(57)【要約】標的（例えば、ウイルス上に存在する標的）と相互作用するリガンドは、儀陽性の相互作用（特異的または非特異的）が、その標的特異的相互作用と区別される場合に、より容易に同定され得る。標的に結合する表面に固定したリガンドのライブラリーをスクリーニングするための改善された方法を提示する。この方法は、多くの異なるリガンドについて、同じ表面に固定したライブラリーの複数回のスクリーニングに使用され得る。１つの局面において、本発明は、２０アミノ酸未満の長さであり、そしてＰＰＶ結合ドメイン、ＨＡＶ結合ドメインおよびプリオン結合ドメインからなる群より選択される配列を含む、ペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０アミノ酸未満の長さであり、そしてＰＰＶ結合ドメイン、ＨＡＶ結合ドメインおよびプリオン結合ドメインからなる群より選択される配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
ＨＡＶ結合ドメインを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、フィブリノーゲンの存在下でＨＡＶに結合する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、ＦＬＬＦＲＦ（配列番号９）；ＦＬＬＨＥＥ（配列番号１０）；ＦＬＬＨＰＨ（配列番号１１）；ＦＬＬＨＳＬ（配列番号１２）；ＦＬＬＲＫＦ（配列番号１３）；ＦＬＬＲＹＳ（配列番号１４）；ＦＬＬＹＲＹ（配列番号１５）；（Ｆ）ＬＬＤＩＲ；（Ｆ）ＬＬＫＦＰ；（Ｆ）ＬＬＫＱＩ；（Ｆ）ＬＬＰＬＫ；（Ｆ）ＬＬＱＡＹ；（Ｆ）ＬＬＱＨＹ；（Ｆ）ＬＬＲＦＴ；（Ｆ）ＬＬＹＧＫ；（Ｆ）ＬＬＡＴＩ；（Ｆ）ＬＬＤＳＱ；（Ｆ）ＬＬＥＩＫ；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ：ＦＬＬＦＲＨ（配列番号２１）；ＦＬＬＫＤＱ（配列番号２２）；ＦＬＬＱＹＫ（配列番号２３）；ＦＬＬＴＧＫ（配列番号２４）；ＦＬＬＹＦＴ（配列番号２５）および（Ｆ）ＬＬＶＬＰからなる群より選択される配列を含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ＰＰＶ結合ドメインを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ＰＰＶ結合ドメインが、フィブリノーゲンの存在下でＰＰＶに結合する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ＰＰＶ結合ドメインが、（Ｆ）ＬＬＡＥＹ；（Ｆ）ＬＬＡＦＳ；（Ｆ）ＬＬＡＧＶ；（Ｆ）ＬＬＨＨＩ；（Ｆ）ＬＬＫＧＹ；（Ｆ）ＬＬＬＰＫ；（Ｆ）ＬＬＰＡＫ；（Ｆ）ＬＬＰＦＬ：（Ｆ）ＬＬＰＰＲ；（Ｆ）ＬＬＰＹＫ；ＦＬＬＱＮＫ（配列番号１６）；ＦＬＬＱＰＦ（配列番号１７）；ＦＬＬＲＦＡ（配列番号１８）；ＦＬＬＲＹＴ（配列番号１９）；およびＦＬＬＳＶＩ（配列番号２０）からなる群より選択される配列を含む、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
ＨＡＶ結合ドメインを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、フィブリノーゲンの存在下でＨＡＶに結合する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；ＦＬＬＤＬＸ（配列番号２６）；（Ｆ）ＬＬＤＫＸ；およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号２７）からなる群より選択される配列を含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、ＰＲＶを結合する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ＨＡＶ結合ドメインが、ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）；ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）；（Ｆ）ＡＡＦＩＮ：（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；（Ｆ）ＬＫＬＦＰ；（Ｆ）ＰＮＧＧＩ；（Ｆ）ＶＥＶＫＦ；ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）；（Ｆ）ＦＦＴＦＫ；（Ｆ）ＬＬＤＬＸ；（Ｆ）ＹＹＬＮＶ；ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）；ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）；ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）；ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）からなる群より選択される配列を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
プリオンタンパク質に結合する配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記プリオンタンパク質結合配列が、（Ｒ）ＡＡＴＥＨ；（Ｈ）ＨＨＰＱＴ；（Ｖ）ＳＨＬＬＳ；（Ｔ）ＬＨＥＴＬ；（Ｖ）ＡＧＱＧＱ；（Ｓ）ＤＦＬＫＲ；（Ｖ）ＦＶＲＦＸ；（Ｖ）ＡＫＶＳＰ；（Ｒ）ＹＨＶＹＦ；（Ｅ）ＲＰＤＫＧ；ＹＲＮＱＦＲ（配列番号２９）；およびＡＶＦＮＦＤ（配列番号３０）からなる群より選択される、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
１５アミノ酸未満の長さである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１６】
１０アミノ酸未満の長さである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のペプチドであって、該ペプチドは、ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）；ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）；（Ｆ）ＡＡＦＩＮ；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；（Ｆ）ＬＫＬＦＰ；（Ｆ）ＰＮＧＧＩ；（Ｆ）ＶＥＶＫＦ；ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）；（Ｆ）ＦＦＴＦＫ；（Ｆ）ＬＬＤＬＸ；（Ｆ）ＹＹＬＮＶ；ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）；ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）；ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）；ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）；ＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）；ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；（Ｒ）ＡＡＴＥＨ；（Ｈ）ＨＨＰＱＴ；（Ｖ）ＳＨＬＬＳ；（Ｔ）ＬＨＥＴＬ；（Ｖ）ＡＧＱＧＱ；（Ｓ）ＤＦＬＫＲ；（Ｖ）ＦＶＲＦＸ；（Ｖ）ＡＫＶＳＰ；（Ｒ）ＹＨＶＹＦ：（Ｅ）ＲＰＤＫＧ；ＹＲＮＱＦＲ（配列番号２９）；ＡＶＦＮＦＤ（配列番号３０）；ＦＬＬＦＲＦ（配列番号９）；ＦＬＬＨＥＥ（配列番号１０）；ＦＬＬＨＰＨ（配列番号１１）；ＦＬＬＨＳＬ（配列番号１２）；ＦＬＬＲＫＦ（配列番号１３）；ＦＬＬＲＹＳ（配列番号１４）；ＦＬＬＹＲＹ（配列番号１５）；（Ｆ）ＬＬＤＩＲ；（Ｆ）ＬＬＫＦＰ；（Ｆ）ＬＬＫＱＩ；（Ｆ）ＬＬＰＬＫ；（Ｆ）ＬＬＱＡＹ；（Ｆ）ＬＬＱＨＹ；（Ｆ）ＬＬＲＦＴ；（Ｆ）ＬＬＹＧＫ；（Ｆ）ＬＬＡＴＩ；（Ｆ）ＬＬＤＳＱ；（Ｆ）ＬＬＥＩＫ；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；ＦＬＬＦＲＨ（配列番号２１）；ＦＬＬＫＤＱ（配列番号２２）；ＦＬＬＱＹＫ（配列番号２３）；ＦＬＬＴＧＫ（配列番号２４）；ＦＬＬＹＦＴ（配列番号２５）；（Ｆ）ＬＬＶＬＰ；（Ｆ）ＬＬＡＥＹ；（Ｆ）ＬＬＡＦＳ；（Ｆ）ＬＬＡＧＶ；（Ｆ）ＬＬＨＨＩ；（Ｆ）ＬＬＫＧＹ；（Ｆ）ＬＬＬＰＫ；（Ｆ）ＬＬＰＡＫ；（Ｆ）ＬＬＰＦＬ；（Ｆ）ＬＬＰＰＲ；（Ｆ）ＬＬＰＹＫ；ＦＬＬＱＮＫ（配列番号１６）；ＦＬＬＱＰＦ（配列番号１７）；ＦＬＬＲＦＡ（配列番号１８）；ＦＬＬＲＹＴ（配列番号１９）；ＦＬＬＳＶＩ（配列番号２０）；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；ＦＬＬＤＬＸ（配列番号２６）；（Ｆ）ＬＬＤＫＸ；およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号２７）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを含む、組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドが、固体支持体に結合されている請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記固体支持体が、樹脂である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
生物学的流体から標的を除去する方法であって、該方法は、該生物学的流体に、請求項１８に記載の組成物を、該組成物中の前記ペプチドヘの該標的の特異的結合を生じるのに十分な条件下で接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記標的が、ＨＡＶ、ＰＰＶ、ＰＲＶ、プリオンタンパク質、ＨＩＶ、ＥＭＣＶ、ＢＶＤＶ、Ｂ１９およびＳＶ４０からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、乳汁、管の流体、涙および精液からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
２０アミノ酸未満の長さであり、そしてＥＭＣＶ結合ドメイン、ＳＶ４０結合ドメイン、ポリオウイルス結合ドメイン、ＢＶＤＶ結合ドメインおよびＡＰＩ結合ドメインからなる群より選択される配列を含む、ペプチド。
【請求項２５】
ＥＭＣＶ結合ドメインを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記ＥＭＣＶ結合ドメインが、ＦＬＬＲＮＶ（配列番号３３）、ＦＬＬＮＡＨ（配列番号３４）、ＦＬＬＧＰＲ（配列番号３５）およびＦＬＬＮＱＥ（配列番号３６）からなる群より選択される配列を含む、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
ＳＶ４０結合ドメインを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記ＳＶ４０結合ドメインが、ＦＬＬＦＱＰ（配列番号３７）、ＦＬＬＥＶＹ（配列番号３８）およびＦＬＬＲＧＳ（配列番号３９）からなる群より選択される配列を含む、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
ポリオウイルス結合ドメインを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ポリオウイルス結合ドメインが、ＦＬＬＩＤＡ（配列番号４０）、ＦＬＬＱＳＡ（配列番号４１）、ＦＬＬＫＥＩ（配列番号４２）、ＦＬＬＰＦＫ（配列番号４３）、ＦＬＬＡＰＮ（配列番号４４）、ＦＬＬＹＳＡ（配列番号４５）、ＦＬＬＬＮＳ（配列番号４６）、ＦＬＬＹＲＲ（配列番号４７）およびＦＬＬＫＳＶ（配列番号４８）からなる群より選択される配列を含む、請求項２９に記載のペプチド。
【請求項３１】
