(57)【要約】本発明は、正に荷電した表面へのオリゴヌクレオチドの吸着結合に基づいてDNAハイブリダイゼーション装置を作製するための簡便な方法に関する。そのような吸着されたオリゴヌクレオチドプローブは密に詰まった単層を形成し、この単層は溶液状態の核酸ターゲット鎖との塩基対特異的ハイブリダイゼーションを行なって二重鎖を形成するための容積を保持している。しかしながら、鎖解離速度論とDNアーゼの消化速度の両方から、溶液状態の核酸はそのような吸着オリゴヌクレオチドと結合して高度に非対称の巻かれてない二重鎖（ワトソン・クリックDNA二重らせんについて知られている構造と大きく異なる構造細部を有する）を形成することが示唆される。この新規な核酸二重鎖形態は、新しい種類のハイブリダイゼーション装置およびその使用方法の基礎として役立ちうる。また、本明細書に記載の非らせん状二重鎖の独特な構造的特徴を有する染料標識と酵素の相互作用に基づく新しい核酸二重鎖検出法を開発することができることも開示される。本発明の好ましい実施としては、DNAマイクロアレイ、ビーズに基づく核酸分析、核酸ハイブリダイゼーションを検出するマイクロエレクトロニクス装置、および実験室分析のより伝統的な方法、例えば、膜やその他の固相支持体上でのハイブリダイゼーションが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面とそこに吸着された第１の核酸とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、該表面が正電荷基で実質的に飽和されており、該第１の核酸がリンカーをもたず、該表面に非共有結合で付着している、上記ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記電荷基の密度が、中心から中心まで5Åあたり約1個の電荷基である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記電荷基が均一に分布している、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記核酸が約1〜約100個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
前記核酸が約12〜約60個のヌクレオチドを含む、請求項４に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項６】
前記核酸がDNAである、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項７】
前記核酸がRNAである、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
前記核酸が一本鎖である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記核酸が二本鎖である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１１】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項８に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１２】
前記核酸が単層を形成している、請求項８に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記装置が１以上の追加の表面をさらに含んでなり、追加の各表面が正電荷基で実質的に飽和されている、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
追加の各表面が非共有結合により付着された追加の核酸で実質的に飽和されている、請求項13に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１５】
追加の各核酸の配列が前記第１の核酸と同一である、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１６】
追加の各核酸の配列が前記第１の核酸と同一でない、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１７】
前記表面がマイクロアレイフォーマットからなる、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１８】
前記装置が支持体をさらに含んでなる、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１９】
前記支持体がセラミック材料、二酸化ケイ素材料、および金属からなる群より選択される材料で構成されている、請求項18に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２０】
前記装置の形状がスライドガラスおよびビーズからなる群より選択される、請求項18に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２１】
表面とそこに吸着された第１の核酸とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、該表面が官能基で実質的に飽和されており、該第１の核酸がリンカーをもたず、該表面に非共有結合で付着している、上記装置。
【請求項２２】
非共有結合による付着が、前記官能基と前記核酸との間の静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、ロンドン相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組合せからなる、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２３】
前記表面が前記官能基で実質的に飽和されている、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２４】
前記表面が親水性である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２５】
前記表面が疎水性である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２６】
前記表面が有機物質を含む、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２７】
前記有機物質がアミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、炭化水素、およびイソプレノイドからなる群より選択される、請求項26に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２８】
前記表面が無機物質を含む、請求項20に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２９】
前記装置が支持体をさらに含んでなる、請求項20に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３０】
前記支持体がセラミック材料、二酸化ケイ素材料、および金属からなる群より選択される材料で構成されている、請求項29に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３１】
前記装置がビーズまたはスライドガラスである、請求項29に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３２】
前記核酸が約1〜約100個のヌクレオチドを含む、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３３】
前記核酸が約12〜約60個のヌクレオチドを含む、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３４】
前記核酸がDNAである、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３５】
前記核酸がRNAである、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３６】
前記核酸が一本鎖である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３７】
前記核酸が二本鎖である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３８】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３９】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項36に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４０】
前記核酸が単層を形成している、請求項36に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４１】
表面とそこに吸着された核酸プローブとを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置の製造方法であって、
該表面に、飽和量の核酸プローブを、該表面への該プローブの非共有結合吸着を可能にする条件下で接触させることを含んでなり、
その際、前記表面は該核酸と該表面との非共有結合による相互作用を媒介する官能基で実質的に飽和されていることを特徴とする、上記方法。
【請求項４２】
前記官能基が陽イオン電荷基である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記官能基が両性イオン電荷基である、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸が一本鎖である、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸がDNAである、請求項41に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸がRNAである、請求項41に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が前記核酸プローブを溶液状態で前記表面に沈着させることを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触が前記表面への前記核酸プローブの蒸着を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４９】
基体を共有結合により改変して前記表面を加工することで前記表面を形成させることをさらに含んでなる、請求項41に記載の方法。
【請求項５０】
前記共有結合による改変がアミノシラン化である、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記基体がスライドガラスである、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
前記表面をキャッピングすることをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項５３】
前記キャッピングがキャッピング物質を蒸着することを含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記キャッピングが界面活性剤を付着させることを含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
溶液状態のターゲット核酸をプローブ核酸にハイブリダイズさせる方法であって、
表面とそこに吸着された核酸プローブとを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置に、少なくとも１つの溶液状態のターゲット核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でさらし、プローブ-ターゲットハイブリッドを形成させることを含んでなる、上記方法。
【請求項５６】
