(57)【要約】本発明は標的害虫の集団を防除する方法を提供し、この方法は、ａ）酵素／農薬前駆体系の１つの成分をコードするコード配列と、標的植物または脊椎動物宿主において該コード配列を駆動することができるプロモーターとを含む遺伝子を提供すること、ｂ）該遺伝子を用いて標的植物または脊椎動物を形質転換すること、およびｃ）形質転換した標的植物または脊椎動物の集団に、酵素／農薬前駆体系の残りの成分を投与し、その結果として、形質転換した植物または脊椎動物宿主上または該宿主内部で不活性農薬前駆体が活性農薬に変換されて、侵入してくる標的害虫の集団を死滅させること、を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的害虫の集団を防除する方法であって、
（ｉ）　　酵素／プロドラッグ系の１つの成分をコードするコード配列、および標的植物または脊椎動物宿主において該コード配列に機能的に制限される調節領域を含む遺伝子を提供すること、
（ｉｉ） 　該遺伝子を用いて標的植物または脊椎動物の集団を形質転換すること、および
（ｉｉｉ）　形質転換した標的植物または脊椎動物の集団に、酵素／殺虫薬前駆体系の残りの成分を投与し、その結果として、形質転換した植物または脊椎動物宿主内で不活性農薬前駆体を農薬に変換させること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
調節領域が主に植物において該コード配列を発現させるように作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調節領域が主に脊椎動物において該コード配列を発現させるように作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コード配列が農薬前駆体をその活性代謝産物に変換する酵素をコードする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
コード配列が農薬前駆体をその活性代謝産物に変換するアミダーゼ酵素をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
コード配列が農薬前駆体をその活性代謝産物に変換する混合機能オキシダーゼ／シトクロムＰ４５０をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
コード配列が農薬前駆体をその活性代謝産物に変換するエステラーゼ酵素をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
農薬前駆体が有機リン酸、ホスホルアミデート、ネオニコチノイド、またはオキサジアジン誘導体からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
農薬前駆体／活性化酵素が、
（ｉ）　アセフェートまたはアセフェートの類似体、
（ｉｉ） アセフェートまたはアセフェートの類似体をその活性代謝産物メタミドホスに変換できるアミダーゼ、
からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
農薬前駆体／活性化酵素が、
（ｉ）　Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドまたはＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドの類似体、
（ｉｉ） Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドまたはＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドの類似体をその活性代謝産物イミダクロプリドに変換できる混合機能オキシダーゼ／シトクロムＰ４５０、
からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
農薬前駆体／活性化酵素が、
（ｉ）　ＤＰＸ−ＪＷ０６２またはＤＰＸ−ＪＷ０６２の類似体、
（ｉｉ） ＤＰＸ−ＪＷ０６２またはＤＰＸ−ＪＷ０６２の類似体をその活性代謝産物に変換できるエステラーゼ、
からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
標的植物または脊椎動物の細胞を形質転換することができるベクターであって、酵素／農薬前駆体系の１つの成分をコードするコード配列と、標的植物または脊椎動物において該コード配列に機能的に連結される調節領域とを含む遺伝子を含有する上記ベクター。
【請求項１３】
農薬前駆体、または宿主生物におけるその活性農薬への変換が、昆虫、線虫、原生動物、真菌、細菌およびウイルスを含めて、植物および脊椎動物の病原体を防除するために使用される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
吸う昆虫、刺す昆虫、または噛む昆虫を防除するための、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の利用分野
本発明は、遺伝的技法を用いて害虫集団を防除するための方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
昆虫、真菌、線虫、原生動物、細菌およびウイルスは、世界中の作物や動物に広範囲に及ぶ損害を与える原因となっており、同時に莫大な経済的損失をもたらしている。害虫による損害を減らす試みとして、標的害虫を殺すことで害虫集団を駆除する方策は、もっぱら殺虫剤の開発と配置に向けられてきた。殺虫剤は多くの場合に有効ではあるが、それらは標的昆虫以外の生物体にも有毒であることがわかっており、重大な環境問題につながる恐れがある。したがって、主として害虫が常食にしてそこで増えている植物や動物の細胞および組織において、活性型に変換される不活性型の農薬前駆体（ｐｒｏ−ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）を開発することが得策である。
【０００３】
害虫（特に昆虫）を生物学的手段により防除しようとする試みがある。例えば、双翅目に属する特定の昆虫集団を駆除するために現在使用されている方法として、不妊のオス昆虫を放すことがある。
【０００４】
例えば、米国特許第５，８４０，８６５号に記載されるように、チチュウカイミバエ（Ｍｅｄｆｌｙ）Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａは多くの果実種の主な農業害虫であって、地理的には熱帯および温帯地域に広く分布している。Ｍｅｄｆｌｙはアメリカ大陸には比較的最近入ってきたものであるが、急速に広がって北アメリカの果実生産地域を脅かしている（Ｃａｒｅｙ， Ｊ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３： １３６９ （１９９１））。１９７０年代の中頃から、Ｍｅｄｆｌｙの根絶と防除のために不妊昆虫技法が採用されている。この方法はＭｅｄｆｌｙがはびこっている地域に多数の不妊昆虫を放すことによりハエ集団を縮小または絶滅させるもので、殺虫剤を大量に散布する方法に代わる環境的に好ましい方法である（Ｋｎｉｐｌｉｎｇ， Ｅ．Ｆ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０： ９０２ （１９５９））。
【０００５】
不妊のオス昆虫を使用すると、Ｍｅｄｆｌｙ集団の成長が遅くなり、一時的には絶滅することがあるが、作物に害を与えるメス昆虫の破壊にはつながらない。さらに、不妊のオスは繁殖しないので、この方法は不妊のオスを環境に繰り返し放出しなければならない。
【０００６】
