検出されるが、代替法として、基本波とは異なる角度で、例えば基本波ビームに対して９０°の角度で検出することもできる。
【０１８６】
図１２Ｂは、基本波および第二高調波ビームの透過に依存した他の構成の概略図である。基本波３３５はサンプル・セル３４５の上面に導かれ、そこで第二高調波が発生する。この上面を、固定されたプローブ、または吸着させた粒子、リポソーム、細胞などで誘導体化することができる。第二高調波３４０は、上面とセルに含まれる媒質との境界にある、円で示された体積要素の中で発生する。
【０１８７】
図１２Ｃは、図２Ａに示した構成とほぼ同様の構成の概略図である。ただし、上面ではなくサンプル・セル３の下面を使用して第二高調波を発生させる点が異なる。
【０１８８】
全反射
図１３Ａは、全反射導波路の働きをすることができる導波路４の概略図である。基本波３６５を屈折させ、これを、導波路３８０とサンプル・セル３７５の界面上の位置に導く。円で示されたこの位置で、基本波は第二高調波を発生させ、全反射を経る。第二高調波ビームは、基本波と実質的に共線に伝搬し、プリズム３８０を出る。導波路３８０は一般に空気と接触する。この図では、導波路３８０がドーブ・プリズムである。
【０１８９】
図１３Ｂは、図１３Ａに示した構成と同様の構成の概略図である。ただし、導波路４００が、導波路４とサンプル・セル３９５の間の複数の全反射点を可能にし、これによって基本波ビームから発生した第二高調波光の量が増大する点が異なる。
【０１９０】
光ファイバ
図１４に、基本波または第二高調波ビームを送達しまたは収集する、さまざまな構成の光ファイバ手段を示す。図１４Ａには、基本波源と光ファイバの間の結合部品４１０が示されている。このようにして光ファイバ・導波路４０５に結合された基本波はサンプル・セル４１５に進む。図１４Ａでは、ファイバの先端が、第二高調波を発生させることができる関心の界面の役割を果たし、または、ただ単に、懸濁した細胞、粒子などを含むサンプル・セルに基本波ビームを導入する役割を果たす。図１４Ａでは、光ファイバを逆に戻ってきた第二高調波光を集める。
【０１９１】
図１４Ｂは、（当技術分野で周知の手段に基づいて）光ファイバの先端にビーズが付着されているほかは、図１４Ａと全く同じである。このビーズは、第二高調波光の収集効率を向上させる働きをし、あるいは、プローブまたは吸着種で誘導体化することができ、第二高調波光を発生させることができるサンプル・セル４２５の媒質との界面を提供する。
【０１９２】
図１４Ｃは、第二高調波光の収集が立体角検出器４５０を使用して実施されるほかは、図１４Ａおよび１４Ｂと全く同じである。
【０１９３】
光学共振キャビティ（光共振器）
光学共振キャビティは少なくとも２つの反射部品間に画定され、キャビティ内のビーム経路に沿ってキャビティ内光ビームを有する。光学キャビティないし共振器は、入射光を捕獲でき、入射光がミラーとミラーの間で前後に反射するように配置された２面以上の鏡面から成る。こうすると、キャビティ内の光を入射光よりも桁違いに強くすることができる。この現象はよく知られており、さまざまに利用されている（例えば、Ｙａｒｉｖ  Ａ．「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ」，第２版，Ｈｏｌｔ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ，ＮＹ  １９７６年，第８章を参照されたい）。サンプル・セルは光学キャビティの中に置くことができ、または光学共振キャビティの外側に置くこともできる。
【０１９４】
