(57)【要約】本出願は、固形腫瘍の部位に１つ以上の一次エフェクター分子を送達するための弱毒化腫瘍標的細菌（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）ベクターの作製ならびに使用を開示する。本発明の一次エフェクター分子は、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫などの固形腫瘍癌を治療するために本発明の方法において用いられる。本発明は、宿主に全身投与する場合には毒性でありうるエフェクター分子を、宿主への毒性を低下させた弱毒化腫瘍標的細菌によって腫瘍に局所送達できるという驚くべき知見に関する。本出願はまた、一次エフェクター分子と共に弱毒化腫瘍標的細菌によって送達され得る１つ以上の任意のエフェクター分子（二次エフェクター分子と呼ばれる）の送達を開示する。
2004500042.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む、通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２】
１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む、通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項３】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項４】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、またはＡＩＴＲ−Ｌである、請求項３に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項５】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが抗血管新生因子である、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項６】
抗血管新生因子が、エンドスタチン、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の抗血管新生２４アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストである、請求項５に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項７】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがバクテリオシンファミリーのメンバーであるが、ただし、該バクテリオシンはＢＲＰでない、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項８】
バクテリオシンファミリーのメンバーが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１もしくはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ビブリオシン、またはミクロシンＭ１５である、請求項７に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項９】
一次エフェクター分子が腫瘍阻害酵素である、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１０】
腫瘍阻害酵素が、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼ、またはグリコシダーゼである、請求項９に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１１】
一次エフェクター分子がヘモリシン、ベロ毒素、ＣＮＦ１、ＣＮＦ２、またはＰＭＴである、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１２】
一次エフェクター分子が動物、植物、細菌、またはウイルスに由来するものである、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１３】
二次エフェクター分子が免疫調節剤、抗腫瘍タンパク質、プロドラッグ変換酵素、アンチセンス分子、リボザイム、または抗原である、請求項２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１４】
弱毒化腫瘍標的細菌がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項１または２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１５】
弱毒化腫瘍標的細菌が増強された放出系をさらに含む、請求項１に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１６】
二次エフェクター分子がバクテリオシン放出因子（ＢＲＰ）である、請求項２に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１７】
１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む、通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌であって、該融合タンパク質がシグナル配列とエフェクター分子からなる、上記弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１８】
１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む、通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌であって、該融合タンパク質がフェリーペプチドとエフェクター分子からなる、上記弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項１９】
融合タンパク質がシグナル配列をさらに含む、請求項１８に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２０】
シグナル配列がＯｍｐＡ様タンパク質である、請求項１７または１９に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２１】
フェリーペプチドが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヘキサヒスチジン、ヘキサリシン、またはヘキサアルギニンから誘導される、請求項１３または１９に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２２】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項１７、１８または１９に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２３】
弱毒化腫瘍標的細菌が、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項１７、１８または１９に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２４】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項２３に記載の弱毒化腫瘍標的細菌。
【請求項２５】
製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物。
【請求項２６】
製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、またはＡＩＴＲ−Ｌである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが抗血管新生因子である、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
抗血管新生因子が、エンドスタチン、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の抗血管新生２４アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがバクテリオシンファミリーのメンバーであるが、ただし、該バクテリオシンはＢＲＰでない、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
バクテリオシンファミリーのメンバーが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１もしくはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ビブリオシン、またはミクロシンＭ１５である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
一次エフェクター分子が腫瘍阻害酵素である、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
腫瘍阻害酵素が、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼ、またはグリコシダーゼである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
少なくとも１つの一次エフェクター分子がヘモリシン、ベロ毒素、ＣＮＦ１、ＣＮＦ２、またはＰＭＴである、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
一次エフェクター分子が動物、植物、細菌、またはウイルスに由来するものである、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
二次エフェクター分子が免疫調節剤、抗腫瘍タンパク質、プロドラッグ変換酵素、アンチセンス分子、リボザイム、または抗原である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
弱毒化腫瘍標的細菌がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項２５または２６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
弱毒化腫瘍標的細菌が増強された放出系をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
二次エフェクター分子がバクテリオシン放出因子である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物であって、該融合タンパク質がシグナル配列とエフェクター分子からなる、上記医薬組成物。
【請求項４２】
製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物であって、該融合タンパク質がフェリーペプチドとエフェクター分子からなる、上記医薬組成物。
【請求項４３】
融合タンパク質がシグナル配列をさらに含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
シグナル配列がＯｍｐＡ様タンパク質である、請求項４１または４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
フェリーペプチドが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヘキサヒスチジン、ヘキサリシン、またはヘキサアルギニンから誘導される、請求項４２または４３に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項４１、４２または４３に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
弱毒化腫瘍標的細菌が、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項４１、４２または４３に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
固形腫瘍癌の治療のために、そのような治療が必要な被験者に、１つ以上の一次エフェクター分子を送達する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項４９】
固形腫瘍癌の治療のために、そのような治療が必要な被験者に、１つ以上の一次エフェクター分子と１つ以上の二次エフェクター分子を送達する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項５０】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、またはＡＩＴＲ−Ｌである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが抗血管新生因子である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５３】
抗血管新生因子が、エンドスタチン、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の抗血管新生２４アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがバクテリオシンファミリーのメンバーであるが、ただし、該バクテリオシンはＢＲＰでない、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５５】
バクテリオシンファミリーのメンバーが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１もしくはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ビブリオシン、またはミクロシンＭ１５である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが腫瘍阻害酵素である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５７】
腫瘍阻害酵素が、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼ、またはグリコシダーゼである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがヘモリシン、ベロ毒素、ＣＮＦ１、ＣＮＦ２、またはＰＭＴである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５９】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが動物、植物、細菌、またはウイルスに由来するものである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項６０】
二次エフェクター分子の少なくとも１つが抗腫瘍タンパク質、プロドラッグ変換酵素、アンチセンス分子、リボザイム、または抗原である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
弱毒化腫瘍標的細菌がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項６２】
弱毒化腫瘍標的細菌が増強された放出系をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
二次エフェクター分子がバクテリオシン放出因子である、請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
固形腫瘍癌の治療のために、そのような治療が必要な被験者に、１つ以上の融合タンパク質を送達する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を投与することを含んでなり、該融合タンパク質がシグナル配列とエフェクター分子からなる、上記方法。
【請求項６５】
固形腫瘍癌の治療のために、そのような治療が必要な被験者に、１つ以上の融合タンパク質を送達する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を投与することを含んでなり、該融合タンパク質がフェリーペプチドとエフェクター分子からなる、上記方法。
【請求項６６】
融合タンパク質がシグナル配列をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
シグナル配列がＯｍｐＡ様タンパク質である、請求項６４または６６に記載の方法。
【請求項６８】
フェリーペプチドが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヘキサヒスチジン、ヘキサリシン、またはヘキサアルギニンから誘導される、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６９】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項６４、６５または６６に記載の方法。
【請求項７０】
弱毒化腫瘍標的細菌が、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項６４、６５または６６に記載の方法。
【請求項７１】
動物の固形腫瘍癌を治療する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物、および１つ以上の化学療法剤を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項７２】
動物の固形腫瘍癌を治療する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物、および１つ以上の化学療法剤を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項７３】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、またはＡＩＴＲ−Ｌである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが抗血管新生因子である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７６】
抗血管新生因子が、エンドスタチン、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の抗血管新生２４アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがバクテリオシンファミリーのメンバーであるが、ただし、該バクテリオシンはＢＲＰでない、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７８】
バクテリオシンファミリーのメンバーが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１もしくはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ビブリオシン、またはミクロシンＭ１５である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
一次エフェクター分子の少なくとも１つが腫瘍阻害酵素である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項８０】
腫瘍阻害酵素が、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡアーゼ、またはグリコシダーゼである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
一次エフェクター分子の少なくとも１つがヘモリシン、ベロ毒素、ＣＮＦ１、ＣＮＦ２、またはＰＭＴである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項８２】
一次エフェクター分子が動物、植物、細菌、またはウイルスに由来するものである、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項８３】
二次エフェクター分子が免疫調節剤、抗腫瘍タンパク質、プロドラッグ変換酵素、アンチセンス分子、リボザイム、または抗原である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
弱毒化腫瘍標的細菌がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）である、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項８５】
弱毒化腫瘍標的細菌が増強された放出系をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８６】
二次エフェクター分子がバクテリオシン放出因子である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８７】
動物の固形腫瘍癌を治療する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物、および１つ以上の化学療法剤を投与することを含んでなり、該融合タンパク質がシグナル配列とエフェクター分子からなる、上記方法。
【請求項８８】
動物の固形腫瘍癌を治療する方法であって、製薬上許容される担体と、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含む通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物、および１つ以上の化学療法剤を投与することを含んでなり、該融合タンパク質がフェリーペプチドとエフェクター分子からなる、上記方法。
【請求項８９】
融合タンパク質がシグナル配列をさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
シグナル配列がＯｍｐＡ様タンパク質である、請求項８７または８９に記載の方法。
【請求項９１】
フェリーペプチドが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヘキサヒスチジン、ヘキサリシン、またはヘキサアルギニンから誘導される、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９２】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項８７、８８または８９に記載の方法。
【請求項９３】
弱毒化腫瘍標的細菌が、１つ以上のプロモーターに機能的に連結された１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項８７、８８または８９に記載の方法。
【請求項９４】
動物の固形腫瘍癌を治療する方法であって、製薬上許容される担体と弱毒化腫瘍標的細菌とを含有する医薬組成物、および１つ以上の化学療法剤を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項９５】
ＯｍｐＡ様タンパク質およびエフェクター分子からなる融合タンパク質。
【請求項９６】
シグナル配列、フェリーペプチドおよびエフェクター分子からなる融合タンパク質。
【請求項９７】
シグナル配列がＯｍｐＡ様タンパク質である、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項９８】
フェリーペプチドが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ヘキサヒスチジン、ヘキサリシン、またはヘキサアルギニンから誘導される、請求項９６に記載の融合タンパク質。
【請求項９９】
エフェクター分子が一次または二次エフェクター分子である、請求項９５または９６に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は１９９９年１０月４日出願の米国仮特許出願６０／１５７，５００、６０／１５７，５８１、及び６０／１５７，６３７に対する優先権を主張し、それらの各々の内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、固形腫瘍を治療又は阻害するための、固形腫瘍への１種以上の一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）の送達に関する。特には、本発明は、適切な作用部位、例えば、固形腫瘍の部位に１種以上の一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）を送達するためのベクターとしての弱毒化腫瘍標的細菌（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、の調製及び使用に関する。特には、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌は、１種以上の一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）をコードするように改変されている通性好気性菌又は通性嫌気性菌である。本発明の一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）には、ＴＮＦサイトカイン・ファミリーのメンバー、抗血管新生因子、及び細胞傷害性ポリペプチドもしくはペプチドが含まれる。本発明の一次エフェクター分子は、例えば、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫、又はこれらの腫瘍から誘導される転移物のような固形腫瘍癌の治療に有用である。本発明は、さらに、一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）、例えば、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗血管新生因子、及び細胞傷害性ポリペプチドもしくはペプチドを、宿主に対する毒性及び免疫学的合併症を低下させた弱毒化腫瘍標的細菌によって腫瘍に局所送達できるという驚くべき発見に関する。また、本発明は、一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）と共に弱毒化腫瘍標的細菌によって送達することができる１種以上の任意のエフェクター分子（１種もしくは複数種）（「二次エフェクター分子」と呼ばれる）の送達にも関する。この二次エフェクター分子（１種もしくは複数種）はさらなる抗腫瘍治療活性を提供し、弱毒化腫瘍標的細菌からの一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）の放出を増強し、及び／又は適切な作用部位、例えば、固形腫瘍の部位での一次エフェクター分子（１種もしくは複数種）の取り込みを増強する。
【０００３】
２．発明の背景
新生物、すなわち腫瘍は異常な細胞の増殖の結果生じる新生物塊であり、良性又は悪性であり得る。良性腫瘍は、一般には、局在したままである。悪性腫瘍は、一般には、隣接体組織に浸潤してそれを破壊する潜在能力を有し、離れた部位まで広がって死を引き起こす（レビューには、Ｒｏｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ， １９７６， Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２ｄ Ｅｄ， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ｐｐ．６８−１２２ を参照）。腫瘍は、ある器官もしくは組織から別のものに広がったときに転移していると言われる。
【０００４】
固形腫瘍癌の化学療法における主な問題は、同時に正常細胞に対する損傷を最小にしながらの、腫瘍細胞を根絶するのに十分な濃度での治療作用物質、例えば、薬物の送達である。したがって、多くの研究室における研究は生物学的送達系、例えば、薬物を標的送達するための抗体、サイトカイン、及びウイルス、プロドラッグ変換酵素、及び／又は腫瘍細胞に入れる遺伝子の設計に向けられている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−１１０ を参照）。
【０００５】
２．１．細胞性免疫及びサイトカイン
癌を治療するための方策の１つは、細胞性免疫応答を増強又は活性化することを含む。自己腫瘍に向けられた細胞性免疫応答をうまく誘導することで従来の化学療法を上回る幾つかの利点が得られる：１）免疫認識は高度に特異的であり、排他的に腫瘍に向かう；２）免疫監視によって転移部位での増殖を抑制することができる；３）免疫応答及び認識の多様性は腫瘍細胞によって用いられる異なる耐性機構を補償することができる；４）細胞傷害性Ｔ細胞のクローン性増殖が増殖する腫瘍よりも迅速に起こり得、その結果として最終的に腫瘍を征圧する抗腫瘍機構が生じる；及び５）記憶応答が、物理的な検出の前に、疾患の再発をその最初期段階で抑制することができる。応答を示す患者の臨床的研究は、成功する免疫療法が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、及びＮＫ細胞の関与について証拠が存在するものの、ＣＤ８＋Ｔ細胞（クラスＩ応答）の活性化を含むことを示す動物モデルからの結果を支持している。例えば、Ｃｈａｐｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６１：６９７７−６９８４；Ｇｏｌｌｕｂ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２：５６１−５７５；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８０：．４２５−４３０；Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｉｎｔ． Ｊ， Ｃａｎｃｅｒ ８０：４２５−４３０；Ｓａｆｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：３２１−３３０；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９：２８４−２９０を参照のこと。
【０００６】
２．２．サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー
ＴＮＦファミリーの最も特徴付けられたメンバーはＴＮＦ−αである。ＴＮＦ−αは免疫系に対して多面的な効果を発揮することが知られている。ＴＮＦ−αは腫瘍細胞に対して強力な細胞傷害性効果を直接発揮することができるサイトカインである。ＴＮＦ−αは、一般には、他の機構、例えば、増殖及び分化の刺激、並びに単球におけるアポトーシスの防止（例えば、Ｍａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：１５４１−１５４６；及びＯｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：４１８５−４１９１を参照）、最終的には腫瘍内での血餅形成につながる、組織因子様凝血原活性の促進及び内皮細胞表面抗凝血活性の抑制（Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ， １９８９， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：６２５−６５５；及びＶａｓｓａｌｌｉ， Ｐ．， １９９２， Ａｎｎ， Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：４１１−４５２においてレビューされている）。しかしながら、これらの特性の結果として、汎発性血管内凝血のため、ＴＮＦ−αの全身投与は宿主に致命的な結果を生じる。
【０００７】
他のサイトカインも抗腫瘍応答に関連付けられている。ＩＬ−２はクラスＩサイトカインであり、やはり抗腫瘍応答において役割を果たすものと考えられている。例えば、自発的に退行する黒色腫はＴＮＦ−α及びＩＬ−２の腫瘍内レベルの上昇に関連付けられている。例えば、Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｃｅｒａｍｉ， １９８９， Ａｎｎｕ， Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７；６２５−６５５；Ｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０８：９１４−９１９；Ｍａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：１５４１−１５４６；Ｓｃｈｅｒｕｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：１７８６−１７９０を参照のこと。
【０００８】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の両者はリンパ球の帰巣（ｈｏｍｉｎｇ）を助け、ＩＬ−２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ−細胞、及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の腫瘍浸潤を誘発することが示されている（例えば、Ｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １０：３９５−４０３；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｌｏｏｄ ８９：３８３７−４６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ｅｘｐ， Ｎｅｕｒｏｌ． ５６：５４１−５０；Ｖｏｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０５：１５５−６２；Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：３２６−３５；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４７， ５３２−５４０；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎ． １５：８７−９７；及びＷａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５０：１８６９−８０を参照）。ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の両者の存在下においては、ＴＮＦ非感受性細胞株に向けられたときでさえ、ＮＫ及びＬＡＫ細胞の細胞溶解活性が増加する（例えば、Ｏｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：４１８５−４１９１を参照）。しかしながら、ＩＬ−２の治療用レベルは宿主に対して毒性であることも示されている。
【０００９】
明らかに、全身サイトカイン投与に起因する用量制限性の毒性は癌治療におけるサイトカインの潜在能力の実現に重大な障壁を突きつける。さらに、全身性のサイトカイン送達は、望ましくない臨床的副作用に加えて、同系Ｔ細胞の帰巣の減少を生じ、したがって、標的免疫治療に対立することがある。Ａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：１４００−１４０９；Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３：１２７７−１２８８；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７８２６−７８３１；Ｂｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ９２：５０−５９；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２４：８８−９２；Ｄ’Ａｎｇｅｌｉｃａ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４７：２６５−２７１；Ｄｅｓｚｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２：１５４３−１５５２；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４７：５３２−５４０；Ｏｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：４１８５−４ｌ９１；及びＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４：２６３５−２６４５を参照のこと。
【００１０】
２．３．サイトカインの送達
近年の実験的動物及び臨床研究では、サイトカインの亜全身性（ｓｕｂ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）又は代替送達方法により、サイトカインの全身毒性を回避し、かつより高用量を投与する試みがなされている。ネズミモデルにおいては、膜融合リポソーム封入ＴＮＦ−α遺伝子の投与、及び腫瘍脈管構造に局在し得るポリエチレングリコール封入ＴＮＦ−αの全身投与で肉腫−１８０腫瘍が治療されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８７：１０７８−１０８５を参照）。内皮単球活性化ポリペプチドＩＩによるＴＮＦ−αに対する腫瘍の感作も報告されている（Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｓｕｒｇ， Ｒｅｓ． ６３：２４８−２５５；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５９：２０５−２１２）。
【００１１】
臨床研究において、インターフェロン−α又はメルファランと組み合わせた隔離肢灌流（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｉｍｂ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）による患者への高用量ＴＮＦ−αの投与の後、完全な腫瘍の根絶が観察されている。しかしながら、この技術は、治療の後にサイトカインが完全に除去されない場合、患者に重大な危険をもたらす。さらに、これらの治療は肢隔離を必要とし、これはそれ自体が患者に危険をもたらす。Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２４：５４７−５５５ Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｓｃｉ． Ａｍ． １：１２２−１３０；Ｌｅｊｅｕｎｅ ｅｔ ａｌ．， ｌ９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：５７３−５８０；Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ，， １９９６， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ． ６３：２４８−２５５；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：５７２５−５７３０；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８７：１０７８−１０８５；及びＷｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９， ２０５−２１２を参照のこと。
【００１２】
Ｃａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１７６−８１、Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ． Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ． １２：３７−４５、Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔ． Ｓｕｒｇｅｒｙ ３２：３０１−３０６による従来の研究では、ＩＬ−１β（Ｃａｒｒｉｅｒ）及びＩＬ−２（Ｓａｌｔｚｍａｎ）を自然のサルモネラ感染部位である肝臓及び脾臓に直接送達させてワクチン株としての役割を課すか、又は肝臓転移に影響を及ぼすのに弱毒化サルモネラ株の使用が報告されている。Ｓａｌｔｚｍａｎの研究ではサルモネラの経口投与が用いられ、ここでは細菌はＧＡＬＴ（腸随伴リンパ様組織（ｇｕｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）によって取り込まれ、肝臓及び脾臓に輸送される。しかしながら、これらの感染は自然の感染部位に限定される。
【００１３】
２．４．血管新生及び腫瘍形成
癌を治療するための別の方策は血管新生の阻害を含む。血管新生は既存の血管からの新規毛細血管の増殖のプロセスである。新規毛細血管は、既存血管の内皮細胞が、マトリックス・メタロプロテアーゼのようなタンパク分解酵素を用いて、それらの近傍の基底膜を分解し、増殖させ、周囲間質組織内に移動させ、微小管を形成するプロセスによって形成される。この血管新生のプロセスは負及び正の因子の相互作用によって非常に厳密に調節されており、成人においては、通常女性の生殖周期及び創傷の修復に限定される（Ｍａｌｏｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １７：１−１４）。血管新生の異常調節が、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リューマチ、心血管病、及び腫瘍形成を含む多くのヒト障害に関連付けられている（Ｆｏｌｋｍａｎ， １９９５， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２７−３１）。
【００１４】
血管新生は腫瘍の成長及び転移にとって最も重要なプロセスである。腫瘍の形成は２つの段階、前血管及び血管段階に分けられる。前血管腫瘍の細胞が血管新生化腫瘍に由来する細胞と同程度に迅速に増殖することが研究によって示されている。しかしながら、前血管腫瘍が２−３ｍｍ３を上回るまで増殖することはほとんどなく、これは細胞増殖と細胞死との間に平衡が存在するためであり、後者は前血管腫瘍の低酸素性から生じるものである（Ｆｏｌｋｍａｎ， １９９５， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２７−３１）。前血管から血管段階への切り替えには、負の因子が優勢である正味のバランスから正の因子、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が優性であるものへの血管新生の調節因子のバランスの移動を必要とする（Ｃａｏ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｍｏｌ． Ｓｕｂｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１６１−１７６）。調節因子間のバランスの移動は血管新生因子の上方調節とそれと同時の抗血管新生因子の下方調節の結果である（Ｆｏｌｋｍａｎ， １９９５， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３３：１７５７−１７６３）。
【００１５】
２．５．抗血管新生因子
原発腫瘍がそれらの転移物の増殖をしばしば阻害する結果につながる幾つかの関連する現象に基づいて、抗血管新生因子が存在するものと仮定された（Ｃａｏ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｍｏｌ． Ｓｕｂｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１６１−１７６）。単離されるべきこれらの因子のうちの第１のものはマウス・アンギオスタチン、原発Ｌｅｗｉｓ肺癌腫腫瘍によって循環中に放出され、二次転移物の増殖を防止するプラスミノーゲンの３８ｋＤａタンパク分解性断片であった（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８）。ヒトにおいては、メタロエラスターゼでのプラスミノーゲンの制限タンパク分解によって産生される４０、４２及び４５ｋＤａのペプチドがマウス・アンギオスタチンに匹敵する抗血管新生活性を有する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃｅｌｌ ７９：３１５−３２８）。プラスミノーゲンそれ自体はそのような活性を持たない。腫瘍細胞それ自体は検出可能なアンギオスタチンｍＲＮＡを持たないため、腫瘍関連マクロファージがアンギオスタチンの産生の原因であることも考えられる。マクロファージのメタロエラスターゼの発現は、腫瘍細胞によって分泌される顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によって誘導される（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ ８３：８０１−８１０）。特定の腫瘍においては、アンギオスタチン産生はメタロエラスターゼではなくセリンプロテアーゼによって触媒され、セリンプロテアーゼは腫瘍細胞によって直接産生される（Ｇａｔｅｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：４８８７−４８９０）。原発腫瘍を有する実験マウスにアンギオスタチンを１００ｍｇ／ｋｇ／日の濃度で投与することで、毒性副作用なしに腫瘍増殖の強力な阻害が生じた。このアンギオスタチン処置の中止の２週間以内に腫瘍が再増殖し、この処置の結果として腫瘍は完全に死ぬのではなく休眠状態に退行することが示される（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：６８９−６９２）。
【００１６】
アンギオスタチンの発見後、幾つかの血管新生阻害性ペプチドを含む他の血管新生阻害物質が発見され、単離された。アンギオスタチンよりも強力な血管新生の阻害物質はクリングル５（ｋｒｉｎｇｌｅ ５）、プラスミノーゲンの第５クリングル・ドメインを含むペプチドである（アンギオスタチンはクリングル・ドメイン１−４を含む）。クリングル５はプラスミノーゲンのタンパク分解によって産生することができ、組換え形態も活性である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ． ２７２：２２９２４−２２９２８）。
【００１７】
エンドスタチンはアンギオスタチンの単離に類似する方法で単離され（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ ８８：１−２０）、その源はＬｅｗｉｓ肺癌腫ではなくネズミ血管内皮腫であった。このペプチドは２０ｋＤａの見かけの分子量を有し、その配列はコラーゲンＸＶＩＩＩ、様々なコラーゲン分子の間で開散しているＮＣ１と呼ばれる領域（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４２２９−４２３３；及びＲｅｈｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４２３４−４２３８）のＣ末端に相当する（Ｏ’ＲｅｉｌＩｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ ８８：１−２０）。マウスにおいて、Ｌｅｗｉｓ肺癌腫転移物の増殖が０．３ｍｇ／ｋｇ／日の組換えエンドスタチンを投与することによって抑制され、このペプチドを２０ｍｇ／ｋｇ／日で投与したときには原発腫瘍が休眠状態に退行する。機能的組換えエンドスタチンは封入体から、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの変性及び再折り畳みにより、又はｉｎ ｖｉｖｏでの皮下投与されたエンドスタチン封入体製剤の持続性放出により、産生させることができる（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｅｌｌ ８８：１−２０）。エンドスタチン発現プラスミドを筋肉内投与することからなるエンドスタチン送達の代替法は、マウスモデル系において、腫瘍増殖の部分的阻害のみを生じる（Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：３４３−３４８）。同様に、静脈内送達された、リポソームに複合体化されたエンドスタチン又はアンギオテンシン・エンコーディングプラスミドは、乳癌のヌードマウスモデルにおいて、腫瘍増殖の部分的阻害を生じた（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：３３０８−３３１２）。
【００１８】
