(57)【要約】本発明は、ＫＳＨＶ生活環の潜伏及び溶菌期の間に起こる宿主内皮細胞転写パターンにおける変化を同定するために核酸マイクロアレイ技術を利用する。次に、増殖サイクル中にアップレギュレーションされるいくつか遺伝子の生産もしくは活性を阻害し、そして２つのそのような標的は、後期ウイルス遺伝子の発現において役割を有することを示した。この組み合わせた方法を用いて、ＫＳＨＶ感染にとって重要であることが以前に知られていない細胞経路を同定し、そしてこのようにして見出した新規な抗ウイルス方法の有効性の証拠を提示する。さらに、本発明は、血管新生及びトランスフォーメーションを包含する様々な内皮細胞由来の活性に関与する多種多様な内皮細胞遺伝子及び経路を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−Ｋｉｔシグナリング経路を阻害する化合物の投与を含んでなるＫＳＨＶの複製を阻害する方法。
【請求項２】
ｃ−Ｋｉｔシグナリング経路を阻害する化合物の投与を含んでなるカポジ肉腫の処置方法。
【請求項３】
Ｉ型シグマ受容体シグナリング経路を阻害する化合物の投与を含んでなるＫＳＨＶの複製を阻害する方法。
【請求項４】
Ｉ型シグマ受容体シグナリング経路を阻害する化合物の投与を含んでなるカポジ肉腫の処置方法。
【請求項５】
表２に記載する遺伝子よりなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を含んでなるＫＳＨＶ複製の溶菌期に特異的な遺伝子発現プロフィール。
【請求項６】
表２に記載する遺伝子よりなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子を含んでなるＫＳＨＶ複製の潜伏期に特異的な遺伝子発現プロフィール。
【請求項７】
表２に記載する遺伝子よりなる群から選択される一つもしくはそれ以上の遺伝子とハイブリダイズするプローブをコードする核酸を含んでなるマイクロアレイ。
【請求項８】
ａ）ＫＳＨＶに感染していると思われる細胞のサンプルを得ること；
ｂ）細胞からＲＮＡを抽出すること；
ｃ）表２に記載する遺伝子よりなる群から選択される一つもしくはそれ以上の遺伝子に特異的なプローブをコードする核酸を含んでなるマイクロアレイとＲＮＡとを接触させること；及び
ｄ）細胞のサンプルの遺伝子発現プロフィールを決定し、そしてそれをＫＳＨＶ感染細胞の遺伝子発現プロフィールと比較すること、
を含んでなるＫＳＨＶもしくはＫＳＨＶ複製の段階を診断する方法。
【請求項９】
ａ）表２に記載する遺伝子よりなる遺伝子の群から遺伝子産物を選択すること；
ｂ）試験化合物が遺伝子産物を阻害もしくは活性化するかどうかを決定するために遺伝子によりコードされる遺伝子産物と試験化合物とを合わせること；及び
ｃ）試験化合物がＫＳＨＶの複製を阻害もしくは活性化するかどうかを決定するためにＫＳＨＶ感染細胞と試験化合物とを合わせること、
を含んでなるＫＳＨＶ複製のモジュレーターを同定する方法。
【請求項１０】
ｃ−Ｋｉｔを阻害する化合物の投与及びｃ−Ｋｉｔの阻害以外の機構によりＫＳＨＶ複製を調節する化合物の投与を含んでなるＫＳＨＶの複製を阻害する方法。
【請求項１１】
ｃ−Ｋｉｔの阻害以外の機構によりＫＳＨＶ複製を調節する該化合物が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レチノイド及びタキソールよりなる群から選択される請求項１０の方法。
【請求項１２】
ｃ−Ｋｉｔを阻害する化合物の投与及びｃ−Ｋｉｔの阻害以外の機構によりカポジ肉腫を調節する化合物の投与を含んでなるカポジ肉腫の処置方法。
【請求項１３】
ｃ−Ｋｉｔの阻害以外の機構によりＫＳＨＶ複製を調節する該化合物が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レチノイド及びタキソールよりなる群から選択される請求項１２の方法。
【請求項１４】
Ｉ型シグマ受容体を阻害する化合物の投与及びＩ型シグマ受容体の阻害以外の機構によりＫＳＨＶ複製を調節する化合物の投与を含んでなるＫＳＨＶの複製を阻害する方法。
【請求項１５】
Ｉ型シグマ受容体の阻害以外の機構によりＫＳＨＶ複製を調節する該化合物が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レチノイド及びタキソールよりなる群から選択される請求項１４の方法。
【請求項１６】
Ｉ型シグマ受容体を阻害する化合物の投与及びＩ型シグマ受容体の阻害以外の機構によりカポジ肉腫を調節する化合物の投与を含んでなるカポジ肉腫の処置方法。
【請求項１７】
Ｉ型シグマ受容体の阻害以外の機構によりカポジ肉腫を調節する該化合物が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レチノイド及びタキソールよりなる群から選択される請求項１６の方法。
【請求項１８】
ａ）ＲＮＡサンプルのＲＮＡ発現のレベルを決定すること、ここで、該ＲＮＡサンプルは、
ｂ）増幅し、そして蛍光的に標識し、遺伝子発現プロフィールに相当する多数の核酸配列を含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして該マイクロアレイを蛍光に関して走査する；
ｃ）アルゴリズムを用いて該発現レベルを正規化すること；及び
ｄ）該ＲＮＡサンプルを遺伝子発現プロフィールデータベースに対して評点すること、
の工程を含んでなるビジネスを行う方法。
【請求項１９】
該ＲＮＡサンプルを患者から得る請求項１８の方法。
【請求項２０】
該ＲＮＡサンプルを血液、羊水液、血漿、精液、骨髄及び組織生検よりなる群から選択される患者サンプルから単離する請求項１９の方法。
【請求項２１】
該マイクロアレイがＤＮＡマイクロアレイである請求項１８の方法。
【請求項２２】
該データベースがウェブブラウザーインターフェースを介して利用できる請求項１８の方法。
【請求項２３】
該ウェブブラウザーが遺伝子配列分析手段を提供する請求項１８の方法。
【請求項２４】
ユーザーが該データベースへのアクセスの料金を支払う請求項１８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との関係
本願は、２０００年８月２日に出願された米国仮出願第６０／２２２，１６２号の利益を請求する。
【０００２】
発明の背景
カポジ肉腫（ＫＳ）は、皮膚及び内臓器官上の血管増殖性病巣（ａｎｇｉｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ）を特徴とする血管新生物である。病巣は、内皮起源の増殖する紡錘状の腫瘍細胞の存在により識別され、そして炎症性細胞及び赤血球の広範囲血管外遊出を有する異常な血管新生を示す。ＫＳは免疫応答性個体において稀にしか起こらない症状であるが、後天性免疫不全症候群（エイズ）と関連する最も一般的な悪性疾患である。ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）もしくはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ＫＳ発症と関連する感染性病原体である（１４）。ウイルスは、病巣における紡錘細胞の大部分、並びに病変がある内皮細胞及び浸潤する白血球に感染する（７８，７９，８０，８１）。紡錘細胞の大部分は潜伏型のＫＳＨＶゲノムを保有し、わずかな割合の細胞は増殖サイクル（ｌｙｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ）に入り、そして感染性ウイルスを生産する（７２，８２，８０，８１）。ＫＳＨＶの複雑な生物学における潜伏及び増殖ウイルス（ｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）遺伝子発現の正確な役割は、これから完全に解明されなければならない。さらに、細胞性遺伝子プロフィールに対するウイルス遺伝子発現の影響についてもしくはこれらのウイルス−細胞相互作用が腫瘍形成にどのように寄与するかほとんど知られていない。有効なインビトロ培養系の確立は、ＫＳＨＶ及びＫＳと関連する多数の問題の解明を与えるはずである。最近、我々は、ＫＳＨＶ感染に非常に許容的でありそしてゲノムを主に潜伏状態で無限に維持する不死化した皮膚微小血管内皮細胞を用いてそのような培養系を開発した。ＫＳＨＶでのＤＭＶＥＣの感染は、紡錘細胞形成、接触阻止の喪失及び軟寒天における増殖を包含する表現型変化を引き起こし、インビボにおけるＫＳ病巣形成を促進するものによく似たウイルス−細胞相互作用を示唆する。
【０００３】
ＫＳＨＶ感染により誘導される変化は、宿主細胞の改変された転写プログラムに反映される。ＤＮＡマイクロアレイ分析は、数千の宿主遺伝子の転写変化の同時モニタリングを可能にする（６０）。既知のＤＮＡフラグメントをつけたガラススライドにハイブリダイズするＲＮＡサンプルの自動定量により、様々な実験条件下での転写の違いの比較が可能になる。
【０００４】
発明の要約
ヒト内皮細胞のカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス感染は、紡錘細胞形成及び悪性トランスフォーメーションを引き起こす。ＤＮＡマイクロアレイ分析により、ウイルス感染は、血管新生、炎症及び分化を支配するものを包含する多数の細胞経路の大きな変化をもたらすことが示された。増殖サイクルの誘導の際に、ＫＳＨＶは宿主細胞応答をさらに調節した。我々は、増殖サイクル中に過剰発現される遺伝子が、可能性のある抗ウイルス標的であるかどうかを評価するために、それらの誘導もしくは機能を体系的に阻害した。Ｉ型シグマ受容体のアンタゴニスト、ハロペリドール、及びキナーゼアンカリングプロテイン（ｋｉｎａｓｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＫＡＰ）とプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）間の相互作用のペプチドインヒビター、Ｈｔ−３１は、増殖ウイルス遺伝子の発現を阻害したが、潜伏ウイルス遺伝子発現を阻害しなかった。ＫＳＨＶ感染後に有意にアップレギュレーションされる遺伝子の一つは、幹細胞因子（ｓｔｅｅｌ因子、ＳＣＦ）の受容体の機能を果たす受容体チロシンキナーゼ、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）タンパク質の遺伝子であった（８３，８４）。ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣは、外因性ＳＣＦに対する増大した増殖性応答を示し、そしてｃ−Ｋｉｔシグナリングの阻害は、リガンド依存性増殖の減少を引き起こし、そしてＫＳＨＶによって誘導されるトランスフォームした表現型を取り消す。さらに、ｃ−ｋｉｔシグナル伝達の阻害は、ＫＳＨＶによって誘導される紡錘細胞形成を防ぎ、一方、アデノウイルスベクターによるｃ−ｋｉｔの発現は、感染していない内皮細胞における紡錘細胞形成を誘導する。従って、ＫＳＨＶは、ｃ−Ｋｉｔ発現及び機能の調節によってＫＳ発症に寄与する。本発明は、ＫＳＨＶ感染並びにカポジ肉腫を処置及び診断するための方法及び組成物を提供する。本発明はまた、ウイルス複製の様々な段階でのＫＳＨＶ感染細胞の遺伝子発現プロフィールも提供する。さらに、本発明は、内皮細胞トランスフォーメーションの処置及び診断のための方法及び組成物を提供する。本発明はまた、新生血管形成を刺激もしくは阻害することを包含する血管新生を調節するための、並びに内皮細胞を取り囲む細胞外マトリックスを調節するための方法及び組成物も提供する。本発明は、インターフェロンによりもたらされる遺伝子発現の調節のための方法及び組成物を提供する。さらに、本発明は、内皮細胞炎症の調節のための方法及び組成物を提供する。また、本発明に含まれるものは、内皮細胞の脱分化のための方法及び組成物である。本発明はまた、該遺伝子発現プロフィール及びマイクロアレイを使用する方法、並びに遺伝子発現プロフィール及びマイクロアレイの該使用に関するビジネス方法にも関する。
【０００５】
詳細な記述
ＤＮＡマイクロアレイによる宿主細胞−ウイルス相互作用の分析は、細胞経路とウイルス感染間の以前に知られていない関係の発見を可能にする。ＫＳＨＶを保有する内皮細胞にこの技術を用いることにより、我々は、ＫＳＨＶにより発現が調節される細胞性遺伝子を同定した。３つ全ての実験において一貫してアップレギュレーションされる細胞性転写産物の一つはｃ−ｋｉｔであった。ｃ−ｋｉｔは、幹細胞因子（ＳＣＦ）により活性化される受容体チロシンキナーゼである。ＫＳＨＶ感染後のｃ−Ｋｉｔ過剰発現は、パラ分泌及び自己分泌ｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ相互作用の両方に影響を及ぼす。機能性結果を有する増大した発現は、ｃ−Ｋｉｔ発現がＫＳの発症において役割を果たし得る可能性を高める。ＤＭＶＥＣのＫＳＨＶ感染はＳＣＦ受容体、ｃ−Ｋｉｔの発現を高め、そして増大した発現は、外因性ＳＣＦに応答する増大した増殖を促進する。さらに、ＤＭＶＥＣはｃ−ＫｉｔリガンドＳＣＦを共発現し、そして自己分泌ｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性の阻害は、ＫＳＨＶ感染によりＤＭＶＥＣにおいて誘導されるトランスフォームした表現型を抑制する。ｃ−Ｋｉｔ発現及びｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ相互作用は、造血細胞及び限られた数の非造血細胞の正常な発生にとって重要であるが、ｃ−Ｋｉｔの発現はまた様々な悪性疾患とも関連している。ｃ−Ｋｉｔ関連癌では、ｃ−Ｋｉｔの異なる役割が同定されている。例えば、ＧＩＳＴｓ及び生殖細胞新生物では、膜近傍及びチロシンキナーゼドメインにおける機能獲得型突然変異が記述されており、それぞれ、リガンド非依存性二量化もしくは二量化なしの構成的活性化を可能にする（８５，８６，８７，８８）。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び乳癌では、ｃ−Ｋｉｔ及びＳＣＦの共発現が起こり、そして自己分泌増殖ループを生じると考えられる（８９，９０，９１，９２，９３）。内皮細胞はＫＳ紡錘細胞の前駆体であるので、皮膚内皮細胞のＫＳＨＶ感染が、機能性結果を有するｃ−Ｋｉｔ発現を増大するという我々の発見は、ｃ−Ｋｉｔ発現がＫＳの発症において役割を果たし得る可能性を高める。最近の報告により、ＫＳ組織におけるｃ−Ｋｉｔの発現が初めて示され（９４）、そしてさらに詳細に調べた一つの場合には、膜近傍もしくはチロシンキナーゼドメインにおけるいかなる活性化突然変異も認められなかった。このインビボ結果は、ｃ−ＫｉｔがＫＳの発症において役割を果たすことを裏付ける。
【０００６】
ＫＳ疾患中、ＫＳ病巣中の異型内皮細胞におけるＫＳＨＶの存在は、紡錘細胞発生及び腫瘍進行におけるＫＳＨＶの役割を示唆する。我々の研究において、ＤＭＶＥＣのＫＳＨＶ感染が機能性ｃ−Ｋｉｔ受容体をアップレギュレーションするという結果は、ｃ−Ｋｉｔ活性が細胞性トランスフォーメーションに必要とされるという教示と合わせて、ＫＳの発症におけるｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦの役割を強く裏付ける。
【０００７】
ＫＳＨＶに関連する細胞性トランスフォーメーションにおけるｃ−Ｋｉｔの原因的役割の同定は、ＫＳの新規な治療的標的を示唆する。本報告において記述するｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼインヒビター、ＳＴＩ５７１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性と関連する疾患、慢性骨髄性白血病の処置のＩ／ＩＩ相臨床試験においてかなりの見込みを示している（９５）。最近、ＳＴＩ５７１はまた、ｃ−Ｋｉｔ活性の阻害によりインビトロにおいてＳＣＬＣ細胞系の増殖を抑制することも示された（９３，９６）。７０％を超えるＳＣＬＣはｃ−Ｋｉｔ及びＳＣＦを共発現し、ｃ−Ｋｉｔ活性のインヒビターは、自己分泌ｃ−Ｋｉｔシグナリングが役割を果たすこの及び他の癌の処置の臨床用途を有し得ることを示唆する。要するに、ｃ−Ｋｉｔは、ＫＳ腫瘍形成における主要な標的とみなすべきである。従って、ＳＴＩ５７１、もしくはｃ−Ｋｉｔシグナリングの他の薬理学的インヒビターは、ＫＳの処置のための可能性のある治療的因子として評価すべきである。
【０００８】
本報告において記述するｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性の薬理学的インヒビター、ＳＴＩ５７１（ＧＬＥＥＶＥＣＲ）は、最初にＡｂｌチロシンキナーゼに対する特異性に関して選択された２−フェニルアミノピリミジン誘導体である（９７）。続いてこのインヒビターは、幅があるが限られた範囲の特異性を示し、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、血小板由来増殖因子受容体及びｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼに対して有効であることが示された（９７，９８，９９）。Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）にかかっている患者の９５％において見出され、そしてＢｃｒ−Ａｂｌの増大したチロシンキナーゼ活性は、該疾患における主要因子であると考えられる。ＳＴＩ５７１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現細胞の増殖及び腫瘍形成を抑制し（９８）、そしてＣＭＬの処置に対して認可されている（９５）。我々の結果は、ＳＴＩ５７１、並びにｃ−Ｋｉｔシグナリングの他のインヒビターが、ＫＳの処置及びＫＳＨＶの複製を阻害することに治療的潜在能力を有することを示す。
【０００９】
我々はまた、ウイルス遺伝子発現に必要とされる細胞性遺伝子も同定した。誘導していない細胞において発現される全ての遺伝子並びに感染していない細胞において誘導されるものを差し引くことにより、ＰＭＡ刺激の６時間もしくは４８時間後にＫＳＨＶによって特異的に且つ有意に誘導される少数群の遺伝子を同定した。この群の大部分は、前炎症性刺激により誘導され従っておそらくＮＦκＢにより調節される遺伝子を含有した。増殖複製中の前炎症性遺伝子の誘導は、宿主の先天性免疫応答であることができ、もしくはＮＦκＢのウイルス活性化によりもたらされることができる。一致して、ＮＦκＢ活性化の阻害は、Ｂ細胞においてＫＳＨＶによってもたらされるアポトーシスを誘導した。しかしながら、本研究において使用する小分子ＮＦκＢインヒビターでこれを確かめることはできなかった。２３個の遺伝子の機能もしくは誘導をインヒビターにより直接標的とした。これらのうち、２つの標的は、後期遺伝子発現に必要とされることが見出された。従って、アップレギュレーションされる遺伝子のかなりの部分はウイルス遺伝子発現にとって必須であり、そしてより低いストリンジェンシーの検索は、ウイルス生活環に必要とされる追加の遺伝子を明らかにするであろう。例えば、潜伏期の間に誘導されるものに推定標的遺伝子のプールを拡張することにより、腫瘍細胞増殖もしくは潜伏プロウイルスの再活性化にとって必須の細胞性遺伝子産物を明らかにすることができる。従って、ＤＮＡチップは、可能性のある細胞性薬剤標的を迅速に同定するための強力な手段である。
【００１０】
我々は、ＯＲＦ６５遺伝子の発現にとって必須の細胞性成分としてＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用及びＩ型シグマ受容体を同定した。ＰＫＡは、細胞内ｃＡＭＰにより活性化される遍在するシグナリング成分である。様々なＡＫＡＰとの会合は、ＰＫＡの細胞内局在化をもたらし、そして細胞外刺激に応答する適時の活性化を保証する（２１，２６）。ＰＫＡは、ＮＭＤＡ及びグルタミン酸受容体のような細胞表面受容体、並びにミトコンドリアのような細胞内構造と関連することが見出されている（２１，２６）。ＡＫＡＰ  Ｙｏｔｉａｏは、ＰＫＡをプロテインホスファターゼ１及びＮＭＤＡ受容体につなぎ、そしてＰＫＡ活性化はそれによりイオンチャンネルの活性を調節することができる（７０）。さらに、ＰＫＡは、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質のような核因子のリン酸化により転写を制御する（６３）。
