(57)【要約】本発明は、卵黄抗体（ＩｇＹ）からの免疫コンジュゲート、その製造ならびに診断および治療への使用に関する。本発明の課題は、診断的使用および治療的使用のための従来の免疫コンジュゲートに対する代替の生成物を提案することである。本発明による免疫コンジュゲートは、哺乳類からの単クローン抗体および免疫血清ならびに常用のニワトリからのＩｇＹ製剤を純度および抗原ターゲッティングに関して優れている。そのうえ、ヒト抗ＩｇＹ抗体の形成はできるだけ回避されるべきであり、かつ、該免疫コンジュゲートは、動物保護に適合しかつ大量に安価に製造されることができなければならない。この課題は、本発明によれば、ＳＰＦニワトリの、好ましくはトランスジェニックＳＰＦニワトリの、無傷の卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体またはヒト化卵黄抗体からの多クローン性ＩｇＹコンジュゲートによって解決される。該抗体または該抗体フラグメントは免疫効果をもつ成分として、シグナル物質、作用物質または増幅分子でもよい少なくとも１つの別の成分と結合されているものとする。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧの定常領域を有する多クローン性ＩｇＹである、トランスジェニックＳＰＦニワトリもしくはヨーロッパ薬局方およびＤＡＢ１０に従った特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリの卵からの多クローン性ＩｇＹ製剤ならびに少なくとも１つのシグナル物質および／または作用物質および／または増幅分子から成る、卵黄抗体（ＩｇＹ）からの免疫コンジュゲート。
【請求項２】
上記多クローン性ＩｇＹ製剤が精製された卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体またはキメラ卵黄抗体である、請求項１記載の卵黄抗体（ＩｇＹ）からの免疫コンジュゲート。
【請求項３】
調製に使用される上記ＩｇＹ製剤が、鳥類の抗体の可変領域とヒトＩｇＧの定常領域との化学結合によって得られたヒト化卵黄抗体を含むことを特徴とする、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４】
上記ＩｇＹ製剤が一価もしくは二価の抗体フラグメント、好ましくはＦａｂまたはＦ（ａｂ）２、から成ることを特徴とする、請求項１または２記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５】
上記ＩｇＹ製剤が二種特異性、三種特異性もしくは多特異性のＦａｂ構成体から成ることを特徴とする、請求項１または２記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６】
上記シグナル物質が診断用放射性核種、酵素、色素および／または光増感剤であることを特徴とする、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７】
上記作用物質が治療用の放射性核種、細胞増殖抑制剤、毒素、化学療法剤、プロドラッグ、酵素、光増感剤および／または線維素溶解薬剤であることを特徴とする、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８】
上記ＩｇＹ製剤が増幅分子、好ましくはビオチン、または補体システムのタンパク質と結合していることを特徴とする、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９】
上記シグナル物質もしくは作用物質が共役結合により、または助剤、例えばキレート剤、増幅分子および／または該増幅分子に対して高親和性の分子、を用いて上記ＩｇＹ製剤に、あるいは二種特異性、三種特異性もしくは多特異性のＩｇＹ構成体の１つ以上の腕の可変領域を介して結合していることを特徴とする、上記請求項のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０】
上記ＩｇＹ製剤が腫瘍抗原に対して、ホルモンに対して、ＲＮＡ断片および／またはＤＮＡ断片に対して、感染性病原体もしくはその（表面）抗原に対して、白血球抗原に対して、細胞内分子に対して、受容体分子に対して、あるいは凝固因子に対して特異的であることを特徴とする、上記請求項のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１１】
上記免疫コンジュゲートがプレターゲッティングの範囲内で先ずインビボで特異抗原に結合した後で好ましくはビオチン／アビジンもしくはビオチン／ストレプトアビジンを介してシグナル物質もしくは作用物質と結合する、上記請求項のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１２】
上記免疫コンジュゲートがプレターゲッティングの範囲内で先ずインビボで特異抗原に結合した後で二次ヒト抗ＩｇＹ抗体を介してシグナル物質もしくは作用物質ないしは増幅分子と結合する、上記請求項のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１３】
少なくともＩｇＹ製剤およびシグナル物質もしくは作用物質および／または増幅分子ならびに付加的なコンポーネント、例えば、薄層クロマトグラフィー、分離塔、装置用のスタンド、洗浄‐および溶離緩衝液による品質管理のためのセットを含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載された免疫コンジュゲートの製造のための卵黄抗体（ＩｇＹ）のコンフェクショニング。
【請求項１４】
薄層クロマトグラフィーによる品質管理のためのセットおよび適用のための装置を少なくとも含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載された免疫コンジュゲートのコンフェクショニング。
【請求項１５】
上記ＩｇＹ製剤が凍結乾燥された形で存在するかあるいは、最適なｐＨ値に調整された、添加剤、例えば安定剤、と組み合わされた懸濁液の形で存在する、請求項１１または１２記載のコンフェクショニング。
【請求項１６】
特に非感染性の炎症、感染性疾患、凝固障害、自己免疫疾患および腫瘍の疾患に対する、診断剤もしくは治療剤の製造のための、請求項１から１０までのいずれか１項に記載された免疫コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１，１３，１４および１６の特徴部に記載の、卵黄抗体（ＩｇＹ）からの免疫コンジュゲート、そのコンフェクショニング（Ｋｏｎｆｅｋｔｉｏｎｉｅｒｕｎｇ）ならびに診断および治療への使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明のより良い理解のために、本願に記載の術語は、本明細書では次のとおりより詳細に定義され、かつ、本願の範囲内では他の意味を持たないこととする。
【０００３】
「特定病原体除去ニワトリ」（要するに「ＳＰＦニワトリ」）：
ヨーロッパ薬局方およびＤＡＢ１０の基準に従ってＳＰＦ母親動物の血統を引きかつ日齢初日からＳＰＦ条件下に維持される動物のことである。この動物は、ヒト病原性刺激体および家禽病原性刺激体（ｍｅｎｓｃｈｅｎ−  ｕｎｄ  ｇｅｆｌｕｅｇｅｌｐａｔｈｏｇｅｎｅ  Ｅｒｒｅｇｅｒ）ならびにこれらの抗体を有していない。
【０００４】
「ＩｇＹ」（英語：  イムノグロブリンヨーク（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｙｏｌｋ））：
本明細書では、家禽卵の卵黄から抽出され、かつ、ニワトリの血清中におけるＩｇＧに相応する免疫グロブリンのことである。この鳥類の免疫グロブリンは、構造的に、とりわけ、Ｆｃフラグメントにおける定常ドメインの数が多いことによる該免疫グロブリンのより高い分子量によって哺乳類のＩｇＧと異なっている。
【０００５】
「特異性ＩｇＹ」：
は、本明細書では、ＩｇＹ全体のうちの、免疫に使用される抗原を認識する部分として定義されており、一方で非特異性ＩｇＹは、ＩｇＹ全体のうちの、抗原性作用物質または非病原性刺激体および病原性刺激体（ａｐａｔｈｏｇｅｎｅｎ  ｕｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅ  Ｅｒｒｅｇｅｒｎ）との動物の接触による免疫とは無関係に形成される部分を表す。
【０００６】
「無傷の抗体」：
これは、フラグメント化されていない、つまり１つのＦｃフラグメントと２つのＦａｂフラグメントを有し、この場合、Ｆｃは重い鎖の定常領域でありかつＦａｂは重い鎖および軽い鎖の可変領域である免疫グロブリンのこととする。
【０００７】
「ＩｇＹフラグメント」：
「ＩｇＹフラグメント」で、本明細書では、Ｆｃフラグメントの残基を持たないかもしくはわずかにだけ有する鳥類の免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを表している。この場合、本明細書ではこれ以降「Ｆａｂ」という語は、簡略化のためにＦ（ａｂ）２といったフラグメントも表すこととする。
【０００８】
「Ｆａｂ構成体」：
「Ｆａｂ構成体」という語は、１つもしくはそれ以上の異なる抗原決定基を認識し（単一特異性構成体、二種特異性構成体または三種特異性構成体など）かつしたがって１つもしくはそれ以上の機能を満たすことができる、即ち一価、二価もしくは三価で作用する、２つ以上の異なるＦａｂフラグメントから成る人工的な形成物（二価もしくは三価の構成体など）を表すこととする。
【０００９】
「抗原決定基」：
これは、抗原にある、抗体によって特異的に認識される分子構造である（「エピトープ」とも呼ばれる）。
【００１０】
「ＩｇＹ製剤」：
