(57)【要約】本発明は、抗血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子またはその部分を含む抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物に関し、より詳しくは、アンドスタチンのような血管新生抑制活性を有するタンパク質またはその部分をコードする遺伝子を含む組換えベクターを製作し、前記組換えベクターまたは前記組換えベクターで形質移入、あるいは形質導入された細胞株を関節炎患者の患部に移植して慢性関節リウマチを治療する遺伝子治療法および前記遺伝子治療のための組成物を提供する。本発明にかかる遺伝子治療用医薬組成物は、患者の膝に継続的に抗血管新生タンパク質を提供し、滑膜組織の肥厚化および炎症誘発を抑制することにより、現在まで開発されていない慢性関節リウマチの治療に効果的に使用できる。
2004517117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡを含み、慢性関節リウマチに対する治療効果を有することを特徴とする遺伝子治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記抗血管新生タンパク質が、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２または肝細胞成長因子である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、プラスミノゲンタンパク質（配列番号２）の９３〜３６９番目のアミノ酸をコードする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンタンパク質（配列番号８）の１３３４〜１５１６番目のアミノ酸をコードする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡが、配列番号１４で表される血小板因子−４タンパク質をコードする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と連結している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記シグナルペプチドが、ヒトプラスミノゲン（配列番号２）のＮ−末端の１８個のアミノ酸配列を有する、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記シグナルペプチドが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列によってコードされているマウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナルペプチドである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターまたは動物細胞で発現され得るプラスミドに挿入された形態で提供される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記レトロウイルスベクターが、ＭＴ５ベクター（ＫＣＣＭ−１０２０５）である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡが、前記ＤＮＡを含む組換えベクターで細胞株を形質移入または形質導入して得られる組換え細胞株の形態で提供される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組換え細胞株が、慢性関節リウマチ患者のＭＨＣ抗原と同一であるか、類似するＭＨＣ抗原を有する、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組換え細胞株が、慢性関節リウマチ患者から分離した滑膜細胞である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の慢性関節リウマチに対する遺伝子治療用医薬組成物を患者の関節炎部位に送達して慢性関節リウマチを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）タンパク質をコードする遺伝子またはその部分を含む慢性関節リウマチ治療用組成物に関し、より詳しくは、血管新生抑制活性を有するタンパク質またはその部分をコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築し、前記組換えベクターまたは前記組換えベクターで形質移入、あるいは形質導入された細胞株を関節炎患者の患部に移植して慢性関節リウマチを治療する遺伝子治療法および前記遺伝子治療のための組成物に関する。
【０００２】
背景技術
慢性関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、種々の関節で起る慢性炎症疾患である。関節炎にかかった滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）組織の最も重要な特徴は、滑膜組織の肥厚化（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、およびＴリンパ球とＢリンパ球の動脈内膜への浸潤（ｓｕｂｉｎｔｉｍａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。このような滑膜組織の炎症は、未知の自己抗原に対して反応性のあるＴリンパ球により誘発されると考えられている。それにもかかわらず、大部分の組織に浸潤したＴリンパ球は細胞の表面に活性化標識を示さず、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）をほとんど発現しない。これとは対照的に、慢性関節リウマチ症状を有する滑膜組織と滑液にはマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）由来のサイトカインが非常に多く観察されている。このようなサイトカインとしては、滑膜繊維芽細胞の成長を促進することが知られているインターロイキンー１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）などがある。このような実験結果は、Ｔリンパ球が滑膜組織の炎症を誘発するのに非常に重要であり、炎症は活性化された滑膜細胞に由来するサイトカインによって維持されるということを示唆している。
【０００３】
前記のような滑膜組織の肥厚化は、関節炎において血管のない軟骨部に発生する結合組織層であるパンヌス（ｐａｎｎｕｓ）を形成して疾患関節の軟骨と骨組織を非可逆的に破壊するので、慢性関節リウマチ治療の理想的な目標は滑膜組織の肥厚化を抑制することである。慢性関節リウマチに対する効果的な治療剤はまだ開発されておらず、これまで使用されてきた薬品も効果が非常に限られているため、一旦関節炎が生じると深刻な苦痛はもちろん、経済的な損失ももたらす。
【０００４】
現在使用されている慢性関節リウマチの治療方法は次の通りである。初期治療にしばしば用いられる薬物は非ステロイド性消炎剤（ＮＳＡＩＤ： ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍＭａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ）である。これらのＮＳＡＩＤは、症状を若干好転させるものの、関節部位の軟骨損失や疾病の進行を防ぐことができない。また、著しい副作用をもたらすため、この治療法を用いる患者の半分くらいが１年以内に治療を中断しなければならない。次の段階としては、金を含む化合物薬剤（ｇｏｌｄ ｄｒｕｇｓ；例：金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオ硫酸ナトリウム）やペニシラミンおよび抗マラリア剤のような疾患修飾性抗リウマチ薬（ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｎｔｉ−ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｕｇｓ； ＤＭＡＲＤｓ）などが用いられる。しかし、これらの製剤はまた、慢性関節リウマチの進行を多少遅らせるが、深刻な副作用を伴うことがあるため、ＤＭＡＲＤを用いた治療を開始してから５年後には５〜１５％の患者のみがこの薬物の使用を継続する。前述の治療剤がそれ以上効果を示さない場合は、慢性関節リウマチが発生した部位を外科手術によって人工関節に取り替えなければならない。
【０００５】