前記官能基が陽イオン電荷基である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記官能基が両性イオン電荷基である、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸が一本鎖である、請求項55に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸がDNAである、請求項55に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸がRNAである、請求項55に記載の方法。
【請求項６１】
ヌクレオチド結合性タンパク質が結合するヌクレオチド配列を同定する方法であって、
表面と核酸プローブ-ターゲット二重鎖とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置に、ヌクレオチド結合性タンパク質を、結合を可能にする条件下で接触させ、
形成された二重鎖-タンパク質複合体を該表面から溶出し、
溶出された二重鎖の少なくとも一方の鎖を配列決定する、
ことを含んでなり、
その際、該核酸プローブは該表面に非共有結合により付着しており、該ターゲット核酸が該核酸プローブにハイブリダイズしていることを特徴とする、上記方法。
【請求項６２】
前記溶出が、二重鎖-タンパク質複合体を有する少なくとも１つの表面を塩溶液と接触させることを含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
塩溶液が約1M〜約5M NaClの水溶液のイオン強度を有する、請求項62に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正電荷表面へのオリゴヌクレオチドの吸着に基づいたDNAハイブリダイゼーション装置の簡便な作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重らせんは、水溶液中での相補的核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの結果として形成されることが知られている。この二重らせんでは、各核酸鎖の負に荷電したリン酸基が二重らせんの外側にらせん状に分布しており、陽イオン性基との相互作用に利用されている。現在、陽イオンをコーティングした固相支持体はバイオテクノロジーの分野で広く使用されており、特にマイクロアレイ上の表面結合型プローブとしてcDNAおよびオリゴヌクレオチドを共有結合させる場合がそうである。これらの陽イオン性表面はリン酸部分を介して静電的に核酸骨格と結合することができる。100ヌクレオチドより小さいオリゴヌクレオチドは、そのような支持体上でのハイブリダイゼーションに全長遺伝子よりも良く適合する。
【０００３】
マイクロアレイ技術は応用ゲノミクスに大変革をもたらした (Cheung VGら, 1999, Nature Genetics 21:15-19; Duggan DJ ら, 1999, Nature Genetics 21:10-14)。これは、相補的核酸鎖同士の混合相反応によりワトソン・クリック二重らせんを形成させるために、溶液状態の核酸を表面結合核酸にハイブリダイズさせることに基づくものである。生じる二重らせんの二次構造は、一部には、ホスホジエステル骨格のコンフォメーションおよび糖パッカーに課される拘束と共に、塩基対合と塩基スタッキングにより決定される。こうした相互作用は、局部的な塩基対合と、さらには二重らせんのピッチをも規定するように作用する。溶液状態では、二重らせんの平均ピッチは10塩基対に近いが、構造研究により、ピッチ角には高度のばらつきと柔軟性があることが明らかにされている。例えば、平坦な非らせん状のリボン様構造は、極端な機械的拡張作用の条件下で（Leger JFら, 1999, Phys. Rev. Lett. 83: 1066-1069; Bensimon Dら, 1995, Phys. Rev. Lett. 74: 4754-4757; Smith SBら, 1996, Science 271: 795-799; Lebrun Aら, 1996, Nucl. Acids Res. 24: 2260-2267; およびMarko JF, Feig MおよびPettitt BM, J. Phys. Chem., 提出済み(個人的情報)）またはインターカレーターの破壊的結合の際に（Gao Oら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2422-2426）形成されうるという、モデリングに基づいた予測が存在する。
【０００４】
核酸は表面上に共有結合または非共有結合で固定化することができる。核酸を共有結合させるためのいくつかの手段が当技術分野で公知である。例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜への核酸のノーザンおよびサザンブロッティング後に通常実施されるように、オリゴヌクレオチドを化学的または光化学的架橋により表面に共有結合させることが可能である。共有結合はまた、オリゴヌクレオチドの一端または両端に化学的リンカーを付加させた予備合成オリゴヌクレオチドを使用しても可能である。BradleyおよびCaiによる米国特許第6,048,695号は、表面上の反応成分との共有結合を作ることを目的として、オリゴヌクレオチドにリンカーを付加させる方法を開示している。例えば、米国特許第6,048,695号およびそこに含まれる文献を参照されたい。こうして、オリゴヌクレオチドプローブの結合は、プローブと表面との直接的な吸着相互作用によるのではなく、リンカーを介して表面で起こる。
【０００５】
核酸を表面に共有結合させるためのさらに別の手段は、フォトリソグラフィーによるものである。Goldbergらによる米国特許第5,959,098号は、表面を誘導体化して光保護された官能基を提供する方法を開示している。核酸を表面で直接合成するにあたり、表面領域を選択的に照射して保護基を除去する。その後、脱保護された領域を、光保護官能基を有するヌクレオチドモノマーの共有結合に利用する。これらの工程を繰り返すと、表面に共有結合で連結されたオリゴヌクレオチドが得られる。アレイ作製のさらなる例としては、CarenおよびLuebkeによる米国特許第6,221,653号（核酸ビルディングブロックのインクジェットプリンティング）ならびに米国特許第6,024,925号（質量分析計での分析用にサンプルアレイを作製するためのマイクロフルイディクスロボット）が挙げられる。
【０００６】
核酸を非共有結合で固定化するための方法には、一般的に橋かけ剤(bridging agent)が必要である。ある場合に、その橋かけ剤は塩またはデタージェントである。例えば、NikiforovおよびKnappによる米国特許第5,610,287号は、ガラスまたは親水性ポリスチレン固相支持体に核酸と陽イオン性橋かけ剤（塩化ナトリウムまたはデタージェント）の組合せを接触させることを含む、非共有結合固定化法を開示している。例えば、'287特許のアブストラクトを参照されたい。この付着方法は、オリゴヌクレオチドと表面との直接的吸着相互作用ではなく、デタージェント凝集剤と表面との相互作用に基づくものである。
【０００７】
あるいはまた、橋かけ剤はアビジンとビオチンまたはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体といった高親和性の相互作用対であってもよい。例えば、ビオチン化核酸はストレプトアビジンをコーティングした表面に固定化することができる。例えば、Belosludtsev Yら, 2001, Biochem Biophys Res Commun. 282:1263-1267; Holmstromら, 1993, Anal. Biochem. 209(2):278-283を参照されたい。この方法では、表面にコーティングしたアビジンまたはアビジンに類似した基との結合を作ることを目的として、オリゴヌクレオチドにビオチン修飾リンカーを付加する。付着は、プローブと表面との直接的吸着相互作用によるのではなく、ビオチン修飾リンカーを介して表面で起こる。
【０００８】
長い一本鎖または二本鎖DNA分子を膜表面に吸着で非共有結合固定化する方法は、「サザン」または「ノーザン」ブロットと呼ばれる装置の基礎となっている。ブロッティング技術分野では、一般的なプラクティスとして、プローブの長さが約100塩基より小さい場合、ハイブリダイゼーション装置を形成させるのに十分に安定なプローブ付着を支持するには、公知の吸着結合法は弱すぎることが知られている。したがって、ブロッティング用途向けに短い核酸プローブを付着させるための標準方法は、固相支持体への核酸の共有結合架橋（例えば、光化学架橋）または他の非吸着結合手段（例えば、化学架橋）を必要とした。膜支持体への短い核酸の吸着による非共有結合固定化の強度を高めるための公知方法では、DNAがハイブリダイゼーション装置に適合しなくなることが分かっており、それゆえ、短い核酸プローブを必要とする従来のブロッティング法はすべてが共有結合での固定化手段を使用するものである。多孔性ビーズや関連した小粒子状の多孔性基体をはじめとするその他のタイプの多孔性材料は、膜と同じように挙動することが知られており、すなわち、長いDNAプローブは吸着相互作用により付着させることができるが、短いプローブは非吸着手段により結合させなければならない。
【０００９】
長い一本鎖または二本鎖DNA分子を非膜状表面、特に平らな基体（スライドガラスとも呼ばれる）に吸着させて非共有結合固定化することは、公知方法により行なうことができ、DNAマイクロアレイの作製に使用される。吸着プローブ相互作用はDNAマイクロアレイの作製および使用の基礎となり、マイクロアレイを形成させるには、長い（100塩基より多い）核酸プローブを平らな表面にスポットする。マイクロアレイ作製分野の一般的プラクティスとして、長い核酸プローブはポリカチオンコーティング表面（通常はポリリシン）との吸着によって表面に結合させうることが知られている。しかし、短い核酸（100塩基未満）をマイクロアレイ表面に結合させようとする場合、マイクロアレイをベースとしたハイブリダイゼーション装置を形成させるのに十分に安定したプローブを提供するには、マイクロアレイの公知の吸着結合法は弱すぎることが知られている。したがって、マイクロアレイ用途向けにオリゴヌクレオチドプローブ（100塩基未満）を結合させるための標準方法は、マイクロアレイ支持体への核酸の共有結合（一般的には、オリゴヌクレオチド末端(3’または5’)の固相支持体への共有結合）または他の非吸着相互作用手段を必要とした。マイクロアレイ支持体への短い核酸の吸着による非共有結合固定化の強度を高めるための公知方法は、DNAをこうした用途に適さなくすることが分かっている。それは、オリゴヌクレオチドが二重鎖を形成する能力を失うことによるのか、あるいはマイクロアレイへの非特異的ターゲット結合のレベルが不当に高くなることによるのかもしれない。
【００１０】
オリゴヌクレオチド（長さが100塩基より短い一本鎖の核酸(DNA、RNA)）は、ハイブリダイゼーション装置の基礎として固相支持体に結合させるためのプローブとして適している。しかしながら、ハイブリダイゼーションに使用可能なプローブを生成させるように、吸着によりオリゴヌクレオチドを固相支持体に直接結合させる方法は、現在のところ一切知られていない。
【００１１】
実際、文献は、オリゴヌクレオチドの直接吸着がうまくいくとは期待できない、ことを示している。例えば、Lindsayは、原子力顕微鏡による構造解析のために、長さが約100塩基を超えるDNAを雲母にアミノプロピルトリエトキシシランを用いて結合させる方法では、結果的に、in situでのプロセス研究にはDNAがあまりに強く結合しすぎる、と述べている。Lindsay SM, The Scanning Probe Microscope in Biologyを参照されたい（草稿はhttp://green.la.asu.edu/review/chap_7(3-5).htmから入手可能）。
【００１２】
炭化水素をコーティングしたシリカ表面に吸着させたオリゴヌクレオチドに関する最近の研究からは、オリゴヌクレオチド（＜100塩基）の吸着は必然的に塩基対特異的ハイブリダイゼーションを妨げ、従ってその製品はハイブリダイゼーション装置として使い物にならない、と結論づけられた。Wirth MJ, http://www.udel.edu/chem/wirth/oligos.html (「表面上のサイトへのどのような特異的吸着もハイブリダイゼーションプロセスを妨害する。実際、表面はオリゴヌクレオチドの塩基と水素結合する基をもつ傾向がある。そのような基体への水素結合は、オリゴヌクレオチドの検出感度を低下させるバックグラウンドノイズをもたらす。」)を参照されたい。
【００１３】
