(57)【要約】医薬として有用である、配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する、例えばさらに配列中に超可変域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含み、ＣＤＲ１'がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、ＣＤＲ２'がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてＣＤＲ３'がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有する、少なくとも１個の抗原結合部位を含む分子、例えばキメラまたはヒト化抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する、少なくとも１個の抗原結合部位を含む結合性分子。
【請求項２】
ａ）配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する第１ドメイン、および
ｂ）配列中に超可変域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含み、ＣＤＲ１'がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、ＣＤＲ２'がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてＣＤＲ３'がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有する第２ドメイン
を含む、請求項１記載の結合性分子。
【請求項３】
キメラまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１または２のいずれか１項記載の結合性分子。
【請求項４】
配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む、請求項１または２のいずれか１項記載の結合性分子。
【請求項５】
配列番号３のポリペプチドおよび／または配列番号４のポリペプチドを含む、請求項１または２のいずれか１項記載の結合性分子。
【請求項６】
キメラモノクローナル抗体である、請求項４または５のいずれか１項記載の結合性分子。
【請求項７】
配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体である結合性分子。
【請求項８】
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、または
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド
を含むヒト化抗体である結合性分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の結合性分子をコード化するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項２記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をコード化する請求項９記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項２記載のＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号５のポリヌクレオチドおよび／または配列番号６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号７または配列番号８のポリペプチドおよび配列番号９または配列番号１０のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１１または配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチドまたは配列番号１４のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
発現系またはその一部が適合性のある宿主細胞に存在するとき、発現系またはその一部は請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチドを製造し得る、請求項９〜１３のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む発現系。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現系を含む単離宿主細胞。
【請求項１７】
医薬としての請求項１〜８のいずれか１項記載の分子またはヒト化抗体の使用。
【請求項１８】
自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーの処置および／または予防における請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
少なくとも１種の医薬上許容される担体または希釈剤と共に請求項１〜８のいずれか１項記載の分子またはヒト化抗体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか１項記載の分子またはヒト化抗体の有効量を処置および／または予防を必要とする対象に投与することを含む、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに伴う疾患の処置および／または予防方法。
【請求項２１】
薬剤におけるＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢの両方についての結合特異性を有する結合性分子の使用。
【請求項２２】
結合性分子がキメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
結合性分子がＣＤ４５ＲＯイソ型に結合し、その解離定数（Ｋｄ）が＜１５ｎＭである、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
結合性分椎がＣＤ４５ＲＢイソ型に結合し、その解離定数（Ｋｄ）が＜１５ｎＭである、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
結合性分子が、
−ＣＤ４５分子のＡおよびＢエピトープを含むが、Ｃエピトープを含まず、および／または
−ＣＤ４５分子のＢエピトープを含むが、ＡおよびＣエピトープを含まない
ＣＤ４５イソ型、および／または
−ＣＤ４５分子のＡ、ＢまたはＣエピトープのいずれか一つを含まないイソ型
に結合する、請求項２１〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
結合性分子が、
−ＣＤ４５分子のＡ、ＢおよびＣエピトープの全てを含み、および／または
−ＣＤ４５分子のＢおよびＣエピトープの両方を含むが、Ａエピトープを含まない
ＣＤ４５イソ型には結合しない、請求項２１〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
結合性分子がＰＥＥＲ細胞におけるその標的エピトープに結合し、その結合がＫｄ＜１５ｎＭを有する、請求項２１〜２６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物、例えばＣＤ４５抗原イソ型に対する結合性分子、例えばモノクローナル抗体(ｍＡｂ)に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾患の処置における一方法は、病原性白血球の排除または不活化および寛容誘導についての潜在能力による病的免疫応答の不活化の達成である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
臓器、細胞および組織移植拒絶および様々な自己免疫疾患は、主として、抗原−ＭＨＣ複合体形態の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージおよび樹状細胞により捕獲され、処理され、ヘルパーＴ細胞に提示された特異抗原を認識し得るヘルパーＴ細胞により誘発されるＴ細胞性免疫応答の結果である、すなわちヘルパーＴ細胞が特異抗原を認識すると、刺激されてサイトカイン、例えばＩＬ−２を産生し、サイトカインレセプターおよび他の活性化分子を発現またはアップレギュレーションし、増殖させると考えられている。これらの活性化ヘルパーＴ細胞の中には直接的または間接的に作用して、すなわちエフェクター細胞傷害性Ｔ細胞またはＢ細胞を支援して、選択された抗原を発現する細胞または組織を破壊し得るものもある。免疫応答の終結後、成熟クローン選択細胞の中には記憶ヘルパーおよび記憶細胞傷害性Ｔ細胞として残るものもあり、それらは体内で循環し、再び現れた場合抗原を急速に認識する。この応答を誘発する抗原が無害の環境抗原である場合、結果はアレルギーであり、抗原が外来抗原ではなく、自己抗原である場合、それは自己免疫疾患を誘発し得、抗原が移植臓器からの抗原である場合、結果は移植拒絶であり得る。
【０００４】
免疫系が現れて非自己から自己を認識する。この特性は、生物が日常的な病原体の攻撃に曝された環境で生残ることを可能にする。この非自己についての特異性および自己に向かう寛容性は、正および負の選択のプロセスを通じて胸腺におけるＴ細胞レパートリーの発現中に生じ、上記プロセスには自己反応性Ｔ細胞の認識および排除も含まれる。このタイプの寛容は中枢寛容と称される。しかしながら、これらの自己反応性細胞の中には、この選択機構を回避し、自己免疫疾患発現についての潜在的危険を引き起こすものもある。末梢へ逃れた自己反応性Ｔ細胞を制御するため、免疫系は、自己免疫性に対する防御を提供する末梢調節機構を有する。これらの機構は、末梢寛容についての基盤である。
【０００５】
特異的ｍＡｂにより認識される細胞表面抗原は、一般的に、連続国際白血球タイピングワークショップにより割当てられたＣＤ（白血球分化抗原群）番号により示され、本明細書で適用されているＣＤ４５の語は、細胞表面白血球共通抗原ＣＤ４５をいい、その抗原に対するｍＡｂは本明細書では「抗ＣＤ４５」として示される。
【０００６】
白血球共通抗原（ＬＣＡ）またはＣＤ４５は、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）の主成分である。ＣＤ４５は、貫膜チロシンホスファターゼ群に属し、レセプター相互作用によって、細胞活性化の正および負の両レギュレーターとなる。ＣＤ４５のホスファターゼ活性は、ＢおよびＴリンパ球の抗原レセプターに伴うＳｒｃ−ファミリーのキナーゼ類の活性化に要求されると思われる（Trowbridge IS et al.,Annu Rev Immunol．１９９４、１２：８５−１１６）。すなわち、Ｔ細胞活性化では、ＣＤ４５はシグナル１に不可欠であり、ＣＤ４５−欠失細胞は、ＴＣＲ伝達活性化事象において甚大な欠陥を有する。
【０００７】
ＣＤ４５抗原は、一群の貫膜糖タンパク質を含む異なるイソ型で存在する。ＣＤ４５の独特なイソ型は、ＣＤ４５細胞外領域の一部をコーディングする３可変エキソンのオルターナティブスプライシングから生じるそれらの細胞外ドメイン構造が異なる（Streuli MF.et al,J.Exp.Med.１９８７、１６６：１５４８−１５６６）。ＣＤ４５の様々なイソ型は異なる細胞外ドメインを有するが、約３００残基の２つの相同的高度保存ホスファターゼドメインを有する同じ貫膜および細胞質セグメントを有する。異なるイソ型の組合わせは、ＴおよびＢリンパ球の副次集団で差次的に発現される（Thomas ML et al,Immunol.Today１９８８；９：３２０−３２５）。モノクローナル抗体のなかには、種々のイソ型全てに共通のエピトープを認識するものもあれば、それらが認識するオルターナティブスプライシングされたエキソン（Ａ、ＢまたはＣ）により異なる、制限された（ＣＤ４５Ｒ）特異性を有するｍＡｂもある。例えば、その結果としてエキソンＡの生成物を認識するモノクローナル抗体はＣＤ４５ＲＡと称され、エキソンＢを含む様々なイソ型を認識するものはＣＤ４５ＲＢと称されている（Beverley PCL et al,Immunol.Supp.１９８８；１：３−５）。抗体、例えばＵＣＨＬ１は、活性化Ｔ細胞、記憶細胞および皮質胸腺細胞のサブセットに制限されると思われ、Ｂ細胞からは検出されない１８０ｋＤａイソ型ＣＤ４５ＲＯ（可変エキソンＡ、ＢまたはＣのどれも伴わない）に選択的に結合する（Terry LA et al,Immunol.１９８８；６４：３３１−３３６）。
【０００８】
図面の記載
図１は、「候補ｍＡｂ」による一次ＭＬＲの阻害が０.００１および１０μｇ／ｍｌ間の範囲において用量依存的であることを示す。「濃度」は「候補ｍＡｂ」の濃度である。
