(57)【要約】【課題】迅速、簡便かつ信頼性のある分化誘導物質の同定方法およびその方法で使用できる補助物質を提供する。【解決手段】プロモーターの制御下に融合遺伝子を含むＤＮＡ構築物を作製する。この融合遺伝子は少なくとも１つの耐性遺伝子と少なくとも１つのレポーター遺伝子を含んでなり、このＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞に対してやや毒性がある。このＤＮＡ構築物はプラスミドまたはウイルスにコードされていてもよい。さらに、真核細胞において分化を誘導しうる物質を同定において前記ＤＮＡ構築物を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターの制御下に融合遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物であって、上記融合遺伝子が少なくとも１つの耐性遺伝子と少なくとも１つのレポーター遺伝子を含んでなり、上記ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞に対してやや毒性がある、ＤＮＡ構築物。
【請求項２】
プロモーターがＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、腫瘍抑制遺伝子の細胞プロモーターおよび分化遺伝子のプロモーターから選択される、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
レポーター遺伝子がＧＦＰ、ＬａｃＺおよびルシフェラーゼから選択される、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
耐性遺伝子がハイグロマイシン遺伝子、ネオマイシン遺伝子およびピューロマイシン遺伝子から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
融合遺伝子が宿主細胞に有毒な作用を発現しうるポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を有するプラスミド。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む、またはそれをコードする発現カセットを有するウイルス。
【請求項８】
請求項６に記載のプラスミドで安定トランスフェクトされた、または請求項７に記載のウイルスを感染させた真核細胞、特にヒト細胞、特に受託番号２０００年１１月１９日にＤＳＭＺ ＡＣＣ ２４７３としてブダペスト条約（ドイツ、ブラウンシュヴァイク、ＤＳＭＺにて）に従って寄託された細胞株Ｕ８７−ＨＧＦＰ。
【請求項９】
真核細胞において分化を誘導する物質を同定するための、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物、および／または請求項６に記載のプラスミド、および／または請求項７に記載のウイルス、および／または請求項９に記載の細胞の使用。
【請求項１０】
真核細胞において分化を誘導しうる物質を同定する方法であって、
ａ）耐性遺伝子に相当する選択物質を含有する培地で請求項８に記載の細胞をインキュベートし、
ｂ）上記選択物質を欠いた培地に工程ａ）のインキュベート細胞を接種し、このインキュベート細胞を約５ないし約１００時間、好ましくは約２４時間インキュベートし、
ｃ）上記工程ｂ）の細胞の培地に同定しようとする物質を添加し、さらに約１ないし約５日間、好ましくは約２日間インキュベートし、さらに
ｄ）工程ｂ）の細胞と比較して、工程ｃ）のインキュベート細胞のレポーター遺伝子発現が上昇したかどうかを確認する
工程を含んでなることを特徴とする真核細胞において分化を誘導し得る物質の同定方法。
【請求項１１】
悪性および良性腫瘍疾患を治療する医薬組成物の製造のための、請求項１０に記載の方法によって同定される物質の使用。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法および同定された物質を医薬上許容される担体と混合することを含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は真核細胞において分化を誘導する物質を同定する方法、上記方法で用いるＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルスおよび細胞株、ならびに同定された物質を用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
幹細胞からの細胞の分化は胚発達中の一般的な生体現象であるだけでなく、成体器官の再生プロセス（例えば皮膚の再生、造血、腸管上皮の再生、中毒またはアルコール濫用後の肝再生など）にも極めて大きな役割を果たす。重要な生体プロセスはいずれについても損なわれれば慢性疾患を引き起こしたり、死に至ったりすることがある。
【０００３】
腫瘍形成の際、常にというわけではないが極めて頻繁に細胞の「逆」分化が見られ、すなわち細胞が未分化の胚状態に戻る。腫瘍性疾患の早期診断および治療方法が著しく向上したにもかかわらず、死亡率はなお極めて高く、罹患患者の苦しみは大きい。よって、新規かつより効果的な癌薬剤（細胞増殖抑制剤）を発見、開発することは健康政策にとって特に重要なことであり、医薬産業の見通しからも薬剤市場に極めて大きな成長の可能性を持っている。
【０００４】
正常な健康細胞から腫瘍細胞へ過程で多くの遺伝的改変が起こることから、基本的に腫瘍細胞の代謝に干渉し、ひいては成長や伝播を阻害する様々な可能性もある。このように最大級の細胞増殖抑制は細胞ＤＮＡの損傷をもたらす。これは細胞分裂の後に致死的突然変異、すなわちプログラムされた細胞死（アポトーシス）の引き金を引く直接の結果としての細胞死を引き起こす。これは旺盛に増殖しているあらゆる細胞、すなわち腫瘍細胞だけでなく健康な増殖細胞にも影響を及ぼす。
【０００５】
