(57)【要約】本発明は、１つ以上のポリケチドシンターゼ（「ＰＫＳ））遺伝子由来のモジュールのサブセットにより生成される化合物に関する。このＰＫＳ遺伝子は、新規分子（特に、天然に存在するポリケチドまたはその誘導体）の化学合成において出発物質として使用される。この生物学的に誘導される中間体（「生物中間体」）は、一般的に、１つ以上の立体中心が原因で従来の化学的アプローチを用いて合成するのが特に困難な化合物を表す。本発明の１つの局面において、エポチロン合成における中間体が提供される。この中間体は、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙおよび共同研究者の合成プロトコルに供給される。本発明の別の局面において、ディスコデルモリド合成における中間体が提供される。この中間体は、Ｓｍｉｔｈおよび共同研究者の合成プロトコルに供給される。
2004520008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在するポリケチドを生成するための方法であって、以下：
発現ベクターを含む宿主細胞を発酵する工程であって、該ベクターは、ポリケチドシンターゼをコードする組換え遺伝子を含み、該シンターゼは、少なくとも２つの異なる天然に存在するポリケチドシンターゼ由来のモジュールを含み、ここで、該天然に存在するポリケチドシンターゼの少なくとも１つは該ポリケチドを天然では生成しない、工程；および
必要に応じて、発酵培地から該ポリケチドを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ポリケチドが、エポチロンアナログまたはディスコデルモリドアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の化合物を合成するのに有用な第１の化合物を生成するための方法であって、ここで、
該第２の化合物は、４つ以上のキラル中心を含み、
該第１の化合物は、２つ以上のキラル中心を含み、そして
該方法は、組換え宿主細胞中で、該第１の化合物を生成する、天然に存在しない組換えポリケチドシンターゼを発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記第１の化合物が少なくとも３つのキラル中心を含み、そして前記第２の化合物が少なくとも５つのキラル中心を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の化合物が、少なくとも１０のキラル中心を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記天然に存在しない組換えＰＫＳが、天然に存在するＰＫＳ遺伝子の一部であるか、または２つ以上の天然に存在するＰＫＳ遺伝子の一部から構成されるかのいずれかである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の化合物が、エポチロンアナログまたはディスコデルモリドアナログである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の化合物が、以下：
【化１】
2004520008.tif 000159
からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の化合物が、１４−クロロ−１４−デスメチル−６−デオキシエリスロノリドＢおよび１４−デスメチル−６−デオキシ−１４−（フェニルチオ）エリスロノリドＢからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の化合物が、１４−クロロ−１４−デスメチル−６−デオキシ−８−ヒドロキシデオキシエリスロノリドＢおよび１４−デスメチル−６−デオキシ−８−ヒドロキシ−１４（フェニルチオ）エリスロノリドＢからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
以下の式：
【化２】
2004520008.tif 000160
を有する化合物であって、ここで、
Ｒ０は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、アリール、２−フェニルエチル、２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル、または以下の式：
【化３】
2004520008.tif 000161
を有する基であり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；そしてＸはＯ、ＮＨ、またはＮ−アルキルであり；
Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ水素であるか、またはＲ４およびＲ５は一緒になって二重結合を形成し、かつＲ６およびＲ７は一緒になって二重結合を形成し；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２であり、
ただし、Ｒ３が水素またはＣ１−Ｃ６アルキルの場合、（ｉ）Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つが、ヒドロキシルではないか、または（ｉｉ）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が、それぞれ水素であるか、または（ｉｉｉ）Ｘが窒素であるか、または（ｉｖ）Ｙがヒドロキシル、アミノ、もしくは−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２あるか、あるいは（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである、化合物。
【請求項１２】
以下：
【化４】
2004520008.tif 000162
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ水素であるか、またはＲ４およびＲ５は一緒になって二重結合を形成し、かつＲ６およびＲ７は一緒になって二重結合を形成し；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である、化合物。
【請求項１３】
以下：
【化５】
2004520008.tif 000163
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ水素であるか、またはＲ４およびＲ５は一緒になって二重結合を形成し、かつＲ６およびＲ７は一緒になって二重結合を形成し；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２であり、ただし、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つがヒドロキシルではない、化合物。
【請求項１４】
以下：
【化６】
2004520008.tif 000164
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、またはアリールであり；そして
Ｘは、酸素または窒素である、化合物。
【請求項１５】
以下：
【化７】
2004520008.tif 000165
2004520008.tif 000166
からなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
以下：
【化８】
2004520008.tif 000167
からなる群より選択される、請求項１１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景）
真菌および菌糸体細菌（特に、放線菌）を含む多数の型の生物において天然に生成される場合、ポリケチドは、多数の生物学的に活性な分子の供給源である構造的に多様なクラスの化合物である。特に最近興味深いポリケチドの２つの例としては、エポチロン（特に、エポチロンＤ）およびディスコデルモリドが挙げられる。
【０００２】
【化９】
2004520008.tif 000003
チューブリン重合アッセイにおけるこれらの化合物の最初の研究により、これらは強力な抗癌剤として作用し得ることが示唆される。しかし、より広範囲にわたる現在進行中の臨床調査は、天然に存在する供給源から得られ得る少量のエポチロンおよびディスコデルモリドによって妨げられている。
【０００３】
いくつかの研究グループが、エポチロンおよびディスコデルモリドのデノボ化学合成に成功している。エポチリンの合成は、例えば、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ，ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅｒｅｔｏ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」米国特許第６，２０４，３８８号および同第６，２４２，４６９号（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）において記載される。ディスコデルモリドの合成は、例えば、Ｓｍｉｔｈら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ，ｄｉｅｎｙｌ  ｌａｃｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｍｉｃｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」米国特許第５，７８９，６０５号および同第６，０３１，１３３号；ならびにＳｍｉｔｈら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ，ｄｉｅｎｙｌ  ｌａｃｔｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」米国特許第６，０９６，９０４号および第６，２４２，６１６号（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）において記載される。報告された合成は、時間がかかり、複雑で、そして一般に、商業的な量のこれらの化合物を作製するのに受け入れられない。目的の多数の他のポリケチドが、不適切な供給によって妨げられており、そしてエポチロンおよびディスコデルモリドは、より適切な供給が利用可能である場合、治療用途および他の用途のために容易に開発され得るので、これらの重要な化合物を得るための新規なアプローチについての必要性が存在する。
【０００４】
（要約）
本発明は、モジュラーポリケチドシンターゼを作製するための方法、および規定された構造のポリケチドの生成のためのこれらをコードする遺伝子を提供する。このようなポリケチドは、より複雑なポリケチドの化学合成における中間体として有用であるか、またはこれらは、これら独自で有用であり得る。生物学的プロセスの固有の立体化学的特異性は、複雑なポリケチドの化学合成における使用のための光学活性中間体の高度に効率的な生成を生じる。複雑な立体化学的中心を有する中間体は、これらの生物学的ストラテジーを使用して光学的に純粋な形態でより容易に合成されるので、ポリケチドは、これらの方法によって、より簡単かつ経済的に化学的に合成され得る。
【０００５】
本発明の１つの局面において、特定のポリケチド化合物を作製するための遺伝子を設計するための方法が提供される。この方法は、以下：
２炭素単位の配列として化合物を規定する工程；
化合物の２炭素単位配列と天然に存在するＰＫＳ構造のデータベースとを比較する工程であって、ここで、各データベースＰＫＳ構造がまた、２炭素単位の配列として記載される、工程；
化合物の各２炭素単位について、一致する２炭素単位についてデータベースを検索する工程；
一致がデータベース中に見出される化合物の各２炭素単位について、一致したデータベースの２炭素単位に対応するＰＫＳ遺伝子フラグメントを関連付ける工程；および
この化合物を生成し得る新しい遺伝子を設計する工程であって、ここで、この遺伝子は、一致したデータベースの２炭素単位と関連したＰＫＳ遺伝子フラグメントを含む、工程、
を包含する。
【０００６】
本発明の第２の局面において、所望のポリケチドの形成を触媒する新規なポリケチドシンターゼをコードする遺伝子（ＰＫＳ）が提供される。これらの遺伝子は、天然のＰＫＳ遺伝子のフラグメントの収集を含み、各フラグメントは、ＰＫＳの少なくとも１つのモジュール、またはケトシンターゼ、アシルトランスフェラーゼ、およびモジュールのアシル−キャリアタンパク質ドメイン（これは、所望のポリケチドにおいて設計された２炭素単位の形成を触媒し得る）を含む。これらの遺伝子フラグメントは、所望のポリケチドを提供するように、得られたＰＫＳモジュールのドメイン成分を変更するために遺伝子操作され得る。好ましい実施形態において、ＰＫＳ遺伝子フラグメントは、末端のチオエステラーゼドメインについてのコード配列に関連し、そして発現ベクター下に配置される。
【０００７】
本発明の別の局面において、新規のＰＫＳをコードする遺伝子は、発酵の間に所望のポリケチドの生成を支持する宿主細胞に導入される。好ましい実施形態において、宿主細胞は、ポリケチドを天然に生成しないか、またはこれらのネイティブなＰＫＳ遺伝子が欠失しているかのいずれかである。特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅである。
【０００８】
本発明の別の局面において、上記の宿主から生成される新規のポリケチドが提供される。
【０００９】
別の局面において、本発明は、第２の化合物を合成する際に有用な第１の化合物を作製するための方法を提供し、ここで、この第２の化合物は、４つ以上のキラル中心を含み、そしてこの第１の化合物は、２つ以上のキラル中心を含み、この方法は、この第１の化合物を生成する、組換えの天然に存在しないポリケチドシンターゼを、組換え宿主細胞中で発現させる工程を包含する。好ましい実施形態において、第１の化合物は、少なくとも３つのキラル中心を含み、そして第２の化合物は、少なくとも５つのキラル中心を含む。特に好ましい実施形態において、第２の化合物は、少なくとも１０のキラル中心を含む。好ましい実施形態において、この第１および第２の化合物は、ポリケチドである。組換えの天然に存在しないＰＫＳは、天然に存在するＰＫＳ遺伝子の一部であるか、または２つ以上の天然に存在するＰＫＳ遺伝子の一部から構成されるかのいずれかであり得る。２つのＰＫＳ遺伝子の一部は各々、２つ以上の伸長モジュールを含み得る。好ましい実施形態において、第２の化合物は、天然に存在するポリケチドであり、そして天然に存在しない組換えＰＫＳは、第２の化合物を生成しない１つ以上のＰＫＳから誘導される。
【００１０】
本発明の別の局面において、エポチロンおよびエポチロンアナログの合成のための生物学的および化学的方法の組み合わせが提供される。エポチロンの化学合成における出発物質として使用される中間化合物、およびこれを作製する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の局面において、ディスコデルモリドおよびディスコデルモリドアナログの合成のための生物学的および化学的方法の組み合わせが提供される。ディスコデルモリドの化学合成における出発物質として使用される中間化合物、およびこれを作製する方法が提供される。
【００１２】
（定義）
本発明を記載するために使用される種々の用語の定義が以下に列挙される。これらの定義は、特定の場合に他にいわない限り、個々にかまたはより大きい群の一部として、これらが本明細書中で使用される用語に適用する。
【００１３】
用語「ポリケチド」は、マロニルチオエステル伸長単位の出発アシルチオエステルへの遷移の脱炭酸縮合によって誘導され得る化合物をいう。このマロニルチオエステルは、例えば、メチルマロニル、エチルマロニル、メトキシマロニル、ヒドロキシマロニルなどによって必要に応じて置換され得る。出発アシルチオエステルの例としては、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ｓｅｃ−バレリルなどのようなアルカノエート；シクロヘキサノイルのようなシクロアルカノエート；アクリロイルおよびクロトノイルのようなアルケノエート；シクロへキセノイルのようなシクロアルケノエート；およびベンゾイル、チアゾールイルなどのようなアリールなどが挙げられるが、これらに限定されない。縮合後、伸長単位は、酸化還元化学、メチル化、および他の転換によってさらに改変され得る。ポリケチドは、天然の起源であるか、または天然に存在するポリケチドシンターゼによって生成されるかのいずれかであり得るか、あるいはインビボもしくはインビトロのいずれかで遺伝子操作されたポリケチドシンターゼの産物であり得るか、あるいは化学合成によって生成され得る。化学合成によって生成される場合、マロニルチオエステル伸長単位の出発アシルチオエステルへの遷移の脱炭酸縮合以外の方法が、ポリケチドの生成のために使用され得る。
【００１４】
用語「ポリケチドシンターゼ」（「ＰＫＳ」）は、ポリケチドの生合成を触媒する酵素をいう。用語「モジュラーＰＫＳ」は、ＰＫＳのクラスをいい、ここで、複雑なポリケチドの生合成における各工程は、酵素の別々のドメインによって触媒され、そしてこのドメインは、ポリペプチド鎖に沿って推定可能な順序で整列される。天然に存在するポリケチドシンターゼの例としては、エリスロマイシン（ｅｒｙ）、メガロマイシン（ｍｅｇ）、ピクロマイシン（ｐｉｋ）、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）（ｎａｒ）、オレアンドマイシン（ｏｌｅ）、ランカマイシン（ｌｋｍ）、ＦＫ５０６（５０６）、ＦＫ５２０（ａｓｃ）、ラパマイシン（ｒａｐ）、エポチロン（ｅｐｏ）、タイロシン（ｔｙｌ）、スピラマイシン（ｓｐｍ）、ローザマイシン（ｒｏｓａｍｉｃｉｎ）（ｒｓｍ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）（ｇｄｍ）、ピマリシン（ｐｉｍ）、ＦＲ００８（ｆｒ８）、カンジシジン（ｃａｎ）、アベルメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）（ａｖｒ）、タートラロン（ｔａｒｔｒａｌｏｎｅ）（ｔａｒ）、ボロフィシン（ｂｒｏｐｈｙｃｉｎ）（ｂｏｒ）、アプラスモマイシン（ａｐｌａｓｍｏｍｙｃｉｎ）（ａｐｌ）、ボロマイシン（ｂｏｒｏｍｙｃｉｎ）（ｂｒｍ）、ディスコデルモリド（ｄｓｃ）などの生合成に関与する天然に存在するポリケチドシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
用語「組換え」は、遺伝子操作された遺伝子、タンパク質、または生物をいう。組換え遺伝子の例は、その本来の供給源からクローン化され、そしてそのコード配列を変更するように必要に応じて改変されたＤＮＡ配列である。組換えタンパク質の例は、組換え遺伝子から発現されたタンパク質である。組換え生物の例は、組換え遺伝子を含む生物である。
【００１６】
用語「モジュール」は、単一の伸長単位のポリケチドへの付加およびプロセシングのために必要なドメインを含むＰＫＳポリペプチドの連続するセグメントをいう。ＰＫＳモジュールは、ケトシンターゼ、アシルトランスフェラーゼ、およびアシル−キャリアタンパク質ドメインを含む、３つのドメインのコアを含む。モジュールはまた、付加された伸長単位をプロセシングする際に関与するさらなるドメインを含み得る。最も一般的なモジュール型およびこれらのポリケチド構造結果の列挙を、図８に示す。
【００１７】
用語「ドメイン」は、ポリケチドの生合成における単一工程を触媒するＰＫＳの一部をいう。ドメインの例としては、ケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシル−キャリアタンパク質（ＡＣＰ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドロゲナーゼ（ＤＨ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）、Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）、およびチオエステラーゼ（ＴＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。モジュール内のドメインの一般的な順序は、ＫＳ−ＡＴ−［改変ドメイン］−ＡＣＰである。改変ドメインは、単一で（例えば、ＫＲまたはＭＴのような）、対で（ＤＨ−ＫＲにおけるように）、またはＤＨ−ＥＲ−ＫＲにおけるようにトリプレットで生じる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）」「ディスコデルモリド化合物」および「ディスコデルモリドアナログ」は、式：
【００１９】
【化１０】
2004520008.tif 000004
の化合物をいい、ここで、Ｒ０、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｘ、およびＹは、本明細書中に記載され、そしてＢｏｌｌａｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：２３２５−２３３３（１９９５）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されるアッセイの１つまたは匹敵するアッセイにおける微小管安定化活性を保有する、これから誘導されるアナログを含む。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「エポチロン」、「エポチロン化合物」および「エポチロンアナログ」は、式：
【００２１】
【化１１】
2004520008.tif 000005
の化合物をいい、ここで、
Ｒ１０は、以下に定義される１つ以上の基によって必要に応じて置換される、アルケニルまたはアリールであり：
Ｒ１１は、Ｈであり；
Ｒ１２は、Ｈであり；
またはＲ１１およびＲ１２は、一緒に結合を形成し；
またはＲ１１およびＲ１２は、一緒に−Ｏ−を形成し；
Ｒ１３は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはフルオロアルキルであり；
Ｒ１４は、Ｈであり；
Ｒ１５は、Ｈであり；
またはＲ１４およびＲ１５は、一緒に結合を形成し；
またはＲ１５およびＲ１５は、一緒に−Ｏ−を形成し；
そしてＢｏｌｌａｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：２３２５−２３３３（１９９５）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されるアッセイの１つまたは匹敵するアッセイにおける微小管安定化活性を保有する、これから誘導されるアナログを含む。
【００２２】
好ましい実施形態において、Ｒ１０は、１−（２−メチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−ヒドロキシメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−フルオロメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−アミノメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、６−キノールイル、および２−メチルベンゾチアゾール−５−イルからなるセットから選択され；Ｒ１１およびＲ１２は、一緒に結合を形成し；Ｒ１３は、メチル、ヒドロキシメチル、ジオキソラン−２−イルメチル、およびフルオロメチルであり；Ｒ１４は、Ｈであり；Ｒ１５は、Ｈであり；またはＲ１４およびＲ１５は、一緒に結合を形成する。
【００２３】
用語「アルキル」は、以下に定義されるように必要に応じて置換された、直鎖、分枝、または環状の炭化水素をいう。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど（これらの置換された形態を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「アルケニル」は、以下に定義されるように必要に応じて置換された、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、直鎖、分枝、または環状の炭化水素基をいう。アルケニル基の例としては、ビニル、アリル、シクロヘキセニルなど（これらの置換された形態を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「アルキニル」は、以下に定義されるように必要に応じて置換された、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、直鎖、分枝、または環状の炭化水素基をいう。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）など（これらの置換された形態を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「アリール」は、以下に定義されるように必要に応じて置換された、Ｎ、ＯおよびＳのような１つ以上のヘテロ原子を有するへテロアリールを含む芳香族部分をいう。アリール基の例としては、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾールイル、トリアゾールイル、テトラゾールイル、フリル（ｆｕｒｙｌ）、イソキサゾールイル、オキサゾールイル、イミダゾールイル、チアゾールイル、チエニル、インドールイル、インダゾールイル、キノールイル、イソキノールイル、キノキサルイル、フタロイル、フタリミドイル、ベンズイミダゾールイル、べノチアゾールイル、ベンゾフリルなど（これらの置換された形態を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「アルキル」、「アルケニル」、「アリール」および他の部分は、必要に応じて１つ以上の置換基で置換され得る。置換基の例示的な例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシ；ヒドロキシ；アルコキシ；シクロアルコキシ；ヘテロシクロオキシ；オキソ；アルカノイル（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）；アリールオキシ；アルカノイルオキシ；アミノ；アルキルアミノ；アリールアミノ；アラルキルアミノ；シクロアルキルアミノ；ヘテロシクロアミノ；２つのアミノ酸置換基がアルキル、アリールまたはアラルキルより選択される二置換アミン；アルカノイルアミン；アロイルアミノ；アラルカノイルアミノ；置換アルカノイルアミノ；置換アリールアミノ；置換アラルカノイルアミノ；チオール；アルキルチオ；アリールチオ；アラルキルチオ；シクロアルキルチオ；ヘテロシクロチオ；アルキルチオノ；アリールチオノ；アラルキルチオノ；アルキルスルホニル；アリールスルホニル；アラルキルスルホニル；スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）；置換スルホンアミド；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２）；置換カルバミル（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ’、ここで、ＲおよびＲ’は、各々独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキルなどである）；アルコキシカルボニル、アリール、置換アリール、グアニジノ、ならびにインドイル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾールイル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルのようなヘテロシクロなどが挙げられるが、これらに限定されない。適用可能な場合、置換基は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリール、またはアラルキルなどでさらに置換され得る。置換アルキルの特に好ましい例としては、フルオロメチルおよびフルオロエチルが挙げられる。置換アリールの特に好ましい例としては、２−メチル−４チアゾールイル、２−（ヒドロキシメチル）−４−チアゾールイル、２−（フルオロメチル）−４−チアゾールイル、および２−（アミノメチル）−４−チアゾールイルが挙げられる。
【００２８】
用語「ヒドロキシ保護基」は、当該分野で公知のこのような目的のための基をいう。一般に使用されるヒドロキシ保護基は、例えば、Ｔ．Ｈ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、本明細書中に参考として援用される）において開示される。例示的なヒドロキシル保護基としては、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）；ベンジル；４−メトキシベンジル（ＰＭＢ）；メチルチオメチル；エチチオメチル；ピバロイル（ｐｉｖａｌｏｙｌ）；フェニルスルホニル；トリフェニルメチル；トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリブチルシリル、トリ−イソプリルシリル（ＴＩＰＳ）、ｔ−ブチルメチルシリル（ＴＢＳ）、トリ−ｔ−ブチルシリル、メチルジフェニルシリル、エチルジフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなどのような三置換シリル；アセチル（Ａｃ）、ピバロイルベンゾイル（Ｐｉｖ）、４−メトキシベンゾイル、４−ニトロベンゾイルおよび脂肪族アシルアリールのようなアシルおよびアロイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載された化合物の全てのヒドロキシル基は、ヒドロキシル保護基で必要に応じて保護され得る。
【００２９】
上記の基における明らかな置換基に加えて、本発明の化合物は、適用可能である場合、他の置換基を含む。たとえば、ディスコデルモリド骨格（例えば、Ｃ−１〜Ｃ−２４）または骨格置換基は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、フェニルのような１つ以上の置換基、または官能基で、さらに置換され得る（例えば、水素の１つを置換することによって、または非水素基を誘導体化することによって）。適切な官能基の例示的な例としては、アルコール、スルホン酸、ホスフィン、ホスホネート、ホスホン酸、チオール、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、アミン、第４級アンモニウム、イミン、アミド、イミド（ｉｍｉｄｅ）、イミド（ｉｍｉｄｏ）、ニトロ、カルボン酸、ジスルフィド、炭酸塩、イソシアネート、カルボジイミド、カルボアロキシ、カルバメート、アセタール、ケタール、ボロン酸（ｂｏｒｏｎａｔｅ）、シアノヒドリン、ヒドロゾン、オキシム、ヒドラジド、エナミン、スルホン、スルフィド、スルフェニル、およびハロゲンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
（本発明のエポチロン化合物）
本発明の１つの局面において、以下の式：
【００３１】
【化１２】
2004520008.tif 000006
のエポチロンアナログが提供され、ここで、
Ｒ１０は、アルケニルまたはアリールであり；
Ｒ１１は、Ｈであり；
Ｒ１２は、Ｈであり；
またはＲ１１およびＲ１２は、一緒に結合を形成し；
またはＲ１１およびＲ１２は、一緒に−Ｏ−を形成し；
Ｒ１３は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはフルオロアルキルであり；
Ｒ１４は、Ｈであり；
Ｒ１５は、Ｈであり；
またはＲ１４およびＲ１５は、一緒に結合を形成し；
またはＲ１４およびＲ１５は、一緒に−Ｏ−を形成する。
【００３２】
好ましい実施形態において、Ｒ１０は、１−（２−メチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−ヒドロキシメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−フルオロメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、１−（２−アミノメチルチアゾール−４イル）−プロペン−２−イル、６−キノールイル、および２−メチルベンゾチアゾール−５−イルからなるセットから選択され；Ｒ１１およびＲ１２は、一緒に結合を形成し；Ｒ１３は、メチル、ヒドロキシメチル、ジオキソラン−２−イルメチル、およびフルオロメチルであり；Ｒ１４は、Ｈであり；Ｒ１５は、Ｈであり；またはＲ１４およびＲ１５は、一緒に結合を形成する。
【００３３】
特に好ましい実施形態において、エポチロンアナログは、以下の群：
【００３４】
【化１３】
2004520008.tif 000007
より選択される。
【００３５】
本発明の別の局面において、上記のエポチロンアナログの合成を生じる中間体が提供される。好ましい実施形態において、これらの中間体は、以下の群：
【００３６】
【化１４】
2004520008.tif 000008
から選択される。
【００３７】
（本発明のディスコデルモリド化合物）
本発明の１つの局面において、式：
【００３８】
【化１５】
2004520008.tif 000009
の新規のディスコデルモリド化合物が提供され、ここで、
Ｒ０は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、アリール、２−フェニルエチル、２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル、または式：
【００３９】
【化１６】
2004520008.tif 000010
の基であり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；そしてＸは、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−アルキルであり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、各々、水素であり、またはＲ４およびＲ５は、一緒に二重結合を形成し、そしてＲ６およびＲ７は、一緒に二重結合を形成し；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２であり、
だたし、Ｒ３が、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである場合、（ｉ）Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ヒドロキシルではない、または（ｉｉ）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は各々、水素である、または（ｉｉｉ）Ｘは窒素である、または（ｉｖ）Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、もしくは−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である、または（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組み合わせである。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、式：
【００４１】
【化１７】
2004520008.tif 000011