ＢＶＤＶ結合ドメインを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ＢＶＤＶ結合ドメインが、ＦＬＬＬＲＮ（配列番号４９）およびＦＬＬＲＧＨ（配列番号５０）からなる群より選択される配列を含む、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
ＡＰＩ結合ドメインを含む、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記ＡＰＩ結合ドメインが、ＡＱＴＦＨＤ（配列番号５１）、ＲＤＹＤＴＤ（配列番号５２）、ＬＫＲＩＥＹ（配列番号５３）、ＳＤＬＲＲＬ（配列番号５４）、ＡＰＰＲＴＶ（配列番号５５）、ＶＬＹＴＮＮ（配列番号５６）、ＮＦＺＱＮＴ（配列番号５７）およびＳＫＮＮＡＡ（配列番号５８）からなる群より選択される配列を含む、請求項３３に記載のペプチド。
【請求項３５】
請求項２４に記載のペプチドを含む、組成物。
【請求項３６】
前記ペプチドが、固体支持体に結合されている、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記固体支持体が、樹脂である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
生物学的流体から標的を除去する方法であって、該方法は、該生物学的流体に、請求項３５に記載の組成物を、該組成物中の前記ペプチドヘの該標的の特異的結合を生じるのに十分な条件下で接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記標的が、ＥＭＣＶ、ＳＶ４０、ＢＶＤＶ、ＡＰＩおよびポリオウイルスからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的流体が、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、乳汁、管の流体、涙および精液からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
標的に対するリガンドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）複数の固定したリガンドを第１の溶液と共にインキュベートする工程であって、該第１の溶液は、該標的を実質的に含まず、そして１以上の因子を含み、該工程は、該リガンドと該因子との間の安定な複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
ｂ）該リガンド−因子複合体に、該標的に対する親和性を有するプローブ分子を接触させる工程；
ｃ）該リガンド−因子複合体に関連する一過性のシグナルを同定することによって、該リガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；
ｄ）該リガンドを、該標的および該第１の溶液を含む第２の溶液と共にインキュベートする工程であって、該工程は、該標的と該リガンドとの間の安定な複合体の形成および該因子と該リガンドとの間の安定な複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
ｅ）該リガンド−標的複合体および該リガンド−因子複合体に、該プローブ分子を接触させる工程；
ｆ）該一過性のシグナルを検出することによって、該第２の溶液中の該リガンド−標的複合体に結合したプローブ分子および該リガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；および
ｇ）該第２の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関連する該一過性のシグナルを、該第１の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関連する該一過性のシグナルと比較する工程であって、ここで、該第１の溶液に対する該第２の溶液に優先的に関連するシグナルは、該標的に特異的なリガンドを含むリガンド−プローブ分子複合体を示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記リガンドが、個々の支持体に固定されており、それによって、支持体の集団を作製する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記個々の支持体が、ビーズである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の固定されたリガンドが、リガンド含有ビーズのコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記支持体の集団が、表面上に固定されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記表面が、平面である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記表面が、透明である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記支持体の集団が、接着剤中に包理されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記接着剤が、エラストマー性シーラントである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記接着剤が、ビニル接着性コーキング材料である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リガンド分子が、ポリマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記リガンド分子が、ペプチド、ペプチド模倣物、小さい有機分子、核酸および炭水化物からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブ分子が、抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記一過性のシグナルが、化学発光である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記化学発光が、オートラジオグラフィーによって検出される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的が、細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的が、ウイルスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記ウイルスが、ブタパルボウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルスが、仮性狂犬病ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスが、ポリオウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスが、シミアンウイルス４０である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスが、脳心筋炎ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記ウイルスが、ウシウイルス性下痢性ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的が、タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項６６】
前記タンパク質が、α一１プロテイナーゼインヒビターである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記タンパク質が、プリオンである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記プリオンが、スクラピープリオンである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４１に記載の方法であって、前記リガンド−因子複合体に関連する前記一過性のシグナルを検出した後で、かつ該リガンドを該第２の溶液と共にインキュベートする前に、該リガンド−因子複合体から該因子を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７０】
前記標的に特異的なリガンドの正体を決定する工程を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項７１】
複数の標的に対するリガンドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の固定したリガンドを第１の溶液と共にインキュベートする工程であって、該第１の溶液は、第１の標的を実質的に含まず、そして１以上の因子を含み、該工程は、該リガンドと該因子との間の安定な複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
（ｂ）該リガンド−因子複合体に、該第１の標的に対する親和性を有するプローブ分子を接触させる工程；
（ｃ）該リガンド−因子複合体に関連する一過性のシグナルを同定することによって、該リガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；
（ｄ）該リガンド−因子複合体から該因子を除去する工程；
（ｅ）該リガンドを、該第１の標的および該第１の溶液を含む第２の溶液と共にインキュベートする工程であって、該工程は、該第１の標的と該リガンドとの間の安定な複合体の形成および該因子と該リガンドとの間の安定な複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
（ｆ）該リガンド−第１の標的複合体および該リガンド−因子複合体に、該プローブ分子を接触させる工程；
（ｇ）該一過性のシグナルを検出することによって、該第２の溶液中の該リガンド−第１の標的複合体に結合したプローブ分子および該リガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；および
（ｈ）該第２の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関連する該一過性のシグナルを、該第１の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関連する該一過性のシグナルと比較する工程であって、ここで、該第１の溶液に対する該第２の溶液に優先的に関連するシグナルは、該第１の標的に特異的なリガンドを含むリガンド−プローブ分子複合体を示す、工程；
（ｉ）該リガンド−因子複合体から該因子を、そして該リガンド−第１の標的複合体から該第１の標的を除去する工程；および
（ｊ）第２の標的を含む第３の溶液を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項７２】
第１の標的または第２の標的に特異的なリガンドの正体を決定する工程をさらに包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
血液組成物中に存在するウイルスに結合するペプチドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）コンビナトリアルペプチドライブラリーを含む、複数の固定したビーズを提供する工程；
（ｂ）該ペプチドライブラリーを血液組成物と共にインキュベートする工程であって、該血液組成物は、該ウイルスを実質的に含まず、そして１以上の因子を含み、該工程は、該ペプチドと該因子との間の安定な複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
（ｃ）該複合体に、該ウイルスに対する親和性を有する第１の抗体を、ペプチド−因子−第１の抗体複合体の形成を可能にする条件下で、接触させる工程；
（ｄ）該ペプチド−因子複合体に関連する一過性のシグナルを同定する工程；
（ｅ）該ペプチドを、該ウイルス分子および該第１の血液組成物を含む第２の血液組成物と接触させる工程であって、該工程は、安定なペプチド−ウイルス複合体およびペプチド−因子複合体の形成を可能にする条件下で行う、工程；
（ｇ）該ペプチド−ウイルス複合体および該ペプチド−因子複合体に関連する一過性のシグナルを同定する工程；および
