(57)【要約】本発明は、Ｂ．セレウス中のホスファチジルイノシトールのためのＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’、ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’を含む新規なオリゴヌクレオチドプライマーと、混合微生物相中の食物中のＢ．セレウスを検出するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
を含むプライマーであることを特徴とするＢ．セレウス中のホスファチジルイノシトールのための新規なオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
混合微生物相中のＢ．セレウスのホスファチジルイノシトール遺伝子に特異的なプライマーを使用することを含み、前記プライマーが、
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
を含むことを特徴とする食物中のＢ．セレウスを検出するための方法。
【請求項３】
Ｂ．セレウスを検出するための食物基質が乳汁及び調理米であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
調理米中のＢ．セレウスからの鋳型ＤＮＡは、０．５〜２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用い、９６〜１００℃で３〜８分間沸騰することと、２２：２１〜２８：２７の比のフェノール：クロロホルムによる処理とにより抽出されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
乳汁中のＢ．セレウスからの鋳型ＤＮＡは、１：１〜１：３の比のジエチルエーテル：クロロホルムと、１．５〜３．５Ｍの尿素と、０．５〜２％の範囲のドデシル硫酸ナトリウムとを使用して抽出されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
全体積が２５μｌのＰＣＲ反応混合物は、８〜１２ｍＭのトリス(Tris)ＨＣｌと、４５〜５５ｍＭのＫＣｌと、０．５〜３．０ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．００５〜０．０２％のゼラチンと、１５０〜３００μＭの単一のデオキシヌクレオシド三リン酸と、３０〜６０ピコモルのそれぞれの特異的プライマーと、０．５〜２．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼと、１〜３μｌの鋳型ＤＮＡとを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Ｂ．セレウスの検出は、９０〜９８℃での２〜８分間の最初の変性と、それぞれのサイクルが９０〜９８℃での４０〜７０秒間の変性、４６〜５４℃での４０〜８０秒間のアニーリング及び６８〜７６℃での４５〜７５秒間の伸長(extension)からなる２８〜４０回の増幅サイクルと、６８〜７６℃での４〜１２分間の最終伸長とからなる標的遺伝子の増幅プロフィールによって行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ＰＣＲ生成物の分析は、１．２〜１．８％のアガロースゲル電気泳動と、０．５（ｇ／ｍｌの臭化エチジウムを用いた染色によるＰＣＲ生成物の視覚化と、紫外線ライトボックス中での観察とにより行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
Ｂ．セレウス細胞の最小限の数の検出は、ＰＣＲにより食物基質中で行なわれることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルスセレウス中のホスファチジルイノシトールのための新規なオリゴヌクレオチドプライマーに関する。本発明は、食物中のバチルスセレウスを検出するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
優勢に発生する食物媒介の病原性細菌の中で、日和見病原体であるバチルスセレウスは、インドの食物中に多量に存在し、下痢及び／又は嘔吐のような病気をも引き起こすことが見出されている（非特許文献１参照）。この病気は、腸毒素及びＢ．セレウスの菌株によって生成される溶血素を含めた他の毒素の存在に起因している。従来、Ｂ．セレウスは、卵黄を含む選択的なプレート培地上で増殖するその能力と、マンニトールを使用することはできないこととによって検出されている。形態学的、培養的及び生化学的特性によって、これらの分離菌がさらに同定される（非特許文献２参照）。
【０００３】
検出法においてなされた進歩によって、Ｂ．セレウスを特異的に検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用がもたらされている。特異的なプライマーの組を使用して、純粋培養系及び食物サンプル中のＢ．セレウス群の細菌を検出するためのＰＣＲ法が開発されている。
