(57)【要約】リステリオリシンの非溶血切断型または原核生物から由来したＰＥＳＴ様アミノ酸配列への融合により、抗原の免疫原性を増強するための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原の免疫原性を増強するための方法であって、抗原に、リステリオリシンＯの非溶血性切断型を融合させることを含む、前記方法。
【請求項２】
リステリオリシンの非溶血性切断型が、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が、配列番号１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リステリオリシンＯの非溶血性切断型を、抗原に、リステリオリシンＯの切断型をコードするプラスミドおよび抗原の組み換え発現により融合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
増強された細胞媒介免疫性および抗腫瘍免疫性を有する組成物であって、抗原に融合されたかまたは抗原内に包埋された、原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む、前記組成物。
【請求項６】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が、リステリア種から由来する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が、リステリア・モノサイトジェネスから由来する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が、配列番号１を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ＰＥＳＴ様配列が、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
動物における抗原に対する増強された細胞媒介または抗腫瘍免疫原性応答を引き起こす方法であって、動物に、請求項５に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
抗原に対する増強された細胞媒介または抗腫瘍免疫原性応答を引き起こすためのワクチンであって、請求項５に記載の組成物を含む、前記ワクチン。
【請求項１２】
補助剤をさらに含む、請求項１１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
導入
本発明は、部分的に、米国政府からの資金により支持されており（ＮＩＨグラント第ＣＡ６９６３２号）、従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
免疫応答の刺激は、ホスト免疫系により異物であると認識された抗原の存在に依存する。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ）およびマイコバクテリウム・ブービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）ＢＣＧなどの細菌抗原は、ファゴソーム中に残留し、ＣＤ４Ｔ細胞を、主要な組織適合性ＩＩ群分子による抗原提示により刺激する。対照的に、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの細菌抗原は、ファゴソームから細胞質中に進出する。リステリア・モノサイトジェネスのファゴリソソーム逃散は、リステリア抗原の主要な組織適合性Ｉ群抗原提示を促進する独特な機構である。この逃散は、孔形成スルフヒドリル活性化細胞溶解素であるリステリオリシン（ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）Ｏ（ＬＬＯ）に依存する。
【０００３】
リステリア・モノサイトジェネスの、ホスト細胞内の空胞を破壊し、細胞質に進入する能力が、その組み換えワクチンとしての使用をもたらした。米国特許第５，８３０，７０２号には、感染したマクロファージおよび他の細胞の細胞質における外来の抗原を発現するために遺伝子的に作成された、リステリア種の減弱した突然変異体を含むワクチンが記載されている。リステリア種における抗原を発現するためのいくつかの方法が記載されており、これには、選択された外来の抗原およびリステリアタンパク質の融合タンパク質、好ましくは、ホスト空胞の溶解に伴われる酵素の発生が含まれる。特に、リステリア・モノサイトジェネスへの全体のコード形質転換にフレーム中に（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合した、ＬＬＯのｈｌｙプロモーターおよび第１の４１６個のアミノ酸をコードする融合タンパク質は、ＬＬＯおよびＮＰに対する抗血清と反応する、１０５ｋＤＡタンパク質を分泌することが例証されている（’７０２号特許の第２４欄）。
【０００４】
リステリオリシンＯおよびＮＰ（ＬＬＯ−ＮＰ）を含む融合タンパク質を分泌する組み換えリステリア・モノサイトジェネスは、ＮＰ特異性Ｉ群制限細胞毒性Ｔ細胞による溶解のための感染した細胞を標的にすることが例証されている。対照的に、ＬＬＯ−ＮＰを発現する溶血素陰性リステリア・モノサイトジェネス株は、ＩＩ群制限方式で、抗原を提示した（Ｉｋｏｎｉｍｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９４ １８０：２２０９−２２１８）。従って、これらの研究から、空胞からの溶血素依存性細菌逃散が、インビトロでのＩ群提示に必要であることが推測された。
