(57)【要約】抗原擬似体（ＡＤＡＭ）方法による抗体検出によって、血清中の抗抗原抗体分子の結合特異性を同定することを含み、抗原−感染患者および非感染者からの血清を用いるファージライブラリィをスクリーニングし、該抗原と特異的に会合されるペプチド結合抗体（リガンド）を同定することを含む、抗原の診断をなす方法。イン・ビトロ・マチュレーションストラテジー；リガンドを共通のコア、例えばＭＡＰに結合することによって方法の改良を得る。特に、該方法をＨＣＶに適用する。
2004513346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原擬似体（ＡＤＡＭ）方法による抗体検出によって、血清中の抗抗原抗体分子の結合特異性を同定することを含み、抗原−感染患者および非感染者からの血清を用いるファージライブラリィをスクリーニングし、該抗原と特異的に会合されるペプチド結合抗体（リガンド）を同定することを含む、抗原の診断をなす方法。
【請求項２】
該リガンドをイン・ビトロのマチュレーション・ストラテジーによって改良する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該リガンドが合成ペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該リガンドが共通のコアに結合する、請求項１または２または３に記載の方法。
【請求項５】
該共通のコアを持つ該リガンドがＭＡＰである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
下記工程：
ａ）ｎ陽性血清に対してファージライブラリィを最初にパニングして、ｎファージプールの第１系列を生成すること；
ｂ）ｎ−１プールを含有するｎプール混合物を調製すること；
ｃ）ファージの排除されたプールを生成した血清に対してｎ混合物の各々のアフィニティーセレクションを行って、ｎファージプールの第二系列を得ること、および所望により、
ｄ）第一パニングに使用したもの以外の全てのｎオリジナル血清を含む混合物に対してｎファージプールの第二系列の各々をさらにパニングすること；
ｅ）全てのｎオリジナル血清の混合物を用いて、ｎファージプールの得られる第二系列をイムノスクリーニングして、陽性クローンを得ること；
ｆ）ファージ分泌コロニーとして該クローンの整列したアレイを用いて、全ての陽性クローンと陽性および陰性血清のパネルとの個々の反応性を試験すること；
ｇ）該ファージ分泌コロニーのレプリカを生成すること；
ｈ）各レプリカを陽性および陰性血清との反応性についてスクリーニングして、陽性血清と特異的に反応するクローンを明らかにすること；
ｉ） 陽性血清からのアフィニティー純化した抗体に対するリガンドとして特異的に反応するファージの各々を用いること；
ｊ）該抗体を先に同定した抗原特異的ペプチドとの反応性について試験すること；
ｋ） 血清抗体を検出するクローンを選抜すること、
を含む方法によって得られる抗原特異的リガンドのコレクション。
【請求項７】
抗原擬似体（ＡＤＡＭ）方法による抗体検出によって、血清中の抗ＨＣＶ抗体分子の結合特異性を同定することを含み、ＨＣＶ患者および非感染者からの血清を用いるファージライブラリィをスクリーニングし、ＨＣＶ感染と特異的に会合されるペプチド結合抗体（リガンド）を同定することを含む、Ｃ型肝炎の診断をなす方法。
【請求項８】
該リガンドを、イン・ビトロのマチュレーション・ストラテジーによって改良する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該リガンドが合成ペプチドである、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
該リガンドを共通のコアに結合する、請求項６または７または８記載の方法。
【請求項１１】
該共通のコアを持つ該リガンドがＭＡＰである、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
下記工程：
ａ）ｎ陽性血清に対してファージライブラリィを最初にパニングして、ｎファージプールの第１系列を生成すること；
ｂ）ｎ−１プールを含有するｎプール混合物を調製すること；
ｃ）ファージの排除されたプールを生成した血清に対してｎ混合物の各々のアフィニティーセレクションを行って、ｎファージプールの第二系列を得ること、および所望により、
ｄ）第一パニングに使用したもの以外の全てのｎオリジナル血清を含む混合物に対してｎファージプールの第二系列の各々をさらにパニングすること；
ｅ）全てのｎオリジナル血清の混合物を用いて、ｎファージプールの得られる第二系列をイムノスクリーニングして、陽性クローンを得ること；
ｆ）ファージ分泌コロニーとして該クローンの整列したアレイを用いて、全ての陽性クローンと陽性および陰性血清のパネルとの個々の反応性を試験すること；
ｇ）該ファージ分泌コロニーのレプリカを生成すること；
ｈ）各レプリカを陽性および陰性血清との反応性についてスクリーニングして、陽性血清と特異的に反応するクローンを明らかにすること；
ｉ） 陽性血清からのアフィニティー純化した抗体に対するリガンドとして特異的に反応するファージの各々を用いること；
ｊ）該抗体を先に同定した抗原特異的ペプチドとの反応性について試験すること；
ｋ） 血清抗体を検出するクローンを選抜すること、
を含む方法によるＨＣＶ特異的リガンドのコレクション。
【請求項１３】
工程 ａ）のファージライブラリィがｐＶＩＩＩ−１２ａａである、請求項１２に記載のコレクション。
【請求項１４】
請求項１２における工程ｋ）から選抜したクローンの挿入物が下記配列： ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧ； ＲＡＴＬＳＮＥＨＧＩＴＩＧ、ＤＱＲＥＮＷＦＫＹＨＧＦＧ、ＥＷＲＲＹＭＳＤＩＨＧＹＧ、ＤＳＬＲＹＭＹＶＭＰＧＦＧを持つ、請求項１２および１３に記載のコレクション。
【請求項１５】
ファージライブラリィを生成し、そこで最も反応するクローンを、クローン配列の各アミノ酸がその他の任意のアミノ酸によって独立して置換されるように、部分的に変異せしめる、請求項１２に記載のコレクション。
【請求項１６】
ファージライブラリィを生成し、そこで反応するクローンを、クローン配列の各アミノ酸がその他のアミノ酸によって独立して置換されるように、部分的に変異せしめる、請求項１２に記載のコレクション。
【請求項１７】
該クローンが下記挿入配列ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧを持つ、請求項１５または１６に記載のコレクション。
【請求項１８】
該ファージライブラリィにおいて、ランダム配列を２つのシステイン残基で挟む（フランキングされている）、請求項１２−１７のいずれかに記載のコレクション。
【請求項１９】
該ペプチド配列を共通のコアと結合する、請求項１２−１８のいずれかに記載のコレクション。
【請求項２０】
該共通のコアを持つ該ペプチドがＭＡＰである、請求項１７に記載のコレクション。
【請求項２１】
ＨＣＶに感染した疑いのある対象において、ＨＣＶを検出する診断アッセイを調製するための、請求項１２−２０のいずれかに記載のコレクションの使用。
【請求項２２】
請求項６のコレクションを含有する、診断目的のためのキット。
【請求項２３】
請求項１２−２０のいずれか１つのコレクションを含有する、ＨＣＶの診断目的のためのキット。
【請求項２４】
該コレクションが固定化されたストリップを含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
該ストリップがさらに内部標準物を含有する、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
下記：
ｉ） ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧ；
ｉｉ） ＲＡＴＬＳＮＥＨＧＩＴＩＧ；
ｉｉｉ） ＤＱＲＥＮＷＦＫＹＨＧＦＧ；
ｉｖ） ＥＷＲＲＹＭＳＤＩＨＧＹＧ；
ｖ） ＤＳＬＲＹＭＹＶＭＰＧＦＧ；
ｖｉ） ＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＤＭＴ；
ｖｉｉ） ＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＩＳ；
ｖｉｉｉ） ＹＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＥＰＭ；
ｉｘ） ＮＳＲＷＬＳＫＡＨＧＩＥＧＭ；
ｘ） ＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＶＭ；
ｘｉ） ＹＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＴＱ；
ｘｉｉ） ＫＳＲＥＱＬＳＫＬＨＧＶＤＴＳ；
ｘｉｉｉ） ＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＬＴ；
ｘｉｖ） ＭＷＲＴＷＬＭＫＴＨＧＩＥＳＷ；
ｘｖ） ＭＬＲＴＷＬＭＫＹＱＧＩＥＳＷ；
ｘｖｉ） ＹＳＲＳＷＬＭＫＡＨＧＬＥＬＧ；
ｘｖｉｉ） ＭＭＲＳＹＬＭＫＡＨＧＩＥＳＬ；
ｘｖｉｉｉ） ＭＳＲＬＷＬＭＫＡＨＧＩＳＳＥ；
ｘｉｘ） ＫＨＳＥＷＬＮＫＡＲＧＩＥＳＷ；
ｘｘ） ＭＳＲＴＦＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷ；
ｘｘｉ） ＭＳＲＴＷＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷ； ；
ｘｘｉｉ） ＡＥＧＥＫＫＬＲＲＳＴＮＷＧＤＰＡＫ；
ｘｘｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＫＴＲＲＱＴＮＹＱＤＰＡＫ；
ｘｘｉｖ） ＡＥＧＥＦＫＴＬＲＮＡＮＲＬＤＰＡＫ；
ｘｘｖ） ＡＥＧＥＦＫＴＬＲＮＳＮＲＬＤＰＡＫ；
ｘｘｖｉ） ＡＥＧＥＦＫＫＦＰＧＳＳＴＰＫＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｘｘｖｉｉ） ＡＥＧＥＦＰＱＤＡＲＦＰＧＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｘｘｖｉｉｉ） ＰＱＤＡＲＦＰＧＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｘｘｉｘ） ＡＥＧＥＦＫＧＡＧＧＡＱＴＶＤＷＡＬＬＶＤＰＡＫ；
ｘｘｘ） ＡＥＧＥＦＭＱＫＨＦＧＧＡＱＷＩＭＧＤＰＡＫ；
ｘｘｘｉ） ＡＥＧＥＦＬＳＬＫＧＳＧＧＧＱＬＲＡＬＶＤＰＡＫ；
ｘｘｘｉｉ） ＡＥＧＥＦＬＳＬＫＧＳＧＧＡＱＬＲＡＬＶＤＰＡＫ；
ｘｘｘｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＹＬＬＫＲＳＳＰＰＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｘｘｘｉｖ） ＡＥＧＥＦＰＩＬＶＧＰＹＬＬＰＲＲＳＲＥＥＡＶＤＰＡＫ；
ｘｘｘｖ） ＡＥＧＥＦＰＩＬＶＧＰＹＬＬＰＲＲＳＲＥＥＡＶＤＰＡＫＧＫ；
ｘｘｘｖｉ） ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＰＲＫＡＬＤＰＡＫ；
ｘｘｘｖｉｉ） ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＬＤＰＡＫ；
ｘｘｘｖｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＰＤＰＡＫ；
ｘｘｘｉｘ） ＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＰＤＰＡＫ；
ｘｌ） ＡＥＧＥＦＴＱＰＲＧＨＳＹＱＤＰＡＫ；
