(57)【要約】本発明は、写真用ハロゲン化銀乳剤に関する。これらの乳剤は核生成ペプタイザーを含み、該核生成ペプタイザーは１００個以下のアミノ酸からなり、（ｉ）少なくとも２個の銀結合アミノ酸と該銀結合アミノ酸2個の間にある９８個以下のアミノ酸から構成されるか、又は（ii）＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有する９〜１００個のアミノ酸ストレッチで構成される少なくとも1つの領域Ａ、並びに少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有し、メチオニン残基を含まない少なくとも1つの領域Ｂ（領域Ａから分離している）を有するポリペプチドである。上記乳剤には、上記核生成ペプタイザーと同様の特質を備えるが、上記核生成ペプタイザーより長い領域Ａと大きい全長を有する成長ペプタイザーが含まれていてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核生成ペプタイザーを含むハロゲン化銀乳剤において、該核生成ペプタイザーが、
１００アミノ酸を最長とし、（ｉ）ヒスチジン、リシン及びアルギニンから選択され、メチオニン若しくはシステインを含まない少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端の銀結合アミノ酸を境界として有するか、又は（ii）＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、かつ少なくとも９個のアミノ酸を含むがシステイン若しくはメチオニンを含まないアミノ酸の最長ストレッチによって定義されるかのいずれかである少なくとも１つの領域Ａ（ｎ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、メチオニン若しくはシステインを含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）
を含むポリペプチドであることを特徴とするハロゲン化銀乳化剤。
【請求項２】
銀結合アミノ酸がヒスチジンであることを特徴とする請求項１記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項３】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）に少なくとも２個のヒスチジンがあることを特徴とする請求項１又は２いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項４】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）が、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項５】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）が、４〜５０個、好ましくは６〜２０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項６】
領域Ａ（ｎ）を含む最長ストレッチの少なくとも半分のストレッチが該領域Ａ（ｎ）の外に銀結合アミノ酸を含まないことを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項７】
少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）が領域Ａ（ｎ）から分離していることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項８】
領域Ｂ（ｎ）が、−１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有することを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項９】
領域Ｂ（ｎ）が、アミノ酸２０個における移動自由エネルギーの移動平均が＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下に相当する移動極性を有することを特徴とする請求項１〜８いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１０】
領域Ｂ（ｎ）が、５０〜９００個、好ましくは１００〜６００個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１〜９いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１１】
３つ以上の領域Ａ（ｎ）をもたず、好ましくはただ１つの領域Ａ（ｎ）をもつことを特徴とする請求項１〜１０いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１２】
ポリペプチドがコラーゲン様であり、ＧがグリシンでＸ及びＹの５〜５０％がプロリンであるアミノ酸トリプレットＧＸＹを５０％を超えて有することを特徴とする請求項１〜１１いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１３】
さらに成長ペプタイザーを含むハロゲン化銀乳剤であって、該成長ペプタイザーが、
１０１個以上で総アミノ酸数の最大１／３部までのアミノ酸からなり、少なくとも２個の銀結合アミノ酸を含む少なくとも１つの領域Ａ（ｇ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔFに相当する極性を有し、メチオニン残基を含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｇ）
を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１２いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１４】
領域Ａ（ｇ）が、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１３記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１５】
核生成ペプタイザー及び成長ペプタイザーの少なくとも１つが組換え又は合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１６】
平板状であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１７】
５．０を超えるｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）において少なくとも２個の銀結合ヒスチジンの最両端の銀結合ヒスチジンを境界として有する領域Ａ（ｎ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
メチオニン又はシステインを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項１８】
８．０を超えるｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）においてヒスチジン、リシン及びアルギニンから選択される少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端の銀結合アミノ酸を境界として有する領域Ａ（ｎ）（ｉ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
メチオニン又はシステインを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項１９】
５．５未満のｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）において少なくとも２個かつ４個までの銀結合メチオニンの最両端の銀結合メチオニンを境界として有する領域Ａ（ｎ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
システインをもたず、領域Ａ（ｎ）の外にメチオニンを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２０】
