(57)【要約】本発明は、ＨＴ１０８０細胞などのヒト腫瘍細胞株から入手可能なマイトジェンに関する。
2004508300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍細胞株より入手可能な、単離又は精製を行ったマイトジェン。
【請求項２】
マイトジェンを含む条件培地であって、その内部のヒト腫瘍細胞株の増殖を介して条件づけられることを特徴とする条件培地。
【請求項３】
マイトジェンを含む条件培地であって、ヒト腫瘍細胞株の増殖を介して条件づけられることを特徴とする条件培地。
【請求項４】
ヒト腫瘍細胞株より得た、単離又は精製を行ったマイトジェン。
【請求項５】
ヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能なマイトジェン。
【請求項６】
ヒト腫瘍細胞株より入手可能な幹細胞マイトジェン。
【請求項７】
ヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能な幹細胞マイトジェン。
【請求項８】
ヒト腫瘍細胞株より入手可能な神経幹細胞マイトジェン。
【請求項９】
ヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能な神経幹細胞マイトジェン。
【請求項１０】
マイトジェンがＮＳＣ−ＭＦ−１及び／又はＮＳＣ−ＭＦ−２であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のマイトジェン。
【請求項１１】
マイトジェンが、セファロース４Ｂクロマトグラフィー法及びアニオン交換クロマトグラフィー法を連続使用してマイトジェンを他の汚染タンパク質から少なくとも部分的に精製する方法により入手可能であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のマイトジェン。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載のマイトジェンを含む培地における真核細胞のインビトロでの培養方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか記載のマイトジェンを外部から添加した培地における真核細胞のインビトロでの培養方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか記載の条件培地を外部から添加した培地における真核細胞のインビトロでの培養方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか記載のマイトジェンを外部から添加した培地において細胞を培養することを特徴とする細胞の生存の促進方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか記載の条件培地を外部から添加した培地において細胞を培養することを特徴とする細胞の生存の促進方法。
【請求項１７】
マイトジェンがタンパク質又はその断片であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載のマイトジェン。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか記載のマイトジェン及び／又は請求項１〜１７のいずれか記載の条件培地を含む分裂促進組成物。
【請求項１９】
（ｉ）適切な希釈剤を準備すること、（ｉｉ）請求項１〜１８のいずれか記載のマイトジェン及び／又は条件培地を添加することを特徴とする分裂促進組成物の調製方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか記載の第二マイトジェンを適量添加することを特徴とする第一マイトジェンの分裂促進作用の調節方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか記載のマイトジェンを増量して添加することを特徴とする、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−８、トロンボポエチン又はニューロトロフィン３から選択される因子の分裂促進作用を増大させる方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか記載のマイトジェンを含む培地において、細胞のインキュベーションを行うことを特徴とする細胞の増殖方法。
【請求項２３】
ここに記載した本発明のマイトジェンを使用することを特徴とする、添付図面に示したように神経細胞の増殖を助長する方法。
【請求項２４】
神経細胞の増加をもたらす前駆細胞の増殖を選択的に助長するための請求項１〜２３のいずれか記載のマイトジェンの使用。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか記載のマイトジェンと神経幹細胞群とを接触させることを特徴とする、神経幹細胞群から発達する神経細胞の比率を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分裂促進因子に関する。より詳しくは、本発明は、神経幹細胞（ＮＳＣ）などの幹細胞に対する分裂促進作用をもつ、あるいはそうした作用を促進する因子に関する。
【０００２】
細胞をインビトロで培養するには、多数の要素を培地に補充する必要がある。こうした要素としては、緩衝剤、グルコース、タンパク質、血清、塩などが挙げられるが、その他に、特定の細胞株をうまく増殖させるのに必要な、成長因子、生存因子及び関連分子などのシグナル分子が挙げられる。
【０００３】
市販されている成長因子／生存因子は数が少ない。
培養による増殖が困難な細胞は数多く、その理由としては、培養に必要な要素を入手できないことが主に挙げられる。
市販されている成長因子の多くは、購入するには高価であり、及び／又は製造するには労働集約的である。
【０００４】
神経細胞又は幹細胞は、インビトロでの培養が難しい。既知のマイトジェンには、それらの細胞に対する増殖促進効果がない場合が多い。例えば、ＥＧＦ、白血病抑制因子（ＬＩＦ、１０−２０ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１−１０ｎｇ／ｍｌ）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）は、前脳の神経幹細胞用のマイトジェンとしては効果に乏しい。特に、神経伝達物質特異的な神経細胞群の増殖が、神経幹細胞研究の問題点となっている。
【０００５】
ヒト腫瘍細胞株由来の条件培地が強力なマイトジェンとして作用可能であることを、驚きとともにここに示す。このマイトジェンは、ＮＳＣ−ＭＦと命名されている。
ＮＳＣ−ＭＦは、その分裂促進特性に加えて、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を始めとする神経幹細胞（ＮＳＣ）のマイトジェンなど、他の幹細胞のマイトジェンの作用を促進する。
【０００６】
このように、本発明は、ＮＳＣ−ＭＦ及びマイトジェンとしてのＮＳＣ−ＭＦの使用に関する。
別の態様においては、本発明は、他のマイトジェンの効果促進剤としてのＮＳＣ−ＭＦの使用に関する。ここで使用されている「ＮＳＣ−ＭＦ」という語句は、かかるマイトジェン自体及び／又はＮＳＣ−ＭＦマイトジェンを含む条件培地又は細胞上清液を意味する。
【０００７】
本発明は、ＮＳＣ−ＭＦが分裂促進特性をもつという知見に基づくものである。本発明の方法は、この知見を利用している。その方法により、従来のマイトジェン又は成長因子を低いレベルで使用した場合や部分的に使用した場合、さらにはその不在下においてさえ、細胞をインビトロで増殖させることが可能になる。
【０００８】
ある態様においては、本発明は、ヒト腫瘍細胞株より入手可能な、単離又は精製を行ったマイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、マイトジェンを含む条件培地であって、その内部のヒト腫瘍細胞株の増殖を介して条件づけられている培地に関する。
別の態様においては、本発明は、マイトジェンを含む条件培地であって、その内部のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株の増殖を介して条件づけられている培地に関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株より得た、単離又は精製を行ったマイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能なマイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株より入手可能な幹細胞マイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能な幹細胞マイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株より入手可能な神経幹細胞マイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）などのヒト腫瘍細胞株を培養した培地より入手可能な神経幹細胞マイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェンを含む培地における真核細胞のインビトロでの培養方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェンを外部から添加した培地における真核細胞のインビトロでの培養方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載の条件培地を外部から添加した培地における真核細胞のインビトロでの培養方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェンを外部から添加した培地において細胞を培養することを特徴とする細胞の生存の促進方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載の条件培地を外部から添加した培地において細胞を培養することを特徴とする細胞の生存の促進方法に関する。
別の態様においては、本発明は、マイトジェンがタンパク質又はその断片であることを特徴とするここに記載のマイトジェンに関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェン及び／又はここに記載の条件培地を含む分裂促進組成物に関する。
別の態様においては、本発明は、
（ｉ）適切な希釈剤を準備すること
（ｉｉ）ここに記載のマイトジェン及び／又は条件培地を添加すること
を特徴とする分裂促進組成物の調製方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載の本発明のマイトジェンである第二マイトジェンを適量添加することを特徴とする第一マイトジェンの分裂促進作用の調節方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェンを増量して添加することを特徴とするＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ、トロンボポエチン、ニューロトロフィン３、又はＦＧＦ−８から選択される因子の分裂促進作用を増大させる方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載のマイトジェンを含む培地において細胞のインキュベーションを行うことを特徴とする細胞の増殖方法に関する。
別の態様においては、本発明は、ここに記載した本発明のマイトジェンを使用することを特徴とする、添付図面に示したように神経細胞の成長を促進する方法に関する。該細胞は、図４Ｂ及び／又は５Ｂなどの図に示された形態を有していることが好ましい。かかる促進作用は、図１及び／又は図２及び／又は図３に示されたものと同程度の強さであることが好ましい。
別の態様においては、本発明は、神経細胞の増加をもたらす前駆細胞の増殖を選択的に促進するための、前記請求項いずれか記載のマイトジェンの使用に関する。
【０００９】
そうした作用の一例は、ＮＳＣ−ＭＦ無添加培地での培養と比較して、ＮＳＣ−ＭＦ含有培地で切除直後の前脳ＮＳＣを培養した場合に見受けられる場合がある。ＮＳＣ−ＭＦ含有培地で培養した細胞は、ここに述べるように数が増大し、好ましいことに、神経細胞となるこれらの細胞は、選択的に促進作用を受けている。本発明のＮＳＣ−ＭＦマイトジェンを含む培地で培養した場合の神経細胞へと発達する細胞の比率と、培養培地中にＮＳＣ−ＭＦマイトジェンが含まれない場合の神経細胞へと発達する細胞の比率との比較により、この効果を査定してもよい。このようにして比率を比較することで、かかる細胞増殖を増大させるＮＳＣ−ＭＦの有利な作用が、ここに記載の神経細胞となる細胞の比率を増加させるというＮＳＣ−ＭＦの有利な特徴を比較した結果を偏らせるものではない。例えば、切除直後の前脳ＮＳＣをＥＧＦ含有培地で増殖させると、２−５％の神経前駆細胞を生じさせることができ、切除直後の前脳ＮＳＣをＦＧＦ含有培地で増殖させると、２０％の神経前駆細胞を生じさせることができる一方で、切除直後の前脳ＮＳＣをＮＳＣ−ＭＦ含有培地で増殖させると、２０％以上、好ましくは３０％以上、又はさらにそれ以上の神経前駆細胞を生じさせることができる。詳しくは、下記の実施例の部分で述べる。
【００１０】
したがって、別の態様においては、本発明は、前記請求項いずれか記載のマイトジェンと神経幹細胞群を接触させることを特徴とする神経幹細胞群から発達する神経細胞の比率を増大させる方法に関する。
【００１１】
参照しやすいように、これよりは、セクションごとに適切な見出しを設け、その下で本発明のこれらの態様及びその他の態様について論じることとする。しかし、各セクションにおける教示は、必ずしも各特定のセクションに限定されるものではない。
【００１２】
（好ましい態様）
好ましくは、本発明は、真核細胞群用マイトジェンとしてのＮＳＣ−ＭＦの使用に関する。
好ましい実施形態においては、本発明は、幹細胞群用マイトジェンとしてのＮＳＣ−ＭＦの使用に関する。
さらに好ましい実施形態においては、本発明は、ＮＳＣ用マイトジェンとしてのＮＳＣ−ＭＦの使用に関する。
【００１３】
（利点）
細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると従来のマイトジェンの使用量を減らせるのは、本発明の利点である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると外部から添加する必要のある他のマイトジェンの量を減らせるのは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると細胞生存率が上昇するのは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると細胞死亡率が低下するのは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用するとかかる細胞の初期密度が低くても培養しうることは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると細胞増殖速度（例えば増殖拡散速度）がさらに速くなることは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用するとより多くの神経細胞群が生じることは、本発明の態様の有利な特徴である。
