(57)【要約】本発明は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組合せたかまたは同時に抑制することによって緩和するかまたは予防することができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）とＩＧＳ５と呼称される新規メタロプロテアーゼ上での、組み合わされた、特に同時の抑制活性を有する化合物、またはその製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。特別な態様において、本発明は、ｂｉｇ−ＥＴ−レベルが増加した疾病または症状、およびＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせてかまたは同時に抑制することによって緩和または予防ができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する前記化合物の使用に関する。他の態様において、本発明は、ＥＴ−１が著しくアップレギュレーションされた疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせてかまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を患うかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、組み合わせたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物の使用に関する。本発明において、組み合わせたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物は、好ましくは、大型哺乳類、好ましくはヒトにおいて、より好ましくは、ＮＥＰ／ＩＧＳ５の組み合わせたかまたは同時の抑制によって緩和または予防することができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の患者の亜群において、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防に使用する。さらに、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す化合物と、ＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビター、たとえば、別個のＡＣＥ−および／またはＮＥＰ−インヒビター、および／またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターとを付加的に組み合わせることは有利であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、
ｃ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）上および、
ｄ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、メタロプロテアーゼＩＧＳ５上での、
組み合わされた、特に同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項２】
ｂｉｇ−ＥＴ−１レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項３】
ＥＴ−１が著しくアップレギュレーションされる疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項４】
大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防の医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１から３までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項５】
大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項２または３に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項６】
大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防のための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項２または３に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項７】
メタロプロテアーゼＩＧＳ５が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１から６までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項８】
メタロプロテアーゼに含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物または生物的不安定性エステルの使用。
【請求項９】
メタロプロテアーゼに含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一である、請求項８に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１０】
ａ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）上と
ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、メタロプロテアーゼＩＧＳ５とを、組み合わせてまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を患うか、あるいはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、
式Ｉ
【化１】
2004536063.tif 000014
［式中、Ａは式ＩＩまたは式ＩＩＩ
【化２】
2004536063.tif 000015
の基を意味し、その際、式ＩＩ中、Ｒ１ａは、フェニル環中で、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたはハロゲンによって置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基を示すか、あるいは、ナフチル−低級−アルキル基を示し、
Ｒ２ａは水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を意味し；かつ、
式ＩＩＩ中、Ｒ１ｂは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
Ｒ２ｂは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、かつ、その際、Ｒ３は、水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基を意味する］の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１１】
式Ｉの化合物が、式Ｉａ
【化３】
2004536063.tif 000016
［式中、Ｒ１ａは、フェニル環中で、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたはハロゲンによって置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基であるか、あるいはナフチル−低級−アルキル基を意味し、
Ｒ２ａは水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を意味し、かつ、
Ｒ３は水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を意味する］の構造を有する化合物の亜群から選択される、請求項１０に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１２】
式Ｉの化合物が、式Ｉｂ
【化４】
2004536063.tif 000017
［式中、Ｒ１ｂは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
Ｒ２ｂは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
Ｒ３は水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基である］の構造を有する化合物の亜群から選択される、請求項１０に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１３】
ｂｉｇ−ＥＴ−１レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病（症状）を患うか、あるいはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１４】
ＥＴ−１が著しくアップレギュレーションされた疾病（症状）であり、かつ、ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病（症状）を患うか、あるいはこれらに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬品（医薬品組成物）を製造するための、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１５】
大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防のための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１０から１４までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１６】
大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防のための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１３または１４に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１７】
哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防のための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１３または１４に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１８】
メタロプロテアーゼＩＧＳ５が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１０から１７までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項１９】
メタロプロテアーゼＩＧＳ５に含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１０から１８までのいずれか１項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項２０】
メタロプロテアーゼＩＧＳ５に含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して同一である、請求項１９に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
【請求項２１】
請求項１から２０までのいずれか１項に記載の疾病または症状を、併用治療および／または併用予防するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも１種の付加的な化合物との組合せ物の使用において、この付加的な化合物が、好ましくはＡＣＥインヒビター、選択的ＥＣＥインヒビター、選択的ＮＥＰインヒビター、二重のＮＥＰ／ＥＣＥインヒビター、およびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターから選択されている、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも１種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
【請求項２２】
第一化合物が、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の式Ｉの構造、好ましくは請求項１１に記載の式Ｉａの構造または請求項１２に記載の式Ｉｂの構造を有する、請求項２１に記載の、第一化合物と少なくとも１種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
【請求項２３】
組合せ物が、同時に効果的であるか、好ましくは相乗効果を示す、請求項２１または２２に記載の、第一化合物と少なくとも１種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
【請求項２４】
請求項１から２０までのいずれか１項に記載の疾病または症状の併用治療および／または併用予防のための、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の、組合せまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組合されたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組合されたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも１種の付加的な化合物とを、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量で含有する医薬品組成物において、この付加的な化合物が、好ましくは、ＡＣＥインヒビター、選択的ＥＣＥインヒビター、選択的ＮＥＰインヒビター、二重のＮＥＰ／ＥＣＥインヒビター、およびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている、医薬品組成物。
【請求項２５】
第一化合物が、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の式Ｉの構造、好ましくは請求項１１に記載の式Ｉａまたは請求項１２に記載の式Ｉｂの構造を有する、第一化合物と少なくとも１種の付加的な化合物とを、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量で含有する、請求項２４に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）と特異的メタロプロテアーゼ（ＭＰ）とを組み合わせたかまたは同時に作用するインヒビターとして働く化合物の新規医薬としての使用に関し、この場合、これらのインヒビターは、近年、クローニングされ、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼとして新規に同定されているものである。
【背景技術】
【０００２】
メタロプロテアーゼは、構造的および機能的に関連する酵素、たとえばペプチダーゼの特定のファミリーを形成するポリペプチドであり、この場合、これらは、種々の疾病の治療または予防において製薬学的または薬理的重要性を有するものである。幾つかの疾病において、メタロプロテアーゼがその疾病の病理において重要な役割を示すものであることが同定されている。たとえば、技術水準において、多くの亜鉛メタロプロテアーゼまたは構造的および機能的に関連する酵素の特定のファミリーが同定され、特徴付けられており、これによって、これらの酵素、たとえば、亜鉛メタロプロテアーゼの関与が、健康状態および疾病状態の双方に包含される生物学的機能の種々のアレイにおいて、重要な役割を果たすことが明らかになってきた。亜鉛メタロプロテアーゼは、その触媒機能が、活性部位での亜鉛イオンにクリティカルに依存する酵素のサブセットである。配列および構造情報の双方に基づいてクラス分けされた種々のファミリーを含むこれらの酵素群は、たとえば、肺の発生、軟骨および骨の形成、ペプチドホルモンのプロセッシング、生殖（reproduction）、心臓血管障害、関節炎および癌の過程に、密接に作用するものであると記載されている。したがって、健常時および疾病時におけるそれぞれのメタロプロテアーゼの重要な役割、およびこれらの潜在的相互関係を調べるばかりでなく、特に、前記メタロプロテアーゼが影響を及ぼす疾病の管理のために、改善された治療概念をデザインする上で、製薬技術において特に重要である。
【０００３】
亜鉛メタロプロテアーゼの亜鉛結合部位周囲の配列および構造情報に基づいて、これらの酵素はいくつかのファミリーに分類されてもよく、この場合、これらのファミリーは、さらにスーパーファミリー、たとえば“メチジシン（metzincins）（アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン）”、“グルジンシン（テルモライシン、ネプリライシン、アンジオテンシン変換酵素、アミノペプチダーゼ）”であるか、あるいはメチジシンおよびグルジンシンのスーパーフェミリーを含む“ジンシン”に分類されてもよい。このようなグループ分けは、一般的な触媒的および生合成的機序の解明手段であるだけでなく、類似の亜鉛結合モティーフを有する新規に同定されたタンパク質の機能を解明する手段でもある。メタロプロテアーゼ、たとえば、亜鉛酵素のいくつかの別個の例は、すでに技術水準において同定されているネプリライシン、エンドセリン変換酵素、アンジオテンシン変換酵素、サーモリシン、アミノペプチダーゼ、アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン、インスリナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびＤＤ−カルボキシペプチダーゼを含む。
【０００４】
中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）およびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のような、特に重要なメタロプロテアーゼサブタイプのいくつかのより特異的特徴および関連する公知の活性については以下に説明する。
【０００５】
アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ；ペプチジル  ジペプチダーゼ  Ａ；ＥＣ３．４．１５．１）は、亜鉛メタロプロテアーゼのアンジオテンシン変換酵素ファミリーのメンバーである。ＡＣＥは、主に、内皮細胞、上皮細胞および神経上皮細胞（somatic ACE）の表面上で、細胞外酵素として発現し、この場合、細胞外酵素とは、１個または複数個の触媒部位を含むその塊の大部分が、細胞膜に固定され、細胞外環境に接していることを意味する。ＡＣＥは、血管内皮細胞の細胞膜中で見出され、その際、肺の血管内皮表面では、ＡＣＥの活性部位が循環物質を代謝しているかのように高いレベルで見出されている。ＡＣＥの内皮局在に加えて、酵素はさらに、小腸および腎臓近位の曲尿細管の吸収上皮のブラシ縁膜中で発現する。さらに、ＡＣＥは単核細胞、たとえば、マクロファージ分別後の単球およびＴ−リンパ球、さらには繊維芽細胞中で見出される。放射線ラベルした特異的ＡＣＥインヒビターを用いてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  オートラジオグラフィーにおいて、および免疫組織化学的試験において、脳におけるＡＣＥの主な局在がマッピングされた。ＡＣＥは、主に、脈絡叢中で見出され、この場合、これらは、髄液、上衣、脳弓下器官、脳底神経節（尾状−被殻および淡蒼球）、黒質および下垂体中のＡＣＥに由来するものであってもよい。ＡＣＥの可溶性の形は、たとえば血清、精液、羊水および脳脊髄液の多くの生物学的流体中で検出されてもよい。ＡＣＥの可溶性の形は、内皮細胞の酵素の膜結合した形から誘導されることが明らかになった。ＡＣＥの主な生理学的活性は、Ｃ−末端ジペプチドを切断し、アンジオテンシンＩから潜在的血管収縮性ペプチドであるアンジオテンシンＩＩを生成し、引き続いて、２個のＣ−末端ジペプチドを除去することによって、血管拡張性ペプチドブラジキニンを不活性化することである。血管作動性ペプチド  アンジオテンシンＩＩとブラジキニンのこれら２種の代謝におけるＡＣＥ関与の結果から、ＡＣＥは、高血圧および鬱血性心不全の治療における重要な分子標的となった。これは、高い効力および特異性を有するＡＣＥインヒビターを改善させ、これによりＡＣＥインヒビターは、高血圧および鬱血性心不全のこれらの症状をコントロールするための経口活性剤として、臨床的に重要でありかつ普及してきた。血管作動性ペプチドの代謝は、ＡＣＥの公知の生理学的機能を維持すると同時に、さらに酵素は、血圧調整に関連しない他の生理学的プロセスの範囲で、ＡＣＥの局在化および／または生物学的活性ペプチドのin vitroの切断範囲によって、たとえば、免疫、生殖および神経ペプチド代謝を包含する。
【０００６】
