(57)【要約】本発明は、ＰＧ−３遺伝子のゲノム配列およびｃＤＮＡ配列に関する。本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子の二対立遺伝子マーカーに関する。本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、診断試薬として有用であるこのようなポリペプチドに対して特異的に指向される抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離、精製または組換えられた核酸分子を含有する組成物。
ａ）配列番号１の、少なくとも２００ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖であって、ここで、該連続した範囲が、少なくとも１つの、配列番号１の以下のヌクレオチド位置を含むヌクレオチドまたはその相補鎖：１〜９７９２１、９８５１７〜１０３４７１、１０３６０３〜１０８２２２、１０８３９０〜１０９２２１、１０９３２４〜１１４４０９、１１４５３８〜１１５７２３、１１５９５７〜１２２１０２、１２２２２５〜１２６８７６、１２７０３３〜１５７２１２、１５７８０８〜２４０８２５；
ｂ）配列番号２の、少なくとも１５ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖；
ｃ）配列番号１または２の、少なくとも１５ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖であって、ここで、該範囲が、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０、ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択されるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドまたはその相補鎖；
ｄ）本質的に、以下の配列：Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０、ならびにこれらの配列に相補的な配列から選択される配列からなるポリヌクレオチド；
ｅ）本質的に、以下の配列：Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０から選択される配列からなるポリヌクレオチド；
ｆ）本質的に、以下の配列：Ｂ１〜Ｂ５２およびＣ１〜Ｃ５２から選択される配列からなるポリヌクレオチド；ならびに
ｇ）配列番号３の、少なくとも６アミノ酸の連続した範囲を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む単離された組換えベクターを含有する組成物。
【請求項３】
請求項２記載の組換えベクターまたは非相同調節エレメントに作動可能に連結されたＰＧ−３遺伝子のいずれかを含む単離された宿主細胞を含有する組成物。
【請求項４】
請求項２記載の組換えベクターまたは請求項１記載のポリヌクレオチドを含むノックアウトベクターを用いた相同組換えにより分離されたＰＧ−３遺伝子のいずれかを含有する非ヒト宿主動物。
【請求項５】
配列番号３の、少なくとも６アミノ酸の連続した範囲を含む単離、精製または組換えられたポリペプチドを含有する組成物。
【請求項６】
請求項５記載のポリペプチドのエピトープ含有フラグメントに選択的に結合可能な単離または精製された抗体を含有する組成物。
【請求項７】
生物学的試料中の、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーまたはその相補鎖においてヌクレオチドの同一性を決定する工程を包含する遺伝子型決定方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が単一個体由来の試料である請求項７記載の遺伝子型決定方法。
【請求項９】
さらに、前記決定工程の前に前記二対立遺伝子マーカーを含む配列の一部を増幅する工程を包含する請求項７記載の遺伝子型決定方法。
【請求項１０】
集団におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度を推定する方法であって、
ａ）請求項７記載の方法にしたがって該二対立遺伝子マーカーについて該集団由来の個体の遺伝子型を決定する工程；
ｂ）該集団における該二対立遺伝子マーカーの比例した発現量を決定する工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
遺伝子型と形質との間の関連性の決定方法であって、
ａ）請求項１０記載の方法にしたがって形質優性集団において少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの頻度を決定する工程；
ｂ）請求項１０記載の方法にしたがって対照集団において少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの頻度を決定する工程；
ｃ）該遺伝子型と該形質との間に統計的に有意な関連性が存在するか否かを決定する工程、
を包含する方法。
【請求項１２】
集団において１組の二対立遺伝子マーカーについてハプロタイプの頻度を推定する方法であって、
ａ）該集団の各個体について、請求項８にしたがって少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する工程；
ｂ）該集団の各個体のゲノム中に存在する第２の二対立遺伝子マーカーの両複製物について、第２の二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することによって、第２の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する工程；ならびに
ｃ）工程ａ）およびｂ）において決定されるヌクレオチドの同一性にハプロタイプ決定方法を適用して、該頻度の推定値を得る工程、
を包含する方法。
【請求項１３】
ハプロタイプと形質との間の関連性を検出する方法であって、
ａ）請求項１２記載の方法にしたがって、形質優性集団において少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する工程；
ｂ）請求項１２記載の方法にしたがって、対照集団において該ハプロタイプの頻度を推定する工程；
ｃ）該ハプロタイプと該形質との間に統計的に有意な関連性が存在するか否かを決定する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＧ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにこのコード領域の５’末端および３’末端に位置する調節領域に関する。本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子によってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、診断試薬として有用であるこのようなポリペプチドに対して特異的に指向される抗体に関する。本発明はさらに、遺伝子分析において有用であるＰＧ−３遺伝子の二対立遺伝子マーカーを包含する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、先進工業国における主な死亡原因の一つである。これは、公衆衛生の点から、とくに、人口の高齢化を考えれば、ガンを深刻な負担としている。実際には、今後２５年間、ガンに罹患する人口数が劇的に増加すると考えられる。全世界で、毎年、１０００万人の新たなガン患者が診断され、そして２０２０年には、年単位で２０００万人の新たなガン診断がされると考えられる。
【０００３】
多数の利用可能な治療技術（外科手術、化学療法、放射線治療、骨髄移植を含むが、これらに限定されない）や、免疫療法または遺伝子治療における実験プロトコルを用いて得られる有望な結果にもかかわらず、ガン患者の全体としての生存率は、５年後でも５０％に達しない。したがって、早期のガン予後診断を可能にする信頼性のある診断方法、ならびに疾患の予防処置および治療処置の双方が強く必要とされている。
【０００４】
ガンは、集積的な遺伝子損傷の結果として生じる細胞のクローン増殖であり、最終的には無制限の細胞増殖、組織浸潤および移転（細胞形質転換）を生じる。ガンの型に関係なく、形質転換細胞は、巨視的な染色体転座として、またはより繊細には、ＤＮＡ増幅、再配列もしくは同等の点変異として損傷ＤＮＡを保持する。
【０００５】
ガンは、特定の遺伝子の発現の調節障害によって引き起こされる。腫瘍の発生は、重要な一連の工程を必要とする。これらの工程のそれぞれには、細胞周期活性またはゲノムの安定性のいずれかに関与する遺伝子の調節障害、および増殖の優位性から他の正常な細胞型を制圧する異常な変異クローンの出現を含む。ガンは、実際には、２つの機構の組み合わせが原因で起こる。いくつかの変異は、細胞増殖を促進し、つぎの変異のための細胞のターゲット集団を増大させる。他の変異は、全ゲノムの安定性に影響を与え、ミスマッチ修復タンパクの場合には、全体として変異速度を上昇させる（Arnheim NおよびShibata D, 1997に概説）。
【０００６】
最近の研究では、ガンにおいて頻繁に変異する３つの群の遺伝子が同定されている。最初の２つの群は、細胞周期活性に関与している。細胞周期活性は、正常な細胞増殖を駆動し、そして、器官の、正常な発生およびホメオスタシスを確保する機構である。逆に、ガン細胞の性質の多く（制御できない増殖、上昇した変異速度、異常な転座および遺伝子増幅）は、細胞周期の正常な調節または進行の混乱に直接関係し得る。
【０００７】
第１の群の遺伝子はオンコジーンといわれ、その産物は細胞増殖を活性化する。正常な非変異型はプロトオンコジーンといわれる。変異形態は、細胞増殖の促進において過度にまたは不適切に活性であり、そして細胞において、単一の変異体対立遺伝子が細胞表現型に影響を与えるのに十分であるといったように優性的に作用する。活性化されたオンコジーンは、生体中のすべての細胞で発現されるとたいてい死をもたらすため、ほとんど生殖細胞系列変異として伝達されない。したがって、オンコジーンのみが、腫瘍組織において研究され得る。オンコジーンおよびプロトオンコジーンは、それらの機能によって、いくつかの異なるカテゴリーに分類され得る。この分類としては、増殖因子（すなわち、ｓｉｓ,ｉｎｔ−２）；受容体および非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（すなわち、ｅｒｂＢ,ｓｒｃ,ｂｃｒ−ａｂｌ，ｍｅｔ，ｔｒｋ）；膜関連Ｇタンパク質（すなわち、ｒａｓ）；細胞質タンパク質キナーゼ（すなわち、細胞分裂活性化タンパク質キナーゼ−ＭＡＰＫファミリー、ｒａｆ，ｍｏｓ，ｐａｋ）、または、核転写因子（すなわち、ｍｙｃ，ｍｙｂ，ｆｏｓ，ｊｕｎ，ｒｅｌ）などのシグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子があげられる（参考のためにHunter T, 1991; Fanger GRら、1997; Weiss FUら、1997参照）。
【０００８】
ガンにおいて頻繁に変異される第２の群の遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子といわれ、その産物は細胞増殖を阻害する。ガン細胞における変異体型は、それらの正常な機能を損失し、そして細胞において、遺伝子の両複製物が細胞表現型を変化するために不活性化されてしまうといったように劣性的に作用する。もっとも重要なことには、Harrisおよびその共同研究者によって最初に記載された細胞融合実験によって示されるように、腫瘍表現型は、野生型対立遺伝子によって救済され得る（Harris Hら、1969）。腫瘍サプレッサー遺伝子の生殖細胞系列変異は伝達され、その結果、家族性腫瘍または散発性腫瘍由来の構成ＤＮＡおよび腫瘍ＤＮＡの両方において研究される。腫瘍サプレッサーの現在のファミリーとしては、ＤＮＡ結合転写因子（すなわち、ｐ５３、ＷＴ１）、転写レギュレーター（すなわち、ＲＢ、ＡＰＣおよびＢＲＣＡ１）、およびタンパク質キナーゼインヒビター（すなわち、ｐ１６）などがあげられる（参考のためにHaber DおよびHarlow E，1997参照）。
【０００９】
ガンにおいて頻繁に変異される第３の群の遺伝子はミューテーター遺伝子といわれ、ゲノムの保全および／または低い変異率の維持を担っている。両対立遺伝子の機能の損失は細胞変異率を上昇させ、結果として、プロトオンコジーンおよび腫瘍サプレッサー遺伝子が変異される。このクラスの遺伝子によって引き起こされる腫瘍形成が、前記のように、野生型対立遺伝子の修復によっては、単純には抑制され得ないという事実を除いては、ミューテーター遺伝子はまた、腫瘍サプレッサー遺伝子として分類される。その不活性化がミューテーター表現型の原因となる遺伝子としては、ミスマッチ修復遺伝子（すなわち、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２）、ＤＮＡヘリカーゼ（すなわち、ＢＬＭ、ＷＲＮ）、またはＤＮＡ修復およびゲノム安定性に関与するその他の遺伝子（すなわち、ｐ５３、おそらくＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２）があげられる（参考のためにHaber DおよびHarlow E, 1997； FishelおよびWilson. 1997; Ellis，1997を参照）。
【００１０】
遺伝子マッピングに関する高度な技術の最近の進展は、結果として、特定の型のヒトガンに関する遺伝子のリストの絶え間ない拡大をもたらしている。ヒト半数体ゲノムは、３×１０9塩基長の２本鎖ＤＮＡ上に点在して推定８０，０００〜１００，０００遺伝子を含んでいる。各々のヒトは二倍体である。すなわち、父系由来のゲノムと母系由来のゲノムの２つの半数体ゲノムを保持している。所定の遺伝子座の配列は、集団における個体間または単一の個体の染色体上の遺伝子座の２つの複製物間で相違し得る。遺伝子マッピング技術では、多型といわれるこれらの相違を頻繁に利用して、ヒト表現型に関する遺伝子座をマッピングする。
【００１１】
ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）技術といわれる１つのマッピング技術は、機能の喪失によりガンを生じる遺伝子（たとえば、前記した腫瘍サプレッサー遺伝子）を検出するために頻繁に使用される。腫瘍サプレッサー遺伝子は、第１の変異（たとえば、点突然変異（または小さな欠失または挿入））が腫瘍サプレッサー遺伝子の１つの対立遺伝子を不活性化する２ヒット機構を介してガンを頻繁に生じる。頻繁に、この第１の変異は、代々遺伝される。第２の変異、たいてい自発的な体細胞変異（たとえば、腫瘍サプレッサー遺伝子の他の複製物を保有する染色体の全てまたは一部を欠失する欠失）は、腫瘍サプレッサー遺伝子の両複製物が不活性化される細胞を生じる。腫瘍サプレッサー遺伝子における欠失の結果、１つの対立遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子に近接して位置する任意の遺伝子マーカーを消失する。したがって、親がマーカーについてヘテロ接合体である場合、腫瘍組織はヘテロ接合性を消失し、ホモ接合体またはヘミ接合体になる。このヘテロ接合性の消失は、一般的に、消失領域における腫瘍サプレッサー遺伝子の存在に関する強力な証拠を提供する。
【００１２】
ＬＯＨは、ガンに関連するいくつかの染色体領域の同定を可能にする。実際には、相当量のＬＯＨデータは、異なるガンの型に関する遺伝子がヒトゲノムの８ｐ２３領域内に位置されるという仮説を支持する。染色体のアーム８ｐのいくつかの領域は、種々のヒト悪性疾患（前立腺悪性疾患、頭頸部悪性疾患、肺悪性疾患および結腸悪性疾患を含む）において頻繁に欠失されることを見出した。Emiらは、肝細胞ガン腫、結腸直腸ガン、および非小細胞肺ガンの場合、８ｐ２３．１〜８ｐ２１．３領域の関与を実証した（Emiら、1992）。Yaremkoら（1994）は、８７個の結腸直腸ガン腫の試料において、染色体８マーカーに関するＬＯＨの２つの主要な領域の存在を示した。もっとも顕著な消失は、８ｐ２３．１−ｐｔｅｒについて見られ、全体の４５％で対立遺伝子の消失が実証された。Scholnickら（Scholnickら、1996およびSunwooら、1996）は、声門上の喉頭の扁平上皮細胞ガン腫の場合、染色体８のマーカーについてＬＯＨの３の異なる領域の存在を実証した。彼らは、８ｐ２３マーカーＤ８Ｓ２６４の対立遺伝子の消失が、声門上の扁平上皮細胞ガン腫を保持する患者についてのわずかな予後の統計的に有意な独立予測因子としての機能を果たすことを示した。５１の頭頸部扁平上皮細胞ガン腫細胞株および２９の口部扁平上皮細胞ガン腫細胞株の研究は、８ｐ２３領域に位置する１つ以上の遺伝子座における、頻繁な対立遺伝子の消失およびホモ接合性の欠失を示した（Ishwad CSら、1999）。さらに、喉頭および口腔の１５０の扁平上皮細胞ガン腫の高分解能欠失地図は、Ｄ８Ｓ２６４からＤ８Ｓ１７８８の区間内の８ｐ２３領域について、２つの異なるクラスの欠失を示した（Sunwooら、1999）。
【００１３】
他の研究において、Nagaiら（1997）は、肝細胞ガン腫（ＨＣＣ）の１２０のケースにおいて、ＬＯＨのゲノムの広範囲のスキャンによって８ｐ２３の特定領域内におけるヘテロ接合性の高い消失を実証した。高密度多型マーカー分析を用いるさらなる研究は、染色体８ｐ上の３つの最小限の欠失領域を同定した。そのうちの１つは、８ｐ２３における５ｃＭ領域であり、おそらくＨＣＣに関する腫瘍サプレッサー遺伝子座の存在を示す（Pineau Pら、1999）。Gronwaldら（1997）はまた、腎臓の明らかな細胞ガン腫における８ｐ２３−ｐｔｅｒの消失を実証した。
【００１４】
同じ領域は、前立腺ガンの特定の場合に関与する。Matsuyamaら（1994）は、Ｄ８Ｓ７プローブでのＦＩＳＨによってモニタされるように、前立腺ガンの場合、８ｐ２３帯の特定の欠失を示した。彼らは、相当数の８ｐ２３の欠失を伴うケースを記録し得たが、８ｐ２２マーカーＬＰＬの保持は記録し得なかった。さらに、Ichikawaら（1996）は、前立腺ガン転移サプレッサー遺伝子の存在を推論し、そしてヒト染色体の転移後の高度転移性のラット前立腺細胞における転移抑制の研究によって、８ｐ２３−ｑ１２に前立腺ガン転移サプレッサー遺伝子を位置決めした。最近になって、Washbumら（1997）は、３１ケースのヒト前立腺ガンのＬＯＨ研究によって、８ｐ２３に特異的な対立遺伝子が消失している相当量の腫瘍を見出し得た。これらの試料において、彼らは、遺伝的なインターバルＤ８Ｓ２６２〜Ｄ８Ｓ２７７を保護する欠失を有する最小の重複領域を定義し得た。さらに、多型マイクロサテライト反復マーカーのＰＣＲ分析を用いて、６０の前立腺腫瘍のうち２９％が８ｐ２３領域の遺伝子座Ｄ８Ｓ２６２でＬＯＨであることを示した（Perincheryら、1999）。
【００１５】
最近の研究はまた、線維性組織球腫、卵巣腺癌および胃ガンなどの他の型のガンにおける８ｐ２３領域に関係している。実際に、比較ゲノムハイブリダイゼーションデータは、線維性組織球腫における８ｐ２３．１領域の関与を示し、そして、遺伝子ＭＡＳＬ１を含むＤ８Ｓ１８１９とＤ８Ｓ５５０との間の最小増幅領域を検出した。ＭＡＳＬ１の過剰発現は腫瘍形成性であり得る（Sakabeら、1999）。ＬＯＨはまた、２７の卵巣腺癌について８ｐ上で観察された。部分欠失を有する９の腫瘍の詳細な調査は、３つの重複領域（８ｐ２３中に２つ含む）を定義した（Wrightら、1998）。５８の原発性胃癌の比較ゲノムハイブリダイゼーションは、腫瘍のうち２４％において８ｐ２２−２３領域の増加および腫瘍のうち５％において同じ領域の同等の高いレベルの増幅を検出した。この増幅した領域は、前期染色体に対する逆ペインティングＦＩＳＨによって８ｐ２３．１に至るまで狭くなった（Sakakuraら、1999）。
【００１６】
本発明は、ＰＧ−３遺伝子、８ｐ２３ガン候補領域に存在する遺伝子、ならびにガンの原因であり得るＰＧ−３遺伝子の対立遺伝子を検出するための診断方法および診断試薬、ならびにガンの治療方法に関する。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は、ＰＧ−３タンパク質をコードする新規なヒト遺伝子の、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列を含む核酸分子に関する。ＰＧ−３遺伝子は、ＬＯＨ研究によっていくつかの型のガンに関係されることが示される８ｐ２３候補領域に位置される。
【００１８】
ＰＧ−３ゲノム配列は、この遺伝子の転写部分の上流（５’末端）および下流（３’末端）に位置される調節配列を含む。これらの調節配列はまた、本発明の一部である。
【００１９】
本発明はまた、ＰＧ−３タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列および対応する翻訳産物に関する。
【００２０】
ＰＧ−３ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーはまた、本発明の一部であり、そして、該プライマーおよびプローブを使用するＤＮＡ増幅方法およびＤＮＡ検出方法も本発明の一部である。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、本明細書中に記載の核酸配列のいずれかを含む組換えベクターに関する。とくに、ＰＧ−３調節配列またはＰＧ−３タンパク質をコードする配列を含む組換えベクターに関する。本発明はまた、この核酸配列または組換えベクターを含有する宿主細胞および遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【００２２】
本発明はさらに、遺伝子分析に有用であるＰＧ−３遺伝子の二対立遺伝子マーカーを包含する。
【００２３】
最後に、本発明は、ＰＧ−３の発現を阻害する物質または分子のスクリーニング方法、およびＰＧ−３ポリペプチドと相互作用する、またはＰＧ−３ポリペプチドの活性を調節する物質または分子のスクリーニング方法に関する。
【００２４】
［配列表に示されている配列の簡単な説明］
配列番号１は、５’調節領域（上流非転写領域）、エクソンおよびイントロン、ならびに３’調節領域（下流非転写領域）を含むＰＧ−３のゲノム配列である。
【００２５】
配列番号２は、ＰＧ−３のｃＤＮＡ配列である。
【００２６】
配列番号３は、配列番号２のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号４は、実施例２にさらに記載されている付加的なＰＵ５’配列を含むプライマーである。
【００２８】
配列番号５は、実施例２にさらに記載されている付加的なＲＰ５’配列を含むプライマーである。
【００２９】
配列表に関する規定に従って、以下のコードは、配列内の二対立遺伝子マーカーの位置を示すため、および多型塩基に存在する対立遺伝子のそれぞれを同定するために配列表において用いられている。配列中のコード「ｒ」は、多型塩基の一つの対立遺伝子がグアニンであり、他の対立遺伝子がアデニンであることを示す。配列中のコード「ｙ」は、多型塩基の一つの対立遺伝子がチミンであり、他の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列中のコード「ｍ」は、多型塩基の一つがアデニンであり、他の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列中のコード「ｋ」は、多型塩基の一つの対立遺伝子がグアニンであり、他の対立遺伝子がチミンであることを示す。配列中のコード「ｓ」は、多型塩基の一つの対立遺伝子がグアニンであり、他の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列中のコード「ｗ」は、多型塩基の一つの対立遺伝子がアデニンであり、他の対立遺伝子がチミンであることを示す。それぞれの二塩基対立遺伝子マーカーについての本来の対立遺伝子のヌクレオチドコードは以下のとおりである：
二対立遺伝子マーカー 本来の対立遺伝子
５−３９０−１７７                  Ｃ
５−３９１−４３                    Ｇ
５−３９２−２２２                  Ｔ
５−３９２−２８０                  Ｔ
４−５９−２７                      Ｇ
４−５８−２８９                    Ｃ
４−５４−１９９                    Ａ
４−５４−１８０                    Ｃ
４−５１−３１２                    Ｇ
９９−８６−２６６                  Ａ
４−８８−１０７                    Ｇ
５−３９７−１４１                  Ｇ
５−３９８−２０３                  Ｃ
９９−１２７３８−２４８            Ａ
９９−１０９−３５８                Ｃ
９９−１２７４９−１７５            Ｔ
４−２１−１５４                    Ｃ
４−２１−３１７                    Ｇ
４−２３−３２６                    Ｇ
９９−１２７５３−３４                      Ａ
５−３６４−２５２                  Ｇ
９９−１２７５５−２８０            Ｇ
９９−１２７５５−３２９            Ｃ
４−８７−２１２                    Ａ
９９−１２７５７−３１８            Ｃ
９９−１２７５８−１０２            Ｇ
９９−１２７５８−１３６            Ｃ
４−１０５−９８                    Ａ
４−１０５−８６                    Ｇ
４−４５−４９                      Ｔ
４−４４−２７７                    Ｔ
４−８６−６０                      Ｃ
４−８４−３３４                    Ｇ
９９−７８−３２１                  Ｔ
９９−１２７６７−３６                      Ｇ
９９−１２７６７−１４３            Ｔ
９９−１２７６７−１８９            Ｔ
９９−１２７６７−３８０            Ｇ
４−８０−３２８                    Ｃ
４−３６−３８４                    Ｃ
４−３６−２６４                    Ｇ
４−３６−２６１                    Ｃ
４−３５−３３３                    Ａ
４−３５−２４０                    Ｇ
４−３５−１７３                    Ｔ
４−３５−１３３                    Ｃ
９９−１２７７１−５９                      Ｔ
９９−１２７７４−３３４            Ａ
９９−１２７７６−３５８            Ｇ
９９−１２７８１−１１３            Ａ
４−１０４−２９８                  Ｃ
４−１０４−２５４                  Ｇ
４−１０４−２５０                  Ｃ
４−１０４−２１４                  Ａ
９９−１２８１８−２８９            Ｔ
９９−２４８０７−２７１            Ｃ
９９−２４８０７−８４                      Ｇ
９９−１２８３１−１５７            Ｇ
９９−１２８３１−２４１            Ｃ
９９−１２８３２−３８７            Ｔ
９９−１２８３６−３０                      Ｇ
９９−１２８４４−２６２            Ｃ
４−２４−７４                      Ｃ
４−２４−２４６                    Ｃ
４−２４−３１４                    Ｇ
４−２７−１９０                    Ａ
５−４００−１４５                  Ｇ
５−４００−１４９                  Ｇ
５−４００−１７５                  Ｔ
５−４００−２３１                  Ｔ
５−４００−３６７                  Ａ
９９−１２８５２−１１０            Ｔ
９９−１２８５２−３２５            Ａ
４−３７−３２６                    Ａ
４−３７−１０７                    Ｇ
５−２７０−９２                    Ｇ
９９−１２８６０−４７                      Ｇ
９９−１２８６０−５７                      Ｔ
５−４０２−１４４                  Ｃ
【００３０】
ある場合に、二対立遺伝子マーカーの多型塩基は、コードポリペプチドにおける１つのアミノ酸の同一性を変更する。これは、性質ＶＡＲＩＡＮＴの使用、多型アミノ酸の位置におけるＸａａの配置、および２つの別のアミノ酸としてのＸａａの定義により添付した配列表において示される。たとえば、二対立遺伝子マーカーの１つの対立遺伝子がコドンＣＡＣ（ヒスチジンをコードする）である場合、二対立遺伝子マーカーの他の対立遺伝子はＣＡＡ（グルタミンをコードする）であるが、コードポリペプチドについての配列表は多型アミノ酸の位置にＸａａを含む。この場合、Ｘａａはヒスチジンまたはグルタミンであると定義される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、ＰＧ−３遺伝子に関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。ＰＧ−３のゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーはまた、本発明の一部である。本発明のさらなる目的は、本発明において記載される核酸配列のいずれかを含む組換えベクターに関する。とくに、ＰＧ−３の調節領域またはＰＧ−３タンパク質をコードする配列を含む組換えベクター、ならびにこの核酸配列または組換えベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子の発現を調節する、またはＰＧ−３タンパク質の活性を調節する分子のスクリーニング方法を包含する。本発明はまた、診断試薬として有用なこのようなポリペプチドに対して特異的に指向される抗体に関する。
【００３２】
本発明はまた、家族における連鎖研究、集団における連鎖不平衡研究および患者対照集団の関連研究を含む遺伝子分析のいずれかの方法において用いられ得るＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーに関する。本発明の重要な態様は、二対立遺伝子は複雑な形質に関係する遺伝子を同定するために実施されるべき関連研究を可能にする。これらの二対立遺伝子マーカーは、ＰＧ−３タンパク質の対立遺伝子改変体を導き得る。
【００３３】
［定義］
本発明を非常に詳細に説明する前に、以下の定義は本明細書中において発明を説明するために用いられる用語の意味および範囲を例証ならびに定義するために示される。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＰＧ−３遺伝子」は、ゲノムＤＮＡの非転写調節領域を含むＰＧ−３タンパク質をコードするゲノム配列、ｍＲＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列を包含する。
【００３５】
用語「ＰＧ−３生物学的活性」は、本明細書中、とくに、「ＰＧ−３ポリペプチド生物学的活性」と題される節において説明される本発明のＰＧ−３ポリペプチドの活性と類似（同一である必要はない）の活性を示すポリペプチドを意味する。
【００３６】
本明細書中において用いられる場合、用語「非相同タンパク質」は、ＰＧ−３タンパク質以外の任意のタンパク質またはポリペプチドを示すことを意味する。より詳細には、非相同タンパク質は、ＰＧ−３調節領域を用いるさらなる実験においてマーカーとして用いられ得る化合物であり得る。
【００３７】
用語「単離された（isolated）」は、物質がその本来の環境（たとえば、物質が天然物である場合には、自然環境など）から取り出されることを必要とする。たとえば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、自然系に共存する物質のいくつかまたは全てから分離した同じポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であり得る。そして、ベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないからやはり単離される。
【００３８】
用語「精製された（purified）」は、完全に純粋である必要はない；より正確には、相対定義を意味する。出発物質または天然物の、少なくとも１オーダーの規模、好ましくは２または３オーダー、およびより好ましくは４または５オーダーの規模の精製は明らかに考慮される。一例としては、０．１％濃度から１０％濃度への精製は２オーダーの規模である。例証するために、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のｃＤＮＡクローンは、電気泳動均一性に慣用的に精製される。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーまたは全ヒトＤＮＡのいずれからも直接得られ得ない。ｃＤＮＡクローンは、それ自体では天然に存在しないが、部分的に精製された天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーへの変換は、合成物質（ｃＤＮＡ）の作製に関連し、そして純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、クローン選択によって合成ライブラリーから単離され得る。したがって、メッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製およびその後のこのライブラリーからの個々のクローンの単
離は、天然のメッセージの約１０4〜１０6倍の精製という結果を生じる。
【００３９】
用語「精製された」はさらに、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、糖質、脂質などを含むが、これらに限定されない他の化合物から分離される、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するために、本明細書中で用いられる。用語「精製された」は、オリゴマーの形態（たとえば、ホモ−またはへテロ−ダイマー、トリマーなど）からの本発明のモノマーポリペプチドの分離を特定するために用いられ得る。用語「精製された」はまた、線状ポリヌクレオチドからの共有的に閉鎖した（covalently closed）ポリヌクレオチドの分離を特定するために用いられ得る。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも約５０％、好ましくは６０〜７５％が、単一のポリヌクレオチド配列および配置（線状対共有的に閉鎖）を示す場合、実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは代表的には、それぞれのポリペプチド試料またはポリヌクレオチド試料の約５０％、好ましくは６０〜９０％（重量／重量）、より一般的には約９５％含む。そして、好ましくは約９９％純度を超える。ポリペプチドおよびポリヌクレオチド純度または均一性は、当該分野で周知の多数の手段（たとえば、試料のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後の、ゲル染色による単一バンドの可視化）によって示される。特定の目的に関しては、ＨＰＬＣまたは当該分野で周知のその他の手段を用いることによって、高い分解能が提供され得る。別の実施態様として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、非相同の、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方）と比較して「少なくとも」％純度として表現され得る。好ましい実施態様としては、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ、非相同の、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％または１００％純度である。さらなる好ましい実施態様として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ、非相同の、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと比較して、または、キャリアに存在するポリペプチドおよびポリヌクレオチド以外の全ての化合物および分子と比較した重量／重量比として、９０％〜１００％の小数点以下第３位（たとえば、少なくとも９９．９９５％純度のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）までの任意の数の純度範囲を有する。小数点以下第３位までの％純度を示すそれぞれの数は、個々の種の純度として要求され得る。小数点以下第３位までの％純度を示すそれぞれの数は、個々の種の純度として要求され得る。
【００４０】
本明細書中で互換可能に用いられる用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ポリマーの長さに関係せずにアミノ酸のポリマーを意味する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。本発明のポリペプチドの化学的修飾物または発現後修飾物は、特定の実施態様として含まれ得るまたは排除され得るけれども、この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学的修飾物または発現後修飾物を、特定または排除しない。したがって、たとえば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドへの修飾は、用語ポリペプチドによって、明らかに包含される。さらに、これらの修飾を含むポリペプチドは、本発明に含まれるべき、または本発明から排除されるべき個々の種として特定され得る。自然な修飾または他の化学的な修飾（たとえば、前記例において列記した修飾）は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含むポリペプチドの何処ででも起こり得る。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位において同じかまたは異なる程度で存在され得ることは理解される。また、所定のポリペプチドは、多くの型の修飾を含み得る。ポリペプチドは、たとえば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そして、これらのポリペプチドは、分枝を有するまたは有さない環状であり得る。修飾としては、アセルチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペギル化（pegylation）、タンパク質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ触媒付加（たとえば、アルギニル化）およびユビキチン化があげられる（たとえば、Creighton（1993）；Seifterら（1990）；Rattanら（1992）を参照）。アミノ酸の１つ以上のアナログ（たとえば、非天然アミノ酸、非関連生態系にのみ自然に存在するアミノ酸、哺乳動物系由来の修飾アミノ酸など）を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチドならびに当該分野で公知の他の修飾物（天然修飾物および非天然修飾物の両方）はまた、この定義内に含まれる。
【００４１】
本明細書中で用いる場合、用語「組換えポリヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド構築物」は、人工的に設計された、およびポリヌクレオチドの最初の自然環境において、連続したヌクレオチド配列とし見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、線状または環状で、精製または単離されたポリヌクレオチドに言及するために、互換可能に用いられる。とくに、この用語は、ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡがその自然環境に近接しない「骨格」核酸に近接することを意味する。さらに、ｃＤＮＡが「富化された（enriched）」とは、核酸骨格分子の集団において核酸挿入物の数が５％以上であることを示す。本発明による骨格分子としては、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組込み核酸、および目的の核酸挿入物を維持または操作するために用いられるその他のベクターまたは核酸などの核酸があげられる。好ましくは、富化されたｃＤＮＡは、組換え骨格分子の集団において１５％以上の数の核酸挿入物を示す。より好ましくは、富化されたｃＤＮＡは、組換え骨格分子の集団において５０％以上の数の核酸挿入物を示す。高度に好ましい実施態様において、富化されたｃＤＮＡは、組換え骨格分子の集団において９０％以上（９０〜１００％で、小数点以下第３位までの任意の数（たとえば、９９．５％）を含む）の数の核酸挿入物を示す。
【００４２】
用語「組換えポリペプチド」は、人工的に設計され、そしてポリペプチドの最初の自然環境において連続したポリペプチド配列として見出されない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドをいうために、または組換えポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドをいうために本明細書中で用いられる。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、用語「非ヒト動物」とは、任意の非ヒト脊椎動物、鳥類およびより一般的には哺乳動物、好ましくは霊長類、家畜（たとえば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバおよびウマ）、ウサギまたはげっ歯類、より好ましくはラットまたはマウスをいう。本明細書中で用いられる場合、用語「動物」は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物をいうために用いられる。用語「動物」および「哺乳動物」の両方は、用語「非ヒト」が前に付随していなければ明らかにヒトを包含する。
【００４４】
本明細書全体にわたって、表現「ヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチドまたは核酸を無関係に示すために使用され得る。より正確には、表現「ヌクレオチド配列」は核酸物質自体を包含する。そのため、特定のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を生物化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、４塩基の文字の中から選択される一連の文字）に制限されない。
【００４５】
本明細書中で互換可能に用いられる場合、用語「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（相補鎖またはアンチセンスをコードする１本鎖または２本鎖のいずれか）、または１本鎖または重複形態のいずれかにおいて１ヌクレオチドより多くのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列（たとえ、前記の種の各々がとくに明記され得ても）があげられる。用語「ヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または１本鎖形態もしくは重複形態で任意の長さのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を記載するのに付随的に本明細書中で用いられる。より正確には、表現「ヌクレオチド配列」は、核酸物質自体を包含する。そのため、特定のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を生物化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、４塩基の文字の中から選択される一連の文字）に制限されない。用語「ヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの場合、大きな核酸分子（プリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分、およびリン酸基またはホスホジエステル結合を含む）における分子または個々の単位を意味する、個々のヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドをいうための名詞として本明細書中で用いられる。用語「ヌクレオチド」はまた、（ａ）別の連結基、（ｂ）プリンのアナログ形態、（ｃ）ピリミジンのアナログ形態、または（ｄ）アナログ糖などの少なくとも１つの修飾を含む「修飾されたヌクレオチド」を包含するように、本明細書中で用いられる。アナログ連結基、プリン、ピリミジン、および糖の例は、たとえば、国際公開第９５／０４０６４号パンフレット（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照する。本発明の好ましい修飾としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）ブトキソシン、偽ウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンがあげられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エキソビボ産生��またはこれらの組み合わせを含む任意の公知の方法、および当該分野で公知の任意の精製方法を利用することによって調製され得る。メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、およびこれを有する混合された骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号；米国特許第５，３８６，０２３号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；および同第５，６１０，２８９号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号明細書および同第５，２６４，５６４号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。エチレンオキサイド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０８，２７０号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは米国特許第５，６１０，２８９号明細書または同第５，６２５，０５０号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号明細書または同第５，３６６，８７８号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、国際公開第９４／１７０９３号パンフレットおよび同第９４／０２４９９号パンフレット（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。３’−デオキシ−３’−アミノホスホラミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号明細書および同第５，１７７，１９８号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように調製され得る。
【００４６】
「プロモーター」とは、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列をいう。
【００４７】
プロモーターなどの調節配列に配列が「作動可能に連結される（する）」とは、調節エレメントが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および目的の核酸の発現を制御するための核酸に対して正確な位置に存在しかつ配向されていることを意味する。本明細書中で用いる場合、用語「作動可能に連結される（する）」とは、機能的な関係でのポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。より正確には、２つのＤＮＡ分子（たとえば、プロモーター領域を含むポリヌクレオチドおよび所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド）は、２つのポリヌクレオチド間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じることも、（２）プロモーターを含むポリヌクレオチドが、コードポリヌクレオチドの転写に指向する能力を妨害することもない場合、「作動可能に連結される（する）」といわれる。
【００４８】
用語「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列に相補的である特定のオリゴヌクレオチド配列を示し、その標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために用いられる。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合についての開始点としての役割を果たす。
