(57)【要約】本発明は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβを含む結晶に関する。本発明はまた、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβならびにＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡとの相互作用の構造モデル、ならびにＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに結合することができ、および／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドデザインの改良手段に関する。
2004507449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインを含む結晶。
【請求項２】
ＣＢＦβを含む結晶。
【請求項３】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインと、ＣＢＦβと、任意選択的に同族ＤＮＡ結合部位との複合体を含む、請求項１または請求項２に記載の結晶。
【請求項４】
Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２およびＲｕｎｔドメインホモ二量体の２つの二量体として配置された、６つのＲｕｎｔドメインサブユニットおよび４つのＣＢＦβサブユニットを含む請求項３に記載の結晶。
【請求項５】
ＣＢＦβとのヘテロ二量体形成に関与するＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン領域を含む結晶。
【請求項６】
ループβＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、βＢ−Ｃ、およびβＣ−ＤならびにストランドβＣ、βＦ、およびβＧを含む、請求項５に記載の結晶。
【請求項７】
ＡＭＬ１とのヘテロ二量体形成に関与するＣＢＦβ領域を含む結晶。
【請求項８】
アミノ末端ループおよびヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１−Ｈ３；ストランドβ２、β３および連結ループβ２−β３；ストランドβ４および少なくとも一部のループβ４−β５の二次構造エレメントを含む請求項７に記載の結晶。
【請求項９】
ヘテロ二量体形成に関与する残基が表３に記載のものである請求項５〜８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１０】
前記結晶がＰ２Ｉ対称を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１１】
前記結晶が、ａ＝１０３．２Å、ｂ＝７９．４Å、ｃ＝１３０．１Åの直径を有する単位格子を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１２】
表４または表５に記載された構造座標を有する結晶。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結晶を使用して作製した、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインの少なくとも一部および／またはＣＢＦβの少なくとも一部についてのモデル。
【請求項１４】
請求項１３に記載のモデルの使用を含む、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに結合することができるリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結晶を使用して作製した、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインによるＤＮＡ結合モデル。
【請求項１６】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン上へのＳｔａｔ３β／ＤＮＡ複合体の座標の最小二乗法の重ね合わせによって作製される請求項１５に記載のモデル。
【請求項１７】
請求項１３または請求項１４に記載のモデルの使用を含む、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の結晶構造；請求項１３に記載の少なくとも一部のＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／または少なくとも一部のＣＢＦβについてのモデル；または請求項１５または請求項１６に記載のＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインによるＤＮＡ結合モデルが保存された、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１９】
請求項１４または請求項１７に記載の方法によって同定されたリガンド。
【請求項２０】
ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのループβＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、βＢ−Ｃ、およびβＣ−ＤならびにストランドβＣ、βＦ、およびβＧと相互作用することができる請求項１４に記載の方法によって同定されたリガンド。
【請求項２１】
表３に記載のＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインの残基と相互作用することができる請求項２０に記載のリガンド。
【請求項２２】
ＡＭＬ１遺伝子の染色体転座に起因するキメラ融合タンパク質と相互作用することができる請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２３】
アミノ末端ループおよびヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１−Ｈ３；ストランドβ２、β３、および連結ループβ２−β３；およびストランドβ４および少なくとも一部のループβ４−β５のＣＢＦβ二次構造エレメントと相互作用することができる請求項１４に記載の方法によって同定されたリガンド。
【請求項２４】
表３に記載のＣＢＦβ残基と相互作用することができる請求項２３に記載のリガンド。
【請求項２５】
ＣＢＦＢ遺伝子の染色体転座に起因するキメラ融合タンパク質と相互作用することができる請求項２３または請求項２４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２６】
ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＡ−ＢおよびＥ’−ＦループおよびＣ末端に結合することができる請求項１７に記載の方法によって同定されたリガンド。
【請求項２７】
前記リガンドの複合体化により、Ｒｕｎｔドメインの高次構造が変化する請求項１７に記載の方法によって同定されるリガンド。
【請求項２８】
前記高次構造の変化により、ＲｕｎｔドメインのＣ末端残基が順序付けられて、βＥ’−Ｆループの方向にβＡ’−βＧ’βシートがシフトする請求項２７に記載のリガンド。
【請求項２９】
前記高次構造の変化により、ＲｕｎｔドメインのＣｙｓ８１の位置がシフトし、Ｔｈｒ１６９および／またはＶａｌ１３７との水素結合相互作用を形成することができる請求項２７または請求項２８に記載のリガンド。
【請求項３０】
前記ＲｕｎｔドメインのＴｙｒ１６２側鎖の安定化により前記高次構造の変化が誘導される請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項３１】
哺乳動物患者の疾患の治療および／または予防のための薬物製造における請求項１９〜３０のいずれか１項に記載のリガンドの使用。
【請求項３２】
ＡＭＬ１および／またはＣＢＦＢ遺伝子が関与する染色体転座に関連する白血病の治療および／または予防のための請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小児急性リンパ芽球性白血病、治療関連白血病、脊髄形成異常、家族性血小板障害（ＦＤＰ）、鎖骨頭蓋骨形成不全（ＣＣＤ）、ならびに骨形成障害および／または造血障害に関連する病態の治療および／または予防のための請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
請求項１９〜３０のいずれか１項に記載のリガンドと、任意選択的に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、またはアジュバント、またはその組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１９〜３０のいずれか１項に記載のリガンドおよび／または請求項３４に記載の医薬組成物を哺乳動物患者に投与するステップを含む疾患の治療方法および／または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβの結晶構造に関する。特に、本発明は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体および三元ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ：ＤＮＡ複合体の結晶構造に関し、ならびにＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに結合できるリガンドを同定するための結晶構造の使用、および／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドを同定するための結晶構造の使用に関する。
【０００２】
［背景］
白血病は、再発性染色体転座の存在によって特徴付けられる（Ｒａｂｂｉｔｔｓ、１９９４）。急性白血病のこれらの染色体のブレークポイントに関連する遺伝子は、正常な発生および白血病誘発において極めて重要な役割を果たすことが示されている転写因子をコードする。コア結合因子（ＣＢＦ）は、このようなファミリーの１つである。これらのヘテロ二量体因子は、ＤＮＡ結合αサブユニットおよびαサブユニットと非常に関連する非ＤＮＡ結合βサブユニットからなる（Ｏｇａｗａら、１９９３ｂ）。全てのαサブユニットは、ＤＮＡ結合およびβサブユニットへのヘテロ二量体形成の両方を媒介するＲｕｎｔドメイン（図２Ｃ）として公知の進化的に保存された１２８アミノ酸領域を共有する。αサブユニットファミリーの「基本メンバー」であるショウジョウバエ遺伝子ｒｕｎｔは、卵割、性決定、および神経発生に必要である。３つの哺乳動物遺伝子は、αサブユニット：ＡＭＬ１／ＣＢＦＡ２／ＰＥＰＢＰ２αＢ（本明細書中で、ＡＭＬ１と呼ぶ）（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９１）、ＡＭＬ２／ＣＢＦＡ３／ＰＥＰＢＰ２αＣ（Ｌｅｖａｎｏｎら、１９９４）、およびＡＭＬ３／ＣＢＦＡ１／ＰＥＢＰ２αＡ／Ｏｓｆ２（Ｏｇａｗａら、１９９３ｂ）（本明細書中で、ＡＭＬ３と呼ぶ）をコードする。たった１つの遺伝子（ＣＢＦＢ）がＣＢＦβと呼ばれる哺乳動物βサブユニット（Ｏｇａｗａら、１９９３ａ）（Ｗａｎｇら、１９９３）をコードすることが知られているが、２つのホモログｂｒｏｔｈｅｒおよびｂｉｇ　ｂｒｏｔｈｅｒがショウジョウバエで同定されている（図２Ｄ）（Ｇｏｌｌｉｎｇら、１９９６）。
【０００３】
ＡＭＬ１遺伝子は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における最も頻繁に必要な細胞遺伝異常の１つである、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）染色体転座から最初にクローニングされ（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９３）、その後小児急性リンパ芽球性白血病に関連する再発性染色体転座ｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）（Ｇｏｌｕｂら、１９９４）（Ｒｏｍａｎａら、１９９５）および治療関連白血病および脊髄形成異常に関連する転座ｔ（３；２１）（ｑ２６；ｑ２２）（Ｎｕｃｉｆｏｒａら、１９９３）に関連することを示した。ＡＭＬ１遺伝子のナンセンス変異、ミスセンス変異、およびフレームシフト変異は、散発性ＡＭＬ（Ｏｓａｔｏら、１９９９）に関連し、ＡＭＬ１の先天性変異については、まれな常染色体優性疾患である家族性血小板障害（ＦＤＰ）に罹患した患者において記載されており、ＡＭＬの発症の先天的傾向が存在する（Ｓｏｎｇら、１９９９）。散発性および先天性障害における疾患関連変異は、ＡＭＬ１のＲｕｎｔドメイン内に群集しており、４５１のうちの残基５０〜１７７に存在する。Ｃ末端は、プロリン−セリン−トレオニンが豊富であり、これは標的遺伝子の転写活性化に必要である。ヒトでは、ＡＭＬ３変異は、鎖骨頭蓋骨形成不全（ＣＣＤ）、骨格形態発生の常染色体優性障害（Ｍｕｎｄｌｏｓら、１９９７）（Ｌｅｅら、１９９７）に関連し、また、多数の点変異は、Ｒｕｎｔドメイン内の障害クラスターに関連する（Ｌｅｅら、１９９７）（Ｑｕａｃｋら、１９９９）（Ｚｈｏｕら、１９９９）。したがって、転写因子のＣＢＦファミリーの保存Ｒｕｎｔドメインは、ヒトの疾患関連変異の鍵となる標的である。
【０００４】
ＣＢＦβをコードする遺伝子であるＣＢＦのβサブユニットはまた、ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）、ｔ（１６；１６）およびｄｅｌ（１６）（ｑ２２）の結果としてＡＭＬの染色体転座に関与し、これらは、ＣＢＦβのＮ末端１６５アミノ酸を、ＡＭＬのＭ４Ｅｏ　Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ（ＦＡＢ）サブタイプ中の平滑筋ミオシン重鎖のＣ末端部分とインフレームで融合させる。同時に、ヘテロ二量体ＣＢＦ転写因子遺伝子ＡＭＬ１およびＣＢＦＢは、ヒト急性白血病で最も頻繁に変異し、ＡＭＬの２５％および小児共通Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病の２０％を占める（Ｌｏｏｋ、１９９７）。ＡＭＬ１およびＣＢＦＢ遺伝子に関連する染色体転座により、新規のキメラ融合タンパク質が産生され、その全てがＣＢＦβとＤＮＡ結合複合体を形成するコアＲｕｎｔドメインを保持する。ＡＭＬ１に関連する染色体転座は、白血病誘発における共通の作用機構を有し得るドミナント転写抑制タンパク質を生成すると考えられる。したがって、ｔ（８；２１）転座は、ＲｕｎｔドメインにＥＴＯ（ＭＴＧ８）コリプレッサーＣ末端を融合させて、ヒストンデアセチラーゼの補充による転写を阻害する（Ｇｅｌｍｅｔｔｉら、１９９８）（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈら、１９９８）；ｔ（１２；２１）は、ＡＭＬ１のＮ末端にＴＥＬ遺伝子由来のリプレッサードメインを融合させて、構成的リプレッサーを産生する（Ｈｉｅｂｅｒｔら、１９９６）。最近のデータも、ｉｎｖ（１６）融合タンパク質産物は、コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａを補強することを明示する（Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈら、１９９９）。
【０００５】
マウスの遺伝子ターゲティングにより、正常な骨形成および造血におけるコア結合因子タンパク質の本質的な役割が明らかとなった。Ａｍｌ３のヌル変異マウスホモ接合性は骨形成を欠くので、Ａｍｌ３は骨芽細胞分化および骨成長に不可欠である（Ｋｏｍｏｒｉら、１９９７）（Ｏｔｔｏら、１９９７）。複合体は胚発生における決定的な造血前駆細胞の出現に不可欠であるので（Ｎｏｒｔｈｒａ、１９９９）、マウスＡｍｌ１またはＣｂｆβをコードする遺伝子のヌル変異により、胎児肝臓由来造血が不全となる（Ｏｋｕｄａら、１９９６）（Ｗａｎｇら、１９９６ｂ）（Ｗａｎｇら、１９９６ａ）。ショウジョウバエでは、Ｂｒｏｔｈｅｒタンパク質とのヘテロ二量体形成を特異的に不活化する変異Ｒｕｎｔタンパク質は、いくつかのインビボ機能アッセイにおいて欠失していた（Ｌｉ　ａｎｄ　Ｇｅｒｇｅｎ、１９９９）。したがって、転写因子のコア結合ファミリーの機能は、ＲｕｎｔドメインのＣＢＦβおよびそのホモログとの相互作用に非常に依存する。
【０００６】
ＡＭＬ１は、モノマーとしてコアＤＮＡ配列ＴＧＴ／ｃＧＧＴに結合し、このＴＧＴ／ｃＧＧＴは、多数の異なるウイルスおよび細胞プロモーターおよびエンハンサー、ならびにＴ細胞レセプターα、β、γ、ＣＤ３ε、ミエロペルオキシダーゼ、好中球エラスターゼ、グランザイムＢ、サイトカインおよびそのレセプターをコードするいくつかの遺伝子に存在する（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９９１）（Ｍａｎｌｅｙら、１９９３）（Ｇｉｅｓｅら、１９９５）（Ｒｏｄａｎ　ａｎｄ　Ｈａｒａｄａ、１９９７）。メチル化およびエチル化干渉実験により、Ｒｕｎｔドメインは、ＤＮＡの主要な溝に結合することが示されている（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９８８）（Ｍｅｌｎｉｋｏｖａら、１９９３）。ＣＢＦβは、少なくとも２つの異なる機構によりＡＭＬ１のＤＮＡ結合活性を増強させる。電気泳動移動性シフトアッセイにより、ＣＢＦβは、Ｒｕｎｔドメインへの配列Ｃ末端およびＮ末端によって媒介される阻害機構の克服によって全長ＡＭＬ１分子のＤＮＡ結合を４０倍増強させることが示されている（Ｋａｎｎｏら、１９９８ａ）。インビトロ実験により、ＡＭＬ１のＲｕｎｔドメインが５０ｎＭの解離定数の高親和性認識部位に結合することが証明された（Ｃｒｕｔｅら、１９９６）。単離ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合はＣＢＦβの添加により５〜６倍に増強するが（Ｏｇａｗａら、１９９３ａ）、エチル化干渉分析ではＤＮＡフットプリントは伸長しない（Ｋａｍａｃｈｉら、１９９０）。ＲｕｎｔドメインＣｙｓ８１は、立体障害に依存しない機構によってＣＢＦβの結合における酸化から保護されている（Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７ａ）。これらのデータから、Ｒｕｎｔドメインは、ＣＢＦβへの結合の際に高次構造が変化して、ＤＮＡ結合が増強し、Ｃｙｓ８１の本来の酸化能力（ｏｘｉｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）が変化することが示唆されるが、これに関する直接的な証拠は依然として得られていない。
【０００７】
ＡＭＬ１およびＣＢＦＢ遺伝子に関する白血病関連染色体転座により、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインがＣＢＦβへのヘテロ二量体形成に能力を保持している融合タンパク質が得られる。この機能はまた、散在性ＡＭＬおよびＦＰＤ／ＡＭＬ系統に関連する多数のＡＭＬの点突然変異によって保持されると予想される。活性ヘテロ二量体は正常な造血に不可欠であるので、変異ＡＭＬ１対立遺伝子のヘテロ二量体形能力は、βサブユニットの活性遺伝子産物への利用可能性が低下し得るので、その転写トランス活性化特性が変化する。ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１融合遺伝子産物が不活性転写複合体中の機能的ＡＭＬ１サブユニットを隔離することができる場合、ヘテロ二量体形成はまた、ＡＭＬのＭ４Ｅｏ　ＦＡＢサブタイプに置ける白血病形質転換のプロセスの基礎をなし得る。
