(57)【要約】ｉｉｉ）レトロウイルスゲノムと、ｉｖ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列とによって産生細胞をトランスフェクトするステップを含み、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞での発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、複製欠損レトロウイルスの産生方法。
2004508808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生細胞でレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子中に構築して、標的細胞中に複製欠損レトロウイルスを作製することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用であって、前記ヌクレオチド配列は前記産生細胞における発現について最適化されたコドンであることを特徴とする使用。
【請求項２】
産生細胞でレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子中に構築して、標的細胞中のレトロウイルスベクターゲノムのパッケージングを防止することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用であって、前記ヌクレオチド配列は前記産生細胞における発現について最適化されたコドンであることを特徴とする使用。
【請求項３】
産生細胞でｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子中に構築して、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列とｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部との間の組換えを防止することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用であって、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は前記産生細胞での発現について最適化されたコドンであることを特徴とする使用。
【請求項４】
前記レトロウイルスゲノムは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）をさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記レトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記レトロウイルス粒子は、実質的にＨＩＶ−１に由来する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１５に記載の配列を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記レトロウイルス粒子が実質的にＥＩＡＶに由来する、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１６に記載の配列を有する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
（ｉ）レトロウイルスゲノムと、
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトするステップを含み、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞における発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、複製欠損レトロウイルスの産生方法。
【請求項１１】
ａ．（ｉ）レトロウイルスゲノムと、
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）１つまたは複数の（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトしてレトロウイルス粒子を産生するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）のレトロウイルス粒子により標的細胞をトランスフェクトするステップと
を含み、
レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞における発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、標的細胞におけるレトロウイルスゲノムのパッケージングの防止方法。
【請求項１２】
（ｉ）ｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むレトロウイルスゲノムと、
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトするステップを含み、
レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞における発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、ウイルスゲノムのレトロウイルス粒子中での構築に必要なウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とレトロウイルスベクターゲノムとの間の組換えの防止方法。
【請求項１３】
前記レトロウイルスゲノムは、目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記レトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記レトロウイルス粒子は、実質的にＨＩＶ−１に由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１５に記載の配列を有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記レトロウイルス粒子が実質的にＥＩＡＶに由来する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記コドン最適化ヌクレオチド配列が配列番号１６に記載の配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｉｉｉ）ｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１５または配列番号１６の配列を有するレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２１】
前記ｉ）〜ｉｉｉ）の少なくとも１つが、１つまたは複数の機能的な補助遺伝子を含む、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｉ）〜ｉｉｉ）は、任意の機能的な補助遺伝子を欠いている、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ｉ）目的のヌクレオチド配列と、
ｉｉ）ウイルス粒子の構築に必要なウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含み、前記ヌクレオチド配列は請求項２０で定義されている、ウイルスベクター系。
【請求項２４】
ｉ）少なくとも１つの目的のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムと、
ｉｉ）前記ウイルスゲノムのウイルス粒子中への構築に必要なウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含み、前記ヌクレオチド配列は請求項２０で定義されている、ウイルス産生系。
【請求項２５】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２３または請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２５に記載の系。
【請求項２７】
前記レンチウイルスベクターが、実質的にＨＩＶ−１またはＥＩＡＶに由来する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の系。
【請求項２８】
前記ｉ）〜ｉｉ）で定義の前記ヌクレオチド配列がエンベロープタンパク質も含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の系。
【請求項２９】
前記エンベロープ遺伝子がコドン最適化されている、請求項２８に記載の系。
【請求項３０】
前記目的のヌクレオチドが、治療遺伝子、マーカー遺伝子、および選択遺伝子から選択される、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の系。
【請求項３１】
１つまたは複数の機能的な補助遺伝子を含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の系。
【請求項３２】
任意の機能的な補助遺伝子を欠いている、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の系。
【請求項３３】
ウイルス粒子産生方法で使用される、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のウイルス系。
【請求項３４】
ｉ）請求項２４〜３３のいずれか１項で定義されたウイルスゲノムと、
ｉｉ）請求項２０で定義された１つまたは複数のヌクレオチド配列と、
ｉｉｉ）１つまたは複数の（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
を産生細胞に移入するステップを含むウイルス粒子の産生方法。
【請求項３５】
請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の産生系または請求項３４に記載の方法によって産生される、ウイルス粒子。
【請求項３６】
ウイルス感染治療用の請求項２３〜３３のいずれか１項に記載のウイルス系または請求項３５に記載のウイルス粒子。
【請求項３７】
薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とともに請求項２３〜３３のいずれか１項に記載のウイルス系または請求項３５に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子治療用の治療遺伝子を送達することができるレトロウイルスベクターの安全性を改良する方法およびこのような方法で使用するための新規のヌクレオチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
レトロウイルスベクターは、遺伝子を細胞に送達する送達体として現在広く使用されている。その汎用性は、その産生が容易で標的細胞のゲノムに送達される遺伝子が安定に組み込まれるという事実に起因する。これにより、送達した遺伝子を長期間発現させることができる（１）。
【０００３】
かねてより、レンチウイルスを基本としたレトロウイルスベクター系の開発に非常に興味がもたれている。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスの小さな亜群に属する。これらには、共通のレトロウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）に加えて、その生活環を制御し、非分裂細胞に感染することができる遺伝子を含む（２）。したがって、これらに基づくベクター系は、ニューロンなどの非分裂細胞への目的の遺伝子の導入における潜在的な用途のために興味がもたれている。さらに、レンチウイルスベクターは、目的の遺伝子を長期間安定に発現することができる。これは、形質導入ラットニューロン細胞で少なくとも３ヶ月間認められる一方で、ＭＬＶベースのベクターは目的の遺伝子を６週間だけ発現することができる。
【０００４】
最も一般的に使用されているレンチウイルスは、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の病因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。ＨＩＶベースのベクターは非分裂細胞に有効に形質導入され（３）、例えば、ＨＩＶ感受性細胞への抗ＨＩＶ治療遺伝子の標的に使用することができる。
【０００５】
しかし、ＨＩＶベクターには、一定の疾患の治療への適用を制限し得る多数の深刻な不都合が存在する。特に、ＨＩＶ−１は、潜在的に癌タンパク質およびその配列を有するヒトの病原体である。ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌを発現するパッケージング細胞で産生したベクター粒子の移入により、患者にこれらのタンパク質が移入されて血清変換が起こるリスクが存在する。
【０００６】
したがって、これらのベクターの安全性が注目されている。１つのストラテジーでは、レトロウイルスベクター用産生系のデザインを調査している。レトロウイルスベクター系は、基本的に、２つのエレメントであるパッケージング細胞株およびベクターゲノムからなる。最も単純なパッケージング株は、ψ配列（Ｕ５とｇａｇの間に存在する、ＨＩＶにおけるＲＮＡパッケージングレポーティングの決定要因）を欠くプロウイルスからなる。細胞に安定に組み込まれた場合、逆転写酵素を含むウイルス粒子は産生されるが、ビリオンＲＮＡはこれらの粒子内にパッケージングされない。レトロウイルスベクター系での補充成分はゲノムベクター自体である。ゲノムベクターは、パッケージング配列を含むことが必要であるが、ほとんどの構造コード領域を欠失し得る。しばしば選択マーカー遺伝子または目的の他のヌクレオチド配列がベクターに組み込まれる。次いで、パッケージング株のベクターストックを使用して、標的細胞に感染することができる。ウイルス粒子が首尾よく細胞に感染した場合、ゲノムベクター配列が逆転写し、レトロウイルス機構によって組み込まれる。しかし、感染は最後のプロセスであるので、ベクターの複製または拡散がさらに起こるはずである。
【０００７】
しかし、上記のように、安全なデザインおよび効果的なレトロウイルスベクターという問題に直面している。これらには、パッケージングベクターとパッケージング配列との間の組換えにより野生型複製可能ウイルスを作製することができるという可能性が含まれる。したがって、パッケージング細胞構築物の安全性の改良に尽力している。
【０００８】
第２世代のパッケージング細胞株では、パッケージング配列に加えて、野生型ウイルスの作製に２つの組換えが必要なように３’ＬＴＲもまた欠失していた。
【０００９】
第３世代のパッケージング株では、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を別の構築物に置き、その後連続的にパッケージング細胞に移入してトランスフェクション間の組換えを防止する。
【００１０】
パッケージングシグナルに関して、欧州特許第０３６８８８２号（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ）は、ＨＩＶでは、これは５’主要スプライスドナーとｇａｇ開始コドンとの間の領域、特に５’主要スプライスドナーのすぐ下流で、且つｇａｇ開始コドンの約１４塩基上流のセグメントに対応することを開示している。この領域は、Ｓｏｄｒｏｓｋｉがｇａｇ−ｐｏｌカセットから欠失すべきであると教示した領域である。ＷＯ９７／１２６２２（Ｖｅｒｍａ）は、ＨＩＶ−１では、ψ配列中の３９ｂｐを、ｇａｇ遺伝子の５’スプライスドナー部位と開始コドンとの間に欠失することができることを記載している。
【００１１】
コドンの揺らぎを使用して、組換え頻度を減少させながら構築物の一次タンパク質配列を維持することができる（ｇａｇ−ｐｏｌとｅｎｖ発現構築物との間の重複領域を、異なる読み取り枠中に存在するｐｏｌとｅｎｖとの間の共通領域よりも６１ｂｐ減少させている）（（４）を参照のこと）。ｐｏｌの最後の２０コドンにトランスバージョン変異を移入して、コード領域の完全性を維持しながら重複領域中のｅｎｖとの相同性を５５％に減少させた。ｅｎｖの３’に類似の揺らぎ変異を移入し、ｅｎｖ終止コドンの下流の全ての配列を欠失した。
【００１２】
有効なベクターは、通常、ビリオンタイターを増加させるためにゲノムベクターにｇａｇの一部を含む。パッケージングを行うための配列内の任意の位置に存在することができるパッケージング配列と異なり、ｇａｇ配列は、任意の効果をもたせるためにψに隣接したその本来の位置に存在しなければならない。
パッケージング細胞およびベクターデザインが有意に改良される一方で、現在のパッケージング株をさらに改良する余地が残されていることが認識される。
【００１３】
（発明の要旨）
したがって、本発明の目的は、レトロウイルス粒子、特にレンチウイルス粒子、とりわけ対応する野生型ウイルス粒子を超える安全性が改良された治療タンパク質をコードするヌクレオチド構築物を保有するレンチウイルス粒子を提供することにある。本発明者らのＷＯ９９／４１３９７では、本発明者らは、輸送およびＲＮＡ安定性を向上させるためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服する手段としてｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のコドン最適化を記載している。しかし、本発者らは、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列がタイター増強を目的とするｇａｇ配列の一部を保有するベクターゲノムにかかる潜在的な組換え問題が克服されることを見出した。このストラテジーはまた、パッケージング中の異なるウイルスおよびベクターゲノム構築物由来のｇａｇ領域の使用が回避される。
【００１４】
本発明によって得られる別の有意な利点は、コドン最適化によりパッケージングシグナルなどのＲＮＡ二次構造を崩壊させてｇａｇ−ｐｏｌ　ｍＲＮＡをパッケージングさせないという点である。したがって、本発明によれば、ＳｏｄｒｏｓｋｉおよびＶｅｒｍａと対照的に、有意に安全性を損なうことなくｇａｇ開始コドン上流のレトロウイルス配列が保持される。
【００１５】
（発明の記述）
したがって、１つの態様では、本発明は、ヌクレオチド配列が産生細胞での発現について最適化されたコドンである、産生細胞中でレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子に構築して標的細胞中に複製欠損レトロウイルスを作製することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用を提供する。
【００１６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列が産生細胞での発現について最適化されたコドンである、産生細胞中でレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子に構築して標的細胞中のレトロウイルスベクターゲノムのパッケージングを減少または防止することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列が産生細胞での発現について最適化されたコドンである、産生細胞中でｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むレトロウイルスベクターゲノムをレトロウイルス粒子に構築してレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列とｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部との間の組換えを防止することができるレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用を提供する。
【００１８】
言い換えると、本発明は、ｉ）レトロウイルスゲノムと、
ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトするステップを含み、レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞での発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、複製欠損レトロウイルスの産生方法を提供する。
【００１９】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ａ．（ｉ）レトロウイルスゲノムと、
ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉｉｉ）１つまたは複数の（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトしてレトロウイルス粒子を産生するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）のレトロウイルス粒子で標的細胞をトランスフェクトするステップと
を含み、
レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞での発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、標的細胞中でのレトロウイルスゲノムのパッケージングの減少および防止方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ｇａｇヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むレトロウイルスゲノムと、
ｉｉ）レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない他の必須のウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
によって産生細胞をトランスフェクトするステップを含み、
レトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が前記産生細胞での発現のために最適化されたコドンであることを特徴とする、レトロウイルスベクターゲノムとウイルスゲノムの構築に必要なウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間でのレトロウイルス粒子への組換えの減少または防止方法を提供する。
【００２１】
本発明者らはまた、配列番号１５および１６に記載し、本発明で使用することができるコドン最適化配列を提供する。しかし、任意の都合の良いコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列を本発明で使用することができることが認識される。
【００２２】
本発明は、さらに、本発明の配列を使用して産生したレトロウイルス粒子およびその産生方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアと共に本発明のウイルス粒子を含む薬学的組成物を提供する。
【００２４】
「減少する」は、野生型ｇａｇ−ｐｏｌ配列を有する類似の集団と比較してその事象が起こる機会が減少することを意味する。集団内で、各レトロウイルスベクターまたは粒子についてその減少が起こる機会を防止することができる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を、非限定的な例によって説明する。
【００２６】
本発明は、コドン最適化概念を利用する。