成長ペプタイザーとして適した組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、１０１個以上で総アミノ酸数の最大１／３部までのアミノ酸からなり、少なくとも２個の銀結合アミノ酸と、これら少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端間に存在する少なくとも９９個のアミノ酸で構成され、上記少なくとも２個の銀結合アミノ酸が３個以上のメチオニン残基をもたず、及び／又は少なくとも２個のヒスチジン残基をもち、システインを含まない１つ又は２つの領域Ａ（ｇ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有し、メチオニン又はシステインを含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｇ）（領域Ａ（ｇ）から分離している）
を有することを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２１】
領域Ａ（ｎ）が、０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１７〜２０いずれかに記載の組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２２】
領域Ａをただ１つ有することを特徴とする請求項１７〜２１いずれかに記載の組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀分散性をもつバイオポリマー、及びこれらのバイオポリマーを含み、改良写真製品への使用に適した乳剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
写真紙材又はフィルムの製造方法は、ラミネート紙、又はトリアセテートセルロースフィルム等の透明ポリマー支持体のいずれかの表面に数層のコーティングを施す工程からなる。これらの層には、主要成分として感光性ハロゲン化銀結晶を含む乳剤層及びかかる感光成分を含まない中間層がある。
【０００３】
ハロゲン化銀粒子の形成過程は、一般にペプタイザーと称される分散剤を使用して制御される。核生成ペプタイザー（nucleation peptiser）は、凝集が制御されずに発生することを回避するためにハロゲン化銀粒子の沈殿過程で使用される。成長ペプタイザー（growth peptiser）は、成長過程においてハロゲン化銀結晶に対する分散安定剤として使用され、その機能性は成長の種々の過程において、また貯蔵条件下で結晶の安定性が必要とされる成長過程以降においても利用される。高縦横比（aspect ratio）を示す平板状粒子には、向上した尖鋭度、速度・粒子形成関係の改善、現像速度の短縮、及び銀被覆力の増強など、写真にとっての利点がいくつかあることは広く知られていることである（Research disclosure, Vol.225 Jan.1983, Item 22534；欧州特許第０６１０７９６Ａ号）。高縦横比である平板状粒子だけでなく、粒子サイズ分布範囲の狭い平板状粒子を製造することもこれまで所望されてきた。これは単分散性又はホモ分散性が所望されていると表現することもできる。
【０００４】
ポリペプチドはペプタイザーとして写真製造過程でよく用いられている。ポリペプチドとして適しているのは、多様な形態のゼラチン等のコラーゲン様タンパク質である。商業目的に用いられるゼラチンは、動物の骨や皮など動物由来であることが一般的である。かかる材料には、非コラーゲンタンパク質、ムコ多糖類、ポリ核酸及び脂質などの不純物が存在することや、また成分特質が明確に定義されていないため再現性がないという欠点がある。さらに、いずれの成分が最適活性のために実際に必要とされているかについても不明瞭である。写真製造過程の種々の段階で使用されるゼラチン成分に統一性が欠如していることから、写真製造過程に再現性があるかどうかには疑問が残る。
【０００５】
米国特許第５５８０７１２、５６７０６１６及び５７１０２５２号は、修飾コラーゲン様ポリペプチド、その製造方法、及び写真へのその利用に関するものである。これらの特許には、５０ｍＶ未満の銀結合力をもつコラーゲン様ペプタイザーにより、極薄平板状粒子が得られることが開示され、合成により作製された多数の２５アミノ酸長ポリペプチドを例に取り説明している。これらの特許にはまた、組換え技術により作出したコラーゲン様構造のポリペプチドが開示されている。この組換えポリペプチドは、４種類のアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ）からなるブロックコポリマー構造をとる合成ポリペプチド、或いはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｇｌｙ−ｌｅｕ−Ｘａａ2−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（ここで、Ｘａａ1とＸａａ2はＭｅｔ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ又はＧｌｎである）から始まる２５−ｍｅｒのペプチドである。
【０００６】
欧州特許出願第０９２６５４３及び同１０１４１７６号は、平板状粒子が全粒子投影面積の７５％を超えるハロゲン化銀乳剤の製造に、組換えコラーゲン様バイオポリマーを用いることについて開示している。これらのコラーゲン様材料はプロテアーゼの影響を受けることなく、高発現率ながら経済的に実行可能な発現率で作出され、かかる組換え材料は、より優れた写真特質を備えた写真ハロゲン化銀乳剤の調製に用いることができる。
【０００７】
ＷＯ９２１０５６７号には、へリックスにおける個々の「螺旋」が極性側と非極性側を有し、かかる両親媒性タンパク質が界面全体を覆うように平坦に折りたたまれたへリックス構造が開示されている。特開平０９−２７８７９３（Ａ）号には、疎水性及び親水性領域がヘリックス構造の反対側にそれぞれ位置している同様の構造が開示されている。これらの特許出願は写真への利用を意図するものではなく、開示されているタンパク質もその界面表面が広く覆われてしまうために写真への利用には適さない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、ハロゲン化銀結晶をより良好な分散状態に保つ改良ハロゲン化銀分散性を備えたペプチドを提供することにある。本発明の別の目的は、均一な粒子サイズ分布を示す写真乳剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、平板状結晶の数が増大した写真乳剤を提供することにある。本発明は、組換えペプタイザーを使用する際のコスト軽減もまた目的としている。本発明の目的はまた、良好なハロゲン化銀結晶分散安定性をもつ写真乳剤を提供することにある。
【０００９】
ハロゲン化銀乳剤中の核生成ペプタイザー（nucleation peptiser）として本明細書の請求項にあるポリペプチドを用いることにより、驚くことに上述の目的は全て達成される。従って本発明は、核生成ペプタイザーを含むハロゲン化銀乳剤に関し、該核生成ペプタイザーは、
（ｉ）ヒスチジン、リシン及びアルギニンから選択され、メチオニン若しくはシステインを含まない少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端のアミノ酸を境界として有するか、又は（ii）＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、少なくとも９個のアミノ酸からなるが、システイン若しくはメチオニンを含まないアミノ酸最長ストレッチによって定義されるかのいずれかで最大アミノ酸長が１００である少なくとも１つの領域Ａ（ｎ）、及び
少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、メチオニン若しくはシステインを含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）を有するポリペプチドである。
【００１０】
本発明はまた、上に示した乳剤に用いる核生成ペプタイザー及び成長ペプタイザーにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ハロゲン化銀に対する高親和性を有する領域Ａ（ｎ）と、ハロゲン化銀に対する高親和性をもたずに分散特質を有する領域Ｂという機能の異なる領域Ａ（ｎ）及びＢを有し、核生成ペプタイザーとして用いる二機能ポリペプチドを提供するものである。また本発明は、領域Ａ（ｇ）においてハロゲン化銀に対する高親和性を有し、領域Ｂにおいてはハロゲン化銀に対する高親和性をもたずに分散特質を有し、成長ペプタイザーとして用いる上記と同様な二機能ポリペプチドも提供し、また、これらの核生成及び成長ペプタイザーを組み合わせて写真ハロゲン化銀乳剤に使用する方法も提供する。
【００１２】
ポリペプチドとしては組換えポリペプチドが好ましい。本発明はまた、上述の二機能ポリペプチドを含むハロゲン化銀乳剤を提供するものである。本発明のポリペプチドは、ハロゲン化銀結晶表面が遮断されるという望ましくない現象を生じることなく従来のポリペプチドやタンパク質における必要濃度より低濃度で良好な分散安定性が得られるという点において先行技術のポリペプチドより優れている。