【０００８】
今日まで、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインまたはＣＢＦβは、単独でもヘテロ二量体複合体としてもその結晶構造は得られていなかった。さらに、ＤＮＡとのＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体の相互作用を説明するＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ：ＤＮＡ三元複合体の結晶構造も利用できなかった。
【０００９】
［発明の要旨］
本発明は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインを含む結晶およびＣＢＦβを含む結晶ならびに相互またはＤＮＡとの複合体の結晶構造を提供する。
【００１０】
上記のように、ＡＭＬ１およびＣＢＦβはインビボで二量体を形成して転写因子複合体を生成し、ＡＭＬ１のＲｕｎｔドメインは、βサブユニットへのヘテロ二量体形成を担う。さらなる態様では、本発明は、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインとＣＢＦβとの複合体の結晶構造を提供する。この結晶構造は決定されており、表４に記載する。
【００１１】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体の結晶構造の解明により、ヘテロ二量体形成に関連するＡＮＬ１　ＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβの領域が明らかとなる。さらなる態様では、本発明は、ヘテロ二量体形成に関連するＡＮＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβ領域を含む結晶構造を提供する。
【００１２】
特に、結晶構造により、ヘテロ二量体形成に関連するＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン領域は、ループβＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、βＢ−Ｃ、およびβＣ−ＤならびにストランドβＣ、βＦ、およびβＧを含み、ヘテロ二量体形成に関連するＣＢＦβ領域は、アミノ末端ループおよびヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１−Ｈ３；ストランドβ２、β３、および連結ループβ２−β３；およびストランドβ４およびループβ４−β５の少なくとも一部を含むことが示される。ヘテロ二量体形成に関連するＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβの残基を表３に示す。
【００１３】
ヘテロ二量体複合体の結晶構造により、モデルはＡＭＬ１、ＣＢＦβ、およびヘテロ二量体形成領域を産生することができる。したがって、本発明は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβ相互作用することができるリガンドのスクリーニングに使用することができるモデルを提供する。
【００１４】
本発明は、さらに、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ：ＤＮＡ三元複合体の結晶構造を提供する。このような構造を使用して、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ−ＤＮＡ相互作用（したがって、ＤＮＡ結合の媒介に重要なポリペプチドとＤＮＡとの間の鍵となる相互作用の）モデルを作製することができる。したがって、本発明は、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドのスクリーニングに使用することができるモデルを提供する。このようなリガンドは、例えば、ＡＭＬ１のＣＢＦβに関連する高次構造の変化を誘導または阻害し、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβヘテロ二量体のＤＮＡに誘導された高次構造を調整し、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン常のＤＮＡ結合部位を遮断することができる。
【００１５】
上記のモデルにより、ＤＮＡ相互作用に関連するＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインは、ループＡ’−ＢおよびＥ’−ＦおよびＣ末端を含むことが示される。上記モデルにより、高次構造の変化によって誘導されるＲｕｎｔドメインの構造再配置に関する情報が得られる。特に、高次構造の変化により、ＲｕｎｔドメインのＣ末端残基が順序付けられて、βＥ’−Ｆループの方向にβＡ’−βＧ’βシートが変化する。これはまた、ＲｕｎｔドメインのＣｙｓ８１の位置がシフトし、Ｔｈｒ１６９および／またはＶａｌ１３７との水素結合相互作用を形成することができる。モデルから、ＲｕｎｔドメインのＴｙｒ１６２側鎖を安定化することにより、前記高次構造の変化を誘導すると予想することができる。
【００１６】
本発明はまた、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβまたは上記モデルの結晶構造が保存されたコンピューター読み取り可能な媒体を提供する。
【００１７】
リガンド自体に加えて、本発明はまた、このようなリガンドを含む医薬組成物、このようなリガンドまたは医薬組成物の哺乳動物患者への投与を含む、疾患の治療法および／または予防法を提供する。この方法は、ＡＭＬ１およびＣＢＦＢ遺伝子を含む染色体転座に関連する白血病の治療および／または予防に特に有用であると予想される。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
本発明の１つの態様では、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβおよび／またはＡＭＬ１：ＣＢＦβ二量体に結合したＤＮＡを含む結晶が得られる。
【００１９】
本明細書中で使用される、用語「結晶」は、平面が一定の角度で交差し、化学構成種の規則的構造（内部構造など）が存在する構造（三次元（３Ｄ）固体凝集体）を意味する。したがって、用語「結晶」には、固体物理的結晶形態（実験で調製した結晶など）、結晶構造を基本とした３Ｄモデル、その図（その略図または図式など）、コンピュータのそのデータセットのうちの任意の１つを含み得る。
【００２０】
上記で説明するように、Ｒｕｎｔドメインは、転写因子のＣＢＦファミリーとこのドメイン内の疾患関連変異クラスターの大部分との間で非常に保存されている。Ｒｕｎｔドメインは１２８個のアミノ酸領域にわたり、βサブユニットに対しＤＮＡ結合およびヘテロ二量体形成を共に媒介する。ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインは４５１アミノ酸残基のうち５０〜１７７にわたる。ＡＭＬ１の完全なコード配列（選択的スプライシングによって作製された３つの変種を含む）を利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１７５４、ＡＦ　０２５８４１１、Ｅ０５０３７、およびＤ４３９６７−Ｄ４３９６９）。
【００２１】
ＣＢＦβは、任意の３つのαサブユニット（ＡＭＬ１、ＡＭＬ２、およびＡＭＬ３）に会合するコア結合因子のβサブユニットである。ＣＢＦβの完全な配列は公知である（例えば、Ｏｇａｗａら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９４、３１４〜３３１またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ２０２９８を参照のこと）。
【００２２】
本発明の別の態様では、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインとＣＢＦβとの複合体を含む結晶が得られる。
【００２３】
コア結合因子は、ＤＮＡ結合αサブユニット（ＡＭＬ１など）と非ＤＮＡ結合βサブユニット（ＣＢＦβ）とのヘテロ二量体として機能する。形成前のヘテロ二量体の結晶化によって本発明のこの態様の結晶を作製して、αおよびβサブユニットを同時結晶化することができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、非対称性結晶単位は、Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２およびＲｕｎｔドメインホモ二量体（図１に記載）の２つの二量体として配置された６つのＲｕｎｔドメインサブユニットおよび４つのＣＢＦβサブユニットを含む。ａ＝１０３．２Å、ｂ＝７９．４Å、ｃ＝１３０．１Åの直径を有する単位格子を含むＰ２１対称性を有する結晶が最も好ましい。結晶化に使用した特定の条件に依存して、単位格子を特徴付ける上記のパラメータは、限られた範囲内で変化し得る（例えば、ａ、ｂ、およびｃが５まで変化し得る）。
【００２５】
本発明のこの態様の非常に好ましい実施形態では、結晶は表４に記載の構造座標を有する。
【００２６】
本明細書中で使用される、用語「構造座標」は、軸システムに関して１つまたは複数のアミノ酸残基の位置を定義した一組の値をいう。
【００２７】
本発明はまた、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβの結晶構造を提供する。結晶構造は、任意の公知の方法（例えば、Ｘ線回折および多波長異常分散法（ＭＡＤ））によって解明することができる。
【００２８】
本発明のＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体の結晶構造は、各サブユニットの全構造およびヘテロ二量体形成に関連する各サブユニットについての二次構造の特定のエレメントについての情報を提供する。この態様では、結晶構造は、ヘテロ二量体形成に重要であるＡＭＬ１領域にはβストランド間の種々のループ（すなわち、βＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、βＢ−Ｃ、およびβＣ−Ｄ）および多数のβストランド（βＣ、βＦ、およびβＧ）が含まれることを示す。ＣＢＦβに関して、以下に重要な二次構造エレメントを示す：アミノ末端ループおよびαヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１およびαヘリックスＨ３；βストランドβ２、β３、および連結ループβ２−β３；およびβストランドβ４およびループβ４−β５。
【００２９】
本明細書中で使用される、用語「αヘリックス」は、ヘリックスの連続ターンがアミド（ペプチド）結合間の水素によって相互に保持され、任意の所与の残基のカルボニル基が鎖中のその残基の後の第３の残基のイミノ基と水素結合しているポリペプチド鎖のらせんまたは渦巻き状の配置を意味する。これは、主鎖のペプチド結合のカルボニル基およびアミド基の全ての場合である。典型的には、αヘリックスはターンあたり３．６個の残基を有し、ヘリックス軸に沿ったトランスロケーションまたはピッチは、残基あたり１．５Åおよびターンあたり５．４Åである。ヘリックスは、左巻きまたは右巻きであってよく、後者がより一般的である。αヘリックスは、球状タンパク質の疎水性コア内のポリペプチド鎖を導入した二次構造の２つの塩基性エレメントの１つである。他の塩基性エレメントは、βストランドである。
【００３０】
βストランドは、通常、５〜１０残基長であり、構造的に広く認められたラマチャンドランプロットの四分円の左上の領域内のφ、Ψ角でほとんど完全に伸長した高次構造に存在する。これらのβストランドは、１つのβストランドのＣ’Ｏ基と隣接するβストランド上のＮＨ基およびその逆との間に水素結合を形成することができるように互いに隣接して配列している。平行および逆平行βシートを、βシート平面の少し上および下にＣα原子で首尾よく「ひだがついた」いくつかのこのようなβストランドから形成することができる。側鎖は、βストランド内で側鎖がβシートの上下に二者択一的に指し示されるようにこのパターンに続く。
【００３１】
ヘテロ二量体形成に関連するアミノ酸残基（結晶構造から解明）を、表３に示す。
【００３２】
公知のモデリング技術の使用によって、本発明の結晶構造を使用してＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインの少なくとも一部および／またはＣＢＦβの少なくとも一部ならびに／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合についてのモデルを作製することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「モデリング」には、原子構造情報および相互作用モデルに基づいた分子構造および／または機能の定量的および定性的分析が含まれる。用語「モデリング」には、従来の数値ベースの分子力学およびエネルギー最小モデル、相互作用性コンピュータグラフィックモデル、修正分子機械モデル、ディスタンスジオメトリーモデルおよび他の構造ベースの制限モデルが含まれる。
【００３４】
本発明の結晶構造を使用して、三次元（３Ｄ）構造モデルなどの構造モデル（またはその図）を作製することができる。あるいは、結晶構造を使用して、構造についてのコンピュータモデルを作製することができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインによるＤＮＡ結合を、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインへのＳＴＡＴ３β／ＤＮＡ同時結晶複合体の座標の最小二乗の重ね合わせによって作製する。ＳＴＡＴ３βは、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインが密接に関わる転写因子である。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、ＡＭＬ１：ＣＢＦβ：ＤＮＡ三元複合体の結晶構造を提供する。好ましい態様では、結晶は、表５に記載の座標を有する。
【００３７】
この構造を使用して、上記のように作製したモデルの精度を評価することができる。さらに、三元複合体のさらに正確な図は、座標に直接的に基づくので、上記のモデルはまったく必要ない。
【００３８】
本発明の別の態様では、上記のモデルおよび構造を使用して、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβを結合することができ、そして／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドをスクリーニングすることができる。
【００３９】
スクリーニングには、固体３Ｄスクリーニングシステムまたはコンピュータスクリーニングシステムを使用することができる。これらのシステムを使用して、試験化合物をスクリーニングして、コンピュータまたは手動でのドッキングによりＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβおよび／またはＤＮＡと空間的および優先的に相互作用する化合物を見出すことができる。
【００４０】
本明細書中で使用される、用語「試験化合物」は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβとの相互作用能力および／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインＤＮＡ結合能力の調整能力を試験することができる化合物を意味する。試験化合物を、ペプチドおよび他の化合物（小さな有機分子および特に新規のリード化合物など）を含み得る化合物ライブラリーからデザインするか得ることができる。例として、試験化合物は、天然物、生体高分子、または生体材料（細菌、真菌、動物（特に哺乳動物）細胞または組織）から作製した抽出物、有機または無機分子、合成試験化合物、半合成試験化合物、構造または機能模倣物、ペプチド、ペプチド模倣物、誘導試験化合物、完全なタンパク質から切断したペプチド、または１つまたは複数の合成ペプチド（例として、ペプチド合成機または組換え技術またはその組み合わせなど）、組換え試験化合物、天然または非天然試験化合物、融合タンパク質またはその等価物および変異体、その誘導体または組み合わせであり得る。
【００４１】
したがって、本発明の結晶構造由来の構造情報は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβと相互作用することができ、そして／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができる潜在的リガンドのデザインに有用であり、本発明のモデルは、このようなリガンドがＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβの構造および／または機能を有する効果の試験に有用である。本発明もまた、このような方法を使用して同定されたリガンドに関する。
【００４２】
本明細書中で使用される、用語「リガンド」は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに結合することができる試験化合物をいう。好ましくは、リガンドは、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインとＣＢＦβとの間の相互作用を調整し、および／またはＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整する。
【００４３】
リガンドは、天然または合成であり得る。用語「リガンド」はまた、化学合成リガンドをいう。
【００４４】
１つの態様では、同定されたリガンドは、他の化合物の開発のためのリガンドモデル（例えば、テンプレート）として作用することができる。
【００４５】
ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインまたはＣＢＦβのヘテロ二量体形成領域と相互作用するリガンドは、ヘテロ二量体形成能力に影響を与え得る。このようなリガンドは、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのループβＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、βＢ−Ｃ、およびβＣ−ＤおよびストランドβＣ、βＦ、およびβＧのいくつかまたは以下のＣＢＦβの二次構造：アミノ末端ループおよびヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１−Ｈ３；ストランドβ２、β３、および連結ループβ２−β３；およびストランドβ４およびループβ４−β５の少なくともいくつかと相互作用し得る。このようなリガンドは、表３に記載のヘテロ二量体形成残基の少なくともいくつか（例えば、ヘテロ二量体形成能力に影響を与える十分なヘテロ二量体形成残基数）と相互作用することができる。さらなるリガンド相互作用部位は、以下の実施例から明らかである。
