(57)【要約】本発明は、次の工程を含む、ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを生産するための新規な方法に関する：酵母を、該ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドの前駆体を少なくとも１種含む培地において培養し、次いで、生物変換の後にヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを培地より分離する。この方法は、前記酵母がＣｙｐ７ｂ 遺伝子の産物を発現するように形質転換された酵母であることを特徴とする。本発明は、改変された酵母株にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを生産するための方法であり、酵母がＣｙｐ７ｂ 遺伝子の産物を発現するように形質転換された酵母であることを特徴とする、前記方法：
・酵母を、該ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドの前駆体を少なくとも１種含む培地において培養し、次いで、
・生物変換の後にヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを培地より分離する。
【請求項２】
前記酵母のＡＰＡＴ活性が低いか全くないこと、及び／又は前記酵母を酸化的な条件下で培養することを特徴とする、ヒドロキシル化ステロイドを生産するための請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記前駆体がヒドロキシル化されうる７の位置を有することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体が３−ヒドロキシル化ステロイド、好ましくは３ β− ヒドロキシル化ステロイド、または３−ケト官能基を有するステロイドである、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体が、アンドロスタン、アンドロステン、プレグナン、プレグネン、コラン、コレン、コレステロール、エルゴスタン、エルゴステン、テストステロンまたはスチグマスタン型の構造を有するステロイドから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項６】
前記前駆体が、ＤＨＥＡ、テストステロン、プレグネノロン、プレグナノロン、２５− ヒドロキシコレステロール、５−α− アンドロスタン−３β，１７ β− ジオールおよび５−α− アンドロステン−３β，１７ β− ジオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵母のＡＰＡＴ活性が、ａｔｆ２遺伝子の不活化またはａｔｆ２− 突然変異体の使用により、低下しているか全くない状態にされていることを特徴とする、請求項２〜６のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
酵母がデヒドロゲナーゼ活性も有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
前記デヒドロゲナーゼ活性が、１７− ヒドロキシル化誘導体を産生する１７− デヒドロゲナーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１７− デヒドロゲナーゼ活性がｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子により発現されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
酵母の１７− デヒドロゲナーゼ活性が、特に、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の不活化または ｙｉｌ１２４ｗ− 突然変異体の使用により、低下しているか全くない状態にされていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかの項記載の方法。
【請求項１２】
酵母がサッカロミセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法。
【請求項１３】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子が、ＣＹＣ１、ＴＥＦ１およびＴＤＨ３から選択される酵母プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの項記載の方法を用いて得ることができることを特徴とする、ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイド。
【請求項１５】
ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の不活化により１７− デヒドロゲナーゼ活性をもたない酵母株。
【請求項１６】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子を発現する発現カセットを含むプラスミドで形質転換された酵母株。
【請求項１７】
中枢神経系疾患の処置用の医薬品を製造するための、請求項１４記載ステロイドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、酵母発酵によりヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイド類を製造する新規な方法に関する。
【０００２】
ステロイド類、特にコレステロール誘導ステロイド類は多くの生理学的過程に関与しており、その中には循環血液中の炭水化物およびコレステロール濃度の調節、筋肉量の維持並びに発達および中枢神経系の発達が挙げられる。
【０００３】
ステロイドの血中濃度における平衡異常の場合に見られる欠点の中に、自己免疫疾患 （例、狼瘡） 、ある種のがん （例、乳がん） および心血管の疾患 （例、アテローム硬化症） の引き金の可能性が挙げられる。ステロイド調節に関する問題はまた、パーキンソン病やアルツハイマー病などのある種の神経学的疾患の引き金の場合においても疑われている。
