(57)【要約】レシチンと重合体とを含有してなるワクチン用のアジュバントであり、前記重合体はポリアクリル酸であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン抗原とアジュバントとを含有してなる組成物であって、前記アジュバントがレシチンと重合体とを含有してなるものである組成物。
【請求項２】
前記重合体がアクリル重合体、アクリル共重合体及びこれらの混合物からなる群から選択されるものである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記重合体が ポリアクリル酸、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、アクリル酸エステル、アクリロニトリル、ポリ(アクリルアミド-コブチル、メタクリレート)、アクリル-メタクリル酸、アクリル-アクリルアミド、ポリ(メタクリル酸エステル)及びポリアクリル酸アルキルエステルからなる群から選択されるアクリル重合体である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記重合体がポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリオキシエチレンからなる群から選択される非アクリル重合体である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
架橋されているアクリル重合体を含有する請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
架橋剤がポリアルケニルポリエーテル及びアルキルスクロースからなる群から選択されるものである請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
組成物中のレシチンと重合体の濃度がそれぞれ約0.0001〜10重量％である請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
組成物中のレシチンと重合体の濃度がそれぞれ約0.001〜1.0重量％である請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ワクチン抗原が細菌、ウイルス、寄生動物、DNA及びこれらの生物の構造サブユニットからなる群から選択される不活化又は弱毒化物質からなるものである請求項に記載の組成物。
【請求項１０】
防腐剤、界面活性剤及びプロバイオティックスからなる群の１種又はそれ以上から選択される物質をさらに含有してなる請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに１種又はそれ以上の微量成分を約0.001〜1.0重量％の範囲内の濃度で含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗原をアジュバントに結合する架橋剤をさらに含有してなる請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
架橋剤がグルタルアルデヒド、カルボジイミド、混成酸無水物及びビスジアゾ化ベンジジンからなる群から選択される化合物からなるものである請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
サポニン、サポニン画分、サポニンの合成画分、ISCOMS、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド及びその類縁体、トレハロースジミコール酸、リポポリサッカライド誘導体並びにサイトカインからなる群から選択されるアジュバントをさらに含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
アジュバントが組成物の約10重量％までの濃度で存在する請求項12に記載の組成物。
【請求項１６】
凍結乾燥される請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
レシチンと重合体とを含有してなるアジュバント。
【請求項１８】
レシチンとアクリル重合体とを含有してなるアジュバントと、抗原とを含有してなるワクチンを製剤し、該ワクチンを粘膜表面に投与することからなるヒト又は動物にワクチンを粘膜から送達させる方法。
【請求項１９】
前記ワクチンを口腔、腸、鼻、膣及び直腸の粘膜表面からなる群から選択される粘膜表面に投与する請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ワクチンを食物又は飲料に入れることによってヒト又は動物に投与する請求項18に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ワクチンを食物又は飲料組成物に約0.0001〜5.0重量％の濃度で投与する請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記ワクチンを食物又は飲料組成物に約0.01〜1.0重量％の濃度で投与する請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワクチンを錠剤、カプセル、顆粒剤、懸濁剤、溶液、坐薬及びトローチからなる群から選択される剤形で投与する請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
前記ワクチンを約0.0001〜5.0重量％の濃度で投与する請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ワクチンを注射剤で投与する請求項18に記載の方法。
【請求項２６】
前記ワクチンを約0.2〜2.0重量％の濃度で投与する請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
レシチンと重合体とを食塩水又は水に水和し；次いでレシチンと重合体とを混合してアジュバントを形成することからなるアジュバント組成物の製造方法。
【請求項２８】
レシチンと重合体とをブレンダーに入れることにより混合する請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
レシチンと重合体とを界面活性剤の存在下で混合する請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記アジュバントをマイクロ波又は高圧滅菌処理する工程をさらに有する請求項27に記載の方法。
【請求項３１】
乾燥レシチン約0.001〜10重量％と重合体約0.001〜10重量％とを水和する請求項18に記載の方法。
【請求項３２】
抗原を加える工程をさらに有する請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
抗原を水和工程中に加える請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