【０００５】
リステリア・モノサイトジェネスの逃散機能はまた、バシルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および減弱したサルモネラ種株に転移された（Ｂｉｅｌｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９９０ ３５４：１７５−１７６， Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９５ ６３：４２０２−４２０５）。また、リステリオリシンＯを分泌するサルモネラ・エンテリックおよびマイコバクテリウム・ブービスＢＣＧワクチン担体が、構築された（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｓ．Ｈ． およびＨｅｓｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９９９年１月、６５（１−２）：８１−４）。これらの構築物は、ＭＨＣ  ＩＩ群およびＭＨＣ  Ｉ群経路中に抗原を導入することができ、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方の刺激をもたらすことが教示されている。分泌されたおよび体細胞形態の同一のリステリア抗原を示す、サルモネラ・エンテリカワクチンの比較により、分泌された抗原表示が、体細胞抗原表示よりも優れていることが示された（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｓ．Ｈ．およびＨｅｓｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９９９年１月、６５（１−２）：８１−４）。
【０００６】
ＷＯ ９９／１０４９６には、結核に対するワクチンとして用いるための、改善されたＭＨＣ  Ｉ群制限免疫応答を有する溶血的に活性なｈｌｙを分泌する組み換えＢＣＧ株が開示されている。
【０００７】
リポソーム中に封入された、精製されたリステリオリシンＯの投与はまた、インビボでの種々の種類の細胞内寄生細菌に対する抗原特異性Ｔｈｌ依存性保護免疫性の誘発に有効であることが報告された（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９９年２月、６７（２）：５６８−７５）。真核タンパク質におけるＰＥＳＴ配列は、長く同定された。プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）が豊富であり、一般的に、しかし常にではなく、いくつかの正に帯電したアミノ酸を含むクラスターにより隣接しているアミノ酸配列を含むタンパク質は、迅速な細胞内半減期を有することが教示されている（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６ ２３４：３６４−３６９）。
【０００８】
さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためのユビキチン−プロテオソーム経路を標的にすることが示されている（ＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ ＴＩＢＳ １９９６ ２１：２６７−２７１）。この経路はまた、真核細胞により用いられて、ＭＨＣ  Ｉ群に結合する免疫原性ペプチドを生成し、ＰＥＳＴ配列は、免疫原性ペプチドを生じる真核タンパク質の中で豊富であると仮説されている（Ｒｅａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９４ ３４８：１０９−１１３）。原核タンパク質は、これらがこの酵素的経路を有しないため、通常はＰＥＳＴ配列を含まない。
【０００９】
しかし、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）が豊富であるＰＥＳＴ様配列が、最近、ＬＬＯのアミノ末端において同定され、リステリア・モノサイトジェネスの病原性に必須であることが例証された（Ｄｅｃａｔｕｒ， Ａ．Ｌ．およびＰｏｒｔｎｏｙ， Ｄ．Ａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００ ２９０：９９２−９９５）。ＤｅｃａｔｕｒおよびＰｏｒｔｎｏｙは、ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在が、ホスト細胞のタンパク質分解機構により、分解のためのタンパク質を標的し、従ってＬＬＯが、この機能を奏し、リステリア・モノサイトジェネスのファゴリソソーム空胞からの逃散を容易にした後に、これが、細胞を損傷し得る前に分解されることを教示している。
【００１０】
ここで、抗原に対する免疫応答を、抗原の、リステリオリシンＯの非溶血性切断型（ΔＬＬＯ）への融合により増強することができることが見出された。融合タンパク質の観察された増強された細胞媒介免疫性および抗腫瘍免疫性は、プロセシングのための抗原を標的とするＬＬＯ中に存在するＰＥＳＴ様配列から生じると考えられる。