近年、新規抗血管新生活性がＳｅｒｐｉｎ（セリンプロテアーゼ阻害物質）抗トロンビンのＣ末端切断ペプチドに帰されている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９２６−１９２５）。完全長抗トロンビンには固有の抗血管新生活性はないが、トロンビンによるそのタンパク質のＣ末端反応性ループの開裂により、抗トロンビンは強力な血管新生活性を獲得する。以下、このタンパク分解断片を抗血管新生性抗トロンビンと呼ぶ。
【００１９】
当該技術分野において公知の他の血管新生阻害性ペプチドにはフィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端及び４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク分解断片（Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ａｍ． Ｐａｔｈｏｌ． １２０：３２７−３３２）；プロラクチンの１６ｋＤａタンパク分解断片（Ｃｌａｐｐ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３：１２９２−１２９９）；及び血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク分解断片（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７７９９−７８０３）が含まれる。
【００２０】
抗血管新生効果が示されている天然産生タンパク分解断片に加えて、公知の細胞外マトリックスタンパク質の領域に相当する幾つかの合成ペプチドが血管新生の阻害における活性について評価されている。機能的内皮阻害性物質、すなわち、血管新生阻害物質であることが示されている合成ペプチドには、血小板第４因子の断片に相当する１３アミノ酸ペプチド（Ｍａｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２０７７−２０８３）；コラーゲンＩの断片に相当する１４アミノ酸ペプチド（Ｔｏｌｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２２：４９７−５１１）；トロンボスポンジンＩの断片に相当する１９アミノ酸ペプチド（Ｔｏｌｓｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２２：４９７−５１１）；及び、ヒト黒色腫細胞における発現がｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞浸潤の減少及びｉｎ ｖｉｖｏヌードマウスモデルにおける腫瘍形成能の減少につながる分泌性のシステインに富む細胞外マトリックス糖タンパク質である（Ｌｅｄｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ， ３：１７１−１７６）ＳＰＡＲＣの断片に相当する２０アミノ酸ペプチド（Ｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：１３２９−１３３４）が含まれる。
【００２１】
血管新生を阻害し、かつラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲン、及びＥＧＦの断片に相当する１０アミノ酸未満の他のペプチドも記載されている（Ｃａｏ， １９９８， Ｐｒｏｇ． Ｍｏｌ． Ｓｕｂｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１６１−１７６ による総説を参照）。
【００２２】
血管新生を阻害する小フィブロネクチンペプチドは、一般に、モチーフＲＧＤを含む。ＲＧＤはインテグリン分子の認識とそれに結合するためにタンパク質によって用いられるペプチドモチーフ（アミノ酸Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）である。インテグリンαｖβ３の発現は血管新生性血管に関連し、モノクローナル抗体によるその活性の阻害は血管新生を遮断する（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：５６９−５７１）。これは、ＲＧＤモチーフを含む環状ペンタペプチドの投与がビトロネクチン受容体型インテグリンの活性を阻害し、網膜の血管新生を遮断することを示す研究によって確認されている（Ｈａｍｍｅｓ ｅｔ ａｌ，， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：５２９−５３３）。インテグリン・ブロッカー、例えば、環状ペンタペプチド及びモノクローナル抗体の抗血管新生効果は、血管新生性血管のアポトーシスを誘導することにより腫瘍の退行を促進することが示されている（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｃｅｌｌ ７９：１１５７−１１６４）。ＲＧＤモチーフ、及び他のインテグリン結合性モチーフＮＧＲ（アミノ酸Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ）を含むペプチドは顕著に強化された抗腫瘍活性を示した。
【００２３】
別のタイプの細胞表面受容体、すなわち、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）受容体の活性の阻害も血管新生の阻害を生じる。ｕＰＡ受容体は、リガンドの結合により、血管新生の基底膜浸潤工程に必要なタンパク分解カスケードを開始する。受容体アンタゴニストによるｕＰＡ受容体の阻害は血管新生、腫瘍増殖（Ｍｉｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２４２８−２４３３）及び転移（Ｃｒｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９０：５０２１−５０２５）を阻害する。そのようなアンタゴニストは無作為ペプチドのバクテリオファージ・ペプチド表示によって同定されている（Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７１２９−７１３３）。受容体のリガンド、ｕＰＡの優性ネガティブ形態も同定されている（Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２４２８−２４３３）。
【００２４】
アンギオスタチン、エンドスタチン及び他の抗血管新生ペプチドの発見は癌治療の刺激的な新規アプローチをもたらしたものの、これらのペプチドを１つ以上を含む治療課程の実態は、ペプチドの大量産生の非現実性（６５ｋｇ、すなわち１４３ｌｂの平均的な人物について、ペプチドによっては毎日約１．３又は６．５グラムのタンパク質を生成するコスト及び／又は労力から生じる）及び治療の持続期間（腫瘍を退行状態に留めるには持続しなければならない）である。これらのペプチドをそのように多量に投与しなければならない２つの主な理由は、第１に、大部分が血流中で分解し、第２に、分解を免れた分子のうち、非常に限定された部分のみが腫瘍まで到達する。したがって、抗血管新生タンパク質又はペプチドをより効率的に腫瘍部に、かつより対費用効果が高くて患者に優しい方法で送達することができれば、腫瘍治療の分野にとって非常に利点がある。
【００２５】
２．６．バクテリオシン・ファミリー
コリシンＥ３（以下、ＣｏｌＥ３と呼ぶ）はバクテリオシン、すなわち、選択的活性を有するバクテリアタンパク質性毒素であり、その宿主はその毒素に対して免役される。バクテリオシンは宿主ゲノム又はプラスミドによってコードされ得、広範な、もしくは狭い範囲の宿主を有することができ、かつ１つもしくは２つのサブユニットを含む単純構造又は多サブユニット構造を有することができる（Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４）。加えて、バクテリオシン宿主はバクテリオシンに対する免疫を有する。この免疫は、バクテリオシンを発現しないとしても、所定の宿主集団の全ての細胞において見いだされる。
【００２６】
ＣｏｌＥ３の細胞傷害性はそのタンパク質合成の阻害から生じる（Ｎｏｍｕｒａ， １９６３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２８：３１５−３２４）。ＣｏｌＥ３活性の標的は細菌リボソームの１６Ｓ成分（これは、３０Ｓ及び７０Ｓリボソームに共通である）であり（Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９７１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ６８：９６４−９６８）、その活性はリボソームの分解を生じる（Ｍｅｙｈａｃｋ， １９７０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）。ＣｏｌＥ３の活性はＲＮＡ分解酵素のうちで独特であり、ＲＮＡの全体的な分解は生じないが、ｍＲＮＡ分子を末端から４９ヌクレオチドで開裂し、ｍＲＮＡからのｔＲＮＡの分離と、それによる翻訳の阻害を生じる。ＣｏｌＥ３のリボヌクレアーゼ活性は、他のタンパク質が介在するのではなく、その分子それ自体にある（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， １９７８， Ｎａｔｕｒｅ ２７４：１１３−１１４）。ＣｏｌＥ３は標的細胞の内膜及び外膜を通過することもできる。
【００２７】
その天然形態において、ＣｏｌＥ３は１：１比の５０ｋＤａ及び１０ｋＤａタンパク質からなる６０ｋＤａタンパク質複合体であり、大きいサブユニットはヌクレアーゼ活性を有し、小さいサブユニットは５０ｋＤａサブユニットの阻害機能を有する。したがって、５０ｋＤａタンパク質は細胞傷害性タンパク質（すなわち、毒素）として作用し、１０ｋＤａタンパク質は抗毒素として作用する。５０ｋＤａサブユニットは少なくとも２つの機能的ドメイン、標的細胞膜を横切っての転位に必要なＮ末端領域、及び触媒（ＲＮＡ分解酵素）活性を有するＣ末端領域を含む。宿主生物内で、大サブユニットの活性は小サブユニットによって阻害される。これらのサブユニットは、その毒素が標的細胞内に侵入したときに、標的細胞の外膜との相互作用の結果として解離するものと考えられる（Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４による総説）。
【００２８】
ＣｏｌＥ３の大サブユニットの毒性は微生物のうちでのクローン化遺伝子の外側拡散の防止に利用されている。Ｄｉａｚら（１９９４， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３：８５５−８６１）は、ＣｏｌＥ３のこれら２つの成分を、小（抗毒性）サブユニットが染色体に統合されたコーディング配列として発現し、大サブユニットがプラスミドから発現されるように分離した。染色体に組み込まれた小サブユニットを有する細菌はＣｏｌＥ３大サブユニットを発現するプラスミドに対して免疫されているが、そのプラスミドが小サブユニットを欠く別のレシピエントに向けて外部に搬送された場合、その細胞は殺される。
【００２９】
コリシンＥ３（ＣｏｌＥ３）は、白血病細胞モデル系（Ｆｉｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ ３５；４０６−４０７を参照）を含む哺乳動物細胞に対する大きな細胞傷害性効果を有することも示されている（Ｓｍａｒｄａ， ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２３：２７２−２７７を参照）。ＣｏｌＥ３の活性は８０Ｓ哺乳動物リボソームの４０Ｓサブユニットを標的とする（Ｔｕｍｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ５２：３２７−３３４）。
【００３０】
２．７．細菌の感染及び癌
初期の臨床観察で、細菌が感染した患者においてある種の癌が退行することが報告された症例が報告された。Ｎａｕｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９５３， Ａｃｔａ Ｍｅｄｉｃａ． Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ １４５：１−１０２， （Ｓｕｐｐｌ． ２７６）；及びＳｈｅａｒ， １９５０， Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ． １４２：３８３−３９０を参照のこと。これらの観察以来、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８４７−１８５１（Ｌｅｅら）及びＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｉｎｆｅｃｔ， Ｉｍｍｕｎ． ６０：２４７５−２４８０（Ｊｏｎｅｓら）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで野生型株よりもかなり多くの数がＨＥｐ−２（ヒト類表皮癌腫）細胞に浸潤し得るサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の突然変異体を単離した。これらの「過剰浸潤性（ｈｙｐｅｒｉｎｖａｓｉｖｅ）」突然変異体は、ＨＥｐ−２動物細胞に浸潤する野生型株の能力を通常は抑制する細菌の好気性増殖の条件下で単離した。しかしながら、Ｌｅｅら及びＪｏｎｅｓらによって記載されるような過剰浸潤性サルモネラ菌には汎浸潤性（ｐａｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）感染の危険性があり、癌患者に広範に広がる細菌感染につながる可能性がある。
【００３１】
Ｃａｒｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：３６６６−３６６９は、ウシ型弱毒結核菌ワクチン（ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）を注射したマウスでＴＮＦの血清濃度が増加し、ＴＮＦ陽性血清がマウスにおいて肉腫Ｍｅｔｈ Ａ及び他の移植腫瘍の壊死を生じたことを示した。このような観察の結果として、ＢＣＧ注射での癌患者の免疫化が現在幾つかの癌治療プロトコルにおいて用いられている。ＢＣＧ治療のレビューには、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ， １９９４， Ｃｏｍｐｒ． Ｔｈｅｒ． ２０：６９５−７０１；Ｂａｒｔｈ ａｎｄ Ｍｏｒｔｏｎ， １９９５， Ｃａｎｃｅｒ ７５ （Ｓｕｐｐｌ． ２）：７２６−７３４；Ｆｒｉｂｅｒｇ， １９９３， Ｍｅｄ． Ｏｎｃｏｌ． Ｔｕｍｏｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ， １０：３１−３６を参照のこと。
【００３２】
しかしながら、ＴＮＦ−α介在敗血症性ショックが細菌に関連する主な懸念のうちにあり、宿主にとって毒性もしくは致命的な結果を有する可能性がある（Ｂｏｎｅ， １９９２， ＪＡＭＡ ２６８：３４５２−３４５５；Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， ＪＡＭＡ ２６９：１８２９−１８３５）。さらに、ＴＮＦ−αの用量制限性の全身毒性は有効な臨床使用の主要な障壁であった。ＴＮＦ−αのレベルが毒性ではなく、治療用ベクターのより有効な濃度及び／又は持続期間を用いることができれば、この形態の免疫応答を低下させる改変は有用であろう。
【００３３】
２．８．腫瘍標的細菌
遺伝子操作されたサルモネラが、腫瘍を標的とすることが可能であり、抗腫瘍活性を有し、かつ固形腫瘍へのエフェクター遺伝子、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）の送達において有用であることが示されている（Ｐａｗｅｌｅｋ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９６／４０２３８）。
【００３４】
２．９．改変細菌リピドＡによるＴＮＦ−αの誘導の減少
ＴＮＦα産生の誘導が減少する結果として免疫応答を変化させる腫瘍標的細菌の脂質組成を改変することがＰａｗｅｌｅｋら（Ｐａｗｅｌｅｋ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ９６／４０２３８）によって示唆された。Ｐａｗｅｌｅｋらは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）産生の責を負うロードバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）から遺伝子を単離するための方法を提供した。ＭＬＡは敗血症性ショックのアンタゴニストとして作用する。また、Ｐａｗｅｌｅｋらは、リピドＡ生合成における第３酵素ＵＤＰ−３−Ｏ（Ｒ−３０ヒドロキシルミリストイル）−グルコサミン−アシルトランスフェラーゼをコードする突然変異ｆｉｒＡ（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ， ２６８；１９８６６−１９８７４）を含む、リピドＡ生合成経路における遺伝子的改変の使用を提案した。Ｐａｗｅｌｅｋらは、ｆｉｒＡ遺伝子における突然変異が低レベルのＴＮＦαを誘導することを示した。
【００３５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、リピドＡの末端ミリスチル化の原因である遺伝子ｍｓｂＢ（ｍｌｔ）が同定されている（Ｅｎｇｅｌ， ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４：６３９４−６４０３；Ｋａｒｏｗ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ １９９２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ． １７４：７０２−７１０；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：３５９−３６５）。この遺伝子の遺伝子的破壊は安定な無条件的突然変異を生じ、これはＴＮＦαの誘導を低下させる（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，， １９９６， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：３５９−３６５；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＷＯ ９７／２５０６１）。しかしながら、これらの参考文献は、腫瘍標的サルモネラベクターにおけるｍｓｂＢ遺伝子の破壊が、病原性が低く、かつキレート剤に対してより感受性である細菌を生じるであろうことを示唆してはいない。
【００３６】
細菌を遺伝子送達ベクターとして用いることに関連する問題は、正常哺乳動物細胞を直接殺す細菌の一般的な能力に加えて、宿主にとって毒性の結果を有するＴＮＦαを介して免疫系を過剰刺激するそれらの能力に集中している（Ｂｏｎｅ， １９９２， ＪＡＭＡ ２６８：３４５２−３４５５；及びＤｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， ＪＡＭＡ ２６９：１８２９−１８３５）。これらの要素に加えて、抗生物質に対する耐性は、ヒト体内での細菌の存在との対処を非常に複雑にする可能性がある（Ｔｓｃｈａｐｅ， １９９６， Ｄ Ｔ Ｗ Ｄｔｓｃｈ Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １９９６ １０３：２７３−７；Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｅｎｆｅｒｍ Ｉｎｆｅｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｃｌｉｎ． １４：３４５−５１）。
【００３７】
Ｈｏｎｅ ａｎｄ Ｐｏｗｅｌｌ、Ｗ０９７／１８８３７（「Ｈｏｎｅ及びＰｏｗｅｌｌ」）は、非発熱性リピドＡ又はＬＰＳを有するグラム陰性細菌を産生する方法を開示している。
【００３８】
Ｍａｓｋｅｌｌ、Ｗ０９８／３３９２３は、ＴＮＦαを野生型株と比較して低レベルで誘導するｍｓｂＢ遺伝子内の突然変異を有するサルモネラの突然変異株を記載している。
【００３９】
Ｂｅｒｍｕｄｅｓら、ＷＯ ９９／１３０５３は、サルモネラにおけるｍｓｂＢ遺伝子を遺伝子的に破壊するための組成物及び方法を教示し、これは、野生型と比較してＴＮＦαを誘発する能力に劣り、かつ病原性が低いサルモネラを生じる。ある種の態様においては、幾つかのそのような突然変異体サルモネラは野生型サルモネラと比較してキレート剤に対する感受性を高めた。Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １７：３７−４７も参照のこと。
【００４０】
セクション２又は本願のあらゆるセクションにおけるあらゆる参考文献の引用又は同定は、そのような参考文献が本発明に対する従来技術として利用可能であることを承認するものであると解釈されるべきではない。
【００４１】
３．発明の概要
本発明は、固形腫瘍に１つ以上の一次エフェクター分子を送達する方法を提供する。一つの実施形態において、この方法は高レベルの１つ以上の一次エフェクター分子の送達を提供する。特に、本発明は、宿主に全身投与した場合には毒性であるか望ましくない作用（例えば、望ましくない免疫作用）を誘導しうる一次エフェクター分子を、宿主への毒性を低下させたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のような弱毒化腫瘍標的細菌によって腫瘍に局所送達する方法を提供する。本発明は、１つ以上の一次エフェクター分子および場合により１つ以上の二次エフェクター分子を、適当な作用部位（例えば、固形腫瘍部位）に送達するためのベクターとしての弱毒化腫瘍標的細菌（例えば、サルモネラ）の作製ならびに使用を包含する。詳細には、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌は、１つ以上の一次エフェクター分子および場合により１つ以上の二次エフェクター分子をコードするように遺伝子操作された通性好気性菌または通性嫌気性菌である。
【００４２】
本発明は、固形腫瘍の部位で一次エフェクター分子をコードする核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。特定の実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌は１つの一次エフェクター分子をコードする核酸分子を発現するように遺伝子操作される。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態に従うと、１つの細菌株が固形腫瘍の部位で１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。別の実施形態においては、２つ以上の弱毒化腫瘍標的細菌株が１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態の様式では、弱毒化腫瘍標的細菌株が同一の種のものである。この実施形態の別の様式では、弱毒化腫瘍標的細菌株が異なる種（例えば、リステリア属とサルモネラ属）のものである。
【００４３】
本発明の一次エフェクター分子は癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫などの固形腫瘍癌を治療するのに有用である。本明細書中で用いる「固形腫瘍の治療」または「固形腫瘍を治療する」とは、腫瘍もしくは腫瘍細胞の増殖を阻害すること、腫瘍の体積を縮小すること、腫瘍細胞を殺すこと、または腫瘍細胞の広がり（転移）を防止することを包含する。特定の実施形態において、本発明の一次エフェクター分子は腫瘍部位で局所免疫応答を引き出して、結果的に腫瘍もしくは腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞を死滅させ、または腫瘍細胞の他の身体部分への転移を防止する。したがって、一次エフェクター分子は腫瘍治療効果をもたらす。
【００４４】
一次エフェクター分子は、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、ウイルスを含むがこれらに限らない、あらゆる既知の生物から誘導することができる。本発明の一実施形態の好ましい様式において、一次エフェクター分子は哺乳動物に由来するものである。この実施形態のより好ましい様式では、一次エフェクター分子はヒト由来のものである。本発明の一次エフェクター分子としては、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗血管新生因子、細胞傷害性ポリペプチドもしくはペプチド、腫瘍阻害酵素、およびこれらの機能性断片が挙げられる。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明の一次エフェクター分子はＴＮＦファミリーのメンバーまたはその機能性断片である。ＴＮＦファミリーのメンバーの例として、制限するものではないが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α（リンホトキシンα）、ＬＴ−β（リンホトキシンβ）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド）、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ２７リガンド）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ３０リガンド）、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導性リガンド）、ＬＩＧＨＴ（活性化Ｔ細胞により産生される２９ｋＤａタイプＩＩ膜貫通タンパク質）、ＴＬ１（腫瘍壊死因子様サイトカイン）、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１７、およびＡＩＴＲ−Ｌ（活性化により誘導されるＴＮＦＲファミリーのメンバーのリガンド）がある。好ましい実施形態において、本発明の一次エフェクター分子は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、またはこれらの機能性断片である。
【００４６】
別の特定の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は抗血管新生因子またはその機能性断片である。抗血管新生因子の例として、制限するものではないが、エンドスタチン、アンギオスタチン、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の抗血管新生２４アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、ならびにインテグリンαｖβ３およびＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストがある。本発明の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子はエンドスタチン、アポミグレンまたはトロンボスポンジンＩの機能性断片である。
【００４７】
別の特定の実施形態において、本発明の一次エフェクター分子は細胞傷害性ポリペプチドもしくはペプチド、またはその機能性断片である。細胞傷害性ポリペプチドもしくはペプチドの例として、制限するものではないが、バクテリオシンファミリーのメンバー、ベロ毒素、細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１）、細胞傷害性壊死因子２（ＣＮＦ２）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｏｃｉｄａ毒素（ＰＭＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素、ヘモリシン、ファルネシルトランスフェラーゼの強力な競合阻害剤であるＣＡＡＸテトラペプチド、サイクリン阻害剤、Ｒａｆキナーゼ阻害剤、ＣＤＣキナーゼ阻害剤、カスパーゼ、ｐ５３、ｐ１６およびｐ２１がある。好ましい実施形態では、一次エフェクター分子はバクテリオシンファミリーのメンバーであるが、ただし、バクテリオシンファミリーのメンバーはバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）ではない。バクテリオシンファミリーのメンバーの例として、制限するものではないが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１もしくはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、およびビブリオシンがある。特定の実施形態において、一次エフェクター分子はコリシンＥ３である。
【００４８】
別の特定の実施形態において、本発明の一次エフェクター分子は腫瘍阻害酵素またはその機能性断片である。腫瘍阻害酵素の例として、制限するものではないが、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ（ｃｏｌＥ３を除く）、ＤＮＡアーゼ、およびグリコシダーゼがある。好ましい実施形態では、一次エフェクター分子はメチオナーゼである。
【００４９】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌（例えば、サルモネラ）により固形腫瘍に１つ以上の一次エフェクター分子と１つ以上の二次エフェクター分子を局所組合せ送達するための方法を提供する。特定の実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌は１つの一次エフェクター分子と１つの二次エフェクター分子をコードする１つの核酸分子を発現するように遺伝子操作される。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は１つ以上の一次エフェクター分子と１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態に従うと、１つの細菌株が固形腫瘍の部位で１つ以上の一次エフェクター分子と１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。別の実施形態においては、２つ以上の弱毒化腫瘍標的細菌株が固形腫瘍の部位で１つ以上の一次エフェクター分子と１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態の様式では、弱毒化腫瘍標的細菌株が同一の種のものである。この実施形態の別の様式では、弱毒化腫瘍標的細菌株が異なる種（例えば、リステリア属とサルモネラ属）のものである。
【００５０】
本発明の二次エフェクター分子は、追加の抗腫瘍治療活性をもたらし、弱毒化一次エフェクター分子に加えて、本発明の方法により送達されて標的細菌からの一次エフェクター分子の放出を促進し、そして／また、作用部位（例えば、固形腫瘍の部位）での内在化を高める。本発明の二次エフェクター分子は、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫などの固形腫瘍癌を治療するために、一次エフェクター分子に加えて、本発明の方法により送達される分子（例えば、細胞毒素、酵素、バクテリオシンを含むがこれに限らない抗腫瘍タンパク質、プロドラッグ変換酵素、アンチセンス分子、リボザイム、抗原など）からなる。
【００５１】
二次エフェクター分子は、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、ウイルスを含むがこれらに限らない、あらゆる既知の生物から誘導することができる。特定の実施形態において、二次エフェクター分子は細菌またはウイルスに由来するものである。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、二次エフェクター分子は細菌由来のもの（例えば、ＢＲＰ）である。本発明の他の好ましい実施形態では、二次エフェクター分子はウイルス由来のもの（例えば、ＴＡＴ）である。本発明のさらに他の好ましい実施形態では、二次エフェクター分子は哺乳動物に由来するものである。いくつかの好ましい実施形態において、二次エフェクター分子はヒト由来である。
【００５２】
本発明は、プラスミドまたはトランスフェクトしうる核酸によりコードされるエフェクター分子を含む弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明の好ましい実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラである。２つ以上のエフェクター分子（例えば、一次または二次）が弱毒化腫瘍標的細菌（例えば、サルモネラ）において発現される場合、それらのエフェクター分子は同一のプラスミドまたは核酸によりコードされても、２つ以上のプラスミドまたは核酸によりコードされてもよい。本発明はまた、細菌ゲノムに組み込まれる核酸によりコードされるエフェクター分子を含む弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。組み込まれるエフェクター分子は、弱毒化腫瘍標的細菌（例えば、サルモネラ）に対して内因性であってもよいし、また、（例えば、プラスミド、トランスフェクトしうる核酸、トランスポゾンのような、エフェクター分子をコードする核酸の導入により）弱毒化腫瘍標的細菌に導入されてもよい。結果的に、エフェクター分子をコードする核酸が弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれるようにする。本発明は、適切なプロモーターに機能的に連結されたエフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。エフェクター分子をコードする核酸に機能的に連結されるプロモーターは、同種（すなわち、天然）であっても異種（すなわち、エフェクター分子をコードする核酸本来のものではない）であってもよい。適当なプロモーターの例としては、制限するものではないが、Ｔｅｔプロモーター、ｔｒｃ、ｐｅｐＴ、ｌａｃ、ｓｕｌＡ、ｐｏｌ ＩＩ（ｄｉｎＡ）、ｒｕｖ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＤ、ｕｍｕＤＣ、ｌｅｘＡ、ｃｅａ、ｃａａ、ｒｅｃＮ、およびｐａｇＣが挙げられる。
【００５３】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌によりシグナル配列とエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質を局所送達するための方法を提供する。好ましい実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌は、Ｏｍｐ様タンパク質またはその一部（例えば、シグナル配列、リーダー配列、周辺細胞質領域、膜貫通ドメイン、複数回膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せ；「Ｏｍｐ様タンパク質」の定義については下記の第３．１節を参照のこと）およびエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。作用機構に関して制限されるものではないが、本発明は、Ｏｍｐ様タンパク質が外膜にエフェクター分子を固定もしくはつなぎ止める働きをしているか、細菌外膜にエフェクター分子を局在させるように働く、と考えられる。いくつかの実施形態において、エフェクター分子は細菌外膜への送達が増加される。ある実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質にエフェクター分子を融合させることで、エフェクター分子の周辺細胞質への局在が増加される。Ｏｍｐ様タンパク質の例として、制限するものではないが、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＢ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＥ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ポーリン様タンパク質、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ｌａｍＢ、β−ラクタマーゼ、エンテロトキシン、プロテインＡ、エンドグルカナーゼ、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＮｍｐＡ、ＮｍｐＢ、ＮｍｐＣ、および主要外膜リポタンパク質（例えば、ＬＬＰ）のそれぞれの少なくとも一部が挙げられる。本発明の他の実施形態では、本発明の融合タンパク質はタンパク質分解切断部位を含む。このタンパク質分解切断部位はエフェクター分子またはＯｍｐ様タンパク質に内因性のものであってよく、あるいはタンパク質分解切断部位を融合タンパク質中に構築してもよい。
【００５４】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍にフェリーペプチドとエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質を局所送達するための方法を提供する。融合タンパク質中で用いるフェリーペプチドは、その生産または導入の拡散範囲内のほぼすべての細胞への目的のポリペプチドまたはペプチドの送達を促進することが分かっている（例えば、Ｂａｙｌｅｙ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： １０６６−１０６７； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ４１８−４２０； Ｄｅｒｏｓｓｉら， １９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８： ８４−８７を参照のこと）。したがって、フェリーペプチドとエフェクター分子からなる融合タンパク質を発現するように弱毒化腫瘍標的細菌を遺伝子操作することは、腫瘍細胞に内在化されるエフェクター分子の能力を高める。特定の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はフェリーペプチドとエフェクター分子からなる１つの融合タンパク質をコードする１つの核酸分子を発現するように遺伝子操作される。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はフェリーペプチドとエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。これらの実施形態によれば、エフェクター分子は一次または二次エフェクター分子でありうる。フェリーペプチドの例として、制限するものではないが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、および単純ヘルペスウイルスＶＰ２２がある。
【００５５】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍にシグナル配列とフェリーペプチドとエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質を局所送達するための方法を提供する。特定の実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列とフェリーペプチドとエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態において、エフェクター分子は一次または二次エフェクター分子でありうる。
【００５６】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍にシグナル配列、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質を局所送達するための方法を提供する。特定の実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子からなる１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。この実施形態において、エフェクター分子は一次または二次エフェクター分子でありうる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、１つの細菌株が固形腫瘍の部位で本発明の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。いくつかの他の実施形態では、２つ以上の弱毒化腫瘍標的細菌株が固形腫瘍の部位で本発明の１つ以上の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作される。これらの実施形態の様式において、弱毒化腫瘍標的細菌株は同一種のものである。これらの実施形態の別の様式において、弱毒化腫瘍標的細菌株は異なる種（例えば、リステリア属とサルモネラ属）のものである。
【００５８】
本発明はまた、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍の部位に本発明の１つ以上の融合タンパク質および本発明の１つ以上のエフェクター分子を局所送達するための方法を提供する。好ましくは、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍の部位で融合タンパク質とエフェクター分子の両方が発現されると、融合タンパク質のみまたはエフェクター分子のみが発現される場合に比べて、腫瘍または腫瘍細胞の増殖の阻害されるレベルが向上する。
【００５９】
本発明はまた、高められた放出系をもつサルモネラのような弱毒化腫瘍標的細菌における一次エフェクター分子および場合により二次エフェクター分子の発現を提供する。本発明の好ましい実施形態において、高められた放出は弱毒化腫瘍標的細菌による放出因子の発現と関係する。一つの実施形態では、かかる放出により細胞質または細胞周辺腔からのエフェクター分子の放出が増大する。放出因子は弱毒化腫瘍標的細菌に内因性のものであっても、外因性のもの（すなわち、弱毒化腫瘍標的細菌には本来存在しない核酸分子によりコードされるもの）であってもよい。放出因子はプラスミドからなる核酸によってコードされてもよいし、弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれる核酸によってコードされてもよい。放出因子は一次エフェクター分子をコードする核酸もしくはプラスミドと同じもの、または別個の核酸もしくはプラスミドでコードされ得る。放出因子は二次エフェクター分子をコードする核酸もしくはプラスミドと同じもの、または別個の核酸もしくはプラスミドでコードされ得る。好ましい実施形態において、放出因子はバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）である。特定の実施形態において、ＢＲＰはクロアシンＤＦ１３プラスミドのもの、コリシンＥ１〜Ｅ９プラスミドのもの、またはコリシンＡ、ＮまたはＤプラスミドのものである。好ましい実施形態では、ＢＲＰはクロアシンＤＦ１３のもの（ｐＣｌｏＤＦ１３ ＢＲＰ）である。本発明の別の実施形態では、高められた放出系はポーリンタンパク質の過剰発現を含む。
【００６０】
本発明はまた、高められた放出系をもつサルモネラのような弱毒化腫瘍標的細菌における本発明の融合タンパク質の発現を提供する。特定の実施形態において、放出因子はＯｍｐ様タンパク質に融合された一次エフェクター分子からなる融合タンパク質を発現する細胞において発現される。この実施形態では、放出因子の共発現が細胞周辺腔からの融合タンパク質の放出を高める。
【００６１】
一つの実施形態において、本発明は、エフェクター分子または融合タンパク質を発現しながら腫瘍内に選択的に蓄積する、改変された弱毒化腫瘍標的細菌株を用いて、高レベルのエフェクター分子または融合タンパク質を送達するための方法を提供する。特定の様式において、改変された弱毒化腫瘍標的細菌株は腫瘍内でエフェクター分子を選択的に増幅する。以下の分節の教示内容は、単純化するために、特にサルモネラに関して述べるが、本発明の組成物および方法は、いかなる場合も、サルモネラに限定されるものではなく、その教示内容が当てはまる他のあらゆる細菌を包含するものである。特定的には、本発明は通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。弱毒化腫瘍標的細菌の例として、制限するものではないが、大腸菌（腸侵入性大腸菌を含む）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｉｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる。
【００６２】
本発明はさらに、製薬上許容される担体と、１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。本発明はさらに、製薬上許容される担体と、１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。本発明はさらに、製薬上許容される担体と、１つ以上の本発明の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、製薬上許容される担体と、１つ以上の本発明の融合タンパク質および１つ以上のエフェクター分子（すなわち、一次および／または二次分子）をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌がサルモネラである。
【００６３】
本発明の医薬組成物は固形腫瘍の治療に有用である。固形腫瘍には、肉腫、癌腫、リンパ腫、その他の固形腫瘍癌（例えば、生殖細胞系の腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、グリオーム、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、中皮腫）が含まれるが、これらに限らない。
【００６４】
本発明は、固形腫瘍癌の治療のために一次エフェクター分子を送達する方法を提供し、この方法は、そのような治療が必要な動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる。本発明はまた、固形腫瘍癌の治療のために一次エフェクター分子を送達する方法を提供し、この方法は、そのような治療が必要な動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる。本発明はまた、固形腫瘍癌の治療のために一次エフェクター分子を送達する方法を提供し、この方法は、そのような治療が必要な動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、１つ以上の本発明の融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる。さらに、本発明は、固形腫瘍癌の治療のために一次エフェクター分子を送達する方法を提供し、この方法は、そのような治療が必要な動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに、１つ以上の本発明の融合タンパク質および１つ以上のエフェクター分子（すなわち、一次および／または二次分子）をコードする１つ以上の核酸分子を含むように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を含有する医薬組成物を投与することを含んでなる。好ましい実施形態において、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラである。特定の様式では、弱毒化腫瘍標的細菌が高められた放出系を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌は、他の公知の癌治療法と共に使用することができる。例えば、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌は、化学療法剤と共に用いられる。化学療法剤の例として、制限するものではないが、シスプラチン、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、パクリタキソール、タキサン類、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−１１、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レウコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、テモダール（ｔｅｍｏｄａｌ）、タキソール、サイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｂ、グラミシジンＤ、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、メルファラン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン同族体、ならびにサイトキサンが挙げられる。あるいはまた、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌は、放射線療法と共に用いられる。
