(57)【要約】植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定するための方法を提供する。該方法は、（ａ）基材に植物処置剤を適用すること、（ｂ）疾患生物体を基材に接種し、そして光発生部分からの光子放射を検出することを包含する。該方法はまた、（１ｃ）疾患生物体が増殖する期間後に、疾患生物体または基材によって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用すること、（１ｄ）光発生部分由来の光子放射を（例えば、基材の領域上で）検出すること、ならびに（１ｅ）検出された光子放射の量および／または光子放射が検出される基材領域の画分に基づいて、植物処置剤の有効性を決定することを包含する。
2004506879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物処置剤を植物疾患生物体の増殖に適切な基材に適用すること；
（ｂ）疾患生物体を基材に接種すること、ならびに以下の工程、
（Ａ１ｃ）生物体が増殖し得る期間後に、疾患生物体によって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用すること；
（Ａ１ｄ）工程（Ａ１ｃ）において光発生部分から生じた光子放射を検出すること；および
（Ａ１ｅ）工程（Ａ１ｄ）において検出された光子放射の量に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること；あるいは（Ｂ）基材が植物基材である場合、
（Ｂ１ｃ）疾患が植物基材に出現し得る期間後に、疾患生物体または植物基材によって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用すること；
（Ｂ１ｄ）植物基材の領域上で工程（Ｂ１ｃ）において光発生部分から生じた光子放射を検出すること；および
（Ｂ１ｅ）工程（Ｂ１ｄ）において光子放射が検出される植物基材領域の画分に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること；あるいは（Ｃ）疾患生物体が基材には存在しない内因性の光発生部分を有する場合、
（Ｃ２ｃ）生物体が増殖し得る期間後に、光発生部分からの光子放射を検出すること；および
（Ｃ２ｄ）工程（Ｃ２ｃ）において検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること；あるいは（Ｄ）基材が、疾患生物体には存在しない内因性の光発生部分を有する植物基材である場合、
（Ｄ２ｃ）疾患が植物基材に出現し得る期間後に、光発生部分からの光子放射を検出すること；および
（Ｄ２ｄ）工程（Ｄ２ｃ）において検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、
のいずれか１つを含んで成ることを特徴とする、植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項２】
（ａ）植物処置剤を植物疾患生物体の増殖に適切な基材に適用すること；
（ｂ）疾患生物体を基材に接種すること；
（１ｃ）生物体が増殖し得る期間後に、疾患生物体によって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用すること；
（１ｄ）光発生部分由来の光子放射を検出すること；および
（１ｅ）検出された光子放射の量に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、
を含んで成る、請求項１に記載の植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項３】
疾患生物体は真菌病原体であり；かつ植物処置剤で処置された接種された非植物増殖培地を有する容器由来の光子放射の全量が少なくとも１つの非処理のコントロール、少なくとも１つの標準および少なくとも１つのブランク由来の全光子放射と比較される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）植物処置剤を植物基材に適用すること；
（ｂ）疾患生物体を植物基材に接種すること；
（１ｃ）疾患が植物基材に出現し得る期間後に、疾患生物体または植物基材によって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用すること；
（１ｄ）植物基材の領域上で光発生部分由来の光子放射を検出すること；および
（１ｅ）光子放射が検出される植物基材領域の画分に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、
を含んで成る、請求項１に記載の植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項５】
疾患生物体は真菌病原体であり；かつ前光発生部分は真菌病原体によって選択的に蛍光発生部分に変換される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記前光発生部分はフルオレセイン二酢酸であり、かつ前記植物基材上に噴霧される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記前光発生部分は前記植物によって選択的に変換される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）植物処置剤を植物疾患生物体の増殖に適切な基材に適用すること；
（ｂ）基材には存在しない内因性の光発生部分を有する疾患生物体を基材に接種すること；
（２ｃ）生物体が増殖し得る期間後に、光発生部分由来の光子放射を検出すること；および
（２ｄ）検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、を含んで成る、請求項１に記載の植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項９】
疾患生物体は真菌病原体であり；かつ植物処置剤で処置された接種された非植物増殖培地を有する容器由来の光子放射の全量が少なくとも１つの非処理のコントロール、少なくとも１つの標準および少なくとも１つのブランク由来の全光子放射と比較される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患生物体は、内因性の蛍光発生部分を有する真菌病原体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）植物処置剤を植物基材に適用すること；
（ｂ）植物基材には存在しない内因性の光発生部分を有する疾患生物体を該植物基材に接種すること；
（２ｃ）疾患が植物基材に出現し得る期間後に、光発生部分由来の光子放射を検出すること；および
（２ｄ）検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、を含んで成る、請求項１に記載の植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項１２】
前記疾患生物体は内因性の蛍光発生部分を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）疾患生物体には存在しない内因性の光発生部分を有する植物基材に植物処置剤を適用し；
（ｂ）疾患生物体を基材に接種すること；
（２ｃ）疾患が植物基材に出現し得る期間後に、光発生部分由来の光子放射を検出すること；および
（２ｄ）検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定すること、を含んで成る、請求項１に記載の植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定する方法。
【請求項１４】
前記植物基材は内因性の生物発光発生部分を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物基材は内因性の蛍光発生部分を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物処置剤の有効性は、光子放射の量を測定することによって決定される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物処置剤の有効性は、光子放射が検出される基材領域の画分を測定することによって決定される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
疾患の予防における前記植物処置剤の有効性を決定するために、接種（ｂ）の前に、前記植物処置剤が前記基材に適用される（ａ）、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
疾患の治療における前記植物処置剤の有効性を決定するために、前記植物処置剤の前記基材への適用（ａ）の前に、前記基材が接種される（ｂ）、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記植物疾患生物体の制御における前記植物処置剤の有効性を決定すること、
を含んで成る、植物疾患生物体によって生じる植物疾患の制御に適切であり、かつ植物処置剤を含む、作物保護剤の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法を使用して、植物処置剤が前記植物疾患生物体の制御に有効であることを決定すること；および
保護しようとする植物もしくはその部分、または保護しようとする植物の種苗に有効量の前記植物処置剤を適用すること、
を含んで成る、植物疾患生物体によって生じる植物疾患を制御するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
植物病原体によって生じる植物疾患の制御は、収量または質について、高い収穫効率を達成するのに極めて重要である。植物疾患による観賞、野菜、田畑、穀類、および果実作物への損害は、消費者の経済的負担を増大させる。これらの目的のために多くの製品が市販されているが、より効果的であるか、より経済的負担が低いか、より環境に安全であるかまたは異なる作用様式を有する新規の植物処理剤が引き続き求められている。
【０００２】
植物病原体の制御に作物保護化学物質の同定は、疾患の評価およびその制御に依存し、日常的に感染した植物組織の領域の目視評価に基づく。場合によって、化合物は、予防および／または治療活性のいずれかについて評価される。疾患生物に感染する前に試験化合物が適用される場合、予防活性が評価され、そして疾患生物体に感染した後に試験化合物が適用される場合、治療活性が評価される。植物疾患の予防制御をアッセイするための代表的方法については、米国特許第５，７４７，４９７号、試験Ａ〜Ｅを参照のこと。植物疾患の治療制御をアッセイするための代表的方法については、米国特許第３，９５４，９９２号、実施例３、４および９を参照のこと。疾患の目視評価は、疾患が占める植物領域について見積もられた百分率などの量的数値または数によるクラス標示を量的評価（例えば、軽症または重度）に割り当てることに依存する。正確な評価および観察時の偏りがこの種類の評価に影響しないことを確実にするためには、個々の疾患について広範な訓練が必要である。迅速化学評価技術（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）によりサンプル数が増加すると、観察時の偏りおよび採点時の主観的なずれにより評価の正確度が減少する可能性がある。
【０００３】
植物病因学におけるデジタル画像分析は、フィールドレベルでの作物疾患の早期症状の決定に関連している（ブラズクエズ（Ｂｌａｚｑｕｅｚ，　Ｃ．Ｈ．）１９９０，　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓ．　７４：　５８９−５９２；エベリットら（Ｅｖｅｒｉｔｔ，　Ｊ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９９，　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓ．　８３：　５０２−５０５）。コンピュータに基づく画像技術の進歩により、個々の植物または葉に関する疾患の評価のための画像分析が開発および応用されている。画像分析の植物疾患の評価への応用のほとんどは、電磁放射のスペクトルの可視または赤外領域のいずれかにおいて植物の非感染領域と感染領域との間における反射光の固有の色の差異を検出することに依存している。そのような方法は、感染によって生じる色の微細な差異を区別する能力によって制限され、検出および評価に十分な広範な疾患症候学の開発を必要とする。最近、生物発光または蛍光によって発生した光の非侵襲的検出に依存するアプローチが、植物宿主−病原体相互作用の部分である細胞生物学レベルの事象に関する顕微鏡的研究（ダンら（Ｄａｎｅ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９４，　Ｈｏｒｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９：　１０３７−１０３８；スペリングら（Ｓｐｅｌｌｉｇ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９６，　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２５２：　５０３−５０９；ダンカンら（Ｄｕｎｃａｎ，　Ｋ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９７，　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　８７：　Ｓ２６）および土壌中における真菌類のバイオマスの決定（モリスら（Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｓ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．）１９９６，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｏｉｌ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　６：　１６１−１６７）に使用されている。米国特許第５，６５０，１３５号は、動物内の哺乳動物病原体を検出ための光放射複合体の非侵襲的なマクロ規模の画像の使用について開示している。
【０００４】
従って、客観的画像方法論による植物処置剤による植物疾患の高感度かつ高信頼性の検出および測定ならびに植物疾患の制御のための手段が求められる。さらに、理想的な画像方法論は色の区別には依存せず、むしろ電磁放射の差分生成およびそれ以降の光放射の検出に依存する。本発明の方法は、植物処置剤の有効性を評価することを目的する植物疾患を検出し、局在化しそしてその程度を測定するための客観的、高感度かつ非侵襲的アプローチを提供する。
【０００５】
（発明の概要）
植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定するための方法を提供する。さらに開示されているように、該方法は、光発生部分由来の光子放射を検出することを包含する。該方法は、（ａ）植物処置剤を基材に適用すること、（ｂ）疾患生物体を該基材に接種し、そして光発生部分由来の光子放射を検出することを包含する。（ａ）および（ｂ）は、いずれの順序で達成されてもよいことに留意する。一般に、（ｂ）の前に（ａ）が達成される場合、疾患の予防における植物処置剤の有効性が評価され、（ａ）の前に（ｂ）が達成される場合、疾患の治療における植物処置剤の有効性が評価される。
【０００６】
１つの実施態様（実施態様Ｉ）において、該方法は、（１ｃ）該生物体が増殖し得る期間後に、該疾患生物体または該基材によって選択的に光発生部分（「ＬＧＭ」）に変換される前光発生部分（「ＰＬＧＭ」）を適用すること、（１ｄ）該光発生部分由来の光子放射を（例えば、基材の領域上で）検出すること、ならびに（１ｅ）検出された光子放射の量および／または光子放射が検出される基材領域の画分に基づいて、植物処置剤の有効性を決定することをさらに包含する。基材は植物基材であり、そして前光発生部分は、疾患が植物基材に出現し得る期間後に適用される方法に留意すべきである。
【０００７】
もう１つの実施態様（実施態様ＩＩ）において、該方法は、（２ｃ）該疾患が増殖し得る期間後に、内因性の光発生部分由来の光子放射を検出すること、および（２ｄ）検出された光子放射に基づいて植物処置剤の有効性を決定することをさらに含む。本方法は、疾患生物体には存在しない内因性の光発生部分を有する基材および／または基材には存在しない内因性の光発生部分を有する疾患生物体を特徴とする。基材は植物基材であり、期間は疾患が植物基材に出現し得る期間である方法に留意すべきである。
【０００８】
本発明は、植物疾患生物体によって生じる植物疾患を制御するのに適した作物保護剤を生産する方法をさらに提供し、そして植物処置剤を含んで成る。本方法は、上記のように、植物疾患生物体の制御における植物処置剤の有効性を決定することを含んで成る。
【０００９】
本発明はまた、植物疾患生物体（例えば、真菌性植物病原体）によって生じる植物疾患を制御する方法を提供する。本方法は、上記のように、植物処置剤が植物疾患生物体の制御に有効であることを決定すること；および保護しようとする植物もしくはその部分、または保護しようとする植物の種苗に有効量の前記植物処置剤を適用することを含んで成る。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、植物処置剤の有効性を評価することを目的とする基材における植物疾患生物体の増殖の程度を検出するために使用することができる方法に関する。該方法は、光発生部分由来の光子放射を検出することを包含する。本発明の実施態様ＩおよびＩＩは、両方とも植物処置剤の基材への適用および疾患生物体による該基材への接種を包含する。疾患生物体が増殖し得る期間後に、疾患生物体もしくは基材のいずれかによって選択的に光発生部分に変換される前光発生部分を適用し、そしてその後に得られる光を検出する（実施態様Ｉ）か、または疾患生物体もしくは基材のいずれかにおいて特異に存在する内因性の光発生部分から光を検出してもよい（実施態様ＩＩ）。植物処置剤は既知の薬剤（多くの目的について評価することができる）であってもまたは基材が接種される植物疾患生物体に有効な制御剤としてこれまで知られていない基材であってもよい（以下のセクションＩを参照のこと）。基材は植物（または葉などの植物の一部）であってもまたは接種される植物疾患生物体の増殖を支持するために適応される非植物媒体であってもよい（以下のセクションＩＩを参照のこと）。一般に、植物病原体が本発明の方法で使用されえる場合、該方法は、真菌病原体の制御における植物処置剤の有効性を決定するのに特に適切であると考えられる（以下のセクションＩＩＩを参照のこと）。本発明において使用される適切なＰＬＧＭは選択的にＬＧＭに変換され、例えば、蛍光性フルオロセイン分子に変換されるフルオロセイン二酢酸などの化合物を含む。真菌病原体によって選択的に蛍光ＬＧＭ（特に植物基材と共に使用される）に転換されるＰＬＧＭに留意すべきである。また、植物基材によって選択的に変換されるＰＬＧＭに留意すべきである。また、内因性のＬＧＭを有する疾患生物体または基材を使用してもよい。内因性のＬＧＭは、天然に存在しても（例えば、クロロフィル）あるいは（例えば、遺伝子の形質転換によって）疾患生物体および／または生体基材に導入してもよい（以下のセクションＩＶを参照のこと）。内因性の蛍光ＬＧＭを有する真菌病原体に留意すべきである。また、内因性の生物発光ＬＧＭを有する植物基材に留意すべきである。
【００１１】
