(57)【要約】本発明は、新規なＢｉｎ１ｂタンパク質及びＢｉｎ１ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。Ｂｉｎ１ｂタンパク質は天然の抗菌性ペプチドであり、精子の成熟化に関連している。本発明はさらに、Ｂｉｎ１ｂタンパク質及び核酸の製造法並びにそれらの使用を開示する。Ｂｉｎ１ｂタンパク質は、泌尿生殖器系の感染などの様々な障害を処置するために有用である。本発明はまた、Ｂｉｎ１ｂタンパク質を含有する医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
該ポリペプチドの配列が、配列番号２又は配列番号３である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的なポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含有する、ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項７】
（ａ）請求項６に記載の宿主細胞を、発現条件のもとで培養し、
（ｂ）Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性を有するポリペプチドを培養物から単離する
ことを含む、Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性を有するポリペプチドを製造するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＢｉｎ１ｂポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項９】
安全かつ有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと、製薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
抗菌的に有効な量の、請求項１に記載のポリペプチドを含む殺菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び免疫学、生殖生物学、並びに医学に関する。詳細には、本発明は、ラットの精巣上体頭部において特異的に発現する新規な天然の抗菌性ペプチド、すなわち、Ｂｉｎ１ｂタンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの調製及び使用に関する。Ｂｉｎ１ｂタンパク質は雄性の生殖能力（特に精子の成熟化）に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのゲノムを配列決定することにより、コード配列が明らかにされる。どの領域が遺伝子であるか。機能は何であるか。どの遺伝子が生物学的機能のために必要であるか。遺伝子は正常な生命においてどのように共同しているか。どの誤りが疾患の原因であるか。困難で、興味をかき立てる、有益、かつ利益をもたらし得るこの解読作業により、機能ゲノミクスの時代に入っている。
【０００３】
新しい世紀の変わり目において、科学者は、生殖生物学の成果は大きいが、新しい技術が利用されずに、また分子機構が研究されずに、更には異なる研究分野が組み合わせられずに、組織及び細胞に限定される古典的な方法が使用されるだけであるならば、発達の見込みは悲観的であると考えている。雌性生殖には関心が集中しているが、雄性生殖にはほとんど関心が払われていない。生殖原理に関する基礎研究は無視され、その結果、受胎調節のための理想的な医学及び技術並びにヒト生殖の十分な知識が得られていない。生殖生物学は２１世紀において大転換をもたらす２つの変化に遭遇している。１つは、基礎研究を強化し、そして分子生物学、分子免疫学及び細胞生物の新しい方法を使用することによってヒトの生殖及び先天的欠損症に対する機構を研究することである。もう一方は、雄性生殖生物学の研究を強化し、それにより男性避妊薬を開発することである。
【０００４】
中国は世界人口の２２％を有しているが、世界の耕作地の７％及び世界の淡水の６％を有するにすぎない。たとえ増加率が０．０１％であるとしても、毎年、１３００万人の人口が増大する。不完全で、ときには副作用を有する避妊法が、多くの場合、女性によって使用されている。安全な不妊手段もまた女性によって用いられている。ＷＨＯの統計によれば、四川省では１／１２の男性が精管結紮しているにすぎない。実際には、男性及び女性の両方が避妊の責任を有する。雄性生殖の調節は人口及び人間特性にとって重要である。これは、（１）健康な男性は１０８個／日の精子を５０年にわたって産生し、女性は１個／月の卵子を４０年にわたって産生し、（２）精子は環境の影響を受けやすく、（３）精子の数及び性状は、その５０年の最後では４０％低下し、（４）４５歳未満の５％〜１０％の男性が原発性不妊症を有する、からである。この片寄りを正すためには、研究を強化し、男性の避妊手段を開発することが必要である。ヒトの生殖が健康であることは世界的に重要であることが十分に知られている。避妊は人口危機に対する一時的な措置にすぎず、後の世代は身体的及び精神的に健康な生活を探し求めなければならない。受胎調節医薬品の設計はこの新しい要求に適合しなければならない。１９９９年９月９日〜１０日、ＮＩＨ本部でのＮＩＣＨＤにより開催された「２１世紀の男性避妊」のセミナーにおいて、状況が研究され、目的が提出され、そして協力及び資金援助を含む活動が決められた［内分泌学及び代謝の動向（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、２０００、１１（２）：６６〜６９］。
【０００５】
精母細胞は、精巣において、有糸分裂、減数分裂及び分化を受け、精子を形成する。その後、精子は精巣上体に入り、頭部及び体部において徐々に成熟し、そして射精まで尾部に留まる。精子の運動能、アクロソーム機能の形成、代謝の変換を含む一連の成熟化変化は精子自身によって達成されない。精子は、精巣上体を通過するとき、精巣上体の微小環境と相互作用することによって徐々に成熟する。精巣上体は、精巣及び精管をつなぐ狭いジグザグ状の長い経路である。精巣上体の種々の部分における細胞は異なる遺伝子及び産物を発現し、異なるタンパク質及び分子を放出している。異なる液成分、イオン強度及びｐＨは、次第に変化する微小環境を形成し、精子と相互作用して、精子表面タンパク質の部分的な変化又は修飾、例えば、リン酸化、エステル化、アシル化、カルボキシル化及びグリコシル化などをもたらす。精子は、成熟化のための機能及び免疫学的防御を徐々に得る。これらにより、精子が卵子に向かって雌性生殖器管を通過するまで、精巣上体内の精子が保護される。
【０００６】
精巣上体の成熟化、貯蔵性及び防護は下記の性質を有しており、したがって、精巣上体は受胎調節に対する理想的な標的である。
【０００７】
（１）その機能は単純である。干渉する医薬品は、重篤な副作用を生じさせないと考えられる。
【０００８】
（２）精巣上体はホルモンに対する最終的な器官であり、内分泌機能を有していない。精巣上体の医薬品は、通常、ホルモン分泌を行わせない。
【０００９】
（３）精巣上体に入る前に、精子は完全に分化しており、転写は停止している。成熟化には、タンパク質の修飾が含まれるが、ＤＮＡの複製は含まれない。医薬品は、ＤＮＡの変異及びＤＮＡ疾患を生じさせないと考えられる。
【００１０】
（４）精巣上体の研究は強調されておらず、有望な可能性を有する。
【００１１】
精巣上体の様々な部分における微小環境を形成させる機構は、１つ又は２つの遺伝子及びタンパク質によって決定されず、一群の共同する産物によって決定される。精子の成熟化に関連する精巣上体の遺伝子発現の開始及びプロセスについてはほとんど知られていない。その研究は、精子成熟化の分子機構を明らかにし、ゲノムコードを解読し、精子に関連する不妊症に対する基礎を明らかにし、かつ精子の成熟化を阻止する男性避妊薬の開発に対するための新しい経路を提供するために役立つ。
【００１２】
１９７０年代以降、精巣上体に関する研究は、主に下記の３つの面に集中していた：
【００１３】
（１）いくつかの結果が、２次元電気泳動により、精巣上体の異なる部分での内腔タンパク質、又は異なる部分での精子の異なる成熟化膜タンパク質を比較することによって、或いはタンパク質に対するポリクローナル抗体を使用する免疫アッセイでそれらを比較することによって、タンパク質レベルで得られている。しかし、その開発技術は、分離技術又は分析技術の感度が低いために満足できるものではない。Ｄａｃｈｅｕｘ研究室（フランス）は、２００を超えるタンパク質がブタ及びヒツジの精巣上体の内腔から確認されたことを報告している。このことは、精巣上体に対する研究がそれ他の器官よりも困難でないことを示している。しかし、１５個の精巣上体特異的なｃＤＮＡがクローン化されているだけである。
【００１４】
（２）精子の成熟化における精巣上体の既知の役割は、精巣上体の特定の機能が、いくつかの既知タンパク質に関連するかどうかを明らかにするために使用することができる。例えば、精巣上体は、酸素フリー・ラジカルによって引き起こされる損傷から精子を保護することが知られている。精巣上体の異なる部分における６個のアンチオキシダーゼのｍＲＮＡが検出されている。Ｅ−ＧＰＸ及びＥ−ＳＯＤが、それぞれ頭部及び体部において最も多い量のｍＲＮＡを有している。このことは、精巣上体の異なる部分は、異なるアンチオキシダーゼを必要とすることを示している。しかし、そのような研究は、既知の知識に限られており、新しい機能の遺伝子又は産物を見出すためにはほとんど役立っていない。さらに、保護的な免疫学的微小環境を形成する精巣上体には多くの免疫細胞及び免疫抑制分子が存在する。しかし、形成及び調節に対する分子及び細胞機構は不明である。