の化合物が提供され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は各々、水素であり、またはＲ４およびＲ５は、一緒に二重結合を形成し、そしてＲ６およびＲ７は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ８は、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキルであり；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、式：
【００４３】
【化１８】
2004520008.tif 000012
の化合物が提供され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は各々、水素であり、またはＲ４およびＲ５は、一緒に二重結合を形成し、そしてＲ６およびＲ７は、一緒に二重結合を形成し；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２であり、
ただし、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、ヒドロキシルではない。
【００４４】
本発明のなお別の実施形態において、式：
【００４５】
【化１９】
2004520008.tif 000013
の化合物が提供され、ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素、ヒドロキシル、またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはアリールであり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−アルキルであり；そして
Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２または−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である。
【００４６】
本発明の特に好ましい実施形態としては、以下：
【００４７】
【化２０】
2004520008.tif 000014
2004520008.tif 000015
2004520008.tif 000016
を含むがこれらに限定されない。
【００４８】
本発明の別の局面において、上記ディスコデルモリドアナログの合成を生じる中間体が提供される。
【００４９】
１つの実施形態において、式：
【００５０】
【化２１】
2004520008.tif 000017
の中間体が提供され、ここで、Ｒ２０は、水素、アルキル、またはアリールであり；そしてＲ２１は、水素またはアリールである。
【００５１】
好ましい実施形態としては、以下：
【００５２】
【化２２】
2004520008.tif 000018
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
別の実施形態において、以下の式：
【００５４】
【化２３】
2004520008.tif 000019
の化合物が提供され、ここで、
Ｒ３１は、水素、アルキル、アルケニル、ハロゲン、またはフェニルチオであり；そして
Ｒ３２は、水素またはヒドロキシであり；
但し、Ｒ３１が水素またはアルキルである場合には、Ｒ３２は水素ではあり得ない。
【００５５】
好ましい実施形態は、以下を含むが、これらに限定されない：
【００５６】
【化２４】
2004520008.tif 000020
（本発明の遺伝子および酵素）
本発明の１つの局面において、新規なポリケチドシンターゼ遺伝子が、天然に存在するＰＫＳ遺伝子のフラグメントと、最後の伸長モジュールをコードする配列の末端に位置する末端チオエステラーゼドメインをコードするＤＮＡ配列を組み合わせ、そしてこれらを、機能的プロモーターの後の適切な発現ベクターにクローニングすることによって、構築される。放線菌類宿主細胞（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））に適切な発現ベクターの例としては、自律的に複製するベクターと宿主染色体に挿入される統合されるベクターとの両方が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのための複製するベクターの好ましい例としては、ＳＣＰ２＊レプリコン（例えば、ｐＲＭ１およびｐＲＭ５）に基づくものが挙げられる。統合されるベクターの好ましい例としては、ファージ結合部位における統合を可能にする配列を含むベクターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのための統合されるベクターの特に好ましい例は、φＣ３１ファージ配列を使用するものであり、ｐＳＥＴおよびｐＳＡＭが挙げられるが、これらに限定されない。適切な放線菌類ベクターの列挙は、Ｋｉｅｓｅｒら、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，２０００）に見出され、これは、本明細書中に参考として援用される。
【００５７】
適切な宿主における、構築されたＰＫＳ遺伝子の発現は、機能的ＰＫＳの産生を生じる。適切な放線菌類宿主細胞としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、およびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。放線菌類宿主細胞の好ましい例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属のメンバーである。特に好ましい放線菌類宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａである。適切な宿主細胞は、代表的に、そのネイティブのＰＫＳ遺伝子が欠失しているか、または他の様式で非機能的にされている（例えば、Ｋｈｏｓｌａら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ」米国特許第５，８３０，７５０号（本明細書中に参考として援用される）に記載される方法に従って変異誘発を介して）。非放線菌類宿主細胞の特に好ましい例としては、安定に調製されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ、およびＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓが挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主細胞およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ宿主細胞の調製および使用は、Ｓａｎｔｉら、「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ」ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３１０３５ならびにＰｆｅｉｆｅｒおよびＫｈｏｓｌａ、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２７３０６に記載されている（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓの、宿主細胞としての使用は、Ｊｕｌｉｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００５８】
１つの実施形態において、ｎ−モジュールＰＫＳ遺伝子は、天然のＰＫＳ由来のモジュールに対する連続的なコード配列を、末端ＴＥドメインに対するコード配列に融合させて、新たなＰＫＳ遺伝子を産生することによって、構築される。このような新規ＰＫＳ酵素およびこれらをコードする遺伝子は、本明細書中において、以下のように示される：
（供給源）［モジュール（１）］−［モジュール（２）］−・・・−［モジュール（ｎ−１）］−［モジュール（ｎ）］−ＴＥ。
【００５９】
一例として、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール５および６をＴＥドメインと共に含む２モジュールＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥ。
【００６０】
別の実施形態において、モジュールを含むＰＫＳは、モジュール、または異なる天然ＰＫＳ遺伝子から得られたモジュールの隣接するセットを融合させることによって、構築される。一例として、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）ＰＫＳのモジュール５およびモジュール６ならびにＴＥと融合したエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１からなる、３モジュールのＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（１）］−（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥ。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、モジュール内に含まれるドメインの補体を変更するように変異されたモジュールを含むＰＫＳが構築される。このようなＰＫＳは、同じ天然ＰＫＳ遺伝子または異なる天然ＰＫＳ遺伝子のいずれか由来のモジュールを使用して、構築される。変異誘発によって不活化されているが欠失してはいないドメインは、記号「０」によって示される。一例として、ナルボマイシンＰＫＳのモジュール５およびモジュール６ならびにＴＥと融合した、ＫＳドメインが変異誘発によって不活化されたエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１を含む３モジュールのＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（１）−ＫＳ０］−（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥ。
【００６２】
ドメインの欠失は、「Δ」によって示され、その結果、エリスロマイシンＰＫＳのモジュール１およびモジュール２を含み、モジュール２のＫＲドメインが欠失している、２モジュールのＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（１）］−［モジュール（２）−ΔＫＲ］−ＴＥ。
【００６３】
ドメインの置換は、「／」によって示される。従って、エリスロマイシンＰＫＳのモジュール１およびモジュール２を含み、モジュール２のＫＲドメインがラパマイシンＰＫＳのモジュール４由来のＫＲドメインで置換されている、２モジュールのＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（１）］−［モジュール（２）ＫＲ／ｒａｐＫＲ４］−ＴＥ。
【００６４】
ドメインの付加は、「＋」によって示され、その結果、エリスロマイシンＰＫＳのモジュール１およびモジュール２を含み、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）ＰＫＳ遺伝子のモジュール８由来のＭＴドメインが付加され、モジュールドメインの他の変更を伴わない、２モジュールのＰＫＳは、本明細書中において、以下のように示される：
（ｅｒｙ）［モジュール（１）］−［モジュール（２）＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥ。
【００６５】
ポリケチド構造の試験は、種々のＰＫＳにおいて同一の機能を有するモジュールの複数の出現を明らかにする。このことに起因して、いくつかのＰＫＳ遺伝子は、等価な機能のモジュールを提供し得、そして本発明によって交換可能に使用され得る。従って、モジュールについての特定の源が、説明の目的で本発明の記載において使用されるが、異なる源由来の等価な機能のモジュールが、本発明の方法に従って自由に交換され得ることが、意図される。
【００６６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ポリケチドは、真菌および菌糸体細菌を含む多くの生物によって作製される、天然に存在する化合物である。天然の生成物の多様なクラスのポリケチドは、ポリケチドシンターゼ（「ＰＫＳ」）酵素による一連のクライゼン型縮合を介して、２つの炭素ユニット構築ブロックから少なくとも部分的に合成されるので、このように分類される。２つの主要な型のＰＫＳ酵素は、モジュラーＰＫＳおよび反復（または「芳香族」）ＰＫＳである。モジュラーＰＫＳ酵素は、代表的に、各タンパク質が複数の活性部位を含み、これらの活性部位の各々が、炭素鎖のアセンブリおよび改変の間に１回のみ使用される、多タンパク質複合体である。反復ＰＫＳ酵素は、代表的に、各タンパク質が１つのみまたは多くとも２つの活性部位を含み、これらの活性部位の各々が、炭素鎖のアセンブリおよび改変の間に複数回使用される、多タンパク質複合体である。
【００６７】
モジュラーＰＫＳ酵素によって作製されるポリケチドは、種々の生物学的活性を有し、そしてエリスロマイシンおよびタクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）（ＦＫ−５０６としてもまた公知）のような重要な薬物を含む。モジュラーＰＫＳ酵素の基本の例は、デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（「ＤＥＢＳ」）であり、これは、６−デオキシエリスロノリドＢ（「６−ｄＥＢ」）（エリスロマイシン前駆体）を合成する。ＤＥＢＳをコードするこれらのｅｒｙＡ遺伝子の構築およびこれらの操作の方法は、米国特許第５，７１２，１４６号および同第５，８２４，５１３号、同第６，００４，７８７号、同第６，０６０，２３４号；および同第６，０６３，５６１号に記載されており、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００６８】
モジュラーＰＫＳ酵素は、ポリケチドの不連続の２個の炭素部分の構造を究極的に制御する、別個の単位（または、モジュール）に組織されるので、このように呼ばれる。ＰＫＳ酵素は、一般に、（ｉ）ローディングドメイン、（ｉｉ）多数の伸長モジュール、および（ｉｉｉ）放出ドメイン（これは、チオエステラーゼとも呼ばれる）を含む。この２個の炭素単位は、一般式（Ｒ−Ｃ（＝Ｏ））（これからポリケチドは合成される）から構成され、そして一般に、出発単位または伸長単位と呼ばれ、この２個の炭素単位が、ポリケチドの合成を開始し、合成の間に成長ポリケチド鎖を伸長（またはこれに付加）するかどうかに依存する。出発単位は、ローディングドメインに結合し、そしてポリケチド合成を開始し、そして（ｉｉ）伸長単位（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）は、伸長モジュールに結合し、そしてポリケチド鎖を伸長させる。出発単位および伸長単位は、代表的に、出発単位として、アクリルチオエステル、最も一般的にアセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡなど、および伸長単位としてマロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、メトキシマロニルＣｏＡ、ヒドロキシマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡなどである。
【００６９】
モジュラーＰＫＳの各モジュールは、ポリケチド合成に必要とされる３つのコアドメイン（適切な伸長単位を選択しそして結合することを担うアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、成長ポリケチド鎖を運ぶことを担うアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、および伸長単位を成長ポリケチド鎖に融合することを担うβ−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ））を含む。これらのコアドメインは、共に、２−炭素β−ケトチオエステルをポリケチド鎖の成長末端に付加する。
【００７０】
さらに、モジュールは、コアドメインによって産生されたβ−ケトンを改変することを担う一組の還元型サイクルドメインを含み得る。存在する場合、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインは、β−ケトンを規定された立体化学のアルコールに還元する。ＫＲとともに存在する場合、デヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインは、ＫＲによって産生されたアルコールを除去し、アルケンを形成する。ＤＨおよびＫＲとともに存在する場合、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインは、ＤＨによって産生されるアルケンを還元し、飽和アルカンを形成する。改変ドメインの他の型（例えば、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメイン）がまた、分子中に存在し得る。ＭＴドメインは、代表的にＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からのメチル基を、新しく付加された２個の炭素単位に付加させ、それに対して、Ｏ−メチルトランスフェラーゼドメイン（ＯＭＴ）は、β−ケトチオエステルのエノール形態の酸素原子にメチル基を付加し、メチルビニルエーテルを形成させるか、またはＫＲドメインの作用から生じるアルコールにメチル基を付加し、メチルエーテルを形成させる。ＭＴドメインまたはＯＭＴドメインを有する公知のモジュールの例を、図８に示す。
【００７１】
最適のマロニル特異的ＡＴドメインおよびメチルマロニル特異的ＡＴドメインならびに最適のＫＲ改変ドメイン、ＤＨ改変ドメインおよびＥＲ改変ドメインを使用可能な１４個の機能的なモジュールのリストを、図８に示す。他のモジュールが公知であり、例えば、エチルマロニル伸長単位およびメトキシマロニル伸長単位についてのＡＴ特異性もまた公知である。
【００７２】
モジュールが遺伝子内でコードされる場合に、モジュールの順番は、このモジュールが生合成において機能する順番に従うようである。モジュール内のドメインの順番は、ＰＫＳ間で保存されるが、このモジュールが生合成において機能する順番に従わないようである。このドメインの境界は、多くの公知の例のＰＫＳ遺伝子間に存在する、高い相同性に起因して容易に認識される。
【００７３】
図１は、ＤＥＢＳ酵素の略図であり、この酵素は、エリスロマイシンのポリケチドコアの生合成を担う。ＤＥＢＳは、プロトタイプのモジュラーＰＫＳであり、３種のタンパク質（ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３）のダイマーである。ＤＥＢＳをコードする遺伝子の機構およびそれらの操作方法は、米国特許５，７１２，１４６号、同第５，８２４，５１３号、同第６，００４，７８７号、同第６，０６０，２３４号、および同第６，０６３，５６１号（これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用されている）に記載されている。
【００７４】
図１に示されるように、ＤＥＢＳ１は、ローディングドメインならびに第１の伸長モジュールおよび第２の伸長モジュールを含む。ＤＥＢＳ２は、第３の伸長モジュールおよび第４の伸長モジュールを含む。ＤＥＢＳ３は、第５の伸長モジュールおよび第６の伸長モジュールならびに放出ドメインを含む。モジュラーＰＫＳは、一般的に、複数のポリペプチドのダイマーであるが、ポリペプチド間のモジュールの数の分類は、高度に可変性である。
【００７５】
ＤＥＢＳローディングドメインは、開始単位とアシルキャリアタンパク質（「ＳＣＰ」）とを結合させる特定のＡＴドメインからなる。６−ｄＥＢの合成は、以下のように進む。このローディングドメインＡＴは、プロピオニルＣｏＡを認識し、そしてこのアシル基（プロピオニル基）をセリン残基を介して結合する（Ｓｅｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ３）。このローディングドメインＡＴは、このアシル基をローディングドメインＡＣＰに移動させ、これにより、アシル基をシステイン残基を介して結合する（Ｃｙｓ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ３）。結論としては、６つの伸長モジュールの各々は、メチルマロニルＣｏＡを認識し、そして対応するアシル基をこのモジュールのＡＣＰに移動させる（Ｃｙｓ−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）。合成は、このローディングドメインＡＣＰがプロピオニル基を第１の伸長モジュラー分子のＫＳに移動させる場合に開始し、このモジュールは、第１の伸長モジュールＡＰＣのメチルマロニルチオエステルとの（ＣＯ２の同時の排出を伴う）縮合反応のための基を位置付ける。この縮合反応後に、この第１の伸長ＡＣＰは、ここで、β−ケトチオエステル
【００７６】
【数１】
2004520008.tif 000021
に結合し、ここで、このイタリックで表示した部分は、メチルマロニルＣｏＡからの２個の炭素単位を表し、そして太文字で表示した部分は、プロピオニルＣｏＡからの２個の炭素単位を表す。
【００７７】
モジュール１中のＫＲドメインの存在に起因して、β−ケトチオエステルのケト基は、アルコールに改変される。図１において、第１の伸長モジュールＡＣＰに結合された、この改変された前駆体を示す。合成が進行する場合、この前駆体は、第２の伸長モジュールＫＳに移動され、最近、伸長したアシル基は、第２の伸長分子ＡＣＰに結合したメチルマロニルチオエステルと縮合反応するために位置付けられる。この第２の伸長モジュールＡＣＰに結合したポリケチド鎖はまた、アルコールに還元される前のケト基を示す。この第３の伸長モジュールＫＲドメインは不活性であるので、第３の伸長モジュールＡＣＰに結合したポリケチド鎖は、改変されていないケト基を閉めす。この第４の伸長モジュールに結合したポリケチド鎖は、ＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインの存在に起因して、完全に飽和の２個の炭素単位を示す。第１の伸長モジュールＡＣＰおよび第２の伸長モジュールＡＣＰと同様に、第５の伸長モジュールおよび第６の伸長モジュールに結合したポリケチド鎖は、代表的なＫＲドメインの存在に起因してアルコール部分を示す。最後に、このポリケチド合成は、それがＴＥドメインによってＰＫＳ酵素から放出される場合に終了し、そして環状エステル（ラクトンまたはマクロラクトンとも呼ばれる）を形成する。
【００７８】
他のモジュラーＰＫＳ酵素は、類似の様式でポリケチドを合成する。天然に存在するポリケチドの構造のバリエーションは、出発単位の同一性の差異、伸長モジュールの数、各伸長モジュールによって認識される伸長ユニットの同一性の差異、および各伸長モジュール中にさらなる機能（例えば、ＫＲ、ＤＨ、ＥＲ、ＭＴ）の存在または非存在から生じる。同様の型のバリエーションを、組換え技術を使用して操作し、天然に存在するポリケチドおよび全体的に新規なポリケチドの誘導体を産生し得る。モジュラーＰＫＳ遺伝子を操作するための組換え方法は、例えば、米国特許第５，６７２，４９１号；同第５，７１２，１４６号；５，８３０，７５０号；および同第５，８４３，７１８号；ならびにＰＣＴ特許公開番号９８／４９３１５および９７／０２３５８（これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用されている）に記載されている。
【００７９】
本発明は、これらの技術をうまく利用し、宿主生物または天然に存在するＰＫＳ遺伝子に依存しない任意のポリケチドを作製するための一般的なプロセスを提供する。この方法は、一般に、以下の工程：
生物学的に作製されるポリケチド化合物またはポリケチド様化合物の構造をＰＫＳ構造のライブラリと比較する工程；
共通の要素を有する少なくとも１つのライブラリ構造を上記化合物の構造を用いて同定する工程；
ＰＫＳ遺伝子を各々の同定されたライブラリ構造と結合する工程；および
上記化合物を生成し得る新しい遺伝子を設計する工程、
を包含し、ここで、この新しい遺伝子は、同定されたライブラリ構造に対応する一つのＰＫＳ遺伝子の少なくとも一部を含む。コンピュータを使用するこのような方法を実行するための方法は、発明者Ｄａｎｉｅｌ  Ｖ．Ｓａｎｔｉらによって、２００１年５月２９日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＵＳ０１／１７３５２（表題：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ）（これは、本明細書中で参考として援用されている）において以前に記載された。
【００８０】
好ましい実施形態において、この方法は、さらに、以下の工程：
標的ポリケチド構造を２個の炭素単位に分割し、そして各々２個の炭素単位に対して標的ポリケチド構造を分割する工程；
対応する構造を提供する伸長モジュールを同定する工程を包含する。この方法は、以下の工程を包含する：
この標的化合物を２個の炭素単位の配列として記述する工程；
この標的化合物の２個の炭素単位配列を天然に存在するＰＫＳ構造のデータベースと比較する工程であって、ここで、各々のデータベースＰＫＳ構造はまた、２個の炭素単位の配列としても記述される、工程；
この標的化合物の各々の２個の炭素単位に対して、一致する２個の炭素単位についてデータベースを検索する工程；
一致がこのデータベースに見出された標的化合物の各々の２個の炭素単位について、一致したデータベースの２個の炭素単位に対応するＰＫＳ遺伝子フラグメントを結合する工程；ならびに
上記化合物を産生し得る新しい遺伝子を設計する工程であって、ここで、この遺伝子は、一致したデータベースの２個の炭素単位と結合したＰＫＳ遺伝子フラグメントを含む、工程。
【００８１】
理想的に、標的化合物の各々の２個の炭素単位は、天然に存在するポリケチドのライブラリまたはデータベースに一致する対応物を見出す。これが見出された場合、この同定されたＰＫＳ遺伝子フラグメントまたは伸長モジュールは、放出ドメインとともに遺伝子へと構築され、この遺伝子は、機能的なＰＫＳシステムとして発現される場合に、所望の産物を産生する。この伸長モジュールは、単一のＰＫＳ酵素または複数のＰＫＳ酵素由来であり得るが、単一のＰＳＫ酵素から得られる連続モジュールの数を最大にすることが一般に好ましい。この様式において、最小数のネイティブではないモジュールの境界を有する遺伝子を構築して、ＰＫＳ酵素構造への過度の崩壊を避ける。
【００８２】
簡潔に、この一般的な方法は、以下の構造：
【００８３】
【化２５】
2004520008.tif 000022
を有するポリケチドフラグメントについて例示する。このフラグメントは、２個の炭素単位（ｉおよびｉ＋１）を含む。このｉ番目の伸長モジュールは、２個の炭素単位に結合し、この骨格炭素を、αｉおよびβｉとして命名し、そして第２の伸長モジュールは、２個の炭素単位に結合し、この骨格炭素を、αｉ＋１およびβｉ＋１として命名する。
【００８４】
伸長モジュールｉおよびｉ＋１に必要とされる成分を、α炭素およびβ炭素から離れた基を試験することによって分析した。上記のように、α位にある炭素から離れた置換基の違いは、アシルチオエステルについての異なる伸長モジュールＡＴ特異性に起因する。α炭素から離れた置換基として一般に見出される２個の基は、メチルおよび水素であり、これらは、それぞれメチルマロニルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡについての伸長モジュールＡＴ特異性に起因する。同様に、他の基は、エチル、ヒドロキシ、およびメトキシを含み、これらは、一般に、それぞれメチルマロニルＣｏＡ、ヒドロキシマロニルＣｏＡ、およびメトキシマロニルＣｏＡに対する伸長モジュールＡＴの特異性に起因する。β炭素と機能的に結合する置換基の違いは、上記のような１以上の改変ドメインの存在または非存在に起因する。
【００８５】
上記のフラグメントにおいて、ｉ番目のモジュールは、メチルマロニルＣｏＡに特異的であるＡＴ（αｉから離れたメチル基に起因する）およびβｉ−１炭素から離れたアルコール部分の存在に起因するＫＲを必要とする。従って、ｉ番目の伸長モジュールは、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＫＲドメインおよびＡＣＰドメインを含む。ｉ＋１番目の伸長モジュールはまた、メチルマロニルＣｏＡに特異的であるＡＴ（αｉ＋１から離れたメチル基に起因する）も必要とする。βｉから離れたヒドロキシル基に起因して、ｉ＋１番目の伸長モジュールはまた、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＫＲドメイン、およびＡＣＰドメインを含む。βｉ＋１炭素から離れたケト基は、次の伸長モジュール（またはｉ＋２番目の伸長モジュール）が任意のさらなる機能的酵素を必要としないことを示す。言い換えれば、ｉ＋２番目のモジュールは、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、およびＡＣＰドメインのみを含む。ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、およびＡＣＰドメインからなるモジュールは、最小モジュールと呼ばれる。
【００８６】
多くの異なる戦略を使用して、上記のフラグメントを合成し得る遺伝子の部分を作製し得る。一つの実施形態において、公知のＰＫＳ遺伝子由来の伸長モジュールを使用し得る。例えば、上記のフラグメントの構造は、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子の伸長モジュール５および６によって合成されるエリスロマイシンの部分と同一である。例えば、図１を参照こと。結果として、伸長モジュール５および６をコードする遺伝子は、改変なしで使用され得る。
【００８７】
単一のＰＫＳの連続的モジュールへの特定のフラグメント構造の正確な一致は、このフラグメントを含む２個の炭素単位の数が小さい場合に、より可能性がある。このような正確な一致が見出されない場合、所望のフラグメントを作製するための遺伝子は、複数のＰＫＳ遺伝子から本発明の方法に従って構築され得る。例えば、所望のフラグメントが、６個の伸長モジュールを用いて構築するのに必要である場合、これは、第１のＰＫＳ由来の２個の伸長モジュールおよび第２のＰＫＳ由来の４個のモジュールを組み合わせることによって構築され得る。このモジュールをコードする遺伝子を操作して、２個の異なるＰＫＳ由来のモジュールが協働するのを可能とするが、個々のモジュールのＡＴ特異性または機能的な酵素ドメインの数は、通常、変更されない。可能な場合、一般に、単一のＰＫＳ遺伝子由来の保存的モジュールの最大数を使用することが好ましい。言い換えれば、最小数のネイティブではないモジュールの境界を有する遺伝子を構築して、生じるＰＫＳ酵素構造への過剰の崩壊を避け、遺伝子を構築するために実施されなければならないクローニング操作の数を最小にする。
【００８８】
モジュール機構が最終のポリケチド構造から推測され得るので、本発明の実施は、成分ＰＫＳ遺伝子自体が未だ同定されていない状況下でさえ受け入れ可能である。例えば、ＤＥＢＳ遺伝子が公知でない場合、所望のフラグメントが、ＤＥＢＳ  ＰＫＳ遺伝子の伸長モジュール５および６によってコードされる６−ｄＥＢの部分と同一であるという事実は、モジュラーＰＫＳ遺伝子の一般的な機構からなお決定され得る。ＤＥＢＳ遺伝子の部分が決定され、最も適切であると決定される場合、プローブは、ＤＥＢＳ遺伝子を見出し、そして配列決定するために、公知のＰＫＳ遺伝子の保存された領域から構築され得る。一般に、インタクトなＰＫＳ遺伝子は、容易に回収可能である、なぜならば、ＰＫＳのコア成分（ローディングドメイン、伸長モジュール、および放出ドメイン）をコードする遺伝子ならびに適合する酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）についての遺伝子は、一般に、近接している。一旦、所望のＰＫＳ遺伝子が得られると、この機構により、本明細書中に記載されるように使用されるそのモジュールについてのコード配列が決定され得る。
【００８９】
別の実施形態において、必要とされる伸長モジュールは、特定のＰＫＳの１以上のモジュールを改善することによって操作される。改変の例示的な例は、モジュールのＡＴ特異性を変化している。別の改変は、１以上の機能的なドメインを追加または削除のいずれかをすることによって、機能的なドメインの数を変化している。後者のバリエーションにおいて、存在する機能的なドメインの機能は、不活性化され得る。これらの場合の各々において、この方法は、以下の工程を包含する：
化合物を２個の炭素単位の配列として記述する工程；
この化合物の２個の炭素単位を天然に存在するＰＫＳ構造のデータベースと比較する工程であって、ここで、各々のデータベースＰＫＳ構造はまた、２個の炭素単位の配列としても記述される、工程；
最も多くの数の一致する連続的な２個の炭素単位を有し、そして少なくとも１個の一致しない２個の炭素単位を有する、データベースＰＫＳ構造を同定する工程；
このデータベースＰＫＳ構造を作製することを担うＰＫＳ遺伝子を同定する工程；ならびに
少なくとも１つの一致しない２個の炭素単位を作製することを担う部分において、ＰＫＳ遺伝子に対する１以上の変更を決定して、一致する２個の炭素単位を作製する工程。
【００９０】
この実施形態の一つの例示はまた、単純化された例から役立つ。プロトタイプのＰＫＳ遺伝子を使用して、ＤＥＢＳ  ＰＫＳの伸長モジュール５および６を以下のフラグメント構造：
【００９１】
【化２６】
2004520008.tif 000023
に対応するように改変する。このフラグメントは、βｉ−１炭素からのヒドロキシル基の代わりにケト基が存在する上記の例において使用したフラグメントとは異なる。結果として、このフラグメントに対応する遺伝子としては、以下の配列が挙げられる：ＫＳｉ、ＡＴｉ、ＡＣＰｉ、ＫＳｉ＋１、ＡＴｉ＋１、ＫＲｉ＋１およびＡＣＰｉ＋１（ここで、ＡＴｉおよびＡＴｉ＋１の両方は、メチルマロニルＣｏＡに対する特異性を有する）。エリスロマイシンＰＫＳの伸長モジュール５および
６に対するドメインの配列としては、ＫＳ５、ＡＴ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５、ＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６がある。結果として、エリスロマイシンＰＫＳモジュール５および６に対応するドメインの配列は、ＫＲ５の官能基が不活性化される場合、改変される必要がある。不活性化は、ＫＳ５の配列を変異させて、ＫＳ５がもはや機能しなくなるようにすることにより、またはこのドメインを全て一緒に欠失することによって生じる。上記の例は、単純化されているが、存在するモジュールが複数の方法で改変され得ることを例示することは、プラットホームとして役立つ。第１に、このＡＴを、異なる特異性を有する別のＡＴで置換（マロニルＣｏＡ特異的ＡＴをメチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴに置換）し得えるか、または存在するＡＴを、異なる特異性を有するように変異させ得る。第２に、存在する機能的なドメインは、上記の例におけるＫＲ５のように不活性化され得る。あるいは機能的なドメインが、加えられ得る。例えば、ＫＲは、ＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰを含む最小のモジュールに加えられ得る。同様に、ＤＨまたはＤＨおよびＥＲは、ＫＳ、ＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含むドメインに加えられ得る。
