(57)【要約】ハイブリダイゼーション反応によって形成される、４つの核酸分子からなる複合体を開示する。本複合体は標的核酸分子ならびに第１、第２および第３核酸プローブ分子からなる。上記第１プローブは、標的の第１部分に相補的であってその部分にハイブリダイズされるフット領域と、標的には実質的に非相補的であるアーム領域とを含む。上記第２プローブは標的の第２部分に相補的なフット領域を含み、第２プローブのフット領域は第１プローブのフット領域に隣接してまたは実質的に隣接して標的にハイブリダイズされるようになっている。また上記第２プローブは、標的には実質的に非相補的であるが、第１プローブのアーム領域には相補的であって第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるアーム領域も含む。上記第３プローブは、第１プローブのアーム領域の一部分に少なくとも部分的に相補的であって、第３プローブは第２プローブに隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるようになっている。そして上記複合体の形成により、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成する。また、興味ある標的核酸配列を検出する方法であって、上記複合体の形成を伴う方法も開示する。
2004507203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション反応によって形成される、４つの核酸分子からなる複合体であって、前記複合体は標的核酸分子ならびに第１、第２および第３核酸プローブ分子からなり、前記第１プローブは、標的の第１部分に相補的であってその部分にハイブリダイズされるフット領域と、標的には実質的に非相補的であるアーム領域とを含み、前記第２プローブは標的の第２部分に相補的なフット領域を含み、第２プローブのフット領域は第１プローブのフット領域に隣接してまたは実質的に隣接して標的にハイブリダイズされるようになっており、また上記第２プローブは、標的には実質的に非相補的であるが、第１プローブのアーム領域には相補的であって第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるアーム領域も含み、上記第３プローブは、第１プローブのアーム領域の一部分に少なくとも部分的に相補的であって、第３プローブは第２プローブに隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるようになっており、そして上記複合体の形成により、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成する複合体。
【請求項２】
第１、第２または第３プローブの少なくとも一つがＰＮＡおよび／またはＬＮＡを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
第１および／または第２プローブがＰＮＡおよび／またはＬＮＡを含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
機能的二本鎖Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
プロモーターの活性を増大させる一本鎖または二本鎖配列をプロモーターに隣接して含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記プローブの一つが＋１２配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
第１プローブが＋１２配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
ＲＮＡに転写された時に転写物の単離、同定、検出、定量または増幅を容易にする配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記プローブの一つが不安定化部分を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
第２および第３プローブがＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型鎖の不連続な配列を形成する、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
第２および第３プローブがＲＮＡポリメラーゼプロモーターの非鋳型鎖の不連続な配列を形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
試料中の標的核酸分子の存在を検出する方法であって、標的を含む試料を、標的のそれぞれ第１および第２部分（この第１部分と第２部分とは隣接しているか、または実質的に隣接している）に相補的なフット領域を含む第１および第２核酸プローブと接触させる工程（ここに、第１および第２プローブはそれぞれ、標的とは実質的に非相補的であるアーム領域をさらに含み、第１プローブのアーム領域の少なくとも一部分は、第２プローブのアーム領域の少なくとも一部分に相補的であって、第１および第２プローブの各フット領域が標的にハイブリダイズすると、第１および第２プローブのアーム領域の相補部分のハイブリダイゼーションが可能になるようになっている）、第１プローブのアーム領域の一部分に相補的な第３核酸プローブ分子を、第３プローブが第２プローブのアーム領域に隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブにハイブリダイズするように存在させ、よって、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを生成させる工程、前記ＲＮＡプロモーターからＲＮＡを合成させる工程、およびそのように合成されたＲＮＡを直接的または間接的に検出する工程を含む方法。
【請求項１３】
当該方法の実施によって請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体の形成が起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
機能的ＲＮＡプロモーターから生成したＲＮＡを検出に先立って増幅させる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
機能的ＲＮＡプロモーターから生成したＲＮＡを、分子ビーコンまたは蛍光体の使用を伴う方法によって直接的または間接的に検出する、請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
３つの核酸分子、すなわち標的核酸配列、第１プローブおよび第２プローブからなる複合体であって、前記第１プローブは、５’から３’に向かって、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されうる鋳型部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの鋳型鎖、および標的配列の少なくとも３’末端領域にハイブリダイズされる標的相補部分を含み、前記第２プローブは標的配列の３’末端に隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブにハイブリダイズされ、また第２プローブは第１プローブ中に存在するプロモーターの鋳型鎖に相補的な非鋳型鎖の一部分を含み、プロモーター配列の非鋳型鎖の残りの部分は標的配列の３’末端に存在していて、本複合体の形成によって、非鋳型鎖が第２プローブと標的配列との間に不連続点を持つ機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成するような構成になっている複合体。
【請求項１７】
試料中の核酸標的配列の存在を検出する方法であって、請求項１６の複合体が形成されるように、上に定義した第１および第２プローブを試料と接触させる工程、および第１プローブの鋳型部分のＲＮＡ転写物を直接的または間接的に検出する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸複合体に関する。また本発明は興味ある標的核酸配列の検出方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＲＮＡポリメラーゼは分子生物学分野および分子診断キット分野の当業者には周知の酵素分子である。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型鎖からＲＮＡ分子を合成する。
【０００３】
ＲＮＡポリメラーゼ、特にバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼについては、多くの研究が行われてきた。
【０００４】