【００１５】
（３）分子生化学技術は１９９０年代以降急速に発達しており、精巣上体において特異的に発現する新しい遺伝子をサブトラクション・ハイブリダイゼーションなどによってｍＲＮＡレベルで見つけることができる。ドイツの研究室では、６個の新しいｍＲＮＡが、ｃＤＮＡライブラリーのサブトラクション・スクリーニングによってヒト精巣上体において見出された。しかし、ヒトの精巣上体やヒトの他の材料は、利用が制限されるために、それらの機能は徹底的には研究されなかった。したがって、実験室動物が種々の手段によって研究されている。
【００１６】
したがって、雄性生殖及び精巣上体に関連する新しい天然タンパク質を開発することが差し迫って求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の１つの目的は、新規な抗菌性ペプチドである、Ｂｉｎ１ｂ、並びにそのフラグメント、類似体及び誘導体を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、そのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドの製造方法及び使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
第１の態様において、本発明は、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む単離されたラットＢｉｎ１ｂポリペプチド、その保存的な変異体、その活性なフラグメント、及びその活性な誘導体を提供する。好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を持っている。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、下記のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号２又は配列番号３のＢｉｎ１ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするものが好ましく、（ａ）配列番号１の５７〜２６０、（ｂ）配列番号１の１０５〜２６０、及び（ｃ）配列番号１の１〜３３６からなる群から選択されるものがより好ましい。
【００２２】
第３の態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなベクター又はポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２３】
第４の態様において、本発明は、Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、
（ａ）上記の形質転換された宿主細胞を発現条件のもとで培養し、
（ｂ）Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性を有するポリペプチドを培養物から単離する、ことを含む方法を提供する。
【００２４】
第５の態様において、本発明は、Ｂｉｎ１ｂタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。また、上記ポリヌクレオチドの連続した１５〜１７５７のヌクレオチドを含む核酸分子も提供される。
【００２５】
第６の態様において、本発明は、Ｂｉｎ１ｂ活性を刺激し、促進し、弱める、或いはＢｉｎ１ｂ発現を阻害する、化合物、及びこのような化合物をスクリーニングし、調製する方法を提供する。当該化合物は、好ましくは、Ｂｉｎ１ｂをコードする配列又はそのフラグメントのアンチセンス配列である。
【００２６】
第７の態様において、本発明は、サンプル中のＢｉｎ１ｂタンパク質を検出するための方法であって、サンプルをＢｉｎ１ｂタンパク質に対して特異的な抗体と接触させ、サンプル中のＢｉｎ１ｂタンパク質の存在を示す抗体複合体の形成を観測する、ことを含む方法を提供する。
【００２７】
第８の態様において、本発明は、Ｂｉｎ１ｂの異常な発現に関連する疾患又はその感受性を決定するための方法であって、Ｂｉｎ１ｂをコードする配列の変異を検出することを含む方法を提供する。
【００２８】
第９の態様において、本発明は、Ｂｉｎ１ｂ及びＢｉｎ１ｂをコードする配列の使用、例えば、Ｂｉｎ１ｂのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング、並びにペプチド・フィンガープリンティングにおけるそれらの使用を提供する。Ｂｉｎ１ｂをコードする配列及びそのフラグメントは、ＰＣＲにおけるプライマーとして、又はハイブリダイゼーション及びミクロアレイにおけるプローブとして使用することができる。
【００２９】
第１０の態様において、本発明は、安全かつ有効な量のＢｉｎ１ｂタンパク質又はそのアゴニスト若しくはアンタゴニストと、製薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、泌尿生殖器感染などの疾患を処置するために使用することができる。
【００３０】
第１１の態様において、本発明は、抗菌性において有効な量のＢｉｎ１ｂポリペプチドを含む殺菌剤を提供する。
【００３１】
本発明のそれ以外の態様は、本発明の教示に照らして当業者には明らかである。
【００３２】
本発明者らは、ディファレンシャル・ディスプレー及びサブトラクション・ハイブリダイゼーションによって、ラット及びサルの精巣上体の様々な部分において特異的に発現する遺伝子をスクリーニングしたが、サルの研究に関してはノースカロライナ大学と協同で行なった。本発明者らは、既知の特異的な遺伝子を同定しただけでなく、特異的に発現する遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンをいくつか得ている（ラット精巣上体頭部において２個、サル精巣上体頭部において４個、サル精巣上体体部において４個、そしてサル精巣上体尾部において３個）。
【００３３】
Ｂｉｎ１ｂは、ラットの精巣上体頭部において特異的に発現するものであり、上記のうちの１つである。その全長ｃＤＮＡクローン及びゲノムＤＮＡクローンを得た。そのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＡＦ２１７０８８及びＡＦ２１７０８９の受託番号でＮＩＨのＧｅｎｂａｎｋに登録されたが、これらは本明細書の出願後に公開されるであろう。Ｂｉｎ１ｂ遺伝子は非常に特異的に発現しており、ラットの精巣上体頭部の上皮細胞においてだけ発現している。
【００３４】
Ｂｉｎ１ｂ遺伝子は、性的に成熟したラットで最大に発現し、老齢のラットでは低下しており、このことが、Ｂｉｎ１ｂが生殖に関連することを示している。アンドロゲンは、Ｂｉｎ１ｂの発現を上方制御する。Ｂｉｎ１ｂの発現は、ホルモンによって影響され得るので、精子の成熟化を調節するための男性避妊薬を設計することができる。さらに、Ｂｉｎ１ｂは、ラットの精巣上体で見出されたβ−ディフェンシン・ファミリーにおける最初の天然の抗菌性ペプチドである。Ｂｉｎ１ｂは、泌尿生殖器感染を治療するための天然薬物に発展していくことが見込まれる。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｂｉｎ１ｂタンパク質」、用語「Ｂｉｎ１ｂポリペプチド」又は用語「抗菌性ペプチドＢｉｎ１ｂ」は、交換可能であり、これらは、天然の抗菌性ペプチドＢｉｎ１ｂのアミノ酸配列（配列番号２又は配列番号３）を含むタンパク質又はポリペプチドを示す。この用語には、開始Ｍｅｔ残基を有するＢｉｎ１ｂ又は開始Ｍｅｔ残基を有しないＢｉｎ１ｂ、シグナルペプチドを有するＢｉｎ１ｂ又はシグナルペプチドを有しないＢｉｎ１ｂが含まれる。成熟型Ｂｉｎ１ｂが配列番号３に示される。
【００３６】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離された」とは、本来の環境から単離されている物質をいう。天然に存在する物質の場合、本来の環境は、自然環境である。例えば、生細胞中で天然に存在する状態にあるポリヌクレオチド及びポリペプチドは単離又は精製されていない。しかし、この同じポリヌクレオチド及びポリペプチドが、それらに天然の状態で付随する他の成分から隔てられている場合、それらは単離又は精製されている。「単離」及び「精製」には、組換えＢｉｎ１ｂタンパク質を他のタンパク質及び糖類などから分離することが含まれる。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、用語「単離されたＢｉｎ１ｂタンパク質又はポリペプチド」とは、Ｂｉｎ１ｂポリペプチドが、他のタンパク質、脂質、炭水化物、又は自然界でＢｉｎ１ｂポリペプチドと会合する任意の他の物質を本質的には含有していないことを意味する。当業者は、標準的なタンパク質精製技術によってＢｉｎ１ｂタンパク質を精製することができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであってもよく、好ましくは組換えポリペプチドである。本発明のポリペプチドは精製された天然産物又は化学合成された産物であってもよい。或いは、本発明のポリペプチドは、組換え技術を使用して、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞などの、原核生物宿主又は真核生物宿主から製造することができる。組換え製造において使用される宿主によって、ポリペプチドはグリコシル化されてもよく、又はグルコシル化されなくてもよい。ポリペプチドは、開始Ｍｅｔ残基を含んでもよく、又は開始Ｍｅｔ残基を含まなくてもよい。
