(57)【要約】本発明は遺伝的又は後発的増殖性眼疾患に対するヒト遺伝子治療の方法を提供する。これは眼疾患を治療するためにレンチウイルス・ベクターが有する分裂活性及び不活性の両方の細胞に対して形質導入する能力を利用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼内細胞増殖を阻害する治療遺伝子を含む薬理学的有効量のレンチウイルス・ベクターを、眼疾患を有する個人に対して投与するステップを含む、眼疾患を有する個人における眼内細胞増殖を阻害する方法。
【請求項２】
前記眼疾患が、加齢黄斑変性、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障及び増殖性硝子体網膜症からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記治療遺伝子が構成的活性型網膜芽腫遺伝子、ｐ１６遺伝子及びｐ２１遺伝子からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記レンチウイルス・ベクターが約１０6から１０9形質導入粒子までの投与量で嚢、硝子体又は網膜下の空間に投与する請求項１の方法。
【請求項５】
眼内血管新生を阻害する治療遺伝子を含む薬理学的有効量のレンチウイルス・ベクターを、眼疾患を有する個人に対して投与するステップを含む、眼疾患を有する個人における眼内血管新生を阻害する方法。
【請求項６】
前記眼疾患が、加齢黄斑変性、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障及び増殖性硝子体網膜症からなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
前記治療遺伝子が血管形成を調節する遺伝子及びアポトーシスを調節する遺伝子からなる群から選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
前記血管形成を調節する遺伝子がメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、エンドスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩ、エンドスタチンＸＶ、基質メタロプロテイナーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル−５ドメイン、エンドスタチンとアンジオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインの融合タンパク質、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、インターフェロンα誘導可能タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇとＩＰ１０の融合タンパク質、可溶性ＦＬＴ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１受容体）、及び、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）からなる群から選択されたタンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項７の方法。
【請求項９】
前記アポトーシスを調節する遺伝子がＢｃｌ−２、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ、Ｂｃｌ−Ｘショートアイソフォーム及びＧａｘからなる群から選択されたタンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項７の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルス・ベクターを約１０6から１０9形質導入粒子の投与量で嚢、硝子体又は網膜下の空間に投与する請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ベクター及び遺伝子治療の分子生物学の分野に関するものである。より詳しくは、本発明は遺伝性及び増殖性の眼疾患に対する人間の遺伝子治療におけるレンチウイルス・ベクターの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人間の失明の最も一般的な原因の一つは、しばしば視軸の明確さの損失、あるいは網膜表面に対し、直接的に働く牽引力のために網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）から網膜の剥離の結果を生じさせる異常眼球内細胞増殖である。増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、又は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のいずれかに関連した増殖性網膜剥離であると、治療を行わないままにしておくと、最終的には、視野の永遠の損失となってしまう。
【０００３】
目における新しい血管の異常な増殖、眼の血管新生（ネオバスキュラリゼーション）は、先進国における永久失明の最も一般的な原因である。三つの疾病が眼内の新生血管形成のすべての原因に占める主要な部分と関連している。すなわち、糖尿病、未熟児網膜症、及び加齢黄斑変性である。これら三つの病気は区別でき、異なった群の患者に影響を与えるが、それらは最終的な網膜機能を含む新血管の形成を導く上皮細胞の抑制できない分裂を含む最終的な共通の経路を含んでいる。合計すると、これらの病気は米国における治療不可能な失明の約６０％を占めている。
【０００４】
網膜内の血管内皮細胞の増殖が、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）の開始となる。もし治療を行わなければ、これらの内皮細胞は分裂を続け、結局は網膜の内表面に沿った、あるいは硝子体腔内部に広がる血管結合組織膜を形成する。後部網膜表面の収縮は、網膜−血管結合組織接着部位を牽引する結果となり、最終的には網膜剥離を引き起こす。タイプ１糖尿病の約５０％は、糖尿病であるとの診断から２０年以内に増殖糖尿病網膜症を発症し、一方タイプ２の疾患の患者の１０％は、同じ時間枠内で増殖糖尿病網膜症が明らかになる。
【０００５】
血管は通常、脈管形成（バスクロジェネシス）又は血管形成（アンジオジェネシス）の２つの過程のうちの一つにより発生する。脈管形成中、毛細血管の初期ネットワークは胚形成の間に多能性間葉前駆体の成熟により形成される。一方、血管形成は以前に存在している血管の改造のことを言うものである。血管形成では、新しい血管芽が古いものから生じ、形成された血管が周辺組織に進入する。網膜において、正常な血管のネットワークが確立した場合、このネットワークの改造は組織の酸素濃度に大きな影響を受けるものであり、低酸素症（酸素欠乏）が血管新生を刺激する。これは社会における、多数の糖尿病患者、未熟児又は老人の失明をもたらすプロセスである。
【０００６】
加齢黄斑変性、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障及び増殖性硝子体網膜症のような眼内疾患は、従って、遺伝子治療が有用である異常増殖、その他の状態によって特徴づけられる。しかしながら、哺乳類の細胞に大きな効果を有する遺伝子形質導入を実施するのは困難であった。さらに、アデノウイルス・ベクター、リポソーム、及び、デンドリマーベース試薬のような従来用いられているベクターによって見られる効果は、全く一過性のものである。これらのベクターの眼への導入は、また、強い炎症反応を引き起こすので問題が多い。
【非特許文献１】ナルディニ（Naldini）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９６年、２７２：２６３−２６７
【非特許文献２】ミヨシ（Miyoshi）ら著、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）１９９７年、９４：１０３１９−１０３２３
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００７】
従って、従来の技術は眼の中、又は眼由来の最終的に分化した又は増殖性ヒト細胞に形質導入の手段の欠如の点で不十分である。本発明は、この分野における長年の要求と要望を満たすものである。
本発明の目的はレンチウイルス・ベクター及び遺伝的及び増殖性眼性疾患に対するヒト遺伝子治療におけるこれらのベクターの使用方法の開発である。ヒト網膜細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、増殖性硝子体網膜細胞及び色素上皮細胞の形質導入に対するレンチウイルス・ベクターの有用性が記載されている。
【０００８】
本発明の一つの実施態様においては、レンチウイルス運搬構成的活性（突然変異体又はバリアント）網膜芽腫（ＣＡ−ｒｂ）遺伝子による眼内細胞分裂の抑制の可能性を示すものである。ヒトの眼の細胞がイン・ビトロで検査され、眼内増殖性疾患の２つのモデル（増殖性硝子体網膜症及びポスト・レンズ摘出後嚢混濁）はイン・ビボで検査した。イン・ビトロでの細胞分裂の有効で長期間の阻害が多くの異なった細胞型で観察された。増殖性硝子体網膜症及びポスト・レンズ摘出後嚢混濁の厳しさの減少がイン・ビボで観察された。
【０００９】
本発明の別の実施態様においては、新血管の成長（血管形成）又は前プログラム細胞死（アポトーシス）の成長及び阻害に重要なものとして知られている遺伝子のレンチウイルス介在移転が病理的眼性血管形成（例えば、糖尿病性網膜症又は「ウェット」加齢黄斑変性）又は病理的細胞死（例えば、「ドライ」加齢黄斑変性）に有用なものとなることが示された。これらの遺伝子は、ヒト網膜、角膜及び網膜色素上皮細胞の活性化、及び、ウサギの実験における角膜血管新生を阻害するものとして知られている二つの分離した強力なプロモーターのいずれか一つの制御下に置かれていた。
【００１０】