【００１３】
領域Ａ（ｎ）の機能は、銀イオンへの強い結合によりポリペプチドをハロゲン化銀表面に結合させることである。この機能は基本的に、硫黄、窒素等の自由電子を共有する能力を備えた元素を有するアミノ酸が関与する相互作用により、又はイソロイシン、ロイシン、バリン及びフェニルアラニン（並びにノルロイシン等の類似の非天然型アミノ酸）などの疎水性アミノ酸が関与する疎水相互作用により、或いはこれらの相互作用が複合することによりもたらされる。本明細書における「ハロゲン化銀表面への結合」なる表現は、銀イオンへの結合を意味している。
【００１４】
メチオニン及びヒスチジンはハロゲン化銀に対し高親和性である。メチオニン及びヒスチジンについて言及するときは、修飾されていないアミノ酸を指している。酸化メチオニンなどのように、銀結合能力の一部又は全部を消失した修飾アミノ酸は、ここには含まれない。上述のアミノ酸以外にも、リシンやアルギニン等のアミノ基を含む側基をもつアミノ酸もまた適当である。Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓにおけるカルボキシ基若しくはアミノ基のような側基をもつアミノ酸等の銀結合性を備えた非天然型アミノ酸又は誘導アミノ酸も使用することができる。これらの側基は以下に列記する物質と結合させることにより修飾されている。
−アミノトリアジン及びアミノピリミジン（例：２，４−ジアミノ−１，３，５−トリアジン、４−アミノピラゾロ［３，４，ｄ］ピリミジン、４，６−ジアミノピリミジン、４，６−ビス（メチルアミノ）ピリミジン、４，５，６−トリアミノピリミジン、５，６−ジアミノ−４−（Ｎ−メチルアミノ）ピリミジン、４，５，６−トリス（Ｎ−メチルアミノ）ピリミジン、４，６−ジアミノ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリミジン、４，６−ジアミノ−５−（Ｎ−ヘキシルアミノ）ピリミジン、
−アミノアザインデネス（例、アデニン、グアニン）、
−ヨードフェノール（例、２，６−ジヨードフェノール、２，４，６−トリヨードフェノール、２，６−ジヨード−４−ニトロフェノール）、
−欧州特許第０７３７８８７号明細書第３頁に記載されているごとく、共鳴安定化したπ−電子対をもつ窒素原子を少なくとも1個有する有機化合物であって、唯一のヘテロ原子として窒素を有する（例、ピリジン、ピロール、ピロリジン、キノリン）、又は窒素原子とさらに少なくとも1個のヘテロ原子を有する（例、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、オキサゾール、ピペラジン、トリアゾール、テトラゾール、オキサジアゾール、オキサトリアゾール、ジオキサゾール、ピリミジン、ピリミダゾール、ピラジン、トリアジン、テトラジン、ベンゾイミダゾール）置換若しくは非置換及び飽和若しくは不飽和複素環化合物等の含窒素複素環化合物を有する有機化合物。
【００１５】
核生成ペプタイザーの領域Ａ（ｎ）は少なくとも２個のアミノ酸、最長で１００個のアミノ酸からなり、３〜５０個のアミノ酸、さらには４個から、よりさらには６個から２０個までのアミノ酸からなることが、より好ましい。領域Ａは、銀イオンに強く結合するアミノ酸を少なくとも２個有する。銀イオンに強く結合する基が少なくとも２個存在することにより、良好な影響がポリマー慣性にもたらされる。すなわちポリペプチドが吸着されるためには、両方の、又は3個以上の場合は全ての結合アミノ酸が同時に吸着されなければならないことになるからである。結合基の数が増加すると、全体としてポリペプチドが吸着される機会が減少することになる。領域Ａ（ｎ）を含む上記最長ストレッチの少なくとも半分の長さのストレッチが、上記領域Ａ（ｎ）の外に銀結合アミノ酸をもたないことが好ましい。より好ましくは、領域Ａは、アミノ酸最長ストレッチ（１００、５０又は２０）内において２個の末端銀結合アミノ酸を有する最大部分であると定義される。すなわち領域Ａ（ｎ）を有する最長ストレッチは、上記領域Ａ（ｎ）の外に銀結合アミノ酸をもたないのである。所定のアミノ酸配列において２個以上の銀結合アミノ酸に基づいて領域Ａの範囲を定めるという選択をする場合、領域Ａは、２個の銀結合アミノ酸の間（両該アミノ酸を含む）において分断されていない一番長いストレッチであると定義される。しかし例えばポリペプチドが約１００アミノ酸からなるストレッチであり、そのストレッチ内で２つの領域Ａが該ストレッチのＣ末端及びＮ末端近傍にそれぞれ位置し、これら２つの領域Ａが部分Ｂによって分離されているとき、上述した好ましい定義はこのような構造を排除しない。
【００１６】
銀イオンに強く結合するアミノ酸はヒスチジンであることが好ましい。銀イオンに最も強く結合するのはメチオニンである。メチオニンの特徴は、その銀イオンへの結合がｐＨに依存せず、従って広範なｐＨにおいて利用できることである。しかしメチオニンの銀への結合力は、写真乳剤用として理想的な銀結合アミノ酸ではない。銀に対するバインダーとして他のアミノ酸を用いることができない場合においてのみ、特に低ｐＨ値（約５．５未満、特に５．０未満）の場合においてメチオニンを本発明のペプタイザーとして用いてもよい。それより高ｐＨ値では銀結合領域にメチオニンが存在しないことが好ましい。組換え又は合成構造物を構築する際に結合部分Ａにメチオニンを含め、該メチオニンを酸化等により修飾してメチオニンの銀イオンへの結合能を消失させることも考えられるが、組換え又は合成方法ではメチオニンの存在を回避する機会が得られるので、その可能性は考慮しない。銀イオンに対するヒスチジンの結合性はメチオニンのそれより弱いが、ヒスチジンにはｐＨを変化させることによって銀への結合力を調節できるというさらなる特質がある。これにより、ヒスチジンを有する組換えポリペプチドの結合力をハロゲン化銀乳剤製造過程の各段階に適したものにすることが可能になる。領域Ａ（ｎ）には少なくともヒスチジンが２個あることが好ましく、少なくとも３個あることがより好ましい。８．０以上、特に８．５以上という高ｐＨ値にあっては、リシンやアルギニンといった遊離窒素含有アミノ酸を銀イオンへの結合に用いることができる。かかる高ｐＨ値においては、上記アミノ酸が、つまりリシンやアルギニンが、領域Ｂ（ｎ）に存在しないことが好ましい。種々の実施例にみる領域Ａ及びＢにおいて必要なアミノ酸成分は下記のとおりである。
【００１７】
【表ａ】
2004520611.tif 000002
領域Ａ（ｎ）の極性は種々に変化してもよいが、領域Ｂ（ｎ）は比較的極性を示すものでなければならない。本発明において用いられるポリペプチドにおける各領域の極性は、ポリマーの極性及び非極性部分を構成する個々のアミノ酸の移動自由エネルギー（ＴＦＥ）との関連においてそれぞれ求められる。ここで移動自由エネルギー（ΔＦ）とは、α−へリックス中のアミノ酸残基において膜内部から水層へと移動するエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅで表される）である。かかるエネルギー値を、Engelman et al, Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15 (1986), 330 に従って求め、以下の表にまとめた。
【００１８】
【表ｂ】
2004520611.tif 000003
所定のアミノ酸配列の極性は、ここでは該配列中のアミノ酸毎の平均移動自由エネルギーとして求められ、その値は、各アミノ酸の数と各アミノ酸の移動自由エネルギーとの積の合計を総アミノ酸数で割った値と一致する。次式で表される。
【００１９】
極性＝（Σｎi＊ΔＦi）／ｎt
ｎiは各アミノ酸の数、ΔＦiは対応するアミノ酸の移動自由エネルギー、またｎtは総アミノ酸数を表す。Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏのアミノ酸配列からなる１５−ｍｅｒの非極性ペプチドを例にとると、このペプチドは、５Ｇｌｙ＋５Ｐｒｏ＋１Ｖａｌ＋２Ｐｈｅ＋１Ｉｌｅ＋１Ｌｅｕというアミノ酸構成であり、従って次の極性を有する（アミノ酸毎のｋｃａｌ／ｍｏｌｅで表す）。
【００２０】
（５*１．０＋５*−０．２＋１*２．６＋２*３．７＋１*３．１＋１*２．８）／１５＝１９．９／１５＝＋１．３３
非極性配列は通常正の極性度を示し、極性配列は負の極性度を示す。
【００２１】