さらに、BradleyおよびCaiは、DNAハイブリダイゼーション装置を作製するための吸着法は、ガラス表面上の静電電荷ゆえに装置の性能品質に悪影響を及ぼす、と述べている。米国特許第6,048,695号の第1欄第46行〜第2欄第8行を参照されたい。
【００１４】
こうして、いくつかの文献における論証は、オリゴヌクレオチドプローブの固相支持体への直接吸着に基づいたハイブリダイゼーション装置が実現可能でない、と断言している。本発明者らの知るかぎりでは、文献に記載されたまたは市販されている、そのようなオリゴヌクレオチド吸着に基づくハイブリダイゼーション装置の証拠または考察は皆無である。あらゆる公知のオリゴヌクレオチドに基づくハイブリダイゼーション装置（マイクロアレイ、膜、ビーズ支持体、および支持体へのプローブ結合を含む他の全ての形状）は、上述した結合方法の一つに基づくものである。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、表面へのオリゴヌクレオチドの共有結合ではなく吸着結合に基づいてDNAハイブリダイゼーション装置を作製するための簡便な方法に関する。そのような吸着されたオリゴヌクレオチドプローブは密に詰まった単層を形成し、この単層は溶液状態の核酸ターゲット鎖との塩基対特異的ハイブリダイゼーションを行なって二重鎖を形成する能力を保持している。しかしながら、鎖解離速度論とDNアーゼの消化速度の両方から、ターゲット核酸はそのような吸着オリゴヌクレオチドと結合して高度に非対称の巻かれてない二重鎖を形成していることが、示唆される。こうして、非らせん状の核酸二重鎖は荷電表面上の好ましい構造異性体でありうる。
【００１６】
新規な二重鎖を形成させるための方法は、現在行なわれている方法に比べて、約1/10の作製コストで実施に移すことができるという点で、即実用的であることがわかる。ハイブリダイゼーションシグナルは表面結合プローブの濃密なパッキングのために高いことが見出され、また、選択性はワトソン・クリック二重らせん形成に基づいたハイブリダイゼーションについてすでに知られている限界であるかまたはそれに近いと考えられる。
【００１７】
本発明はさらに、溶液状態の核酸アナライトを検出するための装置、すなわち、装置の表面に吸着により結合された核酸プローブを含む装置に関する。表面への吸着結合の後、結合された核酸（装置の表面上に存在）は溶液状態の核酸ターゲットと結合することができる。かかる結合は蛍光、光学、放射線または電位差分析などの標準方法で検出することができる。
【００１８】
本発明は、固相支持体へのオリゴヌクレオチドプローブの直接物理的吸着に基づいたマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション装置の実施例を提供する。この装置は、表面に永久陽イオン電荷のフィルムと、その表面に直接吸着された、リンカーをもたない未改変のオリゴヌクレオチドと、を含んでなる。オリゴヌクレオチドを表面に結合させる力としては、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用、およびこれらの組合せが挙げられる。本発明の装置は表面とオリゴヌクレオチドの間にどのような介在性生体分子または橋かけ用生体分子も必要としない。
【００１９】
本発明の装置の表面は疎水性であっても親水性であってもよい。親水性の装置表面は、荷電していない（極性）、負に荷電した、または正に荷電した表面でありうる。核酸プローブが表面に結合される吸着力は、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組合せからなる群より選択することができる。
【００２０】
本発明のある実施形態においては、装置の表面は滑らかかつ平坦である（ガラス、プラスチック、金属またはセラミック）。基体表面がリン酸バックボーンとの直接結合に係わることができない場合には、その基体に適切な表面フィルムをコーティングして、所望の吸着結合ができるようにする。本発明の他の実施形態では、基体は滑らかかつ平坦でなくてもよく、例えば、適切な基体材料（ガラス、プラスチック、金属またはセラミック）から作られたビーズ、または織布もしくは紙でありうる。
【００２１】
本発明のある実施形態において、装置の表面は多孔質で、平坦であっても平坦でなくてもよい。細孔は、ポリマーの網状構造、セラミック細孔の網状構造として装置表面に導入したり、あるいは、滑らかなガラス、プラスチック、金属またはセラミック表面のエッチングにより導入することができる。
【００２２】
本発明のある実施形態において、装置の表面はマイクロアレイである。本発明のある実施形態において、装置の表面はマイクロビーズである。本発明のある実施形態では、装置の表面が電極である。本発明のある実施形態では、装置の表面が集積回路である。
【００２３】
本発明のある実施形態においては、装置の表面が小分子アナライトの検出およびスクリーニングに使用されるが、それは、プローブ-ターゲット二重鎖と結合する小分子アナライトの親和性に基づいている。これを行なうには、(i) 装置表面に吸着によって結合された核酸プローブを含んでなる装置を作製し、(ii) 該装置をターゲット核酸に、二重鎖の形成を可能にする条件下でさらし、(iii) 該装置を小分子アナライトの溶液にさらし、(iv) 該アナライトが二重鎖と結合する親和性に基づいて、１以上のアナライトを検出および／または回収する。
【００２４】
本発明はまた、そのようなスクリーニングで発見された小分子アナライト、ならびにそれらの使用に関する。例えば、二重鎖と結合する小分子は、(i) 本発明の装置での二重鎖形成の光学的検出のために、または薬剤として使用することができる。
【００２５】
本発明の基礎となる、新規な表面結合形態の二重鎖は、ほどけて長く延びた高エネルギー遷移状態（通常のワトソン・クリック二重らせんへのDNA特異的化合物の結合によって誘発される）に似ている構造を有する。本発明の装置を用いて、ほどけた二重鎖遷移状態と高親和性でもって結合する化合物をスクリーニングすることができる。その後、これらの化合物は医薬開発のためのリード化合物として、または本発明の核酸二重鎖の形成を検出するために用いるプローブ分子として使用することができる。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の核酸二重鎖と特異的に結合する小分子の使用に基づいて、装置表面上の二重鎖形成を検出する方法に関する。本発明の核酸二重鎖は標準的な核酸二重らせんと大きく異なった構造上の特徴を備えている。すなわち、それは非常にほどけていて、隣接した塩基対が大きく離れている。したがって、二重らせん形態の核酸との結合能を有する化合物は、本発明の核酸二重鎖に対する結合親和性について異なった親和性を示す可能性がある。特に、標準的な二重らせん形態の核酸に挿入（インターカレート）することができる染料およびハプテンは、二重らせんの場合よりも高い親和性で本発明のほどけて長く延びた二重鎖と結合する可能性がある。そのような化合物を使用して、ハイブリダイゼーション分析中に副反応として溶液中に形成されうる標準的な二重らせんから、表面結合型二重鎖を区別することができるだろう。
【００２７】
本発明はまた、表面への核酸の吸着が、一級アミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、グアニジニウム基、アミジニウム基、イミダゾリウム基、非荷電有機H結合供与体（アルデヒド、アルコール、ホルムアミドなど）、非荷電無機H結合供与体（SiO2、TiO2、AlO2など）、またはこれらの組合せをコーティングした表面へのリン酸結合を介したものである、上記方法ならびに装置に関する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書に提示した結果の一部は、米国仮出願第60/304,500号 (Lemeshko SVら, 2001, Nucleic Acids Research 29(14):3051-3058)の出願日後に発表されたものである。前記出願の開示内容はそのまま参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
本発明において、「吸着させる」、「吸着」およびその文法的に等価な用語は、表面と生体分子との非共有結合相互作用を意味する。本発明の好ましい実施形態において、生体分子は核酸である。本発明の他の実施形態では、生体分子が１以上のアミノ酸、脂質、および／または炭水化物であってもよく、それを含むものであってもよい。相互作用は静電的吸引、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および／または疎水性相互作用に基づくものでありうる。目下好ましい実施形態では、相互作用が、少なくとも部分的に、リン酸バックグラウンドと陽イオン性官能基を有する表面との静電的吸引に基づいている。
【００３０】
本発明において「官能基」とは、化合物の特徴的な反応に関与する原子（群）を意味する。例えば、アルコールの官能基は-OHであり、アルデヒドの官能基は-CHOであり、カルボン酸の官能基は-COOHである。所定の官能基はあらゆる分子（官能基がその分子の一部である）においてほぼ同様にふるまう。１つの分子が複数の官能基をもっていてもよい。本発明の官能基は表面と核酸との間の非共有結合相互作用を媒介する。
【００３１】
本発明において「プローブ」とは、表面に吸着される核酸（典型的には、一本鎖）を意味する。本発明のプローブは約1ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さのものであってよく、好ましくは約12ヌクレオチドから約60ヌクレオチドまでである。吸着されたプローブ構造のモデルは、限定するものではないが、非らせん状構造であって、実質的に全てのバックボーンリン酸基が表面に接触するものである。
【００３２】
本発明において「ターゲット」とは、溶液状態にある核酸、またはプローブ分子にハイブリダイズされる核酸のいずれかをさす。本発明のターゲットは一本鎖でも二本鎖でもよく、DNA、RNAまたはその両方を含んでいてよい。本発明のある実施形態において、ターゲットは約1ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さのものであってよく、好ましくは約12ヌクレオチドから約60ヌクレオチドまでである。本発明のいくつか実施形態において、ターゲットは約100ヌクレオチドから全長cDNAまたはmRNAまでの長さであってよく、マウスまたはヒトのものが好ましい。ハイブリダイズしたプローブ-ターゲット構造のモデルは、限定するものではないが、ゼロに近いらせんピッチ角を有する非らせん状の二重鎖であって、10ヌクレオチドごとに少なくとも約9個が塩基対合している。
【００３３】
本発明において「基体」とは、本発明の表面をもともと備えている材料をさす。また、それは本発明の表面をもたらすように改変され得る材料をも意味する。基体はガラス、セラミック、金属、有機材料、無機材料、またはこれらの組合せであってよい。基体の形状はスライド、ビーズ、または当技術分野で公知のどのような他の形態であってもよい。
【００３４】
本発明において「表面」とは、周囲の媒体による直接接触が可能で、静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、ロンドン相互作用、疎水性相互作用またはこれらの組合せにより核酸の吸着を支持しうる官能基を有する、共有結合で連続した幾何学的ドメインまたは幾何学的ドメインの一領域をさす。本発明のある実施形態では、生体分子の吸着を支持するために両性イオン表面を用いることができる。本発明の表面は基体上に加工されても、その基体の固有の性質であってもよい。表面加工の例としては、限定するものではないが、ガラス基体のアミノシラン化があり、この場合には陽イオン官能基が基体に共有結合で結合される。いくつかの実施形態において、本発明の装置は各スポットが上述した表面からなるマイクロアレイである。
【００３５】
本発明は、溶液状態のターゲット核酸を検出するための装置および方法を提供する。本発明の装置は表面と該表面に吸着されている核酸とから構成される。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、吸着表面は核酸結合を媒介する官能基、例えば、極性基、非電荷基、電荷基、疎水性基およびこれらの組合せに関して均一かつ濃密である。これらの実施形態によれば、官能基の均一性および密度はきわめて重要な特性である。ある実施形態において、官能基は陽イオンであり、その密度は、中心から中心までで、5Åあたり約1個の基である。本発明のいくつかの実施形態では、所望の官能基を共有結合で基体に結合させて表面を形成させる。いくつかの好ましい実施形態では、官能基を蒸着によって基体に結合させる。限定するものではないが、従来の溶液浸漬法に対する好適な官能基蒸着法の比較例を実施例13および図8に示す。