【００４６】
上記で説明したように、ＡＭＬ１およびＣＢＦＢを含む白血病関連染色体転座に起因する融合タンパク質は、ヘテロ二量体形成能力を保持している。したがって、治療的観点から、変異へテロ二量体にも結合することができる活性へテロ二量体のヘテロ二量体形成領域に結合するリガンドが好ましい。
【００４７】
ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合能力を調整することができるリガンドは、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＡ’−ＢおよびＥ’−ＦループおよびＣ末端に結合することができる。
【００４８】
上記で説明したように、ＣＢＦβの結合により、ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合が増強する。本発明の結晶構造は、これがＲｕｎｔドメインの高次構造の変化に起因し、結合親和性の増加を担うＡＭＬ１ドメインの構造再配置についての情報が得られるという理論を支持する。本発明のリガンドは、Ｒｕｎｔドメインの高次構造変化の誘導によるＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合親和性を増強することができる。
【００４９】
高次構造の変化は、例えば、ＲｕｎｔドメインのＣ末端残基が順序付けられて、βＥ’−Ｆループの方向にβＡ’−βＧ’βシートが変化し、および／またはＲｕｎｔドメインのＣｙｓ８１の位置がシフトし、Ｔｈｒ１６９および／またはＶａｌ１３７との水素結合相互作用を形成し得る、ＣＢＦβ結合によって誘導された高次構造の変化に類似し得る。
【００５０】
また、ＣＢＦβ結合に類似の様式で、リガンドは、ＲｕｎｔドメインのＴｙｒ１６２側鎖を安定化して、高次構造の変化を誘導することができる。
【００５１】
本発明の結晶で同定される化合物およびリガンドを、例えば当該分野で周知のアッセイでスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、インビトロ、細胞培養、および／またはインビボであり得る。生物学的スクリーニングアッセイは、好ましくは、活性ベースの反応モデル、結合アッセイ（化合物がどれぐらい十分にＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに結合するかを測定する）、細菌、酵母、および動物細胞株（細胞中の化合物の生物学的効果を測定する）を軸とする。多数の化合物を試験して所望の活性を有する化合物を同定することができる高容量高速大量処理スクリーニング（ＨＴＳ）のために、アッセイを自動化することができる。生物アッセイはまた、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβに選択的に結合する化合物のリガンド結合活性についてのアッセイであり得る。
【００５２】
本発明のリガンドを、任意選択的に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤（その組み合わせを含む）を含む医薬組成物で使用することができる。
【００５３】
医薬組成物は、ヒト用薬物および動物薬におけるヒトおよび動物用であり、典型的には、任意の１つまたは複数の薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤を含み得る。治療用の許容可能なキャリアまたは希釈剤は薬学分野で周知であり、例えば、「レミントン薬学」Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的キャリア、希釈剤、または賦形剤を、意図する投与経路および標準的薬学業務に関して選択することができる。医薬組成物は、キャリア、賦形剤希釈剤を含むか、それらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
【００５４】
防腐剤、安定剤、色素、さらに着色料を医薬組成物に含めることができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁剤を使用することもできる。
【００５５】
異なる送達系に依存した異なる組成物／処方物要件が存在し得る。例として、本発明の医薬組成物を、ミニポンプを使用するか粘膜経路（例えば、吸入用鼻スプレーもしくはエアゾールまたは摂取用溶液）、または組成物が送達のために注射用形態で処方された非経口経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮下経路）で送達されるように処方することができる。あるいは、処方物を、両方の経路で送達されるようにデザインすることができる。
【００５６】
医薬組成物が胃腸粘膜を介して粘膜送達される場合、胃腸管を介した輸送の間に安定に保持することができるはずである。例えば、タンパク質分解に耐性を示し、酸性ｐＨで安定であり、胆汁の洗浄効果に耐性を示すはずである。
【００５７】
適切ならば、医薬組成物を、吸入、座剤またはペッサリーの形態、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤、皮膚パッチの使用、デンプン、ラクトース、もしくはチョークを含む錠剤、または単独もしくは賦形剤と混合したカプセルもしくは卵、エリキシル、香料または着色料を含む溶液もしくは懸濁液によって投与することができるか、これらを非経口で注射することができる（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）。非経口投与には、組成物を他の物質（例えば、血液と等張な溶液の作製に十分な塩または単糖類）を含むことができる滅菌水性溶液の形態で使用することが最良であり得る。口腔内または舌下投与には、組成物を、従来の様式で処方することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与することができる。
【００５８】
本発明は、さらに、哺乳動物に本発明のリガンドまたは医薬組成物を投与する工程を含む哺乳動物の疾患の予防法および／または治療法を提供する。
【００５９】
典型的には、医師は、各被験体に最も適切な実際の投薬量を決定し、これは、特定の患者の年齢、体重、および反応ならびに病態の重篤度によって変化する。以下の投薬量は、平均的な症例の例である。勿論、より高いまたはより低い投薬量範囲が都合がよい例がそれぞれ存在し得る。
【００６０】
本発明の組成物（またはその成分の一部）を、経口投与することができる。さらに、または別の方法では、本発明の組成物（または成分の一部）を、直接注射で投与することができる。さらに、または別の方法では、本発明の組成物（または成分の一部）を、局所投与することができる。さらに、または別の方法では、本発明の組成物（または成分の一部）を、吸入で投与することができる。さらに、または別の方法では、本発明の組成物（または成分の一部）を、１つまたは複数の非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、または経皮投与手段で投与することもでき、これらはこのような投与用に処方されている。
【００６１】
さらなる例として、本発明の医薬組成物を、１〜１０回／日（１回または２回／日など）の投薬計画に従って投与することができる。任意の特定の患者のための特定の用量レベルおよび投薬頻度を変更することができ、これは、使用した特定の化合物の活性、化合物の代謝安定性および長さ、年齢、体重、身体全体の健康性、性、食事、投与様式および時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の病態の重篤度、および各々が受けた治療を含む種々の因子に依存する。
【００６２】
用語「投与した」には、粘膜経路（例えば、吸入用鼻スプレーもしくはエアゾールまたは摂取用溶液）、または注射用形態で送達される非経口経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮下経路）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
したがって、本発明の医薬組成物を、１つまたは複数の以下の経路、すなわち、経口投与、注射（直接的注射）、局所、吸入、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与、または経皮投与によって投与することができる。
【００６４】
本発明の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小児急性リンパ芽球性白血病、治療関連白血病、脊髄形成異常、家族性血小板障害（ＦＤＰ）、鎖骨頭蓋骨形成不全（ＣＣＤ）、および骨形成障害および／または造血障害に関連する病態の治療または予防に特に適切である。
【００６５】
特に、本発明の方法を使用して、ＡＭＬ１および／またはＣＢＦＢ遺伝子を含む染色体転座に関連する白血病を治療または予防する。
【００６６】
［結晶の作製］
本発明の結晶を、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβをコードするヌクレオチド配列の発現、適切な宿主細胞の使用、および精製タンパク質の結晶化によって調製することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される、用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ならびにＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むその変異体、ホモログ、フラグメント、および誘導体（その一部など）をいう。ヌクレオチド配列は、二本鎖または一本鎖（センスまたはアンチセンス鎖またはその組み合わせ）であり得るゲノムまたは合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、用語「ヌクレオチド配列」を、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）の使用によって調製する。ヌクレオチド配列は、合成または改変ヌクレオチドの範囲内に含めることができる。多数の異なる型のオリゴヌクレオチドへの改変が当該分野で公知である。これらには、メチルホスホン酸、ホスホロチオアート骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の添加が含まれる。本発明の目的では、本明細書中に記載のヌクレオチド配列を、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変することができることが理解される。このような改変を行って、本発明のヌクレオチド配列のインビトロ活性を増強するか寿命を延ばすことができる。
【００６８】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体を作製するために、「同時発現」（すなわち、同一プロモーターからの駆動）させるためのＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインをコードする遺伝子およびＣＢＦβをコードする遺伝子が好ましい。
【００６９】
ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の野生型ＡＭＬ１　ｒｕｎｔドメインアミノ酸配列および／または配列番号２に記載の野生型ＣＢＦβ配列の少なくとも残基２〜１３５またはその変異体またはホモログをコードすることができる。
【００７０】
用語「野生型」は、天然に存在するほとんどの種のメンバーに特徴的で、変異種の表現型に対照的な表現型をいう。
【００７１】
用語「変異体」は、変異を受けたか、その生物の表現型で発現される変異遺伝子を保有する任意の生物をいう。あるヌクレオチドの別のものへの置換またはヌクレオチドの欠失、または対象としている野生型配列に関連するヌクレオチドの挿入によって変異を惹起することができる。これらの単一のヌクレオチドのバリエーションを、しばしば一塩基多型（ＳＮＰ）という。いくつかのＳＮＰは、タンパク質コード配列で起こり、このような場合、多型形態の１つが欠失または他の変異タンパク質を発現し、遺伝病を発症する場合があり得る。他のＳＮＰは、非コード領域に発生し得る。これらの多型うちのいくつかにより、欠陥タンパク質発現が起こり得る（例えば、欠陥スプライシングの結果として）。他のＳＮＰは表現型効果を有さない。
【００７２】
本明細書中で使用される、用語「変異体」は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβの配列（構造座標）およびアミノ酸残基の１つまたは複数の変化を含むポリペプチドをいう。特に、しかし排他的ではないが、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβの変異は、ヘテロ二量体形成に関連する領域に存在し得る（表３）。
【００７３】
本明細書中で使用される、用語「ホモログ」は、分子の結合特異性が保持されている限り、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有し得るＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβまたはその一部をいう。これに関して、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβ分子の結合特異性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて意図的アミノ酸置換を行うことができる。
【００７４】
広範な種々の宿主細胞を、本発明のＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に使用することができる。これらの細胞は、原核および真核宿主細胞であり得る。適切な宿主には、細菌（大腸菌）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、典型的には、不死化された例えばマウス、ＣＨＯ、ヒト、およびサル細胞株およびその誘導体が含まれる。好ましい宿主細胞は、発現産物をプロセシングして適切な成熟ポリペプチドを産生することができる。プロセシングには、グリコシル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成、および一般的な翻訳後修飾が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
宿主組換え細胞によって産生されたＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβを含むタンパク質は、使用したヌクレオチド配列および／またはベクターに依存して細胞内に分泌されるか含み得る。当業者に理解されるように、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβコードヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、特定の原核細胞膜または真核細胞膜によってＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβコード配列の分泌を指示するシグナル配列を用いてデザインすることができる。
【００７６】
他の組換え構築物は、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列にＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβコード配列を結合することができる（Ｋｒｏｌｌ　ＤＪら、１９９３、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１２、４４１〜５３）。このような精製促進ドメインには、金属キレートペプチド（固定化金属上で精製可能なヒスチジン−トリプトファン分子など）（Ｐｏｒａｔｈ　Ｊ，１９９２、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ３−．２６３２８　１）、固定化免疫グロブリン上で精製可能なプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システムで利用されるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が含まれるが、これらに限定されない。精製ドメインとＡＲおよびＰＲとの間の切断可能なリンカー配列（第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））の封入は、精製の簡易化に有用である。
【００７７】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβを、例えば、抽出および精製を補助する機能性タンパク質として作製することもできる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）、およびβガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列を除去するために、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解部位を含めることも便利であり得る。
【００７８】
好ましくは、融合タンパク質は、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインおよび／またはＣＢＦβのヘテロ二量体形成能力を妨げない。
【００７９】
発現後、タンパク質を、例えば、固定化金属親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および／またはゲル濾過によって精製および／または濃縮することができる。ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン：ＣＢＦβ複合体の結晶について、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβフラグメントを精製して溶液中で二量体形成させた。複合体のＤＮＡ結合能力を、例えば、電気泳動移動度シフトアッセイによって同定することができる。
【００８０】
タンパク質を、任意の公知の技術を使用して結晶化させることができる。通常、結晶化プロセスでは、結晶形成に必要な低濃度の沈殿剤を使用して結晶化緩衝液を調製する。結晶形成には、沈殿剤の添加または結晶化緩衝液とリザーバ緩衝液との間の沈殿剤の拡散によって沈殿剤の濃度を増加させなければならない。公知の技術（「ハンギングドロップ」または「シッティングドロップ」法など）によって拡散させることができる。これらの方法では、タンパク質を含む結晶化緩衝液の液滴を、より大量のリザーバ緩衝液プールの上にハンギングするかその側面にシッティングさせる。あるいは、結晶化緩衝液を分離し、リザーバ緩衝液へのタンパク質の分散を回避する半透膜によって沈殿剤を平衡にする。
【００８１】
［結晶構造の作製］