中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ、ネプリライシン、ＥＣ３．４．２４．１１）は、亜鉛メタロプロテアーゼであり、かつ多くのネプリライシンファミリーに分類される。ＮＥＰは、ウサギ腎臓のブラシ縁膜から最初に単離された。その後に、ＮＥＰ類似酵素が、ウサギ脳で、オピオイドペプチド、エンケファリンの分解において作用するものとして同定された。細胞外酵素ＮＥＰのクローニング、および引き続いての特定部位の突然変異誘発試験によって、サーモライシンと類似の特異性を有することが示され、さらに、類似の活性部位構成を有している。また、ＮＥＰは、疎水性残基のＮ−末端において、ペプチド切断に関してサーモライシン類似特異性を示す。ＮＥＰの一般的分布に関しては、脳および脊髄、さらには病変において測定されており、かつ電子顕微鏡試験は、一般に、ＮＥＰが主に神経的局在を示すことを支持するが、しかしながら酵素は、線条体−淡蒼球および線条体−黒質経路の線維によって取り囲まれた乏突起神経膠芽細胞上、および末梢神経系中のシュワン細胞上に存在していてもよい。ＮＥＰは、シナプスとして特異的な膜境界上での濃縮されることなく、むしろ神経核周囲部および神経樹状細胞の表面上に均一に分布している。末梢において、ＮＥＰは、特に、腎臓および小腸のブラシ縁膜、リンパ節および胎盤中に富み、かつ大動脈の血管壁を含む他の多くの組織中では低い濃度で見出されている。急性リンパ芽球白血病の共通抗原がＮＥＰであることが見出されたことによって、さらに技術水準においては、酵素が、リンパ球生成細胞（Lymphohaematopoietic cell）の表面上で一時的に存在し、かつ特定の疾病において成熟リンパ球が高レベルで見出されたことが示されている。ＮＥＰにおける臨床的重要性、特に、有効な臨床薬としてのＮＥＰインヒビターの重要性は、他の亜鉛メタロプロテアーゼと組合わせてのＮＥＰの作用に由来し、この場合、他の亜鉛メタロプロテアーゼは、エンケファリンの分解、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）の分解におけるその役割から、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ、膜アラニルアミノペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１１．２）である。たとえば、ＮＥＰとアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）との二重のインヒビターは、有効な抗高血圧薬であることが公知であり、これによって、ＮＥＰ抑制による心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの循環レベルの増加と、ＡＣＥ抑制によるアンジオテンシンＩＩの循環レベルの減少とを同時に生じる。末梢性酵素がナトリウム排泄増加ペプチドおよび利尿ペプチド、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの分解を示す場合に、臨床的に有効なＮＥＰインヒビターが得られることは興味深い。したがって、ＮＥＰインヒビターは、その抗高血圧特性について試験された。他の例から、合成ＮＥＰインヒビター、チオファンによるエンケファリン代謝による抑制が、マウスにおいてナロキソン可逆性抗侵害受容性応答を生じることは公知である。これは、その標的レセプターの範囲で内因性オピオイドを増加させることによって、モルホリンまたは他の古典的なアヘン剤の副作用からかなり解放される痛覚欠如が得られる可能性が見出された。これは、任意の顕著な効果を達成するために、他のエン��ファリン−代謝酵素が、特にアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）を抑制しなければならないことを実現した。このようなＮＥＰ／ＡＰＮの二重のインヒビターは、完全にエンケファリン代謝をブロックし、かつ強い抗侵害受容特性を有するものである。
【０００７】
エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）は、有効な血管収縮ペプチド  エンドセリン（ＥＴ）の生合成における最終過程を触媒する。これは、不活性の中間産物、ｂｉｇ−エンドセリン中のＴｒｐ−Ｖａｌ結合の切断に作用する。ＥＣＥ−１は、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ；ネプリライシン；ＥＣ３．４．２４．１１、前記）と同種の亜鉛メタロプロテアーゼである。ＮＥＰと同様に、ＥＣＥ−１は、化合物ホスホラミドンによって抑制され、かつ、タイプＩＩの内在性膜タンパク質である。しかしながら、ＮＥＰとは異なり、ＥＣＥ−１は、ジスルフィド結合二量体として存在し、かつ他のＮＥＰインヒビター、たとえばチオファンによって抑制されることはない。免疫細胞化学的試験は、ＥＣＥ−１が細胞外酵素として存在する、主な細胞−表面局在を示した。ＥＣＥ−１は内皮細胞およびいくつかの分泌細胞、たとえば、膵臓中のβ−細胞、および平滑筋細胞に局在している。ＥＣＥの有効かつ選択的インヒビターであるか、あるいはＥＣＥおよびＮＥＰの二重のインヒビターは、心臓血管系および腎臓系医薬における治療的適用を有していてもよい。２個の分子内ジスルフィド結合を有する、２１アミノ酸の二環式ペプチドであるエンドセリン（ＥＴ）は、現在において最も有効な血管収縮性ペプチドの一つであると同定されており、かつ動物に投与することで、血圧の持続的増加を生じ、心臓血管調節におけるその有効な働きを増強させた。ヒトにおけるＥＴ−１の内在的産生は、基底部（basal）の血管緊張の維持に寄与する。したがって、エンドセリン系および関連酵素たとえばＥＣＥは、新規薬剤の改善のための適切な指標を示す。これによって、ＥＣＥにおける臨床的重要性、特に有効臨床薬としてのＥＣＥインヒビターの重要性は、特に、ＥＴの生合成を含むＥＣＥの作用に由来する。したがって、顕著なエンドセリン変換酵素抑制活性を示す化合物は、ＥＴによって誘発されるかまたは誘発が示唆される種々の疾病の治療および予防において有用である。
【０００８】
技術水準から公知のメタロプロテアーゼまたはメタロエンドペプチダーゼの特別な基質は、たとえば、ｂｉｇ−エンドセリン−１（ｂｉｇ−ＥＴ−１）、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）、およびブラジキニンである。たとえば、ｂｉｇ−ＥＴ−１は、エンドセリン−１（ＥＴ−１）の生物学的に不活性な前駆体であることが公知であり、この場合、これらは、特定のタンパク質分解過程を介して、その前駆体  ｂｉｇ−エンドセリン−１から製造される、高い有効性を有する血管収縮ペプチドである。ＥＴ−１は、ヒトにおける基底部血管緊張の維持において生理学的役割を有しているが、しかしながら、高血圧、心不全およびアテローム性動脈硬化症のような種々の心臓血管疾病の原因であるともみられている。ＥＴ−１過剰の副作用を減衰させるための一つの試みは、ｂｉｇ−ＥＴ−１のＥＴ−１への酵素的変換を抑制することである。しかしながら、エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）は、１９９４年にクローニングされており（Xu Dら、Cell, 1994,78: 473-485）、この酵素は一般的に、ｂｉｇ−ＥＴ−１のＥＴ−１への生理学的変換に応答性のエンドペプチダーゼとして認められるようになった。さらに、これ以来、ＮＥＰ−インヒビダー  ホスホラミドンは、さらに有効にＥＣＥ−１を抑制するツール化合物として広範囲に認められるようになり；さらにその活性は、ｂｉｇ−ＥＴ−１の注射液を投与された心不全の患者において確認されている（Love MP ら、Circ, 1996, 94: 2131-2137）。
【０００９】
しかしながら、ＥＣＥ−１が、ｂｉｇ−ＥＴ−１を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告では、ＥＣＥ−１が生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるか疑わしいか、あるいは少なくとも、付加的な酵素がＥＴ−１の製造で影響しているにちがいないとの主張が報告された（Barker S ら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，５９；１６３−１６９）。さらに、Ｂａｒｋｅｒらによれば、エンドセリン−１（ＥＴ−１）は、高血圧、肺高血圧、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、および喘息における原因として挙げられた（Douglas, 1997, Tends Pharmacol Sci 18:408-412; Haynes and web, 1998, J Hypertension 16: 1081-1098; Goldie and Henry, 1999, Life Sci 65: 1-15）。多くの高ポテンシャルなＥＴ受容体アンタゴニストが、治療的適用に関して報告されているが、しかしながらこれらの化合物は一般に、ＥＴＡ受容体選択的であるか、あるいは非−選択的ＥＴＡ／ＥＴＢアンタゴニストである（Douglas, 1997,前記）。ＥＴＢ受容体はいくつかの組織において優位であるが、しかしながら、選択的ＥＴＢまたは非−選択的ＥＴＡ／ＥＴＢアンタゴニストによるブッロッキングに耐性である（Hay ら、1998, J Pharmacol Exp Ther 284: 669-677）。したがって、ＥＣＥインヒビターでのＥＴ−１合成の特異的抑制は、いくつかの条件下で、ＥＴ−１過剰の副作用を減衰させるための良好なアプローチであってもよい。
【００１０】
本発明の目的は、メタロプロテアーゼ−関連疾病の治療および／または予防のための新規の治療概念を見出すことであり、この場合、これは、たとえば、第１段階においては、製薬学的に重要な別個のメタロプロテアーゼを特異的に抑制するか、あるいは、少なくとも２種の型のメタロプロテアーゼの選択的な組合せを、作用プロフィールの組み合わされた様式で特異的に抑制する、治療的に有用な化合物を供給することであり、かつ、第２段階においては、前記メタロプロテアーゼ抑制化合物の治療的に有用な組み合わせ物を提供することである。
発明の開示
ＥＣＥ−１が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるとする技術水準が疑わしく（Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169）、かつ、付加的な酵素が、ＥＴ−１の産生に影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、ｂｉｇ−ＥＴ−１をＥＴ−１に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。これらの試みによって、メプロライシン  メタロプロテアーゼファミリーの２個の最も特徴的なメンバーであるＮＥＰに対する高いホモロジー（５４％同一性）およびＥＣＥ−１に対するやや低いホモロジー（３７％同一性）を有する新規のヒト遺伝子が見出された。このヒト遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中において、多数発現することが見出され、かつ、“ＩＧＳ５”として呼称されている（同時係争中の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／１１５３２）。
【００１１】
したがって、本発明は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に、同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するかまたはこれらに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、
ａ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）上および
ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、メタロプロテアーゼＩＧＳ５上での、
組み合わされたか、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステル（biolabile ester）の使用に関する。
【００１２】
特別な態様において、本発明は、ｂｉｇ−ＥＴ−１レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に、同時に抑制するによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００１３】
他の特別な態様において、本発明は、ＥＴ−１が著しくアップレギュレーションされた疾病または症状であり、かつ、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬組成物）の製造のための、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５阻害活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００１４】
他の特別な実施態様において、本発明は、大型哺乳類、特にヒトにおける高血圧症の二次的形態、たとえば、腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および／または予防のための医薬（医薬組成物）を製造するための、組み合わせたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する前記化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００１５】
さらに、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す前記化合物と、ＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビター、たとえば、別個のＡＣＥ−および／またはＥＣＥ−および／またはＮＥＰ−インヒビターおよび／またはこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターとを付加的に組み合わせることは有利であってもよい。
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で使用された用語は、以下に別記しない限りは、本発明の技術分野における当業者が認識している通常の意味を有するものとする。以下のいくつかの定義は、本明細書中でしばしば使用される特定の用語の意味を簡単に説明するものである。
【００１６】
“ＩＧＳ５”は、特に、配列番号２、配列番号４および配列番号６の一つに示されたアミノ酸配列、またはこれらそれぞれの変異体を含むポリペプチドを意味する。したがって“ＩＧＳ５”は、特に、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２を含む。
【００１７】
“酵素活性”または“生物学的活性”は同様の活性または改善された活性か、あるいは、好ましくない副作用が減少したこれらの活性を含む、前記ＩＧＳ５の代謝的または生理学的機能に関する。
【００１８】
“ＩＧＳ５−遺伝子”は、配列番号１、配列番号３および配列番号５の一つに示されたヌクレオチド配列、あるいはこれらそれぞれの変異体、たとえば、これらの突然変異体および／またはこれらの補体を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００１９】
本発明の技術分野において同一性の尺度として公知の“同一性”とは、２個またはそれ以上のポリペプチド配列、または２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間での関連性を意味する。この技術分野において、さらに“同一性”は、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド間の配列の関連性の度合いを意味し、たとえば、一般には最も大きいオーダーの適合率（matching）が得られるように配列を調節することによって、このような配列群間の適合を測定してもよい。したがって、“同一性”または二者択一的な用語“類似性”は、当業者によって認識されている意味を有するものであって、かつ公知方法によって簡単に算定できるものであるが、この場合、“Computational Molecular Biology”, Lesk, A.M., Ed., oxford University Press, New York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith, D,W., Ed., Academic Press, New York, 1993; “Computer Analysis of Sequence Data”, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; “Sequence Analysis Primer”Gribskov, M. and Devereux, J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものによって制限されることはない。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間で最も大きい適合性が得られるように設定される。同一性および類似性を測定するための方法は、市販のコンピュータープログラムで見出すことができる。２個の配列間の同一性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 ( 1984)）, BLASTP, BLASTNおよびFASTA（Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)）を含むが、これに制限されることはない。ＢＬＡＳＴ  Ｘ  プログラムは、ＮＣＢＩおよび他の機関から公的に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）。さらによく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  アルゴリズムは、同一性を測定するために使用されてもよい。それぞれ、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の同一性または類似性を測定するために有用な公的に利用可能なプログラムは、“ｇａｐ”プログラムとして、Genetics Computer Group, マディソンWI から公知であり、この場合、これは、通常は、比較のためのデフォルトパラメータを用いておこなうものである（エンドギャップに対するペナルティーはないことに加えて）。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータ（すなわちデフォルトパラメータ）は、以下のものを含む：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）で記載されたアルゴリズム；ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からの比較マトリックスＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティー：１２；ギャップ長ペナルティー：１４。ポリヌクレオチドを比較するための好ましいパラメータ（すなわちデフォルトパラメータ）は、以下のものを含む：Ｎｅｅｄｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｙｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）によって記載されたアルゴリズム；比較マトリックス：マッチ数＝±１０、ミスマッチ数＝０；ギャップペナルティー：��０；ギャップ長ペナルティー：３である。用語“相同性”は用語“同一性”と置き換えることができる。
【００２０】
たとえば、参考ヌクレオチド配列、たとえば、配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択された参考ヌクレオチド配列に対して、たとえば、少なくとも９５％の“同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が、それぞれ参考ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５箇所までの変異を含んでいてもよいことを除き、参考配列と同一であると見なされる。いいかえれば、参考ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参考配列中のヌクレオチド５％までが欠損しているかまたは他のヌクレオチドによって置換されていてもよいか、あるいは、参考配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が、参考配列中に挿入されるか、あるいは、参考ヌクレオチド中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が、欠損、挿入および置換の組合せで変異していてもよい。参考配列のこれらの変異は、参考ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端で生じてもよいか、あるいは、参考配列中または参考配列の範囲内の一つまたはそれ以上の近接する群中のヌクレオチド中で、それぞれ別個に点在していてもよい。
【００２１】
同様に、たとえば参考アミノ酸配列、たとえば、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択された参考アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の“同一性”を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が、それぞれの参考アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５個までのアミノ酸変異を含んでいてもよいことを除いて、参考配列と同一であるとみなされる。いいかえれば、参考アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参考配列中の５％までのアミノ酸残基は、欠失されていてもよいかまたは他のアミノ酸によって置換されていてもよいか、あるいは、比較される配列中の５％までの全アミノ酸残基の多くのアミノ酸は、比較される配列中に挿入されていてもよい。比較配列のこれらの変異は、比較アミノ酸配列のアミノ末端基またはカルボキシ末端基で生じてもよいか、あるいは、これらの末端基中で、比較配列中の残基中でかまたは比較配列の範囲内で１個またはそれ以上の近接する群で別個に散在していてもよい。
【００２２】
“ホモログ”は、対象となる配列に対する高い度合いの配列関連性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示す、本発明の技術分野で使用される遺伝子学用語である。このような関連性は、ここで記載されたものと比較しての配列間で同一性および／または類似性の度合いを測定することによって定量されてもよい。この遺伝子学用語の範囲内において、用語“オルトログ”は他種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、かつ“パラログ”は同種の範囲を考慮した場合の機能的に類似する配列を意味するものである。したがって、たとえばヒトにおいて、エンドセリン変換酵素のファミリーの範囲内で、ＥＣＥ−１は、他のメンバー、たとえばＥＣＥ−２のパラログである。