（ｈ）ペプチド−ウイルス複合体に関連する該一過性のシグナルおよびペプチド−因子複合体に関連する該一過性のシグナルを、該第１の血液組成物中のペプチド−因子複合体に関連する該一過性のシグナルと比較する工程であって、ここで、該第１の血液組成物に対する該第２の血液組成物に優先的に関連する一過性のシグナルは、該ウイルスに特異的なペプチドを含むペプチド−ウイルス複合体を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項７４】
第１の標的または第２の標的に特異的なリガンドの正体を決定する工程をさらに包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ペプチドの配列を同定する工程をさらに包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ペプチドライブラリーが、ビニルコーキング接着剤を使用して透明のフィルムに固定されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
第２の標的を含む第３の血液組成物を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
第３の標的を含む第４の血液組成物を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、標的に結合するリガンド（例えば、ポリペプチド、ペプチド、およびポリヌクレオチド）を同定するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの生物学的なプロセスは、１つの高分子の、第２の分子への結合を必要とする。第２の分子は、しばしば、第１の分子のリガンドと呼ばれる。標的分子とリガンドとの間の相互作用が、免疫認識、細胞のシグナル伝達および情報伝達、転写および翻訳、細胞内シグナル伝達、ならびに酵素による触媒のような、生物学的なプロセスにおいて重要であり得る。結果として、所定の分子のリガンドを同定することにかなりの目的が存在する。このようなリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定することもまた、目的である。
【０００３】
ポリマー性の生物学的試験化合物または合成試験化合物のライブラリーが、しばしば、生物学的に活性な分子についてのリガンドを同定するために使用される。現在は、高スループットスクリーニング技術が、生物学的標的についてのリガンド分子を迅速に同定し、最適化するために、化合物ライブラリー（分子生物学的または組換え化学技術、および他の高スループットの合成方法のいずれかによって得られる）の合成と組み合わせられる。
【０００４】
多くの生物学的なリガンドは、タンパク質またはペプチドであるので、推定されるリガンドのライブラリーは、代表的には、ペプチドの設計および合成を含む。他のライブラリーは、ポリマー性の化合物（例えば、ペプチド様オリゴマー化合物）および低分子有機（非オリゴマー）化合物を含み得る。
【０００５】
所定の標的のリガンドについてライブラリーをスクリーニングするための現在の方法は、高いバックグラウンドによって妨害され得る。これらのバックグラウンドのレベルは、ライブラリー中の１つ以上のリガンドに対する標的以外の因子の結合に関係し得る。これらの因子は、リガンドのライブラリーをプローブするために使用されるスクリーニング溶液中に、標的とともに存在し得る。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、リガンドライブラリーをスクリーニングするための、迅速な、高感度な、そして再使用が可能な方法の発見に、一部基づく。この方法は、リガンドと標的との間の特異的な結合とスクリーニング溶液中の因子へのリガンドの非特異的な結合とを区別する。リガンドライブラリーは、標的に対する結合および同定された標的について特異的なリガンドのプロフィールについてスクリーニングされ得る。次いで、所望される場合には、このプロセスが、１つ以上のさらなる標的を用いて繰り返され得る。
【０００７】
この方法は、実質的に標的を含まない１つ以上の溶液とともに、複数の固定されたリガンドをインキュベーションする工程を包含する。この溶液は、ライブラリー中の１つ以上のリガンドに対する所望されない結合を示し得る、１つ以上の因子を含む。溶液は、リガンドと因子との間での安定な複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベーションされる。いくつかのリガンド−因子複合体が、標的について親和性を有するプローブ分子を用いて検出される。リガンド−因子複合体に結合したプローブ分子が、複合体と関連したシグナルを同定することによって検出される。
【０００８】
次いで、リガンドが、標的および先に使用した少なくとも１つの溶液を含む第２の溶液とともに、インキュベーションされる。第２の溶液はまた、標的とリガンドとの間の安定な複合体の形成を可能にしかつ因子とリガンドとの間での安定な複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベーションされる。次いで、これらの複合体をプローブ分子と接触させ、リガンド−標的複合体に結合したプローブ分子およびリガンド−因子複合体に結合したプローブ分子が同定される。
【０００９】
第２の溶液中のリガンド−プローブ複合体と関係するシグナルが、第１の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関係する一過性のシグナルと比較される。第１の溶液と比較して第２の溶液に優先的に関連するシグナルは、標的についての特異的なリガンドを含有しているリガンド−プローブ分子複合体を示す。
【００１０】
スクリーニング方法において使用されるシグナルの少なくとも１つは、一過性のシグナルである。好ましい実施形態において、この方法で使用されるシグナルの２つ以上または全てが、一過性のシグナルである。
【００１１】
本明細書中で開示されるスクリーニング方法を使用して同定されるペプチドもまた、本発明の範囲内である。１つの局面において、本発明は、２０未満のアミノ酸長であり、そして、そしてブタのパルボウイルス（ＰＰＶ）結合ドメイン、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）結合ドメイン、またはプリオン結合ドメインを含むペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、１８、１６、１５、１４、または１３未満のアミノ酸長である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＨＡＶ結合ドメインは、フィブリノーゲンの存在下でＨＡＶに結合する。ＨＡＶ結合ドメインを含むペプチド配列の例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＦＲＦ（配列番号９）；ＦＬＩＨＥＥ（配列番号１０）；ＦＬＬＨＰＨ（配列番号１１）；ＦＬＬＨＳＬ（配列番号１２）；ＦＬＬＲＫＦ（配列番号１３）；ＦＬＬＲＹＳ（配列番号１４）；ＦＬＬＹＲＹ（配列番号１５）；（Ｆ）ＬＬＤＩＲ；（Ｆ）ＬＬＫＦＰ；（Ｆ）ＬＬＫＱＩ；（Ｆ）ＬＬＰＬＫ；（Ｆ）ＬＬＱＡＹ；（Ｆ）ＬＬＱＨＹ；（Ｆ）ＬＬＲＦＴ；（Ｆ）ＬＬＹＧＫ；（Ｆ）ＬＬＡＴＩ；（Ｆ）ＬＬＤＳＱ；（Ｆ）ＬＬＥＩＫ；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；ＦＬＬＦＲＨ（配列番号２１）；ＦＬＬＫＤＱ（配列番号２２）；ＦＬＬＱＹＫ（配列番号２３）；ＦＬＬＴＧＫ（配列番号２４）；ＦＬＬＹＦＴ（配列番号２５）、および（Ｆ）ＬＬＶＬＰ。本明細書中の括弧中に示されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸を示す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＰＰＶ結合ドメインは、フィブリノーゲンの存在下でＰＰＶに結合する。ＰＰＶ結合ドメインを含むペプチド配列の例として、例えば、以下が挙げられる：（Ｆ）ＬＬＡＥＹ；（Ｆ）ＬＬＡＦＳ；（Ｆ）ＬＬＡＧＶ；（Ｆ）ＬＬＨＨＩ；（Ｆ）ＬＬＫＧＹ；（Ｆ）ＬＬＬＰＫ；（Ｆ）ＬＬＰＡＫ；（Ｆ）ＬＬＰＦＬ；（Ｆ）ＬＬＰＰＲ；（Ｆ）ＬＬＰＹＫ；ＦＬＬＱＮＫ（配列番号１６）；ＦＬＬＱＰＦ（配列番号１７）；ＦＬＬＲＦＡ（配列番号１８）；ＦＬＬＲＹＴ（配列番号１９）；およびＦＬＬＳＶＩ（配列番号２０）。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＨＡＶ結合ドメインは、フィブリノーゲンの存在下でＨＡＶに結合する。ＨＡＶ結合ドメインを含むこのようなペプチドの例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；ＦＬＬＤＬＸ（配列番号２６）；（Ｆ）ＬＬＤＫＸ；およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号２７）。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＨＡＶ結合ドメインはＰＲＶに結合する。このようなＨＡＶ結合ドメインの例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）；ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）；（Ｆ）ＡＡＦＩＮ；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；（Ｆ）ＬＫＬＦＰ；（Ｆ）ＰＮＧＧＩ；（Ｆ）ＶＥＶＫＦ；ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）；（Ｆ）ＦＦＴＦＫ；（Ｆ）ＬＬＤＬＸ；（Ｆ）ＹＹＬＮＶ；ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）；ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）；ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）；ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）；およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、プリオンタンパク質に結合する配列（すなわち、プリオンタンパク質結合配列）を含む。プリオン結合配列を含有しているタンパク質の例として、例えば、以下が挙げられる：（Ｒ）ＡＡＴＥＨ；（Ｈ）ＨＨＰＱＴ；（Ｖ）ＳＨＬＬＳ；（Ｔ）ＬＨＥＴＬ；（Ｖ）ＡＧＱＧＱ；（Ｓ）ＤＦＬＫＲ；（Ｖ）ＦＶＲＦＸ；（Ｖ）ＡＫＶＳＰ；（Ｒ）ＹＨＶＹＦ；（Ｅ）ＲＰＤＫＧ；ＹＲＮＱＦＲ（配列番号２９）；およびＡＶＦＮＦＤ（配列番号３０）。
【００１７】