【０００４】
デヒドロエピアンドロステロン、すなわちＤＨＥＡに関する、特にＢａｕｌｉｅｕ 教授による研究により中枢神経系の発達におけるステロイド類、特に神経ステロイド （ニューロステロイド、ｎｅｕｒｏｓｔｅｒｏｉｄ） の重要性だけでなく、老化現象 （Ｂａｕｌｉｅｕ ａｎ Ｒｏｂｅｌ， １９９８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９５，４０８９−４０９１）を含むすべての密接に関連するプロセスにおけるこの種のステロイドの影響の可能性が示された。
【０００５】
従って、非常に多くの生理学的プロセスに関与する新規ステロイド誘導体、特に神経ステロイド族を得られることは特に有利である。
これはまさに本発明の主題の１つ、すなわち高い特異性および高い収量を可能にする発酵法を用いて、新規なステロイド誘導体、特に神経ステロイド類の入手を可能にする方法の開発である。
【０００６】
さらに、本発明の方法は、既知ではあるがこれまで工業的に許容しうる方法を用いて入手することが困難だった構造を有するステロイド類を得るために用いることができる。
【０００７】
本発明は、酵母がステロイド前駆体を生物学的に変換する、すなわち生物変換 （ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｔ） して多様なヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを生産することができ、当然、これらは次いで必要であれば、特に反応性であるかかる官能基において修飾されうるという事実の実証に基づいている。
【０００８】
従って、本発明は特に、下記工程を含む、ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを生産するための方法であり、この方法は、酵母がＣｙｐ７ｂ 遺伝子の産物を発現するように形質転換された酵母であることを特徴とする方法に関する：
・酵母を、上記ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドの前駆体を少なくとも１種含む培地において培養し、次いで、
・生物変換 （ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の後にヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを培地より分離する。
【０００９】
酵母は本来、ａｔｆ２遺伝子によりコードされる酵素的アセチル化活性およびｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子によりコードされる酵素的脱水素活性を有する。
ａｔｆ２遺伝子によりコードされる酵素 （その配列および活性はＣａｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６１，３１７−３２４および仏国特許出願ＦＲ２７７４３９３ に記載、またはｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのアドレスに開示） は、アセチル補酵素Ａ−プレグネノロンアセチルトランスフェラーゼであり、以後「ＡＰＡＴ」と称する。この酵素は、プレグネノロン、１７− ヒドロキシプレグネノロン、デヒドロエピアンドロステロン （ＤＨＥＡ） または４−プレグネン−３β− オール−２０−オンといったΔ５ − またはΔ４ −３β− ヒドロキシステロイドなどのステロイド前駆体のエステル化、特にアセチル化を可能にする。このエステル化は好ましくは上記前駆体の３位におけるＯＨ官能基上で行われる。従って、酵母においてこの活性が発現すると、完全にまたは部分的にアセチル化されたステロイド前駆体の誘導体の産生を可能にする。同様に、この官能基の全部または一部においてアセチル化反応が生じないように、培地中に導入された前駆体のＯＨ官能基の全部または一部を化学的に保護することが可能である。かかる保護方法は周知であり、例えばシランの添加、エステル官能基への修飾などからなる。
【００１０】
しかし、以下に記載の本発明のある特定の態様によれば、ＡＰＡＴ酵素活性を欠損した酵母株、例えば特にＣａｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９９， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６１，３１７−３２４） または仏国特許出願ＦＲ２７７４３９３（この内容は参照として本願において援用する） に記載されたもの等を使用することも可能である。
【００１１】
ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子は酵母ゲノム配列決定プロジェクトの期間中に報告されたが、その機能は決定されていない。これは染色体ＩＸの１２６２０４〜１２７０９７の位置にある。その配列は、例えばｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ のアドレスに存在するサッカロミセス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムのためのデータベースにおいて当業者が容易に入手できる。本発明の研究に関して、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子によりコードされるタンパク質は、哺乳動物において既報の１７β− ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ （１７ＢＤＨ； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６８，１２９６４−１２９６９）の活性に匹敵するデヒドロゲナーゼ （脱水素酵素） 活性を有することが示された。この活性はより具体的には、ＤＨＥＡなどのある種のステロイド前駆体の１７の位置において天然にまたは化学修飾後に存在するケトン官能基のアルコールへの還元を行わせる。より詳しくは、ＤＨＥＡ基質の場合、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子によりコードされるタンパク質の酵素活性は、このステロイドのケトン官能基の還元および３，１７− ジオール （以後、「ジオール」と称する） の形成へと導く。さらに、必要な場合には、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の配列は既知であるので、突然変異誘発の技術を熟知した当業者にとってｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子が不活化された酵母株を作製することは容易である。例えば、以下の実施例に従って、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子をコードする配列がノックアウトされ （ノックアウト技術） 、その酵素活性が抑制された酵母株を得ることが可能である。
