(57)【要約】本発明は、テトラペプチド：アセチル−グルタミル−グルタミル−グルタミル−アスパルチルを細胞に導入させることができる化学物質とあわせて前記テトラペプチドを含むぺプチド産物に関する。本発明は、少くとも１つの医薬として許容される賦形剤及び有効量の本発明によるペプチド産物を含む医薬組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラペプチド：アセチル−グルタミル−グルタミル−グルタミル−アスパルチルを細胞に導入することができる化学物質とあわせて前記テトラペプチドを含むペプチド産物。
【請求項２】
前記化学物質が、リポソーム、脂質及び／又は脂肪酸から作られた脂質ベシクル、カチオン性ベシクル又はそれらの混合物である請求項１に記載のペプチド産物。
【請求項３】
前記化学物質が少くとも８アミノ酸のポリペプチドである請求項１に記載のペプチド産物。
【請求項４】
前記ポリペプチドがｔａｔに媒介されるタンパク質である請求項３に記載のペプチド産物。
【請求項５】
前記ポリペプチドがホメオボックスポリペプチドである請求項３に記載のペプチド産物。
【請求項６】
前記テトラペプチドが前記化学物質にスペーサーを介して連結されている請求項１〜５のいずれか一に記載のペプチド産物。
【請求項７】
ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；ＡｃＥＥＥＤ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：α−（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０）（次の構造で表される：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）；及びα−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），（次の構造で表される：α−（ＢｉｏｔｉｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）からなる群から選択される請求項１に記載のペプチド産物。
【請求項８】
少くとも１の医薬として許容される賦形剤と、有効量の請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチド産物と、を含む医薬組成物。
【請求項９】
薬剤の製造のための、請求項８に記載の医薬組成物又は請求項１〜７のいずれか一に記載のペプチド産物の使用。
【請求項１０】
α−ＳＭアクチン発現に関連する疾患の予防及び／又は治療における請求項９に記載の使用であって、前記疾患が、創傷収縮、肥大性瘢痕、線維腫症及び線維症状態からなる群から選択される使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、活性なテトラペプチド：アセチル−グルタミル−グルタミル−グルタミル−アスパルチルを細胞に導入させるベクターとあわせて前記テトラペプチドを含むペプチド産物に関する。
本発明は、前記ペプチド産物を含む医薬組成物、並びに創傷収縮、肥大性瘢痕、線維腫症、特にいわゆるデュプイトラン病及び線維症状態（特に肺線維症）の予防及び／又は治療のためのその使用に関する。
Ｓｋａｌｌｉら（Ｊ．ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１０３　Ｎｏ．６，ｐｐ．２７８７−２７９６（１９８６））は、α平滑筋（α−ＳＭ）アクチンを排他的に認識する抗体（抗α−ＳＭ−１）は、担体分子に結合したα−ＳＭアクチンのアミノ末端の合成デカペプチドでのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化の後に選択されキャラクタライズされることを記載する。
【０００２】
α−ＳＭアクチンは実験的創傷治癒の間、ミオフィブロブラストにおいて一時的に発現されることも知られている（Ｄａｒｂｙら、Ｌａｂｏｒａｔｏｎ，ｔｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　Ｖｏｌ．６３，２１〜２９（１９８０））、Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒら（Ｊ．ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１３０　Ｎｏ．４，８８７−８９５（１９９５））は、特定のモノクローナル抗体抗α−ＳＭ−１の結合へのα−ＳＭアクチンのアミノ末端デカペプチド（ＡｃＥＥＥＤＳＴＡＬＶＣ）のブロッキング効果を記述する。
抗α−ＳＭ−１は、単一のアクチンアイソフォームに特異的であると記述される最初のモノクローナル抗体であり、生理学的及び病理学的過程における脈管ＳＭ細胞及びミオフィブロブラスト表現型調節の研究のための信頼できるツールである。
この文献は、前記抗体（特にそのＦａｂフラグメント）が試験管内α−ＳＭアクチン重合を増加させることを示す。その文献はテトラペプチドＡｃＥＥＥＤが、α−ＳＭアクチン発現が調節される生理学的及び病理学的状態において、ＳＭ細胞、フィブロブラスト、ミオフィブロブラスト又は筋上皮細胞のような細胞においてα−ＳＭアクチンの機能の研究のために用いることができる。その文献は、テトラペプチドＡｃＥＥＥＤが、マイクロインジェクション技術を用いる時にＳＭ細胞の培養において張力繊維へのα−ＳＭアクチンの組込みを阻害することも示唆する。
【０００３】
張力繊維へのα−ＳＭアクチンの活性をターンホーバーが存在すること、及びＡｃＥＥＥＤがα−ＳＭアクチンのアミノ末端配列と相互作用し重合を活性化するタンパク質を捕獲することも示されている（Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ，Ｃ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，１９９５，５１．Ａ６２）。
Ｊａｒｌｅｂａｒｋ，Ｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９６， ２２９（２）， ３６３〜３６９）は、アデノシン５′−カルボン酸の特定のペプチジル誘導体が、特定のＰ２プリン受容体保有生物システム（グリオーメ及び平滑筋細胞系及び単離された平滑筋組織調製物）において阻害効果を有することを開示する。