さらに、このベクター系は、遺伝的な眼の疾患を持つ人間では欠損していることが知られている遺伝子がある場合には、これらの遺伝子をヒトの眼の細胞に伝達することができる。この系によるこれらの遺伝子の伝達は眼疾患を持つこれらの患者に対する有効な治療の基本形を形成する。
【００１１】
本発明は眼の疾患を持つ個人のような、このような治療の必要性のある個人における眼内細胞性増殖の阻害の方法を与えるものである。この方法は、前記の個人に眼内細胞性増殖を阻害する治療的遺伝子を含む薬理的有効量のレンチウイルス・ベクターの投与のステップを含むものである。
【００１２】
本発明は眼の疾患を持つ個人に、眼内血管新生を阻害する治療的遺伝子を含む薬理的有効量のレンチウイルス・ベクターの投与のステップを含む、眼内血管新生の方法を示すものである。
【００１３】
本発明の別の、そしてさらなる側面、特徴及び利点は、発明の現在の好ましい実施態様の以下の記載により明らかになるであろう。これらの実施態様は開示されるために与えられたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
レンチウイルスは、自然における病気の発症に数ヶ月から数年以上かかるスローウイルスである。この種類のウイルスには、ＨＩＶのようなレトルウイルスを含むものである。これらのウイルスは、最終的な分化を果たした、分裂活性あるいは不活性の多くの種類のヒト細胞型に感染及び移転することが知られている。それらの形質導入効率は、ヒト網膜、角膜、小柱、レンズ、網膜色素上皮、増殖性硝子体網膜及び血管内皮細胞のような遺伝子導入に対して伝統的に非常に抵抗力がある細胞系に対してさえ非常に高い値を取る。
【００１５】
レンチウイルスに感染されると、ウイルス遺伝子物質は宿主ゲノム内でそれ自身統合する。従って、ウイルス遺伝子は宿主細胞の遺伝子物質の恒久的な一部となり、細胞の一生の中で遺伝子発現が常に行われる。レンチウイルスによって形質導入された各細胞は遺伝子情報をその子孫に伝える。親ウイルスによる感染の天然の状況下では、ウイルスは炎症反応を伴わない眼内病原体であるので、眼内疾患に対する遺伝子治療におけるレンチウイルスの使用は可能である。このウイルスについての従来の研究では、神経細胞及び網膜細胞の両方の形質導入における使用に有効的であることが示されている（ナルディニ（Naldini）ら、１９９６；ミヨシ（Miyoshi）ら、１９９７）。
【００１６】
本発明は、２つのクローニング部位の間にＩＥＲＳ（内部リボソームエントリー部位）を取り込んだ新規なレトロウイルス・ベクターを提供する。ＩＲＥＳ要素はｍＲＮＡ−リボソーム結合及びタンパク質合成を可能にする。このバックボーンは２つの発現可能な遺伝子を収容できる。形質導入された細胞では単一のメッセージが造り出される；しかしながら、ＩＲＥＳ要素のため、このメッセージは機能的に２遺伝子的なものであり２つの異なったタンパク質を合成させる。これら２つの遺伝子はＣＭＶ又はＨＴＬＶプロモーターのような強力なプロモーターの制御下に置かれる。あるいは、当業者であれば容易にヒト網膜、角膜又は網膜色素上皮細胞において活性があるとして知られている他のプロモーターを採用できるであろう。このようなやり方で、以下に記載するそれぞれの潜在的治療遺伝子は、形質導入された細胞が同時に標識されることと対象の治療遺伝子の発現とが可能となるように、標識遺伝子（例えば、促進緑色蛍光遺伝子−ｅＧＦＰ遺伝子）と結合することができる。標識された細胞は容易にイン・ビトロにおいて単離でき、また、イン・ビボにおいて観察することができる。当業者にとって促進緑色蛍光タンパク質遺伝子以外のレンチウイルス・ベクターに取り込むことができることは容易に理解できるであろう。遺伝子工学及びクローニング分野の平均的科学者の技術レベルは近年かなり増加しているので、この技術分野の通常の技術を有するものは、ここで開示されるものに加え対象となる他の治療遺伝子を含んだレンチウイルス・ベクターを容易に構築することができるであろう。さらに、ここに開示されたレンチウイルス・ベクター系は遺伝性眼疾患又は他の疾患を有する患者に欠如していることが知られている遺伝子を導入することができる。この系によるこれらの遺伝子のヒト眼細胞又は他の組織に対する導入は、様々な疾患を有する患者に対する有効な治療の基本を形成する。
【００１７】
ここで記載されている基本的な発見は、レンチウイルス・ベクターは異常眼内増殖を是正させる多種の遺伝子を導入することができ、それにより、新生血管疾患、網膜剥離又はポスト・レンズ摘出後嚢混濁の発生を減少させることできることを示す。多くの治療遺伝子がイン・ビボで眼内細胞分裂を阻害することで治療を行う状況で有用なものとなる可能性がある。これらの遺伝子には新血管成長（アンジオジェネシス）又はアポトーシスの過程に対する調節物として近年同定された多くのものが含まれる。レンチウイルス媒介遺伝子導入によるこれらの調節物発現の遺伝子的制御は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、又は、増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）のような、眼内新生血管疾患の治療に有効であることが証明されたと考えられる。
ここで開示されているレンチウイルス・ベクターは治療用のセッティングに適用できる。
【００１８】
血管内皮細胞は脈管形成及び血管形成の中心的役割を果たす。これらの細胞は様々なタンパク質サイトカイニンに対してマイトジェン的に応答する（細胞分裂又は細胞移動に関して活性を持つようになる）。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ）−１（Ａｎｇ１）及びアンジオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）は内皮細胞分裂、移動及び細胞−細胞接着を刺激し、よって血管形成に有利なサイトカイニンである。エンドスタチン、可溶（デコイ）ＶＥＧＦ受容体（ｓｆｌｔ）及びトロンボスポンジンは血管形成を阻害させる内在タンパク質サイトカイニンである。本発明により、レンチウイルス・ベクターによって伝達されたこれら抑制性タンパク質の多くが眼内血管新生に有効であることが示された。本発明のレンチウイルス・ベクターに取り込むことのできる遺伝子には、それに制限されるものではないが、以下の遺伝子が含まれる：
【００１９】
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の自然の阻害物である偏在するタンパク質のファミリーを表す。マトリックスメタロプロテイナーゼは、がんの侵入、血管新生及びがんの転移の本質的ステップである、転移結合組織マトリックスの改造及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に関連する亜鉛結合エンドペプチターゼの一群であり。ＭＭＰｓはそれぞれＥＣＭの中の特異的な異なった基質を有し、その分解において重要なものである。ヒト乳腺の病気におけるＭＭＰｓの分析によってはＥＭＣの分解に関連するいくつかのＭＭＰｓが示された：コラーゲナーゼ（ＭＭＰ１）は原繊維間質コラーゲンを分解する；ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２）は主にタイプＩＶコラーゲンを分解する；ストロメライシン（ＭＭＰ３）は広範な機能を有する（ブラムホール（Bramhall）ら、１９９６、１９９７）。ＴＩＭＰファミリーには４つのメンバーが存在する。ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２はＭＭＰ阻害活性に関連しているがんの成長、侵入及び転移を阻害することができる。さらに、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の両方とも血管形成に関連する。ＴＩＭＰファミリーの他のメンバーはこれと異なり、ＴＩＭＰ−３はＥＣＭのみに見出され、最終的な分化のマーカーとして機能している可能性がある。最後に、ＴＩＭＰ−４は細胞外マトリックスホメオスタシスにおいて組織特異的なやり方で機能するものと考えられる（ゴメス（Gomez）ら、１９９７）。
【００２０】
ＴＩＭＰ−１
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤−１（ＴＩＭＰ−１）は、メタロプロテイナーゼインヒビター１、繊維芽細胞コラーゲナーゼインヒビター、コラーゲナーゼインヒビター、赤芽球ポテンティアティング活性化物（ＥＰＡ）としても知られている２３ｋＤタンパク質である。ＴＩＭＰ−１をコードする遺伝子はドチェルティ（Docherty）ら（１９８５）によって記載された。ＴＩＭＰ−１は不可逆的不活性化の原因となるメタロプロテイナーゼ（コラーゲナーゼのような）と複合体を形成する。ＴＩＭＰ−１の効果はトランスジェニックマウスのモデルで調査されてきた：一つは肝臓における過剰発現であり、もう一つは肝細胞がんの遺伝性発生を導くウイルス性がん遺伝子シマンウイルス４０／Ｔの発現である。ダブルトランスジェニック実験（ＴＩＭＰ−１系がＴＡｇトランスジェニック系と交雑された）において、肝ＴＩＭＰ−１の過剰発現が成長及び血管形成を阻害することによりＴＡｇ−誘導肝細胞がんの成長を阻害することが報告されている（マーティン（Martin）ら、１９９６）。
【００２１】
ＴＩＭＰ−２
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤−２（ＴＩＭＰ−２）は、メタロプロテイナーゼインヒビター２としても知られている２４ｋＤタンパク質である。ＴＩＭＰ−２をコードする遺伝子はステトラー−ステベンソン（Stetler-Stevenson）ら（１９８５）によって開示された。がんの侵入に重要な役割を果たすメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ２）はＴＩＭＰ−２によって複合され、阻害される。従って、ＴＩＭＰ−２はがんの転移の阻害に有効であった（ムッソ（Musso）ら、１９９７）。Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞（高度侵入性及び転移性細胞系）を、ヒトＴＩＭＰ−２をコードするプラスミドによってトランスフェクトし、マウスに皮下注射した場合に、イン・ビボにおいてＴＩＭＰ−２の過剰発現ががんの成長及び新生血管形成（ネオアンジオジェネシス）を制限した（バレンテ（Valente）ら、１９９８）。
