(57)【要約】本発明はヒト酵素（ＮＺＭＳ）およびＮＺＭＳを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＮＺＭＳの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｂ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列と少なくとも９４％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含む請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなる。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的なＮＺＭＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２２】
機能的なＮＺＭＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能性ＮＺＭＳの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２４に記載の成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５に記載の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２に記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＮＺＭＳの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項１１に記載の抗体と結合する過程と
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記抗体が、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体のいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む化合物。
【請求項３３】
被検者のＮＺＭＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
被検者のＮＺＭＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアを含む化合物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞を不死化の細胞と融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクロナール抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製したポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化すること
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６に記載のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドを接触させる方法。
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現量を定量するステップを含む。
【請求項４８】
固体上の別個の物理的位置に固定した異なるヌクレオチド分子を含むアレイであり、該ヌクレオチド分子の少なくとも１つが標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続するヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーション可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、標的ポリヌクレオチドは請求項１２に記載のポリヌクレオチドである。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続するヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続するヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチドに完全に相補的である。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイであり、マイクロアレイである。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイであり、最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチドをも含む。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイであり、リンカーは少なくとも１つのヌクレオチド分子を固体基板に接合する。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイであり、基板上のそれぞれ別個の物理的位置には複数のヌクレオチド分子を含む。またいかなる単一な別個の物理位置の複数のヌクレオチド分子は同じ配列を有する。基板上の各別個の物理的位置には基板上の別の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列と異なる配列を含むヌクレオチド分子が含まれる。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、酵素の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、胃腸疾患、神経系疾患、肺の疾患、生殖系疾患および眼疾患の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ヒドロラーゼ
加水分解とは、水分子の導入による基質内の共有結合の切断である。この反応は加水分解酵素（別名ヒドロラーゼ）により触媒され、水分子の酸素原子が基質内の標的結合に求核攻撃を加える。水分子が標的結合のところで分かれて結合を破り、二つの生成分子が生成される。加水分解反応は多くの代謝経路の基礎を形成し、多くの生合成経路に存在する。例えば細胞内で生成されるエネルギーは、ＡＴＰの加水分解から来る。ヒドロラーゼは細胞シグナル伝達、細胞増殖、炎症、アポトーシス、分泌および排出等の機能に必須な反応にもかかわっている。ヒドロラーゼはこれらの機能にかかわる病気プロセスの重要な過程に関連している。ヒドロラーゼは基質特異性によって、アミノヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ホスホジエステラーゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、グリオキサラーゼ、スルファターゼ、ホスホヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレオチダーゼ、その他多くなどに分類され得る。
【０００３】
セリンヒドロラーゼは活性部位にセリン残基を含む加水分解酵素の機能クラスである。このクラスの酵素としては、さまざまな基質を加水分解するプロテイナーゼ、エステラーゼおよびリパーゼが含まれ、生物学的な役割もさまざまである。このスーパーファミリのタンパク質は基質特異性またはアミノ酸類似性によってさらにサブファミリ−に分けることができる（Ｐｕｅｎｔｅ， Ｘ．Ｓ．およびＬｏｐｅｚ−Ｏｎｔ， Ｃ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（２１）： １２９２６−１２９３２）。ＤＨＨホスホエステラーゼには、プルーンタンパク質が含まれる（Ａｒａｖｉｎｄ， Ｌ．及びＫｏｏｎｉｎ， Ｅ． Ｖ． （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３：１７−１９）。
【０００４】
カルボキシルエステラーゼはカルボキシルエステルを加水分解するタンパク質であり、Ａ、ＢおよびＣの３つのカテゴリーに分類される。ほとんどのタイプＢカルボキシルエステラーゼは進化的に関連しており、１つのタンパク質ファミリを構成すると考えられている。タイプＢカルボキシルエステラーゼファミリのタンパク質としては、脊椎動物のアセチルコリンエステラーゼ、哺乳動物の肝臓ミクロソームカルボキシルエステラーゼ、哺乳動物の胆汁塩活性化リパーゼおよびアヒルの脂肪酸ＣｏＡヒドロラーゼが含まれる。このタンパク質ファミリの一部は触媒活性がないが、他のタイプＢカルボキシルエステラーゼと進化的に関係するドメインを含んでおり、例としてはサイログロブリンとショウジョウバエのタンパク質であるｎｅｕｒａｃｔｉｎが挙げられる。
【０００５】
ヌクレオチダーゼはヌクレオチドから遊離ヌクレオシドを生成する反応を触媒する。ハトの心臓からクローン化されたサイトゾルヌクレオチダーゼｃＮ−Ｉ（５‘ヌクレオチダーゼＩ）はＡＴＰの加水分解中に生成されるＡＭＰからアデノシンを生成する反応を触媒する（Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙ， Ｇ．Ｂ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１７７８９−１７７９３）。アデノシン濃度の増加は代謝ストレスのシグナルであると考えられており、アデノシン受容体は血管拡張、興奮性ニューロン発火の減少および心臓内の虚血性プレコンディショニングを含む効果を仲介する（Ｓｃｈｒａｄｅｒ， Ｊ． （１９９０） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８１：３８９−３９１； Ｒｕｂｉｎｏ， Ａ． 他 （１９９２） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２２０：９５−９８； ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｊ．Ｗ． 他 （２０００） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ８７：１４１−１４９）。ピリミジン５‘ヌクレオチダーゼの欠損は遺伝的な溶血性貧血（ＯＭＩＭ Ｅｎｔｒｙ ２６６１２０）を引き起こすことがある。
【０００６】
ＡＤＰリボシル化は、ＡＤＰリボース部分がβ−ＮＡＤからアルギニンまたはシステインなどの標的アミノ酸に移される可逆的な翻訳後タンパク質修飾である。ＡＤＰリボシルアルギニンヒドラーゼはタンパク質からＡＤＰリボースを除去してアルギニンを再生することによりＡＤＰリボシル化サイクルを完了する（Ｍｏｓｓ， Ｊ． 他 （１９９７） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４１９：２５−３３）。ＡＤＰリボシル化はバクテリア毒素でよく知られた反応である。たとえば、コレラ毒素は興奮性Ｇタンパク質のαサブユニットをＡＤＰリボシル化することによりアデニリルシクラーゼ系を乱して細胞内ｃＡＭＰの増加を引き起こす（Ｍｏｓｓ， Ｊ．およびＶａｕｇｈａｎ， Ｍ． （ｅｄｓ） （１９９０） ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）。また、ＡＤＰリボシル化は、真核生物において調節機能を持ち、細胞骨格アセンブリ（Ｚｈｏｕ， Ｈ． 他 （１９９６） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３３４：２１４−２２２）および細胞毒性Ｔ細胞の細胞増殖（Ｗａｎｇ， Ｊ． 他 （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：２８１９−２８２７）に影響している可能性がある。
【０００７】
ＡＴＰ分解酵素は、様々な細胞プロセスにおいてＡＤＰへのＡＴＰの加水分解を触媒する。細胞機能に関わるＡＴＰ分解酵素ファミリー（ＡＡＡファミリー）は、各タンパク質の１つか２つのコピーに存在する２３０アミノ酸の保存したモジュールにより特徴付けられる。細胞周期調節、酵母とＨＩＶの遺伝子発現、小胞媒介輸送、ペルオキシソームアセンブリ、２６Ｓプロテアーゼ機能を含むプロセス中でＡＡＡは機能する（Ｃｏｎｆａｌｏｎｉｅｒｉ， Ｆ．及びＤｕｇｕｅｔ， Ｍ． （１９９５） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ． １７：６３９６５０）。ＳＰＡＦは早期精子形成と悪性転換に特異なＡＡＡタンパク質である（Ｌｉｕ， Ｙ． 他． （２０００） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１５７９１５８８）。
【０００８】
スルファターゼは、グリコサミノグリカン、スルホリピド、ステロイド・サルフェート等の多様な基質から硫酸エステル結合の加水分解を触媒する。スルファターゼ欠損は、主にリソソーム貯蔵障害である数種類のヒトの疾患の原因である。スルファターゼと関係する他の疾患には、異染性白質萎縮症、アリールスルファターゼＡの欠損に起因する神経の疾患、Ｘ連鎖劣性の点状軟骨異形成症（ｃｈｏｎｄｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、アリールスルファターゼＥの欠損に起因する軟骨組織と骨格の発達の異常が含まれる（Ｐａｒｅｎｔｉ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ， Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ７：３８６−３９１の概説を参照）。
【０００９】
ヌクレアーゼは、ＤＮＡ（ＤＮアーゼ）とＲＮＡ（ＲＮアーゼ）を加水分解する酵素両方を含む。それらは核酸代謝において異なる目的で働く。ヌクレアーゼは、内部位置（エンドヌクレアーゼ）または末端３’あるいは５’ヌクレオチド位置（エキソヌクレアーゼ）において隣接するヌクレオチド間でホスホジエステル結合を加水分解する。例えばＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性は、伸長するＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ末端に、ポリメラーゼにより付着される不適切に対となったヌクレオチドを除去するよう作用して、それによって「校正」機能として作用する。ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ修復プロセスの切除段階にも関係する。
【００１０】
ＲＮアーゼもまた、多様な機能で作用する。例えばＲＮアーゼＰは、成熟プロセスの一部としてプレｔＲＮＡの５’末端を切断するリボ核タンパク質酵素である。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を消化する。そのようなハイブリッドはレトロウイルスにより侵襲された細胞で発生する。またＲＮアーゼＨはレトロウイルス複製周期において重要な酵素である。膵臓によって腸へ分泌した膵臓ＲＮアーゼは、消化した食物に存在するＲＮＡを加水分解する。血清と細胞抽出物中のＲＮアーゼ活性は、多様な癌と感染性疾患において上昇する（Ｓｃｈｅｉｎ， Ｃ．Ｈ． （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：５２９−５３６）。腫瘍脈管形成、アレルギー反応、ウイルス感染及び複製と真菌感染症を制御する手段としてＲＮアーゼ活性の調節が研究されている。
【００１１】
リアーゼ
リアーゼは、２分子を形成するために加水分解や酸化せずにＣ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｓ、Ｃ−（ハロゲン化合物）、Ｐ−Ｏあるいは他の結合の切断を触媒する酵素のクラスであり、その２分子の少なくとも１つは二重結合を含んでいる（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ６２０ページ）。酵素の国際的な分類（Ｗｅｂｂ， Ｅ．Ｃ． （１９９２） Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２： Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の下で、リアーゼは酵素番号（例えばＥＣ ４．ｘ．ｘ．ｘ）の最初の数字が数字４で名付けられる別個のクラスを形成する。
【００１２】
リアーゼのさらに細かい分類は、切断した分子基の性質だけでなく切断した結合のタイプを反映している。Ｃ−Ｃリアーゼのグループには、カルボキシル・リアーゼ（デカルボキシラーゼ）、アルデヒド・リアーゼ（アルドラーゼ）、オキソ酸リアーゼとその他のリアーゼが含まれる。Ｃ−Ｏリアーゼのグループには、多糖に作用するリアーゼであるヒドロリアーゼや他のリアーゼが含まれる。Ｃ−Ｎリアーゼのグループには、アンモニアリアーゼ、アミジンリアーゼ、アミンリアーゼ（デアミナーゼ）その他のリアーゼが含まれる。リアーゼは細胞生化学の重要な成分であり、脂肪酸代謝、トリカルボン酸回路や他の多様な酵素プロセス等の代謝エネルギー生産において役割を果たしている。
【００１３】
１つの重要なリアーゼのファミリーは、炭酸デヒドラターゼとも呼ばれる炭酸脱水素酵素（ＣＡ）であり、Ｈ２Ｏ ＋ ＣＯ２  → ＨＣＯ３ −  ＋ Ｈ＋反応における二酸化炭素の水和を触媒する。タンパク質の表面下の約１５Åにあり、深い裂け目に位置し、３つのＨｉｓ残基のイミダゾール群に配位結合する亜鉛イオンにより、ＣＡはこの反応を１０６を超える割合で加速する。亜鉛イオンに結合する水は、急速にＨＣＯ３に変換される。
【００１４】
炭酸脱水素酵素の８つの酵素そして進化的に関連する形態が、現在ヒトに存在することが知られている：３つのサイトソルイソ酵素（ＣＡＩ、ＣＡＩＩ、ＣＡＩＩＩ）、２つの膜結合型（ＣＡＩＶ、ＣＡＶＩＩ）、ミトコンドリア型（ＣＡＶ）、分泌唾液型（ＣＡＶＩ）、まだ特徴付けられていないイソ酵素（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００１４６ 真核生物タイプ炭酸脱水素酵素シグネチャ）。イソ酵素ＣＡＩ、ＣＡＩＩとウシＣＡＩＩＩは類似の二次構造とポリペプチド鎖折り畳みを有するが、ＣＡＩは６つのトリプトファン、ＣＡＩＩは７つのトリプトファン、ＣＡＩＩＩは８つのトリプトファンを有する（Ｂｏｒｅｎ， Ｋ． 他． （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ５：２４７９−２４８４）。ＣＡＩＩは哺乳動物の脳の主要なＣＡイソ酵素である。
【００１５】
ＣＡは、ｐＨ調節、ＣＯ２及びＨＣＯ３輸送、イオン輸送、水分と電解質バランスを含む多様な生理的プロセスに関与する。例えばＣＡＩＩは、骨を吸収する区画を酸性化するＨ＋を分泌する破骨細胞、および胃壁細胞、尿細管細胞によるＨ＋ 分泌に寄与する。更にＣＡＩＩは膵管細胞、毛様体上皮組織、脈絡叢、唾液腺腺房細胞、遠位腸上皮組織によりＨＣＯ３分泌を促進する。それにより膵液、房水、脳脊髄液、唾液の生成に関与すると共に、電解質と水分のバランスに寄与する。ＣＡＩＩは腎臓の近位尿細管、赤血球、肺におけるＣＯ２交換をも促進する。ＣＡＩＶは幾つかの組織において役割を果たす。：腎臓においてＨＣＯ３の再吸収を促進する；脳、骨格筋、心筋等の組織におけるＣＯ２流動を促進する；血液中から肺の肺胞へのＣＯ２交換を促進する。ＣＡＶＩはＣＡＩＩと共に唾液のｐＨ調節におそらく関与する。また食道と胃での保護効果を有し得るミトコンドリアのＣＡＶは、糖新生と尿生成の経路へのＣＡのインヒビター効果に基づいてこれらにおいて重要な役割を果たすように思われる（Ｓｌｙ， Ｗ．Ｓ及び Ｈｕ， Ｐ．Ｙ． （１９９５） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：３７５−４０１．）。
【００１６】
多数の疾患状態が、ＣＡ活性の変化によって特徴付けられる。ＣＡＩＩの欠損を引き起こすＣＡＩＩにおける突然変異は、尿細管性アシドーシスによる骨石化症の原因である（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ ２５９７３０ Ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｎａｌ Ｔｕｂｕｌａｒ Ａｃｉｄｏｓｉｓ）。脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＣＡＩＩの濃度は、脳損傷の患者の疾患作用を特徴付けるように思われる。高いＣＡ濃度が脳梗塞を患う患者に観察された。一過性脳虚血発作、多発性硬化症あるいは癲癇を患う患者のＣＡＩＩの濃度は、通常正常な範囲であるが、中枢神経系感染、痴呆あるいは三叉神経痛の患者にはＣＳＦにおいて高いレベルのＣＡＩＩが観察されてきた（Ｐａｒｋｋｉｌａ， Ａ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２７：３９２−３９７）。非腫瘍性対照は、大腸陰窩の上半分に並んだ円柱細胞の細胞質にＣＡＩとＣＡＩＩを示すが、大腸腺腫と腺癌はＣＡの対して染色しないことが観察されてきた。腫瘍は、正常な陰窩の基底に並ぶ、それほど成熟していない細胞に類似の染色パターン示す（Ｇｒａｍｌｉｃｈ Ｔ．Ｌ．他 （１９９０） Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ． １１４：４１５−４１９）。
【００１７】
多数の疾患における治療は、ＣＡ活性を変更することを伴う。アセタゾールアミド等のＣＡインヒビターが緑内障（Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｗ．Ｃ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｐｔｈａｍｏｌ． １０：９９−１０８）、本態性振戦とパーキンソン病（Ｕｉｔｔｉ， Ｒ．Ｊ． （１９９８） Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ ５３：４６−４８， ５３−５７）、間欠性運動失調（Ｓｉｎｇｈｖｉ， Ｊ．Ｐ． 他． （２０００） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｉｎｄｉａ ４８：７８−８０）、高度と関連する疾患（Ｋｌｏｃｋｅ， Ｄ．Ｌ． 他 （１９９８） Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ． Ｐｒｏｃ． ７３：９８８−９９２）の治療において使用される。
【００１８】
ＣＡ活性は、酵素が生理学的変化に対して比較的ゆっくり反応するので、長期の疾患状態の指標として特に有用である。甲状腺亢進症のグレーブス病ではＣＡＩと亜鉛濃度の下降（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｋ． （１９９６） Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：３４５−３５６）、糖尿病ではグリコシル化ＣＡＩ（Ｋｏｎｄｏ， Ｔ． 他 （１９８７） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １６６：２２７−２３６）が観察される。正の相関性がＣＡＩ、ＣＡＩＩ反応性と子宮内膜症の間で観察される（Ｂｒｉｎｔｏｎ， Ｄ．Ａ他 （１９９６） Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｓｃｉ． ２６：４０９−４２０、Ｄ’Ｃｒｕｚ ， Ｏ．Ｊ． 他 （１９９６） Ｆｅｒｔｉｌ． Ｓｔｅｒｉｌ． ６６：５４７−５５６）。
【００１９】