【００６６】
本発明は、抗癌剤と、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、の連続的または並行投与を含む。本発明は、抗癌剤と、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、の相加的または相乗的組合せを包含する。
【００６７】
本発明はまた、作用部位がそれぞれ異なっている、抗癌剤と、１つ以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、の組合せを包含する。そのような組合せは、その組合せが相加的であろうと相乗的であろうと、これらの治療薬の二重作用に基づく向上した治療を提供する。したがって、本発明の新規組合せ療法は、単一薬剤療法として用いられるいずれか一方の薬剤と比べて、向上した効力をもたらす。
【００６８】
３．１．　定義と略語
本明細書で用いる用語「サルモネラ」とは、チフス菌、ブタコレラ菌、および腸炎菌等のすべてのサルモネラ種を包含する。また、例えば、腸炎菌の亜群であり、一般にネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）と呼ばれる、ネズミチフス菌等のサルモネラの血清型も含まれる。
【００６９】
類似体：　本明細書で用いる用語「類似体」は、一次または二次エフェクター分子として類似または同一の機能を有するが、一次または二次エフェクター分子の類似または同一のアミノ酸配列を必ずしも含まない、あるいは、一次または二次エフェクター分子の類似または同一の構造を必ずしも有していないポリペプチドを意味する。類似アミノ酸配列を含むポリペプチドとは、下記事項の少なくとも１つを満たすポリペプチドを意味する：（ａ）本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）少なくとも５個連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個連続したアミノ酸残基、または少なくとも１５０個連続したアミノ酸残基の、本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子をコードするヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；（ｃ）本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子をコードするヌクレオチドに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子と類似した構造を有するポリペプチドとは、本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子と類似した二次、三次または四次構造を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドの構造は、当業者には公知の方法により決定することができ、このような方法として、限定するものではないが、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶検査、核磁気共鳴、円二色性、結晶電子顕微鏡検査法が挙げられる。
【００７０】
抗血管新生因子：　抗血管新生因子は、抗血管新生活性を有するタンパク質性分子、あるいは、このようなタンパク質性分子をコードする核酸である。好ましい実施形態では、抗血管新生因子は、ペプチド断片、またはこれより大きいタンパク質の切断断片である。
【００７１】
弱毒化：　弱毒化は、微生物またはベクターの病原性が弱まるような改変である。弱毒化が目的とする結果は、上記微生物またはベクターを患者に投与したとき、毒性や他の副作用等の危険性が低減することである。
【００７２】
バクテリオシン：　バクテリオシンは、細菌の宿主が毒素に対して免疫性であるという点で、選択的活性を有する細菌タンパク質性毒素である。バクテリオシンは、細菌の宿主ゲノムまたはプラスミドによりコードされ、広いもしくは狭い範囲の他の細菌に対して毒性であり、１つまたは２つのサブユニットからなる単純な構造であるか、あるいは、多サブフニット構造である。さらに、バクテリオシンを発現する宿主は、該バクテリオシンに対する免疫を有する。
【００７３】
キレート剤感受性：　キレート剤感受性は、細菌の増殖が影響を受ける有効濃度として定義されるか、または、回収可能なコロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）によって決定されるような、細菌の生存能が低下する濃度として定義される。
【００７４】
誘導体：　本明細書において、「ポリペプチドの誘導体」という表現で用いる用語「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加の導入、またはあらゆるタイプの分子のポリペプチドへの共有結合により、改変された一次または二次エフェクター分子のようなポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。本明細書において、「一次または二次エフェクター分子の誘導体」という表現で用いられる用語「誘導体」は、例えば、あらゆるタイプの分子の上記一次または二次エフェクター分子への共有結合により、そのように修飾された一次または二次エフェクター分子を意味する。例えば、限定するものではないが、一次または二次エフェクター分子は、例えば、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくはその他のタンパク質との連結等により、修飾することができる。一次または二次エフェクター分子の誘導体は、当業者には公知の技法を用いた化学的修飾（例えば、アシル化、リン酸化、カルボキシル化、グルコシル化、セレン修飾および硫酸化）により修飾することができる。さらに、一次または二次エフェクター分子の誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチド誘導体は、本明細書に記載した一次または二次エフェクター分子と類似または同一の機能を有する。本明細書において、「ｍｓｂＢ−弱毒化腫瘍標的サルモネラ突然変異体の誘導体」という表現で用いる用語「誘導体」は、国際公開番号ＷＯ ９９／１３０５３（本明細書に、参照により全文が組み込まれる）の第１７頁に定義された修飾ｍｓｂＢ−ルモネラ突然変異体を意味する。
【００７５】
断片：　本明細書で用いる用語「断片」とは、一次または二次エフェクター分子のアミノ酸配列の少なくとも２個連続したアミノ酸残基、少なくとも５個連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個連続したアミノ酸残基の、少なくとも１７５個連続したアミノ酸残基の、少なくとも２００個連続したアミノ酸残基の、もしくは少なくとも２５０個連続したアミノ酸残基の、アミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００７６】
機能性断片：　本明細書で用いる用語「機能性断片」とは、上記一次または二次エフェクター分子の少なくとも１つの機能（例えば、エフェクター分子の酵素活性、抗血管新生活性、もしくは抗腫瘍活性等）を保持する一次または二次エフェクター分子の断片を意味する。
【００７７】
融合タンパク質：　一次もしくは二次エフェクター分子のアミノ酸配列、またはその機能性断片もしくは誘導体と、異種ポリペプチド（例えば、非一次または非二次エフェクター分子）のアミノ酸配列と、を含むポリペプチドを意味する。
【００７８】
Ｏｍｐ様タンパク質：　本明細書で用いる用語「Ｏｍｐ様タンパク質」とは、あらゆる細菌の外膜タンパク質またはその一部分（例えば、シグナル配列、リーダー配列、周辺細胞質領域、膜貫通ドメイン、複数回膜貫通ドメイン、またはこれらの組合せ）を意味する。具体的態様では、Ｏｍｐ様タンパク質は、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＢ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＥ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ポーリン様タンパク質、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ｌａｍＢ、β−ラクタマーゼ、エンテロトキシン、プロテインＡ、エンドグルカナーゼ、ペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＮｍｐＡ、ＮｍｐＢ、ＮｍｐＣ、または主要な外膜リポタンパク質（例えばＬＬＰ）等の少なくとも一部分である。
【００７９】
精製された：　本明細書で用いる「精製された」弱毒化腫瘍標的細菌株は、混入タンパク質またはアミノ酸（例えば、死滅した細菌からの残屑）または培地を実質的に含まない。混入タンパク質またはアミノ酸を実質的に含まない弱毒化腫瘍標的細菌株はまた、約３０％、２０％、１０％、もしくは５％（乾燥重量基準）以下の混入タンパク質またはアミノ酸を含む弱毒化腫瘍標的細菌も意味する。
【００８０】
放出因子：　本明細書で用いる放出因子は、細菌成分の放出を増強するあらゆるタンパク質またはその一部分を意味する。一実施形態では、放出因子は、バクテリオシン放出タンパク質である。放出因子としては、限定するものではないが、クロアシンＤ１３プラスミドによってコードされるバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）、コリシンＥ１〜Ｅ９プラスミドによりコードされるＢＲＰ、あるいは、コリシンＡ、ＮまたはＤプラスミドによりによりコードされるＢＲＰが挙げられる。
【００８１】
敗血症性ショック：　敗血症性ショックは、ＴＮＦ−αにより開始される複合サイトカインカスケードによる内部臓器不全の状態である。微生物またはベクターがＴＮＦ−αを誘導する相対能力は、敗血症性ショックを誘導するその相対能力を示す１つの基準として用いられる。
【００８２】
腫瘍標的（ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）：　腫瘍標的とは、非癌性の対応細胞または組織に比べて、癌性の標的細胞または組織に優先的に局在化し、複製する能力として定義される。従って、サルモネラのような腫瘍標的細菌は、癌性の標的細胞または腫瘍環境に優先的に結合し、感染し、かつ／または依然として生存可能である。
【００８３】
毒力：　毒力は、疾病を引き起こす一般的能力を表す相対語であり、正常細胞を死滅させる能力、または敗血症性ショック（以下の具体的定義を参照）を誘導する能力が含まれる。
【００８４】
本明細書において、株の名称ＶＮＰ２０００９（国際公開番号ＷＯ９９／１３０５３）、ＹＳ１６４６および４１．２．９は、互換的に用いられ、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号２０２１６５が与えられた株を指す。株の名称ＹＳ１４５６および８．７は、互換的に用いられ、それぞれ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号２０２１６４が与えられた株を指す。
【００８５】
本発明は、以下に行う詳細な説明、具体的実施形態の例示、および添付の図面を参照することにより、さらによく理解されるであろう。
【００８６】
４．図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については本明細書の最後を参照のこと。
【００８７】
５．本発明の詳細な説明
本発明は、弱毒化腫瘍標的細菌株を用いて、高レベルの治療用一次エフェクター分子を腫瘍に送達するものである。本発明は、所定の一次エフェクター分子の潜在的全身性毒性（例えば、ＴＮＦ−αによって起こる敗血症性ショック）を回避するという利点をもたらす。本発明は、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子を固形腫瘍に送達する。さらに具体的には、本発明は、適切な作用部位、例えば、固形腫瘍の部位への、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子を送達するためのベクターとして、例えば、サルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌を調製および使用することを包含する。具体的には、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌は、通性好気性菌または通性嫌気性菌であり、これらは、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子をコードするように操作されている。
【００８８】
ここに記載される弱毒化腫瘍標的細菌に基づく送達系は、固形腫瘍の部位への１つ以上のエフェクター分子の局所送達を提供する。本発明は、宿主に全身投与する場合には、毒性でありうる、または望ましくない副作用（例えば、望ましくない免疫作用）を誘導する恐れがある一次エフェクター分子を、宿主への毒性を低下させたサルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌によって腫瘍に局所送達することができる、安全かつ効果的な方法を提供する。本発明はまた、サルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌により送達される、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子の組合せ送達を提供する。さらに本発明は、１つ以上の異なる一次エフェクター分子、および場合に応じて、１つ以上の異なる二次エフェクター分子を保有する、異なる弱毒化腫瘍標的細菌の組合せ送達を提供する。
【００８９】
また、本発明は、固形腫瘍の部位で該融合タンパク質を発現させるように操作された弱毒化腫瘍標的細菌によって、エフェクター分子を含む１つ以上の融合タンパク質を局所送達する方法を提供する。一実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナルペプチドとエフェクター分子からなる融合タンパク質を発現するように操作される。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナルペプチドと、タンパク質分解切断部位と、エフェクター分子からなる融合タンパク質を発現させるように操作される。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、フェリーペプチドとエフェクター分子からなる融合タンパク質を発現させるように操作される。さらに別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナルペプチドと、フェリーペプチドと、エフェクター分子からなる融合タンパク質を発現させるように操作される。さらにまた別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナルペプチドと、タンパク質分解切断部位と、フェリーペプチドと、エフェクター分子からなる融合タンパク質を発現させるように操作される。弱毒化腫瘍標的細菌は、本発明の１つ以上の融合タンパク質と、本発明の１つ以上のエフェクター分子を発現させるように操作される。
【００９０】
本発明はまた、製薬上許容される担体と、１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、製薬上許容される担体と、１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物も提供する。さらに、本発明は、製薬上許容される担体と、１つ以上の融合タンパク質および１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように操作された弱毒化腫瘍標的細菌と、を含有する医薬組成物を提供する。
【００９１】
本発明は、動物における固形腫瘍癌を治療する方法であって、１つ以上の一次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現すように操作された弱毒化腫瘍標的細菌を、治療を要する動物に投与することを含んでなる方法を提供する。本発明はまた、動物における固形腫瘍癌を治療する方法であって、そのような治療が必要な動物に、１つ以上の一次エフェクター分子および１つ以上の二次エフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように操作された弱毒化腫瘍標的細菌を投与することを含んでなる方法を提供する。さらに、本発明は、動物における固形腫瘍癌を治療する方法であって、そのような治療が必要な動物に、１つ以上の融合タンパク質および１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むように操作された弱毒化腫瘍標的細菌を投与することを含んでなる方法を提供する。好ましくは、上記動物は、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル、またはブタ）であり、さらに好ましくは、動物はヒトである。固形腫瘍癌の例として、限定するものではないが、肉腫、癌腫、リンパ腫が挙げられ、その他の固形腫瘍癌として、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌、子宮頚癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、グリオーマ、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、中枢神経系の癌、生殖細胞系の癌、腎臓癌、膀胱癌、および中皮種が挙げられる。
【００９２】
特定の作用機構に制限する意図はないが、本発明者らは、本発明に従い、エフェクター分子を含む弱毒化腫瘍標的細菌ベクターの送達によって、腫瘍の部位にエフェクター分子の標的発現が達成されると考える。
【００９３】
明瞭にするため、詳細な説明を次の小節に分けるものとする：細菌ベクター；腫瘍治療のための一次エフェクター分子；一次エフェクター分子との共発現のための二次エフェクター分子；誘導体と類似体；融合タンパク質；発現ベクター；ならびに、送達のための方法および組成物。
【００９４】
５．１．　細菌ベクター
本発明の方法では、あらゆる弱毒化腫瘍標的細菌を用いることができる。さらに具体的には、本発明の方法で用いられる弱毒化腫瘍標的細菌は、通性好気性菌または通性嫌気性菌である。本発明の方法で用いられる、通性好気性菌または通性嫌気性菌である弱毒化腫瘍標的細菌の例としては、限定するものではないが、腸管組織侵入性大腸菌等の大腸菌、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、単球症リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｉｅｓ）、ヒトマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、およびレンサ球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）が挙げられる。
【００９５】
弱毒化および腫瘍ターゲッティングに寄与する因子を本明細書に記載するが、これらを用いて、本発明の方法で使用する好適な細菌株を構築または選択することができる。例えば、腫瘍標的細菌を選択および単離する方法については、国際公開番号ＷＯ９６／４０２３８の第６．１節に記載され、また、細菌を弱毒化する方法については、同第６．２節に記載されている。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする。弱毒化腫瘍標的細菌の例は、国際出願ＷＯ９９／１３０５３（参照により本明細書に全文を組み込む）にも記載されている。本発明の特定の実施形態では、当業者には公知の方法で細菌を修飾することにより、弱毒化または高度に弱毒化することができる。
【００９６】
本発明は、１つ以上の一次エフェクター分子（例えば、ＴＮＦファミリーメンバー、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド、腫瘍阻害酵素、もしくは抗血管新生因子）を単独で、または１つ以上の二次エフェクター分子と組み合わせて送達するベクターとして、弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明はまた、１つ以上の本発明の融合タンパク質を単独で、または１つ以上のエフェクター分子と組み合わせて送達するベクターとして、弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明の好ましい実施形態では、エフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を発現するように操作された弱毒化腫瘍標的細菌は、サルモネラである。
【００９７】
以下の節では、特にサルモネラに関して教示するが、本発明の組成物および方法は、何らサルモネラに限定されるわけではなく、教示が適用するあらゆる他の細菌を包含する。適した細菌種として、限定するものではないが、腸管組織侵入性大腸菌等の大腸菌、サルモネラ種、赤痢菌種、エルシニアエンテロコリチカ、単球症リステリア、ヒトマイコプラズマ、およびレンサ球菌種が挙げられ、ここで、該細菌は、通性好気性菌または通性嫌気性菌である。
【００９８】
５．１．１　サルモネラベクター
本発明の教示に従い、あらゆる弱毒化腫瘍標的細菌を修飾して、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子をコードすることにより、本発明の１つ以上のエフェクター分子を固形腫瘍に送達するのに有用な新規の弱毒化腫瘍標的細菌を作製することができる。さらに、本発明の教示に従い、あらゆる弱毒化腫瘍標的細菌を修飾して、本発明１つ以上の融合タンパク質および場合に応じて、本発明の１つ以上のエフェクター分子をコードすることにより、本発明の融合タンパク質およびエフェクター分子を固形腫瘍に送達するのに有用な新規の弱毒化腫瘍標的細菌を作製することができる。
【００９９】
サルモネラ等の細菌は、ヒトおよび動物の疾病を引き起こす病原体である。サルモネラによって発生し得る疾病の１つは、敗血症であり、これは、敗血症性ショックの発作に関連する高い死亡率（Ｂｏｎｅ， １９９３， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｓ． ６：５７−６８）のために、深刻な問題である。従って、本発明で、サルモネラベクターを安全に使用できるようにするためには、サルモネラ等の細菌ベクターの病原性を低減（弱毒化）する。本発明では、弱毒化は、微生物ベクターを修飾することにより、該微生物ベクターの病原性を低減するという従来の定義に加えて、微生物ベクターを修飾することにより、低力価の該誘導微生物ベクターを患者に投与し、それでも尚、高力価の親微生物ベクターを投与したのと同等の結果を達成できるようにすることも含む。その結果、ベクターを患者に投与したことによる毒性ショックまたはその他の副作用の危険性を低下させることができる。このように弱毒化された細菌は、多数の技法により単離される。例えば、宿主細胞、特にマクロファージおよび好中球内での細菌の生存を確実にするビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）因子をコードするＤＮＡ配列の欠失または破壊により、弱毒化を達成することができる。このような欠失または破壊技法は、当業者には公知であり、例えば、相同的組換え、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、もしくはトランスポゾン突然変異誘発が挙げられる。マクロファージ内での生存に関連するビルレンス因子は、例えば、酸性化のようなストレスシグナルに応答して、またはマクロピノサイトーシス等の宿主細胞防御機構に応答して、通常、マクロファージ内で特異的に発現される（Ｆｉｅｌｄｓら、１９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５１８９−５１９３）。国際公開番号ＷＯ９６／４０２３８の表４には、欠失によって弱毒化が起こるサルモネラ・ビルレンス因子が例示的に列挙されている。
【０１００】
サルモネラのような細菌ベクターの弱毒化の別の方法は、細菌の毒性の原因となる細菌の置換基を修飾するものである。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）または内毒素は、細菌性敗血症の病理作用の主な原因である。この応答を起こすＬＰＳの成分は、リピドＡ（「ＬＡ」）である。ＬＡの毒性作用の排除または軽減により、１）患者における敗血症性ショックの危険性が低下すると共に、２）さらに高レベルの細菌ベクターを許容できることから、弱毒化細菌が得られる。
【０１０１】
サルモネラのような細菌のＬＡ含有率の改変は、ＬＰＳ生合成経路に突然変異を導入することにより達成することができる。ＬＰＳ生合成におけるいくつかの酵素段階、およびサルモネラ内でそれらを制御する遺伝子座、ならびに対応する突然変異体が確認されている（Ｒａｅｔｚ， １９９３， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５：５７４５−５７５３およびその中の参考文献）。このような突然変異体の一例として、ｆｉｒＡがあるが、これは、酵素ＵＤＰ−３−Ｏ（Ｒ−３０ヒドロキシミリストイル）−グリコシアミンＮ−アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子内の突然変異であり、該酵素は、内毒素生合成における第３段階を調節する（Ｋｅｌｌｅｙら、１９９３、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９８６６−１９８７４）。このタイプの突然変異を担持する細菌株はリピドＡを生産するが、これは第７脂肪酸、すなわちヘキサデカン酸、を含むという点で野生型リピドＡとは異なる（ＲｏｙおよびＣｏｌｅｍａｎ， １９９４， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６：１６３９−１６４６）。ＲｏｙおよびＣｏｌｅｍａｎは、内毒素生合成における第３段階の遮断のほかに、ｆｉｒＡ−突然変異は、リピドＡ生合成の第６段階を調節するリピドＡ ４’キナーゼの酵素活性を低下させることも明らかにした。
【０１０２】
弱毒化に加えて、本発明の細菌ベクターは腫瘍ターゲッティングされる。すなわち、細菌は、正常組織、非腫瘍または非腫瘍細胞に対して、腫瘍または腫瘍細胞に優先的に結合し、感染し、かつ／または依然として生存可能である。弱毒化腫瘍標的細菌を取得するのに適した方法は、国際公開ＷＯ９６／４０２３８の第６．１節（第２５〜３２頁；腫瘍ターゲッティング）および第６．２．２節（第４３〜５１頁；弱毒化）に記載されており、該文献は、参照により本発明に組み込まれるものとする。こうして得られるベクターは高度に特異的で、かつ重感染性であることから、標的腫瘍または腫瘍細胞に存在する感染細菌の数と、非癌性対応部でのそれとの差は、微生物培養物の稀釈度が増加するほど大きくなるため、これまでより低力価の微生物ベクターを用いて、正の結果を得ることができる。また、国際公開ＷＯ９６／４０２３８に記載される技法を用いて、弱毒化腫瘍標的サルモネラまたは非サルモネラ細菌ベクターを作製することも可能である。
【０１０３】
ＬＳＰ経路突然変異を有する弱毒化腫瘍標的細菌の一例が、国際公開ＷＯ９９／１３０５３に記載されたｍｓｂＢ−サルモネラ突然変異体である。尚、該文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。特に、ｍｓｂＢ−サルモネラ突然変異体の特徴について説明する第６．１．２節を参照されたい。ｍｓｂＢ−サルモネラの１つの特徴は、野生型細菌ベクターと比較して、ＴＮＦ−α応答を誘導する能力が低下していることである。ｍｓｂＢ−サルモネラは、野生型細菌ベクターの誘導レベルと比較して、約５％から約４０％のレベルでＴＮＦ−α発現を誘導する。
【０１０４】
全細菌または単離もしくは精製されたＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α応答は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等、市販のアッセイ装置を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）当たりの、またはμｇ／ｋｇに基づくＴＮＦ−α生産の比較を用いて、相対活性を決定する。単位当たりのＴＮＦ−αレベルが低いほど、ＴＮＦ−α生産の誘導が減少していることを示す。好ましい実施形態では、ｍｓｂＢ−サルモネラベクターを修飾して、本発明の１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子を含むようにする。
【０１０５】
本発明はまた、ｍｓｂＢ−弱毒化腫瘍標的サルモネラ突然変異体の誘導体の使用も包含する。本発明の教示に従い、ｍｓｂＢ−弱毒化腫瘍標的サルモネラ突然変異体の誘導体を修飾し、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子をコードすることにより、本発明の１つ以上のエフェクター分子を固形腫瘍に送達するのに有用な新規の腫瘍標的細菌を作製することができる。
【０１０６】
患者への治療の過程で、さらに毒性の高い表現型に復帰しないような、弱毒化表現型の安定性は重要である。このような安定性は、例えば、ビルレンス遺伝子が、エピスタシス的（ｅｐｉｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）ではなく、欠失または染色体レベルでのその他の非復帰突然変異によって破壊されるように備えることにより、獲得することができる。
【０１０７】
弱毒化表現型を安全にする別の方法は、例えば、ｍｓｂＢ−突然変異（国際公開ＷＯ９９／１３０５３）のように、リピドＡ生産用の経路における突然変異や、Ｂｏｃｈｎｅｒ， １９８０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １４３：９２６−９３３により記載されたウラシル生合成、プリン生合成、およびアルギニン生合成のように、１以上の栄養素または代謝物の栄養要求性突然変異体への１以上の突然変異等、１以上の方法で弱毒化されるように、細菌を操作することである。好ましい実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子をコードまたは発現する腫瘍標的ｍｓｂＢ−サルモネラもまた、プリンに対して栄養要求性である。特定の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子をコードまたは発現する弱毒化腫瘍標的細菌は、ＡｒｏＡ、ｍｓｂＢ、ＰｕｒＩまたはＳｅｒＣにおける突然変異の存在によって、弱毒化される。他の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子をコードする弱毒化腫瘍標的細菌は、ＡｒｏＡ、ｍｓｂＢ、ＰｕｒＩまたはＳｅｒＣにおける欠失の存在によって、弱毒化される。
【０１０８】
従って、本発明の方法では、あらゆる弱毒化腫瘍標的細菌を用いて、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子を発現し、固形腫瘍癌に送達することができる。好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子を発現するように構築する。さらに、本発明の方法では、あらゆる弱毒化腫瘍標的細菌を用いて、１つ以上の融合タンパク質および場合に応じて、１つ以上のエフェクター分子を発現し、固形腫瘍癌に送達することができる。好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、１つ以上の融合タンパク質および場合に応じて、１つ以上のエフェクター分子を発現するように構築する。
【０１０９】
５．２．　腫瘍治療のための一次エフェクター分子
本発明は、サルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌による、一次（および場合に応じて、二次）エフェクター分子の送達を達成する。本発明のエフェクター分子は、タンパク質性分子（例えば、タンパク質（限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質等を含む））である。本発明はさらに、本発明の一次エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。
【０１１０】
一次エフェクター分子は、あらゆる公知の生物、例えば、限定するものではないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルス等に由来するものでよい。本発明の好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、哺乳動物に由来する。さらに好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、ヒトに由来する。本発明の一次エフェクター分子は、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗血管新生因子、細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチド、腫瘍阻害酵素、ならびに、これらの機能性断片を含む。
【０１１１】
具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、ＴＮＦファミリーのメンバーまたはその機能性断片である。ＴＮＦファミリーのメンバーの例としては、限定するものではないが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＬＴ−α、ＬＴ−α、ＬＴ−β、ＯＸ４ＯＬ、ＣＤ４ＯＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＦＳＦ１６、ＴＮＳＦ１７およびＡＩＴＲ−Ｌが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、もしくはこれらの機能性断片である。これらについて詳しくは、例えば、ＴＮＦファミリーのメンバーを記載したＫｗｏｎ， Ｂ．ら、１９９９， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：３４０−３４５を参照されたい。また、以下の表１は、ＴＮＦファミリーのメンバー例の古典的名称および標準化された名称の一覧を示す。本発明の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）、ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α関連活性化により誘導されるサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦ−α関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、もしくはＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。
【０１１２】
【表１】
2004500042.tif 000003
【０１１３】
別の具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、抗血管新生因子もしくはその機能性断片である。抗血管新生因子の例として、限定するものではないが、エンドスタチン、アンギオスタチン、アポミグレン、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａ Ｎ末端および４０ｋＤａ Ｃ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａタンパク質分解断片、血小板第４因子の７．８ ｋＤａタンパク質分解断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポンジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ＲＧＤおよびＮＧＲ含有ペプチド、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンおよびＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、ならびに、インテグリンαｖβ３およびＶＥＧＦ受容体のペプチドアンタゴニストが挙げられる。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子はエンドスタチンである。天然のエンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端の約１８０アミノ酸からなる（コラーゲンＸＶＩＩＩの２つのスプライス形態をコードするｃＤＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１８０１およびＡＦ１８０８２を有する）。
【０１１５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、プラスミノーゲン断片である（プラスミノーゲンのコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−０００３０１およびＡ３３０９６）にみいだすことができる）。アンギオスタチンペプチドは、言うまでもなく、プラスミノーゲンの４つのクリングルドメイン、すなわち、クリングル１〜クリングル４を含む。組換えクリングル１，２および３は、天然ペプチドの抗血管新生特性を有するのに対し、クリングル４にはそのような活性がない（Ｃａｏら、１９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２９４６１−２９５６７）。従って、本発明のアンギオスタチンエフェクター分子は、クリングル１、クリングル２およびクリングル３からなる群より選択される少なくとも１つの、好ましくは、１つ以上のクリングルドメインを含む。具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、４０ ｋＤａイソ型、４２ ｋＤａイソ型、４５ ｋＤａイソ型、またはこれらの組合せからなる群より選択されるヒトアンギオスタチン分子である。別の実施形態では、該一次エフェクター分子は、プラスミノーゲンのクリングル５ドメインであり、これは、アンギオスタチン（アンギオスタチンはクリングルドメイン１〜４からなる）より強力な血管新生阻害物質である。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、アンチトロンビンＩＩＩである。アンチトロンビンＩＩＩは、以後アンチトロビンと呼び、これは、タンパク質を血管壁に連結するヘパリン結合ドメインと、トロンビンと相互作用する活性部位ループとを含む。アンチトロンビンをヘパリンと結合させると、タンパク質はコンホメーション変化を引き起こし、これによって、活性ループがトロンビンと相互作用し、その結果、トロンビンによる該ループのタンパク質分解切断が起こる。タンパク質分解切断事象により、アンチトロンビンのコンホメーションにさらに別の変化が起こり、これによって（ｉ）トロンビンとアンチトロンビンとの間の相互作用界面が改変され、（ｉｉ）ヘパリンから複合体が放出される（Ｃａｒｒｅｌｌ， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１８６１−１８６２、およびその中の参考文献）。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９２６−１９２８）は、切断されたアンチトロンビンが、強力な抗血管新生活性を有することをみいだした。従って、一実施形態では、本発明の抗血管新生因子は、抗血管新生形態のアンチトロンビンである。本発明の方法に従う固形腫瘍への上記タンパク質の送達のために、細菌ベクターを修飾し、全長アンチトロンビンＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−０００４８８およびアンチトロンビンの切断を触媒するタンパク質分解酵素を発現させることにより、抗血管新生形態のタンパク質を生成する。タンパク質分解酵素は、トロンビン、膵エラスターゼ、およびヒト好中球エラスターゼからなる群より選択される。好ましい実施形態では、タンパク質分解酵素は膵エラスターゼである。機能性膵エラスターゼの組換え発現の方法は、Ｓｈｉｒａｓｕにより教示されている（Ｓｈｉｒａｓｕら、１９８７， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：１５５５−１５６３）。
【０１１７】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、フィブロネクチンの４０ ｋＤａおよび／または２９ ｋＤａタンパク質分解断片である。これら断片の発現ベクターは、フィブロネクチン前駆体タンパク質をコードする全長核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０２７６１）、およびコードされたタンパク質の成熟化についての記載事項（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を用いた標準的方法により生成することができる。好ましい実施形態では、フィブロネクチンの４０ ｋＤａおよび／または２９ ｋＤａ断片は、例えば、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドへの挿入により、ｔｒｃプロモーターの制御下で細胞質タンパク質として発現させる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）受容体のアンタゴニストである。実施形態の一態様では、該アンタゴニストは、ｕＰＡのドミナントネガティブ突然変異体である（例えば、Ｃｒｏｗｌｅｙら、１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０２１−５０２５）。実施形態の別の態様では、アンタゴニストは、ペプチドアンタゴニストまたはその融合タンパク質である（Ｇｏｏｄｓｏｎら、１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７１２９−７１３３）。実施形態のさらに別の態様では、アンタゴニストは、ドミナントネガティブ可溶性ｕＰＡ受容体である（Ｍｉｎら、１９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２４２８−２４３３）。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、約１２０のアミノ酸からなる、プロラクチンの１６ ｋＤａ Ｎ末端断片、またはその生物学的に活性な断片である（プロラクチンのコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−０００９４８にみいだすことができる）。具体的実施形態では、上記プロラクチン断片は、ジスルフィド結合によるタンパク質の不要な架橋を回避するため、Ｃｙｓ５８→Ｓｅｒ５８突然変異を有する。
【０１２０】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、７．８ ｋＤａ 血小板第４因子断片である。具体的実施形態では、７．８ ｋＤａ 血小板第４因子断片は、融合タンパク質として発現され、該融合タンパク質において、アミノ末端は、大腸菌βグルクロニダーゼの最初の３５アミノ酸からなる。別の実施形態では、血小板第４因子のヘパリン結合性リシンをグルタミン酸残基に突然変異させることにより、強力な抗血管新生活性を有する変異型タンパク質が得られる（Ｍａｉｏｎｅら、１９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２０７７−２０８３）。血小板第４因子のコード配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ−００２６１９である。
【０１２１】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、血小板第４因子の抗血管新生１３アミノ酸断片、１３．４０と称する抗血管新生因子、トロンボスポジンＩの抗血管新生２２アミノ酸ペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管新生２０アミノ酸ペプチド断片、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンもしくはＥＧＦの小さい抗血管新生ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体の小さいペプチドアンタゴニストに相当する小さなペプチドである。具体的実施形態では、小さいペプチドをタンデムに発現させることにより、タンパク質安定性が高まる。小さいペプチドの配列は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（Ｓｏｋｅｒら、１９９３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３１５８２−３１５８８）を除いて、Ｃａｏ（１９９８， Ｐｒｏｇ． Ｍｏｌ． Ｓｕｂｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１６１−１７６）により提供されている。極めて好ましい実施形態では、小さいペプチドは、ＲＧＤまたはＮＧＲモチーフを含む。この実施形態の特定の様式では、ＲＧＤまたはＮＧＲモチーフを含むペプチドは、例えば、ＯｍｐＡの１つ以上の細胞外ループをコードする核酸と、読み枠を合わせて該ペプチドをコードする核酸を融合することにより、宿主細菌の細胞表面上に提示される。
【０１２２】
別の具体的実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチド、もしくはそれらの機能性断片である。細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、タンパク質合成の干渉または細胞周期の破壊を介して、細胞増殖を阻害することにより、細胞に対して毒性を有するか、または細胞分裂を抑制する。このような物質は、ｒＲＮＡまたはリボ核タンパク質を切断するか、伸長因子を阻害するか、ｍＲＮＡを切断することにより、あるいは、タンパク質合成を、細胞が生存できないようなレベルにまで低下させるその他の機構によって、作用すると考えられる。
【０１２３】
細胞傷害性ポリペプチドまたはペプチドの例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：バクテリオシンファミリーのメンバー、ベロ毒素、細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１；例えば、大腸菌ＣＮＦ１およびＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＣＮＦ１）、細胞傷害性壊死因子２（ＣＮＦ２）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｏｃｉｄａ毒素（ＰＭＴ）、溶血素、ファルネシルトランスフェラーゼの強力な競合阻害物質であるＣＡＡＸテトラペプチド、サポリン、リシン、アブリン、その他のリポソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、シュードモナス外毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質合成の阻害剤、アンチセンス核酸、その他の代謝阻害物質（例えば、ＤＮアーゼおよびリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ等のＤＮＡまたはＲＮＡ切断分子）、プロドラッグ変換酵素（例えば、ＨＳＶ由来のチミジンキナーゼおよび細菌シトシンデアミナーゼ）、光活性化ポルフィリン、リシン、リシンＡ鎖、トウモロコシＲＩＰ、ゲロニン、細胞致死拡大（ｃｙｔｏｌｅｔｈａｌ ｄｉｓｔｅｎｄｉｎｇ）毒素、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素Ａ鎖、トリコサンチン、トリチン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、ミラビリス（ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）抗ウイルスタンパク質（ＭＡＰ）、ジアンチン３２および３０、アブリン、モノドリン、ブリオジン、志賀毒素（ｓｈｉｇａ）、キュウリの種子からのタンパク質生合成の触媒阻害物質（例えば、国際公開ＷＯ９３／２４６２０を参照）、シュードモナス外毒素、大腸菌熱不安定性毒素、大腸菌熱安定性毒素、ＥａｇｇＥＣ安定性毒素−１（ＥＡＳＴ）、細胞毒素の生物学的に活性の断片、ならびに、当業者には公知のその他の物質。大腸菌およびサルモネラの毒素については、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編）におけるＯ’ＢｒｉａｎおよびＨｏｌｍｅｓによるＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ｐｐ．２７８８−２８０２， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， ワシントンＤ．Ｃ．を参照されたい。
