(57)【要約】本発明は、シンチレータ分子であって、親油性基または両親媒性基である一以上のＲ１部分に結合されたリン光体である一以上のＸ部分を含み、前記シンチレータ分子は、細胞、細胞膜、生体膜、人工膜またはデリバリー媒体に取り込まれることができ、取り込まれたときにリン光体として作用すことがるシンチレータ分子を提供する。また、新規シンチレータ化合物を包むリポソームまたはミセル、新規シンチレータ化合物を包むリポソームまたはミセルを製造する方法、およびシンチレータ化合物を細胞の細胞膜に挿入するためのデリバリー媒体としての、リポソームまたはミセルの使用を提供する。加えて、本発明は、新規シンチレータ化合物を包む細胞および該細胞のアッセイ系における使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性または両親媒性の基である一以上のＲ１部分に共有結合で結合された、リン光体である一以上のＸ部分からなるシンチレータ分子であって、前記シンチレータ分子は、細胞、細胞膜、生体膜、人工膜またはデリバリー媒体に組み込まれることが可能であり、且つ組み込まれたときにリン光体として作用することができるシンチレータ分子。
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｉ）のシンチレータ分子またはその塩：
（Ｘ）ｍ−（Ｒ１）ｎ　　　　　（Ｉ）
ここで、ｍおよびｎは、独立して１〜２０である。
【請求項３】
請求項２に記載のシンチレータ分子であって、ｍおよびｎは、独立して１〜４であるシンチレータ分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシンチレータ分子であって、ｍおよびｎは、同じ値であるシンチレータ分子。
【請求項５】
請求項４に記載のシンチレータ分子であって、ｍおよびｎは、両方とも１であるシンチレータ分子。
【請求項６】
請求項１および２に記載のシンチレータ分子であって、一つのＸ部分および２以上のＲ１部分からなるシンチレータ分子。
【請求項７】
請求項１および２に記載のシンチレータ分子であって、一つのＲ１部分および２以上のＸ部分からなるシンチレータ分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のシンチレータ分子であって、前記Ｘ部分およびＲ１部分は、リンカー部分を介して結合されているシンチレータ分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のシンチレータ分子であって、前記Ｒ１部分は、独立して一以上の枝なしまたは分岐したアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケニオキシ基、アルキニル基、アルキニルオキシ基、アリール基、ヘテロアリール基、アミド基、アミン基、アルキルアリール基、アルキオキシアリール基、還元アリールアルキル基、還元アルコキシアリール基、アルケニルアリール基、アルケニルオキシアリール基、アルキルヘテロアリール基、アルキオキシヘテロアリール基、アルケニルヘテロアリール基、アルケニルオキシヘテロアリール基、還元アルキルヘテロアリール基、還元アルコキシヘテロアリール基、またはハロゲン、アルキル、アルコキシアリールアルキル、アリールアルコキシ、シアノ、ニトロ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−ＮＲ３Ｒ４、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４もしくは脂質（天然もしくは合成）から独立して選択される一以上の基によって置換された上記基のいずれかの置換された誘導体であり；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリールまたはＲ１で定義された基であり；および
Ｒ３およびＲ４は、独立してＨ、アルキル、アリールまたはＲ１で定義された基であるシンチレータ分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のシンチレータ分子であって、前記Ｘは、独立して一以上のベンゾトリアゾール、クマリン、芳香族炭化水素、オキサゾール、１，３，４オキサゾールまたはこれらの誘導体であるシンチレータ分子。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のシンチレータ分子であって、前記Ｘは、独立して一以上のｐ−テルフェニル、ｐ−クアテルフェニル、２，４−（ビフェニリル−６フェニルベンゾオキサオール、２，５−ビス−（５’−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾオキサゾリリ−［２’］チオフェン、２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール、２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール、２−フェニル−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール、１，４−ビス［５−フェニル−２−オキサゾリル］−ベンゼン、２，５−ジフェニルオキサゾール、１，４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン（１，４−ｂｉｓ（５−ｐｈｅｎｙ−２−ｏｘａｚｏｌｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ）、９，１０−ジフェニルアントラセン、１，６−ジフェニル−１，３，４−ヘキサトリエン、ｔｒａｎｓ−ｐ、ｐ’ジフェニルスチルベン、１，１４，４−テトラフェニル−１，３−ブタジエン、３−ヒドロキシフラボン、１，４−ビス（２−メチルスチリル）ベンゼン、またはその誘導体であるシンチレータ分子。
【請求項１２】
【化１】
2004506754.tif 000018
から選択されるシンチレータ分子またはその塩。
【請求項１３】
請求項８に記載のシンチレータ分子であって、前記リンカーは、アルコキシ、アミノアルキル、アリールオキシ、アリールアミノ、アルキルアミノ、カルボニル、アミジル、エステル、アミニルシリル、イミジル、尿素アルキルチオまたはアリールチオであるシンチレータ分子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシンチレータ分子を製造するための方法であって、一以上のＸ部分は、一以上のＲ１部分に結合されている方法。
【請求項１５】
請求項８に記載のシンチレータ分子であって、一以上のＸ部分は、リンカー分子を介して一以上のＲ１部分に結合されている方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシンチレータ分子を製造するための方法であって、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む方法：
（ｉ）塩基の存在下において、ハロアルキル基で２，５−ジフェニルオキサゾールの４−アルコール誘導体をアルキル化すること、または
（ｉｉ）塩基の存在下において、アルコールで２，５−ジフェニルオキサゾールの４−ハロゲン誘導体をアルキル化すること、または
（ｉｉｉ）式（Ｉ）の化合物を、たとえば
保護基の除去、
保護基の付加、
酸化（たとえば、アルコールをアルデヒドもしくはケトンに、またはアルデヒドを酸性基にする）、
酸またはアルコールのエステル化、
酸またはアミンのアミド化、
還元（たとえば、アルケンをアルカンに、またはアルデヒドをアルコールにする）
特定の化合物の塩の生成、もしくは
その他の官能基の相互転換（たとえば、アルコールの臭素化）、
により、式（Ｉ）の異なる化合物に変換すること。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を取り込んだリポソーム。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を取り込んだミセル。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子をリポソームに取り込むための方法であって、
−有機溶媒中でシンチレータ分子と脂質をインキュベートすること、
−有機溶媒を除去すること、
−水溶液中にシンチレータ分子と脂質を再懸濁すること、
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載に記載の方法であって、前記脂質シンチレータ懸濁液は、８０℃〜３０℃の間の温度に温められる方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載に記載の方法であって、前記脂質シンチレータ懸濁液は、６０℃以上の温度に温められる方法。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法であって、前記脂質およびシンチレータ分子は、１：１〜１０：１の間の比でインキュベートされる方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法であって、前記脂質およびシンチレータ分子は、２：１〜８：１の間の比でインキュベートされる方法。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、前記脂質およびシンチレータ分子は、約４：１の比でインキュベートされる方法。
【請求項２５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシンチレータ分子を取り込んだ細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を細胞に挿入する方法であって、前記細胞を請求項１７に記載のリポソームまたは請求項１８に記載のミセルとインキュベートすることを含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞は、２０℃〜４０℃で温められる方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記細胞は、３７℃で温められる方法
【請求項２９】
脂質分子および請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を含むキット。
【請求項３０】
アッセイ系であって、興味の対象のタンパク質または受容体および請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を含むアッセイ系。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子を含む組成物。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の一以上のシンチレータ分子および放射線源を含むキット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキットであって、前記放射線源は放射線標識されたリガンドであるキット。
【請求項３４】
アッセイにおける請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシンチレータ分子の使用。
【請求項３５】
請求項３４に記載の使用であって、前記アッセイは、取り込みアッセイ、輸送アッセイ、受容体結合アッセイまたはシグナル伝達アッセイである使用。
【請求項３６】
請求項１７または１８に記載のリポソームまたはミセルであって、興味の対象のタンパク質もしくは受容体をさらに含むリポソームまたはミセル。
【請求項３７】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示したシンチレータ分子。
【請求項３８】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示した方法。
【請求項３９】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示したリポソーム。
【請求項４０】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示したミセル。
【請求項４１】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示した方法。
【請求項４２】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示したキット。
【請求項４３】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示した細胞。
【請求項４４】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示したアッセイ系。
【請求項４５】
前記実施例または図において、実質的に上記で議論したか、または示した組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
化合物
本発明は、新規シンチレータ化合物、これらの新規シンチレータ化合物の製造およびアッセイ系におけるこれらの使用を提供する。また、本発明は、新規シンチレータ化合物を含有するリポソームまたはミセル、新規シンチレータ化合物を含有するリポソームまたはミセルを製造するための方法、および細胞の細胞膜にシンチレータ化合物を挿入するためのデリバリー媒体としてのリポソームまたはミセルの使用を提供する。加えて、本発明は、新規シンチレータ化合物を含有する細胞およびアッセイ系における該細胞の使用を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
新薬および新規治療法の開発は、生物学的標的の同定に依存している。一旦同定されると、標的の受容体、酵素またはタンパク質は、新規リガンドを同定するために使用することができ、最終的に新薬の開発へと導かれる。化学的または生物学的な系における分子の相互作用をモニターするための１つの方法は、シンチレータの使用を含む。
【０００３】
シンチレータは、リン光体であるか、またはリン光体を含む分子である。リン光体は、多くの異なった種（たとえば光子、電子または化学反応）による励起に続いて発光可能な化学構造である。β粒子、ボート錐電子または光子などの電離性粒子とリン光体との相互作用は、リン光体の励起を生じる。短い遅れ（通常１０−１０〜１０−４秒の範囲）の後、リン光体は、通常目に見える形態またはその他の検出可能な形態で、電磁エネルギーの光子を放出して基底（非励起）状態に戻る。シンチレータの緩和によって放射される光は、適切なシンチレーションカウンタで定量的に検出および測定することができる。
【０００４】
本発明の目的において、シンチラント分子またはシンチレータの用語は、リン光体であるか、またはこれを含む分子を定義するために使用され、シンチレーションは、このようなシンチレーション分子によって生成される電磁放射線（通常光の形態で）を定義するために使用される。