リアーゼのファミリーの別の重要なメンバーは、ポリアミン生合成における初期律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）である。ＯＤＣは、Ｌ−オルニチン→ プトレッシン＋ＣＯ２反応におけるオルニチンからプトレッシンへの転換を触媒する。ポリアミンは、プトレッシン、および続く代謝経路の生成物であるスペルミジンとスペルミンを含み、ＤＮＡ合成、細胞分化、増殖に不可決な遍在性細胞構成成分である。このようにポリアミンは腫瘍増殖において重要な役割を果たす（Ｍｅｄｉｎａ， Ｍ．Ａ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５７：１３４１−１３４４）。
【００２０】
ＯＤＣは、ホモ二量体として活性であるピリドキサル−５−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素である。保存した残基には、ＰＬＰ 結合部位での残基と基質結合領域の一部と思われるグリシン残基の区間が含まれる（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００６８５ Ｏｒｎ／ＤＡＰ／Ａｒｇ デカルボキシラーゼファミリー ２ シグネチャ）。哺乳動物のＯＤＣは、ＰＥＳＴ領域、細胞内分解のためにシグナルとして作用するプロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン残基がリッチな配列断片をも含む（前出のＭｅｄｉｎａ）。
【００２１】
多くの化学発癌物質と腫瘍プロモータがＯＤＣレベルと活性を上昇させる。複数の既知の発癌遺伝子が、ＯＤＣ遺伝子の転写を促進することによりＯＤＣレベルを上昇させる。また超高レベルで発現する時、ＯＤＣ自体が発癌遺伝子として作用する可能性がある。高レベルのＯＤＣが多数の前癌症状で見出される。またＯＤＣレベルの上昇が腫瘍促進複合物のためのスクリーニングの一部として使用されている（Ｐｅｇｇ， Ａ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｕｐｐｌ． ２２：１３２−１３８）。
【００２２】
動物モデルとヒトの臨床試験において腫瘍を治療するためにＯＤＣのインヒビターが使用されている。膀胱、脳、食道、胃腸管、肺、口腔、乳腺、胃、皮膚、気管の腫瘍の発達を抑制することを示してきた（前出Ｐｅｇｇ、ＭｃＣａｎｎ， Ｐ．Ｐ及びＰｅｇｇ， Ａ．Ｅ． （１９９２） Ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ５４：１９５−２１５）。ＯＤＣは化学防御のための標的としても有望でもある（前出Ｐｅｇｇ）。ＯＤＣインヒビターは、アフリカトリパノゾーマ、マラリア、ニューモシスティスカリニ属による感染を治療するためにも使用されている。また狼瘡とリウマチ様関節炎等の自己免疫性疾患の治療のために潜在的に有用である（前出ＭｃＣａｎｎ）。
【００２３】
ピリドキサル依存性デカルボキシラーゼの別のファミリーは、グループＩＩデカルボキシラーゼである。このファミリーには、グルタミン酸塩から神経伝達物質ＧＡＢＡの脱炭酸反応を触媒するグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ヒスチジンからヒスタミンへの脱炭酸反応を触媒するヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＨＤＣ）、トリプトファンからトリプタミンへ脱炭酸反応を触媒し、また５−ヒドロキシ−トリプトファンとジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ｄｏｐａ）にも作用する芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素（ＤＤＣ）（Ｌ−ドーパ脱炭酸酵素またはトリプトファン・デカルボキシラーゼとしても知られる）、システインからタウリンの合成における律速酵素であるシステインスルフィン酸脱炭酸酵素（ＣＳＤ）が含まれる（ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ００３２９ ＤＤＣ／ＧＡＤ／ＨＤＣ／ＴｙｒＤＣ ピリドキサルリン酸付着部位）。タウリンは脳内の豊富なスルホン基アミノ酸（ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）であり、脳細胞内で浸透圧調節器として作用すると思われる（Ｂｉｔｏｕｎ， Ｍ．及びＴａｐｐａｚ， Ｍ． （２０００） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７５：９１９−９２４）。
【００２４】
ホスファターゼは加水分解によりタンパク質からリン酸基を除去する。これは、多くの細胞内シグナル伝達経路を調節し、ひいては細胞成長と分化、細胞間接触、細胞周期および発癌を制御するエネルギー供給過程である。
【００２５】
ペプチダーゼはプロテアーゼとも呼ばれ、ペプチドやタンパク質の鎖のバックボーンを形成するペプチド結合を切断する。タンパク分解は細胞増殖、分化、再構築や恒常性ならびに炎症および免疫反応において重要である。典型的なタンパク質の半減期は数時間から数日の範囲であるため、ペプチダーゼはつねにタンパク質前駆体を切断して活性型に変え、標的タンパク質からシグナル配列を除去し、古いタンパク質や欠陥のあるタンパク質を分解している。ペプチダーゼはバクテリア、寄生生物およびウィルスの侵入と宿主内での複製の際に機能する。ペプチダーゼの例としてはトリプシンおよびキモトリプシン、補体カスケードと血液凝固カスケードの成分、リソソームのカテプシン、カルパイン、ペプシン、レニンおよびキモシンなどが挙げられる（Ｂｅｙｎｏｎ， Ｒ．Ｊ． および Ｊ．Ｓ． Ｂｏｎｄ （１９９４） Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １−５ページ）。
【００２６】
リゾホスホリパーゼ（ＬＰＬ）はエステル結合の加水分解でアシル基を除去するという、脂質分解の重要な過程を触媒することによって細胞内脂質を調節する。約１５〜３０ｋＤの小さいＬＰＬアイソフォームはヒドロラーゼとして機能し、大きなアイソフォームはヒドロラーゼとアシル基転移酵素の両方の機能をする。ＬＰＬの特定の基質であるリソホスファチジルコリンは細胞膜の溶解を起こす。ＬＰＬの活性は、炎症反応を含む数多くの経路で重要なシグナル伝達分子によって調節される。
【００２７】
チオエステラーゼとしても知られるチオールエステルヒドロラーゼは、脂質代謝に関与する酵素の別のファミリーを含む。これらの酵素は腸と副腎組織の他にも肝臓、腎臓、心臓、肺、精巣、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織に見出される。チオエステラーゼファミリーのあるメンバーの命名は、細胞質（ＣＴＥ）、ペルオキシソーム（ＰＴＥ）、ミトコンドリア（ＭＴＥ）のこれらの組織内で区画化の実証に由来する（Ｈｕｎｔ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：３４３１７−３４３２６）。一般的には、チオエステラーゼは長鎖脂肪酸の加水分解に関与する。アシルＣｏＡチオエステラーゼは、アシルＣｏＡ分子の遊離脂肪酸とＣｏＡへの加水分解を触媒する。この酵素活性は、動物脂肪酸シンテターゼの内在的成分であり、この関連において鎖の伸長を停止するよう働く（Ｊｏｎｅｓ， Ｊ．Ｍ． 他． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：９２１６−９２２３）。細胞におけるアシルＣｏＡ濃度を調節するチオエステラーゼの能力は、脂質代謝の制御のためのメカニズムを提供し得る（Ｐｏｕｐｏｎ， Ｖ． 他． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９１８８−１９１９４）。
【００２８】
ホスホジエステラーゼはホスホジエステル化合物内の２つのエステル結合のうちの１つの加水分解を触媒する。従って、ホスホジエステラーゼは様々な細胞プロセスにとって重要である。ホスホジエステラーゼにはＤＮＡおよびＲＮＡのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼが含まれるが、これらは細胞の成長と複製およびタンパク質合成に必須である。もう１つのホスホジエステラーゼである酸性スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する。ホスホリルコリンはホスファチジルコリンの合成に使用されるが、ホスファチジルコリンは数多くの細胞内シグナル伝達経路に関与している。セラミドは、神経組織に高濃度に存在する膜脂質であるガングリオシドの生成に必須な前駆体である。酸性スフィンゴミエリナーゼが欠損すると、リソソームにおいてスフィンゴミエリン分子が蓄積され、それによってニーマン−ピック病が引き起こされる。
【００２９】
グリコシダーゼはグリコシドのヘミアセチル結合を切断する。グリコシドは１つ以上の糖を含む化合物である。たとえば、哺乳動物のラクターゼ・フロリジンヒドロラーゼは乳糖を分割する腸酵素である。哺乳動物のベータガラクトシダーゼはガングリオシド、糖タンパク質およびグリコサミノグリカンから末端ガラクトースを除去し、この酵素の欠損はモルキオ病タイプＢとして知られるガングリオシド蓄積症と関連している。脊椎動物のリソソームのアルファグルコシダーゼ（グリコーゲン、マルトースおよびイソマルトースを加水分解）および脊椎動物の腸スクラーゼ・イソマルターゼ（スクロース、マルトースおよびイソマルトースを加水分解）はこのファミリの広範囲に分布するメンバーであり、活性部位に高度に保存された配列を持っている。
【００３０】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＡＴＰ）（ＥＣ ４．１．１．４９）は、体内に保存された化合物からグルコースを生成する糖新生に関与するリアーゼである。この酵素は、ホスホエノールピルビン酸を形成するためにオキサロ酢酸の脱炭酸反応を触媒し、ＡＴＰの加水分解を伴う。（Ｍａｔｔｅ， Ａ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：８１０５−８１０８、Ｍｅｄｉｎａ， Ｖ． 他． （１９９０） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７２：７１５１−７１５６等を参照）。
【００３１】
Ｌ−ラムノースとＤ−フコースは、細菌細胞壁の複雑な炭水化物に見出される６−デオキシヘキソースである。これらの炭水化物の合成に導く経路の段階の１つは、リアーゼｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼ（ＥＣ ４．２．１．４６）により触媒される反応である、ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコースから不安定な４−ケト−６−デオキシ中間体への変換である。（Ｔｏｎｅｔｔｉ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８０：９２３−９３１、Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｙ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１６９３３−１６９３９等を参照）。
【００３２】
イソシトレート・リアーゼ（ＥＣ ４．１．３．１）は、クエン酸回路の修飾であるグリオキシル酸回路に関与する。グリオキシル酸回路は、バクテリア、真菌、植物において発生する。イソシトレート・リアーゼは、イソシトレートの切断を触媒して琥珀酸とグリオキシル酸を産出する。（Ｂｅｅｃｈｉｎｇ， Ｊ．Ｒ． （１９８９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ． Ｄａｔａ Ａｎａｌ． ２：４６３−４６６、Ａｔｏｍｉ， Ｈ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０７：２６２−２６６等を参照）。
【００３３】
アルドラーゼは、アルドール縮合反応を触媒するリアーゼである。フルクトース１、６−２リン酸アルドラーゼ（ＦＢＰ−アルドラーゼ； ＥＣ ４．１．２．１３）は、フルクトース１、６−２リン酸の可逆的な切断を触媒して、ジヒドロキシアセトンリン酸（ケトースの一種）、グリセルアルデヒド３リン酸（アルドースの一種）を生成する。クラスＩのＦＢＰ−アルドラーゼは、高等生物に見出され、ホモ四量体として存在する。クラスＩＩのＦＢＰ−アルドラーゼは二量体である傾向があり、酵母菌と細菌で発生する。また触媒活性のための２価陽イオンの絶対的な必要性がある。（Ｈａｌｌ， Ｄ．Ｒ．他 （１９９９） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７：３８３−３９４等を参照）。
【００３４】
プソイドウリジンは、あるｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡと核小体ＲＮＡの特異的三次構造の維持を助けるウリジンの異性体である。プソイドウリジンはこれらのＲＮＡに直接組み込まれないが、これらのＲＮＡ内の特異ウリジン残基で作用するリアーゼであるプソイドウリジンシンターゼ（ＥＣ ４．２．１．７０）により合成される。プソイドウリジンシンターゼのＲｌｕファミリーには、２３Ｓ ｒＲＮＡの位置７４６でプソイドウリジンを合成する大腸菌リボソーム大サブユニットシンターゼＡ、また２３Ｓ ｒＲＮＡの位置９５５、２５０４、２５８０でプソイドウリジンを合成する大腸菌リボソーム大サブユニットシンターゼＣが含まれる。（Ｃｏｎｒａｄ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１８５６２−１８５６６等を参照）。
【００３５】
フマル酸リアーゼは、限られた配列相同性を共有し、また基質としてフマル酸塩を使用するリアーゼの群である。これらの酵素には、フマラーゼ（ＥＣ ４．２．１．２）、アスパルターゼ（ＥＣ ４．３．１．１）、アルギノサクシナーゼ（ＥＣ ４．３．２．２）、アデニロスクシナーゼ（ＥＣ ４．３．２．２）が含まれる。（Ｗｏｏｄｓ， Ｓ．Ａ． 他 （１９８８） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９５４：１４−２６、Ｗｏｏｄｓ， Ｓ．Ａ． 他 （１９８８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５１：１８１−１８６、Ｚａｌｋｉｎ， Ｈ及びＪ．Ｅ． Ｄｉｘｏｎ （１９９２） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２：２５９−２８７等を参照）。
【００３６】
グリオキシラーゼ系は糖新生、すなわち体内に保存された化合物からグルコースを産生することに関与している。この系はグリオキシラーゼＩ（トリオースリン酸エネルギー代謝の副産物であるメチルグリオキサルからＳ−Ｄラクトイルグルタチオンを形成する反応を触媒）およびグリオキシラーゼＩＩ（Ｓ−ＤラクトイルグルタチオンをＤ乳酸と還元グルタチオンに加水分解）からなっている。グリオキシラーゼは高血糖症、インシュリン非依存性糖尿病、バクテリア毒素の解毒、および細胞増殖と微小管アセンブリの制御に関与している。
【００３７】
エーテル結合に作用するヒドロラーゼの小さなサブクラスとして、チオエーテルヒドロラーゼなどが挙げられる。Ｓ‐アデノシル‐Ｌ‐ホモシステインヒドラーゼはＡｄｏＨｃｙａｓｅ または ＳＡＨＨ （ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ００６０３； ＥＣ ３．３．１．１）としても知られているが、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＡｄｏＨｃｙ）からアデノシンとホモシステインへの可逆的な加水分解に関与する活性としてラットの肝臓抽出物中で初めて記述されたチオエーテルヒドラーゼである（Ｓｇａｎｇａ， Ｍ．Ｗ．他 （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６３２８−６３３２）。ＳＡＨＨはサイトゾル酵素であって、大腸菌およびある種の関連バクテリアを除いて、試験されたすべての細胞で見つかっている（Ｗａｌｋｅｒ， Ｒ．Ｄ． 他（１９７５） Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３１２−３１９、Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ． 他 （１９８８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５１：１７７−１８０、Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ． 他 （１９８４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４１：３８５−３９２）。ＳＡＨＨ活性は補助因子としてＮＡＤ＋ に依存している。ＳＡＨＨの欠損は高メチオニン血症（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） ＃１８０９６０ Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｍｉａ）に関連しているが、これは新生児胆汁鬱滞、成長障害、知的および運動能力の遅進、異常な毛および歯を含む顔面異形症、および心筋症によって特徴付けられる病理学的状態である（Ｌａｂｒｕｎｅ， Ｐ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｐｅｄｉａｔ． １１７：２２０−２２６）。
【００３８】
ヒドロラーゼのもう１つのサブクラスにはペプチド結合以外の炭素窒素（Ｃ−Ｎ）結合に作用する酵素が含まれる。このサブクラスにはアミド、アミジンおよびその他のＣ−Ｎ結合を加水分解する酵素が属している。このサブクラスはさらにリニアアミド、サイクリックアミド、リニアアミジン、サイクリックアミジン、ニトリルおよびその他の化合物を含む基質の特異性によって分けられている。１つのアミノ酸を含むアスパラギンオリゴ糖だけに作用する酵素のこのサブクラスに所属するヒドロラーゼは、Ｎ４−（β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｌ−アスパラギナーゼ（別名：アスパルチルグルコシラミニダーゼ）（ＡＧＡ； ＥＣ ３．５．１．２６）である。ＡＧＡは、糖タンパク質のＮ結合性オリゴサッカライドの異化作用における主要酵素である。その酵素は糖タンパク質のリソソーム分解の最終段階の１つとして残留Ｎ−アセチルグルコサミンからアスパラギンを切断する。ＡＧＡは、ミミズ、ラット、マウス、ブタ、ヒト、フラボバクテリアに見出されるリソソーム起源の酵素である（ＥｘＰＡＳｙ Ｅｎｚｙｍｅ Ｖｉｅｗ ｏｆ ＥＮＺＹＭＥ： ３．５．１．２； ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｐ２０９３３）。ＡＧＡ欠損は、アスパルチルグルコミン尿症（ＡＧＵ）として知られるリソソーム病引き起こす（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） ＃２０８４００ Ａｓｐａｒｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｕｒｉａ、Ｊｅｎｎｅｒ， Ｆ．Ａ． 他． （１９６７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １０３：４８Ｐ−４９Ｐ、Ｐｏｌｌｉｔｔ， Ｒ．Ｊ． 他． （１９６８） Ｌａｎｃｅｔ ＩＩ：２５３−２５５）。ＡＧＵ患者は、重度の精神遅滞、頭蓋非対称性（ｃｒａｎｉａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）、脊柱側弯症、周期性多動（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）、液胞のあるリンパ球を示す。乳児のＡＧＵは、下痢と頻繁な感染によって特徴付けられる（Ｐａｌｏ， Ｊ． 他 （１９７０） Ｊ． Ｍｅｎｔ． Ｄｅｆｉｃ． Ｒｅｓ． １４：１６８−１７３）。ＡＧＵがＡＧＵ遺伝子の遺伝的な突然変異から生じることが示されてきた。それらの突然変異はおそらくＡＧＵ分子の折り畳みと安定性に影響を与える（Ｉｋｏｎｅｎ， Ｅ． 他 （１９９１） ＰＮＡＳ ８８：１１２２２−１１２２６、Ｉｋｏｎｅｎ， Ｅ． 他 （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０：５１−５８、Ｉｋｏｎｅｎ， Ｅ． 他． （１９９１） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：２０６−２１１）。マウスのＡＧＡ欠損の代謝への影響が、老年のマウスにおける正常に機能しない膀胱機能、重度の失調性歩行を含む神経支配の協調における欠損と関連することが発見されてきた（Ｔｅｎｈｕｎｅｎ， Ｋ． 他 （１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：２４４−２５０、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｏｍｅｚ， Ｉ． 他． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５３：１２９３−１３００）。
【００３９】
膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ） は、ある種の哺乳動物分類群および一部の爬虫類の膵臓に大量に見られるピリミジン特異的なエンドヌクレアーゼである（Ｂｅｉｎｔｅｍａ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９８８） Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５１：１６５−１９２）。哺乳動物の膵臓Ｒｎａｓｅスーパーファミリーのタンパク質は、２段階リン酸転移性加水分解反応を通じてＲＮＡを分解する非サイトゾルのエンドヌクレアーゼである（Ｂｅｉｎｔｅｍａ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９８６） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３：２６２−２７５）。特に、これらの酵素は３‘ホスホモノヌクレオチドと３’ホスホオリゴヌクレオチドの内ヌクレオチド結合を切断してＣ−ＰまたはＵ−Ｐと２‘、３’サイクリックリン酸中間体にする過程に関与している。リボヌクレアーゼは一本鎖のＤＮＡと複合体を作ってＤＮＡヘリックスを巻き戻すことができる。この複合体は酵素のリジンおよびアルギニン残基とヌクレオチドのリン酸基の間の広範囲な複数部位におけるカチオン・アニオン相互作用によって生じる。このファミリに属する酵素の一部は純粋な消化機能を演じているようであるが、その他のものは強力で異例な生物学的活性を示す（Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ， Ｇ． （１９９３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：１０６−１０９）。膵臓ＲＮａｓｅファミリに属するタンパク質としては、ウシの精嚢および脳リボヌクレアーゼ、腎臓非分泌型リボヌクレアーゼ（Ｂｅｉｎｔｅｍａ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９８６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９４：３３８−３４３）、肝臓タイプリボヌクレアーゼ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｆ． 他（１９８９） ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：４４６０−４４６４）、正常および悪性組織の血管新生を誘発するアンギオジェニン、リボヌクレアーゼ活性を持つ細胞毒素および寄生虫毒素である好酸球カチオン性タンパク質（Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９８０６−９８１３）、およびカエル肝臓リボヌクレアーゼとカエルのシアル酸結合レクチンが含まれる。膵臓ＲＮａｓｅの配列には４つの保存されたジスルフィド結合と触媒活性に関与する３つのアミノ酸残基が含まれている。
