(57)【要約】本発明は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸を含むＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を培養することによるデスアセチルセファロスポリンＣの直接製造法に関する。
2004500826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セファロスポリンＣの合成およびセファロスポリンエステラーゼの発現を生じる条件下でセファロスポリンＣ生合成のための酵素をコードする核酸およびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸を含むＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの菌株を培養し、そのようにして生成したセファロスポリンＣをデスアセチルセファロスポリンＣに変換することを含むデスアセチルセファロスポリンＣの直接製造法。
【請求項２】
セファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学的分解が４０％以下である請求項１記載の方法。
【請求項３】
セファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学的分解が３０％以下である請求項１記載の方法。
【請求項４】
セファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学的分解が２０％以下である請求項１記載の方法。
【請求項５】
セファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学的分解が１０％以下である請求項１記載の方法。
【請求項６】
セファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学的分解が５％以下である請求項１記載の方法。
【請求項７】
温度約２２℃〜約２９℃およびｐＨ約５．５〜約７．５で行われる請求項１記載の方法。
【請求項８】
栄養細胞増殖期が温度約２５℃〜約２９℃およびｐＨ約６．２〜約７．０で、デスアセチルセファロスポリンＣ生成期が温度約２２℃〜約２６℃およびｐＨ約５．７〜約６．５で行われる請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸がＤＮＡおよびプラスミドの部分である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ セファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸が配列番号：１または３の配列を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１２】
プラスミドがｐＳＪＣ６２．３である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
プラスミドがｐＢＭエステラーゼ１１である請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸を含むＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの菌株を培養することによるデスアセチルセファロスポリンＣの直接製造法に関する。
【０００２】
本発明の背景
セファロスポリンＣは、真菌Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（以前のＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の発酵生成物である。セファロスポリンＣは、半合成セファロスポリンの製造に用いるβ−ラクタム核、７−アミノセファロスポラニン酸（７−ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃ ａｃｉｄ、７−ＡＣＡ）に化学的に変換させることができる。発酵ブロス中でセファロスポリンＣを２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸（化合物Ｘ、図１）に非酵素的に分解すると生成したセファロスポリンＣの約４０％の損失が生じる（Ｕｓｈｅｒら、１９８８， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １０， ５４３−５４８）。しかしながら、デスアセチルセファロスポリンＣは、この反応に対してはるかに抵抗性である。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓが生成するセファロスポリンエステラーゼ酵素はセファロスポリンＣを脱アセチル化し、デスアセチルセファロスポリンＣを形成させることができる。
【０００３】
米国特許５，８６９，３０９には、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓセファロスポリンエステラーゼ ゲノムおよびｃＤＮＡ遺伝子のクローニングとシーケンシングが記載されている。従来、Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのセファロスポリンエステラーゼ遺伝子を発現させ、デスアセチルセファロスポリンＣを直接発酵させることは知られていなかった。
【０００４】
発明の要約
本発明者らは、セファロスポリンエステラーゼ遺伝子をＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓからＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）中に形質転換することによりデスアセチルセファロスポリンＣを発酵させることができる組換え真菌生物を製造した。セファロスポリンエステラーゼ遺伝子は、真菌プロモーター、好ましくはＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの標準的発酵条件下でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子のプロモーターから発現する。Ａ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中の活性セファロスポリンエステラーゼ酵素の発現は、デスアセチルセファロスポリンＣを製造するための新規発酵方法であるｉｎ ｖｉｖｏにおけるセファロスポリンＣからデスアセチルセファロスポリンＣへの変換を生じる。すなわち、本発明は、セファロスポリンＣの合成およびセファロスポリンエステラーゼの発現に適した条件下でセファロスポリンＣ生合成のための酵素をコードする核酸およびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍセファロスポリンエステラーゼをコードする組換え核酸を含むＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの菌株を培養し、そのようにして生成したセファロスポリンＣをデスアセチルセファロスポリンＣに変換することを含むデスアセチルセファロスポリンＣの直接製造法に関する。
【０００５】
図面の簡単な説明
図１．セファロスポリンＣのデスアセチルセファロスポリンＣへの変換、およびセファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）チアゾール−４−カルボン酸（化合物Ｘ）への化学的分解。
図２．プラスミドｐＢＭエステラーゼ１ａおよびｐＢＭエステラーゼ１ｂの製造。
図３．プラスミドｐＢＭエステラーゼ３の製造。
図４．プラスミドｐＳＪＣ６２．３の製造。
図５．プラスミドＡの製造。
図６．プラスミドｐＢＭエステラーゼ１１の製造。
図７．該タンパク質のＮ末端（配列番号：９）、該ゲノムＮ末端の逆翻訳配列（配列番号：１０）、該逆翻訳配列に相補的な逆翻訳配列（配列番号：１１）、および該エステラーゼ遺伝子を同定するのに用いる４つのオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ１−４、それぞれ配列番号：１２−１５）。
図８Ａおよび８Ｂ．本発明において有用なエステラーゼをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）。
図９Ａおよび９Ｂ．本発明において有用なエステラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列（配列番号：３）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）。
図１０．典型的には完全ペプチドより良好な酵素活性を有する成熟ペプチドの５４４アミノ酸配列（配列番号：４）を示す５７２アミノ酸を含む本発明に有用なエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）。
図１１．本発明において有用な完全なエステラーゼのアミノ酸組成物の分析。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のセファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードする配列を有する組換え核酸を含む宿主細胞を用いるデスアセチルセファロスポリンＣの直接製造法に関する。該エステラーゼ核酸の好ましい供給源は、当該分野でよく知られているＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ １０６５７であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤに寄託され、そこから利用でき、米国特許４，５３３，６３２に記載されている。好ましくは、組換え核酸分子はＤＮＡ分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列はすべて左から右方向が常套的に５’から３’の方向である通常の方式により本明細書に示される。本明細書で用いているヌクレオチド塩基の略号は当該分野で常套的なものであり、Ｔはチミジン、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、およびＧはグアニンであり、またＸはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、Ｐｕはプリン（すなわちＧまたはＡ）であり、Ｐｙはピリミジン（すなわちＴまたはＧ）である。組換えエステラーゼのＤＮＡとしてさらに好ましいのは、図２および３に実質的に示すヌクレオチド配列のすべてまたは部分を有するＤＮＡ配列、またはこれらＤＮＡ配列の１つと相補的なＤＮＡ配列、またはこれらＤＮＡ配列の１つと相補的なＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列である。好ましくは、該ＤＮＡ配列はストリンジェント条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、同一性が８０％以上の、好ましくは８５％以上の、より好ましくは同一性が９０％以上のＤＮＡ配列を選択する。ストリンジェント条件下のＤＮＡのスクリーニングはＮａｔｕｒｅ ３１３，４０２−４０４（１９８５）に記載の方法に従って行ってよい。本出願に開示したＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列は、例えば、開示したＤＮＡ配列のアレル変異体であるか、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ中に（しかし開示したＤＮＡ配列に関連して）天然に存在するか、または他の細菌、真菌もしくは酵母供給源由来であってよい。核酸ハイブリダイゼーションの一般的技術は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．（１９８９）、およびＨａｙｍｅｓらのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９８５）に開示されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。セファロスポリンエステラーゼの部分をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）の場合、該ヌクレオチド配列は触媒的に活性であるかもしくはプロセシングにより触媒的に活性である、すなわちエステラーゼ活性を有する断片をコードすることが必要である。