【００９２】
この例の単純化に起因して、新規な遺伝子を、単一のＰＫＳ遺伝子から誘導される化合物を使用して設計した。より複雑な化合物について、新規なＰＫＳ遺伝子は、少なくとも２つのＰＫＳ遺伝子から産生されるキメラ遺伝子であるようであり、この遺伝子の各々は、天然に存在するＰＫＳ化合物をコードする。多くのこのようなＰＫＳ遺伝子は、公知であり、そしてこの目的に適しており、この遺伝子としては、以下の生合成に関連するＰＫＳが挙げられるが、これらに限定されない：エリスロマイシン、メガロマイシン、ピクロマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ランカマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０（アスコマイシン）、ラパマイシン、エポチロン、チロシン、スピラマイシン、ロサミシン、ゲルダナマイシン、ピマリシン、ＦＲ００８、カンディシジン、アベルメクチンなど。さらに、新しいＰＫＳ遺伝子を同定およびクローニングするための方法は、例えば、Ｓａｎｔｉらの２００１年７月２６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ０１／５３５３３、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＰＫＳ  Ｇｅｎｅｓ」（本明細書中で参考として援用される）のように公知であり、そして本発明の方法に従って使用されるべきＰＫＳ遺伝子のフラグメントを得るために使用され得る。
【００９３】
本発明の方法に従って、上記の方法は、任意のポリケチドを合成するために任意の回数で反復され得る。このポリケチドは、最終の化合物であり得るか、またはさらなる化学的改変のための出発物質として使用され得る。本発明は、新規のポリケチドを作製するために使用され得るが、新規なＰＫＳ遺伝子を使用して公知のポリケチドを作製するようにもまた、使用され得る。例えば、エポチロンは、このエポチロン遺伝子が公知であるという事実にもかかわらず、キメラ遺伝子から作製され得る。しかし、エポチロンは、このような低収率で天然において産生されるので、キメラ遺伝子（特に、高度に発現するＰＫＳ遺伝子を含む遺伝子）に関する戦略はまた、キメラエポチロン産生遺伝子の高度な発現を生じ得る。
【００９４】
（エポチロン）
全長ポリケチドを作製するバリエーションは、化学合成において立体配置的に純粋な試薬として使用され得るポリケチドフラグメントを作製することである。合成有機化学に典型的な非酵素反応とは異なり、酵素反応は、代表的には、本質的に絶対立体配置を示す。従って、ＤＥＢＳにより実施される反応の複雑な順序（約２７工程）は、見かけの絶対立体配置で進む。なぜなら、生成物の６−デオキシエリスロノリドＢの立体異性体は、酵素反応から同定されていないからである。
【００９５】
本発明のこの局面の一実施形態において、新規の化合物および方法は、エポチロン中間体と共に本明細書中で記載されるように、上記の化合物を作製するために使用される。本発明の他の局面において、新規の化合物および方法は、エポチロンに関して本明細書中に例示されるように、上記の合成プロトコルにおいて使用するための新規の中間体を作製するために使用される。本発明のさらに他の局面において、新規の化合物および方法は、エポチロンに関して本明細書中で例示されるように、新規の合成方法を使用して化合物を作製するために使用される。上記のように、エポチロンの臨床的評価における障壁は、天然の供給源から得られ得る量が制限されることである。いくつかのグループが、エポチロンＡ〜Ｄを作製するためのデノボ合成プロトコルを開発したが、これらの合成は複雑であり、扱いにくく、そして一般に、多量の物質を作製するのに適していない。これらのプロトコルに伴う一般的な問題は、代表的には化合物の立体中心の数および複雑性に起因して、特定の前駆体化合物の合成が困難であるということである。多くの場合、これらの前駆体の合成が単純化されるならば、エポチロンのようなポリケチドを工業規模で作製するためのデノボプロトコルは、経済的に実行可能となるであろう。
【００９６】
エポチロンを作製するための例示的なデノボ合成プロトコルは、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙおよび共同研究者（Ｂａｌｏｇら、１９９８，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｄｏｌ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｅｎｔｅｎａｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ｂ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７（１９）：２６７５−２６７８（本明細書中で参考として援用される））により概説されるマクロラクトン化（ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法である。図２は、２つの重要な中間体、チアゾール中間体および化合物Ａから出発するエポチロンＤの合成に適用される場合の合成プロトコルを例示する。
【００９７】
化合物Ａの式は、以下である：
【００９８】
【化２７】
2004520008.tif 000024
ここで、Ｐ１およびＰ２は、Ｈまたは保護基であり、そしてＸは、酸素または硫黄のいずれかである。Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｌｙプロトコルにおいて、Ｐ１は、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（「Ｔｒｏｃ」）であり、Ｐ２は，ｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＸは、酸素である。Ｃ１０−Ｃ１１二重結合は、Ｓｕｚｕｋｉカップリングによりチアゾール中間体にカップリングされる。Ｃ１のカルボン酸基は、続いて、分子内エステル化によってエポチロンマクロラクトンを形成するために使用される。図２に示されるように、マクロラクトン化反応の前に、Ｎｏｙｏｒｉ還元を実施して、化合物Ａから誘導されるＣ−３ケト基をアルコールに還元して、炭素１〜１１上に適切なエポチロン官能基を提供する。
【００９９】
化合物Ａ、または化合物Ａ中に不斉中心を含む化合物Ａの進んだ前駆体が生物学的に作製され得る場合、エポチロンの作製に関連する立体選択性の問題の多くは、排除され、エポチロンの費用効果のある合成が可能となる。
【０１００】
本発明の１つの局面において、化合物ＡのＣ３〜Ｃ１１を含む、以下の式の化合物（１）は、操作されたポリケチドシンターゼを使用して作製される：
【０１０１】
【化２８】
2004520008.tif 000025
一実施形態において、（１）は、短い一連の化学変換により化合物Ａに変換される。さらなる実施形態において、（１）は、より直接的にエポチロンに変換される。本発明の一実施形態において、（１）は、以下の式の化合物であるラセミ体の２−メチル−４−ペンタン酸Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル（２）を、（２）を（１）に変換し得る操作されたポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に提供することによって、調製される。
【０１０２】
【化２９】
2004520008.tif 000026
（２）を作製するための詳細なプロトコルは、実施例１に見出される。様々なチオエステルを作製するための一般的な方法およびポリケチドを作製するためにチオエステルを使用する方法は、例えば、米国特許第６，０６６，７２１号および同第６，０８０，５５５号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９９／０３９８６（これらは本明細書中で参考として援用される）に開示される。簡単に述べると、チオエステルは発生期のポリケチド鎖を模倣し、従って官能性のＰＫＳ系の第１の伸長モジュールから出発するポリケチド合成プロセスに供給される。
【０１０３】
適切なドメインを含む２モジュールＰＫＳは、（２）を（１）に変換する。第１のモジュールは（２）を出発単位として認識し、次いでメチルマロニル伸長単位を付加し、次いで得られるβケトン単位を（Ｓ）−アルコールに還元する。第２のモジュールは、メチルマロニル伸長単位およびメチル基を付加する。最後に、チオエステラーゼドメインは、ラクトンを生成し、（１）をＰＫＳから遊離させる。このプロセスは、図３に例示される。
【０１０４】
本発明の一実施形態は、（２）を（１）に変換するために必要な上記の活性の全てを含む、天然に存在するＰＫＳの２モジュールフラグメントを提供する。このようなフラグメントの例は、エポチロンＰＫＳのモジュール７および８であり（図４）、このモジュールは、ＰＫＳ（ｅｐｏ）［モジュール（７）］−［モジュール（８）］−ＴＥを生成するように、チオエステラーゼ（ＴＥ）と融合されている。エポチロンＰＫＳの遺伝子は、Ｔａｎｇら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（本明細書中で参考として援用される）に記載される。ＴＥドメインは、エポチロン遺伝子または異種遺伝子（例えば、ＤＥＢＳ遺伝子）のいずれかから得られる。融合ＴＥドメインを有するＰＫＳの２モジュールフラグメントの構築および異種発現のための方法は、Ｋｈｏｓｌａら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ」、米国特許第５，７１２，１４６号（本明細書中で参考として援用される）に記載される。化合物（１）は、エポチロンＰＫＳのモジュール７および８の発現系を含む生物体（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９）の増殖培地に、（２）が供給される場合、本発明の方法に従って生成される。得られる（１）は、当該分野で公知の方法に従って、培養培地から抽出される。他の異種発現宿主（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない）は、Ｂａｒｒら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔｓ」、米国特許第６，０３３，８８３号および同第６，２５８，５６６号、ならびにＴａｎｇら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして、使用され得る。
【０１０５】
本発明の別の実施形態は、天然に存在するＰＫＳから得られる２モジュールフラグメントの遺伝子操作から生じる（１）へ（２）を変換するための、２モジュールＰＫＳを提供する。このようなフラグメントの例は、天然のＴＥドメインに加えて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓのいずれか由来のナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳのモジュール５および６であり、これはメチルトランスフェラーゼドメインをモジュール６に組込み、ＰＫＳ（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥを生成するように遺伝子操作されている（図３）。ナルボノリドＰＫＳおよびそれらの異種発現のための遺伝子は、ＭｃＤａｎｉｅｌら、米国特許第６，１１７，６５９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。適切なメチルトランスフェラーゼドメイン（例えば、エポチロンＰＫＳのモジュール８由来のドメイン）もまた、記載されている。ドメインの付加および置換によるＰＫＳドメインの操作方法は、例えば、ＭｃＤａｎｉｅｌ、「Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ”Ｕｎｎａｔｕｒａｌ”  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、ＰＣＴ公開ＷＯ００／２４９０７（本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１０６】
化合物（１）は、（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥの発現系を含む生物体（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９）の増殖中の培養物に（２）が供給される場合、本発明の方法に従って生成される。得られる（１）は、当該分野で公知の方法に従って、培養培地から抽出される。
【０１０７】
さらなる例として、エリスロマイシンＰＫＳのＤＥＢＳ３タンパク質の操作形態が使用される。ＤＥＢＳ３タンパク質は、エリスロマイシンＰＫＳ中の３つのタンパク質サブユニットの１つであり、伸長モジュール５、伸長モジュール６および終止チオエステラーゼを含む。両方のモジュールは、本来、活性なＫＲドメインを含む。この実施形態において、ＤＥＢＳ３は、モジュール６のケトリダクターゼドメインを不活性化し、そしてメチルトランスフェラーゼドメインを組み込んで、（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）−ＫＲ０＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥを生成するように変異される。代替の例において、ＫＲドメインが欠失して、（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）−ΔＫＲ＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥが生じる。これらのＰＫＳ遺伝子は、宿主（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）において異種発現される。
【０１０８】
ＤＥＢＳ以外の天然のＰＫＳ由来の２モジュールＰＫＳは、（２）を（１）に変換するために有用である。例えば、メガロマイシンＰＫＳ由来のモジュール５および６もまた使用され得る。モジュールＰＫＳ遺伝子を操作するための組換え方法は、例えば、米国特許第５，６７２，４９１号；同第５，７１２，１４６号；同第５，８３０，７５０号；および同第５，８４３，７１８号；ならびにＰＣＴ公開番号９８／４９３１５および９７／０２３５８（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１０９】
本発明の別の実施形態において、異なる天然に存在するＰＫＳから得られる２つ以上のモジュールの組み合わせにより生じる（１）への（２）の変換のための、ＰＫＳが提供される。従って、ＤＥＢＳ由来のモジュールおよびエポチロンＰＫＳ由来のモジュールが組み合わせられ得る。例として、遺伝子（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−（ｅｐｏ）［モジュール（８）］−ＴＥが、構築され、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９において発現される。（２）が供給される場合、得られるＰＫＳは（１）を生成する。ハイブリッドモジュールＰＫＳの構築および最適化のための方法は、Ｔａｎｇら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ，ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），７：７７：８４；およびＧｏｋｈａｌｅら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＰＫＳ  ｍｏｄｕｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ」、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４７７２４（この両方は本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１１０】
本発明のさらに別の実施形態において、化合物（２）を化合物（１）に変換するための、２より多いモジュールを含むＰＫＳが提供され、ここで第１のモジュールは、化合物（２）のローディングモジュールとして働き、そして伸長単位をポリケチド鎖に付加することが不可能である。一例は、末端チオエステラーゼドメインと共に、ＤＥＢＳのモジュール１、２および３からなる３モジュールＰＫＳであり、ここで、モジュール１のＫＳは、例えば、変異誘発によって不活性化されており、そしてメチルトランスフェラーゼドメインは、モジュール３に付加されて、（ｅｒｙ）［モジュール（１）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−［モジュール（３）＋ｅｐｏＭＴ８］−ＴＥが提供される。ＤＥＢＳのモジュール１、２および３を含む３モジュールＰＫＳの操作は、ＭｃＤａｎｉｅｌら、「Ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９７）１１９：４３０９−４３１０（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。［ＫＳ０］変異体の構築は、３モジュール構築物を変異誘発して［ＫＳ０］変異を誘発することによって、またはモジュール３を現存の２モジュール［ＫＳ０］変異体に付加することによって（Ｋｈｏｓｌａら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｋｅｔｉｄｅｓ」、米国特許第６，０８０，５５５号（本明細書中で参考として援用される）に記載される）のいずれかで実施される。
【０１１１】
エリスロマイシンＰＫＳ、ＤＥＢＳ由来のＰＫＳモジュールを使用して例示してきたが、モジュールの他の供給源が、本発明の方法に従って使用され得、他の供給源としては、エリスロマイシン、メガロミシン、ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ランカマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０（アスコマイシン）、ラパマイシン、エポチロン、チロシン、スピラマイシン、ロサミシン、ゲルダナマイシン、ピマリシン、ＦＲ００８、カンジシジン、アベルメクチンなどの生合成に関与するＰＫＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の別の局面において、以下の式の化合物（３）が、操作されたポリケチドシンターゼを使用して調製される：
【０１１３】
【化３０】
2004520008.tif 000027
この化合物（３）は、本発明の方法に従って、短い一連の化学変換によって（１）に変換され、従って、エポチロンのようなポリケチドの合成のための前駆体として働く。（３）中のＣ２メチル基の立体配置は、この中心のエピマー化の容易さおよびエポチロンの合成における両方のジアステレオマーの有用性に起因して、特定されていない。
【０１１４】
本発明の方法に従う（３）の生成は、メチルトランスフェラーゼドメインが（１）中の第２のＣ２メチル基への付加のために使用されないという点において、上記の（１）の生成とは異なる。メチルマロニル特異的ＡＴドメインおよび（Ｓ）特異的ＫＲドメインを有する１つのモジュール、ならびにメチルマロニル特異的ＡＴドメインおよびチオエステラーゼを有する第２のモジュールを含むＰＫＳは、化合物（２）を化合物（３）に変換するために、本発明によって提供される。
【０１１５】
本発明の一実施形態は、化合物（２）を化合物（３）に変換するために必要な上記の活性の全てを含む天然に存在するＰＫＳの２モジュールフラグメントを提供する。このようなフラグメントの例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓのいずれか由来のナルボノリドＰＫＳのモジュール５および６、（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥである。化合物（３）は、（ｎａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥの発現系を含む生物体（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９）の増殖中の培養物に（２）が供給される場合、本発明の方法に従って生成される。得られる（３）は、当該分野で公知の方法に従って、培養培地から抽出される。他の異種発現宿主（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅが挙げられるが、これらに限定されない）が使用され得る。
【０１１６】
本発明の別の実施形態は、天然に存在するＰＫＳから得られる２モジュールフラグメントの遺伝子操作により生じる（３）への（２）の変換のための２モジュールＰＫＳを提供する。一例として、エリスロマイシンＰＫＳのＤＥＢＳ３タンパク質の操作形態である、（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）−ＫＲ０］−ＴＥまたは（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）−ΔＫＲ］−ＴＥが使用される。ＤＥＢＳ以外の天然のＰＫＳ由来の２モジュールＰＫＳは、（２）を（３）に変換するために有用である。例えば、メガロミシンＰＫＳ由来のモジュール５および６もまた、使用され得る。
【０１１７】
本発明の別の実施形態において、異なる天然に存在するＰＫＳから得られる２つ以上のモジュールの組み合わせから生じる（３）への（２）の変換のための、ＰＫＳが提供される。従って、ＤＥＢＳ由来のモジュールおよびナルボノリドＰＫＳ由来のモジュールが、（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−（ｎａｒ）［モジュール（６）］−ＴＥの場合のように、組み合わされ得る。
【０１１８】
本発明のさらに別の実施形態において、（２）を（３）に変換するための、２つより多いモジュールを含むＰＫＳが提供され、ここで第１のモジュールは、（２）のローディングモジュールとして働き、そして伸長単位をポリケチド鎖に付加することが不可能である。一例は、末端チオエステラーゼと共に、ＤＥＢＳのモジュール１、２および３からなる３モジュールＰＫＳであり、ここでモジュール１のＫＳは、例えば、変異誘発によって、不活性化されて、（ｅｒｙ）［モジュール（１）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−［モジュール（３）］−ＴＥを提供する。いくつかのＰＫＳ遺伝子由来のモジュール（例えば、（ｅｒｙ）［モジュール（１）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−（ｎａｒ）［モジュール（６）］−ＴＥもまた、使用され得る。
【０１１９】
エリスロマイシンＰＫＳ、ＤＥＢＳ由来のＰＫＳモジュールを使用して例示してきたが、モジュールの他の供給源が、本発明の方法に従って使用され得、他の供給源としては、エリスロマイシン、メガロミシン、ピコマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ランカマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０（アスコマイシン）、ラパマイシン、エポチロン、チロシン、スピラマイシン、ロサミシン、ゲルダナマイシン、ピマリシン、ＦＲ００８、カンジシジン、アベルメクチンなどの生合成に関与するＰＫＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
化合物（３）は、本発明の方法に従って、化学的メチル化により（１）に変換される。（３）を塩基（例えば、水素化ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなど）で処理し、次いでメチル化試薬（例えば、ヨウ化メチル）で処理して、（３）を（１）に変換する：
【０１２１】
【化３１】
2004520008.tif 000028
化学的メチル化反応の例示的なプロトコルは、実施例７に見出される。
【０１２２】
本発明の別の局面において、Ｃ３−ケトンではなくＣ３−アルコールを有するという点で（３）とは異なる、式（４）の化合物が、提供される：
【０１２３】
【化３２】
2004520008.tif 000029
本発明の方法に従って、（４）は、酸化によって（３）に変換される。Ｃ３−アルコールの立体配置は、両方の異性体が、酸化されると（３）を生じるため、特定されておらず、その結果、本発明の方法によると有用である。Ｃ２−メチルの立体配置は、両方の異性体が、酸化され続いてメチル化されると（１）を生じるため、特定されておらず、その結果、本発明の方法によると有用である。
【０１２４】
本発明の方法に従う（２）から（４）の生成は、第２のモジュール中の官能性ＫＲドメインがＣ３−アルコールを提供するという点において、上記の（３）の生成とは異なる。メチルマロニル特異的ＡＴドメインおよび（Ｓ）特異的ＫＲドメインを有する１つのモジュール、ならびにメチルマロニル特異的ＡＴドメイン、活性なＫＲおよびチオエステラーゼを有する第２のモジュールを含む、ＰＫＳが、（２）を（４）に変換するために、本発明によって提供される。
【０１２５】
本発明の一実施形態は、（２）を（４）に変換するために必要な上記の活性の全てを含む天然に存在するＰＫＳの２モジュールフラグメントを提供する。一例として、エリスロマイシンＰＫＳのＤＥＢＳ３タンパク質、（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥが使用される。この実施形態において、ＤＥＢＳ３は、宿主（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）において、異種発現される。ＤＥＢＳ以外の天然のＰＫＳ由来の２モジュールＰＫＳは、（２）を（４）に変換するために有用であり、天然のＰＫＳとしては、エリスロマイシン、メガロミシン、ピコマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ランカマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０（アスコマイシン）、ラパマイシン、エポチロン、チロシン、スピラマイシン、ロサミシン、ゲルダナマイシン、ピマリシン、ＦＲ００８、カンジシジン、アベルメクチンなどの生合成に関与するＰＫＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明の別の実施形態において、異なる天然に存在するＰＫＳから得られる２つ以上のモジュールの組み合わせから生じる（４）への（２）の変換のためのＰＫＳが提供される。従って、ＤＥＢＳ由来のモジュールおよびナルボノリドＰＫＳ由来のモジュールは、例えば、（ｎａｒ）［モジュール（５）］−（ｅｒｙ）［モジュール（６）］−ＴＥにおける場合のように、組み合わされ得る。
【０１２７】
本発明のさらに別の実施形態において、２つより多いモジュールを含むＰＫＳが、（２）から（４）への変換のために提供され、ここで第１のモジュールは、（２）のローディングモジュールとして働き、そして伸長単位をポリケチド鎖に付加することが不可能である。一例は、末端チオエステラーゼドメインと共に、ＤＥＢＳのモジュール１、５および６からなる３モジュールＰＫＳであり、ここで、モジュール１のＫＳは、例えば、変異誘発によって、不活性化されており、その結果、（ｅｒｙ）［モジュール（１）］−ＫＳ０］−［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥが提供される。
【０１２８】
エリスロマイシンＰＫＳ、ＤＥＢＳ由来のＰＫＳモジュールを使用して例示してきたが、モジュールの他の供給源が、本発明の方法に従って使用され得、他の供給源としては、エリスロマイシン、メガロミシン、ピコマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ランカマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０（アスコマイシン）、ラパマイシン、エポチロン、チロシン、スピラマイシン、ロサミシン、ゲルダナマイシン、ピマリシン、ＦＲ００８、カンジシジン、アベルメクチンなどの生合成に関与するＰＫＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
さらなる化学修飾がこれらの実施形態のいくつかにおいて必要であるが、それにもかかわらず、本発明の方法は以下の利点を提供する。第１に、この方法は、比較的安価である。生物学的系の固有の立体選択性に起因して、ＳＮＡｃ化合物のラセミ混合物は、純粋なエナンチオマーの代わりとして使用され得る。第２に、ＤＥＢＳおよび他のＰＫＳ遺伝子のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおける発現は、十分に特徴付けされており、そしてヒドロキシラクトン生成物が、簡単な発酵によって、比較的多量に作製され得る。
【０１３０】
（４）のヒドロキシル基（これは後に、エポチロンのＣ−５ケト基になる）は、穏やかな酸化剤（例えば、メチルスルホキシド／オキサリルクロリド／トリエチルアミン（すなわち、Ｓｗｅｒｎ酸化）、メチルスルホキシド／カルボジイミド（すなわち、Ｍｏｆｆａｔ酸化）、クロム酸（Ｈ２ＣｒＯ４）、超原子価ヨウ素酸化剤（例えば、ＩＢＸ、Ｄｅｓｓ−ｍａｒｔｉｎペルヨージナン）など）を使用して、本発明の方法によって、化学的に酸化され、（３）が提供され得る。このような酸化プロトコルの例示的な例は、実施例６に見出される。
【０１３１】
本発明のさらなる局面において、（３）を化合物Ａに変換するための方法が、提供される。スキーム１は、本発明の一実施形態を例示する。
【０１３２】
【化３３】
2004520008.tif 000030
簡単に述べると、（３）のラクトンを、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンおよびトリメチルアルミニウムを使用して開環し、Ｗｅｉｎｒｅｂアミド（５）を形成し、そして得られる遊離ヒドロキシル基を、トリクロロエチルクロロホルメート（「Ｔｒｏｃ−Ｃｌ）」）を使用して保護して、（６）を得る。このＷｅｉｎｒｅｂアミドを、求核性のアセテート源（例えば、酢酸ｔｅｒｔ−ブチルのリチウムエノレート）と反応させて、化合物Ａである（７）を得る。ここで、Ｐ１は、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（「Ｔｒｏｃ」）であり、Ｐ２は、ｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＸは、酸素である。トリクロロエチルクロロホルメートの別の保護試薬（三置換シリルクロリド、三置換シリルトリフルオロメタンスルホネート（「ｔｒｉｆｌａｔｅ」）などが挙げられるが、これらに限定されない）での置換により、化合物Ａが生じる。ここで、Ｐ１は、対応する保護基（例えば、トリアルキルシリルエーテル）である。特に好ましい例としては、Ｐ１＝Ｔｒｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（「ＴＢＳ」）、およびトリエチルシリル（「ＴＥＳ」）が挙げられる。
【０１３３】
本発明の第２の実施形態において、スキーム１の酢酸ｔｅｒｔ−ブチルは、三酢酸ｔｅｒｔ−ブチルで置換され、化合物Ａが形成される。ここで、Ｐ１は、Ｔｒｏｃ、ＴＢＳまたはＴＥＳであり、Ｐ２は、ｔｅｒｔ−ブチルであり、そしてＸは、硫黄である。
【０１３４】
本発明の別の局面において、後に適切な立体配置を有するＣ−３アルコールになる部分をすでに含む化合物Ｂが提供される：
【０１３５】
【化３４】
2004520008.tif 000031
ここで、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、Ｈまたは保護基であり、そしてＸは、酸素または硫黄である。
【０１３６】
本発明の方法に従って、（６）（故に、（３））から化合物Ｂを作製するための一実施形態が、スキーム２により例示される：
【０１３７】
【化３５】
2004520008.tif 000032
上記のように、（１）は、（６）に変換される。ジイソブチルアルミニウムヒドリドは、アミドをアルデヒド（８）に還元するために使用される。アルドール反応または類似の反応は、引き続いて立体選択的にアルデヒドを２炭素だけ伸長し、そして３−アルコールの立体配置を決める。一実施形態において、非対称Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応は、キラルなプロリン誘導リガンドの存在下でブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび亜鉛を使用して行われる。この実施形態において、生成物は化合物Ｂである（９）であり、ここで、Ｐ１＝Ｔｒｏｃ、Ｐ２＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｐ３＝Ｈ、そしてＸ＝Ｏである。これは、ヒドロキシル保護試薬（例えば、トリエチルクロロシラン）と反応して、３−ＯＨを保護し、化合物Ｂである（１０）を与え、ここで、Ｐ１＝Ｔｒｏｃ、Ｐ２＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｐ３＝Ｅｔ３Ｓｉ（「ＴＥＳ」）、そしてＸ＝Ｏである。トリエチルクロロシラン以外の試薬の使用は、他のＰ３保護基を導入するために使用され得る。Ｐ３保護基の好ましい例としては、ＴＥＳおよびＴＢＳが挙げられる。
【０１３８】
本発明の方法（図６）によると、（１０）およびＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙトリアゾール中間体は、Ｓｕｚｕｋｉカップリング法によりカップリングされ、ラクトン化されそして脱保護されて、エポチロンＤが生成する。
【０１３９】
本発明の別の局面において、化合物Ｂ（ここで、Ｐ１＝Ｈ、Ｐ２＝Ｈ、Ｐ３＝Ｈ、およびＸ＝Ｏである）（１１）は、生物学的方法を使用して直接作製される。この方法は一般に、ポリケチドのライブラリの使用を包含し、ここでこのライブラリは、このポリケチドの構造に関する情報を含む。好ましい実施形態において、ライブラリにおけるポリケチド構造は、直線形態で表される。この直線形態は、化学構造の直線型であり得る。この直線化されたポリケチドの構造は、１つのポリケチドの構造を別の構造と比較するために好都合な表現である。さらに好ましい実施形態において、各々の直線化されたポリケチドの構造は、２炭素単位の配列に分割される。さらに好ましい実施形態において、この２炭素単位の化学構造は、記号により表され、その結果、この２炭素単位の構造配列は、そこで符号の直線配列に変換される。この直線化された構造は、２炭素単位にさらに分解され、この各々は、次いで、記号により表される。記号を構造フラグメントに割り当てるための一般的な方法は、米国特許出願０１／１７３５２においてさらに詳細に記載される。簡単に述べると、ＣＨＵＣＫＬＥＳ法の改変型が、ポリケチド構造を表すために提供される（Ｓｉａｎｉら、ＣＨＵＣＫＬＥＳ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｏｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐ．Ｓｃｉ，１９９４  ３４：５８８−５９３（これは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１４０】