【００４０】
アコニターゼ（ＥＣ ４．２．１．３）は、トリカルボン酸回路において重要な段階を実行するリアーゼである。アコニターゼは、シス・アコニテート媒介を通してクエン酸塩からイソシトレートへの可逆的な変換を触媒する。サイトゾル・アコニターゼ（Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１１７３０−１１７３４）とミトコンドリア・アコニターゼ（Ｍｉｒｅｌ， Ｄ．Ｂ． 他 （１９９８） Ｇｅｎｅ ２１３：２０５−２１８）というアコニテートの２つの形態が哺乳動物細胞に見出される。
【００４１】
リブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ； ＥＣ ４．１．１．３９）は、光合成中にカルビン回路において重要な段階を実行するリアーゼである。Ｒｕｂｉｓｃｏは、二酸化炭素の５−炭素糖リブロース１，５−２リン酸への共有結合による取り込みと、この分子から２分子の３−ホスホグリセリン酸への同時切断とを共に触媒する（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｆ．Ｃ及びＭ．Ｒ． Ｈａｒｐｅｌ （１９９４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３：１９７−２３４等を参照）。特異メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．１．４３）は、Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブユニットと大サブユニットのＮ末端近くのアミノ基のメチル化を触媒する（Ｙｉｎｇ， Ｚ． 他 （１９９８） Ａｃｔａ Ｂｉｏｌ． Ｈｕｎｇ． ４９：１７３−１８４、Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．Ｒ．及びＲ．Ｌ． Ｈｏｕｔｚ （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７：２４９−２６１）。
【００４２】
ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ（ＥＣ ４．２．１．５２）は、リジン生合成に関与するリアーゼである。この酵素は、ピルビン酸とアスパラギン−β−セミアルデヒドの縮合と水分子の除去を触媒して、２，３−ジヒドロジピコリン酸を生成する。
【００４３】
リアーゼの適切な調節は、正常な生理機能に重要である。例えば、突然変異によって誘発されるウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼの欠損は、遺伝的に連鎖する家族性晩発性皮膚ポルフィリン症で感光性皮膚障害を引き起こし得る（Ｍｅｎｄｅｚ， Ｍ． 他 （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｇｅｎｅｔ． ６３：１３６３−１３７５）。アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損はＡＤＡ遺伝子の遺伝的な突然変異に起因し、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を引き起こすことが示されている（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， Ｍ．Ｓ． （１９９８） Ｓｅｍｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ３５：２９１−２９８）。
【００４４】
新規の酵素およびそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、胃腸障害、神経系疾患、肺疾患、生殖系疾患および眼疾患の診断、予防、ならびに治療という点、および酵素の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響に関する評価という点において有用である新たな組成物を提供することにより、当分野における要求を満たす。
【００４５】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＮＺＭＳ」、個別にはそれぞれ「ＮＺＭＳ−１」、「ＮＺＭＳ−２」、「ＮＺＭＳ−３」、「ＮＺＭＳ−４」、「ＮＺＭＳ−５」、「ＮＺＭＳ−６」、「ＮＺＭＳ−７」、「ＮＺＭＳ−８」、「ＮＺＭＳ−９」、「ＮＺＭＳ−１０」、「ＮＺＭＳ−１１」、「ＮＺＭＳ−１２」、「ＮＺＭＳ−１３」、「ＮＺＭＳ−１４」、「ＮＺＭＳ−１５」、「ＮＺＭＳ−１６」、「ＮＺＭＳ−１７」および「ＮＺＭＳ−１８」と呼ぶ酵素である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。 一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００４６】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択される。
【００４７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００４８】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から成る群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを含み、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００４９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００５０】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００５１】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドまたはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００５２】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００５３】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含む。一実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的ＮＺＭＳの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＮＺＭＳの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００５５】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％のが同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＮＺＭＳの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００５６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００５７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一の天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択したポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００５８】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに化合物の効果を評価するためにスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【００５９】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるを有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）を含む群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【００６０】
（発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６１】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００６２】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６３】
（定義）
用語「ＮＺＭＳ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＮＺＭＳのアミノ酸配列を指す。
【００６４】
用語「アゴニスト」は、ＮＺＭＳの生物学的活性を強めたり、模倣する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物を挙げることができるが、これらはＮＺＭＳと直接相互作用することによって、或いはＮＺＭＳが関与する生物学的経路の構成要素に作用することによって、ＮＺＭＳの活性を調節する。
【００６５】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＮＺＭＳをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異ＲＮＡまたはポリペプチドを作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で１回若しくは数回生じ得る。
【００６６】
ＮＺＭＳをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＮＺＭＳと同じポリペプチド或いはＮＺＭＳの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も「変異」され得り、サイレント変化を生じＮＺＭＳと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＮＺＭＳの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００６７】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００６８】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
【００６９】
「アンタゴニスト」の語は、ＮＺＭＳの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指す。アンタゴニストは、ＮＺＭＳに直接相互作用するか、或いはＮＺＭＳが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＮＺＭＳの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００７０】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 及びＦｖ断片を指す。ＮＺＭＳポリペプチドを結合する抗体は、免疫原として、そのままのポリペプチド、または目的の小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラットあるいはウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）等がある。その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００７１】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００７２】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏの進化過程（例えば米国特許番号第５，２７０，１６３号に記載されたＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの２’−ＯＨ基が２’−Ｆまたは２’−ＮＨ２で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命などの望ましい性質に改善し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリア等の他の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々のリガンドと特異的に架橋させることができる。（Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ．およびＬ． Ｇｏｌｄ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３等を参照）。
【００７３】
「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」の用語はｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを意味するたとえば、ワクシニアウィルスに基づＲＮＡ発現系は、白血球の細胞質で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルで発現するために使用されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【００７４】
「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」の語はＬ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性のヌクレオチドを含むアプタマーは右旋性ヌクレオチドを含む基質に作用する天然の酵素による分解に対して耐性がある。
【００７５】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。
【００７６】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＮＺＭＳ、合成のＮＺＭＳまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００７７】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は、相補配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」と対を形成する。
【００７８】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＮＺＭＳ若しくはＮＺＭＳの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のＤＮＡ等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００７９】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００８０】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2004530415.tif 000002
【００８１】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００８２】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００８３】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００８４】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００８５】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現の欠損またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００８６】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。１つのエキソンがコードされたタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定した基礎構造の新規な再分類を介して新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００８７】
「断片」は、ＮＺＭＳまたはＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの固有部分であって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０ 若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００８８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。 この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を特異的に同定するものであり、例えば断片が得られる同一ゲノム中の他すべての配列とは異なるものである。ＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：１９−３６の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列からＳＥＱ ＮＯ ＩＤ：１９−３６を区別する類似の方法において有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片の正確な長さ及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００８９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のある断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のある断片によってコードされている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のある断片の正確な長さとその断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８での領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９０】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００９１】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００９２】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００９３】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．及びＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００９４】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）から提供されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）、これはメリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列を直接にペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ：５ 及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ：ペナルティ  ２
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ：ｏｎ
【００９５】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００９６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００９７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００９８】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００９９】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （２０００年４月２１日）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
2004530415.tif 000003
【０１００】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義されたポリペプチド、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０１】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ（キロベース）〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した染色体複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１０２】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１０３】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定できる。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１０４】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１０５】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０．２×ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳ存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌのせん断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【０１０６】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１０７】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１０８】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１０９】
「免疫原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなＮＺＭＳのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＮＺＭＳのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１１０】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１１１】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１１２】