本発明は、試験管内及び生体内で張力繊維における、α−ＳＭ−アクチン組織化を妨害するために、細胞内への導入を許容する特定のテトラペプチドＡｃＥＥＥＤを含むペプチド産物を供することを目的とする。
【０００４】
本発明の別の目的は、α−ＳＭアクチン発現に関連する種々の疾患、例えば創傷収縮、肥大性瘢痕、線維腫症、特にデュプイトラン病及び線維症状態（特に肺線維症）を治療及び／又は予防するために、そのペプチド産物を含む医薬組成物を供することである。
本発明は、活性なテトラペプチド：アセチル−グルタミル−グルタミル−グルタミル−アスパルチル（以後、式：ＡｃＥＥＥＤで示す）を細胞に導入することができる化学物質と会合した前記テトラペプチドを含むペプチド産物に関する。
本発明によれば、活性なテトラペプチドにおいて、Ａｃはアセチルを意味し、Ｅはグルタミン酸残基を意味し、Ｄはアスパラギン酸残基を意味する。
本発明によれば、化学物質には、ベクターがある。
【０００５】
本発明によれば、細胞には、生体内細胞、例えば生きている動物もしくはヒトの器官もしくは組織を構成する細胞、又は生きている動物もしくはヒト中に見い出される微生物；又は試験管内細胞、例えば培養した動物細胞、ヒト細胞もしくは微生物がある。好ましくは、それはヒト細胞、より好ましくは繊維芽細胞又は平滑筋細胞を意味する。
本発明の第１の実施形態によれば、化学物質は、リポソーム、脂質及び／又は脂肪酸から作られた脂質ベシクル、又はカチオン性ベシクル。例えばＧａｏ　Ｘ及びＨｕａｎｇ　Ｌ．（Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ， ｐｐ．７１０−７２２（１９９５））に記載されるもの及び／又はそれらの混合物であり得る。
本発明の第２の実施形態によれば、化学物質は好ましくは少くとも約８アミノ酸、好ましくは８〜４０、より好ましくは１０〜３０アミノ酸を有するポリペプチドである。
【０００６】
本発明の別の実施形態によれば、前記ポリペプチドは、有利には特定細胞の膜レセプターと結合する能力を有するｔａｔ媒介タンパク質である。
異種ペプチドの細胞へのデリバリーのための、本発明によるテトラペプチドへのｔａｔ媒介タンパク質のような化学物質の好ましい連結は、引用により本明細書に組み込まれる国際特許公報ＷＯ９４／０４６８６に記載される。式：ｔａｔ３７−７２，ｔａｔ３７−５８，ｔａｔ３８−５８ＧＧＣ，ｔａｔＣＧＧ４７−５８，ｔａｔ４７−５８ＧＧＣ及びｔａｔΔＣで最も良い結果が得られている。
本発明の好ましい実施形態によれば、化学物質はホメオボックスペプチド、好ましくは、引用により本明細書に組み込まれる国際特許公報ＷＯ９７／１２９１２に記載されるｐＡｎｔｐペプチドである。ペプチドｐＡｎｔｐ［４３−５８］、及びペプチドｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０で最も良い結果が得られている。ペプチドｐＡｎｔｐ［４３−５８］は、Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを意味する。ここで、この記載について、第１のアミノ酸Ａｒｇは位置４３のアミノ酸と呼ばれ、最後のアミノ酸Ｌｙｓは位置５８のアミノ酸と呼ばれる。ペプチドｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０は、ｐＡｎｔｐ［４３−５８］と同じ配列であってＧｌｎが位置５０でＰｒｏに置換されているものを示す。
【０００７】
本発明は、当業者に知られた方法、例えば脂質ベシクル（Ｍａｒｔｉｎ Ｆ．Ｇ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ， Ｐｒａｖｅｅｎ Ｔｙｌｅ Ｅｄ．， Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））、自動ペプチド合成、分子間架橋の方法を用いるこれら産物の調製方法にも関する。
おそらく、テトラペプチドは、スペーサー、好ましくはペプチドスペーサーを介して、化学物質に連結される。そのスペーサーは、好ましくはアミノ酸又は５以下のアミノ酸を含むペプチドである。好ましくは、スペーサーとして用いるアミノ酸は、ＡｃＥＥＥＤテトラペプチドがα−アミノ基を介してもしくはε−アミノ基を介して結合するリシル残基（“Ｋ”）、又はＡｃＥＥＥＤテトラペプチドがα−アミノ基を介して結合するシスチール残基（“Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ”により表される、ジスルフィド結合を形成するそれらのβスルフィド官能基により連結される２つのシスティニル残基（“Ｃ”）を意味する）、又はＡｃＥＥＥＤテトラペプチドがα−アミノ基を介して結合するβ−アラニル−β−アラニルジペプチド（“β−Ａ−β−Ａ”）、又はＡｃＥＥＥＤテトラペプチドがε−アミノ基を介して結合するリシル残基（“Ｋ”）、及びＡｃＥＥＥＤテトラペプチドがα−アミノ基を介して結合するビオチニルＧＧ残基（２つの連続的グリシル残基にそのカルボキシル官能基を介して結合するビオチニル官能基を意味する）である。
【０００８】
α−アミノ基を介して又はリシル残基のε−アミノ基を介して連結されたＡｃＥＥＥＤテトラペプチドで、最も優れた結果が得られている。
本発明によれば、ペプチド産物は、好ましくは、
ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），
ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），
ＡｃＥＥＥＤ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），
ＡｃＥＥＥＤ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０）．
α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］），
ε−ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），
α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０），
