(57)【要約】本願は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーターをコードする異種核酸を含む、フェロモンに応答する新規の細胞を記載する。この細胞はさらに、ＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸を含み得る。ＲＧＳタンパク質媒介性レポーター遺伝子発現を変更する試験サンプルの能力を検出するための、これらの細胞の使用に関する方法もまた、提供される。特定の実施形態において、このレポーターは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、またはグリーン蛍光タンパク質の誘導体である。
2004520824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードする異種核酸を含む、フェロモンに応答する細胞であって、該レポーターは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質の誘導体である、細胞。
【請求項２】
前記細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記異種核酸がプラスミド上にある、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記異種核酸が前記細胞のゲノム中に統合される、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞であって、前記フェロモン応答性プロモーターが、ＬＵＣ１、ＦＵＳ１、ＦＵＳ２、ＫＡＲ３、ＦＵＳ３、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１３、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＦＡＲ１、ＡＧＡ１、ＡＧＡ２、ＡＧａα１、ＧＰＡ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ６、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＭＦα１、ＭＦα２、ＣＩＫ１またはＢＡＲ１である、細胞。
【請求項７】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項３に記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項７に記載の酵母細胞。
【請求項９】
ＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＲＧＳタンパク質がＧＧＬドメインまたはＤＥＰドメインを欠いている、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞であって、該細胞がさらに、異種ＲＧＳタンパク質に対応するネイティブなＲＧＳタンパク質をコードする内因性核酸を含み、ここで、該内因性核酸は変異され、その結果、機能的なネイティブなＲＧＳタンパク質を生成しない、細胞。
【請求項１２】
前記変異が、欠失、挿入または置換のいずれかであるか、あるいは欠失、挿入または置換の各々である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項９に記載の細胞であって、前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳＺ１、ＲＧＳＺ２、Ｒｅｔ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９−１、ＲＧＳ９−２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ−ＰＸ１、ＧＡＩＰ、Ａｘｉｎ、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、ｅｇｌ−１０、ｅａｔ−１６、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびそれらのアイソフォームまたはＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインを含むタンパク質である、細胞。
【請求項１４】
前記ＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインが、ＰＬＣＢまたはｃＧＭＰ  ＰＤＥのγサブユニットである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ２、ＲＧＳ４、ＲＧＳ６、ＲＧＳ１１、またはＲＧＳＺである、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＲＧＳタンパク質がキメラである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細胞であって、前記キメラが、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを欠くＲＧＳ９のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを有するＲＧＳ９のＣ末端ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメイン、またはそれらの一部分を含む、細胞。
【請求項１８】
前記ＲＧＳ４のＮ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記ＲＧＳ７のＣ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＲＧＳ７のＮ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ＲＧＳ４のＣ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ａｘｉｎ  ＲＧＳドメインがａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２３】
キメラＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸を含む、細胞。
【請求項２４】
前記細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が酵母細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記異種核酸がプラスミド上にある、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
前記異種核酸が前記細胞のゲノム中に統合される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項２３に記載の細胞であって、前記キメラが、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを欠くＲＧＳ９のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを有するＲＧＳ９のＣ末端ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメインを含む、細胞。
【請求項２９】
前記ＲＧＳ４のＮ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記ＲＧＳ７のＣ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ＲＧＳ７のＮ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＲＧＳ４のＣ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３３】
前記ａｘｉｎ  ＲＧＳドメインがａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３４】
キメラＲＧＳタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項３５】
請求項３４に記載の単離された核酸であって、前記キメラが、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを欠くＲＧＳ９のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを有するＲＧＳ９のＣ末端ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメイン、またはそれらの一部分を含む、細胞。
【請求項３６】
前記ＲＧＳ４のＮ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含む、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
前記ＲＧＳ７のＣ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含む、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３８】
前記ＲＧＳ７のＮ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含む、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項３９】
前記ＲＧＳ４のＣ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含む、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項４０】
前記ａｘｉｎ  ＲＧＳドメインがａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む、請求項３５に記載の単離された核酸。
【請求項４１】
請求項３４に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４２】
前期ベクターがプラスミドまたはウイルスである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記プラスミドが低コピー数のプラスミドである、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
請求項４１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４６】
Ｇｂｅｔａ５をコードする異種核酸をさらに含む、請求項９に記載の細胞。
【請求項４７】
前記Ｇｂｅｔａ５がヒトＧｂｅｔａ５である、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
ＲＧＳタンパク質媒介性レポーター遺伝子発現を変更させる試験サンプルの能力を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フェロモンに応答する、少なくとも１つの第１の細胞を提供する工程であって、ここで、該第１の細胞は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードする異種核酸を含み、異種核酸の発現が測定可能なシグナルを産生する、工程；
（ｂ）フェロモンに応答する、少なくとも１つの第２の細胞を提供する工程であって、該第２の細胞は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードする異種核酸を含み、ここで、該異種核酸の発現は測定可能なシグナルを産生し、かつ第２のＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸を含む、工程；
（ｂ）測定可能なシグナルを検出するのに適切な条件下で、フェロモンの存在下において、試験サンプルを、該第１および第２の細胞と共にインキュベートする工程；
（ｃ）該レポーターをコードする該異種核酸の発現レベルを検出する工程；ならびに
（ｄ）該第１の細胞と第２の細胞における発現レベルを比較する工程であって、ここで、発現レベルの差異は、該試験サンプルが、ＲＧＳタンパク質媒介性レポーター遺伝子発現を変更することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記試験サンプルが単一の濃度で使用される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験サンプルが、ある範囲の濃度で使用される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記レポーターの発現レベルが、ハロアッセイにおいて検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記レポーターの発現レベルが、分光測定的により検出される、請求項４８に記載の方法．
【請求項５３】
前記検出が自動化される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記異種核酸が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質の誘導体をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１および第２の細胞が、哺乳動物細胞または酵母細胞のいずれかである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１および第２の細胞が酵母細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記レポーター遺伝子をコードする前記異種核酸が、プラスミド上にある、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記レポーター遺伝子をコードする前記異種核酸が、前記細胞のゲノム中に統合される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＧＳタンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、プラスミド上にある、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＲＧＳタンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、前記細胞のゲノム中に統合される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
請求項４８に記載の方法であって、前記フェロモン応答性プロモーターが、ＬＵＣ１、ＦＵＳ１、ＦＵＳ２、ＫＡＲ３、ＦＵＳ３、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１３、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＦＡＲ１、ＡＧＡ１、ＡＧＡ２、ＡＧα１、ＧＰＡ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ６、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＭＦα１、ＭＦα２、ＣＩＫ１またはＢＡＲ１である、方法。
【請求項６２】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＧＧＬドメインまたはＤＥＰドメインを欠いている、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
請求項４８に記載の方法であって、該方法がさらに、異種ＲＧＳタンパク質に対応するネイティブなＲＧＳタンパク質をコードする内因性核酸を含み、ここで、該内因性核酸は変異され、その結果、機能的なネイティブなＲＧＳタンパク質を生成しない、方法。
【請求項６６】
前記変異が、欠失、挿入または置換のいずれかであるか、あるいは欠失、挿入または置換の各々である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項４８に記載の方法であって、前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳＺ１、ＲＧＳＺ２、Ｒｅｔ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９−１、ＲＧＳ９−２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ−ＰＸ１、ＧＡＩＰ、Ａｘｉｎ、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、ｅｇｌ−１０、ｅａｔ−１６、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびそれらのアイソフォームまたはＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインを含むタンパク質である、方法。