抗原を前記アジュバントに加える請求項33に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ワクチンを粘膜表面に送達する、例えば経口又は鼻内投与するための組成物及び方法に関する。また、本発明は、抗原を用いて注射剤として局所又は非経口投与し得る。さらにまた、本発明は、レシチンと、アクリルの重合体又は共重合体とを含有してなる組成物であって、抗原を胃中での分解から保護し、該ワクチン抗原を粘膜表面に吸着させ、その下にある粘膜リンパ組織への該ワクチン抗原の浸透を高めるのに有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンの粘膜送達は、ワクチン抗原を粘膜表面やその下にある粘膜リンパ組織に効果的に送達させることに関連した問題があるために十分に利用されていない。粘膜表面は多数の感染性因子の侵入口であることから(Sabin, A.B., Vaccination at the portal of entry of infectious agents. Dev. Biol. Stand., 33:3-9, 1976)、動物の健康には前記の侵入口において強力な感染防御抗体及び細胞性免疫応答を発現させる(develop)ことが重要である。これは、ワクチン抗原を口腔、腸、鼻、直腸又は膣のいずれかの粘膜を標的とするワクチン送達システムを用いて最もよく行われる。これは、通常は注射可能なワクチンを用いて行われないことから、ワクチンを上記の粘膜表面に吸着させ、次いで吸収に続いて粘膜関連リンパ組織と接触するであろうワクチンアジュバント送達組成物を手に入れることが都合がよい。
【０００３】
例えば、腸病原体に対するワクチンの経口投与は、粘膜部位において分泌性免疫グロブリンＡ抗体の産生を誘発させることによりかかる病原体に対してより強い免疫応答を生じさせ得る。これは、ワクチンを消化管関連リンパ組織に提示した場合に生じる〔O'Hagen, D, Oral Delivery of Vaccines: Formulation and Clinical Pharmacokinetic Considerations 1992, Clin. Pharmacokinet., 22(1): 1-10〕。同様に、上部呼吸器病原体に対するワクチンの投与は、口腔又は鼻腔の粘膜関連リンパ組織に送達させた場合に最も効果的であり得る。興味深いことには、抗原の投与は、抗原施用の部位、例えば口腔粘膜においてばかりではなく、鼻粘膜などのその他の粘膜部位においても粘膜の免疫応答を誘発する〔Mestecky, JI, The Common Mucosal Immune System and Current Strategies for Induction of Immune Response in External Secretions. J. Clin. Immunol., 7 (4): 265-76〕。
【０００４】
多数の動物、例えば牛、豚及び家禽などの多数の動物のワクチン接種は、極めて骨の折れることであり、しかも費用がかかる。それぞれの個々の動物は、ワクチンを注射するためにはワクチン接種の時に処理しなければならない。ほとんどの場合、ワクチンは、動物に少なくとも２回投与しなければならなし、場合によっては３回又はそれ以上投与しなければならない。ワクチンを多数の動物に食物又は水と同時に投与できる場合には、時間と費用の点で都合がよいであろう。
【０００５】
ワクチンを粘膜表面に標的とする別の利点は、ワクチンが、非経口投与されるワクチンを妨害する循環抗体の存在下で、感染防御免疫応答を刺激することができることである〔Periwal, SB, et. al., Orally administered microencapsulated reovirus can bypass suckled、neutralizing maternal antibody that inhibits active immunization of neonates.  J. Virol., 1997 (Apr 71(4)): 2844-50〕。
【０００６】
ワクチン抗原に対する動物の免疫応答を高めるためのアジュバント系は、当該技術において周知である。同様に、粘膜表面にワクチンや薬物を送達するための系が、当該技術において周知である。ワクチンや薬物を胃酸及び消化酵素による分解から保護するために及び抗原を粘膜表面に吸着させるために、種々の方法が報告されている。これらのアジュバント及び送達系(system)は、抗原を１種又はそれ以上の成分と混合することを含む。
【０００７】
従来のアジュバントの例としては、下記の例が挙げられる。
1990年４月17日付け発行のSpeakerらの米国特許第4,917,892号明細書には、溶解又は分散した活性剤を含有する粘稠性担体と、半透性の異方性塩フィルム内にマイクロカプセル化した活性剤とを含有してなる局所送達システムであって、前記の半透性の異方性塩フィルムが、a)水性媒体中の部分親油性、部分親水性の多官能性ルイス酸又はその塩、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸のアルカリ金属塩又は架橋ポリアクリル酸／ポリオキシエチレンと、b)ルイス塩基用の水不混和性で微極性の有機溶媒中のルイス塩基又はその塩、例えば塩化ベンザルコニウム及びピペリジンとの反応生成物である局所送達システムが記載されている。
【０００８】
1992年７月21日付け発行のSpeakerらの米国特許第5,132,117号明細書には、水溶性及び親水性の高分子ルイス酸又はその塩の水溶液と、親油性のルイス塩基又はその塩の非水溶液とからなるエマルジョンの界面反応生成物から形成されるマイクロカプセルであって水性コア、カプセルの(capsular)イオン性の安定化させた異方性ルイス塩膜を有するマイクロカプセルが記載されている。例えば、前記のルイス塩基はステアリルアミン、ピペリジン又は塩化ベンザルコニウムであり得、またルイス酸はカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、又はポリアクリル酸／ポリオキシエチレン共重合体であり得る。
【０００９】
1988年４月26日付け発行のYukimatsuらの米国特許第4,740,365号明細書には、口腔の粘膜に施用できる徐放性製剤が記載されている。該製剤は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、アルギン酸又はその塩、及び無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの交互共重合体の中から選択される１種又はそれ以上の重合体からなる重合体成分(A)と、ポリアクリル酸及びその塩の中から選択される１種又はそれ以上の重合体からなる重合体成分(B)との混合物中の有効成分からなる。重合体成分(A)と(B)は、重量比で95：５〜５：95である。該製剤は、有効成分の層をなし、しかも場合によっては慣用の担体及び添加剤を有していてもよい。
【００１０】
1995年９月19日付け発行のGombotzらの米国特許第5,451,411号明細書には、陽イオン性治療剤の送達システムであって、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルが経口送達用の徐放性組成物を得るために前記治療剤及びポリアクリル酸の存在下で架橋されている送達システムが記載されている。