からなる群から選択される。
【０００９】
ペプチド産物は、より好ましくは、
ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物１”と呼ぶ）；
ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物２”と呼ぶ）；
ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物３”と呼ぶ）；
ＡｃＥＥＥＤ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物４”と呼ぶ）；
ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物５”と呼ぶ）；
α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）（次の構造で表される：α−（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物６”と呼ぶ）；
ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０）（次の構造で表される：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物７”と呼ぶ）；
α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０）（次の構造で表される：α−（ＢｉｏｔｉｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ）（以後、“産物８”と呼ぶ）からなる群から選択される。
【００１０】
最も優れた結果は、産物α−（ＢｉｏｔｙｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］−Ｐｒｏ５０）及び産物ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）で得られる。
産物１〜８において、α−（　　）−Ｋ−は、括弧内の官能基がリシル残基のα−アミノ基上に結合していることを意味し；ε−（　　）−Ｋ−は、括弧内の官能基がリシル残基のε−アミノ基上に結合していることを意味し；−β−Ａは、β−アラニル残基を示し；そしてＣ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃは、それらのβスルフィド機能を介して結合し、ジスルフィド架橋を形成する２つのシスティニル残基を示す。産物１，５〜８は直鎖でなく、分枝鎖配列であり；産物２，３及び４は直鎖状で、非分枝鎖配列である。配列表において産物２は配列番号：１の配列で示され；産物３は配列番号：２の配列で示され；ここでＸａａはβＡｌａを意味し；そして産物４は配列番号：３の配列で示される。
産物１はε−（Ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ）Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
産物２はＡｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
産物３はＡｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ βＡｌａ βＡｌａ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
産物４はＡｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
【００１１】
産物５はＡｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｃｙｓ［Ｓ−Ｓ］Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
【００１２】
産物６はα−（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）ε−（Ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ）Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
産物７はε−（Ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ）Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
産物８はα−（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）ε−（Ａｃｅｔｙｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ）Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＯＨである。
本発明は、化学物質と会合した活性をテトラペプチドＡｃＥＥＥＤを含むペプチド産物を調製するための方法にも関する。
本発明のペプチド産物は、当業者に知られた方法、例えば段階的固相合成、ペプチドの直接（ストレートフォワード）合成、ペプチドの合成的又は生物的調製（例えば”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”； ｖｏｌ．１ ｔｏ ９， Ｓ． Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ， Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ， １９７７ ｔｏ １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ； ｏｒ ｉｎ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， ｖｏｌ．３５， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍ．Ｗ． Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＆ Ｂ．Ｍ． Ｄｕｎｎ （Ｅｄｓ）， １９９４， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ Ｎ．Ｊ．．に記載）を用いて調製することができる。