メタロプロテアーゼの特異的インヒビターである、新規に同定されたメタロプロテアーゼＩＧＳ５の薬理学的評価
ＥＣＥ−１が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるといった技術水準が疑わしく（Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169）、かつ、付加的な酵素が、ＥＴ−１の産生において影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、ｂｉｇ−ＥＴ−１をＥＴ−１に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。類似する活性を有する酵素は、これらのアミノ酸配列においても類似性を有するであろうといった仮定のもとに、ヒトゲノムを、２種の最も特徴的なネプリライシンメタリプロテアーゼファミリーのメンバーである、ＮＥＰおよびＥＣＥとのホモロジーを有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列についてサーチした。これらの試みによって、ＮＥＰに対して高い相同性（５４％同一性）およびＥＣＥ−１に対するやや低い相同性（３７％同一性）を有する新規のヒト遺伝子を発見するに至った。この遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中で多く発現することが見い出され、かつ “ＩＧＳ５”と呼称されている。ＩＧＳ５のクローニング、発現および基本的な生物学的特徴付けは、詳細には、同時係争中の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／１１５３２に記載されており、この場合、これら全内容は、参考例のために以下ＩＧＳ５についてそれぞれ詳細に例証されている。
【００２３】
本発明の目的のために、ＩＧＳ５の薬理学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトＩＧＳ５タンパク質を、発現系として昆虫細胞系を使用することにより製造し、ＩＧＳ５タンパク質の種々の有効な基質について試験した。ＩＧＳ５は、ｂｉｇ−ＥＴ−１、ブラジキニンおよびサブスタンスＰを効率よく切断することが確認されており、これによって、さらにこの新規タンパク質が、メタロプロテアーゼ共通の特徴である広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることが確認され、かつ、これらの特徴は、ＮＥＰ、ＥＣＥ−１およびさらにＡＣＥに関しても報告されている。さらに本発明によれば、ＩＧＳ５によるｂｉｇ−ＥＴ−１のタンパク質分解は、驚くべきことに、ＥＴ−１の正確な形成を生じ、たとえば、ｂｉｇ−ＥＴ−１は、正確に、アミノ酸Ｔｒｐ２１とＶａｌ２２との間を切断することが見出された。
【００２４】
さらに、本発明によれば、ｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への変換を抑制するメタロプロテアーゼインヒビター化合物の有効性を、蛍光ラベルされたｂｉｇ−ＥＴ−１アナログを用いて最初に試験したものである。結果は、実施例部分の第９表に示した。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への変換抑制が公知であるホスホラミドンが、さらに本発明において使用された生化学的アッセイで、高いポテンシャルでＩＧＳ５を抑制し、さらにおどろくべきことに、ホスホラミドンによるＩＧＳ５の抑制が、実際にはかなりＥＣＥ−１よりも高いことは興味深い。対照的に、選択的ＮＥＰインヒビター  チオルファンならびに選択的ＥＣＥ−１インヒビターＳＭ−１９７１２（４−クロロ−Ｎ−［［［（４−シアノ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ］カルボニル］ベンズスルホンアミド、一ナトリウム塩；Ｕｍｅｋａｗａ  Ｋ．Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｈ．Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｙ，Ｓａｔｏ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；８４（１）：７−１５；Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ，Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）は、ＩＧＳ５活性を示さなかった（第９表、実施例部分参照）。
【００２５】
本発明の特別な態様において、最も重要でありかつ特徴的であるのは、メタロプロテアーゼインヒビターであるとして示された多くの化合物が、低いナノモル量での濃度、たとえば、約１〜１０ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有する濃度であっても、ＩＧＳ５酵素を抑制することが可能であることであり、これによって、特に製薬学的重要性を有する新規に同定されたＩＧＳ５メタロプロテアーゼを特異的に抑制することを明らかにした。
【００２６】
したがって、本発明は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、
ａ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）上および
ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、メタロプロテアーゼＩＧＳ５上での、
組み合わされた、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００２７】
特別な態様において、本発明は、ｂｉｇ−ＥＴ−１レベルが増加する疾病または症状であり、かつＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、組合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ＥＴ−１が著しくアップレギュレーションされる疾病または症状であり、かつＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するための、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【００２９】
本発明において、“組合わされたかまたは特に同時の抑制活性”は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５の双方の酵素系を同時にブロッキングすることによる少なくとも二重のＮＥＰおよびＩＧＳ５の抑制を意味し、かつ場合により、第３の系の付加的な同時の抑制、たとえば、ＮＥＰ、ＩＧＳおよびたとえばＥＣＥ−１の酵素系の三重の抑制を意味する。本発明の結果から、ＮＥＰおよびＩＧＳ５の双方の酵素系の組合わされたか、同時の抑制が、異なる化合物によるブロッキングであるか、または単に、前記のそれぞれの酵素の別個のブロッキングよりも、より効果的であることが期待された。したがって本発明は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防されてもよい特定の疾病または症状の治療および／または予防のための、組み合わせた、特に同時のＮＥＰおよびＩＧＳインヒビターの使用を提案することによる、新規治療概念を提供する。さらに、これに関連して、本発明は、ＮＥＰおよびＩＧＳ５の双方の組み合わされたか、または同時の抑制を示す化合物を提供し、これによって、考えられうる疾病または症状の治療および／または予防のために、改善された治療的価値を有する化合物の新規かつ期待される使用を提供する。
【００３０】
治療的利点としての医学的に重要であるとされる、組み合わされた、特に同時に生じる作用機序は、それぞれの単独の系を別個に調節するよりも、より顕著であることが期待された。
【００３１】
たとえば、エンドセリン−変換酵素インヒビターに関して、この原理の現在の状況および背景の解明、さらには関連する利点は、近年、Ｂ−Ｍ．Ｌｏｅｆｆｌｅｒ（J. Cardiovasc. Pharmacl. (2000), 35(Suppl.2), S79-S82）による論文で報告されている。Ｌｏｅｆｆｅｒらによれば、近年の研究により、有効な選択的または混合されたエンドセリン−変換酵素（ＥＣＥ）、ＥＣＥ／中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）およびＥＣＥ／ＮＥＰアンジオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターを見出したという。さらに、これらは、エンドセリン（ＥＴ）、レニン−アンジオテンシンおよびＮＥＰ系の、心臓血管系ホメオスタシスの調整のための機能が、複合的な調整ネットワークによって関連付けられている証拠を多く報告している。したがってＬｏｅｆｆｌｅｒは、新規に可能な選択的かつ混合ＥＣＥ−１インヒビターに関する将来的な研究課題は、一つ以上の心臓血管系の組み合わされた抑制が、選択的抑制よりも優れているかどうかを示すのに挑むことであるとみている。これに関して、本発明は、少なくともＮＥＰおよびＩＧＳ５の酵素系の組み合わされたまたは同時の抑制に関する、技術水準に貢献する最初の優れた進歩を提供する。
【００３２】
特別な態様において、本発明は、哺乳類、特にヒトでの、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌の疼痛の治療および／または予防に好ましい医薬を製造するための化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。特に、本発明において、好ましくは、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制活性を有する化合物を、ＮＥＰおよび／またはＩＧＳ５を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病また症状を有するかまたはこれに感受性の患者の部分母集団において、前記疾病または症状を治療および／または予防するために使用する。
【００３３】
さらに、本発明による組み合わされたかまたは同時に生じるＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す化合物と、組合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターとを付加的に組合せることは有利であってもよい。組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物との組合せ物中で使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ＡＣＥインヒビター、たとえばカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ホシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり；さらに、選択的ＥＣＥインヒビター、たとえば化合物ＳＭ−１９７１２（Sumitomo、前記）;選択的ＮＥＰインヒビター、たとえば、チオルファン；二重のＮＥＰ／ＥＣＥインヒビター、たとえば化合物ＣＧＳ−３５０６６（De Lombart ら、J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504）：またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえば、オマパトリレートまたはサムパトリレートである。このタイプの組合せた治療および／または予防によって、組み合わされたかまたは同時に生じるＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物の治療的重要性は、さらに増加させることができ、この場合、これらは特に、前記に挙げられた疾病および／または症状に関するものである。したがって、他の態様において、本発明は、さらに以下のようにして記載された、併用療法および／または併用予防法に関する。
【００３４】
特に、本発明によれば、主に中性のエンドペプチダーゼインヒビター（ＮＥＰ−インヒビター）である化合物が、低いナノモル濃度であっても製薬学的重要性を有する新規に同定されたＩＧＳ５メタロプロテアーゼ酵素を十分に抑制し、これによって、これらの化合物が、組み合わされた作用プロフィール、たとえば、組み合わされたかまたは同時に書汁選択的ＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性プロフィールを有するメタロプロテアーゼインヒビターであることが明らかにされた。このような化合物は、式Ｉ：
【００３５】
【化１】
2004536063.tif 000002
［式中、Ａは式ＩＩまたは式ＩＩＩ
【００３６】
【化２】
2004536063.tif 000003
を有する基を示し、その際、式ＩＩ中、
Ｒ１ａは、フェニル環中で、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたはハロゲンによって置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基であるか、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
Ｒ２ａは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつ、
式ＩＩＩ中、
Ｒ１ｂは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
Ｒ２ｂは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
かつ、
Ｒ３は、水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基を示す］の構造を有していてもよい化合物、および式Ｉの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【００３７】
式Ｉの化合物における置換基は、低級アルキルまたはアルコキシ基であるかまたはこれらを含んでおり、これらは、直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ、特に１〜４個、好ましくは１〜２個の炭素原子を含み、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に、フッ素、塩素または臭素、好ましくはフッ素または塩素である。
【００３８】
基Ｒ１ａにおいて、低級アルキレン鎖は、１〜４個、好ましくは１〜２個の炭素原子を含有していてもよい。Ｒ１は、特に、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって１個またはそれ以上が置換されていてもよい、場合によっては置換されたフェニル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【００３９】
式Ｉａの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。
【００４０】
生分解可能なカルボン酸エステルを形成する適した基Ｒ３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適しているのは、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキルまたは低級アルコキシまたは２個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって、モノまたはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキサン環中で低級アルキル基によって置換されていてもよいか、あるいは、Ｃ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、場合によっては低級アルキルによってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基Ｒ３が低級アルキルを含む場合には、これらは、分枝または非分枝であってもよく、かつ１〜４個の炭素原子を有していてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、１〜３個、好ましくは１個の炭素原子を有するアルキレン鎖を有していてもよく、かつ好ましくはベンジルである。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、３〜４個、好ましくは３個の炭素原子を有していてもよい。Ｒ３が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらは、２〜６個、好ましくは３〜５個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を有していてもよく、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基（＝ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル−オキシメチル基）であってもよい。
【００４１】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する適した基Ｒ２ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基であり、かつ、基Ｒ３に関して挙げられた基に相当する。
【００４２】
生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基として適した基Ｒ１ｂおよびＲ２ｂは、ｉｎｖｉｖｏでの生理学的条件下で、それぞれホスホン酸官能基を遊離させながら、除去されてもよい基である。たとえば、この目的に適した基は、低級アルキル基、場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されたＣ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基、またはフェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらのフェニル環は、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは２個の隣あった炭素原子と結合した低級アルキレン基によって、モノ−またはポリ置換される。生物的不安定性エステルを形成する基Ｒ１ｂおよび／またはＲ２ｂが低級アルキル基であるかまたはこれらを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ１〜４個の炭素原子を含有していてもよい。Ｒ１ｂおよび／またはＲ２ｂが場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これは、好ましくは、２〜６個、より好ましくは３〜５個の炭素原子を有する分枝のアルカノイル基を有していてもよく、かつ、たとえばピバロイルオキシメチル基であってもよい（＝ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルオキシメチル基）。Ｒ１ｂおよび／またはＲ２ｂが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、１〜３個、好ましくは１個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは３〜４個、特に３個の炭素原子を含んでいてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【００４３】
式Ｉの酸の適した生理学的に認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミンまたはｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはフェニル−低級アルキルアミン、たとえば、α−メチルベンジルアミンとの塩である。
【００４４】
式Ｉの化合物は、少なくとも１個のキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の３位でアミド側鎖を有する炭素原子である。したがって、このような化合物は、２個の光学的活性の立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Ｉの化合物のラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を含む。式Ｉの化合物において、基Ａは式ＩＩを示す場合には、式Ｉの化合物は２個のキラル炭素原子、すなわち環骨格の３位で、かつアミド側鎖を含む炭素原子、および基Ｒ１ａを有するアミド側鎖の炭素原子を有する。したがって、基Ａが式ＩＩを意味する式Ｉのこれらの化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形でかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、ラセミ混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を使用することができる。式Ｉの化合物において、基Ａが式ＩＩＩを意味し、かつＲ１ｂおよびＲ２ｂは水素でなくそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子はキラルであってもよい。さらに本発明は、式Ｉの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関し、その際、基Ａはキラルのリン原子により形成される式ＩＩＩを意味する。
【００４５】
本発明によれば、式Ｉの化合物、その塩およびその生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で得られてもよい（以下参照のこと）。
【００４６】
本発明の好ましい態様において、第１ＮＥＰ−抑制化合物、たとえば式Ｉａの構造を有するベンズアゼピノン−Ｎ−酢酸誘導体、あるいは、式Ｉｂの構造を有するホスホノ−置換されたベンズアゼピン誘導体が見出された。