コドン最適化は、本発明者らのＷＯ９９／４１３９７に輸送およびＲＮＡ安定性を向上させるためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服する手段として記載している。ウイルス成分のコード配列への変更によって、レトロウイルスベクター粒子産生のための産生細胞として作用するために存在する哺乳動物細胞または他の細胞でのコドン使用頻度についての配列が改良される。このコドン使用頻度の改良を、「コドン最適化」という。ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多数のウイルスは、多数の希少なコドンを使用し、一般に使用される哺乳動物コドンに対応するこれらのコドンの変化により、哺乳動物産生細胞におけるパッケージング成分の発現を増加させることができる。哺乳動物細胞ならびに種々の他の生物についてのコドン使用頻度表は、当該分野で公知である。
【００２７】
これらの配列の変更によって、産生細胞／パッケージング細胞でのウイルス粒子の構築に必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、これらの配列から除去したＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有する。同時に、パッケージング成分の配列をコードするアミノ酸が、これらの配列によってコードされるウイルス成分が同一であるか、パッケージング成分の機能を妥協しないほど少なくとも十分に類似するように保持される。
【００２８】
用語「ウイルス粒子の構築に必要なウイルスポリペプチド」は、ウイルス粒子にパッケージングされるウイルスゲノムによって通常コードされ、それが存在しない場合にウイルスゲノムをパッケージングすることができないポリペプチドを意味する。例えば、レトロウイルスでは、このようなポリペプチドには、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖが含まれる。用語「パッケージング成分」はまた、この定義に含まれる。
【００２９】
本発明者らによるＷＯ９９／３２６４６における考察のように、ＨＩＶベクターゲノムのパッケージングのための配列要件は複雑である。ＨＩＶ−１パッケージングシグナルは、スプライスドナー部位を含み、４つの短いステムループを含む推定二次構造を有するｇａｇ遺伝子の５’非翻訳領域の一部を含む。しかし、ゲノム中の他の場所のさらなる配列もまた、ＨＩＶの有効なキャップ形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に重要であることが公知である。例えば、ｇａｇタンパク質コード配列の最初の３５０ｂｐは、有効なパッケージングに寄与し得る。したがって、異種遺伝子を発現することができるＨＩＶ−１ベクターの構築のために、ｇａｇタンパク質コード領域の３５０ｂｐに及ぶパッケージングシグナルがベクターゲノム上で使用されている。本発明者らは、パッケージングベクター上のｇａｇコード領域のコドン最適化は、少なくともパッケージングシグナルが存在する領域中で、ベクターゲノムのパッケージングを崩壊する効果も有することを見出した。したがって、コドン最適化は、新規の複製欠損ウイルス粒子の獲得法である。
【００３０】
ＷＯ９９／３２６４６でも開示するように、ウマレンチウイルスにおけるパッケージングシグナルの構造は、ＨＩＶの構造とは異なる。ｇａｇタンパク質コード領域の３５０ｂｐに及ぶパッケージングシグナルを含む短い４つのステムループ配列の代わりに、本発明者らは、ウマレンチウイルスにおいて、パッケージングシグナルは、考えられる限り、ｇａｇタンパク質コード領域には伸長し得ないことを見出した。
【００３１】
１つの実施形態では、パッケージングシグナルに関連するコドンのみが最適化コドンである。したがって、１つの実施形態では、コドン最適化は、ｇａｇタンパク質コード領域の少なくとも最初の３５０ｂｐに及ぶ。ウマレンチウイルスでは、少なくともコドン最適化は、ｇａｇコード領域の少なくともヌクレオチド３００、より好ましくはｇａｇコード領域の少なくともヌクレオチド１５０に及ぶ。至適でなくとも、コドン最適化は、例えば、ｇａｇコード領域の最初の１０９ヌクレオチドのみに及び得る。ｇａｇコード領域の最初のコドンのみにコドン最適化を行うことも可能であり得る。
【００３２】
しかし、さらにより好ましく、且つ実用的な実施形態では、配列は、フレームシフト部を含む配列以外はその全体が最適化されたコドンである。
【００３３】
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、それぞれｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複読み取り枠を含む。両タンパク質の発現は、翻訳の際のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳の際の「すべり」の結果として起こる。このすべりは、少なくとも一部がリボゾームＲＮＡ二次構造によって起こると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子中のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶについては、重複領域は、ｇａｇの最初のヌクレオチド１２２２下流から（ヌクレオチド１はｇａｇ　ＡＴＧのＡである）ｇａｇの末端までに及ぶ（ｎｔ１５０３）。したがって、２つの読み取り枠のフレームシフト部位および重複領域にわたる２８１ｂｐフラグメントは、コドン最適化されていないことが好ましい。このフラグメントの保持により、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより有効な発現が可能である。
【００３４】
ＥＩＡＶでは、重複の開始は、ｎｔ１２６２に及んでいる（ヌクレオチド１はｇａｇ　ＡＴＧのＡである）。重複の末端は、１４６１ｂｐである。フレームシフト部位およびｇａｇがｇａｇ−ｐｏｌ重複していることを確認するために、野生型配列は、ｎｔ１１５６〜１４６５が保持されている。これは、図９ｂで認められる。
【００３５】
例えば、都合のよい制限部位に対応するために至適コドン使用頻度から誘導することができ、保存的アミノ酸変更をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に移入することができる。
【００３６】
非常に好ましい実施形態では、コドン最適化は、容易に発現する哺乳動物遺伝子に基づいていた。第３およびしばしば第２および第３の塩基を変化させることができる。コドン使用頻度表の例を、図３ｂに示す。
【００３７】
遺伝コードの縮重のために、当業者によって多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列得ることができることが認識される。また、説明され、且つコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列の作製開始点として使用することができる多数のレトロウイルス変異体が存在する。レンチウイルスゲノムは、非常に変化しやすい。例えば、依然として機能的なＨＩＶ−１の多数の類似の種が存在する。これはまた、ＥＩＡＶの場合にも当てはまる。これらの変異体を使用して、形質導入プロセスの特定の部分を増強することができる。ＨＩＶ−１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖに見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、以下のＮＣＢＩデータベースに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ。
【００３８】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列のストラテジーを、任意のレトロウイルスに関して使用することができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む全てのレンチウイルスに適用されるであろう。さらに、この方法を使用して、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来の遺伝子の発現を増加することができる。
【００３９】
コドン最適化によりパッケージングシグナルなどのＲＮＡ二次構造が崩壊されるので、ｇａｇ開始コドンの任意の内在性パッケージングシグナル上流が安全性を損なうことなく保持することができると認識される。
【００４０】
コドン最適化パッケージング成分のさらなる利点は、これにより遺伝子発現を増加させることができることである。特に、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ依存性にすることができることである。しかし、レトロウイルスベクター中の抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子を使用可能にするために、ウイルスベクター作製系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ依存性にすることが必要であろう（５）。したがって、ゲノムもまた改変する必要がある。ベクターゲノム成分の最適化によってこれを行う。有利には、これらの改変により、産生細胞および形質導入細胞の両方で全ての補助タンパク質を欠くより安全な系も産生される。
【００４１】
上記のように、レトロウイルスベクターのパッケージング成分には、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の発現産物が含まれる。さらに、有効なパッケージングは、４つの短いステムループ配列の後のｇａｇおよびｅｎｖ由来の部分配列（「パッケージングシグナル」）に依存する。したがって、レトロウイルスベクターゲノム（パッケージング構築物上の完全なｇａｇ配列に加えて）への欠失ｇａｇ配列の封入により、ベクタータイターが最適化する。今までのところ、有効なパッケージングには依然としてｅｎｖ配列を保持しているベクター中のｇａｇの２５５〜３６０ヌクレオチドまたはスプライスドナー変異の特定の組み合わせ（ｇａｇおよびｅｎｖ欠失）におけるｇａｇの約４０ヌクレオチドが必要であることが報告されている。驚いたことに、本発明者らは、ｇａｇ中の３６０ヌクレオチドまでの欠失によりベクタータイターが増加することを見出した。さらなる欠失により、タイターは低下した。ｇａｇの主要なスプライスドナー部位上流でのさらなる変異により、パッケージングシグナルの二次構造が崩壊してベクタータイターが減少することが見出された。したがって、好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムには、３６０ｂｐまでが除去されたｇａｇ配列が含まれる。
【００４２】
したがって、本発明者らは、全ての補助遺伝子が除去されたいわゆる「最小」系を調製することができる。ＨＩＶでは、これらの補助遺伝子は、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｖｐｕ、およびｒｅｖである。同様に、他のレンチウイルスでは、通常レンチウイルスに存在する相同性補助遺伝子を除去することができる。しかし、疑念を回避するために、本発明者らは、本発明はまた、１つまたは複数のこれらの補助遺伝子が存在し、かつ任意の組み合わせである系、粒子、およびベクターにまで及ぶことを言及する。
【００４３】
用語「ウイルスベクター」は、宿主細胞中で転写することができるウイルスゲノムを含み、このゲノムはパッケージング成分の存在下でウイルスＲＮＡゲノムを標的細胞に感染することができるウイルス粒子にパッケージングするための十分なウイルスゲノム情報を含むヌクレオチド構築物をいう。標的細胞の感染には、特定のウイルスに適切である場合、逆転写および標的細胞ゲノムへの取り込みが含まれる。使用されるウイルスベクターは、典型的には、ベクターによって標的細胞に送達される異種コード配列（目的のヌクレオチド「ＮＯＩ」）（例えば、リボザイムをコードする第１のヌクレオチド配列）を保有する。「組換え欠損」は、ウイルスベクターが最終の標的細胞内の感染性ウイルス粒子を産生するために自己複製が可能であることを意味する。
【００４４】
用語「ウイルスベクター系」は、ウイルス粒子の他の必要な成分と組み合わせた場合に使用して宿主中にウイルス粒子を産生することができるキットのパーツを意味することを意図する。例えば、ＮＯＩは、典型的には、ウイルスゲノムベクター構築物へのＮＯＩのクローニングに適切なプラスミドベクター構築物中に存在し得る。キットにおいて典型的は別のプラスミドベクター構築物に存在するさらなるヌクレオチド配列と組み合わせた場合、得られたＮＯＩを含むプラスミドとさらなるヌクレオチド配列を含むプラスミドとの組み合わせは、本発明の必須のエレメントを含む。次いで、当業者は、このようなキットを適切なウイルスベクターゲノム構築物の産生に使用することができ、さらなるヌクレオチド配列および任意選択的にウイルス構築に必要な他の成分をコードする核酸構築物を含むプラスミドと共に宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、感染性ウイルス粒子が産生される。
【００４５】
あるいは、さらなるヌクレオチド配列は、キットに含まれるパッケージング細胞株内に安定に存在し得る。
【００４６】
キットには、宿主細胞およびウイルス構築に必要な必須のウイルスポリペプチドをコードする他のプラスミドなどのウイルス粒子の産生に必要な他の成分を含み得る。例として、キットには、（ｉ）ＮＯＩを含むプラスミドおよび（ｉｉ）最適なプロデューサーでの発現のために最適化されたコドンである改変レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌ構築物をコードするさらなるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含み得る。次いで、至適成分は、（ａ）任意選択的に少なくとも部分的なｇａｇ配列を含むウイルスゲノムへのＮＯＩのクローニングに適切な制限酵素認識部位を含むレトロウイルスゲノム構築物；（ｂ）ＶＳＶ−Ｇ　ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミドである。あるいは、ウイルス粒子の構築に必要なウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、このヌクレオチド配列を含むパッケージング細胞株（例えば、ＶＳＶ−Ｇ発現細胞株）として、キットに提供することができる。
【００４７】
用語「ウイルスベクター産生系」は、適切なウイルスベクターゲノムにＮＯＩがすでに挿入された、上記のウイルスベクター系をいう。
【００４８】
本発明では、いくつかの用語を交換可能に使用している。したがって、「ビリオン」、「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「レトロウイルス粒子」、「レトロウイルス」、および「ベクター粒子」は、ウイルス様侵入機構によって細胞に核酸を移入することができるウイルスおよびウイルス様粒子を意味する。このようなベクター粒子は、一定の環境下で、感染した細胞へのＮＯＩの導入を媒介することができる。レトロウイルスは、ＤＮＡにその遺伝物質を逆転写し、形質導入の際にこの遺伝物質を標的細胞のＤＮＡに組み込むことができる。このような細胞を、本明細書中で「標的細胞」と呼ぶ。
【００４９】
本明細書中で使用される、用語「標的細胞」は、単純に、天然または標的化された本発明の制御されたレトロウイルスベクターを感染または形質導入することができる細胞をいう。
【００５０】
本発明のレンチウイルスベクター粒子は、ゆっくりと分裂し、ＭＬＶなどの非レンチウイルスが有効に形質導入することができない細胞に形質導入することができる。ゆっくりと分裂する細胞は、３日〜４日毎に１回分裂し、これには、一定の主要細胞が含まれる。腫瘍は急速に分裂する細胞を含むにもかかわらず、いくつかの腫瘍細胞（特に、腫瘍中心部の細胞）は、分裂頻度は低い。
【００５１】
あるいは、標的細胞は、腫瘍塊の中心部の細胞などの細胞分裂をすることができる成長停止細胞または造血幹細胞などの幹細胞またはＣＤ３４陽性細胞であり得る。
【００５２】
あるいは、標的細胞は、単球前駆体、ＣＤ３３陽性細胞、または骨髄細胞前駆体などの分化細胞の前駆体であり得る。
【００５３】
あるいは、標的細胞は、ニューロン、星状細胞、グリア細胞、小グリア細胞、マクロファージ、単球、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、精母細胞、精子細胞、または精子などの分裂細胞であり得る。
【００５４】
標的細胞を、ヒト個体からの単離後にインビトロで形質導入するか、インビボで形質導入することができる。
【００５５】
本発明のベクターは、レトロウイルスベクター、特に、ＨＩＶおよびＥＩＡＶベクターなどのレンチウイルスベクターである。本発明のレンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスに由来し得るか由来可能であり得る。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例には、以下が含まれる。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ　ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら、「レトロウイルス」、１９９７、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ編、ＪＭ　Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ　Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ　Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３に見出すことができる。
【００５６】
用語「由来する」は、ＬＴＲまたはその一部などのヌクレオチド配列を意味する通常の意味で使用され、レトロウイルスベクターなどのベクターから必ずしも得る必要はない代わりにそれに由来し得る。例として、合成または組換えＤＮＡ技術の使用によって配列を調製することができる。
【００５７】
いくつかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は、当該分野で見出すことができる。例として、ＨＩＶおよびＭｏ−ＭＬＶについての詳細を、ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｂａｎｋから見出すことができる（それぞれ、ゲノムアクセッション番号ＡＦ０３３８１９およびＡＦ０３３８１１）。ＨＩＶ−１変異体についての詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖに見出すことができる。ＥＩＡＶ変異体の詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに見出すことができる。
【００５８】
レンチウイルス群を、「霊長類」および「非霊長類」にさらに分類することができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因因子、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レンチウイルス群には、「遅発型」ウイルスｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉウイルス（ＶＭＶ）ならびに、関連ヤギ脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＶＡ）、およびより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【００５９】
レトロウイルスゲノムの基本構造は、その間またはそれらの中にゲノムをパッケージングすることができるパッケージングシグナルが存在する５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムに組み込むための組み込み部位、パッケージング成分（これらは、ウイルス粒子の構築に必要なポリペプチドである）をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。より複雑なレトロウイルスは、感染標的細胞の核から細胞質に組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物を有効に輸送することができるＨＩＶ中のｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのさらなる特徴を有する。
【００６０】
プロウイルスでは、これらの遺伝子は、長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域と両端が隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組み込みおよび転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列として作用し、ウイルス遺伝子の発現を調節することができる。レトロウイルスＲＮＡの包膜は、ψ配列（ＨＩＶに関して開示されており、少なくともウイルスゲノムの５’末端に存在する）によって起こる。
【００６１】
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両末端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、レトロウイルスによって非常に異なり得る。
【００６２】
欠損レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは存在しないか機能しない。ＲＮＡの両末端のＲ領域は、繰り返し配列である。Ｕ５およびＵ３は、それぞれＲＮＡゲノムの５’および３’末端に固有の配列を示す。
【００６３】
上記で考察のように、遺伝子治療用の典型的なレトロウイルスベクターでは、１つまたは複数の複製に不可欠なｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質コード領域の少なくとも一部を、ウイルスベクターから除去することができる。これにより、レトロウイルスベクター複製欠損になる。除去部分を、本発明に記載のようにさらに目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）に置換して、そのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができるが、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質の欠損のために自己増殖できないウイルスを作製することができる。宿主ゲノムに組み込まれた場合、ＮＯＩが発現して、例えば、治療および／または診断効果が得られる。したがって、目的の部位へのＮＯＩの導入は、典型的には、組換えウイルスベクターへのＮＯＩの組み込み、ビリオン被覆への改変ウイルスベクターのパッケージング、および目的の部位（標的化細胞または標的化細胞集団など）への形質導入によって行われる。
【００６４】
したがって、本発明で使用される最小レトロウイルスゲノムは、（５’）Ｒ−Ｕ５−１つまたは複数のＮＯＩ−Ｕ３−Ｒ（３’）を含み得る。しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でレトロウイルスゲノムを産生させるために使用するプラスミドベクターには、宿主細胞／パッケージング細胞中でゲノムの転写を指示するようにレトロウイルスゲノムに作動可能に連結した転写調節配列も含まれる。これらの調節配列は転写レトロウイルス配列（すなわち、５’Ｕ３領域）に関連する天然の配列であるか、これらは別のウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）などの異種プロモーターであり得る。
【００６５】