一旦結晶が得られると、公知のＸ線回折によって構造を解明することができる。多くの技術は化学修飾結晶（重金属誘導体化によって修飾されたものなど）を使用する。特に、結晶を、重金属原子塩または有機金属化合物（例えば、結晶によって分散されてタンパク質表面に結合する塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロサールまたは酢酸ウラニル）を含む溶液に浸漬する。結合した重金属原子の位置を、浸漬金属のＸ線回折分析によって決定することができる。結晶の原子（散乱中心）によるＸ線の単色ビームの回折によって得られたパターンを数式によって解明して、数学的座標を得ることができる。回折データを使用して、金属の反復単位の電子密度地図を計算する。電子密度地図を使用して、結晶の単位格子内の各原子の位置を確立する。Ｂｌｕｎｄｅｌ．Ｔ．Ｌ．ａｎｄ　Ｎ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、「タンパク質結晶学」、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９７６。
【００８２】
当業者は、Ｘ線結晶学によって決定した１組の構造座標には、標準誤差なしでは存在しないと理解するであろう。本発明の目的のために、表４に列挙した構造座標に重ね合わせた場合に（主鎖原子を用いて）、０．７５Å未満のタンパク質主鎖原子の根平均二乗偏差を有するＡＭＬ１：ＣＢＦβ複合体の任意のセットの構造座標が理想的であるはずである。
【００８３】
［モデリング］
新規の結晶の三次元構造を、分子置換を使用してモデリングすることができる。用語「分子置換」は、未知の結晶の認められた回折パターンを説明するために、未知の結晶の単位格子内の構造座標が公知の分子の方向付けおよび位置付けによって構造座標が未知の分子または複合体の予備モデルを作製する工程を含む方法をいう。このモデルから位相を計算して、認められた振幅と組み合わせて座標が未知の構造の適切なフーリエ合成を得る。言い換えると、これを、任意のいくつかの改良形態に供して、最終的に未知の結晶の正確な構造を得る。Ｌａｔｔｍａｎ，Ｅ．、「回転および翻訳機能の使用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１５、５５〜７７、１９８５；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編、「分子置換法」、Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．、第１３号、Ｇｏｒｄｏｎ　＆　Ｂｒｅａｃｈ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７２。
【００８４】
本発明によれば、他の分子モデリング技術を使用することもできる。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら、「分子モデリングソフトウェアおよび医薬品化学法」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３、８８３〜９４、１９９０を参照のこと。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．　ａｎｄ　Ｍ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、「薬物デザインの構造情報の使用」、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２、２０２〜２１０、１９９２も参照のこと。
【００８５】
本発明で得たＡＭＬ１：ＣＢＦβ結晶複合体の構造座標を使用し、分子置換を使用して、ＡＭＬ１および／またはＣＢＦβまたは関連タンパク質（ＡＭＬ２、ＡＭＬ３、または別の転写因子）の結晶変異体またはホモログの構造座標を決定することができる。
【００８６】
［リガンドスクリーニング］
当業者は、いくつかの方法の１つを使用して、化合物のＡＭＬ１および／またはＣＢＦβへの会合能力を試験することができる。このプロセスは、例えば、表４に記載の構造座標を基本としたコンピュータスクリーン上の標的部位の目視検査から開始することができる。選択した試験化合物を、前記定義のＡＭＬ１および／またはＣＢＦβの各標的部位内に種々の配向で位置付けるかドッキングすることができる。ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌなどのソフトウェア、エネルギーを最小化、標準分子機構の力場を使用した分子力学（ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲなど）を使用してドッキングすることができる。専門コンピュータプログラムはまた、潜在的なリガンドの選択プロセスを支援することができる。これらには、以下が含まれる。
【００８７】
１．ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．、「生物学的に重要な高分子のエネルギー的に好ましい結合部位決定用のコンピュータ計算手順」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２８、８４９〜８５７、１９８５）ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫから利用可能である。
【００８８】
２．ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．ａｎｄ　Ｍ．Ｋａｒｐｌｕｓ、「結合部位の機能地図：多コピー同時検索法」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１、２９〜３４、１９９１）。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓから利用可能である。
【００８９】
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ　Ａ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、「シュミレーションアニーリングによるタンパク質への基質の自動化ドッキング」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８、１９５〜２０２、１９９０）。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．から利用可能である。
【００９０】
４．ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら、「分子−リガンド相互作用への幾何学的アプローチ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１、２６９〜２８８、１９８２）。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から利用可能である。
【００９１】
一旦リガンドが最適に選択またはデザインされると、その原子または側鎖基のいくつかを置換してその結合性を改良または改変することができる。一般に、最初の置換は保存的である（すなわち、置換基は元の基とおよそ同一のサイズ、形、疎水性、および電荷である）。勿論、高次構造を変化させることが当該分野で公知の成分を回避すべきであることが理解されるべきである。このような置換化合物を、上記の同一のコンピュータ法によってＡＭＬ１および／またはＣＢＦβへの適合効率について分析することができる。
【００９２】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の例示に役立つが、本発明を制限すると解釈すべきではない。本発明は、特に、これらの実施例に記載の特定の実施形態に関する。
【００９３】
例１：Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ複合体の結晶化
＜タンパク質発現および精製＞
ヒトＡＭＬ１（残基５０〜１８３）をコードするＤＮＡ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によってプラスミドｐＥＴ／ＲＭ７（Ｆ．Ｃａｌａｂｉ博士より贈与）から増幅する。ＢａｍＨ１ｏｙｏｂｉＥｃｏＲ１の固有の制限部位を有するＤＮＡフラグメントを得る。このＰＣＲフラグメントを、ｍｉｎｉ−ｐＲＳＥＴベクター（Ｏ．ｐｅｒｉｓｉｃから贈与）にクローニングし、Ｔ７プロモーターから転写し、Ｎ末端の１６個の残基（ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＬＶＰＲＧ）を付加する。ヒトＣＢＦβ残基１〜１３５をコードするＤＮＡ配列を、ＨＥＬ細胞から精製したＲＮＡから合成したｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅して、Ｎｄｅ１およｂＢａｍＨ１の固有の制限部位を有するフラグメントを得る。このフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のシャイン−ダルガーノ配列の下流にクローニングし、ＡＭＬ１コード配列のｍｉｎｉ−ｐＲＳＥＴベクター下流にサブクローニングする。このバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）クローンに同一のＴ７プロモーターからＡＭＬ１およびＣＢＦβを同時発現させる。ヒトＡＭＬ１およびＣＢＦβタンパク質の同時発現は、変異誘発または再折りたたみを必要とせずに可溶性機能へテロ二量体を得るのに都合がよい。
【００９４】
ｐｍｉｎｉ−α／β発現プラスミドを、大腸菌Ｃ４１（ＤＥ３）細胞にトランスフェクトする（Ｍｉｒｏｕｘ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ、１９９６）。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３７℃の２×ＴＹ培地中で０．６のＯＤ６００まで増殖させ、１ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細胞を回収し、２０ｍＭ　β−メルカプト−エタノール、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール中で超音波処理する。発現したヒトＡＭＬ１フラグメント（残基５０〜１８３）（本明細書中ではＲｕｎｔドメインと呼ぶ）およびＣＢＦβ（残基２〜１３５）は、電気泳動移動度シフトアッセイ（データ示さず）で同定したところ、配列特異的ＤＮＡ結合において十分に活性な溶液中で安定な複合体を形成する。ヘテロ二量体複合体を、固定化金属親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびゲル濾過によって溶解物から精製する。この終わりに、溶解物をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）にロードし、同一の緩衝液で強力に洗浄し、ＤＴＴおよびＥＤＴＡ（最終濃度はそれぞれ５ｍＭおよび１ｍＭ）を含むチューブに直接溶出する（２０ｍＭ　β−メルカプト−エタノール、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１５０ｍＭイミダゾール）。ＮａＣｌの濃度を無ＮａＣｌ緩衝液での溶出によって２００ｍＭまで低下させ、サンプルを、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐｈ７．０）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および５ｍＭ　ＤＴＴで平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライする。溶出物を、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．６）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化したＨｉＰｒｅｐ　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライする。プールした画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ限外濾過膜を使用して濃縮し、アリコートを２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．６）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液中、１２ｍｇ／ｍｌの濃度で液体窒素にて保存する。
【００９５】
＜セレノメチオニン置換ＡＭＬ１／ＣＢＦβの調製＞
セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）置換タンパク質を、メチオニン栄養要求株である大腸菌ＤＥ３宿主中でｐｍｉｎｉ−α／βプラスミドから発現させる。２×ＴＹで継代した対数期の細胞（ＯＤ６００＝０．３）を、０．４％グルコース、４０μｇ／ｍｌの１９種のアミノ酸、４０μｇ／ｍｌのセレノ−Ｌ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ）、および１μｇ／ｍｌのビタミン（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｕ、１９９７）を補足した２×Ｍ９最少培地で１：１００に希釈する。細菌を３７℃で静置し、８時間後に誘導する（ＯＤ６００＝０．６）。インキュベーションは、２５℃で一晩である（ＯＤ６００＝１．１）。タンパク質精製法は、非置換タンパク質の方法と同一である。非置換タンパク質およびＳｅＭｅｔ置換タンパク質の分子量を、ＭＡＬＤＩ質量分光光度法でアッセイし（ＣＢＦμ−測定値１５７６Ｄａ、計算値１５９２３Ｄａ；ＡＭＬ１−測定値１６７３０Ｄａ、計算値１６７２０Ｄａ；ＳｅＭｅｔ　ＢＦβ−測定値１５８８０Ｄａ、ＳｅＭｅｔ　ＡＭＬ１−測定値１６９１６Ｄａ）、メチオニン残基のＳｅＭｅｔへの完全な置換に一致したが、ＣＢＦβのＮ末端メチオニンは損失している。
【００９６】
＜結晶化＞
最初に、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶を成長させる。精製複合体は、３０ｍｇ／ｍｌまで溶解する。複合体の結晶を、１００ｍＭイミダゾール、６％ＰＥＧ８０００、５％スクロース、および５ｍＭ　ＤＴＴを含むリザーバに対するハンギングドロップとして成長させる。液滴を、最初に、１μｌの１２ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液および１μｌの結晶化溶液を使用して１８℃に設定する。トレイを２１℃で少なくとも１週間平衡化する。結晶の結合に伴う問題を克服するために、マクロシーディング（ｍａｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）を使用して、回折の質を有する結晶を得る。シードを、１００ｍＭイミダゾール、５％スクロース、５％ＰＥＧ８０００、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％　２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）（Ｈａｍｐｔｏｎ）中で洗浄し、それぞれをＭＰＤ添加物を含まない１ｍＭ　ＤＴＴを補足した緩衝液に対して一晩予備平衡化した２μｌ　１２ｍｇ／ｍｌタンパク質および２μｌ洗浄緩衝液の新鮮な液滴に移す。結晶を、２週間にわたりその最終サイズまで成長させた。これらを、３０％スクロース、１２％ＰＥＧ８０００、５％ＭＰＤ，２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．５）を含む最終冷凍用緩衝液への３０分間の段階的移行によって回収し、液体窒素中で冷凍する。結晶を、最初の液滴に５％ＭＰＤを添加剤として組み込むこと以外は類似の条件下でＳｅＭｅｔ置換タンパク質から調製する。空間群Ｐ６１に属する結晶も、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＤＴＴ、５％ＰＥＧ８０００を含む結晶化溶液を使用して得られる。これらを、３０％グリセロール、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、５％　ＰＥＧ８０００を含む緩衝液への事前に移行によって凍結する。
【００９７】
例２：結晶構造の決定
＜データ収集＞
天然のタンパク質のデータ収集に使用した結晶は、典型的には４００×２００×４０μｍまたはそれ以上であり、ａ＝１０３．２Å、ｂ＝７９．４Å、ｃ＝１３０．１Å、β＝１０１．６３°の単位格子の寸法を有するＰ２１対称を有する。これらの結晶は、２．６Åで回折する。Ｓｅ−Ｍｅｔ置換結晶は、ａ＝１０４．０Å、ｂ＝７９．３Å、ｃ＝１３０．９Å、β＝１０１．５°の寸法の単位格子を有し、これは幾らか小さく、２．８Åの分解能で回折する。天然の結晶の回折データを、ＭＡＲ　ＣＣＤ検出器を使用したＥＳＲＦビームラインＩＤ１４−３で収集し、Ｓｅ−Ｍｅｔ置換結晶のデータを、ＡＤＳＣ　ＣＣＤ検出器を使用してＩＤＩ１４−４で収集する。天然のデータを、ＭＯＳＦＬＭ（Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２）を使用して処理する。各データセットを、１８０　１°の振幅として収集される。Ｓｅ−Ｍｅｔ置換結晶では、データセットをＳｅ−Ｍｅｔ置換結晶の蛍光スペクトル中のピークおよび屈折点に対応する２つの波長（λ１＝０．９７９３Åおよびλ２＝０．９７９５Å）で回収する。
【００９８】
＜データ処理＞
Ｓｅ−Ｍｅｔ置換結晶のデータセットを、ＨＫＬ２０００で積算し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで測定する。天然のデータを測定し、ＳＣＡＬＡでマージングする。ＳＯＬＶＥ（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ、１９９９）を用いてＳｅ−Ｍｅｔデータの最終マージングを行う。λ１で収集したデータとλ２で収集したデータとの間の分散の差についてのＲ因子は、０．０４６である。異常な差についてのＲ因子は、λ１では０．０７７であり、λ２では０．０６６である。ＳＯＬＶＥを使用して、２１個のＳｅ部位を位置付ける。パターソン相関のＳＯＬＶＥ　Ｚスコア、相互検証（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）フーリエ、天然のフーリエ、および２１部位溶液の平均性能指数は、それぞれ、７．４、５２、２１、および９４である。全Ｚスコアは６６である。平均性能指数は、０．４７である。３．５Åの分解能でのＳｅ−Ｍｅｔデータを使用して、天然のデータセットの位相について最初に評価する。密度修飾を行って、位相を改良し、２．６Åの分解能に広げる（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）。プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、１９９１）を使用してモデルを２．６Åの分解能の電子密度地図に構築し、ＣＮＳを使用して精密化する。全原子の平均Ｂ因子は、５５．９Åである。構造は、ラマチャンドランプロットの認められない領域中に残基を含まない良好な立体化学を示す。さらなる天然のデータセットを、ビームライン９．６（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ、ＵＫ）、ビームラインＸ１６（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＥＬＥＴＴＲＡ（Ｔｒｉｅｓｔｅ、Ｉｔａｌｙ）から収集することができる。