具体的に述べると、バクテリオファージＴ７由来のＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＤＮＡと無関係なＤＮＡでは稀にしか出会わない特殊なプロモーターに極めて選択的であることが示されている（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら，１９７０ Ｎａｔｕｒｅ ２２８，２２７、ＤｕｎｎおよびＳｔｕｄｉｅｒ １９８３ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６，４７７）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターの制御下に置かれたほとんど全てのＤＮＡの完全な転写物を作ることができる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは大腸菌ＲＮＡポリメラーゼより約５倍速く転写を行なう著しく活性な酵素である（Ｓｔｕｄｉｅｒら，１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５，６０）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた小さいＲＮＡの合成が記述されているが、それによると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列周辺の配列は、生成するＲＮＡの収量を再現性よく向上させるのに重要であることがわかる（ＭｉｌｌｉｇａｎおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８０，５１、Ｍｉｌｌｉｇａｎら，１９８７ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５，８７８３−８７９８）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと類似する性質を持つ他のＲＮＡポリメラーゼにはバクテリオファージＴ３およびＳＰ６に由来するものがあり、その遺伝子はいずれもクローン化され、対応する酵素が市販されている。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼについては最適なプロモーター配列が知られており、それらは基本的に１７ヌクレオチド長である。
【０００５】
ＲＮＡポリメラーゼを利用して、興味ある特定の核酸配列（「標的」）が存在することの結果としてＲＮＡを直接的または間接的に合成する方法は、数多く知られている。このようにして（直接的または間接的に検出される）ＲＮＡの存在は、興味ある配列の存在を示すのに役立ち、アッセイ法および／または診断法もしくは診断キットの基礎として利用することができる。ＷＯ９３／０６２４０、ＷＯ９４／２９４８１、ＥＰ０８５１０３３およびＥＰ０５５２９３１の開示は、その例である。
【０００６】
特にＷＯ９３／０６２４０には、２つのプローブの間で起こるハイブリダイゼーションが興味ある配列の存在を示すことになるように、興味ある標的核酸配列が存在する場合にのみ一緒にハイブリダイズする２つのプローブの使用が開示されている。
【０００７】
本明細書で言及する刊行物は全て、参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００８】
（発明の概要）
第１の側面として本発明は、ハイブリダイゼーション反応によって形成される、４つの核酸分子からなる複合体を提供する。本複合体は標的核酸分子ならびに第１、第２および第３核酸プローブ分子からなる。上記第１プローブは、標的の第１部分に相補的であってその部分にハイブリダイズされるフット領域と、標的には実質的に非相補的であるアーム領域とを含む。上記第２プローブは標的の第２部分に相補的なフット領域を含み、第２プローブのフット領域は第１プローブのフット領域に隣接してまたは実質的に隣接して標的にハイブリダイズされるようになっている。また上記第２プローブは、標的には実質的に非相補的であるが、第１プローブのアーム領域には相補的であって第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるアーム領域も含む。上記第３プローブは、第１プローブのアーム領域の一部分に少なくとも部分的に相補的であって、第３プローブは第２プローブに隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるようになっている。そして上記複合体の形成により、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成する。
【０００９】
プローブの配列およびハイブリダイゼーション反応条件は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの形成が標的依存的に起こるように、標的が存在しない場合には第１プローブと第２プローブとがハイブリダイズした状態になることができないように選択することが好ましい。
【００１０】
第２の側面として本発明は、試料中の標的核酸分子の存在を検出する方法を提供する。本方法は、標的を含む試料を、標的のそれぞれ第１および第２部分（この第１部分と第２部分とは隣接しているか、または実質的に隣接している）に相補的なフット領域を含む第１および第２核酸プローブと接触させる工程（ここに、第１および第２プローブはそれぞれ、標的とは実質的に非相補的であるアーム領域をさらに含み、第１プローブのアーム領域の少なくとも一部分は、第２プローブのアーム領域の少なくとも一部分に相補的であって、第１および第２プローブの各フット領域が標的にハイブリダイズすると、第１および第２プローブのアーム領域の相補部分のハイブリダイゼーションが可能になるようになっている）；第１プローブのアーム領域の一部分に相補的な第３核酸プローブ分子を、第３プローブが第２プローブのアーム領域に隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブにハイブリダイズするように存在させ、よって、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを生成させる工程；前記ＲＮＡプロモーターからＲＮＡを合成させる工程；およびそのように合成されたＲＮＡを直接的または間接的に検出する工程を含む。
【００１１】
したがって、本発明の第２の側面である方法は、第１の側面である複合体の形成をもたらす。
【００１２】
第１および第２プローブは、標的配列にハイブリダイズした時に、互いに隣接するかまたは実質的に隣接することが、本発明の本質的特徴である。「隣接する」という用語の使用は、本明細書では、プローブの相補的配列と塩基対を形成する標的配列の部分間に、塩基対を形成せずに残っている標的配列のヌクレオチドがないことを意味するものとする。このプローブ間の近接性はプローブの相補的アーム部分のアニーリングを可能にする。当業者にはすぐにわかるだろうが、標的配列からより離れた位置で互いにアニーリングできるようにプローブを設計することにより、標的ヌクレオチド配列においてプローブがハイブリダイズする位置の間に、ギャップを導入してもよい。この場合、プローブは「本質的に隣接する」という。なぜなら、プローブの相補的配列と塩基対を形成する標的配列の部分間に、標的ヌクレオチド配列のいくつかのヌクレオチドが、塩基対を形成せずに残っていてもよいからである。標的配列上で塩基対を形成せずに介在しているヌクレオチドの数がプローブの設計によって変化しうることは明らかである。したがって、第１プローブと第２プローブとは隣接するようにハイブリダイズすることが好ましいものの、プローブは５ヌクレオチドまでの標的配列で分離されていてもよく、「実質的に隣接する」という用語は、このような状況を指すものとする。
【００１３】
また、第２および第３プローブは、第２プローブと第３プローブとが「隣接する」か実質的に隣接する（これらの用語は上記の定義と同じ意味を持つものとする）ような形で、第１プローブのアーム領域にハイブリダイズしなければならないことも、上記の説明からわかるだろう。しかし、第２および第３プローブは共同してプロモーターの一方の鎖を構成するので、第２および第３プローブは最適なプロモーター活性が得られるように隣接した形でハイブリダイズすることが極めて望ましい。本発明者らは、第２プローブと第３プローブの間に１ヌクレオチドのギャップがあるだけでも、プロモーター活性は著しく低下することを見出している。
【００１４】
核酸複合体を形成させる際のプローブの添加順序が重要でないことは当業者には明らかだろう。例えば第３プローブは、第２プローブおよび試料を添加する前に、第１プローブにハイブリダイズさせることができる。あるいは、例えば３つのプローブの全てを同時に、標的分子を含有する試料と混合してもよい。
【００１５】
また、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの一方の鎖を共同して提供する第２および第３プローブは共有結合しているわけではなく、したがってプロモーター配列は一方の鎖のリン酸ジエステル主鎖に「ニック」を含んでいることも、当業者には明らかだろう。説明が不明瞭にならないように述べておくが、本明細書では、上記第１、第２および第３プローブをそれぞれ「鋳型」、「相補体」および「分割相補体」という場合もある。
【００１６】
本発明で使用される好ましいプロモーターは、バクテリオファージポリメラーゼによって認識されるもの、特にＴ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼの一つによって認識されるプロモーターである。これらのプロモーターは一般に最低１７〜１８塩基からなり、基本的に二本鎖であるだろう。二本鎖Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列（先行技術に記載）は、
【００１７】
【化１】
2004507203.tif 000003
【００１８】
または
【００１９】
【化２】
2004507203.tif 000004
【００２０】
である。
ｉ）＝配列番号１
ｉｉ）＝配列番号２
（例えば非鋳型鎖［上記の配列で上側の鎖］の最初の３塩基がＡＡＴではなく５’ＴＴＡ３’であるものなど、いくつかの変異型Ｔ３プロモーター配列が知られている。）
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列（先行技術に記載）は、
【００２１】
【化３】
2004507203.tif 000005
【００２２】
である。
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列（先行技術に記載）は、
【００２３】
【化４】
2004507203.tif 000006
【００２４】
である。