【００４９】
用語「プローブ」は、試料中に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するために用いられ得る規定された核酸セグメント（またはヌクレオチドアナログセグメント（たとえば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチド））を示す。この核酸セグメントは、同定されるべき特定のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列相補鎖を含む。
【００５０】
用語「形質」および「表現型」は、本明細書中で互換可能に用いられ、そして、任意の可視的な、検出可能な、またはその他の測定可能な、生体の性質（たとえば、疾患の症状または疾患に対する感受性）をいう。代表的には、用語「形質」または「表現型」は、疾患の症状または疾患に対する感受性、処置またはワクチン接種への有益な応答またはそれに関する副作用をいうために本明細書中で用いられる。この疾患は、ガン、発達性疾患、神経学的疾患、異常な細胞分化、増殖または変性に関連する障害（アルドステロン症、コルチゾール低下症（アディソン病）、甲状腺機能亢進症（グレーブス病）、甲状腺機能低下症、大腸ポリープ、胃炎、胃十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、およびクローン病を含むがこれらに限定されない）であり得るが、これらに限定されない；この疾患は、好ましくはガンまたは異常な細胞分化、増殖または変性に関連する障害であり、そしてより好ましくは、この疾患は、前立腺、頭部、頸部、肺、肝臓、腎臓、卵巣、胃または大腸のガンである。好ましくは、用語「形質」または「表現型」は、本明細書中で用いられる場合、疾患、疾患の初期症状、疾患に対する処置またはワクチン接種への有益な応答またはそれに関する副作用、疾患に対する感受性、疾患の攻撃レベル、ＰＧ−３遺伝子の変更された発現または上昇された発現、ＰＧ−３タンパク質の変更された産生または上昇された産生、あるいは修飾ＰＧ−３タンパク質の産生を包含するが、これらに限定されない。
【００５１】
用語「対立遺伝子」は、ヌクレオチド配列の改変体をいうために本明細書中で用いられる。二対立遺伝子多型は、２つの形態を有している。代表的には、第一の同定対立遺伝子が、本来の対立遺伝子として指定されるのに対して、その他の対立遺伝子は、別の対立遺伝子として指定される。二倍体生体は、対立遺伝子形態についてホモ接合体でもヘテロ接合体でもよい。
【００５２】
用語「ヘテロ接合率」は、集団における、特定の対立遺伝子においてヘテロ接合性である個体の発生率をいうために本明細書中で用いられる。二対立遺伝子系において、ヘテロ接合率は、平均して２Ｐa（１−Ｐa）と等しく、ここで、Ｐaは共通（the least common）対立遺伝子の頻度である。遺伝学研究において有用であるために、遺伝子マーカーは、無作為に選択したヒトがヘテロ接合性であるという合理的な可能性を許容するために、適当なレベルのヘテロ接合性を有するべきである。
【００５３】
本明細書中で用いる場合、用語「遺伝子型」は、個体または試料に存在する対立遺伝子の同一性をいう。本発明との関係では、遺伝子型は、好ましくは、個体または試料に存在する二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の概要をいう。二対立遺伝子マーカーについての試料または個体の「遺伝子型の決定（genotyping）」という用語は、二対立遺伝子マーカーにおいて、個体によって保有される特定の対立遺伝子または特定のヌクレオチドを決定する工程からなる。
【００５４】
用語「変異」とは、本明細書中で用いられる場合、１％より低い頻度を有する異なるゲノムまたは個体間のＤＮＡ配列の相違をいう。
【００５５】
用語「ハプロタイプ」とは、個体または試料に存在する対立遺伝子の組合わせをいう。本発明との関係では、ハプロタイプは、好ましくは、所定の個体に見出される二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の組合わせをいい、そして、表現型と関連し得る。
【００５６】
用語「多型」は、本明細書中で用いられる場合、異なるゲノムまたは個体間に２つ以上の別のゲノム配列または対立遺伝子が存在することをいう。「多型の」とは、特定のゲノム配列の２つ以上の改変体が集団において見出され得る状態をいう。「多型部位」は、改変が存在する遺伝子座である。一塩基多型は、多型部位における別のヌクレオチドによる１ヌクレオチドの置換である。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入はまた、一塩基多型の原因となる。本発明との関係では、「一塩基多型」とは、好ましくは、単一ヌクレオチド置換をいう。代表的には、異なる個体間で、多型部位は、２つの異なるヌクレオチドによって占有され得る。
【００５７】
用語「二対立遺伝子多型」および「二対立遺伝子マーカー」は、集団においてかなり高頻度で２つの対立遺伝子を含む一塩基多型をいうために、本明細書中で互換可能に用いられる。「二対立遺伝子マーカー対立遺伝子」とは、二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチド改変体をいう。代表的には、本発明の二対立遺伝子マーカーの最もまれな対立遺伝子の頻度は、１％より高いと確認されている。好ましくは、その頻度は１０％より高く、より好ましくは、その頻度は少なくとも２０％であり（すなわち、少なくとも０．３２のヘテロ接合率）、なおより好ましくは、その頻度は少なくとも３０％である（すなわち、少なくとも０．４２のヘテロ接合率）。最もまれな対立遺伝子の頻度が３０％以上である二対立遺伝子マーカーは、「高品質二対立遺伝子マーカー」といわれる。
【００５８】
ポリヌクレオチドの中心に関して、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの位置は、以下の様式で本明細書中において説明される。ポリヌクレオチドが奇数のヌクレオチドからなる場合、ポリヌクレオチドの３’末端および５’末端から同距離にあるヌクレオチドがポリヌクレオチドの「中心」と考えられる。そして、中心のヌクレオチドに隣接する任意のヌクレオチド、またはその中心のヌクレオチド自体は、「中心から１ヌクレオチドの範囲内」と考えられる。ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドは奇数であるので、ポリヌクレオチドの中央における５つのヌクレオチド位置のいずれも、中心から２ヌクレオチドの範囲内にあるなどと考えられる。ポリヌクレオチドが偶数のヌクレオチドからなる場合、ポリヌクレオチドの中心には、ヌクレオチドではなく結合が存在する。したがって、中心の２つのヌクレオチドはいずれも、「中心から１ヌクレオチドの範囲内」であると考えられ、そして、ポリヌクレオチドの中央における４つのヌクレオチドのいずれも、「中心から２ヌクレオチドの範囲内」であるなどと考えられる。１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失に関与する多型について、多型の置換、挿入、または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの３’末端との距離と、多型の置換、挿入、または欠失されたポリヌクレオチドとポリヌクレオチドの５’末端との距離との間の差が、０または１ヌクレオチドである場合、多型、対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドの「中心」である。この差が０〜３である場合、多型は「中心から１ヌクレオチドの範囲内」であると考えられる。この差が０〜５である場合、多型は「中心から２ヌクレオチドの範囲内」であると考えられる。この差が０〜７である場合、多型は「中心から３ヌクレオチドの範囲内」であるなどと考えられる。
【００５９】
用語「上流」とは、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端へ向かう位置のことをいうために、本明細書中で用いられる。
【００６０】
用語「塩基対」および「ワトソン・クリック塩基対」は、２本の水素結合によってアデニン残基に結合されるチミン残基またはウラシル残基および３本の水素結合によって結合されるシトシン残基およびグアニン残基からなる二本鎖ＤＮＡにおいて見出される様式（Stryer,L、1995参照）で、ヌクレオチド配列同一性によって、互いに水素結合され得るヌクレオチドをいうために本明細書中で互換可能に用いられる。
【００６１】
用語「相補的な」または「その相補鎖」は、相補領域の全体にわたって、別の特定のポリヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対を形成し得るポリヌクレオチドの配列をいうために、本明細書中で用いられる。本発明の目的のために、第１のポリヌクレオチドにおける各々の塩基が第２のポリヌクレオチドの相補塩基と対となる場合、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに相補的であると考えられる。相補塩基は、一般的にＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。「相補鎖」は、「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として本明細書中で用いられる。これらの用語は、それらの配列に単にもとづいてポリヌクレオチドの対に適用され、そして、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する条件の任意の特定の設定はない。
【００６２】
用語「含む（含有する、包含する）（comprising）」、「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」は、本出願にわたって、相互に置き換えられ得る。用語「有する（含む、保持する）（having）」は、「含む（含有する、包含する）（comprising）」と同じ意味を有し、そして、用語「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consisting essentially of）」のいずれとも置換され得る。
【００６３】
本出願において特定されない限り、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸はそれぞれ、連続しており、かつ非相同配列によって中断されない。
【００６４】
［核酸間またはポリペプチド間の同一性］
用語「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセンテージ相同性」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較をいうために本明細書中で互換可能に用いられる。そして、これらは、比較ウインドウ上で２つの適切に整合される配列を比較することによって決定される。ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の適切なアライメントについて、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列において存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を、比較のウインドウにおける位置の全ての数で除し、そして、その得られた数に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。相同性は種々の配列比較アルゴリズムおよび当該分野で公知のプログラムのいずれかを用いて評価される。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＦＡＳＴＤＢ（PearsonおよびLipman, 1988；Altschulら、1990；Thompsonら、1994; Higginsら、1996； Altschulら、1990；Altschulら、1993；Brutlagら、1990（これらの文献の開示は、その全体が参考として援用される））があげられるが、これらに限定されることを意味しない。
【００６５】
とくに好ましい実施態様において、タンパク質配列および核酸配列の相同性は、当該分野において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）（たとえば、KarlinおよびAltschul、1990；Altschulら、1990、1993、1997参照（これらの文献の開示は、その全体が参考として援用される））を用いて評価される。とくに、５つの特定のＢＬＡＳＴプログラムを用いて、以下のタスクが実施される：
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３が、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸照会配列を比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮが、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド照会配列を比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸが、タンパク質配列データベースに対して照会ヌクレオチド配列（両鎖）の６フレーム概念翻訳産物を比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、６つ全てのリーディングフレーム（両鎖）において翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して照会タンパク質配列を比較する；および
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物に対してヌクレオチド照会配列の６フレーム翻訳物を比較する。
【００６６】
ＢＬＡＳＴプログラムは、照会アミノ酸配列または照会核酸配列と、タンパク質配列または核酸配列データベースから好ましく得られる試験配列との間の、「高スコアセグメント対」と本明細書中でいわれる類似のセグメントを同定することによって相同配列を同定する。高スコアセグメント対は、好ましくは、スコアリングマトリクスの手段（この手段の多くは、当該分野で公知である）によって同定される（すなわち、配列される）。好ましくは、用いられるスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスである（Gonnetら、１９９２；HenikoffおよびHenikoff、1993（これらの文献の開示は、その全体が参考として援用される））。もう少し好ましくは、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリクスがまた用いられ得る（たとえば、SchwartzおよびDayhoff編、1978年参照（この文献の開示は、その全体が参考として援用される））。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された全ての高スコアセグメント対の統計的有意性を評価し、そして好ましくは、ユーザー指定の有意性閾値（たとえば、ユーザー指定のパーセント相同性）を満足するそれらのセグメントを選択する。好ましくは、高スコアセグメント対の統計的有意性は、Ｋａｒｌｉｎの統計的有意性の式（たとえば、KarlinおよびAltschul、1990参照（この文献の開示は、その全体が参考として援用される））を用いて評価される。ＢＬＡＳＴプログラムは、規定のパラメータまたはユーザーによって規定される変更されたパラメータとともに用いられ得る。
【００６７】
全体的な配列アライメント（global sequence alignment）ともいわれる、照会ヌクレオチド配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体としての一致を決定するための別の好ましい方法は、Brutlagら（1990）（この文献の開示は、その全体が参考として援用される）のアルゴリズムにもとづくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定され得る。配列アライメントにおいて、照会配列と対象配列は、ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、まずＵからＴへ変換することによって比較され得る。この全体的な配列アライメントの結果は、パーセント同一性で示される。パーセント同一性を算出するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて用いられる好ましいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれにしても３５未満である）である。対象配列が、内部欠失ではなく、５’欠失または３’欠失のために照会配列よりも短い場合、手動による補正が結果に対してなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性の算出の際に、対象配列の５’切断および３’切断を考慮しないためである。照会配列に関連して５’末端または３’末端において切断された対象配列について、パーセント同一性は、対象配列の５’末端および３’末端であって、一致／整合されない照会配列の塩基の数を、照会配列の全塩基のパーセンテージとして算出することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整合されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、指定パラメータ１０を用いる前記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出されたパーセント同一性から減じて、最終的なパーセント同一性スコアに達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために用いられるものである。ＦＡＳＴＤＢアライメントによって表示されるように、照会配列と一致／整合されない対象配列の５’ヌクレオチドおよび３’ヌクレオチドの外側のヌクレオチドのみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために算出される。たとえば、９０ヌクレオチド対象配列は、パーセント同一性を決定するために１００ヌクレオチド照会配列と整合される。欠失は、対象配列の５’末端において存在する。したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、５’末端における最初の１０ヌクレオチドの一致／整合を示さない。１０の対にならないヌクレオチドは、その配列のうち１０％（照会配列におけるヌクレオチドの総数と一致しない５’末端および３’末端におけるヌクレオチドの数）であることを示す。したがって、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出されるパーセント同一性スコアから減じられる。残りの９０ヌクレオチドが完全に一致した場合、最終的なパーセント同一性は、９０％である。別の実施例において、９０ヌクレオチド対象配列は、１００ヌクレオチ���照会配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であるので、対象配列の５’末端または３’末端には、照会配列と一致／整合されないヌクレオチドは存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出されるパーセント同一性は、手動で補正されない。再度、照会配列と一致／整合されない対象配列の５’末端および３’末端のヌクレオチドのみが手動で補正される。その他の手動による補正は、本発明の目的のためになされない。
【００６８】
全体的な配列アライメントともいわれる、照会アミノ酸配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体としての一致を決定するための別の好ましい方法は、Brutlagら（1990）のアルゴリズムにもとづくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定され得る。配列アライメントにおいて、照会配列と対象配列は、ともにアミノ酸配列である。この全体的な配列アライメントの結果は、パーセント同一性で示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにおいて用いられる好ましいパラメータは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ２５Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（いずれにしてもより短い）である。対象配列が、内部欠失ではなく、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失のために照会配列よりも短い場合、パーセント同一性における結果は、手動によって補正されなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的なパーセント同一性の算出の際に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないためである。照会配列に関連してＮ末端およびＣ末端において切断された対象配列について、パーセント同一性は、対象配列のＮ末端およびＣ末端であって、対応する対象残基と一致／整合されない照会配列の残基の数を、照会配列の全残基のパーセンテージとして算出することによって補正される。残基が一致／整合されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、指定パラメータを用いる前記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出されたパーセント同一性から減じて、最終的なパーセント同一性スコアに達する。この最終的なパーセント同一性スコアは、本発明の目的のために用いられるものである。照会配列と一致／整合されない対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基のみ（すなわち、対象配列の最も遠くのＮ末端残基およびＣ末端残基の外側の照会アミノ酸残基のみ）が、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために考慮される。たとえば、９０アミノ酸残基対象配列は、パーセント同一性を決定するために１００残基照会配列と整合される。欠失は、対象配列のＮ末端において存在する。したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端における最初の残基と一致／整合しない。１０の対にならない残基は、配列のうち１０％（照会配列における残基の総数と一致しないＮ末端およびＣ末端における残基数）であることを示す。したがって、１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出されるパーセント同一性スコアから減じられる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的なパーセント同一性は、９０％である。別の実施例において、９０残基対象配列は、１００残基照会配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であるので、照会配列と一致／整合されない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出されるパーセン���同一性は、手動で補正されない。再度、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて表示されるように、照会配列と一致／整合されない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側に位置する残基のみが手動で補正される。その他の手動による補正は、本発明の目的のためになされない。
【００６９】
用語「配列類似性のパーセンテージ」とは、ポリペプチド配列間の比較をいい、そして、比較ウインドウ上で、２つの適切に整合される配列を比較することによって決定される。ここで、比較ウインドウにおけるポリペプチド配列の一部は、２つの配列の適切なアライメントについて、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一または等価なアミノ酸残基が両配列において存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を、比較のウインドウにおける位置の全ての数で除し、そして、その得られた数に１００を乗じて、配列類似性のパーセンテージを算出することによって計算される。類似性は、当該分野で既知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラム（この節において前記したアルゴリズムおよびプログラムを含む）のいずれかを用いて評価される。等価なアミノ酸残基は、本明細書中で定義される。
【００７０】
［ハイブリダイゼーション条件］
（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブに対して高いレベルの同一性を有する核酸のみがそのプローブにハイブリダイズし得る条件として定義される。これらの条件は、以下のように算出され得る：
１４〜７０ヌクレオチド長のプローブに関して、融解温度（Ｔｍ）は以下の式を用いて算出される：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ（Ｎａ+））＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（ここで、Ｎはプローブの長さ）
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液において実施される場合、融解温度は以下の式を用いて算出され得る：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ（Ｎａ+））＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（ここで、Ｎはプローブの長さ）
【００７１】
プレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、または６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミドにおいて実施され得る。ＳＳＣおよびデンハルト溶液の処方は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８６に列記される。
【００７２】
ハイブリダイゼーションは、検出可能なプローブを前記プレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって行われる。プローブが２本鎖ＤＮＡを含む場合、プローブは変性した後にハイブリダイゼーション溶液に添加される。フィルタは、プローブを、それに相補的な配列またはそれに相同な配列を含む核酸にハイブリダイズさせるのに十分な期間、ハイブリダイゼーション溶液と接触される。２００を超えるヌクレオチド長のプローブに関して、ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより１５〜２５℃低い温度で実施され得る。オリゴヌクレオチドプローブなどの短いプローブに関して、ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより１５〜２５℃低い温度で行われ得る。好ましくは、６×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションについて、ハイブリダイゼーションは約６８℃で行われる。好ましくは、５０％ホルムアミド含有溶液におけるハイブリダイゼーションについて、ハイブリダイゼーションは約４２℃で行われる。
【００７３】
ハイブリダイゼーションの後、フィルタは２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、室温で１５分間洗浄される。ついで、そのフィルタは、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで、室温で３０分〜１時間洗浄される。その後、その溶液は、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおいて、ハイブリダイゼーション温度で洗浄される。最後の洗浄は、０．１×ＳＳＣにおいて、室温で行われる。
【００７４】
プローブにハイブリダイズされている核酸は、オートラジオグラフィーまたはその他の慣用的な技術によって同定される。
【００７５】
用いられ得る高ストリンジェンシーのその他の条件は当該分野で周知であり、かつSambrookら、1989；およびAusubelら、1989に記載される。例であって限定的ではないが、高ストリンジェンシーの条件を用いる方法は、以下のとおりである：ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中で、６５℃で８時間から一晩中実施される。フィルタは、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中で、６５℃（好ましいハイブリダイゼーション温度）で４８時間ハイブリダイズされる。あるいは、ハイブリダイゼーション工程は、ＳＳＣ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５Ｍ  クエン酸ナトリウムに相当する１×ＳＳＣ）の存在下で６５℃で実施され得る。その後、フィルタ洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％  Ｆｉｃｏｌｌおよび０．０１％  ＢＳＡを含む溶液中で、３７℃で１時間行われ得る。つづいて、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄され得る。代替的に、フィルタ洗浄は、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または０．５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、または０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で、６８℃で１５分間隔で行われ得る。洗浄工程の後、ハイブリダイズしたプローブは、オートラジオグラフィーによって検出可能である。これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適切である。前記ハイブリダイゼーション条件は、所望の核酸の長さ、当業者に周知のその後の技術にしたがって適合されるべきであることはいうまでもない。適切なハイブリダイゼーション条件は、たとえば、HamesおよびHiggins（1985）またはSambrookら（1989）において開示された教示にしたがって適合され得る。
【００７６】
（低い条件および中程度の条件）
ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーにおける変化は、主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの低いパーセンテージは、低いストリンジェンシーの原因となる）；塩濃度または温度の操作を通じて達成される。したがって、前記方法を変更することにより、プローブ配列に対する減少されたレベルの同一性を有する核酸が同定され得る。たとえば、ハイブリダイゼーション温度は、約１Ｍのナトリウム濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中で、６５℃から４２℃に５℃単位で減少され得る。ハイブリダイゼーションの後、フィルタは、ハイブリダイゼーション温度で、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで洗浄され得る。これらの条件は、５０℃を超える「中程度」の条件、および５０℃未満の「低い」条件が考えられる。代替的に、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む緩衝液（たとえば、６×ＳＳＣ）中で、４２℃の温度で実施され得る。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を５０％から０％に５％単位で減少させることにより、プローブに対する減少されたレベルの同一性を有するクローンが同定され得る。ハイブリダイゼーションの後、フィルタを６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで、５０℃で洗浄され得る。これらの条件は、ホルムアミド濃度が２５％を超える「中程度」の条件、およびホルムアミド濃度が２５％未満の「低い」条件が考えられる。プローブにハイブリダイズしているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、オートラジオグラフィーまたはその他の慣用的な技術によって同定される。
【００７７】
前記条件のバリエーションは、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑えるために用いられる別のブロッキング試薬の含有および／または置換を通じて達成され得る。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販のメーカー独自の処方物があげられる。特定のブロッキング試薬を含有する場合、適合性の問題のために、前記ハイブリダイゼーション条件の変更を必要とし得る。
【００７８】
［本発明のポリヌクレオチド］
１）ＰＧ−３遺伝子のゲノム配列
本発明はＰＧ−３のゲノム配列に関する。本発明は、ＰＧ−３遺伝子、または配列番号１の配列、それに相補的な配列、ならびにそのフラグメントおよび改変体からなるＰＧ−３ゲノム配列、それらから本質的になるＰＧ−３ゲノム配列、もしくはそれらを含むＰＧ−３ゲノム配列を含有する組成物を包含する。これらのポリヌクレオチドは、精製、単離または組換えられ得る。
【００７９】
本発明のとくに好ましい核酸としては、配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号１の以下のヌクレオチド位置を含む：１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−２４０８２５）またはその相補鎖を含む組成物における単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドがあげられる。本発明のさらなる好ましい核酸としては、配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号１の以下のヌクレオチド位置を含む：１−１００００、１０００１−２００００、２０００１−３００００、３０００１−４００００、４０００１−５００００、５０００１−６００００、６０００１−７００００、７０００１−８００００、８０００１−９００００、９０００１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−１５９０００、１５９００１−１６００００、１６０００１−１７００００、１７０００１−１８００００、１８０００１−１９００００、１９０００１−２０００００、２００００１−２１００００、２１０００１−２２００００、２２０００１−２３００００、２３０００１−２４０８２５）またはその相補鎖を含む組成物における単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドがあげられる。任意の大きさおよび配列の核酸フラグメントはまた、この節において説明されるヌクレオチドに含まれ得ることに留意しなければならない。
【００８０】
ＰＧ−３ゲノム核酸は１４個のエクソンを含む。配列番号１におけるエクソン位置は、以下の表Ａにおいて詳述される。
【００８１】
【表１】
2004520055.tif 000002
【００８２】
したがって、本発明は、ＰＧ−３遺伝子の１４個のエクソンからなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む、精製、単離または組換えられたポリヌクレオチドを含有する組成物を具現化する。本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子の少なくとも２つのエクソンの組合わせを含む、精製、単離または組換えられた核酸（ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１と同じ規則で、核酸において、該核酸の５’末端から３’末端へと配置される）を含有する組成物に関する。
【００８３】
イントロンＡ−Ｂとは、エクソンＡとエクソンＢとの間に位置されるヌクレオチド配列をいう。イントロンの位置は、表Ａにおいて詳述される。イントロンＪ−Ｋは大きい。実際に、イントロンＪ−Ｋは１２０ｋｂ長であり、そして完全なアンギオポイエチン遺伝子を含む。
【００８４】
したがって、本発明は、ＰＧ−３遺伝子の１３個のイントロンからなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む、精製、単離、または組換えられたポリヌクレオチドを含有する組成物を具現化する。
【００８５】
この節は「ＰＧ−３のゲノム配列」と題されるが、任意の大きさおよび配列の核酸フラグメントもまた、２つ以上のこのようなゲノム配列の両側または間に、ＰＧ−３のゲノム配列が隣接する、この節において説明されるポリヌクレオチドに含まれ得ることに留意しなければならない。
【００８６】
２）ＰＧ−３ｃＤＮＡ配列
ＰＧ−３遺伝子の発現は、核酸配列が配列番号２において示される、少なくとも１つのｍＲＮＡ種の産物を導くことが示されている。３つのｃＤＮＡは、独立してクローン化されている。３つのすべてのｃＤＮＡは、同一の大きさを有するが、互いの間および各ｃＤＮＡとゲノム配列との間で、強い多型を示す。これらの多型は、配列番号２において性質「ｖａｒｉａｔｉｏｎ」の使用によって載せている添付の配列表において示される。
【００８７】
本発明の別の目的は、配列番号２のヌクレオチド配列、それに相補的な配列、ならびにそれらの対立遺伝子改変体およびフラグメントを含む、精製、単離または組換えられた核酸を含有する組成物である。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチド組成物としては、配列番号２の配列からなる、配列番号２の配列から本質的になる、または配列番号２の配列を含む、精製、単離または組換えられたＰＧ−３ｃＤＮＡがあげられる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態としては、配列番号２の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号２の以下のヌクレオチド位置を含む：１−５００、５０１−１０００、１００１−１５００、１５０１−２０００、２００１−２５００、２５０１−３０００、３００１−３５００、３５０１−３８０９）またはその相補鎖を含む、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドを含有する組成物があげられる。
【００８９】
配列番号２のｃＤＮＡは、配列番号２の位置１におけるヌクレオチドから始まり、位置５７におけるヌクレオチドで終わる５’−ＵＴＲ領域を含む。配列番号２のｃＤＮＡは、配列番号２の位置２５６６におけるヌクレオチドから始まり、位置３８０９におけるヌクレオチドで終わる３’−ＵＴＲ領域を含む。ポリアデニル化シグナルは、配列番号２の位置３７９５におけるヌクレオチドから始まり、位置３８００におけるヌクレオチドで終わる。
【００９０】
そのため、本発明は、ＰＧ−３ｃＤＮＡの５’ＵＴＲのヌクレオチド配列、それに相補的な配列、またはその対立遺伝子改変体を含む、精製、単離、または組換えられた核酸を含有する組成物に関する。本発明はまた、ＰＧ−３ｃＤＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列、それに相補的な配列、またはその対立遺伝子改変体を含む、精製、単離、または組換えられた核酸を含有する組成物に関する。
【００９１】
この節は「ＰＧ−３のゲノム配列」と題されるが、任意の大きさおよび配列の核酸フラグメントはまた、２つ以上のこのようなＰＧ−３配列の両側またはその間に、ＰＧ−３配列が隣接する、この節において説明されるポリヌクレオチドに含まれ得ることに留意しなければならない。
【００９２】
３）コード領域
ＰＧ−３オープンリーディングフレームは、配列番号２の対応するｍＲＮＡに含まれる。より正確には、有効なＰＧ−３コード配列（ＣＤＳ）としては、配列番号２のヌクレオチド位置５８（ＡＴＧコドンの最初のヌクレオチド）とヌクレオチド位置２５６５（ＴＧＡコドンの最後のヌクレオチド）との間の領域があげられる。
【００９３】
本発明はまた、配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８または１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むポリペプチドをコードする、単離、精製、および組換えられたポリヌクレオチドを含有する組成物を具現化する。好ましくは、本発明はまた、配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８または１０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００アミノ酸の連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号３の以下のアミノ酸位置を含む：１−１００、１０１−２００、２０１−３００、３０１−４００、４０１−５００、５０１−６００、６０１−７００、７０１−８３５）を含むポリペプチドをコードする、単離、精製、および組換えられたポリヌクレオチドを含有する組成物を具現化する。
【００９４】
ＰＧ−３遺伝子のコード配列を含む前記ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが、適切な発現シグナルの制御下に配置される場合、所望の宿主細胞または所望の宿主生物において発現され得る。その発現シグナルは、本発明のＰＧ−３遺伝子における調節領域に含まれる発現シグナル、または、一方、外因性調節核酸配列であり得るシグナルのいずれかであり得る。このようなポリヌクレオチドは、適切な発現シグナルの下に配置される場合、その発現および／または増幅のためのベクターに挿入され得る。
【００９５】
４）ＰＧ−３の調節配列
前記のように、ＰＧ−３遺伝子のゲノム配列は、この遺伝子の１４個のエクソンを含むＰＧ−３コード領域に隣接する非転写５’−隣接領域および非転写３’−隣接領域の両方に調節配列を含む。
【００９６】
ＰＧ−３遺伝子の５’調節領域は、配列番号１のヌクレオチド配列の位置１におけるヌクレオチドと位置２０００におけるヌクレオチドとの間に位置される。ＰＧ−３遺伝子の３’調節領域は、配列番号１のヌクレオチド位置２３８８２６とヌクレオチド位置２４０８２５との間に位置される。
【００９７】
５’調節領域および３’調節領域から生じるポリヌクレオチドは、試験試料における配列番号１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントの少なくとも１つの複製物の存在を検出するために有用である。
【００９８】
ＰＧ−３に含まれる５’調節領域のプロモーター活性は、以下に説明されるように評価され得る。
【００９９】
配列番号１の、関連する調節活性ポリヌクレオチドフラグメントまたは改変体を同定するために、当業者は、マーカー遺伝子（すなわち、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）を保持する組換えベクターの使用を記載するSambrookら（1989）の書を参照する。このマーカー遺伝子の発現は、配列番号１の生物学的に活性なポリヌクレオチドフラグメントまたは改変体の制御下に配置された場合、検出されるであろう。ＰＧ−３遺伝子の最初のエクソンの上流に位置されるゲノム配列は、適切なプロモーターレポーターベクター（たとえば、ｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−ＥｎｈａｎｃｅｒまたはｐＥＧＦＰ−１  プロモーターレポーターベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、またはｐＧＬ２−ｂａｓｉｃもしくはｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプロモーターレスルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化される。簡潔には、これらのプロモーターレポーターベクターの各々は、容易に分析可能なタンパク質（たとえば、分泌アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、または緑蛍光タンパク質）をコードするレポーター遺伝子の上流に位置されるマルチプルクローニング部位を含む。ＰＧ−３コード領域の上流配列は、レポーター遺伝子の上流のクローング部位に共に配向された状態で挿入され、そして適切な宿主細胞に導入される。レポータータンパク質のレベルが分析され、そして、クローニング部位に挿入物を含まないベクターから得られたレベルと比較される。コントロールベクターに対して、挿入物を含むベクターにおける上昇された発現レベルの存在は、挿入物におけるプロモーターの存在を示す。必要であれば、上流配列は、弱いプロモーター配列からの転写レベルを上昇するエンハンサーを含むベクターにクローン化され得る。挿入物を含まないベクターで観察される有意なレベルの前記発現は、プロモーター配列が、挿入された上流配列に存在することを示す。
【０１００】
上流ゲノムＤＮＡ内のプロモーター配列は、慣用的な技術（たとえば、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは適切な制限エンドヌクレアーゼ消化）を用いて上流ＤＮＡにおけるネスティッド５’および／または３’欠失を構築することによってさらに規定され得る。得られる欠失フラグメントを、プロモーターレポーターベクターに挿入し、その欠失がプロモーター活性を減少または消滅させるか否かが決定され得る（たとえば、Colesら（1998）によって説明される）。この方法では、プロモーターの境界が規定され得る。所望の場合、プロモーター内の潜在的な個々の調節部位は、プロモーター内の潜在的な転写因子結合部位を消滅させるための部位特異的変異またはリンカースキャニングを、個々にあるいは組合わせて用いて同定され得る。転写レベルに対するこれらの変異の効果は、プロモーターレポーターベクターにおけるクローニング部位への変異の挿入によって決定され得る。この型のアッセイは、当業者に周知であり、かつ、国際公開第  ９７／１７３５９号パンフレット、米国特許第５，３７４，５４４号明細書；欧州特許第５８２  ７９６号明細書；米国特許第５，６９８，３８９号明細書；同第５，６４３，７４６号明細書；同第５，５０２，１７６号明細書；および同第５，２６６，４８８号明細書に記載される。
【０１０１】
ＰＧ−３遺伝子のプロモーターの強度および特異性は、種々の型の細胞および組織におけるＰＧ−３プロモーターに作動可能に連結される検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルを介して評価され得る。検出可能なポリヌクレオチドは、所定のオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは検出可能なタンパク質（ＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドのいずれかであり得る。この型のアッセイは当業者に周知であり、かつ米国特許第５，５０２，１７６号明細書；および同第５，２６６，４８８号明細書に記載される。この方法のいくつかは、以下により詳細に議論される。
【０１０２】
ＰＧ−３コード領域の５’末端および３’末端に位置される調節エレメントを保持するポリヌクレオチドは、目的の非相同ポリヌクレオチドの転写活性および翻訳活性を制御するために、有利に用いられ得る。
【０１０３】
したがって、本発明はまた、５’および３’調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチド、あるいはそれに相補的な配列またはそれの調節活性フラグメントもしくは改変体を含む、精製または単離された核酸に関する。
【０１０４】
５’調節領域の好ましいフラグメントは、約１５００ヌクレオチドまたは１０００ヌクレオチド長、好ましくは約５００ヌクレオチド長、より好ましくは約４００ヌクレオチド長、なおより好ましくは３００ヌクレオチド長およびもっとも好ましくは約２００ヌクレオチド長を有する。
【０１０５】
３’調節領域の好ましいフラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、３００または４００塩基長である。
【０１０６】
配列番号１の「調節活性」ポリヌクレオチド誘導体は、組換え細胞宿主において組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための調節領域として機能的である、そのポリヌクレオチドのフラグメントを含む、あるいはそのフラグメントから本質的になる、またはそのフラグメントからなるポリヌクレオチドである。そのポリヌクレオチド誘導体は、エンハンサーまたはリプレッサーのいずれかとして作用し得る。