このように現在まで使用されてきた慢性関節リウマチ治療の大部分は、特定の標的分子に注目して考案されたものではなく、多くの場合、わずかな治療効果のみを示すという限界を有する。一方、ＴＮＦのような炎症誘発サイトカインを慢性関節リウマチ治療の標的分子として注目し、ＴＮＦに対する抗体や可溶性ＴＮＦ−レセプター（ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を患者の関節炎部位に注入してＴＮＦを失活させることにより治療効果を得たという報告がある（Ｍａｉｎｉ， Ｒ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １４４：１９５， １９９５； Ｍｏｒｅｌａｎｄ， Ｌ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３７：１４１， １９９７）。これとともに、免疫抑制効果を有する分子を生体内で持続的に発現する方法で様々な遺伝子移植実験が慢性関節リウマチ動物モデルにおいて行われている。以上のように現在大部分の慢性関節リウマチ治療法は、滑膜細胞の増殖を誘導すると推定される免疫学的問題を解決するのに焦点を合わせている。
【０００６】
血管新生、すなわち新たな血管の形成は、初期に明らかになった慢性関節リウマチの組織病理学的な特性中の一つであって、パンヌスの形成に必要であるとみられる。このような新たな血管の形成は血液を通じてパンヌスに必須要素を供給することにより、慢性的な構造的変化を保持する役割を果すだけでなく、サイトカインやプロテアーゼを提供することにより炎症持続に重要な役割を果す。また、血管新生は、血液容量を拡張させることにより、より多くの炎症細胞が滑膜に浸潤するようにする。慢性関節リウマチにおいて特異的に血管新生を誘導する因子は正確に糾明されていないが、滑膜組織と滑液において血管新生を促進する種々の分子が発見されている。これらの分子としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）などのサイトカイン類の分子およびＥ−セレクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）のような可溶性接着分子が知られている。このような事実は、慢性関節リウマチの進行において血管新生が重要な役割を果すことを強く示唆する。
【０００７】
現在まで血管新生を抑制することが知られている因子が多数発見され、これらの大部分はプロトプロテイン（ｐｒｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）が切断されて生成するが、代表的には、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ−４）などが知られている。
【０００８】
このうち、アンジオスタチンは、ルイス肺悪性腫瘍を有するマウスから分離されたタンパク質であって、プラスミノゲンの９８番から４４０番までのアミノ酸から構成され、３８ｋＤのサイズを有する（Ｏ’Ｒｅｌｌｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７９：７１５， １９９４）。アンジオスタチンは４つのクリングルモチーフ（ｋｒｉｎｇｌｅ ｍｏｔｉｆ）を有しているが、精製されたアンジオスタチンを皮下注射することにより、１次腫瘍の成長を効果的に抑制できることが６つの癌モデル実験から判明したと報告された（Ｏ’Ｒｅｌｌｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：６８９， １９９６）。
【０００９】
エンドスタチンは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩＩＩ）のＣ−末端アミノ酸１８３個からなるタンパク質であって、抗血管新生活性を有し、精製されたエンドスタチンを皮下注射することにより１次腫瘍の成長を効果的に抑制できることが４つの癌モデル実験から判明したと報告された（Ｏ’Ｒｅｌｌｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８８：２７７， １９９７）。
【００１０】
血小板因子−４は、１０ｋＤａ以下の走化性ポリペプチド（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）から構成されるＣＸＣサイトカイン群に属するタンパク質であって、抗血管新生活性を有し、Ｂ−１６黒色腫とＨＣＴ−１１６大腸癌のような癌の成長を抑制すると報告されている（Ｍａｉｏｎ， Ｔ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：２０７７， １９９１）。
【００１１】
しかし、血管新生は、腫瘍形成および転移、網膜炎、血管腫、慢性炎症、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、慢性関節リウマチなどの様々な疾患に係っていることが知られているが、実際抗血管新生因子はこれらの疾患のすべてに対して効果を示すかどうかについては立証されておらず、ただ、具体的な疾患と関連して、これらの因子の腫瘍抑制効果についてのみ報告されているだけである（米国特許第５，８５６，３１５号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７９２，８４５号、米国特許第５，８５４，２０５号、米国特許第６，０２４，６８８号）。これらの特許は、血管生成抑制因子を組換えタンパク質の形で投与して卵巣悪性腫瘍（ＨＴＢ１６１， Ａ２７８０Ｓ）、大腸悪性腫瘍（ＭＩＰ， ＣＡＣＯ２）、ルイス肺悪性腫瘍（Ｌｅｗｉｓ Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ； ＬＬＣ）、繊維肉腫（Ｔ２４１）、前立腺悪性腫瘍（ＰＣ−３）、乳房悪性腫瘍（ＭＤＡ−ＭＢ）のような各種腫瘍に対する治療効果を確認したことを報告しているだけである。
【００１２】
一方、前記のような血管新生を抑制する因子を供給して血管新生を抑制することにより疾患を治療する方法は、直接的に細胞に毒性を与える一般的な治療方法とは異なり、細胞の成長を抑制する原理に基づくため、生体内で効果を示すためには、一定濃度以上の血管新生抑制因子が持続的に供給されなければならない。しかし、血管新生抑制因子を組換えタンパク質の形で供給する方法は、タンパク質を持続的に投与するのに非常に多くの費用がかかり、煩わしく、かつ患者に毒性を示し得るという問題がある。したがって、血管新生抑制因子を疾患部位に持続的かつ局部的に供給できる方法の開発が求められていた。
【００１３】
このような状況下で、本発明者らは免疫学的問題を解決するのに焦点が合わされている既存の慢性関節リウマチの治療法の代わりに血管新生抑制による慢性関節リウマチの治療可能性に対する新たな接近を試みた。すなわち、本発明者らは、血管新生抑制因子のうち代表的なアンジオスタチン、エンドスタチンおよび血小板因子−４遺伝子をウイルスベクターに挿入してアンジオスタチン、エンドスタチンおよび血小板因子−４を生産する細胞株を得、これを慢性関節リウマチの誘導されたマウスの患部に移植した。関節部位腫脹（ｊｏｉｎｔ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）のような肉眼的所見はもちろん、関節部位滑膜細胞の増殖程度、軟骨損傷度測定のような組織学的所見および関節部位炎症関連サイトカイン濃度のような免疫学的所見などを調査して慢性関節リウマチの進行程度を測定した結果、対照群に比べて慢性関節リウマチ発生率が著しく減少することを確認し、抗血管新生遺伝子を用いた遺伝子治療法が慢性関節リウマチの治療に効果的であることを確認することにより本発明を完成した。
【００１４】
発明の開示
本発明の目的は、慢性関節リウマチの治療のために抗血管新生因子タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡを含む遺伝子治療用医薬組成物を提供することである。具体的には、本発明は、抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡをベクターに挿入した組換えベクター、前記組換えベクターが導入された細胞株および前記組換えベクターまたは組換え細胞株を有効成分とする抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡを含み、慢性関節リウマチに対する治療効果を有する遺伝子治療用医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明にかかる医薬組成物において、抗血管新生因子を疾患部位に持続的かつ局部的に供給できるように、抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクターまたは動物細胞において発現され得るプラスミドに含まれた形態で提供することができ、また前記ＤＮＡを含む組換えベクターで細胞株を形質移入または形質導入して得られる組換え細胞株の形で提供できる。