もう１つの細胞増殖抑制剤種としては、旺盛に増殖している細胞の代謝を停止させる代謝拮抗物質がある。第３の細胞増殖抑制剤種は分裂中の細胞の、いわゆる紡錘体を損ない、それにより細胞分裂を阻害するか、直接細胞を死滅させる。比較的新しい第４の種としては、腫瘍細胞の、それら自身への供給のための新しい血管を誘導する能力に干渉する抗脈管形成物質がある。
本発明に関する比較的新しい種の細胞増殖阻害剤は、腫瘍形成中に部分的にスイッチオフされていた遺伝子の発現パターンに干渉するものである。これらの多くはいわゆる腫瘍抑制遺伝子および分化遺伝子である。上記遺伝子の新たな誘導および発現は通常、癌細胞の増殖の優位性を弱め、また、免疫系が上記細胞を攻撃しやすいようにする。
【０００６】
かかる分化誘導物質がいわゆる「ＣｐＧアイランド」のメチル化状態に干渉するということは長年知られていた。ＧｐＧアイランドは特に遺伝子の５’調節配列でよく見られ、遺伝的インプリンティング、すなわち父系遺伝子発現と母系遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす。プロモーターに存在するＧｐＧアイランドをメチル化することで遺伝子をスイッチオフすることができる。マウスのノックアウトモデルで見られるように、主としてメチル化をつかさどるＤＮＡメチラーゼが不活性であれば、発達の致死的破壊が起こる。
【０００７】
従って、現在では、胚形成におけるメチル化と脱メチル化には遺伝的に制御された平衡状態が存在すると推測されている。腫瘍細胞ではこの平衡の混乱がしばしば存在する。このように、例えば多くのタイプの腫瘍で低メチル化誘導物質５’−アザシチジン（Ａｚａ）が強力な細胞増殖抑制剤として働くことから、ＣｐＧアイランドのメチル化によって腫瘍抑制遺伝子のプロモーターをスイッチオフすることが可能であることが分かっている。
【０００８】
分化にとって重要なもう１つの機構として、ヒストンのアセチル化の影響がある。ヒストンは染色質の構造を調節して遺伝子発現に影響を及ぼしうるＤＮＡ結合タンパク質である。これは好ましくは例えばアセチル化またはリン酸化による上記ヒストンの生化学的修飾を介して起こる。そして、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）という物質がヒストンデアセチラーゼの特異的阻害剤として知られている。最近、ヒストンＨ４の脱アセチル化が染色質凝縮をもたらし、それにより遺伝子発現を抑制することができることが示された。従って、ＴＳＡによりヒストンの脱アセチル化を阻害することで染色質の脱凝縮をもたらし、それにより遺伝子発現の抑制を解除することができる。
【０００９】
腫瘍細胞がそれらにとって有害な分化遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現をスイッチオフするために使用できる未知の機構としてまだ多くのものがあると考えなければならない。
いくつかのタイプの細胞増殖抑制剤ではすでに、新規な化合物の同定にも使用できる極めて良好なアッセイ系がありながら、上記のように、分化を誘導しうる物質を同定する方法はない。しかしながら、この新規なタイプの細胞増殖抑制剤は腫瘍の制御に極めて有効であり、かつ、従来の細胞増殖抑制剤よりも不随する副作用が実質的に少ないことから特に注目されるものである。
【００１０】
ＤＮＡの損傷を引き起こし、従って細胞増殖抑制剤として使用できる可能性のある物質を同定するには以下の汎用ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系が利用できる：エームス試験その他のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）試験（ＳＴＹ）は細菌における物質の変異原性に基づくものであり、ＳＯＳクロモテストは遺伝的毒性剤による細菌のＳＯＳ系の誘導に基づくものである。両試験とも匹敵する感度を持つが、物質の遺伝的毒性作用が細菌やより高等な生物によって様々であるという基本的な欠点を持っている。
【００１１】
このため、コメットアッセイとしても知られる単一細胞ゲル試験（ＳＣＧ試験）である小核試験および姉妹染色体交換試験（ＳＣＥ試験）が開発された。文献では、重金属誘導性メタロチオネインプロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子を含む細胞株Ａ４／４が記載されている。著者らは、このプロモーターは培養中はスイッチオフされているが、脱メチル化物質５’−アザシチジンによって再び誘導することができると報告している（Ｂｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ＤＮＡ傷害剤を同定するためにこれまで知られているアッセイ系は、その機構が全く異なっているため、分化を誘導する物質を同定する目的では適切でない。
Ｂｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （ａｏｃ． ｃｉｔ． ｌｏｃ．）により記載されているレポーター細胞株は誘導系であるという決定的な欠点を持つ。物質の脱メチル化作用は同時にプロモーターのインデユーサーを用いる場合にしか可視化できない。著者らはカドミウムおよび亜鉛などの重金属によって誘導されるメタロチオネインプロモーターを選択した。遺伝子発現を誘導する重金属自体は何百と文献に示されている。結果として、この系に必要な重金属の遺伝子発現誘導作用はいくつかの物質の脱メチル化作用を重ね合わせたものであり、すなわち、非特異的、偽陰性または偽陽性結果が非常に出やすい。これらの細胞株は脱メチル化物質を発見すべく作り出されたものである。これらの物質は分化を誘導しうるが、上記に説明したようにその能力を持つ物質のみに限ったことではない。１９９２年以降、この細胞株に関するそれ以上の刊行物はないので、この細胞株が安定かどうかも、同様に他の分化プロセスの検出にも適切かどうかも分からない。
【００１３】