【請求項６８】
前記ＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインが、ＰＬＣＢまたはｃＧＭＰ  ＰＤＥのγサブユニットである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ２、ＲＧＳ４、ＲＧＳ６、ＲＧＳ１１、またはＲＧＳＺである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＲＧＳタンパク質がキメラである、請求項４８に記載の方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法であって、前記キメラが、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを欠くＲＧＳ９のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを有するＲＧＳ９のＣ末端ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメイン、またはそれらの一部分を含む、方法。
【請求項７２】
前記ＲＧＳ４のＮ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＲＧＳ７のＣ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＲＧＳ７のＮ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＲＧＳ４のＣ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記ａｘｉｎ  ＲＧＳドメインがａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
ＲＧＳタンパク質媒介性レポーター遺伝子発現を変更させる試験サンプルの能力を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）フェロモンに応答する細胞の、少なくとも２つのアリコートを提供する工程であって、該細胞は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードする異種核酸を含み、ここで、異種核酸の発現は測定可能なシグナルを産生し、かつ第２のＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸を含む、工程；
（ｂ）測定可能なシグナルを検出するのに適切な条件下で、フェロモンの存在下において、細胞の該アリコートをインキュベートする工程であって、該アリコートの１つは試験サンプルを含む、工程；
（ｃ）該アリコートにおいて、レポーターをコードする該異種核酸の発現レベルを検出する工程；ならびに
（ｄ）該アリコートにおける該レポーターの発現レベルを比較する工程であって、ここで、該アリコート間の発現レベルの差異は、該試験サンプルが、ＲＧＳタンパク質媒介性レポーター遺伝子発現を変更することを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記試験サンプルが単一の濃度で使用される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記試験サンプルが、ある範囲の濃度で使用される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記レポーターの発現レベルが、ハロアッセイにおいて検出される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記レポーターの発現レベルが、分光測定的により検出される、請求項７７に記載の方法．
【請求項８２】
前記検出が自動化される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記異種核酸が、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質の誘導体をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が酵母細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記レポーター遺伝子をコードする前記異種核酸が、プラスミド上にある、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
前記レポーター遺伝子をコードする前記異種核酸が、前記細胞のゲノム中に統合される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＲＧＳタンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、プラスミド上にある、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＲＧＳタンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、前記細胞のゲノム中に統合される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
請求項７７に記載の方法であって、前記フェロモン応答性プロモーターが、ＬＵＣ１、ＦＵＳ１、ＦＵＳ２、ＫＡＲ３、ＦＵＳ３、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１３、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＦＡＲ１、ＡＧＡ１、ＡＧＡ２、ＡＧα１、ＧＰＡ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ６、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＭＦα１、ＭＦα２、ＣＩＫ１またはＢＡＲ１である、方法。
【請求項９１】
前記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＧＧＬドメインまたはＤＥＰドメインを欠いている、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
請求項７７に記載の方法であって、該方法がさらに、異種ＲＧＳタンパク質に対応するネイティブなＲＧＳタンパク質をコードする内因性核酸を含み、ここで、該内因性核酸は変異され、その結果、機能的なネイティブなＲＧＳタンパク質を生成しない、方法。
【請求項９５】
前記変異が、欠失、挿入または置換のいずれかであるか、あるいは欠失、挿入または置換の各々である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
請求項７７に記載の方法であって、前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳＺ１、ＲＧＳＺ２、Ｒｅｔ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９−１、ＲＧＳ９−２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ−ＰＸ１、ＧＡＩＰ、Ａｘｉｎ、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、ｅｇｌ−１０、ｅａｔ−１６、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびそれらのアイソフォームまたはＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインを含むタンパク質である、方法。
【請求項９７】
前記ＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインが、ＰＬＣＢまたはｃＧＭＰ  ＰＤＥのγサブユニットである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ２、ＲＧＳ４、ＲＧＳ６、ＲＧＳ１１、またはＲＧＳＺである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＲＧＳタンパク質がキメラである、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法であって、前記キメラが、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを欠くＲＧＳ９のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端およびＧＧＬドメインを有するＲＧＳ９のＣ末端ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメイン、またはそれらの一部分を含む、方法。
【請求項１０１】
前記ＲＧＳ４のＮ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＲＧＳ７のＣ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＲＧＳ７のＮ末端が、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＲＧＳ４のＣ末端が、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ａｘｉｎ  ＲＧＳドメインがａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む、請求項１００に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、フェロモンに応答し、そしてフェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を発現する新規の細胞に関する。特定の実施形態において、このレポーターは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、またはグリーン蛍光タンパク質の誘導体である。他の実施形態において、この細胞はまた、Ｇタンパク質の異種の調節因子（「ＲＧＳタンパク質」）を発現する。
【０００２】
別の実施形態において、本発明は、ＲＧＳタンパク質を調節する化合物をスクリーニングする方法に関し、ここでこの方法は、本発明の新規の細胞を使用する。
【０００３】
（発明の背景）
Ｇタンパク質シグナル伝達経路は、細胞外シグナル（例えば、神経伝達物質、ホルモン、臭気剤（ｏｄｏｒａｎｔ）、および光）を中継するための最も重要なシグナル伝達カスケードの一つである。このような経路は、酵母および哺乳動物を含む、種々の生物体において同定されてきた。古典的に、この系は、以下の３つの主要な構成要素からなる：Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）、α、βおよびγサブユニットを有するヘテロ３量体Ｇタンパク質、および細胞内エフェクター（Ｇｉｌｍａｎ、１９８７）。最近、タンパク質のＲＧＳファミリーが、発見された。ＲＧＳタンパク質は、細胞がＧタンパク質経路を介し生成されるシグナルの持続時間および大きさの両方を微調整し得る、機構を提供する（Ｋｅｈｒｌら、１９９９）。本発明は、ＲＧＳタンパク質を調節する新規の因子を単離し、そして特徴づけるために使用され得る、改変された宿主系に関する。このような因子は、Ｇタンパク質シグナル伝達経路の不適切な活性に起因する疾患の制御および処置のための大きな可能性を示す。
【０００４】
Ｇタンパク質シグナル伝達経路は、その７回膜貫通ドメインによって特徴付けられるＧＰＣＲの活性化により始まる。ＧＰＣＲが刺激された場合、その細胞内ループおよびＣ末端テールは、会合したＧタンパク質と相互作用する（Ｗｉｅｌａｎｄら、１９９９）。次いで、Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、グアノシンニリン酸（ＧＤＰ）を放出し、そしてグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を代わりに結合する。このＧＴＰの結合は、Ｇαサブユニットの形状および三次元立体配座を変え、ヘテロトリマーの解離を生じ、ＧＴＰが配位されたＧαサブユニットおよびＧβγダイマーとなる。次いで、放出されたサブユニットは、下流のシグナル伝達事象を自由に誘導し、最終的に、生化学的応答、細胞内の生理の変化または他の特定の細胞性応答を媒介する。このシグナル伝達は、ＧαサブユニットがＧＴＰを加水分解する場合に終わり、ＧＤＰ結合状態に戻り、次いで、不活性のヘテロトリマーを形成するためにＧβγサブユニットと再会合する（Ｋｅｈｒｌ、１９９８）。
【０００５】
適切な細胞性応答を誘発するために、細胞内シグナルの強度は、厳重に調節されていなければならない。ＧＰＣＲのリン酸化、レセプター結合タンパク質、およびＧβγ捕捉タンパク質のような、この系の調節の多くの型が存在するが、多くの研究者は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）に焦点を当ててきた（Ｗｉｅｌａｎｄら、１９９９を参照のこと）。ＧＡＰは、Ｇα−ＧＴＰａｓｅ加水分解の割合を増進し、これによって、その経路で生じるシグナルを減少し、そしてその系を「脱感作する」（ＤｅＶｒｉｅｓら、１９９９）。
【０００６】
ＲＧＳタンパク質は、ＧＡＰの比較的新しいクラスを代表する。このファミリーの最初のメンバーは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られた（Ｄｏｈｌｍａｎら、１９９６；Ｗｅｉｌａｎｄら、１９９９）。ＧＰＣＲ経路によって媒介される応答であるフェロモン誘導型細胞周期阻止に対し高感受性である、ハプロイド（ｈａｐｌｉｏｄ）変異体が、同定された。研究は、変異した遺伝子産物、Ｓｓｔ２が、ＧＡＰとしてＧタンパク質Ｇαサブユニットと相互作用することを明らかにした。従って、Ｓｓｔ２は、この系のネガティブ調節因子として役割を果たし、酵母の成熟を制御する。その後、哺乳動物における２０以上の異なるメンバーを含む、ＲＧＳファミリーの多くのさらなるメンバーが、多くの種において特徴付けられてきた（Ｚｈｅｎｇら、１９９９）。ＲＧＳタンパク質のレパートリーは、選択的スプライシングによって非常に増加されると仮説立てられている（Ｐａｎｅｔｔａら、１９９９）。
【０００７】
活性化されたＧαサブユニットについてのＧＡＰとしての役割に加えて、ＲＧＳタンパク質はまた、Ｇβγ媒介性経路を刺激することが報告されてきた。ＲＧＳタンパク質は、Ｇα−ＧＴＰタンパク質に対し有意に高い親和性を有するが、ＲＧＳタンパク質は、Ｇα−ＧＤＰに対し低い親和性を有する。ＲＧＳタンパク質が、Ｇα−ＧＤＰに結合する場合、Ｇβγタンパク質は、下流の事象を自由に媒介したままである（Ｐａｎｅｔｔａら、１９９９を参照のこと）。従って、ＲＧＳタンパク質は、１より多い様式でのＧタンパク質シグナル伝達経路の調節において重要であり得る。
【０００８】
ＲＧＳファミリーの大きさおよびＧタンパク質シグナル伝達経路の調節におけるＲＧＳタンパク質の重要な役割に起因して、科学者は、どのように個々のＲＧＳタンパク質が、その特異性を達成するのかを研究し始めた。特異性のあるレベルは、異なるＲＧＳタンパク質の発現パターンから生じ；いくつかのＲＧＳタンパク質は、遍在的に発現されるが、いくつかのＲＧＳタンパク質は、特定の組織において発現される（Ｚｈｅｎｇら、１９９９；Ｐａｎｅｔｔａら、１９９９）。異なるＲＧＳタンパク質は、個々のＧα−サブユニットに対して異なる特異性を有し得ることもまた推測されている（Ｋｅｈｒｌら、１９９８）。このことは、特定のＲＧＳタンパク質が他の経路よりもＧタンパク質シグナル経路を優先的に調節することを可能にするか（Ｚｈｅｎｇら、１９９９）、または単一のＧＰＣＲから２つのＧα応答を偏向させることを可能にする。
【０００９】
Ｇタンパク質シグナル伝達経路の制御はまた、ＲＧＳタンパク質の濃度または活性の調節を通して達成され得る。例えば、ＲＧＳタンパク質をコードする遺伝子の転写は、生化学的なフィードバック機構を通して変更され得る（Ｐａｎｅｔｔａら、１９９９を参照のこと）。ＲＧＳ１６の発現は、カルバコールによって誘導されるが、血小板活性化因子は、Ｂ細胞においてＲＧＳ１の発現を誘発することが示されてきた。逆に、ＲＧＳ４の発現は、細胞内ｃＡＭＰレベルに応じてダウンレギュレートされる。
【００１０】
多くの細胞に基づく研究の土台は、レポーター遺伝子の使用によって、細胞表現型の変化に対して目的の遺伝子または薬物の所望の効果を関連づける。酵母の系において、例えば、レポーター遺伝子は、通常、選択培地における細胞増殖のための栄養要求性遺伝子、またはβ−ガラクトシダーゼ活性を検出するアッセイを使用する比色分析指標のためのＬａｃＺ遺伝子に焦点が合わされる。例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子もまた、酵母におけるレポーター遺伝子として有用である。ルシフェラーゼレポーターは、アッセイの感度、速さ、容易さ、シグナル：ノイズ比の増加を提供し、そして無数の標的の同定および薬物発見適用のための酵母ベースのアッセイに対して高質の定量的なデータを提供する。酵母におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用は、酵母に基づくアッセイ（例えば、ＲＧＳタンパク質の修飾因子に対するアッセイ）に対し、実質的な改善を提供する。