【０００９】
図２は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１５におけるヌクレオチド配列の配列番号１２（３９２１−４２７４）を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＱのプラスミド地図を示す。
【００１０】
図３は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１６におけるヌクレオチド配列の配列番号１１（３９２１−４２７４）を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＥのプラスミド地図を示す。
【００１１】
図４は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１７におけるヌクレオチド配列の配列番号１４（３９６４−４２８４）を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ｈｕｍＶ１のプラスミド地図を示す。
【００１２】
図５は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１８におけるヌクレオチド配列の配列番号１３（３９２６−４２４６）を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ｈｕｍＶ２のプラスミド地図を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の記載
我々は、以後、「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子」とも称する、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢに結合するポリペプチド配列を含む結合性分子を見出した。本発明によるこれらの結合性分子は、免疫抑制を誘導し、一次Ｔ細胞応答を阻害し、そしてＴ細胞寛容を誘導し得る。さらに、本発明結合性分子は、一次混合リンパ球応答（ＭＬＲ）を阻害する。好ましくはＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子で処理した培養物から誘導された細胞はまた、二次ＭＬＲにおけるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の不存在下でさえ二次ＭＬＲでの充分に機能を果たさない増殖応答を有する。二次ＭＬＲにおける充分に機能を果たさない上記増殖応答は、本発明結合性分子の寛容誘導能力の指標である。さらに、ヒトＰＢＭＣによる注射後に異種ＧＶＨＤを発現している重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子をインビボ投与すると、循環しているヒトＴ細胞は依然としてＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子処理マウスから検出され得るが、対照処理マウスと比べてマウスの生存期間が延長され得る。
【００１４】
「ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子」とは、単独または他の分子と共に、ＣＤ４５抗原のＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ４５ＲＯイソ型に特異的に結合し得る分子を全て包含する。結合反応は標準的方法（定量的検定法）により示され得、例えばあらゆる種類の結合検定法、例えば直接または間接免疫蛍光法を蛍光顕微鏡法または細胞蛍光解析（ＦＡＣＳ）分析と共に行うか、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイが行なわれ、特定ＣＤ４５イソ型を発現する細胞への分子の結合が視覚化され得る。さらに、この分子の結合の結果、これらのイソ型を発現する細胞の機能が改変され得る。例えば、一次または二次混合リンパ球応答（ＭＬＲ）の阻害が測定され得、例えばインビトロ検定法またはバイオアッセイによりＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の存在および不存在下における一次または二次ＭＬＲの阻害が測定され、そして一次ＭＬＲ阻害における差異が測定され得る。
【００１５】
別法として、インビトロ機能変調効果はまた、例えばＭＬＲにおける細胞活性化後、または特異抗原、例えばテタヌス(破傷風)トキソイドまたは他の抗原、またはポリクローナル抗原細胞、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体またはホルボールエステルおよびＣａ２＋イオノホアによる刺激後に、ＰＢＭＣまたはＴ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、サイトカインの生産、細胞表面分子の発現の変化を測定することにより測定され得る。抗原細胞としての同種異系細胞の代わりに可溶性抗原またはポリクローナル抗原細胞、例えば上述のものを使用する以外は、ＭＬＲについて記載した方法と同様にして培養を始める。好ましくは上記要領で３Ｈ−チミジン取込みによりＴ細胞増殖を測定する。好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡによりサイトカイン生産を測定し、その場合、サイトカイン捕獲抗体を９６ウェルプレートの表面でコーティングし、培養物からの上清を加え、１時間室温でインキュベーションし、次に特定サイトカインに特異的な検出性抗体を加えるが、第２工程抗体には酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、次いで対応する基質をコンジュゲートさせておくものとし、そしてプレート読取装置で吸光度を測定する。細胞表面分子の変化は、好ましくは特定細胞表面分子に特異的な抗体による標的細胞の染色後、直接または間接免疫蛍光法により測定され得る。抗体は蛍光色素により直接標識され得るかまたは第１抗体に特異的な蛍光標識第２工程抗体が使用され得、そして細胞をサイトフルオリメーターにより分析する。
【００１６】
本発明結合性分子は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢの両方についての結合特異性を有する(「ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性分子」)。
【００１７】
好ましくは、結合性分子は、１５ｎＭ未満の解離定数(Ｋｄ)、さらに好ましくはＫｄ＜１０ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜５ｎＭでＣＤ４５ＲＯイソ型に結合する。好ましくは、結合性分子は、Ｋｄ＜１５ｎＭ、さらに好ましくはＫｄ＜１０ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜５ｎＭでＣＤ４５ＲＢイソ型に結合する。
【００１８】
さらに好ましい態様において、本発明結合性分子は、
１）ＣＤ４５分子のＡおよびＢエピトープを含むが、Ｃエピトープを含まず、および／または
２）ＣＤ４５分子のＢエピトープを含むが、ＡおよびＣエピトープを含まない
ＣＤ４５イソ型、および／または
３）ＣＤ４５分子のＡ、ＢまたはＣエピトープのいずれも含まないイソ型
に結合する。
【００１９】
さらに別の好ましい態様において、本発明の結合性分子は、
１）ＣＤ４５分子のＡ、ＢおよびＣエピトープの全て、および／または
２）ＣＤ４５分子のＢおよびＣエピトープの両方を含むが、Ａエピトープを含まない
ＣＤ４５イソ型には結合しない。
【００２０】
さらに好ましい態様において、本発明の結合性分子は、さらに
１）記憶およびインビボアロ活性化Ｔ細胞を認識し、および／または
２）ヒトＴ細胞、例えばＰＥＥＲ細胞におけるその標的に結合し、ただし、上記結合は、好ましくはＫｄ＜１５ｎＭ、さらにこのましくはＫｄ＜１０ｎＭ、最も好ましくはＫｄ＜５ｎＭを伴うものとし、および／または
３）インビトロアロ反応性Ｔ細胞機能を阻害し、ただし好ましくは約５ｎＭのＩＣ５０、さらに好ましくは約１ｎＭのＩＣ５０、最も好ましくは約０.５ｎＭまたはさらには０.１ｎＭのＩＣ５０を伴い、および／または
４）インビトロでアロ抗原−特異的Ｔ細胞寛容を誘導し、および／または
５）有効量で投与されたとき、ヒトＰＢＭＣの注射によりＳＣＩＤマウスで誘導された致命的な異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を阻止する。
【００２１】
さらに好ましい態様では、Aversa et al.,Cellular Immunology１５８、３１４−３２８(１９９４)により報告されている通り、本発明結合性分子は、モノクローナル抗体「Ａ６」と同じエピトープに結合する。
【００２２】
上記結合特性および生物活性故に、上記の本発明結合性分子は、医学上、治療および／または予防に特に有用である。本発明結合性分子が特に有用である疾患には、下記でさらに示されている通り、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーがある。
【００２３】
我々は、配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含む分子がＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子であることを見出した。我々はまた、配列番号１のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子における超可変域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を見出しており、ＣＤＲ１'はアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、ＣＤＲ２'はアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてＣＤＲ３'はアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有するものであった。
【００２４】
我々はまた、配列番号２のＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子における超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を見出しており、ＣＤＲ１はアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３はアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有するものであった。
【００２５】
ＣＤＲは、本質的に抗原結合特性を決定するいわゆる超可変域でもある３つの特異的な相補的決定領域である。これらのＣＤＲは、例えばそれぞれ配列番号１または配列番号２の可変域の一部であり、これらのＣＤＲはフレームワーク領域(ＦＲ)、例えば定常域と交互にくる。本発明によるキメラ抗体において、配列番号１は、例えば配列番号３の軽鎖の一部であり、配列番号２は例えば配列番号４の重鎖の一部である。重鎖のＣＤＲは会合した軽鎖のＣＤＲと共に、本質的に本発明分子の抗原結合部位を構成する。軽鎖可変域により為される結合エネルギー特性への寄与は、会合した重鎖可変域による場合と比べて小さいこと、および単離された重鎖可変域はそれら自体に抗原結合活性を有することが知られている。上記分子は、一般に単一ドメイン抗体といわれる。
【００２６】
一態様において、本発明は、少なくとも１個の抗原結合部位を含む分子であって、配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有するものである分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子、例えばおよびその直接均等内容物を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、少なくとも１個の抗原結合部位を含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ分子であって、
ａ）配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１がアミノ酸配列Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH)を有し、ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG)を有し、そしてＣＤＲ３がアミノ酸配列Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT)を有する第１ドメイン、および