【００３６】
いくつかの好ましい実施形態では、吸着表面をオリゴヌクレオチドで飽和させて単層を形成させることによりプローブ保持を最大にする。これは、必要とされる量の約2倍多いプローブを表面に適用することによって達成しうる。非限定的な仮定上の例において、飽和に必要なプローブの量が5μMであるとタイトレーション曲線（例えば、図１に示すもの）が示す場合には、10μMのプローブ濃度を用いる。
【００３７】
いくつかの好ましい実施形態においては、プローブの吸着後に残留表面電荷をキャップすることが不可欠である。本発明では、当技術分野で公知のどのようなキャッピング手段を使用してもよい。ある実施形態では、化学的キャッピングを使用しうる。他の実施形態では、界面活性剤（例えば、SDS）によってキャッピングを行なってもよい。
【００３８】
本発明はさらに、表面に核酸を吸着させるための方法に関し、この方法は、表面に飽和量の核酸を、吸着を可能にする条件下で接触させ、その後、残留核酸結合部位をキャップすることを含んでなり、ただし、該表面は吸着を支持する均一に分布している官能基を有する。いくつかの実施形態において、この方法は所望の官能基で表面を共有結合的に改変することをさらに含む。
【００３９】
本発明はまた、新規な組成物、すなわち、安定した新形態の核酸二重鎖に関する。本明細書に示すデータは、一本鎖DNAを正に荷電したアミノシラン化ガラス表面に強固に結合させて、密に充填された核酸単層を形成しうることを示唆している。そのような吸着プローブがその逆平行ワトソン・クリック相補鎖に配列選択的にハイブリダイズすると、A、BまたはZ二重らせんのような既知のらせん状DNA構造とは合致しがたいようにみえる、明確に非対称の性質を有する二重鎖が形成される。本出願を通して、「二重鎖」という用語は、特に断らない限り、らせんピッチ角がゼロに近い値に低下することを特徴とするこの形態の核酸を意味する。この新形態は、長さが10塩基より大きいDNAまたはRNA一本鎖「プローブ」のリン酸バックボーンを表面に吸着結合させ、続いてコグネイトRNAまたはDNA鎖「ターゲット」をワトソン・クリック塩基対合（A-T、C-G）させて、表面に結合された、巻かれてないプローブ-ターゲット二重鎖を形成することにより作られる。
【００４０】
本明細書に示した単純な混合相ハイブリダイゼーション実験では予測されないことであったが、巻かれてないリボン様二重鎖が他の比較的極端な状況において一過性に存在することが提案されたことに注目することは、興味深いことである。例えば、X線結晶学により明らかにされたジテルカリニウム(ditercalinium)のようなインターカレーターが結合したときに形成されるDNA複合体(Gao Oら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2422-2426)は、らせん巻きをほぼ完全に喪失している。同様に、巻かれてない著しく延びた二重らせんが、ストレッチングにより誘発された機械的応力への応答として溶液状態で形成されることが提案されている (Leger JFら, 1999, Phys. Rev. Lett. 83:1066-1069; Bensimon Dら, 1995, Phys. Rev. Lett. 74:4754-4757; Smith SBら, 1996, Science 271:795-799; Lebrun Aら, 1996, Nucl. Acids Res. 24:2260-2267)。
【００４１】
逆平行二重らせんにおいては、塩基スタッキングとらせん状ねじれとが機械的に結びついていることはよく知られている。以前に発表された研究では、化学的な力（塩基平面間への複素環の挿入）または二重鎖への機械的歪（ストレッチング）のいずれかが、塩基対の分離の増加と、その結果としてのらせん状ねじれの減少に関連している。
【００４２】
本明細書に記載した実験データは塩基対の分離を直接測定したものではない。しかし、モデリング研究から以前に予測されたように、これらの発明者らは、B-ヘリックスに対して二重鎖の長さが50％以上増加していない、吸着された線状のリボン様二重鎖を生成することは難しいと気づいていた（図3B）。こうして、本明細書に記載の研究から推論されたリボン様二重鎖が、ストレッチングのため塩基スタッキングの著しい減少を必然的に招いたと考えることは興味深いことである。二重鎖形成のエネルギー論が、主として、塩基スタッキング相互作用とリン酸間の静電反発により決定されることは周知である (Dickerson RE, 1992, Methods Enzymol. 211:67-111; McConnell KJら, 2000, J. Mol. Biol. 304:803-820)。
【００４３】
本発明の方法および装置は、従来の方法および装置と比べていくつかの利点をもたらす。例えば、本発明の方法および装置はリンカーによる核酸の誘導体化を必要とせず、そのために、かかる工程に関係した非効率およびコストを排除することができる。既存の方法の起こりうる非効率として、リンカーによる核酸の不完全な誘導体化、一部のヌクレオチド配列と他のものとを比べたときの偏りのある誘導体化、表面へのリンカーの不完全な結合、追加の製造工程の必要性などが挙げられる。共有結合による付着方法と比べたときのさらなる利点は、プローブ-表面結合の可逆性である。いくつかの実施形態において、本発明は、ヌクレオチド結合性タンパク質（例えば、転写因子）が結合するヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、この方法は、表面に結合したプローブ-ターゲット二重鎖を有するマイクロアレイに、ヌクレオチド結合性タンパク質を、少なくとも1つの二重鎖と該タンパク質との結合を可能にする条件下で接触させ、二重鎖-タンパク質複合体を表面から溶出し（例えば、濃厚な塩溶液を用いる）、該二重鎖の少なくとも1つの鎖の配列決定を行なう、ことを含んでなる。
【００４４】
実施例に示した知見は、平面への二重鎖吸着の直接的および間接的結果ゆえに、リボン様二重鎖形成の構造とエネルギー論のいずれもが希薄な水溶液中で知られているものと相違している、ことを示唆する。そのような構造上およびエネルギー上の差異の実際的応用は重要である：
新規な二重鎖は遷移状態を模倣する。二重らせんへの薬物およびタンパク質の結合は、二重らせんの巻かれてない、延びた形態の一時的な形成と関連している。本明細書に示したデータは、ほとんどの点で、本明細書に記載の新規らせん形態がそのような遷移状態を模倣していることを示している。遷移状態の基質-酵素複合体（いわゆる遷移状態アナログ）と結合する能力に基づいて、強力な薬物が開発されている。類推によれば、本明細書に記載した新規二重鎖形態を（適切な装置および方法の状況のもとで）使用することにより、そのようなDNA遷移状態アナログを医薬のリード化合物として探索することが可能である。
【００４５】
新規二重鎖形態は水素結合選択性を増強した。示したデータは、新規二重鎖形態における塩基対合選択性が標準的なワトソン・クリック二重らせんで見られるものに合致するか、またはそれを上回ることを示す。新規二重鎖形態の分子モデリングは、塩基スタッキング（あまり配列依存性でない）が水素結合のエネルギー（核酸配列選択性の基礎となる）と比べて大いに低減されていることを示唆する。こうして、モデリングと実験の両方から、新規な巻かれてない二重鎖に基づいた方法および装置は二重らせんにより得られるものよりも正確な塩基配列認識を示すと考えられる。
【００４６】
表面にすぐ近いことはハイブリダイゼーションの調節を可能にする。新規なほどけた二重鎖形態の形成は、表面吸着と関係した対称拘束により駆動される。こうして、その根底では、新規二重鎖形態は表面の物理化学と緊密に結びついた構造およびエネルギー論を有する分子実在物である。実施例に示すように、表面が陽イオン性である場合、二重鎖-表面相互作用の静電成分はハイブリダイゼーション溶液中の陽イオンの通常の必要性を排除することができる。この観察は、（新規二重鎖を形成させるための）ハイブリダイゼーションのイオン依存性、温度依存性および選択性が慎重な表面修飾によって大いに改変され得るという概念を実行させるものである。
【００４７】
陽イオン性および非陽イオン性のいずれの表面も新規二重鎖形態を支持する。示したデータでは、下にある基体が一級アミンをコーティングしたガラスであった。したがって、この基体への核酸プローブの吸着は、アミノ基とリン酸バックボーンとの間の静電および水素結合相互作用の組合せに基づいている。実験データおよびモデリングから、新規らせん形態はリン酸により媒介される安定した吸着を必要とすると考えられる。負に荷電したリン酸基と下側の表面との静電相互作用は、この種の安定した吸着を達成するのに十分でなければならない。こうして、あらゆる種類の荷電表面コーティング（例えば、一級、二級、三級アミン、アミジニウムおよびグアニジウム基、ならびに金属イオン）が新規表面形態を支持する可能性がある。他方の極端な例では、リン酸基はすぐれた水素結合受容体でもあるので、中性の水素結合供与表面が新規らせん形態の形成を支持できる可能性がある。これには、特に、ヒドロキシル、アミド、尿素およびその他の良好な金属性水素結合供与体（例えば、AlO2、TiO2およびSiO2）が含まれる。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は単に例示のために提示されるのであって、いかなる場合も本発明の範囲内に含まれる種々の実施形態を限定するものではない。
【００４９】
実施例１：  ガラス表面のアミノシラン化
予備洗浄したガラス、マイクロスライド (Gold Seal, Gold Seal Products)を脱イオン水で洗浄し、次いでHPLCグレードのメタノールですすぎ、ダストフリーのオーブンに入れて45℃で乾かした。このスライドガラスを、p-キシレン(Aldrich)に対して1:2の割合の3-アミノプロピルトリメトキシシラン(Aldrich)で平衡化させた82℃の真空オーブンに移した。その後、スライドガラスを27 mmHgで一晩インキュベートし、続いてダストフリーの条件下で室温にて保存した。
【００５０】
実施例２：  アレイの作製
全てのオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、その5’末端をCy3またはCy5蛍光染料で標識して、BioSource International (Camarillo, CA)にてHPLC精製した。10μlシリンジを備えたMicrolab 4200ロボット(Hamilton)を使って、アミノシラン化スライドガラスに6X8アレイをプリントした。すなわち、アレイエレメント（直径500μm、中心から中心まで900μm）あたり10 nlの容量とした。オリゴデオキシリボヌクレオチドを70% DMSO (Aldrich)/30% H2O中の所望の濃度で384ウェルプレート(NUNC)からプリントした。プリンティング溶液にDMSOを加えると乾燥のプロセスが遅くなり、その結果、水の中に入れたプローブをプリントすることに比べてアレイエレメント内のプローブ密度がより均一になった。プリントした後、アレイを10 mM NaOH、100 mM 炭酸ナトリウム、2% ポリビニルアルコール、5X デンハートで１分間洗浄し、その後脱イオン水で複数回すすぎ、保存のため乾燥させた。全ての手順は室温で行なった。
【００５１】
実施例３：  ハイブリダイゼーションおよびイメージング
ハイブリダイゼーションを次のハイブリダイゼーションバッファー中で実施した：12-merターゲットについては90 mM 炭酸ナトリウム、5X デンハート、pH=9.5、そして24-merターゲットについては60 mM 炭酸ナトリウム、5X デンハート、20% ホルムアミド、0.6% ポリビニルアルコール、pH=9.5。遊離アミノ基による表面電荷を下げるために全体を通してpHを9.5に維持した。ハイブリダイゼーションに先立って、ブロッキング剤として用いられる1.5% (w/v)ポリビニルアルコール(Aldrich)を含むターゲット不含の対応ハイブリダイゼーションバッファーでアレイを前処理した。全ステップを室温で行なった。10分のハイブリダイゼーション後、スライドガラスを対応ハイブリダイゼーションバッファーで洗浄し、脱イオン水で数回すすぎ、乾燥し、イメージングを行なった。アレイをCCDに基づくArrayworx Imager (Applied Precision, Inc.)で解像度10μmにてイメージングした。アレイのイメージング中はCy3およびCy5光学フィルターを使用した。感度を標準化するため、照射時間をCy3チャンネルの場合は0.2秒に、Cy5チャンネルの場合は1秒に保持した。Cy3およびCy5チャンネルからの強度の解析は、ArrayWoRx Version 1.50ソフトウェア(Applied Precision, Inc.)を用いてオリジナルのステッチ画像から行ない、マイクロソフトエクセルで棒グラフを作成した。代表的なアレイの画像は、単にプレゼンテーションの目的のためにAdobe Photoshop 5.5でそのレベルを調整することにより変更したが、レベルの調整は結論にいかなる影響も与えなかった。なんとなれば、定量はリジナルの画像に基づいて行なったからである。