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、抗原の免疫原性を増強する方法であって、抗原に、リステリオリシンＯの非溶血性切断型（ΔＬＬＯ）を融合させることを含む、前記方法を提供することにある。好ましい態様において、抗原を、リステリア・モノサイトジェネスから由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列に融合させる。
【００１２】
本発明の他の目的は、増強された細胞媒介免疫性および抗腫瘍免疫性を有する組成物であって、原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列に融合された抗原を含む、前記組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらなる他の目的は、動物における抗原に対する増強された細胞媒介または抗腫瘍免疫原性応答を引き起こす方法であって、動物に、原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列に融合した抗原を含む組成物を投与することを含む、前記方法を提供することにある。
【００１４】
発明の詳説
本発明は、選択された抗原の、リステリオリシンＯの非溶血性切断型への融合による、選択された抗原の免疫原性を増強する方法に関する。ここで、リステリオリシンＯの非溶血性切断型への抗原の融合により、抗原単独と比較して、増強された免疫原性を有する抗原が得られることが見出された。抗原に融合されたリステリオリシンＯのこの切断型は、抗原単独と比較して、細胞媒介免疫性および抗腫瘍免疫性を良好に可能にする。さらに、これらの融合タンパク質は、リステリア・モノサイトジェネスにより発現される必要はなく、むしろ、タンパク質発現および単離のためにルーチンに用いられる他のベクターおよび細胞系から発現され、単離されることができる。
【００１５】
リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、コレステロール含有膜に結合し、ここでこれは、オリゴマー化して、孔を形成する。オリゴマー化は、オリゴマー化に必要な配列中の位置４８４における還元されたシスチン残基の存在に依存する。ｈｌｙ遺伝子は、５２９の残基のプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ、登録番号Ｐ１３１２８）をコードし、最初の２５個のアミノ酸は、シグナル配列であり、これが細菌により分泌される際に、ＬＬＯから切断される。従って、全長の活性ＬＬＯタンパク質は、約５０４個の残基である。本発明の目的のために、「ＬＬＯの切断型またはΔＬＬＯ」により、シスチン４８４を含むアミノ末端において活性化ドメインを含まない、ＬＬＯのフラグメントを意味する。
【００１６】
本発明はまた、原核生物から由来したＰＥＳＴ様アミノ酸配列への選択された抗原の融合による、選択された抗原の細胞媒介または抗腫瘍免疫性を増強するための方法および組成物に関する。本発明の目的のために、「ＰＥＳＴ様アミノ酸配列」により、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）が豊富であるペプチドを意味する。好ましい態様において、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、即ちリステリア・モノサイトジェネスの溶血性病原性因子のアミノ酸末端から由来する。一層好ましい態様において、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１）を含む。
【００１７】
増強された細胞媒介免疫性は、抗原およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列、配列番号１を含む切断されたＬＬＯを含む融合タンパク質について例証された。これらの実験において用いられるΔＬＬＯは、シスチン４８４を含む活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されたため、４１６アミノ酸長であった。しかし、活性化ドメインおよび特にシスチン４８４を有しない他のΔＬＬＯはまた、有効であると考えられる。さらに特に、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、配列番号１を含むすべてのΔＬＬＯへの抗原の融合は、抗原の細胞媒介および抗腫瘍免疫性を増強し得ると考えられる。
【００１８】
リステリオリシンＯの非溶血性切断型への融合に続く、抗原の増強された免疫原性を例証した。特に、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、配列番号１を含む、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）株１６  Ｅ７およびリステリオリシンの融合生成物を発現し、分泌するリステリア・モノサイトジェネスベクターが、Ｅ７タンパク質のみを分泌するリステリア・モノサイトジェネスの株よりも、ＨＰＶ不死化腫瘍について、はるかに有効な癌免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）であることを例証する実験を実施した。また、配列番号１のＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む融合タンパク質ＬＬＯ−Ｅ７についての遺伝子を担持する組み換えワクシニアウイルスが、Ｅ７タンパク質のみについての遺伝子を担持するワクシニアの同質遺伝子系統よりも、ＨＰＶ不死化腫瘍について、はるかに有効な癌免疫治療であることを例証する実験を実施した。