【００１１】
１実施形態において、本発明は、ＲＧＳタンパク質を調節し得る化合物（例えば、直接的または間接的にＲＧＳタンパク質自体と相互作用する化合物）を同定するための方法に関する。このような因子の手掛かりは、文献において見出され得る。例えば、ＲＧＳ３およびＲＧＳ１２の両方は、コイルドコイル構造を有すると予測される領域を有し；このようなドメインは、しばしば、細胞の細胞骨格タンパク質との相互作用を媒介する（Ｋｅｈｒｌら、１９９９）。これは、ＲＧＳタンパク質が、膜結合型プールと細胞質ゾルのプールとの間で変動することを可能にし得、従って、所定の時点のＲＧＳタンパク質の有効性を変更し、そして／または、ＲＧＳタンパク質が調節するＧαサブユニットの型に影響する（ＤｅＶｒｉｅｓら、１９９９）。
【００１２】
本発明の新規の改変された細胞およびこれらの細胞を含む新規の方法は、ＲＧＳタンパク質に影響する物質を検出するための有意な進歩を提供する。現時点では、ＲＧＳ活性を調節し得る化合物を系統的に検出するための効率的かつ特異的なスクリーニング系は開発されていない。このような化合物は、広範な多くの生物学的なプロセスを媒介し得かつ多くの疾患の根底となる数百のＧタンパク質経路の一つ以上を潜在的に調節し得るので、治療上大きな価値を有する化合物である。さらに、薬理学者は、今日使用されている全ての医薬のうち６０％までがＧタンパク質シグナル伝達経路を介してその効果を発揮すると推測している（Ｒｏｕｓｈ、１９９６）。これらの系を調節する新しい因子の発見により、これらの医薬の多くと関連する薬物耐性の現象が、対処され得る。
【００１３】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結された適切なレポーターをコードする異種核酸を含むフェロモンに応答する細胞に関する、ここでこのレポーターは、例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、または緑色蛍光タンパク質の誘導体である。この細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞であり得る。特定の実施形態では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００１４】
プロモーターをコードする異種核酸は、ベクター上（例えば、プラスミド）に含まれ得る。代替の実施形態において、異種核酸は、細胞のゲノム内に組み込まれる。
【００１５】
特定の実施形態において、フェロモン応答性プロモーターは、ＬＵＣ１、ＦＵＳ１、ＦＵＳ２、ＫＡＲ３、ＦＵＳ３、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１３、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＦＡＲ１、ＡＧＡ１、ＡＧＡ２、ＡＧα１、ＧＰＡ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ６、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＭＦα１、ＭＦα２、ＣＩＫ１、またはＢＡＲ１である。
【００１６】
別の局面において、本発明の細胞は、さらにＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸を含み得る。ＲＧＳタンパク質は、Ｇγ様（「ＧＧＬ」）ドメインまたは乱雑なＥＧＬ−１０プレクストリン（「ＤＥＰ」）ドメインを欠失している。代替の実施形態において、この細胞はさらに、異種ＲＧＳタンパク質に対応するネィティブなＲＧＳタンパク質をコードする内在性の核酸を含む、ここでこの内在性の核酸は変異され、その結果、機能的なネィティブのＲＧＳタンパク質を産生しない。変異は欠失、挿入、または置換のいずれかまたは各々である。
【００１７】
任意のＲＧＳタンパク質は、本発明の使用に適しており、これらとしては、以下のものが挙げられる；ＲＧＳＺ１、ＲＧＳＺ２、Ｒｅｔ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９−１、ＲＧＳ９−２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ−ＰＸ１、ＧＡＩＰ、Ａｘｉｎ、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、ｅｇｌ−１０、ｅａｔ−１６、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ、およびそのアイソフォームまたはＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインを含むタンパク質。このタンパク質が、ＲＧＳ様（ＲＧＬ）ドメインを含む場合、そのドメインは、ＰＣＬＢまたはｃＧＭＰ  ＰＤＥのγサブユニットであり得る。好ましくは、ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳ２、ＲＧＳ４、ＲＧＳ６、ＲＧＳ１１、またはＲＧＳＺである。いくつかの実施形態では、ＲＧＳタンパク質は、ＧＧＬまたはＤＥＰドメインを欠失している。
【００１８】
いくつかの実施形態において、この細胞はさらに、Ｇβ５をコードする異種核酸を含む。特定の実施形態において、このＧβ５はヒトである。
【００１９】
特定の実施形態において、このＲＧＳタンパク質はキメラである。このキメラは、ＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ７のＣ末端、ＲＧＳ７のＮ末端およびＲＧＳ４のＣ末端、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ１０、ＲＧＳ４のＮ末端および完全なＲＧＳ７、ＧＧＬドメインを欠失しているＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ９のＣ末端、ＧＧＬドメインを有するＲＧＳ４のＮ末端およびＲＧＳ９のＣ末端、ならびにＲＧＳ４のＮ末端およびａｘｉｎのＲＧＳドメイン、またはそれらの部分を備え得る。
【００２０】
特定の実施形態では、ＲＧＳ４のＮ末端は、ＲＧＳ４のアミノ酸１〜５７を含み、ＲＧＳ７のＣ末端は、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０を含み、ＲＧＳ７のＮ末端は、ＲＧＳ７のアミノ酸１〜３３２を含み、ＲＧＳ４のＣ末端は、ＲＧＳ４のアミノ酸５８〜２０６を含み、そしてａｘｉｎ  ＲＧＳドメインはａｘｉｎのアミノ酸１９９〜３４５を含む。
【００２１】
本発明は、キメラＲＧＳタンパク質（例えば、上記で記載したもの）をコードする異種核酸を含む細胞を含む。この細胞は、哺乳動物細胞または酵母細胞であり得る。特定の実施形態において、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２２】
キメラＲＧＳタンパク質をコードする異種核酸は、ベクター上（例えば、プラスミド）に含まれ得る。代替の実施形態において、異種核酸は、細胞のゲノム内に組み込まれる。
【００２３】
本発明の別の局面は、キメラＲＧＳタンパク質をコードする単離された核酸に関する。キメラＲＧＳタンパク質は、上記で記載されたもののいずれかであり得る。この単離された核酸は、ベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）に挿入され得る。このプラスミドは低コピー数プラスミドであり得る。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、試験サンプルがＲＧＳタンパク質を媒介するレポーター遺伝子発現を変化する能力を検出する方法であって、この方法は以下を包含する：
（ａ）フェロモンに応答する少なくとも１つの第一の細胞を提供する工程であって、ここでこの第一の細胞は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーターをコードする異種核酸を含み、ここでこの異種核酸の発現は、測定可能なシグナルを生じる、工程；
（ｂ）フェロモンに応答する少なくとも１つの第二の細胞を提供する工程であって、ここでこの第二の細胞はフェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されるレポーターをコードする異種核酸を含み、ここでこの異種核酸の発現は、測定可能なシグナル、およびＲＧＳタンパク質をコードする第二の異種核酸を生じる、工程；
（ｂ）測定可能なシグナルを検出するのに適した条件下、フェロモンの存在下で試験サンプルを第一の細胞および第二の細胞と共にインキュベートする工程；
（ｃ）レポーターをコードする異種核酸の発現のレベルを検出する、工程；および
（ｄ）第一の細胞および第二の細胞内の発現のレベルを比較する工程であって、ここで発現のレベルの差異は、試験サンプルがＲＧＳタンパク質媒介性のレポーター遺伝子発現を変化することを示す工程。
【００２５】
本発明の方法を実行するために、本発明の任意の適切な細胞（例えば、上記で記載したもの）が、使用され得る。
【００２６】
一つの実施形態において、この方法は、単一の濃度で試験サンプルを使用して実施され得るか、あるいは試験サンプルは、ある濃度の範囲で使用される。
【００２７】
本発明の方法を実施するにおいて、レポーター遺伝子の発現のレベルの検出は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して達成され得る。特定の実施形態において、レポーター遺伝子の検出は、ハロアッセイを使用して達成される。代替の実施形態では、レポーターの発現のレベルは、分光光度法で検出される。検出は自動化され、それによって大スケールで試験化合物をスクリーニングすることについて、本発明の有用性を増大させる。
【００２８】
異なる局面において、本発明は、試験サンプルがＲＧＳを媒介するレポーター遺伝子発現を変化する能力を検出する方法であって、方法は以下を包含する：
（ａ）フェロモンに応答する細胞の少なくとも２つのアリコートを提供する工程であって、ここでこの細胞はフェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーターをコードする異種核酸を含み、ここでこの異種核酸の発現が、測定可能なシグナル、およびＲＧＳタンパク質をコードする第二の異種核酸を生じる、工程；
（ｂ）測定可能なシグナルを検出するのに適した条件下、フェロモンの存在下で細胞のアリコートをインキュベートする工程であって、ここでアリコートの１つは、試験サンプルを含む、工程；
（ｃ）アリコートにおいてレポーターをコードする異種核酸の発現のレベルを検出する、工程；および
（ｄ）このアリコートにおいてレポーターの発現のレベルを比較する工程であって、ここでアリコート間の発現のレベルの差異は、試験サンプルがＲＧＳタンパク質媒介性のレポーター遺伝子発現を変えることを示す工程。
【００２９】
本発明の方法を実行するために、本発明の任意の適切な細胞（例えば、上記で記載したもの）が、使用され得る。
【００３０】
一つの実施形態において、この方法は、単一の濃度で試験サンプルを使用して実施され得るか、あるいは試験サンプルは、ある範囲の濃度で使用される。
【００３１】
本発明の方法を実施する際に、レポーター遺伝子の発現のレベルの検出は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して達成され得る。特定の実施形態において、レポーター遺伝子の検出は、ハロアッセイを使用して達成される。代替の実施形態では、レポーターの発現のレベルは、分光光度法で検出される。検出は自動化され、それによって大スケールで試験化合物をスクリーニングすることについて、本発明の有用性を増大させる。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明の改変細胞は、宿主細胞を使用する。本発明における使用に効果的な宿主細胞は、レポーター（必要に応じて外因性のＲＧＳタンパク質）に連結された、フェロモン応答プロモーターの適切な発現、および他所望の任意の遺伝子操作を操作するよう遺伝学的に定義されることのみを必要とする。宿主細胞は、フェロモンまたはＧＰＣＲに対するリガンドとして役立つ他の化学物質に応答し得る、真核生物細胞または原核生物細胞のような、任意の細胞（例えば、哺乳動物細胞）であり得る。その細胞は天然で、フェロモンまたは他の化学物質に応答し得るか、またはそれらに応答するように遺伝子操作され得る。好ましくは、宿主細胞は真菌細胞（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＮｅｕｒｏｐｏｒａ属のメンバー）である。より好ましい実施形態において、宿主細胞は酵母細胞である。代替の好ましい実施形態において、酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである。
【００３３】
本発明の細胞は、フェロモン応答性プロモーターに作動可能に連結されたレポーターをコードする異種核酸を含む、少なくとも１つの構築物を使用し、ここで、その異種核酸の発現が測定可能なシグナルを生成する。好ましくは、その異種核酸は、ベクター（例えば、プラスミド）に含まれるか、あるいはその核酸は、細胞の染色体中に組み込まれ得る。
【００３４】
特定の実施形態において、宿主細胞はさらに外因性のＲＧＳタンパク質を含む。好ましい実施形態において、宿主細胞内の内因性のＲＧＳタンパク質は変異している。フェロモン（例えば、α因子）で処理されると、フェロモン感受性プロモーターは活性化され、レポーター遺伝子の発現が生じる。機能的なＲＧＳタンパク質の発現は、フェロモン応答性プロモーターの活性化を阻害し、レポーター遺伝子の発現の減少を生じる。ＲＧＳタンパク質活性を阻害する化合物の存在は、レポーター遺伝子発現の増加を生じる。
【００３５】
異種核酸配列は、細胞において、例えば、発現ベクターまたは発現プラスミドを利用して発現される。発現ベクターまたは発現プラスミドは、異種核酸が、意図される宿主細胞内で異種核酸配列によりコードされるレポータータンパク質またはレポータータンパク質サブユニットの発現に影響し得る１つ以上の適切なコントロール配列と作動可能に連結された、複製可能なＤＮＡ構築物である。一般的に、コントロール配列としては、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。
【００３６】
プラスミドに加えて、本発明の実施に有用なベクターとしては、ウイルス、ならびに遺伝子組換えにより宿主ゲノム中に組み込まれる、挿入配列およびトランスポゾンのような、組み込み可能なＤＮＡフラグメントが挙げられる。本発明において使用に適したウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルスが挙げられる。ベクターは、プラスミドの場合と同様に、宿主のゲノムから独立して複製および機能し得るか、または、組み込み可能なＤＮＡフラグメント（例えば、挿入配列またはトランスポゾン）の場合と同様に、そのゲノム自体に組み込まれ得る。適切なベクターは、意図される宿主細胞と適合性の種に由来する、複製配列および制御配列を含む。例えば、宿主細胞で作動可能なプロモーターは、その細胞のＲＮＡポリメラーゼを結合するプロモーターである。適切な複製配列および制御配列は、当業者に周知である。
【００３７】
核酸は、それらが機能的に互いに関係する場合、作動可能に制御配列に結合する。例えば、プロモーターは、ある核酸の転写を制御する場合、その核酸に作動可能に連結される。リボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように位置する場合、核酸に作動可能に連結される。
【００３８】
使用されるフェロモン応答性プロモーターおよびリガンドは、それらの特異的な相互作用が公知であるか、または利用可能な科学的方法により推定され得る限り、広範に変動し得る。種々の天然に存在するフェロモン応答性プロモーター、もしくは合成フェロモン応答エレメント、または他のフェロモン応答エレメント含有遺伝子のうちの任意のものが使用され得る。好ましくは、フェロモン応答性プロモーターは、ＦＵＳ１、ＦＵＳ２、ＫＡＲ３、ＦＵＳ３、ＳＴＥ３、ＳＴＥ１３、ＳＴＥ１２、ＣＨＳ１、ＦＡＲ１、ＡＧＡ１、ＡＧＡ２、ＡＧα１、ＧＰＡ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＴＥ６、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＭＦα１、ＭＦα２、ＣＩＫ１、ＬＵＣ１、ＢＡＲ１、またはωエレメント由来である。
【００３９】