（１１）のようなポリケチド化合物を作製するための遺伝子を設計するための詳細な方法は、ポリケチドのライブラリーがどのように系統立てられているかに依存する。一般的に、この方法は、合成される化合物の構造をライブラリー中のポリケチドの構造と比較する工程と、細胞中で発現させる場合、所望の化合物を合成するために使用し得るＰＫＳ酵素を作製する遺伝子を設計するためにこの情報を使用する工程とを包含する。
【０１４１】
１つの実施形態において、下式：
【０１４２】
【化３６】
2004520008.tif 000033
を有する（１１）は、エポチロンＰＫＳ遺伝子のサブセットを用いることによって作製される。というのは、エポチロン自体は、炭素２個のユニットの標的配列（化合物１１）と、ほとんどの数がほとんど適合する連続する炭素２個のユニットを含むからである。結果として、本発明の方法の変形が使用される。一般的な方法は、以下を含む：
炭素２個のユニットの配列として標的化合物の少なくとも一部を記載する工程；
天然に生じるポリケチドの産生を生じるＰＫＳ遺伝子を関連付ける工程；
炭素２個のユニットの化合物の配列の作製に関連するＰＫＳ遺伝子のフラグメントを決定する工程、および；
ＰＫＳ遺伝子のフラグメントを含む新規遺伝子を設計する工程。
【０１４３】
上記のエポチロンＰＫＳ遺伝子は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（本明細書中で参考として援用される）によって記載されるようにクローン化されている。（１１）の構造を、以下のエポチロン構造：
【０１４４】
【化３７】
2004520008.tif 000034
の線形化表現と比較することからわかり得るように、化合物（１１）は（驚くべきことではないが）、エポチロン構造の右手部分と実質的に同一である。さらに、この右手部分は、４個の炭素２個のユニットへと分割され得る。従って、１つの方法において、（２）は、官能性のＥｐｏＥおよびＥｐｏＦサブユニット、（ｅｐｏ）［モジュール（７）］−［モジュール（８）］−［モジュール（９）］−ＴＥを含むＰＫＳ系に加えられる。官能性のＰＫＳ系は、適切な宿主細胞中に存在し得るか、または無細胞系の一部であり得る。
【０１４５】
本発明の多くの代替の方法は、（１１）（または任意の他のポリケチド）を作製するために使用され得る。（１１）が非エポチロンＰＫＳ遺伝子を用いて作製される場合、本発明の実施は、前述のとおりである。例えば、別の実施形態において、タートラロン（ｔａｒｔｒａｌｏｎｅ）Ｂ（「ｔａｒ」）からのモジュールのサブセットは、（１１）を作製するために使用される。タートラロンＢの線形表現は、以下のようである：
【０１４６】
【化３８】
2004520008.tif 000035
ここで、構造の四角で囲った部分は、タートラロン  Ｂ  ＰＫＳ  酵素の伸長モジュール５からモジュール７に起因する。結果として、（１１）に類似の化合物（１２）は、下式：
【０１４７】
【化３９】
2004520008.tif 000036
を有し、（２）を（ｔａｒ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−［モジュール（７）］−ＴＥを含むＰＫＳ系に添加することによって作製され得る。化合物（１１）は、ＰＫＳ系を修飾することによって作製され得る。タートラロンＢ伸長モジュール５においてＡＴをメチルマロニルＣｏＡに関して特異的なＡＴ（例えば、タートラロンＢ伸長モジュール６中のＡＴ）に置換して、エポチロン伸長モジュール８からタートラロンＢ  伸長モジュール６へとメチルトランスフェラーゼドメインを挿入することによって、（ｔａｒ）［モジュール（５）−ＡＴ／ｔａｒＡＴ６］−［モジュール（６）＋ｅｐｏＭＴ８］−［モジュール（７）］−ＴＥを生成する。
【０１４８】
さらに別の実施形態において、ボロフィシン（ｂｏｒｏｐｈｙｃｉｎ）（「ｂｏｒ」）伸長モジュール４からモジュール６が、タートラロンＢ伸長モジュールのかわりに使用される以外は、同様の方法が使用されて、（１１）が作製される。化合物（２）が（ｂｏｒ）［モジュール（４）］−［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥを発現する宿主細胞に添加されて、次いで下式：
【０１４９】
【化４０】
2004520008.tif 000037
のポリケチド（１３）が得られる。
【０１５０】
化合物（１１）は、ボロフィシン伸長モジュール４中のメチルマロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴを、例えば、（ｂｏｒ）［モジュール（４）−ＡＴ／ｔａｒＡＴ６］−［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥ中で修飾することによって作製される。
【０１５１】
同様に、アプラスモマイシン（ａｐｌａｓｍｏｍｙｃｉｎ）（「ａｐｌ」）およびボロマイシンＰＫＳ遺伝子の修飾された部分は、（１１）を作製するために使用され得る。修飾された遺伝子構築物の例示的な例としては、以下がある：
（ａｐｌ）［モジュール（３）−ＡＴ／ｔａｒＡＴ６−ＤＨ０］−［モジュール（４）］−［モジュール（５）］−ＴＥ、
（ｂｏｒ）［モジュール（３）−ＡＴ／ｒａｐＡＴ２−ＤＨ０］−［モジュール（４）］−［モジュール（５）］−ＴＥ。
【０１５２】
ボロマイシンモジュール３は、ＤＨ／ＥＲ／ＫＲ修飾ドメインの完全なセットを含む一方、ＤＨドメインの不活化は、ＥＲドメインの不活化を確実にするのに十分である。というのは、ＤＨ活性は、ＥＲ活性のために必須であるからである。
【０１５３】
別の実施形態において、上述の（１）が別の新規プロトコルに使用されてエポチロンＤを生成する。図７によって示されるように、メチル化ケトラクトンは、Ｓｕｚｕｋｉカップリング法を用いてチアゾール中間体にカップリングされる。拡大されたラクトンは、開環してＷｅｉｎｒｅｂアミドになり、得られる遊離のヒドロキシルは、保護される。このアミドはアルデヒドに還元されて、２炭素だけ伸長される。得られる生成物を、Ｂｕ４ＮＦと反応させ、保護基を除去して、同時にラクトンを形成し、エポチロンＤを生成する。
【０１５４】
（ディスコデルモリド）
本発明の別の局面において、生物学的方法および化学的方法の組み合わせは、ディスコデルモリドアナログの合成において有用なディスコデルモリドアナログおよび中間体を作製するために提供される。ディスコデルモリドの初期研究は、チューブリン重合アッセイにおいて、強力な抗癌性を有することを示唆する。エポチロンを用いる場合、より広汎な研究が、天然に存在する供給源から得られ得る少量のディスコデルモリドによって妨害される。
【０１５５】
この問題を回避するために、いくつかの研究グループが、ディスコデルモリドの新規化学合成の完結において成功している。これらの中で、Ｓｍｉｔｈおよび共同研究者によって報告された合成（スキーム  ３）は、特に注目すべきである。というのは、共通の前駆体（１４）から誘導される３つのフラグメントが、共に連結されるモジュラーアプローチを使用しているからである。例えば、Ｓｍｉｔｈら、１９９９，Ｇｒａｍ−ｓｃａｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ，Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．１（１１）：１８２３−６；米国特許第６，０９６，９０４号、同第６，０３１，１３３号、および同第５，７８９，６０５号；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０４８６５および同ＷＯ９８／２４４２９を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【０１５６】
【化４１】
2004520008.tif 000038
Ｓｍｉｔｈ合成は、長くて複雑で、そして一般的に商業的な量を作製するために修正することができない。というのは、ディスコデルモリドは、その使用が不十分な供給によって妨害されるポリケチドであるというだけでなく、これらの重要な化合物を得るための新規なアプローチが必要であるからである。
【０１５７】
本発明の１つの実施形態において、Ｓｍｉｔｈの共通の前駆体（１４）は、生物学的方法および化学的方法の組み合わせを用いて作製される。Ｓｍｉｔｈの共通の前駆体は、式（Ｃ）の化合物である。
【０１５８】
【化４２】
2004520008.tif 000039
ここで、Ｐ１は、４−メトキシベンジル（「ＰＭＢ」）であり、Ｐ２は、Ｈである。
本発明の方法は、式（Ｄ）の化合物：
【０１５９】
【化４３】
2004520008.tif 000040
（ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルである）
を官能性ＰＫＳ系に添加して、下式：
【０１６０】
【化４４】
2004520008.tif 000041
のラクトン（Ｅ）を作製する工程を包含する。
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルである。
【０１６１】
適切な官能性ＰＫＳの好ましい例としては、（ｅｒｙ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−ＴＥ、（ｏｌｅ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−ＴＥ、および（ｍｅｇ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−ＴＥが挙げられる。
【０１６２】
スキーム４は、本発明の１つの実施形態を示し、ここで、Ｒ２はＨであり、化合物（Ｄ）を（ｅｒｙ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（２）］−ＴＥポリケチドシンターゼに供給することから生じるラクトン（Ｅ）は、化学的に修飾されてＳｍｉｔｈのキラル前駆体（１４）を得る。
【０１６３】
【化４５】
2004520008.tif 000042
上記ラクトンのビニル基は、例えば、還元的操作でのオゾン分解または四酸化オスニウムの後に過ヨウ素酸ナトリウムを用いる二段階プロセスを用いて、アルデヒド（１８）へと酸化される。得られるアルデヒドは、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ触媒（トリス（トリフェニルホスフィン）ロジウムクロリド）を用いて、脱カルボニル化されて（１９）を生成する。ラクトン（１９）は、Ｗｅｉｎｒｅｂアミド（２０）に変換して末端一級アルコールを選択的に保護することによって（１４）へと変換され得る。好ましい例において、この保護は、環状ジブチルスタンオキサンを最初に形成し、４−メトキシベンジルクロリドのようなアルキル化剤と反応させることによって行われる。
【０１６４】
本発明の別の実施形態において、化合物（Ｄ）（ここで、Ｒ１は、Ｈであり、そしてＲ２は、メチルである）（２１）を（ｅｒｙ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（２）−ＫＲ／ｒａｐＫＲ２］−ＴＥ  ＰＫＳを発現する宿主細胞に供給することから生じるラクトン（２２）またはその等価体は、スキーム５において示されるように使用され、Ｓｍｉｔｈのディスコデルモリド（１５）の「フラグメントＡ」を調製する。
【０１６５】
【化４６】
2004520008.tif 000043
ＤＥＢＳ１＋ＴＥ中のＫＲ２と、ラパマイシンＰＫＳからのモジュール２ＫＲの置換は、３位のアルコールで反対の立体化学を有するラクトン（２２）の形成を生じる。ラクトン（２２）は、例えば、リチウムアルミニウムヒドリドを用いて還元され、そして得られるトリオール（２３）は、ピリジニウムパラトルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）のような酸触媒下、（４−メトキシフェニル）ベンズアルデヒドジメチルアセタール（ＰＭＰＣＨ（ＯＭｅ）２）を用いて処理し、その後に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドおよび塩基を用いて連続的に処理することによって保護され、（２５）を生成する。このアルケンは、Ａｌｐｉｎｅ−ボラン（Ｂ−イソピノカンフェニル−９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン）を用いて、酸化的操作で、立体選択的にヒドロホウ素化され、一級アルコール（２６）を与える。アルコールの一級ヨウ化物への変換は、ヨウ素およびトリフェニルホスフィンを用いて、イミダゾールの存在下行われ、（１５）を与える。
【０１６６】
別の実施形態において、遺伝子操作されたポリケチドシンターゼが提供され、これはディスコデルモリドのＣ１５〜Ｃ２４セグメントのより直接的な調製において有用な化合物を生成する。
【０１６７】
【化４７】
2004520008.tif 000044
６−ｄＥＢの鋸歯（ｓａｗ−ｔｏｏｔｈ）表現を用いた比較は、ディスコデルモリドの立体化学的に複雑なセグメントが、６−ｄＥＢのＣ１〜Ｃ７フラグメントを産生するタンパク質によって生成され得ることを明らかにする。
【０１６８】
【化４８】
2004520008.tif 000045
本発明の１つの実施形態において、ＰＫＳは、下式：
【０１６９】
【化４９】
2004520008.tif 000046
の化合物（２７）を生成するために構築され使用され、この化合物は、ディスコデルモリドのＣ１５〜Ｃ２４セグメントの合成のための前駆体として役立つ。（２７）の鋸歯図の検査から、適切なＰＫＳは、ＤＥＢＳモジュール５およびモジュール６と機能において等しい２つのモジュールを含むことが明らかであり、この２つのモジュールは、ＤＥＢＳ３タンパク質中にＴＥドメインと共に見い出される。従って、この実施形態において、異種発現された（ｅｒｙ）［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥは、式（２８）：
【０１７０】
【化５０】
2004520008.tif 000047
のチオエステルを、（２７）を生成するために供給される。また、ＤＥＢＳ遺伝子クラスターから採られるモジュールを用いて示してきたが、等価なドメインを含む他のモジュールは、本発明の方法のために適切である。
【０１７１】
第２の実施形態において、３モジュール構築物（ｅｒｙ）［モジュール（ｌ）−ＫＳ０］−［モジュール（５）］−［モジュール（６）］−ＴＥが構築される。このＰＫＳを発現する宿主細胞に（２８）を供給することはまた、（２７）の形成を生じる。
【０１７２】
本発明の別の局面において、ディスコデルモリドおよび他のポリケチドの合成において有用な式（Ｆ）：
【０１７３】
【化５１】
2004520008.tif 000048
の６−ｄＥＢアナログが提供される。
ここで、Ｒ１は、ハロゲンまたはフェニルチオであり；そしてＲ２は、ＨまたはＯＨである。この化合物は、最初にＰＫＳ（例えば、ＫＳ１０変異を含む完全なエリスロマイシンＰＫＳ）を式（Ｇ）：
【０１７４】
【化５２】
2004520008.tif 000049
のチオエステルと接触させることによって式（Ｆ）（ここで、Ｒ２＝Ｈ）の化合物を生成するように調製され、次いで、必要に応じて、上記生成物と、Ｃ８でのヒドロキシル化に関して特異的なチトクロムＰ４５０型ヒドロキシラーゼとを接触させて式（Ｆ）（ここで、Ｒ２＝ＯＨ）の化合物を生成する。
【０１７５】
このようなヒドロキシラーゼは、天然遺伝子クラスター（例えば、それぞれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ由来のオレアンドマイシンおよびランカマイシン（ｌａｎｋａｍｙｃｉｎ）遺伝子クラスター）から公知である。オレアンドマイシンにおいて、ｏｌｅＰ遺伝子は、ＭｃＤａｎｉｅｌら，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ８，８１−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ」，米国特許出願０９／７６８，９２７号（本明細書中で参考として援用される）中に記載のように、６−ｄＥＢの８位にヒドロキシ基を付加するチトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼをコードする。ランカマイシンにおいて、ｌｋｍ  Ｐ４５０遺伝子は、８−ヒドロキシラーゼをコードする。
【０１７６】
６−ｄＥＢアナログ（Ｆ）（ここで、Ｒ２＝Ｈ）を生成するためのラセミ前駆体（Ｇ）の使用は、Ａｓｈｌｅｙら，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｋｅｔｉｄｅｓ」，ＰＣＴ出願番号ＵＳ００／０２３９７（本明細書中で参考として援用される）中に記載される。
【０１７７】
本発明の１つの実施形態において、アナログ（Ｆ）（ここで、Ｒ２＝Ｈ）は、スキーム６に示されるように、ディスコデルモリドの合成において有用な中間体へと変換される。
【０１７８】
【化５３】
2004520008.tif 000050
過酸（例えば、トリフルオロ過酢酸、過酢酸、ｍ−クロロ過安息香酸、モノ過マレイン酸など）を用いる（Ｆ）のＣ９−ケトンのＢａｙｅｒ−Ｖｉｌｌａｇｅｒ酸化は、環拡大されたジラクトン（Ｇ）を与える。Ｒ１＝ＳＰｈの場合、過酸処理はまた、チオエーテルをスルホンＳＯ２Ｐｈへと酸化する。本発明の１つの実施形態において、（Ｇ）は、亜鉛、次いでメタノール性塩基（例えば、メタノール中の炭酸カリウムの使用によって生成されるような）によって処理され、分子を２つのフラグメント、酸（２９）およびラクトン（３０）へと開裂させる。本発明の第２の実施形態において、ジラクトンは、メタノール性塩基で直接的に処理され、フラグメント（３０）および（３１）を生成する。
【０１７９】
ラクトン（３０）は、ディスコデルモリドのＣ１５〜Ｃ２４フラグメント中に存在する不斉中心を含み、そして、本発明の実施形態（スキーム７）において、ディスコデルモリドおよびアナログの合成のために適切なフラグメントへと変換される。
【０１８０】
【化５４】
2004520008.tif 000051
例えば、スルホネートエステル（トシレート、メシレート、トリフラートなど）への変換を介する活性化、次いで、塩基（例えば、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン、「ＤＢＵ」）で処理することによってＣ８−アルコールを脱離して、７，８−アルケン（３２）を生成する。３−ヒドロキシル基は、例えば、トリアルキルシリルエーテル（３３）を用いて保護される。好ましい保護基としては、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ＴＥＳ、およびＴＢＳが挙げられる。アルケンのアルデヒドへのオゾン分解の後、ディスコデルモリドジエンセグメントの導入によって中間体（３４）を生成する。アルデヒドからジエン（３５）を構築するためのいくつかの方法が公知であり、この方法としては、トリメチルシリルアリルボロネート：Ｈａｒｒｉｅｄら，「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （−）ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ：Ａｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）６２：６０９８−６０９９；α−（トリメチルシリル）アリルブロミド，Ｍａｒｓｈａｌｌら，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｂｙ  ＳＥ２’  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｒａｃｅｍｉｃ  ａｌｌｅｎｙｌｓｔａｎｎａｎｅｓ  ｔｏ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）６３：８１７−８２３；およびホスフィノアリルチタン試薬，Ｓｍｉｔｈら，「Ｇｒａｍ−ｓｃａｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ」，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９），１：１８２３−１８２６（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）の使用が挙げられる。ジエンを導入して（ＸＶ）を形成するための好ましい方法は、３−（トリアルキルシリル）アリルボロネート、具体的には、ジメチル３−（トリメチルシリル）アリルボロネートのアルデヒドへの付加、次いで、強塩基、具体的にはＫＨを用いての処理である。
【０１８１】
本発明による中間体（３５）のディスコデルモリド中間体（３８）への生成は、ラクトンカルボニルの一級アルコールへの還元、次いで、得られるヒドロキシル基の差次的保護および一級アルコールを、第２のディスコデルモリドフラグメントにカップリングするための適切な基への最終的な変換を含む。
【０１８２】
１つの実施形態において、（３５）は、始めに、ヒドリド試薬を用いて還元される。このようなヒドリド試薬の好ましい例としては、以下が挙げられる：リチウムアルミニウムヒドリド、リチウムトリエチルボロヒドリド、およびナトリウムボロヒドリド。得られる一級アルコールは、選択的に保護される。保護基の好ましい例としては、以下が挙げられる：イソブチレートエステル、アセテートエステル、ベンゾエートエステル、トリフェニルメチルエーテル、およびジ（４−メトキシフェニル）フェニルメチルエーテル。イソブチレートエステルは、特に好ましい。次いで、残りの二級アルコールは、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）  エーテルとして保護され、酸触媒下、ｐ−メトキシベンジルトリクロロアセトイミデートと反応させることによって、または塩基触媒下、ｐ−メトキシベンジルブロミドと反応させることのいずれかによって導入される。酸触媒の好ましい例としては、トリフルオロメタンスルホン酸およびピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）が挙げられる。塩基触媒の好ましい例としては、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン、およびナトリウムヒドリドが挙げられる。
ＰＭＢエーテルを導入した後、一級アルコールは、脱保護されて（３７）を生成する。保護基がエステルである場合、脱保護は、メタノール中の炭酸カリウムの混合物を使用する。保護基がトリチルまたはＤＭＴエーテルである場合、脱保護は、メタノール中のクロロカテコールボレートを使用する。
【０１８３】
本発明の方法によれば、遊離した一級アルコールは、塩基（例えばイミダゾール）存在下、トリフェニルホスフィンおよびヨウ素を用いてヨウ化物へと変換され、ディスコデルモリドフラグメント（３８）を生成する。このフラグメントは、当該分野で公知の方法を用いて、ディスコデルモリドまたはディスコデルモリドアナログへと組込まれ得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、ＭａｒｓｈａｌｌおよびＪｏｈｎｓ，「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ」，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），６３：７８８５−７８９２）。
【０１８４】
本発明の別の実施形態において、フラグメント（２９）が使用されＳｍｉｔｈの「キラル前駆体」（１４）が調製される。スキーム８に示されるように、（ＸＩ）のアルケンがアルデヒドへと酸化される。酸化のための好ましい方法としては、オゾン分解および四酸化オスミウム／過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられ；オゾン分解が特に好ましい。アルデヒドのアルコール（３９）への還元は、好ましくは、中間体のオゾニドをナトリウムボロヒドリドで処理し、次いで酸触媒によるラクトン化によって化合物（１９）が得られ、この化合物（１９）が上述のようなＳｍｉｔｈ前駆体へと変換される。
【０１８５】
【化５５】
2004520008.tif 000052
別の実施形態において、（２９）は、ディスコデルモリドおよびそのアナログの合成において有用な別の中間体を調製するために使用される。スキーム９に示されるように、（２９）のアルケンは、アルデヒドへと酸化される。酸化のための好ましい方法としては、オゾン分解および四酸化オスミウム／過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられ；オゾン分解が特に好ましい。アルデヒドは、酸性メタノールを用いて処理することによって、メチルラクトンアセタール（４０）として捕捉される。遊離のヒドロキシル基は、保護される。保護基の好ましい例としては、トリアルキルシラン（例えば、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、およびＴＩＰＳ）が挙げられ；ＴＩＰＳが特に好ましい。ラクトンは、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンを用いて処理することによって、開環してＷｅｉｎｒｅｂアミド（４１）になる。化合物（４１）は、Ｓｍｉｔｈら，「Ｇｒａｍ−ｓｃａｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ」，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）１：１８２３−１８２６中の化合物「（−）−８」を用いて同様に使用され、ディスコデルモリドを生成し、この化合物は、ＴＢＳ保護基の代わりにＴＩＰＳ保護基を用いていることのみが異なる。
【０１８６】
【化５６】
2004520008.tif 000053
別の実施形態において、（４１）は、本発明の方法に従って、ディスコデルモリドのＣ９〜Ｃ１４セグメントに対する前駆体として使用される（スキーム  １０）。ナトリウムボロヒドリドを用いたアルデヒドの還元の後、ＴＢＳを用いてアルコールを保護する。Ｗｅｉｎｒｅｂアミドをジイソブチルアルミニウムヒドリド（ＤｉＢＡｌ−Ｈ）を用いて還元して、アルデヒド（４２）を生成し、この化合物は、Ｗｉｔｔｉｇ試薬を用いてヨウ化ビニル（４３）へと変換される。Ｗｉｔｔｉｇ試薬の好ましい例としては、（ヨードメチリデン）トリフェニルホスホラン、（１−ヨードエチリデン）−トリフェニルホスホランなどが挙げられる。
【０１８７】
【化５７】
2004520008.tif 000054
本発明の別の実施形態において、フラグメント（３１）は、ディスコデルモリドのＣ１〜Ｃ８セグメントを調製するために使用される。スキーム１１に示されるように、フラグメント（３１）は、酸触媒を用いて処理することによってラクトン化される。酸触媒の好ましい例としては、１０−カンファースルホン酸（「ＣＳＡ」）、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などが挙げられる。得られるラクトン（４４）は、６−アルコールで、好ましくはエステルを用いて、最も好ましくは３−アルコールでイソブチレートエステルを用いて、好ましくは、トリアルキルシリルエーテルを用いて、そして最も好ましくは、ＴＢＳエーテルを用いて差次的に保護される。次いで、６−アルコールは、メタノール中の炭酸カリウムを用いて脱保護され、次いで、アルデヒド（４５）へと酸化される。酸化は、好ましくは、メチルスルホキシド／オキサリルクロリド／トリエチルアミン（すなわち、Ｓｗｅｒｎ酸化）、超原子価ヨウ素試薬（Ｄｅｓｓ−ｍａｒｔｉｎ  ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅまたはＩＢＸ）、またはピリジン中の三酸化クロムを用いて行われ、最も好ましくは、メチルスルホキシド／オキサリルクロリド／トリエチルアミンを用いて行われる。
【０１８８】
【化５８】
2004520008.tif 000055
本発明の１つの実施形態（スキーム１２）において、（４５）は、（エチリデン）トリフェニルホスホランと反応して、化合物（４６）を生成する。（４６）を、ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウムクロリドヒドリド（Ｃｐ２ＺｒＨＣｌ）を用いて処理して、アルケンを末端位に異性化する。キラルＣ２−対称ジアミンリガンド［Ｎ，Ｎ’−ビス（メシチルメチル）−（Ｒ，Ｒ’）−１，２−ジフェニル−１，２−ジアミノエタン］を用いるＣｏｒｅｙの化学量論的なオスミウム化（ｏｓｙｍｌａｔｉｏｎ）条件を用いて、アルケンの非対称ジヒドロキシル化によってジオール（４７）を生成し、この化合物を再び、差次的に保護して末端アルコールをアルデヒド（４８）へと酸化し得る。化合物（４８）は、Ｓｍｉｔｈら，「Ｇｒａｍ−ｓｃａｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ」，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）１：１８２３−１８２６に従ってディスコデルモリドへと変換される。
【０１８９】
【化５９】
2004520008.tif 000056
本発明によるディスコデルモリドの合成の完成は、当該分野で公知の方法に従う。
【０１９０】
別の実施形態において、式（Ｆ）の化合物
【０１９１】
【化６０】
2004520008.tif 000057
（ここで、Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、またはフェニルチオであり、そしてＲ２は、ＯＨである）は、スキーム１３に示されるように、上記中間体（２９）、（３０）、および（３１）を調製するために使用される。
【０１９２】
【化６１】
2004520008.tif 000058
α−ヒドロキシケトンを切断し得る試薬（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）での（Ｆ）（ここで、Ｒ２は、ＯＨである）の処理は、Ｃ８−Ｃ９結合の分裂を生じる。Ｒ１がハロゲンまたはフェニルチオである場合、上記亜鉛での処理は、ハロラクトンの脱離を生じて、（２９）および（４９）を得る。Ｒ１がＨである場合、塩基性メタノールを使用するエステル交換反応を使用して、ラクトンを切断するために使用されて、（３１）および（４９）を得る。化合物（４９）は、（３０）のケトンアナログであり、そして還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）との反応によって（３０）に変換される。
【０１９３】
（Ｃ−１４改変を有するディスコデルモリド化合物）
本発明の別の局面において、Ｃ−１４に変更を有するディスコデルモリドが提供される。スキーム１０に示されるように、化合物（４２）を（１−ヨードエチリデン）−トリフェニルホスホラン以外のウィッティヒ試薬で処理すると、Ｃ１４においてメチル以外の基を有するディスコデルモリドを生じる。代替のウィッティヒ試薬の好ましい例は、（ヨードメチリデン）−トリフェニルホスホランであり、これは、Ｓｍｉｔｈプロトコルに従って使用される場合、１４−ノルディスコデルモリドの形成を生じる。
【０１９４】
別の実施形態において、１４−ノルディスコデルモリド化合物は、Ｓｍｉｔｈらのパラジウム媒介カップリングよりもウィッティヒオレフィン化により、適切なフラグメントをカップリングすることによって作製される。スキーム１４に示されるように、適切な「Ａフラグメント」は、同族体化によって中間体（３８）から調製されて、アルデヒド（５１）を形成する。
【０１９５】
【化６２】
2004520008.tif 000059
アルデヒド（５１）は、リンイリド（５２）（スキーム１５に示されるような先に記載された（４２）から誘導される）とカップリングされて、１４−ノルディスコデルモリド中間体（５３）を生じる。
【０１９６】
【化６３】
2004520008.tif 000060
（５３）の１４−ノルディスコデルモリドへの続く変換は、スキーム１６に示される。中程度の酸処理を使用する選択的脱保護（例えば、ＨＣｌへの短時間の曝露）は、アルコール（５４）を生じ、これは、ヨージドを介してホスホニウム塩（５５）に変換される。（５５）からのイリドを、ディスコデルモリド炭素骨格を完全に組み立てるために、「Ｃフラグメント」またはアナログを含むアルデヒド（Ｒ−ＣＨＯ）と反応させる。
【０１９７】
【化６４】
2004520008.tif 000061
（「Ｃフラグメント」改変を有するディスコデルモリド化合物）
ディスコデルモリドの「Ｃフラグメント」（Ｃ１−Ｃ７を含む）は、公知の構造−活性関係に基づくアナログ生成について、特に魅力的な標的である。Ｃ３位およびＣ７位のヒドロキシル基は、他の基（例えば、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基または他のヒドロキシ保護基）に変換され得る。あるいは、全「Ｃフラグメント」は、他の基（例えば、ラクトン以外のラクタム）によって、またはより単純な化学的アナログ（ここで、「Ｃフラグメント」に存在する官能基の１つ以上が非存在である）によって、置換され得る。
【０１９８】
本発明の１つの局面において、Ｃ−３位および／またはＣ−７位に水素を有するディスコデルモリド化合物が提供される。
【０１９９】
別の実施形態において、（４５）を、スキーム１７に示される（プロピリデン）トリフェニルホスホランと反応させる。得られるアルケンを、ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウムヒドリドクロリドで処理して、アルケンを末端位置に異性化する。オゾン分解によって、フラグメント（５７）を得、これを使用して、７−デオキシディスコデルモリドを調製する。
【０２００】
【化６５】
2004520008.tif 000062
第２の実施形態において、化合物（５６）は、脱保護され（スキーム１８）、そしてアルコールを、Ｂａｒｔｏｎ脱酸素（チオカルボニルジイミダゾール、続いて、Ｂｕ３ＳｎＨ）によって除去して、（５８）を得る。上記のような続く処理によってフラグメント（５９）を得る。これは、３，７−ジデオキシディスコデルモリドの合成に有用である。
【０２０１】
【化６６】
2004520008.tif 000063
（ラクタムディスコデルモリド化合物）
本発明の別の局面において、遺伝子操作されたＰＫＳを使用して調製された、発酵誘導ポリケチドを使用して、ディスコデルモリドのラクタムアナログ（すなわち、５−デオキシ−５−アミノディスコデルモリド）を作製する。
【０２０２】
１つの実施形態において、ラクタムディスコデルモリドは、化合物（６４）を使用して作製される。（６４）を作製するための１つの方法は、スキーム１９によって概略が示される。
【０２０３】
【化６７】
2004520008.tif 000064
ラクトン（Ｅ）（ここで、Ｒ１は、メチルであり、そしてＲ２は、Ｈである）（６０）を、上記のように調製する。アルコールの保護（好ましくは、ＴＢＳシリルエーテルとして）、続く脱ラクトン化によって、Ｗｅｉｎｒｅｂアミド（６２）を得る。（６２）のアリルアルコールを（好ましくは、メシレートとして）活性化し、そしてアジドを使用して配置を反転させて置換する。トリメチルホスフィンを使用するＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ還元によって、ラクタム（６３）を得、これを、上記スキーム１２に示される方法に従って、ラクタムフラグメント（６４）に変換する。
【０２０４】
本発明の別の実施形態において、ラクタム（６３）の窒素は、必要に応じて、強塩基（ｓｔｒｏｎ  ｂａｓｅ）（好ましくは、ＮａＨ）で処理され、続いて、アルキル化剤（例えば、ヨウ化メチル）と反応して、アルキル化される（スキーム２０）。この様式において、Ｎ−アルキル化ディスコデルモリドが調製される。