ＬＧＭによって生じる光（即ち、光子放射）は、植物処置剤の有効性を決定するために本発明に従って使用される。本発明を実施するための多くの様式において光子検出器を使用することができる。光子検出デバイスは、好ましくは、光子発生部分由来の光子放射を検出するためにされ、そして、植物処置剤の有効性は、そのようなデバイスによって検出される光子放射に基づいて決定することができる（セクションＶを参照のこと）。画像および光子放射分析のさまざまな手段を用いて、植物処置剤の有効性を決定してもよい（セクションＶＩを参照のこと）。植物処置剤の有効性を決定するための１つの手段は、光子放射の量を測定することである。例えば、ＰＬＧＭが疾患生物体によって選択的にＬＧＭに転換される場合または疾患生物体が基材には存在しない内因性のＬＧＭを有する場合、植物処置剤で処置された接種された基材（例えば、植物疾患生物体を接種された非植物増殖培地または植物疾患生物体を接種された標準植物基材）由来の光子放射の全量と（ｉ）植物処置剤で処置していない等価な接種された基材（即ち、非処置コントロール）、（ｉｉ）疾患生物体の制御における有効性が公知である既知の植物処置剤で処置された等価な接種された基材（即ち、標準）および／または（ｉｉｉ）等価な非接種基材（即ち、ブランク）由来の光子放射の全量とを比較することができる。好ましくは、少なくとも１つのコントロール、少なくとも１つの標準および少なくとも１つのブランクとの比較を使用する。同様に、植物基材が植物疾患生物体には存在しない内因性のＬＧＭを有する場合、光子放射の全量を使用して、植物処置剤の有効性を示すことができ、但し、放射した光は植物疾患生物体に罹患していない植物の部分を示す。植物処置剤の有効性を決定するためのもう１つの手段は、光子放射が検出される基材領域の画分を測定することである。例えば、ＰＬＧＭが疾患生物体によって選択的にＬＧＭに変換される場合または疾患生物体が基材には存在しない内因性のＬＧＭを有する場合、光子が前記ＬＧＭから放射される全領域と植物処置剤で処置した接種された基材とを比較して、疾患生物体に罹患した画分領域を決定することができる。好ましくは、この結果は、（ｉ）植物処置剤で処置していない等価な接種された基材（即ち、非処置コントロール）、（ｉｉ）疾患生物体の制御における有効性が公知である既知の植物処置剤で処置された等価な接種された基材（即ち、標準）および／または（ｉｉｉ）等価な非接種基材（即ち、ブランク）から得られる疾患生物体に罹患した画分領域と比較される。同様に、植物基材が植物疾患生物体には存在しない内因性のＬＧＭを有する場合、光子放射の画分領域を使用して、植物処置剤の有効性を示すことができ、但し、放射した光は植物疾患生物体に罹患していない植物の部分を示す。
【００１２】
好ましくはコントロールサンプルと比較しておよび／または既知の有効な化学標準物質で処置したサンプルと比較して、植物処置剤が実験サンプルにおいて疾患の増殖を有意に阻害することが可能である場合、植物処置剤は有効であると同定される。疾患生物体の増殖は、基材内または基材上における疾患生物体の画分領域および／もしくは分布、または損傷を受けていない植物基材に対する感染プロセスから生じた損傷を受けた植物基材の画分領域として、あるいは疾患生物体の蓄積量として、アプリケーションに依存して、さらに規定される。
【００１３】
従って、光発生部分および光子検出デバイスの使用により、該方法を使用して、植物疾患の制御における処置剤の有効性を評価する目的の手段が提供される。さらに、光子検出デバイスを使用することにより、しばしば疾患の検出が増強され、従って、植物処置剤の有効性をより高感度かつ、場合によってはより簡便に決定する手段が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の方法は、非侵襲的な画像アプローチと接続して使用してもよい。これにより、使用者は、選択された間隔で画像工程を反復し、そしてそれらの間隔のそれぞれに対応する画像を構築することによって、疾患生物体の程度および局在を追跡することが可能である。該方法のこの態様は、治療アプリケーションにおける植物処置剤の有効性を決定するのに特に有用である。疾患状態の植物材料のコンピュータに基づくデジタル画像分析は、目的の定量評価を作製することができる。それにもかかわらず、本発明は、必ずしも画像の形態で被験体を局在化する必要なく疾患生物体のレベルを検出するために使用することができる。このことは、例えば、基材の領域が均質である場合の植物処置剤の有効性の評価に有用であり得る。
【００１５】
植物処置剤の有効性を検出するための本発明の方法は、有効な植物処置剤（セクションＶＩＩを参照）およびそれらの使用（セクションＶＩＩＩを参照）を含有する植物疾患を制御するための作物保護剤の製造に重要な工程として組み入れられ得る。
【００１６】
Ｉ．植物処置剤
植物処置剤は、植物疾患（例えば、殺菌剤、抗微生物および抗ウイルス剤、および／または系統性後天的疾患耐性の誘導剤）の制御において有効な作物保護剤の有効成分として作物学的有用性について試験される物質であり、化学化合物または化学化合物の混合物（例えば、物理的混合プロセスまたは化学合成プロセスの混合、醗酵ブロス、または生物学的もしくは非生物学的起源からの抽出調製）であってもよい。殺菌剤であることが既知である化合物としては、アシベンゾラルＳ−メチル、アゾキシストロビン、ベノミル、ブラストサイジンＳ、ボルドー液（三塩基性硫酸銅）、ブロムコナゾール、カルプロパミド、カプタホール、キャプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロタロニル、オキシ塩化銅、銅塩、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、（Ｓ）−３，５−ジクロロ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）−４−メチルベンズアミド（ＲＨ７２８１）、ジクロシメット（Ｓ−２９００）、ジクロメジン、ジクロラン、ジフェノコナゾール、フェナミドン（ＲＰ４０７２１３）、ジメトモルフ、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ドジン、エディフェンホス、エポキシコナゾール、ファモキサゾン、フェナリモル、フェンブコナゾール、イプロバリカルブ、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸トリフェニルスズ、水酸化トリフェニルスズ、フルアジナム、フルジオキソニル、フルメトベル（ｆｌｕｍｅｔｏｖｅｒ）（ＲＰＡ４０３３９７）、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトラニル、フルトリアフォル、ホルペット、ホセチル−アルミニウム、フララキシル、フラメタピル（ｆｕｒａｍｅｔａｐｙｒ）（Ｓ−８２６５８）、ヘキサコナゾール、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イソプロチオラン、カスガマイシン、クレソキシムメチル、マンコセブ、マネブ、メフェノキサム（ｍｅｆｅｎｏｘａｍ）、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ネオアソジン（ｎｅｏ−ａｓｏｚｉｎ）（メタンアルソン酸鉄）、オキサジキシル、ペンコナゾール、ペンシクロン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロパモカルブ、プロピコナゾール、ピリフェノックス、ピルクロストロビン（ｐｙｒｃｌｏｓｔｒｏｂｉｎ）、ピリメタニル、ピロキロン、キノキシフェン、スピロキサミン、イオウ、テブコナゾール、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファネート−メチル、チラム、トリアジメホン、トリアジメノール、トリシクラゾール、トリチコナゾール、バリダマイシンおよびビンクロゾリンが挙げられる。評価しようとする物質はまた、標的疾患生物体を潜在的に攻撃することが可能である生物体（例えば、ウイルス、細菌、真菌）であってもよい。例えば、本発明の方法を使用して、既知のアプリケーション中の上記で開示した植物処置剤などの公知の植物処置剤の有効性を確認するため、または新規のアプリケーションについてそれらの有効性を評価してもよい。しかし、本発明の方法は、真菌の制御に有効であることがこれまで知られていない薬剤の有効性を決定するのに特に有用である。該アッセイにおいて、評価する植物処置剤は、従来の噴霧技術、浸漬または滴注方法を使用して、植物の葉処理として適用してもよい。１つの好適な葉適用方法は、マイクログラム量の植物処置剤の効率的な適用のために特別に設計された噴霧装置の使用による（米国特許出願第６０／１７２９２８号、およびその対応欧州特許出願公開ＥＰ１１１０６１７（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。あるいは、植物処置剤は、系統的処置として増殖培地に直接適用してもよく、続いて、その後に植物に取り込まれ、疾患生物体に提示される。既知の植物処置剤は、有効性の相対的測定を提供するための新規の薬剤の評価に伴うコントロールとして使用してもよい。
【００１７】
ＩＩ．基材
基材は、植物生物体の増殖に適切な任意の材料であってもよい。例示的な基材は、植物基材（即ち、草、広葉植物、木本植物および樹木、作物学的作物種、ならびに雑草種およびそのような植物の部分）を含む。標準化された植物基材、即ち、異なる処置に対する異なる応答が処置における差異に帰することができるような種、サイズ、齢および／または発達段階などの因子について均一である植物基材に留意すべきである。植物基材を使用する本発明の好適な方法は、アラビドプシス　タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、オオムギ、キュウリ、ブドウ、カゼクサ、トウモロコシ、ポテト、イネ、カボチャ、トマト、またはコムギの品種を使用する方法を含む。基材はまた、液体、固体または疾患生物体の代謝を支持するのに十分な他の固体増殖培地であってもよい。典型的に、基材は、容器内または支持体上において保持される。例としては、植物の園芸学的保護のために使用される容器、試験管、ジャー、マイクロタイタープレートのウェル、またはガラスもしくはプラスチックなどの平板支持体が挙げられる。容器はまた、岩綿、もしくは他の不活な支持体材料を含有または支持してもよい。
【００１８】
ＩＩＩ．疾患生物体
疾患生物体は植物病原体として規定される。植物病原体は、植物において疾患を生じる真菌、細菌またはウイルス因子を含むことができる。本発明の好適な方法は、疾患病原体が真菌病原体である方法を含む。真菌病原体の例としては、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、モニリニア（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ）、プラスモポーラ（Ｐｌａｓｍｏｐｏｒａ）、シュードセルコスポーラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、プクキニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）、リンコスポラム（Ｒｈｙｎｃｏｓｐｏｒｕｍ）、およびスレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）種、ならびにエリシフェ　チコラセアルム（Ｅｒｙｓｉｐｈａｅ　ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）、エリシフェ　グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈａｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）、マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）、フィトフトラ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ピリキュラリア・オリザエ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏｒｙｚａｅ）、セプトリア　トリティサイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｔｒｉｔｉｃｉｉ）、およびスタゴノスポラ　ノドラム（Ｓｔａｇｎｏｓｐｏｒａ　ｎｏｄｏｒｕｍ）の株が挙げられる。
【００１９】
ＩＶ．前および光発生部分
前光発生部分（ＰＬＧＭ）は、植物基材もしくは疾患生物体のいずれかの作用によって代謝されるかまたは選択的に変換されて光発生部分（ＬＧＭ）を生成する実体である。例えば、ＰＬＧＭが疾患生物体によって選択的に変換される場合、発生した光は疾患生物体の存在を示す。光生成部分は、典型的に、スペクトルの紫外（ＵＶ）、可視および／または赤外（ＩＲ）部分において光を放射する分子あるいは巨大分子である。本明細書では、光は、約３００ｎｍ〜約１１００ｎｍの波長を有する電磁放射と規定する。
【００２０】
本発明の実施において有用なＰＬＧＭおよびＬＧＭは、アプリケーションおよび特定の疾患／基材の組み合わせに依存してさまざまな形態を取ることができる。ＬＧＭは、放射吸収（例えば、蛍光もしくは燐光分子）の結果、または化学反応（例えば、触媒作用の結果としての生物発光、および化学発光を生成するタンパク質）の結果として光を発生することができる。
【００２１】
蛍光に基づくＰＬＧＭおよびＬＧＭ
蛍光は、電子遷移を誘導するのに適切な波長の光を有する物資の励起によって誘発される一電子励起状態にある物質から放射された発光である。励起した電子は最も低い励起状態に緩和して、蛍光量子を放射して基底状態に戻る前に副産物として熱を発生するため、放射された光の波長は励起光の波長よりも長い（ストークスシフト）。
【００２２】
本発明における蛍光の使用は、光入力部が発光を生じる必要があるために複雑になっている。蛍光標的を励起するために使用される光は、意図された標的以外の物質の蛍光を生じ得る。これは、画像処理されるサンプルが生物学的生物体の化学的環境と同程度に複雑である場合に特にそうである。蛍光放射の特異性は、サンプルに衝突する励起光のスペクトル範囲に制限する光学的フィルターを使用することによって達成される。適切に選択された励起フィルターは、蛍光ＬＧＭから放射される光子に類似の波長を有する光子およびサンプル中に存在し得る他の従属的ＬＧＭの大部分を遮断する。励起波長付近であるが放射波長付近ではない高い強度の光を発生するレーザーを使用して、共焦点画像アプリケーションなどにおいて特異的にＬＧＭを励起させることができる。さらに、サンプルの励起は、より長い波長の光の２つの光子（従って、それぞれの光子はより低いエネルギーを有する）によるレーザー励起によって共焦点画像において達成させてもよい。２光子励起として公知である本方法により、しばしば蛍光団の高エネルギーレーザー励起を伴う光退色の量が減少する。
【００２３】
さらに、光子検出デバイスのスペクトルの感度は、検出器に到達する光のスペクトル範囲を蛍光ＬＧＭの光子の放射波長に一致する光子に制限する検出器窓の前方に光学的フィルターを追加することによって調節することができる。ＬＧＭを励起するために使用される光の波長にまで感度を減少した検出器を選択してもよい。さらなる追加事項として、サンプルを収容するのに適した画像チャンバ、励起光および光検出器（例えば、カメラ）を使用して、さらなる照射源（例えば、室内光）が集積期間中にサンプルおよび／または光検出器に照射されることを防止してもよい（これらの素子を含んで成るマクロ画像システムに関する図１を参照のこと）。
【００２４】
例示的蛍光発生部分は、抗体もしくは他のタンパク質、ポリマーまたは炭水化物との非複合形態および／または複合形態のいずれかにおいて使用されるフルオレセインなどの小さな蛍光分子；ならびに海洋性腔腸動物由来などの蛍光タンパク質（ＦＰ’ｓ）（例えば、緑色蛍光タンパク質）である。ＰＬＧＭフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）、およびＬＧＭ　ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰは本発明について特に留意すべきである。
【００２５】
フルオレセインの二酢酸誘導体は、生体細胞の研究に有用な化合物である。ＦＤＡ自体は非蛍光性であるが、生体細胞に取り込まれる際に、ＦＤＡはＬＧＭフルオレセインに変換される。フルオレセインは約４７５ｎｍで最大に光を吸収し、そして約５１７ｎｍでの最大放射により緑色領域のスペクトルで放射する。
【００２６】
ＦＰ’ｓ（他で述べない限り）は腔腸動物由来の蛍光タンパク質と規定する。ＦＰ’ｓは、ＧＦＰ、海洋性クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質を含み、蛍光色のシフトおよび蛍光の増強された量子収率の増加した励起係数などの光学的特性の変更伴う操作された変異体、溶液中の溶解度の変更などのタンパク質特性の変更を伴う操作された変異体を含む。ＦＰ’ｓはまた、関連する海洋性腔腸動物（例えば、マメスナギンチャク種（Ｚｏａｎｔｈｕｓ　ｓｐ．）またはディスコソマ　ストリアタ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ　ｓｔｒｉａｔａ））およびそれらの操作された亜変異体から単離されたＡｍシアン、Ｚｓグリーン、Ｚｓイエロー、Ｄｓレッド、およびＡｓレッド蛍光タンパク質（ＦＰ）などの他の天然供給源から単離された蛍光タンパク質変異体を含む。ここで規定されるＦＰ’ｓは、天然に存在する他の傾向タンパク質とは異なる。何故なら、ＦＰの蛍光は、完全にタンパク質内のアミノ酸間の内部相互作用によるからである。該ＦＰ’ｓは、クロロフィル結合タンパク質などの蛍光色素タンパク質に必要な他の補欠分子族または補因子を必要としない。
【００２７】
アエクオリア　ヴイクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）は明るい蛍光性であり、クラゲの傘の縁部周囲の発光点として光を出現させる。光は、それぞれが約６，０００〜７，０００個の光発生細胞から成る黄色の組織塊から生じる。これらの細胞の細胞質は、単位膜で囲まれた直径約０．２μｍの細密な顆粒に稠密に充填され、生物発光に必要な成分を含有する。成分は、青緑色光を放射するＣａ２＋活性化発光タンパク質、エクオリン、およびエクオリンからエネルギーを受け取って、緑色光として該エネルギーを放射する補助緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。ＧＦＰタンパク質は、約８０％の量子効率で強度の蛍光性である。ＧＦＰは約３９５ｎｍで最大に光を吸収し、４７０ｎｍでより小さな吸収ピーク、および約５０９ｎｍで蛍光放射ピークを有し、約５４０ｎｍでショルダーを伴う。これらの光学的特性のため、ＧＦＰはアルゴンレーザー励起型共焦点顕微鏡および共通フルオレセインフィルターを具備するエピ蛍光顕微鏡での使用に適切である。タンパク質の蛍光は、タンパク質内の残基Ｓｅｒ−デヒドロＴｙｒ−Ｇｌｙの環化によって翻訳後に形成される独特な共有結合した発色団による。緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子はクローン化されており（シャルフィーら（Ｃｈａｌｆｉｅ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．）１９９４，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：　８０２−８０５）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、土壌線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、哺乳動物および植物を含む広範な異種生物体において首尾よく発現されている（シャルフィーら（Ｃｈａｌｆｉｅ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．）１９９４，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：　８０２−８０５；ワング（Ｗａｎｇ）およびヘーゼルリッグ（Ｈａｚｅｌｒｉｇｇ）１９９４，　Ｎａｔｕｒｅ　３６９：　４００−４０３；ヘーゼロフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）およびアモス（Ａｍｏｓ）１９９５，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　１１：　３２８−３２９；キュービットら（Ｃｕｂｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９９５，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ　２０：　４４８−４５５；バウルコーブら（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ　ｅｔ　ａｌ．）１９９５，　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　７：　１０４５−１０５３；シーンら（Ｓｈｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９９５，　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　８：　７７７−７８４）。ＦＰのＡｍシアン、Ｚｓグリーン、Ｚｓイエロー、およびＡｓレッドの遺伝子は、Ａ．ヴイクトリア（Ａ．　ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰに相同性を有する変性プライマーを使用して、非生物発光性岩礁サンゴからクローニングされている（マッツら（Ｍａｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）１９９９，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：　９６９−９７３）。これらのＦＰ’ｓは、多くのアエクオリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ）種の明るい蛍光色に寄与して、強度の太陽照射から保護し、深層水に住む種では、藻類の内部共生体によって、主に青色を光合成にさらに適切であるより長い波長に変換するのを援助することが提唱さ���ている。