【０００５】
上記のように、シンチレーションは、リン光体と電離性粒子間との相互作用の結果として生じる。電離性粒子は、放射性化合物などの電離性照射の供与源によって生み出される。シンチレータの励起およびその結果として生じるシンチレーションが起こるためには、電離性粒子が直接または溶媒分子を介して間接的にシンチレータと相互作用しなければならない。放射性化合物の例は、放射標識化合物として日常的に使用されるトリチウム種である。トリチウムは、非常に短い経路長で電離性照射を放射し、たとえば水中ではトリチウムの平均経路長は１．５マイクロメータである。粉末にされた分子とシンチレータ分子の間の距離が１．５マイクロメータ未満のときに、シンチレーションが生じるであろう。水中では、１．５マイクロメータより長い距離で、シンチレータ分子と放射識別された化合物の間で有意なシンチレーションが生じることはないであろう。
【０００６】
シンチレータによって放射される光量は、電離性粒子の供与源の近さに比例するので、シンチレーション計測は、２種の近さおよび潜在的な結合の程度を定量的に評価するために使用できる。
【０００７】
シンチラント分子についての先出願には、シンチレータを取り入んだ高分子樹脂またはビーズなどの固体支持体の使用に関するものであった。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は、蛍光分子含浸ビーズ（たとえばセファロースビーズ）を含む。該ビーズは、非特異的、非共有結合性の相互作用または共有結合のいずれかを介して生物学的受容体分子で被覆する。次いで、該ビーズを放射識別されたリガンドとインキュベートする。放射標識は、水中で単波長を有するものが選択される。受容体がリガンドに結合したときに、有意な放射活性部分が含浸蛍光分子の非常に近くに導かれ、活性化されて光を放射する。
【０００８】
この方法に関する１つの課題は、有機溶媒の使用では蛍光分子を溶解してビーズからこれらを除去してしまうので、該ビーズは水性系のみでしか使用することができないということである。この課題は、ＷＯ００／２０４７５で言及されており、ここでは、シンチレータ分子がポリメリゼーションにより固体支持体に直接組み込まれている。
【０００９】
さらなる課題は、シンチレーション接近アッセイに関連する。受容体、タンパク質または酵素などの標的分子を固体支持体に付着するためには、初めに標的を単離して、それからこれを精製することが必要である。一部の標的分子は、この単離手順の結果、活性を失ってしまうであろう。内部からまたは外部から強く膜に結合したタンパク質（酵素、受容体またはチャネル）などの疎水性特性を示すタンパク質は、精製が困難であり、疎水性膜から除去されると活性を失うことがよく知られている。加えて、このようなタンパク質は、ＳＰＡに必須の水性条件にさらされたときに変性してしまうであろう。マルチサブユニット複合体については、タンパク質の単離でサブユニットのうちの１以上が失われることにより、タンパク質が機能しなくなってしまうかもしれない。
【００１０】
加えて、タンパク質を固体支持体に取り付けるためには、タンパク質から固体支持体に対して結合を形成させる必要がある。この結合は、共有結合性、イオン性または水素結合性の結合であってもよい。加えて、該結合は、極性、非極性、疎水性または親水性の相互作用によって形成されてもよい。場合によっては、この結合の形成は、特定のリガンドの結合部位を歪ませ、または遮断するかもしれない。
【００１１】
シンチラント分子の別の適用には、シンチレーションプレート技術（Ｗ０９４／２６４１３において審議されるので）があり、ここでは、シンチラント分子とプラスチックの混合物で構成されたプレートが、製造されて被覆で封止されている。細胞は、該プレートにおいて放射性リガンドと培養およびインキュベートされる。
【００１２】
シンチレーション接近アッセイおよびシンチレーションプレート技術における主な不都合の１つは、一部の適用において電離性照射の供与源として１２５Ｉｏｄｉｎｅを使用する必要があることである。１２５Ｉｏｄｉｎｅは、主にガンマおよびＸ線エミッタであり、その使用は、厳重な安全対策を必要とする。
【００１３】
本発明は、リン光体ヘッドおよび親油性または両親媒性の尾部を含むシンチレータ分子、およびそれらを製造するための方法に関する。加えて、本発明は、一以上のシンチレータ分子を取り込んでリポソームの脂質二重層に挿入されたリポソーム、または一以上のシンチレータ分子を取り込んでミセルの単層に挿入されたミセルに関する。さらに、本発明は、リポソームまたはミセルにシンチレータ分子を挿入する方法に関する。加えて、本発明は、一以上のシンチレータ分子を取り込んで該細胞の細胞膜に挿入された細胞、およびこのようなシンチレータ分子を細胞に挿入する方法に関する。本発明は、さらにアッセイ系におけるシンチレータ分子の使用に関する。このような使用は、標的の精製または単離を必要とすることなく、これらの細胞の生育環境で標的分子を同定することであり、したがって、新薬および治療法の開発のために使用される。これらのアッセイでは、その不安定性または高い疎水性のために以前はアッセイすることができなかった標的に対し、リガンドを産生することが可能となるであろう。
【００１４】
本発明の第一の態様は、親油性または両親媒性の基である一以上のＲ１部分に共有結合で結合された、リン光体である一以上のＸ部分からなるシンチレータ分子であって、前記シンチレータ分子は、細胞、細胞膜、生体膜、人工膜またはデリバリー媒体に組み込まれることが可能であり、且つ組み込まれたときにリン光体として作用することができるシンチレータ分子を提供する。
【００１５】
本発明において、前記「膜」の用語は、細胞膜、合成または人工の膜標品（リポソーム、ミセルその他同種のものを含む）を包含する。本発明の目的におけるデリバリー媒体は、膜に本発明のシンチレータ分子を挿入することが可能なあらゆる薬剤またはキャリア（たとえばリポソームまたはミセル）である。
【００１６】
ＸおよびＲ１部分の数は、必要とされるシンチレータ分子の大きさに依存し、シンチレータ分子は、ＸおよびＲ１基のオリゴマなどであってもよい。また、異なったＸおよびＲ１部分の混合物を使用してもよい。オリゴマは、同数のＸおよびＲ１基から構成されていてもよい。あるいは、異なった数のＸおよびＲ１部分が使用されてもよい。当業者であれば、シンチレータ分子が細胞膜に組み込まれ、且つシンチレータ分子の存在が細胞に許容されることが必要であるため、シンチレータ分子の大きさが制限されることを理解するであろう。
【００１７】
好ましい態様において、シンチレータ分子は、式（Ｉ）またはその塩を有する：
（Ｘ）ｍ−（Ｒ１）ｎ　　　　　（Ｉ）
ここで、ｍは１〜２０であり、ｎは１〜２０であり、好ましくはｍおよびｎはそれぞれに１〜１０であり、より好ましくは、ｍおよびｎは１〜４であり、最も好ましくはｍおよびｎは両方とも１である。
【００１８】
本発明の目的において、親油性部分は化学基であり、これは親油性（または疎水性）の性質を示す。
【００１９】
親油性は、分子または部分の親油性環境に対するアフィニティを示す。これは、二相系における分子の分配挙動（液体−液体（１−オクタノール／水における分配係数）または固体−液体（逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）系における保持のいずれか）により、通常は測定される。
【００２０】
本発明の目的において、両親媒性部分は、親油性および撥油性の性質を示す化学構造である。したがって、該構造は、通常、水性溶媒または有機溶媒中で別々の方法での挙動を示すことができる異なった領域を含む。
【００２１】
Ｒ１基は、基Ｘが付着するための一以上の部位を包んでもよいことはいうまでもない。
【００２２】
好ましくは、Ｒ１は、枝なしまたは分岐したアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケニオキシ基、アルキニル基、アルキニルオキシ基、アリール基、ヘテロアリール基、アミド基、アミン基、アルキルアリール基、アルキオキシアリール基、還元アリールアルキル基、還元アルコキシアリール基、アルケニルアリール基、アルケニルオキシアリール基、アルキルヘテロアリール基、アルキオキシヘテロアリール基、アルケニルヘテロアリール基、アルケニルオキシヘテロアリール基、還元アルキルヘテロアリール基、還元アルコキシヘテロアリール基、またはハロゲン、アルキル、アルコキシアリールアルキル、アリールアルコキシ、シアノ、ニトロ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２、−ＣＯ２Ｒ２、−ＮＲ３Ｒ４、−ＯＲ２、−ＳＲ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４もしくは脂質（天然もしくは合成）から独立して選択される一以上の基によって置換された上記基のいずれかの置換された誘導体であり；
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリールまたはＲ１で定義された基であり；および
Ｒ３およびＲ４は、独立してＨ、アルキル、アリールまたはＲ１で定義された基である。
【００２３】
好ましい態様において、Ｒ１は、枝なしまたは分岐のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルケニルオキシ基または上記基のいずれかの置換された誘導体であって、−ＣＯ２Ｒ２、−ＯＲ２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２であり、
Ｒ２は、Ｈ、アルキルまたはアリールである。
【００２４】
Ｒ１基には、シンチレータ分子が組み込まれること、または細胞膜と結合することが可能なように、親油性を与えるべきである。シンチレータ分子が１つのＸ基および１つのＲ１で構成されるときに、Ｒ１がメチルまたはエチルである場合、これらの基はシンチレータ分子に充分な親油性を授けそうにないことは言うまでもない。しかし、シンチレータ基が１つのＸ基および多数のＲ１基（すなわち複数のＲ１基）を含む場合に、Ｒ１がメチルまたはエチルであるときは、多数のメチル基またはエチル基の存在により、シンチレータ分子が組み込まれること、または細胞膜と結合することが十分可能であろう。
【００２５】
好ましくは、アルキルは、１〜３０炭素原子、より好ましくは、６〜３０炭素原子、最も好ましくは８〜２０炭素原子である。アルコキシは、１〜３０の炭素原子、好ましくは１〜２０炭素原子、最も好ましくは、１〜１０炭素原子の炭化水素鎖であり、任意に一以上の酸素原子で中断される。好ましい態様において、アルコキシ部分内の酸素原子は、リン光体基Ｘから少なくとも一つの炭素原子（好ましくは、飽和されている）によって分離される。アルケニルは、一以上の二重結合を含む炭化水素鎖であり、該アルケニル基は、２〜３０炭素原子、好ましくは８〜３０炭素原子である。アルキニルは、一以上の三重結合を含む炭化水素鎖であり、該アルキニル基は、２〜３０炭素原子、好ましくは８〜３０炭素原子である。アリールは、芳香環（たとえばフェニルまたは６員の芳香環）または縮合環（たとえば、ナフチル、アンスラシル（ａｎｔｈｒａｃｙｌ））である。ヘテロアリールは、Ｏ、ＳまたはＮから選択される一以上の異種原子を含む５または６員の芳香環であるか、または２以上の縮合環を含む縮合環系であって、１以上の縮合環が異種原子を含む環である。このような基の例は、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、チオフェニル、オキサゾリル、ピラゾリル、キノリニル、キナゾリニルおよびインドリルを含む。
【００２６】
本発明の目的において、脂質は有機分子であり、これは、細胞および組織から非極性有機溶媒で抽出することにより、または合成の相当物から、またはこのような分子の誘導体から単離することができる。
【００２７】
本発明の目的における基Ｘは、光子、電子または化学反応、好ましくは電離性照射の供与源などの多くの異なった種によって励起された後に発光可能なあらゆる化学基を含む。
【００２８】
本発明の目的における基Ｘの例は、ベンゾトリアゾールおよびその誘導体、クマリンおよびその誘導体、ｐ−テルフェニル、ｐ−クアテルフェニルなどの芳香族炭化水素およびその誘導体、オキサゾールおよび１，３，４オキサゾール（２，４−（ビフェニリル−６−フェニルベンゾオキサオール、２，５−ビス−（５’−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾオキサゾリリ−［２’］チオフェン、２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール、２−（１−ナフチル）−５−フェニル−オキサゾール、２−フェニル−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール、１，４−ビス［５−フェニル−２−オキサゾリル］−ベンゼン、２，５−ジフェニルオキサゾールなど）の誘導体を含む。基Ｘのさらなる例は、１，４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン（１，４−ｂｉｓ（５−ｐｈｅｎｙ−２−ｏｘａｚｏｌｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ）、９，１０−ジフェニルアントラセン、１，６−ジフェニル−１，３，４−ヘキサトリエン、トランス−ｐ，ｐ’ジフェニルスチルベン、１，１４，４−テトラフェニル−１，３ブタジエン、３−ヒドロキシフラボンおよび１，４−ビス（２−メチルスチリル）ベンゼンを含む。
【００２９】
ヘッド基には、親油性Ｒ１基を付着するための一以上の部位を含んでもよいことが理解されるであろう。
【００３０】
本発明の第一の態様のさらなる好ましい態様において、シンチレータ分子は、１つのヘッド基（すなわちｍ＝１）を含む。該ヘッド基は、親油性Ｒ１基を付着するための２以上の部位を含んでもよい。したがって、式
Ｘ−（Ｒ１）ｎ　　　（ＩＩ（ａ））
（ここで、ｎは２以上の整数である）
の化合物である。
【００３１】
さらにもう一つの好ましい態様において、シンチレータ分子は、１つの親油性Ｒ１基（すなわちｎ＝１）を含む。親油性Ｒ１基は、ヘッド基Ｘを付着するための２以上の部位を含み、その結果、式
（Ｘ）ｍ−Ｒ１　　　　　　　　　（ＩＩ（ｂ））
（ここで、ｍは２以上の整数である）
の化合物を生じる。
【００３２】
本発明のもっとも好ましい態様において、式
Ｘ−Ｒ１　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
（ここで、１つのＸ基は、１つの親油基Ｒ１に付着される（すなわちｍおよびｎ＝１））
のシンチレータ分子を提供する。
【００３３】
本発明の第一の側面におけるシンチレータ分子は、リンカー部分を介して一以上のＲ１基に付着した一以上のＸ基を含み、式（Ｖ）；
（Ｘ）ｍ−（リンカー）−（Ｒ１）ｎ　　　　　（Ｖ）