【０１０７】
本発明の目的のために、核酸またはポリヌクレオチドは、調節ポリヌクレオチドが、転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含む場合、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための調節領域として「機能的」であり、そして、このような配列は、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または所望のポリヌクレオチドに「作動可能に連結」される。
【０１０８】
本発明の調節ポリヌクレオチドは、たとえば、Sambrookら（1989）の書に記載されるように、適切な制限酵素を用いて切断することによって配列番号１のヌクレオチド配列から調製され得る。調節ポリヌクレオチドはまた、エキソヌクレアーゼ酵素（たとえば、Ｂａｌ３１）による配列番号１の消化によって調製され得る（Wabikoら、1986）。これらの調節ポリヌクレオチドはまた、本明細書中の他の場所に記載されるように核酸化学合成によって調製され得る。
【０１０９】
本発明にしたがう調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物においてコード配列を発現するために用いられ得る組換え発現ベクターの一部であり得る。本発明にしたがう組換え発現ベクターは、本明細書中の他の場所に記載される。
【０１１０】
本発明の好ましい５’−調節ポリヌクレオチドとしては、ＰＧ−３ｃＤＮＡの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体があげられる。
【０１１１】
本発明の好ましい３’−調節ポリヌクレオチドとしては、ＰＧ−３ｃＤＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体があげられる。
【０１１２】
本発明のさらなる目的は、ａ）以下からなる群から選択される調節ヌクレオチド配列を含む核酸：
（ｉ）５’調節領域のポリヌクレオチドまたはそれに相補的な配列を含むヌクレオチド配列；または
（ii）５’調節領域のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列と少なくとも８０、８５、９０または９５％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；または
（iii）５’調節領域のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；または
（iv）（ｉ）、（ii）および（iii）におけるポリヌクレオチドの調節活性フラグメントまたは改変体；
ｂ）前記（ａ）において規定された核酸に作動可能に連結された目的の所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは目的の核酸；
ｃ）任意に、３’−調節ポリヌクレオチド、好ましくはＰＧ−３遺伝子の３’−調節ポリヌクレオチドを含む核酸
を含む、精製または単離された核酸に関する。
【０１１３】
前記で規定される核酸の特定の実施形態において、この核酸としては、ＰＧ−３ｃＤＮＡの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）またはその調節活性フラグメントもしくは改変体があげられる。
【０１１４】
前記で規定される核酸の第２の特定の実施形態において、この核酸としては、ＰＧ−３ｃＤＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）またはその調節活性フラグメントもしくは改変体があげられる。
【０１１５】
５’調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは所望のポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。
【０１１６】
３’調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは所望のポリヌクレオチドの３’末端に有利に作動可能に連結される。
【０１１７】
前記核酸によってコードされる所望のポリペプチドは、種々の天然物または起源物（原核生物起源または真核生物起源のタンパク質を含む）であり得る。ＰＧ−３調節領域の制御下で発現され得るポリペプチドとしては、細菌抗原、真菌抗原またはウイルス抗原である。真核生物のタンパク質（たとえば、「ハウスキーピング」タンパク質などの細胞内タンパク質、レセプタータンパク質などの膜結合タンパク質、および内因性メディエーター（たとえば、サイトカイン）などの分泌タンパク質）もまた包含される。所望のポリペプチドは、ＰＧ−３タンパク質、とくに配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体であり得る。
【０１１８】
前記ポリヌクレオチドによってコードされる所望の核酸（通常は、ＲＮＡ分子）は、所望のコードポリヌクレオチド、たとえば、ＰＧ−３コード配列に相補的であり得る。したがって、この核酸は、アンチセンスポリヌクレオチドとして有用である。
【０１１９】
このようなポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物において所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現するために、組換え発現ベクターに含まれ得る。本明細書中に記載されるようなポリヌクレオチドを含む適切な組換えベクターは、本明細書中の他の場所に開示される。
【０１２０】
５）ポリヌクレオチド改変体
本発明はまた、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの改変体およびフラグメント、とくに、本発明にしたがう二対立遺伝子マーカーを１つ以上含むＰＧ−３遺伝子の改変体およびフラグメントに関する。
【０１２１】
ａ）対立遺伝子改変体
ポリヌクレオチドの改変体は、天然に存在する改変体（たとえば、天然に存在する対立遺伝子改変体）または天然に存在することが公知でない改変体であり得る。「対立遺伝子改変体」によって、生体の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの別の形態の１つが意味される（Lewin、1990（この文献の開示は、その全体が参考として援用される）参照）。二倍体生体は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。ポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術（ポリヌクレオチド、細胞または生体に適用される技術を含む）によって作製され得る。
【０１２２】
ｂ）縮重改変体
本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびそのフラグメントに加えて、本発明はさらに、前記配列とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝子コードの縮重のために、本発明のＰＧ−３ポリペプチドをなおコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチド改変体は、本出願にわたって「縮重改変体」という。すなわち、本発明のＰＧ−３ポリペプチドをコードする全ての可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。これは、当該分野で公知の遺伝子コードおよび種特異的コドン選択性を含む。したがって、前記縮重改変体を産生、たとえば、特定の宿主に関してコドン表現を最適化（たとえば、ヒトｍＲＮＡにおいてコドンをその他の哺乳動物宿主細胞または細菌宿主細胞によって好ましいコドンに変更）することは当業者には慣用的である。
【０１２３】
改変体ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチド変化は、サイレントであり得る。サイレントとは、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更しないという意味である。しかし、ヌクレオチド変化はまた、基準配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を生じる。置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドに関係し得る。改変体は、コード領域または非コード領域あるいはその両方において変更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的なアミノ酸の、置換、欠失または付加を生じ得る。本発明との関係では、好ましい実施形態は、ポリヌクレオチド改変体が、ＰＧ−３タンパク質と実質的に同一の生物学的特性または活性を保持するポリペプチドをコードする実施形態である。より好ましいポリヌクレオチド改変体は、保存的置換を含む改変体である。
【０１２４】
ｃ）類似のポリヌクレオチド
本発明の他の実施形態は、配列番号１および２の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列もしくはそのフラグメントと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、精製、単離または組換えられたポリヌクレオチドである。配列番号１のヌクレオチド配列についてのヌクレオチドの相違は、一般的に、全核酸にわたって無作為に分布され得る。それにもかかわらず、好ましい核酸は、ヌクレオチドの相違が、その大部分が、配列番号１のエクソン中に含まれるコード配列の外側に位置される核酸である。前記ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが生物学的活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく含まれる。これは、特定の核酸分子が、活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者には、たとえば、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとしての核酸分子の使用方法がなお公知であるためである。生物学的活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とくに、ＤＮＡライブラリーからのＰＧ−３遺伝子またはその対立遺伝子改変体の単離、およびノーザンブロット分析またはＰＣＲ分析による、ＰＧ−３ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含むと推測される生物学的試料におけるＰＧ−３遺伝子の複製物またはＰＧ−３ｍＲＮＡ発現の検出があげられる。
【０１２５】
本発明はまた、５’および３’ＰＧ−３調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの、少なくとも８０、８５、９０または９５％ヌクレオチド同一性、有利には、５’および３’ＰＧ−３調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの９９％ヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％ヌクレオチド同一性およびもっとも好ましくは９９．８％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチド、あるいはそれに相補的な配列またはその改変体もしくはその調節活性フラグメントを含む、精製、単離または組換えられた核酸分子に関する。
【０１２６】
本発明はさらに、配列番号１および２の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドに少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する配列からなるポリヌクレオチド（ここで、前記ポリペプチドは、実際にＰＧ−３生物学的活性を有するポリペプチドをコードする）に関する。当然、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、配列番号１および２の配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドに少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する多数のポリヌクレオチドが、ＰＧ−３生物学的活性を有するポリペプチドをコードすることをすぐに理解するであろう。実際に、これらのヌクレオチド配列のすべての縮重改変体は同一のポリペプチドをコードするので、これは、前記比較アッセイを実施しなくても当業者に明らかである。縮重改変体ではないこのような核酸分子について、相当数がまたＰＧ−３生物学的活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野においてさらに認識される。これは、当業者が、以下にさらに記載されるように、タンパク質の機能をあまり顕著に達成しそうにない、またはしないかのいずれかであるアミノ酸置換（たとえば、ある脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸での置換）を完全に把握しているためである。本発明の基準ヌクレオチド配列に少なくとも、たとえば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、ＰＧ−３ポリペプチドをコードする基準ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたりに５つまでの点変異を含み得ることを除いては、ポリヌクレオチドの核酸配列が基準配列と同一であることを意味する。換言すると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列をからなるポリヌクレオチドを得るために、基準配列において５％までのヌクレオチドが、欠失、挿入、または別のヌクレオチドで置換され得る。照会配列は、配列番号１および２の配列からなる群から選択される完全配列、またはこの群から選択されるポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、もしくは本明細書中に記載される特定の任意のフラグメントであり得る。
【０１２７】
ｄ）ハイブリダイズするポリヌクレオチド
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法を含む当業者に公知の任意の方法を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の任意のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離または精製された核酸分子を提供する。
【０１２８】
本発明の目的は、本明細書中に規定されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチド、あるいはこれらに相補的な配列またはこれらの改変体もしくはこれらのフラグメントとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製、単離または組換えられた核酸分子に関する。本発明の別の目的は、本明細書中に規定されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、５’調節領域および３’調節領域のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド、あるいはこれらに相補的な配列またはこれらの改変体もしくはこれらの調節活性フラグメントとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製、単離または組換えられた核酸に関する。
【０１２９】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、好ましくは本明細書中に規定される中程度または低ストリンジェンシー条件で、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた含まれる。このようなハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００、５００または１０００ヌクレオチド長であり得る。
【０１３０】
当然、ポリＡ＋配列（たとえば、任意の３’末端ｐｏｌｙＡ＋配列表において示されるｃＤＮＡの区域）、またはＴ（もしくはＵ）残基の５’相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれの相補鎖を含む任意の核酸分子（たとえば、実際には、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて生じた任意の２本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【０１３１】
ＰＧ−３ポリペプチド、とくにＰＧ−３生物学的活性を示すＰＧ−３ポリペプチドをコードする本発明の任意のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドはとくに目的とされる。
【０１３２】
６）ポリヌクレオチドフラグメント
本発明はさらに、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の一部またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドフラグメントは、所定のヌクレオチド配列、好ましくは、ＰＧ−３遺伝子のヌクレオチド配列およびその改変体の全てではないが一部と完全に同一である配列を含むポリヌクレオチドである。このフラグメントは、ＰＧ−３遺伝子のイントロンまたはエクソンの一部であり得る。このフラグメントは、ＰＧ−３遺伝子のオープンリーディングフレームであり得る。このフラグメントはまた、ＰＧ−３の調節領域の一部であり得る。
【０１３３】
好ましくは、このようなフラグメントは、少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含む。ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０またはその相補鎖もしくは１以上の二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０を用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーからなる群から選択される；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにその相補鎖からなる群から選択され、または任意にそれらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７、ならびにその相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである。１組の好ましいフラグメントは、本明細書中に記載されるＰＧ−３遺伝子またはその相補鎖の二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０の少なくとも１つを含む。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチドフラグメントの用途としては、プローブ、プライマー、分子量マーカーおよび本発明のポリペプチドフラグメントの発現用があげられる。フラグメントは、ａ）配列番号１および２の配列、ｂ）配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびｃ）ａ）またはｂ）に記載されるポリヌクレオチドの改変体からなる群から選択されるポリヌクレオチドの一部を含む。本発明のポリヌクレオチドの、少なくとも８連続した塩基を含む、精製または単離されたポリヌクレオチドは、本発明にとくに含まれる。この実施形態の１つの側面において、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの、少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、８００、１０００、１５００または２０００連続したヌクレオチドを含む。
【０１３５】
前記好ましいポリヌクレオチドサイズに加えて、さらに好ましいポリヌクレオチドの亜属は、少なくとも８ヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも８」は、８と配列表または本明細書中の他の場所に示されるもっとも３’のヌクレオチド位置に示される整数との間の任意の整数と定義される。ポリヌクレオチドの５’位置および３’位置によって、さらに特定される前記のような少なくとも８ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメントは本発明の好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれる。５’位置および３’位置は、添付の配列表において示される位置番号によって示される。対立遺伝子、縮重およびその他の改変体について、位置１は、ＯＲＦのもっとも５’のヌクレオチド（すなわち、連続して数字を付けられた残りのヌクレオチドを有する開始コドンのヌクレオチド「Ａ」）として定義される。したがって、少なくとも８連続したヌクレオチド長の本発明のポリヌクレオチドフラグメントが本発明のポリヌクレオチド上を占有し得る、５’および３’ヌクレオチド位置のすべての組合わせは、個々の種として本発明に含まれる。５’位置および３’位置によって特定されるポリヌクレオチドフラグメントは、すぐに認識され得る。したがって、それらのポリヌクレオチドフラグメントは、明細書を不必要に長くしないために単に個々に列記されない。
【０１３６】
本発明のポリヌクレオチドフラグメントの前記種類は、式「ａ〜ｂ」によって代替的に記載され得ることに留意される。ここで、「ａ」は、ポリヌクレオチドのもっとも５’のヌクレオチド位置と等しく、そして「ｂ」は、ポリヌクレオチドのもっとも３’のヌクレオチド位置と等しい；さらに、ここで、「ａ」は、１と本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの数から８を除した数との間の整数と等しく、「ｂ」は、９と本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの数との間の整数と等しい；そして、「ａ」は少なくとも８まで「ｂ」よりも小さい整数である。
【０１３７】
本発明はまた、前記のように、５’位置および３’位置によって特定される本発明のポリヌクレオチドフラグメントの任意の種類またはヌクレオチドにおける大きさによって特定されるポリヌクレオチドの亜属の排除を提供する。前記のように、かなり多数の、５’位置および３’位置またはヌクレオチドにおける大きさよって特定されるフラグメントが、排除され得る。
【０１３８】
本発明の好ましいフラグメントは、ポリペプチドのドメインをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。このようなフラグメントは、ハイブリダイゼーション技術またはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、類似のドメインを含むポリペプチドをコードするその他のポリヌクレオチドを得るために用いられ得る。代替的に、これらのフラグメントは、特定の生物学的性質を示し得るポリペプチドドメインを発現するために用いられ得る。本発明のＰＧ−３ポリペプチドに関する好ましいドメイン（本明細書中で「記載されたＰＧ−３ドメイン」と呼ばれる）は、配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０および位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むドメインである。したがって、本発明の別の目的は、配列番号３の、少なくとも５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１５０または２００連続したアミノ酸の連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、記載されたＰＧ−３ドメインのアミノ酸位置を含む）からなる、これらのアミノ酸から本質的になる、またはこれらのアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドである。本発明はまた、配列番号３の、少なくとも５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１５０または２００連続したアミノ酸の連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、記載されたＰＧ−３ドメインである）を含むポリペプチドをコードする、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、配列番号３の、記載されたＰＧ−３ドメインを含むポリペプチドをコードする、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドを包含する。
【０１３９】
本発明はさらに、この節において列記されるポリヌクレオチドフラグメントの任意の組合わせを包含する。
【０１４０】
このようなフラグメントは「自立」であり得る。すなわち、他のポリヌクレオチドの一部でも、他のポリヌクレオチドに融合もされていない。また、このようなフラグメントは、フラグメントが一部または領域を形成する単一の大きなポリヌクレオチド内に含まれ得る。実際に、これらのフラグメントのいくつかは、単一の大きなポリヌクレオチド内に存在され得る。
【０１４１】
７）ポリヌクレオチド構築物
用語「ポリヌクレオチド構築物」および「組換えポリヌクレオチド」は、人工的に設計された、およびポリヌクレオチドの最初の自然環境において連続したヌクレオチド配列として見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む、線状または環状で、精製または単離されたポリヌクレオチドに言及するために、本明細書中で互換可能に用いられる。
【０１４２】
［組換え細胞宿主およびトランスジェニック動物において一時的かつ空間的なＰＧ−３遺伝子発現を可能にするＤＮＡ構築物］
細胞レベルおよび多細胞生物レベルの両方において、ＰＧ−３タンパク質の合成の欠失の、生理学的および表現型の結果を研究するために、本発明はまた、
ＰＧ−３ゲノム配列またはｃＤＮＡの特定の対立遺伝子、ならびに配列番号１および２のＰＧ−３ヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメントとみなす１以上の塩基の置換、欠失もしくは付加を保有するＰＧ−３ゲノム配列またはｃＤＮＡの複製物、エクソン、イントロンもしくは調節配列、好ましくは、５’調節配列またはＰＧ−３ゲノム配列のエクソンまたは配列番号２のＰＧ−３ｃＤＮＡ内のエクソン、イントロンもしくは調節配列のいずれかに位置されるこれらの塩基置換物、欠失物もしくは付加物の条件付きの発現を可能にするＤＮＡ構築物および組換えベクターを包含する。好ましい実施形態において、ＰＧ−３配列は本発明の二対立遺伝子マーカーを含む。好ましい実施形態において、ＰＧ−３配列は、二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０の少なくとも１つを含む。
【０１４３】
本発明は、本発明において記載されるポリヌクレオチドのいずれか１つを含む組換えベクターを具現化する。とくに、本発明にしたがうポリヌクレオチド構築物は、「ＰＧ−３遺伝子のゲノム配列」節、「ＰＧ−３ｃＤＮＡ配列」節、「コード領域」節、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」節において記載されるポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０１４４】
第１の好ましいＤＮＡ構築物は、たとえば、Gossenら（1992、1995）およびFurthら（1994）に記載されるように、ＰＧ−３遺伝子発現の制御のためのＥ．ｃｏｌｉトランスポゾンＴｎ１０由来のテトラサイクリン耐性オペロンｔｅｔを基礎とする。このようなＤＮＡ構築物は、最小プロモーターまたはＰＧ−３遺伝子の５’−調節配列のいずれかに融合されるＴｎ１０由来の７つのｔｅｔオペレーター配列（ｔｅｔｏｐ）を含む。この最小プロモーターまたはＰＧ−３調節配列は、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドか、ポリペプチド（ＰＧ−３ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントを含む）のいずれかをコードする目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結される。このＤＮＡ構築物は、同じ細胞がまた、プロモーター（たとえば、ＨＣＭＶＩＥ１エンハンサー／プロモーターまたはＭＭＴＶ−ＬＴＲ）の制御下に位置される、単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインに融合される野生型（ｔＴＡ）または変異体（ｒＴＡ）のリプレッサーのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む場合、目的のヌクレオチド配列のための条件付き発現系として機能的である。実際に、本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、ｔｅｔオペレーター配列を含むポリヌクレオチドおよびｔＴＡまたはｒＴＡリプレッサーをコードする配列を含むポリヌクレオチドの両方を含む。
【０１４５】
特定の実施形態において、条件付発現ＤＮＡ構築物は、変異体テトラサイクリンリプレッサーｒＴＡをコードする配列を含み、目的のポリヌクレオチドの発現は、テトラサイクリンが存在しない場合はサイレントであり、そして、テトラサイクリンの存在下では誘導される。
【０１４６】
［相同組換えを可能にするＤＮＡ構築物：置換ベクター］
第２の好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に（ａ）ＰＧ−３ゲノム配列内に含まれる第１ヌクレオチド配列；（ｂ）陽性選択マーカー（たとえば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）についてのマーカー）を含むヌクレオチド配列；および（ｃ）ＰＧ−３ゲノム配列内に含まれ、かつ第１のＰＧ−３ヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノムに位置される第２ヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
好ましい実施形態において、このＤＮＡ構築物はまた、ヌクレオチド配列（ａ）の上流またはヌクレオチド配列（ｃ）の下流に位置する陰性選択マーカーを含む。好ましくは、陰性選択マーカーは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（Thomasら、1986）、ハイグロマイシンβ遺伝子（Te Rieleら、1990）、ｈｐｒｔ遺伝子（Van der Lugtら、1991；Reidら、1990）またはジフテリア毒Ａフラグメント（Ｄｔ−Ａ）遺伝子（Nadaら、1993；Yagiら、1990）からなる。好ましくは、陽性選択マーカーは、ＰＧ−３タンパク質をコードする配列を中断するように、ＰＧ−３エクソン配列内に位置される。これらの置換ベクターは、たとえば、Thomasら（1986；1987）、Mansourら（1988）およびKollerら（1992）によって記載される。
【０１４８】
第１および第２のヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）は、ＰＧ−３調節配列、イントロン配列、エクソン配列あるいは調節配列ならびに／またはイントロン配列および／もしくはエクソン配列の両方を含む配列内に関係なく位置され得る。ヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）の大きさは、１〜５０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂ、より好ましくは２〜６ｋｂおよびもっとも好ましくは２〜４ｋｂの範囲である。
【０１４９】
［相同組換えを可能にするＤＮＡ構築物：Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系］
これらの新規なＤＮＡ構築物は、Ｐ１ファージの部位特異的組換え系を利用する。Ｐ１ファージは、３４塩基対のｌｏｘＰ部位と特異的に相互作用するＣｒｅといわれるレコンビナーゼを保持する。ｌｏｘＰ部位は、８ｂｐの保存配列によって分離される１３ｂｐの２つのパリンドローム配列からなる（Hoessら、1986）。同一の配向を有する２つのｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ酵素による組換えは、ＤＮＡフラグメントの欠失を導く。
【０１５０】
相同組換え技術と組合わせて用いるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系は、Guら（1993、1994）によって最初に記載されている。簡潔には、ゲノムの標的とした位置に挿入される目的のヌクレオチド配列は、同一の配向で少なくとも２つのｌｏｘＰ部位を保有し、かつ組換えゲノムから切出されるヌクレオチド配列のそれぞれの末端に位置される。切出し事象は、組換え細胞宿主の核内のレコンビナーゼ（Ｃｒｅ）酵素の存在を必要とする。レコンビナーゼ酵素は、（ａ）この酵素を含む培養培地において組換え細胞宿主をインキュベートするか、Ｃｒｅ酵素を、たとえば、Arakiら（１９９５）によって記載される所望の細胞に直接注入するか、または酵素を、たとえば、Baubonisら（1993）によって記載される細胞へのリポフェクションのいずれかによって；（ｂ）たとえば、Guら（1993）およびSauerら（1988）によって記載される組換え宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるＣｒｅコード配列を含むベクターを用いて、細胞宿主をトランスフェクトすることによって（このプロモーターは任意に誘導性であり、このベクターは組換え細胞宿主に導入される）；（ｃ）たとえば、Guら（1994）によって記載される組換え細胞宿主において機能的なプロモーターに作動可能に連結されるＣｒｅコード配列を含むポリヌクレオチドを、細胞宿主のゲノムに導入することによって（プロモーターは任意に誘導性であり、そしてこのポリヌクレオチドは、無作為挿入事象または相同組換え事象のいずれかによって細胞宿主のゲノムに挿入される）、所望の時期に提供され得る。
【０１５１】
特定の実施形態において、相同組換えによってＰＧ−３遺伝子に挿入される配列を含むベクターは、選択マーカーが同一の配向のｌｏｘＰ部位に隣接されるように構築され、Ｃｒｅ酵素による処理によって、相同組換え事象によって挿入されている目的のＰＧ−３配列を残す一方、選択マーカーを除去させることが可能となる。また、以下の２つの選択マーカーが必要である：組換え事象を選択するための陽性選択マーカーおよび相同組換え事象を選択するための陰性選択マーカー。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いるベクターおよび方法は、Zouら（1994）によって記載される。
【０１５２】
したがって、本発明の第３の好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に（ａ）ＰＧ−３ゲノム配列に含まれる第１ヌクレオチド配列；（ｂ）陽性選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列（このヌクレオチド配列は、レコンビナーゼによって認識される部位（たとえば、ｌｏｘＰ部位（同一の配向に配置される２つの部位））を規定するさらに２つの配列を含む）；および（ｃ）ＰＧ−３ゲノム配列に含まれ、かつ第１のＰＧ−３ヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノムに位置される第２のヌクレオチド配列を含む。
【０１５３】
レコンビナーゼによって認識される部位（たとえば、ｌｏｘＰ部位）を規定する配列は、好ましくは、条件付き切出しが要求されるヌクレオチド配列に隣接する適切な位置でヌクレオチド配列（ｂ）内に位置される。１つの特定の実施形態において、相同組換え事象の発生後、ヌクレオチド配列の所望の時期での切出しを可能にするために、２つのｌｏｘＰ部位は、陽性選択マーカー配列の各側に位置される。
【０１５４】
前記第３のＤＮＡ構築物を用いる方法の好ましい実施形態において、レコンビナーゼによって認識される２つの部位、好ましくは２つのｌｏｘＰ部位に隣接するポリヌクレオチドフラグメントの切出しは、プロモーター配列、好ましくは誘導性プロモーター、より好ましくは組織特異的プロモーター配列およびもっとも好ましくは、たとえば、Guら（1994）によって記載される誘導性および組織特異的の両方であるプロモーター配列に作動可能に連結されるＣｒｅ酵素をコードする配列が組換え宿主細胞のゲノム内に存在するため、所望の時期に実施される。
【０１５５】
組換え細胞宿主のゲノム内のＣｒｅ酵素の存在は、前記のｌｏｘＰ部位を含む目的のＰＧ−３誘導配列を保有する第１のトランスジェニック動物およびたとえば、Ｇｕら（1994）によって記載される適切なプロモーター配列に作動可能に連結されるＣｒｅコード配列を保有する第２のトランスジェニック動物の２つのトランスジェニック動物の繁殖から生じ得る。
【０１５６】
Ｃｒｅ酵素発現の空間−時間的コントロールはまた、たとえば、Antonら（1995）およびKanegaeら（1995）によって記載されるように、Ｃｒｅ遺伝子を含むアデノウイルスベースのベクターを用いて達成され得、したがって、Ｃｒｅ酵素の送達のための、細胞のインフェクションまたは器官のインビボインフェクションを可能にする。
【０１５７】
前記ＤＮＡ構築物を用いて、本発明の標的ゲノムの所定の位置内に、所望のヌクレオチド配列、好ましくはＰＧ−３ゲノム配列またはＰＧ−３ｃＤＮＡ配列、およびもっとも好ましくはＰＧ−３ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の変更された複製物が導入され得、標的とされた遺伝子の変更された複製物の生成（ノックアウト相同組換え）、または相同組換え事象を起こすのに充分相同な別の複製物による標的とされた遺伝子の複製物の置換（ノックイン相同組換え）のいずれかを導く。特定の実施形態において、前記ＤＮＡ構築物を用いて、本発明の少なくとも１つの二対立遺伝子マーカー、好ましくはＡ１〜Ａ８０からなる群から選択される少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーを含むＰＧ−３ゲノム配列またはＰＧ−３ｃＤＮＡ配列が導入され得る。
【０１５８】
（核アンチセンスＤＮＡ構築物）
その他の組成物は、対応のＰＧ−３遺伝子の発現を阻害するアンチセンス手段として、配列番号２の核酸配列のオリゴヌクレオチドフラグメント、好ましくはＰＧ−３遺伝子の開始コドンを含むフラグメントを含む本発明のベクターを含む。本発明にしたがうアンチセンスポリヌクレオチドを用いる好ましい方法は、「アンチセンスアプローチ」と題される節において説明される。
【０１５９】
８）オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー
ＰＧ−３遺伝子由来のポリヌクレオチドは、試験試料において、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、相補鎖もしくは改変体の少なくとも１つの複製物の存在を検出するために有用である。
【０１６０】
ａ）構造的定義
本発明のとくに好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号１の以下のヌクレオチド位置を含む：１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−２４０８２５）またはその相補鎖を含む、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドがあげられる。本発明のさらなる好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号１の以下のヌクレオチド位置を含む：１−１００００、１０００１−２００００、２０００１−３００００、３０００１−４００００、４０００１−５００００、５０００１−６００００、６０００１−７００００、７０００１−８００００、８０００１−９００００、９０００１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−１５９０００、１５９００１−１６００００、１６０００１−１７００００、１７０００１−１８００００、１８０００１−１９００００、１９０００１−２０００００、２００００１−２１００００、２１０００１−２２００００、２２０００１−２３００００、２３０００１−２４０８２５）またはその相補鎖を含む、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドがあげられる。
【０１６１】
本発明の別の目的は、配列番号２のヌクレオチド配列、それに相補的な配列、ならびにそれらの対立遺伝子改変体およびフラグメントを含む、精製、単離または組換えられた核酸である。さらに、本発明の好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号２の配列からなる、配列番号２の配列から本質的になる、または配列番号２の配列を含む、精製、単離または組換えられたＰＧ−３ｃＤＮＡがあげられる。本発明のとくに好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号２の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖を含む、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドがあげられる。本発明のさらなる好ましい実施形態としては、配列番号２の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号２の以下のヌクレオチド位置を含む：１−５００、５０１−１０００、１００１−１５００、１５０１−２０００、２００１−２５００、２５０１−３０００、３００１−３５００、３５０１−３８０９）またはその相補鎖を含むプローブおよびプライマーがあげられる。
【０１６２】
したがって、本発明はまた、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−２４０８２５、またはその改変体もしくはそれらに相補的な配列からなる群から選択される核酸と特異的にハイブリダイズすることを特徴とする核酸プローブに関する。本発明は、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２の核酸またはそれらの改変体もしくはフラグメントあるいはそれらに相補的な配列と特異的にハイブリダイズすることを特徴とする核酸プローブに関する。
【０１６３】
１つの実施態様において、本発明は、配列番号１および２のいずれか１つの、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチド長の連続した範囲からなる、またはこの連続した範囲から本質的になる、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチド、およびそれらの相補鎖を包含する。ここで、前記範囲は、前記配列にＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含む；任意に、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびその相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにその相補鎖からなる群から選択され、または任意にそれらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７、ならびにその相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記連続した範囲が、１８〜３５ヌクレオチド長であり、そして二対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの中心から４ヌクレオチドの範囲内にある；任意に、前記ポリヌクレオチドは、前記連続した範囲を含み、前記連続した範囲から本質的になり、または前記連続した範囲からなり、そして、前記連続した範囲は２５ヌクレオチド長であり、そして前記二対立遺伝子マーカーは前記ポリヌクレオチドの中心にある；任意に、前記連続した範囲の３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在する；ならびに任意には、前記連続した範囲の３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置され、そして前記二対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。好ましい実施態様において、前記プローブは、以下の配列：Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０ならびにそれに相補的な配列から選択される配列を含む、これらの配列からなる、またはこれらの配列から本質的になる。
【０１６４】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１および２の、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチド長の連続した範囲を含む、この連続した範囲からなる、またはこの連続した範囲から本質的になる、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチド、またはそれらの相補鎖を包含する。ここで、この連続した範囲の３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置される。ここで、前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの上流の２０ヌクレオチドの範囲内に位置される；任意に、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０、およびその相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、またはそれらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列のＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの上流の１ヌクレオチドの範囲内に位置される；ならびに任意に、ここで、前記ポリヌクレオチドは、以下の配列から選択される配列から本質的になる：Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０。
【０１６５】
さらなる実施形態において、本発明は、以下の配列から選択される配列を含む、これらの配列からなる、またはこれらの配列から本質的になる、単離、精製または組換えられたポリヌクレオチドを包含する：Ｂ１〜Ｂ５２およびＣ１〜Ｃ５２。
【０１６６】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１および２において、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、および酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおいて用いるポリヌクレオチド、ならびに配列番号１および２において、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅させる際に用いるポリヌクレオチドを包含する；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである。
【０１６７】
本発明は、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するために、好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロ配列決定アッセイまたは酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおける、およびＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントの増幅における、本発明にしたがうポリヌクレオチドの使用に関する。
【０１６８】
ｂ）プライマーおよびプローブの設計