ｘｌｉ） ＡＥＧＥＦＬＫＥＲＡＥＭＳＡＲＫＴＬＧＡＤＰＡＫ；
ｘｌｉｉ） ＡＥＧＥＦＦＹＱＩＰＲＲＭＥＴＫＹＧＤＰＡＫ；
ｘｌｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧＤＰＡＫ；
ｘｌｉｖ） ＡＥＧＥＦＮＳＲＥＷＬＳＫＡＨＧＩＥＧＭＤＰＡＫ；
ｘｌｖ） ＡＥＧＥＦＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＬＴＤＰＡＫ；
ｘｌｖｉ） ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＤＭＴＤＰＡＫ；
ｘｌｖｉｉ） ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＴＳＤＰＡＫ；
ｘｌｖｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＶＭＤＰＡＫ；
ｘｌｉｘ） ＡＥＧＥＦＫＳＲＥＱＬＲＫＬＨＧＦＤＴＳＤＰＡＫ；
ｌ） ＡＥＧＥＦＫＭＲＮＹＬＮＫＡＦＧＩＥＧＭＤＰＡＫ；
ｌｉ） ＡＥＧＥＦＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＥＬＴＤＰＡＫ；
ｌｉｉ） ＡＥＧＥＦＳＲＲＥＹＳＮＫＡＦＧＩＥＴＱＤＰＡＫ；
ｌｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＲＲＲＥＹＬＮＫＡＦＧＩＥＧＧＤＰＡＫ；
ｌｉｖ） ＡＥＧＥＦＳＲＲＥＷＬＮＫＲＦＧＩＥＹＬＤＰＡＫ；
ｌｖ） ＡＥＧＥＦＭＳＲＴＷＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷＤＰＡＫ；
ｌｖｉ） ＡＥＧＥＦＹＳＰＥＷＬＮＫＡＲＧＩＤＲＳＤＰＡＫ；
ｌｖｉｉ） ＡＥＧＥＦＫＳＲＥＱＬＳＫＬＨＧＶＤＴＳＤＰＡＫ；
ｌｖｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＩＳＤＰＡＫ；
ｌｉｘ） ＡＥＧＥＦＹＳＲＳＷＬＭＫＡＨＧＬＥＬＧＤＰＡＫ；
ｌｘ） ＡＥＧＥＦＭＭＲＳＹＬＭＫＡＨＧＩＥＳＬＤＰＡＫ；
ｌｘｉ） ＡＥＧＥＦＭＳＲＬＷＬＭＫＡＨＧＩＳＳＥＤＰＡＫ；
ｌｘｉｉ） ＡＥＧＥＦＰＱＰＱＥＶＨＶＹＲＥＱＬＧＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｌｘｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＧＥＶＬＹＲＧＦＤＥＶＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｌｘｉｖ） ＡＧＥＰＹＶＩＥＲＧＭＱＤＰＡＫ；
ｌｘｖ） ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＲＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｌｘｖｉ） ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＡＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｌｘｖｉｉ） ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＳＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
ｌｘｖｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＲＨＹＳＷＤＰＡＫ；
ｌｘｉｘ） ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＡＨＹＳＷＤＰＡＫ；
ｌｘｘ） ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＳＨＹＳＷＤＰＡＫ；
ｌｘｘｉ） ＡＥＧＥＦＲＦＷＫＶＰＤＹＤＰＰＡＡＧＧＤＰＡＫ；
ｌｘｘｉｉ） ＡＥＧＥＦＴＥＳＳＶＳＳＴＬＡＤＬＡＳＫＴＦＧＳＡＤＰＡＫ；
ｌｘｘｉｉｉ） ＡＥＧＥＦＴＬＡＤＬＡＴＭＴＦＧＳＴＤＰＡＫ；
ｌｘｘｉｖ） ＡＥＧＥＦＧＬＡＤＬＡＴＬＴＦＧＳＰＤＰＡＫ；
からなる群から選択したペプチド。
【請求項２７】
請求項７−１１の方法における、請求項２６のペプチドの使用。
【請求項２８】
請求項２６の少なくとも１つのペプチドを含有する、請求項１２−２０のいずれかに記載のコレクション。
【請求項２９】
請求項６のコレクションを含有する、感染を検出するためのキット。
【請求項３０】
該コレクションが固定化されたストリップを含有する、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
該ストリップがさらに内部標準物を含有する、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
請求項１２−２０のいずれか１つのコレクションを含有する、ＨＣＶ感染を検出するためのキット。
【請求項３３】
請求項２５のコレクションからの少なくとも１つのペプチドを含有する、ＨＣＶ感染を検出するためのキット。
【請求項３４】
該コレクションが固定したストリップを含有する、請求項３２または３３に記載のキット。
【請求項３５】
該ストリップがさらに内部標準物を含有する、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ワクチンの調製のための請求項６のコレクションの使用。
【請求項３７】
ＨＣＶに対するワクチンの調製のための請求項１２−２０のいずれかに１つのコレクションの使用。
【請求項３８】
請求項１２−２０のいずれかの少なくとも１つのコレクション、または請求項２６の少なくとも１つのペプチドを含有する、ＨＣＶに対するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、感染物質、特にウイルス物質、具体的にはヒトのＣ型肝炎ウイルス（本明細書中では短縮してＨＣＶと称する）を検出するための診断アッセイ、該アッセイにおいて有用な抗感染物質抗体結合ペプチド、該ペプチドを調製するための方法および該アッセイを実施するためのキットに関する。本発明は、診断アッセイにおいて有用な、特にＨＣＶ抗ＨＣＶ抗体結合ペプチド、それらを調製するための方法および該アッセイを行うためのキットに関する。
【０００２】
本発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非経口的に伝播される非Ａ、非Ｂ型肝炎の主な病因物質である。このウイルスは、永続性感染を引き起こすことが多く、慢性肝炎および肝硬変の進行を導くことが多く、慢性肝臓疾病の主な世界的な原因を構成する （Ｂｏｙｅｒ Ｎ， Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ Ｐ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．， Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００； ３２：９８−１１２）。
【０００３】
ウイルス感染は、血清中の抗ＨＣＶ抗体を検出すること、または核酸増幅方法からウイルスＲＮＡを明らかにすることによって診断される（Ｒｏｂｂｉｎｓ ＤＪ， Ｐａｓｕｐｕｌｅｔｉ Ｖ， Ｃｕａｎ Ｊ， Ｃｈｉａｎｇ ＣＳ， Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ， Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ ２０００ Ｗｉｎｔｅｒ；１３：２３−３０）。後者の方法は、非常に感度は高いが、高価であり、技術的または実験的エラー傾向がある。さらに、ＰＣＲ技術の信頼性および特異性は標準化されていない（Ｇｒｅｔｃｈ ＤＲ， ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ Ｓｅｐ；２６（３ Ｓｕｐｐｌ １）：４３Ｓ−４７Ｓ）。
【０００４】
本発明は、感染物質に対して生じた抗体、特に抗ＨＣＶ抗体を検出する方法による、感染疾患、例えばウイルス感染、特にＨＣＶ感染の診断に関する。
【０００５】
最近、ＨＣＶコアタンパク質の感度の高い検出をするためのシステムが報告された（Ｋｏｍａｔｓｕ Ｆ， Ｔａｋａｓａｋｉ Ｋ， Ｌｉｖｅｒ １９９９ Ｏｃｔ； １９（５）：３７５−８０）。
【０００６】
特許および非特許文献の多数は、ＨＣＶの検出のための診断方法およびキットを目的としている。
【０００７】
Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙのＵＳ ５，９８５，５４２は、肝臓疾患、例えばＣ型肝炎およびアルコール性肝硬変のためのキットを提供するものであり、これはシトクロームＰ４５０を認識し得る抗体を含有する。
【０００８】
Ｂａｘｔｅｒ ＡｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｅｓｃｈａｆｔのＵＳ ５，９７２，３４７は、中和ヒトＨＣＶ抗体（該抗体は、ＨＣＶ−コアタンパク質およびＮＳ３−タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質に対するものである）に結合する不活性ＨＣＶを含有する、ＨＣＶ感染を処置するための組成物を提供する。
【０００９】
Ａｍｂｉｏｎ ａｎｄ ＣｅｎｅｔｒｏｎのＵＳ ５，９３９，２６２、ＵＳ ５，９１９，６２５およびＵＳ ５，６７７，１２４は、（リボ）ヌクレース耐性、（リボ）核酸セグメントの入手が含まれる、試料中の試験した核酸配列の存在を決定するための非常に広い方法を提供する。
【００１０】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒのＵＳ ５，８６６，１３９は、ＨＣＶ Ｅ−１特異的抗体の存在を決定するためのキットを提供する。ＡｂｂｏｔｔのＵＳ ５，８５４，００１も参照されたい。
【００１１】
ＴｏｎｅｎのＵＳ ５，８００，９８２は、ＨＣＶのＧｒｏｕｐ ＩＩに対して指向された抗体と特異的に反応しうる抗原性ペプチドを開示する。ＴｏｎｅｎのＪＰ １００１９８９７は、ＨＣＶの非構造領域４Ａ（ＮＳ４Ａ）のタンパク質を構成する少なくとも５つの連続したアミノ酸のアミノ酸配列を持つペプチドおよびＨＣＶの非構造領域４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）のタンパク質を構成する少なくとも５つの連続したアミノ酸のアミノ酸配列を持つペプチドを含有するキットを提供する。
【００１２】
技術段階の状況について、ＵＳ ５，８７１，９０４、ＵＳ ５，８６９，２５３， ＵＳ ５，７５０，３３１、ＵＳ ５，７４７，２４１、ＵＳ ５，６６７，９９２、ＵＳ ５，６４５，９８３、ＵＳ ５，６２５，０３４、ＵＳ ５，６１０，００９、ＷＯ ９７０７４００、ＷＯ ９６３７７８３、ＥＰ ５９３２９１、ＥＰ ５９３２９０、ＥＰ ５８６０６５、ＪＰ ４３４９８８５を参照されたい。
【００１３】
血清中の抗ＨＣＶ抗体の検出は、ＨＣＶ感染を評価するために最も広範に使用された試験として現在も用いられている。ＨＣＶゲノムがクローンされた１９８７以来、抗−ＨＣＶ診断アッセイに関する様々な改善版が開発されてきた。現在利用し得る診断キットは、ＨＣＶコア、ＨＣＶポリペプチドの非構造３、非構造４および非構造５領域の一部に対応する４つの組換え抗原の混合物に対する血清抗体を提示している（Ｇｒｅｔｃｈ ＤＲ， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ Ｓｅｐ；２６（３ Ｓｕｐｐｌ １）：４３Ｓ−４７Ｓ）。このスクリーニングＥＬＩＳＡによって陽性とみなされた試料は、同じ４つの抗原に対する抗体の存在が別々に検出されるイムノブロットアッセイによって確認されるはずである。陽性診断には、少なくとも２つの組換え抗原に対する抗体の検出が必要とされる。