【００１１】
Ｉ型シグマ受容体は、ハロペリドールのような抗精神病薬の結合部位として特性化された（３３）。該受容体はＥＲに局在し、そして活性化の際に細胞表面にトランスロケーションすることができる（４２）。ＰＫＡのように、Ｉ型シグマ受容体は、イオンチャンネル活性の制御に関与している。例えば、Ｉ型シグマアゴニストは、ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘発性カルシウムシグナリングに影響を与える（２８，３２）。Ｉ型シグマ受容体は、ＥＲからのＩＰ３を介したカルシウム放出及び膜脱分極後の細胞外カルシウム流入の両方に影響を及ぼすことが示されている（２９）。興味深いことに、ＩＰ３受容体のＰＫＡリン酸化はその感受性を高め（７）、同定される薬剤標的の共通の作用部位を示唆する。ＫＳＨＶ感染中のカルシウムシグナリングの重要性についてはほとんど知られていないが、しかしながら、イオノマイシンは、ホルボールエステルによって誘導される再活性化プロセスを強力に増大することが報告されている（１３）。総合すると、これは、カルシウムシグナリングが、ＫＳＨＶの効率のよい再活性化もしくは複製に必要とされ得ることを示唆する。興味深いことに、ハロペリドールは、組織培養において、別のガンマ−ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の複製を阻害することが示されている（４９）。ガンマ−ヘルペスウイルス再活性化及び複製におけるカルシウムシグナリングの必要条件をさらに調べる実験は、現在進行中である。
【００１２】
我々の方法は、抗ウイルス研究の新規な戦略である。伝統的な仮説駆動型の方法と異なり、我々は、ＫＳＨＶの増殖サイクル介入のための可能性のある標的を同定するためにデータ駆動型の方法を用いた。我々は、ウイルスに感染した宿主細胞の大域転写解析により得られるデータの大本体から、ある種の前もって決定した規準を満たす遺伝子を選択した。これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の大部分の上流調節因子もしくは機能のいずれかを阻害することにより、ウイルス複製にとって重要な宿主細胞経路を同定することができる。これらの経路は、新規な介入経路、もしくは既知の薬剤の新規な用途さえ提供する。従って、ＤＮＡ−マイクロアレイは、ウイルス疾患の新規な処置の開発に適用することができる。
【００１３】
本発明は、表２において同定する核酸分子及びそれによりコードされるポリペプチドに関し、それらは、ＫＳＨＶ感染によりその発現が調節される内皮細胞遺伝子である。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子（ＫＳＨＶ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ）の完全なアミノ酸配列は既知であってもなくてもよく、そして全長ゲノムＤＮＡもしくはアミノ酸コーディング領域をコードする完全なヌクレオチド配列は既知であってもなくてもよい。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのような寄託物から容易に入手可能である内皮細胞系の多種多様な哺乳動物細胞及び細胞タイプが、記述する遺伝子を含有すると予測される。１つもしくはそれ以上のＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を生産することができるヒト起源の内皮細胞には、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ（ＣＲＬ−１７３０）、ＨＡＡＥ−１（ＣＲＬ−２４７２）、ＨＡＡＥ−２（ＣＲＬ−２４７３）、ＨＦＡＥ−２（ＣＲＬ−２４７４）、ＨＩＡＥ−７８（ＣＲＬ−２４７５）、ＨＩＡＥ−１０１（ＣＲＬ−２４７８）、ＨＵＶＥ−１２（ＣＲＬ−２４８０）及びＤＭＶＥＣが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１４】
他の細胞及び細胞系もまた、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ｃＤＮＡを単離する用途のために適当であることができる。適当な細胞の選択は、細胞抽出物におけるもしくは全細胞アッセイにおけるＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子発現活性のスクリーニングにより行うことができる。これらのアッセイのいずれか一つにおいてＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子活性を有する細胞は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離のために適当であることができる。
【００１５】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡを分子的にクローン化するためには、当該技術分野において既知である様々な方法のいずれかを用いることができる。これらの方法には、適切な発現ベクター系における適切な細胞からのｃＤＮＡライブラリーの構築後のＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の直接機能性発現が包含されるがこれに限定されるものではない。別の方法は、１つもしくはそれ以上のＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされるアミノ酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。さらなる方法は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされるタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることからなる。この部分ｃＤＮＡは、１つもしくはそれ以上のＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされる精製タンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によってＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
【００１６】
別の方法は、細胞からＲＮＡを単離しそしてＲＮＡをインビトロもしくはインビボ翻訳系によってタンパク質に翻訳することである。ペプチド、タンパク質へのＲＮＡの翻訳は、例えば、抗−タンパク質抗体との免疫学的反応性によりもしくはタンパク質の生物学的活性により同定することができる目的のタンパク質の少なくとも一部の生産をもたらす。この方法では、適切な細胞から単離したＲＮＡのプールを、所望のタンパク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在に関して分析することができる。不要なＲＮＡから適切なＲＮＡを精製するためにＲＮＡプールのさらなる分別を行うことができる。この方法により生産されるペプチドもしくはタンパク質は、アミノ酸配列を提供するために分析することができ、それを今度はＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ｃＤＮＡの生産のためのプライマーを提供するために用いる、もしくは翻訳に使用したＲＮＡを、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を提供しそしてｃＤＮＡのこの生産のプローブを製造するために分析することができる。この方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に見出すことができる。
【００１７】
他のタイプのライブラリー、並びに他の細胞もしくは細胞タイプから構築したライブラリーが、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡを単離するために有用であり得ることは当業者に容易に明らかである。他のタイプのライブラリーには、他の細胞から得られるｃＤＮＡライブラリー、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）及びコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００１８】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子活性を有する細胞もしくは細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリーを製造できることは、当業者に容易に明らかである。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの製造に使用する細胞もしくは細胞系の選択は、適切な生物学的活性の測定もしくはリガンド結合アッセイを用いて最初に細胞関連生物学的活性を測定することにより行うことができる。
【００１９】
ｃＤＮＡライブラリーの製造は、当該技術分野において周知である標準的な技術により行うことができる。周知であるｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）に見出すことができる。
【００２０】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡはまた、適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離できることもまた、当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知である標準的な技術により行うことができる。周知であるゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）に見出すことができる。
【００２１】
上記の方法によってＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をクローン化するためには、遺伝子産物のアミノ酸配列が必要であり得る。これを成し遂げるために、タンパク質を精製し、そして部分アミノ酸配列を自動シークェネーターにより決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するためのプライマーを製造するためにタンパク質からの６〜８アミノ酸の２つの領域の線状配列を決定する。
【００２２】
いったん適当なアミノ酸配列が同定されると、それらをコードすることができるＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１つより多くのコドンを用いることができ、従って、アミノ酸配列を１組の同様のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。該組の一つのメンバーのみが、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子配列と同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえＤＮＡにハイブリダイズすることができる。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡにそれでもなお十分にハイブリダイズすることができ、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にする。これらの方法により単離されるＤＮＡは、無脊椎動物及び脊椎動物起源から、様々な細胞タイプからのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため及び相同遺伝子を単離するために用いることができる。
【００２３】
遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１つより多くのコドンを用いることができ、従って、アミノ酸配列を１組の同様のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。該組の一つのメンバーのみが、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子配列と同一であるが、適切な条件下ではミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子核酸にハイブリダイズすることができる。別の条件下では、ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡにそれでもなおハイブリダイズすることができ、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡの同定及び／もしくは単離を可能にする。
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の組換え発現
本明細書において記述する方法により得られるクローン化したＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡは、適当なプロモーター及び他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組換え的に発現することができ、そして組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子タンパク質を生産するために原核もしくは真核宿主細胞に導入することができる。そのような操作のための技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、上記に十分に記述されており、そして当該技術分野において周知である。
【００２４】
発現ベクターは、適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と本明細書において定義する。そのようなベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、及び動物細胞のような様々な宿主において真核生物遺伝子を発現するために用いることができる。
【００２５】
特に考案されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力、及び有効なプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＤＮＡに結合しそしてＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを導くＤＮＡ配列と定義する強力なプロモーターは、高頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特に考案されたプラスミドもしくはウイルスが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２６】
組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を哺乳動物細胞において発現するために様々な哺乳動物発現ベクターを用いることができる。組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子発現のために適当であることができる市販されている哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２７】
組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を細菌細胞において発現するために様々な細菌発現ベクターを用いることができる。組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子発現のために適当であることができる市販されている細菌発現ベクターには、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２８】
組換えタンパク質を酵母のような真菌細胞において発現するために様々な真菌細胞発現ベクターを用いることができる。組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子発現のために適当であることができる市販されている真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００２９】
組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を昆虫細胞において発現するために様々な昆虫細胞発現ベクターを用いることができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の組換え発現のために適当であることができる市販されている昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が包含されるがこれに限定されるものではない。
【００３０】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡは、組換え宿主細胞における発現のために発現ベクターにクローン化することができる。組換え宿主細胞は、エシェリキア・コリのような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類動物起源の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ及びカイコ由来の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない昆虫細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない原核生物もしくは真核生物であることができる。適当であることができそして市販されている哺乳動物種から得られる細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ細胞及びＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００３１】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション及び電気穿孔が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の技術のいずれか一つにより宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増殖させ、そしてそれらがＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされるタンパク質を生産するかどうかを決定するために個々に分析する。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を発現する宿主細胞クローンの同定は、抗体との免疫学的反応性、及び宿主細胞関連タンパク質生物学的活性の存在が包含されるがこれらに限定されるものではないいくつかの手段により行うことができる。
【００３２】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡの発現はまた、インビトロで製造される合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡもしくは適切な細胞から単離したｍＲＮＡをコムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な無細胞系において効率よく翻訳することができ、そしてカエル卵母細胞への微量注入が包含されるがこれに限定されるものではない細胞に基づく系において効率よく翻訳することもでき、一般に、カエル卵母細胞への微量注入が好ましい。
【００３３】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子のアッセイ方法