【００１９】
対照的に、ＬＬＯのプロモーター、シグナル配列および最初の７個のアミノ酸残基に融合したＥ７抗原を含む短い融合タンパク質Ｌｍ−ＡＺ／−Ｅ７は、無効な抗腫瘍免疫治療であった。この短い融合タンパク質は、ＰＥＳＴ様配列の直前で終了し、これを含まない。実験の最初の組において、ＨＰＶ−Ｅ７抗原を、リステリア・モノサイトジェネスにおいて発現させた。Ｅ７を発現したリステリア・モノサイトジェネス組み換え体を、ｈｌｙプロモーターの制御の下に、およびｈｌｙシグナル配列の導入と共に、Ｅ７遺伝子の染色体統合により作成して、遺伝子生成物の分泌を確実にした。
【００２０】
相同性組み換えによる染色体中への統合の部位は、Ｌｍ病原性に必須ではない領域中であった。このための図式を、図１に示す。このタイプの形質転換を用いた利点は、プラスミド中に含まれて、エレクトロポレーションの後に好首尾な形質転換体について選択されるＣＡＴ遺伝子が、第２の組み換え事象の間に切り取られるため、得られる組み換え体が安定に形質転換され、薬剤選択マーカーを含まないことである。得られた組み換え体Ｌｍ−Ｅ７からの抗原の発現および分泌を、ウエスタンブロットにより実証した。さらに、Ｌｍ−Ｅ７の治療的効果を最適化した。例えば、ワクチンを経口的に送達することによって、非経口的に、および組み合わせた保護および腫瘍誘発の前にＬｍ−Ｅ７での初回刺激および次にＬｍ−Ｅ７を腫瘍誘発の後に投与することを必要とする退行モードと比較して、最良の結果が達成されることが見出された。
【００２１】
表１は、３種の異なる腫瘍細胞系、ＴＣ−１、Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７においてこのモデルにおいて観察された、最適化された抗腫瘍効果についてのさらなる詳細を提供する。細菌を、腫瘍誘発の１４日および７日前並びに腫瘍誘発の７日および１４日後に、経口的に送達した。同様のプロトコルでの腹腔内への１０６個の細菌の送達により、長期の防御は与えられなかった。しかし、Ｌｍ−Ｅ７を経口的に送達した際には、より良好な防御が観察された。さらに特に、この措置で、約５０％の動物が、永久に腫瘍非保有のままであり、免疫化は、すべての動物において腫瘍成長を顕著に遅延させた。
【００２２】
【表１】
2004500405.tif 000002
【００２３】
腫瘍非保有であったＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞を投与された動物を、それぞれ６０日においてＴＣ−１で、または４０日においてＥＬ−４／Ｅ７で再誘発した。Ｌｍ−Ｇａｇで免疫化した、各々の群における２匹の動物は、腫瘍を成長させた一方、Ｌｍ−Ｅ７で免疫化した動物は、実験の終了（ＴＣ−１の場合において１２４日およびＥＬ−４／Ｅ７について５４日）まで腫瘍非保有のままであった。
【００２４】
Ｌｍ−ＮＰおよびＲＥＮＣＡ、ＣＴ−２６およびＢ１６Ｆ１０−ＮＰモデルを用いた、以前開示された結果（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ． １９９５）と比較して、Ｌｍ−Ｅ７は、予測されたよりも有効ではなかった。従って、Ｌｍ−Ｅ７構築物を、Ｐａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５ ５５：４７７６−４７７９）のＬｍ−ＮＰ構築物の製造について教示された方法に従って製造した。
【００２５】
特に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と呼ぶ、Ｅ７融合タンパク質を発現する第２のリステリア・モノサイトジェネスワクチンを、ｐｒｆＡ欠失突然変異体に、切断されて酵素の溶血活性を消失させるｈｌｙ遺伝子の形態、ΔＬＬＯに融合するｐｒｆＡ遺伝子のコピーおよびＥ７遺伝子のコピーを含むプラスミドを補完することにより製造した（図２参照）。機能的ＬＬＯを、ｈｌｙの内在性染色体コピーを介して、生物により維持する。融合タンパク質の発現および分泌を、ウエスタンブロットにより検証した。
【００２６】
次に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７ワクチンの、抗腫瘍免疫性を誘発する能力を退行モデルにおいて比較した。表２に示すように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、Ｌｍ−Ｅ７よりも有効であることが見出された。この効力の差異は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７における、ＰＥＳＴ様配列、配列番号１の存在に起因するものであると考えられる。
【００２７】
【表２】
2004500405.tif 000003
【００２８】
このように、ΔＬＬＯとの融合タンパク質としての外来の遺伝子の発現は、抗原の免疫原性を増強する。
【００２９】