プロモーターの一方の鎖は第１プローブによって提供される。これは、典型的には、ポリメラーゼによって転写される「センス」（＋）鎖になるだろう。したがって第１プローブは、一般的には、転写されるべき一続きの「鋳型」核酸を含むだろう。鋳型は、望ましくは、生成するＲＮＡ転写物の捕捉（例えばハイブリダイゼーション）および／または検出を容易にする配列を含むだろう。さらに第１プローブは、プロモーターの活性を増大させるのに役立つ配列（例えば「＋１２配列」）をプロモーター配列に隣接して含有することが望ましいかもしれない。そのような配列の具体例を下記実施例に開示する。「＋１２配列」は、プロモーターのすぐ下流（すなわち＋１〜＋１２の位置）にある１２塩基から構成されるのでこのような名前で呼ばれる配列であり、転写レベルの増大を引き起こす。
【００２５】
本発明者らは、Ｔ７ポリメラーゼについて、＋１２領域の最適な配列を解明した（以下に、より詳しく論じる）。これらが、例えばＴ３ポリメラーゼやＳＰ６ポリメラーゼにも最適であるかどうかは、現時点ではわかっていない。ＳＰ６ポリメラーゼやＴ３ポリメラーゼは異なる最適＋１２領域を持つことも考えられるが、その場合、本発明の開示を利用して試行錯誤により適切な配列を同定することは、当業者にとっては簡単なことだろう。
【００２６】
第１プローブの鋳型部分への組み込みに関して好ましい＋１２領域の配列（Ｔ７プロモーターの場合）を下記の表１に示す。最も活性な＋１２領域（最大の転写を与えるもの）は一番上の配列であり、下に行くほど優位度は低下する。
【００２７】
表１　Ｔ７ポリメラーゼ用の鋳型＋１〜＋１２配列の選択肢（下へ行くほど転写効率が低下）（それぞれ配列番号５〜１４）
【００２８】
【化５】
2004507203.tif 000007
【００２９】
（５’塩基には＋１（プロモーター配列の末端から下流に向かって１番目の塩基）が割り当てられ、３’塩基には＋１２が割り当てられる）。
【００３０】
さらにもう一つの態様として、複合体の鋳型部分（一般的には第１プローブ上にある）は、新規合成されたＲＮＡ転写物を単離、同定、検出、定量または増幅するために使用することができる配列を含有してもよい（例えばＷＯ９３／０６２４０、ＵＳ５，５５４，５１６を参照されたい。あるいは、例えばＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ １９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４，３０３−３０８に開示されているような分子ビーコン配列を用いる）。これらの配列は（上記の）＋１２領域に隣接させてその下流に配置するとよく、例えばユニークな「分子ビーコン」配列、捕捉配列、検出プローブ相補配列など（ただしこれらに限るわけではない）の１または複数からなることがでできる。
【００３１】
原則的に、第２プローブと第３プローブとが共同して全プロモーター配列の一方の鎖を与える限り、プロモーター配列の１７塩基は、第２プローブと第３プローブにどのような形で分割してもよい。実際面では、一般に、第２プローブがプロモーター配列の５’末端の２〜４（好ましくは３）塩基を与え、プロモーターの残り（１５〜１３塩基）が第３プローブによってもたらされる場合に最適な結果が得られることを、本発明者らは見出した。さらに本発明者らは、第３プローブの３’末端にいくつかの追加塩基（通例、１〜３塩基またはそれ以上）を組み入れることによって（例えば鋳型鎖上の＋１２配列に相補的な少なくとも数個の塩基を与えて、＋１２配列が少なくとも部分的には二本鎖になるようにすることによって）、プロモーター活性を増大させうることも見出した。
【００３２】
第１、第２または第３プローブはいずれもＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡ（ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））、（それほど好ましくはないがＲＮＡ）、またはそれらの任意の組み合わせからなってよい。ただし一般的には、プローブのうちプロモーターを構成する部分については、適切なポリメラーゼによって確実に認識されるように、通常のＤＮＡからなることが望ましいだろう。したがって「核酸複合体」「核酸分子」および「核酸プローブ」という用語は、それぞれ通常の核酸だけから構成される複合体、分子またはプローブに限られると解釈すべきではなく、非通常型の核酸（ＰＮＡやＬＮＡなど）または非核酸部分を含む複合体、分子またはプローブも包含する。
【００３３】
ＰＮＡは、糖／リン酸エステル主鎖がペプチド連結鎖（通例、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位が繰返されてなる鎖）で置き換えられ、そこにメチレンカルボニル結合によって塩基が結合されている合成核酸類似体である。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは二本鎖ＤＮＡ分子と比較して高いＴｍ値を持つ。というのも、ＤＮＡでは著しく負に帯電したリン酸エステル主鎖が各鎖間の静電反発を引き起こすのに対して、ＰＮＡの主鎖は帯電していないからである。ＰＮＡのもう一つの特徴は、一塩基ミスマッチの不安定化効果が、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ中の一塩基ミスマッチよりも相対的に言って強いことである。したがって、本発明で使用されるプローブにＰＮＡを組み入れることは、得られるプローブがＤＮＡだけから構成されるプローブよりも高い特異性を持つので、有用である。ＰＮＡの合成および使用法は、例えばＯｒｕｍら（１９９３ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１，５３３２）、Ｅｇｈｏｌｍら（１９９２ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４，１８９５）およびＥｇｈｏｌｍら（１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）などに開示されている。
【００３４】
ＬＮＡは「内部架橋型」ヌクレオシド類似体を組み込んだ合成核酸類似体である。ＬＮＡの合成とその諸性質は多くの著者によって記述されている：Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７ Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １，３４２３）、Ｋｏｓｈｋｉｎら（１９９８ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９，４３８１）、ＳｉｎｇｈおよびＷｅｎｇｅｌ （１９９８ Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． １２４７）、Ｓｉｎｇｈら（１９９８ Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　４５５）。ＰＮＡの場合と同様に、ＬＮＡはＤＮＡと組み合わせると、通常のＤＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖よりも高い熱安定性を示す。しかしＬＮＡは従来の核酸合成装置で合成することができるのに対し、ＰＮＡは従来の核酸合成装置では合成できない。
【００３５】
非通常型の核酸（ＬＮＡ、ＰＮＡまたは塩基類似体を含有する核酸）の他に、本発明で使用される１または複数のプローブは、１または複数の不安定化部分を含んでもよい。
【００３６】
不安定化部分は、核酸の相補鎖がハイブリダイズした状態になる時に通常起こるような正常な形では塩基対形成および水素結合を起こすことが一般にできない化学物質である。
【００３７】
どのような種類の分子でも不安定化部分としての使用に適しうるが、以下に述べるように一部の化合物は特に好ましい。本明細書を利用すれば、当業者は、他の化合物を試験して、興味ある標的核酸が存在しない場合にはプローブのハイブリダイゼーションが起こらないように適当な不安定化度を与える化合物を、容易に選択することができるだろう。従来の自動固相核酸合成装置による合成オリゴヌクレオチドへの組み込みが容易な形で（例えばホスホロアミダイトとして）市販されている化合物は、便宜上、特に好ましい。
【００３８】
塩基対は形成できないものの、柔軟な折りたたみ構造および／またはヘアピン構造を形成することができる不安定化部分は、特に適切である。そのような好ましい不安定化部分の一つはヘキサエチレングリコール（ここでは「Ｈｅｘ」と略記する）からなり（図５参照）、このヘキサエチレングリコール部分は単独で存在してもよいし、またはｎ回まで直列に並んで存在してもよい（ここにｎは任意の数字であってよいが、最大値は５であるとよい）。特に好ましい一態様では第３プローブが１つのＨｅｘ分子を含む。この場合、第１プローブのアーム領域においてこの不安定化部分に相対する塩基の数は、３〜４塩基になるはずである。もう一つの好ましい不安定化部分は、複数のアルキレン（特にメチレン）反復からなる。ペンタメチレンまたはヘキサメチレンスペーサーは特に好ましい。
【００３９】
あるいは、他のそれほど好ましくない不安定化部分を使用してもよい。これらの不安定化部分としては、例えばイノシン、Ｖｉｒａｚｏｌｅ（商標）（Ｎ［１］−［１−β−Ｄ−リボフラノシル］−３−カルボキサミド−１，２，４−トリアゾール）、Ｎｅｂｕｌａｒｉｎ（商標）（Ｎ［９］−［１−β−Ｄ−リボフラノシル］−プリン）、ニトロピロール、リボース、プロピルまたは上記の組み合わせ、例えばプロピル−Ｈｅｘ−プロピル、プロピル−Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−プロピルなどが挙げられる。プロピルは例えばエチル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチルなどで置き換えてもよい。相補プローブのアーム領域においてこの不安定化部分に相対する塩基の数はｘになるはずである（ｘは１または１より大きい整数である）。正確な塩基数はもちろん不安定化部分のサイズおよびｎの値に依存するだろう。
【００４０】