図１５は、光学共振出力増強キャビティ構成の概略図である。図１５Ａは、サンプル・セル４６５がキャビティ内に配置され、基本波および第二高調波ビームがサンプル・セルを透過する光学共振キャビティの概略図である。この構成は、懸濁した粒子、細胞、ビーズなどを含むサンプル・セルに対して有効である。基本波ビーム４５５は、反射光学部品４６０のところから光学共振キャビティに入り、反射部品４６０と４６２の間で出力を増強する（キャビティ内ビーム）。キャビティ内ビームの直接反射が光源へ逆戻りしないように、ミラー４６０は傾いている（入射基本波４５５の方向に対して垂直でない）ことが好ましい。キャビティ内で基本波が都合のよい出力レベルまで増強されるように、４６０および４６２の反射率および透過率を調整することができる。基本波は、円で示されたサンプル・セル内の体積要素の中で第二高調波光を発生させる。反射光学部品４６０は基本波および第二高調波を反射することができ、一方、反射光学部品４６２は基本波を実質的に反射するが、第二高調波ビーム４７５は通過させ、通過した第二高調波ビームは続いて検出される。米国特許第５４３２６１０号（Ｋｉｎｇ他）には、化学センシング用のダイオード・ポンプ式の出力増強キャビティが記載されている。この特許およびその参照文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
図１５Ｂは、光学共振出力増強キャビティ構成の概略図である。この構成では、基本波ビーム４７５が光学部品４８０で反射して光学キャビティに入る。第２の反射光学部品４８２が光学共振キャビティを画定する。部品４９０は、サンプル・セル４８５と接触した（プリズムなどの）導波路であり、導波路とサンプル・セル表面の界面での基本波ビームの全反射および第二高調波光の発生を可能にする。部品４８２は基本波ビームを実質的に反射するが、第二高調波ビーム４９５は通過させ、通過した第二高調波ビームは続いて検出される。
【０１９６】
反射
図１６Ａは、基本波および第二高調波ビームの反射を含む一構成の概略図である。基板５２５は、金属などの薄い反射性材料層５２０でコーティングされており、この層の上面には、プローブの付着、または粒子、細胞などの吸着に適した層５１５（例えばＳｉＯ２）が付着されている。この層はサンプル・セル５１０と接触している。基本波５００はサンプル・セル５１０を通過し、層５１５と５２０の界面で第二高調波を発生させる。基本波および第二高調波５０５は層５２０の表面で反射される。
【０１９７】
図１６Ｂは、第二高調波および基本波ビーム５３５が、サンプル・セル５４０に含まれる媒質と層５４５の界面で反射されるほかは、図１５Ａとほぼ同様である。層５４５は、基板５５０の表面に付着させた反射層または部分反射層であり、粒子、細胞などの吸着またはプローブの付着に適している。
【０１９８】
図１６Ｃは、サンプル・セル５６５だけを使用して反射幾何構造を得ることができること示す概略図である。サンプル・セル５６５にはある媒質５７０が途中まで充てんされており、基本波および第二高調波ビーム５６０は、５７０の表面の気−液または蒸気−液界面で反射される。
【０１９９】
検出モード
電荷結合検出器（ＣＣＤ）アレイ検出器は、情報を、基板位置（ｘ，ｙ）の関数として欲しいときに特に有用である。ＣＣＤは画素（すなわちフォトダイオード）のアレイを含み、画素はそれぞれ、自体に入射した光を独立に測定することができる。所与の装置幾何形状に関して、特定の基板位置（ｘ，ｙ）で発生した非線形光を、基板からある距離にあるＣＣＤアレイ位置（Ｑ，Ｒ）に入射した非線形光の強度を測定することによって決定することができる。これができるのは、蛍光放射の自発的、確率的、多方向的性質に比べて、非線形光学ビームがコヒ―レントかつ平行である（さらに一般に基本波と一緒に伝搬する）ためである。ＣＣＤアレイを用いると、検出器中の１つまたは複数のアレイ要素｛Ｑ，Ｒ｝が、基板表面の特定の領域にマップされ、これによって情報を、基板位置（ｘ，ｙ）の関数として容易に決定することができる。フォトダイオード検出器および光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェ・フォトダイオード、フォトトランジスタ、真空フォトダイオード、または入射光を電気信号（すなわち電流、電圧など）に変換する当技術分野で知られている他の検出器を使用しても、光の強度を検出することができる。ＣＣＤ検出器では、ＣＣＤが、装置のコンピュータに取り付けられたデータ取得ボードと通信し、これによって制御される。