【００１１】
1994年10月４日付け発行のBowersockらの米国特許第5,352,448号明細書には、腸関連リンパ組織における免疫応答を刺激するためのヒドロゲルマトリックス中の酵素分解性抗原を含有してなる経口ワクチン製剤が記載されている。前記のヒドロゲルペレットは、メチレンビス-アクリルアミド及び過硫酸アンモニウム及び亜硫酸水素ナトリウム塩の存在下でメタクリル酸を重合することによって合成することが好ましい。
【００１２】
1997年10月７日付け発行のBowersockらの米国特許第5,674,495号明細書には、アルギン酸ゲルを離散粒子の形態で含有してなる経口投与用ワクチン組成物が記載されている。アルギン酸ゲルは、安定性を高めるために及び陽電荷を表面に付加するためにポリ-l-リシンなどの重合体被膜を有していてもよい。
【００１３】
1990年７月31日付け発行のBrownらの米国特許第4,944,942号明細書には、馬用の鼻内ワクチンであって、アジュバントとして、Carbopol 934Pとして販売されているポリアクリル酸架橋ポリアリルスクロースを、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート及びソルビタンモノラウレートと組み合わせて、好ましくは製剤の全重量を基準として7.5〜15容量％含有してなる馬用の鼻内ワクチンが記載されている。
【００１４】
1996年３月19日付け発行のAndrianovらの米国特許第5,500,161号明細書には、実質的に水不溶性の非イオン性又はイオン性重合体を、送達すべき物質をも溶解、分散又は懸濁する水溶液に分散し、次いで該重合体を前記物質と一緒に衝撃力によって凝結させて微粒子を形成することを含む微粒子の製造方法及びその生成物が記載されている。別法として、前記微粒子は、電解質、pH変化、低濃度の有機溶媒又は温度変化を使用することにより水性高分子分散物を凝結させて生物学的材料をカプセル化する重合体マトリックスを形成することによって形成される。
【００１５】
2000年１月18日付け発行のSeeらの米国特許第6,015,576号明細書には、抗原を含有する凍結乾燥多重膜リポソームであって、該リポソーム製剤がピルの形態で含有されるか又は腸溶性カプセル内に含有されているものである凍結乾燥多重膜リポソームを経口投与することからなる方法が記載されている。かかる腸溶コーティングは、アクリル重合体及び共重合体からんるものであってもよい。
【００１６】
1998年９月22日付け発行のTiceらの米国特許第5,811,128号明細書には、有効量の生物活性剤を生体適合性賦形剤にマイクロカプセル化して約10μm未満の大きさをもつマイクロカプセルを形成し、次いで該マイクロカプセルの有効量を動物に投与する工程を伴う生物活性剤を動物に送達するための方法及び組成物が記載されている。拍動応答 並びに粘膜及び全身免疫が得られる。上記の生体適合性賦形剤は、ポリ(DL-ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリ酸無水物並びにこれらの混合物からなる群から選択される。
【００１７】
1996年10月15日付け発行のRijkeの米国特許第5,565,209号明細書には、注射ワクチン用のアジュバント構成成分としてリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンポリオールとアクリル酸重合体とを含有してなる油無含有ワクチンが記載されている。
【００１８】
1992年１月28日付け発行のKullenbergの米国特許第5,084,269号明細書には、鉱油などの非食用油及び大豆油などの可食性トリグリセリド油からなる群から選択し得る担体と組み合わせたレシンチンからなる注射ワクチン用アジュバントが記載されている。
【００１９】
1991年６月25日付け発行のRijkeの米国特許第5,026,543号明細書には、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンポリオール及びアクリル酸重合体をアジュバント構成成分として含有する油無含有ワクチンが記載されている。
【００２０】
1995年９月19日付け発行のGombotzらの米国特許第5,451,411号明細書には、陽イオン性治療剤を小腸の管腔部位に指向させるために設計された陽イオン性治療剤用の部位特異的経口送達システムとしてのアルギン酸塩ビーズが記載されている。前記のアルギン酸塩から、放出される治療剤の高められた生物活性は、酸処理したアルギン酸塩の低分子量断片との相互作用から前記治療剤を保護するポリアクリル酸の能力によるものである。
【００２１】
1996年10月22日付け発行のCollinsの米国特許第5,567,433号明細書には、様々な生物学的活性物質をカプセル化し、送達するのに有用なリポソームを製造する方法が記載されている。この方法は、有機溶媒又は界面活性剤(detergent)の不存在下でリポソーム分散物を形成し、凍結及び融解のサイクルを１回又は数回行い、次いで脱水して脂質粉末を形成することを伴う。該粉末は生物学的活性物質の存在下で水和されて該物質をリポソーム中にカプセル化する。
【００２２】
1992年２月25日付け発行のHaynesの米国特許第5,091,188号明細書には、水不溶性薬物がリン脂質被覆微細結晶の水性懸濁物として製剤化することによって注射可能になることが記載されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、これまでよりも単純な組成物及びこれまでよりも容易な製剤方法を提供し且つこれまでよりも容易な送達(delivery)を提供することによって従来技術において認められていた問題を解決する。
【００２４】
従って、本発明の主な目的は、新規なワクチン送達システム(system)及びアジュバントを提供することにある。
【００２５】
本発明の別の目的は、ワクチンの粘膜送達に特に有用なワクチンアジュバントを提供することにある。
【００２６】
本発明の別の目的は、ワクチンを動物の餌又は水に投与することを可能にするワクチンアジュバントを提供することにある。
【００２７】
本発明のさらに別の目的は、多数の動物に実質的に同時に都合よく投与し得るワクチンアジュバントを提供することにある。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、抗原をワクチン送達システムに組みこむ方法であってワクチンエピトープに対する損傷が最小限である方法を提供することにある。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、高められた温度又は有機溶媒又はデタージェントすなわち界面活性剤などの過酷な条件を必要としないワクチン送達システムを製造する簡単な方法及び手段を提供することにある。
【００３０】
これらの目的及びその他の目的、特徴及び利点は、以下の記載及び本発明の特許請求の範囲を検討した後に明らかになるであろう。
【００３１】
発明の要約
本発明は、レシチンと重合体（これはアクリル重合体又は共重合体であることが好ましい）とを含有するアジュバント組成物を記載する。好ましいアクリル重合体はポリアクリル酸重合体である。