【００３９】
本発明はさらに、Ｂｉｎ１ｂのフラグメント、誘導体及び類似体を含む。本明細書中で使用されるとき、用語「フラグメント」、用語「誘導体」及び用語「類似体」は、本質的に、天然のＢｉｎ１ｂタンパク質と同じ生物学的機能又は生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。ポリペプチドのフラグメント、誘導体及び類似体には、下記のものを挙げることができる：
（ｉ）１個又は２個以上のアミノ酸残基が保存型アミノ酸残基又は非保存型アミノ酸残基（好ましくは保存型アミノ酸残基）で置換されているもの、
（ｉｉ）１個又は２個以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、
（ｉｉｉ）成熟型ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物に融合しているもの、或いは
（ｉｖ）リーダー配列若しくは分泌配列、又はポリペプチド若しくはプロタンパク質を精製するために使用される配列などのさらなるアミノ酸が成熟型ポリペプチドに融合しているもの（例えば、ＩｇＣフラグメントとともに形成される融合タンパク質）。
そのようなフラグメント、誘導体及び類似体は、本明細書中の教示に基づいて当業者には知られている。
【００４０】
具体的なＢｉｎ１ｂ類似体としては、他の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、サル、ヒトなど）における相同的なタンパク質である。これらの相同的なタンパク質をコードする配列は、本明細書中の開示された配列に基づくハイブリダイゼーション又は増幅によって得ることができ、そのようなタンパク質は、従来の組換え技術を使用して得ることができる。
【００４１】
本発明において、用語「Ｂｉｎ１ｂポリペプチド」は、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含む、Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性を有するポリペプチドを意味する。この用語はまた、Ｂｉｎ１ｂの同じ機能を有する変異体を含む。このような変異体は、いくつかのアミノ酸（典型的には１個〜２０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、最も好ましくは１個〜３個）の欠失、挿入及び／又は置換、そしてＣ末端及び／又はＮ末端における１個又は２個以上のアミノ酸（典型的には２０個未満、好ましくは１０個未満、より好ましくは５個未満）の付加を含むが、これらに限定されない。例えば、タンパク質の機能は、アミノ残基が類似のアミノ残基により置換されたとき、通常、変化しない。さらに、Ｃ末端及び／又はＮ末端における１個又は数個のアミノ酸の付加は、通常、タンパク質の機能を変化させない。この用語にはまた、Ｂｉｎ１ｂタンパク質の活性なフラグメント及び誘導体が含まれる。
【００４２】
ポリペプチドの変異体には、相同的な配列体、保存的な変異体、対立遺伝子変異体、天然の変異体、誘導された変異体、高ストリンジェント又は低ストリンジェントな条件のもとでＢｉｎ１ｂのＤＮＡにハイブリダイゼーションするＤＮＡによってコードされるタンパク質、並びにＢｉｎ１ｂポリペプチドに対して惹起された抗血清によって回収されるポリペプチドが含まれる。本発明はまた、Ｂｉｎ１ｂポリペプチド又はそのフラグメントを含む他のポリペプチド（例えば、融合タンパク質）を提供する。実質的に全長のポリペプチドのほかに、Ｂｉｎ１ｂポリペプチドの可溶性フラグメントもまた含まれる。一般に、これらのフラグメントは、Ｂｉｎ１ｂポリペプチドの少なくとも１５個、典型的には少なくとも２５個、好ましくは少なくとも３５個、より好ましくは少なくとも４０個、の連続したアミノ酸を含む。
【００４３】
本発明はまた、Ｂｉｎ１ｂポリペプチドの類似体を提供する。類似体は、アミノ酸配列の違い若しくは配列に影響を及ぼさない修飾によって、又はその両方によって、天然に存在するＢｉｎ１ｂポリペプチドとは異なり得る。このようなポリペプチドには、遺伝子的変異体（天然型及び誘導型の両方）が含まれる。誘導型の変異体は、様々な技術によって、例えば、放射線照射若しくは変異原への暴露を使用するランダム変異誘発によって、又は部位特異的変異誘発若しくは他の知られている分子生物学的技術によって作製することができる。また、そのような天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸）、又は天然に存在しないアミノ酸、すなわち、合成されたアミノ酸（例えば、β−アミノ酸又はγ−アミノ酸）を含む類似体も含まれる。本発明のポリペプチドは、本明細書中上記された代表的なポリペプチドに限定されないことが理解される。
【００４４】
修飾（これは、通常、一次構造を変化させない）には、ポリペプチドのインビボ又はインビトロでの化学的な誘導、例えば、アセチル化又はカルボキシル化が含まれる。また、グリコシル化による修飾、例えば、その合成若しくはプロセシングが行われているときにポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって行われる修飾、或いはさらなるプロセシング・ステップにおいてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって行われる修飾（例えば、哺乳動物のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素などのポリペプチドをグリコシル化酵素にさらすことによって行われる修飾）も含まれる。また、リン酸化されたアミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホトレオニン）を有する配列、並びにタンパク質分解的な分解に対する抵抗性を改善するために、又は溶解性を最適化するために修飾された配列も含まれる。
【００４５】
本発明において、「Ｂｉｎ１ｂの保存的変異体」とは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列と比較したとき、実質的に同じ性質又は類似する性質を有するアミノ酸で、多くても１０個、好ましくは多くても８個、より好ましくは５個、最も好ましくは多くても３個、のアミノ酸を置換することによって形成されるポリペプチドを意味する。好ましくは、このような保存的変異体は、表１に従った置換によって形成される。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態及びＲＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡには、一本鎖又は二本鎖でのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡなどが含まれる。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。成熟ポリペプチドに対するコード配列は、配列番号１に示されるコード配列と同一であってもよく、又は縮重配列であってもよい。本明細書中で使用されるとき、用語「縮重配列」は、配列番号２又は配列番号３の配列を含むタンパク質をコードする配列で、配列番号１におけるコード領域とは異なるヌクレオチド配列を有する配列を意味する。
【００４８】
成熟ポリペプチドをコードする配列には、成熟ポリペプチドのみをコードする配列、成熟ポリペプチドをコードする配列＋異なる付加的コード配列、成熟ポリペプチドに対するコード配列＋非コード配列及び任意の付加的コード配列が含まれる。
【００４９】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」には、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに付加的配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００５０】
本発明はさらに、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体、そのフラグメント、類似体及び誘導体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体又は天然に存在しない変異体であってもよい。そのようなヌクレオチド変異体には、置換変異体、欠失変異体及び挿入変異体が含まれる。この分野では知られているように、対立遺伝子変異体は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させることがなく、１個又は２個以上のヌクレオチドの置換、欠失及び挿入が存在し得るポリヌクレオチドの置換形態である。
【００５１】
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性が存在する場合、本明細書中上記に記載される配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用されるとき、用語「ストリンジェントな条件」は下記の条件を意味する：
（１）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃などの低イオン強度及び高温でのハイブリダイゼーション及び洗浄；
（２）５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％フィコールなどの変性剤を添加した後の４２℃でのハイブリダイゼーション；又は
（３）少なくとも９５％（好ましくは９７％）の相同性を有する２つの配列のハイブリダイゼーション。