「調節（する）」の語は、ＮＺＭＳの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＮＺＭＳのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１１３】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１１４】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【０１１５】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、組成物に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１１６】
ＮＺＭＳの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク分解性開裂及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。 これらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、ＮＺＭＳの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。
【０１１７】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＮＺＭＳやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１１８】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１１９】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．他， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ他 （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１２０】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド及び最大５，０００ヌクレオチドまでの大きめのポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「ミスプライミングライブラリ」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンター（英国ケンブリッジ）から一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１２１】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えば細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１２２】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１２３】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１２４】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１２５】
本明細書において、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなることを除いて、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチドから構成される。
【０１２６】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＮＺＭＳ、ＮＺＭＳをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官と、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１２７】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１２８】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１２９】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１３０】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１３１】
「転写イメージ」あるいは「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１３２】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージ、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１３３】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他（１９８９）等の参考文献に記載されている。
【０１３４】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、所定の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１３５】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として画定される。 ここで、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、ポリペプチドの１つの所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１３６】
（発明）
本発明は、新規な酵素（ＮＺＭＳ）及びＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの発見、および細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、胃腸疾患、神経系疾患、肺の疾患、生殖系疾患および眼疾患の診断、治療ならびに予防に対するこれらの組成物の使用に基づいている。
【０１３７】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１３８】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースとＰＲＯＴＥＯＭＥデータベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）と、それに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）とを示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）とＰＲＯＴＥＯＭＥデータベースの最も近い相同体のＰＲＯＴＥＯＭＥデータベースの識別番号（ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＩＤ ＮＯ：）を示す。列４は各ポリペプチドとその相同体の間の一致の確率スコアを示す。列５は、ＧｗｎＢａｎｋとＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース相同体の注釈を示し、更に該当箇所には適当な引用文献も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１３９】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチド ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１４０】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが酵素であることを確立している。
【０１４１】
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はヒトの炭酸脱水素酵素Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７９７９３）と５９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．５ｅ−８７であるが、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、１つの真核生物タイプ炭酸脱水素酵素ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１が炭酸脱水素酵素である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４２】
例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は好塩性細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０５８００５３）と３４％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．０ｅ−２９であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はまたジヒドロジピコリン酸シンテターゼファミリ−ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３がジヒドロジピコリン酸シンターゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４３】
また他の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はネズミのＳ‐アデノシル‐Ｌ‐ホモシステインヒドラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１８５３６３）と９８％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．１ｅ−２３０であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４もまた、Ｓ‐アデノシル‐Ｌ‐ホモシステインヒドラーゼシグネチャパターンを有するが、 これは隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。付加的なＢＬＡＳＴ及びＭＯＴＩＦＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がＳ‐アデノシルＬホモシステインヒドラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４４】
別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はワタボウシタマリン（Ｓａｎｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ） のリボヌクレアーゼｋ６前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２７４５７６０）と５９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．３ｅ−４４であり、これは保存されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はまた、膵臓リボヌクレアーゼドメイン有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７が膵臓リボヌクレアーゼである、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１４５】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ がヒトのアリールスルファターゼＢ 前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７９０７７）に５５％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．９ｅ−１４４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はまた、スルファターゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ がスルファターゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４６】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ がネコのアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２５８８５６）に５５％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは３．１ｅ−１４４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はまた、スルファターゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ がスルファターゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１４７】
別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４が残基Ｎ２００からＫ３６２までヒトのＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７８２７９）に８０％同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは５．６ｅ−８３であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４もまた、Ｓ‐アデノシル‐Ｌ‐ホモシステインヒドラーゼドメインを有するが、 これは隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及び付加的なＢＬＡＳＴ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４がＳアデノシルＬホモシステインヒドラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の解析のためのアルゴリズム及びパラメータは表７に記述する。
【０１４８】
別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はマウスの精子形成と関連するＡＴＰ分解酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４１０５６１９）と５６％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは８．６ｅ−１４４であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５もまた、ＡＡＡ ＡＴＰ分解酵素ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ及びＭＯＴＩＦＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５がＡＡＡ ＡＴＰ分解酵素であることをさらに確証する証拠を提供する。   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５−６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６−１８は同様にして解析し、注釈付けをされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１４９】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）および対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ＩＤ）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の全長ポリヌクレオチド配列を構築するために使われたｃＤＮＡ配列および／またゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示し、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を同定するための、あるいはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と関連するポリヌクレオチド配列の間で区別するための技術（例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術）に有用なポリヌクレオチド配列の断片の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１５０】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は特に、例えば組織特異的ｃＤＮＡライブラリあるいはプールしたｃＤＮＡライブラリに由来するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを指す場合もある。或いは列２のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡまたはＥＳＴを指す場合もある。さらに、列２のポリヌクレオチド断片は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、（英国ケンブリッジ））データベースから由来した配列を同定し得る（例えば、「ＥＮＳＴ」命名を含む配列）。また、列２のポリヌクレオチド断片は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑヌクレオチド配列記録データベースに由来する（すなわち、名前に「ＮＭ」または「ＮＴ」を含む配列）あるいはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑタンパク質配列記録に由来する（すなわち、名前に「ＮＰ」を含む配列）場合もある。または列２のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がＸＸＸＸＸＸであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がＹＹＹＹＹ であり、（もし存在すれば）Ｎ１，２，３．．が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された」配列である（ 実施例５参照）。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。ＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ 識別番号であり、Ｎは特定のエキソンに言及している（実施例５を参照）。あるＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、ＲｅｆＳｅｑ識別番号（「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表される）が、ＧｅｎＢａｎｋ識別（即ち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用される場合もある。
【０１５１】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2004530415.tif 000004
【０１５２】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するための列２に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１５３】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって、最も頻繁に代表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５４】
本発明はまた、ＮＺＭＳの変異体も含む。好適なＮＺＭＳの変異体は、ＮＺＭＳの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつＮＺＭＳアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１５５】
本発明はまた、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例において、本発明は、ＮＺＭＳをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１５６】
本発明はまた、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、ＮＺＭＳの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１５７】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチドの変異体はＮＺＭＳをコ−ドするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体はＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列とかなりの相同性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによる配列ブロックの追加または削除により、通常、ヌクレオチドをより多くまたはより少数有することになる。スプライス変異体はその全長についてＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列とのポリヌクレオチド配列相同性が約７０％以下、あるいは約６０％、あるいは約５０％以下でありえるが、そのスプライス変異体のある部分はＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列のある部分とのポリヌクレオチド配列相同性が少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは１００％になっている。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の配列を含むポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記に説明されている任意のスプライス変異体は、ＮＺＭＳの少なくとも１つの機能的あるいは構造的特徴を含むアミノ酸配列をコ−ドすることができる。
【０１５８】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、ＮＺＭＳをコードする多数のポリヌクレオチド配列（既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）を産出し得ることは理解できよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組合せは、天然のＮＺＭＳのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられる。
【０１５９】
ＮＺＭＳ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のＮＺＭＳのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、ＮＺＭＳまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなくＮＺＭＳ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するＲＮＡ転写物の作製がある。