【００３２】
前記のレシチンと重合体は、ワクチン抗原を捕捉又は封入するのに有効なマトリックス又は網状構造を形成する。また、前記のレシチンと重合体との組み合わせの強い粘膜付着性及び吸着性は、ワクチン抗原の粘膜表面に対する吸着を高める。また、レシチン組成物は、抗原が下層のリンパ組織と接触することを促進する吸収を高める〔Swenson、ES and WJ Curatolo, (著作権) Means to Enhance Penetration (2) Intestinal permeability enhancement for proteins, peptides and other polar drugs: mechanisms and potential toxicity. Advanced Drug Delivery Reviews. 1992.8: 39-92〕。
【００３３】
本発明のアジュバント組成物は、粘膜表面、例えば口腔、腸、鼻、直腸又は膣の表面を介してワクチン接種することを可能にする。ワクチンは、ピル又は錠剤の形で、ペーストの形で投与してもよいし、あるいは点滴注入器又は無針注射器を使用して液状で投与してもよい。このアジュバント組成物は、食物、餌及び／又は水を介してワクチン接種する方法を可能にする。この組成物は、また注射剤として慣用し得る。本発明は該組成物を調製する方法及び使用する方法を提供する。
【００３４】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、抗原又はハプテンと混合し、ヒト又は動物に投与した際に、抗原を単独で投与する場合よりも抗原に対して強い免疫応答を生じるであろうワクチンアジュバントを記載する。本発明はまた、抗原又は抗原群と、新規アジュバントであって本明細書に記載のレシチンと重合体（これはアクリル重合体であることが好ましい）の組み合わせからなるアジュバントとを含有してなるワクチンも包含する。本発明はまた、該ワクチンの調製方法及び使用方法からなる。
【００３５】
本発明は、ワクチンを粘膜表面に直接に施用することを可能にするという利点を提供する。その際に、前記ワクチンは、例えば新生児又は乳児に存在し得る母性抗体の循環に関する妨害を防止するのに役立つ感染防御免疫応答を刺激する。
【００３６】
“抗原”とは、本明細書では、動物又はヒトに導入した場合に抗体及び細胞性免疫の形成をもたらすであろう化合物として定義する。
【００３７】
“アジュバント”とは、本明細書では、製剤に特異ワクチン抗原と組み合わせて使用した場合に、得られる免疫応答を増強するか、あるいは部分的に変化させるか又は変性する１種又は複数の化合物として定義する。
【００３８】
“ワクチン”とは、本明細書では、通常は変性された生の(modified-live)(すなわち弱毒化)感染因子又は不活性化感染因子あるいは該感染因子のある部分からなる抗原部分の組成物であって、ほとんどの場合にアジュバントと共に体内に投与されて能動免疫を生じる抗原部分の組成物として定義する。
【００３９】
本発明で使用する抗原は、前記の定義の範囲に入る所定の抗原であり得る。抗原は商業的に入手できるし又は当業者は該抗原を生産できる。本発明のワクチンを構成する抗原部分は、変性された生の微生物又は不活性化微生物であるか、あるいは微生物又は他の細胞から精製された天然産物、例えば腫瘍細胞、合成物質、遺伝子組換えタンパク質、ペプチド、ポリサッカライド又は同様の産物、あるいはアレルゲンであることができるが、これらに限定されない。抗原部分はまた、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド又は同様の産物のサブユニットであることができる。抗原はまた、遺伝子抗原、すなわち免疫応答を生じるDNA又はRNAであってもよい。本発明に従って使用できる代表的な抗原としては、自己免疫疾患、ホルモン、又は予防用又は治療用ワクチン及びアレルゲンに使用し得る腫瘍抗原の他にウイルス、細菌、真菌、寄生動物 及びその他の感染因子から誘導される天然、組換え又は合成物質が挙げられるが、これに限定されない。ウイルス又は細菌の産物は、酵素切断によって製造される有機体の成分であり得るし又は当業者に周知の組換えDNA技術によって製造された有機体の成分であり得る。本発明の性質及びその送達の様式により、本発明はまたホルモン、抗生物質及び抗ウイルス剤などの薬物の送達システムとしても機能することが考えられる。
【００４０】
本発明で使用するレシチンは、任意のレシチンであるか、又は例えばリポソームを形成するのに使用できるレシチン脂質材料、例えばホスファチジルコリンである。リン脂質、リゾリン脂質、糖脂質及び中性脂質は、レシチンの典型的な組成物を構成する。レシチンは、完全に加水分解した場合に、脂肪酸２分子とグリセリン、リン酸及び塩基性窒素化合物（これは通常はコリンである）それぞれ１分子とを生成する分子である。加水分解でレシチンから得られる脂肪酸は、通常はオレイン酸、パルミチン酸及びステアリン酸であるが、これらに限定されない。リン酸は、グリセリンにα-位又はβ-位で結合してα-グリセロリン酸又はβ-グリセロリン酸それぞれを形成し得るし、しかもα-レシチン及びβ-レシチンとして知られている対応する一連のレシチンを生成し得る。
【００４１】
市販のレシチンは、卵黄、脳組織又は大豆から抽出法によって得られる。卵由来のオボレシチンン(ビテリン)及び大豆由来の植物レシチン、並びに子ウシの脳由来の精製レシチンは、食物及び医薬製剤において乳化剤、酸化防止剤及び安定剤として使用されている。市販のレシチンは、種々様々な起源、例えばセントラル・ソーヤ(Central Soya)社（米国インディアナ州フォートウェーン所在）から入手し得る。当業者は、所定の用途に適切なレシチンを決定できるであろう。
【００４２】
前記の重合体はアクリル重合体であることが好ましく、該アクリル重合体はアクリル部分を含有する任意の重合体又は共重合体である。適当なアクリル重合体の例としては、ポリアクリル酸、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、アクリル酸エステル、アクリロニトリル及びポリアクリル酸アルキルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。アクリル共重合体の例は、ポリ(アクリルアミド-コ ブチルメタクリレート)、アクリル-メタクリル酸、アクリル-アクリルアミド及びポリ(メタクリレート)であるが、これらに限定されない。商業的に入手し得るアクリル重合体の例としては、Carbopol（米国オハイオ州クリーブランド所在のB.F. Goodrich Co.製）、Carboset (米国オハイオ州クリーブランド所在のB.F. Goodrich Co.製)、Neocryl（米国デラウエア州ウィルミントン所在のAvecia Inc.製）及びEudragit（米国マサチューセッツ州モールデン所在のRohm Tech. Inc.製）が挙げられる。
【００４３】