さらに、ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドと同じ生物学的な機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００５２】
本発明はまた、本明細書中上記の配列とハイブリダイゼーションする核酸フラグメントに関する。本明細書中で使用されるように、「核酸フラグメント」の長さは少なくとも１５ｂｐであり、好ましくは３０ｂｐで、より好ましくは５０ｂｐで、最も好ましくは少なくとも１００ｂｐである。これらのフラグメントは、Ｂｉｎ１ｂをコードするポリヌクレオチドを測定及び／又は単離するために、核酸の様々な増幅技術（例えば、ＰＣＲ）において使用することができる。
【００５３】
全長のＢｉｎ１ｂヌクレオチド配列又はそのフラグメントは、ＰＣＲ増幅、組換え法及び合成法によって調製することができる。ＰＣＲ増幅の場合、前記配列を、本明細書中に開示されたヌクレオチド配列（特に、ＯＲＦ）に基づいてプライマーを設計し、そして市販の、又はこの分野における日常的な技術により調製されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用することによって得ることができる。配列が長いときには、通常、２回以上のＰＣＲ増幅を行い、増幅されたフラグメントを正しく連結することが必要である。
【００５４】
配列が一旦得られると、組換え法によって多数の配列を製造することができる。通常、前記配列は、宿主細胞に形質転換されるベクターにクローン化される。配列は、増幅された宿主細胞から従来の技術を使用して単離することができる。
【００５５】
さらに、Ｂｉｎ１ｂ配列は短いので、配列を合成することができる。典型的には、長い配列を得るために、数個の小さいフラグメントが合成され、一緒に連結される。
【００５６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列又はそのフラグメント若しくは誘導体を化学合成することは完全に実施可能である。さらに、変異を化学合成によってタンパク質配列に導入することができる。
【００５７】
ＰＣＲによるＤＮＡ／ＲＮＡの増幅（Ｓａｉｋｉ他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８５、２３０：１３５０〜１３５４）が、Ｂｉｎ１ｂ遺伝子を得るために好ましくは使用される。特に、全長のｃＤＮＡを得ることが困難であるときには、ＲＡＣＥが好ましくは使用される。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、本明細書中に開示される配列情報に従って適宜選択し、従来の方法によって合成することができる。増幅されたＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントは、従来の方法、例えば、ゲル電気泳動によって単離及び精製することができる。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、Ｂｉｎ１ｂタンパク質をコードするベクター又は配列で形質転換されている遺伝子操作宿主細胞、並びに組換え技術によるＢｉｎ１ｂポリペプチドの製造方法に関する。
【００５９】
組換えＢｉｎ１ｂポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチド配列を使用して従来の組換えＤＮＡ技術（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８４、２２４：１４３１）によって発現又は製造することができる。一般には、下記のステップが含まれる：
（１）Ｂｉｎ１ｂポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はこのポリヌクレオチドを含有するベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクション又は形質転換するステップ；
（２）宿主細胞を適切な培地で培養するステップ；
（３）タンパク質を培地又は細胞から単離又は精製するステップ。
【００６０】
本発明においては、Ｂｉｎ１ｂをコードするポリヌクレオチド配列を、組換え発現ベクターに挿入することができる。用語「発現ベクター」とは、細菌プラスミド、バクテリアファージ、酵母プラスミド、植物ウイルス若しくは哺乳動物細胞ウイルス（アデノウイルス、レトロウイルスなど）、又はこの分野で知られている任意の他の伝達体を意味する。プラスミド又はベクターが宿主内で複製することができ、かつ宿主内で安定である限り、任意のプラスミド又はベクターを使用して、組換え発現ベクターを構築することができる。発現ベクターの重要な特徴の１つは、発現ベクターが、典型的には、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子、並びに翻訳調節部位を含むということである。
【００６１】
知られている様々な方法を、Ｂｉｎ１ｂのＤＮＡ配列及び適切な転写／翻訳調節部位を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などが含まれる。ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を行わせるために、発現ベクターにおいて適切なプロモーターに有効に連結される。例示的なプロモーターには、大腸菌のｌａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーター；ファージのＰＬプロモーター；真核生物プロモーター（ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ・プロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、そして原核生物細胞、真核生物細胞又はウイルスにおける遺伝子発現を制御する他の既知のプロモーターを含む）がある。発現ベクターは、翻訳を開始するためのリボソーム結合部位、転写ターミネーターなどをさらに含むことができる。
【００６２】
発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型を提供する１つ又は２つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば、真核生物細胞についてはデヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を、そして大腸菌についてはテトラサイクリン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００６３】
前記ＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は調節エレメントを含有するベクターは、タンパク質を発現させるために、適切な宿主細胞に形質転換することができる。
【００６４】
「宿主細胞」には、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）；原始的な真核生物細胞（例えば、酵母）；進化した真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）が含まれる。代表的な例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセス属細菌、ネズミチフス菌；菌類細胞、例えば、酵母；植物細胞；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズ黒色腫などがある。
【００６５】
高等真核生物におけるポリヌクレオチドの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増進する。エンハンサーは、プロモーターに作用して遺伝子の転写を増進させるＤＮＡのシス作用エレメント（通常、約１０ｂｐ〜３００ｂｐ）である。例としては、複製起点の後期側の１００ｂｐ〜２７０ｂｐにあるＳＶ４０エンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマ・エンハンサー、及びアデノウイルス・エンハンサーが含まれる。
【００６６】
当業者は、適切なベクター、プロモーター、エンハンサー及び宿主細胞を選択する方法を明確に知っている。
【００６７】
ＤＮＡによる宿主細胞の組換え形質転換は、当業者に知られている従来の技術によって行うことができる。宿主が原核生物（例えば、大腸菌）である場合、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピーテント細胞を、指数増殖期の後に集められ、その後、既知の手順を用いるＣａＣｌ２法によって処理された細胞から調製することができる。或いは、ＭｇＣｌ２を使用することができる。形質転換はまた、エレクトロポレーションによっても行うことができる。宿主が真核生物である場合には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、従来の機械的な手段（マイクロインジェクション等）、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介トランスフェクションなどのＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。
【００６８】