これは、卵黄から抽出された、さらに場合によっては精製された卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体またはキメラ卵黄抗体のこととする。
【００１１】
「シグナル物質」：
この語で、病理学的もしくは生理学的な所見の分析的判定、視覚的判定もしくは画像判定を可能にする全ての物質を意味することとする。
【００１２】
「作用物質」：
この語で、治療に利用可能である全ての物質、例えば酵素、抗生物質、抗ウイルス剤および、毒素もしくは放射性核種といった細胞毒素、を表している。この場合、該作用物質が同時にシグナル物質の性質を満たすことは、ありえないことではない。
【００１３】
「プロドラッグ」：
この語で、無傷の前駆体から体の中でその場で活性の作用物質に変換される全ての物質が表されることとする。
【００１４】
「ブースター」および「追加免疫」：
ＳＰＦニワトリの免疫に関してこの２つの語が取り上げられる。ブースターは、最大のＩｇＹ力価を達成するのに用いられる。追加免疫は、再度の抗体曝露を意味し、この抗体曝露によって最大のＩｇＹ力価が産卵期間（Ｌｅｇｅｐｅｒｉｏｄｅ）の終わりまで持続される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
公知技術水準から、マウスからの単クローン抗体（マウスＭＡｂｓ）またはヒトからの単クローン抗体（ヒトＭＡｂｓ）を基礎とする免疫コンジュゲートが公知である。シグナル物質（色素、蛍光色素、診断用放射性核種）または作用物質（例えば毒素、治療用放射性核種、光増感剤、プロドラッグ）をこれら抗体に結合させるための数多くの方法が確立された。これによって、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー（Ｄｕｃｈｆｌｕｓｓｚｙｔｏｍｅｔｒｉｅ）、シンチグラフィ、ＳＰＥＣＴ（英語：  シングルフォトンエミッションコンピューテッドトモグラフィ（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ））、ＰＥＴ（陽電子射出断層撮影）および光免疫診断（Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ）といった検査ないしは例えば放射免疫療法、免疫毒素療法または光力学療法といった治療を実施することが可能である。
【００１６】
単クローン抗体の欠点にはとりわけ抗体の単一特異性があり、かつ単クローン抗体の比較的高費用でコスト集約的な開発および製造がある。大量生産は通常大きな発酵槽で行われなければならず、それというのも、マウスの腹水内での製造が一方で多くの国で広く禁止されているからである。
【００１７】
哺乳類（ヒツジ、ウマ、ブタなど）および免疫になった／感染した提供者からの多クローン性免疫血清（例えば高いｐ２４‐抗体力価を有するＨＩＶ感染者の血液からの）は、種々の診断方法および受動免疫療法において重要である。この免疫血清の多クローン性は、複合抗原の改善されたターゲッティングの見地に立って重要である。しかしながら、哺乳類または慣習的なニワトリの免疫血清は、定義づけが比較的不適切である多特異性抗体混合物を含有しており、その際、所望の特異性抗体は極めて僅かな部分を形成し、これに対して非特異性の、したがって望ましくない抗体が大部分を成す。哺乳類からの免疫血清の獲得は、動物保護の見地に立ってあまり是認することができず、したがってより多くの国で既に広く禁止されている。免疫血清をヒトの給血から獲得することは、費用が高く、危険がないということは決してなく（例えばＨＩＶ、ＨＣＶおよび場合によってはプリオンといった病原体の感染）、倫理的に問題があり、かつしたがって幅広い応用に対して実施可能ではない。
【００１８】
鳥類起源の多クローン抗体、特に卵黄抗体（ＩｇＹ）は、公知技術水準で同様に公知である。ＩｇＹは今日、さまざまな製造業者によって、インビトロ診断用に哺乳類からの免疫血清もしくは多クローン抗体に対する代替物として提供される。専門書にはこれについての例も、卵黄抗体をインビトロ診断に使用可能にするために、該卵黄抗体をビオチン、ＦＩＴＣもしくはセイヨウワサビ（ホースラディッシュ）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合させることができる（ＳＣＨＡＤＥら著、２００１年［１］）といったように記載されている。
【００１９】
常用のニワトリに由来する鳥類の抗体の経口使用も公知である。ＩｇＹが哺乳類においては系統学的な距離ゆえに補体因子Ｃ１にもＦｃ受容体にも結合せず、したがって哺乳類の防御システムと効果的に相互に作用することができないために、そしてまた一方でＩｇＹがアレルギー反応を引き起こすことがあるために、人間医学における非経口的な使用はこれまで幅広く排除されてきた。さらに、常用のニワトリの卵黄からのＩｇＹの製造はあまり効率的ではなく、かつ純度および親和性に関して質的に劣る生成物を生じさせるという事情がある。この理由は、常用のニワトリが他の刺激体に対する多数の非特異性抗体を産生し、したがって標的免疫原に対する応答が比較的弱くかつ短時間しか持続しないということである。したがって常用のニワトリの場合のＩｇＹ全体における特異性ＩｇＹの割合は、１０％を大きく下回る（米国特許第４５５００１９号明細書；ＨＡＮＳＥＮら著，１９９８年［２］；ＢＯＵＨＯＵＲＳら著，１９９８年［３］；ＧＡＳＳＭＡＮＮら著，１９９０年［４］）。
【００２０】
次の公知技術が、ＩｇＹを用いたＨＩＶ感染の受動免疫療法に関する独国特許１９５０４７５５明細書に記載されている。このＩｇＹは、特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリからのＨＩＶコア抗原ｐ２４およびｐ１７に対して向けられている。ヒト免疫血清を用いた受動免疫療法も公知である。しかし、免疫血清および多クローン抗体に比べＩｇＹは比較的容易にかつ安価に製造することができる。このＳＰＦニワトリは、実施例２に記載された免疫プロトコル下に基礎免疫およびブースターの後に第１６月齢まで週に５〜７個の卵を産む。この場合、経験によれば１個の卵黄が所望の特異性のＩｇＹを少なくとも５０ｍｇ含有しているので、ＳＰＦニワトリの２５０〜３５０個の卵から特異性ＩｇＹを約１５，０００ｍｇ獲得できることが明らかである。さらに、ＳＰＦニワトリへの負荷は、この動物のために規定された、種類相応の動物飼育ゆえに、従来の肥育鶏および産卵鶏の飼育の場合より極めてわずかである。このことによって、例えば従来のニワトリ飼育の場合には通常である、その中に２つの強制予防接種を含む１９までの経済的に重大な意味をもつ伝染病に対する通常の能動免疫はもはや行われない。このことは、従来のニワトリのＩｇＹ製剤が劣っていることおよび、特異性ＩｇＹの単離が困難でありかつ価格を上昇させることの原因である。ＳＰＦニワトリの飼育は、ヒト病原性細菌および家禽病原性細菌の無い状態で行われる。このような細菌を排除するために規則的な飼料、水および免疫状態の管理が実施される。該動物のＳＰＦ状態を覆い隠さないようにするために、飼料への抗生物質の添加は不要である。
【００２１】
医学的な見地からＩｇＹの利点は一般的に、特異抗原による複数の抗原決定基の認識にあり、このことにより標的抗原の改善されたターゲッティングが保証され、かつ、その免疫システムが抗原認識に関して哺乳動物およびヒトの免疫システムと異なる家禽に由来する抗体が重要であるという事実にある。このことは標的抗原のターゲッティングをも改善し、それというのも、鳥類の免疫システムが（系統学的に条件付けられて）人間のヒト免疫システムと異なる抗原決定基を認識するからである。したがって鳥類の抗体は、エピトープを認識するのに、インビボで患者の本来存在する抗体と競合する必要があまりない。さらに、鳥類の抗体がヒトの補体システムとも、Ｆｃ受容体、プロテインＡもしくはプロテインＧとも多くの場合に反応しないという、一般に欠点と思われていることが本質的なものではなく、それどころか利点であることを証明することが可能である。
【００２２】
したがって本発明の課題は、従来の免疫コンジュゲートに対する代替の生成物であって、診断への使用および治療への使用に適しており、その際、哺乳類からの単クローン抗体および免疫血清ならびに常用のニワトリからのＩｇＹ製剤を純度および抗原ターゲッティングに関して優れている生成物を開発しかつ提供することである。そのうえ、ヒト抗ＩｇＹ抗体の形成はできるだけ回避されるべきであり、かつ、該免疫コンジュゲートは、動物保護に適合しかつ大量に安価に製造されることができなければならない。
【００２３】
次に発明の説明のはじめに、例えば一貫して以下の発明の説明およびさらに特許請求の範囲において理解される更なる用語が定義されなければならない。これら用語は、本願の範囲内で他の意味を持たないものとする。
【００２４】
「放射免疫コンジュゲート（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｋｏｎｊｕｇａｔ）」：
これは、本願の場合には、診断用および／または治療用放射性核種および／または増幅分子（Verstaerker-Molekeuel ）と結合しておりかつ核医学診断および／または放射免疫療法の分野に応用される、ＳＰＦ雌鶏もしくはトランスジェニックＳＰＦ雌鶏に由来するＩｇＹ製剤の化合物のことである。
【００２５】
「免疫毒素」：
これは、毒素（植物性毒素、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、抗生物質など）と結合しておりかつ免疫毒素療法の分野に応用される、ＩｇＹ製剤の化合物のことである。
【００２６】
「特異的ターゲッティング」：
これは、シグナル物質もしくは作用物質が免疫グロブリンによって所望の標的抗原に結合される過程を表す。
【００２７】
「プレターゲッティング」：