いくつかのレトロウイルスゲノムは、有効なウイルス産生のためにさらなる配列が必要である。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列を含むべきである。しかし、本発明者らは、コドン最適化によってｒｅｖおよびＲＲＥの必要条件を減少および排除することができることを見出した。コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ発現がＲＥＶ独立性であるので、ＲＲＥをｇａｇ−ｐｏｌ発現カセットから除去して、ベクターゲノムに含まれる任意のＲＲＥとの組換えについての任意の可能性を除去することができる。
【００６６】
以前は発現にはレトロウイルスベクターのＮＯＩ配列が必要であった。レトロウイルスでは、プロモーターはプロウイルスの５’ＬＴＲ　Ｕ３領域中に存在する。レトロウイルスベクターでは、治療遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、５’Ｕ３領域中の天然のレトロウイルスプロモーターであるかベクターに操作した選択的プロモーターであり得る。選択的プロモーターは、物理的にレトロウイルス起源の５’Ｕ３プロモーターを置換するか、ＬＴＲの間などのベクタ−ゲノム内の異なる場所に組み込むことができる。
【００６７】
したがって、ＮＯＩはまた、標的細胞中で第１のヌクレオチド配列が転写されるように転写調節配列に作動可能に連結されている。調節配列は、典型的には哺乳動物細胞中で活性である。調節配列は、例えば、天然のウイルスプロモーターまたはＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターであるか、哺乳動物プロモーターであり得る。好ましくは治療すべきウイルスが最初に感染した特定の細胞型または組織型で活性なプロモーターを使用することが特に好ましい。したがって、１つの実施形態では、組織特異的調節配列を使用することができる。１つまたは複数の第１のヌクレオチド配列の発現を駆動する調節配列は、構成プロモーターまたは調節プロモーターであり得る。
【００６８】
用語「作動可能に連結された」は、調節領域（典型的には、プロモーターエレメントであるが、エンハンサーエレメントも含み得る）と遺伝子のコード配列との間の関係を示し、これによりコード領域の転写が調節領域の制御下に置かれる。
【００６９】
本明細書中で使用される、用語「エンハンサー」には、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合してその関連プロモーターによって指示された転写開始を促進するＤＮＡ配列が含まれる。
【００７０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、エンハンサーは、虚血様応答エレメント（ＩＬＲＥ）である。
【００７１】
ＩＬＲＥとも記載される、用語「虚血様応答エレメント」には、虚血の病態または虚血に類似しているか虚血によって引き起こされる病態に応答するかこの病態下で活性なエレメントが含まれる。例として、虚血に類似するか虚血によって引き起こされる病態には、低酸素症および／または低グルコース濃度が含まれる。
【００７２】
用語「低酸素症」は、特定の器官または組織の酸素供給が不適切である条件を意味する。
【００７３】
虚血は、特定の器官または組織への不十分な血液供給であり得る。血液供給の減少により、器官または組織への酸素供給が不適切となる（低酸素症）。低酸素症が長期化すると罹患器官または組織が損傷し得る。
【００７４】
好ましいＩＬＲＥは、低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）である。
本発明の１つの好ましい態様では、レトロウイルスベクター成分の発現を調節可能な低酸素症または虚血が存在する。これに関して、低酸素症は、広範な異なる細胞型での遺伝子発現の強力な調節因子であり、同族ＤＮＡ認識部位（種々の遺伝子プロモーター上の低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ））に結合する低酸素症誘導因子１（ＨＩＦ−１；６）などの低酸素症誘導転写因子の活性の誘導によって作用する。Ｄａｃｈｓら（７）は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）遺伝子（８）由来のＨＲＥの多量体形態を使用して、インビトロで低酸素症に応答し、インビボでは固形腫瘍内のヒト線維肉腫によって両マーカーおよび治療遺伝子の発現を調節した（７、前出）。
【００７５】
低酸素症応答エンハンサーエレメント（ＨＲＥＥ）はまた、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）遺伝子を含む多数の遺伝子との会合において見出されている（９；１０）。他のＨＲＥＥは、筋肉解糖系酵素ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）遺伝子（１１）、ヒト筋肉特異的βエノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ３；１２）、およびエンドセリン１（ＥＴ−１）遺伝子（１３）の調節領域から単離されている。
【００７６】
好ましくは、本発明のＨＲＥは、例えば、エリスロポイエチンＨＲＥエレメント（ＨＲＥＥ１）、筋肉ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、ＨＲＥエレメント、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ＨＲＥ、βエノラーゼ（エノラーゼ３；ＥＮＯ３）ＨＲＥエレメント、エンドセリン１（ＥＴ−１）ＨＲＥエレメント、およびメタロチオネインＩＩ（ＭＴＩＩ）ＨＲＥエレメントから選択される。
【００７７】
好ましくは、プロモーターなどの転写調節エレメントＩＬＲＥを使用し、転写調節エレメントは１つまたは複数の選択された細胞型で活性であることが好ましく、１つの細胞型でのみ活性であることが好ましい。
【００７８】
上記で概説のように、本発明のこの組み合わせた態様を、応答エレメントと呼ぶ。
好ましくは、応答エレメントは、少なくとも本明細書中で定義したＩＬＲＥを含む。
【００７９】
このような応答エレメントの非限定的な例は、ＯＢＨＲＥ１およびＸｉａＭａｃである。別の非限定的な例には、ＭＬＶプロモーターおよび／または組織限定虚血応答プロモーターと併せて使用されるＩＬＲＥが含まれる。これらの応答エレメントを、ＷＯ９９／１５６８４に開示する。
【００８０】
適切な組織限定プロモーター／エンハンサーの他の例は、ＭＵＣ１遺伝子、ＣＥＡ遺伝子、または５Ｔ４抗原遺伝子由来のプロモーター／エンハンサーなどの腫瘍細胞で活性の高いものである。αフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターはまた、腫瘍特異的プロモーターである。１つの好ましいプロモーター−エンハンサーの組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要最初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサーの組み合わせである。
【００８１】
用語「プロモーター」を、当該分野での通常の意味で使用する（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位）。
【００８２】
プロモーターは、ＮＯＩおよび／またはｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡの発現を調節するためにレトロウイルス５’ＬＴＲ中に存在し得る。
【００８３】
好ましくは、ＮＯＩおよび／またはｇａｇ−ｐｏｌタンパク質は、長末端反復（ＬＴＲ）中の内因性レトロウイルスプロモーターなどのレトロウイルスゲノムから発現することができる。
【００８４】
好ましくは、ＮＯＩおよび／またはｇａｇ−ｐｏｌタンパク質は、異種遺伝子または配列、および／またはコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列が作動可能に連結した異種プロモーターから発現する。
【００８５】
あるいは、プロモーターは内部プロモーターであり得る。
好ましくは、ＮＯＩは、内部プロモーターから発現する。
【００８６】
内部プロモーターを含むベクターは、複数の遺伝子の発現に広く使用されている。内部プロモーターは、遺伝子発現の駆動用のウイルスＬＴＲ中で見出されるもの以外のプロモーター／エンハンサー組み合わせの使用を可能にする。複数の内部プロモーターをレトロウイルスベクターに含めることができ、それぞれそれ自体のプロモーター由来の少なくとも３つの異なるｃＤＮＡを発現可能であることが証明されている（１４）。内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して１つのｍＲＮＡまたは融合タンパク質由来の複数のコード領域を翻訳して、読み取り枠から発現させることもできる。
【００８７】
本発明のプロモーターは、その活性が構成的に有効であっても、組織または一過性に制限されていてもよい。
好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶなどの構成プロモーターである。
【００８８】
好ましくは、本発明のプロモーターは、組織特異的である。すなわち、プロモーターは、一方の組織中でＮＯＩの転写を駆動する一方で、他方の組織型において広く「サイレント」を維持することができる。
【００８９】
用語「組織特異的」は、１つの組織型に対する活性に制限されないが、一方の組織群では活性であり、他方の組織群では活性が低いかサイレントであるという選択性を示すプロモーターを意味する。
【００９０】
特定のプロモーターの調節下でのＮＯＩの発現レベルを、プロモーター領域の操作によって調整することができる。例えば、プロモーター領域内の異なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を有し得る。これらの異なる領域の役割を、典型的には、特異的領域が欠失したプロモーターの異なる変異体を有するベクター構築物を使用して評価する（すなわち、欠失分析）。このアプローチを使用して、例えば、組織特異性を付与することができる最小の領域または低酸素症を付与することができる最小の領域を同定することができる。
【００９１】
上記の多数の組織特異的プロモーターは、本発明の実施に特に有利であり得る。ほとんどの場合、これらのプロモーターを、選択したベクターのクローニングに適切な都合のよい制限消化フラグメントとして単離することができる。あるいは、プロモーターフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して単離することができる。増幅フラグメントのクローニングを、プライマーの５’末端での制限部位の組み込みによって容易にすることができる。
【００９２】
ＮＯＩは、プロモーターまたはエンハンサーなどの発現調節エレメントの発現調節下にあり得る。
【００９３】
好ましくは、虚血応答プロモーターは、組織限定虚血応答プロモーターである。
好ましくは、組織限定虚血応答プロモーターは、抑制によって制限されたマクロファージ特異的プロモーターである。
好ましくは、組織限定虚血応答プロモーターは、内皮特異的プロモーターである。
【００９４】
好ましくは、本発明の調節レトロウイルスベクターは、ＩＬＲＥ調節レトロウイルスベクターである。
好ましくは、本発明の調節レトロウイルスベクターは、ＩＬＲＥ調節レンチウイルスベクターである。
好ましくは、本発明の調節レトロウイルスベクターは、自己調節低酸素症応答レンチウイルスベクターである。
好ましくは、本発明の調節レトロウイルスベクターは、グルコース濃度によって調節される。
【００９５】
例えば、ｇｒｐ７８およびｇｒｐ９４などのグルコース調節タンパク質（ｇｒｐ）は、グルコースの枯渇によって誘導されることが公知の高度に保存されたタンパク質である（１５）。ｇｒｐ７８遺伝子は、基底レベルのプロモーターエレメントの影響下でほとんどの正常な健常組織で低レベルで発現されるが、ＴＡＴＡエレメントの上流に少なくとも２つの重要な「ストレス誘導性調節エレメント」を有する（１５、前出；１６）。ｇｒｐ７８プロモーターの５’末端の短縮６３２塩基対配列への結合により、インビトロでのレポーター遺伝子を非常にグルコース枯渇させる（１６、前出）。さらに、レトロウイルスベクター中プロモーター配列は、マウス線維肉腫、特に比較的中央の虚血／線維症部位中の腫瘍細胞中のレポーター遺伝子の高レベル発現を駆動することができた（１６、前出）。
【００９６】
好ましくは、本発明の調節レトロウイルスベクターは、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターである。
【００９７】
例として、自己不活性化レトロウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーターの欠失により構築されている。１ラウンドのベクター逆転写および組み込み後、これらの変化は５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされて、転写不活性プロウイルスが産生される（１７；１８；１９；２０）。しかし、このようなベクター中のＬＴＲの内部の任意のプロモーターは転写活性を示す。このストラテジーを使用して、内部に存在する遺伝子由来の転写に対するウイルスＬＴＲ中のエンハンサーおよびプロモーターの効果が排除される。このような効果には、転写の増加（２１）または転写の抑制（２２）が含まれる。このストラテジーを使用して、ゲノムＤＮＡへの３’ＬＴＲから下流の転写も排除することができる。これは、内因性癌遺伝子の偶発的活性化の防止に非常に重要なヒト遺伝子治療で特に懸念されている。
【００９８】
上記で考察のように、複製欠損レトロウイルスベクターは、典型的には、例えばパッケージングまたはヘルパー細胞株と組換えベクターとの組み合わせの使用によってレトロウイルスベクターがその後の形質導入のための適切なタイターが得られるように増殖する。すなわち、３つのパッケージングタンパク質を、トランスで得ることができる。
【００９９】
一般に、「パッケージング細胞株」は、１つまたは複数のｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。本発明では、これは、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子および任意選択的にｅｎｖ遺伝子を含む。パッケージング細胞株は、レトロウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、包膜することができない。従来は、これをψ領域の欠失によって行っていた。しかし、ＮＯＩおよびψ領域を保有する組換えベクターをパッケージング細胞株に移入した場合、ヘルパータンパク質がψ陽性組換えベクターをパッケージングして組換えウイルスストックを産生することができる。このウイルスストックを使用して、細胞に形質導入し、標的細胞のゲノムへのＮＯＩを移入することができる。従来は、ウイルスタイターが増加するので、スプライスドナーの上流からｇａｇ開始コドンの下流まで（２４）に及ぶさらなる配列を含むψ＋と呼ばれるψパッケージングシグナルを使用していた。
【０１００】
ゲノムがウイルスタンパク質の作製に必要な全ての遺伝子を欠く組換えウイルスは、１回だけ形質導入されて増殖することができない。標的細胞の１回の形質導入のみが可能なこれらのウイルスベクターは、複製欠損ベクターとして公知である。したがって、潜在的に有害なレトロウイルスを産生することなくＮＯＩが宿主／標的細胞ゲノムに移入される。利用可能なパッケージング株のまとめは、Ｃｏｆｆｉｎら、１９９７（前出）に示されている。
【０１０１】
レトロウイルスパッケージング細胞は、好ましくは、一過性にトランスフェクトされた細胞株の形態である。一過性トランスフェクションを使用して、ベクターが開発された場合にベクター産生レベルを有利に測定することができる。これに関して、一過性トランスフェクションにより、より長い時間を要する安定なベクター産生細胞株の作製を回避し、ベクターまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に有毒である場合に使用することもできる。レトロウイルスベクターの作製に典型的に使用される成分には、ａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミド、およびＮＯＩを含むプラスミドが含まれる。ベクター産生は、他の必要な成分を含む細胞への１つまたは複数のこれらの成分の一過性トランスフェクションを含む。ベクターが有毒遺伝子または宿主細胞の複製を妨害する遺伝子（細胞周期のインヒビター）、またはアポトーシスを誘導する遺伝子をコードする場合、安定なベクター産生細胞株を作製することは困難であるが、一過性トランスフェクションを使用して細胞死の前にベクターを産生することができる。また、安定なベクター産生細胞株から得られたレベルに匹敵するベクタータイターレベルが得られる一過性トランスフェクションを使用して細胞株が開発されている（２５）。
【０１０２】
産生細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞型であり得る。産生細胞は、一般に、哺乳動物細胞であるが、例えば、昆虫細胞であり得る。産生細胞は、通常、本発明の調節レトロウイルスベクターが移入されたゲノムに組み込まれたウイルス構造遺伝子を含むパッケージング細胞であり得る。あるいは、産生細胞を、構造成分をコードする核酸（プラスミド、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどの１つまたは複数のベクター上のコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖなど）または標的細胞に機能的ＤＮＡを送達させることが公知の方法でトランスフェクトすることができる。次いで、本発明のベクターを、本発明の方法によってパッケージング細胞に移入する。
【０１０３】
本明細書中で使用される、用語「産生細胞」または「ベクター産生細胞」は、調節レトロウイルスベクター粒子および直接レトロウイルス送達系の産生に必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。
【０１０４】
好ましくは、産生細胞は、安定な産生細胞株から得ることができる。
好ましくは、産生細胞は、誘導された安定な産生細胞株から得ることができる。
好ましくは、産生細胞は、誘導された産生細胞株から得ることができる。
【０１０５】
本明細書中で使用される、用語「誘導された産生細胞」は、高発現マーカー遺伝子についてスクリーニングおよび選択された形質導入産生細胞株である。このような細胞株は、組み込み部位中にレトロウイルスゲノム由来の高レベル発現を支持するレトロウイルス挿入物を含む。用語「誘導された産生細胞株」を、用語「誘導された安定な産生細胞株」および用語「安定な産生細胞株」と交換可能に使用する。
【０１０６】
好ましくは、誘導された産生細胞株には、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、誘導された産生細胞株は、ＨＩＶまたはＥＩＡＶ産生細胞株、より好ましくはＥＩＡＶ産生細胞株である。
【０１０７】
好ましくは、エンベロープタンパク質配列およびヌクレオキャプシド配列は全て産生細胞および／またはパッケージング細胞に安定に組み込まれる。しかし、１つまたは複数のこれらの配列はまた、エピソーム形態で存在し、遺伝子発現はエピソームから起こり得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される、用語「パッケージング細胞」は、組換えウイルスベクターを欠く感染性組換えウイルスの産生に必要なエレメントを含む細胞をいう。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖなど）を発現することができるが、パッケージングシグナルを含まない１つまたは複数のベクターを含む。
【０１０９】
「パッケージング配列」または「ψ」と交換可能に呼ばれる、用語「パッケージングシグナル」を、ウイルス粒子形成の際のレトロウイルスＲＮＡ鎖の包膜に必要な非コードシス活性化配列に関して使用する。ＨＩＶ−１では、この配列は、主要なスプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまでに及ぶ遺伝子座にマッピングされている。
【０１１０】
上記ベクター構築物との使用に適切なパッケージング細胞株を容易に調製することができ（ＷＯ９２／０５２６６も参照のこと）、これを使用してレトロウイルスベクター粒子の産生のための産生細胞株を作製する。すでに記載したように、利用可能なパッケージング株のまとめは、「レトロウイルス」（１９９７、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ編：ＪＭ　Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ　Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ　Ｖａｒｍｕｓ、４４９）に示されている。
【０１１１】
上記で考察するように、パッケージングシグナルが欠失したプロウイルスを含む単純なパッケージング細胞株は、組換えによって望ましくない複製成分ウイルスを迅速に産生することが見出されている。安全性を改善するために、プロウイルスの３’ＬＴＲが欠失した第２世代の細胞株が産生されている。このような細胞では、野生型ウイルスの産生に２つの組換えが必要である。さらなる改良は、異なる構築物上でのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の移入を含む（いわゆる第３世代のパッケージング細胞株）。これらの構築物を連続的に移入して、トランスフェクションの際の組換えを防止する（２６；２７）。
【０１１２】
好ましくは、パッケージング細胞株は、第２世代のパッケージング細胞株である。
好ましくは、パッケージング細胞株は、第３世代のパッケージング細胞株である。
【０１１３】
これらの分割構築物である第３世代の細胞株では、「コドンのゆらぎ」によってさらに組換えを行うことができる。遺伝コードの重複に基づくこの技術は、別の構築物の間（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌの読み取り枠とｅｎｖの読み取り枠における重複領域の間）の相同性を低下させることを目的とする。
【０１１４】
パッケージング細胞株は、高タイターのレトロウイルスベクターのための膜タンパク質の包膜および獲得に必要な遺伝子産物の獲得および調節核酸送達体の産生に有用である。調節レトロウイルス配列がパッケージング細胞株に移入された場合、このような配列はヌクレオキャプシド（ｇａｇ−ｐｏｌ）タンパク質で包膜され、次いで、細胞膜で取り囲まれ、パッケージング細胞株中に産生されるエンベロープタンパク質を含むようにこれらの単位が細胞膜から出芽する。これらの感染性調節レトロウイルスは、それ自体が感染単位として有用であるか、遺伝子送達ベクターとして有用である。
【０１１５】
パッケージング細胞株は、組織培養細胞株などのインビトロで培養された細胞であり得る。適切な細胞株には、マウス線維芽細胞由来の細胞株またはヒト細胞株などの哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０など）である。
【０１１６】
あるいは、パッケージング細胞株は、治療を受ける個体由来の細胞（単球、マクロファージ、血球、または線維芽細胞など）であり得る。個体からおよびパッケージングおよびベクター成分のｅｘ　ｖｉｖｏでの投与後の自家パッケージング細胞の再投与によって細胞を単離することができる。
【０１１７】
実験および実践の両方において高タイターウイルス調製物を使用することが非常に望ましい。ウイルスタイターの増加法には、上記のψ＋パッケージングシグナルの使用およびウイルスストックの濃縮が含まれる。さらに、水疱性口内炎ウイルス由来のＧタンパク質などの異なるエンベロープタンパク質により、１０９／ｍｌまでの濃度にタイターが改良された（２８）。しかし、典型的には、ウイルス粒子が好ましくは治療が望まれるウイルスで感染された細胞を感染するようにエンベロープタンパク質を選択する。例えば、ＨＩＶベクターを使用してＨＩＶ感染を治療する場合、使用されるｅｎｖタンパク質はＨＩＶｅｎｖタンパク質である。