したがって、標的害虫を選択的に死滅させることができるが、有害な殺虫剤の大量散布よりも環境的に受け入れられる、Ｍｅｄｆｌｙや他の昆虫および他の害虫を防除するための技法が今なお必要とされている。
【０００７】
さらに、多くのヒトと家畜の健康上の問題は、昆虫や他の害虫による病気の広がりと関連している。そのような例として、蚊、ツェツェバエおよび普通のイエバエが挙げられる。かくして、ヒトや動物の健康を危険にさらす害虫集団の防除も望まれている。
【０００８】
発明の概要
本発明は、標的害虫の集団を防除するための方法を提供し、この方法は、
ａ）　酵素／農薬前駆体の１つの成分をコードするコード配列と、標的植物または脊椎動物宿主において該コード配列を駆動することができるプロモーターとを含む遺伝子を提供すること、
ｂ）　該遺伝子を用いて標的植物または脊椎動物の集団を形質転換すること、
ｃ）　形質転換した標的植物または脊椎動物の集団に、酵素／農薬前駆体系の残りの成分を投与し、その結果として、形質転換した植物または脊椎動物宿主内で不活性農薬前駆体が活性農薬に変換されるようにし、侵入している標的害虫のあらゆる集団を死へと至らせること、
を含んでなる。
【０００９】
本明細書中で用いる「標的害虫の集団」とは、その境界が種によってまたは地理上のラインに沿って画定されようと、種と地理の両方に沿って画定されようと、宿主植物または脊椎動物に侵入してそれを常食したり、そこで増えたりする、真菌、線虫、原生動物、細菌およびウイルスを含めた、防除することが望ましい昆虫および他の寄生または感染生物の群をさす。例えば、害虫の集団は、所定の地域において特定の作物または脊椎動物にはびこる所定の種の害虫をさす。あるいはまた、ある地域の任意の作物もしくは脊椎動物にはびこるあらゆる害虫、いかなる地理的制限もない所定の種、またはヒトや家畜の健康上の問題（例えば、マラリアの蔓延）に関与する害虫の集団をさすこともある。標的害虫とは、その害虫集団の個々のメンバーのことである。
【００１０】
本明細書中で用いる「植物または脊椎動物宿主」とは、酵素／プロドラッグ系の取り込みを介して害虫から保護されるあらゆる宿主生物を意味する。これは、標的宿主内で生存する共生生物への酵素／プロドラッグ系の取り込みを含むものとする。
【００１１】
本明細書中で用いる「農薬」とは、害虫の細胞を標的とすることによって標的害虫を防除することを意図した、あらゆる農薬を意味する。本発明に従って殺虫薬前駆体に改変しうる殺虫薬としては、限定するものではないが、イミダクロプリド（ｉｍｉｄａｃｌｏｐｒｉｄ）およびメタミドホス（ｍｅｔｈａｍｉｄｏｐｈｏｓ）がある。
【００１２】
「殺虫薬前駆体」（ｐｒｏ−ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、「プロドラッグ」（ｐｒｏ−ｄｒｕｇ）および「農薬前駆体」（ｐｒｏ−ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）は相互に交換可能に用いられ、本明細書においては、変換酵素の不在下では実質的に不活性または実質的に無毒性である物質を意味するか、あるいは酵素の作用によって活性または毒性のある物質に変換され得る物質を含む混合物を意味する。農薬前駆体はその目的のために特別に設計することができ、例えば本明細書で教示するようなアミド化、メチル化またはアセチル化を使って、既存の農薬を化学修飾することによって設計することが好ましい。本明細書中で用いる「実質的に」という用語は、活性型と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、９８％および最大１００％不活性である「殺虫薬前駆体」、「プロドラッグ」および「農薬前駆体」を意味する。
【００１３】
本明細書中で用いる「酵素」とは、ある反応を触媒する物質を指し、限定するものではないが、ＲＮＡ、タンパク質もしくはポリペプチド、またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの断片が含まれる。本明細書中で用いる「酵素」は、殺虫薬前駆体または農薬前駆体をそれぞれ殺虫薬または農薬に変換する反応を触媒するものである。そのような酵素の例として、限定するものではないが、オキシダーゼ、エステラーゼ、およびアミダーゼ、またはプロテアーゼが挙げられる。
【００１４】
本明細書中で用いる「防除」とは、昆虫集団の繁殖を、世代あたり少なくとも約１０％、好ましくは、少なくとも約５０％、８０％、または最大１００％までも制限、防止または抑制することを意味する。これは標的害虫を殺すことによって達成することが好ましい。害虫集団が排除されることが有利である。
【００１５】
本明細書中で用いる「遺伝子」とは、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列（通常はＤＮＡ）を指し、これはさらに適当な宿主細胞においてコード配列を転写するのに必要とされる核酸配列を含む。ポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を本明細書では「コード配列」といい、配列転写の調節に必要とされる配列を「制御配列」、例えば、「エンハンサー」、「プロモーター」または「遺伝子座接触領域」という。
【００１６】
コード配列は酵素／農薬前駆体系の１つの成分をコードする。この成分は上記系のいずれか１つ以上の部分であってよいが、それ自体が活性農薬を生産したり、農薬前駆体から活性農薬に変換するには十分でないことを条件とする。したがって、この成分は農薬前駆体の活性化に関与する酵素または酵素の断片とすることが好ましい。あるいはまた、これは農薬前駆体それ自体とすることもできる。酵素／農薬前駆体系の残りの成分は別個に、例えばスプレーによって、投与する。こうして、本発明に従ってコード配列を発現する宿主植物または脊椎動物に侵入してくる標的害虫は死滅する。
【００１７】
本発明の特徴は、コード配列の転写を駆動するために用いるプロモーターが、害虫活性の標的となる宿主植物または脊椎動物内で機能的に作用しうる点にある。このことは、そのコード配列が実質的にその宿主植物または脊椎動物においてのみ発現されることを意味する。
【００１８】
かくして、比較的毒性のない農薬前駆体を施用すると、農薬前駆体は形質転換された宿主植物または脊椎動物において毒性農薬に変換されることとなり、その結果、その環境内の他の生物種が毒性農薬の大量施用の影響から保護される。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、酵素／プロドラッグ系の１つの成分をコードするコード配列および標的植物または脊椎動物宿主において該コード配列を駆動することができるプロモーターを含む遺伝子を含有し、標的植物または脊椎動物宿主細胞を形質転換することができるベクターを提供する。
【００２０】
発明の開示
本発明は、農薬前駆体をその活性毒性形態に変換する酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物または脊椎動物宿主に侵入または感染しうるあらゆる均一または不均一の標的害虫集団を、農薬前駆体を使って、防除するために適用可能である。
【００２１】
例えば、ホスホルアミデート系の殺虫薬であるメタミドホス（ｍｅｔｈａｍｉｄｏｐｈｏｓ）は、アブラムシ、ケムシおよびダニに対する広域スペクトル活性を有するが、哺乳動物に対する毒性が強い。これは不活性類似体のアセフェート（ａｃｅｐｈａｔｅ）と対照的で、アセフェートは哺乳動物に対する毒性が低く、全てではないにしても、いくつかの植物および昆虫に存在するアミダーゼ酵素により毒性のメタミドホスに変換され得る（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ， １９８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １０１−１６１に掲載のＭａｇｅｅを参照のこと）。