ある細胞をインビトロで培養する際にＮＳＣ−ＭＦを使用すると培養における一次細胞の維持が容易になることは、本発明の態様の有利な特徴である。
【００１４】
（ＮＳＣ−ＭＦポリペプチド）
ＮＳＣ−ＭＦは、上清液でも、その有効な断片でも、それらいずれかの有効成分であってもよい。ＮＳＣ−ＭＦにはＮＳＣ−ＭＦの混合物も含まれる。ここで使用している「有効」とは、ここに記載のマイトジェンとして作用可能であるという意味である。
【００１５】
ここに、ＮＳＣ−ＭＦの単離について開示する。また、その精製についても記載する。
条件培地からのＮＳＣ−ＭＦの単離及び／又は状況に応じた濃縮及び／又は状況に応じた精製を行う際に、タンパク質化学の技術を用いてもよい。そうした技術は当該分野では周知であるが、特にタンパク質化学において使用されている技術を利用してもよい。例えば、無血清条件培地を凍結乾燥して、透析により脱塩してもよい。その後抽出物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で分画し、前脳ＮＳＣの増殖分析を利用してかかる抽出物の分裂促進活性を分析してもよい。こうした技術については、下記の実施例でさらに詳しく述べる。
【００１６】
有効成分の比較的きれいな画分が得られるまで、このプロセスを繰り返してもよい。この段階で、かかる画分に二次元電気泳動を行うのが望ましい。ペプチドを化学的又は酵素的に切断してもよく、ゲル上のそうした切断部にあるペプチド混合物に直接マトリックス支援レーザー脱離質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行ってもよい。
【００１７】
かかるデータをオンラインで評価することができるため、（タンパク質が既知のものであれば）得られたペプチドマスパターンからタンパク質を配列データバンクにおいて高い確度で同定することができる。タンパク質のなかには、同定があいまいな結果に終わるものもあり、それらをはっきりと同定するためにさらに分析を行うこともありうる（例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析法）。
【００１８】
ペプチドの配列を利用すれば、当該分野では周知のように、かかるペプチドが化学的に合成され、その代わりに、あるいはそれに加えて、組換えＤＮＡ技術を利用すれば、かかるペプチドが作製される。
【００１９】
ＭＳ分析のペプチド配列情報を利用すれば、ＮＳＣ−ＭＦのｃＤＮＡの単離及び配列決定が行われるであろう。
【００２０】
このようにして、当該分野で周知の適切な方法に基づいて、ＮＳＣ−ＭＦの単離、そのアミノ酸配列の決定、タンパク質の特徴決定を行ってもよい。これについては、これよりさらに詳しく述べる。
【００２１】
本発明のマイトジェンは、約８．７、１０．１、１１．８、１２．５、１３．６、３３．５、４５．３及び６７．１キロダルトン（ｋＤａ）から選択される分子量を有すると考えられている。
【００２２】
１つの好ましい態様においては、本発明のマイトジェンが有する分子量は、３０ｋＤを越える場合（「ＮＳＣ−ＭＦ−１」と称することもある）又は１０ｋＤ未満の場合（「ＮＳＣ−ＭＦ−２」と称することもある）のいずれかである。
【００２３】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）から得ることができる。
【００２４】
かかるマイトジェンは、セファロース４Ｂカラムクロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィーの技術を連続して使用して、混入している他のタンパク質から少なくとも部分的にかかるマイトジェンを精製する方法から得られるのが好ましい。
【００２５】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で増殖したＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）から得ることができる。
【００２６】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）でＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）を増殖させる方法であって、かかる細胞が約９０％の周密度を有した時点で、かかる血清含有培地を除去し、かかる細胞を無血清培地に曝露させることを特徴とする方法から得ることができる。
【００２７】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）でＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）を増殖させる方法であって、かかる細胞がおよそ９０％の周密度を有した時点で、かかる血清含有培地を除去し、かかる細胞を無血清培地に３６−４８時間曝露させることを特徴とする方法から得ることができる。
【００２８】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）でＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）を増殖させる方法であって、かかる細胞がおよそ９０％の周密度を有した時点で、かかる血清含有培地を除去し、かかる細胞を無血清培地に（好ましくは３６−４８時間）曝露させ、かかる培地を除去し、遠心分離を行い、ペレット状の細胞から回収された上清液を回収することを特徴とする方法から得ることができる。
【００２９】
ある好ましい態様においては、本発明のマイトジェンは、１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）でＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）を増殖させる方法であって、かかる細胞がおよそ９０％の周密度を有した時点で、かかる血清含有培地を除去し、かかる細胞を無血清培地に（好ましくは３６−４８時間）曝露させ、かかる培地を除去し、遠心分離を行い、ペレット状の細胞から回収された上清液を回収し、かかる培地を濾過することを特徴とする方法から得ることができる。
【００３０】
かかるマイトジェンは、組織培養培地に分泌され、１００℃での５分間の加熱に対して感受性を示し、０．２２μｍのフィルターによる濾過でも失われないものが好ましい。
【００３１】
（発現）
本発明のマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクターに組み込むなど、組換えＤＮＡ技術を用いて作製してもよい。発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含んでおり、また、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードする核酸と操作可能な状態で結合している。かかるプロモーターは、誘導可能又は構成的であってもよい。制限酵素で分解して元のＤＮＡからかかるプロモーターを除去すること、及びその単離したプロモーター配列をベクターに挿入することにより、かかるプロモーターは、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡと操作可能な状態で結合する。未変性マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用して、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡの直接的増幅及び／又は発現を起こしてもよい。
【００３２】
宿主の原核生物に用いる適切なプロモーターには、例えば、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターがある。それらのヌクレオチド配列は公開されているため、当業者は、核酸結合タンパク質をコードするＤＮＡにそうしたプロモーターを操作可能な状態で結合し、リンカー又はアダプターを用いて必要な制限部位を供給することができる。細菌系で使用するプロモーターには、一般的に、核酸結合タンパク質をコードするＤＮＡと操作可能な状態で結合しているＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列も含まれている。
【００３３】
好ましい発現ベクターは、細菌中で機能することが可能なｐｈａｇｅｘやＴ７などのバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広く使用されている発現系の１つにおいて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、融合タンパク質をコードする核酸をかかるベクターから転写してもよい（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５； ６０−８９， １９９０）。ｐＥＴベクターと連結して使用する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主株において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは宿主細菌のλ−溶原菌株ＤＥ３から産生され、その発現はＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。多くのタンパク質の過剰生産は、この系を用いて順調に行われてきた。その他、市販されているＣＥ６ファージ（アメリカ合衆国マディソン、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などのｉｎｔファージに感染させることにより、ポリメラーゼ遺伝子をラムダファージに導入してもよい。他のベクターとして、ＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＮＬ）などのラムダＰＬプロモーターを含むベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）若しくはｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＳＥ）などのプロモーターを含むベクター、又はｐＫＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）若しくはＰＭＡＬ（アメリカ合衆国マサチューセッツ州、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）などのｔａｃプロモーターを含むベクターが挙げられる。
【００３４】
また、本発明のマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）遺伝子は、ポリペプチドが封入体としてよりも可溶性の未変性ペプチドとして産生されるように、宿主細菌からのかかるポリペプチドの分泌を促すための分泌配列を含んでいるのが好ましい。かかるペプチドは、適切な細菌ペリプラズム空間又は培養培地より回収してもよい。「リーダー」ペプチドをＮ−末端フィンガーに添加してもよい。かかるリーダーペプチドは、ＭＡＥＥＫＰであるのが好ましい。
【００３５】
宿主酵母に使用する適切な配列は、調節されていても、又は構成的であってもよく、高い発現を示す酵母遺伝子、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子に由来するものが好ましい。このように、ＴＲＰ１遺伝子のプロモーター、ＡＤＨＩ遺伝子若しくはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子、ａ因子若しくはα因子をコードする酵母交配フェロモン遺伝子のプロモーター、又は、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ，３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ若しくはグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターなどの、解糖酵素をコードする遺伝子由来のプロモーター、又は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子由来のプロモーターを使用することができる。また、ある酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）及び別の酵母遺伝子の機能的なＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター要素からなるハイブリッドプロモーター、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳと酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的なＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター要素からなるハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することができる。適切な構成的ＰＨ０５プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３から始まりヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーター要素などの、上流活性化配列（ＵＡＳ）が欠如した短縮型（ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ）酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーターが挙げられる。
【００３６】
宿主哺乳動物におけるベクターからのマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）の転写にあたっては、宿主細胞系との共存が可能である限りにおいて、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、ウシ乳頭ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、レトロウィルス及びシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムに由来するプロモーターや、アクチンプロモーター又は例えばリボソームタンパク質プロモーターといった非常に強いプロモーターなどの異種哺乳動物プロモーターに由来するプロモーター、及び通常はマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）配列と会合するプロモーター由来のプロモーターによって制御を行ってもよい。
【００３７】