追加の実験を実施して、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの確立された皮下ＨＰＶ−１６不死化腫瘍の退行を誘発する能力を、Ｌｍ−Ｅ７とＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７とで比較した。これらの実験において、マウスを、４種の構築物、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｇａｇ（発現した抗原以外はＬｍ−Ｅ７と同質遺伝子）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰの１種を有する０．１ＬＤ５０で腹腔内で免疫化した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同質遺伝子であるが、インフルエンザ抗原を発現する。第２の免疫化を、１４日において実施した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化した８匹のマウスのうち６匹は、これらの腫瘍が治癒し、腫瘍非保有を維持した。他の動物のいずれも、確立された腫瘍の退行を示さなかった。種々の免疫化プロトコルの下で、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７について、同様の結果が達成された。さらに、１つのみの免疫化が、直径５ｍｍの確立されたＴＣ−１を有するマウスを治癒すると例証された。
【００３０】
ＬＬＯを抗原に融合することにより、増強された免疫性が与えられるという発見の一般性を確認するために、Ｌｍ−Ｅ７に類似するＬｍ−ＮＰの異形を構築した。この組み換え体を、インフルエンザ核タンパク質を抗原としてＥ７で置き換えた以外は、図１に示すように製造した。新たなＬｍ−ＮＰの能力を、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（米国特許第５，８３０，７０２号に記載されており、図２に示すように製造した）と比較した。これらの実験において、３２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０５のＲＥＮＣＡ−ＮＰ腫瘍細胞を接種した。ＲＥＮＣＡ−ＮＰは、インフルエンザ核タンパク質ＮＰ（米国特許第５，８３０，７０２号に記載されている）をレトロウイルス的に形質導入した腎細胞癌である。明白な巨視的腫瘍が１０日後に成長した後に、各群における８匹の動物を、３種の構築物、Ｌｍ−ＮＰ、Ｌｍ−Ｇａｇ（発現した抗原以外はＬｍ−ＮＰと同質遺伝子）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰの１種を有する０．１ＬＤ５０で腹腔内で免疫化した。１週間後に、動物に、第２の免疫化を施した。８匹の動物を、未処理のままとした。４０日における実験の終了時に、未処置の群のすべてのマウスは、大きい腫瘍を有していたか、または死亡した。Ｌｍ−Ｇａｇを施された群における１匹のマウスおよびＬｍ−ＮＰを施された群における２匹のマウスのみが、腫瘍非保有であった。この実験は、抗原のＬＬＯへの融合は、Ｅ７に限定されないことを示し、抗原の形態が重要ではないことを示唆する。
【００３１】
追加の実験を実施して、Ｅ７抗原およびリステリオリシンＯの切断型を含む融合タンパク質の増強された治療効果を確認した。これらの実験において、リステリオリシンＯの非溶血性切断型との融合タンパク質としてＥ７を発現するワクシニアベクターを構築した。ワクシニアのＷＲ株を、受容体として用い、融合遺伝子を、リステリアプラスミドから切り取り、ｐ７５プロモーターの制御の下でｐＳＣ１１中に挿入した。このベクターが、ワクシニア構築物Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７ＬａｍｐおよびＶａｃ−Ｅ７について用いられる移送ベクターであり、従ってＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７との直接の比較を可能にするため、このベクターを選択した。このようにして、３種のワクシニア組み換え体のすべては、同一の早期／末期化合物プロモーターｐ７．５の制御の下で発現した。さらに、ＳＣ１１は、ＴＫ選択およびβ−ガラクトシダーゼスクリーニングに対する組み換えウイルス疫病の選択を可能にする。
【００３２】
図３は、これらの実験において用いられる種々のワクシニア構築物を示す。Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐは、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）シグナル配列とＬＡＭＰ−１の細胞質尾部からの配列との間に融合した、Ｅ７タンパク質を発現した組み換えワクシニアウイルスである（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９５ ９２：１１６７１−５； Ｗｕ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９６：５６：２１−６）。これは、抗原のＭＨＣ  ＩＩ群経路への標的を容易にするために設計された。
【００３３】