【００１７】
また、本発明は、前記組成物を患者の関節炎部位に移植して慢性関節リウマチを治療する遺伝子治療法を提供する。
【００１８】
本発明において、「抗血管新生（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）遺伝子」とは、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を抑制する活性を有するタンパク質またはその部分をコードするＤＮＡを意味し、天然型ＤＮＡに限定されず、血管新生抑制活性を保持する範囲内で適切な変形が加えられるか、発現調節のための要素が付加されるか、遺伝工学的方法、あるいは化学的方法によって得られるかどうかを問わず、本発明の目的に適宜使用できることを意味する。
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物は、活性成分として抗血管新生タンパク質またはその部分をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするが、前記抗関節炎遺伝子治療法に用いられる抗血管新生遺伝子としては、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン （ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、血小板因子−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ−４）、トロンボスポンジン−１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１）、トロンボスポンジン−２、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎとｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｄｏｍａｉｎを有する抗血管新生タンパク質；Ｖａｎｚｑｕｅｚ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（３３）： ２３３４９−５７， １９９９）および肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２０】
特に、本発明にかかる抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物に含まれる抗血管新生遺伝子は、ヒトプラスミノゲンの９８番目のアミノ酸から４４０番目のアミノ酸部位を含み、４つのクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）部位を有するアンジオスタチンをコードする遺伝子、ヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲンの１３３４番目のアミノ酸から１５１６番目のアミノ酸部位を含むエンドスタチンをコードする遺伝子、そしてマウス血小板因子−４タンパク質をコードする遺伝子を用いることが好ましい。
【００２１】
前記抗血管新生因子としては、全アミノ酸配列を用いてもよいが、抗血管新生活性を有するフラグメントを用いてもよく、その例としては、アンジオスタチンクリングル１−３フラグメントを用いてもよい。
【００２２】
本発明にかかる抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物に含まれ得る好ましい抗血管新生遺伝子の例としては、ヒトプラスミノゲン、マウスプラスミノゲン、サル（ｒｈｅｓｕｓ）プラスミノゲン、ブタプラスミノゲンまたはウシプラスミノゲンなどに由来するＤＮＡが挙げられ、さらに好ましくは、ヒトアンジオスタチンｃＤＮＡである。また、前記エンドスタチン遺伝子の場合は、ヒト、マウス、サル、ブタまたはウシのＸＶＩＩＩ型コラーゲンなどに由来するＤＮＡを含み得、さらに好ましくは、ヒトエンドスタチンｃＤＮＡを使用し得る。本発明の好ましい実施態様においては、ヒト包茎包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）からクローニングされたアンジオスタチンおよびエンドスタチン遺伝子は抗関節炎遺伝子治療に効果的であることが確認された。
【００２３】
また、本発明の抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物に含まれる前記組換えベクターは抗血管新生遺伝子を含む。前記組換えベクターは、前記遺伝子が発現されてタンパク質に合成された後細胞外に分泌されるようにするため、分泌に必要なシグナルペプチドをコードする塩基配列を前記遺伝子の上流または下流に含むことがさらに好ましい。
【００２４】
前記シグナルペプチドとしては、真核細胞においてタンパク質分泌に関与する公知のすべてのシグナルペプチドを含み得、好ましくは配列番号２で表されるヒトプラスミノゲンのアミノ末端１８個のアミノ酸配列または配列番号１３の塩基配列によってコードされているマウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナルペプチドを使用してもよい。
【００２５】
たとえば、本発明の好ましい一実施例に示すように、ヒトプラスミノゲンアミノ末端の１８個アミノ酸をコードする塩基配列および制限酵素切断部位を有する配列を含むヌクレオチドを合成し、これを２本鎖ＤＮＡにハイブリダイズした後、制限酵素で処理して目的とするベクターの特定位置に挿入する方法で抗血管新生遺伝子に機能的にシグナル配列を連結できる。しかし、シグナル配列を有する分泌型抗血管新生タンパク質を生産するベクターの製造方法は前述のものに限定されるものではなく、当該技術分野において広く知られている方法に従って同様の目的を達成することができる。
【００２６】
本発明にかかる抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物に用いられるベクターは、抗血管新生因子を患部に持続的に供給するために抗血管新生遺伝子を挿入し得るベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターのようなウイルス由来ベクターと、ｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ， １０８：１９３−２００， １９９１）、ＰＡＧＥ２０７（日本特開昭６−４６８４）のように動物の体内で発現され得るプラスミドおよびこれらの変形ベクターが用いられる。
【００２７】
本発明の好ましい実施例においては、本発明者によって韓国特許庁に特許出願されたＭＴ５レトロウイルスベクター（韓国特許出願第９７−４８０９５号；ＫＣＣＭ−１０２０５）を用いて抗血管新生因子としてアンジオスタチン、エンドスタチンまたは血小板因子−４を産生するウイルスベクターを製造し、これを用いてマウスを対象に関節炎治療効果を確認した。前記ＭＴ５レトロウイルスベクターは、ウイルス由来のコード配列が全くなく、突然変異が導入されたヒト伸張因子ＥＦ１（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ）の非翻訳配列（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ； ＭＬＶ）に起因するベクターであって、外来遺伝子発現効率およびウイルス力価とも優れている特性がある。すなわち、前記ベクターはＭＬＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ 遺伝子配列を完全に除去して安全性を向上させただけでなく、スプライシング受容体を提供するための異種遺伝子由来の非翻訳配列として伸張因子ＥＦ １ａの非翻訳配列の一部を外来遺伝子挿入位置の上流に含んでおり、スプライシング効率を適切に調節することにより高い遺伝子発現を保ち、かつウイルス生産濃度もまた高く保持できるようにしたベクターである。
【００２８】