【０００７】
本発明において有用な組換えＤＮＡが修飾された配列を含むことも予期される。本出願で用いている用語「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」は、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に言及する場合、天然の野生型配列と異なるヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
本発明に有用な組換えＤＮＡ配列は、当業者によく知られた種々の方法を用いて得ることができる。少なくとも３つの主な代替法を用いてよい：
（１）該配列を含むゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）からの２本鎖ＤＮＡ配列の単離、
（２）該ＤＮＡ配列の化学合成、および
（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ配列の合成。
【０００８】
最初のアプローチにおいて、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。例えば、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。種々の技術を用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
例えば、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードする標的ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中に存在する配列と二重になる標識された一本鎖ＤＮＡプローブ配列は、一本鎖に変性したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのクローンされたコピーを用いて行うＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用いることができる。
【０００９】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、イムノブロッティング技術を用いてセファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについてスクリーニングすることもできる。
イムノブロッティングまたはハイブリダイゼーション技術のいずれかに適したある典型的なスクリーニング方法において、通常、ベクターに含まれるゲノムＤＮＡライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーを最初に寒天プレート上に散布し、次いで該クローンをフィルター膜、例えば、ニトロセルロース膜に移す。次に、ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるか、または次いで抗体を該クローンと結合させ、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むそれらクローンを同定することができる。
【００１０】
第二アプローチにおいて、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードする本発明のＤＮＡ配列を化学的に合成することができる。例えば、セファロスポリンエステラーゼをコードするＤＮＡ配列を、ヌクレオチドの正しい直線配列を形成するように実質的に結合させることができる（適切な末端制限部位または相補的末端配列を介して）一連の１００塩基オリゴヌクレオチドとして合成することができる。
【００１１】
第三アプローチにおいて、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードする本発明のＤＮＡ配列をＰＣＲを用いて合成することができる。簡単には、標的ＤＮＡ配列の反対の鎖とハイブリダイズする長さが少なくとも１５塩基の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド対（ＰＣＲプライマー）を用いて、標的配列上のＤＮＡの介在領域を酵素的に増幅する。鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、およびアリールしたプライマーの３’末端のＤＮＡポリメラーゼによる伸張のサイクルを反復することによりＰＣＲプライマーの５’末端により定義した断片の増幅が生じる。Ｗｈｉｔｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ５，１８５−１８９（１９８９）参照。
【００１２】
セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードする本発明において有用な組換えＤＮＡ配列を修飾し（すなわち、突然変異させ）、種々の突然変異を作製することもできる。そのような突然変異は、変性的（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）、すなわちその突然変異が突然変異したコドンによってコードされるアミノ酸配列を変化させるか、または非変性的、すなわち、その突然変異が突然変異したコドンによってコードされるアミノ酸配列を変化させないものであってよい。これら修飾されたＤＮＡ配列は、例えば、当該分野で知られた種々の方法を用い、コードされたポリペプチド中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆転、または付加を生じるようにセファロスポリンエステラーゼＤＮＡ配列を突然変異させることにより製造してよい。例えば、Ｍｏｒｉｎａｇａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２， ６３６−６３９（１９８４）、Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３， ８７４９−８７６４（１９８５）、およびＫｕｎｋｅｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ４８２−４９２（１９８５）に記載の部位指向性突然変異誘発法を用いてよい。さらに、部位指向性突然変異誘発用のキットは業者から購入してよい。例えば、部位指向性突然変異誘発用のキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）から購入してよい。さらに、Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，７９１−８０２（１９８８）に記載の破壊、欠失、およびトランケーションを用いてもよい。変性的および非変性的突然変異は、本発明のポリペプチドを生成するかまたは用いるのに好都合なことがある。例えば、これら突然変異はより高レベルの生成をもたらし、精製をより簡単にし、さらなる制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもたらし得る。そのような修飾されたＤＮＡおよびポリペプチド分子はすべて本発明において有用であると予期される。
【００１３】
本発明の方法に有用なＡ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞は、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む。発現ベクターは図８または９に実質的に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の一つのすべてまたは部分を含むことが好ましい。セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結した１またはそれ以上の調節ＤＮＡ配列を含む発現ベクターがさらに好ましい。この文脈で用いている用語「機能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結した」は、調節ＤＮＡ配列がセファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を指示することができることを意味する。
【００１４】
本発明に用いる発現ベクターは、しばしば、そのベクター形において染色体と結合しない環状二本鎖ＤＮＡループを表す「プラスミド」の形である。しかしながら、本発明は、同等の機能を提供し、この点に関してその後当業者に知られるようになる、そのような他の形の発現ベクターを含むものとする。
【００１５】
本発明において有用な発現ベクターは、典型的には、複製起点、ＤＮＡ配列の前方（すなわち上流）に位置するプロモーター、次いでセファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を含む。構造タンパク質のすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列に、転写終止配列および残存ベクターが続く。発現ベクターは、当該分野で知られた他のＤＮＡ配列、例えば、発現産物の安定性をもたらす安定リーダー配列、発現産物の分泌をもたらす分泌リーダー配列、構造遺伝子の発現を変調させる配列（例えば増殖培地中に栄養または他のインデューサーが存在するかまたは存在しないことにより）、形質転換宿主細胞中で表現型を選択することができるマーキング配列、安定エレメント、例えばプラスミドに有糸分裂安定性をもたらす動原体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）、および制限エンドヌクレアーゼによる切断部位をもたらす配列を含んでいてもよい。用いる実際の発現ベクターの特徴は、用いる宿主と適合性でなければならない。例えば、真菌細胞系でクローニングするとき、発現ベクターは真菌細胞のゲノムから単離されたプロモーター（例えば、Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のセファロスポリンエステラーゼプロモーターまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｔｒｐＣ プロモーター）を含むべきである。ある種の発現ベクターは、真菌宿主において自己複製プラスミドのｉｎ ｖｉｖｏ生成を促進する真菌自律複製配列（ＡＲＳ、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲＳ）を含んでよい。本発明の真菌発現ベクターは真菌ＡＲＳ配列をもたず、宿主細胞にプラスミドが入る際に宿主染色体に統合されることが好ましい。遺伝的安定性が増すためそのような統合が好ましい。本発明での使用に予期される発現ベクターは、少なくともＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける複製および真菌細胞における統合、好ましくは本発明のセファロスポリンエステラーゼＤＮＡ配列の発現を指示することができる。種々のＥ． ｃｏｌｉ宿主における適切な複製起点には、例えば、ＣｏｌＥｌプラスミド複製起点が含まれる。適切なプロモーターには、例えば、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｔｒｐＣプロモーターおよびＥ． ｃｏｌｉ由来のｎｅｏ−ｒ遺伝子プロモーターが含まれる。適切な終止配列には、例えば、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｔｒｐＣターミネーター、およびＥ． ｃｏｌｉ由来のｎｅｏ−ｒ遺伝子ターミネーターが含まれる。発現ベクターは選択可能なマーカーをコードする配列を含むことも好ましい。選択可能なマーカーは好ましくは薬剤耐性である。選択可能なマーカーとしてフレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）耐性（真菌細胞に対して）、アンピシリン耐性およびネオマイシン耐性（細菌細胞に対して）を好都合に用いることができる。これら物質はすべて当該分野で知られており、市販品を利用できる。
【００１６】
望ましいコーディングおよび制御配列を含む適切な発現ベクターは当該分野で知られた標準的組換えＤＮＡ技術を用いて構築してよく、その多くがＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。好ましいプラスミドはこの中に記載のｐＳＪＣ６２．３およびｐＢＭエステラーゼ１１である。