【００１４】
抗ＨＣＶ抗体をもつ集団の関連部分については、１つの抗原のみに対する反応性が提示されるので、最終的な診断を定式化することが不可能となる。さらなる問題が、ＨＣＶ−非関連の抗体によって認識され、そして偽陽性診断を生じさせ得る組換え抗原の使用から派生する。そのため、患者に関する補充調査および長期モニタリングが、最終的な診断に到達するに必要とされる。
【００１５】
外来抗原と生物体との接触は、特定の免疫応答を活性化する。体液応答によって検出される抗原のイメージは、宿主抗体によって認識されるエピトープによって定義される。抗体結合部位がエピトープの陰性イメージであると仮定すれば、パラトープを特異的に結合する分子はエピトープの陽性イメージを示すはずである。この考え方によると、体液応答に関する限り、抗原は抗原特異的抗体に結合する特定のリガンドによって忠実に記述される。これらのリガンドの同定によって同じ抗原が知られているおよび／または利用され得るかどうかには関係なく、抗原に対する特異的な体液応答を検出する方法が提供されるだろう。
【００１６】
これらの考えは、ヒトにおけるＨＣＶ感染を含む、感染物と会合する抗体を検出するための診断アッセイを開発するために用いられた。ＨＣＶ陽性血清と共にファージライブラリィをスクリーニングして、抗ＨＣＶ抗体を特異的に結合するペプチドリガンドが同定されている。これは、感染患者由来の血清が様々な結合特異性を有する別の抗体の非常に大きな集団中に散在するウイルス特異的抗体を含有するため、特別の選択ストラテジーを用いることによって達成された。
【００１７】
陰性試料（偽陽性）中の抗体を検出したそれらのリガンドを排除した多数の陰性血清とペプチドをスクリーニングすると、一組の高特異的ペプチドの選択を導いた。非特異的活性の範囲は、短鎖ペプチド配列および天然の抗原からはずれたものの使用によって低下した。この技術は、１９９６年に２月２８日に公表されたＥＰ ０ ６９８ ０９１ Ｂ１に記載されている。ＥＰ ０ ６９８ ０９１において開示されたミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）およびファゴトープ（ｐｈａｇｏｔｏｐｅ）ならびにその実施方法についての総説は、下記を参照されたい：Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９１）， ２２２， ３０１−３１０； Ｇｅｎｅ， １２８ （１９９３）， ５１−５７； Ｇｅｎｅ， １４８ （１９９４）， ７−１３； Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ．１３， ｎｏ．９， ２２３６−２２４３， １９９４； Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ， Ｚｂ． Ｂａｋｔ．Ｓｕｐｐｌ ２４， ４１５−４２５ （１９９４）； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９６） ４５０４−４５１３； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．８７， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ｐｐ． １９５−２０８； Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ （Ｒ．Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｄ．） Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ １９９６， ｃｈａｐｔｅｒ ８； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， （１９９６） ｖｏｌ． ２６７， ．１１６−１２９； Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ３７８， ４９５−５０２， Ｊｕｎｅ １９９７； Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ． １７， Ｎｏ． １３， ３５２１−３５３３， １９９８； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １６， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８， １０６８−１０７３。
【００１８】
これらの選択ストラテジーによって免疫優性な抗ＨＣＶ抗体を最も良好に結合するペプチド構造が同定された。さらに、リガンドの多価ディスプレイは、感受性を検出するために有効な強い親和力の一因であった。このような考察にもかかわらず、ＡＤＡＭ−ＨＣＶ（ＡＤＡＭ抗原擬似体による抗体検出）混合物は、スクリーニングに使用していなかった血清のパネルに対して試験すると、非常に高いが１００％よりも低い感受性を生じた。抗−ＨＣＶ体液応答に関する特定の特徴は、それが主な免疫優性エピトープに関与するものではなく、むしろ数多くの様々なウイルス決定基に対して指向しているものとして、この結果を説明することが可能である。様々なウイルス遺伝子型の存在が、問題をさらに複雑にしている。
【００１９】
現在利用可能な診断キットは、ＨＣＶポリペプチドの広い領域に対応する４つの組換え抗原に対する血清抗体を提示した（Ｇｒｅｔｃｈ ＤＲ， Ｄａｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ Ｓｅｐ；２６（３ Ｓｕｐｐｌ １）：４３Ｓ−４７Ｓ）。陽性診断は、少なくとも２つの組換え抗原に対する血清抗体の検出を必要とする： この理由については、ただ１つの抗原との独特の反応性が明らかにされ得るので、抗ＨＣＶ抗体を用いて集団の関連のある一部に対して最終的な診断を定式化することは不可能である。ＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）は、多様な抗原由来のいくつかの異なる免疫優性エピトープの擬似体を用い、これにより、分析中における解析能力を確実にする。即時結果として、不確定試料の頻度は著しく低下する。
【００２０】
我々は、ＡＤＡＭ−ＨＣＶアッセイ（基本的に上記ＥＰ ０ ６９８ ０９１に開示された戦略を使用して）に関する技術開発のために非常に力を注いだ。ファージライブラリィから選択されたペプチドを、主要キャプシドタンパク質 ｐＶＩＩＩに対するＮ末端融合物として提示する。診断試薬としてファージを用いると、多くの利点がある：それは、非常に柔軟性のある試薬であり、多様なタイプの免疫アッセイに役立ち（Ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｆ． Ｆｅｌｉｃｉ， Ｇ． Ｇａｌｆｒｅ， Ａ． Ｌｕｚｚａｇｏ， Ｐ． Ｍｏｎａｃｉ， Ａ． Ｎｉｃｏｓｉａ ａｎｄ Ｒ． Ｃｏｒｔｅｓｅ ”Ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７， １１６−１２９ − １９９６，　Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １６， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８， １０６８−１０７３）、また少量の生産が容易かつ安価である。
【００２１】
これらの利点にも拘わらず、ファージ粒子のサイズがアッセイで達成され得るペプチド分子の濃度を制限する。ファージキャプシドに対する血清抗体の干渉は、抗ファージ抗体を隔離するために、アッセイ混合物中にキャリアーファージの添加を必要とする。最終的には、この生物学的試薬の大量生産は、いずれにしても、微生物汚染、再現性、品質管理および生産コストに関する問題に直面する。ファージに対して提示されたペプチド配列から誘導される簡単な直線状の合成ペプチドは、ほとんどの場合、有効な抗体検出を達成するための感受性または特異性のいずれかを保持しなかった。
【００２２】
本発明の要約
本発明の目的は、抗原擬似体（ＡＤＡＭ）方法による抗体検出によって、血清中の抗抗原抗体分子の結合特異性を同定することを含み、抗原−感染患者および非感染者からの血清を用いるファージライブラリィをスクリーニングし、該抗原と特異的に会合されるペプチド結合抗体（リガンド）を同定することを含む、感染疾患、例えば、ウイルス感染、特にＣ型肝炎に対する診断を行うための方法である。
特に好ましい態様において、本発明はＨＣＶ感染に関する。
【００２３】
本発明の詳細な説明
第一の好ましい態様において、本発明の方法では、該リガンドを、イン・ビトロのマチュレーション・ストラテジー（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）によって改良する。
第二の好ましい態様において、本発明の方法では、該リガンドは合成ペプチドである。
【００２４】
第三の好ましい態様において、該リガンドを共通のコアに結合する。特に好ましい態様において、該共通のコアを持つ該リガンドはＭＡＰである。ＭＡＰは後に明確にする。また、本発明の別の目的は、下記：
ａ）ｎ陽性血清に対してファージライブラリィを最初にパニングして、ｎファージプールの第１系列を生成すること；
ｂ）ｎ−１プールを含有するｎプール混合物を調製すること；
ｃ）ファージの排除されたプールを生成した血清に対してｎ混合物の各々のアフィニティーセレクション（親和性選択）を行って、ｎファージプールの第二系列を得ること、および所望により、
ｄ）第一パニングに使用したもの以外の全てのｎオリジナル血清を含む混合物に対してｎファージプールの第二系列の各々をさらにパニングすること；
ｅ）全てのｎオリジナル血清の混合物を用いて、ｎファージプールの得られる第二系列をイムノスクリーニングして、陽性クローンを得ること；
ｆ）ファージ分泌コロニーとして該クローンの整列したアレイを用いて、全ての陽性クローンと陽性および陰性血清のパネルとの個々の反応性を試験すること；
ｇ）該ファージ分泌コロニーのレプリカを生成すること；
ｈ）各レプリカを陽性および陰性血清と反応性についてスクリーニングして、陽性血清と特異的に反応するクローンを明らかにすること；
ｉ） 陽性血清からのアフィニティー純化した抗体に対するリガンドとして特異的に反応するファージの各々を用いること；
ｊ）該抗体を先に同定したＨＣＶペプチドと反応性について試験すること；
ｋ） 血清抗体を検出するクローンを選抜すること、
を含む方法によって得られるＨＣＶ特異的リガンドのコレクションである。
【００２５】
また、上記方法から生じるシングルペプチドも、本発明の目的物である。
特に、ＨＣＶに供した本発明の好ましい態様において、下記ペプチド：
−ＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＤＭＴ；
−ＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＩＳ；
−ＹＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＥＰＭ；
−ＮＳＲＷＬＳＫＡＨＧＩＥＧＭ；
−ＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＶＭ；
−ＹＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＴＱ；
−ＫＳＲＥＱＬＳＫＬＨＧＶＤＴＳ；
−ＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＬＴ；