形質転換体は、通常、Ｂｉｎ１ｂポリペプチドを発現させるために培養される。使用される宿主細胞によって、培養培地を様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞は、宿主細胞が適切な細胞密度に増殖するまで、その増殖に好適な条件のもとで培養される。その後、選択されたプロモーターが、適切な手段（例えば、温度変化又は化学的誘導）によって誘導され、細胞はさらなる期間培養される。
【００６９】
上記の方法において、組換えポリペプチドは、細胞内に含めてもよく、細胞膜上に発現させてもよく、或いは分泌させてもよい。所望の場合、物理的性質、化学的性質及び他の性質を、組換えタンパク質を単離及び精製するために、様々な単離方法において利用することができる。これらの方法は、当業者には十分に知られており、従来の再生処理、タンパク質沈殿による処理（例えば、塩沈殿）、遠心分離、浸透圧作用による細胞溶解、超音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー又はゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、及び任意の他の液体クロマトグラフィー、並びにそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
組換えＢｉｎ１ｂポリペプチドは、泌尿生殖器感染を治療すること、そしてＢｉｎ１ｂのアゴニスト又はアンタゴニストとして抗体又はポリペプチド又はリガンドをスクリーニングすること（これらに限定されない）を含む様々な用途を有する。発現したＢｉｎ１ｂタンパク質は、ポリペプチドライブラリーをスクリーニングして、Ｂｉｎ１ｂタンパク質を阻害又は活性化する治療上有益なポリペプチド分子を見出すために使用することができる。
【００７１】
別の態様において、本発明はまた、Ｂｉｎ１ｂのＤＮＡによってコードされるポリペプチド又はそのフラグメントに対して特異的であるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、好ましくはｍＡｂを含む。「特異性」により、Ｂｉｎ１ｂ遺伝子産物又はそのフラグメントに結合する抗体が意味される。好ましくは、抗体は、Ｂｉｎ１ｂ遺伝子産物又はそのフラグメントには結合するが、抗原的に非関連の他の分子を実質的に認識せず、またそのような分子には実質的に結合しない。Ｂｉｎ１ｂに結合してＢｉｎ１ｂタンパク質を阻止する抗体、及びＢｉｎ１ｂの機能に影響を及ぼさない抗体は、本発明に含まれる。
【００７２】
本発明は、完全なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又は（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体重鎖、抗体軽鎖、又はキメラ抗体を含む。
【００７３】
本発明における抗体は、この分野で知られている様々な方法によって調製することができる。例えば、精製されたＢｉｎ１ｂ遺伝子産物又はその抗原性フラグメントを、ポリクローナル抗体を産生させるために動物（例えば、ウサギ、マウス及びラット）に投与することができる。同様に、Ｂｉｎ１ｂ又はその抗原性フラグメントを発現する細胞を、動物を免疫化して抗体を産生させるために使用することができる。様々なアジュバント（例えば、フロイント・アジュバント）を、免疫化を高めるために使用することができる。
【００７４】
ｍＡｂは、ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５、１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ他、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、６：５１１、１９７６；Ｋｏｈｌｅｒ他、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、６：２９２、１９７６；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）。抗体は、Ｂｉｎ１ｂの機能を阻止する抗体、及びＢｉｎ１ｂの機能に影響を及ぼさない抗体を含む。抗体は、日常的な免疫学技術により、組換え法によって調製されるか又はペプチド合成機によって合成されるＢｉｎ１ｂ遺伝子産物のフラグメント又は機能的領域を使用して、製造することができる。修飾されていないＢｉｎ１ｂ遺伝子産物に結合する抗体は、原核生物細胞（例えば、大腸菌）によって産生された遺伝子産物で動物を免疫化することによって製造することができ、そしてその翻訳後修飾形態に結合する抗体は、真核生物細胞（例えば、酵母又は昆虫細胞）によって産生された遺伝子産物で動物を免疫化することによって得ることができる。
【００７５】
Ｂｉｎ１ｂに対する抗体は、生検試料におけるＢｉｎ１ｂタンパク質の存在を検出するために免疫組織化学的方法において使用することができる。ｍＡｂは、Ｂｉｎ１ｂの位置及び分布を追跡するために、放射能標識して、体内に注射することができる。
【００７６】
Ｂｉｎ１ｂタンパク質と作用する物質、例えば、受容体、阻害剤、アゴニスト及びアンタゴニストを、Ｂｉｎ１ｂタンパク質を使用して、様々な従来の技術によってスクリーニングすることができる。
【００７７】
本発明のＢｉｎ１ｂタンパク質、抗体、阻害剤、アゴニスト又はアンタゴニストは、治療において投与されたとき、種々の異なる効果をもたらす。通常、これらの物質は、非毒性で、不活性かつ製薬上許容可能な水性担体とともに配合される。ｐＨは、配合された物質の性質及び処置される疾患に従って変化し得るが、典型的には約５〜８であり、好ましくは６〜８である。配合された医薬組成物は、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は局所投与（これらに限定されない）を含む従来の経路で投与される。
【００７８】
Ｂｉｎ１ｂポリペプチドは、様々な障害（例えば、泌尿生殖器感染）を治療するために直接使用することができる。Ｂｉｎ１ｂタンパク質は、他の医薬品と組み合わせて、例えば、ペニシリンを含む抗生物質と組み合わせて投与することができる。
【００７９】
本発明はまた、安全かつ有効な量のＢｉｎ１ｂタンパク質を、製剤上許容可能な担体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。そのような担体としては、食塩水、緩衝溶液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、又はそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されない。薬剤処方は、送達方法に好適なものでなければならない。医薬組成物は、生理学的な食塩水又はグルコース又は補助物質を含有する他の水溶液を使用して従来の方法によって調製される注射液の形態であってもよい。錠剤又はカプセルの形態にある医薬組成物を日常的な方法によって調製することができる。医薬組成物、例えば、注射液、液剤、錠剤及びカプセルは、無菌条件のもとで製造されなければならない。有効成分が、治療効果的な量で、例えば、１日あたり体重１ｋｇについて約１ｕｇ〜５ｍｇで投与される。そのうえ、本発明のポリペプチドは、他の治療剤と一緒に投与することができる。
【００８０】
医薬組成物を使用するとき、安全かつ有効な量のＢｉｎ１ｂタンパク質又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニストが哺乳動物に投与される。典型的には、安全かつ有効な量は、ほとんどの場合、少なくとも約１ｕｇ／ｋｇ体重で、約８ｍｇ／ｋｇ体重よりも少なく、好ましくは約１０ｕｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。明らかなことではあるが、正確な量は、送達方法、患者の健康状態などの様々な要因に依存するが、通常の医師の判断の範囲に含まれる。
【００８１】
Ｂｉｎ１ｂタンパク質と結合し得るポリペプチド分子は、固体マトリックスに結合したアミノ酸の様々な組合せからなるランダム・ポリペプチド・ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【００８２】
本発明はさらに、Ｂｉｎ１ｂタンパク質レベルの定量的測定及びｉｎ  ｓｉｔｕ測定を行うための診断アッセイを提供する。このようなアッセイは、この分野では知られており、ＦＩＳＨアッセイ及び放射免疫アッセイを含む。アッセイで検出されるＢｉｎ１ｂタンパク質のレベルは、疾患におけるＢｉｎ１ｂタンパク質の重要性を明らかにするため、並びにＢｉｎ１ｂ関連疾患を判定するために使用することができる。
【００８３】
Ｂｉｎ１ｂタンパク質に対して特異的な抗体を利用することによってサンプル中のＢｉｎ１ｂタンパク質を検出する方法は、サンプルをＢｉｎ１ｂタンパク質に対して特異的な抗体と接触させるステップ；サンプル中のＢｉｎ１ｂタンパク質の存在を示す抗体複合体の形成を観測するステップを含む。
【００８４】
Ｂｉｎ１ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂｉｎ１ｂ関連疾患の診断及び処置において使用することができる。診断においては、Ｂｉｎ１ｂをコードするポリヌクレオチドを、Ｂｉｎ１ｂを発現しているか否かを検出するために使用することができ、更に疾患の場合においては、発現が正常であるか異常であるかを検出するために使用することができる。Ｂｉｎ１ｂのＤＮＡ配列は、Ｂｉｎ１ｂの発現を検出するために、生検サンプルとのハイブリダイゼーションにおいて使用することができる。ハイブリダイゼーション法には、サザン・ブロッティング、ノーザン・ブロッティング及びインシトゥー・ブロッティングなどが含まれ、これらは、公知で洗練された技術である。対応するキットが市販されている。本発明のポリヌクレオチドの一部分又は全体を、組織における遺伝子の特異的な発現を分析するため、及び遺伝子を診断するために、プローブとして使用し、マイクロアレイ又はＤＮＡチップに固定することができる。Ｂｉｎ１ｂに特異的なプライマーは、Ｂｉｎ１ｂの転写物を検出するために、ＲＴ−ＰＣＲ及びインビトロ増幅において使用することができる。