好ましくは、接合プロセス（例えば、形態学的変化、凝集、形態形成、細胞融合、核融合、など）に関連する酵母細胞における変化を開始する、任意のフェロモンまたは機能性成分が本発明における使用に適切であるが、本発明において使用されるフェロモンは、α因子、ａ因子またはＭフェロモンである。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「異種（の）」とは、本発明の細胞以外の生物由来の核酸、タンパク質およびその他物質、または本発明の細胞において天然では見出されないそれらの組み合わせをいう。この用語はまた、本発明の細胞と同じ生物由来であるが、対応する内因性配列に関して、任意の方法で改変された核酸をいう。
【００４１】
任意のＧタンパク質結合レセプター系が、本発明を実行するのに使用され得る。そのようなレセプター系の例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：アデノシンレセプターと関連するレセプター系、ソマソスタチンレセプターと関連するレセプター系、ドーパミンレセプターと関連するレセプター系、コレシストキニンレセプターと関連するレセプター系、ムスカリン性コリン作用性レセプターと関連するレセプター系、α−アドレナリン作用性レセプターと関連するレセプター系、β−アドレナリン作用性レセプターと関連するレセプター系、オピエートレセプターと関連するレセプター系、カンナビノイドレセプターと関連するレセプター系、ヒスタミンレセプターと関連するレセプター系、成長ホルモン放出因子レセプターと関連するレセプター系、グルカゴンレセプターと関連するレセプター系、セロトニンレセプターと関連するレセプター系、バソプレシンレセプターと関連するレセプター系、メラノコルチン（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）レセプターと関連するレセプター系、およびニューロテンシンレセプターと関連するレセプター系。
【００４２】
そのレセプター遺伝子は、リガンドのそのＧＰＣＲに対する結合とフェロモン応答性プロモーターとの間の相互作用が、周知および簡単な技術によってモニターされ得る目的で、一般的に選択される。好ましくは、そのレセプター遺伝子は、その費用、その活性の測定の容易さおよび低いバックグラウンドに基づいて選択される。すなわち、その活性は、バックグラウンド比に対する高いシグナル、および／または相対的に低いもしくは誘導されない活性がもとで、相対的に低いレベルのレセプター遺伝子の発現で決定され得る。レポーターは、その活性が利用可能な任意の手段によって検出され得る、任意のレポーターであり得る。例証される、本発明に使用され得るレポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子の誘導体、またはＣＡＴである。好ましくは、そのレポーターの活性は、比色法または蛍光法によって示される。
【００４３】
好ましい実施形態において、そのレポーター遺伝子は、例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ遺伝子である。他の生物体由来のルシフェラーゼ遺伝子はまた、当業者に周知である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用によって与えられる有意な利点は、迅速な液体アッセイをそれらの遺伝子が可能にすることであり、それによって試験サンプルの高スループットスクリーニングが可能となる。さらに、酵母におけるルシフェラーゼレポーターの使用は、アッセイの感度を亢進し、定量的なデータを集めることを可能にし、そしてアッセイの自動化（特に高スループット（３８４ウェル）のアッセイフォーマット）を可能にする。その短いアッセイ時間は、長い（４８時間＋）インキュベーション時間による化合物毒性の影響を避ける、薬物スクリーニング用途における有用性を付与する。その長いインキュベーション時間は、標準の栄養要求性（ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３）レポーター、または対抗選択（ＣＡＮ１、ＵＲＡ３、ＣＹＨ２）レポーター（これらの両方は、終末点決定のために細胞増殖を必要とする）のために、現在必要とされている。
【００４４】
本発明に使用され得るＲＧＳタンパク質の例証としては、ＲＧＳドメイン（ＲＧＳＺ１、ＲＧＳＺ２、Ｒｅｔ−ＲＧＳ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＲＧＳ３、ＲＧＳ４、ＲＧＳ５、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、ＲＧＳ８、ＲＧＳ９−１、ＲＧＳ９−２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１１、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ１４、ＲＧＳ１６、ＲＧＳ−ＰＸ１、ＧＡＩＰ、Ａｘｉｎ、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ、ｅｇｌ−１０、ｅａｔ−１６、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびそれらのアイソフォームなど）を含むタンパク質、またはＲＧＳ−様（ＲＧＬ）ドメイン（たとえば、ＰＬＣＢ、ｃＧＭＰ  ＰＤＥのγサブユニット）を含むタンパク質である。
【００４５】
２ミクロンおよび低いコピー数（ＣＥＮ）の両方のバージョンのフェロモン応答性プロモーターレポーター遺伝子構築物は、細胞内でレポーター遺伝子コピー数を操作することによって、レポーター遺伝子機能またはアッセイ感度をさらに制御することを可能にし得る。
【００４６】
分子クローニング技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８によって記載される、標準の方法を使用して実行される。制限消化は、製造の仕様書に従って行われる。そのクローニングスキームに適切な場合、ｃＤＮＡフラグメントは標準の技術に従うＫｌｅｎｏｗを使用して、平滑断端を作製するために末端を充填された。ｃＤＮＡフラグメントおよび／またはベクターの脱リン酸は、製造者の指示書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｈｅｉｍまたはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）を使用して行われる。連結反応は、標準の技術を使用して行われ、そして組換えベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞に形質転換され、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレートにプレートされる。コロニーが、回収され、そしてプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ  ｍｉｄｉ  ｐｒｅｐキットかまたは自動ＤＮＡ調製機（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して調製された。プラスミドおよびクローニングストラテジーの完全性は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製の試薬、およびＡＢＩ製の自動化された配列決定装置を使用して確認された。酵母株は、Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ手順を使用して形質転換され、適切な培地にプレートされた（Ｒｏｓｅら、１９９０）。全ての酵母培地および試薬は、標準の方法を使用して調製された。
【００４７】
本発明の新規の改変された細胞は、試験化合物の存在下で、レポーター遺伝子の発現を決定するための様々なスクリーニング方法に容易に適用される。本発明のスクリーニング方法は、レポーター遺伝子の活性の変化によって決定されるような、Ｇタンパク質応答経路を改変するようにＲＧＳタンパク質の能力と相互作用する化合物を検出するために設計された。その試験化合物は、好ましくは約２アミノ酸長である、ペプチドであり得るか、または非ペプチド化学化合物であり得る。非ペプチド試験化合物としては、化合物、錯体および塩ならびに天然産物サンプル（植物抽出物、組織抽出物など）および醗酵ブロスから得られた物質が挙げられる。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、ＲＧＳ活性がモニターされ得る細胞が、開発された。１つの例において、ルシフェラーゼ遺伝子は、フェロモン応答性プロモーター、ＦＵＳ１に連結された。このＦＵＳ１ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、酵母細胞中で発現され、その中で内在性のＲＧＳタンパク質、Ｓｓｔ２は、内在性ｓｓｔ２遺伝子がｓｓｔ２欠失株に対してその機能性を等価にする変異を含む酵母株中で欠失または発現された。その「試験」細胞において、プラスミドは哺乳動物ＲＧＳ４タンパク質の発現を付与されたが、一方、「コントロール」細胞は、ＲＧＳ４遺伝子を欠くプラスミドで形質転換された。試験細胞およびコントロール細胞は、レセプターに結合しＦＵＳ１プロモーターおよびルシフェラーゼレセプター遺伝子の発現を駆動するための細胞内カスケードを刺激するα因子リガンドで処理される。コントロール株において、高レベルのルシフェラーゼが発現され、基質の存在下で強い蛍光を生じた。逆に、ＲＧＳ４を含む酵母株は、シグナルカスケードをネガティブに調製し、ＦＵＳ１−ルシフェラーゼレセプター遺伝子の大きく減少された活性を示した。これらの発見は、β−ｇａｌ活性または栄養要求性のマーカーのような他のレポーターを使用する以前の研究に関連する。
【００４９】
これらの酵母細胞は、ＲＧＳタンパク質と相互作用する因子の研究または発見のための多くの方法で使用され得る。例えば、試験化合物は、ＲＧＳ４タンパク質を発現するベクターを含む試験株に添加され得る。その因子がＲＧＳ４タンパク質と相互作用する場合、その因子は、ＲＧＳ４タンパク質機能をブロックまたは亢進し、従って、α因子／レセプター相互作用から誘導されたシグナルをネガティブに調製するＲＧＳタンパク質の能力に影響を及ぼす。次いで、そのα因子シグナル刺激は、レポーター遺伝子の発現を減少させるのに役立ち（その能力をのばし）、高レベルの発光を生じる。あるいは、ＲＧＳ機能を亢進する化合物は、レポーター遺伝子発現を減少する。コントロール株と比較すると、試験（ＲＧＳ４を発現する）株内にルシフェラーゼ活性の増加を示す化合物は、潜在的な薬剤候補であるとみなされる。ベクターコントロール細胞について見出されるルシフェラーゼ活性よりも、約５０％（またはいくつかの他の適切に決定された割合）の試験株中のルシフェラーゼ活性の増加を生じる化合物は、用量応答アッセイにおいて試験され得る。
【００５０】
これらの型のＲＧＳアッセイは、薬剤発見において、大きな潜在性を示す。これらは、非常に感度がよく、短い試験期間を有し、そして大規模な薬剤発見に使用される高スループットシステムに理想的である。さらに、そのルシフェラーゼ−ＲＧＳアッセイは、オーファンＧタンパク質レセプターに対するリガンドの同定に使用され得、キナーゼのようなＧタンパク質経路における他のメンバーを研究またはスクリーニングするために使用され得る。
【００５１】
以下の実施例は本発明の様々な局面をさらに図示するために提供される。これらは、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５２】
（実施例１．ＦＵＳ１−ＬａｃＺレセプターＲＧＳアッセイ）
酵母中のα因子によるＧＰＣＲレセプターの刺激は、十分に特徴付けられている（Ｄｏｈｌｍａｎら、１９９６参照）。この経路の刺激は通常、酵母の細胞周期の停止を生じる。このシグナル伝達経路は、ＧＰＣＲシグナル伝達のネガティブな調節因子として機能する内在性のＲＧＳタンパク質、Ｓｓｔ２によって制御される。そのＲＧＳタンパク質は、Ｇα−サブユニットの内在性のＧＴＰａｓｅ活性を促進するように作用した。ＧＰＣＲシグナルを遮断する能力が損なわれたので、酵母中でＳｓｔ２をコードする遺伝子の欠失は、リガンドに対して超高感度である酵母細胞を生じた。哺乳動物ＲＧＳタンパク質、ＲＧＳ４は、酵母中のＳｓｔ２に対して機能的に相補し得る。
【００５３】
本実施例において、レポーター遺伝子活性を、哺乳動物ＲＧＳ４タンパク質の存在または非存在下において、ｓｓｔ２を欠失した酵母株中で測定した。このアッセイにおいて、本発明者らは、ＲＧＳ４タンパク質が、フェロモン応答性遺伝子の活性を導く、α因子誘導されたフェロモン応答性経路を調節し得るか否か試験した。ｌａｃＺ遺伝子を、フェロモン応答性プロモーター（ＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子）の下流に作動可能に連結され、フェロモンα因子に応答し得るＭＡＴａ細胞のような細胞中で発現させた。
【００５４】
ＦＵＳ−１プロモーターおよびＬａｃＺレポーター遺伝子を含むプラスミド（Ｋｐ２７）を、調製した。このプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＥａｇＩを用いるｐＲＳ４２４プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の消化によって産生した。ＦＵＳ１−プロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１６７１７）を、１．０９５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントとして産生し、一方で、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＶＵ８９６７１）を、３．０ｋｂのＳａｌＩ−ＥａｇＩフラグメントとして産生した。３方向の、方向性ライゲーションを、標準的な方法を用いて、調製されたｐＲＳ４２４ベクター、ＦＵＳ１フラグメントおよびβ−ガラクトシダーゼフラグメントの間で行って、プラスミドＫｐ２７を産生した。組換えＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換し、そして選択された形質転換株由来のＤＮＡを、標準的な方法によって調製した。このＫｐ２７構築物を、制限消化および配列分析によって確認した。
【００５５】
本発明者らはまた、ＲＧＳ４タンパク質をコードするプラスミド構築物も調製した。全長ラットＲＧＳ４（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ１１７２１１）をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーと共に、テンプレートとしてプラスミドｐＷＥ２ＲＧＳ４を用いるＰＣＲ（Ｓｈｕｅｙら、１９９７）によって得た：
【００５６】
【化１】
2004520824.tif 000003
（これは、包理されたＢｓｍＢＩ部位およびＮｃｏＩ配列の部分を含む）；および
【００５７】
【化２】
2004520824.tif 000004
（これは、さらなる終結コドンおよび包理されたＢａｍＨＩ部位を含む）。
【００５８】
ヘマグルチニン標識（「ＨＡ」）ＲＧＳ４を構築するために、終結コドンを欠損するが、包理されたＢａｍＨＩ部位を含む、異なる３’プライマーを用いた：
【００５９】
【化３】
2004520824.tif 000005
。
【００６０】
このＰＣＲ産物（約６５０ｂｐ）を、ＢｓｍＢＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そして非標識ＲＧＳ４タンパク質およびＨＡ標識ＲＧＳ４タンパク質各々の発現のために、ベクターＫｐ４６またはＫｐ５７に連結させた。生じたプラスミドＫｐ１１８（ＲＧＳ４−Ｋｐ４６）およびＫｐ１１９（ＲＧＳ４−Ｋｐ５７）を、細菌細胞に形質転換した。組換えＤＮＡを調製し、そして以下のプライマーを用いる配列分析によって確認した：
【００６１】
【化４】
2004520824.tif 000006
。
【００６２】
内因性ＲＧＳタンパク質（ＳＳＴ２）が除去された酵母株を産生するために、ＳＳＴ２：：ＮＥＯ構築物を、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩを用いる消化によって、ＬＥＵマークされたプラスミドｐＥＫ１３９／１３８から得た。ｓｓｔ２−ＮＥＯ−ｓｓｔ２カセットを含む、得られた４．０ｋｂのフラグメントを、ゲル単離および精製した。このｃＤＮＡフラグメントを、導入を増強するためにＵＲＡでマークされたｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、酵母株ＣＹ７７０（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−９０１  ｈｉｓ−２００  ａｄｅ２−１０１  ｇａｌ４  ｇａｌ８０  ｌｙｓ２：：ＧＡＬｕａｓ−ＨＩＳ３  ｃｙｈＲ；Ｙｏｕｎｇら、１９９５）へと同時形質転換した。形質転換の後で、酵母細胞を、ＹＰＤ培地中で増殖させ、そしてＳＣ−ｕｒａ培地上で培養した。得られたＵＲＡ＋酵母のコロニーを、５０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（ＢＲＬからのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含むＹＰＤ培地上で、次いで１００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地上で、連続して複製培養（ｒｅｐｌｉｃａ  ｐｌａｔｅ）した。Ｇ４１８耐性ＣＹ７７０酵母のコロニーを、ＰＣＲ分析によって確認して、ｓｓｔ２−ＮＥＯ−ｓｓｔ２構築物の導入を証明した。ＰＣＲ検定に用いたプライマーは、以下のものであった：