データ取得ボードは、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｂｏａｒｄｓ社によって製造されているＣＩＯ−ＤＡＳ１６／Ｊｒなど、当技術分野で周知のタイプのボードとすることができる。データ取得ボードおよびＣＣＤサブシステムは例えば以下のように動作する。ＣＣＤサブシステムにクロック信号を送ることによって、データ取得ボードがＣＣＤ積分周期を制御する。一実施形態では、ＣＣＤサブシステムがＣＣＤの積分周期を４０９６クロック周期にセットする。クロック・レートを変更することによって、ＣＣＤがデータを積分する実際の時間を操作することができる。積分周期の間に、それぞれのフォトダイオードが、到達した光の量に比例した電荷を蓄積する。積分周期の終わりに、電荷はＣＣＤのシフト・レジスタへ移され、新しい積分周期が始まる。シフト・レジスタは電荷を、ＣＣＤアレイに入射した光パターンを表す電圧として蓄積する。この電圧は次いで、クロック・レートでデータ取得ボードに伝送され、そこでディジタル化されてコンピュータの記憶装置に記憶される。このようにして、それぞれの積分周期の間にサンプル・ストリップが画像化される。その後、サンプルの走査が完了するまで次の列が積分される。
【０２００】
サンプル基板およびサンプル・セル
サンプル基板およびセルは、以下の特徴のうちの１つまたは複数の特徴から描かれるさまざまな形態をとることができる：完全に密封され、密封され、または密封されず、フロー・セルおよびポンプに接続されている、非線形ビームのエバネッセント発生を可能にする全反射プリズムを有する一体化された基板、基本波の出力増強用の共振キャビティを有する一体化された基板、非線形応答を高めるために基本波の多重パスを可能にする光学的構成、懸濁した生物細胞、粒子、ビーズなどを含むサンプル・セル。ただしこれらに限定されるわけではない。
【０２０１】
データ分析
データ分析では、検出器によって測定された情報ベクトルを処理する。情報は、時間依存の速度論情報とすることができる。この情報は、測定中、または測定と測定の間に変化する可能性がある、１種または数種の生物学的成分、阻害剤、アンタゴニスト、アゴニスト、薬物、小分子などの濃度に依存する。これはさらに波長などに依存することがある。一般に、非線形光の強度は、特定の状態の濃度または量（例えば表面に関連した成分の濃度、細胞膜の開いたイオン・チャネルまたは閉じたイオン・チャネルの量）に変換される。一例では、第二高調波光の生成が下式に従う。
【０２０２】
（ＩＳＨ）０．５∝Ｅ２ω＝Ａχ（２）＋ＢΦ０χ（３）  （１）
上式で、ＩＳＨは第二高調波光の強度、Ｅ２ωは第二高調波光の電場の振幅、ＡおよびＢは、所与の界面およびサンプル幾何形状に固有の定数、Φ０は表面電位、χ（２）およびχ（３）は、２階および３階の非線形感受率テンソルである。χ（２）は、Ｎ（表面またはプローブに結合したターゲット）およびターゲットあたりの超分極率に比例する。表面結合反応は以下のラングミュア型の式に従うことができる。
【０２０３】
ｄＮ／ｄｔ＝ｋ１（Ｃ−Ｎ）／５５．５×（Ｎｍａｘ−Ｎ）−ｋ−１Ｎ  （２）
上式で、Ｎは、表面に結合したターゲット（例えばプローブに結合したターゲット）の量、Ｎｍａｘは、平衡状態での表面の結合種の最大数、ｋ１は会合速度定数、ｋ−１は解離速度定数、ｄＮ／ｄｔは、表面に結合したターゲットの量の瞬時変化率、Ｃは種のバルク濃度である。表面に結合した種の量を求める際に当技術分野で使用されている修正ラングミュア式または他の式を、このデータ分析に使用することもできる。
【０２０４】