以下の方法により機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子活性のレベル及びＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされる総タンパク質のレベルの両方をアッセイするために、宿主細胞トランスフェクタント及び微量注入した卵母細胞を用いることができる。組換え宿主細胞の場合、これは、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされるタンパク質の一つもしくはそれ以上のフラグメントもしくはサブユニットをコードするＤＮＡを含有する一つまたはおそらく二つもしくはそれ以上のプラスミドの共トランスフェクションを伴う。卵母細胞の場合、これは、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされるタンパク質の合成ＲＮＡの共注入を伴う。発現を与える適切な期間の後、細胞性タンパク質を例えば３５Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識し、その後に細胞ライセート及び細胞培養上清を採取し、そしてタンパク質に対して向けられるポリクローナル抗体での免疫沈降に供する。
【００３４】
宿主細胞における適切なタンパク質のレベルは、免疫アフィニティー及び／もしくはリガンドアフィニティー技術により定量する。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を発現する細胞は、細胞膜への放射性［リガンド］結合の量を測定することにより発現されるタンパク質分子の数に関してアッセイすることができる。例えば３５Ｓ−メチオニンで標識されたもしくは標識されていないタンパク質を単離するためにタンパク質特異的アフィニティービーズもしくはタンパク質特異的抗体を用いる。標識されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識されていないタンパク質は、タンパク質特異的抗体を用いてウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出する。
【００３５】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子活性を検出する別の方法は、ｃＤＮＡをトランスフェクションした全細胞もしくはｍＲＮＡを注入した卵母細胞におけるＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質活性の直接測定を伴う。所望のタンパク質活性は、特異的リガンド結合もしくはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡを発現する宿主細胞の生物学的特性により測定する。
細胞に基づくアッセイ
本発明は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子発現もしくは遺伝子産物のいずれかの化合物調節を検出するための全細胞法を提供する。該方法は、工程：
１）ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子によりコードされる機能性タンパク質を含有する細胞、または内皮細胞もしくは細胞系と試験化合物とを接触させること、及び
２）試験化合物により改変されたＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物機能に応答する細胞における変化を測定すること、
を含んでなる。
【００３６】
試験化合物との細胞接触に必要な時間の量は、例えば、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはその遺伝子産物の活性の既知のモジュレーターで時間経過を試験しそして時間の関数として細胞変化を測定することにより、実験的に決定する。
【００３７】
本発明の方法の測定手段は、試験化合物に同様にさらされていない同一の細胞に対して試験化合物にさらされている細胞を比較することによりさらに特定することができる。あるはまた、２種の細胞、機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を含有するもの及び第一のものと同一であるが機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を欠く第二の細胞を両方とも同じ化合物と接触させ、そして２種の細胞間の違いに関して比較することができる。この技術はまた、これらのアッセイのバックグラウンドノイズを確定することにおいても有用である。これらのコントロール機構はまた、機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはその遺伝子産物の調節に応答する細胞変化の容易な選択も可能にすることを当業者は理解する。
【００３８】
「細胞」という用語は少なくとも１個の細胞をさすが、検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明のために適当な細胞は、細菌、酵母もしくは真核細胞であることができる。
【００３９】
機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物の化合物調節を決定するためのアッセイ方法は、通常の実験室形態であることができ、もしくは高処理量に適合させることができる。「高処理量」という用語は、同時に複数サンプルの容易な分析、及びロボット操作能力を与えるアッセイ設計をさす。高処理量アッセイの別の所望される特徴は、試薬使用量を減らすようにもしくは所望の分析を行うために操作の数を最小限度に抑えるように最適化されるアッセイ設計である。アッセイ形態の例には、９６ウェルもしくは３８４ウェルプレート、浮上液滴（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ）、及び液体処理実験に用いる「ラボ・オン・チップ（実験室チップ）（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」マイクロチャンネルチップが包含される。プラスチック型及び液体処理装置の小型化は進んでいるので、もしくは改善されたアッセイ装置が設計されるので、さらに多数のサンプルを本発明の設計を用いて実施できることを当業者は周知である。
【００４０】
本発明の方法に適当な細胞変化は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物の機能もしくは量における変化を直接測定すること、あるいはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子機能の下流効果を測定すること、例えば二次メッセンジャー濃度またはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子により転写的に影響を受ける遺伝子の転写における変化もしくはタンパク質レベルにおける変化を測定すること、あるいは細胞における表現型変化を測定することを含んでなる。好ましい測定手段には、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはコードタンパク質の量における変化、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはコードタンパク質の機能活性における変化、ｍＲＮＡの量における変化、細胞内タンパク質における変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌タンパク質における変化、またはＣａ＋２、ｃＡＭＰもしくはＧＴＰ濃度における変化が包含される。ｍＲＮＡのレベルの変化は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりもしくはディファレンシャル遺伝子発現により検出する。免疫アフィニティー、リガンドアフィニティーもしくは酵素測定は、宿主細胞におけるタンパク質のレベルの変化を定量する。例えば３５Ｓ−メチオニンで標識されたもしくは標識されていないタンパク質を単離するためにタンパク質特異的アフィニティービーズもしくは特異的抗体を用いる。標識されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。標識されていないタンパク質は、特異的抗体を用いて、ウェスタンブロッティング、蛍光セルソーティングによる細胞表面検出、細胞画像分析、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡにより検出する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は、発光源もしくは比色定量基質の切断によりモニターする。
【００４１】
細胞表面タンパク質の好ましい検出手段には、フローサイトメトリーもしくは統計的細胞イメージングが包含される。両技術において、目的のタンパク質は細胞表面に局在し、特異的蛍光プローブで標識し、そして細胞性蛍光の程度によって検出する。フローサイトメトリーでは、細胞を溶液において分析し、一方、細胞イメージング技術では、細胞の視野を相対蛍光に関して比較する。
【００４２】
アルカリホスファターゼもしくはプロテアーゼのような酵素である分泌タンパク質の好ましい検出手段は、蛍光もしくは比色定量酵素アッセイである。アルカリホスファターゼの蛍光／発光／発色基質は市販されており、そしてそのようなアッセイは、高処理量マルチウェルプレートスクリーニング形態に容易に適応可能である。プロテアーゼアッセイには、蛍光エネルギー移動に基づくアッセイを用いる。発蛍光団及びクエンチャー分子をプロテアーゼのペプチド基質の２つの末端に導入する。特異的基質の切断の際に、発蛍光団及びクエンチャーの分離は、検出可能な蛍光を与える。分泌タンパク質が、放射性の方法により測定できる場合、シンチレーション近接技術を用いることができる。目的のタンパク質の基質を、蛍光物質を含有する固体支持体への被覆もしくは導入のいずれかにより固定する。酵素反応により固相にごく接近する放射性分子は、蛍光物質が励起状態になりそして可視光を出すようにする。可視光の発光は、うまくいくリガンド／標的相互作用の検出の基礎を成し、そして適切なモニタリング装置により測定する。シンチレーション近接アッセイの例は、１９８６年２月４日に発行された米国特許第４，５６８，６４９号に開示されている。これらのタイプのアッセイの材料は、Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮＲ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から商標ＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭで市販されている。
【００４３】
内因性遺伝子が表現型細胞構造変化をもたらす場合の好ましい検出手段は、細胞形態もしくは細胞内表現型変化の統計的画像分析である。例えば、限定としてではなく、細胞は、表面に対して平らなままであることに対して丸くなるように形態を変えることができ、もしくは増殖が表面非依存性になり従って腫瘍細胞生物学の技術分野において周知であるトランスフォームした細胞表現型に似ることができ、もしくは細胞は新規な発生物を生じることができる。細胞内的に起こることができる表現型変化には、細胞骨格変化、新しい遺伝子転写に応答する小胞体／ゴルジ複合体における変化、もしくは新しい小胞の生産が包含される。
【００４４】
内因性遺伝子が可溶性の細胞内タンパク質をコードする場合、内因性遺伝子における変化は、細胞ライセート内に含まれる特定のタンパク質の変化により測定することができる。可溶性タンパク質は、本明細書において記述する方法により測定することができる。
【００４５】
本発明はまた、インビボにおいてＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の発現並びにコードタンパク質の機能を調節する化合物をスクリーニングする方法にも関する。化合物は、タンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはタンパク質の機能を増加もしくは減少することにより調節することができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の発現もしくはコードタンパク質の機能を調節する化合物は、様々なアッセイにより検出することができる。アッセイは、発現もしくは機能における変化があるかどうかを決定するための簡単な「イエス／ノー」アッセイであることができる。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を基準サンプルにおける発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にすることができる。この方法において同定されるモジュレーターは、治療的因子として有用である。
タンパク質に基づくアッセイ
本発明は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質活性の試験化合物調節を検出するためのインビトロタンパク質アッセイ方法を提供する。該方法は工程：
１）試験化合物及び機能性ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質を接触させること、及び
２）試験化合物によるタンパク質機能に対する変化を測定すること、
を含んでなる。
【００４６】
化合物との細胞接触に必要な時間の量は、例えば、既知のタンパク質モジュレーターで時間経過を試験しそして時間の関数として変化を測定することにより、実験的に決定する。
【００４７】
タンパク質分解活性を調節する化合物を検出する方法は、ｐｕｎｉｔｉｖｅ調節化合物、機能性タンパク質及び適当な標識基質を合わせること及び時間の関数としてもしくは前もって特定した期間の後のいずれかで基質の量の変化によりプロテアーゼに対する化合物の影響をモニターすることを含んでなる。標識基質には；放射性標識される基質（Ｃｏｏｌｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７０−６）、蛍光基質（Ｌｏｎｅｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６０：７２−３，７８；Ｔｗｉｎｉｎｇ（１９８４）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４３：３０−４）もしくは比色定量基質（Ｂｕｒｏｋｅｒ−Ｋｉｌｇｏｒｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（１９９３）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：３８７−９２）が包含されるがこれらに限定されるものではない。本発明における使用のために有用な放射性同位体には、当該技術分野において周知であるもの、特に１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ及び３３Ｐが包含される。放射性同位体は、チロシン残基のヨード化、セリンもしくはトレオニン残基のリン酸化、または放射性アミノ酸前駆体を利用するトリチウム、炭素もしくは硫黄の導入のような常法によりペプチドに導入する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のザイモグラフィー（Ｗａｄｓｔｒｏｅｍ  ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ（１９７３）．Ｓｃｉ．Ｔｏｏｌｓ  ２０：１７−２１）、並びに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく方法（Ｎｇ  ａｎｄ  Ａｕｌｄ（１９８９）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：５０−６）もまた、タンパク質分解活性を調節する化合物を検出するために用いる方法である。アゴニストである化合物は、基質分解の速度を増し、そして時間の関数としていっそう少ない残存基質をもたらす。アンタゴニストである化合物は、基質分解の速度を減少し、そして時間の関数としていっそう多い残存基質をもたらす。
【００４８】
本発明の方法のために有用な好ましいアッセイ形態は、プロテアーゼ切断部位をコードするペプチド配列により隔てられているクエンチャーもしくは受容体のいずれかと蛍光供与体とを含有するペプチド基質を用いるＦＲＥＴに基づく方法である。蛍光供与体は、エネルギーを吸着しそしてエネルギーの一部を別の化合物に移動することができる発光源化合物である。本発明における使用のために適当な蛍光供与体の例には、クマリン、フルオレセイン、ロードール（ｒｈｏｄｏｌ）及びローダミンのようなキサンテン色素、レゾルフィン、シアニン色素ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノール及びイソルミノール誘導体のようなアミノフタリックヒドラジド（ａｍｉｎｏｐｈｔｈａｌｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジカノヒドロキノン（ｄｉｃａｎｏｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、並びにユウロピウム及びテルビウム複合体並びに関連化合物が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００４９】
クエンチャーは、それが発光供与体に対して適切に近接して位置する場合に供与体からの発光を減らしそして一般に蛍光の形態でエネルギーを再放出しない化合物である。そのような成分の例には、インジゴ、ベンゾキノン、アントラキノン、アゾ化合物、ニトロ化合物、インドアニリン、並びにジ−及びトリフェニルメタンが包含される。供与体／クエンチャー対を用いるＦＲＥＴ法は、ペプチド基質に対する酵素活性の関数として蛍光供与体からの増加した発光を測定する。従って、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質と拮抗する試験化合物は、２つのコントロールサンプル、ＦＲＥＴペプチドのみからの低い（基礎）蛍光及び酵素的に有効なタンパク質の活性により消化されるＦＲＥＴペプチドからの高い蛍光の間の発光シグナルを生じる。
【００５０】
受容体は、蛍光供与体からエネルギーを吸着しそしてエネルギーの一部を蛍光として再放出する蛍光分子である。受容体は、別個の機構がタンパク質分解効能を測定できるようにする特定のタイプのクエンチャーである。供与体／受容体対を利用する方法は、ペプチド基質に対する酵素活性の関数として受容体発光の減少を測定する。従って、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質と拮抗する試験化合物は、２つのコントロールサンプル、ＦＲＥＴペプチドのみからの高い基礎蛍光及び酵素的に有効なタンパク質の活性により消化されるＦＲＥＴペプチドからの低い蛍光の間の発光シグナルを生じる。本発明の方法のために有用な受容体の例には、クマリン、フルオレセイン、ロードール、ローダミン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアジンダセン及びフタルシアニンが包含されるがこれらに限定されるものではない。
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質に結合する抗体の製造及び使用