高等真核生物による、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡの転写を、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大させてもよい。エンハンサーは、比較的に、配置及び位置には非依存的である。哺乳動物の遺伝子に由来するエンハンサー配列は数多く知られている（例えば、エラスターゼやグロビン）。しかし、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点（ｂｐ１００−２７０）の後部側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）上のＳＶ４０エンハンサー、及びＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーが挙げられる。かかるエンハンサーをスプライスするベクター内の位置については、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）ＤＮＡの５’又は３’の位置でもよいが、かかるプロモーターから５’の部位に位置しているのが好ましい。
【００３８】
有利なことに、本発明のマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードする真核生物発現ベクターは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含んでいてもよい。ＬＣＲは、宿主細胞のクロマチンに組み込まれる導入遺伝子の、高レベルの組み込み部位非依存的発現を誘導することができる。これは、かかるベクターの染色体組み込みが起こった永久的トランスフェクション処理済真核細胞株において、又はトランスジェニック動物において、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）遺伝子が発現する場合には特に重要なことである。
【００３９】
真核生物ベクターは、転写の終了及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含んでいてもよい。かかる配列は一般的に、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び３’非翻訳領域から入手できる。こうした領域は、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを、核酸結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域中に含んでいる。
【００４０】
発現ベクターは、ＤＮＡを発現できるプロモーター領域など、操作可能な状態で制御配列と結合したマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）核酸を発現できるものであれば、どのようなベクターでもよい。このように、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウィルス又はその他のベクターなどの組換えＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトであり、適切な宿主細胞へ導入すると、クローン化ＤＮＡが発現する。適切な発現ベクターは、当該分野で通常の技能を有する者にはよく知られており、真核細胞及び／又は原核細胞中で複製可能なもの、並びにエピソームを保持し続けているもの、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるものなどが例示できる。例えば、ｃＤＮＡを哺乳類細胞中で発現させるのに適切なベクター、例えばｐＥＶＲＦなどのＣＭＶエンハンサー系のベクターに、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡを挿入してもよい（Ｍａｔｔｈｉａｓ， ｅｔ ａｌ．， （１９８９） ＮＡＲ １７， ６４１８）。
【００４１】
本発明を実施するにあたって特に有用なのは、哺乳動物細胞中で、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡの一過性発現をもたらす発現ベクターである。通常、一過性発現には、宿主細胞が発現ベクターのコピーを多数蓄積できるように、宿主細胞中で効率よく複製を行える発現ベクターの使用が伴うが、その一方で、核酸結合タンパク質が高いレベルで合成されている。本発明の目的を考慮すると、一過性発現系は、例えば、マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）変異体の同定、潜在的なリン酸化部位の同定、又はかかるタンパク質の機能領域の特徴づけに有用である。
【００４２】
本発明のベクターを構築する際には従来の結合技術を用いる。単離したプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、調節し、必要とするプラスミドを作製するのに望ましい形で結合する。必要であれば、構築したプラスミド中の配列が正しいものかどうかを既知の方法で分析して確認する。当業者であれば、発現ベクターの構築、インビトロでの転写物の調製、ＤＮＡの宿主細胞への導入、及びマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）発現及び機能を査定するための分析についての適切な方法を知っている。例えば、本明細書中の配列に基づく適切な標識プローブを使用した、サザンブロッティングやノーザンブロッティングなどの従来の方法によるｍＲＮＡ転写の定量、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、遺伝子の存在、増幅及び／又は発現の測定をサンプル中で直接行ってもよい。当業者であれば、これらの方法を必要に応じてどのように改良したらよいか、即座に思い浮かぶであろう。
【００４３】
本発明の他の実施形態によると、上記核酸を含む細胞が提供される。そのような宿主細胞、例えば原核細胞、酵母、高級真核細胞などを用いて、ＤＮＡの複製や核酸結合タンパク質の産生を行ってもよい。適切な原核生物には、グラム陰性菌やグラム陽性菌のような真性細菌、例えば大腸菌Ｋ−１２株のような大腸菌、ＤＨ５ａ及びＨＢ１０１、又は桿菌がある。ベクターをコードするマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）用の適切な宿主としては、糸状菌や、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母といった、真核微生物が挙げられる。高級真核細胞としては、昆虫細胞、脊椎動物細胞、特にヒトの細胞をはじめとする哺乳動物細胞、又は他の多細胞生物の有核細胞が挙げられる。近年では、培養（組織培養）によって脊椎動物細胞を増殖させるのは一般的な手順となっている。有用な宿主哺乳動物細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３Ｔ細胞などの、上皮細胞株や線維芽細胞株がある。本開示においては、宿主動物体内の細胞だけではなく、インビトロで培養した細胞も宿主細胞に含まれる。
【００４４】
当該分野において公知の方法を使用して、ＤＮＡを安定的に細胞に組み込んでもよく、また、ＤＮＡを一過性に発現させてもよい。選択マーカー遺伝子をもつ発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、該マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下でかかるトランスフェクションした細胞を増殖させることにより、安定的にトランスフェクションした哺乳類細胞を調製してもよい。一過性の形質転換体を調製するため、レポーター遺伝子で哺乳類細胞をトランスフェクションし、トランスフェクション効率をモニターする。
【００４５】
かかる安定的又は一過性トランスフェクションを行った細胞を作製するためには、充分な量の核酸結合タンパク質をコードする核酸を用いて細胞をトランスフェクションし、かかる核酸結合タンパク質を形成しなくてはならない。マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）をコードするＤＮＡの正確な量については、特定の細胞や分析法に応じて、経験に基づいて決定又は最適化を行ってもよい。
【００４６】
上記本発明の発現ベクター又はクローニングベクターを用いて、宿主細胞をトランスフェクション、好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は目的の配列をコードする遺伝子の増幅を行うために従来の栄養培地に適宜改良を加えた培地で培養する。リン酸カルシウム共沈殿法やエレクトロポレーションにより、異種ＤＮＡをコードするベクターでトランスフェクションを行うなど、当該分野において公知の方法で異種ＤＮＡを宿主細胞に導入してもよい。当該分野の熟練者の間には多数のトランスフェクション法が知られている。トランスフェクションが成功したかどうかは、一般に、このベクターによる作用が生じたという徴候が宿主細胞中に認められたときに確認される。使用した特定の宿主細胞に適切な標準的方法を用いて、形質転換を行う。
【００４７】
クローン化ＤＮＡの適切な発現ベクターへの組み込み、プラスミドベクター又はそれぞれが１つ以上の異なる遺伝子又は線状化ＤＮＡをコードするプラスミドベクターを組み合わせたものを用いた真核細胞のトランスフェクション、及びトランスフェクションした細胞の選択は、当該分野ではよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４８】
トランスフェクション又は形質転換を行った細胞を、当該分野で公知の培地及び培養法を使用し、好ましくは、ＤＮＡがコードするマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）が発現するような条件下で培養する。適切な培地の組成は当業者には周知であるため、即座に調製可能である。適切な培養培地は市販もされている。
【００４９】
別の態様においては、ＮＳＣ−ＭＦの発現を誘導できる核酸コンストラクトは、ベクター、好ましくはウィルスベクター、さらに好ましくはレトロウィルスベクターを用いて投与される。非常に好ましい実施形態においては、ＮＳＣ−ＭＦの発現を誘導できる核酸コンストラクトは、神経細胞などの非分裂哺乳動物細胞を感染させられるレトロウィルスベクターを用いて投与される。
【００５０】
トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションなど当該分野で公知の各種方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入してもよい。本発明のポリヌクレオチドを動物に投与する場合には、例えば、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス及びアデノウィルスなどの組換え型ウィルスベクターを用いた感染、核酸の直接注入、及び遺伝子銃による形質転換など、いくつかの方法が当該分野で知られている。
【００５１】
伝達系を用いて、本発明の分子を適切な宿主細胞に導入してもよい。かかる伝達系はウィルス伝達系でもよい。ウィルス伝達系には、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
適切な組換え型ウィルスベクターには、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、バキュロウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、又はパルボウィルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｋｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ １９９９ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０ （１０）： １６１９−３２を参照のこと）。ウィルスベクターの場合、遺伝子の伝達は標的細胞のウィルス感染により媒介されるのが典型的である。
【００５３】
（レトロウィルスベクター）
レトロウィルスの例としては、マウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウィルス（ＦｕＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｙマウス白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウィルス（ＦＢＲ　ＭＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｙマウス肉腫ウィルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウィルス２９（ＭＣ２９）、及びトリ赤芽球症ウィルス（ＡＥＶ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
したがって本発明に使用するベクターとしては、組換え型ウィルスベクター、特にレンチウィルスベクターなどの特定の組換え型レトロウィルスベクター（ＲＲＶ）が好ましい。
【００５５】
「組換え型レトロウィルスベクター」（ＲＲＶ）という語は、パッケージング成分の存在下において、標的細胞を感染させられるウィルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングが可能なほど充分なレトロウィルスの遺伝子情報をもつベクターを指している。標的細胞の感染には、逆転写及び標的細胞のゲノムへの組み込みも含まれる。かかるＲＲＶは、当該ベクターによって標的細胞へと伝達される非ウィルスコード配列を有している。ＲＲＶは、最終標的細胞内で伝染性レトロウィルス粒子を生産するための個別複製を行うことができない。通常、ＲＲＶには、複製に不可欠な機能的ｇａｐ−ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子及び／又はその他の遺伝子が欠如している。
【００５６】
レトロウィルスについての詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ （”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ” １９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ： ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）にて見ることができる。
【００５７】
その他に、かかる伝達系は、プラスミド、染色体又は人工染色体などのＤＮＡトランスフェクション法を一例とする非ウィルス伝達系であってもよい。ここでトランスフェクションとは、非ウィルスベクターを用いて遺伝子を標的哺乳動物細胞へ伝達するプロセスを含むものである。典型的なトランスフェクション法には、エレクトロポレーション、ＤＮＡ遺伝子銃、脂質媒介トランスフェクション、圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン性物質媒介、カチオン性表面両親媒性物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｆａｃｉａｌ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９６ １４； ５５６）及びそれらを組み合わせたものがある。