具体的に、本発明の一実施例においては、ＰＣＲを通じてヒト包茎包皮繊維芽細胞から配列番号２で表されるヒトプラスミノゲンの９３番から３６８番までのアミノ酸をコードするアンジオスタチンＤＮＡ切片を得た後、これをｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙベクターに挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉベクターを構築した。また、シグナル配列として配列番号２で表されるプラスミノゲンアミノ末端の１８個アミノ酸をコードする配列を合成し、これを前記ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉ ベクターに挿入することによりｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴベクターを構築した。その後前記ベクターをＢａｍＨＩで切断してシグナル配列と連結されたヒトアンジオスタチン遺伝子切片を得た後、これをＭＴ５ベクターに挿入した。一方、ヒトアンジオスタチンを発現する細胞株を得るためにＭＴ５−ｈＡＳＴ ベクターＤＮＡをマウス白血病ウイルスのｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ 遺伝子を発現するプラスミドとともに２９３Ｔ細胞に形質移入し、細胞培養液から無細胞ウイルスを得た。
【００２９】
前記ウイルスはＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入した後レトロウイルスが導入された細胞株のみを選別培養してヒトアンジオスタチンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を製造した。これと同様な方法に従って、ヒトエンドスタチンタンパク質およびマウス血小板因子−４タンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３ 細胞株をそれぞれ製造した。
【００３０】
本発明の他の実施例では、抗血管新生タンパク質、具体的には、前記ヒトアンジオスタチンタンパク質、ヒトエンドスタチンタンパク質およびマウス血小板因子−４タンパク質のそれぞれを発現する細胞株を用いる遺伝子治療によって関節炎治療効果が得られるかどうかを確認した。
【００３１】
具体的には、コラーゲン−誘導関節炎マウスモデルにおいて肉眼所見で何ら炎症症状を示さないマウスを対象に遺伝子治療法を行った。すなわち、関節炎マウスの後足の膝関節部位にＰＢＳと混合した抗血管新生タンパク質生産ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植し、関節部位腫脹、関節部位滑膜細胞の増殖程度、軟骨損傷度および関節部位炎症関連サイトカインの濃度を測定して関節炎の進行程度を調査した。
【００３２】
その結果、アンジオスタチン産生ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合、ＰＢＳのみを注射したかＭＴ５ベクターのみを送達した細胞株を移植した対照群に比べて、足首関節部位の腫脹程度は対照群の４７％または６７％に比べて２７％と著しく減少し、かなりの濃度のＩＬ−１を示す頻度も著しく減少したことを確認した。また、膝関節部位における滑膜細胞の肥厚化程度および軟骨組織の損傷程度も著しく減少することが分かった。さらに、エンドスタチン生産ＮＩＨ３Ｔ３細胞株および血小板因子−４生産ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合も前記アンジオスタチン生産ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合と類似する結果を示すことを確認することにより、本発明の抗血管新生遺伝子を用いた遺伝子治療法が関節炎の発生抑制および治療に効果的であることが分かった。
【００３３】
本発明のまた他の実施例では、治療効果の持続性を測定したが、１回の注入で治療後１４日間治療効果が持続することが分かった。
【００３４】
一方、抗血管新生タンパク質をコードするＤＮＡをウイルスベクターに挿入する場合、本発明の抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物は前記組換えＤＮＡを含むウイルス粒子または前記ウイルス粒子を用いて形質導入された細胞株を製造した後、これを遺伝子治療に用いられる担体と混合することにより製造できる（Ｃｒｙｓｔａｌ ＲＧ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ８：４２−５１， １９９４）。
【００３５】
遺伝子治療に用いられる担体は、注射剤において通常用いられるいずれの担体をも使用し得る。たとえば、担体は、蒸留水、塩化ナトリウム溶液、塩化ナトリウムおよび無機塩の混合物またはそれと類似する混合物、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンのようなアミノ酸溶液、有機酸溶液または塩溶液およびグルコース溶液の混合およびそれと類似する溶液などを含む。また、注射剤は、通常の方法で浸透圧調節剤、ｐＨ調整剤、胡麻油や豆油のような植物性油、またはレシチン、非イオン性界面活性剤のような界面活性剤を前記担体に添加して溶液、懸濁液またはコロイド溶液の形に製造できる。このような注射剤は粉末、凍結乾燥の形に製造し、使用直前に溶解して使用してもよい。
【００３６】
本発明の抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物は、固相の場合、遺伝子治療直前に必要に応じて予め滅菌した担体に溶解して使用するか、液相の場合、別途の処理なしにそのまま使用できる。
【００３７】
本発明の抗関節炎遺伝子治療用医薬組成物は、有効成分を基準として患者の関節炎部位に局部的に１ｎｇ〜１ｇの投与量で投与するか、手術後にカテーテルを通じて１回投与する方法によって、標的領域の血管滑膜細胞で吸収されるようにすることができる。
【００３８】
前記の抗血管新生因子を生産するベクターを含む細胞株としては患者の主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）が同一であるか、類似するため移植時拒絶反応が起らないすべての細胞が用いられ、患者自身の滑膜細胞を分離して遺伝子送達に用いることにより、組織移植拒否反応を完全に排除することが好ましい。
【００３９】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を下記実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定しない。
【００４０】
実施例１：抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターの製造
（１−１）ヒトアンジオスタチンの遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターの製造
（１−１−１）ヒトアンジオスタチン遺伝子のクローニング（ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉ ベクターの構築）
ヒトアンジオスタチン遺伝子は、正常人の包茎包皮繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＦＦ）からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを得た後ＰＣＲを行ってクローニングした。まず、ＨＦＦ細胞からトリゾール（Ｔｒｙｚｏｌ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）法を用いてＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡから逆転写酵素重合反応を用いてｃＤＮＡを得た。その後、前記ｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、配列番号３および配列番号４の合成ヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲによってヒトアンジオスタチン遺伝子を含むＤＮＡ切片を得た。前記ＰＣＲを行うために、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｌ、拡張高性能酵素（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｅｎｚｙｍｅ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）３．５ユニットと酵素用緩衝溶液１０μｌを混合して総量１００μｌの混合溶液を作った後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒で３０サイクルを行った。増幅されたアンジオスタチン遺伝子は配列番号２で表されるヒトプラスミノゲンの９３番目から３６８番目までのアミノ酸をコードするＤＮＡを含む。前記増幅された約８００ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉベクターを製造した（図１参照）。