【００４７】
式Ｉａの構造を有する化合物はすでに、ＵＳ５６７７２９７からのＮＥＰ−抑制化合物として公知であり、その際、化合物は、前記に示したような疾病または症状の治療に有用である。式Ｉの化合物は、以下の構造
【００４８】
【化３】
2004536063.tif 000004
［Ｒ１ａは、フェニル環中で、低級アルキル、低級アルコキシまたは水素によって場合によっては置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
Ｒ２ａは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示し、かつ、
Ｒ３は、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示す］を有する化合物および式Ｉの酸の製薬学的に認容性の塩である。
【００４９】
式Ｉａの化合物における置換基が、低級アルキルまたはアルコキシ基であるか、あるいはこれを含有する場合には、これらは直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ特に、１〜４個、好ましくは１〜２個の炭素原子を含み、かつ、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に適しているのはフッ素、塩素または臭素であり、好ましくはフッ素または塩素である。
【００５０】
基Ｒ１ａにおいて、低級アルキレン鎖は１〜４個、好ましくは１〜２個の炭素原子を含有していてもよい。特にＲ１ａは、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって１個またはそれ以上が置換されていてもよい。場合によっては置換されたフェネチル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【００５１】
式Ｉａの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。投与形態に依存して、生分解可能なモノエステル、特にＲ２ａが生分解可能なエステルを形成する基であり、かつＲ３が水素である化合物であるか、あるいはジカルボン酸が好ましく、この場合、ジカルボン酸は特に静脈内投与（ｉ．ｖ．）に適している。
【００５２】
生物的不安定性エステルを形成する、式Ｉａの化合物において適した基Ｒ２ａおよびＲ３は、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によってはフェニル環中で、低級アルキルによってかまたは２個の隣り合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって置換されているか、オキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されており、あるいは、Ｃ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、オキシメチル基上で場合によっては低級アルキルによって置換されている。生物的不安定性エステルを形成する基Ｒ２ａまたは基Ｒ３が低級アルキル基である場合には、これは好ましくは、１〜４個、好ましくは２個の炭素原子を有する非分枝のアルキル基であってもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級−アルキル基である場合には、そのアルキレン基は１〜３個、好ましくは１個の炭素原子を有していてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これは、３〜４個、特に３個の炭素原子を含んでいてもよい。フェニル、ベンジルまたはインダニルが、特にフェニル含有置換基Ｒ２ａおよび／またはＲ３として特に適している。Ｒ２ａおよび／またはＲ３が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらのアルカノイルオキシ基は２〜６個、好ましくは３〜５個の炭素原子を含有していてもよく、かつ好ましくは、分枝であり、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基（＝ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル−オキシメチル基）であってもよい。
【００５３】
式Ｉのジカルボン酸またはモノエステルの適した生理学的認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえば、ナトリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえばジエチルアミンまたはｔｅｒｔ−ブチルアミンとの塩を含む。
【００５４】
式Ｉａの化合物は、２個のキラルの炭素原子、すなわち、環骨格の３位で、かつアミド側鎖を有する炭素原子、および基Ｒ１ａを有するアミド側鎖の炭素原子を含む。したがって、化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形であるかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、式Ｉａのラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物の双方を使用することができる。
【００５５】
本発明によれば、式Ｉａの化合物およびその塩および生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で、たとえば、ＵＳ５６７７２９７に記載のようにして得ることができる。
【００５６】
式Ｉの好ましい化合物は、たとえば、Ｒ２および／またはＲ３が生物的不安定性エステルを形成する基を意味する化合物、およびその生理学的に認容性の塩である。生物的不安定性エステルを形成する基は、低級アルキル基、またはフェニルまたはフェニル−低級−アルキル基であってもよく、特にフェニル基、ベンジル基またはインダニル基であり、この場合、これらは、場合によっては、低級アルキルまたは２個の隣合う炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環中で置換されていてもよいか、ジオキソラニルメチル基、特に（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルであり、この場合、これらは場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されていてもよいか、あるいはＣ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基であり、場合によってはオキシメチル基上で、低級アルキルによって置換されていてもよい。特に、式Ｉａの化合物は、Ｒ２が生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつＲ３が水素であることを特徴とする化合物であることが好ましい。
【００５７】
式Ｉａの化合物の特に好ましい例は、たとえば、
（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−カルボキシ−４’−フェニルブチル］−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（化合物Ｉａ−１）；
（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−（エトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（化合物Ｉａ−２）；
（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−（エトキシカルボニル）−４’−ナフチルブチル］−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（化合物Ｉａ−３）；およびこれらの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【００５８】
式Ｉａの化合物の他の特別な例は、たとえば、
３−｛１−［２’−（エトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（化合物Ｉａ−４）；
３−｛１−［２’−（エトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１酢酸（化合物Ｉａ−５）；
（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−エトキシカルボニル)−４’−フェニルブチル］シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物Ｉａ−６）；
（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−（カルボキシ−４’−フェニルブチル）シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１酢酸（化合物Ｉａ−７）；
３−｛１−［２’−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンジアゼピン−１−アセテート−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物Ｉａ−８）；
３−［１−（２’−カルボキシ−４’−フェニルブチル）シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（化合物Ｉａ−９）；
３−｛１−［２’−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート−ベンジルエステル（化合物Ｉａ−１０）；
３−［１−（２’−カルボキシ−４’−フェニルブチル）シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート−ベンジルエステル（化合物Ｉａ−１１）；
３−｛１−［２’−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルオキシメトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート−ベンジルエステル（化合物Ｉａ−１２）；
３−｛１−［２’−（ピバロイルオキシメトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］−シクロペンタン−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１酢酸（化合物Ｉａ−１３）；
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【００５９】
式Ｉｂの構造を有する化合物は、ＮＥＰ−抑制化合物、さらにはＵＳ５９５２３２７からの弱いエンドセリン変換酵素インヒビター（ＥＣＥ−インヒビター）としてすでに公知であり、その際、化合物は、前記に示されたような疾病または症状の治療に有用である。したがって、さらに本発明は、式Ｉｂ
【００６０】
【化４】
2004536063.tif 000005
［式中、Ｒ１ｂは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、
Ｒ２ｂは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、かつ、
Ｒ３は、水素であるか、あるいは生物的不安定性のカルボン酸エステルを形成する基である］の化合物および式Ｉｂの酸の生理学的に認容性の塩に関する。
【００６１】
式Ｉｂの化合物は、カルボン酸およびホスホン酸を含む酸誘導体であり、この場合、これらは場合によっては、生分解可能なエステルを形成する基によってエステル化される。式Ｉｂの生分解可能なエステルは遊離酸のプロドラックである。投与形態に依存して、生分解可能なエステルまたは酸が好ましく、特に酸は、静脈内投与に適している。
【００６２】
生分解可能なホスホン酸エステルを形成する基として適した基Ｒ１ｂおよびＲ２ｂはｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下で、それぞれのホスホン酸官能基を遊離しながら、除去することができる。たとえば、本発明の目的のために適した基は低級アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されていてもよく、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは２個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環がモノまたはポリ置換されているものである。生分解可能なエステルを形成する基Ｒ１ｂおよび／または基Ｒ２ｂが低級アルキルであるかまたはこれを含有する場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ１〜４個の炭素原子を含有していてもよい。Ｒ１ｂおよび／またはＲ２ｂが場合によっては置換されたアルカノイルメチル基である場合には、好ましくは、２〜６個、好ましくは３〜５個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシメチル基であってもよい（＝ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルオキシメチル基）。Ｒ１ｂおよび／またはＲ２ｂが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、１〜３個、好ましくは１個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは３〜４個、特に３個の炭素原子を含有していてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【００６３】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する式Ｉｂの化合物のための適した基Ｒ３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適した基は、低級アルキル基、フェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合これらは、フェニル環中で、低級アルキル基かまたは低級アルコキシ基によってか、あるいは２個の隣接した炭素原子と結合した低級アルキレン基によってモノ置換またはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基であり、この場合、これらはジオキサン環中で、低級アルキル基によって場合によっては置換されていてもよく、あるいはＣ２〜Ｃ６−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキル基によってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生分解生エステルを形成する基Ｒ３基が低級アルキルであるかまたはこれを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ１〜４個の炭素原子を含有していてもよい。生分解可能なエステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは１〜３個、好ましくは１個の炭素原子を有するアルキレン基を含有してもよく、かつ好ましくはベンジル基である。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、３〜４個、好ましくは３個の炭素原子を含有していてもよい。Ｒ３が、場合によってはアルカノイルオキシメチル基である場合には、この場合、これらは、炭素原子２〜６個、好ましくは３〜５個を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシ基であってもよい。
【００６４】
本発明によれば、式Ｉｂの化合物およびその塩、ならびにその生分解可能なエステルは、技術水準において当業者に公知の方法で得ることができる。
【００６５】
式Ｉｂの酸の適した生理学的に認容性の塩は、それぞれの場合において、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩であり、たとえば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩、またはその生理学的認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミンまたはフェニル−低級アルカリアミン、たとえばα−メチルベンジルアミンとの塩である。
【００６６】
式Ｉｂの化合物はキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の３位においてアミド側鎖を有する炭素原子を含む。したがって、化合物は、２個の光学的活性立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Ｉのラセミ混合物と、異性体的に純粋な化合物との双方を包含する。式Ｉｂの化合物においてＲ１ｂとＲ２ｂが水素でなく、かつそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子もまたキラルであってもよい。さらに、本発明は、キラルのリン原子により形成される、式Ｉの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関する。
【００６７】
式Ｉｂの好ましい化合物は、Ｒ３が水素または低級アルキル、たとえば、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、特にＣ１〜Ｃ２−アルキルを意味する化合物、および式Ｉｂの酸の生理学的に許容可能な塩である。
【００６８】
式Ｉｂの化合物の好ましい例は、たとえば、
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−ジベンジルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１）；
（３Ｓ）−３−（１−ホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（＝化合物Ｉｂ−２）；
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−３）；
エチル（３Ｓ）−３−（１−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−４）；
エチル（３Ｓ）−３−（１−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−５）；
エチル（３Ｓ）−３−［１−（ピバロイルオキシメチルエチルホスホノメチル）−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−６）；
エチル（３Ｓ）−３−［１−（５−インダニルエチルホスホノメチル）−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−７）；
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−（１−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−８）；
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−９）；
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−ジエチルホスホノメチル−１−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１０）；
（３Ｓ）−３−（１−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸（＝化合物Ｉｂ−１１）；
エチル（３Ｓ）−３−（１−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１２）；
エチル（３Ｓ）−３−（１−ホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（化合物Ｉｂ−１３）；
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−ホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１４）；
ベンジル（３Ｓ）−３−（１−ジイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５，−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ＝１５）；
エチル（３Ｓ）−３−（１−ベンジルイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ＝１６）；
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−（１−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１７）；
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−［１−（ピバロイルオキシメチル−エチルホスホノメチル）−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１８）；
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−（１−ホスホノメチル−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−アセテート（＝化合物Ｉｂ−１９）；
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩である。
【００６９】
式Ｉｂの化合物の特に好ましい例は、たとえば、化合物Ｉｂ−２、化合物Ｉｂ−８、化合物Ｉｂ−１８または化合物Ｉｂ−１９であり、最も好ましくは化合物Ｉｂ−８、およびこれらの生理学的に認容性の塩である。
【００７０】