【０１６０】
本発明には、ＮＺＭＳ、ＮＺＭＳ誘導体及びこれらの断片をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＮＺＭＳまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０１６１】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１等を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１６２】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の調製を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページ等を参照）。
【０１６３】
ＮＺＭＳをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られているＰＣＲ法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１６４】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１６５】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６６】
本発明の別の実施例では、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、適切な宿主細胞内でＮＺＭＳ、ＮＺＭＳの断片またはその機能的等価物を発現させるような組換えＤＮＡ分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＮＺＭＳの発現に利用可能である。
【０１６７】
種々の目的でＮＺＭＳがコードする配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１６８】
本発明のヌクレオチドは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ（Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ；米国特許第５，８３７，４５８号、Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ．他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４、Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９に記載）等のＤＮＡシャッフリング技術の対象となり、ＮＺＭＳの生物学的特性、例えば生物活性、酵素活性、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１６９】
別の実施例によれば、ＮＺＭＳをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他（１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５２２３、Ｈｏｒｎ， Ｔ． 他． （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５２３２等を参照）。別法として、化学的方法を用いてＮＺＭＳ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＮＺＭＳのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１７０】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．及びＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページ等を参照）。
【０１７１】
生物学的に活性なＮＺＭＳを発現させるために、ＮＺＭＳをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含むベクターである。必要な因子の例には、ベクターに、またＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５’および３’の非翻訳領域などが含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、ＮＺＭＳをコードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＮＺＭＳをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ．他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２．等を参照）。
【０１７２】
当業者によく知られている方法を用いて、ＮＺＭＳをコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章及び１６章等を参照）。
【０１７３】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＮＺＭＳをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物等や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、；『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＴ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５、ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ．他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．及びＮ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１７４】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成できる。ＮＺＭＳをコードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９等を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＮＺＭＳが必要な場合は、ＮＺＭＳの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７５】
ＮＺＭＳの生成に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ．他（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｓｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ．他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４等を参照）。
【０１７６】
植物系もＮＺＭＳの発現に使用可能である。ＮＺＭＳをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターによって促進される。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他 （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３ ： １６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ．他 （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４ ： ８３８−８４３、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ．他（１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５等を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページ等を参照）。
【０１７７】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＮＺＭＳをコードする配列を結合し得る。非必須のＥ１またはＥ３領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞でＮＺＭＳを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＴ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９等を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１７８】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）。
【０１７９】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＮＺＭＳの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一ベクター上或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用いて、ＮＺＭＳをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１８０】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他． （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ．他． （１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３等を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７３５７０、ＣｏｌｂｅｒｅＧａｒａｐｉｎ， Ｆ．他． （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１１４等を参照）。  この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１等を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１等を参照）。
【０１８１】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＮＺＭＳをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＮＺＭＳをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＮＺＭＳをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１８２】
一般に、ＮＺＭＳをコードする核酸配列を含み且つＮＺＭＳを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０１８３】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＮＺＭＳの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）などがある。ＮＺＭＳ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１８４】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＮＺＭＳをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１８５】
ＮＺＭＳ をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＮＺＭＳの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８６】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１８７】
本発明の別の実施例では、ＮＺＭＳをコードする天然の核酸配列、変更した核酸配列または組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもたらす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラＮＺＭＳタンパク質は、ＮＺＭＳ活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＮＺＭＳが精製後に異種部分から切断できるように、ＮＺＭＳコード配列と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を含めるように融合タンパク質を遺伝子操作することもできる。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１８８】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＮＺＭＳの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１８９】
本発明のＮＺＭＳまたはその断片を用いて、ＮＺＭＳに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＮＺＭＳへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１９０】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＮＺＭＳの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＮＺＭＳが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＮＺＭＳを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョバエ、大腸菌からの細胞が含まれる。ＮＺＭＳを発現する細胞またはＮＺＭＳを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＮＺＭＳまたは化合物の何れかの結合、刺激または活性の阻害を分析する。
【０１９１】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＮＺＭＳと結合させるステップと、ＮＺＭＳとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、アッセイでは標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１９２】
本発明のＮＺＭＳまたはその断片を用いて、ＮＺＭＳの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＮＺＭＳの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも１つの試験化合物をＮＺＭＳと混合し、試験化合物の存在下でＮＺＭＳの活性を試験化合物不在下でのＮＺＭＳの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＮＺＭＳの活性の変化は、ＮＺＭＳの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、ＮＺＭＳの活性に適した条件下で、ＮＺＭＳを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ系すなわち無細胞系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、ＮＺＭＳの活性を調節する試験化合物は間接的に調節する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１９３】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＮＺＭＳまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２、Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１９４】
ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１９５】
ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＮＺＭＳを乳汁内に分泌するなどＮＺＭＳを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１９６】
（治療）
ＮＺＭＳのある領域と酵素の領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。さらに、ＮＺＭＳの発現は頭脳組織、乳組織、気管平滑筋組織、子宮内組織、腎臓組織、肝臓組織、肺組織、下垂体組織、前立腺組織、小腸組織、ＴＨＰ−１前単球細胞、胸腺組織に密接に関連している。したがって、ＮＺＭＳは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、胃腸障害、神経障害、肺疾患、発達障害、生殖障害、眼疾患における役割を果たすようである。ＮＺＭＳの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＮＺＭＳの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＮＺＭＳの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１９７】
従って、一実施例において、ＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＮＺＭＳまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌等が含まれ、また自己免疫／炎症疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷、ブルートン型伴性無ガンマロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺形成不全症）、胸腺異型性、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、血小板減少および湿疹を伴う免疫不全症（ウィスコット‐アルドリッチ症候群）、チェディアック‐東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経性浮腫、クッシング病と関連する免疫不全が含まれ、また心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患、先天性肺異��、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などがあり、また胃腸障害も含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、血色素症、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌が含まれる。神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病及びガストマン‐ストラウスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管芽腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、精神薄弱、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害及び精神分裂病を含む精神障害と、季節型感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジ���トニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、家族性前頭側頭骨痴呆が含まれ、また肺疾患も含まれ、その中には先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束型肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症などが含まれる。そして、生殖障害の中には、プロラクチンの産生異常と、卵管病及び排卵異常、子宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含む不妊症と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症と、精子形成異常、生理学上の精子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房及び女性化乳房癌とが含まれ、眼疾患として高眼圧症と緑内障が含まれる。
【０１９８】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＮＺＭＳまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１９９】
更に別の実施例では、実質的に精製されたＮＺＭＳを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２００】
更に別の実施例では、ＮＺＭＳの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２０１】
更に別の実施例では、患者にＮＺＭＳのアンタゴニストを投与して、ＮＺＭＳの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、心血管疾患、胃腸疾患、神経系疾患、肺の疾患、生殖系疾患および眼疾患が含まれる。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、或いはＮＺＭＳを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは輸送機構として間接的にＮＺＭＳと特異結合する抗体を用いることができる。
【０２０２】
別の実施例では、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＮＺＭＳの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２０３】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２０４】
ＮＺＭＳのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＮＺＭＳを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＮＺＭＳと特異的に結合するものの同定が可能である。ＮＺＭＳの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２０５】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＮＺＭＳまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２０６】