【００４１】
（１−１−２）シグナル配列の連結およびウイルスベクターＭＴ５−ｈＡＳＴの構築
前記実施例（１−１−１）でクローニングされたヒトアンジオスタチン遺伝子がタンパク質に発現された後細胞外に分泌されるようにするために、シグナルペプチドをコードする塩基配列をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉ ベクターに挿入されたアンジオスタチン遺伝子の上流に機能的に連結した。具体的には、シグナルペプチドとしてヒトプラスミノゲンのアミノ基末端１８個のアミノ酸をコードする塩基配列を製作するために配列番号５および配列番号６の塩基配列を有するヌクレオチドを合成し、前記合成ヌクレオチドを混合して９４℃で１分間放置した後、次いで５０℃で１分３０秒間放置して２つの合成ヌクレオチドが結合され２本鎖ＤＮＡを形成するようにした。図２に示すように、前記２本鎖合成ヌクレオチドは、一方の末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位を有しており、他方の末端にＮｈｅＩ部位を有している。前記塩基配列をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴｉベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＮｈｅＩ部位に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴ ベクターを製造した。その後、前記ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＡＳＴ ベクターをＢａｍＨＩで切断してシグナルペプチドと連結されたヒトアンジオスタチン遺伝子を得、これをＭＴ５ベクター（ＫＣＣＭ−１０２０５）のＢａｍＨＩ部位に挿入してＭＴ５−ｈＡＳＴベクターを製造した（図１参照）。
【００４２】
（１−２）ヒトエンドスタチン遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターの構築
（１−２−１）ヒトエンドスタチン遺伝子のクローニング（ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴｉ ベクターの構築）
ヒトエンドスタチン遺伝子は、ヒト包茎包皮繊維芽細胞からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを得た後ＰＣＲを行ってクローニングした。配列番号９および配列番号１０の合成ヌクレオチドをプライマーとして用いたことを除いては、前記実施例（１−１−１）と同様な方法および同様なＰＣＲ条件で行ってヒトエンドスタチン遺伝子を含むＤＮＡ切片を得た。増幅されたエンドスタチン遺伝子は配列番号８で表されるヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ ＸＶＩＩＩ）の１３３４番目から１５１６番目までのアミノ酸をコードするＤＮＡを含む。前記増幅された約５５０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴｉベクターを製造した。
【００４３】
（１−２−２）シグナル配列の連結およびウイルスベクターＭＴ５−ｈＥＳＴの構築
前記実施例（１−２−１）でクローニングされたヒトエンドスタチン遺伝子がタンパク質に発現された後細胞外に分泌されるようにするために、シグナルペプチドをコードする塩基配列をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴｉベクターに挿入されたエンドスタチン遺伝子の上流に機能的に連結した。具体的には、シグナルペプチドとしてマウス免疫グロブリンカッパ鎖（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐａ ｃｈａｉｎ）のアミノ基末端２５個のアミノ酸をコードする塩基配列を得るためにｐＳｅｃＴａｇプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１１および配列番号１２の合成ヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲを行うために、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｌ、拡張高性能酵素（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｅｎｚｙｍｅ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）３．５ユニットと酵素用緩衝溶液１０μｌを混合して総量１００μｌの混合溶液を作った後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒で３０サイクルを行った。増幅されたマウス免疫グロブリンカッパ鎖のシグナル配列は配列番号１３で表される。前記増幅された約１２０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ＳｉｇＰｅｐベクターを製造した。その後、前記ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴｉベクターをＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで切断してエンドスタチン遺伝子を得た後、ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ＳｉｇＰｅｐプラスミドのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴを製造した。次いで、前記ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｈＥＳＴプラスミドをＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩで切断してシグナル配列と連結されたヒトエンドスタチン遺伝子を得、これをＭＴ５ベクター（ＫＣＣＭ−１０２０５）のＢａｍＨＩ部位に挿入してＭＴ５−ｈＥＳＴベクターを構築した。
【００４４】
（１−３）マウス血小板因子−４の遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターの製造
（１−３−１）マウス血小板因子−４遺伝子のクローニング（ｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｍＰＦ４ ベクターの構築）
マウス血小板因子−４遺伝子はＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ， Ｈａｍａｍａｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）の脾臓からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを得た後ＰＣＲを行ってクローニングした。まず、マウスの脾臓組織からトリゾール（Ｔｒｙｚｏｌ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）法を用いてＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡから逆転写酵素重合反応を用いてｃＤＮＡを得た。その後、前記ｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、配列番号１５および配列番号１６の合成ヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを通じてマウス血小板因子−４遺伝子を含むＤＮＡ切片を得た。前記ＰＣＲを行うために、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｌ、拡張高性能酵素（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｅｎｚｙｍｅ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）３．５ユニットと酵素用緩衝溶液１０μｌを混合して総１００μｌの混合溶液を作った後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で１分３０秒で３０サイクルを行った。増幅された血小板因子−４遺伝子は配列番号１４で表される。前記増幅された約３８０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）に挿入してｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｍＰＦ４ベクターを構築した。