【００５２】
実施例４：  ターゲット対プローブの比の計算
これらの実験では、高いターゲット対プローブ比をもつことが重要であったので、特に断らないかぎり、12-merターゲットは5μM濃度でハイブリダイズさせ、24-merターゲットは3μM濃度でハイブリダイズさせた。時間経過と濃度依存性の実験から、このようなターゲット濃度では、5分のハイブリダイゼーション後に特異的プローブに対してそれらのシグナルが飽和に達することが明らかにされた。ターゲット対プローブ比は、プローブについてはハイブリダイゼーション前のCy5シグナルの分析、ターゲットについてはハイブリダイゼーション後のCy3シグナルの分析、およびCy3およびCy5で標識したオリゴデオキシリボヌクレオチドの標準曲線（図1a）から分子の数を算出して測定した。Cy5-wt-24-as (n=56)の標準曲線は、Sigma Plot 2000で線形回帰(log(Cy5シグナル)＝yo＋a*log(分子の数))に適合した。分子の数は既知の容量（アレイエレメント当たり10 nl）およびアレイエレメント当たりのプリント溶液中のオリゴデオキシリボヌクレオチドの濃度から求めた。Cy3-wt-24-s (n=56)およびCy3-wt-12-s (n=56)の標準曲線は、Sigma Plot 2000で線形回帰(log(Cy3シグナル)＝yo＋a*log(分子の数))に適合した。Cy5-wt-24-asプローブの回帰曲線は、次の値yo=-13.1、a=1.58、R=0.999（ここで、Rは平均の回帰係数である）を有していた。ターゲットCy3-wt-24-sおよびCy3-wt-12-sの回帰曲線は、それぞれ次の値yo=-9.69、a=1.29、R=0.997およびyo=-13.7、a=1.64、R=0.999を有していた。ハイブリダイゼーション前のCy5-wt-24-asプローブの、バックグラウンドを差し引いた平均Cy5シグナルは332であった。
【００５３】
したがって、アレイエレメント当たりのCy5-wt-24-asプローブの数は、その回帰方程式から算出することができた：(プローブ分子の数)=10^[(log(Cy5シグナル)-yo)/a]＝10^[(log(332)+13.1)/1.58]＝7.7*10^9。同様にして、ハイブリダイゼーション後のターゲット分子の数は、Cy3-wt-24-sについては3.8*10^9であり、Cy3-wt-12-sについては7.8*10^9であることが見出された。こうして、24塩基長プローブへの24および12塩基長ターゲットのハイブリダイゼーションについて、ターゲット対プローブ比はそれぞれ0.5および1であった。24塩基長ターゲットの濃度は3μM以上に増加させなかった。なぜならば、バックグラウンドの劇的な増加につながる恐れがあるからである。12塩基長ターゲットの場合には5μM濃度を使用できるという事実は、長い核酸のほうが多くの負電荷を有するため、正に荷電した表面により強く引きつけられるという事実により説明がつくだろう。ターゲット対プローブ比が1に近似している場合の、正に荷電した表面に吸着されたオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブが核酸ターゲットと特異的にハイブリダイズする能力は、ターゲットを放射性標識することで以前に示されている (Belosludtsev YYら, 2001, Anal. Biochem. 292:250-256)。
【００５４】
実施例５：  解離実験
ハイブリダイゼーション後、1.5%(w/v) ポリビニルアルコールを含有する対応のハイブリダイゼーションバッファーでスライドガラスを5回洗浄した。次に、スライドガラスを、60 mM 炭酸ナトリウム、20% ホルムアミド（12-merの場合）または35% ホルムアミド（24-merの場合）、5X デンハート、0.6% ポリビニルアルコールを含有する洗浄バッファー(pH=9.5)中で室温にてさまざまな時間にわたりインキュベートした。
【００５５】
実施例６：  DNアーゼプロテクションアッセイ
ハイブリダイゼーション後、1.5%(w/v) ポリビニルアルコールを含有する対応のハイブリダイゼーションバッファーでスライドガラスを2回洗浄し、続いて50 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM Tris-HCl、pH=8.0を含有するDNアーゼI消化バッファーを短時間加えた。次に、スライドガラスを上記バッファー中の0、0.1、1.0、または10 u/μlのDNアーゼI (Roche)の存在下で室温にて20分間インキュベートし、1.5% ポリビニルアルコールを含有する対応のハイブリダイゼーションバッファーで8回すすぎ、その後脱イオン水で洗浄して乾燥し、イメージングを行なった。
【００５６】
実施例７：  アミノシラン化ガラス表面へのオリゴデオキシリボヌクレオチドの吸着
Cy5(インドジカルボシアニン、λ(ex)max=651 nm、λ(em)max=651 nm、赤色)染料で標識した12塩基長(12-mer)および24-merオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）プローブを、アレイフォーマットで、アミノシラン化ガラス表面(3-アミノプロピルトリメトキシシラン)にプリントした。吸着されていない物質を室温で十分に洗浄して取り除いた。プリントされたオリゴヌクレオチド1μMから開始して、結合されたCy5オリゴヌクレオチドのシグナルを飽和させた。標準曲線（図1A）を参考にして、結合されたオリゴヌクレオチド当たりの表面積を、アプライした全プローブ濃度の関数として計算することができる。12-merおよび24-merプローブの両者について、明確に規定された密度限界が検出された（図1A）。飽和では、10.6+0.3 nm2が1つのCy5標識12-merオリゴヌクレオチドによって占められ、16.6+0.5 nm2が1つのCy5標識24-merオリゴヌクレオチドによって占められることが見出された。1本のオリゴヌクレオチド鎖の幅を1 nmと仮定し、リン酸バックボーンが（塩基反復当たり0.7 nmで）完全に伸長しているとすると、12-merまたは24-merはそれぞれ、およそ7.7 nm2 または16.1 nm2の表面を占有すべきであると推定される。追加の染料標識が上記数値に1 nm2を付け加えると予想される。したがって、これらのデータは、吸着結合の飽和状態において、12-merと24-merの両者の表面構造は伸長したプローブオリゴヌクレオチド鎖の密に充填された単層に近似したものとなる、ことを示唆している。
【００５７】
そのような標識オリゴヌクレオチドの吸着結合は、ゆっくりと可逆的であることがわかり、プローブは沸騰している脱イオン水で繰り返し洗浄した後でさえ表面に結合したままである。吸着されたオリゴヌクレオチドは沸騰5 M NaClで洗浄することにより取り除かれ、このことは可逆的な非共有結合静電相互作用を示唆している。こうして、オリゴヌクレオチドの表面への結合は、負に荷電した核酸のリン酸バックボーンと正に荷電した表面のアミン基との極めて堅い静電相互作用に起因すると考えられる。
【００５８】
実施例８：  吸着オリゴヌクレオチドへのDNAの特異的ハイブリダイゼーション
このように密に吸着されたオリゴヌクレオチド単層にDNAが特異的にハイブリダイズできるか否かを調べるために、6つのCy5標識DNAオリゴヌクレオチドプローブ（赤色）をアミノプロピルシラン表面に4回反復で、やや飽和を下回るプローブ吸着（0.3μMの添加プローブ）と、さらに3.0μMの飽和プローブ濃度でプリントして、マイクロアレイを作製した。12-merプローブ（図2に示すアレイの左側）および24-merプローブ（図2に示すアレイの右側）について、3種のプローブ配列相同体を使用した：野生型基準配列(wt)、12塩基当たり1個のヌクレオチド変化(mt)、および無作為に寄せ集めた異性体(scr)。これらの配列を表１に示す。
【００５９】
マイクロアレイを、野生型基準プローブ配列と相補的となるように選択された、Cy3(インドカルボキシシアニン、λ(ex)max=552 nm、λ(em)max=565 nm、緑色)で標識した12-merターゲット(図2B)または24-merオリゴヌクレオチドターゲット(図2C)にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、完全に一致した二重鎖の結合平衡（黄色）を達成するために、比較的高い溶液状態のターゲット濃度（24-merターゲットについては3μM、12-merターゲットについては5μM）で実施した。飽和点において、これらのハイブリダイゼーション実験での結合ターゲット対プローブ比は、24-merターゲットの場合が0.5、12-merターゲットの場合が1であると測定された（材料および方法を参照されたい）。したがって、得られた特異性データは全吸着プローブ単層に対する平均を表す。
【００６０】
12-merターゲット(図2B)は、野生型12-merと24-merプローブ鎖のセグメントの両者に相補的となるように設計されたことに留意されたい。同様に、24-merターゲット(図2C)は、野生型24-merプローブおよび12-mer野生型プローブ鎖（ターゲット鎖オーバーハングを有する）の両者に相補的となるように設計された。しかし、24-merターゲットのハイブリダイゼーションの場合は、12-merプローブへの結合が弱すぎて検出できないように実験上のストリンジェンシーを増加させた（図2C、左側）。
【００６１】
データの目視検査から、飽和状態の吸着結合でさえも、ハイブリダイゼーションは高度に特異的であることが明らかにされた。12-mer塩基対合における単一塩基のミスマッチ、または24-mer塩基対合における2塩基のミスマッチは、ターゲット結合を5分の1以下に低下させることがわかる（図2Bおよび2Cにおける2および4列を比較されたい）。一方、寄せ集め異性体への結合は検出されない。したがって、上記データから、アミノシラン化表面に吸着により結合されたオリゴヌクレオチドは、それらの逆平行ワトソン・クリック配列相補体と結合する能力を保持しており、12-mer二重鎖内の単一ミスマッチおよび24-mer塩基対合での二重ミスマッチを識別して測定できることが確認された。mtプロープに相補的なターゲットのハイブリダイゼーション、ならびにターゲットとプローブの逆転がこの結論をさらに支持する。
【表１】
2004534546.tif 000002
2004534546.tif 000003
【００６２】
実施例９：  らせん状二重鎖についての対称論の系統的論述
正に荷電したアミノシラン化表面への一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの、ほとんど不可逆的な強い吸着は、図3Aに示すような、バックボーンリン酸基と表面との複数の静電相互作用を示唆する。アミノシラン単層は密に充填されたアミン基の平面を溶液に提示する（図3D）。通常の10塩基対ピッチを有する回転対称二重らせん（図3C）の形成の間、プローブのリボン様リン酸バックボーン（図3A）は、入ってくるターゲット鎖に巻きつくために、一時的に、その密に荷電した表面から離れなければならない。対照的に、図3Bに示すような、非らせん状二重鎖の形成を説明するのに、表面からのプローブの脱着は必要でない。
【００６３】
表面上に形成された二重鎖が相対的に通常のピッチを有するらせんであるとすると、らせん対称は、両鎖（ターゲットとプローブ）がそれらの回転上等しいリン酸バックボーンを介して表面に等しく結合することを要求する（図3C）。したがって、二重鎖の解離プロセスにおいて、対称的に等しいプローブ鎖の付随的解離なしにターゲットを取り除くことは不可能であろう。モデリング技術の単純性および表面力の大きな不確実性を考慮すれば、図3に示すモデルは近似の描写として扱われるべきである。