本発明にしたがうプローブまたはプライマーは、８〜１０００ヌクレオチド長を有するか、または少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００もしくは１０００ヌクレオチド長と特定される。とくに、これらのプローブおよびプライマーの長さは、８、１０、１５、２０または３０から１００ヌクレオチドまで、好ましくは１０から５０まで、より好ましくは１５から３０ヌクレオチドまでの範囲であり得る。短いプローブおよびプライマーは、標的とされる核酸配列に対する特異性が消失し、そして、より一般的には、鋳型と充分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに低い温度を必要とする傾向がある。長いプローブおよびプライマーは製造するのが高価であり、そして、ときどき、セルフハイブリダイズし、ヘアピン構造を形成する。特定の設定のアッセイ条件下でのプライマーおよびプローブに適切な長さは、当業者に経験的に決定され得る。安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）に依存する。このＴｍは、プライマーまたはプローブの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含量に依存する。プライマーまたはプローブのＧ＋Ｃ含量が高くなれば、融解温度も高くなる。なぜなら、Ａ：Ｔ対は２つのみのＨ結合を有するのに対して、Ｇ：Ｃ対は３つのＨ結合によって維持されるからである。本発明のプローブにおけるＧＣ含量は、通常１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、およびより好ましくは４０〜５５％の範囲である。
【０１６９】
増幅の目的のために、ほぼ同じＴｍを有するプライマーの対が好ましい。プライマーは、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量および融解温度に基づいて、ＯＳＰソフトウェア（HillerおよびGreen、1991（この文献の開示は、その全体が参考として援用される））を用いて、またはオクタマー頻度不一致法（octamer frequency disparity method）（Griffaisら、1991（この文献の開示は、その全体が参考として援用される））に基づいて、ＰＣ−Ｒａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＰＣ−Ｒａｒｅ／ｄｏｃ／ｍａｎｕｅｌ．ｈｔｍｌ）を用いて設計され得る。ＤＮＡ増幅技術は当業者に周知である。本発明との関係で用いられ得る増幅技術としては、欧州特許出願公開第３２０  ３０８号明細書、国際公開第  ９３／２０２２７号パンフレットおよび欧州特許出願公開第４３９  １８２号明細書に記載されるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）およびGuatelliら（1990）およびCompton（1991）に記載される核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、欧州特許出願番号第４５４４６１０号明細書に記載のＱ−β増幅、Walkerら（1996）および欧州特許出願公開第６８４  ３１５号明細書に記載の鎖置換増幅、ならびに国際公開第  ９３／２２４６１号パンフレットに記載の標的触媒増幅があげられるが、これらに限定されない（これらの文献の開示は、その全体が参考として援用される）。
【０１７０】
好ましいプローブまたはプライマーは、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０のヌクレオチド配列ならびにそれらに相補的な配列、Ｂ１〜Ｂ５２、Ｃ１〜Ｃ５２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０（配列表におけるそれぞれの位置は表１、２および３に示される）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む核酸からなる。
【０１７１】
ｃ）プライマーおよびプローブの調製
プライマーおよびプローブは、たとえば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびに、Narangら（1979）のホスホジエステル法、Brownら（1979）のホスホジエステル法、Beaucageら（1981）（これらの文献の開示は、その全体が参考として援用される）のジエチルホスホラミダイト法および欧州特許第０７０７５９２号明細書に記載の固体支持体法などの方法による直接的化学合成を含む任意の適切な方法によって調製され得る。
【０１７２】
検出プローブは、一般的に、核酸配列または非荷電の核酸アナログ（たとえば、国際公開第  ９２／２０７０２号パンフレットに記載されるペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号明細書；同第５，０３４，５０６号明細書および同第５，１４２，０４７号明細書に記載されるモルホリノアナログ（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））である。プローブは、さらなるｄＮＴＰがプローブに付加され得ないので、「伸張不可能」にされるべきであり得る。プローブ自体において、アナログは通常伸張不可能であり、そして核酸プローブは、ヒドロキシル基がもはや伸張に関与し得ないように、プローブの３’末端を修飾することによって伸張不可能にされ得る。たとえば、プローブの３’末端は、捕獲または検出標識により機能的にされ得、その結果、ヒドロキシル基が確保され、そうでなければヒドロキシル基が妨害される。代替的に、３’ヒドロキシル基は、簡単に、切断、置換または修飾され得る。１９９３年４月１９日に出願された米国特許出願番号第０７／０４９，０６１号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）には、プローブを伸張不可能にするために用いられ得る修飾物が記載されている。
【０１７３】
ｄ）プローブの標識化
本発明のポリヌクレオチドのいずれかは、所望の場合、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段によって検出される当該分野で公知の任意の標識を取り込むことによって標識され得る。たとえば、有用な標識としては、放射活性物質（32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、125Ｉを含む）、蛍光色素（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニンを含む）またはビオチンがあげられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、それらの３’末端および５’末端において標識される。核酸フラグメントの非放射活性標識の例は、仏国特許第ＦＲ−７８１０９７５号明細書またはUrdeaら（1988）もしくはSanchez-Pescadorら（1988）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される。さらに、本発明にしたがうプローブは、そのプローブがシグナル増幅を可能にするような構造的特徴を有し得る。この構造的特徴は、たとえば、Urdeaら（1991）または欧州特許第０  ２２５  ８０７号明細書（Chiron）（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される分枝ＤＮＡプローブである。
【０１７４】
検出可能なプローブは、１本鎖または２本鎖であり得、そしてインビトロ転写、ニック翻訳またはキナーゼ反応を含む当該分野で公知の技術を用いて作製され得る。標識されたプローブにハイブリダイズし得る配列を含む核酸試料は、標識されたプローブと接触される。試料における核酸が２本鎖である場合、変性後、プローブと接触される。いくつかの適用において、核酸試料は、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などの表面に固定化され得る。核酸試料は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ＲＮＡまたは組織試料を含む種々の起源から得られる核酸を含み得る。
【０１７５】
検出可能なプローブにハイブリダイズし得る核酸の存在を検出するために用いられる方法としては、サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークハイブリダイゼーションなどの周知の技術があげられる。いくつかの適用において、標識されたプローブにハイブリダイズし得る核酸は、発現ベクター、配列決定ベクター、またはインビトロ転写ベクターなどのベクターにクローン化することで、試料におけるハイブリダイズする核酸の特徴付けおよび発現が容易になり得る。たとえば、このような技術を用いて、本明細書中に記載される検出可能なプローブにハイブリダイズし得る、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーにおける配列が単離およびクローン化され得る。
【０１７６】
ｅ）プローブの固定化
標識をまた、プライマーを捕獲するために用いて、固体支持体上への、プライマーまたはプライマー伸張産物（たとえば、増幅ＤＮＡ）のいずれかの固定化を容易にし得る。捕獲標識は、プライマーまたはプローブに結合され、そして、固相試薬特異的結合成分（たとえば、ビオチンおよびストレプトアビジン）と結合対を形成する特異的結合成分であり得る。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブに保有される標識の型に依存して、標的ＤＮＡを捕獲するか、または検出するために使用され得る。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブ自体が、捕獲標識としての役割を果たすことは、理解される。たとえば、固相試薬結合成分が核酸配列である場合、プライマーまたはプローブの相補的な部分に結合するように選択される。その結果、固相にプライマーまたはプローブが固定化される。ポリヌクレオチドプローブ自体が、結合成分としての役割を果たす場合、当業者は、プローブが標的に相補的でない配列または「テール」を含むことを理解する。ポリヌクレオチドプライマー自体が捕獲標識としての役割を果たす場合、プライマーの少なくとも一部が、固相上で、核酸とハイブリダイズするために自由となる。ＤＮＡ標識技術は、当業者に周知である。
【０１７７】
本発明のプローブは、多くの目的のために有用である。このプローブは、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションにおいて、有意に用いられ得る。プローブはまた、ＰＣＲ増幅産物を検出するために用いられ得る。プローブはまた、他の技術を用いてＰＧ−３遺伝子またはｍＲＮＡにおけるミスマッチを検出するために用いられ得る。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも、固体支持体に慣用的に固定化され得る。固体支持体は重要ではなく、当業者によって選択され得る。したがって、ラテックス粒子、マイクロ粒子、磁気ビーズ、非磁気ビーズ（ポリスチレンビーズを含む）、膜（ニトロセルロースストリップを含む）、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（またはその他の動物）の赤血球細胞およびｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）はすべて適切な例である。固相上に核酸を固定化する適切な方法としては、イオン相互作用、疎水性相互作用、共有相互作用などがあげられる。本明細書中で用いられる場合、固体支持体とは、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶化され得る任意の物質いう。固体支持体は、捕獲試薬を引き付け、そして固定化するといったその固有の能力について選択され得る。代替的に、固相は、捕獲試薬を引き付け、そして固定化する能力を有するさらなるレセプターを保持し得る。さらなるレセプターは、捕獲試薬自体または捕獲試薬に結合される荷電した物質に関して反対に荷電される荷電した物質を含む。なお別の代替的なレセプター分子は、固体支持体上に固定化（固体支持体に結合）され、そして、特定の結合反応を介して捕獲試薬を固定化する能力を有する任意の特定の結合成分であり得る。レセプター分子は、アッセイの実行前またはアッセイの実行中に固体支持体物質への捕獲試薬の直接の結合を可能する。したがって、固相は、プラスチック、誘導プラスチック、磁気または非磁気金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マクロタイターウェル、シート、ビーズ、マイクロ粒子、チップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）および当業者に公知のその他の構造であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、個々に、固体支持体に結合または固定化され得るか、または少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０または２５の別個の本発明のポリヌクレオチドが一組となって、単一の固体支持体に結合または固定化され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドは、１つ以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に結合され得る。
【０１７９】
結果として、本発明はまた、試料中の、配列番号１および２、それらのフラグメント、それらの改変体およびそれらに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の存在を検出する方法に関する。その方法は、以下の工程を包含する：
ａ）アッセイされるべき試料における核酸分子に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る１つまたは複数の核酸プローブを接触させる工程；ならびに
ｂ）前記プローブと前記試料中の核酸分子との間で形成されるハイブリッド複合体を検出する工程。
【０１８０】
本発明はさらに、試料中の、配列番号１および２、そのフラグメント、その改変体およびそれに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子の存在を検出するためのキットに関する。そのキットは以下を含む：
ａ）アッセイされるべき試料における核酸分子に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズし得る１つまたは複数の核酸プローブ；および
ｂ）任意に、ハイブリダイゼーション反応を実施するのに必要な試薬。
【０１８１】
この検出方法およびキットの第１の好ましい実施形態において、前記１つまたは複数の核酸プローブは、検出可能な分子で標識される。前記方法およびキットの第２の好ましい実施形態において、前記１つまたは複数の核酸プローブは、基材上に固定化される。第３の好ましい実施形態において、前記１つまたは複数の核酸プローブは、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０のヌクレオチド配列ならびにそれらに相補的な配列、Ｂ１〜Ｂ５２、Ｃ１〜Ｃ５２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０からなる群から選択される配列、またはＡ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーのいずれかを含む。
【０１８２】
ｆ）オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む基材は、ＰＧ−３遺伝子における標的配列の検出または増幅のいずれかのために用いられ得、そしてまた、ＰＧ−３遺伝子のコード配列または非コード配列における変異を検出するために用いられ得る。
【０１８３】
本明細書中で用いる場合、用語「アレイ」は、遺伝子発現の特定の検出を可能にするのに十分な長さの核酸の１次元、２次元または多次元の配列を意味する。たとえば、アレイは、発現レベルが評価されるべきである遺伝子由来の複数の核酸を含み得る。アレイは、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡ、ＰＧ−３ｃＤＮＡ、それらに相補的な配列またはそれのフラグメントを含み得る。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチド長である。より好ましくは、フラグメントは、少なくとも１００ヌクレオチド長である。なおより好ましくは、フラグメントは、１００を超えるヌクレオチド長である。ある実施形態において、フラグメントは、５００を超えるヌクレオチド長であり得る。
【０１８４】
本明細書中で提供される任意のポリヌクレオチドは、固体支持体上の重複領域において、または無作為な位置に結合され得る。代替的には、本発明のポリヌクレオチドは、規則正しい配列で結合され得る。ここで、各ポリヌクレオチドは、任意の他のポリヌクレオチドの結合部位と重複しない固体支持体の異なる領域に結合される。好ましくは、ポリヌクレオチドのこのような規則正しい配列は、異なる位置が記録され、そしてアッセイ方法の一部としてアクセスされ得る「アドレス可能」に設計される。アドレス可能なポリヌクレオチドアレイは、代表的に、異なる既知の位置における基材の表面に結合される複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチドの正確な位置の知識は、これらの「アドレス可能な」アレイを、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてとくに有用なものとする。当該分野で公知の任意のアドレス可能なアッセイ技術は、本発明のポリヌクレオチドとともに用いられ得る。これらのポリヌクレオチドアレイの１つの特定の実施形態は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）として公知であり、そして、一般的に、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；国際公開第  ９０／１５０７０号パンフレットおよび同第９２／１００９２号パンフレットに記載されている。これらのアレイは、一般的に、機械的合成方法、または写真平板法もしくは固相オリゴヌクレオチド合成の組合わせを組み込む光指向合成方法（Fodorら、1991）を用いて製造され得る。固体支持体上でのオリゴヌクレオチドのアレイの固定化は、「Ｖｅｒｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＶＬＳＩＰＳ（商標））」と一般的に特定される技術の開発によって可能にされる。この技術においては、代表的に、プローブは、チップの固体表面上で高密度アレイにおいて固定化される。ＶＬＳＩＰＳ（商標）技術の例は、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；および同第５，４１２，０８７号明細書ならびに国際公開第  ９０／１５０７０号パンフレット、同第  ９２／１００９２号パンフレットおよび同第  ９５／１１９９５号パンフレット（これらの文献は、光指向合成技術などの技術を通じてオリゴヌクレオチドアレイを形成するための方法を記載する）において提供される。固体支持体上で固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することを目的とする設計された計画において、さらに、提示された計画は、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大化するために、チップ上のオリゴヌクレオチドアレイを規則正しくし、かつ表示するために開発された。このような提示された計画の例は、国際公開第  ９４／１２３０５号パンフレット、同第  ９４／１１５３０号パンフレット、同第  ９７／２９２１２号パンフレットおよび同第  ９７／３１２５６号パンフレットにおいて開示される。
【０１８５】
本発明のオリゴヌクレオチドアレイの別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブマトリクスは、ＰＧ−３遺伝子および好ましくはその調節領域に存在する変異体を検出するために有利に用いられ得る。この特定の目的のために、プローブは、既知の変異（１つまたはいくつかのヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいずれか）を保有する遺伝子にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド配列を有するように特異的に設計される。既知の変異によって、たとえば、Huangら（1996）またはSamsonら（1996）によって用いられる技術にしたがって、同定されるＰＧ−３遺伝子上の変異を意味する。
【０１８６】
ＰＧ−３遺伝子における変異を検出するために用いられ得る別の技術は、高密度ＤＮＡアレイの使用である。高密度ＤＮＡアレイの単位エレメントからなる各オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの特定の部分と一致するように設計される。したがって、標的とされる遺伝子配列の部分に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイを用いて、試料内の標的配列の同一性が決定され、その量が測定され、そして標的配列と試料におけるＰＧ−３遺伝子の配列との間の相違が検出される。４Ｌタイル張りアレイ（4L tiled array）といわれる１つのこのような設計において、４つのプローブの組（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）、好ましくは１５ヌクレオチドオリゴマーが使用される。４つのプローブの各組において、完璧な相補鎖は、ミスマッチのプローブよりも強力にハイブリダイズする。結果として、長さＬの核酸標的は、４Ｌプローブを含むタイル張りアレイを用いて変異についてスキャンされる。全プローブ組は、既知の配列において可能な変異の全てを含む。１５マーのプローブ組タイル張りアレイのハイブリダイゼーションシグナルは、標的配列における単一の塩基変化によって混乱される。結果として、シグナルの特徴的な損失、または変異位置に隣接するプローブについての「足跡」がある。この技術はCheeら（1996）によって記載される。
【０１８７】
結果として、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド、とくに本明細書中に記載されるプローブまたはプライマーを含む核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明は、本発明の少なくとも２つのポリヌクレオチド、とくに本明細書中に記載されるプローブまたはプライマーを含む核酸のアレイに関する。好ましくは、本発明は、本発明の少なくとも５つのポリヌクレオチド、とくに本明細書中に記載されるプローブまたはプライマーを含む核酸のアレイに関する。
【０１８８】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号１および２、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらに完全に相補的な配列、およびそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、３５、５０または１００配列を含む、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００または５００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドのアレイである。
【０１８９】
本発明のさらなる目的は、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０、Ｂ１〜Ｂ５２、Ｃ１〜Ｃ５２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０、それらに相補的な配列、それらの、少なくとも８、１０、１２、１５、１８または２０連続したヌクレオチドのそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも１つの配列、またはＡ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーを含む少なくとも１つの配列のいずれかを含む核酸配列のアレイからなる。
【０１９０】
本発明はまた、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０、Ｂ１〜Ｂ５２、Ｃ１〜Ｃ５２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０、それらに相補的な配列、それらの、少なくとも８連続したヌクレオチドのそれらのフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つの配列、またはＡ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーを含む少なくとも２つの配列のいずれかを含む核酸配列のアレイに関する。
【０１９１】
［ＰＧ−３タンパク質およびポリペプチドフラグメント］
用語「ＰＧ−３ポリペプチド」は、本発明のタンパク質およびポリペプチドのすべてを包含するために用いられる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドはまた、本発明の一部を形成する。本発明は、配列番号３の配列からなる、配列番号３の配列から本質的になる、または配列番号３の配列を含む、単離または精製されたＰＧ−３タンパク質を含むヒト由来のＰＧ−３タンパク質を具現化する。とくに、本発明は、配列番号３のアミノ酸位置３０４におけるアルギニン残基またはイソロイシン残基、配列番号３のアミノ酸位置３１４におけるヒスチジン残基またはアスパラギン酸残基、配列番号３のアミノ酸位置６８２におけるスレオニン残基またはアスパラギン残基、配列番号３のアミノ酸位置７６１におけるアラニン残基またはバリン残基、および配列番号３のアミノ酸位置８２８におけるプロリン残基またはセリン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＰＧ−３タンパク質の対立遺伝子改変体に関する。さらに、本発明はまた、配列番号３の位置９１におけるメチオニン残基またはイソロイシン残基、配列番号３の位置３０６におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置４１３におけるプロリン残基またはセリン残基、配列番号３の位置５２８におけるグリシン残基またはアスパラギン残基、配列番号３の位置６１４におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置６７７におけるスレオニン残基またはアスパラギン残基、配列番号３の位置７５６におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置７５８におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置８０９におけるリジン残基またはグルタミン残基、および配列番号３の位置８２１におけるシステイン残基またはアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むＰＧ−３のポリペプチド改変体を包含する。
【０１９２】
［改変体ポリペプチド］
本発明はさらに、対立遺伝子およびスプライス改変体、オルトログ、種相同体によってコードされるＰＧ−３ポリペプチド、ならびに本明細書中に記載されるポリペプチドの誘導体（変異したＰＧ−３タンパク質を含む）を提供する。当該分野で公知の手法は、配列番号３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体、スプライス改変体、オルトログ、および／または種相同体を本明細書中で開示される配列からの情報を用いて得るために用いられ得る。
【０１９３】
本発明はまた、配列番号３のポリペプチドまたはそのフラグメントに対して、少なくとも５０％同一、より好ましくは少なくとも６０％同一、およびなおより好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む、精製、単離または組換えられたポリペプチドを包含する。
【０１９４】
たとえば、本発明の照会アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって、対象ポリペプチド配列が照会アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変更を含み得ることを除いては、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、照会配列に対して同一であることが意図される。換言すると、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを得るために、対象配列において５％（１００のうち５）までのアミノ酸残基が、挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換され得る。
【０１９５】
本発明のさらなるポリペプチドは、前記のポリペプチドに対して、少なくとも９０％類似性、より好ましくは少なくとも９５％類似性、およびなおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％類似性を有するポリペプチドを含む。たとえば、本発明の照会アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％「類似」であるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が照会アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５個までのアミノ酸の変更を含み得ることを除いては、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、照会配列に対して類似（すなわち、同一または等価なアミノ酸残基を含む）であることが意図される。換言すると、照会アミノ酸配列と少なくとも９５％類似であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを得るために、対象配列において５％（１００のうち５）までのアミノ酸残基が、挿入、欠失、または別の等価でないアミノ酸で置換され得る。
【０１９６】
基準アミノ酸配列のこれらの変更は、基準配列における残基間の個々にか、または基準配列内の１つ以上の連続した群においてかのいずれかに散在して、基準アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置またはそれらの末端間のいずれかの位置に存在し得る。照会配列は、配列番号３の全アミノ酸配列または本明細書中に記載される特定の任意のフラグメントであり得る。
【０１９７】
本明細書中に記載される改変体ポリペプチドは、それらが正常な生物学的活性を有するか否かに関係なく本発明に含まれる。これは、特定のポリペプチド分子が、生物学的活性を有さない場合でさえも、当業者には、たとえば、ワクチンとして、または抗体を生成するためのポリペプチドの使用方法がなお公知であるためである。生物学的活性を有さない本発明のポリペプチドのその他の使用としては、とくに、当業者に公知の方法を用いる、エピトープタグとして、エピトープマッピングにおいて、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムでの分子量マーカーとしての使用があげられる。下記のように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために用いられる。これらの抗体は、ＰＧ−３タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、またはＰＧ−３タンパク質機能を向上もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは、酵母ツーハイブリッドシステムにおいて用いられ、本発明にしたがう候補アゴニストおよび候補アンタゴニストでもあるＰＧ−３タンパク質結合タンパク質を「捕獲」し得る（たとえば、Fieldsら、1989（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。
【０１９８】
［本発明のポリペプチドの調製］
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に産生されるポリペプチド、合成的に産生されるポリペプチド、またはこれらの方法の組合わせによって産生されるポリペプチドがあげられる。本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形で提供され、部分的に、または好ましくは実質的に精製されていてもよい。
【０１９９】
結果として、本発明はまた、本発明のポリペプチド、とくに、配列番号１および２の配列によってコードされるポリペプチド、またはそれらのフラグメントを作製する方法、ならびに配列番号３のポリペプチドまたはそのフラグメントを作製する方法を含む。この方法は、先行配列を含む核ポリペプチドを産生するために連続して互いに結合しているアミノ酸を含む。いくつかの実施態様において、これらの方法によって作製されるポリペプチドは、１５０アミノ酸長以下である。他の実施態様において、これらの方法によって作製されるポリペプチドは、１２０アミノ酸長以下である。
【０２００】
［単離］
［天然起源由来］
本発明のＰＧ−３タンパク質は、体液、組織および細胞（ヒトまたは非ヒト動物の、直接単離された細胞または培養された細胞である）を含む天然起源から単離され得る。天然のタンパク質を抽出および精製する方法は当該分野で既知であり、そして、粒子を分解するための界面活性剤またはカオトロピック剤の使用、それにつづく、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、密度にしたがう沈降法、およびゲル電気泳動による微分抽出および微分分離を含む。たとえば、タンパク質を精製するための種々の方法については「Method in Enzymology, Academic Press, 1993」（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野において周知である方法で、本発明のポリペプチド（たとえば、本明細書中に記載されるポリペプチド）に対して指向される抗体を用いて天然起源から精製され得る。
【０２０１】
［組換え起源由来］
好ましくは、本発明のＰＧ−３ポリペプチドは、当該分野で公知の従来の発現方法を用いて、組換え的に産生される。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意の従来の宿主に適切な発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結される。真核細胞宿主系および原核細胞宿主系は、組換えポリペプチドを形成する際に用いられる。ついで、ポリペプチドは、溶解した細胞または培養培地から単離され、そして、その意図される用途に必要な程度に精製される。
【０２０２】
配列番号２に記載されるｃＤＮＡを含む任意のＰＧ−３ポリヌクレオチド、およびその対立遺伝子改変体は、ＰＧ−３ポリペプチドを発現するために用いられ得る。発現されるべきＰＧ−３ポリペプチドをコードする核酸は、従来のクローニング技術を用いて発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結される。発現ベクター内のＰＧ−３挿入物は、ＰＧ−３タンパク質に関する全コード配列またはその一部を含み得る。たとえば、ＰＧ−３誘導挿入物は、配列番号３のＰＧ−３タンパク質の、少なくとも６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードし得る。
【０２０３】
結果として、本発明のさらなる実施態様は、ＰＧ−３ポリペプチド、好ましくは配列番号３のタンパク質を作製する方法であって、
ａ）前記ＰＧ−３ポリペプチドをコードする核酸分子を得る工程（好ましくは、該核酸分子は、配列番号２の配列および配列番号３のポリペプチドをコードする配列からなる群から選択される）；
ｂ）発現ベクターに核酸分子を挿入する工程（このような該核酸分子はプロモーターに作動可能に連結される）；ならびに
ｃ）宿主細胞に発現ベクターを導入する工程（これにより、この宿主細胞はＰＧ−３ポリペプチドを産生する）
を包含する方法である。
【０２０４】
この実施態様の１つの側面において、この方法はさらに、ポリペプチドを単離する工程を包含する。本発明の別の実施態様は、先の段落に記載される方法によって取得可能なポリペプチドである。
【０２０５】
発現ベクターは、当該分野で公知の哺乳動物、酵母、昆虫または細菌発現系である。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ケンブリッジ、マサチューセッツ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラ・ホーヤ、カリホルニア）、Ｐｒｏｍｅｇａ（マジソン、ウィスコンシン）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（サンディエゴ、カリホルニア）を含む種々の供給業者から入手可能である。所望の場合、発現を向上させ、そして適切なタンパク質の折り畳みを容易にするために、コドン文脈および配列のコドン組合わせは、米国特許第５，０８２，７６７号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に説明されるように、発現ベクターが導入される特定の発現生体に対して最適化される。
【０２０６】
１つの実施態様において、ＰＧ−３ｃＤＮＡの全コード配列およびｃＤＮＡのポリＡシグナルを介する３’ＵＴＲは、発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結される。あるいは、ＰＧ−３タンパク質の一部をコードする核酸が開始部位としての役割を果たすメチオニンを欠失する場合、開始メチオニンは、従来の技術を用いて核酸の第１コドンの次に導入され得る。同様に、ＰＧ−３ｃＤＮＡ由来の挿入物が、ポリＡシグナルを欠失する場合、この配列は、ＢｇｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からポリＡシグナルをスプライシングアウトし、そして、ポリＡシグナルを哺乳動物発現ベクターｐＸＴｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込むことによってその構築物に付加され得る。ｐＸｌは、ＬＴＲおよびモロニーマウス肉腫ウイルス由来のｇａｇ遺伝子の一部を含む。この構築物におけるＬＴＲの位置が、効果的で安定なトランスフェクションを可能にする。ベクターは、ヘルペス単純チミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。ＰＧ−３タンパク質またはその一部をコードする核酸は、ＰＧ−３ｃＤＮＡまたはその一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（５’プライマーに組み込まれたＰｓｔＩおよびその対応のｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端のＢｇｌＩＩについての制限エンドヌクレアーゼ配列を含む）を用いて、配列番号２のＰＧ−３ｃＤＮＡを含むベクターからＰＣＲによって得られる。得られたＰＧ−３タンパク質またはその一部をコードする配列が、ポリＡシグナルに関して適切に位置付けられるということを確実にすることに留意する。得られたＰＣＲ反応から得られた精製フラグメントは、ＰｓｔＩを用いて消化され、エキソヌクレアーゼを用いて平滑末端化され、ＢｇｌＩＩを用いて消化され、精製され、そしてポリＡシグナルを含み、かつＢｇｌＩＩで消化されたｐＸＴｌに連結される。
【０２０７】
別の実施態様において、しばしば、分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列（たとえば、多ヒスチジン残基）、または組換え産生中の安定性のための付加的配列をコードする付加的なヌクレオチド配列が、組換えポリヌクレオチドに付加されることが有益である。
【０２０８】
対照としては、ｃＤＮＡ挿入物を欠失する発現ベクターが、宿主細胞または生体に導入される。
【０２０９】
ＰＧ−３発現ベクターのマウスＮＴＨ  ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは、宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する１つの実施態様でしかない。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、カルシウムリン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって達成され得る。このような方法は、たとえば、Davisら（1986）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）などの多くの標準的な研究手引書に記載される。たとえば、発現ベクターは、製品仕様書に説明される条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、グランドアイランド、ニューヨーク）を用いて、マウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞にトランスフェクションされる。陽性トランスフェクション細胞は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ）においてトランスフェクション細胞を増殖させた後に選択される。本発明のポリペプチドが、実際に、組換えベクターを欠失する宿主細胞によって発現され得ることは具体的に考慮される。
【０２１０】
ついで、組換え細胞抽出物、または発現ポリペプチドが分泌される場合は培養培地からのタンパク質は、調製され、タンパク質はゲル電気泳動によって分離される。所望の場合、電気泳動に先立って、タンパク質は硫酸アンモニウム沈殿されるか、または大きさまたは電荷にもとづいて分離される。タンパク質の存在は、クーマシー染色または銀染色などの技術を用いて、または目的のＰＧ−３タンパク質に対する抗体を用いて検出される。クーマシー染色または銀染色技術は、当業者に慣用的である。
【０２１１】
ＰＧ−３タンパク質またはその一部の発現を確認するために、ＰＧ−３タンパク質またはその一部をコードする挿入物を含む発現ベクターを含有する宿主細胞または生体から発現されるタンパク質は、挿入物を含まない発現ベクターを含有する対照細胞または生体から発現されるタンパク質と比較される。対照細胞においては存在しない、発現ベクターを含む細胞からのバンドの存在は、ＰＧ−３ｃＤＮＡが発現されることを示す。一般的に、ＰＧ−３ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質に対応するバンドは、ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームにおけるアミノ酸の数に基づいて予測されるのと近似する移動性を有する。しかし、このバンドは、グリコシル化、ユビキチン化または酵素的切断などの修飾の結果として予測されるのとは異なる移動性を有し得る。
【０２１２】
あるいは、発現されるべきＰＧ−３ポリペプチドはまた、トランスジェニック動物の産物（すなわち、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞によって特徴付けられるトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の構成成分として）でもあり得る。
【０２１３】
本発明のポリペプチドは、微分抽出、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収かつ精製され得る。たとえば、タンパク質を精製するための種々の方法については「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（前出）を参照のこと。もっとも好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために用いられる。ＰＧ−３ポリペプチドの組換え的産生バージョンは、本明細書中で記載される技術または当該分野で公知の他の技術（たとえば、SmithおよびJohnson（1988）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される一工程方法など）を用いて実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野において周知である方法において、本発明のポリペプチド（たとえば、本明細書中に記載されるポリペプチド）に対して指向される抗体を用いて組換え起源から精製され得る。
【０２１４】
好ましくは、組換え的に発現されるＰＧ−３ポリペプチドは、標準的な免疫クロマトグラフィー技術を用いて精製される。このような手法において、目的のタンパク質を含む溶液（たとえば、培養培地または細胞抽出物）は、クロマトグラフィーマトリクスに結合されるタンパク質に対する抗体を保有するカラムに適用される。組換えタンパク質は、免疫クロマトグラフィーカラムに結合される。その後、カラムは、非特異的結合タンパク質を除去するために洗浄される。ついで、特異的結合分泌タンパク質は、標準的技術を用いてカラムから放出され、そして回収される。
【０２１５】
抗体産生が不可能である場合、ＰＧ−３ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントは、キメラポリペプチドを用いる精製スキームに使用するために設計された発現ベクターに組み込まれ得る。このような方策において、ＰＧ−３ｃＤＮＡのコード配列またはそのフラグメントは、キメラの他の半分をコードする遺伝子とインフレームで挿入される。キメラの他の半分は、β−グロブリンまたはニッケル結合ポリペプチドコード配列であり得る。ついで、それに結合されるβ−グロブリンまたはニッケルに対する抗体を有するクロマトグラフィーマトリクスを用いて、キメラタンパク質が精製される。プロテアーゼ切断部位は、β−グロブリン遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドと、ＰＧ−３ｃＤＮＡまたはそのフラグメントとの間に作製され得る。したがって、キメラの２つのポリペプチドは、プロテアーゼ消化によって互いから分離され得る。発現されたＰＧ−３タンパク質またはその一部を特異的に認識し得る抗体は、以下に記載される。
【０２１６】
β−グロブリンキメラを作製する１つの有用な発現ベクターは、ウサギβ−グロブリンをコードするｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ウサギβ−グロブリン遺伝子のイントロンＩＩは、発現された転写のスプライシングが容易であり、そして、構築物に組み込まれるポリアデニル化シグナルは、発現のレベルを増大する。記載されるこれらの技術は、分子生物学の当業者に周知である。標準的な方法は、Davisら（1986）などの方法の教科書に発表されており、そして、その方法の多くは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．またはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である。ポリペプチドは、インビトロ翻訳システム（たとえば、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いる構築物からさらに産生され得る。
【０２１７】
組換え産生手法において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合には、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。したがって、一般的に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核細胞において、翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質については、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合されるというアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
【０２１８】
前記手法はまた、検出可能な表現型の原因である変異ＰＧ−３タンパク質またはその一部を発現するために用いられ得る。
【０２１９】
［化学合成由来］
さらに、本発明のポリペプチド、とくに短いタンパク質フラグメントは、当該分野において公知の技術（たとえば、Creighton, 1983；およびHunkapillerら、1984（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）を用いて化学的に合成され得る。たとえば、本発明のポリペプチド配列のフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用によって合成され得る。カルボキシル末端のアミノ酸がポリビニルベンゼンまたは別の適切な樹脂に結合される方法などのポリペプチドの種々の作製方法は、当業者に公知である。付加されるべきアミノ酸は、そのカルボキシル部分のみが反応できるように、そのアミノ部分および任意の側鎖反応基に保護基を保有する。カルボキシル基は、カルボジイミドまたは別の活性化剤で活性化され、固定化アミノ酸に結合される。保護基の除去の後、サイクルを繰り返すことで、所望の配列からなるポリペプチドが生成される。代替的には、米国特許第５，０４９，６５６号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載の方法が用いられ得る。
【０２２０】
さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、ポリペプチド配列への置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノブチル酸、α−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（たとえば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、）および一般的なアミノ酸アナログがあげられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋回）またはＬ（左旋回）であり得る。
【０２２１】
［修飾］
本発明は、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護（protecting）基／保護（blocking）基による誘導、タンパク質分解性切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドへの連結などによって、翻訳中または翻訳後に示差的に修飾されるポリペプチドを包含する。多数の化学修飾のいずれも、シアノゲンブロミド、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成を含むが、これらに限定されない公知の技術によって実施され得る。
【０２２２】
本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾としては、たとえば、Ｎ結合糖鎖またはＯ結合糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセッシング、化学部分のアミノ酸骨格への結合、Ｎ結合糖鎖またはＯ結合糖鎖の化学修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失があげられる。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単離を可能とするために、検出可能な標識（たとえば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識またはアフィニティ標識）で修飾され得る。
【０２２３】
さらなる利点（たとえば、溶解性、安定性およびポリペプチドの循環時間の上昇、または免疫原性の減少）を与え得る本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体はまた、本発明によって提供される。米国特許第４，１７９，３３７号明細書を参照のこと。誘導化のための化学的部分は選択され得る。米国特許第４，１７９，３３７号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。誘導化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択され得る。ポリペプチドは、分子内の無作為な位置または分子内の所定の位置において修飾され得、そして、１つ、２つ、３つまたはそれより多くの結合化学的部分を含み得る。
【０２２４】
ポリマーは任意の分子量のポリマーであり得、そして、分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、取り扱いまたは製造が容易であるために、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製品において、いくつかの分子が示された分子量よりもいくらか大きいか小さいことを示す）。その他のサイズは、所望の治療プロフィール（たとえば、所望の徐放の持続時間、生物学的活性があれば効能、取り扱いの容易性、抗原性の程度または欠失および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの既知の効果）に依存して用いられ得る。
【０２２５】
ポリエチレングリコール分子（またはその他の化学的部分）は、タンパク質の機能的または抗原性ドメインに対する効果を考慮して、タンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法がある（たとえば、欧州特許第０  ４０１  ３８４号明細書（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）およびMalikら（1992）（トレシルクロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペギル化についての報告）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））。たとえば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介して、アミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離アミノ基を保持するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基があげられ得、；遊離のカルボキシル基を保持するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基があげられ得る。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子を結合する反応性基として用いられ得る。Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が治療目的のために好ましい。
【０２２６】
Ｎ末端において化学的に修飾されたタンパク質がとくに望ましい。その組成物の例証としてポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによる）、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する割合、実施されるべきペグリル化反応の型、および選択されたＮ末端ペグリル化タンパク質を得る方法から選択され得る。Ｎ末端ペグリル化調製物を得る（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグリル化部分から分離する）方法は、ペグリル化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペグリル化物質の精製により得る。Ｎ末端修飾物において化学修飾された選択的なタンパク質は、特定のタンパク質における誘導化に利用可能な第１級アミノ基の異なる型の示差的な反応性（リジン対Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いて、Ｎ末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導が達成される。
【０２２７】
［マルチマー化］
本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度なマルチマー）の状態であり得る。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドのモノマーおよびマルチマー、それらの調製物、およびそれらを含む組成物に関する。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施態様において、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマーまたは少なくともテトラマーである。
【０２２８】
本発明によって包含されるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で用いる場合、用語「ホモマー」とは、配列番号３のアミノ酸に対応するポリペプチド（本明細書中に記載されるこれらのポリペプチドに対応するフラグメント、改変体、スプライス改変体、および融合タンパク質を含む）のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施態様において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施態様において、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（たとえば、同一または異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む）またはホモトリマー（たとえば、同一および／または異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む）である。さらなる実施態様において、本発明のホモマルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマー、または少なくともホモテトラマーである。
【０２２９】
本明細書中において用いられる場合、用語「ヘテロマー」とは、本発明のポリペプチドに加えて、１つ以上の非相同ポリペプチド（すなわち異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施態様において、本発明のマルチマーはへテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施態様において、本発明のヘテロマルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマー、または少なくともヘテロテトラマーである。
【０２３０】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオンおよび／または共有結合の結果であり得、および／または、たとえば、リポソーム形成によって直接連結され得る。したがって、１つの実施態様において、たとえば、ホモダイマーまたはホモトリマーなどの本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドが溶液において互いに接触する場合に形成される。別の実施態様において、たとえば、へテロトリマーまたはヘテロテトラマーなどの本発明のヘテロマルチマーは、本発明のポリペプチドが、溶液において本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における非相同ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。他の実施態様において、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの共有結合、および／または本発明のポリペプチド間の共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリペプチド配列（たとえば、配列表に列挙されている、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれている）に含まれる１つ以上のアミノ酸残基に関与し得る。ある場合には、共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）のポリペプチド内で相互作用するポリペプチド配列内に位置されるシステイン残基間の架橋である。別の場合において、共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。代替的には、このような共有結合は、本発明の融合タンパク質における非相同ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基に関与し得る。
【０２３１】
１つの例においては、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる非相同配列間にある（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。特定の例においては、共有結合は、本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる非相同配列間にある（本明細書中に記載される）。別の特定の例においては、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（たとえば、オステオプロテゲリンなど）由来の非相同ポリペプチド配列間にある（たとえば、国際公開第  ９８／４９３０５号パンフレット（この文献の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。別の実施態様において、本発明の２つ以上のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して結合される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号明細書（参考として本明細書中に援用される）に記載されるそれらのペプチドリンカーがあげられる。ペプチドリンカーによって分けられる本発明の複数のポリペプチドが含まれるタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。
【０２３２】
本発明のマルチマーポリペプチドを調製する別の方法は、ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合される本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、これらのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは、最初、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定された。そして、それ以来、種々の異なるタンパク質において見出されている（Landschulzら、1988）。公知のロイシンジッパーは、天然に存在するペプチドおよびダイマー化またはトリマー化したその誘導体である。本発明の可溶性マルチマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例としては、国際公開第  ９４／１０３０８号パンフレット（参考として本明細書中に援用される）に記載されるロイシンジッパードメインがある。溶液においてダイマー化またはトリマー化されるポリペプチド配列に融合される本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞において発現される。そして、得られた可溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０２３３】
本発明のトリマーポリペプチドは、生物学的活性の増強という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシンジッパー部分は、好ましくは、トリマーを形成する部分である。１つの例は、Hoppeら（1994）および米国特許出願番号第０８／４４６，９２２号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来のその他のポリペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドを調製する際に用いられ得る。別の例において、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相互作用によって結合される。さらなる実施態様において、本発明の結合タンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる非相同ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合される。
【０２３４】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学的技術を用いて生成され得る。たとえば、本発明のマルチマーに含まれるべきことが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。さらに、本発明のマルチマーは、マルチマーに含まれるべきことが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に１つ以上の分子内架橋を形成するために当該分野で公知の技術を用いて生成され得る（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的に修飾され得、そして当該分野で公知の技術は、これらの修飾されたポリペプチドの１つ以上を含むマルチマーを生成するために適用され得る（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。さらに、当該分野で公知の３０の技術が、本発明のマルチマーに含まれるべきことが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。
【０２３５】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子工学技術を用いて生成され得る。１つの実施態様において、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載される融合タンパク質技術または当該分野で公知のその他の技術を用いて組換え的に産生される（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。特定の実施態様において、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードする配列に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を連結し、ついで、本来のＣ末端からＮ末端への逆方向にポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠失する）にさらに連結することによって生成される（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。別の実施態様において、本明細書中に記載される組換え技術または当該分野で公知のその他の技術は、膜貫通ドメイン（または疎水性ペプチドまたはシグナルペプチド）を含み、かつ膜再編成技術よってリポソームに組み込まれ得る本発明の組換えポリペプチドを生成するために適用される（たとえば、米国特許第５，４７８，９２５号明細書（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。
【０２３６】
［変異ポリペプチド］
本発明のＰＧ−３ポリペプチドの特徴を向上または変更するために、タンパク質工学が用いられ得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む新規な変異タンパク質もしくはムテイン、または融合タンパク質が作製され得る。このような修飾ポリペプチドは、たとえば、上昇／低下された生物学的活性または上昇／低下された安定性を示し得る。さらに、これらの修飾ポリペプチドは、少なくとも特定の精製および保存条件下で、対応する天然のポリペプチドよりも高い収率で精製され、かつ上昇した安定性を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、ダイマー、トリマーおよびテトラマーなどのマルチマーとして調製され得る。マルチマー化は、リンカーによって、または非相同タンパク質（たとえば、Ｆｃ領域）を組換え的に介することによって容易にされ得る。
【０２３７】
［Ｎ末端欠失およびＣ末端欠失］
１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な欠失なしに、Ｎ末端またはＣ末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。たとえば、Ronら（1993）は、３個、８個または２７個のＮ末端アミノ酸残基が欠失されている場合でさえも、ヘパリン結合活性を有している修飾ＫＧＦタンパク質を報告した。したがって、本発明は、配列番号３のポリペプチドのアミノ末端から１つ以上の残基が欠失されたポリペプチドを提供する。同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失変異体の多くの例が公知である。たとえば、インターフェロンγは、タンパク質のＣ末端から８１０個のアミノ酸残基を欠失することによって１０倍まで高い活性を示す（たとえば、Dobeliら、1988（その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。したがって、本発明は、配列番号３のポリペプチドのカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、以下に記載するようなアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供する。
【０２３８】
［他の変異］
前記したタンパク質のＮ末端欠失形態およびＣ末端欠失形態に加えて、他の変異体は本発明に含まれる。本発明のＰＧ−３ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能の顕著な影響なしに変化され得ることはまた、当業者によって認識される。配列におけるこのような違いが考慮される場合、活性を決定するタンパク質上の重要部位があることを思い出すべきである。したがって、本発明はさらに、実質的なＰＧ−３ポリペプチド活性を示すＰＧ−３ポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体は、活性に対してあまり影響を及ぼさないように、当該分野で公知の一般的な規則にしたがって選択される欠失、挿入、逆位、繰り返し、および置換を含む。たとえば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する手引書が提供される。
【０２３９】
変化に対するアミノ酸配列の許容を研究するための２つの主な手段がある（Bowieら、1994（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。第１の方法では進化の過程をもとにする。進化において、変異は、自然選択によって容認されるかまたは却下されるかのいずれかである。
【０２４０】
第２の手段では、クローン化された遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸変化を導入するために遺伝子工学を用い、そして、選択またはスクリーニングにより、機能性を維持する配列を同定する。これらの研究は、驚くべきことに、タンパク質がアミノ酸置換に寛容であることを示した。この研究は、アミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置において寛容である可能性があることを示す。たとえば、ほとんどの埋没アミノ酸残基は、非極性側鎖である必要がある。これに対して、表面側鎖の性質は、一般的に、ほとんど保存されない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Bowieら（前出）およびそこで引用される参考文献に記載されている。
【０２４１】
代表的に、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＰｈｅの間での他のものでの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間での置換は、保存的置換として理解される。したがって、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、アナログまたは相同体は、たとえば、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸）で置換されるものである（このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされているアミノ酸残基かどうかは不明である）：または（ii）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの：または（iii）ＰＧ−３ポリペプチドが別の化合物（たとえば、ポリペプチドの半減期を上昇させる化合物（たとえば、ポリエチレングリコール））と融合されるもの：または（iv）さらなるアミノ酸がポリペプチドの前記形態（たとえば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列あるいはポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の前記形態の精製のために用いられる配列）に融合されるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の技術から当業者の範囲内であると考える。
【０２４２】
したがって、本発明のＰＧ−３ポリペプチドは、天然の変異または人工的な変異のいずれかにより１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。示したように、変化は、好ましくは、タンパク質の折り畳みまたは活性に顕著に影響しない保存されたアミノ酸置換などの軽度のものである。以下の群のアミノ酸は、一般的に、等価な変化を示す：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ，Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。
【０２４３】
本発明にしたがう目的の、修飾されたＰＧ−３ペプチド分子の特定の実施態様としては、タンパク質分解に耐性であるペプチド分子、−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が修飾されるペプチド、および−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が（ＣＨ2ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロインベルソ（retro inverso）結合、（ＣＨ2−Ｏ）メチレンオキシ結合、（ＣＨ2−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ2ＣＨ2）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ2）セトメチレン結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ2）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン結合または−ＣＨ＝ＣＨ−結合によって置換されるペプチドがあげられるが、これらに限定されない。本発明はまた、少なくとも１つのペプチド結合が、前記のとおり、修飾されているヒトＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を包含する。
【０２４４】
機能に必須である本発明のＰＧ−３タンパク質におけるアミノ酸は、たとえば、部位特異的変異またはアラニンスキャニング変異などの当該分野で公知の方法によって同定され得る（たとえば、Cunninghamら（1989）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。後者の手法は、分子内の全ての残基に単一のアラニン変異を導入する。ついで、得られる変異体分子は、特定のタンパク質の機能の測定に適切なアッセイを用いて、生物学的活性、好ましくはＰＧ−３生物学的活性について試験される。より少ない凝集などの非常に所望される向上された特徴を有するタンパク質を産生し得る、電荷を持つアミノ酸の、他の電荷または中性のアミノ酸での置換はとくに興味深い。凝集は活性を低下させるだけでなく、薬学的処方物を調製する際にも問題となり得る。なぜなら、凝集体は、免疫原性であり得るからである（たとえば、Pinckardら（1967）；Robbinsら（1987）；およびClelandら（1993）参照）。
【０２４５】
本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つの保存アミノ酸置換であるが、５０個以下の保存アミノ酸置換、４０個以下の保存アミノ酸置換、３０個以下の保存されたアミノ酸置換、および２０個以下の保存アミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるＰＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。少なくとも１つであるが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保存アミノ酸置換を含むＰＧ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドがまた提供される。
【０２４６】
［ポリペプチドフラグメント］
ａ）構造的定義
本発明はさらに、配列番号３のポリペプチドなどの本明細書中に記載のアミノ酸配列のフラグメントに関する。とくに、本発明は、配列番号３の、少なくとも５、６、好ましくは少なくとも８〜１０、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００の連続したアミノ酸を含む、精製、単離および組換えられたポリペプチド、ならびに本発明の他のポリペプチドを具現化する。本発明はまた、配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００アミノ酸の連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０個の、配列番号３の以下のアミノ酸位置を含む：１−１００、１０１−２００、２０１−３００、３０１−４００、４０１−５００、５０１−６００、６０１−７００、７０１−８３５）を含む、単離、精製および組換えられたポリペプチドを具現化する。その他の好ましい実施態様において、アミノ酸の連続した広がりは、アミノ酸の欠失、付加、交換または切断などの変異または機能的変異の部位を含む。
【０２４７】
前記ポリペプチドフラグメントに加えて、さらに好ましいポリペプチドの亜属は、少なくとも６つのアミノ酸を含み、ここで、「少なくとも６」は、６と、以下の配列表のポリペプチド配列を含む本発明のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を示す整数との間の任意の整数と定義される。ポリペプチドのＮ末端位置およびＣ末端位置の点からさらに特定される前記のように、Ｎ末端およびＣ末端位置の点でさらに特定される、少なくとも６アミノ酸長のポリペプチドフラグメントの種がさらに含まれる。しかし、前記の少なくとも６アミノ酸長のポリペプチドフラグメントの全ては、個々の種として本発明に含まれ、そして、Ｎ末端およびＣ末端位置によってとくに特定され得る。すなわち、少なくとも６連続したアミノ酸残基長のフラグメントが配列表または本発明のいずれかの所定のアミノ酸配列上を占有し得る、Ｎ末端およびＣ末端位置のすべての組合わせは、本発明に含まれる。
【０２４８】
本発明はまた、Ｎ末端およびＣ末端位置によって特定される任意のフラグメント種または前記のアミノ酸残基における大きさによって特定される任意のフラグメント亜属の排除を提供する。Ｎ末端およびＣ末端位置によって、または前記のアミノ酸残基における大きさによって特定される多数のフラグメントは、個々の種として排除され得る。
【０２４９】
本発明の前記ポリペプチドフラグメントは、前記の記載を用いてすぐに認識され得、したがって、明細書を不必要に長くしないために単に個々に列記されない。さらに、生物学的活性を有するポリペプチドは本発明の好ましい実施態様であるが、前記フラグメントは生物学的活性を有することを必要としない。なぜなら、これらのフラグメントは、たとえば、免疫アッセイ、エピトープマッピング、エピトープタギングにおいて、ワクチンおよび分子量マーカーとして有用であるからである。前記フラグメントはまた、ポリペプチドの特定の部分に対する抗体を生成させるために用いられ得る。ついで、これらの抗体は、当該分野で周知の免疫アッセイに用いて、ヒト細胞および組織と非ヒト細胞および組織との間の区別がされ得るか、または、生物学的試料における細胞または組織が、本発明のポリペプチドを発現する同じ型の細胞または組織か否かが決定され得る。
【０２５０】
本発明のポリペプチドフラグメントの前記種は、式「ａ〜ｂ」によって代替的に記載され得ることに留意する。ここで、「ａ」は、ポリヌクレオチドのもっともＮ末端位置と同じであり、そして「ｂ」は、ポリヌクレオチドのもっともＣ末端位置と同じである；さらに、ここで、「ａ」は、１と本発明のポリペプチド配列のアミノ酸の数から６を除した数との間の整数と同一であり、そして「ｂ」は、７と本発明のポリペプチド配列のアミノ酸の数との間の整数と同一である；そして、「ａ」は少なくとも６まで「ｂ」よりも少ない整数である。
【０２５１】
ｂ）ドメイン
本発明の好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、本発明のポリペプチドのドメインである。このようなドメインは、最終的には、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、翻訳後修飾部位（たとえば、グリコシル部位、ユビキチン部位）、αヘリックスおよびβシート、コードされたタンパク質の分泌を指向するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（たとえば、ホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位があげられるが、これらに限定されない線状または構造的なモチーフおよびサインを含み得る。このようなドメインには、特定の生物学的活性（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合、タンパク質の分泌、転写調節、酵素活性、基質結合活性など）が存在し得る。
【０２５２】
ドメインは、一般的には、３〜１００アミノ酸からなる大きさである。好ましい実施態様において、ドメインは、６〜２００の任意の整数であるアミノ酸数を含む。ドメインは、本明細書中、とくに「本発明のポリペプチドの調製」と題される節において開示される方法を含む当業者に公知の任意の方法を用いて合成され得る。特定の生物学的活性を有するドメインを作り出すアミノ酸を決定する方法としては、試験されるべき生物学的活性を決定するための変異研究およびアッセイがあげられる。
【０２５３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意のコンピュータ方法を用いて、データベースにおいてモチーフ、ドメインおよび／またはサインについてスキャンされ得る。検索可能なデータベースとしては、Ｐｒｏｓｉｔｅ（Hofmannら、1999；BucherおよびBairoch、1994）、Ｐｆａｍ（Sonnhammerら、1997；Henikoffら、2000；Batemanら、2000）、Ｂｌｏｃｋｓ（Henikoffら、2000）、Ｐｒｉｎｔ（Attwoodら、1996）、Ｐｒｏｄｏｍ（SonnhammerおよびKahn、1994；Corpetら、2000）、Ｓｂａｓｅ（Pongorら、1993；Murvaiら、2000）、Ｓｍａｒｔ（Schultzら、1998）、Ｄａｌｉ／ＦＳＳＰ（HolmおよびSander、1996、1997および1999）、ＨＳＳＰ（SanderおよびSchneider、1991）、ＣＡＴＨ（Orengoら、1997；Pearlら、2000）、ＳＣＯＰ（Murzinら、1995；Lo Conteら、2000）、ＣＯＧ（Tatusovら、1997および2000）、特定のファミリーデータベースおよびその派生物（Nevill-Manningら、1998；Yonaら、1999；Attwoodら、2000）（この文献の各々の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）があげられる。利用可能なデータベースに対する概説として、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（2000）  第２８巻  第１版（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２５４】
結果として、本発明の好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号３のポリペプチドのドメインである。本明細書中で「記載されたＰＧ−３ドメイン」といわれる本発明のＰＧ−３ポリペプチドの好ましいドメインは、配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０、および位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むドメインである。
【０２５５】
したがって、本発明は、配列番号３のポリペプチドの、少なくとも６、好ましくは少なくとも８〜１０、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００アミノ酸の連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０個の、記載されたＰＧ−３ドメインのアミノ酸位置を含む）からなる、これらの連続した範囲から本質的になる、またはこれらの連続した範囲を含む、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号３のポリペプチドの、少なくとも６、好ましくは少なくとも８〜１０、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０または９０アミノ酸の連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、記載されたＰＧ−３ドメイン）を含む、これらの連続した範囲から本質的になる、またはこれらの連続した範囲からなる、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号３のポリペプチドの、記載されたＰＧ−３ドメインを含む、このドメインからなる、またはこのドメインから本質的になる、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。
【０２５６】
この表にとくに記載されない本発明のポリペプチドは、ドメインに属さないと考えられない。これは、これらのポリペプチドがなお、用いられる特定のアルゴリズムによって認識も、検索される特定のデータベースにおいて含まれもし得ないからである。実際には、本発明のポリペプチドのすべてのフラグメント（少なくとも６アミノ酸残基長）は、ドメインであるとして本発明に含まれる。本発明のドメインは、好ましくは、本発明のポリペプチドの６〜２００個のアミノ酸（すなわち、包括的な６〜２００の任意の整数）を含む。また、６の整数と配列表の全長ＰＧ−３配列との間のドメインフラグメントは、本発明に含まれる。６の整数とＰＧ−３ポリペプチドの全長配列との間の配列のすべての組合わせが含まれる。ドメインフラグメントは、本発明のポリペプチドフラグメントについて前記のとおり、連続したアミノ酸残基の数（亜属として）または特定のＮ末端位置およびＣ末端位置（種として）のいずれかによって特定され得る。本発明の多数のドメインフラグメントはまた、同様の様式で排除され得る。
【０２５７】
ｃ）エピトープおよび抗体融合
本発明の好ましい実施態様は、エピトープ保有ポリペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドフラグメントに関する。これらのエピトープは、「抗原性エピトープ」、または「抗原性エピトープ」および「免疫原性エピトープ」の両方であり得る。「免疫原性エピトープ」は、ポリペプチドが免疫原である場合、抗体のインビボでの応答を誘導するタンパク質の一部として定義される。他方で、抗体が結合するポリペプチドの領域は、「抗原性決定基」または「抗原性エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般的に、抗原性エピトープの数よりも少ない（たとえば、Geysenら、1984（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。特定のエピトープは免疫原性であり得ないが、それでもなお有用であることにとくに留意する。なぜなら、抗体は、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方に対して作製され得るからである。
【０２５８】
エピトープは、そのエピトープに対して独特である空間的な配置においてわずか３アミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも６個のこのようなアミノ酸およびより頻繁には、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。好ましい実施態様において、抗原性エピトープは、３〜５０の任意の整数であるアミノ酸数を含む。エピトープとして機能するフラグメントは、任意の慣用的な手段（たとえば、Houghten、1985参照）、さらに米国特許第４，６３１，２１号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）にも記載される手段によって作製され得る。エピトープを作り出すアミノ酸を決定する方法としては、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング（たとえば、Geysenら（1984）；国際公開第  ８４／０３５６４号パンフレット；および同第  ８４／０３５０６号パンフレット（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるＰｅｐｓｃａｎ法）があげられる。別の例は、JamesonおよびWolf（1988）（この参考文献は、その全体が参考として援用される）のアルゴリズムである。たとえば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原分析は、デフォルトパラメータを用いて、コンピュータプログラムＰＲＯＴＥＡＮ（バージョン４．０  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８  Ｓｏｕｔｈ  Ｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により実施され得る。
【０２５９】
配列番号３のＰＧ−３ポリペプチドについてのＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆアルゴリズムによって予期される抗原性エピトープは、以下の位置のアミノ酸を含むフラグメントである：１７〜２９、５２〜６８、１０４〜１２７、１３８〜１４８、１８８〜１９５、１９８〜２１０、２３８〜２５４、２８０〜２９２、３３６〜３４１、３４６〜３８３、３８６〜３９５、４０６〜４２０、４１９〜４３８、４６５〜４７０、４８０〜４９７、５１１〜５２６、５３２〜５４４、５５９〜５７０、５６８〜５８０、５９９〜６０９、６１０〜６１８、６１９〜６２８、６３６〜６４７、６５５〜６６１、７４７〜７５４または７９９〜８０８。本明細書中で用いる場合、用語「ＰＧ−３について記載されたエピトープ」は、前記リストにおいて記載された、すべての好ましいポリヌクレオチドフラグメントをいう。前記列挙された免疫原性エピトープは、特定のアルゴリズムによって最高度の免疫原性を有すると予期されるエピトープを含むアミノ酸残基のみを記載することが指摘される。免疫原性としてとくに記載されない本発明のポリペプチドは、非抗原性であるとは考えられない。これは、これらのポリペプチドがなお、インビボで抗原性であるが、たとえば、用いた特定のアルゴリズムによって単に認識され得ないからである。代替的には、このポリペプチドは、ファージディスプレイなどの方法を用いて、おそらくインビトロで抗原性である。したがって、前記列記ものは単に好ましいエピトープのみを含むアミノ酸残基であるが、完全な表ではない。実際に、本発明のＰＧ−３ポリペプチドのすべてのフラグメント（少なくとも６アミノ酸残基長）は、抗原性エピトープとして有用であるとして本発明に含まれる。他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に類似のアルゴリズムによって、または本明細書中に記載の方法または当該分野で公知の方法を用いて、抗原性応答についてのインビボでの試験によって決定され得る。
【０２６０】
したがって、本発明は、配列番号３の、少なくとも６、好ましくは少なくとも８〜１０、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００アミノ酸の連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、少なくとも１、２、３、５または１０の、ＰＧ−３について記載されたエピトープのアミノ酸位置を含む）からなる、これらの連続した範囲から本質的になる、またはこれらの連続した範囲を含む、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号３の、少なくとも６、好ましくは少なくとも７または８、より好ましくは１０、１２、１５、１８または２０アミノ酸の連続した範囲（ここで、その連続した範囲は、ＰＧ−３について記載されたエピトープである）を含む、これらの連続した範囲から本質的になる、またはこれらの連続した範囲からなる、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。本発明はまた、配列番号３の、ＰＧ−３について記載されたエピトープを含む、このエピトープからなる、またはこのエピトープから本質的になる、単離、精製または組換えられたポリペプチドを包含する。
【０２６１】
本発明のエピトープ保有フラグメントは、好ましくは、本発明のポリペプチドの６〜５０アミノ酸（すなわち、包括的な６〜５０の任意の整数）を含む。また、６の整数と配列表の全長ＰＧ−３配列との間の抗原性フラグメントは、本発明に含まれる。６の整数とＰＧ−３ポリペプチドの全長配列との間の配列のすべての組合わせが含まれる。エピトープ保有フラグメントは、本発明のポリペプチドフラグメントについて、前記のとおり、連続したアミノ酸残基の数（亜属として）または特定のＮ末端位置およびＣ末端位置（種として）のいずれかによって特定され得る。本発明の多数のエピトープ保有フラグメントはまた、同様の様式で排除され得る。
【０２６２】
抗原性エピトープは、たとえば、エピトープを特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するのに有用である（Wilsonら、1984；およびSutcliffeら、1983（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。ついで、抗体は、本明細書中に記載される種々の技術（たとえば、診断技術および組織／細胞同定技術）において、および精製方法（たとえば、免疫アフィニティクロマトグラフィー）において用いられる。
【０２６３】
同様に、免疫原性エピトープを用いて、当該分野で周知の方法（Sutcliffeら、前出；Wilsonら、前出；Chowら、（1985）およびBittleら、（1985）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）にしたがって抗体が誘導され得る。好ましい免疫原性エピトープとしては、天然ＰＧ−３タンパク質があげられる。免疫原性エピトープは、動物系（たとえば、ウサギまたはマウス）に対して、アルブミンなどのキャリアタンパク質とともに存在され得るか、または充分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）場合は、キャリアを有さない。しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピトープは、最低限でも、変性ポリペプチドにおける線状エピトープに結合し得る抗体を惹起するのに充分であることが示されている（たとえば、ウエスタンブロッティングにおいて）。
【０２６４】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、インビボ免疫化、インビトロ免疫化、およびファージディスプレイ法があげられるが、これらに限定されない当該分野で周知の方法にしたがって抗体を誘導するために用いられる。インビボ免疫化を用いる場合、動物は遊離ペプチドを用いて免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、ペプチドの高分子キャリア（たとえば、キーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）または破傷風毒）への結合によってブーストされ得る。たとえば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）などのリンカーを用いて、キャリアに結合され得る。一方、他のポリペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的な結合剤を用いて、キャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は、たとえば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロインドアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内注入および／または皮膚内注入によって、遊離ペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて免疫化される。いくつかのブースター注入は、たとえば、固体表面に吸着した遊離ペプチドを用いてＥＬＩＳＡアッセイによって検出され得る抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、たとえば、約２週間の間隔が必要とされ得る。免疫化動物由来の血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択によって（たとえば、当該分野で周知の方法にしたがう固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出によって）上昇され得る。