−ＭＷＲＴＷＬＭＫＴＨＧＩＥＳＷ；
−ＭＬＲＴＷＬＭＫＹＱＧＩＥＳＷ；
−ＹＳＲＳＷＬＭＫＡＨＧＬＥＬＧ；
−ＭＭＲＳＹＬＭＫＡＨＧＩＥＳＬ；
−ＭＳＲＬＷＬＭＫＡＨＧＩＳＳＥ；
−ＫＨＳＥＷＬＮＫＡＲＧＩＥＳＷ；
−ＭＳＲＴＦＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷ；
−ＭＳＲＴＷＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷ； ；
−ＡＥＧＥＫＫＬＲＲＳＴＮＷＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＴＲＲＱＴＮＹＱＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＴＬＲＮＡＮＲＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＴＬＲＮＳＮＲＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＫＦＰＧＳＳＴＰＫＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＰＱＤＡＲＦＰＧＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＰＱＤＡＲＦＰＧＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＫＧＡＧＧＡＱＴＶＤＷＡＬＬＶＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＭＱＫＨＦＧＧＡＱＷＩＭＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＬＳＬＫＧＳＧＧＧＱＬＲＡＬＶＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＬＳＬＫＧＳＧＧＡＱＬＲＡＬＶＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＬＬＫＲＳＳＰＰＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＰＩＬＶＧＰＹＬＬＰＲＲＳＲＥＥＡＶＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＰＩＬＶＧＰＹＬＬＰＲＲＳＲＥＥＡＶＤＰＡＫＧＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＰＲＫＡＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＰＤＰＡＫ；
−ＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＰＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＴＱＰＲＧＨＳＹＱＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＬＫＥＲＡＥＭＳＡＲＫＴＬＧＡＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＦＹＱＩＰＲＲＭＥＴＫＹＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＮＳＲＥＷＬＳＫＡＨＧＩＥＧＭＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＬＴＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＤＭＴＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＴＳＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＶＭＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＳＲＥＱＬＲＫＬＨＧＦＤＴＳＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＭＲＮＹＬＮＫＡＦＧＩＥＧＭＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＥＬＴＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＳＲＲＥＹＳＮＫＡＦＧＩＥＴＱＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＲＲＥＹＬＮＫＡＦＧＩＥＧＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＳＲＲＥＷＬＮＫＲＦＧＩＥＹＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＭＳＲＴＷＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＰＥＷＬＮＫＡＲＧＩＤＲＳＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＫＳＲＥＱＬＳＫＬＨＧＶＤＴＳＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＲＥＱＬＮＫＭＦＧＩＥＩＳＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＹＳＲＳＷＬＭＫＡＨＧＬＥＬＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＭＭＲＳＹＬＭＫＡＨＧＩＥＳＬＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＭＳＲＬＷＬＭＫＡＨＧＩＳＳＥＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＰＱＰＱＥＶＨＶＹＲＥＱＬＧＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＧＥＶＬＹＲＧＦＤＥＶＧＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＧＥＰＹＶＩＥＲＧＭＱＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＲＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＡＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＳＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ；
−ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＲＨＹＳＷＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＡＨＹＳＷＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＳＨＹＳＷＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＲＦＷＫＶＰＤＹＤＰＰＡＡＧＧＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＴＥＳＳＶＳＳＴＬＡＤＬＡＳＫＴＦＧＳＡＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＴＬＡＤＬＡＴＭＴＦＧＳＴＤＰＡＫ；
−ＡＥＧＥＦＧＬＡＤＬＡＴＬＴＦＧＳＰＤＰＡＫ；
は、本発明のさらなる目的物である。
【００２６】
本発明のコレクションについて、工程ａ）の好ましいファージライブラリィは、ｐＶＩＩＩ−１２ａａである。
【００２７】
本発明のコレクションについて、工程ｋ）から選抜された好ましいクローンの挿入物は下記配列である：
１．ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧ；
２．ＲＡＴＬＳＮＥＨＧＩＴＩＧ；
３．ＤＱＲＥＮＷＦＫＹＨＧＦＧ；
４．ＥＷＲＲＹＭＳＤＩＨＧＹＧ；
５．ＤＳＬＲＹＭＹＶＭＰＧＦＧ。
【００２８】
本発明のコレクションにおいて、好ましくはファージライブラリィを生成し、そこで反応性クローン、好ましくは最も反応性の高いクローンを、クローン配列の各アミノ酸がその他の任意のアミノ酸によって独立して置換されるように、部分的に変異せしめる。
【００２９】
本発明のコレクションにおいて、好ましい該クローンは、好ましい挿入配列：ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧを持つ。
【００３０】
本発明のコレクションにおいて、ファージライブラリィで、ランダム配列は、２つのシステイン残基によって挟み得る。この態様は、本発明の広い開発に適用でき、ＨＣＶの場合に限定されない。
【００３１】
本発明の目的は、感染物質、例えばウイルス、特にＨＣＶに影響された疑いのある患者において、感染物質、例えばウイルス、特にＨＣＶを検出するための診断アッセイの調製に上記コレクションを使用することである。
【００３２】
本発明の目的は、上記コレクションを含む診断目的のためのキットである。
【００３３】
本発明の目的は、本明細書中の開示した方法からコレクションの形態またはシングルペプチド形態のいずれかで、免疫原性ペプチドを得ることである。該ペプチドは免疫原性として有効であり、ワクチン、特にＨＣＶに対するワクチンの調製に有用である。適切には、該ペプチドは、上記のキットの形態である。
【００３４】
有利なことには、抗原を基にしたシステムとは対照的に、我々が試験した診断アッセイは内蔵型のアップグレード能を持つ： 特別な選択は、応答が検出されない血清を用いて行い得る。類似の方法を用いて、様々なＨＣＶ遺伝子型を識別するペプチドパネルを同定でき、それにより高価かつ労働集約型のＰＣＲ法を安価かつ迅速なＥＩＡに代え得る。
【００３５】
本発明は、実施例および図によってさらに詳細に説明する。後者においては：
図１は、スクリーニングから誘導されたクローンの特徴を示す。選択されたクローンのアミノ酸配列は１文字コードで報告する。上段と低段のパネルは、オリジナルまたは二次ライブラリィから各々誘導された配列を提示する。外来エピトープをフランキングするｐＶＩＩＩ配列は、（ＮＨ２）ＡＥＧＥＦ［外来エピトープ］ＤＰＡＫである。グレイボックスは、オリジナルライブラリィからのクローン中で任意の与えられた位置で頻繁に存在する残基を示す。二次ライブラリィからのペプチドのコンセンサス配列に寄与する残基を黒で示す。報告データは、２つの独立したアッセイからの平均値であり、表示のファージに対して測定した吸光度（Ａ＝Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）と、ｗｔファージｐＣ８９（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）に対して測定した吸光度との違いを示す。＊は、試験しなかった血清を示す。
【００３６】
図２は、同じ抗原決定基を擬態するファージの同定を示す。クローンＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ８、ＰＡ１２またはＰ１８（第１欄に示す）による陽性血清Ｃ６５によって精製された抗体親和性は、同じファージ（第１欄に示す）に対する反応性についてＥＬＩＳＡで試験した。
【００３７】