本明細書では、他の生物種の別の抗体または他の適当な分子（本明細書ではさらに「増幅分子」という用語にまとめられる）が抗原結合部（Ａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｕｎｇ）とシグナル物質もしくは作用物質との間のなんらかの相に挿入されることによって、ＩｇＹ製剤のシグナルもしくは作用物質の増幅を生じさせる使用のことである。
【００２８】
「キメラ卵黄抗体」：
これは、
ｉ）ニワトリのＦａｂフラグメントがヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと生化学的に相互に結合されたヒト化免疫グロブリン、または
ｉｉ）ＩｇＹの定常領域についての遺伝子部分が多少とも完全にヒトＩｇＧの定常領域によって置換されているトランスジェニックＳＰＦニワトリのヒト化免疫グロブリン
を表す。
【００２９】
「ＩｇＹコンジュゲート」：
この用語は、本明細書の場合には多クローン性ＩｇＹ製剤（免疫成分）ならびにシグナル物質および／または作用物質（診断成分もしくは治療成分）および／または増幅分子から成る化合物を内容とする。
【００３０】
上記課題は、本発明によれば、ＳＰＦニワトリの、好ましくはトランスジェニックＳＰＦニワトリの、無傷の卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体またはヒト化卵黄抗体からの多クローン性ＩｇＹコンジュゲートによって解決される。該抗体または該抗体フラグメントは免疫効果をもつ成分として、シグナル物質、作用物質または増幅分子でもよい少なくとも１つの別の成分と結合されているものとする。
【００３１】
本発明は、本発明によるＩｇＹコンジュゲートの、医学における診断的かつ治療的使用ならびに動物モデル（例えばマウス、ヒツジまたはヒトではない霊長類）における実験的使用に関する。該ＩｇＹコンジュゲートの使用は、非経口的適用に限定されておらず、使用目的に応じて外的適用（例えば黒色腫の場合）および経口的適用（例えば食道癌の場合）も含む。
【００３２】
そのうえ本発明は、各成分の形での、標識セット（Ｍａｒｋｉｅｒｕｎｇｓｂｅｓｔｅｃｋｅ）（いわゆるキット）の形での、またはすぐに使用できる製剤の形での、すぐに使用できる診断剤もしくは医薬品としてのＩｇＹコンジュゲートのコンフェクションに関する。標的抗原として全てのタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、核酸、多糖およびリポタンパク質が考慮の対象となる。本発明は、とりわけ腫瘍抗原、ホルモン、受容体タンパク質、ＲＮＡ断片およびＤＮＡ断片、感染性病原体、プリオンまたはこれら標的抗原の抗原決定基の部分に対するＩｇＹコンジュゲートに関する。この場合、本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、免疫に使用される抗原の複雑度に応じて多少とも多特異性のＩｇＹを含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の別の側面は、
ｉ）ビオチニル化ＩｇＹを標的抗原に結合させ、かつ標識化されたアビジンもしくはストレプトアビジンのための剤として使用するか、あるいは
ｉｉ）結合されていないＩｇＹを標的抗原に結合させ、かつヒト抗ＩｇＹコンジュゲートもしくはヒト化抗ＩｇＹコンジュゲートのための剤として使用する
プレターゲッティング方法に関する。
（ｉ）の場合にはビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの強い結合が利用され、そのためにＩｇＹコンジュゲート中のビオチン成分を増幅分子と呼ぶこともできる。
【００３４】
そして本発明は、例えば外科的手術、化学療法剤、免疫調節剤およびパラ免疫誘導物質（Ｐａｒａｉｍｍｕｎｉｔａｅｔｓｉｎｄｕｃｅｒ）との組合せといった、ＩｇＹコンジュゲートの診断的および／または治療的性質を改善させる、本発明によるＩｇＹコンジュゲートの調製および使用にも関する。
【００３５】
次に、本発明に直接関係している成分、その機能、作用様式および本発明によるＩｇＹコンジュゲートの使用の特性を詳細に示し、かつ溶液を詳細に示す。
【００３６】
ａ）免疫学的成分
本発明によればこの免疫学的に効果のある成分は、
（ｉ）無傷の卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体、または
（ｉｉ）キメラ卵黄抗体、即ちトランスジェニックＳＰＦニワトリの卵に由来する生化学的にヒト化されたＩｇＹないしは好ましくは遺伝子工学によりヒト化されたＩｇＹから成る。この場合、Ｆａｂ構成体は一価でも、二価でも、三価でもよく、かつ、単一特異的にも、二種特異的にも、三種特異的にも作用することができる（即ち１個、２個もしくは種々の３個の抗原決定基を認識する）。Ｆａｂフラグメントは、酵素的消化により得ることができる。キメラ抗体は、鳥類のフラグメントと他の生物のＦｃフラグメント（本明細書の場合には好ましくはヒトＦｃフラグメント）との結合によって得ることができる。超可変領域がニワトリのＩｇＹに由来しかつ全ての定常領域がヒトのＩｇＧに由来することにほかならないヒト化されたＩｇＹは、トランスジェニックニワトリにおいて得ることができる。キメラ抗体によって、ＩｇＹに対する望ましくない抗体の形成が減少もしくは阻止されうるばかりではなく、ヒトのＩｇＧの定常領域の天然のエフェクターメカニズムを利用することもできる。
【００３７】
ｂ）シグナル物質
本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、診断的成分として、例えば放射性核種（γ放出体、例えばテクネチウム‐９９ｍ、インジウム‐１１１、ヨウ素‐１２３、ヨウ素‐１２５、ヨウ素‐１３１、タリウム‐２０１、セレン‐７５、ガリウム‐６７、キセノン‐１３３）、酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびガラクトシダーゼ）、光増感剤（ポルフィリン誘導体など）または色素（例えば蛍光色素、コロイド金）といったシグナル物質を含有する。シンチグラフィ診断のために問題提起、投与経路、抗体の親和性および放射性核種に応じて１０〜１８５０ＭＢｑ（０．２７〜５０ｍＣｉ）の放射能が必要である。詳細には、例えばヨウ素‐１３１には３７〜３７０ＭＢｑ（１〜１０ｍＣｉ）（好ましくは３７〜７４ＭＢｑ（１〜３ｍＣｉ））、ヨウ素‐１２３には１８５〜３７０ＭＢｑ（５〜１０ｍＣｉ）、テクネチウム‐９９ｍには７４〜１４８０ＭＢｑ（２〜４０ｍＣｉ）（好ましくは７４〜７４０ＭＢｑ（２〜２０ｍＣｉ））、インジウム‐１１１およびガリウム‐６７には７４〜１８５ＭＢｑ（２〜５ｍＣｉ）、あるいはセレン‐７５には約１０ＭＢｑ（０．２７ｍＣｉ）が考慮の対象となる。
【００３８】
ｃ）作用物質
本発明によるＩｇＹコンジュゲートは代替的もしくは付加的に治療的成分として放射性核種を含有していてもよい（β放出体、α放出体またはオージェ電子放出体）、例えばリン‐３２、ストロンチウム‐８９、イットリウム‐９０、ヨウ素‐１２５、ヨウ素‐１３１、サマリウム‐１５３、エルビウム‐１６９、レニウム‐１８６、レニウム‐１８８、Ｋｒ‐８５、ホルミウム‐１６６、アスタチン‐２１１、ビスマス‐２１２、ビスマス‐２１３、ラジウム‐２２４、アクチニウム‐２２５。診断の場合と同様に、放射免疫療法の場合に必要な放射能は次のような多くの因子に依存する：疾患の種類、罹患細胞の放射線感受性、治療すべき細胞の量、疾患の蔓延および分布パターン（Ｖｅｒｔｅｉｌｕｎｇｓｍｕｓｔｅｒ）、抗原発現、投与経路、抗体の親和性および放射性核種のエネルギースペクトル。したがって例えばヨウ素‐１３１の場合には３７０ＭＢｑ〜１１．１ＧＢｑ（１０〜３００ｍＣｉ）の広い範囲内の放射能が考慮の対象となる。この放射能は通常１回で適用されるが、分割的に数週間から数か月（好ましくは３〜６週間）のインターバルをおいてか、ないしは再発が生じた際に総線量４０〜８０ＧＢｑ（１〜２Ｃｉ）までで繰り返し投与することもできる。腫瘍特異性ＩｇＹと細胞分裂抑制剤との結合は、従来の化学療法の欠点を減少させることができる。腫瘍学の最大の問題に、ステージング検査の際に診断の正確さが制限されていること（特に、微小癌組織の転移の存在を証明もしくは排除することができる技術の不足）ならびに、その高い毒性と同時に低い特異性ゆえに細胞分裂抑制剤の治療の幅が僅かであることが含まれる。これらの要因から繰り返し繰り返し、治療手続きについての著しい不正確さが生じる。抗体によって媒介されかつ副作用のより少ない特異的な細胞性塞栓は、化学療法のための決定を容易にするであろうし、したがって費用にかかる、高価な、および／または負荷のかかるステージング検査を節約するのも助けるであろう。本発明の範囲内では卵黄抗体は、種々の細胞分裂抑制剤と結合させることもできる（例えばアルキル化剤、ビンカアルカロイド、挿入抗生物質（ｉｎｔｅｒｋａｌｉｅｒｅｎｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ）、代謝拮抗物質、タキソール）。本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、治療効果のある成分として毒素を含有していてもよい（リシンＡ、アブリン、シュードモナス‐エキソトキシン、ジフテリア毒素、ゲロニンなど）。化学療法剤（細胞分裂抑制剤、抗生物質、抗ウイルス物質）、線維素溶解薬剤（例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ｒｔ‐ＰＡ）、プロドラッグの活性化のための酵素（例えば、還元された葉酸塩および還元されていない葉酸塩の加水分解による分裂を触媒する細菌性カルボキシペプチダーゼＣＰＧ２）またはプロドラッグ自体は、本発明によるＩｇＹコンジュゲート中の治療的成分として適当である。そして本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、光力学療法を用いて罹患細胞を狙いをつけて破壊することを可能にする光増感剤を作用成分として含有していてもよい。光増感剤は、例えばフォトフリンでもよいし、５‐アミノレブリン酸でもよいし、フォスカン（Ｆｏｓｃａｎ）でもよい。