【００２２】
ＴＩＭＰ−３
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤−３（ＴＩＭＰ−３）は、メタロプロテイナーゼインヒビター３としても知られている。乳がん及び悪性黒色腫細胞系をＴＩＭＰ−３プラスミドでトランスフェクトし、ヌードマウスに皮下注射した時に、がん細胞の成長が抑制されるのが観察された（アナンド−アプテ（Anand-Apte）ら、１９９６）。しかしながら、ＴＩＭＰ−３の過剰発現はイン・ビトロの２つの細胞系の成長に対して何も効果を示さなかった。従って、がん細胞に近接するＥＣＭに対して放出されたＴＩＭＰ−３がＥＣＭとは隔離された増殖因子の放出の抑制、又は、血管形成の阻害によってがんの成長を阻害することが示唆された（アナンド−アプテ（Anand-Apte）ら、１９９６）。
【００２３】
ＴＩＭＰ−４
メタロプロテイナーゼ組織阻害剤−４（ＴＩＭＰ−４）は、メタロプロテイナーゼインヒビター４としても知られている。ＴＩＭＰ−４遺伝子及び組織分布はグリーン（Green）ら（１９９６）によって記載された。生化学的研究により、ＴＩＭＰ−４はＴＩＭＰ−２と同様にヒトグルタチナーゼＡに結合することが示された。イン・ビボのヒト乳がんの成長に対するＴＩＭＰ−４調節の効果がワン（Wang）ら（１９９７）によって調査された。ＴＩＭＰ−４の過剰発現はイン・ビトロで細胞侵入を阻害することが見出され、イン・ビボにおいてＴＩＭＰ−４がん細胞トランスフェクトをヌードマウス注射した後にがんの成長が有意に減少した（ワン（Wang）ら、１９９７）
【００２４】
エンドスタチン、アンジオスタチン、ＰＥＸ、クリングル−５、及び、融合遺伝子
フォークマン（J. Folkman）及び彼の共同研究者（ボーエン（Boehm）ら、１９９７）は、ルイス肺がんを持ったマウスをエンドスタチン＋アンジオスタチンタンパク質の組み合わせで処理すると、がんの完全な退化を誘発し、マウスは残りの一生を健康的な状態を維持することを示した。この効果は、エンドスタチン単独ではがんの休止を誘発するのに６サイクルを要するにもかかわらず、エンドスタチン＋アンジオスタチン処理ではわずか１サイクル（２５日）後に獲得された。
ハナハン（D. Hanahan）及び共同研究者（ベルガーズ（Bergers）ら、１９９９）は、マウスモデルにおいて、エンドスタチン＋アンジオスタチンタンパク質の組み合わせはランゲルハンス島がんに対して非常に優れた抗腫瘍があることを示した。エンドスタチン＋アンジオスタチンタンパク質の組み合わせは、エンドスタチン又はアンジオスタチン単独では何も効果を有していないにもかかわらず、結果的にがんを有意に退化させた。
【００２５】
エンドスタチンＸＶＩＩＩ
ヘマンジオエンドセリオーマ（ｈｅｍａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｍａ）によって生産される血管形成阻害剤であるエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）オーレイリー（O'Reilly）ら（１９９７）によって最初に確認された。エンドスタチンは内皮増殖を特異的に阻害するコラーゲンＸＶＩＩＩの２０ｋＤのＣ末端断片であり、血管形成及び腫瘍増殖に対して有効な阻害を行うものである。実際に、初期の腫瘍が組換えエンドスタチンの投与後、休眠した、顕微鏡レベルの障害にまで退化させることが示されている（オーレイリー（O'Reilly）ら、１９９７）。エンドスタチンは増殖因子信号を含むヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合することにより、血管形成を阻害することが報告されている（ゼッター（Zetter）、１９９８）。
【００２６】
エンドスタチンＸＶ
最近、コラーゲンＸＶのＣ末端断片（エンドスタチンＸＶ）がエンドスタチンＸＶＩＩＩと同様に、しかしいくつかの機能的差異を持って、血管形成を阻害することが示された（ササキ（Sasaki）ら、２０００）
【００２７】
アンジオスタチン
第１の４クリンングル構造の一つを含むプラスミノーゲンであるアンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）は、今日までに文書で明らかにされた最も強力な血管形成阻害剤の一つである。アンジオスタチンの組織だった投与はイン・ビボにおいて悪性グリオーマの成長を効果的に抑制することが示されている（キルッシュ（Kirsch）ら、１９９８）。アンジオスタチンは、従来の放射線療法と組み合わせると、イン・ビボで毒性作用の増加無しにより多くの腫瘍を根絶した（マウセリ（Mauceri）ら、１９９８）。他の研究では、レトロウイルス及びアデノウイルスが媒介したアンジオスタチンｃＤＮＡの遺伝子導入は、イン・ビトロで内皮細胞成長を阻害し、イン・ビボで血管形成を阻害した。腫瘍誘導血管形成の阻害は腫瘍細胞の死滅を増加させる（タナカ（Tanaka）ら、１９９８）。マウスアンジオスタチンをコードするｃＤＮＡのマウスＴ２４１線維肉腫細胞に対する遺伝子導入は、初期及び転移性腫瘍をイン・ビボで抑制することが明らかにされている（カオ（Cao）ら、１９９８）。
【００２８】
ＰＥＸ
ＰＥＸは、血管形成及び腫瘍増殖に要求される細胞表面コラーゲン結合活性を遮断するインテグリン・アルファＶベータ３に対するＭＭＰ−２の結合を阻害するＭＭＰ−２のＣ末端ヘモペキシンドメインであり、ブルックス（Brooks）ら（１９９８）によってクローン化され、開示された。
【００２９】
クリングル−５
アンジオスタチンの４クリングルと高い配列相同性を有する、ヒトプラスミノーゲンのクリングル−５ドメインは内皮細胞増殖の特異的な阻害剤であることが報告されている。クリングル−５は毛細血管内皮細胞増殖刺激塩基性繊維芽細胞増殖因子の阻害において、アンジオスタチンよりも強力であると考えられる（カオ（Cao）ら、１９９７）。それ自身の抗増殖特性に加え、クリングル−５はアンジオスタチンと同様に、選択的に内皮細胞に影響を及ぼす抗移動活性も示す（ジ（Ji）ら、１９９８）。
【００３０】
アンジオスタティック融合遺伝子
新規なアンジオスタティック融合遺伝子がリンカーとしてエラスチンペプチドモチーフ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）を使用してクローニングできる。これらの融合物は腫瘍血管形成の抑制力を増加させるために２つの高いアンジオスタティック効果を示す遺伝子を組み合わせたものである。これらの分子は異なった機構により作用するので、それらの組み合わせは相互作用効果を生み出す。アンジオスタチン融合タンパク質の例としては、それに限定されるものではないが、エンドスタチン１８及びアンジオスタチン（ｅｎｄｏ／ａｎｇ）、エンドスタチン１８及びプラスミノーゲンのクリングル５（ｅｎｄｏ／ｋ５）、並びに、インターフェロン・ガンマ誘導モノカイン及びインターフェロン・アルファ誘発性タンパク質（ＭＩＧ／ＩＰ１０）の融合物が挙げられる。
【００３１】
ケモカイン
ケモカインは白血球の走化性を引き出す能力のある低分子量前炎症性サイトカインである。考えられるケモカインに依存して、化学誘引はある型の白血球に対して特異的である。腫瘍内でのケモカイン遺伝子の発現は、白血球の抗腫瘍活性能力の強化効果を導く可能性がある。さらに、それらの走化性活性に加え、いくつかのケモカイン類は抗血管新生活性を有する：それらは、腫瘍に栄養を与える血管の形成を阻害する。この理由のため、これらのケモカインはがん治療に有効なものである。
【００３２】
ＭＩＧ
インターフェロンγにより誘導されるモノカインであるＭｉｇは、ＩＰ−１０と関連するＣＸＣケモカインであり、単球によって生産される。Ｍｉｇは活性化Ｔ細胞に対する化学誘引物質であり、また、強力なアンジオスタティック特性を有する。Ｍｉｇの腫瘍内注射は腫瘍ネクローシスを誘導する（スガダリ（Sugadari）ら、１９９７）。
【００３３】
ＩＰ−１０
インターフェロンα誘導可能タンパク質１０であるＩＰ−１０は、ＣＸＣケモカインファミリーの一員である。ＩＰ−１０は主に単球によって生産されるが、Ｔ−細胞、繊維芽細胞及び内皮細胞によっても生産される。ＩＰ−１０は、Ｔ−細胞、単球及びＮＫ細胞のようなリンパ球に対して走化性を発揮する。ＩＰ−１０は血管形成の強力な阻害剤でもある：それは内皮細胞の分化を抑制することによって血管新生を阻害する。免疫細胞に向う走化性のため、ＩＰ−１０は抗腫瘍免疫反応を高める、優れた候補者と考えられた。腫瘍細胞内にＩＰ−１０の遺伝子導入を行うとそれらの腫瘍化を減少させ、長期の防御免疫反応を引き出した（ラスター及びレーダー（Luster and Leder）、１９９３）。ＩＰ−１０のアンジオスタティック活性はまた腫瘍退化を仲介することが示された：ＩＰ−１０を発現する腫瘍細胞はイン・ビボで懐死性となった（スガダリ（Sgadari）ら、１９９６）。ＩＰ−１０は腫瘍の退化を導くＩＬ−１２の血管静止効果を仲介することが示された（タンネンバウム（Tannenbaum）ら、１９９８）。
【００３４】
可溶性ＶＧＥＦ受容体
ＦＬＴ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１受容体）は、膜結合性のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ受容体１）である。ＦＬＴ−１の可溶性断片（ｓＦＬＴ−１）はＶＥＧＦに対するアンタゴニスト活性によりアンジオスタティック特性を有する。可溶性ＦＬＴ−１はＶＥＧＦに結合することによって作用するだけではなく、結合によって膜結合ＦＬＴ−１の外部ドメインを妨害することによっても作用を及ぼす（ケンダル及びトーマス（Kendall & Thomas）１９９３、ゴールドマン（Goldman）ら、１９９８）。ｓＦＬＴ−１の一例はＦＬＴ−１の外部の７免疫グロブリン様ドメインに渡るヒトｓＦＬＴ−１である。
【００３５】
ｓＦＬＫ−１／ＫＤＲ