以下の変法を実施して、ワクシニアによる遺伝子生成物の発現を可能にした：（ａ）ワクシニアによる早期の転写を妨害するＴ５ＸＴ配列を、ＬＬＯ−Ｅ７配列の５’部分から、ＰＣＲにより除去した；および（ｂ）追加のＸｍａＩ制限部位を、ＰＣＲにより導入して、ＬＬＯ−Ｅ７のＳＣ１１中への最終的な挿入を可能にした。これらの変更の好首尾な導入（ＬＬＯ−Ｅ７をコードする最初の配列の損失を伴わない）を、配列決定により実証した。得られたｐＳＣ１１−Ｅ７構築物を用いて、野生型のワクシニア株、ＷＲで感染したＴＫ−ｖｅ細胞系ＣＶ１をトランスフェクトした。この同時感染／トランスフェクション段階から得られた細胞溶解物は、３回プラーク精製されたワクシニア組み換え体を含む。プラーク精製したワクシニアによるＬＬＯ−Ｅ７融合生成物の発現を、ＬＬＯタンパク質配列に対して向けられた抗体を用いて、ウエスタンブロットにより検証した。さらに、ＬＬＯおよびＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７の能力を、それぞれ、Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ６マウスのＬＬＯ（９１−９９）およびＥ７（４９−５７）エピトープを用いて決定した。結果を、クロム放出アッセイにおいて確認した。
【００３４】
腫瘍拒絶の研究を、前に記載したものと同一のプロトコルに従って、ＴＣ−１を用いて実施した。処理を開始する前の異なる遅延を用いて、２種の実験を実施した。１つの実験において、処理を、腫瘍が直径約３ｍｍであった際に開始した。７６日において、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理したマウスの５０％が、腫瘍非保有であり、Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐマウスの２５％が、腫瘍非保有である。
【００３５】
第２の実験において、ＴＣ−１腫瘍が、より大きい大きさ（５〜６ｍｍ）に成長した。次に、ＬＬＯ−Ｅ７融合タンパク質に基づくベクターを、より大きい数のベクターに対して比較した。いくつかのワクチン群が、ＴＣ−１の顕著な一時的な退行を示したが、６５日までに、データは、明らかに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７が、確立されたＴＣ−１の退行を永久的に誘発する能力に関して、最も有効なワクチンであることを示している。Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐで処理したマウスの１２％のみが、腫瘍非保有であった一方、３７％のＶａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７マウスが、腫瘍非保有であった。他のマウスは、すべて死亡した。
【００３６】
このように、リステリアにおけるホスト細胞系およびリステリア以外のホスト細胞系における、リステリオリシンＯの非溶血性切断型との融合タンパク質としての抗原の発現は、抗原の増大した免疫原性をもたらす。比較実験を、ワクシニアについて実施したが、これらの融合タンパク質を発現するために用いることができる、多数の他のプラスミドおよび発現系が知られている。例えば、本発明において有用な細菌ベクターには、サルモネラ種、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌａ）種、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトジェネスおよびエス・ゴードニ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）が含まれるが、これらには限定されない。
【００３７】
さらに、融合タンパク質を、ファゴリソソーム融合を逃散させ、細胞の細胞質中で生存するように改変された組み換え細菌ベクターにより送達することができる。本発明において有用なウイルスベクターには、ワクシニア、アビポックス（Ａｖｉｐｏｘ）、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、改変ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキフォレストウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスが含まれるが、これらには限定されない。裸のＤＮＡベクターもまた、用いることができる。
【００３８】
従って、本発明は、リステリオリシンＯの非溶血性切断型またはΔＬＬＯへの抗原の融合により抗原の免疫原性を増強するための方法を提供する。好ましい態様においては、抗原を、ＬＬＯのＰＥＳＴ様アミノ酸配列、配列番号１に融合させる。
【００３９】
本発明はまた、細胞媒介および抗腫瘍免疫性を増強させる方法および、抗原に融合されたかまたは抗原内に包埋された、原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含む、増強された免疫原性を有する組成物を提供する。ＰＥＳＴ様配列を、抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合させることができる。本明細書中で例証されるように、リステリア・モノサイトジェネスのＰＥＳＴ様配列への抗原の融合により、抗原の細胞媒介および抗腫瘍免疫性が増強された。他の原核生物から由来する他のＰＥＳＴ様配列への抗原の融合はまた、抗原の免疫原性を増強すると考えられる。他の原核生物のＰＥＳＴ様配列を、リステリア・モノサイトジェネスについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ （ＴＢＳ ２１：２６７−２７１， １９９６）により記載された方法に従って、ルーチンに同定することができる。