【０１１８】
エンベロープタンパク質がレトロウイルスの天然のエンベロープではないレトロウイルスベクターの作製プロセスは、「偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）」として公知である。一定のエンベロープタンパク質（ＭＬＶエンベロープタンパク質、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質など）により、レトロウイルスは非常によく偽型化されている。偽型化は、新規の減少ではなく、その例をＷＯ−Ａ−９８／０５７５９、ＷＯ−Ａ−９８／０５７５４、ＷＯ−Ａ−９７／１７４５７、ＷＯ−Ａ−９６／０９４００、ＷＯ−Ａ−９１／０００４７、および（２９）に見出すことができる。
【０１１９】
本明細書中で使用される、用語「高タイター」は、細胞などの標的部位に形質導入することができるレトロウイルスベクターまたは粒子の有効量を意味する。
【０１２０】
本明細書中で使用される、用語「有効量」は、標的部位でのＮＯＩの発現の誘導に十分な調節レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターまたはベクター粒子の量を意味する。
【０１２１】
好ましくは、タイターは、少なくとも１０６レトロウイルス粒子／ｍｌ（１０６〜１０７／ｍｌなど）、より好ましくは少なくとも１０７レトロウイルス粒子／ｍｌである。
【０１２２】
本発明によれば、ウイルスゲノムまたは調節レトロウイルスヌクレオチド配列を操作して、ウイルスゲノムを異種ＮＯＩであり得る１つまたは複数のＮＯＩに置換するか補足することが可能である。
【０１２３】
用語「異種」は、天然に連結しないヌクレオチドまたはタンパク質配列に連結した核酸配列またはタンパク質配列をいう。
【０１２４】
本発明によれば、用語ＮＯＩ（すなわち、目的のヌクレオチド配列）には、任意の適切なヌクレオチド配列が含まれるが、完全に天然に存在するＤＮＡ配列である必要はない。したがって、ＤＮＡ配列は、例えば、合成ＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製された）、ｃＤＮＡ配列、または部分的にゲノムＤＮＡ配列（その組み合わせを含む）であり得る。ＤＮＡ配列は、コード領域である必要はない。コード領域である場合、全コード領域である必要はない。さらに、ＤＮＡ配列センス方向でもアンチセンス方向でも良い。好ましくは、センス方向である。好ましくは、ＤＮＡは、ｃＤＮＡであるか、それを含む。
【０１２５】
ＮＯＩは、任意の１つまたは複数の選択遺伝子、マーカー遺伝子、および知慮遺伝子であり得る。
【０１２６】
本明細書中で使用される、用語「選択遺伝子」は、選択マーカーを発現する細胞に抗生物質または薬物耐性を付与する酵素活性を有し得る選択マーカーをコードするＮＯＩの使用をいう。
レトロウイルスベクターで多数の異なる選択マーカーが首尾よく使用されている。これらは、「レトロウイルス」（１９９７、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ編、ＪＭ　Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ　Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ　Ｖａｒｍｕｓ、４４４）に概説されており、Ｇ４１８およびハイグロマイシン耐性を付与する細菌ネオマイシン（ｎｅｏ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；メトトレキセート耐性を付与する変異マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子；ミコフェノール酸、キサンチン、およびアミノプテリンを含む培地中で細胞を成長させる細菌ｇｐｔ遺伝子；ヒスチジンを含まないが、ヒスチジノールを含む培地中で細胞を成長させる細菌ｈｉｓＤ遺伝子；種々の薬物に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）；およびプロマイシンまたはフレオマイシン耐性を付与する細菌遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。これらのマーカーの全てが支配的選択性を示し、これらの遺伝子を発現するほとんどの細胞を化学的に選択可能である。他の選択マーカーは、関連する酵素活性を欠く細胞株と共に使用しなければならないという点で支配的ではない。非支配的選択マーカーの例には、ｔｋ細胞株と併せて使用されるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が含まれる。
【０１２７】
特に好ましいマーカーは、典型的にはＳＶ４０プロモーターなどの強力ウイルスプロモーターの転写調節下で、任意選択的にチミジンキナーゼコード配列に作動可能に連結されたブラスチシジンおよびネオマイシンである。
【０１２８】
本発明によれば、適切なＮＯＩには、治療および／または診断用であるものが含まれる（サイトカイン、ケイモカイン、ホルモン、抗体、操作免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激因子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、ターゲットタンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件的毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにその誘導体（レポーター群に関連するものなど）をコードする配列などであるが、これらに限定されない）。含まれる場合、このようなコード配列を、典型的には、リボザイム発現を駆動するプロモーターまたは１つまたは複数の特異的細胞型などの異なるプロモーターであり得る適切なプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１２９】
本発明で癌の治療または予防に使用される適切なＮＯＩには、ＮＯＩコードタンパク質（標的細胞（例えば、リボゾーム毒素）を破壊するもの、腫瘍抑制因子（野生型ｐ５３など）；抗腫瘍免疫機構のアクチベーター（サイトカイン、同時刺激分子、および免疫グロブリンなど）；血管新生のインヒビターとして作用するもの；または薬物感受性を向上せるもの（プロドラッグ活性化酵素など）；天然の効果細胞によって標的細胞の破壊を間接的に刺激するもの（例えば、免疫系を刺激するための強力な抗原または前駆物質を標的細胞を破壊する有毒物質に変換するもの（例えば、プロドラッグ活性化酵素）））が含まれる。
【０１３０】
プロドラッグの例には、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと使用する）；５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと使用）；ドキソルビン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと使用）；パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンジルグルタメート（カルボキシペプチドＧ２と使用）；セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（βラクタマーゼと使用）；ＳＲ４２３３（ｐ４５０還元酵素と使用）；ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと使用）；ニトロレダクターゼおよびシクロホスファミドまたはイフォスファミドを含むマスタードプロドラッグ（シトクロムｐ４５０と使用）；が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
虚血性心疾患の治療または予防での使用に適切なＮＯＩには、プラスミノゲンアクチベーターをコードするＮＯＩが含まれる。慢性関節リウマチまたは大脳マラリアの治療または予防に適切なＮＯＩには、抗炎症性タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αに指向する抗体、および抗接着分子（抗体分子または接着分子に特異的な受容体など）をコードする遺伝子が含まれる。
【０１３２】
ＮＯＩによってコードされる発現産物は、細胞から選択されたタンパク質であり得る。あるいは、ＮＯＩ発現産物は分泌されずに細胞内で活性である。いずれの事象でも、バイスタンダー効果または離れた（ｄｉｓｔａｎｔ）バイスタンダー効果（すなわち、共通の表現型を有するさらなる細胞、関連細胞、近隣または離れた（例えば、転移）細胞を死滅させるある細胞での発現産物の産生）の証明にはＮＯＩ発現産物が好ましい。コードされたタンパク質はまた、バイスタンダー腫瘍細胞を破壊するか（例えば、分泌された抗腫瘍抗体−リボゾーム毒素融合タンパク質による）、バイスタンダー腫瘍細胞の破壊を間接的に刺激するか（例えば、免疫系を刺激するためのサイトカインまたは局所性血管閉塞を引き起こす凝血原タンパク質）、前駆物質をバイスタンダー腫瘍細胞を破壊する有毒物質（例えば、プロドラッグを拡散性薬物に活性化する酵素）に変換することができる。また、腫瘍の存続のための細胞遺伝子の発現を妨害するアンチセンス転写物またはリボザイム（例えば、バーキットリンパ腫における異常なｍｙｃ転写物または慢性骨髄性白血病におけるｂｃｒ−ａｂｌ転写物）をコードするＮＯＩの送達。
【０１３３】
本発明のＮＯＩはまた、１つまたは複数のサイトカインコードＮＯＩを含み得る。適切なサイトカインおよび成長因子には、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルディオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、ＦＧＦ酸性、ＦＧＦ塩基性、第１０線維芽細胞成長因子（３０）、ＥＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２アミノ酸）、ＩＬ−８（７７アミノ酸）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、第２ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー刺激因子、単球誘引タンパク質（３０、前出）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７アミノ酸）、ＭＤＣ（６９アミノ酸）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７アミノ酸）、ＭＤＣ（６９アミノ酸）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆物質阻害因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニューロツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
ＮＯＩは、発現調節エレメント（本発明の「応答エレメント」として公知のプロモーターおよび／またはプロモーターエンハンサーなど）の発現調節下で存在し得る。
【０１３５】
調節レトロウイルスベクター粒子を使用してＮＯＩを形質導入される細胞に導入する場合、このようなベクター粒子を、「ウイルス送達系」または「レトロウイルス送達系」とも呼ぶ。レトロウイルスベクターを含むウイルスベクターを使用して、ウイルス形質導入の利用によってＮＯＩを有効に導入した。レトロウイルスゲノムにクローン化されたＮＯＩを、レトロウイルスによる形質導入に感受性を示す細胞に有効に送達することができる。他のゲノム操作によって、レトロウイルスゲノムの複製能力を破壊することができる。ベクターは、細胞に新規の遺伝物質を移入するが、複製できない。
【０１３６】
本発明の調節されたレトロウイルスベクターを、ウイルスまたは非ウイルス技術によって送達することができる。非ウイルス送達系には、ＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これに限定されない。本明細書中のトランスフェクションには、ターゲット哺乳動物細胞に遺伝子を送達させるための非ウイルスベクターを使用したプロセスが含まれる。
【０１３７】
典型的なトランスフェクション法には、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介トランスフェクション、小型ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽性因子媒介の陽性表面の両親媒性物質（ＣＦＡ）（３１）、スペルミン、カチオニックリピド、またはポリリジンなどの多価陽イオン、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロール複合体（３２）、およびその組み合わせが含まれる。
【０１３８】
ウイルス送達系には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。これらのウイルス送達系を、分割（ｓｐｌｉｔ）イントロンベクターとして構成することができる。分割イントロンベクターは、ＷＯ９９／１５６８３に記載されている。
【０１３９】
ベクターの他の例には、ｅｘ　ｖｉｖｏ送達系（ｅｘ　ｖｉｖｏ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ）が含まれ、これには、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介トランスフェクション、小型ＤＮＡ媒介トランスフェクションなどのＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
ベクターは、プラスミドＤＮＡベクターであり得る。あるいは、ベクターは、組換えウイルスベクターであり得る。適切な組換えウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターとレンチウイルスベクターとの組み合わせが含まれる。ウイルスベクターの場合、遺伝子送達は標識細胞のウイルス感染によって媒介される。
【０１４１】
アデノウイルスの特徴がレトロ／レンチウイルスの遺伝子安定性と組み合わされた場合、本質的にアデノウイルスを使用し、標的細胞に形質導入して、近隣の細胞に安定して感染することができる一過性レトロウイルス産生細胞とすることができる。
【０１４２】
本発明はまた、治療有効量の本発明の調節レトロウイルスベクターを含む、遺伝子治療によって個体を治療するための薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、ヒトまたは動物用であり得る。典型的には、医師が各被験体に最も適切な実際の投薬量を決定し、この量は年齢、体重、および特定の患者の応答によって変化する。
【０１４３】
組成物は、任意選択的に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み得る。薬学的キャリア、賦形剤、または希釈剤の選択を、意図する投与経路および標準的な薬学的業務に関して選択することができる。薬学的組成物は、キャリア、賦形剤、希釈剤、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤、および標的部位へのウイルスの侵入を補助するか増加することができる他のキャリア（例えば、脂質送達系など）を含むか、これらを添加することができる。
【０１４４】
適切な場合、薬剤組成物を、任意の以下の１つまたは複数のミニポンプ、吸入、座薬または膣座薬の形態、局所（ローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形態、皮膚パッチの使用）、経口（デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態または単独または賦形剤と混合したカプセルまたは小卵、または香料または着色料を含むエリキシル、溶液または懸濁液の形態）によって投与するか、非経口（例えば、海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌｌｙ）、静脈内、筋肉内、または皮下）で注射することができる。非経口投与には、組成物を、他の物質（例えば、血液と等張の溶液を作製するのに十分な塩または単糖類）を含み得る滅菌水溶液の形態で使用するのが最良であり得る。口内または舌下投与には、組成物を、従来の様式で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形態で投与することができる。
【０１４５】
本発明は、特に１つまたは複数のＮＯＩの選択に依存する広範な治療適用性を有すると考えられる。
【０１４６】
例えば、本発明は、ＷＯ−Ａ−９８／０５６３５に列挙した障害の治療に有用であり得る。容易に参照するために、そのリストの一部を以下に示す。癌、炎症または炎症疾患、皮膚障害、熱、心血管作用、出血、凝固および急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、再灌流障害、髄膜炎、偏頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍の成長、浸潤、および拡大、新脈管形成、転移、悪性腫瘍、腹水、および悪性胸水；大脳虚血、虚血性心疾患、変形性関節症、慢性間接リウマチ、骨粗しょう症、喘息、多発性硬化症、神経変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、脈管炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎；歯周病、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水疱症；角膜潰瘍、網膜症および手術損傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシー、再狭窄、うっ血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化、またはエンドスレロシス（ｅｎｄｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）。
【０１４７】
さらに、またはその代わりに、本発明は、ＷＯ−Ａ−９８／０７８５９に列挙の障害の治療に有用であり得る。容易に参照するために、そのリストの一部を以下に示す。サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスの感染を含む免疫不全治療；リンパ球増殖の制御；癌および多くの自己免疫疾患の治療、および移植片拒絶の予防または腫瘍免疫の誘導）；造血の制御（例えば、骨髄またはリンパ球疾患の治療）；骨、軟骨、腱、微細線維、および神経組織の成長の促進（損傷治癒、やけどの治療、潰瘍、および歯周病および神経変性の治療）；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（受精の調整）；走化性／化学速度活性（例えば、損傷または感染部位への特定の細胞の移動）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中の治療）；抗炎症活性（例えば、敗血症ショックまたはクローン病の治療）；抗菌剤；例えば、代謝または共同のモジュレーター；鎮痛薬として；特定の欠乏疾患の治療；例えば乾癬の治療、ヒトまたは脊椎動物用薬物。
【０１４８】
さらに、またはその代わりに、本発明は、ＷＯ−Ａ−９８／０９９８５に列挙の障害の治療に有用であり得る。容易に参照するために、そのリストの一部を以下に示す：マクロファージ阻害および／またはＴ細胞阻害活性およびそれによる抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、細胞性および／または体液性免疫応答（炎症に関連しない応答を含む）に対する阻害効果）；マクロファージおよびＴ細胞の細胞外基質成分およびフィブロネクチンに接着する能力の阻害ならびにＴ細胞でのｆａｓレセプター発現の上方制御；望ましくない免疫反応および炎症（慢性間接リウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病、および他の自己免疫疾患に関連する炎症を含む）、関節硬化症、動脈硬化、アテローム性心臓病、再灌流障害、心停止、心筋梗塞、血管炎症障害、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に関連する炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および他の胃腸管疾患に関連する炎症の阻害、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の陣疾患および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周病または他の歯の疾患、精巣炎または精巣上体炎、不妊症、精巣損傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤不全、胎盤機能不全、習慣性流産、子かん、子かん前症および他の免疫および／または炎症関連婦人病、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、視神経網膜炎、軸性神経炎、眼内炎（例えば、網膜炎または類嚢胞黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性基底部疾患の免疫および炎症成分、眼外傷の炎症成分、感染による眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性眼神経障害、過剰な瘢痕（例えば、緑内障のろ過操作後）、眼移植片に対する免疫および／または炎症反応および他の免疫および炎症関連眼病）、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の器官において免疫および／または炎症の抑制が有利である場合の自己免疫疾患または病態または障害に関連する炎症、パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合体、ＨＩＶ関連脳障害、ドビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病、および他の変性疾患、ＣＮＳの病態または障害、脳卒中の炎症成分、ポリオ後症候群、精神病、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギヤン−バーレ症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症の免疫および炎症成分、ＣＮＳ圧迫症またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳの感染の炎症成分、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症成分、中枢神経系および末梢神経系の免疫および炎症関連疾患、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術、骨髄移植における炎症性合併症または副作用、他の移植合併症および／または副作用、遺伝子治療による炎症性および／または免疫合併症および副作用（例えば、ウイルスキャリアでの感染による）、ＡＩＤＳに関連する炎症（体液性および／または細胞性免疫反応を抑制または阻害）、一定量の単球またはリンパ球の減少による単球または白血球増殖疾患（例えば、白血病）の治療または改善、天然または人工の細胞、組織、および器官（角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然または人工の皮膚組織など）の移植時の移植片拒絶の予防および／または治療。
【０１４９】
本発明を、実施例によってさらに説明しているが、これは当業者が本発明を実行するときの補助として利用されることを意味し、本発明の制限することを決して意図しない。実施例については、図を参照のこと。