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質に対する単一特異性抗体は、該タンパク質に対して反応する抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、もしくは最初にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）により記述された技術を用いて該タンパク質と反応するモノクローナル抗体として製造する。免疫学的技術は当該技術分野において周知であり、そして例えば、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＩＳＢＮ  ０８７９６９３１４２により出版されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌに記述されている。単一特異性抗体は、本明細書において用いる場合、単一の抗体種もしくはあるタンパク質に対する均質な結合特性を有する複数の抗体種と定義する。均質な結合は、本明細書において用いる場合、上記のような、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質と関連するもののような、特定の抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力をさす。タンパク質特異的抗体は、免疫アジュバントと一緒にもしくはそれなしに適切な濃度のタンパク質で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物（ウサギが好ましい）を免疫化することによりもたらされる。
【００５１】
初回免疫の前に免疫前血清を集める。各動物に、許容しうる免疫アジュバントと会合した約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの間のタンパク質を与える。そのような許容しうるアジュバントには、フロイント完全、フロイント不完全、明礬沈殿物、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を含有する油中水滴型エマルジョン及びｔＲＮＡが包含されるがこれらに限定されるものではない。初回免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは両方のいずれかで複数部位で好ましくはフロイント完全アジュバント中のタンパク質からなる。抗体力価を決定するために各動物から一定間隔で、好ましくは毎週、瀉血する。動物には、初回免疫後にブースター注射を与えても与えなくてもよい。ブースター注射を与える動物には、一般に、同じ経路によりフロイント不完全アジュバント中の等量の抗原を与える。ブースター注射は、最大力価が得られるまで約３週間隔で与える。各ブースター免疫後約７日でもしくは単一の免疫後ほぼ毎週、動物から瀉血し、血清を集め、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００５２】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、該タンパク質で同系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを免疫化することにより製造する。上記に説明したように、等容量の許容しうるアジュバントに導入した約０．１ｍｌのバッファーもしくは食塩水中約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇのタンパク質抗原でＩＰもしくはＳＣ経路によりマウスを免疫化する。フロイントアジュバントが好ましく、フロイント完全アジュバントを初回免疫に使用し、そしてフロイント不完全アジュバントをその後に使用する。マウスに０日に初回免疫を与え、そして約２〜約３０週間休ませる。免疫化したマウスに静脈内（ＩＶ）経路によりリン酸緩衝食塩水のようなバッファー溶液中約０．００１〜約１．０ｍｇのタンパク質抗原の１回もしくはそれ以上のブースター免疫を与える。免疫化したマウスから当該技術分野において既知である標準的な方法によって脾臓を取り除くことにより抗体陽性のマウスからリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を得る。安定なハイブリドーマの形成を与える条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を製造する。融合相手には：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１：Ｓ−１９４及びＳｐ２／０を包含することができるがこれらに限定されるものではなく、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、約３０％〜約５０％の濃度で、ポリエチレングリコール、約１０００ｍｏｌ．ｗｔ．において融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当該技術分野において既知である方法によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）における増殖によって選択する。増殖陽性ウェルから約１４、１８及び２１日に上清液を集め、そしてＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質を抗原として用いて固相免疫放射線アッセイ（ＳＰＩＲＡ）のような免疫アッセイにより抗体生産に関してスクリーニングする。培養液もまた、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためにオクタロニー沈降アッセイにおいて試験する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天技術のような技術によりもしくは限界希釈の技術によりクローン化する。
【００５３】
モノクローナル抗体は、プリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスにプライミングの少なくとも約４日後に約１ｘ１０６〜約６ｘ１０６のハイブリドーマ細胞をマウス当たり約０．５ｍｌ注入することによりインビボにおいて製造する。腹水液を細胞導入後約８−１２日で集め、そして当該技術分野において既知である技術によりモノクローナル抗体を精製する。
【００５４】
ｍＡｂのインビトロにおける製造は、当該技術分野において周知である組織培養培地においてハイブリドーマを増殖させることにより実施する。当該技術分野において周知である中空糸培養技術、エアリフト反応器、ローラーボトル、もしくはスピナーフラスコ培養技術を用いて大量のｍＡｂを製造するために高密度インビトロ細胞培養を行うことができる。ｍＡｂは、当該技術分野において既知である技術により精製する。
【００５５】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術及び放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）技術が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより決定する。体液もしくは組織及び細胞抽出物におけるＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質の存在を検出するために同様のアッセイを用いる。
【００５６】
単一特異性抗体を製造するための上記の方法は、ポリペプチドフラグメントもしくは全長の新生ポリペプチドもしくは個々のサブユニットに特異的な抗体を製造するために利用できることは当業者に容易に明らかである。特に、１つのタンパク質サブユニットのみもしくは完全に機能性のタンパク質に特異的な単一特異性抗体を作製できることは当業者に容易に明らかである。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質の通常の機能を阻害する単一特異性抗体を作製できることもまた当業者に明らかである。
【００５７】
抗体アフィニティーカラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合連結を形成するように抗体をゲル支持体に加えることにより作製する。好ましい共有結合連結は、抗体上に含まれるアミン、アルデヒドもしくはスルフィドリル残基によってなされる。抗体上にアルデヒドもしくは遊離スルフィドリル基を生成せしめる方法は当該技術分野において周知であり；アミン基は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応する。
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物特異的試薬を含有するキット組成物
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質に対する抗体、またはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質を含有するキットを製造することができる。そのようなキットは、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するためまたはサンプルにおけるＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するために用いる。そのような特性化は、法廷分析、診断用途及び疫学研究が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な目的のために有用である。
【００５８】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡ、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＲＮＡもしくはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質をスクリーニングしそしてそのレベルを測定するために用いることができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ＫＳＨＶ感染細胞、カポジ肉腫組織もしくは腫瘍細胞の検出及びタイピングが包含されるがこれらに限定されるものではない様々な使用のために適当なキットの構築に役立つ。そのようなキットは、少なくとも一つの容器を厳重に閉じ込めて保持するために適当な区分されたキャリヤーを含んでなる。キャリヤーは、組換えＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質またはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物を検出するために適当な抗−タンパク質抗体のような試薬をさらに含んでなる。キャリヤーはまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出の手段を含有することもできる。
遺伝子治療
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子をコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をアンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他のＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子アンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であることができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子アンチセンス分子は、微量注入、リポソーム被包により、もしくはアンチセンス配列を保有するベクターからの発現により細胞に導入することができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子アンチセンス治療は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物の活性を減らすことが有益である疾患の処置のために特に有用であることができる。
【００５９】
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子遺伝子治療は、標的生物体の細胞にＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子を導入するために用いることができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によりＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡの導入をもたらすウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが包含される。あるいはまた、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートもしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを用いる受容体を介した選択的ＤＮＡ導入、リポフェクション膜融合または直接微量導入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のために細胞に導入することができる。これらの方法及びその変形は、エクスビボ並びにインビボＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子遺伝子治療のために適当である。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子遺伝子治療は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子活性を高めることが有益である疾患の処置のために特に有用であることができる。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子での使用のために適当な遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ  ＮＪ，１９９６によって編集された、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記述されている。
製薬学的組成物
ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＤＮＡ、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子ＲＮＡ、またはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子コードタンパク質、またはＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子及び／もしくは遺伝子産物活性のモジュレーターを含んでなる製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容しうる担体の混合によるような既知の方法に従って調合することができる。そのような担体及び調合方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与のために適当な製薬学的に許容しうる組成物を生成せしめるために、そのような組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはモジュレーターを含有する。
【００６０】
本発明の治療もしくは診断組成物は、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物関連活性の調節の適応がある疾患を処置もしくは診断するために十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のような様々な因子に従って変わることができる。他の因子には、投与の形態が包含される。製薬学的組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路により個体に与えることができる。
【００６１】
「化学誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部ではない追加の化学成分を含有する分子を表す。そのような成分は、基本分子の可溶性、半減期、吸収などを向上することができる。あるいはまた、該成分は、基本分子の望ましくない副作用を弱めるかもしくは基本分子の毒性を減らすことができる。そのような分子の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような様々な指定研究書に記述されている。
【００６２】
本明細書において開示する方法に従って同定される化合物は、あらゆる潜在的毒性を最小限度に抑えながら、ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子、遺伝子産物もしくはその活性の最適阻害を得るために日常的試験により特定される適切な投与量で単独で用いることができる。さらに、他の因子の共投与もしくは逐次投与が望ましい可能性がある。例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、インターフェロンアルファ、レチノイド及びタキソールのような、カポジ肉腫の処置のために有用な化合物を本明細書において記述するＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物のモジュレーターと組み合わせて用いることができる。さらに、他の既知の抗腫瘍因子を本明細書において記述するＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物のモジュレーターと組み合わせることができる。
【００６３】
本発明はまた、本発明の新規な処置方法における使用のために適当な局所、経口、全身及び非経口製薬学的配合物を提供する目的も有する。ＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子の調節における使用のための有効成分として本発明に従って同定される化合物もしくはモジュレーターを含有する組成物は、投与のための通常の賦形剤における多種多様な治療剤形で投与することができる。例えば、化合物もしくはモジュレーターは、錠剤、カプセル剤（各々、持続性及び徐放性製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及び乳剤のような経口剤形において、もしくは注入により投与することができる。同様に、全て製薬学的技術分野の当業者に周知である形態を用いて、静脈内（ボーラス及び注入の両方）、腹腔内、皮下、密閉したもしくはしない局所、または筋肉内形態でそれらを投与することもできる。所望の化合物の有効であるが無毒の量をＫＳＨＶ調節内皮細胞遺伝子もしくは遺伝子産物調節因子として用いることができる。
【００６４】
生成物の日量は、１日につき、患者当たり０．０１〜１０００ｍｇの広い範囲にわたって変えることができる。経口投与のためには、組成物は、好ましくは、処置する患者に対する投与量の対症調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線錠もしくは非割線錠の形態で与える。薬剤の有効量は、通常、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで与える。該範囲は、より特に１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。化合物もしくはモジュレーターの投与量は、所望の効果を得るために組み合わせる場合、調整する。一方、これらの様々な因子の投与量は、独立して最適化しそしていずれかの因子を単独で用いる場合より病状が減少する相乗結果を得るように組み合わせることができる。
【００６５】
本発明の化合物もしくはモジュレーターは、都合よく、単一の日量で投与することができ、または総日量を毎日２、３もしくは４回の分割した用量で投与することができる。さらに、本発明の化合物もしくはモジュレーターは、適当な鼻内賦形剤の局所使用によって鼻内形態で、もしくは該分野の当業者に周知である経皮皮膚パッチの形態を用いて、経皮経路により投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、用量投与は、もちろん、投与処方計画の全体にわたって断続的よりむしろ連続的である。