ＮＺＭＳに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＮＺＭＳのアミノ酸群の短い区間を、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２０７】
ＮＺＭＳに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ．他 （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他 （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ．他 （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０２０８】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４等を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＮＺＭＳ特異性一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０２０９】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ．他 （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３８３３３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他 （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３２９９等を参照）。
【０２１０】
ＮＺＭＳのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性で迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５１２８１等を参照）。
【０２１１】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＮＺＭＳとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性ＮＺＭＳエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２１２】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＮＺＭＳに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＮＺＭＳ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＮＺＭＳエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、ＮＺＭＳに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＮＺＭＳエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＮＺＭＳ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＮＺＭＳが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい。 （Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ．およびＣｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２１３】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＮＺＭＳ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性の評価、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ他の文献等を参照）。
【０２１４】
本発明の別の実施例では、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＮＺＭＳをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡあるいは修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはより大きな断片が、ＮＺＭＳをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．編集 （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪ等を参照）。
【０２１５】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５、Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．及びＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５、Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ．他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６等を参照）。
【０２１６】
本発明の別の実施例では、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． 他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． 他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ． 他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． 他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． 及びＳｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、並びにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＮＺＭＳの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＮＺＭＳを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２１７】
本発明の更なる実施例では、ＮＺＭＳの欠損による疾患や異常症は、ＮＺＭＳをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＮＺＭＳ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ．およびＷ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０、Ｂｏｕｌａｙ，Ｊ−Ｌ．およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）がある。
【０２１８】
限定するものではないがＮＺＭＳの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）及びＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）がある。ＮＺＭＳを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ．及びＨ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ及びＨ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ．及びＨ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＮＺＭＳをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２１９】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ．及びＡ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ．他 （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。（１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １８：４５９１−８４５）。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２２０】
本発明の別の実施例では、ＮＺＭＳの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性因子（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ．他． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他（１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ．及びＡ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ．他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ．他（１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ．他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２２１】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、ＮＺＭＳの発現に関連する１つ若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを輸送する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために融通のきくことが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ．他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ．及びＮ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２２】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＮＺＭＳの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターの使用は、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＮＺＭＳを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２の使用についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ．他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２及びＸｕ， Ｈ． 他（１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２２３】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＮＺＭＳ をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ．及びＫ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＮＺＭＳに対するコード配列をカプシドコード領域のαウイルスゲノムに導入することにより、ベクター導入細胞において多数のＮＺＭＳコードＲＮＡが産生され、高レベルのＮＺＭＳが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ．他（１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＮＺＭＳを導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２２４】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ．他 （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ、Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２２５】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＮＺＭＳをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２２６】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２２７】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＮＺＭＳをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０２２８】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０２２９】
本発明の追加実施例は、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＮＺＭＳの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＮＺＭＳの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２３０】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、未処理のそのままの細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ．他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ．他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド等）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２３１】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０２３２】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２３３】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＮＺＭＳ、ＮＺＭＳの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＮＺＭＳのインヒビターなどからなる。
【０２３４】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２３５】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２３６】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２３７】
ＮＺＭＳまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、ＮＺＭＳまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の短陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２３８】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２３９】
治療有効量は、治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（例えば、ＮＺＭＳまたはその断片、ＮＺＭＳの抗体、ＮＺＭＳのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）の量を意味する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２４０】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２４１】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２４２】
（診断）
別の実施例では、ＮＺＭＳに特異的に結合する抗体が、ＮＺＭＳの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＮＺＭＳやＮＺＭＳのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＮＺＭＳの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＮＺＭＳを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４３】
ＮＺＭＳを測定するための様々なプロトコル、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ等が本技術分野において知られており、ＮＺＭＳ発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。正常あるいは標準的なＮＺＭＳの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物とＮＺＭＳに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者のＮＺＭＳの発現の量、対照及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２４４】
本発明の別の実施例によれば、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＮＺＭＳを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。診断アッセイは、ＮＺＭＳの不在、存在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にＮＺＭＳレベルの調製をモニターするために用いることができる。
【０２４５】
ある実施形態では、ＮＺＭＳをコードする核酸配列を同定するために、ＮＺＭＳまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５’調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、そのプローブがＮＺＭＳをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２４６】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はＮＺＭＳをコードする任意の配列と少なくとも５０％の相同性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の配列、或いはＮＺＭＳ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２４７】
ＮＺＭＳをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＮＺＭＳまたはＮＺＭＳ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２４８】
ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＮＺＭＳの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症およびアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに癌には腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病性疾患を含む精神病と、季節性障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体��路性終末欠陥症候群（遅発性ジスキネジア）、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭性健忘症が含まれる。また眼疾患として高眼圧症と緑内障がある。ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やその他の膜ベースの技術と、ＰＣＲ法と、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）法、ピン及びマルチフォーマットＥＬＩＳＡ様アッセイと、変異ＮＺＭＳの発現を検出するために患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得る。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２４９】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、ＮＺＭＳをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。ＮＺＭＳをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＮＺＭＳをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２５０】
ＮＺＭＳの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞抽出物と、ＮＺＭＳをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２５１】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２５２】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５３】
ＮＺＭＳをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２５４】
或る実施態様において、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法がある。ＳＳＣＰでは、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２５５】
ＮＺＭＳの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４、Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２： ２２９−２３６を参照）。目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２５６】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２５７】