【０２０５】
【化６８】
2004520008.tif 000065
上記化合物（５７）、（５９）、（６４）などのうちの任意が、先に記載される反応のいずれかにおいて、Ｓｍｉｔｈ「Ｃフラグメント」（１６）を置き換えて、ディスコデルモリド化合物（１４−ノルディスコデルモリドを含む）を作製し得る。さらに、「Ｃフラグメント」の代わりの、より単純なアルデヒドの使用は、さらなるディスコデルモリドアナログを生じる。単純化されたＣフラグメントを含むディスコデルモリドアナログのような例は、Ｈｉｒｏｋａｚｕら、「Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｈｉｃｈ  ｍｉｍｉｃ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ」、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／４２１７９（本明細書中において参考として援用される）に与えられる。
【０２０６】
本発明の特に好ましい実施形態は、「Ｃフラグメント」が、（３−ヒドロキシフェニル）エチル基によって置換されるディスコデルモリドアナログを含む（例えば、化合物（１０４））。
【０２０７】
【化６９】
2004520008.tif 000066
化合物（１０４）は、上記のスキーム１６に記載されるように調製される。ここで、「Ｒ−ＣＨＯ」は、３−（３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）フェニルプロパナールである。
【０２０８】
（Ｙがアミノまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である、ディスコデルモリド化合物）
本発明の別の局面において、Ｙがアミノまたは−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２である、ディスコデルモリド化合物は、化合物（７１）（ＰＭＢ保護アルコールを含む炭素中心が、反対の立体化学である、化合物（３７）の改変版）を使用して作製される。化合物（７１）は、発酵誘導ラクトン（６５）（（ｅｒｙ）［モジュール（１）−ＫＳＯ］−［モジュール（２）］−ＴＥ  ＰＫＳを使用して調製される、Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝メチルである式（Ｅ）の化合物）から調製される（スキーム２１）。
【０２０９】
【化７０】
2004520008.tif 000067
ラクトン（６５）を、ＰＭＢトリクロロアセトイミデートおよび酸触媒を使用して、ＰＭＢエーテルとしてヒドロキシルを保護し、次いで、Ｗｅｉｎｒｅｂアミド（６７）に変換する。Ａｌｐｉｎｅ−Ｂｏｒａｎｅを使用する立体選択的ヒドロホウ素化、続く酸化的ワークアップによって、ジオール（６８）を得、これを、ビス−ＴＢＳエーテル（６９）として保護する。Ｗｅｉｎｒｅｂアミドのアルデヒドへの還元は、上記スキーム７に記載されるように、ディスコデルモリドのジエンセグメントの導入を可能にする。第１級アルコールの選択的脱保護は、（７１）を提供する。
【０２１０】
化合物（７１）は、本発明の他の化合物と組み合わせられて、Ｙを含む炭素（Ｃ１９）が、１４−ノルディスコデルモリドおよびＣセグメントにさらなる改変を有するディスコデルモリド（例えば、デオキシアナログおよびラクタム）を含む、ディスコデルモリド（１００）において通常見出される立体化学とは反対である、Ｙにおいてヒドロキシルを有するディスコデルモリド誘導体を調製し得る。これらの化合物は、ＰＭＢエーテルの除去（ジクロロジシアノキノン、ＤＤＱ）により、１９−アミノディスコデルモリドへ変換されて、アルコール（１０１）を得、メシレートとしてのヒドロキシルの活性化、Ｃ１９での配置の変換を伴う、アジドによるメシレートの置換、および最後に、アジドのアミンへのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ還元により、（１０２）を得る（スキーム２２）。
【０２１１】
【化７１】
2004520008.tif 000068
化合物（１０２）のアミノ基は、当該分野で公知の任意の多くの標準的な反応を使用して、さらに改変され得る。１つの好ましい実施形態において、化合物（１０２）のアミノ基は、尿素基に変換されて、スキーム２１に示すように、１９−尿素化合物（１０３）を生じる。別の好ましい実施形態において、化合物（１０４）の１９−尿素アナログ（１０５）は、本発明の方法に従って調製される。
【０２１２】
【化７２】
2004520008.tif 000069
上記エポチロンおよびディスコデルモリドの例によって説明されるように、本発明のキメラＰＫＳ構築物を使用して、特定のポリケチドを作製するための種々の方法が存在する。多くの代替の合成スキームが、ＢＩＯ−ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＯＦ  ＰＯＬＹＫＥＴＩＤＥＳと題された、発明者Ｄａｎｉｅｌ  ＳａｎｔｉおよびＧａｒｙ  Ａｓｈｌｅｙによる、２０００年８月９日に出願された、米国特許出願第６０／２２４，０３８号（本明細書中で参考として援用される）に提示される。これらの代替の手順の多くの例は、以下の実施例に与えられる。ポリケチド構造のライブラリーが、公知になるさらなるポリケチドとして修正され得るが、純粋に生物学的な技術を使用して、ほとんど任意のポリケチド構造を作製するために十分な多様性が現在のライブラリーに存在する。作製され得るポリケチドの数および多様性は、本明細書中に記載される生物学的技術が、標準的な化学戦略と組み合わされる場合、劇的に増加する。
【０２１３】
本発明の詳細な説明は、上に提供され、以下の実施例は、本発明を説明するために与えられ、本発明の範囲つまり特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。
【０２１４】
（実施例１）
（２−メチル−４−ペンテノエート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
【０２１５】
【化７３】
2004520008.tif 000070
氷で冷却された、１０ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中の２−メチル−４−ペンテン酸（１．１４ｇ）およびジフェニルホスホリルアジド（３．０ｇ）の溶液を、５ｍＬの乾燥トリエチルアミンで処理し、そして不活性雰囲気下で３０分間攪拌した。新たに蒸留されたＮ−アセチルシステアミン（１．５ｇ）を添加し、そしてこの混合物をさらに１時間攪拌した。反応を１０ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌの添加によってクエンチし、５０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、そして相を分離した。有機相を連続的に水およびブラインで洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、黄色油状物として、粗製のチオエステルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー（エーテル）での精製によって、油状物として純粋な生成物を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００  ＭＨｚ）：δ５．９６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．７２（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝７．２，１０．０，１７．２Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄｍ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄｍ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），３．４２（２Ｈ，ｍ），３．０２（２Ｈ，ｍ），２．７４（ｌＨ，ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７），２．４４（１Ｈ，ｍ），２．１８（１Ｈ，ｍ），１．９６（３Ｈ，ｓ），１．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）：δ２０３．６８，１７０．４９，１３４．８５，１１７．２５，４８．１７，３９．７６，３８．０３，２８．２０，２３．１７，１７．１３。
【０２１６】
（実施例２）
（±）−ｓｙｎ−２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキセノエート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
【０２１７】
【化７４】
2004520008.tif 000071
（工程１）無水ＣＨ２Ｃｌ２（１１００ｍＬ）中のＮ−プロピオニル−２−ベンゾオキサゾロン（１００．０ｇ）の溶液を、Ｎ２雰囲気下で、機械的に攪拌（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｉｒｒｉｎｇ）して、３℃に冷却した。ＴｉＣｌ４（５８．４ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加した（約１０分）。得られた黄色のスラリーを４０分間激しく攪拌し、次いで、トリエチルアミン（８７．４ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加した（約１０分）。得られた深赤色溶液を８０分間攪拌した。クロトンアルデヒド（５５ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加し（約２０分）、そして反応を薄層クロマトグラフィー（４：１  ヘキサン／酢酸エチル）で追った。９０分間攪拌した後、反応を、４５０ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌの添加によってクエンチした。相を分離し、そして水相を３回、７５０ｍＬ部のエーテルで抽出した。有機相を合わせ、そして２００ｍＬ部の２Ｎ  ＨＣｌで３回洗浄した。酸性洗浄液を合わせ、そして１５０ｍＬ部のエーテルで３回逆抽出した。合わせた有機抽出物を、３００ｍｌ飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回、そして３００ｍＬの飽和ＮａＣｌ水溶液で１回洗浄した。次いで、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で黄色スラリーに濃縮した。生成物を減圧濾過で集め、そしてヘキサンでリンスして無色固体を得た。濾液の濃縮によって、第２の産物生成物を得、これを、同じ様式で集め、１０３ｇ（８０％収率）の結晶生成物を得た；融点＝１２３〜４℃。母液をクロマトグラフィー（４：１  ヘキサン／酢酸エチル）にかけて、さらなる生成物を得た。融点７４〜６℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．０６（ｍ，１Ｈ）；７．２３（ｍ，３Ｈ）；５．７８（ｄｑｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５，７，１Ｈｚ）；５．５５（ｄｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝１５，７，２Ｈｚ）；４．５２（ｂｒ，１Ｈ）；４．０５（ｑｄ，１Ｈ，Ｊ＝７，４Ｈｚ）；２．３８（ｂｒ  ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ）；１．７０（ｄｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝７，１，１Ｈｚ，３Ｈ）；１．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７５．５０，１５１．２０，１４２．１８，１２９．９９，１２８．７８，１２７．８０，１２５．４３，１２４．８６，１１６．２２，１０９．８５，７２．９２，４４．３１，１７．７１，１１．０４。
【０２１８】
（工程２）１モル等量のナトリウムメトキシド（メタノール中、２５％ｗ／ｖ；約１５０ｍＬ）を、Ｎ２下でメタノール（９１０ｍＬ）中のＮ，Ｓ−ジアセチルシステアミン（１７３ｇ）の溶液にゆっくりしたストリームで添加する。計算された容量の半分を添加したときに、反応をＴＬＣ（１：１  酢酸エチル／ヘキサン）によってモニターし、そしてメトキシド添加を、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミンがＮ−アセチルシステアミンに完全に変換するまで、続けた。酢酸（５０ｇ）を添加し、そして得られたナトリウムチオエートの溶液を、Ｎ２下で、固体（±）−Ｎ−［ｓｙｎ−２−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキセノイル］−２−ベンゾオキサゾロン（２４０ｇ）を含むフラスコにカニューレで移した。１５分後、反応を、固体シュウ酸二水和物（８０．４ｇ）でクエンチし、濾過し、そして黄色油状物へと濃縮した。残留物を２：１ヘキサン／酢酸エチルに溶解して、そしてＳｉＯ２上のバッチ溶出クロマトグラフィーに供した。シリカを２：１ヘキサン／酢酸エチルで洗浄して、２−ベンゾオキサゾロンを除去し、次いで、生成物チオエステルを溶出するために、酢酸エチル／メタノール（９：１）で洗浄した。チオエステル含有溶出液のエバポレーションは、生成物を生じる。
【０２１９】
（実施例３）
（（±）−ｓｙｎ−４−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキセノエート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
【０２２０】
【化７５】
2004520008.tif 000072
（工程１）無水ＣＨ２Ｃｌ２（１１００ｍＬ）中のＮ−プロピオニル−２−ベンゾオキサゾロン（１００．０ｇ）の溶液を、Ｎ２雰囲気下で機械的に攪拌しながら３℃に冷却する。ＴｉＣｌ４（５８．４ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加する（約１０分）。得られた黄色のスラリーを４０分間激しく攪拌し、次いで、トリエチルアミン（８７．４ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加する（約１０分）。得られた深赤色溶液を８０分間攪拌する。メタクロレイン（５５ｍＬ）を、内部温度を１０℃以下に維持するような速度で添加し（約２０分）、そして反応を薄層クロマトグラフィー（４：１  ヘキサン／酢酸エチル）で追う。９０分間攪拌した後、反応を、４５０ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌの添加によってクエンチする。相を分離し、そして有機相をシリカゲルのパッドを通して濾過する。シリカゲルをエーテルで洗浄し、そして合わせた有機相を減圧下で濃縮した。生成物を減圧濾過によって集め、ヘキサンでリンスして、無色固体を得る。
【０２２１】
（工程２）１モル等量のナトリウムメトキシド（メタノール中、２５％ｗ／ｖ；約１５０ｍＬ）を、Ｎ２下でメタノール（９１０ｍＬ）中のＮ，Ｓ−ジアセチルシステアミン（１７３ｇ）の溶液にゆっくりしたストリームで添加する。計算された容量の半分を添加したときに、反応をＴＬＣ（１：１  酢酸エチル／ヘキサン）によってモニターし、そしてメトキシド添加を、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミンがＮ−アセチルシステアミンに完全に変換するまで、続ける。酢酸（５０ｇ）を添加し、そして得られたナトリウムチオエートの溶液を、Ｎ２下で、固体（±）−Ｎ−［ｓｙｎ−４−メチル−３−ヒドロキシ−４−ヘキセノイル］−２−ベンゾオキサゾロン（２４０ｇ）を含むフラスコにカニューレで移す。１５分後、反応を、固体シュウ酸二水和物（８０．４ｇ）でクエンチし、濾過し、そして黄色油状物へと濃縮する。残留物を２：１ヘキサン／酢酸エチル中に溶解し、そしてＳｉＯ２上のバッチ溶出クロマトグラフィーに供する。シリカを２：１ヘキサン／酢酸エチルで洗浄して、２−ベンゾオキサゾロンを除去し、次いで、生成物チオエステルを溶出するために、酢酸エチル／メタノール（９：１）で洗浄する。チオエステル含有溶出液のエバポレーションは、生成物を生じる。
【０２２２】
（実施例４）
（発酵によるポリケチド産生のための一般的な手順）
培養物を、ＦＫＡ基底培地（４５ｇ／Ｌデンプン、１０ｇ／Ｌコーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、１０ｇ／Ｌ乾燥デビッタードブリューワーズ酵母（ｄｅｂｉｔｔｅｒｅｄ  ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ）、１ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、および２３．８ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、遊離酸）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で、３０℃、１５０〜２５０ｒｐｍで増殖させる。振盪フラスコ培地ｐＨを、ｐＨ７．０に調節した後、１２１℃で９０分間オートクレービングにより滅菌する。バイオリアクター発酵培地を、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含まないで調製し、１２１℃で９０分間オートクレーブした。滅菌および冷却の後に、培地をｐＨ６．５に調節した。全ての培地に、滅菌後添加物として、（５０ｍｇ／ｍＬ）ＤＭＳＯ中の５０ｍｇ／Ｌチオストレプトン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および１０ｍＬ／Ｌの５０％（ｖ／ｖ）消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ，Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を補充する。グリセロール（３０％  ｖ／ｖ最終）を対数増殖培養物（ＦＫＡ培地中）に添加し、そして１ｍＬアリコートを−８５℃に凍結することによって調製した凍結細胞バンクとして株を維持する。チオエステルフィードストック（４００ｍｇ／ｍＬ）およびチオストレプトン（５０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭＳＯ溶液として調製し、これを培養物への添加の前に、０．２μｍナイロン膜を使用して滅菌濾過した。
【０２２３】
一次種培養物を、５０ｍＬのＦＫＡを細胞バンクバイアルに播種し、そして３日間培養することによって確立した。グルコース栄養補給を、単回の毎日のボーラスとして、滅菌濾過５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液の添加によって実行し、所望の補給速度を得る。３０℃、０．３ＶＶＭ気流、および６００ｒｐｍ攪拌で操作される、３Ｌの産生培地を用いて、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  ＭＤ  ５Ｌ発酵槽で、バイオリアクター発酵を行う。溶解した酸素濃度およびｐＨを、オートクレーブ可能電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用してモニターする。これらの操作条件下で、溶解した酸素を、全ての回において、５０％より多く維持する。５０％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ溶液の自動添加によって泡立ちを制御する。ｐＨを、２．５Ｎ水酸化ナトリウムまたは硫酸の自動添加によって制御する。バイオリアクターを、２５ｍＬの一次種を５００ｍＬのＦＫＡにサブ培養し、そして２日間培養することによって調製した、５％（ｖ／ｖ）二次種培養物を用いて播種する。バイオリアクターへの播種のときに、チオエステル供給原料を、２ｇ／Ｌの最終濃度まで添加し、そして発酵を６日間進める。細胞を遠心分離によって除去し、そしてブロスをＸＡＤ−１６のカラムを通して濾過して、ポリケチド産物を吸収する。２カラム容量の水で洗浄後、樹脂を、アセトンで溶出する。溶出液を水性スラリーにエバポレートし、これを、酢酸エチルで抽出する。抽出物を乾燥しそして濃縮する。ポリケチド産物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２２４】
（実施例５）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４，６−トリメチル−８−ノネノエート  δ−ラクトン）
【０２２５】
【化７６】
2004520008.tif 000073
（方法Ａ：）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１５５を、ｐＳＥＴ型（組み込み）プラスミド中のＤＥＢＳ３タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＯＳ１０−１５３を用いて形質転換した。寒天プラグを使用して、Ｒ６ブロスの５ｍＬ種培養物を播種し、そして２００ｒｐｍで３０℃で２日間、増殖させた。この培養物の２．５ｍＬ部を使用して、２５０ｍＬ緩衝化フラスコ中の５０ｍＬのＲ６培地を播種し、そして２００ｒｐｍで３０℃でインキュベートした。一日後、２−メチル−４−ペンテノエート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエーテルの溶液を、（ＤＭＳＯ中、４０％ｗ／ｖ溶液から１ｇ／Ｌの最終濃度まで）添加した。次いで、ブロスのサンプルを、間隔をおいてフラスコから採取した。チオエステルを添加した培養物からのブロスおよびチオエステルを添加していない培養物からのブロスを、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０２２６】
（方法Ｂ：）
メチルスルホキシド中の２−メチル−４−ペンテノエート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル（２０ｇ／Ｌ）の溶液を、ＤＥＢＳ３タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９の２日培養物に添加する。発酵を、実施例４の一般的な手順に記載したように、実行する。
【０２２７】
（実施例６）
（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，４，６−トリメチル−８−ノネノエート  δ−ラクトン）
【０２２８】
【化７７】
2004520008.tif 000074
乾燥メチルスルホキシド（０．４５ｍＬ）を、−７８℃で、不活性雰囲気下で、３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の塩化オキサリル（０．２８ｍＬ）の溶液に滴下する。１０分後、１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４，６−トリメチル−８−ノネノエート  δ−ラクトン（６００ｍｇ）の溶液を滴下し、続いてトリエチルアミン（２．０ｍＬ）を添加した。攪拌を、２０分間続け、次いで、反応物を３０分間にわたって室温に温める。ブライン（３０ｍＬ）を添加し、そして混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。生成物をシリカクロマトグラフィーによって精製する。
【０２２９】
（実施例７）
（（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエート  δ−ラクトン）
【０２３０】
【化７８】
2004520008.tif 000075
１０ｍＬのテトラヒドロフラン中の（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，４，６−トリメチル−８−ノネノエート  δ−ラクトン（２．１ｇ）の溶液を、１０ｍＬのテトラヒドロフラン中の水素化ナトリウム（オイル中６０％分散物の０．５０ｇ）の０℃懸濁液に滴下する。ヨウ化メチル（２ｇ）を添加し、そして混合物を室温まで温め、そして薄層クロマトグラフィー分析によって示されるように、完了するまで攪拌する。反応物をエーテルで希釈し、０℃で１Ｎ  ＨＣｌの添加によってクエンチし、そして相を分離する。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２３１】
（実施例８）
【０２３２】
【化７９】
2004520008.tif 000076
（Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシ（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエートアミド）
トルエン中のトリメチルアルミニウム（１０ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液を、８ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で滴下して加える。得られる均一溶液を、大気温度で３０分間攪拌する。４ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエート□−ラクトン（２ｍｍｏｌ）の溶液を、１０分間かけて添加し、そして得られる溶液を、出発材料の完全な消費まで、還流下で加熱する。冷却の際に、この混合物を１Ｍ  ＨＣｌに注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を、５％  ＮａＨＣＯ３およびブラインを用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２３３】
（実施例９）
（Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシ（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエートアミド）
【０２３４】
【化８０】
2004520008.tif 000077
ピリジン（２ｍＬ）中、Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシ（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエートアミド（１ｍｍｏｌ）および２，２，２−トリクロロエチルクロロホルメート（１．５ｍｍｏｌ）の溶液を、一晩攪拌する。この混合物を、乾燥するまで濃縮する。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、１Ｎ  ＨＣ１、５％  ＮａＨＣＯ３、およびブラインで連続的に洗浄する。ＭｇＳＯ４での乾燥後、この溶液を濾過し、乾燥するまでエバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２３５】
（実施例１０）
（（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネナール）
【０２３６】
【化８１】
2004520008.tif 000078
２０ｍＬ  トルエン中のＮ−メチル−Ｎ−メトキシ（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエートアミド（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃に冷却し、トルエン中の水素化ジイソブチルアルミニウム（５０ｍｍｏｌ）の１．５Ｍ溶液を、４５分間かけて滴下して加える。攪拌を、薄層クロマトグラフィー分析によって決定されるように、出発材料の完全な消費まで続ける。酢酸エチル（１０ｍＬ）を添加し、この混合物を、大気温度まで温める。１００ｍＬ部の１Ｎ  ＨＣｌを添加し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する前に、この混合物をさらに１時間攪拌する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２３７】
（実施例１１）
（ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−オキソ−４，４，６，８−テトラメチル−７−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）−１０−ウンデセノエート）
【０２３８】
【化８２】
2004520008.tif 000079
酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．０ｍＬ）を、３５ｍＬ  エーテル中のリチウムジイソプロピルアミド（８．７ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に添加し、この混合物を１時間攪拌する。１００ｍＬ  エーテル中のビス［１，２：５，６−ジ−Ｏ−イソプロピリデン−α−Ｌ−グルコフラノース−３−Ｏ−イル］シクロペンタジエニルチタニウムクロライド（９．７ｍｍｏｌ）の溶液を、１時間かけて添加し、攪拌をさらに３０分間続ける。反応を−３０℃まで温め、１時間維持し、次いで、−７８℃に冷却する。２０ｍＬ  エーテル中の（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−３−オキソ−２，４，６−テトラメチル−８−ノネナールの溶液を添加し、反応物を２時間攪拌し、水性ＴＨＦでクエンチし、次いで、セライトを通して濾過し、濃縮する。生成物を、ヘキサン中の７％  酢酸エチルを用いて、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２３９】
（実施例１２）
（ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−（トリエチルシリルオキシ）−５−オキソ−４，４，６，８−テトラメチル−７−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）−１０−ウンデセノエート）
【０２４０】
【化８３】
2004520008.tif 000080
５ｍＬ  ジメチルホルムアミド中のｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−オキソ−４，４，６，８−テトラメチル−７−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）−１０−ウンデセノエート（１．０ｇ）、トリエチルクロロシラン（０．３８ｇ）、およびイミダゾール（０．２７ｇ）の混合物を、一晩攪拌し、次いで水に注ぎ、エーテルで抽出した。抽出物を蒸発させ、シリカゲルでクロマトグラフィーにかけ、生成物を得る。
【０２４１】
（実施例１３）
（３Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−１５−ヒドロキシ−３−（トリエチルシリルオキシ）−５−オキソ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−７−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−１７−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１２，１６−ジエン酸）
【０２４２】
【化８４】
2004520008.tif 000081
８０ｍＬ  テトラヒドロフラン中のｔブチル（３Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−（トリエチルシリルオキシ）−５−オキソ−４，４，６，８−テトラメチル−７−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−１０−ウンデセノエートチオエステル（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンの０．５Ｍ溶液で処理する。別のフラスコにおいて、４−（６−ヨード−３−アセトキシ−２−メチル−２，６，−ヘプタジエニル）−２−メチルチアゾール（１３ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬ  ジメチルホルムアミドに溶解し、炭酸セシウム（２１ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら添加し、続いて、トリフェニルアルシン（１１ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１ｍｍｏｌ）、および水（７ｍＬ）を連続的に添加する。４時間後、ボラン混合物を、ヨージド混合物に添加する。色が消失した後（約２時間）、混合物を水に注ぎ、１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ４．０に調整し、この混合物をエーテルを用いて抽出する。抽出物を水およびブラインを用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。粗物質を１：１  メタノール／水に溶解し、炭酸カリウムと共に攪拌して、アセテートおよびチオエステルを除去する。完了した際に、この混合物を濃縮して、メタノールを除去し、エーテルを用いた抽出の前に、水相を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ  ４に調整する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２４３】
（実施例１４）
（３−Ｏ−トリエチルシリル−７−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）エポチロンＤ）
【０２４４】
【化８５】
2004520008.tif 000082
テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中の（３Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−１５−ヒドロキシ−３−（トリエチルシリルオキシ）−５−オキソ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−７−（（２，２，２−トリクロロエトキシ）カルボニルオキシ）−１７−（２−メチル−４−チアゾリル）ヘプタデカ−１２，１６−ジエン酸（１０ｍｍｏｌ）溶液を、トリエチルアミン（６０ｍｍｏｌ）および２，４，６−トリクロロベンゾイルクロライド（５０ｍｍｏｌ）を用いて大気温度で１５分間処理し、次いで、８００ｍＬ  トルエンを用いて希釈する。この溶液を、１２Ｌ  トルエン中の４−ジメチルアミノピリジン（１０５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に滴下して加える。添加後、この混合物をさらに１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮する。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２４５】