さらなる実施形態において、ペプチドは、以下のポリペプチド配列を含む：ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）；ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）；（Ｆ）ＡＡＦＩＮ；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；（Ｆ）ＬＫＬＦＰ；（Ｆ）ＰＮＧＧＩ；（Ｆ）ＶＥＶＫＦ；ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）；（Ｆ）ＦＦＴＦＫ；（Ｆ）ＬＬＤＬＸ；（Ｆ）ＹＹＬＮＶ；ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）；ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）；ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）；ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）；ＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）；ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；（Ｒ）ＡＡＴＥＨ；（Ｈ）ＨＨＰＱＴ；（Ｖ）ＳＨＬＬＳ；（Ｔ）ＬＨＥＴＬ；（Ｖ）ＡＧＱＧＱ；（Ｓ）ＤＦＬＫＲ；（Ｖ）ＦＶＲＦＸ；（Ｖ）ＡＫＶＳＰ；（Ｒ）ＹＨＶＹＦ；（Ｅ）ＲＰＤＫＧ；ＹＲＮＱＦＲ（配列番号２９）；ＡＶＦＮＦＤ（配列番号３０）；ＦＬＬＦＲＦ（配列番号９）；ＦＬＬＨＥＥ（配列番号１０）；ＦＬＬＨＰＨ（配列番号１１）；ＦＬＬＨＳＬ（配列番号１２）；ＦＬＬＲＫＦ（配列番号１３）；ＦＬＬＲＹＳ（配列番号１４）；ＦＬＬＹＲＹ（配列番号１５）；（Ｆ）ＬＬＤＩＲ；（Ｆ）ＬＬＫＦＰ；（Ｆ）ＬＬＫＱＩ；（Ｆ）ＬＬＰＬＫ；（Ｆ）ＬＬＱＡＹ；（Ｆ）ＬＬＱＨＹ；（Ｆ）ＬＬＲＦＴ；（Ｆ）ＬＬＹＧＫ；（Ｆ）ＬＬＡＴＩ；（Ｆ）ＬＬＤＳＱ；（Ｆ）ＬＬＥＩＫ；（Ｆ）ＬＬＨＰＩ；ＦＬＬＦＲＨ（配列番号２１）；ＦＬＬＫＤＱ（配列番号２２）；ＦＬＬＱＹＫ（配列番号２３）；ＦＬＬＴＧＫ（配列番号２４）；ＦＬＬＹＦＴ（配列番号２５）、（Ｆ）ＬＬＶＬＰ；（Ｆ）ＬＬＡＥＹ；（Ｆ）ＬＬＡＦＳ；（Ｆ）ＬＬＡＧＶ；（Ｆ）ＬＬＨＨＩ；（Ｆ）ＬＬＫＧＹ；（Ｆ）ＬＬＬＰＫ；（Ｆ）ＬＬＰＡＫ；（Ｆ）ＬＬＰＦＬ；（Ｆ）ＬＬＰＰＲ；（Ｆ）ＬＬＰＹＫ；ＦＬＬＱＮＫ（配列番号１６）；ＦＬＬＱＰＦ（配列番号１７）；ＦＬＬＲＦＡ（配列番号１８）；ＦＬＬＲＹＴ（配列番号１９）；およびＦＬＬＳＶＩ（配列番号２０）；（Ｆ）ＬＬＴＳＹ；ＦＬＬＤＬＸ（配列番号２６）；（Ｆ）ＬＬＤＫＸ；またはＦＬＬＹＡＫ（配列番号２７）。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は、２０未満のアミノ酸長であり、そして脳心筋炎（ＥＭＣＶ）結合ドメイン、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）結合ドメイン、ポリオウイルス結合ドメイン、ウシウイルス性下痢ウシウイルス（ＢＶＤＶ）結合ドメイン、またはα−１−プロテイナーゼインヒビター（ＡＰＩ）結合ドメインを含む配列を含有するペプチドを提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＥＭＣＶ結合ドメインを含む。ＥＭＣＶ結合ドメインを有するペプチド配列の例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＲＮＶ（配列番号３３）、ＦＬＬＮＡＨ（配列番号３４）、ＦＬＬＧＰＲ（配列番号３５）、およびＦＬＬＮＱＥ（配列番号３６）。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＳＶ−４０結合ドメインを含む。ＳＶ−４０結合ドメインを有するペプチド配列の例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＦＱＰ（配列番号３７）、ＦＬＬＥＶＹ（配列番号３８）、およびＦＬＬＲＧＳ（配列番号３９）。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ポリオウイルス結合ドメインを含む。ポリオウイルス結合ドメインを有するペプチドの例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＩＤＡ（配列番号４０）、ＦＬＬＱＳＡ（配列番号４１）、ＦＬＬＫＥＩ（配列番号４２）、ＦＬＬＰＦＫ（配列番号４３）、ＦＬＬＡＰＮ（配列番号４４）、ＦＬＬＹＳＡ（配列番号４５）、ＦＬＬＬＮＳ（配列番号４６）、ＦＬＬＹＲＲ（配列番号４７）、およびＦＬＬＫＳＶ（配列番号４８）。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＢＶＤＶ結合ドメインを含む。ＢＶＤＶ結合ドメインを有するペプチドの例として、例えば、以下が挙げられる：ＦＬＬＬＲＮ（配列番号４９）、およびＦＬＬＲＧＨ（配列番号５０）。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＡＰＩ結合ドメインを含む。ＡＰＩ結合ドメインを有するペプチドの例として、例えば、以下が挙げられる：ＡＱＴＦＨＤ（配列番号５１）、ＲＤＹＤＴＤ（配列番号５２）、ＬＫＲＩＥＹ（配列番号５３）、ＳＤＬＲＲＬ（配列番号５４）、ＡＰＰＲＴＶ（配列番号５５）、ＶＬＹＴＮＮ（配列番号５６）、ＮＦＺＱＮＴ（配列番号５７）、およびＳＫＮＮＡＡ（配列番号５８）。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中に記載されるリガンド結合ペプチドを含む組成物を提供する。例えば、組成物は、２０未満のアミノ酸長を有し、そしてＰＰＶ結合ドメイン、ＨＡＶ結合ドメイン、またはプリオン結合ドメインを含有している配列を含むペプチドを含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、固体支持体に結合されている。固体支持体は、例えば、樹脂であり得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、生物学的な流体を本明細書中に記載されているリガンド結合ペプチドを含む組成物と接触させることによって、生物学的な流体から標的を除去する方法を含む。組成物は、その組成物中のペプチドに対する標的の特異的な結合を引き起こすに十分な条件下で、標的と接触させられる。
【００２７】
いくつかの実施形態においては、標的は、例えば、ＨＡＶ、ＰＰＶ、ＰＲＶ、プリオンタンパク質、ＨＩＶ、ＥＭＣＶ、ＢＶＤＶ、ヒトのパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、またはＳＶ４０である。他の実施形態においては、標的は、例えば、ＥＭＣＶ、ＳＶ４０、ＢＶＤＶ、ＡＰＩ、またはポリオウイルスである。
【００２８】
生物学的な流体は、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、乳汁、導管液（ｄｕｃｔａｌ　ｆｌｕｉｄ）、涙液、または精液であり得る。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、標的についてのリガンドを同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数の固定されたリガンドを、標的を実質的に含まず、１つ以上の因子を含有する第１の溶液とともに、リガンドと因子との間での安定な複合体の形成を可能にする条件下でインキュベーションする工程；（ｂ）リガンド−因子複合体を、標的について親和性を有するプローブ分子と接触させる工程；（ｃ）複合体に関係する一過性のシグナルを同定することによって、リガンド−因子複合体に対して結合したプローブ分子を同定する工程；（ｄ）リガンドを、標的および第１の溶液を含む第２の溶液とともに、標的とリガンドの間で安定な複合体の形成を可能にしかつ因子とリガンドの間で安定な複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベーションする工程；（ｅ）リガンド−標的複合体およびリガンド−因子複合体を、プローブ分子と接触させる工程；（ｆ）一過性のシグナルを検出することによって、第２の溶液中のリガンド−標的複合体に結合したプローブ分子およびリガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；ならびに（ｇ）第２の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関係する一過性のシグナルを、第１の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関係する一過性のシグナルと比較する工程。第１の溶液に対して第２の溶液と優先的に関係するシグナルは、標的に特異的なリガンドを含むリガンド−プローブ分子複合体を示す。
【００３０】
いくつかの実施形態において、複数の固定されたリガンドは、個々に支持体上に固定され、それによって、支持体の集団を生成する。支持体は、例えば、ビーズであり得る。例えば、複数の固定されたリガンドは、リガンドを含有するビーズのコンビナトリアルライブラリーを含む。いくつかの実施形態において、支持体の集団が、表面上に固定される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、表面は、平面である。いくつかの実施形態においては、表面は透明であり、例えば、表面は、平面な透明の表面であり得る。
【００３２】
本発明のいくつかの局面において、支持体の集団は、接着剤中に包埋させられる。接着剤は、例えば、ビニル接着コーキング材料（ｖｉｎｙｌ　ａｄｈｅｓｉｖｅ　ｃａｕｌｋｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉａｌ）のような、エラストマー封止剤（シーラント）であり得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、リガンド分子は、ポリマーである。例えば、リガンド分子は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低有機分子、核酸、および炭水化物であり得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、プローブ分子は、抗体である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、検出可能な一過性のシグナルは、化学発光である。特定の局面においては、化学発光は、例えば、オートラジオグラフィーによって検出され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、標的は細胞である。他の実施形態において、標的はウイルスである。ウイルス標的の例として、例えば、ブタのパルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、脳心筋炎ウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルスが挙げられる。
【００３７】
なお他の実施形態において、標的は、タンパク質（例えば、α−１−プロテイナーゼインヒビター）である。他の実施形態において、標的は、プリオン（例えば、スクラピープリオン）である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、この方法は、複合体に関係する一過性のシグナルを検出した後でかつリガンドと第２の溶液をインキュベーションする前に、リガンド−因子複合体から因子を除去する工程をさらに包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、標的に特異的であるリガンドの正体を決定する工程を包含する。
【００３９】
なおさらなる局面において、本発明は、複数の標的ついてリガンドを同定するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数の固定されたリガンドを、第１の標的を実質的に含まず、１つ以上の因子を含有する第１の溶液とともに、リガンドと因子との間で安定な複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベーションする工程；（ｂ）リガンド−因子複合体を、第１の標的について親和性を有するプローブ分子と接触させる工程；（ｃ）複合体に関係する一過性のシグナルを同定することによって、リガンド−因子複合体に対して結合したプローブ分子を同定する工程；（ｄ）リガンド−因子複合体から因子を除去する工程；（ｅ）リガンドを、第１の標的および第１の溶液を含有する第２の溶液とともに、第１の標的とリガンドとの間での安定な複合体の形成を可能にしかつ因子とリガンドの間で安定な複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベーションする工程；（ｆ）リガンド−第１の標的複合体およびリガンド−因子複合体を、プローブ分子と接触させる工程；（ｇ）一過性のシグナルを検出することによって、第２の溶液中のリガンド−第１の標的複合体に結合したプローブ分子およびリガンド−因子複合体に結合したプローブ分子を同定する工程；（ｈ）第２の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関係する一過性のシグナルを、第１の溶液中のリガンド−プローブ複合体に関係する一過性のシグナルと比較する工程、ここで、第１の標的に対して第２の溶液に優先的に関係するシグナルが、第１の標的に特異的なリガンドを含むリガンド−プローブ分子複合体を示す、工程；（ｉ）リガンド−因子複合体から因子を、そしてリガンド−第１の標的複合体から第１の標的を除去する工程；ならびに（ｊ）第２の標的を含む第３の溶液を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程。