以下の指針を使用できる。相対するプローブは、不安定化部分中の各Ｈｅｘ分子について、好ましくは３〜４（好ましくは３）塩基を含むべきである（すなわちＸは３ｎ〜４ｎ）。また、相対するプローブは、不安定化部分に存在する上述した他の分子または基のそれぞれについて、次の例外を除いて好ましくは１塩基を含むべきである：ブチル−２塩基、ペンチル−２塩基、ヘプチル−３塩基、オクチル−４塩基。
【００４１】
不安定化部分として使用される上記の化学物質は全て（例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国）などから）市販されている。
【００４２】
第１、第２および第３プローブの複合体（つまりは機能的ＲＮＡプロモーターの形成）が標的依存的に起こることを保証するために、プローブに関して適切な条件、材料および配列を選択する方法は、当業者には理解されるだろう。基本的に、第１および第２プローブのアーム領域間の相補性の程度は、使用する条件において、標的に対する第１および第２プローブの各フット領域のハイブリダイゼーションによって安定化されない限り、第１および第２プローブのアーム領域がハイブリダイズしないようなものでなければならない。
【００４３】
したがって一般に、第１および第２プローブのフット領域は、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも２０塩基、より好ましくは少なくとも２５塩基からなるだろう。フット領域のサイズに上限はない（フット領域は例えば数キロ塩基からなってもよい）。しかし実際問題としては、通常、プローブはインビトロ合成されたオリゴヌクレオチドであるだろうから、フット領域は約７５残基を超えない塩基からなることが好ましいだろう。
【００４４】
これに対して、第１および第２プローブのアーム領域間の相補塩基の数は、標的が存在しない場合には（使用するアッセイ条件下で）当該アーム領域が互いにハイブリダイズした状態にならないように、通常は２５塩基を超えず、典型的には１５塩基未満、最適には５〜１３塩基であるだろう。
【００４５】
好ましい態様として、本発明は、標的依存的にシグナルを生成させ（すなわち複合体の生成、つまりは機能的プロモーターの形成）、追加酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）を必要とせずに１種類の酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）を使用するだけで増幅が起こる系で、前記シグナルの増幅（前記プロモーターの制御下に起こる多数のＲＮＡ転写物の生成）を引き起こす方法を提供する。ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼが最適な活性を示す反応条件は一般的には両立しえないので、追加酵素を必要としないという上記の点は重要である。
【００４６】
検出方法
本発明の方法に従って生成されたＲＮＡは、所望により増幅を行った後（最も好ましくは、例えばＵＳ５，３９９，４９１およびＵＳ５，４８０，７８４に開示されているような等温増幅法による増幅後に）、いくつかの方法で検出できるだろう。例えば、新たに合成されるＲＮＡは、合成中に標識塩基の組み込みを行って、または合成中には標識塩基の組み込みを行わずに、従来の方法で（例えばゲル電気泳動によって）検出できるだろう。
【００４７】
もう一つの選択肢として、例えば新たに合成されたＲＮＡを固体表面（例えばビーズ上、またはマイクロタイタープレート中）に捕捉し、捕捉された分子を標識核酸プローブ（例えば放射標識プローブ、さらに好ましくは酵素、発色団、蛍光体などで標識したプローブ）とのハイブリダイゼーションによって検出することもできるだろう。好ましい酵素ラベルには西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼがある。
【００４８】
好ましい一検出方法では、分子ビーコン、または蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）法、遅延蛍光エネルギー移動（「ＤＥＦＲＥＴ」）法もしくは均一系時間分解蛍光（「ＨＴＲＦ」）法を使用する。分子ビーコンは、当該分子のコンフォメーションに依存して蛍光シグナルを生成したり生成しなかったりする分子である。典型的には、分子の一部分が蛍光体を含み、その分子の別の部分が前記蛍光体から生じる蛍光を消光するための「消光体」を含むだろう。したがって、前記蛍光体と消光体とが近接するようなコンフォメーションを分子がとった場合は、その分子ビーコンは蛍光を発しないが、蛍光体と消光体とが比較的遠く分離されている場合は、その分子は蛍光を発する。分子ビーコンは適当な蛍光体および消光体で標識された核酸分子からなるとよい。
【００４９】
分子ビーコンのコンフォメーションを変化させることができる一つの方法は、核酸へのハイブリダイゼーションによって、例えば分子ビーコンの一部のループアウトを誘発する方法である。もう一つの選択肢として、分子ビーコンが最初はヘアピン型構造（自己相補的塩基対形成によって安定化された構造）をとっていて、その構造をハイブリダイゼーションによって、または酵素もしくはリボザイムによる切断によって変化させてもよい。
【００５０】
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は蛍光供与体分子が無放射双極子−双極子相互作用によって受容体分子にエネルギーを移動させるときに起こる。供与体と受容体の間のＲ−６距離に依存するエネルギー移動が起こると、供与体の寿命と量子収率は低下し、受容体蛍光は増大または増感する。
【００５１】
もう一つの方法（ＤＥＦＲＥＴ、遅延蛍光エネルギー移動）は、励起状態に励起された時に効率のよい長寿命放射（励起波長＝３３７ｎｍ、放射波長＝６２０ｎｍ）を示すことができるという特定金属イオン（ランタニド、例えばユウロピウム）のユニークな性質を利用している。このような長寿命放射の利点は、放射の測定を初期ポーズ後に始めることによってあらゆるバックグラウンド蛍光および光散乱を散逸させる時間分解（ＴＲ）技術を使用できることである。Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）（励起波長＝６２０ｎｍ、放射波長＝６６５ｎｍ）をＤＥＦＲＥＴパートナーとして使用することができる。
【００５２】
ＨＴＲＦ（ＷＯ９２／０１２２４およびＵＳ５，５３４，６２２を参照されたい）は、供与体（例えばユウロピウム）を保護ケージ（クリプテート）に包接して、オリゴマーの５’末端に取り付けるた場合に起こる。この系のために開発された受容体分子はＸＬ６６５と呼ばれるタンパク質蛍光体である。この分子を第２のプローブの３’末端に連結する。この系はＰａｃｋａｒｄによって開発されたものである。
【００５３】
ＲＮＡまたは他の核酸分子の増幅および検出は、本願出願人による先願ＷＯ９９／３７８０５およびＷＯ９９／３７８０６に詳述されている。
【００５４】
もう一つの態様では、新たに合成されるＲＮＡによって、増幅前または増幅後に、リボザイムの形成が起こり、このリボザイムは、特定の核酸基質配列の切断（例えば蛍光体／消光体二重標識オリゴヌクレオチドの切断）によって検出することができる。
【００５５】
第３の側面として本発明は、３つの核酸分子、すなわち標的核酸配列、第１プローブおよび第２プローブからなる複合体を提供する。この複合体では、前記第１プローブは、５’から３’に向かって、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されうる鋳型部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの鋳型鎖、および標的配列の少なくとも３’末端領域にハイブリダイズされる標的相補部分を含み、前記第２プローブは標的配列の３’末端に隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブにハイブリダイズされる。また、第２プローブは第１プローブ中に存在するプロモーターの鋳型鎖に相補的な非鋳型鎖の一部分を含み、プロモーター配列の非鋳型鎖の残りの部分は標的配列の３’末端に存在していて、本複合体の形成によって、非鋳型鎖が第２プローブと標的配列との間に不連続点を持つ機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成するような構成になっている。
【００５６】
機能的な二本鎖プロモーターを形成させるためには、第２プローブと標的配列の両方が第１プローブにハイブリダイズする必要があることは、当業者には理解されるだろう。したがって第１プローブの鋳型部分のＲＮＡ転写物は、標的配列が試料中に存在することを示す。したがって本発明の第３の側面の複合体は、試料中の興味ある核酸配列の存在を検出するためのアッセイの基礎になる。
【００５７】
したがって第４の側面として本発明は、試料中の興味ある核酸配列の存在を検出する方法であって、本発明の第３の側面の複合体が形成されるように、上に定義した第１および第２プローブを試料と接触させる工程（この場合、標的配列は興味ある配列であるか、または興味ある配列が試料中に存在することの結果として形成される配列である）、および第１プローブの鋳型部分のＲＮＡ転写物を直接的または間接的に検出する工程を含む方法を提供する。
【００５８】
標的配列はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、また興味ある配列であってもよいし、興味ある配列が試料中に存在することの結果として（例えばＰＣＲによって、またはＷＯ９３／０６２４０、ＷＯ９４／２９４８１、ＥＰ０８５１０３３もしくはＥＰ０５５２９３１の一つに開示されている方法の一つによって）形成されるものであってもよい。ＲＮＡ転写物は、本明細書に項を改めて説明する方法を使って増幅し、検出すると便利である。
【００５９】
本発明の第３の側面の複合体および本発明の第４の側面の方法では、プロモーターの非鋳型鎖中の不連続点は原則としてどの位置にあってもよい（すなわちプロモーター配列のうち標的配列の３’末端に由来する塩基の数はいくつでもよい）。実際面では、生成するプロモーターが最適な活性を持つように、プロモーター配列の１〜５塩基（より好ましくは３塩基）が標的配列に由来することが好ましい。また、プロモーターの非鋳型鎖中の不連続点が可能な限り小さくなるように、第２プローブは標的配列に直接隣接して第１プローブにハイブリダイズすることが、極めて好ましい。これによっても、複合体が形成された時にプロモーター活性が最適化される。