【０００４】
Ｂ．セレウスのセレオリシンＡＢ遺伝子（Ｍ２４１４９）用のプライマーが設計されている（非特許文献３参照）。人工的に汚染させた乳汁サンプル中の、乳汁の濃縮なしのＰＣＲによるＢ．セレウスに関する検出限界は、１０３ＣＦＵ／ｍｌであった。
【０００５】
ＢｃｅＴ遺伝子用のプライマーを設計し、これを使用して、Ｂ．セレウスの臨床的及び食物中の分離菌の毒素遺伝子の分布が研究された（非特許文献４，５参照）。この研究では定性的観察のみがなされ、定量化は報告されなかった。Ｂ．セレウス菌株の腸毒素的可能性を評価するために、ＢｃｅＴ遺伝子が標的化される可能性がないとも仮定された。
【０００６】
溶血素を標的遺伝子として使用する、いくつかの食物媒介の病原性細菌のＰＣＲ検出用の共通のプロトコルが考案された（非特許文献６参照）。Ｂ．セレウスの毒素生成菌株の検出は、これらのプライマーを使用して行い、次に実験用の成長培地においてさまざまな食物サンプルを一晩濃縮した。この研究は定性的な情報のみを与え、定量化は述べられていない。
【０００７】
スフィンゴミエリナーゼ遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマーが設計され、食物サンプル中のＢ．セレウス群の菌株の、ＰＣＲに基づく検出用にそれが使用された（非特許文献７参照）。これらのプライマーは、８時間の濃縮ステップの後に、１００個の細胞／食物サンプル１グラムのみを検出することができ、感度が低いことが示される。
【０００８】
Ｂ．セレウスの細胞濃度がさまざまな汚染米飯サンプルを開示されている（非特許文献８参照）。この米サンプルは、異なる時間間隔でブイヨン中において濃縮された。最初の細胞数が米飯１グラム当たりＢ．セレウスが２．４×１０４ＣＦＵであったときでさえ、ジャイレースＢ特異的プライマーを含む非濃縮食物サンプルに関して、増幅が観察されることはなかった。ブイヨン中でのわずか１５時間の濃縮後に、ＰＣＲによる少数のＢ．セレウスの検出が可能であった。
【０００９】
１６ｓリボゾームＲＮＡ（リボ核酸）用のプライマーが設計され、食物サンプルを汚染したＢ．セレウスの、ＰＣＲに基づく定量化用にそれが使用された（非特許文献９参照）。
１〜９ＣＦＵ／食物サンプル１グラムの範囲の標的細胞を、グルコースを補充した脳心臓浸出物ブロス中でのわずか８時間の濃縮後に、検出することができた。
【００１０】
配列は、バチルスセレウスの検出に用いる１６ｓリボゾームＲＮＡ（リボ核酸）及びジャイレースＢ特異的プライマーについて言及されている（特許文献１，２参照）。
【００１１】
乳汁サンプルから標的ＤＮＡを単離するための方法が考案された（非特許文献１０，１１参照）。酵素、洗浄剤及びカラムクロマトグラフィの組合せを使用する多数のステップを含むこの方法は精巧であった。この方法は感度が欠けている難点もあり、セレオリシンＡＢ遺伝子用のプライマーを使用するＰＣＲによって、１０３ＣＦＵ／１ｍｌのＢ．セレウスのみを検出することができた。
【００１２】
米飯からＢ．セレウスを検出するためのプロトコルが記載されている（非特許文献１２参照）。この方法は予備濃縮ステップ、濾過の２ステップ、次にＰＣＲにおける使用前にサンプルを沸騰させることを含んでいた。ゼロ時間において、米飯１グラム当たり２．４×１０４ＣＦＵという適度に多数のＢ．セレウスは、いかなるＰＣＲ増幅産物も生成することができなかったことが報告された。濃縮の１５時間後に、少数のＢ．セレウスのみを検出することができた。
【００１３】
これらすべての方法の欠点は、標的生物、すなわちＢ．セレウスの非特異的な検出、再現性に欠けていること、食物系中のＢ．セレウスのすべての分離菌を検出できないこと、少数の標的生物を検出するための感度に欠けていることであった。さらにこれらの方法は面倒で、手順が冗長である。Ｂ．セレウス群の生物による胞子の形成という問題によって、ＰＣＲによる検出は困難な事柄となる。大部分の方法では、ＰＣＲ検出において使用するための標的ＤＮＡを生成させることができ、細胞数を増大させるための８〜１５時間の培養が可能である、適切な実験用の成長培地中での濃縮のステップが含まれる。
【特許文献１】
独国特許発明第１９９１５１４１号明細書
【特許文献２】
独国特許発明第１９９１５１４号明細書
【非特許文献１】
Ｒａｋｈ他、１９８８
【非特許文献２】
Ｄｕｇｕｉｄ、１９９６
【非特許文献３】
Ｓｃｈｒａｆｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９５）
【非特許文献４】
Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）
【非特許文献５】
Ｍａｎｔｙｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ（１９９８）
【非特許文献６】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）