ある種のアクリル重合体、例えばCarbopolやEudragitは、重合体を結合するのに有効な架橋剤、例えばポリアルケニルポリエーテル又はアルキルスクロースを含むという恩恵を享受し得る。Carbopol と Eudragit の両方は、ポリアルケニルポリエーテル又はアルキルスクロース架橋剤を含有する市販製剤に利用できる。本発明で使用する最も好ましいアクリル重合体は、ポリアルケニルポリエーテル架橋剤を有するか又は有しないポリアクリル酸 (Carbopol)である。当業者は所定の用途に適切なアクリル重合体を決定できるであろう。
【００４４】
適当な非アクリル重合体の例は、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリオキシエチレンである。
【００４５】
本発明のアジュバントの製造方法は、最初に、乾燥レシチン約0.0001〜10％(重量／容量)と重合体約0.0001〜10重量％／容量を食塩水又は水に懸濁することによって水和することを伴う。レシチンと重合体の好ましい濃度は、それぞれ0.001〜1.0％(重量／容量)である。上記の２つの成分は、例えばワーリングブレンダー、乳化装置又は微細流動化装置などの慣用の方法を使用して一緒に混合し得る。界面活性剤（乳化剤）を添加してレシチンと重合体の混合又は乳化を促進させてもよい。適当な合成界面活性剤(detergent）は、当業者には周知である。適当な界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノタウレート、ステアリン酸ナトリウム、非イオン性エーテル架橋界面活性剤、例えばLaureth(登録商標)４ 及び Laureth(登録商標)23、アルキルサルフェート系界面活性剤、アルキルアルコキシル化サルフェート系界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルカンスルホネート、オレフィンスルホネート、スルホン化ポリカルボン酸、アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールサルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルサルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イソチオネート例えばアシルイソチオネート、N-アシルタウレート、メチルタウリド(tauride)の脂肪酸アミド、アルキルスクシネート及びスルホスクシネート、スルホコハク酸のモノ及びジエステル、N-アシル サルコシネート、アルキルポリサッカライドのサルフェート、分岐第一級アルキルサルフェート、アルキルポリエトキシカルボキシレート、並びにイセチオン酸でエステル化された脂肪酸及び水酸化ナトリウムで中和された脂肪酸が挙げられる。  別の例は、Surface Active Agents and Detergents (Vol. I and II by Schwartz、Perry and Berch)に記載されており、その記載は本明細書で参照される。適当な非イオン性デタージェント界面活性剤は、1975年12月30日付け発行のLaughlinらの米国特許3,929,678号明細書第13欄の第14行〜第16欄第６行に記載されており、その記載は本明細書で参照される。乳化剤は、含有される場合には、混合物の容量で約0.001〜0.05％の範囲の濃度で添加されるべきである。
【００４６】
本発明それ自体がアジュバント特性を有するが、他のアジュバント、例えばサポニン、サポニン画分、サポニンの合成成分、ISCOMS、ムラミルジペプチド及びその類縁体、プルロニック(pluronic)ポリオール、トレハロースジミコール酸、アミン含有化合物、サイトカイン及びリポポリサッカライド誘導体（これらに限定されない）と組み合わせて使用してもよい。別のアジュバントの添加は、粘膜免疫応答の刺激を促進し得る。追加のアジュバントは、含有される場合には、組成物の約10重量％までの濃度で存在させてもよいが、約１重量％未満の濃度が好ましい。
【００４７】
本発明はまた、１種又はそれ以上のプロバイオティックスを含有していてもよい。プロバイオティックスは、ヒト又は動物の健康に有益な細菌又は微生物である。一般に使用されるプロバイオティックスの例としては、ラクトバシラス（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）などの種々の有益な菌株が挙げられるが、これらに限定されない。存在する場合には、前記の微生物のそれぞれは、約103〜108 CFUの範囲の濃度で投与されるべきである。
【００４８】
前記の全ての成分の他に、当業者に十分に理解されるように、製薬学的に及び／又は化粧料的に優れた基剤組成物を調製するために他の少量成分を使用できる。例えば、染料を極めて低い濃度で、アルコールなどの缶希釈剤、緩衝液、安定剤、湿潤剤、溶解剤、着色剤などのように加えることができる。上記の濃度よりも高い濃度で使用される希釈剤を除いて、これらの微量成分の濃度は一般に0.001重量％〜1.0重量％である。
【００４９】
所望ならば、前記の種々のアジュバント成分は、水和工程の前に高圧滅菌によって滅菌してもよい。前記の諸成分を高圧滅菌及び／又はマイクロ波処理すると、これらの成分の懸濁能を向上させ得ることも認められている。ワクチン抗原は、アジュバントの形成後に加えてもよいし 又はアジュバント成分の水和の時点で加えてもよい。錠剤の形の場合には、抗原は、アジュバント発明の乾燥成分と錠剤形成に必要な他の賦形剤と共に混合し得る。ワクチン抗原の適切な種類の例としては、不活化又は弱毒化した細菌、ウイルス、寄生動物又はこれらの生物のサブユニット、あるいはゲノムワクチン抗原、例えばDNAが挙げられる。
【００５０】
前記の成分、例えば抗原の相対濃度は、製剤を動物において製剤を低用量で用いて試験を開始し、次いでし免疫応答を監視しながら用量を大きくすることによって決定し得る。最適用量を決定する場合には、例えば血統、年齢、大きさ及び妨害母性抗体の有無を考慮すべきである。
【００５１】
弱毒化ウイルスワクチンの濃度は、動物当たり約10s〜109 TCID50である。その量は動物当たり約104〜107 TCID50であるのが好ましい。不活化抗原又はサブユニット抗原の濃度は、抗原のナノグラム〜ミリグラム量の範囲であり得、約１μg〜１mgが好ましい。
【００５２】
アクリル重合体とレシチンとを組み合わせると、マトリックス又は網状構造が形成される。レシチンと重合体の比は１：1000 〜 1000：１の比である。レシチンと重合体との好ましい比は１：10 〜 10：１である。レシチンとアクリル重合体の相対比は、種々の抗原、すなわち細菌、ウイルス、寄生動物又はこれらの生物のサブユニットの送達の効率に重要であると認め得る。最適比は、動物において所定の抗原を用いてレシチンと重合体の種々の比を試験する慣用の手段で決定し得る。
【００５３】
本発明のアジュバント組成物は、粘膜表面、例えば口腔、腸、鼻、膣及び直腸の表面へのワクチン抗原、例えば完全不活化又は弱毒化したウイルス、細菌又は寄生動物ワクチン抗原あるいはかかる生物のサブユニットの送達に使用できる。電子顕微鏡による評価は、レシチンと重合体の間に物理的及び／又は化学的親和性が存在することを示す。この親和性又は関連性はマトリックス又は網状構造として現われる。特定の理論に束縛されることを意図することなく、このような構造は、ワクチン抗原を物理的に捕捉又は封入する手段として機能し得ると考えられる。抗原のかかる結合は、電荷並びに本発明のレシチン及びアクリル重合体の親水性及び疎水性によってさらに高められる。これを促進するために、種々の電荷をもつ重合体が抗原の陰イオン性又は陽イオン性に応じて選択し得る。同様に、種々の疎水性をもつ重合体とレシチンが抗原の親油性又は親水性に応じて選択し得る。