【００１３】
本発明は、薬剤として用いるための化学物質と会合した活性なテトラペプチドＡｃＥＥＥＤを含むペプチド産物にも関する。
本発明の別の態様は、少くとも１の医薬として許容される担体、ビヒクル又は賦形剤、及びペプチド産物を含む医薬組成物に関する。
前記医薬組成物での医学的調製物は、１〜３ｍｇペプチド／１ｍＬ塩類溶液の有効投与量で局所的に適用され、本発明による最も優れた効能を与える。
本発明の治療の方法を行うために、上述の医薬組成物は、有効量のペプチド産物を含む。有効量は、慣用的な技術を用いることにより、及び同様の環境下で得られる結果を観察することにより直ちに得ることができる。有効量を決定することにおいて、これらに限られたいが、次のいくつかの因子が考えられる：患者の種類；その大きさ、年齢、及び全般的な健康状態；関連する特定の疾患；その関連の程度又はその疾患の激しさ；個々の患者の応答；投与する特定の化合物；投与の態様；投与する調製物のバイオアベイラビリティー特性；選択した投与管理；及び付随する投薬の使用。
【００１４】
本発明の組成物中のペプチド産物の有効量は、広くは、１日当り体重１キログラム当り約１マイクログラム（μｇ／ｋｇ／日）〜約５００ミリグラム／ｋｇ体重／日であろう。１日１回又は２回の約１００μｇ〜約１０ｍｇの薬量（投与量）が好ましい。
前記医薬組成物での医学的調製物は、いずれの形態で調剤してもよく、種々の経路又は態様で投与することができる。これには、これらに限らないが、臨床適応に従って、静脈内注入、筋肉注入、吸入、経粘膜又は経皮デリバリー、経鼻投与、経口投与、経腸及び直腸投与がある。製剤を調製する当業者は、治療すべき病状の特徴、その病気の段階、及び他の関連する状況により、投与の正確な形態及び態様を直ちに選択することができる。
本発明の組成物は、少くとも１の医薬として許容される担体又は賦形剤と組み合わせてペプチド産物を含み得る。その割合及び性質は、選択した組成物の溶解度及び化学的特性、選択した投与の経路、及び標準的な医薬的プラクティスにより決定される。
【００１５】
より詳しくは、本発明は１又は複数の医薬として許容される担体又は賦形剤（集合的に以後“担体”材料と呼ぶ）との混合物において又はさもなければそれと会合して治療に有効な量の上述のペプチド産物から本質的になる医薬組成物に関する。
担体材料は、活性成分のためのビヒクル又は媒体として機能し得る固体、半固体、又は液体機能であり得る。好適な担体材料は当業界で公知である。本発明の医薬組成物は、局所的、注入又は他の使用のために適合し得、注入、クリーム、軟骨、粉末、エリキシル、シロップ、溶液、懸濁液等の形態で患者に投与することができる。本発明の医薬組成物は、直腸の使用のためにも適合し得、製剤の形態で患者に投与することができる。
担体材料は、好適には、意図した投与の形態に関して選択し、慣用的な医薬プラスティスと一致すべきである。任意に、本発明の医薬組成物は、バインダー、例えば微結晶性セルロース、ガム又はゼラチン、分解剤、例えばアルギン酸、滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）、例えばコロイド状二酸化ケイ素、甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン、着色剤又は芳香剤、例えば、ペパーミント又はメチルサリチレートも含む。
【００１６】
それらの容易な投与のため、クリーム及び溶液は最も有利な局所的投与単位形態である。
上述の一般的な投与に加え、本発明の組成物は、徐放手段及びデリバリー装置によっても投与することができる。
このような溶液又はクリームは、次のアジュバントのうちの１又は複数も含み得る：滅菌希釈液、例えば注入用水、生理食塩水、油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロリピレングリコール又は他の合成溶媒；抗微生物剤、例えばベンジルアルコール；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えばアセテート、シトレート又はホスフェート及び張度の調節のための剤、例えば塩化ナトリウム又はデオストロース。その調製物は、アンプル、又はガラスもしくはプラスチックから得られた多重投与容器に入れることができる。
医薬として許容される賦形剤は、投与の態様により多様であり得、医薬組成物の治療特性を改善するため、又はその可能性ある副作用を減少させるために、アジュバントと組み合わせることができよう。
【００１７】
好適な医薬として許容される賦形剤は当業界で公知であり、一般に、薬剤師又は医師により適用される方法に従って選択され、そして固体、液体又は気体の非毒性の医薬として許容されるビヒクルを含み得る。活性産物対医薬として許容される賦形剤のパーセンテージは、極めて大きな範囲内で多様であり得、ヒトを含む、動物への許容性及び可能性ある副作用により、及び投与の頻度によってのみ制限される。
本発明は、薬剤の製造のための前記医薬組成物又は前記ペプチド産物の使用にも関する。本発明は、細胞へのα−ＳＭアクチン発現（細胞への過剰発現又はα−ＳＭアクチンを通常、発現しない細胞における発現）に関連する疾患の予防及び／又は治療における薬剤の製造のための前記医薬組成物又は前記ペプチド産物の使用にも関する。好ましくは、前記疾患は、創傷収縮（ｗｏｕｎｄ　ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）、肥大性瘢痕、線維腫症（特にＤｕｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ病）及び線維症状態（特に肺繊維症）からなる群から選択される。
本発明は、薬剤を製造するための方法であって、前記ペプチド産物を用いる方法にも関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、前記病気の治療及び／又は予防の方法であって、前記ペプチド産物又は前記医薬組成物を、前記病気又は該病気の症状を示す哺乳動物、特にヒトに投与する方法に関する。