【非特許文献７】
Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）
【非特許文献８】
Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）
【非特許文献９】
Ｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）
【非特許文献１０】
Ｓｃｈｒａｆｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９５）
【非特許文献１１】
Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）
【非特許文献１２】
Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主な目的は、前に詳述した欠点を回避する、食物中のバチルスセレウスを検出するための改善された方法を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、標的生物中の特定の遺伝子の保存領域用に設計したプライマーを使用することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、Ｂ．セレウス群に属する分離菌の検出において、設計したプライマーを使用することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、ＰＣＲによって直接、食物系中のＢ．セレウスを検出することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、生物の鋳型ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を食物から直接調製するための簡単で有効な方法を使用することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、生物中の標的遺伝子の検出に特異的な、ＰＣＲ条件を使用することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、食物系中の非常に少数の標的生物を検出することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって本発明は、
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
を含むプライマーであることを特徴とするＢ．セレウス中のホスファチジルイノシトールのための新規なオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００２２】
本発明は、混合微生物相中のＢ．セレウスのホスファチジルイノシトール遺伝子に特異的なプライマーを使用することを含み、前記プライマーが、
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
を含むことを特徴とする食物中のＢ．セレウスを検出するための方法にも関する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、Ｂ．セレウスを検出するための食物基質は乳汁及び調理米である。
【００２４】
本発明の他の実施形態では、調理米中のＢ．セレウスからの鋳型ＤＮＡは、０．５〜２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用い、９６〜１００℃で３〜８分間沸騰することと、２２：２１〜２８：２７の比のフェノール：クロロホルムによる処理とにより抽出される。
【００２５】
本発明の他の実施形態では、乳汁中のＢ．セレウスからの鋳型ＤＮＡは、１：１〜１：３の比のジエチルエーテル：クロロホルムと、１．５〜３．５Ｍの尿素と、０．５〜２％の範囲のドデシル硫酸ナトリウムとを使用して抽出される。
【００２６】
本発明の他の実施形態では、全体積が２５μｌのＰＣＲ反応混合物は、８〜１２ｍＭのトリス(Tris)ＨＣｌと、４５〜５５ｍＭのＫＣｌと、０．５〜３．０ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．００５〜０．０２％のゼラチンと、１５０〜３００μＭの単一のデオキシヌクレオシド三リン酸と、３０〜６０ピコモルのそれぞれの特異的プライマーと、０．５〜２．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼと、１〜３μｌの鋳型ＤＮＡとを含む。
【００２７】
本発明の他の実施形態では、Ｂ．セレウスの検出は、９０〜９８℃での２〜８分間の最初の変性と、それぞれのサイクルが９０〜９８℃での４０〜７０秒間の変性、４６〜５４℃での４０〜８０秒間のアニーリング及び６８〜７６℃での４５〜７５秒間の伸長(extension)からなる２８〜４０回の増幅サイクルと、６８〜７６℃での４〜１２分間の最終伸長とからなる標的遺伝子の増幅プロフィールによって行う。