【００２２】
したがって、本発明は、宿主生物種の組織および細胞において不活性で無毒性の農薬前駆体をその活性形態に変換しうる殺虫薬前駆体変換酵素をその細胞および組織に発現する、経済上重要なトランスジェニック植物および脊椎動物を作製できる、ことを教示する。活性農薬の局在化は、毒性農薬単独の広域適用に見られるような見境のない悪影響を環境に及ぼすことなく、宿主植物または脊椎動物を常食したりそこで繁殖する昆虫、線虫、原生動物、真菌、細菌、ウイルスなどの有害生物を排除するだろう。好ましい実施形態において、本発明は、農業上重要な昆虫集団を防除するために、特にイネ、穀物、トウモロコシ、ジャガイモ、野菜、サトウダイコン、小果樹の実、柑橘類、オリーブ、ワタ、ホップ、ブドウの木、タバコおよび芝生を攻撃するライスホッパー（ｒｉｃｅ ｈｏｐｐｅｒ）、アブラムシ、アザミウマ、コナジラミ、シロアリ、芝生の昆虫および土壌の昆虫といった、吸う、刺す、または噛む昆虫を防除するために使用される。
【００２３】
本発明に従うベクターおよび形質転換
トランスジェニック植物における遺伝子の組織特異的ターゲッティングに用いるためのベクターは、典型的には組織特異的プロモーターを含み、また、エンハンサー配列のような他の組織特異的制御エレメントを含んでもよい。特定の植物組織での特異的なまたは増大した発現を指令するプロモーターとしては、例えば、緑色の組織に特異的なｒｂｃＳプロモーター、根または傷ついた葉組織での活性がより高いｏｃｓ、ｎｏｓおよびｍａｓプロモーター、根での増大した発現を指令するトランケート型（約９０〜１８）３５Ｓプロモーター、根での発現を指令するΔ−チューブリン遺伝子、および貯蔵組織での発現を指令するゼイン貯蔵タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる（Ｔａｑｕｅら、（１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８６：５０６を参照のこと）。特に、根での増大した発現を達成するためには、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子由来の１６ ｂｐ ｏｃｓエンハンサーエレメント（Ｅｌｌｉｓら、１９８７； Ｂｏｎｃｈｅｚら、１９８９）を、特に多コピー数で存在させて、使用することが有利であると考えられる。
【００２４】
トランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。単子葉植物の例は、イネ科の草（例：イチゴツナギ（ブルーグラス、Ｐｏａ））、飼料用の草（例：フェストカ属（ｆｅｓｔｏｃａ）、ドクムギ属（ｌｏｌｉｕｍ））、ｔｅｍｐｅｒａｔｅ ｇｒａｓｓ（例：Ａｇｒｏｓｔｉｓ属）、並びに穀草、例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、およびトウモロコシである。双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物（例：ハウチワマメ）、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウ、インゲンマメ、ダイズ、アブラナ科植物（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｒａｅ科）、例えば、カリフラワー、アブラナおよび近縁のモデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。トランスジェニック植物は小果樹や柑橘類の木であってもよい。
【００２５】
核酸構築物は当技術分野で知られている従来の技法、例えば、アグロバクテリウム介在形質転換、ウイルス介在形質転換、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント、バイオリスティック形質転換、およびエレクトロポレーションにより植物のゲノムに組み入れる（Ｇａｓｓｅｒら、１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １２９３； Ｐｏｔｒｙｋｕｓ， １９９０， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ５３５； Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４）。目下のところ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介在遺伝子導入がトランスジェニック双子葉植物を作製するための好適な方法である（ＨｏｏｙｋａｓおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９： １５−３８を参照のこと）。現在、トランスジェニック単子葉植物を作製するための好適な方法は、胚性カルスまたは発生中の胚のパーティクルボンバードメント（形質転換用のＤＮＡをコーティングした微細な金またはタングステンの粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｎ， １９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２： ２７５−２８１； Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５： １５８−１６２）。
【００２６】
トランスジェニック動物の作製
トランスジェニック動物を作出するための技法は、当技術分野で公知である。この主題に関する有用な一般的参考書は、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ − Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ （Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ， １９９７）であり、これは魚からマウスやウシまでのトランスジェニック動物を作製するために用いられる技法を広範囲に概説している。
【００２７】
胚の顕微操作技術の進歩により、今では、異種ＤＮＡを、例えば哺乳動物の受精卵に導入することが可能である。例えば、全能性または多能性幹細胞をマイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染などの手段により形質転換し、その後形質転換した細胞を胚に導入して、その胚をトランスジェニック動物へと発生させることができる。より好ましい方法は、発生しつつある胚に目的のＤＮＡを含むレトロウイルスを感染させ、その感染させた胚からトランスジェニック動物を作出するものである。しかし、最も好ましい方法は、適切なＤＮＡを胚（好ましくは、１細胞期の胚）の前核または細胞質に共注入し、その胚を成熟トランスジェニック動物へと発生させるものである。こうした技法はよく知られている。異種ＤＮＡを哺乳動物の受精卵にマイクロインジェクションするための標準的な実験室手法については、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８６）； Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８４４ （１９９１）； Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｃｅｌｌ， ４１： ３４３ （１９８５）； Ｋｒａｅｍｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８５）； Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１５： ６８０ （１９８５）； Ｗａｇｎｅｒら、米国特許第５，１７５，３８５号； Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、米国特許第５，１７５，３８４号を参照されたい（これらの開示内容を参照により本明細書に組み入れるものとする）。