領域Ａ（ｎ）の極性は、正の平均ＴＦＥ値、すなわちΔF＞０に対応して低いことが考えられる。疎水性が十分であれば（低極性）、核生成ペプタイザーに特異的銀結合アミノ酸が１若しくは２個存在する必要はない。その場合の平均ΔFは、少なくとも＋１．０又は＋１．３又はそれを超える値でなければならない。従って領域Ａ（ｎ）は、（ｉ）２個（最も離れて位置する）の銀結合アミノ酸及びこれら２個のアミノ酸間に位置する０〜９８個の中間アミノ酸（上述したように中間アミノ酸には銀結合アミノ酸がさらに含まれていてもよい）、或いは（ii）平均ΔFが＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅから選択されるアミノ酸を少なくとも２個含み、Ｍｅｔ若しくはＣｙｓを含まない少なくとも９個から最大１００個までのストレッチのいずれかを範囲とする。実施態様（ii）においては、領域Ａ（ｎ）の平均ΔFが少なくとも＋１．３以上であるか、或いは該領域が少なくとも１６アミノ酸長であるか、或いはその両方であることが好ましい。領域Ａ（ｎ）（ii）の好ましい長さは１６〜１００、最も好ましくは２６〜５０アミノ酸長である。
【００２２】
本発明の組換えポリペプチドの利点は、ハロゲン化銀表面に結合する領域Ａの他に、領域Ａとは異なりハロゲン化銀表面への結合性が低い領域Ｂを有することである。アミノ酸毎の平均移動自由エネルギーが、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−１．３ｋｃａｌ以下となるように、領域Ｂには十分数の極性アミノ酸が存在している必要がある。領域Ｂが全体としておおよそ一定に高極性を示すことが好ましい。従って、アミノ酸２０個における移動自由エネルギーの移動平均が＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下に相当する移動極性を領域Ｂが有していることが好ましい。少なくとも２種の酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）が領域Ｂに存在することが有利である。リシン及びアルギニンは、自身の等電点を大きく下回るｐＨ下（特にｐＨ３〜８）で用いることができ、その場合これら両アミノ酸は、実質的にハロゲン化銀表面に結合せずに、領域Ｂの極性に影響を及ぼす。領域Ｂに存在する銀結合アミノ酸数は３個未満が好ましく、さらに２個未満が好ましく、０個であることが最も好ましい（ｐＨ＞８でＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ｐＨ＞５．５でＨｉｓ；全ｐＨでＭｅｔ及びＣｙｓ）。
【００２３】
立体反発、すなわちポリペプチドが吸着されるハロゲン化銀粒子間における反発を十分に生じせしめるため、領域Ｂは少なくとも５０個のアミノ酸からなり、１００〜６００個のアミノ酸からなることが好ましい。低結合領域である領域Ｂは結合部位から分散媒体へと伸張し、それにより立体反発による凝集を防いでいる。この機能は、設計上機能性部分をもたない天然、組換え又は合成ポリペプチドによっても得ることができる。しかし、本発明の組換えポリペプチドと比較した場合、これらの材料には重大な欠点がある。
【００２４】
ゼラチン等の従来型ポリペプチドにおける結合基は、ポリペプチド鎖上に多かれ少なかれランダムに分散している。その結果、従来型ポリペプチドは低濃度にあっては、ハロゲン化銀表面に対し平面方向に（in a flat orientation）ハロゲン化銀に吸着される。結合基間の非結合領域では、いくつかのループが形成されるものの、従来型ポリペプチドにおいて低濃度下で認められる立体反発は無視し得る程度のものである。上述の従来型材料を用いて許容される程度の立体反発を得るためには、分散媒体内に伸張していく遊離ポリペプチド「尾部」が十分量存在し得る前に、従来型ポリペプチドの吸着層が存在していなければならない。これには、高価なポリペプチド材料の多くが立体反発における所望効果を得ることに貢献することなく消費されるという難点がある。さらに従来型ポリペプチドは、結晶表面を効果的に遮断してしまうため、該表面で生じる双晶などのプロセスが阻害されるというさらなる難点がある。本発明による組換えポリペプチドには、既に低い濃度においてもかかる材料が結晶表面を遮断することなく立体反発をもたらすという長所がある。
【００２５】
領域Ａは、単一の領域Ｂに連結する単一の領域であることが好ましい（Ａ−Ｂ）。２つの領域Ｂに連結する単一の領域Ａ（Ｂ−Ａ−Ｂ）、又は１若しくは２以上の領域Ｂに連結する複数の領域（Ａ−Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ）等であってもよい。領域Ａ及びＢは（Ａ）又は（Ｂ）に該当しない無関係小領域、すなわち例えば、より低い極性（ΔＦ＞−０．５）を示し、３０アミノ酸以下の銀非結合領域によって分離されていてもよい。上記例に示されているように、領域Ａは３つ以上存在しないことが好ましく、１つであることがより好ましい。領域Ａが２つ存在する場合、かかる２つの領域Ａは領域Ｂにより分離されていなければならず、それに加えさらに１つ又は２つの短い無関係領域によっても分離されることもある。末端領域として非Ａ、非Ｂ無関係領域が存在しないか、又は存在しても非常に短い領域（アミノ酸長１０未満）であることが好ましい。ポリペプチド全体に非Ａ、非Ｂ領域が存在しないか、存在しても極めて短い領域（６アミノ酸以下）であることが最も好ましい。あるタイプの領域が、別タイプの１つ又は２つ（３つでもよい）の領域と結合するのは、「通常」のペプチド結合であるか、或いはコラーゲン型架橋が関与する結合、すなわち結合する各鎖に含まれるヒドロキシリシン（リシン残基の酸化によって得られる）との化学結合による結合であると考えられる。ポリペプチド全体としては、５２〜約数千アミノ酸長であり、７５〜約１２００アミノ酸長（約８〜１３０ｋＤａ）が好ましく、約１００〜６００アミノ酸長（約１１〜６５ｋＤａ）が最も好ましい。
【００２６】
ポリペプチドとしては、上に示したように種類の異なる領域であるＡ及びＢにおける銀結合性や極性の要件を満たすポリペプチドであればどのようなものでもよい。本発明に有用に用いられるポリペプチド型は、コラーゲン型ポリペプチドである。コラーゲン型ポリペプチドとは、少なくとも２１アミノ酸、又は総アミノ酸数の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％がトリプレット形態を呈し、各トリプレットの配列はＧＸＹであり、Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｙはアミノ酸である。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸中、少なくとも１７％から６７％までがプロリンであることが好ましく、特にトリプレットの少なくとも半分がＧＸＰ又はＧＰＹの配列をとることが好ましい。
【００２７】
成長ペプタイザーは、少なくとも２個の銀結合アミノ酸で構成される領域Ａ（ｇ）を少なくとも１つ有し、該領域Ａ（ｇ）は、その最両端の銀結合アミノ酸を境界として有する、１０１個以上かつ総アミノ酸数の１／３部までのアミノ酸で構成されている。領域Ａ（ｇ）のアミノ酸は、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均ＴＦＥに相当する低極性であることが好ましい。成長ペプタイザーには常に少なくとも２個の銀結合アミノ酸が含まれていなければならない。銀結合アミノ酸は３個以上あることが好ましく、その内少なくとも２個はヒスチジンであり、メチオニンは４個以上含まれないことが好ましく、３個以上含まれないことがより好ましい。成長ペプタイザーは、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個さらには少なくとも２００個のアミノ酸を有し、平均ＴＦＥが−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満に相当する極性を有し、好ましくは−１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であり、メチオニン又はシステインを含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｇ）も有している。従って、核生成ペプタイザーに対するときの方が厳しいメチオニンに関する要件を除き、成長ペプタイザーの特質は、上述した核生成ペプタイザーの特質にかなり一致しているが、成長ペプタイザーの方が大きい。成長ペプタイザーは、少なくとも１８０アミノ酸長から数千アミノ酸長であることが好ましく、少なくとも２４０アミノ酸長から、例えば１８００アミノ酸長までのものがより好ましい。
【００２８】
本発明によるハロゲン化銀乳剤としては、実質的にへリックス構造をとらない組換えポリペプチドが好適である。かかる組換えポリペプチドはいかなるへリックス構造もとらないことが好適である。ハロゲン化銀乳剤製造に適用される約３５℃という高温度下では通常へリックス構造は形成されない。ハロゲン化銀の核生成は、より広い温度範囲で実施でき、より具体的には従来の核生成時の温度（約３５℃）より低温（１５〜２５℃）で実施でき、へリックス構造は通常かかる低温度範囲において形成されるので、（トリプル）へリックス構造が存在しないことは有利である。ハロゲン化銀乳剤製造技術分野では、低温度範囲での核生成が望まれている。その方がハロゲン化銀の粒子サイズ分布が狭くなるからである。へリックス構造の不在による利点はこれ以外にも、低温度下ではポリペプチドがハロゲン化銀表面からさらに分散媒体へと伸長していくことが挙げられる。分散安定性は、数ある要素の中でもハロゲン化銀表面から分散媒体へと伸長するポリペプチド鎖の長さに依存している。