上記の点で、本発明の目的は分化を誘導する物質を迅速、簡便かつ信頼性のある方法で同定するために使用できる、はじめに記載したタイプの方法、およびその方法で使用できる補助物質を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この目的はプロモーターの制御下に融合遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物によって達成され、この融合遺伝子は少なくとも１つの耐性遺伝子と少なくとも１つのレポーター遺伝子を含んでなり、上記ＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞に対してやや毒性があり、これにより、例えば栄養培地に適当な抗生物質が含まれていない際に、トランスフェクトされた宿主細胞の増殖に耐性遺伝子の発現が必要でない場合は上記プロモータースイッチオフされる。
【００１５】
本発明はさらに、このようなＤＮＡ構築物を有するプラスミド、上記ＤＮＡ構築物を含む、またはそれをコードする発現カセットを有するウイルス、すなわちＤＮＡウイルスまたはレトロウイルス、および真核細胞、特に上記プラスミドで安定トランスフェクトした、または上記ウイルスを感染させたヒト細胞、特に２０００年１１月９日にＤＳＭＺ（ドイツ、ブラウンシュヴァイク）にて受託番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ ２４７３としてブダペスト条約に従って寄託された細胞株Ｕ８７−ＨＧＦＰ、ならびに真核細胞において分化を誘導する物質を同定するために、上記ＤＮＡ構築物、および／または上記プラスミド、および／または上記ウイルス、および／または上記細胞を用いる方法に関する。
【００１６】
この目的はさらに、
ａ）耐性遺伝子に相当する選択物質を含有する培地でこの新規な細胞をインキュベートし、
ｂ）上記選択物質を欠いた培地に工程ａ）のインキュベート細胞を接種し、このインキュベート細胞を約５ないし約１００時間、好ましくは約２４時間インキュベートし、
ｃ）上記工程ｂ）の細胞の培地に同定しようとする物質を添加し、さらに約１ないし約５日間、好ましくは約２日間インキュベートし、さらに
ｄ）工程ｂ）の細胞と比較して、工程ｃ）のインキュベート細胞のレポーター遺伝子発現が上昇したかどうかを確認する
工程を含んでなり、真核細胞において分化を誘導しうる物質を同定する方法によって達成される。
【００１７】
本発明は分化を誘導する物質の同定に関する問題を完全に解決するものである。
この点で、プロモーターはＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、腫瘍抑制遺伝子の細胞プロモーターおよび分化遺伝子のプロモーターから選択し、レポーター遺伝子はＧＦＰ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼから選択し、耐性遺伝子はハイグロマイシン遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、および／または例えばそれ自体やや毒性があるＧＦＰまたはそれぞれプロドラッグとしての５’−フルオロシトシンおよびガンシクロビルを毒性物質に変換するシトシンデアミナーゼもしくはチミジンキナーゼなど、宿主細胞に有毒な作用を発現しうるポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を含有する融合遺伝子を選択するのが好ましい。
【００１８】
この細胞株はまた、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）の制御下に融合遺伝子を含む。このプロモーターは通常、先行技術のメタロチオネインプロモーターとは対照的に、細胞中で極めて強力であるので誘導する必要がない。さらにまた、このプロモーターは特にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ある特定の条件下でスイッチオフできることが知られている。
この融合遺伝子は抗生物質ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏ）耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる。神経膠芽腫細胞株Ｕ８７をこの構築物でトランスフェクトし、抗生物質ハイグロマイシンを用いて選択したところ、Ｕ８７−ＨＧＦＰが得られた。この細胞株は抗生物質の存在下で融合遺伝子を発現し、これはＧＦＰの蛍光に基づき、蛍光顕微鏡下で極めて明瞭に確認される。この抗生物質数日間で除去すれば、この融合タンパク質は細胞に対してやや毒性があるので、細胞はＣＭＶプロモーターをダウンレギュレートする。本発明者らが観測したように、上記融合タンパク質は特定の細胞コンパートメント（おそらくはＥＲ）に集積する。この細胞を極めて低濃度の分化誘導物質５’−アザシチジンおよび／またはトリコスタチンＡで処理すると、わずか２日以内にＧＦＰ蛍光の増強によって確認できるＣＭＶプロモーターの極めて強力なアップレギュレーションが生じる。
【００１９】
これまでに分化誘導物質がＣＭＶプロモーターとハイグロマイシンＧＦＰの融合物からなる発現ユニットを用いて検出できるという細胞株は記載されたり、知られたりしていない。この系は極めて信頼性の高いものであり、この細胞株の通常培養下にハイグロマイシンが存在すればこの発現ユニットの欠損は避けられる。この細胞株はハイグロマイシンを除去した後数日だけ実質的に完全にＣＭＶプロモーターをダウンレギュレートする固有の能力を有する。このプロモーターは分化誘導物質を添加すると再びアップレギュレートされる。
【００２０】