データ分析の詳細はそれぞれの特定のケースに依存する。表面の正味電荷による分極応答χ（３）が存在する場合には、測定を実施する際にそれを差し引くことができる。したがって、表面に結合した種の数Ｎを、このようにして第二高調波の強度から直接に計算することができる。速度論的または平衡特性を、例えば式２および当技術分野で周知の手順に従って、（平衡時に、またはリアルタイムで）Ｎから決定することができる。このプロセスを記述した当技術分野の関連論文がいくつかあり、これには例えば、Ｊ．Ｓ．Ｓａｌａｆｓｋｙ，Ｋ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，「Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｔ  ａ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ」，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０００，３１９，４３５、およびＥｉｓｅｎｔｈａｌ，Ｋ．Ｂ．「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１００，１２９９７が含まれる。
【０２０５】
直接または間接的に表面電荷密度または電位の変化につながるプローブ−ターゲット・プロセス（間接型の例は、ターゲットがプローブに結合し、それによってイオン・チャネルの動力学が調節され、それによって表面電荷密度が変化する、細胞のイオン・チャネルを用いたイオン・チャネル実験である）。この場合には、細胞の表面に付着させた標識を使用して、イオン・チャネルの動力学または状態を、表面電荷密度が標識の非線形特性に対して持つ影響を介して感知する。
【０２０６】
データ分析
データ分析では、検出器によって測定された情報ベクトルを処理する。情報は、時間依存の速度論情報とすることができる。この情報は、測定中、または測定と測定の間に変化する可能性がある、１種または数種の生物学的成分（プローブ、ターゲット、薬物など）の濃度に依存する。これはさらに波長などに依存することがある。一般に、非線形光の強度は、特定の状態の濃度または量に変換される。一例では、第二高調波光の生成が下式に従う。
【０２０７】
（ＩＳＨ）０．５∝Ｅ２ω＝Ａχ（２）＋ＢΦ０χ（３）  （１）
上式で、ＩＳＨは第二高調波光の強度、Ｅ２ωは第二高調波光の電場の振幅、ＡおよびＢは、所与の界面およびサンプル幾何形状に固有の定数、Φ０は表面電位、χ（２）およびχ（３）は、２階および３階の非線形感受率テンソルである。表面結合反応は以下のラングミュア型の式に従うことができる。
【０２０８】
ｄＮ／ｄｔ＝ｋ１（Ｃ−Ｎ）／５５．５×（Ｎｍａｘ−Ｎ）−ｋ−１Ｎ  （２）
上式で、Ｎは、表面に結合したターゲット（例えばプローブに結合したターゲット）の量、ｄＮ／ｄｔは、表面に結合したターゲットの瞬時速度、Ｎｍａｘは、平衡状態での表面の結合種の最大数、ｋ１は会合速度定数、ｋ−１は解離速度定数、ｄＮ／ｄｔは、表面に結合したターゲットの量の瞬時変化率、Ｃは種のバルク濃度である。表面に吸着した種または表面に結合した種の量を求める際に当技術分野で使用されている修正ラングミュア式または他の式を、このデータ分析に使用することもできる。
【０２０９】
データ分析の詳細はそれぞれのケースの特定の詳細に依存する。表面に結合した標識された種の数Ｎを第二高調波の強度から直接に計算することができる。速度論的または平衡特性を、例えば式２および当技術分野で周知の手順に従って、（平衡時に、またはリアルタイムで）Ｎから決定することができる。このプロセスを詳細に記述した当技術分野の関連論文がいくつかあり、これには例えば、Ｊ．Ｓ．Ｓａｌａｆｓｋｙ，Ｋ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ，「Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｔ  ａ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ」，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０００，３１９，４３５、およびＥｉｓｅｎｔｈａｌ，Ｋ．Ｂ．「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｈａｒｍｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１００，１２９９７が含まれる。
【０２１０】
図面の説明