【００４０】
いくつかの実施形態において、この方法はさらに、第１の標的または第２の標的に特異的なリガンドの正体を決定する工程を包含する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、血液組成物中に存在するウイルスに結合するペプチドを同定するための方法を含む。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）コンビナトリアルペプチドライブラリーを含む複数の固定されたビーズを提供する工程；（ｂ）このペプチドライブラリーを、ウイルスを実質的に含まず、１つ以上の因子を含有する血液組成物とともに、ペプチドと因子の間で安定な複合体の形成を可能にする条件下でインキュベーションする工程；（ｃ）複合体を、ペプチド−因子−第１の抗体複合体の形成を可能にする条件下で、ウイルスについて親和性を有する第１の抗体と接触させる工程；（ｄ）ペプチド−因子複合体に関係する一過性のシグナルを同定する工程；（ｅ）ペプチドを、ウイルス分子および第１の血液組成物を含有する第２の血液組成物とともに、安定なペプチド−ウイルス複合体およびペプチド−因子複合体の形成を可能にする条件下で、接触させる工程；（ｇ）ペプチド−ウイルス複合体およびペプチド−因子複合体に関係する一過性のシグナルを同定する工程；ならびに（ｈ）このペプチド−ウイルス複合体に関係する一過性のシグナルおよびペプチド−因子複合体に関係する一過性のシグナルを、第１の血液組成物中のペプチド−因子複合体に関係する一過性のシグナルと、比較する工程であって、ここで、第１の血液組成物に対して第２の血液組成物に優先的に関係する一過性のシグナルが、ウイルスに特異的なペプチドを含むペプチド−ウイルス複合体を示す、工程。
【００４２】
いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、第１の標的または第２の標的に特異的なリガンドの正体を決定する工程を包含する。いくつかの局面において、この方法は、ペプチドの配列を同定する工程を包含する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ペプチドライブラリーは、ビニルコーキング接着剤を使用して透明なフィルム上に固定される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、この方法はさらに、第２の標的を含有する第３の血液組成物を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程を包含する。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、第３の標的を含む第４の血液組成物を用いて、工程（ｅ）から（ｉ）を繰り返す工程を包含する。
【００４５】
本発明は、多くの利点を付与する。例えば、これは、反応媒体中に含まれる因子に対するビーズ（および／または対応しているリガンド）の結合を含む結合反応から、特異的なリガンド−標的相互作用に関係している結合反応を区別する能力を付与する。
【００４６】
本発明の別の利点は、リガンドがスクリーニングプロセスにおいて消費されないことである。さらに、リガンドの結合は、結合したプローブ分子に関係している一過的なシグナルを使用して検出される。従って、複数のプローブ分子が、リガンドの同じ固定化されたライブラリーに対して連続的に適用され得る。一連のプロフィールが作成され得、そしてその結果が、例えば、多数の異なる標的とのリガンドの結合プロフィールを比較することによって、互いに直接比較され得る。
【００４７】
他に特に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される、ものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されているものと類似または等価である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中に記載されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、それらの全体において参考として援用されている。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のためだけであり、限定するようには意図されない。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００４９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的に対するリガンドを同定する方法を記載する。標的は、目的の任意の分子または複合体であり得る。従って、これは、例えば、ポリペプチド、リポポリサッカライド、ポリサッカライド、または生物学的な目的の他の分子であり得る。これは、さらに、ウイルスまたは細胞のような、高分子構造を含み得る。この方法は、必要に応じて、ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニング：「Ｑｕｉｃｋ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ」と呼ばれ得る。
【００５０】
この方法は、標的に対して特異的に結合するリガンドライブラリーのメンバーについての差引き分析技術（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）の選択を使用する。一般的には、２工程のスクリーニング手順が使用される。第１に、リガンドの固定化されたライブラリーが、標的を含まないスクリーニング溶液と共にインキュベートされる。スクリーニング溶液は、因子−リガンド複合体を形成するように、ライブラリー中の１つ以上のリガンドに結合する１つ以上の因子を含み得る。次いで、リガンド−因子複合体は、特異的なリガンド−標的複合体を同定するために使用される検出システムによって検出され得る。同定されない限りは、因子−リガンド複合体は、標的について特異的であるリガンドの同定を曖昧（ｏｂｆｕｓｃａｔｅ）にし得る。
【００５１】
スクリーニング溶液は、代表的には、標的がスクリーニングライブラリーとともにインキュベートされる溶液である。例えば、標的が細胞培養培地中に分泌される成長因子である場合には、スクリーニング溶液は、分泌される成長因子を欠いている細胞培養培地であり得る。他のスクリーニング溶液は、例えば、ウイルスに対応している標的が試験される場合には、ウイルス増殖培地であり得るか、または血液組成物中の標的が試験される場合には、血液組成物などの他の液体であり得る。別の適切な第１のスクリーニング溶液は、プローブ分子を含む溶液である。このスクリーニングは、因子または標的の非存在下でプローブ分子に結合するそのようなライブラリーのメンバーを同定する。
【００５２】
所望される場合には、標的を欠いている複数のスクリーニング溶液が、使用され得る。例えば、１つのスクリーニング溶液は、スクリーニング溶液中に存在する因子の非存在下でプローブ分子を含み得、そして別の予備スクリーニング溶液は、標的を含まない細胞性の抽出物を含み得る。従って、プリオンタンパク質に対して惹起された標的のスクリーニングのためには、適切な予備スクリーニング溶液は、プリオンタンパク質についての抗体を含有している第１の溶液、および感染性のプリオンタンパク質が存在していないことが既知であるかまたは存在していないと思われる「ブランク」または「コントロール」の脳抽出物を含有している第２の溶液を含む。
【００５３】
次に、プローブ分子が、リガンド−因子複合体を同定するために添加される。一般的には、標的を認識する限り、任意のプローブ分子が使用され得る。プローブ分子は、例えば、ウイルスまたはウイルスタンパク質がプローブとして使用される場合には、そのウイルスまたはウイルスタンパク質に対する抗体であり得るか、あるいは、タンパク質または成長因子が標的として使用され得る場合には、そのタンパク質または成長因子に対する抗体であり得る。
【００５４】
ライブラリー中の１つ以上のリガンドに結合した因子を検出するプローブ分子は、結合したプローブ分子に関係しているシグナルを生成することによって、同定される。いくつかの実施態様においては、シグナルは、Ｘ線（オートラジオグラフィー）フィルム上に記録され、そしてフィルムに対する曝露のパターンは、スターマップ（ｓｔａｒ  ｍａｐ）と呼ばれる。フィルムの曝露された部分は、プローブ分子に結合したリガンドライブラリー中の領域を示す。
【００５５】
因子−リガンド複合体を認識するプローブ分子が同定された後に、固定されたリガンドが、第２のスクリーニング溶液を用いてプローブされる。上記に記載されるように、第２の溶液は、代表的には、第１の溶液の成分の全て、および標的を含む。第２のスクリーニング溶液およびリガンドライブラリーは、リガンド−標的複合体、ならびにスクリーニング溶液中の１つ以上の因子とリガンドとの間での複合体の形成を可能にする条件下で、インキュベートされる。
【００５６】
第２の溶液分子とのインキュベーション後に、プローブ分子が、ライブラリー中の１つ以上のビーズに結合した因子および標的を検出するために添加される。標的−リガンド複合体、または因子−リガンド複合体に結合するプローブ分子が、結合したプローブ分子に関係する一過的なシグナルを生成することによって、同定される。一過的なシグナルは、第１回目のスクリーニングと同様に記録されて、第２のスターマップを作製する。このマップは、第１のスクリーニング溶液とのインキュベーションの後で観察されるものと同じ位置のシグナル、および新しいシグナルセットを含む。スクリーニングが、同じタイプのシグナルを生成することによって２工程で行われ得る（ここでは、種々のマップ位置が、同じ様式で標識される）か、あるいは、スクリーニングは、異なるタイプのシグナルを生成することによって２工程で行われ得る（ここでは、種々のマップ位置は、異なる様式で標識される）ことが、理解される。
【００５７】
標的に関係しているシグナルを同定することは、第１および第２の工程において生成されたシグナルを比較することを必要とする。第２のシグナルセットは、代表的には、第１のセットと共通であり、そしてリガンドをプローブする際に使用される試薬に結合するビーズからのシグナルに対応する大部分のシグナル、およびリガンド−標的結合からのシグナルを有する。第２のシグナルセットからの第１のシグナルセットの差引きによって、標的に対して特異的に結合するリガンドを含むビーズに対応するシグナルのセットを明らかにする。
【００５８】
第１または第２のスクリーニング工程においてプローブ分子を同定するために使用される少なくとも１つのシグナルは、一過的なシグナルである。一過的なシグナルとは、その持続期間が有限であるシグナルを意味する。いくつかの実施態様においては、シグナルは、１４日またはそれ未満の間持続する。例えば、シグナルは、７日間、３日間、２日間、１日間、１２時間、６時間、３時間、１時間、または３０分間、あるいはそれ未満の間、持続し得る。結合した因子−リガンド複合体、または標的−因子複合体に関係している一過的なシグナルは、代表的には、永久的な媒体上に記録され、そして保存される。好ましい実施態様においては、両方のスクリーニング工程が、一過的なシグナルを使用して検出される。
【００５９】
所望される場合には、リガンドの同じライブラリーが、種々の標的に対する結合についてスクリーニングされ得る。例えば、それぞれが特有のリガンドを有している個々のビーズが、接着剤の薄いフィルム上に固定され、そして標的の非存在下で培養培地（「コントロール」または「ブランク」）のようなスクリーニング溶液を用いてプローブされる。スクリーニング溶液中の因子に結合するビーズが、プローブに対して交差反応するビーズとして同定される。次いで、スクリーニング溶液が除去され、そして洗浄後に、標的を含有している培地を用いてプローブ手順が繰り返される。シグナルの生成および同定の後、因子、標的、およびプローブ分子が除去され、それによってライブラリー中のリガンドを結合のために再び利用可能にする。この手順はまた、リガンドライブラリーの再生と呼ばれる。次いで、再生されたライブラリーは、異なる標的に対する結合について再スクリーニングされ得る。全てのスクリーニングが完了すると、特異的なシグナルに対応しているビーズが接着剤から除去され、そして１つ以上の標的に結合するリガンドが特徴付けられる。例えば、特定のライブラリーが、標的のファミリー（例えば、類似の構造的なモチーフを有すると考えられるタンパク質のグループ、または血液中に見出される種々のウイルス）のメンバーに結合するリガンドについて、多くの種々の時点でスクリーニングされ得る。特定のファミリー中の多数の標的に対して効率的に結合するリガンドの比較によって、治療薬の設計のための有用な情報を提供する。