ＦＬＫ−１又はＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）は膜結合性のＶＥＧＦ受容体である（ＶＧＥＦ受容体２）。恐らく、それがＶＥＧＦに結合するためだけではなく、結合によって膜結合ＫＤＲの外部ドメインを妨害するため、ＫＤＲの可溶性断片（ｓＫＤＲ）はＶＥＧＦに対するアンタゴニスト活性によりアンジオスタティック特性を有する（ケンダル及びトーマス（Kendall & Thomas）１９９６、ミラー（Millauer）ら、１９９４）。ｓＫＤＲの一例はＫＤＲの外部の７免疫グロブリン様ドメインに渡るヒトｓＫＤＲである。
【００３６】
アポトーシス
アポトーシスとはプログラム細胞死又は細胞自殺の過程を記載するために用いられる用語である。この過程は、多細胞性器官の成長及び健康維持の正常な構成要素である。アポトーシスの異常な制御は、がんから自己免疫疾患までの様々な病理学上の障害に関与するものである。
【００３７】
ＢＩＫ
ＢｉｋはＢｃｌ−２関連キラー、アポトーシス誘導ＮＢＫ、ＢＰ４、及びＢＩＰ１としても知られている１８ｋＤ（１６０アミノ酸）の強力前アポトーシスタンパク質である。Ｂｉｋはｂｉｋ（又はｎｂｋ）遺伝子によってコードされている。Ｂｉｋの機能は、Ｂｃｌ−ＸＬ、ＢＨＲＦ１、Ｂｃｌ−２、又は、そのアデノウイルス相同Ｅ１Ｂタンパク質のような様々なアポトーシスリプレッサーと複合体を形成することによって、プログラム細胞死を加速させることにある。一過性トランスフェクションの研究においては、ＢｉｋはＢｃｌ−２ファミリーの前アポトーシスメンバーであるＢａｘ及びＢａｋと同様なやり方でプログラム細胞死を促進させた（ボイド（Boyd）ら、１９９５）。
【００３８】
ＢＡＫ
Ｂｃｌ−２と相同のＢａｋは、前記のＢｉｋについて述べたのと同じように、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬを含む抗アポトーシスファミリーメンバーに結合し、それらの活性を阻害することにより、アポトーシスを促進する前アポトーシスタンパク質である（チッテンデン（Chittenden）ら、１９９５）。
【００３９】
Ｂａｘ
Ｂａｘはアポトーシスの調節物として機能する２１ｋＤタンパク質である。ＢａｘはアポトーシスリプレサーＢｃｌ−２と二量化し、相殺することによりプログラム細胞死を加速させる。これらのタンパク質二量体の比率がアポトーシスの開始と関係していると考えられる。Ｋ５６２赤白血病細胞における組換えＢａｘ発現の効果がコバヤシ（Kobayashi）ら（１９９８）によって調査された。ＢａｘベクターによるＫ５６２細胞へのトランスフェクションは、アポトーシスを誘導する結果となった。さらに、Ｂａｘで安定的にトランスフェクトされた細胞は化学療法剤ａｒａ−Ｘ、ドキソルビシン、及びＳＮ−３８に対してより高い感受性を示した（コバヤシ（Kobayashi）ら、１９９８）。
【００４０】
ＢＡＤ
Ｂａｄタンパク質（Ｂｃｌ−２結合成分６、ｂａｄ遺伝子又はｂｂｃ６又はｂｃｌ２１８）は細胞死を促進する小規模タンパク質（１６８アミノ酸、１８ｋＤ）である。Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−２に対しての結合が効果的に競合することにより、これらの２つのタンパク質とＢａｘとのヘテロダイマー化のレベルに影響を及ぼす。これは、Ｂｃｌ−ＸＬの死リプレッサー活性を逆にすることができるができるが、Ｂｃｌ−２の活性を逆にすることができない。
【００４１】
ＢＣＬ−２
Ｂ細胞白血病／リンパ腫−２（Ｂｃｌ−２）は細胞死調節タンパク質のファミリーの原始型メンバーである。Ｂｃｌ−２は主にミトコンドリアで見出され、カスパーゼの活性化を妨害することでアポトーシスの進行を阻止する。腫瘍細胞へのＢｃｌ−２遺伝子導入が、それらの転移ポテンシャルを高めることが示された（ミヤケ（Miyake）ら、１９９９）。Ｂｃｌ−２遺伝子導入は、Ｂｃｌ−２が放射線照射を受けたものの再構成の後に造血幹細胞の生存を高めることから、骨髄移植に適用できる可能性がある（アイネス（Iness）ら、１９９９）。また、ニューロンにおけるＢｃｌ−２の発現により、それらをアポトーシスから保護するので、Ｂｃｌ−２遺伝子導入は神経退化性疾患に有効であると考えられる（サイレ（Saille）ら、１９９９）。
【００４２】
ＢＣＬ−ＸＳ
Ｂｃｌ−ＸＳ（ショートアイソフォーム）はＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬの優性ネガティブリプレサーである。これはＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬを発現した腫瘍におけるアポトーシスを開始させる遺伝子治療実験に用いられてきた。Ｂｃｌ−ＸＬの発現は腫瘍の大きさを減少させ（エアロベガ（Ealovega）ら、１９９６）、腫瘍細胞を化学療法剤に対して敏感にさせ（スマトラン（Sumatran）ら、１９９５）、これらはＢｃｌ−２又はＢｃｌ−ＸＬを発現した腫瘍における細胞死を開始するＢｃｌ−ＸＳの役割を示唆している（ドール（Dole）ら、１９９６）。
【００４３】
ＧＡＸ
Ｇａｘはｐ２１に依存する方法で細胞増殖を阻害する転写因子をコードするホメオボックス遺伝子である。Ｇａｘは細胞が増殖するように刺激された時にダウンレギュレーションを行う。Ｇａｘの過剰発現は、マイトジェン活性細胞においてＢｃｌ−２ダウンレギュレーション及びＢａｘアップレギュレーションを導く（ペルマン（Perlman）ら、１９９８）。したがって、Ｇａｘはある腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効である可能性がある。さらに、血管平滑筋におけるＧａｘの過剰発現はそれらの増殖を阻害する（ペルマン（Perlman）ら、１９９８）。したがって、Ｇａｘ遺伝子導入は、血管障害後の血管狭窄症を制限することができるであろう。
【００４４】
がん抑制遺伝子
がん抑制遺伝子の様々な突然変異が異なったタイプのがんと関連づけられてきた。これらの場合において、野生型のがん抑制遺伝子の体細胞遺伝子治療が、抗がん治療方法として観察されてきた。ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７及びｐ５３はサイクリン依存性キナーゼに作用することにより細胞周期を阻害する。
【００４５】
Ｐ１６
１５ｋＤタンパク質（１４８アミノ酸）のＰ１６はＣＤＫ４、ＩＰ１６−ＩＮＫ４、Ｐ−１６ＩＮＫ４Ａ又は多重がんサプレッサー１（ＭＴＳ１）としても知られているものである。Ｐ１６はｃｄｋｎ２ａ又はｃｄｋｎ２遺伝子によりコードされている。Ｐ１６はサイクリン依存性キナーゼ４及び６とヘテロダイマーを形成し、それにより、それらのサイクリンＤとの相互関係をイン・ビトロ及びイン・ビボの両方で妨害する。したがって、Ｐ１６は正常な細胞の増殖に対する負の調節物として作用する。Ｐ１６（ｃｄｋｎ２）突然変異は広範囲の組織における腫瘍の形成に関連している。ｃｄｋｎ２は高い比率の腫瘍細胞系、並びに、黒色腫及び胆汁管、すい臓及び胃の腫瘍を含むいくつかの初期腫瘍において、ホモ接合的に欠損、変異、あるいは別に不活性化される（バイデン（Biden）ら、１９９７；カステラノ（Castellano）ら、１９９７）。ｐ１６ＩＫＮ４ａ遺伝子発現の欠如は、中皮腫及び他の細胞系で一般的に観察される。中皮腫細胞への発現アデノウイルスによるｐ１６ＮＫ４ａの形質導入は、形質導入された細胞の成長を減少させ、細胞死を導く結果となった（フリゼル（Frizelle）ら、１９９８）。さらに、内因性ｐ１６／ＣＤＫＮ２遺伝子を発現していない３つのヒトグリオーマ細胞系（Ｕ２５１  ＭＧ、Ｕ−８７  ＭＧ及びＤ５４  ＭＧ）に対する野生型ｐ１６のアデノウイルス媒介遺伝子導入の結果、Ｇ０及びＧ１期の細胞成長を停止させた（フエヨ（Fueyo）ら、１９９８）。さらに、ｐ１６−ＩＮＫ４Ａを発現していない肺がん細胞系への野生型ｐ１６−ＩＮＫ４Ａのアデノウイルス媒介遺伝子導入は、イン・ビトロ及びイン・ビボの両方で腫瘍の増殖を阻害した（ジン（Jin）ら、１９９５）。したがって、腫瘍細胞における野生型Ｐ１６タンパク質の回復はがん治療に有効であると考えられる。
【００４６】
Ｐ２１
ｐ２１はサイクリン依存性キナーゼインヒビター１（ＣＤＫＮ１）、黒色腫分化関連タンパク質６、及び、ＣＤＫ相互作用タンパク質１としても知られているものである。ｐ２１はＣＩＰ１及びＷＡＦ１としても知られているＣＤＫＮ１遺伝子によってコードされている（ハーパー（Harper）ら、１９９３）。ｐ２１は、ｐ５３がＤＮＡ障害に対する応答における細胞増殖の阻害剤としての役割を仲介することによる重要な中間体であると思われる。ｐ２１はサイクリン依存性キナーゼに結合し、その活性を阻害し、重要なサイクリン依存性キナーゼ基質のリン酸化を阻止し、そして、細胞周期の進行及び増殖を妨害すると思われる。ｐ２１はすべての成人ヒト組織で発現される。腫瘍細胞に対するｐ２１遺伝子導入は、腫瘍成長の阻害に有効であると考えることができる。２つの非小規模細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞系に組換えアデノウイルス媒介ｐ２１遺伝子導入を行った結果、投与量依存ｐ２１誘導及びＧ０／Ｇ１細胞周期停止のための付随した細胞成長阻害が起こった。さらに、マウスにおけるＮＳＣＬＣ確立前腫瘍へのｐ２１運搬アデノウイルスの注入は腫瘍の成長を減少させ、動物の生存数を増加させた（ジョシ（Joshi）ら、１９９８）。これらの結果はがん遺伝子治療に対するｐ２１の使用を支持するものである。
【００４７】