【００２８】
本発明の他の実施形態では、ＰＣＲ産物の分析は、１．２〜１．８％のアガロースゲル電気泳動と、０．５（ｇ／ｍｌの臭化エチジウムを用いた染色によるＰＣＲ産物の視覚化と、紫外線ライトボックス中での観察とにより行われる。
【００２９】
本発明の他の実施形態では、Ｂ．セレウス細胞の最小限の数の検出は、ＰＣＲにより食物基質中で行なわれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、食物中のＢ．セレウスを検出するための改善されたＰＣＲ法に関する。本発明のプライマーを使用するＰＣＲ法は、食物中の１〜１０６個のＢ．セレウスの細胞を直接検出する。ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、Ｂ．セレウス中のホスファチジルイノシトールの遺伝子を選択的に増幅させる。乳汁及び調理米サンプルは、１〜１００００００の範囲のさまざまな細胞数のＢ．セレウスが混入された。食物基質中に存在するＢ．セレウスから鋳型ＤＮＡを、洗浄剤及び有機溶媒を使用して抽出するための方法を標準化した。ＰＣＲの反応混合物及び増幅条件を、特異的な増幅用に最適化した。ＰＣＲ産物の視覚化によって、以下の方法により、乳汁及び調理米サンプル中の、１〜１，０００，０００の範囲の細胞数を検出することができることが明らかになった。
【００３１】
本発明のプライマーは、食物系中のバチルスセレウスをＰＣＲによって直接検出する。この方法によって、Ｂ．セレウスのすべての菌株を検出することができる。この方法は迅速で高感度であり、食物基質中のただ１個の細胞を検出することを可能にし、濃縮の任意のステップを克服する。
【００３２】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００３３】
Ｂ．セレウスのホスファチジルイノシトール遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマーを、ソフトウェアプログラムＰｒｉｍｅｒ３．０を使用して、遺伝子配列（Ｍ３０８０９）に基づいて設計した。このプライマーセットは、遺伝子の３４２塩基対（ｂｐ）断片を増幅させ、その配列は以下に与えられる。培地と他の溶液との滅菌は、１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理によって行った。
【００３４】
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
元の食物中のＢ．セレウスの分離菌の１００μｌ分量を、滅菌した１０ｍｌの脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスに接種し、攪拌培養器中において１４０ｒｐｍ、３７℃で１８時間培養した。４℃で１０分間の１００００ｒｐｍでの遠心分離によって、細胞を採取した。細胞を１０ｍｌの滅菌した０．８５％生理食塩水に懸濁させて、１ミリリットル当たり１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞濃度を得た。このストックから、９ｍｌの滅菌した０．８５％生理食塩水による一連の希釈を行って、１０８〜１０１ＣＦＵ／ｍｌの範囲の細胞濃度を得た。個々の希釈物は、乳汁サンプルに混入するために使用した。
【００３５】
２０ミリリットルの殺菌乳を、２５×１２５ｍｍの寸法の滅菌したスクリューキャップチューブ中に取り、いかなる圧力も加えずに調理器具中で３０分間蒸気処理し、３０℃に冷却した。１．５ｍｌの滅菌した各マイクロ遠心分離チューブ中で、０．４ｍｌの冷却した乳汁サンプルを、Ｂ．セレウスの０．８５％生理食塩水懸濁液０．４ｍｌと混合させて、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１及び１００ＣＦＵ／ｍｌの範囲の最終細胞濃度を得た。それぞれのチューブに、それぞれ０．２５ｍｌのジエチルエーテルを加え、クロロホルムをサンプルに加えて、３０秒間攪拌した。サンプルは２５℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。水相を、新しい１．５ｍｌの滅菌したマイクロ遠心分離チューブに移し、６Ｍの尿素０．５ｍｌと、１０％のドデシル硫酸ナトリウム０．１ｍｌとを加えた。サンプルは３７℃で２０分間培養し、次いで２５℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。上澄みを捨て、０．２ＮのＮａＯＨ０．１ｍｌをサンプルに加え、３７℃で１０分間培養した。冷無水エタノール１．０ｍｌと、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）０．１ｍｌとを加え、サンプルを−２０℃で２時間保持することによって、ＤＮＡを沈殿させた。サンプルを４℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。上澄みを捨て、１．０ｍｌの冷７０％エタノールを加え、サンプルを４℃で１５分間１０，０００ｒｐｍの遠心分離にかけることによって、ＤＮＡ調製物中の過剰な塩を除去した。上澄みを捨て、ＤＮＡペレットを空気乾燥させ、１５（ｌの滅菌した限外濾過水に再懸濁させた。