【００６３】
【化５】
2004520824.tif 000007
。
【００６４】
Ｋｘ２４プライマーおよびＫｘ２５プライマーから、確認されたノックアウト株については４．２ｋｂのＰＣＲフラグメントが予想されたが、野生型（非ノックアウト）酵母株については４．９ｋｂのＰＣＲ産物が予想された。Ｋｘ２４プライマーおよびＫｘ２７プライマーから、確認されたノックアウト株については２．６ｋｂのＰＣＲ産物が予想されたが、野生型（非ノックアウト）由来のＰＣＲ産物は全く予想されなかった。Ｋｘ２５プライマーおよびＫｘ２６プライマーから、確認されたノックアウト株については２．４ｋｂのＰＣＲ産物が予想されたが、野生型（非ノックアウト）株由来のＰＣＲ産物は全く予想されなかった。
【００６５】
ＰＣＲ検定の後に、候補酵母のコロニーを、ＳＣ−ｕｒａプレート上で培養して、導入を容易にするために用いたｐＲＳ４１６プラスミドの損失を確認した。ＲＧＳ４タンパク質がＳｓｔ２タンパク質の損失を補う能力を試験するために、Ｇ４１８耐性、ｕｒａマイナスコロニーを、フェロモン応答性ハロ（ｈａｌｏ）アッセイ（Ｄｏｈｌｍａｎら、１９９６）を用いて、α因子刺激に対する応答について試験した。結果を、図１、図２Ａおよび図２Ｂに示す（この結果は、２種類の酵母のバックグラウンドにおけるハロアッセイおよび用量曲線をそれぞれ示す。１つの試験および確認されたＣＹ７７０Δｓｓｔ（ノックアウト）酵母コロニーを、ＫＹ１０３（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−９０１  ｈｉｓ−２００  ａｄｅ２−１０１  ｇａｌ４  ｇａｌ８０  Ｌｙｓ２：：ＧＡＬｕａｓ−ＨＩＳ３  ｃｙｈＲ，ｓｓｔ２，Ｇ４１８Ｒ）と示した。同様に、酵母株ＹＰＨ４９９（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、そのｓｓｔ２遺伝子について除去し、そしてＫＹ１１３（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１ａ  ａｄｅ２−１０１ｏ  ｔｒｐ１−Ｄ６３  ｈｉｓ３−Ｄ２００  ｌｅｕ２−Ｄ１，ｓｓｔ２）と示した。
【００６６】
フェロモン応答性酵母試験株を、Ｌｉ酢酸法（Ｒｏｓｅら、１９９０）を用いて産生し、そしてプラスミドを保持する培地上で培養した。プラスミドＫｐ１１８（ＲＧＳ発現プラスミド）およびＫｐ２７（ＦＵＳ１−ｌａｃＺレポータープラスミド）を、ＫＹ１０３へと形質転換した。
【００６７】
コントロール酵母株を、空（ｅｍｐｔｙ）発現プラスミドＫｐ４６（このプラスミドは、ＲＧＳコード配列を欠損する）およびレポータープラスミドＫｐ１３１を、株ＫＹ１０３へと同時形質転換して、酵母株Ｋｙ１１６を産生し、そしてＫＹ１１３へと同時形質転換して酵母株ＫＹ１１８を産生するように調製した。
【００６８】
ＲＧＳ４タンパク質が、フェロモンに誘導された、βガラクトシダーゼ遺伝子の転写を干渉するかどうかを知るために、ＲＧＳ４構築物を有する酵母および空ベクターを有するコントロール酵母を、α因子（２５ｎＭ）を用いて処理した。株ＫＹ１１７中のＲＧＳ４の発現は、フェロモンに誘導されたＬａｃＺシグナルを脱感作した（データを示さず）。ＲＧＳ４の発現はまた、フェロモンに誘導された増殖阻害をレスキューする。
【００６９】
（実施例２．ＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーターＲＧＳアッセイ）
実施例１は、所望の骨格およびＬａｃＺ遺伝子の上流に作動可能に連結されたフェロモン応答性ＦＵＳ１プロモーターを用いて産生されたプラスミドが、ＲＧＳタンパク質の活性を研究するために用いられる得ることを確認した。この実験において、ｌａｃＺ遺伝子の代わりに、ルシフェラーゼ遺伝子を、ＦＵＳ１プロモーターの下流に連結させた。このルシフェラーゼ系は、ｌａｃＺレポーター遺伝子を備える系よりも確かな利点（最も顕著には遺伝子発現の観察の、増加された速度および容易さ）を提供する。
【００７０】
ルシフェラーゼ遺伝子を含むＦＵＳ−１レポータープラスミド（Ｋｐ１２０）を構築した。このＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーターカセットを、プラスミドｐＧＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化によって構築し、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのフラグメントを単離した。このフラグメントを、平滑末端化し、そして精製した。このＫｐ２７ベクターは、ベースのベクターとして作用した。そしてそのベクターを、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ（ＬａｃＺ遺伝子を除去するため）を用いた消化によって調製し、脱リン酸化し、平滑末端化し、精製した。この調製されたベクターおよびルシフェラーゼフラグメントを連結して、プラスミドＫｐ１２０を産生した。このクローニング機構により、元のＫｐ２７ベクターより余分な予想される４つのアミノ酸残基（メチオニン、アラニン、グリシン、セリン）を得、このアミノ酸残基を、ルシフェラーゼＯＲＦのＮ末端にインフレームで融合させた。ＢａｍＨＩ制限部位およびＮｃｏＩ制限部位は、保持された。このプラスミドＫｐ１２０構築物を、以下のプライマーを用いるＤＮＡ配列決定によって確認した：
【００７１】
【化６】
2004520824.tif 000008
。
【００７２】
ＲＧＳ４タンパク質をコードするプラスミド構築物および内因性ＲＧＳタンパク質（ＳＳＴ２）が欠失された酵母株を、実施例１に記載するように調製した。
【００７３】
フェロモン応答性酵母試験株を、Ｌｉ酢酸法（Ｒｏｓｅら、１９９０）を用いて産生し、そしてプラスミド保持培地上で培養した。酵母株ＫＹ１０３への、プラスミドＫｐ１１８（ＲＧＳ発現プラスミド）およびプラスミドＫｐ１３１（ＦＵＳ１−ｌｕｃレポータープラスミド）の形質転換により、酵母株ＫＹ１１５を産生した。Ｋｐ１３１を、Ｋｐ１２０より誘導した。簡単には、このＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーターカセットを、ＫｐｎＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を用いてＫｐ１２０より摘出した。その２．８ｋｂのフラグメントを、ゲル精製し、平滑末端化し、そしてｐＲＳ４１６へと連結させて、Ｋｐ１３１を産生した。Ｋｐ１１８およびＫｐ１３１をまた、ＫＹ１１３へと同時形質転換して、酵母株ＫＹ１１７を産生した。
【００７４】
コントロール酵母株を、空の発現プラスミドＫｐ４６およびレポータープラスミドＫｐ１３１を、ＫＹ１０３へと同時形質転換して酵母株Ｋｙ１１６を産生し、そして株ＫＹ１１３へと同時形質転換して株ＫＹ１１８を産生するように調製した。
【００７５】
ＲＧＳ４タンパク質が、フェロモンに誘導された、ルシフェラーゼタンパク質の転写を干渉するかどうかを決定するために、ＲＧＳ４構築物を有する酵母および空のベクターを有するコントロール酵母を、α因子（２５ｎＭ）を用いて処理した。ＫＹ１１３に基づく株ＫＹ１１７（ＲＧＳ４）およびＫＹ１１８（コントロール）を用いた結果を図３に示す。この図は、ＲＧＳ４タンパク質が、酵母Ｇαサブユニット（Ｇｐａｌｐ）と相互作用し、α因子に誘導されたルシフェラーゼシグナルの減少を引き起こしそうであることを示す。強いルミネセンスが、ＲＧＳ４タンパク質を欠損するコントロール株で見られた。対照的に、弱いルミネセンスが、ＲＧＳ４タンパク質を発現する酵母株において見られた。フェロモン応答性ルシフェラーゼ活性を、ベースの酵母株ＫＹ１０３およびＫＹ１１３の両方から産生された酵母株において、認められた。しかし、ＫＹ１１３に基づく酵母株の応答は、わずかだけ強く（データは示さず）、従って、これらの株はより感受性である。
【００７６】
本発明者らがβ−ｇａｌ活性を観察したこれらの発見を、実施例１に記載される発見と相関付けた。図４Ａおよび図４Ｂに示されるルシフェラーゼ系に関する用量応答曲線は、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼがｌａｃＺと同様に働くことを示す。さらに、強度の増加がより高いため、ルシフェラーゼレポーターは、β−ガラクトシダーゼよりもより感受性である（データは示されていない）。
【００７７】
（実施例３．低コピーバージョンのＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーター）
前述の２μｍバージョンのＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーター構築物の代替として、実施例２の低コピー数（ＣＥＮ）バージョンのルシフェラーゼ構築物を作製した。ＣＥＮバージョンのフェロモン経路応答性ＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーターを、ＦＵＳ１プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子レポーターカセットを含む２．８ｋｂのフラグメントを単離する、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを用いたプラスミドＫｐ１２０の消化によって作製した。プラスミドｐＲＳ４１４およびｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを用いて各々消化し、そしてゲル精製した。標準的なライゲーションを、２つのさらなるＦＵＳ１−ルシフェラーゼ組換えプラスミド；Ｋｐ１３３（ＴＲＰ１標識）およびＫｐ１３５／Ｋｐ１３１＊（ＵＲＡ３標識）を作製するために実行した。細菌の形質転換およびプラスミドＤＮＡの作製を、標準的な方法により実行した。プラスミドを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。プラスミドＫｐ１３１＊は、Ｋｐ１３５に類似の構築物を示すが、これは異なるクローニングの仕組みを用いて独立して作製した。
【００７８】
レポーター遺伝子のＣＥＮバージョンを、フェロモン応答性アッセイにおいて試験した。これらのバージョンが、フェロモン応答性アッセイにおいて機能すること、および適切なシグナル対ノイズの割合を提供することを見出した（データは示されていない）。
【００７９】
（実施例４．代替のレポーター遺伝子の組込み）
種々のレポーター遺伝子が、この系において用いられ得る。本発明において用いられ得るレポーターの実例としては、ホタル以外の種由来のルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子またはＣＡＴのようなレポーター遺伝子がある。例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子レポーターは、ホタルのルシフェラーゼレポーターに対する代替物として用いられ得る。これらを構築するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするオープンリーディングフレームを、実施例１または２に記載されたフェロモン応答性レポータープラスミドにクローン化し、ＦＵＳ１−ＲｅｎＬｕｃを作製した。高い（２ミクロン）および低い（ＣＥＮ）コピー数のプラスミドを、ホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子について記載されるのと類似の様式で作製した。
【００８０】
（実施例５．ＲＧＳアッセイ−単一点薬剤スクリーニング）
上述の確認された株を、同時発現した哺乳動物ＲＧＳタンパク質の活性を調節する低分子の同定のために用いた。スクリーニングの図式は、図５に示される。ＲＧＳ発現プラスミドを有する酵母株およびコントロール株を、ルシフェラーゼ活性における増加を生じる、ＲＧＳ４の機能を調節する低分子について試験するために使用した。分子モデリングに基づいて、試験化学物質のライブラリーにおける分子の部分集合を、単一点アッセイにおいて試験した。コントロール株と比較して、試験（ＲＧＳ４）株におけるルシフェラーゼ活性の増加を実証した化合物は「陽性」であり、そしてさらなる研究のための興味深い候補であると考えられた。
【００８１】
詳細には、ＲＧＳ発現プラスミド（ＫＹ１１７）またはコントロールのバックボーンベクター（ＫＹ１１８株）のいずれかを含む酵母株を、適切な培地（ＳＣ−ｌｅｕ−ｔｒｐ）に接種し、そして３０℃で一晩インキュベートした。これらの新鮮な酵母培養物の細胞密度をＯＤ６００によって測定し、そして細胞を適切な増殖培地（ＳＣ−ｌｅｕ−ｔｒｐ）に０．０５のＯＤ６００まで希釈した。１５０μｌの細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種し、そして約１μｌの試験化合物ストック（１０ｍｇ／ｍｌ）を、レプリケーターを用いて各ウェルに移した。
【００８２】
試験化合物を細胞と共に３０℃で３時間インキュベートした。次いで、細胞をリガンド（２０ｎＭの終濃度に対する１０μｌα因子（１０×溶液中の２００ｎＭストック））を用いて刺激した。プレートを短時間振盪し、そして３０℃で２時間インキュベートした。１００μｌのＬｕｃＬｉｔｅ基質（Ｐａｃｋａｒｄ）を各ウェルに添加し、そしてプレートに封をし、そして暗所において室温で１時間振盪した。発光を、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて２秒間測定した。
【００８３】
９６化合物の単一用量アッセイの結果は、図６に示される。各化合物を２つの酵母株：ＲＧＳ４株（図６Ａ）およびコントロールベクター株（図６Ｂ）に添加した。発光（強度）における違いは、１秒当たりの計数（ＲＧＳ）／１秒当たりの計数（ベクター）として計算される（図６Ｃ）。平均よりも高い、発光における強度の増加を有する化合物は、ＲＧＳ遮断剤としての候補と考えられる。
【００８４】
（実施例６．ＲＧＳアッセイ−潜在的な薬剤の用量応答アッセイ）
次いで、単一点アッセイ（実施例５）におけるコントロール株において見られるものの約５０％を超える、試験株におけるルシフェラーゼ活性の増加を引き起こす化合物を、用量応答アッセイにおいて試験した。
【００８５】
ＲＧＳ発現プラスミド（ＫＹ１１７）を含む酵母株、およびバックボーンベクター（ＫＹ１１８）を含むコントロール酵母株を、適切な培地（ＳＣ−ｌｅｕ−ｔｒｐ）に接種し、そして３０℃で一晩インキュベートした。新鮮な酵母培養物の細胞密度を、ＯＤ６００によって決定し、そして細胞を適切な増殖培地（ＳＣ−ＬＴ）において０．０５のＯＤ６００まで希釈した。１５０μｌの懸濁細胞のアリコートを、９６ウェルマイクロタイタープレートの列Ａに分配した。ＤＭＳＯを３％の終濃度まで残りの酵母細胞に添加し、そして１００μｌの細胞を９６ウェルプレートの残りのウェルに播種した。試験化合物（４．５μｌ）を列Ａ中の細胞に添加し、これは９００μＭの終濃度を生じ、混合され、そして５０μｌを列Ａから列Ｂに移し、そしてよく混合した。続いて、５０μｌを、列Ｂから列Ｃに移す、などを列Ｇまで行い、そして９６ウェルプレートの行内で希釈系列を作製した。これは、３％ＤＭＳＯを含む全てのウェルで８点の用量応答曲線を確立した。
【００８６】
細胞および試験化合物を３０℃で４時間インキュベートし、次いで１０μｌのリガンド（２００ｎＭストック１０×溶液中のα因子）を、２０ｎＭの終濃度まで添加した。プレートを短時間振盪し、そして３０℃で２時間インキュベートした。１００μｌのＬｕｃＬｉｔｅ基質を各ウェルに添加し、そしてプレートに封をし、そして暗所において室温で１時間振盪した。発光を、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて２秒間測定した。４つの試験化合物についての結果は、図７Ａ−Ｄに示される。化合物ＳＢＱ８／Ｂ１は、ＲＧＳ４機能に大きく影響する能力を実証した。
【００８７】
（実施例７．さらなる哺乳動物ＲＧＳタンパク質による機能的補完）
以前に、哺乳動物ＲＧＳ４が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを増殖の交配を生じないα因子刺激から回復可能にするためにＳＳＴ２ｐを補完し得ることが実証された。このＲＧＳタンパク質は、酵母Ｇ−αタンパク質、Ｇｐａ１の内因性ＧＴＰａｓｅ活性を促進する。前述のデータは、ＳＳＴ２の機能的置換を可能としてＲＧＳ４のみを支持する。哺乳動物ＲＧＳタンパク質の機能を研究するためのフェロモン応答性経路の使用における全体の有用性を研究するために、ＲＧＳＺ１およびＲＧＳ２をまた、前述のフェロモン応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＦＵＳ１−ｌｕｃ）を含むｓｓｔ２ノックアウト株において発現した。