のシンチレータ分子を生成してもよい。
【００３４】
本発明の目的において、リンカー部分は、アルコキシ、アミノアルキル、アリールオキシ、アリールアミノ、アルキル酸（ａｌｋｙｌａｃｉｄ）、カルボニルアミジル、エステル、アミン、シリル、イミジル、尿素、アルキルチオ、アリールチオであることができる。
【００３５】
リンカーは、一以上のＸ基および一以上のＲ１基を付着するための多重部位を提供してもよい。このようなリンカーの例は、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリセロールなどのアミノ酸、ポリチオール、ポリ酸またはポリアミンなど多価アルコールを含む。
【００３６】
適切には、シンチレータ分子は、リンカーを介して２以上のＲ１基に結合した１つのＸ基からなる。あるいは、シンチレータ分子は、リンカーを介して２以上のヘッド基に結合した１つの親油性Ｒ１基からなる。好ましくは、該分子は、１つのＲ１基および適切なリンカー基によって結合された１つのＸ基からなる。
【００３７】
本発明の好ましい態様において、リン光体ヘッドは、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）または２，５−ジフェニルオキサゾールの誘導体である。より好ましくは、２，５−ジフェニルオキサゾールは、リンカー基によりまたは直接、４−炭素に親油性尾部で誘導体化される。
【００３８】
式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物の塩の例は、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸、塩酸および硫酸などの鉱酸、並びにその他同種のものから誘導されるもの（それぞれメタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸、塩酸塩および硫酸塩、並びにその他同種のものを与える）、または有機塩基および無機塩基などの塩基由来のものを含む。
【００３９】
本発明の化合物の塩を形成するための適切な無機塩の例は、アンモニア、リチウム、ナトリウム、カルシウム、カリウム、アルミニウム、鉄、マグネシウム、亜鉛その他同種のものの水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩を含む。また、塩は、適切な有機塩基を形成することができる。本発明の化合物との塩基添加塩の形成に適したこのような塩基は、非毒性で塩の形成に十分強力な有機塩基を含む。このような有機塩基は、すでに当業者に周知であり、アルギニンおよびリジンなどのアミノ酸、モノ−、ジ−またはトリエタノールアミンなどのモノ−、ジ−またはトリヒドロキシアルキルアミンと、コリンと、メチルアミン、ジメチルアミンおよびトリメチルアミンなどのモノ−、ジ−またはトリアルキルアミンと、グアニジン；Ｎ−メチルグルコサミン；Ｎ−メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ−ベンジルフェネチルアミン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；その他同種のものを含む。
【００４０】
塩は、当業者に周知の方法を使用して、従来の方法で調製してもよい。前記塩基性化合物の酸添加塩は、本発明の第一または第二の側面に従った遊離塩基化合物を、必要とされる酸を含む適切な溶媒中に溶解することによって調製してもよい。式（Ｉ）の化合物が酸性官能基を含むときは、前記化合物の塩基性塩は、前記化合物を適切な塩基と反応させることによってよって調製してもよい。酸性塩または塩基性塩は、直接分離してもよく、またはたとえば、蒸発により溶液を濃縮することによって得ることもできる。
【００４１】
本発明の好ましい化合物の例は、
【００４２】
【化２】
2004506754.tif 000002
を含む。
【００４３】
本発明の第二の側面において、本発明の第一の側面に従った化合物または誘導体の製造方法を提供する。
【００４４】
一般に、本発明の化合物は、１以上の基Ｘを一以上の基Ｒ１にカップリングすることによって提供される。このようなカップリング反応は、当業者に既知の従来のカップリング技術を使用して行うことができる。使用される特異的カップリング反応は、ＸおよびＲ１基に存在する官能基に依存し、かつ形成される結合に依存するであろう。
【００４５】
より好ましくは、本発明の第一の側面の好ましい化合物は、以下の方法によって製造される；
塩基の存在下において、ハロアルキル基により２，５−ジフェニルオキサゾールの４−アルコール誘導体をアルキル化すること。ハロアルキル基は、さらなる官能基を含んでもよく、これがアルキル化工程の前に保護を必要としてもよいことは理解されるはずである。保護が必要とされる場合、これはいずれの従来の保護試薬によっても行うことができる。アルキル化工程後、従来の脱保護技術を使用して保護基を除去することができ、または一以上の保護基をシンチレータ化合物に残したままにすることもできる。
【００４６】
または、
塩基の存在下において、アルコールにより２，５−ジフェニルオキサゾールの４−ハロゲン誘導体をアルキル化すること。再び、アルコールは、さらなる官能基を含んでもよく、これがアルキル化工程の前に保護を必要としてもよい。このような保護は、従来の保護試薬を使用して行うことができる。保護基の除去は、従来の脱保護技術を使用して行うことができるが、一以上の保護基をシンチレータ化合物に残したままにすることもできる。
【００４７】
または、
本発明の１つのシンチレータ分子を、本発明の異なったシンチレータ分子へ変換すること。これを成し遂げることができる方法の例は、以下のものを含む；
保護基の除去、
保護基の付加、
酸化（たとえば、アルコールをアルデヒドもしくはケトンに、またはアルデヒドを酸性基にする）、
酸またはアルコールのエステル化、
酸またはアミンのアミド化、
還元（たとえば、アルケンをアルカンに、またはアルデヒドをアルコールにする）
特定の化合物の塩の生成、または
その他の官能基の相互転換（たとえば、アルコールの臭素化）。
【００４８】
４−位における２，５−ジフェニルオキサゾール基の官能性付与は、当業者に既知の技術を使用して行うことができる。好ましくは、２，５−ジフェニルオキサゾールは、最初にエチル２，５−ジフェニル−４−オキサゾールカルボキシレートに変換され（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｅｎｔ Ａｂｓ． （１９６３）， ５８， ３４０７ｆ））、次いで水素化ホウ素ナトリウムのエタノール溶液を使用して還元する（Ｃｌａｐｈａｍ ｅｔ ａｌ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， （１９９７）， ５２，９０６１）。アルコールのハロゲン化物との相互転換は、当業者に既知の試薬を使用して行うことができる。
【００４９】
本発明の第一の側面の全ての好ましい特徴は、本発明の第二の側面に適用する。
【００５０】
第三本発明の側面は、本発明のシンチレータ分子を取り込んだリポソームを提供する。
【００５１】
本発明の目的において、リポソームは、脂質分子の二重層から構成される球状構造である。シンチレータ分子は、その脂質尾部を介して脂質二重層に挿入されることが提案されている。リポソームを形成する脂質分子は、天然に存在するかまたは合成脂質のいずれででもあることもできる。より好ましくは、これらの脂質分子は、脂質尾部を有する正に荷電したヘッド基から構成される。好ましくは、リポソームは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルオキシプロピル−トリメチルアミン塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）の一以上から選択される脂質を含む。
【００５２】
リポソーム形成のため、および本発明のシンチレータ分子を細胞膜にデリバリーするために適しているであろう多種多様なその他の脂質が存在し、これらは、単鎖炭化水素、二重鎖炭化水素または疎水性アンカーとしてコレステロールを有するカチオン性脂質を含む。本目的の包括的レビューは、Ｃｈｅｓｎｏｙ Ｓ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｌｌｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２９．２７−４７； ２０００．に見つけることができる。
【００５３】
本発明の好ましい特徴において、リポソーム−シンチレータ抱合体は、細胞の細胞膜にシンチレータ分子の挿入を可能にするデリバリー系として提供される。
【００５４】
あるいは、本発明の第三の側面は、本発明のシンチレータ分子を取り込んだミセルを提供する。
【００５５】
本発明の第一および第２の側面の全ての好ましい特徴も、第三の側面に適用する。
【００５６】
本発明の第四の態様は、リポソーム中にシンチレータ分子を挿入するための方法を提供する。この方法の１例において、脂質とシンチレータ分子を一緒に有機溶媒中でインキュベートして、次いで除去し、生じた混合液を水に再懸濁してリポソームを形成する。次いで、再懸濁したリポソーム−シンチレータ分子複合体を凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末として提供することもできる。あるいは、リポソーム−シンチレータ分子複合体は、水溶性溶媒（たとえば水または水性バッファまたは界面活性剤の溶液）の懸濁液として提供される。
【００５７】
別の方法では、リポソームを形成するためにリポソーム懸濁液を温めることが必要である。好ましくは、リポソーム懸濁液は、８０℃〜３０℃の間、より好ましくは、７０℃〜５０℃の間、最も好ましくは６０℃以上の温度に温められる。
【００５８】
脂質およびシンチレータ分子は、シンチレータ分子対脂質が１：１から１０：１の間で、より好ましくは、シンチレータ分子対脂質が２：１から８：１、もっとも好ましくはシンチレータ分子対脂質が４：１の比でインキュベートされる。
【００５９】
別の方法において、シンチレータ分子は、予め形成されたリポソームとインキュベートされる。リポソームの形成は、当業者に周知であることはいうまでもないだろう。したがって、当業者であれば、シンチレータ分子を取り込んだ異なった大きさ、組成物その他のリポソームを製造することできるであろう。
【００６０】
リポソームの代わりとして、シンチレータ分子を細胞膜にデリバリーするためにミセルを使用することが研究されている。ミセルは、界面活性剤などの親油性分子の会合物であり、広くドラッグデリバリーにおいて使用されている。本発明の一つの態様において、ミセルは、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）に０．１％、０．５％または１．０％、好ましくは０．１％で溶解した界面活性剤の臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）を使用して形成した。さらなる態様において、０．１〜２５ｍｇのシンチレータ分子、好ましくは０．５ｍｇから１５ｍｇのシンチレータ分子、より好ましくは１０ｍｇ以上のシンチレータ分子を１０ｍｌの１％ＤＴＡＢ溶液に分散した。
【００６１】
したがって、本発明の第四の側面はまた、ミセルにシンチレータ分子を挿入するための方法を提供する。
【００６２】
本発明の第一、第二および第三の側面の全ての好ましい特徴も、第四の側面に適用する。
【００６３】
本発明の第五の側面は、シンチレータ分子を取り込んだ細胞であって、正常細胞機能に影響を与えることなく、シンチレータ分子が細胞の細胞膜に挿入された細胞を提供する。好ましくは、該細胞は、膜に挿入されたシンチレータ分子と興味の対象の膜結合タンパク質または受容体とを含む。
【００６４】
細胞は、一以上の原核細胞（たとえば細菌）または真核（たとえば真菌、哺乳類、爬虫類、昆虫、魚類）細胞であることもできる。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００６５】
本発明の第五の側面の細胞は、興味の対象のタンパク質を発現しているどのような細胞株から得てもよい。タンパク質は、未変性または細胞に導入されていてもよく、恒常性（すなわちいつでも発現する）または誘導性（特定の刺激に応答して産生される）であってもよい。タンパク質は、膜結合性（複合的または外因性）であってもよく、またはサイトゾルに位置していてもよい。あるいは、サイトゾルタンパク質は、細胞表面の内部または外部において発現されるように設計されてもよい。細胞は、細胞により発現されるタンパク質レベルがその正常レベル以上に増加するように修飾されていてもよい。
【００６６】
細胞は、生殖系列細胞または幹細胞であることもできる。加えて、細胞は、混合細胞集団（すなわち複数のタイプまたは複数の供与源に由来）として提供することもできる。
【００６７】
シンチレータ分子が添加された細胞は、放射性識別された分子を用いてモニターされる生物学的活性または薬剤活性といった様々な細胞ベースのアッセイに使用することができる。これらのシンチレータ分子を取り込んだアッセイ系は、実時間で細胞プロセスを研究するために使用することができる。これらのシンチレータ分子を使用することができるアッセイ系は、（ｉ）取込みアッセイ（ｉｉ）輸送アッセイする（ｉｉｉ）結合アッセイおよび（ｉｖ）シグナル伝達研究を含む。
【００６８】
（ｉ）取込みアッセイは、タンパク質合成（１４Ｃ／３Ｈ／３５Ｓ−Ｍ取込み）、細胞増殖およびＤＮＡ修復／損傷（１４Ｃ／３Ｈ−チミジン組み込み／取込み）および脂質代謝（１４Ｃ／３Ｈラベルした前駆体の取込み）などの細胞内の生化学的プロセスをモニターするために使用される。
【００６９】
（ｉｉ）多種多様な放射性標識された（３Ｈ／１４Ｃ／３５Ｓ／４５Ｃａ／１２５Ｉ）基質の細胞内（流入）または細胞外（流出）への輸送を測定する膜輸送アッセイでは、チャネルおよびキャリアの活性をモニターするために使用することができる。膜輸送タンパク質の速度論的研究に加えて、インヒビター／アクティベータ研究は、潜在的な治療薬であるかもしれない輸送インヒビターの同定に至ることもできる。
【００７０】
（ｉｉｉ）受容体結合実験を含む結合実験では、放射性標識リガンド（３Ｈ／１４Ｃ／３５Ｓ／４５Ｃａ／１２５Ｉ）の結合を必要とし、これにより受容体数およびアフィニティを確かめることができる。また、競合実験では、標的受容体がインヒビター／アクティベータである可能性を評価するために使用することができる。広範なリガンドが市販で入手可能であり、プリン作動性、アドレナリン作用性およびニコチン性受容体、その他の多くの物を含む全てのタイプの受容体をカバーしている。
【００７１】