【００６０】
以下に、説明に役立つ実施例を挙げ、添付の図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００６１】
実施例１
この実施例では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと３つのオリゴヌクレオチドプローブとを使って特定の標的配列を検出できることを実証する。プローブ１（「鋳型」）は、標的配列に相補的な３４塩基のフット領域、８塩基のオーバーラップ配列、１７塩基のＴ７プロモーター鋳型鎖、＋１２配列ならびに検出用の捕捉およびプローブ配列を順に含む。プローブ２（「相補体」）は、標的配列に相補的な３１塩基のフット領域、８塩基のオーバーラップ配列およびＴ７プロモーターの相補鎖（または非鋳型鎖）鎖の最初の３塩基を含む。プローブ３（「分割相補体」）は、１７塩基のＴ７プロモーター配列の相補鎖（または非鋳型鎖）の残りの１４塩基を含む。この例を図１に図解する。
【００６２】
図１を参照して説明すると、ハイブリダイゼーション反応によって形成される複合体は４つの核酸分子、すなわち１２０塩基対の標的配列２、第１プローブ４（「鋳型」）、第２プローブ（「相補体」）６および第３プローブ（「分割相補体」）８からなる。４つの分子２、４、６および８の向き（５’→３’）は表示した通りである。
【００６３】
第１プローブ／鋳型４は、５’から３’に向かって、ＲＮＡ転写物の単離および検出を容易にする鋳型部分４ａ、プロモーター活性を増大させるための＋１２配列４ｂ、Ｔ７プロモーターの１７塩基から構成されるプロモーター配列４ｃ、第２プローブ／相補体６の相補部分６ｂにハイブリダイズさせるためのオーバーラップ領域４ｄ、および標的２の相補部分にハイブリダイズさせるための３４塩基からなるフット領域４ｅを含む。
【００６４】
第２プローブ／相補体６は、５’から３’に向かって、標的にハイブリダイズさせるための３１塩基のフット領域６ａ、第１プローブ４の相補部分４ｄにハイブリダイズさせるための８塩基のオーバーラップ領域６ｂ、およびＴ７プロモーターの一方の鎖の最初の３塩基（ＴＡＡ）から構成される部分プロモーター領域６ｃを含む。
【００６５】
第３プローブ８は上記Ｔ７プロモーター鎖の残りの１４塩基を含む。
標的２ならびにプローブ分子４、６および８が存在すると、第１プローブ４および第２プローブ６の各フット領域が隣接してまたは実質的に隣接して標的にハイブリダイズした複合体が形成され、その結果、相補的オーバーラップ部分４ｄおよび６ｂのハイブリダイゼーションが可能になる。したがって、第１プローブのプロモーター配列４ｃに第３プローブ８がハイブリダイズすることにより、一方の鎖（第２および第３プローブ６および８によって形成される鎖）が不連続な機能的二本鎖Ｔ７プロモーターが生成する。
【００６６】
１．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ａシンセサイザーを製造者の説明書に従って使用して、ホスホロアミダイト法によって合成した。オリゴヌクレオチドプローブのビオチン化はビオチンホスホロアミダイトの組み込みによって達成した。アルカリホスファターゼで官能化されたオリゴヌクレオチドは、製造者独自の方法（Ｏｓｗｅｌ）を用いて調製した。オリゴヌクレオチドは全て、標準的な技法により、ＨＰＬＣ精製した。
【００６７】
１．２　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
ハイブリダイゼーションは、１０ｆｍｏｌのプローブ１、５０ｆｍｏｌのプローブ２、２５ｆｍｏｌのプローブ３および１ｆｍｏｌのプローブ４（ＣＦＴＲ遺伝子用の標的）を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）（Ｐｒｏｍｅｇａ；４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＮａＣｌ（最終濃度））と共に含むアッセイ混合物で行った。（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）ＲＮａｓｅフリーの蒸留水で反応液量を２０μｌにした。対照反応液には標的（プローブ４）なしでプローブ１、２および３を含めた。その混合物を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させた後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２５単位）と２μｌのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製ｒＮＴＰミックス（各２０ｍＭのｒＮＴＰ、すなわちアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン５’−リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ））を加え、その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
【００６８】
１．３　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
ストレプトアビジン被覆ウェルで、０．９ｐｍｏｌのビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド（検出すべきＲＮＡに特異的なもの）と６ｐｍｏｌの特異的アルカリホスファターゼオリゴヌクレオチドとを含む１４５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＢＳＡ）に、２０μｌのアッセイ試料を加えた。インキュベーション（３００ｒｐｍで振とうしながら室温で６０分）により、ビオチン化捕捉抗体を介してＲＮＡをウェルに固定化し、検出プローブにアニールさせた。ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、次にアルカリホスファターゼ基質緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で１回洗浄することによって、未結合の物質をウェルから除去した。最後に、４−ニトロフェニルリン酸（５ｍｇ／ｍｌ）を含有するアルカリホスファターゼ基質緩衝液を各ウェルに加えた。そのプレートをＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ ＥＩＡプレートリーダーにて３７℃でインキュベートし、２分毎に４０５ｎｍで測定値を読み取った。結果を図２に示す。図２は、二重試料について、１ｆｍｏｌの標的の存在下（＋）または不在下（−）で生成したＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を示すグラフである。
【００６９】
１．４　オリゴヌクレオチドの一覧
プローブ１（鋳型）配列番号１５
【００７０】
【化６】
2004507203.tif 000008
【００７１】
プローブ２（相補体）配列番号１６
【００７２】
【化７】
2004507203.tif 000009
【００７３】
プローブ３（分割相補体）配列番号１７
【００７４】
【化８】
2004507203.tif 000010
【００７５】
プローブ４（標的）配列番号１８
【００７６】
【化９】
2004507203.tif 000011
【００７７】
転写されたＲＮＡの配列　配列番号１９
【００７８】
【化１０】
2004507203.tif 000012
【００７９】
捕捉プローブ　配列番号２０
【００８０】
【化１１】
2004507203.tif 000013
【００８１】
検出プローブ　配列番号２１
【００８２】
【化１２】
2004507203.tif 000014
【００８３】
実施例２
この実施例では、プローブ３（すなわち分割相補体プローブ）の３’末端から３塩基の位置に置いたヘキサエチレングリコールリンカー（Ｈｅｘ）が、生成するシグナルの量を増加させることを実証する。この例を図３に図解する。図１で採用した符号と同じ符号を使っている。Ｈは分割相補体プローブに組み込まれたヘキサエチレン残基のおよその位置を示している。
【００８４】
２．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、実施例１．１に記述したように調製し、官能化した。Ｈｅｘの組み込みは、伸長中の鎖を１８−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイトと反応させることによって達成した。オリゴヌクレオチドは全て、標準的な技術を使ってＨＰＬＣ精製した。使用したオリゴヌクレオチドは、（５’末端から数えて）１１番目の塩基と１２番目の塩基の間にＨｅｘを含有している変異型プローブ３（分割相補体）オリゴ（以下「プローブ５」という）を除けば、実施例１と同じである。
【００８５】
２．２　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
ハイブリダイゼーションは、１０ｆｍｏｌのプローブ１、５０ｆｍｏｌのプローブ２、５０ｆｍｏｌのプローブ３またはプローブ５（プローブ３のＨｅｘ含有変異体）および１ｆｍｏｌのプローブ４（ＣＦＴＲ遺伝子用の標的）を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に含有するアッセイ混合物で行った。（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）ＲＮａｓｅフリーの蒸留水で反応液量を２０μｌにした。対照反応液には標的（プローブ４）なしでプローブ１、２および３またはプローブ１、２および５を含めた。その混合物を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させた後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２５単位）と２μｌのｒＮＴＰミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