図面は、第二高調波発生を使用した装置およびサンプルのさまざまな実施形態を示す。本明細書では和または差周波数の使用を説明しないが、同様の構成ならびに２つの基本波ビーム（ω１、ω２）の使用が必要である。ただし、ω１±ω２＝Ωであり、Ωは和または差周波数である。サンプル表面が、分離された要素から成るアレイである場合には、基本光で単一の要素をアドレスし、または２つ以上の要素を同時にアドレスすることができる。さらに、特定の装置構成に応じて、単一の要素に対して検出を実行し、または多くの要素に対して同時に検出を実行することができる。
【０２１１】
図１は、入射した基本光を表面で反射させることによって第二高調波光を発生させる実施形態を示す。光源５は、サンプルのところで第二高調波光を発生させるのに必要な基本光を提供する。光源は一般に、波長可変または波長固定の市販ピコ秒またはフェムト秒レーザである。基本周波数（ω）の光がレーザを出て、例えば光の周波数および強度に適合した二分の一波長板１０（例えばＭｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ、ＯｒｉｅｌまたはＮｅｗｐｏｒｔ社から販売されている）を使用してその偏光が選択される。ビームは次いでレンズ１５によって集束され、基本光は通過させるが非線形光（例えば第二高調波）は遮断するように設計されたパス・フィルタ２０を通過する。このフィルタは、レイジング特性の外乱を引き起こす可能性がある第二高調波ビームのレーザ空胴への後方反射（ｂａｃｋ−ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を防ぐために使用される。ビームはミラー２５で反射され、特定の角度θで表面の特定の位置に入射する。必要ならば、検流計制御のミラー・スキャナ、回転ポリゴン・ミラー・スキャナ、ブラッグ回折器、音響光学デフレクタ、またはミラーの位置を制御できる当技術分野で周知の他の手段を使用してミラー２５を走査することができる。第二高調波ビームを発生させる表面上の特定の位置を選択するために、（コンピュータ制御の）ｘ−ｙ並進ステージ３５にサンプル表面３０を載せることができる。表面は、基本波または第二高調波ビームを反射するガラス、プラスチック、シリコンまたは他の任意の固体表面とすることができる。サンプル表面は封入することができ、液体と接触させることができる。さらに、マイクロキャピラリまたは他の輸液チャネル（図示せず）、ポンプあるいは電気泳動部品によって、サンプル３０に給液し、または排液することができ、これらの装置をコンピュータ制御とすることができる。基本波および第二高調波出射ビーム（これらは表面に関して特定の角度すなわちθ１で出射し、それらの方向は一般にほぼ共線関係にある）は次いで表面で反射され、基本波は、第二高調波ビームを通過させるパス・フィルタ４５を使用して除去され、高調波ビーム（２ω）だけが残る。この第二高調波はミラー４０で反射され、必要ならば、偏光光学部品５０によってその偏光が選択され、レンズ５５を使用して検出器６０上へ集束される。レンズ１５と５５はさらに、集束またはビーム整形用の当技術分野で周知の任意の組合せとすることができる。必要ならば、第二高調波ビームのスペクトル帯の中の特定の波長を選択するために、モノクロメータ６０を使用することもできる。検出器は、光電子増倍管、ＣＣＤアレイ、または当技術分野で周知の他の高感度検出装置とすることができる。例えば、単光子計数モードで動作する光電子増倍管を使用することができる。検出器で、光はその強度に比例した電圧を発生させる。アレイ表面をステージによって並進させ、または走査した（あるいはその両方を実施した）ときにアレイ表面のそれぞれの位置のデータが記録され、表面のそれぞれの領域で発生した第二高調波強度の画像が構築される。
【０２１２】