（ｉｖ）また、シグナル伝達活性は、放射性標識二次メッセンジャおよび基質と共に研究することができる。ＧＴＰ結合蛋白質活性は、３５Ｓ−ＧＴＰガンマ−Ｓを使用してモニターすることができる。タンパク質リン酸化をモニターするために、［３３Ｐ］−ＡＴＰ結合を使用することもできる。カルシウムは、シグナル伝達において主要な役割を演じており、４５Ｃａを使用してカルシウム取り込みを測定することができる。また、放射性標識されたＩＰ３、ＩＰ４およびサイクリックＡＭＰは、市販されており、シグナル伝達を研究するために使用することができる。
【００７２】
一般に、ラジオアイソトープの活性を測定するには、細胞の細胞膜を破壊または単離することを必要とし；また、実時間計測を行うことは不可能である。細胞膜に組み込んだ本発明の第一の側面のシンチレータ分子を使用して、これらの課題を解決することができる。
【００７３】
本発明の第五の側面の別の態様では、第一の側面の一以上のシンチレータ分子を取り込んだリポソームまたはミセルと、一以上の興味の対象のタンパク質または受容体とを提供する。本発明の目的において、タンパク質または受容体は、精製されているか、部分的に精製されているか、または組換え体である。上記のように、タンパク質は、サイトゾル性（たとえばプロテインキナーゼ）または膜結合性（たとえば７回膜貫通受容器またはイオンチャネル）であってもよい。このようなリポソームまたはミセルは、結合アッセイ系において上記のように使用することもできる。
【００７４】
本発明の第一、第二、第三および第四の側面の全ての好ましい特徴は、第五の側面に適用する。
【００７５】
本発明の第六の側面は、第一の側面のシンチレータ分子を細胞に挿入する方法を提供する。１つの方法において、シンチレータ分子は、最初にリポソームまたはミセルに挿入される。シンチレータ分子−ミセルまたはシンチレータ分子−リポソームを、細胞と好ましくは２０−４０℃で、好ましくは３７℃で、３０〜１２０分間インキュベートする。別の方式において、シンチレータ分子は、直接細胞とインキュベートされる。
【００７６】
また、本発明の第一、第二、第三、第四および第五の側面の全ての好ましい側面を第六の側面に適用する。
【００７７】
本発明の第七の側面は、リポソームまたはミセルおよび本発明のシンチレータ分子を含むキットを提供する。別の態様において、該キットは、リポソームまたはミセルを形成するための一以上の試薬、たとえば界面活性剤分子または脂質と、本発明のシンチレータ分子とを含む。
【００７８】
本発明の第一、第二、第三、第四、第五および第六の側面の全ての好ましい特徴は、第七の側面に適用する。
【００７９】
本発明の第八の側面は、細胞と、本発明の一以上のシンチレータ分子と、興味の対象のタンパク質または受容体とを含むアッセイ系を提供する。
【００８０】
本発明の一つの態様において、シンチレータ分子は、特定の受容体を含む細胞の細胞膜に挿入される。放射性標識された薬物分子が受容体に結合し、シンチレータ分子がアンカーされた膜と相互作用した結果としてシンチレーションを引き起こす。次いで、本技術は、競合分子が放射性標識リガンドを置き換える能力を通じて、受容体に結合する新薬（競合分子）を同定するために使用することができる。新薬の同定は、放射性標識リガンドが置き換えられて、シンチレーションが観察されないときに同定されるであろう。
【００８１】
別の態様において、シンチレータ分子は、アンチセンス分子と連動して、特定の分子が所与の細胞タンパク質に結合することができるかどうかを確認するために使用される。アンチセンス分子は、所与のタンパク質の発現を遮断する。したがって、放射性標識された分子で処理した後にシンチレーションが起こらないときは、その薬剤の真の標的が同定されている。
【００８２】
本発明の第八の側面の一つの態様は、特定の種が細胞に取り込まれているかどうかを決定するための、シンチレータ分子の使用である。放射性標識されたメチオニンの細胞取込みを測定してタンパク質合成をモニターすること、および放射性標識されたチミジンの取込みおよび組み込みにより細胞増殖をモニターすることが、これらの適用に含まれる。加えて、放射性標識された基質の流入および流出は、チャネルなどの膜輸送系の活性および潜在的な治療薬によるこれらの経路の阻害を評価するために使用することができる。
【００８３】
さらなる取込み実験では、電離性照射の供与源が１４ｃａｒｂｏｎ、４５ｃａｌｃｉｕｍ、３５ｓｕｌｐｈｕｒおよび３３ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓでラベルされた化合物であるときに、シンチレータ分子が効率よく使用可能であることを示していた。したがって、このシンチレーションアッセイは、１２５Ｉｏｄｉｎｅ以外のラジオアイソトープを使用できるので、以前に議論されたシンチレーション接近アッセイより有利である。
【００８４】
本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の側面の全ての好ましい特徴は、第八の側面に適用する。
【００８５】
本発明の第九の側面は、本発明の一以上のシンチレータ分子を含む組成物を提供する。該組成物は、安定剤、界面活性剤および／または色素を含むさらなる成分と併用して、本発明の第一の側面の一以上のシンチレータ分子を含んでいてもよい。該組成物は、液体として溶液で、固体として粉末、凍結乾燥された粉末、一以上の顆粒またはペレットで提供されてもよい。
【００８６】
本発明の第九の側面のさらなる特徴において、組成物は、相補的または相乗的な性質を有する２以上のシンチレータ分子を含んでいてもよい。たとえば、シンチレータ分子のそれぞれは、種々のラジオアイソトープとシンチレートして、より高い感受性を達成することもできる。
【００８７】
本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八の側面の全ての好ましい側面も、第九の側面に適用する。
【００８８】
本発明の第十の側面は、特定の細胞株に挿入するためのシンチレータ分子と、放射性標識リガンドを含むキットを提供する。別の態様において、シンチレータ分子は、リポソームまたはミセルのデリバリー媒体に挿入されて提供される。
【００８９】
本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八および第九の側面の全ての好ましい側面も、第十の側面に適用する。
【００９０】
本発明の第十一の側面は、アッセイ系における、本発明の第一の側面のシンチレータ分子の使用を提供する。好ましくは、アッセイ系は、一以上の原核細胞または真核細胞の使用を含む。より好ましくは、細胞は、哺乳類細胞である。
【００９１】
本発明の好ましい態様において、シンチレータ分子は、細胞の細胞膜に挿入される。シンチレータ分子の挿入は、直接またはリポソームもしくはミセルなどのデリバリー媒体を介してのいずれかによって生じる。
【００９２】
好ましくは、シンチレータ分子は、該部分が１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、３３Ｐ、４５Ｃａ、１２５Ｉで放射性標識された放射性標識部分と組み合わせて使用される。
【００９３】
本発明の第十一の側面において記載したアッセイ系は、細胞内の細胞標的を同定するために使用することができる。
【００９４】
本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九および第十の側面の全ての好ましい側面も、第十一の側面に適用する。
【００９５】
本発明は、ここで以下の限定されない実施例を参照することで具体的に説明される。これらの実施例は、以下に要約した図面によってさらに具体的に説明される。
【００９６】
【実施例】
実施例１：市販のシンチラントとシンチレータ分子の比較。
【００９７】
合成したシンチレータ分子のシンチラント活性を、Ｃｌａｐｈａｍ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａ１ｚｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３８，５２の記載に基づいた方法を使用して、市販のシンチラントＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ２０ （Ｐａｃｋａｒｄ）と比較した。ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄｓの階段希釈をトルエンで調製して、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭおよび０．０１ｍＭの終濃度濃度にした。また、１００μｌトルエンにつき０．１μＣｉを含む１４Ｃ−ヘキサデカンを調製し、９６穴プレート型式で１００μｌの放射標識を１００μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０に添加し、混合して計測した。比較するために、放射標識１００μｌを１００μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ２０に添加した。結果は、図２において具体的に説明する。
【００９８】
１０ｍＭのそれぞれのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄについて、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ２０と比較したシンチレーションのパーセンテージ効率を評価して表にした（表１）。
【００９９】
【表１】
2004506754.tif 000003
発明者により、さらなる実験が行われ、市販のシンチラントの３−ヒドロキシフラボン、ＰＯＰＯＰ（１，４−ビス［５−フェニル−２−オキサゾール］−ベンゼン）またはブチル−ＰＢＤ（２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール）は、リポソームに取り込まれることができないことが見出された。
【０１００】
実施例２：リポソームへのシンチレータ分子の取込み。
【０１０１】
脂質（ａ）ホスファチジルコリン、ｂ）ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンおよびｃ）ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン／ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）をクロロホルム／メタノール中にｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄとともに論文の条件下（１：１；脂質：ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ）で溶解し、次いで、Ｎ２流の下で蒸発させて乾燥する。脂質を確実に完全脱水さるために、少なくとも２時間減圧して最終的に乾燥する。次いで、Ｈ２０に再懸濁することによってリポソームを形成させて、最終的に１０ｍｇ／ｍｌの脂質含量を得た。一部の場合、リポソーム懸濁液を６０℃に加温する必要があった。リポソームを顕微鏡で調べて、安定なリポソーム構造であることをチェックし、リポソーム標品の一定量に１４Ｃ−タウリンを添加して、シンチレーションをチェックした（図３）。
【０１０２】
シンチレータ分子ＳＴ３乃至ＳＴ７およびＳＴ１０は、有意なシンチラント活性を示した。顕微鏡下におけるリポソーム標品の検査では、リポソーム膜にｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄが取込まれていることの定性的測定が得られる。この結果は、ＳＴ４、ＳＴ５およびＳＴ１０は、より安定なリポソームを形成し、ＳＴ３、ＳＴ６およびＳＴ７標品は、ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄの結晶沈殿を有することを示す。したがって、細胞にｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄｓが取込まれることのさらなる実験およびその後の細胞ベースアッセイにおける使用は、ＳＴ４、ＳＴ５およびＳＴ１０で行った。
【０１０３】
ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ含量が増加したリポソームの製剤は、１ｍｌのリポソーム懸濁液あたり、ＤＯＴＡＰ２ｍｇ／ｍｌに対して８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄが最適のリポソーム標品であることを示しており（図４）、これが、次の実験に使用したリポソーム組成物である。１４Ｃ−タウリン活性を０．１μＣｉ〜１．０μＣｉまで増加したときの線形応答を観察した（図５）。
【０１０４】
実施例３：細胞膜へのへのシンチレータ分子の取込み。
【０１０５】
細胞膜にｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ化合物を組み込むために２つのアプローチを使用した。（Ａ） ＤＯＴＡＰ（上記の通りの）を含むカチオン性リポソームおよび（Ｂ）ミセル。ミセルは、界面活性剤などの親油性分子の会合物であり、ドラッグデリバリーにおいて広く使用されている。本研究において、我々は、ＰＢＳで０．１％、０．５％または１．０％のいずれかに溶解した界面活性剤ＤＴＡＢ（臭化ドデシルトリメチルアンモニウム）を使用した。予備実験では、１０ｍｇまでのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄが１０ｍｌの１％ＤＴＡＢ溶液に分散できることを示した。
【０１０６】
ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ分子を含む放射性標識されたリポソームを製造し、広く利用可能な上皮細胞系株（ＨｅＬａ）による取込みを研究された。放射性標識されたリポソームは、８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ、２ｍｇのＤＯＴＡＰおよび０．５μＣｉの１４Ｃ−ＤＯＰＥから構成され、１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。次いで、リポソームをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に５０％希釈した後、ＨｅＬａ細胞とインキュベーションした。７５ｃｍ２フラスコにおいて、ＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞をコンフルエントまで培養し、該細胞をトリプシン処理して９６穴プレートにまき、３７℃のＯ２／ＣＯ２インキュベータで約４８時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄して細胞増殖培養液を除去し（血清が存在するとリポソーム取込みを乱す）、放射性標識されたリポソーム標品（１００μｌ／穴）と、３０分または１２０分間、３７℃においてインキュベートした。インキュベーション後、９６穴プレートをＰＢＳでよく洗浄して、結合していない全てのリポソームを除去し、プレートのβ−シンチレーションを計測した（図７）。