【００３９】
ｄ）増幅分子
本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、アビジンビオチン‐もしくはストレプトアビジンビオチン結合を基礎としてシグナルもしくは作用を増幅する（いわゆるプレターゲッティング）ために、診断的かつ治療的使用のためにビオチンを含有していてもよい。さらにＩｇＹコンジュゲートのシグナルもしくは作用は、ＩｇＹ分子に結合させることができる更なる成分によって増幅することができる（例えば補体）。
【００４０】
ｅ）アジュバント、相補的措置
本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、治療目的の最適化のために他の作用物質と有意義に結合させることができる。鳥類の抗体は、ヒト抗ＩｇＹ抗体の形成を引き起こすことができる。ＩｇＹコンジュゲートの繰り返しの使用によって、その場合、診断もしくは治療に使用される抗体の中和が生じるか、あるいはそれどころかアレルギー反応が生じる。このことは、例えばシクロスポリンを用いた免疫システムのサプレッションによって阻止することができる。その一方で放射性ヨウ素の使用によって甲状腺の望ましくない放射線による負荷が生じる可能性がある。したがってこの場合には、甲状腺の機能をＩｇＹ‐ヨウ素‐１３１による放射免疫療法の前にヨウ化カリウムもしくは過塩素酸ナトリウムの投与によって遮断することが有意義である。さらに、ウイルス性感染の免疫療法の場合には遊離ウイルス粒子をＩｇＹコンジュゲートが捕捉してしまい、すると該ＩｇＹコンジュゲートは、ウイルスを複製する細胞の特異的ターゲッティングにもはや利用することができない。したがって、ウイルス複製を抗ウイルス作用もしくは抗レトロウイルス作用を有する１つ以上の化学療法剤を用いた前処理によって阻止すること、ならびに新たな抗体発現を場合によってはこの治療の一時的な中止によって開始もしくは誘発することは有意義である。さらにウイルス粒子の遊離は、細胞膜を安定させる剤（例えばインターフェロンα）によって阻止することができる。潜伏性ウィルス感染（例えばＨＩＶ‐もしくはＥＢＶ感染）の場合には他方では、感染された細胞の抗原発現を刺激する（例えばインターロイキン２の使用によって）か、またはＩｇＹコンジュゲートの効果を他の抗ウイルス作用物質（例えばＣ型肝炎の治療の場合のインターフェロンαおよび／またはリバビリン）によって高めることが必要となる場合がある。同様に細菌感染の治療の場合には、相補的に更なる作用物質（抗生物質）を使用することは、有意義である場合がある。これと同様に腫瘍の疾患の場合には、例えば放射免疫療法を細胞増殖抑制剤の添加によって補完するかあるいは、免疫毒素療法を局所的な体外放射線によって補完することが必要となる場合がある。ごく一般的に免疫調節剤もしくはパラ免疫誘導物質は、放射免疫療法、免疫毒素療法もしくは光力学療法の効果に有利に作用することもできる。
【００４１】
ｆ）標識方法
マウス単クローン抗体およびヒト単クローン抗体の放射性標識には既に数年前から多くの確立された方法が利用されている（Ｐｅｔｅｒｓ  ＪＨ，Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ  Ｈ（編）：”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ刊，Ｂｅｒｌｉｎ１９９２年）。金属の放射性核種、例えばテクネチウム‐９９ｍ、インジウム‐１１１またはアスタチン‐２１１は、多くの場合、錯化剤、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）もしくはデフェロキサミン（ＤＦＡ）、によってかまたは抗体のジスルフィド架橋の部分的な還元（例えば２‐メルカプトエタノールによる）によって安定的に抗体に結合される。多くの放射性ヨウ素アイソトープは、直接の求電子置換によって抗体の活性化芳香族基（とりわけチロシンのフェノール環）に結合させることもできる。ヨウ素陽イオンを得るための酸化剤として通常、ヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ３）、溶解クロラミンＴないしは、担体（例えばポリスチレン‐ビード）に結合したクロラミンＴ（ヨードビード）またはヨードゲン（１，３，４，６‐テトラクロロ‐３α，６α‐ジフェニルグリコウリル（１，３，４，６−Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒ−３α，６α−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｇｌｙｃｏｕｒｉｌ））が使用される。各抗体は、少なくとも１つの放射性原子で標識されることができる。抗体の特異的結合能が損なわれることなく、より高い比放射能を達成するために、コンジュゲーションを標的抗原の存在下に行うことができ、次にこの標的抗原は元通り分離され、このことによって超可変領域の範囲内での放射性核種の結合が妨げられる。蛍光色素、光増感剤、細胞増殖抑制剤、毒素は、抗体のアミノ基との反応に基づく方法で、また部分的には市販のスペーサーを介してかまたは抗体中へのＳＨ基の導入によって、抗体に結合することができる。他の方法は、抗体の分割および、シグナル物質もしくは作用物質が結合することができるＳＨ基の遊離に基づいている。そのうえ、抗体の炭水化物基は、過ヨウ素酸塩で酸化することができ、これによりアルデヒド基が生じ、このアルデヒド基を介してシグナル物質および作用物質を結合させることができる。そして作用物質を有する二価および三価のＦａｂ構成体は、該分子の１つもしくは２つのＦａｂフラグメントに結合されることができかつこの遊離Ｆａｂフラグメントを介して標的抗原に結合することができる。
【００４２】
ｇ）コンフェクション
本発明の範囲内では放射免疫コンジュゲートのために、ＩｇＹ製剤を有する標識セット（製剤キット）を提供することができ、その結果、この放射免疫コンジュゲートは使用者によってその場でしばしば短寿命の放射性核種で標識されることができる。著しく長い半減期の場合には、放射性核種と結合したＩｇＹ製剤（即ち完成した放射免疫コンジュゲート）を使用者に直接提供することもできる。標識セットないしは完成した製剤の場合にはＩｇＹ製剤または完成した放射免疫コンジュゲートは、適当な添加剤（例えば安定剤）を含有する、場合によっては適当な緩衝液（好ましくはＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の、無菌の等張の注射液として、さらに適当な包装（場合によっては＋４〜２０℃で冷却された、場合によっては鉛容器中の、プラスチック‐／ガラスアンプル、突刺し（Ｄｕｒｃｈｓｔｅｃｈｆｌａｓｃｈｅ））に入れられて、存在する。標識セットの場合にはＩｇＹ製剤は、この第１のアンプル／突刺し栓瓶）中に入れられており、第２のアンプル／突刺し栓瓶中には還元剤（例えばテクネチウム‐９９ｍを用いた標識の場合）ないしは酸化剤（例えばヨウ素‐１３１を用いた標識の場合）が入れられている。放射免疫コンジュゲートの精製のために各標識セットはカラムクロマトグラフィー‐カラムを含んでいてもよく、かつ、品質管理のために例えば薄層クロマトグラフィー‐セットを含んでいてもよい。必要に応じて標識セットは、１つもしくは同時にいくつかの使用のためのＩｇＹ製剤または完成したＩｇＹコンジュゲートを含むことができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば次の使用分野および応用が想定されている。
ａ）一般使用分野：本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、多くの抗原と次のとおり反応することができる。即ち、生理的分子と、腫瘍特異性抗原と、感染性病原体およびその抗原と、プリオンと、ならびにＲＮＡ断片もしくはＤＮＡ断片またはこれに会合した分子と反応することができる。シグナル物質もしくは作用物質（放射性核種、酵素、線維素溶解薬剤、色素、光増感剤、毒素）に応じて、本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、腫瘍、感染、凝固障害および自己免疫疾患のインビトロおよびインビボの診断および／または治療に使用することができる。
【００４４】
ｂ）生理的標的抗原：本発明によるＩｇＹコンジュゲートのための標的として考慮の対象となる生理的分子には、ＣＤ分類に相応する白血球抗原（ＮＫ細胞の抗原、Ｂ細胞抗原、骨髄性抗原、抗原前駆体（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒａｎｔｉｇｅｎｅ）、活性化抗原、接着分子、サイトカイン受容体）、ならびに細胞内分子（例えばサイトケラチン）、受容体（アンドロゲン‐、エストロゲン‐、ドーパミン‐Ｄ２‐もしくはソマトスタチン受容体など）または例えば凝固因子（例えばフィブリンまたはプラスミノゲン）が含まれる。
【００４５】