ｂ）配列中に超可変域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含み、ＣＤＲ１'がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ)を有し、ＣＤＲ２'がアミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS)を有し、そしてＣＤＲ３'がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT)を有する第２ドメイン
を含むものである分子、例えばおよびその直接均等内容物を提供する。
【００２８】
好ましい態様において、配列中に超可変域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第１ドメインは、免疫グロブリン重鎖であり、配列中に超可変域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む第２ドメインは免疫グロブリン軽鎖である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドを含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子、好ましくは一ドメインに配列番号１のポリペプチドおよび別のドメインに配列番号２のポリペプチドを含む、例えばキメラモノクローナル抗体を提供し、また別の態様では、配列番号３のポリペプチドおよび／または配列番号４のポリペプチドを含む分子、例えばＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子、好ましくは一ドメインに配列番号３のポリペプチドおよび別のドメインに配列番号４のポリペプチドを含む、例えばキメラモノクローナル抗体を提供する。
【００３０】
抗原結合部位が第１および第２ドメインの両方または配列番号１または配列番号３の各ポリペプチドおよび配列番号２または配列番号４の各ポリペプチドを含む場合、これらは同じポリペプチドに位置し得るか、または好ましくは、各ドメインは異なる鎖にあり得、例えば第１ドメインは重鎖、例えば免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部であり、第２ドメインは軽鎖、例えば免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメントの一部であり得る。
【００３１】
さらに我々は、本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が哺乳類、例えばヒト体内環境においてＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子であることを見出した。すなわち本発明によるＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）として示され得、結合活性は、主として上記ＣＤＲ領域、例えば結合特異性を伴わずに他の分子と会合しているＣＤＲ領域、例えばフレームワーク、例えば定常域により決定され、これらは実質的にヒトに由来する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、Aversa et al. Cellular Immunology１５８、３１４−３２８（１９９４）により報告されている、モノクローナル抗体「Ａ６」ではないＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子を提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、キメラ、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体である本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子を提供する。
【００３４】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の例には、例えばＢ細胞またはハイブリドーマにより産生された抗体から誘導されるキメラまたはヒト化抗体またはそのフラグメント、例えばＦ(ａｂ')２およびＦａｂフラグメント、並びに一本鎖または単一ドメイン抗体が含まれる。一本鎖抗体は、通常１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５〜２５アミノ酸から成る、ペプチドリンカーにより共有結合した抗体重および軽鎖の可変域により構成される。従って、かかる構造は重および軽鎖の定常部分を含まないため、小ペプチドスペーサーは全定常部より当然抗原性が低いと考えられている。キメラ抗体とは、重および軽鎖または両方の定常域がヒト起源を有し、重および軽鎖の両方の可変域がヒト以外（例、ネズミ）の起源である抗体をいう。ヒト化抗体とは、超可変域（ＣＤＲ）がヒト以外(例、ネズミ)の起源を有し、他の部分の全部または実質的に全部、例えば定常域および可変域の高度保存部分がヒト起源である抗体をいう。しかしながら、ヒト化抗体は、超可変域に近接した可変域の一部にネズミ配列の数個のアミノ酸を保持し得る。
【００３５】
超可変域、すなわち本発明によるＣＤＲは、ヒトに由来するあらゆる種類のフレームワーク領域、例えば軽および重鎖の定常部と会合し得る。適切なフレームワーク領域は、例えば“Sequences of proteins of immunological interest”、Kabat, E.A. et al.（米国厚生省、公衆衛生総局、国立衛生研究所）に記載されている。好ましくは、ヒト重鎖の定常部は、サブタイプを含むＩｇＧ１タイプに属し、好ましくはヒト軽鎖の定常部は、κまたはλタイプ、さらに好ましくはκタイプに属する。重鎖の好ましい定常部は配列番号４のポリペプチドであり(上記で明記したＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'配列部分を伴わない)、軽鎖の好ましい定常部は配列番号３のポリペプチドである(上記で明記したＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列部分を伴わない)。
【００３６】
我々はまた、本発明によるＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む、アミノ酸配列番号７またはアミノ酸配列番号８の軽鎖可変域および本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、アミノ酸配列番号９またはアミノ酸配列番号１０の重鎖可変域を含むヒト化抗体を見出した。
【００３７】
別の態様において、本発明は、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７または配列番号８のポリペプチドを含むヒト化抗体を提供する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、
−配列番号９のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド、
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号７のポリペプチド、または
−配列番号１０のポリペプチドおよび配列番号８のポリペプチド
を含むヒト化抗体を提供する。
【００３９】
例えば本明細書記載の配列、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'、ＣＤＲ３'、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の本発明ポリペプチドは、例えば上記ポリペプチドの機能的誘導体を含む、上記(ポリ)ペプチド(配列)の直接的均等内容体を包含する。上記機能的誘導体は本明細書で明記された配列の共有結合修飾体を含み得、および／または上記機能的誘導体は本明細書で明記された配列のアミノ酸配列変異体を含み得る。
【００４０】
「ポリペプチド」は、本明細書で他に特記しない場合、Ｎ−末端先端部から出発し、Ｃ−末端先端部で終結するアミノ酸配列を有する、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を包含する。好ましくは、本発明ポリペプチドはモノクローナル抗体であり、さらに好ましくは、キメラ(Ｖ−グラフト化)またはヒト化(ＣＤＲ−グラフト化)モノクローナル抗体である。ヒト化(ＣＤＲ−グラフト化)モノクローナル抗体は、受容抗体のフレームワーク(ＦＲ)配列へ導入されたさらなる突然変異を含む場合も含まない場合もあり得る。
【００４１】
本明細書で使用されているポリペプチドの機能的誘導体は、本発明ポリペプチドと共通した定性的生物活性を有する、すなわちＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能力を有する分子を包含する。機能的誘導体は、本発明ポリペプチドのフラグメントおよびペプチド類似体を包含する。フラグメントは、例えば本明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドの配列内の領域を含む。「誘導体」の語は、例えば本明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列変異体および共有結合修飾体を特定するのに使用されている。例えば本明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドの機能的誘導体は、例えば本明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の全体的配列相同性を有し、実質的にＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能力を保持している。
【００４２】
「共有結合修飾」の語は、有機タンパク質性または非有機タンパク質性誘導体化剤による、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドまたはそのフラグメントの修飾、異種ポリペプチド配列への融合、および翻訳後修飾を包含する。例えば明細書に示された配列の、共有結合修飾ポリペプチドは、依然として架橋によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能力を有している。共有結合修飾は、慣例的にはターゲッティングされたアミノ酸残基を選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより、または選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより導入される。ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に翻訳後脱アミド化されることが多い。別法として、これらの残基は、弱い酸性条件下で脱アミノ化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化がある。例えば、T.E.Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ、７９−８６頁(１９８３)参照。例えば共有結合修飾は、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドを含む融合タンパク質およびそれらのアミノ酸配列変異体、例えば免疫接着体、および異種シグナル配列へのＮ−末端融合体を包含する。
【００４３】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する「相同性」は、本明細書では、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義されるもので、先に配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して最大相同性パーセントを得るが、保存的置換を配列同一性の一部とは見なさない。Ｎ−またはＣ−末端伸長も挿入も、同一性または相同性を低減化させるものとして解釈すべきではない。アラインメントについての方法およびコンピュータープログラムは公知である。
【００４４】
「アミノ酸(複数も可)」は、天然に存する例えばＬ−α−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を全て含めたものをいう。アミノ酸は、公知の一文字または三文字名称により識別される。
【００４５】