【０１２４】
好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、バクテリオシンファミリーのメンバー（例えば、Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４参照）であるが、ただし、該バクテリオシンファミリーのメンバーは、バクテイロシン放出タンパク質（ＢＲＰ）ではない。バクテリオシンファミリーのメンバーの例として、限定するものではないが、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ１ａ、ＣｏｌＥ１ｂ、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、ＣｏｌＥ９、コリシンＡ、コリシンＫ、コリシンＬ、コリシンＭ、クロアシンＤＦ１３、ペスチシンＡ１１２２、スタフィロコクシン１５８０、ブチリシン７４２３、ピオシンＲ１またはＡＰ４１、メガシンＡ−２１６、ミクロシンＭ１５、およびビブリオシン（ＪａｙａｗａｒｄｅｎｅおよびＦａｒｋａｓ−Ｈｉｍｓｌｅｙ， １９７０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １０２ ｐｐ ３８２−３８８）が挙げられる。最も好ましくは、一次エフェクター分子は、コリシンＥ３またはＶであるが、コリシンＡ、Ｅ１、Ｅ２、Ｉａ、Ｉｂ、Ｋ、Ｌ、およびＭ（Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４参照）も、一次エフェクター分子として適している。この実施形態の別の好ましい態様では、バクテリオシンは、クロアシンであり、最も好ましくは、クロアシンＤＦ１３である。
【０１２５】
好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、ＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２、ＣｏｌＥ３、ＣｏｌＥ４、ＣｏｌＥ５、ＣｏｌＥ６、ＣｏｌＥ７、ＣｏｌＥ８、またはＣｏｌＥ９である。コリシンＥ３（ＣｏｌＥ３）は、白血病細胞モデル系（Ｆｉｓｋａら、１９７８， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ３５：４０６−４０）等の哺乳動物細胞（Ｓｍａｒｄａら、１９７８， Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３：２７２−２７７）に深く細胞傷害性作用を及ぼすことがわかっている。ＣｏｌＥ３の細胞毒性は、タンパク質合成を停止する機能であり、これは、８０Ｓリボソームの阻害により媒介される（Ｔｕｒｎｏｗｓｋｙら、１９７３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ５２：３２７−３３４）。さらに具体的には、ＣｏｌＥ３は、リボヌクレアーゼ活性（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， １９７８， Ｎａｔｕｒｅ ２７４：１１３−１１４）を有する。その天然形態では、ＣｏｌＥ３は、１：１の比で５０ｋＤａおよび１０ｋＤａタンパク質からなる６０ｋＤａタンパク質複合体であり、大きい方のサブユニットはヌクレアーゼ活性を有し、また、小さい方のサブユニットは５０ｋＤａサブユニットの阻害機能を有する。このように、５０ｋＤａタンパク質は、細胞傷害性タンパク質（または毒素）として作用し、１０ｋＤａタンパク質は、抗毒素として作用する。従って、一実施形態では、ＣｏｌＥ３を二次エフェクター分子として用いる場合には、大きい方のＣｏｌＥ３サブユニットもしくはその活性断片を単独で、または小さい方のサブユニットより高いレベルで発現させる。本発明の別の実施形態では、ＣｏｌＥ３ ５０ｋＤａ毒素および１０ｋＤａ抗毒素を、サルモネラ等の弱毒化腫瘍標的細菌内の単一プラスミドにコードさせる。この実施形態では、毒素／抗毒素は、プラスミドを保有するサルモネラの選択系として作用することができ、これにより、該プラスミドを欠失したサルモネラは上記毒素により死滅する。別の実施形態では、１０ｋＤａ抗毒素は、プラスミド上のｃｏｌＥ３毒素から離れて染色体上にあり、他の細菌に対する透過障壁を形成している（以下の第５．６節を参照）。
【０１２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、クロアシンＤＦ１３である。クロアシンＤＦ１３は、ＣｏｌＥ３と同様に機能する。タンパク質複合体は、６７ｋＤａ分子量である。個々の成分のサイズは、５７ｋＤａおよび９ｋＤａである。リボヌクレアーゼ活性以外に、ＤＦ１３は、細胞カリウムの漏出を引き起こすことができる。
【０１２７】
別の好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、コリシンＶである（Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９８７， Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編におけるＰｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．およびＯｕｄｅｇａ， Ｂ．による”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ”；Ｇｉｌｓｏｎ， Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ９：３８７５−３８８４）。
【０１２８】
別の実施形態では、一次エフェクター分子は、下記のものである：コリシンＥ２（構造は、ＣｏｌＥ３に類似した二重サブユニットであるが、リボヌクレアーゼ活性ではなく、エンドヌクレアーゼ活性を有する）；イオン透過性チャンネルを形成し、細胞のプロトン駆動力を崩壊させ、細胞死に至らしめるコリシンＡ、Ｅ１、Ｉａ、ＩｂまたはＫ；タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を阻害するコリシンＬ；細胞の浸透圧環境を改変することにより、細胞敗血症を引き起こすコリシンＭ；コリシンＢと同様に機能するペスチシンＡ１１２２；細孔形成バクテリオシンであるスタフィコクシン１５８０；未知の標的を介して、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質合成を間接的に阻害するブチリシン７４２３；ピオシンＰ１、すなわち、溶質輸送からの呼吸を脱共役することにより、細胞を死滅させるバクテリオファージテールタンパク質に似たタンパク質；コリシンＥ２様の作用を有するピオシンＡＰ４１；または細胞内物質の漏出を引き起こすホスホリパーゼであるメガシンＡ−２１６（バクテリオシンの概要については、Ｋｏｎｉｓｋｙ， １９８２， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６：１２５−１４４を参照）：コリシンＡ（Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １９８７， Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編におけるＰｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．およびＯｕｄｅｇａ， Ｂ．による”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ”）。
【０１２９】
従って、一次エフェクター分子は、本明細書に記載した、または当業者には公知のあらゆるバクテリオシンを含んでよいが、ただし、該バクテリオシンは、バクテリオシン放出タンパク質ではない。
【０１３０】
別の具体的な実施形態では、本発明の一次エフェクター分子は、腫瘍阻害酵素またはその機能性断片である。腫瘍阻害酵素の例として、限定するものではないが、メチオナーゼ、アスパラギナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡアーゼ、およびグリコシダーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、一次エフェクター分子は、メチオナーゼである。
【０１３１】
本発明の一次エフェクター分子は、例えば、癌腫、黒色腫、リンパ腫、肉腫等の固形腫瘍癌を治療または予防する上で有用である。
【０１３２】
本発明は、一次エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、１つ以上の一次エフェクター分子および場合に応じて、１つ以上の二次エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。本発明は、適したプロモーターに機能的に連結された本発明のエフェクター分子をコードする核酸を提供する。場合に応じて、エフェクター分子をコードする核酸は、転写、翻訳、局在化、安定性等に関与するその他のエレメントに機能的に連結することもできる。
【０１３３】
一次エフェクター分子をコードする核酸分子は、長さが約６〜約１００，０００塩基対である。好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約５０，０００塩基対である。さらに好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約１０，０００塩基対である。さらにまた好ましくは、この核酸分子は、長さが約２０塩基対〜約４，０００塩基対である。
【０１３４】
５．３．　一次エフェクター分子との共発現のための二次エフェクター分子
本発明の特定の実施形態では、一次エフェクター分子（例えば、ＴＮＦファミリーのメンバー、細胞傷害性ペプチドもしくはポリペプチド、抗血管新生因子、または腫瘍抑制酵素）は、場合に応じて、別の分子、すなわち、二次エフェクター分子と一緒に、細菌ベクター内で共発現させる。二次エフェクター分子は、付加的治療価値を提供し、かつ／または、周囲の環境へ（少なくとも１種の一次エフェクター分子、および、場合に応じて、１以上の二次エフェクター分子を発現させる）修飾細菌ベクターの内容物の放出を促進する。本明細書で用いる用語「付加的治療価値」とは、一次エフェクター分子が提供するもの以外に、二次エフェクター分子が、腫瘍に対し、付加的もしくは相乗的、細胞分裂抑制性、または細胞傷害性作用をもたらすことを指す。従って、二次エフェクター分子は、付加的治療因子および／または放出因子として機能する。好ましくは、二次エフェクター分子は、付加的治療因子もしくは放出因子（または両方）のいずれであっても、所望の部位、すなわち、腫瘍の部位で、優先的または特異的に活性化もしくは発現させる。特定の実施形態では、二次エフェクター分子は、２つの機能を果たす、すなわち、細菌細胞内容物の放出を促進する（例えば、細菌細胞溶解または準溶解を促進することにより）と同時に、治療価値を提供する（例えば、腫瘍細胞に対する細胞毒性により）ことができる。特定の非制限的実施形態では、二次エフェクター分子の細胞毒性は、患者の免疫系が介在しうる；従って、このような二次エフェクター分子は、免疫調節剤として機能することができる。
【０１３５】
本明細書の特定の実施形態では、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現させるように操作する。すなわち、二次エフェクター分子の発現により、腫瘍または腫瘍細胞の死滅または成長の阻害が起こる。
【０１３６】
二次エフェクター分子は、タンパク質性または核酸分子である。核酸分子は、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ、ならびに、三重らせん核酸分子のいずれでもよい。核酸分子は、リボザイム、またはアンチセンス核酸等として機能することができる。
【０１３７】
アンチセンスヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸に、配列特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結合すると、アンチセンスは、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する（例えば、米国特許第５，１６８，０５３；５，１９０，９３１；５，１３５，９１７；および５，０８７，６１７号参照）。三重らせん分子とは、二重らせんＤＮＡと結合して、共直線性三重らせん分子を形成し、これにより、転写を阻止する一本鎖ＤＮＡを意味する（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号を参照）。
【０１３８】
リボザイムは、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ基質を特異的に切断することにより、細胞成長もしくは発現を阻害または干渉するＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の切断および／または連結に関与するリボザイムとして、少なくとも５クラスのリボザイムが知られている。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写産物を標的とすることができ、その転写産物を触媒的に切断することができる（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号；および米国特許第５，１６８，０５３、５，１８０，８１８、５，１１６，７４２および５，０９３，２４６号を参照）。
【０１３９】
一次エフェクター分子についてすでに記載したように、二次エフェクター分子をコードまたは含有する核酸には、機能的連結で、選択したプロモーターを付与する、また、場合に応じて、機能的連結で、転写、翻訳、局在化、安定性および／またはその他に参加する他のエレメントを付与する。さらに、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子および内部リボソーム結合部位と同じプロモーターを用いて、または、一次エフェクター分子とは異なるプロモーターを用いて、発現させることができる。
【０１４０】
二次エフェクター分子をコードする核酸分子は、長さが約６塩基対から約１００，０００塩基対である。好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約５０，０００塩基対である。より好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約１０，０００塩基対である。さらにより好ましくは、核酸分子の長さは、約２０塩基対から約４，０００塩基対である。
【０１４１】
下記の二次エフェクター分子をコードするエフェクター分子のヌクレオチド配列は、よく知られている（ＧｅｎＢａｎｋ参照）。二次エフェクター分子（この二次エフェクター分子は、細胞傷害性もしくは細胞分裂抑制因子、またはその生物学的に活性の断片、変異体もしくは誘導体である）をコードする核酸分子は、増幅（例えば、ＰＣＲ）、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、発現ライブラリーの抗体スクリーニング等の標準的方法により単離してもよいし、化学的に合成しても、または市販の、もしくは他の供給源から得られたものでもよい。
【０１４２】
本明細書に記載した用途で使用する核酸分子およびオリゴヌクレオチドは、当業者には公知である任意の方法により合成することができる（例えば、国際公開ＷＯ９３／０１２８６、米国特許第５，２１８，０８８；５，１７５，２６９；および５，１０９，１２４号参照）。アンチセンス試薬として使用するオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定は、当業者には公知の方法を含む。
【０１４３】
５．３．１．　付加的治療価値をもたらす因子
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子を発現し、かつ好ましくは、サルモネラベクターである本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現する。すなわち、該二次エフェクター分子の発現により、腫瘍もしくは腫瘍細胞の死滅、またはそれらの成長の阻害、あるいは、腫瘍細胞の転移の阻害が起こり、これによって、一次エフェクター分子の細胞傷害性または細胞分裂抑制作用を増強する。一実施形態では、二次エフェクター分子の腫瘍への作用は、一次エフェクター分子の作用に付加的なものである。好ましい実施形態では、この作用は、超付加的または相乗的である、すなわち、一次および二次エフェクター分子を個別に投与した場合の作用を合わせたものより大きい。
【０１４４】
特定の実施形態では、二次エフェクター分子は、タンパク質合成との干渉、または細胞周期の破壊により細胞成長を阻害することによって、細胞に対し、細胞傷害性または細胞分裂抑制性である。このような物質は、例えば、ｒＲＮＡもしくはリボ核タンパク質を切断する、伸張因子を阻害する、ｍＲＮＡを切断する、または、タンパク質合成を細胞が生存できないレベルまで低下させるその他の機構により、作用すると考えられる。このような二次エフェクター分子の例として、限定するものではないが、サポリン、リシン、アブリン、およびその他のタンパク質不活性化リボソーム（ＲＩＰ）が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、プロドラッグ変換酵素またはこれをコードする核酸、すなわち、薬物の化学的性質を調節して、細胞傷害性薬剤を生成する酵素である。プロドラッグ変換酵素の例は、Ｐａｗｅｌｅｋらにより国際公開ＷＯ９６／４０２３８の第３３頁の表２に一覧が記載されている。尚、この文献は、参照により本明細書に組み入れる。国際公開ＷＯ９６／４０２３８はまた、このようなプロドラッグ変換酵素を含む分泌融合タンパク質の生成方法も教示している。本発明によれば、プロドラッグ変換酵素は、ＢＲＰのような放出因子と共発現させた場合、分泌タンパク質である必要はない（以下の第５．３．２節を参照）。具体的実施形態では、プロドラッグ変換酵素は、マイトマイシンＣおよびポルフィロマイシン（Ｍｕｒｒａｙら、１９９４， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ． ２７０：６４５−６４９）に作用するシトクロムｐ４５０ ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼである。別の実施形態では、二次エフェクター分子を、ＢＲＰのような放出因子と共発現させて、補因子（例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ等）の放出を起こすことにより、プロドラッグ変換酵素の活性を増強する。この実施形態の別の態様では、二次エフェクター分子を、ＢＲＰのような放出因子と共発現させて、活性化薬物（例えば、細菌細胞質または周辺細胞質内で活性化され、細菌ベクターから放出された薬物）を放出させる。
【０１４６】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、誘導性酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）または内皮性酸化窒素シンターゼの阻害剤である。酸化窒素（ＮＯ）は、血管成長の調節および動脈硬化に関与すると考えられている。ＮＯは、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によりＬ−アルギニンから形成され、免疫、炎症および心臓血管応答を調節する。
【０１４７】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、癌遺伝子もしくは増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ｉｎｔ−２、ｈｓｔ−１／Ｋ−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ−２／ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８）または細胞受容体もしくはリガンド等の細胞増殖に関与するタンパク質の生成または活性を阻害することによって、細胞に対し、毒性を有する、または細胞分裂を抑制する。阻害は、転写または翻訳（リボザイムまたは三重らせんＤＮＡである二次エフェクター分子により媒介される）のレベルで、あるいは、タンパク質活性（ドミナントネガティブ突然変異体等の増殖因子経路の阻害剤である二次エフェクター分子により媒介される）のレベルで、行うことができる。
【０１４８】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、または免疫調節タンパク質もしくはこれをコードする核酸、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）；内皮単球活性化タンパク質−２（ＥＭＡＰ２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＩＰ−３α、ＳＬＣ、ＭＩＰ−３β、またはＨＬＡ−Ｂ７のようなＭＨＣ遺伝子である。このような免疫調節エフェクター分子の送達は、免疫系を調節し、宿主の抗腫瘍免疫の能力を高めるであろう。あるいは、Ｂ７．１およびＢ７．２等の共刺激分子、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４両方に対するリガンドをコードする核酸分子も送達することにより、Ｔ細胞性免疫を増強することもできる。さらに別の免疫調節剤は、α−１，３−ガラクトシルトランスファーゼであり、これを腫瘍細胞に発現させると、補体性細胞死を可能とする。さらに、別の免疫調節剤は、腫瘍関連抗原、すなわち、対応する非癌性細胞には発現しないが、腫瘍細胞に特異的に発現する分子、または対応する非癌性細胞よりも高いレベルで、腫瘍細胞に発現する分子である。腫瘍関連抗原の例は、Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ニューヨーク、ＮＹ， 第１版（１９９２）、ｐｐ． ５１５−５２０（本明細書に参照により組み入れる）に記載されている。腫瘍関連抗原の他の例は、当業者には公知である。
【０１４９】
別の実施形態では、二次エフェクター分子は、Ｆｌｔ−３リガンドまたはこれをコードする核酸である。別の実施形態では、二次エフェクター分子は、ＢＲＰである。
【０１５０】
具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子がＴＮＦファミリーのメンバーのとき、ＴＮＦファミリーメンバーではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が抗血管新生因子のとき、抗血管新生因子ではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチドのとき、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチドではない。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子は、一次エフェクター分子が腫瘍抑制酵素のとき、腫瘍抑制酵素ではない。
【０１５１】
５．３．２．　腫瘍環境への抗腫瘍エフェクター分子の放出を促進する因子
本発明の他の実施形態では、少なくとも１種の一次エフェクター分子を発現し、かつ好ましくは、サルモネラベクターである本発明の弱毒化腫瘍標的細菌ベクターは、少なくとも１種の二次エフェクター分子を発現するが、該二次エフェクター分子は、細菌細胞膜を透過可能にする、もしくは細胞外環境への細胞内成分の放出を増強する機能を果たし、これによって、一次および／または二次エフェクター分子の送達を増強する。このように、細菌細胞を透過可能にする、または放出を増強する二次エフェクター分子は、「放出因子」と呼ぶ。特定の実施形態では、放出因子は抗腫瘍活性も有するのが有利である。
【０１５２】
本発明の細菌ベクターにより発現させる放出因子は、修飾弱毒化腫瘍標的細菌に内在性のものでも、あるいは、外因性のもの（例えば、弱毒化腫瘍標的細菌にネイティブではない核酸によりコードされたもの）でもよい。放出因子は、プラスミドを含む核酸、または弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれた核酸により、コードすることができる。放出因子は、一次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。放出因子は、二次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。一実施形態では、放出因子は、Ｏｍｐ様タンパク質と融合させた一次エフェクター分子を含む融合タンパク質も発現する細胞内で発現させる。この実施形態では、放出因子の共発現により、細胞周辺腔からの融合タンパク質の放出を増強することができる。
【０１５３】
好ましい実施形態では、このような因子は、バクテリオシン放出タンパク質、すなわち、ＢＲＰ（本明細書では、一般にＢＲＰと呼ぶ）の１つである。本発明で用いるＢＲＰは、限定するものではないが、クロアシンＤＦ１３プラスミド、コリシンＥ１〜Ｅ９プラスミドの１つ、もしくはコリシンＡ、ＮまたはＤプラスミドを含む当業者には公知の任意の供給源に由来するものでよい。好ましい実施形態では、ＢＲＰはクロアシンＤＦ１３（ｐＣｌｏＤＦ１３ ＢＲＰ）から成る。
【０１５４】
一般に、ＢＲＰは、４５〜５２アミノ酸ペプチドであり、これは、初め、シグナルエンドペプチダーゼによって切断されないシグナル配列を含む前駆体分子（ＰｒｅＢＲＰ）として合成される。ＢＲＰ活性は、少なくとも部分的に、デタージェント耐性外膜ホスホリパーゼＡ（ＰｌｄＡ）により媒介されると考えられ、通常、外膜リン脂質の分解の増加に関連している（ＢＲＰの概要については、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌら、１９９５， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ １７：３８１−３９９を参照されたい）。機構に関して制限するわけではないが、ＢＲＰは、周辺細胞質成分の優先的放出を促進するが、これより少ない程度での細胞質成分の放出も検出されている。適度に過剰発現させると、ＢＲＰは細菌膜を脆弱にし、細胞質成分の準溶解および高放出を誘導する。さらに、ＢＲＰは、超高レベルで発現させると、このタンパク質が細菌細胞溶解を引き起こし、溶菌放出により細胞内容物を送達することができると考えられる。この実施形態で、ＢＲＰ発現は、ＢＲＰ活性（例えば、細菌内容物の放出）と相関すると考えられる。例えば、超高ＢＲＰ活性により、実質的にすべての細菌の細菌細胞溶解が起こる。従って、本明細書で用いる「超高発現」は、実質的に全細菌の細菌細胞溶解を引き起こすＢＲＰの発現レベルとして定義される。ＢＲＰを発現しない対照細菌と比較して、適度のＢＲＰ活性は、細菌の溶解を必要とせずに、細菌内容物の部分的または増強された放出を伴う。従って、この実施形態では、ＢＲＰの適度な過剰発現とは、実質的にすべての細菌の細菌溶解を伴なわずに、細胞質成分の放出が増加される発現レベルを意味する。本明細書で用いる実質的にすべての細菌とは、細菌の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９０〜１００％を意味する。
【０１５５】
本発明の具体的実施形態では、ＢＲＰタンパク質は、ｐＣｌｏＤＦ１３ＢＲＰ突然変異体であり、その溶菌機能は、そのタンパク質放出機能とは分離されているため、細菌溶解なしに、タンパク質放出を増強する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌら、１９９８， Ａｐｐ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：３９２−３９８）。この実施形態により、細菌ベクターからのタンパク質放出が長くなると共に、ベクターの頻繁な投与の必要性が減少する。別の具体的実施形態では、本発明のＢＲＰは、Ｃ末端を短くしたｐＣｌｏＤＦ１３ＢＲＰであり、これは、タンパク質放出に加えて、細胞溶解を引き起こす（Ｌｕｉｒｉｎｋら、１９８９， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：２６７３−２６７９）。
【０１５６】
本発明の別の実施形態では、増強された放出系は、ポーリンタンパク質の過剰発現を含む；例えば、Ｓｕｇａｗａｒａ， Ｅ．およびＮｉｋａｉｄｏ， Ｈ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２５０７−１１を参照のこと。
【０１５７】
特定の実施形態では、本発明の細菌ベクターによりＢＲＰを発現させる場合、ＢＲＰは、修飾弱毒化腫瘍標的細菌に内在性でも、あるいは、外因性のもの（例えば、弱毒化腫瘍標的細胞にネイティブではない核酸によりコードされたもの）でもよい。ＢＲＰは、プラスミドを含む核酸により、または弱毒化腫瘍標的細胞のゲノムに組み込まれたタンパク質核酸によりコードすることができる。また、ＢＲＰは、一次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。さらに、ＢＲＰは、二次エフェクター分子をコードする同じ核酸またはプラスミドでコードしてもよいし、あるいは、別々の核酸またはプラスミドでコードしてもよい。一実施形態では、ＢＲＰ様タンパク質は、Ｏｍｐ様タンパク質と融合させたエフェクター分子を含む融合タンパク質も発現する細胞内で発現させる。この実施形態では、ＢＲＰの共発現により、融合タンパク質の放出を増強することができる。
【０１５８】
本発明の好ましい具体的実施形態では、ＢＲＰをコードする核酸は、コリシンプラスミドによりコードされる。本発明の別の具体的実施形態では、ＢＲＰコード核酸は、ネイティブのＢＲＰプロモーターの制御下で発現させるが、その際のプロモーターは、その正常な宿主（ＢＲＰの場合、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌｏａｃａｅ）においてストレス（例えば、紫外線等のＤＮＡ損傷を起こす条件）に応答するＳＯＳプロモーターであり、しかも、サルモネラにおいて部分的に構成的である。好ましい実施形態では、ＢＲＰコード核酸は、ｐｅｐＴプロモーターの制御下で発現させるが、その際、該プロモーターは、腫瘍環境の嫌気性性質に応答して活性化する（例えば、Ｌｏｍｂａｒｄｏら、１９７７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１７）。
【０１５９】
あるいは、プロモーターは、Ｔｎ１０トランスポゾンのｔｅｔプロモーター等の抗生物質誘導プロモーターであることができる。好ましい実施形態では、ｔｅｔプロモーターは、単量体（ｓｉｎｇｌｅｍｅｒ）であり、該単量体は、ドキシサイクリンおよびアンヒドロテトラサイクリン等のテトラサイクリンまたはその類似体の存在に、悉無律的に応答し、遺伝学的に安定したオン−オフスイッチを提供する。別の実施形態では、ｔｅｔプロモーターは、多量体化（例えば、３倍）する。このような多量体は、テトラサイクリンの存在に段階的に応答し、エフェクター分子レベルの制御をより操作しうる系を提供する。次に、本発明の弱毒化腫瘍標的細菌で治療している被験者に、適した用量のテトラサイクリンを投与することにより、プロモーター活性を誘導する。ｔｅｔ誘導性発現系は、当初、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＦａｒｙａｒおよびＧａｔｚ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３４５−３４９）および哺乳動物細胞（ＬａｎｇおよびＦｅｉｎｇｏｌｄ， １９９６， Ｇｅｎｅ １６８：１６９−１７１）等の真核細胞系について記載されていたが、近年の研究で、細菌細胞までその適用性が広がっている。例えば、Ｓｔｉｅｇｅｒら（１９９９， Ｇｅｎｅ ２２６：２４３−２５２）は、ｔｅｔプロモーターに機能的に連結させたｔｅｔ誘導における、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子の８０倍誘導を明らかにした。このプロモーターの利点は、非常に低レベルのテトラサイクリン、すなわち、抗生物質活性に必要な用量の約１／１０で、誘導される点である。
【０１６０】
５．４．　誘導体と類似体
本発明は、さらに、誘導体をコードまたは送達するように修飾された細菌ベクターを包含する。この誘導体として、限定するものではないが、一次および／または二次エフェクター分子、もしくはこれをコードする核酸の断片、類似体、あるいは変異型が挙げられる。誘導体、類似体または変異型は、機能的に活性であり、例えば、全長の、野生型エフェクター分子に関連する１以上の機能活性を示すことができる。一例として、所望の治療特性を有するこのような誘導体、類似体または変異型を用いて、腫瘍成長または腫瘍細胞の分散（転移）を阻害することができる。エフェクター分子の誘導体または類似体は、本明細書に記載したもの等、当業者には公知の方法により、所望の活性について試験することができる。
【０１６１】
特に、野生型エフェクター分子と同じ、もしくはこれより高い抗腫瘍機能を有する分子を提供する置換、付加（例えば、挿入）または欠失により、エフェクター分子コード配列を改変することにより、変異型を作製することができる。例えば、本発明の変異型としては、限定するものではないが、一次アミノ酸配列として、エフェクター分子のアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられ、これには、機能的に同等のアミノ酸残基を配列内で、サイレント変化を起こす残基で置換した、改変された配列がある。すなわち、改変された配列は、少なくとも１の保存的置換を有する。
【０１６２】
哺乳動物に由来する一次または二次エフェクターコード核酸のいずれかを改変して、当業者には公知の方法により、細菌コドン使用頻度を用いることができる。好ましいコドン使用頻度は、下記に例示されている：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク， およびＺｈａｎｇら、１９９１， Ｇｅｎｅ １０５：６１−７２。
【０１６３】
具体的実施形態では、一次または二次エフェクター分子の誘導体、類似体または変異型は、一次または二次エフェクター分子、またはその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。ここで、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で、例えば、約４５℃で６ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせた後、約５０〜６５℃で０．２ ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄することにより行う。または、高度にストリンジェントな条件下で、例えば、約４５℃で６ｘ ＳＳＣ中でフィルターに結合させた核酸とハイブリダイズさせた後、約６８℃で０．１ ｘ ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄することにより実施する。あるいは、当業者には公知の他のストリンジェントな条件下で実施することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、編、１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ニューヨーク、ｐａｇｅｓ ６．３．１〜６．３．６および２．１０．３）。
【０１６４】
一次もしくは二次エフェクター分子の誘導体または類似体としては、限定するものではないが、一次もしくは二次エフェクター分子またはその断片に実質的に相同的な領域を含む分子（例えば、様々な実施形態における、挿入または欠失を一切含まない同じサイズのアミノ酸配列に対して、あるいは、アラインメントが当業者には公知のコンピュータ相同性プログラムにより実施されたアラインメント済配列と比較して、少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％同一性）、あるいは、そのコード核酸が、高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、エフェクター分子タンパク質エフェクター分子コード配列にハイブリダイズすることができる分子が挙げられる。
【０１６５】
例えば、一次エフェクター分子の配列と他の既知配列間の、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性百分率を決定するために、最適な比較目的に合わせて配列をアラインメントする（例えば、第１アミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入して、第２アミノ酸または核酸配列との最適アラインメントを達成することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列における位置が、第２配列における対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合には、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数＃／位置の総数＃（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
【０１６６】
２つの配列間の同一性百分率は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの好ましい非制限的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７に記載されているように修正された）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて実施することにより、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施することにより、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されているように、ギャップＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施してもよい（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの別の好ましい非制限的例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＡＬＩＧＮプログラムを使用してアミノ酸配列を比較する場合には、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および、４のギャップペナルティーを用いることができる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは、当業者には公知であり、次のものが挙げられる：ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ， １９９４， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， １０：３−５に記載されたＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−８に記載されたＦＡＳＴＡ。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐが、検索の鋭敏性および速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２であれば、比較している２つの配列における類似領域は、アラインメント済残基対を調べることによりみつけられる。また、ｋｔｕｐ＝１であれば、単一のアラインメント済アミノ酸を調べる。ｋｔｕｐは、タンパク質配列の場合は、２または１に、ＤＮＡ配列の場合は、１〜６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合には、デフォ��トは、タンパク質については２、ＤＮＡについては６である。ＦＡＳＴＡパラメターのさらに詳細な説明については、
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２
を参照されたい。尚、この内容は、本明細書に参照により組み入れる。
【０１６７】
あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：３８３−４０２に記載されているＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを用いて実施することができる。
【０１６８】
２つの配列間の同一性百分率は、ギャップのあるなしに拘わらず、前述したものと同様の技法を用いて決定することができる。同一性百分率を計算する際には、正確に同じものだけを計数する。
【０１６９】
一次エフェクター分子もしくは二次エフェクター分子、またはその誘導体または類似体は、当業者には公知の様々な方法により生成することができる。これらを生成するための操作は、核酸またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、エフェクター分子をコードする、クローン化されたエフェクター分子コード配列は、当業者には公知の多数の戦略のいずれかによって修飾することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ニューヨーク）。該配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な部位で切断し、次いで、所望であれば、さらに酵素による修飾を施し、単離した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連結することができる。一次または二次エフェクター分子の誘導体または類似体をコードする修飾エフェクター分子の生成の際、所望の一次または二次エフェクター分子活性がコードされるエフェクター分子コード配列領域において、修飾エフェクター分子コード配列が、翻訳停止シグナルにより中断されない状態で、ネイティブタンパク質と同じ翻訳リーディングフレーム内に残ることを確実にするよう注意しなければならない。
【０１７０】
さらに、エフェクター分子をコードする核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで突然変異させることにより、翻訳、開始、および／または終結配列を形成および／または破壊する、あるいは、コード領域に変異を発生させる、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、もしくは既存のものを破壊することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾をさらに促進することができる。好ましい具体的実施形態では、エフェクター分子コード核酸を突然変異させることにより、例えば、さらに強力な変異型を生成する。当業者には公知の任意の突然変異誘発技法を用いることができ、この技法には、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位指定突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、突然変異を含むプライマーを用いるＰＣＲ等。好ましい実施形態では、エフェクター分子の１以上の推定非必須アミノ酸残基の位置において、保存的アミノ酸置換物を作製する。「保存的アミノ酸置換物」とは、アミノ酸残基を、類似した電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものを意味する。類似した電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーとしては、下記のものが挙げられる：塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β枝分かれ側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をそれぞれ有するアミノ酸。あるいは、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発により、コード配列の全部または部分に沿って、ランダムに導入することができ、こうして得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングすることにより、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードタンパク質を発現させ、該タンパク質の活性を決定することができる。
【０１７１】
別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を含むように、本発明のエフェクター分子または融合タンパク質を構築する。
【０１７２】
５．５．　融合タンパク質
特定の実施形態では、本発明は、融合タンパク質（例えば、別のタンパク質と共有結合している）として構築される一次または二次エフェクター分子を提供する。本発明は、このような融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸を、適したプロモーターに機能的に連結する。
【０１７３】
特定の実施形態では、エフェクター分子は、別のタンパク質のアミノ酸配列とのペプチド結合を介して、そのアミノ−またはカルボキシ−末端に結合したエフェクター分子もしくはその断片（好ましくは、該エフェクター分子の少なくともドメインもしくはモチーフ、または、該エフェクター分子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、もしくは少なくとも１００のアミノ酸からなる）を含むキメラタンパク質または融合タンパク質として構築される。特定の実施形態では、融合物は、機能的に活性である異種ポリペプチドまたはその断片の少なくとも２、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、もしくは少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む。一実施形態では、このようなキメラタンパク質または融合タンパク質は、別のタンパク質のコード配列にフレーム内結合した一次エフェクター分子をコードする核酸（例えば、ＴＮＦコード配列、抗血管新生因子コード配列、腫瘍抑制酵素コード配列、もしくは細胞傷害性ポリペプチドコード配列）の組換え発現により生成する。このようなキメラタンパク質は、当業者には公知の方法により、適正なコードフレーム内で、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結した後、当業者には公知の方法で最適の発現運搬体にキメラ産物を発現することにより、作製することができる。任意の異種ポリペプチドコード配列と融合させたエフェクター分子をコードする核酸部分を含むキメラ核酸を構築してもよい。具体的実施形態は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、もしくは少なくとも１００のアミノ酸からなる一次または二次エフェクター分子の断片、あるいは、全長一次または二次エフェクター分子の１以上の機能活性を示す断片を含むキメラタンパク質に関する。
【０１７４】
具体的実施形態では、融合タンパク質は、ヘキサヒスチジンタグ等のアフィニティータグ、または精製、単離、同定もしくは発現アッセイで用いることができるその他のアフィニティータグを含む。別の具体的実施形態では、融合タンパク質は、メタルプロテアーゼまたはセリン切断部位等のプロテアーゼ部位を含む。この実施形態では、腫瘍部位で活性であるプロテアーゼに対応するプロテアーゼ部位を本発明の融合タンパク質中に構築するのが好ましい場合もある。いくつかの実施形態では、エフェクター分子は、Ｏｍｐ様タンパク質、もしくはその断片（例えば、シグナル配列、リーダー配列、周辺細胞質領域、膜貫通ドメイン、多重膜貫通ドメイン、あるいは、これらの組合せ；以下の第３．１節、Ｏｍｐ様タンパク質の定義を参照）との融合タンパク質として構築する。
【０１７５】