【００８６】
２．３　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
２０μｌのアッセイ試料を、実施例１．３に記述したように処理した。結果を図４に示す。図４は、分割相補体プローブ中にヘキサメチレン残基を含まない複合体（「Ｈｅｘなし」）およびヘキサメチレン残基を含む複合体について、標的の存在下（＋）または不在下（−）で生成したＲＮＡの量を示すグラフである。
【００８７】
実施例３
この実施例では、分割相補体プローブの３’末端を１、２または３塩基分伸ばすことによって、観察されるＲＮＡシグナルの量が増加することを実証する。
【００８８】
３．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、上記実施例に記述したように調製し、精製した。
【００８９】
３．２　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
ハイブリダイゼーションは、１０ｆｍｏｌのプローブ１、５０ｆｍｏｌのプローブ２、５０ｆｍｏｌのプローブ３（１４塩基分割相補体）、４（１５塩基分割相補体）、５（１６塩基分割相補体）または６（１７塩基分割相補体）および１ｆｍｏｌのプローブ７（ＣＦＴＲ遺伝子用の標的）を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に含むアッセイ混合物で行った。全ての反応液に５０ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）と５％ポリエチレングリコール３００（Ｓｉｇｍａ）も含めた。（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）ＲＮａｓｅフリーの蒸留水で反応液量を２０μｌにした。対照反応液には標的（プローブ７）なしでプローブ１および２ならびにプローブ４、５または６の一つを含めた。その混合物を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させた後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。１時間後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２５単位）および２μｌのｒＮＴＰを混合（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【００９０】
３．３　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
２０μｌのアッセイ試料を、実施例１．３に記述したように処理した。結果を図６に示す。図６は、１４、１５、１６または１７塩基長の分割相補体プローブを使った反応で生成したＲＮＡの量を示すグラフである。
【００９１】
３．４　オリゴヌクレオチドの一覧
プローブ１（鋳型）（配列番号２２）
【００９２】
【化１３】
2004507203.tif 000015
【００９３】
プローブ２（相補体）−実施例１のプローブ２に同じ
プローブ３（１４塩基分割相補体）−実施例１のプローブ３に同じ
プローブ４（１５塩基分割相補体）−３’末端にＧが追加されている点以外は実施例１のプローブ３に同じ
プローブ５（１６塩基分割相補体）−３’末端にＧＧが追加されている点以外は実施例１のプローブ３に同じ
プローブ６（１７塩基分割相補体）−３’末端にＧＧＧが追加されている点以外は実施例１のプローブ３に同じ
プローブ７（標的）−実施例１のプローブ４に同じ
転写されたＲＮＡの配列（配列番号２３）
【００９４】
【化１４】
2004507203.tif 000016
【００９５】
捕捉プローブ（配列番号２４）
【００９６】
【化１５】
2004507203.tif 000017
【００９７】
検出プローブ　（配列番号２５）
【００９８】
【化１６】
2004507203.tif 000018
【００９９】
実施例４
この実施例では標的配列中の３塩基欠失を検出できることを実証する。相補体プローブのフット領域を３０塩基とし、鋳型プローブのフット領域を１４塩基または３０塩基とした。３塩基欠失は、接続点から、接続点の鋳型プローブフット側に向かって７塩基の位置にあった。
【０１００】
４．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、先に記述したように調製し、精製した。オクタンジオールは、伸長中の鎖を８−ジメトキシトリチルオクタンジオール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホロアミダイトと反応させることによって組み込んだ。
【０１０１】
４．２　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
ハイブリダイゼーションは、１０ｆｍｏｌのプローブ１（１４塩基鋳型フット）、５０ｆｍｏｌのプローブ３、５０ｆｍｏｌのプローブ４および１ｆｍｏｌのプローブ５（野生型標的配列）を含有するアッセイ混合物、または１０ｆｍｏｌのプローブ２（３０塩基鋳型フット）、５０ｆｍｏｌのプローブ３、５０ｆｍｏｌのプローブ４および１ｆｍｏｌのプローブ５（野生型標的配列）もしくは１ｆｍｏｌのプローブ６（突然変異型標的配列）を含有するアッセイ混合物で行った。全ての反応液に５０ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）と５％ポリエチレングリコール３００（Ｓｉｇｍａ）も含めた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）ＲＮａｓｅフリーの蒸留水で反応液量を２０μｌにした。対照反応液では標的（プローブ５または６）を除いた。その混合物を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させた後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。１時間後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２５単位）と２μｌのｒＮＴＰミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
【０１０２】
４．３　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
２０μｌのアッセイ試料を、先に記述したように処理した。結果を図７に示す。図７は、野生型（ｉ）もしくは突然変異型（ｉｉ）標的配列、または標的を含まない対照（ｉｉｉ）について、鋳型がそれぞれ１４塩基または３０塩基のフット領域を含む反応（「Ａ」および「Ｂ」）で生成したＲＮＡの量を示している。これらの結果は、野生型遺伝子と突然変異型遺伝子とを容易に識別できることを実証している。
【０１０３】
４．４　オリゴヌクレオチドの一覧
プローブ１（１４塩基のフット領域を持つ鋳型プローブ）（配列番号２６）
【０１０４】
【化１７】
2004507203.tif 000019
【０１０５】
Ｏ＝オクタンジオール
プローブ２（３０塩基のフット領域を持つ鋳型プローブ）（配列番号２７）
【０１０６】
【化１８】
2004507203.tif 000020
【０１０７】
Ｏ＝オクタンジオール
プローブ３（相補体プローブ）（配列番号２８）
【０１０８】
【化１９】
2004507203.tif 000021
【０１０９】
プローブ４（分割相補体プローブ）−実施例３のプローブ４に同じ
プローブ５（野生型標的配列）−実施例１に記載の配列番号１８に同じ
【０１１０】
【化２０】
2004507203.tif 000022
【０１１１】
ボールド体の記号は突然変異体中で欠失している３塩基を表す。
プローブ６（突然変異型標的配列）（配列番号２９）
【０１１２】
【化２１】
2004507203.tif 000023
【０１１３】
［矢印は３塩基欠失の位置を表す。この３塩基欠失は接続点から７塩基の位置にある。］
転写されたＲＮＡの配列（実施例３に記載の配列番号２３に同じ）
捕捉プローブ（実施例３に記載の配列番号２４に同じ）
検出プローブ（実施例３に記載の配列番号２５に同じ）
実施例５
この実施例では大腸菌Ｋ１２から精製された全ＲＮＡ中の２３Ｓ ｒＲＮＡを検出できることを実証する。
【０１１４】
５．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、先に記述したように調製し、精製した。
【０１１５】
５．２　全ＲＮＡの調製
大腸菌を、ルリア−ベルターニ培地（１０ｇ／ｌのバクトトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキスおよび１０ｇ／ｌの塩化ナトリウム）中、３７℃で、培養物のＯＤ６００が１．０に達するまで生育させた。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを使って全ＲＮＡを精製した。製造者の説明書に従って細胞を収集し、溶解した。ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使って製造者の説明書に従ってＲＮＡを定量し、小分けして使用準備ができるまで−８０℃で保存した。
【０１１６】
５．３　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