【００８８】
（一般のクローニング）
種々の哺乳動物のＲＧＳＺ１タンパク質およびＲＧＳＺ２タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ベクターｐ４２６−ＴＥＦ（ＡＴＣＣ＃８７６６９）にサブクローン化した。このベクター［６３５９ｂｐ、ＵＲＡ３、２ｍｕ−ｏｒｉ、ＴＥＦｐ−ＣＹＣ１ｔ、ＲＥＰ３、ＡｍｐＲ］は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列についてＧｅｎｂａｎｋ  ＹＳＣＥＦ１ＡＢを参照のこと）由来の伸長因子１−αプロモーターを含み、そしてＡＤＨプロモーターよりも５倍強力であることが示唆される（Ｍｕｍｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ、１５６：１１９）。指定されたｃＤＮＡ挿入物を、ポリメラーゼ連鎖反応、制限消化、ライゲーション、およびＤＨ５−αＥ．ｃｏｌｉ細胞への形質転換に関する標準的な方法を用いて作製した。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ｐｒｅｐを用いて調製し、制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確認した。生じた構築物を５’末端接合部位で配列決定した。この配列決定のプライマーは、Ｋｘ６５である：
【００８９】
【化７】
2004520824.tif 000009
このプライマーは、ＴＥＦプロモーター領域にハイブリダイズする。
【００９０】
（ヒトＲＧＳＺ１）
ＲＧＳＺ１  ｃＤＮＡを、組み込まれたＢＡＭ  ＨＩ制限部位を含む２６ｂｐの５’順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【００９１】
【化８】
2004520824.tif 000010
ならびに組み込まれたＣｌａＩ制限部位および終止コドンを含む２７ｂｐの３’逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【００９２】
【化９】
2004520824.tif 000011
を用いて調製した。これらのプライマーを、前述のＲＧＳＺ１−ｐＡＣＴ組換えベクターを鋳型として用いて、標準的なＰＣＲ反応に使用した。全長ＲＧＳＺ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０７９４７９）をコードし、そして内因性の開始コドンおよび終止コドンを含む６５０ｂｐのフラグメントが得られる。このＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＣｌａＩ制限酵素を用いて消化し、そして調製されたｐ４２６ＴＥＦのＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位にライゲーションした。ＨｉｎｃＩＩ単独、ＳｐｈＩ単独、またはＳａｌＩ＋ＳｐｈＩを用いる制限消化分析は、ｃＤＮＡ挿入物の方向を確認する。この生じるプラスミド、ｐＴＥＦ４２６−ＲＧＳＺ１は、Ｋｐ１４０（ｐＫＨＹ５５としてもまた公知）およびＫｐ１４１（ｐＫＨＹ５６としてもまた公知）と命名される。
【００９３】
（ヒトＲＧＳ２：）
ヒトＲＧＳ２  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ  ００２９２３）を、組込まれたＮｏｔＩ部位を有する２１ｂｐの順方向５’オリゴヌクレオチドプライマー：
【００９４】
【化１０】
2004520824.tif 000012
および組込まれたＢａｍＨＩ部位を有する１９ｂｐの３’逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【００９５】
【化１１】
2004520824.tif 000013
を使用する、ＰＣＲ増幅によってヒト全脳ライブラリーから入手した。７０５ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結し、ｐＫＨＹ１４６（ｈＲＧＳ２−ｐＣＲＩＩ）を産生した。ｐＫＨＹ１４６を、製造業者の使用説明書に従って細菌細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製し、そして配列を確認した。ｈＲＧＳ２  ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを使用してｐＫＨＹ１４６から切り取り、そして、調製したｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩ部位およびＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化した。得られた組換えプラスミド（ｈＲＧＳ２−ｐｃＤＮＡ３．１）を、ｐＫＨＹ１５０と命名する。ｐＫＨＹ１５０を、ＰｍｅＩで消化し、そして６５０ｂｐのフラグメントを単離し、ゲル精製し、そして調製したｐ４２６ＴＥＦのＳｍａＩ部位への平滑末端連結に使用し、組換えプラスミドｈＲＧＳ２−ｐＴＥＦ４２６ならびにＫｐ１３８（ｐＫＨＹ５３としても知られる）およびＫｐ１３９（ｐＫＨＹ５４としても知られる）と命名される２つの得られた（同胞）組換えプラスミドを作製した。ｈＲＧＳ２  ｃＤＮＡ挿入物の方向は、ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限消化分析によって決定した。
【００９６】
（株の作製：）  これらのＲＧＳ構築物を、酵母ＫＹ１１３中に形質転換し；ＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーター（Ｋｐ１２０）をまた、ＫＹ１１３中に同時に形質転換した。得られた酵母株を、以下のように命名した：
【００９７】
【表１】
2004520824.tif 000014
各酵母の形質転換体から３つのコロニーを採取して、そしてＳＣ−Ｕｒａ−Ｔｒｐプレート上にストリーキングした。３つのコロニーの２つを、フェロモン応答性アッセイ（以前に記載されるように）において試験し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性を測定した。簡単には、１００μｌの０．１  ＯＤ６００の一晩培養物を、２５ｎｇまたは２２５ｎｇの濃度のα因子によって３０℃で２時間刺激した。この培養物をまた、フェロモン応答性ハロアッセイ（以前に記載されるように）にかけた。ＳＣ−Ｕｒａ−Ｔｒｐ寒天プレート上の細胞ローン（ｌａｗｎ）（０．３  ＯＤ６００の培養物から作製された）を、各スポットあたり５０ｎｇまたは２５０ｎｇの濃度のα因子で刺激した。プレートを、３０℃で約４０時間インキュベートし、次いで、ハロの形成について観察した。
【００９８】
（結果：）
ハロアッセイの結果を図８に示し、そしてルシフェラーゼレポーターアッセイについての結果を、図９Ａおよび図９Ｂに示す。ＲＧＳＺ１を発現する酵母株は、空のベクターを発現する酵母株と比較して、より小さいハロおよび減少した発光を示し、従って、酵母中のｓｓｔ２の相補性を示す。さらなる用量反応曲線およびより詳細なハロアッセイ（１スポットあたり４３１ｎｇ、４８ｎｇ、５．３ｎｇ、もしくは０．６ｎｇ、または１スポットあたり４３１ｎｇ、１４４ｎｇ、４８ｎｇ、もしくは１６ｎｇのα因子）を、これらの株に対して実施した。ＲＧＳＺ１を発現する株からの応答は、ＲＧＳ４を発現する株から以前に観察された応答ほど、強くなかった。これは、ＲＧＳＺ１がＲＧＳ４で観察された応答の３３％を示すことを示唆する（そのコントロールベクターと比較した場合、１／８対１／２７倍）。
【００９９】
ＲＧＳ２を発現する酵母株は、ベクターのみを発現する株について観測されたハロよりも、わずかに小さいハロを示す。しかし、ＲＧＳ２を発現する株は、コントロール株と比較して（特に６２ｎＭで）減少した発光を示し、これは、ｓｓｔ２の機能的な相補性を示唆する。
【０１００】
（ヒトＲＧＳ７：）
完全長ヒトＲＧＳ７（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０９０１１６）を、組込まれたＮｏｔＩ部位を有する２０塩基の順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０１】
【化１２】
2004520824.tif 000015
および組込まれたＢａｍＨＩ部位を有する逆方向の２２塩基のオリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０２】
【化１３】
2004520824.tif 000016
を使用するＰＣＲ増幅によってヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手した。
【０１０３】
得られた１６９８ｂｐのＰＣＲ産物を、適切な酵素で制限消化し、そしてｐｃＤＮＡ３．１のＮｏｔＩ部位およびＢａｍＨＩ部位中に連結した。得られた組換えベクター（ｈＲＧＳ７−ｐｃＤＮＡ３．１）を、ｐＫＨＹ１２６と命名し、そしてこのｐＫＨＹ１２６を、制限消化および配列分析によって確認した。ｐＫＨＹ１２６を、ＰｍｅＩで消化し、１．５ｋｂのフラグメントを、単離し、ゲル精製し、そしてｐ４２６ＴＥＦのＳｍａＩ部位中に平滑に連結した。ｈＲＧＳ７  ｃＤＮＡ挿入物の方向を、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＣｌａＩおよびＳａｃＩを使用する制限消化分析によって決定した。確認したｈＲＧＳ７−ｐＴＥＦ４２６プラスミドの２つの同胞単離体を、Ｋｐ１４４（ｐＫＨＹ５９としても知られる）およびＫｐ１４５（ｐＫＨＹ６０としても知られる）と命名した。
【０１０４】
タンパク質のＧ−γ様（「ＧＧＬ」）ドメインから末端までコードする、第２のｈＲＧＳ７のクローンを、作製した。このＧＧＬ−ｈＲＧＳ７  ｃＤＮＡを、組込まれたＢａｍＨＩ部位および開始コドンを含有する、２７塩基の順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０５】
【化１４】
2004520824.tif 000017
ならびに組込まれたＣｌａＩ部位および外因性の終止コドンを含有する、２６塩基の逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０６】
【化１５】
2004520824.tif 000018
を、鋳型としてｐＫＨＹ１２６を使用する、ＰＣＲによって作製した。得られたＰＣＲ産物は、６６０ｂｐであり、そしてアミノ酸配列ＫＰＰＴから末端アミノ酸までコードする。６５０ｂｐのＰＣＲ産物を、適切な酵素で消化し、単離し、ゲル精製し、そして調製されたｐ４２６ＴＥＦベクター（ＡＴＣＣ）のＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位に直接的に連結した。組換えプラスミドを、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ、ＸｂａＩ単独、またはＣｌａＩおよびＮｃｏＩを使用する、制限消化によって確認した。組換えプラスミド（ＧＧＬ−ｈＲＧＳ７−ｐ４２６ＴＥＦ）の２つの同胞単離体を、Ｋｐ１４２（ｐＫＨＹ５７としても知られる）またはＫｐ１４３（ｐＫＨＹ５８としても知られる）と命名した。
【０１０７】
（ヒトＲＧＳ９：）
完全長ヒトＲＧＳ９（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０７１４７６）を、組込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する４０塩基の順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０８】
【化１６】
2004520824.tif 000019
および組込まれたＸｂａＩ部位を有する３９塩基の逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１０９】
【化１７】
2004520824.tif 000020
を使用するＰＣＲ増幅によってヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手した。
【０１１０】
得られた２．０ｋｂのＰＣＲ産物を、適切な酵素で制限消化し、そしてｐＷＥ３のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａＩ部位中に連結し、組換えベクターｈＲＧＳ９−ｐＷＥ３を作製した。構築物を、制限消化および配列分析によって確認した。ｈＲＧＳ９−ｐＷＥ３を、テンプレートとして使用し、標準的なＰＣＲ法を使用して２．０ｋｂのフラグメントを作製するために、組込まれたＢａｍＨＩ部位を含有する順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１１１】
【化１８】
2004520824.tif 000021
および組込まれたＸｈｏＩ部位を含有する逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１１２】
【化１９】
2004520824.tif 000022
を使用した。ｈＲＧＳ９のＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、精製し、調製されたｐＡＣＴ２のＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位に直接的に連結し、プラスミドｐＡＣＴ−ｈＲＧＳ９を作製した。このｐＡＣＴ−ｈＲＧＳ９を、配列分析によって確認した。外因性の開始コドンおよび終止コドンを含有する、完全長ｈＲＧＳ９をコードするｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＡＣＴ−ｈＲＧＳ９から切り取り、２．０ｋｂのフラグメントを得た。２．０ｋｂのフラグメントを、単離し、ゲル精製し、そして調製されたベクターｐ４２６ＴＥＦのＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位中に直接的に連結した。得られた組換えプラスミド（ｈＲＧＳ９−ＴＥＦ４２６）を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩでの制限消化によって確認し、そしてＫｐ１４８（ｐＫＨＹ６３としても知られる）およびＫｐ１４９（ｐＫＨＹ６２としても知られる）と命名した。
【０１１３】
タンパク質のＧ−γ様（ＧＧＬ）ドメインから末端までをコードする、第２のｈＲＧＳ９のクローンを、作製した。このＧＧＬ−ｈＲＧＳ９  ｃＤＮＡを、組込まれたＢａｍＨＩ部位および開始コドンを含有する、２８塩基の順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１１４】
【化２０】
2004520824.tif 000023
ならびに組込まれたＣｌａＩ部位および外因性の終止コドンを含有する、２６塩基の逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１１５】
【化２１】
2004520824.tif 000024
を、鋳型としてＫｐ１４８と使用して、ＰＣＲによって作製した。
【０１１６】
得られたＰＣＲ産物は、１．４ｋｂのフラグメントである。クローニングのストラテジーは、ＧＧＬ−ＲＧＳ７について記載されたクローニングのストラテジーと同様であり、その結果、１４００ｂｐのＰＣＲ産物を、適切な酵素で消化し、単離し、ゲル精製し、そして調製されたｐ４２６ＴＥＦベクター（ＡＴＣＣ）のＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位に直接的に連結した。組換えプラスミドを、ＳａｃＩ単独、ＥｃｏＲＩ単独、ＳａｌＩ単独、またはＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩでの制限消化によって確認し、方向を確証した。組換えプラスミド（ＧＧＬ−ＲＧＳ９−ｐ４２６ＴＥＦ）の２つの同胞単離体を、Ｋｐ１４６（ｐＫＨＹ６１としても知られる）およびＫｐ１４７（ｐＫＨＹ６２としても知られる）と命名した。
（株の作製）：上記のＲＧＳ構築物を、酵母ＫＹ１１３に形質転換した。ＦＵＳ１−ルシフェラーゼレポーター（Ｋｐ１２０）もまた、この酵母株に同時形質転換した。得られた酵母株を以下に記載する。
【０１１７】
【表２】
2004520824.tif 000025
各酵母形質転換体から３つのコロニーを選び、そしてＳＣ−Ｕｒａ−Ｔｒｐプレートにストリーク（ｓｔｒｅａｋ）した。３つのコロニーのうち２つを、フェロモン応答性アッセイ（以前に記載されている）に供し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定した。端的に言うと、ＯＤ６００が０．１である一晩培養物１００μｌを、３０℃で２時間、２５ｎｇまたは２２５ｎｇの濃度のα因子によって刺激した。同じ培養物をまた、フェロモン応答性ハロアッセイ（以前に記載されている）に供した。ＳＣ−Ｕｒａ−Ｔｒｐアガープレート上の細胞ローン（ｌａｗｎ）（ＯＤ６００が０．３である培養物から作製した）を、１スポットあたり５０ｎｇまたは２５０ｎｇの濃度のα因子によって刺激した。このプレートを、３０℃で約４０時間インキュベートし、ハロ形成を観察した。