【００１２】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子は既知である；これは、Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０，２９７３９−２９７４５）またはＲｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９４，４９２５−４９３０） により既に報告されている。その配列は特に、特許出願ＷＯ ９６１２８２０に記載され、受託番号ＩＦＯ ２０３１として発酵研究所 （大阪）（ＩＦＯ）から入手できる。それらの文献の内容は参照として本願において援用される。しかし、この哺乳動物の遺伝子が酵母により発現されること、より詳しくは、その活性形態で発現されることを示す文献はない。さらに、酵母が基質としてステロイドを用いうるであろうことを想像させうるものはない。具体的には、Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子は哺乳動物、特にラット、マウスおよびヒトから分離された遺伝子であり、この遺伝子によりコードされる酵素は、共通して「シトクロムＰ４５０」と呼ばれる酵素のファミリーに属し、その活性型はヘムを含有し （Ｐｏｕｌｏｓ， １９８８， Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，５，６７−７５） 、そしてステロイドの代謝経路に関与している （Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９４，４９２５−４９３０ 参照） 。Ｃｙｐ７ｂ タンパク質はヒドロキシラーゼ （水酸化酵素） であり、より詳しくは７−ヒドロキシル化ステロイド、特に７ α− ヒドロキシル化ステロイドを得ることを可能にする７−ヒドロキシラーゼである。しかし、ステロイドの基質が、環の１つの構造の修飾により、「本来は７の位置」が「同等の６の位置」に変えられた既知ステロイド化合物と均等である特定の場合を想像することが可能である。この具体例において、Ｃｙｐ７ｂ タンパク質は６−ヒドロキシル化ステロイドを得ることを可能にする。
【００１３】
本発明の好ましい例によれば、使用される酵母において発現されたＣｙｐ７ｂ 酵素の上記「ジオール」化合物に対する作用により、３，７，１７− トリオール （以後、「トリオール」と称する） の生成を可能にする。さらに、このジオールまたはトリオールの３−ＯＨ官能基がアセチル化された場合、それぞれ「アセチル− ジオール」または「アセチル− トリオール」と称される。
【００１４】
従って、本発明方法により産生されるヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドの性質は、ヒドロキシル化酵素Ｃｙｐ７ｂ を発現する前記酵母の可能性と組み合わせた、ａｔｆ２遺伝子にコードされるアセチル化及び／又はｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子によりコードされる脱水素の機能を発現している、または発現していない酵母の可能性による。
【００１５】
非常に多数のステロイドについて、ヒドロキシル化誘導体がアセチル化誘導体よりも活性であることが示されたため、本発明による産生が望ましいであろう化合物は、ヒドロキシル化化合物であるのが好ましい。しかし、この点に関し、アセチル官能基はｉｎ ｖｉｖｏ で徐々に加水分解されることができ、従って、遅延型のヒドロキシル化形態 （すなわち、患者に投与される化合物は活性型ではないが、アセチル化化合物の自然の代謝後に活性型がｉｎ ｖｉｖｏ で得られる） を構成できることに注意すべきである。従って、本発明は、遊離ＯＨ官能基を含むステロイドを製造する方法、およびアセチル基で保護されたＯＨ官能基を含むステロイドを製造する方法の両方に関する。
【００１６】
いずれにしても、ヒドロキシル化ステロイド誘導体の製造が求められる好ましい態様によれば、本発明の方法で用いられる酵母のＡＰＡＴ活性は低いか全くないのが望ましい。これを達成するための様々な可能性がある。
【００１７】
第１の方法によれば、ａｔｆ２遺伝子が自然に欠損しているか、少なくとも、ほとんどもしくは全く発現しない酵母株を用いることが可能である。このように、Ｎａｇａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６２，１８５２−１８５７， １９９８） はＩＦＯ ２０３１株 （サッカロミセス・バヤヌス， Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）がａｔｆ２遺伝子を欠損していると述べている。
【００１８】
別の方法によれば、培地中に存在するステロイド前駆体をアセチル化する酵母の能力が大きく低下するか消失さえする培養条件を用いることができる。特に、出願人はａｔｆ２＋ 活性を有する株が、酸化的、特にグリセロールやアセテートなどの非発酵性炭素源での生育により酸化的である条件下では、より制限されたアセチル化反応を行うという事実を実証した。
【００１９】
第３の方法では、本来あるいは遺伝的操作後にデアセチラーゼ活性を有する酵母株を用いることができる。この活性は短鎖アルコールエステル類 （ｒＥＦ）に作用するとして報告されている。かかる系の使用により、ＡＰＡＴ活性により得られる産物の脱アセチル化が可能となる。