【０１５０】
より詳細には、図８は、野生型ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ｐＧＰ−ＲＲＥ３）とコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ｐＳＹＮＧＰ）との間の配列比較を示し、上の配列はｐＳＹＮＧＰを示し、下の配列はｐＧＰ−ＲＲＥ３を示す。
【０１５１】
図１０は、タンパク質発現粒子形成のＲｅｖ独立性を示す。Ｒｅｖ（ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、１μｇ）の存在下または非存在下で５μｇのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後に培養上清（Ａ）および細胞溶解物（Ｂ）のタンパク質レベルを同定した。ＨＩＶ−１陽性ヒト血清を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質を検出した。内部コントロールとして抗アクチン抗体を使用してブロットを再探索した（Ｃ）。タンパク質マーカー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のサイズ（ｋＤａ）を、ゲルの端に示す。レーン：１．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、２．ｐＧＰ−ＲＲＥ３、３．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、４．ｐＳＹＮＧＰ、５．ｐＳＹＮＧＰ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、６．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、７．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、８．ｐＳＹＮＧＰ−ＥＲＲ、９．ｐＳＹＮＧＰ−ＥＲＲ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ。
【０１５２】
図１１は、ＷＴとコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌの翻訳速度を示す。２９３Ｔ細胞を、２μｇのｐＧＰ−ＲＲＥ３（＋／−　１μｇ　ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ）または２μｇのｐＳＹＮＧＰでトランスフェクトした。トランスフェクションから１２、２５、３７、および４８時間後にウェスタンブロッティングによって培養上清（Ａ）および細胞抽出物（Ｂ）由来のタンパク質サンプルを分析した。ＨＩＶ−１陽性ヒト血清を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質（Ａ、Ｂ）を検出し、内部コントロールとして抗アクチン抗体を使用した（Ｃ）。タンパク質マーカー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）のサイズ（ｋＤａ）を、ゲルの端に示す。ホスホロイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して、結果を定量した。レーン：１．ｐＧＰ−ＲＲＥ３（１２時間）、２．ｐＧＰ−ＲＲＥ３（２５時間）、３．ｐＧＰ−ＲＲＥ３（３７時間）、４．ｐＧＰ−ＲＲＥ３（４８時間）、５．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（１２時間）、６．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（２５時間）、７．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（３７時間）、８．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（４８時間）、９．ｐＳＹＮＧＰ（１２時間）、１０．ｐＳＹＮＧＰ（２５時間）、１１．ｐＳＹＮＧＰ（３７時間）、１２．ｐＳＹＮＧＰ（４８時間）、１３．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞。
【０１５３】
図１２は、全画分および細胞質画分のｇａｇ−ｐｏｌ　ｍＲＮＡレベルを示す。５μｇのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド（＋／−　１μｇ　ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ）でのトランスフェクションから３６時間後に２９３Ｔ細胞から全ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットによってｍＲＮＡレベルを評価した。野生型およびコドン最適化遺伝子のｎｔ１２２２〜１５０３に相補的なプローブを使用した。パネルＡは、ＨＩＶ−１　ｇａｇ−ｐｏｌに対応するバンドを示す。ｍＲＮＡのサイズは、コドン最適化遺伝子が４．４ｋｂであり、野生型遺伝子が６ｋｂである。パネルＢは、ヒトユビキチンに対応するバンドを示す（結果を基準化するための内部コントロール）。ホスホロイメージャーを使用して定量した。レーンの番号づけ：ｃは細胞質画分を示し、ｔは全ＲＮＡ画分を示す。レーン：１．ｐＧＰ−ＲＲＥ３、２．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、３．ｐＳＹＮＧＰ、４．ｐＳＹＮＧＰ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、５．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、６．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、７．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、８．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、９．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、１０．ｐＳＹＮＧＰ。
【０１５４】
図１３は、ＲＮＡおよびタンパク質レベルに対するコドン最適化遺伝子のＷＴｇａｇ下流挿入の効果を示す。ｗｔ　ｇａｇ配列を、両方向のコドン最適化遺伝子の下流（ＮｏｔＩ部位）に挿入し、プラスミドｐＳＹＮ６（正方向、図１４を参照のこと）およびｐＳＹＮ７（逆方向、図１４を参照のこと）を得た。βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）もまた同一の部位に挿入し、正方向プラスミド（ｐＳＹＮ８、図１４を参照のこと）を得た。２９３Ｔ細胞を５μｇの各プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションｍＲＮＡから４８時間後に、先に記載のノーザンおよびウェスタンブロット分析によってタンパク質レベルを同定した。
【０１５５】
細胞質ＲＮＡ画分のノーザンブロット分析。コドン最適化遺伝子（Ｉ）のｎｔ１５１０〜２２９０に相補的なプローブを使用してブロットを探索し、ヒトユビキチンに特異的なプローブ（ＩＩ）を使用して再探索した。レーン：１．ｐＳＹＮＧＰ、２．ｐＳＹＮ８、３．ｐＳＹＮ７、４．ｐＳＹＮ６。
【０１５６】
ウェスタンブロット分析：ＨＩＶ−１陽性ヒト血清を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質（Ｉ）を検出し、抗アクチン抗体を内部コントロールとしてＫ使用した（ＩＩ）。レーン：細胞溶解物：１．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、２．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、３．ｐＳＹＮＧＰ、４．ｐＳＹＮ６、５．ｐＳＹＮ７、６．ｐＳＹＮ８。上清：７．偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞、８．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、９．ｐＳＹＮＧＰ、１０．ｐＳＹＮ６、１１．ｐＳＹＮ７、１２．ｐＳＹＮ８。タンパク質マーカー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）のサイズを、ゲルの端に示す。
【０１５７】
図１４は、コドン最適化遺伝子に対するＨＩＶ−１ｇａｇの効果を研究するために使用したプラスミドを示す。全ての構築物の主鎖は、ｐＣＩ−Ｎｅｏであった。Ｓｙｎ　ｇｐ：コドン最適化ＨＩＶ−１　ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子。ＨＸＢ２ｇａｇ：野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子。ＨＸＢ２ｇａｇ，ｒ：逆方向の野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子。ＨＸＢ２ｇａｇＡＡＴＧ：ｇａｇＡＴＧを含まない野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子。ＨＸＢ２ｇａｇｆｒ．ｓｈ．：フレームシフト変異した野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子。ＨＸＢ２ｇａｇ６２５〜１５０３：野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド６２５〜１５０３。ＨＸＢ２ｇａｇ１〜６２５：野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド１〜６２５。
図１５は、コドン最適化遺伝子のＨＩＶ−１ｇａｇ上流挿入の細胞質ＲＮＡに対する効果を示す。２９３Ｔ細胞のトランスフェクションから４８時間後に細胞質ＲＮＡを抽出した（５μｇの各ｐＳＹＮプラスミドを使用し、いくつかの場合、１μｇのｐＣＭＶ−Ｒｅｖを同時トランスフェクトした）。使用プローブは、コドン最適化遺伝子のｎｔ１５１０〜２２９０に相補的なようにデザインした（Ｉ）。ヒトユビキチンに特異的なプローブを、内部コントロールとして使用した（ＩＩ）。
レーン：１．ｐＳＹＮＧＰ、２．ｐＳＹＮ９、３．ｐＳＹＮ１０、４．ｐＳＹＮ１０＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、５．ｐＳＹＮ１１、６．ｐＳＹＮ１１＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、７．ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ。
【０１５８】
レーン：１．ｐＳＹＮＧＰ、２．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、３．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、４．ｐＳＹＮ１２、５．ｐＳＹＮ１４、６．ｐＳＹＮ１４＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、７．ｐＳＹＮ１３、８．ｐＳＹＮ１５、９．ｐＳＹＮ１７、１０．ｐＧＰ−ＲＲＥ３、１１．ｐＳＹＮ６、１２．ｐＳＹＮ９、１３．ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ。
【０１５９】
図１６は、タンパク質産生に対するＬＭＢの効果を示す。２９３Ｔ細胞を、１μｇのｐＣＭＶ−Ｒｅｖおよび３μｇのｐＧＰ−ＲＲＥ３／ｐＳＹＮＧＰ／ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ（＋／−　１μＧ　ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ）でトランスフェクトした。トランスフェクションを２連で行った。トランスフェクションから５時間後、培地を最初に新鮮な培地に置換し、その後７．５ｎＭ　ＬＭＢを含む新鮮な培地に置換した。２０時間後、細胞を溶解し、タンパク質産生を、ウェスタンブロット分析によって評価した。ＨＩＶ−１陽性ヒト血清を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質（Ａ）を検出し、抗アクチン抗体を内部コントロールとして使用した（Ｂ）。レーン：１．ｐＧＰ−ＲＲＥ３、２．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ＬＭＢ、３．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、４．ｐＧＰ−ＲＲＥ３＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ＋ＬＭＢ、５．ｐＳＹＮＧＰ、６．ｐＳＹＮＧＰ＋ＬＭＢ、７．ｐＳＹＮＧＰ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、８．ｐＳＹＮＧＰ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ＋ＬＭＢ、９．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、１０．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ＬＭＢ、１１．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、１２．ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ＋ＬＭＢ。
【０１６０】
図１７は、ベクターゲノムの細胞質ＲＮＡレベルを示す。２９３Ｔ細胞を、１０μｇの各ベクターゲノムでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に細胞質ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロット分析のために、各サンプル由来の２０μｇのＲＮＡを使用した。全てのベクターゲノムＲＮＡとハイブリッド形成させるために、７００ｂｐのプローブをデザインした（「材料と方法」を参照のこと）。レーン：１．ｐＨ６ｎＺ、２．ｐＨ６ｎＺ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、３．ｐＨ６．１ｎＺ、４．ｐＨ６．１ｎＺ＋ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ、５．ｐＨＳ１ｎＺ、６．ｐＨＳ２ｎＺ、７．ｐＨＳ３ｎＺ、８．ｐＨＳ４ｎＺ、９．ｐＨＳ５ｎＺ、１０．ｐＨＳ６ｎＺ、１１．ｐＨＳ７ｎＺ、１２．ｐＨＳ８ｎＺ、１３．ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ。
【０１６１】
図１８は、ＭＯＩ１での形質導入効率を示す。ウイルスストックを、２９３Ｔ細胞における各ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド（５または０．５μｇ）、１５μｇのｐＨ６ｎＺまたはｐＨＳ３ｎＺ（ベクターゲノムプラスミド）および５μｇのｐＨＣＭＶＧ（ＶＳＶエンベロープ発現プラスミド）の同時トランスフェクションによって作製した。ウイルスを以前に記載のように濃縮し（４５）、形質導入効率を、ＨＴ１０８０細胞に対するｍ．ｏ．ｉ．０．０１〜１で同定した。全てのケースで形質導入効率とｍ．ｏ．ｉ．との間に線形相関が存在した。ここでは、ｍ．ｏ．ｉ．１を示す写真を示す。形質導入効率は、全てのゲノム、全てのｇａｇ−ｐｏｌ、および全ての大量または少量ｐＳＹＮＧＰで８０％を超えていた。濃縮前のタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）：２９３Ｔ細胞：Ａ．　６．６×１０５、Ｂ．７．６×１０５、Ｃ．９．２×１０５、Ｄ．１．５×１０５、ＨＴ１０８０細胞：Ａ．６．０×１０４、Ｂ．９．９×１０４、Ｃ．８．０×１０４、Ｄ．２．９×１０４。濃縮後のＨＴ１０８０細胞のタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）：Ａ．６．０×１０５、Ｂ．２．０×１０６、Ｃ．１．４×１０６、Ｄ．２．０×１０５。
【０１６２】
図２１は、異なるｇａｇ−ｐｏｌ構築物で得られたベクタータイターを示す。ウイルスストックを、２９３Ｔ細胞における各ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＨ６ｎＺ（ベクターゲノムプラスミド）、およびｐＨＣＭＶＧ（ＶＳＶエンベロープ発現プラスミド、各トランスフェクションたり２．５μｇ）の同時トランスフェクションによって作製した。２９３Ｔについてのタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌウイルスストック）を、トランスフェクションから４８時間後にＸ−Ｇａｌ染色後の青色コロニー数の計数によって測定した。実験を少なくとも２回行い、実験のばらつきは１５％未満であった。
【０１６３】
図２２は、Ｒｅｖ／ＲＲＥ（−）および（＋）ゲノム由来のウイルスタイターを示す。ウイルスベクターを、実施例に記載のように作製した。２９３Ｔ細胞におけるタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌウイルスストック＋ＳＤ）を同定した。
【０１６４】
図２３は、ベクターゲノムのｐＨＳシリーズ由来のベクタータイターを示す。ウイルスベクターを、実施例に記載のように作製した。２９３Ｔ細胞におけるタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌウイルスストック＋ＳＤ）を同定した。ｐＣＭＶ−ＲｅｖからＲｅｖが得られる。ｐＨ６ｎＺはＲｅｖを発現し、ＲＲＥを含むことに留意のこと。他のゲノムはＲｅｖを発現することもＲＲＥを含むこともない。ｐＳＹＮＧＰ由来の発現はＲｅｖ独立性であり、ｐＧＰ−ＲＲＥ３はＲｅｖ依存性である。
【０１６５】
図２４は、Ｒｅｖ／ＲＲＥの存在下または非存在下でのベクターゲノムのｐＨＳシリーズについてのベクタータイターを示す。実施例に記載のようにレトロウイルスベクターを作製した。５μｇのベクターゲノム、５μｇのｐＳＹＮＧＰ、および２．５μｇのｐＨＣＭＶＧを使用し、２９３Ｔ細胞におけるタイター（Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を同定した。実験を少なくとも２回行い、実験のばらつきは１５％未満であった。Ｒｅｖを、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（１μｇ）から得る。ｐＨ６ｎＺはＲｅｖを発現し、ＲＲＥを含むことに留意のこと。ｐＨＳゲノムはＲｅｖを発現せず、ｐＨＳ１ｎＺＲ、ｐＨＳ３ｎＺＲ、ｐＨＳ７ｎＺＲ、およびｐＨ６．１ｎＺＲのみがＲＲＥを含む。ｐＳＹＮＧＰからのｇａｇ−ｐｏｌ発現は、Ｒｅｖ独立性である。
【０１６６】
図２６は、３０μｇの全細胞タンパク質をＳＤＳ／Ｐａｇｅ電気泳動で分離し、ニトロセルロースに移し、抗ＥＩＡＶ抗体で探索する、２９３Ｔ抽出物のウェスタンブロットを示す。二次抗体は、抗ウマＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）であった。
【０１６７】
図３８は、ｌａｃＺ形成単位（Ｌ．Ｆ．Ｕ．）／ｍｌにおけるタイターを示す。使用ベクターを、バーの上のボックス中に示す。
容易に参照するために、以下に添付の配列表に列挙した配列を記載する。
【０１６８】
配列番号１は、ＨＸＢ２株（アクセッション番号Ｋ０３４５５）の野生型ｇａｇ−ｐｏｌ配列を示す。
配列番号２は、ｐＳＹＮＧＰ配列を示す。
配列番号３は、ＨＩＶ−１　ＭＮ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１７４４９）のエンベロープ遺伝子配列を示す。
配列番号４は、ＳＹＮｇｐ−１６０ｍｎ配列（コドン最適化ｅｎｖ配列）を示す。
配列番号５は、ｐＥＳＹＮＧＰ配列を示す。
配列番号６は、ＬｐＥＳＹＮＧＰ配列を示す。
配列番号７は、ｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥ配列を示す。
配列番号８は、ＬｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥ配列を示す。
配列番号９は、ｐＯＮＹ４．０Ｚ配列を示す。
配列番号１０は、ｐＯＮＹ８．０Ｚ配列を示す。
配列番号１１は、ｐＯＮＹ８．１Ｚ配列を示す。
配列番号１２は、ｐＯＮＹ３．１配列を示す。
配列番号１３は、ｐＣＩｎｅｏＥＲｅｖ配列を示す。
配列番号１４は、ｐＥＳＹＮＲＥＶ配列を示す。
配列番号１５は、コドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ配列を示す。
配列番号１６は、コドン最適化ＥＩＡＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ配列を示す。
配列番号１７は、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇＥＳＹＮＧＰ配列を示す。
配列番号１８は、ｐＥＳＤＳＹＮＧＰ配列を示す。
配列番号１９は、ｐＯＮＹ８．３Ｇ　ＦＢ２９（−）配列を示す。
【０１６９】
実施例１−ＨＩＶ
細胞株
２９３Ｔ細胞（３３）およびＨｅＬａ細胞（３４）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含み、Ｌグルタミンおよび抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）を補足したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。２９３Ｔ細胞は、Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（ロックフェラー大学）から得た。
【０１７０】
ＨＩＶ−１プロウイルスクローン
プロウイルスクローンｐＷＩ３およびｐＮＬ４−３（３６）を使用した。
【０１７１】
パッケージング系の構築
１つの実施例では、改変コドン最適化ＨＩＶｅｎｖ配列（配列番号４）を使用する。対応するｅｎｖ発現プラスミドを、ｐＳＹＮｇｐ１６０ｍｎと命名する。改変配列は、（３７）で使用されなかった余剰のモチーフを含む。余剰の配列を、ＭＮ株のＨＩＶｅｎｖ配列およびコドン最適化から得た。核酸配列の任意の類似の改変により、豊富なｔＲＮＡに対応するコドンを使用する限り同様に機能する。
【０１７２】
コドン最適化ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子