【００１７】
セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含むＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞は、セファロスポリンＣ生合成酵素をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）も含む。セファロスポリンＣ生合成酵素をコードするＤＮＡは、典型的にはＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株に内因性であるが、セファロスポリンＣ生合成酵素をコードする核酸を含むように操作された宿主細胞も本発明の範囲内にあると予期される。本発明に従って形質転換することができる宿主細胞の例には、Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＡＴＣＣ １１５５０、ＡＴＣＣ ３６２２５、ＡＴＣＣ ４８２７２株および種々の産業的菌株改良プログラムに従って開発されたそれらの誘導体が含まれる。
【００１８】
宿主細胞は、実質的に図８または９に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列の一つのすべてまたは部分を含む発現ベクターを含むことが好ましい。セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列と機能的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結され、その複製および／または発現を指示することができる１またはそれ以上の制御ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞がさらに好ましい。  発現ベクターは当該分野で知られた種々の方法により宿主細胞中に導入してよい。例えば、宿主細胞の発現ベクターによる形質転換は、ポリエチレングリコール介在プロトプラスト形質転換法により行うことができる。しかしながら、宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、例えば、エレクトロポーレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注入、またはプロトプラスト融合も使用可能である。
【００１９】
発現ベクターが適切な宿主細胞に導入されたら、宿主細胞をセファロスポリンＣの生成とセファロスポリンエステラーゼの発現を許す条件下で培養し、ｉｎ ｖｉｖｏでセファロスポリンＣのデスアセチルセファロスポリンＣへの変換をもたらすことができよう。
該宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合された組換えＤＮＡ発現ベクタープラスミドｐＢＭエステラーゼ１１で形質転換した、ＤＣ１１として同定されるＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞を含む上記タイプの新規形質転換体は、ブダペスト条約の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ．に１９９９年１月２７日に寄託された（ＡＴＣＣによる受託番号７４４８２）。
【００２０】
セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞は、１またはそれ以上の、下記の６つの一般的アプローチにより同定することができよう：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）マーカー遺伝子機能の存在の有無、（ｃ）宿主細胞中のセファロスポリンエステラーゼｍＲＮＡ転写物の生成により測定される遺伝子発現レベルの評価、（ｄ） 酵素アッセイ、（ｅ）比色定量検出法、および（ｆ）発酵物中の発現セファロスポリンエステラーゼの終末生成物、例えば、デスアセチルセファロスポリンＣの検出、終末生成物の検出が好ましい同定方法である。
【００２１】
最初のアプローチでは、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列の存在を、該ＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出することができる。
【００２２】
第二アプローチでは、組換え発現ベクター宿主系を、ある種のマーカー遺伝子機能（例えば、アセトアミド利用、抗生物質耐性、抗真菌剤耐性、ウラシルプロトトロフィ（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙなど）の存在の有無に基づいて同定および選択することができる。マーカー遺伝子を、セファロスポリンエステラーゼをコードする配列を制御するのに用いる同じかまたは異なるプロモーターの制御下でセファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列と同じプラスミド中に置くことができる。導入または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、セファロスポリンエステラーゼのすべてまたは部分をコードするＤＮＡ配列を保持する完全な組換え発現ベクターの存在を示す。あるいはまた、マーカー遺伝子を、セファロスポリンエステラーゼ遺伝子として異なるプラスミド中におき、両プラスミドをＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中に共形質転換することができる（Ｍｅｎｎｅら、１９９４， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４２，２７−３５）。
【００２３】
第三アプローチでは、セファロスポリンエステラーゼｍＲＮＡ転写物の生成を、ハイブリダイゼーションアッセイにより評価することができる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡを単離し、該ＲＮＡ配列に相補的なプローブを用いるノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロッティングまたは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイにより分析することができる。あるいはまた、宿主細胞の総ＲＮＡを抽出し、そのようなプローブに対するハイブリダイゼーションをアッセイしてよい。
【００２４】
第四アプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの発現を、既知の方法を用いてセファロスポリンエステラーゼ酵素活性をアッセイすることにより測定することができる。例えば、本明細書の実施例の項に記載のアッセイを用いてよい。
【００２５】
第五アプローチでは、セファロスポリンエステラーゼタンパク質の発現を比色測定検出法により評価することもできる。例えば、この酵素が欠損していることが知られている細胞において、セファロスポリンエステラーゼ活性の発現は、無色基質、ｐ−ニトロフェニルアセテートが培地プレート上で酵素的に加水分解されて黄色に着色したｐ−ニトロフェニレートになることで検出することができる。
【００２６】
第六アプローチでは、セファロスポリンエステラーゼの発現を、発酵ブロス中でセファロスポリンＣがデスアセチルセファロスポリンＣに変換されることによりさらに評価することができる。例えば、発酵ブロス中のセファロスポリンＣおよびデスアセチルセファロスポリンＣの濃度は、逆相カラム高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出することができる（Ｕｓｈｅｒら、１９８５， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４９，１０５−１１０）。
【００２７】
本発明において有用な発現ベクター、プラスミド、またはＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当該分野で知られた種々の方法により決定することができよう。例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７（１９７７）に記載のジデオキシ鎖終止法、またはＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５６０−５６４（１９７７）に記載のＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を用いてよい。
【００２８】
もちろん、すべての発現ベクターおよびＤＮＡ制御配列が本発明において有用なＤＮＡ配列を同様に十分発現するわけではないことを理解すべきである。すべての宿主細胞が同じ発現系で同様に十分機能するわけでもない。しかしながら、当業者は、過度な実験を行うことなく、また本発明の範囲を離れることなく本明細書に記載の手引きを用いて発現ベクター、ＤＮＡ制御配列、および宿主細胞を選択することができよう。
本明細書に記載のすべてのアミノ酸残基は天然のＬ配置である。標準的ポリペプチド命名法、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４３， ３５５７−３５５９（１９６９）に従って、アミノ酸残基の略号を下記対応表に示す。
【００２９】
対応表
2004500826.tif 000003
【００３０】
本明細書では、すべてのアミノ酸配列は、その左から右への方向付けが通常のアミノ末端からカルボキシル末端への方向である式により示される。
本発明方法により製造したデスアセチルセファロスポリンＣは種々のタンパク質精製技術を用いてある程度単離、精製することができよう。例えば、クロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーを用いてよい。
【００３１】
本明細書に記載のポリペプチドは、決定されたＤＮＡおよび推定アミノ酸シーケンシング（配列決定）により定義された。ほとんどのアミノ酸残基および終止シグナルが１コドン以上であることから生じる遺伝子コードの縮重性により、同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明のポリペプチドの製造に用いてよい。さらに、これらＤＮＡおよびアミノ酸配列のアレル変化が天然に存在するか、または当該分野で知られた方法を用いて意図的に導入されてよいことは理解されよう。これら変化は、全配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の相違、または該配列中の１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆転または付加により証明することができよう。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってよい。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には、リジンとアルギニンが含まれ、同様な親水性を有する非荷電極性末端基または非極性末端基を有するアミノ酸には、以下のものが含まれる：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン。他の予期される変化には、前記ポリペプチドの前駆体、例えば、リーダー配列として用いられるメチオニン、Ｎ−ホルミル−メチオニンのようなＮ末端置換基を有する前駆体、ならびに前記ポリペプチドの塩とエステルが含まれる。そのような変化はすべて本発明の範囲内に含まれる。
【００３２】
本明細書で用いている用語「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、所望のポリペプチドを製造するために培地中で微生物を培養すること、例えば増殖培地中で該細胞を活発に増殖させることを意味する。本発明の方法はｉｎ ｓｉｔｕ発酵および変換（一段階発酵および変換）である。本発明の方法は所望のデスアセチルセファロスポリンＣを製造するのに適した条件下で行われる。水性液を反応（培養）培地として用いるのが好ましいが、有機液または混和性または非混和性（二相性）有機／水性混合物も用いてよい。
【００３３】
Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞の培養は適切な培地を用いて当業者が達成することができよう。宿主細胞の適切な増殖培地には、細胞の増殖に必要な栄養を提供するものが含まれる。典型的な増殖培地には、必要な炭素源、窒素源、および微量元素が含まれる。インデューサー（ｉｎｄｕｃｅｒ）を加えてもよい。本明細書で用いている用語「インデューサー」には、所望のタンパク質、ペプチドまたは抗生物質の形成を増大させるあらゆる化合物が含まれる。
【００３４】
炭素源は、糖、例えば、マルトース、ラクトース、グルコース、フラクトース、グリセロール、セレロース、ソルビトール、ショ糖、デンプン、マンニトール、ガラクトース、ラフィノースなど；有機酸、例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど；アミノ酸、例えば、リジン、グルタミン酸ナトリウムなど含んでよい。
窒素源は、Ｎ−ＺアミンＡ、コーン浸漬液（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、ダイズ粕（ｓｏｙ ｂｅａｎ ｍｅａｌ）、牛肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カザミノ酸、酵母アミン（ｙｅａｓｔａｍｉｎ）、糖蜜、パン酵母、トリプトン、ダイズ粉、ペプトン、ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどを含んでいてよい。
微量元素は、リン酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銅マンガン塩、カルシウム塩、コバルト塩、ニッケル塩、鉄塩、ナトリウム塩、カリウム塩などを含んでいてよい。
【００３５】
用いる培地は１またはそれ以上の炭素もしくは窒素源、または他の栄養素を含んでいてよい。
好ましい発酵培地は、５−１５％コーン浸漬液、１−６％ダイズ粉、１−６％ファーマメディア、１−６％グルコース、０．１−１．０％ ＣａＳＯ４、０．１−１．０％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１−１．０％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１−１．０％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５−２．０％メチオニン、および１−５％豚脂油を含む。発酵培地のｐＨは好ましくは約５．５〜７．５、より好ましくは約６．２〜７．０に調整される。
種培地を用いるのが望ましい場合があるかもしれない。「種培地」は、総細胞量が急速に増加するのを促進するために容易に利用できる炭素および窒素源を用いる点が通常の発酵培地とは異なる。通常、ある種のインデューサーは種培地中には含まれない。好ましい種培地は、１−１０％コーン浸漬液、２−１０％グルコース、２−１０％ファーマメディア、０．１−１．０％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５−２．０％ ＣａＣＯ３、および０．００１−０．０１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。種培地のｐＨは好ましくは約６．０〜７．５、より好ましくは約６．５〜７．２に調整する。
発酵培地のｐＨは、例えば温度１２１℃で３０分間滅菌し、次いで滅菌後に望ましいｐＨに調整される特定培地に応じて約５．５〜７．５に調整することが好ましい。宿主細胞増殖時の培地のｐＨは、栄養細胞増殖期には約６．２〜７．０に維持するのが最も好ましく、デスアセチルセファロスポリンＣ産生期は約５．７〜６．５に維持するのが最も好ましい。本発明の方法に適した温度範囲は、栄養細胞増殖期が約２２℃〜約２９℃、最も好ましくは約２５℃〜約２９℃であり、デスアセチルセファロスポリンＣ産生期が約２２℃〜約２６℃であることが最も好ましい。
圧が本発明の実施に重要であるとは認識されておらず、便宜上、ほぼ大気圧が通常用いられる。
【００３６】
宿主細胞を増殖させるときは、本発明の方法は嫌気性条件下で実施するのが好ましい。反応混合物の撹拌およびエアレーションは、例えば一段階または二段階法で微生物を増殖時に振盪フラスコ培養または発酵器中で行うことができる立体選択的還元プロセス時に利用できる酸素の量に影響する。２００〜１，０００ＲＰＭの撹拌範囲が好ましく、４００〜８００ＲＰＭが最も好ましい。１分間あたりの培地１容量あたり約０．１〜１０容量の空気（すなわち、０．１〜１０ｖｖｍ）のエアレーションが好ましく、１分間あたりの培地１容量あたり約５容量の空気（すなわち、５ｖｖｍ）のエアレーションが最も好ましい。
【００３７】
最初の２４−４８時間の細胞増殖期後、発酵器に種々の量の（ＮＨ４）２ＳＯ４、グルコース、および豚脂油を入れ、残りの発酵期におけるデスアセチルセファロスポリンＣの産生条件を最適にすることが好ましい。デスアセチルセファロスポリンＣのスタティスファクトリー（ｓｔａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ）な生成は、例えば、約７２〜２４０時間、好ましくは１４４〜１９２時間かかってよい。
本発明の方法では、発現したセファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）−チアゾール−４−カルボン酸への化学分解は好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１０％以下、最も好ましくは５％以下である。
【００３８】
本発明方法の生成物、すなわち、デスアセチルセファロスポリンＣは、既知の方法論、例えば抽出蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィーなどにより単離、精製することができよう。
発酵培地の残留化合物からデスアセチルセファロスポリンＣの所望の化合物を製造するための好ましい方法は、水の除去による濃縮、次いで吸着クロマトグラフィーによる抽出である。
【００３９】
以下の実施例で本発明をさらに例示する。これら実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明のさらなる理解をもたらすものである。
下記実施例において、ある種の試薬、プラスミド、制限酵素、および他の物質は商業的供給源から得、供給者の指示に従って用いた。ＤＮＡの精製、特徴づけ、およびクローニングに用いる操作は当該分野でよく知られているか、または文献から適応させることができる。
【００４０】
実施例１
セファロスポリンエステラーゼの精製
１．１ 微生物の培養
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ １０６５７）種培養を、下記培地１００ｍＬを含む５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに凍結保存培養を２％摂取して開始した： ２％グルコース、１％酵母エキス、１％Ｂａｃｔｏ（バクト）ペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０。種フラスコを２５０ｒｐｍで２８℃、２４時間を培養した。２％の接種容量を用いて製造段階の発酵を開始した。製造段階用培地は、８％コーン浸漬液、１％ ＫＨ２ＰＯ４、３％グルコース、ｐＨ６．２からなった。培地を２時間オートクレーブにかけた。これにより通常のオートクレーブ時間３０分に比べて力価が増大した。発酵器のブロスを１６−２１℃で高エアレーションしながら３〜４日間培養した。全ブロスの比活性は典型的には２０−３７ ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
【００４１】
１．２ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来の酵素の精製
該エステラーゼは、発酵ブロスをｐＨ４．０の１００ｍＭ ＥＤＴＡで８時間発酵処理することによりＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ細胞から放出された。このようにして該細胞から約５０％の酵素活性を放出させることができた。ブロスを５，０００ ｘ ｇで遠心して細胞およびコーン浸漬組成物を除去した。上清を、分子量のカットオフ値３０，０００のＡｍｉｃｏｎ中空繊維カートリッジで限外ろ過して最初の容量の１０％とした。脱イオン水を加えて酵素を初期容量とした。２Ｍ水酸化アンモニウムを加えてｐＨを７．０とし、酵素溶液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液 ７．０で洗浄したＤＥＡＥトリスアクリル（１００ｇ樹脂／５０ｍｌ酵素溶液）に加えた。酵素はＤＥＡＥに結合せず、ろ液中に得られ、次いでこれを１．０Ｍ酢酸でｐＨ４．５とした。次いで、この溶液をカルボキシメチルＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１８ ｘ ３ ｃｍ）にかけ、２８０ｎｍの吸光度が０．１以下（約４カラム容量）になるまで５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５で洗浄した。該エステラーゼを５０〜５００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．５（流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ）の直線勾配で溶出した。７．０ｍＬの分画を回収してエステラーゼ含有分画をプールし、分子量のカットオフ値が５０，０００のＣｅｎｔｒｉｃｏｎを用いて濃縮した。
【００４２】
実施例２
セファロスポリンエステラーゼの特徴付け
２．１ 酵素の比活性
酵素を、終量０．５ｍｌでセファロスポリンのカリウム塩（２５−４００ｍＭ）、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５を含む反応混合物に加えた。混合物を３０℃でインキュベーションし（特記しない限り）、５０％アセトニトリル２．０ｍｌを加えて止めた。反応を、移動相が２５ｍＭオクタンスルホン酸、０．１％リン酸、１２％メタノール、ｐＨ２．５からなる５ミクロン Ｃ１８カラム（５０ ｘ ４ｍｍ）ＨＰＬＣにより２５４ｎｍでモニターした。タンパク質を、ウシ血清アルブミンを標準として用いるＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏ．， ＵＳＡ）を用いてアッセイした。該酵素はセファロスポリンＣとＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ速度論を示した。二重逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）プロットから、セファロスポリンＣの加水分解のＫｍは５１．８ｍＭであり、対応するＶｍａｘは７７．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであることがわかった。反応生成物、デスアセチルセファロスポリンＣおよびアセテートはいかなる認め得る程度の反応も阻害しなかった。セファロスポリンＣの１．０％溶液は３０℃で３０分間以内に完全に加水分解され、ＨＰＬＣにより副産物は観察されなかった。
【００４３】
２．２ 基質ファイル
エステラーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニルエステル基質とセファロスポリン誘導体を用いて測定した。酵素を、１００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．５および２％アセトニトリル中の炭素鎖長Ｃ：２〜Ｃ：１８の範囲の１０．０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルエステル、または１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５中のｐ−ニトロフェニルアセテート、１０．０ｍＭとインキュベーションした。酵素活性を、ｐ−ニトロフェニレートイオンの発酵による４０５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより分光測光法的に測定した。セファロスポリン誘導体のアッセイは実施例２．１に記載した通りである。結果は、ｐ−ニトロフェニルエステル誘導体については表１に、セファロスポリン誘導体については表２に記載する。
【００４４】