報告データは、２つの独立したアッセイからの平均値であり、表示のファージに対して測定された吸光度（Ａ＝Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）と、ｗｔファージｐＣ８９（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）に対して測定された吸光度との違いを示す。
【００３８】
図３は、ライブラリィｐＶＩＩＩＡ１２の選択から誘導されたプールのＥＬＩＳＡ反応性を示す。陽性血清Ｃ７６に対するライブラリィｐＶＩＩＩＡ１２をパニングするライブラリィから誘導されたファージプールを、陽性血清Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ２９、Ｃ４０、Ｃ４７、Ｃ６５、Ｃ７３、Ｃ７４、Ｃ７６、Ｃ８３およびＣ８５との反応性について、ＥＬＩＳＡで試験した。白、グレイおよび黒の棒は、ｗｔファージ、ｐＶＩＩＩＡ１２ライブラリィおよびプールｐ７６ＩＩの各々の反応性を示す。ＥＬＩＳＡの結果は、Ａ＝Ａ４０５ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして表現した。報告データは、２つの独立したアッセイからの平均値である。
【００３９】
図４は、ＡおよびＢを示す。Ａ．ＡＤＡＭ−ＨＣＶ混合物と血清との反応性。カット・オフ値（ＣＯ＝０．２３２）をＣＯ＝Ｎ＋５σとして計算した。式中、Ｎおよびσは、陰性対照血清を用いて得られたデータの各々平均および標準偏差である。Ｂ．イタリア赤十字から得た血清のパネルに対するＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡ。カット・オフ値（ＣＯ＝０．２５２）をＣＯ＝Ｎ＋５σとして計算した。式中、５つのＮおよびσは、陰性対照血清を用いて得られたデータの各々平均および標準偏差である。材料および方法に記載のＥＬＩＳＡにより、ヒト血清中に存在する抗体とペプチドとの結合を検出した。２つの独立した実験からの平均値をあつめた。結果は、測定シグナルとカット・オフ値（Ｓ／ＣＯ）の比として表現する。各グループの血清について試験した血清の数を表示する。
【００４０】
図５は、不確定血清のパネルに対するＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡである。左側の欄は、結合特異性に従ってグループ分けし試験したＨＣＶペプチドの名前を示す。次ぎの４つの欄は、列挙したペプチドと陽性（ｃ２５およびｒ１５）および陰性（ｒ６およびｒ１３）対照血清との反応性を示す。各追加欄は、列挙したペプチドと不確定血清との反応性を示す。ヒト血清中に存在するＨＣＶペプチドと抗体との結合は、材料および方法に記載のＥＬＩＳＡにより検出した。２つの独立した実験からの平均値を測定した。各々ペプチドについて、カット・オフ値（ＣＯ）をＣＯ＝Ｎ＋５σとして計算した。式中、Ｎおよびσは、３１の陰性対照血清から得られた各々の平均および標準偏差である。結果は、測定シグナルとカット・オフ値（Ｓ／ＣＯ）の比として表示する。
【００４１】
図６は、陽性、陰性および不確定血清に対するＡＤＡＭ−ＨＣＶ／ＳＩＡである。下記ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドを、結合特異性に従ってグループ分けし、ナイロン膜上に固定化し、１０バンドを得た： ｍ１９０９．２およびｍ１９１３．２（Ａ）； ｍ１９０１．３１、ｍ３３２２．３、ｍ３３６２．３（Ｂ）； ｍ１９７７．１ （Ｃ）； ｍ３５５１．３ （Ｄ）； ｍ３５６６．３ （Ｅ）； ｍ８５８、ｍＦ７８およびｍＨ１（Ｆ）； ｍＡ１２．１、ｍＡ１２．２およびｍＡ１２．１２ （Ｇ）； ｍＢ１１．１７（Ｈ）； ｍＧ２１．２ （Ｉ）； ｍ１９２９Ａ３．１、ｍ１９２９Ｃ３．４およびｍ１９２９．２１ （Ｊ）。精製したヒトＩｇＧを含有する追加のラインは、内部陽性対照として含める。ヒト血清中に存在するＨＣＶペプチドと抗体との結合を、材料および方法に記載のように検出した。
【００４２】
本発明の最も好ましい態様において、８つの同一ペプチド配列のＣ−末端が共通のコアに結合する多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ．： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５ （１９８８） ５４０９−５４１３）を合成し、ファージ由来ペプチドの特異性に匹敵するレベルの特異性を維持する試薬を準備する。ファージ−スキャホルドの除去は、固定化リガンドの高いペプチド濃度を可能にし、これは高い感受性をもたらす。
【００４３】
好ましくは、本発明で得られるＨＣＶ特異的リガンドのパネルは、ＨＣＶ ＮＳ３を擬態するペプチド、免疫優性なＨＣＶ抗原を包含する。われわれの知る限りでは、好ましい態様において、これは、免疫優性なＮＳ３決定基を擬態する短いペプチドについて初めて記載されたのものである。ＮＳ３タンパク質のペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）分析により、陽性血清とまれにしか反応しない比較的長い配列（Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０６：６６６−６７２）であった。
【００４４】
対照的に、別のアプローチ（Ｓａｎｔｉｎｉ Ｃ， Ｂｒｅｎｎａｎ Ｄ， Ｍｅｎｎｕｎｉ Ｃ， Ｈｏｅｓｓ ＲＨ， Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ， Ｃｏｒｔｅｓｅ Ｒ， Ｌｕｚｚａｇｏ Ａ， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ａｎ ＨＣＶ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９８ Ｓｅｐ １１；２８２（１）：１２５−３５； Ｐｅｒｅｂｏｅｖａ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ １９９８ Ｏｃｔ； ５６ （２）： １０５−１１）により、抗原特性を保持する大きなタンパク質ドメインを単離した。即ち、我々が開発したこのアプローチは、そのＨＣＶ抗原の使用またはそれについての情報に依存しない本質的な特性を含んでおり、抗原が知られていないシステムにも適用でき、そして、抗原発見に導く工程を創出するであろう。
【００４５】
ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリィ（ファージライブラリィ）は、抗ＨＣＶ血清抗体によって特異的に認識されるリガンドを同定するための強力な手段である。ファージ由来ペプチドは、直線的、立体構造的および非タンパク質的（ｎｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）エピトープを擬態することができるので、広範な擬態潜在性を持つ（Ｆｅｌｉｃｉ Ｆ， Ｌｕｚｚａｇｏ Ａ， Ｍｏｎａｃｉ Ｐ， Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ， Ｓｏｌｌａｚｚｏ Ｍ， Ｔｒａｂｏｎｉ Ｃ． ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ． １９９５；１：１４９−８３；　Ｚｗｉｃｋ ＭＢ， Ｓｈｅｎ Ｊ， Ｓｃｏｔｔ ＪＫ． ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ａｕｇ；９（４）：４２７−３６を参照されたい）。
【００４６】
本発明において、効率的なＨＣＶ特異的リガンドの広範なコレクションの同定、および血清中の抗ＨＣＶ抗体の検出のための新規タイプの診断用キットの開発を報告する。
【００４７】
本発明で提供されるペプチドは、診断物質または免疫原またはワクチンとして有用である。
【００４８】
本発明の免疫原およびワクチンを含む医薬組成物は、当分野での通常の経験を有する技術者が理解できる従来的方法で調製する。例えば、それらは、ＥＰ０６９８ ０９１に記載されたように調製できる。
【００４９】
下記実施例は、さらに本発明を説明するものである。
【００５０】
実施例
新規結合特異性を有するＨＣＶ特異的リガンドの同定
ファージライブラリィｐＶＩＩＩ−１２ａａを、８つの陽性血清（Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ４０、Ｃ４７、Ｃ６２およびＣ６５）に対してパニングし、８つのファージプールを生成した（ｐ１３Ｉ、ｐ１４Ｉ、ｐ２７Ｉ、ｐ２９Ｉ、ｐ４０Ｉ、ｐ４７Ｉ、ｐ６２Ｉおよびｐ６５Ｉとして各々示す）。これら８つのファージプールのうちの７つの異なる組合せを各々含有する８つの混合物を調製した。各混合物を、排除したファージプールを生成した血清を用いてアフィニティーセレクションを行った： 例えば、プールｐ１３Ｉ、ｐ１４Ｉ、ｐ２７Ｉ、ｐ２９Ｉ、ｐ４０Ｉ、ｐ４７Ｉおよびｐ６２Ｉを含んだ混合物、混合物Δｐ６５を血清Ｃ６５に対してパニングした。各々得られる８つのファージプール（ｐ１３ＩＩ、ｐ１４ＩＩなどとして示す）を、前記選択に使用したもの以外の全てオリジナル血清からなる混合物に再度個々にパニングした。例えば、プールｐ１３ＩＩを、血清Ｃ１４、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ４０、Ｃ４７、Ｃ６２およびＣ６５の混合物でパニングした。
【００５１】
全８つのオリジナル血清の混合物を用いて得られる８つのファージプールをイムノスクリーニングして、多数の陽性クローンを明らかにした。これらクローンと陽性および陰性血清のパネルとの個々の反応性を、ファージ分泌コロニーとしてクローンの整列したアレイを生成することによって明らかにした。それらの増殖の後、完全な一組のクローンを、整列したアレイとしてマルチピン装置を用いて、ニトロセルロースフィルター上にスポットした。同じ方法を反復し、多くのレプリカを生成し、次いで、陽性および陰性血清とそれらの反応性について、個別にそして同時にスクリーニングし、陽性血清と特異的に反応した多くのクローンを明らかにした。これらファージの各々を陽性血清からのアフィニティー純化した抗体への結合物として用いた。次いで、これら抗体を、先に同定したＨＣＶペプチドの４グループのいずれかとの反応性について、ＥＬＩＳＡで試験した（Ｐｒｅｚｚｉ， Ｃ．， Ｎｕｚｚｏ， Ｍ．， Ｍｅｏｌａ， Ａ．， Ｄｅｌｍａｓｔｒｏ， ＾Ｒ， Ｇａｌｆｒｅ’， Ｃ．， Ｃｏｒｔｅｓｅ， Ｒ．， Ｎｉｃｏｓｉａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｏｎａｃｉ， Ｐ． １９９６． １． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５６： ４５０４−４５１３．， Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １６， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８， １０６８−１０７３を参照されたい）。この分析により、新規結合特異性を有する血清抗体を検出した１２のクローンを選抜した、即ち、それらは、すでに同定されてものとは異なった偽抗原決定基を示す。
【００５２】
配列分析から、５つの異なった配列を明らかにした。これら５つのクローン（ＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ８、ＰＡ１２およびＰＡ１８）各々からの培養上清物を、調製し、それらのＥＬＩＳＡ反応性を、３０の異なる陽性および２４の陰性血清（図１）を用いて試験した。クローンＰＡ８およびＰＡ１２のみが、陽性血清との統計学的に有意な反応性を示した（ｐ＜０．２）。
【００５３】