【００６０】
この方法はさらに、１つ以上の標的に結合するが、第２の標的（単数または複数）には結合しないリガンドを同定するために、使用され得る。さらに、この方法は、血液に関係しているタンパク質であるフィブリノーゲンのような、生物学的な液体の成分（単数または複数）の存在下で標的に結合するリガンドを同定するために使用され得る。成分（例えば、フィブリノーゲン）は、リガンドについて標的と競合し得る。
【００６１】
本明細書中で記載されるスクリーニング方法は、一般的には、標的を含まない溶液での最初のスクリーニング（単数または複数）、次いで、標的を含有している溶液でのスクリーニングをいう。しかし、この時間的順序は、絶対的ではない。従って、他の場所で特に記載されない限りは、本明細書中に記載されている方法は、リガンドライブラリーが、１つ以上の標的を含有している溶液（単数または複数）を用いて最初にスクリーニングされ、続いて標的を含まない溶液（単数または複数）を用いてスクリーニングされる工程を包含する。
【００６２】
本明細書中に記載される方法は、種々の適用において使用され得る。リガンド分子のライブラリーは、例えば、標的（「レセプター」）分子に結合するそれらに能力についてスクリーニングされ得る。これらの標的として、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、低分子、または細胞が挙げられる。一般的には、任意のタイプの細胞が、このアッセイにおいて使用され得る。従って、細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞を含み得る。原核生物細胞の例として、例えば、グラム陰性細菌（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）またはグラム陽性細菌（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）が挙げられる。真核生物細胞として、単細胞生物（例えば、原生生物または真菌細胞（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．のような酵母）、あるいは後生生物に由来する細胞が挙げられ得る。例えば、いくつかの実施態様においては、細胞は、哺乳動物の血液の種々の成分に関係し得る。従って、細胞は、例えば、血小板、赤血球、リンパ球を含み得る。
【００６３】
用語「標的」は、それについての結合リガンド（例えば、核酸、ペプチド、ペプトイド、またはそれらに結合し得る他の化合物）が所望されるものをいう。新しくリガンドを同定することによって、標的の配列または構造、あるいはその天然の結合パートナーの正体または構造が既知である必要はない。実際、多くの「レセプター」分子についての結合パートナーは、同定されていない。
【００６４】
本明細書中で使用される場合には、ライブラリーは、異なる配列を有する、少なくとも２つ（例えば、５；１０；５０；１００；２００；５００；１，０００；２，５００；５，０００；１０，０００；２５，０００；またはそれ以上）の分子のものを意味する。ライブラリーは、核酸、炭水化物、またはペプチドのようなポリマー性の化合物を含み得る。ペプチドライブラリーの場合には、アミノ酸の基礎曝露は、２０個の遺伝的にコードされるＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、合成のアミノ酸、側鎖の改変（例えば、硫酸基、リン酸基、炭水化物部分など）を有するアミノ酸であり得る。本明細書中で使用される場合には、アミノ酸のＤイソマーは、括弧内に示される。例えば、（Ｆ）は、フェニルアラニンのＤ−イソマーを示す。ランダムペプチドライブラリーは、２〜１００アミノ酸またはそれ以上の長さの範囲のペプチドの混合物を含み得るが、代表的には、約５〜１５アミノ酸の長さである。用語「ランダム」は、ライブラリーの最も代表的な調製物のみを示し、そして組成物が未知であることを必要としない。従って、当業者は、所望される場合には、正確に公知の組成物の混合物を調製し得る。ライブラリーはまた、非オリゴマーであるリガンド（例えば、小さい非オリゴマーである有機化合物）を含み得る。
【００６５】
一般的には、リガンドライブラリーを構築するための、当該分野で認識される任意の方法が、使用され得る。不活性な表面上で合成のペプチドコンビナトリアルライブラリーの開発によって、リガンド−標的相互作用を研究するために多数の異なるペプチドが利用可能となった。ランダムペプチドライブラリーは、マイクロビーズ上に重合化されたアミノ酸の標準的な有機合成によって産生され得る。代表的には、ライブラリー中の任意の１つのビーズ上のペプチドは、実質的には同じであるが；しかし、ペプチド配列は、個々のビーズによって変化する。例えば、混合、分離、およびカップリング合成方法が、Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１）に記載されているように、ポリスチレンに基づく樹脂ビーズ上に特有のペプチド配列を作製するために使用され得る。あるいは、表面に結合した、化学的に合成されたライブラリーは、現在、商業的な製造業者から購入することができる。例えば、ライブラリーは、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から得ることができる。
【００６６】
リガンドのライブラリーは、任意の接着方法を使用して表面（例えば、ビーズ）に固定され得る。これによって、ライブラリーの膜の相対的な空間位置が、表面上で検出され得るために十分に安定な連結を生じる。
【００６７】
いくつかの実施態様においては、ペプチドリガンドを含有しているライブラリーは、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）上でペプチドを合成することによって構築される。このゼラチン様の樹脂は、ポリオキシエチレン（ポリエチレングリコール）と融合された低架橋ポリスチレンの骨格から構築される。代表的なポリエチレンの鎖の長さは、６８エチレンオキシド単位である。ポリエチレンの末端には、リガンドが付着する反応基（例えば、第１級アミンまたはチオール）が存在する。例えば、反応基は、そのカルボキシ基を通じてカップリングされる第１の保護されたアミノ酸の接着部位である。カップリング後に、第１のアミノ酸の保護されたアミノ基が、新しいアミノ末端を露出するように脱保護される。この新しいアミノ末端は、次の保護されたアミノ酸の付着のための部位として機能する。カップリングおよび脱保護のサイクルを通じて、ライブラリーは、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂の最初の反応基から発展する。
【００６８】
いくつかの実施態様においては、それぞれが特有のリガンドを有している個々のビーズが、平面上に固定される。例えば、リガンドライブラリーが付着させられる表面は、不活性なポリマーのシートであり得る。最も好ましい実施態様においては、表面は、透明なフィルムである。接着剤は、ビーズを固定するために使用され得る。好ましい接着剤は、ｍｅｔａｌ−ｇｒａｙＰＨＥＮＯＳＥＡＬＴＭｖｉｎｙｌ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｃａｕｌｋ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）である。
【００６９】
リガンドに対する因子または標的の結合は、当該分野で認識されている方法を使用することによってプローブ分子を用いて検出され得る。少なくとも１つのスクリーニング工程によって、プローブ分子の存在に関係している一過的なシグナルを使用して標的を同定する。例えば、表面に固定されたリガンドに対する標的の結合を検出するために当該分野で一般的に利用されるいくつかの方法が、存在する。
【００７０】
結合していないリガンドと標的に結合したリガンドとの間での任意の検出可能な差異が、利用され得る。例えば、標的を認識するプローブ分子が、スクリーニングされるリガンドライブラリーに対して添加され得、そして結合させられ得る。あるいは（またはさらに）、リガンドに結合した蛍光標識された標的が、分光光度的に測定され得る。放射性標識されたプローブ分子もまた、使用され得る。例えば、標識は、放射性ヨウ素であり得る。他の実施態様においては、標的に対する抗体が、検出分子として使用され得る。特定の実施態様においては、標的は、それ自体は標識されないが、結合反応の後に、標的が、検出可能な一過的なシグナル（すなわち、一過的に光を放射するシグナル）を生じるように反応させられる。
【００７１】
１つの実施態様においては、結合事象の検出は、標的を認識する一次抗体を含有しているスクリーニング溶液でリガンド−標的複合体をプローブする工程、続いて、一次抗体に対して結合する二次抗体／ホスファターゼ結合体を含有しているスクリーニング溶液でプローブする工程を包含する。抗体またはホスファターゼのいずれかに結合したリガンドを有するビーズが、ホスファターゼの存在を検出するために化学発光基質（例えば、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡによる）を添加することによって可視化される。光の産生の検出は、オートラジオグラフィーフィルム上に捕捉される。得られるフィルムは、「スターマップ」として現れ、フィルム上のシグナルの強度は、異なるビーズによる光の生成の強度を反映する。
【００７２】
一旦、リガンド−標的複合体が検出されると、リガンドが同定され、そしてさらに、特徴付けられる。リガンドを同定することは、推定の標的−結合リガンドを含有しているリガンドライブラリーの領域から元々のライブラリー中のいくつかのメンバーを再度スクリーニングすることを含み得る。これは、代表的には、リガンドライブラリーが比較的高い密度で配置される場合に、行われる。
【００７３】
１つの実施態様においては、多数の異なるタイプの標的に結合するペプチドリガンドが、同定される。特定の実施態様においては、標的は低分子またはポリマー（例えば、タンパク質、核酸、または炭水化物）である。他の実施態様においては、標的は大きい細胞（例えば、赤血球、リンパ球、または血小板）である。なお他の実施態様においては、標的は、完全な生物体（例えば、細菌）である。
【００７４】
１つの局面においては、ペプチドライブラリーは、１つ以上のウイルスに結合し得るリガンドについてスクリーニングされる。例えば、１つの適切なウイルス標的は、ウイルスのキャニオン（ｃａｎｙｏｎ）構造モチーフである。これは、ウイルスのキャプシド中の深い陥没（すなわち、キャニオン）である。例えば、Ｒｏｓｓｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：１４５−１５３（１９８５）；Ｃｏｌｏｎｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：５４４９−５４５３（１９８８）；Ｒｏｓｓｍａｎｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５３３−５７３（１９８９）を参照のこと。このキャニオンの基底の残基は、細胞内接着分子（ＩｎｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−１（ＩＣＡＭ−１）の結合に関係している。従って、リガンドライブラリー中のペプチドは、ウイルスの表面上のキャニオンのような一般的な構造に結合し、そしておそらくＩＣＡＭ−１の結合を模倣する能力についてスクリーニングされ得る。
【００７５】
（ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用して同定されたペプチドリガンド）