「アミノ酸配列変異体」の語は、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドと比べた場合にアミノ酸配列に何らかの差異を伴う分子をいう。例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、依然としてＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの結合能力を有する。置換変異体は、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドにおいて少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸がその場所の同じ位置に挿入されたものである。これらの置換は、分子中のアミノ酸が１個のみ置換された場合は単一であり得、または同分子中で２個またはそれ以上のアミノ酸が置換された場合、それらは多重であり得る。挿入変異体は、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドにおける特定位置のアミノ酸に隣接して１個またはそれ以上のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸に隣接しているとは、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基に連結されていることをいう。欠失変異体は、例えば明細書に示された配列の、本発明ポリペプチドにおいて１個またはそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は、分子の特定領域における１個または２個のアミノ酸の欠失を伴うものである。
【００４６】
我々はまた、以下のポリヌクレオチドを見出した：
−ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコード化する、GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG、
−ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコード化する、TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG、
−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコード化する、ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT、
−ＣＤＲ１'のアミノ酸配列をコード化する、TTATATTATCCACTG、
−ＣＤＲ２'のアミノ酸配列をコード化する、TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG、
−ＣＤＲ３'のアミノ酸配列をコード化する、AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG、
−配列番号１、すなわち本発明ｍＡｂの軽鎖の可変域のポリペプチドをコード化する配列番号５、
−配列番号２、すなわち本発明ｍＡｂの重鎖の可変域のポリペプチドをコード化する配列番号６、
−配列番号９、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号１１、
−配列番号１０、すなわち本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号１２、
−配列番号７、すなわち本発明によるＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む軽鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号１３、
−配列番号８、すなわち本発明によるＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む軽鎖可変域のポリペプチドをコード化する配列番号１４。
【００４７】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子をコード化する、例えば本発明によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドおよび／または、好ましくは本発明によるＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチド、および
配列番号５のポリヌクレオチドおよび／または好ましくは配列番号６のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および
配列番号７または配列番号８のポリペプチドおよび配列番号９または配列番号１０のポリペプチドをコード化する、例えば
−配列番号７のポリペプチドおよび配列番号９のポリペプチド、
−配列番号７のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチド、
−配列番号８のポリペプチドおよび配列番号９のポリペプチド、または
−配列番号８のポリペプチドおよび配列番号１０のポリペプチド、
をコード化するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および
配列番号１１または配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチドまたは配列番号１４のポリヌクレオチドを含む、好ましくは
−配列番号１１のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチド、
−配列番号１１のポリヌクレオチドおよび配列番号１４のポリヌクレオチド、
−配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１３のポリヌクレオチド、または
−配列番号１２のポリヌクレオチドおよび配列番号１４のポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチド
を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」は、本明細書において他に特記しない場合、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ただし限定するわけではないが１本および２本鎖ＲＮＡを含むものとし、および１本および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡであり得る。
【００４９】
本発明によるポリヌクレオチド、例えばアミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'、ＣＤＲ３'をコード化するか、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の各ポリヌクレオチド、例えば配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４の各ポリヌクレオチドは、そのアレリック変異体および／またはそれらの補体を含み、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０と少なくとも８０％相同性を有するポリペプチドをコード化する、例えばそれぞれ配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれ、例えば上記ポリペプチドの機能的誘導体、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０と少なくとも６５％相同性を有する機能的誘導体、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の共有結合修飾体を含む機能的誘導体、例えばそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列変異体を含む機能的誘導体が含まれる。例えば配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４はまた、それぞれ、遺伝コードの重複性（縮重）の結果として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０のポリペプチドをそれぞれコード化するか、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の各アミノ酸配列と少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化する配列を含む。
【００５０】
例えばキメラまたはヒト化抗体である、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子は、組換えＤＮＡ技術により製造され得る。すなわち、ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢをコード化する１個またはそれ以上のＤＮＡ分子は、構築され、適切な制御配列下に置かれ、適切なベクターにより発現に適切な宿主(生物体)中に移入され得る。
【００５１】
別の態様では、本発明は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の単一の重および軽鎖をコード化するポリヌクレオチド、および組換え手段による本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子製造を目的とする本発明ポリヌクレオチドの使用に関するものである。
【００５２】
ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子は、本明細書で提供されている情報、例えば超可変または可変域のアミノ酸配列およびこれらの領域をコード化するポリヌクレオチド配列の情報と共に慣用的方法に従い、例えばそれと同様にして得られる。可変ドメイン遺伝子の構築方法は、例えばＥＰ２３９４００に報告されており、簡単に述べると以下の通りに要約され得る。何にせよ特異性を有するｍＡｂの可変域をコード化する遺伝子をクローン化し得る。フレームワークおよび超可変域をコード化するＤＮＡセグメントを決定し、超可変域をコード化するＤＮＡセグメントを除去する。二本鎖合成ＣＤＲカセットを、本明細書で明記されたＣＤＲおよびＣＤＲ'配列にしたがいＤＮＡ合成法により製造する。これらのカセットに付着末端を随伴させることにより、それらはヒト起源の所望のフレームワークの接合点でライゲーションされ得る。１本鎖抗体をコード化するポリヌクレオチドはまた、慣用的方法に従い、例えばそれと同様にして製造され得る。こうして製造された本発明ポリヌクレオチドは、好都合には適切な発現ベクターへ移入され得る。
【００５３】
適切なセルラインは、慣用的方法にしたがい、例えばそれと同様の方法で見出され得る。例えば適切なプロモーター(複数も可)および重および軽鎖定常部をコード化する遺伝子を含む発現ベクターは、公知であり、例えば市販されている。適切な宿主は、公知であるかまたは慣用的方法にしたがい、例えばそれと同様にして見出され得、細胞培養物またはトランスジェニック動物が含まれる。
【００５４】
別の態様において、本発明は、例えば配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列の、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５５】
別の態様では、本発明は、
−本発明ポリヌクレオチドを含む発現系（上記発現系またはその一部が適格宿主細胞に存在するとき、上記発現系またはその一部は本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子を生産し得る）
および
−上記発現系を含む単離された宿主細胞
を提供する。
【００５６】