【００２０】
最後に、ａｔｆ２− 株、すなわちこの遺伝子が発現しないか、もしくはこの遺伝子の産物が不活性である株を用いることが可能である。より詳しくは、当業者は通常の実験により、例えば、特にＣａｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９９， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６１，３１７−３２４） 、または仏国特許出願ＦＲ２７７４３９３（これらの内容は参考文献として本願に援用する） に記載されたようなＡＰＡＴ酵素活性を欠損した酵母株を調製することができる。
【００２１】
また、本発明方法のある時期のみに、例えばＣｙｐ７ｂ 遺伝子の発現に続いて、ａｔｆ２遺伝子の活性を誘導することが有利であるかもしれない。このように、ある種のプロモーターが、外部刺激の存在下でのみ （Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ７９，７４１０−７４１４） 、または酵母が定常期である場合 （Ｐａｎａｒｅｔｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０６，６３５−６４０）に活性である酵母において報告されている。従って、かかるプロモーターの制御下に置かれたａｔｆ２遺伝子の使用は、上記組換え遺伝子を含む酵母におけるａｔｆ２活性を制御することを可能にする。
【００２２】
また、哺乳動物の１７ＢＤＨ 活性に類似した内在性活性 （ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子によりコードされる） を有する本発明の方法で使用する酵母の存在は、未修飾産物に比較して付加的価値を与えることができる還元化合物の生成を導く。一方、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の活性が低下あるいは抑制される酵母株または培養条件を得ることも望ましいかもしれない。従って、酸化性培地で培養するための条件、またはｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子が不活化されている酵母株を利用することも可能である。
【００２３】
当然、還元化合物を得ることが有利である本発明の好ましい例によれば、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子を過発現しうる、または例えば上記記載のような誘導性プロモーターの制御下にｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子が置かれた株を使用することにより生物変換の好ましい時期に１７ＢＤＨ 活性を発現しうる酵母株を得ることが可能である。
【００２４】
例えば前記酵母株をこの基質上で反応する酵素活性をも発現するように形質転換することにより、ａｔｆ２＋ 酵母株を用いた本発明方法においてＡＰＡＴ活性の作用後に得られるアセチル官能基を修飾することももちろん可能である。
【００２５】
本発明において使用できるステロイド前駆体基質には、ヒドロキシル化されうる、すなわち入手可能でヒドロキシラーゼ活性を有する酵素によりヒドロキシル化されうる７位を有するステロイドまたはステロイド前駆体が例示される。ヒドロキシル化可能なかかる位置の例としては特に、炭素、硫黄および窒素がある。
【００２６】
本発明において使用できるステロイド前駆体基質には、より詳しくは３−ヒドロキシル化ステロイド、特に３−β− ヒドロキシル化ステロイド、または３−ケト官能基を有するステロイドが挙げられる。
【００２７】
より詳しくは、本発明において、アンドロスタン、アンドロステン、プレグナン、プレグネン、コラン、コレン、コレステロール、エルゴスタン、エルゴステン、テストステロンまたはスチグマスタン型の構造を有するステロイド、例えば、ＤＨＥＡ、テストステロン、プレグネノロン、プレグナノロン、２５− ヒドロキシコレステロール、５−α− アンドロスタン−３β，１７ β− ジオールまたは５−α− アンドロステン−３β，１７ β− ジオール、からなる群より選択される前駆体が考慮されるが、これらに限定されることはない。
【００２８】
これらの化合物はアセチル化形態で得られてもよいことは当然である。１７位にケトン官能基を有する前駆体において、この官能基は既述のようにして還元することもできる。
【００２９】
限定はされないが、カンジダ属 （Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロビア属 （Ｙａｒｒｏｖｉａ） 、クルイベロミセス属 （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属 （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属 （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ） 、ピヒア属 （Ｐｉｃｈｉａ） およびハンゼヌラ属 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）から選択されてもよい各種の属の酵母を使用することにより本発明を実施することができる。
【００３０】
本発明の好ましい態様はエス・セレビシアエ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） などのサッカロミセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母を使用するであろう。
これらの酵母を培養することができる条件は当業者に既知である；本発明方法を実施するためには培地に所望のステロイドの前駆体である基質を添加すれば十分である。
【００３１】
以下に示す例は、ある種の培地が他のものよりもヒドロキシル化ステロイドの産生にとってより好ましことを示す；これは当業者により容易に最適化されうるパラメーターである。
【００３２】