本明細書中ではまた、種々のウイルスまたはタンパク質標的に結合するリガンドが、開示される。従って、本発明はまた、これらの標的−結合ペプチドのアミノ酸配列を含有しているペプチドを含む。いくつかの実施形態においては、本発明は、２０未満のアミノ酸の長さ（例えば、１８、１５、１２、１０、または８未満のアミノ酸）で、そして標的に結合する配列を含有しているペプチドを含む。このペプチド中の、標的に結合する配列は、「結合ドメイン」と呼ばれる。従って、ペプチドは、例えば、以下に対して結合するドメインを規定するアミノ酸配列を含み得る：ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ブタのパルボウイルス（ＰＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトのパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、ウシのウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはタンパク質標的（例えば、プリオンタンパク質またはα−１−プロテイナーゼインヒビター（ＡＰＩ））。いくつかの実施形態においては、結合ドメインは標的（例えば、ＨＡＶ、ＰＲＶ、またはＰＰＶ）に対して、体液の構成成分の存在下で結合する。例えば、ペプチドは、血液に関係しているタンパク質であるフィブリノーゲンの存在下で標的に対して結合する。表４のサンプル１〜１２および１５〜１７に示されているアミノ酸配列を有しているペプチドは、血漿またはフィブリノーゲンを含有しているスクリーニング溶液の存在下でＨＡＶ標的に結合する。表４のサンプル１８〜３２に示されるアミノ酸配列を有しているペプチドは、血漿またはフィブリノーゲンの存在下でＰＰＶに結合するが、一方、表４のサンプル３３〜４２に示されるアミノ酸配列を有しているペプチドは、ＨＡＶに結合するが、全血を有している第１のスクリーニング溶液には結合しない。
【００７６】
いくつかのペプチドは、１つより多くの標的に結合する。例えば、いくつかのペプチドは、２個、３個、またはそれより多くの標的に結合する。例えば、いくつかのペプチドは、ＨＡＶまたはＰＰＶの両方に結合する。好ましくは、縮重結合を示すこれらのペプチドは、内因性の体液の成分（例えば、フィブリノーゲン）について親和性をほとんど示さないかまたは全く親和性を示さない。ＨＡＶ、ＰＰＶ、およびＰＲＶに結合するが、体液の構成成分には結合しないペプチドの例は、表４のサンプル４３〜４６に示されるものである。
【００７７】
ＨＡＶ、ＰＡＶ、およびＰＲＶに結合するペプチドの例は、ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）、ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）、（Ｆ）ＡＡＦＩＮ、（Ｆ）ＬＬＴＳＹ、（Ｆ）ＬＫＬＦＰ、（Ｆ）ＰＮＧＧＩ、（Ｆ）ＶＥＶＫＦ、ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）、（Ｆ）ＦＦＴＦＫ、（Ｆ）ＬＬＤＬＸ、（Ｆ）ＹＹＬＮＶ、ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）、ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）、ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）、ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）である。ここでは、Ｘは、その正体が配列決定の後で曖昧であるアミノ酸を示し、そしてＸは、ライブラリーの構築において使用される１７個のアミノ酸の任意のものであり得る。
【００７８】
スクラピーに感染したハムスターに由来するプリオンタンパク質に結合するが、健康な同腹子に由来する脳抽出物には結合しないペプチドとして、表６に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらの配列を有するペプチドはまた、プローブ分子であるモノクローナル抗体ＦＨ１１を含有しているコントロール溶液に対しても結合しない。この抗体は、組換えＰｒＰタンパク質のアミノ末端領域を認識する。
【００７９】
これらの配列を含むポリペプチドが、種々の分析適用、調製適用、および診断適用のために有用である。例えば、これらは、固体支持体（例えば、樹脂）に対してカップリングされ得、そして溶液（例えば、生物学的な流体）中に存在する標的を結合させるために使用され得る。例えば、Ｄｏｙｌｅ、米国特許第５，７５０，３４４号を参照のこと。生物学的な流体の例として、例えば、血液または血液の成分（例えば、血漿または血清）が挙げられる。さらなる流体として、脳脊髄液、尿、唾液、乳汁、管液、涙、または精液が挙げられる。
【００８０】
結合は、溶液中の標的の存在を明らかにし得る。あるいは、またはさらに、結合は、生物学的な流体から同種の標的（単数または複数）を選択的に除去するために使用され得る。溶液からの標的の選択的な検出および除去のために、ペプチドは、固体支持体（例えば、樹脂）に付着させられ得る。流体（例えば、血液または血液産物）から因子を除去するための樹脂は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、米国特許第５，５４１，２９４号；Ｂｕｅｔｔｎｅｒら、米国特許第５，７２３，５７９号；Ｂｕｅｔｔｎｅｒ、米国特許第５，８３４，３１８号に記載されている。除去され得る標的は、中でも、ＨＡＶ、ＰＰＶ、ＰＲＶ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＨＩＶ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ヒトのパルボウイルスＢ１９（Ｂ１９）、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ポリオウイルス、ならびにプリオンタンパク質およびＡＰＩのようなタンパク質である。さらに、標的は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲を限定しない。
【００８２】
（実施例１：ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用した、ウイルスに結合するペプチドの同定）
ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニング方法を、血液中に見出される標的に対して特異的に結合するペプチドを同定するために使用する。
【００８３】
ＰＨＥＮＯＳＥＡＬＴＭ接着剤の薄いフィルムを、透明なフィルム上に広げる。２枚の透明な接着テープを、表面に平行に貼り付け、そしてＰＨＥＮＯＳＥＡＬＴＭ接着剤を、金属チューブを用いてテープの小片の間に広げる。テープを、そのテープの厚みの接着剤のフィルムを提供するためにスペーサーとして使用する。それぞれ３３個のサブライブラリーのそれぞれに由来する約１０００個のビーズ（５ｍｇ）を、プラスチックラップ上の薄層の中の水の中に配置する。接着剤によってビーズが固体の表面に貼り付くように、接着剤で覆われた透明なものを、ビーズ溶液上に反転させる。透明なもの／ラップを、次いで反転させて、ここでラップが上部にある。ラップを取り除き、そしてビーズをＰＨＥＮＯＳＥＡＬＴＭ接着剤に固着したままにする。
【００８４】
ビーズの上部を空気と接触させたままにする。接着剤を数時間の間硬化させた後、ビーズをタンパク質溶液で４℃でブロック（２時間から一晩）する。通常は、カゼインをブロッキング剤として使用する。ブロッキング剤は、損傷したビーズの表面に接着して、疎水性表面に対する標的の非特異的な結合を妨げる。いくつかの実験においては、ビーズを、ブロッキング工程の前に、再生緩衝液（下記を参照のこと）であらかじめ洗浄する。
【００８５】
表面に固定されたライブラリーを、次いで、室温で２時間の間、新しい媒質（例えば、血漿）とともにインキュベートする。次いで、ビーズを、ＴＳ（０．０５ＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でそれぞれ５分間、６回洗浄する。この洗浄によって、ビーズから任意の弱く結合したタンパク質を除去する。ビーズを、代表的には、目的の標的（例えば、タンパク質またはウイルス）に対する一次抗体とともに一晩インキュベートする。次いで、洗浄工程を繰り返して、あらゆる弱く結合した一次抗体を除去する。ビーズを、一次抗体について特異的である標識された二次抗体とともに約３０分間インキュベートする。ほとんどの試行において、二次抗体は、ホスファターゼで標識される。抗体とのインキュベーションの後、ビーズを、ＴＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎで６回洗浄し、そしてＴＳで６回洗浄する。全ての洗浄は、１０分の長さである。大量洗浄プロトコールが、結合してないホスファターゼを全て除去するために必要である。最後のＴＳでの洗浄の後、ビーズを、０．０５ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ９．５＋０．００５ＭのＭｇＣｌ２で１０分間洗浄する。より高いｐＨが、結合したホスファターゼの活性については必要である。
【００８６】
ホスファターゼ標識した二次抗体を使用する場合には、それぞれのビーズと会合させたホスファターゼを、０．０５ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ９．５、０．００５ＭのＭｇＣｌ２中に化学発光基質（例えば、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡによる）を添加することによって発光させる。この基質を、ビーズの表面に対して穏やかに適用し、そして化学発光をオートラジオグラフィーによって検出する：固定されたビーズを、防水性の接着フィルムでラップし、そしてオートラジオグラフィーフィルムに対して曝露する。
【００８７】
化学発光シグナルを放出するビーズは、シグナルのパターンを生じるか、または「スターマップ」をフィルム上に生じる。透明なものの上のフィルムの位置を、３個のピンの穴で印をつけることによっていくつかの場合において記録する。曝露時間を、産生されるシグナルの強度に基づいて経験的に評価する。バックグラウンドのスクリーニングのために、フィルムを、弱いシグナルを生じるビーズさえも検出することを確実にするために、過剰に曝露（通常は、一晩の曝露）させる。化学発光アッセイの感度のために、高い割合のビーズが最終的に、非常に長いインキュベーション期間（例えば、７２時間またはそれより長く）にわたって検出可能なシグナルを生じる。この過剰な曝露によって、オートラジオグラフィーフィルム上のパターンとのビーズの正確なアラインメントを容易にする。
【００８８】
標的のスクリーニングのためにビーズを再生するために、試薬を、代表的には、３Ｍのチオ硫酸ナトリウム中で１５分間；６Ｍの尿素、および２％の酢酸で各１５分間を３回洗浄することによって、ビーズから洗い流す。ｐＨを、０．１５Ｍのクエン酸、ｐＨ７．４での十分な洗浄によって平衡化させて、ｐＨを約７にする。標的に特異的に結合するペプチドを含有しているビーズを検出するために、上記のブロッキング手順およびブローブ手順を、標的が２時間の結合インキュベーション中に存在することを除いて、二連で行う。いくつかのスクリーニングにおいては、標的は、ＰＰＶ、ＰＲＶ、またはＨＡＶである。他においては、標的は、スクラピータンパク質またはＡＰＩである。
【００８９】
第２回目のオートラジオグラムを上記に記載するように行い、そして第１回目のバックグラウンドのオートラジオグラムと比較する。標的の存在下での第２回目のスクリーニングにおいてのみ検出されるビーズを、同定する。このビーズのサブ−セットは、通常は、標的特異的ビーズに対応する、過剰に発光させたオートラジオグラフィーのフィルム上のスポット上に赤い印を配置することによって示される。フィルムを、透明な支持体の下に配置し、そしてビーズをオートラジオグラム上のそれらの対応しているスポットを用いて集める。フィルムおよび透明なものを、正確なアラインメントを維持するためにともにテープで止める。赤いスポット上のビーズは、視覚的にまたは顕微鏡を用いて容易に同定される。
【００９０】
個々のポジティブなビーズを、以下の手順に従って接着剤から除去する：接着剤の表面を生理食塩水溶液で湿らせ、そしてポジティブなビーズ（赤い点で示されるような）を、注射器の針を使用して接着剤から採取する。これらを、次いで、小さいチューブ中に別々に入れ、そして取り扱いを容易にするためにクマシーブルーで染色する。次いで、ビーズを、タンパク質配列決定装置上にロードし、そしてポジティブなビーズ上のリガンドを、Ｅｄｍａｎ分解によって特徴付ける。