本発明は、技術水準から公知のＥＣＥ−１メタロプロテアーゼに加えて、エンドセリン変換酵素のＩＧＳ５型が、さらに、ｂｉｇ−ＥＴをＥＴ−１に切断するのに特に作用するメタロプロテアーゼであると定められたことを、最初に証明するものである。したがって、本発明によるこれらの発見は、ＩＧＳ５によって介在された、ｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への切断によって、影響を受けるかおよび／またはこれを包含する種々の疾病の治療および／または予防のための、改善された治療概念に関して、新規かつ重要な有力な候補を提供するものであって、本発明によれば、公知のＥＣＥ−１と結合する化合物を探索および使用よりもむしろ、治療的に活性の化合物、すなわち、特異的にＩＧＳ５型のメタロプロテアーゼを抑制する化合物の同定および使用を示唆した。
【００７１】
前記に示された式Ｉａまたは式Ｉｂの構造を有する化合物は、元来、そのＮＥＰ−抑制活性に基づいて、技術水準で選択された。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＧＳ５に対する極めて高い効果は、驚くべきことに、本発明による化合物が、麻酔をかけられたラットにおけるｂｉｇ−ＥＴの血圧上昇作用を本質的に減少させる前記化合物の可能性によって、見出された。
【００７２】
結論として、本発明による試験は、新規のＥＣＥ−／ＮＥＰ−様メタロプロテアーゼを見出し、この場合、これらはｂｉｇ−ＥＴを効果的に切断し、かつ、公知のエンドセリン変換酵素インヒビターホスホラミドンに対して感受性でないばかりか、さらに、式Ｉの構造を有する、好ましくは式Ｉａまたは式Ｉｂの構造を有する多くの定義されたメタロプロテアーゼインヒビターに対しても感受性でない。したがって、ＩＧＳ５が、ＥＴ−１製造において重要な役割を示し、かつ、式Ｉ、好ましくは式Ｉａまたは式Ｉｂのような構造を有する化合物は、この新規に同定されたＩＧＳ５メタロプロテアーゼ酵素を抑制することによるそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用を有してもよいことが考えられうる。
【００７３】
したがって、種々の疾病において、好ましくは高血圧症、腎臓病および心不全における、ＩＧＳ５の組織分布、生理学的機能および病理学的役割を明確にするさらなる試験は、本発明において、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す化合物を用いておこなわれた。
【００７４】
３０人の健康なボランティアを含む二重盲プラセボコントロール臨床試験において、化合物Ｉａ−２が、ｂｉｇ−ＥＴによって誘発された圧力応答を用量依存的に抑制し、かつ、そのＮＥＰ−抑制特性の指標となる、ＡＮＰレベルにおいて明らかに用量に関連する増加を示した。ＥＴ−１レベルは、選択的ＮＥＰインヒビターから期待されるような増加を示すことなく、その一方で、ｂｉｇ−ＥＴレベルは、化合物Ｉａ−２においてプラセボ群と比較して用量依存的に増加し、この場合、これは、ｂｉｇ−ＥＴの分解（breakdown）がさらに抑制されることを示している。ヒトにおける化合物Ｉａ−２の臨床的効果およびその安全性に関する概念を立証するために、６種の臨床試験を、健康なボランティアで行い、かつ、２種の概念的試験を患者についておこなった：一つは、無作為プラセボコントロール二重盲試験を、高血圧症患者（Ｎ＝１９１）について、もう一つはオープンな基線コントロール予備試験を、鬱血性心不全患者（Ｎ＝２９）についておこなった。結果は、化合物Ｉａ−２の経口投与後の、ボランティアおよび患者の双方におけるＡＮＰおよびそのセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの著しく増加しかつ維持された血漿濃度によって、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）の抑制が示された。さらに、鬱血性心不全患者における結果は、化合物Ｉａ−２の投与後に、化合物Ｉａ−１（化合物Ｉａ−２の活性代謝物）のｌｏｇ血漿濃度と、ｂｉｇ−ＥＴ血漿レベルとの間の著しくポジティブな相関を示した（ｐ＜０．００１）。実際に、ｂｉｇ−ＥＴの血漿レベルは、化合物Ｉａ−２の投与後に基準線（２００ｍｇ：４．９〜６．５ｆｍｏｌ／ｍｌ（＋３２．６％）；４００ｍｇ：２．３〜３．５ｆｍｏｌ／ｍｌ（＋５６％））から増加する傾向にあり、経口投与された化合物Ｉａ−２の活性が、ｂｉｇ−ＥＴの切断を妨げるといった概念が支持された。最も重要なことは、化合物Ｉａ−２は、ＷＨＯ基準でＩ〜ＩＩ度の高血圧症を有する患者で、近年行われた４週間に亘っての試験（Ｎ＝１９１）で、顕著かつ臨床的な抗高血圧活性の証拠を最初に明らかにされたものであるということである。治療すべき患者群（Intent-to treat）（ＩＴＴ）で、用量の最も高い試験において（２００ｍｇ  一日二回ｂｉｄ）、プラセボに対するオフィス（office）最低血圧が−６．９ｍｍＨｇ減少し（治療下での最終値；ｐ＜０．００１）、かつプラセボに対するオフィス最高血圧が−９．２ｍｍＨｇ減少した（治療下での最終値；ｐ＝０．００３）。この観察で重要であるのは、純粋なＮＥＰインヒビターが、ＥＴ−１を増加させ、その結果、血圧を減少させるよりむしろ増加させることを示したことであった。
【００７５】
さらなる研究において、鬱血性心不全を有する患者の心臓血流力学パラメータ上においての、化合物Ｉａ−２の用量依存的関係を試験し、さらに、高血圧症患者に対して一日一回の投与後の、抗−高血圧作用の時間経過について試験した。
本発明におけるＩＧＳ５メタロプロテアーゼ
本発明は、ＩＧＳ５ポリペプチド（またはＩＧＳ５酵素またはＩＧＳ５メタロプロテアーゼ、たとえばＩＧＳ５ＰＲＯＴ、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１またはＩＧＳ５ＰＲＯＴ２、それぞれ）、特にヒトＩＧＳ５ポリペプチド（またはヒトＩＧＳ５酵素）に関する。ＩＧＳ５ポリペプチドは、ポリペプチド、特にヒトのポリペプチドに相当し、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択された一つの配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、および特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のＩＧＳ５ポリペプチドを含有するものである。
【００７６】
さらにこのようなポリペプチチドはＩＧＳ５ポリペプチド、特にヒトＩＧＳ５ポリペプチドを含み、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、および特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のＩＧＳ５ポリペプチドを含む。
【００７７】
本発明の他のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の一つを含む配列を含有する単離されたＩＧＳ５ポリペプチドを含む。
【００７８】
本発明のＩＧＳ５ポリペプチドは、ネプリライシンメタロプロテアーゼファミリーのメンバーであり、かつ特にヒトの種類のポリペプチドである。これらは、いくつかの機能不全、障害、疾病が前記で同定されており、かつこれらにおいて、新規に同定されたメタロプロテアーゼが、疾病の病理学において重要な役割を示すことから重要である。
【００７９】
したがって本発明は、ＩＧＳ５ポリペプチドが生物学的に活性のペプチドの代謝において作用していてもよく、かつ特に、このようなＩＧＳ５ポリペプチドが種々の血管作動性ペプチド上で作用しうるメタロプロテアーゼ型の酵素であることが見出された。技術水準から公知の血管作動性ペプチドは、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）、ブラジキニン、ｂｉｇエンドセリン（ｂｉｇ  ＥＴ−１）、エンドセリン（ＥＴ−１）、サブスタンスＰおよびアンジオテンシン−１である。さらに、新規のヒトメタロプロテアーゼであるＩＧＳ５エクトドメインが、効果的に、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記の種々の血管作動性ペプチド、特にｂｉｇ−ＥＴ−１、ブラジキニンおよびサブスタンスＰを加水分解することが見出された。
【００８０】
ＩＧＳ５メタロプロテアーゼ型酵素は、ＥＣＥ／ＮＥＰ−特性を有する酵素に関する抑制活性、たとえばホスホラミドンのような化合物による抑制を測定するために使用される参考化合物によって抑制されてもよい。しかしながら、ＩＧＳ５の抑制は、ＮＥＰを選択的に抑制する参考化合物によっては観察されることがなく、たとえば、チオルファンのような化合物によるＩＧＳ５の抑制は観察されないか、あるいはＥＣＥを選択的に抑制する参考化合物、たとえば、ＳＭ−１９７１２（Sumitomo、前記）のような化合物に関してはＩＧＳ５の抑制は観察されることがなかった。
【００８１】
ＩＧＳ５の抑制は、ＮＥＰ／ＥＣＥを抑制する参考化合物、たとえば、ＮＥＰ／ＥＣＥインヒビターＣＧＳ−３５０６６（DeLombartら、前記）に関してのみ、高い濃度で観察された。本発明のＩＧＳ５メタロプロテアーゼ型酵素の抑制に関するこれらの参考化合物の抑制データは、さらに以下の実施例において記載されている。
【００８２】
本発明のＩＧＳ５ポリペプチドは、任意の適した方法で製造することができる。このようなポリペプチドは、天然由来のポリペプチド、組み換え技術によって製造されたポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの方法を組み合わせることによって製造されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを製造するための方法は、当業者に公知である。したがって、実施例におけるＩＧＳ５メタロプロテアーゼは、特に、同時係属出願である国際出願ＰＣＴ／ＥＰ００／１１５３２記載の方法によって製造することができ、この場合、これは、そのすべての内容に関して、特に、ヒトＩＧＳ５遺伝子の相同性クローニングおよび相当するヒトＩＧＳ５タンパク質の発現に関して、参考のためにのみ本明細書中に示されている。
【００８３】
さらに、前記ＩＧＳ５メタロプロテアーゼをコードするＩＧＳ５ポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技術を用いて、ヒト精巣組織の細胞におけるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、発現シークエンスｔａｇ（ＥＳＴ）分析を用いて得ることができる（Adams, M.D., et al. Science (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D. et al., Nature, (1992) 355: 632-634; Adams, M.D., et al., Nature (1995) 377 Supp:3-174）。さらにＩＧＳ５ポリペプチドは、たとえばゲノミックＤＮＡライブラリーのような天然源のものから得ることができるか、あるいは公知の方法および市販の技術を用いて合成することができる（たとえば、F.M. Ausubel et al., 2000, Current Protocols in Molecular Biology）。
【００８４】
ＩＧＳ５ポリヌクレオチドが、ＩＧＳ５ポリペプチドの組み換え製造のために使用される場合には、ポリヌクレオチドは、それ自身が、成熟ポリペプチドのコーディング配列を含んでいるか、あるいは、他のコーディング配列を含むリーディングフレーム中で成熟ポリペプチドのためのコーディング配列を含んでいてもよく、たとえば、これらをコードするリーダー配列または分泌配列、プレ−、プロ−、またはプレプロ−タンパク質配列であるか、あるいは他の融合ペプチド部分を含む。たとえば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列がコードされてもよい。たとえば、マーカー配列は、好ましくはヘキサ−ヒスチジンペプチドであってもよく、この場合、これはｐＱＥベクター中に提供され（Qiagen, Inc.）、かつＧｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）で記載されているか、あるいはＨＡ  ｔａｇであってもよい。さらにポリヌクレオチドが非コーディング５’および３’配列を含んでいてもよく、たとえば、転写、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボゾーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含んでいてもよい。配列番号１、配列番号３または配列番号５の一つに含まれるヌクレオチド配列と同一または十分に同一であるＩＧＳ５ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノミックＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとしてか、あるいは核酸増幅反応（ＰＣＲ）のためのプライマーとして、全長ｃＤＮＡｓおよびＩＧＳ５ポリペプチドをコードするゲノミッククローンを単離し、かつ、配列番号１、配列番号３および配列番号５の一つと、高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノミッククローンを単離するために使用されてもよい（ヒト由来のパラログ、およびヒト以外の種に由来するオルトログおよびパラログをコードする遺伝子を含む）。典型的に、これらのヌクレオチド配列は、指示されるものに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、および特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。プローブまたはプライマーは、一般には少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含有していてもよく、かつ、少なくとも５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプライマーは、２０〜２５個のヌクレオチドを有していてもよい。
【００８５】
ＩＧＳ５ポリヌクレオチドをコードするＩＧＳ５ポリペプチド、特にヒトＩＧＳ５ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５、あるいはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニング工程、および前記ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノミッククローンを単離する工程を含む方法によって得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に公知である。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）および２０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩に亘ってインキュベートし、その後に、０．１ｘＳＳＣ中で、約６５℃でフィルターを洗浄することによっておこなった。したがって、ＩＧＳ５ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５、またはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得られてもよい。
【００８６】
当業者は、多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域が、ｃＤＮＡの５’末端で短く切断されているために、単離されたｃＤＮＡ配列が不完全であろうことを認識している。これは、固有の低い“プロセシング能力（重合反応中において、テンプレートに対して結合し続ける酵素能力の尺度）”を有する酵素である逆転写酵素によるものであり、第１ストランドのｃＤＮＡ合成の間において、ｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完全にすることができないためである。考えられうる当業者に公知の、完全長ｃＤＮＡを得るか、あるいは短いｃＤＮＡｓを伸長させるためのいくつかの方法、たとえば、ｃＤＮＡ末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）（たとえば、Frohmenら、 PNAS USA 85, 8998-9002, 1988 参照）に基づく方法がある。この技術の最近の変法は、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＴＭ技術によって例証されており（Clontech Laboratories Inc.）、より長いｃＤＮＡｓをサーチするためにかなり簡略化されている。このＭａｒａｔｈｏｎ  ＴＭ技術において、ｃＤＮＡは、選択組織から抽出されたｍＲＮＡと、それぞれの末端に結合された“アダプター配列”とから製造された。その後に核酸増幅法（ＰＣＲ）は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーとの組合せ物を使用することによって、ｃＤＮＡの５’末端の“欠損（missing）”の増幅を実施する。その後にＰＣＲ反応は、増幅産物の範囲内でアニールするようにデザインされた“ネストされた”プライマーを用いて反復させた（典型的に、アダプター配列の他の３’をアニーリングするアダプター特異的プライマーと公知の遺伝子配列中の他の５’をアニーリングする遺伝子特異的プライマーである）。この反応産物はその後に、ＤＮＡシークエンシングによって分析されてもよく、かつ完全な配列を得るために、産物を直接的に存在するｃＤＮＡに結合させるか、あるいは、５’プライマーのデザインに関する新規の配列情報を用いて、別個の完全長ＰＣＲを行うことによって、完全長ｃＤＮＡを構築した。
【００８７】
組み換えＩＧＳ５ポリペプチドは、発現系を有する遺伝子技術によって製造されたホスト細胞から、公知方法で製造されてもよく、この場合、この発現系は、１個または複数個のＩＧＳ５ポリヌクレオチドを含有する。このような発現系を用いて遺伝子技術によって製造されたホスト細胞は、組換え技術によってＩＧＳ５ポリペプチドを製造するために使用することができる。さらに、無細胞翻訳系は、このようなＩＧＳ５タンパク質を、ＩＧＳ５ＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡｓを用いて製造するために使用することができる。ＩＧＳ５ポリヌクレオチドのホスト細胞への導入は、多くの標準的な実験用マニュアルで記載された方法、たとえばＤａｖｉｓらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）で実施することができる。このような方法は、たとえば、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、カチオン脂質−介在型トランスフェクション法、エレクトロポレーション方法、トランスダクション法、スクラップローディング法（scrape loading）、衝撃導入法（ballistic introduction）またはインフェクション法である。適切なホストの典型的な例は、細菌細胞、たとえば、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、Ｅ．Ｃｏｌｉ、ストレプトミセスおよびバチルススブチリス細胞；酵母菌、たとえばイースト菌およびアスペルギルス細胞；昆虫細胞、たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞、動物細胞、たとえばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ，ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｓメラノーマ細胞、および植物細胞である。
【００８８】
極めて多様の発現系は、たとえば、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入要素、イースト染色体要素、ウイルス、たとえばバキュロウイルス、パボラウイルス、たとえばＳＶ４０、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびこれら組合せ物からのベクター、たとえば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的要素から誘導されたベクター、たとえばコスミドおよびファージミドであってもよい。発現系は、発現を調節ならびに発生させるコントロール領域を含んでいてもよい。一般には、ポリペプチドを製造するポリヌクレオチドをホスト中で保持、伝播または発現させる能力を有する任意の系またはベクターを使用してもよい。適したヌクレオチド配列は、任意の種々の公知および通常の技術によって、発現系中に挿入することができ、この場合、これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（前記）に記載されている。適切な分泌シグナルは、好ましいポリペプチド中に混合され、小胞体腔、細胞周辺腔または細胞外環境に、翻訳タンパク質を分泌する。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内在性のものであるか、あるいは、たとえば異なる種由来の異種シグナルであってもよい。
【００８９】
ポリペプチドを、スクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合には、一般には、ＩＧＳ５ポリペプチドを、細胞表面上でか、または可溶性タンパク質の形で製造することができる。ＩＧＳ５ポリペプチドが、媒体中に分泌される場合には、媒体はＩＧＳ５ポリペプチドを捕集および精製するために回収することができる。細胞内で製造する場合には、細胞は、最初に、ＩＧＳ５ポリペプチドを捕集する前に溶解させなければならない。ＩＧＳ５ポリペプチドが、細胞表面と結合する（膜結合ポリペプチド）場合には、通常は膜画分が、膜結合ＩＧＳ５ポリペプチドを蓄積させるために製造される。ＩＧＳ５ポリペプチドは捕集され、かつ、硫酸アンモニウム沈殿法またはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水干渉クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組み換え細胞カルチャーから精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製のために使用する。タンパク質を再生するための公知の方法は、ポリペプチドが、細胞内合成、単離および／または精製中で変性される場合には、活性のコンフォメーションを再生するために使用されてもよい。