【００４５】
（１−３−２）レトロウイルスベクターＭＴ５−ｍＰＦ４の製造
前記実施例（１−３−１）で製造されたｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ−ｍＰＦ４ ベクターをＥｃｏＲＶで切断して血小板因子−４遺伝子の塩基配列を得た後、これをＢａｍＨＩで切断し、クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）で処理して平滑末端化（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）されたＭＴ５ベクター（ＫＣＣＭ−１０２０５）に挿入してＭＴ５−ｍＰＦ４ ベクターを製造した。
【００４６】
実施例２：抗血管新生タンパク質を発現する細胞株の製造
（２−１）ヒトアンジオスタチンを発現する細胞株の製造
ヒトアンジオスタチンを発現する細胞株を製造するために、前記ＭＴ５−ｈＡＳＴ ベクターを含むレトロウイルスを生産した。まず、前記実施例（１−１−２）で製造したＭＴ５−ｈＡＳＴベクターＤＮＡをマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ； ＭＬＶ）のｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミド（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ ａｍｐｈｏ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃６１６１； ＴＡＫＡＲＡ ＳＨＵＺＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．， ＳＨＩＧＡ， Ｊａｐａｎ）とともに２９３Ｔ細胞に形質移入した後８時間後新たな培地に取り替えた。４８時間後培養液を０．４５μｍのろ紙で濾過して無細胞ウイルスを得た。
【００４７】
前記で生産したＭＴ５−ｈＡＳＴレトロウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）に形質導入した後２４時間後から１４日間Ｇ４１８（１μｇ／μｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）で処理してレトロウイルスが導入された細胞株のみを選別した。以上のように選別培養された細胞群を得ることによってヒトアンジオスタチンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を製造した。
【００４８】
（２−２）ヒトエンドスタチンを発現する細胞株の製造
ＭＴ５−ｈＡＳＴベクターの代わりに実施例（１−２−２）で製造したＭＴ５−ｈＥＳＴ ベクターを用いた以外は、前記実施例（２−１）と同様な方法でヒトエンドスタチンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を製造した。
【００４９】
（２−３）マウス血小板因子−４を発現する細胞株の製造
ＭＴ５−ｈＡＳＴベクターの代わりに実施例（１−３−２）で製造したＭＴ５−ｍＰＦベクターを用いたこと以外は、前記実施例（２−１）と同様な方法で血小板因子−４タンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を製造した。
【００５０】
実施例３：マウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗血管新生因子を用いた遺伝子治療法の治療効果
（３−１）コラーゲン誘導関節炎マウスモデルの製造
マウスコラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ＣＩＡ）モデルはヒトの慢性関節リウマチと類似する特徴を有する自己免疫疾患系列の関節炎モデルである。コラーゲン誘導性関節炎モデルは次のような方法で製造した。ウシのＩＩ型コラーゲン（ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ， Ｃｈｏｎｄｒｅｘ， ＷＡ， ＵＳＡ）１００μｇをフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）に混合してエマルジョン化した後、前記エマルジョン化されたコラーゲン溶液を９〜１０週齢のＤＢＡ／１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｍａｉｎｅ， ＵＳＡ）の尻尾部位に皮内注射して免疫化した。１次免疫後２１日目にウシのＩＩ型コラーゲン１００μｇを尻尾部位に皮内注射して２次免疫反応を誘導した。通常、免疫後４週間が経過すると、関節炎症状が次第に現れる。本実施例では、免疫開始後３０日目の肉眼所見で何ら炎症症状を示さないマウスを対象に遺伝子治療法を行った。
【００５１】
（３−２）関節炎進行程度の測定
関節炎の進行程度を測定するための指標の具体的な判定または測定方法を詳細に説明すると次の通りである。まず、抗血管新生タンパク質（ヒトアンジオスタチン、ヒトエンドスタチン、マウス血小板因子−４）を発現する細胞株を移植した部位である膝関節腔に対しては、組織学的分析を行った。慢性関節リウマチの病理のうち最も重要な点は、関節滑膜細胞の肥厚化とそれによる軟骨組織の非可逆的破壊であると要約できる。前述のような滑膜細胞の肥厚化と軟骨組織損傷の進行を判定するためには組織学的分析が最も有効である。このために、マウスの膝組織を分離した後、１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液（１０％ ｆｏｒｍａｌｉｎ ｉｎ ＰＢＳ）を用いて固定し、１０％  ＥＤＴＡ溶液を用いてカルシウム除去過程（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を経た後パラフィンに包埋した。その後、７μｍの標準正方面切片を作り、ヘマトキシリン／エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ）染色またはサフラニン−Ｏ／ファストグリーン（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ／ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ）染色を行った（Ｂａｋｋｅｒ Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４０：８９３−９００， １９９７； Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：５２１３−５２２０， １９９８）。
【００５２】
滑膜細胞の肥厚化程度は、ヘマトキシリン／エオシン染色の結果に基づいて既存の論文（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ５２１３−５２２０， １９９８； Ｌｕｂｂｅｒｔｓ Ｅｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３： ４５４６−４５５６， １９９９）に記載の基準に従い、正常は０、軽い炎症と微弱な滑膜の肥厚化は１、パンヌスの形成と重症度以上の滑膜肥厚化は２とし、滑膜細胞の肥厚化程度が２以上の場合を膝に関節炎が発生したと判定した。
【００５３】
軟骨損傷の程度は、サフラニン−Ｏ／ファストグリーン染色の結果に基づいて既存の論文（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ Ｅｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：４５４６−４５５６， １９９９）に記載の基準に従い、正常は０、軟骨細胞の空胞化（ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）およびプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）の僅かな損失は１、前記１の症状に加えて軟骨び爛（ｅｒｏｓｉｏｎ）が観察されると２、２個所以上の軟骨び爛および軟骨下層（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ ｌａｙｅｒ）の破壊は３とした。このうち２以上を膝に関節炎が発生したと判定した。