【００９９】
例３：相同性研究
結晶構造由来の座標を使用し、Ｄａｌｉサーバを使用して他の転写因子（ｐ５３、ＮＦ−κＢ　ｐ５２、ＮＦ−κＢ　ｐ６５、ＮＦＡＴ１、Ｔドメイン、およびＳＴＡＴタンパク質など）のタンパク質データベースを検索する。
【０１００】
例４：ＲｕｎｔドメインによるＤＮＡ結合モデルの作製
ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインへのＳＴＡＴ３β／ＤＮＡ（ＰＤＢコード１ｂｇ１）共結晶複合体の座標の最小二乗の重ね合わせを使用して、Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体による主要な溝ＤＮＡ結合モデルを作製する。
【０１０１】
結果１：結晶研究
＜Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体の全結晶構造＞
結晶の非対称単位は、Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２およびＲｕｎｔドメインホモ二量体（図１）として配置した６つのＲｕｎｔドメインサブユニットおよび４つのＣＢＦβサブユニットを含む。この分子は、ヘテロ二量体およびホモ二量体の別の層に充填されている。最終原子モデルは、ヘテロ二量体ＣＤについてほぼ完全であり、ＡＭＬ１の残基５４〜１７７（保存Ｒｕｎｔドメイン由来の全ての残基は、Ｎ末端２アミノ酸とは別である）およびＣＢＦβサブユニット由来の残基２〜１３５を含む。Ｒｕｎｔドメインの残基１７８〜１８３Ｃ末端はＣＢＦβ由来の残基７５〜８０のように崩壊し、モデルに含まれていない。１２１個の水分子もまた、モデルに含まれる。Ｒｕｎｔドメインホモ二量体ＱＲ（図１）は、ＣＢＦβがヘテロ二量体中で結合しているが、より高いＲ因子が得られる密度にＣＢＦβモデルを適合させることを意図する場合の境界での密度を示す。これは、ＣＢＦβサブユニットによる部分的占有を示し得る。２つの異なる結晶形態（Ｐ２１およびＰ６２対称）中の２つのＲｕｎｔドメイン中のアミノ末端残基と各結晶形態の対称単位中の３つの独立した例との間の相互作用によって媒介されるヘテロ二量体の（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２二量体の形成が認められる。ゲル濾過研究（データ示さず）はまた、溶液中の（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２二量体の形成に一致する。これらのデータにより、（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２二量体の形成は、結晶充填の結果ではなく、溶液中のＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ複合体のホモ二量体を反映することが示唆される。
【０１０２】
＜Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体複合体の全構造＞
ヘテロ二量体の（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２二量体の全構造を、図２に示す。複合体の各サブユニットの折りたたみが最近のＮＭＲ研究（Ｂｅｒａｒｄｉら、１９９９）（Ｇｏｇｅｒら、１９９９；Ｎａｇａｔａら、１９９９）（Ｈｕａｎｇら、１９９９）と一致したにもかかわらず、Ｒｕｎｔドメインの特定の領域の高次構造が異なる（後で考察する）。ＡＭＬ１形態のＲｕｎｔドメインは、ｓ型免疫グロブリン折りたたみを取り入れた１２個のストランド（１０逆平行および２平行ストランド）のβバレルを形成する。ＣＢＦβは、上部および下部に対して充填されたαヘリックスを有する部分的に開いた６つのストランドβバレルからなる混合α／β構造である。ＤＡＬＩデータベースでの構造比較により、ＣＢＦβのβバレル成分が多数の機能的に無関係のタンパク質と全体的に類似しているにもかかわらず、以前のクレーム（Ｇｏｇｅｒら、１９９９）と対照的に折りたたみは非常に明白であり、ＯＢ折りたたみと非常に関連する（Ｍｕｒｚｉｎら、１９９５）。ＳＣＯＰタンパク質構造データベース（Ｍｕｒｚｉｎら、１９９５）で分類されているように、ＯＢ折りたたみは、Ｇｒｅｅｋキートポロジー（Ｇｒｅｅｋ　ｋｅｙ　ｔｏｐｏｌｏｇｙ）および剪断数（ｓｈｅａｒ　ｎｕｍｂｅｒ）８または１０を有する５ストランドのβバレルからなる。それに対して、ＣＢＦβは、βストランドの上下に曲がりくねったトポロジーおよび剪断数１０の固有の組み合わせを有する部分的に開いた６ストランドβバレルを形成する。したがって、この特定のβバレル構造を、異なるトポロジーおよび剪断数の組み合わせ由来の新規の折りたたみとして分類することができる。図２ＤおよびＥは、タンパク質配列の頂点で整列したＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβの二次構造エレメントを示す。
【０１０３】
ＲｕｎｔドメインとＣＢＦβサブユニットとの間の境界でのヘテロ二量体の接触の拡大、Ｒｕｎｔドメインのアミノ末端間のホモ二量体の接触が認められるが、ＣＢＦβサブユニット間の接触は認められない。（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２構造の温度因子は、Ｒｕｎｔドメインで最も低く、ＣＢＦβサブユニット内で全体として比較的より高い。これは、構造的に、Ｒｕｎｔドメインは比較的安定なコアを形成するが、ＣＢＦβはより移動性を示すことを示す。
【０１０４】
１つのＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体の全体的な寸法は、約４１×５０×２７Åである。結晶の非対称単位中の４つのＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体Ｃα主鎖の軌跡の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）に有意差は存在しない。図３に示すように、ＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβは、２つのβバレルドメインの長軸は互いに直角になるように配向し、巨大な連続的に湾曲した境界に沿って相互作用する。下に配向したＲｕｎｔドメインのＣ末端を有する図３Ｂの視点から見た場合、ＣＢＦβはＲｕｎｔβバレルの上部のみと関連することが証明される。ＣＢＦβは、ＲｕｎｔドメインループβＡ−Ｂ、βＥ’−Ｆとも、Ｃ末端とも直接接触しない。これらのループ内の残基は、ＤＮＡ結合に生物化学的に不可欠であることが示されている（Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９６）（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。ＣＢＦβのαヘリックスＨ５、Ｈ１、およびＨ２は、Ｒｕｎｔβバレルの上半分の右側面に存在し、ヘリックスＨ３は、左側面に存在する（図３Ｂ）。
【０１０５】
結晶構造由来のデータは、化学シフト分析（Ｎａｇａｔａら、１９９９）に基づいたＲｕｎｔドメインとＣＢＦβとの間の相互作用の様式についての以前の提案と異なる。化学シフトデータは、ヘリックスＨ１、Ｈ２、およびＨ５を上に、ヘリックスＨ３を下に有するヘテロ二量体中のＣＢＦβを配向して、ＣＢＦβ残基Ｇｌｎ７４、Ｇｌｎ７９、およびＡｒｇ８３がＲｕｎｔドメイン（ループβＡ−ＢおよびβＥ’−ＦおよびＣ末端）の提案したＤＮＡ結合表面と同一のヘテロ二量体表面上に配置されていると解釈される。実際、結晶構造は、ＣＢＦβがこの提案と比較して９０°回転して、ヘテロ二量体境界に埋没も分子の提案したＤＮＡ結合表面にも関連しないヘテロ二量体（図３Ｂ）の上部外側の局面上に進化的に保存されていないＣＢＦβループβ３−β４（残基６８〜９３）が配置されていることを示す。
【０１０６】
ＤＮＡ結合に不可欠なＲｕｎｔドメインのＣ末端（残基１６９〜１７７）の高次構造を、結晶構造中に明白に定義する。Ｃ末端の二次構造は証明されていないが、ループβＡ’−Ｂを通過してＲｕｎｔドメインのＮ末端に向かって（図３Ｂで認められる配向）伸長しているループを形成する。Ｃ末端は、ＮｇａｔａらのＮＭＲ構造中残基１６８（Ｎａｇａｔａら、１９９９）を超えて定義しない。Ｒｕｎｔドメインβバレルの下の表面上のすべてのループは、図３Ｂ（βＣ−Ｄ、βＥ’−Ｆ、Ｃ末端およびβＡ’−Ｂ）のように配向しているので、相互に連結し、ループβＣ−ＤとＣＢＦβとの相互作用の結果として片側に十分に突出している。Ｃ末端は、隣接するループβＥ’−ＦとβＡ’−Ｂとの間の相互作用によって安定化する。ストランドβＧ’およびβＡ’は、Ｃ末端にループβＡ’−Ｂが連結している小さな平行βシートを形成する。Ｓｅｒ１４０のカルボニルは、見かけの水素結合によってループβＥ’−ＦをストランドβＧ’中のＩｌｅ１６８に連結させる。ＤＮＡ結合に関連していないＲｕｎｔドメインループβＣ−Ｄにより、Ｔｙｒ１１３の側鎖を介したＣＢＦβと多数接触する。最後に、ＣＢＦβ中の３つのＣｙｓ残基（Ｃｙｓ２５、Ｃｙｓ１０７、およびＣｙｓ１２４）は、提案（Ｈｕａｎｇら、１９９９）のようにヘテロ二量体境界に関連せず、これにより、これらの残基は、ＡＭＬ１の酸化状態依存性挙動の調整に直接関連しないと示唆される。
【０１０７】
＜Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ境界面での相互作用＞
ＲｕｎｔドメインおよびＣＢＦβサブユニットは、溶媒が接近可能な表面領域中の全部で１９００Å（（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）に記載のように計算）が埋没するように巨大な連続して湾曲する境界（図３）上で相互作用する。Ｒｕｎｔドメインの境界面は窪んでおり、ＣＢＦβ上の相補的凸状の表面を充填する。図３に記載のＲｕｎｔドメインの湾曲したヘテロ二量体形成表面は、βバレルの頂点にループβＦ−Ｇ、βＯ−Ａ、およびβＢ−Ｃ；３ストランドのβシート（ストランドβＣ、βＦ、およびβＧ）；およびβバレルの底にループβＤを含む。ヘテロ二量体形成に関連するＣＢＦβ領域は、アミノ末端ループおよびヘリックスＨ１；ストランドβ１およびループβ１−Ｈ３；共に中央の凸状相互作用表面を形成するストランドβ２、β３、および連結ループβ２−β３；ストランドβ４およびループβ４−β５の近接部分である。
【０１０８】
ヘテロ二量体境界面を形成するＣＢＦβ由来の特定の残基を、表３に示す。境界面でＲｕｎｔドメイン中に埋没しているＣＢＦβ表面上の残基を、プログラムＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）で定義することができる。このような手順で示した２１個の残基のうち、ヒトＣＢＦβと２つの関連するショウジョウバエタンパク質ＢｒｏｔｈｅｒおよびＢｉｇ　ｂｒｏｔｈｅｒとの間でたった２個が保存されていない。２１残基のうち１３残基が絶対的に保存され、６残基が保存的に置換されている（図２Ｅ）。
【０１０９】
Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ相互作用は、ＣＢＦβのＮ末端（残基２〜５）が関連する。ＲｕｎｔドメインループβＯ−Ａ、ループβＢ−Ｃ、およびストランドβＧは、全てＣＢＦβのＡｒｇ３によって媒介される４つの潜在的な水素結合相互作用を有するＣＢＦβＮ末端との相互作用に関連する（表３）。これにより、Ｒｕｎｔドメインへのヘテロ二量体形成にＣＢＦβのＮ末端５〜６残基が必要であり（Ｇｏｌｌｉｎｇら、１９９６）（Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９６）、Ｈｕａｎｇら（Ｈｕａｎｇら、１９９９）の化学シフトデータと一致する変異誘発研究が説明される。Ｇｏｇｅｒら（Ｇｏｇｅｒら、１９９９）は、ＣＢＦβへのＲｕｎｔドメイン−ＤＮＡ複合体の結合に対するＧｌｎ７４、Ｇｌｎ７９、およびＡｒｇ８３の有意な化学シフトを注記しているが、結晶構造は、これは、ヘテロ二量体境界面でのこれらの残基の埋没の結果ではなく、Ｒｕｎｔドメインの推定ＤＮＡ結合ループβＥ’−ＦまたはβＡ’−Ｂに隣接して存在しないことを示している。
【０１１０】
ヘテロ二量体境界面でのＲｕｎｔドメイン中の残基によって媒介される接触を、表３に示す。ＣＢＦβサブユニットに埋没しているＲｕｎｔドメインの境界面上の残基を、プログラムＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）によってサイド定義することができる。このプログラムで同定された残基の２／３は、完全に保存されているか保存的に置換されている（図２Ｅ）。構造的に、絶対的に保存されているＣｉｓ−Ｐｒｏ１５６は、ＣＢＦβ中運残基と重要な接触をするＲｕｎｔドメインループβＦ−Ｇ中のもつれを誘導する。ＲｕｎｔドメインストランドβＧ（残基１５９〜１６１）はＣＢＦβストランドβ４（残基１０２〜１０４）と対合して、短い逆平行βシートを形成する。２つのサブユニット間のβサブユニットの伸長は、保存疎水性残基のクラスター（ＲｕｎｔドメインＶａｌ１５９およびＴｈｒ１６１；ＣＢＦβ　Ｍｅｔ１０１、Ｉｌｅ１０２、およびＬｅｕ１０３β）によって安定化される。この領域中の配列保存は、重要な基礎的機能を支持する。ＲｕｎｔドメインループβＦ−ＧおよびストランドβＧは、ＤＮＡに結合したこの化合物の結晶構造中のＡＰ１と相互作用するＮＦＡＴ領域に構造的に相同である（Ｃｈｅｎら、１９９８）。したがって、他のＩｇ折りたたみタンパク質の類似領域は、タンパク質−タンパク質相互作用に関連する。ヘテロ二量体境界面の反対の末端で、ＲｕｎｔドメインＳｅｒ１１４およびＴｙｒ１１３により、ＣＢＦβとの大きな相互作用領域が得られる。これらの残基は、溶媒に接近可能な極性環境におかれ、これは以前の分光分析と一致する（Ｃｒｕｔｅら、１９９６）。ＣＢＦβ残基Ｇｌｕ１１１およびＡｓｐ１１０はまた、この極性環境に寄与する。ＲｕｎｔドメインＭｅｔ１０６は、ヘテロ二量体境界面中の埋没した表面領域に有意に寄与する。この残基の相互作用における機能的重要性は、Ｍ１０６Ｖ変異がＡＭＬ１とＣＢＦβとの間の相互作用をインビトロで消滅させることを示す生化学研究によって支持される（Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７ｂ）。
【０１１１】
２つのサブユニット間の全部で４２の接触のうち、１０個は水素結合相互作用を示す。接触はまた、境界面付近の水分子を介して直接媒介される。本発明者らは、ヘテロ二量体境界面で埋没した８個の水分子を同定し、その役割は、おそらく相互作用境界面の相補性を至適にすることである。ヘテロ二量体境界面でＣＢＦβ中に埋没したと定義されたＲｕｎｔドメインの表面残基は、一般に、Ｎａｇａｔａら（Ｎａｇａｔａら、１９９９）の化学シフトデータと一致する。
【０１１２】
＜Ｒｕｎｔドメインのホモ二量体境界面＞
結晶構造は、Ｒｕｎｔドメイン間の以下の２つのホモ二量体相互作用、すなわちヘテロ二量体中のＲｕｎｔドメイン間の境界面、およびホモ二量体ＱＲ内のこれらの相互作用のサブセットを含むより小さな境界面（ＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）を使用して同定した１３００Å２とは対照的に、８９０Å２溶媒に接触可能な埋没表面領域）を同定する。境界面を図２に示す。Ｎ末端残基（５９〜６６）はこの境界面に最も顕著に寄与し、ストランドβＡとβＢとの間およびループβＢ−ＣとβＣ’−Ｅとの間の接触によってさらに安定化されている。
【０１１３】
ホモ二量体境界面中に埋没している残基を、ＧＲＡＳＰプログラムを使用して同定することができる。ＲｕｎｔドメインＡｓｐ６６は、ヘテロ二量体およびホモ二量体境界面の両方に寄与する。ヘテロ二量体の二量体中のホモ二量体相互作用は、各サブユニット由来のＰｒｏ５９、Ｌｅｕ６２、Ｖａｌ６３、Ｌｅｕ７１、Ｖａｌ９２、およびＬｅｕ９４を含む疎水性クラスターによって安定化されたＲｕｎｔドメインのアミノ末端での残基６０〜６２の対合から形成された短い先端から先端までの逆平行βシートによって媒介される。境界面の疎水性コアは、強い配列保存性を示す（図２Ｄ）。４つの潜在的水素結合相互作用はまた、βシート相互作用を媒介するものに加えて、この境界面に寄与する。Ｃ：ＡへのＱ：Ｒホモ二量体の重ね合わせ（図４）は、Ｑ：Ｒホモ二量体中のＲサブユニットは比較的回転し、Ａ：Ｃ二量体に関する接触境界面からはなれて傾斜していることを示す。これにより、ホモ二量体境界面でのＲＨＤ表面の間で移動性を示すことが示唆される。
【０１１４】
＜Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体の表面静電ポテンシャル＞
表面静電ポテンシャルに関して２つの対照的な表面が存在する。強力な塩基性表面は、ループβＡ−Ｂ、βＥ’−Ｆ、およびＣ末端の位置に対応する。これは、ＤＮＡ結合におけるＲｕｎｔドメインのこれらの領域に直接関連する生化学的およびヒト変異データを支持する。それに対して、この領域からの１４５°の回転により、ＣＢＦβの上方の外表面に対応する顕著に酸性の表面が明らかになる。ＣＢＦβ表面上の以下の５つの領域によりこの変化した表面が得られる：ストランドβ６の末端およびヘリックスＨ５の前の残基；ループβ３−β４中の残基；β５−β６ループ；ストランドβ１；およびヘリックスＨ１。これらの残基の大部分は、進化的に保存されており（図２Ｅ）、これらの残基が機能的に重要であることが示唆される。
【０１１５】
＜ＤＮＡに結合したＲｕｎｔドメインとＣＢＦβに結合したＲｕｎｔドメインとの間の高次構造の相違＞
ＣＢＦβとの相互作用は、ＡＭＬ１のインビボ機能に不可欠である（Ｓａｓａｋｉら、１９９６）（Ｗａｎｇら、１９９６ｂ）（Ｗａｎｇら、１９９６ａ）。生化学的に、ＣＢＦβは、同族ＤＮＡ結合部位の単離Ｒｕｎｔドメインの解離定数（Ｋｄ）を１／５〜１／１０に減少させる（Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９６）。ＣＢＦβの存在下でのＲｕｎｔドメインのこのＤＮＡ結合親和性の増加についての分子の基礎は、明らかではない。Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ二元複合体の構造の利用可能性（本発明）、ＲｕｎｔドメインのＮＭＲの座標（ＤＮＡの存在下で行った）（Ｎａｇａｔａら、１９９９）、非複合体形成ＣＢＦβサブユニットのＮＭＲ構造のバンドル（Ｈｕａｎｇら、１９９９）（Ｇｏｇｅｒら、１９９９）（取り組むべき問題）。
【０１１６】