本発明は、以下の非限定的例に詳細に記載されよう。
実施例１〜８：ペプチド産物合成
ペプチド産物を、”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”； ｖｏｌ．１ ｔｏ ９， Ｓ． Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ， Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ， １９７７ ｔｏ １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ．に記載されるようにメリフィールド合成により合成で調製した。
【００１９】
アミノ酸は、不溶性樹脂に段々と加える。
（リシンを除く）各々のアミノ酸は、そのα−アミノ基で、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ−と呼ぶ）で保護することができ、そして他の官能基は、保護基により保護される。
−セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）のヒドロキシル官能基は、ベンジル基で保護することができ；
−アルギニン（Ｒ）のグアニジノ官能基はトシル基で保護することができ；
−トリプトファン（Ｗ）のインドール環のアミノ基はホルミル基で保護することができ；
−リシン（Ｋ）のα−アミノ官能基は、Ｂｏｃ−基又はフルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ−）又はベンジルオキシカルボニル基（Ｚ−）で保護することができ、そしてリシンのε−アミノ基は、Ｂｏｃ−基又は２−クロロベンジルオキシカルボニル基で保護することができ；
−アスパラギン酸（Ｄ）のβ−カルボキシ官能基はシクロヘキシル基で保護することができ；
−グルタミン酸（Ｅ）のγ−カルボキシル官能基はベンジル基で保護することができる。
【００２０】
カルボキシルＣ末端ペプチドは、クロロメチルスチレン／１％ジビニルベンゼン樹脂上で合成した、アシドＣ末端ペプチドは、４−メチルベンズヒドリルアミンポリスチレン／１％ジビニルベンゼン樹脂上で、”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”； ｖｏｌ．１ ｔｏ ９， Ｓ． Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ， Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ， １９７７ ｔｏ １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋに記載される方法に従って合成した。
クロロメチルスチレン樹脂の場合、最初のアミノ酸（ＡＡ）は次の通り導入される：Ｂｏｃ−ＡＡ（Ｂｏｃ−ＡＡは、そのα−アミノ基上のｔ−ブトキシカルボニル基により保護されるアミノ酸を意味する）のセシウム塩を形成し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１等量のセシウムカーボネートを加え、そしてこの塩をＤＭＦ中のクロロメチル樹脂に加える。その混合物を５０℃で一晩、撹拌する。
最初のＡＡによる樹脂の置換レベルは、塩酸（ＨＣｌ）加水分解後のアミノ酸分析により決定される。
【００２１】
次のアミノ酸を標準的な手順（”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”； ｖｏｌ．１ ｔｏ ９， Ｓ． Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ， Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ， １９７７ ｔｏ １９８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋに記載の方法）を用いて段々と加える：
−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ＣＨ２ Ｃｌ２ 中での樹脂上でのＡＡのＮ末端Ｂｏｃ基の脱プロトン化：
−ＣＨ２ Ｃｌ２ での洗浄；
−トリエチルアミン（ＴＥＡ）／ＣＨ２ Ｃｌ２ 中での中和；
−ＣＨ２ Ｃｌ２ での洗浄；
−以下の条件下での次のＢｏｃ−ＡＡのカップリング：
２．５等量のＢｏｃ−ＡＡを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣｃ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を伴うＤＭＦ中でプレ活性化する。その得られた活性化されたＢｏｃ−ＡＡ−ベンゾトリアゾレートをＤＭＦ中の樹脂−ペプチドに加えた。その反応の完了を、Ｋａｉｓｅｒ　ａｎｄ　Ｃｈｌｏｒａｎｙｌテスト（各々、Ｅ． Ｋａｉｓｅｒ， Ｒ．Ｌ． Ｃｏｌｅｓｃｏｔｔ， Ｌ．Ｄ． Ｂａｓｓｉｎｇｅｒ， Ｐ．Ｉ． Ｃｏｏｋ； Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３４， ５９５ （１９７０） ａｎｄ ｉｎ Ｔ． Ｖｏｊｋｏｖｓｋｙ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．８， ｎｏ ４， ２３６−２３７（１９９５）に記載）により制御する。
【００２２】
その反応が完了したなら、樹脂−ペプチドのＤＭＦでの洗浄後、再カップリング手順を用いる：１．２５等量のＢｏｃ−ＡＡをＤＭＦ中の１．２５等量の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及び１．２５等量のＨＯＢｔと一緒に加える。再カップリング手順後のテストの１つが陽性であるなら、残りのアミノ官能基のアセチル化を無水酢酸を用いて行う
−ＤＭＦ，ＣＨ２ Ｃｌ２ ，ＣＨ３ ＯＨでの洗浄。
全てのアミノ酸を加えた時、ペプチド−樹脂を真空下で乾燥させ、そのペプチドを標準的低−高ＨＦ開裂に従って樹脂から開裂する。これで得られた脱プロトン化ペプチドをＴＦＡ０．１％／ＣＨ３ ＣＮシステムで逆相ＨＰＬＣで精製する。凍結乾燥の後、純粋なペプチドを白色粉末として得る。