好ましい実施形態では、本発明のエフェクター分子（一次または二次）は、外膜タンパク質（Ｏｍｐ様タンパク質）を含む融合タンパク質として発現させる。細菌外膜タンパク質は、細菌外膜の膜内在性タンパク質であり、多重膜貫通（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを有し、多くの場合、１以上の脂質成分に結合している。外膜タンパク質は、初め、タンパク質を膜に向かわせるアミノ末端シグナルペプチドを有する前駆体の形態で発現し、その際に、シグナルペプチドをシグナルペプチダーゼにより切断して、成熟タンパク質を生成する。一実施形態では、エフェクター分子は、Ｏｍｐ様タンパク質との融合タンパク質として発現させる。この実施形態では、一次エフェクター分子は、細菌の外膜への送達が増強されている。機構に関して制限するわけではないが、本発明者は、Ｏｍｐ様タンパク質が、外膜に対するエフェクター分子のアンカーまたは連結鎖（ｔｅｔｈｅｒ）として働く、あるいは、細菌外膜にタンパク質を局在化させる役割を果たすと考える。一実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質とのエフェクター分子との融合を用いて、周辺細胞質へのエフェクター分子の局在化を増強する。別の実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質とエフェクター分子の融合を用いて、エフェクター分子の放出を増強する。具体的実施形態では、Ｏｍｐ様タンパク質は、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＢ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＤ、ＯｍｐＥ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ポーリン様タンパク質、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ｌａｍＢ、βラクタマーゼ、エンテロトキシン、プロテインＡ、エンドグルカナーゼ、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）、ＦｅｐＡ、ＦｈｕＡ、ＮｍｐＡ、ＮｍｐＢ、ＮｍｐＣ、もしくは主要な外膜リポタンパク質（ＬＰＰ等）の少なくとも一部である。本発明の特定の実施形態では、シグナル配列は、疎水性を高めて構築する（例えば、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン）への、シグナル配列内のアミノ酸の挿入または置換による）。実施例については、以下の第７．１〜７．４節を参照のこと。
【０１７６】
本発明の別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、タンパク質分解切断部位を含む。タンパク質分解切断部位は、エフェクター分子に内在的またはＯｍｐ様タンパク質に内在的である、あるいは、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質中に構築してもよい。特定の具体的実施形態では、本発明のＯｍｐ様タンパク質は、別々のタンパク質に由来する構造エレメントを含むハイブリッドＯｍｐである。
【０１７７】
上記実施形態の態様例では、Ｏｍｐ様タンパク質はＯｍｐＡである。具体的Ｏｍｐ様タンパク質の構造的立体配置に留意しながら、ＯｍｐＡ様融合タンパク質の構築に用いた同じ原理を他のＯｍｐ様タンパク質に適用することができる。
【０１７８】
例えば、ネイティブＯｍｐＡタンパク質は、該タンパク質の１７０アミノ酸Ｎ末端ドメイン内に８つのアンチパラレル膜貫通β鎖を含む。膜貫通ドメインの各対の間には、膜貫通ドメインの挿入方向に応じて、細胞外または細胞内ループがある。Ｃ末端ドメインは、１５５アミノ酸からなり、これらは、細胞内に位置し、恐らく、細胞周辺腔を占めるペプチドグリカンと接触していると思われる。ＯｍｐＡ融合タンパク質の生成を促進する発現ベクターが作製されている。例えば、Ｈｏｂｏｍら（１９９５， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔｒａｎｄ． ８４：２５５−２６２）は、ＯｍｐＡオープンリーディングフレームを含むベクターを開発しており、これは、第３または第４細胞外ループをコードする配列内にリンカーが挿入されている。該ループにより、選択した異種タンパク質のフレーム内挿入が可能になる。
【０１７９】
本発明の一実施形態では、一次エフェクター分子を含むＯｍｐＡ融合タンパク質部分は、周辺細胞質において発現を増強させた。該実施形態の一態様では、融合タンパク質は、成熟前に、シグナル配列、または、一次エフェクター分子もＮ末端に位置するＯｍｐＡの少なくとも１の膜貫通ドメインが続くシグナル配列を含む。シグナル配列は切断され、成熟タンパク質から欠失している。上記実施形態の別の態様では、一次エフェクター分子は、ＯｍｐＡ融合タンパク質のＮ末端にあるため、融合タンパク質が安定している限り、使用したＯｍｐＡの膜貫通ドメインの数は、一次エフェクター分子の位置決定にとって重要ではなくなる。上記実施形態のさらに別の態様では、一次エフェクター分子は、ＯｍｐＡのＮおよびＣ末端ドメインの間に配置し、これによって、可溶性周辺細胞質タンパク質は、周辺細胞質内の周辺細胞質プロテアーゼによる切断の際に、一次エフェクター分子を含有する。この実施形態の特定の態様では、周辺細胞質一次エフェクター分子を発現する細菌ベクターは、ＢＰＲも共発現することにより、細菌細胞からのエフェクター分子の放出を増強する。
【０１８０】
本発明の別の実施形態では、一次エフェクター分子を含むＯｍｐＡ融合タンパク質部分は、細胞外細菌表面にある。該実施形態の一態様では、融合タンパク質は、一次エフェクター分子のＮ末端に位置するＯｍｐＡの偶数または奇数の膜貫通ドメインを含む。上記実施形態の別の態様では、一次エフェクター分子をＯｍｐＡの２つの細胞外ループ間に配置して、細菌細胞による腫瘍細胞への表示を達成する。具体的実施形態では、本発明は、細菌細胞外表面に位置するエフェクター分子融合タンパク質の発現プラスミドを提供する。例えば、Ｔｒｃ（ｌｐｐ）ｏｍｐＡと称されるプラスミドは、切断型ｏｍｐＡ膜貫通配列に融合したｔｒｃプロモーター駆動リポポリタンパク質（ｌｐｐ）アンカー配列を含む。別の例として、上記プラスミドは、ＴｒｃｏｍｐＡと称し、ｔｒｃプロモーター駆動ｏｍｐＡコードシグナル配列を含む。このようなプラスミドは、本発明の１以上のエフェクター分子をコードする核酸を含むように構築することができる。
【０１８１】
場合に応じて、エフェクター分子は、腫瘍に豊富に存在するメタロプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼの共通切断部位に先行されるか、もしくは該部位と隣接させることにより、腫瘍環境にエフェクター分子の放出を起こす。一次エフェクター分子が、プロテアーゼ切断部位に先行されるか、隣接させるかは、それぞれ、融合タンパク質内の末端に位置するか、内部に位置するかによる。
【０１８２】
同様の融合タンパク質は、ＯｍｐＡに関して前述した戦略を使用し、任意のＯｍｐ様タンパク質と構築することができる。このような融合タンパク質の構築に際して、当業者には明らかなように、エフェクター分子に融合させるＯｍｐ様タンパク質部分の選択は、エフェクター分子の発現のために望ましい位置（例えば、周辺細胞質に、細胞外に、膜に結合して等）に応じて異なる。一次エフェクター分子に関して、本明細書に記載したこのようなタンパク質構築は、二次エフェクター分子に対しても適切である。
【０１８３】
好ましい実施形態では、エフェクター分子はフェリーペプチドに融合させる。融合タンパク質に用いられるフェリーペプチドは、その生成または導入の拡散範囲（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ）内で、実質的にあらゆる細胞へ、目的とするポリペプチドまたはペプチドの送達を促進することが明らかにされている（例えば、Ｂａｙｌｅｙ， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１０６６−１０６７；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４１８−４２０；およびＤｅｒｏｓｓｉら、１９９８， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：８４−８７）。従って、弱毒化腫瘍標的細菌が、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む融合タンパク質を発現するように、該細菌を操作することにより、エフェクター分子が腫瘍細胞によって取り込まれる能力を増強する。具体的実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現するように操作する。別の実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。これらの実施形態によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。フェリーペプチドの例として、限定するものではないが、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質に由来するペプチド、アンテナペディアホメオドメイン（ペネトラキシン）、カポジ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）膜移行性配列（ＭＴＳ）、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、ポリヒスタジン（例えば、ヘキサヒスタジン；６Ｈ）、ポリリシン（例えば、ヘキサリシン；６Ｋ）およびポリアルギニン（例えば、ヘキサアルギニン；６Ｒ）（例えば、Ｂｌａｎｋｅら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：８４３７−８４４２）が挙げられる。
【０１８４】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチド、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む。この実施形態の具体的態様では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。この態様によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。
【０１８５】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、弱毒化腫瘍標的細菌により固形腫瘍癌に送達するための、シグナルペプチド、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む。具体的実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は、シグナル配列、タンパク質分解切断部位、フェリーペプチドおよびエフェクター分子を含む１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するように操作する。この態様によれば、エフェクター分子は、一次または二次エフェクター分子でよい。
【０１８６】
非制限的例として、コリシン活性は、ＨＩＶ ＴＡＴ、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、アンテナペディア、６Ｈ、６Ｋおよび６Ｒに由来する取り込み用ペプチドを添加することにより増強することができる。融合は、Ｃ末端、Ｎ末端または内部のいずれにおいても可能である。内部での融合は、Ｎ末端シグナル配列切断ペプチドの後に融合が続く場合、特に好ましい。融合タンパク質は、さらに、ＯｍｐＡ等のＮ末端シグナル配列、またはｈｌｙＡ等のＣ末端シグナル配列を含む。
【０１８７】
好ましい実施形態では、エフェクター分子を毒素の送達部分に融合させる。様々な毒素が、自己送達能力を有することで知られており、その際、毒素の一部分が、毒素の第２部分の送達因子として働く。例えば、Ｂａｌｌａｒｄら（１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ　９３：１２５３１−１２５３４）は、哺乳動物細胞の細胞質ゾルコンパートメントへの致死因子（ＬＦ）および浮腫因子のエントリーを媒介する炭疽（ａｎｔｈｒａｘ）保護剤（ＰＡ）が、ＬＦの切断型（ＬＦｎ；２５５アミノ酸残基）へのタンパク質融合物のエントリーも媒介できることを明らかにした。従って、本発明のエフェクター分子は、細胞の外部で機能するものを除き、ＬＦｎ、またはその他の毒素系（限定するものではないが、ジフテリア毒素Ａ鎖残基１−１９３等）（Ｂｌａｎｋｅら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ／ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：８４３７−８４４２）、コレラ毒素、ベロ毒素、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）、大腸菌熱安定性毒素（ＳＴ）、腸溶血素、エンテロトキシン、細胞毒素、ＥａｇｇＥＣ安定性毒素１（ＥＡＳＴ）、ＣＮＦ、細胞致死性膨張毒素、α溶血素、β溶血素、およびＳｈｅＡ溶血素に融合することができる（詳しくは、例えば、Ｏ’ＢｒｉｅｎおよびＨｏｌｍｅｓ， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（編）， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， ワシントンＤ．Ｃ．， ｐｐ２７８８−２８０２参照）。具体的実施形態では、一次エフェクター分子を毒素の送達部分に融合する。別の具体的実施形態では、二次エフェクター分子を毒素の送達部分に融合する。
【０１８８】
細菌内で発現させるための融合タンパク質の構築は、当業者には公知であり、このような方法は、本発明の範囲に含まれる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ．， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｓ ６０：５１２−５３８を参照。尚、この文献は、参照により本明細書にその全文を組み入れる）。
【０１８９】
５．６　発現運搬体
本発明は１以上の一次エフェクター分子および１以上の任意の二次エフェクター分子をコードするよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明はプラスミドまたはトランスフェクト可能な核酸にコードされるエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。本発明の好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌において２以上のエフェクター分子（例えば、一次または二次）が発現される場合には、エフェクター分子は同一のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよいし、または２以上のプラスミドもしくは核酸分子にコードされていてもよい。本発明はまた細菌ゲノムに組み込まれた核酸分子にコードされるエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。組み込まれるエフェクター分子はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌の内生のものであってもよいし、またはエフェクター分子をコードする核酸分子が弱毒化腫瘍標的細菌のゲノムに組み込まれるように、弱毒化腫瘍標的細菌に導入してもよい（例えば、プラスミド、トランスフェクト可能な核酸、トランスポゾンなどのようなエフェクター分子をコードする核酸の導入による）。本発明の好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。本発明は適当なプロモーターに機能的に連結されている、エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。エフェクター分子をコードする核酸分子に機能的に連結されているプロモーターは同種（すなわち、天然のもの）または異種（すなわち、エフェクター分子をコードする核酸分子に対して天然のものでない）であってもよい。
【０１９０】
本発明のエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列またはその機能的に活性な類似体もしくは断片もしくはその他の誘導体は、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含む適当な発現運搬体、例えばプラスミドに挿入してもよい。必須転写および翻訳シグナルはエフェクター分子および／またはそのフランキング領域によって供給されてもよい。あるいは、発現運搬体は、ＤＮＡ操作の分野で公知の種々の方法の１つを用いて、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、好適な翻訳開始および終結シグナルとともに、機能性プロモーターと機能可能な読み取り相で挿入することによって構築する。概論として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照。これらの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）を含み得る。本発明は適当なプロモーターに機能的に連結されている、エフェクター分子をコードする核酸分子を提供する。
【０１９１】
本発明はまた１以上の融合タンパク質および１以上の任意のエフェクター分子をコードするよう改変された弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。本発明はプラスミドまたはトランスフェクト可能な核酸にコードされる融合タンパク質を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を提供する。サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌において２以上の融合タンパク質および／またはエフェクター分子（例えば、一次または二次）が発現される場合には、融合タンパク質および／もしくはエフェクター分子は同一のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよいし、または２以上のプラスミドもしくは核酸にコードされていてもよい。本発明はまた細菌ゲノムに組み込まれた核酸にコードされる融合タンパク質を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も提供する。本発明はまた適当なプロモーターに機能的に連結されている融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のための必須エレメントを含む適当な発現運搬体、例えばプラスミドに挿入してもよい。
【０１９２】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の発現運搬体はプラスミドである。当業者には多数の好適なプラスミドが知られており、また市販のものを入手して本発明の組換え構築物を作製することもできる。
【０１９３】
かかる市販のプラスミドとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「基幹」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。ｐＢＲ３２２は低コピー数プラスミドであると考えられている。高レベルの発現を望む場合には、プラスミドは高コピー数プラスミド、例えば、ｐＵＣ基幹を含むプラスミドであってもよい。ｐＵＣプラスミドとしては、限定されるものではないが、ｐＵＣ１９（例えば、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら， １９８５， Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９参照）およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
【０１９４】
以下のプラスミドが例として挙げられ、本発明の方法とともに使用できる。細菌性：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｈｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。ｐＢＲ３２２「基幹」を含む市販のプラスミド、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）も使用できる。これらを適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。ｐＣＥＴ、ｐＴＳ（本明細書の第６節に記載されるような）。
【０１９５】
本発明の特定の実施形態では、エフェクター分子をコードするプラスミドは本明細書の第６節に記載されるｐＴＳ−ＴＮＦ−αプラスミド、ｐＴＳ−ＢＲＰプラスミド、またはｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αプラスミドである。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態では、ＯｍｐＡシグナル配列および一次エフェクタータンパク質を含んでなる、細胞膜周辺腔への分泌のための本発明の融合タンパク質はプラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−Ｈｉｎｄにコードされており、これは一次エフェクター分子のコード配列がクローニングされ得るリンカー配列の上流にｏｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む。好ましい特定の実施形態では、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−Ｈｉｎｄベクターのｌａｃ誘導性プロモーターをｐｅｐＴまたはｔｅｔプロモーターで置換する（Ｒｅｎｔｉｅｒ−Ｄｅｌｒｕｅら（１９８８）， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８７２６参照）。
【０１９７】
本発明はまたエフェクター分子のトランスポゾン媒介性染色体組込みを提供する。本発明の方法には、エフェクター分子をコードする核酸がトランスポゾンカセット中に構築され得る限り、当技術分野で公知のいずれのトランスポゾンプラスミドを用いてもよい。例えば、本発明はトランスポゾンまたはミニトランスポゾンおよびＭＣＳを含んでなるトランスポゾンプラスミドを提供する。
【０１９８】
本発明のある実施形態では、本発明のプラスミドはトランスポゾンプラスミドである、すなわち、注目されるエフェクター分子をコードする配列が挿入されたトランスポゾンを含んでなる。トランスポゾンプラスミドはトランスポゾンカセットを含み、このカセットが細菌ゲノムに組み込まれる。従って、エフェクター分子またはその融合タンパク質をコードする核酸をトランスポゾンカセットに挿入する。このようにして、トランスポゾン挿入によりそのカセットが細菌ゲノムに組み込まれる。エフェクター分子のコード配列はプロモーターに機能的に連結していてもよいし、またはプロモーターなしでもよい。後者の場合には、選択マーカーの発現は細菌ゲノムへのトランスポゾン挿入部位にあるプロモーターによってなされる。トランスポゾンが挿入された細菌のコロニーを本発明の要件に一致する発現レベルについて、例えば、腫瘍の細胞傷害性、静止、退縮を増強するのに十分なレベルのサイトカインを発現するものをスクリーニングする。
【０１９９】
ある実施形態では、トランスポゾンプラスミドがトランスポゾンの他に、トランスポゾンの逆位反復配列の外側に、トランスポゾンとともに運ばれることなく、トランスポゾンの細菌ゲノムへの挿入を触媒するトランスポザーゼ遺伝子を含んでなり、そのようにして安定なトランスポゾン挿入を有する細菌菌株を作製する。
【０２００】
本発明に利用されるトランスポゾンとしては、限定されるものではないが、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０およびＴｎ５が挙げられる。好ましい実施形態では、トランスポゾンプラスミドはＴｎ１０挿入エレメントの外側に位置するアンピシリン耐性遺伝子を有するｐＮＫ２８８３（ＡＴＣＣ）であり、１以上のエフェクター分子をコードする核酸が２個のＴｎ１０挿入エレメントの間（例えば、トランスポゾンカセット内）に挿入されている。好ましくは、構築物はその他のエレメントをコードするさらなる配列が２個のＴｎ１０挿入エレメントの間に挿入されるように作製する。特定の実施形態では、かかるエレメントは所望により（１）プラスミドを含む細菌の陽性選抜のための選択マーカー（例えば、ＳｅｒＣ、ＡｒｏＡなど）のプロモーターのないコピー；（２）ＢＲＰ遺伝子、（３）１以上の一次エフェクター分子（ＴＮＦ−α、またはその融合タンパク質、例えば、Ｏｍｐ−Ａ−ＴＮＦ−α融合物など）をコードする核酸に機能的に連結されたエフェクター分子（ｔｒｃなど）のプロモーター、（４）１以上のエフェクター分子をコードする核酸のターミネーターを含んでもよい。
【０２０１】
ある実施形態では、必要に応じてプラスミドを操作し、プラスミドにコードされるアンピシリン耐性特性を用いて所望の構築物を有するクローンを選抜した後、プラスミドの喪失によって抗生物質選抜が除去され、ヒト患者への投与のための染色体トランスポゾン挿入部分を有する菌株を選択する（例えば、選択培地にプレーティングすることによる）。
【０２０２】
もう１つの特定の実施形態では、標的特異性が変化したトランスポザーゼ遺伝子およびプロモーターのないｓｅｒＣ遺伝子のコード配列およびＭＣＳを含むミニトランスポゾンを含んでなるプラスミドｐＴＳを用いる。もう１つの特定の実施形態では、標的特異性が変化したトランスポザーゼ遺伝子およびプロモーターのないｓｅｒＣ遺伝子のコード配列、およびアルキル化剤誘導性バクテリオシン放出因子およびＭＣＳを含むミニトランスポゾンを含んでなるプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰを用いる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、トランスポゾン媒介性染色体組込み体の選抜のためのトランスポゾンプラスミドは以下を含んでなる：
ａ）トランスポゾン挿入配列の外側に（例えば、トランスポゾンカセットの外側に）位置するトランスポゾン切り出しおよび組込みのためのトランスポザーゼ遺伝子；
ｂ）細菌菌株において欠失した選択遺伝子（例えば、ｓｅｒＣ）に相当する野生型コード配列ならびにリボソーム結合部位および野生型遺伝子のターミネーター（ただし、プロモーターは欠く）。この配列は好ましくは左側のＴＮ１０トランスポゾン挿入配列の直後に位置する；
ｃ）所望により、右側および左側の挿入配列の間が放出増強核酸（例えば、ＢＲＰ）をコードする核酸配列である；ならびに
ｄ）右側および左側の挿入配列の間に位置し、プラスミド内に唯一の制限部位を複数含む、エフェクター分子の組込みのためのマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）。ＭＣＳは好ましくは放出増強核酸の直後（使用する場合には）、かつ、右側のＴＮ１０挿入配列の直前に位置する。
【０２０４】
もう１つの実施形態では、宿主染色体へのエフェクター分子のランダムな組込みに起因する遺伝子破壊により、エフェクター挿入の遺伝子位置の適性を確認する。
【０２０５】
さらにもう１つの実施形態では、発現運搬体は抗生物質選抜を必要としない安定な、すなわち、自己維持される染色体外プラスミドである。限定するものではないひとつの実施例では、自己維持型発現運搬体はサルモネラ病原性プラスミドである。
【０２０６】
例えば、本発明のある実施形態では、プラスミド選抜系をサルモネラ菌などの細菌が失っている機能を提供することで維持し、それに基づいて機能を有するサルモネラ菌をそうでないものから選抜することができる。ある実施形態では、本発明のサルモネラ菌は栄養要求性変異菌株であり、発現プラスミドは変異株すなわち生合成酵素機能が欠けたものを提供する。発現プラスミドを含むサルモネラ菌は細胞を所望の細胞、すなわち、発現プラスミドを含むもののみが代謝できる栄養素を欠く増殖培地で増殖させることで選抜できる。この実施形態の非常に好ましい態様では、最も好ましくはａｓｄ遺伝子の欠失によって、本発明のサルモネラ菌はＤＡＰ（メソ−ジアミノピメリン酸）を不可避に要求する。ＤＡＰはグラム陰性菌の周辺細胞質に存在するペプチドグリカンの構成要素であり、完全な細菌外膜に必要である。ＤＡＰがないと細菌細胞は外膜が完全でないために溶解してしまう。ａｓｄ（β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）遺伝子はＤＡＰ生合成経路中の酵素をコードしている。ａｓｄ機能を欠くグラム陰性菌は培養培地にＤＡＰを供給することで増殖させられる。同種または異種プロモーターに機能しうる形で連結したａｓｄ遺伝子配列を保持するプラスミド、例えば、本発明の発現プラスミドはＤＡＰの不在下でａｓｄ活性を欠くグラム陰性菌を増殖させることで選抜できる（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ， ＩＩＩの米国特許第５，８４０，４８３号参照）。
【０２０７】
その他の非抗生物質選抜系が当技術分野で知られており、かつ、本発明の範囲内にある。例えば、安定な毒素とあまり安定でない抗毒素を含んでなるプラスミドを利用する選抜系を使用してかかるプラスミドを維持する細菌を選抜してもよい。
【０２０８】
もう１つの実施形態では、発現運搬体は非抗生物質的方法で選抜できる染色体外プラスミド、例えば、コリシンプラスミドである。本明細書において、コリシンプラスミドは最低限コリシン毒素および抗コリシンをコードし（コリシン毒素は抗コリシンよりもより安定である）、その結果、コリシンプラスミドを欠く細菌はいずれもコリシン毒素が継続する結果として死滅する。好ましい実施形態では、コリシン毒素はＣｏｌＥ３の大サブユニットであり、抗コリシンはＣｏｌＥ３の小サブユニットである。
【０２０９】
本発明のその他の実施形態では、発現運搬体はλベクター、より詳しくは溶原性λベクターである。好ましい実施形態では、λベクターを含んでなる細菌宿主は３０℃では機能的であるが３７℃ではそうでない温度感受性λリプレッサーをさらに含んでなる。従って、細菌宿主は３０℃で細菌細胞にとって毒性であり得る一次および／または二次エフェクター分子を発現せずにｉｎ ｖｉｖｏで増殖させ操作できる。細菌菌株の患者への導入の際には、λリプレッサーは正常な体温により不活化され、一次エフェクター分子および所望により二次エフェクター分子の発現が活性化される。
【０２１０】
エフェクター分子または融合タンパク質をコードする核酸配列の発現は、エフェクター分子が組換えＤＮＡ分子で形質転換された細菌において発現されるよう第２の核酸配列によって調節できる。例えば、エフェクター分子の発現は当技術分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御できる。プロモーター／エンハンサーは同種（すなわち、天然のもの）または異種（すなわち、天然のものでない）であってもよい。細菌におけるエフェクター分子、例えば、サイトカイン、または融合タンパク質の発現を制御するために使用できるプロモーターとしては、限定されるものではないが、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら， １９７８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７５：３７２７−３７３１）、またはｌａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２１−２５；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０， ２４２：７４−９４）などの原核生物プロモーターが挙げられる。本発明に包含されるその他のプロモーターとしては、限定されるものではないが、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、λＰＬ、ｔｒｃ、ｐａｇＣ、ｓｕｌＡ、ｐｏｌＩＩ（ｄｉｎＡ）、ｒｕｖ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＤ、ｕｍｕＤＣ、ｌｅｘＡ、ｃｅａ、ｃａａ、およびｒｅｃＮが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｎａｒｒら， １９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７３：４２３−４３１参照）。好ましい実施形態では、プロモーターはｔｒｃである（例えば、Ａｍａｎｎら， １９８８， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−１５参照）。
【０２１１】
一次エフェクター分子がＳＯＳ応答性プロモーターの制御下で発現されるコリシンである特定の実施形態では、弱毒化細菌菌株をコリシンの発現が増加するようｘ線、紫外線、アルカリ化剤または別のＤＮＡ損傷剤で処理してもよい。例示的ＳＯＳ応答性プロモーターとしては、限定されるものではないが、ｒｅｃＡ、ｓｕｌＡ、ｕｍｕＣ、ｄｉｎＡ、ｒｕｖ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＤ、ｌｅｘＡ、ｃｅａ、ｃａａ、ｒｃｃＮなどが挙げられる。
【０２１２】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーターは腫瘍環境において増大した活性を有する、例えば、ｐｅｐＴ遺伝子のＰ１プロモーターなどの腫瘍の嫌気環境により活性化されるプロモーターである。Ｐ１プロモーターの活性化はＦＮＲ転写アクチベーターに依存している（Ｓｔｒａｕｃｈら， １９８５， Ｊ， Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５６：７４３−７５１）。特定の実施形態では、Ｐ１プロモーターは嫌気条件下でｐｅｐＴ２００プロモーターなどの天然のＰ１プロモーターよりも高レベルで誘導される変異体プロモーターであり、嫌気条件に応じてその活性がＦＮＲではなくＣＲＰ−ｃＡＭＰによって誘導される（Ｌｏｍｂａｒｄｏら， １９９７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１９１７）。もう１つの実施形態では、嫌気的に誘導されるプロモーター、例えば、ｐｏｔＡＢＣＤプロモーターを用いる。ｐｏｔＡＢＣＤは嫌気条件下でｐｅｐＴから分岐して発現されるオペロンである。ｐｅｐＴ遺伝子においてこの発現にあずかっているプロモーターは単離されており（Ｌｏｍｂａｒｄｏら， １９９７， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：１９０９−１９１７）、本発明の方法に従って使用できる。
【０２１３】
あるいは、プロモーターはＴｎ１０トランスポゾンのｔｅｔプロモーターなどの抗生物質誘導性プロモーターであってもよい。好ましい実施形態では、ｔｅｔプロモーターは例えば三倍に多量化されている。次いで、プロモーター活性は本発明の弱毒化腫瘍標的細菌で治療された患者に適当な用量のテトラサイクリンを投与することによって誘導される。ｔｅｔ誘導可能な発現系は最初にスチゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｆａｒｙａｒ ａｎｄ Ｇａｔｚ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１：３４５−３４９）および哺乳類細胞（Ｌａｎｇ ａｎｄ Ｆｅｉｎｇｏｌｄ， １９９６， Ｇｅｎｅ １６８：１６９−１７１）などの真核細胞系について記載されたが、最近の研究はその適用を細菌細胞にまで拡げている。例えば、Ｓｔｉｅｇｅｒら（１９９９， Ｇｅｎｅ ２２６：２４３−２５２）はｔｅｔプロモーターに機能しうる形で連結される場合のｔｅｔ誘導でホタルルシフェラーゼ遺伝子の８０倍の誘導を示した。このプロモーターの利点は極めて低いレベルのテトラサイクリン、すなわち抗生物質活性に必要とされる用量の約１／１０で誘導されるということである。
【０２１４】
ひとたび、エフェクター分子または融合タンパク質を含んでなるプラスミドを構築し、弱毒化腫瘍標的細菌に導入すれば、エフェクター分子発現または融合タンパク質発現は、限定するものではないが、生物学的活性、酵素活性、ノーザンブロット解析、およびウェスタンブロット解析をはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法によってアッセイできる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。
【０２１５】
５．７．　組合せ療法
ある実施形態では、固形癌腫瘍を治療するために弱毒化腫瘍標的細菌をその他の公知の癌療法とともに用いる。あるその他の実施形態では、固形癌腫瘍を治療するために１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌をその他の公知の癌療法とともに用いる。例えば、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を化学療法薬とともに使用してもよい。化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、シスプラチン、イホスファミド、タキソールおよびパクリタキソールなどのタキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−ＩＩ、トポテカン、９−ＡＣ、およびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプレチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン相同物、およびサイトキサンが挙げられる。あるいは、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌を放射線療法（例えば、γ線またはｘ線照射）とともに使用してもよい。治療される癌の種類によっていずれの放射線療法プロトコールを用いてもよい。例えば、限定されるものではないが、ｘ線を照射してもよく、特に、深い腫瘍には高エネルギーメガボルト（１ＭｅＶエネルギー以上の照射）を用いてもよく、皮膚癌には電子ビームおよび正中電圧ｘ線照射を用いてもよい。放射線に組織を曝露するためにラジウム、コバルトおよびその他の元素の放射活性アイソトープなどのγ線放射性ラジオアイソトープを投与してもよい。
【０２１６】
本発明は抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の逐次または同時投与を含む。本発明は、相加的または相乗的である、抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせを包含する。
【０２１７】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、１以上の抗癌剤と弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせも包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられるいずれかの薬剤よりも向上した効力をもたらす。
【０２１８】
本発明はまた抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との逐次または同時投与を含む。本発明は、相加的であるか相乗的である、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との組み合わせを包含する。
【０２１９】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、１以上の抗癌剤と、１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌との組み合わせを包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重の作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられるいずれかの薬剤よりも向上した効力をもたらす。
【０２２０】
５．８　送達のための方法および組成物
本発明は、宿主に対する毒性を低下させた弱毒化腫瘍標的細菌によって、宿主の全身に送達されれば有毒であり得る１以上の一次エフェクター分子を腫瘍に局所的に送達できる方法を提供する。ある実施形態では、一次エフェクター分子は肉腫、リンパ腫、癌腫、またはその他の固形腫瘍癌を治療するのに有用である。ある限定するものではない実施形態では、エフェクター分子は腫瘍の部位での局所免疫応答の誘導に有用である。
【０２２１】
本発明によれば、１以上の一次エフェクター分子をコードする核酸分子を含む弱毒化腫瘍標的細菌ベクターおよび所望により１以上の一次エフェクター分子を、固形腫瘍癌を有するヒト患者をはじめとする動物において腫瘍の増殖を阻害するか、腫瘍の容積を減少させるか、または腫瘍細胞の蔓延を防ぐ方法に用いるのが有利である。
【０２２２】
本発明はかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための１以上の一次エフェクター分子の送達法を提供する。本発明はまたかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子および１以上の二次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための１以上の一次エフェクター分子の送達法を提供する。ある実施形態では、一次エフェクター分子はＴＮＦファミリーのメンバー、細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド、抗血管新生因子、腫瘍阻害酵素、またはその機能的断片である。
【０２２３】
本発明はかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための本発明の１以上の融合タンパク質の送達法を提供する。本発明はまたかかる治療を必要とする動物に、１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる、固形腫瘍癌の治療のための本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子の送達法を提供する。
【０２２４】
好ましい実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌はサルモネラ菌である。もう１つの実施形態では、弱毒化腫瘍標的細菌は増強された放出系を含んでなる。好ましい実施形態では、動物は哺乳類である。高度に好ましい実施形態では、動物はヒトである。
【０２２５】
本発明はまたサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌によって送達される、１以上の一次エフェクター分子と所望により１以上の二次エフェクター分子の組み合わせ送達を提供する。本発明はまた１以上の異なる一次エフェクター分子および／または所望により１以上の異なる二次エフェクター分子を保持する、異なる弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせ送達も提供する。
【０２２６】
本発明はまたサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌により送達される、本発明の１以上の融合タンパク質の送達を提供する。本発明はまた、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌によって送達される、本発明の１以上の融合タンパク質と所望により本発明の１以上のエフェクター分子の組み合わせ送達を提供する。本発明はまた１以上の異なる融合タンパク質および／または所望により１以上の異なるエフェクター分子を保持する、異なる弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせ送達を提供する。
【０２２７】
固形腫瘍としては、限定されるものではないが、肉腫、癌腫および限定されるものではないが生殖細胞系腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星状細胞腫、神経膠腫、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、黒色腫、腎臓癌、膀胱癌、および中皮腫をはじめとするその他の固形腫瘍癌が挙げられる。患者は好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、ウマなどのような動物をはじめとする動物であり、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。本明細書において、固形腫瘍の治療とは、限定されるものではないが、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍細胞増殖を阻害すること、腫瘍容積を減少させること、または腫瘍細胞の身体のその他の部分への蔓延（転移）を阻害することを含む。
【０２２８】
本発明は医薬上許容される担体および１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は医薬上許容される担体ならびに１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された１以上の一次エフェクター分子および１以上の二次エフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０２２９】
本発明は医薬上許容される担体および１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明は医薬上許容される担体ならびに１以上の適当なプロモーターに機能しうる形で連結された本発明の１以上の融合タンパク質および１以上のエフェクター分子をコードする１以上の核酸分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物を提供する。
【０２３０】
本発明はまた医薬上許容される担体および弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物も提供する。本発明はまた医薬上許容される担体ならびに１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌を含んでなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は治療上有効な量の、１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ベクターならびに医薬上許容される担体を含んでなる。本発明はまた医薬上許容される担体ならびに本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌を含んでなる医薬組成物も提供する。かかる組成物は治療上有効な量の、本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ベクターならびに医薬上許容される担体を含んでなる。
【０２３１】
特定の実施形態では、「医薬（製薬）上許容される」とは、連邦または州政府の監督官庁によって承認された、または米国薬局方もしくは動物、より詳しくはヒトに使用するためのその他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」とはそれとともに治療薬が投与される希釈剤、佐剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は水および、ピーナッツ油、ダイズ油、無機油、ゴマ油、オリーブ油などのような石油、動物、植物からのまたは合成起源のものをはじめとする油などの滅菌液体であってよい。医薬組成物が静脈投与される場合には生理食塩水が好ましい担体である。また、生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は特に注射用溶液のための液体担体として使用できる。好適な医薬賦形剤としてはデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は所望により少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐法性製剤などの形態をとり得る。経口製剤は医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的な担体を含み得る。好適な医薬担体の例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。かかる組成物は治療上有効な量の、精製された形態の治療用の弱毒化腫瘍標的細菌を、患者への適当な投与のための形態を提供する好適な量の担体とともに含む。製剤は投与様式に適合するべきである。
【０２３２】
好ましい実施形態では、組成物は慣例の手順に従ってヒト生命体への静脈投与に合わせた医薬組成物として処方される。典型的には、静脈投与用組成物は滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要であれば、組成物はまた沈殿防止剤および注射部位で痛みを和らげるにはリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は個別にまたは混合して単位用量形態で、例えば、有効薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密閉容器中の凍結乾燥散剤または水を含まない濃縮物として供給される。組成物を点滴によって投与する場合には、滅菌医薬等級水または生理食塩水を含む点滴ボトルで調剤してもよい。組成物を注射によって投与する場合には、成分を投与前に混合できるよう注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２３３】