配列番号２のｎｔ１１０８〜５４１４に示すコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を、一連の短い重複オリゴヌクレオチド（約２５％が重複した約３０〜４０量体、すなわち約９ヌクレオチド）のアニーリングによって構築した。オリゴヌクレオチドを、Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ　（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｅｕｒｏｐｅ　Ｌｔｄ、４−１０　Ｔｈｅ　Ｑｕａｄｒａｎｔ、Ｂａｒｔｏｎ　Ｌａｎｅ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＯＸ１４　３ＹＳ、ＵＫ）から購入した。ＨＸＢ−２株の配列（ＡＣ：Ｋ０３４５５）（３９）を使用してコドン最適化を行った。至適な翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列（４０）も含む。フレームシフトおよびｇａｇとｐｏｌ両読み取り枠の間の重複を維持するために、ｇａｇの最初からｇａｇの最後（１５０３）までの１２２２塩基由来のフラグメントを最適化しなかった。これは、クローンｐＮＬ４−３由来であった。（ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子内の塩基番号をいう場合、塩基１は、ＨＸＢ２配列の最初から７９０塩基に対応するｇａｇ　ＡＴＧのＡである。）ｇａｇ−ｐｏｌの外側の配列をいう場合、数字は５’ＬＴＲの最初に対応するＨＸＢ２配列の最初由来の塩基をいう。都合の良い制限部位を移入するために、最適化由来のいくつかのばらつきを作製した。最終的なコドン使用頻度を図３ｂに示し、これは、高度に発現するヒト遺伝子の使用頻度に類似するが、野生型ＨＩＶ−１　ｇａｇ−ｐｏｌの使用頻度と非常に異なる。遺伝子を哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＳＹＮＧＰと命名した（図２０、配列番号２）。両鎖の遺伝子の配列決定により、いかなる誤りもないことが確認された。コドン最適化配列と野生型ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌ配列との間の配列比較を、図８に示す。
【０１７３】
Ｒｅｖ／ＲＲＥ構築物
ＨＩＶ−１　ＲＲＥ配列（ＨＸＢ２配列の塩基７７６９〜８０２１）を、ＮｏｔＩ制限部位を有するプライマーを使用して、ｐＷＩ３プロウイルスクローンからＰＣＲによって増幅し、ｐＳＹＮＧＰのＮｏｔＩ部にクローン化した。得られたプラスミドを、ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ（正方向のＲＲＥ）およびｐＳＹＮＧＰ−ＥＲＲ（逆方向のＲＲＥ）と命名した。
【０１７４】
偽型化ウイルス粒子
パッケージング系の１つの形態では、合成ｇａｇ−ｐｏｌカセットを、異種エンベロープコード配列とともに同時発現する。これは、例えば、ＶＳＶ−Ｇ（４４、４５）、アンフォトロピックＭＬＶ　ｅｎｖ（４６、４７）、またはＨＩＶまたはＥＩＡＶ粒子に組み込まれる任意の他のタンパク質（４８）であり得る。これには、特異的組織にベクターを標的化することができる分子が含まれる。
【０１７５】
ＨＩＶ−１ベクターゲノム構築物
ｐＨ６ｎＺは、逆転写を最適化するためにｐＨ４Ｚからベクターゲノム転写物の５’末端が欠失している余剰のグアニン残基を置換するために１つのヌクレオチドが添加されたｐＨ４Ｚ（４９）由来である。さらに、核局在化βガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をコードする遺伝子に置換した。（本発明者らは、ｐＨ６ｎＺを提供したＥｎｃａ　Ｍａｒｔｉｎ−ＲｅｎｄｏｎとＳａｉｄ　Ｉｓｍａｉｌに感謝する）。Ｒｅｖ（−）ゲノムを構築するために、以下の改変を行った。ａ）ｐＨ６ｎＺから１．８ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントを除去して、プラスミドｐＨ６．１ｎＺを得ることおよびｂ）ＥｃｏＮＩ（充填）−ＳｐｈＩフラグメントを同一のプラスミド（ｐＨ６ｎＺ）由来のＳｐｅＩ（充填）−ＳｐｈＩフラグメントに置換して、プラスミドｐＨ６．２ｎＺを得ること。両方の場合、パッケージングの役割を果たすことが認められているように（９３）、ｇａｇ内の配列（ｎｔ　１〜６２５）が保持された。Ｒｅｖ、ＲＲＥ、および任意の他の残存ｅｎｖ配列を除去した。ｐＨ６．２ｎＺは、ｅｎｖスプライス受容体を含むが、ｐＨ６．１ｎＺは含まない。
【０１７６】
ｇａｇ欠失＋または−変異体主要スプライスドナー（ＳＤ）（ＧＴからＣＡへの変異）をさらに含む一連のベクターはまた、ｐＨ６Ｚに由来した。これらを、ＮａｒＩを有するプライマー（５’プライマー）部位およびＳｐｅＩを有するプライマー（３’プライマー）部位を使用したＰＣＲによって作製した。ＰＣＲ産物をｐＨ６ＺのＮａｒＩ−ＳｐｅＩ部位に挿入した。得られたベクターを、ｐＨＳ１ｎＺ（ｇａｇ４０までのＨＩＶ−１配列を含む）、ｐＨＳ２ｎＺ（ｇａｇ２６０までのＨＩＶ−１配列を含む）、ｐＨＳ３ｎＺ（ｇａｇ３６０までのＨＩＶ−１配列を含む）、ｐＨＳ４ｎＺ（ｇａｇ６２５までのＨＩＶ−１配列を含む）、ｐＨＳ５ｎＺ（ｐＨＳ１ｎＺと同一であるがＳＤ変異を有する）、ｐＨＳ６ｎＺ（ｐＨＳ２ｎＺと同一であるがＳＤ変異を有する）、ｐＨＳ７ｎＺ（ｐＨＳ３ｎＺと同一であるがＳＤ変異を有する）、およびｐＨＳ８ｎＺ（ｐＨＳ４ｎＺと同一であるがＳＤ変異を有する）と命名した。
【０１７７】
さらに、ＲＲＥ配列（ＨＸＢ２配列のｎｔ７７６９〜８０２１）を、ｐＨ６．１ｎＺ、ｐＨＳ１ｎＺ、ｐＨＳ３ｎＺ、およびｐＨＳ７ｎＺのＳｐｅＩ（充填）部位に挿入して、それぞれプラスミドｐＨ６．１ｎＺＲ、ｐＨＳ１ｎＺＲ、ｐＨＳ３ｎＺＲ、および　ｐＨＳ７ｎＺＲを得た。
【０１７８】
ＳＩＮベクターの作製（３’Ｕ３部分の欠失による）、ＬＴＲのＭＬＶ由来のＬＴＲへの置換、または３’Ｕ３部分のＭＬＶ　Ｕ３領域への置換を含む他のゲノム改変を行った。
【０１７９】
一過性トランスフェクション、形質導入、およびウイルスタイターの同定
これらは以前に記載のように行った（４９、５０）。簡単に述べれば、２９３Ｔ細胞を６ｃｍ皿に播種し、２４時間後にこれを一晩のリン酸カルシウム処理によって一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから１２時間後に培地を置換し、特記しない限り、トランスフェクションの４８時間後に上清を回収し、濾過し（０．２２または０．４５μｍのフィルター）、２９３Ｔ細胞の形質導入によって滴定した。この理由のために、元のストックの適切な希釈物の上清を２９３Ｔ細胞に添加した（形質導入の２４時間前に６〜１２ウェルプレートにプレートする）。８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加し、形質導入から４８時間後にＸ−ｇａｌ染色によってウイルスタイターを同定した。
【０１８０】
発光βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）アッセイ
発光β−ｇａｌレポーター系（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、全細胞抽出物についてこれらのアッセイを行う。非トランスフェクト２９３Ｔ細胞をネガティブコントロールとして使用し、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【０１８１】
ＲＮＡ分析
トランスフェクションから３６〜４８時間後に、ＲＮアーゼミニキット（ＱＵＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡまたは細胞質ＲＮＡを２９３Ｔ細胞から抽出した。以前に記載のように（５１）、５〜１０μｇのＲＮＡをノーザンブロット分析に供した。アガロースゲルの染色によって正確なフラクションであることを確認した。ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の塩基１２２２〜１５０３に相補的なプローブを、ＨＩＶ−１　ｐＮＬ４−３プロウイルスクローンからＰＣＲによって増幅し、これを使用してコドン最適化および野生型のｇａｇ−ｐｏｌｍＲＮＡを検出した。コドン最適化遺伝子のｎｔ１５１０〜２２９０に相補的な第２のプローブもまた、プラスミドｐＳＹＮＧＰからＰＣＲによって増幅し、これを使用してコドン最適化遺伝子のみを検出した。本研究で使用した全てのベクターゲノムに相補的な７３２ｂｐフラグメントを、ｐＨ６ｎＺのＳｐｅＩ−ＡｖｒＩＩ消化によって調製した。ユビキチンに特異的なプローブ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、結果を標準化した。全てのプローブを、α３２Ｐ　ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した無作為標識（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）によって標識した。Ｓｔｏｒｍホスホロイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して結果を定量し、これを図１２に示す。全細胞画分では、４７Ｓ　ｒＲＮＡ前駆体が明らかに認められるが、これは細胞質画分では認められない。予想されるように（５２）、Ｒｅｖは、野生型ｇａｇ−ｐｏｌ　ｍＲＮＡの細胞質での蓄積を刺激する（レーン１ｃおよび２ｃ）。野生型遺伝子と比較して、コドン最適化遺伝子のＲＮＡレベルは全画分および細胞質画分のいずれにおいても１０〜２０倍高かった（レーン３ｔ−２ｔ、３ｃ−２ｃ、１０ｃ−８ｃとを比較のこと）。ＲＲＥ配列の有無にかかわらずＲＮＡレベルがコドン最適化ＲＮＡと類似していたので、ＲＲＥ配列はコドン最適化ＲＮＡを有意に不安定化しなかった（レーン３と５とを比較のこと）。Ｒｅｖは、ＲＲＥ配列を含む場合でさえもコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌｍＲＮＡの細胞質蓄積をあまり増加させなかった（ＲＮＡレベルの相違は２倍未満であった、レーン３〜４または５〜６と比較のこと）。
【０１８２】
図１０と図１２の比較により、ｓｙｎｇｐからのタンパク質発現の増加の全てをＲＮＡレベルの増加によって説明することができるようである。これが細胞中のＲＮＡレベルの飽和によるかどうかを調査するために、０．１、１、および１０μｇの野生型またはコドン最適化発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生を比較した。全ての場合、タンパク質産生は、コドン最適化遺伝子では同量のトランスフェクトＤＮＡより１０倍である一方で、タンパク質レベルの増加は、各遺伝子のトランスフェクトＤＮＡの量に比例していた。したがって、コドン最適化遺伝子の発現の増加は主に細胞質に存在するＲＮＡレベルの増加に起因し、翻訳の増加には起因しないようである。
【０１８３】
タンパク質分析
全細胞溶解物を、アルカリ性の溶解緩衝液を使用してトランスフェクションから４８時間後に（特記ない限り）２９３Ｔ細胞から調製した。細胞上清からのタンパク質の抽出のために、上清を最初に０．２２μｍのフィルターで濾過し、ベクター粒子を１ｍｌの上清の２１，０００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、少量（２〜１０μｌ）の溶解緩衝液に再懸濁した。等量のタンパク質を、１０〜１２％（ｖ／ｖ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、１：５００倍希釈したＨＩＶ−１陽性ヒト血清（ＡＩＤＳ試薬プロジェクト、ＡＤＰ５０８、パネルＥ）および１：１０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ａ０１７６）で連続的に探索した。タンパク質を、ＥＣＬまたはＥＣＬ＋ウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して視覚化した。等しいタンパク質のローディングを確認するために、膜を剥ぎ取り、１：１０００倍希釈の抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ２０６６）、その後１：２０００倍希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＩ−１０００）で再探索した。
【０１８４】
ｇａｇ−ｐｏｌ産物の発現およびベクター粒子産生
野生型ｇａｇ−ｐｏｌ（ｐＧＰ−ＲＲＥ３、図１９）およびコドン最適化発現ベクター（ｐＳＹＮＧＰ、ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、および　ｐＳＹＮＧＰ−ＥＲＲ）を、２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。Ｒｅｖ発現ベクターｐＣＭＶ−Ｒｅｖ（５３）の存在下または非存在下でトランスフェクションを行い、発現についてＲｅｖ独立性であるかを評価した。細胞溶解物および上清についてウェスタンブロット分析を行い、タンパク質産生を評価した。結果を、図１０に示す。予想されるように（５３）、Ｒｅｖがトランスで得られる場合に（レーン２および３）野生型遺伝子が発現する。それに対して、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌを使用した場合、Ｒｅｖの存在下および非存在下のいずれにおいても高レベルで発現し（レーン４および５）、これは、この系において、Ｒｅｖは必要ないことを示す。タンパク質レベルは、野生型ｇａｇ−ｐｏｌよりもコドン最適化遺伝子で高かった（レーン４〜９とレーン３とを比較のこと）。この相違は、細胞溶解物よりも細胞上清で明白であった（ホスホロイメージャーで定量したところ、野生型と比較してコドン最適化遺伝子でのたんぱく質レベルは約１０倍高い）。
【０１８５】
以前の研究では、ＲＲＥは、ＩＮＳ配列を除去するように操作されたｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターに含まれており、ＲＲＥの含有によりタンパク質レベルが減少し、トランスでのＲｅｖの獲得によって回復した（５５）。本発明者らの方法では、完全にコドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌｍＲＮＡ中のＲＲＥの存在はタンパク質レベルに影響を与えず、トランスでのＲｅｖの獲得は発現をさらに増強させなかった（レーン６および７）。
【０１８６】
野生型遺伝子とコドン最適化遺伝子との間の翻訳速度を比較するために、野生型発現ベクターおよびコドン最適化発現ベクター由来のタンパク質産生を、２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション後数回の間隔で同定した。タンパク質産生および粒子形成を、ウェスタンブロット分析によって同定し、結果を図１１に示す。タンパク質産生および粒子形成は、全ての測定点でコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌで１０倍であった。
【０１８７】
コドン最適化遺伝子で認められたこの発現の増強がより良好な翻訳によるのか、あるいはＲＮＡに対する効果によるのかをさらに同定するために、ＲＮＡ分析を行った。
【０１８８】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を使用したベクター産生の有効性
ベクター産生に対するコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌの効果を同定するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞の３つのプラスミド同時トランスフェクションにおいて２：１：２のプラスミド比で、ｇａｇ−ｐｏｌの供給源としてｐＳＹＮＧＰ、ｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ、ｐＳＹＮＧＰ−ＥＲＲ、またはｐＧＰ−ＲＲＥ３のいずれかと組み合わせて、ＨＩＶベクターゲノム、ｐＨ６ｎＺ、およびＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドｐＨＣＭＶＧ（１１３）を使用した（４９）。全細胞抽出物および培養上清を、ｇａｇおよびｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物の存在についてウェスタンブロット分析によって評価した。予想されたように（図１０）、粒子産生は、野生型と比較した場合、コドン最適化遺伝子で５〜１０倍であった。
【０１８９】
ベクタータイターに対するコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の効果を同定するために、いくつかのベクター成分の比を使用した。結果を、図２１に示す。ｇａｇ−ｐｏｌが系で制限された成分である場合（野生型遺伝子でタイターの低下が認められたように）、タイターはコドン最適化ベクターで１０倍高い。これは、これらのベクターで認められた高タンパク質産生と一致するが、通常のベクター産生条件下でｇａｇ−ｐｏｌが飽和し、コドン最適化が産生量についての最大の利点ではなかったことが示唆される。
【０１９０】
コドン最適化遺伝子に対するＨＩＶ−１　ｇａｇＩＮＳ配列の効果は位置依存性である。
他のＲＮＡの野生がｔＨＩＶ−１ｇａｇ配列下流（例えば、ＨＩＶ−１ｔａｔ（５６）、ＨＩＶ−１ｇａｇ（５５）、またはＣＡＴ（５７））への挿入により、おそらくＩＮＳ配列の結果として定常状態のｍＲＮＡレベルが劇的に減少することが以前に証明されている。他の場合では（例えば、βグロビン（５８））、この効果はスプライス部位依存性であることが示された。不安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に見出される細胞ＡＲＥ（ＡＵリッチなエレメント）は、転写物の細胞質の脱アデニル化の誘導によってｍＲＮＡを不安定化することができる（５９）。ＨＩＶ−１ｇａｇＩＮＳ配列がコドン最適化ＲＮＡを不安定化するかどうかを試験するために、野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ配列またはその一部（ｎｔ１〜６２５またはｎｔ６２５〜１５０３）をプロウイルスクローンｐＷ１３からＰＣＲによって増幅した。全フラグメントを平滑末端にし、平滑末端にしたＥｃｏＲ１またはＮｏｔＩ部位（それぞれ、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の上流または下流）のいずれかにｐＳＹＮＧＰまたはｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥに挿入した。コントロールとして、逆方向のｗｔＨＩＶ−１ｇａｇ（ＩＮＳ配列は方向依存様式で作用することが示されているので）（５７）（ｐＳＹＮ７）およびプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から切り出したＬａｃＺ（ｐＳＹＮ８）もまた同一の部位に挿入した。本発明者らの予想に反して、図１３に示すように、野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ配列は、コドン最適化遺伝子のＲＮＡまたはタンパク質レベルに有意に影響を与えないようであった。本発明者らは、さらに、正方向または逆方向の野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ、ｇａｇのサブフラグメント（ｎｔ１〜６２５またはｎｔ６２５〜１５０３）、ＡＴＧを含まないかＡＴＧの２５塩基下流のフレームシフト変異を有する野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ、またはＬａｃＺのｎｔ７２〜１０９３（プラスミドｐＨ６Ｚからの切り出し）、またはＡＴＧを含むか含まないｌａｃＺの最初の１０９３塩基をｐＳＹＮＧＰおよび／またはｐＳＹＮＧＰ−ＲＲＥ（ｐＳＹＮ９−ｐＳＹＮ２２、図１４）中のコドン最適化ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の上流に挿入する、他の一連のプラスミドを構築した（ＰＣＲおよび同一のプラスミドによる）。ノーザンブロット分析により、コドン最適化ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌ（ｐＳＹＮ９、ｐＳＹＮ１０）の野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子上流の挿入により、Ｒｅｖ／ＲＲＥの存在下または非存在下でＲＮＡレベルが減少することが示された（図１５Ａのレーン１〜４および図１５Ｂのレーン１＋１２）。ＡＴＧを欠き且つフレームシフト変異を有する野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ（ｐＳＹＮ１２、ｐＳＹＮ１３、およびｐＳＹＮ１４）の挿入によってもＲＮＡレベルが減少するので、この効果は翻訳依存性ではなかった（図１５Ｂ、レーン１〜７）。ウェスタンブロット分析により、ｐＳＹＮ１２−１４のＨＩＶ−１ｇａｇ翻訳産物は存在しないことが確認された。しかし、ｗｔＨＩＶ−１ｇａｇがこのような逆のコドン使用頻度を示すので、ｓｙｎｇｐの非翻訳長５’リーダーとして作用することが可能であり、これが真である場合、ＡＴＧ変異はいかなる効果も示さないはずである
【０１９１】
野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子より小さな部分（ｐＳＹＮ１５およびｐＳＹＮ１７）の挿入によってもＲＮＡレベルが減少するが（図１５Ｂ、レーン１〜３および８〜９）、全ｇａｇは位裂を使用した場合ほどレベルは低くない（図１５Ｂのレーン１〜３、４〜７および８〜９）。これは、ＩＮＳ配列の効果はそのサイズに依存することを示す。逆方向の野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ（ｐＳＹＮ１１）の挿入では、ＲＮＡレベルに対する効果を示さなかった（図１５Ａ、レーン１および５〜６）。しかし、ＲＮＡサイズ（コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌＲＮＡのサイズに等しい）および翻訳産物（ウェスタンブロット分析によって確認したところ、ｐＳＹＮＧＰと比較して同量のｇａｇ−ｐｏｌ）によって示されるように、この場合スプライシングが起こったようであった。
【０１９２】
したがって、これらのデータは、野生型ＨＩＶ−１ｇａｇ不安定配列は、おそらく翻訳とは無関係に位置およびサイズ依存様式で作用することを示す。ＲＲＥは、Ｒｅｖとの相互作用によって不安定化したＲＮＡをレスキュー不可能であることもまた留意すべきである。
【０１９３】
全ての補助タンパク質を欠くＨＩＶ−１ベースのベクター系の構築
これまで、Ｒｅｖ以外の全ての補助タンパク質を欠くいくつかのＨＩＶ−１ベースのベクター系が報告されている（４９、６０）。本発明者らは、コドン最適化遺伝子が全ての補助タンパク質を欠くＨＩＶ−１ベースのベクター系が構築されるかどうかを調査することを所望した。本発明者らは、最初にｒｅｖ／ＲＲＥおよび任意の残存ｅｎｖ配列を欠失させるが、有効なパッケージングを行う役割を果たすので（６１）ｇａｇの最初の６２５ヌクレオチドは保持した。ベクターゲノム構築物（ｐＨ６．１ｎＺ（ｇａｇのｎｔ６２５までのＨＩＶ配列のみを保持している）およびｐＨ６．２ｎＺ（ｐＨ６．１ｎＺと同一であるがｅｎｖスプライス受容体も保持している）を作製した。これらは、ＲＲＥを含み且つＲｅｖ（ｐＨ６ｎＺ）を発現する従来のＨＩＶベクターゲノム由来であった。本発明者らの３プラスミドベクター系は、ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質のみを発煙した。ベクター粒子タイターを、先の節で記載のように同定した。２：２：１のベクターゲノム比（（ｐＨ６ＺまたはｐＨ６．１ｎＺまたはｐＨ６．２ｎＺ）：ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐＧＰ−ＲＲＥ３またはｐＳＹＮＧＰ）：ｐＨＣＭＶ−Ｇ）を使用した。野生型遺伝子についてはｇａｇ−ｐｏｌ発現が依然としてＲｅｖ依存性であるので、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖの存在下または非存在下でトランスフェクションを行った。結果を図２２にまとめ、これは、全てのＲｅｖの非存在下でＨＩＶベクターを産生することができるが、最大タイターは、Ｒｅｖの存在下で達成することがきるタイターの１／２０にとどまることを示す。ｇａｇ−ｐｏｌ発現は、Ｒｅｖがトランスで得られた場合にｐＧＰ−ＲＲＥ３と同様に、ｐＨ６ｎＺ、ｐＨ６．１ｎＺ、またはｐＨ６．２ｎＺを有するｐＳＹＮＧＰも同一であるはずであり（Ｒｅｖ独立性であるので）、これにより、ベクターゲノムはＲｅｖの要件を保持するのでタイターが制限されると示唆される。これを確認するために、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖの存在下または非存在下でｐＨ６ｎＺまたはｐＨ６．１ｎＺでトランスフェクトした細胞から調製した細胞質ＲＮＡに対してノーザンブロット分析を行った。図１７のレーン１〜４に認められるように、ｐＨ６ｎＺ由来の細胞質ＲＮＡレベルは、ｐＨ６．１ｎＺで得られたレベルの５〜１０倍であった（レーン１〜２とレーン３〜４とを比較のこと）。これらのデータは、ベクターゲノムから産生したＲＮＡには高細胞質レベルを確保するためのＲｅｖ／ＲＲＥ系が必要であるという概念を支持する。ｇａｇ内に残存するＩＮＳ配列が依然として存在するので、これは、不十分なＲＮＡの核輸送に起因し得る。