培地としては、特にグリセロール及び／又はグルコースを含むＹＰＤ 、ＹＰＧ 、ＹＮＢＤおよびＹＮＢＧが挙げられる （Ｓｈｅｒｍａｎ， １９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４，３−２１ 参照） 。また、方法の実施の際に培地の組成を調整すること、またはＣｙｐ７ｂ 遺伝子の発現を指令するために選択されるプロモーターに関連して培地を選択することが可能である （例えば、ＣＹＣ１プロモーターの場合では最小培地ＹＮＢＤが選択され、ＴＥＦ１プロモーターの場合はリッチな培地ＹＰＧ が選択されるであろう） 。
【００３３】
その他の培養条件は通常の条件であるが、それらを最適化することができる。　本発明方法に関して、培地に添加される前駆体の量は、生物変換培地の濃度を１０〜２００ μｇ／ｍｌ 、好ましくは２０〜１００ μｇ／ｍｌ の範囲とするように選択されるであろう。
【００３４】
本発明に関して使用される酵母は、Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子の産物を発現するように形質転換された株である。これは、この株が、酵母にＣｙｐ７ｂ 遺伝子を導入し、その発現を可能にするように予め改変されていることを意味する。Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子の発現のための酵母の形質転換に関し、この遺伝子を酵母のゲノムに導入するか、または染色体外に位置するように導入することが可能である。これらの目的にとって、プラスミド型の環状または直鎖状の系を使用することができる。酵母由来の複製起点を含むプラスミドのなかで、選択マーカーとして抗生物質耐性の選択マーカー （例，Ｇ４１８Ｒ遺伝子） か、少なくとも１つの栄養要求性マーカー （例、ＵＲＡ３、ＵＲＡ３ｄ またはＬＥＵ２） を含むサッカロミセスの２μプラスミド由来のプラスミドが挙げられる。かかる形質転換技術は文献に十分に記載され、特に困難な点はない。
【００３５】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子に関しては、形質転換酵母においてその発現を可能にするために、その核酸配列 ［発酵研究所、大阪 （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｏｓａｋａ，ＩＦＯ）の受託番号ＩＦＯ ２０３１または配列番号１） をＣＹＣ１ （Ｄｅｇｒｙｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ， １９９５， １１，ｐｐ．６２９−６４０）、ＴＥＦ１ （Ｃｏｔｒｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６０，３０９０−３０９６） またはＴＤＨ３ （Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｅｇａｎ， １９８４， Ｇｅｎｅ， ３２，２６３−２７４）などの酵母プロモーターの制御下でクローン化することができる。
【００３６】
本発明方法は、産生されたステロイドを培地から分離する工程も含む。かかる工程はこの方法の決定的要素となることはなく、ステロイド精製の分野で一般的に使用されている各種技術 （クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等） を行うことができる。
【００３７】
本発明はまた、上記方法を用いて得ることができる、あるいは得られる新規なヒドロキシル化ステロイド、および治療または予防用途に関して、特に神経ステロイドとして、ヒトまたは動物の体を処置するための医薬品を製造するためのその使用にも関する。
【００３８】
また、本発明は、上記新規なヒドロキシル化ステロイドを含む組成物、特に薬剤組成物にも関する。これらの薬剤組成物は薬剤的観点から許容しうる１または２以上の担体も含む。かかる担体は好ましくは、等張性、低張性またはやや高張性であり、例えばショ糖溶液のような、比較的低いイオン強度を有する。さらに、かかる担体は任意の溶剤または水溶液もしくは部分的水溶液、例えば非発熱性滅菌水などを含んでいてもよい。また、ｉｎ ｖｉｖｏ での使用の必要に合わせるために製剤のｐＨを調整し緩衝化する。製剤はまた、薬剤の観点から許容できる希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、および可溶化、可溶化及び／又は保存のための薬剤を含有してもよい。注射可能な投与のためには、水溶液、非水溶液または等張液の処方が好ましい。これは適宜希釈剤とその場で再構成しうる液状形態または乾燥形態 （粉末、凍結乾燥物等） の一回量または複数回量で供給してもよい。
【００３９】
以下の実施例は、ベクターの作製および酵母の形質転換のための方法の理解を可能にするものであるが、これは大部分について当業者に既に知られた技術を含む。ベクターはＤｅｇｒｙｓｅ ｅｔ ａｌ． （Ｙｅａｓｔ， １９９５，１１，ｐｐ．６２９−６４０）に記載されている。
【００４０】
以下の結果は単なる例示として示されることは当然である。従って、例えば生物変換操作において得られるレベルは単なる例示であり、決して、最適化された条件下での系の最大能力を示すものではない。
【００４１】
【実施例】
【実施例１】ｃｙｐ７ｂ ｃＤＮＡ用発現ベクターの作製
ｃｙｐ７ｂ ｃＤＮＡを配列番号１のオリゴを用いて増幅し、ＳａｌＩ部位 （下線） および４Ａｓ 配列をＡＴＧ コドンの前に導入し、配列番号２の第二のプライマーで終結コドンの後にＭｕｌＩ部位を導入する。
【００４２】
第一の ＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＭｌｕＩ 切断後に、ｐＴＧ１０１６４ （Ｄｅｇｒｙｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ， １９９５，１１，ｐｐ．６２９−６４０） と同等のベクターのＳａｌＩ／ＭｌｕＩ 部位中にサブクローン化する。これにより、２μ環境でＧ４１８Ｒ （ｎｅｏ） 遺伝子と共にＣＹＣ１プロモーター （Ｄｅｇｒｙｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｙｅａｓｔ， １９９５，１１，ｐｐ．６２９−６４０） の制御下にＣｙｐ７ｂ 遺伝子を含むベクターｐＴＧ１４０１０が得られる。
【００４３】