【００２８】
生物発光に基づくＬＧＭ
生物発光分子は、光を生成するための照射の入力を必要としない蛍光分子とは区別される。むしろ、生物発光分子は、光を生成するためにＡＴＰなどの化学エネルギーを利用する。生物発光ＬＧＭの利点は、蛍光ＬＧＭと比較して、励起光の非存在下では、疾患生物体においてもまたは基材においてもバックグランドとなる光シグナルが事実上存在しないことである。検出される光シグナルのみが生物発光ＬＧＭによって生成される光シグナルである。
【００２９】
注目すべき生物発光タンパク質はルシフェラーゼである。ここで規定されるルシフェラーゼは、原核生物および真核生物のルシフェラーゼ、ならびに色がシフトした発光を伴うルシフェラーゼなどの光学的特性の改変または変更を有する変異体を含む。原核生物のルシフェラーゼおよび原核生物のルシフェラーゼ（ｌｕｘ）系に関与する他の酵素ならびにそれらの対応する遺伝子は、ビブリオおよびフォトバクテリウム属の海洋性細菌ならびに陸生微生物フォトルハブダス　ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）からクローン化されている。フォトルハブダス　ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンの発現は、３７℃で至適活性であり、４７℃まで耐熱性である細菌ルシフェラーゼ酵素の合成に関する遺伝子（ｌｕｘＡＢ）および原核生物ルシフェラーゼのアルデヒド基材の合成に関する遺伝子（ｌｕｘＣＤＥ）を提供する。酸素は、原核生物ｌｕｘ系を使用する生物発光の唯一の外的要件である。
【００３０】
ルシフェラーゼ系（ｌｕｘ）を含有する例示的な真核生物体は、北アメリカホタルフォチヌス　ピラリス（Ｐｈｏｔｉｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）である。ホタルルシフェラーゼについては広範に研究されており、長い間ＡＴＰアッセイに使用されている。ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｘ）のｃＤＮＡはホタル、フォチヌス　ピラリス（Ｐｈｏｔｉｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）からクローン化されており（デウェットら（ＤｅＷｅｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９８５，　ＰＮＡＳ　８２：　７８７０−７８７３）、より最近では、細菌、植物および動物細胞を含む広い範囲の生物学的系において発現されている（デウェットら（ＤｅＷｅｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９８７：　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　７：　７２５−７３７；デウェットら（ＤｅＷｅｔ　ｅｔ　ａｌ．）１９８５，　ＰＮＡＳ　８２：　７８７０−７８７３；オウら（Ｏｗ　ｅｔ　ａｌ．）１９８６，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：　８５６−８５９）。ホタルルシフェラーゼ由来の光は緑〜黄の色（５５０〜５８０ｎｍ）の範囲である。関連する発光コメツキムシ（ピロフォラス　プラジオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ　ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ））から放射される生物発光の光の範囲は、青緑色〜橙色（５３０〜５９０ｎｍ）の範囲のほたるから放射される光の範囲よりも大きい。発光コメツキムシの生物発光の光をになう遺伝子のｃＤＮＡもクローン化されている。ある範囲のスペクトル放射を有するルシフェラーゼ系が利用可能であると、以下に記載のように、本発明の用途に合わせたアプリケーションに最適化された色の変異体を選択することが可能である。ホタルｌｕｃ系では光の生成にただ１つの遺伝しか必要とせず、このことは真核生物系での発現に潜在的に有利である。本発明のいくつかのアプリケーションにおけるレポーターとしてのホタルルシフェラーゼのもう１つの利点は、疾患生物体の培養および植物基材に使用される周囲室温（例えば、約２３〜２８℃）でのルシフェラーゼ酵素の光学的触媒活性に由来する。ホタルルシフェラーゼ系には、触媒のための基質Ｏ２、ＡＴＰ、およびルシフェリンが必要である。ｌｕｃ系の典型的なアプリケーションでは、Ｏ２およびＡＴＰは生物学的組織から誘導され、そして生物体および試験形式に依存して噴霧、送り供給、給水、注入、または他の手段のいずれかによって、ホタルルシフェリン（（Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾイル）−４−チアゾールカルボン酸）が生物学的サンプルに供給される。
【００３１】
ＬＧＭスペクトル特性
本発明の好適なＰＬＧＭおよびＬＧＭは、光子の検出を可能にするスペクトル特性を有する（即ち、それらは、アプリケーションに依存して、疾患生物体および／または基材によって発生する光と区別することができる波長の光を生成する）。基材が植物である場合、疾患生物体での使用のために選択されるＬＧＭのスペクトル特性は特に重要である。植物は、多様なスペクトル特性を有し、植物種、増殖条件および疾患状態に依存する多様な程度で蓄積する広範なＬＧＭを天然に産生する。植物ＬＧＭは、色素タンパク質ならびにクロロフィル、カロチノイド、およびアントシアニンなどの色素、いくつかの芳香族アミノ酸、ならびにいくつかの植物二次代謝物を含む。断然豊富に存在する植物ＬＧＭは、植物光合成機構のクロロフィル含有組織タンパク質複合体である。クロロフィルは、２つの波長極大（約４３０ｎｍの可視スペクトルの青色末端の波長極大、および最大約６６０ｎｍでの赤色波長での広範なアプリケーションバンド）で光を吸収する蛍光分子である。得られるクロロフィル蛍光放射は、赤および遠赤範囲の可視スペクトルに存在する。クロロフィルは緑色波長の光エネルギーをほとんど吸収せず、とりわけ植物は緑色光のほとんどを反射して環境に戻すため、ほとんどの植物種は典型的な緑色を生じる。しかし、本発明のいくつかのアプリケーションでは、内因性のＬＧＭおよび具体的には豊富に存在するクロロフィル色素−タンパク質複合体に対する吸収ならびに放射波長と有意に重複しない波長の光を放射および／または吸収するＬＧＭを選択しなければならない。
【００３２】
植物組織を有し、そして疾患生物体に位置する蛍光ＬＧＭを用いる本発明のアプリケーションでは、ＬＧＭは、主要なクロロフィル組織とのスペクトル重複を回避するように、青から緑色の波長で最適に吸収し、そして緑領域のスペクトルで放射すべきである。上記のように、ＰＬＧＭ誘導性フルオレセインならびに約４７３ｎｍ〜４８９ｎｍの範囲で最大に吸収するように修飾されている操作されたＧＦＰを含むＧＦＰ、ならびにＺｓＧｒｅｅｎなどのＦＰ’ｓの吸収および放射スペクトルは、クロロフィル吸収のスペクトルの間隙に存在する。フルオレセイン、ＧＦＰおよびＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰは、吸収された光ではなくむしろ植物によって反射された波長の光を生成するため、本発明での使用に特に良好に適する。
【００３３】
ＧＦＰ発現マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）株の構築は、以下に記載のように行うことができる。「コンプロ（ｃｏｍｐｒｏ）」（何故なら、該シリーズのすべてのプラスミドは、プロモーターの３’末端に共通の２０ｂｐ配列を有するからである）と呼ばれる一連のプラスミドは、当業者に周知である標準的な分子生物学技術に従って構築することができる。例えば、そのようなプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づき、「コンプロ」配列を有する真菌プロモーター、（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）β−チューブリン転写ターミネーター、真菌選択のためのビアラホス耐性遺伝子、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｔｒｐ　１、および２μｍ酵母の複製開始点を含有する。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）Ｐ２リボソームタンパク質プロモーターを含有するバージョンは、ｐＳＭ３２４である。プラスミドｐＳＭ３２４はＸｈｏ　Ｉで消化し、５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填した。本発明において使用されるのは、ＥＧＦＰ（クロンテックラボラトリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）より市販されている）およびｒｓＧＦＰ（クアンタムバイオテクノロジー（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃｓ，　Ｉｎｃ．　Ｍｏｎｔｒｅａｌ，　Ｑｕｅｂｅｃ，　Ｃａｎａｄａ）より市販されている）などの野生型ＧＦＰと比較して、蛍光収量が増強されるように操作されたＧＦＰ変異体である。ＧＦＰ発現ベクターを作製するためには、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ＧＦＰ配列のそれぞれの末端に対して設計された５’および３’プライマーならびにＸｈｏ　Ｉ部位に隣接するｐＳＭ３２４配列に相同でありかつ相同組換えに十分な配列伸長によって、ＧＦＰコーディング配列を増幅する。例えば、クロンテックＥＧＦＰ配列に対して設計されたプライマー「ＸＦＰ５」（ａｇｇａａｃｃｃａａｔｃｔｔｃａａａａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇ）および「ＸＦＰ３」（ａａｔｇｔｔｇａｇｔｇｇａａｔｇａｔｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃ）は、Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）におけるＧＦＰの発現のためのベクターの構築に使用することができる。次いで、ＸＦＰ５／ＸＦＰ３増幅産物およびＸｈｏ消化ｐＳＭ３２４は、酢酸リチウム法（アガテップら（Ａｇａｔｅｐ　ｅｔ　ａｌ．）１９９８）によってサッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｗ３０３−１Ａに形質転換して、プラスミドのギャプ修復を可能にすることができる。酵母のコロニーは、トリプトファンを含有しないプレート上で選択することができる。プラスミドミニプレップは、酵母トリプトファンプロトトロフおよびエレクトロポレーションによって大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に形質転換されたアリコート上で実施することができる。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、ＸＦＰ５／ＸＦＰ３増幅産物のｐＳＭ３２４への適切なギャップ修復のための制限酵素消化によってスクリーニングして、ＧＦＰ発現ベクター��図２）を作製することができる。ＧＦＰ発現ベクターは、公開された形質転換プロトコル（スウェイガードら（Ｓｗｅｉｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）を使用して、Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）４０９１−５−８株へ形質転換することができる。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）のビアラホス耐性形質転換体は、単一胞子選択（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｐｏｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって選択し、精製することができる。蛍光強度について独立した形質転換体をスクリーニングすることができ、さらなる使用のために並外れて明るい形質転換体を選択することができる。
【００３４】
さらに、植物病原体によって感染時に蓄積が誘発され、蛍光性である植物二次代謝物は、本発明に関連する。そのような化合物は、特に、リグニン、リンゴ酸シナポイル（ｓｉｎａｐｏｙｌ　ｍａｌａｔｅ）および他のフェニルプロパノイド誘導体を含む。従って、そのような二次代謝物の吸収および放射波長と重複しないＬＧＭを選択することが所望されることがあり得る。蛍光性の二次代謝物由来の光が本発明のＬＧＭによって生成される光のレベルと比べて低い場合、二次代謝物から誘導される発光を減少させおよび／または適切なコントロール（例えば、該方法で検出されるＬＧＭを欠く罹患した宿主植物）由来のシグナルと比較することによって補正することができる。
【００３５】
スペクトル特性に関する同様の考えが生物発光ＬＧＭの使用にも当てはまる。植物基材または疾患生物体による生物発光の光の吸収によって生物発光の観察が妨げられ得る。上記の植物組織は、定量的には緑色光を吸収しない。しかし、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応によって生じるスペクトルの緑色領域における生物発光はクロロフィルの吸収によって顕著に消光することなく、植物組織を介して最適に遷移する。植物基材を介する光の最適な遷移は、それが蛍光から生じるかまたは生物発光から生じるかにかかわらず、主に葉の表面上に露出して増殖するのではなく、むしろ植物葉の内部に増殖する疾患生物体のアッセイのための本発明のアプリケーションにおいて特に重要である。
【００３６】
特異なＰＬＧＭおよびＬＧＭ蓄積
疾患生物体および基材間のＰＬＧＭまたはＬＧＭの特異な局在化および蓄積のための方法は、本発明の首尾よいアプリケーションに極めて重要であり得る。ある実施態様において、該方法とは、疾患生物体の増殖の程度を検出するための方法の基礎を形成するＬＧＭの特異な蓄積およびその後の検出である。
【００３７】
小さな分子もしくは化学物質の注入、ピペッティング、給水、浸水または噴霧による疾患生物体への特異な適用あるいは蓄積を含む多様な技術によって、ＰＬＧＭまたはＬＧＭは疾患生物体または基材に特異に結合することができる。そのような方法では、生物学的生物体の作用によるＰＬＧＭもしくはＬＧＭの以後の再分布および／または排除が必要とされる（例えば、フルオレセイン二酢酸、実施態様Ｉ）。ＬＧＭは、特異に蓄積する疾患生物体および／または植物基材のいずれかの内因性成分であってもよい。内因性とは、本明細書において、疾患生物体または植物基材のいずれかにおいて発生もしくは発達する特性または実体として規定され、異種遺伝子による生物体の遺伝子形質転換の結果として発現されるタンパク質を含む。１つの例は、疾患生物体ならびに／または植物基材の増殖中における内因性ＰＬＧＭもしくはＬＧＭの生合成およびその破壊である（例えば、クロロフィル生合成、実施態様ＩＩ）。あるいは、疾患生物体および／または植物基材は、ＬＧＭのインサイチュ合成について操作することもできる（例えば、適切なプロモーター誘導物質の投与によって制御される構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかによって調節される形質転換された細胞における異種蛍光タンパク質の発現、実施態様ＩＩ）。
【００３８】
適用された小さな分子、蛍光ＰＬＧＭおよびＬＧＭ
疾患生物体もしくは基材のいずれかに単に生物物理学的および／または化学的特性に基づいて局在し、そして特異的に蓄積することができる小さな分子ＰＬＧＭおよびＬＧＭを同定することがしばしば所望される。ＰＬＧＭフルオレセイン二酢酸は、植物基材に比べていくつかの真菌疾患生物体において好適に蓄積し、そしてＬＧＭに変換されることを可能にする化学的特性を有する。親油性二酢酸部分によって、ＦＤＡ分子は細胞膜を透過することが可能である。一旦、細胞の内部で二酢酸基は、非特異的細胞エステラーゼによって切断され、親化合物よりもはるかにゆっくりと細胞から漏出する荷電形態の蛍光フルオレセイン分子を形成する。
【００３９】
植物の多くの真菌病原体は、ＦＤＡが容易に透過する表面、細胞壁および膜を有し、それらは、ＦＤＡのフルオレセインへの定量的変換に対し十分な細胞エステラーゼ活性を含有する。比較のために、植物葉の外表面はエピクチクラろうの層によって被覆されており、疎水性であることが特徴である。主に葉の表面上に露出して増殖するウドン粉病（エリシフェ　グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈａｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ））などの植物の真菌病原体について、表面に適用されたＦＤＡは容易に病原体に接近可能であるが、植物基材を透過することができない。プクキニア　グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）（葉さび病の原因因子）などの他の病原体は、病巣を生じ、葉の表面上に露出した子実構造（ｆｒｕｉｔｉｎｇ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を伴うが、おそらくＦＤＡの取り込みおよび／または代謝に病原体に特異的な差異があるため、ＦＤＡ投与時にはそれほど高い蛍光性にはならない。ＦＤＡは、疎水的エピクチクラろうによって葉から排出されるため、その結果、主に葉の内部に増殖する病原体に接近することはできない。いくつかの病原体は、適切な環境条件（即ち、高い湿度）下で胞子形成するように誘導することができ、葉の外部にＦＤＡ染色に接近可能な子実構造を生成する。マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）（イモチ病の原因因子）は、葉身の内部に増殖するが、胞子形成後にＦＤＡによって特異に標識することができる例示的病原体である。
【００４０】
従って、ＦＤＡ／フルオレセイン対の化学的特性、基材と比較した疾患病原体の細胞膜の疎水性の生物物理的差異、および葉表面と比較した病原体の病原体の増殖習性の組み合わせることにより、疾患生物体におけるフルオレセインの特異な蓄積が調節される。本発明の分野における当業者であれば、ＦＤＡが好適なＰＬＧＭである増殖習性および生物物理的特徴（例えば、ＦＤＡの取り込みが可能な表面病原体）の適切な組み合わせによって、疾患生物体／基材の対を同定することが可能である。
【００４１】
本発明について、ＦＤＡは典型的に、ＦＤＡ溶液中および疎水性の葉の表面上に分散することを援助する薄い界面活性作用溶液中で処方される。アッセイでは、ＦＤＡは、従来の噴霧技術、浸漬または滴注方法を使用して、植物の葉処理として適用してもよい。ＦＤＡ作用溶液は、好ましくは、真菌の細密な構造を変位させることを回避するために細密なミストとして無傷な植物上に適用され、表面に液体の流動が認められるまで適用する。市販のプレバル（Ｐｒｅｖａｌ）（登録商標）噴霧器（プレサイジョンバルブコーポレーション（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｖａｌｖｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）Ｙｏｎｋｅｒｓ，　Ｎ．Ｙ．）は、このアプリケーションについて有効であることが証明されている。さらに、エアブラシ塗料アプリケーターも本アプリケーションに適切な細密なミストを提供する。
【００４２】
内因性ＬＧＭ
疾患生物体による感染時に、多くの宿主植物は、感染の拡張を削減することを試みて局在化した細胞死のプロセスを経る。場合によって、疾患は宿主の正常な細胞プロセスを破壊しおよび／または細胞死を生じる。感染および疾患進行プロセスの結果、クロロフィルなどの内因性ＬＧＭの生合成および蓄積が変更し得る。この病因から生じる特異な黄白化は、疾患増殖のマーカーとして使用することができる。しかし、本発明のもう１つのアプリケーションでは、クロロフィル組織由来の主要な蛍光シグナルを有利に使用して、植物基材の感染されていない健康な領域が検出される。対照画像より決定された葉の全面積からクロロフィル蛍光性の健康な葉組織の面積を差し引くことによって、疾患生物体に感染された面積を決定することができる。