【００９０】
ＩＧＳ５ポリペプチドを製造するために使用される、単離されたＩＧＳ５ポリヌクレオチド、特に単離されたヒトＩＧＳ５ポリヌクレオチドは、通常、全コーディング領域上で、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたポリペプチドの１種をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。これに関連して、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが好ましいが、さらに少なくとも９８〜９９％の同一性を有するポリヌクレオチドがより好ましく、かつ少なくとも９９％、特に９９．９％の同一性を有するポリヌクレオチドは勿論好ましい。たとえば、このような単離された、特にＩＧＳ５ポリペプチドを製造するために使用されてもよいヒトＩＧＳ５ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、完全長で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。これに関連して、配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＩＧＳ５ポリヌクレオチドが好ましく、さらに少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものが特に好ましく、かつ少なくとも９９％、特異９９．９％の同一性を有するものが最も好ましい。配列番号１のＩＧＳ５ポリヌクレオチド配列（“ＩＧＳ５ＤＮＡ”と呼称される）は、第１表に示されており、この場合、これらは、長さ２０７６ヌクレオチドを有するヒト由来（ホモサピエンス）のｃＤＮＡ配列を示しており、かつ、第２表に示された配列番号２のポリペプチド（“ＩＧＳ５ＰＲＯＴ”と呼称される）である、６９１アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列（１〜２０７３のヌクレオチド）を含む。配列番号３のヌクレオチド配列（“ＩＧＳ５ＤＮＡ１”と呼称される）は、第３表に示されており、この場合、これは、長さ２３４０ヌクレオチド（停止コドン  ｔａｇを含む）を有するヒト由来（ホモサピエンス）のｃＤＮＡ配列を示し、かつ第４表に示された配列番号４のポリペプチド（“ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１”と呼称される）である、７７９アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列（ヌクレオチド１〜２３３７）を含む。配列番号５のヌクレオチド配列（“ＩＧＳ５ＤＮＡ２”と呼称される）は、第５表に示されており、この場合、これは、長さ２２６２ヌクレオチド（停止コドン  ｔａｇを含む）を有するヒト（ホモサピエンス）由来のｃＤＮＡ配列を示し、かつ、第６表に示された配列番号６のポリペプチド（“ＩＧＳ５ＰＲＯＴ２”と呼称される）である、７５３アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列（ヌクレオチド１〜２２５９）を含む。
新規の治療的概念として組み合わされたか、または同時に生じる選択的ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制活性を有する化合物
本発明は、ＩＧＳ５メタロプロテアーゼと、少なくとも１個の他のメタロプロテアーゼ、たとえば、特にＮＥＰ、さらに場合によってはＥＣＥ／ＡＣＥとの組合せ物が、前記に示された疾病に関する１種またはそれ以上の生物学的機能に対して応答性であることを見出した。したがって、最も広範囲の態様において、本発明は、前記疾病を治療するための新規治療概念を提供するものであって、この場合、これは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）およびメタロプロテアーゼＩＧＳ５上での、組み合わされたかまたは同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物または生分解可能なエステルについて、ＮＥＰとＩＧＳ５とを組み合わせて、または同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するために使用することを、初めて示唆するものである。
【００９１】
ＩＧＳメタロプロテアーゼおよびＮＥＰの機能を同時に抑制する、本発明による有用な化合物は、ＩＧＳ５メタロプロテアーゼ、および場合によってはＮＥＰを用いてのスクリーニング方法によって、適切な酵素阻害アッセイ法において同定されてもよい。このような酵素阻害アッセイ法は、詳細には、以下の実施例において記載されている。組み合わされたかまたは同時の選択的ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制活性を有する化合物を同定するために、候補化合物を、別々に、ＮＥＰ−抑制アッセイおよびＩＧＳ５−抑制アッセイの双方において試験することができる。ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制化合物は、種々の源、たとえば、細胞、無細胞調製物、ケミカルライブラリー、および天然産物混合物から同定することができる。
【００９２】
スクリーニング方法は、細胞媒体上に放出したポリペプチドの活性上であるか、あるいはポリペプチドを有する細胞または膜上での候補化合物の作用を簡単に測定することができる。二者択一的に、スクリーニング方法は、競合相手を用いての競合スクリーニングを含むものであってもよい。さらに、これらのスクリーニング方法は、候補化合物が、ポリペプチドの活性または抑制によって生成されたシグナルを生じるかどうかについて、細胞媒体中に放出されたポリペプチドの活性またはポリペプチドを有する細胞または膜に適した検出系を用いて試験することができる。ポリペプチド活性の抑制は、一般には、公知の基質の存在下でアッセイされ、かつ候補化合物の作用を、変更された活性によって、たとえば、候補化合物がポリペプチドの抑制を生じるかどうかについて試験することによって観察した。たとえば、スクリーニング方法は、簡単には、候補化合物、本発明において重要とされるポリペプチドを含有する溶液、さらには適した基質を混合することで混合物を形成し、混合物中のポリペプチド活性を測定し、かつ、混合物のポリペプチド活性と、候補化合物を含まないスタンダードとを比較する工程を含んでいてもよい。
【００９３】
さらに、本発明は、当業者によって化合物、たとえば、候補化合物を、本発明によって見出されたものを含むスクリーニング方法を用いて同定することを可能にし、この場合、前記化合物は、特に、前記に示された機能不全、障害または疾病に期待される薬剤候補物として示されてもよい。当業者によれば、さらにＩＧＳメタロプロテアーゼが、ＩＧＳ５抑制化合物の構造に基づくデザインのための方法において、使用されてもよいことが容易に認識され、この場合、この方法は、
（ａ）まず、ＩＧＳ５メタロプロテアーゼの三次元的構造を測定または使用し、
（ｂ）ＩＧＳ５インヒビターの１個または複数個の考えられうる反応部位かまたは結合部位に関する三次元構造を導きだし、
（ｃ）導き出された結合部位または反応部位と結合または反応することが予想される候補化合物を合成し、かつ、
（ｄ）候補化合物がさらにＩＧＳ５インヒビターであるかどうかについて試験する。さらに、これは通常反復工程であってもよいとみなされる。
【００９４】
今日において、当業者であれば、有効な生理学的性質または薬理学的性質を試験すべき価値を有する新規物質または化合物を製造するために、有機合成の計画および実施のための近代的な戦略をよくこころえており、このような化合物は、特定の機能不全、障害または疾病の治療および／または予防のための期待される新規薬剤候補物として立証されることが期待される。したがって、今日においては、コンビナトリーケミストリー、たとえば、一般的かつ“直接的な”薬剤または化合物ライブラリーを用いて、化合物ライブラリーを提供することが一般的であり、この場合、このファルマコフォアの構造および多様性および残基または置換基は当業者に公知である。未知の構造を有するケミカルライブラリーまたは化合物ライブラリーが、スクリーニングアッセイにおいて試験される場合には、それにもかかわらず、有効性が期待される化合物、たとえば候補化合物を、今日において確立されている分析手段、たとえば質量分光分析、核磁気共鳴、赤外分光、融点、キラル化合物が含まれる場合にはその旋光性および元素分析によって、その構造および化学的性質について簡単に分析することができる。
【００９５】
したがって、本発明は、ＩＧＳ５ポリペプチドを抑制する能力を有する定義された化学構造を有する候補化合物を製造するための方法に関し、この場合、この方法は、化合物、その製薬学的に認容性の塩、またはその生物的不安定性エステルを、化学合成によって製造することを含み、この場合、ＩＧＳ５ポリペプチドを抑制するための化合物の活性は、たとえば、本発明の実施例部分で記載されているようなスクリーニング方法によって同定することが可能である。
【００９６】
たとえば、化学有機合成の詳細、および、化学的、分析的および物理的方法に関してのその詳細は、“Houben-Weyl”（Houben-Weyl, “Methoden der Organischen Chemie”, Georf Thieme Verlag, Stuttgart, New York）ハンドブック最新版に記載されている。
【００９７】
本発明の１個の実施態様は、前記に示されたような式Ｉの化合物、およびその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルを、
ａ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）と、
ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼＩＧＳ５とを、
組み合わせてかまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬（医薬品組成物）を製造するために使用することに関する。
【００９８】
本発明の好ましい実施態様は、
ａ）中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）上および、
ｂ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼＩＧＳ５上での、組み合わされたかまた同時の抑制活性を有する、本発明による化合物、特に式Ｉを有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生分解生エステルを、大型哺乳類、好ましくはヒトにおいて、高血圧症の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および／または予防するための医薬（医薬品組成物）を製造するために使用することに関する。
【００９９】
式Ｉの化合物は、式Ｉａの化合物に関して適した、米国特許第５６７７２９７号明細書の開示、および式Ｉｂの化合物に関して適した米国特許第５９５２３２７号明細書の開示にしたがって製造することができる。
ドラックデザインおよびリード構造の最適化における、タンパク質−リガンド複合体
他の態様において、本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号５のポリペプチドの一つに対して、少なくとも７０％の同一性を有するＩＧＳ５ポリペプチドを含有するタンパク質−リガンド−複合体、およびＩＧＳ−化合物、好ましくは、少なくとも式Ｉの化合物またはこれに匹敵するＩＧＳ５抑制活性を有する化合物に関する。このようなタンパク質−リガンド−複合体は、特に、ドラックデザイン法、リード構造の発見、リード構造の最適化および修飾方法において特に有用である。これらの方法は、当業者に公知である。たとえばコンビナトリー合成および多次元ＮＭＲ−スペクトルは文献に記載されており、かつ、これはタンパク質−リガンド−相互作用を認識するのに役立つ（Kressler, Angew. Chem. 1997, 109,857-859；James K. Chen et al., Angew. Chem. 107(1995), S. 1041-1058）。さらに、ドラックデザインにおけるツールとしての分子錯体のＮＭＲ試験は、Ｆｅｓｉｋ（Journal of Medicinal Chemistry, 34 (1991), S.2937-2945）によって記載されており、かつ、ドラックデザインにおける手段として酵素／インヒビター複合体の構造を測定するためのＮＭＲ方法もＦｅｓｉｋらによって示されてる（Biochemical Pharｍacology 40 (1990), S. 161-167）。Ｒｏｓｓらの極めて最新の報告（Journal of Biomolecular NMR, 16:139-146 (2000)）によれば、ＮＭＲ測定の自動化および標的タンパク質、たとえばレセプターを有する小さい分子の体系的スクリーニング相互作用に関するデータの評価が記載されている。
【０１００】
したがって、さらに本発明は、配列番号２、配列番号４および配列番号６のポリペプチドの一つに対して、少なくとも７０％の同一性を有するＩＧＳ５ポリペプチドと、ＩＧＳ５結合活性およびＩＧＳ５抑制活性を有するリード構造のデザインおよび修飾または最適化のためのＩＧＳ５結合化合物とを含有するタンパク質−リガンド−複合体の使用に関する。
併用療法（ＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制化合物およびＥＣＥ／ＡＣＥ−抑制化合物）
すでに前記に簡単に示したように、本発明による、組み合わせたかまたは同時に生じるＮＥＰ／ＩＧＳ抑制活性を示す化合物、たとえば、式Ｉの化合物、好ましくは式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物と、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の、別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼ活性を有する化合物とを、付加的に組み合わせることは有利である。組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する前記化合物との組合せにおいて使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ＡＣＥインヒビター、たとえば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり、さらに、選択的ＥＣＥインヒビター、たとえば、化合物ＳＭ−１９７１２（Sumitomo前記）；選択的ＮＥＰインヒビター、たとえば、チオファン、ＮＥＰ／ＥＣＥの二重インヒビター、たとえば化合物ＣＧＳ−３５０６６（De Lombart et al., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504）；またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえばオマパトリエートまたはサンパトリエートである。組み合わされた治療および／または予防のこの型によって、組み合わされたかまたは同時に生じるＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する化合物の治療的価値はさらに増加してもよく、特にこれは、前記疾病および／または症状に関するものである。したがって、本発明の他の態様において、併用治療および／または併用予防に関連する。併用治療および／または予防のこの型によって、組み合わせたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する前記化合物、特に式Ｉを有する化合物、好ましくは式ＩａまたはＩｂを有する化合物の治療的価値は、特に、前記に示された疾病および／または症状に関してさらに増加する。
【０１０１】
したがって、これに関連して、本発明は、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示す第一化合物、または製薬学的に認容性の塩または溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関するが、本発明に関しては前記に記載したように、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも一つの付加的な化合物との組合せ物で、本発明に関連して、前記に示されたような任意の疾病または症状の組み合わされた治療および／または予防のための医薬品（医薬品組成物）の製造のために使用することができる。この場合、前記の付加的な化合物は、好ましくはＡＣＥインヒビター、選択的ＥＣＥインヒビター、選択的ＮＥＰインヒビター、ＮＥＰ／ＥＣＥの二重のインヒビターおよびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、前記の付加的な化合物の少なくとも１個との組合せにおいて、前記の第一化合物の本発明による使用は、第一化合物において、化合物が式Ｉの構造、好ましくは式ＩａまたはＩｂの構造を有する化合物であり、その際、これらの式は、本発明において前記に示されたものである。好ましくは、前記第一化合物と、少なくとも１個の前記付加的な化合物との組合せにおける使用は、さらに、組合せ物が、同時に効果的であり、好ましくは、相乗的に効果的であることを特徴とする。
【０１０２】
さらに、これに関して本発明は、前記に示された任意の疾病または症状の組み合わされた治療および／または組み合わされた予防のために、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記に示したように組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制を有する第一化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個および／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された少なくとも１個の付加的な化合物とを含有する医薬品組成物（医薬）に関し、その際、付加的な化合物は、好ましくは、ＡＣＥインヒビター、選択的ＥＣＥインヒビター、選択的ＮＥＰインヒビター、ＮＥＰ／ＥＣＥの二重のインヒビター、およびこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、本発明による医薬品組成物は、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記第一化合物と少なくとも１個の前記付加的化合物とを含有し、この場合、これらは、本発明に関して前記に示したように、第一化合物が、式Ｉの構造、好ましくは式Ｉａまたは式Ｉｂの構造を有することを特徴とする。
【０１０３】
本発明による併用治療および／または併用予防が、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を有する第一化合物またはその製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたＮＥＰ／ＩＧＳ５インヒビター以外の他の別個かおよび／または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された付加的な化合物とを、同時に、第一化合物および第二化合物に関して、単一の医薬品組合せ製剤または別個の医薬品組成物として投与するか、別個に、たとえば、連続的または順次であってもよい投与計画または体系によってか、あるいは患者の緩和および／または予防すべき疾病または症状に適しているかどうかをみながら段階的に、このような治療および／または予防を必要とする患者に投与することによって達成することができることは当業者にとっては自明である。
配合および投与
前記のように本発明は、組み合わされたかまたは同時の選択的ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制化合物、場合によっては、別個のＡＣＥ−および／またはＥＣＥ−抑制化合物との組み合わせ物、またはこれらそれぞれの製薬学的に認容性の塩、溶媒和物または生物的不安定性エステルが、有利な治療的活性を有することを示した。したがって、これらの化合物、場合によっては別個のＡＣＥ−および／またはＥＣＥ−インヒビターとの組合せ物は、大型哺乳類、特にヒトにおいて、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および／または予防するための医薬として適している。ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制化合物、場合によっては別個のＡＣＥ−および／またはＥＣＥ−抑制化合物との組み合わせ物は、すべての公知の投与経路で投与されてもよい。
【０１０４】
組成物は、投与経路に関して適用されてもよく、特に、全身的であるかまたは経口経路によるものである。全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を含む。他の注入経路、たとえば座薬、筋注または皮下注射が使用されてもよい。二者択一的な全身投与のための手段は、粘膜吸収および経皮吸収投与を包含し、この場合、これらは、浸透剤、たとえば胆汁酸塩またはフシジン酸塩または他のデタージェントを含む。さらに、化合物は、腸溶製剤またはカプセル化剤の形で処方されてもよく、さらに経口投与も可能であってもよい。このような化合物の投与はさらに、局所的および／または局在的に、軟膏、ペースト、ゲル等の形であってもよい。
【０１０５】
本発明による投与に関して、本発明において前記に示された疾病または症状を、緩和するかおよび／または予防する、ＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制化合物の治療的活性量は、通常の製薬学的助剤および／または添加剤を、固体または液体の製薬学的処方において包含することができる。
【０１０６】