【０１９４】
したがって、ベクターゲノムのｇａｇ配列中のさらなる欠失がタイターの回復には必要であろう。今日まで、有効なパッケージングには、依然としてｅｎｖ配列を保持するベクター中のｇａｇの３６０（６２）もしくは２５５（６３）ヌクレオチドまたはスプライスドナー変異の特定の組み合わせ（ｇａｇおよびｅｎｖ欠失（６４、６３））におけるｇａｇの約４０ヌクレオチドが必要であると報告されている。有効なパッケージングを妥協することなく本発明者らのベクターゲノム中のＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を取り除くために、本発明者らは、次第に大きくなる（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ　ｌａｒｇｅｒ）ＨＩＶ−１配列の欠失（上流のみおよびｇａｇ内が保持されている）＋および−変異主要スプライスドナー（ＳＤ）（ＧＴからＣＴへの変異）を含むｐＨ６ｎＺ由来の一連のベクターを構築した。ベクター粒子タイターを先に記載のように同定し、結果を図２３にまとめる。認められるように、ｇａｇ中のｎｔ３６０までの欠失により（ベクターｐＨＳ３ｎＺ）、タイターが増加し（ｐＨ６．１ｎＺまたはｐＨ６．２ｎＺと比較）、ｐＨ６ｎＺｔｏ比較して１／５に減少した（タイターは１．３〜１．７×１０５）。さらなる欠失によりタイターはｐＨＳ３ｎＺよりも低くなり、ｐＨ６．１ｎＺに類似した。さらに、ＳＤ変異は、ベクタータイターに正の効果を示さず、ｐＨＳ３ｎＺの場合、タイターが１／１０に減少した（図２３のｐＨＳ３ｎＺおよびｐＨＳ７ｎＺと比較）。細胞質ＲＮＡに対するノーザンブロット分析（図１７、レーン１および５〜１２）によって、実際はｐＨ６ｎＺのＲＮＡレベルは高く、このベクターを使用して認められる最大タイターを説明することができることが示された。ｐＨＳ１ｎＺ（レーン５）、ｐＨＳ２ｎＺ（レーン６）、およびｐＨＳ３ｎＺ（レーン７）のＲＮＡレベルは等しいが、ｐＨＳ３ｎＺのタイターは５〜８倍であった。ｇａｇのさらなる欠失（ｐＨＳ３ｎＺに見出されるものより）により、パッケージングの有効性が低下するので（ＨＩＶ−１に関して、パッケージングシグナルがｇａｇに及ぶ）、３つ全てのベクターが類似の量のＲＮＡを産生するにもかかわらず、ｐＨＳ３ｎＺのみは最大のパッケージング効率を保持することが可能である。ＳＤ変異により、細胞質中のＲＮＡレベルが増加するが（図１７のレーン６と１０、７と１１、または８と１２を比較のこと）、タイターは等しいか減少する（図２３）ことに留意することも興味深い。変異したＧＴジヌクレオチドは、パッケージングシグナルのＳＬ２のステムに存在する（６５）。ＳＬ２はＨＩＶ−１　ＲＮＡ包膜にあまり重要ではないが（６５、６６）、ＳＬ３は非常に重要である（６７）ことが報告されている。ＲＮＡ描写ソフトウェアプログラムを用いた野生型およびＳＤ変異ベクター配列の折り畳みにより、変異によりＳＬ２だけでなくＲＮＡの二次構造が有意に変化することが明らかになった。しがって、ＳＤ変異は細胞質ＲＮＡレベルを増加させるにもかかわらず、パッケージングシグナルの二次構造を変化させるのでタイターを増加させないようである。
【０１９５】
Ｒｅｖ−ベクターで認められたタイターの相違が実際にゲノムのＲｅｖ独立性に起因するかどうかを調査するために、ＲＲＥ配列（ＨＸＢ２配列のｎｔ７７６９〜８０２１）を、ｐＨ６．１ｎＺ、ｐＨＳ１ｎＺ、ｐＨＳ３ｎＺ、およびｐＨＳ７ｎＺのＳｐｅＩ部位（ｇａｇ配列の下流且つ内部ＣＭＶプロモーターのすぐ上流）に挿入して、プラスミドｐＨ６．１ｎＺＲ、ｐＨＳ１ｎＺＲ、ｐＨＳ３ｎＺＲ、およびｐＨＳ７ｎＺＲを得た。先に記載のようにＲｅｖ（ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ）の存在下または非存在下でｐＳＹＮＧＰおよびｐＨＣＭＶＧを使用してベクター粒子タイターを同定し、結果を図２４にまとめる。Ｒｅｖの非存在下では、ｐＨ６．１ｎＺＲ（ｐＨ６．１ｎＺと比較して７倍）、ｐＨＳ３ｎＺＲ（ｐＨＳ３ｎＺと比較して６倍）、およびｐＨＳ７ｎＺＲ（ｐＨＳ７ｎＺと比較して２．５倍）のタイターはさらに妥協された。ＲＲＥはまた不安定配列（６８）として作用し、それによりＲｅｖ依存性を付与すると予想されるので、このことは予想されていた。Ｒｅｖの存在下では、ｐＨＳ３ｎＺＲ（５×１０５）およびｐＨ６．１ｎＺＲ（２×１０５）の場合、タイターは、ｐＨ６ｎＺで認められる最大タイターに回復した。Ｒｅｖの存在以下では、ｐＨＳ７ｎＺのタイターは回復しなかった。これは、ｐＨＳ７ｎＺのＳＤ変異はパッケージングシグナルの構造に影響を与えるので、このベクターゲノムのパッケージング能力に影響を与えるという仮説を支持し、この場合、ＲｅｖはベクターゲノムＲＮＡレベルを刺激することができるが、ｐＨＳ３ｎＺＲおよびｐＨ６．１ｎＺＲに関しては、パッケージングシグナルの二次構造に影響を与えることができない。ベクターについては、ＲＲＥのｐＨＳ１ｎＺ封入により、タイターは減少しない。これは、ｐＨＳ１ｎＺはｇａｇ配列の４０ヌクレオチドのみを含むので、ＲＲＥを使用しても不安定配列のサイズはｐＨＳ１ｎＺに等しいタイターが与えられるｐＨＳ２ｎＺのタイターより高いという事実に起因し得る。ＲｅｖはｐＨＳ１ｎＺＲのタイターを部分的に回復することができたが（ｐＨＳ１ｎＺと比較した場合１０倍増加し、ｐＨ６ｎＺの１／８である）、ｐＨＳ３ｎＺの場合のように完全ではなかった。これはまた、ＨＩＶ−１ｇａｇ配列の４０ヌクレオチドは有効なベクターＲＮＡパッケージングに十分であるという仮説と一致し、これは、Ｒｅｖの存在下でｐＨＳ１ｎＺＲを使用して認められたタイターの部分的回復を説明できるが完全な回復を説明できない。
【０１９６】
さらに、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０ヒト細胞株におけるｐＨＳ３ｎＺおよびｐＳＹＮＧＰを含むｐＨ６ｎＺの終点タイターを同定した。両方の場合、タイターは、２９３Ｔ細胞で認められるパターンに従い、タイターはｐＨＳ３ｎＺのタイターはｐＨ６ｎＺの１／２〜１／３である（図１０を参照のこと）。最後に、ＨＴ１０８０細胞におけるｐＨＳ３ｎＺまたはｐＨ６ｎＺおよび異なるｍ．ｏ．ｉ．（および１ほどの高さ）での異なる量のｐＳＹＮＧＰまたはｐＧＰ−ＲＲＥ３で産生したベクターの導入効率を同定した。ｐＳＹＮＧＰ由来の高レベルのｇａｇ−ｐｏｌ発現が高ベクター濃度で空のゲノム粒子によって妨害され得るようにこの実験を行った。ＶＳＶＧ偽型化レトロウイルス粒子（６９）で予想されるように、導入効率はｍ．ｏ．ｉ．、大量または少量のいずれのｐＳＹＮＧＰを使用するか、ならびにｐＨ６ｎＺまたはｐＨＳ３ｎＺに相関した。ｍ．ｏ．ｉ．１では、導入効率は全ての場合で約５０〜６０％であった（図１８）。上記のデータは、本実験系では空のゲノム粒子による妨害は認められないことを示す。
【０１９７】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、エクスポーチン１核輸出経路を使用しない
Ｒｅｖは、核輸送レセプターエクスポーチン１（ＣＲＭ１）（７０、７１、７２、７３、７４）を介した非スプライシングおよび個々にスプライシングするＨＩＶ−１ｍＲＮＡの輸出を媒介する。レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）は、エクスポーチン１／ＮＥＳ／ＲａｎＧＴＰの形成の破壊によってロイシンリッチなＮＥＳ媒介核輸出を阻害することが示されている（７５、７２）。特に、ＬＭＢは、ＲｅｖおよびＲｅｖ依存性ＨＩＶｍＲＮＡの核−細胞質転座を阻害する（７６）。エクスポーチン１がコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ構築物の輸出を媒介するかどうかを調査するために、タンパク質産生に対するＬＭＢの効果を試験した。ｇａｇ−ｐｏｌ構築物（＋／−ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ）でトランスフェクトし、ＬＭＢで処理しているかしていない（７．５ｎＭ、２０時間、トランスフェクションから５時間後に処理開始）細胞由来の細胞溶解物に対してウェスタンブロット分析を行った。ＬＭＢが輸送に対して全体的な効果を示さないことを確認するために、コントロールプラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌ由来のβ−ｇａｌの発現も測定した。アクチン内部コントロールを使用して、サンプル間のタンパク質のばらつきを説明した。結果を、図１６に示す。予想通り（７６）、野生型ｇａｇ−ｐｏｌは、ＬＭＢの存在下で発現しないが（レーン３と４とを比較のこと）、ＬＭＢは、転写物中のＲＲＥの存在およびトランスでのＲｅｖの獲得に無関係にコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌからのタンパク質産生に効果がなかった（レーン５と６、７と８、９と１０、１１と１２、５〜６と１１〜１２とを比較のこと）。ＬＭＢによる阻害に対するコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌの発現の耐性は、エクスポーチン１経路が使用されないので、代わりの輸出経路が使用されなければならないことを示す。これにより、Ｒｅｖ独立発現を説明することができる。非機能的Ｒｅｖ／ＲＲＥ相互作用の存在が発現に影響を与えないという事実は、ＲＲＥはそれ自体が阻害（例えば、核保持）シグナルとして必ずしも作用しないことを意味し、これは以前の所見と一致する（５、５８）。
【０１９８】
結論として、これは、全ての補助タンパク質の非存在下で有意にベクターを産生することができるｐＳＹＮＧＰ、ｐＨＳ３ｎＺ、およびｐＨＣＭＶＧから構成されるＨＩＶ−１ベースのベクター系の最初の報告である。これらのデータは、最大タイターを達成するために、ＨＩＶベクターゲノムを有効なパッケージングを保持するように設定しなければならず、これには、ｇａｇ配列およびスプライスドナーの保持が必要であることを示す。ｐＨＳ３ｎＺ中のｇａｇ配列を３６０ｎｔに減少させ、これをｐＳＹＮＧＰと組み合わせることにより、Ｒｅｖの存在下で達成された最大レベルのたった１／５である少なくとも１０５Ｉ．Ｕ．／ｍｌのタイターを達成可能である。
【０１９９】
実施例２−ＥＩＡＶ
コドン最適化ＥＩＡＶｇａｇ−ｐｏｌ発現カセット
本発明者らはまた、コドン最適化プロセスにより非霊長類レンチウイルスＥＩＡＶのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の性質が変化するかどうかを試験した。配列は、配列番号５のｎｔ１１０３〜５７６０で示したコドン最適化遺伝子配列である（図９）。野生型およびコドン最適化配列を、それぞれＷＴおよびＣＯと命名する。コドン使用頻度を、高発現哺乳動物遺伝子の使用頻度に変化させた。ｐＥＳＹＮＧＰ（図２７および配列番号５）を、Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡで合成したコドン最適化ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミド由来のＸｂａＩ−ＮｏｔＩフラグメントのｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）への導入によって作製した。遺伝子は、専用（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）プラスミド骨格ＧｅｎｅＯｐ中に供給した。ｐＣＩｎｅｏに導入したフラグメントには、コドン最適化ｇａｇ／ｐｏｌＯＲＦ：ｔｃｔａｇａＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ−　ＥＩＡＶ　ｇａｇ／ｐｏｌ−　ＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧｇｃｇｇｃｃｇｃに隣接する配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＧＡ終止コドンを下線で示し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位の認識配列を小文字で示す。
【０２００】
コドン最適化遺伝子からのＧａｇ／Ｐｏｌの発現を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによる種々の野生型ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物由来の発現に関して評価した（図２５）。野生型配列または遺伝子のコドン最適化変形形態（それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＥＲＥＶ（Ｗ０　９９／３２６４６）（図３５および配列番号１３）またはｐＥＳＹＮＲＥＶ（図３６および配列番号１４））のいずれからＥＩＡＶ　Ｒｅｖを発現するプラスミドと共に等モルの各Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミドを使用した、リン酸カルシウム沈殿を使用してトランスフェクションを行った。ｐＥＳＹＮＲＥＶは、Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡによって作製した合成ＥＩＡＶ　ＲＥＶプラスミド由来のＳａｌＩフラグメントへのＥｃｏＲＩの移入によって作製されたｐＣＩｎｅｏベースのプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。プラスミド骨格は、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ認識配列および有効な遺伝子翻訳を駆動するためのコザックコンセンサス配列に隣接するコドン最適化ＥＩＡＶ　ＲＥＶ遺伝子を挿入した専用プラスミドＧｅｎｅＯｐであった。各トランスフェクションに対するＤＮＡの質量を、ｐＣＩｎｅｏプラスミドの添加によって均一にした。Ｒｅｖ発現プラスミドを省略するトランスフェクションでは、代わりに類似の質量のｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した（ｐＣＩｎｅｏで標識したレーン）。トランスフェクションから４８時間後に細胞質抽出物を調製し、１５μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで断片化し、Ｈｙｂｏｎｄ　ＥＣＬに移した。ウェスタンブロットを、ＥＩＡＶ感染ウマ由来のポリクローナル抗血清および二次抗体、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物で探索した。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してブロットの顕色を行った。ブロッティングおよび顕色手順のポジティブコントロールおよび非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の細胞質抽出物を示す。種々のＥＩＡＶタンパク質の位置を示す。
【０２０１】
種々のプラスミドからの野生型ｇａｇ／ｐｏｌ由来の発現を行った（図２５を参照のこと）。ｐＯＮＹ３．２Ｔは、ＴａｔおよびＳ２の発現を除去した変異体が作製されたｐＯＮＹ３．１（ＷＯ９９／３２６４６）（図３４および配列番号１２）の誘導体である。さらに、ＥＩＡＶ配列は、ｒｅｖの第２のエクソンの上流が短縮している。詳細には、Ｔａｔの発現を、野生型ＥＩＡＶ配列（Ａｃｃ．番号Ｕ０１８６６）に関して対応するｔａｔのエクソン２中の８３ｎｔ欠失（ｎｔ５２３４〜５３１６の欠失）によって除去する。Ｓ２ＯＲＦ発現は、Ａｃｃ．番号Ｕ０１８６６のｎｔ５３４６〜５３９６対応する５１ｎｔの欠失によって除去する。ＥＩＡＶ配列は、Ａｃｃ．番号Ｕ０１８６６のｎｔ７８１５に対応する位置の欠失下流である。これらの変化によりｒｅｖは変化しないので、この遺伝子発現はｐＯＮＹ３．１に関して示される。ｐＯＮＹ３．２　ＯＰＴＩは、上記のＴａｔおよびＳ２発現除去のために同様に欠失されたｐＯＮＹ３．１の誘導体である。さらに、ｇａｇの最初の３７２ｎｔは、ヒト細胞の発現ついて「コドン最適化」されている。この領域中のｐＯＮＹ３．２ＯＰＴＩに存在する野生型配列およびコドン最適化配列を、図４３で比較している。配列間の塩基の相違を示す。コドン最適化された領域は、ベクターと野生型ｇａｇ／ｐｏｌ発現構築物との間の重複領域を示す。この領域内での相同性の低下により、ベクターゲノムとｇａｇ／ｐｏｌ転写物との間で組換えが起こる機会が減少するので、ベクター系の安全プロフィールが改良されると予想される。３．２ＯＰＴＩ−Ｉｈｙｇは、３．２ＯＰＴＩのＳｎａＢＩ−ＮｏｔＩフラグメントが同一の部位での消化によるライゲーションのために調製されたｐＩＲＥＳ１ｈｙｇｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に導入された３．２ＯＰＴＩの誘導体である。したがって、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は、ＩＲＥＳハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの上流に存在する。得られた構築物はｐＩＲＥＳ１ｈｙｇｒｏ由来ではなくｐＣＩｎｅｏ由来のイントロンを含むという事実に留意のこと。ｐＥＶ５３Ｂは、Ｇａｇ開始コドン上流のＥＩＡＶ由来の配列が主要なスプライスドナーおよび周囲の配列：ＣＡＧ／ＧＴＡＡＧＡＴＧのみを（Ｇａｇ開始コドンを下線で示す）含むように減少されたＰＥＶ５３Ａ（ＷＯ　９８／５１８１０）の誘導体である。
【０２０２】
プライマー結合部位のすぐ下流から始まるＥＩＡＶ由来のリーダー配列および２つのＥＩＡＶ配列から構成されるｇａｇ／ｐｏｌの下流に存在するＲＲＥを有する、ｐＨＯＲＳＥ３．１（ＷＯ　９９／３２６４６）由来のＧａｇ／Ｐｏｌ発現のＲｅｖ依存性を示す結果（図２６）により、ＲＲＥ活性を有することを報告した。Ｒｅｖ発現が野生型（ｐＣＩｎｅｏＥＲｅｖ）（図３５）およびコドン最適化（ｐＥＳＹＮＲＥＶ）（図３６）遺伝子によって駆動される場合、同量で発現が増強された。この結果により、コドン最適化Ｒｅｖ発現プラスミドの機能性が確認される。
【０２０３】
ｐＯＮＹ３．１由来のＧａｇ／Ｐｏｌの発現とは対照的に、ｐＥＳＹＮＧＰ由来の発現は、Ｒｅｖの存在に影響されなかったが、その発現はｐＯＮＹ３．１またはｐＯＮ３．２Ｔよりもわずかに低かった。ｐＨＯＲＳＥ３．１中に存在するＥＩＡＶ　ＲＲＥ配列がｇａｇ／ｐｏｌの下流に存在するｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥ（図３０および配列番号７）由来の発現は、ｐＥＳＹＮＧＰ由来の発現よりわずかに低いようである。３．２ＯＰＴＩおよび３．２ＯＰＴＩ−Ｉｈｙｇ由来の発現レベルは、Ｒｅｖの存在下でさえもｐＥＳＹＮＧＰまたはｐＯＮＹ３．１由来の発現よりも有意に低かった。この結果により、ｇａｇの最初の３７２ｎｔ内にＧａｇ／Ｐｏｌ発現の決定要因が存在し得ることが示唆され、３．２ＯＰＴＩはＥＩＡＶベクター産生の基礎として有用でないようであることを示す。さらに、全ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の一定の領域のみのコドン最適化により、高レベルのＲｅｖ独立性発現を得ることができないことを示す。
【０２０４】
本発明者らは、以前に、５’リーダー（ＡＴＧ開始コドンの１２１ｂｐ上流）およびＲＲＥ配列（４３）が野生型ＥＩＡＶｇａｇ−ｐｏｌの高発現に重要であることを証明していた（４３）。リーダー配列（ＬｐＥＳＹＮＧＰ）、リーダー配列およびＲＲＥ配列（ＬｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥ）、またはＲＲＥ配列（ｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥ）のいずれかを含む３つの構築物を作製した。これらの構築物の配列を、配列番号６〜８および図２８〜３０に示す。これらを、Ｒｅｖ発現プラスミドの存在下または非存在下で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次いで、細胞上清を従来のＲＴアッセイを使用した逆転写酵素活性（ＲＴ）について測定して、最も大量のｇａｇ−ｐｏｌｍＲＮＡを作製した構築物を評価した。結果を、図３９および４０に示す。これらの結果から、５’リーダーによりＲＴ活性が増加することが明らかである。これらＧａｇ／Ｐｏｌ発現構築物の感染性ベクター粒子の形成を支持する能力もまた、ＨＥＨ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって試験した。この分析結果は、全ての構築物は、機能的ＥＩＡＶＧａｌ／Ｐｏｌを得ることができ、いかなるＥＩＡＶタンパク質もコードしないｐＯＮＹ８．０ＺベクターゲノムプラスミドのタイターがＲｅｖ依存性であることを示す（図４１）。
【０２０５】
ｐＥＳＹＮＧＰの最小ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹ８．１Ｚ（図３３、配列番号１１）と共に作用する能力を評価した（図４２）。結果は、ｐＥＳＹＮＧＰおよびｐＯＮＹ８．１Ｚを用いて得たタイターは、ｐＯＮＹ３．１およびｐＯＮＹ８．１Ｚ由来のタイターの約１／１０であることを示す。このタイターの減少は、Ｒｅｖ発現との独立性がすでに示されているＧａｇ／Ｐｏｌ産生の欠損よりもむしろ系中のＲｅｖタンパク質の欠乏を反映している。
【０２０６】
ＥＩＡＶ　Ｇａｇ／Ｐｏｌの発現を、天然のＥＩＡＶスプライスドナーをＧａｇのコザックコンセンサス配列に置換するｐＥＳＤＳＹＮＧＰ（図５０および配列番号１８）から試験することもできる。テンプレートとしてｐＥＳＹＮＧＰおよび以下のプライマー：ＳＤ　ＦＯＲ（ＧＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧ）およびＳＤ　ＲＥＶ（ＴＴＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＴＡＧＧＴＴＣ）を使用して作製した、ｇａｇ／ｐｏｌの開始コドンのすぐ上流からＰＣＲ産物の消化に由来する３０８ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントを有するｇａｇ／ｐｏｌＯＲＦの内側の約３００塩基対に及ぶ、３０６ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントの交換によってｐＥＳＹＮＧＰからｐＥＳＤＳＹＮＧＰを作製した。この操作により、ＥＩＡＶで見出されたスプライスドナーをｐＥＳＹＮＧＰ中のＡＴＧ上流のコザックコンセンサス配列に置換する。したがって、天然ウイルス配列で正確に認められるように、ＥｃｏＲＩ部位とｇａｇ／ｐｏｌのＡＴＧとの間の配列は、ＣＡＧＧＴＡＡＧである。したがって、ｍＲＮＡは、スプライスドナーの上流配列を欠失するが、下流配列を欠失しない。産物増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）アッセイのＴａｑｕｍａｎベースの変形形態を使用した一過性トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の上清中の逆転写酵素活性の測定によってｐＥＳＹＮＧＰおよび他の発現プラスミドと比較したｐＥＳＤＳＹＮＧＰの性能を評価した。この方法では、ベクター粒子に会合している逆転写酵素を、穏やかな界面活性剤処理によって放出させ、テンプレートとしてＭＳ２バクテリオファージＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成した。ＭＳ２　ＲＮＡテンプレートおよびプライマーが過剰に存在しているので、ｃＤＮＡ量は、粒子から放出されたＲＴの量に比例する。したがって、ｃＤＮＡの合成量は、粒子数に比例する。ＭＳ２　ｃＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎ技術を使用して定量する。既知タイターのベクターストックと並行して試験サンプルについてアッセイを行い、粒子含有量を評価する。標準の使用により「検量線」を作成し、種々のサンプルの相対ＲＴ含有量を計算する。この分析の結果を、図４９に示す。結果は、Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現は、ｐＥＳＹＮＧＰおよびｐＥＳＤＳＹＮＧＰと事実上同一であることを示す。結果はまた、Ｒｅｖによって発現は有意に増強されないことを示す。Ｒｅｖ発現プラスミドの活性を、野生型ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌのＲＲＥ下流に存在するｐＨＯＲＳＥ＋で得た結果によって確認し、Ｒｅｖの存在下で６倍の発現を示す。本発明者らはまた、Ｒｅｖの存在下でｐＨＯＲＳＥ由来の発現が３倍増強したことに留意した。この構築物はＲＲＥを含まないので、Ｒｅｖは、おそらく本実験系での高レベルの発現の結果として、発現に対する効果を非特異的に増強し得ることが示唆される。