固形腫瘍癌の治療または予防に有効である本発明の医薬組成物量は癌の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって決定できる。さらに、所望により最適な用量範囲を確認するのを補助するためにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してもよい。処方に使用される正確な用量は投与経路、および癌の重篤度によっても異なり、開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。しかしながら、一般には、好適な用量範囲は約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１×１０２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；所望により約１×１０４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；および所望により約１×１０４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇないし約１×１０１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇである。有効な用量はｉｎ ｖｉｔｒｏで得られる用量応答曲線または動物モデル試験系から推定できる。
【０２３４】
種々の送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用できる。導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、くも膜下腔内、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。導入方法はまた腫瘍内（例えば、腫瘍領域への直接投与による）であってもよい。
【０２３５】
組成物はいずれの便宜な経路で、例えば、点滴またはボーラス投与によって、上皮または粘膜皮膚（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収によって投与してもよいし、その他の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身性であっても局所であってもよい。さらに、本発明の医薬組成物を脳室内およびくも膜下腔内注射をはじめとするいずれかの好適な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合もあり、脳室内注射は例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けた脳室内カテーテルによって容易になり得る。肺投与も例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル化剤を含む処方の使用によって使用できる。
【０２３６】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合もあり、これは例えば、限定されるものではないが、手術の際の局所注入、カテーテルによる注入、またはシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜もしくは繊維をはじめとする多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状物質であるインプラントによって達成できる。ある実施形態では、悪性腫瘍または新生物もしくは新生物発生前組織の部位（または元の部位）に直接注射によって投与し得る。
【０２３７】
１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌は徐放システムで送達できる。本発明の１以上の融合タンパク質および所望により１以上のエフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌も徐放システムで送達できる。ある実施形態では、ポンプを使用する場合もある（Ｌａｎｇｅｒ，上記； Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）； Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；およびＳａｕｄｅｋ ら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４参照）。もう１つの実施形態では、高分子材料を使用する場合もある（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ （１９７４）； Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（編）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）； Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙら， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０； Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１；およびＨｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５も参照）。さらにもう１つの実施形態では、徐放システムを治療標的、すなわち、全身用量の一部のみを必要とする脳の近くに置くこともできる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， 上記， ２巻，１１５−１３８頁（１９８４）参照）。
【０２３８】
その他の徐放システムはＬａｎｇｅｒ （１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３）による総説で論じられており、１以上の一次エフェクター分子および所望により１以上の二次エフェクター分子を含んでなる弱毒化腫瘍標的細菌の投与と関連して使用できる。
【０２３９】
本発明はまた本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。かかる容器に関しては、随意的に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示される形の通知がある場合もあり、この通知はヒト投与のための製造、使用または販売に関する機関による承認を反映している。
【０２４０】
本発明はまた本発明の医薬組成物および少なくとも１種のその他の既知の癌治療をそれを必要とする動物に投与することを含んでなる固形腫瘍の治療法を提供する。特定の実施形態では、固形腫瘍癌の動物に本発明の医薬組成物および少なくとも１種の化学療法薬を投与する。化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、シスプラチン、イホスファミド、タキソールおよびパクリタキソールなどのタキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、ＣＰＴ−ＩＩ、トポテカン、９−ＡＣおよびＧＧ−２１１）、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン相同物、およびサイトキサンが挙げられる。
【０２４１】
本発明は本発明の医薬組成物と化学療法薬などの抗癌剤の逐次または同時投与を含む。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤の投与前に（例えば、２時間、６時間、１２時間、１日、４日、６日、１２日、１４日、１ヶ月または数ヶ月前）投与する。もう１つの特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤の投与後に（例えば、２時間、６時間、１２時間、１日、４日、６日、１２日、１４日、１ヶ月または数ヶ月後）投与する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を抗癌剤と同時に投与する。本発明は、相加的または相乗的である、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせを包含する。
【０２４２】
本発明はまた、異なる作用部位を有する、抗癌剤と１以上のエフェクター分子および／または融合タンパク質をコードする１以上の核酸分子を発現するよう設計された弱毒化腫瘍標的細菌の組み合わせも包含する。かかる組み合わせは、組み合わせが相乗的であろうと相加的であろうと、これらの治療の二重の作用に基づいて改善された治療法を提供する。従って、本発明の新規組合せ療法は単一薬剤療法として用いられる薬剤のいずれかよりも向上した効力をもたらす。
【０２４３】
ある実施形態では、固形腫瘍癌の動物に本発明の医薬組成物を投与し、かつ、放射線療法（例えば、γ線またはｘ線照射）で治療する。特定の実施形態では、本発明は放射線療法では効果がないと示されている癌の治療法または予防法を提供する。医薬組成物は放射線療法と同時に投与してもよい。あるいは、放射線療法を本発明の医薬組成物の投与後に、好ましくは医薬組成物の投与の少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、より好ましくは数ヶ月（例えば、３ヶ月まで）後に投与してもよい。
【０２４４】
本発明の医薬組成物の投与の前、同時、またはその後に投与される放射線療法は当技術分野で公知のいずれかの方法で投与できる。治療される癌の種類次第でいずれの放射線療法プロトコールを使用してもよい。例えば、限定されるものではないが、ｘ線照射を投与してもよく、特に、深い腫瘍には高エネルギーメガボルト（１ＭｅＶエネルギーより高い照射）を用いてもよく、皮膚癌には電子ビームおよび正中電圧ｘ線照射を用いてもよい。放射線に組織を曝露するためにラジウム、コバルトおよびその他の元素の放射活性アイソトープなどのγ線放射性ラジオアイソトープを投与してもよい。
【０２４５】
さらに、本発明はまた放射線療法があまりにも毒性を示すか、または示し得る、すなわち、治療を受けている患者にとって受け入れられないか、または耐えがたい副作用をもたらす場合に、放射線療法の代替として癌を医薬組成物で治療する方法を提供する。
【０２４６】
５．９　本発明の医薬組成物の治療または予防有用性の証明
本発明の医薬組成物はヒトにおける使用に先立って所望の治療または予防活性について好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が指示されるかどうか決定するために使用できるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、患者組織サンプルを培養で増殖させ、医薬組成物に曝露するか、あるいはこれを投与し、かかる組成物の組織サンプルに対する作用を観察する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイが挙げられる。
【０２４７】
本発明の医薬組成物は免疫細胞を試験医薬組成物または対照と接触させ、試験医薬組成物の免疫細胞の生物学的活性を調節する（例えば、増大させる）能力を調べることによって、活性化された免疫細胞を増強するその能力について試験できる。試験組成物の免疫細胞の生物学的活性を調節する能力はサイトカインまたは抗原の発現を検出すること、免疫細胞の増殖を検出すること、シグナル伝達分子の活性化を検出すること、免疫細胞のエフェクター機能を検出すること、または免疫細胞の分化を検出することで評価できる。これらの活性の測定には当業者に公知の技術を使用できる。例えば、細胞増殖は３Ｈ−チミジン取込みアッセイおよびトリパンブルー細胞計数によってアッセイできる。サイトカインおよび抗原発現は、例えば、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、免疫組織化学放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイおよびＦＡＣＳ解析などの技術を用いる競合アッセイおよび非競合アッセイ系をはじめとする免疫アッセイによってアッセイできる。シグナル伝達分子の活性化は、例えば、キナーゼアッセイおよび電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってアッセイできる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイによって測定できる（例えば、Ｐａｌｌａｄｉｎｏら， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４７：５０７４−５０７９およびＢｌａｃｈｅｒｅら， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３５２−３５６参照）。
【０２４８】
本発明の医薬組成物は癌を患う動物において腫瘍形成を低下させるその能力について試験できる。本発明の医薬組成物はまた固形腫瘍癌に関係する１以上の症状を軽減するその能力について試験できる。さらに、本発明の医薬組成物は固形腫瘍癌を患う患者の生存期間を延長するその能力について試験できる。当業者に公知の技術を用いて動物における本発明の医薬組成物の機能を分析できる。
【０２４９】
種々の特定実施形態では、固形腫瘍癌に関与する細胞種のうち代表的な細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施し、本発明の医薬組成物がかかる細胞種に対して所望の作用を及ぼすかどうかを調べることができる。
【０２５０】
治療用の本発明の医薬組成物はヒトにおける試験に先立って、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどをはじめとする好適な動物モデル系で試験できる。ヒトへの投与に先立つｉｎ ｖｉｖｏ試験のために、当技術分野で公知のいずれの動物モデル系を用いてもよい。
【０２５１】
以下の一連の実施例は例示のために示されるのであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２５２】
６． 実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌によるＴＮＦ−αの発現
以下の実施例は、ＴＮＦファミリーのメンバーをコードする核酸分子を含有する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌などの細菌がＴＮＦファミリーのメンバーを発現できることを証明する。
【０２５３】
６．１　ＴＮＦ−αプラスミドの構築
本明細書に記載されるプラスミドは本発明の特定の実施形態の実施例を示すためのものである。当業者には明らかであろうが、ｔｒｃプロモーターおよび／またはＴＮＦ−αをコードする核酸などのプロモーターおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸は当技術分野で公知の方法によってその他の適当なプロモーターまたはエフェクター分子で置換してもよい。
【０２５４】
ｔｒｃプロモーターを用いる、エフェクター分子をコードする核酸のプラスミドに基づく細菌による発現のために、プラスミドＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されている）またはＴｒｃＨｉｓＢ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている）を用いた。両プラスミドとも開始コドンとしてのＮｃｏＩ部位とそれに続くマルチプルクローニング部位を用いる。
【０２５５】
６．１．１．　ｐＣＥＴプラスミド
二重λＰＬまたはλＰＲプロモーターを用いるエフェクター分子をコードする核酸のプラスミドに基づく細菌による発現のために、以下のようにｐＣＥＴプラスミドを構築した。プラスミドｐＣＥ３３（Ｅｌｖｉｎら， １９９０， Ｇｅｎｅ ８７：１２３−１２６）を逐次、制限酵素ＣｌａＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とし、次いで制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。次いで、得られた１．４ｋｂの断片を２．１ｋｂのｐＵＣ１９（ＧＩＢＣＯから市販されている）のＳｓｐＩ／ＢａｍＨＩ断片に結合してプラスミドｐＣＩを作製した。プラスミドｐＣＩを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とし、次いで制限酵素ＡｆｌＩＩＩで切断した。得られた３．１ｋｂのバンドを単離した。プラスミドＴｒｃＨｉｓＢを制限酵素ＣｌａＩで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いでＡｆｌＩＩＩで切断した。次いで、得られたミニシストロンおよびターミネーターを含む０．６ｋｂのバンドを３．１ｋｂのｐＣＩ断片に結合してプラスミドｐＣＥＴを得た。ｐＣＥＴは、Ｔｒｃ９９ＡまたはＴｒｃＨｉｓＢと同様に、開始コドンとしてのＮｃｏＩ部位とそれに続くＴｒｃＨｉｓＢマルチプルクローニング部位を用いる。λＰＬまたはλＰＲプロモーターを含むいずれかのプラスミドを保持する細菌を３０℃で増殖させた。
【０２５６】
６．１．２．　ｐＴＳプラスミド
トランスポゾン媒介性染色体組込みおよびエフェクター分子をコードする核酸のセリン原栄養性選抜を行う、ｐＴＳと示されるプラスミドを以下のように構築した。プラスミドｐＮＫ２８８３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販されている）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、４．８ｋｂのバンドを単離した。配列ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧ（配列番号１）からなる正プライマーおよび配列ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣ（配列番号２）からなる逆プライマーを用いるＰＣＲによってネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株１４０２８（ＡＴＣＣから市販されている）からネズミチフス菌ｓｅｒＣをコードする核酸を単離した。ＰＣＲ反応混合物を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、１．１ｋｂのＰＣＲ産物を単離して４．８のｐＮＫ２８８３断片に結合してｐＴＳと示されるプラスミドを得た。ｓｅｒＣをコードする核酸のすぐ３’側にエフェクター分子をコードする核酸の挿入のためのクローニング部位が存在した。
【０２５７】
６．１．３．　ｐＴＳ−ＴＮＦ−αプラスミド
ｔｒｃプロモーターによって制御されるヒトＴＮＦ−αをコードする核酸のｐＴＳ媒介性染色体組込みのために、プラスミド（ｐＴＳ−ＴＮＦ−α）を以下のように構築した。プラスミドＰＹＡ３３３２は、複製開始点がｃｏｌＥ１プラスミド（例えば、ＢａｚａｒａｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ， １９７０， Ｂｉｏｃｈｅｍ ９：３９９−４０６参照）の複製開始点で置換されているＡＳＤプラスミドＰＹＡ２７２である（例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓ，ＩＩＩの米国特許第５，８４０，４８３号参照）。プラスミドＰＹＡ３３３２を制限酵素ＮｃｏＩで切断し、ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端とした。次いで、平滑末端とした断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して３．３ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。次いで、図１に示される大腸菌最適化ヒトＴＮＦ−αをコードする核酸（Ｐｅｎｎｉｃａら， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４−７２９；およびＳａｌｚｔｍａｎら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １１：１４５−１５３参照）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた０．５ｋｂの断片を３．３ｋｂのＰＹＡ３３３２断片に結合してプラスミドＡｓｄ３４ＴＮＦ−αを得た。次いで、Ａｓｄ３４ＴＮＦ−αを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をコードする１．１ｋｂの断片をｐＴＳのＢａｍＨＩ部位に結合してプラスミドｐＴＳ−ＴＮＦ−αを得た。
【０２５８】
６．１．４．　ｐＴＳ−ＢＲＰプラスミド
ＢＲＰをコードする核酸のトランスポゾン媒介性染色体組込みおよびエフェクター分子をコードする核酸のセリン原栄養性選抜を行う、ｐＴＳ−ＢＲＰと示されるプラスミドを以下のように構築した。配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧ（配列番号５）からなる正プライマーおよび配列ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号６）からなる逆プライマーを用いるＰＣＲによってＢＲＰをコードする核酸をプラスミドｐＳＷＩ（Ｂｉｏ１０１， Ｖｉｓｔａ， ＣＡから市販されている）から単離してＴＯＰＯ−ＴＡクローニングプラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡから市販されている）にクローニングしてｐＢＲＰ＃５と示されるプラスミドを得た。プラスミドｐＢＲＰ＃５を制限酵素ＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、得られたＢＲＰをコードする核酸を含む０．６ｋｂのバンドを５．９ｋｂのＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ ｐｒｏｔｏ−ｐＴＳ断片に結合してプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰを得た。エフェクター分子をコードする核酸の挿入のためのクローニング部位はＢＲＰをコードする核酸の５’および３’の両側に存在した。
【０２５９】
６．１．５．　ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αプラスミド
ＢＲＰおよびｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸のｐＴＳ媒介性染色体組込みのために、プラスミド（ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−α）を以下のように構築した。ｐＴＳ−ＴＮＦ−αの構築のために上記に記載したプラスミドＡｓｄ３４ＴＮＦ−αを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をコードする１．１ｋｂの断片をｐＴＳ−ＢＲＰのＢａｍＨＩ部位に結合してプラスミドｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αを得た。
【０２６０】
６．２．　エフェクター分子をコードする核酸のサルモネラ菌宿主染色体への組込み　本明細書に記載される系は、セリンまたはグリシン栄養要求性のΔｓｅｒＣ−サルモネラ菌株および活発に転写される領域への染色体組込みの際にセリン／グリシン原栄養性を回復するプラスミドを用いる。しかしながら、染色体組込み体を選抜するためにその他の選択マーカーを使用してもよいということは当技術分野では十分に知られており、かかるマーカーは本発明の範囲内にある。例えば、Ｋｌｅｃｋｎｅｒら， １９９１， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４：１３９−１８０参照。
【０２６１】
エフェクター分子をコードする核酸を含むｐＴＳまたはｐＴＳ−ＢＲＰプラスミドを化学的形質転換およびエレクトロポレーションをはじめとする当技術分野で十分に公知のいくつかの手段によってｓｅｒＣ−サルモネラ菌株に導入してもよい。エフェクター分子をコードする核酸の導入後、サルモネラ菌をアンピシリン含有増殖培地で最小限２時間、より好ましくは６時間以上増殖させる。次いで、セリン原栄養性の細菌を選抜できる培地、例えば、Ｍ５６培地、Ａｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ」 Ｌ．Ｃ．Ｐａｒｋｓ，編， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ， １９９３に細菌をおく。エフェクター分子をコードする核酸の染色体組込みを有する細菌は選抜培地で増殖できる。次いで、エフェクター分子をコードする核酸の発現を以下に示されるように測定する。エフェクター分子をコードする核酸の発現は酵素活性、生物学的活性、ノーザンブロット解析、またはウェスタンブロット解析などの当業者に公知のいくつかの方法のいずれで測定してもよい。
【０２６２】
６．２．１．　サルモネラ菌によって発現されたＴＮＦ−αの送達および発現
上記のように、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸をｐＴＳ−ＢＲＰのＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αと示されるプラスミドを得た。当技術分野で公知の標準的な方法によって、プラスミドｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αを、遺伝形質がΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ΔｓｅｒＣ（図２）となるようにｓｅｒＣ−として構築したネズミチフス菌の弱毒化菌株、菌株ＶＮＰ２０００９（国際特許ＷＯ９９／１３０５３参照）にエレクトロポレーションした。メカニズムについて限定するものではないが、プラスミドの細菌ゲノムへの組込みによりｓｅｒＣをコードする核酸の活性化が可能となり、ｓｅｒＣ＋表現型をもたらす。従って、エレクトロポレーションした細菌をアデニンを添加したＭ５６寒天プレートにプレーティングすることでＴＮＦ−αをコードする核酸の染色体組込みを有する細菌を選択した。細菌を、プラスミドの喪失および同時にプラスミドに基づくＴＮＦ−α発現の喪失を示す、アンピシリン耐性の喪失についてさらに特性決定した。
【０２６３】
本発明の腫瘍を標的とする細菌によるＴＮＦ−αの発現を調べて定量するために、ＴＮＦ−αをコードする核酸の染色体組込みを有するサルモネラ菌を一晩増殖させ、培養物の測定したサンプルをウェスタンブロット解析に用いた。特に、ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αクローン２と示される代表的なｓｅｒＣ＋アンピシリン感受性クローンからのＴＮＦ−αの発現が図３に示されている。ウェスタンブロット解析により、３．９×１０７ｃｆｕのｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−αクローン２細菌に相当する（レーン１）細菌タンパク質が５０ｎｇより多いＴＮＦ−αを発現するということが示され（レーン５）、このことは１０ｎｇ／１０７細菌より多いレベルでのＴＮＦ−αの発現を示唆する。従って、ヒトＴＮＦ−αは、サルモネラ菌において、染色体に組み込まれた、ｔｒｃプロモーターによって制御されるＴＮＦ−αをコードする核酸から上手く発現された。
【０２６４】
７．　ＯＭＰＡ融合タンパク質を発現する弱毒化腫瘍標的細菌
種々のシグナルペプチドへの融合によるタンパク質の周辺細胞質局在化はシグナルペプチドとタンパク質の双方に依存している。例えば、タンパク質はタンパク質のアミノ末端へのシグナルペプチドの融合によって細菌の細胞周辺コンパートメントに局在化され得る。限定することはないが、周辺細胞質局在化は、細菌の成分（タンパク質など）が周囲の環境に放出されるために単一の膜のみを通過すればよいので、細菌の成分の放出を促進すると考えられている。対照的に、細胞質内局在化は、成分が周囲の環境に放出されるためには細菌の内膜と外膜の双方を通過することを要求する。さらに、特定のタンパク質の周辺細胞質局在化は生物学的活性を補助する場合もある。
【０２６５】
本発明のエフェクター分子を周辺細胞質に向けるためには当技術分野で公知の種々の方法を使用できる。本実施例はＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド）、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）などのエフェクター分子のアミノ末端へのｏｍｐＡシグナルペプチドの融合が周辺細胞質局在化とその後のタンパク質のプロセッシングをもたらすということを証明している。
【０２６６】
７．１．　ＯＭＰＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質のプロセッシング
４種の異なるクローンにおけるＴＮＦ−α発現、すなわちＪＭ１０９細菌においてプラスミドに基づくｔｒｃプロモーターによって動かされるｏｍｐＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質の発現を全細胞溶解物のウェスタンブロット解析によって調べた。周辺細胞質に局在する酵素であるシグナルペプチダーゼによる前駆体融合タンパク質の成熟ＴＮＦ−αへの切断によって周辺細胞質局在が証明された。４種のクローンすべてにおいて、ＩＰＴＧでの誘導後のＴＮＦ−αの過剰発現により、ＴＮＦ−αが、プロセッシングされていない型とプロセッシングされた型の双方に対応する約２０ｋｄで移動する二重線として現れた（図５、レーン４〜７）。比較のために、染色体に組み込まれたＴＮＦ−αをコードする核酸を有する成熟（プロセッシングされた）型のＴＮＦ−αを発現するサルモネラ菌株を正の対照として用いた（図５、レーン３）。ＴＮＦ−αをコードする核酸を欠いている細菌ではＴＮＦ−α発現は検出されなかった（図５、レーン２）。
【０２６７】
これらの結果は、成熟ヒトＴＮＦ−αタンパク質の大腸菌ｏｍｐＡシグナルペプチドへの融合（図４に示されるような）は大腸菌で発現される場合には周辺細胞質局在およびプロセッシングもたらすということを証明する。さらに、分泌されるタンパク質の過剰発現が細菌宿主にとって毒性であるかどうかは、正常な分泌組織が圧倒的に多いためにわからなかった。プロセッシングされたｏｍｐＡ−ＴＮＦ−α融合タンパク質の発現についてのこの証明は正常な分泌組織は分泌されるタンパク質の高レベル発現に適応できるということを示唆した。
【０２６８】
７．２．　ＯＭＰＡ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質のプロセッシング
ｏｍｐＡシグナルペプチドのＴＮＦファミリーのメンバーを周辺細胞質に局在させる能力を、ＴＮＦファミリーのもう１つのメンバーであるＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−α関連アポトーシス誘導性リガンド）にまで拡張した。これらの実験のために、ヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ）の成熟型をコードする、ｔｒｃプロモーターによって動かされるＴＲＡＩＬをコードする核酸をｏｍｐＡシグナルペプチドのコード配列に融合した（図６に示されるように）。一方はＮｃｏＩ部位をコードし、もう一方はＮｄｅＩ部位をコードする２種の異なるｏｍｐＡ／ＴＲＡＩＬ接合点を調べた（ＮｄｅＩを含む配列については図６参照）。両種のクローンのウェスタン解析が図７に示されている。抗ｈＴＲＡＩＬ抗体を用いるウェスタンブロット解析によってＮｃｏＩ接合したｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬを過剰発現する細菌はｈＴＲＡＩＬのプロセッシングされた型（２８．２ｋｄ）とプロセッシングされていない型（３０．２ｋｄ）の双方を発現し（図７、レーン２〜４）、他方、ＮｄｅＩ接合したｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬを過剰発現する細菌はもっぱらプロセッシングされた型を発現する（図７、レーン４〜７）ということが示され、このことはＮｄｅＩ接合がより効率的なプロセッシングをもたらしたということを示唆する。
【０２６９】
これらの結果は、成熟ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の大腸菌ｏｍｐＡシグナルペプチドへの融合は周辺細胞質局在およびプロセッシングをもたらすということを証明した。さらに、分泌されるタンパク質の過剰発現が細菌宿主にとって毒性であるかどうかは正常な分泌組織が圧倒的に多いためにわからなかった。プロセッシングされたｏｍｐＡ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の発現についてのこの証明は正常な分泌組織は分泌されるタンパク質の高レベル発現に適応できるということを示唆した。
【０２７０】
７．３．　ＯＭＰＡ（８Ｌ）−ＩＬ−２融合タンパク質のプロセッシング
二次エフェクター分子（ＩＬ−２）を融合タンパク質として発現させた。成熟（Ｃ１２５Ａ）ｈＩＬ−２の、ＴＮＦ−αおよびＴＲＡＩＬついて上記で用いたような、野生型ＯｍｐＡシグナル配列への融合ではＩＬ−２のプロセッシングが可能にならなかった。ヒトＩＬ−２サイトカインの周辺細胞質局在およびプロセッシングを調べるために、成熟ヒト（Ｃ１２５Ａ）ＩＬ−２を図８に示されるように、ｏｍｐＡ（８Ｌ）と示される改変ｏｍｐＡシグナルペプチドに融合させた。改変ｏｍｐＡシグナルペプチドはｏｍｐＡシグナルのアミノ酸６〜１７を図８に示されるもので置換することによって改変した。発現およびプロセッシングが図９に示されている（レーン６および７）。各レーンは単一のクローンを表す。ウェスタンブロット解析の結果はｏｍｐＡ（８Ｌ）シグナルペプチドを用いることで、事実上完全なプロセッシングが認められるということを示した（図９、レーン６および７）。
【０２７１】
７．４．　ＰＨＯＡ（８Ｌ）−ＩＬ−２融合タンパク質のプロセッシング
ヒトＩＬ−２の周辺細胞質局在およびプロセッシングについて第２の融合タンパク質を調べ、７．３．節の融合タンパク質と比較した。図１０中で、ｐｈｏＡ（８Ｌ）と示される改変ｐｈｏＡシグナルペプチドに融合した成熟ヒト（Ｃ１２５Ａ）ＩＬ−２の発現およびプロセッシングを調べた。発現およびプロセッシングが図９に示されている。ｏｍｐＡ（８Ｌ）シグナルペプチドを用いてより完全なプロセッシングが認められたのに対し（図９、レーン６および７）、合成ｐｈｏＡ（８Ｌ）シグナルペプチドでは部分的なプロセッシングしか認められなかった（図９、レーン４および５）。
【０２７２】
これらの結果はＩＬ−２の局在およびプロセッシングが異なるシグナルペプチドによって提供されたということを示す。この結果はまた、種々のシグナルペプチドへの融合によるタンパク質の周辺細胞質局在はシグナルペプチドとタンパク質の双方に依存しているということを証明する。
【０２７３】
融合タンパク質研究の結果は、Ｉｌ−２などの本発明の二次エフェクタータンパク質はＯｍｐＡまたはＰｈｏＡなどのタンパク質シグナルペプチドとの融合によって発現され、細菌の周辺細胞質に局在され得るということを示す。当業者には明らかであろうが、その他のシグナル配列を用いて利用され得るエフェクター分子の周辺細胞質局在を引き起こすこともできる。当業者にはさらに明らかであろうが、本発明のその他のエフェクター分子を本明細書の実施例に記載されるエフェクター分子と置換することもできる。
【０２７４】
８．　実施例：成熟型のＴＮＦ−αを発現するサルモネラ（ΔＭＳＢＢ、ΔＰＵＲＩ）の抗腫瘍効果
以下の実験は、一次エフェクター分子（例えば、ＴＮＦファミリーのメンバー）をコードする核酸を含むサルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌は哺乳類腫瘍に一次エフェクターを送達することができ、腫瘍体積を減少させることを証明する。
【０２７５】
ＴＮＦ−αのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の抗腫瘍効果を高める能力は段階的なネズミ大腸３８癌腫モデルで評価した。これらの実験では、大腸３８腫瘍由来の１ｍｍ３の腫瘍断片をＣ５７ＢＬ／６マウス腫瘍へ移植し、腫瘍を平均サイズ約０．３ｇまで増殖させ、この時、動物を以下の処理群（ｎ＝１０）に無作為に配置した：１）無処理；２） ネズミチフス菌（ΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ｓｅｒＣ）（親株）；および３）ｐＴＳ−ＢＲＰＴＮＦ−α（上記の大腸２）。各群のマウスは処理しないか、あるいは適当な細菌株１×１０６ｃｆｕの静脈注射を１回施した。細菌接種時から始め、毎週腫瘍サイズを測定した。
【０２７６】
ＴＮＦ−αを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラを施した群では、処理後２週間で腫瘍の退縮が明白であり、処理後４週間以内に動物のうち６個体で完全な退縮が見られた（図１１）。無処理群では腫瘍は徐々に大きくなったが、ネズミチフス菌親株（ΔｍｓｂＢ、ΔｐｕｒＩ、ｓｅｒＣ）で処理した群の腫瘍は処理後３ないし４週の間に部分的退縮を示したが、その後徐々に大きくなった（図１１）。
【０２７７】
これらの結果は、弱毒化腫瘍標的サルモネラがＴＮＦファミリーのメンバーなどのエフェクター分子を発現して腫瘍へ送達できることを証明するものである。このようなサルモネラは腫瘍の治療に有用であり、ＴＮＦファミリーのメンバーを発現しないサルモネラ親株と比較して腫瘍退縮の結果を増強する。
【０２７８】
染色体に組み込まれた核酸からＴＮＦ−αを発現するサルモネラにより完全な腫瘍退縮が示されることは、染色体に組み込まれたエフェクター分子をコードするからから生物学的に有効な発現が生じるということを示す。
【０２７９】
９．　実施例：ＢＲＰを発現する細菌による核酸分子の送達の増強
ＢＲＰ活性がサルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌からのプラスミドの放出を増強することを示すため、プラスミドならびに放出マーカー（ＡＭＰマーカーを有するｐＴｒｃ９９ａ）として用いられる第２のプラスミドにＢＲＰを含んだ弱毒化腫瘍標的サルモネラ株を構築した。ＢＲＰの活性を評価するため、ＢＲＰを含む、あるいは含まないサルモネラを標準法による培養で増殖させた。次ぎに得られた上清から遠心分離および濾過によって残存する細菌を除去した後、明澄な上清をコンピテント細胞に加え、形質転換反応を行った。次ぎにこれらのレシピエント細胞をＬＢ ａｍｐ培地で平板培養し、ＡＭＰマーカープラスミドの取り込みを調べた。ＢＲＰを有するＡＭＰ耐性コロニー数が増加していれば、より多くのプラスミドがＢＲＰ発現株から培地へ放出されたことを示す。
【０２８０】
結果は以下の表２に要約されている。
【０２８１】
【表２】
2004500042.tif 000004
【０２８２】
これらの結果はＢＲＰが存在すると培地へ分泌されるａｍｐプラスミドの量が増えたことを示している。このように、ＢＲＰ発現細胞由来上清の「レシピエント細胞」への形質転換ではコロニー数が増える。これらの結果は、ＢＲＰが核酸プラスミドを含む二次エフェクター分子の放出を増強したことを示す。従って、これらの結果は、ＢＲＰがプラスミドの放出またはＤＮＡ送達に有用であることを示す。さらに、ＢＲＰを発現し、ＤＮＡを送達することができるこれらのサルモネラ株は集団として複製能を留めていた。
【０２８３】
１０．　実施例：ＢＲＰ発現は弱毒化腫瘍標的サルモネラの腫瘍標的化能または腫瘍阻害能を損なわない
以下の実施例は、弱毒化腫瘍標的細菌が１以上のエフェクター分子と共にＢＲＰを発現するよう操作して細菌の腫瘍標的能を阻害することなくエフェクター分子の腫瘍への送達を増強することができることを示す。
【０２８４】
固形腫瘍モデルはＢ１６メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右後脚の腿に皮下注射することで得た。腫瘍の移植のために、トリプシン処理によりフラスコから細胞を解離させ、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に２．５×１０６細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞懸濁液０．２ｍｌアリコート（総数５×１０５細胞／マウス）を第０日目に注射した。腫瘍の体積が１５０ないし２００ｍｍ３に達した際（移植後約１０日）、マウスを無作為に１０個体の群に分け、各群に異なる処理を施した。対照群（図１２の曲線＃１）には０．２ｍｌのＰＢＳを施した。別の群にはサルモネラＶＮＰ２０００９の弱毒化腫瘍標的株２×１０６ｃ．ｆ．ｕ．／マウスを含有する０．２ｍｌを施した（図１２の曲線＃２）。第３の群には、その天然プロモーターの制御下にＢＲＰ遺伝子を含むプラスミドであるｐＳＷ１を含む弱毒化腫瘍標的サルモネラ株２×１０６ｃ．ｆ．ｕ．／マウスを含有する０．２ｍｌを施した（図１２の曲線＃３）。ＢＲＰ遺伝子は大腸菌内ではＳＯＳ誘導性である。しかしながら本発明者らは、メカニズムは特定できないが、ＢＲＰ遺伝子はサルモネラ菌内では部分的に構成的であり、低レベルから中レベルのＢＲＰタンパク質を産生するが、腫瘍環境におけるＳＯＳの性質によってその産生はさらに増強すると信じている。ＢＲＰ発現ＶＮＰ２０００９サルモネラを注射したマウスは非ＢＲＰ発現ＶＮＰ２０００９を注射したものとほぼ同様の抗腫瘍応答を示したが、このことはこれらのサルモネラ菌の生存または腫瘍標的化能がＢＲＰの発現によって変化しないし、腫瘍増殖阻害能も変化しないことを示している。弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌におけるＢＲＰ発現の結果は分泌型ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の発現の効果と対照的である。ＨＳＶ−ＴＫの発現はＶＮＰ２０００９の腫瘍阻害能の欠損をもたらす（Ｐａｗｅｌｅｋら， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４５３７−４５４４）。このようにＢＲＰ系はさならる改変を伴わずに一次および／または二次エフェクター分子の腫瘍への送達を増強するのに使用できる。
【０２８５】
１１．　実施例：ｐｅｐＴプロモーター発現運搬体
この実施例はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌におけるｐｅｐＴプロモーターの制御下、β−ｇａｌなどのレポーターをコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ発現を示す。
【０２８６】
１１．１　実施例：ｐｅｐＴ−ＢＲＰ−βＧＡＬ発現プラスミドの構築
ｐｅｐＴプロモーターは、以下のプライマー：
フォワード：５’−ＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＧ−３’（配列番号１５）
リバース：５’−ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＣＴ ＴＴＴ Ｃ−３’（配列番号１６）
を用いて、単離した野生型ネズミチフス菌（ＡＴＣＣ１４０２８）のコロニー由来の領域のＰＣＲ増幅によりクローニングした。
【０２８７】
ＰＣＲ条件は、９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、６５℃にて１分間、７２℃にて２分間を３５サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクルであった。このＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へクローニングし、ＰｅｐＴ／ＰＣＲ２．１と名付けた。
【０２８８】
このＰｅｐＴ／ＰＣＲ２．１ベクターをＮｃｏＩおよびＸｂａＩで切断した。ＰｅｐＴ断片をゲルで単離し、同じ酵素で切断したβ−ｇａｌ Ｚｔｅｒｍベクターへ連結した。Ｚｔｅｒｍ（Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｇｅｎｂａｎｋ Ｂａｎｋｉｔ Ｎｏ． ２９６４９５）は、βＧａｌオープンリーディングフレームをｐＵＣ１９へクローニングすることによって作製されたプロモーターのないβ−ｇａｌプラスミドである。得られたプラスミドをｐｅｐＴ−βＧＡＬと名付けた。
【０２８９】
１１．２　 ｐｅｐＴ−βＧＡＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現とｐｅｐＴ−βＧＡＬ活性の測定
ｐｅｐＴ−βＧＡＬを担持するサルモネラ株ＹＳ１４５６（図１３ＡのＣＣ１４；この菌株の遺伝構成についてはＷＯ９６／４０２３８参照）またはＶＮＰ２０００９（図１３ＡのＣＣ１６）を嫌気または好気条件のいずれかの下でＯＤ６００が〜０．５ないし０．８まで増殖させた。β−ｇａｌ活性はＢｉｒｇｅおよびＬｏｗ（１９７４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８３：４４７−４５７）の方法で測定した。結果は図１３Ａに示しているが、嫌気条件下での細菌の増殖時のβ−ｇａｌ活性が約１４ないし２４倍誘導されたことを示す。
【０２９０】
１１．３　ｐｅｐＴ−βＧＡＬのｉｎ ｖｉｖｏ発現とｐｅｐＴ−βＧＡＬ活性の測定
ｐｅｐＴ−βｇａｌ発現プラスミド、ＢＲＰ発現プラスミド（ＢＩＯ１０１由来のｐＳＷ１（Ｖｉｓｔａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、これはその天然プロモーターの制御下にｐＣｌｏＤＦ１３ ＢＲＰコード配列を含む）、または双方の発現プラスミドを担持するサルモネラ株ＹＳ１４５６の細胞を腫瘍担持マウスに静脈注射した。注射後５日目に腫瘍および肝臓をホモジナイズし、細菌を単離してｐｅｐＴ−βｇａｌおよび／またはＢＲＰのプラスミドの存在がこれらの細菌の腫瘍標的化能を阻害しなかったことを示した。さらに、腫瘍および肝臓ホモジネートを用いてβ−ｇａｌ活性を測定し、活性型β−ｇａｌがｉｎ ｖｉｖｏで測定可能かどうか、またｐｅｐＴプロモーターが嫌気性腫瘍環境において誘導されるかどうかを調べた。結果は図１３Ｂに示されており、腫瘍環境における極めて高レベルのｐｅｐＴプロモーター活性を示す。バックグラウンドレベルに対して肝臓のβ−ｇａｌ発現における有意な増強は見られず、これは好気性の肝臓環境におけるｐｅｐＴプロモーターの低活性および／または細菌ベクターの肝臓への標的化能が低いことに帰因するものと思われる。
【０２９１】
１２．　実施例：テトラサイクリン誘導発現系
この実施例はサルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌のｔｅｔプロモーターの制御下にあるβ−ｇａｌなどのリポーター遺伝子をコードする核酸分子の発現を示す。
【０２９２】
ｔｅｔプロモーターは以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＣＡ ＴＴＴ ＡＡＧ−３’（配列番号１７）
リバース：５’−ＧＧＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＴＡ ＴＣＡ Ｃ−３’（配列番号１８）
を用いてＰＣＲ増幅によりミニ−ＴＮ１０トランスポゾンからクローニングした。
【０２９３】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて２分間を３５サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクル。
【０２９４】
〜４００ｂｐのＰＣＲ断片をゲルで単離し、ＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＰＣＲ２．１／ｔｅｔプロモーターベクターをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断した。この〜４００ｂｐのｔｅｔプロモーター断片をゲル単離し、同じ２酵素で切断したプロモーターのないβ−ｇａｌベクターＺｔｅｒｍに連結した。連結混合物を形質転換し、形質転換した細菌をテトラサイクリン／Ｘ−ｇａｌプレート上で平板培養した。陽性コロニーを青色を基に単離した。いくつかの陽性コロニーからの抽出物を作製し、ＢｉｒｇｅおよびＬｏｗ（１９７４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８３：４４７−４５７）の方法によりテトラサイクリンの存在下でのβ−ｇａｌ活性に関してアッセイした。１つのクローンを単離し、一定の範囲のテトラサイクリン濃度にわたってβ−ｇａｌ発現に関してアッセイした。アッセイの結果はテトラサイクリンによって用量依存的にβ−ｇａｌ活性が誘導されることを示し、図１４に示されている。
【０２９５】