次いで、ＴＥＦ１プロモーター（Ｃｏｔｒｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６０，３０９０−３０９６）をＣｌａＩ／ＳａｌＩ 交換によりクローン化し、ベクターｐＴＧ１４０１１を作製する；対応するプラスミドは上記Ｙｅａｓｔ の論文に記載されている。
【００４４】
ＣＹＣ１ （またはＴＥＦ１） プロモーターを含むＮｏｔＩ発現ブロックを、ＵＲＡ３ｄ 遺伝子を含む２μ系プラスミドｐＴＧ１００４２ （またはｐＴＧ１００９２） 中に、Ｙｅａｓｔ の論文中に既報の組換え方法によって導入して、プラスミドｐＴＧ１４０１２ （またはｐＴＧ１４０１４） を得た。ｐＴＧ１４０１５プラスミドをｐＴＧ１４０１４と同様の方法により、ＵＲＡ３遺伝子を選択遺伝子として含むｐＴＧ１０２２０から作製した。
【００４５】
ＵＲＡ３ｄ 遺伝子は、最小培地において非常に多数のコピーのための選択を可能にするので、この遺伝子を選択した。ＵＲＡ３遺伝子は平均的数のコピーを産生し、選択圧 （ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ） は最小培地において適当である。
【００４６】
ｐＴＧ１４０１２、ｐＴＧ１４０１４およびｐＴＧ１４０１５プラスミドを形質転換によってＦＹ１６７９−２８ｃ株中に形質転換により導入し、形質転換体を適宜最小培地において選択し、貯蔵した。
【００４７】
以下の表はｃｙｐ７ｂ 用の発現ベクターをまとめたものである。
2004500340.tif 000002
すべてのベクターはＥ．ｃｏｌｉレプリコンおよび酵母２μプラスミドの複製起点を含む。
【００４８】
使用した酵母は以下の通りである：
ＦＹ１６７９−２８ｃ （Ｍａｔａ ｕｒａ３−５２　ｔｒｐ１−６３ ｌｅｕ２ −１ ｈｉｓ３−２００ ＧＡＬ ｆｅｎ１）、ＦＹ１６７９由来のＭａｔａ ｓｅｇｒｅｇａｎｔ
ＴＧＹ２０２およびＴＧＹ２０６は、それぞれＦＹ１６７９−２８ｃおよびＴＧＹ１８６株の形質転換後に得られるＴＲＰ１誘導体である。
【００４９】
ＴＧＹ１５６においては、ａｔｆ２遺伝子の一部が不活化され、ＵＲＡ３で置換されている。ＴＧＹ１８６は、ａｔｆ２遺伝子座のＵＲＡ３遺伝子が発現ブロックの形態のＴＥＦ１：：ＰＧＫ１で置換された、ＴＧＹ１５６の誘導体である。
【００５０】
これらの株を酢酸リチウム操作 （Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｊ．Ｂａｃｔ． １５３，１６３−１６８）または電気穿孔法 （Ｎａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２，１５０９−１０） を用いて形質転換し、適宜アミノ酸を含むＹＮＢＧ固形培地上で選択する。
【００５１】
【実施例２】生物変換
細胞を適宜アミノ酸を添加したＹＮＢＧ固形培地上で増殖させる。試験すべき培地と同じ組成を有する培地中、２８℃において２４時間予備培養を行う。最小培地 （ＹＮＢ および炭素源） にカザミノ酸を０．５ ％添加する （この株に必要な栄養素に加え） 。
【００５２】
増殖培地がグリセロール （２％） を含む場合、培養を開始するためにグルコースも０．１ ％存在させる。
予備培養物の一部を用いて、 ６００ｎｍの光学密度が０．１ となるように培地１０ｍｌに接種し、ＤＨＥＡを５０／５０ のタージトル （ｔｅｒｇｉｔｏｌ） ／エタノール混合物中に１０ｍｇ／ｍｌ で可溶化する （または指定された時間に添加する） 。各時間に、培地の５００ μｌ部分をとり、ステロイドを分析のために抽出する。
【００５３】
ジクロロメタン４ｍｌを培地に添加し、混合物を１０分間攪拌し、３０００ｒｐｍ で３分間遠心分離する。有機相を５０℃窒素気流下で乾燥させる。ジクロロメタンを５００ μｌを残渣に添加し、試料を急速に攪拌し、次いで上記のように乾燥させる。残渣を９０／１０ イソプロパノール／水混合物にとり、注入管に移し封をする。試料をＤＨＥＡ、７−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ およびアセチル−ＤＨＥＡ からなる標準物に対してＨＰＬＣで分析する。いくつかの標準物は５−アンドロステン−３β，１７ β− ジオールも含む。
【００５４】
使用した各種培地はＹＰＧ 、ＹＮＢＤ （２％グルコース） およびＹＮＢＧ （２％グリセロール、０．１ ％グルコース） である。
得られた結果を以下の実施例において示す。
【００５５】
【実施例３】酵母における固有の１７− デヒドロゲナーゼ活性の実証
ＴＧＹ２０２およびアセチル−ＤＨＥＡ をＹＮＢＤにおいて４９時間培養するとアセチル− ジオールの分離が可能となり、これは酵母のデヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００５６】
得られた産物の性状決定により、この活性が哺乳動物の１７β− ヒドロキシステロイドのデヒドロゲナーゼ （１７ＢＤＨ）の活性に類似していると決定することができた。
【００５７】
【実施例４】酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１７ＢＤＨ 活性をコードするｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の同定
ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子を配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて ＰＣＲ法により増幅し、それぞれＳａｌＩおよびＭｕｌＩ制限部位を導入する。増幅産物を、ＳａｌＩおよびＭｕｌＩ酵素で切断後、酵母ベクターｐＴＧ１０８５１中にサブクローン化してベクターｐＴＧ１４４９１を得た。従って、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子は酵母プロモーターＴＥＦ１および酵母ターミネーターＰＧＫ１の制御下にある。複製起点は２−μであり、選択マーカーはＧ４１８− 耐性遺伝子である。
【００５８】
ＴＧＹ２０６をｐＴＧ１４４９１で形質転換後、基質としてＤＨＥＡを用いてＹＮＢＤ培地において２４時間生物変換を行う。培地中に存在するステロイドを分析する：