（実施例１５）
（３−Ｏ−（トリエチルシリル）エポチロンＤ）
【０２４６】
【化８６】
2004520008.tif 000083
４０ｍＬ  テトラヒドロフラン中のサマリウム（３．４３ｍｍｏｌ）およびヨウ素（３．０９ｍｍｏｌ）の溶液を還流下で２．５時間攪拌することによって、ヨウ化サマリウムを調製する。大気温度に冷却する際、１０ｍｇ  ＮｉＩ２を添加し、この混合物を−７８℃に冷却する。１０ｍＬ  テトラヒドロフラン中の３−Ｏ−トリエチルシリル−７−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）エポチロンＤ（０．３８６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、この混合物を、−７８℃で１時間攪拌する。反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３の添加によってクエンチし、大気温度に温め、エーテルを用いて抽出する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２４７】
（実施例１６）
（エポチロンＤ）
【０２４８】
【化８７】
2004520008.tif 000084
テフロン（登録商標）反応容器中の２０ｍＬ  テトラヒドロフラン中の３−Ｏ−（トリエチルシリル）エポチロンＤ（１ｍｍｏｌ）の溶液を、氷上で冷却し、１０ｍＬ  ＨＦ・ピリジンを用いて９０分間処理する。反応物を飽和ＮａＨＣＯ３に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２４９】
（実施例１７）
（（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエン酸δ−ラクトン）
【０２５０】
【化８８】
2004520008.tif 000085
８０ｍＬ  テトラヒドロフラン中（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６−テトラメチル−８−ノネノエートδ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナンの０．５Ｍ溶液を用いて処理する。別のフラスコにおいて、４−（６−ヨード−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−２−メチル−２，６，−ヘプタジエニル）−２−メチルチアゾール（１３ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬ  ジメチルホルムアミドに溶解し、炭酸セシウム（２１ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら添加し、続いて、トリフェニルアルシン（１１ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］−ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１ｍｍｏｌ）、および水（７ｍＬ）を連続的に添加する。４時間後、ボラン混合物を、ヨージド混合物に添加する。色が消失した後（約２時間）、混合物を水に注ぎ、エーテルを用いて抽出する。抽出物を水およびブラインを用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２５１】
（実施例１８）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエンアミド）
【０２５２】
【化８９】
2004520008.tif 000086
トルエン中のトリメチルアルミニウム（１０ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液を、８ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で滴下して加える。得られる均一溶液を、大気温度で３０分間攪拌する。４ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエン酸□−ラクトン（２ｍｍｏｌ）の溶液を、１０分間かけて添加し、そして得られる溶液を、出発材料の完全な消費まで、還流下で加熱する。冷却の際に、この混合物を１Ｍ  ＨＣ１に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を、５％  ＮａＨＣＯ３およびブラインを用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２５３】
（実施例１９）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエンアミド）
【０２５４】
【化９０】
2004520008.tif 000087
５０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエンアミド（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、２，６−ルチジン（３０ｍｍｏｌ）およびｔブチルジメチルシリルトリフレート（ｔｒｉｆｌａｔｅ）（２５ｍｍｏｌ）を用いて１時間処理する。混合物を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出する。抽出物を１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６）、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインを用いて連続的に洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２５５】
（実施例２０）
（（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエナール）
【０２５６】
【化９１】
2004520008.tif 000088
２０ｍＬ  トルエン中のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエンアミド（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃に冷却し、トルエン中の水素化ジイソブチルアルミニウム（５０ｍｍｏｌ）の１．５Ｍ溶液を、４５分間かけて滴下して加える。攪拌を、薄層クロマトグラフィー分析によって決定されるように、出発材料の完全な消費まで続ける。酢酸エチル（１０ｍＬ）を添加し、この混合物を、大気温度まで温める。１００ｍＬ部の１Ｎ  ＨＣｌを添加し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する前に、この混合物をさらに１時間攪拌する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２５７】
（実施例２１）
（ｔブチル（３Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−オキソ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−７，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１７−（２−メチル−４−チアゾリル）ヘプタデカ−１２，１６−ジエン酸チオエステル）
【０２５８】
【化９２】
2004520008.tif 000089
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のｔブチルチオアセテート（１０ｍｍｏｌ）の溶液を氷上で冷却し、（２Ｓ，５Ｓ）−２，５−ジメチルボロラントリフレート（（２Ｓ，５Ｓ）−２，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｏｒｏｌａｎｅ  ｔｒｉｆｌａｔｅ）（１１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１２ｍｍｏｌ）を用いて連続的に処理する。この混合物を−７８℃に冷却し、１０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ，１３Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−２，２，４，６，１０，１４−ヘキサメチル−１３，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１５−（２−メチル−４−チアゾリル）ペンタデカ−１０，１４−ジエナール（ｄｉｅｎａｌ）（９ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下して加える。この混合物を３０分間攪拌し、次いで、０℃に温め、１時間維持する。２５ｍＬの１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）および７５ｍＬのメタノールの混合物を添加し、続いて、７５ｍＬの２：１  メタノール／５０％  Ｈ２Ｏ２を添加し、次いで、この混合物を、１時間０℃で攪拌する。反応物を、減圧下でスラリーに濃縮し、水で希釈し、そして酢酸エチルを用いて抽出する。この抽出物を、５％  ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、ついで、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２５９】
（実施例２２）
（エポチロンＤ）
【０２６０】
【化９３】
2004520008.tif 000090
２０ｍＬ  テトラヒドロフラン中のｔブチル（３Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−オキソ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−７，１５−ジ（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１７−（２−メチル−４−チアゾリル）ヘプタデカ−１２，１６−ジエン酸チオエステル（１ｍｍｏｌ）の溶液を、氷上で冷却し、無水フッ化テトラブチルアンモニウム（５ｍｍｏｌ）を用いて処理する。完了の際に、反応物を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出する。抽出物を、水、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブラインを用いて連続的に洗浄する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２６１】
（実施例２３）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトンの調製）
【０２６２】
【化９４】
2004520008.tif 000091
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトンを、２−メチル−３−ヒドロキシル−４−ヘキセノイエート（ｈｅｘｅｎｏｉａｔｅ）ＮアセチルシステアミンチオエステルをＤＥＢＳ１を含む機能的ＰＫＳ系に提供し、ドメインを遊離させることによって作製する。ここで、モジュール１のケトシンターゼドメインを、不活性化し、実施例４の手順に従って発酵させている。
【０２６３】
（実施例２４）
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトンの調製）
【０２６４】
【化９５】
2004520008.tif 000092
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトンを、２−メチル−３−ヒドロキシル−４−ヘキセノイエートＮアセチルシステアミンチオエステルをＤＥＢＳ１を含む機能的ＰＫＳ系に提供し、ドメインを遊離させることによって作製する。ここで、モジュール１のケトシンターゼドメインを、不活性化し、ＤＥＢＳのモジュール２のケトレダクターゼ（「ＫＲ」）ドメインを、ラパマイシンのモジュール２のケトレダクターゼドメインと置換させ、実施例４の手順に従って発酵させている。
【０２６５】
（実施例２５）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オキソ−６−ヘキサン酸δ−ラクトンの調製）
【０２６６】
【化９６】
2004520008.tif 000093
１０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトン（１．８４ｇ）の溶液を、−７８℃に冷却し、青色が持続するまでオゾンのストリームの気泡を通す。混合物に、青色が消えるまで窒素ガスのストリームを流し、次いで、硫化ジメチル（２ｍＬ）を用いて処理し、大気温度まで温め、濃縮する。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２６７】
（実施例２６）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−ペンタン酸δ−ラクトンの調製）
【０２６８】
【化９７】
2004520008.tif 000094
１００ｍＬ  ベンゼン中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オキソ−６−ヘキサン酸δ−ラクトン（１．７２ｇ）およびトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウムクロリド（９．２５ｇ）の溶液を、還流下で８時間加熱し、次いでエバポレートさせる。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２６９】
（実施例２７）
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４，６−トリメチル−６−ヘプテン酸δ−ラクトンの調製）
【０２７０】
【化９８】
2004520008.tif 000095
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４，６−トリメチル−６−ヘプテン酸δ−ラクトンを、２，４−ジメチル−３−ヒドロキシ−４−ペンテノエートＮ−アセチルシステアミンチオエステルをＤＥＢＳ１を含む機能性ＰＫＳ系に提供し、ドメインを遊離させることによって作製する。ここで、モジュール１のケトシンターゼドメインを不活性化し、ＤＥＢＳのモジュール２のケトレダクターゼ（「ＫＲ」）ドメインを、ラパマイシンのモジュール２のケトレダクターゼドメインと置換し、実施例４の手順に従って発酵させている。
【０２７１】
（実施例２８）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド）
【０２７２】
【化９９】
2004520008.tif 000096
トルエン中のトリメチルアルミニウム（１０ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液を、８ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンハイドロクロライド（１０ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で滴下して加える。得られる均一溶液を、大気温度で３０分間攪拌する。４ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−ペンタン酸δ−ラクトン（２ｍｍｏｌ）の溶液を、１０分間かけて添加し、出発材料の完全な消費まで、得られる溶液を還流下で加熱する。冷却の際に、この混合物を１Ｍ  ＨＣｌに注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出する。抽出物を、５％  ＮａＨＣＯ３およびブラインを用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７３】
（実施例２９）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）ペンタンアミド（「一般的な前駆体」））
【０２７４】
【化１００】
2004520008.tif 000097
５ｍＬ  メタノール中のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド（１ｍｍｏｌ）の溶液を、ジブチルスズオキシド（２５０ｍｇ）を用いて還流下で１時間処理し、次いで、４−メトキシベンジルクロリド（２５０ｍｇ）を用いて処理する。混合物を蒸発させ、生成物を、シリカゲルのクロマトグラフィーによって単離する。
【０２７５】
（実施例３０）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３，５−トリオール）
【０２７６】
【化１０１】
2004520008.tif 000098
１．５ｍＬ  テトラヒドロフラン中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４，６−トリメチル−６−ヘプテン酸δ−ラクトン（１ｍｍｏｌ）の溶液を、氷上で冷却した３ｍＬ  テトラヒドロフラン中の水素化アルミニウムリチウム（２ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下して加える。１時間攪拌した後、この混合物を大気温度まで温め、２４時間攪拌する。次いで、反応物を、氷上で冷却し、水および１５％  ＫＯＨを用いて連続的に処理し、次いで、大気温度で２４時間激しく攪拌する。濾過によって固体を除去し、溶離剤を減圧下で濃縮する。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７７】
（実施例３１）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３，５−トリオール１，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４，６−ｔｒｉｉｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔ−６−ｅｎ−１，３，５−ｔｒｉｏｌ  １，３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔａｌ））
【０２７８】
【化１０２】
2004520008.tif 000099
５ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３，５−トリオール（１ｍｍｏｌ）および４−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（１．２ｍｍｏｌ）の混合物を、ショウノウスルホン酸（０．０５ｍｍｏｌ）を用いて１２時間処理する。飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物をブラインを用いて洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７９】
（実施例３２）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３−ジオール１，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０２８０】
【化１０３】
2004520008.tif 000100
２５ｍＬ  ジメチルホルムアミド中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３，５−トリオール１，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１２ｍｍｏｌ）、およびイミダゾール（２０ｍｍｏｌ）の混合物を、大気温度で２４時間攪拌し、次いで、水に注ぎ、エーテルで抽出する。抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２８１】
（実施例３３）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヘプタノール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタールの代替調製物）
【０２８２】
【化１０４】
2004520008.tif 000101
１０ｍＬ  テトラヒドロフラン中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２，４，６−トリメチルヘプト−６−エン−１，３−ジオール１，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１０ｍｍｏｌ）およびトリス（トリフェニルホスフィン）ロジウムクロリド（０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、テトラヒドロフラン中のカテコールボラン（３０ｍｍｏｌ）の１Ｍ溶液を用いて、大気温度で８時間処理する。エタノール（３ｍＬ）を添加し、続いて２５ｍＬ  飽和ＮａＨＣＯ３および１０ｍＬ  ３０％  Ｈ２Ｏ２を添加する。この混合物を、２時間激しく攪拌し、次いで、飽和Ｎａ２ＳＯ３で希釈し、エーテルで抽出する。抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２８３】
（実施例３４）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヨードヘプタン５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０２８４】
【化１０５】
2004520008.tif 000102
７０ｍＬ  １：２  ベンゼン／エーテル中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヘプタノール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、トリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１５ｍｍｏｌ）、およびヨウ素（１５ｍｍｏｌ）を用いて激しく攪拌しながら処理する。１時間後、混合物をエーテルで希釈し、飽和チオ硫酸ナトリウムおよびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２８５】
（実施例３５）
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテン酸δ−ラクトン）
【０２８６】
【化１０６】
2004520008.tif 000103
１０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）、２，６−ルチジン（１５ｍｍｏｌ）、およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（１１ｍｍｏｌ）の溶液を、１時間攪拌する。この混合物を水で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２８７】
（実施例３６）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５−ヒドロキシ−８−オキソ−２，４−ジメチル−３，７−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−オクタン酸δ−ラクトン）
【０２８８】
【化１０７】
2004520008.tif 000104
１５０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５−ヒドロキシ−２，４，９−トリメチル−３，７−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−デセン酸δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、−７８℃に冷却し、青色が持続するまで酸素中のオゾンストリームの気泡を通す。混合物を、空気のストリームによって１０分間パージし、次いで、トリフェニルホスフィン（１１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加する。混合物を大気温度に温め、１時間攪拌し、次いで、濃縮する。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２８９】
（実施例３７）
【０２９０】
【化１０８】
2004520008.tif 000105
１００ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２中の実施例５１の生成物（１０ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ  ペリオジナン（ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）（１２ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（３０ｍｍｏｌ）を用いて３時間処理し、続いて、飽和ＮａＳ２Ｏ３および飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加してクエンチする。混合物を、エーテルで抽出し、抽出物を水およびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。粗アルデヒドを、次の工程に直ぐに使用する。
【０２９１】
ペンタン（２０ｍｍｏｌ）中のｔｅｒｔ−ブチルリチウムの１．７Ｍ溶液を、６０ｍＬの脱気したテトラヒドロフラン中のアリルジフェニルホスフィン（２０ｍｍｏｌ）の−７８℃溶液に添加する。混合物を５分間攪拌し、０℃に温め、３０分間攪拌し、−７８℃に再冷却する。チタンテトライソプロポキシド（２０ｍｍｏｌ）を添加する。３０分後、３５ｍＬ  テトラヒドロフラン中の上記からのアルデヒドの冷溶液を添加し、１時間攪拌する。この溶液を０℃に温め、ヨウ化メチル（１００ｍＬ）を添加する。溶液を大気温度で１６時間攪拌し、リン酸緩衝液（ｐＨ７）の添加によってクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出する。抽出物をブラインを用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートさせる。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２９２】
（実施例３８）
【０２９３】
【化１０９】
2004520008.tif 000106
メタノール（０．７５ｍＬ）を、クロロカテコールボラン（７２．５ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）の０℃溶液に加える。得られた溶液を、０℃にて、実施例５２の生成物（１０ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ２Ｃｌ２溶液に滴下し、この反応物を、薄層クロマトグラフィーによってモニタリングする。一旦、反応が約９０％完了すると、この混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３で処理して、１５分間攪拌する。この混合物をエーテルで抽出し、この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０２９４】
（実施例３９）
【０２９５】
【化１１０】
2004520008.tif 000107
ヨウ素（２０ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬのエーテル溶液を、実施例５３のアルコール生成物（１０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２５ｍｍｏｌ）、およびイミダゾール（２５ｍｍｏｌ）を含有する、０℃まで冷却した２００ｍＬの１：１  エーテル／ベンゼン溶液に滴下する。得られた懸濁液を、３０分間攪拌し、次いで、７５０ｍＬの１：１  水／ヘキサン中に注ぐ。相を分離し、水相を、ヘキサンで抽出する。有機相を合わせて、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液、水およびブラインでアッシュし、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、スラリーを得る。このスラリーを、少容量のＣＨ２Ｃｌ２と共にシリカゲルのショートカラムに充填し、そしてこの生成物を、２％  エーテル＋０．０５％  Ｅｔ３Ｎ含有ヘキサンの混合物を用いて迅速に溶出する。この溶出液を減圧中で濃縮して、粗状ヨウ化物を得る。これを、２５ｍＬの７：３  ベンゼン／トルエンに溶解し、１ｍＬのジイソプロピルエチルアミンおよび１２．５ｇのトリフェニルホスフィンで処理し、高圧装置にロードし、１４日間１２．８ｋｂａｒの圧力に供する。次いで、この混合物を濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィーを行って生成物を得る。この生成物を、ベンゼンから繰返しエバポレートさせることによって乾燥し、続いて減圧下で、５０℃にて１２時間加熱する。
【０２９６】
（実施例４０）
【０２９７】
【化１１１】
2004520008.tif 000108
実施例５４のホスホニウム塩生成物（１１ｍｍｏｌ）を、６０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、アルゴン雰囲気下に置いて、−２０℃まで冷却する。ビス（トリメチルシリル）アミドナトリウム（１０．５ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフランの１．０Ｍ溶液を加え、この混合物を１５分間攪拌し、０℃まで温め、３０分間攪拌し、次いで、−２５℃まで再冷却する。実施例４７からのアルデヒド（１１ｍｍｏｌ）を含有する３０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、１５分間にわたって加え、次いで、この混合物を−１０℃までゆっくりと温め、飽和ＮＨ４Ｃｌとエーテルとの混合物でクエンチする。この混合物をエーテルで抽出し、この抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０２９８】
（実施例４１）
【０２９９】
【化１１２】
2004520008.tif 000109
実施例５５の生成物（１０ｍｍｏｌ）を含有する１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を、０℃まで冷却し、水（５ｍＬ）および２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（１２ｍｍｏｌ）で１０分間処理する。この混合物を、大気温度まで温めて、５分間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３で処理し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、水およびブラインで洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０３００】
（実施例４２）
【０３０１】
【化１１３】
2004520008.tif 000110
実施例５６（１０ｍｍｏｌ）からのアルコールを含有するＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液を、大気温度にて１時間、トリクロロアセチルイソシアネート（１２ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を、中性アルミナにロードし、酢酸エチルを用いて４時間後にアリミナから溶出させる。この溶出液を濃縮し、この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３０２】
（実施例４３）
（（＋）−ディスコデルモリド）
【０３０３】
【化１１４】
2004520008.tif 000111
実施例５７の生成物（１ｍｍｏｌ）を、３００ｍＬのメタノールに溶解し、１５分間攪拌し、次いで、３Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）を、沈殿が最小となるような速度で、２０ｍＬずつ加える。この添加の完了後、さらなる３Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を、１５分間隔で４回で加える。８時間後、最終部の３Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を加え、この溶液を２時間攪拌し、最後に、酢酸エチル（２０００ｍＬ）で希釈する。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物に、シリカゲル上のクロマトグラフィーを行って、次いでアセトニトリルから結晶化させる。
【０３０４】
（実施例４４）
（（７Ｚ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−２，４，６−トリメチルデカ−７，９−ジエノエート（ｄｉｅｎｏａｔｅ）  δ−ラクトン）
【０３０５】
【化１１５】
2004520008.tif 000112
アリルジフェニルホスフィン（１０．８ｍｍｏｌ）を含有する３５ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、−７８℃まで冷却し、そしてｔｅｒｔ−ブチルリチウムを含有するペンタン（１０．８ｍｍｏｌ）の１．７Ｍ溶液で５分間処理する。この溶液を０℃まで温め、さらに３０分間攪拌し、次いで、−７８℃まで再冷却する。チタンテトライソプロポキシド（１０．８ｍｍｏｌ）を加え、攪拌を３０分間続け、その後、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−５−ヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−７−オキソ−２，４，６−トリメチルヘプタノエート  δ−ラクトン（５．４ｍｍｏｌ）を含有する２０ｍＬのテトラヒドロフランの−７８℃溶液を加える。１時間後、この混合物を０℃まで温め、ヨードメタン（３．４ｍＬ）を加え、そしてこの混合物を、大気温度で１６時間攪拌する。リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３０６】
（実施例４５）
（（７Ｚ）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−（（ｔブチルジメチルシリル）オキシ）−２，４，６−トリメチルデカ−７，９−ジエン−１−オール）
【０３０７】
【化１１６】
2004520008.tif 000113