（結果）：
ルシフェラーゼレポーターアッセイについての結果を、図９Ａ〜Ｄに示し、ハロアッセイの結果を図８に示す。ＲＧＳＺ１を発現する酵母株は、空のベクターを発現する酵母株より小さいハロおよび発光の低下を示し、このことは、酵母のｓｓｔ２の相補性を示している。さらなる用量応答曲線およびより詳細なハロアッセイ（１スポットあたり４３１ｎｇ、４８ｎｇ、５．３ｎｇ、および０．６ｎｇのα因子、または１スポットあたり、４３１ｎｇ、１４４ｎｇ、４８ｎｇ、または１６ｎｇのα因子）を、３つの株に対して行った。ＲＧＳＺ１を発現する株からの応答は、以前にＲＧＳ４を発現する株から観察された応答ほどは、強くなかった。このことは、ＲＧＳＺ１が、ＲＧＳ４で観察される応答の３３％を示すことを示唆している（コントロールベクターと比較した場合、それぞれ、１／８倍対１／２７倍である）。
【０１１８】
ＲＧＳ２を発現する酵母株は、ベクターのみを発現する株で観察されるハロよりわずかに小さいハロを示す。しかし、ＲＧＳ２を発現する株は、コントロール株（特に、６２ｎＭにおいて）と比較して減少した発光を示し、このことは、ｓｓｔ２を機能的相補性を示唆する。ＲＧＳ７の全長またはＧＧＬ＋ＲＧＳ  Ｃ末端のいずれかを発現する酵母株は、ネガティブコントロール株と類似のハロおよび発光を示し、このことは、ＲＧＳのこの形態が、容易には、ｓｓｔ２の機能的相補性を提供しないことを示唆する。ＲＧＳ９の全長またはＧＧＬ＋ＲＧＳ  Ｃ末端のいずれかを発現する酵母株は、ネガティブコントロール株と類似のハロを示す。しかし、ネガティブコントロール株と比較して、全長ＲＧＳ９を発現する株における減少した発光について、いくつか示唆されている。
【０１１９】
（実施例８：ヒトＧβ５の同時発現）
ＲＧＳ７およびＲＧＳ９はそれぞれ、４６９アミノ酸および６７３アミノ酸である、より長いＲＧＳタンパク質であり、ＲＧＳ６およびＲＧＳ１１と共にＲＧＳタンパク質ファミリーのサブクラス内にあり、ＤＥＰドメインおよび高度に保存されたＧＧＬドメイン（Ｇβ５に結合する）を含む（Ｓｎｏｗら、１９９９）。ＲＧＳ７およびＲＧＳ９は、ＧＧＬドメイン内に高レベルの相同性を示す。ＲＧＳ６およびＲＧＳ７は、ＤＥＰドメインにおいて８０％の相同性を有するが、ＲＧＳ７およびＲＧＳ９は、５０％のみの相同性を有する。ＲＧＳ分野における現在の研究は、ＧＧＬドメインを含むＲＧＳタンパク質のサブクラスが同様に機能することを示唆する。しかし、本発明者らの知見は、これら、およびＲＧＳタンパク質の他のサブクラスの潜在的なメンバーが、同一の機能を示し得ないことを示唆する。ＧＧＬドメインは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質Ｇβ５に結合することが示されており、ＧＧＬ−ＲＧＳ／Ｇβ５相互作用が、両方のタンパク質の適切なフォールディングのために重要であり、そして機能的に関連し得ることを示唆している。Ｇβ５は、Ｇβタンパク質のうちの最も異なったアイソフォームであり、脳において高度に発現される。Ｇβ５と酵母Ｇβ（ＳＴＥ４）の間の相同性は、４０％未満である。従って、本発明者らは、酵母中で、ヒトＧβ５を、ＲＧＳ７またはＲＧＳ９（またはコントロールとしてＲＧＳ４）と同時発現させて、ヒトＧβ５が、ＧＧＬドメインを含むＲＧＳタンパク質がｓｓｔ２を機能的に相補することを可能にするか否かを決定した。
【０１２０】
ヒトＧβ５をコードするｃＤＮＡを、組みこまれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む３９塩基の順方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１２１】
【化２２】
2004520824.tif 000026
および組みこまれたＸｈｏＩ部位を含む２４塩基の逆方向オリゴヌクレオチドプライマー：
【０１２２】
【化２３】
2004520824.tif 000027
およびテンプレートとしてｈＧΒ５組換えベクター（Ｌｉａｎｇら、２０００）を使用するＰＣＲによって得た。ｈＧβ５ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩによって消化し、ゲル精製し、そしてｐ４２５ＴＥＦ（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ消化されている）とライゲーションした。得られた組換えベクターを、配列分析によって確認し、そしてｈＧβ５−ｐ４２５ＴＥＦと名づけた。このベクターを、ＦＵＳ１ルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｋｐ１２０）、およびＲＧＳ２、ＲＧＳ４、ＲＧＳ７、ＲＧＳ９、ならびにＲＧＳＺ１をコードする組換えプラスミド（以前に記載されている）、または空のプラスミドコントロールベクターと酵母株ＫＹ１１３に同時形質転換した。プラスミドの組み合わせを含む、得られた酵母株を、以下の表に要約する。
【０１２３】
【表３】
2004520824.tif 000028
株を、以前に記載されているように、フェロモン応答性ハロアッセイおよびルシフェラーゼレポーターアッセイにおける活性について試験した。ハロアッセイの結果を、ＲＧＳ７に関しては図１０に、ＲＧＳ９に関しては図１１に、示す。コントロールとして、本発明者らは、ｓｓｔ２を相補するＲＧＳ４の能力に対するｈＧβ５の効果を試験した。ＲＧＳ４は、２０６アミノ酸の短いＲＧＳタンパク質であり、ＧＧＬドメインを含まない。ｈＧβ５およびＲＧＳ４を同時発現する株におけるハロアッセイおよび発光は、ＲＧＳ４および空のコントロールベクターを発現する株と類似していた（データを示さず）。ＲＧＳ７およびＲＧＳ９の両方が、ＧＧＬドメインを含むので、これらＲＧＳタンパク質は、Ｇβ５の同時発現によって同様に影響を受けていると予想される。しかし、ｈＧβ５のＲＧＳ９との同時発現は、ＲＧＳ７に対して何の影響も与えない。なぜなら、ハロがベクターコントロール株と類似しているからである。しかし、ｈＧβ５の同時発現は、ベクターコントロール株と比較して、（ＲＧＳ４発現によって生じるような減少ではなく）ハロのサイズの増加を生じる。ｈＧβ５のみの発現は、ベクターのみのコントロールと同様に、何の影響も与えない。これは、予想されない結果であり、ＲＧＳ７およびＲＧＳ９のドメイン構造に関する類似性にもかかわらず、これらの２つのＲＧＳタンパク質が、実際には、機能的に類似し得ないことを示唆する。
【０１２４】
（実施例９：キメラＲＧＳタンパク質）
本アッセイの有用性をさらに調査するために、いくつかのキメラＲＧＳタンパク質を試験した。特定のＲＧＳキメラタンパク質が以下に記載されるが、一般的に、本発明者らは、Ｎ末端ＲＧＳタンパク質およびＣ末端ＲＧＳタンパク質の組み合わせの効果、またはｓｓｔ２ノックアウト変異を相補することが示されているＲＧＳタンパク質（例えば、ＲＧＳ４）のＮ末端領域の、様々な長さの（全長ではない）ＲＧＳタンパク質への付加を調査した。
【０１２５】
キメラ遺伝子構築物に使用されたクローニングストラテジー
１．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ７Ｃ
１７１ｂｐのＲＧＳ４Ｎ末端領域（ＲＧＳ４のアミノ酸１−５７をコードする）を、テンプレートとしてラットＲＧＳ４  ｃＤＮＡを使用するＰＣＲによって得た。順方向プライマー：
【０１２６】
【化２４】
2004520824.tif 000029
は、組み込まれたＢａｍＨＩ部位を含み；
一方、逆方向プライマー：
【０１２７】
【化２５】
2004520824.tif 000030
は、組み込まれたＳｍａＩ部位を含んだ。
【０１２８】
ＲＧＳ７のＣ末端領域（これは、全長ヒトＲＧＳ７のＧＧＬドメインから始まり、最後のアミノ酸まで）を増幅し、６４５ｂｐ産物（これは、ＲＧＳ７のアミノ酸２５５〜４７０をコードする）を生成した。順方向プライマー：
【０１２９】
【化２６】
2004520824.tif 000031
は、組み込まれたＳｍａＩ部位を含み；
逆方向プライマー：
【０１３０】
【化２７】
2004520824.tif 000032
は、組み込まれたＣｌａＩ部位を含んだ。
【０１３１】
２つのＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＳｍａＩでカットし、そして連結した。ライゲーション混合物を、次いで、テンプレートとして使用し、全長８１６ｂｐのキメラＰＣＲ産物を生成した。このＰＣＲ反応に使用した順方向プライマーは、ｃｈｉＲｇｓ４  Ｎｔｅｒｍ（配列番号３１）であり、逆方向プライマーは、ｃｈｉＲｇｓ７ｒ  Ｃｔｅｒｍ（配列番号３４）であった。得られたキメラ遺伝子を、ゲル精製し、再増幅し、適切な制限酵素で切断し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦ（Ｎ末端ＨＡタグをコードする）のＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位にクローニングした。
【０１３２】
（２．ＲＧＳ７Ｎ／ＲＧＳ４Ｃ）
ＲＧＳ７  Ｎ末端領域は、ＲＧＳ７のＧＧＬドメインを含む。そして、ＲＧＳ７  Ｎ末端領域を、ヒトＲＧＳ７  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅して、アミノ酸１〜３３２をコードする９９６ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。順方向プライマーは、埋め込まれたＢａｍＨＩ部位を含む：
【０１３３】
【化２８】
2004520824.tif 000033
逆方向プライマーは、埋め込まれたＳｍａＩ部位を含む：
【０１３４】
【化２９】
2004520824.tif 000034
。
【０１３５】
ＲＧＳ４Ｃ領域は、ＲＧＳ４コアドメインのみを含む。そして、ＲＧＳ４Ｃ領域を、ＲＧＳ４  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅して、アミノ酸５８〜２０６をコードする４４７ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。順方向プライマーは、埋め込まれたＳｍａＩ部位を含む：
【０１３６】
【化３０】
2004520824.tif 000035
逆方向プライマーは、埋め込まれたＣｌａＩ部位を含む：
【０１３７】
【化３１】
2004520824.tif 000036
。
【０１３８】
２つのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳｍａＩで切断し、そして連結した。この連結混合物を、１４４３ｂｐのキメラ遺伝子生成物のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。用いたプライマーは上記の通りであった。順方向プライマーはｃｈｉＲｇｓ７  Ｎｔｅｒｍ（配列番号３５）であったが、逆方向プライマーはｃｈｉＲｇｓ４ｒ  Ｃｔｅｒｍ（配列番号３８）であった。得られたキメラ遺伝子をゲル精製し、再増幅し、適切な制限酵素で切断し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦ（これは、Ｎ末端ＨＡタグをコードする）のＢａｍＨ１部位およびＣｌａ１部位にクローン化した。
【０１３９】
（３．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ１０（全長））
このＲＧＳ４Ｎ領域は、上記のＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ７Ｃキメラについて記載されたＲＧＳ４Ｎ領域と同一である。
【０１４０】
このキメラのためのＲＧＳ１０（全長）を、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩを用いる制限消化によって、ｐ４２６−ＲＧＳ１０から得た。プラスミドｐ４２６−ＲＧＳ１０を、ヒトＲＧＳ１０  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＸＭ＿０４９７９７）をテンプレートとして用いる、ＰＣＲ増幅によって構築した。順方向プライマーは、埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む：
【０１４１】
【化３２】
2004520824.tif 000037
逆方向プライマーは、埋め込まれたＸｈｏＩ部位を含む：
【０１４２】
【化３３】
2004520824.tif 000038
。
【０１４３】
５０４ｂｐのＰＣＲ産物（これは、全長ＲＧＳ１０をコードする）をゲル精製し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローン化した。
【０１４４】
上記のＲＧＳ４  Ｎ末端領域ＰＣＲ産物をＳｍａＩで切断し、そして、ＲＧＳ１０のゲル精製ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ制限フラグメントと連結した。この連結混合物を、ＰＣＲのためのテンプレートとして用いて、キメラＲＧＳ４／ＲＧＳ１０を得た。用いた順方向プライマーはｃｈｉＲｇｓ４  Ｎｔｅｒｍ（配列番号３２）であり、一方、逆方向プライマーはＲＧＳ１０  ｒｅｖ（配列番号４０）であった（ともに上記）。得られたキメラ遺伝子をゲル精製し、再増幅し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦ（これは、Ｎ末端ＨＡタグをコードする）のＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローン化した。
【０１４５】
（４．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ７全長）
ＲＧＳ４  Ｎ末端領域を、上記のように得た。全長ＲＧＳ７  ｃＤＮＡを、クローン化ヒトＲＧＳ７をテンプレートとして用いて増幅して、アミノ酸１〜４７０をコードする１４１０ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。順方向プライマーは、埋め込まれたＳｍａＩ部位を含む：
【０１４６】
【化３４】
2004520824.tif 000039
逆方向プライマーは、埋め込まれたＣｌａＩ部位を含む：
【０１４７】
【化３５】
2004520824.tif 000040
。
【０１４８】
これらの２つのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳｍａＩで切断し、そして連結した。次いで、この連結混合物を、ＰＣＲのためのテンプレートとして用いて、ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ７全長キメラ遺伝子を得た。順方向プライマーはｃｈｉＲｇｓ４  Ｎｔｅｒｍ（配列番号３１）であり、そして逆方向プライマーはＲｇｓ７ｒ  Ｃｔｅｒｍ（配列番号４２）であった。得られたキメラ遺伝子をゲル精製し、再増幅し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦ（これは、Ｎ末端ＨＡタグをコードする）のＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩ部位にクローン化した。
【０１４９】
（５．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９Ｃ）
ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９Ｃに対する２つの異なるキメラを構築した。ここで、一方はＲＧＳ９  Ｃ末端領域にＧＧＬドメインを含むが、もう一方はＲＧＳ９  Ｃ末端領域にＧＧＬドメインを含まない。
【０１５０】
（５ａ．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９Ｃ（−ＧＧＬドメイン））
ＲＧＳ４  Ｎ末端領域を、前記のようにＰＣＲによって増幅し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてゲル精製した。
【０１５１】
ＲＧＳ９  Ｃ末端領域（−ＧＧＬドメイン）を、ヒトＲＧＳ９  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅して、アミノ酸３０２〜６７５をコードする１１２５ｂｐの生成物を得た。順方向プライマーは、埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む：ＲＧＳ９ＲＧＳ  ｆｗｄ（−ＧＧＬドメイン）
【０１５２】
【化３６】
2004520824.tif 000041
逆方向プライマーは、埋め込まれたＸｈｏＩ部位を含む：
【０１５３】
【化３７】
2004520824.tif 000042
。
【０１５４】