公知の系に比べた場合の利点としては、とりわけ、（Ｉ）ハイグロマイシン遺伝子による正の選択性（すなわち、この発現ユニットは抗生物質を添加すると安定して維持される）、（ＩＩ）負の選択性（すなわち、ハイグロマイシンＢの不在下ではＧＦＰ遺伝子の毒性作用が、プロモーターをスイッチオフする細胞を選択する）、（ＩＩＩ）ＧＦＰの固有蛍光による同定性といった複数の特性を組み合わせた融合遺伝子を用いることである。これらの特性によってこの系は極めて安定かつ信頼性の高いものとなる。
【００２１】
この系は処理する分化物質以外にはインデューサーを必要としないことから、インデューサーによる妨害や重ね合わせが影響することはない。
この系は脱メチル化だけでなくヒストンのアセチル化を見出しうることが分かっている。
レポーターとしてＧＦＰを用いると、生細胞および固定細胞のいずれであってもプロモーター活性、ひいては分化誘導物質の作用を観測することが可能となり（蛍光顕微鏡）、かつ、フローサイトメトリーの手段によってそれを正確かつ再現性よく定量することが可能となる。
【００２２】
この新規な方法では、プロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、腫瘍抑制遺伝子または分化遺伝子の細胞プロモーター）、レポーター（ＧＦＰ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ）と融合させた選択マーカー（ハイグロマイシン遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ピューロマイシン遺伝子など）、および「毒性」遺伝子（例えば、ＧＦＰ、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ）からなる他のレポーター発現ユニットを用いることもできる。
【００２３】
シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼはさらに、それぞれ致死的ではないが毒性がある濃度のプロドラッグ５’−フルオロシトシンおよびガンシクロビルが必要となる。これはプロモーターをダウンレギュレートする細胞を選択する。
これらの構築物はまた、Ｕ８７以外の細胞株においてトランスフェクトしてもよいし、あるいはこの研究はｉｎ ｖｉｖｏ、すなわちトランスジェニック動物で行ってもよい。
【００２４】
細胞株Ｕ８７−ＨＧＦＰは特に、短時間内に信頼をもってプロモーターがスイッチオフできるという利点を有する。さらにまた、この方法は自動化可能であり、短時間に多くの物質をスクリーニングすることが可能となる。
この細胞株は腫瘍細胞であるというさらなる利点を有し、従ってモデル系のみならず、同時に試験系でもある癌細胞に関して物質を検討できる。もう１つの利点として、これらの細胞は適当な物質を添加することで分化し、これが形態的変化によって観察できるということである。
【００２５】
従って、このようにして同定された物質はダウンレギュレートされたプロモーターを再活性化できるだけでなく、癌細胞を分化へ向かわせることもできるので、可能性のある細胞増殖抑制剤となる。
このような背景に対し、本発明はまた、悪性および良性の腫瘍性疾患を治療するための医薬組成物を調製することを目的として、この新規な方法によって同定された物質を使用する方法、およびこの新規な方法と、同定された物質を医薬上許容される担体と混合することを含んでなる医薬組成物の調製方法に関する。
【００２６】
さらなる利点は説明および添付の図面から明らかになる。
上記またはさらに以下で説明する特徴は各事例に示されている組合せだけでなく、本発明の範囲を逸脱しない限り、他の組合せやそれら単独でも使用できることは明らかである。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施形態および添付の図面をもとに説明する。
図１
５’−アザシチジンおよびトリコスタチンＡによるＨ−ＧＦＰ遺伝子の増幅を蛍光顕微鏡によって検出したものを示す。カバースリップ上で増殖中のＵ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞を５−アザシチジン（０．５〜２．５〜２０μＭ）およびトリコスタチンＡ（０．１〜１μＭ）で４８時間処理した。処理細胞で処理しなかったものに比べ、Ｈ−ＧＦＰ遺伝子の増幅による緑色蛍光シグナルの増強が見られた。親細胞は蛍光顕微鏡によって観察するに十分強いシグナルは見られなかった（データは示されていない）。画像は全て４００倍である。
図２
種々の濃度の５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡを用いて４８時間処理した後に得られたＵ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞および親細胞でのＦＡＣＳ蛍光プロフィールを示す。１〜２×１０５細胞のＵ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親株を６ウェルプレートに播種し、５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡで４８時間処理した後、下記のようにフローサイトメトリーで分析した。ヒストグラムはいずれも、横座標は蛍光強度を表す任意のログスケールに相当し、縦座標は細胞数を表す。各曲線は総数２×１０４細胞に相当し、重なりの部分で濃いプロフィールは未処理細胞に相当し、薄いものは処理細胞に相当する。
【００２８】
プロフィール（ａ）〜（ｅ）：Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰ。２．５、２０μＭ Ａｚａおよび１μＭ ＴＳＡで蛍光強度の高い方へのシフトが明らかに見られ、一方、０．５μＭ Ａｚａおよび１００ｎＭ ＴＳＡの曲線では未処理細胞のシフトを完全に抑制する。
プロフィール（ｆ）〜（ｌ）：Ｕ８７。特に２０μＭ Ａｚａおよび１μＭ ＴＳＡを用いた場合に小さなシフトが見られるが、これはプラスミドにより生じたバックグラウンドの増強であると考えられ、蛍光顕微鏡によっては観察できない。
図３