４−メトキシベンジルアルコール（１１ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、水素化ナトリウム（１２ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬのテトラヒドロフランの懸濁液に滴下する。ガス展開を停止した後、この混合物を、（７Ｚ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−２，４，６−トリメチルデカ−７，９−ジエノエート  δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬのテトラヒドロフラン溶液で処理する。この反応物を、薄層クロマトグラフィーによってモニタリングする。ラクトンが消失した後、この混合物を、４−メトキシベンジルブロミド（１２ｍｍｏｌ）およびヨウ化テトラブチルアンモニウム（１ｍｍｏｌ）で、大気温度にて５時間処理する。この混合物を、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を加えることによってクエンチし、エーテルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、粗状保護エステルを得る。この粗状エステルを１０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、水素化アルミニウムリチウム（１０ｍＬ）の１．０Ｍ溶液に０℃で加える。３時間攪拌した後、この混合物を、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、エーテルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、粗状アルコールを得る。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３０８】
（実施例４６）
（（７Ｚ）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−（（ｔブチルジメチルシリル）オキシ）−２，４，６−トリメチルウンデカ−７，９−ジエンニトリル）
【０３０９】
【化１１７】
2004520008.tif 000114
（７Ｚ）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−（（ｔブチルジメチルシリル）オキシ）−２，４，６−トリメチルデカ−７，９−ジエン−１−オール（１０ｍｍｏｌ）を含有する７０ｍＬの１：２  ベンゼン／エーテル溶液を、激しく攪拌しながら、トリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１５ｍｍｏｌ）、およびヨウ素（１５ｍｍｏｌ）で処理する。１時間後、この混合物を、エーテルで希釈し、飽和チオ硫酸ナトリウムおよびブラインで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この粗状ヨウ化物を、メチルスルホキシド（５０ｍＬ）に溶解し、シアン化ナトリウム（１５ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を、水で希釈し、エーテルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０３１０】
（実施例４７）
（（７Ｚ）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−（（ｔブチルジメチルシリル）オキシ）−２，４，６−トリメチルウンデカ−７，９−ジエニール（ｄｉｅｎｅａｌ））
【０３１１】
【化１１８】
2004520008.tif 000115
（７Ｚ）−（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）−３−（（ｔブチルジメチルシリル）オキシ）−２，４，６−トリメチルウンデカ−７，９−ジエンニトリル（１０ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液を、−６０℃まで冷却し、ジイソブチルアルミニウムヒドリドを含有するトルエン（１２ｍＬ）の１．０Ｍ溶液で処理する。１時間後、この混合物を、大気温度まで温め、さらに３時間保持して、その後、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を加える。３０分後、この混合物を、５％  Ｈ２ＳＯ４で慎重に酸性化し、直ちにエーテルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０３１２】
（実施例４８）
（３，７，１１，１７−テトラ−（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１９−（Ｏ−デスカルバモイルオキシ）−１９−アミノディスコデルモリド）
【０３１３】
【化１１９】
2004520008.tif 000116
３，７，１１，１７−テトラ−（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１９−（Ｏ−デスカルバモイル）−１９−エピ−ディスコデルモリド（１ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬのＤＭＦ溶液を０℃まで冷却し、ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍｍｏｌ）およびメタンスルホン酸無水物（１．５ｍｍｏｌ）で処理する。１時間後、この混合物を、アジ化ナトリウム（１０ｍｍｏｌ）で処理する。この反応を、５０℃にて２時間継続し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この１９−アジド生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３１４】
この１９−アジドを１０ｍＬのＴＨＦに溶解し、トリメチルホスフィン含有ＴＨＦの１Ｍ溶液の５ｍＬで処理する。２時間後、水を加え、この混合物を一晩攪拌し、次いで乾燥するまで濃縮する。この１９−アミンを、シリカゲルクロマトグラフィーによって単離する。
【０３１５】
（実施例４９）
（３，７，１１，１７−テトラ−（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１９−（Ｏ−デスカルバモイルオキシ）−１９−（カルバモイルアミノ）ディスコデルモリド）
【０３１６】
【化１２０】
2004520008.tif 000117
３，７，１１，１７−テトラ−（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１９−（Ｏ−デスカルバモイルオキシ）−１９−アミノディスコデルモリド（１ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を、大気温度にて１時間、トリクロロアセチルイソシアネート（１．２ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を、中性アルミナにロードし、酢酸エチルを用いて４時間後にアリミナから溶出させる。この溶出液を濃縮し、そしてこの生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３１７】
（実施例５０）
（１９−（Ｏ−デスカルバモイルオキシ）−１９−（カルバモイルアミノ）ディスコデルモリド）
【０３１８】
【化１２１】
2004520008.tif 000118
３，７，１１，１７−テトラ−（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１９−（Ｏ−デスカルバモイルオキシ）−１９−（カルバモイルアミノ）ディスコデルモリド（１ｍｍｏｌ）を、３００ｍＬのメタノールに溶解し、１５分間攪拌し、次いで、３Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）を、沈殿が最小となるような速度で、２０ｍＬずつ加える。この添加の完了後、さらなる３Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を、１５分間隔で４回で加える。８時間後、最終部の３Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）を加え、この溶液を２時間攪拌し、最後に、酢酸エチル（２０００ｍＬ）で希釈する。相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物に、シリカゲル上のクロマトグラフィーを行う。
【０３１９】
（実施例５１）
（（±）−（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−４−クロロ−３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
【０３２０】
【化１２２】
2004520008.tif 000119
（工程１．）
Ｎ−プロピオニル−２−ベンズオキサゾロン（１００．０ｇ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（１１００ｍＬ）溶液を、Ｎ２雰囲気下で機械的に攪拌しながら、３℃まで冷却する。ＴｉＣｌ４（５８．４ｍｍｏｌ）を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約１０分間）加える。得られた黄色スラリーを、４０分間激しく攪拌し、次いで、トリエチルアミン（８７．４ｍＬ）を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約１０分間）加える。得られた深紅色溶液を、８０分間攪拌する。クロロアセトアルデヒド含有ＣＨ２Ｃｌ２（１０００ｍＬ）の１Ｍ溶液を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約２０分間）加え、続いて、この反応物に、薄層クロマトグラフィー（４：１  ヘキサン／酢酸エチル）を行う。９０分間攪拌した後、この反応物を、４５０ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを加えることによってクエンチする。相を分離し、そして有機相を、シリカゲルのパッドを通して濾過する。このシリカゲルをエーテルで洗浄し、合わせた有機相を、減圧下である程度まで濃縮する。この生成物を、減圧濾過によって収集し、ヘキサンでリンスして、無色固体を得る。
【０３２１】
（工程２．）
１モル当量のナトリウムメトキシド（メタノール中２５ｗ／ｖ％；約１５０ｍＬ）を、Ｎ２下で、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミン（１７３ｇ）含有メタノール（９１０ｍＬ）溶液にゆっくりと流す。算定した容量の半分を加えたとき、この反応を、ＴＬＣ（１：１  酢酸エチル／ヘキサン）によってモニタリングし、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミンがＮ−アセチルシステアミンに完全に転換するまで、メトキシドを添加し続ける。酢酸（５０ｇ）を加え、そして得られたナトリウムチオレートの溶液を、Ｎ２下で、固形（±）−Ｎ−［シン−４−クロロ−３−ヒドロキシ−４−ブタノイル］−２−ベンズオキサゾロン（２７０ｇ）を含むフラスコにカニューレ挿入する。１５分後、この反応物を、固形シュウ酸二水和物（８０．４ｇ）でクエンチし、濾過し、黄色油状物になるまで濃縮する。この残渣を、２：１  ヘキサン／酢酸エチルに溶解し、ＳｉＯ２上の溶出クロマトグラフィーによりバッチ処理する。このシリカを、２：１  ヘキサン／酢酸エチルで洗浄して２−ベンズオキサゾロンを取り除き、次いで、酢酸エチル／メタノール（９：１）で洗浄して、生成物であるチオエステルを溶出する。チオエステル含有溶出液のエバポレーションにより、生成物を得る。
【０３２２】
（実施例５２）
（（±）−（２Ｓ＊，３Ｒ＊）−３−ヒドロキシ−２−メチル−４−（フェニルチオ）ブチレート  Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
【０３２３】
【化１２３】
2004520008.tif 000120
（工程１．）
Ｎ−プロピオニル−２−ベンズオキサゾロン（１００．０ｇ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（１１００ｍＬ）溶液を、Ｎ２雰囲気下で機械的に攪拌しながら、３℃まで冷却する。ＴｉＣｌ４（５８．４ｍＬ）を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約１０分間）加える。得られた黄色スラリーを、４０分間激しく攪拌し、次いで、トリエチルアミン（８７．４ｍＬ）を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約１０分間）加える。得られた深紅色溶液を、８０分間攪拌する。フェニルチオアセトアルデヒド（１６０ｇｍ）を、内部温度が１０℃より低く維持されるような速度で（約２０分間）加え、続いて、この反応物に、薄層クロマトグラフィー（４：１  ヘキサン／酢酸エチル）を行う。９０分間攪拌した後、この反応物を、４５０ｍＬの２Ｎ  ＨＣｌを加えることによってクエンチする。相を分離し、そして有機相を、シリカゲルのパッドを通して濾過する。このシリカゲルをエーテルで洗浄し、合わせた有機相を、減圧下である程度まで濃縮する。この生成物を、減圧濾過によって収集し、ヘキサンでリンスして、無色固体を得る。
【０３２４】
（工程２．）
１モル当量のナトリウムメトキシド（メタノール中２５ｗ／ｖ％；約１５０ｍＬ）を、Ｎ２下で、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミン（１７３ｇ）含有メタノール（９１０ｍＬ）溶液にゆっくりと流す。算定した容量の半分を加えたとき、この反応を、ＴＬＣ（１：１  酢酸エチル／ヘキサン）によってモニタリングし、Ｎ，Ｓ−ジアセチルシステアミンがＮ−アセチルシステアミンに完全に転換するまで、メトキシドを添加し続ける。酢酸（５０ｇ）を加え、そして得られたナトリウムチオレートの溶液を、Ｎ２下で、固形（±）−Ｎ−［シン−４−フェニルチオ−３−ヒドロキシ−４−ブタノイル］−２−ベンズオキサゾロン（３４０ｇ）を含むフラスコにカニューレ挿入する。１５分後、この反応物を、固形シュウ酸二水和物（８０．４ｇ）でクエンチし、濾過し、黄色油状物になるまで濃縮する。この残渣を、２：１  ヘキサン／酢酸エチルに溶解し、ＳｉＯ２上の溶出クロマトグラフィーによりバッチ処理する。このシリカを、２：１  ヘキサン／酢酸エチルで洗浄して２−ベンズオキサゾロンを取り除き、次いで、酢酸エチル／メタノール（９：１）で洗浄して、生成物であるチオエステルを溶出する。チオエステル含有溶出液のエバポレーションにより、生成物を得る。
【０３２５】
（実施例５３）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−ペンタン酸  δ−ラクトンの代替調製）
【０３２６】
【化１２４】
2004520008.tif 000121
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸  δ−ラクトン（１．８４ｇ）を含有する１０ｍＬの水の懸濁液を、１５ｍＬの１Ｎ  水酸化ナトリウムで処理し、完全な溶解が得られるまで攪拌する。この溶液のｐＨを、７．０に調整し、四酸化オスミウムの４％水溶液（２ｍＬ）、続いて過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｇ）を加える。この混合物を、一晩激しく攪拌し、次いで、アリコートとジニトロフェニルヒドラジン酸性溶液との反応によって決定するように、アルデヒドが消失するまで、水素化ホウ素ナトリウムで処理する。この反応物を、ｐＨ３に調整し、酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、生成物を得る。
【０３２７】
（実施例５４）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド）
【０３２８】
【化１２５】
2004520008.tif 000122
トリメチルアルミニウム（１０ｍｍｏｌ）含有２Ｍトルエン溶液を、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンヒドロクロリド（１０ｍｍｏｌ）を含有する８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の懸濁液に、０℃で滴下する。得られた均一溶液を、大気温度にて３０分間攪拌する。（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドキシ−２，４−ジメチル−６−ペンタン酸  δ−ラクトン（２ｍｍｏｌ）を含有する４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を、１０分間かけて加え、得られた溶液を、出発物質が完全に消費されるまで、還流で加熱する。冷却の際に、この混合物を、１Ｍ  ＨＣｌ中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、５％  ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３２９】
（実施例５５）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド  ３，５−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３３０】
【化１２６】
2004520008.tif 000123
Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド（１０ｍｍｏｌ）、および４−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（１２ｍｍｏｌ）を含有する５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を、２０時間、無水塩化亜鉛（１ｍｍｏｌ）で処理する。飽和ＮａＨＣＯ３を加え、この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３３１】
（実施例５６）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）ペンタンアミドの代替調製）
【０３３２】
【化１２７】
2004520008.tif 000124
Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルペンタンアミド  ３，５−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１ｍｍｏｌ）を含有する５ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、１．０Ｍ  ＨＣｌ含有エーテルおよびシアノホウ化水素ナトリウムで処理する。例えば、ＧａｒｅｇｇおよびＨｕｌｔｂｅｒｇ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９８１，９３：１２３を参照のこと。
【０３３３】
完了した際、この反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３を加えることによってクエンチし、エーテルで抽出する。この抽出物を、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３３４】
（実施例５７）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチルオクト（ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔ）−６−エン−１，３，５−トリオール）
【０３３５】
【化１２８】
2004520008.tif 000125
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−６−オクテン酸  δ−ラクトン（１ｍｍｏｌ）を含有する１．５ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、氷上で冷却した、水素化アルミニウムリチウム（２ｍｍｏｌ）を含有する３ｍＬのテトラヒドロフランの懸濁液に滴下する。１時間攪拌した後、この混合物を大気温度まで温め、２４時間攪拌する。次いで、この反応物を、氷上で冷却し、水および１５％  ＫＯＨで連続的に処理し、次いで大気温度にて２４時間激しく攪拌する。固体を濾過によって取り除き、そして溶出液を減圧下で濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３３６】
（実施例５８）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−１−（（４−メトキシベンジル）オキシ）オクト−６−エン）
【０３３７】
【化１２９】
2004520008.tif 000126
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチルオクト−６−エン−１，３，５−トリオール（１０ｍｍｏｌ）、および新しく調製された４−メトキシベンジル  ２，２，２−トリクロロアセチミデート（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）（１３ｍｍｏｌ）を含有する１５ｍＬの１：２  ＣＨ２Ｃｌ２／シクロヘキサン溶液を、０℃にて、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（０．５ｍｍｏｌ）で処理する。３時間後、この混合物を大気温度まで温め、さらに４８時間攪拌する。この溶媒をエバポレートし、そして生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３３８】
（実施例５９）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチルオクト−６−エン−１，３，５−トリオール  １，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３３９】
【化１３０】
2004520008.tif 000127
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチルオクト−６−エン−１，３，５−トリオール（１ｍｍｏｌ）、および４−メトキシベンズアルデヒドジメチルアセタール（１．２ｍｍｏｌ）を含有する５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２の混合物を、１２時間、樟脳スルホン酸（０．０５ｍｍｏｌ）で処理する。飽和ＮａＨＣＯ３を加え、この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３４０】
（実施例６０）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−１−（（４−メトキシベンジル）オキシ）オクト−６−エンの代替調製）
【０３４１】
【化１３１】
2004520008.tif 000128
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチルオクト−６−エン−１−オール  １，３−（４−メトキシフェニル）アセタール（１ｍｍｏｌ）を含有する５ｍＬのテトラヒドロフラン溶液を、１．０Ｍ  ＨＣｌ含有エーテルおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムで処理する。例えば、ＧａｒｅｇｇおよびＨｕｌｔｂｅｒｇ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９８１，９３：１２３を参照のこと。
【０３４２】
完了した際、この反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３を加えることによってクエンチし、エーテルで抽出する。この抽出物を、１Ｎ  ＨＣｌ、飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３４３】
（実施例６１）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，４−ジメチル−３−ヒドロキシ−５−（（４−メトキシベンジル）オキシ）ペンタン酸）
【０３４４】
【化１３２】
2004520008.tif 000129
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−１−（（４−メトキシベンジル）オキシ）オクト−６−エン（１ｍｍｏｌ）含有ＣＣｌ４、およびアセトニトリルの溶液を、触媒二塩化ルテニウムの存在下で、過ヨウ素酸ナトリウムで処理する。例えば、Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５２：６８９−９１を参照のこと。
【０３４５】
（実施例６２）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシペンタナール（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎａｌ）  ３，５−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３４６】
【化１３３】
2004520008.tif 000130
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチルオクト−６−エン−１，３，５−トリオール  １，３−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（２．６ｍｍｏｌ）を含有する、２，２−ジメチルプロパノール（３０ｍＬ）とアセトン（６５ｍＬ）と水（１６ｍＬ）との混合物溶液を、大気温度にて１１時間、四酸化オスミウム（０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド（１３ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を、１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、粗状トリオール中間体を得る。この物質を、テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）と水（２５ｍＬ）との混合物に溶解し、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１３ｍｍｏｌ）を加える。２４時間激しく攪拌した後、この混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３４７】
（実施例６３）
（４Ｒ）−４−ベンジル−３−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−３，５，７−トリヒドロキシヘプタノイル  ５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール］−２−オキサゾリジノン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ））
【０３４８】
【化１３４】
2004520008.tif 000131
（４Ｒ）−４−ベンジル−３−プロピオニル−２−オキサゾリジノン（１０ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を、氷上で冷却し、ジブチルボロントリフレート含有ＣＨ２Ｃｌ２（１１ｍｍｏｌ）の１．０Ｍ溶液、続いてトリエチルアミン（１２ｍｍｏｌ）で処理する。３０分間攪拌した後、この溶液を−７８℃まで冷却し、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシペンタナール  ３，５−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（９ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２溶液を滴下する。この混合物を３０分間攪拌し、次いで０℃まで温め、１時間保持する。２５ｍＬの１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）と７５ｍＬのメタノールとの混合物、続いて、７５ｍＬの２：１  メタノール／５０％Ｈ２Ｏ２を加え、この混合物を、０℃にて１時間攪拌する。この反応物を、スラリーになるまで減圧下で濃縮し、水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、５％ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０３４９】
（実施例６４）
（（４Ｒ）−４−ベンジル−３−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ヘプタノイル５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール］−２−オキサゾリジノン）
【０３５０】
【化１３５】
2004520008.tif 000132
（４Ｒ）−４−ベンジル−３−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−３，５，７−トリヒドロキシヘプタナール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール］−２−オキサゾリジノン（１０ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）を、ｔブチルジメチルシリルトリフレート（１２ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（２０ｍｍｏｌ）で処理する。１時間後、この混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３５１】
（実施例６５）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヘプタノール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタールの代替調製物）
【０３５２】
【化１３６】
2004520008.tif 000133
（４Ｒ）−４−ベンジル−３−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ヘプタノイル５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール］−２−オキサゾリジノン（１０ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）を−３０℃まで冷却し、そしてエタノール（２０ｍｍｏｌ）を添加し、その後２Ｍ  ホウ化水素リチウム含有テトラヒドロフラン溶液（２０ｍｍｏｌ）を１５分間にわたり添加する。氷上で１時間攪拌した後、この混合物を大気温度まで暖め、そしてさらに１２時間攪拌する。この混合物をエーテルで希釈し、そして４０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨを添加する。２時間後、相を分離し、そして有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３５３】
（実施例６６）
（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ヘプタナール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３５４】
【化１３７】
2004520008.tif 000134
塩化オキサリル（２６ｍｍｏｌ）を、１時間にわたり、−７８℃まで冷却したメチルスルホキシド（５６ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１００ｍＬ）に添加する。さらに１５分後、−７８℃の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヘプタノール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１８ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（５ｍＬ）を１５分間にわたり添加する。３０分間攪拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（８６ｍｍｏｌ）を、１５分間にわたり添加する。この反応物を、−７８℃でさらに３０分間攪拌し、次いで、１時間にわたり大気温度まで暖める。１Ｎ  ＮａＨＳＯ４を添加した後、この混合物をエーテルで希釈し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３５５】
（実施例６７）
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）オクト−１−エン６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３５６】
【化１３８】
2004520008.tif 000135
１．６Ｍ  ブチルリチウム含有ヘキサン溶液（１２ｍｍｏｌ）を、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（１２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液に滴下する。１時間後、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−ヘプタナール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール溶液（１０ｍｍｏｌ）を添加し、１２時間攪拌する。この混合物を大気温度まで冷却し、そして濃縮する。残留物を、１：１  エーテル／ヘキサン中に溶解し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３５７】
（実施例６８）
（（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ノン−２−エン７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３５８】
【化１３９】
2004520008.tif 000136
１．６Ｍ  ブチルリチウム含有ヘキサン溶液（１２ｍｍｏｌ）を、エチルトリフェニルホスホニウムブロミド（１２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液に滴下する。１時間後、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，４，６−トリメチル−５，７−ジヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−ヘプタナール５，７−（４−メトキシベンジリデン）アセタール溶液（１０ｍｍｏｌ）を添加し、１２時間攪拌する。この混合物を大気温度まで冷却し、そして濃縮する。残留物を、１：１  エーテル／ヘキサン中に溶解し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３５９】
（実施例６９）
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−オクタノール６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３６０】
【化１４０】
2004520008.tif 000137