さらに我々は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が、インビトロＭＬＲにより測定された通り一次アロ免疫応答を用量依存的に阻害することを見出した。それらの結果は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の存在下でアロ活性化された細胞が、アロ抗原に対するそれらの応答において充分に機能を果たしていないことを示している。これは、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が、エフェクターアロ反応性Ｔ細胞に直接作用し、それらの機能を変調し得るという指摘を確認している。さらに、一次ＭＬＲから誘導されたＴ細胞の機能特性を、二次ＭＬＲにおける再刺激実験で、特異的抗原細胞または第三者の抗原細胞を用いて観察された機能性効果の特異性を評価することによりさらに試験した。我々は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が存在する一次ＭＬＲから誘導された細胞について、二次培養物に抗体は全く加えられなかったが、特異的抗原細胞による後続の最適刺激に対するそれらの応答能力が損なわれていることを見出した。阻害の特異性は、非関連第三者ドナーからの抗原細胞に対する本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子で処理された細胞の通常応答能力により立証された。すなわち、一次ＭＬＲ培養物から誘導されたＴ細胞を用いる再刺激実験は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の存在下でアロ活性化された細胞が、原初アロ抗原に対し低応答性、すなわち寛容性であることを示している。
【００５７】
さらに、我々は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子で前処理した細胞における細胞増殖が外生ＩＬ−２により立て直され得ることを見出した。これは、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子によるアロ反応性Ｔ細胞の処理が、寛容状態を誘導することを示している。事実、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子で処理した細胞で観察される増殖応答の低下は、Ｔ細胞機能の損傷に起因しており、これらの細胞は外生ＩＬ−２に応答し得たことから、これらの細胞はアネルギーで真の不応答状態であることを示している。この応答の特異性は、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子により処理した細胞が非関連ドナー細胞に対し対照処理細胞のレベルまで正常に増殖させる能力により示された。
【００５８】
さらに、実験は、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の結合が、特異的リコール抗原に対する免疫化ドナーからの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の記憶応答を阻害し得ることを示している。すなわち、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ４５ＲＢへの本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の結合はまた、可溶性Ａｇに対する記憶応答の阻害にも有効である。本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が免疫化ドナーからのＰＢＭＣにおける破傷風に対するリコール応答を阻害し得るということは、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が、記憶Ｔ細胞の活性化をターゲッティングし、変調し得ることを示している。例えば、これらのデータは、アロ反応性および活性化Ｔ細胞の認識に加えて本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子がそれらの機能を変調し得、それによってＴ細胞アネルギーを誘導することを示している。この特性は、自己免疫疾患、アレルギーおよび慢性拒絶、および疾患、例えば乾癬、炎症性腸疾患で見られる通り、自己抗原およびアレルゲンおよび恐らくはアロ抗原に対して進行中の免疫応答の処置において重要であり得、その場合記憶応答が病状の持続においてある役割を演じている。それは、病気の状況、例えば自己抗原に対する記憶応答が病気の持続にとって主たる役割を演じ得る自己免疫疾患における重要な特徴であると考えられている。
【００５９】
我々はまた、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子が、インビボ混合リンパ球応答(ＭＬＲ)においてＴ細胞増殖応答を変調し得ることを見出しており、すなわち本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子はインビボ試験において対応する阻害特性を有することが見出された。
【００６０】
すなわち、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子は、免疫抑制および寛容原性特性を有し得、アロ抗原、自己抗原、アレルゲンおよび細菌叢抗原に対するインビボおよびエクスビボ寛容誘導に有用であり得、例えば本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子は、例えば自己免疫疾患、例えば限定されるわけではないが、慢性関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびII型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎、糸球体腎炎、移植拒絶、例えば臓器および組織アロ移植および異種移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーを含む病気の処置および予防に有用であり得る。
【００６１】
別の態様において、本発明は、例えば自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーの処置および予防における、医薬としての本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の使用法を提供する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに伴う疾病の処置および予防における医薬の製造用の本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子を提供する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、少なくとも１種の医薬上許容される担体または希釈剤と共に本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子を含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
医薬組成物は、さらに例えば有効成分、例えば他の免疫変調性抗体、例えば限定されるわけではないが、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１５４、抗ＣＤ１３４Ｌまたは組換えタンパク質、例えば限定されるわけではないがｒＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ｒＯＸ４０（ＣＤ１３４）または免疫変調性化合物、例えば限定されるわけではないがシクロスポリンＡ、ＦＴＹ７２０、ＲＡＤ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ステロイド類を含み得る。
【００６５】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、乾癬、炎症性腸疾患およびアレルギーに伴う疾病の処置および予防方法であって、上記処置および／または予防を必要とする対象に例えば本発明医薬組成物形態を呈する、本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００６６】
さらに本発明結合性分子で処置される自己免疫疾患には、限定されるわけではないが、慢性関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎、グレーブス病、Ｉ型およびII型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、自己免疫性胃炎、糸球体腎炎、移植拒絶、例えば臓器および組織アロ移植および異種移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれる。
【００６７】
実施例
以下の実施例により本発明に関する理解がさらに深められるはずである。しかしながら、それらは発明の範囲を制限するものと見なされるべきではない。以下の実施例において、温度は全て摂氏である。
【００６８】
「候補ｍＡｂ」または「キメラ抗体」は、配列番号３の軽鎖および配列番号４の重鎖を含む本発明ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ結合性分子である。
【００６９】
以下の略語を使用する：
ＥＬＩＳＡ：固相酵素免疫測定法
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選択装置
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＦＢＳ：胎児牛血清
ＧＶＨＤ：移植片対宿主病
ＨＣＭＶ：ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
ＩｇＥ：免疫グロブリンイソ型Ｅ
ＩｇＧ：免疫グロブリンイソ型Ｇ
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ｘＧＶＨＤ：異種移植片対宿主病
【００７０】
実施例１：一次混合リンパ球応答（ＭＬＲ）
細胞
血液試料を健康なヒトドナーから入手する。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、血液型は既知であるが、ＨＬＡ型は未知である全末梢血、ロイコフェレーシスまたはバフィーコートからの白血球からフィコル−ハイパーク（ファルマシアＬＫＢ）での遠心分離により分離する。ＭＬＲ実験の中には、４０Ｇｙでの照射後ＰＢＭＣを抗原細胞として直接使用する場合もある。他の実験では、ＣＤ２またはＣＤ３ダイナビーズ(ダイナール、オスロ、ノルウェー)を用いることにより、Ｔ細胞をＰＢＭＣから枯渇させる。ビーズおよび汚染細胞を磁場により除去する。Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣを照射後抗原細胞として使用する。
【００７１】
ＰＢＭＣ、ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＬＲにおける応答細胞として使用する。細胞を抗原細胞に対し異なるドナーから調製する。抗ＣＤ１６ｍＡｂ（ザイムド、カリフォルニア）、ヤギ抗マウスＩｇＧダイナビーズ、抗ＣＤ１４ダイナビーズ、ＣＤ１９ダイナビーズを用いる負の選択によりＣＤ３＋Ｔ細胞を精製する。さらに抗ＣＤ８ダイナビーズを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製する。得られた細胞をＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー、カリフォルニア）により分析すると、得られた細胞の純度は＞７５％であった。細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁する。
【００７２】
試薬
また、キメラ抗ＣＤ４５ＲＯ／ＲＢ ｍＡｂ「候補ｍＡｂ」およびイソ型マッチ対照キメラ抗体を生成する。ＫＬＨ（キーホール・リンペットヘモシアニン）または組換えヒトＩＬ−１０に特異的なマウス（ヒト）対照ＩｇＧ１抗体をＢＤファーミンゲン(サンディエゴ、カリフォルニア)から購入する。抗ヒトＣＤ１５４ ｍＡｂ ５ｃ８は、Lederman et al（１９９２）によるものである。
【００７３】
一次混合リンパ球応答（ＭＬＲ）
１×１０５ＰＢＭＣまたは５×１０４のＣＤ３＋またはＣＤ４＋細胞のアリコートを、示されたｍＡｂの存在下またはＡｂの不存在下で９６ウェル培養プレート(コスター、ケンブリッジ、マサチューセッツ)の各ウェル中１×１０５照射ＰＭＢＣまたは５×１０４Ｔ細胞枯渇照射(５０Ｇｙ)ＰＢＭＣと混合する。幾つかの実験では、Ｆｃ部分に特異的なヤギ抗マウスＩｇまたはヤギ抗ヒトＩｇのＦ(ａｂ')２フラグメント(ジャクソン、イムノリサーチ、ウエストグローヴ、ペンシルベニア)を候補ｍＡｂに加えて１０μｇ／ｍｌで加えることにより、標的ＣＤ４５分子の最適なインビトロ架橋を確実にする。混合細胞を５％ＣＯ２中３７℃で４または５日間培養し、培養の最後の１６〜２０時間３Ｈ−チミジンを細胞に適用することにより増殖を測定する。他の実験も上記実験と同様に行うが、ただし以下の例外を伴う：１）使用培地は、１０％ＦＢＳおよび１％ヒト血漿含有ＥＸ−ＶＩＶＯ(バイオ−ウイタッカー)である；２）抗マウス全ＩｇＧ(５μｇ／ｍｌ)を２次架橋工程として使用する；３）抗原細胞の照射は６０Ｇｙである。
【００７４】