【００６６】
有効因子が別個の投与配合物である１種より多くの有効因子での組み合わせ処置には、有効因子を同時に投与することができ、もしくはそれらを各々別個にずらした時間で投与することができる。
【００６７】
本発明の化合物もしくはモジュレーターを利用する投与処方計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的症状；処置する症状の重さ；投与の経路；患者の腎及び肝機能；並びに用いるその特定の化合物を包含する様々な因子に従って選択する。通常の技量を有する医師もしくは獣医は、症状の進行を防ぐか、阻止するかもしくは抑えるために必要とされる薬剤の有効量を容易に決定しそして処方することができる。毒性なしに効能をもたらす範囲内の薬剤の濃度を得ることにおける最高精度は、標的部位への薬剤の有効性の反応速度論に基づく処方計画を必要とする。これは、薬剤の分配、平衡及び除去の考察を伴う。
【００６８】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述する化合物もしくはモジュレーターは有効成分を成すことができ、そして典型的には意図する投与形態、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適当に選択しそして通常の製薬学的実践と一致する適当な製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（本明細書において集合的に「担体」材料と称する）と混合して投与する。
【００６９】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態の経口投与には、有効薬剤成分をエタノール、グリセロール、水などのような経口の無毒の製薬学的に許容しうる不活性担体と合わせることができる。さらに、所望もしくは必要に応じて、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤もまた混合物に導入することができる。適当な結合剤には、限定なしに、澱粉、ゼラチン、グルコースもしくはベータ−ラクトースのような天然の糖、コーン甘味料、アラビアゴム、トラガカントゴムもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然及び合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが包含される。これらの剤形に使用する潤滑剤には、限定なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが包含される。崩壊剤には、限定なしに、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが包含される。
【００７０】
液体形態には、有効薬剤成分を合成及び天然のゴム、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、メチル−セルロースなどのような適当に風味をつけた沈殿防止剤もしくは分散助剤に合わせることができる。使用することができる他の分散助剤には、グリセリンなどが包含される。非経口投与には、滅菌した懸濁剤及び液剤が所望される。静脈剤投与が所望される場合、一般に適当な防腐剤を含有する等張製剤を用いる。
【００７１】
有効薬剤成分を含有する局所製剤は、例えば、アルコール性溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリームもしくはゲル配合物のシャンプーを生成せしめるために、例えば、アルコール、アロエ・ベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチルなどのような当該技術分野において周知である様々な担体材料と混合することができる。
【００７２】
本発明の化合物もしくはモジュレーターはまた、小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）及び多重層小胞のようなリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような様々なリン脂質から生成せしめることができる。
【００７３】
本発明の化合物はまた、化合物分子を連結する個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により送達することもできる。本発明の化合物もしくはモジュレーターはまた、目標設定可能な薬剤担体として可溶性ポリマーと連結することもできる。そのようなポリマーには、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノールもしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチル−エンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくはモジュレーターは、薬剤の制御放出を行うことにおいて有用な生物分解性ポリマー類、例えば、ポリ乳酸、ポリエプシロン（ｐｏｌｙｅｐｓｉｌｏｎ）、カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに連結することができる。
【００７４】
経口投与には、化合物もしくはモジュレーターをカプセル剤、錠剤もしくはボーラス形態で投与することができ、あるいはまた、それらを動物飼料に混合することができる。カプセル剤、錠剤及びボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸ジ−カルシウムのような適切な担体賦形剤と組み合わせた有効成分を含んでなる。これらの単位剤形は、均一な混合物が得られるように希釈剤、増量剤、崩壊剤及び／もしくは結合剤を包含する適当な細かく粉末にした不活性成分と有効成分とをよく混合することにより製造する。不活性成分は、化合物もしくはモジュレーターと反応せずそして処置する動物に対して無毒であるものである。適当な不活性成分には、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴム及び油などが包含される。これらの配合物は、処置する動物種の大きさ及びタイプ並びに感染のタイプ及び重さのような多数の因子により広範囲にわたって変えられる量の有効及び不活性成分を含有することができる。有効成分はまた、単に化合物を飼料と混合することによりもしくは飼料の表面に化合物を加えることにより添加物として飼料に投与することもできる。あるいはまた、有効成分を不活性担体と混合することができ、そして得られる組成物を次に飼料と混合するかもしくは動物に直接与えることができる。適当な不活性担体には、コーンミール、シトラスミール（ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅａｌ）、発酵残留物、ひき割りダイズ（ｓｏｙａ  ｇｒｉｔｓ）、乾燥穀類などが包含される。有効成分は、最終組成物が０．００１〜５重量％の有効成分を含有するように粉砕、攪拌、微粉砕もしくは混転によりこれらの不活性担体とよく混合する。
【００７５】
あるいはまた、化合物もしくはモジュレーターは、不活性液体担体に溶解した有効成分からなる配合物の注入により非経口的に投与することができる。注入は、筋肉内、第一胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであることができる。注入可能な配合物は、適切な不活性液体担体と混合した有効成分からなる。許容しうる液体担体には、落花生油、綿実油、ゴマ油などのような植物油並びにソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセロール、ホルマールなどのような有機溶媒が包含される。代わりのものとして、水性の非経口配合物を用いることもできる。植物油が好ましい液体担体である。配合物は、最終配合物が０．００５〜１０重量％の有効成分を含有するように有効成分を液体担体に溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【００７６】
化合物もしくはモジュレーターの局所施用は、水性の溶液もしくは懸濁液として本発明の化合物もしくはモジュレーターを含有する液体ドレンチ（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｒｅｎｃｈ）もしくはシャンプーの使用により可能である。これらの配合物は、一般にベントナイトのような沈殿防止剤を含有し、そして通常は消泡剤も含有する。０．００５〜１０重量％の有効成分を含有する配合物が許容できる。好ましい配合物は、０．０１〜５重量％の本発明の化合物もしくはモジュレーターを含有するものである。
【００７７】
本発明はまた、ＲＮＡサンプルのＲＮＡ発現のレベルを決定すること、ここで、ＲＮＡサンプルを増幅し、そして蛍光的に標識する、蛍光的に標識したＲＮＡを、特定の細胞もしくは組織タイプ（例えばニューロン細胞もしくは疾患組織）の遺伝子発現プロフィールに相当する多数の核酸配列を含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせること、及び蛍光検出のためにマイクロアレイを走査すること；該蛍光を正規化すること；及び遺伝子発現プロフィールを作製するために特徴抽出（ｓｉｎａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）アルゴリズム（例えばＭａｘＣｏｒもしくはＭｅａｎ  Ｌｏｇアルゴリズム）を使用することの工程を含んでなるビジネスを行う方法にも関する。好ましい態様として、ＲＮＡサンプルは患者から得られ、そして患者サンプルには、血液、羊水液、血漿、精液、骨髄及び組織生検が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００７８】
本発明はまた、試験サンプル（例えば患者サンプル）を分析するために遺伝子発現プロフィールを用いるビジネス方法にも関する。特定の態様として、この方法は、本発明の遺伝子発現プロフィールマイクロアレイを用いて実施することができる。例えば、ユーザー（例えば、医師のような保健従事者）は、患者からサンプル（例えば、血液、組織生検）を得ることができる。サンプルは、例えば、病院施設を用いて組織内で調製することができ、もしくはサンプルを商業研究施設に送ることができる。簡潔に言えば、ＲＮＡを当該技術分野において周知である方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９））を用いて患者サンプルから抽出する。次にＲＮＡを例えばＰＣＲにより増幅し、発蛍光団で標識し、そして特定の遺伝子発現プロフィールに相当する支持体にハイブリダイズさせる。支持体を蛍光に関して走査し、そして走査の結果を分析のために中央遺伝子発現プロフィールデータベースに送ることができる。別の態様として、サンプル自体を走査分析のために中央研究所施設に送る。走査結果は、コンピューター端末を介して、そしてインターネットもしくは他の手段によって分析のために中央研究所施設に送ることができる。好ましくは、ユーザーとコンピューターシステム間の接続は安全である。実際、ユーザーは、例えば、支持体の蛍光走査結果に関する情報並びに患者の疾患状態、臨床化学（例えば赤血球算定、電解質）及び患者の疾患状態に関する他の因子のような患者に関する追加の情報を入力することができる。中央コンピューターシステムは、次に、常駐コンピュータープログラムの使用によって、患者のサンプルの分析を提供し、そして患者の遺伝子プロフィールを示す遺伝子発現プロフィールを作製する。
【００７９】
本発明の方法及び装置は、コンピューターシステムが複雑なマルチユーザー計算装置またはパーソナルコンピューターもしくはワークステーションのようなシングルユーザー装置であるかどうかにかかわらず、任意のコンピューターシステムに適用されることを当業者は理解する。コンピューターシステムは、好適には、プロセッサー、メインメモリー、メモリーコントローラー、補助記憶インターフェース及び端末インターフェースを含んでなり、これらの全ては相互に接続されている。キャッシュメモリーもしくは他の周辺装置の付加のような、様々な改変、付加もしくは削除を本発明の範囲内でコンピューターシステムに行うことができることに留意せよ。
【００８０】
プロセッサーは、コンピューターシステムの計算及び制御機能を果たし、そして適当な中央演算装置（ＣＰＵ）を含んでなる。プロセッサーは、マイクロプロセッサーのような単一の集積回路を含んでなることができ、またはプロセッサーの機能を果たすために協同して働く任意の適当な数の集積回路装置及び／回路板を含んでなることができる。
【００８１】
好ましい態様として、補助記憶インターフェースは、コンピューターシステムが磁気ディスク（例えばハードディスクもしくはフロッピーディスケット）または光学記憶装置（例えばＣＤ−ＲＯＭ）のような補助記憶装置から情報を記憶しそして引き出すことを可能にする。一つの適当な記憶装置は、直接アクセス記憶装置（ＤＡＳＤ）である。ＤＡＳＤは、フロッピーディスクからプログラム及びデータを読み取ることができるフロッピーディスク装置であることができる。本発明は完全に機能性のコンピューターシステムに関連して記述され（そして引き続き記述され）るが、本発明の機構は様々な形態のプログラム製品として配布できること、及び本発明は実際に配布を実施する特定のタイプのシグナル保有メディアにかかわらず同等に適用されることを当業者は理解することに留意することが重要である。シグナル保有メディアの例には：フロッピーディスク及びＣＤ ＲＯＭＳのような記録型メディア並びにワイアレスコミュニケーションリンクを含むデジタル及びアナログコミュニケーションリンクのような伝送型メディアが包含される。
【００８２】
コンピューターシステムはまた、必要とされる情報をメインメモリーから動かすことを担う別個のプロセッサーの使用によって、そして／もしくはメインプロセッサーへの補助記憶インターフェースによって、メモリーコントローラーを含んでなることもできる。説明の目的のために、メモリーコントローラーを別個の存在として記述するが、実際には、メモリーコントローラーにより提供される機能の部分は、メインプロセッサー、メインメモリー及び／もしくは補助記憶インターフェースと関連する回路に実際に存在できることを当業者は理解する。
【００８３】
さらに、コンピューターシステムは、システム管理者及びコンピュータープログラマーが、通常はプログラム可能なワークステーションによって、コンピューターシステムと通信できるようにする端末インターフェースを含んでなることができる。本発明は、複数のプロセッサー及び複数のシステムバスを有するコンピューターシステムに同等に適用されると理解されるべきである。同様に、好ましい態様のシステムバスは典型的なハードウェアに組み込みのマルチドロップバスであるが、コンピューター関連環境における双方向通信をサポートする任意の接続手段を用いることができる。
【００８４】
コンピューターシステムのメインメモリーは、好適には、遺伝子発現プロフィールを作製するために用いるアルゴリズムに関連する一つもしくはそれ以上のコンピュータープログラム及びオペレーティングシステムを含有する。メモリーにおけるコンピュータープログラムは、その最も広い意味において用い、そして原始コード、中間コード、機械言語及びコンピュータープログラムの任意の他の表示を包含する全ての形態のコンピュータープログラムが包含される。「メモリー」という用語は、本明細書において用いる場合、システムの実際のメモリー空間における任意の記憶場所をさす。コンピュータープログラム及びオペレーティングシステムの部分は、メインプロセッサーが実行するために命令キャッシュにロードすることができ、一方、他のファイルは磁気もしくは光学ディスク記憶装置上に記憶してもよいと理解されるべきである。さらに、メインメモリーは異種のメモリー場所を含んでなることができると理解されるべきである。
【００８５】
本発明の別の好ましい態様は、組織もしくは細胞サンプルに対する薬剤及び毒性作用をスクリーニングする方法、並びに疾患を処置するための新規薬剤の開発方法を包含する様々なビジネス方法を含んでなる。本発明のさらなる態様は、正常及び疾患組織の遺伝子発現プロフィールを提供するビジネス方法を含んでなる。また本発明の範囲内であるのは、患者サンプルの診断及び予測子を提供するビジネス方法である。
【００８６】
本願のビジネス方法は、本発明の方法論の商業的及び他の使用に関する。一つの態様として、ビジネス方法には、本発明により提供される遺伝子発現プロフィールを消費者、すなわち、患者、開業医、保健診療機関、並びに製薬販売業者及び製造業者に提供することに関連する本発明の方法論のマーケティング、販売もしくはライセンスが包含される。
【００８７】
遺伝子発現プロフィールデータベースは、本発明の方法により作製される遺伝子発現プロフィールに関する注釈情報を含むように設計した内部データベースであることができる。そのような情報には、例えば、既定の核酸配列が見出されたマイクロアレイ、該配列と関連する関連ｃＤＮＡに関する記述的情報、組織もしくは細胞源、外部源から得られる配列データ、及び調製方法を包含することができる。データベースは、２つの部分：配列を記憶するものと関連情報を記憶するものに分かれることができる。このデータベースは、中央コンピューター施設内のファイアウォールを有するプライベートデータベースとして維持することができる。しかしながら、本発明はそのように限定されず、そして遺伝子発現プロフィールデータベースを一般に公開することができる。
【００８８】
データベースは、クライアントとネットワークサーバーとをつなぐネットワークシステムであることができる。ネットワークは、当該技術分野において既知であるような（例えばＥｔｈｅｒｎｅｔ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）もしくは広域ネットワーク（ＷＡＮ）を包含する多数の通常のネットワークシステムのいずれか一つであることができる。サーバーは、ユーザー要求を処理するためにデータベース情報にアクセスしそしてクライアントの機械に情報を供給するためにインターフェースを提供するソフトウェアを含むことができる。サーバーは、ワールドワイドウェブをサポートしそしてクライアントの使用のためにウェブサイト及びウェブブラウザーを維持することができる。クライアント／サーバー環境、データベースサーバー及びネットワークは、技術、営業用及び特許文献に十分に解説されている。
【００８９】
ウェブブラウザーを通して、クライアントはマイクロアレイデータベース及び遺伝子発現データベースからデータを取り出すための検索要求を構築することができる。例えば、ユーザーは、ボタンのようなユーザーインターフェース要素を「指してクリックし」、メニューを開き、そしてバーをスクロールすることができる。クライアントの要求は、ウェブアプリケーションに送ることができ、それはマイクロアレイデータベースもしくは遺伝子発現データベースから情報を集めるために用いることができるクエリーを生じるようにそれらをフォーマットする。さらに、ウェブサイトは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの一部、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されるＧｅｎＢａｎｋ及び関連データベースのような公開データベースへのハイパーテキストリンク、並びに遺伝子発現分析、遺伝病、科学文献などの関連情報を提供する任意のリンクを提供することができる。
【００９０】
以下の実施例は、本発明を例示するが、しかしながら、本発明をこれらに限定しない。
【００９１】
実施例１
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの誘導