【００２９】
（トリプル）へリックス構造を確実に存在させないようにするために、ハロゲン化銀乳剤の核生成ペプタイザー及び成長ペプタイザー双方の組換えポリペプチドがヒドロキシプロリンをもたないことが、本発明の実施態様として好ましい。従って、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることによって作製すると、該遺伝子をもつ有機体は好ましいことにプロリン−ヒドロキシル化酵素を発現しない。本発明のポリペプチドはシステイン残基を含まないことが好ましい。なぜならシステインの銀への結合力は強すぎ、望ましくない折りたたみや結合がポリペプチドに生じる恐れがあり、分散効率が阻害されるからである。同様に、核生成ペプタイザーが２個以下のメチオニンを、成長ペプタイザーが４個以下のメチオニンをそれぞれ有していてもよい酸性ｐＨ（５．５未満）以外では、本発明のポリペプチドはメチオニン残基を含まないことが好ましい。システイン（及びメチオニン）の存在を容易に回避できない場合は、例えば酸化及び／又はアルキル化によってこれらのアミノ酸を修飾し、その折りたたみや錯化作用を抑制することが好ましい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、その長さに応じ、核生成ペプタイザー、成長ペプタイザー又はその両方として好都合に使用できる。欧州特許第０２２８２５６号、同第０８４３２０８号に例示されているように、核生成中、強力すぎる結合性は回避しなければならず、上記特許の教示によれば核生成中の結合性は、ポリペプチド１ｇあたり、３０μｍｏｌ未満のメチオニンに相当する結合性でなければならない。
【００３１】
好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドは、（１１１）主平面を備えた薄い平板状（tabular）ハロゲン化銀結晶の製造に用いられる。上記組換えポリペプチドは、ハロゲン化銀表面を遮断することなく良好な分散安定性が得られるという点で、核生成ペプタイザーとして有利である。例えば米国特許第５０８７５５５号の教示によれば、結晶表面で生じる制御された二重双晶現象に基づいて平板状結晶を定量している。ヒスチジンを使用するとｐＨを調整して結合力を調節できるので、核生成中はヒスチジンを優先的に結合アミノ酸として使用している。米国特許５０８７５５５号には、結合力が双晶に影響するとの教示もある。これに加えて本発明のポリペプチドを用いることにより、ハロゲン化銀乳剤製造過程の後期段階においても結合力を制御する方法がもたらされることもさらなる利点である。核生成後、ｐＨを熟成に最適な結合力をもたらすように調整することができ、さらに後の段階では最適貯蔵期間を実現するために結合力を最大化することができる。
【００３２】
結晶界面で生じる他の過程においても本発明のコラーゲン様ポリペプチドを使用する方が、従来型コラーゲン様材料を使用するより有利である。スペクトル増感剤の吸着は吸着されたコラーゲンに影響される。本発明のコラーゲン様ポリペプチドを用いることにより、より多くの増感剤を表面に吸着せしめる方法が実現する。特別に分離された部分を設けることの機能上の長所、つまり各部分が独自の機能性を有するという長所を、狭い分子量分布範囲、コンタミネーションを生じることのない高い再現性、生分解性に対する感受性の低減などの組換えコラーゲン様ポリペプチドに認められている他の長所と有利に組み合わせる。
【００３３】
別の実施態様においてはポリペプチドが、銀イオンに対し強力な結合性を示す領域Ａ、及び側基が修飾されたアミノ酸を有する領域Ｂを有している。写真用として有用な基に結合したカルボン酸基が活性化させられ、いわゆる活性化カルボキシルとなる。欧州特許第０５７６９１１号及び同０４８７６８６号には、かかる活性化カルボキシルが、上記領域Ｂに存在するアミノ酸（例えばリシン）のペンダントアミノ基と反応してアミド結合が形成されるとの教示がある。カルボキシルアクティベーターを加えることにより、上記領域Ｂに存在するアミノ酸（例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸）のペンダントカルボキシル基を活性化することも可能であり、その後、アミノ基を有する写真用として有用な基がアミド結合により上記アミノ酸に結合する。上記領域Ｂに結合する写真用として有用な基には、現像スカベンジャー（developer scavengers）、紫外線吸収剤、蛍光増白剤等がある。これは、従来このような写真用として有用な化合物を写真乳剤層に溶解したり、又は疎水性溶媒にまず溶解した後に写真乳剤層に分散していた先行技術より有利である。これらの従来方法には、環境に悪影響を及ぼす溶媒が使用され、また写真用として有用な化合物の望ましくない分散が生じるという問題がある。上に示した以外にも、琥珀酸化、フタル酸化、ビニルスルホン酸化、 アリルスルホベタイン化、フッ素化などの修飾を上記領域Ｂに施すことも可能であり、それによる利点は、例えばドイツ特許４２３１２７８号、米国特許第５０８７６９４号、同第３１３２９４５号、同第５３１６９０２号、又はThe Imaging Science Journal Vol 45, no3/4, 1997, 102-106、S.J. Brand, Photographic Gelatin, Royal Photographic Society, 1987, 206に記載されている。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、欧州特許出願公開第０９２６５４３号及び同１０１４１７６号に記載されているように組換え法により作製できる。従ってコラーゲン様ポリペプチドは、かかるポリペプチドをコードする核酸配列を適当な微生物を用いて発現させることによって作製できる。この方法は真菌細胞又は酵母細胞を用いることにより適切に実施できる。宿主細胞としては、Hansenula、Trichoderma、Aspergillus、Penicillium、Neurospora、又はPichia等の高発現宿主細胞が適当である。真菌及び酵母細胞は、反復配列の不適当な発現に対して細菌より低感受性であることから細菌より好ましい。最も好ましいのは、宿主細胞が、発現されたコラーゲン構造を分解するプロテアーゼを高レベルに含まないことである。この観点からPichiaが非常に適切な発現系として例示される。
【００３５】
コラーゲン様配列をフィブリルにプロセシングする活性な翻訳後プロセシング機構を微生物が有していないことが好ましく、それにより、へリックス構造は確実に発現産物に存在しなくなる。コラーゲン様配列をトリプルへリックスにプロセシングする活性な翻訳後プロセシング機構を微生物がもたない場合、及び／又は発現させる核酸配列にプロコラーゲンやテロペプチドをコードする配列がない場合にも上記プロセスが生じることがある。コラーゲン産生に関する技術分野で従来示唆されてきたこととは相反するが、コラーゲンのトリプルへリックス会合に必要とされる酵素のプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現させる遺伝子が、使用する宿主に含まれていなくてもよい。宿主細胞や発現させる配列に関する知識とあわせ、本明細書に示すパラメーター要件に基づいて既知の産業用の酵素産生真菌宿主細胞、特に酵母細胞のなかから適切な宿主細胞を選択して、写真への利用に適した本発明の組換えコラーゲンを発現させるのに適切な宿主細胞を提供することは、当業者には可能なことである。
【００３６】
或いは、本発明のポリペプチドは化学的手法により、すなわち適当な化学的ペプチド結合方法を用いて個々のアミノ酸又はアミノ酸鎖を結合させることにより、全体的に若しくは部分的に作製される。例えば組換え法により作製された領域Ｂをもつポリペプチドを、領域Ｂのオリゴペプチド若しくはポリペプチドと化学的に結合させ、本発明のポリペプチドを作製してもよい。化学合成は一般的に組換えによる作製より複雑であるが、化学合成により、非天然型アミノ酸又は誘導アミノ酸も含まれ得る種々の型のサブユニットを組み合わせることが可能になる。
【００３７】