【０１０７】
シンチレーション計測は、ＨｅＬａ細胞がｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄを取り込んだこと、１４Ｃ−ＤＯＰＥも取り込まれて、接近によりシンチレーションを生じることを示した。
【０１０８】
実施例４：１４Ｃ−メチオニン取込みアッセイ。
【０１０９】
７５ｃｍ２フラスコにおいて、ＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞をコンフルエントまで培養し、次いで９６穴プレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。種々の時点で、ＤＭＥＭを１４Ｃ−メチオニンが添加されたＰＢＳを有するＤＭＥＭと置換し、リポソームを添加した。リポソームの組成物は、１ｍｌのＨ２０に再懸濁した８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ、２ｍｇのＤＯＴＡＰであり、最終的に１ｍｌのＰＢＳで希釈した。細胞は、リポソームの存在下で１２０、６０および３０分間インキュベートした。
【０１１０】
図８は、ＳＴ４、ＳＴ５およびＳＴ１０についての結果を示す。挿入図は、市販のシンチラント反応混液（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０）を使用して測定したＨｅＬａ細胞におけるメチオニンの取込みを示し、これは、ＳＴ４およびＳＴ５含有細胞における結果を反映している。図４および図７の結果から予測されるように、ＳＴ４含有細胞のシンチラント活性は、ＳＴ５またはＳＴ１０含有細胞より大きい。
【０１１１】
メチオニン取込みアッセイをラット神経細胞系（Ｃ６神経膠腫）で繰り返した。Ｃ６グリオーマ細胞をＨａｍｓＦ１２培地中で培養したが、これ以外は、実験プロトコールは同一であった。結果は、ＳＴ４のものを図９に示す。
【０１１２】
実施例５：３５Ｓ−メチオニンの取込み。
【０１１３】
ＨｅＬａへのメチオニンの取込みを３５Ｓ−メチオニンを使用して繰り返した。得られた結果は、１４Ｃ−メチオニンの取込みと一致しており、図１０に示される。
【０１１４】
実施例６：「実時間」１４Ｃ−メチオニン取込みアッセイ。
【０１１５】
また、１４Ｃ−メチオニン取込みを「実時間」で示した。７５ｃｍ２フラスコにおいて、ＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞をコンフルエントまで培養し、９６穴プレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、リポソームを含むｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄと培養した。リポソームの組成物は、１ｍｌのＨ２０に再懸濁した８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ、１ｍｇのＤＯＴＡＰ、１ｍｇのＤＯＰＥであり、最終的に１ｍｌのＰＢＳで希釈した。細胞をリポソームの存在下で３０℃において１２０分間インキュベートした。次いで、１４Ｃ−メチオニン含有ＤＭＥＭを添加して、期間にわたり取込みを測定した。図１１は、ＳＴ４についての結果を示し、最初は１４Ｃ−メチオニンの取込みがなかったが、約７２時間後、１４Ｃ−メチオニンの蓄積が生じ始めた。ＳＴ４／ＤＯＴＡＰまたはＳＴ４／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥでプレインキュベートした細胞間に有意差はなかった。
【０１１６】
実施例７：１４Ｃ−チミジン取込みアッセイ
７５ｃｍ２フラスコにおいて、ＤＭＥＭ中でＨｅＬａ細胞をコンフルエントまで培養し、２４穴プレートにいまき、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、血清フリーＤＭＥＭと置換して、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、血清フリーＤＭＥＭを、１４Ｃ−チミジン（０．２ｐＣｉ／穴）を含むＤＭＥＭで置換して、３７℃で２４時間インキュベートした。取込みアッセイを止めるために、細胞をＰＢＳで洗浄してリポソームを添加した。リポソームの組成物は、１ｍｌのＨ２０に再懸濁した８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ、２ｍｇのＤＯＴＡＰであり、最終的に１ｍｌのＰＢＳで希釈した。細胞は、リポソームの存在下で３０℃において１２０、６０および３０分間インキュベートした。図１２は、ＳＴ４についての結果であり、市販のシンチラント反応混液を使用して測定したＨｅＬａ細胞におけるチミジンの取込みを示す挿入図を伴う。
【０１１７】
実施例８：ラジオリガンド結合アッセイ
ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ技術を使用して、三種のラジオリガンド結合アッセイとして、ＨＴＣ細胞における糖質コルチコイド受容体に対する３Ｈ−デキサメサゾンの結合、Ｃ６グリオーマ細胞におけるβ−アドレナリン性受容体に対する３Ｈ−ジヒドロアルプレノロールの結合、およびＨｅＬａ細胞におけるＮａ／Ｋポンプに対する３Ｈ−ウワバインの結合を行った。
【０１１８】
実験の細目の多くは、実行した全ての三アッセイに共通である。それぞれの細胞株を、７５ｃｍ２フラスコにおいてコンフルエントまで培養した後、９６穴または２４穴プレートにまいた。ＨＴＣ細胞は必須アミノ酸を補った最小必須培地中で培養し、Ｃ６グリオーマ細胞はＨａｍｓＦ１２培地中で培養し、およびＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ中で培養した。一旦細胞がコンフルエントな状態になると、これらをＰＢＳで洗浄し、細胞に、３７℃で２時間ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄを含有させる。ｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄの組成物は、１ｍｌのＨ２０に再懸濁した８ｍｇのｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄ、２ｍｇのＤＯＴＡＰであり、最終的に１ｍｌのＰＢＳで希釈した。次いで、細胞をＰＢＳで再び洗浄して培地を添加し、細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。
【０１１９】
実施例９：グルココルチコイド受容体アッセイ。
【０１２０】
糖質コルチコイド受容器結合アッセイは、ＨＴＣ細胞で、９６穴において培養してｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄとともにインキュベートして行った。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩溶液（ＨＢＳ）（１５５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で三回洗浄し、次いで種々の濃度の３Ｈ−デキサメサゾン（５ｘ１０−１０Ｍ〜１ｘ１０−８Ｍ）と３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＨＢＳで三回洗浄し、次いで全結合量を確かめるために計測した。非特異的結合を確かめるために、同じ濃度の３Ｈ−デキサメサゾンをを使用し、２０ｘ１０−６Ｍの「冷却」デキサメタゾンを添加して、特異的結合を全結合量と非特異的結合間の相違として見積もった。結果は、図１３に示す。
【０１２１】
また、３Ｈ−デキサメサゾンの置換を示す実験を行った。１ｘ１０−９Ｍ ３Ｈ−デキサメタゾンを、「冷却」デキサメタゾン（５ｘ１０−１０Ｍ〜１ｘ１０−８Ｍ）の濃度を増加してその存在下で細胞に添加し、該細胞を３７℃において３０分間インキュベートした後で洗浄して計測し、このアッセイの結果を図１４に示す。
【０１２２】
実施例１０：β−アドレナリン作用性受容体アッセイ。
【０１２３】
β−アドレナリン性受容体結合アッセイは、Ｃ６グリオーマ細胞で、９６穴において培養してｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄとともにインキュベートして行った。細胞をＭＯＰＳ緩衝食塩溶液（ＭＢＳ）（１２５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ８．２）で三回洗浄し、次いで種々の濃度の３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（１ｘ１０−８Ｍ〜１ｘ１０−４Ｍ）と３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＭＢＳで三回洗浄し、次いで全結合量を確かめるためにプレートを計測した。非特異的結合を確かめるために、同じ濃度の３Ｈ−ジヒドロアルプレノロールを使用して１０ｘ１０−３Ｍの「冷却」デキサメタゾンを添加し、特異的結合を全結合量と非特異的結合間の相違として見積もった。結果は、図１５に示す。
【０１２４】
実施例１１：Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ結合アッセイ。
【０１２５】
Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅに対する結合は、ラジオリガンドとして３Ｈ−ウワバインを使用して、２４穴プレート中で培養したＨｅＬａ細胞において行った。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩溶液（ＨＢＳ）（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコース、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐｈ７．４）で三回洗浄し、次いで種々の濃度の３Ｈ−ウワバイン（５ｘ１０−８Ｍ〜１ｘ１０−５Ｍ）と３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＭＢＳで三回洗浄し、次いで全結合量を確かめるために計測した。非特異的結合を確かめるために、同じ濃度の３Ｈ−ウワバインを使用して１５ｍＭのＫＣＩをインキュベーション培地に添加し、特異的結合を全結合量と非特異的結合間の相違として見積もった。結果は、図１６に示す。
【０１２６】
実施例１２：シンチレータ分子ＳＴ１の調製。
【０１２７】
ＳＴ１
【０１２８】
【化３】
2004506754.tif 000004
アルコール　　　　　　　　　＝０．５０ｇ　　　　＝２ｍｍｏｌ。
【０１２９】
水素化ナトリウム（油中６０％）＝０．１６０ｇ（６０％）＝０．０９６ｇ＝４ｍｍｏｌ＝２等量。
【０１３０】
ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　＝１０ｃｍ３。
【０１３１】
ブロモオクタン　　　　　　　＝０．３４６ｃｍ３　　　＝０．３８６ｇ＝２ｍｍｏｌ＝１等量。
【０１３２】
水素化ナトリウムおよびアルコールを５０ｃｍ３の丸底フラスコに入れた。ＤＭＦを添加して、反応生成物の灰色／黒スラリーを室温で１５分間撹拌した。次いで、ブロモオクタンをゆっくり添加して、反応液を撹拌して一晩おいた。混合液を水（４０ｃｍ３）に注いで、酢酸エチル（２×５０ｃｍ３）で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し（５ｘ５０ｃｍ３）、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製のエーテルを得た（１．０５８ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（勾配溶出：１００ｃｍ３ヘキサンの後、２００ｃｍ３５％酢酸エチルのヘキサン溶液）で、無色のオイルとして純粋のエーテルを得た（０．５４７４ｇ、８３％）。大部分のオイルをサンプルチューブに置いて、数時間の間にオイルが固まって、ろう様の白い固体を得た（０．５５２８ｇ、７６％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌプレート） ３０６０ （ｍ， Ｃ−Ｈ）， ２９２５ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５４ （ｓ， Ｃ−Ｈ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．８５ （３ Ｈ ｔ Ｊ ６．９）， １．２０−１．４０ （１０ Ｈ ｂｓ）， １．６５ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ７．５）， ３．６１ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．７）， ４．６５ （２ Ｈ ｓ）， ７．３４−７．５０ （６ Ｈ ｍ）， ７．７９ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７．３）， ８．１０ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ５．３， １．８）； □Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ， Ｐｅｎｄａｎｔ） １４ （ＣＨ３）， ２２．７ （ＣＨ２）， ２６．３ （ＣＨ２）， ２９．４ （ＣＨ２）， ２９．５ （ＣＨ２）， ２９．８ （ＣＨ２）， ３１．９ （ＣＨ２）， ６５．５ （ＣＨ２）， ７１．１ （ＣＨ２），　１２６．９ （ＣＨ）， １２７．１ （ＣＨ）， １２９．２ （ＣＨ）， １２９．４ （ＣＨ）， １２９．５ （ＣＨ）， １３１．０ （ＣＨ）， 残りの四級炭素シグナルは弱すぎて分解できない； Ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ３６４ Ｍ＋Ｈ＋ （Ｃ２４Ｈ２９ＮＯ２ は Ｍ＋ ３６３を必要とする）， ２３４ （１００％）．
ＳＴ２
【０１３３】
【化４】
2004506754.tif 000005
アルコール　　　　　　　　　＝０．５０ｇ　　　　＝２ｍｍｏｌ。
【０１３４】
水素化ナトリウム（油中６０％）＝０．１６０ｇ（６０％）＝０．０９６ｇ＝４ｍｍｏｌ＝２等量。
【０１３５】
ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　＝５ｃｍ３。
【０１３６】
ブロモオクタン　　　　　　　＝０．４１５ｃｍ３　　　＝０．４４２ｇ＝２ｍｍｏｌ＝１等量。
【０１３７】