【０２６５】
当業者に理解されるように、前記の、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のＰＧ−３ポリペプチドは、非相同ポリペプチド配列に融合され得る。たとえば、本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、完全なドメインとその一部との両方を含むその任意の組合わせ）と融合され、キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製が容易であり、そして上昇したインビボ半減期を示す。これは、たとえば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物イムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（たとえば、欧州特許出願第０，３９４，８２７号明細書；およびTrauneckerら、1988（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。ＩｇＧ部分のためにジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、モノマーポリペプチドまたはそのフラグメント単独よりも結合および他の分子の中和において効率的であり得る（たとえば、Fountoulakisら、1995（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）参照）。前記エピトープをコードする核酸はまた、発現されたポリペプチドの検出および精製を助けるために、エピトープタグとして目的の遺伝子と組換えられ得る。
【０２６６】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、またはコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャッフリング」という）の技術により生成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節するために用いられ得、それにより、ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストが効率的に生じ得る。たとえば、米国特許第５，６０５，７９３号明細書；同第５，８１１，２３８号明細書；同第５，８３４，２５２号明細書；同第５，８３７，４５８号明細書；ならびにPattenら、(1997)；Harayama、(1998)；Hanssonら、(1999)；および、LorenzoおよびBlasco、(1998)（これらの文献の各々は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。１つの実施態様において、本発明のコードポリヌクレオチドの１つ以上の構成成分（モチーフ、セクション、パート、ドメイン、フラグメントなど）、またはそれによってコードされるポリペプチドは、１つ以上の非相同分子の１つ以上の構成成分（モチーフ、セクション、パート、ドメイン、フラグメントなど）と組換えられ得る。
【０２６７】
本発明はさらに、この節において列記されたポリペプチドフラグメントの任意の組合わせを包含する。
【０２６８】
［ＰＧ−３ポリペプチド生物学的活性］
本発明のＰＧ−３ポリペプチドは、ＤＮＡ修復、組換えおよび細胞周期制御に関与する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０、および位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは、本明細書中に記載される生物学的活性のいずれかを有する配列番号３の任意のフラグメントである。
【０２６９】
［マルチマー化］
本発明は、目的のタンパク質のマルチマー化を媒介するための、本発明のＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメント、好ましくはＰＧ−３マルチマー化ドメイン、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０、位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むＰＧ−３フラグメントを用いる組成物および方法に関する。
【０２７０】
マルチマー化ドメインは、生物工学、とくにタンパク質工学のいくつかの分野において有用な手段であることが示されている。ここで、それらのマルチマー化ドメインのホモダイマー化またはヘテロダイマー化を媒介する能力は、いくつかの適用で見出されている。たとえば、Bossletらは、インビトロ診断、とくに生物学的液体の検体の免疫化学的検出および決定のために、一対のロイシンジッパーの使用を記載する（米国特許第５，６４３，７３１号明細書）／Tsoらは、特定の抗体へテロダイマーを産生するためにロイシンジッパーを使用している（米国特許第５，９３２，４４８号明細書）／ロイシンジッパーを用いる可溶性オリゴマータンパク質を調製する方法は、Conradら（米国特許第５，９６５，７１２号明細書）、Ciardelliら（米国特許第５，８３７，８１６号明細書）、Spriggsら（国際公開第  ９４／１０３０８号パンフレット）によって記載されている／ロイシンジッパー形成配列は、Pelletierらによって、生体分子相互作用を検出するためにタンパク質フラグメント補体アッセイにおいて用いられている（国際公開第  ９８／３４１２０号パンフレット）。生物工学におけるそれらの有用性のために、新規なマルチマー化ドメインを単離することに高い関心がある。
【０２７１】
ＰＧ−３、またはＰＧ−３フラグメント、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを含む任意のタンパク質は、当業者に公知のアッセイ（本明細書中に引用された参考文献に開示されたアッセイを含む）のいずれかを用いてアッセイされ得る。
【０２７２】
好ましい実施態様において、本発明は、可溶性マルチマータンパク質を調製するための、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを使用する組成物および方法に関する。この可溶性マルチマータンパク質は、当業者に公知の任意の技術（国際公開第  ９４／１０３０８号パンフレット（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に教示される技術）を用いて目的のタンパク質に融合されるＰＧ−３またはその一部を含む融合タンパク質のマルチマーに存在する。別の好ましい実施態様において、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、米国特許第５，９３２，４４８号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）の教示を用いて二重特異性抗体へテロダイマーを産生するために用いられる。簡潔には、ＰＧ−３またはその一部は、エピトープ結合構成成分に結合される。これに対して、第２のマルチマー化ドメインは、異なる特異性で第２のエピトープ結合構成成分に結合される。第２のマルチマー化ドメインは、同じまたは別のＰＧ−３フラグメントか、非相同マルチマー化ドメインかのいずれかであり得る。二重特異的抗体は、マルチマー化ドメインの、一対の連結によって形成され、２つの異なるエピトープ結合構成成分を結合するヘテロダイマーを形成する。なお別の好ましい実施態様において、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、米国特許第５，６４３，７３１号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、生物学的液体における検体の検出および決定のために用いられる。簡潔には、第１のＰＧ−３メルチマー化ドメインは固体支持体上に固定化され、そして、第２のマルチマー化ドメインは、生物学的液体における検体に対して特異的な結合パートナーに連結される。ついで、２つのペプチドが接触され、それによって、固相上に結合パートナーを固定化する。ついで、生物学的試料は、固定化された結合パートナーと接触され、そして、結合パートナーに結合される試料中の検体量が決定される。第２のマルチマー化ドメインは、同じまたは別のＰＧ−３フラグメントか、非相同マルチマー化ドメインのいずれかであり得る。なお別の好ましい実施態様において、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、たとえば、当業者に公知の任意の遺伝子工学技術（たとえば、米国特許第５，９４２，４３３号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される技術を含む）を用いて、細胞増殖を阻害および／または制御するために、目的のタンパク質とマルチマー化し得る新規な核酸結合タンパク質を合成するために用いられ得る。
【０２７３】
別の実施態様において、本発明は、国際公開第  ９８／３４１２０号パンフレット（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のように、インビボおよびインビトロでの生体分子相互作用を検出するための、タンパク質フラグメント補体アッセイにおける、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを用いる組成物および方法に関する。このようなアッセイを用いて、未知のタンパク質と目的タンパク質の結合に関してｃＤＮＡライブラリーを、または生物学的アッセイに関して低有機分子ライブラリーをスクリーニングするために、分子相互作用（タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−糖およびタンパク質−低分子の相互作用を含む）の均衡および動力学的性質が研究され得る。
【０２７４】
なお、本発明の別の目的は、当業者に公知のタンパク質−タンパク質相互作用を検出する任意の技術を用いて新規なマルチマー化ドメインを同定するための、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントの使用に関する。用いられ得る伝統的な方法としては、細胞溶解物の勾配またはクロマトグラフカラムを介する共免疫沈殿、架橋および共沈殿がある。ＰＧ−３またはその一部と相互作用するタンパク質として、いったん単離されると、このような細胞内タンパク質は同定され（たとえば、そのアミノ酸配列が決定される）、つぎに、それと相互作用するその他のタンパク質を同定するために、標準的な技術とともに用いられ得る。かくして得られるアミノ酸配列は、このような細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために用いられ得る、オリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイドとして用いられ得る。スクリーニングは、たとえば、標準的なハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術によって、達成され得る。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングのための技術は周知である（たとえば、Ausubelら著、Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons（New York，NY  1993）およびPR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M.ら著、Academic Press, Inc., New York）。
【０２７５】
あるいは、ＰＧ−３またはそのフラグメント、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、充分に開発された酵母二重ハイブリダイゼーションシステムにおいて「ベイトタンパク質」として当業者によって用いられ、所定の生体の異なる組織または細胞型由来のｃＤＮＡライブラリーからインビボでその相互作用タンパク質パートナーが同定され得る。代替的には、ＰＧ−３またはそのフラグメント、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、哺乳動物細胞トランスフェクション実験において当業者によって用いられ得る。タンパク質発現ベクターにおいて［Ｈｉｓ］6タグなどの適切なペプチドタグに融合され、そして、培養細胞に導入された場合、この発現された融合タンパク質は、抗タグペプチド抗体を用いることによって、その潜在的な相互作用タンパク質とともに免疫沈澱され得る。この方法は、関連するパートナーの同定か、またはその他の方法（たとえば、本明細書中に記載される方法）によって得られる結果の確認のいずれかのために選択され得る。
【０２７６】
あるいは、当業者に公知の任意の技術を用いてＰＧ−３またはそのフラグメントとダイマー化し得る細胞内タンパク質をコードする遺伝子の同時同定を得る方法が用いられ得る。これらの方法としては、たとえば、ＰＧ−３タンパク質またはその一部の標識化バージョン、あるいは融合タンパク質（たとえば、マーカー（たとえば、酵素、蛍光、発光タンパク質、または色素）に融合されたＰＧ−３もしくはその一部、またはＩｇ−Ｆｃドメイン）をプローブとして用いる、λｇｔ１１ライブラリーの抗体探査の周知の技術と同様の様式でのｃＤＮＡ発現ベクターの探査があげられる（ｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングの詳細な技術については、Ausubelら（前出）参照）。代替的には、インビボでのタンパク質相互作用の検出のための別の方法（ツーハイブリッドシステム）が用いられ得る。
【０２７７】
［転写の調節］
本発明は、遺伝子転写を調節するための、ＰＧ−３ポリペプチドまたはその一部、好ましくは転写調節ドメインを含むフラグメント、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むＰＧ−３フラグメントを用いる組成物および方法に関する。
【０２７８】
ＰＧ−３、またはＰＧ−３フラグメント、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを含む任意のタンパク質の転写調節活性は、当業者に公知のアッセイ（本明細書中で引用される参考文献に開示されるアッセイを含む）のいずれかを用いてアッセイされ得る。このようなアッセイとしては、Hayesら、Cancer Res. 60:2411-2418（2000）およびMiyakeら、J. Biol. Chem. 275:40169-40173（2000）に記載される酵母転写アッセイがあげられる。
【０２７９】
転写因子のこのようなドメインの顕著な性質の１つは、一般的に、広範種々のプロモーターに補強される場合、このようなドメインの非相同タンパク質ドメインへの「融合」が、転写を調節する転写因子の能力に影響を及ぼすことがめったにないということである。これらの調節ドメインによって示される高度な機能独立性は、調節ドメインを、遺伝子発現およびタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用またはタンパク質−低分子薬物相互作用を分析する種々の生物学的アッセイにおいて価値のある手段にする。このような転写調節ドメインの潜在力を向上させ、それによって、その制御下の遺伝子の発現を向上させるいくつかの方策が報告されている。これらの手段は、一般的に、ＤＮＡ結合ドメインに融合される調節ドメインの複製数の増加または調節ドメインの相乗作用を与える組合わせを含む転写調節因子の生成に関与する。
【０２８０】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは転写調節ドメインを含むフラグメント、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを含む新規な転写因子を含有する組成物および方法を提供する。このような転写因子は、目的の標的遺伝子の発現を調節するように設計され得る。本発明の態様は、転写調節ドメインのＤＮＡ結合ドメインへの共有または非共有のいずれかの結合に関与する系に適用可能である。実際には、細胞は、少なくとも２つのお互いに非相同なドメインを含む融合タンパク質をコードする組換え核酸の導入によって操作され得る。そのドメインのうち１つは、本発明の調節ドメインであり、そして、いくつかの場合、その調節ドメインを、標的遺伝子の転写のリガンド依存性調節を可能にするさらなる核酸構築物である。ついで、細胞へのリガンドの投与は、標的遺伝子転写を陽性にまたは陰性に調節する（この実施態様に関連するすべての研究方法は、米国特許第６，０１５，７０９号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に完全に記載される）。本発明の種々の融合タンパク質において、本発明の調節ドメインとともに含まれ得る非相同ドメインの例証（非限定的）としては、別の転写調節ドメイン（すなわち、ｐ６５、ＶＰ１６またはＡＰドメインなどの転写活性化ドメイン）；転写可能ドメインもしくは転写相乗ドメイン；またはｓｓｎ−６／ＴＵＰ−１ドメインもしくはＫｒｕｐｐｅｌファミリー抑制ドメインなどの転写抑制ドメイン；ＧＡＬ４、ｌｅｘ  ＡなどのＤＮＡ結合ドメイン、もしくは合成ジンクフィンガードメインもしくはＺＦＨＤ１ドメインなどの合成ＤＮＡ結合ドメイン；または（ａ）イムノフィリン、シクロフィリンもしくはＦＲＢドメイン；（ｂ）ｔｅｔＲなどの抗体結合ドメイン；もしくは（ｃ）プロゲステロンレセプターもしくはエクジソンレセプターなどのホルモンレセプターを含むまたはこれらから誘導されるリガンド結合ドメインがあげられる。細胞浸透ペプチドに結合するリガンド結合ドメインが好ましいが、広範種々のリガンド結合ドメインが、本発明において用いられ得る。リガンドは、約５ｋＤ未満、より好ましくは２．５ｋＤ未満、および最適には約１５００Ｄ未満の分子量を有することがまた好ましい。非タンパク質様リガンドがまた好ましい。本発明の実施に用いられ得るリガンド結合ドメイン／リガンド対の例としては、ＦＫＢＰ：ＦＫ１０１２、ＦＫＢＰ：合成二価ＦＫＢＰリガンド（国際公開第  ９６／０６０９号パンフレットおよび同第  ９７／３１８９８号パンフレット参照）、ＦＲＢ：ラパマイシン／ＦＫＢＰ（たとえば、国際公開第  ９６／４１８６５号パンフレットおよびRiveraら「A humanized system for pharmacologic control of gene expression」、Nature Medicine 2(9):1028-1032(1997)参照）、シクロフィリン：シクロスポリン（たとえば、国際公開第  ９４／１８３１７号パンフレット参照）、ＤＨＦＲ：メトトレキサート（たとえば、Licitraら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:12817-12821）、ＴｅｔＲ：テトラサイクリンまたはドキシシクリンまたはその他のアナログもしくはそれらの模倣物（GossenおよびBujard、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89：5547；Gossenら、1995、Science 268：1766-1769；Kistnerら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：10933-10938）、プロゲステロンレセプター：ＲＵ４８６（Wangら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91：8180-8184）、エコジソンレセプター：エコジソンまたはムリステロンＡまたはその他のアナログもしくはそれらの模倣物（Noら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：3346-3351)、およびＤＮＡジャイレース：クメルマイシン（たとえば、Farrarら、1996、Nature 383：178-181参照）があげられるが、これらに限定されない。多くの適用において、操作されるべき細胞に非相同であるＤＮＡ結合ドメインを用いることが好ましい。合成ＤＮＡ結合ドメインの場合、操作されるべき細胞または生体に対して内因性である成分ペプチド部分が一般的に好ましい。
【０２８１】
この実施態様の別の側面において、転写調節ドメインをコードするポリヌクレオチドおよびＰＧ３の任意の他の機能的フラグメントは、種々の調節される遺伝子発現系のための融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに導入され得る。この調節される遺伝子発現系は、アロステリックベースの系（たとえば、テトラサイクリン、ＲＵ４８６もしくはエクジソン、またはそれらのアナログもしくは模倣物によって調節される系）、およびジメチル化ベースの系（ＦＫ１０１２、ＦＫＣｓＡ、ラパマイシン、ＡＰ１０５１０もしくはクメルマイシンまたはそれらのアナログもしくは模倣物などの二価化合物によって調節される系）の双方を含む（たとえば、Clackson, Controlling mammalian gene expression with small molecules, Current Opinion in Chem. Biol. 1：210-218（1997）参照）。融合タンパク質は、バンドルドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性（または抑制）ドメインおよびリガンド結合ドメインなどの関連する構成成分の任意の組合わせを含み得る。その他の非相同ドメインもまた含まれ得る。
【０２８２】
本発明の別の実施態様は、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは転写調節ドメインを含むフラグメント、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを用いる発現系、好ましくはベクターおよびベクター含有細胞に関する。この点について、本発明の転写調節ドメインおよびこれらに対して非相同である少なくとも１のさらなるドメインを含む融合タンパク質をコードする組換え核酸が提供される。ここで、前記活性化ドメインのペプチド配列は、それ自体が、最終的に、天然に存在する配列に関連して修飾される。その修飾により、ネイティブなペプチド配列を含む対応物に関連して転写調節因子としてのその可能性の上昇または低下が導かれる。本発明の組換え核酸の各々は、さらに、コード配列に作動可能に連結される発現対照配列を含み得、そして、たとえば、原核生物細胞または真核生物細胞を形質導入する際に用いるためにＤＮＡベクター内に提供され得る。任意の組換え核酸を含む前記のような所定の組成物の組換え核酸のいくつかは、単一のベクター内に存在され得るか、または２つ以上のベクター間に分配され得る。組換え核酸は、たとえば、インビトロで細胞に、またはヒトもしくは非ヒト哺乳動物被験体を含む生体内に存在する細胞に形質導入するために用いられ得る１つ以上の組換えウイルス内に挿入物として提供され得る。非ウイルス性手段（裸ＤＮＡ、リポソームまたはその他の脂質組成物など）は、宿主生体における細胞に本発明の組換え核酸を送達するために用いられ得ることが理解されるべきである。本発明のこれらの組換え核酸または核酸組成物の１つ以上を含む、得られる操作された細胞およびそれらの子孫は、ヒト遺伝子療法、類似の獣医用途、細胞モデルまたは動物モデルの作製（遺伝子組換え用途を含む）およびアッセイ用途を含む種々の重要な用途に用いられ得る。このような細胞は、たとえば、標的遺伝子の発現を調節するために、リガンド、好ましくは細胞浸透リガンドの細胞への付加（またはリガンドの、その細胞を含む生体への投与）に関与する方法において有用である。
【０２８３】
別の実施態様において、本発明は、標的細胞における目的の遺伝子の発現を変更するための、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは転写調節ドメインを含むフラグメント、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントを用いる組成物および方法に関する。このような目的の遺伝子は、当業者に公知の任意の技術（米国特許第５，８６１，４９５号明細書；同第５，８６６，３２５号明細書および同第６，０１３，４５３号明細書に記載の技術を含む）を用いるオンコジーンなどの疾患に関連する遺伝子または病原体（たとえば、細菌またはウイルス）由来の外因性遺伝子であり得る。
【０２８４】
なお別の実施態様において、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは転写調節ドメインを含むフラグメント、より好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のＰＧ−３フラグメントは、遺伝子転写の調節障害に関連する障害（たとえば、ガン）、異常な細胞分化、増殖または変性に関連するその他の障害（アルドステロン症、コルチゾール低下症（アディソン病）、甲状腺機能亢進症（グレーブス病）、甲状腺機能低下症、大腸ポリープ、胃炎、胃十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、およびクローン病を含む）を診断、処置および/または予防するために用いられ得る。
【０２８５】
［ＤＮＡ修復活性］
本発明は、ＤＮＡの崩壊を修復するための、本発明のＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメント、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むＰＧ−３フラグメントを用いる組成物および方法に関する。
【０２８６】
１つの実施態様において、細胞株は、ＰＧ−３またはその一部、好ましくは配列番号３の位置３〜８７、位置６４２〜７３０もしくは位置７５３〜８３３のアミノ酸を含むＰＧ−３フラグメントを過剰発現するために、当業者に周知の遺伝子工学技術を用いて遺伝的に操作され得る。任意には、このような細胞株は、ＤＮＡの損傷を修復し得るタンパク質に融合されたＰＧ−３またはその一部を含む融合タンパク質を過剰に発現するために操作され得る。本発明において用いるための例示的なＤＮＡ修復タンパク質としては、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路由来のＤＮＡ修復タンパク質（たとえば、ヒトＡＰＥ（ｈＡＰＥ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８０２６１）などのＡＰエンドヌクレアーゼ、およびＡＰＮ−１のような細菌または酵母関連タンパク質（たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ３３６２５およびＭ３３６６７）、エキソヌクレアーゼIII（ＥｘｏIII、ｘｔｈ遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２２５９２）、細菌エンドヌクレアーゼIII（ＥｎｄｏIII、ｎｔｈ遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ０２８５７）、ｈｕＥｎｄｏIII（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ７９７１８）、およびエンドヌクレアーゼIV（ＥｎｄｏIV  ｎｆｏ遺伝子  Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２２５９１））があげられる。本発明に用いるのに適切なさらなるＢＥＲタンパク質としては、たとえば、ＤＮＡグリコシラーゼ（たとえば、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ０６０３６）、ヒト３−アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＨＡＡＧ（ヒトメチルプリン−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＭＰＧ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ７４９０５）としてもまた公知である））、ＮＴＧ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３１３７８または１７１８６０）、ＳＣＲ−１（ＹＡＬ０１５Ｃ）、ＳＣＲ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＹＯＬ０４３Ｃ）、ＤＮＡリガーゼＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３６０６７）、β−ポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１３１４０（ヒト））および８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１  Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４４８５５（酵母）；Ｙ１３４７９（マウス）；Ｙ１１７３１（ヒト））があげられる。直接逆経路（direct reversal pathway）由来の本発明において用いるためのタンパク質としては、ヒトＭＧＭＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２９９７１）およびその他の類似のタンパク質があげられる。
【０２８７】
このような細胞株は、高レベルのＤＮＡ修復活性を示し、そして、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ崩壊を誘導する発癌物質により耐性である。したがって、このような細胞株は、発癌物質および薬物を試験するための関心のあるモデルを提供する。
【０２８８】
［本発明のＰＧ−３ポリペプチドを結合する抗体］
［定義］
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に、および本発明のポリペプチドのエピトープにより特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭおよびＩｇＹがあげられる。用語「抗体（Ａｂ）」とは、少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチドの群をいう。ここで、結合ドメインは、抗原と免疫学的反応を可能にする抗原の抗原決定基の性質に相補的な内部表面の形状および電荷分布を有する３次元結合空間を形成するために、抗体分子の可変ドメインの折り畳みにより形成される。本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、一本鎖抗体全体、およびその抗原結合フラグメントを含む抗体全体を含むことを意味する。好ましい実施態様において、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶLドメインまたはＶHドメインのいずれかを含むフラグメントがあげられるが、これらに限定されない。抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ由来である。
【０２８９】
一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域単独または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全体または一部の組合わせを含み得る。可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組合わせはまた、本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する、キメラ、ヒト化、およびヒトモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０２９０】
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的および三重特異的であり得、または、より高度に多重特異性を有する。多重特異的抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または、本発明のポリペプチドおよび非相同構成成分（たとえば、非相同ポリペプチドまたは固体支持体物質）の双方に特異的であり得る。たとえば、国際公開第  ９３／１７７１５号パンフレット；同第  ９２／０８８０２号パンフレット；同第  ９１／００３６０号パンフレット；同第  ９２／０５７９３号パンフレット；Tuttら（1991）；米国特許第５，５７３，９２０号明細書、同第４，４７４，８９３号明細書、同第５，６０１，８１９号明細書、同第４，７１４，６８１号明細書、同第４，９２５，６４８号明細書；Kostelnyら（1992）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２９１】
本発明の抗体は、抗体によって認識または特異的に結合される本発明のポリペプチドのエピトープまたはエピトープ保有部分について説明または特定され得る。この抗体は、本発明の核酸によってコードされる完全なタンパク質、またはそのフラグメントを特異的に結合し得る。したがって、エピトープまたはエピトープ保有ポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、たとえば、Ｎ末端部分およびＣ末端部分によって、連続したアミノ酸残基の大きさによって、または本明細書中に記載されるその他（配列表を含む）によって特定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた、個々の種として排除され得る。したがって、本発明としては、本発明の特定されたポリペプチドを特異的に結合する抗体があげられる。そして、この同じ抗体の排除を可能にする。
【０２９２】
したがって、本発明の別の実施態様は、配列番号３の配列を含むポリペプチドに特異的に結合し得る、精製または単離された抗体である。この実施態様の１つの態様において、抗体は、配列番号３の、少なくとも６個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００個の連続したアミノ酸を含むエピトープ含有ポリペプチドに結合し得る。
【０２９３】
本発明の抗体はまた、それらの交差反応性について記載または特定され得る。本発明のポリペプチドの任意のその他のアナログ、オルトログまたはホモログを特異的に結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに（当該分野で公知の方法を用いて、たとえば、ＦＡＳＴＤＢおよび本明細書中に示されたパラメータを用いて算出されるように）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性を有するポリペプチドを結合しない抗体がまた本発明に含まれる。（本明細書中に記載されるような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリペプチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみを結合する抗体がさらに、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、それらの結合アフィニティについて記載または特定され得る。好ましい結合アフィニティとしては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍおよび１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有するアフィニティがあげられる。
【０２９４】
任意のＰＧ−３ポリペプチドまたはタンパク質全体は、記載されるように発現されるＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合し得る抗体を生成するために用いられ得る。
【０２９５】
本発明の１つの抗体組成物は、配列番号３のＰＧ−３タンパク質に特異的に結合し得る。ＰＧ−３タンパク質に特異的に結合する抗体組成物に関して、ＰＧ−３タンパク質について、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはその他の抗体ベースの結合アッセイにおいて別のタンパク質についての結合アフィニティよりも、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％または１００％を超える結合アフィニティを実証しなければならない。
【０２９６】
本発明はまた、ＰＧ−３タンパク質の改変体、とくに、配列番号３の位置９１におけるメチオニン残基またはイソロイシン残基、配列番号３の位置３０６におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置４１３におけるプロリン残基またはセリン残基、配列番号３の位置５２８におけるグリシン残基またはアスパラギン残基、配列番号３の位置６１４におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置６７７におけるスレオニン残基またはアスパラギン残基、配列番号３の位置７５６におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置７５８におけるバリン残基またはアラニン残基、配列番号３の位置８０９におけるリジン残基またはグルタミン酸残基、および配列番号３の位置８２１におけるシステイン残基またはアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む改変体に特異的な抗体組成物に関する。より好ましくは、本発明は、ＰＧ−３タンパク質の対立遺伝子改変体、とくに、配列番号３のアミノ酸位置３０４におけるアルギニン残基またはイソロイシン残基、配列番号３のアミノ酸位置３１４におけるヒスチジン残基またはアスパラギン酸残基、配列番号３のアミノ酸位置６８２におけるスレオニン残基またはアスパラギン残基、配列番号３のアミノ酸位置７６１におけるアラニン残基またはバリン残基および配列番号３のアミノ酸位置８２８におけるプロリン残基またはセリン残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む改変体に特異的な抗体組成物を包含する。
【０２９７】
好ましい実施態様において、本発明は、配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは１００アミノ酸の連続した範囲を含むエピトープ（好ましくは、このエピトープは、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号３の以下のアミノ酸位置を含む：１−１００、１０１−２００、２０１−３００、３０１−４００、４０１−５００、５０１−６００、６０１−７００、７０１−８３５）含有ポリペプチドに選択的に結合し得る、またはこのポリペプチドに選択的に結合するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体組成物に関する。
【０２９８】
本発明はまた、変異ＰＧ−３タンパク質のエピトープを含む、変異ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体に特異的に結合し得る、精製または単離された抗体に関する。別の好ましい実施態様において、本発明は、ＰＧ−３タンパク質の少なくとも１０個連続したアミノ酸を含み、かつ形質の原因となる変異によってコードされ得る少なくとも１つのアミノ酸を含むポリペプチドに結合し得る抗体に関する。
【０２９９】
好ましい実施態様において、本発明は、配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０または１００アミノ酸の連続した範囲（好ましくは、前記連続した範囲が、少なくとも１、２、３、５または１０の、配列番号３の以下のアミノ酸位置を含む：１−１００、１０１−２００、２０１−３００、３０１−４００、４０１−５００、５０１−６００、６０１−７００、７０１−８３５）を含むポリペプチドの抗体の作製における使用に関する。
【０３００】
本発明の抗体は、当該分野で公知の放射活性標識、蛍光標識または酵素標識のいずれか１つを用いて標識され得る。
【０３０１】
結果として、本発明はまた、生物学的試料において、本発明にしたがうＰＧ−３ポリペプチドの存在を特異的に検出する方法に関する。この方法は、以下の工程：
ａ）生物学的試料を、配列番号３のアミノ酸配列を含むＰＧ−３ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と接触させる工程；および
ｂ）形成された抗原−抗体複合体を検出する工程、
を包含する。
【０３０２】
本発明はまた、インビトロで、生物学的試料において、本発明にしたがうＰＧ−３ポリペプチドの存在を検出するための診断キットに関する。このキットは、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＰＧ−３ポリペプチド、またはそのペプチドフラグメントもしくはそれらの改変体に特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体；任意に、抗体は標識され得る；および
ｂ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、任意に、標識を保持するか、または標識された試薬によってそれ自体が認識され得る試薬（とくに、前記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体自体が標識されない場合）
を含む。
【０３０３】
［抗体の調製］
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。これらの方法のいくつかは、「ＰＧ−３タンパク質に対する抗体組成物の調製」と題された実施例により詳細に記載される。たとえば、本発明のポリペプチドまたはそれらの抗原性フラグメントは、「ポリクローナル抗体」を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。本明細書中で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体に限定されないが、より正確には、真核クローン、原核クローンまたはファージクローンを含む単一クローン由来の抗体をいい、それらを産生する方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術の使用を含む当該分野で公知の広範種々の技術を用いて調製され得る。
【０３０４】
ハイブリドーマ技術としては、当該分野で公知の技術があげられる（たとえば、Harlowら、1988；Hammerlingら、1981（この文献は、その全体が参考として援用される）参照）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、たとえば、酵素（たとえば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する））を用いるタンパク質分解性切断によってハイブリドーマ産生抗体から産生され得る。
【０３０５】
あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を用いる組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学を通じて産生され得る。たとえば、本発明の抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて調製され得る。ファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインは、この抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に表示される。所望の結合特性を有するファージは、抗原、代表的には、固体表面またはビーズに結合または捕獲された抗原を用いて直接選択することによって、レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（たとえば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的に、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子IIIタンパク質のいずれかに組換え的に融合されるＦａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｂおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら、(1995)；Amesら、(1995)；Kettleboroughら、(1994)；Persicら、(1997)；Burtonら、(1994)；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際公開第  ９０／０２８０９号パンフレット；同第  ９１／１０７３７号パンフレット；同第  ９２／０１０４７号パンフレット；同第  ９２／１８６１９号パンフレット；同第  ９３／１１２３６号パンフレット；同第  ９５／１５９８２号パンフレット；同第  ９５／２０４０１号パンフレット；および米国特許第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書および同第５，７３３，７４３号明細書（これらの文献は、その全体が参考として援用される）に開示の方法があげられる。
【０３０６】
前記文献に記載のように、ファージ選択の後、ファージ由来の抗体コード領域は、抗体全体（ヒト抗体を含む）または任意のその他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離および用いられ得、そして任意の所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む）において発現される。たとえば、当該分野で公知の方法（たとえば、国際公開第  ９２／２２３２４号パンフレット; Mullinaxら、(1992)；およびSawaiら、(1995)；およびBetterら(1988)（これらの文献は、その全体が参考として援用される）に開示される方法）を用いるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生する技術がまた、使用され得る。
【０３０７】
一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および同第５，２５８，４９８号明細書；Hustonら、(1991)；Shuら、(1993)；およびSkerraら(1988)（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載される技術があげられる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途について、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いることが好ましくあり得る。キメラ抗体を産生する方法は当該分野で公知である。たとえば、Morrison、(1985)；Oiら、(1986)；Gilliesら、(1989)；および米国特許第５，８０７，７１５号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。抗体は、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第０  ２３９  ４００号明細書；国際公開第  ９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；および同第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（veneering）または再表面化（resurfacing）（欧州特許第０  ５９２  １０６号明細書；同第０  ５１９  ５９６号明細書；Padlan,1991；Studnickaら、1994；Roguskaら、1994）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を含む種々の技術を用いてヒト化され得る。ヒト抗体は、前記ファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号明細書、同第４，７１６，１１１号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書および同第５，８１４，３１８号明細書；国際公開第  ９８／４６６４５号パンフレット；同第  ９８／５０４３３号パンフレット；同第  ９８／２４８９３号パンフレット；同第  ９６／３４０９６号パンフレット；同第  ９６／３３７３５号パンフレット；および同第  ９１／１０７４１号パンフレット（これらの文献は、その全体が参考として援用される）もまた参照のこと。
【０３０８】