一次ＭＬＲを、「候補ｍＡｂ」または対照キメラＩｇＧ１(１０μｇ／ｍｌ)の存在下第２工程試薬、Ｆｃ部分に特異的なヤギ抗ヒトＩｇのＦ(ａｂ')フラグメント(１０μｇ／ｍｌ)の両方により遂行する。「候補ｍＡｂ」による阻害パーセントを、対照ＩｇＧ１の存在下における細胞増殖と比較して算出する。結果を下表１に示す。
【００７５】
【表１】
2004533816.tif 000002
【００７６】
本発明候補ｍＡｂは、表１から明らかな通り一次ＭＬＲを阻害する。平均阻害効果は、４種の異なるドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において６０.８３±６.８３％であり、統計的に有意である。「候補ｍＡｂ」による一次ＭＬＲの阻害は、図１に示されている通り０.００１および１０μｇ／ｍｌの「候補ｍＡｂ」の範囲で用量依存的であることが示されている。「候補ｍＡｂ」による一次ＭＬＲの阻害についてのＩＣ５０は、応答細胞として一ドナーＰＢＭＣを用いる３つの別々のＭＬＲ実験の結果から測定される。すなわち、ドナー＃２２９および＃２１９からの応答ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗原細胞としてＴ細胞を枯渇させた照射ＰＢＭＣを、「候補ｍＡｂ」または対照キメラＡｂの存在下１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇのＦ(ａｂ')２フラグメントと混合する。実験を３回反復し、「候補ｍＡｂ」の存在下における増殖のパーセントを、対照Ａｂの存在下におけるＴ細胞増殖と比較して算出する。オリジン(Ｖ.６.０(登録商標))を用いてＩＣ５０値を測定する。細胞活性ＩＣ５０値を計算したところ、０.８７±０.３５ｎＭ（０.１３±０.０５２μｇ／ｍｌ）であった。
【００７７】
実施例２：二次ＭＬＲ
「候補ｍＡｂ」が特異的アロ抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の非応答性を誘導するか否かを評価するため、一次ＭＬＣ後に抗体の不存在下で二次ＭＬＲを遂行する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０日間９６ウェル培養プレート中指示抗体の存在下で照射同種異系抗原細胞(Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ)と培養する(一次ＭＬＣ)。次いで、細胞を集め、フィコル−ハイパーク勾配上で層状に重ねて死んだ細胞を除去し、ＲＰＭＩで２回洗浄し、同じ抗原細胞、第３者抗原細胞またはＩＬ−２(５０Ｕ／ｍｌ)で再刺激する。細胞を３日間培養し、培養の最後の１６〜２１時間細胞に３Ｈ−チミジンを適用することにより、増殖性応答を測定する。
【００７８】
具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌの「候補ｍＡｂ」、対照ＩｇＧ１キメラＡｂおよびヤギ抗ヒトＩｇのＦ(ａｂ')２フラグメントの存在下照射した同種異系抗原細胞（他のドナーから採取したＴ細胞枯渇ＰＢＭＣ）と培養する。一次ＭＬＲ増殖を５日目に測定する。二次ＭＬＲについては、応答および抗原細胞を、「候補ｍＡｂ」の存在下で１０日間培養し、次いで細胞を採取し、ＲＰＭＩ１６４０中で２回洗浄し、Ａｂの不存在下で特異的抗原細胞、第３者抗原細胞またはＩＬ−２(５０Ｕ／ｍｌ)により再刺激する。３日目に細胞増殖を測定する。結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2004533816.tif 000003
【００８０】
増殖が損なわれるのは「候補ｍＡｂ」による処理の結果としての非応答性に起因するか否かを試験するため、一次ＭＬＲから誘導された細胞をＩＬ−２(５０Ｕ／ｍｌ)の存在下で培養する。ＩＬ−２を添加することにより、一次ＭＬＲにおいて「候補ｍＡｂ」で処理されたＴ細胞の増殖応答がＩｇＧ１対照Ａｂの存在下で観察されるのと同様のレベルまで立て直される。これらのデータは、「候補ｍＡｂ」で処理されたＴ細胞において損なわれた二次応答が、特異的抗原細胞に対して不応答性となった応答Ｔ細胞の機能的改変に起因することを示している。
【００８１】
阻害パーセントは、下式にしたがって計算される：
【数１】
2004533816.tif 000004
【００８２】
統計分析は、シグマスタット（バージョン２.０３）を用いて遂行される。二方向ＡＮＯＶＡ、次いでDunnett方法によりデータを分析する。全試験手順において、確率＜０.０５は有意であるとみなされる。実験によってはｔ−試験を使用する場合もある（シグマスタットＶ.２.０３）。
【００８３】
実施例３：ＳＣＩＤマウスにおけるインビボ生存試験
ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕ−ＰＢＬの移植
ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、ＳＣＩＤマウスＣＢ１７／ＧｂｍｓＴａｃ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇマウス(タコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク)へ、細胞移入後４週間以内に９０％を越えるマウスにおいて致命的な異種移植片対宿主病（ｘＧｖＨＤ）を誘発するのに充分な量で腹腔内注射する。以後、上記処理ＳＣＩＤマウスをｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスと称す。
【００８４】
ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのＭａｂ−処理
０日目、ＰＢＭＣ注射直後、３日目、７日目そしてその後１週間間隔でｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを「候補ｍＡｂ」またはマウスまたはキメライソ型マッチｍＡｂ対照により処理する。Ｍａｂを１００μｌのＰＢＳ中体重１ｋｇ当たり５ｍｇ／ｋｇの最終濃度で皮下送達させる。全対照マウスが死亡した時点で処理を停止した。
【００８５】
処理結果の評価
この試験における「候補ｍＡｂ」の効果を評価する主たる基準は、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの生存であった。Ｓｙｓｔａｔ ｖ９.０１ソフトウエアの支援により対数ランク試験（マンテル法）を用いる統計的生存分析方法により結果の有意性を評価する。生存分析方法はノンパラメトリック試験であり、特定マウスがまだ生きているかどうかだけでなく、それが処理／病気とは関連性の無い理由、例えばその臓器／細胞によるインビトロ分析の遂行に必要とされる理由から殺されたか否かを考慮する。肝臓、肺、腎臓および脾臓のバイオプシーを死んだマウスから入手することにより、さらに評価を行う。さらに、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを、実験開始時(細胞移入前)および終始（二日毎に）それらの健康状態の間接的評価として秤量する。各マウスから得た体重対ＰＢＭＣ移入後の日数値を用いて一次回帰線を作成し、それに続いて、ノンパラメトリックのマン-ウイットニー試験を用いてそれらの傾き（対照対抗ＣＤ４５処理マウス）を比較した。
【００８６】
結果
マウスｍＡｂ対照で処理したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは全て、肺、肝臓および脾臓でヒト白血球を浸潤させており、細胞移入後約２〜３週間以内に死亡した(４／４)。死亡は、ｘＧｖＨＤの起こりがちな結果である。さらに対照ｍＡｂ処理マウスは３週間以内に、約１０％およびそれ以上の割合で直線的に体重を減らしていた。
【００８７】
「候補ｍＡｂ」処理を３週間後に停止したが、それでも「候補ｍＡｂ」で処理されたｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは全て生存しており(４／４)、４週間を越えても病気の明白な徴候は見られなかった。「候補ｍＡｂ」処理マウスは４週間以内に約５％以下まで直線的に体重を増加させていた。
【００８８】
実施例４：本発明抗体の発現
配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０を含むヒト化抗体の発現
図２〜５で示されたプラスミド地図による発現ベクターで、それぞれヒト化軽鎖可変域ｈｕｍＶ１(配列番号７)、ヒト化軽鎖可変域ｈｕｍＶ２(配列番号８)、ヒト化重鎖可変域ＶＨＥ(配列番号９)またはヒト化重鎖可変域ＶＨＱ(配列番号１０)のアミノ酸配列をコード化する対応するヌクレオチドを含むものを構築する。これらの発現ベクターは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の各ＤＮＡ(ヌクレオチド)配列を有する。
【００８９】
ヒト化抗体重および軽鎖発現ベクターの構築
バージョンＶＬｈおよびＶＬｍについてのヒトカッパ軽鎖発現ベクター
ヒトカッパイソ型の完全ヒト化軽鎖をコード化する最終発現ベクターを構築するために、完全軽鎖可変域(ＶＬｈおよびＶＬｍ)をコード化するＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄIIIおよびＢｇIIIを用いてＶＬｈおよびＶＬｍ含有ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔクローニングベクター(ストラタジーン)(ＶＬｍ領域)から切除した。次いで、ゲル精製フラグメントを、ヒト化抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳＣ−２１(Kolbinger et al、１９９３)の構築中に作製され、もともとM.Bendigから受けた(ＭＲＣコラボレイティブ・センター、ロンドン、イギリス国)(Maeda et al.１９９１)Ｃ２１−ＨＣＭＶカッパ発現ベクターのＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ部位へサブクローニングした。ライゲーション生成物を、フェノール／クロロホルム抽出により精製し、電気共穿孔コンピテントのエピキュリアン・コリ(登録商標)ＸＬ１−ブルー株(カタログ番号＃２００２２８、ストラタジーン)へ電気穿孔した。ＬＢ／ａｍｐ寒天プレートにおいて一晩３７℃で培養後、各１２コロニーを選び取り、バイオロボット９６００(キアゲン)を用いて、３ｍｌ培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。図面でさらに記載されているように、この結果、ヒト化抗体バージョンＶＬｈおよびＶＬｍについての軽鎖発現ベクターがそれぞれ得られた。
【００９０】
ＶＨＱについてのヒトガンマ−１重鎖発現ベクター
ＶＨＱ発現ベクターを構築するため、段階的方法を採った。まず、Kolbinger et al １９９３(Protein Eng.１９９３年１１月；６(８)：９７１−８０)に記載の方法論にしたがってＰＣＲによりＶＨＱの完全可変域を組立て、同酵素を用いてＣ２１挿入体が除去されたＣ２１−ＨＣＭＶ−ガンマ−１発現ベクターへサブクローニングした。次いで、完全可変域を含むＰＣＲＳｃｒｉｐｔクローンＶＨＱのＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩフラグメントを、同酵素により開裂された発現ベクターＣ２１−ＨＣＭＶ−ガンマ−１中へサブクローニングした。これにより、ヒト化抗体バージョンＶＨＱについての最終発現ベクターが得られた。
【００９１】
ＶＨＥについてのヒトガンマー１重鎖発現ベクター
ヒトガンマ−１イソ型の完全ヒト化重鎖をコード化する最終ＶＨＥ発現ベクターの構築は、可変域をコード化するＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ制限ＰＣＲフラグメントを、ヒト化抗ＩｇＥ抗体ＴＥＳＣ−２１(Kolbinger et al、１９９３)の構築中に作製され、またもともとM.Bendigから受けた(ＭＲＣコラボレイティブ・センター、ロンドン、イギリス国)(Maeda et al.１９９１)Ｃ２１−ＨＣＭＶガンマ−１発現ベクターのＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ部位へ直接ライゲーションすることにより達成された。
【００９２】
ＣＯＳ細胞における一時的発現