（Ａ）は種々の最終濃度の５−アザシチジンで４８時間処理したＵ８７親株およびＨ−ＧＦＰを示す。Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰは２．５μＭ Ａｚａですでに蛍光強度の平均値に２倍の増強を示す（非処理細胞と比較）。このレポーター細胞株は２０μＭ Ａｚａを用いた場合には３倍の増強を示す。最高濃度を用いた場合にのみＵ８７親株の蛍光強度平均値におよそ２倍の増強が得られる。
【００２９】
（Ｂ）はトリコスタチンＡによるＨ−ＧＦＰ遺伝子発現の増強を示す。各細胞株およそ１０５細胞ずつを種々の最終濃度のトリコスタチンＡとともに４８時間培養した。ヒストグラムが示しているように、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰで１μＭおよび３μＭ ＴＳＡを用いた場合には蛍光強度平均値に３倍および４倍の増強が得られた（非処理細胞と比較）。
両ヒストグラムとも、全ての平均値、標準偏差、およびＰ値は、２つの異なる独立した実験から得られた少なくとも５つの異なる値（ｎ＝５）から導き出したものである。Ｐ値は全て非処理細胞をさす。
【００３０】
（Ｃの上）は５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡの異なる２種類の組合せによる処理を示す。２種類の細胞株（１０５細胞／ウェル）をＡｚａおよびＴＳＡの２種類の異なる組合せの存在下で４８時間培養した。いずれの場合にも、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰでは蛍光強度平均値に３倍の増強が見られた（非処理細胞と比較）。しかし、この違いはこの２種類の異なる薬剤の組合せで処理したＵ８７ Ｈ−ＧＦＰに関する増強と比べると有意ではない（ｐ＝０．０９）。
【００３１】
（Ｃの下）はそれぞれ単独、および組み合わせたトリコスタチンＡおよび５−アザシチジンを示す。１０５細胞のＵ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞株を２００ｎＭ ＴＳＡ、１μＭ Ａｚａ、および両者の組合せで４８時間処理した。この２種類の薬剤それぞれ単独で処理した場合、蛍光強度平均値におよそ２倍の増強が得られる（Ｐ〜１０９および＜１０−４、非処理細胞と比較）。この２種類の薬剤の組合せを用いた場合は、それぞれ単独の薬剤を用いた場合に比べて蛍光強度に小さいが有意な増強が得られた（Ｐ−０．０２）。
【００３２】
平均値、標準偏差、およびＰ値は２つの独立した実験で得られた１０個の値（ｎ＝１０）に基づくものである。
図４
それぞれ５μＭ ５−アザシチジンで４８時間処理した、または処理しなかったＵ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親株のＦＡＣＳ分析によって得られたドットプロットを示す。両細胞株とも５μＭ Ａｚａの存在下で培養維持した。２日後、記載のように細胞種浮きを調べた。１０，０００細胞を分析した。ＦＡＣＳ分析による細胞周期の調査方法を以下に示す。
【００３３】
［ＩおよびＩＩ］は処理細胞および非処理細胞のＤＮＡ染色を示したドットプロットを示す。（２Ｎ＋４Ｎ）核の母集団を正確に定義するために（Ｒ１）領域を用いた。［ＩＩおよびＶ］はＤＮＡへのＢｒｄＵの組み込みを示したドットプロットを示す。ＦＬ３−Ａの蛍光の直線スケール上の値２００および４００は核内の２Ｎおよび４Ｎ ＤＮＡの量に相当する。示されているものは全てＲ１領域に相当する。［ＩＩＩおよびＶＩ］はＢｒｄＵ組み込みのドットプロットの象限を確率するためのイソタイプ対照を示す。抗イソタイプ抗体は非特異的結合を示し、抗ＢｒｄＵ抗体の負の対照として用いた。このＢｒｄＵ組み込みのドットブロットを用いて種々の細胞周期相にある細胞のパーセンテージを求めた（象限：左下の領域＝Ｇ１〜Ｇ０期；右下の領域＝Ｇ２期；左上の領域＝Ｓ期；右上の領域＝Ｍ期）。
図５
実験に用いたプラスミドｐＣＭＶ−ＨｙｇｒｏＥＧＦＰを示す。
１）ｐＣＭＶ−ＨｙｇｒｏＥＧＦＰのクローニング
ｐＳｃｒｉｐｔｐｏｌｙＡと呼ばれる中間プラスミド１（３５９５ｂｐ）：
出発プラスミドｃＣＲＳｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋） ＡｍｐＲ＋をＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ｐＴＫｎｅｏ由来の６２５ｂｐ ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルを含むＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩと連結（平滑末端連結）。
【００３４】
中間体２：ｐＣＭＶＡ（４２６０ｂｐ）
ｐＬ１５ＴＫ由来の６７０ｂｐ ｈＣＭＶプロモーター断片（ＰｓｔＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化）をＳｒｆＩで切断した中間体Ｉ ｐＳｃｒｉｐｔｐｏｌｙＡに挿入。
中間体３：ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ（４９７５ｂｐ）
ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＥＧＦＰリーディングフレーム（クレノウポリメラーゼを用いて末端を埋めたもの）をＰｓｔＩで開環したベクターｐＣＭＶＡ（中間体２、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化）に連結（平滑末端連結）。
【００３５】
最終のｐＣＭＶ−ＨｙｇｒｏＥＧＦＰ（６０５２ｂｐ）
ｐＴｋＨｙｇｒｏ由来のハイグロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する１０２６ｂｐのＰＣＲ断片（このＰＣＲによって停止コドンは除去）をＡｇｅＩで開環したベクターｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ（クレノウポリメラーゼを用いて末端を埋めることで平滑末端化）へ連結（平滑末端連結）。