固体の投与形の例は、たとえば固体、半固体、凍結乾燥粉末、タブレット、被覆タブレット、ピル、カプセル、粉末、顆粒または坐剤であってもよく、さらに、持効性製剤の形であってもよい。このような固体の投与形は、標準的な製薬学的無機および／または有機助剤を含有していてもよい。このような助剤は、製薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、硫酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、さらに常用の製薬学的添加剤、たとえば、充填剤、潤滑剤またはタブレット崩壊剤を含む。液体製剤、たとえば活性成分の溶液、懸濁液または乳液は、通常の希釈剤、たとえば水、油および／または懸濁剤、たとえばポリエチレングリコール等を含有していてもよい、他の添加剤、たとえば保存剤、矯味剤等をさらに添加してもよい。
【０１０７】
活性成分は、公知の方法で、製薬学的助剤および／または添加剤と一緒に混合してもよいかまたは配合してもよい。固体の投与形態の製造に関して、たとえば、活性成分は、助剤および／または添加剤と一緒に混合されてもよく、かつ、ウェットまたはドライの工程で造粒されてもよい。顆粒または粉末は、直接的にカプセル中に装填されてもよいか、あるいは、タブレットコアの形に圧縮されてもよい。好ましい場合には、これらは公知の方法で被覆されてもよい。
【０１０８】
液体製剤は、化合物および場合によっては製薬学的アジュバントを、キャリアー、たとえば塩水溶液、水性デキストロースまたはエタノール中に溶解するかまたは分散することによって製造することで、溶液または懸濁液を形成することができる。
【０１０９】
投与すべき用量は、固体間で、かつ勿論、治療すべき症状の型およぶ投与経路に依存して異なっていてもよい。たとえば、局所的に適用可能な製剤、注入可能な製剤は、一般には、本質的に全身適応の製剤よりも低い活性物質の量を含む。このようにして、要求される用量範囲は、特に、化合物の選択、投与経路、処方の性質および患者の症状の点で担当の医師の判断にゆだねるものである。しかしながら、適した用量の範囲は、患者当たり０．１〜１００μｇ／ｋｇである。しかしながら、必要とされる投与量の広範囲の多様性は、化合物の種々の利用可能性および種々の投与経路の異なる効率の点で、予想されるものである。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量における差異は、最適化のための標準的経験によってかまたは同様に技術水準において調整することができる。
ＩＧＳ５ＤＮＡおよびＩＧＳ５タンパク質配列を含む表
【０１１０】
【表１】
2004536063.tif 000006
【０１１１】
【表２】
2004536063.tif 000007
【０１１２】
【表３】
2004536063.tif 000008
【０１１３】
【表４】
2004536063.tif 000009
【０１１４】
【表５】
2004536063.tif 000010
【０１１５】
【表６】
2004536063.tif 000011
【０１１６】
本明細書中で引用された、特許および特許出願に制限することのないすべての刊行物は、ここでは参考のためにのみ記載されているものである。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例証するものであって、いずれの場合であっても、本発明の範囲を制限するものではない。
例１  ネプリライシン  ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーの新規メンバーをコードするｃＤＮＡのクローニング
例１ａ  ＩＧＳ５のｃＤＮＡコーディング配列の相同性クローニングの概略
Ｍ１３サブファミリーのメタロプロテアーゼは、種々の神経ペプチドおよびホルモンペプチドの代謝において含まれる。現在において、このサブファミリーは、ネプリライシン（ＮＥＰ）、エンドセリン−変換酵素−１（ＥＣＥ−１）、ＥＣＥ−２、Ｋｅｌｌ、ＰｅｘおよびＸＣＥを含む。
【０１１８】
ＮＥＰおよびＥＣＥのインヒビターは、たとえば、心臓および胃腸における治療的使用のために開発されてきたものである。このファミリーの付加的なメンバーは、重要な薬剤の標的であってもよいことから、相同性クローニングを、ヒトゲノム中で新規の遺伝子を同定するために使用した。
【０１１９】
ＩＧＳ５の相同性クローニングは、前記に示された一般的な記載および本明細書中で参考のために記載されている国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／１１５３２の実施例の部分においてさらに例証されている試験データによって実施された。方法は以下の通りである。
【０１２０】
発現配列ｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）のデータバンクにおいて、配列は、ＮＥＰ／ＥＣＥ−様のメタロプロテアーゼのＣ−末端部との類似を示す小さいオープンリーディングフレームを含んでいることが検出された。これらのＥＳＴ配列およびＮＥＰ／ＥＣＥ−様メタロプロテアーゼの保存的ペプチドモティーフに基づいて、我々は、ヒトの肺、心臓および精巣ｃＤＮＡから完全なｃＤＮＡ配列をクローニングするための変性ＰＣＲを使用した。
【０１２１】
ｃＤＮＡ配列はグリコシル化タンパク質、すなわちＩＧＳ５か、あるいは、二者択一的なヒト可溶性エンドペプチダーゼ（ｈＳＥＰ）をコードし、この場合、これは、Ｍ１３ファミリーメンバーの特徴を示している。ＩＧＳ５は、マウスＳＥＰ（７８％）、マウス、ラットおよびヒトＮＥＰ（５４％）およびヒトＥＣＥ−１（３９％）に対して高いアミノ酸配列の同一性を示した。マウスＳＥＰおよびＳＥＰ△スプライシング変異体との類似性において、さらに、７８ｂｐで二者択一的なエキソンで異なる２種のＩＧＳ５スプライシングの型が検出された。これらのスプライシング型は、それぞれ、タンパク質の７５３および７７９残基をコードする。より長い型は、膜内外アンカーと近接して配置された推定タンパク質分解部位を含む。したがって、２種のスプライシング変異体は、ＩＧＳ５タンパク質の膜結合および可溶性の形を示す。
【０１２２】
多重組織ドットブロット分析（multiple tissue dot blot analysis）および定量的ＰＣＲを用いての発現分析は、種々のヒト組織中で、精巣中で観察された最も強いシグナルでの発現を示した。さらに、ＩＧＳ５ｍＲＮＡ発現は、たとえば、前立腺、小腸、胃、結腸、腎臓および脳で観察された。２種のスプライシング変異体は、顕著な発現パターンを示した。
【０１２３】
機能的特徴については、この酵素が、ネプリライシンファミリーの真性メンバーであり、かつＥＣＥ活性を有することが確認された。
例１ｂ．ＮＥＰ／ＥＣＥ  メタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含むＩＧＳ５のアライメント
オリジナルとしてクローニングされたＩＧＳ５に関して（実施例１参照）、最新のタンパク質データバンクおよび翻訳ＤＮＡデータバンクのホモロジーサーチは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて実施された（Altschul S.F. et al. ［1997］, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）。これらのサーチは、オリジナルとして得られたＩＧＳ５タンパク質が、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼに対して最も類似していることを示した（ＳＷ：ＮＥＰ＿MOUSE 寄託番号Ｑ６１３９１；ＳＷ：ＮＥＰ＿ＲＡＴ、寄託番号Ｐ０７８６１およびＳＷ：ＮＥＰ＿ＨＵＭＡＮ、寄託番号Ｐ０８４７３）。したがって、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの他のメンバーを含むほぼ完全なＩＧＳ５タンパク質配列のこのアライメントは、一般にはＩＧＳ５とメタロプロテアーゼとの関連性を示し、特に、ＮＥＰおよび／またはＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーとの関連性を示した。この構造的アライメントから、ＩＧＳ５が、メタロプロテアーゼの機能を有していると考えられ、したがって、これらは、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要である。
例１ｃ．ＩＧＳ５の完全長コーディング配列を含むｃＤＮＡフラグメントのクローニング
付加的なＩＧＳ５ｃＤＮＡ配列を得るために、ＲＴ−ＰＣＲの他のラウンドを、ヒト肺ＲＮＡ上で、前記条件下で、ＩＧＳ５特異的リバースプライマーを用いておこなった。得られるコンティグは、“ＡＴＧ”開始コドンで開始し、かつ、マウスＳＥＰタンパク質のＮ−末端配列と高い類似性を示すタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。
【０１２４】
すべての単離されたクローンのＤＮＡ配列のアセンブリは、２種のｃＤＮＡ配列の存在を示し、この場合、これらは、ゲノミッククローンＩＧＳ５／Ｓ１の範囲内で最初に同定された、７８ｂｐセグメントの有無によって異なっていた。これらの２種の配列は同様に、二者択一的なスプライシングＲＮＡ分子に由来するものである。最も長いトランスクリプトは、２３３７ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み（７７９残基のタンパク質をコードする）、その一方で、最も短いトランスクリプトは、２２５９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有している（７５３残基のタンパク質をコードする）。コーディング配列および長鎖のタンパク質配列は、ＩＧＳ５ＤＮＡ１（配列番号３で示され、停止コドンｔａｇを含む２３４０ｂｐ）およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ１（配列番号４）としてそれぞれ呼称され、その一方で、短鎖のコーディング配列およびタンパク質配列は、ＩＧＳ５ＤＮＡ２（配列番号５；停止コドンｔａｇを含む２２６２ｂｐ）およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２（配列番号６）と、それぞれ呼称される。ＩＧＳ５ＤＮＡ１およびＩＧＳ５ＤＮＡ２の範囲内で仮定されるメチオニン開始コドンの下流には、付加的なインフレームメチオニンコドンが、コドン位置１０で存在する。開始コドンとしての第１メチオニンコドンに関しては、コドン位置１０でいくつかの翻訳を開始（またはさらには排他的に）を排除することができないが、それというのも双方のメチオニンが、翻訳内容の同等に好ましい “Ｋｏｚａｋ”開始の範囲内で生じるためである（Koza M., Gene ［1999］:234:187-208）。ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２配列のハイドロパシー分析（Kyte J. et al., J. Mol. Biol. ［1982］157:105-132; Klein P et al., Biochem. Biophys. Acta ［1985］815: 468-476）は、残基２２〜５０の間のシングルトランスメンブレンドメインの存在を示した。これは、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２が、タイプＩＩの一体型膜タンパク質であることを示し、かつこれによって、ＮＥＰ／ＥＣＥタンパク質ファミリーの他のメンバーとの膜トポロジー類似性を有する。
例１ｃ．ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含む、例１ｃのＩＧＳ５タンパク質配列のアライメント
例１ｃでクローニングされたＩＧＳ５に関して、今日のタンパク質データバンクおよび翻訳されたＤＮＡデータバンクのホモロジーサーチを、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて実施した（Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. ［1997］25:3389-3402）。これらのサーチは、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１がマウスＳＥＰと最も類似しており（７７８の配列された残基上での７６％の同一性）（GenBank 寄託番号ＡＦ１５７１０５）、さらには、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼ（ＳＷ：ＮＥＰ＿MOUSE 寄託番号Ｑ６１３９１；ＳＷ：ＮＥＰ＿ＲＡＴ、寄託番号Ｐ０７８６１およびＳＷ：ＮＥＰ＿ＨＵＭＡＮ、寄託番号Ｐ０８４７３）に対する６９６の配列された残基上で、５４〜５５％の同一性を示した。ＩＧＳ５ＰＲＯＴ２のホモロジーサーチは、この配列が、マウスＳＥＰΔ（GenBank 配列番号ＡＦ１５７１０６）に対して最も類似していることを示した（７５２配列残基上の７８％の同一性）。マウスＳＥＰおよびＳＥＰΔタンパク質との類似において、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２が、ＩＧＳ５タンパク質の可溶性形態および膜結合形態をそれぞれ示すことが予想された。これは、二者択一的なスプライシング７８ｂｐエキソンの３’末端でコードされた二塩基性残基（ＫＲＫ）の存在によって確立された。
【０１２５】
したがって、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの他のメンバーを含む完全なＩＧＳ５タンパク質配列のこのアライメントは、一般に、ＩＧＳ５とＮＥＰ／ＥＣＥ／メタロプロテアーゼとの関連性、特に、ＳＥＰとＮＥＰファミリーメンバーとの関連性を示す。この構造的アライメントから、ＩＧＳ５タンパク質が、メタロプロテアーゼの機能を有しており、これによって、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要であることが推測された。
【０１２６】
例２．ヒトＩＧＳ５の可溶性ＨＩＳ−ｔａｇエクトドメインの発現および精製
試験の目的は、バキュロウイルス発現系を用いて、可溶性ＩＧＳ５タンパク質を製造することである。組み換えバキュロウイルスは、Ｓｆ９細胞系の感染を用いて、Ｈｉｓ６−ｔａｇＩＧＳ５エクトドメインの発現を構築する。その後に、可溶性ＩＧＳ５タンパク質は、培養上清から、レンチル−レクチンおよびＺｎ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーを含む２段階工程で精製され、かつ、Ｈｉｓ６−ＥＣＥ−１に関する技術水準でおこなった。
例２ａ．試験方法
キネティック発現分析
１０％の不活化ウシ胎児血清を含むＴＣ１００培地（JRH Bioscience キット番号10084168）中で、２７℃で、撹拌フラスコ中の懸濁液中で指数的に増殖させた５１９細胞（IGCL 83.0）を、低速の遠心分離によって捕集し、かつ、血清不含のＴＣ１００培地中で、５ｘ１０５細胞／Ｆｋ（２５ｃｍ２）で、血清不含のＴＣ１００媒体中に接種した。候補となる組み換えウイルスクローンを、３ｐｆｕ／細胞の多重感染（ＭＯＩ）で添加し、その後に、細胞／ウイルスを、２７℃でインキュベートした、細胞および調製培地（ＣＭ）を、２回に亘っての連続的な低速遠心分離によって、感染の２４、４８および７２時間後にハーベストした。試料をＳＤＳ  ＰＡＧＥによるゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによって分析した。
脱グリコシル化試験
試料に最終濃度１％でＳＤＳを添加し、かつ５分間に亘って９５℃でインキュベートした。２ｘインキュベーションバッファー１容量（２５０ｍＭ  リン酸バッファー、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  Ｎ−オクチルグリコシド、１％  ２−メルカプトエタノール）を添加し、かつ付加的な５分間に亘っての９５℃でのインキュベーション時間の後に、試料を３７℃に冷却した。Ｎ−グリコシダーゼＦ  １Ｕ（Boehringer Mannheim, キット番号１３６５１７７）を添加し、かつ３７℃で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、試料を１００ｍＭ  ＤＴＴで還元した（最終濃度）。
製造工程
１０％の不活性化ウシ胎児血清を含むＴＣ１００培地（JRH Biosciences, キット番号５６９４１）中で、２７℃で、撹拌フラスコ中で、懸濁液中で指数的に増殖した５１９細胞（ＩＧＣＬ  ８３−２）を、低速の遠心分離によって回収し、かつ、ＴＣ１００媒体中の２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で懸濁し、０．０１３  ＴＩＵ  アプロチニン／ｍｌ（Pentex）を添加した。組換えウイルスＩＧＢＶ７３を、２．２５ｐｆｕ／細胞の多重感染（ＭＯＩ）で細胞に添加した（ＭＯＩ３の代わりに、主要ウイルスバンクの低いタイターによって）。細胞／ウイルス懸濁液をその後に、２７℃で、ガラスローラーボトル（3 x 500 ml /1260 cm２）中で、７２時間に亘ってインキュベーションした。その後に、ＣＭ（１．５ｌ）を、細胞および細胞崩壊物から、２回に亘っての連続的な低速遠心分離によって洗浄した。アリコートをウエスタンブロッティング分析による質的調整のために取り出し、かつ、エンドトキシンレベルを測定した。
例２ｂ．結果
発現のキネティクス
３個の候補となる組換えウイルスクローンの発現のキネティクスを、ウエスタンブロット分析により試験した。ウエスタンブロットは、すべての候補となるクローンのＣＭ中でほぼ８１ｋＤａで、明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟タンパク質（８１．２ｋＤａ）の理論的Ｍｒに相当する。細胞溶解物に関しては、ＳＤＳゲルはオーバーロードであったために結果は得られなかった。全部で３個のクローンの発現レベルは、感染後４８〜７２時間でピークに達した。クローン２をさらに増幅させるために選択し、かつ、ＩＧＢＶ７３として寄託した。最適なハーベスト時間は感染後７２時間に設定した。
脱グリコシル化試験
可溶性のＩＧＳ５タンパク質配列は、８個のポテンシャルなＮ−グリコシル化部位を有している。精製工程は、ＣＭおよび細胞溶解物のレンチル−レクチンカラム試料上での糖残基の結合を含むが、感染後７２時間にハーベストされたものは、Ｎ−グリコシダーゼＦでの脱グリコシル化のために使用し、組み換えの可溶性Ｈｉｓ６ＩＧＳ５タンパク質がさらにグリコシル化タンパク質として発現されるかどうかを試験した。
【０１２７】
Ｎ−グリコシダーゼＦによって処理されたＣＭ試料、および非処理のコントロール群のウエスタンブロット分析は、試料が脱グリコシル化された場合にＭｒ中でのシフトを示し、その際、溶解性のヒトＨｉｓ−ｔａｇＩＧＳ５が、グリコシル化タンパク質として発現するかどうかを試験した。非処理の細胞溶解物中において、約８０〜８２ｋＤａの３個のタンパク質バンドが観察されてもよい。Ｎ−グリコシダーゼＦ処理上で、おおよそ８０ｋＤａの１バンドは、依然として可視的であり、この場合、これは、非処理試料の最も低いＭＷバンドに相当する。
製造工程
ＣＭ  １．５ｌを、感染７２時間後に、ＩＧＢＶ７感染されたＳｆ９昆虫細胞からハーベストした。エンドトキシン内容を、０．０８４７ＥＵ／ｍｌであると測定した。ウエスタンブロット分析は、ＣＭ中でおおよそ８１ｋＤａの明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟した可溶性ＨｉｓｔａｇＩＧＳ５のＭＷに相当する。細胞溶解物試料と比較した場合に、３個のタンパク質バンドが示され、弱い中程度のＭｒバンドに相当するＣＭタンパク質バンドが、細胞中に存在した。
例３．ＩＧＳ５の精製
例３ａ．実験方法
試料処理
１タブレットのＥＤＴＡ不含コンプレート（ＥＦＣ；Roche Biochemicals,  キット番号１８７３５８０）を３００ｍｌの精製されたバキュロＣＭに添加した。ＨＥＰＥＳ、グリセロールおよびＴｗｅｅｎ２０を、それぞれ２０ｍＭ、５％（ｖ／ｖ）および０．００５％（ｗ／ｖ）の最終濃度に添加した。ＣＭのｐＨを７．４に調整し、かつ試料を、Ｄｕｒａｐｏｒａ  メンブレンフィルター  ０．２μ  ＧＶで濾過した。すべての精製工程を４℃で実施した。
レンチル  レクチン  クロマトグラフィー
バキュロ試料を、Ｃ１０／１０カラム（Pharmacia）中の５ｍｌ  レンチル  レクチン  セファロース樹脂上で、０．３ｍｌ／分で、一晩に亘ってロードし、この場合、このカラムは、１タブレットのＥＦＣ／５００ｍｌが添加されたバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で平衡化した。カラムを、平衡化バッファーで、２８０ｎｍでの吸光度が基準値に達するまで洗浄し、かつ結合タンパク質を、０．５Ｍ  α−メチルピラノシドを含有するバッファーＡを添加することによって溶離した。カラムに、１００ｍＭアセテート、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０を添加することによって再生させた。溶離液および再生液を捕集し、かつプールを１２．５％のＰｈａｓｔゲル（Pharmacia）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析した。前染色マーカー（Gibco）は、相対的な分子量マーカー（Ｍｒ）スタンダードとして含まれている。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および透析
１ｍｌのキレ−ト化ＨｉＴｒａｐ（Pharmacia）を製品説明書に記載されているように亜鉛イオンでロードし、かつバッファーＢ（20mM Hepes, 100mM NaCl, 5% グリセロール、０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で平衡化した。レンチル溶離プール１および２を別個に、ＨｉＴｒａｐカラム上でそれぞれ０．５ｍｌ／分でロードした（ＩＭＡＣランＡおよびＩＭＡＣランＢ）。ブランクのランは、クロマトグラフィーの吸光プロフィールとの比較のために使用した。カラムをバッファーＢで、基準値のレベルまで洗浄し、かつ結合タンパク質は、バッファーＢ中のイミダゾール勾配溶液（２０、５０、１００および２００ｍＭ）を添加することによって溶離した。画分を手動で捕集した。ＩＭＡＣカラムに、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を添加することによって再生させた。溶離プールおよび再生プールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ Phast gels, Pharmacia）および銀染色によって分析した。２００ｍＭ  イミダゾールプールを、  ｓｌｉｄｅ  ａ−ｌｙｚｅｒ−ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＭＷＣＯ  １０，０００，Ｐｉｅｒｃｅ）に移し、かつバッファーＢに対して一晩に亘って透析した（１３０倍過剰量、バッファーは置換しない）。