【００５４】
必要又は所望ならば、抗原は、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を約１〜50mM、好ましくは約15mMの濃度で用いてレシチン-アクリル重合体マトリックスに連結し得る。また、抗原は、水溶性カルボジイミドを約0.05〜0.5 Mの濃度（約0.1 Mが好ましい）で用いて連結し得るし、又はN-ヒドロキシスクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP) などの異種機能試薬を約0.1〜1.0mMの範囲の濃度、好ましくは約0.2mMの濃度で使用する連結法を用いて連結し得る。その他の適当な連結剤としては、混成酸無水物及びビスジアゾ化ベンジジンが挙げられる。架橋剤は、アジュバント組成物、例えばその成分が互いに対して電気的に引き付けられていないものであるアジュバント組成物の成分の結合親和性を高めるのに使用される。
【００５５】
アクリル酸／レシチンの組み合わせの強い粘膜付着性及び吸着性もまた、それを粘膜表面に対するワクチン抗原の吸着を促進するための優れたメカニズムにする。アジュバント送達システムの吸収増強特性は、ワクチン抗原が粘膜関連リンパ組織と接触するのを促進する。従って、感染症及び／又は疾患プロセスから動物を保護することにおいて促進するであろう免疫応答を生じる。強い粘膜免疫応答は、大部分の感染性疾患を引き起こす生物が動物に粘膜表面で侵入を獲得することから、重要である。本発明はまた注射可能なワクチン用のアジュバントとしても使用できる。
【００５６】
アジュバントを含有してなるワクチンは、直接施用、口腔からの摂取、挿入、注射によって及び当該技術において知られている慣用の手段によって粘膜表面に送達される。別法として、アジュバントは、慣用の注射剤（これは典型的には溶液又は懸濁液である）として投与してもよい。食物、餌又は飲料担体中に投与する場合には、本発明のアジュバント／ワクチン組成物は、一般に前記担体組成物に飲料担体の場合には約0.0001〜10％〔重量／用量(w/v)〕の範囲の濃度で且つ食物、餌担体の場合には重量／重量(w/w)で約0.0001〜10％の範囲の濃度で含有され、それぞれ約0.01〜1.0％(w/v又はw/w)が好ましい。注射剤で投与される場合には、アジュバント／ワクチン組成物は、約0.02〜2.0重量％の範囲で存在させるべきであり、約0.1〜0.5重量％が好ましい。
【００５７】
また、アジュバント／ワクチンは、他の慣用の固体剤形で、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ及び膣又は直腸坐薬で投与し得る。アジュバント／ワクチン組成物は、固体剤形で投与される場合には、固形剤形の0.0001〜10重量％を構成すべきであり、約0.01〜1.0重量％が好ましい。
【００５８】
活性化合物のほかに、本発明の医薬組成物は、活性化合物を製薬学的に使用できる製剤に加工することを促進する適当な賦形剤及び補助剤を含有していてもよい。経口製剤は、錠剤、カプセル剤及び顆粒剤を包含する。直腸投与できる製剤としては、坐薬が挙げられる。その他の製剤としては、非経口投与又は経口投与に適した溶液及び頬に又は舌下に投与できる組成物が挙げられる。
【００５９】
本発明の医薬製剤は、当業者にそれ自体周知の方法で製造される。例えば、本発明の医薬製剤は、慣用の混合法、造粒法、溶解法及び凍結乾燥法によって製造し得る。使用すべき方法は、究極的には使用する有効成分の物性に左右されるであろう。
【００６０】
適当な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖、例えばラクトース又はスクロース、マンニトール又はソルビトール、セルロース調剤及び／又はリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム、並びに結合剤、例えばデンプン、ペースト、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプンを使用するペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドンである。所望ならば、崩壊剤、例えば前記のデンプン類、及びカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてもよい。補助剤は流動調節剤及び潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸又はその塩、例えばステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び／又はポリエチレングリコールである。経口製剤は、所望ならば胃酸に耐性であり得る適当な被膜を有していてもよい。
【００６１】
このためには、濃厚な糖溶液を使用してもよく、該濃厚な糖溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適当な有機溶媒又は溶媒混合物を使用してもよい。胃酸に耐性の被膜を製造するためには、例えば種々の組み合わせの化合物量を確認又は特定するために、適当なセルロース調剤、例えばアセチルセルロースフタレート又はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、染料及び顔料の溶液を錠剤被膜に加えてもよい。
【００６２】
経口使用できる別の医薬製剤としては、ゼラチン製の押出し(push-fit)カプセル、並びにゼラチンと可塑剤、例えばグリセリン又はソルビトールとから調製される密封軟カプセルが挙げられる。押出しカプセルは、活性化合物をラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに場合によっては安定剤と混合されていてもよい顆粒の形態で含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物は、適当な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン又は液状ポリエチレングリコールに溶解又は懸濁することが好ましい。また、安定剤を加えてもよい。直腸に使用できる可能な医薬製剤としては、例えば活性化合物と坐薬基剤との組み合わせからなる坐薬が挙げられる。適当な坐薬基剤は、例えば、天然又は合成トリグリセリド、パラフィン系炭化水素、ポリエチレングリコール又は高級アルカノールである。また、活性化合物と基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。可能な基剤としては、例えば液状トリグリセリド、ポリエチレングリコール又はパラフィン系炭化水素が挙げられる。
【００６３】