【００８５】
Ｂｉｎ１ｂ遺伝子の変異の検出は、Ｂｉｎ１ｂ関連疾患を診断するために有用である。Ｂｉｎ１ｂの変異形態には、野生型Ｂｉｎ１ｂのＤＮＡ配列と比較して、部位変異、転座、欠失、再編成及び任意の他の変異が含まれる。従来の方法、例えば、サザン・ブロッティング、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ及びインシトゥー・ブロッティングを、変異を検出するために使用することができる。そのうえ、変異はタンパク質の発現を変化させることがあるので、ノーザン・ブロッティング及びウエスタン・ブロッティングを、遺伝子の変異を間接的に明らかにするために使用することができる。
【００８６】
本発明の配列はまた染色体同定のためにも有益である。簡単に記載すると、様々な配列を、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐ）をＢｉｎ１ｂのｃＤＮＡから調製することによって染色体にマッピングすることができる。それから、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。プライマーに対応する遺伝子を含有する細胞ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントをもたらす。
【００８７】
配列が一旦正確な染色体位置にマッピングされると、染色体における配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、（ジョーンズ・ホプキンス大学ウエルチ医学図書館からオン・ラインで得られる）ヒトでのメンデル遺伝（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）において見出される。それで、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析によって確認される。
【００８８】
Ｂｉｎ１ｂは、泌尿生殖器系の疾患を治療するために、そして男性避妊を開発するための方法を提供し、したがって、非常に大きな潜在能力を持つ応用力を有する。
【００８９】
本発明は下記の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、本発明を例示することを意図するだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。下記の実施例における実験方法に関して、それらは、別途示されない限り、日常的な条件のもとで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他により、分子クローン：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｌｏｎｅ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件のもとで、又は製造者によって指示されるように行われる。
【実施例１】
【００９０】
Ｂｉｎ１ｂに特異的なｃＤＮＡフラグメントの発見
Ｌｉａｎｇ，Ｐ．他［Ｐ．Ｌｉａｎｇ及びＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５７、９６７（１９９２）］によって記載される手順に主に従って、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ消化により残留する染色体ＤＮＡを除いて、総ＲＮＡを、成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの精巣上体の頭部及び体部及び尾部の各領域から単離した。沈殿後、逆転写を、２ｕｇの単離された全ＤＮＡを用いて行なったが、２．５ｕＭの下流プライマーＴ１１ＣＡを４００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）とともに使用した。逆転写産物の１／２０をテンプレートとして使用して、ＰＣＲを、２．５ｕＭの上流プライマー５０２（５’−ＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣ−３’）及び０．５ｕＭの下流プライマーＴ１１ＣＡを用いて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、４ｕＭの各ｄＮＴＰ、１ｕＣｉの３２Ｐ−ｄＡＴＰ及び３単位Ｔａｑポリメラーゼを含有する２０ｕｌの液中で行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、４０℃で６０秒間及び７２℃で５０秒間のサイクルを４０回繰り返し、７２℃で１０分間で最終的な伸長を行なった。ＰＣＲ産物を沈殿させ、０．２ｍｍ厚の６％配列決定用ゲルで分画した。
【００９１】
頭部領域に由来するＲＮＡにだけ特異的に示されたバンド（約３４０ｂｐ）をＢｉｎ１ｂと名付け（図１）、そしてこのバンドを切り出し、沸騰した蒸留水中に１５分間置いた。溶出したＤＮＡをエタノール沈殿し、４ｕＭに代えて４０ｕＭの各ｄＮＴＰを使用し、かつ放射性同位体を含まないことを除いて上記に記載されるのと同じ条件で再び増幅した。得られた３４０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミドにクローン化した。５２個のクローンを、リバース・ノーザンによってスクリーニングして、頭部領域において特異的なハイブリダイゼーション・シグナルを有するクローンをＢｉｎ−１ｂと名付けた。Ｂｉｎ１ｂの全長ｃＤＮＡを、前記フラグメントに基づいて５’−ＲＡＣＥによってクローン化した。
【実施例２】
【００９２】
全長Ｂｉｎ１ｂｃＤＮＡのクローニング及び特徴づけ
プライマーを、５’末端を伸長させるために、得られたｃＤＮＡフラグメントに基づいて設計した。２つの５’−ＲＡＣＥ法を使用して、全長のｃＤＮＡを得た。
【００９３】
最初の方法は、オリゴＤＮＡ−１本鎖ｃＤＮＡ連結を使用する、Ａ．Ｎ．Ａｐｔｅ及びＰ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ［逆転写酵素ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ）、Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ、Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ編（Ｈｏｒｗｏｏｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９５）、２３２頁〜２４４頁］によって報告される従来の方法であった。
【００９４】
もう１つの方法は、オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ連結［これは、５’−キャッピング部位を確実に得るために、Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１３８、１７１（１９９４）からの改変である］を用いる方法であった。オリゴＤＮＡが、全ＲＮＡと連結するために、オリゴＲＮＡの代わりに使用された。手順は下記の通りであった：
【００９５】
ラット精巣上体頭部に由来する全ＲＮＡ（５０ｕｇ）を、４００単位の細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）を用いて３７℃で３０分間、更に６５℃で３０分間インキュベーションして消化した。その後、ＢＡＰを、プロテイナーゼＫ（５０ｎｇ／μｌ）を用いて３７℃で３０分間消化した。精製後、１０ｕｇのＲＮＡを、２単位のタバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）を用いて３７℃で２時間さらに処理して、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。未処理のＲＮＡ、ＢＡＰ処理されたＲＮＡ、及びＴＡＰ処理されたＲＮＡ（それぞれ、０．７５ｕｇ、約３ｐｍｏｌ）を１．２５ｐｍｏｌのＤＮＡオリゴヌクレオチド７２０９（５’−ＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴ−ＧＡＣＧＴＧＧＴＣＣ−３’）（配列番号５）と混合し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ塩化コバルトヘキサミン、２５％ＰＥＧ８０００及び１ｍＭアデノシン三リン酸からなる１０ｕｌ液中で、１７℃で１８時間、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（１．２ユニット／ｕｌ）を用いて連結した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩワン・ステップＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を使用して、２００ｍＭのオリゴＤＮＡ＃７２０９（５’−ＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＣ−３’、配列番号５）及び２００ｍＭのＢｉｎ１ｂ遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）（５’−ＴＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣ−３’、配列番号６）を含有する２０ｕｌ液中で、０．２ｕｌの連結産物とＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は下記の通りであった。