【００４０】
あるいはまた、他の原核生物からのＰＥＳＴ様アミノ酸配列を、この方法に基づいて同定することができる。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予測される他の原核生物には、他のリステリア種が含まれるが、これらには限定されない。例えば、リステリア・モノサイトジェネスタンパク質ＡｃｔＡは、このような配列を４つ含む。これらは、
【外１】
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である。また、ストレプトコッカス種からのストレプトリシンＯは、ＰＥＳＴ様配列を含む。
【００４１】
例えば、ストレプトコッカス・ピロゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）ストレプトリシンＯは、ＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号６）を、アミノ酸３５〜５１において含み、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ストレプトリシンＯは、ＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号７）を、アミノ酸３８〜５４において含む。さらに、ＰＥＳＴ様配列を、抗原性タンパク質内に包埋することができると考えられる。すなわち、本発明の目的においては、「融合」によって、抗原性タンパク質が、抗原および、抗原の一方の末端において結合しているかまたは抗原内に包埋されているＰＥＳＴ様アミノ酸配列を共に含むことを意味する。
【００４２】
好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、リステリア・モノサイトジェネスのＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含むリステリオリシンＯの切断型または、他の原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列および抗原のいずれかをコードするプラスミドを介して、組み換え的に生成する。しかし、抗原はまた、リステリア・モノサイトジェネスのＰＥＳＴ様アミノ酸配列または他の原核生物から由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列を含むリステリオリシンＯの切断型に、化学的に共役することができる。本発明の目的においては、「抗原」によって、生来の抗原遺伝子または遺伝子生成物あるいは、同定されたＴ細胞エピトープを含むこれらの切断異形を含むことを意味する。
【００４３】
次に、これらの融合タンパク質を、動物、好ましくはヒトへの投与のためのワクチン中に導入して、融合タンパク質の抗原に対する増強された免疫応答を引き起こすことができる。１つの態様において、本発明の融合タンパク質は、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチンまたは複製ＲＮＡワクチンとして送達される。この開示により当業者に明らかなように、本発明の融合タンパク質を含むワクチンは、感染性および腫瘍性疾患の防止および治療において、特に有用である。
【００４４】
これらのワクチンは、さらに、補助剤を含むことができる。これらのワクチンにおいて有用な補助剤の例には、非メチル化ＣｐＧ、キル（ｑｕｉｌｌ）グリコシド、ＣＦＡ、ＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、リポソーム、並びに細菌マイトジェンおよび毒素が含まれるが、これらには限定されない。
以下の例は、例示目的のみのために提供し、本発明を限定することを意図しない。
【００４５】
例
例１：腫瘍細胞系
ＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６よびＥ７により不死化させ、活性化ヒトｃ−ＨＡ−ｒａｓを発現するｐＶＥＪＢにより形質転換したＣ５７ＢＬ／６マウスからの肺上皮細胞である。Ｃ３は、マウス胚細胞ｆｒｐ、ＨＰＶ１６の完全なゲノムで不死化させ、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換したＣ５７ＢＬ／６マウスである。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７によりレトロウイルス的に形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。
【００４６】
例２：Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７およびＶａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐの効能の比較
ＴＣ−１（１×１０５）またはＣ−３（５×１０５）腫瘍細胞を、マウス中に皮下的に移植し、７〜９日間放置して成長させ、この時までに、これらは明瞭になった（大きさ〜５ｍｍ）。次に、マウスを、３種の構築物、Ｖａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐ（１０７ＰＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）の１種で、腹腔内に免疫化した。７日および１４日において、動物に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬＭ−Ｅ７を施した。生存するマウスを、４３日において、１０５ＴＣ−１で再誘発した。