ハイブリダイゼーションは、１ｆｍｏｌのプローブ１、５ｆｍｏｌのプローブ２、５ｆｍｏｌのプローブ３、および１０、１または０．１ｎｇの大腸菌Ｋ１２由来全ＲＮＡを含有するアッセイ混合物で行った。全ての反応液に５０ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）と５％ポリエチレングリコール３００（Ｓｉｇｍａ）も含めた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）ＲＮａｓｅフリーの蒸留水で反応液量を２０μｌにした。対照反応液には標的ＲＮＡなしでプローブ１、２および３を含めた。その混合物を９５℃に５分間加熱した後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。１時間後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２５単位）と２μｌのｒＮＴＰミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。反応液を−８０℃で保存した。
【０１１７】
５．４　ＲＮＡシグナルの増幅
複合体中のＴ７プロモーターから転写されたＲＮＡをさらに増幅するために、一本鎖Ｔ７プロモーター配列を含む直線状ＤＮＡ鋳型（プローブ４）を使用した。各反応液１０μｌを、２０ｆｍｏｌのプローブ４、８μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液、５０μＭ ｄＮＴＰ類、２ｍＭ ｒＮＴＰ類、５１単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび４単位のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物に加えた。ＲＮａｓｅフリーの蒸留水を使って液量を４０μｌにした。その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。最初の反応（５．３）で得たＲＮＡをプローブ４にハイブリダイズさせ、Ｂｓｔポリメラーゼで伸長させることによって、完全に機能的な二本鎖ＲＮＡプロモーターを形成させ、そのプロモーターにより、第２のＤＮＡテンプレートであるプローブ４のＲＮＡ転写物を多数生成させた。
【０１１８】
５．５　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
４０μｌのアッセイ試料を先に記述したように処理した。結果を図８に示す。図８は、様々な量（１０、１または０．１ｎｇ）の大腸菌Ｋ１２由来全ＲＮＡを標的として使用した反応で生成したＲＮＡの量を、対照反応（標的なし）と比較して示している。
【０１１９】
５．６　オリゴヌクレオチドの一覧
プローブ１（鋳型プローブ）（配列番号３０）
【０１２０】
【化２２】
2004507203.tif 000024
【０１２１】
Ｏ＝オクタンジオール
プローブ２（相補体プローブ）（配列番号３１）
【０１２２】
【化２３】
2004507203.tif 000025
【０１２３】
プローブ３（分割相補体プローブ）−実施例３のプローブ４に同じ
プローブ４（第２のＤＮＡ鋳型プローブ）−（配列番号３２）
【０１２４】
【化２４】
2004507203.tif 000026
【０１２５】
Ｏ＝オクタンジオール
検出対象である転写されたＲＮＡの配列（配列番号３３）
【０１２６】
【化２５】
2004507203.tif 000027
【０１２７】
捕捉プローブ−実施例１に記載の配列番号２０に同じ
検出プローブ−実施例１に記載の配列番号２１に同じ
実施例６
この実施例では、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの代わりにＴ３プロモーターおよびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用できることを実証する。１７塩基のＴ３プロモーターに、１４塩基の分割相補体プローブを使用した。
【０１２８】
６．１　オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブは全て、先に記述したように調製し、精製した。
【０１２９】
６．２　ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからのＲＮＡの合成
Ｔ７プロモーターを含むアッセイには、１０ｆｍｏｌのプローブ１、５０ｆｍｏｌのプローブ２、５０ｆｍｏｌのプローブ３、および１ｆｍｏｌのプローブ４を使用した。Ｔ３プロモーターを含むアッセイには、１０ｆｍｏｌのプローブ５、５０ｆｍｏｌのプローブ６、５０ｆｍｏｌのプローブ７、および１ｆｍｏｌのプローブ４を使用した。全ての反応液に５０ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）と５％ポリエチレングリコール３００（Ｓｉｇｍａ）も含めた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にもＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にも、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、（後で酵素とＮＴＰ類を添加できるように）反応液量をＲＮａｓｅフリーの蒸留水で２０μｌにした。対照反応液にはプローブ１、２および３またはプローブ５、６および７を含めた。その混合物を９０℃に３分間加熱した後、（０．１℃／秒の降温速度で）３７℃に冷却した。１時間後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２５単位）またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ（２５単位）と２μｌのｒＮＴＰミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、その混合物を３７℃で３時間インキュベートした。反応液を−８０℃で保存した。
【０１３０】
６．３　合成されたＲＮＡの捕捉および検出
２０μｌのアッセイ試料を先に記述したように処理した。結果を図９に示す。
【０１３１】
図９は、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いた反応で生成したＲＮＡの量を示している。予想通り、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターからしかＲＮＡを生成せず、Ｔ３プロモーターからはＲＮＡを生成しない、またＴ３ ＲＮＡポリメラーゼについてはその逆が成り立つという点で、反応は特異的だった。Ｔ３ポリメラーゼはＲＮＡをＴ７ポリメラーゼよりもわずかに多く生成したが、この系の場合、バックグラウンドシグナル（標的不在下）はＴ３の方がはるかに高かった。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドの一覧
プローブ１（Ｔ７鋳型）（配列番号３４）
【０１３３】
【化２６】
2004507203.tif 000028
【０１３４】
プローブ２（Ｔ７相補体）−実施例１に記載の配列番号１６に同じ
プローブ３（Ｔ７分割相補体）−実施例１に記載の配列番号１７に同じ
プローブ４（標的）（配列番号３５）
【０１３５】
【化２７】
2004507203.tif 000029
【０１３６】
プローブ５（Ｔ３鋳型）（配列番号３６）
【０１３７】
【化２８】
2004507203.tif 000030
【０１３８】
プローブ６（Ｔ３相補体）（配列番号３７）
【０１３９】
【化２９】
2004507203.tif 000031
【０１４０】
プローブ７（Ｔ３分割相補体）（配列番号３８）
【０１４１】
【化３０】
2004507203.tif 000032
【０１４２】
転写されたＲＮＡの配列（配列番号３９）
【０１４３】
【化３１】
2004507203.tif 000033
【０１４４】
捕捉プローブ−実施例３に記載の配列番号２４
検出プローブ−実施例３に記載の配列番号２５
実施例７
この実施例では、図１０を参照して、本発明の第３の側面の複合体を例示する。
【０１４５】
図１０を参照して説明すると、本複合体は第１プローブ２０、第２プローブ２２および標的核酸２４からなる。第１プローブ２０は、転写可能部分２０ａ、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡプロモーターなど）の鋳型鎖２０ｂ、および標的配列２４の３’末端にハイブリダイズされる標的相補部分２０ｃを含む。
【０１４６】
第２プローブ２２は、標的配列２４に隣接して第１プローブ２０にハイブリダイズされる。第２プローブ２２は第１プローブ２０上のプロモーターの鋳型鎖の一部分（好ましくは大半、例えば１３〜１５塩基）に相補的な塩基を含む（すなわち第２プローブ２２はプロモーターの非鋳型鎖の一部分（好ましくは大半）を含む）。非鋳型鎖の残り（通例４〜２塩基）は標的配列２４の３’末端によって与えられる。したがって本複合体は、機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、適切なＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチド三リン酸の存在下では、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが第１プローブの鋳型部分２０ａのＲＮＡ転写物２６の合成を引き起こすようになっている。
【０１４７】
ＲＮＡ転写物２６を（好ましくは随意の増幅工程後に）検出することにより、標的配列２４（これは興味ある配列であってもよいし、興味ある配列が存在することの結果として（例えばＰＣＲによって、またはＷＯ９３／０６２４０、ＷＯ９４／２９４８１もしくはＥＰ０８５１０３３などの先行技術に記載されている他の方法の一つを使って）生成させたものであってもよい）の存在を示すことができる。
【０１４８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の側面による核酸複合体の概略図。