【００４３】
内因性ＰＬＧＭまたはＬＧＭの特異な蓄積のためのもう１つの方法は、疾患生物体または植物基材のいずれかにおける光発生タンパク質をコードする異種遺伝子の発現による。異種遺伝子とは、宿主生物体に形質転換されている遺伝子である。典型的に、異種遺伝子は形質転換された宿主生物体のゲノムＤＮＡからは本来誘導されない遺伝子である。本発明のアプリケーションでは、好適な異種遺伝子は、上記のＧＦＰまたはＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰなどのＬＧＭルシフェラーゼおよび緑色の波長での放射を伴うＦＰ’ｓをコードする遺伝子である。本方法は、遺伝子の形質転換が可能である疾患生物体および宿主植物種に適用可能である。本方法は、被験体（疾患生物体または植物宿主のいずれか）に、被験体の細胞に導入遺伝子を組み込むのに有効なベクター構築物を投与することを含む。ベクター構築物の例は、図２、３および９のプラスミド地図に表されている。効率的に組み込むのに必要なエレメントに加えて、構築物は導入遺伝子（例えば、治療遺伝子または選択マーカー）および選択された活性化可能なプロモーターの制御下でＬＧＭをコードする遺伝子を含有する。
【００４４】
疾患生物体におけるルシフェラーゼまたはＦＰ（例えば、ＧＦＰまたはＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ）レポーター遺伝子の発現により、生物体はそれぞれ生物発光性かまたは蛍光性となり、そして得られる光の発生を使用して、疾患生物体による感染の程度を直接検出することができる。構成性プロモーターを使用して、疾患生物体中の発現を駆動させ、生物体が葉の表面上で増殖するかまたは葉身の内部で増殖するかにかかわらず、生物体の検出を可能にすることができる。また、誘導性プロモーターを使用して、疾患の検出が所望されかつプロモーター誘導事象に応答する場合にのみ発現を駆動させることも可能である。プロモーター誘導事象としては、プロモーターを直接活性化する基材の投与、内因性プロモーターの活性化因子の産生を刺激する基材の投与、内因性プロモーター活性化因子（例えば、熱ショックまたはストレス）の産生をもたらす条件の設定などが挙げられる。さらに、病原体の再生構造において単独でＬＧＭの発現を指令する組織特異的プロモーターを使用して、感染サイクルの阻害により植物処置剤が疾患の拡張を予防する能力を検出してもよい。
【００４５】
あるいは、宿主植物においてルシフェラーゼまたはＦＰ（例えば、ＧＦＰまたはＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ）が発現されると、宿主植物は光を発生する。上記の内因性ＬＧＭクロロフィルの使用については、ＬＧＭをコードする異種遺伝子の宿主植物発現を使用して、宿主植物の健康な非感染領域を検出することができる。感染および疾患の進行プロセスの結果、ルシフェラーゼまたはＦＰなどの異種ＬＧＭの発現および蓄積は変更し得る。この病因によって生じる特異なレポーター遺伝子の発現および光の発生を疾患増殖のマーカーとして使用することができる。疾患生物体におけるルシフェラーゼまたはＦＰ発現の方法と同様に、誘導性プロモーターシステムを使用して、宿主植物でのレポーター遺伝子の発現を指令することができ、該システムは病原体の感染に応答して誘導される宿主プロモーターを含むことができる。
【００４６】
Ｖ．光子検出器
光子検出デバイスは、光子放射を検出することができる計器である。光子検出デバイスは、ヒト裸眼、暗視ゴーグル、蛍光スキャナー、蛍光光度計、分光光度計、デジタルカメラ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電化結合素子（ＣＣＤ）、または光子が検出器に対して進行する場合の対象由来の光子を検出する遅延積算（ＴＤＩ）型ＣＣＤを含むことができる。本発明の多くのアプリケーションについて重要な態様は、十分なサンプル流量を提供するために合理的な期間に、植物内または植物上の微弱光の検出および画像化を可能にするのに十分な感度を備えた光子検出デバイスを選択することである。例えば、ＰＬＧＭまたはＬＧＭが被験体に特異に局在化することができ、そしてＰＬＧＭが被験体によってＬＧＭに変換される期間後に、被験体は、画像を構築するのに十分な量の光子放射を測定するのに必要な期間の間に、光子検出デバイスの検出フィールド内に保持されることができる。極めて明るいＬＧＭを使用することが可能である場合、１対の暗視ゴーグルまたはシリコン増強管（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ　Ｔｕｂｅ）（ＳＩＴ）カメラなどの標準的な高感度ビデオカメラを使用してもよい。しかし、より典型的には、光検出のより高感度な方法が要求される。
【００４７】
本発明の実施において典型的に遭遇するような極めて低い光レベルでは、単位面積あたりの光子束が非常に低く、画像化している被写体がもはや連続して出現しない可能性がある。その代わり、それは、時間的および空間的の両方が相互に異なる個々の光子によって表してもよい。モニターを観察すると、そのような画像は、典型的に光の閃光ポイントとして出現し、それぞれのポイントは検出された単一の光子を表す。それにもかかわらず、デジタル画像プロセッサでは経時的にこれらの光子を蓄積することによって画像を獲得することができる。
【００４８】
以下に記載の少なくとも２つの種類の光子検出デバイスは、個々の光子を検出し、画像プロセッサによって解析することができるシグナルを発生する。
【００４９】
光子増幅デバイス
このクラスの高感度光子検出デバイスは、光子が検出器に到達する前に、単一の光子事象を増幅するためのさらなるデバイスを用いる。このクラスは、マイクロチャンネル増強装置などの増強装置を有するＣＣＤカメラを含む。例示的なマイクロチャンネル増強装置に基づく単一光子検出デバイスは、ハママツフォトニクスシステム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，　Ｎ．Ｊ．）より市販されているＣ２４００システムである。マイクロチャンネル増強装置は、典型的に、検出器スクリーンに対して同延であり、該スクリーンの前方に位置する、検出スクリーンに対して垂直か、または僅かな角度にあるチャンネルの金属アレイを含有する。光電陰極デバイスは、マイクロチャンネルアレイとサンプルとの間に位置する。光子が光電陰極に衝突すると電子が放出し、マイクロチャンネルアレイに入射する。マイクロチャンネルアレイに入る電子のほとんどは、励起する前にチャンネルの側面に接触する。アレイに沿って電圧が印加されているため、それぞれの電子が衝突すると多くの電子が放出される。得られた電子雲はマイクロチャンネルアレイを出て、カメラによって検出される。増強マイクロチャンネルアレイを直列に配置し、本来の光子シグナルをより強力に増幅することによって、さらに高い感度を達成することができる。しかし、光子シグナルを増強するためにマイクロチャンネルアレイを使用することによって達成される感度の増加は、空間分解能を犠牲にして得られている。増殖の計量値として疾患生物体が及んだ範囲の面積を検出する本発明のいくつかのアプリケーションには、高い空間分解能が必要である。
【００５０】
ノイズ低減型光子検出デバイス
このクラスの光子検出デバイスは、シグナルを増幅こととは反対に検出器のバックグランドノイズを低減することによって感度を達成する。ノイズは、主に検出器を冷却し、それによって暗電流（即ち、装置の回路系からの流出によって生じる電流）を抑制することによって抑制され、検出器の頂部に最も顕著に蓄積する。（例えば、ＣＣＤアレイの温度を約−１２０℃まで低下させることができる液体窒素によって）より低温に冷却する程、検出器の感度は高くなる。これらの冷却型デバイスのより高感度のバージョンには、背面照射型で操作することができる「後方薄型（ｂａｃｋｔｈｉｎｎｅｄ）」と呼ばれるＣＣＤアレイが含まれる。「後方薄薄型」とは、ＣＣＤアレイの超薄バックプレートである。ＣＣＤアレイを薄化すると、検出され、そして背面照射に結合されるために光子が移動しなければならない経路の長さが短くなり、ＣＣＤアレイ前方のポリシリコンゲートによる光の吸収が回避され、従って、一般に、検出器の量子効率が向上する。さらに、露出時間中のＣＣＤ表面の電圧を抑制することによるマルチピンフェージング（ＭＰＰ）と呼ばれる新規のＣＣＤ技術により、暗電流を１００倍以上低減することができる。光学的カメラの性能についてこれらのすべての技術（即ち、冷却、後方薄型アレイ、およびＭＰＰ）を用いる検出器を利用することが可能である。これらのすべての技術を用い、さらに優れた高分解能性質（６．８×６．８μｍピクセルの１３１７×１３１７画像アレイ）を用いるノイズ低減型光子検出カメラの例としては、ローパーサイエンティフィック（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｔｕｃｓｏｎ，　ＡＺ）より市販されているＳｅｎＳｙｓ（登録商標）１４０１Ｅカメラシステムがある。
【００５１】
光子増幅とノイズ低減技術の両方を組み合わせたカメラシステムを利用することも可能である（例えば、冷却、増強型ＣＣＤ）。そのようなカメラシステムは、一般に光検出に対して極めて高感度を呈するが、ノイズ低減技術のみを用いるカメラよりは若干低い空間分解能を提供する。
【００５２】
画像プロセッサ
単一の光子を計数する光子検出デバイスによって発生したシグナルは、例えば、モニター上に表示するかまたは印刷することができる画像を構築するために、画像プロセッサによって処理される必要がある。光子放射の検出によって、画像プロセッサに、各ピクセル位置で検出された光子の数を表す数値の配列が作成される。これらの数値を使用して、典型的に、（固定された予め選択された値かまたはフィールド内の任意のピクセルにおいて検出された最大数のいずれかに対する）光子カウントを正規化し、そして正規化された数をモニター上に表示された輝度（グレースケール）または色（擬似色）に変換することによって、画像が作成される。グレースケールの提示では、典型的な色の割り当ては次の通りである。光子カウントが０であるピクセルには黒色が割り当てられ、低いカウントには灰色の色調が割り当てられ、最も高い光子カウントには白色が割り当てられる。モニター表示での灰色および白色ピクセルを局在化することによって、光子放射の分布、即ち、光発生部分の局在が表される。
【００５３】
画像プロセッサは、典型的に、上記の高感度光子計数カメラを含むシステムの部分として販売されており、従って、同じ供給源（例えば、ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）およびローパーサイエンティフィック（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））から入手することが可能である。画像プロセッサは、通常、ＩＢＭ互換性ＰＣまたはアップル社（Ａｐｐｌｅ）製マッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）などのパーソナルコンピュータ（購入したカメラシステムの部分として含まれていてもまたは含まれていなくてもよい）に接続される。画像はデジタルフィルムの形態であるため、カメラシステム販売業者より市販されているソフトウェアアプリケーション、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）（ユニバーサルイメージング（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ）Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ，　ＰＡ）もしくはＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）（アドビシステムズ（Ａｄｏｂｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　ＣＡ）などの他の市販のアプリケーション、または用途に合わせたソフトウェアアプリケーションを含むさまざまな画像処理プログラムでそれらを操作および解析することができる。
【００５４】
画像システムの統合
本発明において使用することができる１つのマクロ画像システム（図１）は、統合型コンピュータ制御装置である。画像システムに関する本実施例では、その形状構成は、画像チャンバ（１０）の基部（１）にサンプルが配置され、カメラ（２）は下方に向かって焦点を形成するような構成になっている。しかし、該方法のアプリケーションによっては、チャンバの側部にカメラを搭載することが所望されることもあり得る。本方法の他のアプリケーションのために、画像処理しようとするサンプルに対するカメラのさらなる他の形状構成を使用することもあり得る。
【００５５】
蛍光方式で使用する場合、本実施例の励起光は、それぞれ適切な帯域通過フィルター（４）（例えば、オメガオプティカル（Ｏｍｅｇａ　Ｏｐｔｉｃａｌ）Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴより市販のフィルター）を装着し、１４インチ×０．０１５インチ（３５．６ｃｍ×０．０３８ｃｍ）の光ファイバーライン灯（６）（例えば、オプティカルアパレイタス（Ｏｐｔｉｃａｌ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．）Ａｒｄｍｏｒｅ，　ＰＡより市販のＬｉｇｈｔｌｉｎｅ（登録商標））への光ファイバー束（５）に結合した二光源（３）（例えば、オプティカルアパレイタス（Ｏｐｔｉｃａｌ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．）Ａｒｄｍｏｒｅ，　ＰＡより市販のＤＣＲ（登録商標）ＩＩ　ＬＩＴＥ　ＳＯＵＲＣＥ）により生成される。ライン灯（６）は、カメラの視野の外部で画像チャンバの内部に装着され、画像視野に沿ってスペクトルの反射率を伴うことなく平坦な照明を提供するように配向される。拡散体を被覆された低いワット数の白色灯（７）もチャンバの内部に装着され、参照画像の収集のために平坦かつ非反射性の照明を提供するために使用される。均質な励起およびスペクトル反射率を伴わない参照光条件を確立することは、特に、Ｌｕｃｉｔｅ（登録商標）ポリカーボネートまたはＭｙｌａｒ（登録商標）ポリエステルなどの平坦で透明な材料を使用して、画像の正確度の向上のために単一平面内に植物サンプルを保持する場合、または宿主基材がマイクロタイタープレートなどの反射性の材料を含有する場合、均質な励起およびスペクトル反射率を伴わない参照光条件を確立することは重要である。必要に応じて、カメラ（２）に関するバックライトサンプルに対し、さらなる平坦床盤参照光（１５）を画像チャンバ（１）の基部に配置してもよい。
【００５６】
放射された蛍光、生物発光または反射光は、ＡＦ　Ｎｉｋｋｏｒ　３５ｍｍ　ｆ２．０レンズ（ニコン（Ｎｉｋｏｎ，　Ｉｎｃ．）Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，　Ｎ．Ｙ．より市販されている）などのマクロ写真用レンズ、および適切な励起フィルター（８）（例えば、オメガオプティカル（Ｏｍｅｇａ　Ｏｐｔｉｃａｌ）、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，　ＶＴ）を装着し、１６ビット枠取りを有する画像プロセッサ（９）に接続されたカメラ（２）（例えば、ＳｅｎＳｙｓ（登録商標）１４０１Ｅ冷却ＣＣＤカメラ（ローパーサイエンティフィック（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｔｕｃｓｏｎ，　ＡＺ）によって検出することができる。
【００５７】
蛍光および参照画像のための発光システムならびにＣＣＤカメラの操作は、それぞれワイヤー接続（１２）および（１３）を介してコンピュータ（１１）によって制御される。励起光および参照光の制御のために、多機能Ｉ／Ｏボード（１４）（例えば、ナショナルインシュツルメント（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）Ａｕｓｔｉｎ，　ＴＸ）がコンピュータに設置されている。カメラの操作および制御のためのソフトウェアドライバは、一般にカメラの製造者によって提供され、コンピュータに設置される。本実施例では、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｗｉｎｄｏｗｓ　ＮＴ（登録商標）オペレーティングシステムが作動するＰＣに設置された用途に合わせた画像解析ソフトウェアプログラムが、発光およびカメラの操作を制御する。
【００５８】
ＶＩ．画像の獲得および解析
画像化しようとするサンプルは、カメラに対して配向され、基材の形式（例えば、マイクロタイタープレートもしくは植物葉）、および／または植物が基材である場合、宿主植物の増殖習性（例えば、広葉または草葉）に依存して画像チャンバ（１０）内に配置される（図１参照）。３５ｍｍマクロレンズによる視野は、それらのサイズに依存して１つ以上の植物、および作動距離に依存して１つ以上のマイクロタイタープレートを収容することができる。２８または２４ｍｍレンズなどのより短い焦点距離レンズを使用することによって、より大きな視野、即ち処理量の増加を達成することができる。フィールドレンズは、特に、深底ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合、視差を補正するのに役立てることができる。しかし、そのようなレンズは、一般に、光学的に緩慢であり、光の検出量が減少する場合がある。該方法のいくつかのアプリケーションにおいて、特に、基材が、ねじれており、そうでなければ非均質な３次元画像化標的である葉を有する宿主植物である場合、サンプルを平坦化して単一平面にし、それによって照明およびカメラによる検出に一貫性および均質性を提示することが所望されることがあり得る。ガラスシートであるＬｕｃｉｔｅ（登録商標）ポリカーボネート、可撓性Ｍｙｌａｒ（登録商標）ポリエステルまたは他の透明な材料を使用して、透明なシートの間に葉を積層することによってサンプルを平坦化することができる。要求される解析の種類に依存して、前記の平坦化されたサンプルにより、宿主葉の両面を容易に画像化することができる。この態様は、葉のそれぞれの側に無作為に感染が出現する疾患を画像化する場合に特に有用である。例えば、穀類のウドン粉病感染は、２つの葉の表面間でのばらつきが大きく、疾患が及んだ範囲を正確に評価するためには、両表面を検査しなければならない。対照的に、トマト疫病の程度は葉の上下表面に一貫して存在するため、感染の程度を正確に評価するために画像化する必要があるのは一方の表面だけでよい。
【００５９】
蛍光のデータは、通常、励起照明の存在下で獲得されるが、生物発光のデータは、通常、外部照明の非存在下で獲得される。光発生部分の性質（例えば、蛍光または生物発光）、蛍光発生部分のスペクトルの特徴（例えば、ＦＤＡ、ＦＰ’ｓまたはクロロフィル）、および疾患生物体の病因学（例えば、表面対内部病原体）に依存する光シグナルの増強に従って、統合時間を調整することができる。サンプルのグレースケールの対照画像は、マクロ画像化システムを使用して白色光下で獲得することができる。
【００６０】
該方法のアプリケーションによっては、疾患生物体を局在化しおよび／あるいは基材（または宿主植物基材の場合では葉）の全面積に対する疾患生物体の増殖もしくは程度を表現することが所望されることがあり得る。該方法の本態様の例として、ＬＧＭを含有する疾患生物体に感染した葉の分画された領域を、以下のフロースキームに従って決定する。当業者であれば、光子検出器を操作して、光子放射を検出し、そしてフロースキームに従って画像を解析することによって、本方法を実施することができる。コンピュータプログラミングの分野の当業者であれば、市販のソフトウェアもしくは用途に合わせたソフトウェアを使用することによって、これらの工程を実施するためのプログラムを入手または作成することができる。
【００６１】
【表１】
2004506879.tif 000003
【００６２】
フロースキームに示す画像の獲得および解析の例をさらに以下に説明する。サンプルの対照画像は、弱い白色光照明下で獲得される。用途に合わせたソフトウェアアプリケーションを使用して、画像の閾値を決定し、サンプルについて設定された強度の閾値を超える各ピクセルが１の値が割り当てられ、そして該閾値より小さな各ピクセルがバックグランドの視野として規定され、０の値が割り当てられるようにする。この工程により二進数の画像が作成され、その後、これを使用して、視野における各対象の全面積を決定する。ソフトウェアアプリケーションによって、ピクセル値が１である各連続対象周囲の最小有界区画が表現され、それによって、視野における各対象が規定され、それに対象番号が割り当てられる。最小ピクセル数のサイズは、外的対象物（例えば、汚れまたは他の破片）の検出および局在化を排除するように設定することができる。視野における対象物の総数はこのようにして規定され、各対象を含むピクセルの総数、またはすべての葉の面積が決定される。