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの樹立は、以前に詳細に記述されている（４３）。簡潔に言えば、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６及びＥ７遺伝子のレトロウイルス発現により不死化した皮膚微小血管細胞（ＤＭＶＥＣ）に、テトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）で刺激したＢＣＢＬ−１細胞の上清から得られたＫＳＨＶを感染させた。感染は、ＯＲＦ２６遺伝子のＫＳ３３０ ＢａｍＨＩフラグメントの増幅のＤＮＡ ＰＣＲ、ＯＲＦ２９遺伝子からのスプライシングされたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより確かめた（１１３）。潜伏的に感染した細胞のパーセンテージは、ＬＡＮＡ／ＯＲＦ７３（８２）の免疫蛍光染色により決定した。増殖誘導は、初期増殖タンパク質ＯＲＦ５９／ＰＦ−８（１１０）及び後期増殖糖タンパク質のタンパク質ＯＲＦ Ｋ８．１Ａ／Ｂ（１１１）に対する抗体で評価した。ＤＭＶＥＣは、＞９０％の細胞がＯＲＦ７３を発現する場合に実験に用いた。化学誘導なしに、２−５％の感染細胞はＯＲＦ５９を発現し、約１０％のＯＲＦ５９陽性細胞はＫ８．１Ａ／Ｂを発現した。ウイルスタンパク質に対する抗体は、Ｂａｌａ  Ｃｈａｎｄｒａｎ博士からの寛大な贈与であった。
ＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイは、マイクロアレイヤー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）を用いてガラススライド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上にヒトｃＤＮＡのＰＣＲフラグメントをスポットすることによりＳａｌｕｎｇａ ｅｔ ａｌ．（５７）に記述されているように製造した。１つのＤＮＡマイクロアレイを用いた：Ｍｅｇａ−Ａチップ：４４２８クローン。各クローンを二重反復でスポットした。各マイクロアレイは、３０種の植物遺伝子をバックグラウンドコントロールとして含有した（６０）。記述されているように（５７）ハイブリダイゼーションシグナルを走査し、そして正規化した。
プローブ調製及びハイブリダイゼーション
ＫＳＨＶを感染させたトランスフォームした皮膚微小血管内皮細胞を以前に記述されているように（４３）増殖させた。２種の異なる感染していない及び３種の異なる感染した細胞系を誘導しないかまたはＰＭＡで６時間もしくは４８時間誘導し、そしてトリプシン消化により採取した。ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製し、その後、各サンプルをＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）処理し、そしてＲＮｅａｓｙカラム上で再精製した。Ｔ７ポリメラーゼ線状増幅プロトコル（５７）を用いてメッセンジャーＲＮＡを一度増幅した。増幅後に、ＲＮＡをＣｙ３−シチジンの存在下で逆転写により標識した。
【００９２】
対応する感染した及び感染していないサンプルを記述されているように（５７）ハイブリダイズさせた。変動係数（ＣＶ）決定を可能にするために各々の標識しそして増幅したＲＮＡを少なくとも２つの別個のチップにハイブリダイズさせ、そして５０％未満のＣＶを有する遺伝子の平均強度を次の発現比の計算に用いた。各マイクロアレイの結果は、記述されているように（５７）第７５百分位数に正規化した。
ＳＣＦ及びｃ−ＫｉｔのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って用いて、擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを分光測光により定量し、そしてｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＲＴ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を２００Ｕ／ｌ・ｇ ＲＮＡで用いてｃＤＮＡを合成した。ｃ−Ｋｉｔ及びＳＣＦ ｍＲＮＡの増幅に用いたプライマーは：ｃ−Ｋｉｔ，５’−ＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡ−３’（配列番号：１）及び５’−ＡＡＧＣＣＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＣＡ−３’（配列番号：２）（８３）、並びにＳＣＦ，５’−ＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：３）及び５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号：４）（８４）であり、これらはそれぞれｃ−Ｋｉｔ及びＳＣＦの２４２ｂｐ及び２７４ｂｐの産物を生じた。ｃＤＮＡ合成のコントロールとして細胞性遺伝子ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を各サンプルから増幅した。一致するＨＰＲＴ増幅産物が比較下のサンプルから得られた。各反応には、ＲＴなしのサンプルを含んだ。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により分離し、そして臭化エチジウム染色により視覚化した。
免疫蛍光染色
ｃ−Ｋｉｔタンパク質の検出のために、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（染色バッファー）においてＤＭＶＥＣ単層をすすぎ、そして抗−ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体、クローンＮｕ−ｃ−ｋｉｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）もしくはクローン５７Ａ５（Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、続いてヤギ抗−マウスＦＩＴＣ結合抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）で染色した。両抗体とも、染色バッファーにおける１：１００希釈で３７℃で６０分間用いた。染色した細胞を２％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、封入し、そしてＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡上で調べた。二重反復単層からの一次抗体の削除は、二次コンジュゲートの非特異的結合を示さなかった。免疫蛍光分析は、擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣ並びにｃ−Ｋｉｔタンパク質を発現するアデノウイルス構築物を感染させたＤＭＶＥＣ上で実施した。
ＳＣＦ ＥＬＩＳＡ
擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣの合流した単層から６〜４８時間に及ぶインキュベーション期間の後に上清を採取した。採取した上清に存在するＳＣＦは、ＳＣＦ ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｒ＆Ｄ）を製造業者の説明書に従って用いて定量した。
増殖アッセイ
擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣ、並びにＳＣＬＣ系統ＨＴＢ−１７２の増殖を、ＸＴＴに基づくアッセイを用いて定量した。細胞を１ｘ１０４もしくは５ｘ１０４細胞／ウェルでＰｒｉｍａｒｉａ ９６ウェルトレー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に加えた。外因性ＳＣＦ（２０、５０及び１００ｎｇ／ｍｌ）及びＳＴＩ５７１（０．０１、０．１、１及び１０μＭ）を実験プロトコルにより示すように平板培養の２４時間後に加えた。ＸＴＴ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を製造業者の説明書に従って４８時間後に加えた。４〜６時間後に吸光度をマイクロプレート読み取り装置上で読み取った。ＨＴＢ−１７２系統は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。
アデノウイルスベクターの構築及び使用
ドミナントネガティブｃ−Ｋｉｔ突然変異体（ｃ−Ｋｉｔ／ＤＮ）は、標準的なＰＣＲに基づく突然変異誘発を用いて細胞質ドメイン中のＳｅｒ６１４での未熟終止コドンの挿入により構築した。この部位でのｃ−Ｋｉｔの欠失は、二量化ドメインに影響を与えずにＡＴＰ結合及びホスホトランスフェラーゼドメインを欠失する。突然変異誘発を確認するためのＤＮＡ配列分析の後、以前に記述されているように（１１５）ｃ−Ｋｉｔ／ＤＮをアデノウイルス発現ベクターにクローン化した。これは、ｃ−Ｋｉｔ／ＤＮをｔｅｔ応答性プロモーター／エンハンサー要素の制御下に置き、そしてタンパク質発現は、‘ｔｅｔ−オフ’トランスアクチベーターを発現するアデノウイルス（Ａｄ／ｔｒａｎｓ）との共感染により導かれる。組換えウイルスは、ＰＣＲによりスクリーニングし、そしてタンパク質発現は、ｃ−ＫｉｔのＮ末端に対して向けられるウサギポリクローナル抗体（Ｈ−３００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて感染細胞ライセートのウェスタン免疫ブロットにより確かめた。ＫＳＨＶの非存在下でのＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔの過剰発現のために、野生型ｃ−Ｋｉｔを発現するアデノウイルス（ｃ−Ｋｉｔ／ＷＴ）を同様に構築した。全ての組換えアデノウイルスをプラーク精製し、ウイルスストックを増殖させ、そして２９３細胞上で滴定した。ＤＭＶＥＣ感染には、単層を１：１０〜１：１００の感染多重度（ＭＯＩ）のｃ−Ｋｉｔ／ＷＴもしくはｃ−Ｋｉｔ／ＤＮ及びＭＯＩ １：１０のＡｄ／ｔｒａｎｓと３７℃で４時間インキュベーションした。最適ＭＯＩ用量は前もって決定した。ウイルスストックは、２％ヒト血清及びポリブレン（４μｇ／ｍｌ）を含有する培地において希釈した。アデノウイルス感染の感染効率及び非特異的作用のコントロールとして、グリーン蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ／ＧＦＰ）を二重反復単層に感染させた。それぞれ１：１００及び１：１０のＭＯＩのＡｄ／ＧＦＰ及びＡｄ／ｔｒａｎｓでの感染は、最小の細胞変性効果で培養における細胞の＞８０％の感染を与えた。
トランスフォーメーションアッセイ
トランスフォームした表現型を促進するために、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣを３５ｍｍ Ｐｒｉｍａｒｉａ培養皿において合流後（ｐｏｓｔ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）培養した。これらの条件下で、細胞は顕著な紡錘形態をとり、無秩序な増殖パターンを示し、そして単層内に多層フォーカスを生じた。同様の条件下で培養した感染していないＤＭＶＥＣは増殖阻止を示し、そして整った細胞境界を有する丸石表現型を維持した。合流後の細胞は、上記のようにアデノウイルス構築物を感染させるか、もしくは増加する用量（０．０１、０．１、１及び１０μＭ）のＳＴＩ５７１にさらした。ＳＴＩ５７１は、凍結ストックから新しく調製した希釈物を用いて４８〜３６時間ごとに補充した。細胞を表現型変化の徴候に関して位相差顕微鏡を用いて毎日調べ、そして結果を写真撮影により記録した。
試薬
２−フェニルアミノピリミジン誘導体ＳＴＩ５７１は、Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ  Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ博士（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって開発され、そして寛大に提供された。ＳＴＩ５７１のストック溶液は、５ｍｇのＳＴＩ５７１を１ｍｌのＰＢＳに溶解することにより１０ｍｍｏｌ／Ｌで調製し、そして即時に使用するかもしくは−２０℃で保存した。使用溶液は、使用直前にＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ＳＦＭにおいて希釈した。
【００９３】
ＰＤＴＣ（ピロリジンジチオカルバメート）、トランス−レチノイン酸及びＳＢ２０３５８０は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）及びＣＧＲＰ−８−３７ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍから購入した。ＩｎＣＥＬＬｅｃｔ  ＡＫＡＰ  Ｓｔ−Ｈｔ３１及びＳｔ−Ｈｔ３１−コントロールペプチドは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ハロペリドール及びホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｔ２２は、Ａｍｅｒｉａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。ガンシクロビル、ＢＱ７８８は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から購入した。１５−デオキシ（１２−１４）プロスタグランジンＪ２は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した。
ＲＴ ＰＣＲ
ＫＳＨＶ遺伝子ＯＲＦ６４及びＫ１２（カポシン（ｋａｐｏｓｉｎ））を以前に記述されているように（４３）逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）鋳型として用いた。ＯＲＦ６５配列は、プライマー５’−ＧＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＧＡ（配列番号：５）及び５’−ＡＡＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号：６）で増幅した。ｃＤＮＡ合成のコントロールとして細胞性遺伝子（ＨＰＲＴ、ＧＡＰＤＨもしくは−アクチン）を各サンプルから増幅した。ＰＣＲ産物は、アガロース−臭化エチジウムゲル上での電気泳動後に視覚化した。
ＫＳＨＶを感染させた細胞における広域ＲＮＡ変化
我々は以前に、皮膚微小血管内皮細胞（ＤＭＶＥＣ）のＫＳＨＶ感染に基づくインビトロモデルを記述しており、ここで、ウイルスで攻撃した細胞の大部分は潜伏ウイルスを保有し、そして４０％までの細胞は、増殖複製を受けるように化学的に誘導することができる（４３）。この系における潜伏ウイルスを保有する細胞の高いパーセンテージ及び増殖複製の誘導の高効率のために、感染細胞のさらなる濃縮なしに組織培養細胞からＲＮＡを直接単離することが可能であった。３種の感染した及び２種の感染していないＤＭＶＥＣ系統からのＲＮＡサンプルを、誘導していない細胞並びにＰＭＡで６及び４８時間誘導した細胞から調製した。感染していない細胞及び感染した細胞のＲＮＡをそれぞれｃｙ−３で蛍光的に標識したｃＤＮＡに転化し、そして全部で４４２８個のＰＣＲフラグメントを展示するＤＮＡチップにハイブリダイズさせた。各チップは、２組のＰＣＲフラグメントを含有し、そしてチップ内並びにチップ間変動の両方を制御するためにハイブリダイゼーションを二重反復で行った。２つの独立したハイブリダイゼーションの比較を図１ｃに示す。チップ〜チップシグナル間の変動は、シグナルの９９．９％に対して１．８倍未満であった。従って、１．８より大きい比率は、有意であるとみなした。相加平均を計算するために、同じクローンで得られる全てのハイブリダイゼーションシグナルを用いた。個々のクローンは、１時点当たり３回の実験うち少なくとも２回において１．８倍より大きく誘導されることが見出され、一方、他のクローンは、分析した３時点の少なくとも一つで１．８倍より大きく（比率＜０．５５）抑制された。全てのクローンの比率を表２に示す。いくつかのクローンが同じ遺伝子に相当する場合、全ての個々のクローンの結果を示す。これらの場合において認められるシグナル比率の変動は、ハイブリダイゼーションシグナルが同じ遺伝子の異なるセグメントに対して異なり得るという事実によって引き起こされる。
血管新生に関与する遺伝子
ＫＳＨＶに感染した細胞において誘導される遺伝子の中には、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのいくつかのメンバーがあった（表２）。ＭＭＰは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を分解させる。様々なタイプのＭＭＰ並びにＥＣＭ分解プロテアーゼがアップレギュレーションされた。従って、本発明はまた、内皮細胞トランスフォーメーション、トランスフォームした内皮細胞の侵襲性、並びに新生血管形成の調節のための方法及び組成物も包含する。
【００９４】
データはさらに、ＫＳＨＶが、内皮細胞の増殖を調節する因子の遺伝子発現パターンを調節することを示す。ＫＳＨＶによるプロ−血管新生因子の誘導は、感染していない細胞より増殖優位性を与えることができ、これは、ＫＳＨＶに感染した内皮細胞のパーセンテージがＫＳの進行中に増加する結果（２０）を説明するかもしれない。従って、本発明はまた、内皮細胞増殖を増やすこともしくは減らすことを包含する、内皮細胞増殖の調節のための方法及び組成物にも関する。
インターフェロンにより誘導される遺伝子
ＫＳＨＶに感染した細胞において強く誘導される遺伝子の別の群は、インターフェロンにより誘導されることが既知である（表２）。
炎症
いくつかの前炎症性サイトカイン及びいくつかの前炎症性遺伝子は、ＫＳＨＶによりアップレギュレーションされた（表２）。潜伏期と比較して感染の溶菌期の間のこれらの前炎症性及び化学誘引物質サイトカインの強い誘導は、ＫＳＨＶに感染した細胞が、ＫＳ腫瘍への単球及び白血球の誘引において主要な役割を果たすことを示唆する。
分化マーカー
ＫＳＨＶは、いくつかの既知の分化マーカー並びに細胞分化における既知の機能を有する遺伝子の発現パターンを調節した（表２）。最も顕著には、ｃ−ｋｉｔは、内皮細胞におけるその通常の発現レベルを超えて増加した。ＫＳＨＶにより調節される分化マーカーは、骨髄ストロマ細胞に由来する異なる間充織系統に相応する。脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞は多能性間充織幹細胞に由来し（５４）、一方、ＥＣ及び造血細胞は共通の前駆細胞、血管芽細胞から分化する（１８）。これらの様々な系統に対応する分化マーカーの発現は、ＫＳＨＶが、感染した内皮細胞の脱分化を誘導することを示す。
ＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔの発現は、ＫＳＨＶ感染によりアップレギュレーションされる。
【００９５】
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣのＤＮＡマイクロアレイ分析において最も一貫してアップレギュレーションされる遺伝子の一つは、ｃ−Ｋｉｔ遺伝子であった（表２）。マイクロアレイ結果と一致して、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥ上のｃ−Ｋｉｔ ｍＲＮＡ及び表面タンパク質の増大した発現が、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ（図１Ａ）及び免疫蛍光染色（図１Ｂ）により示された。過去の研究により、臍静脈及び大動脈からの内皮細胞は、ｃ−Ｋｉｔ及びＳＣＦリガンドを共発現することが示されている（１００，１０１，１０２，１０３）。ＤＭＶＥＣがｃ−Ｋｉｔに加えてＳＣＦを発現するどうかを決定するために、ＳＣＦ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＳＣＦ ｍＲＮＡは、ＫＳＨＶに感染した及び感染していないＤＭＶＥＣの両方において容易に検出され、これらの細胞における受容体及びリガンドの共発現を示したが、ＳＣＦ発現レベルにおけるウイルスにより誘導されるいかなる変化も認められなかった（図２Ａ）。選択的ＲＮＡスプライシングのために、ＳＣＦタンパク質は膜結合型及び可溶性型の両方で存在する（１０４）。図２Ａに示す小さい方のＰＣＲ産物は、該タンパク質の膜結合型を表し、ＤＭＶＥＣにおける可溶性に対する膜結合型ＳＣＦの比率もまたＫＳＨＶ感染により影響を受けないことを示唆する。膜結合型及び可溶性ＳＣＦ転写産物間を直接区別するためのアイソフォーム特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ（１０５）は、この結論を裏付けた。ＲＴ−ＰＣＲ結果と一致して、ＳＣＦの分泌を測定するためのＳＣＦ特異的ＥＬＩＳＡを用いるＤＭＶＥＣ培養上清の分析は、ＫＳＨＶ感染と関連するタンパク質レベルにおけるいかなる有意な変化も示さなかった（図２Ｂ）。従って、ＫＳＨＶ感染が、ｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦにより調節されるシグナリング経路を改変する場合、ウイルス感染の寄与は、おそらくｃ−Ｋｉｔ発現のレベルにおいてである。