本発明において、この分野の技術範囲内における従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡの手法を採用することができる。このような手法は文献に完全に記載されている。例えば、マニアティス、フリッチェ及びサムブルック（Manitis, Fritch & Sambrook）「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（１９８２）」；「ＤＮＡクローニング：実際の研究法（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏｃｈ）」、Ｉ及びＩＩ巻（グローバー（D.N. Glover）ら、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ガイト（M.J. Gait）ら、１９８４）；「核酸交雑（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（ハムス及びヒギンス（B.D. Hames & S.J. Higgins）編（１９８５））；「転写及び翻訳（Ｔｒａｎｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」（ハムス及びヒギンス（B.D. Hames & S.J. Higgins）編（１９８４））；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｕｌｔｕｒｅ）」（フレッシュニー（R.I. Freshney）ら（１８８６）；「固定化細胞及び酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）」（ＩＲＬ出版、（１９８６）；ペルバル（B. Perbal）、「分子クローニングの実際のガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）を参照。
【００４８】
「ベクター」とは、別のＤＮＡ部分の複製を輸送するために別のＤＮＡ部分を付着させたプラスミド、ファージ又はコスミドのようなレプリコンである。
【００４９】
「プロモーター配列」とは、細胞でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３        ´方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列はその３´末端で転写開始部位と境界を接し、バックグラウンド上で検出できるレベルの転写を開始させるのに必要な最小限の塩基及び要素を含んだ上流（５´方向）に伸びている。プロモーター配列内には、ＲＮＡポリメラーゼの結合を行うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）だけでなく、転写開始部位（通常はヌクレアーゼＳ１によるマッピングで定義される）がある。真核生物プロモーターはいつもではないが、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。様々なプロモーターがベクターを操縦するために使用できる。
【００５０】
細胞は、外因性及び異種ＤＮＡが細胞内に、通常はウイルス・ベクターにより、導入された場合に、これらのＤＮＡによって「形質導入」される。形質導入ＤＮＡは細胞のゲノム内に統合（共有的に結合）するか（レンチウイルス・ベクターを使用したような場合）、或いは、統合しない。例えば原核生物、酵母、及び哺乳類動物においては、ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素において維持できる。真核生物細胞に関しては、安定して形質導入された細胞は、形質導入ＤＮＡは染色体内に統合され、それゆえ、染色体複製を通じて娘細胞に遺伝される。この安定性は、真核生物細胞が形質導入ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる樹立細胞系又はクローンとなる能力によって示される。「クローン」とは単一の細胞又は有糸分裂の共通の祖先から派生した細胞の集団である。「細胞系」とは多くの世代においてイン・ビトロで安定的な成長を行うことができる初代細胞のクローンである。
【００５１】
「治療遺伝子」は、望まれる表現型を与える遺伝子のことを言う。例えば、構成的活性網膜芽腫（ＣＡ−ｒｂ）遺伝子は眼内増殖を阻止するために使用され、または、遺伝子の欠損はペリフェリン遺伝子の導入により回復される。
【００５２】
ここにおいて、「標識遺伝子」という用語は、異種プロモーター又はエンハンサーに付随され、構築体が組織又は細胞に導入された時に、それらの産物が容易に、かつ定量的に分析できるコーディング配列を言うものである。標識には、通常、放射性要素、酵素、タンパク質（促進緑色蛍光タンパク質のような）、又は、紫外線を照射された時に蛍光を発する化学薬品、その他が含まれる。
【００５３】
本発明はレンチウイルス遺伝子導入手段による、遺伝性、或いは、増殖性失明疾患の新規な治療方法を提供するものである。したがって、本発明にはこのような疾患の治療に助けとなる遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を運搬するレンチウイルス・ベクターが含まれる。この例は、それに制限されるものではないが、ペリフェリン遺伝子、構成的活性型のｒｂ遺伝子及び前述の様々な治療遺伝子が挙げられる。
【００５４】
本発明は、眼疾患を有する個人に対し、眼内細胞増殖を阻害する治療遺伝子を含む薬理学的有効量のレンチウイルス・ベクターを投与するステップを含む、眼疾患を有する個人における眼内細胞増殖を阻害する方法を示すものである。本発明の方法で治療することができる眼疾患の代表例としては、加齢黄斑変性、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障、及び、増殖性硝子体網膜症が挙げられる。治療遺伝子は、構成的活性型の網膜芽腫、ｐ１６遺伝子又はｐ２１遺伝子を用いることができる。好ましくはレンチウイルス・ベクターを約１０６から１０９形質導入ユニットを嚢（ｃａｐｓｕｌａｒ）、硝子体（ｖｉｔｒｅａｌ）又は網膜下（ｓｕｂ−ｒｅｔｉｎａｌ）の空間に投与するものである。
【００５５】
本発明は、また、眼疾患を有する個人に対し、眼内血管新生を阻害する治療遺伝子を含む薬理学的有効量のレンチウイルス・ベクターを投与するステップを含む、眼疾患を有する個人における眼内血管新生を阻害する方法を示すものである。本発明の方法で治療することができる眼疾患の代表例としては、加齢黄斑変性、増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症、緑内障、及び、増殖性硝子体網膜症が挙げられる。治療遺伝子は、血管形成又はアポトーシスを調節する遺伝子とすることができる。一般的に、血管形成を調節する遺伝子としては、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、エンドスタチン、アンジオスタチン、エンドスタチンＸＶＩＩＩ、エンドスタチンＸＶ、基質メタロプロテイナーゼ−２のＣ末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル−５ドメイン、エンドスタチンとアンジオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインの融合タンパク質、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、インターフェロンα誘導可能タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＭｉｇとＩＰ−１０の融合タンパク質、可溶性ＦＬＴ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１受容体）、及び、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）をコードする遺伝子を含み、一方、アポトーシスを調節する遺伝子には、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ、Ｂｃｌ−Ｘショートアイソフォーム、及び、Ｇａｘが含まれる。好ましくはレンチウイルス・ベクターを約１０6から１０9形質導入ユニットを嚢、硝子体又は網膜下空間に投与するものである。
【００５６】
以下の実施例は本発明の様々な態様を示すために与えられたもので、いかなるやり方においても本発明を制限することを意味するものではない。
【実施例１】
【００５７】
細胞及び組織
ヒト脈絡膜繊維芽細胞（ＨＣＦ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト胎児網膜色素上皮細胞（ＨＲＰＥ）の一次外植片を作り、分裂活性を促進する、若しくは促進しないかのいずれかの状況に置かれた。安定した光受容器由来細胞（Ｙ−７９及びＷｅｒｉ−Ｒｂ−１）もまた培養した。
ヒト網膜及び網膜芽腫の脱核した際に得られたＲＰＥをレンチウイルス・ベクターのこれらの分裂不活性細胞にたいする形質導入の能力及び外因性ヒトペリフェリントランスジーンの発現を誘導する能力を示すために用いられた。角膜移植手術の際に得られたヒト角膜がレンチウイルス・ベクターがこれらの分裂不活性細胞に標識遺伝子である促進緑色蛍光タンパク質遺伝子を形質導入する能力を示すために用いられた。
【実施例２】
【００５８】
レンチウイルス・ベクター
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープを持ち、標識として緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を含有した３つのプラスミドに基づく偽型レンチウイルス・ベクター系を使用した（図１）。組換えレンチウイルスはナルディニ（Naldini）らの方法により作成した。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期遺伝子プロモーターはｐＨＲ´−ＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドでｅＧＦＰの発現をもたらす。ウイルスの株は以下のように発生させた。ヒト腎臓２９３Ｔ細胞（５×１０6）が１０ｃｍプレートに播かれ、後日、Ｄ１０増殖培地（１０％ウシ胎仔血清を含む高濃度グルコースＤＭＥＭ）及び抗生物質中でのリン酸カルシウム沈殿により、１０ｕｇのｐＣＭＶΔＲ８．９１（パッケージング機能プラスミド）、１０ｕｇのｐＨＲ´−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ（標識遺伝子プラスミド）、及び、２ｕｇのｐＭＤ．Ｇ（ＶＳＶ−Ｇエンベロープ含有プラスミド）でコトランスフェクトされた。３７℃で１２〜１６時間後、培地は取り除かれ、新鮮なＤ１０増殖培地が加えられた。細胞はさらに１０時間培養された。１０ｍＭの酪酸ナトリウム及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含有する新鮮Ｄ１０培地が細胞に加えられ、細胞はさらに１２時間培養された。新鮮培地が加えられ、その後４日間、２４時間ごとに上清を回収した。ウイルス性上清は回収後直ちに−８０℃で保存した。