【００６３】
二進数の画像も使用して、以後の画像獲得工程、即ち、規定された対象の領域由来の蛍光または生物発光部分から発生する光の検出のための対照マスクを作製する。蛍光または生物発光画像の閾値を決定し、設定された閾値より大きい発光を生成する対象の領域に１に等しいピクセル値を割り当て、該閾値よりも小さい発光を有する対象の領域には０のピクセル値を割り当てる。このようにして、光発生部分を含有する各対象の境界内のピクセルを規定し、光発生部分が局在化されたピクセルの総数を決定する。
【００６４】
ＬＧＭを有する疾患病原体を含有する画分の面積を決定するために、局在化された光発生に関連するピクセルの数を対象または葉を含むピクセルの総数で割る。疾患生物体の局在化を検出する画像を、植物基材の対照画像に重ね合わせて、対照の空間フレームを提供する合成画像を形成することができる。疾患生物体の局在および／または分布に関する空間的情報を提供するために、合成画像をさらに解析してもよい。例えば、規定されたピクセル長のセグメントに葉を分割し、疾患生物体が感染した葉の頂部から基部の各セグメントの画分の面積を算出することができる。
【００６５】
本発明の他のアプリケーションでは、感染した基材の画分の面積について空間的に詳細に決定することはせず、その代わりに、規定されたサンプル領域内のＬＧＭ由来の全発光を統合することによって提示される疾患生物体の蓄積量を決定することが所望されることがあり得る。例えば、感染区域についてかなり均質である領域を利用する場合、またはサンプルの形状構成により空間的に十分に詳細な事項を有する画像の獲得が阻止される場合、そのような事態が生じる。例えば、基材が、他の増殖培地もしくは支持体を有するかまたは有さないマイクロタイタープレート、あるいはマイクロタイタープレート内の宿主植物、あるいは比較的均質な葉領域が得られるように培養した植物である場合、空間的情報は不適切であり得る。同様に、複数の宿主植物が、小さな園芸ポット内もしくはマイクロタイタープレート内などの制限された領域内に含有される場合、および／または光子検出器の軸が穀類および草植物の長軸に平行である場合、十分な空間的情報を達成することができない可能性がある。該方法の本態様の例として、マイクロタイタープレートの単一のウェル内に含有されるおよびＬＧＭを含有する疾患生物体に感染した複数の植物由来のシグナルの検出および統合は、以下のように実施される。
【００６６】
マイクロタイタープレート全体についての本実施例におけるサンプルの蛍光または生物発光の画像は、励起照明下で獲得される。操作者は、指標となるプレートの地図を位置付け、コンピュータのモニター上でプレートの画像上に個々のウェルの位置を定めることができる。本画像由来のピクセル強度を、プレートのそれぞれのウェルについて規定された領域ついて合計し、蛍光または生物発光ＬＧＭ由来の前シグナルを、ウェルの位置によって報告する。各ウェルの境界内の発光強度はこのようにして規定され、疾患生物体の蓄積量の測定値として使用される。
【００６７】
画像システムからのすべてのデータの出力はデジタル化され、さらなる解析および保管のためにスプレッドシートまたは選択されたデータ処理システムに容易に出力される。感染の画分の面積（即ち、感染％）および／または実験植物処置剤に対する疾患生物体の蓄積量を、感染および非処置サンプル、ならびに植物疾患の制御に有効であることが既知である濃度において化学標準物質で処置した感染サンプルに対する同一の処置と比較する。
【００６８】
ＶＩＩ．穀物保護剤
植物疾患（例えば、殺菌剤、抗微生物および抗ウイルス剤、および／または系統性後天的疾患耐性の誘導剤）の制御において有効である作物保護剤を生成するこのと１つの態様は、植物疾患を生じる植物疾患生物体を制御するのに有効な植物処置剤の獲得である。場合によって、植物処置剤は、（それらが利用可能である場合）製造者または他の供給者によって獲得することができる。供給者または植物処置剤を獲得する関係者は、本発明の方法を使用して、植物処置剤の有効性を決定することができる。また別の場合によっては、作物保護剤の製造者は、公知の植物処置剤を調製することができる。製造者は、本発明の方法を使用して、植物処置剤の有効性を決定することができる。さらに、本発明の方法を使用して、植物疾患を制御するのに特に有効である新規の植物処置剤を明らかにすることができる。本発明の方法は、植物疾患の制御について植物処置剤およびそれらを含有する組成物の有効性を決定することによって、作物保護剤の生成に使用することができる。有効性を決定することは、作物学的有用性に適切な作物保護剤の生成に重要な工程を示すことができる。例えば、植物疾患生物体の制御に有効であることがこれまでに知られていない植物処置剤および／または前記植物処置剤を含有する組成物の有効性を決定することができれば、当業者は、前記処置剤および／または前記組成物を作物保護剤として生成のために選択することが可能である。過去に公知である植物処置剤を含有するこれまでに知られていない組成物の有効性を決定することができれば、当業者は、前記組成物を作物保護剤として生成のために選択することが可能である。本発明の方法を使用して、植物疾患を制御するための植物処置剤の混合物の有効性を決定することができる。また、本発明の方法を使用して、既知の組成物のサンプルをアッセイし、前記組成物の製造、生成および／または貯蔵中における高い品質の制御の目的のために、植物疾患の制御における有効性を決定することもできる。
【００６９】
有効な植物処置剤
本発明の方法によって有効であると決定された所定の植物処置剤は、植物疾患の制御に有効である作物保護剤の生成において有効成分として使用することができる。それらは、化学化合物または化学化合物の混合物（例えば、物理的混合プロセスまたは化学合成プロセスの混合、醗酵ブロス、または生物学的もしくは非生物学的起源からの抽出調製）であってもよい。有効であると決定された化学化合物は、化学製造業者から入手することができ、典型的に、従来の溶液相合成、ポリマー結合性または固相試薬または基質などのコンビナトリアル化学技術を用いる合成およびパラレル合成技術ならびに／あるいは殺微生物剤、酵素または醗酵などの酵素調製を用いるプロセスを含む化学プロセスおよび変換による化学合成の分野の当業者によって調製される。
【００７０】
調合
植物処置剤は、一般に、少なくとも１つの液体希釈剤、固体希釈剤または界面活性剤を含んで成る農学的に適切なキャリアによる調合物または組成物から成る作物保護剤として使用することができる。従って、植物疾患の制御に有効な植物保護剤を生成することのもう１つの態様は、他の成分と共に植物処置剤を調合することに関与し得る。本発明の方法を使用して、特別の調合の他の成分と組み合わせて、植物処置剤の有効性を決定することができる。通常、調合物または組成物成分は、有効成分（即ち、植物処置剤）の物理的特性、土壌の種類などの適用の様式および環境因子、水分ならびに温度に合致させて選択する。有用な調合物は、必要に応じてゲルに濃縮することができる溶液（農耕乳剤を含む）、懸濁液、乳濁液（マイクロエマルションおよび／または偽乳剤（ｓｕｓｐｏｅｍｕｌｓｉｏｎ））などを含む。有用な調合物はさらに、水分散性（「可湿性」）または水溶性であることができる粉剤（ｄｕｓｔ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、顆粒、ペレット、錠剤、フィルムなどを含む。有効成分は、（マイクロ）カプセル化することができ、さらに、懸濁液または固体調合物に形成させることができる。あるいは、有効成分の調合全体をカプセル化（または被覆化）することができる。カプセル化は、有効成分を制御または除放放出することができる。適切な媒体において噴霧可能な調合物にまで範囲を広げることができ、１ヘクタールあたり約１〜７００リットルの噴霧容量で使用することができる。高濃度の組成物は、主に、さらなる調合の中間体として使用される。
【００７１】
調合物は、典型的に有効量の有効成分ならびに１００重量％まで添加される以下のおおよその範囲内で希釈剤および界面活性剤を含有する。
【００７２】
【表２】
2004506879.tif 000004
【００７３】
典型的な固体希釈剤については、ワトキンスら（Ｗａｔｋｉｎｓ，　ｅｔ　ａｌ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ　Ｄｕｓｔ　Ｄｉｌｕｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｄｏｒｌａｎｄ　Ｂｏｏｋｓ，　Ｃａｌｄｗｅｌｌ，　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙに記載されている。典型的な液体希釈剤については、マスデン（Ｍａｒｓｄｅｎ）Ｓｏｌｖｅｎｔｓ　Ｇｕｉｄｅ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９５０に記載されている。ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　Ａｎｎｕａｌ，　Ａｌｌｕｒｅｄ　Ｐｕｂｌ．　Ｃｏｒｐ．，　Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、ならびにシセリー（Ｓｉｓｅｌｙ）およびウッド（Ｗｏｏｄ）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇｅｎｔｓ，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｕｂｌ．　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９６４には、界面活性剤および推奨される用途が列挙されている。すべての調合物は、泡、固塊化、腐食、微生物の増殖を抑制するための添加物、または粘度の増加させるための濃縮化剤を少量含有することができる。
【００７４】
界面活性剤としては、例えば、ポリエトキシル化アルコール類、ポリエトキシル化アルキルフェノール類、ポリエトキシル化ソルビタン脂肪酸エステル類、ジアルキルスルホ琥珀酸類、硫酸アルキル類、スルホン酸アルキルベンゼン類、有機シリコーン類、Ｎ，Ｎ−ジアルキルタウレート類、リグニンスルホン酸塩類、ナフタレンスルホネート、ホルムアルデヒド縮合物、ポリカルボキシレート類、およびポリエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体が挙げられる。固体希釈剤としては、例えば、ベントナイト、モンモリロナイト、アタパルガイトおよびカオリンなどのクレー、デンプン、糖、シリカ、タルク、珪藻土、尿素、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウム、ならびに硫酸ナトリウムが挙げられる。液体希釈剤としては、例えば、水、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−アルキルピロリドン、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、パラフィン、アルキルベンゼン、アルキルナフタレン、オリーブ油、ひまし油、亜麻仁油、桐油、ゴマ油、コーン油、ピーナツ油、綿実油、大豆油、菜種油およびココナッツ油、脂肪酸エステル、シクロヘキサノン、２−ヘプタノン、イソホロンおよび４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン、ならびにメタノール、シクロヘキサノール、デカノールおよびテトラヒドロフルフリルアルコールなどのアルコールが挙げられる。
【００７５】
濃厚乳剤を包含する液剤は、成分を単に混合することにより製造することができる。粉剤および散剤は、配合しそして一般的にはハンマーミルまたは流体エネルギーミル中でのように粉砕することにより製造できる。懸濁剤は一般的には湿式粉砕により製造され、例えば、米国特許第３，０６０，０８４号を参照のこと。顆粒剤およびペレットは活性物質を予め成形された粒状担体に噴霧することによりまたは凝集技術により製造することができる。ブロウニング（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）“Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ”，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　４，　１９６７，　ｐｐ　１４７−１４８，　Ｐｅｒｒｙ’ｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，　４ｔｈ　Ｅｄ．，　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９６３，　ｐａｇｅｓ　８−５７　以下、並びにＷＯ　９１／１３５４６を参照のこと。ペレットは米国特許第４，１７２，７１４号に記載されている通りにして製造することができる。水−分散性および水溶性顆粒剤は米国特許第４，１４４，０５０号，米国特許第３，９２０，４４２号およびＤＥ３，２４６，４９３号に教示されている通りにして製造することができる。錠剤は米国特許第５，１８０，５８７号，米国特許第５，２３２，７０１号および米国特許第５，２０８，０３０号に教示されている通りにして製造することができる。フィルムは英国特許第２，０９５，５５８号および米国特許第３，２９９，５６６号に教示されている通りにして製造することができる。
【００７６】
調合技術に関する別の情報に関しては、米国特許第３，２３５，３６１号，６欄、１６行〜７欄、１９行および実施例１０−４１；米国特許第３，３０９，１９２号、５欄、４３行〜７欄、６２行および実施例８、１２、１５、３９、４１、５２、５３、５８、１３２、１３８−１４０、１６２−１６４、１６６、１６７および１６９−１８２；米国特許第２，８９１，８５５号、３欄、６６行〜５欄、１７行および実施例１−４；クリングマン（Ｋｌｉｎｇｍａｎ）Ｗｅｅｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｓ　ａ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９６１，　ｐｐ　８１−９６；並びにハンスら（Ｈａｎｃｅ　ｅｔ　ａｌ）Ｗｅｅｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，　８ｔｈ　Ｅｄ．，　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　１９８９を参照のこと。
【００７７】
特定の植物処置剤を含有するいくつかの調合物は、前記植物処置剤を含有する他の調合物よりも植物疾患の制御により有効である可能性がある。本発明の方法を使用して、特定の調合物における植物処置剤の有効性を確認することができる。
【００７８】
処方物に関する以下の実施例では、百分率はすべて重量によるものであり、そして調合物はすべて、本発明の方法によって有効であると決定された植物処置剤（有効成分）を使用して一般的方法で製造される。
【００７９】
実施例Ａ
湿潤性散剤
有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６５．０％
ドデシルフェノールポリエチレングリコールエステル　　２．０％
リグニンスルホン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　４．０％
ケイアルミン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　６．０％
モンモリロナイト（か焼されたもの）　　　　　　　　２３．０％
実施例Ｂ
顆粒
有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
アタパルガイト（低揮発性物体、
０．７１／０．３０ｍｍ、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎｏ．２５−５０ふるい）　９０．０％
実施例Ｃ
押し出し成形されたペレット
有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．０％
無水硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
粗製リグニンスルホン酸カルシウム　　　　　　　　　　５．０％
カルシウム／マグネシウムベントナイト　　　　　　　５９．０％
実施例Ｄ
乳化可能な濃縮物
有効成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０％
油溶性スルホン酸塩およびポリオキシエチレン　　　　１０．０％
イソホロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０．０％
【００８０】
混合物
本発明の方法によって有効であると決定された植物処置剤はまた、１つ以上の他の殺虫剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺細菌剤、ダニ駆除剤、増殖調節剤、不妊化剤、信号化学剤、駆虫剤、誘引物質、フェロモン類、摂食刺激物または広範なスペクトルの農学的保護を呈する多成分作物保護剤を形成するための他の生物学的に活性な植物処置剤と混合することができる。これらの混合物は、個々の有効成分を入手し、そしてそれらを上記の他の調合成分と組み合わせて、２つ以上の有効成分を含有する調合物を提供することによって調製することができる。混合物はまた、個々の有効成分を含有する調合物を入手し、そしてそれらを物理的に混合して、２つ以上の有効成分を含有する新規の調合物を得ることによっても入手される。２つ以上の有効成分を含有する植物疾患を制御するための混合物の有効性は、本発明の方法を使用して決定することができる。
【００８１】
本発明の方法によって試験される組成物に含まれ得る上記の農学的保護物質の例には：アバメクチン、アセフェート、アジンホスメチル、ビフェントリン、ブプロフェジン、カルボフラン、クロルフェンピル、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、シフルトリン、βシフルトリン、シハロトリン、λシハロトリン、デルタメトリン、ジアフェンチウロン、ジアジノン、ジフルベンズロン、ジメトエート、エスフェンバレレート、フェノキシカルブ、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フィプロニル、フルシトリネート、タウ−フルバリネート、ホノホス、イミダクロプリド、イソフェンホス、マラチオン、メタアルデヒド、メタアミドホス、メチダチオン、メトモイル、メトプレン、メトキシクロル、メチル７−クロロ−２，５−ジヒドロ−２−［［Ｎ−（メトキシカルボニル）−Ｎ−［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ］カルボニル］インデノ［１，２−ｅ］［１，３，４］オキサジアジン−４ａ（３Ｈ）−カルボキシレート（インドキサカルブ、ＤＰＸ−ＪＷ０６２）、モノクロトホス、オキサミル、パラチオン、パラチオンメチル、ペルメトリン、ホレート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ピリミカルブ、プロフェノホス、ロテノン、サルプロホス、テブフェノジド、テフルトリン、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオジカルブ、トラロメトリン、トリクロルホンおよびトリフルムロンなどの殺虫剤；アシベンゾラル、アゾキシストロビン、ベノミル、ブラストサイジンＳ、ボルドー液（三塩基性硫酸銅）、ブロムコナゾール、カルプロパミド（ＫＴＵ３６１６）、カプタホール、キャプタン、カルベンダジム、クロロネブ、クロロタロニル、オキシ塩化銅、銅塩、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル（ＣＧＡ２１９４１７）、（Ｓ）−３，５−ジクロロ−Ｎ−（３−クロロ−１−エチル−１−メチル−２−オキソプロピル）−４−メチルベンズアミド（ＲＨ７２８１）、ジクロシメット（Ｓ−２９００）、ジクロメジン、ジクロラン、ジフェノコナゾール、（Ｓ）−３，５−ジヒドロ−５−メチル−２−（メチルチオ）−５−フェニル−３−（フェニルアミノ）−４Ｈ−イミダゾール−４−オン（ＲＰ４０７２１３）、ジメトモルフ、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ドジン、エディフェンホス、エポキシコナゾール（ＢＡＳ４８０Ｆ）、ファモキサゾン、フェナミゾン、フェナリモル、フェンブコナゾール、フェンカラミド（ＳＺＸ０７２２）、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸トリフェニルスズ、水酸化トリフェニルスズ、フルアジナム、フルジオキソニル、フルメトベル（ｆｌｕｍｅｔｏｖｅｒ）（ＲＰＡ４０３３９７）、フルキンコナゾール、フルシラゾール、フルトラニル、フルトリアフォル、ホルペット、ホセチル−アルミニウム、フララキシル、フラメタピル（ｆｕｒａｍｅｔａｐｙｒ）（Ｓ−８２６５８）、ヘキサコナゾール、イプコナゾール、イプロベンホス、イプロジオン、イソプロチオラン、カスガマイシン、クレソキシムメチル、マンコセブ、マネブ、メフェノキサム（ｍｅｆｅｎｏｘａｍ）、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メトミノストロビン／フェノミノストロビン（ＳＳＦ−１２��）、ミクロブタニル、ネオアソジン（ｎｅｏ−ａｓｏｚｉｎ）（メタンアルソン酸鉄）、オキサジキシル、ペンコナゾール、ペンシクロン、プロベナゾール、プロクロラズ、プロパモカルブ、プロピコナゾール、ピラクロストロビン、ピリフェノックス、ピリメタニル、ピロキロン、キノキシフェン、スピロキサミン、イオウ、テブコナゾール、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チフルザミド、チオファネート−メチル、チラム、トリアジメホン、トリアジメノール、トリシクラゾール、トリフルオキシストロビン、トリチコナゾール、バリダマイシンおよびビンクロゾリンなどの殺菌剤；アルドキシカルブおよびフェナミホスなどの殺線虫剤；ストレプトマイシンなどの殺細菌剤；アミトラズ、キノメチオネート、クロロベンジレート、シヘキサチン、ジコホール、ジエノクロル、エトキサゾール、フェナザキン、フェンブタチンオキシド、フェンプロパトリン、フェンピロキシメート、ヘキシチアゾックス、プロパルギット、ピリダベンおよびテブフェンピラドなどのダニ駆除剤；ならびにバチルス　チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス　チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ内毒素、バキュロウイルス、および食虫性（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）細菌、ウイルスおよび真菌などの生物学的薬剤がある。