このプラスミドは図５に示されている。
２）材料および方法
細胞株
Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰはプラスミドｐＣＭＶ−ｈｙｇｒｏＥＧＦＰで安定トラスフェクトした後のヒト神経膠腫細胞株Ｕ８７に由来する細胞株である。ゲノムＤＮＡに組み込まれるこのプラスミドはＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に由来し、ヒトＣＭＶプロモーターの下流に融合遺伝子を有している。この融合遺伝子は増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。結果として得られた遺伝子（Ｈ−ＧＦＰと呼ばれる）はハイグロマイシンＢに対する耐性を付与し、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー分析によって容易に検出できるタンパク質をコードしている。これに対し、親細胞株Ｕ８７はいずれのプラスミドも含まず、負の対照として使用できる。
【００３６】
Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親株Ｕ８７は、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃にて１０％ウシ胎児血清（Ｓｅｒｏｍｅｄ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、低グルコース、Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬ）中で培養した。Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞株については、培地に６００単位／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した。
Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親細胞をハイグロマイシンＢを含まないＤ−ＭＥＭを用い、６ウェルプレート（Ｎｕｃｌｏｎ， ＮＵＮＣ）中、１〜２×１０５細胞／ｍｌで播種し、接着させるために２４時間インキュベートした。その後、培地に種々の最終濃度（Ａｚａは２．５−５−１０−２０−４０μＭ、ＴＳＡは１０ｎＭから３μＭ）で５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｃｏ．）を添加した。処理から２日後、蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー分析を行った。
【００３７】
蛍光顕微鏡観察
各細胞株およそ１０５細胞をポリリジンコートカバースリップ上に播種し、種々の濃度のＡｚａおよびＴＳＡで４８時間処理した後、室温で３０分間、５％ホルムアルデヒドで固定した。その後、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｈｏｔ， Ｚｅｉｓｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）下で全てのサンプルを分析し、種々の最終濃度の各薬剤に対応する様々な画像を記録した（図１）。
ハイグロマイシン−ＥＧＦＰ融合遺伝子発現細胞のフローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳ分析用のサンプルを調製するため、細胞を３７℃、６ウェルプレートにて、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬ）を含有する０．０５％トリプシン中で５分間インキュベートした後、２容量の培地を加えることでトリプシンの作用を停止させた。この細胞を回収し、５００ｘｇで５分間遠心分離し、１ｍｌの完全Ｄ−ＥＭＥに再懸濁させた。死細胞を染色するため、ヨウ化プロピジウム（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を各サンプルに加えた。次に細胞を再び遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×， ｐＨ７．４）に再懸濁させた後、それらをＦＡＣＳにより分析した。
【００３８】
細胞はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、およそ５００度数／ｓに相当する流速で分析した。
細胞の母集団を正確に定義し、細胞屑や凝集物を除くため、ドットブロットにて目的領域を設定した（ＳＳＣと比較したＦＣＳ）。ヨウ化プロピジウムの２パラメーターヒストグラムにおいて、前方角光散乱（ＦＳＣ）と比較することで死細胞を識別した。個々の細胞の蛍光強度は対数で測定し、各対数ヒストグラムは２×１０４度数表す。蛍光強度平均値（ＭＦＩ）とは各細胞集団で蛍光強度の増強を定義するために用いたパラメーターである。
【００３９】
細胞周期の分析
Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親細胞を、両細胞株ともハイグロマイシンＢを含まないＤ−ＭＥＭを用い、Ｔ２５フラスコ（Ｎｕｃｌｏｎ， ＮＵＮＣ）に５×１０３／ｃｍ２で播種した。これらフラスコの半数を５μＭのＡｚａで処理し、他方は薬剤を用いずに負の対照とした。４２時間後、培地にＢｒｄＵを加え（最終濃度１０μＭ）、６時間後に細胞周期分析のために細胞を調製した。
【００４０】
細胞を回収し、５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、冷却した７０％強度のエタノール中で２０分間固定した。ＢｒｄＵのＤＮＡへの組み込みは各々Ａｚａ処理細胞株または非処理細胞株３×１０５細胞を用いて検出した。