【００２８】
トランスジェニック動物の作製に用いられる別の方法として、前核期の卵に核酸を標準方法でマイクロインジェクションし、次いでその卵を培養してから偽妊娠レシピエントの輸卵管に導入するという方法がある。
【００２９】
トランスジェニック動物は核導入法によっても作製することができ、この方法は、例えばＳｃｈｎｉｅｋｅ， Ａ．Ｅ．ら、１９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７８： ２１３０およびＣｉｂｅｌｌｉ， Ｊ．Ｂ．ら、１９９８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８０： １２５６に記載されている。この方法を用いて、ドナー動物から得た繊維芽細胞を、調節制御下に目的の結合ドメインまたは結合パートナーのコード配列を含むプラスミドで安定にトランスフェクトする。次に、安定なトランスフェクタントを除核卵母細胞に融合させ、培養して、雌のレシピエントに導入する。
【００３０】
トランスジェニック配列を含むと予想される動物の分析は、一般的には、標準方法に従ってＰＣＲまたはサザンブロット分析のいずれかで実施することができる。
【００３１】
トランスジェニック哺乳動物（例えば、雌ウシ）を作製するための具体例としては、殺虫薬前駆体変換酵素を含むヌクレオチド構築物を、例えば米国特許第４，８７３，１９１号に記載される技法を使って、該哺乳動物から新たに摘出した卵巣より得られた卵母細胞にマイクロインジェクションする。その卵母細胞を卵胞から吸引し、沈降させてから、解凍した凍結精子（ヘパリンで受精能を獲得させ、パーコール勾配で予め分画化して運動性画分を単離したもの）と受精させる。
【００３２】
受精卵母細胞は、注入用の前核を可視化するために、例えば、１５，０００ ｇで８分間遠心分離し、その後輸卵管組織−調整培地にて接合体から桑実胚または胚盤胞の時期まで培養する。この培地は輸卵管からかきとった管腔組織を用いて調製し、培地で希釈したものである。接合体はマイクロインジェクション後２時間以内に培地に配置しなければならない。
【００３３】
その後、意図したレシピエント哺乳動物（例えば、ウシ）にコプロスタノールを投与して発情を同時に起こさせる。２日以内に発情させて、発情後５〜７日目のレシピエントに胚を導入する。導入が成功したかは、その子にサザンブロットを実施することで評価することができる。
【００３４】
あるいはまた、目的の構築物を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、その細胞を培養してトランスジーンによる改変を確実なものとすることができる。その後、改変細胞を胞胚に注入し、その胞胚を偽妊娠宿主に再導入する。得られる子はＥＳ細胞と宿主細胞に関してキメラであり、ＥＳ子孫だけを含む非キメラ系統は通常の交雑育種により得ることができる。この技法は例えば国際公開ＷＯ９１／１０７４１に記載されている。
【００３５】
本発明に従う有用なプロドラッグ系
プロドラッグ変換酵素遺伝子（「自殺」遺伝子としても知られている）は、トランスフェクト腫瘍細胞において細胞傷害性薬物を選択的に活性化するために使用されてきた。酵素／プロドラッグ系は当技術分野で公知である。プロドラッグとは、酵素の作用により選択的に活性化される（すなわち、毒性にされる）薬物（多くの場合は、潜在的に毒性の薬物）のことである。酵素／プロドラッグ系は、プロドラッグの投与前に標的細胞または生物へ酵素を送達することを当てにしたものである。酵素を発現する標的細胞または生物だけが、そのプロドラッグによって影響を受けることとなる。よく見られる酵素／プロドラッグ系は５−フルオロウラシル／シトシンデアミナーゼ系であり、この場合には、無毒性前駆体の５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）がシトシンデアミナーゼの作用により細胞傷害性薬物の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換される（Ａｕｓｔｉｎ ＆ Ｈｕｂｅｒ， （１９９３） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４３：３８０−３８７を参照のこと）。
【００３６】
一つの実施形態においては、農薬前駆体を活性農薬に変換するために使用可能な酵素、例えば、エステラーゼ、アミダーゼ、および混合機能オキシダーゼ（Ｐ４５０とも呼ばれる）など、を特徴づけて、真正細菌、古細菌および真核生物を含めて、様々な生物からクローニングする。そのような酵素を利用する（例えば、特定の農薬前駆体を代謝する）ための典型的な戦略は、生物を酵素活性の存在についてスクリーニングすることを伴う。この目的のために生物のコレクションを使用することができ、例えば、培養土壌細菌のコレクション、昆虫組織または細胞のコレクション、あるいは植物組織または細胞のコレクションなどである。
【００３７】
スクリーニングを行うには、例えば、農薬前駆体を組織または細菌由来の抽出物とともにインキュベートする。真核生物の組織のミクロソームに局在する混合機能オキシダーゼの場合は、ミクロソーム画分を活性源として用いることができる。ミクロソーム画分は通常の細胞分画法により単離することができる。他の可溶性酵素の場合は細胞抽出物の高速上清を使用することができる。酵素活性を測定するには、反応産物を、当業者には公知の標準化学分析法で検出する。例えば、反応産物をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を使って分離する。化合物の構造を確認するには、ＧＣと組み合わせた質量分析（ＧＣＭＳ）を使用することができる。
【００３８】
酵素活性の確認ができたら、その活性化酵素をコードする遺伝子を、当技術分野で公知の様々なクローニング技法を使ってクローニングする。例えば、標準的な組換えＤＮＡ法を用いてその生物の核酸ライブラリーを作製する。その後、細菌遺伝子のゲノムライブラリーまたは真核生物遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを標準方法によりスクリーニングする。
【００３９】
ある実施形態においては、関連のある遺伝子（例えば、進化的に関連のある生物に由来するクローン化エステラーゼまたはＰ４５０遺伝子）由来の核酸プローブとのハイブリダイゼーションを用いる。あるいはまた、相補性によってスクリーニングを行うこともできる。後者のアプローチでは、発現ライブラリー、すなわち、市販の発現プラスミドまたはウイルスベクター中に構築されたライブラリーを使用して、通常は酵素活性を発現しない細胞をトランスフェクトする。活性化遺伝子を含むクローンは、そのライブラリーの個々のコロニーを酵素活性の発現についてスクリーニングすることで単離できる。続いて、新たに同定された遺伝子を、以下に記載する本発明において有用なベクターにクローニングする。
【００４０】
プロドラッグは、それらを変換できない生物や細胞において不活性であるばかりでなく、脂質溶解性および／または化学安定性の向上といった、その他の利点をも備えている。
【００４１】