テストしたペプチド産物を、後に、それらの特徴と共に同定する。
【００２３】
実施例１のペプチド産物は、次の構造：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ で表される。その式は、Ｃ１３１ Ｈ２０８ Ｎ４０ Ｏ３４ Ｓ１である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２９１９．４である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝２９２１を与える。ここで、ＦＡＢ／ＭＳは、高速原子衝撃質量分析法を意味し、この分析法は、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， ｖｏｌ．３６； Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍ．Ｗ． Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ＆ Ｂ．Ｍ． Ｄｕｎｎ （Ｅｄｓ）， １９９４， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ Ｎ．Ｊ．に記載される。
実施例２のペプチド産物は、次の構造：ＡｃＥＥＥＤ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで示される。その式は、Ｃ１３１ Ｈ２０８ Ｎ４０ Ｏ３４ Ｓ１である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２９１９．４である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝２９２０を与える。
【００２４】
実施例３のペプチド産物は、次の構造：ＡｃＥＥＥＤ−β−Ａ−β−Ａ−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで表される。その式は、Ｃ１３１ Ｈ２０６ Ｎ４０ Ｏ３５ Ｓ１である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２９３３．４である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝２９３４を与える。
【００２５】
実施例４のペプチド産物は、次の構造：ＡｃＥＥＥＤ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで表される。その式は、Ｃ１２５ Ｈ１９６ Ｎ３８ Ｏ３３ Ｓ１である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２７９１．３である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝２７９２を与える。
実施例５のペプチド産物は、次の構造：ＡｃＥＥＥＤ−Ｃ−［Ｓ−Ｓ］−Ｃ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで表される。その式はＣ１３１ Ｈ２０６ Ｎ４０ Ｏ３６ Ｓ３である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２９３３．４である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝２９３４を与える。
【００２６】
実施例６のペプチド産物は、次の構造：α−（Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで示される。その式は、Ｃ１４５ Ｈ２２８ Ｎ４４ Ｏ３８ Ｓ２である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は３２５９．８である。そのＦＡＢ／ＭＳ分析は、次の結果：［Ｍ＋Ｈ］＋ ＝３２６０を与える。
実施例７のペプチド産物は、次の構造：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨ で表される。その式は、Ｃ１３１ Ｈ２０８ Ｎ４０ Ｏ３２ Ｓ１である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は２８８７．４である。そのＥＳ／ＭＳ分析は、次の結果２８８７．６を与える。ＥＳ／ＭＳはエレクトロスプレー質量分析を意味する。ＥＳ／ＭＳの一般的な原理は、Ｊ．Ｂ． Ｆｅｎｎ， Ｍ． Ｍａｎｎ， Ｃ．Ｋ． Ｍｅｎｇ， Ｃ．Ｍ． Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６， ｐ．６４−７１， １９８９ ｏｒ ｉｎ Ｒ．Ｄ． Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ａ． Ｌｏｏ， Ｃ．Ｇ． Ｅｄｍｏｎｄｓ， Ｃ．Ｊ． Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｈ．Ｒ． Ｕｄｓｅｔｈ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６２， ｐ．８８２−８９９， １９９０に記載される。
実施例７のアミノ酸分析は次の通りである：
【００２７】
【表１】
2004513059.tif 000002
【００２８】
Ｔｈｅｏ．＝理論値、Ｅｘｐ．＝実験値。
アミノ酸分析の一般的な原理は、Ｓ．Ｍｏｏｒｅ， Ｗ．Ｈ． Ｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２００． ｐ．８０３， １９５３に記載される。
実施例８のペプチド産物は、次の構造：α−（ＢｉｏｔｉｎｙｌＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−ＲＱＩＫＩＷＦＰＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＯＨで表される。その式は、Ｃ１４５ Ｈ２２８ Ｎ４４ Ｏ３６ Ｓ２である。その分子量（Ｍ．Ｗ．）は３２２７．８である。そのＥＳ／ＭＳ分析は、次の結果：３２２７．２を与える。実施例８のペプチド産物のアミノ酸分析は次の通りである：
【００２９】
【表２】