表１．エステラーゼ活性に対するエステル鎖長の増加の影響
2004500826.tif 000004
【００４５】
表２． セフェム基質に対するエステラーゼ活性の相対比
【化１】
2004500826.tif 000005
【化２】
2004500826.tif 000006
【００４６】
２．３ 温度の影響
Ａ． 最適温度
酵素を、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５中の１０．０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルアセテートとインキュベーションした。反応混合物を温度１０〜６５℃、３００ｒｐｍの振盪水浴中で１０分間インキュベーションした。最適反応温度は２５℃であった。
Ｂ． 熱安定性
酵素を、実施例２．３Ａに記載のごとくｐ−ニトロフェニルアセテートとインキュベーションした。酵素を種々の温度で１５分インキュベーションし、次いで急速に氷上においた。該酵素は温度約２５℃でインキュベーションすると不安定であり、３０〜４５℃で急速に不活性化した。
【００４７】
２．４ ｐＨの影響
酵素を、実施例２．３Ａに記載のごとくｐ−ニトロフェニルアセテートとインキュベーションした。ｐＨ４〜８の範囲の１００ｍＭトリスマレエート万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）緩衝液を用いた。該エステラーゼはｐ−ニトロフェニルアセテートおよびセファロスポリンＣの両方にｐＨ４．５〜７の範囲で活性であり、ｐＨ６．０で最大活性を示した。
【００４８】
２．５ 種々の酵素モジュレーターの影響
酵素を１０ｍＭ試薬の存在下で２５℃にて１５分間インキュベーションした。次に、反応混合物を１００倍希釈してアッセイ混合物とし、ｐ−ニトロフェニルアセテートを用いてアッセイした。結果は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ酵素に対する活性部位セリンの存在を強く示唆した。フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）、３，４−ジクロロイソクマリン（ＤＣＩ）、および亜リン酸ジメチルはすべて該酵素を阻害した。ヒスチジン修飾試薬ジエチルピロカーボネートは実質的に該酵素を不活性化した。スルフヒドリル修飾剤のヨードアセトアミドおよびＮ−エチルマレイミドは該酵素の活性にほとんどまたは全く影響しなかったが、β−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールではわずかな活性が認められた。金属イオンの存在の有無も該酵素に対してほとんどまたは全く影響しなかったが、ＥＤＴＡではわずかな阻害が認められた。
【００４９】
２．６ 等電点（ｐｌ）の測定
等電点フォーカシングゲルをＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｗｅｄｅｎ）が開発したＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧプレートシステムを用いｐＨ３〜９の範囲で操作した。ｐｌも、Ｒａｉｎｉｎ Ｃｏ．（ＵＳＡ）が開発したＭｉｎｐＨｏｒシステムを用い、ブロードレンジアンフォライト混合物ｐＨ３〜９を用いて測定した。該タンパク質の等電点は約５．６であった。
【００５０】
２．７ 分子量の測定
分子量を、ゲル浸透クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（勾配８−２５％）をＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， １９７０， Ｎａｔｕｒｅ ２２７， ６８０−６８５）の方法に従って操作した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。ゲル浸透クロマトグラフィーは、２００ｍＭリン酸カリウム ｐＨ６．８、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを移動相に用いる７５ ｘ ３００ｍｍ ＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫ−ＧＥＬ ＧＳ３０００ＳＷ ＸＬカラムＨＰＬＣにより行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルろ過標準的混合物（ＭＷ ６７０，０００−１，３５０）をマーカーに用いた。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎであり、溶出液を２８０ｎｍでモニターした。ろ液を回収し、エステラーゼ活性をアッセイした。該酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルろ過クロマトグラフィーにより８０，０００ Ｄａｌｔｏｎ単一バンドが観察され、該酵素が天然の状態で単量体であることが示された。
【００５１】
２．８ 酵素の炭化水素含量の測定
組換えペプチドＮ−グリコシダーゼによる炭化水素の除去は、Ｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９， ４５４０−４５４４（１９８２）の記載に従って行い、またエンドグリコシダーゼＨについてはＴｒｉｍｂｌｅら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４１，５１５−５２２（１９８４）に従った。次に、天然および脱グリコシル化酵素を実施例２．７に記載のごとくＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、炭化水素の損失を測定した。該酵素のエンドグリコシダーゼによる処理により分子量は１５−２０％減少し、約６２，０００ Ｄａｌｔｏｎとなった。
【００５２】
２．９ Ｎ−末端アミノ酸配列の測定
アミノ末端配列を、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙの自動化Ｅｄｍａｎ分解により決定した。精製酵素から得られたアミノ末端配列はＨ２Ｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号：５）であった。
【００５３】
実施例３
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓからのセファロスポリンエステラーゼ遺伝子のクローニング
３．１ Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓの染色体ＤＮＡの調製
種培地培養にＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ １０６５７）の凍結培養物を４％接種した。培養を、２％グルコース、１％酵母エキス、１％ Ｂａｃｔｏ−ペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０中、２８℃で２４時間増殖させた。細胞を遠心して回収し、１Ｍソルビトール、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．４を含む緩衝液で１回洗浄した。細胞を再度遠心し、０．５％溶解酵素（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＵＳＡ）を含む洗浄用緩衝液に３７℃で３時間再懸濁した。スフェロプラストを遠心して回収し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で消化した。該溶液を５０℃で１６時間インキュベーションした。混合物を２回、最初はフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で、次いでクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、ＤＮＡをエタノール（７０％）で沈殿させた。ＤＮＡを遠心して回収し、７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットをＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）および１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡに溶解し、３７℃で１６時間インキュベーションした。有機抽出およびエタノール沈殿を繰り返し、ＤＮＡをＴＥに溶解した。ＤＮＡ濃度を分光測光法的に決定した。
【００５４】
３．２ Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのゲノムＤＮＡライブラリーの構築
Ｎ−末端アミノ酸配列（実施例２．９）から、４つの１７マー オリゴヌクレオチドプローブを合成し（図７）、［γ−３２Ｐ］ ＡＴＰで末端標識し、これを用いて制限エンドヌクレアーゼ ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したＲ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ染色体ＤＮＡのサザンブロットをプローブした。ハイブリダイゼーションは、ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， ＵＳＡ）緩衝液中、４６．８℃で４８時間行った。３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片は該プローブの１つとハイブリダイズした。該３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を単離し、ＢａｍＨＩで切断し、細菌アルカリホスファターゼで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ファージミッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）に連結した。ライゲーション混合物を用い、２．５Ｋｖｏｌｔｓ， ２００ｏｈｍｓ， ２５μＦｄでエレクトロポーレーションしてＥ ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ 細胞 ［Ｅ． ｃｏｌｉ， ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ（Ｆ’ ｐｒｏＡＢ／ａｃｌｑＺΔＭ１５ Ｔｎ１０）］を形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で選択した。
【００５５】
３．３ セファロスポリンエステラーゼ遺伝子を含むクローンの選択
ゲノムライブラリーのコロニーブロットを調製し、Ｎ−末端オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。さらに評価するため、最初に１２クローンを選択した。プラスミドＤＮＡを、ＴＥＬＴｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（ミニプレップ）方法（Ｈｅら、１９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８，１６６０）を用いて各形質転換体から単離した。これらクローンのサザン分析により、該プローブとハイブリダイズするものが２つ確認された。隣接ＤＮＡ配列の翻訳により、該Ｎ−末端タンパク質配列と同一なアミノ酸配列が生じた。プライマー伸張法およびサザンブロッティングによる３ｋｂ ＢａｍＨＩ断片のさらなる分析により該断片内のエステラーゼ遺伝子の位置と方向が決定された。
【００５６】
３．４ ｃＤＮＡクローニング
ｃＤＮＡクローンを３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）により調製した。Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来の総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）を用いて単離し、さらに塩化リチウム沈殿により精製した。第１鎖ｃＤＮＡをアダプタープライマーからの逆転写により調製した。ＲＮＡ鋳型をＲＮアーゼＨで消化し、ｃＤＮＡを遺伝子特異的プライマーおよびアダプタープライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。推定翻訳開始部位および該翻訳開始部位にＮｃｏＩ制限部位を含む内部遺伝子特異的プライマーを用いる第二回のＰＣＲによりコーディング領域を増幅し、突然変異させ、次いで発現ベクター中にクローニングした。これにより１．９ｋｂ断片を生成し、ゲル精製した。この断片の制限分析およびヌクレオチドシーケンシングにより該断片が該エステラーゼ遺伝子を含むことを確認した。発現ベクターへのクローニングをさらに促がすため、成熟ペプチドの始めにＢｓｐＨＩ部位を、また該遺伝子の３末端にＢａｍＨＩ部位を含む別のｃＤＮＡクローンを開発した。