【００５４】
これに加えて、関節部位の血管生成程度は血管内皮細胞の表面タンパク質であるＣＤ３１に対する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＵＳ）を用いた免疫組織染色法を行って調査した（Ｘｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ６３：１０３−１０９， １９９８）。
【００５５】
足首部位の関節炎進行は関節部位腫脹のような肉眼的所見と炎症関連サイトカインの発現量のような免疫学的所見で判断した。関節部位腫脹は肉眼所見に基づいて既存の論文（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：５２１３−５２２０， １９９８）に記載の基準に従い、正常は０、腫脹および微弱な紅斑は１、顕著な紅斑は１、顕著な紅斑および腫脹は２、創傷を伴う甚だしい水腫は３とし、このうち２以上の場合を足首に関節炎が発生したと判定し、３以上の場合は重症関節炎と判定した。炎症関連サイトカインの検出は関節炎進行時重要な役割を果すことが知られているマウスインターロイキン−１の発現量を市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従って測定した。関節組織タンパク質１ｇ当たり１０ｎｇ以上のインターロイキン−１が現れる場合を関節炎発生と分類した。
【００５６】
（３−３）遺伝子治療法の実施および実験結果の分析
（３−３−１）ヒトアンジオスタチンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合
１群当たり１５匹のマウスを選択した後、１ｘ１０５のアンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を無菌状態のＰＢＳ溶液２５μｌと混合し、これを３０ゲージの注射器を用いてマウスの膝関節腔内に注入することにより前記細胞株を移植した。一つの陰性対照群にはＭＴ５ベクターのみを送達したＮＩＨ３Ｔ３を移植し、他の陰性対照群にはＰＢＳのみを注射した。その後関節炎進行推移を観察し、前記細胞株を移植した後１０日目に関節部位腫脹（ｊｏｉｎｔ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）のような肉眼的所見、関節部位滑膜細胞の肥厚化程度、軟骨損傷度測定のような組織学的所見、関節部位炎症関連サイトカインレベルのような免疫学的所見などを調査して関節炎の進行程度を測定した。また、関節部位の血管生成程度を免疫組織染色法を用いて調査した。その結果を下記表１、図３、図４および図５に示す。
【００５７】
【表１】
2004517117.tif 000003
【００５８】
前記表１から判明したように、マウスの後足の足首関節部位の腫脹（ｊｏｉｎｔ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）程度を調査した結果、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合、対照群に比べて腫脹程度が著しく低かった。すなわち、腫脹程度に基づいて関節炎発生率を調査した場合、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合の関節炎発生率は２７％であるのに対し、対照群細胞株を移植した場合やＰＢＳのみを注入した場合の関節炎発生率は各々６７％と４７％であった。これらの結果から、アンジオスタチンを発現する細胞における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。
【００５９】
また、マウスの後足の膝関節部位の滑膜細胞肥厚化程度を調査した結果、図３に示すように、アンジオスタチンを発現する細胞を膝に移植した場合は対照群に比べて滑膜細胞の成長が著しく減少した。すなわち、滑膜細胞の肥厚化程度に基づいて関節炎発生率を調査したとき、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合は４７％である反面、対照群細胞株を移植した場合は９３％、ＰＢＳのみを注入した場合は６５％であった。これらの結果から、アンジオスタチンを発現する細胞における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。
【００６０】
また、マウスの後足の膝関節部位軟骨組織の損傷程度を調査した結果、図４に示すように、アンジオスタチンを発現する細胞を膝に移植した場合は対照群に比べて軟骨組織の損傷が著しく減少した。すなわち、軟骨組織の損傷程度に基づいて関節炎発生率を調査したとき、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合は３３％であるのに対し、対照群細胞株を移植した場合は６７％、ＰＢＳのみを注入した場合は５３％であった。これらの結果から、アンジオスタチンを発現する細胞における軟骨組織損傷程度が著しく減少したことが確認できた。
【００６１】
なお、マウスの後足の膝関節部位の血管生成程度を血管内皮細胞の表面タンパク質であるＣＤ３１に対する抗体を用いて免疫組織染色法を行って調査した結果、図５に示すように、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合は対照群細胞株株を移植した場合に比べて血管生成程度が著しく減少した。
【００６２】
一方、マウスの後足の足首関節部位のＩＬ−１の濃度は、アンジオスタチンを発現する細胞を同じ足の膝に移植した場合、対照群に比べて著しく低かった。すなわち、１ｇ当たり１０ｎｇ以上のＩＬ−１を示す頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を調査した結果、アンジオスタチンを発現する細胞を移植した場合の頻度は２７％、対照群細胞株を移植した場合は６７％、ＰＢＳのみを注入した場合は４１％であった。これらの結果から、アンジオスタチンを発現する細胞におけるかなりの濃度のＩＬ−１を示す頻度が著しく減少したことが確認できた。
【００６３】
以上の結果を総合するとき、アンジオスタチンを発現する細胞を関節炎が発生した膝部位に移植することにより、膝関節だけでなく、膝と同じ足の足首関節部位における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。このような結果は、膝関節のような大きい関節に対して遺伝子治療を施すと、関節部位の間に連結された体液の流れに沿って炎症誘発または炎症抑制因子が移動することにより、同じ足の足首のような小さい関節においても治療効果を示し得ることを示す。
【００６４】
（３−３−２）ヒトエンドスタチンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合
１群当たり１５匹のマウスを選択した後、１ｘ１０５のヒトエンドスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を無菌状態のＰＢＳ溶液２５μｌと混合し、これを３０ゲージの注射器を用いてマウスの膝関節腔内に注入することにより前記細胞株を移植した。陰性対照群にはＭＴ５ベクターのみを伝達したＮＩＨ３Ｔ３を移植した。その後、関節炎の進行推移を観察し、関節部位腫脹（ｊｏｉｎｔ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）のような肉眼的所見を調査した。その結果を下記表２に示す。
【００６５】
【表２】
2004517117.tif 000004
【００６６】
前記表２から判明したように、マウスの後足の足首関節部位の腫脹程度を調査した結果、エンドスタチンを発現する細胞を移植した場合、対照群に比べて腫脹程度が著しく低かった。すなわち、腫脹程度を基準として関節炎発生率を調査した場合、エンドスタチンを発現する細胞を移植した場合の関節炎発生率は２３％である反面、対照群細胞株を移植した場合の関節炎発生率は７５％であった。これらの結果から、エンドスタチンを発現する細胞における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。また、このような結果は、エンドスタチンを用いた遺伝子治療法が関節炎の発生を効果的に抑制できることを示す。