【００６４】
実施例10：  アミノシラン化ガラス表面に形成されたDNA二重鎖の非対称的解離
このような実験的解離分析は図4に示されるが、そこには図2の平衡結合実験と同様の形の解離速度実験が示される。簡単に説明すると、Cy3標識12-merターゲット(左)またはCy3標識24-merターゲット(右)を、図2に記載したCy5標識オリゴヌクレオチドプローブのマイクロアレイにハイブリダイズさせた。次に、ターゲットをストリンジェントな洗浄により時間の関数としてプローブから解離させた。それぞれの時点で、結合二重鎖からのシグナル（黄色）をその2つの成分：Cy3ターゲット（緑色）とCy5プローブ（赤色）に巻き戻すことによって蛍光光度法で定量した。
【００６５】
最初と最後の解離時点の比較（図4、アレイ2対アレイ5、これに続く棒グラフ）により、12-merおよび24-mer二重鎖対合の両者のターゲット鎖は、16分間の洗浄中に、吸着プローブの密度をインタクトに保持した条件下で、マイクロアレイから90％を超えて解離されることが明らかである（アレイ1とアレイ5の比較およびその後の棒グラフ）。さらに、予めハイブリダイズさせた後16分間の洗浄を行なったアレイでのハイブリダイゼーションの繰り返し（アレイ6）は、ハイブリダイゼーションと解離のプロセスが完全に可逆的であることを明らかにし、それにより、プローブは二重鎖形成および解離の過程で失われていないし、構造的にも改変されていないことが確認される。この場合も、結合ターゲットとプローブの初期比はこれらの実験で１に近いことが測定されたので、解離中に観察された速度論的非対称はマイクロアレイ表面上に形成された全ての二重鎖対合の一般的な性質であると結論することができる。
【００６６】
この非常に非対称性の速度論的挙動は、表面に結合された二重鎖がらせん構造の場合には合理的に説明するのが容易でない。なんとなれば、その場合には、ターゲットはプローブ鎖と同様の様式で表面に結合されると考えられるからである（図3C）。この重要な実験的観察を確かめるため、アミノシラン化ガラス表面の3 mm2領域を、マイクロアレイ分析において記載したものと同一のセットのCy5標識12-merおよび24-merプローブ（wt、mt、scr）で飽和させた。吸着プローブのこのパッチに、Cy3標識した相補的ターゲット（緑色）を、図4にマイクロアレイ分析について記載したのと同じ条件下でハイブリダイズさせ、イメージングを行なった。その後、この表面をハイブリダイゼーションバッファーで短時間すすぎ（未結合のターゲットを除去するため）、続いて洗浄バッファーをアプライして、マイクロアレイ分析について先に記載したように二重鎖の解離を開始させた。図5Aはこれらのイメージデータを示す。第1列は、ハイブリダイゼーション前の1 mm2のプローブ改変表面単層のもとのままのイメージデータを表し、第2列は、ターゲットの結合飽和へのハイブリダイゼーション後の1 mm2の同表面を表し、第3列は、ハイブリダイゼーションおよび続く15分の洗浄後の1 mm2の同表面を表す。全体として、図5A（1〜3列）における表面ハイブリダイゼーションのバルク分析から、マイクロアレイフォーマットで先にモニタリングされていた解離の特異性および速度論が直接確認される。
【００６７】
15分の解離後、洗浄バッファーを集めて、清浄なアミノシラン化スライドガラス上に分注してイメージングを行なった。これらのイメージデータを4列に示す。強いCy3シグナルと弱いCy5シグナルが得られる（図5A）。実験プロトコルを逆転させて、プローブを溶液状態のターゲットとして使用し、ターゲットを表面結合プローブとして使用したとき、結果は逆になり、すなわち、洗浄バッファーが相対的な割合で強いCy5シグナルと弱いCy3シグナルを含み（図5B）、これは最初の分析で得られた分布の逆であった。全体として、図5のデータから、2つの表面結合二重鎖の解離について5〜20倍の速度論的非対称が確認される。
【００６８】
実施例11：  アミノシラン化ガラス表面に形成されたDNA二重鎖の非対称的DNアーゼI消化
観察された鎖の非対称性を第3の方法で確認するため、表面結合二重鎖を定量的DNアーゼI消化により分析した（図6）。簡単に説明すると、実験は図4におけると同様に設計したが、解離速度論についてモニタリングするのではなく、結合二重鎖を、次第に増加するDNアーゼI濃度の関数として室温で20分間消化した（アレイ2〜5はそれぞれ0、0.1、1.0および10単位のDNアーゼIを含む）。直接比較（アレイ1対アレイ5）からわかるように、吸着プローブ鎖からの蛍光シグナルは、結合された12-mer（図6A）または24-mer（図6B）ターゲット鎖の90％以上がDNアーゼIで消化される条件下で、DNアーゼI消化から完全に保護された（おそらく、リン酸バックボーンと表面アミンとの直接的相互作用による）。しかしながら、最高濃度のDNアーゼIで先に消化しておいたアレイの再ハイブリダイゼーション（アレイ2とアレイ6を比較されたい）は、ターゲットと結合するプローブの能力がわずかではあるが有限に低下したことを示唆しており、このことは、DNアーゼI（蛍光により検出されるように、表面とのプローブ結合を改変するとは思われない）による、遅いが有限の速度のプローブ開裂を反映している可能性がある。
【００６９】
標準的なB形二重らせんを最初に溶液中で形成させてから表面に付着される場合は、DNアーゼIが両鎖を対称的に消化することはよく知られている (Rhodes Dら, 1980, Nature 286:573-578)。したがって、本研究で検出された高度に非対称的なDNアーゼプロテクションのパターンは、吸着プローブ鎖のリン酸バックボーンが溶液状態のDNアーゼIとの相互作用に利用されない代わりに、アミノシラン化表面に面しているという考えを裏付けている。一方で、これらのデータは、結合されたターゲット鎖のリン酸バックボーンが溶液相に面していて、DNアーゼ消化を容易に受けやすくなっていることを裏付けている。
【００７０】
実施例12：  B-ヘリックスの2より多いヘリックスターンの長さに沿った二重鎖形態
解離速度論とDNアーゼプロテクションアッセイのいずれもが、高度に非対称的な二重鎖構造を示唆して、対称的な二重らせんと総じて不一致であったが、そのような単純なデータ解析は、研究中の二重鎖が表面結合プローブのスパンにわたって完全に形成されている場合にのみ可能である。この課題を解決するために、1セット10個のさまざまな長さのCy3標識（緑色）ターゲットオリゴヌクレオチドを合成して、図2Aに記載したアレイにハイブリダイズさせた。ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のもとでは、相補的24-merプローブ（アミノシラン化表面に0.3μMでプリントされた）に対する結合安定性は、24塩基の完全プローブ長までターゲットの長さの関数として増加し（図7）、その後は横ばいになった。全体を通して、塩基対合の特異性は24-merプローブ当たり2塩基変化のレベルで維持された。この比較的単純な結果は、配列特異的二重鎖が、平均して、利用可能な24塩基プローブ鎖の全体に沿って形成されている、ことを示唆しており、もしも得られた産物が標準的なB形ヘリックスであるとするならば、それはわずかに2より多いヘリックスターンに一致すると考えられる。
【００７１】
実施例13：  反復可能で信頼性のある吸着マイクロアレイの作製およびハイブリダイゼーションのためのプロトコル
吸着表面の作製：  顕微鏡用スライドガラスを脱イオン水で洗い、ダストフリーのオーブンに入れて乾かした。吸着表面材料を真空オーブン内82℃、27 mmHgで一晩平衡化することにより、ガラスの表面上に吸着表面を作った。
【００７２】
オリゴヌクレオチドの調製：  予め合成したリンカー不含のオリゴヌクレオチドを脱イオン水に溶解した。ジメチルスルホキシド(DMSO)を用いることにより、オリゴヌクレオチドを均一に乾燥させて吸着表面上に均一な単層を形成させた。オリゴヌクレオチドについての表面の飽和限界を、標識オリゴヌクレオチドを用いて計算し、オリゴヌクレオチドの濃度を飽和限界より高く維持した。
【００７３】
表面へのオリゴヌクレオチドの直接吸着：  制御された既知量を分配するロボットマシーンを使用して表面にオリゴヌクレオチドを吸着させて、オリゴヌクレオチド溶液の1滴がハイブリダイゼーション装置上のもう一方のものに類似する（変動＜1％）ようにした。
【００７４】
プレハイブリダイゼーション：  吸着させたオリゴヌクレオチドを、5X デンハート溶液および1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加したリン酸バッファー（第一リン酸カリウム、第二リン酸ナトリウム、pH 8.0）を含むプレハイブリダイゼーション溶液とともに15分インキュベートする。
【００７５】
ハイブリダイゼーション：  対象のサンプルからの20μLの蛍光標識ターゲット（全長mRNAまたはcDNA）を加えて、加湿条件下に室温で一晩インキュベートすることによりハイブリダイゼーションを実施する。
【００７６】
洗浄：  12時間のハイブリダイゼーション後、結合バッファーと比べてモル濃度(150 mM)が少なくとも半分までのリン酸バッファー（デンハート溶液を含まない）中で洗浄を行なう。
【００７７】
スキャン：  洗浄後のスライドガラスを遠心または加熱により乾燥させ、レーザーまたはCCDのいずれかをベースとしたスキャナーを使ってスキャンし、蛍光イメージを生成させる。
【００７８】
分析：  グリッドを適用するか、または自動スポット検出アルゴリズムを使用するかのいずれかにより、マイクロアレイ上のスポットを定量して蛍光イメージの強度を得る。
【００７９】
実施例14：  比較実施例
第1セットのCy3標識DNA 50-merを、実施例１に従って蒸着により均一な陽イオン性表面に直接吸着させた。第2セットのCy3標識DNA 50-merは、Cel Associatesの溶液浸漬法 (CSA-25; http://www.cel-1.com/)により均一な陽イオン性表面に吸着させた。その後、これらの表面は実施例16に記載の洗浄バッファーを用いて5分間または24時間洗浄した。洗浄後に残存しているDNAの蛍光強度を図8および表2に示す。5分洗浄後の蛍光強度はゼロ時のときと実質的に同じであった。しかし、ゼロ時におけるバックグラウンドは検出されなかった。
【表２】
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【００８０】
実施例15：  ハイブリダイゼーションに対するキャッピングの効果
1.0μMでプリントした40-mer DNAプローブを、完全に一致するターゲット40-merとハイブリダイズさせた。ターゲット40-merは、0.1μMのCy3標識ターゲットを含む全濃度1.0μMでハイブリダイズさせた。2つのキャッピング法を採用した。化学的キャッピングは気相法（50℃でDMF中の0.5 M無水酢酸および25インチの水銀を16時間、続いてDMF中の0.5 M無水コハク酸の液相を室温で1時間）により行なった。これとは別に、プレハイブリダイゼーションバッファー中のSDSを用いて界面活性剤によるキャッピングを行なった。
【００８１】
およそ40のプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーションバッファーの組合せのブロッキング効率を試験した。すべてが満足のいく性能を示した。8種類の好ましい組合せを表3および図9に示す。
【表３】
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【００８２】
文献で用いられた従来の化学的キャッピングと相違して、SDSのような界面活性剤は非特異的結合を効率よくブロックする。従来のキャッピング法では77蛍光単位の平均ハイブリダイゼーション強度が得られたが、界面活性剤法を用いると、ハイブリダイゼーションのシグナル強度が150蛍光単位へとほぼ倍増した。
【００８３】
実施例16：  吸着マイクロアレイは溶液状態のcDNAの検出に使用できる
プローブは予め決定された配列の60-mer（マウスp53関連遺伝子に由来する）であり、実施例13に従ってガラス表面に吸着させた。
【００８４】