ある種の昆虫においてだけ変換可能であるように設計された殺虫薬前駆体またはプロドラッグトキシンは、当技術分野で知られており、特に有機リン酸類およびカルバメート類の場合には、例えば、最終トキシンの選択的誘導体化により調製されてきた。例を挙げると、パラチオンやプロフェノホスなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の前駆体があり、これらはシトクロムＰ４５０ファミリーの酵素により活性殺虫薬に酸化される。しかし、殺虫薬前駆体を昆虫集団に適用しても、もともと自然界でこの酵素を発現している昆虫が死滅するにすぎない。自然界でこの変換酵素を発現していない害虫を感受性にするためには、変換酵素をコードする遺伝子を宿主に導入すること、ならびに、標的昆虫集団に環境上受け入れられるやり方で該遺伝子を導入することが必要である。
【００４２】
一つの実施形態において、変換酵素をコードする配列は、Ｗｉｎｇら、Ａｒｃｈ Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３７： ９１−１０３， １９９８（参照により本明細書中に組み入れる）に記載されるような、ＤＰＸ−ＪＷ０６２をその活性代謝産物に変換するエステラーゼ酵素をコードしている。本発明のこの形態において、殺虫薬前駆体はＤＰＸ−ＪＷ０６２である。ＤＰＸ−ＪＷ０６２はオキサジアジン化合物であり、鱗翅類では、この化合物が電位依存性ナトリウムチャンネルをブロックする強力なトキシンに生物変換される。ＤＰＸ−ＪＷ０６２の活性／毒性は他の生物では低い。その結果、鱗翅類の変換酵素を植物または脊椎動物において発現させると、標的がＤＰＸ−ＪＷ０６２をその毒性型に変換できる酵素を含もうと含むまいと、侵入してくる昆虫はＤＰＸ−ＪＷ０６２に起因する毒性に対して感受性となろう。
【００４３】
あるいはまた、変換酵素をコードする配列は、シトクロムＰ４５０ファミリーの酵素をコードすることができる。大部分の昆虫はシトクロムＰ４５０ファミリーの酵素を保有するが、より効果的で、かつ／または過剰発現される酵素で昆虫を形質転換することによって、該酵素により変換される殺虫薬前駆体の生物変換効率が高まり、殺虫薬前駆体の有効投薬量を減らすことが可能となる。本発明のこの形態において適切な殺虫薬前駆体としては、有機リン酸類とカルバメート類が挙げられる。例えば、殺虫薬前駆体はパラチオンやプロフェノホスのようなアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であってよい。パラチオンおよびプロフェノホスの変換に関与するアブラムシのシトクロムＰ４５０酵素のクローニングおよび植物または脊椎動物における発現は、その昆虫が適切な変換酵素を発現しようとしまいと、侵入してくる昆虫の感受性範囲を拡大することになろう。
【００４４】
一般に、本発明の実施において有用な遺伝子、ならびにそれらをコードするベクターは、分子生物学の分野で用いられる標準的な手法に従って作製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） ４ｔｈ Ｅｄ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を参照されたい。
【００４５】
本発明に従う既存の農薬からの農薬前駆体の設計
無毒性の殺虫薬前駆体を製造するには、現在入手可能な殺虫薬を、生物学的活性に必要とされる化学基を誘導体化することで不活性にすることができる。そのような化学基として、限定するものではないが、アミノ基またはイミノ基が挙げられる。誘導体化は例えばメチル化またはアセチル化によって行うことができる。
【００４６】
農薬を生物学的により活性の高い構造に変換する代謝活性化は、その標的生物種における酵素的過程である。したがって、弱い阻害剤または非阻害剤が、生体異物としての化合物を分解するように設計された系によって、致死的な毒性産物へと偶然に変化することがある（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ， Ｊｏｅｌ Ｒ． Ｃｏａｔｓ（編）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８２の１２９頁）。
【００４７】
リン酸系殺虫薬の一般的分野において、混合機能オキシダーゼが介在する最も一般的な活性化プロセスは、Ｐ→ＳからＰ→Ｏへの変換、例えば、パラチオンからパラオクソンへの変換である（ＮａｋａｔｓｏｇａｗａおよびＭｏｒｅｌｌｉ， １９７６； Ｅｒｏ， １９７４； Ｆｕｋｕｔｏ， １９７８）。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、アセフェート−メタミドホスの農薬前駆体−農薬系を用いることができる。メタミドホス（Ｏ，Ｓ−ジメチルホスホルアミドチケート、Ｃ２Ｈ８ＮＯ２ＰＳ）は１９６９年にＣｈｅｖｒｏｎ ＣｈｅｍｉｃａｌおよびＢａｙｅｒによって導入されたものである。これは接触作用および胃作用を有し、高活性、浸透性、残留性の有機リン系殺虫薬／ダニ駆除薬である。メタミドホスは強力なアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）阻害剤である。これは吸う昆虫や噛む昆虫に有効であり、アブラムシ、トビハムシ、ケムシ、コナジラミ、アザミウマ、イラクサキンウワバ、コロラドジャガイモハムシ、ジャガイモ棲管虫、ヨトウムシ、ダニ、ヨコバイなどの防除に用いられる。メタミドホスの毒性は、雄ラットおよび雌ラットについて、それぞれ急性経口ＬＤ５０値が２１および１６ ｍｇ／ｋｇ（体重）であると決定されている。
【００４９】
アセフェートは、メタミドホスのＮ−アセチル誘導体（Ｏ，Ｓ−ジメチルアセチルホスホルアミドチケート、Ｃ９Ｈ１０ＮＯ３ＰＳ）であり、改良された第二世代のメタミドホスとしてＣｈｅｖｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌにより導入されたものである。これは果実、野菜（例えば、ジャガイモやサトウダイコン）、ブドウの木、ホップの栽培において、また園芸（例えば、屋外で育てるバラやキク）において、種々の刺す昆虫および吸う昆虫、特にアブラムシ（耐性種を含む）の防除に用いられる。アセフェートとその一次代謝産物であるメタミドホスは、他の有機リン系殺虫薬には耐性であると思われるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｐｐ．に対して毒性を示す。アセフェートの毒性は、雄ラットおよび雌ラットについて、それぞれ急性経口ＬＤ５０値が９４５および８６６ ｍｇ／ｋｇ（その代謝産物メタミドホスより４５〜５４倍低い毒性）であると決定されている。
【００５０】
【化１】
2004508058.tif 000002
【００５１】
アセフェート自体はＡｃｈＥ阻害剤ではない。阻害剤であるメタミドホスへのその変換には、酵素によって媒介されるカルボニル−Ｎ結合の切断が必要となる。生物系はほとんど全てが単純な脂肪族アミドを切断するアミダーゼを含んでいる。しかし、アセフェートは単純なアミドではなく、いくつかの非特異的アミダーゼにはアセフェートが低い基質となるかもしれない。メタミドホスはインゲンマメ、キャベツおよびトマトの苗においてアセフェートの主な代謝産物であることが観察されている（Ｔｕｃｋｅｒ， １９７２， Ｒｅｐｏｒｔ， Ｃｈｅｖｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｉｃｈｍｏｎｔ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。カルボニル−Ｎ結合の切断は非特異的プロセスではない。これは、活性化酵素アミダーゼの活性がアセフェート構造の変化に非常に敏感であるという知見により示される。
【００５２】