ボラン−ジメチルスルフィド（２３ｍｍｏｌ）を、２−メチル−２−ブテン（４５ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（６０ｍＬ）に０℃で添加し、この溶液を２時間攪拌する。このジシアミルボラン溶液を、（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）オクト−１−エン６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（７．５ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（９０ｍＬ）に０℃で添加する。９０分間攪拌した後、エタノール（３ｍＬ）を添加し、その後、２５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および１０ｍＬの３０％  Ｈ２Ｏ２を添加する。この混合物を、２時間にわたり激しく攪拌しながら大気温度まで暖め、次いで、飽和Ｎａ２ＳＯ３で希釈し、そしてエーテルで抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３６１】
（実施例７０）
（（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ノナン−２−オール７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタール）
【０３６２】
【化１４１】
2004520008.tif 000138
ボラン−ジメチルスルフィド（２３ｍｍｏｌ）を、２−メチル−２−ブテン（４５ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（６０ｍＬ）に０℃で添加し、この溶液を２時間攪拌する。このジシアミルボラン溶液を、（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ノン−２−エン７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（７．５ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（９０ｍＬ）に０℃で添加する。９０分間攪拌した後、エタノール（３ｍＬ）を添加し、その後、２５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および１０ｍＬの３０％  Ｈ２Ｏ２を添加する。この混合物を、２時間にわたり激しく攪拌しながら大気温度まで暖め、次いで、飽和Ｎａ２ＳＯ３で希釈し、そしてエーテルで抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３６３】
（実施例７１）
（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−１−トリフェニルホスホニウム−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）オクタン６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタールヨージド）
【０３６４】
【化１４２】
2004520008.tif 000139
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−１−オクタノール６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１０ｍｍｏｌ）含有１：２  ベンゼン／エーテル溶液（７０ｍＬ）を、トリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１５ｍｍｏｌ）、およびヨウ素（１５ｍｍｏｌ）を用いて、激しく攪拌しながら処理する。１時間後、この混合物をエーテルで希釈し、そして飽和チオ硫酸ナトリウムおよびブラインで連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この粗ヨウ化物をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、そして還流状態でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を大気温度まで冷却し、そしてヘキサンを添加してホスホニウム塩を結晶化させる。
【０３６５】
（実施例７２）
（（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−２−トリフェニルホスホニウム−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ノナン−２−オール７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタールヨージド）
【０３６６】
【化１４３】
2004520008.tif 000140
（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−ノナン−２−オール７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタール（１０ｍｍｏｌ）含有１：２  ベンゼン／エーテル溶液（７０ｍＬ）を、トリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１５ｍｍｏｌ）、およびヨウ素（１５ｍｍｏｌ）を用いて、激しく攪拌しながら処理する。１時間後、この混合物をエーテルで希釈し、そして飽和チオ硫酸ナトリウムおよびブラインで連続して洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この粗ヨウ化物をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、そして還流状態でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を大気温度まで冷却し、そしてヘキサンを添加してホスホニウム塩を結晶化させる。
【０３６７】
（実施例７３）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−１，５−ジオール）
【０３６８】
【化１４４】
2004520008.tif 000141
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２、４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテン酸δ−ラクトン（１ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（１．５ｍＬ）を、氷上で冷却した塩化リチウムアルミニウム（２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（３ｍＬ）に滴下する。１時間攪拌した後、この混合物を大気温度まで暖め、そして２４時間攪拌する。次いで、この反応物を氷上で冷却し、そして水および１５％  ＫＯＨで連続的に処理し、次いで大気温度で２４時間激しく攪拌する。固体を濾過により除去し、そして溶出物を減圧下で濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３６９】
（実施例７４）
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−５−オール）
【０３７０】
【化１４５】
2004520008.tif 000142
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２、４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−１，５−ジオール（１０ｍｍｏｌ）および新たに調製した４−メトキシベンジル２，２，２，−トリクロロアセトイミデート（１３ｍｍｏｌ）を含有する１：２  ＣＨ２Ｃｌ２／シクロヘキサン溶液（１５ｍＬ）を、０℃にてピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（０．５ｍｍｏｌ）で処理する。３時間後、この混合物を大気温度まで暖め、そして４８時間さらに攪拌する。この溶媒をエバポレートし、そしてこの生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３７１】
（実施例７５）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール）
【０３７２】
【化１４６】
2004520008.tif 000143
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−５−オール（２．６ｍｍｏｌ）を含有する２，２−ジメチルプロパノール（３０ｍＬ）、アセトン（６５ｍＬ）、および水（１６ｍＬ）の混合溶液を、四酸化オスミウム（０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリンＮ−オキシド（１３ｍｍｏｌ）を用い、１１時間、大気温度にて処理する。この溶液を１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして粗トリオール中間体を生成する。この物質を、テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）および水（２５ｍＬ）の混合物中に溶解し、そしてメタ過ヨウ素酸ナトリウム（１３ｍｍｏｌ）を添加する。２４時間激しく攪拌した後、この混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３７３】
（実施例７６）
（（３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−１−ヨード−６−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−３，５−ジメチル−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１−ヘキセン）
【０３７４】
【化１４７】
2004520008.tif 000144
１．６Ｍブチルリチウム含有ヘキサン溶液（３７ｍｍｏｌ）を、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド（３６ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（２００ｍＬ）に１０分間にわたり添加する。さらに１０分後、この溶液を、−７８℃のヨウ素（３２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（３００ｍＬ）に１５分間にわたり添加する。得られる黄色スラリーを５分間攪拌し、次いで−２５℃まで暖め、そして１０分間維持する。１Ｍ  ヘキサメチルジシルアジドナトリウム含有テトラヒドロフラン溶液（３１ｍｍｏｌ）を８分間にわたり添加し、そしてこの混合物をさらに１５分間攪拌した後、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール（１８ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）を添加する。１０分後、この混合物を大気温度まで暖め、そして３時間攪拌する。メタノール（１０ｍＬ）を添加し、そして混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物を１：１  酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのパッドを通して濾過する。この濾液を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３７５】
（実施例７７）
（（４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−２−ヨード−７−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−４，６−ジメチル−５−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２−ヘプテン）
【０３７６】
【化１４８】
2004520008.tif 000145
１．６Ｍブチルリチウム含有ヘキサン溶液（３７ｍｍｏｌ）を、エチルトリフェニルホスホニウムヨージド（３６ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（２００ｍＬ）に１０分間にわたり添加する。さらに１０分後、この溶液を、−７８℃のヨウ素（３２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（３００ｍＬ）に１５分間にわたり添加する。得られる黄色スラリーを５分間攪拌し、次いで−２３℃まで暖め、そして１０分間維持する。１Ｍ  ヘキサメチルジシルアジドナトリウム含有テトラヒドロフラン溶液（３１ｍｍｏｌ）を８分間にわたり添加し、そしてこの混合物をさらに１５分間攪拌した後、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（（４−メトキシフェニル）メトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール（１８ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）を添加する。１０分後、この混合物を大気温度まで暖め、そして３時間攪拌する。メタノール（１０ｍＬ）を添加し、そして混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物を１：１  酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのパッドを通して濾過する。この濾液を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３７７】
（実施例７８）
（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（トリフェニルメトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−５−オール）
【０３７８】
【化１４９】
2004520008.tif 000146
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２、４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−１，５−ジオール（１０ｍｍｏｌ）および塩化トリフェニルメチル（１１ｍｍｏｌ）を含有するピリジン溶液（２５ｍＬ）を、１２時間攪拌する。溶媒をエバポレートし、そしてこの生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３７９】
（実施例７９）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（トリフェニルメトキシ）２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール）
【０３８０】
【化１５０】
2004520008.tif 000147
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−１−（トリフェニルメトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）オクト−６−エン−５−オール（２．６ｍｍｏｌ）を含有する２，２−ジメチルプロパノール（３０ｍＬ）、アセトン（６５ｍＬ）、および水（１６ｍＬ）の混合溶液を、四酸化オスミウム（０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリンＮ−オキシド（１３ｍｍｏｌ）を用い、１１時間、大気温度にて処理する。この溶液を１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして粗トリオール中間体を生成する。この物質を、テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）および水（２５ｍＬ）の混合物中に溶解し、そしてメタ過ヨウ素酸ナトリウム（１３ｍｍｏｌ）を添加する。２４時間激しく攪拌した後、この混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３８１】
（実施例８０）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテン酸δ−ラクトン）
【０３８２】
【化１５１】
2004520008.tif 000148
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−３，５−ヒドロキシ−２、４−ジメチル−６−オクテン酸δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（１５ｍｍｏｌ）、およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフレート（１１ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）を、１時間攪拌する。この混合物を水で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３８３】
（実施例８１）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテンアミド）
【０３８４】
【化１５２】
2004520008.tif 000149
２Ｍ  トリメチルアルミニウム含有トルエン溶液（１０ｍｍｏｌ）を、０℃にてＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンヒドロクロリド（１０ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２懸濁液（８ｍＬ）に滴下する。得られる均質な溶液を、大気温度にて３０分間攪拌する。（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテン酸δ−ラクトン（２ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（４ｍＬ）を１０分間にわたり添加し、そして得られる溶液を、出発物質が完全に消費されるまで還流状態で加熱する。冷却の際に、この混合物を１Ｍ  ＨＣｌに注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を５％ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続的に洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３８５】
（実施例８２）
（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）
【０３８６】
【化１５３】
2004520008.tif 000150
Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オクテンアミド（２．６ｍｍｏｌ）を含有する２，２−ジメチルプロパノール（３０ｍＬ）、アセトン（６５ｍＬ）、および水（１６ｍＬ）の混合溶液を、四酸化オスミウム（０．０８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリンＮ−オキシド（１３ｍｍｏｌ）を用い、１１時間、大気温度にて処理する。この溶液を１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして粗トリオール中間体を生成する。この物質を、テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）および水（２５ｍＬ）の混合物中に溶解し、そしてメタ過ヨウ素酸ナトリウム（１３ｍｍｏｌ）を添加する。２４時間激しく攪拌した後、この混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で希釈し、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３８７】
（実施例８３）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−７−オキソ−２，４，９−トリメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトン）
【０３８８】
【化１５４】
2004520008.tif 000151
１．０Ｍ  ＴｉＣｌ４含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍｍｏｌ）を、−７８℃のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタンアミド（１０ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（８０ｍＬ）に滴下する。この混合物に、４−メチル−２−（トリメチルシリルオキシ）−１，３−ペンタジエン（２０ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を−７８℃にて２時間攪拌する。２：１  リン酸緩衝液（ｐＨ  ８）および飽和ＮａＨＣＯ３（２５０ｍＬ）を添加することにより、この反応をクエンチし、そして大気温度まで暖める。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この残留物を５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン中に溶解し、そして氷上で５時間、トリクロロ酢酸（１５ｍｍｏｌ）で処理する。この混合物をヘキサンで希釈し、水、リン酸緩衝液（ｐＨ  ８）、およびブラインで連続的に洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０３８９】
（実施例８４）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２，４，９−トリメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトン）
【０３９０】
【化１５５】
2004520008.tif 000152
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−７−オキソ−２，４，９−トリメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）含有トルエン溶液（２５０ｍＬ）を−９５℃まで冷却し、そして１．０Ｍ  Ｋ−セレクトライド（Ｋ−ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ）（カリウムトリ−ｓｅｃ−ブチルボロヒドリド）含有テトラヒドロフラン溶液（１２ｍｍｏｌ）で処理する。２時間後、０．５ｍＬの酢酸を添加し、そしてこの溶液を大気温度まで暖め、そしてリン酸緩衝液（ｐＨ  ７）（３２５ｍＬ）および３０％  Ｈ２Ｏ２（１５ｍＬ）の混合物を添加する。２時間攪拌した後、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０３９１】
（実施例８５）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５−ヒドロキシ−２，４，９−トリメチル−３，７−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトン）
【０３９２】
【化１５６】
2004520008.tif 000153
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２，４，９−トリメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２０ｍｍｏｌ）、およびイミダゾール（３０ｍｍｏｌ）を含有するジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）を、大気温度にて１２時間攪拌し、次いで、エーテルで希釈し、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０３９３】
（実施例８６）
（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｓ）−５，７−ジヒドロキシ−２，４，９−トリメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−８−デセン酸δ−ラクトンの代替調製物）
【０３９４】
【化１５７】
2004520008.tif 000154
１．０Ｍ  ＴｉＣｌ４含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍｍｏｌ）を、−７８℃のＮ−メトキシ−Ｎ−メチル（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタンアミド（１０ｍｍｏｌ）含有ＣＨ２Ｃｌ２溶液（８０ｍＬ）に滴下する。この混合物に、４−メチル−２−（トリメチルシリルオキシ）−１，３−ペンタジエン（２０ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を−７８℃にて２時間攪拌する。２：１  リン酸緩衝液（ｐＨ  ８）および飽和ＮａＨＣＯ３（２５０ｍＬ）を添加することにより、この反応をクエンチし、そして大気温度まで暖める。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この残留物を５０ｍＬのアセトニトリル中に溶解し、そして−４０℃のテトラメチルアンモニウムトリアセトキシボロヒドリド（８０ｍｍｏｌ）および酢酸（４４ｍＬ）を含有する、冷却前に大気温度で３０分間攪拌したアセトニトリル溶液（４４ｍＬ）に添加する。この反応を、−４０℃にて１８時間継続し、次いで、０．５Ｍ  水性酒石酸ナトリウムカリウムを添加することによりクエンチし、そして大気温度まで暖める。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、そしてこの抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この残留物を５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン中に溶解し、そして氷上で５時間、トリクロロ酢酸（１５ｍｍｏｌ）で処理する。この混合物をヘキサンで希釈し、水、リン酸緩衝液（ｐＨ８）、およびブラインで連続的に洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０３９５】
（実施例８７）
【０３９６】
【化１５８】
2004520008.tif 000155
１Ｍ  ヘキサメチルジシルアジドナトリウム含有テトラヒドロフラン溶液（１０ｍｍｏｌ）を（４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ）−２−トリフェニルホスホニウム−４，６，８−トリメチル−７，９−ジヒドロキシ−５−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）ノナン−２−オール７，９−（４−メトキシベンジリデン）アセタールヨージド（１０ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（１０ｍＬ）に添加する。１５分間後、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（トリフェニルメトキシ）２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール溶液（１０ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を３時間攪拌する。この混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物を１：１  酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのパッドを通して濾過する。この濾液を濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３９７】
（実施例８８）
【０３９８】
【化１５９】
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１Ｍ  ヘキサメチルジシルアジドナトリウム含有テトラヒドロフラン溶液（１０ｍｍｏｌ）を（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−１−トリフェニルホスホニウム−３，５，７−トリメチル−６，８−ジヒドロキシ−４−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）オクタン６，８−（４−メトキシベンジリデン）アセタールヨージド（１０ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（１０ｍＬ）に添加する。１５分間後、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−５−（トリフェニルメトキシ）−２，４−ジメチル−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ペンタナール（１０ｍｍｏｌ）溶液（１０ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を３時間攪拌する。この混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物を１：１  酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのパッドを通して濾過する。この濾液を濃縮する。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３９９】
（実施例８９）
【０４００】
【化１６０】
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１Ｍ  ジイソブチルアルミニウムヒドリド含有トルエン溶液（３０ｍｍｏｌ）を０℃の実施例４９の生成物（１０ｍｍｏｌ）を含有するＣＨ２Ｃｌ２溶液（１００ｍ）に添加し、この混合物を５時間攪拌する。水性リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を滴下してクエンチし、この混合物を１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１００ｍＬの飽和酒石酸ナトリウムカリウムに注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０４０１】
（実施例９０）
【０４０２】
【化１６１】
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４−メトキシベンジルアルコール（１１ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を、水素化ナトリウム（１２ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン懸濁液（５０ｍＬ）に滴下する。気体の発生が停止した後、この混合物を、（７Ｚ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−５−ヒドロキシ−３−（ｔブチルジメチルシリルオキシ）−２，４，６−トリメチルデカ−７，９−ジエノエートδ−ラクトン（１０ｍｍｏｌ）含有テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）で処理する。この反応を、薄層クロマトグラフィーによりモニターする。ラクトンが見えなくなったら、この混合物を０℃まで冷却し、そしてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１２ｍｍｏｌ）で処理する。トリフレートの形成後、この混合物を２，３−ジクロロ−１，５−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（１２ｍｍｏｌ）および水を用いて、０℃にて１０分間処理し、次いで大気温度まで暖め、その後トリエチルアミン（１２ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を、薄層クロマトグラフィーによりモニターする。完了した場合、飽和水性ＮａＨＣＯ３を添加することによりこの混合物をクエンチし、そしてエーテルで抽出する。この抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０４０３】
本発明の化合物は、該して、複数のキラル中心および必要に応じて二重結合を含む。本発明を説明するために、好ましい実施形態（好ましい異性体）を使用しているが、本発明は、全ての立体異性体および幾何異性体を包含する。本明細書中で列挙される全ての科学刊行物および特許公開物は、本明細書中で参考として援用される。本発明は、ここに、記載された説明および実施例により示されるが、当業者は、本発明が、種々の実施形態において実施され得ること、前述の説明および実施例が説明の目的のためのものであり、前述の特許請求の範囲を限定するためのものでないことを認識する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、６−デオキシエリスロノリドＢ（「６−ｄＥＢ」）を作製するＰＫＳ酵素であるデオキシエリスロノリドＢシンターゼ（「ＤＥＢＳ」）（これは、ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３のタンパク質サブユニットからなる）をコードする、ｅｒｙＡＩ遺伝子、ｅｒｙＡＩＩ遺伝子、およびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子の構築を示す。
【図２】
図２は、２つの主要な中間体である、チアゾールフラグメントおよび化合物Ａから出発するエポチロンＤのデノボ合成のためにＤａｎｉｓｈｅｆｌｋｙによって開発された、マクロラクトン化合成ストラテジーである。
【図３】
図３は、化合物（２）を化合物（１）に転換し得る、２モジュールのＰＫＳの構築を示す。
【図４】
図４は、エポチロンＰＫＳの図式的表現である。
【図５】
図５は、本発明のいくつかの主要な化合物の間の関係を説明する。一本線の矢印は、生物学的転換または生化学的転換を示し、二重の矢印は、化学的転換を示す。複数の矢印は、複数の工程を表し得る。
【図６】
図６は、化合物Ａの代わりに化合物（１０）を使用する、エポチロンＤの合成のための新規プロトコルを説明する。
【図７】
図７は、化合物Ａの代わりに化合物（１）を使用する、エポチロンＤの合成のための別の新規プロトコルを説明する。
【図８】
図８は、１４の共通のＰＫＳモジュールによって生成されるポリケチド構造を、ＭＴドメインを含むモジュールの報告された場合と共に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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