マイクロアレイにハイブリダイズさせるためのターゲットは次のように調製した。未処理およびγ照射マウス胸腺組織から、改変されたグアニジン-イソチオシアネート法(Qiagen, Valencia, CA, USA)により全細胞RNAを抽出した。このRNAの品質および濃度を分光光度試験および染料試験(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)の両方を用いて調べた。未処理のマウス胸腺組織に由来する10μgの全細胞RNAを、未処理マウス胸腺由来のCy3標識mRNAをもたらすCy3染料(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)の存在下でMMLV-RT (Clontech, Palo Alto, CA, USA)により逆転写した。γ照射マウス胸腺組織由来の10μgの全細胞RNAは、未処理マウス胸腺由来のCy5標識mRNAをもたらすCy5染料(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)の存在下でMMLV-RT (Clontech, Palo Alto, CA, USA)により、MMLV-RTキット中のClontechが提供する逆転写プロトコルを用いて逆転写した。得られた標識cDNAを95% エタノール中-70℃で1時間インキュベートして沈澱させ、沈殿物を微量遠心機により12,000 rpmで10分ペレット化した。このペレットを70% エタノール中で洗浄して自然乾燥させた。乾燥したペレットをハイブリダイゼーションバッファーに溶解した。等量のCy3およびCy5標識cDNAターゲットをマイクロアレイに添加し、加湿チャンバー内で室温にて12時間インキュベートした。12時間後、マイクロアレイをオービタルシェーカー上で10分ごとに洗浄バッファーを交換して30分間洗浄することにより、未結合のターゲットを除いた。30分の終わりに、マイクロアレイを自然乾燥させ、CCDイメージャー(Array Worx, Applied Precision, Inc. Issaquah, WA, USA)でスキャンした。得られたイメージはアレイ上の各スポットについて次のように読み取る。緑色強度の量は未処理遺伝子のレベルを示し、赤色強度の量はγ照射遺伝子のレベルを示す。黄色は両方のサンプルからの遺伝子発現が等しいレベルであることを示す（図10）。
【００８５】
プレハイブリダイゼーションバッファーおよびハイブリダイゼーションバッファーは、300 mMリン酸バッファー(0.017 M 第一リン酸ナトリウム(一水和物)、0.305 M 第二リン酸ナトリウム、pH 8.0); 5X デンハート溶液(0.1% フィコール(タイプ400)、0.1% ポリビニルピロリドン、および0.1% ウシ血清アルブミン); および1% ドデシル硫酸ナトリウムを含んでいた。
【００８６】
洗浄バッファーは、150 mM リン酸バッファー(0.0085 M 第一リン酸ナトリウム(一水和物)、0.15 M 第二リン酸ナトリウム、pH 8.0); 1% ドデシル硫酸ナトリウムであった。
【００８７】
文献
本明細書を通して引用した文献はそのまま参照により本明細書に組み入れられる。これらの文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術を構成することを認めるもの、と解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】正に荷電した表面へのDNAオリゴヌクレオチドの非共有結合吸着。(A) 12-mer(黒四角)および24-mer(白四角)についての標準曲線。Cy5標識プローブを10 nlでプリントし、その後洗浄せずにArrayWorxイメージャー(Applied Precision, Inc.)で画像化した。アレイエレメント当たりのプローブ分子の数（ｘ軸）は、プリント容量、プローブ濃度およびアボガドロ数の積から計算した。ｙ軸は、アレイエレメントからのCy5染料の蛍光シグナルの平均積分値のlogを表す。各データ点は、56のアレイエレメントから計算した平均と、その平均からの単一標準偏差を表す。(B) 12-mer(黒丸)または24-mer(白丸)により占有された、オリゴヌクレオチド当たりの表面積。Cy5標識オリゴヌクレオチドプローブを70% DMSO/30% H2O中にてアレイエレメント当たり10 nlで、アミノシラン化ガラス表面に濃度の関数としてプリントし、続いて洗浄して未結合プローブを除いた。ｙ軸は、測定したアレイエレメント表面積を、アレイエレメント当たりの吸着プローブ分子の数（図1Aの標準曲線から計算）で割ることにより計算した。各データ点は、56のアレイエレメントから計算した平均と、その平均からの単一標準偏差を表す。
【図２】アレイの作製および特異的ハイブリダイゼーション。(A) 本発明のマイクロアレイのレイアウトの原型。(B) 図2Aに示すアレイへの12-mer Cy3標識ターゲットのハイブリダイゼーション。5 mMで室温にて10分のハイブリダイゼーションを行なった後、60 mM 炭酸ナトリウム、20% ホルムアミド、0.6% ポリビニルアルコール、5X デンハート、pH=9.5中で室温にて１分の洗浄を行なった。(C) 図2Aに示すアレイへの24-mer Cy3標識ターゲットのハイブリダイゼーション。3 mMで室温にて10分のハイブリダイゼーションを行なった後、60 mM 炭酸ナトリウム、35% ホルムアミド、0.6% ポリビニルアルコール、5X デンハート、pH=9.5中で室温にて１分の洗浄を行なった。ハイブリダイゼーション条件を「材料および方法」に記載する。プローブとターゲット配列を表１に記載する。Cy3シグナルは緑色で、Cy5シグナルは赤色である。
【図３】本発明の陽イオン性表面での二重鎖形成のモデル。(A) アミノシラン化表面に静電的に結合させた一本鎖の24-merオリゴヌクレオチドプローブ。(B) 長く延びた24-merプローブとその相補的24-merターゲットとの間でその全長に沿って形成された、本発明の陽イオン性表面上の線状非らせん状DNAリボン二重鎖。(C) 本発明の陽イオン性表面上の24塩基対の長さのB形DNA二重らせん。(D) 本発明の3-アミノプロピルトリメトキシシラン化ガラス表面の化学構造。図3A〜CのモデルはInsightIIのMolecular Builderモデルで作成し、リボン二重鎖構造のエネルギー最小化はDiscover 3 パッケージ(MSI)のAmber力場により行なった。一本鎖（図3A）および二本鎖（図3B）DNAの大部分の通常の異性体は、正に荷電した表面上で幾分か屈曲しうると予想されるが、単純化するために線状異性体のみを示してある。
【図４】表面結合型二重鎖内の鎖非対称を分析するための解離速度論。(A) Cy3で標識した野生型センス12-merターゲットを図2に記載のアレイにハイブリダイズさせた。(B) Cy3で標識した野生型センス24-merターゲットを図2に記載のアレイにハイブリダイズさせた。洗浄中のターゲット解離の速度論：(1) ハイブリダイゼーションなし、(2) ハイブリダイゼーション後および解離なし、(3) ハイブリダイゼーション後および１分間の解離、(4) ハイブリダイゼーション後および4分間の解離、(5) ハイブリダイゼーション後および16分間の解離、(6) ハイブリダイゼーション後および16分間の解離、その後2回目のハイブリダイゼーション工程。棒グラフは、8個のアレイエレメントからの基準化された平均と、その平均の標準偏差を表す。
【図５】洗浄溶出液の分析。(A) アミノシラン化表面のパッチ（各3mm2）をCy5標識プローブ（赤色）で飽和させ、続いて「材料および方法」に記載したとおりに洗浄して過剰のプローブを除去した。これらのパッチにCy3標識ターゲット（緑色）をハイブリダイズさせ、洗浄して未結合ターゲットを取り除き、2 μlの洗浄バッファー中で15分間洗浄した（「材料および方法」を参照）。得られた洗浄バッファーから0.2μlアリコートを吸引してクリーンスライド上にスポットし、続いてArrayWorx Imager (Applied Precision)でCy3およびCy5フィルターセットにより画像化した。(B) ターゲットとプローブを逆にした逆転実験も示される。棒グラフは、4つのそのような0.2μl溶出液からの基準化された平均と、その平均の標準偏差を表す。
【図６】実施例６に従うDNアーゼプロテクションアッセイ。(A) 野生型センスCy3染料標識12-merターゲットを図２に記載したアレイにハイブリダイズさせた。(B) 野生型センスCy3染料標識24-merターゲットを図２に記載したアレイにハイブリダイズさせた。(1) ハイブリダイゼーションなし、(2) ハイブリダイゼーション後およびDNアーゼバッファー中0 u/μlのDNアーゼIと共にインキュベーション、(3) ハイブリダイゼーション後および0.1 u/μlのDNアーゼIと共にインキュベーション、(4) ハイブリダイゼーション後および1.0 u/μlのDNアーゼIと共にインキュベーション、(5) ハイブリダイゼーション後および10.0 u/μlのDNアーゼIと共にインキュベーション、(6) ハイブリダイゼーション後10.0 u/μlのDNアーゼIと共にインキュベーション、プレハイブリダイゼーション、および2回目のハイブリダイゼーション。棒グラフは、8個のアレイエレメントからの基準化平均と、その平均の標準偏差を表す。Cy3シグナルは緑色で、Cy5シグナルは赤色である。
【図７】24塩基の表面結合プローブへのターゲットハイブリダイゼーション安定性の長さ依存性。以下のプロトコルを全体をとおして室温で用いた：(1) 60 mM 炭酸ナトリウム、20% ホルムアミド、5X デンハート、1.5% ポリビニルアルコール(PVA)、pH 9.5中で1分のプレハイブリダイゼーション；(2) 60 mM 炭酸ナトリウム、20% ホルムアミド、5X デンハート、0.6% PVA、pH=9.5中で3μMのCy3標識ターゲット（10〜28塩基）との10分のハイブリダイゼーション；(3) プレハイブリダイゼーションバッファー中での2回の洗浄；(4) 60 mM 炭酸ナトリウム、25% ホルムアミド、5X デンハート、0.6% PVA、pH=9.5中で10分の洗浄；(5)脱イオン水での短時間の洗浄；(6) 乾燥。ｘ軸のオリゴヌクレオチドの配列は表１に示してある。これらの実験で使用したアレイは図2Aに示すアレイと同一である。棒グラフは、12のアレイエレメントからの基準化平均と、その平均の標準偏差を表す。
【図８】吸着されたDNAの安定性。陽イオン性表面に蒸着により直接吸着させたCy3標識DNA 50-mer（実施例１）を5分間(A)または24時間(B)洗浄した。数字による強度を表２に示してある。Cel Associates (CSA-25; http://www.cel-1.com/)の溶液浸漬法に従って陽イオン性表面に直接吸着させたCy3標識DNA 50-merを5分間(C)または24時間(D)洗浄した。
【図９Ａ】キャッピングおよびハイブリダイゼーション条件がプローブ-ターゲット二重鎖形成の検出に及ぼす影響。40-merプローブをプリントし、キャップしたDNAマイクロアレイについて、絶対シグナル、絶対シグナル−（マイナス）バックグラウンド蛍光、およびシグナル対バックグラウンドの比を示す。
【図９Ｂ】キャッピングおよびハイブリダイゼーション条件がプローブ-ターゲット二重鎖形成の検出に及ぼす影響。40-merプローブをプリントした非キャップDNAマイクロアレイについて、絶対シグナル、絶対シグナル−（マイナス）バックグラウンド蛍光、およびシグナル対バックグラウンドの比を示す。
【図１０】未処理（緑色）またはγ照射（赤色）マウス胸腺組織に由来するcDNAターゲットとハイブリダイズさせた吸着マイクロアレイ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月11日(2003.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面とそこに吸着された第１の核酸とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、該表面が正電荷基で実質的に飽和されており、該第１の核酸がリンカーをもたず、かつ該表面に非共有結合で付着している、上記ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２】
前記電荷基の密度が、中心から中心まで5Åあたり約1個の電荷基である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３】
前記電荷基が均一に分布している、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４】
前記核酸が約1〜約100個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項５】
前記核酸が約12〜約60個のヌクレオチドを含む、請求項４に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項６】