次いで、ファージＰＡ１を使用して、血清Ｃ６５からの抗体を免疫純化した。これら精製した抗体は、クローンＰＡ３、ＰＡ８、ＰＡ１２、ＰＡ１８、さらにクローンＰＡ１それ自身と特異的に反応し、このことは、全てのこれらファージが、同じ特異性を持つ抗体によって認識した独特のクラスにグループ分けし得ることを示す（図２）。上記クローンのいずれかとの反応性は、野生型を結合物として使用する場合、または抗体を陰性血清からアフィニティー精製した場合に全く検出されなかった。
【００５４】
同じグループからの異なったクローンを使い、血清抗体を免疫純化した場合、または異なった陽性血清を用した場合、我々は、図ｌで報告した反応性と一致する結果を得た。例えば、ファージＰＡ３を、同じ血清からの免疫純化した抗体に使用した場合、これら抗体は、同じＰＡ３に加えて、クローンＰＡ８およびＰＡ１２と反応した。これらの結果は、ペプチド配列の中の弱い類似性によると示唆されるように、クローンＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ８、ＰＡ１２およびＰＡ１８が、同じＢ−細胞エピトープと反応する抗体を検出することを示す（図１）。
【００５５】
ＨＣＶペプチドのアフィニティー・マチュレーション（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）
クローンＰＡ１２の配列が部分的に変異されたファージライブラリィを、生成した。ｐＶＩＩＩＡ１２と呼ばれるこの「２次」ライブラリィにおいて、オリゴヌクレオチドを、ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧ 配列の各アミノ酸を独立して他のアミノ酸によって置換するように合成した： 理論的には、各部位での置換は、２０％の頻度で起こる。さらに、ランダム残基を、外来ペプチド配列の両部位で包含した。ｐＶＩＩＩＡ１２ライブラリィを、１２の陽性血清（Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ２２、Ｃ５８、Ｃ６０、Ｃ７６、Ｃ８３、Ｃ８５、Ｃ１４１およびＣ１７７）で２回パニングした。
【００５６】
ＥＬＩＳＡで試験した場合、ファージプールｐ７６ＩＩ、ｐ１４１ＩＩおよびｐ１７７ＩＩ（血清Ｃ７６、Ｃ１４１およびＣ１７７、各々を用いる選択から誘導される）は、陽性血清のパネルと最も高くかつ最も広い反応性を示した。これを、さらに分析した（図３）。この反応性を基にして、血清Ｃ４０、Ｃ１４１およびＣ１７７各々を用いて、ファージプールｐ７６ＩＩ、ｐ１４１ＩＩおよびｐ１７７ＩＩをイムノスクリーニングした。各々のプールについて、この分析は、上記に示したようなフィルターレプリカ法によって、様々な陽性および陰性血清との反応性について独立して試験したいくつかのクローンを選抜した。この最終スクリーニングにより、陽性血清と特異的に反応する５１のクローンを選択した。
【００５７】
配列分析によって、１６の異なる配列を明らかにした（各々、プールｐ７６ＩＩ、ｐ１４１ＩＩおよびｐ１７７ＩＩから誘導された８、５および３）。これらクローンの各々からの培養物上清を調製し、それらのＥＬＩＳＡ反応性を、３３の異なる陽性および２４の陰性血清で試験した（図１）。
【００５８】
クローンＰ４０．１７およびＰ４０．７を、試験したより高い陽性血清（４２％各々）と反応させた。クローンＰ１４１．７およびＰ１７７．２２との組合せが、該パネルの７０％の陽性血清を記録した。選択したペプチドのアライメントは、コンセンサス配列（Ｍ／Ｙ）ＳＲＥ（Ｗ／Ｑ）Ｌ（Ｍ／Ｎ）Ｋ（Ａ／Ｌ）（Ｈ／Ｆ）ＧＩＥＳ（Ｗ／Ｍ）を明確にした。
【００５９】
別のＨＣＶ特異的リガンドの同定
類似の選択ストラテジーを、先に同定されたものとは異なる新規結合特異性を有するリガンドの同定を目指して実施した。ランダム配列がディスプレイペプチドの立体構造を制限する２つのシステイン残基によって、完全にランダムまたは挟まれる様々な長さのファージライブラリィをスクリーニングした。
【００６０】
血清およびファージプールの多様な組み合せを用い、ファージライブラリィを選択した。目的とする陽性血清との反応性プロファイルを示すファージプールをさらに分析した。レプリカスクリーニングによって、多数の個々のクローンに関する反応性を評価して、陽性血清と特異的な反応性を提示するファージを選抜した。
【００６１】
我々は、目的の反応性パターンを有するクローンに注目した。
ＨＣＶペプチドから精製した抗体親和性を有するクローンを探索するために、先に同定したペプチドの抗原決定基を擬態したクローンを排除した。これらの選択工程を乗り越えたクローンを、それらＨＣＶ特異性を統計学的に定義するために、多数の陽性および陰性血清を用いて、ＥＬＩＳＡで試験した。
【００６２】
これら選択されたクローンを、二次ライブラリィを創出およびスクリーニングすることによってさらに改良した。二次ライブラリィのオリジナルクローンの配列またはクローン集団を部分的に変異させ、再びスクリーニングし、改良した結合特異性を有する変異体を選抜した。この工程を、すでに述べてきた適合する様々なストラテジーにより実施した（Ｕｒｂａｎｅｌｌｉ， Ｚｈｕの論文を参照されたい）。この広範な、そして反復した努力により、異なる結合特異性を有するＨＣＶ特異的血清抗体を特異的に結合するリガンドに関する７つの新規グループを同定した。
【００６３】
血清を用いてＨＶＲ１変異体のファージディスプレイリポーターをスクリーニングし、多数の陽性血清と特異的に反応するペプチドを単離した（Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．； Ｎｉｃｏｓｉａ ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）。このスクリーニングから誘導された一組のＨＶＲ１ファージ由来ペプチドを、我々の血清のパネルとの反応性について分析した。３つのペプチド（ｍＦ７８、ｍＨ１およびｍ８５８）を、陽性血清と反応性の最も高くかつ特異的な頻度によって同定した。
【００６４】
要約すると、先に同定した４つのグループを包含する１２のリガンドを同定した（Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １６， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８， １０６８−１０７３， Ｐｒｅｚｚｉ， Ｃ．， Ｎｕｚｚｏ， Ｍ．， Ｍｅｏｌａ， Ａ．， Ｄｅｌｍａｓｔｒｏ， ＾Ｒ， Ｇａｌｆｒｅ’， Ｃ．， Ｃｏｒｔｅｓｅ， Ｒ．， Ｎｉｃｏｓｉａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｏｎａｃｉ， Ｐ． １９９６． １． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５６： ４５０４−４５１３．）； 図５、グループＡ〜Ｌを参照されたい。
【００６５】
ファージ−由来から合成ペプチドへ
１２のグループのＨＣＶ−リガンドから誘導された２２のペプチド配列を、オクタ−分岐多重抗原ペプチド（ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチド）として合成した。この分子において、８つの同一ペプチド配列を、ファージキャプシドのｐＶＩＩＩ−融合ペプチドのものと類似する多重ディスプレイを形成する共通のコアに対してリジン・フォークにより結合した。ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドの配列を下記に報告する。
【００６６】
ｍ８５８　　ＥＴＹＴＴＧＧＡＡＡＲＴＴＳＧＬＴＳＬＦＳＰＧＰＳＱＮ
ｍ１９０１．３１　　ＡＥＧＥＦＫＫＦＰＧＳＳＴＰＫＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ
ｍ１９０１．３４　　ＡＥＧＥＦＰＥＤＴＦＰＧＳＫＬＩＬＳＧＤＰＡＫＡＡＦＤＳＬ
ｍ１９０９．２　　ＡＥＧＥＦＫＴＲＲＮＴＮＹＱＤＰＡＫ
ｍ１９１３．２　　ＡＥＧＥＦＫＴＬＲＮＴＮＲＬＤＰＡＫ
ｍ１９２９．２１　　ＡＥＧＥＦＡＴＡＳＰＴＨＹＴＳＥＬＤＰＡＫ
ｍ１９２９Ａ３．１　　ＡＥＧＥＦＴＴＡＳＰＴＨＦＬＶＰＬＤＰＡＫ
ｍ１９２９Ｃ３．４　　ＡＥＧＥＦＡＴＡＰＰＳＨＹＳＷＤＰＡＫ
ｍ１９７７．１　　ＡＥＧＥＦＰＹＬＬＰＲＲＳＲＥＥＡＶＤＰＡＫ
ｍ３３２２．３　　ＡＥＧＥＦＰＱＤＡＲＦＰＧＧＧＤＰＡＫ
ｍ３３６２．３　　ＡＥＧＥＦＬＳＬＫＧＳＧＧＧＱＬＲＡＬＶＤＰＡＫ
ｍ３５５１．３　　ＡＥＧＥＦＲＬＧＶＲＡＬＲＫＡＰＤＰＡＫ
ｍ３５６６．３　　ＡＥＧＥＦＫＴＳＶＲＳＶＰＲＡＲＰＰＩＮＧＤＰＡＫ
ｍＡ１２．１　　ＡＥＧＥＦＮＳＲＥＷＬＳＫＡＨＧＩＥＧＭＤＰＡＫ
ｍＡ１２．２　　ＡＥＧＥＦＲＳＲＥＱＬＳＫＬＦＧＩＤＬＴＤＰＡＫ
ｍＡ１２．１３　　ＡＥＧＥＦＭＳＲＴＷＬＭＫＡＨＧＩＥＳＷＤＰＡＫ
ｍＢ１１．１７　　ＡＥＧＥＦＲＥＬＬＹＥＡＦＤＤＭＥＧＤＰＡＫ
ｍＦ７８　　ＱＴＨＴＴＧＧＱＡＧＨＱＡＨＳＬＴＧＬＦＳＰＧＡＫＱＮ
ｍＧ２１．２　　ＡＧＥＰＹＶＩＥＱＧＭＭＤＰＡＫ
ｍＨ１　　ＱＴＨＴＴＧＧＶＶＧＨＡＴＳＧＬＴＳＬＦＳＰＧＰＳＱＮ
ｍＮ１５．３　　ＡＥＧＥＦＧＬＡＤＬＡＴＬＴＦＧＳＴＤＰＡＫ
ｍＳ４８．５　　ＡＥＧＥＦＲＦＷＫＶＰＤＹＤＰＰＡＡＧＧＤＰＡＫ
一方、それらの分析性能に対するデータを表１に要約し、本明細書に図と共に添付した。
【００６７】
多くの場合において、外来エピトープ（ＮＨ２ＡＥＧＥＦおよび／またはＤＰＡＫ‐ＣＯＯＨ）を挟むｐＶＩＩＩ配列が、対応するペプチドの結合特異性に関連していることを示した。
【００６８】
これら２２ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチド（ＡＤＡＭ−ＨＣＶ混合物）を含有する混合物を用いて、ＥＩＡ（ＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡ）によって、抗ＨＣＶ抗体の存在を検出した。ペプチドのＡＤＡＭ−ＨＣＶ混合物を、マルチウェルＥＬＩＳＡプレートの底部で不動態コーティングによって固定化し、１：４０稀釈の血清試料を、４０分間インキュベートした。ペプチドに結合したヒト抗体を、抗ヒト接合体と２０分間インキュベートして検出し、比色酵素反応により測定した。
【００６９】
図４Ａで報告したように、ＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡは、陽性および陰性血清とを効率的に識別した。
【００７０】
ＡＤＡＭ‐ＨＣＶ／ＥＩＡ
ＨＣＶ陽性およびＨＣＶ陰性血清のパネルを、ＡＤＡＭ／ＨＣＶ−ＥＩＡによる抗ＨＣＶ抗体の存在について試験した（図４Ｂ）。該試験は、このパネル中に含まれる全ての陽性血清を同定し、また全ての陰性試料を同定することによって、１００％の特異性を示した。
【００７１】
不確定試料
市販のＨＣＶ−確認アッセイにしたがって、不確定として診断された血清のコレクションを、様々な源から得た。２３のＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドを、３１の試料を用いて、それらの反応性について、ＥＬＩＳＡで個々に試験した（図５）。６つの試料は、試験したＭＡＰのいずれとも反応しなかった。即ち、陰性として評価した。８つの試料は、１つの抗原のみを認識した。即ち、不確定分析を確認した。最終的に、１７の試料は、様々なグループのペプチドに対して２つ以上の反応を示した、即ち、陽性として同定した。
【００７２】
ＡＤＡＭ−ＨＣＶ ストリップ・イムノブロットアッセイ（ＡＤＡＭ−ＨＣＶ／ＳＩＡ）
ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドを、活性化したナイロン膜上に共有結合的に固定化し、１０のバンドを有するストリップを得た。各ラインは、図６の解説で説明したように、同じ結合特異性を持つ様々なペプチドを包含した。精製ヒトＩｇＧを含有する対照系を、内部陽性対照として含む。不確定血清のパネルから選択された多くの試料を、血清試料をストリップとインキュベートすることによって固定化抗原との反応性を試験した。個々の抗原によって補足した抗ＨＣＶ抗体を、抗ヒト酵素接合体とストリップをインキュベートし、次いで比色酵素反応により画像化した。ペプチドバンドを有する試験片の反応性を、各バンドの強度と内部陽性対照のものと視覚的に比較することによって測定した。
【００７３】
ＡＤＡＭ−ＨＣＶ／ＳＩＡは、ＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドによって擬態したいくつかの異なるウイルス決定基に対して、試験した８つの全陽性血清の反応性を明らかにした。８つの陰性血清を試験した場合、反応性を検出できなかった（図６）。
【００７４】
我々は、選択された数の不確定試料をＡＤＡＭ−ＳＩＡによって分析した。図６に示したように、８つの不確定血清の分析によって、個々のペプチドを用いて、ＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡによって得られた結果を確認した。結果は２つのアッセイに相当し得る感受性を示した。
【００７５】
材料および方法
ファージライブラリィ
４つの異なったファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリィ：ｐＶＩＩＩ９ａａ、ｐＶＩＩＩ９ａａ＿ｃｙｓ、ｐＶＩＩＩ−１２ａａ、ｐＶＩＩＩ１５ａａおよびｐＶＩＩＩＡ１２を、リガンド源として用いた。ｐＶＩＩＩ９ａａ（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、ｐＶＩＩＩ１２ａａおよびｐＶＩＩＩ１５ａａは、主なコートタンパク質ｐＶＩＩＩのＮＨ２−末端に融合するものとして、フィラメント様ファージに提示したランダム９量体、１２量体および１５量体の各々から構成される３つの異なるライブラリィである。ｐＶＩＩＩ９ａａ＿ｃｙｓは、ランダムノナペプチドが２つのシステイン残基に挟まれたランダムライブラリィである （Ｌｕｚｚａｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。この後者ライブラリィにおいて、システインは、ディスプレイペプチドのある程度の立体構造を制限するジスルフィド架橋の形成を促進する。該ｐＶＩＩＩＡ１２ライブラリィを、アミノ酸配列ＳＲＥＱＬＮＫＬＦＧＩＥＧをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって構築した。レジン−スプリッティング（ｒｅｓｉｎ−ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）合成法（Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）を採用することによって、各アミノ酸位置を、２０％の頻度でＮＮＳトリプレットで置換した。さらに、ランダム残基は外来ペプチド配列の両部位を包含する。全ての５つのライブラリィを記載のように生成した（Ｆｏｌｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。微生物の形質転換で得られた個々のクローンの数から誘導されるようにライブラリィの複雑さは、５つのライブラリィ各々に対して約１ｘ１０８であった。
【００７６】
ヒト血清
この研究で使用したヒト血清を、輸血センターおよび病院からのドナー血液の拒絶ユニットと、健康な有志者からのユニットからランダムに収集した。即ち、この研究で使用した多くの不確定試料は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ ｄｉ Ｓａｎｉｔａ， Ｒｏｍａ （Ｉｔａｌｙ） および ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｔｒａｓｆｕｓｉｏｎｅ Ｓａｎｇｕｅ ｄｅｌｌａ Ｃｒｏｃｅ Ｒｏｓｓａ Ｉｔａｌｉａｎａ， Ｒｏｍａ （Ｉｔａｌｙ）から得た。血清を、第２次世代ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ試験系 （Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｅｒｓｅｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）によってＨＣＶに対する抗体の存在について試験し、第１次世代ドット・ブロットイムノアッセイＲＩＢＡ ＨＣＶ試験系（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ．， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を用いて確認した。また、血清を、ＡＵＳＡＢ ＥＩＡ試験（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）および第３次世代ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ ＥＩＡ試験（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ， Ｓｏｕｔｈ Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ）によってＨＢｓＡｇおよびＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２に対する抗体の非存在について試験した。抗ＨＣＶ抗体の存在に対して陽性であるが抗ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＩＶ抗体に対して陰性である試料は、ＨＣＶ陽性血清として、この実験に包含される。全３つの抗原に対する抗体の存在に対する血清陰性はＨＣＶ陰性血清としてこの研究に包含される。
【００７７】
アフィニティーセレクションおよびイムノスクリーニング
ＨＣＶ陽性血清を記載のようにファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリィをアフィニティーセレクションに用いた（Ｆｏｌｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｐｒｅｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。アフィニティーセレクションから誘導されたクローンを記載の血清を用いてイムノスクリーニングした （Ｐｒｅｚｚｉ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｍｉｎｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ）。
【００７８】
ファージクローンを用いるＥＬＩＳＡ
ファージ上清およびヒト血清を用いるＥＬＩＳＡを下記のように行った。ファージ上清を、前に発表されているように（Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、ＤＨ５α−Ｆ’感染細胞から調製した。マルチウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、一晩、４℃、２００μｌの抗−ｐＩＩＩモノクローナル抗体５７Ｄ１（Ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ （ｐＨ９．６）中、抗体１μｇ／ｍｌの濃度で被覆した。被覆溶液を除去した後、プレートを、３７℃、６０分間、ＥＬＩＳＡ ブロッキング緩衝液（０．１％カゼイン、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ＰＢＳ中）でインキュベートした。プレートを、数回、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ （洗浄緩衝液）で洗浄した。ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液と澄んだファージ上清の１：１の混合物を、各々のウェルに添加し、１時間、３７℃で結合させた。１：４０希釈したヒト血清を、３０分間、室温で、ファージ ｆ１１．１のｍｌあたり５ｘ１０１０ プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）（Ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、ファージｆ１１．１（ｄｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．）で感染させたＤＨ５α−Ｆ’細胞から抽出したタンパク質２５μｌ／ｍｌおよびＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液で非処理ラットハイブリドーマー細胞からの上清２５μｌ／ｍｌと共にインキュベートした。
【００７９】
ファージ上清を含有する混合物を除去した後、プレートを、洗浄緩衝液で洗浄し、２００μｌのプレインキュベートした血清混合物を各ウェルに添加し、６０分間、３７℃でインキュベートし、次いで洗浄緩衝液で洗浄し、２次抗体ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％ Ｔｒｉｔｏｎ、１％ ウマ血清、５０％ 胎児ウシ血清、Ｍａｂ上清５μｌ／ウェル）の、１：２０．０００稀釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ−接合体を（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）各ウェルに添加した。３７℃で、３０分間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を、２００μｌのＴＭＢ液体基質系（ＳＩＧＭＡ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）とのインキュベーションによって検出した。１５分間の展開後、反応を、２５μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止した。プレートを、自動化ＥＬＩＳＡリーダーで読み（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）、結果をＡ＝Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして表現した。表示項目に記載したＥＬＩＳＡデータは、２つの独立したアッセイからの平均値である。それらは、０．３カット・オフ値以上に大きく、ｗｔファージに対して観察されたバックグラウンドシグナルからの３σ（σ ＝ ｛１／２［σ２ｐ＋ σ２ｗ］｝１／２）以上に異なる場合、統計学的に有意であると考えられる。
クローンＰＡ８およびＰＡ１２を参照したｐ値は、陽性および陰性血清の反応性の観察された度数分布が、χ２テストによって統計学的に同じであるという確率である。
【００８０】
血清からのファゴトープ−特異的抗体に関するアフィニティー精製