タンパク質の定量化
透析プールにおける溶解性ＩＧＳ５の量を、マイクロ−ＢＣＡ法を用いて測定した（Ｐｉｅｒｃｅ）。ＢＳＡは参考のために使用した。
タンパク質の特徴付け
透析されたバキュロＩＧＳ５を、生化学的に、（１）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および（２）抗Ｈｉｇ−ｔａｇｍＡｂでのウエスタンブロッティング、その後のアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗−マウスＩｇ（Dako）でのインキュベーション、およびＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色による検出によって特徴付けした。溶解性のＩＧＳ５のグリコシル化状態を、ＰＧＮａｓｅＦ処理によって検証した（Biorad）。
例３ｂ．結果
０．５Ｍ  α−メチルピラノシドを有するレシチル溶離プロフィールは、テーリングのあるピークを生じた。流動、洗浄および溶離プールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析した。タンパク質の主要な量を、流動中で検索し、約８５０００のＭｒを有するＩＧＳ５−候補となるバンドを、溶離プール１〜３中で観察した。抗Ｈｉｓ  ｔａｇ  ｍＡｂを有するレンチルクロマトグラフィーのウエスタンブロット分析は、溶解性ｈＩＧＳ５タンパク質（Ｍｒ＝８５０００）が、定量的にレンチルレシチン樹脂と結合し、かつＨｉｓ−ｔａｇタンパク質を、すべての溶離ピーク上で捕集されることを示したが、しかしながら主にプール１と２からであった。レンチルレクチン溶離プール１および２を、さらに亜鉛−ＩＭＡＣカラム（ランＡおよびＢ）上で処理した。結合タンパク質を、イミダゾー勾配により溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色は、コンタミネートされたタンパク質の塊が、２０ｍＭおよび５０ｍＭイミダゾール工程によって溶離したことを示した。ｈＩＧＳ５タンパク質は、１００ｍＭおよび２００ｍMのイミダゾール溶離工程において検索された。溶離物中で、最大１０％のｈＩＧＳ５を含有する１００ｍＭイミダゾール溶離物は、依然としてＭｒ＞１１５０００を有するタンパク質でのコンタミネーションがみられた。さらに、１００ｍＭ中のＩＧＳ５バンドは、ダブルバンドであった。これは、１０％未満の二重の弱い上部のバンドが、残留するバキュロウイルスによるコンタミネーションであるかまたはＩＧＳ５異性体型であるかどうか、あるいは、下部の（強い）バンドが、カルボキシ残基分解産物であるかどうかを試験するために残した。２００ｍＭイミダゾールプール中の８５ｋＤａのバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のシングルバンドであり、この場合、これらは、抗ｈｉｓ−ｔａｇ  ｍＡｂと反応されたものである。
【０１２８】
銀染色では、ＩＭＡＣランＡおよびランＢから得られたｈＩＧＳ５材料との間の任意の純度の違いについては示されない。これは、レシチン溶離物のプール１とプール２とが、さらにプールされ、かつ亜鉛−ＩＭＡＣカラム上の単一のランで同時に処理されてもよいことを示す。
【０１２９】
同一のバンドパターンは、還元または非還元条件下で、クマシン染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察され、その際、精製されたｈＩＧＳ５が、ジスルフィドに基づくオチゴマーを含んでいないことを示した。ＰＧＮａｓｅＦでの処理は、約５ｋＤａを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＭｒを減少させた。エンドグリコシダーゼでの処理の後のバキュロ発現ｈＩＧＳ５のこの最小限のシフトは、ＣＨＯ発現マウスＳＥＰに関して観察されたイミグレーションシフトとは明らかに異なっていた（Ikeda et al., JBC, 274, 32469,1999）。
【０１３０】
バキュロＣＭ  ３００ｍｌから出発して、９５％を上廻る純度のＨｉｓ−ｔａｇｈＩＧＳ５エクトドメイン３４０μｇが、２段階の精製工程によって得られた（すなわち、約１ｍｇ／ｌの収率）。その後に精製産物は、酵素抑制アッセイ中で、以下の実施例で示されたように使用される。
例４．ＩＧＳ５酵素抑制アッセイ
本発明のＩＧＳ５ポリペプチド酵素活性は、生物学的活性ペプチドの代謝に関連して試験された。特に、これらのＩＧＳ５ポリペプチドが、当業者に公知の種々の血管作用性ペプチド、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）、ブラジキニン、ｂｉｇ−エンドセリン（ｂｉｇ−ＥＴ−１）、エンドセリン（ＥＴ−１）、サブスタンスＰおよびアンジオテンシン−１上で作用するかどうかについて試験した。本発明の範囲内では、特に、新規のヒトメタロプロテアーゼであるＩＧＳ５エクトドメインが、前記血管作用性ペプチドを加水分解するかどうかについて試験した。比較のために、アッセイをさらに、以前Ｅｍｏｔｏらによって示された可溶性分泌エンドペプチダーゼ（ＳＥＰ）である、公知のメタロプロテアーゼファミリーメンバーに関しておこなった（J.Biol.Chem., Vol. 274 (1999): pp. 32469-32477）。さらに、ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ（いわゆる１７ａａｂｉｇ−ＥＴ−１）に変換するＩＧＳ５活性が、ＥＣＥおよび／またはＮＥＰ−特性を有する酵素に関する抑制特性を測定するために使用された、参考化合物によって抑制されるかどうかについて試験した。ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ上のＩＧＳ５−活性の抑制を試験するために使用された化合物は、ＮＥＰ−特性を有するエンドペプチダーゼを抑制する化合物ホスホラミドン、ＮＥＰを選択的に抑制する化合物チオファン、およびＮＥＰ／ＥＣＥの二重のインヒビターである化合物ＣＧＳ−３５０６６である。
例４ａ．材料
酵素：ＩＧＳ−５（ｓｏｌ  ｈｕ）（ｈｉｓ）６；または；Ｈｉｓ６−ｔａｇ  ＩＧＳ５エクトドメイン；
ストック溶液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、５％グリセロール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、純度＞９９％；保存４℃
ワーキング溶液：ストック溶液をアッセイバッファーで１０μｇ／ｍｌに希釈した。
基質：Ｍｃａ−Ａｓｐ−ＩＩｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄｐａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ；
フルオレセンス−クエンチング  ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ；
Ｍｃａ＝７−メトキシクマリン−４−イル；
Ｄｐａ＝３−［２，４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニル；
ストック溶液：アッセイバッファー中１００μＭ；−２０℃保存（次の供給元から市販されている：Polypeptide Laboratories, Wolfenbuettel, Germany）
アッセイバッファー：１００ｍＭトリスｐＨ７．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ
すべての試験化合物は、１０ｍＭのＤＭＳＯ中で溶解され、かつさらにアッセイバッファーで希釈した。
例４ｂ．アッセイ工程
１０μｌの酵素ワーキング溶液および１０μｌの試験化合物溶液を含有するアッセイバッファー  ７０μｌ量を、エッペンドルフチューブ中で混合し、かつ、３７℃で１５分間に亘ってプレインキュベートした。その後に、１０μｌの基質ストック溶液を添加し、かつ反応混合物を３７℃で６０分に亘ってインキュベートし、酵素的加水分解をおこなった。引き続いて酵素反応を、９５℃で加熱することによって５分に亘って完了させた。遠心分離（Herawus Biofuge B 3分）の後に、上清についてＨＰＬＣ分析をおこなった。
例４ｃ．ＨＰＬＣ工程
消化産物からの残留する基質を分離するために、逆相ＨＰＬＣ技術を、ＣＣ１２５／４Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ３００／５  Ｃ１８  ＲＰカラムおよびＣＣ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００／５  Ｃ１８  プレカラムを用いて使用した（Macherey-Nagel, Dueren, Germanyから商業的に入手可能である）。したがって、例７ｂ中で得られた反応試料  ６０μｌを、ＨＰＬＣ中に装入し、かつカラムを以下の勾配および溶液を適用させることによって、１ｍｌ／分の流量で溶離した：
溶液Ａ：１００％      Ｈ２Ｏ＋０．５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ＝２．０
溶液Ｂ：１００％      アセトニトリル＋０．５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４
０〜２分      ２０％      Ｂ
２〜６分      ２０〜６０％      Ｂ
６〜８分      ６０％      Ｂ
８〜１０分      ６０〜９０％      Ｂ
１０〜１３分      ９０％      Ｂ
１３〜１５分      ９０〜１００％      Ｂ
ペプチドを、２１４ｎｍの吸光度で、かつ励起波長３２８ｎｍおよび放出波長３９３ｎｍでのフルオレセンスによって検出した。
例４ｄ．算定
加水分解後のクエンチングされていないＭｃａ−発けい団を用いての、ペプチドのＨＰＬＣ−ピークの増加した蛍光シグナルが、任意の算定のためのベースとして使用された。
【０１３１】
このシグナルを、インヒビターを含むかまたは含まない試料と比較し、かつ抑制％をそれぞれのピーク面積に基づいて算定した。
抑制％＝１００★（１−Ａ抑制／Ａコントロール）
すべての試料について二重に流し、かつその平均値を使用した。
【０１３２】
スタンダードインヒビター（１０ｎＭおよび１００ｎＭホスホアミドン）および溶剤コントロール（０．１％）をそれぞれのアッセイのランに加えた。
例４ｅ．結果
本発明のＩＧＳ５ポリペプチドに関して、例４の結果は、これらのＩＧＳ５メタロプロテアーゼポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、当業者に公知の血管作用性ペプチドを加水分解することを示した。ＳＥＰ活性と比較しての加水分解アッセイの結果は、第７表に示した。これらの結果から、ＩＧＳ５は、前記生物学的血管作用性ペプチドの代謝において、特に影響を与えるものと推測される。
【０１３３】
【表７】
2004536063.tif 000012
★            ５００μｇ  ＩＧＳ５  ポリペプチド
★★          １０μｇ  ＩＧＳ５  ポリペプチド
★★★        アンジオテンシンＩＩの形成を生じないアンジオテンシンＩの分解
★★★★      １７ａａｂｉｇ−ＥＴ−１を、中性ｂｉｇ−ＥＴ−１のアナログとして使用され；さらにＩＧＳ５の加水分解活性が、中性ｂｉｇ−ＥＴ−１を用いて検出されたが、しかしながら、ＨＰＬＣ−検出を用いての困難性によって定量化されない。
例５．ＮＥＰ酵素抑制アッセイ
中性エンドペプチダーゼ（E.C. 3.4.24.11）を、Ｇｅｅらの方法によって、ブタの腎皮質から製造され（Biochem J 1985 May 15; 228 (1): 119-26）、かつＲｅｌｔｏｎら（Biochem J 1983 Dec 1; 215 (3): 519-23）によって示されたように精製した。酵素抑制アッセイに関して、精製された酵素１０ｎｇ、２０μＭ基質（メチオニン−エンケファリン）および種々のインヒビター濃度を使用した。アッセイバッファーを、５０ｍＭ  トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／ＨＣｌ  ｐＨ７．４であり、全アッセイ容量は１００μｌであった。酵素およびインヒビターの５分間に亘ってのプレインキュベーション後に、基質を添加し、引き続いて酵素によって誘導される基質の加水分解のための第２インキュベーション工程を、３７℃で３０分に亘って開始した。酵素反応を、９５℃で５分間に亘って加熱することによって停止させた。遠心分離の後に、上清についてＨＰＬＣをおこなった。酵素による基質加水分解の産物を、ＨＰＬＣ技術によって、本来の基質から分離し、かつインヒビターのポテンシャルを産物のピーク面積と、本来の基質のピーク面積とを、インヒビターを含むかまたは含まない（コントロール群）双方の試料について比較することによって算定した。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール群、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料、および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給元：
ＮＥＰ：Ｄｒ．Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｃｒｉｎｅ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ
メチオニン−エンケファリン：Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ
例６．ＥＣＥ酵素抑制アッセイ
組み換えヒトＣＯＯＨ−末端  Ｈｉｓ６−ｔａｇ  エンドセリン変換酵素−１を、Ｓｆ９−細胞中で発現させた。精製を、アフィニティークロマトグラフィーを用いておこなった。酵素抑制アッセイは、酵素（２．８μｇ）、５μｇ  基質（適度に改質化された１７アミノ酸切断ｂｉｇエントセリン−１）、種々の最終濃度でのインヒビターおよび１００ｍＭトリス−バッファー（トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン／ＨＣｌ、ｐＨ７．０＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を最終容量１００μｌ中に含む。３７℃で１５分に亘ってのインヒビターを含む酵素のプレインキュベーションは、基質の添加および酵素加水分解のためのインキュベーション（３７℃で６０分）の前におこなった。酵素反応を、９５℃で５分に亘っての加熱によって停止させた。遠心分離の後に、上清を、未分解基質からの酵素加水分解産物の分離のためにＨＰＬＣをおこなった。抑制％を、コントロール群と比較して、抑制反応に関しての産物および未切断の基質に関するピーク面積に基づいて算定した（インヒビター不含）。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給源：
ＥＣＥ：  Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
ＥＣＥ基質：Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｗｏｌｆｅｎｂｕｅｔｔｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ
例７：参考化合物と比較してのＮＥＰ／ＩＧＳ５−抑制化合物の生化学的プロフィール
本発明の目的のための、ＩＧＳ５の製薬学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトＩＧＳ５タンパク質を、前記実施例中で記載したような発現系としての昆虫細胞を用いて製造し、かつ、ＩＧＳ５タンパク質の種々のポテンシャルな基質を試験した。例４の結果によれば、ＩＧＳ５は、ｂｉｇ−ＥＴ−１、ＡＮＰおよびブラジキニンを効果的に消化することを見出し、これによって、新規タンパク質が、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることを確認し、この場合、これは、メタロプロテアーゼの一般的な特徴であり、かつ、これらの特徴は、ＮＥＰ、ＥＣＥ−１さらにはＡＣＥに関して報告されている。さらに本発明によれば、ｂｉｇ−ＥＴ−１のＩＧＳ５によるタンパク質分解は、驚くべきことに、ＥＴ−の正確な形成を生じ、この場合、これは、たとえばｂｉｇ−ＥＴ−１が、正確にアミノ酸Ｔｒｐ２１とＶａｌ２２との間を切断されることによるものである。
【０１３４】
さらに、メタロプロテアーゼインヒビター化合物と、ｂｉｇ−ＥＴをＥＴ−１に変換するのを抑制する参考化合物とのポテンシャルは、標識化された蛍光ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログを使用して、例７に記載のようにして試験された。酵素アッセイにおいて適用された方法は、ＩＧＳ５に関しては例４で前記に示されたように、ＮＥＰに関しては例５で、およびＥＣＥに関しては例６で記載されている。
【０１３５】
酵素抑制試験の結果は、第８表に示した。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに本発明において使用された生化学アッセイにおいて高いポテンシャルでＩＧＳ５を抑制し、かつ驚くべきことに、ホスホラミドンによるＩＧＳ５の抑制は、実際には、ＥＣＥ−１よりもかなり高かった。対照的に、選択的ＮＥＰインヒビターチオファンならびに選択的ＥＣＥ−１インヒビターＳＭ−１９７１２（４−クロロ−Ｎ−［［（４−シアノ−３−メチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）アミノ）カルボニル］ベンゼンスルホンアミド、一ナトリウム塩；Ｕｍｅｋａｗａ  Ｋ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｈ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｙ，Ｓａｔｏ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｎ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；８４（１）：７−１５；Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｐｏｒｉｅｓ  Ｉ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ，Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）は、ＩＧＳ５の活性に作用しなかった（第８表）。
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
本発明による結果は、特に以下の事実から極めて驚異的である。エンドセリン変換酵素−１（ＥＣＥ−１）が、１９９４年にクローニングされ、この酵素は、一般にはｂｉｇ−ＥＴ−１のＥＴ−１への生理学的変換に関して応答可能なエンドペプチダーゼとして認められるようになった。しかしながら、ＥＣＥ−１がｂｉｇ−ＥＴ−１を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告によれば、ＥＣＥ−１が唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるのかといった疑問、あるいは少なくとも付加的な酵素が、ＥＴ−１生成に係わっているに違いないといった意見が生じた。ＩＧＳ５タンパク質は、ＮＥＰに対して高い類似性を有する（５４％の同一性）メタロプロテアーゼであることが見出され、かつ、ＥＣＥ−１に対してはやや低い類似性である（３９％同一性）。例４以下の試験によって、この新規メタロプロテアーゼの酵素的性質を特徴付けるために、ポテンシャルな基質が探され、かつサブスタンスＰ、ブラジキニン、ｂｉｇ−ＥＴ−１および効率の低いＡＮＰ、アンジオテンシンＩおよびＥＴ−１が、ＩＧＳ５によって切断されることが見出された。ＩＧＳ５の酵素活性は、中性ｐＨ（７．０〜７．５）で最適化される。ｂｉｇ−ＥＴ−１のＩＧＳ５によるタンパク質分解が、ＥＴ−１の正確な形成中に生じることは重要である。
【０１３８】
本発明による例７の試験によって、ＩＧＳ５による、ｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への変換抑制のためのメタロプロテアーゼインヒビターのポテンシャルが、基質として標識化された蛍光ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログを用いて試験された。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、ｂｉｇ−ＥＴのＥＴ−１への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに、生化学的アッセイにおいて、高いポテンシャル（ＩＣ５０＝１８ｎＭ）でＩＧＳ５を抑制する（ＥＣＥ−１よりも著しく高い）ことは興味深い。対照的に、Ｓｕｍｉｔｏｍｏからの選択的ＮＥＰインヒビター  チオファンならびに選択的ＥＣＥ−１インヒビター  ＳＭ−１９７１２は、ＩＧＳ５の活性に作用するものではなかった。
【０１３９】
したがって、式Ｉの化合物、特に、式ＩａまたはＩｂを有する化合物は、それぞれ、驚くべきことに、組み合わされたかまたは同時のＮＥＰ／ＩＧＳ５抑制活性を示した。式Ｉａの化合物の典型例として、式Ｉａ−２の化合物、および式Ｉｂの化合物の典型例として、式Ｉｂ−８の化合物が、本発明の例中で試験された。双方の化合物は、新規に同定されたＩＧＳ５メタロプロテアーゼの極めてポテンシャルなインヒビター（ＩＣ５０＝１．２および２．９ｎＭ）であることを示した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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