非経口投与に適した製剤としては、水溶性又は水分散性の活性化合物の水性溶液が挙げられる。また、適当な油性注入懸濁液として活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適当な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリドが挙げられる。水性注入懸濁液は、該懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有していてもよい。かかる組成物はまた、補助剤、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有していてもよい。また、かかる組成物は、例えば細菌保持性フィルターを通して濾過することによって、又は該組成物に殺菌剤を配合することによって滅菌し得る。かかる組成物はまた、投与前に滅菌水、食塩水、又はその他の注射媒体に溶解又は懸濁することができる滅菌固体組成物の形態で製造できる。
【００６４】
慣用の担体を用いる投与の他に、当業者に知られている種々様々な専門的薬物送達法、例えば携帯用薬物注入ポンプによって有効成分を投与してもよい。
【００６５】
本発明のレシチン／重合体アジュバントは、食物、餌及び水に経口により送達される場合には多機能を果たす：すなわち、本発明のアジュバントは、前記の２つの成分のアジュバント特性により、1)ワクチン抗原を胃酸及び消化酵素による分解から保護し； 2)抗原を粘膜表面に運搬し； 3)粘膜表面へのワクチン抗原の吸着を促進し； 4)ワクチン抗原の吸収を高め；且つ 5)ワクチン抗原に対する免疫応答を高める。鼻、口腔、膣及び直腸の粘膜への送達の場合には、本発明のレシチン／アクリル重合体複合体は、抗原を粘膜表面に送達及び吸着させるためのシステムとして機能する。粘膜表面に吸着し、吸収されると免疫応答が生じる。
【００６６】
本発明の重合体とレシチンとの組み合わせは、意外にもワクチン抗原用の改良されたワクチン送達システムを提供する。本発明はまた薬物、例えばホルモン、抗生物質及び抗ウイルス剤用の改良された送達システムであることは明らかである。本発明は、抗原を送達システムに組みこむ簡単で効率的な方法であって、ワクチンエピトープに対する損傷が全くないか又は最小限である方法を提供する。該ワクチン製剤は低コストで行い得、しかも食物、餌又は水の添加剤としてあるいは経口用ペースト又は錠剤として容易に商業化し得る。これらの製剤はまた、抗原を他の粘膜表面、例えば鼻、直腸及び膣の粘膜表面に送達するのに有効であり且つ注射ワクチン用のアジュバントとして有効であることが理解されるべきである。また、粘膜表面に対するアジュバント及びワクチン抗原の吸着を促進する疎水性もまた、動物用飼料が疎水性のワックス表面をもつ植物の葉又は種子であるか否かにかかわらず動物飼料に施用する手段を提供する。
【００６７】
本発明は、レシチンと、アクリル重合体又は共重合体との混合物を含有するという点で従来技術と異なる。本発明は、従来技術文献に記載の別のワクチン送達システムよりも優れたある種の利点を提供する。本発明は、物質に悪影響を及ぼす過酷な条件下で、例えば有機溶媒の使用の下では調製されない。本発明は、製造に高められた温度を必要とせず且つ安定化工程を必要としない。本発明は、ワクチンエピトープに対する影響が最小限の抗原を組みこむ簡単な方法を提供する。この簡単な製造方法は低コストと商品化し易さをもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
下記の実施例は、本発明及びその好ましい態様をさらに例証するものである。下記の実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
ワクチンとアジュバントの効果
非生存(non-living)モデル抗原としてウシ血清アルブミンFraction 5(BSA)(Sigma社、米国ミズリー州セントルイス)、レシチン(Centrolex P、Central Soya社、米国インディアナ州フォートウェーン) 及びアクリル酸重合体樹脂(Carbopol 934P、BF Goodrich社、米国オハイオ州クリ−ブランド)を含有する実験ワクチンを調製した。BSAのみを含有する第二のワクチンを調製した。
前記のレシチンとアクリル重合体とを一緒に、リン酸塩緩衝食塩水(PBS) 150ミリリットル(ml)にそれぞれ１ミリリットル(ml)当たり４ミリグラム(mg)の濃度で懸濁した。上記の二つの成分を先ず電磁攪拌棒を用いて攪拌することにより分散し、次いでさらにワーリングブレンダー中で乳化ヘッドを使用して混合した。次いで、得られた混合物を高圧滅菌して該アジュバント混合物を滅菌した。ウシ血清アルブミンをPBSに２mg/mlの濃度で溶解し、フィルター滅菌した。次いで、レシチン/アクリル重合体アジュバント１部をBSA１部と一緒にした。メルチオレート(0.01％)を防腐剤として加えた。ワクチン成分の最終濃度は、レシチン／アクリル重合体については２mg/mlであり、BSAについては１mg/mlであった。
チャールスリバー・ラボラトリー（米国ミシガン州ウィルミントン所在）産の体重約18gのCF-１雌性マウスの鼠径部に、ワクチン(BSA 0.1mg／投与量) 0.1mlを０日目及び21日目に皮下注射した。45日目に、すなわち２回目のワクチン接種後24日目に、マウスから採血した。マウスは、頚部脱臼により安楽死させた後に上腕動脈を切断することによって出血させた。
血清免疫グロブリンＧ(IgＧ)抗BSA抗体力価を、酵素結合免疫検定法(EL1SA)によって測定した。結果を表１に示す。
【００７０】
2004534798.tif 000002
結果は、レシチンとアクリル重合体の組み合わせが実際に抗原に対する免疫応答を高めることを示している。
【００７１】
実施例２
経口投与した個々のワクチンアジュバントの比較
経口経路による送達用の複数の実験ワクチンをPBS中で調製した。得られたワクチンは抗原BSA Fraction 5を１ml当たり400マイクログラム(μg)の濃度で含有していた。ワクチン１は、アジュバントを含有せず、BSAだけを含有していた。ワクチン２は、レシチン Cerrtrolex P ３mg/mlと混合したBSAからなっていた。ワクチン３は、アクリル重合体Carbopol 934P ３mg/mlと混合したBSAからなっていた。ワクチン４は、レシチン(Centrolex P) ３mg/ml及びアクリル重合体(Carbopol 934P)３mg/mlと混合したBSAからなっていた。混合は先ず実験台上部電磁攪拌棒を用いて行い、次いでワーリングブレンダー中で乳化ヘッドを使用して行った。全てのワクチンにラクトバシラス培養物をワクチン接種の直前に加えた。ラクトバシラスの最終濃度は0.01μg/mlワクチンであった。０日目、４日目、29日目及び33日目に、チャールスリバー・ラボラトリー（米国ミシガン州ウィルミントン所在）産の体重約18gのCF-１雌性マウス群にワクチン0.5mlを注射針で供給することによって経口投与した。53日目に、すなわち４回目のワクチン接種後20日目に、マウスを安楽死させ、上腕動脈から出血させた。終点(end-point)の抗BSA血清IgＧ抗体力価をELISAにより測定した。血清の1/100未満希釈液では非特異的背景色が発色することから、血清の1/100開始希釈液を使用した。結果を表２に記載した。