ｃ）病原性標的抗原：ＩｇＹコンジュゲートのためのターゲットとして考慮の対象となる腫瘍特異性抗原には同様に特定の高発現白血球抗原（例えばＣＤ２０、ＣＤ２２）、高発現アンドロゲン‐もしくはエストロゲン受容体、カルシトニンおよびチレオグロブリンが含まれるが、狭い意味において腫瘍マーカー、例えばＥｇｐ３４、Ｃａ１５‐３、シアリル‐Ｌｅａ‐抗原、ＢＣＡ２２５、黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）、ＣＥＡ、１７‐１Ａ、ＰＡＰ、ニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、Ｋｉ  ６７、ＰＣＮＡ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）および変異ｐ５３も含まれる。本発明によるＩｇＹコンジュゲートのためのターゲットとなりうる感染性病原体には、細菌（バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ぶどう状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ））、ウイルス（ＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、ＨＴＬＶ‐１、ＨＴＬＶ‐２、ＨＣＶおよび他のフラビウイルス、ＨＢＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＨＨＶ‐８、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、パピローマウイルス、デングウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルス）、原生動物（プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、菌類（カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、寄生虫（カイチュウ、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ロア・ロア（Ｌｏａ  Ｌｏａ）、オンコセルカ・ウォルウルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、マンソネラ（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ブルギア属糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ−Ｆｉｌａｒｉｅｎ）、キスチケルクス（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、バンクロフト糸状虫）および感染粒子（プリオン）が含まれる。感染性病原体の抗原決定基は、例えば、ＥＢＶ関連抗原（ＥＢＮＡ１‐３、ＬＭＰ１‐２）の発現が特徴であるバーキットリンパ腫、鼻咽腔癌、ホジキン病、Ｔ細胞性リンパ腫および免疫芽球性リンパ腫において、ＨＨＶ‐８にともに関連するカポジ肉腫およびＡＩＤＳ関連リンパ腫において、あるいはＨＴＬＶ‐１感染に関連する成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）において、あるいは、ＨＰＶに関連している可能性がある生殖器癌において腫瘍の診断および／または治療の際にも、本発明によるＩｇＹコンジュゲートのためのターゲットとして役割を果たすことができる。
【００４６】
ｄ）投与形態：必要に応じて、本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、インビトロでもインビボでも投与することができる。この投与はインビボの場合には、（例えば光力学療法の分野では）外的もしくは経口的に、ならびに（例えばシンチグラフィ、ＳＰＥＣＴ、放射免疫療法または免疫毒素療法では）非経口的に行うことができる。非経口という用語には、本明細書の場合には静脈内、動脈内、皮下、皮内、髄腔内、間質、腔内および病変内（ｉｎｔｒａｌａｅｓｉｏｎａｌｅ）もしくは腫瘍内の投与経路が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
次に本発明を詳細な実施例につき詳しく図解しかつ説明する。図面および記述から認めることができる特徴は、本発明の他の実施の形態にそれぞれ単独で適用することもできるし、いくつかを任意に組み合わせて適用することもできる。次の適用および実施方法は実施例を示しているにすぎず、これらの実施例とて、ＳＰＦニワトリを基礎とする本発明によるＩｇＹコンジュゲートのもつ可能性を余すところなく示すことは決してできない。したがって当業者は、本発明の特許請求の範囲に属する更なる実施および適用を導き出す。
【実施例１】
【００４８】
本発明によるＩｇＹコンジュゲートの製造のためにＳＰＦニワトリもしくはトランスジェニックＳＰＦニワトリを好ましくは第１４週齢時に標的抗原ないしは該標的抗原のフラグメント５０〜１０００μｇ（好ましくは５０〜２００μｇ）および完全フロインドアジュバントを用いて皮下ないしは（好ましくは）筋肉内により免疫にする。その後で産卵期間のほぼ全体にわたって分散させて、最大のＩｇＹ力価を達成するまでの３回のブースターならびに最大のＩｇＹ力価を維持するための３回の追加をそれぞれ同じ抗原５０〜１０００μｇ（好ましくは５０〜２００μｇ）および不完全フロインドアジュバントを用いて行う。注射液は、例えばそれぞれ抗原懸濁剤１ｍｌおよびアジュバント０．５ｍｌを含有する。それに従ってＳＰＦ状態のニワトリのための有利な免疫計画は、例えば次のような時間経過となる：
０日＊  ＝  第１免疫（基本免疫）  筋肉内注射
２８日  ＝  第２免疫（第１ブースター）  筋肉内注射
５６日  ＝  第３免疫（第２ブースター）  筋肉内注射  ＩｇＹ獲得
８４日  ＝  第４免疫（第３ブースター）  筋肉内注射  ＩｇＹ獲得
１６８日  ＝  第５免疫（第１追加）  筋肉内注射  ＩｇＹ獲得
２５２日  ＝  第６免疫（第２追加）  筋肉内注射  ＩｇＹ獲得
３３６日  ＝  第７免疫（第３追加）  筋肉内注射  ＩｇＹ獲得
４９０日  ＝  ＩｇＹ獲得のための利用の終了
＊＝第１４週齢
ＳＰＦ条件下で飼育されたニワトリの卵を１２〜１４か月の期間にわたって集めかつ処理することができる。卵黄を先ず卵白から分離し、かつ、Ｓｃｈａｄｅら著（「Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ刊、Ｂｅｒｌｉｎ２００１年［１］）による標準方法で処理することができる。ＳＰＦニワトリの決定的な利点は、該動物がそのＳＰＦ雌鶏からの血統とＳＰＦ条件下での飼育ゆえに免疫や固有の感染性疾患によって免疫学的にあらかじめ負荷されていないことである。したがって該動物は、該動物を免疫にした抗原に対して特に強い免疫応答で反応し、その結果、特異性抗体の割合が、従来のニワトリの免疫の場合に比べ何倍も高くなる（特異性ＩｇＹ５０〜９０％）。さらに該動物の場合にはブースター後の特異抗原の高い力価を数回の追加免疫によって第１６月齢まで安定して維持することができる。このことは、本発明によるＩｇＹコンジュゲートにとって本質的に重要であり、それというのも、特に高い親和性の抗体が形成される形でリンパ球集団が免疫記憶の繰り返される刺激によって変化することが十分に証明されているからである。したがってＳＰＦニワトリの卵からのＩｇＹ製剤は、特異抗原に対する親和性に関しても従来のニワトリからのＩｇＹ製剤と異なる。より低い抗体の超可変領域の構造に比べより良好に抗原に適合するこの抗体の超可変領域の構造によってより高い親和性が分子レベルで生じている。したがってＳＰＦニワトリからの本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、最終的に分子レベルで（即ち該ＩｇＹコンジュゲートの超可変領域の特別な構造によって）再現可能に、従来のニワトリからのＩｇＹコンジュゲートと異なる。
【実施例２】
【００４９】
この実施例にはトランスジェニックニワトリからのヒト化ＩｇＹの製造が記載されている。トランスフェクションは、例えば米国特許第５１６２２１５号明細書、米国特許第６０２０４６５号明細書および国際公開第００／７５３００号パンフレットに記載されている自体公知の方法で行うことができる。このトランスフェクションは、雄鶏の精子への顕微注射によって行うこともできる。次に人工受精によって形質を卵細胞内に導入しかつ子へとさらに渡す。代替的にこのトランスフェクションを精子のレトロウイルス感染によって行うことができる。その際、複製能欠損レトロウイルスがＦｃフラグメントのためのヒト遺伝子を有する。ＳＰＦニワトリの免疫グロブリン‐遺伝子座への定常ヒトＩｇＧドメインの遺伝子断片の統合を相同的組換えによって行う。ヒト「ノックイン」遺伝子ターゲッティングベクターはとりわけ、置換すべき遺伝子のエキソン、選択マーカー（例えばネオマイシン耐性）、定常ヒトＩｇＧ領域のエキソンおよびプロモーターについて相同である配列を有する。一時的なＣｒｅリコンビナーゼの発現によってネオマイシン‐およびチミジンキナーゼ‐カセットの欠失ならびに定常の鳥類のＩｇＹ領域の欠失が起こる可能性がある。このようにしてトランスジェニックニワトリが得られ、該ニワトリはヒト化ＩｇＹのためのその遺伝子を生殖細胞系を介してその子へとさらに渡す。トランスジェニックニワトリの選択は、ニワトリの血液中または卵中でのヒト定常領域を有するＩｇＹの検出によって行うことができる。ヒト化抗体の検出にはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法またはＰＣＲが適当である。
【実施例３】
【００５０】