ＲＧＳ９Ｃ（−ＧＧＬドメイン）ＰＣＲ産物を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてベクターｐ４２６ＴＥＦのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローン化した。次いで、得られたプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして上記ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  ＲＧＳ４  Ｎ末端フラグメントと連結して、ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９ｃ−ＧＧＬドメインキメラプラスミドを生成した。
【０１５５】
（５ｂ．ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９Ｃ（＋ＧＧＬドメイン））
ＧＧＬドメインフラグメントを含むＲＧＳ９  Ｃ末端領域を、ＲＧＳ９  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅して、ヒトＲＧＳ９のアミノ酸２２３〜６７５をコードする１３５６ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。順方向プライマー（ＲＧＳ９ｃｈｉ  Ｃｔｅｒｍ  ＨｉｎｄＩＩＩ  ｆｗｄ（＋ＧＧＬドメイン））は、埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む：
【０１５６】
【化３８】
2004520824.tif 000043
逆方向プライマーは、埋め込まれたＸｈｏＩ部位を含む：
【０１５７】
【化３９】
2004520824.tif 000044
。
【０１５８】
ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９Ｃ（−ＧＧＬドメイン）キメラプラスミド（上記）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、そして、ＲＧＳ４Ｎを含むベクターを含むｃＤＮＡバンドを、ゲル精製した。次いで、このベクター−ＲＧＳ４Ｎ  ｃＤＮＡを、上記ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ  ＲＧＳ９Ｃ（＋ＧＧＬ）調製ＰＣＲ産物に連結して、ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ９＋ＧＧＬドメインのキメラプラスミドを生成した。
【０１５９】
（６．ＲＧＳ４Ｎ／ａｘｉｎ）
ヒトａｘｉｎ中に存在するＲＧＳドメインをＰＣＲ増幅して、アミノ酸１９９〜３４５をコードする４４１ｂｐのフラグメントを生成した。順方向プライマー（ＡｘｉｎＳｍａＩ  ｆｗｄ）は、埋め込まれたＳｍａＩ部位を含む：
【０１６０】
【化４０】
2004520824.tif 000045
逆方向プライマー（ＡｘｉｎＸｈｏＩ  ｒｅｖ）は、埋め込まれたＸｈｏＩ部位を含む：
【０１６１】
【化４１】
2004520824.tif 000046
。
【０１６２】
ＲＧＳ４Ｎ／ＲＧＳ７Ｃキメラを含むｐ４２６ＴＥＦプラスミドを、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで切断してＲＧＳ７Ｃフラグメントを除去し、次いでゲル精製した。次いで、このベクター−ＲＧＳ４  ＤＮＡを、ａｘｉｎ遺伝子のＲＧＳドメインをコードする、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩフラグメントと連結して、ＲＧＳ４Ｎ／Ａｘｉｎキメラプラスミドを生成した。
【０１６３】
（７．ＲＧＳ１１：）
ヒトＲＧＳ１１を、ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＮＭ＿００３８３４）を鋳型として使用することで増幅し、アミノ酸１〜４４７をコードする、１３４１ｂｐのＰＣＲ産物を生成した。順方向プライマーは、組み込まれたＥｃｏＲＩ部位を、含む：
【０１６４】
【化４２】
2004520824.tif 000047
逆方向プライマーは、組み込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を、含む。
【０１６５】
【化４３】
2004520824.tif 000048
。
【０１６６】
得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そして、ｐ４２６ＴＥＦベクターの類似する部位へサブクローニングした。
【０１６７】
（８．ＲＧＳ６：）
ヒトＲＧＳ６を、ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＡＦ１５６９３２）から増幅し、アミノ酸１〜４７３の全長タンパク質をコードする、１４１９ｂｐのＰＣＲ産物を取得した。順方向プライマーは、組み込まれたＨｉｎｄＩＩＩ部位を、含む。
【０１６８】
【化４４】
2004520824.tif 000049
逆方向プライマーは、組み込まれたＸｈｏＩ部位を含む。
【０１６９】
【化４５】
2004520824.tif 000050
このＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、そしてｐ４２６ＴＥＦベクターの類似する部位へクローニングした。
【０１７０】
（株の生成）
酵母の株を生成し、ｓｓｔ２ノックアウトを補完する、種々のＲＧＳキメラタンパク質の能力を、評価した。このＲＧＳキメラプラスミドを、ヒトＧｂｅｔａ５の存在下または非存在下で、基本株であるＫＹ１１３へ形質転換した。全株は、コントロールプラスミドまたは発現プラスミドのいずれか、および類似する培地条件下で研究できるように、ホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子を、含有した。株を、以下の表にまとめた。
【０１７１】
【表４】
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（結果）
これらの株を、フェロモン応答性アッセイにおける機能的相補性について、フェロモン応答性レポーター遺伝子を使用することで、試験した。例えば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、定量アッセイにおいて使用した。株をまた、フェロモン応答のための定性アッセイにおけるα因子への２日間の曝露に応答して、「ハロアッセイ」において、試験した。
【０１７２】
全株を、用量応答アッセイにおいて試験した。ルシフェラーゼに基づくアッセイに関して、試験されるα因子用量は、０、１００ｐｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌ、１μｍｏｌ、１０μｍｏｌおよび１００μｍｏｌである。
【０１７３】
ハロアッセイを、以前に言及したように、実施した。多数の用量応答曲線の比較のために、応答を、曲線内のα因子の単一用量に対して決定した。次いで、応答を、ＲＧＳおよびＧｂｅｔａ５を含まないネガティブコントロール株に対する応答のパーセントとして、決定した。例えば、効果を有さない構築物（空のベクターを含むｓｓｔ２ノックアウト株に類似する）を１００と順位付け、機能的に高度に補完するＲＧＳタンパク質（例えば、ＲＧＳ４）は、０と順位付けられる。
【０１７４】
本発明者らは、種々の短い、すなわち比較的低分子量である、ＲＧＳタンパク質を、試験した。ＲＧＳ２およびＲＧＳｚを以前試験し、そして、ＲＧＳ４ほど効果的ではないが、これらがｓｓｔ２ノックアウト表現型を補完する能力を立証した。ＲＧＳ１０もまた、短いＲＧＳタンパク質である。しかし、野生型タンパク質として発現した場合、ルシフェラーゼアッセイまたはハロアッセイのどちらにおいても、相補性は立証されなかった。しかし、ＲＧＳ４／ＲＧＳ１０キメラは、ＲＧＳの機能をＲＧＳ４単独の発現で観察された値と非常に近い値に、戻した。これらの結果を、図１２に示す。
【０１７５】
これらのデータから、ＲＧＳ４は、ｓｓｔ２ノックアウト表現型の相補性において、最も効果的なＲＧＳタンパク質である。ＲＧＳ７は非機能的で、そして、Ｎ末端領域の欠失によって、十分に改善されなかった。これらのデータを、図１４に示す。しかし、ＲＧＳ４のＮ末端領域をＲＧＳ７のＣ末端領域に加えること、またはＲＧＳ４のＮ末端領域をＲＧＳ７タンパク質の全長を加えることは、機能的相補性のある程度のレベルを、可能にする。さらに、ハロアッセイにおける改善をまた、注目する。
【０１７６】
ネイティブな状態におけるＲＧＳ９は、ｓｓｔ２ノックアウト表現型を補完するような中間能力を、立証した。この相補性は、ＲＧＳ９のＮ末端領域非存在下では、消失した。しかし、ＲＧＳ４のＮ末端を非機能的なＣ末端ＲＧＳ９−ｇｇｌに加えることで、相補性を改善し、その相補性はさらに、ＲＧＳ９のｇｇｌドメインを除去することによって、改善される。
【０１７７】
さらに、本発明者らは、ＲＧＳ６（２５値）およびＲＧＳ１１（５０値）によるある程度の中間相補性を確認し、そしてこれらは、Ｇ−ｂｅｔａ５の共発現によって、影響されなかった。
【０１７８】
本発明者らは、ＲＧＳ９を発現する株の応答において、差異を確認した。それは、野生型タンパク質ではある程度の効果を有する；しかし、Ｇｂｅｔａ５と共発現されると、しばしば、フェロモン応答を強めることを、確認した。類似する効果は、他のＧＧＬ含有ＲＧＳタンパク質（すなわち、ＲＧＳ６、ＲＧＳ７、およびＲＧＡ１１）を用いたＧｂｅｔａ５の共発現によって、観察されなかった。この発見は、ＲＧＳ９の代替的な機能を、示唆する。
【０１７９】
【表５】
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全ての引用された出版物、特許および特許出願は、本明細書によって、その全体が参考として援用される。
【０１８０】
例示の目的で提供された実施例を用いて、前述の明細書が本発明の本質を教示するが、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に種々の変化がなされ得るということを、本開示を読解した当業者は理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＲＧＳ４構築物を含むプラスミドを有する酵母に対するハロ−アッセイを図示する。ＫＹ１０３株およびＫＹ１１３株由来の酵母を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、ＲＧＳ４構築物およびＦＵＳ１−ｌａｃＺ構築物を有する酵母が、ＫＹ１０３由来の株においてＲＧＳ４構築物を欠いたコントロール株と比較した場合、フェロモン誘導性増殖の著明な減衰を呈示することを示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ＲＧＳ４構築物およびＦＵＳ１−ｌａｃＺ構築物を有する酵母が、ＫＹ１１３由来の株においてＲＧＳ４構築物を欠いたコントロール株と比較した場合、フェロモン誘導性増殖の著明な減衰を呈示することを示す。
【図３】
図３は、ＲＧＳ４構築物およびＦＵＳ１−ルシフェラーゼ構築物を有する酵母株（ＫＹ１１７）が、ＲＧＳ４構築物を欠いたコントロール株（ＫＹ１１８）と比較した場合、α因子の存在下で減衰したレベルの発光を呈示することを示す。
【図４Ａ】
図４Ａは、ＲＧＳ４構築物およびＦＵＳ１−ルシフェラーゼ構築物を含む細胞、およびＲＧＳ４構築物を欠いたコントロール株における、α因子に応答する発光の用量応答曲線を示す。両方の株はＫＹ１０３由来である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、ＲＧＳ４構築物およびＦＵＳ１−ルシフェラーゼ構築物を含む細胞、およびＲＧＳ４構築物を欠いたコントロール株における、α因子に応答する発光の用量応答曲線を示す。両方の株はＫＹ１１３由来である。
【図５】
図５は、ＲＧＳブロッカーとしての化合物をスクリーニングするための、酵母フェロモンに基づいたアッセイの概略図を示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、ＲＧＳ４媒介性の発光の減衰を妨害する化合物に対するスクリーニングとして、９６個の化合物に対する単回用量アッセイを示す。図６Ａは、ＲＧＳ４を発現する酵母株における化合物の効果を示す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ＲＧＳ４媒介性の発光の減衰を妨害する化合物に対するスクリーニングとして、９６個の化合物に対する単回用量アッセイを示す。図６Ｂは、ＲＧＳ４配列を欠いたコントロールベクターを有する酵母株における化合物の効果を示す。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、ＲＧＳ４媒介性の発光の減衰を妨害する化合物に対するスクリーニングとして、９６個の化合物に対する単回用量アッセイを示す。図６Ｃは、ＲＧＳ４発現性酵母株とコントロール酵母株との間の差異の度合を示す。
【図７Ａ】
図７Ａは、試験化合物ＳＢＱ７／Ｄ１に対する用量応答曲線を示す。この化合物について、１秒当たりの元のカウント、株間の差異の度合、およびある株内での差異の度合を示す図が示される。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、試験化合物ＳＢＱ８／Ｂ１に対する用量応答曲線を示す。この化合物について、１秒当たりの元のカウント、株間の差異の度合、およびある株内での差異の度合を示す図が示される。
【図７Ｃ】
図７Ｃは、試験化合物ＣＬ４８５に対する用量応答曲線を示す。この化合物について、１秒当たりの元のカウント、株間の差異の度合、およびある株内での差異の度合を示す図が示される。
【図７Ｄ】
図７Ｄは、試験化合物ＣＬ７４４に対する用量応答曲線を示す。この化合物について、１秒当たりの元のカウント、株間の差異の度合、およびある株内での差異の度合を示す図が示される。
【図８】
図８は、ＲＧＳＺ１を発現する酵母株が、空ベクターを発現するコントロール酵母株よりも、より小さいハロ−および減少した発光を呈示しすることを示し、このことは酵母におけるｓｓｔ２の相補性を示唆する。また、ＲＧＳ２、ＲＧＳ７およびＲＧＳ９を発現する酵母株に対するハロ−アッセイの結果も示される。
【図９Ａ】
図９Ａは、種々の濃度のα因子に応答して、空ベクターを発現するコントロール酵母株と比較した、ＲＧＳＺ１を発現する試験酵母株に対する用量応答曲線を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、種々の濃度のα因子に応答して、空ベクターを発現するコントロール酵母株と比較した、ＲＧＳ２を発現する試験酵母株に対する用量応答曲線を示す。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、種々の濃度のα因子に応答して、空ベクターを発現するコントロール酵母株と比較した、ＲＧＳ７を発現する試験酵母株に対する用量応答曲線を示す。
【図９Ｄ】
図９Ｄは、種々の濃度のα因子に応答して、空ベクターを発現するコントロール酵母株と比較した、ＲＧＳ９を発現する試験酵母株に対する用量応答曲線を示す。
【図１０】
図１０は、ＲＧＳ９およびｈＧβ５を同時発現する酵母株に対するハロ−アッセイの結果を示す。
【図１１】
図１１は、ＲＧＳ７およびｈＧβ５を同時発現する酵母株に対するハロ−アッセイの結果を示す。
【図１２】
図１２は、キメラＲＧＳ４／ＲＧＳ１０、ＲＧＳ４、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ７、ＲＧＳ９、ＲＧＳ６およびＲＧＳ１１に対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図１３】
図１３は、ＲＧＳ７、キメラＲＧＳ７（ｇｇｌ）／ＲＧＳ４、キメラＲＧＳ４／ＲＧＳ７（ｇｇｌ）４／ＲＧＳ１０、ＲＧＳ４、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ７、ＲＧＳ９、ＲＧＳ６およびＲＧＳ１１に対するルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図１】
2004520824.tif 000055
【図２Ａ】
2004520824.tif 000056
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2004520824.tif 000060
【図５】
2004520824.tif 000061
【図６Ａ】
2004520824.tif 000062
【図６Ｂ】
2004520824.tif 000063
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
2004520824.tif 000074
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004520824.tif 000174
2004520824.tif 000175
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520824.tif 000268
2004520824.tif 000269
【国際調査報告】
2004520824.tif 000270
2004520824.tif 000271
2004520824.tif 000272
2004520824.tif 000273