【００５８】
（分析法）
各種薬剤スクリーニング法のいずれかにより、ＮＳＣ−ＭＦの調節又はＮＳＣ−ＭＦとの相互作用が可能な試薬を同定する際には、アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など、適切な標的を１つ以上用いてもよい。かかる実験に使用される標的は、溶液中で遊離状態であっても、固体支持体に添付されていても、細胞表面上にあっても、細胞内に局在していてもよい。標的活性の消失又はかかる標的と実験に用いた試薬との結合複合体の形成が認められる場合がある。
【００５９】
本発明の分析法は、多数の試薬を検査するスクリーニングであってもよい。ある態様においては、本発明の分析法は、処理能力の高いスクリーニングといえる。
【００６０】
薬剤のスクリーニング法は、１９８４年９月１３日に公開された、Ｇｅｙｓｅｎの欧州特許出願第８４／０３５６４号に記載の方法に基づくものであってもよい。かかる方法を以下に簡潔に述べる。大量の各種小型ペプチド被験化合物を、プラスチックのピンやその他の表面など、固体基質上で合成する。かかるペプチド被験化合物を適切な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、当該分野で周知の方法を適宜採用して、結合した物質を検出する。薬剤のスクリーニングに使用するため、精製した標的をプレート上に直接コーティングすることもできる。その他に、非中和抗体を使用してかかるペプチドを捕獲し、固体支持体上で固定化することができる。
【００６１】
本発明は、標的と結合できる中和抗体が標的結合用の被験化合物と特異的に競合する、競合的な薬剤スクリーニング方法の使用についても考慮している。
【００６２】
別のスクリーニング方法は、かかる物質に対して適切な結合親和性を有する試薬の処理能力の高いスクリーニング（ＨＴＳ）を提供するものであり、ＷＯ−Ａ−８４／０３５６４に詳述されている方法に基づいている。
【００６３】
本発明の分析方法は、定量分析の場合と同様に、被験化合物の大規模及び小規模スクリーニングの両方に適していると予想される。
１つの好ましい態様においては、本発明は、ＮＳＣ−ＭＦの調節又はＮＳＣ−ＭＦとの相互作用を選択的に行う試薬の同定方法に関する。
使用してもよい分析方法の別の例としては、ＷＯ−Ａ−９８４９２７１に記載された、不死化ヒト奇形癌ＣＮＳ神経細胞株に関するものがあり、かかる細胞株は、高いレベルの神経細胞分化が生じるとされており、ＮＳＣ−ＭＦに結合する化合物を検出するのに有用である。
【００６４】
（ＮＳＣ−ＭＦの、分裂促進特性）
神経幹細胞（ＮＳＣ）群用マイトジェンとして作用するＮＳＣ−ＭＦの潜在能力を、ここに記載した方法で測定してもよい。学説にとらわれずに考えると、ＮＳＣ−ＭＦは分裂促進作用を他の細胞群だけではなく幹細胞群にも及ぼしていると思われる。例えば、ＮＳＣ−ＭＦは、筋肉細胞又は筋肉細胞由来細胞株に、そして他の細胞型にも分裂促進作用を及ぼしていると考えられる。
【００６５】
ＮＳＣ−ＭＦは、本明細書の図などにおいて、プロリフェリン、因子Ｘ又はＦ−Ｘと称されている場合がある。これらの語句は同意語であり、本発明のＮＳＣ−ＭＦを指すものである。
【００６６】
他の幹細胞群に及ぼす作用を調べることで、分裂促進に関するＮＳＣ−ＭＦのあらゆる潜在能力を査定することが望ましい。
【００６７】
ここに開示したように、ＮＳＣ−ＭＦはマイトジェンとして有用である。さらに、ＮＳＣ−ＭＦは他の分裂促進シグナルの促進という点で有用であることもここで開示している。ＮＳＣ−ＭＦの非存在下で必要とされる濃度よりも低い濃度のある特定の因子をＮＳＣ−ＭＦの存在下で用いることも、促進のうちに含まれる。また、相乗効果、すなわち、別の因子に加えてＮＳＣ−ＭＦを用いた場合に生じた効果は、かかる二つの因子を別個に用いた場合の効果の和よりも大きくなることも含まれる。分裂促進シグナル又はマイトジェンが有する１つ以上の作用の調節、増強、増大又は変容も促進のうちに含まれる。ここでは、促進及び増大という語句は同意語として使われている。
【００６８】
ＮＳＣ−ＭＦは、神経幹細胞のマイトジェンである。
ＮＳＣ−ＭＦの本質は、ここに記載したその特徴との関連で理解されている。
ＮＳＣ−ＭＦのアミノ酸配列は、ここに記載したとおり、入手可能である。
【００６９】
好ましい実施形態においては、ＮＳＣ−ＭＦは、ＬＩＦやＧＭ−ＣＳＦなどの他の幹細胞マイトジェンとの間で相乗作用を示す。非常に好ましい実施形態においては、ＮＳＣ−ＭＦは、ヒト胚幹細胞、造血幹細胞などの他の幹細胞群、及び他のＣＮＳ神経幹細胞群の潜在的増殖力を有意に増大させる。
【００７０】
本発明によると、幹細胞群がＮＳＣ−ＭＦ応答性かどうかが確認される。一例を挙げると、前脳ＮＳＣに及ぼすＮＳＣ−ＭＦの効果が示されたのと同様の方法、例えばヒト腫瘍細胞株ＨＴ１０８０由来の条件培地（すなわちＮＳＣ−ＭＦを含むもの）を用いた方法によって行われた分裂促進活性の検出を介して、この確認は行われる。
【００７１】
ＮＳＣ−ＭＦは、ラット腹側前脳のＮＳＣの増殖を促進する。
【００７２】
重要なことに、ＮＳＣ−ＭＦは他のマイトジェンと比べて、神経細胞をもたらす前駆細胞の数を増加させるようである。すなわち、ＮＳＣ−ＭＦは、神経細胞の前駆細胞を優先的に刺激する。
【００７３】
ＮＳＣ−ＭＦを単独で使用した場合と他のＮＳＣマイトジェンと組み合わせて使用した場合の両方について、下記のＮＳＣ群の少なくとも１つ又は他の適切な細胞群に対するその作用の査定を行ってもよい。
【００７４】
腹側中脳――脳のこの部位は、パーキンソン病で選択的に失われる神経細胞であるドーパミン（ＤＡ）含有神経細胞の供給源となっている。胎児のドーパミン含有細胞を移植するとパーキンソン病患者の症状が有意に改善するのであれば、ＤＡ神経細胞をインビトロで濃縮する条件を見出すために、商業的にも学術的にも多大な努力が払われる。これまで、齧歯類及びヒトの神経幹細胞からのドーパミン含有神経細胞の取り出しは、どちらもほぼ全面的に不成功に終わっている。重要な考察対象の１つとして、不適切な培養条件（例えば、決定的因子の欠如）という原因があると思われる。ＮＳＣ−ＭＦはＤＡ神経細胞前駆細胞の増殖を促進する場合がある。
【００７５】
脊髄――ＦＧＦ−２を使用すると、脊髄ＮＳＣの限定的増殖が認められた。一方、ＦＧＦ−２を粗ニワトリ胚抽出液（ＣＥＥ）と組み合わせると、より大規模な増殖が認められた。ＣＥＥによるＦＧＦ−２の促進は、ＦＧＦ−２及びＮＳＣ−ＭＦを前脳ＮＳＣに使用したときに認められたものと類似している。したがって、ＮＳＣ−ＭＦは脊髄幹細胞に類似した作用を及ぼすのかもしれない。脊髄損傷の機能回復及び脊髄移植の可能性への関心を思えば、ＮＳＣ−ＭＦによる脊髄ＮＳＣの増殖促進の上限を測定するのは、明らかに望ましいことである。
【００７６】
組織培養用品（例えば、プラスチック製品、ラミニン、Ｎ２サプリメント、ＦＧＦ−２）は、一般に、当該分野の市販品が利用できる。中脳及び脊髄の神経幹細胞はともに、前脳ＮＳＣ培養で用いた動物の胎児から入手可能である。これらの細胞の増殖方法（すなわち、培養条件など）は、前脳幹細胞培養の場合に用いたものと同様であるが、必要に応じてここに記載した改良を施してある。
【００７７】
ＮＳＣ−ＭＦは、ＬＩＦがＮＳＣに及ぼす分裂促進作用を促進する。重要なことに、ＬＩＦはマウス胚幹（ＥＳ）細胞の絶対的なマイトジェンでもあり、ＥＳ細胞を未分化の状態に保っている。ＥＳ細胞とは最も原始的な全能性幹細胞のことであり、原則として、あらゆる組織特異的幹細胞群、したがって、全生物のあらゆる細胞型となることができる。近年、全能性で増殖性のヒトＥＳ細胞株が作製された。ＮＳＣ−ＭＦは、ＥＳ細胞培養においてＬＩＦの分裂促進作用を代替又は促進できる場合があり、マウスＥＳ細胞の効果的なマイトジェンでいえるのかもしれない。ここに記載した当該分野で周知の方法を用いて、こうした特性の特徴づけをさらに行ってもよい。
【００７８】
確定したプロトコルにしたがって、ＥＳ細胞を培養してもよい（例えば、Ｎｉｗａ Ｈ， Ｂｕｒｄｏｎ Ｔ， Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｉ， Ｓｍｉｔｈ Ａ．　Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３．　Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９８ Ｊｕｌ １；１２ （１３）： ２０４８−６０）。これらの条件は神経幹細胞を培養する場合とは異なるため、培地、成長因子、及び補充物質は、適切な納入業者から別々に購入してもよい。マウス胚幹細胞株は、ＡＴＣＣ、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ社から購入してもよく、ヒト胚幹細胞株は、ウィスコンシン大学で作製してもよい（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０００， ３， ｐｇ ２３７）。
【００７９】
本発明の方法を改変神経細胞の作製に有効に応用してもよい。トランスフェクションを行った神経細胞など、遺伝的に改変した神経細胞を作製する従来の試みは、これまで比較的不成功に終わっている。本発明のマイトジェン（例えばＮＮＳＣ−ＭＦ）の存在下で細胞を培養し、遺伝的変化を起こさせる（例えば、リポフェクトアミンやエレクトロトランスフェクションなどによるトランスフェクション又は当業者には周知の他の適切な方法）ことにより、本発明の方法をこの問題点に応用してもよい。例えばプレセニリン変異型神経細胞株の作製にこれを有効に応用してもよい。また、ＮＳＣ−ＭＦは、神経細胞のレトロウィルスによる改変を促進することがある。これについては本明細書中の適切な箇所で記載する。
【００８０】
ＮＳＣ−ＭＦのクローニング、シーケンシング及び特徴づけは、ここに記載の方法及び当該分野で周知の適切な方法で行ってもよい。
【００８１】
ＮＳＣ−ＭＦを均質になるまで精製し、そのアミノ酸配列を決定してもよい。この情報により、対応するＮＳＣ−ＭＦのｃＤＮＡ及び／又は遺伝子の単離及び配列決定を容易に行えるようになる。
【００８２】
タンパク質／ＤＮＡデータベースで配列相同性が一致するものを検索する際に、アミノ酸配列情報を使用してもよい。
分子プローブは、かかるアミノ酸配列情報に基づいて設計してもよい。例えば、かかる腫瘍細胞株自体から作製されたｃＤＮＡライブラリー、又は目的とする他のライブラリーのスクリーニングにこれらを用いてもよい。
【００８３】
ＮＳＣ−ＭＦは、幹細胞に対して分裂促進作用を及ぼす新規タンパク質／遺伝子である。
ＮＳＣ−ＭＦは、神経幹細胞に対する強力な分裂促進タンパク質である。
【００８４】
学説にとらわれずに考えると、本発明は下記の実施形態において有効と思われる。
【００８５】
ヒト胚盤胞由来ＥＳ細胞の増殖にはマウス線維芽細胞の支持細胞層が必要であることが、最近になって判明している。支持細胞層の非存在下では、ＬＩＦを培養培地に添加しただけでは効果がない。ＮＳＣ−ＭＦの供給源がヒト線維芽細胞株であることから、ＮＳＣ−ＭＦはヒトＥＳ細胞にとって必要な因子ではないかと思われる。それに加えて、又はその代わりに、別の因子がＬＩＦの作用を促進する粗条件培地中に存在するのかもしれない。ここに記載の方法で入手したＮＳＣ−ＭＦを含む培地のＨＰＬＣ画分及び又は／ＮＳＣ−ＭＦ単独のＨＰＬＣ画分によって、ヒトＥＳ細胞の増殖が引き起こされるかもしれない。
【００８６】
ＮＳＣ−ＭＦは、神経幹細胞以外の種々の幹細胞に対して分裂促進作用を有している。ＮＳＣ−ＭＦは、造血幹細胞（ＨＳＣ）に対して分裂促進作用を有しているかもしれない。こうした細胞は、全造血系を多系統で再構成できる。一般に、ＨＳＣはインビトロでは満足に増殖せず、ＨＳＣの増殖には、複雑な培養条件（例えば、間質細胞株の成長）が必要とされてきた。最近、いくつかのマイトジェン（例えば、ＩＬ−１１、Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ、トロンボポエチン）が懸濁液におけるこれらの細胞の短期増殖を支えていることがわかったが、これらの細胞の長期増殖についてはいまだに解明されていない。ＮＳＣ−ＭＦは、ＨＣＳマイトジェンとして作用するのかもしれない。
【００８７】
親ＥＳ細胞からの組織特異的幹細胞群の誘導は、ＮＳＣ−ＭＦを用いると促進されることがある。神経細胞様細胞がヒトＥＳ細胞をはじめとするＥＳ細胞群から単離される場合があることが、近年報告されている。ＥＳ細胞由来ＮＳＣには、組織由来ＮＳＣと比較して数多くの利点がある。ヒトの細胞の場合、早期人工妊娠中絶などから胎児脳組織を得る必要がなくなる。さらに多能なＮＳＣ、すなわち、胎児脳から単離したＮＳＣよりも多くのタイプのＣＮＳ細胞を作製する能力を有するＮＳＣを作製する能力もある。ＮＳＣ−ＭＦを単独であるいは他の既知の神経幹細胞マイトジェンと組み合わせて使用すると、ＥＳ細胞から長期増殖性ＮＳＣを作製することができるかもしれない。これらの研究はマウスＥＳ細胞及び／又はヒトの細胞を用いて行ってもよい。
【００８８】
遺伝子療法への応用にあたって核酸コンストラクトの伝達に幹細胞を使用してもよいことは知られている。特に、神経幹細胞／ＣＮＳ幹細胞をそうした方法に使用してもよい。一例として、哺乳動物のグリア芽腫へのＩＬ−４（インターロイキン４）遺伝子の伝達にＣＮＳ幹細胞を使用する場合が挙げられる。これにより腫瘍が縮小し、関連の死亡率も低下した（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ａｐｒｉｌ ２０００， ｐ． ４４７を参照のこと）。本発明のマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）がかかる幹細胞の調製及び／又は増殖に有用であるのは明らかである。有利なことに、かかる細胞が本発明のマイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）を含んでいる場合さえある。
【００８９】
さらに、本発明は、ＮＳＣ−ＭＦのレセプターの同定、応答性細胞が使用する細胞内シグナル伝達経路、ＮＳＣ−ＭＦの標的エフェクター、ＮＳＣにおけるＮＳＣ−ＭＦ誘導性増殖及び関連分野の研究において有用であると思われる。
かかるレセプター又はシグナル伝達経路の研究により、例えば、癌治療、癌のスクリーニング、抗癌薬学、ＣＮＳ薬剤、又は他の関連分野における、商業上の新たな開発目標が生じるかもしれない。
【００９０】
ＮＳＣ−ＭＦは非常に重要な因子であり、その細胞の状態に応じた無数の細胞作用を有している場合がある。
【００９１】
ＮＳＣ−ＭＦは、かなりの商業的可能性を秘めている。
【００９２】
これより本発明を説明するが、これはほんの一例であり、場合によって下記の図を参照する。
【００９３】
図１、棒グラフを示すもの、
図２、棒グラフを示すもの、
図３、グラフを示すもの、
図４、写真を示すもの、
図５、写真を示すもの、
図６、スキャッタープロットを示すもの、
図７、グラフを示すもの、
図８、棒グラフを示すもの、
図９、写真を示すもの、
図１０、棒グラフを示すもの、
図１１、棒グラフを示すもの、