６０ｍｍの直径のポリスチンレンのペトリディッシュ（Ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， ＮＪ）を、一晩、４０℃で、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中、１ｘ１０１１ ＣｓＣｌ−精製ファージ粒子／ｍｌ溶液で被覆した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ディッシュを、６０分間、３７℃、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液とインキュベートした。ヒト血清（ＥＬＩＳＡ ブロッキング緩衝液で１／１００稀釈）、１ｘ１０１２ ｆ１１．１ ｐｆｕ／ｍｌおよび２５μｌ／ｍｌのＸＬ１−ブルー 細胞タンパク質抽出物の混合物を、６０分、室温でインキュベートした。ブロッキング溶液を除去した後、プレインキュベート混合物を、プレートに添加し、一晩４℃でインキュベートした。血清稀釈物を除去し、ディッシュを洗浄緩衝液で洗浄した。結合抗体を、１０μｇ／ｍｌＢＳＡを添加した０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ ２．７）によって溶出し、中和した。
【００８１】
ファージクローン特徴分析
アフィニティー精製抗体を、ファゴトープに対するそれらの反応性について標準的ＥＬＩＳＡで試験した。通常、マルチウェルプレートを、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中ＣｓＣｌ−精製ファージ１ｘ１０１１ ＴＵ／ｍｌの溶液、１００μｌ／ウェルで、一晩、４℃で被覆した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄後、プレートを、６０分間、３７℃で、ブロッキング緩衝液と共に、インキュベートした。その後、アフィニティー精製抗体（１００μｌ）を、各ウェルに添加し、一晩、４℃で結合させた。次いで、プレートを、冷ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ブロッキング緩衝液で１／５０００稀釈した１００μｌ／ウェルのヤギ 抗ヒトＩｇＧ（ＦＣ特異性） アルカリホスファターゼ接合抗体（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を添加した。室温で２時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼを上記のように曝露した。
【００８２】
合成ペプチド
合成オクタ−分岐多重抗原ペプチド（ＭＡＰｓ）を使用した（Ｔａｍ， １９９Ｘ）。合成をフロー・ポリアミド方法（Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０）によって行った。ペプチドをジメチルスルホキシドに溶解した。
【００８３】
合成ペプチドを用いるＥＬＩＳＡ
マルチウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ） を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ９．６）中、１０μｇ／ｍｌのＭＡＰ溶液を用いて一晩、４℃で被覆した。被覆溶液除去後、プレートを、３７℃、６０分間、ＥＬＩＳＡ ブロッキング緩衝液 （ＰＢＳ中、０．１％ カゼイン、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と共にインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液）で数回洗浄した。１：４０稀釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＥＬＩＳＡ ブロッキング緩衝液の、ヤギ 抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ−接合体の１：２０．０００稀釈物を各ウェルに添加した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）。３７℃で、２０分間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ活性をＴＭＢ液体基質系（ＳＩＧＭＡ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）とのインキュベーションによって検出した。１５分間の展開後、反応を、２５μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止した。プレートを自動化ＥＬＩＳＡリーダーで読み（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）、結果をＡ＝Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍとして表現した。表示項目に記載したＥＬＩＳＡデータは２つの独立したアッセイからの平均値である。
【００８４】
引例
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Ｆｏｌｇｏｒｉ， Ａ．， Ｔａｆｉ， Ｒ．， Ｍｅｏｌａ， Ａ．， Ｆｅｌｉｃｉ， Ｆ．， Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ．， Ｃｏｒｔｅｓｅ， Ｒ．， Ｍｏｎａｃｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｎｉｃｏｓｉａ， Ａ． １９９４． Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ｏｎｌｙ ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ． ＥＭＢＯ １． １３：２２３６−”４３．
Ｐｒｅｚｚｉ， Ｃ．， Ｎｕｚｚｏ， Ｍ．， Ｍｅｏｌａ， Ａ．， Ｄｅｌｍａｓｔｒｏ， ＾Ｒ， Ｇａｌｆｒｅ’， Ｃ．， Ｃｏｒｔｅｓｅ， Ｒ．， Ｎｉｃｏｓｉａ， Ａ． ａｎｄ Ｍｏｎａｃｉ， Ｐ． １９９６． １． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５６： ４５０４−４５１３．
Ａｌｔｅｒ， Ｈ． ｊ． １９９５． Ｔｏ Ｃ ｏｒ ｎｏｔ ｔｏ Ｃ： ｔｈｅｓｅ ａｒｅ ｔｈｅ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ’． Ｂｌｏｏｄ． ８５：１６８１．
Ｆｅｌｉｃｉ， Ｆ．， Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ， Ｌ．， Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ， Ａ．， Ｊａｐｐｅｌｌｉ， Ｒ． ａｎｄ Ｃｅｓａｒｅｎｉ， Ｃ． １９９１． Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ａ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． ｆ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０．
Ｌｕｚｚａｇｏ， Ａ．， ＿Ｆｅｌｉｃｉ， Ｆ．， Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ， Ａ．， Ｐｅｓｓｉ， Ａ． ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ， Ｒ． １９９３． Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｉ． Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｈ ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｃｅｎｅ． １２８：５１−５７．
Ｄｅｎｔｅ， Ｌ．， Ｃｅｓａｒｅｎｉ， Ｇ．， Ｍｉｃｈｅｌｉ， Ｃ．， Ｆｅｌｉｃｉ， Ｆ．， Ｆｏｌｇｏｒｉ， Ａ．， Ｌｕｚｚａｇｏ， Ａ．， Ｍｏｎａｃｉ， Ｐ．， Ｎｉｃｏｓｉａ， Ａ． ａｎｄ Ｄｅｌｍａｓｔｒｏ， Ｐ． １９９４． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｓｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ． Ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｇｅｎｅ． １４８：７
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｔ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｔａｋａｍｉｚａｗａ， Ａ．， Ｍｏｒｉ， Ｃ．， Ｆｕｋｅ， Ｉ．， Ｍａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｍｕｒａｋａｍｉ， Ｓ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｊ．， Ｏｎｏｓｈｉ， Ｅ．， Ａｎｄｏｈ， Ｔ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｉ． ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． １９９１． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ． Ｉ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：１１０５−１１１３．
Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｂ． １９９３． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． ４：２２０−２２９．
Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ， ｆ．Ｖ． ａｎｄ Ｎｅｅｌ， Ｂ．Ｊ． １９９３． Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ｐＧｅｘ） ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１０：１７９−１８７．
Ｋｏｍａｔｓｕ Ｆ， Ｔａｋａｓａｋｉ Ｋ １９９９
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ （ＨＣＶ） ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＶ ｖｉｒａｅｍｉａ ｉｎ ａｎｔｉ−ＨＣＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｌｉｖｅｒ １９：３７５−８０
【図面の簡単な説明】
【図１】表１はＡＤＡＭ−ＨＣＶペプチドの分析性能に対するデータである。
【図２】図１は、スクリーニングから誘導されたクローンの特徴を示す。
【図３】図２は、同じ抗原決定基を擬態するファージの同定を示す。
【図４】図３は、ライブラリィｐＶＩＩＩＡ１２の選択から誘導したプールのＥＬＩＳＡ反応性を示す。
【図５】図４は、４Ａ．ＡＤＡＭ−ＨＣＶ混合物と血清との反応性。４Ｂ．イタリア赤十字から得た血清のパネルに対するＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡ、を示す。
【図６】図５は、不確定血清のパネルに対するＡＤＡＭ／ＨＣＶ ＥＩＡである。
【図７】図６は、陽性、陰性および不確定血清に対するＡＤＡＭ−ＨＣＶ／ＳＩＡである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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