【００５７】
３．５ ヌクレオチド配列の決定
ヌクレオチド配列を、Ｔａｑ Ｔｒａｃｋ ｆｍｏｌ ＤＮＡシーケンシングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）を用いるジデオキシ鎖終止法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７）により決定した。Ｔ３、Ｔ７、および合成内部プライマーを用い、両鎖から完全遺伝子をシーケンシングした。エレクトロポーレーションを、ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の７Ｍ尿素を含む７％ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（ＡＴ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ＵＳＡ）ポリアクリルアミドゲルを用い２７００ｖｏｌｔｓで実施した。完全ヌクレオチド配列を図８に示す。コーディングｃＤＮＡ領域は長さ１７１６ｂｐであり、分子量６１．３ｋＤの５７２アミノ酸タンパク質をコードする。これは該酵素の脱グリコシル化形（実施例２．８）と一致する。ＤＮＡ配列から決定したＮ−末端タンパク質配列は実施例２．９で確認されたタンパク質配列と同一である。この配列は、推定ＡＴＧ翻訳開始部位から２８残基下流で始まる。ｃＤＮＡクローンもゲノムクローンと比較するためシーケンシングされた。該遺伝子は図９Ａおよび９Ｂに示す５つのイントロンを含む。
【００５８】
実施例４
エステラーゼ発現用真菌ベクターの構築
４．１ エステラーゼ遺伝子プラスミドの再構築
Ａ． ゲノムエステラーゼコーディング領域のサブクローニング
Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ゲノムエステラーゼ遺伝子プラスミド、ｐＢＭエステラーゼ１ ５μｇをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位でベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）と連結した。ライゲーション混合物をＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞［Ｅ ｃｏｌｉ Ｆ−ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ） Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｐｈｏＡ ｓｕｐＥ４４λ−ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１］に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天にまいた。アンピシリン耐性コロニーをＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ切断部を有する挿入物についてスクリーニングした。構築されたプラスミドをｐＢＭエステラーゼ１ａ（図２）と呼んだ。
【００５９】
オリゴヌクレオチド断片：
【化３】
2004500826.tif 000007
（配列番号：６）を合成し、ｐＢＭエステラーゼ１ａのＢａｍＨＩ部位をＳｍａＩ部位に変換した。オリゴヌクレオチド断片をキナーゼし（ｋｉｎａｓｅ）、ＢａｍＨＩで切断し、細菌アルカリホスファターゼで処理したｐＢＭエステラーゼ１ａに連結した。ライゲーション混合物を形質転換し、コロニーミニプレップをＢａｍＨＩ部位のＳｍａＩ部位への置換についてチェックした。確認されたプラスミドをｐＢＭエステラーゼ１ｂ（図２）と呼んだ。
【００６０】
Ｂ． Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓエステラーゼ遺伝子プロモーターのクローニング
ａ．エステラーゼ遺伝子プロモーターのクローニング：該エステラーゼ遺伝子の５’末端からのＤＮＡ断片をジゴキシゲニン標識し、これを用いてＰｓｔＩで切断したＲ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ染色体ＤＮＡのサザンブロットをプローブした。１．６ｋｂ ＰｓｔＩ断片が、該エステラーゼタンパク質のＮ末端部分をコードする領域とエステラーゼプロモーター領域を含むことがわかった。１．６ｋｂ ＰｓｔＩゲノムＤＮＡ断片を単離し、ＰｓｔＩで切断し、細菌アルカリホスファターゼで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターに連結した。ライゲーション混合物を用いてＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞を形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天上で選択した。
【００６１】
ｂ． コロニーブロット：形質転換混合物を選択プレートにまき、一夜増殖後、プレートを４℃に２時間おいた。ＭａｇｎａＧｒａｐｈ ０．４５μｍナイロンフィルター（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， ＵＳＡ）を各プレート上に２分間おいた。フィルターをプレートから静かに除去し、コロニー側を上にして１０分間乾燥した。フィルターを、２ｍｌの１０％ ＳＤＳで１０分間、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌで１０分間、１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＮａＣｌで５分間、および２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で１５分間飽和したＷｈａｔｍａｎ １２．５ｃｍろ紙ディスク上にコロニー側を上にしておいた。フィルターを、ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ ＵＶ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＵＳＡ）を用いて１５０ｍＪｏｕｌｅの線量でＵＶ照射して架橋させた。フィルターを３Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで６５℃、６０分間処理し、次いで手袋で静かに擦って細胞屑を除去した。次に、フィルターを２Ｘ ＳＳＣで５分間洗浄し、空気乾燥した。
【００６２】
ｃ． コロニーハイブリダイゼーション：フィルターを各フィルターについて３ｍｌのＤｉｇ−Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ＃１６０３５８， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡ）で３９℃、３０分間、プレハイブリダイズさせた。ガラス製ペトリ皿を用い、各フィルター間にガラスメッシュを置いたフィルターを入れ、１００ｒｐｍで撹拌した。１．６ｋｂジゴキシゲニン標識エステラーゼ特異的プローブ５０μＬをＤｉｇ−Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液１ｍＬで希釈し、沸騰水浴中で１０分間変性させ、次いで速やかに氷上に２分間おいた。プレハイブリダイゼーション溶液をフィルターに注ぎ、５０ｍＬチューブ（Ｆａｌｃｏｎ＃２０９８， Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， ＵＳＡ）で受けた。プローブをこの溶液に加え、ピペットでフィルター上に戻した。次に、フィルターを５０ｒｐｍで３９℃、一夜ハイブリダイズした。フィルターを２Ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで２５℃、５分間２回洗浄し、次いで０．１Ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳで６５℃、１５分間２回洗浄した。フィルターを１％ブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ＃１０９６１７６）を含むＧｅｎｉｕｓ緩衝液１（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５）１００ｍＬで２５℃、３時間インキュベーションした。抗ジゴキシゲニンＦａｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ＃１０９３２７）を１％ブロッキング試薬を含む緩衝液１ １００ｍＬで１：１５，０００に希釈した。ブロッキング溶液をフィルターから除去し、抗体溶液で置換した。フィルターを抗体溶液中で静かに撹拌しながら２５℃、３０分間インキュベーションした。抗体溶液を除去し、フィルターを０．３％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＧｅｎｉｕｓ緩衝液１ １００ｍＬで各１５分間２回洗浄した。最終洗浄後、フィルターをＧｅｎｉｕｓ緩衝液３（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ， ｐＨ９．５， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で２分間インキュベーションした。過剰の溶液をフィルターから除去し、Ｇｅｎｉｕｓ緩衝液３で１：１００に希釈したＣＳＰＤ（Ｃ１８Ｈ２０ＣｌＯ７ＰＮａ２Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ＃１６５５８８４） ０．５ｍｌを各フィルターに適用し、全表面を被うように散布した。フィルターをプラスチックシートプロテクター内におき、２５℃で５分間インキュベーションした。過剰の溶液をフィルター表面からビンに移し、フィルターを新鮮プラスチックシートプロテクターに移した。フィルターを３７℃で１５分間インキュベーションし、Ｘ線フィルム（Ｘ−Ｏｍａｔ ＡＲ， Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＵＳＡ）上に１時間おいた。フィルムを現像すると、単一のハイブリダイゼーションシグナルが観察された。
対応するコロニーをプラスミドミニプレップ用の３０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ） １ｍＬにとった。１．６ｋｂ ＰｓｔＩ挿入物を含むこのプラスミドをｐＢＭエステラーゼ２（図３）と呼んだ。
【００６３】
Ｃ． エステラーゼコーディング配列およびプロモーターの再構築
エステラーゼプロモーターベクター、ｐＢＭエステラーゼ２をＰｓｔＩで切断し、０．７％アガロースゲル上で分離して１．６ｋｂプロモーター断片を単離した。次に、この断片を、ＰｓｔＩで切断し、細菌アルカリホスファターゼ処理したｐＢＭエステラーゼ１ｂに連結した。ライゲーション混合物をＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞に移し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天上にまいた。形質転換体における挿入物の存在を分析した。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化物を用いて挿入方向を決定した。このベクター、ｐＢＭエステラーゼ３からＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ消化により３．８ｋｂ断片上の約７５０ｂｐのプロモーター領域と完全エステラーゼコーディング配列を取り出す（図３）。
【００６４】
４．２ 真菌ベクターｐＳＪＣ６２．３の構築