ＰＢＳ １ｘ／０．５％ ＢＳＡ（洗浄バッファー）を加え、細胞を５００ ｘ ｇで５分間遠心分離した。次にペレットを変性溶液（ＨＣｌ １Ｍ， ＰＢＳ ０．５ｘ ＢＳＡ ０．５％）に再懸濁させ、２０分後に再び洗浄した。その後、ペレットを０．１Ｍホウ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７）、ｐＨ８．５に２分間再懸濁させた後、洗浄バッファーを加えた。その後、各サンプルの全量を二等分し（半分はイソタイプ抗体用、もう半分はＢｒｄＵ抗体用）、５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、抗イソタイプまたは抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含有するバッファーに再懸濁させ、３０分後にＰＢＳ １ｘ／０．５％ ＢＳＡで洗浄した。上清を廃棄し、ペレットをＲＮＡアーゼＡに再懸濁させ（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、７−ＡＡＤ溶液（Ｖｉａ−ＰＲＯＢＥ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に加えることでＤＮＡを染色した。１時間後（暗所）、サンプルを洗浄した後、ＰＢＳ １ｘ／０．５％ ＢＳＡに再懸濁させた。核のＤＮＡ蛍光（各細胞集団についておよそ１０４個の核を分析）を、上記のＦＡＣスキャンフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により測定し、細胞周期のＧ０およびＧ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期にある細胞のパーセンテージをＦＡＣスキャンソフトプログラムに基づいて分析した。
３）結果
細胞株Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰはプラスミドｐＣＭＶ−ｈｙｄｒｏＥＧＦＰを含み、ｈＣＭＶプロモーターの活性が通常低レベルで調節される。このプラスミドは細胞株にハイグロマイシンＢに対する耐性および親細胞株に対して基礎緑色蛍光を付与する。ｈＣＭＶプロモーターはシトシンの５’−ＣｐＧ部位のメチル化により完全に抑制されることが示されている（Ｐｒｏｓｈ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ １９９６， Ｍａｒ ３７７（３）： １９５−２０１）。このプロモーターの特性がＤＮＡのメチル化状態および染色質凝縮に干渉する薬剤によって活性化されうるかどうかを評価するため、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親株Ｕ８７を数日間ＡｚａおよびＴＳＡの存在下で維持した。ｈＣＭＶプロモーターの基礎レベルの活性化を低下させ、ＡｚａおよびＴＳＡによるプロモーターの活性化を検出するため、実験前に培地からハイグロマイシンＢを除いた。
【００４１】
図１は種々の最終濃度のＡｚａ（０．５−２．５−２０μＭ）およびＴＳＡ（１００ｎＭ， １μＭ）で４８時間処理したＵ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。レポーター細胞株（非処理細胞）の基礎発現を種々の最終濃度のＡｚａおよびＴＳＡで処理したサンプルと比べると、これらの画像でＨ−ＧＦＰ遺伝子の発現の増強を検出することができる。２０μＭ Ａｚａおよび１μＭ ＴＳＡで緑色蛍光シグナルの増強が明らかである。親細胞は基礎緑色蛍光の弱い増強を示したが、これはＦＡＣＳ分析によってのみ検出可能なものであり、蛍光顕微鏡観察では検出できなかった。
【００４２】
さらにまた、高濃度のＴＳＡおよびＡｚａでは細胞の形態学変化が見られたが、これはこれらの物質が腫瘍細胞Ｕ８７を分化へ引き戻しうることを示唆している。
図２は蛍光顕微鏡観察について同濃度のＡｚａおよびＴＳＡで処理したサンプルのＦＡＣＳプロフィール（対数ヒストグラム）を示す。
横座標は蛍光強度の対数を表す任意のスケールを示し、縦座標は細胞の相対数を表す。レポーター細胞株で処理しなかった対照と上記の最終濃度で処理したレポーター細胞株とを比べると、蛍光プロフィールのより高い強度の方向へのシフトが見られた。このシフトはすでに２．５μＭ Ａｚａを添加した場合に明らかに認められ（図２のプロフィールｂ）、より高い濃度でも十分定義される（プロフィールｃ）。
【００４３】
最終濃度１００ｎＭでＴＳＡはＨ−ＧＦＰ発現に何ら増強を誘導しないが（プロフィールｄ）、最終濃度１μＭで飽和限界に達する（プロフィールｌ）。３μＭを超える最終ＴＳＡ濃度は、極めて毒性が高く、ＦＡＣＳによって見られたように生細胞数を著しく少なくすることから使用できなかった（データは示されていない）。
親細胞株も同様にＡｚａ （図２、プロフィールｆ〜ｈ）およびＴＳＡ（プロフィールＩおよびｌ）に感受性があるが、蛍光強度のシフトはレポーター細胞株で得られたものに匹敵するものではないことから、プラスミドによって誘導されたものではなくバックグラウンドの増強であると説明できる。
【００４４】
図３Ａのヒストグラムはレポーター細胞株および親細胞株を種々のＡｚａ濃度で４８時間だけ処理した実験に相当する。このヒストグラムは、対照（非処理Ｕ８７ Ｇ−ＧＦＰ）と２．５μＭ Ａｚａで処理した細胞を比較した場合、蛍光強度平均値に２倍の増強を示す（Ｐ＞１０−６、対照と比較）。２０μＭ Ａｚａを用いた場合、Ｈ−ＧＦＰ遺伝子発現は蛍光強度に３倍の増強を達成できる（Ｐ＞１０−５、対照と比較）。基礎蛍光の緩やかな増強（ＦＡＣＳ分析によってのみ、蛍光顕微鏡観察では認められず）は親細胞株でも見られ（ヒストグラムの下のバー）、これは最高濃度（４０μＭ Ａｚａ）を用いた場合の２倍未満に相当する。この実験をＡｚａを１４４時間（５日間）保持し、同じ最終濃度で繰り返したところ、蛍光強度平均値に同様のシフトが見られた（データは示されていない）。