ウイルス株は上清を室温で１４０分間の超遠心分離することによって濃縮され、得られたウイルスのペレットは１〜３ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁された。アリコートされたウイルス株は２９３細胞で力価を求め、残りのサンプルは−８０℃で保存した。
全てのレンチウイルス・ベクターはフィトヘマグルニチン刺激ヒト末梢血単核細胞の感染により複製コンピテントレトロウイルス（ＲＣＲ）の存在が分析され、続いてＥＬＩＳＡによる培養培地のｐ２４ギャグが分析された。ＲＣＲは生産されたどのウイルス性上澄みにおいても観察されなかった。
【実施例３】
【００５９】
レンチウイルス・ベクター形質導入
２×１０6複製欠如レンチウイルス粒子／ｍｌ含有上清は、上記のレンチウイルス・ベクターによる２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって作られた。細胞はウイルス粒子と共に２４時間培養され、蛍光標示式細胞分取によるＧＦＰ発現の決定の前に、４日間通常培地に戻された（図２〜３）。
形質導入効果は１〜１０００の範囲のＭＯＩにおける感染多重度の関数として測定された。多くのヒト細胞系におけるイン・ビトロ形質導入の結果は、レンチウイルスの数が増加するにつれてより多くの細胞が形質導入されているように、ＭＯＩと形質導入効果との間に正の相関を示した（図２）。
レンチウイルス・ベクターの非分裂細胞に対して形質導入する能力を調査した。ヒト網膜色素上皮細胞がレンチウイルス又はマウス白血病ウイルスベクターによって形質導入された。細胞は、ベクターにさらされた時、分裂不活性（融合）又は分裂活性（成長）であった。図４に示す結果はレンチウイルス・ベクターが他のレトロウイルス・ベクターに比べ、非分裂細胞に対して非常に高い形質導入能力を有することを示している。レンチウイルス・ベクターはまた、非レンチウイルス・レトロウイルス・ベクターに比べ、ヒト胎児細胞に対し、高い形質導入効果を示した（図６）。
ｅＧＦＰトランスジーン発現の継続性を決定するために、レンチウイルス・ベクターで形質導入された細胞を１２０日の間試験した。形質導入された細胞のクローン集団のサザンブロット分析の結果は、レンチウイルスｅＧＦＰベクターが宿主ゲノムに統合されたことを示した（図５Ｂ）。統合されたトランスジーンの発現は１２０日間に渡って安定しており、形質導入された細胞に対する、選択的な有利さも、不利さも与えなかった（図５Ａ）。
【実施例４】
【００６０】
イン・シトウ(in situ)（角膜形質導入）
角膜移植の際に得られたヒト角膜ボタンをレンチウイルス・ベクターがこれら分裂不活性細胞に緑色蛍光タンパク質遺伝子で促進された標識遺伝子を形質導入した効果を示すために使用した（図７）。デスメ膜に接触する内皮細胞を形質導入された角膜組織から剥ぎ、光学及び蛍光顕微鏡で観察した。角膜上皮はｅＧＦＰに対してポジティブであり、有効な遺伝子導入と発現が達成されたことが示された（図７Ｂ）。イン・シトウ形質導入の効果及び上皮層におけるｅＧＦＰの発現も観察された（図７Ｃ）。
従って、これら結果は複製欠如レンチウイルス・ベクターは、イン・シトウでヒト角膜内皮及び上皮細胞に対してトランスジーンを効果的に導入できることを示すものである。このベクターは角膜内皮及び上皮の治療で有効であると考えられ、同種移植拒絶の過程の恒久的な調節に関する方法のように、移植前にエクス・ビボで提供者の角膜組織の遺伝子構成の修正に応用することができる。
【実施例５】
【００６１】
眼性増殖疾患に対する増殖抑制治療
ヒト・ペリフェリン（ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｎ）遺伝子を治療遺伝子の一例として使用した。ヒトにおけるペリフェリン遺伝子の欠如は、結果的に多様な無力化表現型となることが知られている。網膜芽腫の脱核の際に外科的に切除された正常ヒト網膜又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）組織を、治療遺伝子を欠いているか、ヒト・ペリフェリン遺伝子を含んでいるかのいずれかのレンチウイルス・ベクターにさらした。図８に示す結果は、ペリフェリン遺伝子がレンチウイルス・ベクターによって有効に導入されたことを示している。
【００６２】
別の治療遺伝子導入の実験には、構成的活性型の網膜芽腫遺伝子（ＣＡ−ｒｂ）が使用された。ここで開示されるレンチウイルス・ベクターは構成的活性型の網膜芽腫遺伝子の有効な導入を媒介した（図９）。導入されたＣＡ−ｒｂ遺伝子はヒト網膜及び脈絡膜細胞（図１０）並びにヒトレンズ上皮細胞（図１１）の増殖に対して、量依存性阻害効果を示した。
レンチウイルス・ベクターにより導入された構成的活性型の網膜芽腫遺伝子はまた、イン・ビボで眼内細胞増殖を阻害する。２つの眼内増殖性疾患のモデル（増殖性硝子体網膜症及びポスト・レンズ摘出後嚢混濁）をイン・ビボで試験を行った。増殖性硝子体網膜症が３組のウサギで誘導された（図１２）。１つの組は処理を行わないものであり、別の１組は構成的活性網膜芽腫遺伝子を欠いたレンチウイルス・ベクターで処理したものであり、残りの１組は硝子体内由来のレンチウイルスＣＡ−ｒｂで処理されたものである。増殖性硝子体網膜症及び網膜剥離は、最初の２組において高い頻度（＞９０％）で現れているが、一方、網膜剥離に至った動物の割合は、ＣＡ−ｒｂで処理した組において有意に低下した（２６％）。
【００６３】
図１３に表された結果は、ポスト・レンズ摘出後嚢混濁の過程におけるレンチウイルスＣＡ−ｒｂのイン・ビボにおける阻害効果を示している。３組のウサギが生まれつきのレンズを除去して標準的な水晶体混濁を生じさせた。第１の組（グループ１）はその後何も処理されず、残りの２組は空のレンチウイルス構築体（治療遺伝子無し、グループ２）又はレンチウイルスＣＡ−ｒｂ（グループ３）を白内障の傷が閉塞する際に、傷のないレンズ嚢バックに伝達する処理を行った。動物を順次後嚢混濁が存在するかどうか調査した。混濁の存在は、１が混濁の無いものを表し、５が間接双眼検眼鏡による検査により網膜の視覚化を妨げるのに十分な重度の混濁を表す、１〜５の各段階で表された。グループ１及び２（未処理及び空ベクター）の間で結果に有意な差は存在しなかったが、一方、後嚢混濁の発生に対するレンチウイルスＣＡ−ｒｂの著しい阻害効果が観察された。２８日目において、コントロールの動物は平均混濁段階が４．４であり、一方、レンチウイルスＣＡ−ｒｂで処理した動物では平均混濁段階が２．１であった。
【実施例６】
【００６４】
「２遺伝子」レンチウイルス・ベクター
２つのクローニング部位の間にＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）を取り込んだ新規なレトロウイルス・ベクターを構築した。ＩＲＥＳ要素はｍＲＮＡ−リボソーム結合及びタンパク質合成を可能にする。このバックボーンは２つの発現可能な遺伝子を収容できる。形質導入された細胞では単一のメッセージが造り出される；しかしながら、ＩＲＥＳ要素のため、このメッセージは機能的に２遺伝子的なものであり２つの異なったタンパク質の合成を行わせる。このようなやり方で、上記に記載のそれぞれの潜在的治療遺伝子は、形質導入された細胞が同時に標識と対象の治療遺伝子の発現が可能となるように、標識遺伝子（例えば、促進緑色蛍光遺伝子−ｅＧＦＰ遺伝子）と結合することができる。標識された細胞は容易にイン・ビトロにおいて単離でき、また、イン・ビボにおいて観察することができる。様々な治療遺伝子を運搬する多くのレンチウイルス・ベクターの遺伝子マップを図１５〜３１に示す。遺伝子工学及びクローニング分野の平均的科学者の技術レベルは近年かなり増加しているので、この技術分野の通常の技術を有するものは、ここで開示されるものに加え対象となる他の治療遺伝子を含んだレンチウイルス・ベクターを容易に構築することができるであろう。
【実施例７】
【００６５】
抗血管新生遺伝子治療
天然の細胞（治療遺伝子を発現しないことが知られている細胞）を前述のレンチウイルス・ベクターにさらした。ベクターにさらした２日後、これらの細胞からＲＮＡを分離し、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、トランスジーン発現を検査した。図３２は、ヒト皮膚毛細血管内皮細胞から分離されたｍＲＮＡからのエンドスタチン−１８／アンジオスタチン融合遺伝子に対してポジティブなＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。
上記のイン・ビトロレンチウイルス・ベクター媒介遺伝子導入の後、イン・ビボの血管新生を阻害する能力を調査した。以下のようなやり方で、ウサギ角膜組織に血管新生を誘導した：
【００６６】
角膜ストローマ内マイクロポケットの創出及びレンチウイルス含浸ナイロンメッシュの挿入
ウサギはマスキングを用いたイソフルオラン（Ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（４  Ｌ／Ｍｉｎ）及び酸素（２  Ｌ／Ｍｉｎ）により通常の麻酔をされた。プロパラカイネ（Ｐｒｏｐａｒａｃａｉｎｅ）を一滴、局部麻酔のため脳弓にたらした。イソフルオランを２．５  Ｌ／Ｍｉｎに減少させた。ベータダイン（Ｂｅｒａｄｉｎｅ）を脳弓に３０秒間置き、ＢＢＳ（平衡塩類水溶液、アルコン（Ａｌｃｏｎ）社）ですすいだ。リドスペクラウムを目においた。２．８ｍｍマイクロケラトーマを角膜ストローマに１２時の方向に挿入するのに使用した。このストローマ内の切り口はマックフェルソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）鉗子及びアイリッシュスイープ（Ｉｒｉｓｈ  Ｓｗｅｅｐ）器機を使用して前後に掃くことによって、５×５ｍｍポケットに広げた。１２時の切り口はバンナ（Ｖａｎｎａｓ）はさみによって両サイドに４．５ｍｍに開かれた。１０μＬのレンチウイルスを含浸させた４×４ｍｍアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）交雑ナイロンメッシュ（アメルシャム・バイオサイエンティストＲＰＮ２５１９）を先に形成したポケットに挿入した。１滴のトブラマイシンが角膜にたらされた。イソフルオランを中止し、鼻入酸素量を４Ｌ／Ｍｉｎにした。このようなやり方で、２０分後にウサギは問題なく麻酔から覚め、通常の不可欠な機能を持ったままかれらのケージに戻された。ウサギには２日間、無覚性を指示するためブプレネックス（ｂｕｐｒｅｎｅｘ）（．３ｍｇ／ｃｃ）が与えられた。ウサギにはまた、手術後の毛様体筋麻痺及び抗生物質のケアのため、２日間一滴のアトロピン及び一滴のトブラマイシンが与えられた。手術の１日後それぞれのウサギは、局部麻酔のため一滴のプロパラカイネを与えられ、．１２鉗子によって角膜ストローマ内ポッケトからナイロンメッシュが取り除かれた。２週間にわたり毎日、手術後の痛みの制御とケアについて監視を行った。