感光材料の写真乳剤層に好適に使用される本発明のハロゲン化銀は、約３０ｍｏｌ％以下のヨウ化銀を含有するヨード臭化銀、ヨード塩化銀、又はヨードクロロ臭化銀である。特に好適なハロゲン化銀は、それぞれ約２ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のヨウ化銀を含有するヨード臭化銀又はヨードクロロ臭化銀である。写真乳剤に含まれるハロゲン化銀粒子としては、立方体、８面体、及び１４面体（decatetrahedrons）等の規則結晶、球状及び平板状等の不規則結晶、双晶平面等の欠陥結晶、又はこれらを組み合わせた形状のものが可能である。ハロゲン化銀の粒子サイズとしては、粒子直径が約０．２μｍ以下の微粒子から、粒子の投影面積の直径が１０μｍ位までの大粒子に至る範囲が可能である。さらにハロゲン化銀乳剤は、多分散乳剤若しくは単分散乳剤のいずれでもよいが、単分散乳剤であることが好ましい。本発明において使用可能なハロゲン化銀写真乳剤は、例えば、リサーチディスクロージャー（Research Disclosure、以下ＲＤと略記）１７６４３号（１９７８年１２月）の２２〜２３頁 "I. Emulsion Preparation and Types"、ＲＤ１８７１６号（１９７９年１１月）の６４８頁、及びＲＤ３０７１０５号（１９８９年１１月）の８６３〜８６５頁、 P. Glafkides, "Chimie et Physique Photographiques", Paul Montel, 1967、 G.F. Duffin, "Photographic Emulsion Chemistry", Focal Press 1966、及びV.L. Zelikman et al., "Making and Coating Photographic emulsion" Focal Press, 1964に記載されている方法により調製できる。米国特許第３５７４６２８号、同３６５５３９４号、及び英国特許１４１３７４８号に記載のある単分散乳剤も好適である。
【００３８】
また、縦横比が約３以上の平板状粒子も本発明に用いることができる。かかる平板状粒子は、Gutoff, "Photographic Science and Engineering", Vol.14, pp.248-257, 1970、米国特許第４４３４２２６号、同４４１４３１０号、４４３３０４８号、及び４４３９５２０号、並びに英国特許第２１１２１５７号に記載されている方法により容易に調製できる。結晶形態は均一で、その内部と外部でハロゲン組成が異なっていてもよく、層構造を有していてもよい。或いは、組成の異なるハロゲン化銀をエピタキシャル結合によって結合させたり、又はチオシアン酸銀や酸化鉛等のハロゲン化銀以外の化合物を結合させてもよい。種々の結晶形態を呈する粒子からなる混合物も使用できる。
【００３９】
上述の乳剤は、主として粒子表面に潜像を形成する表面潜像型、粒子内部に潜像を形成する内部潜像型、又は粒子の内部と外部の両方に潜像を形成するその他の型のいずれでもよいが、いずれもネガティブ型乳剤でなければならない。内部潜像型に属する乳剤は、特開昭６３−２６４７４０（Ａ）号に記載されているコア／シェル構造を有する内部潜像型でもよく、かかる乳剤の作製方法は特開昭５９−１３３５４２（Ａ）号に記載されている。この乳剤のシェル厚は、現像処理条件などに依存して変化するが、３〜４０ｎｍが好ましく、５〜２０ｎｍが最も好ましい。本発明の感光材料を使用する前に、ハロゲン化銀は、化学熟成工程、物理熟成工程、及びスペクトル増感工程を経ることが一般的である。これらの工程で用いられる添加剤に関しては、ＲＤ１７６４３号、ＲＤ１８７１６号、及びＲＤ３０７１０５号に記載されている。
【実施例１】
【００４０】
組換えコラーゲン様ペプチド
一般的な分子生物学的技術
クローニングの手順は基本的にManiatis et al.（Maniatis T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982) Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY））の方法に従った。Wizard Plus SV miniprep又はQiagen midiprep systemsにより、プラスミドＤＮＡを単離した。QIAquick Gel Extraction Kit （Qiagen社製）を用いてＤＮＡをアガロースゲルから単離した。別途特記しない限り、使用した酵素は全てAmersham Pharmacia Biotech社製であり、製造者の指示に従って使用した。Pichia pastorisの処理及び形質転換を含めた全手順は基本的に、Pichia Expression Kit （Invitrogen社製）のマニュアル（Manual of the Pichia Expression Kit Version E (Invitrogen, San Diego, CA, USA)）に従って行った。
【００４１】
ｐＰＩＣ９−Ｈ１の構築
６個のヒスチジン残基をもつ親水性ゼラチン（以下「Ｈ−ゼラチン」）をコードする合成遺伝子を、Pichia pastorisで高頻度で発現する遺伝子のコドンを使用して設計した（Sreekrishna, K. and Kropp, K.E. (1996) Pichia pastoris, Wolf, K.(Ed), Non conventional yeasts in biotechnology. A handbook, Springer-Verlag, pp. 6/203-6/253）。
【００４２】
以下のオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲ反応を個別に２回行った。
１０．１ｐｍｏｌのＯＶＬ−ＰＡ−ＦＷ、１ｐｍｏｌのＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ、５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ、及び５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ
１１．１ｐｍｏｌのＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ、１ｐｍｏｌのＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ、５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ、及び５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおり。
【００４３】
GeneAmp 9700 （Perkin-Elmer社製）を用いて、０．２ｍMのｄＮＴＰ’ｓ（Pharmacia社製）、１×Ｐｗｏ緩衝液（Eurogentec社製）及び１．２５Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（Eurogentec社製）を含む５０μｌのＰＣＲ反応を行った。反応１では、９４℃で１５秒、７２℃で１５秒のサイクルを１８回行った。反応２では、９４℃で１５秒、アニーリング温度で１５秒及び７２℃で１５秒により１回のサイクルが構成されるタッチダウンＰＣＲを行った。アニーリング温度は、最初の５サイクルを行う間に７２℃から６８℃に低下させ、その後６７℃のアニーリング温度でさらに２０サイクルを行った。
【００４４】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。各断片からの０．３ｐｍｏｌ、外側のプライマーであるＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷとＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶからの５０ｐｍｏｌをオーバーラップ伸長ＰＣＲにかけた。９４℃で１５秒、６７℃で１５秒、７２℃で１５秒のサイクルを２５回行った。その結果得られた０．３ｋｂのＰＣＲ断片をXhoI/EcoRIで消化してクローニングベクターｐＭＴＬ２３に挿入した。自動ＤＮＡシークエンシングにより配列を調べ、エラーのない１個のクローン（以後「ｐＭＴＬ２３−Ｐ」と記す）を選択した。
【００４５】
以下のオリゴヌクレオチドを用いてさらにＰＣＲ反応を実施した。
１ｐｍｏｌのＯＶＬ−Ｈ−ＦＷ、１ｐｍｏｌのＯＶＬ−Ｈ−ＲＶ、５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−Ｈ−ＦＷ及び５０ｐｍｏｌのＨＬＰ−Ｈ−ＲＶ。
【００４６】
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおり。