別の実施例では、ＮＺＭＳ、ＮＺＭＳの断片、ＮＺＭＳに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２５８】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号 「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２５９】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２６０】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ．及びＮ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと類似のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的に一致させるのに遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２６１】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６２】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られる同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２６３】
プロテオームのプロファイルは、ＮＺＭＳに特異的な抗体を用いてＮＺＭＳ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他（１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２６４】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ．及びＪ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２６５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２６６】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２６７】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他 （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２６８】
本発明の別の実施例ではまた、ＮＺＭＳをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体よりも非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他． （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７１３４、Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る。（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．及びＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２６９】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他 （１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＮＺＭＳをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２７０】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体の遺伝子座がわかっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされた任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を提示している可能性がある（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２７１】
本発明の別の実施例では、任意の種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のライブラリをスクリーニングするために、ＮＺＭＳ、ＮＺＭＳの触媒作用断片、免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＮＺＭＳと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２７２】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ，他（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４等を参照）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＮＺＭＳ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＮＺＭＳが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＮＺＭＳはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２７３】
別の実施例では、ＮＺＭＳと結合可能な中和抗体がＮＺＭＳと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＮＺＭＳと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０２７４】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、ＮＺＭＳをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０２７５】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２７６】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第６０／２５１，８２４号、第６０／２５５，７７３号、第６０／２５４，３１２号、第６０／２５６，１８８号、第６０／２５７，４８８号、第６０／２６２，８３９号、第６０／２６４，４０２号、第６０／２５５，９４０及び２００１年１０月１９日に提出、米国弁護士側管理番号Ｎｏ．ＰＦ−１２４５Ｐは、言及することをもって本明細書の一部となす。   （実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり、表４の列２に列記した。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、またホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２７７】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２７８】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ５．１−６．６等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ（３００〜１０００ｂｐ）選択は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。 ＣＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位で連結された。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１ プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＤＮＡ２．１ プラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶ プラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、ｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２７９】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例１のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃で保管した。
【０２８０】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８１】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。 ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ｕｎｉｔ ７．７に概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２８２】
ＩｎｃｙｔｅのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列の除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ 由来の配列を伴うＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰＲＯＴＥＯＭＥ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）並びにＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースの選択に対してＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照のこと）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用い���生成する。
【０２８３】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、また確率値が低いほど、２配列間の同一性が高くなる）。
【０２８４】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列２に示した。
【０２８５】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定及び編集
推定上の酵素は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ．およびＳ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ．及びＳ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいて酵素について問合せて分析した。潜在的酵素が、酵素として注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２８６】
５  ｃＤＮＡ配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからトップのＢＬＡＳＴヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２８７】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２８８】
６  ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２８９】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。 尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２９０】
この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１は、６４．６０〜７８．８０センチモルガンの間隔内で染色体８にマッピングされた。
【０２９１】
この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２は、９２．５０〜９６．２０センチモルガンの間隔内で染色体１１にマッピングされた。
【０２９２】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５）， ４章及び１６章等を参照）。
【０２９３】
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等のｃＤＮＡデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【数１】
2004530415.tif 000005
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、他端が７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２９４】
或いは、ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝臓、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、ＮＺＭＳをコードするｃＤＮＡの組織特異発現または疾患特異発現を反映する。ｃＤＮＡ配列及びｃＤＮＡライブラリ／組織情報については、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）で見られる。
【０２９５】
８  ＮＺＭＳをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【０２９６】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２９７】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。 ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。 プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：６０℃で１分間、ステップ ４：６８℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２０回繰り返す。ステップ ６：６８℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。別法では、プライマー対、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：５７℃で１分間、ステップ ４：６８℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２０回繰り返す。ステップ ６：６８℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。
【０２９８】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するべくプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２９９】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニーを選択してＬＢ／２ｘ ｃａｒｂ液体培地の３８４穴プレート内において３７℃で一晩培養した。
【０３００】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ステップ １：９４℃で３分間、ステップ ２：９４℃で１５秒間、ステップ ３：６０℃で１分間、ステップ ４：７２℃で２分間、ステップ ５：ステップ２、３及び４を２９回繰り返す。ステップ ６：７２℃で５分間、ステップ ７：４℃で保存。上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３０１】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０３０２】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ３２Ｐ］ アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３０３】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３０４】
１０  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一且つ非多孔性表面の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ．及びＪ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１等を参照）。
【０３０５】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３０６】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖合成バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて２００ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ含有の２５体積ｍｌ内で行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。 混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３０７】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲで１〜２ｎｇの初期量から５μｇより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０３０８】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波をかけ、蒸留水で非常に良く洗って洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０３０９】
米国特許第５，８０７，５２２号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３１０】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３１１】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応は、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中のＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成生成物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。 アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０３１２】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０３１３】
２つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３１４】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比１：１００，０００に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３１５】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３１６】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３１７】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＮＺＭＳをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然ＮＺＭＳの発現が検出、低減、または阻害される。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＮＺＭＳのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＮＺＭＳをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３１８】
１２  ＮＺＭＳの発現
ＮＺＭＳの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でＮＺＭＳが発現するよう、ｃＤＮＡを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、ｃＤＮＡ転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節因子に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＮＺＭＳを発現する。真核細胞でのＮＺＭＳの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＮＺＭＳをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ．他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５等を参照）。
【０３１９】
殆どの発現系では、ＮＺＭＳが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製後、ＧＳＴの部分を特定の開発部位においてＮＺＭＳからタンパク分解的に切断することが可能である。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＮＺＭＳを直接用いて以下の実施例１６、１７、及び１８のアッセイを行うことができる。
【０３２０】
１３  機能的アッセイ
ＮＺＭＳの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＮＺＭＳをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選り抜きのベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方光散乱と９０°側方光散乱によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０３２１】
遺伝子発現におけるＮＺＭＳの影響は、ＮＺＭＳをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、ヒトＩｇＧまたはＣＤ６４に対する抗体（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）で覆われた磁気ビーズを用いて有効に分離することができる。ｍＲＮＡは、本技術分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＮＺＭＳその他の目的の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３２２】
１４  ＮＺＭＳに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製されたＮＺＭＳを用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。
【０３２３】
別法では、ＮＺＭＳアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３２４】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＮＺＭＳ活性を検査するには、ペプチドまたはＮＺＭＳを基質に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３２５】