【００４７】
例３：Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｖａｃ−Ｅ７およびＶａｃ−ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐの効能の比較
８匹のマウスの４つの群に、ＴＣ−１の１０５個の細胞を移植した。７日後、腫瘍は、大きさが約４ｍｍであった。１つの群のマウスは、未処理であった。他の群の各々に、１０７ＰＦＵのＶａｃ−Ｅ７、Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＶａｃ−Ｓｉｇ−Ｅ７−ｌａｍｐ７のいずれかを施した。ブースター用量を、１４日において投与した。
【００４８】
例４：Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の種々の他のベクターとの効能の比較
ＴＣ−１腫瘍細胞（２×１０５）を、９６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左側に皮下移植し、７日間放置して成長させた。マウスを、８匹のマウスの群に分割し、各々の群を、以下のワクチンの１種で処理した：未処置（ワクチンなし）；Ｖａｃ　ＳｉｇＥ７Ｌａｍｐ、１０７ＰＦＵ、腹腔内；Ｖａｃ−ＬＬＯ−Ｅ７、１０７ＰＦＵ、腹腔内；またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、１０７ＰＦＵ、腹腔内。１週間後、動物に、ブースター免疫化を施した。腫瘍成長を、２日おきに、ノギス測定により追跡し、最も狭いおよび最も長い表面長さの平均として記録した。また、免疫パラメーターを決定した。
【００４９】
例５：Ｌｍ−ＬＬＯＰＥＳＴ−Ｅ７の構築
ＬＬＯ−ＰＥＳＴ−Ｅ７フラグメントを、ＳＯＥｉｎｇ　ＰＣＲにより構築することができる。
この方法の段階１においては、ＰＣＲ反応１は、プライマー対ＧＧ−３６／ＧＧ−７８またはＧＧ−７７／ＡＺ−９を、鋳型としてのｐＧＧ−５５と共に用いる。ＰＣＲ反応２は、鋳型として第１の反応からのＬＬＯ−ＰＥＳＴおよびＥ７生成物並びにプライマーＧＧ−３６およびＡＺ−９を用いる。
【外２】
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【００５０】
段階２においては、０．７Ｋｂの最終的なＳＯＥｉｎｇ　ＰＣＲ生成物を、ＴＡベクターｐＣＲ２．１中につないだ。
段階３においては、ＬＬＯ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を、酵素ＮｈｅＩを有するプラスミドから２時間にわたり消化し、続いてエタノール沈殿および酵素ＸｍａＩを一夜施す。ｐＧＧ−４９からのｐｒｆＡフラグメントを、酵素ＳａｌＩで、２時間消化し、続いて、エタノール沈殿および酵素ＸｍａＩによる沈殿を一晩施す。ｐＤＰ−２０２８を、ＳａｌＩおよびＸｂａＩで２時間消化し、続いて、エタノール沈殿およびＴｒｉｓ：ＥＤＴＡ（ＴＥ）中での再懸濁を施す。フラグメントを、４℃で一夜貯蔵することができる。
【００５１】
段階４において、０．７Ｋｂ　ＬＬＯ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、１．０Ｋｂ　ｐｒｆＡおよび９．７Ｋｂプラスミドをつなぐ。次に、このプラスミドを用いて、ＸＦＬ−７を形質転換する。１５Ｋｂフラグメントの分泌を、ウエスタンブロットにより検証することができる。効能を、ＴＣ−１腫瘍に対して検証する。
【００５２】
あるいはまた、染色体統合体を、ＬＬＯ−ＰＥＳＴ−Ｅ７フラグメントをプライマーＡＺ−Ｂ（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’；配列番号１２）を用いて増幅して、３’ＸｂａＩ部位を設置し、プライマーＺＹ−３（５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴ−３’；配列番号１３）を用いて５’ＫｐｎＩ部位を設置することにより、発生することができる。ｐＺＹ−３７およびＬＬＯ−ＰＥＳＴ−Ｅ７フラグメントを、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで個別に、またはＮＥＢ緩衝液２＋ＢＳＡ中で一夜消化する。フラグメントを、ｐＺＹ−３７中につなぎ、染色体統合のための以下のプロトコルを追跡する。分泌および効能を、前記のようにして検証する。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ７遺伝子をリステリア染色体中に統合することにより構築した、ＨＰＶ−Ｅ７染色体発現系の図である。
【図２】ΔＬＬＯを生成するｈｌｙ遺伝子の切断型（Δｈｌｙ）に融合したｐｒｆＡよびＥ７を含む、好ましい多コピープラスミドの図である。
【図３】種々の型のＨＰＶ１６　Ｅ７タンパク質を発現する種々のワクシニアウイルス構築物の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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