図１２、棒グラフを示すもの、
図１３、棒グラフを示すもの、
図１４、棒グラフを示すもの、
図１５、棒グラフを示すもの、
図１６、棒グラフを示すもの、及び
図１７、ＭＡＬＤＩのプロフィールを示すもの。
【００９４】
実施例
セクションＡ
【００９５】
実施例１：ＮＳＣ−ＭＦの調製
ここに記載したとおり、ヒト線維肉腫細胞株であるＨＴ１０８０の条件培地には、神経幹細胞マイトジェンが含まれている。
これらの細胞に由来する条件培地の１０％希釈物を線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）と併用すると、ＦＧＦ−２を単独で使用した場合と比較して、齧歯類の前脳神経幹細胞／前駆細胞（ＮＳＣ）の数が増大する（図１を参照のこと）。
一連の研究を行い、ＮＳＣ−ＭＦを同定する。
本実施例において、ＮＳＣ−ＭＦは、１０％のウシ胎児血清を含むＨＴ１０８０細胞由来の条件培地にて調製されている。
【００９６】
（ＮＳＣ−ＭＦの調製）
１０％のＦＣＳ（抗生物質無添加）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を入れた２２５ｃｍ２のフラスコで、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＩ−１２１）を増殖させる。細胞の周密度が約９０％となった時点で、血清含有培地を除去して細胞を無血清培地に３６−４８時間曝露する。かかる培地を除去して１０００ｇで遠心分離を行い、ペレット状の細胞から上清液を回収する。かかる培地を０．２２μｍのフィルターで濾過して、そのまま直接使用するか、又は、使用時まで−７０℃で凍結しておく。
【００９７】
分裂促進活性（すなわちＮＳＣ−ＭＦ）が、組織培養培地中に分泌していること、１００℃での５分間の加熱に感受性を示すこと、０．２２μｍのフィルターで濾過しても残ることがわかっている。こうした特徴は、分泌タンパク質を連想させる。
【００９８】
ＮＳＣ−ＭＦの単離を促進するため、ＨＴ１０８０細胞を無血清条件下で増殖させるのに必要な条件を決定する。無血清条件培地と血清含有条件培地（ＦＧＦ−２を組み合わせたもの）との直接比較では、ＮＳＣの増殖に有意な差異は見られない。このことは、この二つの条件培地に存在するＮＳＣ−ＭＦの濃度がほぼ同一であることを示唆している。次に概述する研究は、無血清条件培地（ＮＳＣ−ＭＦ）を用いて行われている。
【００９９】
このように、ここに開示した新規神経幹細胞マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）は、ヒト腫瘍細胞株由来の細胞により分泌されるものである。上記のとおり調製したこれらの細胞由来の条件培地を使用すると、最も広範囲に使用されている市販の神経幹細胞マイトジェンの１つである線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）を用いて得られる数と比較して、齧歯類の前脳神経幹細胞／前駆細胞（ＮＳＣ）の数が有意に増大する。
【０１００】
活性を示すＣＮＳ幹細胞マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ）は、ここに開示したとおり、腫瘍由来細胞株の条件培地中に存在している。ＮＳＣ−ＭＦはかかる培地に分泌し、熱による不活化に感受性を示しており、分泌タンパク質であると思わせる。ＮＳＣ−ＭＦはまた、細胞が無血清培地に曝露される際には培養培地にも分泌する。無血清条件培地と血清含有条件培地との直接比較では、神経幹細胞の増殖に有意な差異は見られない。このことは、この二つの培地に存在するＮＳＣ−ＭＦの濃度がほぼ同程度であることを示唆している。これは、さらにＮＳＣ−ＭＦの特徴を決定するにあたって、非常に有用なことである。下記の研究では、無血清条件培地を使用している（ＮＳＣ−ＭＦ）。
【０１０１】
（ＮＳＣ−ＭＦの単離及び特徴づけ）
無血清条件培養培地のＨＰＬＣ及び質量分析法を利用して、ＮＳＣ−ＭＦの特徴づけを行う。
【０１０２】
ＨＰＬＣでは、７０分間に少なくとも９つの大きなピークが認められる。
細胞上清液（これは上記のとおり調製したＮＳＣ−ＭＦの一例である）及び透析したサンプルの質量分析により、約８．７、１０．１、１１．８、１２．５、１３．６、３３．５、４５．３、及び６７．１キロダルトンの分子量をもつ、少なくとも８つの大きなタンパク質のピークが明らかになっている。この分析は少なくとも３回繰返され、本質的に同一の結果が得られている。
【０１０３】
ＮＳＣ−ＭＦを精製して均一にするために、条件培地を凍結乾燥し、濃縮し、ＵＶ検出を伴うＨＰＬＣにかける。
約２００ｍｌの無血清条件培地を一晩凍結乾燥させる。５ｍｌの０．０５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸中で、残さを再構成する。かかる溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、この溶液４ｍｌをＨＰＬＣで精製する。
【０１０４】
ＨＰＬＣの条件には、逆相Ｃ１８カラム、５ｍ、３００Å、２１×２４０ｍｍカラムが含まれる。緩衝液Ａは０．０５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸であり、緩衝液Ｂは１０％の緩衝液Ａ＋９０％のアセトニトリルである。排出液をダイオードアレー（２００ｎｍ−４００ｎｍ）でモニターし、流速を７ｍｌ／分とする。０％Ｂから９０％Ｂまで、４０分間にわたって線形勾配を用いる。この手順において一連の連続した４つの画分を単離する。それらの画分はそれぞれカラムから約７−１５分（画分１）、１５−２８分（画分２）、２８−４０分（画分３）、４０−５０分（画分４）に相当している。画分を回収して一晩凍結乾燥させた後、使用に先だって水中で再構成する。
【０１０５】
この手順において一連の連続した４つの画分を単離する。それらの画分はそれぞれカラムからの溶出が約７−１５分（画分１）、１５−２８分（画分２）、２８−４０分（画分３）、４０−５０分（画分４）に相当している（ＨＰＬＣプロフィールについては、図７を参照のこと）。
本発明者らの前脳ＮＳＣ増殖分析法を使用して、これらの画分の分裂促進活性を調べてみる。前脳ＮＳＣを下記のとおり調製する。
【０１０６】
文献（Ｍｉｎｇｅｒ ＳＬ， Ｆｉｓｈｅｒ ＬＪ， Ｒａｙ Ｊ， Ｇａｇｅ ＦＨ．　Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２．　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９６ Ｓｅｐ； １４１ （１）： １２−２４）記載の方法に、ここに述べるとおりの改良を施した方法により、胎児腹側前脳細胞培養物を調製する。すなわち、妊娠日数１３．５−１４（Ｅ１４）のＦｉｓｈｅｒ３４４ラット胎児（頭殿長９−１１ｍｍ）について、透明中膜を含む腹側前脳の脳室帯を、隣接する線条体原基及び淡蒼球原基、並びにその周囲の皮質外套から慎重に切り離す。組織を回収し、無菌のＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れ、ＰＢＳで軽く洗浄した後、０．１％のトリプシン／ＰＢＳ中で、３０分間３７℃でインキュベーションする。その後、かかる組織の洗浄、１０００ｇでの沈殿、及びＰＢＳ−グルコースでの再懸濁を３回行い、先端を細くしたパスツールピペットを数種類使用してピペッティングを繰り返すことによりかかる組織を分離して、単個細胞懸濁液とする。トリパンブルーを排除して血球計算法により細胞を計数し、細胞生存率を測定する。
【０１０７】
組織培養フラスコ、マルチウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ社製）、又は必要な場合には直径１３ｍｍのガラス製カバースリップ（ＢＤＨ／Ｍｅｒｃｋ社製）において、標準培養条件下で前脳細胞を増殖させる。これらの器具はすべて、１０μｇ／ｍｌのポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ社製）及び１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）であらかじめコーティングされている。Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２高グルコース培地（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）中で、９５％空気／５％ＣＯ２の加湿雰囲気条件下で、細胞を増殖させる。３〜４日ごとに培地を交換し、細胞が周密する前に継代を行う。この手順で調製した細胞を用いてここに記載の分析を行う。ＮＳＣ増殖分析は、下記のように行われる。
【０１０８】
脳から採取した直後の細胞を、５×１０３個／ウェル（２．６３×１０３個／ｃｍ２）となるように、Ｐ＋Ｌであらかじめコーティングした２４ウェルプレートに入れ、その際に因子も添加する。かかる培地は３日ごとに全部交換する。細胞を毎日モニターし、因子のいずれかにより細胞密度が８０−９０％に達した時点で培養物を処理する（通常は、ウェルに入れてから９−１２日後）。単独であるいは組み合わせて用いている因子又はマイトジェンは下記のとおりである。ヘパリン（０．０５−２．０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社製）、ヘパリン線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ、１０−２０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、組換え型上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、組換え型マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１−１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型マウス血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、１−１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型ヒトインシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型ヒト線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型ヒトトロンボポエチン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、及び組換え型ヒトニューロトロフィン３（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）。
【０１０９】
各実験において１つの条件につき６個のウェルを使用し、かかる実験を少なくとも２回繰り返す。粗無血清条件培地由来のＮＳＣ−ＭＦを単独で使用する際は、ＦＧＦ−２含有培地の場合には１：１０に希釈して用い、Ｎ２含有培地の場合には５０％で用いる。各ウェルの細胞の周密度が８０−９０％に到達したようであれば、０．１ｍｇのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、Ｓｉｇｍａ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、英国、プール）を各ウェルに添加する。３７℃で４時間のインキュベーションを行った後、かかる培地を除去し、５００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ社製、英国、ラッターワース）を各ウェルに添加し、ピペットで激しく混ぜ合わせる。各ウェルから１００μｌずつ取り出して、新しい９６ウェルプレートに移し、６３０ｎｍでの吸光度を測定する。コントロール用のブランクは、細胞を含まないすべての溶液を添加したもので構成されている。各実験は陽性コントロールとしてＦＧＦ−２中で増殖した細胞を使用しており、各種因子／マイトジェン間の比較は、ＦＧＦ−２を単独で用いた場合に観察されるものを基準としている。
【０１１０】
ＮＳＣ−ＭＦと比較した場合の、各種因子の相対的な分裂促進効果を測定するため、関連する因子／既知のマイトジェンの存在下／非存在下で増殖した細胞を用いて、上記のとおりＭＴＴ分析を行う。これについては、実施例２で詳しく述べる。
【０１１１】
ＮＳＣ−ＭＦ（条件培地）のＨＬＰＣ画分の分裂促進活性を、単独の場合及びＦＧＦ−２と組み合わせた場合の両方について調べてみる。
【０１１２】
ＮＳＣ−ＭＦが精製により均一になるまで、分裂促進活性を含む画分をさらに精製し、質量分析にかける。
ＨＬＰＣ及び質量分析法を用いて、無血清条件培養培地からＮＳＣ−ＭＦを精製する。ＨＰＬＣを用いた場合は、９つの大きなピークが認められる。
粗上清液及び透析したサンプルの質量分析により、約８．７、１０．１、１１．８、１２．５、１３．６、３３．５、４５．３、及び６７．１キロダルトンの分子量をもつ、少なくとも８つの大きなタンパク質のピークが明らかになっている。この分析は少なくとも３回繰返され、その都度、本質的に同一の結果が得られている。ＨＰＬＣ勾配の前後の時間間隔で得られる一連の連続画分について、その分裂促進活性を分析する（単独使用の場合とＦＧＦ−２との併用の場合の両方）。この分析により、注意を集中すべき候補タンパク質の数が少なくなり、条件培地中のマイトジェン（すなわち、ＮＳＣ−ＭＦ及び／又はその他の、又は関連するマイトジェン）の同定が容易になる。
よって、ＮＳＣ−ＭＦは、新規神経幹細胞マイトジェンである。
ＮＳＣ−ＭＦは、ここに開示する特性により同定される。
ＮＳＣ−ＭＦの特定の（例えば分子的な）特性は、上記の方法によって及び下記の実施例において測定される。
【０１１３】
実施例２：ＮＳＣ−ＭＦの使用
ここに示したように、ＮＳＣ−ＭＦはマイトジェンとして有用である。ここではさらに、ＮＳＣ−ＭＦが他の分裂促進シグナルの促進にも有用であることについても開示する。
【０１１４】
（ＮＳＣ−ＭＦと既知のマイトジェンとの併用）
ＨＴ１０８０条件培地中の分裂促進活性が、以前に同定されたＮＳＣマイトジェンによるものというよりは、ＮＳＣ−ＭＦによるものであることを示すために、ＮＳＣ−ＭＦと数種類の市販のマイトジェンとの直接比較を行う。ポリオルニチン及びラミニン（Ｐ＋Ｌ）の確定基質でのＮＳＣの増殖、Ｎ２神経細胞サプリメントを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の使用を含め、この実施例では、前脳ＮＳＣの長期間増殖用標準条件（上記参照）を一貫して使用する。これらの条件のもとでは、前脳ＮＳＣは少なくとも５ヶ月間増殖し、この間ずっと神経細胞を産生しつづけ、かつ、レトロウィルスが仲介する遺伝子修飾及び長期間の導入遺伝子発現の影響を受けやすい。
【０１１５】
切除直後の前脳ＮＳＣを低密度（５×１０３個／ウェル）で２４ウェルプレートに入れ、その際にマイトジェンを添加する（１条件につき、６ウェル／マイトジェン）。実験の各セットにおける陽性コントロールとしては、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２だけに曝露させた前脳ＮＳＣを使用しており、分裂促進活性は、ＦＧＦ−２単独の場合を基準として相対的に示されている。