【００４５】
図３で明らかなように、ＴＳＡもまたＨ−ＧＦＰ遺伝子の増幅を誘導することができる。両細胞株とも種々の最終ＴＳＡ濃度で４８時間培養維持した。ヒストグラムから、ＴＳＡでは５００ｎＭではじめてＵ８７ Ｈ−ＧＦＰの蛍光強度にわずかながら有意な増強が明らかであり、それより低い濃度を用いた場合では増強は見られない。しかし、ＴＳＡ １μＭおよび３μＭを用いた場合には３倍および４倍の蛍光強度増強が見られた（Ｐ＝０．００１およびＰ＞１０−５、非処理細胞と比較）。親細胞株では３μＭ ＴＳＡでのみ２倍の増強が見られる。
【００４６】
他の腫瘍細胞株で示されているように（Ｃａｍｅｒｏｎ Ｅ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９９９； Ｖｏｌ． ２１， １０３−１０７）、ＴＳＡがＡｚａと相乗作用しうるかどうかをさらに検討するため、ＴＳＡをＡｚａと組み合わせて４８時間用いた（図４ｃ）。この実験では、ＴＳＡを最終濃度１μＭに固定し、Ａｚａを２．５から５μｍに変化させた。いずれの場合にも、非処理細胞に比べＵ８７ Ｈ−ＧＦＰでは３倍の蛍光増強が見られるが、この差は２種類の薬剤の組合せを比較した場合では有意ではない（ｐ＝０．０９）。次の実験では（図４ｄ）、ＴＳＡとＡｚａをそれぞれ単独で、また組み合わせて４８時間用いた（図３ｃ）。これらの薬剤単独による増強は有意であり、２００ｎＭ ＴＳＡでも（Ｐ＝１０−９、非処理細胞と比較）１μＭ Ａｚａでも（Ｐ＜１０−４、非処理細胞と比較）約２倍の増強に相当した。両者の組合せ（２００ｎＭ ＴＳＡ＋１μＭ Ａｚａ）を用いた場合では、薬剤単独に関する小さな増強は有意であったが（Ｐ〜０．０２、薬剤単独と比較）、これらの薬剤は相乗作用も相加作用も見られず、この理由はおそらく蛍光強度の増強がこれらの薬剤濃度でのＣＭＶプロモーターの最大活性に相当していたためであろう。
【００４７】
細胞周期に対する５−アザシチジンの作用
細胞周期に対するシトシン類似体の作用を調べるため、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰおよび親細胞を５μＭ Ａｚａで２日間処理した。図４が示すように、ＤＮＡは７−ＡＡＤで染まり、１つの２Ｎ核集団と１つの４Ｎ核集団を正確に定義するため、最初の２つのドットプロット（Ｉ−ＩＶ）で１つのウインドウを用いた（Ｒ１）（ＦＬ３−Ａスケールで２００および４００の値に相当する）。次に囲まれた核集団を、ＢｒｕＵに対するＰＥコンジュゲート抗体を用いてＢｒｄＵの組み込みに関して試験した（ＩＩ−Ｖ）。ＢｒｄＵ抗体の非特異的結合を定義するため、また、ＢｒｄＵ組み込みドットプロットの象限を設定するためにイソタイプ染色（ドットプロットＩＩＩ−ＶＩ）を用いた。このＢｒｄＵ組み込みドットプロットから、種々の細胞周期にある細胞のパーセンテージを得た。表１は種々の細胞周期にある細胞のパーセンテージを示す。アザシチジン（５μＭ濃度）はＧ２期の細胞のパーセンテージをやや高める以外には、種々の細胞期に有意な作用を持たない。これに対し、親細胞株（Ｕ８７）は５−アザシチジン感受性がより高いと見られる。この細胞株で５−アザシチジンは、Ｓ期（対照の〜６．９％、５μＭ Ａｚａの〜１３．５％と比較）およびＧ２期（対照の〜５．２％、５μＭ Ａｚａの〜１３．１％と比較）の細胞数の上昇に伴って、Ｍ期（対照の〜１５．７％、５μＭ Ａｚａの〜１０．６％と比較）およびＧ１−Ｇ０期（対照の〜７２．２％、５μＭ Ａｚａの〜６２．６％と比較）の細胞数の減少をもたらした。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
４）統計分析
Ｐ値はＭＳエクセルで、プログラム”Ａｎｏｚａ， １−ｆａｋｔｏｒｉｅｌｌｅ−Ｖａｒｉａｎｚ−Ａｎａｌｙｓｅ”を用いて計算した。Ｐ値＜０．０５は統計学的に有意であるとみなされる。
表１は細胞周期分析を表すが、５−アザシチジンは親細胞株Ｕ８７でのみ細胞周期に影響を及ぼし、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰには影響しなかった。細胞周期Ｇ１−Ｇ０、Ｓ、Ｇ２およびＭ期の細胞のパーセンテージが図４に記載のように得られた。
【００５０】
Ｇ２期の細胞数の増加を除けば、Ｕ８７ Ｈ−ＧＦＰは５μＭ Ａｚａで処理した場合でも細胞周期に有意な変化を示さなかった。これに対し、Ｕ８７を５μＭ Ａｚａを含有する培地で２日間維持した場合には細胞周期に有意な変化が見られた。Ｇ１−Ｇ０およびＭ期の細胞数の減少には、Ｇ２およびＳ期の細胞数の増加が伴っていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
５’−アザシチジンおよびトリコスタチンＡによるＨ−ＧＦＰ遺伝子の増幅を蛍光顕微鏡によって検出したものを示す。
【図２】
５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡで処理したＵ８７ Ｈ−ＧＦＰ細胞および親細胞でのＦＡＣＳ蛍光プロフィールを示す。
【図３】
（Ａ）は、５−アザシチジンで処理したＵ８７親株およびＨ−ＧＦＰの蛍光強度を示す。
（Ｂ）のヒストグラムはトリコスタチンＡによるＨ−ＧＦＰ遺伝子発現の増強を示す。
（Ｃ）は、５−アザシチジンおよびトリコスタチンの組合わせによる処理を示す。
（Ｄ）は、トリコスタチンＡおよび５−アザシチジンをそれぞれ単独、および組合わせた例を示す。
【図４】
５−アザシチジンで処理または未処理のＵ８７ Ｈ−ＧＦＲおよび親株のＦＡＣＳ分析によって得られたドットプロットを示す。
【図５】
プラスミドｐＣＭＶ−ｈｙｄｒｏＥＧＦＰを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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