【００６７】
（３−３−３）マウス血小板因子−４タンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合
１群当たり１５匹のマウスを選択した後、１ｘ１０５の血小板因子−４を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を無菌状態のＰＢＳ溶液２５μｌと混合し、これを３０ゲージの注射器を用いてマウスの膝関節腔内に注射することにより前記細胞株を移植した。陰性対照群には、ＭＴ５ベクターのみを送達したＮＩＨ３Ｔ３を移植した。その後、関節炎の進行推移を観察し、関節部位腫脹のような肉眼的所見、関節部位滑膜細胞の増殖程度、軟骨損傷度測定のような組織学的所見、関節部位炎症関連サイトカインレベルのような免疫学的所見などを調査して関節炎の進行程度を測定した。その結果を下記表３に示す。
【００６８】
【表３】
2004517117.tif 000005
【００６９】
前記表３から判明したように、マウスの後足の足首関節部位の腫脹程度を調査した結果、血小板因子−４を発現する細胞を移植した場合、対照群に比べて腫脹程度が著しく低かった。すなわち、腫脹程度を基準として関節炎発生率を調査した場合、血小板因子−４を発現する細胞を移植した場合の関節炎発生率は２９％である反面、対照群細胞株を移植した場合の関節炎発生率は６４％であった。これらの結果から、血小板因子−４を発現する細胞における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。
【００７０】
なお、マウスの後足の膝関節部位の滑膜細胞増殖程度を調査した結果、血小板因子−４を発現する細胞を膝に移植した場合、対照群に比べて滑膜細胞の成長が著しく減少した。具体的に、滑膜細胞の肥厚化程度を基準として関節炎発生率を調査したとき、血小板因子−４を発現する細胞を移植した場合は４３％であるのに対し、対照群細胞株を移植した場合は７７％であった。これらの結果から、血小板因子−４を発現する細胞における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。
【００７１】
なお、マウスの後足の膝関節部位の軟骨組織損傷程度を基準として関節炎発生率を調査したとき、血小板因子−４を発現する細胞を移植した場合は３６％であるのに対し、対照群細胞株を移植した場合は５４％であった。これらの結果から、血小板因子−４を発現する細胞における軟骨組織損傷程度が著しく減少したことが確認できた。
【００７２】
一方、マウスの後足の足首関節部位のＩＬ−１の濃度は、血小板因子−４を発現する細胞を同じ足の膝に移植した場合、対照群に比べて著しく低かった。具体的に、関節組織１ｇ当たり１０ｎｇ以上のＩＬ−１を示す頻度を調査した結果、血小板因子−４を発現する細胞を移植した場合の頻度は２９％で、対照群細胞株を移植した場合は６４％であった。これらの結果から、かなりの濃度のＩＬ−１を示す頻度が著しく減少したことが確認できた。
【００７３】
以上の結果を総合するとき、血小板因子−４を発現する細胞を関節炎が発生した膝部位に移植することにより、膝観察だけでなく、膝と同じ足の足首関節部位における関節炎発生率が著しく減少したことが確認できた。
【００７４】
実施例４：治療効果の持続性測定
アンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株の治療効果の持続性を測定するために、１ｘ１０５のＮＩＨ３Ｔ３細胞株を無菌状態のＰＢＳ溶液２５μｌと混合し、これを３０ゲージの注射器を用いてマウスの膝関節腔内に注入することにより前記細胞株を移植した。対照群にはＭＴ５ベクターのみを伝達したＮＩＨ３Ｔ３を移植した。
【００７５】
移植後２０日まで毎３日または４日ごとに足における重症関節炎（足首腫脹評価を基準として３以上）発生率を測定した。その結果、図６に示すように、アンジオスタチンを発現する１ｘ１０５のＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した場合、移植後１４日まで重症関節炎発生が抑制されたことが分かる（Ｐ＜０．０５）。このような結果から、１回の注入で治療効果が治療後１４日間保持されることが分かる。
【００７６】
産業上利用可能性
本発明によって提供される抗血管新生因子をコードする遺伝子を用いた慢性関節リウマチに対する遺伝子治療法は、腫脹の減少など肉眼的所見だけでなく、炎症関連サイトカインの減少、滑膜組織の肥厚化抑制、軟骨組織の損傷減少など免疫学的および組織学的所見においても関節炎の進行を著しく抑制できる。したがって、現在まで効果的な治療法が示されていない関節炎の治療に効果的に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトアンジオスタチン遺伝子をＰＣＲを通じてクローニングし、これをｐＧＥＭ Ｔ ｅａｓｙ ベクターに挿入してｐＧＥＭ Ｔ−ｈＡＳＴｉベクターを製造する過程と、ＰＣＲを通じて得られたシグナル配列を前記ベクターに挿入されたアンジオスタチン遺伝子の上流に機能的に連結してｐＧＥＭ Ｔ−ｈＡＳＴベクターを製造する過程および前記シグナル配列と結合されたアンジオスタチン遺伝子をレトロウイルスＭＴ５ベクターのＢａｍＨＩ位置に挿入してＭＴ５−ｈＡＳＴベクターを製造する過程を示す模式図である。
【図２】ヒトプラスミノゲンのアミノ基末端１８個のアミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする遺伝子を得るために、配列番号５と配列番号６の合成ヌクレオチドを製作し、前記合成ヌクレオチドをハイブリダイゼーションによって製造される２本鎖ＤＮＡの構造およびそれからコードされているシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】アンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３ 細胞株（Ｂ）およびアンジオスタチン遺伝子を含まないウイルスベクターＭＴ５のみで形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３対照群細胞株（Ａ）をそれぞれ注入したコラーゲン−誘導関節炎モデルマウスにおける膝関節部位をヘマトキシリン／エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ）で染色して滑膜細胞肥厚化程度を調査した写真である。
【図４】アンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株（Ｂ）およびアンジオスタチン遺伝子を含まないウイルスベクターＭＴ５のみで形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３対照群細胞株（Ａ）をそれぞれ注入したコラーゲン−誘導関節炎モデルマウスにおける膝関節部位をサフラニン−Ｏ／ファストグリーン（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ／ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ）で染色して軟骨損傷程度を調査した写真である。
【図５】アンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株（Ｂ）およびアンジオスタチン遺伝子を含まないウイルスベクターＭＴ５のみで形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３ 対照群細胞株（Ａ）を各々注入したコラーゲン−誘導関節炎モデルマウスにおける膝関節部位を血管内皮細胞の表面タンパク質であるＣＤ３１に対する抗体を用いた免疫組織染色法で染色して血管生成程度を調査した写真である。
【図６】アンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株の治療効果持続性測定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
■：対照群
・：１ｘ１０５のアンジオスタチンを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を移植した群＊ ：Ｐ＜０．０５
＊＊ ：Ｐ＜０．０６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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