【００６７】
アルカリ誘導血管新生
最初の手術から２週間後、角膜は２０μｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨで飽和されたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃３フィルター板に１分間当てられた。全ての角膜は多量のＢＢＳで洗浄された。ウサギには、手術後の毛様体筋麻痺及び抗生物質のケアのため、２日間一滴のアトロピン及び一滴のトブラマイシンが与えられた。新血管応答を記録するために、デジタル光文書化が行われた。新血管応答を外傷を与えた後１，３，５，７及び１０日に、時間と血管の長さを記録するスリットランプ試験により測定した。血管新生は、以下の記載のように血管成長の範囲を計算することで定量化した。
【００６８】
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【００６９】
角膜の血管新生を評価する標準的な方法は、以下のプロトコル及び式を記録するために工夫をし、アルカリ燃焼後の血管新生と比較することである。血管新生の範囲を示す式は半径ＲＴで囲まれた大きな区域の範囲を計算し、半径Ｒ２で囲まれた小さな範囲を引くことによって得られる。半径ＲＴで囲まれた大きな区域の範囲は１２で割られた時計の時間にあたる数をπＲＴ2で掛けたものである。半径Ｒ２で囲まれた大きな区域の範囲は１２で割られた時間にあたるの数をπ（Ｒ２）2で掛けたものである。２つの区域を引いて残った範囲が血管新生の範囲である。
【００７０】
レンチウイルス・バイシストロン・メッセージを含む標識遺伝子の促進緑色蛍光タンパク質の発現を文書化するために、共焦点顕微鏡観察を行った。図３３はレンチウイルス・ベクターで処理された動物における角膜マイクロポケット内でのｅＧＦＰの存在を示す光学顕微鏡写真である。
【００７１】
血管新生の阻害効果を示すために、上記の動物に血管新生を誘導した。Ｍｉｇ／ＩＰ１０融合遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターによる処理の後阻害効果が確認された。表１に示すように、レンチウイルス・ベクターを用いてＭｉｇ／ＩＰ１０融合遺伝子またはクリングル１−５遺伝子で処理された動物において、血管新生の有意な減少が確認された。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
この明細書に記載された特許及び文献は本発明が属する技術分野の通常の知識を有する人の水準を示すものである。さらに、これらの特許及び文献は、個々の文献が特にまた個々に参照することによって取り込まれることが記載されているのと同じ範囲で参照することによって取り込まれる。
【００７４】
当業者は、ここに本来備わっている目的、結果及び利点と同じように、目的に応じて実行し、記載された結果及び利点を容易に得ることを理解されるであろう。好ましい態様の代表例としてここに記載された方法、手順、処理、分子、及び特異的な化合物を伴った本発明の実施例は、例示されたものであり、発明の範囲の限定を意図するものではない。その点の変化及び他の使用は、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内において当業者が考え付くものである。
【００７５】
上記記載の側面、特徴及び利点は、これから明らかになる他のものを含め、添付の図面に示される実施態様を参照することにより、達成し、詳細に理解できるように、発明の要旨をより詳細に記載している。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施態様を記載したものであり、したがって発明の範囲を制限するものでないことを特記する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ベクター（カリフォルニア州、サンディエゴ、サルク（Ｓａｌｋ）大学、インデル・ベルマ（Ｉｎｄｅｒ  Ｖｅｒｍａ）博士より提供）を示すものである。ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス、ＬＴＲ：ロングリピートターミナル、ＧＡＧ：ＨＩＶ  ＧＡＧ遺伝子、ＰＯＬ：ＨＩＶ逆転写酵素、ＥＮＶ：ＨＩＶエンベロープ遺伝子、ｒｒｅ：ｒｅｖ応答配列、ＣＭＶ：サイトメガロイウルス、ＶＳＶ：水疱性口内炎ウイルス、Ｐｏｌｙ  Ａ：ポリアデニル化信号、特異的プロモーター：治療的遺伝子の発現の空間的、時間的又は量的側面を調節するために、ここにおいて置き換えることができるいずれかの転写促進プロモーター、治療遺伝子：それに限定されるものではないが、例えば、構成的活性網膜芽腫遺伝子、又は、疾患の結果欠損することとなる遺伝子のような、ここにおいて置き換えることができる治療的可能性を伴ったいずれかの遺伝子。
【図２】ヒト細胞系である、ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脈絡膜繊維芽細胞（ＣＦ）、ヒト網膜芽腫（網膜由来）細胞（Ｗｅｒｉ−Ｒｂ−１及びＹ７９）のイン・ビトロ形質導入を示すものである。これらの細胞系は標識遺伝子（促進緑色蛍光タンパク質遺伝子）を含むレンンチウイルス粒子で形質導入され、標識遺伝子の発現した細胞の割合は、蛍光活性化セルソーティングにより決定した。より多数のレンチウイルス粒子で形質導入された細胞でより多数発現しているように、投与量依存反応が示されている（感染の多様性−ＭＯＩ）。
【図３Ａ】培養網膜色素細胞へのレンチウイルス形質導入を示すものである。標識遺伝子（ｅＧＦＰ）の発現の結果、緑色に蛍光発色した細胞となる。
【図３Ｂ】形質導入効率の蛍光活性化セルソーティング分析の結果を示すものである。第１パネルにおけるＲ２の枠外のデータは、前期形質導入の蛍光発光欠如を反映している。第２パネルは、後期形質導入で９５％以上の蛍光発光に移行したことを示している。
【図４】ヒト網膜色素上皮細胞における分裂活性化度及び形質導入効率を示している。ヒト網膜色素上皮細胞は、レンチウイルス又はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）で形質導入された。ベクターにさらされた時間により、細胞は分裂不活性（融合）又は分裂活性（成長）となる。図４に示されたこれらの結果は、非分割細胞の形質導入において、レンチウイルス・ベクターが他のレトロウイルス・ベクターより優れた能力を持つことを示している。
【図５Ａ】図５はヒト網膜色素上皮細胞における発現の安定性を示すものである。細胞はｅＧＦＰ含有レンチウイルス・ベクターの作用を受け、引き続き少なくとも１２０日間連続培養された。図５Ａはレンチウイルス形質導入細胞に対する、又は除外する選択の欠如に加え、これらの細胞におけるｅＧＦＰの安定性を示している（形質導入された細胞の割合は一定時間あたり一定である）。
【図５Ｂ】細胞の５クローン集団のサザン分析の結果である。レーン１は非形質導入親系由来のゲノムＤＮＡを含んでいる。レーン２及び３は、ベクターにさらされたが、緑色ではない（非形質導入）細胞由来のＤＮＡを含んでいる。レーン４及び５は形質導入された緑色の細胞由来のＤＮＡを含んでいる。細胞はゲノム統合の結果、細胞はｅＧＦＰポジティブのままであった。
【図６】ヒト胎児トランスジーン発現を示すものである。このグラフは、ヒト胎児細胞におけるにおける、非レンチウイルス・レトロウイルス・ベクター（ＭＮＤ−ｅＧＦＰ）又はウイルス・ベクターがない状態（コントロール）と比較した場合に、レンチウイルス・ベクターは形質導入が高い効率で達成されることを示されている。
【図７Ａ】図７は角膜における形質導入を示すものである。図７はヒト角膜の概要図である。
【図７Ｂ】ｅ−ＧＦＰ含有レンチウイルス・ベクターによるヒト角膜内皮細胞の形質導入を示すものである。角膜移植の際に除去されたヒト角膜のボタンをレンチウイルス粒子にさらした。デスメ膜が続いて除去され、室内光（左側）、及び、蛍光検出が可能な状況（右側）で写真撮影された。
【図７Ｃ】ヒト角膜上皮細胞に対するレンチウイルス媒介ｅＧＦＰ遺伝子導入を示すものである。サブパネルＡは人工的に上皮層を剥離させたヒト角膜の光学顕微鏡写真を示すものである。蛍光顕微鏡写真（サブパネルＢ）は上皮の蛍光を示すものである。
【図８】欠損の結果ヒト疾患を生じさせる遺伝子のレンチウイルス遺伝子導入の例である。網膜芽腫の脱核の際に外科的に切開された正常ヒト網膜組織又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）組織は、治療遺伝子（Ｍｏｃｋ）を欠いているか、またはヒト・ペリフェリン遺伝子を含むレンチイルス・ベクターにさらされた。この遺伝子が、ヒトにおいて遺伝的に欠損した場合には、非常に多種の無力化表現型を生み出す結果となることが知られている。導入されたペリフェリン遺伝子のみを認識するように設計されたプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）の結果が示されている。ヒト網膜及び網膜色素上皮におけるヒトにおけるヒト・ペリフェリンの発現が明確に示されている。
【図９】ＣＡ−ｒｂ  ｍＲＮＡのレンチウイルス媒介発現を示すものである。これは、構成的活性型の網膜芽腫遺伝子のみを認識するように設計されたプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）の結果を示している。レーン１：マーカー、レーン２：レンチウイルスｅＧＦＰ形質導入細胞から分離されたＲＮＡとの反応結果、レーン３：レンチウイルスＣＡ−ｒｂ形質導入細胞から分離されたＲＮＡとの反応結果。反応産物は予測された大きさであった。