2004500340.tif 000003
値は培地から抽出されたステロイドμｇ／ｍｌ で表される。
【００５９】
これらの結果は、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の１７ＢＤＨ 活性を確認し、その過発現が還元されたステロイド誘導体の産生を可能にすることを示す。
【００６０】
【実施例５】ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子のノックアウト突然変異体の作製
ｐＴＧ１４４９１プラスミドをＰｓｔＩおよびＮｃｏＩ （ｙｉｌ１２４ｗ のコーディング配列のユニーク制限部位） で切断し、付着末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。次いでＵＲＡ３遺伝子を、ｙｉｌ１２４ｗ のコーディング配列がこの選択マーカーＵＲＡ３でノックアウトされるように、このプラスミド中にクローン化する。得られたプラスミド、ｐＴＧ１４５８４は、ＴＩＬ１２４ｗ 遺伝子と同じ翻訳方向にＵＲＡ３遺伝子を含む。ｐＴＧ１４５８４をＳａｌＩおよびＭｕｌＩで切断後、ＵＲＡ３によりノックアウトされたｙｉｌ１２４ｗ を含む切断断片を、ＴＧＹ２０２およびＴＧＹ２０６株中に導入し、組換え体コロニーをＹＮＢＤ＋ＬＨ上で選択し、この選択はウラシルの原栄養性に対するものである。このようにしてＴＧＹ２７９およびＴＧＹ２８２株がそれぞれ得られる。
【００６１】
ＴＧＹ２０６およびＴＧＹ２８２株をＹＮＢＤ培地中ＤＨＥＡまたはアセチル−ＤＨＥＡ の存在下で２４時間培養し、得られた産物を測定する。
【００６２】
【表】
2004500340.tif 000004
【００６３】
結果は培地より抽出されたμｇ／ｍｌ で表される。
従って、ＴＧＹ２８２株はもはやＤＨＥＡまたはアセチル−ＤＨＥＡ をそれぞれジオールまたはアセチル− ジオールに還元できないことが明かである。これはｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子および１７− デヒドロゲナーゼ機能の不活化を確認する。
【００６４】
さらに、酵母がアセチル−ＤＨＥＡ をＤＨＥＡに脱アセチル化する固有の活性を有することが観察されるかもしれない。従って、関与する遺伝子の同定およびＡＰＡＴ活性に関する過発現により、ａｔｆ２遺伝子の突然変異体を用いることなくステロイドを産生することが可能となるであろう。
【００６５】
【実施例６】ｃｙｐ７ｂ 用発現プラスミドで形質転換されたＴＧＹ２０２株を用いたＤＨＥＡから７−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ を得るための本発明方法の使用
ｐＴＧ１４０１２、ｐＴＧ１４０１４またはｐＴＧ１４０１５プラスミドで形質転換されたＴＧＹ２０２株を、ＹＰＧ 培地中ＤＨＥＡ （４０μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養し、培地中の７−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ （７αＨＯ−ＤＨＥＡ）の存在を評価する。
【００６６】
結果を以下の表に示す：
ＴＧＹ２０２　　　　 ７− ヒドロキシ−ＤＨＥＡ
ｐＴＧ１４０１２　　　　　　　４．２
ｐＴＧ１４０１４　　　　　　　６．４
ｐＴＧ１４０１５　　　　　　　３．１
培地中の７αＨＯ−ＤＨＥＡ の存在は、ｃｙｐ７ｂ 遺伝子が、酵母によるＤＨＥＡの７αＨＯ−ＤＨＥＡ への生物変換を可能にする活性形で発現されることを示す。従って、Ｃｙｐ７ｂ の任意の可能な基質がｃｙｐ７ｂ を発現する酵母株によりｉｎ ｖｉｖｏ でヒドロキシル化されうる。
【００６７】
さらに、これらの結果は、ＴＥＦ１プロモーターがＣＹＣ１よりもより効果的であること、および選択マーカーＵＲＡ３ｄ がマーカーＵＲＡ３よりも良好な結果を与えることを示す。
【００６８】
【実施例７】発酵条件の変更による生物変換での７αＨＯ−ＤＨＥＡ の産生の向上
ＴＧＹ２０２−ｐＴＧ１４０１２ およびＴＧＹ２０２−ｐＴＧ１４０１４ をＹＮＢＤおよびＹＮＢＧ培地中で、接種直後または培養８時間後に培地に添加したＤＨＥＡ （４０μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養する。
【００６９】
結果を以下の表に示す （蓄積した産物％として） 。
【００７０】
【表】
2004500340.tif 000005
【００７１】
このように、発酵培地およＤＨＥＡ基質を添加する時間は７αＨＯ−ＤＨＥＡ の選択的産生に影響し、遅い接種が一般的に良好な結果を与え、ＹＮＢＧ培地が他の培地よりも優れていることが分かる。
【００７２】
【実施例８】ＡＰＡＴ活性のＫＯ株を用いることによるアセチル化誘導体の不在下での７αＨＯ−ＤＨＥＡ の優先的産生
ＴＧＹ２０６ｐ−ｐＴＧ１４０１４をＹＮＢＤ中でＤＨＥＡ（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で４９時間培養する。
【００７３】
得られた産物の分析により、７αＨＯ−ＤＨＥＡ が １００％回収された （９１．７μｇ／ｍｌ）ことが示される。培地がＹＮＢＧである場合は、７αＨＯ−ＤＨＥＡ（８９％、７３．８μｇ／ｍｌ）、トリオール （６％、５μｇ／ｍｌ）およびＤＨＥＡ（５．３％、４．４ μｇ／ｍｌ）の混合物が得られる。
【００７４】
これらの結果は、ＡＰＡＴ活性が存在しないと、アセチル化誘導体の産生が避けられることを示す。一方、固有の１７ＢＤＨ 活性の存在はジオールおよびトリオールの混入を生じさせる。
【００７５】
【実施例９】トリオールの優先的産生
ＴＧＹ２０６ｐ−ｐＴＧ１４０１４をジオール（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養すると、ＹＮＢＧ中で２６．４μｇ／ｍｌ のトリオール （最終産物の３６％、残部ジオール７４％） の産生を生じる。ＹＮＢＤを用いると １００％の生物変換率を与える。
【００７６】