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔ発現は、外因性ＳＣＦに応答する増殖を促進する。
【００９６】
ＫＳＨＶにより誘導されるｃ−Ｋｉｔのアップレギュレーションが機能性結果を有するかどうかを調べるために、外因性ＳＣＦに対するＤＭＶＥＣの細胞分裂誘起応答がＫＳＨＶ感染後に高められるかどうかを試験した。擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣを組換えＳＣＦの非存在下及び存在下で増殖因子枯渇培地において培養し、そして増殖をＸＴＴに基づく色素還元アッセイ（１１２）を用いて測定した。擬似感染及びＫＳＨＶ感染したＤＭＶＥＣは両方とも、５０〜１００ｎｇ／ｍｌで最大である外因性ＳＣＦに応答する用量依存性増殖を示した。しかしながら、感染したＤＭＶＥＣは、擬似感染したＤＭＶＥＣより外因性リガンドに対して有意に大きく応答した（図３Ａ）。擬似感染した培養物において、組換えＳＣＦの非存在下での基礎増殖を超える増加は決して４０％より大きくなく、一方、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの増殖は８５％ほども増加した。ＫＳ疾患中に、隣接する内皮細胞によりもしくはＫＳ病巣に浸潤するマクロファージ及びマスト細胞により生産されるＳＣＦに応答するＫＳＨＶ感染内皮細胞の増大した能力は、ウイルス感染細胞のより迅速な増殖を促進する。
ｃ−ＫｉｔチロシンキナーゼインヒビターＳＴＩ５７１は、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの増殖を阻止する。
【００９７】
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの増大した増殖応答におけるｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦの役割を確かめるために、外因性ＳＣＦに応答する感染したＤＭＶＥＣの増殖をｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性のインヒビター（９９）、２−フェニルアミノピリミジン誘導体、ＳＴＩ５７１（正式にはＣＧＰ ５７１４８Ｂとして知られている）（１０６，９７）の増加する濃度の存在下で測定した。図３Ｂにおいて例示するように、外因性ＳＣＦに対するＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの増殖応答は、１μＭ用量のＳＴＩ５７１により完全に阻止された。トリパンブルー排除によるＤＭＶＥＣ生存能力の試験により、増殖阻止はＳＴＩ５７１の非特異的細胞毒性のためではないことが示された。さらに、ＳＴＩ５７１は、外因性ＩＬ−２に応答して増殖するヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞系の能力にいかなる影響ももたなかった。ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣ増殖を阻止するＳＴＩ５７１の能力は、ＫＳＨＶに感染した細胞の増殖応答におけるｃ−Ｋｉｔシグナリングの役割を裏付け、そしてさらにＫＳ治療の新規な戦略を示唆する。
ＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔの発現は、形態学的トランスフォーメーションの誘導のために十分である。
【００９８】
増殖シグナリングループの誘導は、腫瘍細胞系における異常なｃ−Ｋｉｔ／ＳＣＦ活性の最も一般に記述されている結果であるが、増大したｃ−Ｋｉｔ発現はまた、細胞形態における変化及びトランスフォームした表現型の獲得とも直接関連している。例えば、マウス繊維芽細胞におけるｃ−Ｋｉｔの異所性発現は、形態変化、軟寒天における増殖及びヌードマウスにおける腫瘍形成を誘導する（１０７，１０８，１０９）。我々は以前に、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣが、紡錘形態並びに無秩序な増殖、フォーカス形成及び半固体寒天における足場非依存性増殖を包含するトランスフォーメーションの特徴を生じることを示した（４３）。ｃ−Ｋｉｔアップレギュレーションは、ＫＳＨＶ感染により引き起こされる形態変化を誘導するために十分であるかどうかを決定するために、ｃ−ＫｉｔをあらゆるＫＳＨＶ遺伝子の非存在下で正常なＤＭＶＥＣにおいて過剰発現させた。ｃ−Ｋｉｔ過剰発現は、ｃ−Ｋｉｔ遺伝子発現の誘導に必要なトランスアクチベーターを発現するアデノウイルス（Ａｄ／ｔｒａｎｓ）と一緒に野生型ｃ−Ｋｉｔタンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＷＴ）をＤＭＶＥＣに感染させることにより実施した。アデノウイルス感染の感染効率及び非特異的作用を確認するために、並行ＤＭＶＥＣ培養物にグリーン蛍光タンパク質を発現するアデノウイルス（Ａｄ／ＧＦＰ）及びＡｄ／ｔｒａｎを感染させた。ＧＦＰは、蛍光顕微鏡検査により視覚化した場合に、ＤＭＶＥＣの大部分（＞８０％）において高レベルで発現された。匹敵する感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄ／ｃ−ＫｉｔＷＴを感染させたＤＭＶＥＣの免疫蛍光染色は、約５０％の細胞上でｃ−Ｋｉｔタンパク質の強い表面発現を示した。図４Ａにおいて例示するように、ｃ−Ｋｉｔ過剰発現は、ＫＳＨＶ感染後に認められるものと同一であるＤＭＶＥＣ形態に対する用量依存性結果を有した。Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＷｔに感染した細胞は、単層の過剰増殖及び別個の細胞境界の喪失を有して、紡錘状で且つ無秩序になった。紡錘形成は、細胞表面上で高レベルのｃ−Ｋｉｔタンパク質を発現する細胞に限られた（図４Ｂ）。形態変化は、感染後（ＰＩ）５日で最初に認められ、そしてＰＩ １０日までに顕著であった。Ａｄ／ＧＦＰを感染させたＤＭＶＥＣは表現型変化なしに３週までの間維持されたので、これらの変化は、ｃ−Ｋｉｔを過剰発現するアデノウイルス感染培養物に特異的であった。Ａｄ／ＧＦＰもしくはＡｄ／ｃ−ＫｉｔＷＴに感染したＤＭＶＥＣへの外因性ＳＣＦの添加は形態変化を誘導もしくは助長せず、そしてアデノウイルス感染は、ＤＭＶＥＣによるＳＣＦ生産を改変しなかった。これらの結果は、ＤＭＶＥＣにより生産される内因性ＳＣＦが、形態学的トランスフォーメーションを引き起こす経路を活性化するために十分であることを示す。重要なことには、これらの研究は、ＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔの増加した発現が、ＤＭＶＥＣのＫＳＨＶ感染後に認められるものに匹敵する形態変化を誘導するために十分であることを示す。
ｃ−Ｋｉｔ活性の阻害は、ＫＳＨＶにより誘導されるトランスフォーメーションを打ち消す。
【００９９】
ＫＳＨＶによるｃ−Ｋｉｔの誘導が、ウイルスにより誘導されるトランスフォーメーションに必要かどうかを直接試験するために、ＫＳＨＶによりトランスフォームしたＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔシグナリングを阻害することの結果を評価した。図５Ａにおいて例示するように、ＫＳＨＶによりトランスフォームしたＤＭＶＥＣは、単層培養において無秩序な増殖、接触阻止の喪失及びフォーカス形成を示す。しかしながら、内因性ｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性を阻害するためのＳＴＩ５７１でのＤＭＶＥＣの処理の後、フォーカス形成は阻止され、そして別個の細胞縁を有する整った単層が再建された。ＳＴＩ５７１の影響は用量依存性であり、そして１μＭの薬剤濃度で完全であった。ＳＴＩ５７１の除去は、１０μＭ用量に細胞をさらした後でさえ、トランスフォームした表現型の再生を引き起こしたので、トランスフォームした増殖特性の喪失は、薬剤により誘発される細胞毒性のためではなかった。感染していないＤＭＶＥＣは、合流の状態で維持した場合に整った丸石表現型を有する正常な増殖を示し、そしてＳＴＩ５７１にさらすことにより、細胞形態もしくは生存能力にいかなる影響もなかった。
【０１００】
ＳＴＩ５７１はＡｂｌ及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）β受容体チロシンキナーゼに対しても有効であるので（１０６，９８）、ＤＭＶＥＣにおける阻害活性は、ＫＳＨＶにより誘導されるトランスフォーメーションにおけるこれらの受容体のいずれかの役割を含む可能性がある。ＤＭＶＥＣのＤＮＡマイクロアレイ分析は、ＫＳＨＶにより誘導されるＡｂｌ、ＰＤＧＦもしくはＰＤＧＦ受容体遺伝子のいかなるアップレギュレーションも示さず、ｃ−Ｋｉｔが主要な薬剤標的であることを示唆した。しかしながら、ＫＳＨＶにより誘導されるＤＭＶＥＣトランスフォーメーションにおけるｃ−Ｋｉｔの中心的役割を確かめるために、ＫＳＨＶによりトランスフォームしたＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔシグナリングを特異的に阻害する相補的方法を考案した。この方法では、ｃ−Ｋｉｔシグナリングに必要な細胞質ＡＴＰ結合及びホスホトランスフェラーゼドメインを欠くドミナントネガティブｃ−Ｋｉｔタンパク質（Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＤＮ）を上記に略述するアデノウイルス送達系を用いてＫＳＨＶ感染細胞において発現させた。Ａｄ／ＧＦＰのみを感染させたコントロール培養物では、トランスフォームした表現型のいかなる変化も認められなかった。それに反して、ＫＨＳＶによりトランスフォームしたＤＭＶＥＣにおけるドミナントネガティブｃ−Ｋｉｔタンパク質の発現は、トランスフォームしたフォーカスの劇的な喪失をもたらし、細胞は、ＳＴＩ５７１処理後に認められるものと同じように平らになりそして整うようになった（図５Ｂ）。ＫＳＨＶに誘導される形態学的トランスフォーメーションをｃ−Ｋｉｔ活性の特異的阻害によって打ち消すことができることは、ＫＳＨＶにより誘導される内皮細胞のトランスフォーメーションにおけるｃ−Ｋｉｔシグナリングの重要な役割を示し、そしてＫＳ腫瘍形成における因子としてのｃ−Ｋｉｔのアップレギュレーションの役割を裏付ける。
増殖複製中に誘導される宿主遺伝子産物の機能
ウイルス感染による細胞経路の誘導もしくは抑制は、細胞防御機構、ウイルス遺伝子産物のいくつかによる宿主遺伝子発現の選択的調節、もしくは中立傍観者効果（ｎｅｕｔｒａｌ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）のいずれかである。これらの可能性を区別する一つの方法は、既定の細胞経路の阻害もしくは活性化がウイルス複製に影響を及ぼすかどうかを調べることによる。
【０１０１】
増殖複製中に特に誘導される宿主遺伝子は、処置していない及びＰＭＡで処置した感染していない細胞と一緒に対応する誘導していないＫＳＨＶ感染細胞と６時間もしくは４８時間誘導したＫＳＨＶ感染細胞（１７）間のハイブリダイゼーション強度を比較することにより同定した。コントロールのいずれかにおいて得られる最大ハイブリダイゼーションシグナルを少なくとも２倍超えるハイブリダイゼーションシグナルを示す遺伝子をさらなる分析のために選択した。これらの規準を満たした２３個の遺伝子を表１に示す。ＫＳＨＶ感染細胞のＰＭＡ誘導の６及び４８時間後にアップレギュレーションされる遺伝子は、様々な化合物により標的とされる。直接標的は、化合物により標的とされる遺伝子であり、間接標的は、標的とされる遺伝子と異なる場合にチップ上でアップレギュレーションされる遺伝子である。
【０１０２】
ウイルス複製のためのこれらの遺伝子の重要性を評価するために、我々は、特定の宿主遺伝子の誘導もしくは遺伝子産物の機能のいずれかを調節することが既知である化合物を選択した。大部分の遺伝子に対して、特異的アンタゴニストを同定することが可能であった。誘導後６時間で誘導されるいくつかの遺伝子は、前炎症性刺激により誘導されることが既知である。周知の例は、Ａ２０、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ−１及びｃｏｘ−２である。しかしながら、ｊａｇｇｅｄ１、ＭＭＰ−１０もしくはアンジオポエチン−２のようなこの群の他の遺伝子はまた、炎症性シグナルにより誘導されることも示されている。ＮＦκＢの活性化はこの転写応答にとって必須であるので、ＮＦκＢ活性化のインヒビター（６１）、１−ピロリジンカルボジチオン酸（ＰＤＴＣ）が、増殖複製中にＫＳＨＶ遺伝子の発現を調節するかどうかを分析した。６時間で誘導される他の遺伝子の中には、プリンヌクレオシドのそれらのそれぞれのプリン塩基及び対応するペントース−１−リン酸への加リン酸分解を可逆的に触媒するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）があった。ＰＮＰ活性は、８−アミノグアノシンにより阻害することができる（５８）。４種のＧタンパク質共役受容体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体（ＣＧＲＰ−１）、ラットＰＤＣ１のヒト相同物、エンドセリンＢ受容体及びケモカイン受容体（及びＨＩＶ−共受容体）ＣＸＣＲ４もまた、増殖サイクル中に特に誘導された。ＲＤＣ１及びＣＧＲＰ−１は両方とも、そのリガンドの欠失バージョン、カルシトニン遺伝子関連ペプチドで阻害することができる（５９，６０）。エンドセリンＢ受容体へのエンドセリン結合は、アンタゴニストペプチドＢＱ７８８により阻止することができる（６１）。同様に、ＣＸＣＲ４へのストロマ細胞由来因子−１結合、並びにＨＩＶ融合は、ペプチドＴ２２により阻害することができる。ＰＤＧＦによりもたらされるＭＣＰ−１の誘導は、トランス−レチノイン酸で阻害することができる（５３）。シグナル伝達に関与するいくつかの遺伝子が増殖感染中に誘導された。Ｈｓｐ２７は、ｐ３８ＭＡＰＫにより活性化されるストレス経路の一部であり、そしてＭＡＰＫによりもたらされるＨｓｐ２７のリン酸化は、ＳＢ２０３５８０により阻害することができる。グラビン（Ｇｒａｖｉｎ）は、プロテインキナーゼＡの細胞内局在化を招くアンカリングタンパク質のファミリーに属する（６３）。グラビンとＰＫＡ間の相互作用は、インビトロ及び細胞の両方においてＡＫＡＰ−フラグメントペプチドＨｔ３１で阻害することができる（６４，６５）。Ｉ型シグマ受容体活性化は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体からのシグナリングを増大し（６６）、そしてその活性化は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体により調節することができる（６７）。Ｉ型シグマ受容体は、抗精神病薬ハロペリドールにより中和される。
【０１０３】
細胞を阻害化合物もしくはペプチドで１時間処理し、そして増殖複製を４８時間のＰＭＡ処理により誘導した。ＫＳＨＶ複製及び後期遺伝子発現の阻害のコントロール化合物としてガンシクロビルを用いた（１０）。４８時間後に、細胞を採取し、そして潜伏遺伝子Ｋ１２並びに後期遺伝子ＯＲＦ６５の発現をＲＴ−ＰＣＲにより分析した。コントロールには、細胞性遺伝子α−アクチンもしくはＨＰＲＴの発現をモニターした。予想されるように、ガンシクロビルは、潜伏遺伝子発現を妨げなかったが、ＯＲＦ６５転写を阻害した（図７）。それに反して、大部分の他のインヒビターは、ＫＳＨＶ潜伏もしくは後期遺伝子発現のいずれも妨げなかった。しかしながら、Ｈｔ３１及びハロペリドールは両方とも後期遺伝子発現を阻害したが、潜伏遺伝子発現を阻害しなかった。両方のインヒビターは潜在的にＰＫＣシグナリングを妨げるので、Ｈｔ３１もしくはハロペリドールが、ＰＭＡによりもたらされる前初期遺伝子の誘導を阻害するかどうかを調べた。しかしながら、いずれの化合物も前初期遺伝子Ｋ３の誘導を妨げなかった。さらに、ペプチドＨｔ−３１は、Ａキナーゼアンカリングタンパク質（ＡＫＡＰｓ）とＰＫＡ間の会合を阻害する（２１，６４）。２５μＭのＨｔ−３１は、Ｋ１２ ＲＮＡのレベルに影響を与えずにＯＲＦ６５発現を阻害した（図７Ｂ、レーン６）。従って、Ｉ型シグマ受容体及びＡＫＡＰにより調節されるシグナル伝達経路は、ＫＳＨＶの増殖進行に必要とされると結論を下す。
【０１０４】
ＰＫＡ−ＡＫＡＰ相互作用及びＩ型シグマ受容体は、ＯＲＦ６５発現に必要とされる。ＡＫＡＰグラビン（ＡＫＡＰ２５０）は、重症筋無力症を患っている患者における自己抗原として最初に同定された（２５）。グラビンは、ベータ−２アドレナリン受容体からのシグナリングに関与することができ（６４）、そしてＰＫＡとＰＫＣ経路間のクロストークをもたらすことができる（４７）。グラビンが感染細胞においてアップレギュレーションされたことを確証するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図７Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、グラビンが感染細胞において過剰発現されることを裏付け、最高レベルの発現は、誘導後６及び４８時間で認められた（図７Ａ）。
【０１０５】
同定されるグラビンの特異的インヒビターはないが、しかしながら、ヒト甲状腺ＡＫＡＰのＰＫＡ Ｒ−ＩＩ結合ドメインから得られるＨｔ−３１ペプチドは、インビボ及びインビトロにおいてＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用を阻害する（２１，６４）。このペプチドのステアレート化（ｓｔｅａｒａｔｅｄ）バージョンは膜透過性であり、そして組織培養においてＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用を阻止することができる。ＰＫＡシグナリングの必要条件は、グラビンのアップレギュレーションから推論することができ、そしてＫＳＨＶ後期遺伝子発現のためのＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用の必要条件をさらに調べるために、感染した及び感染していない細胞を２つの濃度のステアレート化Ｈｔ−３１で処理した（図７Ｂ）。２５μＭ及び５μＭ濃度の両方で、Ｈｔ−３１は、ＯＲＦ６５発現を感染していない細胞において認められるものより低いレベルまで効率よく抑制した（図４Ｂ、レーン２−３を１と比較せよ）。ＰＫＡと相互作用することができないステアレート化コントロールペプチド、Ｈｔ−３１Ｐは、後期遺伝子発現に対する影響がなかった（図７Ｂ、レーン４−５）。これらの結果は、異なる株の感染細胞を用いて再現可能に得られた。これらのデータは、ＰＫＡシグナリングがＯＲＦ６５遺伝子の発現に必要とされることを示す。Ｈｔ−３１は広範囲のＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用を阻害するので、Ｈｔ−３１の阻害作用がグラビンもしくはいずれかの他のＡＫＡＰを通して起こるかどうか結論を下すことはできない。
【０１０６】