標的昆虫においては活性化反応と毒性との直接的関係が存在するようである。タバコのケムシであるＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓでは、アセフェートとメタミドホスが同様の活性を示す。アセフェートを局所適用すると、２時間以内に少量のメタミドホスが幼虫に認められた。しかし、成体メキシコワタミゾウムシＡｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｉｄｓ Ｂｏｈｅｍａｎでは、両化合物の迅速な吸収にもかかわらず、メタミドホスの毒性のほうがアセフェートよりも７５倍高い。メキシコワタミゾウムシではアセフェートのメタミドホスへの代謝が全く観察されず、この事実はその低い毒性と一致していた（Ｂｕｌｌ， １９７９， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２７：２６８）。
【００５３】
多くの生物は、施用されたアセフェートの大部分を切断してメタミドホスに変換するアミダーゼを１種以上もっている。ラット（Ｔｕｃｋｅｒ， １９７６）や雌の白マウス（ＫａｏおよびＦｕｋｕｔｏ， １９７７）のような動物も相当量のアセフェートまたはその類似体をメタミドホスに変換する。ＫａｏとＦｕｋｕｔｏは、プロピオニルおよびヘキサノイル類似体に関する彼らの研究において、その毒性を活性化の量に直接関連づけることができた。このことは、変換されないアセフェートが本質的に無毒であることを示唆している。
【００５４】
したがって、アセフェートをその活性型メタミドホスに変換できるアミダーゼ酵素をコードする遺伝子を組み合わせると、それまではアセフェートの適用に対して毒性を示さなかった昆虫を感受性にすることができるだろう。
【００５５】
また、アセフェート類似体のイエバエに対する毒性は代謝的に生成されるメタミドホスの量と密接な関連があり、この生物種において、プロピオニル類似体は実質的により多くのメタミドホスを生成し、毒性が３５倍強い、と報告されている（ＫａｏおよびＦｕｋｕｔｏ， １９７７， Ｐｅｓｔｃ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ７：８３）。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、イミダクロプリド（１−［８−クロロ−３−ピリジニル）メチル］−Ｎ−ニトロ−２−イミダゾリジンイミン、Ｃ９Ｈ１０ＣｌＮ５Ｏ２）およびＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドを農薬前駆体系として使用することができる。
【００５７】
イミダクロプリドは、ライスホッパー、アブラムシ、アザミウマ、コナジラミ、シロアリ、芝生の昆虫、土壌の昆虫、いくつかの甲虫といった、吸う昆虫を防除するための浸透性のクロロ−ニコチニル殺虫薬である。これはイネ、穀物、トウモロコシ、ジャガイモ、野菜、サトウダイコン、果樹、ワタ、ホップ、およびブドウの木に常用されており、種子または土壌の処理剤として用いる場合には特に浸透性である。この化学薬品は温血動物よりも昆虫に豊富に存在するニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡｃＲ）を阻害することによって作用する。これは接触時に、また胃作用により有効である（Ｋｉｄｄ， Ｈ．およびＪａｍｅｓ， Ｄ．Ｒ．（編）， Ｔｈｅ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， 第３版， Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ， １９９１（改定）， １０−２）。イミダクロプリドの毒性は、ラットにおける急性経口ＬＤ５０が４５０ ｍｇ／ｋｇ（体重）であると決定されている。
【００５８】
Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドはイミダクロプリドの殺虫薬前駆体である。イミダクロプリドのイミダゾール環の３位にメチル基を導入すると、ｎＡｃＲへの結合親和性が１／１００に低下する。しかしながら、Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドはイエバエに対してはイミダクロプリドと同様の効力がある。Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて混合機能オキシダーゼ系によってイミダクロプリドに変換される（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９８， Ａｒｃｈ． Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：２４）。現在のところ、Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドの毒性データは入手できない。
【００５９】
【化２】
2004508058.tif 000003
【００６０】
イエバエにおけるＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドのイミダクロプリドへの変換は、農薬前駆体を変換することができる酵素の存在を示している。Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ， Ｃｈｐ ５， Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ｍｏｄｅ ａ ａｃｔｉｏｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに掲載のＭａｇｅｅ （１９８２）を参照されたい。
【００６１】
得られる誘導体（農薬前駆体）は、標的昆虫中に存在するかまたはトランスフェクトされた酵素すなわち「活性化酵素」によって活性農薬に代謝される。数種の活性化酵素、例えば、オキシダーゼ（Ｐ４５０）、エステラーゼおよびアミダーゼを使用することができる。
【００６２】
要するに、無毒性の農薬前駆体を活性農薬に変換する活性化酵素をコードする遺伝子を、その活性化酵素を通常産生しないか、または低レベルでしか産生しない宿主植物または脊椎動物種のゲノムに導入する。形質転換された宿主植物または脊椎動物に侵入する害虫は、無毒性農薬前駆体の投与と、これに続く宿主生物種内での活性型への変換後に、選択的に排除されることとなる。
【００６３】
イミダクロプリドのような登録殺虫薬に基づいて農薬前駆体を設計することは、新規の農薬前駆体を導入することに比べて、経済上の利点を有する。新規化合物の徹底的な毒性分析に代えて、既知の殺虫薬の毒物学を利用することができ、ひいては市場に出すための時間や毒性分析に要するコストを節約することが可能である。
【００６４】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００６５】
実施例
遺伝的に増強されて農薬前駆体に対して感受性にされた植物
いくつかの農薬を、農薬前駆体、すなわち、標的生物中の酵素の作用により活性型に変換される生物学的に不活性（または低活性）の誘導体化合物の形態で用いる。そのような農薬前駆体は、活性化酵素を産生しない（または過少産生する）生物におけるそれらの低い毒性のため、対応する活性化合物よりも一般に安全である。それらはまた、安定性の向上や生物または細胞への浸透性の増加といった、他の利点も提供しうる。こうした農薬前駆体を有害昆虫の標的集団防除のために利用する方法は、国際特許出願ＷＯ０１１０２２０（「昆虫防除系」（Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍ））に開示されている。この方法は殺虫薬前駆体に対する昆虫集団の感受性増強（Ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｐｒｏ−ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ： ＳＩＰＰ）と呼ばれているもので、殺虫薬前駆体を活性化する遺伝子が標的種のゲノムに導入され、そして組換え昆虫が標的集団へ該遺伝子を駆動できる条件下で適切なエリアに放たれる。ＳＩＰＰは大量飼育技術が存在している昆虫種に対してのみ利用可能である。