１３．　実施例：エンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌による腫瘍増殖の阻害
以下の実施例はエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の作製、およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるかかるサルモネラ菌による腫瘍治療の効果を示す。
【０２９６】
１３．１　エンドスタチン発現プラスミドの構築
エンドスタチンは、以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ ＣＡＧ−３’（配列番号１９）
リバース：５’−ＡＣＡ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＧＣ Ｔ−３’（配列番号２０）
を用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。
【０２９７】
得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングした。ヘキサヒスチジン−エンドスタチンは以下のプライマー：
フォワード：５’−ＧＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＧＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＧＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＴＴＣ−３’（配列番号２１）
リバース：５’−ＧＴＧ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＡＧＣ ＴＧ−３’（配列番号２２）
とともに、鋳型として上記で構築したプラスミドを用いてＰＣＲ増幅した。
【０２９８】
ＰＣＲ増幅条件は、９５℃にて５分間を１サイクル、９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間を３０サイクル、および７２℃にて１０分間を１サイクルであった。
【０２９９】
得られた産物はそのアミノ末端にペプチド配列ＭＡＲＲＡＳＶＧＴＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有するヒトエンドスタチンをコードするＮｃｏＩ（５’）およびＢａｍＨＩ（３’）制限部位を持つＤＮＡ断片であった。
【０３００】
このＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、５５０ｂｐの産物をゲルで単離し、同じ酵素で予め切断したｐＴｒｃ９９Ａベクターへ連結した。この連結反応産物を大腸菌ＤＨ５αおよび弱毒化腫瘍標的サルモネラ株ＶＮＰ２０００９へ形質転換した。
【０３０１】
ヘキサヒスチジン−エンドスタチンコード配列もまた、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターＹＡ３３３４にクローニングした。ＹＡ３３３４はＣｏｌＥＩの複製起点に置き換えられた複製起点を有する（ＢａｚａｒａｌおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ， １９７０， Ｂｉｏｃｈｅｍ ９：３９９−４０６）ａｓｄプラスミドＰＹＡ２７２（Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ， 米国特許第５，８４０，４８３号）である。陽性クローンから調製したプラスミドＤＮＡを単離し、サルモネラ株８３２４へ形質転換し、これがａｓｄ変異を有するＶＮＰ２０００９である。この菌株はＣｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ（米国特許第５，８４０，４８３号）に記載の方法に従って作製した。
【０３０２】
１３．２　弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌によるエンドスタチンのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現
ｐＴｒｃ９９Ａ−ヘキサヒスチジン−エンドスタチンプラスミドを含む種々のサルモネラ菌ＶＮＰ２０００９株および大腸菌ＤＨ５α株を対数増殖中期（Ｏ．Ｄ．６００が〜０．６ないし０．８）まで増殖させ、この時点で各培養物を分割し、一方にはｔｒｃプロモーター活性の誘導のために０．１ｍＭ ＩＰＴＧを施し、もう一方にはＩＰＴＧは施さなかった。さらに３時間増殖させた後、細菌抽出物を調製し、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンの発現を抗ヒスチジン抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてウエスタンブロット解析により確認した。図１５Ａおよび１５Ｂはそれぞれ大腸菌ＤＨ５αおよびサルモネラ菌ＶＮＰ２０００９におけるｐＴｒｃ９９Ａ−ヘキサヒスチジン−エンドスタチン（ＨｅｘＨＩＳ−エンドスタチン）の発現を示すウエスタンブロットの結果を示している。ｔｒｃプロモーターはＩＰＴＧの不在下の大腸菌では活性は見られなかったが、同じプロモーターがサルモネラ菌では構造的に活性であった。ヘキサヒスチジン−エンドスタチンは約２５ｋＤの単一のバンドで現れ、これがこの融合タンパク質の推定分子量である。
【０３０３】
ヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質は同様に、発現の支配にｔｒｃプロモーターを利用するＹＡ３３３４プラスミドからも発現した。図１６に示されているように抗ヒスチジン抗体を用いて推定分子量２５ｋＤａのタンパク質を検出した。図１６では、サンプルが由来する全ての細菌培養物を０．１ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導した。
【０３０４】
１３．３　Ｃ３８ネズミ大腸癌に対するエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の効果
２×２×２ｍｍ３の体積の大腸３８腫瘍断片を９週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した。腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達した際、それらを摘出し、２×２×２ｍｍ３の断片に切断した。これらの断片をもう１回一連のサイクルを経させ、得られた２×２×２ｍｍ３の断片を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右腿に皮下移植した。腫瘍体積が１５０ないし２００ｍｍ３に達した際（移植後約２４日後）、マウスを１０個体６群に無作為に分け、各群に異なる処理を施した。１つの対照群には０．２ｍｌのＰＢＳを施した。もう１つの対照群には対照ａｓｄプラスミド（すなわち、上記第５．６に記載のようにａｓｄプラスミドは挿入されていない）を有する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌株ＶＮＰ２０００９を１×１０６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．２ｍｌを施した。第１の実験群にはａｓｄプラスミドにおいてヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質を発現するＶＮＰ２０００９を１×１０６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．２ｍｌを施した。第２の実験群には第１の群と同じ発現構築物およびさらに発現されるＢＲＰを有するＶＮＰ２０００９を施した。
【０３０５】
図１７はこれらの実験の結果を示したものであり、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９株のよる腫瘍抑制の効果を示す。処理後６０日では、エンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９サルモネラ菌の腫瘍サイズ中間値は、対照動物の腫瘍サイズ中間値の約１３％であり、空のベクターを担持するＶＮＰ２０００９サルモネラ菌で処理した動物の腫瘍サイズ中間値より３０％以上低かった。生き残った動物のうちの多くが、正味の腫瘍サイズの小さな変化によって示されるように腫瘍増殖にほとんど変化が無いことを示し、あるものは強い腫瘍抑制を示した。処理の浸透または効果が不十分なことが、エンドスタチン送達系が不十分であることに反映されている可能性が最も高い。このことは、エンドスタチンが封入体に集積することを見出しているＯ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９７， Ｃｅｌｌ ８８：２７７−２８５）と合致する。エンドスタチン送達系はＢＲＰの発現によって増強される。ＢＲＰの発現はその天然プロモーターによって制御されるが、通常は細菌でＳＯＳ応答を示す。ＢＲＰ発現は対照集団の平均腫瘍体積の約６％まで平均腫瘍体積を小さくすることが示された。さらに、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンおよびＢＲＰで処理したマウス集団では、数個体のマウスが経時的に腫瘍体積に著しい減少を示し、腫瘍体積は最初の腫瘍体積の約１０以下まで退縮した。ＢＲＰの効果は二重であると考えられ、１つはＢＲＰ自体が抗腫瘍活性を有すること、もう１つはＢＲＰが周辺細胞質内容物の放出、およびエンドスタチンをはじめ細胞質内容物の放出をある程度は促進し、これが封入体でタンパク質が集積するのを防ぐということである。
【０３０６】
１３．４　ＤＬＤヒト大腸癌に対するエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の効果
対数増殖期まで増殖させたＤＬＤ１細胞培養物にトリプシン処理を施し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中５×１０７細胞／ｍｌの懸濁液を再構成した。各々５×１０６細胞を含む単一の細胞懸濁液のアリコート０．１ｍｌを９週齢の雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒからのＮｕ／Ｎｕ−ＣＤ１）の右腿に皮下注射した。マウスを各１０個体３群に無作為に分けた後、注射後１０ないし１５日、または腫瘍体積が２００ないし４００ｍｍ３に達するまで同期化した。
【０３０７】
第１群のマウスは対照群であり、各々に０．３ｍｌのＰＢＳ注射を施した。第２群のマウスには対照ａｓｄプラスミドを担持する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ＶＮＰ２を０００９ １×１０６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．３ｍｌを施した。第３群のマウスにはヘキサヒスチジン−エンドスタチン融合タンパク質およびＢＲＰを発現するａｓｄプラスミドを担持する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌ＶＮＰ２０００９を１×１０６ｃ．ｆ．ｕ．含む０．３ｍｌを施した。腫瘍をモニターし、１週間に２回測定した。図１３は３処理の投与後の腫瘍体積をグラフで表したものであり、ＤＬＤ１ヒト大腸癌の増殖に対する、ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌の抑制作用が示されている。
【０３０８】
空のベクターＰＹＡ３３３２を担持するＶＮＰ２０００９は腫瘍増殖を有意に阻害することはできなかった。しかし、エンドスタチンおよびＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９は腫瘍増殖を阻害することができた。これらの結果は、エンドスタチンとＢＲＰの組合せがＰＹＡ３３３２ベクターを担持するＶＮＰ２０００９（８３２４株）のいずれかの抗腫瘍作用を増強することを示している。
【０３０９】
１４．　実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌による抗血管新生因子の発現
以下の実施例は、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌を、抗血管新生因子トロンボスポンジンＡＨＲ、血小板第４因子およびアポミグレンを発現するよう操作するために用いられる方法論を示す。
【０３１０】
１４．１　トロンボスポンジンＡＨＲをコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
トロンボスポンジンの抗血管新生相同領域（ＡＨＲ）に相当するペプチド配列ＴｉＰ１３．４０： ＡＹＲＷＲＬＳＨＲＰＫＴＧＦＩＲＶＶＭＹＥＧ（配列番号２４）（例えば、特許出願第Ｃ０７Ｋ−１４／７８参照）を逆転操作し、サルモネラ菌での発現のためにコドンの至適化を行い、ＤＮＡ配列：
ＧＣＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＧＧＣ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＧＣ（配列番号２５）を得た。このペプチドを合成するため相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ１３：４０−１およびオリゴ１３：４０−２）を作製した。５’末端において、ＯＭＰＡのプロセッシング領域をコードする配列およびＳｐｅＩ制限部位を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。この２つのオリゴをアニーリングして二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターｐＴｒｃ８０１ＩＬ２に連結して、全長改変ＯｍｐＡリーダー配列を含むプラスミドｐＴｒｃ８０１−１３．４０を作製した。プロセッシングされると、この配列は完全長の１３．４０トロンボスポンジンペプチドとなる。
【０３１１】
2004500042.tif 000005
（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１２】
１４．２　血小板第４因子ペプチド（４７−７０）をコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
血小板第４因子（ＰＦ−４； 例えばＭａｉｏｎｅら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：７７−７９およびＪｏｕａｎら， １９９９， Ｂｌｏｏｄ ９４：９８４−９９３参照）のＣ末端のアミノ酸残基４７−７０からなるペプチドを、サルモネラ菌での発現のためにコドンの至適化を行った。以下に示されるこのペプチドは、ＣＦＵ−ＧＭ始原細胞上でＰＦ−４の活性阻害に関与するＤＬＱモチーフおよび主なヘパリン結合ドメインである塩基性アミノ酸クラスターを含む。
【０３１３】
2004500042.tif 000006
シグナルペプチド＝下線・太字
Ｌｙｓ６１、６２、６５、６６＝主なヘパリン結合ドメイン（太字）
ＤＬＱ（７−９、５４−５６）＝ ＣＦＵ−ＧＭ始原細胞に対する阻害活性（太字）
【０３１４】
このペプチドを合成するため、相補的オリゴヌクレオチド（オリゴＰＦ４−１およびオリゴＰＦ４−２）を作製した。５’末端においてＯｍｐＡおよびＳｐｅＩ制限部位のプロセッシング領域コードする配列を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。この２つのオリゴをアニーリングして二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。制限切断した後、この断片をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したベクターｐＴｒｃ８０１に連結してプラスミドｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４を作製した。プロセッシングされると、この配列は完全長のＰＦ−４（４７−７０）ペプチドとなる。
【０３１５】
2004500042.tif 000007
（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１６】
１４．３　アポミグレンをコードする核酸配列を含むプラスミドの構築
抗血管新生ペプチドアポミグレン
（ＩＹＳＦＤＧＲＤＩＭＴＤＰＳＷＰＱＫＶＩＷＨＧＳＳＰＨＧＶＲＬＶＤＮＹＣＥＡＷＲＴＡＤＴＡＶＴＧＬＡＳＰＬＳＴＧＫＩＬＤＱＫＡＹＳＣＡＮＲＬＩＶＬＣＩＥＮＳＦＭＴＤＡＲＫ（配列番号３１）；例えば、国際公報ＷＯ９９／２９８５６参照）はコラーゲンＸＶのタンパク質分解断片であるレスチンのＣ末端に相当する。オリゴヌクレオチド（オリゴＡｐｏｍ５ＦおよびオリゴＡｐｏｍ６Ｆ）を、ヒトｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅するように設計した。５’末端において、ＯｍｐＡのプロセッシング領域をコードする配列およびＳｐｅＩ制限部位を付加した。３’末端において、ＢａｍＨＩ制限部位とともに停止コドンを付加した。
【０３１７】
2004500042.tif 000008
（制限部位はイタリックで示し、ＯｍｐＡプロセッシング認識部位は下線で示す）
【０３１８】
正確なサイズの断片を、鋳型として胎盤ｃＤＮＡを用いてＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断し、改変ｏｍｐＡシグナル配列を含むＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したベクターｐＴｒｃ８０１に連結してプラスミドｐＴｒｃ８０１−Ａｐｏｍを作製した。プロセッシングされると、この配列はアポミグレンペプチドとなる。
【０３１９】
１４．４　内皮細胞増殖を阻害するサルモネラ菌によって産生される抗血管新生ペプチド
ｐＴｒｃＯｍｐＡ−エンドスタチン、ｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４およびｐＴｒｃ８０１−１３．４０プラスミドを弱毒化腫瘍標的サルモネラＶＮＰ２０００９株にエレクトロポレートした。ｐＴｒｃＯｍｐＡ−エンドスタチン、ｐＴｒｃ８０１−ＰＦ４およびｐＴｒｃ８０１−１３．４０を発現するサルモネラ株を、Ｆｅｌｄｍａｎら， ２０００， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：１５０３−１５０６およびＢｌｅｚｉｎｇｅｒら， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：３４３−３４８により記載されてように、抗増殖活性に関してスクリーニングした。各コロニーの培養物５ｍｌを４時間増殖させた。１００ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する１／２０容量のＨＵＶＥＣ培地に細胞ペレットを再懸濁させ、３回連続して凍結／解凍サイクルを行うことで細胞溶菌液を作製した。この溶菌液を遠心分離して明澄化し、０．２ｍｍのシリンジフィルターを用いて濾過除菌した。この溶菌液２５または５０ｍｌを、１００ｍｌ基本培地２％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦを含有する９６ウェルプレート中のヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に添加した。対照として空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラ菌を用いた。プレートを７２時間インキュベートし、増殖をＭＳＴアッセイによって測定した（Ｍｏｓｍａｎら， １９８３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３）。
【０３２０】
図１９および２０で得られた予備的結果は、サルモネラ菌によって産生された血小板第４因子ペプチド（ＰＦ４−２）、トロンボスポンジンペプチド１３．４０（１３．４０−３）およびエンドスタチンが４０ないし６０％の抗増殖活性を有すると思われることが示される。
【０３２１】
１５．　実施例：弱毒化腫瘍標的サルモネラ菌によるバクテリオシンファミリーのメンバーの発現
この実施例はバクテリオシンファミリーのメンバーをコードする核酸を含む、サルモネラ菌などの弱毒化腫瘍標的細菌がバクテリオシンファミリーのメンバーを発現することができることを示す。
【０３２２】
１５．１　ＣＯＬＥ３プラスミドの構築
本明細書に記載のプラスミドは本発明の特定の実施形態の例を示すものである。当業者には明らかなように、ｔｒｃプロモーターおよび／またはバクテリオシンをコードする核酸のようなプロモーターおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸は、当業者に公知の方法によって他の適当なプロモーターまたはエフェクター分子と置き換えてもよい。
【０３２３】
１５．１．１．　ｐＥ３．シャトル−１（ｓｈｕｔｔｌｅ−１）中間体ベクタープラスミド
ｐＥ３．シャトル−１は、複数のクローニング部位及びプラスミドベクターＣｏｌＥ３−ＣＡ３８（配列番号３４）中へのクローニング／選択のためのｌａｃＺ断片を含むカセットを作製するために用いられる中間体ベクターを示す。ＢＲＰのＥ３へのクローニングを容易にするために、ＢＲＰを先ず中間体シャトルベクター上にクローニングした（図２１）。このベクターは、染色体ｌａｃＺ中の突然変異（群）を有する細菌株中のラクトースに関してクローンを選択するために使用できるｌａｃＺ断片を含んでいる。次いで、ＢＲＰ断片を、ｌａｃＺα相補性断片を含むカセットとして、Ｅ３プラスミドＳｍａＩ部位（図２２）中にクローニングした。ｌａｃＺ断片によって、このステップにおけるインサートの選択（すなわち、Ｌａｃ＋）が可能になる。天然に存在するＥ３プラスミドは、抗生物質選択マーカーを有していない（図２３）が、プラスミドの存在の選択は、ハローアッセイ（ｈａｌｏ ａｓｓａｙ；Ｐｕｇｓｌｅｙ， Ａ．Ｐ．及びＯｕｄｅｇａ， Ｂ．、”コリシン類及びそれらのプラスミドの研究方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｃｏｌｉｃｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍｉｄｓ）”、「Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」 １９８７、Ｋ．Ｇ． Ｈａｒｄｙ編集；Ｇｉｌｓｏｎ， Ｌ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． ９：３８７５−３８８４）を用いることによって可能である。このシャトルベクターは、ＢＲＰのＥ３プラスミド上へのクローニングだけでなく、Ｅ３又はＥ３／ＢＲＰと組み合わせうる任意のＤＮＡのクローニングをも容易にするはずである。次いで、新規なＥ３／ＢＲＰプラスミドを、４１．２．９中に形質転換し、活性を試験した。予備的なハロー形成アッセイ（ｈａｌｏ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙｓ）によって、プラスミド上のＢＲＰの存在が、この株のＥ３を産生する能力を妨害しないことが証明された。４１．２．９ Ｅ３／ＢＲＰが、４１．２．９ Ｅ３を超えて活性を増大させたか否かを判定するため、各株によって産生されたＥ３の致死ユニット量を測定した（図２４）。４１．２．９ Ｅ３／ＢＲＰは、４１．２．９ Ｅ３単独よりも１００％多い致死ユニットを産生し、これにより、この株が４１．２．９ Ｅ３単独を超える増大した活性を有することが証明された。
【０３２４】
１５．１．２．　Ｅ３活性に関するハロー「穿刺」アッセイ（ｈａｌｏ ”ｓｔａｂ” ａｓｓａｙ）
感受性試験株（ＳＫ５２２）を、ＯＤ６００が０．８になるまで増殖させる。試験株１００μｌを、（１００×１５ｍｍディッシュに対して）３ｍｌの加温した（約５５℃）ＬＢ軟寒天に添加し、素早くＬＢ寒天プレート上に注ぐ。このプレートを穏やかに揺とうしてプレート全体に均一に広げ、寒天を１０〜１５分間かけて固化させる。Ｅ３活性アッセイが望まれる大腸菌又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のコロニーを、滅菌したつまようじ（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）で単離し、寒天中に「穿刺（ｓｔａｂｂｅｄ）」する。次いで、この寒天プレートを、逆さまにして３７℃で一晩インキュベートする。次の日、分泌されたコリシンＥ３が感受性株を殺傷するので、ハロー又は透明領域（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｚｏｎｅ）がＥ３穿刺の周囲に現れる。コロニーは、さらに誘導されて、アルキル化剤（例えば、マイトマイシン）、紫外線又はＸ線などの多様なＳＯＳ誘導試薬のいずれかによる処理によって、Ｅ３の産生又は分泌を増加させることができる。
【０３２５】
１つのハローアッセイの結果を図２５に示す。ある細菌株がペトリ皿上の細菌巣（ｌａｗｎ）上で増殖した感受性株の存在下でコリシンを分泌すると、分泌されたコリシンは、外側に広がり（ｄｉｆｆｕｓｅｓ ｏｕｔ）、細菌巣中に含まれている細菌細胞を殺傷し、それらを溶解して透明領域又はハローを作りだす。ハローの大きさは、分泌されたコリシン量に対応している。図２５に示される結果は、多数の株を示している。ｃｏｌＥ３−ＣＡ３８プラスミドを含んでいない株の回りには、ハローは絶対に観察されない。誘導剤（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）の不存在下では、コリシンはサルモネラ株によって産生される。また、種々のタイプの誘導剤（すなわち、アルキル化剤、紫外線、Ｘ線）によって、全てのハローは用量依存的にその大きさを増すという証拠がある。
【０３２６】
１５．１．３．　選択的Ｅ３クローンのオーバーレイアッセイ
形質転換体を種々の希釈濃度（１：１０，０００まで）でＬＢ上にプレーティングし、３７℃で２時間増殖させる。次いで、感受性試験株をハローアッセイで上記の様に調製し、軟寒天によってオーバーレイを注ぐ。１０分間固化させた後、次いで、プレートを逆さまにし、３７℃で一晩インキュベートする。次いで、次の日に、透明領域の中央に小さなコロニー（又はコロニー群）を伴って、（バクテリオファージのプラークに似た）小さな透明領域が現れる。
【０３２７】
１５．１．４．　「プラーク」又はハロー精製アッセイ
次に、上記のオーバーレイ寒天の透明領域の中心の小さなコロニーを、滅菌したパスツールピペットを用いて単離する。目に見えるコロニーが無いか、又は１つのハロー中に複数のコロニー群が有る場合のいずれかの場合には、ハロー全体を滅菌したパスツールピペットで吸い取る。コロニー又はハローを５００μｌのＬＢ中に移す。希釈（１：１０，０００まで）を行い、ＬＢ寒天上に戻し、３７℃で２時間増殖させる。次いで、オーバーレイを上述した感受性試験株に注ぐ。次の日、コロニー群の全部又は殆どが、それらの回りにハローを有するはずである。
【０３２８】
１６．　実施例：Ｅ３のｉｎ ｖｉｖｏ注射、及びサルモネラ中のプラスミド保持率（％）の測定
下記実施例によって、ｉｎ ｖｉｖｏでのサルモネラ中のｃｏｌＥ３−ＣＡ３８プラスミドの保持を証明する。
【０３２９】
４１．２．９（又は４１．２．９Ｅ３−ＣＡ３８）のいずれかの注射の３０日後の２匹のマウス由来の腫瘍及び肝臓のホモジェネートを、この研究に用いた。下記の記載中において、Ｌ＝肝臓、Ｔ＝腫瘍である。４つ全てのホモジェネートをＣＦＵのためにプレーティングし、コロニー群をｍｓｂＢ ＰＣＲによる分析及びコリシン産生のためにかきとった。４１．２．９に類似するコロニーのほぼ純粋な培養物を全てのホモジェネートから得た。それぞれから、５つのコロニーを、コリシン及びＰＣＲ分析のためにかきとった。さらに４１．２．９ Ｅ３肝臓ホモジェネート中のコリシン産生体（ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ）及び非産生体の混合集団であるように見える３０個のコロニーを、さらなる分析のために、４１．２．９ Ｅ３ Ｔ及びＬプレートからかきとった。これらの結果に基づいて、４１．２．９ Ｅ３腫瘍及び肝臓由来のさらに１００個のコロニーをかき取り、コリシン産生及びｍｓｂＢ ＰＣＲについて試験した。分布及びプラスミド保持率を組み合わせた日付（ｃｏｍｂｉｎｄｅｄ ｄａｔｅ）から算出した。
【０３３０】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＥ３注射、サルモネラ中のプラスミドの保持率（％）の測定の結果を下記表３に示す。
【０３３１】
【表３】
2004500042.tif 000009
【０３３２】
ｃｏｌＥ３プラスミドがｉｎ ｖｉｖｏで効果を有するようにするため、及びそれがｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍部位に他の遺伝子を運搬するために、ｃｏｌＥ３プラスミドは、ｉｎ ｖｉｖｏで効力を有するように保持されていなければならない。エフェクターの標的は腫瘍であるので、この実験で得られた結果は、驚くべきことであり、また利点を有し、従って、肝臓それ自体への影響は少ないであろう。
【０３３３】
１７．　実施例：Ｍ２７肺腫瘍モデルでの種々の４１．２．９．株の腫瘍標的化
下記実験によって、４１．２．９ ｃｏｌＥ３及び４１．２．９ ｃｏｌＥ３ ＢＲＰ及び４１．２．９ ｃｏｌＥ３ ＢＲＰ−ｍ（改変ＢＲＰ）サルモネラ株の腫瘍を標的とする能力を証明する。
【０３３４】
下記表４に列挙されたサルモネラ株をＭ２７肺腫瘍を有する動物に注射し、動物を７日目に犠牲にした。臓器重量を、ｃｆｕ／ｇの算出のために、次の日にアッセイした。腫瘍及び肝臓をホモジェネートし、ｍｓｂＢ上に置き、コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を測定した。グループ１、２、４、及び６では、全ての株が、肝臓では６×１０４〜４×１０６ｃｆｕ／ｇの範囲で種々の蓄積量を伴って、腫瘍中では約４×１０８ｃｆｕ／ｇまで蓄積された。表４は、全てのグループのデータをまとめたものであり、平均ｃｆｕ／ｇで示されている。全ての株が良好な腫瘍蓄積量（１０８ｃ．ｆ．ｕ．／グラム組織より良好）を有することが見出され、全ての株が正の腫瘍対肝臓比を与えた。ＢＲＰ ｃｏｌＥ３は、最良の比を有するが、他の全ての利用可能な株よりも必ずしも良好ではなかった。Ｅ３及びＥ３ ＢＲＰ株は、腫瘍対肝臓比が１００〜２００：１の間で腫瘍において相当に高い濃度まで蓄積する。
【０３３５】
【表４】
2004500042.tif 000010
１：ＢＲＰｍとは、９６位（ＧからＡへの変異であり、グリシンからアルギニンへのアミノ酸変化をもたらす）及び１１４位（ＴからＡへの変異であり、セリンからスレオニンへのアミノ酸変化をもたらす）での点突然変異を含む改変ＢＲＰをいう。突然変異体ＢＲＰｍは、もはや同様の溶解（ｑｕａｓｉ ｌｙｓｉｓ）を起こさないが、まだ細菌からのタンパク質分泌能を有する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ， Ｆ．， Ｋｏｎｉｎｇｓｔｅｉｎ， Ｇ．， Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ， Ｃ．Ｍ．， Ｏｕｄｅｇａ， Ｂ．及びＬｕｉｒｉｎｋ， Ｊ． （１９９８）、大腸菌によるバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）仲介タンパク質放出の最適化：タンパク質放出から致死率及び同様の溶解を切り離すためのｐＣｌｏＤＦ１３誘導性ＢＲＰ遺伝子の無作為突然変異（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＲＰ）−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｐＣｌｏＤＦ１３−Ｄｅｒｉｖｅｄ ＢＲＰ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｕｎｃｏｕｐｌｅ Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｑｕａｓｉ−Ｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ）， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６４， ｐｐ． ３９２−３９８）。
【０３３６】
１８．　実施例：Ｃ３８ネズミ大腸癌への４１．２．９／ＣｏｌＥ３の効力
下記実施例によって、Ｃ３８ネズミ大腸癌の増殖を阻害する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の能力を証明する。
【０３３７】
大腸３８腫瘍断片（２×２×２ｍｍ３）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、９週令）の皮下に埋め込んだ。腫瘍の体積が１，０００ｍｍ３に達した後、滅菌条件下でマウスから腫瘍を除去し、小さな断片（約２×２×２ｍｍ３／断片）に切断し、上記操作を５回繰り返した。腫瘍埋め込みの０日目に腫瘍埋め込み針（ｔｕｍｏｒ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｎｅｅｄｌｅ）を用いて、断片をマウスの右脇腹の皮下に埋め込んだ。
【０３３８】
腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達したときに、動物をサルモネラ投与の０日目に無作為化した。凍結保存されていた４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３を室温で解凍し、ＰＢＳで希釈してそれぞれ最終濃度７．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌとした。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（１．５×１０６ＣＦＵ／マウス）を、０日目に記載のグループのマウスに静脈内投与した。細菌懸濁液を１×１０３ＣＦＵまで希釈し、ｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートして、投与された細菌ｃｆｕの数を測定した。実験の終わりまで、週２回腫瘍を測定した。各グループ（ＣｏｌＥ３）の３つの腫瘍を解剖し、ｃｆｕ及びプラスミドの保持率を測定するために処理した。
【０３３９】
2004500042.tif 000011
【０３４０】
４１．２．９／ＣｏｌＥ３のＣ３８ネズミ大腸癌への効力の結果を図２６に示す。このデータは、ＶＮＰ２０００９（４１．２．９）の静脈内注射によって処置されたマウスがＣ３８ネズミ大腸癌の増殖を有意に阻害することができることを証明している。さらに、マウスをＣｏｌＥ３プラスミドを含有するＶＮＰ２０００９で処置すると、腫瘍退化（すなわち、腫瘍が、実験の初めよりも実験の終わりの方が小さい）が達成された。
【０３４１】
１９．　実施例：ヌードマウス中のＤＬＤ１ヒト大腸癌に対するＶＮＰ２０００９／ＣｏｌＥ３の抗腫瘍活性
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９に対するＤＬＤ１ヒト大腸癌の増殖を阻害する、サルモネラ突然変異体ＶＮＰ２０００９／ＣｏｌＥ３（４１．２．９／ＣｏｌＥ３）の増大した能力を証明する。
【０３４２】
対数増殖期に増殖したＤＬＤ１細胞をトリプシン処理によって除去し、ＰＢＳで洗浄し、５×１０７細胞／ｍｌ ＰＢＳに再構成した。細胞懸濁液（０．１ｍｌ）をヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ−ＣＤ１雌、９週令；Ｃｈａｒｌｅｄ Ｒｉｖｅｒ社より）の右脇腹に、０日目に単回皮下注射した（５×１０６細胞／マウス）。１０匹の動物を各グループで用い、腫瘍サイズが３００〜４００ｍｍ３に達する、腫瘍埋め込みの約１０〜１５日後に無作為化し、供試した（ｓｔａｇｅｄ）。サルモネラ突然変異体４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３のＣＦＵを１日前に計数した。細菌（４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３）を１×１０７ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（２×１０６ＣＦＵ／マウス）を、所定の日にマウスに皮下注射した。細菌懸濁液を１×１０３ＣＦＵに希釈し、各溶液１００μｌをｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、このプレートを一晩インキュベートした。次の日に細菌コロニーを計数した。腫瘍は、週２回測定した。
【０３４３】
2004500042.tif 000012
　ヌードマウス中のＤＬＤ１ヒト大腸癌に対する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の抗腫瘍活性の結果を図２７に示す。コリシンＥ３含有４１．２．９株は、４１．２．９株単独に比べて増大した活性を示す。
【０３４４】
２０．　実施例：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＢ１６ネズミ黒色腫に対する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の効力
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９／ＣｏｌＥ３の、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫の増殖を阻害する能力を証明する。
【０３４５】
対数増殖期で増殖するＢ１６−Ｆ１０細胞を、トリプリン処理によって除去し、ＰＢＳで洗浄し、５×１０６細胞／ｍｌ ＰＢＳに再構成した。細胞懸濁液（０．１ｍｌ）をＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、９週令）の右脇腹に０日目に単回皮下注射した（５×１０５細胞／マウス）。１０匹の動物を各グループで用い、腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達する９日目に無作為化した。凍結保存されていたサルモネラクローン４１．２．９及び４１．２．９／ＣｏｌＥ３を室温で解凍し、ＰＢＳで希釈してそれぞれ最終濃度７．５×１０６ｃｆｕ／ｍｌとした。０．２ｍｌの細菌懸濁液のアリコート（１．５×１０６ＣＦＵ／マウス）を、９日目に所定のグループのマウスに静脈内投与した。細菌懸濁液を１×１０３ＣＦＵに希釈し、ｍｓｂＢプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートして、投与された細菌ｃｆｕの数を測定した。腫瘍は、実験の終わりまで週２回測定した。
【０３４６】
2004500042.tif 000013
　Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＢ１６ネズミ黒色腫に対する４１．２．９／ＣｏｌＥ３の効力の結果を図２８に示す。データは、４１．２．９（４１．２．９）による静脈内注射によって処置されたマウスが、Ｂ１６ネズミ黒色腫の増殖を有意に阻害できることを証明している。さらに、４１．２．９／ＣｏｌＥ３によって処置されたマウスは、４１．２．９単独に比べて早い時点（最高３７日まで）に腫瘍サイズの有意な減少を示した。より小さい腫瘍サイズは、より容易に他の治療剤（例えば、化学療法剤及びＸ線などの照射）の影響を受け易いので、この知見は非常に重要である。
【０３４７】
２１．　実施例：ＢＲＰと組み合わせた４１．２．９／Ｅ３の抗腫瘍効力
下記実施例によって、サルモネラ突然変異体４１．２．９におけるＢＲＰとＥ３の共発現が突然変異体の抗腫瘍効力を増加させることを証明する。
【０３４８】
サルモネラ突然変異体４１．２．９におけるＢＲＰとＥ３の共発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細菌から分泌されるＥ３の量を増加させる。ＢＲＰがｉｎ ｖｉｖｏでサルモネラから分泌されるＥ３の量を増加させうる場合には、この追加的な細胞外Ｅ３が腫瘍細胞に容易に利用可能であり、従ってこれらの細胞に対する細胞毒性を増加させるという仮説を立てることができるであろう。この実験では、４つの動物グループ（グループ当たり１０匹の動物）を試験した：
2004500042.tif 000014
　この実験で用いたモデルは、ヒト肺癌系統ＨＴＢ１７７とした。細胞を１日目にマウスの脇腹の皮下に埋め込んだ。腫瘍がおよそ５００ｍｍ３に達した１４日目に、動物に上記表に記載の株の１×１０６ｃｆｕ、又はグループ１の場合には生理食塩水を静脈内注射により注射した。腫瘍体積は、２４日目まで毎週測定した。表５の結果は、４１．２．９が単独で腫瘍増殖を阻害でき（４０％阻害）、一方、Ｅ３との組み合わせは抗腫瘍効力を増大させる（６３％）ことができることを示している。しかしながら、Ｅ３及びＢＲＰの両者を有する株をこのモデルで用いた場合、抗腫瘍効力はさらに増大し（未処置コントロールに比べて６７％阻害）、増大した阻害率は、より早い時点で非常に有意である（表５）。
【０３４９】
【表５】
2004500042.tif 000015
【０３５０】
結論として、細胞毒性コリシンＥ３及び機能強化された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）分泌系ＢＲＰの両者を有するサルモネラによる処置によって、未処置コントロール及び４１．２．９／Ｅ３単独での処置に比べて抗腫瘍効力が増加する。
【０３５１】
２２．　実施例：コリシンＥ３含有サルモネラとＸ線処置との組合せ
下記実施例によって、４１．２．９と２つの用量のＸ線との組み合わせが、Ｘ線単独で見られるよりもマウスの生存期間を有意に延長することを証明する。
【０３５２】
スケジュールは次の通りである：０日目に、１００匹のＣ５７Ｂ６雌マウス（５〜７週令）の身体の中心（ｍｉｄ ｂｏｄｙ）の右側の皮下にＢ１６Ｆ１０黒色腫（５×１０５細胞／マウス）を投与することによって腫瘍を埋め込んだ。、８日目に、コリシンＥ３含有サルモネラ４１．２．９を注射し、１２日目及び２６日目に、Ｘ線を照射した。
【０３５３】
コリシンＥ３含有サルモネラとＸ線処置との組み合わせの結果を表６に示す。
【０３５４】
【表６】
2004500042.tif 000016
【０３５５】
このデータは、４１．２．９と２つの用量のＸ線との組み合わせが、Ｘ線単独で見られるよりもマウスの生存期間を有意に延長することを証明している。Ｅ３は、４１．２．９＋Ｘ線で見られるよりもマウスの生存期間をさらに延長させた。
【０３５６】
２３．　実施例：腫瘍標的細菌による細胞傷害性壊死因子の発現
下記実施例によって、腫瘍標的細菌による大腸菌細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１）の発現を証明する。
【０３５７】
細胞傷害性壊死因子としては、以下に限定されないが、大腸菌細胞傷害性壊死因子１（ＣＮＦ１；Ｆａｌｂｏら， １９９３， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６１：４９０４−４９１４）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ＣＮＦ１（Ｌｉｎら， １９９８， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２５０：４６２−４６５）及び大腸菌細胞傷害性壊死因子２（ＣＮＦ２；Ｓｕｇａｉら， １９９９， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６７：６５５０−６５５７）が挙げられる。また、ＣＮＦファミリーとしては、ＣＮＦ２のＮ末端部分と、２７％の同一の残基及び８０％の保存された残基を有するパスツレラ・ムルチオシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｏｃｉｄａ）毒素（ＰＭＴ）（Ｏｓｗａｌｄら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３８１４−３８１８）も挙げられる。
【０３５８】
ＣＮＦ１は、大腸菌１９６（ＡＴＣＣ ７００３３６）から、標準的なＰＣＲを用いて、プライマー、（フォワード）５’−ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号３５）及び（リバース）５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号３６）を用いたＰＣＲによってクローニングした。約３１００ｂｐの産物が得られ、タンパク質の発現並びにＤＮＡクローニング宿主として大腸菌を用いるＤＮＡシーケンシングのためにｐＴｒｃ９９ａのＮｃｏＩ及びＳａｃＩ部位中にクローニングした。ＤＮＡシーケンシングは、エール大学ケックバイオテクノロジー研究室（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の標準的な方法によって行った。ＤＮＡシーケンシングによって、クローン化ＰＣＲ産物が、３０６５塩基対のうちの６つのほんの小さな配列変異を有するＣＮＦ１であることを確認した。
【０３５９】
ＣＮＦ１プラスミドを、大腸菌ＤＮＡクローニング宿主ＤＨ５α及びサルモネラＹＳ１６４６株（国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号）中に電気穿孔した。標準的なＬＤＨアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州、Ｃｙｔｏｔｏｘ ９６（登録商標））を用いて、大腸菌ＤＮＡクローニング宿主及びサルモネラＹＳ１６４９株におけるＣＮＦ１の発現を測定した。図２９は、ＣＮＦ含有プラスミドの存在が細胞毒性の増大をもたらすことを示している。続くアッセイを用いて、ＣＮＦ含有プラスミドを有するサルモネラが多核化（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）（Ｒｙｃｋｅら， １９９０， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８：６９４−６９９）などのＣＮＦ１の他の既知の特性をも示すことを示した。ＣＮＦ１に暴露したＨｅｌａ細胞の核を、光学顕微鏡法によって試験した。図３０の結果は、サルモネラ中にＣＮＦ１が存在することによって期待される多核化及び細胞肥大（ｃｅｌｌ ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）がもたらされることを明瞭に示している。
【０３６０】
２４．　実施例：腫瘍標的細菌によるベロ毒素の発現
下記実施例によって、ベロ毒素ＡＢを発現するように遺伝子操作された腫瘍標的細菌によって産生されるベロ毒素ＡＢの細胞毒性を証明する。
【０３６１】
ベロ毒素（合成（ｓｙｎ．）ＨＳＣ１０毒素、シガ（Ｓｈｉｇａ）毒素、シガ様毒素、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素）。この毒素は、コリシン産生大腸菌ＨＳＣ１０株から単離されたものであり、元々はコリシンであると考えられていた（Ｆａｒｋａｓ−Ｈｉｍｓｌｅｙら， １９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２（１５）： ６９９６−７０００）。それは抗腫瘍活性、特に卵巣癌及び脳腫瘍に対する抗腫瘍活性の長い歴史を有しているが、この抗腫瘍活性は、生きている細菌全体ではなく、精製された調製物と関係している。
【０３６２】
ベロ毒素を、ベロ毒素Ｉの公開されている配列に基づくプライマーを用いて大腸菌ＨＳＣ１０（ＡＴＣＣ ５５２２７）からクローニングし、標準的なＤＮＡシーケンシング法を用いて、エール・ケック・バイオテクノロジー・センター（Ｙａｌｅ Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ）でのＤＮＡシーケンシングによって確認した。ベロ毒素の発現は、ベロ毒素Ａ及びＢサブユニットによる多シストロン性のテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で、ＢＲＰ遺伝子を用いて達成した。このテトラサイクリン誘導性ＢＲＰベロ毒素ＡＢを、ｍｓｂＢ遺伝子を用いる染色体組み込みのためのベクター中にクローニングした。
【０３６３】
２４．１．　ベクターの構築
２４．１．１．　ＡＢの増幅及びクローニング
ベロ毒素ＡＢ（ＡＢ）は、下記プライマーを用いるＰＣＲによって生成した：
Ｈ１９Ｂ−７：フォワード：５’−ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号３７）；及び
ＱＳＴＸ−Ｒ１：リバース：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧＡＡＴＴＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号３８）。
【０３６４】
また、これらのプライマーは、ｐｔｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ部位中にクローニングするための外側のＮｃｏＩ（５’）及びＰｓｔＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。