Ｉ型シグマ受容体は、多種多様な細胞タイプにおいて発現され（３１）、そして細胞内カルシウム濃度の調節に関与することができる。Ｉ型シグマ受容体が感染細胞においてアップレギュレーションされたことを確証するために、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した（図７Ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、シグマ受容体が、潜伏的に感染した細胞では低レベルで発現され、そして増殖複製中に有意に誘導されることを裏付けた（図７Ｃ）。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、チップから得られるデータと異なり、Ｉ型シグマ受容体が誘導後６時間ですでに有意に誘導されることを示唆する（図４Ｃ、レーン２）。これは、実験条件間のある種の変動もしくは感染細胞の異なる株間の変動を反映する可能性がある。しかしながら、データは、シグマ受容体が溶菌期中に有意にアップレギュレーションされることを裏付ける。
【０１０７】
Ｉ型シグマ受容体は、抗精神病薬ハロペロドールにより中和される（６６）。後期遺伝子発現のためのシグマ受容体機能の必要条件を調べるために、細胞をＰＭＡ添加の前に１時間５μＭのハロペリドールで処理した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ハロペリドールは潜伏Ｋ１２遺伝子の発現に影響を与えないが、ＯＲＦ６５発現は有意に減少することが示された（図７Ｄ、レーン５）。後期遺伝子発現の阻害は、ガンシクロビルよりハロペリドールでいっそう完全であった（図７Ｄ、レーン５−６）。それに反して、プリンヌクレオチドホスホリラーゼインヒビター、８−アミノグアノシン（８−ＡＭＧ）は、ウイルス遺伝子発現に対していかなる影響もなかった（図７Ｄ、レーン４）。これらのデータは、異なる株の感染細胞を用いて再現され、従って、Ｉ型シグマ受容体がＯＲＦ６５発現に必要とされることを裏付けた。我々の結果は、ＤＮＡマイクロアレイ分析が、後期遺伝子発現に必要とされる細胞性因子を同定するために使用でき、従って、抗ウイルス研究の新規な手段であることを示す。
【０１０８】
実施例２
ｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーを利用するアンチセンス治療は、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣにおいてｃ−ｋｉｔタンパク質発現を阻害しそしてトランスフォームした表現型の発生を妨げる。
【０１０９】
ＤＭＶＥＣにおけるＫＳＨＶにより誘導されるｃ−ｋｉｔ発現と関連する表現型変化を改善するアンチセンス治療の能力を調べるために、タンパク質翻訳を阻止するためのｃ−ｋｉｔの開始コドンを標的とするホスホロジアミデートアンチセンス（ＰＭＯ−ＡＳ）オリゴマーを考案した。ＰＭＯ−ＡＳオリゴマーは、立体障害により翻訳を妨げると考えられ、そしてＲＮアーゼＨを活性化しないという利点を有する。オリゴマーのエンドサイトーシス取り込み及びサイトゾルへの送達を促進するために、ＰＭＯ−ＡＳと陰イオン複合体を形成するエトキシル化ポリエチレンイミン（ＥＰＥＩ）を送達試薬として用いた。蛍光顕微鏡検査による取り込み効率のモニタリングを可能にするためにＦＩＴＣ成分をオリゴマーに導入した。
【０１１０】
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣ上での初期滴定実験を一続きの異なるオリゴマー／ＥＰＥＩ容量で行った。３５ｍｍ皿当たり２．５μｌのＥＰＥＩ試薬と１．２５ｎＭｏｌのオリゴマーを加えることは、ＥＰＥＩにより誘導される非特異的な毒性なしに効率のよいアンチセンスの取り込みを与えた。ｃ−ｋｉｔオリゴマーがｃ−Ｋｉｔをダウンレギュレーションすることにおいて有効であることを確かめるために、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣに抗−ｃ−ｋｉｔオリゴマー−ＥＰＥＩ複合体を加え、そしてオリゴマーの取り込みを可能にするために無血清培地において３７℃で３時間インキュベーションした。コントロールとして、ＤＭＶＥＣ培養物をＥＰＥＩ試薬と滅菌水もしくは滅菌水のみで処理するか、もしくは関係のないＦＩＴＣ標識オリゴマーを含有するオリゴマー／ＥＰＥＩ複合体を加えた。オリゴマー−ＥＰＥＩ溶液の除去の際に、細胞単層を無血清培地においてすすぎ、完全培地を与え、そしてオリゴマーの取り込み及び安定性を評価するために毎日調べた。強い細胞質蛍光が添加後１日までに認められ、そして１０日までにわたって十分に維持された。添加後４日で、細胞を固定し、そしてｃ−ｋｉｔ発現レベルを評価するためにｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体及びヤギ−抗−マウス−Ａｌｅｘａコンジュゲートで染色した。ｃ−ｋｉｔ発現は、コントロールオリゴマーもしくは送達試薬のみで処理した細胞において強かったが、ｃ−ｋｉｔオリゴマーで処理した培養物は、有意に減少したｃ−ｋｉｔレベルを示した。重要なことには、ｃ−ｋｉｔオリゴマーを取り込まなかったところどころの個々の細胞（ＦＩＴＣ−陰性）は、依然として強いｃ−ｋｉｔ発現を示し、そして一貫してごくわずかのｃ−ｋｉｔ発現を示すオリゴマーを取り込んだ細胞（ＦＩＴＣ−陽性）に隣接して認めることができた。この結果の代表的な例を図８Ａにおいて示し、そしてそれはアンチセンス活性が、認められたｃ−ｋｉｔ発現の減少を直接招くことを強く示唆する。
【０１１１】
次に、アンチセンス治療は、ｃ−ｋｉｔ過剰発現が重要な役割を果たすことが示されたＫＳＨＶにより誘導されるトランスフォーメーションを防ぐことにおいて有効であるかどうかを確かめた。これらの実験のために、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣを３５ｍｍ皿において合流まで増殖させ、上記のようにアンチセンスを加え、そしてフォーカス形成を与えるために合流後状態で維持した。試験的実験により、前もって形成したフォーカスを有する細胞はＥＰＥＩ毒性に異常に感受性であることが示されたので、この方法は、すでにフォーカスを形成した細胞の添加より好ましかった。我々の以前の実験から予想されるように、合流後のＫＳＨＶ感染ＤＭＶＥＣは接触阻止の喪失を示し、そして添加後６日までに非常に明白である無秩序な多層フォーカスを形成した（図８Ｂ）。しかしながら、それに反して、１．２５ｎＭｏｌの抗−ｃ−ｋｉｔオリゴマー及び２．５μｌのＥＰＥＩを加えた細胞はフォーカスを発生せず、静止性の接触阻止された単層を維持した（図８Ｃ）。２．５μｌのＥＰＥＩのみと培養した細胞は、処理していない細胞と同様のフォーカス形成を示した（図８Ｄ）。擬似感染したＫＳＨＶ単層は、合流の状態で静止性になり、そしてアンチセンス処理にかかわらずフォーカスを形成せず、また、処理に関連するいかなる毒性も認められなかった。我々の以前の実験は、ＤＭＶＥＣトランスフォーメーションにおけるｃ−ｋｉｔ過剰発現の直接的役割を示している。ｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーで処理した培養物がトランスフォームした表現型を発生できないことは、ｃ−ｋｉｔ機能を阻害することにおけるアンチセンスの効果的な役割を強く示唆する。
【０１１２】
表１
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表２
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色コード：
３つ全てにおいて１．８倍より多く０時間で減少した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く０時間で減少した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く６時間で増加した。
３つ全てにおいて１．８倍より多く０時間で増加した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く０時間で増加した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く６時間で減少した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く４８時間で増加した。
３つ全てにおいて１．８倍より多く４８時間で減少した。
３つのうち２つにおいて１．８倍より多く４８時間で減少した。
３つ全てにおいて１．８倍より多く６時間で増加した。
３つ全てにおいて１．８倍より多く６時間で増加した。
３つ全てにおいて１．８倍より多く４８時間で増加した。
〜−擬似及び感染サンプルの平均強度＜８０
表の説明文：示すのは、ＫＳＨＶに感染した内皮細胞及び感染していない内皮細胞間の比率である。各時点で試験した３つの感染細胞培養物のうち少なくとも２つにおいて１．８倍（アップもしくはダウン）より大きく変化した転写産物のみ。〜は、感染した及び感染していない細胞サンプルの両方が８０未満の平均強度を有したことを示し、従って、両方のサンプルにおける弱いシグナルを示す。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
【表５】
2004520007.tif 000015
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
【表８】
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【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
【表１２】
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【０１２５】
【表１３】
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【０１２６】
【表１４】
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【０１２７】
【表１５】
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【０１２８】
【表１６】
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【０１２９】
【表１７】
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【０１３０】
【表１８】
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【０１３１】
【表１９】
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【０１３２】
【表２０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
パネルＡ、Ｂ及びＣ：ＫＳＨＶ感染後のＤＭＶＥＣ上のｃ−Ｋｉｔ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の誘導
Ａ）擬似感染（Ｍｏｃｋ）及びＫＳＨＶ感染（ＫＳＨＶ）したＤＭＶＥＣから調製した逆転写した全ＲＮＡを用いるｃ−Ｋｉｔ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ｃ−Ｋｉｔの２４２ｂｐフラグメントを増幅するように設計したプライマーを用いて行った。ＨＰＲＴのＲＴ−ＰＣＲを各サンプルのコントロールとして行った。増幅産物は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色により視覚化した。
Ｂ）ＫＳＨＶに感染した（ＫＳＨＶ）ＤＭＶＥＣの表面上のｃ−Ｋｉｔタンパク質のアップレギュレーションを示す免疫蛍光顕微鏡検査。擬似感染した細胞（Ｍｏｃｋ）の表面上では低レベルの構成的ｃ−Ｋｉｔ発現が検出された。
Ｃ）ヒト遺伝子発現のマイクロアレイ分析の再現性。感染していない細胞から単離したＲＮＡの２つの独立したマイクロアレイハイブリダイゼーション間の相関関係を示す散布図分析。各実験の蛍光強度を示す。
【図２】
パネルＡ及びＢ：ＳＣＦのＤＭＶＥＣ生産はＫＳＨＶ感染により影響を受けない。
Ａ）擬似感染（Ｍｏｃｋ）及びＫＳＨＶ感染（ＫＳＨＶ）したＤＭＶＥＣから調製した逆転写した全ＲＮＡを用いるＳＣＦ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＳＣＦの２７４ｂｐフラグメントを増幅するように設計したプライマーを用いて行った。ＨＰＲＴのＲＴ−ＰＣＲを各サンプルのコントロールとして行った。増幅産物は、アガロースゲルの臭化エチジウム染色により視覚化した。
Ｂ）擬似感染したＤＭＶＥＣ（開いた棒）及びＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの２つの異なる系統（線影をつけた及び中身の詰まった棒）により２４及び４８時間馴化した上清中の可溶性ＳＣＦ（ｐｇ／ｍｌ）。ＳＣＦレベルは、ＥＬＩＳＡにより定量した。三重反復サンプルからの結果（±ＳＤ）を示す。
【図３】
パネルＡ及びＢ：ＤＭＶＥＣのＳＣＦ依存性増殖はＫＳＨＶ感染により高められる。
Ａ）外因性ＳＣＦに対する擬似感染（開いた四角）及びＫＳＨＶに感染（詰まった四角）したＤＭＶＥＣの増殖応答。増殖は、ＸＴＴに基づくアッセイを用いて測定した（方法を参照）。三重反復ウェルからの結果（±ＳＤ）を外因性ＳＣＦの非存在下で測定した基礎増殖を超える増加パーセンテージとして表す。３回の独立した実験の１つからの代表的結果を示す。
Ｂ）ｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性のインヒビター（ＳＴＩ５７１）は、ＳＣＦ依存性ＤＭＶＥＣ増殖を阻止する。ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣを、増加する用量のＳＴＩ５７１の存在下で且つ外因性ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（詰まった丸）もしくは非存在下（開いた丸）で培養した。ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣの増殖は、上記のようにＸＴＴに基づくアッセイで測定したが、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と同時に加えた。三重反復ウェルからの結果（±ＳＤ）をＳＣＦ及びＳＴＩ５７１の非存在下で測定した基礎増殖（１００％として表す）のパーセンテージとして表す。３回の独立した実験の１つからの代表的結果を示す。
【図４】
パネルＡ及びＢ：正常なＤＭＶＥＣにおけるｃ−Ｋｉｔの異所性発現は形態変化を誘導する。
Ａ）ｃ−Ｋｉｔを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＷＴ）を１０もしくは１００のＭＯＩで感染させた後の正常なＤＭＶＥＣにおける紡錘形態及び無秩序な増殖の用量依存的発生を例示する光学顕微鏡検査。１００のＭＯＩでＡｄ／ＧＦＰ（Ａｄ／ＧＦＰ）を感染させたＤＭＶＥＣは、正常な丸石形態を維持した。
Ｂ）Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＷＴを感染させた後に紡錘形態を生じたＤＭＶＥＣ上に特にｃ−Ｋｉｔタンパク質の強い発現を示す免疫蛍光顕微鏡検査。
【図５】
パネルＡ及びＢ：ｃ−Ｋｉｔチロシンキナーゼ活性の阻害は、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣのトランスフォームした表現型を取り消す。
Ａ）無秩序な増殖及びフォーカス形成を示すＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣを未処理のままにしておく（コントロール）か、もしくはＳＴＩ５７１（０．１及び１μＭ）で５日間処理した。ＳＴＩ５７１により引き起こされるフォーカス喪失及び単層再構築が認められ、ニコン光学顕微鏡で記録した。
Ｂ）無秩序な増殖及びフォーカス形成を示すＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣを未処理のままにしておく（０）か、もしくはドミナントネガティブｃ−Ｋｉｔタンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ／ｃ−ＫｉｔＤＮ）を１０もしくは１００のＭＯＩで５日間感染させ、そしてフォーカス形成の阻止を上記のように記録した。薬理学的及びドミナントネガティブタンパク質阻害プロトコルの両方について、３回の独立した実験の１つからの結果を示す。撮影した視野は、処理した細胞の全単層に相応した。
【図６】
ＫＳＨＶ後期遺伝子発現の阻害
ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣをホルボールエステルで誘導し、そしてＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲの前に４８時間示す化合物で処理した。化合物の濃度は５μＭであった。Ｋ１２（潜伏遺伝子）もしくはＯＲＦ６５（増殖遺伝子）、細胞性遺伝子ＨＰＲＴもしくはベータ−アクチンに特異的なプライマーをＲＴ ＰＣＲに使用した。
【図７】
パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ：ＡＫＡＰ／ＰＫＡ相互作用及びＩ型シグマ受容体は後期遺伝子発現に必要とされる。
Ａ）感染していない及びＫＳＨＶに感染した内皮細胞におけるグラビン発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。細胞を示す時間にわたってＰＭＡで処理した；
Ｂ）示す濃度のＡＫＡＰ／ＰＫＡ阻害ペプチドＨｔ−３１もしくはコントロールペプチドＨｔ−３１Ｐでの処置後のＯＲＦ６５遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析；
Ｃ）感染していない細胞及びＫＳＨＶに感染した細胞におけるＩ型シグマ受容体発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。細胞を示す時間にわたってＰＭＡで処理した。細胞性ＧＡＰＤＨ遺伝子をｃＤＮＡ合成のコントロールとして増幅した；
Ｄ）様々な阻害化合物での処理後の潜伏（Ｋ１２）もしくは後期（ＯＲＦ６５）遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。最終薬剤濃度は以下のとおりであった：５μＭ ハロペリドール、１０μＭ ８−アミノグアノシン及び２５μＭ ガンシクロビル。細胞性ＨＰＲＴ遺伝子をｃＤＮＡ合成のコントロールとして増幅した。
【図８】
パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ：ｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーは、ＫＳＨＶに感染したＤＭＶＥＣにおいてｃ−ｋｉｔタンパク質発現を阻害しそしてトランスフォームした表現型の発生を防ぐ。
Ａ）アンチセンス−陰性（ＦＩＴＣ陰性）細胞の、ヤギ抗−マウスＡｌｅｘａ ５９４二次抗体の結合により視覚化した（赤色）、強いｃ−Ｋｉｔ発現に対して、ＦＩＴＣ標識したｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーを取り込んでいる細胞（緑色）におけるｃ−ｋｉｔ発現の阻害を示すＫＳＨＶ感染ＤＭＶＥＣ単層上で行った免疫蛍光顕微鏡検査；
Ｂ）合流後に培養したＫＳＨＶ感染ＤＭＶＥＣにおけるフォーカス形成；
Ｃ）合流状態でｃ−ｋｉｔアンチセンスオリゴマーで処理したＫＳＨＶ感染ＤＭＶＥＣにおけるフォーカス形成の阻止；
Ｄ）合流状態でＥＰＥＩ送達試薬にさらしたコントロールＫＳＨＶ感染ＤＭＶＥＣにおけるフォーカス形成。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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