無傷の抗体によって、血液からの該抗体の緩慢な消失（ＨＷＺ：  １〜３日間）ゆえに免疫シンチグラフィの場合に、示すべき病変と背景との最適なコントラストが得られるまでのしばしば長い検査時間が得られる。治療的使用の場合には、無傷の抗体が充実性腫瘍中または血液脳関門の向こう側に達しにくいことにむしろに問題がある。このような理由から、Ｆａｂフラグメントを基礎とするコンジュゲートによって一定の状況の中で決定的な利点が得られる。Ｆａｂフラグメントの製造のためにＳＰＦニワトリもしくはトランスジェニックＳＰＦニワトリを実施例１に記載したように標的抗原ないしは該標的抗原のフラグメント５０〜１０００μｇ（好ましくは５０〜２００μｇ）を用いて免疫にする。卵を上記のとおり処理し、かつＩｇＹを特異抗原（標的抗原）でのアフィニティークロマトグラフィーにより単離する。無傷の抗体を次に酵素的に、例えばペプシンを用いてヒンジ領域の範囲内で分離し、その結果、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントとが得られる。特異性Ｆａｂフラグメントを特異抗原でのアフィニティークロマトグラフィーによりＦｃフラグメントおよび非特異性Ｆａｂフラグメントから分離かつ単離することができる。このようにして得られた特異性Ｆａｂフラグメントを除菌する。該特異性Ｆａｂフラグメントを臨床的な使用に、第２の突刺し栓瓶の中に標識用の還元剤が入れられた標識セットの形で、短寿命の診断用の放射性核種（例えばテクネチウム‐９９ｍ）とのコンジュゲーションのために提供することができる。放射免疫コンジュゲートをより長い寿命の診断用もしくは治療用の放射性核種（例えばヨウ素‐１３１）を用いて製造業者のもとで集中的に標識することもでき、かつさらに販売することもできる。この場合には使用者への発送は、放射性核種の崩壊および抗体の解離による製品の品質の損失を最小にとどめるために、現行の放射線防護基準に従って標識の日にうちに行う。集中的な標識は、ＩｇＹ製剤を化学療法剤、毒素、蛍光色素、線維素溶解薬剤、酵素またはプロドラッグと結合する場合にも可能である。
【実施例４】
【００５１】
不明瞭な品位の放射線医学的な病巣は、今日では顆粒球‐シンチグラフィを用いて鑑別診断的に明瞭にすることができる。目下使用されているマウス単クローン抗体は、前骨髄球、骨髄球および顆粒球に発現した非特異性交叉反応性抗原を認識し、ＮＣＡ‐９５（＝ＣＤ６６ｂ）もＮＣＡ‐９０（＝ＣＤ６６ｃ）も認識しない。該マウス単クローン抗体を診断用の放射性核種（γ放出体）で標識し、静脈内投与する。血液中および炎症病巣において該マウス単クローン抗体は顆粒球に結合する。このようにして炎症プロセス、例えば骨髄炎、シンチグラフィにより検出することができる。本発明による放射免疫コンジュゲートの製造のためにＳＰＦニワトリをＮＣＡ‐９０もしくはＮＣＡ‐９５ないしはこれらのフラグメントで、実施例１に記載されているように、免疫にしかつブースターを行う。ＮＣＡ‐９０‐もしくはＮＣＡ‐９５‐特異性のＩｇＹを再度ＮＣＡ‐９０もしくはＮＣＡ‐９５でのアフィニティークロマトグラフィーにより単離する。次にこの無菌のＩｇＹを、例えば等張ＮａＣｌ中にＩｇＹ１ｍｇと還元剤が入れられた第２の突刺し栓瓶とを含む標識セットとして、テクネチウム‐９９ｍを用いた標識用に市場に出すことができる。使用者によってその場で調製された抗ＮＣＡ‐ＩｇＹ‐Ｔｃ‐９９ｍは、一緒に提供されている前記カラムを用いて結合していない放射性核種を分離除去しかつ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは好ましくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による最終産物の放射化学的純度についての最終的な品質管理した後に、静脈内投与することができる。１つの抗原決定基を認識しかつ結合することしかできない従来の単クローン抗体と異なり、多クローン性の卵黄抗体を用いてＮＣＡ‐９５もしくはＮＣＡ‐９０の異なる抗原決定基を同時に認識し、そのことにより、バックグラウンドに対してより高い特異的なアップテークを伴った、より良好なイメージが得られる。
【実施例５】
【００５２】
ＩｇＹコンジュゲートをセンチネルリンパ節の検出に使用することもできる。例えば悪性黒色腫、乳癌もしくは前立腺癌の場合に行われる広範囲にわたるリンパ節切除は、通常、高い罹患率を伴う。したがって腫瘍の流出範囲に存在するリンパ節への転移の検出は、治療の手続きにとって最高に重要な情報である。これまでこの検出は、Ｔｃ‐９９ｍ標識コロイド状ヒト血清アルブミンを用いて行われるかまたはＴｃ‐９９ｍ‐ナノコロイドを用いて行われる。粒径は、直径１００〜１０００ｎｍである。ラジオコロイドの腫瘍周囲の（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌｅ）注射後に通常、注射後（ｐ．ｉ．）１５分間〜約６時間にわたり３回の連続した平面的撮影をガンマカメラにて行う。この方法の欠点は、粒径および欠如した腫瘍特異性にある。このことによって、一方では注射箇所に放射能の大部分が残留しかつセンチネルリンパ節の表示がブルーミングによって困難になる。したがってまたもう一方ではリンパ節が、その罹患が証明されることなく表示される。これに対して同様の方法でリンパ球特異性ないしは腫瘍特異性の放射免疫コンジュゲートを使用すると、これら欠点が部分的もしくは全体的に回避される。溶解したＩｇＹ‐もしくはＦａｂコンジュゲートはリンパ管を経てコロイド状アルブミンより速く流れるので、その結果、残留放射能が注射箇所に残るのはわずかであり、これによりセンチネルリンパ節がさらに強く表示される。そのうえ、抗体がリンパ節内で特異的にリンパ球ないしは転移した腫瘍に結合することによって特異的な表示が得られる。これらリンパ節は手術中に適当なガンマプローブ（Ｇａｍｍａｓｏｎｄｅ）を用いて狙いをつけて探し出しかつさらに切除することもできる。センチネルリンパ節の表示に対して代替的もしくは付加的に、診断用に使用されるＩｇＹコンジュゲートまたは第２のＩｇＹコンジュゲートが治療用放射性核種（例えばＩ‐１３１）または毒素（例えばタキソール）を有する場合には、リンパ節ないしはリンパ節転移の十分に選択的な照射または化学療法を行うことができる。黒色腫のリンパ節転移の検出は、ｐ２１０、黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）、に対する放射免疫コンジュゲートによって行うことができる。本発明による放射免疫コンジュゲートの製造のためにＳＰＦニワトリを実施例１と同様にしてｐ２１０  ５０〜１０００μｇ（好ましくは５０〜２００μｇ）を用いて免疫にする。ＩｇＹを卵黄から単離する。精製したＩｇＹを次に除菌することができ、さらに凍結乾燥してもよいし、無菌かつ等張のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁させてもよい。この市販の製剤キットには例えば第１の突刺し栓瓶の中に特異性ＩｇＹ１００ｍｇが含まれ、かつ第２の突刺し栓瓶の中にＴｃ‐９９ｍでの標識のための還元剤が含まれる。計画した検査の直前にＩｇＹ製剤をＴｃ‐９９ｍ  １０〜１０００ＭＢｑ（好ましくは２０〜１００ＭＢｑ）と結合させる。本発明による放射免疫コンジュゲートの腫瘍周囲の注射後に通常、注射の２４時間後まで（好ましくは注射の３〜６時間後に平面的撮影を３面でガンマカメラで行いかつ場合によっては関連する領域の補足的なＳＰＥＣＴを行う。さらに関連するリンパ節を引き続き手術中に適当な携帯測定器（Ｈａｎｄｍｅｓｓｇｅｒ���ｅｔ）を用いて検出することができかつ狙いをつけて切除することができる。
【実施例６】
【００５３】
神経内分泌腫瘍の診断を放射免疫コンジュゲートを用いたシンチグラフィにより行う。褐色細胞腫、神経芽細胞腫、カルチノイドおよびパラガングリオーマは、全ての生物にわたり分布している神経内分泌系（ＡＰＵＤ系）の細胞から成る。したがってこれら細胞は一般的にソマトスタチン受容体を有し、このソマトスタチン受容体によってこれら細胞がインジウム‐１１１標識オクトレオチド（ソマトスタチン類似化合物）を用いてシンチグラフィにより表示されることができる。しかしながら、ソマトスタチン類似化合物は受容体に１：１の比でしか結合しない。これに対して多クローン性ＩｇＹは、受容体のいくつかの抗原決定基を認識する。このことから、より良好なターゲッティングとより感度の高い画像診断が得られる。ソマトスタチン受容体に対するＩｇＹ製剤の製造のためにまたもやＳＰＦニワトリを実施例１と同様にして免疫にする。この特異性ＩｇＹは、実施例３，４もしくは５の場合と同様に標識セットの形で提供することができる。この場合、該特異性ＩｇＹは使用者によりその場でγ放出体（例えばテクネチウム‐９９ｍ）で標識することができる。特異性ＩｇＹ‐Ｔｃ‐９９ｍ（１０〜１０００ＭＢｑ、好ましくは５０〜２００ＭＢｑ）１００ｍｇの静脈内投与の１〜２４時間後に平面的撮影を２面で実施しかつ場合によってはＳＰＥＣＴを実施する。手術中にしばしば発見しづらい神経内分泌腫瘍は、引き続いての手術の際に適当なプローブを用いて容易につきとめることができ、さらに切除することができる。
【実施例７】
【００５４】