【０３６５】
２４．１．２．　ＴｅｔＢＲＰの増幅及びクローニング
ＴｅｔＢＲＰ−ＡＢを、中間体ベクターｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６中に構築した。ＴｅｔＢＲＰは、次のプライマーを用いてＰＣＲによって生成した：Ｔｅｔ−５’：フォワード５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号３９）及びＢＲＰ−ＴＥＴ−３’：リバース５’−ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号４０）。これらのプライマーは、ｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６ベクターのＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ部位中にクローニングするためのＢｇｌＩＩ（５’）及びＢａｍＨＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。
【０３６６】
２４．１．３．　ｐＳＰ７２−Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ中へのＡＢのサブクローニング
ｐｔｒｃ９９Ａ−ＡＢを、ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ中に挿入するためにＢａｍＨＩ及びＡｖａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＡＢを除去し、また、ＢａｍＨＩ及びＡｖａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６ベクターは、トランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）ｌａｃＺ−α相補性のためのβ−ｇａｌ遺伝子の部分の他に、クローニングのための複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。ベクター（ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ）及びＡＢインサートの両者は、０．８％１ＸＴＡＥアガロースゲル上で分離し、キアーゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて精製した。Ｔ４リガーゼを用いて、ベクター及びインサートを連結し、熱ショック法を用いてＤＨ５ａ大腸菌細胞中に形質転換した。この細胞を、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ及び４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含有するＬＢプレートにプレーティングした。アンピシリン耐性及び機能性β−ｇａｌ遺伝子の存在に基づいて陽性コロニーを選択した（陽性コロニーは青色だった）。
【０３６７】
２４．１．４．　ｐＣＤＶ４４２中へのＴｅｔＢＲＰ−ＡＢのサブクローニング
ｐＳＰ７２Ｆ６／Ｒ６−ＴｅｔＢＲＰ−ＡＢを、ｐＣＶＤ４４２ベクター中にサブクローニングするためにＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、また、ＮｏｔＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【０３６８】
２４．１．５．　ｍｓｂＢ染色体ベクター
ＶＮＰ２０００９株の染色体中のＤｍｓｂＢ遺伝子との相同組み換えを行うことができるベクター（国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号中のａ．ｋ．ａ． ＹＳ１６４６）を、自殺ベクターｐＣＶＤ４４２（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５９： ４３１０−４３１７）中に構築した。２つの別の産物としてＶＮＰ２０００９中に存在するｍｓｂＢ欠損の５’及び３’側切片の部分を生産する、ＰＣＲ用のプライマーを設計した（ｍｓｂＢ−５’：フォワード５’−ＧＴＧ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ＴＴＡ ＡＣＣ ＣＴＣ ＴＧＡ Ｃ−３’（配列番号４１）及びリバース５’−ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＴＡ ＴＡＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ＧＣＡ ＡＡＣ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＧＣＡ Ｃ−３’（配列番号４２）；並びにｍｓｂＢ−３’：フォワード５’−ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＧＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＡＴＴ ＧＧＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＣ−３’（配列番号４３）及びリバース５’−ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＧＡ ＣＧＴ ＴＧＴ Ｇ−３’（配列番号４４））。また、これらのプライマーは、これらの２つの断片が共通のＳｐｈＩ部位を介して結合するときに、ｐＣＶＤ４４２のＳａｃＩ及びＳａｌＩ部位中へのクローニングを容易にするために、外側のＳａｃＩ（５’）及びＡｃａＩ（３’）制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、抗生物質耐性を伴わない安定な染色体組み込みのためのＤＮＡ断片のＤｍｓｂＢ中へのクローニングを容易にするために、内部のＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩ及びＤｒａＩを生成する（図３１）。このベクターをｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢと呼ぶ（図３２及び３３を参照されたい）。
【０３６９】
Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢをｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢ中にクローニングするために、Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢプラスミドＤＮＡを制限消化し、適当なＤＮＡを精製し、Ｔ４リガーゼを用いて、これら２つの構成要素を含む連結反応を行った。次いで、連結反応物をＤＨ５１ ｐｉｒに形質転換し、コロニーをＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢの存在及び配向でスクリーニングした。Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢクローンをＳＭ１０ １ ｐｉｒ株（前記Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１）中に形質転換し、そのプラスミドをｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢと称した。ＳＭ１０ １ ｐｉｒのコロニーを、ＰＣＲによるＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子についてスクリーニングし、サルモネラ株に対する交配ドナー（ｍａｔｉｎｇ ｄｏｎｏｒ）として用いるために、ＳＭ１０ １ ｐｉｒクローンｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを選択した。ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを含有するＳＭ１０ １ ｐｉｒを、標準的な方法（Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｗ．， Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ｄ．，及びＲｏｔｈ， Ｊ． Ｒ．， １９８０，最新細菌遺伝学（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）によって、サルモネラＹＳ５０１０１株（Ｄｉｆｃｏ ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天に対する増強された耐性を有するテトラサイクリン耐性ＹＳ８２株（前記Ｌｏｗら， １９９９）の自然発生誘導体）と交配し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｃａｒｂ）及び３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）を含むプレート上で選択した。得られたＹＳ５０１０２−ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢクローンを、ＰＣＲによりｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子についてチェックした。
【０３７０】
２４．２．　４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ株を生産するために染色体に組み込まれたｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢの４１．２．９（ＹＳ１６４６）中への送達
ドナーとしてＹＳ５０１０２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ株を用い、バクテリオファージＰ２２（突然変異体ＨＴ１０５／１ ｉｎｔ−２０１；Ｄａｖｉｓら， １９８０）によって、カルベニシリン耐性を４１．２．９に形質導入した。ｐＣＶＤ４４２由来のｂｌａ及びｓａｃＢ遺伝子の存在によって、ＤｍｓｂＢ及びＤｍｓｂＢ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子の両者を含む４１．２．９−ｐＣＶＤ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ−１を表すｃａｒｂｒ（又はａｍｐｒ）ｓｕｃｓ株の選択が可能になる（図３３、＃３）。４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ−１株をＬＢスクロース上にプレーティングし、ｓｕｃｒ ｃａｒｂｓ誘導体を選択し、ＤｍｓｂＢ遺伝子を除去し、ＬＢ−スクロース寒天プレートを、ＮａＣｌ無しで作製する以外は、前記Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ及びＫａｐｅｒ， １９９１（図３３、＃４）の方法に従ってＤｍｓｂＢ−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子を残し、プレートを３０℃でインキュベートした。これらのプレート上でコロニーが増殖した後、それらをｍｓｂＢプレートにグリッドを据え（ｇｒｉｄｄｅｄ）、抗生物質及びスクロースマーカーの両方を欠損したクローンの存在を検出するために、複製をカルベニシリン又はスクロースのいずれかを含有するプレートにプレーティングした。得られたクローンを、ＰＣＲによりＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢ遺伝子の存在についてチェックした。染色体に組み込まれたＴｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢを含有し、スクロース感受性及びカルベニシリン耐性を欠損している１つの誘導体を、４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ベロ毒素ＡＢと表示した。
【０３７１】
標準的なＬＤＨ細胞毒性アッセイ（Ｃｙｔｏｔｏｘ９６（登録商標）；Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウイスコンシン州）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ベロ毒素ＡＢの細胞毒性を試験した。結果を図３４に示す。この結果は、ベロ毒素発現クローン２６及び３１の毒性特性を証明している。クローン２６及び３１は、テトラサイクリンで処理しなかったときよりもテトラサイクリンで処理したときの方が有意に高い細胞毒性率（％）を有していた。
【０３７２】
２５．　実施例：腫瘍標的細菌による溶血素の発現
下記実施例によって、腫瘍標的細菌を遺伝子操作して溶血素などの溶血性タンパク質を、構成的に又は誘導性制御下で発現できることを証明する。
【０３７３】
溶血素は、赤血球細胞を溶解させる能力を有する、周知の細胞毒性タンパク質である（例えば、Ｂｅｕｔｉｎ， １９９１， Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０：１６７−１８２）を参照されたい）。ＳｈｅＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＥＣＯ２３８９５４）は、殆どが野生型大腸菌で見出される、通常は発現されないサイレントな溶血素である（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら， １９９８， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １６８：８５−９０）。ＳｈｅＡ（ａ．ｋ．ａ． ｈｌｙＥ；Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｕ５７４３０）は、野生型大腸菌（２５０７株、エール大学大腸菌遺伝子保存センター（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ））から、下記プライマー（フォワード）５’−ＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴ ＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧ ＡＣＴＧＡＡＡＴＣＧ ＴＴＧＣＡＧＡＴＡＡ ＡＡＣＧＧ−３’（配列番号４５）及び（リバース）５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣ ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣ ＡＧＡＣＴＴＣＡＧＧ ＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧ ＡＧＴＧＴＣ−３’（配列番号４６）を用いたＰＣＲによって、標準的なＰＣＲ条件下でクローニングした。正しいサイズのＰＣＲ産物を、部分的に構成性のｔｒｃプロモーター下に置くために、ｐｔｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローニングした。また、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶによって切断したｔｅｔ−ｂｇａｌ−Ｚ−ｔｅｒｍベクター（前記）中にクローニングした。次いで、大腸菌ＤＨ５ａ（Ｇｉｂｃｏ社製）を、そのプラスミドで形質転換し、０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した及び添加しない血液寒天培地（５％ヒツジ血液を有するトリプシン性ダイズ寒天培地；ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、ロンバード、イリノイ州）にプレーティングした。溶血を示すコロニーの周りの透明なハローを含むコロニーを陽性コロニーとして取り上げた。陽性コロニーを標準的なプラスミド精製に付し、サルモネラＹＳ５０１に形質転換し、再度ハローについてスクリーニングした。
【０３７４】
構成性のハロー形成を、テトラサイクリンの添加によって又は添加無しにハローが観察される、ｔｒｃ９９ａ構築物について図３５（２Ａ及び２Ｂ）に示す。テトラサイクリン依存性ハロー形成を、テトラサイクリンの添加を伴わずにハローが観察されない、テトラサイクリン−プロモーター誘導性ＳｈｅＡについて図３５（３Ａ及び３Ｂ）に示す。これらの結果は、腫瘍標的細菌が、構成的に又は誘導性制御下で、溶血性タンパク質を発現できることを証明している。
【０３７５】
２６．　実施例：腫瘍標的細菌によるメチオナーゼの発現
下記実施例によって、サルモネラなどの弱毒化腫瘍標的細菌を遺伝子操作して、メチオナーゼを発現させることができることを証明する。
【０３７６】
メチオナーゼは、腫瘍増殖に必要な必須アミノ酸であるメチオニンを分解する酵素である。腫瘍増殖を阻害するための又はメチオナーゼをコードするＤＮＡ若しくはウイルスベクターを投与するための精製メチオナーゼの投与に関しては報告されている（Ｘｕ及びＴａｎによる国際公開第ＷＯ００／２９５８９号）。Ｘｕ及びＴａｎは、メチオナーゼの送達のための腫瘍特異的細菌ベクターの使用方法を開示しておらず、精製タンパク質によって効力を達成するためには、大量のメチオナーゼが必要である。メチオナーゼを直接腫瘍に送達する新規な方法は、腫瘍標的細菌を用いて酵素を発現させる。
【０３７７】
Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｌ４３１３３に基づくニュードマス・プティダ（Ｐｎｅｕｄｏｍａｓ ｐｕｔｉｄａ）から、下記プライマーを、メチオナーゼ用に生成した：
フォワード：ＭＥＴＨ−ＸＨＯＩ
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＣＣＡ−３’（配列番号４７）；及び
リバース：ＭＥＴＨ−ＢＡＭ
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４８）
上記列挙したプライマー（４ｍＭ）及び鋳型として、ニュードマス・プティダの単離されたコロニーを用いて、メチオナーゼの配列を下記条件下でのＰＣＲによって増幅した：
９４℃、５分間を１サイクル、次いで９４℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃で２分間を３５サイクル。７２℃、１０分間の最終増幅工程は、ＰＣＲ反応の最後の工程として行った。ＰＣＲ産物を０．８％１Ｘ ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、メチオナーゼの予想されるサイズ（約１１９６ｂｐ）からなるＰＣＲ産物を同定した。バンドを、ゲルから切り取り、キアーゲンゲル抽出キットを用いて精製した。
【０３７８】
ｐＳＰ７２ベクター及び上記で得られた単離したゲル精製メチオナーゼ遺伝子の両者を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した。消化したベクター及びメチオナーゼを、０．８％１ＸＴＡＥアガロースゲル上で分離した。線状化ベクターに対応する消化生成物及び消化されたメチオナーゼ遺伝子をゲルから切り取り、キアーゲンゲル抽出キットを用いて精製した。線状化ベクター及びインサート（メチオナーゼ）をＴ４リガーゼを用いて一緒に連結した。連結混合物を、熱ショック法によってＤｈ５ａ大腸菌細胞中に形質転換した。細胞を、回収した後、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）を含有するＬＢ培地にプレーティングして、完全なｐＳＰ７２ベクターを含有する細胞を選択した。Ａｍｐ耐性コロニーを同定し、キアーゲンミニ−プレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ）を用いたプラスミド調製並びに酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＢｓｐ ＨＩによる制限消化によって、メチオナーゼ遺伝子を含有するｐＳＰ７２ベクターの存在を確認した。クローン＃９を、配列決定のために、エール大学医学部（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のエール・シーケンシング・ファシリティー（Ｙａｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に送った。ＳＰ６（フォワード）及びＴ７（リバース）シーケンシング・プライマーの両者を用いて配列決定がなされた。結果は、配列が、ＰＣＲによってＴＡＡに変わっているＴＧＡ停止コドンを除いて、公表されているメチオナーゼの配列と１００％一致することを証明している。
【０３７９】
メチオナーゼ活性は、Ｈｏｒｉら， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：２１１６−２１２２に記載のメチオナーゼアッセイを用いて測定できる。
【０３８０】
２７．　実施例：弱毒化腫瘍標的細菌でのＴＡＴ融合物としてのアポチン（ａｐｏｐｔｉｎ）タンパク質の発現
下記実施例によって、弱毒化腫瘍標的細菌を遺伝子操作して、エフェクター分子、並びにＴＡＴ、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ＶＰ２２、及びカポジ（Ｋａｐｏｓｉ）ＦＧＦ ＭＴＳなどのフェリー・ペプチド（ｆｅｒｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む融合タンパク質を発現させ分泌させることができることを証明する。
【０３８１】
２７．１．　ＴＡＴ−アポチンベクターの構築
カナリア・ウイルス（ＣＡＶ）タンパク質であるアポチンは、アデノウイルスベクターによって送達されたときに、新生物細胞中でアポトーシスを誘導することが知られている（例えば、Ｎｏｔｅｂｏｒｎら， １９９９， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：８８２−８９２を参照されたい）。
【０３８２】
サルモネラの細胞質中で転写されるが、腫瘍細胞の核に輸送され、アポトーシスを引き起こす能力を有するタンパク質を生産するために、アポチンタンパク質をヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴタンパク質から誘導されるペプチドに融合した（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅら， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−２５７２を参照されたい）。ＴＡＴタンパク質融合物は、正電荷を増加させ、タンパク質精製を容易にもするポリヒスチジン（ヘキサヒスチジン）アミノ酸と融合した場合に、機能性であることも示されているので（前記Ｓｃｈｗａｒｔｚｅら， １９９９）、ＴＡＴ−アポチン融合物を、ヘキサヒスチジンによって及びそれ無しで生産した（図３６Ａ及びＢ）。さらに、ＴＡＴ−アポチン融合物は、ＯｍｐＡ−８Ｌシグナル配列によって及びそれ無しに生産できる（図３６Ａ及びＣ）。
【０３８３】
アポチン及びヘキサヒスチジン・アポチンは、オーバーラップ・オリゴヌクレオチドを用いて構築される。アポチンをコードする核酸配列は、下記オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成した：
2004500042.tif 000017
ＴＡＰ ２−ＴＡＰ６オリゴヌクレオチド及びＴＡＰ６Ｈ１オリゴヌクレオチド
2004500042.tif 000018
を用いて、ＴＡＴ−アポチン融合タンパク質のヘキサヒスチジン含有バージョンをコードする核酸配列を生成した。ＴＡＰ６オリゴヌクレオチド及びｏｍｐ８ＬＦ１オリゴヌクレオチド
2004500042.tif 000019
を用いてＰＣＲにより、ＴＡＰ１−ＴＡＰ６オリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物から、ＴＡＴ−アポチン融合タンパク質のＯｍｐＡ８Ｌ含有バージョンをコードする核酸配列を生成した。
【０３８４】
各オリゴヌクレオチドを、４μＭ濃度の保存溶液に調製した。予め混合されたＰＣＲ反応ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ ｂｅａｄｓ）を用い、各オリゴヌクレオチドの２μｌを使用した。ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間を１サイクル；９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を３５サイクル；及び７２℃で１０分間を１サイクルから構成されていた。次いで、ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、水中に再び溶解し、Ｎｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩによる制限消化に付した。制限消化されたＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分離し、正しいサイズの産物（ＴＡＴ−アポチン及びヘキサヒスチジン−ＴＡＴ−アポチンに対して、それぞれ約４２０及び４５０ｂｐ）をゲルから切り取り、標準的な分子生物学的方法を用いて単離した。これらの産物をＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ消化されたｐｔｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）中に連結し、ｐｔｒｃ９９ａ−ＴＡＴ−アポチン構築物を得た。ＴＡＴ−アポチン（図３７）及びヘキサヒスチジンＴＡＴ−アポチン（図３８）の両者の正しいＤＮＡ配列を得た。
【０３８５】
２７．２．　ＴＡＴ−アポチンの分泌及び取り込みの証明
弱毒化腫瘍標的細菌を、当業界で公知の標準的な方法によって（例えば、熱ショック又は電気穿孔によって）ｐｔｒｃ９９ａ−ＴＡＴ−アポチン構築物によって形質転換し、培地中で培養する。当業者に公知の方法（例えば、ウエスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡ）を用いて、ＴＡＴ−アポチンの存在について、細菌培養物からの上清を試験する。一旦、細菌培養物の上清中のＴＡＴ−アポチンの存在が確認されたなら、細菌培養上清を哺乳動物細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、２９３、及び２９３Ｔ細胞）と共にインキュベートし、細胞内部のＴＡＴ−アポチンの存在を、当業者に公知のアポチンアッセイによって確認する。
【０３８６】
２７．３．　腫瘍内へのＴＡＴ−アポチンの取り込みの証明
ＴＡＴ−アポチン又はアポチンを発現するように遺伝子操作された弱毒化腫瘍標的細菌を、Ｂ１６腫瘍モデルに静脈内投与する。マウスは、細菌の投与後数日で犠牲にし、臓器重量を測定する。当業者に公知のアポトーシスアッセイ（例えば、ＤＮＡラダーリング（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）及びフルオレセインｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製、マンハイム、ドイツ）を用いてＴＡＴ−アポチン又はアポチンの存在及び局在について腫瘍をアッセイする。さらに、腫瘍のサイズをアッセイし、ＴＡＴ−アポチンの抗腫瘍活性を測定する。また、腫瘍をホモジェネートし、プレーティングして、コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）を測定する。
【０３８７】
２８．　実施例：マウスのＭ２７肺癌の増殖に対するＶＮＰ２０００９と化学療法剤との組合せの効力
下記実施例によって、化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与が、相乗的又は相加的に働いて、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを証明する。
【０３８８】
２８．１．　マウスのＭ２７肺癌の増殖に対するＶＮＰ２０００９とサイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）又はＶＮＰ２０００９とマイトマイシンＣとの組合せの効力
液体窒素保存されたＭ２７ネズミ肺癌細胞（１×１０６／ｍｌ×１ｍｌ）を、３７℃で細胞を素早く解凍することによって正常な状態に戻し、３７℃、５％ＣＯ２で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培養培地１０ｍｌで培養した。細胞を２世代継代させた後、対数増殖期にあるＭ２７細胞をトリプシン処理によって取り出し、１×ＰＢＳで洗浄し、腫瘍埋め込みのために、１×ＰＢＳで２．５×１０６細胞／ｍｌに再構成した。Ｍ２７細胞懸濁液を、０日目に、１００匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週令、２０ｇ；５×１０５細胞／マウス）の右脇腹の皮下に埋め込んだ。マウスを、各グループが１０匹のマウスからなるように、無作為に１０のグループに分けた。
【０３８９】
サルモネラＶＮＰ２０００９株を、本発明者の標準的な希釈方法によって、１×ＰＢＳで５×１０６ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。各マウスに、下記表６に従って１２日目に、希釈したサルモネラ（１×１０６ＣＦＵ／マウス）０．２ｍｌを静脈内投与した。注射した細菌の実数を測定するため、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を、さらに１×１０３ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、栄養寒天培地（ＭｓｂＢプレート；国際公開第ＷＯ９９／１３０５３号）上にプレーティングした。形成されたコロニーを翌日計数した。
【０３９０】
マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社製）及びサイトキサン（Ｓｉｇｍａ社製）を、下記表７に従ってマウスに投与した。マイトマイシンＣの２回目の用量を２２日目に組み合わせグループには投与したが、腫瘍のサイズが大きいために、マイトマイシンＣ単独で処置されたグループには投与しなかった。ＶＮＰ２０００９＋サイトキサンで処置したグループで、重篤な中毒反応が観察されたので、シプロ（Ｃｉｐｒｏ；Ｂａｙｅｒ Ｉｎｃ．社製、ウエストハーベン、コネチカット州）２００ｍｐｋを、ＶＮＰ２０００９単独又はＶＮＰ２０００９＋化学療法剤で処置した各マウスに投与した。実験の終わりまで、腫瘍体積を週２回測定した。動物の行動、外観及び死亡率を毎日観察した。マウスは、清潔で、一定温度の実験室に保持した。床敷きを週２回取り換え、マウスには十分な食物と飲料水を与えた。
【０３９１】
【表７】
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【０３９２】
図３９に示すように、ＶＮＰ２０００９＋サイトキサンによる組み合わせ処理は、ＶＮＰ２０００９処置単独又はサイトキサン処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。図４０に示すように、ＶＮＰ２０００９＋マイトマイシンＣの組み合わせは、マイトマイシンＣ単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。しかしながら、ＶＮＰ２０００９＋マイトマイシンＣの組み合わせは、ＶＮＰ２０００９処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害しなかった（図４０）。これらの結果は、化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与が、相乗的又は相加的に働き、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを示唆している。
【０３９３】
２８．２．　マウスのＭ２７肺癌の増殖に対するＶＮＰ２０００９とシスプラチンとの組合せの効力
液体窒素保存されたＭ２７ネズミ肺癌細胞（１×１０６／ｍｌ×１ｍｌ）を、３７℃で素早く細胞を解凍することによって正常な状態に戻し、３７℃、５％ＣＯ２でウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培養培地２５ｍｌで培養した。細胞を２世代継代させた後、対数増殖期（約９０〜９５％飽和）にあるＭ２７細胞を、トリプシン処理によって取り出し、１×ＰＢＳで洗浄し、腫瘍埋め込みのために、１×ＰＢＳで２．５×１０６細胞／ｍｌに再構成した。Ｍ２７細胞懸濁液（０．２ｍｌ）を、０日目に、３６匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、８週令、２０ｇ；５×１０５細胞／マウス）の右脇腹の皮下に埋め込んだ。マウスを、各グループが９匹のマウスからなるように、無作為にグループ分けした。
【０３９４】
サルモネラＶＮＰ２０００９株を、本発明者の標準的な希釈方法によって１×ＰＢＳで５×１０６ＣＦＵ／ｍｌに希釈した。下記表８に従って１２日目にサルモネラ（１×１０６ＣＦＵ／マウス）０．２ｍｌを、各マウスに尾静脈経由で投与した。注射した細菌の実数を測定するために、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液を、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌにさらに希釈し、ＭｓＢｂプレート上にプレーティングした。形成されたコロニーを翌日計数した。
【０３９５】
細菌注射の２日後の１４日目に、マウスにシスプラチンを投与した（下記表８）。シスプラチンを、投与前に、正常生理食塩水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。腫瘍体積は、実験の終わりまで週２回測定した。動物の行動、外観及び死亡率を毎日観察した。マウスは、清潔で、一定温度の実験室内に保持した。床敷きは週２回取り換え、マウスには十分な食物と飲料水を与えた。
【０３９６】
【表８】
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【０３９７】
図４１に示すように、ＶＮＰ２０００９＋シスプラチンによる組み合わせ処置は、ＶＮＰ２０００９処置単独又はシスプラチン処置単独よりもＭ２７肺癌の増殖を強く阻害した。これらの結果は、シスプラチンなどの化学療法剤と組み合わせた弱毒化腫瘍標的細菌の投与は、相乗的又は相加的に働き、肺癌などの固形腫瘍の増殖を阻害できることを示唆している。
【０３９８】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施態様によってその範囲を限定されるものではない。実際に、先行する記載及び添付の図面から、本明細書中に記載されているものの他に、本発明の多様な変形が存在することは、当業者には明らかであろう。そのような変形は、特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０３９９】
種々の刊行物が本明細書中で引用されており、それらの開示は、参照によってそれらの全体が本明細書中に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
成熟ヒトＴＮＦ−αのコード配列を示す図である。ＤＮＡ配列（配列番号３）とタンパク質配列（配列番号４）の両方を示す。
【図２】
サルモネラＶＮＰ２０００９ ｓｅｒＣ株の誘導を示す図である。
【図３】
ネズミチフス菌における、染色体に組み込まれたｔｒｃプロモーター駆動ＴＮＦ−α遺伝子からのＴＮＦ−α発現を示す図である。
【図４】
成熟ヒトＴＮＦ−α（ヌクレオチド６７−５４３）との合成ＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号７）とタンパク質配列（配列番号８）の両配列を示す。
【図５】
大腸菌（ＪＭ１０９株）におけるＯｍｐＡ／ＴＮＦ−α融合タンパク質の周辺細胞質局在化およびプロセシングを示す図である。
【図６】
成熟ヒトＴＲＡＩＬ（ヌクレオチド６７−８０１）とのＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号９）とタンパク質配列（配列番号１０）の両配列を示す。
【図７】
大腸菌（ＪＭ１０９株）におけるＯｍｐＡ ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の発現およびプロセシングを示す図である。
【図８】
成熟（Ｃ１２５Ａ）ヒトＩＬ−２（ヌクレオチド６４−４６２）との修飾ＯｍｐＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号１１）とタンパク質配列（配列番号１２）の両配列を示す。
【図９】
ｐｈｏＡ（８Ｌ）またはｏｍｐＡ （８Ｌ）合成シグナルペプチドに融合した成熟ヒトＩＬ−２の発現およびプロセシングを示す図である。
【図１０】
成熟（Ｃ１２５Ａ）ヒトＩＬ−２（ヌクレオチド６４−４６２）との修飾ｐｈｏＡシグナル配列（ヌクレオチド１−６３）融合物のコード配列を示す図である。融合構築物についてのＤＮＡ配列（配列番号１３）とタンパク質配列（配列番号１４）の両配列を示す。
【図１１】
ヒトＴＮＦ−αの成熟形態を発現するネズミチフス菌弱毒化株のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効力を示す図である。
【図１２】
ＢＲＰ発現がｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効力に及ぼす影響を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）ＶＮＰ２０００９；および（３）ＢＲＰ遺伝子を含むｐＳＷ１プラスミドを保有するＶＮＰ２０００９で治療した、Ｂ１６黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示したグラフである。
【図１３】
サルモネラにおける、ｐｅｐＴプロモーターの制御下でのβ−ｇａｌ遺伝子発現の嫌気性菌誘導を示す図である。図１３Ａは、２株のサルモネラ、ＹＳ１４５６およびＶＮＰ２０００９の嫌気性条件に応答するβ−ｇａｌ発現のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を示す図である。図１３Ｂは、ＢＲＰ、β−ｇａｌ、もしくはＢＲＰとβ−ｇａｌを発現するＶＮＰ２０００９サルモネラの、腫瘍対肝細胞におけるβ−ｇａｌのｉｎ ｖｉｖｏ誘導を示す図である。
【図１４】
サルモネラにおける、Ｔｅｔプロモーターの制御下でのβ−ｇａｌ遺伝子発現のテトラサイクリン誘導を示す図である。用量応答は、約０．１５μｇ／ｍｌの濃度までテトラサイクリンに対し線形応答を示すが、これを超えると、応答の低下がみられ、これは恐らく、テトラサイクリンの抗生物質作用によるものと考えられる。
【図１５】
ｐＴｒｃ９９ａベクターからのヘキサヒスチジン−エンドスタチン（ヘキサＨＩＳ−エンドスタチン）発現を示す図である。図１５Ａは、サルモネラ（ＶＮＰ２０００９）に形質転換させた３つの独立したクローンからのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。図１５Ｂは、大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換させた５つの独立したクローンからのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。偶数番号のレーンは、非誘導培養物からの抽出物を、また、奇数番号のレーンは、対応するＩＰＴＧ誘導培養物からの抽出物をそれぞれ示す。
【図１６】
プラスミドＹＡ３３３４からのヘキサＨＩＳ−エンドスタチンの発現を示す図である。ａｓｄ系（ｔｒｃプロモーターを用いる）におけるヘキサＨＩＳ−エンドスタチンは、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタン分析によりヘキサＨＩＳ−エンドスタチン（〜２５ｋＤ）の適正サイズのバンドを発現することができる。
【図１７】
Ｃ３８マウス大腸癌に対するエンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９細胞の効力を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）空のＹＡ３３３４ベクターを保有するａｓｄ−ＶＮＰ２０００９；（３）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンを発現するａｓｄ−ＶＮＰ２０００９；および（４）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンとＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９でそれぞれ治療した、確立されたＣ３８腫瘍を有するマウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示すグラフである。
【図１８】
ＤＬＤ１ヒト大腸癌に対するエンドスタチンを発現するＶＮＰ２０００９細胞の効力を示す図である。同図は、（１）ＰＢＳ対照；（２）空のＹＡ３３３４ベクターを保有するａｓｄ−ＶＮＰ２０００９；および（３）ヘキサヒスチジン−エンドスタチンとＢＲＰを発現するＶＮＰ２０００９でそれぞれ治療した、確立されたＤＬＤ１腫瘍を有するヌードマウス集団の時間経過に対する平均腫瘍サイズを示すグラフである。
【図１９】
内皮細胞に対するヒトエンドスタチンを発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラからの溶解物の抗増殖活性を示す図である。同図は、ｂＦＧＦおよび８ ｘ １０８細菌に相当する溶解物に応答するヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害を示す。対照として、空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラを使用した。各データの点数は、４回反復して行なった代表的実験からの平均値である。サンプルを細菌数で基準化した。
【図２０】
内皮細胞に対する血小板第４因子ペプチド（血小板第４因子のアミノ酸４７−７０）およびトロンボスポンジンペプチド（１３．４０）を発現する弱毒化腫瘍標的サルモネラからの溶解物の抗増殖活性を示す図である。同図は、ｂＦＧＦおよび８ ｘ １０８細菌に相当する溶解物に応答するヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖の阻害を示す。対照として、空のｐＴｒｃベクターを含むサルモネラを使用した。各データの点数は、４回反復して行なった代表的実験からの平均値である。サンプルを細菌数で基準化した。
【図２１】
ｐＥ３．シャトル−１ベクターの構築を示す図である。
【図２２】
ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２９２７０）の構築を示す図である。ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクターのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。ＣｏｌＥ３−ＣＡ３８ベクターは、配列番号２〜５にそれぞれ示すように、５つのオープンリーディングフレームを含む。
【図２３】
Ｃｏｌ Ｅ３−ＣＡ３８／ＢＲＰ−１ベクターの構築を示す図である。
【図２４】
各株によって産生されたコリシンＥ３の致死単位の量を示す棒グラフである。
【図２５】
紫外線またはＸ線に暴露された各種菌株についてのハロー（ｈａｌｏ）アッセイを示す図である。
【図２６】
Ｃ３８マウス大腸癌に対する４１．２．９／Ｃｏｌ Ｅ３の効力を示す図である。
【図２７】
ＮＵ／ＮｕマウスにおけるＤＬＤ１ヒト大腸癌に対する４１．２．９／Ｃｏｌ／Ｅ３の抗腫瘍活性を示す図である。
【図２８】
Ｂ１６マウス黒色腫に対する４１．２．９／Ｃｏｌ Ｅ３の効力を示す図である。
【図２９】
クローン化大腸菌ＣＮＦ１を発現するサルモネラの細胞毒性を示す図である。
【図３０】
ＣＮＦに暴露されたＨｅＬａ細胞（Ａ）は、正常なＨｅＬａ細胞（Ｂ）と比べて、腫脹および多核形成を示す。
【図３１】
３’から５’方向（図３２のマップからわかるように）のｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢベクターのｍｓｂＢ部分を示す図であり、該部分は、ｍｓｂＢの中央に欠失を有し、かつその箇所に内部Ｎｏｔ１、ＰａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＳｆｉＩ、ＳｗａＩおよびＤｒａＩポリリンカーを含む（配列番号６１）。図３２参照。
【図３２】
ＤｍｓｂＢ領域にＤＮＡをクローン化し、続いて染色体に挿入するためのｐＣＶＤ４４２−ｍｓｂＢベクターの制限マップおよび概略図である。ＭｓｂＢｄｅｌは、ＤｍｓｂＢの５’および３’領域であり；ｍｏｂ ＲＰ４は、プラスミドを１つの株から別の株に転移させるための可動化エレメントである。ｂｌａは、カルベニシリンおよびアンピシリン等のｂ−ラクタム抗生物質に対する感受性を賦与するβラクタマーゼである。ＳａｃＢは、スクロースに対する感受性を賦与する遺伝子である。
【図３３】
１）ｐＣＶＤ４４２−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢベクター、２）サルモネラＹＳ５０１０２におけるＤｍｓｂＢ染色体コピーによる相同的組換え、３）サルモネラＹＳ５０１０２への染色体組込みと、これに続く株ＶＮＰ２０００９へのファージ形質導入、４）株４１．２．９−Ｔｅｔ−ＢＲＰ−ＡＢをもたらすスクロース分離を示す図である。ＯｒｉＲ６Ｋはプラスミド複製起点であり；ｍｏｂ ＲＰ４は、プラスミドを１つの株から別の株に転移させるための可動化エレメントである。ａｍｐは、カルベニシリンおよびアンピシリン等のｂ−ラクタム抗生物質に対する感受性を賦与するβラクタマーゼである。ｓａｃＢは、スクロースに対する感受性を賦与する遺伝子である。定尺度で表示していないことに注意。
【図３４】
ＳＫＯＶ３細胞（平均数＝８）に７２時間暴露した後の、陽性および陰性対照（ＨＳＣ１０および４１．２．９）と比較したｔｅｔＢＲＰＡＢクローン＃２６およびクローン＃３１の細胞毒性％を示す図である。ベロ毒素の発現は、テトラサイクリンにより誘導した（クローン２６および３１を参照）。テトラサイクリン治療あり（＋）；およびテトラサイクリン治療なし（−）。大腸菌株ＨＳＣ１０は、細胞毒性％の陽性対照として使用した。
【図３５】
テトラサイクリンの不在下（１Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（１Ｂ）で、弱毒化腫瘍標的サルモネラの、血液寒天上でのハロー形成を示す。また、テトラサイクリンの不在下（２Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（２Ｂ）で、構成的にＳｈｅＡ．を発現するよう操作された弱毒化腫瘍標的サルモネラについてのハロー形成を示す。さらに、テトラサイクリンの不在下（３Ａ）およびテトラサイクリンの存在下（３Ｂ）で、テトラサイクリン誘導性ＳｈｅＡ．を発現するよう操作された弱毒化腫瘍標的サルモネラについてのハロー形成を示す。
【図３６】
（Ａ）ヘキサヒスタジンタグを含まないＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。（Ｂ）ヘキサヒスタジンタグを含むＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。（Ｃ）ＯｍｐＡ−８Ｌシグナル配列を含むＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質を示す。
【図３７】
ＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質のコード配列を示す図である。ＤＮＡ（配列番号５７）およびタンパク質（配列番号５８）の両配列を示す。
【図３８】
ヘキサヒスチジン−ＴＡＴ−アポプチン融合タンパク質のコード配列を示す図である。ＤＮＡ（配列番号５９）およびタンパク質（配列番号６０）の両配列を示す。
【図３９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／サイトキサン組合せ治療の効力を示す図である。
【図４０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／マイトマイシン組合せ治療の効力を示す図である。
【図４１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭ２７肺癌増殖に対するＶＮＰ２０００９／シスプラチン組合せ治療の効力を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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