１５  特異的抗体を用いる天然ＮＺＭＳの精製
天然または組換えＮＺＭＳを、ＮＺＭＳ特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗ＮＺＭＳ抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばＣＮＢｒ活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３２６】
ＮＺＭＳを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＮＺＭＳを優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＮＺＭＳとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピック塩で）溶出させ、ＮＺＭＳを回収する。
【０３２７】
１６  ＮＺＭＳと相互作用する分子の同定
ＮＺＭＳまたは生物学的に活性であるＮＺＭＳ断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する。（例えば Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．およびＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＮＺＭＳと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＮＺＭＳ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＮＺＭＳ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＮＺＭＳの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３２８】
或いは、ＮＺＭＳと相互作用する分子は、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６ に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等の２ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３２９】
ＮＺＭＳはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． ら （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３３０】
１７  ＮＺＭＳ活性の実証
ＮＺＭＳのリアーゼ活性はさまざまな特定の酵素アッセイによって実証される。一般に、アッセイする酵素反応に適した条件下でＮＺＭＳをその基質と共にインキュベートする。好適な時間後、反応を停止する。そして生成物の形成を分光光度法、クロマトグラフ分析法、蛍光分析的または他の適切な方法でモニタ−する。リアーゼ活性は、形成される生成物の量あるいは生成物形成の速度に比例する。特異的リアーゼ活性アッセイの数例を下記に説明する。
【０３３１】
記述されているように、ＮＺＭＳのグリオキサラーゼ活性を分光光度法で測定する（Ｒｉｄｄｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ． 他． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：３１９−３２３）。ＮＺＭＳを、１００ ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ ７．２）中に９００ μＭ Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンと２００ μＭ ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を含む１ｍｌの反応液量に３７℃で加える。グルタチオンの形成を４１２ ｎｍで分光光度法でモニターする。
【０３３２】
ＮＺＭＳのグリオキサラーゼＩ活性を、メチルグリオキサールとグルタチオンからのグルタチオン・チオエステルの形成のモニターにより測定する。ＮＺＭＳを０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）中の２ｍＭのメチルグリオキサールと２ ｍＭの還元型グルタチオンと共に３０℃でインキュベートする。グルタチオン・チオエステルの形成を波長２４０ｎｍで分光光度法でモニターする。ＮＺＭＳのグリオキサラーゼＩ活性は、グルタチオン・チオエステルの形成の速度に比例する。（Ｒｉｄｄｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２１６２３−２１６２８等を参照）。
【０３３３】
ＮＺＭＳのｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−脱水酵素活性をｄＴＤＰ−Ｄ−グルコースからｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースの形成のモニターにより測定する。ＮＺＭＳを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのｄＴＤＰ−Ｄ−グルコース、０．９ユニットの無機ピロホスファターゼ、８ｍＭのＮＡＤＰＨと共に３時間、３７℃でインキュベートする。混合液中の糖成分を２−アミノピリジンと結合し、次にアニオン交換カラムを用いてクロマトグラフ分析法で分析する。脱水酵素活性は、形成されたｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースの量に比例する。（前出のＹｏｓｈｉｄａ、１９９９等を参照）。
【０３３４】
ＮＺＭＳのアコニターゼ活性をイソクエン酸デヒドロゲナーゼと共役したアッセイで測定する。ＮＺＭＳはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ、クエン酸塩と共にインキュベートされ、ＮＡＤＰの還元が蛍光分析的にモニターされる。アコニターゼ活性は、ＮＡＤＰ還元の速度に比例する。（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ， Ｌ．Ｃ． 他． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２８８７５−２８８８１、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ， Ｌ．Ｃ． 他． （１９９６） Ｕｒｏｌｏｇｙ ４８：６５４−６５９等を参照）。
【０３３５】
ＮＺＭＳのジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性は、ｏ−アミノベンズアルデヒド方法を用いて測定される（Ｙｕｇａｒｉ， Ｙ．及びＣ． Ｇｉｌｖａｒｇ （１９６５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４０：４７１０−４７１６、Ｋａｒｃｈｉ， Ｈ．他． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：２５７７−２５８１）。あるいは、ＮＺＭＳのジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性は、Ｆｒｉｓｃｈらが記述した方法で測定される（Ｆｒｉｓｃｈ， Ｄ．Ａ他． （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９６：４４４−４５２、Ｓｈａｖｅｒ， Ｊ．Ｍ． 他． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１９６２−１９６６）。
【０３３６】
ＮＺＭＳのスルファターゼ活性は、ＮＺＭＳを合成基質であるｐ−ニトロカテコール硫酸（ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ ｓｕｆａｔｅ）と共にインキュベートし、塩基を加えた後に遊離したｐ−ニトロカテコールの放出をモニターすることにより測定される。ＮＺＭＳの活性は、５１５ ｎｍで分光光度法で測定される遊離したｐ−ニトロカテコールの放出量に比例している。
【０３３７】
ＮＺＭＳのリボヌクレアーゼ活性は、ＮＺＭＳと共にＲＮＡ基質のインキュベートする結果として生成される可溶性ＲＮＡの量を決定することにより分光光度法で測定することが可能である。ＮＺＭＳを含有する４０ ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）の０．８ ｍｌに、４ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ （Ｓｉｇｍａ）溶液を５μｌ（２０ μｇ）を加える。反応液を２５℃で１５分間インキュベートする。３％過塩素酸を加えた２０ ｍＭ 硝酸ランタンの氷冷した新鮮な溶液０．５ ｍｌを加えることにより、反応を停止する。停止した反応液を氷上で少なくとも１５分インキュベートする。そして１０，０００ｇで５分間遠心分離機にかけることにより不溶性ｔＲＮＡを除去する。可溶性ｔＲＮＡは、残りの上澄みのＵＶ吸収（２６０ ｎｍ）として決定され、ここでＡ２６０の１．０は、４０ μｇの可溶性ｔＲＮＡに対応する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｆ．他． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３５０７−３５１３）。
【０３３８】
ＮＺＭＳの炭酸脱水酵素活性のアッセイは、炭酸脱水酵素活性を測定するためにストップドフローの蛍光光度法を併用して蛍光ｐＨ指示薬８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ピラニン）を使用する（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ， 他． １９９７， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５２： １９０−１９７）。ｐＨ ６．０の溶液をｐＨ ８．０の溶液と混合し、重炭酸の脱水化の初期速度を測定する。ｐＨ ６．０の溶液への炭酸脱水酵素の追加により、２ ミリ秒の分解能時間で生理学的温度における活性の初期速度の測定が可能となる。Ｓｈｉｎｇｌｅｓ他はこのアッセイを使用して、哺乳動物の炭酸脱水酵素アイソフォームとの比較により活性とスルホンアミドへの感度の差異を解決した。蛍光技術の感度により、６５ ｎｇ／ｍｌほどの少量のタンパク質濃度の初期速度の決定が可能となる。
【０３３９】
ＮＺＭＳのデカルボキシラーゼ活性は、標識化基質からのＣＯ２の放出として測定される。例えば、ＮＺＭＳのオルニチンデカルボキシラーゼ活性をＬ−［１−１４Ｃ］−オルニチンからのＣＯ２の放出を測定することによりアッセイする（Ｒｅｄｄｙ， Ｓ．Ｇ 他． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２４９４５−２４９５３）。活性は、０．５ μＣｉのＬ−［１−１４Ｃ］オルニチンを加えた０．５ ｍＭ Ｌ−オルニチンを含有する２００ μｌアッセイバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ、２ ｍＭジチオスレイトール、５ ｍＭ ＮａＦ、０．１％ Ｂｒｉｊ３５、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、６０ μＭ ピリドキサール−５−リン酸）で測定される。１５〜３０分後に、１Ｍ クエン酸を加えることにより反応を停止し、放出された１４ＣＯ２が２０ μｌの２Ｎ ＮａＯＨで飽和したペーパー・ディスク・フィルタに吸着させる。ディスク上の放射能は、液体シンチレーションｓｐｅｃｔｏｇｒａｐｈｙにより測定される。放出した１４ＣＯ２の量は、ＮＺＭＳのオルニチンデカルボキシラーゼ活性に比例する。
【０３４０】
タンパク質ホスファターゼ活性は、Ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）の加水分解によって測定することが可能である。ＮＺＭＳを、０．１％のβメルカプトエタノールの存在下で、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファー中にＰＮＰＰと共に３７℃で６０分インキュベートする。この反応は６ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨを加えて停止する（Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｒ．Ｈ．他 （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：３７５２６２）。或るいは、ＮＺＭＳの酸性ホスファターゼ活性は、ｐＨ４．５の０．１Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０μｌの４０ｍＭ塩化ナトリウム中にＮＺＭＳを含む抽出液と１００μｌの１０ｍＭ ＰＮＰＰを３７℃で２０分インキュベートして実証する。この反応は０．５ ｍｌの０．４Ｍ グリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．４）を加えて止める（Ｓａｆｔｉｇ， Ｐ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１８６２８１８６３５）。ＰＮＰＰの加水分解によって起こる４１０ｎｍでの光吸収の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がＮＺＭＳの活性に比例する。
【０３４１】
別法では、ＮＺＭＳ活性は、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。反応は、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％２−メルカプトエタノールおよび１０μＭ 基質（セリン／トレオニンまたはチロシン残基で好適に３２Ｐ標識された基質）を含む最終容量３０μｌに、２ｎＭ或いは４ｎＭのＮＺＭＳを加えて行なう。反応は基質で開始し、３０℃で１０〜１５分間インキュベートする。０．６ Ｍ ＨＣ１、９０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、および２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中の４％（ｗ／ｖ）活性化木炭４５０μｌで停止させ、次に１２，０００×ｇで５分間遠心分離する。酸可溶性３２Ｐｉを液体シンチレーションカウンターで定量する（Ｓｉｎｃｌａｉｒ， Ｃ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２３６６６２３６７２）。
【０３４２】
更に、ＮＺＭＳ活性は、スルフォン化したタンパク質基質から除去された硫酸塩の量を測定して決定する。反応は、５ ｍＭの４−ニトロカテコール硫酸とＮＺＭＳを発現する細胞から抽出した未精製の上澄みタンパク質を５ μｌ含有する、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ バッファー（ｐＨ ８．０）で実行される。反応液を３７℃で３０分間インキュベートする（Ｈａｌｌｍａｎｎ， Ａ． 他． （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２１：１４３−１５０）。フェノール硫酸基質の加水分解によって起こる４１０ｎｍでの光吸収の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がＮＺＭＳの活性に比例する。
【０３４３】
ＮＺＭＳ活性は、前出のＳａｌａ−Ｎｅｗｂｙ他が記載しているように、ＡＭＰの加水分解の結果として生成される遊離アデノシンの量を決定することにより測定することが可能である。短時間の間、３７℃の適切なバッファ内でＮＺＭＳとＡＭＰを１０分間インキュベートする。遊離アデノシンをＡＭＰから分離して逆相ＨＰＬＣで測定する。
【０３４４】
別方法として、ＡＤＰリボシルアルギニンのＮＺＭＳによる分解によってＮＺＭＳ活性を測定することもできる（Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ， Ｐ．およびＪ． Ｍｏｓｓ （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１６７３６１６７４０）。５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ ７．５）、５ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の中で５０ｎｇのＮＺＭＳを１００ μＭ のＡＤＰリボシル［１４Ｃ］アルギニン （７８，０００ ｃｐｍ） と共にインキュベートする（最終容積１００ μｌ）。３７℃で１時間経過した後、サンプルの９０μｌ をＡｆｆｉＧｅｌ ６０１ （ｂｏｒｏｎａｔｅ） カラム（０．５ × ４ ｃｍ） に注入する（１ｍｌの０．１ Ｍ グリシン（ｐＨ ９．０）、０．１ Ｍ ＮａＣｌおよび １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２で５回平衡化、溶出）。全溶出液中の遊離１４Ｃ−Ａｒｇ を液体シンチュレーションカウンターにより測定する。
【０３４５】
ＮＺＭＳ加水分解活性は、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸） （ＤＴＮＢ）との反応により形成された生成物（ホモシステイン）の速度を測定することにより加水分解方向で分光器で測定される。１ ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ ｍＭのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ ７．２）（バッファＡ）中に、４．７μｇ のＮＺＭＳ と４ユニットのアデノシンデアミナーゼを含有する８００ μｌの酵素溶液に、バッファＡ中で２５０ μＭ ＤＴＮＢを含有する２００ μｌの Ｓ−アデノシル‐Ｌ‐ホモシステイン（５００ μＭ）が加えられる。反応混合物は３７℃で２分間インキュベートされる。加水分解活性を４１２ ｎｍでダイオード・アレイＵＶ分光光度計を用いて連続してモニタ−する。酵素活性とは、１分間に１μｍｏｌのＳアデノシル‐Ｌ‐ホモシステインを加水分解することができる酵素の量として定義される（Ｙｕａｎ， Ｃ−Ｓ 他． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２８００９−２８０１５）。
【０３４６】
ＮＺＭＳ加水分解活性は、基質として３−デアザアデノシンを用いて形成された生成物（Ｓアデノシルホモシステイン）として合成方向で測定される（前出、Ｓｇａｎｇａ， Ｍ．Ｗ．他）。要するに、ＮＺＭＳを０．１ ｍＭの３−デアザアデノシン（ｄｅａｚａａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、５ ｍＭのホモシステイン、２０ ｍＭのＨｅｐｅｓ （ｐＨ ７．２）を含有する容量１００ μｌ中でインキュベートする。アッセイ混合液を３７℃で１５分間インキュベートする。１０ μｌの３ Ｍ 過塩素酸を加えることにより反応を停止する。氷上で１５分間インキュベートした後、混合液をマイクロ遠心分離で４℃で５分間１８，０００ ｘ ｇで遠心分離機にかけた。上澄みを除去して、１ Ｍ 炭酸カリウムの添加により中和して、再び遠心分離した。次に上澄みの５０ μｌのアリコットは、Ａｌｔｅｘ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳカラム（５ μｍの粒子、４．６ ｘ ２５０ ｍｍ）でクロマトグラフィーにかけ、流速１ ｍｌ／ｍｉｎで０．２ Ｍ 無水リン酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）での定組成溶離により。ビシンコニン酸アッセイによりタンパク質を決定した（Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０３４７】
または、ＮＺＭＳ加水分解活性はＴＬＣ方法による合成方向で測定することが可能である（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， Ｍ．Ｓ． 他． （１９７９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：２２−２５）。プレインキュベーション段階で、５０ μＭ ［８−１４Ｃ］アデノシンはＮＡＤ＋の５モルの等価物と共に１５分間２２℃でインキュベートする。
【０３４８】
５０ ｍＭのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ ７．４）、１ ｍＭのＤＴＴ、５ ｍＭのホモシステインから中にＮＺＭＳを含有するアッセイサンプル（５０ μｌの最終容量）は、反応を開始するためにプレインキュベートした［８−１４Ｃ］アデノシン／ＮＡＤ＋と混合させる。反応は３７℃でインキュベートする。またサンプル１μｌを３０分間、５分間隔でＴＬＣプレートにスポットとして載せる。クロマトグラムはブタノール−１／氷酢酸／水（１２：３：５， ｖ／ｖ）で現像して、乾燥させる。紫外線下で基質と生成物を同定するために標準が用いられる。次に［１４Ｃ］アデノシンと［１４Ｃ］ＳＡＨを含有する完全なスポットは、Ｘ線フィルムをＴＬＣプレートに曝露することにより検出される。次に放射標識した基質と生成物はクロマトグラムから切断され、液体シンチレーション分析器により計数される。生成物量対時間のプロットの線形最小二乗法の傾斜とサンプル中のタンパク質のｍｇから酵素の特異的活性を決定する（Ｂｅｔｈｉｎ， Ｋ．Ｅ． 他． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２０６９８−２０７０２）。
【０３４９】
１８  ＮＺＭＳアゴニスト及びアンタゴニストの同定
ＮＺＭＳ活性化若しくは抑制のアゴニスト若しくはアンタゴニストは、実施例１７で記述したアッセイを用いてテストしても良い。アゴニストは、ＮＺＭＳ活性の増加を引き起こし、アンタゴニストはＮＺＭＳ活性の減少を引き起こす。
【０３５０】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３５１】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３５２】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。またＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとその相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３５３】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリペプチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３５４】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡ及び／またはゲノムＤＮＡ断片を示す。
【０３５５】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３５６】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３５７】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004530415.tif 000207
2004530415.tif 000208
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