水素化ナトリウムおよびアルコールを５０ｃｍ３の丸底フラスコに入れた。ＤＭＦを添加して、反応生成物の灰色／黒スラリーを室温で１５分間撹拌した。次いで、ブロモオクタンをゆっくり添加して、反応液を撹拌して一晩おいた。混合液を水（４０ｃｍ３）に注いで、酢酸エチル（２×５０ｃｍ３）で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し（５ｘ５０ｃｍ３）、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製のエーテルを得た（１．１７３ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（勾配溶出：３００ｃｍ３ヘキサンの後、２００ｃｍ３７％酢酸エチルのヘキサン溶液）で、白色個体として純粋のエーテルを得た（０．５６１９ｇ、７２％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌ プレート） ３０５９ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９２４ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５２ （ｓ， Ｃ−Ｈ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．８８ （３ Ｈ ｔ Ｊ ６．９）， １．２０−１．４０ （１４ Ｈ ｂｓ）， １．６６ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ７．１）， ３．６２ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．６５ （２ Ｈ ｓ）， ７．３３−７．５０ （６ Ｈ ｍ）， ７．８０ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７．７）， ８．１１ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ５．０， １．６）； □Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ， Ｐｅｎｄａｎｔ） １４．１ （ＣＨ３）， ２２．７ （ＣＨ２）， ２６．３ （ＣＨ２）， ２９．４ （ＣＨ２）， ２９．６ （ＣＨ２）， ２９．７０ （ＣＨ２）， ２９．７２ （ＣＨ２）， ２９．９ （ＣＨ２）， ３２．０ （ＣＨ２）， ６５．６ （ＣＨ２）， ７１．１ （ＣＨ２），　１２６．９ （ＣＨ）， １２７．１ （ＣＨ）， １２８．１ （四級Ｃ）， １２９．０２ （四級Ｃ）， １２９．０４ （ＣＨ）， １２９．４６ （ＣＨ）， １２９．５４ （ＣＨ）， １３１．０ （ＣＨ）， １３５．１ （四級Ｃ）， １４９．７ （四級 Ｃ）， １６０．５ （四級Ｃ）； Ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ３９２ Ｍ＋Ｈ＋ （Ｃ２６Ｈ３３ＮＯ２はＭ＋ ３９１を必要とする）， ２３４ （１００％）．
ＳＴ３
【０１３８】
【化５】
2004506754.tif 000006
アルコール　　　　　　　　　＝０．４０ｇ　　　　＝１．６ｍｍｏｌ。
【０１３９】
水素化ナトリウム（油中６０％）＝０．１２８ｇ（６０％）＝０．０７７ｇ＝３．２ｍｍｏｌ＝２等量。
【０１４０】
ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　＝５ｃｍ３。
【０１４１】
ブロモオクタン　　　　　　　＝０．５３１ｃｍ３　　＝１．６ｍｍｏｌ＝１等量。
【０１４２】
水素化ナトリウムおよびアルコールを５０ｃｍ３の丸底フラスコに入れた。ＤＭＦを添加して、反応生成物の灰色／黒スラリーを室温で１５分間撹拌した。次いで、ブロモオクタンをゆっくり添加して、反応液を撹拌して一晩おいた。混合液を水（４０ｃｍ３）に注いで、酢酸エチル（２×５０ｃｍ３）で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し（５ｘ５０ｃｍ３）、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色の体として未精製のエーテルを得た（１．０７７２ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（勾配溶出：４００ｃｍ３ヘキサンの後、２００ｃｍ３７％酢酸エチルのヘキサン溶液）で、白色固体として純粋のエーテルを得た（０．６１４６ｇ、７６％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌ プレート） ３０５９ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９１５ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８４８ （ｓ， Ｃ−Ｈ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．８７ （３ Ｈ ｔ Ｊ ６．９）， １．１５−１．４０ （３０ Ｈ ｂｓ）， １．６５ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ７．３）， ３．６１ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．６３ （２ Ｈ ｓ）， ７．３２−７．５０ （６ Ｈ ｍ）， ７．７９ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７．３）， ８．１０ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ７．７， １．８）； ｄ Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ， Ｐｅｎｄａｎｔ） １４．１ （ＣＨ３）， ２２．７ （ＣＨ２）， ２６．３ （ＣＨ２）， ２９．４ （ＣＨ２）， ２９．６ （ＣＨ２）， ２９．６８ （ＣＨ２）， ２９．７２ （ＣＨ２）， ２９．９ （ＣＨ２）， ３２．０ （ＣＨ２）， 直前の８ＣＨ２シグナルの下に残りの８ＣＨ２基， ６５．６ （ＣＨ２）， ７１．１ （ＣＨ２）， １２６．９ （ＣＨ）， １２７．１ （ＣＨ）， １２８．１ （四級Ｃ）， １２９．０４ （四級Ｃ）， １２９．１９ （ＣＨ）， １２９．４６ （ＣＨ）， １２９．５４ （ＣＨ）， １３１．０ （ＣＨ）， １｀３５．１ （四級Ｃ）， １４９．７ （四級Ｃ）， １６０．５ （四級Ｃ）； Ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ５０４ Ｍ＋Ｈ＋ （Ｃ３４Ｈ４９ＮＯ２ はＭ＋５０３を必要とする）， ２３４ （１００％）。
【０１４３】
ＳＴ４−方法「Ａ」
【０１４４】
【化６】
2004506754.tif 000007
８−ブロモ−１−オクタノール１　　　　＝１．０ｇ 　　＝４．８ｍｍｏｌ。
【０１４５】
ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ　　　　　　　　　　　　＝０．９９３ｇ　　＝６．６ｍｍｏｌ　　＝１．４等量。
【０１４６】
イミダゾール　　　　　　　　　　＝０．４５８ｇ　　＝６．７ｍｍｏｌ　　＝１．４等量。
【０１４７】
ＤＣＭ　　　　　　　　　　　　　　＝３０ｃｍ３
上記試薬を合わせて窒素雰囲気下で室温において２０時間攪拌した。混合液を水（１００ｃｍ３）に注いで、ＤＣＭ（２×５０ｃｍ３）で抽出した。有機相を合わせてブラインで洗浄し（２ｘ５０ｃｍ３）、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製の生成物を得た（１．９５５ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（２％トリエチルアミンを含む１０％酢酸エチルのヘキサン溶液）で、無色のオイルとして純粋シリルエーテル２を得た（１．５１２ｇ　９８％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌ プレート） ２９２８ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５５ （ｓ， Ｃ−Ｈ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．０２ （６ Ｈ ｓ）， ０．８７ （９ Ｈ ｓ）， １．２９ （６ Ｈ ｓ）， １．４０ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．４）， １．４８ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．４）， １．８５ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ７．１）， ３．３７ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．９３） ３．５５ （２ Ｈ ｔ Ｊ ７）； □□Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ， Ｐｅｎｄａｎｔ） −５．５ （２ｘ ＣＨ３）， １８ （Ｃ）， ２５．５ （ＣＨ２）， ２６ （３ｘ ＣＨ３）， ２８ （ＣＨ２）， ２９ （ＣＨ２）， ２９．５ （ＣＨ２）， ３２．８ （ＣＨ２）， ３４ （ＣＨ２）， ６３．２ （ＣＨ２）， ７１．５ （ＣＨ２）．
シリルエーテル２　　　＝１．２１１ｇ　　　　　＝３．７５ｍｍｏｌ
オキサゾール３　　　　＝０．９８８ｇ　　　　　＝３．９４ｍｍｏｌ　　＝１．０５当量
水素化ナトリウム　　　＝０．９００ｇ　　　　＝３７．４９ｍｍｏｌ　　＝１０当量
ＤＭＦ　　　　　　　　　＝３０ｃｍ３
上記試薬を合わせて窒素雰囲気下で室温において２時間攪拌した。水（５０ｃｍ３）で反応を注意して停止して、酢酸エチル（３ｘ３０ｃｍ３）で水相を抽出した。混合液を水（ｌ００ｃｍ３）へ注いでＤＣＭ（２ｘ５０ｃｍ３）と抽出された。有機相を合わせてブラインで洗浄し（２ｘ５０ｃｍ３）、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製の生成物４を得た（２．９９７ｇ、１６２％）。この生成物（一部酢酸エチルを含む）は、さらに精製することなく反応させた。□□□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．００ （６ Ｈ ｓ）， ０．８５ （９ Ｈ ｓ）， １．２１ （８ Ｈ ｍ）， １．４５ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．６）， １．６２ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．８）， ３．５１−４．６０ （４ Ｈ ｍ）， ４．５９ （２ Ｈ ｓ）， ７．３ − ８．２ （１０ Ｈ ｍ）。
【０１４８】
オキサゾールシリルエーテル４　＝２．８３８ｇ　　＝３．７５ｍｍｏｌ（最大理論量）
ＴＢＡＦ　　　　　　　　　　　　＝１．６５６ｇ　　＝６．３３ｍｍｏｌ　　　　　＝１．７ 当量。
【０１４９】
ＴＨＦ　　　　　　　　　　　　　＝３０ ｃｍ３ｍ。
【０１５０】
上記試薬を合わせて、窒素雰囲気下で室温において１６時間撹拌した。混合液を水（５０ｃｍ３）に注いで、酢酸エチル（２×４０ｃｍ３）で抽出した。有機抽出物を合わせて、飽和水性塩化アンモニウム溶液（２×４０ｃｍ３）、ブライン（２×４０ｃｍ３）で洗浄して、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製の生成物を得た（１．８３ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（２０％酢酸エチルのヘキサン溶液（１５０ｃｍ３）の後、４０％酢酸エチルのヘキサン溶液（１５０ｃｍ３）の勾配溶出で、生成物Ｒｆ＝０．２１の２０％酢酸エチルのヘキサン溶液を単離した）で、黄色のオイルとして純粋アルコールを得た（シリルエーテル２からの２工程で０．７３５ｇ、５２％）。黄色のオイルを４０％酢酸エチルのヘキサン溶液（２０ｃｍ３）に溶解して、穏やかに１０分間、活性炭（脱色剤として１ｇ）とともに温めた。混合液をシーライトのパッドを通して濾過し、減圧下で淡黄色オイルとして、純粋な生成物５を得た（シリルエーテル２から２工程で、０．３９７ｇ、２８％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （ＫＢｒ ｄｉｓｋ） ３４２５ （ｍ， Ｏ−Ｈ）， ３０５７ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９２８ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５０ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， １５４９ （ｍ， Ｃ＝Ｃ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） １．３０ （８ Ｈ ｂｒ ｓ）， １．５３−１．６７ （４ Ｈ ｍ）， ３．６０ （４ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．６３ （２ Ｈ ｓ）， ７．３０−７．６０ （６ Ｈ ｍ）， ７．７８ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８）， ８．０９ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ４， ７．９）； ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ３８０ （Ｍ＋Ｈ＋） （Ｃ２４Ｈ２９ＮＯ３ は Ｍ＋ ３７９を必要とする）， ２３４ （１００％）。
【０１５１】
ＳＴ４−方法「Ｂ」
図解の概要
【０１５２】
【化７】
2004506754.tif 000008
ａ． ｉ． ｓ−ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、−７８℃。ｉｉ．Ｃ０２（ｓ）は、７３％収率。
【０１５３】
ｂ． ＭｅＯＨ、Ｈ２ＳＯ４、還流、４２％の収率。
【０１５４】
ｃ． ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール、ＤＣＭ、９８％の収率。
【０１５５】
ｄ． ＮａＢＨ４、ＥｔＯＨ、９３％の収率。
【０１５６】
ｅ． ＮａＨ、ＤＭＦ。
【０１５７】
ｆ． ＴＨＦ、ＴＢＡＦ、６から２８％。
【０１５８】
実験
２．５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボン酸、２
２，５−ジフェニルオキサゾール１　　＝９４．０ｇ　　＝０．４２５ｍｏｌ