本発明のポリペプチドに組換え的に融合されるか、または化学的に結合される（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体はさらに本発明に含まれる。抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。たとえば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用である分子およびエフェクター分子（たとえば、非相同ポリペプチド、薬物または毒物）に組換え的に融合され得るか、または結合され得る。たとえば、国際公開第  ９２／０８４９５号パンフレット；同第  ９１／１４４３８号パンフレット；同第  ８９／１２６２４号パンフレット；米国特許第５，３１４，９９５号明細書；および欧州特許第０  ３９６  ３８７号明細書（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。融合抗体はまた、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、インビトロまたはインビボで、特定の細胞型に対して本発明のポリペプチドを標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに融合または結合される抗体はまた、当該分野で公知の方法（たとえば、Harborら（前出）；国際公開第  ９３／２１２３２号パンフレット；欧州特許第０  ４３９  ０９５号明細書；Naramura, Mら、1994；米国特許第５，４７４，９８１号明細書；Gilliesら、1992；Fellら、1991（これらの文献は、その全体が参考として援用される）参照）を用いるインビトロ免疫アッセイ法および精製法において用いられ得る。
【０３０９】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合される本発明のポリペプチドを含有する組成物を含む。たとえば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域またはその一部に融合または結合され得る。本発明のポリペプチドに融合される抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインまたはドメイン全体の任意の組合わせもしくはその一部を含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの半減期を上昇させるか、または当該分野で公知の方法を用いる免疫アッセイにおける使用のために、前記抗体部分に融合または結合され得る。ポリペプチドはまた、マルチマーを形成するために前記抗体部分に融合または結合され得る。たとえば、本発明のポリペプチドに融合されるＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を通じてダイマーを形成し得る。高度のマルチマー形成体は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合することによって作製され得る。抗体部分に本発明のポリペプチドを融合または結合する方法は当該分野で公知である。たとえば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第０  ３０７  ４３４号明細書、同第０  ３６７  １６６号明細書；国際公開第  ９６／０４３８８号パンフレット、同第  ９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenaziら、(1991)；Zhengら、(1995)；およびVilら、(1992)（これらの文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３１０】
抗体結合が所望されないＰＧ−３の異なる種を発現する非ヒト動物または哺乳動物（野生型でも遺伝子組換えでも）、およびＰＧ−３を発現しない動物（すなわち、本明細書中に記載されるＰＧ−３ノックアウト動物）は、抗体を調製するためにとくに有用である。ＰＧ−３ノックアウト動物は、外来抗原としてＰＧ−３タンパク質の曝露された領域の全てまたはほとんどを認識し、したがって、ＰＧ−３エピトープのワイダーアレイを用いて抗体を産生する。さらに、１０〜３０個のみのアミノ酸からなる小さなポリペプチドは、ＰＧ−３タンパク質のいずれか１つに対する特異的な結合を得るのに有用であり得る。さらに、抗原配列に似ているＰＧ−３の種を産生する動物の体液性免疫系は、好ましくは、動物のネイティブＰＧ−３種と抗原配列との間の差を認識し、そして、抗原配列内のこれらの独特な部位に対して抗体を産生する。このような技術は、ＰＧ−３タンパク質のいずれか１つに特異的に結合する抗体を得るのにとくに有用である。
【０３１１】
いずれかのプロトコルにしたがって調製された抗体調製物は、生物学的試料における抗原保有物質の濃度を決定する定量的な免疫アッセイにおいて有用である；これらの抗体調製物はまた、生物学的試料における抗原の存在を同定するために、半定量的にまたは定量的に用いられる。抗体はまた、タンパク質を発現する細胞を殺滅するため、または体内のタンパク質のレベルを減少させるための治療組成物において用いられ得る。
【０３１２】
本発明の抗体は、当該分野で公知の放射標識、蛍光標識または酵素標識のいずれか１つによって標識され得る。
【０３１３】
［ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカー］
［本発明の二対立遺伝子マーカーの利点］
本発明のＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）マーカーおよびＶＮＴＲ（繰り返し配列数多型）マーカーなどのその他の遺伝子マーカーを超えて多数の重要な利点を提供する。
【０３１４】
マーカーの最初の生成は、制限フラグメントの長さを修飾する改変体であるＲＦＬＰであった。しかし、ＲＦＬＰの同定および型決定するために用いられる方法は、材料、努力および時間が比較的浪費的である。遺伝子マーカーの第２の生成は、ミニサテライトまたはマイクロサテライトのいずれかとして分類され得るＶＮＴＲであった。ミニサテライトは、０．１〜２０キロベース長の範囲のヒト染色体の領域の間に分布される５〜５０の繰り返し単位で存在する直列に繰返されたＤＮＡ配列がある。ミニサテライトは、多くの潜在的な対立遺伝子を示すので、それらの情報量は非常に多い。ミニサテライトは、試験される個体由来の核酸試料に存在する直列繰り返しの数を同定するためにサザンブロットを実施することによってスコア化される。しかし、サザンブロットによって型決定され得るわずか１０4の潜在的なＶＮＴＲが存在する。さらに、ＲＦＬＰマーカーおよびＶＮＴＲマーカーの双方は、確立するのにコストと時間がかかり、そして数多くのアッセイが必要である。
【０３１５】
一塩基多型（ＳＮＰ）または二対立遺伝子マーカーは、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲと同様の様式で用いられ得るが、いくつかの利点を提供する。ＳＮＰは、ヒトゲノムにおいて高密度に存在し、そして、もっとも頻繁な型のバリエーションを示す。概算数で１０7を超える部位が、ヒトゲノムの３×１０9塩基対に沿って分散される。したがって、ＳＮＰは、非常に高い頻度で、かつＲＦＬＰマーカーまたはＶＮＴＲマーカーよりも高い均一性（このようなマーカーが目的の遺伝子座に非常に近接して見出される確率が高いことを意味する）で存在する。ＳＮＰは、ＶＮＴＲマーカーよりも変化せず、変異的により安定である。
【０３１６】
また、特徴付けられた一塩基多型の異なる形態（たとえば、本発明の二対立遺伝子マーカー）は、たいてい区別するのは容易であり、したがって、慣用的な基準により容易に型決定され得る。二対立遺伝子マーカーは、一塩基多型ベースの対立遺伝子を保持しており、かつそれらは、非常に平行な検出および自動化されたスコア化を可能にする２つの共通の対立遺伝子のみを保持する。本発明の二対立遺伝子マーカーは、迅速に、高速に個体の多くの遺伝子型を決定する可能性を提供する。
【０３１７】
二対立遺伝子マーカーは、ゲノムにおいて高密度に存在し、十分に情報量があり、そして数多くがアッセイされ得る。これらの利点の組み合わされた効果は、遺伝子研究において非常に価値のある二対立遺伝子マーカーを作製する。二対立遺伝子マーカーは、家族における連鎖研究、対立遺伝子共有方法、集団における連鎖不平衡研究、患者対照集団または形質陽性集団および形質陰性集団の関連研究において用いられ得る。本発明の重要な態様は、二対立遺伝子マーカーが複雑な形質に関与する遺伝子を同定するために実施されるべき関連研究を可能にする。関連研究は、無関係な患者対照集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度を調査し、そして、一般的に、ポリジーン形質または散発性形質の検出において使用される。関連研究は、一般的な集団内で実施され得、そして、罹患した家族における関連する個体に対して実施される研究（連鎖研究）には限定されない。異なる遺伝子における二対立遺伝子マーカーは、処置に対する減少または応答との直接関連について平行にスクリーニングされ得る。この多重遺伝子手法は、特定の表現型、薬物応答、散発性形質、または複合遺伝子病因を伴う疾患状態に対して、多重遺伝子因子の相乗効果を試験するために必須の統計的検出力を提供するので、種々のヒト遺伝子研究のための強力な手段である。
【０３１８】
［本発明の候補遺伝子］
異なる方法が以下の関連研究を実施するために使用され得る：ゲノムワイド関連研究、候補領域関連研究および候補遺伝子関連研究。ゲノムワイド関連研究は、均一に間隔を空けた遺伝子マーカーのスクリーニングおよび全ゲノムのカバーリングによる。候補遺伝子手法は、目的の形質に関連する生物学的経路に潜在的に関与する遺伝子に特異的に位置する遺伝子マーカーの研究に基づく。本発明において、ＰＧ−３は、異常な細胞分化に関連する癌または障害についての良好な候補遺伝子である。候補遺伝子分析は、形質の生物学に関係するいくつかの情報が利用可能である場合、遺伝子および遺伝子多型の同定への簡便な手法を明らかに提供する。しかし、本発明に開示される二対立遺伝子マーカーのすべてが、ゲノムワイド関連研究の一部、または候補領域関連研究の一部として使用され得、そして、このような用途は、本発明においてとくに考慮され、かつ主張されることに留意しなければならない。
【０３１９】
［ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーおよびそれに関するポリヌクレオチド］
本発明はまた、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーに関する。本明細書中で用いられる場合、「ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカー」は、ＰＧ−３遺伝子との連鎖不平衡における一組の二対立遺伝子マーカーに関する。用語ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーとしては、Ａ１〜Ａ８０で指定された二対立遺伝子マーカーがあげられる。
【０３２０】
本発明の二対立遺伝子マーカーの一部は表２に開示される。ＰＧ−３遺伝子におけるそれらの位置は表２に示され、そして、また、添付の配列表に列挙される配列番号１および２の特徴において一塩基多型として示される。１つのＰＧ−３二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む核酸の増幅を可能にするプライマーの対は、実施例２の表１に列挙される。
【０３２１】
８個のＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーＡ３、Ａ６、Ａ７、Ａ１４、Ａ７０、Ａ７１、Ａ７２およびＡ８０は、以下の位置におけるＰＧ−３のゲノム配列のエクソン領域に位置される：配列番号１の１０２２８、３９９４４、３９９７３、７６０６０、２１６０２６、２１６０８２、２１６２１８および２３７５５。これらは、ＰＧ−３遺伝子のエクソンＣ、Ｔ、Ｉ、ＫおよびＬに位置される。ｃＤＮＡおよびタンパク質配列におけるそれらのそれぞれの位置は表２に示される。
【０３２２】
本発明はまた、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカー、好ましくはＡ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む、精製および/または単離されたヌクレオチド配列に関する。この配列は、８〜１０００ヌクレオチド長であり、そして、好ましくは、配列番号１および２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００もしくは１０００連続したヌクレオチドまたはそれらの改変体もしくはそれらに相補的な配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、考慮される二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１または対立遺伝子２のいずれかの多型塩基を含む。任意に、前記二対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの中心から６、５、４、３、２または１ヌクレオチドの範囲内またはポリヌクレオチドの中心にあり得る。任意に、前記連続した長さの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在し得る。任意に、二対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在し得る。任意に、前記ポリヌクレオチドは、標識をさらに含み得る。任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合され得る。さらなる実施態様において、前記に定義されるポリヌクレオチドは、単独で、または任意の組合わせで用いられ得る。
【０３２３】
本発明はまた、配列番号１および２からなる群から選択されるヌクレオチド配列の、８〜１０００ヌクレオチド長、そして、好ましくは、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００もしくは１０００連続したヌクレオチドまたはそれらの改変体もしくはそれらに相補的な配列を含む、精製および/または単離されたヌクレオチド配列に関する。任意に、前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカー内またはこのマーカーから少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチド上流に位置され得る。任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０からなる群から選択される；任意に、前記ポリヌクレオチドの３’末端は前記配列におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの１ヌクレオチド上流に位置され得る。前記ポリヌクレオチドは、標識をさらに含み得る。任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合され得る。さらなる実施態様において、前記に定義されるポリヌクレオチドは、単独で、または任意の組合わせで用いられ得る。
【０３２４】
好ましい実施態様において、表２に列記される二対立遺伝子マーカーのうち１つの多型塩基を含む配列は、表１に列記されるアンプリコンまたはその改変体もしくはそれに相補的な配列を含む、これらから本質的になる、またはこれらからなるヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【０３２５】
本発明はさらに、ＰＧ−３タンパク質をコードする核酸に関する。ここで、この核酸は、Ａ１〜Ａ８０およびその相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む。
【０３２６】
本発明はまた、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおける１つ以上のヌクレオチドの同一性を決定するための任意のポリヌクレオチドの使用、またはその決定の際に用いる任意のポリヌクレオチドを包含する。さらに、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおける１つ以上のヌクレオチドの同一性の決定の際に用いる本発明のポリヌクレオチドは、この開示に記載される任意のさらなる限定を有するポリヌクレオチド、または以下に特定される単独または任意の組み合わせのポリヌクレオチドを包含する。任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；前記ポリヌクレオチドは、本発明において開示される配列を含み得る；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本発明において記載される任意のポリヌクレオチドを含む、このポリヌクレオチドからなる、またはこのポリヌクレオチドから本質的になる；任意に、前記決定は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロ配列決定アッセイ、または酵素ベースのミスマッチ検出アッセイに関与し得る；任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体、アレイ、またはアドレス可能なアレイに結合され得る；任意に、前記ポリヌクレオチドは、標識され得る。好ましいポリヌクレオチドは、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。別の好ましいポリヌクレオチドは、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するために配列決定アッセイまたはマイクロ配列決定アッセイにおいて用いられ得る。第３の好ましいポリヌクレオチドは、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおける同一性を決定するために酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおいて用いられ得る。第４の好ましいポリヌクレオチドは、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドのセグメントを増幅する際に用いられ得る。任意に、前記されたポリヌクレオチドのいずれかは、固体支持体、アレイ、またはアドレス可能なアレイに結合され得る；任意に、前記ポリヌクレオチドは標識され得る。
【０３２７】
さらに、本発明は、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅する際に用いるための任意のポリヌクレオチドの使用、またはそれに用いるための任意のポリヌクレオチドを包含する。さらに、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅する際に用いるための本発明のポリヌクレオチドは、この開示に記載される任意のさらなる限定を有するポリヌクレオチド、または以下に特定される単独または任意の組み合わせのポリヌクレオチドを包含する；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである。任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示される配列を含み得る；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本明細書中で記載される任意のポリヌクレオチドを含む、このポリヌクレオチドからなる、またはこのポリヌクレオチドから本質的になる；任意に、増幅はＰＣＲまたはＬＣＲに関与し得る。任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体、アレイ、またはアドレス可能なアレイに結合され得る。任意に、前記ポリヌクレオチドは標識され得る。
【０３２８】
本発明の二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドの増幅反応または配列決定反応のためのプライマーは、当該分野で公知の任意の方法に関して、開示された配列から設計され得る。プライマーの好ましい組は、配列番号１および２からなる群から選択される配列またはそれらに相補的な配列もしくはそれらの改変体と同一の連続した範囲の３’末端が、プライマーの３’末端に存在するように作製される。このような配置は、プライマーの３’末端が、選択された核酸配列にハイブリダイズすることを可能にし、そして、増幅反応または配列決定反応のためのプライマーの効率性を劇的に上昇させる。対立遺伝子特異的プライマーは、二対立遺伝子マーカーの多型塩基が、連続した範囲の３’末端にあり、そして、その連続した範囲がそのプライマーの３’末端に存在するように設計され得る。このような対立遺伝子特異的プライマーは、それらのプライマーが、二対立遺伝子マーカーに存在する２つの対立遺伝子のうち１つを含む核酸試料とともに用いられる限り、増幅反応または配列決定反応を選択的に促進する傾向がある。本発明のプライマーの３’末端は、前記配列におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカー内またはその遺伝子マーカーの少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチド上流、あるいは新規な配列またはマーカーの配列決定、増幅または位置付けの際のそれらの意図される使用に適切である任意のその他の位置に位置され得る。したがって、好ましい増幅プライマーの別の組は、配列番号１および２からなる群から選択される配列またはそれに相補的な配列もしくはそれらの改変体の、連続した長さが、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０または５０ヌクレオチド長（前記連続した長さの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置され、そして、前記ポリヌクレオチドの３’末端は前記配列におけるＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの上流に位置される）から本質的になる単離されたポリヌクレオチドを含む。好ましくは、それらの増幅プライマーは、配列Ｂ１〜Ｂ５２およびＣ１〜Ｃ５２からなる群から選択される配列を含む。ＰＧ−３の二対立遺伝子マーカーの１ヌクレオチド上流に位置されるそれらの３’末端を有するプライマーは、マイクロ配列決定アッセイとして特別な有用性を有する。好ましいマイクロ配列決定プライマーは、表４に記載される。任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、マイクロ配列決定プライマーは、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０のヌクレオチド配列からなる群から選択される。より好ましいマイクロ配列決定プライマーは、Ｄ１４、Ｄ４６、Ｄ６８、Ｄ７０、Ｄ７１、Ｅ３、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ４２、Ｅ４４、Ｅ７２およびＥ７５のヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【０３２９】
本発明のプローブは、当該分野で公知の任意の方法、とくに、本明細書中に開示されるマーカーが試料において存在する場合、試験方法において用いるために開示された配列から設計され得る。プローブの好ましい組は、プローブが、アッセイ条件の任意の特定の設定の下で二対立遺伝子マーカーの１つの対立遺伝子に選択的に結合するが、その他の核酸は結合しないように、当該分野で公知の任意の様式で、本発明のハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるために設計され得る。好ましいハイブリダイゼーションプローブは、関連する二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１または対立遺伝子２のいずれかの多型塩基を含む。任意に、前記二対立遺伝子マーカーは、ハイブリダイゼーションプローブの中心から６、５、４、３、２または１ヌクレオチドの範囲内または前記プローブの中心にあり得る。好ましい実施態様において、このプローブは、配列Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０ならびにそれらに相補的な配列からなる群から選択される。
【０３３０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列表に列挙される多型塩基を囲む的確な隣接配列を含むことに限定されないことに留意すべきである。より正確にいうと、二対立遺伝子マーカーを囲む隣接配列が、それらが意図される使用に任意の程度適合するように延長または短縮され得、そして本発明は、このような配列をとくに考慮する。連続した範囲の外側の隣接領域は、ヒトに実際に存在するネイティブな隣接配列に相同であることを必要としない。ポリヌクレオチドの意図される使用に適合する任意のヌクレオチド配列の付加は、とくに考慮される。
【０３３１】
プライマーおよびプローブは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」と題された節に記載されるように固体支持体上に標識または固定化され得る。
【０３３２】
固体支持体に結合される本発明のポリヌクレオチドは、この開示に記載される任意のさらなる限定を有するポリヌクレオチド、または以下に特定される単独または任意の組み合わせのポリヌクレオチドを包含する：任意に、前記ポリヌクレオチドは個々に、または本発明の少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０または２５の別個のポリヌクレオチドが一組となって、単一の固体支持体に結合され得る。任意に、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドとして同じの固体支持体に結合され得る。任意に、複数のポリヌクレオチドが固体支持体に結合される場合、それらの複数のポリヌクレオチドは、無作為な位置において、または、規則正しい配列で結合され得る。任意に、前記規則正しい配列はアドレス可能であり得る。
【０３３３】
本発明はまた、必要な試薬の一部またはすべて、およびＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することによって試験被験体の遺伝子型を決定するための使用説明書とともに、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む診断キットを包含する。キットのポリヌクレオチドは、固体支持体に任意に結合され得るか、またはポリヌクレオチドのアレイまたはアドレス可能なアレイの一部であり得る。このキットは、配列決定方法、マイクロ配列決定方法、ハイブリダイゼーションアッセイ法、または酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ法を含むが、これらに限定されない当該分野で公知の任意の方法による、マーカー位置におけるヌクレオチドの同一性の決定のために提供され得る。
【０３３４】
［二対立遺伝子マーカーのデノボ同定のための方法］
オリゴヌクレオチドプローブを用いた示差的ハイブリダイゼーション、増幅した核酸のゲル電気泳動または直接配列決定により測定される移動度における変化の検出などの方法を含むさまざまな方法のいずれも、一塩基多型について、ゲノムフラグメントをスクリーニングするのに用い得る。二対立遺伝子マーカーを同定するための１つの好ましい方法には、家族歴のない個体の適当な数から得られるゲノムＤＮＡフラグメントの比較配列決定が含まれる。
【０３３５】
第１の実施態様において、家族歴のない個体から得られたＤＮＡ試料は、一緒にプールされ、つづいて、目的のゲノムＤＮＡが増幅され、かつ、配列決定される。このようにして得られたヌクレオチド配列はその後、顕著な多型を同定するために分析される。本方法の主要な長所の１つは、ＤＮＡ試料をプールすることにより実質的に、実施しなければならないＤＮＡ増幅反応と配列反応の数を減少させることになるという点にある。さらに、本方法は、それによって得られた二対立遺伝子マーカーが、関連研究を行うのに有用とされる通常のものではない対立遺伝子の十分な頻度を通常示すのには十分な感受性がある。
【０３３６】
第２の実施態様において、ＤＮＡ試料はプールされず、したがって、個別に増幅され、かつ、配列決定される。本方法は、候補遺伝子内の関連研究を実施するために二対立遺伝子マーカーが同定される必要がある場合には通常好ましい。好ましくは、プロモーター領域またはエクソン領域などといったきわめて関連している遺伝子領域が二対立遺伝子マーカーについてスクリーニングされ得る。本方法を用いることにより得られる二対立遺伝子マーカーは、たとえば、対立遺伝子の頻度が少なくて約１０％未満である場合には、関連研究を実施するための情報性の程度が低いことを示し得る。しかし、こうした二対立遺伝子マーカーは、関連研究を実施するのには十分に情報性があり、そして、さらに、本発明の遺伝子分析研究においてはそれほど情報性がない二対立遺伝子マーカーを含めることにより、場合によっては、その浸透度によもよるが、まれな変異であり得る原因となる変異の直接的な同定を可能にし得る。
【０３３７】
以下は、本発明の二対立遺伝子マーカーの同定のために本発明者らにより用いられる１つの好ましい方法の種々のパラメーターの記載である。
【０３３８】
［ゲノムＤＮＡ試料］
本発明の二対立遺伝子マーカーが生成される前記ゲノムＤＮＡ試料は、好ましくは、公知の民族的背景の異種集団に相当する家族歴のない個体から得られる。ＤＮＡ試料が得られる個体の数は、実質的にはさまざまなものであり得るが、好ましくは、約１０〜約１０００、または好ましくは約５０〜約２００の個体である。可能な限り数多くのマーカーを同定し、かつ統計的に有意な結果を得るのに所定の集団における十分な多型の多様性を得るために、少なくとも約１００の個体からＤＮＡ試料を採取することが通常好ましい。
【０３３９】
分析に供されるゲノムＤＮＡの供給源に関しては、いずれの試験試料も、任意の特定の制限もなく、予見し得る。これらの試験試料には、本明細書中に記載されている本発明の方法により試験され得る生物学的試料が含まれ、そして、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液などのヒトおよび動物体液、および、呼吸管、腸管、泌尿生殖器路、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などのさまざまな外部への排出物；細胞培養上清などの生物学的液体；腫瘍および非腫瘍組織ならびにリンパ節組織を含む固定組織標本；骨髄吸引液および固定細胞標本が含まれる。本発明において用いられるゲノムＤＮＡの好ましい供給源は、各ドナーの末梢静脈血由来である。生物学的試料由来のゲノムＤＮＡを作製するための技術は、当業者に周知である。１つの好ましい実施態様の詳細は、実施例１において提示されている。当業者は、プールされたＤＮＡ試料またはプールされてないＤＮＡ試料を増幅するために選択し得る。
【０３４０】
［ＤＮＡ増幅］
ゲノムＤＮＡの試料における二対立遺伝子マーカーの同定は、ＤＮＡ増幅方法を使用することにより容易にされ得る。ＤＮＡ試料は、増幅工程のためにプールまたはプールされ得ない。ＤＮＡ増幅技術は、当業者に周知である。
【０３４１】
本発明との関係で用いられ得る増幅技術としては、欧州特許公開第３２０  ３０８号明細書、国際公開第９３／２０２２７号パンフレットおよび欧州特許公開第４３９  １８２号明細書に記載されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、  Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）およびＣｏｍｐｔｏｎ  Ｊ．（１９９１）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などの技術、欧州特許出願第４５４４６１０号明細書に記載されているＱ−ベータ増幅、Ｗａｌｋｅｒら（１９９６）および欧州特許出願第６８４  ３１５号明細書に記載されている鎖置換増幅、ならびに国際公開第９３／２２４６１号パンフレットに記載されている標的触媒増幅があげられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
ＬＣＲおよびＧａｐ  ＬＣＲは指数関数的増幅技術であり、その両方ともＤＮＡ分子にアニーリングされる隣接プライマーを連結するのにＤＮＡリガーゼを利用する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）において、２つの１次（第１および第２）プローブおよび２つの２次（第３および第４）プローブを含むプローブ対が用いられ、これらの全てが標的に対してモル過剰に使用される。第１プローブは、標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、そして、第２プローブは、標的鎖の第２セグメントとハイブリダイズし、第１および第２セグメントは、１次プローブが５’リン酸−３’ヒドロキシルの関係に互いに接するように、かつリガーゼが２つのプローブを融合産物に共有結合的に融合または結合し得るように接触する。さらに、第３（２次）プローブは第１プローブの一部にハイブリダイズし得、そして、第４（２次）プローブは、同様の接触様式で第２プローブの一部にハイブリダイズし得る。当然、標的が最初、２本鎖である場合には、２次プローブもまた、第１例における標的相補鎖にハイブリダイズする。一旦、１次プローブの連結鎖が標的鎖から分離されると、連結鎖は、相補的な２次連結産物を形成するように連結され得る第３および第４プローブとハイブリダイズする。連結産物が機能的に、標的またはその相補鎖のいずれかに対して等価であることを実現することが重要である。ハイブリダイゼーションと、連結のサイクルを繰り返し行うことによって、標的配列の増幅が達成される。多重ＬＣＲのための方法もまた記載されている（国際公開第９３／２０２２７号パンフレット）。Ｇａｐ  ＬＣＲ（ＧＬＣＲ）は、プローブが隣接していないが、２〜３塩基分だけ離れている場合には、ＬＣＲのバージョンである。
【０３４３】
ｍＲＮＡの増幅に関しては、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、つづいて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が行われること；または、米国特許第５，３２２，７７０号明細書に記載されているように、両方の工程について、単一の酵素を用いること；または、Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９９４）により記載されているように、非対称性Ｇａｐ  ＬＣＲ（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を用いることは、本発明の範囲内である。ＡＧＬＣＲは、ＲＮＡの増幅を可能にするＧＬＣＲの変更型である。
【０３４４】
ＰＣＲ技術は本発明において使用される好ましい増幅技術である。種々のＰＣＲ技術は当業者に周知である。ＰＣＲ技術の概説に関しては、Ｗｈｉｔｅ（１９９２）および「ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）と題される刊行物を参照のこと。これらのＰＣＲ方法のそれぞれにおいて、増幅されるべき核酸配列のいずれの側でもＰＣＲプライマーは、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、またはＶｅｎｔポリメラーゼといった熱安定性ポリメラーゼとともに、適切に調製された核酸試料に添加される。試料中の核酸は変性され、そしてＰＣＲプライマーは試料中の相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたプライマーは伸張される。その後、変性、ハイブリダイゼーション、伸張の別のサイクルが開始される。サイクルは、プライマー部位の間にある核酸配列を含む増幅断片を産生すために、複数回繰り返される。ＰＣＲはさらに、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；および同第４，９６５，１８８号明細書を含むいくつかの特許に記載されている。
【０３４５】
ＰＣＲ技術は、新規な二対立遺伝子マーカーを同定するために用いられる好ましい増幅技術である。本発明の目的に適切なＰＣＲ反応の代表的な例は、実施例２で提示されている。
【０３４６】
本発明の態様の１つは、試験試料中の、ヒトＰＧ−３遺伝子、とくに、配列番号１のゲノム配列のフラグメント、または配列番号２のｃＤＮＡ配列、あるいはそのフラグメントもしくは改変体の増幅のための方法であって、好ましくはＰＣＲ技術が用いられる。この方法は以下の工程を包含する：
ａ）試験試料を、増幅されるべきポリヌクレオチド領域のいずれの側にも位置している前記の増幅プライマーの対を含む増幅反応試薬と接触させる工程、および
ｂ）任意に、増幅産物を検出する工程。
【０３４７】
本発明はまた、試験試料中の、ＰＧ−３遺伝子配列、とくに、配列番号１のゲノム配列の一部、または配列番号２のｃＤＮＡ配列、あるいは、その改変体の増幅のためのキットに関する。このキットは以下を含む：
ａ）増幅されるべきＰＧ−３領域のいずれの側にも位置しているオリゴヌクレオチドプライマーの対；および
ｂ）任意に、増幅反応を実施するために必要な前記試薬。
【０３４８】
前記増幅方法およびキットの１つの実施態様において、増幅産物は増幅された領域に相補的である配列を含む標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。前記増幅方法およびキットの別の実施態様において、プライマーはＢ１〜Ｂ５２、Ｃ１〜Ｃ５２、Ｄ１〜Ｄ４、Ｄ６〜Ｄ８０、Ｅ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０のヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む。
【０３４９】
本発明の第１の実施態様において、二対立遺伝子マーカーが、本発明者により産出されたゲノム配列情報を用いて同定される。配列決定されたゲノムＤＮＡフラグメントは、５００ｂｐフラグメントの増幅のためのプライマーを設計するのに用いられる。これらの５００ｂｐフラグメントは、ゲノムＤＮＡから増幅され、そして二対立遺伝子マーカーについてスキャンされる。プライマーはＯＳＰソフトウェア（Ｈｉｌｌｉｅｒ  Ｌ．およびＧｒｅｅｎ  Ｐ．，１９９１）を用いて設計され得る。全てのプライマーには、特異的標的塩基の上流と、配列決定プライマーとして役に立つ共通オリゴヌクレオチドテールとを含み得る。当業者は、これらの目的のために用い得るプライマー伸張には精通している。
【０３５０】
候補遺伝子をコードするゲノム配列の増幅のために有用である好ましいプライマーは、遺伝子のプロモーター、エクソン、スプライング部位上に集中する。二対立遺伝子マーカーが遺伝子のこれらの機能的領域に位置している場合には、それは、原因となる変異であるということを高い確率で提示する。本発明の好ましい増幅プライマーとしては、さらに実施例２、表１に詳述されているヌクレオチド配列Ｂ１〜Ｂ５２およびＣ１〜Ｃ５２があげられる。
【０３５１】
［増幅ゲノムＤＮＡの配列決定および一塩基多型の同定］
前記のように産生された増幅産物はその後、当業者には公知であり、かつ利用可能な任意の方法を用いて配列決定される。ジデオキシ触媒方法（サンガー法）か、またはマキザム−ギルバート法かのいずれかを用いてＤＮＡを配列決定するための方法は、当業者には広く公知である。このような方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に開示される。別のアプローチとしては、Ｃｈｅｅら（１９９６）に記載されているように、高密度ＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションがあげられる。
【０３５２】
好ましくは、増幅ＤＮＡは、色素プライマーサイクル配列決定プロトコルを用いて自動化ジデオキシターミネーター配列決定反応に供される。配列決定反応の産物は、配列決定ゲルを泳動させ、そして、配列がゲル画像分析を用いて決定される。多型検索は、同一位置で起こる異なる塩基から生じる電気泳動パターンにおける重複ピークの存在に基づく。各ジデオキシターミネーターは、異なる蛍光分子により標識されており、二対立遺伝子部位に相当する２つのピークが、配列上の同一位置にある２つの異なるヌクレオチドに相当する別個の色調を呈する。しかし、２つのピークの存在は、バックグラウンドノイズにより人工産物となり得る。このような人工産物を排除するために、２つのＤＮＡ鎖が配列決定され、そして、ピーク間の比較が実施される。配列が多型であることを確かめるために、多型は両方の鎖上で検出される。
【０３５３】
前記方法により、同定されるべき二対立遺伝子マーカーを含むこれらの増幅産物が可能なものとなる。１００の個体のプールを配列決定することにより検出される二対立遺伝子多型の頻度に対する検出限度は、公知の対立遺伝子頻度のプールを配列決定することにより証明されているように、マイナーな対立遺伝子に関しては、およそ０．１である。しかし、プールする方法により検出される二対立遺伝子多型の９０％より多くが、０．２５よりも高い少数の対立遺伝子に関する頻度を有する。したがって、本方法により選択される二対立遺伝子マーカーは、少数の対立遺伝子に関しては少なくとも０．１の頻度を有し、そして、主な対立遺伝子に関しては０．９未満の頻度を有する。好ましくは、本方法により選択される二対立遺伝子マーカーは、少数の対立遺伝子に関しては少なくとも０．２の頻度を有し、そして、主な対立遺伝子に関しては、０．８未満の頻度を有し、さらに好ましくは、少数の対立遺伝子に関しては、少なくとも０．３の頻度を有し、そして、主な対立遺伝子に関しては、０．７未満の頻度を有する。したがって、二対立遺伝子マーカーは好ましくは、０．１８よりも高く、さらに好ましくは、０．３２よりも高く、なおより好ましくは、０．４２よりも高いヘテロ接合性率を有する。
【０３５４】
別の実施態様において、二対立遺伝子マーカーは、個々のＤＮＡ試料を配列決定することにより検出される。いくつかの実施態様において、このような二対立遺伝子マーカーの少数の対立遺伝子の頻度は０．１未満であり得る。
【０３５５】
［本発明の二対立遺伝子マーカーの認証］
多型は、両方の対立遺伝子が１つの集団中に存在していることを認証することより、遺伝子マーカーとしてのその有用性に関して評価される。二対立遺伝子マーカーの認証は、本発明の方法によって個体の群の遺伝子型を決定することによって、そして、両方の対立遺伝子が存在していることを示すことにより達成される。マイクロ配列決定は、対立遺伝子の遺伝子型を決定する好ましい方法である。遺伝子型を決定する工程による認証は、群中の各個体から得られる各試料に対して、すなわち１よりも多くの個体から得られるプールされた試料の遺伝子型を決定することによって行われ得る。この群は、個体が問題となっている対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合には、１の個体を１単位とするものまで小さくされ得る。好ましくは、この群には少なくとも３の個体が含まれ、より好ましくは、この群には、５または６の個体が含まれ、そのため、単一の認証試験は、試験されるいっそう多くの二対立遺伝子マーカーの認証を生じる可能性が高い。しかし、認証試験が１つの小さな群に対して実施される場合には、サンプリング誤差の結果として、試験される個体は誰も２つのうち１つも対立遺伝子を保持してはいないとき、偽陰性の結果という結果を生じ得ることに留意しなければならない。したがって、認証プロセスは、配列中の特定の位置に真正な二対立遺伝子マーカーが存在することを実証するよりも、特定の当初の結果が人工産物であることを実証するのにはさほど有用ではない。本発明の遺伝子型決定、ハプロタイプ型決定、関連および相互作用研究の方法はすべて、認証された二対立遺伝子マーカーによってのみ任意に実施され得る。
【０３５６】
［本発明の二対立遺伝子マーカーの頻度の評価］
認証された二対立遺伝子マーカーはさらに、二対立遺伝子マーカー部位にある少なくとも共通の対立遺伝子の頻度を決定することにより、遺伝子マーカーとしてのその有用性が評価される。まれな対立遺伝子の頻度が高くなれば、関連および相互作用研究における二対立遺伝子マーカーの有用性は大きくなる。最少共通対立遺伝子の同定は、本発明の方法により個体の群の遺伝子型を決定することによって、そして、両方の対立遺伝子が存在することを実証することによって達成される。遺伝子型を決定することによるマーカー頻度の決定は、群における各個体から得られる個々の試料を用いて、または１より多くの個体から得られるプールされた試料の遺伝子型を決定することによって実施され得る。この群は、全体としての集団を代表するものであるのに十分大きなものでなければならない。好ましくは、この群には、少なくとも２０の個体が含まれ、より好ましくは、この群には、少なくとも５０の個体が含まれ、もっとも好ましくは、この群には、少なくとも１００の個体が含まれる。当然、この群が大きければ、サンプリング誤差が小さくなるため、頻度決定の精度は高くなる。まれな対立遺伝子の頻度が３０％以上である場合には、二対立遺伝子マーカーは、「高度の二対立遺伝子マーカー」といわれる。本発明の遺伝子型決定、ハプロタイプ型決定、関連および相互作用研究の方法すべては、任意に、高度の二対立遺伝子マーカーを用いてのみ実施され得る。
【０３５７】
［二対立遺伝子マーカーについて個体の遺伝子型を決定する方法］
本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーについて、生物学的試料の遺伝子型を決定するための方法が提供される。その方法の全てがインビトロで実施され得る。遺伝子型を決定するこのような方法は、当該分野で公知の任意の方法によりＰＧ−３二対立遺伝子マーカー部位でヌクレオチドの同一性を決定する工程を包含する。これらの方法は、関連研究における患者対象集団、および所定の形質に関連していることが既知である二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の検出との関係において個体（この場合、個体のゲノムに存在する二対立遺伝子マーカーの両複製物が決定される）の遺伝子型を決定する際の用途を見出す。その結果、個体は、特定の対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性として分類され得る。
【０３５８】
これらの遺伝子型決定方法は、単一の個体またはプールされたＤＮＡ試料から得られる核酸試料に対して実施され得る。
【０３５９】
遺伝子型決定は、二対立遺伝子マーカーの同定に関して、前記方法と同様の方法を用いて、または、さらに以下に記載されるような他の遺伝子型決定方法を用いて実施され得る。好ましい実施態様において、異なる個体由来の増幅されたゲノムフラグメントの配列の比較は、新規の二対立遺伝子マーカーを同定するために用いられる。一方、マイクロ配列決定は、診断および関連研究の適用における公知の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型決定について用いられる。
【０３６０】
１つの実施態様において、本発明は、生物学的試料中の、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドまたはその相補鎖の同一性を決定する工程を含む遺伝子型決定方法を包含する；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、生物学的試料は、単一の被験体から得られる；任意に、前記二対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性は、前記個体のゲノムに存在する前記二対立遺伝子マーカーの両複製物について決定される；任意に、前記生物学的試料は、複数の被験体から得られる；任意に、本発明の遺伝子型決定方法は、この開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、または以下に特定される単独または任意の組み合わせの方法を包含する；任意に、前記方法は、インビトロで実施される；任意に、前記方法はさらに、前記決定工程の前に、二対立遺伝子マーカーを含む前記配列の一部を増幅する工程を包含する；任意に、前記増幅は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、または複製起点および前記フラグメントを含む組換えベクターの宿主細胞における複製によって実施される；任意に、前記決定は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロ配列決定アッセイ、または酵素ベースのミスマッチ検出アッセイに関与する。
【０３６１】
［遺伝子型決定のための核酸の供給源］
精製された形態または精製されていない形態の核酸の任意の供給源は、出発核酸として利用され得、所望される特定の核酸配列を含むか、または含んでいると推測される場合に提供される。ＤＮＡまたはＲＮＡは、前記のように細胞、組織、体液などから抽出され得る。本発明の遺伝子型決定方法における使用のための核酸は、任意の哺乳動物供給源から得られ得るが、核酸試料が採取される試験被験体および個体は一般的にはヒトであることが理解される。
【０３６２】
［二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントの増幅］
方法およびポリヌクレオチドは、本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅するために提供される。二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントの増幅は、種々の方法および種々の目的に用いられ得、そして、遺伝子型決定に限定されない。それにもかかわらず、数多くの遺伝子型決定方法は、全てではないが、目的の二対立遺伝子マーカーを保持するＤＮＡ領域を予め増幅することが必要である。このような方法は、とくに、二対立遺伝子マーカーに及ぶ、または、二対立遺伝子マーカーに対して遠位もしくは近位のいずれかに位置される部位および配列を含む配列の密度または合計数を増加させる。診断アッセイはまた、本発明の二対立遺伝子マーカーを保持するＤＮＡセグメントの増幅に依存し得る。ＤＮＡの増幅は、当業者に公知の任意の方法により達成され得る。増幅技術は、「ＤＮＡ増幅」と題される節において前記される。
【０３６３】