図２に、全反射（エバネッセント波発生）を使用して第二高調波光を発生させる一実施形態を示す。プリズム部品７０の表面に基本光（ω）を導く。ビームは位置（ａ）で屈折し、プリズムおよび屈折率整合フィルム７５を通過し、基板８０に入射する。プリズム７０および基板８０は光学的に透明な材料から作られる。これらは同じタイプであることが好ましい。プリズム７０は、ドーブ・プリズム、またはエバネッセント・フィールドを支持することができる他の任意の部品（例えば導波路、ファイバおよび金属薄膜）とすることができる。屈折率整合フィルム７５は油とすることができるが、Ｓｊｏｄｉｎの「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｍｅａｎｓ」という名称のＰＣＴ出願ＷＯ９０／０５３１７（１９９０年）に記載されているものなどの圧縮可能な光学ポリマーとすることが好ましい。さらに、プリズム７５および基板８０を同じ材料から作られた（すなわち屈折率整合フィルムを持たない）一体部片とすることもできる。８０とサンプル区画８５の中の媒質との界面で、８０および８５の屈折率、および界面でのビームの入射角に従って、エバネッセント波が発生する。電界の振幅は、基板表面から離れるにつれて１／ｅの指数関数的に減衰し、長さは、表面電位、（もしあれば）サンプル区画中の反対イオン密度を含むいくつかの因子に応じてナノメートルからミクロン程度である。サンプル区画は、空気、ガス、または溶液、水などの液体で満たすことができる。サンプル区画に面した８０の表面の「ｘ」マークは、関心のサンプル（例えば製造されたプローブ）がこの側に置かれることを強調するためのものである。基板８０は、７５と８５の間からスライドさせて取り出すことができる「チップ」とすることができ、こうすることによってさまざまな基板の測定が可能になる。図中の部品９０は、例えばポンプ、静電手段などによって区画に液体またはガスを引き込み、区画から液体またはガスを抜き出すためのサンプル区画のポートである。必要ならば、サンプル・アセンブリ全体を、ｘ−ｙ並進ステージ９５に載せることができる。
【０２１３】
図３に、スラブ誘電体導波路を使用して基本光をサンプル表面へ送達する一実施形態を示す（光ビームは、図１のように部品１〜５および８〜１３を用いて生成され、導かれ、検出される）。平行プレートまたは誘電体導波路を使用して、導波路伝搬モードに基本光を結合することができる。この図には、２つのスラブ（１１０、１１５）および領域（１２０）が示されている。スラブ１１５および領域１２０の屈折率が光（基本波および第二高調波）の屈折率よりも小さい場合いは、導波モードを開発することができる。このモードは、基板のところに複数の内部反射を生み出し、これを使用して、界面によって生成された第二高調波光の量を増大させることができる。例えば導波路の上面にけがかれ、または浮き彫りされた回折格子１０５を使用して、基本波ビーム１００を導波路１１０に結合することができる。基本波は、導波路に沿って伝搬し、上面および下面で複数の全反射を受ける。基板１１０の表面の「ｘ」マークは、測定対象の（すなわちプローブを含む）表面サンプルを表す。この界面が、材料１１０と１１５の界面よりも大幅に多くの第二高調波光を発生させる場合には、光の強度を無視することができる。例えば、ＳＨで標識したターゲットが、「ｘ」位置に固定したプローブに結合しており、１１０と１１５の界面の原子構造がエピタキシャルに整合している場合、界面１１０／１２０は、界面１１０／１１５よりもはるかに多くの第二高調波光を発生させる。
【０２１４】
したがって、本発明の範囲を以上の説明を参照して決定してはならない。本発明の範囲は、添付の請求項、およびこのような請求項が権利を有する等価物の完全な範囲を参照して決定しなければならない。
【０２１５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】
第二高調波光の発生および収集モードが、表面に付着したプローブを有する基板からの反射による装置の一実施形態を示す図である。
【図２】
第二高調波光の発生および収集モードがプリズムを通した全反射による装置の一実施形態を示す図である。プリズムは、表面に付着したプローブを有する基板に屈折率整合材料によって結合されている。
【図３】
第二高調波光の発生および収集モードが、導波路を通した全反射による装置の一実施形態を示す図である。ここでは、導波路の内側の破線によって示すように多重反射する。