【００８２】
ＶＩＩＩ．植物疾患を制御するための方法
本発明はさらに、植物処置剤が本発明の方法によって有効であることを決定することおよび保護しようとする植物もしくはその部分、または保護しようとする植物種子または苗に有効量の前記植物処置剤を（前記植物処置剤を含有する殺菌剤の成分として）適用することを含んで成る植物疾患（例えば、真菌植物病原体によって生じる疾患）を制御するための方法を提供する。本発明の方法を使用して、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）、卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ）および不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅ）網の１つ以上の真菌植物病原体によって生じる疾患の制御を提供するのに有効な植物処置剤および組成物を同定することができる。それらは、植物疾患、特に観賞、野菜、田畑、穀類、および果実作物の葉病原体を制御するのに有効であり得る。これらの病原体には、プラスモポーラ　ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐｏｒａ　ｖｉｔｉｃｏｌａ）、フィトフトラ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ペロノスポラ　タバシナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｔａｂａｃｉｎａ）、シュードペロノスポラ　キュベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、フィチウム　アファニデルマトウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、アルテリナリア　ブランシー（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、セプトリア　ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ）、セプトリア　トリティサイ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｔｒｉｔｉｃｉ）、セルコスポリジウム　ペルソナタム（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｓｏｎａｔｕｍ）、セルコスポーラ　アラキジコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ａｒａｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、シュードセルコスポーラ　ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ　ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）、セルコスポーラ　ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｌａ）、ボツリチス　シネリア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）、モニリニア・フルクティコラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ　ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、ピリキュラリア　オリザエ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏｒｙｚａｅ）、ポドスファエラ　ロイコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ　ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、ヴェンツリア　イナエキュアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ　ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、エリシフェ　グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）、アンシヌラ　ネカチュラ（Ｕｎｃｉｎｕｌａ　ｎｅｃａｔｕｒ）、プクキニア　レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、プクキニア　グラミニス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ヘミレニア　バスタトリックス（Ｈｅｍｉｌｅｉａ　ｖａｓｔａｔｒｉｘ）、プクキニア　ストリイホルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、プクキニア　アラキジス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ　ａｒａｃｈｉｄｉｓ）、リゾクトニア　ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、スファロタカ　フリギニ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ　ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、フザリウム　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ヴェルティシラム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ）、フィチウム　アファニデルマトウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、フィトフトラ　メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、スクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、スクレロチウム　ロルフシ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｒｏｌｆｓｉｉ）、エリシフェ　ポリゴニ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ　ｐｏｌｙｇｏｎｉ）、ピレノフォラ　テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓ）、ガエウマノマイセス　グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）、リンコスポリウム　セカリス（Ｒｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｓｅｃａｌｉｓ）、フザリウム　ロゼウス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）、ブレミア　ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ　ｌａｃｔｕｃａｅ）ならびにこれらの病原体に近い関係の他の属および種が含まれる。
【００８３】
所定の場合において、１つの有効成分と類似の制御スペクトルを有するが作用様式が異なる別の有効成分との組み合わせ（セクションＶＩＩの混合物を参照のこと）を含む植物処置剤は、耐性の管理に特に有利である。本発明の方法によって真菌植物疾患を制御するために使用され、アゾキシストロビン、シモキサニル、エポキシコナゾール、ファモキサゾン、フェナミゾン、フェンプロピモルフ、フルシラゾール、ホセチル−アルミニウム、クレソキシムメチル、マンコセブ、マネブ、メララキシル、メトコナゾール、オキサジキシル、ピラクロストロビン、キノキシフェン、トリシクラゾールおよび／またはトリフルオキシストロビンを異なる作用様式を有する別の有効成分との組み合わせで含む植物処置剤に留意すべきである。
【００８４】
植物疾患の制御は、通常、本発明の有効量の植物処置剤を、感染の前または後のいずれかにおいて、根、幹、葉、果実、種子、根茎もしくは鱗茎などの保護しようとする植物の部分、または保護しようとする植物が生育している培地（土壌もしくは砂）に適用することによって達成される。植物処置剤はまた、種苗を保護するために種子に適用することができる。
【００８５】
これらの作物保護剤の適用速度は、多くの環境因子に影響され得、実際の使用条件下で決定されるべきである。１ｇ／ｈａ〜５，０００ｇ／ｈａの有効成分の速度で処置する場合、通常、葉を保護することができる。種苗は、通常、種子の１キログラムあたり０．１〜１０ｇの有効成分の速度で処置する場合、保護することができる。
【００８６】
実施例
Ａ．植物の培養、処置および接種
オオムギ植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｉ、またはブーン（Ｂｏｏｎｅ））を、典型的に、２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍポットの土壌において植物生育ユニットあたり単一または複数植物として培養する。植物を、環境調節された生育チャンバ中、２０℃および７０％湿度で生育させる。植物処置剤の適用時は、植物は約７日齢である。単一植物のユニットに、殺菌剤標準物質または実験植物処置剤を表面流去点まで噴霧する。
【００８７】
植物処置剤適用の２４時間後、続いて、オオムギ植物に真菌植物病原体の胞子を接種し、適切な条件下で目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。
【００８８】
ウドン粉病の接種は、エリシフェ　グラミニス　エフ．スピー．ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ　ｆ．　ｓｐ．　ｈｏｒｄｅｉ）の胞子懸濁液による。ウドン粉病接種植物は、接種４時間後に乾燥領域に配置し、続いて、２０℃および６５％湿度でさらに７日間生育させる。ウドン粉病感染植物は疾患段階の時点で１５日齢である。
【００８９】
オオムギ枯れ病の接種は、マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）（枯れ病の原因因子）の胞子懸濁液を植物に噴霧することによる。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）の野生型またはリボソームタンパク質ＲＰ２７（ｐ２）プロモーターの制御下でＦＰ遺伝子（ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ）を発現する遺伝子導入株（以下に記載されている）を接種に使用する。枯れ病接種オオムギ植物を飽和大気中、２７℃で２４時間、インキュベートし、次いで、生育チャンバに移動させて、３０℃で５日間置き、その後、疾患状態にさせる。枯れ病感染植物は疾患段階の時点で１３日齢である。
【００９０】
エラグロスティス　カルブラ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ　ｃｕｒｖｕｌａ）植物を、固体１／２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地を含有する深底ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート中で培養し、気体透過性シール（マーシュバイオメディカル（Ｍａｒｓｈ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））で被覆する。植物は１ウェルあたり約５〜６種子で播種し、環境調節された生育チャンバ中、２５℃および８５％湿度、１％ＣＯ２富化大気で生育させる。枯れ病接種は、植物が１０日齢のときにマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）の胞子懸濁液を植物に噴霧することによって実施する。リボソームタンパク質ＲＰ２７（ｐ２）プロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子の操作された変異体を発現するＭ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）の遺伝子導入株（プラスミド地図に関する図２を参照のこと）を感染に使用することができる（前記遺伝子導入株の調製については上記を参照のこと）。続いて、枯れ病接種植物を含有するプレートを気体透過性シールで被覆し、感染前の宿主植物増殖のための条件に類似の条件下で維持する。接種４日後に疾患状態となる。殺菌剤標準物質または実験植物処置剤を、系統的アプリケーションとして種子形成（ｓｅｅｄｉｎｇ）前に培地に適用する。
【００９１】
トマト植物（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍまたは（Ｏｒａｎｇｅ　Ｐｉｘｉｅ））を、典型的に、２．５４ｃｍ×２．５４ｃｍポットの土壌において植物生育ユニットあたり単一植物として培養する。植物を、環境調節された生育チャンバ中、２０℃および７０％湿度で生育させる。植物処置剤の適用時は、植物は約１４日齢である。単一植物のユニットに、殺菌剤標準物質または実験植物処置剤を表面流去点まで噴霧する。
【００９２】
植物処置剤適用の２４時間後、続いて、トマト植物に真菌植物病原体の胞子を接種し、適切な条件下で目視で疾患の症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。
【００９３】
トマト疫病の接種は、フィトフトラ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（トマト疫病の原因因子）の胞子懸濁液による。接種後、植物を飽和大気中に２４時間保持し、続いて、２０℃および７０％湿度でさらに７日間生育させる。疫病感染植物は疾患段階の時点で２０日齢である。
【００９４】
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する遺伝子導入タバコ植物に感染するために使用する乾燥スクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）感染完熟インゲンマメ（ｄｒｙ　ｂｅａｎ）の花部は、次のようにして作製する。５週齢の完熟インゲンマメ植物（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、「ガーデンブッシュ」赤インゲンマメ）の花を収穫し、湿潤させたろ紙を含有する１５０×１５ｍｍのペトリ皿に配置する。Ｐｒｅｖａｌ（登録商標）を使用して、花部に、２，０００胞子／ｍＬを含有するスクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）の胞子懸濁液を接種する。接種された花部を含有するペトリ皿を密封し、２０℃インキュベーターに４８時間貯蔵し、花部感染を開始する。得られる感染花部を２４℃で２４時間空気乾燥させ、使用時まで密封されたペトリ皿中に４℃で貯蔵する。
【００９５】
トマト種子（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍまたはキサンチ（Ｘａｎｔｈｉ））（野生型および３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯＳ３’Ｔ２作製物（プラスミド地図に関する図３および以下のセクションＣを参照のこと））を、環境調節された生育チャンバ内、２４℃で、３％ショ糖、および遺伝子導入用に１００μｇ　ｍＬ−１カナマイシンおよび１００μｇ　ｍＬ−１カルベニシリンを含有する１×ＭＳ培地を有する寒天培地上で発芽させる。約１０日齢の苗を土壌に移し、温室条件下で生育させる。８週齢植物への接種は、２つの乾燥スクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）感染完熟インゲンマメ（ｄｒｙ　ｂｅａｎ）の花部を、予め湿潤させたタバコのそれぞれの葉に配置することによる。感染を促進させるために、植物を２０℃デューチャンバに４８時間移し、その後植物を画像処理する。
【００９６】
Ｂ．３５Ｓ：：ルシフェラーゼ遺伝子導入タバコの構築
ｐＳＬＡ２プラスミドの略図を図３に示す。該プラスミドは、プラスミドｐＭＬ０８９由来のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子由来プロモーター配列を含有する約１．４ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ／Ｎｃｏ　Ｉ断片をプラスミドｐＳＬＡ１にクローン化し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子ＬＵＣ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）、続いてｐＫＳ　ＩＩ−Ｂｌｕｓｃｒｉｐｔプラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）中のＮＯ３’ポリＡ追加配列に融合させることによって構築する。ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯ３’レポーターを約３．３ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ／Ｓａｌ　Ｉ断片としてバイナリーベクターｐＺＢＬ１Ｎにサブクローン化する。プラスミドの構造を、制限酵素消化および電気泳動後の断片のサイズマッピングによって確認し、制限酵素クローン化部位に隣接する配列に基づいて設計されているプライマーを使用して配列決定することにより、すべてのクローン化接続部を確認する。
【００９７】