【０１１６】
ＮＳＣ又はその他の幹細胞の培養に関して公開されている／推奨されている濃度に準じた濃度範囲で、市販のマイトジェンを使用する。無血清条件培地（ＮＳＣ−ＭＦ）は、他の因子に添加する場合は１：１０希釈で、単独の場合は５０％希釈で使用する。
【０１１７】
かかるＮＳＣ−ＭＦの活性は、条件培地でＦＧＦ−２がさらに分泌していることを示すものにすぎないという可能性を排除するため、段階的に濃度を上げたＦＧＦ−２（２０、５０、１００及び２００ｎｇ／ｍｌ）中で前脳ＮＳＣを増殖させる。ＦＧＦ−２の濃度が２０ｎｇ／ｍｌを越えるとＮＳＣ細胞数の有意な増加は認められず、これは、ＮＳＣ−ＭＦがＦＧＦ−２ではないことを示している。
【０１１８】
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）も、強力なＮＳＣマイトジェンであることが判明している。前脳ＮＳＣが懸濁液中で球体として成長する場合、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦは相対的に強力ではあるが、Ｐ＋Ｌ上で成長する場合は、ＥＧＦ中での前脳ＮＳＣの生存率はきわめて低くなる。ＥＧＦの濃度を１００ｎｇ／ｍｌに上げると、ＮＳＣ増殖促進効果が消失する。
【０１１９】
これらのデータにより、ＮＳＣ−ＭＦは、入手可能で最も強力な先行技術のＮＳＣマイトジェンであるＦＧＦ−２及びＥＧＦとは異なることがわかる。
【０１２０】
ヘパリン及び硫酸ヘパリンは、ＦＧＦ−２のＮＳＣに対する分裂促進活性を促進する化合物として知られている。２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及びある濃度範囲のヘパリン（０．０５−２．０μｇ／ｍｌ）を用いて前脳ＮＳＣを増殖させる場合には、細胞数の有意な増加は認められない。したがって、ＮＳＣ−ＭＦはヘパリン又は硫酸ヘパリンではない。
【０１２１】
幹細胞群の増殖を誘導する他のマイトジェンとＮＳＣ−ＭＦとが同一であることを確認するため、前脳ＮＳＣを顆粒球マクロファージコロニー増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１−１０ｎｇ／ｍｌ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）中で増殖させる。これらの因子はどちらもＮＳＣの増殖を促進するものではない。実験開始時にプレートに入れる初期細胞数を２倍の１×１０４個にしても、どちらの因子に対しても有意な作用は認められない。したがって、ＮＳＣ−ＭＦはＧＭ−ＣＳＦではなく、ＶＥＧＦでもない。さらに、これら先行技術の幹細胞マイトジェンとは違って、ＮＳＣ−ＭＦは有意なＮＳＣ分裂促進作用を示している。
【０１２２】
各種ＮＳＣ群に対する、ＦＧＦ−２及びＥＧＦの分裂促進作用の特徴づけは進んでいるが、それに加えて、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を組み合わせると、ヒト胎児前脳ＮＳＣ神経球に対して強力な分裂促進作用をもつカクテル剤になり、結果として、ＦＧＦ−２単独使用の場合よりも増殖が有意に増大することが近年になって示されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＭＫ， Ｃｕｉ Ｘ， Ｈｕ ＺＹ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｊ， Ｓｈｅｒｍａｎ Ｓ， Ｓｅｉｇｅｒ Ａ， Ｗａｈｌｂｅｒｇ ＬＵ．　Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９９ Ａｕｇ； １５８ （２）： ２６５−７８を参照のこと）。よって、このマイトジェンの組み合わせが上述のＮＳＣ培養条件を用いたＦＧＦ−２よりも効果的かどうかを確認する。ＬＩＦ＋ＦＧＦの組み合わせは、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを単独で用いた場合と比較して、前脳ＮＳＣの増殖を有意に増大させる（図２を参照のこと、処理の９日後には細胞数が平均で６０％増加している；ｐ＜０．０１）、その一方、１０又は２０ｍｇ／ｍｌのＬＩＦ単独では、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の場合と比較して、著しく効果が低くなる（図２を参照のこと）。
【０１２３】
ＮＳＣ−ＭＦ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２という組み合わせは、ＦＧＦ＋ＬＩＦという組み合わせよりも有意に効果的であり、結果的に、ＬＩＦ＋ＦＧＦと比較してＮＳＣ細胞数が４０％以上増大した（図２を参照のこと、ｐ＜０．０１７）。低密度でプレートに入れ、５０％のＮＳＣ−ＭＦ（無血清条件培地）でマイトジェンを添加しないで増殖させた前脳ＮＳＣは、ＦＧＦ−２を用いた場合の約５０％の効率で、少なくとも９日間（本実験の期間）は増殖しており、これは、ＮＳＣ−ＭＦが、たとえＦＧＦ−２の非存在下であっても分裂促進活性を有することを示している。
【０１２４】
ＦＧＦ−２を用いたＮＳＣの増殖の促進に加えて、ＮＳＣ−ＭＦは、ＬＩＦ及びＬＩＨ＋ＦＧＦ−２両方の分裂促進作用も促進し、各因子セットを単独で用いる場合と比較して、ＮＳＣ細胞数を増大させる。これは、ＮＳＣ−ＭＦが、各種幹細胞マイトジェン及び幹細胞群の作用を促進することを示している。
【０１２５】
ＮＳＣ−ＭＦは、ＮＳＣ生存促進作用をもつ。学説にとらわれずに考えると、この作用は、その分裂促進作用から機械的に独立しているものなのかもしれない。非常に低い密度（２５０−１０００個／ウェル）でプレートに入れられたＮＳＣは、ＮＳＣ−ＭＦ＋ＦＧＦ−２の存在下でプレートに入れられた場合は生存及びその後の増殖が可能である。同様の細胞をＦＧＦ−２又はその他のマイトジェンが単独で存在するプレートに入れると、その細胞は死滅する。
【０１２６】
上記のとおり、既知の幹細胞マイトジェンからＮＳＣ−ＭＦをスクリーニングする。ＮＳＣ−ＭＦは、現在市販されているうちで最も強力な神経幹細胞マイトジェンである、ＦＧＦ−２及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のどちらでもない。ＮＳＣ−ＭＦは、組換え型ヒトインシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型ヒト線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、組換え型ヒトトロンボポエチン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、又は組換え型ヒトニューロトロフィン３（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）のどれでもない。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦは、前脳神経幹細胞に対しては非常に効果の乏しいマイトジェンであり、結果的に増殖が最大となったのは、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を用いた場合で、単にＦＧＦ−２の濃度を上げるだけでは、幹細胞数が有意に増大することはない。しかし、ＮＳＣ−ＭＦは、ＦＧＦ−２作用促進剤に対して相乗作用を示す。同一濃度のＦＧＦ−２を単独で用いた場合と比較して、ＮＳＣ−ＭＦ（１０％の条件無血清培地）と２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を組み合わせて用いた場合は、神経幹細胞の増殖の有意な増大が認められる（ＮＳＣ−ＭＦ＋ＦＧＦの場合、１５日後の細胞数が平均で９３％増加；図１を参照のこと）。ＥＧＦと同様、白血病抑制因子（ＬＩＦ、１０−２０ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１−１０ｎｇ／ｍｌ）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）は、単独使用の場合、前脳の神経幹細胞用のマイトジェンとしては効果に乏しい。したがって、ＮＳＣ−ＭＦと類似しているとはいえない。
【０１２７】
１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦと２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を組み合わせると、ヒト胎児前脳神経幹細胞に対して強力な分裂促進作用をもつカクテル剤になり、結果として、ＦＧＦ−２単独使用の場合よりも神経幹細胞の増殖が有意に増大する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９９−ｉｂｉｄ）。ＬＩＦとＦＧＦとを組み合わせると、齧歯類前脳幹細胞の増殖も有意に増大する（２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを単独で使用した場合と比べて、処理の９日後の細胞数が平均で６０％増大する、図２を参照のこと）。
【０１２８】
ＮＳＣ−ＭＦとＦＧＦ−２とを組み合わせると、ＬＩＦとＦＧＦとを組み合わせた場合よりも、神経幹細胞の増殖を誘導する強さが有意に増大する（ＬＩＦ＋ＦＧＦの場合と比べて、処理の９日後の細胞数が平均で４３％増大する、図２を参照のこと）。したがって、本発明の条件培養培地は、強力な神経幹細胞マイトジェンである因子（すなわち、ＮＳＣ−ＭＦ）を含んでいる。
マイトジェンとしてのＮＳＣ−ＭＦの有用性が、明確に示されている。
【０１２９】
ＮＳＣ−ＭＦの別の使用法、例えば、細胞の増殖への応用としてのＮＳＣ−ＭＦの使用法について、ここに記載する。
【０１３０】
ＮＳＣ−ＭＦは、細胞群の増殖を促進する。
ＮＳＣがＮＳＣ−ＭＦの作用に対してどの程度まで感受性を示すのか、及び特定の細胞（サブ）群が特別に影響を受けるのかどうかを確認するため、より長期にわたる経時的研究を行う。
【０１３１】
回収直後の前脳幹／前駆細胞を、初期密度１×１０５個でＰ＋Ｌ７５ｃｍ２フラスコ（１．３３×１０３個／ｃｍ２）に入れ、ＦＧＦ−２単独で、又は１０％条件培地（ＮＳＣ−ＭＦ）を含むＦＧＦ−２含有培地（１フラスコあたり７．５ｍｌの培地）で、周密度が約７５％となるまで増殖させる。その際に、細胞を基質からトリプシン化し、回収し、洗浄する。各フラスコから回収した細胞の総数を確認し、新しい７５ｃｍ２フラスコに１×１０５個の細胞を加え、上記のように、周密度が７５％となるまで増殖させる。継代の際にはその都度、免疫細胞化学的査定用に、かかる細胞をカバースリップにもとっておく。当初の細胞数が１００，０００個であることに基づき、増殖した細胞の総数を確認する。
【０１３２】
１：１０に希釈した条件培地（ＮＳＣ−ＭＦ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を使用すると、ＮＳＣ−ＭＦの作用は、ＣＮＳ幹細胞を脳から単離したのち少なくとも４０日間は堅調であり、この期間中は神経幹細胞が４０００倍以上に増殖する。ＦＧＦ−２を単独で用いた他は同一条件下で増殖させた細胞に対してＮＳＣ−ＭＦ＋ＦＧＦ−２を用いると、ＦＧＦを単独で用いた場合よりも、神経幹細胞数が同じ時間で約１０倍に増殖する（図３を参照のこと）。
【０１３３】
ＦＧＦ−２中で増殖した神経幹細胞とＮＳＣ−ＭＦ＋ＦＧＦ−２中で増殖した神経幹細胞を直接比較すると、ＮＳＣ−ＭＦ中で増殖した細胞は、時間に伴って神経幹細胞の総数がかなり増加するのに加え、（ＭＡＰ−２及びβ−チューブリンの免疫応答性が陽性であることからわかるように）非常に多数の分化神経細胞を産生しているのがわかる。ＦＧＦ−２単独で培養した細胞由来の神経細胞数と比較して、約４倍の神経細胞が存在することが定量分析によりわかっている（図４及び５を参照のこと）。こうした細胞の神経伝達物質の表現型を調べて、神経前駆細胞のどの群がこのＮＳＣ−ＭＦの有用な特性に最も影響を受けやすいのかを確認する。
【０１３４】
（コリン作動性神経前駆細胞の増殖におけるＮＳＣ−ＭＦの使用）
神経伝達物質特異的神経細胞群の増殖は、神経幹細胞研究の問題点である。
齧歯類腹側前脳前駆細胞がＦＧＦ−２での増殖開始から３週間以内にアセチルコリンを合成する神経細胞を作製することは、まれである（図６を参照のこと）。
【０１３５】
免疫細胞化学的手順を用いて幹／前駆細胞を分析する。増殖した神経幹／前駆細胞を培養の様々な時点で回収して、２４ウェルプレート中の、あらかじめＰ＋Ｌでコーティングを施した直径１３ｍｍのガラス製カバースリップ上に、５×１０３個／ウェルの密度で置く。４８−７２時間後、ＦＧＦ−２を除去し、１００ｎｇ／ｍｌのオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）又は１％のウシ胎児血清を含む培地（成分は、別個に又は組み合わせて用いられる）と交換することにより、細胞を分化へと誘導する。培地を３日ごとに交換し、分化開始から６−１２日後に細胞を分析する。増殖した細胞の細胞表現型を確認するため、カバースリップをＰＢＳでそっと洗浄して、４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで２度洗浄した後、０．１％のトリトンＸ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ＋）中に入れ、３０分間室温で放置する。５％乳液と０．１％のトリトンＸ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ＋）で細胞を３０分間室温でインキュベーションすることで、細胞に結合する非特異的抗体を遮断し、その後、ＴＢＳ＋／５％乳液で希釈した一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベーションする。翌日、かかる一次抗体を除去し、細胞をＴＢＳ＋中で１５分間ずつ３回洗浄し、種特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ社製）を用いて室温で１時間インキュベーションする。次いで細胞をＴＢＳ中で１５分間ずつ３回洗浄し、ジアミノベンジジンの０．０５％溶液、０．０４％の塩化ニッケル及び０．０１％のＨ２Ｏ２に６−１５分間曝露させる。その後、段階的濃度のアルコールでカバースリップを軽く脱水し、顕微鏡用のガラス製スライドに載せて分析する。一次神経細胞の希釈曲線を用いて個々の抗体についての最適抗体濃度を測定するとともに、各免疫細胞化学的手順においてコントロールとしての一次抗体を除去することによって、抗体結合の特異性を確認する。
【０１３６】