【００９１】
種々のウイルス標的について同定されたリガンドの例を、表１に示す。全てのビーズは、１位〜３位で（Ｆ）ＬＬまたはＦＬＬのいずれかで始まった。ポジティブなビーズの４位〜６位の配列の結果を、表１に概説する。
【００９２】
【表１】
2004500350.tif 000002
α−１−プロテイナーゼインヒビター（ＡＰＩ）に結合するリガンドの例を、表２に示す。ＡＰＩタンパク質の欠損は、肺気腫の早発性発症に関係していると考えられる。例えば、米国特許第４，４９６，６８９号を参照のこと。
【００９３】
【表２】
2004500350.tif 000003
（実施例２：ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用した、複数のウイルスに対して結合するペプチドの同定）
ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用して、フィブリノーゲン、または全血もしくは血清の成分の存在下でもなお、１つ以上のウイルスに結合するペプチドリガンドを同定する。
【００９４】
３３個のサブライブラリーを、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上で合成する。それぞれのビーズは、遊離のアミノ基上で合成された６個のアミノ酸配列を有する。これらのライブラリーは、Ｎ末端（１位）にＤ−またはＬ−アミノ酸を有する。システイン、メチオニン、およびトリプトファンを除いて、一般的なアミノ酸の全てを使用する。他の５個の位置（２位〜６位）は、Ｌ−アミノ酸のみを有する。それぞれのサブライブラリーを、ＰＰＶに対する抗体を用い、続いて上記のような化学発光検出によって個々にスクリーニングする。サブライブラリーを、次いで、上記に記載するように、ＰＰＶの存在下で再スクリーニングする。それぞれのサブライブラリーにおけるＰＰＶの結合について特異的なビーズの数を計数する。８１個のポジティブなシグナルのうち、５６個が、Ｄ−フェニルアラニン（Ｆ）で始まるペプチドを含有しているサブライブラリー中に存在する。３個のシグナルが、フェイニアラニンＦで始まるサブライブラリー中に存在し；３個が、Ｌ−アラニンＡで始まるサブライブラリー中に存在し；３個が、Ｌ−プロリンＰで始まるサブライブラリー中に存在し；そして３個が、Ｄ−ロイシン（Ｌ）で始まるサブライブラリー中に存在する。
【００９５】
（Ｆ）およびＦで始まるサブライブラリーを、それらをプレートし、そしてウイルスＰＰＶ、ＨＡＶ、およびＰＲＶでプローブすることによってさらに分析する。３個のウイルス全てに結合する１６個の配列を得、そしてそれらのアミノ酸配列を決定する。これらのペプチドおよびそれらの配列は、以下を含む：ＦＨＡＬＲＨ（配列番号１）、ＦＦＳＫＱＮ（配列番号２）、（Ｆ）ＡＡＦＩＮ、（Ｆ）ＬＬＴＳＹ、（Ｆ）ＬＫＬＦＰ、（Ｆ）ＰＮＧＧＩ、（Ｆ）ＶＥＶＫＦ、ＦＰＬＩＫＡ（配列番号３）、（Ｆ）ＦＦＴＦＫ、（Ｆ）ＬＬＤＬＸ、（Ｆ）ＹＹＬＮＶ、ＦＬＩＬＤＰ（配列番号４）、ＦＹＴＰＰＹ（配列番号５）、ＦＦＹＰＡＸ（配列番号６）、ＦＬＬＤＫＸ（配列番号７）、およびＦＬＬＹＡＫ（配列番号８）。ここでは、Ｘは、その正体が配列決定の後で曖昧であるアミノ酸を示し、そしてＸは、ライブラリーの構築において使用される１７個のアミノ酸の任意のものであり得る。
【００９６】
配列は、アミノ酸のランダムな分布は示さない。例えば、１つのアミノ酸Ｌは、２位で６回見出されるが、６位では１回も見られない。さらに、１６個のペプチドのうちの４個が、ＦＬＬで始まる。統計学的には、２８９個のうちの１個が、これらの３個のアミノ酸で始まると予想され、このことは、この配列がウイルスの結合について偏っていることを示している。
【００９７】
複数のウイルスに対して結合するペプチド配列をさらに規定するために、（Ｆ）ＬＬＸＸＸ  ＦＬＬＸＸＸ配列モチーフに基づくサブライブラリーを合成し、そしてＰＰＶ、ＰＲＶ、ポリオウイルス、ＥＭＣＶ、ＢＶＤＶ、ＳＶ４０、およびＨＡＶの結合についてスクリーニングする。
【００９８】
それぞれのウイルスと関係しているシグナルの強度を、シグナルがＨＡＶ、ＰＰＶ、ＰＲＶ、または媒質のみでのプロービングの後に観察されるかどうかに従って分類する。シグナルの強度を、その特定のプレートについての曝露の範囲に基づいてそれぞれのビーズについて考慮し、そして＋／−のスケールで記録する。ここで、［−］は検出可能ではないものであり、そして［＋＋＋＋］はスターマップ中の最も高い強度である。ビーズの詳細の表の例を、以下の表３に示す：
【００９９】
【表３】
2004500350.tif 000004
（実施例３：ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用した、体液の成分の存在下で複数のウイルスに対して結合するペプチドの同定）
バックグラウンドの結合は、標的が、標的に対する結合についてリガンドと競合し得る１つ以上の成分を有している溶液中に存在する場合には、標的に対して特異的に結合するリガンドのスクリーニングにおいて重要な考慮すべき事柄である。これらの競合するリガンドは、例えば、体液（特に、フィブリノーゲン）中に見出され得る。従って、ウイルスのレセプター結合ドメインを標的化する実験は、ＩＣＡＭ結合部位を通じてフィブリノーゲンにもまた結合する、ペプチドに対して選択するように設計される。スクリーニング手順は、本質的には、過剰のフィブリノーゲンの存在下でウイルスに結合するビーズについてのスクリーニングが行われることを除いて、実施例１に記載されるとおりである。すなわち、フィブリノーゲンが、第１回目のスクリーニングの媒体中の因子である。
【０１００】
実施例１に記載する手順を使用して、ビーズ上に固定されたヘキサマーのペプチドのライブラリーを、血漿、フィブリノーゲン溶液、または全血中でＨＡＶ、ＰＰＶ、およびＰＲＶについてスクリーニングする。結果を、以下の表に示す。全ての３個のウイルスに結合する配列をもまた、示す。全てのビーズは、１位〜３位で（Ｆ）ＬＬまたはＦＬＬのいずれかで始まる。ポジティブなビーズの４〜６の位置の配列の結果を、表４に概説する。
【０１０１】
【表４】
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４位〜６位での種々のアミノ酸の頻度を、表５にまとめる。上記に示すように、Ｘは、その正体が配列決定の後で曖昧なままであるアミノ酸を示し、そして、これは、ライブラリーの構築において使用されるアミノ酸の任意のものであり得る。
【０１０２】
４位〜６位で頻繁に検出される３個のアミノ酸は、それぞれ、Ｐ、Ｙ、およびＫである。配列ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）および（Ｆ）ＬＬＨＰＩを、血液サンプルからのウイルスの除去におけるさらなる研究のために使用されるコンセンサスペプチドとして選択する。
【０１０３】
【表５】
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ペプチドを、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０アミノ樹脂上に、またはＴｏｓｏＨａａｓ製のより大きな孔隙の樹脂（例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　７５０アミノ）上に直接合成する。最初の実験によって、ＰＰＶがペプチドＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）に結合したかどうかを評価する。生理食塩水を、ＰＰＶでスパイクし、そして溶液を、アミノ樹脂上に合成したＦＬＬＰＹＫのカラムに通過させる。εアミノ酸が、ペプチドと樹脂との間にスペーサーとして作用するように、ペプチドのカルボキシ末端に含まれる。出発物質およびフロースルーのサンプルを、感染性のＰＰＶについてアッセイする。代表的には、ウイルスの５ｌｏｇの減少が、ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）ペプチドを有するカラムのフロースルー中で見出されるが、一方、３ｌｏｇの除去がアミノ樹脂のみを用いて見出される。１ｌｏｇの減少は９０％の除去を意味し、２ｌｏｇは９９％を意味するなどである。接触時間は４分であり、そして実験を室温で行う。アミノ−ＦＬＬＰＹ（配列番号３１）は、４．５ｌｏｇのクリアランスを生じ、一方、アミノ−ＦＬＬＰ（配列番号３２）およびアミノ−ＦＬＬは有意なクリアランスを生じない。アセチル−ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）はクリアランスを生じず、そしてアセチル−ＦＬＬＰＹ（配列番号３１）も生じない。従って、このペプチドの末端アミノ基が、ＰＰＶへの効率的な結合に不可欠である。匹敵する実験は、アミノ−ＦＬＬＰＹＫ（配列番号２８）がＨＡＶ、ＰＲＶ、ＨＩＶ、およびＢＶＤＶに結合することを示す。
【０１０４】
配列（Ｆ）ＬＬＨＰＩを用いる一連の実験を、遊離のアミノ末端およびアセチル化アミノ末端の両方を用いて行う。ＰＰＶでスパイクした生理食塩水（１０ｍＬ）を、４分間の滞留時間で、配列（Ｆ）ＬＬＨＰＩを含有している樹脂（１ｍＬ）を通過させる。このカラムは、５ｌｏｇのクリアランスを提供する。アミノ樹脂を用いる同一の実験においては、約２〜３ｌｏｇのクリアランスが見られる。このことは、ウイルスの除去の２つの方法が存在していることを示唆する：１）ペプチド配列との親和性相互作用、および２）遊離のアミノ基とのより弱いイオン交換。遊離のアミノ基がアセチル化されている場合には、基本の樹脂（アセチル化アミノ樹脂）は、ウイルスをほとんどクリアリングせず（１ｌｏｇ未満）、一方、アセチル化（Ｆ）ＬＬＨＰＩは、２〜３ｌｏｇのＰＰＶに結合する。
【０１０５】
アセチル化―（Ｆ）ＬＬＨＰＩ配列がウイルスに選択的に結合する能力をさらに、血漿に対するＰＰＶの添加によって示す。ＰＰＶでスパイクした血漿１０ｍＬを、１ｍｌの樹脂に通過させる。全部で２ｌｏｇのＰＰＶがクリアリングされる。血漿を同じ樹脂に再び通過させる場合には、３．２ｌｏｇが除去される。リサイクルされる場合には、３．５ｌｏｇが除去され、そして３回目に通過させる場合には、全部で４．７ｌｏｇが血漿からクリアされる。従って、ウイルスは、樹脂に対して実質的に結合し得る、すなわち、９９．９９％より多くが血漿から除去され得る。この樹脂はまた、ＰＲＶ、ＨＡＶ、ＨＩＶ、ＥＭＣＶ、ＢＶＤＶ、Ｂ１９、およびＳＶ４０に結合することが示される。
【０１０６】
（実施例４：ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニングを使用した、プリオンに対して結合するペプチドの同定）
ＱｕＡＳＡＲＴＭスクリーニング方法をまた、プリオン粒子について特異的なリガンドを同定するために使用する。ペプチドライブラリーを再生し、そして組換えＰｒＰタンパク質のアミノ末端領域に対して惹起された、モノクローナル抗体ＦＨ１１（Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫのＪｉｍ  Ｈｏｐｅによって提供された；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１３９：５１２−５１５（１９９６）もまた参照のこと）を用いて予備スクリーニングする。リガンドライブラリーを、次いで、再生し、そしてスクラピー粒子に感染した動物の同腹子である正常なハムスターに由来する脳抽出物でプローブする。正常なプリオンについての４個のリガンドが、表６に示すように同定される。
【０１０７】
再生後、ライブラリーを、スクラピーに感染したハムスターに由来する脳の抽出物に対して結合するリガンドについてスクリーニングする。さらに１０個のリガンドが、表６に示すように同定される。スクラピータンパク質について特異的な合計１４個の異なるリガンドが同定され、そのうちの１２個を配列決定する。配列決定の結果を、表６に提供する。
【０１０８】
【表６】
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上記の記載は、説明の目的だけのために示されており、そして本明細書に添付される特許請求の範囲による以外は、開示されている正確な形態に本発明を限定することは意図されない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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