【００６６】
ＳＩＰＰの代替法は、植物における農薬前駆体活性化酵素（ｐｒｏ−ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ： ＰＡＥ）の産生に基づく方法である。この方法では、適切な組織（例えば、葉や根）でＰＡＥを発現するトランスジェニック標的植物を作製する。適当な農薬前駆体を適用すると、その植物の組織を常食とする昆虫が駆除されるであろう。
【００６７】
実施例１：　アセフェート−メタミドホス系
メタミドホスは広く用いられている強力な有機リン系殺虫薬で、昆虫と哺乳動物に高い毒性を示す。アセフェートは毒性がかなり低い殺虫薬前駆体で、種々の昆虫中に存在するアミダーゼの作用によってメタミドホスに変換される。本実施例では、アミダーゼをコードする遺伝子をクローニングすること、植物においてそれを発現させること、ならびに、植物および農薬前駆体に暴露した有害昆虫に対するアセフェートの毒性を高める発現アミダーゼの能力を試験すること、について記載する。
【００６８】
ショウジョウバエ・アミダーゼ遺伝子のクローニングおよび特徴づけ
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびチチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ （Ｍｅｄｆｌｙ））はアセフェートとメタミドホスに対して感受性である（図１）。メタミドホスと比べると、アセフェートは活性が低い。ショウジョウバエのゲノムデータベースをアミダーゼについて検索することにより、既知のアミダーゼとの配列相同性に基づいて、推定アミダーゼ様遺伝子の６つのエントリーが明らかにされた。相対的データベースエントリーは以下のとおりである：
2004508058.tif 000004
エントリーＱ９ＶＤＬ３およびＱ９Ｉ７Ｉ６は同一の遺伝子（ＦＢｇｎ００３８８０３；ＣＧ５１９１）に相当するが、転写物の構造の点で相違している。
【００６９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために５対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのプライマーは、増幅された断片が進化的に保存されている遺伝子の領域を含むように選択する。プライマーの配列を以下に示す：
2004508058.tif 000005
【００７０】
上記のプライマーと鋳型としてのショウジョウバエゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した（図２）。増幅されたＤＮＡ断片は予想されたサイズのもので、配列解析により標的遺伝子に相当することが示された。
【００７１】
ＰＣＲ断片を用いて、ショウジョウバエと他の双翅目の昆虫種におけるアミダーゼ遺伝子をサザンブロット分析により同定した（図３）。４種の双翅目昆虫、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ科）、チチュウカイミバエ、オリーブミバエ（Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ ｏｌｅａｅ）（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ科）およびイエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（Ｍｕｓｃｉｄａｅ科）由来のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、３２Ｐ標識ＰＣＲ断片とハイブリダイズさせた。予想通り、全てのプローブがショウジョウバエとの強いハイブリダイゼーションシグナルを与えた。遺伝子のうち２つ（ＣＧ５１９１およびＣＧ８８３９）は２種のミバエ（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄ ｆｒｕｉｔ ｆｌｙ）（チチュウカイミバエおよびオリーブミバエ）との比較的弱いシグナルを与えた。より遠縁のイエバエでは、使用したどのプローブとのシグナルも検出されなかった。これらの結果は、対応するショウジョウバエ遺伝子を同定するためには全てのプローブが使用可能であること、チチュウカイミバエとオリーブミバエ由来の対応する相同遺伝子を同定するのにＣＧ５１９１およびＣＧ８８３９プローブが役に立つこと、を実証している。これらの結果はまた、ＣＧ５１９１およびＣＧ８８３９プローブがＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ科とＭｕｓｃｉｄａｅ科に属する他の双翅目昆虫由来のアミダーゼ遺伝子を同定するにも有用でありうることを強く示唆している。
【００７２】
５種全てのショウジョウバエ・アミダーゼ遺伝子はイントロンを含んでおり、おそらくプロセッシングされないままであるか、あるいは植物細胞においては不適切にスプライシングされると予想される。これを避けるために、アミダーゼｃＤＮＡ配列を発現のため植物にクローニングした。ショウジョウバエ由来の５つの遺伝子を、コード領域（開始ＡＴＧから終結コドンまで）の両末端をカバーするように設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅反応によりクローニングした。プライマーは発現ベクターへの該遺伝子の定方向クローニングを容易にするための制限部位を含んでいる。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。ＲＮＡは、先のノーザン分析で測定して、ショウジョウバエの適切な段階および／または組織に由来するものであった。
【００７３】
アミダーゼ遺伝子の中でどれがアセフェートをメタミドホスに変換する反応を触媒することができるのかを調べるため、遺伝子を、ショウジョウバエの熱誘導性ｈｓｐ７０プロモーターを含むショウジョウバエ発現カセットに導入した。この発現カセットを、Ｍｉｎｏｓトランスポゾンにより媒介される生殖細胞系の形質転換によって、キイロショウジョウバエのゲノムに導入した。形質転換細胞系を樹立し、熱ショック処理を行ってまたは行わずにアセフェートに対する感受性について試験した。変換酵素アミダーゼを発現する細胞系は、殺虫薬前駆体に対する感受性の増加を示した。
【００７４】
同じ発現ベクターを、文献に記載されるような、ショウジョウバエ細胞系における一過性発現の実験のために使用した。これらの実験では、プラスミドＤＮＡをカルシウム共沈により培養細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの１〜２日後に遺伝子産物の存在についてトランスフェクト細胞をアッセイした。この実施例でのアッセイは、アセフェートからメタミドホスへの変換の直接検出に基づくもので、標準分析用ガスクロマトグラフィー／質量分析により行った。
【００７５】
実施例２：　細菌アミダーゼ遺伝子のクローニングおよび特徴づけ