ヘテロ二量体中の可動性非保存ループβ３−β４（残基７５〜８０）中の不規則性以外の利用可能なＮＭＲ座標（Ｈｕａｎｇら、１９９９）（Ｇｏｇｅｒら、１９９９）（ＰＤＢコード２ｊｈｂおよび１ｃｌ３）に関してＣＢＦβの結晶構造における有意差は認められなかった。座標（ＰＤＢコード１ｃｍｏ）が利用可能なＲｕｎｔドメインＮＭＲ構造（残基６２〜１７０）のバンドルの骨格残基についての座標精度は高い（０．５９Å２）。ＲｕｎｔドメインのＣＢＦβおよびＤＮＡ結合形態の構造についてのＣα軌跡は、ほとんどの部分で十分に重ねあわされる（図５Ａ）。しかし、推定ＤＮＡ結合ループ領域では、構造は有意に異なる。Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体では、ＲｕｎｔドメインのＣ末端残基は順序付けられており、この必須のＤＮＡ結合領域の高次構造が定義される。ＲｕｎｔドメインループβＡ’−ＢおよびＣ末端に連結している小さな平行βシート（βＡ’−βＧ’）は、βＥ’−Ｆループに向かって有意にシフトする。結晶構造の高次構造は、ループβＥ’−Ｆ（Ａｒｇ１３９およびＧｌｙ１４１）とＲｕｎｔドメインＣ末端（Ｉｌｅ１６８）との間の潜在的な主鎖水素結合相互作用によって安定化される。その位置での７．２Åのシフト（任意のＣαの相対的位置の最も大きな変化）後、Ｃｙｓ８１は、ループβＡ’−Ｂ（Ｃｙｓ８１）をストランドβＧ’（Ｔｈｒ１６９）およびストランドβＥ’（Ｖａｌ１３７）に連結させる潜在的水素結合相互作用を形成する。この化学的環境の変化は、酸化に対するＣｙｓ８１の感受性を変化させると予想される。ＲｕｎｔドメインＣｙｓ８１の酸化状態を、ＣＢＦβ誘導高次構造変化の結果として調整することができ（Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７ａ）、結晶由来の構造データはこの仮説を支持すると提案されている。ＮＭＲ構造では、ＲｕｎｔドメインループβＣ−ＤおよびβＥ’−Ｆはより密接に関連し、Ａｓｐ１１０（ループβＣ−Ｄ）とＳｅｒ１４５（ループβＥ’−Ｆ）との間の潜在的な水素結合相互作用は、ＣＢＦβ−Ｒｕｎｔドメイン複合体で証明されていない。βＡ’−βＧ’シートの移動を適応するために、残基８５〜８９（Ｐｒｏ８６は５．９Åシフトする）由来の主鎖高次構造中に隆起が存在し、ＮＭＲ構造と比較してＡｌａ１６５（６．５Åのシフト）で上にねじれている。Ａｌａ１６５でのねじれは、Ｔｙｒ１６２との主鎖の潜在的水素結合によって安定化されている。Ｔｙｒ１６２は、分子の疎水性コアに突出しているが、間接的に隣接する残基（Ｔｈｒ１６１およびＨｉｓ１６３）は、ヘテロ二量体の境界面でＣＢＦβサブユニット中に埋没しており、これにより、誘導された高次構造の変化の可能性がＴｙｒ１６２側鎖の配向の安定化によってヘテロ二量体境界面から伝達されたことが示唆される。さらに、ＲｕｎｔドメインβＦ−Ｇループ（残基１５３〜１５９）の高次構造が変化し、これは、結晶構造が９０°ねじれて、ＮＭＲ構造中の位置と比較してＰｒｏ１５６が６．１５Å移動している。上で考察のように、このＲｕｎｔドメイン領域は、ＣＢＦβとさらなる接触を形成する。これらの比較により、ＣＢＦβの存在下でのＲｕｎｔドメインのＣ末端の順序付けおよび特異的ＤＮＡ結合サブドメインの相対的配向を変化させるこ��ができるＲｕｎｔドメイン内の高次構造の可動性が示される。これにより、ＣＢＦβへの結合に対するＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインＤＮＡ結合表面の特異的高次構造により、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体による増強されたＤＮＡ結合の１つの機構を得ることができることが示唆される。
【０１１７】
結果２：公知の変異の構造へのマッピング
＜ヘテロ二量体境界面への鎖骨頭蓋骨形成不全地図の変異＞
ＡＭＬ１およびＡＭＬ３のＲｕｎｔドメイン内の先天的点変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ１）（Ｓｏｎｇら、１９９９）および骨形成障害である鎖骨頭蓋骨形成不全（ＡＭＬ３）（Ｌｅｅら、１９９７）（Ｍｕｎｄｌｏｓら、１９９７）に進行する先天性家族性血小板障害の病因に寄与している。ＡＭＬ１の体細胞変異もまた、急性白血病で示されている（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。点変異の大部分はＤＮＡ結合に直接関連する残基を含むが、最近、ヘテロ二量体境界面への骨形成不全に関連するミスセンス変異が記載されている（Ｚｈｏｕら、１９９９）（Ｑｕａｃｋら、１９９９）（図７Ａ）。
【０１１８】
３つの変異は、ヘテロ二量体境界面に埋没している結晶構造で同定された残基（Ｔ１４９Ａ、Ｑ１５８Ｒ、およびＳ６７Ｒ）（図６Ａおよび表３）に影響を与え、ＲｕｎｔドメインストランドβＦ、ストランドβＧ、およびループβＯ−Ａにマッピングされている。Ｔ１４９変異は、古典的ＣＣＤから歯の奇形のみまでの範囲の１つのファミリーの可変性発現度に関連する一方で、Ｑ１５８およびＳ６７Ｒ変異は、古典的ＣＣＤに関連する（Ｚｈｏｕら、１９９９）。Ｔ１４９Ａ変異は、ＣＢＦβ　Ａｓｎ６３との潜在的塩橋を破壊すると予想される。Ｑ１５８は、ＣＢＦβと相互作用するが、潜在的な塩橋によってＲｕｎｔドメインループβＯ−ＡおよびβＦ−Ｇの高次構造を安定化する。インビトロでのＱ１５８Ｌ変異により、ＤＮＡ結合が損なわれ、ヘテロ二量体形成が損失する（Ｌｅｎｎｙら、１９９５）。Ｑ１５８はまた、潜在的な塩橋を破壊すると考えられる。これらの変異は、ＲｕｎｔドメインループβＦ−ＧおよびβＯ−Ａの高次構造は、ＣＢＦβとの相互作用およびＤＮＡ結合に極めて重大であるにもかかわらず、推定ＤＮＡ結合表面に対してβバレルの反対側の面に存在することを示す。
【０１１９】
結晶構造は、核局在化およびＤＮＡ結合に不可欠なＲｕｎｔドメインＣ末端の高次構造を定義する（Ｑｕａｃｋら、１９９９）（Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９６）（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。ＦＤＰ、ＡＭＬ、およびＣＣＤに関連する変異の構造上へのマッピングは、潜在的なＤＮＡ結合表面を明白に描写する（図７Ａ）。ＦＰＤ、Ｒ１３９に記載されており、ＣＣＤにも記載されている１つの変異は、実際にインビトロでの機能損失を付与することが示されている（Ｚｈｏｕら、１９９９）。Ａｒｇ１７４は、最近のＣＣＤ研究（Ｑｕａｃｋら、１９９９）においてＡＭＬ３Ｒｕｎｔドメイン中の変異によって最も頻繁に影響を受ける残基であり、変異Ｒ１７４ＱはインビトロでＤＮＡ結合を停止し、Ｒ１７４ＱおよびＲ１７４Ｗは、核に蓄積されるＡＭＬ３中の各局在化シグナルの機能を破壊することも示されている。
【０１２０】
ヘテロ二量体境界面の構造は、ヘテロ二量体の損失を示すが、ＤＮＡ結合活性を防止するインビトロＲｕｎｔドメイン変異体Ｍ１０６Ｖ、Ｇ１０８Ｒ、およびＮ１０９Ｄと一致する。βＯ−Ａループ上に存在するＲｕｎｔドメイン残基６６〜６９中の変異もまた、ヘテロ二量体形成を停止させる。最近のショウジョウバエインビボ実験により、Ｇ１０８Ｒ　Ｒｕｎｔタンパク質変異体もまた、インビボアッセイでいくつかが機能不全を示し、これはＲｕｎｔのＣＢＦβホモログＢｒｏｔｈｅｒおよびＢｉｇ　ｂｒｏｔｈｅｒとの相互作用はインビボでのコア結合因子複合体に不可欠であることが示された。
【０１２１】
結果３：他の転写因子での相同性モデリング
転写因子ｐ５３、ＮＦ−κＢ　ｐ５２、ＮＦ−κＢ　ｐ６５、ＮＦＡＴ１、Ｔドメイン、およびＳＴＡＴに対するＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメインの構造相同性が言及されている（Ｎａｇａｔａら、１９９９）（Ｂｅｒａｒｄｉら、１９９９）。結晶構造由来の座標を使用し、Ｄａｌｉサーバを使用してタンパク質データベースを検索し、これにより、Ｒｕｎｔドメインが転写因子ＳＴＡＴ３βに最も密接に関連していることを示された。ＳＴＡＴ３βとのＲｕｎｔドメインの構造アラインメントにより、８２残基について２．１Åのｒｍｓｄが得られる（図２Ｃを参照のこと）。構造相同性は、Ｒｕｎｔドメイン領域内でさえも顕著であり、Ｃ末端内が最も顕著である。より小さいサイズのＲｕｎｔドメインＤＮＡ結合モジュールは、より短い長さの推定ＤＮＡ結合ループに関連する。５つの他の関連転写因子で見出されるＲｕｎｔドメインループβＡ−Ｂに対するループアナログは、大きな溝での重要なＤＮＡ接触を媒介する。ＮＭＲ研究により、βＡ−Ｂループ中のＲｕｎｔドメインＡｒｇ８０からＤＮＡまでのＮＯＥが示され（Ｎａｇａｔａら、１９９９）、変異Ｒ８０ＣはＤＮＡ結合を停止させる（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。ＲｕｎｔドメインＡｒｇ８０、Ｌｙｓ８３、およびＴｈｒ８４に構造的に等価なＳＴＡＴ３β中の残基は、ＤＮＡ結合接触を媒介する。ＲｕｎｔドメインＡｒｇ８０は、ＤＮＡと直接接触するＮＦ−βＢのアナログβＡ−ＢループおよびＮＦＡＴ１に構造が等価である。ＲｕｎｔドメインがＳＴＡＴ３βに構造が密接に関連しているにもかかわらず、ＤＮＡ結合様式は、単量体以外である証拠はない（Ｏｇａｗａら、１９９３ａ）。
【０１２２】
結果４：ＡＭＬ１　ＤＮＡ結合部位のモデル化構造
結晶構造を使用して、Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体、ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインへのＳＴＡＴ３β／ＤＮＡ（ＰＤＢコード１ｂｇ１）共結晶複合体座標の最小二乗の重ね合わせによる主要な溝のＤＮＡ結合モデルを作製することができる（図６Ｂ）。このモデルでは、ＤＮＡに関するＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ複合体の配向は、以下の他のデータに一致する：ヒト疾患変異の位置（図６Ａ）；ヘテロ二量体の表面静電ポテンシャル；インビトロ変異誘発データ（Ｋａｇｏｓｈｉｍａら、１９９６）（Ｌｅｎｎｙら、１９９５）（Ｏｓａｔｏら、１９９９）；化学的フットプリント分析（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９８８）（Ｍｅｌｎｉｋｏｖａら、１９９３）；ＮＭＲ研究由来の制限されたＮＯＥデータ（Ｎａｇａｔａら、１９９９）；およびＣＢＦβがＤＮＡと直接接触することもＤＮＡ上のＲｕｎｔドメインフットプリントも伸長させないという所見（Ｋａｍａｃｈｉら、１９９０）。Ｒｕｎｔドメインβバレル由来の３つのループにより、モデル由来のＤＮＡとノ密接な接触が予想される。βＡ−ＢループおよびＣ末端は、主要な溝中のコア配列認識に関連すると予想される。小さな平行βシートによるループβＡ−Ｂと相互作用するＣ末端の高次構造は、関連するＩｇ折りたたみ転写因子の間の保存された構造の特徴である。本発明のモデルにより、ループβＥ’−ＦはＤＮＡ骨格を作成し、小さな溝に接触することが予想される。ＳＴＡＴ３β中の類似セグメントは、ＤＮＡ骨格相互作用に関連する（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９８）。
【０１２３】
Ｓ１４０Ｎ変異は、ＲｕｎｔドメインによるＤＮＡ結合を停止させる（Ｌｅｅら、１９９７）。Ｓｅｒ１４０は、βＥ’−Ｆループ内の潜在的な水素結合相互作用によってβＥ’−Ｆループの高次構造を安定化し、ループβＥ’−ＦからＣ末端への主鎖相互作用を媒介する保存残基である。Ｓ１４０Ｎ変異により、潜在的な水素結合相互作用を変化させると予想され、ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合およびヘテロ二量体形成機能の両方を停止させるインビトロ変異体Ｓ１４０Ｇに類似の配列を有すると予想される（Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７ｂ）。ＡＭＬに関連する変異Ｇ１３８Ｄ（Ｐ．Ｆｅｒｎａｕｘ、私信）は、分子の疎水性コアに荷電側鎖が導入された重要なβＥ’−Ｆに非常に近い残基に影響を与える。βＥ’−Ｆループの可動性を変化させると予想される類似変異により、ＳＴＡＴ３βおよびＳＴＡＴ６のＤＮＡ結合機能が破壊される（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９８）。これらのデータにより、Ｒｕｎｔドメインβバレルの下の面上のループの可動度が重要な決定要因（ＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合およびヘテロ二量体形成機能の両方）であることが示唆される。これにより、ＣＢＦβがＲｕｎｔドメインのＤＮＡ結合親和性を変化させる重要な機構はＤＮＡ結合ループの突出およびその高次構造の安定化によることが示唆される。
【０１２４】
Ｂｅｒａｒｄｉらは、ＮＭＲ研究におけるＲｕｎｔドメインループβＦ−Ｇ由来のＤＮＡに対するＮＯＥに注目している（Ｂｅｒａｒｄｉら、１９９９）。しかし、ヘテロ二量体の結晶構造では、ＲｕｎｔドメインループβＦ−Ｇの表面上の残基（ｃｉｓ−Ｐｒｏ１５６、Ｐｒｏ１５７、Ｇｌｎ１５８）は明らかにＣＢＦβサブユニット内に埋没している（図４Ｂおよび表３）。ＲｕｎｔドメインループβＦ−ＧおよびストランドβＧは、ＤＮＡに結合するこの複合体の結晶構造中のＡＰ１と相互作用するＮＦＡＴ領域に構造が類似しており（Ｃｈｅｎら、１９９８）、本発明のモデルは、ＡＭＬ１／ＣＢＦβ複合体が約１０塩基対のＤＮＡを保護することが示されている現存のフットプリントデータと適合する（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９８８）。したがって、モデルにより、コア結合因子ヘテロ二量体は、ＲｕｎｔドメインループβＥ’−Ｆ、βＡ’−Ｂ、およびＣ末端を介してＤＮＡに結合することが示唆される。
【０１２５】
例５：三元複合体の結晶構造
１つのＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβヘテロ二量体は、１０塩基対（ｂｐ）の標的オリゴヌクレオチド大きなまたは小さな溝に結合して、ＤＮＡの塩基およびヌクレオチド骨格と潜在的な水素結合相互作用が得られる（図７）。概して、複合体の寸法は、約５０×６２×２４Åである。Ｒｕｎｔドメイン免疫グロブリンβバレルの１つの面はＤＮＡと結合するが、ＣＢＦβはＮＡと接触しない。Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβヘテロ二量体の全体的な折りたたみは、本発明者らの以前の報告（Ｗａｒｒｅｎら、２０００）と一致するが、２つの構造の適合により、ＲｕｎｔドメインはＤＮＡとの相互作用が拡大していることが確認される。ＲｕｎｔドメインのＣ末端「テール」および「ウイング」は、ＤＮＡを拘束するために高次構造を劇的に変化させ、ＡＭＬ１結合部位内のタンパク質に向かって有意に湾曲している。
【０１２６】
＜ＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン＞
Ｒｕｎｔドメイン１２ストランドβバレルは、ＤＮＡらせん軸に垂直の長軸に配向している（図７）。ＤＮＡに接触する全ての構造エレメントは、βバレルの１つの面から突出している。Ｒｕｎｔドメインは、２つのループ、βシート、βストランド、およびＤＮＡに接触するための伸長したＣ末端「テール」を使用する。βＡ’−Ｂループ（残基８１〜８９）、βＡ’−Ｇ’シート（βＡ’−残基７７〜８０；βＧ’−残基１６６〜１６９）、βＥ’ストランド（残基１３５〜１３８）、およびＣ末端「テール」（残基１７０〜１７７）を、大きな溝でドッキングし、ＤＮＡ塩基対の末端およびヌクレオチド骨格と接触させる。βＥ’−Ｆループ（「ウイング」）（残基１３９〜１４５）により、小さな溝に適合するアルギニンが得られる。β−Ａ’−Ｇ’シート、「テール」、および「ウイング」由来の残基は、大きなおよび小さな溝を分割するヌクレオチド骨格と接触し、カニの爪のようにＤＮＡ周囲を固定する連続的表面を形成する（図７Ｃ）。Ｃ末端「テール」および「ウイング」は、大きな溝中でのＤＮＡとの接触表面領域全体を有意に増強して、溶媒が背植可能な表面領域中で全部で１５１９Å２が埋没している（ＧＲＡＳＰのデフォルト半径および１．４Å溶媒プローブを想定）（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）。
【０１２７】
＜ＣＢＦβ＞
三元Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ複合体中のＣＢＦβの構造モデルは、β３’と呼ばれるさらなる短いβストランド（残基Ｙ８５−Ｄ８７）を含む（図７Ｂ）。ストラド３’は、ストランドβ４（残基Ｋ９８〜Ｔ９６）との水素結合相互作用を介したβストランドβ４、β５、およびβ６によって形成された逆平行βシートを伸長させる。ストランドβ３’はまた、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβヘテロ二量体データのさらなる精密化の後に存在するが、高温（Ｂ）因子と関連する構造の一部に見出される。以前のＮＭＲ研究では、ＣＢＦβ残基Ｒ８〜Ｒ９０を含む３１０−ヘリックス（Ｈ４）の存在が報告されている（Ｗｅｒｎｅｒら、１９９９）。これらの研究では二次構造の相違および高Ｂ関連因子が認められ、これは、この領域が高次構造として可動性を示すことを示唆する。本発明者らの現在のＣＢＦβモデルは、４つの周囲のα−ヘリックスを有する７ストランドβバレルを含む（図７）。しかし、ＣＢＦβループβ２−３は、ＲｕｎｔドメインループβＣ−Ｄ上に重ねるように分子の中心部分からＣＢＦβループβ２−３が突き出しており、言い換えれば、ＲｕｎｔドメインループβＥ’−Ｆに対して充填されている（図７Ｂ）。変異分析により、Ｒｕｎｔドメインとのヘテロ二量体形成におけるＣＢＦβループβ２−３の重要なエネルギーおよび機能的役割が示された（Ｔａｎｇら、２０ｂ）。
【０１２８】
＜複合体におけるＤＮＡ高次構造＞
結晶の非対称単位中の２つのＤＮＡ二重らせん（ＥＦおよびＧＨと呼ぶ）は、全ての原子（４０４原子）が０．１７１の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）を有するほぼ同一の構造を有する。表３は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドＥＦの構造を説明する種々のパラメータを列挙する。ＤＮＡ二重らせんは、全Ｂ−ＤＮＡ様高次構造を利用しているが、わずかにアンダーワインディングし（ターンあたり１０．８塩基対）、平均ヘリックスの上昇は３．２７Åであるが、標準的なＢ−ＤＮＡ幾何学由来の偏差が存在する。最も顕著なものは、ストランドＥ上の塩基対Ｇ４−Ｃ５（１８．８°）、Ｇ７−Ｔ８（１８．５°）、およびＴ９−Ｇ１０（１７．３°）との間の顕著な傾斜である。これらの塩基対ステップは、タンパク質に向かうＤＮＡの有意な屈曲（約４０°）を生じる関連する高回転値（ｒｏｏｌ　ｖａｌｕｅ）を有する。大きな溝は、幅が広く（１８．３Å）、小さな溝は、Ｒｕｎｔドメインによる配列特異的塩基接触領域中で拡大する（１３．４Å）。この型のＤＮＡ構造（他の無関係タンパク質−ＤＮＡ複合体中で認められる）は、Ｂｅｇ−ＤＮＡ（ｅｇは拡大した溝を意味する）サブクラスＤＮＡと分類されている（Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ　ａｎｄ　Ｐａｂｏ、１９９４）。したがって、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ複合体中のＤＮＡ高次構造は、他の無関係の糖質コルチコイド、ＭｅｔＪ、波形縁（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）、およびＴｒａｍｔｒａｃｋタンパク質−ＤＮＡ複合体に類似性を示し（Ｎｅｋｌｕｄｏｖａ　ａｎｄ　Ｐａｂｏ、１９９４）、ＤＮＡ自体がタンパク質−ＤＮＡ認識において重要な役割を果たすことが示唆される。