前記核酸がDNAである、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項７】
前記核酸がRNAである、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
前記核酸が一本鎖である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記核酸が二本鎖である、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１１】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項８に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１２】
前記核酸が単層を形成している、請求項８に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記装置が１以上の追加の表面をさらに含んでなり、追加の各表面が正電荷基で実質的に飽和されている、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
追加の各表面が非共有結合により付着された追加の核酸で実質的に飽和されている、請求項13に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１５】
追加の各核酸の配列が前記第１の核酸と同一である、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１６】
追加の各核酸の配列が前記第１の核酸と同一でない、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１７】
前記表面がマイクロアレイフォーマットからなる、請求項14に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１８】
前記装置が支持体をさらに含んでなる、請求項１に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項１９】
前記支持体がセラミック材料、二酸化ケイ素材料、および金属からなる群より選択される材料で構成されている、請求項18に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２０】
前記装置の形状がスライドガラスおよびビーズからなる群より選択される、請求項18に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２１】
表面とそこに吸着された第１の核酸とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置であって、該表面が官能基で実質的に飽和されており、該第１の核酸がリンカーをもたず、かつ該表面に非共有結合で付着している、上記装置。
【請求項２２】
非共有結合による付着が、前記官能基と前記核酸との間の静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、ロンドン相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組合せからなる、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２３】
前記表面が前記官能基で実質的に飽和されている、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２４】
前記表面が親水性である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２５】
前記表面が疎水性である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２６】
前記官能基が極性の非電荷基、電荷基、疎水性基、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項25に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２７】
前記官能基が一級アミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、グアニジニウム基、アミジニウム基、イミダゾリウム基、アルデヒド、アルコール、ホルムアミド、SiO2、TiO2、AlO2、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項26に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２８】
前記表面が有機物質を含む、請求項25に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項２９】
前記有機物質がアミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、炭化水素、およびイソプレノイドからなる群より選択される、請求項28に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３０】
前記表面が無機物質を含む、請求項20に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３１】
前記装置が支持体をさらに含んでなる、請求項20に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３２】
前記支持体がセラミック材料、二酸化ケイ素材料、および金属からなる群より選択される材料で構成されている、請求項31に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３３】
前記装置がビーズまたはスライドガラスである、請求項31に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３４】
前記核酸が約1〜約100個のヌクレオチドを含む、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３５】
前記核酸が約12〜約60個のヌクレオチドを含む、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３６】
前記核酸がDNAである、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３７】
前記核酸がRNAである、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３８】
前記核酸が一本鎖である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項３９】
前記核酸が二本鎖である、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４０】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項21に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４１】
前記表面が前記核酸で実質的に飽和されている、請求項38に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４２】
前記核酸が単層を形成している、請求項38に記載の生体分子ハイブリダイゼーション装置。
【請求項４３】
表面とそこに吸着された核酸プローブとを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置の製造方法であって、
該表面に、飽和量の核酸プローブを、該表面への該プローブの非共有結合吸着を可能にする条件下で接触させることを含んでなり、
その際、前記表面は該核酸と該表面との非共有結合による相互作用を媒介する官能基で実質的に飽和されていることを特徴とする、上記方法。
【請求項４４】
前記官能基が陽イオン電荷基である、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記官能基が両性イオン電荷基である、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸が一本鎖である、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸がDNAである、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸がRNAである、請求項43に記載の方法。
【請求項４９】
前記接触が前記核酸プローブを溶液状態で前記表面に沈着させることを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５０】
前記接触が前記表面への前記核酸プローブの蒸着を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５１】
基体を共有結合により改変して前記表面を加工することで前記表面を形成させることをさらに含んでなる、請求項43に記載の方法。
【請求項５２】
前記共有結合による改変がアミノシラン化である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記基体がスライドガラスである、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
前記表面をキャッピングすることをさらに含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５５】
前記キャッピングがキャッピング物質を蒸着することを含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記キャッピングが界面活性剤を付着させることを含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５７】
溶液状態のターゲット核酸をプローブ核酸にハイブリダイズさせる方法であって、
表面とそこに吸着された核酸プローブとを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置に、少なくとも１つの溶液状態のターゲット核酸を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でさらし、プローブ-ターゲットハイブリッドを形成させることを含んでなる、上記方法。
【請求項５８】
前記官能基が陽イオン電荷基である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記官能基が両性イオン電荷基である、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸が一本鎖である、請求項57に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸がDNAである、請求項57に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸がRNAである、請求項57に記載の方法。
【請求項６３】
ヌクレオチド結合性タンパク質が結合するヌクレオチド配列を同定する方法であって、
表面と核酸プローブ-ターゲット二重鎖とを含んでなる生体分子ハイブリダイゼーション装置に、ヌクレオチド結合性タンパク質を、結合を可能にする条件下で接触させ、
形成された二重鎖-タンパク質複合体を該表面から溶出し、
溶出された二重鎖の少なくとも一方の鎖を配列決定する、
ことを含んでなり、
その際、該核酸プローブは該表面に非共有結合により付着しており、該ターゲット核酸が該核酸プローブにハイブリダイズしていることを特徴とする、上記方法。
【請求項６４】
前記溶出が、二重鎖-タンパク質複合体を有する少なくとも１つの表面を塩溶液と接触させることを含む、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
塩溶液が約1M〜約5M NaClの水溶液のイオン強度を有する、請求項64に記載の方法。
【国際調査報告】
2004534546.tif 000077
2004534546.tif 000078
2004534546.tif 000079
2004534546.tif 000080