ゲノムエステラーゼ遺伝子とＲ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓプロモーターを含むベクターｐＢＭエステラーゼ３由来の３．８ｋｂ ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断した真菌形質転換ベクターｐＳＪＣ６２（米国特許５，５１６，６７９）に連結し、その５’突出末端をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ大断片）で充填し、細菌アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。 ＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）をライゲーション混合物で形質転換し、ネオマイシン３０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天プレートにまいた。プラスミドミニプレップを１２コロニーに実施し、６コロニーが挿入物を含むことがわかった。ＥｃｏＲＩ消化を実施し、該挿入物の方向を決定した。プラスミドｐＳＪＣ６２．３は、フレオマイシン耐性遺伝子の同方向に転写されるエステラーゼ遺伝子を含む（図４）。大規模プラスミドの調製をＤＨ５α ＭＣＲ（ｐＳＪＣ６２．３）＋培養上で行い、十分量の真菌形質転換体用プラスミドを得た。
【００６５】
４．３ 真菌ベクターｐＢＭエステラーゼ１１の構築
Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ プロモーターの制御下でＲ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓエステラーゼ遺伝子含有ベクターを構築し、Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中で該エステラーゼの高レベルの発現が達成された。
プラスミドｐＣＳＮ４３（Ｓｔａｂｅｎら、１９８９， Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３６， ７９−８１）をＮｃｏＩで消化し、クレノー酵素で充填し、次いでＢａｍＨＩで切断した。消化物を０．７％アガロースゲル上で分離した。ｔｒｐＣコーディング配列の３’末端１５３ｂｐを含むＡ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣターミネーターを含む５９１ｂｐ断片を精製し、ＸｂａＩで切断し、クレノー酵素で充填し、次いでＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＷＢ１９Ｎ（米国特許５，５１６，６７９）に連結した。ライゲーション反応物をＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞に形質転換し、得られたプラスミドをプラスミドＡ（図５）と呼んだ。
【００６６】
プラスミドｐＳＪＣ６２をＢａｍＨＩで切断し、クレノー酵素で充填し、次いでＭｓｃＩで消化した。Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓフレオマイシン耐性遺伝子の開始コドンに存在するｔｒｐＣプロモーターおよびＮｃｏＩ部位を含む１．２ｋｂ断片を０．７％アガロースゲル上で精製した。この断片をＳｍａＩで切断し、細菌アルカリホスファターゼで処理したプラスミドＡに連結した。このライゲーション混合物をＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞に形質転換した。得られたプラスミドをｐＪＢ１０（図６）と名づけた。
【００６７】
プラスミドｐＪＢ１０にゲノムエステラーゼ遺伝子を挿入するためのＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ切断部位を得るために、２つのオリゴヌクレオチドプライマー；ＮｃｏＩ部位を生じるＮ．Ｔ．＃８０のＣ→Ｇ変化を有するプライマーＲｃ２ａ＋（５’−ＡＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：７， 配列番号：３のＮ．Ｔ．＃６７〜Ｎ．Ｔ．＃９６に対応）；およびＢａｍＨＩ部位を生じるためのＮ．Ｔ．＃２１１０のＧ→Ｃ変化を有する別のプライマーＲｃ４−（５’−ＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＴＡＧＡＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＣＡＣＣＧＡ−３’（配列番号：８、配列番号：３のＮ．Ｔ．＃２１１７〜Ｎ．Ｔ．＃２０８８に対応）をＰＣＲ反応用に合成した。リーダー配列を含むゲノムエステラーゼ遺伝子断片をベクターｐＳＪＣ６２．３からＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μｌの１ｎｇ／μｌ ｐＳＪＣ６２．３、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌの１０μＭプライマーＲｃ２Ａ＋、２μｌの１０μＭプライマーＲｃ４、５μｌのＰｆｕ １０Ｘ緩衝液、１μｌのＰｆｕｉ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）からなった。反応条件は９６℃で５分間、次いで下記工程：９６℃で３０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で４分間を３２サイクルであった。３２サイクル後、反応を７２℃で１０分間延長した。２，０４８ｂｐ エステラーゼＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、０．７％アガロースゲル上でゲル精製した。ゲノムエステラーゼ遺伝子断片をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＪＢ１０に連結した。ライゲーション反応物をＤＨ５α ＭＣＲコンピテント細胞に形質転換した。得られたプラスミドをｐＢＭエステラーゼ１１（図６）と呼んだ。
【００６８】
実施例５
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換
５．１ 形質転換法
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＢＣ１３８５株の凍結栄養ストック培養１ｍＬを用いて５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のＰＶ培地（２．４％麦芽エキス、２．７％酵母エキス、１％ペプトン）１００ｍｌに接種した（Ｂａｓｃｈら、１９９８， Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０， ３４４−３５３）。培養液をＭｏｄｅｌ Ｇ２５振盪培養器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）中、２５０ｒｐｍで２８℃、６４時間培養した。菌糸体を３０μｍメッシュナイロンフィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｍｅｓｈ Ｎｙｌｏｎ Ｎ， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， ＵＳＡ）で減圧ろ過して回収し、無菌脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。次に、菌糸体を重量測定し、ろ過滅菌した１０ｍＭ ＤＴＴ含有中性Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．１）に菌糸体１ｇ／２０ｍｌ緩衝液の割合で再懸濁した。混合物をＭｏｄｅｌ Ｇ２５振盪培養器中、１５０ｒｐｍで２８℃、９０分インキュベーションした。菌糸体を３０μｍメッシュナイロンフィルターで再度ろ過して回収し、無菌脱イオンＨ２Ｏで洗浄した。菌糸体を、４ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｏｖｏｚｙｍｅ ２３４（ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ． ＵＳＡ）を含有するろ過滅菌等張性および酸性Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．１Ｍクエン酸、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．３５）に再懸濁した。菌糸体１ｇにつき上記緩衝液１０ｍＬを用いた。混合物をＭｏｄｅｌ Ｇ２５振盪培養器中、１００ｒｐｍで２８℃、６０分間インキュベーションした。菌糸体凝集塊を１０ｍＬガラスピペットで上下に１０回ピペッティングして分離させた。洗浄用緩衝液（０．８Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭ ＭｇＳＯ４） ４容量を加え、全溶液をガラスファイバーをゆるく詰めた無菌ガラス漏斗でろ過した。ろ液を回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＪ−６遠心機とＴＨ−４スイングバケットローターを用い、８５０ｘｇで室温、８分間遠心した。上清を速やかにデカントした。プロトプラストペレットを室温で１／２容量の洗浄用緩衝液で２回洗浄し、８５０ ｘ ｇで８分間遠心した。次に、ペレットを３−５ｘ１０８プロトプラスト／ｍｌの濃度で０．８Ｍ ＮａＣｌに再懸濁した。プロトプラスト１ｍｌに、ジメチルスルホキシド５μｌおよび１Ｍ ＣａＣｌ２８０μｌを加えた。ＴＥ ２０μｌおよびヘパリン（１０Ｍｇ／ｍｌ）４μｌ中のＤＮＡ ２０μｇを、１４ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ＃２０５９， １７ｘ１００ｍｍチューブ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）に加えた。真菌形質転換体を選択するためのフレオマイシン耐性遺伝子を持たないプラスミドｐＢＭエステラーゼ１１を形質転換するため、ｐＢＭエステラーゼ１１ １０μｇおよびｐＳＪＣ６２ １０μｇの混合物を用い、共形質転換によりｐＢＭエステラーゼ１１を宿主細胞に導入した。プロトプラスト１００μｌをＤＮＡチューブに加え、次いで２０μｌの４０％ポリエチレングリコール−４０００を加えた。該溶液を静かに混合し、室温で１０分間インキュベーションした。４０％ポリエチレング���コール−４０００ １ｍＬを加え、静かに混合し、次いで溶かした（５０℃）上層寒天（０．８Ｍ ＮａＣｌ， ０．７％寒天） １０ｍｌを加えた。再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）寒天（３％トリプチケースソイブロス、１０．３％ショ糖、２％寒天）２０ｍＬを予め注いだ２プレートに寒天５ｍＬをピペットで入れた。プレートを２８℃で２４時間インキュベーションし、次いで、濃度１２μｇ／ｍｌのフレオマイシン（フレオマイシンの最終濃度は２μｇ／ｍｌ）含有上層寒天５ｍＬを重層した。２８℃で２週間インキュベーションした後、形質転換体を観察した。
【００６９】
５．２ 形質転換体の確認
Ａ． Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡの単離
形質転換体 ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ３、ＤＣ１１、およびＤＣ１４からの凍結栄養ストック培養１ｍＬをＰＶ培地３０ｍＬに接種した。菌糸体培養を増殖させ、回収し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２３４で処理して上記のごとくプロトプラストを形成した。プロトプラストペレットを溶解緩衝液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）３ｍＬに再懸濁し、３７℃で５分間インキュベーションした。０．７Ｍ ＮａＣｌ中の１０％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ） ０．３ｍｌ容量を溶解混合物に加え、６５℃で１０分間インキュベーションした。該溶液を等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出してＣＴＡＢ−多糖複合体を除去した。水性溶液を回収し、１００％エタノール６ｍｌを加えてＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットを遠心して回収し、７０％エタノールで洗浄し、減圧下で５分間乾燥し、ＴＥ ５００μｌに再懸濁した。ＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） １０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。プロテイナーゼＫ溶液を最終濃度が４００μｇ／ｍｌとなるようにチューブに加え、５０℃で３０分間インキュベーションした。３Ｍ ＮａＣｌ ６０μｌを加え、混合物を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）で抽出した。ＤＮＡを１００％エタノール２容量を用い、室温で１時間沈殿させた。次に、ＤＮＡを遠心してペレット化し、 ７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ４００μｌに再懸濁した。