５０℃で３０分間、９４℃で２分間、その後、９４℃で５秒間、６０℃で１５秒間及び７２℃で４５秒間のサイクルを３５回繰り返し、７２℃で５分間の最終的な伸長反応を行なった。
２回目のＰＣＲを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１〜３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ウシ血清アルブミン（２５０ｕｇ／ｍｌ）、０．５％フィコール４００、１ｍＭタルタラジン、２００ｕＭのｄＮＴＰ、５００ｎＭのＢｉｎ１ｂ  ＧＳＰ、５００ｎＭのオリゴＤＮＡ＃７２０９、及び０．４単位のＴａｑポリメラーゼを含有する１０ｕｌ液中で、０．２ｕｌのＲＴ−ＰＣＲ産物を用いて行った。
ＰＣＲ反応はキャピラリー管において下記のように行われた。
９４℃で１分間、その後、９４℃で０秒間、６０℃で０秒間及び７７℃で１５秒間のサイクルを６０回繰り返し、７７℃で５分間の最終的な伸長反応を行なった。
ＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋Ｔベクターにクローン化して、配列決定した。このようにして、Ｂｉｎ１ｂの３’フラグメント及び５’フラグメントが得られた。
【００９６】
プライマーが、ｃＤＮＡフラグメントの両末端について設計された（５’−ＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号７）及び５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡ−３’（配列番号８））。ＲＴ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用して、Ｂｉｎ１ｂの全長ｃＤＮＡクローンをＰＣＲによって得た。配列を、異なる週齢の６匹のラットにおいて確認した。Ｂｉｎ１ｂの全長ｃＤＮＡは、１６アミノ酸のシグナルペプチドをＮ末端に有する６８ａａのペプチド（これはＢｉｎ１ｂタンパク質を名付けられた）（配列番号２）をコードする３８５ｂｐ（配列番号１及び図２Ａ）であった。推定される成熟タンパク質は、４５個のアミノ酸を含有する（別の７個のアミノ酸がプロＢｉｎ１ｂの成熟化のときに除かれた）。
【００９７】
ｂｌａｓｔ検索の結果により、Ｂｉｎ１ｂのコード配列（１８０〜２４１）が、ヒト精子抗原ＨＥ２（６７３ｂｐ）の非コード配列（４５６〜５１８）と８３％の相同性を有することが示された。Ｂｉｎ１ｂによってコードされるペプチドは哺乳動物のβ−ディフェンシンとある程度の類似性を示した（図２Ｂ）。
【００９８】
Ｂｉｎ１ｂのゲノムＤＮＡを、類似するＰＣＲ法によってクローン化した（配列番号４、図２Ａ）。Ｂｉｎ１ｂのゲノムＤＮＡは、１つのイントロンにより隔てられた２つのエキソンを含有した。これはβ−ディフェンシン遺伝子ファミリーにおいて特徴的であった。
【００９９】
ヒトＨＥ２のいくつかの異性体及びチンパンジーにおけるその相同体ＥＰ２がいくつかの研究室によって報告されていた。それらのいくつかは低い発現であったが、Ｂｉｎ１ｂとの大きな配列相同性を有した（図２Ｃ）。
【実施例３】
【０１００】
Ｂｉｎ１ｂタンパク質の発現
Ｂｉｎ１ｂペプチドのサイズが、インビトロでの転写及び翻訳によって、約３１ｋＤであることが確認され、理論的予測と一致した。
【０１０１】
プラスミドｐＳＰＴ１８−Ｂｉｎ１ｂ（図３Ｃ）を、６８アミノ酸のＯＲＦ（７７９９ダルトン）をコードするＢｉｎ１ｂの全長ｃＤＮＡ（７５ｂｐのポリＡテールを含む）を、ｐＳＰＴ１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）の（Ｔ７プロモーターの下流の）ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間で、クローニングすることによって構築した。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した。反応は、３５Ｓ−Ｍｅｔによって標識されたＴＮＴ  Ｔ７共役網状赤血球溶解系を用いて行われ、次いで、Ｓｃｈａｇｇｅｒ及びＶｏｎ  Ｊａｇｏｗによって記載されるように１６．５％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果が図３Ａに示された。結果を、プラスミドＤＮＡを有しない陰性対照並びにルシフェラーゼのＳＰ６及びＴ７と比較した（図３Ｂ）。
【実施例４】
【０１０２】
Ｂｉｎ１ｂの融合発現及び抗体調製
Ｂｉｎ１ｂのｃＤＮＡのフラグメント（１２６〜２８１）を融合発現ベクターｐＱＥ−４０（ＱＩＡＧＥＮ）にクローン化した。陽性クローンを、製造者によって記載されるように、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した（ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を参照のこと）。
【０１０３】
精製された融合タンパク質ＤＨＦＲ−Ｂｉｎ１ｂは、３１ｋＤである（図４）。ウサギを、その精製タンパク質で免疫化し、ＤＨＦＲ−１ｂに対する抗血清を産生させた。しかし、Ｂｉｎ１ｂに対する抗血清の力価はまだ改善されなければならなかった。
【実施例５】
【０１０４】
Ｂｉｎ１ｂの組織分布
Ｂｉｎ１ｂの組織分布分析を、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）の方法に従ってノーザン・ブロットにより行った。総ＲＮＡを、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの精巣上体頭部、精巣、腹側前立腺、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、胸腺、副腎、凝固腺、精嚢、視床下部、線条体、下垂体、海馬、小脳、大脳皮質及び精巣上体頭部からそれぞれ抽出した。それぞれ２０ｕｇの総ＲＮＡを１．２％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル電気泳動で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。Ｂｉｎ１ｂプローブを、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅシステム・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって標識した。ハイブリダイゼーションの結果は、Ｂｉｎ１ｂがラットの精巣上体頭部でのみ発現していることを示した（図５Ａ）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、精巣上体におけるＢｉｎ１ｂの正確な局在化を決定するために使用した。
【実施例６】
【０１０５】
精巣上体におけるＢｉｎ１ｂｍＲＮＡの局在性
本実施例では、従来のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、Ｂｉｎ１ｂをマッピングするために使用された。顕微鏡観察により、Ｂｉｎ１ｂが精巣上体頭部中央の上皮に局在化することが示された（図５Ｂ〜Ｅ）。
【実施例７】
【０１０６】
ラット成長時におけるＢｉｎ１ｂの発達による変化
Ｂｉｎ１ｂの発達による変化を、実施例５の場合と同じノーザン・ブロットによって分析した。ＲＮＡを、１５日齢ラットの精巣上体頭部、並びに３０日齢、４５日齢、６０日齢、１２０日齢、２７０日齢及び７２０日齢のラットの精巣上体の頭部、体部及び尾部から抽出した。
【０１０７】
結果は、Ｂｉｎ１ｂの発現が性的成熟期間（性的に活性な期間を含む）において最大であり、それ以降は徐々に減少することを示した（図５Ｆ）。このことにより、Ｂｉｎ１ｂが精子の成熟化と関連し得ること、そしてＢｉｎ１ｂが雄性避妊のために調節され得ることが示された。
【実施例８】
【０１０８】
Ｂｉｎ１ｂの発現はホルモンなどの小分子によって調節される。
本実施例では、ＥＤＳラットモデルに対する研究により、Ｂｉｎ１ｂの発現がアンドロゲンによって部分的に上方制御されることが示された。
【０１０９】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙに、ＤＭＳＯ−Ｈ２Ｏ（１：３、ｖ／ｖ）中ＥＤＳ（７．５ｍｇ／１００ｇ体重）を腹腔内注射した。ラットは、１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目及び４２日目に屠殺された。ＥＤＳ注射を受けなかったラットは、陰性対照として使用された。２０ｕｇの全ＲＮＡをラットの精巣上体頭部から抽出して、１．２％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル電気泳動によって分画し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブランにブロットして、Ｂｉｎ１ｂのｃＤＮＡの３’末端の位置を示すプローブ及び１８ｓリボソームＲＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションした。