これらの結果は、発酵培地を変更することにより、基質からの代謝物の産生を導くことが可能であることを示す。特に、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の過発現が還元誘導体の急速及び／又は完全な蓄積を可能にすることを容易に想像できる。従って、この過発現とｃｙｐ７ｂ の過発現とを組み合わせることにより、出発基質としてのＤＨＥＡからトリオールへの実質的に完全な変換を達成することができる。
【００７７】
【実施例１０】１７ＢＤＨ 活性のＫＯ株である酵母株を用いるアセチル−ＤＨＥＡ の優先的産生
ＴＧＹ２０２およびＴＧＹ２７９株を ＹＰＤ培地中でＤＨＥＡと共に２４時間培養し、産生されたステロイドを測定した。
2004500340.tif 000006
結果は培地から抽出されたステロイド全量の％として表される。
【００７８】
ＴＧＹ２７９株は、１７ＢＤＨ 活性が存在しないとＤＨＥＡをアセチル−ＤＨＥＡ に実質的に完全に変換することが明かである。
【００７９】
【実施例１１】ＡＰＡＴ活性および１７ＢＤＨ 活性のＫＯ株であり、ｃｙｐ７ｂ を発現するＴＧＹ２８２株を用いる７αＨＯ−ＤＨＥＡ の独占的産生
ＴＧＹ２７９およびＴＧＹ２８２株をｐＴＧ１４０１１プラスミドで形質転換し、ＹＰＧ ＋Ｇ４１８上で選択する。ＤＨＥＡを基質として用い、ＹＰＧ 培地中で２４時間形質転換株を培養すると、これらの株により産生されたステロイドの濃度を測定することが可能になる。
2004500340.tif 000007
結果は培地から抽出されたステロイド全量の％として表される。
【００８０】
この実験においては生物変換は完了しなかったが、ＴＧＹ２８２−ｐＴＧ１４０１１ 株はＤＨＥＡからもっぱら７αＨＯ−ＤＨＥＡ を産生し、一方ＡＰＡＴ活性をも含む株は７αＨＯ−ＤＨＥＡ だけでなくアセチル−ＤＨＥＡ も産生する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年9月3日(2001.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを生産するための方法であり、酵母がＣｙｐ７ｂ 遺伝子の産物を発現するように形質転換された酵母であることを特徴とする、前記方法：
・酵母を、該ヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドの前駆体を少なくとも１種含む培地において培養し、次いで、
・生物変換の後にヒドロキシル化及び／又はアセチル化ステロイドを培地より分離する。
【請求項２】
前記酵母のＡＰＡＴ活性が低いか全くないこと、及び／又は前記酵母を酸化的な条件下で培養することを特徴とする、ヒドロキシル化ステロイドを生産するための請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記前駆体がヒドロキシル化されうる７の位置を有することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記前駆体が３−ヒドロキシル化ステロイド、好ましくは３ β− ヒドロキシル化ステロイド、または３−ケト官能基を有するステロイドである、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体が、アンドロスタン、アンドロステン、プレグナン、プレグネン、コラン、コレン、コレステロール、エルゴスタン、エルゴステン、テストステロンまたはスチグマスタン型の構造を有するステロイドから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかの項記載の方法。
【請求項６】
前記前駆体が、ＤＨＥＡ、テストステロン、プレグネノロン、プレグナノロン、２５− ヒドロキシコレステロール、５−α− アンドロスタン−３β，１７ β− ジオールおよび５−α− アンドロステン−３β，１７ β− ジオールからなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵母のＡＰＡＴ活性が、ａｔｆ２遺伝子の不活化またはａｔｆ２− 突然変異体の使用により、低下しているか全くない状態にされていることを特徴とする、請求項２〜６のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
酵母がデヒドロゲナーゼ活性も有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
前記デヒドロゲナーゼ活性が、１７− ヒドロキシル化誘導体を産生する１７− デヒドロゲナーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１７− デヒドロゲナーゼ活性がｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子により発現されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
酵母の１７− デヒドロゲナーゼ活性が、特に、ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の不活化または ｙｉｌ１２４ｗ− 突然変異体の使用により、低下しているか全くない状態にされていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかの項記載の方法。
【請求項１２】
酵母がサッカロミセス属 （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法。
【請求項１３】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子が、ＣＹＣ１、ＴＥＦ１およびＴＤＨ３から選択される酵母プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかの項記載の方法。
【請求項１４】
ｙｉｌ１２４ｗ 遺伝子の不活化により１７− デヒドロゲナーゼ活性をもたない酵母株。
【請求項１５】
Ｃｙｐ７ｂ 遺伝子を発現する発現カセットを含むプラスミドで形質転換された酵母株。
【請求項１６】
中枢神経系疾患の処置用の医薬品を製造するための、請求項１〜１３のいずれかの項記載の方法を用いて得られるステロイドの使用。
【国際調査報告】
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