以下のトランスフェクションプロトコルを、スーパーフェクト(登録商標)トランスフェクション試薬(カタログ番号３０１３０５、キアゲン)を用いて、１５０ｍｍ細胞培養皿において接着性ＣＯＳ細胞に適合化させる。上記４種の異なる発現ベクターを、細胞の一時的トランスフェクションに使用する。ヒト化抗体を発現させるため、重鎖挿入体を含む２つのクローン(それぞれＶＨＥまたはＶＨＱ)の各々を、軽鎖をコード化する２つのクローン(それぞれｈｕｍＶ１またはｈｕｍＶ２)の各々と共に、重および軽鎖発現ベクターの全部で４つの異なる組み合わせ(ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１、ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２、ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１およびＶＨＱ／ｈｕｍＶ２)で細胞へ共トランスフェクションする。トランスフェクション前、プラスミドを、アンピシリン耐性遺伝子をコード化する領域で開裂する制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩにより線状にする。トランスフェクション前日、３０ｍｌの新鮮な培養培地中４×１０６ＣＯＳ細胞を、１５０ｍｍ細胞培養皿に播種する。この細胞密度で播種すると、一般的に２４時間後には培養飽和密度の８０％に達した。トランスフェクション当日、線状重および軽鎖ＤＮＡ発現ベクターの４種の異なる組み合わせ(各々１５μｇ)を、全体積９００μｌの血清および抗生物質を含まない新鮮培地中で希釈する。次いで、１８０μｌのスーパーフェクトトランスフェクション試薬を充分にＤＮＡ溶液と混合する。ＤＮＡ混合物を室温で１０分間インキュベーションすることにより、複合体を形成させる。複合体の形成が行われている間、成長培地をＣＯＳ細胞培養物から除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄する。次いで、新鮮な培養培地（１０％ＦＢＳおよび抗生物質含有）９ｍｌを、トランスフェクション複合体を含む各反応管に加え、充分に混合する。最終調製物を即座に４培養物の各々に移してトランスフェクションさせ、静かに混合する。次いで、細胞培養物を３７℃で５％ＣＯ２中３時間ＤＮＡ複合体とインキュベーションする。インキュベーション後、トランスフェクション複合体含有培地を除去し、３０ｍｌの新鮮な培養培地と交換する。トランスフェクションの４８時間後、培養上清を採取する。
【００９３】
培養上清の濃縮
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析のため、重および軽鎖プラスミドによりトランスフェクションしたＣＯＳ細胞から集められた細胞上清を以下の要領で濃縮する。各上清１０ｍｌを、製造業者の記載に従いセントリプレップＹＭ−５０遠心分離フィルター装置（カタログ番号４３１０、ミリポア）に加える。セントリプレップフィルターを室温で１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。次いで、５分のみの遠心分離を用い、濃縮の展開を監視しながら上清の残りの２０ｍｌにより遠心分離工程を再び反復する。濃縮上清の中間５００μｌを回収し、新たなミクロコン遠心分離フィルター装置(カタログ番号４２４１２、ミクロコン)に移し、製造業者のプロトコルにしたがってさらに濃縮する。濃縮上清を室温で２４分間３０００ｒｐｍで４回、１０分間６０００ｒｐｍで１回、次いで５分間を３回常に濃縮の展開を監視しながら遠心分離にかける。到達した濃縮条件培地の最終体積は、最初の培養培地の２５０〜３００倍濃度に相当する１００〜１２０μｌであり、使用時まで４℃で貯蔵する。比較および対照のため、上記と同じ遠心分離プロトコルを用いて、非トランスフェクション細胞からの培養培地を同様に濃縮する。
【００９４】
実施例５：ＥＬＩＳＡによる組換えヒトＩｇＧ発現の測定
培養上清で発現された組換えヒト抗体のＩｇＧ濃度を測定するため、サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルが開発され、標準としてヒトＩｇＧを用いて最適化された。平底９６ウェルのマイクロタイタープレート(カタログ番号４−３９４５４、ヌンク・イムノプレート・マキシソープ)を、４℃で一晩１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（全分子、カタログ番号ｌ１０１１、シグマ）によりＰＢＳ中０.５μｇ／ｍｌの最終濃度でコーティングする。次いで、ウェルを洗浄緩衝液(０.０５％トウィーン２０含有ＰＢＳ)で３回洗浄し、３７℃で１.５時間遮断緩衝液(ＰＢＳ中０.５％ＢＳＡ)で遮断する。３洗浄サイクル後、抗体試料および標準ヒトＩｇＧ（カタログ番号１４５０６、シグマ）を、遮断緩衝液中系列１.５倍希釈により調製する。１００μｌの希釈試料または標準をデュプリケイトでコーティングしたプレートに移し、室温で１時間インキュベーションする。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、それに続いて１時間遮断緩衝液中で１／４０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧカッパ−軽鎖(カタログ番号Ａ−７１６４、シグマ)１００μｌとインキュベーションする。対照ウェルには１００μｌの遮断緩衝液または濃縮通常培養培地を投与した。洗浄後、製造業者の使用説明書にしたがいＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット(カタログ番号１７２−１０６７、バイオ−ラッド)を用いて、試料および標準ウェルで結合したペルオキシダーゼの比色定量を行う。
【００９５】
ペルオキシダーゼ混合物を１ウェル当たり１００μｌの割合で加え、暗所中室温で３０分間インキュベーションする。１００μｌの１Ｍ硫酸を加えることにより比色定量反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレート読取り装置(モデル３３５０−ＵＶ、バイオラッド)を用いて、各ウェルにおける吸光度を４５０ｎｍで読み取る。
【００９６】
ＩｇＧ標準曲線に関する０.９９８の相関係数により、以下の濃度を４つの異なる培養濃縮物(約２５０〜３００倍濃縮)について測定する：
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ１上清＝８.２６μｇ／ｍｌ
ＶＨＥ／ｈｕｍＶ２上清＝６.２７μｇ／ｍｌ
ＶＨＱ／ｈｕｍＶ１上清＝５.３μｇ／ｍｌ
ＶＨＱ／ｈｕｍＶ２上清＝５.５６μｇ／ｍｌ
【００９７】
実施例６：ＦＡＣＳ競合分析(結合親和力)
その細胞表面でＣＤ４５抗原を発現したことから、ヒトＴセルラインＰＥＥＲを、ＦＡＣＳ分析についての標的細胞として選択する。ヒト化抗体上清の結合親和力を分析するため、レファレンスとしてＦＩＴＣ標識キメラ抗体を用いる競合実験を遂行し、精製マウス抗体およびキメラ抗体の阻害と比較する。ＰＥＥＲ細胞培養物を１０秒間３０００ｒｐｍでの遠心分離にかけ、培地を除去する。細胞をＦＡＣＳ緩衝液(１％ＦＢＳおよび０.１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ)に再懸濁し、１ウェル当たり１×１０５細胞の細胞密度で９６ウェル丸底マイクロタイタープレート中に播種する。プレートを遠心分離にかけ、上清を廃棄する。遮断試験を行うため、まず、２５μｌの濃縮非トランスフェクション培地またはイソ型マッチ対照抗体(陰性対照)、非標識マウス抗体またはキメラ抗体(陽性対照)並びに様々な組み合わせのヒト化抗体（試料）を含む濃縮上清を、各ウェルへ明細書に示された濃度で加える。４℃で１時間のインキュベーション後、ＰＥＥＲ細胞を遠心分離により２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液により洗浄する。それに続いて、細胞を４℃で１時間、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中ＦＩＴＣとコンジュゲートしたキメラ抗体とインキュベーションする。細胞を洗浄し、２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム含有ＦＡＣＳ緩衝液３００μｌに再懸濁することにより、生存し得る細胞がゲーティングされ得る。細胞調製物をフローサイトメーターで分析する（ＦＡＣＳカリバー、ベクトン、ディッキンソン）。
【００９８】
ＦＡＣＳ分析は、濃縮ヒト化抗体培養上清による蛍光色素標識キメラ抗体の用量依存的阻害を示している。キメラ抗体結合の用量依存的阻害は、イソ型マッチ対照抗体については全く見られないことから、異なるヒト化抗体の組み合わせによる遮断効果はエピトープ特異的であり、エピトープ特異性はヒト化プロセス後も保持されると思われることが示されている。
【００９９】
実施例７：ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性分子の生物活性
この試験では、我々は、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体が、ポリクローナル活性化一次ヒトＴ細胞の培養物に存在するとき、(ｉ)特徴的なＴｒｅｇ表現型をもつＴ細胞の分化を持続させるか、(ii)Ｔ細胞活性化後にアポトーシスを阻止または促進するか、そして(iii)再刺激後にサブセット特異的抗原および受容体の発現に影響するか否かという疑問に取り組んだ。
【０１００】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体は、ポリクローナル活性化Ｔ細胞における細胞死を促進する。
一次Ｔ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔサブセットの混合物)に対し、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体の存在または不存在(＝対照)下で抗ＣＤ３プラス抗ＣＤ２８ ｍＡｂ(各々２００ｎｇ／ｍｌ)による活性化を行った。２日目に過剰の抗体を洗浄により除去した。アポトーシスおよび壊死細胞により取込まれるＤＮＡ染色染料として７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いることにより、活性化後の細胞死を測定した。結果は、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体の存在下におけるＴ細胞の活性化により、活性化の２日後には７−ＡＡＤ陽性細胞のフラクションは２倍を越えて増加したことを示している。７日目、７−ＡＡＤ陽性細胞の部分は、同じくＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理および対照培養物の場合と類似していた。
【０１０１】
対照ｍＡｂではなくＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞は、Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）表現型を呈する
ＣＤ２５および陰性調節タンパク質ＣＴＬＡ−４(ＣＤ１５２)の発現増加は、Ｔｒｅｇ細胞のマーカーである。ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体による一次および二次Ｔ細胞応答の機能的抑制は、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に起因し得る。この問題点に取り組むため、Ｔ細胞を抗ＣＤ３＋ＣＤ２８ ｍＡｂにより活性化し、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体または抗ＬＰＳ対照ｍＡｂの存在下で培養した。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２５発現の時間経過は、二次刺激後１および３日目に対照およびＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞間で著しい差異を示す。
【０１０２】
細胞内ＣＴＬＡ−４発現は、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体の存在下で持続される
かなりの量のＣＴＬＡ−４もまた細胞内で見出され得ることが報告されている。従って、表面ＣＴＬＡ−４染色と並行して、細胞内ＣＴＬＡ−４発現を分析した。Ｔ細胞培養物間の中程度の差異は刺激後４日目に見られた。しかしながら、培養延長後、高レベルの細胞内ＣＴＬＡ−４は、対照Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞でのみ持続された。
【０１０３】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８について二重陽性になる