各種神経細胞及び非神経細胞の抗原に特異的な、広範囲に及ぶ一次抗体を用いて培養物中の細胞の特徴づけを行う。そうした抗体としては、神経上皮由来前駆細胞用マーカーであるネスティン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、分化した神経細胞を認識するβ−チューブリンＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、及び微小管結合タンパク質（ＭＡＰ−２；Ｒｏｃｈｅ社製；英国）、ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ神経細胞専用のガンマアミノ酪酸（ＧＡＤ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、コリン作動性神経細胞の同定用の低親和性神経成長因子受容体（ｐ７５；Ｒｏｃｈｅ社製）、チロシン受容体キナーゼ−Ａ（ＴｒｋＡ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）の抗体、及びグリア酸性線維性タンパク質（ＧＦＡＰ；Ｄａｋｏ社製）、及び星状細胞と希突起膠細胞の同定にそれぞれ用いられる抗ガラクトセレブロシド抗体（ＧａｌＣ、Ｒｏｃｈｅ社製）と抗Ｏ４抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）が挙げられる。
【０１３７】
神経成長因子（ＮＧＦ）生存分析を行う。各種条件及び因子のもとで増殖するコリン作動性前駆細胞の相対数を測定するため、腹側前脳幹／前駆細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性を分析する。すなわち、前脳細胞を約５×１０４個／ウェルで６ウェルプレートに入れ、マイトジェン含有培地で細胞の周密度が約９０％になるまで増殖させ、その時点でマイトジェンを除去し、１００−１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２を添加する。ＮＧＦ含有培地は３−４日ごとに交換し、最初にＮＧＦに曝露させた後の細胞生存状況を確認するため、各ウェルを毎日モニターする。ＮＧＦ単独では細胞が長期間生存しない場合は、生存細胞が観察された最後の日を記録する。
【０１３８】
Ｆｏｎｎｕｍ（１９７６）の技術に基づき、培養神経細胞に関する記載（Ｍｉｎｇｅｒ， １９９６−ｉｂｉｄ）のとおりにＣｈＡＴ酵素分析を行う。０．１％のトリプシンを用いて、ＮＧＦに曝露させてから１４−２８日後の細胞を氷上で回収し、その後０．８７ｍｍのＥＤＴＡ及び０．１％のトリトンＸ−１００を含む１００μｌの溶液（ｐＨ７．０）中で均質化する。５０μＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、９ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭの塩化コリン、１００μＭのサリチル酸エゼリン、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び１００μＭの［アセチル−１−１４Ｃ］−補助酵素Ａを混合した溶液１０μｌ中で、１０μｌの均質化細胞を３７℃で１時間インキュベーションする。１００μｌの氷温蒸留水を添加して、その反応を停止させる。次に１ｍｌの抽出緩衝液（０．５％のテトラフェニルホウ酸ナトリウムを含む８５％のトルエン／１５％のアセトニトリル）を各サンプルに添加して、かかるサンプルを１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離にかける。６５０μｌの上清液を除去して、５ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔシンチレーション液と混合し、かかる生成物に組み込まれた放射能をβカウンターで１０分間計測する。コントロールは、細胞を含まないインキュベーション液と抽出液で構成されている。各サンプルの分析は３回行い、タンパク質の回収前に、サンプルのカウント数からブランクの平均カウント数を差し引いておく。タンパク質濃度の査定は、Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質分析試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて二度行い、５９５ｎｍの吸光度を測定する。ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として使用する。データは、形成されたアセチルコリン（ＡＣｈ）の量（ナノモル）／時間／タンパク質（ｍｇ）又は／ウェルで示してある。
【０１３９】
脳から単離した後に１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子に曝露させ、その約３−４週間後に培養を開始した培養物において、合成酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；図６を参照のこと）の活性並びにｐ７５及びＣｈＡＴに免疫応答性の神経細胞数の有意な増大が観察されている。４−６週間増殖させた後では、ＦＧＦ−２で増殖させた培養物中のコリン作動性神経細胞の数は、全神経細胞群の５％未満から、培養条件によっては約２５％へと増大している。
【０１４０】
ＮＳＣ−ＭＦ＋ＦＧＦ−２で培養した細胞を分析すると、ＦＧＦ−２単独で増殖させたＮＳＣの場合と比較して、生じるコリン作動性神経前駆細胞の数が同じ時間で有意に増加していることがわかる。
学説にとらわれずに考えると、ＮＳＣ−ＭＦのこうした有用な作用は、より多能なＮＳＣの増殖を促進するＮＳＣ−ＭＦ、又はコリン作動性前駆細胞に特異的な作用を及ぼすＮＳＣ−ＭＦによって、又は別の機構によってもたらされるのかもしれない。
ＮＳＣ−ＭＦは異なる神経細胞型の増殖に有用である。
【０１４１】
実施例３：ＮＳＣ−ＭＦの特性
本発明のＮＳＣ−ＭＦの、物理化学的特性及び増殖性をさらに示していく。
無血清条件培地をＨＴ１０８０細胞から回収し、−８０℃で凍結させる。かかる培地を氷上で融解し、分画分子量が１０００Ｄａ又は３５００Ｄａのいずれかである透析チューブを使用して、ＰＢＳ緩衝液で透析を行う。その後、透析したサンプルを０．２２μｍのシリンジフィルターで濾過し、上述の増殖分析法を用いて分裂促進活性を査定する（すなわち、５×１０３個の神経幹細胞／ウェル；１１−１２ウェル／条件；４日目と７日目に培地を完全に交換し、８日目にＭＴＴで細胞を分析する；実施例１に記載の手順）。
【０１４２】
図８のグラフは、以下の培地における相対的な細胞増殖を示している。
ａ）２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２のみ（カラム１）
ｂ）１０％の無血清条件培地（すなわちＮＳＣ−ＭＦ）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（カラム２）
ｃ）濃度１０％の、分画分子量１０００Ｄａで透析したＮＳＣ−ＭＦ条件培地＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（カラム３）
ｄ）濃度１０％の、分画分子量３５００Ｄａで透析したＮＳＣ−ＭＦ条件培地＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（カラム４）
【０１４３】
かかる未加工データについては、（実施例２のように）ＦＧＦ−２の平均ＯＤを１００％に設定したうえで、ＦＧＦ−２を用いて得られたデータに合せた標準化を行っている。ＡＮＯＶＡ及び事後分析によると、三種類のＮＳＣ−ＭＦ条件はすべてＦＧＦ−２単独の場合よりもかなり強力なものであり、透析したサンプルを用いた結果は２つとも、１０％条件培地の場合よりも増殖が有意に増大している（Ｐ＜０．０５）。
【０１４４】
これにより、条件培地ＮＳＣ−ＭＦ及びその画分の増殖的特性は、本発明の強力なマイトジェンによるものであることがわかる。
【０１４５】
実施例４：ＮＳＣ−ＭＦは神経前駆細胞の増殖を選択的に促進する
神経前駆細胞に特有の分子マーカーは当該分野では周知であり、そうしたマーカーとしては、ＭＡＰ−２及びβ−チューブリンＩＩＩが挙げられる。本実施例では、切除直後の前脳ＮＳＣ群（前述の実施例を参照のこと）に下記の処理を施したものを用いて、神経前駆細胞の増殖を選択的に促進するＮＳＣ−ＭＦの能力を示す。
【０１４６】
図９の顕微鏡写真に示されている細胞は、パネルａ及びｃのＮＳＣは２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２単独で増殖させたのに対し、ｂ及びｄのＮＳＣは１０％無血清条件培地（ＮＳＣ−ＭＦ）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２で増殖させていることを別にすれば、同一の培養条件で増殖させた同一の細胞である。どちらの細胞についても、２週間増殖させ、５×１０３個／ウェルでＰ＋Ｌカバースリップ上に置き、分化培地で６日間分化させた後、（実施例２で記載したように）免疫細胞化学用の処理を施す。
【０１４７】
図９のパネルａ及びｂは、神経細胞マーカーのβ−チューブリンＩＩＩで染色された細胞を示しているのに対し、パネルｃ及びｄは、別の神経細胞マーカーである微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ−２）に対する免疫応答性が陽性であることを示している（図４及び５も参照のこと）。
このように、本発明のＮＳＣ−ＭＦは、神経前駆細胞の増殖を選択的に促進することが示されている。
【０１４８】
セクションＢ
方法
【０１４９】
（生化学的精製）
分画分子量が３．５ＫＤａの膜を使用し、かつ、リン酸緩衝生理食塩水を使用して、ＨＴ１０８０条件培地（約２リットル）を透析した。その後、透析用袋をポリエチレングリコール２００００に入れ、透析した物質を約５０ｍｌに濃縮した。２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）で平衡させたレクチン−セファロースカラム４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、濃縮物をアフィニティー精製した。流動中の物質には活性が残っており、２５０ｍＭのアルファメチルマンノシドを添加した溶出物からは、有効成分が得られなかった。その後の手順では、アフィニティー精製工程を省略した。
【０１５０】
かかる濃縮物を、分画分子量３０ＫＤａの遠心分離フィルターであるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＢｉｏｍａｘ ５で分画した。活性はどちらの画分にも残っていた。３０ＫＤａを越える画分について、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８）を使用したＨＩＴＲＡＰ Ｑセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、アニオン交換クロマトグラフィーで精製した。有効成分はカラム上に残り、１Ｍの塩化ナトリウムの勾配で溶出した。カラム上に吸収されない有効成分に対して、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いたＨＩ ＴＲＡＰ ＳＰカラム上でカチオン交換クロマトグラフィーを行った。飽和シナピン酸をマトリックスとして使用したマトリックス支援レーザー脱離質量分析法（ＴｈｅｒｍｏＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ社製）で、かかる画分を分析した（図１７を参照のこと）。かかる画分は、Ｔｒｉｓグリシン緩衝液を使用して７．５％の分離ゲルとした未変性ゲル電気泳動法でも分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅでの染色で５本のバンドが得られた。平行実験では、未染色バンドを切除した後、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液で電気溶出を行った。
【０１５１】
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅで染色したバンドを切除して、アセトニトリル／５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（６０：４０、２５０μｌ）中に入れ、攪拌器上で静かに３０分間攪拌した。この工程を繰り返した後、かかるバンドをアセトニトリル／２０ｍＭの重炭酸アンモニウム（６０：４０、２５０μｌ）中で攪拌した。ゲルバンドをｓｐｅｅｄｅＶａｃ（ＴＭ）中で完全に乾燥させた。かかる乾燥させたゲルバンドを、トリプシン（０．５μｇ／ｍｍ３）を含む２０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液で１５分間処理し、ゲルがトリプシンを吸収した時点で１０μｌの２０ｍＭの重炭酸アンモニウムを添加し、かかる反応を３７℃で２４時間インキュベーションした。かかる分解物（１μｌ）をＭＡＬＤＩの標的部位に置き、その後マトリックスを置いて、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析した。その結果として得られた、５本のバンドのうちの３本の断片をデータベース内の断片と比較したところ、既知のタンパク質と有意な一致を示すものは得られなかった。
【０１５２】
（分裂促進分析）
セクションＡにしたがい、ＮＳＣ−ＭＦの分裂促進活性を調べる分析は、ＭＴＴ（ミトコンドリア呼吸）分析に基づいている。細胞の神経解剖学的供給源及び実験条件に応じて、ポリオルチニン及びラミニン基質（各１０μｇ／ｍｌ）を２５００−１０，０００個／ウェルの密度の範囲で含む２４ウェルプレートに、胎児脳から切除した直後の神経幹細胞を入れた。他に特に記載がない限り、胎生１４日目の前脳に由来する細胞を用いて分析を行った。各個別実験において、プレートに入れたときの細胞密度はすべての条件において同一であった。マイトジェンはプレートに入れた時点で添加し、３日ごとに培地を完全に交換した。１セット以上の細胞の周密度が８０−９０％になった時点（通常はプレートに入れてから６−１２日後）で、細胞をＭＴＴ用に処理した。大半の実験では、陽性コントロール及び参考用標準物は、本発明者らの実験室で使用している標準的な神経幹細胞マイトジェンである、２０／ｍｇの線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）のみの存在下で増殖した神経幹細胞である。こうした条件のもとで、細胞増殖はＦＧＦ−２単独の場合と比較され、データは、ＦＧＦ−２＋／−標準偏差と比較した増殖のパーセンテージとして表されている。
【０１５３】
ディスカッション
上記の報告のとおり、ＨＴ１０８０細胞株が分泌する神経幹細胞分裂促進活性は、熱に対して不安定であり、透析及び／又は遠心濾過（ｃｅｎｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濃縮可能な場合があり、その大きさは３．５キロダルトン（ｋＤ）を越えていた。本発明のマイトジェンと他の既知の因子の分裂促進活性を直接比較した分析において、本発明のマイトジェンが、潜在的な候補マイトジェンである、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ソニックヘッジホッグタンパク質（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子２及び８（ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、インシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）のいずれでもないことが判明した。こうしたことから本発明者らは、ＨＴ１０８０条件培地から得られる神経幹細胞マイトジェンは、新規の幹細胞マイトジェンであるという結論に達したものである。