標準的なプロトコル（アネットら（Ａｎ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８，　Ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒｓ，　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ａ３　（Ｇｅｌｖｉｎ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，　Ｒ．　Ｅｄｓ），　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従い、細菌のコンピテントストックを形質転換することによって、バイナリープラスミドｐＳＬＡ２をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４に可動させる。Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ）Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）に変更を加えて使用し、液体細菌培養液から単離したプラスミドの制限酵素消化分析によって、形質転換されたアグロバクテリウム株のプラスミド構造を確認する。３％ショ糖を含有する固体ＭＳ培地の滅菌培養物中に維持されたタバコ植物葉の切片を、標準的な技術（ホーチら（Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．）１９８８，　Ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ａ５　（Ｇｅｌｖｉｎ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，　Ｒ．　ｅｄｓ），　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に従って形質転換する。形質転換されたカルス組織を、２００μｇ　ｍＬ−１カナマイシンおよび５００μｇ　ｍＬ−１カルベニシリンを含有する固体ＭＳ培地上で選択する。再生発芽株を、３％ショ糖、１００μｇ　ｍＬ−１カナマイシンおよび５００μｇ　ｍＬ−１カルベニシリンを含有する固体ＭＳ培地上で選択する。続いて、ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯ３’融合体を担持する耐性Ｔ１（初代形質転換体）植物を、温室条件下、土壌中で成熟期まで生育させ、Ｔ２種子を回収する。
【００９８】
Ｃ．ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ発現マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）株ＭＧ６１９の構築
ＦＰ発現マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）株の構築は、以下に記載の通りに行われる。「コンプロ」（何故なら、該シリーズのすべてのプラスミドは、プロモーターの３’末端に共通の２０ｂｐ配列を有するからである）と呼ばれる一連のプラスミドは、当業者に周知である標準的な分子生物学技術に従って構築する。そのようなプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づき、「コンプロ」配列を有する真菌プロモーター、（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）β−チューブリン転写ターミネーター、真菌選択のためのビアラホス耐性遺伝子、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｔｒｐ　１、および２μｍ酵母の複製開始点を含有する。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）ＲＰ２７（またはＰ２）リボソームタンパク質プロモーターを含有するバージョンは、ｐＳＭ３２４である。プラスミドｐＳＭ３２４はＸｈｏ　Ｉで消化し、５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填する。本発明において使用されるのは、ＦＰ’ｓ、ならびにＥＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎＦＰ（両方ともクロンテックラボラトリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）より市販されている）およびｒｓＧＦＰ（クアンタムバイオテクノロジー（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃｓ，　Ｉｎｃ．　Ｍｏｎｔｒｅａｌ，　Ｑｕｅｂｅｃ，　Ｃａｎａｄａ）より市販されている）などの野生型ＧＦＰと比較して、増強された蛍光収量をもたらすように操作されたＦＰ’ｓの変異体である。ＧＦＰ発現ベクターを作製するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ＦＰ配列のそれぞれの末端に対して設計された５’および３’プライマーならびにＸｈｏ　Ｉ部位に隣接するｐＳＭ３２４配列に相同でありかつ相同組換えに十分な配列伸長によって、ＦＰコーディング配列を増幅する。クロンテックＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ配列に対して設計されたプライマー「Ｚｓｇｒ５」（ＡＧＧＡＡＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣ）および「Ｚｓｇｒ３」（ＡＡＴＧＴＴＧＡＧＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧ）は、Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）においてＧＦＰを発現させるためのベクターの構築に使用することができる。次いで、Ｚｓｇｒ５／Ｚｓｇｒ３増幅産物およびＸｈｏ消化ｐＳＭ３２４は、酢酸リチウム法（アガテップら（Ａｇａｔｅｐ　ｅｔ　ａｌ．）１９９８）によってサッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｗ３０３−１Ａに形質転換して、プラスミドのギャプ修復を可能にする。酵母のコロニーは、トリプトファンを含有しないプレート上で選択する。プラスミドミニプレップは、酵母トリプトファンプロトトロフおよびエレクトロポレーションによって大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に形質転換されたアリコート上で実施する。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）形質転換体から調製し、Ｚｓｇｒ５／Ｚｓｇｒ３増幅産物のｐＳＭ３２４への適切なギャップ修復のための制限酵素消化によってスクリーニングして、ＦＰ発現ベクタ��ｐＳＭ６１９（図９）を作製する。ＦＰ発現ベクターｐＳＭ６１９は、公開された形質転換プロトコル（スウェイガードら（Ｓｗｅｉｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）１９９２）を使用して、Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）４０９１−５−８株へ形質転換することができる。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）のビアラホス耐性形質転換体を選択し、単一胞子選択（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｐｏｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって精製する。蛍光強度について独立した形質転換体をスクリーニングし、さらなる使用のために並外れて明るい形質転換体ＭＧ６１９を選択する。
【００９９】
Ｄ．画像処理：蛍光
蛍光に対して画像処理しようとするサンプルまたは対照を、ドア、励起用光源、対照画像獲得用の白色光源、ならびにＮｉｋｋｏｒ（登録商標）　ＡＦ３５ｍｍ　ｆ２レンズ（ニコン（Ｎｉｋｏｎ，　Ｉｎｃ．）Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，　Ｎ．Ｙ．）および適切な励起フィルターを装備した冷却ＣＣＤカメラを含有する遮光チャンバに配置する。ＳｅｎＳｙｓ（登録商標）１４０１Ｅカメラシステム（ローパーサイエンティフィック（Ｒｏｐｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、（Ｔｕｃｓｏｎ，　ＡＺ）より市販されている）を使用して、画像データを得る。（図１を参照のこと）。
【０１００】
多くの植物サンプルは処置および感染の時点から有意な生育を経験し、２〜３の新たな葉を同化するため、解析しようとするサンプルから新たな生育部分を排除するための工程を行う。典型的に、ヒト記録者は、以前から評価対象としているときの視野以外に新たな生育については伏せておくかまたは別に確保しておく。本発明の画像化アプリケーションによる識別について同じレベルを達成するために、検出フィールドへの配置の直前に、はさみで物理的に切り出すことによって、新たな生育部分を除去する。あるいは、ソフトウェアアプリケーションを使用して、画像の目的の領域を規定し、新たな生育部分の物理的に除去する必要性を消去することができる。
【０１０１】
弱い白色光照明下のサンプルにより対照画像を入手し、選択された期間、典型的に１００ミリ秒間に光子を集積することによって、作成する。視野内のそれそれの対象およびピクセル内におけるそのそれぞれの領域によって規定されるバイナリー画像を作成するために、ピクセル強度の閾値を調整して、典型的に６０のピクセル強度でサンプルまたはバックグランドに関するピクセルを区別する。
【０１０２】
蛍光データは、励起光の存在下で得られる。ＦＤＡ誘導性および緑色蛍光タンパク質誘導性蛍光（例えば、ＧＦＰ−またはＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ誘導性蛍光）の画像化では、励起のために、光学密度（ＯＤ）５ブロッキングならびに４７５ｍｍおよび４０ｎｍ半値全幅伝達（ＦＷＨＷ）を有するＸＦ１０７３フィルターを使用する。ＡＥＬＰ（α−ε長路）エッジ、５３５ｎｍ中央波長（ＣＷＬ）および４５ｎｍＦＷＨＷを有する増強されたＸＦ３０８４フィルターを、照射のために使用する。クロロフィル蛍光の画像化では、ＯＤ５ブロッキングならびに４３０ｎｍＣＷＬおよび４０ｎｍＦＷＨＷを、励起のために使用する。すべてのフィルターは、オメガオプティカル（Ｏｍｅｇａ　Ｏｐｔｉｃａｌ，　Ｉｎｃ．）Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，　ＶＴ．　　Ｉｍａｇｅｓより入手する。画像は、選択された期間、典型的に２秒間に光子を集積することによって作成される。ピクセル強度に対する閾値を調整して、典型的に６０の値に対し、ＬＧＭおよびサンプルバックグランドに関するピクセルを区別する。
【０１０３】
サンプルに対する疾患領域％を決定するために、視野内のそれぞれの対象に対するＬＧＭに関するピクセルの面積によって規定されるバイナリー画像を作成する。疾患領域パーセントは、ＬＧＭ領域の領域のピクセル数をサンプル領域のピクセル数で割ることによって算出される。植物基材に内因性のＬＧＭを検出するには、疾患領域パーセントを算出するために、全葉面積から蛍光面積を差し引き、次いで、全葉面積で割るさらなる工程が必要である。
【０１０４】
蛍光シグナルを集積することによって疾患生物体の蓄積量を決定するために、ＳｅｎＳｙｓカメラシステムを使用するために励起光源および上記の放射フィルターを装備したＨａｍａｍａｔｓｕ　Ｃ２４００光子検出器システムを使用して、サンプルを画像化した。典型的に、選別装置を２０に設定し、感度（カメラゲイン）を１に設定し、そして蛍光シグナルは１０秒間に集積する。蛍光画像におけるそれぞれのピクセルの蛍光シグナル強度を、目的の規定された領域（典型的に、マイクロタイタープレートのウェルによって規定される面積）について合計し、単位面積に基づいて報告される。対照画像は、弱い緑色照明下で典型的に６４フレームを集積することによって収集される。
【０１０５】
グレースケール画像として対照および蛍光画像データを得ることができる。場合によって、画像プロセッサを使用して、対照および蛍光画像を重ね合わせ、合成画像を形成させることができる。画像をデジタルファイルとして保存し、ファイルをコンピュータに伝送し、コンピュータに接続されたプリンタにファイルを印刷することによって、合成画像のハードコピーを作成される。
【０１０６】
Ｅ．画像化：生物発光
十分な生物発光がサンプルから生成すれば、上記のシステムを使用して、ＳｅｎＳｙｓ（登録商標）検出器を用い、生物発光について画像化しようとするサンプルまたは対象を回収することができる。
【０１０７】
サンプルの対照画像は、弱い白色光を有するエピ−照明（即ち、葉の上面に指向される照明）下で得られ、ＳｅｎＳｙｓ（登録商標）検出器を使用して回収される。生物発光データは、外部光の非存在下で同じ検出器で入手される。
【０１０８】
対照および生物発光画像データは、グレースケールおよびバイナリー画像として得ることができる。画像をデジタルファイルとして保存し、ファイルをコンピュータに伝送し、コンピュータに接続されたプリンタにファイルを印刷することによって、合成画像のハードコピーを作成される。
【０１０９】
実施例１
前ＬＧＭで処置した疾患生物体由来の光子放出を検出すること、および植物基材に感染させること（実施態様Ｉ）−疾患領域の決定
試験単位を前ＬＧＭで処置し、そして光子放射を検出することによって、疾患生物体に感染した植物に対する植物処置剤の有効性を決定する。上記のように培養したオオムギ植物に、４０、５、１、０．４および０．２ｐｐｍフルシダゾールを含有する予防処置の１２５μＬ噴霧適用を施す。植物処置剤は、６μＬのＤＭＳＯ中に適切な量の乾燥化合物を再懸濁して、１晩振盪し、続いて５７０μＬの５０／５０アセトン／水−Ｔｒｅｍ溶液を添加して、所望の濃度を得ることによって調合される。水−Ｔｒｅｍは、水１Ｌあたり１８滴のＴｒｅｍ（登録商標）０１４界面活性剤（ヘンクル（Ｈｅｎｋｅｌ　Ｃｏｒｐ）Ａｍｂｅｒ，　ＰＡ）を含有する。調合された植物処置剤は葉噴霧アプリケーションとして適用される。本実施例では、回転している静電的に帯電した垂直の植物標的に、空気の補助により超音波噴霧器の頂部から細密なエアゾルミストを適用するマイクロ噴霧装置（米国特許出願番号６０／１７２９２８号）を用いる。
【０１１０】
植物処置剤適用の２４時間後、続いて、オオムギ植物に、ウドン粉病（エリシフェ　グラミニス　エフ．スピー．ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ　ｆ．　ｓｐ．　ｈｏｒｄｅｉ））の胞子懸濁液を、目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、接種する。非処置植物もまた、非処置、感染コントロールの生成のためにこの時間に感染させる。非処置、非感染コントロール植物も平行して作製する。
【０１１１】
殺菌活性を評価しようとする植物は、まず、目視で疾患が及んでいる％を評価する。続いて、同じサンプルを前ＬＧＭフルオレセイン二酢酸で処置する。ＦＤＡを、１ｍｇＦＤＡ／ｍＬアセトンでストック溶液中に調合する。５μｇ／ｍＬフルオレセイン二酢酸および０．００５％Ｔｒｅｍ（登録商標）０１４を含有する最終作用溶液を調製する。Ｐｒｅｖａｌ（登録商標）噴霧器（プレサイジョンバルブコーポレーション（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｖａｌｖｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），　Ｙｏｎｋｅｒｓ，　Ｎ．Ｙ．）を使用し、すべての表面が湿潤するように十分な溶液をサンプルに噴霧することによって、ＦＤＡ作用溶液を適用する。ＦＤＡが葉の切断部または摩削面に接近しないように考慮しなければならない。ろう質の葉の表皮にこのような裂傷があるとＦＤＡは葉の維管束系の木質流に接近することができ、葉全体が迅速にＦＤＡで標識され、ＦＤＡにより病原体の特異な染色が妨げられる。ＦＤＡの取り込みおよびＦＤＡのフルオレセインへの変換に十分な時間、典型的に５分間の後、処置および感染後に生育させた植物組織を物理的に取り出し、サンプルを画像化システムの暗箱に配置する。対照および蛍光画像データを上記のように回収し、疾患領域の決定のために処理する。光子放出に基づいて行われる決定の再現性を評価するために、画像の回収プロセスおよび解析を連続的に１０回反復する。
【０１１２】
対照および蛍光データのグレースケールおよびバイナリー画像を図４に示す。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、白色光対照照明下で回収した植物サンプルのグレースケールおよびバイナリー画像を示し、図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ、蛍光励起条件下で回収した同じ材料のグレースケールおよびバイナリー画像を示す。植物１は、非処置、非感染コントロールである。植物２〜６は、感染前に４０、５、１、０．４および０．２ｐｐｍフルシダゾールで処置されている。目視評価から得られたかまたは光子放射に基づく疾患領域％の比較をチャート１に示す。裸眼で評価した植物は、０．５単位の増加で０〜５の尺度で評価する。５のスコアは５２％疾患領域に対応し、目視評価では最大のウドン粉病疾患領域が割り当てられる。チャートに例示されているように、両蛍光および目視評価方法から得られるデータでは、比較可能な結果が得られているが、蛍光による光子放射の検出による疾患領域の決定の方が目視評価方法よりも感度が高い。
【０１１３】
【表３】
2004506879.tif 000005
【０１１４】
光子放射に基づく測定値の再現性を図５に示す。図５Ａは、オオムギに感染したエリシフェ　グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈａｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）の５つの葉サンプルについて画像化によって決定され、裸眼で５２％疾患領域を有すると評価されている葉表面の（Ｙ軸に対する）画分としての疾患領域を表す。サンプルは、ＰＬＧＭフルオレセイン二酢酸による特異染色によって蛍光性にする。それぞれのサンプルを画像化チャンバに配置し、この１回の配置に対し連続で１０回の増加処理を行った（Ｘ軸に対して）。図５Ａに示されるように、画像化によって決定された５つのサンプルに対する疾患の測定値は、（目視評価で５２％であるのに対し）平均で６４〜８４％の範囲であるが、値は、反復した測定値に対する５つのサンプルのそれぞれについて高い再現性を示す。図５Ｂは、疾患領域％（Ａ）、ＬＧＭ領域（Ｂ）および葉領域（Ｃ）の装置自体の測定値の変動率（Ｙ軸）（５Ａと同様に測定した）ならびに疾患領域％（Ｄ）、ＬＧＭ領域（Ｅ）および葉領域（Ｆ）の典型的な操作条件下での測定値の変動率（典型的な操作条件下での変動率を決定するために同じサンプルを連続して１０回が増加チャンバに配置し、配置の度に画像化処理を行った）を示す。装置のみに起因し得る疾患領域に対する変動パーセントの決定値は約１．２５％である。光子放射以降に予想されるＬＧＭ領域の測定値から生じるこの変動のほとんど（約１％）は推計学的プロセスである。疾患領域決定値に対する変動パーセントは、典型的な操作条件下では約４％に増加し、画像化チャンバ内のサンプルの配置およびカメラに対する配向の変動率に反映している。これらのデータから、光子画像化の正確さは約４％の変動率を有すると見積もられる。従って、本発明の画像化方法は、典型的な操作条件下であっても植物処置剤の有効性を決定するための疾患領域％に対し統計的再現性が強健かつ高度な測定値を提供する。
【０１１５】
実施例２
前ＬＧＭで処置して疾患生物体由来の光子放射の検出（実施態様Ｉ）−光子放出の集積および疾患生物体蓄積の決定
基材（即ち、マイクロタイタープレートのウェル内に含有される増殖培地）を前ＬＧＭで処理し、光子放射を検出することによって、マイクロタイタープレートのウェル内の液体培養物における疾患生物体に対する植物処置剤の有効性を決定する。
【０１１６】