GeneAmp 9700 （Perkin-Elmer社製）を用いて、上述のオリゴ各種及び２５μｌのHigh Fidelity PCR Master（Roche社製）を含む５０μｌのＰＣＲ反応を行った。９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で１５秒のサイクルを１８回繰り返す反応を行った。０．１８ｋｂのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Promega社製）にＴ／Ａクローニングした。自動ＤＮＡシークエンシングにより配列を調べ、エラーのない１個のクローンを選択した。次にこのベクターをDraIII/Van９１Iで消化した。その結果得られた０．１８ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し、Van91Iで消化して脱リン酸化したｐＭＴＬ２３−Ｐにクローニングした。得られたベクターをEcoRI/XhoIで切断した後、この挿入物を、EcoRI/XhoIで消化したP. pastoris発現ベクターのｐＰＩＣ９にクローニングし、ｐＰＩＣ９−Ｈ１ベクターを得た。
【００４７】
コードされた成熟（処理済）Ｈ−ゼラチンアミノ酸配列は以下のとおり。
分子量：１５．１ｋＤａ、等電点：５．１、ｐＨ＜８における領域Ａ：１１０〜１５３番目のアミノ酸、ΔＦ＝−２．３、領域Ｂ：１〜１０９番目のアミノ酸；ΔＦ＝−１．４
【実施例２】
【００４８】
（比較）
０．５ｇ／ｌの通常の骨ゼラチンＧ−ＰＢ♯８０８０（PB社製、Tessenderlo, Belgium）と、初期ｐＢｒ値が２．０となるように１．１９ｇ／ｌのＫＢｒとを含む溶液を出発材料として、４Ｌ攪拌槽内で乳剤Ａを作製する。温度４０℃、ｐＨ３．５において核生成を行う。硝酸銀及び臭化カリウムの各溶液をダブルジェット法により同時に、それぞれ流速０．０６２と０．０６３ｍｏｌ／分で２０秒間添加する。核生成後に０．０２１ｍｏｌの銀を加える。核生成後、ｐＢｒを１．８に変更し、温度を４℃／分の割合で６０℃まで徐々に上昇させる。この乳剤を６０℃で２０分間置いた後、同じゼラチンを３３ｇ含む溶液を加え、ゼラチン濃度を２５ｇ／ｌに上昇させる。ｐＨは５．５に調整する。１．０７モルの銀と、カロメル電極に対する電荷を成長過程の間０ｍＶに一定させるのに十分量の臭化カリウムとを５０分間添加する加速式ダブルジェット法により、ゼラチン添加２分後に成長が始まる。最終流速は初期流速の４倍の速度である。得られた乳剤をDisk Centrifuge （CPS Instruments Inc.製）及びTEM replicaにより分析する。結果を表１にまとめた。
【実施例３】
【００４９】
（比較）
１５℃で核生成を実施する以外は、乳剤Ａと同様の方法により乳剤Ｂを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例４】
【００５０】
（発明）
核生成ペプタイザーに代えて本発明のバイオポリマー（Ｈ型、実施例１）を使用する以外は、乳剤Ｂと同様の方法により乳剤Ｃを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例５】
【００５１】
（比較）
ｐＨ６．０下で核生成を実施する以外は、乳剤Ａと同様の方法により乳剤Ｄを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例６】
【００５２】
（比較）
核生成中のｐＨを３．５から６．０に上昇させる以外は、乳剤Ａと同様の方法により乳剤Ｅを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例７】
【００５３】
（発明）
核生成ペプタイザーに代えて本発明のバイオポリマー（Ｈ型）を使用し、かつ核生成を１５℃で実施する以外は、乳剤Ｄと同様の方法により乳剤Ｆを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例８】
【００５４】
（発明）
核生成ペプタイザーに代えて本発明のバイオポリマー（Ｈ型）を使用し、核生成を１５℃で実施する以外は、乳剤Ｅと同様の方法により乳剤Ｇを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例９】
【００５５】
（比較）
成長ペプタイザーの量を４ｇに減らす以外は、乳剤Ａと同様の方法により乳剤Ｈを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【実施例１０】
【００５６】
（発明）
成長ペプタイザーに代えて本発明のバイオポリマー（Ｈ型）を使用する以外は、乳剤Ｃと同様の方法により乳剤Ｊを作製する。この乳剤を分析し、結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2004520611.tif 000004
【００５８】
結論
以上の結果から、本発明のバイオポリマーを用いることにより、同じ品質を保持しながら平板状結晶のサイズを大幅に縮小させることが可能となって利用範囲が広がるとの結論が導かれる。以上の結果からはまた、成長段階において良好な立体保護を得るための成長ペプタイザー必要量を大きく減少し得ることが明らかとなり、バイオポリマーの使用において大幅なコストダウンを可能とする。本実施例は、単に本発明の効果を示すためのものであり、実際の写真製品に使用するにあたっての完全なる最適例では決してないことに留意されたい。
【実施例１１】
【００５９】
（比較）
本発明のバイオポリマーをトリプシンによりｐＨ８で加水分解し、原化合物と同じ結合領域Ａを有するが、領域Ｂは縮小したポリマーを得る。１０９アミノ酸長の親水性尾部の代わりに、１４アミノ酸長しかない尾部が存在している。
乳剤Ｋは、乳剤Ｃと同様の方法で作製されるが、当初の材料に代えて加水分解されたバイオポリマーを使用した。分析の結果、顕著な凝集が認められ、核生成及び／又は熟成における立体保護は短い尾部によっては十分得られないことが示された。
【実施例１２】
【００６０】
（比較）
市販のペプチドである抗ソーバジン（anti-sauvagine）は、１個のＨｉｓ及び１個のＭｅｔを含み６アミノ酸長の結合領域Ａ、並びに平均ＴＦＥが−３．９で２３アミノ酸長の親水性の領域Ｂによって特徴付けられる。このペプチドは、領域Ｂが小さすぎるために本発明のバイオポリマーとはならず、またコラーゲン様でもない。
かかるバイオポリマーを成長ペプタイザーとして用い、乳剤Ｊと同様の方法により乳剤Ｌを作製する。分析の結果、この乳剤には著しい凝集が認められ、本発明によるポリマーを使用したときに得られた立体保護が、上記ペプチドを使用した場合には得られなかったことを示している。
【実施例１３】
【００６１】
（比較）
４個のＭｅｔ及び１個のＨｉｓを含み、１２３アミノ酸長の結合領域Ａ、並びに親水性特質を示し（平均ＴＦＥ＝−１．１）、１８８アミノ酸長の領域Ｂによって特徴付けられるコラーゲン様バイオポリマーを用い、乳剤Ｃと同様の方法により乳剤Ｍを作製する。このポリマーは、領域Ａが大きすぎるために本発明のバイオポリマーとはならない。分析の結果、形成された平板状結晶の割合は非常に低く（総表面積の２０％未満）、結合領域Ａが大きすぎるポリマーは核生成ペプタイザーとして有効ではないことを示している。
【国際公開パンフレット】
2004520611.tif 000005
2004520611.tif 000006
2004520611.tif 000007
2004520611.tif 000008
2004520611.tif 000009
2004520611.tif 000010
2004520611.tif 000011
2004520611.tif 000012
2004520611.tif 000013
2004520611.tif 000014
2004520611.tif 000015
2004520611.tif 000016
2004520611.tif 000017
2004520611.tif 000018
2004520611.tif 000019
2004520611.tif 000020
2004520611.tif 000021
2004520611.tif 000022
2004520611.tif 000023
2004520611.tif 000024
2004520611.tif 000025
2004520611.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月26日(2003.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核生成ペプタイザーを含むハロゲン化銀乳剤において該核生成ペプタイザーが、
−  １００アミノ酸を最長とし、（ｉ）ヒスチジン、リシン及びアルギニンから選択される少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端の銀結合アミノ酸を境界として有するか、又は（ii）＋１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、かつ少なくとも９個のアミノ酸を含むアミノ酸最長ストレッチによって定義されるかのいずれかである少なくとも１つの領域Ａ（ｎ）、及び