この方法に関係するステップとして、（ａ）アセフェートをメタミドホスに変換する細菌種を同定するために細菌種のコレクションをスクリーニングすること、（ｂ）変換しない細菌において補足することにより関与するアミダーゼをクローニングすること、が含まれる。変換する細菌のゲノム配列が入手可能である場合には、原核または真核生物由来の他の既知アミダーゼとの相同性により候補アミダーゼを同定することができる。
【００７６】
変換酵素を葉に発現するトランスジェニックタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）は標準方法により作製される。そのための発現カセットは文献（Ｃｈｒｉｓｔｏｖ ＮＫ， Ｉｍａｉｓｈｉ Ｈ， Ｏｈｋａｗａ Ｈ． （１９９９）「Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａに対する抵抗性を付与する、半数体タバコ植物におけるＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ δ−エンドトキシンの活性断片をコードする再構成ｃｒｙ１Ｃ遺伝子の緑色組織特異的発現」Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６３：１４３３−１４４４）に記載されている。トランスジーンの効果は、アセフェートで処理した植物におけるメタミドホスをガスクロマトグラフィー／質量分析で検出することにより、直接アッセイすることができる。
【００７７】
この方法の効力を評価するために昆虫バイオアッセイを行う。このアッセイには、チョウ・ガ目の昆虫であるオオタバコガの幼虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ａｒｍｉｇｅｒａ）のような「噛む害虫」、またはアブラムシであるモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）のような「吸う害虫」を用いる。別個の環境チャンバーで栽培したトランスジェニック植物と非トランスジェニック対照植物にアセフェートをスプレーし、そのチャンバーに昆虫を放して、昆虫の生存を２４時間にわたり追跡する。メタミドホスを陽性対照として用いる。
【００７８】
その他の実施形態
当業者には、他の実施形態が明白であろう。前述の詳細な説明は明瞭にするために提供されたもので、単なる例示にすぎない。本発明の精神および範囲は、上記の実施例に限定されることなく、特許請求の範囲により包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
表示した濃度の殺虫薬で処理した１６時間後の生存率（％）として表した、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＯＲ／Ｒ株）およびチチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）（Ｂｅｎａｋｅｉｏｎ株）に及ぼすアセフェート（ａｃｅ）とメタミドホス（ｍｅｔ）の効果。
【図２】
ショウジョウバエ・アミダーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅。レーン１：ＤＮＡ対照なし；レーン２：ＣＧ５１１２プライマー；レーン３：ＣＧ５１９１；レーン４：ＣＧ７９００；レーン５：ＣＧ７９１０；レーン６：ＣＧ８８３９；レーン７：サイズマーカー
【図３】
各種ハエのアミダーゼ関連遺伝子のサザン分析。レーン１：Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）；レーン２：Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ ｏｌｅａｅ（オリーブミバエ）；レーン３：Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ（チチュウカイミバエ）；レーン４：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（キイロショウジョウバエ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月25日(2002.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的害虫の集団を防除する方法であって、
（ｉ）　　酵素／殺虫薬前駆体系の１つの成分をコードするコード配列、および標的植物において該コード配列に機能的に連結される調節領域を含む遺伝子を提供すること、
（ｉｉ） 　該遺伝子を用いて標的植物の集団を形質転換すること、および
（ｉｉｉ）　形質転換した標的植物の集団に、酵素／殺虫薬前駆体系の残りの成分を投与し、その結果として、形質転換した植物内で不活性殺虫薬前駆体を殺虫薬に変換させること、
を含んでなり、該コード配列が、殺虫薬前駆体をその活性代謝産物に変換するアミダーゼ酵素、混合機能オキシダーゼ／シトクロムＰ４５０、またはエステラーゼ酵素をコードする、上記方法。
【請求項２】
調節領域が主に植物において該コード配列を発現させるように作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
殺虫薬前駆体が有機リン酸、ホスホルアミデート、ネオニコチノイド、またはオキサジアジン誘導体からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項４】
殺虫薬前駆体／活性化酵素系が、
（ｉ）　アセフェートまたはアセフェートの類似体、および
（ｉｉ） アセフェートまたはアセフェートの類似体をその活性代謝産物メタミドホスに変換できるアミダーゼ、
からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
殺虫薬前駆体／活性化酵素系が、
（ｉ）　Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドまたはＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドの類似体、および
（ｉｉ） Ｎ−Ｍｅ−イミダクロプリドまたはＮ−Ｍｅ−イミダクロプリドの類似体をその活性代謝産物イミダクロプリドに変換できる混合機能オキシダーゼ／シトクロムＰ４５０、
からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
殺虫薬前駆体／活性化酵素系が、
（ｉ）　ＤＰＸ−ＪＷ０６２またはＤＰＸ−ＪＷ０６２の類似体、および
（ｉｉ） ＤＰＸ−ＪＷ０６２またはＤＰＸ−ＪＷ０６２の類似体をその活性代謝産物に変換できるエステラーゼ、
からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
殺虫薬前駆体、または宿主生物におけるその活性殺虫薬への変換が、昆虫、線虫、原生動物、真菌、細菌およびウイルスを含めて、植物病原体を防除するために使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
吸う昆虫、刺す昆虫、および噛む昆虫を防除するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的植物細胞を形質転換することができるベクターであって、酵素／殺虫薬前駆体系の１つの成分をコードするコード配列と、標的植物において該コード配列に機能的に連結される調節領域とを含む遺伝子を含有し、該コード配列が、殺虫薬前駆体をその活性代謝産物に変換するアミダーゼ酵素、混合機能オキシダーゼ／シトクロムＰ４５０、またはエステラーゼ酵素をコードする、上記ベクター。
【国際調査報告】
2004508058.tif 000036
2004508058.tif 000037
2004508058.tif 000038