【図４】
付着したプローブを含む基板に生物学的成分および他の流体を送達し、除去するためのフロー・セルの一実施形態を示す図である。
【図５】
第二高調波光の発生および収集モードがサンプルの透過による装置の３つの実施形態を示す図である。
図５Ａでは、第二高調波ビームが基本波と共線関係にある。
図５Ｂでは、第二高調波を、基本波に対して直角の方向から収集する（「直角収集」）。
図５Ｃでは、積分球および光ファイバ線によって第二高調波光を集める。
【図６】
一連の光学構成部品を使用して平行基本光ビームを、基板の走査に適した線の形に変形する、変形の一実施形態を示す図である。
【図７】
図７Ａは、アレイ形式（要素１〜３５）にパターニングされた（付着したプローブを含む）基板表面の一実施形態を示す図である。
図７Ｂは、基板アレイの１つの要素を示す図である。それぞれの要素は、壁を有し、表面に付着したプローブを有するウェルであり、ウェルは液体を保持することができ、隣接するウェルまたは基板の他の部分からウェルの内容物を物理的に分離する働きをする。
【図８】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド・サンプルを基板表面に付着するのに使用される界面化学の一実施形態を示す図である。
【図９】
図９Ａは、複数のウェル（１〜１６）を含む基板の一実施形態を示す図である。図９Ｂに示すようにウェルはそれぞれ、表面に付着したプローブを含む。
【図１０】
反射コーティングの上に表面に付着させたアミノシラン層を使用した、装置基板の一実施形態を示す図である。アミノシラン層の下の反射コーティングは非線形光学光の収集を向上させる。アミノシラン層は、生体分子または他のプローブ成分を基板に結合させるのに適している。
【図１１】
第二高調波光の発生および収集モードが光ファイバによる装置の一実施形態を示す図である。
図１１Ａは、光ファイバ線束の使用を示す図である。
図１ｌＢは、ファイバの端に結合させたビーズを使用したプローブの付着を示す図である。
【図１２】
第二高調波光の発生および収集モードがサンプルの透過による装置の３つの実施形態を示す図である。
図１２Ａは、サンプルの中を共線関係で伝わる基本波および第二高調波ビームを示す図である。
図１２Ｂは、基板の上面（この上面は付着したプローブを含む）で屈折している基本波および第二高調波ビームを示す図である。この面が第二高調波光を発生させる。
図１２Ｃは、下面（この下面は付着したプローブを含む）が第二高調波光を発生させるほかは図１２Ｂと同様の装置を示す図である。
【図１３】
界面での全反射によって第二高調波光が発生する装置の２つの実施形態を示す図である。第二高調波光の発生点が円で示されている。
図１３Ａでは、ドーブ・プリズムを使用して、第二高調波光を発生させることができる表面（プリズムの下面。ただし屈折率整合材料を介してプリズムに結合された別の表面とすることもできる）に光を誘導する。
図１３Ｂでは、導波路構造を使用して複数の第二高調波発生点を生み出す。
【図１４】
光ファイバ線（ファイバの端にはプローブが付着されている）を使用して第二高調波光を発生させる装置の３つの実施形態を示す図である。
図１４Ａは、第二高調波光の発生と収集の両方が同じファイバで生じる装置を示す図である。
図１４Ｂは、表面に付着したプローブを含む、ファイバの端のビーズの使用を示す図である。
図１４Ｃは、（付着したプローブを含む）光ファイバの端で第二高調波光を発生させ、光ファイバの外部のミラーまたはレンズを使用して第二高調波光を集める装置を示す図である。
【図１５】
光学キャビティを使用して基本波の出力増強を達成する装置の２つの実施形態を示す図である。
【図１６】
第二高調波光の発生および収集モードが界面での光の反射を使用する装置の３つの実施形態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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