【００７０】
Ｂ． ゲル電気泳動およびブロット
ゲノムＤＮＡ ５μｇを総量２００μｌ中のＥｃｏＲＩ ４０単位で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベーションした。３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２ ２０μｌを加え、混合した。次に、消化物を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出した。２容量の１００％エタノールを加え、ＤＮＡを−７０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを４℃で１０分間遠心してペレットとし、減圧下で５分間乾燥し、次いでＴＥ ２０μｌに再懸濁した。消化物８μｌをＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−アセテート、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の０．７％アガロースゲルに流し、１２Ｖで１６時間分離した。ＤＮＡを０．２５Ｎ ＨＣｌで１０分間脱プリン化し（ｄｅ−ｐｕｒｉｎａｔｅｄ）、脱イオンＨ２Ｏでリンスした。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ７８５ Ｖａｃｕｕｍ Ｂｌｏｔｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ＃１６５−５０００）を用い、０．４Ｎ ＮａＯＨを用いてＤＮＡをナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタログ＃ １２０９ ２９９）に移した。移した後、ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋｅｒ ＵＶ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて線量１２５ ｍＪｏｕｌｅをＵＶ照射することによりＤＮＡを膜と架橋させた。
【００７１】
Ｃ． ハイブリダイゼーション
フィルターを、Ｄｉｇ−Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液１０ｍｌ中で５０℃、３０分プレハイブリダイズさせた。ネオマイシン耐性遺伝子特異的な、ＰＣＲ生成ジゴキシゲニン標識プローブ（１０ｎｇ／μｌ）５μｌをＤｉｇ−Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液１ｍｌで希釈し、沸騰水浴中で１０分間変性させた。次に、変性プローブを２分間氷上においた。プレハイブリダイゼーション溶液５ｍＬをフィルターに注ぎ、１４ｍｌ ポリプロピレンチューブで受けた。この溶液にプローブを加え、ピペットでフィルター上に戻した。次に、フィルターを５０℃で一夜ハイブリダイズさせた。フィルターを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで、２５℃５分間２回洗浄し、次いで０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで６５℃１５分間２回洗浄した。次に、フィルターを、Ｄｉｇ−標識ＤＮＡハイブリッドを検出するため実施例４．１．Ｂ ｃ項に記載のごとく処理した。
【００７２】
５．３ 形質転換体中の形質転換プラスミドの状態
ゲノムＤＮＡを、形質転換体 ＤＣ１、ＤＣ２、ＤＣ３、ＤＣ１１およびＤＣ１４、ならびに宿主培養ＢＣ１３８５から単離した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移した。該膜を、ネオマイシン耐性遺伝子またはＲ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ エステラーゼ遺伝子に特異的なＰＣＲ生成プローブとハイブリダイズさせた。生じたサザンブロットは、遺伝子プローブが形質転換体ＤＮＡとハイブリダイズするが非形質転換宿主ＤＮＡとはハイブリダイズしないことを示す。すべての形質転換プラスミドＤＮＡも宿主染色体に統合された。ある種の形質転換体は統合プラスミドを多数コピー有する。
【００７３】
実施例６
デスアセチルセファロスポリンＣの生成
６．１  デスアセチルセファロスポリンＣ生成の振盪フラスコ評価
形質転換プレートを２週間インキュベーションした後、フレオマイシン耐性形質転換体を滅菌爪楊枝でＹＥ寒天（１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、０．４％グルコース、２％寒天、ｐＨ７．３）プレートに移し、２８℃で７日間インキュベーションした。次に、コロニーを用いてＹＥ寒天６ｍｌを含むスラントに接種し、２８℃で７日間増殖させた。無菌脱イオンＨ２Ｏ ２ｍＬを用いて各スラントからの培養を再懸濁し、次いで再懸濁培養１ｍｌを１２５ｍｌ エルレンマイヤーフラスコ中の種培地２５ｍＬに接種した。種培養をシェイカー中、２５０ｒｐｍで２８℃、４８時間培養した。次に、種培養２ｍｌを１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ（ｂｉ−ｉｎｄｅｎｔｅｄ）中の発酵培地２０ｍｌに移し、２５０ｒｐｍで２４℃、７日間培養した。全ブロスを、セファロスポリンＣおよびデスアセチルセファロスポリンＣの濃度のＨＰＬＣアッセイに用いた。発酵コントロールは、デカノール処理Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ 細胞１００μｌを加えたＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＢＣ１３８５培養であった。
形質転換体の振盪フラスコ評価の結果から、すべての５つの形質転換体、３つのｐＳＪＣ６２．３形質転換体および２つのｐＢＭエステラーゼ１１形質転換体が、標準的振盪フラスコスクリーニング条件下でデスアセチルセファロスポリンＣのみを生成することがわかった。デカノール処理Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ細胞１００μｌを加えた非形質転換ＢＣ１３８５培養をコントロールとして含めた。各菌株のセファロスポリンＣおよびデスアセチルセファロスポリンＣ力価を表３に示す。
【００７４】
表３． 組換えＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株の振盪フラスコ評価
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＊発酵ブロス１ｇあたりのセファロスポリンＣまたはデスアセチルセファロスポリンＣの相対単位。
【００７５】
６．２ Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中のエステラーゼ遺伝子発現
Ｒ． ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ セファロスポリンエステラーゼは、タンパク質の酵素活性に必要な炭化水素残基を有する重度にグリコシル化した膜結合タンパク質である。この遺伝子のヌクレオチド配列は、セファロスポリンエステラーゼタンパク質の成熟形では除去される２８アミノ酸リーダー配列があることを示す。Ｅ． ｃｏｌｉ中でこの遺伝子の発現を試みても検出可能な酵素活性を生じることができなかった。Ａ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主の内在性Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍプロモーター（例えば、ｐＳＪＣ６２．３中の遺伝子構築物）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｒｐＣプロモーター（例えば、ｐＢＭエステラーゼ１１中の遺伝子構築物）を有するゲノム遺伝子からのＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主における活性セファロスポリンエステラーゼ酵素のヘテロローガスな発現は、１）該プロモーターがＡ． ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＲＮＡポリメラーゼを認識しなければならず、２） ５つのイントロンが正しくスプライスされ、３） リーダー配列が除去され、そして４） 該タンパク質がグリコシル化されなければならないことを示す。実際に、ほとんどのエステラーゼ遺伝子形質転換体は主にデスアセチルセファロスポリンＣを生成する。形質転換はスーパーコイル化ＤＮＡを用いて行われるので、ある種の形質転換体はデスアセチルセファロスポリンＣプロデューサーではなく、おそらく統合時に破壊されたセファロスポリンエステラーゼ遺伝子を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】セファロスポリンＣのデスアセチルセファロスポリンＣへの変換、およびセファロスポリンＣの２−（Ｄ−４−アミノ−４−カルボキシブチル）チアゾール−４−カルボン酸（化合物Ｘ）への化学的分解を示す図である。
【図２】プラスミドｐＢＭエステラーゼ１ａおよびｐＢＭエステラーゼ１ｂの製造を示す図である。
【図３】プラスミドｐＢＭエステラーゼ３の製造を示す図である。
【図４】プラスミドｐＳＪＣ６２．３の製造を示す図である。
【図５】プラスミドＡの製造を示す図である。
【図６】プラスミドｐＢＭエステラーゼ１１の製造を示す図である。
【図７】該タンパク質のＮ末端（配列番号：９）、該ゲノムＮ末端の逆翻訳配列（配列番号：１０）、該逆翻訳配列に相補的な逆翻訳配列（配列番号：１１）、および該エステラーゼ遺伝子を同定するのに用いる４つのオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ１−４、それぞれ配列番号：１２−１５）を示す図である。
【図８Ａ】本発明において有用なエステラーゼをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図８Ｂ】本発明において有用なエステラーゼをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図９Ａ】本発明において有用なエステラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列（配列番号：３）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２） を示す図である。
【図９Ｂ】本発明において有用なエステラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列（配列番号：３）およびそれに対応する該エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図１０】典型的には完全ペプチドより良好な酵素活性を有する成熟ペプチドの５４４アミノ酸配列（配列番号：４）を示す５７２アミノ酸を含む本発明に有用なエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図１１】本発明において有用な完全なエステラーゼのアミノ酸組成物の分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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