【０１５４】
本発明者らの当初の実験で、条件培地（ＣＭ）に対し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１７５カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行った。３つの非常に大きなタンパク質のピークが得られた。かかる３つのピークにまたがる１４個の個別画分を回収し、陽性コントロールとして２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２及び４％の透析したＣＭ（ＮＳＣ−ＭＦ）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を用いた標準ＮＳＣ増殖分析を利用して、各画分の分裂促進活性を査定した。１４個の個別画分のうちで、明白な分裂促進活性を有しているものは皆無であった。本発明者らはその後、それぞれが一つのタンパク質ピークを完全にカバーする３個の画分を回収したが、透析したサンプルにより誘導される強力なＮＳＣ増殖と比較したところ、有意な分裂促進活性は、やはり認められなかった。こうした知見により、ＮＳＣ−ＭＦタンパク質はＣＭの重要な成分ではなく、むしろ全分泌タンパク質の非常に小さな画分であることが示唆される。ＣＭサンプル中のＮＳＣ−ＭＦタンパク質の存在量が少ないため、ＮＳＣ−ＭＦの単離及び精製を促進するには大量のＣＭが必要になり、６リットル以上の条件培地を回収した。
【０１５５】
Ｔａｕｐｉｎ ｅｔ ａｌ （（２０００） Ｎｅｕｒｏｎ， ｖｏｌ ２８， ｐｐ ３８５−３９７）は、シスタチンＣの単離及び特徴づけについて報告している。シスタチンＣは、成体神経幹細胞に対するＦＧＦ−２の分裂促進作用を促進する。本発明者らの研究において、ＮＳＣ−ＭＦがシスタチンＣであるかどうかを調べた。シスタチンＣ及び他のヘパリン様因子が選択的に結合するセファロース４Ｂヘパリン結合カラムを利用したところ、ＮＳＣ−ＭＦはかかるカラムに結合するのではなく、むしろ、本発明者らの標準的分析法を用いて結合物質及び非結合物質の分裂促進活性を調べる際に、カラムを通過する非結合画分中で認められることが判明した。この知見は、ＮＳＣ−ＭＦがシスタチンＣや他のヘパリン様因子ではない（したがって、グリコシル化タンパク質でもないと思われる）ことだけではなく、驚くべきことに、セファロース４Ｂカラムを使用することが、かかる４Ｂカラムに結合するＣＭ中にある多数の他のタンパク質からＮＳＣ−ＭＦを部分的に精製する手段となることを示している。
【０１５６】
セファロース４Ｂクロマトグラフィーで部分的に精製したＣＭを使用して、ＮＳＣ−ＭＦを含む非結合画分をアニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合画分と非結合画分はともに各タイプのカラムから得られ、本発明者らの標準的分裂促進分析法にかけた。下記の図１０からわかるように、ＮＳＣ−ＭＦはアニオン交換カラムに選択的に結合するため、かかるカラムを通過するタンパク質からさらに精製することができる。
【０１５７】
分裂促進活性の多くは、カラムに結合した画分３から回収可能であることは、図１０から明らかである。セファロース４Ｂ及びアニオン交換によるクロマトグラフィーを連続して使用することは、それゆえ、他の混入タンパク質からＮＳＣ−ＭＦを効率的に部分精製する手段となる。この手順により、他の潜在的に興味深い種がＨＴ１０８０ＣＭから見つかっている。例えば、画分１及び２に存在するタンパク質は非常に強力な抗増殖作用を有しており、ＦＧＦ−２による分裂促進作用を約４０％抑制することが、上述した図１０から見てとれる。
【０１５８】
これまで概述した精製計画に沿って、本発明者らは、ＮＳＣ−ＭＦのおおよその分子量を測定するために一連の実験を開始した。イオン交換クロマトグラフィーを行った条件培地を、分子量によって、１０ｋｄ未満、１０ｋＤ−３０ｋＤ、及び３０ｋＤ超の３つのタンパク質群に分画した。３つの異なるタンパク質画分（＞３０ｋＤ、１０−３０ｋＤ、＜１０ｋＤ）の調査を厳密に行ったところ、ＨＴ１０８０条件培地には、分子量が３０ｋＤを越えているものと１０ｋＤ未満のものの、少なくとも２つの異なる神経幹細胞マイトジェンが存在する可能性があることがわかった。これらの少なくとも２つの神経幹細胞マイトジェンを総称して、神経幹細胞分裂促進因子（ＮＳＣ−ＭＦ）とするが、便宜上、ＮＳＣ−ＭＦ−１（＞３０ｋＤ）及びＮＳＣ−ＭＦ−２（＜１０ｋＤ）とも称することにする。
【０１５９】
下記の図１０及び１２からわかるように、それぞれのマイトジェンは、異なる濃度依存的な分裂促進プロフィールを示しているが、それぞれを直接比較すると、前脳神経幹細胞増殖に及ぼす作用は全体として似通っている（それぞれＦＧＦ−２単独の場合と比較して、増殖が約４０−５０％増大する）（図１３）。
【０１６０】
因子を組み合わせると、場合によっては前脳神経幹細胞の増殖に対する付加的な作用及びおそらくは相乗的な作用が生じることが、予備分析により明らかになった。
【０１６１】
胎児前脳由来の神経幹細胞に加えて、本発明者らは、妊娠１４日目の脊髄由来の神経幹細胞が、３０ｋＤを越える神経幹細胞（ＮＳＣ−ＭＦ−１）マイトジェン及び１０ｋＤ未満の神経幹細胞（ＮＳＣ−ＭＦ−２）マイトジェンの両方の分裂促進作用に感受性を示し、前脳神経幹細胞について観察されたものと類似した濃度作用を有していることも明らかにした。妊娠１４日目の脊髄から約Ｃ８−Ｔ４の段階で脊髄幹細胞を入手し、前脳神経幹細胞の場合に記載したものと同一の方法を用いて培養した（Ｍｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９６−ｉｂｉｄ）。
【０１６２】
総括
新規マイトジェンは、ＨＴ１０８０細胞株条件培地から入手可能である。
ＨＴ１０８０細胞株条件培地のＮＳＣ−ＭＦが示す神経幹細胞分裂促進活性は、１つは３０キロダルトン（ｋＤ）よりも大きく、もう１つは１０ｋＤ未満である、異なる２つのマイトジェンに起因するものである。
【０１６３】
本発明のマイトジェンは、ＦＧＦ−２と併用すると、齧歯類胎児前脳神経幹細胞の増殖を、ＦＧＦ−２単独の場合と比較して約４０−５０％有意に増加させる。
本発明のマイトジェンは、ＦＧＦ−２単独の場合と比較して、齧歯類胎児脊髄幹細胞の増殖を有意に増加させる。
【０１６４】
上記明細書中で述べた刊行物はすべて、ここに参考文献として組み込んである。
当業者であれば、本発明の要旨から逸脱することなく、ここに記載した本発明の方法及びシステムに多様な改良及び変更を加えるのは容易である。ここまで本発明を、特定の好ましい形態に関連して記述してきたが、クレーム記載の本発明がそうした特定の形態に不当に制限されるべきではないことは、承知されてしかるべきである。特に、ここに記述した本発明の実施形態に対して種々の改良を施すことは、生化学及びバイオテクノロジー又はその関連分野の人間にとっては自明であるが、そのような改良を施したものについても、クレームの範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＧＦ−２及びＮＳＣ−ＭＦで処理した細胞のＭＴＴを示す棒グラフである。
【図２】各種成長因子で処理した細胞の増殖平均値を示す棒グラフである。
【図３】ＦＧＦ又はＮＳＣ−ＭＦで培養した細胞の細胞数と培養日数との関係を示すグラフである。
【図４】ＦＧＦ−２又はＦＧＦ−２及びＮＳＣ−ＭＦで増殖させた細胞のＭＡＰ−２免疫応答性を示す写真である。
【図５】ＦＧＦ−２又はＦＧＦ−２及びＮＳＣ−ＭＦで増殖させた細胞のβ−チューブリン免疫応答性を示す写真である。
【図６】各種細胞のＣｈＡＴ作用と培養日数との関係を示すスキャッタープロットである。
【図７】ＮＳＣ−ＭＦのＨＰＬＣクロマトグラフィー分析における２３０ｎｍでの吸光度と時間との関係を示すグラフである。
【図８】ＦＧＦ−２、ＦＧＦ及びＮＳＣ−ＭＦ（条件培地）、ＦＧＦ及びＮＳＣ−ＭＦ（１０００ｋＤａで精製）、ＦＧＦ及びＮＳＣ−ＭＦ（３５００ｋＤａで精製）を用いて増殖させた細胞の平均増殖率を示す棒グラフである。
【図９】ＦＧＦ単独（パネルａ及びｃ）又はＮＳＣ−ＭＦ（条件培地）（パネルｂ及びｄ）で増殖させた細胞における、ＭＡＰ−２（パネルｃ及びｄ）及びβ−チューブリン（パネルａ及びｂ）に対する免疫応答性を示す写真である。
【図１０】イオン交換クロマトグラフィーを行った画分のマイトジェンの分析を示す図である。画分０は出発材料の未分画ＣＭであり、画分３はアニオン交換での結合物質である。画分１及び２はアニオン交換での非結合画分である。画分４（画分３と等量）はカチオン交換カラムからの流入物質であり、画分５及び６は結合物質である。１ウェルあたり５０００個の細胞を入れ、使用したすべての画分４％と、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を添加し、その６日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝６となっている。
【図１１】３０ｋＤを越える神経幹細胞マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ−１）の用量反応曲線を示す図である。１ウェルあたり５０００個の前脳ＮＳＣ細胞を入れ、その６日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１２】１０ｋＤ未満の神経幹細胞マイトジェン（ＮＳＣ−ＭＦ−２）の用量反応曲線を示す図である。１ウェルあたり５０００個の前脳ＮＳＣ細胞を入れ、その６日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１３】ＮＳＣ−ＭＦ−１及びＮＳＣ−ＭＦ−２の分裂促進作用を比較した図である。１ウェルあたり５０００個の前脳ＮＳＣ細胞を入れ、その６日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１４】ＮＳＣ−ＭＦ−１（＞３０ｋＤ）の用量反応曲線を示す図である。１ウェルあたり５０００個の脊髄幹細胞を入れ、その８日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１５】ＮＳＣ−ＭＦ−２（＜１０ｋＤ）の用量反応曲線を示す図である。１ウェルあたり５０００個の脊髄幹細胞を入れ、その８日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１６】腹側中脳由来の神経幹細胞が、ＮＳＣ−ＭＦ含有培地にて増殖を増大させている様子を示す図である。１ウェルあたり２５００個の中脳神経幹細胞を入れ、その１２日後にかかる細胞を分析した。数値は、ＦＧＦ−２（１００％に設定）＋／−ＳＤを基準とした相対的な増殖率である。各条件設定において、ｎ＝３となっている。
【図１７】１０ｋＤを越える物質のＭＡＬＤＩ−ＭＳのプロフィールである（精製の詳細については方法の箇所を参照のこと）。
【図１】
2004508300.tif 000003
【図２】
2004508300.tif 000004
【図３】
2004508300.tif 000005
【図４】
2004508300.tif 000006
【図５】
2004508300.tif 000007
【図６】
2004508300.tif 000008
【図７】
2004508300.tif 000009
【図８】
2004508300.tif 000010
【図９】
2004508300.tif 000011
【図１０】
2004508300.tif 000012
【図１１】
2004508300.tif 000013
【図１２】
2004508300.tif 000014
【図１３】
2004508300.tif 000015
【図１４】
2004508300.tif 000016
【図１５】
2004508300.tif 000017
【図１６】
2004508300.tif 000018
【図１７】
2004508300.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004508300.tif 000020
2004508300.tif 000021
2004508300.tif 000022
2004508300.tif 000023
2004508300.tif 000024
2004508300.tif 000025
2004508300.tif 000026
2004508300.tif 000027
2004508300.tif 000028
2004508300.tif 000029
2004508300.tif 000030
2004508300.tif 000031
2004508300.tif 000032
2004508300.tif 000033
2004508300.tif 000034
2004508300.tif 000035
2004508300.tif 000036
2004508300.tif 000037
2004508300.tif 000038
2004508300.tif 000039
2004508300.tif 000040
2004508300.tif 000041
2004508300.tif 000042
2004508300.tif 000043
2004508300.tif 000044
2004508300.tif 000045
2004508300.tif 000046
2004508300.tif 000047
2004508300.tif 000048
2004508300.tif 000049
2004508300.tif 000050
2004508300.tif 000051
2004508300.tif 000052
2004508300.tif 000053
2004508300.tif 000054
2004508300.tif 000055
2004508300.tif 000056
2004508300.tif 000057
2004508300.tif 000058
2004508300.tif 000059
2004508300.tif 000060
2004508300.tif 000061
2004508300.tif 000062
2004508300.tif 000063
2004508300.tif 000064
2004508300.tif 000065
2004508300.tif 000066
2004508300.tif 000067
2004508300.tif 000068
2004508300.tif 000069
2004508300.tif 000070
2004508300.tif 000071
2004508300.tif 000072
2004508300.tif 000073
2004508300.tif 000074
2004508300.tif 000075
2004508300.tif 000076
2004508300.tif 000077
2004508300.tif 000078
2004508300.tif 000079
2004508300.tif 000080
【国際調査報告】
2004508300.tif 000081
2004508300.tif 000082
2004508300.tif 000083
2004508300.tif 000084