−  少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有し、ヒスチジンを含まず、もしリシン又はアルギニンが領域Ａ（ｎ）の銀結合アミノ酸に含まれる場合はリシン又はアルギニンを含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）
を含むポリペプチドであって、
メチオニン又はシステインを含まないポリペプチドであることを特徴とするハロゲン化銀乳化剤。
【請求項２】
少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）が末端領域であることを特徴とする請求項１記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項３】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）に少なくとも２個のヒスチジンがあることを特徴とする請求項１又は２いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項４】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）が、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項５】
領域Ａ（ｎ）（ｉ）が、４〜５０個、好ましくは６〜２０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項６】
領域Ａ（ｎ）を含む最長ストレッチの少なくとも半分のストレッチが該領域Ａ（ｎ）の外に銀結合アミノ酸を含まないことを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項７】
少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）が領域Ａ（ｎ）から分離していることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項８】
領域Ｂ（ｎ）が、−１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有することを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項９】
領域Ｂ（ｎ）が、アミノ酸２０個における移動自由エネルギーの移動平均が＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下に相当する移動極性を有することを特徴とする請求項１〜８いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１０】
領域Ｂ（ｎ）が、５０〜９００個、好ましくは１００〜６００個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１〜９いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１１】
３つ以上の領域Ａ（ｎ）をもたず、好ましくはただ１つの領域Ａ（ｎ）をもつことを特徴とする請求項１〜１０いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１２】
ポリペプチドがコラーゲン様であり、ＧがグリシンでＸ及びＹの５〜５０％がプロリンであるアミノ酸トリプレットＧＸＹを５０％を超えて有することを特徴とする請求項１〜１１いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１３】
さらに成長ペプタイザーを含むハロゲン化銀乳剤であって、該成長ペプタイザーが、
−  １０１個以上で総アミノ酸数の最大１／３部までのアミノ酸からなり、少なくとも２個の銀結合アミノ酸を含む少なくとも１つの領域Ａ（ｇ）、及び
−  少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔFに相当する極性を有し、メチオニン残基を含まない少なくとも１つの領域Ｂ（ｇ）
を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１２いずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１４】
領域Ａ（ｇ）が、＋０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１３記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１５】
核生成ペプタイザー及び成長ペプタイザーの少なくとも１つが組換え又は合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１６】
平板状であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載のハロゲン化銀乳剤。
【請求項１７】
５．０を超えるｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
−  最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）において少なくとも２個の銀結合ヒスチジンの最両端の銀結合ヒスチジンを境界として有する領域Ａ（ｎ）、及び
−  少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
メチオニン又はシステインを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項１８】
８．０を超えるｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
−  最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）においてヒスチジン、リシン及びアルギニンから選択される少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端の銀結合アミノ酸を境界として有する領域Ａ（ｎ）（ｉ）、及び
−  少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
メチオニン又はシステインを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項１９】
５．５未満のｐＨ下で核生成ペプタイザーとして適する組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
−  最大アミノ酸長が１００である１つ若しくは２つの領域Ａ（ｎ）において少なくとも２個かつ４個までの銀結合メチオニンの最両端の銀結合メチオニンを境界として有する領域Ａ（ｎ）、及び
−少なくとも５０個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｎ）（領域Ａ（ｎ）から分離している）を有し、
システインを含まず、領域Ａ（ｎ）の外にメチオニンを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２０】
成長ペプタイザーとして適した組換えコラーゲン様ポリペプチドであって、
−  １０１個以上で総アミノ酸数の最大１／３部までのアミノ酸からなり、少なくとも２個の銀結合アミノ酸と、これら少なくとも２個の銀結合アミノ酸の最両端間に存在する少なくとも９９個のアミノ酸で構成され、上記少なくとも２個の銀結合アミノ酸が３個以上のメチオニン残基をもたず、及び／又は少なくとも２個のヒスチジン残基をもつ１つ又は２つの領域Ａ（ｇ）、及び
−  少なくとも２００個のアミノ酸からなり、−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の平均移動自由エネルギーに相当する極性を有する少なくとも１つの領域Ｂ（ｇ）（領域Ａ（ｇ）から分離している）
を有し、
システインを含まず、領域Ａ（ｇ）の外にメチオニンを含まないことを特徴とする組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２１】
領域Ａ（ｎ）が、０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える平均移動自由エネルギーΔＦに相当する極性を有することを特徴とする請求項１７〜２０いずれかに記載の組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【請求項２２】
領域Ａをただ１つ有することを特徴とする請求項１７〜２１いずれかに記載の組換えコラーゲン様ポリペプチド。
【国際調査報告】
2004520611.tif 000027
2004520611.tif 000028
2004520611.tif 000029