【０１１０】
アンドロゲンの分泌がＥＤＳの注射直後に減少したが、注射後約２週間で回復した。Ｂｉｎ１ｂの発現は、アンドロゲンのレベルにおける変化と比較すると、アンドロゲンによって上方制御された（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【０１１１】
小さいホルモン分子によるＢｉｎ１ｂ発現の調節によって精子の成熟化を抑制することが可能であり、これにより、男性避妊薬を開発するための新しい方法について道が開かれた。
【実施例９】
【０１１２】
Ｂｉｎ１ｂは天然の抗菌性ペプチドである
上記の研究により、Ｂｉｎ１ｂがβ−ディフェンシン遺伝子ファミリーのメンバーであり、精子の成熟化に関与することが示された。抗菌活性は、本実施例において確認された。
【０１１３】
Ｂｉｎ１ｂの抗菌活性を、精巣上体頭部上皮の初代培養物の分泌物を用いて試験した。合計で１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌を、精巣上体頭部及び精巣上体尾部から別々に得られた上皮細胞の頂端区画に、添加した。培地を、ＣＦＵ計数のために１６時間後に集めた。強い抗菌活性が、頭部培養物から集められた培地において検出されたが、尾部培養物では検出されなかった。このことにより、精巣上体頭部の細胞からの分泌物が、抗菌活性を有することが確認された（図７Ａ）。
【０１１４】
Ｂｉｎ１ｂは精巣上体頭部で発現してものの、抗菌活性がＢｉｎ１ｂによって実際にもたらされたことを確認するために、本発明者らはＢｉｎ１ｂのアンチセンスＲＮＡを設計し、大腸菌を加える２４時間前に培養物に加えて、Ｂｉｎ１ｂの発現を阻止した。頭部培養物の抗菌力が大きく弱められた。このことにより、Ｂｉｎ１ｂの抗菌活性が証明された（図７Ｂ）。
【０１１５】
これらの結果は、Ｂｉｎ１ｂがβ−ディフェンシン・ファミリーにおける新規な天然の抗菌性ペプチドであったことを示している。
【実施例１０】
【０１１６】
Ｂｉｎ１ｂの発現が炎症によって上方制御された。
精巣上体における精子の蓄積をもたらす精管の結紮に起因する炎症を生じたとき、精巣上体頭部におけるＢｉｎ１ｂのｍＲＮＡが、結紮前の正常なレベルの３倍に増大した。精巣上体尾部では変化が見られなかった（図７Ｃ）。このことは、Ｂｉｎ１ｂの発現が炎症によって上方制御されたことを示している。
【０１１７】
本明細書中に引用されている文書はすべて、そのそれぞれが個々に組み込まれているかのように参考として本発明に組み込まれる。さらに、本発明の上記の教示において、当業者は本発明に対するいくつかの変化又は改変を行うことができること、そしてこれらの均等物はなおも、本明細書の添付された請求項によって規定される本発明の範囲に含まれることが理解される。
【０１１８】
下記の図面は、様々な実施形態を例示しているが、特許請求項に規定される本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ラット精巣上体の頭部（１）、体部（２）及び尾部（３）のＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲを示す図である。サンプルは正確性のために二連で処理した。Ｂｉｎ１ｂが、矢印により示されるように頭部領域において特異的に発現している。
【図２Ａ】Ｂｉｎ１ｂの配列及び構造的特徴を示す図である。Ｂｉｎ１ｂのゲノムＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＦ２１７０８９）である。これは、Ｂｉｎ１ｂの全長ｃＤＮＡ（ＡＦ２１７０８８）の両端に位置するプライマー（上流プライマー：５’−ＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＴ−３’（配列番号９）及び下流プライマー：５’−ＴＴＴＧＧＧＧＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号１０））を、テンプレートとしてのラットゲノムＤＮＡとともに使用するＰＣＲによってクローン化される。２つのエキソン：大文字；コード領域：斜影部；ポリＡシグナル：太字の大文字；イントロン：小文字；スプライシング部位：太字の小文字；推定されるシグナルペプチド：下線が付されたアミノ酸。潜在的なＮ末端は、そのコンセンサス・パターン（ＧＩＲＮＴＶ）が太字の斜体大文字である、四角で囲まれるミリストイル化Ｇ残基であり、そして丸で囲まれるＳ残基は、そのコンセンサス・パターン（ＳＩＫ）が太字の斜体大文字であるＰＫＣによってリン酸化され得る。停止コドンが＊によって示される。
【図２Ｂ】Ｂｉｎ１ｂと様々なβ−ディフェンシンとの配列類似性を示す図である。β−ディフェンシンにおける保存された６個のシステイン残基には斜影が付けられている。ウシ由来のＢＮＢＤ９（ＡＡＢ２５８７２）、ＢＮＢＤ３（ＡＡＢ２５８６６）、ＢＮＢＤ７（ＡＡＢ２５８７０）、ＴＡＰ（Ｐ２５０６８）、ＬＡＰ（Ｑ２８８８０）、ＥＢＤ（Ｏ０２７７５）；ヒト由来のＨＢＤ１（Ｑ０９７５３）、ＨＢＤ２（Ｏ１５２６３）、ＨＢＤ３（ＮＰ０６１１３１）；チンパンジー由来のＥＰ２Ｅ（ＡＦ２６３５５５＿１）、ＣＢＤ１（ＡＦ１８８６０７＿１）、ＣＢＤ２（ＡＦ２０９８５５＿１）；マウス由来のＭＢＤ１（ＡＡＢ７２００３）、ＭＢＤ２（ＣＡＢ４２８１５）、ＭＢＤ３（ＡＦ０９２９２９＿１）、ＭＢＤ４（ＡＦ１５５８８２＿１）；ラット由来のＲＢＤ１（ＡＡＣ２８０７１）、ＲＢＤ２（ＡＡＣ２８０７２）；ヤギ由来のＧＢＤ１（ＣＡＡ７６８１１）、ＧＢＤ２（ＣＡＡ０８９０５）；ヒツジ由来のＳＢＤ１（Ｏ１９０３８）、ＳＢＤ２（Ｏ１９０３９）；ブタ由来のＰＢＤ１（Ｏ６２６９７）；Ｇａｌ１（Ｐ４６１５６）、Ｇａｌ１ａ（Ｐ４６１５７）及びＧａｌ２（Ｐ４６１５８）、これらは、それぞれ、ニワトリのガリナシン１、１β及び２である；ＴＨＰ１（Ｐ８０３９１）及びＴＨＰ２（Ｐ８０３９２）、これらは、それぞれ、七面鳥の異好性ペプチド１及び２である。ＥＰ２Ｅは、Ｂｉｎ１ｂのチンパンジー相同体の１つであるが、β−ディフェンシン・ファミリーのメンバーであるとはその原著者らによって見なされていなかった。
【図２Ｃ】Ｂｉｎ１ｂとその霊長類相同体とのアラインメントを示す図である。Ｂｉｎ１ｂと比較したとき、その霊長類相同体のＥＰ２Ｄ（ＡＦ２６３５５４＿１）及びＨＥ２β１（ＡＦ１６８６１７＿１）は伸びたＮ末端及びＣ末端を有するが、ＥＰ２Ｅ（ＡＦ２６２５５５＿１）は伸びたＣ末端を有するだけである。ＨＥ２β１は図ではＨＥ２ｂ１として示される。
【図３】Ｂｉｎ１ｂ全長ｃＤＮＡのインビトロでの転写及び翻訳アッセイを示す図である。図３Ａ：Ｂｉｎ１ｂ全長ｃＤＮＡのインビトロでの転写及び翻訳アッセイ。レーン１及びレーン２は二連のサンプルである。図３Ｂ：陰性対照（プラスミドＤＮＡなし）並びにシフェラーゼのＳＰ６対照及びＴ７対照が３Ａと同じ系でアッセイされるが、分子量が異なるために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動される。レーン１：陰性対照（プラスミドＤＮＡなし）。レーン２：シフェラーゼＳＰ６対照。レーン３：シフェラーゼＴ７対照。図３Ｃ：ｐＳＰＴ１８−Ｂｉｎ１ｂの構築。
【図４】Ｂｉｎ１ｂの組換え融合発現を示す図である。融合タンパク質ＤＨＦＲ−Ｂｉｎ１ｂは、矢印により示されるように３１ＫＤである。ＮＩ：非誘導、Ｉ：誘導後、ＣＬ：透明な溶解物、ＦＴ：非吸着部、Ｗ：洗浄緩衝液、Ｅ１：溶出１、Ｅ２：溶出２、Ｍ：マーカー。
【図５】Ｂｉｎ１ｂの局在化及び発達による調節を示す図である。図５Ａ：ノーザン分析によるＢｉｎ１ｂの組織分布。図５Ｂ：インシトゥー・ハイブリダイゼーションによる精巣上体におけるＢｉｎ１ｂの領域分布。Ｂｉｎ１ｂはラット精巣上体の頭部領域の中央（Ｍｉｄ）に存在する。Ｉｎｓ：初期セグメント。図５Ｃ：アンチセンス・プローブを使用するＢｉｎ１ｂの細胞局在化。Ｂｉｎ１ｂは精巣上体の主細胞（Ｐｒｃ）に存在する。図５Ｄ：センス・プローブ。図５Ｅ：陽性対照としての１８ｓプローブ。（Ｆ）全寿命期間（１５日〜７２０日）中のラット精巣上体におけるＢｉｎ−１ｂのｍＲＮＡの発現プロフィル（１、２及び３は、それぞれ、頭部、体部及び尾部の各領域に由来するｍＲＮＡを表す）。
【図６】エチレンジメタンスルホナート（ＥＤＳ）処置後におけるラット精巣上体頭部の総ＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す図である。図６Ａ：ノーザン・ブロット分析の写真。図６Ｂは、Ｂｉｎ１ｂの発現がアンドロゲンによってアップレギュレーションされることを示す。””の線は、ＥＤＳ注射後の様々な時間間隔におけるラットの血清中テストステロンのレベルを表す。””の線は、１８ｓレベルによって補正されているラットＢｉｎ１ｂ発現の変化を表す。
【図７】Ｂｉｎ１ｂの抗菌活性及び炎症に応答するその発現アップレギュレーションを示す図である。図７Ａ：頭部培養物及び尾部培養物における抗菌活性の比較。１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の大腸菌が試験の１６時間前に培養物に加えられた。図７Ｂ：頭物培養物の抗菌活性に対するＢｉｎ１ｂのアンチセンスの作用。培養物は、アンチセンス・オリゴ又はセンス・オリゴ（５ｕｇ／μｌ）で２０時間トランスフェクションされた。図７Ｃ：精管を２週間結紮することによって炎症を生じさせたラット精巣上体の、尾部領域ではなく、頭部領域において増強されたＢｉｎ１ｂのｍＲＮＡ。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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