2004513059.tif 000003
【００３０】
実施例９：試験管内実験
濃度依存性アッセイ
実施例１〜８に従うペプチド産物は、α−ＳＭアクチンに対する結合性抗αＳＭ−１モノクローナル抗体へのブロッキング効果を示す。培養中の細胞に侵入するそれらの効率を研究するため、及び以下のテストによりストレスファイバーにおけるα−ＳＭアクチン形成を妨害するため、いくつかのテストを行った。
ペプチド産物の培養地への添加の後、細胞を固定し、透過性にし、α−ＳＭアクチン及び全体のアクチン（Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒら（１９９５）に記載されるようなペプチドの浸透及び効果のための通常の対照）について染色した。
実施例１〜８に従うペプチド産物は、１０％胎児ウシ血清及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ　Ｎｏ　１５６３０−０５６）を補給したＤｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）， Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ．４１９６５−０３９， Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ 中、異なる濃度：０．１、０．２、０．５、１、２及び４ｍｇ／ｍＬ（ペプチド産物のｍｇ、細胞培養培地のｍＬ）で３時間の脈管平滑筋（ＶＳＭＣ）の培養物への接種の後、ストレスファイバーへのα−ＳＭアクチン組込みを阻害することにおいて十分に活性であった。
ＶＳＭＣは、Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒら（１９９５）及びＢｏｃｈａｔｏｎ−Ｐｉｏｌｌａｔら（Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１６，８１５〜８２０（１９９６））に記載されるように、ラット大動脈の酵素消化により調製した。
【００３１】
時間経過アッセイ
ペプチドへの時間経過効果をより注意深くアッセイするために、実施例１〜８のペプチド産物で多数の実験を行った。それらの実験は、細胞へのデリバリーの後のビオチニル化ペプチドの位置を研究するためにも用いた。ビオチニル化ペプチドの検出は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）接合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｒｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅｓ， ＰＡ， ＵＳＡ； Ｃａｔ Ｎｏ ０１６−０９０−０８４）で染色することによりアッセイした。
実施例１〜８によるペプチド産物を、１０％胎児ウシ血清及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ　Ｎｏ　１５６３０−０５６）を補給した。Ｄｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）， （Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ．４１９６５−０３９， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む培地中で、３，５，１０，１５，３０及び６０分、２ｍｇ／ｍＬの濃度で培養したＶＳＭＣ中でインキュベートした。
実施例１〜８のペプチド産物は、細胞の９０％においてα−ＳＭアクチン張力繊維形成を阻害することができた。その活性は、３分のインキュベーション後に既に明確に検出することができた。張力繊維でのビオチニル化ペプチドの局在化は、早い時間でも得るのが困難であった。染色のほとんどは膜に局在化し、細胞質内にいくらか染色が拡散した。最初の１５分の間、特定の細胞内でのみ強力な染色が検出され、その後、染色は細胞質内で、更に全ての細胞内でさえ明るくなった。張力繊維に沿ったＦＩＴＣ−ストレプトアビジン染色は、より長いペプチドインキュベーションの時間の後でさえ、検出できなかった。
【００３２】
それゆえ、実施例１〜８のペプチド産物の細胞へのインキュベーションは、特に迅速であるようであり、時間経過アッセイにより追跡することは困難であり得るが、顕微鏡下でペプチド侵入の“ｉｎ　ｌｉｖｅ”観察を許容する他のマーカーペプチド（即ち蛍光ペプチド）を用いることにより追跡することができる。
張力繊維への−ＳＭアクチン回収の時間経過
実施例１〜８のペプチド産物を細胞と共に、３時間、１０％胎児ウシ血清及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ　Ｎｏ　１５６３０−０５６）を補給したＤｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）， Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ ４１９６５−０３９， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを含む媒地中でインキュベートした。
その後、細胞を洗浄し、培地（ペプチドを含まない培地）を異なる時間（１５分、３０分、１時間及び２時間）、残した。
これらの実験は、α−ＳＭ陽性張力繊維は、１時間後に少し再組織化し始めるが、２時間後に明確に組織化することを示す。
【００３３】
実施例１０：ビオチニル化ペプチドを用いる細胞への組込み
この実験は、実施例６のペプチド産物（ペプチドα−（ビオチニルＧＧ），ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）の侵入及び排出（“ｉｎ及びｏｕｔ”）を制御するために用いた。