放射免疫コンジュゲートのさらなる使用は、非ホジキンリンパ腫の治療である。悪性の低い非ホジキンリンパ腫には化学療法が効きづらい。放射免疫療法がこの場合には特に効果があることが判明している。たいていの研究の場合にはヨウ素‐１３１で標識されたマウス単クローン抗体がＣＤ２０、全てのＢ細胞性リンパ腫の９５％の細胞表面に発現される抗原、に対して使用されてきた。しかしながら単クローン抗体は、この抗原の１つの抗原決定基しか認識しない。したがって結合比は、１：１でしかない。これに対して、より良好なターゲッティングが、抗原のいくつかのエピトープを同時に認識するＣＤ２０‐特異性ＩｇＹで達成することができる。このことにより骨髄の放射線被曝も少なくなり、かつ、骨髄移植が必要とされることなく、より高い放射線量を適用することができる。放射線量の削減は、アビジン‐もしくはストレプトアビジン標識された単クローン抗体および放射能標識されたビオチンを用いたプレターゲッティング方法によって達成することもできる。同様に保護が請求されるプレターゲッティングによって、当然のことながら、ＩｇＹを用いた放射免疫療法の治療効果もがいま一度改善されることができる。このためにＳＰＦニワトリをＣＤ２０  ５０〜１０００μｇ（好ましくは５０〜２００μｇ）を用いて実施例１と同様にして免疫にする。約１２〜１４か月の産卵期間にわたって卵が得られ、この卵からＩｇＹ全体を単離しかつＣＤ２０にてアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。プレターゲッティングのために特異性ＩｇＹを除菌し、アビジン（もしくはストレプトアビジン）と結合させ、かつ凍結乾燥させるか、または場合によっては更なるアジュバントとともに等張ＮａＣｌ（場合によってはＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に溶解する。この標識セットにはこの場合には好ましくは、ＩｇＹ‐アビジン‐コンジュゲート（１００μｇ〜５ｍｇ、好ましくは１ｍｇ）が入った突刺し栓瓶、凍結乾燥もしくは溶解された形のビオチン（１〜１０００μｇ）が入った第２の突刺し栓瓶および、酸化剤（例えばヨードゲン）が入った第３の突刺し栓瓶が、ヨウ素‐１３１（１〜４ＧＢｑ）による標識のために含まれており、そのうえ、クロマトグラフィー‐カラムおよびＴＬＣキットといった更なる補助手段が含まれている。代替的にビオチンは、製造業者のもとで集中的に標識されてもよく、かつＩｇＹ‐アビジン‐コンジュゲートと一緒に出荷されてもよい。治療に際し、リンパ球を標識するために、先ずＩｇＹ‐アビジン‐コンジュゲートを静脈内投与する。数日後までにヨウ素‐１３１‐標識ビオチンの静脈内投与を行う。代替的に放射免疫療法をα放出体、例えばアスタチン‐２１１を用いて実施してもよい。
【実施例８】
【００５５】
全ての乳癌の約半分がエストロゲン受容体を有しかつホルモン依存である。したがってエストロゲン受容体に対する卵黄抗体は、該受容体へのエストロゲン結合を競合的に阻止できるだけではない。放射免疫コンジュゲートとして該卵黄抗体は、転移の表示と内部放射線療法とにも適当である。ＳＰＦニワトリの免疫のために、エストロゲン受容体の細胞外抗原決定基を有するペプチドを使用する。ＳＰＦニワトリの免疫ならびに卵の処理およびＩｇＹの精製は実施例１に従って行うことができ、コンフェクショニングはその他の上記実施例に従って行うことができる。
【実施例９】
【００５６】
市販の抗体、例えばＵＲＯ７は、腎細胞癌を認識しかつ健康な腎臓組織には結合しない。したがって腎細胞癌およびその転移を狙いをつけて放射免疫コンジュゲートを用いて検出および／または処置することができる。適当な抗原を確認するためにタンパク質を、均質化した腎細胞癌細胞から電気泳動により分離かつ単離する。ＳＰＦニワトリを該抗原を用いて免疫にし、かつ、獲得された卵黄抗体を腎細胞癌細胞および生理的組織を用いて特異性および交叉反応性について検査する。悪性細胞のみを認識する選択された抗体を治療用の放射性核種、例えばヨウ素‐１３１、または細胞毒素、例えばリシンＡ、と結合させかつ治療に使用する。
【実施例１０】
【００５７】
放射免疫コンジュゲートの別の使用は、ＨＩＶ感染の治療にある。ＨＩＶ感染の場合にはレトロウイルスのゲノムが宿主細胞の染色体の中に導入される。従来の複製抑制ではＨＩＶ感染を治療することはできない。ＨＩＶを複製する宿主細胞は、次にＨＩＶ構造タンパク質（ｐ２４、ｇｐ１２０およびｇｐ４１）をその細胞表面に発現させる。この構造タンパク質に対する抗体はこれら細胞を認識しかつ該細胞に結合する。該抗体は放射性核種または他の細胞毒素と結合している場合には、該抗体はこれら細胞および、ひいてはＨＩＶの産生箇所を狙いをつけて破壊することができる。該細胞の効果的なターゲッティングの前提条件は、血液中の遊離ウイルスの数を例えば、抗レトロウイルス剤を用いた相補的な複製抑制によって減少させることである。これによって、ＨＩＶ感染を効果的に治療する新たな可能性が与えられる。冒頭に記載した理由から、ＳＰＦニワトリの特異性ＩｇＹからの多クローン性コンジュゲートの使用は、例えば独国特許第１９８０９７８５号明細書に記載されている単クローン抗体に比して利点を有する。抗体を得るためにＳＰＦニワトリをＨＩＶ  ｐ２４、ＨＩＶ‐１  ｇｐ１２０もしくはＨＩＶ‐１  ｇｐ４１を用いて実施例１と同様にして免疫にする。約１２〜１４か月の産卵期間にわたって、限定された条件下で飼育されたＳＰＦニワトリの卵を集める。卵黄を卵白から分離し、さらにＩｇＹを常法に従って単離する。ＨＩＶ特異抗体を、特異抗原でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その結果、非特異性ＩｇＹが分離される。無菌のＩｇＹ製剤を治療用の放射性核種（例えばヨウ素‐１３１もしくはアスタチン‐２１１）と結合させる。通常、例えば１回の治療的使用につき特異性ＩｇＹ１００μｇをヨウ素‐１３１  １〜４ＧＢｑで標識する。ＨＩＶ感染の場合にはとりわけ、感染した細胞の比較的少ない数（リンパ腫の場合の悪性の変質細胞の数に比して）ゆえに既にかなりわずかな放射能で治療的に効果があることが証明されることが可能である。標識は、種々の確立されている方法で行うことができる。したがってＩｇＹ‐ヨウ素‐１３１は、好ましくはヨードゲン法によって製造することができる。放射免疫コンジュゲートのコンジュゲーション後の収量ならびに、結合していない放射性核種の分離除去後の放射免疫コンジュゲートの純度は、ＨＰＬＣもしくはＴＬＣを用いて管理することができる。無菌条件下で製造され、および／または除菌された放射免疫コンジュゲートは、等張溶液として注入することができる。
【実施例１１】
【００５８】
さらにＩｇＹコンジュゲートは、自己免疫疾患の治療に使用するものとする。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、自己免疫疾患の病因において、かつ器官の移植後の拒絶反応において重大な役割を果たす。ＣＤ４受容体に対する単クローン抗体は、クローン病（Ｍ．  Ｃｒｏｈｎ）、エリテマトーデス、リウマチ様関節炎の場合には、およびマウスにおける皮膚移植後では、しかしながら臨床的にはわずかな効果しか示さない。ＣＤ４陽性細胞の有効な消失を起こすために、該抗体を治療用の放射性核種、細胞増殖抑制剤もしくは毒素と結合させることができる。ＳＰＦニワトリを実施例１と同様にしてＣＤ４もしくはＣＤ４フラグメントに対して免疫にし、ＩｇＹ全体を卵黄から単離し、そしてＣＤ４特異性ＩｇＹをＣＤ４にてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。場合によっては抗体を酵素により切断し、そして鳥類のＦｃフラグメントをヒトＦｃフラグメントで置換する。その際、ＩｇＹ製剤は、（好ましくは静脈内での）臨床的使用にコンジュゲーションされていなくともよいし、あるいは本発明によるＩｇＹコンジュゲートとして、放射性核種で標識された形で販売されてもよい。
【実施例１２】
【００５９】
血栓症の治療のためのＩｇＹコンジュゲートの使用は、さらなる応用を示している。血栓症は、一般的に、全身投与される線維素溶解薬剤（ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼもしくはｒｔ‐ＰＡ）で処理される。ストレプトキナーゼは、生体に特有のプロテアーゼによって素早く分解される。これに対してウロキナーゼおよびｒｔ‐ＰＡは、肝臓内で迅速に代謝される。したがって、線維素溶解薬剤を血栓に固定することが重要である（Ｂｏｄｅら著「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」１９８９年；２６４（２）：９４４〜８；Ｌｉｊｎｅｎら著「Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ」１９９０年；５７（３）：３３３〜４２）。ＳＰＦニワトリもしくはトランスジェニックＳＰＦニワトリをヒトフィブリンに対して、実施例１に記載された方法で免疫にする。特異性ＩｇＹを単離しかつ精製する。場合によっては該抗体を酵素により切断し、そしてＦｃフラグメントを分離除去する。無傷の抗体またはＦａｂフラグメント（５〜５０ｍｇ）を次にｒｔ‐ＰＡ（５〜５０ｍｇ）と好ましくは１：１の比で結合させる。このＩｇＹコンジュゲートは、凍結乾燥させてかもしくは注射目的のために無菌溶液中で、適当な包装サイズで、深大腿静脈血栓症（ｔｉｅｆｅ  Ｂｅｉｎｖｅｎｅｎｔｈｒｏｍｂｏｓｅ）、肺動脈塞栓症、脳血管障害（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｋｕｌａｅｒｅ  Ｉｎｓｕｌｔｅ）または心筋梗塞の治療用に提供することができる。代替的にＳＰＦニワトリの第２グループをｒｔ‐ＰＡに対して（好ましくは活性部位の外側の領域）免疫にしてもよい。第１のグループのＦａｂフラグメントを第２のグループのＦａｂフラグメントとハイブリッド形成させてもよい。このようにしてフィブリン特異性の二価のＦａｂ構成体を得ることができ、このＦａｂ構成体には１本の腕を介してｒｔ‐ＰＡが結合している。
【実施例１３】
【００６０】
光力学的な診断もしくは療法のためにＩｇＹ製剤を光増感剤と結合させる。光力学療法は、とりわけ表皮癌および粘膜癌、カポジ肉腫および黒色腫の治療のための最小限に侵襲的な方法である。この方法は、感光物質による腫瘍選択性の強化に基づいており、これら感光物質はその光力学的効果（蛍光ないしは細胞を損傷させるラジカルの形成および腫瘍の血管形成の破壊）を光の吸収によって発揮する。光力学的療法の成果は、悪性組織および健康な組織の中での光増感剤の相対的分布に決定的に左右される。腫瘍細胞への光増感剤の固定は、例えば食道癌または悪性黒色腫の場合に腫瘍特異性の抗体によって著しく強化することができる。この場合、適当な光源を用いて診断もしくは治療を行うことができる。診断的な使用の場合には悪性の変質した細胞の固有の蛍光が紫色光線下に生じる。光力学的療法の場合には悪性の変質した組織が赤色光線の作用下に壊死する。