【０１２９】
＜ＤＮＡ認識機構＞
（骨格接触）
Ｒｕｎｔドメインは、コア認識配列に隣接するか一部重複しているリン酸骨格領域と直接接触および水媒介接触を介した大きな溝のいずれかの側面上に固定されている（図８）。相互作用のネットワークは、ＮＡ二重らせんＧＨのみのリン酸骨格に水媒介により接触するＴ８４以外の非対称単位中の両方の二元複合体と本質的に同一である。リン酸基との潜在的な中和接触は、ＤＮＡヘリックスの１つの面に存在し、大きな溝のいずれかの側面上に連続的リン酸を含む。これは、リン酸中和の結果としてタンパク質表面へのＤＮＡ傾斜を促し得る。共通結合部位の５’末端で、ストランドβＥ’（Ｒ１３５）、ループβＡ’−Ｂ（Ｒ８３、Ｔ８４）由来の残基は、ＤＮＡストランドＥ（Ｔ２、Ｔ３、およびＧ４）の骨格ヌクレオチドに接触する（図８Ａ）。反対側のＤＮＡストランドＦ（Ａ２、Ａ３、Ｃ４、Ｃ５）上の骨格ヌクレオチドを、「ウイング」（Ｒ１３９、Ｇ１４１、Ｒ１４２、Ｇ１４３）、ストランドβＧ’（Ｉ１６８、Ｔ１６９）、およびＣ末端（Ｖ１７０）由来の残基によって接触させる（図８Ａ）。「ウイング」由来のＲ１４２は、小さな溝中の両ストランド（ストランドＥ、塩基Ｇ１０；ストランドＦ、塩基Ａ２）由来の塩基をさらに接触させる。ストランドβＥとβＦとの間のアミノ酸配列は、Ｒｕｎｔドメイン中の保存された配列同一性の最も長いストレッチを含み、これはＤＮＡ結合機構のこれらの残基の重要な役割を支持する。
【０１３０】
（塩基対の接触）
非対称単位中の２つのＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβヘテロ二量体は、同一パターンの塩基特異的接触を示す（図２ＡおよびＢ）。一次ＤＮＡ結合特異性決定要因は、ストランドβーＡ’（Ｒ８０）およびＣ末端「テール」（Ｄ１７１、Ｒ１７４、およびＲ１７７）に局在化する。特に、Ｒ８０（ストランドβＡ’）由来の側鎖原子ＮＨ１およびＮＨ２は、それぞれ塩基Ｇ４（ストランドＥ）の窒素Ｎ７および環外酸素Ｏ６との潜在的な二座水素結合相互作用を形成する。２つの他の相互作用は、Ｒ８０側鎖の位置を固定し、特異性を保証する。Ｒ８０（原子ＮＥ１）は、Ｖ１７０の主鎖カルボニルの酸素との潜在的な水素結合（図８Ｂ）およびストランドＥ上の塩基Ｇ４（骨格原子Ｏ１Ｐ）への潜在的な水媒介水素結合（原子ＮＨ１を介する）を形成する。Ｋ８３の側鎖は、塩基Ｇ４への類似の潜在的直接骨格接触を行い、Ｒ８０側鎖の位置をより安定にする。
【０１３１】
ＲｕｎｔドメインＣ末端「テール」により、最も広範な塩基接触組が得られる。Ｒ１７４（原子ＮＨ１およびＮＨ２）により、塩基Ｇ６（ストランドＥ）のそれぞれ原子Ｏ６およびＮ７への潜在的二座水素結合が得られる；Ｒ１７７（側鎖原子ＮＨ１およびＮＨ２）により、塩基Ｇ７（ストランドＥ）のそれぞれ原子Ｎ７およびＯ６への潜在的二座水素結合が得られる。Ｄ１７１（側鎖原子ＯＤ１およびＯＤ２）により、相補性塩基Ｃ４およびＣ５（ストランドＦ）上の２つのＮ４窒素原子との潜在的水素結合相互作用が得られる。Ｄ１７１により、塩基Ｃ４（ストランドＦ）のＯ１Ｐ骨格原子への潜在的水媒介接触も得られ、Ｒ１７４（側鎖原子ＮＨ１）への潜在的な塩橋が安定化する。したがって、Ｒ１７４およびＤ１７１側鎖の配向は、水素結合ネットワークの強化により正確に固定されて、ＤＮＡ相互作用の特異性がさらに増す。
【０１３２】
＜Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体のＤＮＡ誘導性高次構造変化＞
概して、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体およびＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβヘテロ二量体のＣα軌跡は、２４２個の原子でｒｍｓｄが０．７１で十分に重ね合わせられる（図９）。しかし、この比較により、ＲｕｎｔドメインのβＥ’−Ｆループ（「ウイング」）およびＣ末端「テール」の顕著なＤＮＡ誘導性高次構造変化が明らかとなる。
【０１３３】
ＤＮＡの存在下での最も劇的な高次構造の変化は、大部分の配列特異的ＤＮＡ接触が得られる伸長Ｃ末端「テール」内で起こる。Ｐ１７３を超えると、「テール」は１８０°回転して、Ｒ１７４およびＲ１７７と塩基Ｇ６およびＧ７（ストランドＥ）とが並ぶ。伸長「テール」は、大きな溝を通り、ＤＮＡに対して顕著な表面相補性を示す。
【０１３４】
「ウイング」内で、任意のＣα（７Å）の位置で最も顕著なシフトは、三元複合体中のＤＮＡストランドＦ（塩基Ａ３、原子Ｏ２Ｐ）のヌクレオチド骨格への潜在的な水素結合を形成する、Ｇ１４３の主鎖窒素である。Ｒ１４２側鎖の位置を有意に変更して、骨格および塩基を小さな溝に接触させることができる。別の高次構造へのＲｕｎｔドメインβＥ’−Ｆループのロッキングのエントロピーコストを、ループ内残基によるさらなる極性相互作用の形成によって相殺することができる。この仮説は、ＤＮＡの非存在下で崩壊するＫ１４４側鎖（ループβＥ’−Ｆ）は、三元複合体に明白に定義されるという事実によって支持される。Ｋ１４４は、Ｄ１１０およびＥ１１１（ループβＣ−Ｄ）の側鎖への潜在的な塩橋を作製して、Ｒｕｎｔドメインの「ｗｉｎｇ」およびβＣ−Ｄループを架橋する（図９）。変異分析では、Ｋ１４４の重要な構造の役割が支持されている（Ｌｅｎｎｙら、１９９５；Ｃｒｕｔｅら、１９９６）。Ｎ１０９（βＣ−Ｄループ）とＳ１４０（βＥ’−Ｆループ）のカルボニル酸素との間にさらなる新規の潜在的な水素結合を形成させる。ＲｕｎｔドメインＳ１４０（βＥ’−Ｆループ）は、Ｋ１４４のカルボニル酸素への新規の潜在的な水素結合を形成する。したがって、Ｓ１４０は、Ｓ１４０は、ＲｕｎｔドメインループβＣ−Ｄ、βＥ’−Ｆ、およびＤＮＡと塩基特異的接触が得られる平行βＡ’−Ｇ’シートと架橋する。変異体Ｓ１４０ＧおよびＮ１０９Ｄは、ＤＮＡ結合およびヘテロ二量体形成を欠失し、これらの残基の機能上の重要性を示す（Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７）。
【０１３５】
溶液中のＣＢＦβ−Ｒｕｎｔドメイン相互作用のＫｄ（５．２±１．２×１０−７Ｍ）は、ＤＮＡ結合ＲｕｎｔドメインとのＣＢＦβ相互作用のＫｄ（４．５±０．５×１０−８）より１０倍高い（Ｔａｎｇら、２０００ａ）。これにより、ヘテロ二量体がＤＮＡに結合している場合、一方または両方のタンパク質の高次構造が変化したことが示唆される。Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ複合体とＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体との比較により、ＣＢＦβループβ２−３とＲｕｎｔドメインループβＣ−Ｄとの間の局所的な高次構造の変化が同定される（図９）。特に、Ｙ１１３のかさ高い芳香族の側鎖の高次構造が変化し、ＣＢＦβ　Ｎ６３の側鎖の再配向によって順応する。ＣＢＦβループβ２−３は、ヘテロ二量体境界面にエネルギー的および機能的に重要に貢献するので（Ｔａｎｇら、２０００ｂ）、この境界面での高次構造の変化によってＤＮＡの存在下および非存在下でのＣＢＦβとＲｕｎｔドメインとの間の相互作用の自由エネルギーについて説明することが可能である。
【０１３６】
＜ＤＮＡ接触残基の変異分析＞
構造分析由来のＤＮＡの接触に関連する全ての側鎖をアラニン残基に置換する。酵母１ハイブリッドアッセイ（ｙｅａｓｔ−ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ　ａｓｓａｙ）を使用して、ＤＮＡ結合を監視した。アラニンへの置換により、アミノ酸側鎖のβ炭素を超えた原子によって媒介されるＤＮＡとの相互作用が取り除かれるはずである。
【０１３７】
変異Ｒｕｎｔドメインタンパク質を、酵母１ハイブリッドアッセイにおける高親和性コンセンサスＤＮＡ結合部位と相互作用する能力をアッセイした。変異Ｒｕｎｔドメインタンパク質を、ＧＡＬ４活性化ドメインへの融合として示した。プラスミド発現融合タンパク質を、高親和性結合部位の３つの縦列反復の調節下でｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母株に形質転換し、両フィルターおよび液体βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）アッセイを行った（図１０）。構造中のＤＮＡ塩基またはヌクレオチド骨格を直接含む全ての側鎖のアラニン置換（を含むＲ８０、Ｒ１３５、Ｒ１３９、Ｒ１４２、Ｋ１６７、Ｄ１７１、Ｒ１７４、およびＲ１７７）は、ＤＮＡ結合を著しく混乱させ、酵素アッセイにおいて結合はバックグラウンドレベルまで減少する。水媒介接触に関連する２つの側鎖、Ｋ８３、Ｔ１６９はまた、アラニン置換感受性であった。Ｔ８４のアラニンへの置換では、ＤＮＡ結合に影響を与えなかった。しかし、Ｔ８４のＤＮＡへの水媒介性接触を、結晶中の２つの二元化合物のうちの１つにのみ認められた。
【０１３８】
構造および変異分析により、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体のＤＮＡ結合親和性の決定因子およびＤＮＡ結合機構のヒト疾患変異の分子の影響の理解のための確固たる基礎が得られる。構造は、ＤＮＡ結合Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体の構造は転写因子の免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーと明らかに異なるが、依然として転写因子のＲｅｌ基との塩基特異的接触が顕著に保存されていることを示す。ｐ５３との構造および機能の類似性は、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体のＤＮＡ結合機構の理解の一助となる。
【０１３９】
＜ヒト疾患での残基の変異は、危険なＤＮＡ接触を招く＞
ＡＭＬ１遺伝子の後天性体細胞変異を、特にＭｏＡＭＬ変異発生率が高い白血病および骨髄形成異常症ならびに後天性三染色体性２１を有する骨髄悪性腫瘍の患者で説明する（Ｏｓａｔｏら、１９９９；Ｉｍａｉら、２０００；Ｐｒｅｕｄｈｏｍｍｅら、２０００）。ＡＭＬ１の先天性変異および先天性骨形成障害である鎖骨頭蓋骨形成不全（ＣＣＤ）の関連ＡＭＬ３遺伝子の先天性変異を、ＦＰＤ／ＡＭＬ個体で説明する（Ｌｅｅら、１９９７；Ｑｕａｃｋら、１９９９；Ｓｏｎｇら、１９９９；Ｚｈｏｕら、１９９９）。
【０１４０】
三元複合体の構造から得られる鍵となる所見は、Ｒｕｎｔドメインにマッピングするほとんどの疾患関連ミスセンス変異は、配列特異的塩基相互作用またはヌクレオチド骨格接触に関連する残基の影響を受けることである（図８Ｂ）。白血病関連変異は、以下の構造中のＤＮＡに接触するほとんどの残基を標的する：Ｒ８０Ｃ、Ｋ８３Ｎ、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３９Ｑ、Ｄ１７１Ｇ、Ｒ１７４Ｑ、Ｒ１７４Ｇ、Ｒ１７７Ｇ、Ｒ１７７Ｑ、およびＲ１７７ｔｅｒ（終止コドンに変異したＲ１７７）。これらの変異の全ては、ＤＮＡヌクレオチド骨格（Ｋ８３Ｎ、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３９Ｑ）または塩基（Ｒ８０Ｃ、Ｄ１７１Ｇ、Ｒ１７４Ｑ、Ｒ１７４Ｇ、Ｒ１７７Ｇ、Ｒ１７７Ｑ）との重大な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）水素結合相互作用を潜在的に崩壊する。興味深いことに、Ｒ１７７ｔｅｒおよびＲ１７７Ｑはこれら自体による検出可能なＤＮＡ結合はわずかであるが、ＣＢＦβの存在下では、これらは顕著に強度が増加したスーパーシフト（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ）バンドが得られる（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。ＣＢＦβの存在下でのこれらの変異体における有意なＤＮＡ結合活性の回復を、ループβＣ−ＤおよびβＥ’−ＦのＤＮＡ誘導性高次構造変化の安定化によって説明することができる。
【０１４１】
Ｒ８０Ｃを、慢性骨髄性白血病の芽細胞の形質転換患者において同定し、Ｋ８３ＮをＡＭＬ　Ｍ３が再発した患者において同定した（Ｏｓａｔｏら、１９９９）。Ｒ１７４Ｑ変異は、ＦＰＤ／ＡＭＬの文脈で報告されており、Ｒ１７４は、鎖骨頭蓋骨形成不全患者の研究において先天性変異（Ｒ１７４、Ｒ１７４Ｗを含む）に最も頻繁に影響を受けるＡＭＬ３中の残基（Ｒｕｎｘ２／ＣＢＦＡ１）であった（Ｑｕａｃｋら、１９９９；Ｓｏｎｇら、１９９９；Ｚｈｏｕら、１９９９）。Ｒ１３５Ｇ、Ｇ１３８Ｄ、およびＲ１７１Ｇは、ＭｏＡＭＬに記載されている一方で、Ｒ１３９Ｑは、ＦＰＤ／ＡＭＬおよび鎖骨頭蓋骨形成不全で報告されていた（Ｑｕａｃｋら、１９９９；Ｓｏｎｇら、１９９９；Ｚｈｏｕら、１９９９、Ｐｒｅｕｄｈｏｍｍｅら、２０００）。Ｇ１３８（ストランドβＥ’）がＤＮＡと直接相互作用しないにもかかわらず、Ｇ１３８Ｄ変異は、βＥ’−ＦおよびβＣ−Ｄループの高次央像を崩壊して結合を崩壊すると予想される。
【０１４２】
いくつかの他の変異は、ＣＣＤ：Ｋ１６７Ｎ、Ｆ１４６Ｓ、Ｍ１２４Ｒ、およびＳ１４０Ｎとの関連において記載されている（Ｌｅｅら、１９９７；Ｗｅｒｎｅｒら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、２０００）。Ｋ１６７ＮによるＤＮＡ結合の損失は、重大なヌクレオチド骨格接触の崩壊によって説明される（図８）。変異Ｌ１４８Ｆ、Ｆ１４６Ｓ、およびＭ１２４Ｒは、構造の疎水性コアへの残基の突出に影響を受けるので、Ｒｕｎｔドメインの全折りたたみを不安定化すると予想される。Ｓ１４０の構造的役割を上記で明確にする。
【０１４３】
まとめると、ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体の構造および変異分析により、ＤＮＡ結合に対するヒト疾患関連変異の分子の因果関係が明白に説明される。
【０１４４】
＜伸長ＲｕｎｔドメインＣ末端「テール」由来のＲｅｌ様ＤＮＡ接触＞
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメインは、ＳＴＡＴ３βに最も密接な構造相同性を有する転写因子のＩｇドメインスーパーファミリーに属する（Ｗａｒｒｅｎら、２０００）。他のスーパーファミリーのメンバーと共通して、Ｒｕｎｔドメインはβバレルコアの１つの面由来のループを使用したＤＮＡに接触する（図７）。したがって、βＡ’−Ｂループは、ＮＦ−κＢのＡＢ認識ループ、ＢｒａｃｈｙｕｒｙのＴドメイン、ＳＴＡＴおよびｐ５３に構造的および機能的に対応する。全てのＡＢループにより、アルギニン側鎖を介して大きな溝と相互作用し、ＤＮＡに関するドメインの相対的配向は維持される。さらに、ＲｕｎｔドメインβＥ’−Ｆループは、ＮＦＡＴのＥ’Ｆループ（Ｃｈｅｎら、１９８８）およびｐ５３のＬ３ループ（Ｃｈｏら、１９９４）と構造的および機能低に類似し、大きな溝から小さな溝までが由来するＤＮＡヌクレオチド骨格を横切って架橋する。
【０１４５】
しかし、Ｒｕｎｔドメインは、そのＤＮＡ結合構造中に独特のバリエーションを有する。大きな溝での塩基の接触のほとんどがコアＩｇ　βバレルから突き出した固有の伸長Ｃ末端から得られる。これに対して、ｐ５３　ＤＮＡ結合ドメイン（Ｃｈｏら、１９９４）およびＢｒａｃｈｙｕｒｙＴドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｅｒｒｍａｎｎ、１９９７）は、大きな溝および小さな溝に接触するためにＣ末端αヘリックス伸長を使用する。ＤＮＡ認識についてのＲｕｎｔドメイン内の残基の機能的重要性を、アラニン変異およびヒト疾患関連変異のこの領域へのマッピングによって示す。大きな溝中の伸長「テール」の使用によって、ＤＮＡ結合によって埋没していた接近可能表面領域（１５１９Å２）が増強される。この構造の変形形態は、より高次の転写複合体に関連するタンパク質−タンパク質相互作用についてのＤＮＡ結合Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体に利用可能である。したがって、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体で認められたＤＮＡの湾曲および屈曲は、Ｔ細胞レセプターエンハンサーに対するＣＲＥＢ／ＡＴＦ、ＬＥＦ１、およびＥｔｓ−１などの因子との相互作用を促進することができる（Ｇｉｅｓｅら、１９９５）。ＲｕｎｔドメインのＣ末端およびβＥ’−Ｆループの別の高次構造を適用する能力は、全長ＡＭＬ１タンパク質のＤＮＡおよび他のタンパク質との相互作用を調節する役割を果たし得る。
【０１４６】
配列相同性を欠き、且つ配列特異的ＤＮＡ結合についての異なる構造エレメントを使用しているにもかかわらず、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ複合体の構造により、タンパク質のクラスＩＩ　Ｒｅｌファミリーと共に使用すると特異的塩基接触が顕著に保存されることが明らかである（図１１）。このファミリーの代表は、ＮＦ−κＢ　ｐ６５、ＲｅｌＢ、およびｃＲｅｌ、マラリアタンパク質Ｇａｍｂｉｆ１、ショウジョウバエ背側（Ｄｏｒｓａｌ）およびＤｉｆタンパク質（ＡＭＬ１のように、これら全ては、転写活性ドメインを含み、発生において重要な役割を果たし得る）である（Ｃｒａｍｅｒら、１９９９）。３つのグアニン塩基（Ｇ４、Ｇ６、およびＧ７）は、同定された全てのＲｕｎｔドメインＤＮＡ結合認識部位で保存されている（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９８８；Ｋａｍａｃｈｉら、１９９０；Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃ、１９９２）。Ｒｅｌタンパク質ファミリーは、ＲｅｌモノマーのＡＢ認識ループ由来の３つの保存残基、２つのアルギニンおよびグルタミン酸に接触するコアＧＧエレメントを有する。それに対して、Ｒｕｎｔドメインは、Ｃ末端由来の２つの保存アルギニンおよびアスパラギン酸のコアＧＧエレメントへの接触（図２および５）および第３の上流Ｇ遺伝子に接触するためのβＡ’ストランド由来の１つのアルギニンの使用に寄与する。したがって、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ構造により、タンパク質のＲｅｌファミリーでのＤＮＡ結合機構の保存が明らかとなり、転写因子のＩｇドメインスーパーファミリー間の進化上の関係についてのさらなる疑問がでてくる。
【０１４７】
＜ｐ５３との構造および機能の類似性＞
ＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体の構造により、ＲｕｎｔドメインループβＣ−ＤおよびβＥ’−Ｆは、ｐ５３ループＬ２およびＬ３と構造的および機能的に類似しているがことが示唆される（Ｃｈｏら、１９９４）。構造が類似の残基Ｋ１４４（Ｒｕｎｔドメイン）およびＲ２４９（ｐ５３）は、２つのループ間で塩橋相互作用示される。Ｒ２４９は、共通の形質転換変異であり、タンパク質折りたたみの安定性の減少によってｐ５３のＤＮＡ結合親和性が減少されるようである（ＤｅＤｅｃｋｅｒ、２０００）。類似のＲｕｎｔドメイン変異（Ｋ１４４Ｍ）は、ＤＮＡ結合を阻害し、一方でＫ１４４Ｒは阻害しない（Ｃｒｕｔｅら、１９９６）。ＲｕｎｔドメインＮ１０９およびＰ５３　Ｒ１７５（変異多発点）により、同一の２つのループと変異崩壊ＤＮＡ結合機能との間に類似の架橋相互作用が得られる（Ｃｈｏら、１９９４；Ａｋａｍａｔｓｕら、１９９７）。ＲｕｎｔドメインループβＣ−ＤおよびβＥ’−Ｆおよびｐ５３のそのアナログＬ２およびＬ３ループは、ほとんど規則的な二次構造を有さないが、拡張水素結合相互作用の欠如を、ループ間の側鎖−側鎖相互作用および側鎖−骨格相互作用で補うことができる。Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体と対照的に、塩橋相互作用に加えて結合鉛原子は、ｐ５３中の類似のループに連結する。ＲｕｎｔドメインループβＣ−ＤおよびβＥ’−Ｆの高次構造のさらなる安定化を、ＲｕｎｔドメインとＤＮＡとの相互作用について結合定数を低くするＣＢＦβとの相互作用によって得ることができる。
【０１４８】
まとめると、これらの比較により、ＲｕｎｔドメインループβＣ−ＤおよびβＥ’−Ｆの高次構造の変化はＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体とＤＮＡとの間の相互作用の親和性の調整に重要な影響を与えることが示唆される。
【０１４９】
＜生化学データとの一致＞
三元複合体の結晶構造中で示される塩基対およびヌクレオチド骨格の接触（図８Ａ）は、ＤＮＡに対する化学修飾の認められた効果のほとんどを説明している。コア部位中の３つの保存グアニン塩基Ｇ４、Ｇ６、およびＧ７（ストランドＥ）は、メチル化干渉分析由来のＲｕｎｔドメインタンパク質の結合についての重大な接触であることを示した（Ｔｈｏｒｎｅｌｌら、１９８８；Ｋａｍａｃｈｉら、１９９０；Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｋ、１９９２）。塩基対Ｔ３、Ｃ５、およびＴ８（ストランドＥ）は、これらの位置での正常な標的部位中のＤＮＡの配列多様性に一致して、タンパク質との直接接触は存在しない。これらの位置でのピリミジン残基の選択は、ＤＮＡを屈曲させる塩基について「間接的」優先度に影響を与えることができ、これは、構造中これらの塩基ステップで認められた高い回転および充填度で支持されている。認められたＤＮＡの湾曲および屈曲は、ＡＭＬ１−ＣＢＦβ−ＤＮＡ複合体の円順列分析と一致する（Ｇｏｌｌｉｎｇら、１９９６）。Ｒｕｎｔドメイン自体のみがモノマーとしてＤＮＡと結合するという事実にもかかわらず、Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ相互作用についての平衡結合定数が高い（１０−１０〜−１０−１２Ｍ）。これを、複合体形成の際は埋没しており、構造中で認められる多数の塩基との直接的接触（全部で１０）を組み合わせた広い領域の接触可能な表面（１５１９Å２）によって説明することができる。
【０１５０】
これらの生化学データは、本発明者らのＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体の構造および変異分析と一致する。構造中で同定されたＤＮＡ接触への全ての重要な側鎖を、Ｒｕｎｔドメインタンパク質の類似の配列アラインメント中で進化的に不変の残基によって作製することができる（Ｗａｒｒｅｎら、２０００）。これにより、ＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ構造によって明らかとなったＤＮＡ結合機構は、Ｒｕｎｔドメインタンパク質の全ファミリーに共通であることが示唆される。
【０１５１】
本発明に記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求の範囲に記載の本発明はこのような特定の実施形態に過度に制限されないと理解すべきである。実際、化学、生物学、または関連分野の当業者に明白な本発明の実行のための記載様式の種々の修正形態が本発明の対象となることが意図される。本明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【０１５２】
［文献］
【表１−１】
2004507449.tif 000003
【表１−２】
2004507449.tif 000004
【表１−３】
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【表１−４】
2004507449.tif 000006
【表１−５】
2004507449.tif 000007
【表１−６】
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【表１−７】
2004507449.tif 000009
【表１−８】
2004507449.tif 000010
【０１５３】
［配列］
配列番号１
ＡＭＬ１（残基５０−１７８）
【化１】
2004507449.tif 000011
【０１５４】
配列番号２
ＣＢＦβ（残基１−１３５）
【化２】
2004507449.tif 000012
【０１５５】
【表２】
2004507449.tif 000013
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
【表４−１】
2004507449.tif 000015
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【表４−２９】
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【表４−３０】
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【表４−３１】
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【表４−３２】
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【表４−３３】
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【表４−３４】
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【表４−３５】
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【表４−３６】
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【表４−３７】
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【表４−４０】
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【表４−５０】
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【表４−６７】
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【０１５８】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１６】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２４】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表５−４１】
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【表５−８２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
単位格子中の結晶充填配置（ｐａｃｋｉｎｇ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）。６つのＲｕｎｔドメインサブユニットおよび４つのＣＢＦβサブユニットを、結晶中の別の層に充填する。１つの層は、ヘテロ二量体の２つの二量体（Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ）２から構成され、第２の層は、１つのＲｕｎｔドメインホモ二量体を含む。Ｒｕｎｔドメインサブユニットを、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、およびＲと標識する；ＣＢＦβサブユニットはＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨと標識する。
【図２】
Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体複合体の構造。
（ａ）ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ、１９９１）で調製したＣＢＦβ（残基２〜１３５）に結合したＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン（残基５４〜１７８）のＣα追跡の立体図。ＣＢＦβ残基７３〜７８は、非常に崩壊している（示さず）。番号付けは、ヒトＡＭＬ１（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９１）およびヒトＣＢＦβ（Ｌｉｕら、１９９３）のアミノ酸配列に対応している。
（ｂ）Ｒｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体の二量体（非対称単位あたり２つ）のリボン図。ＲｕｎｔドメインのβストランドをβＯ〜βＧと標識し、これは確立した免疫グロブリン折りたたみ命名法（ｆｏｌｄ　ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（Ｎａｇａｔａら、１９９９）に一致する。ストランドβＡおよびβＧの伸長物を、それぞれβＡ’およびβＧ’と標識した。ＣＢＦβのβストランドをβ１〜６と標識し、Ｈ１〜５と数字をつけたヘリックスは、先の命名法と一致する（Ｇｏｇｅｒら、１９９９）。短い潜在的な３１０ヘリックスに対応するたった１つの水素結合は、ヘリックスＨ４に対応する領域に認められるので、示さなかった。ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｅｓｎｏｕｆ、１９９７）を使用して図を作成した。（ｃ）ヒトＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインとヒトホモログＡＭＬ１、ＡＭＬ２、ＡＭＬ３、マウス由来のＰＥＢＰ２αＢ、ウニＳｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ　ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ由来のＳｐＲｕｎｔ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）由来のＸａｍｌ１、ショウジョウバエ由来のＬｏｚｅｎｇｅおよびＲｕｎｔ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＲＮＴ−１との配列アラインメント（プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）、手動で調整）。絶対的に保存された残基にダークグレイで影をつけ、保存的置換残基を薄い灰色で影をつける。二次構造エレメントは、（ａ）のスキームに従う。アラインメントの最後のラインは、ＲｕｎｔドメインのマウスＳＴＡＴ３βとの相同性を示す。配列中の保存残基を示す。ＳＴＡＴ３βの番号付けは、マウス配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ４２２２７）に基づく。
（ｄ）ヒトＣＢＦβおよびショウジョウバエホモログＢｒｏｔｈｅｒおよびＢｉｇ　Ｂｒｏｔｈｅｒの配列アラインメント。番号付けは、ヒトＣＢＦβ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ１３９５１）のものである。二次構造エレメントは、スキーム（ｂ）に従う。ＣＢＦβ中の残基７０〜７４は、ショウジョウバエと同一ではなく、これを破線で示す。
【図３】
ＲｕｎｔドメインとＣＢＦβとの間の相互作用様式。
（ａ）Ｒｕｎｔドメイン（Ｒｕｎｔ）およびＣＢＦβを、ＣＢＦβの長軸に対して並行に示した。ストランドβＧ、βＦ、およびβＦから形成されたＲｕｎｔドメインβシートの窪んだ表面は、ＣＢＦβの相補的な窪んだストランドβ３に対して充填している。
（ｂ）およそ垂直軸で１８０°回転させたＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβ構造の２つの図。ＣＢＦβおよびＲｕｎｔドメインβバレルの長軸は、相互に直行している。
【図４】
Ｒｕｎｔドメインサブユニットを相互作用による相対的配向は、ヘテロ二量体とホモ二量体の二量体境界で異なる。Ｒｕｎｔドメイン鎖ＱおよびＲへのＲｕｎｔドメイン鎖ＣおよびＡの最小二乗の重ね合わせによって図を作成した。鎖ＡおよびＣを細線で示し、鎖Ｒを太線で示す。鎖Ｃ上に重ね合わせた鎖Ｑは示さない。
【図５】
ＣＢＦβと複合体形成したＲｕｎｔドメインは新規の高次構造を有する。最も密接に関連するＮＭＲ適合物への結晶構造由来のＲｕｎｔドメインのＣα軌跡の最小二乗の重ね合わせ（ＰＤＢコード１ｃｍｏ（Ｎａｇａｔａら、１９９９））（全てのＮＭＲ適合物について分析を行い、類似の結果が得られた）。ＲｕｎｔドメインのＮＭＲ構造を太線で示し、結晶構造を細線で示す。
【図６】
コア結合因子構造上のヒト疾患変異の位置。
（ａ）鎖骨頭蓋骨形成不全の変異残基（Ｇ１５８、Ｍ１２４、Ｔ１４９、Ｌ１４８、Ｆ１４６、Ｓ１４０、Ｒ１３９、Ｒ１７４、およびＫ１６７）、家族性血小板障害（ＦＰＤ）の変異残基および急性骨髄性白血病の変異残基（Ｒ１３５、Ｃ８１、Ｃ８３、Ｒ８０、Ｄ１７１、Ｒ１３９、Ｒ１７４、およびＲ１７７）を示したＲｕｎｔドメイン／ＣＢＦβヘテロ二量体のリボン図を示す。
（ｂ）Ｂ形態ＤＮＡに関して中心結合因子へテロ二量体を配向させたモデル。ＡＭＬ１　ＲｕｎｔドメインへのＳＴＡＴ３β−ＤＮＡ複合体（ＰＤＢコード１ｂｇ１（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９８））の座標の最小二乗の重ね合わせによってモデルを作製した。ヒト疾患変異で変異したアミノ酸残基を、丸で示す。
【図７】
ＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体の全体の構造。
（ａ）三元複合体のリボン図。この図は、ページの平面に対して並行なＤＮＡ軸を有する。Ｒｕｎｔドメインを青緑色で示す；ＣＢＦβ、深赤色；ＤＮＡストランドＥ、黄色；ＤＮＡストランドＦ、モーブ。ストランドおよびヘリックスは、β３’と標識したさらなるＣＢＦβのβストランド以外は（Ｗａｒｒｅｎら、２０００）と一致する。ＤＮＡと接触しているＲｕｎｔドメインの構造上の特徴を反転表示する：ストランドβＡ’およびループβＡ’−Ｂの一部（残基Ｔ７７〜Ｔ８４）、赤色；「ウイング」（Ｒ１３９−Ｓ１４５）を含むループＢＥ−Ｆ（残基Ｎ１３２−Ｓ１４５）、緑色；ストランドβＧ’（残基１６６−１６９）灰色；伸長Ｃ末端「テール」（残基Ｖ１７０−Ｒ１７７）、青色。ＣＢＦβの残基７５−７９は崩壊し、これを破線で示す。番号付けは、ヒトＡＭＬ１（Ｍｉｙｏｓｈｉら、１９９１）およびＣＢＦβ（Ｌｉｕら、１９９３）のアミノ酸配列に対応する。プログラムＰＲＥＰＩを使用して図を作成した。
（ｂ）ＤＮＡ軸がページに対して垂直になるようにＸ軸を約９０°回転させた三元複合体の図。
（ｃ）三元複合体の表面の描写。ヌクレオチド骨格を横切って小さな溝にまたがる、主要な溝中Ｃ末端「テール」と「ウイング」との間のＲｕｎｔドメインクランプＤＮＡストランドＦ。ＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）を使用して図を作成した。
（ｄ）本明細書中で使用した番号付けスキームを用いて、同時結晶化で使用したＤＮＡ二本鎖の配列を示す。
【図８】
ＡＭＬ１Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβタンパク質複合体によるＤＮＡ認識。
（ａ）ＤＮＡとタンパク質との間の極性（赤色）および疎水性（青色）相互作用。ＤＮＡストランドＥを黄色、ストランドＦをモーブで示す。コンセンサスＤＮＡ結合配列に対応する中央の６つの塩基対を太字で強調する。Ｔ８４から塩基Ｔ３までの間接的な水との接触および原子０２Ｐ（ストランドＥ）は、２つの複合体のうちの１つのみで見出される。
（ｂ）ＡＭＬ１ＲｕｎｔドメインとＤＮＡとの間の相互作用を示すリボン図。図１のように、ＤＮＡ結合に関連する構造エレメントを強調する。ヒト疾患で変異したＤＮＡに接触している残基を黒のボックスで示す。極性相互作用を破線で示す。含水分子（赤色の丸）は、複合体の両コピーに存在する。ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（Ｋｒａｕｌｉｓ、１９９１）を使用して図を作成した。
【図９】
Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ複合体のＤＮＡに誘導された高次構造の変化。Ｒｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ−ＤＮＡ三元複合体結晶構造へのＲｕｎｔドメイン−ＣＢＦβ結晶構造（ｐｄｂコードｌｅ５０）のＣα軌跡の最小二乗の重ね合わせ。三元複合体では、Ｒｕｎｔドメインを青緑色に、ＣＢＦβを深赤色に色付けし、重ね合わせた二元複合体は、Ｒｕｎｔドメインを茶色に、ＣＢＦβを黄色で示す。矢印は、Ｒｕｎｔドメイン残基Ｇ１４３およびＣ末端「テール」を示す。残基Ｋ１４４（「ウイング」）、Ｄ１１０、およびＥ１１１（ループβＣ−Ｄ）を示す。２つの構造は、βＥ’−ＦループおよびＣ末端「テール」の相対位置が異なる。
【図１０】
酵母１ハイブリッドアッセイ（ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ）において野生型および変異Ｒｕｎｔドメインによって付与されたβガラクトシダーゼ活性。
（ａ）フィルターβガラクトシダーゼアッセイ。酵母形質転換体に含まれるＧＡＬ４−Ｒｕｎｔドメイン融合誘導体を示す。６つ独立したコロニーを、各セグメントに画線培養した。
（ｂ）定量的液体βガラクトシダーゼアッセイ。
【図１１】
ＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン、クラスＩＩＲｅｌタンパク質、およびＮＦＡＴのＤＮＡ認識機構の比較。ヒトＡＭＬ１　Ｒｕｎｔドメイン（本研究）、マウスｐ６５（Ｃｈｅｎら、２０００）、Ｇａｍｂｉｆ１（Ｃｒａｍｅｒら、１９９９）、およびＮＦＡＴ（Ｃｈｅｎら、１９９８）の特異的塩基接触を矢印で示す。保存グルタミン酸またはアスパラギン酸（Ｒｕｎｔドメイン）から得られた水素結合の強化を示す（破線）。保存ＧＧコアエレメントを赤色で強調する。
【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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