ＶＳＭＣ細胞を、１０％胎児ウシ血清及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ　Ｎｏ　１５６３０−０５６）を補給したＤｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）， Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ．４１９６５−０３９， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄを含む培地中でインキュベートした。実施例６のペプチド産物と共に３０分、そしてそのペプチドを回収した後、その細胞を、０．５分、３０分、１時間及び２時間、培養地と共にインキュベートした。その細胞を、Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３４： ５９７〜６０３， １９８９， Ｇｅｌｓｏｌｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ， Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ ａｎｄ Ｇａｂｂｉａｎｉに記載されるように、０．０８Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ６．８；２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；０．１Ｍ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）；０．００１Ｍ　フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）；１０％グリセロールを含む、サンプル緩衝液中での異なる時間のインキュベーションの後に抽出した。
全タンパク質抽出物を、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：８８７−８９５，１９９５，Ｃｈａｂｏｎｎｉｅｒらに記載される方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、ＰＶＤ下膜に移した。
【００３４】
次にその膜を、Ｌｅｖｙ−Ｔｏｌｅｄａｎｏら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３３：１８０３−１８０８，１９９３）に記載される方法に従って、ビオチニル化ペプチドを検出するためにストレプトアビジンペルオキシダーゼと共にインキュベートした。
３０分のペプチドインキュベーション後及びペプチドの除去５分後に強力なシグナルが観察され、３０分の洗浄後に明らかに減少し、そしてペプチドの除去１時間後に明るいシグナルのみが観察された。この実験は、上述のように免疫蛍光染色を確認し、細胞へのペプチド産物の可能性ある“イン及びアウト”を追跡するためのアッセイを許容する。
【００３５】
実施例１１：α−ＳＭアクチン生合成へのペプチド産物の効果
表２は、１０％胎児ウシ血清及び２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ　Ｎｏ．１５６３０−０５６）を補給したＤｕｂｅｌｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）， Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ．４１９６５−０３９， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ を含む培地中での３７℃でのＶＳＭＣ上での２０時間のインキュベーション時間後の、α−ＳＭアクチン合成への、実施例１のペプチド産物（ペプチド産物：ε−（ＡｃＥＥＥＤ）−Ｋ−（ｐＡｎｔｐ［４３−５８］）の効果の４つの実験の結果を示す。
【００３６】
【表３】
2004513059.tif 000004
【００３７】
この表において、コントロール条件の値は、１００％出発値（時間＝０時間）で標準化した。
この表は、２０時間の実施例１のペプチド産物（２ｍｇ／ｍＬ培養培地）のインキュベーションは、コントロール条件と比べて、（Ｓ３５メチオニン組込みを用いて研究して）α−ＳＭアクチン合成の５５％減少（４回の実験の平均値）を引きおこすことを示す。
【００３８】
実施例１２：生体内実験
ラットにおける開いた“副木を施した創傷”でのテスト
排他的に収縮を測定するために、本発明者らは、Ｇａｂｂｉａｎｉ　Ｇ．ら、Ｊ．ｏｆ　Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，ｖｏｌ．１３５　ｐｐ７１９−７３４（１９７２）の技術に基づき“副木を施した創傷（Ｓｐｌｉｎｔｅｄ　ｗｏｕｎｄ）”モデルを開発した。
ラットの背中の２×２ｃｍの創傷を、０日目に縫合系（Ｓｕｐｒａｍｉｄ，ｍｅｔｒｉｃ３，Ｂｒａｕｎ，Ｅｍｍｅｎｂｕｅｃｋｅ）を用いて、その縁をプラスチックフレームに縫合することにより固定する。これは、肉芽組織の発達は影響を受けずに、創傷収縮を阻害する。ペプチド産物を、通常３日間、７日目から始めて開いた創傷に適用し、そのフレームの縫合をはずし、これによりコントロールにおいて４８時間以内に約２１３の創傷の領域を減少させる加速した収縮を許容する。
【００３９】
我々は、面積測定（ＫＳ４００，Ｚｅｉｓｓ　Ｖｉｓｉｏｎ）により創傷の収縮（グループ当り５匹のラット）を形態計測により測定し、組織学的技術、Ｇａｂｂｉａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．１９７２（ｐ．１５，ｌｉｎｅ８）及びＤａｒｂｙら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０（ｐ．１，ｌｉｎｅ２４−２５）に記載される方法に従ってα−ＳＭアクチン抗体での免疫蛍光法により形態学的に組織を研究した。
表３は、０日目に測定した創傷サイズのパーセンテージとして、３日目に測定した創傷サイズ（表面（ｃｍ２））を示す。
ラットは、３ｍｇ／ｍＬ（ぺプチド産物のｍｇ、０．９％ＮａＣｌのｍＬ）の投与量で実施例１のペプチド産物で処理した。
【００４０】
【表４】
2004513059.tif 000005
【００４１】
この結果は、ラットを３ｍｇ／ｍＬの投与量で実施例１のペプチド産物で局所的に処理した時の、収縮活性の現象を示唆する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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