【００３６】
乳汁サンプルからの２μｌのＤＮＡ調製物を含む、合計反応体積２５μｌで増幅を行った。この反応混合物は、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のゼラチン）、それぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸２００μＭ、それぞれのプライマー５０ピコモル、及び１．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなっていた。鋳型ＤＮＡは、最初に９４℃で５分間変性させた。次に、プログラム可能なサーモサイクラー中で、合計３５の増幅サイクルを行った。それぞれのサイクルは、９４℃で１分間の変性と、５０℃で１分間のプライマーアニーリングと、７２℃で１分間の伸長とからなっていた。最後のサイクルの後に、続いて７２℃で８分間の最終伸長を行った。
【００３７】
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ産物の１０μｌ分量を２．０μｌのローディングダイと混合し、１．５％アガロースゲル上に配設し、１×ＴＡＥ緩衝液中において１２０ボルトで２時間、電気泳動を施した。ゲルは臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、蒸留水で脱染色し、紫外線ライトボックス上で調べた。１００ｂｐのラダーを、分子サイズマーカーとして使用した。ゲル中の増幅プロフィールは、ＣＣＤ−カメラに基づくゲル文書化装置(Gel Documentation System)に記録した。
【００３８】
１〜１００００００の範囲のＢ．セレウスの細胞を含む乳汁サンプルに関してＰＣＲを行ったとき、ホスファチジルイノシトールに関する３４２ｂｐの特異的な増幅物を観察した。
【実施例２】
【００３９】
Ｂ．セレウスのホスファチジルイノシトール遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマーを、ソフトウェアプログラムＰｒｉｍｅｒ３．０を使用して、遺伝子配列（Ｍ３０８０９）に基づいて設計した。このプライマーセットは、遺伝子の３４２塩基対（ｂｐ）断片を増幅させ、その配列は以下に与えられる。培地と他の溶液との滅菌は、１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理によって行った。
【００４０】
ＰＩ−１（Ｆ）５’ＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＧ３’
ＰＩ−２（Ｒ）５’ＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡ３’
元の食物中のＢ．セレウスの分離菌の１００μｌ分量を、滅菌した１０ｍｌの脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスに接種し、攪拌培養器中において１４０ｒｐｍ、３７℃で１８時間培養した。４℃で１０分間の１００００ｒｐｍでの遠心分離によって、細胞を採取した。細胞を１０ｍｌの滅菌した０．８５％生理食塩水に懸濁させて、１ミリリットル当たり１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞濃度を得た。このストックから、９ｍｌの滅菌した０．８５％生理食塩水による一連の希釈を行って、１０８〜１０３ＣＦＵ／ｍｌの範囲の細胞濃度を得た。個々の希釈物は、調理米サンプルに混入するために使用した。
【００４１】
１０００ｇの量の玄米を採取し、流れている水道水で研いで洗浄した。研いだ米は１：２の比率で水と混合させ、ステンレス鋼製容器中に取り、圧力調理器具中で２０分間、蒸気調理した。調理米の１００ｇ分量を、個々の滅菌した５００ｍｌのガラスビーカーに取り、Ｂ．セレウスの生理食塩水懸濁液１．０ｍｌを混入して、１０７ＣＦＵ／ｇの細胞濃度を得て、均一に混合した。
【００４２】