【図２】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図３】本発明の第１の側面による核酸複合体の概略図。
【図４】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図５】本発明の一部の態様で使用される好ましい不安定化部分の概略図。
【図６】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図７】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図８】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図９】様々な核酸複合体から生成されるＲＮＡの量（単位：フェムトモル）を表す棒グラフ。
【図１０】本発明の第３の側面による核酸複合体の概略図。
【図２】
2004507203.tif 000034
【図４】
2004507203.tif 000035
【図６】
2004507203.tif 000036
【図７】
2004507203.tif 000037
【図８】
2004507203.tif 000038
【図９】
2004507203.tif 000039
【国際公開パンフレット】
2004507203.tif 000040
2004507203.tif 000041
2004507203.tif 000042
2004507203.tif 000043
2004507203.tif 000044
2004507203.tif 000045
2004507203.tif 000046
2004507203.tif 000047
2004507203.tif 000048
2004507203.tif 000049
2004507203.tif 000050
2004507203.tif 000051
2004507203.tif 000052
2004507203.tif 000053
2004507203.tif 000054
2004507203.tif 000055
2004507203.tif 000056
2004507203.tif 000057
2004507203.tif 000058
2004507203.tif 000059
2004507203.tif 000060
2004507203.tif 000061
2004507203.tif 000062
2004507203.tif 000063
2004507203.tif 000064
2004507203.tif 000065
2004507203.tif 000066
2004507203.tif 000067
2004507203.tif 000068
2004507203.tif 000069
2004507203.tif 000070
2004507203.tif 000071
2004507203.tif 000072
2004507203.tif 000073
2004507203.tif 000074
2004507203.tif 000075
2004507203.tif 000076
2004507203.tif 000077
2004507203.tif 000078
2004507203.tif 000079
2004507203.tif 000080
2004507203.tif 000081
2004507203.tif 000082
2004507203.tif 000083
2004507203.tif 000084
2004507203.tif 000085
2004507203.tif 000086
2004507203.tif 000087
2004507203.tif 000088
2004507203.tif 000089
2004507203.tif 000090
2004507203.tif 000091
2004507203.tif 000092
2004507203.tif 000093
2004507203.tif 000094
【手続補正書】
【提出日】平成13年8月4日(2001.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション反応によって形成される、４つの核酸分子からなる複合体であって、前記複合体は標的核酸分子ならびに第１、第２および第３核酸プローブ分子からなり、前記第１プローブは、標的の第１部分に相補的であってその部分にハイブリダイズされるフット領域と、標的には実質的に非相補的であるアーム領域とを含み、前記第２プローブは標的の第２部分に相補的なフット領域を含み、第２プローブのフット領域は第１プローブのフット領域に隣接してまたは実質的に隣接して標的にハイブリダイズされるようになっており、また上記第２プローブは、標的には実質的に非相補的であるが、第１プローブのアーム領域には相補的であって第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるアーム領域も含み、上記第３プローブは、第１プローブのアーム領域の一部分に少なくとも部分的に相補的であって、第３プローブは第２プローブに隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブのアーム領域にハイブリダイズされるようになっており、そして上記複合体の形成により、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが生成する複合体。
【請求項２】
第１、第２または第３プローブの少なくとも一つがＰＮＡおよび／またはＬＮＡを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
第１および／または第２プローブがＰＮＡおよび／またはＬＮＡを含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
機能的二本鎖Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
プロモーターの活性を増大させる一本鎖または二本鎖配列をプロモーターに隣接して含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記プローブの一つが＋１２配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
第１プローブが＋１２配列を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項８】
ＲＮＡに転写された時に転写物の単離、同定、検出、定量または増幅を容易にする配列を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記プローブの一つが不安定化部分を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
第２および第３プローブがＲＮＡポリメラーゼプロモーター鋳型鎖の不連続な配列を形成する、上記請求項のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
第２および第３プローブがＲＮＡポリメラーゼプロモーターの非鋳型鎖の不連続な配列を形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
試料中の標的核酸分子の存在を検出する方法であって、標的を含む試料を、標的のそれぞれ第１および第２部分（この第１部分と第２部分とは隣接しているか、または実質的に隣接している）に相補的なフット領域を含む第１および第２核酸プローブと接触させる工程（ここに、第１および第２プローブはそれぞれ、標的とは実質的に非相補的であるアーム領域をさらに含み、第１プローブのアーム領域の少なくとも一部分は、第２プローブのアーム領域の少なくとも一部分に相補的であって、第１および第２プローブの各フット領域が標的にハイブリダイズすると、第１および第２プローブのアーム領域の相補部分のハイブリダイゼーションが可能になるようになっている）、第１プローブのアーム領域の一部分に相補的な第３核酸プローブ分子を、第３プローブが第２プローブのアーム領域に隣接してまたは実質的に隣接して第１プローブにハイブリダイズするように存在させ、よって、第１プローブが一方の鎖を提供し第２プローブと第３プローブとが共同して他方の鎖を提供してなる機能的二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを生成させる工程、前記ＲＮＡプロモーターからＲＮＡを合成させる工程、およびそのように合成されたＲＮＡを直接的または間接的に検出する工程を含む方法。
【請求項１３】
当該方法の実施によって請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体の形成が起こる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
機能的ＲＮＡプロモーターから生成したＲＮＡを検出に先立って増幅させる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
機能的ＲＮＡプロモーターから生成したＲＮＡを、分子ビーコンまたは蛍光体の使用を伴う方法によって直接的または間接的に検出する、請求項１２、１３または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の第１プローブおよび第３プローブ分子を含む、請求項１２の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
請求項１に記載の第２プローブおよび第３プローブ分子を含む、請求項１２の方法を実施するためのキット。
【請求項１８】
請求項１に記載の第１、第２および第３プローブ分子を含む、請求項１２の方法を実施するためのキット。
【国際調査報告】
2004507203.tif 000095
2004507203.tif 000096
2004507203.tif 000097