【図１０】ヒト網膜及び角膜細胞分裂に対するレンチウイルス構成的活性網膜芽腫遺伝子ベクターの阻害効果を示すものである。細胞は段階的に希釈された単一レンチウイルス株（１：４００希釈液から１：５０希釈液）にさらされ、その成長を、構成的活性網膜芽腫遺伝子を含有しないレンチウイルス・ベクターにさらした細胞と比較した。時間に対する細胞分裂の阻害効果が明確に見られ、この効果は量依存性であった。
【図１１】ヒトレンズ上皮細胞の細胞分裂の対するレンチウイルスＣＡ−ｒｂの阻害効果を示すものである。白内症摘出の際にヒト眼から除去された細胞は段階的に希釈された単一レンチウイルス株（１：４００希釈液から１：５０希釈液）にさらされ、その成長を、構成的活性網膜芽腫遺伝子を含有しないレンチウイルス・ベクターにさらした細胞と比較した。時間に対する細胞分裂の阻害効果が明確に見られ、この効果は量依存性であった。
【図１２】失明眼内細胞増殖に対するレンチウイルスＣＡ−ｒｂのイン・ビボにおける阻害効果を示している。３組のウサギで増殖性硝子体網膜症が誘発された。１つの組は処理を行わないものであり、別の１組は構成的活性網膜芽腫遺伝子を欠いたレンチウイルス・ベクターで処理したものであり、残りの１組は硝子体内由来のレンチウイルスＣＡ−ｒｂで処理されたものである。増殖性硝子体網膜症及び網膜剥離は、最初の２組において高い頻度（＞９０％）で現れている。網膜剥離に至った動物の割合は、構成的活性網膜芽腫遺伝子で処理した組において有意に低下したのものであった（２６％）。ここでは２つの網膜の写真が示されている。左側の目では、網膜が完全に接着しているものであり、構成的活性網膜芽腫遺伝子で処理したものであった。右側の目は、眼内硝子体内細胞増殖の結果、完全に網膜が剥離したものであって、ＣＡ−ｒｂ遺伝子を欠いたレンチウイルス・ベクターで処理されたものである。
【図１３】ポスト・レンズ摘出後嚢混濁の過程におけるレンチウイルスＣＡ−ｒｂのイン・ビボにおける阻害効果を示している。３組のウサギが生まれつきのレンズを除去して標準的な水晶体混濁を生じさせた。第１の組（グループ１）はその後何も処理されず、残りの２組は空のレンチウイルス構造物（治療遺伝子無し、グループ２）又はレンチウイルスＣＡ−ｒｂ（グループ３）を白内障の傷が閉塞する際に、傷のないレンズ嚢バックに伝達する処理を行った。動物は順次混濁が存在するかどうか調査された。混濁の存在は、１が混濁の無いものを表し、５が間接双眼検眼鏡による検査により網膜の視覚化を妨げるのに十分な重度の混濁を表す、１〜５の各段階で表された。グループ１及び２（未処理及び空ベクター）の間で結果に有意な差は存在しなかった。ここのグラフは後嚢混濁の発生に対するレンチウイルスＣＡ−ｒｂの著しい阻害効果を示している。２８日目において、コントロールの動物は平均混濁段階が４．４であり、一方、レンチウイルスＣＡ−ｒｂで処理した動物では平均混濁段階が２．１であった。
【図１４】レンチウイルス・ベクターによって伝達されたエンドスタチン−１８／アンジオスタチン融合遺伝子の地図を示すものである。
【図１５】エンドスタチン−１８／アンジオスタチン融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−Ｅｎｄｏ／Ａｎｇ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図１６】ＢＩＫ遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−ＢＩＫ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図１７】エンドスタチン／クリングル融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−Ｅｎｄｏ／Ｋｒｉｎｇｌｅ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図１８】ＫＤＲ遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−ＫＤＲ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図１９】ｐ１６遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−Ｐ１６−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２０】ｐ２１遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−Ｐ２１−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２１】Ｔｉｍｐ１遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＣＭＶ−Ｔｉｍｐ１−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２２】アンジオスタチン遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ａｎｇ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２３】エンドスタチンＸＶ遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｅｎｄｏ  ＸＶ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２４】エンドスタチン／アンジオスタチン融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−ＥｎｄｏＡｎｇ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２５】エンドスタチン／クリングル融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−ＥｎｄｏＫｒｉｎｇｌｅ−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２６】クリングル融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２７】Ｍｉｇ／ＩＰ１０融合遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−ＭｉｇＩＰ１０−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２８】Ｔｉｍｐ１遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｔｉｍｐ１−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図２９】Ｔｉｍｐ４遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｔｉｍｐ４−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図３０】ｐ２１遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｐ２１−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図３１】エンドスタチンＸＶIII遺伝子を運搬するレンチウイルス・ベクターｐＨＲ−ＥＦ１／ＨＴＬＶ−Ｅｎｄｏ  ＸＶIII−ｉｒｅｓ−ｅＧＦＰの地図を示すものである。
【図３２】エンドスタチン−１８／アンジオスタチン融合遺伝子で形質導入されたヒト皮膚毛細血管内皮細胞（ｈＤＭＶＥ）から分離されたｍＲＮＡの逆転写ＰＣＲを示すものである。レーン１：１０００／１００ｂｐラダー混合物；レーン２−５：１２ウェルプレートの一つのウェルから得られた、１ｕｌ、５ｕｌ、１０ｕｌ及び２０ｕｌのｐＨＲ'−ｅＦ１α／ＨＴＬＶ−Ｅｎｄｏ：：Ａｎｇ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰウイルス上清で形質導入されたｈＤＭＶＥ細胞から分離されたｍＲＮＡによる逆転写ＰＣＲ；レーン６：２０μｌのＰＢＳとインキュベートされたｈＤＭＶＥ細胞から分離されたｍＲＮＡによる逆転写ＰＣＲ；レーンｈＤＭＶＥ細胞から分離されたｍＲＮＡによる逆転写ＰＣＲ；７：負のコントロール（逆転写ＰＣＲのテンプレートとしての水）；１００ｂｐラダー。
【図３３Ａ】図３３は処理された動物における角膜マイクロポッケトのｅＧＦＰ存在を示すものである。図３３ＡはマイクロポッケトにおけるｅＧＦＰ発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３３Ｂ】図３３Ａで示した組織と同一の組織の非蛍光顕微鏡写真である。
【図３３Ｃ】未処理動物における同様な過程を経た組織の蛍光顕微鏡写真である。
【図３４Ａ】図３４はＭｉｇ／ＩＰ１０レンチウイルス・ベクターで処理された動物における新生血管形成に対する阻害効果を示すものである。図３４Ａは正常な（未処理、無刺激）角膜の写真である。
【図３４Ｂ】Ｍｉｇ／ＩＰ１０レンチイウルス・ベクターで処理された動物のアルカリ攻撃角膜の写真である。角膜中には血管が欠損していることに注意を要する。
【図３４Ｃ】治療的抗血管新生促進遺伝子が無いコントロール・レンチウイルス・ベクターにより処理された動物のアルカリ攻撃角膜の写真である。角膜への血管の侵入に注意を要する。
【図３４Ｄ】未処理動物のアルカリ攻撃角膜の写真である。角膜への血管の侵入に注意を要する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2004520307.tif 000013
【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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