刺激後、Ｔ細胞は、幾つかの表面受容体、例えばＣＤ２５、ＣＤ１５２(ＣＴＬＡ−４)、ＣＤ１５４(ＣＤ４０−リガンド)などの発現を誘導し、アップレギュレーションする。対照的に、ＣＤ４またはＣＤ８の発現レベルは、比較的一定したままであると考えられている。我々は、活性化後対照Ａｂ処理Ｔ細胞ではなくＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞に関するＣＤ４およびＣＤ８両抗原の強度の増加を再現可能なものとして観察した。ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性Ｔ細胞集団の出現は、ＣＤ８＋サブセットにおけるＣＤ４および逆にＣＤ４＋サブセットにおけるＣＤ８のアップレギュレーションに起因すると思われる。これは、対照培養物における二重陽性Ｔ細胞の中程度の低パーセントと対照をなす。
【０１０４】
ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞による高ＩＬ−２受容体アルファ鎖であるが非常に低いベータ鎖発現
Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５、ＩＬ−２受容体アルファ鎖について構成的に陽性であることが知られている。Ｔｒｅｇ細胞におけるトリマーＩＬ−２受容体の他のサブユニットの調節については知られていない。最近、我々は、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体の存在または不存在下で活性化および伸長されたＴ細胞におけるＩＬ−２受容体のベータ鎖、例えばＣＤ１２２の発現を比較した。結果は、ＣＤ４５ＲＢ／ＲＯ結合性キメラ抗体処理Ｔ細胞が、対照培養物におけるＴ細胞の場合と比べて約１０倍低いＣＤ１２２発現性を有することを示している。この差異は、Ｔｒｅｇ細胞が増殖するためにＩＬ−２以外の因子を必要とすることを示し得る。
【０１０５】
実施例８：本発明の配列(本発明ＣＤＲ配列は下線部である)
配列番号１
キメラ軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表３】
2004533816.tif 000005
【０１０６】
配列番号２
キメラ重鎖のアミノ酸配列の一部
【表４】
2004533816.tif 000006
【０１０７】
配列番号３
キメラ軽鎖のアミノ酸配列
【表５】
2004533816.tif 000007
【０１０８】
配列番号４
キメラ重鎖のアミノ酸配列
【表６】
2004533816.tif 000008
【０１０９】
配列番号５
配列番号１のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列
【表７】
2004533816.tif 000009
【０１１０】
配列番号６
配列番号２のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列
【表８】
2004533816.tif 000010
【０１１１】
配列番号７
ｈｕｍＶ２(ｈｕｍＶ２＝ＶＬｍ)と称されるヒト化軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表９】
2004533816.tif 000011
【０１１２】
配列番号８
ｈｕｍＶ１(ｈｕｍＶ１＝ＶＬｈ)と称されるヒト化軽鎖のアミノ酸配列の一部
【表１０】
2004533816.tif 000012
【０１１３】
配列番号９
ＶＨＥと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表１１】
2004533816.tif 000013
【０１１４】
配列番号１０
ＶＨＱと称されるヒト化重鎖のアミノ酸配列の一部
【表１２】
2004533816.tif 000014
【０１１５】
配列番号１１
アミノ酸配列配列番号９をコード化するヌクレオチド配列
【表１３】
2004533816.tif 000015
【０１１６】
配列番号１２
アミノ酸配列配列番号１０をコード化するヌクレオチド配列
【表１４】
2004533816.tif 000016
【０１１７】
配列番号１３
アミノ酸配列配列番号７をコード化するヌクレオチド配列
【表１５】
2004533816.tif 000017
【０１１８】
配列番号１４
アミノ酸配列配列番号８をコード化するヌクレオチド配列
【表１６】
2004533816.tif 000018
【０１１９】
配列番号１５
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＱのヌクレオチド配列
（３９２１〜４２７４の配列番号１２(ＶＨＱ)を含むヒト化重鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【０１２０】
【表１７】
2004533816.tif 000019
【表１８】
2004533816.tif 000020
【表１９】
2004533816.tif 000021
【表２０】
2004533816.tif 000022
【表２１】
2004533816.tif 000023
【表２２】
2004533816.tif 000024
【表２３】
2004533816.tif 000025
【０１２１】
配列番号１６
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＥのヌクレオチド配列
（３９２１〜４２７４の配列番号１１(ＶＨＥ)を含むヒト化重鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表２４】
2004533816.tif 000026
【表２５】
2004533816.tif 000027
【表２６】
2004533816.tif 000028
【表２７】
2004533816.tif 000029
【表２８】
2004533816.tif 000030
【表２９】
2004533816.tif 000031
【０１２２】
配列番号１７
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ＶＬ１ ｈｕｍＶ１のヌクレオチド配列
（３９６４〜４２８４の配列番号１４(ｈｕｍＶ１＝ＶＬｈ)を含むヒト化軽鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表３０】
2004533816.tif 000032
【表３１】
2004533816.tif 000033
【表３２】
2004533816.tif 000034
【表３３】
2004533816.tif 000035
【表３４】
2004533816.tif 000036
【表３５】
2004533816.tif 000037
【表３６】
2004533816.tif 000038
【０１２３】
配列番号１８
発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ＶＬ１ ｈｕｍＶ２のヌクレオチド配列
（３９２６〜４２４６の配列番号１３(ｈｕｍＶ２＝ＶＬｍ)を含むヒト化軽鎖発現ベクターの完全ＤＮＡ配列）
【表３７】
2004533816.tif 000039
【表３８】
2004533816.tif 000040
【表３９】
2004533816.tif 000041
【表４０】
2004533816.tif 000042
【表４１】
2004533816.tif 000043
【表４２】
2004533816.tif 000044
【表４３】
2004533816.tif 000045
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、「候補ｍＡｂ」による一次ＭＬＲの阻害が０.００１および１０μｇ／ｍｌ間の範囲において用量依存的であることを示す。「濃度」は「候補ｍＡｂ」の濃度である。
【図２】図２は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１５におけるヌクレオチド配列の配列番号１２（３９２１−４２７４）を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＱのプラスミド地図を示す。
【図３】図３は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１６におけるヌクレオチド配列の配列番号１１（３９２１−４２７４）を有する重鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｇ１ ＨｕＡｂ−ＶＨＥのプラスミド地図を示す。
【図４】図４は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１７におけるヌクレオチド配列の配列番号１４（３９６４−４２８４）を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ｈｕｍＶ１のプラスミド地図を示す。
【図５】図５は、完全発現ベクターヌクレオチド配列の配列番号１８におけるヌクレオチド配列の配列番号１３（３９２６−４２４６）を有する軽鎖を含む発現ベクターＨＣＭＶ−Ｋ ＨｕＡｂ−ｈｕｍＶ２のプラスミド地図を示す。
【図１】
2004533816.tif 000046
【国際公開パンフレット】
2004533816.tif 000047
2004533816.tif 000048
2004533816.tif 000049
2004533816.tif 000050
2004533816.tif 000051
2004533816.tif 000052
2004533816.tif 000053
2004533816.tif 000054
2004533816.tif 000055
2004533816.tif 000056
2004533816.tif 000057
2004533816.tif 000058
2004533816.tif 000059
2004533816.tif 000060
2004533816.tif 000061
2004533816.tif 000062
2004533816.tif 000063
2004533816.tif 000064
2004533816.tif 000065
2004533816.tif 000066
2004533816.tif 000067
2004533816.tif 000068
2004533816.tif 000069
2004533816.tif 000070
2004533816.tif 000071
2004533816.tif 000072
2004533816.tif 000073
2004533816.tif 000074
2004533816.tif 000075
2004533816.tif 000076
2004533816.tif 000077
2004533816.tif 000078
2004533816.tif 000079
2004533816.tif 000080
2004533816.tif 000081
2004533816.tif 000082
2004533816.tif 000083
2004533816.tif 000084
2004533816.tif 000085
2004533816.tif 000086
2004533816.tif 000087
2004533816.tif 000088
2004533816.tif 000089
2004533816.tif 000090
2004533816.tif 000091
2004533816.tif 000092
2004533816.tif 000093
2004533816.tif 000094
2004533816.tif 000095
2004533816.tif 000096
2004533816.tif 000097
2004533816.tif 000098
2004533816.tif 000099
2004533816.tif 000100
2004533816.tif 000101
2004533816.tif 000102
2004533816.tif 000103
2004533816.tif 000104
2004533816.tif 000105
2004533816.tif 000106
2004533816.tif 000107
2004533816.tif 000108
2004533816.tif 000109
2004533816.tif 000110
2004533816.tif 000111
2004533816.tif 000112
2004533816.tif 000113
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533816.tif 000114
【国際調査報告】
2004533816.tif 000115
2004533816.tif 000116
2004533816.tif 000117
2004533816.tif 000118
2004533816.tif 000119