【０２０７】
ベクターゲノムおよびエンベロープ用のプラスミドで同時トランスフェクトした場合、ｐＥＳＹＮＧＰの感染性ウイルスベクター粒子の形成に関与する能力を、先に記載のように（４９、５０）ＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクションによって評価した。簡単に述べれば、２９３Ｔ細胞を６ｃｍ皿に播種し（１．２×１０６／皿）、２４時間後リン酸カルシウム法でトランスフェクトした。トランスフェクションから１２時間後に培地を置換し、トランスフェクションから４８時間後に上清を回収し、濾過し（０．４５μｍのフィルター）、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でのＤ１７（イヌ骨肉種細胞）の形質導入によって滴定した。１２ウェルプレートに０．９×１０５／ウェルで細胞を播種し、使用２４時間前に滴定アッセイを行った。完全培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）で上清の希釈物を作製し、０．５ｍｌのアリコートを、Ｄ１７細胞にプレーとした。ベクター添加から４時間後、培地をさらに１ｍｌの培地で置換した。ウイルス希釈物の添加から４８時間後、Ｘ−ｇａｌ染色によって形質導入を評価した。
これらの実験で使用したベクターゲノムは、ｐＯＮＹ４．０Ｚ（図３１および配列番号９）およびｐＯＮＹ８．０Ｚ（図３２および配列番号１０）であった。
ｐＯＮＹ４．０Ｚ（ＷＯ　９９／３２６４６）は、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｐＣＭＶ）の５’ＬＴＲ中のＵ３領域の置換により、ｐＯＮＹ２．１１Ｚ由来である。このＣＭＶプロモーター由来の転写物の最初の塩基は、Ｒ領域の最初の塩基に対応するような方法でこれを行った。この操作により、形質導入細胞（特に、ＨＥＲ２９３Ｔ細胞）中で高レベルのベクターゲノムが産生され、この操作は以前に記載されている（５０）。ｐＯＮＹ４．０Ｚは、エンベロープを除く全てのＥＩＡＶタンパク質を発現し、その発現は、ｅｎｖに存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位間の７３６ｎｔの欠失によって除去される。
【０２０８】
ｐＯＮＹ８．０Ｚは、１）ｔａｔのエクソン２での８３ｎｔ欠失によってＴＡＴの発現を防止し、２）５１ｎｔ欠失によるＳ２　ＯＲＦ発現を防止し、３）ｒｅｖのエクソン１内の１塩基欠失によるＲＥＶ発現を防止し、４）ＡＴＧ開始コドン中のＴの挿入によるＮ末端部分の発現を防止して、配列をＡＴＧからＡＴＴＧ変更する変異を移入によりｐＯＮＹ４．０Ｚ由来である。野生型ＥＩＡＶ配列のＡｃｃ番号０１８６６に関して、これらは、５２３４〜５３１６、ｎｔ５３４６〜５３９６、およびｎｔ５５３８の欠失に対応する。Ｔ残基の挿入は、ｎｔ５２６および５４３の後であった。
【０２０９】
本分析の結果を、図３７で表を作成し、図３８にグラフで示す。３つのプラスミドのみ（ベクターゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド）のみでトランスフェクションを行うか（斜線のバー）またはＲｅｖをコードするさらなるプラスミドまたは機能的タンパク質をコードしない類似のプラスミドを含む４つのプラスミド（黒塗りのバー）を使用してトランスフェクションを行った。結果は、ＥＩＡＶＧａｌ／Ｐｏｌを得るためにｐＥＳＹＮＧＰを使用して高タイターのベクターが得られたことを示す。Ｒｅｖ発現ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹ４．０Ｚを使用して最も高いタイターを得たが、これは、ｐＯＮＹ３．１によってＧａｇ／Ｐｏｌが得られた場合に認められるタイターよりもわずかに低い。ｐＯＮＹ３．１よりもｐＥＳＹＮＧＰを有するｐＯＮＹ８．０Ｚベクターゲノムプラスミドで低いタイターが認められた。これは、ｐＯＮＹ８．０ＺのＲｅｖ発現要件に起因する。ＲｅｖはｐＯＮＹ３．１で発現するが、ｐＥＳＹＮＧＰでは発現しない。これらの結果により、コドン最適化Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミドの有用性が確認される。
【０２１０】
ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌが安定に発現する細胞株の構築における合成ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の使用。
大量のＥＩＡＶＧａｇ／ｐｏｌを発現する細胞株は、ＥＩＡＶベクターのパッケージングおよび産生細胞の構築に必要である。その構築の最初のステップとして、ＨＥＫ２９３細胞を、ＥＩＡＶＧａｇ／ｐｏｌ発現がＣＭＶプロモーターによって駆動され、ＥＭＣＶ　ＩＲＥＳによるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの発現のためにＯＲＦに連結しているｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ　ＥＳＹＮＧＰ（図４４および配列番号１７）で安定にトランスフェクトした。ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ　ＥＳＹＮＧＰを以下のように作製した。合成ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子および隣接配列を、ｐＥＳＰＹＮＧＰからｐＩＲＥＳ１ｈｙｇｒｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に導入した。最初に、ｐＥＳＰＹＮＧＰをＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって末端を充填し、ＮｏｔＩで消化した。ライゲーション用に、ＮｓｉＩでの消化によってこのフラグメントを用いてｐＩＲＥＳ１ｈｙｇｒｏを調製し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって末端を平坦に整え、その後ＮｏｔＩで消化した。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの前に、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ　ＥＳＹＮＧＰを、ＡｈｄＩで消化してプラスミドを線状にした。
【０２１１】
クローン細胞株は連続希釈に由来し、Ｔａｑｍａｎベースの産物増強逆転写酵素（ＰＥＲＴ）アッセイによるＧａｇ／Ｐｏｌ発現について分析した。もっとも高レベルのＧａｐ／Ｐｏｌを示す細胞株Ｑ３．２９のデータを示す。分析により、Ｑ３．２９のコドン最適化ＥＩＡＶ　Ｇａｇ／Ｐｏｌカセット由来の発現レベルは、Ｇａｇ／ＰｏｌがｐＥＶ５３Ｂ野生型発現カセットから発現し、ほとんどが１０６形質導入単位／ｍｌのタイターでウイルス粒子を産生する、ＥＩＡＶ産生株８Ｚ．２０で認められるレベルと非常に類似していることが示された（図４５）。アッセイ中に指数関数的に増幅すると仮定すると、１．０のＣｔ値の相違は粒子から放出した逆転写酵素濃度が２倍異なることに相当する。しがって、Ｑ３．２９と８Ｚ．２０細胞との間のＧａｇ／Ｐｏｌ発現の相違は、約２〜８倍である。さらに、認められたＣｔ値は、Ｇａｇ／Ｐｏｌの発現レベルがｐＯＮＹ８Ｇベクター粒子のサンプル（Ｄ１７細胞に対して２×１０６形質導入単位／ｍｌのタイター）よりも有意に高いことを示すが、これはＨＥＫ　２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって得られる。これらのデータは、コドン最適化ＥＩＡＶ　Ｇａｇ／Ｐｏｌ構築物を、ＥＩＡＶのパッケージングおよび産生株の構築に使用して、発現がＲｅｖ発現と独立している先の結果と確認することができることを示す。
【０２１２】
次いで、Ｑ３．２９細胞を、ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹ８．０Ｚ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドｐＲＶ６７、およびＥＩＡＶ　ＲＥＶ発現プラスミドｐＥＳＹＮＲＥＶでトランスフェクトした場合の感染性ベクター粒子の産生を支持する能力について試験した。さらに、本発明者らは、プラスミドｐＯＮＹ８．３Ｇ　ＦＢ２９（−）の性能は、ｐＯＮＹ８Ｇベクターゲノムプラスミドの変形形態であると評価した。ｐＯＮＹ８Ｇは、比較するために使用される標準的なＥＩＡＶベクターゲノムである。ｐＯＮＹ８．３Ｇ　ＦＢ２９（−）（配列番号１９）の改変および構築はＰＣＴ／ＧＢ００／０３８３７に記載されているが、簡単に述べれば、１）ベクターゲノムカセットの上流および下流のｌｏｘＰ認識部位の移入、２）ｐＥＳＹＲＥＶ由来のコドン最適化ＲＥＶの発現カセットの置換、およびベクターゲノムカセット下流のＦＢ２９　Ｕ３プロモーターによる駆動、および転写方向のベクターゲノムカセット方向への配向である。ＲＥＶ発現カセットは、３’ｌｏｘＰ部位上流に存在する。したがって、ｐＯＮＹ８．３ＧＦＢ２９−プラスミドは、ベクターゲノムＲＮＡおよびＥＩＡＶ　Ｒｅｖのための発現カセットを保有する。
【０２１３】
Ｄ１７イヌ骨肉種細胞の限界希釈によってタイターを確立し、これを図４６に示す。
トランスフェクション２〜６から得たタイターは、４．５×１０６形質導入単位／ｍｌまでであり、これは、Ｇａｐ／Ｐｏｌ発現レベルが少なくともこの高さのタイターの支持に十分であることを示す。得られたタイターは、さらなるＧａｇ／Ｐｏｌを供給した場合（トランスフェクション１）に高くないので、これはＧａｇ／Ｐｏｌ発現がタイターを制限しないことを示す。
【０２１４】
コドン最適化発現構築物由来のＧａｇ／Ｐｏｌ発現による安全プロフィールの改良
ＰＣＲは、ベクター系の異なる成分の間の組換えまたはベクター系の成分の産生細胞中に存在するヌクレオチド配列での組換えから構成されている。産生細胞株の構築の際のＤＮＡレベルでの組換えが可能であるにもかかわらず（おそらく、内因性レトロエレメントまたはレトロウイルスの挿入活性化を引き起こす）、ＰＣＲを行うための組換えは主に逆転写を受けるＲＮＡとの間で起こるので、成熟したベクター粒子ないで起こると考えられている。その結果、組換えは、ベクターゲノムおよびｇａｇ／ｐｏｌｍＲＮＡなどのパッケージングシグナルを含むＲＮＡ間で起こるようである。しかし、通常、ｇａｇ／ｐｏｌ転写は、いくつかまたは全ての定義された所定のパッケージングエレメントが欠失して、組換えを起こす機会を減少するように改変する。
【０２１５】
ＨＩＶおよびＥＩＡＶ　Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド、ｐＳＹＭＧＰ、およびｐＥＳＹＮＧＰを作製するために使用されたコドン最適化プロセスにより、およそ３ヌクレオチドごとの変化の移入の結果としてパッケージングを支持する配列および構造が破壊される。本発明者らは、ｐＥＳＹＮＧＰ由来のコドン最適化ＲＮＡのビリオンへの低レベルの組み込みが証明された。
【０２１６】
野生型ｇａｇ／ｐｏｌ　ｐＥＶ５３Ｂ発現カセットおよびコドン最適化ＥＩＡＶｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットｐＥＳＹＮＧＰ由来のｍＲＮＡのパッケージングを比較した。ｐＥＶ５３Ｂ（細胞株Ｂ−２４１）またはｐＥＳＹＮＧＰで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ベースの細胞株から培地を回収した。両細胞株は、ベクターＲＮＡを含まないがエンベロープを有するベクター粒子を産生する。いくつかの実験では、ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミド（ｐＥＣＧ３−ＣＺＷ）を細胞にトランスフェクトして、ハイブリッド形成およびＲＮＡをパッケージングすることができる粒子の存在についての内部ポジティブコントロールとして使用した。ｐＥＣＧ３−ＣＺＷは、ｐＥＣ−ＬａｃＺの誘導体（ＷＯ９８／５１８１０）であり、１）最初の５７７ｎｔよりもむしろ最初の２００ｎｔのｇａｇのみが含まれるようなｇａｇ配列の減少、２）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＨＶ　ＰＲＥ）（アクセッション番号Ｊ０４５１４のｎｔ９０１〜１８００）に相当する）のＬａｃＺレポーター遺伝子下流のＮｏｔＩ部位への封入から作製した。
【０２１７】
次いで、各細胞株由来のウイルス粒子を、平衡密度勾配遠心分離によって培地から部分精製した。これを行うために、誘導から２４時間後に回収した産生細胞由来の１０ｍｌの培地を、２０〜６０％（ｗ／ｗ）スクロース勾配ＴＮＥ緩衝液（ｐＨ７．４）に重層し、２５，０００ｒｐｍで４つのローターで２４時間遠心分離した。底から画分を回収し、１０μｌの各画分を、ウイルス粒子の位置付けるための逆転写酵素活性についてアッセイした。この分析結果を、（図４７）に示し、これは、逆転写酵素活性のプロフィールを勾配画分の関数として示している。これらの図では、勾配の上部を右とする。ｐＥＳＹＮＧＰ発現細胞由来のＲＴ活性レベルは、ｐＥＶ５３Ｂ発現細胞由来の活性よりも優位に低かったことに留意すべきである。精製ビリオンのＲＮＡ含有量を同定するために、上部、中部、または下部の画分由来のアリコートをプールし（Ｔ、Ｍ、およびＢと印をつけたバーで示す）、各画分由来のＲＮＡを、スロットブロットハイブリッド形成分析に供した。野生型および合成ｇａｇ／ｐｏｌの共通領域に特異的なプローブを使用して、野生型構築物（ｐＥＶ５３Ｂ）から合成したビリオンのピーク画分（Ｍ）ではＲＮＡの包膜を容易に検出可能であったが、合成Ｇａｇ／Ｐｏｌ構築物（ｐＥＳＹＮＧＰ）から合成したビリオンからは検出されなかった（図４８）。包膜することができるキャプシドの存在についてのコントロールは、野生型または合成ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質のいずれかを発現する細胞由来のピーク画分中で容易に検出されるＥＩＡＶ　Ｇ３−ＣＺＷベクターゲノムであった。野生型および合成Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現構築物由来の異なるレベルの発現を考慮したとしても、この結果は、コドン最適化ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子由来のＲＮＡは、野生型遺伝子よりもあまり有効にパッケージングされず、系の安全プロフィールが有意に改善されたことを示す。ｐＥＶ５３Ｂから転写されたＲＮＡがパッケージングされたことにさらに留意のこと。このＲＮＡは、スプライスドナー配列（ＣＡＧ／ＧＴＡＡＧ）上流の配列が欠失しているが、依然としてパッケージングされた。これは、ｇａｇコード領域内の主要なパッケージング決定要因の局在化（ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ）を指し、ＨＩＶ−１のパッケージングシグナルの位置について収集した所見と対照的である。
【０２１８】
さらに、実験により、ｐＥＶ５３Ｂ由来の転写物のパッケージングは、ｐＥＶ５３Ａ由来のものよりわずかに低いだけであることが示された（図５１）。これは、主要なパッケージング配列はｇａｇコード領域内に存在することをさらに示す。これらの実験では、細胞株Ｂ−２４１はｐＥＶ５３Ｂ　ＲＮＡを発現し、ＰＥＶ−１７はｐＥＶ５３Ａ　ＲＮＡを発現した。パッケージングコンピテントベクター粒子の存在を確認するために使用したＥＩＡＶベクターゲノムは、Ｇ３−ＣＺＲであり、これは、ウッドチャック転写後調節エレメントのＥＩＡＶ　ＲＲＥエレメントを含む配列への置換以外は上記のＧ３−ＣＺＷと同一である。上記の方法を使用した。
【０２１９】
上記明細書に記載の全ての刊行物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に自明である。本発明は、特定の好ましい実施形態と共に記載しているが、特許卯請求の範囲に記載の本発明がこのような実施形態に過度に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明の本発明の施行のために記載の様式の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０２２０】
［参考文献］
【表１】
2004508808.tif 000003
【表２】
2004508808.tif 000004
【表３】
2004508808.tif 000005
【表４】
2004508808.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＣＲによる適切な３’ＬＴＲの作製方法を示す図である。
【図２】
ＨＸＢ２株（アクセッション番号Ｋ０３４５５）の野生型ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌについてのコドン使用頻度表を示す。
【図３ａ】
ｇａｇｐｏｌ−ＳＹＮｇｐと命名したコドン最適化配列のコドン使用頻度表を示す。
【図３ｂ】
コドン使用頻度表の比較を示す。
【図４】
ｅｎｖ−ｍｎと呼ばれる野生型ＨＩＶ　ｅｎｖのコドン使用頻度表を示す。
【図５】
ＳＹＮｇｐ１６０ｍｎと命名したＨＩＶ　ｅｎｖのコドン最適化配列のコドン使用頻度表を示す。
【図６】
本発明で使用した２つのプラスミド構築物を示す。
【図７】
レトロウイルスベクター粒子の産生のための２つの系の背景となる原理を示す。
【図８】
野生型ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ｐＧＰ−ＲＲＥ３）とコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ｐＳＹＮＧＰ）との間の配列比較を示す。
【図９】
野生型ＥＩＡＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ＷＴ）とコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列（ＣＯ）との間の配列比較を示す。
【図１０】
タンパク質発現粒子形成のＲｅｖ独立性を示す。
【図１１】
野生型（ＷＴ）とコドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌの翻訳速度を示す。
【図１２】
全画分および細胞質画分のｇａｇ−ｐｏｌ　ｍＲＮＡレベルを示す。
【図１３】
ＲＮＡおよびタンパク質レベルに対するコドン最適化遺伝子のＷＴ　ｇａｇ下流挿入の効果を示す。
【図１４】
コドン最適化遺伝子に対するＨＩＶ−１ｇａｇの効果を研究するために使用したプラスミドを示す。
【図１５】
コドン最適化遺伝子のＨＩＶ−１ｇａｇ上流挿入の細胞質ＲＮＡに対する効果を示す。
【図１６】
タンパク質産生に対するレプトマイシンＢ（ＬＭＢ）の効果を示す。
【図１７】
ベクターゲノムの細胞質ＲＮＡレベルを示す。
【図１８】
ＭＯＩ１での形質導入効率を示す。
【図１９】
ｐＧＰ−ＲＲＥ３の略図を示す。
【図２０】
ｐＳＹＮＧＰの略図を示す。
【図２１】
異なるｇａｇ−ｐｏｌ構築物で得られたベクタータイターを示す。
【図２２】
Ｒｅｖ／ＲＲＥ（−）および（＋）ゲノム由来のウイルスタイターを示す。
【図２３】
ベクターゲノムのｐＨＳシリーズ由来のベクタータイターを示す。
【図２４】
Ｒｅｖ／ＲＲＥの存在下または非存在下でのベクターゲノムのｐＨＳシリーズについてのベクタータイターを示す。
【図２５】
ｇａｇ−ｐｏｌ構築物の分析を示す。
【図２６】
２９３Ｔ抽出物のウェスタンブロットを示す。
【図２７】
ｐＥＳＹＮＧＰの略図である。
【図２８】
ＬｐＥＳＹＮＧＰの略図である。
【図２９】
ＬｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥの略図である。
【図３０】
ｐＥＳＹＮＧＰＲＲＥの略図である。
【図３１】
ｐＯＮＹ４．０Ｚの略図である。
【図３２】
ｐＯＮＹ８．０Ｚの略図である。
【図３３】
ｐＯＮＹ８．１Ｚの略図である。
【図３４】
ｐＯＮＹ３．１の略図である。
【図３５】
ｐＣＩｎｅｏＥＲｅｖの略図である。
【図３６】
ｐＥＳＹＮＲＥＶの略図である。
【図３７および図３８】
ウイルスベクタータイターに対する異なるベクター構築物の効果を示す。
【図３９および図４０】
ＲＴ活性に対する異なるベクター構築物の効果を示す。
【図４１】
ウイルスベクタータイターに対する５’リーダー配列の効果を示す。
【図４２】
ｐＯＮＹ８．１Ｚを使用した場合のウイルスベクタータイターを示す。
【図４３】
ｇａｇの最初の３７２ヌクレオチド中のｐＯＮＹ３．１配列とコドン最適化ｐＯＮＹ３．２ＯＰＴＩとの間の比較を示す。
【図４４】
ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇＥＳＹＮＧＰの略図である。
【図４５および図４６】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌがパッケージングおよび産生細胞株の産生に使用することができるかを確認するための実験結果を示す。
【図４７および図４８】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ由来のＲＮＡが野生型遺伝子よりも低い効率でパッケージングされることを確認する実験結果を示す。
【図４９】
ｐＥＳＹＮＧＰおよびｐＥＳＤＳＹＮＧＰ由来の発現が類似していることを確認する実験結果を示す。
【図５０】
ｐＥＳＤＳＹＮＧＰの略図である。
【図５１】
ＰＥＶ−１７細胞およびＢ−２４１細胞へのｇａｇ−ｐｏｌＲＮＡの包膜効率が類似することを確認する実験結果を示す。
【図１】
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【図３ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５１】
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【国際公開パンフレット】
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2004508808.tif 000233
2004508808.tif 000234
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508808.tif 000235
2004508808.tif 000236
【国際調査報告】
2004508808.tif 000237
2004508808.tif 000238
2004508808.tif 000239