文献：
［１］  Ｓｃｈａｄｅら著：「Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｅｒｌｉｎ２００１年）；
［２］Ｈａｎｓｅｎら著，「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」１９９８年，２１５（１〜２）：１〜７；
［３］Ｂｏｕｈｏｕｒｓら著，「Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ」１９９８年，１５（１）：９３〜９；
［４］Ｇａｓｓｍａｎｎら著，「ＦＡＳＥＢ  Ｊ」１９９０年，４（８）：２５２８〜３２
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ａ】図１ａはニワトリのＩｇＹを示す。
【図１ｂ】図１ｂはヒトを含む哺乳類のＩｇＧを示す。
【図２】図２は無傷のＩｇＹを基礎とする放射免疫コンジュゲートを示す。
【図３】図３は一価のＩｇＹ‐Ｆａｂフラグメントを基礎とする放射免疫コンジュゲートを示す。
【図４】図４は二価のＩｇＹ‐Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを基礎とする放射免疫コンジュゲートを示す。
【図５】図５は相互に結合されたＩｇＹ‐Ｆａｂフラグメント（三価のＦａｂ構成体）を基礎とする放射免疫コンジュゲートを示す。
【図６】図６はヒト化ＩｇＹ（ＩｇＹ‐Ｆａｂ  ＋  ヒトＦｃ）を基礎とする放射免疫コンジュゲートを示す。
【図７】図７は無傷のＩｇＹを基礎とする免疫毒素を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月16日(2003.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヨーロッパ薬局方およびＤＡＢ１０に従った特定病原体除去（ＳＰＦ）ニワトリの卵からの多クローン性ＩｇＹ製剤から成るか、あるいはトランスジェニックＳＰＦニワトリの卵からの多クローン性ＩｇＹ製剤から成る、非感染性の炎症、感染性疾患、凝固障害、自己免疫疾患および腫瘍の疾患に対する診断剤もしくは治療剤の製造のためのＩｇＹコンジュゲートであって、この場合、該ＩｇＹコンジュゲートが、ヒトＩｇＧの定常領域を有する多クローン性ＩｇＹを含みかつさらに少なくとも１つのシグナル物質および／または作用物質および／または増幅分子から成る、ＩｇＹコンジュゲート。
【請求項２】
前記多クローン性ＩｇＹ製剤が精製された卵黄抗体（ＩｇＹ）、ＩｇＹフラグメント、Ｆａｂ構成体またはキメラ卵黄抗体である、請求項１記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項３】
調製に使用される前記ＩｇＹ製剤が、鳥類の抗体の可変領域とヒトＩｇＧの定常領域との化学結合によって得られたヒト化卵黄抗体を含むことを特徴とする、請求項１記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項４】
前記ＩｇＹ製剤が一価もしくは二価の抗体フラグメント、好ましくはＦａｂまたはＦ（ａｂ）２、から成ることを特徴とする、請求項１または２記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項５】
前記ＩｇＹ製剤が二種特異性、三種特異性もしくは多特異性のＦａｂ構成体から成ることを特徴とする、請求項１または２記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項６】
前記シグナル物質が診断用放射性核種、酵素、色素および／または光増感剤であることを特徴とする、請求項１記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項７】
前記作用物質が治療用の放射性核種、細胞増殖抑制剤、毒素、化学療法剤、プロドラッグ、酵素、光増感剤および／または線維素溶解薬剤であることを特徴とする、請求項１記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項８】
前記ＩｇＹ製剤が増幅分子、好ましくはビオチン、または補体システムのタンパク質と結合していることを特徴とする、請求項１記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項９】
前記シグナル物質もしくは作用物質が共役結合により、または助剤、例えばキレート剤、増幅分子および／または該増幅分子に対して高親和性の分子、を用いて前記ＩｇＹ製剤に、あるいは二種特異性、三種特異性もしくは多特異性のＩｇＹ構成体の１つ以上の腕の可変領域を介して結合していることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ＩｇＹ製剤が腫瘍抗原に対して、ホルモンに対して、ＲＮＡ断片および／またはＤＮＡ断片に対して、感染性病原体もしくはその（表面）抗原に対して、白血球抗原に対して、細胞内分子に対して、受容体分子に対して、あるいは凝固因子に対して特異的であることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項１１】
前記免疫コンジュゲートがプレターゲッティングの範囲内で先ずインビボで特異抗原に結合した後で好ましくはビオチン／アビジンもしくはビオチン／ストレプトアビジンを介してシグナル物質もしくは作用物質と結合する、前記請求項のいずれか１項に記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項１２】
前記免疫コンジュゲートがプレターゲッティングの範囲内で先ずインビボで特異抗原に結合した後で二次ヒト抗ＩｇＹ抗体を介してシグナル物質もしくは作用物質ないしは増幅分子と結合する、前記請求項のいずれか１項に記載のＩｇＹコンジュゲート。
【請求項１３】
薄層クロマトグラフィー、分離塔、装置用のスタンド、洗浄‐および溶離緩衝液による品質管理用セット少なくとも１個が添えられた、請求項１から１２までのいずれか１項に記載されたＩｇＹコンジュゲートのコンフェクショニング。
【請求項１４】
前記ＩｇＹコンジュゲートが凍結乾燥された形で用意されているかあるいは、最適なｐＨ値に調整された、添加剤、例えば安定剤、と組み合わされた懸濁液の形で用意されている、請求項１３記載のコンフェクショニング。
【請求項１５】
適用のための装置が添えられた、請求項１３記載のＩｇＹコンジュゲートのコンフェクショニング。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、請求項１および１３の特徴部に記載の、卵黄抗体（ＩｇＹ）からのＩｇＹコンジュゲートおよび、診断剤もしくは治療剤のためのそのコンフェクション（Ｋｏｎｆｅｋｔｉｏｎｉｅｒｕｎｇ）に関する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
したがって本発明の課題は、従来の免疫コンジュゲートに対する代替の生成物であって、診断剤もしくは治療剤として適しており、その際、哺乳類からの単クローン抗体および免疫血清ならびに常用のニワトリからのＩｇＹ製剤を純度および抗原ターゲッティングに関して優れている生成物を開発しかつ提供することである。そのうえ、ヒト抗ＩｇＹ抗体の形成はできるだけ回避されるべきであり、かつ、該免疫コンジュゲートは、動物保護に適合しかつ大量に安価に製造されることができなければならない。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明は、卵黄抗体（ＩｇＹ）からのＩｇＹコンジュゲートおよび診断剤への、または、ならびに動物モデル（例えばマウス、ヒツジまたはヒトではない霊長類）における実験的使用のための該ＩｇＹコンジュゲートのコンフェクショニングに関する。該ＩｇＹコンジュゲートの使用は、非経口的適用に限定されておらず、使用目的に応じて外的適用（例えば黒色腫の場合）および経口的適用（例えば食道癌の場合）も含む。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
そのうえ本発明は、各成分の形での、標識セット（Ｍａｒｋｉｅｒｕｎｇｓｂｅｓｔｅｃｋｅ）（いわゆるキット）の形での、またはすぐに使用できる製剤の形での、すぐに使用できる診断剤もしくは医薬品としてのＩｇＹコンジュゲートのコンフェクショニングに関する。標的抗原として全てのタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、核酸、多糖およびリポタンパク質が考慮の対象となる。本発明は、とりわけ腫瘍抗原、ホルモン、受容体タンパク質、ＲＮＡ断片およびＤＮＡ断片、感染性病原体、プリオンまたはこれら標的抗原の抗原決定基の部分に対するＩｇＹコンジュゲートに関する。この場合、本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、免疫に使用される抗原の複雑度に応じて多少とも多特異性のＩｇＹを含んでいてもよい。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ｄ）増幅分子
診断剤もしくは治療剤へとコンフェクショニングされる、本発明によるＩｇＹコンジュゲートは、アビジンビオチン‐もしくはストレプトアビジンビオチン結合を基礎としてシグナルもしくは作用を増幅する（いわゆるプレターゲッティング）ためにビオチンを含有していてもよい。さらにＩｇＹコンジュゲートのシグナルもしくは作用は、ＩｇＹ分子に結合させることができる更なる成分によって増幅することができる（例えば補体）。




【国際調査報告】
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