ｓ−ブチルリチウム　　　　　　　＝３６０ｍＬ＠１．３Ｍ（ヘキサン溶液）　＝１．１当量
カーボンジオキシド（固体）　　≒５０ｇ
無水テトラヒドロフラン　　　　＝１３０ｍＬ
ジフェニルオキサゾールをテトラヒドロフランに溶解して、−７５℃に冷却した。ｓ−ブチルリチウムをこの混合液に滴下して、窒素下において機械で撹拌することにより無色の溶液を濃い赤にさせた。３０分後、圧砕固体炭酸を慎重に添加して、部分的に活発な発熱反応を引き起こした。添加を制御して、反応温度が−６０℃を超えないようにした。完全に添加にした後、混合液を一晩撹拌して室温に温めた。３Ｍ塩酸水溶液でｐＨ１に酸性化すると、白い固体が沈殿した。これを濾過して、水（３ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥して２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボン酸２をオフホワイトの固体として得た（８２．７ｇ，７３％）。Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ７．４７−７．５６ （６Ｈ， ｍ）， ８．１２−８．１７ （２Ｈ， ｍ）， ８．２８−８．３３ （２Ｈ， ｍ）； Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ） １２５．８０， １２６．８１， １２８．３０， １２８．６７， １２９．０３， １３０．８４， １３１．５２， １７１．５８； ＭＳ （ＥＩ） ｍ／ｚ ＝ ２６５ （Ｍ＋） （Ｃ１６Ｈ１１ＮＯ３はＭ＋ ２６５を必要とする）， １０５ （１００％）。
【０１５９】
メチル２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボキシレート、３
２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボン酸，２　＝５０．０ｇ　　＝０．１８９ ｍｏｌ
メタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　＝３００ｍＬ
濃硫酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＝２ｍＬ
上記試薬を合わせて、還流下で大気水分を除去しながら一晩加熱した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発して、該オイルを酢酸エチル（２００ｍＬ）に再融解した。次いで、これを１０％炭酸ナトリウム水、ブラインおよび水（それぞれ３×１００ｍＬ）で洗浄した。有機溶媒は無水硫酸マグネシウムを通して乾燥し、濾過して真空下で蒸発し、２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボキシレート、３を黄色のオイルとして得た（２２．０ ｇ、４２％）
Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ３．９８ （３Ｈ， ｓ）， ７．４７−７．５４ （６Ｈ， ｍ）， ８．１２−８．１８ （４Ｈ， ｍ）； Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ） ５２．４３， １２６．２８， １２６．８５， １２６．９５， １２８．４６， １２８．４８， １２８．８５， １３０．１３， １３０．４０， １３１．１５， １５５．３２， １５９．８１， １６２．７０； ＭＳ （ＥＩ） ｍ／ｚ ＝ ２７９ （Ｍ＋） （Ｃ１７Ｈ１３ＮＯ３はＭ＋ ２７９を必要とする）， １０５ （１００％）。
【０１６０】
３−ヒドロキシメチル−２、５−ジフェニルオキサゾール、６
メチル２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボキシレート、３
＝１５．１ｇ　　　＝０．０５４ｍｏｌ
粉末化した水素化ホウ素ナトリウム＝１０．３ｇ　　　＝０．２７　ｍｏｌ　＝５当量
無水エタノール　　　　　　　　　　　　　　　＝２００ｍＬ
メチル２，５−ジフェニルオキサゾール−４−カルボキシレート、３をエタノールに溶解して０℃に冷却した。水素化ホウ素ナトリウムをこの混合液に滴下して、混合液を１．５時間撹拌し、室温に温めた。次いで、塩化水素酸水溶液でｐＨ１まで酸性化して、ジクロロメタン（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。次いで有機層を無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して真空で蒸発し、クロロホルムから結晶化した黄色の固体を得た。生じた沈降を濾過し、エーテルで洗浄して減圧下で乾燥し、３−ヒドロキシメチル−２，５−ジフェニルオキサゾール、６を淡黄色結晶として得た（１２．６ ｇ， ９３％）． Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ４．４０ （１Ｈ， ｂｓ）， ４．８６ （２Ｈ， ｓ）， ７．３４−７．４９ （６Ｈ， ｍ）， ７．７０−７．７５ （２Ｈ， ｍ）， ８．０１−８．０７ （２Ｈ， ｍ）； Ｃ （ＣＤＣｌ３， ７５ ＭＨｚ） ５６．８５， １２６．１０， １２６．３５， １２６．８５， １２８．００， １２８．５６， １２８．７８， １２８．８９， １３０．４８， １３６．１７， １４７．３９， １５９．８８； ＭＳ （ＥＩ） ｍ／ｚ ＝ ２５１ （Ｍ＋） （１００％） （Ｃ１６Ｈ１３ＮＯ２はＭ＋ ２５１を必要とする）
ＳＴ５
【０１６１】
【化８】
2004506754.tif 000009
ｔｒａｎｓ−４−デセナル　　　　＝ １．０ｃｍ３　＝ ５．５ ｍｍｏｌ。
【０１６２】
水素化ホウ素ナトリウム　＝ １．０３３ｇ　＝ ２７．３ ｍｍｏｌ　＝ ５ 当量。
【０１６３】
メタノール　　　　　　　＝ １０ｃｍ３。
【０１６４】
窒素雰囲気下で、メタノールを水素化ホウ素ナトリウムに添加した。この撹拌された混合液にトランス−４−デセナルを添加して、室温で１６時間撹拌し続けた。混合液を水（３０ｃｍ３）に注いで酢酸エチル（２×２５ｃｍ３）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２×５０ｃｍ３）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥して、濾過して減圧下で黄色のオイルとして、未精製のトランス−４−デセン−１−オルを得た（０．９４７ｇ，１１０％）． □ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜ＮａＣｌプレート） ３３３２ （ｍ， Ｏ−Ｈ）， ２９２５ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５５ （ｓ， Ｃ−Ｈ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．９ （３ Ｈ ｔ Ｊ ７）， １．２０−１．４０ （６ Ｈ ｍ），　１．６１ （ ２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ９．１）， １．９０−２．１０ （４ Ｈ ｍ０， ３．６５ （２ Ｈ ｔ Ｊ ７）， ５．４４ （２ Ｈ ｍ）。
【０１６５】
ｔｒａｎｓ−４−デセン−１−オル　　　　　　　　　　＝０．９４７ｇ　＝６．０７ ｍｍｏｌ。
【０１６６】
４−ブロモメチル−２，５−ジフェニルオキサゾール＝１．９０６ｇ＝６．０７ｍｍｏｌ　　＝１当量。
【０１６７】
水素化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　＝１．４５７ｇ＝６０．７ｍｍｏｌ　＝１０当量。
【０１６８】
ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＝２０ｃｍ３
水素化ナトリウムとｔｒａｎｓ−４−デセン−１−オルをＤＭＦ中で、窒素雰囲気下において室温で１０分間攪拌した。反応生成物の灰色のスラリーに４−ブロモメチル−２，５−ジフェニルオキサゾールのＤＭＦ溶液を添加した。生じた混合液を室温で１６時間撹拌した。水（５０ｃｍ３）で反応を注意して停止し、ジエチルエーテル（３ｘ３０ｃｍ３）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２０ｃｍ３）で洗浄して、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥するし、濾過して減圧下で濃縮し、黄色の固体を得た。ジエチルエーテルで粉砕することにより、反応していないオキサゾールを沈殿させて、これをシーライトのパッドを介した濾過によって除去した。濾液を減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製の生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィによって精製し（勾配溶出：ヘキサン（ｌＯＯｃｍ３）、２０％酢酸エチルのヘキサン溶液（２００ｃｍ３））、無色の固体として純粋な生成物を得た（０．２８４ｇ， １２％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （ＫＢｒ ｄｉｓｋ） ２９１６ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５２ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， １５４５ （ｍ， Ｃ＝Ｃ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．８６ （３ Ｈ ｔ Ｊ ７．１）， １．２０−１．４０ （６ Ｈ ｍ）， １．７１ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ６．９），　１．９３ （２ Ｈ ｑ Ｊ ５．１）， ２．０８ （２ Ｈ ｑ Ｊ ５．６）， ３．６３ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．６４ （２ Ｈ ｓ）， ５．３９ （２ Ｈ ｍ）， ７．３０−７．５０ （６ Ｈ ｍ）， ７．７９ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８），　８．１０ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ４， ７．７）；ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ３９０ （Ｍ＋Ｈ＋） （Ｃ２６Ｈ３１ＮＯ２ はＭ＋ ３８９を必要とする）， ２３４ （１００％）。
【０１６９】
ＳＴ６
【０１７０】
【化９】
2004506754.tif 000010
４−Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌオキサゾール　　　　　　　　　＝０．４９２ｇ＝１．５７ｍｍｏｌ。
【０１７１】
３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパン−ｌ−オル＝０．２４８ｇ＝１．６３ｍｍｏｌ＝１．０４当量。
【０１７２】
炭酸カリウム　　　　　　　　　　　　　　　＝１．２７３ｇ＝１６．３ｍｍｏｌ＝１０．４ 当量。
【０１７３】
１８−クラウン−６ 　　　　　　　　　　　　　　＝触媒作用量
アセトニトリル　　　　　　　　　　　　　　＝２５ｃｍ３。
【０１７４】
上記試薬を合わせて、窒素雰囲気下で１６時間還流した。混合液を水（３０ｃｍ３）へ注いでジエチルエーテル（３ｘ３０ｃｍ３）で抽出した。合わせた有機抽出物を希塩酸（２０％、２×３０ｃｍ３）水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、オフホワイトの固体として未精製の生成物を得た（０．６５１ｇ）。ジエチルエーテルで粉砕することにより、白い固体として生成物を得た（０．３３０ｇ， ５５％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （ＫＢｒ ｄｉｓｋ） ３４４４ （ｍ， Ｏ−Ｈ）， ３０５５ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９２７ （ｓ， Ｃ−Ｈ）；．Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） １．８７ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ６．５）， ２．６６ （２ Ｈ ｔ Ｊ ７．５）， ３．６７ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．２）， ５．１５ （２ Ｈ ｓ）， ７．００ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８．５）， ７．１３ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８．７）， ７．３０−７．６０ （６ Ｈ ｍ）， ７．７７ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７）， ８．１０ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ４， ７．７）； ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ３８６ （Ｍ＋Ｈ＋） （Ｃ２５Ｈ２３ＮＯ３は Ｍ＋ ３８５を必要とする）， ２３４ （１００％）。
【０１７５】
ＳＴ７
【０１７６】
【化１０】
2004506754.tif 000011
ＳＴ６　　　　　　　　　　　　　＝０．４０ｇ　　　＝１．０４ｍｍｏｌ。
【０１７７】
ベンゾイルクロリド　＝０．１３ｃｍ３ ＝０．１５３ｇ　　＝１．０９ｍｍｏｌ　　＝１．０５　当量。
【０１７８】
トリエチルアミン　　＝０．２９ｃｍ３ ＝０．２１０ｇ　　＝２．０８ｍｍｏｌ　　＝２．０　　当量。
【０１７９】
ＤＣＭ　　　　　　　　＝１０ｃｍ３。
【０１８０】