次いで、１１ｇ分量中の汚染した調理米サンプルを、滅菌した０．８５％生理食塩水９９ｍｌに加え、２５０ｍｌの三角フラスコに取り、充分に混合し、滅菌した０．８５％生理食塩水による一連の希釈物を調製して、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１及び１００ＣＦＵ／ｇという個々の細胞濃度を得た。希釈サンプルの１ｍｌ分量を、１．５ｍｌの滅菌したマイクロ遠心分離チューブに移した。サンプルを４℃で５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。ペレットは、４℃で５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけ、洗浄液を捨てることによって、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌで３回、及び滅菌した限外濾過水１．０ｍｌで１回洗浄した。ペレットは、５０μｌの滅菌した限外濾過水及び４５０μｌの滅菌した１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む混合物に再懸濁させた。沸騰水中で５分間サンプルを培養し、０．５ｍｌのフェノール：クロロホルム（２５：２４）をサンプルに加え、短時間撹拌し、４℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。水相を新しい１．５ｍｌの滅菌したマイクロ遠心分離チューブに移し、０．５ｍｌのクロロホルムをサンプルに加えた。サンプルを４℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけ、水相を新しい１．５ｍｌの滅菌したマイクロ遠心分離チューブに移した。冷無水エタノール１．０ｍｌと、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）０．１ｍｌとを加え、サンプルを−２０℃で２時間培養することによって、ＤＮＡを沈殿させた。サンプルを４℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけた。冷蔵７０％エタノール１．０ｍｌを加え、サンプルを４℃で１５分間、１００００ｒｐｍの遠心分離にかけることによって、ＤＮＡペレット中の過剰な塩を除去した。この上澄みは捨てた。ＤＮＡペレットを空気乾燥させ、１５μｌの滅菌した限外濾過水に溶解した。
【００４３】
乳汁サンプルからのＤＮＡ調製物２μｌを含む、合計反応体積２５μｌで増幅を行った。この反応混合物は、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のゼラチン）、それぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸２００μＭ、それぞれのプライマー５０ピコモル、及び１．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなっていた。鋳型ＤＮＡは、最初に９４℃で５分間変性させた。次に、プログラム可能なサーモサイクラー中で、合計３５の増幅サイクルを行った。それぞれのサイクルは、９４℃で１分間の変性と、５０℃で１分間のプライマーアニーリングと、７２℃で１分間の伸長とからなっていた。最後のサイクルの後に、続いて７２℃で８分間の最終伸長を行った。
【００４４】
ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ産物の１０μｌ分量を２．０μｌのローディングダイと混合し、１．５％アガロースゲル上に配設し、１×ＴＡＥ緩衝液中において１２０ボルトで２時間、電気泳動を施した。ゲルは臭化エチジウム（０．５（ｇ／ｍｌ）で染色し、蒸留水で脱染色し、紫外線ライトボックス上で調べた。１００ｂｐのラダーを、分子サイズマーカーとして使用した。ゲル中の増幅プロフィールは、ＣＣＤ−カメラに基づくゲル文書化装置に記録した。
【００４５】
１〜１００００００の範囲のＢ．セレウスの細胞を含む調理米サンプルに関してＰＣＲを行ったとき、ホスファチジルイノシトールに関する３４２ｂｐの特異的な増幅物を観察した。
【００４６】
本発明の主な利点は次のとおりである。
【００４７】
１．設計したホスファチジルイノシトール用のプライマーは、Ｂ．セレウスの検出に特異的である。
【００４８】
２．混合微生物相中において、設計したプライマーセットは、交差反応なしでＢ．セレウスを特異的に検出する。
【００４９】
３．各種食物基質中に存在するＢ．セレウスの鋳型ＤＮＡを抽出するための簡潔で有効な方法。
【００５０】
４．乳汁及び調理米中に存在するＢ．セレウスを検出するための標準化されたＰＣＲ条件。
【００５１】
５．食物系中のＢ．セレウスの１個の細胞さえ検出することができる、迅速で高感度なＰＣＲ法。
【国際公開パンフレット】
2004525638.tif 000002
2004525638.tif 000003
2004525638.tif 000004
2004525638.tif 000005
2004525638.tif 000006
2004525638.tif 000007
2004525638.tif 000008
2004525638.tif 000009
2004525638.tif 000010
2004525638.tif 000011
2004525638.tif 000012
【国際調査報告】
2004525638.tif 000013
2004525638.tif 000014