【００７２】
2004534798.tif 000003
【００７３】
抗BSA IgＧ抗体力価は、レシチンとアクリル重合体との組み合わせをアジュバントとして使用した場合の方がアクリル重合体を単独で使用した場合よりも５倍を超えて高く、またレシチンを単独で使用した場合よりも323倍高かった。これは、リンパ組織によって摂取されるための粘膜表面に抗原を送達する場合において、レシチンとアクリル重合体との組み合わせがレシチン単独又はアクリル重合体単独よりもはるかに効果があることを例証している。マウスの全部が必ずしも血清抗BSA IgＧ抗体応答を示さなかったが、得られた結果は、明らかにアクリル重合体と組み合わせたレシチンの相乗的なアジュバント効果を示している。しかし、セロコンバート(seroconvert)しなかったマウスは分泌性IgＡ抗体応答を有しているかもしれない。実際、経口ワクチン接種及び粘膜ワクチン接種は、一般的に粘膜表面でIgＡ分泌細胞を刺激する。
【００７４】
実施例３
経口経路によるレシチン／重合体アジュバントの第二の試験
抗原BSA Fraction 5を１ml当たり400μgの濃度で含有する２種類のワクチンをPBS中で調製した。一方のワクチンはアジュバントを含有せず、BSAだけを含有していた。他方のワクチンはレシチン(Centrolex P)３mg/mlとアクリル重合体(Carbopol 934P) ３mg/mlとを用いてアジュバント化された(adjuvanted)BSAからなっていた。ワクチンを実施例２に記載のようにして組立てた。０日目、４日目、27日目及び31日目に、チャールスリバー・ラボラトリー（米国ミシガン州ウィルミントン所在）産の体重約18gのCF-１雌性マウス群に、ワクチン0.5mlを注射針で供給することによって経口投与した。52日目、すなわちワクチン接種後21日目に、マウスを安楽死させ、上腕動脈から出血させた。終点の抗BSA血清IgＧ抗体力価をELISAにより測定した。血清の1/100未満希釈液では非特異的背景色が発色することから、血清の1/100開始希釈液を使用した。結果を表３に記載した。
【００７５】
2004534798.tif 000004
【００７６】
この研究もまた、レシチンとアクリル重合体との組み合わせが口腔粘膜表面への抗原の送達において効果があることを例証している。
別の研究において、これと同じワクチンを接種したマウスの4/10は、単回ワクチン接種後６週間目に1/1,345の幾何平均力価を有していた。これは、アジュバント組成物の潜在力(potential)は、一旦最適化されると長期間免疫応答を生じる事を例証している。
【００７７】
実施例４
ワクチンの鼻内投与
抗原BSAを400μg/mlの濃度で含有する鼻内経路による送達用の２種類のワクチンをPBS中で調製した。一方のワクチンはBSAだけからなっていた。第二のワクチンはレシチン(Centrolex P)３mg/mlとアクリル重合体Carbopol 934P ３mg/mlとの組み合わせを用いてアジュバント化したBSAからなっていた。レシチンとアクリル重合体を先ず実験台上部電磁攪拌棒を用いて混合し、次いでワーリングブレンダー中で乳化ヘッドを使用して混合した。次いで、BSAを加え、再度上記の乳化ヘッドを使用して混合した。マウスに０日目及び20日目にワクチン接種した。BSA抗原20μgを含有するワクチン40μgを、マウスの口を閉じながら鼻に入れた。マウスが吸入すると、ワクチンが鼻に入った。41日目、すなわち２回目のワクチン接種後21日目に、マウスを安楽死させ、上腕動脈を切断することにより出血させた。抗BSA血清IgＧ抗体力価をELISAにより測定した。血清の1/100未満希釈液では非特異的背景色が発色することから、血清の開始希釈は1/100であった。結果を表４に示す。
【００７８】
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【００７９】
BSAだけをワクチン接種したマウスはセロコンバートしなかった(0/11)。BSA抗原単独は鼻内投与すると、いずれのマウスでも血清抗体応答を刺激しなかった。これに対して、マウス12匹中７匹、すなわち58％は、BSAをレシチンとアクリル重合体とからなる本発明と組み合わせて用いて鼻内ワクチン接種した後に1/3200程度の高い血清抗BSA IgＧ抗体力価を発現した。マウス全部が必ずしもセロコンバートしなかったという事実は、十分でないか又はおそらくは、ワクチンが1/100よりも高い抗体力価を有していなかったマウスによって吸入されなかったことを示唆している。実際、ワクチンの幾つか、おそらくは大部分が、マウスが息を吐き出した際に、鼻から流れ出ることが観察されるか又は鼻から放出された。さらに、この研究の結果は、レシチンとアクリル重合体からなる本発明がワクチン抗原の鼻内送達用アジュバントとして有効に機能することを示している。
【００８０】
実施例５
豚においてワクチンを用いるアジュバントの使用
レシチン(Centrolex P)２mg/mlと アクリル重合体(Carbopol 934P)２mg/mlとの組み合わせを含有してなるアジュバント発明を、豚用の変性された生の仮性狂犬病ウイルス(ML-PRV)用希釈剤として使用した。このアジュバント希釈剤と、滅菌水からなる対照希釈剤とを使用して凍結乾燥ウイルス(ML-PRV)を再水和した。ML-PRVはワクチン接種の直前に再水和した。６週齢の離乳した子豚10匹の群に、０日目及び21日目にワクチン接種した。抗PRV血清中和抗体について血清学的試験するために、２日目、20日目、28日目及び48日目に血清を採取した。種々のワクチン群の豚の抗PRV抗体応答を表４に示す。
【００８１】
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【００８２】
この研究は、レシチンとアクリル重合体の組み合わせを含有する本発明がML-ウイルスワクチンアジュバントとして機能する（この場合には豚ML仮性狂犬病ワクチンウイルス）ことを示した。ML-PRVに対するウイルス中和抗PRV抗体力価は（これは単独でアジュバントなしで極めて良好な抗原であり、アジュバントなしで商業的に使用される）は、レシチン/アクリル重合体を水に代えて使用した場合に２倍よりも高かった。
【００８３】
特定の組成物、有効性の理論などを挙げて本発明を記載すると、本発明がかかる代表的な具体的態様又は機構によって限定されることを意図するものでないこと、及び添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく改変をなし得ることが、当業者には明白であろう。全てのかかる自明な部分改変及び変化は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内に包含されることが意図される。特許請求の範囲は、特に示さない限りは特許請求した成分及びそこに含まれる目的に合致して有効である任意の配列の工程を保護することを意味する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004534798.tif 000042