９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内に含有される１ウェルあたり２００μＬの液体生育培地および（存在すれば）植物処置剤中でマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａ　ｇｒｉｓｅａ）を培養する。Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）の基本塩培地の組成は（１リットルあたり）：３．０ｇ　Ｋ２ＨＰＯ４、４．０ｇ　ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ　ＮａＣｌ、１．０ｇ　ＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ　ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、１μｇ　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２μｇ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２μｇ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２μｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１μｇ　Ｎａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．６μｇ　ＣｏＳＯ４、０．８μｇ　Ｈ３ＢＯ３、０．０１μｇビオチン、２０ｇグルコース、および５０μＬ　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０界面活性剤である。植物処置剤を生育培地と組み合わせて所望する最終濃度を達成する。本試験では、カラム１は、ＤＭＳＯ希釈液のみで処置したコントロールから成る。カラム２〜６は、それぞれ以下の１：３系列希釈（開始濃度をｐｐｍで示す）：ＭＢＣ（５）、フルシラゾール（２）、ファモキサゾン（２）、アゾキシストロビン（２）およびキャプタン（５）で処置する。同じ処置をカラム７〜１２で反復する。ウェルに上記の培地中２００μＬのＭ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）胞子懸濁液を７５，０００胞子／ｍＬの濃度で接種する。培養を暗所２２℃で維持する。真菌の培養は７日間増殖させる。
【０１１７】
殺菌剤活性を評価しようとする植物を、まず、６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定するためのプレートリーダーを使用して従来的に評価する（図６Ｃを参照のこと）。続いて、サンプルを前ＬＧＭフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）で処置する。上記の実施例１のように調合したＦＤＡを、１ウェルあたり２０μＬピペッティングすることにより本実施例において適用し、または所望するすべてのウェルを処置するのに十分な溶液をマイクロタイタープレートに噴霧することによって適用してもよい（処置を所望しないウェルはマスクするかまたはそれらのウェルへの処置を防止するような噴霧を指向してもよい）。カラム１〜６をＦＤＡで処置し、カラム７〜１２はＦＤＡで処置しない。ＦＤＡの取り込みおよびＦＤＡのフルオレセインへの変換に十分な時間、典型的に５分間の後、サンプルを画像化システムの画像化チャンバに配置する。Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｃ２４００光子検出器（上記）を使用して、上記のように対照および蛍光画像データを回収し、各ウェルからの光子放射について処理する。
【０１１８】
図６に蛍光データのグレースケール画像を示す。正規化された光子カウントをカラム１〜６について図６Ｂに示す。カラム７〜１２の光子カウントの読みを０としたため、表には示していない。図６Ｃは正規化した６５０ｎｍでのＯＤデータを示す。光子カウントおよびＯＤ６５０ｎｍデータの両方を、カラム１のコントロールのそれぞれの測定値の平均値に対して正規化し、２種類の測定から得られるデータの比較を容易にできるようにした。光子カウントとＯＤ測定値との比較は、それらの方法が比較可能な結果を出していることを示す。
【０１１９】
実施例３
疾患生物体由来の光子放射の検出、内因性ＬＧＭのカウントおよび植物基材への感染（実施態様ＩＩ）−疾患領域の決定
植物に感染した疾患生物体に内因性であるＬＧＭ由来の光子放射は、以下のようにして検出される。ＦＰまたは増強された蛍光収量が得られるように操作されたＦＰ変異体（例えば、ＧＦＰ）を発現するマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａ　ｇｒｉｓｅａ）の遺伝子導入株の胞子懸濁液をオオムギ植物に接種し、上記のように、適切な条件下で目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。同時に、非感染植物および野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）のコントロールを作製する。植物からクリッピングすることによって感染された葉を物理的に取り出し、続いて、ＦＰ蛍光についてサンプルを画像化する。上記のように対照および蛍光画像データを回収する。
【０１２０】
ＦＰ　Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）株由来の蛍光は、野生型病原体による感染時に誘導される内因性植物ＬＧＭのバックグランド蛍光上で容易に検出される。
【０１２１】
実施例４
疾患生物体由来の光子放射の検出、内因性ＬＧＭのカウントおよび植物基材への感染（実施態様ＩＩ）−光子放射の集積および疾患蓄積の決定
疾患生物体に内因性のＬＧＭ由来の光子放射を集積し、疾患の蓄積を決定することによって、疾患生物体に感染した植物に対する植物処置剤の有効性を決定する。本実施例は、通常の目視評価を実施することができな環境下で内因性の蛍光を測定することによって真菌疾患を定量することを例示する。
【０１２２】
本発明を使用して有効な植物処置剤を検出する能力の例を実証するために、エラグロスティス　カルブラ（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ　ｃｕｒｖｕｌａ）を上記のように深底ウェルのマイクロタイタープレートで生育させる。５ｐｐｍの市販の殺菌剤トリシクラゾールを含有する予防処置の系統的アプリケーション（種子形成前に植物処置剤で予め処置した培地を有するウェル）を、２つのカラム（非処置、接種コントロールとする）を除く植物のすべてのカラムにおいて作製する。上記のように、ＦＰ（例えば、増強された蛍光収量が得られるように操作されたＧＦＰ変異体）を発現するＭ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）株の胞子懸濁液を植物に接種し、インキュベートする。植物を、上記のようにＦＰ蛍光について画像化する。種子形成前にトリシクラゾールで予め処置した培地を有するウェル中の植物は、非処置、接種されたコントロールカラムで観察された蛍光と比較して低い蛍光を示し、疾患症状が抑制されていることに相関する。サンプルの過剰な種子形成およびウェル内の植物が垂直に生育する習性により裸眼での評価が妨げられるため、定量化のための目視評価はこのような形式では不可能である。蛍光光子放射の検出により、この病原体に対して有効な市販の殺菌剤による制御を検出する高感度な手段が提供される。プレート形式で植物試験全体に対する殺菌剤活性を検出し、そして評価する能力は、いくつかの潜在的利点を提供する。そのような試験は、宿主−病原体相互作用の破壊を検出する能力を維持し、化合物の必要性を減少し、自動化することができ、そしてアッセイ処理量の増加を提供することができる
【０１２３】
実施例５
植物基材の非感染領域に局在する内因性の植物ＬＧＭ由来の光子放射の検出（実施態様ＩＩ）−疾患領域の決定
植物基材に内因性のＬＧＭ由来の光子放射を検出することによって、疾患生物体に感染した植物に対する植物処置剤の有効性を決定する。上記のように培養したトマト植物に、２０、５、１および０ｐｐｍのリドミルを含有する予防処置の１２５μＬ噴霧適用を施す。植物処置剤は上記の実施例１に記載のように調合され、適用される。
【０１２４】
植物処置剤の適用２４時間後、続いて、トマト疫病の原因因子であるフィトフトラ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の胞子懸濁液をトマト植物に接種し、上記のように、適切な条件下で目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。非処置、非感染コントロール植物も平行して作製する。
【０１２５】
殺菌剤活性を評価しようとする植物は、まず、目視で疾患が及んでいる％を評価する。次いで、処置および接種後に育成させた植物組織を物理的に取り出し、続いて、サンプルをクロロフィル蛍光について画像化する。上記のように参照および蛍光画像データを回収し、そして疾患領域の決定のために処理する。
【０１２６】
参照および蛍光データのグレースケールおよびバイナリー画像を図７に示す。カラム１〜３は、２０、５および１ｐｐｍのリドミルで処置し、Ｐ．インフェスタンス（Ｐ．　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）を接種した葉の画像を示す。カラム４は非接種および非処理の葉である。Ｐ．インフェスタンス（Ｐ．　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）を接種した葉および非処置の葉は重度の壊死を患い、しばしば葉が脱離する（例示せず）。図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、白色光対照照明下で回収した植物サンプルのグレースケールおよびバイナリー画像を示し、図７Ｃおよび７Ｄは、それぞれ、蛍光励起条件下で回収した同じ材料のグレースケールおよびバイナリー画像を示す。目視評価から得られたかまたは光子放射に基づく疾患領域％の比較をチャート２に示す。蛍光および目視評価方法の両方から得られたデータは、光子放射の検出および目視評価により比較可能な結果が得られたことを示す。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
実施例６
内因性ＬＧＭを発現するように操作された植物基材の非感染領域由来の光子放射の検出（実施態様ＩＩ）−疾患領域の決定
内因性のＬＧＭを発現するように操作され、疾患生物体に感染した植物由来の光子放射は、以下のようにして検出される。上記のように生成および培養した８週齢３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯ３’タバコ植物上の単一葉の２面にスクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）を感染させ、上記のように、適切な条件下で目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。非接種コントロール植物も平行して作製する。
【０１２９】
続いて、ホタルルシフェリン（生物発光の基質）の投与後、サンプルをルシフェラーゼ生物発光について画像化する。ホタルルシフェリンは、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ）Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ製のカリウム塩として入手可能である。植物の感染およびコントロール葉に、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（登録商標）界面活性剤を含有するルシフェリン水溶液を２時間、表面流去が認められるまで３回噴霧する。ルシフェリンの取り込みに十分な時間後、典型的には最後のルシフェリン投与の１０分後、植物の個々の葉を取り出し、画像化チャンバ内に配置する。対照および生物発光画像データを上記のように回収する。平坦床盤参照光源（図１、素子１５を参照のこと）（例えば、スコット−フォスティック（Ｓｃｈｏｔｔ−Ｆｏｓｔｅｃ）Ａｕｂｕｒｎ，　ＮＹ）を有するバックライト照明下で第２の対照画像を得ることができる。バックライト画像は、エピ照明下では明確にならないスクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）感染区域の局在に関する空間的対照を提供する。
【０１３０】
生物発光のグレースケールおよびバイナリー画像を図８に示す。カラム１は非接種ｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯ３’タバコ葉を示し、カラム２はスクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）を接種したｐ３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯ３’タバコ葉を示す。列Ａはエピ証明下で回収された対照画像を示し、列Ｂはバックライト証明下の同じ葉を示し、列Ｃは生物発光のグレースケール画像を示し、そして列Ｄはバイナリー画像を示す。病原体に感染したタバコ植物の領域は生物発光性ではなく、画像化システムで容易に検出される。
【０１３１】
実施例７
内因性ＬＧＭを発現するように操作された疾患生物体由来の光子放射の検出（実施態様ＩＩ）−光子放射の集積および疾患生物体蓄積の決定
光子放射を集積し、疾患蓄積を決定することによって、内因性ＬＧＭを発現するように操作され、マイクロタイタープレートのウェル内の液体培養物において増殖させた疾患生物体に対する植物処置剤の有効性を決定する。上記のようにＦＰ（例えば、ＧＦＰ）を発現するように操作された遺伝子導入マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）を液体増殖培地で培養し、実施例２に記載のように処置し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに含有させる。続いて、サンプルを画像化システムの暗箱に配置する。参照およびＦＰ蛍光画像データを上記のように回収し、各ウェル由来の光子放射を処理する。
【０１３２】
実施例８
内因性ＬＧＭを含有する疾患生物体由来の光子放射の検出および植物基材への感染（実施態様ＩＩ）−疾患領域の検出
植物に感染した疾患生物体に内因性のＬＧＭ由来の光子放射は、次のようにして検出する。オオムギ植物に、ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰを発現するマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）の遺伝子導入株（ＭＧ６１９）の胞子懸濁液を接種し、上記のように、適切な条件下で目視で疾患症状の発達を確認することができる十分な期間、インキュベートする。非感染植物および野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）を感染させた植物を同時に作製する。植物からクリッピングすることによって感染させた葉を取り出し、続いて、ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ蛍光についてサンプルを画像化する。対照および蛍光画像データを上記のように回収する。
【０１３３】
対照グレースケールおよび蛍光グレースケール画像をそれぞれ図１０ＡおよびＢに示す。カラムＡは非接種葉を示し、カラムＢは野生型Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）を接種した葉を示し、そしてカラムＣはＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰを発現するＭ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）（ＭＧ６１９株）を接種した葉を示す。ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ　Ｍ．グリセア（Ｍ．　ｇｒｉｓｅａ）は、野生型病原体の感染時に含まれる内因性植物ＬＧＭのバックグランド蛍光上で容易に検出される。
【０１３４】
実施例９
内因性ＬＧＭを発現するように操作された疾患生物体由来の光子放射の検出（実施態様ＩＩ）−光子放射の集積および疾患生物体蓄積の決定
光子放出を集積し、そして疾患の蓄積を決定することによって、内因性ＬＧＭを発現するように操作され、マイクロタイタープレートのウェルの液体培養物中で増殖させた疾患生物体に対する植物処置剤の有効性を決定する。上記のようにＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰを発現するように操作された遺伝子導入マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）ＭＧ６１９株を、上記の方法と同様の方法で、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内に含有される植物処置剤を有するまたは有さない液体増殖培地で培養する。
【０１３５】
殺菌剤活性を評価しようとする植物は、まず、従来通りプレートリーダーを使用して、６５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定する（図１１Ｃを参照のこと）。Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｃ２４００光子検出器（上記）を使用して、上記のように対照および蛍光画像データを回収し、各ウェルからの光子放射について処理する。
【０１３６】
蛍光データのグレースケール画像を図１１Ａに示す。正規化された光子カウントを図１１Ｂに示す。図１１Ｃは正規化された６５０ｎｍでのＯＤデータを示す。光子カウントおよびＯＤ６５０ｎｍデータの両方を、カラム１のコントロールのそれぞれの測定値の平均値に対して正規化し、２種類の測定から得られるデータの比較を容易にできるようにした。光子カウントとＯＤ測定値との比較は、それらの方法が比較可能な結果を出していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】光発生部分を検出するためのマクロ画像システムの線図を示す。
【図２】内因性のＬＧＭである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する疾患生物体を作製するためのマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）の形質転換に使用することができるプラスミドの地図を示す。
【図３】内因性のＬＧＭであるホタルルシフェラーゼを発現する植物基材を産生するタバコの形質転換に使用することができるプラスミドｐＳＬＡ２の地図を表す。
【図４】実施例１に関し、オオムギに感染し、ＰＬＧＭ、フルオレセイン二酢酸による分染によって蛍光を生じるエリシフェ　グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈａｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）（ウドン粉病）に対する市販の殺菌剤であるフルシラゾールによる処置の効果の画像検出を表す。
【図５】実施例１に関し、植物疾患の程度の検出および測定のための光放射の使用について装置および操作の変動性に関する試験の結果を表す。
【図６】実施例２に関し、マイクロタイタープレートのウェルにおいて生長増殖させ、フルオレセイン二酢酸の添加によって蛍光を生じる植物病原体マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）に対する市販の抗真菌剤による処置の効果を表す。
【図７】実施例５に関し、トマトに感染し、内因性のＬＧＭ葉緑素由来の蛍光を検出することによって測定されるフィトフトラ　インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する市販の殺菌剤であるリドミルによる処置の効果を表す。
【図８】実施例６に関し、摘出した非感染３５Ｓ：：ＬＵＣ：：ＮＯＳ３’タバコ葉、およびスクレロティニア　スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）を感染させた葉由来の生物発光の検出ならびに分布を表す。
【図９】実施例８および９に関し、内因性のＬＧＭである岩礁サンゴ緑色蛍光タンパク質（ｒｅｅｆ　ｃｏｒａｌ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ）を発現する疾患生物体を作製するためのマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）の形質転換に使用することができるプラスミドｐＳＭ６１９の地図を表す。
【図１０】実施例８に関し、対照ならびにオオムギに感染させたマグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）病原体株ＭＧ６１９の検出および分布を表す蛍光画像を表す。
【図１１】実施例９に関し、ＺｓＧｒｅｅｎ　ＦＰ蛍光タンパク質の発現によって蛍光を生じ、マイクロタイタープレートのウェルにおいて生長増殖させた植物病原体マグナポルテ　グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）に対する市販の殺菌剤による処置の効果を表す。
【図２】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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