ＳＴ６をＤＣＭに溶解して窒素雰囲気下に置いた。ベンゾイルクロリドを添加して室温で１０分間、混合液を撹拌した。次いで、トリエチルアミンを添加して、生じた混合液を室温で３時間撹拌した。混合液を水（２０ｃｍ３）へ注いで酢酸エチル（３ｘ２０ｃｍ３）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして未精製の生成物を得た。このオイルを１６時間静置させた後、黄色の固体を形成させた（０．５１１ｇ）。ヘキサンでこの固体を粉砕し、白い固体を濾過によって回収して乾燥し、純粋な生成物（ＳＴ７）を白い固体として得た（０．３３０ｇ， ６５％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （ｔｈｉｎ ｆｉｌｍ， ＮａＣｌ ｐｌａｔｅ） ３０５１ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９２７ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， １７１６ （ｓ， Ｃ＝Ｏ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ２．０７ （２ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ６．９）， ２．７３ （２ Ｈ ｔ Ｊ ７．９）， ４．３３ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．２）， ５．１４ （２ Ｈ ｓ）， ７．００ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８．５）， ７．１４ （２ Ｈ ｄ Ｊ ８．５）， ７．３０−７．６０ （９ Ｈ ｍ）， ７．７６ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７）， ８．０３ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７）， ８．１０ （２ Ｈ ｍ）； ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ４９０ （Ｍ＋Ｈ＋） （１００％） （Ｃ３２Ｈ２７ＮＯ４は Ｍ＋ ４８９を必要とする）， ２３４。
【０１８１】
【化１１】
2004506754.tif 000012
ＳＴ８
６−ブロモ−１−ヘキサノール＝１．４８６ｇ　＝ ８．２１ｍｍｏｌ。
【０１８２】
ＴＢＤＭＳ−Ｃ１ 　　　　　　　＝１．３６１ｇ　＝ ９．０３ｍｍｏｌ　＝ １．１ 当量。
【０１８３】
イミダゾール　　　　　　＝０．６１５ｇ　＝ ９．０３ｍｍｏｌ　＝ １．１ 当量。
【０１８４】
ＤＣＭ 　　　　　　　　　　＝２０ｃｍ３。
【０１８５】
上記試薬を合わせて、窒素雰囲気下において室温で４８時間撹拌した。イミダゾール塩酸塩の白色沈殿を濾過によって除去して、濾液を酢酸エチル（２×５０ｃｍ３）で抽出された。合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮し、オレンジのオイルとして、未精製の生成物２を得た（２．３６１ｇ，９８％）。この生成物を、さらにいずれの精製もせずに直接使用した。
【０１８６】
シリルエーテル２　　＝ ２．３６１ｇ ＝ ８．０３ｍｍｏｌ。
【０１８７】
オキサゾール３ 　　＝ １．８１８ｇ ＝ ７．２４ｍｍｏｌ＝ ０．９０５当量。
【０１８８】
水酸化ナトリウム　＝ １．９２１ｇ ＝ ８０．３ｍｍｏｌ＝ １０当量。
【０１８９】
ＤＭＦ　　　　　　　　＝３０ｃｍ３。
【０１９０】
上記試薬を合わせて窒素雰囲気下において室温で３時間撹拌した。水（５０ｃｍ３）で反応を注意して停止し、水相を酢酸エチル（３ｘ３０ｃｍ３）で抽出し、この抽出手順の間に生じたエマルジョンを分解するために、ブラインの添加が必要であった。合わせた有機抽出物をブライン（２×２０ｃｍ３）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥して、濾過して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして、未精製の生成物４を得た（３．８８ｇ，１０４％）。この生成物（一部酢酸エチルを含む）は、さらなる精製なしで反応した。
【０１９１】
オキサゾールシリルエーテル４　　＝３．８８ｇ　＝８．０３ｍｍｏｌ（最大理論量）
ＴＢＡＦ 　　　　　　　　　　　　＝４．６３ｇ　＝１７．７ｍｍｏｌ　　　　＝ ２．２当量。
【０１９２】
ＴＨＦ 　　　　　　　　　　　　　＝３０ ｃｍ３。
【０１９３】
2004506754.tif 000013
【０１９４】
塩化ブチリル　　　＝０．１７６ｇ　　　　１．６５ｍｍｏｌ＝　１当量。
【０１９５】
トリエチルアミン　＝０．３３４ｇ　　　　１．６５ｍｍｏｌ＝　２当量。
【０１９６】
ＤＣＭ 　　　　　　　＝２０ｃｍ３。
【０１９７】
アルコールＳＴ１０をＤＣＭに溶解して、生じた黄色の溶液を窒素雰囲気下に置いた。この撹拌された溶液に、トリエチルアミンに続いてブチリル塩化物を添加して、室温で１６時間連続して攪拌した。反応液を水（２０ｃｍ３）へ注いで酢酸エチル（３ｘ２０ｃｍ３）で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン（２０ｃｍ３）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥して減圧下で濃縮し、黄色のオイルとして、未精製のエステルＳＴ８を得た（０．７４７ｇ、１０７％）。活性炭およびジエチルエーテル（３０ｃｍ３）をこの生成物に添加して、生じた混合液を穏やかに温めた。溶液をシーライトのパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮して淡黄色のオイルとして、純粋のエステルＳＴ８を得た（０．３１２ｇ， ４５％）． □ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌプレート） ３０５９ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９３４ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， ２８５９ （ｓ， Ｃ−Ｈ）， １７３２ （ｓ， Ｃ＝Ｏ）， １５４９ （ｍ， Ｃ＝Ｃ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） ０．９２ （３ Ｈ ｔ Ｊ ７．３）， １．３５ （４ Ｈ ｂｒ ｓ）， １．６１ （６ Ｈ ｍ）， ２．２５ （２ Ｈ ｔ Ｊ ７．５）， ３．６０ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．０３ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．７）， ４．６３ （２ Ｈ ｓ）， ７．３０−７．６０ （６ Ｈ ｍ） ７．７８ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７．２）， ８．１０ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ３， ８）； ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ４２２ Ｍ＋Ｈ＋ （Ｃ２６Ｈ３１ＮＯ４はＭ＋ ４２１を必要とする）， ２３４ （１００％）
ＳＴ９
【０１９８】
【化１２】
2004506754.tif 000014
アルコール１ 　　　　　　　　　　＝０．５０１ｇ＝　　１．４３ｍｍｏｌ。
【０１９９】
塩化ベンゾイル　　　＝０．１７ｃｍ３　　＝０．２０１ｇ＝　　１．４３ｍｍｏｌ　＝　１当量。
【０２００】
トリエチルアミン　　＝０．３ｃｍ３　　＝０．２１７ｇ　　　＝２．１５ｍｍｏｌ　＝１．５当量。
【０２０１】
ＤＣＭ　　　　　　　　＝ｌＯｃｍ３。
【０２０２】
アルコール１をＤＣＭに溶解して窒素雰囲気下においた。ベンゾイルクロリドを添加して、混合液を１０分間、室温で撹拌した。次いで、トリエチルアミンを添加して、生じた混合液を１６時間、室温で撹拌した。混合液を水（２０ｃｍ３）へ注いでジエチルエーテル（２×２０ｃｍ３）で抽出して合わせた。有機抽出物を無水硫酸マグネシウムを通じて乾燥し、濾過して減圧下で濃縮して黄色のオイルとして未精製の生成物を得た。このオイルを１６時間静置させた後、黄色の固体が形成した（０．５９９ｇ）。フラッシュカラムクロマトグラフィによる精製（２０％酢酸エチルのヘキサン溶液（２００ｃｍ３））により、無色のオイルとして、純粋のエステルＳＴ９を得た（０．３４０ｇ、５２％）。□ｍａｘ ／ ｃｍ−１ （薄膜， ＮａＣｌ プレート） ３０５９ （ｗ， Ｃ−Ｈ）， ２９３４ （ｍ， Ｃ−Ｈ）， ２８５８ （ｍ， Ｃ−Ｈ）， １７１６ （ｓ， Ｃ＝Ｏ）； □□Ｈ （ＣＤＣｌ３， ３００ ＭＨｚ） １．４６ （４ Ｈ ｐｅｎｔｅｔ Ｊ ３．５）， １．７１ （４ Ｈ ｍ）， ３．６２ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．５）， ４．２８ （２ Ｈ ｔ Ｊ ６．７）， ４．６４ （２ Ｈ ｓ）， ７．３０−７．６０ （９ Ｈ ｍ）， ７．８０ （２ Ｈ ｍ）， ８．０２ （２ Ｈ ｄ Ｊ ７．３）， ８．０９ （２ Ｈ ｄｄ Ｊ ４．２， ７．７）； ｍ／ｚ （ＡＰＣＩ） ４５６ Ｍ＋Ｈ＋ （１００％） （Ｃ２９Ｈ２９ＮＯ４は Ｍ＋ ４５５を必要とする）， ２３４。
【０２０３】
ＳＴｌｌ
【０２０４】
【化１３】
2004506754.tif 000015
ＳＴ１０　　　　　　　　　　　　　　　　　＝２．５ｇ　　＝７．１２ｍｍｏｌ　　＝１当量。
【０２０５】
塩化クロム酸ピリジニウム／シリカゲル （１：１）＝４．６ｇ　　＝１０．６７ｍｍｏｌ　＝１．５当量。
【０２０６】
ジクロロメタン　　　　　　　　　　　　　＝ ３０ｃｍ−３
ＰＣＣ／シリカをＳＴ１０のジクロロメタン（３０ｃｍ３）溶液に添加して、一晩撹拌したままにした。反応液をエーテルで希釈して、シーライトおよびシリカを通して濾過し、減圧下で濃縮して未精製の黄色のオイルとしてオキサゾールアルデヒドを得た（２．０８７ｇ、８４％）。この生成物を、さらなる精製をせずに直接使用した。
【０２０７】
2004506754.tif 000016
【０２０８】
酸化銀（Ｉ）　　　　　＝１．５７４ｇ　　＝　６．７９１ｍｍｏｌ＝　　１．５当量。
【０２０９】
ＮａＯＨ（ａｑ）（２Ｍ）　　＝３０ｃｍ−３。
【０２１０】
メタノール 　　　　＝３０ｃｍ−３。
【０２１１】
2004506754.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、挿入されたシンチレータ分子と興味の対象の輸送チャネルとを含む細胞の略図である。放射性標識された基質は、このチャネルを通過することができ、シンチレータ分子の近くへ基質を運んで、その結果シンチレーションを生じる。輸送インヒビターとインキュベーションすることで、チャネルを介した放射性基質の運搬を妨げることにより、シンチレーションが妨げられるであろう。
【図２】
図２は、市販のシンチラント「Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ」と比較したシンチレータ分子ＳＴｌ−ＳＴｌ１のシンチレーションの程度の比較である。
【図３】
図３は、０．５ｍｌリポソーム溶液に０．１マイクロＣｉ １４Ｃ−タウリンを添加したシンチレータ分子−リポソーム標品のシンチラント活性を示す。
【図４】
図４は、リポソーム形成においてリポソーム（ＤＯＴＡＰ）に対するシンチレータ分子の比を増加する効果を示す。
【図５】
図５は、タウリンの活性を０．１マイクロＣｉから１．０マイクロＣｉに増加したときに観察される、シンチラント分子を含むリポソームの線形応答を示す。
【図６】
図６は、カチオン性リポソーム（ａ）および０．１％のミセル標品（ｂ）とインキュベーションした後の、蛍光プローブＮ−６７８のヒーラー細胞による取込みを示す。
【図７】
図７は、３０分および１２０分後におけるシンチレータ分子ＳＴ４、ＳＴ５およびＳＴ６のヒーラー細胞による取込みを示す。
【図８】
図８は、挿入されたシンチレータ分子を含むヒーラー細胞による１４Ｃ−Ｍの取込みを示す。挿入は、市販のシンチレーション反応混液を使用して測定した、ヒーラー細胞におけるメチオニンの取込みを示す。
【図９】
図９は、挿入されたＳＴ４シンチレータ分子を含むラットＣ６神経膠腫にる１４Ｃ−メチオニンの取込みを示す。挿入は、市販のシンチレーション反応混液を使用して測定した、Ｃ６グリオーマ細胞におけるメチオニンの取込みを示す。
【図１０】
図１０は、ヒーラー細胞による３５Ｓ−メチオニンの取込みを示す。挿入は、市販のシンチレーション反応混液を使用して測定したヒーラー細胞におけるメチオニン取込みを示す。
【図１１】
図１１は、ＳＴ４における結果を示し、最初は１４Ｃ−Ｍの取込みがなかったが、約７２時間後、１４Ｃ−メチオニンの蓄積が起こり始めた。ＳＴ４／ＤＯＴＡＰまたはＳＴ４／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥでプレインキュベートした細胞間に有意差はなかった。
【図１２】
図１２は、挿入図と共に化合物ＳＴ４の結果を示し、市販のシンチレーション反応混液を使用して測定したヒーラー細胞におけるチミジン取込みを示す。
【図１３】
図１３は、ＨＴＣ細胞において行った糖質コルチコイド受容体結合アッセイの結果を示す。
【図１４】
図１４は、ＨＴＣ細胞において行った３Ｈ−デキサメサゾンの置換の実験の示す結果を示す。
【図１５】
図１５は、β−アドレナリン性受容体結合アッセイの結果を示すＣ６グリオーマ細胞をｓｃｉｎｔｉｌｉｐｉｄとインキュベートして行った結果を示す。
【図１６】
図１６は、ラジオリガンドとして３Ｈ−ウワバインを使用して、培養ヒーラー細胞において行ったＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ結合アッセイの結果を示す。
【図１】
2004506754.tif 000019
【図２】
2004506754.tif 000020
【図３】
2004506754.tif 000021
【図４】
2004506754.tif 000022
【図５】
2004506754.tif 000023
【図６】
2004506754.tif 000024
【図７】
2004506754.tif 000025
【図８】
2004506754.tif 000026
【図９】
2004506754.tif 000027
【図１０】
2004506754.tif 000028
【図１１】
2004506754.tif 000029
【図１２】
2004506754.tif 000030
【図１３】
2004506754.tif 000031
【図１４】
2004506754.tif 000032
【図１５】
2004506754.tif 000033
【図１６】
2004506754.tif 000034
【国際公開パンフレット】
2004506754.tif 000035
2004506754.tif 000036
2004506754.tif 000037
2004506754.tif 000038
2004506754.tif 000039
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【国際調査報告】
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