これら増幅の方法のいくつかは、一塩基多型の検出にとくに適しており、そして標的配列の同時増幅と、以下にさらに記載されるように、多型ヌクレオチドの同定を可能にする。
【０３６４】
前記のように二対立遺伝子マーカーの同定は、適当なオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。適当なオリゴヌクレオチドは、本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーとして用いられ得る。増幅は、本明細書中に記載されている新規な二対立遺伝子マーカーを発見するのに最初に用いられるプライマー、または本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントの増幅を可能にするプライマーの任意の組を用いて実施され得る。
【０３６５】
いくつかの実施態様において、本発明は、本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントを増幅するためのプライマーを提供する。好ましい増幅プライマーは、実施例２に列記される。列挙されるプライマーは単に例示的なものであり、そして、本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーを含む増幅産物を生じるプライマーの任意のその他の組もまた用いられることが理解される。
【０３６６】
プライマーの間隔は、増幅されるべきセグメントの長さを決定する。本発明との関係では、二対立遺伝子マーカーを保持する増幅セグメントは、少なくとも約２５ｂｐ〜３５ｋｂｐの大きさに範囲し得る。２５〜３０００ｂｐの増幅フラグメントは代表的であり、５０〜１０００ｂｐのフラグメントは好ましく、そして、１００〜６００ｂｐのフラグメントは非常に好ましい。二対立遺伝子マーカーのための増幅プライマーは、マーカーを保持する任意のＤＮＡフラグメントの特異的な増幅を可能にする任意の配列であり得ることが理解される。増幅プライマーは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」の節に記載されるように、固体支持体上に標識または固定化され得る。
【０３６７】
［二対立遺伝子マーカーについてＤＮＡ試料の遺伝子型を決定する方法］
当該分野で公知の任意の方法は、二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドを同定するのに用いられ得る。検出されるべき二対立遺伝子マーカー対立遺伝子は本発明において同定および特定されているので、検出は、多数の技術のいずれかを使用することによって当業者には、簡単であることが理解される。多数の遺伝子型決定方法は、目的の二対立遺伝子マーカーを保持するＤＮＡ領域を予め増幅することが必要である。標的またはシグナルの増幅は、現在では、たいてい好ましいが、増幅を必要としない超高感度検出方法もまた、この遺伝子型決定方法によって包含される。二対立遺伝子多型を検出するために用いられ得る当業者に周知の方法としては、慣用的なドットブロット分析、Ｏｒｉｔａら（１９８９）によって記載される一本鎖コンホメーション多型分析（ＳＳＣＰ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチ切断検出、およびＳｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９９１）、Ｗｈｉｔｅら（１９９２）、Ｇｒｏｍｐｅら（１９８９および１９９３）に記載されているその他の慣用的な技術などの方法があげられる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するための別の方法は、米国特許第４，６５６，１２７号明細書に記載されている特別なエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体を使用する。
【０３６８】
好ましい方法には、配列決定アッセイ、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、またはハイブリダイゼーションアッセイにより二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接決定することが含まれる。以下は、いくつかの好ましい方法の記載である。非常に好ましい方法は、マイクロ配列決定技術である。用語「配列決定」は、一般的には、２本鎖プライマー／鋳型複合体のポリメラーゼ伸張をいうのに本明細書中で使用され、そして、伝統的な配列決定とマイクロ配列決定の両方が含まれる。
【０３６９】
１）配列決定アッセイ
多型部位に存在するヌクレオチドは配列決定方法により決定され得る。好ましい実施態様において、前記のように、ＤＮＡ試料は、配列決定の前にＰＣＲ増幅に供される。ＤＮＡ配列決定方法は、「増幅ゲノムＤＮＡの配列決定および一塩基多型の同定」と題される節に記載される。
【０３７０】
好ましくは、増幅ＤＮＡは、色素プライマーサイクル配列決定プロトコルを用いて自動化ジデオキシターミネーター配列決定反応に供される。配列分析は、二対立遺伝子マーカー部位に存在する塩基の同定を可能にする。
【０３７１】
２）マイクロ配列決定アッセイ
マイクロ配列決定方法において、標的ＤＮＡにおける多型部位のヌクレオチドは、一塩基プライマー伸張反応によって検出される。この方法には、標的核酸における目的の多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズする適切なマイクロ配列決定プライマーが含まれる。ポリメラーゼは、多型部位のヌクレオチドに相補的な１つの単一ｄｄＮＴＰ（鎖ターミネーター）により、プライマーの３’末端を特異的に伸張するのに用いられる。つぎに、取り込まれたヌクレオチドの同一性が任意の適切な方法で決定される。
【０３７２】
代表的には、マイクロ配列決定反応は、蛍光ｄｄＮＴＰを用いて実施され、そして伸張されたマイクロ配列決定プライマーが、ＡＢＩ３７７配列決定機での電気泳動により分析され、欧州特許第ＥＰ４１２８８３号明細書に記載される取り込まれたヌクレオチドの同一性が決定される。代替的には、キャピラリー電気泳動法が、多数のアッセイを同時に処理するために用いられ得る。本発明との関係で用いられ得る代表的なマイクロ配列決定方法の例は、実施例４に提示されている。
【０３７３】
異なるアプローチは、ｄｄＮＴＰの標識化および検出のために用いられ得る。蛍光共鳴エネルギー移送に基づく均質相検出方法が、ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ（１９９７）ならびにＣｈｅｎら（１９９７）によって記載されている。この方法では、多型部位を含む増幅されたゲノムＤＮＡフラグメントが、対立遺伝子色素標識ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸および修飾Ｔａｑポリメラーゼの存在下で５’−蛍光標識プライマーとともにインキュベートされる。色素標識プライマーは、鋳型上に存在する対立遺伝子に特異的な色素ターミネーターによって一塩基伸張される。遺伝子型決定反応の最後には、反応混合物における２つの色素の蛍光強度が、分離または精製されることなく直接分析される。全てのこれらの工程は、同じ試験管において実施され得、そして蛍光変化は、実時間でモニタされ得る。代替的には、伸張されたプライマーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器により分析され得る。多型部位の塩基はマイクロ配列決定プライマー（ＨａｆｆおよびＳｍｉｒｎｏｖ，１９９７参照）に加えられた質量によって同定される。
【０３７４】
マイクロ配列決定法は、確立されたマイクロ配列決定方法またはそれを発展させた方法もしくはそれから派生した方法によって達成され得る。代替的な方法としては、いくつか固相マイクロ配列決定技術があげられる。基礎的なマイクロ配列決定プロトコルは、異種相アッセイとして実施されることを除いては、前記と同様である。異種相アッセイにおいては、プライマーまたは標的分子が固体支持体上に固定化または捕獲される。プライマー分離および末端ヌクレオチド付加分析を単純化するために、オリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合されるか、または、アフィニティ分離およびポリメラーゼ伸張を可能にするような方法で修飾される。合成オリゴヌクレオチドの５’末端および内部ヌクレオチドは、異なるアフィニティ分離アプローチ（たとえば、ビオチン化）を可能にする多数の異なる方法で修飾され得る。単一のアフィニティ基がオリゴヌクレオチドに対して用いられる場合、オリゴヌクレオチドは、取り込まれたターミネーター試薬から分離され得る。これは、物理的な分離および大きさによる分離の必要性が排除される。１つより多くのオリゴヌクレオチドは、１つより多くのアフィニティ基が用いられる場合、ターミネーター試薬から分離され、そして同時に分析され得る。これによって、いくつかの核酸種または多くの伸張反応当たりの核酸配列情報の分析が可能である。アフィニティ基は、プライミングオリゴヌクレオチド上では必要ないが、代替的に鋳型上に存在され得る。たとえば、固定は、ビオチン化ＤＮＡとストレプトアビジン被覆マイクロ力価ウェルまたはアビジン被覆ポリスチレン微粒子との間の相互作用を介して実施され得る。同じ方法で、オリゴヌクレオチドまたは鋳型が、高密度フォーマットで固体支持体に結合され得る。このような固相マイクロ配列決定反応では、取り込まれたｄｄＮＴＰが放射標識され得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，１９９４）か、またはフルオレセインに連結され得る（ＬｉｖａｋおよびＨａｉｎｅｒ，１９９４）。放射標識されたｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションベースの技術によって達成することができる。フルオレセインに連結されたｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファターゼと結合された抗フルオレセイン抗体の結合に基づき得る。つづいて、発色体基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）とともにインキュベートされる。その他の潜在的なリポーター−検出対としては、以下があげられる：ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に連結されたｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリホスファターゼ共役（Ｈａｒｊｕら、１９９３）またはビオチン化ｄｄＮＴＰおよび基質としてｏ−フェニレンジアミンを有する西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（国際公開第９２／１５７１２号パンフレット）。なお別の代替的な固相マイクロ配列決定方法として、Ｎｙｒｅｎら（１９９３）は、酵素発光計測無機ピロホスフェート検出アッセイ（ＥＬＩＤＡ）によるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に依存する方法を記載した。
【０３７５】
Ｐａｓｔｉｎｅｎら（１９９７）は、固相ミニ配列決定原理がオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用される、一塩基多型の多重検出のための方法を記載する。固体支持体（ＤＮＡチップ）に結合されるＤＮＡプローブの高密度アレイは、以下にさらに記載される。
【０３７６】
１つの態様において、本発明は、ポリヌクレオチド、およびマイクロ配列決定アッセイを実施することによる、本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型決定方法を提供する。好ましいマイクロ配列決定プライマーとしては、ヌクレオチド配列Ｄ１〜Ｄ４およびＤ６〜Ｄ８０、ならびにＥ１〜Ｅ４およびＥ６〜Ｅ８０があげられる。実施例４に列記されるマイクロ配列決定プライマーは単に例示的なものであって、そして、多型ヌクレオチドに隣接する３’末端を有する任意のプライマーが用いられ得ることは理解される。同様に、マイクロ配列決定分析は、任意の二対立遺伝子マーカーまたは本発明の二対立遺伝子マーカーの任意の組合せについて実施され得ることは理解される。本発明の１つの態様は、実施例４に列記される１つ以上のマイクロ配列決定プライマー、または、その少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、４０または５０連続したヌクレオチド（このような長さが、記載されたプライマーと一致する程度まで）を含み、そして、二対立遺伝子マーカー部位のヌクレオチドの同一性を決定するための、対応する二対立遺伝子マーカーのすぐ上流に３’末端を有するフラグメントを含む固体支持体である。
【０３７７】
３）ポリメラーゼおよびリガーゼをに基づくミスマッチ検出アッセイ
１つの態様において、本発明は、ポリヌクレオチド、およびポリメラーゼおよび／またはリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイによる、生物学的試料における本発明の１つ以上の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子を決定するための方法を提供する。これらのアッセイは、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性に基づく。重合反応は、増幅プライマーの３’末端の正確な塩基対および標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズされる２つのオリゴヌクレオチドの結合に対して、とくにストリンジェントな条件を設定し、連結部位、とくに３’末端に近いミスマッチに非常に感受性が高い。本発明の二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントを増幅する方法、プライマーおよび種々のパラメーターは、さらに「二対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡフラグメントの増幅」と題される節において前記される。
【０３７８】
［対立遺伝子特異的増幅プライマー］
二対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子間の識別はまた、対立遺伝子特異的増幅、選択的方策によって達成され得、それによって、対立遺伝子の１つが、他の対立遺伝子の増幅を行うことなく増幅される。対立遺伝子特異的増幅に関しては、プライマーの対の少なくとも１つの成分は、本発明の二対立遺伝子マーカーの多型塩基を含むＰＧ−３の領域とハイブリダイズし、そして増幅を開始するために、そのＰＧ−３の領域と十分に相補的である。このようなプライマーは、二対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子間を識別し得る。
【０３７９】
これは、増幅プライマーの１つの３’末端に、多型塩基を設置することによって達成される。プライマーの３’末端から伸張が進行するため、この位置でのまたはこの位置の付近でのミスマッチは増幅に対する阻害効果を有する。したがって、適切な増幅条件下では、これらのプライマーは、それらの相補的な対立遺伝子に対して増幅のみを指向する。ミスマッチの正確な位置および対応するアッセイ条件の決定は、十分に当該分野における通常の技術の範囲内である。
【０３８０】
［連結／増幅のベースの方法］
「オリゴヌクレオチド連結アッセイ」（ＯＬＡ）は、標的分子の一本鎖の隣接配列にハイブリダイズし得るように設計される２つのオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドの１つはビオチン化され、そして、他方は検出可能に標識される。正確な相補的な配列が、標的分子において見出される場合、オリゴヌクレオチドは、その末端が隣接するようにハイブリダイズし、そして、捕獲および検出され得る連結物質を作製する。ＯＬＡは一塩基多型を検出し得、そして、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）によって記載されるようにＰＣＲと有利に組合わせられ得る。この方法において、ＰＣＲは標的ＤＮＡの指数関数的な増幅を達成するのに使用される。ついで、この標的ＤＮＡはＯＬＡを用いて検出される。
【０３８１】
一塩基多型の検出にとくに適切であるその他の増幅方法としては、「ＤＮＡ増幅」と題とされる節において前記されるＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、Ｇａｐ  ＬＣＲ（ＧＬＣＲ）があげられる。ＬＣＲは、特異的な標的を指数関数的に増幅するように２対のプローブを用いる。オリゴヌクレオチドの各対の配列は、その対が標的の同じ鎖の隣接配列にハイブリダイズすることを可能にするように選択される。このようなハイブリダイゼーションは、鋳型依存性リガーゼのための基質を形成する。本発明によると、ＬＣＲは二対立遺伝子マーカー部位の同じ鎖の近位および遠位配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて実施され得る。１つの実施態様において、いずれかのオリゴヌクレオチドが二対立遺伝子マーカー部位を含むように設計される。このような実施態様において、反応条件は、標的分子がオリゴヌクレオチド上の二対立遺伝子マーカーに相補的である特異的なヌクレオチドを含むか、または欠くかのいずれかの場合のみ、オリゴヌクレオチドが互いに連結され得るように選択される。代替的な実施態様において、オリゴヌクレオチドは二対立遺伝子マーカーは含まず、そのため、それらのオリゴヌクレオチドが標的分子にハイブリダイズする場合は、「ｇａｐ」が国際公開第９０／０１０６９号パンフレットに記載のように作製される。ついで、このｇａｐは、（ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される）相補的なｄＮＴＰによって、またはオリゴヌクレオチドのさらなる対によって「充填」される。したがって、各サイクルの最後には、各１本鎖は、つぎのサイクル中に標的としての役割を果たし得る相補鎖を有し、そして、所望の配列の指数関数的な対立遺伝子特異的増幅が得られる。
【０３８２】
リガーゼ／ポリメラーゼ触媒遺伝子Ｂｉｔ分析（Ligase/Polymerase-mediated Genetic Bit Analysis）（商標）は、核酸分子中の予め選択された部位のヌクレオチドの同一性を決定する別の方法である（国際公開第９５／２１２７１号パンフレット）。この方法には、プライマー分子の末端上の予め選択された部位に存在するヌクレオチドに相補的であるヌクレオシド三リン酸の取り込み、およびその結果としての第２オリゴヌクレオチドへの連結が含まれる。反応は、反応の固相に結合される特異的な標識を検出することによって、または溶液中の検出によってモニタされる。
【０３８３】
４）ハイブリダイゼーションアッセイ方法
二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定する好ましい方法には、核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。このような反応に都合よく用いられ得るハイブリダイゼーションプローブとしては、好ましくは、本明細書中で規定されるプローブがあげられる。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、および固相ハイブリダイゼーションを含む任意のハイブリダイゼーションアッセイが用いられ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）参照）。
【０３８４】
ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基対による２つの１本鎖による二本鎖構造の形成をいう。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖の間で、または、ミスマッチの少数領域を含む核酸鎖の間で起こり得る。二対立遺伝子マーカーの１つの形態にはハイブリダイズするが、他方の形態にはハイブリダイズしない特定のプローブが設計され得、したがって、異なる対立遺伝子形態の間で識別され得る。対立遺伝子特異的プローブは、たいてい対で用いられ、対の１つの成分は本来の対立遺伝子を含む標的配列に完全な一致を示し、そして、他方の成分は、もう一方の対立遺伝子を含む標的配列に完全な一致を示す。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子の間のハイブリダイゼーション強度において有意な差異が存在し、そして、好ましくは、必須に２つの反応が存在するのに十分にストリンジェントであるべきである。これによって、プローブは、対立遺伝子の１つのみにハイブリダイズする。プロープが正確に相補的な標的配列にのみハイブリダイズする、ストリンジェントな、配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９））。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして、異なる環境で異なる。一般的には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特異的配列についての熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低いものに選択される。このようなハイブリダイゼーションは溶液中で実施され得るが、固相ハイブリダイゼーションアッセイを使用するのが好ましい。本発明の二対立遺伝子マーカーを含む標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション反応の前に増幅され得る。試料における特異的な対立遺伝子の存在は、プローブと標的ＤＮＡとの間で形成される安定なハイブリッド２本鎖の存在または欠失を検出することによって決定される。ハイブリッド２本鎖の検出は、多数の方法によって実施され得る。ハイブリッド２本鎖の検出を可能にする標的またはプローブのいずれかに結合される検出可能な標識を利用する種々の検出アッセイ様式は周知である。代表的には、ハイブリダイゼーション２本鎖は、ハイブリダイズしていない核酸から分離され、そして、ついで、２本鎖に結合される標識は検出される。当業者は、洗浄工程が過剰な標的ＤＮＡまたはプローブおよび非結合共役物を洗い流すために用いられ得ることを認識する。さらに、標準的な異種アッセイ様式は、プライマーおよびプローブ上に存在する標識を用いてハイブリッドを検出するのに適切である。
【０３８５】
２つの最近開発されたアッセイは、分離または洗浄の必要がないハイブリダイゼーションベースの対立遺伝子識別が可能である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  Ｕら、１９９８参照）。ＴａｑＭａｎアッセイは、蓄積増幅産物に特異的にアニーリングされたＤＮＡプローブを消化するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５´ヌクレアーゼ活性の利点を利用する。ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光エネルギー移送によって相互作用する供与体−受容体色素対を用いて標識される。増幅の間、進行するポリメラーゼによるＴａｑＭａｎプローブの切断は、供与体色素を、供与体蛍光を非常に増加させるクエンチング受容体色素から解離させる。２つの対立遺伝子の改変体を検出するのに必要な全ての試薬は、反応の開始時に組み立てられ得、そして、その結果は実時間でモニタされる（Ｌｉｖａｋら、（１９９５）参照）。代替的な均質ハイブリダイゼーションベースの方法において、分子ビーコンが対立遺伝子識別のために用いられる。分子ビーコンは、均質な溶液中の特異的な核酸の存在を報告するヘアピン形状のオリゴヌクレオチドプローブである。分子ビーコンがその標的に結合する場合、分子ビーコンは、内部的にクエンチされた蛍光団の蛍光を修復するコンホメーションの再構築を受ける（Ｔｙａｇｉら、（１９９８））。
【０３８６】
本明細書中に提示されるポリヌクレオチドは、生物学的試料における二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の検出のためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得るプローブを作製するのに用いられ得る。これらのプローブは、好ましくは、８〜５０ヌクレオチドを含み、そして、二対立遺伝子マーカーにハイブリダイズするために、本発明の二対立遺伝子マーカーを含む配列に十分に相補的であり、そして、好ましくは、１つのみのヌクレオチドバリエーションについの標的配列を識別し得るように十分に特異的である。とくに好ましいプローブは２５ヌクレオチド長である。好ましくは、二対立遺伝子マーカーはポリヌクレオチドプローブの中心から４ヌクレオチドの範囲内である。とくに好ましいプローブにおいて、二対立遺伝子マーカーは前記ポリヌクレオチドの中心にある。好ましいプローブは、表１に列記されるアンプリコンおよびそれに相補的な配列またはそのフラグメントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記フラグメントは、少なくとも約８連続したヌクレオチド、好ましくは、１０、１５、２０、より好ましくは、２５、３０、４０、４７または５０連続したヌクレオチドを含み、そして、多型塩基を含有する。好ましいプローブは、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ６〜Ｐ８０ならびにそれに相補的である配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様において、多型塩基は、前記ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２、１ヌクレオチドの範囲内、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドの中心にある。
【０３８７】
好ましくは、本発明のプローブは、固体支持体上で標識または固定化される。標識および固体支持体はさらに、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」と題される節において記載される。プローブは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」と題される節において記載されるように伸張不可能であり得る。
【０３８８】
対立遺伝子特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検査することによって、所定の試料における二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の存在または欠失を検出し得る。アレイ様式におけるハイスループット平行ハイブリダイゼーションは、「ハイブリダイゼーションアッセイ」内にとくに包含され、そして、以下に記載される。
【０３８９】
５）オリゴヌクレオチドのアクセス可能なアレイへのハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全一致標的配列改変体および不一致標的配列改変体に対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の差異に依存する。多型情報への効率的なアクセスは、選択された位置における、固体支持体（たとえば、チップ）に結合されるオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基礎構造を通じて得られる。各ＤＮＡチップは、格子様パターンに配置される数千〜数百万の個々の合成ＤＮＡプローブを含み得、そして、小銭（dime）の大きさにまで小型化し得る。
【０３９０】
チップ技術はすでに、多数のケースにおいて首尾よく適用されている。たとえば、変異のスクリーニングはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ変異株におけるＢＲＣＡ１遺伝子で、そして、ＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子で実施されている（Ｈａｃｉａら、（１９９６）；Shoemakerら、（1996）；Ｋｏｚａｌら、１９９６）。二対立遺伝子多型を検出する際に使用するための種々の様式のチップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）），Ｈｙｓｅｑ（ＨｙＣｈｉｐ  ａｎｄ  ＨｙＧｎｏｓｔｉｃｓ）およびＰｒｏｔｏｇｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより製品ベースとして製造され得る。
【０３９１】
一般的には、これらの方法は、標的配列が多型マーカーを含む個体由来の標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを使用する。欧州特許第ＥＰ７８５２８０号明細書は、一塩基多型の検出のためのタイル張り方策が記載されている。簡潔には、アレイが、多数の特定の多型について、一般的に、「タイル張り」され得る。「タイル張り」によって、一般的には、
目的の標的配列およびその配列の予め選択されたバリエーション（たとえば、１つ以上の所定の位置の、ヌクレオチドの基礎の組の1つ以上の成分での置換）に相補的な配列を構成するオリゴヌクレオチドプローブの規定された組の合成が意味される。タイル張り方策はさらに、国際公開第９５／１１９９５号パンフレットに記載される。１つの特定の態様では、アレイは多数の特異的な、同定された二対立遺伝子マーカー配列についてタイル張りされる。とくに、アレイは多数の検出ブロックを含めるようにタイル張りされる。各検出ブロックは、特異的な二対立遺伝子マーカーまたは１組の二対立遺伝子マーカーに対して特異的である。たとえば、検出ブロックは、特定の多型を含む配列セグメントに及ぶ、多数のプローブを含めるようにタイル張りされ得る。各対立遺伝子に対して相補的であるプローブを得るためには、プローブは二対立遺伝子マーカーにおいて異なる対で合成される。多型塩基において異なるプローブに加えて、一置換プローブもまた一般的には検出ブロック内にタイル張りされる。これらの一置換プローブは、多型に、および多型から両方向に一定数まで、残りのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選択される）で置換される塩基を含む。代表的には、タイル張りされた検出ブロックにおけるプローブは、二対立遺伝子マーカーまでの配列位置の置換物を含み、そして、二対立遺伝子マーカーから５塩基離れている置換物を含んでいる。一置換プローブは、人工的な交差ハイブリダイゼーションから実際のハイブリダイゼーションを区別するために、タイル張りされたアレイついて内部制御を提供する。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄の完了の際に、アレイは標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定するためにスキャンされる。ついで、スキャンされたアレイから得られるハイブリダイゼーションデータは、二対立遺伝子マーカーの一方の対立遺伝子または両方の対立遺伝子が試料において存在することを同定するために分析される。ハイブリダイゼーションおよびスキャニングは、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび同第９５／１１９９５号パンフレットならびに米国特許第５，４２４，１８６号明細書に記載されるように実施され得る。
【０３９２】
したがって、いくつかの実施態様において、チップは約１５ヌクレオチド長の核酸配列のアレイを含み得る。さらなる実施態様において、チップは表１に列記されるアンプリコンおよびそれに相補的な配列またはそのフラグメントからなる群から選択される配列の少なくとも１つを含むアレイを含み得る。前記フラグメントは少なくとも約８連続したヌクレオチド、好ましくは、１０、１５、２０、より好ましくは、２５、３０、４０、４７または５０連続したヌクレオチドを含み、そして、多型塩基を含有する。好ましい実施態様において、多型塩基は、ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２、１ヌクレオチドの範囲内、より好ましくは、前記ポリヌクレオチドの中心にある。いくつかの実施態様において、チップは、本発明のこれらのポリヌクレオチドの少なくとも２、３，４、５、６、７、８またはそれ以上のアレイを含み得る。本発明の固体支持体および固体支持体に結合されるポリヌクレオチドはさらに、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」と題される節において記載される。
【０３９３】
６）統合システム
多型を分析するのに用いられ得る別の技術としては、単一の機能的デバイスにおいて、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを小型化、かつコンピュータ化するマルチコンポーネント統合システムがあげられる。このような技術の１つの例が、チップにおけるＰＣＲ増幅およびキャピラリー電気泳動の統合を記載する米国特許第５，５８９，１３６号明細書に開示される。
【０３９４】
統合システムは、マイクロ流体システムが用いられる場合、主に認識され得る。これらのシステムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英またはプラスチックウェハー上に設計されるマイクロチャネルのパターンを含む。試料の移動は、移動する部品を有さない機能的な微視的な弁およびポンプを作製すために、マイクロチップの異なる領域にわたって適用される電気的、電気浸透圧的、または静水圧的な力によって制御される。
【０３９５】
二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定するために、マイクロ流体システムは、核酸増幅、マイクロ配列決定、キャピラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出法などの検出方法を統合し得る。
【０３９６】
［本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる遺伝子分析の方法］
異なる方法が、複雑な形質の遺伝子分析に利用可能である（LanderおよびSchork、1994参照）。疾患−感受性遺伝子に関する検索が以下の2つの主要な方法：家族歴研究を用いる遺伝子座と推定形質遺伝子座との間の同時分離について証拠が求められる連鎖手法、および対立遺伝子と、形質または形質原因対立遺伝子との間の統計的に有意な関連について証拠が求められる関連手法（Khouryら、1993）を用いて実施される。一般的には、本発明の二対立遺伝子マーカーは、遺伝子型と表現型との間の統計的に有意な相関を実証するために、当該分野で公知の任意の方法における用途を見出す。二対立遺伝子マーカーは、パラメトリックおよび非パラメトリック連鎖分析法において用いられ得る。好ましくは、本発明の二対立遺伝子マーカーは、関連研究と、罹患家族を用いることを必要とせず、そして複雑かつ散発性の形質に関連している遺伝子の同定を可能にする手法とを用いて、検出可能な形質と関連している遺伝子を同定するのに用いられる。
【０３９７】
本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる遺伝子分析は、いかなる規模であっても実施され得る。本発明の二対立遺伝子マーカーの全ての組、または、候補遺伝子に相当する本発明の二対立遺伝子マーカーの任意の部分的な組が用いられ得る。さらに、本発明の二対立遺伝子マーカーを含む遺伝子マーカーの任意の組が用いられ得る。本発明の二対立遺伝子マーカーと組み合わせて遺伝子マーカーとして用いられ得る二対立遺伝子多型の組は、国際公開第９８／２０１６５号パンフレットに記載されている。前記のように、本発明の二対立遺伝子マーカーがヒトゲノムのいずれかの完全な、または部分的な遺伝子地図の中に含められ得ることに留意すべきである。これらの異なる用途は、本発明および特許の請求範囲においてとくに考察される。
【０３９８】
［連鎖分析］
連鎖分析は、遺伝子マーカーの伝達と、家族内の世代を通じる特定形質の伝達との間の相関関係の確立に基づく。したがって、連鎖分析の目的は、系統の中にある目的の形質と同時分離を示すマーカー遺伝子座を検出することである。
【０３９９】
［パラメトリック法］
連続している世代からデータが入手可能である場合は、遺伝子座対の間の連鎖の程度を研究する機会が与えられる。組換え分画の推定値により、遺伝子座を遺伝子地図上に規則正しく、かつ位置付けることが可能となる。遺伝子マーカーである遺伝子座により、遺伝子地図は確立され得、ついで、マーカーと形質との間の連鎖の強さが算出され得、そして、マーカーの相対的な位置とそれらの形質に影響を及ぼす遺伝子を示すのに用いられ得る（Weir，1996）。連鎖分析のための古典的な方法は、オッズ（ロッド）スコア法の対数である（Morton，1955；Ott，1991参照）。その疾患に対する遺伝の様式の規格値がロッドスコアの計算には必要となる（パラメトリック法）。一般的には、連鎖分析を用いて同定された候補領域の長さは、２〜２０Ｍｂの間である。いったん、候補領域が前記のように同定されると、さらなるマーカーを用いる組換え個体の分析により、さらに、候補領域の描写が可能となる。連鎖分析研究は、一般的には最大５，０００のマイクロサテライトマーカーの使用に頼っている。したがって、連鎖分析の理論的達成可能最大解像度は、平均で約６００ｋｂまでに制限される。
【０４００】
連鎖分析は、明確なメンデル遺伝パターンを示す単純な遺伝的形質を地図に首尾よく適用され、そして高い浸透度（すなわち、対立遺伝子aの形質陽性キャリアの数と、集団におけるaキャリアの総数との間の比率）を有している。しかし、パラメトリック連鎖分析は、種々の欠点を被る。第1に、それは、それぞれ研究される形質に適切な遺伝子モデルの選択に依存することにより制限される。さらに、すでに述べたように、連鎖分析を用いて達成可能な解像度が限定され、そして、連鎖分析を通じて最初に同定された典型的な２Ｍｂ〜２０Ｍｂ領域の分析を精密化するためには補足的な研究が必要となる。さらに、パラメトリック連鎖分析手法は、複数遺伝子および／または環境因子の組み合わせた作用による遺伝形質などの複雑な遺伝形質に適用する場合は、困難なものとなる。ロッドスコア分析において適切にこれらの因子をモデル化することは非常に困難である。このような場合には、Risch，N．およびMerikangas，K．（1996）により最近になって議論されているように、これらの状況に連鎖分析を適用するために必要とされる罹患家族の十分な数を補うためには、非常に大きな努力と費用が必要となる。
【０４０１】
［非パラメトリック法］
連鎖分析のためのいわゆる非パラメトリック法の利点は、これらの方法では、疾患に対する遺伝の様式の規格値を必要とせず、複雑な形質の分析に対してより有用である傾向にあることである。非パラメトリック法において、染色体領域の遺伝パターンを証明する試みは、罹患した親族が、偶発性が予期されるよりも、頻繁に領域の同一コピーを遺伝的に受け継ぐことを示すことによって、無作為なメンデル分離と一致しない。罹患した親族は、不完全な浸透度で、かつ多遺伝子の遺伝の存在下でも過剰な「対立遺伝子共有」を示すべきである。非パラメトリック連鎖分析においては、２個体におけるマーカー遺伝子座の一致の程度は、状態が同一の対立遺伝子の数（ＩＢＳ）によってか、または家系が同一の対立遺伝子の数（ＩＢＤ）によってかのいずれかで測定され得る。罹患血縁集団対分析は、周知の特別なケースであり、かつ、これらの方法のもっとも簡単な形態である。
【０４０２】
本発明の二対立遺伝子マーカーは、パラメトリックおよび非パラメトリック連鎖分析の両方で用いられ得る。好ましくは、二対立遺伝子マーカーは、複雑な形質に関与している遺伝子の地図作成を可能にする非パラメトリック法において用いられ得る。本発明の二対立遺伝子マーカーは、複雑な形質に影響を及ぼす遺伝子を地図化するＩＢＤ−およびＩＢＳ法の両方で用いられ得る。このような研究においては、二対立遺伝子マーカーの高密度という利点を利用して、いくつかの隣接している二対立遺伝子マーカーの遺伝子座が、複数対立遺伝子マーカーにより獲得される効率を達成するために、プールされ得る（Zhaoら，1998）。
【０４０３】
［集団関連研究］
本発明は、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いて、ＰＧ−３遺伝子および検出可能な形質との間の関連を検出するための方法を含む。１つの実施態様では、本発明は二対立遺伝子マーカー対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーハプロタイプと形質との間の関連を検出するための方法を含む。さらに、本発明は、本発明のいずれかの二対立遺伝子マーカー対立遺伝子と連鎖不平衡にある形質原因対立遺伝子を同定するための方法を含む。
【０４０４】
前記のように、代替的なアプローチは、関連研究、ゲノムワイド関連研究、候補領域関連研究および候補遺伝子関連研究を実施するために用いられ得る。好ましい実施態様では、本発明の二対立遺伝子マーカーは、候補遺伝子関連研究を実施するために用いられる。候補遺伝子分析は、形質の生物学に関する何らかの情報が入手可能な場合には、遺伝子の同定と特定の形質に関する遺伝子多型に対する簡便な手法を明確に提供する。さらに、本発明の二対立遺伝子マーカーは、ゲノムワイド関連研究を実施するために、ヒトゲノムの遺伝子マーカーのいずれかの地図に取り込まれ得る。二対立遺伝子マーカーの高密度地図を生成するための方法は、米国仮特許出願第６０／０８２，６１４号明細書に記載されている。本発明の二対立遺伝子マーカーはさらに、ゲノムの特定候補領域（たとえば、特定の染色体または特定の染色体セグメント）のいずれかの地図に取り込まれ得る。
【０４０５】
前記のように、関連研究は、一般的な集団内で実施され得、かつ、罹患家族における関連個体に対して実施される研究に限定されない。関連研究は、散発性または複数因子の形質の分析を可能にするので、非常に価値が高い。さらに、関連研究は、連鎖研究よりも形質原因対立遺伝子の非常に緻密な地図作成を可能にする緻密なスケールの地図作成のための強力な方法を示す。系統をベースにした研究は、たいてい、形質原因対立遺伝子の位置付けを単に狭くするだけである。したがって、本発明の二対立遺伝子マーカーを用いる関連研究は、連鎖分析法によって同定された候補領域における形質原因対立遺伝子の位置付けを精緻化するのに用いられ得る。さらに、いったん、目的の染色体セグメントが同定されれば、目的の領域にある候補遺伝子（たとえば、本発明の候補遺伝子）の存在により、形質原因対立遺伝子の同定への近道が提供され得る。本発明の二対立遺伝子マーカーは、候補遺伝子が形質と関連していることを実証するのに用いられ得る。このような用途は、本発明にとくに考慮される。
【０４０６】
［集団における二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度または二対立遺伝子マーカーハプロタイプの頻度の測定］
【０４０７】
関連研究は、遺伝子座間の対立遺伝子の組に関する頻度間の関係を探索する。
【０４０８】
［集団における対立遺伝子の頻度の測定］
集団における二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子フラグメントは、「二対立遺伝子マーカーについて個体の遺伝子型を決定する方法」という題名の下で前記の方法のうちの1つ、または、この意図される目的に適切な任意の遺伝子型決定手法を用いて測定され得る。プールされた試料または個体の試料の遺伝子型の決定は、集団における二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を測定し得る。遺伝子型決定の数を減らすのに必要な1つの方法は、プールされた試料を用いることである。プールされた試料を用いる際の欠点は、プールを設定する際に、正確なＤＮＡ濃度を測定するための正確さおよび再現性という点である。個体の試料の遺伝子型を決定することによって、高い感受性、再現性、正確さがもたらされ、そして、これは、本発明で用いられる好ましい方法である。好ましくは、各個人が、別々に遺伝子型決定され、そして、簡単な遺伝子カウントが、二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度、または所定の集団における遺伝子型の頻度を測定するために適用される。
【０４０９】
本発明はまた、以下を含む集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法に関する：ａ）本発明の方法により、前記二対立遺伝子マーカーについて前記集団からの個体の遺伝子型を決定する工程；ｂ）前記集団において、前記二対立遺伝子マーカーの比率を測定する工程。さらに、本発明の集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法は、この開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、または以下に特定される単独または任意の組み合わせの方法を包含する；任意に、ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーの１つである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、集団における二対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度の測定が、この集団における各個体のゲノムに存在する前記二対立遺伝子マーカーの両複製物についてヌクレオチドの同一性の測定、および、集団について前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーにある前記ヌクレオチドの比率の算定を行うことによって達成され得る；任意に、比率の測定は、集団における個体の、または各個人の代表的な数から得られたプールされた生物学的試料に対して、本発明の遺伝子型決定方法の実施、および、合計と比較した前記ヌクレオチドの比率の算定を行うことによって達成され得る。
【０４１０】
［集団におけるハプロタイプの頻度の測定］
二倍体個体が1つより多くの遺伝子座でヘテロ接合性である場合は、ハプロタイプの配偶子相は未知である。家族における系統情報を使用することにより、配偶子相は場合によっては推測され得る（Perlinら、1994）。系統情報が入手不可能である場合は、異なる方策が用いられ得る。１つの可能性は、ホモ接合体と単一部位ヘテロ接合体の個体のみを維持しながら、複数部位へテロ接合二倍体を分析から除外し得るが、この手法は試料組成における潜在的な偏りおよび低頻度のハプロタイプという過小評価を引き起こすことも考えられる。別の可能性は、たとえば、不斉ＰＣＲ増幅（Newtonら、1989；Wuら、1989参照）によって、または、限定希釈により単一染色体の単離（Ruanoら、1990参照）、その後のＰＣＲ増幅によって、単一染色体が個々に研究され得る。さらに、試料は特定の対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅によって十分に近い二対立遺伝子マーカーについてハプロタイプ化され得る（Sarkar，G．とSommer，S．S，1991）。これらの手法は、それらの技術的な複雑さ、それに必然的に伴うさらなる費用、大規模での一般化が欠如しているため、または、それらにより導入される潜在的な偏りのため、いずれも完全には満足できるものではない。これらの困難を克服するために、Clark，A．G．（1990）により導入されたＰＣＲ増幅ＤＮＡ遺伝子型の相を推測するためのアルゴリズムが用いられ得る。簡潔には、その原理は、明らかな個体（すなわち、完全なホモ接合体および単一部位へテロ接合体）を調査することによって、試料に存在するハプロタイプの予備的なリストの補充を開始することである。ついで、同じ試料中の他の個体は、予め認識されたハプロタイプの潜在的な発生についてスクリーニングされる。各陽性同定について、全ての個体についての相情報が解明されるかまたは未解明のまま同定されるまでは、相補的なハプロタイプが、認識されたハプロタイプのリストに加えられる。この方法は、単一ハプロタイプを各複数のヘテロ接合性の個体に割り当てるが、一方、１つより多くのヘテロ接合部位が存在する場合には、いくつかのハプロタイプが可能となる。あるいは、各個体にハプロタイプを割り当てることなく、集団におけるハプロタイプ頻度を推定する方法を用い得る。好ましくは、Hardy−Weimberg比率（無作為マッチング）の仮定の下でハプロタイプの頻度の最尤推定量につながる予測最大化（ＥＭ）アルゴリズム（Dempsterら、1977）に基づく方法が用いられる（Excoffier L．およびSlatkin M．，1995参照）。ＥＭアルゴリズムは、データが曖昧および／または不完全である場合、有用である推定に対する一般化された繰り返し最尤推定手法である。ＥＭアルゴリズムは、ヘテロ接合体をハプロタイプに分析するのに用いられる。ハプロタイプ推定はさらに、「統計的方法」という題名の下、以下に記載される。集団におけるハプロタイプの頻度を測定または推定するための、当該分野で公知の任意の他の方法が用いられ得る。
【０４１１】
本発明はまた、集団における二対立遺伝子マーカーの組に関するハプロタイプの頻度を推定する方法を包含し、以下の工程を含む：ａ）前記集団における各個体について、本発明の方法にしたがって、少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する工程；ｂ）前記集団における各個体のゲノムに存在する第２の二対立遺伝子マーカーの両複製物について、前記第２の二対立遺伝子マーカーにあるヌクレオチドの同一性を決定することによって前記第２の二対立遺伝子マーカーの遺伝子型を決定する工程；およびｃ）前記頻度の推定値を得るために、工程ａ）およびｂ）において決定されたヌクレオチドの同一性に対してハプロタイプ決定方法を適用する工程。さらに、本発明のハプロタイプの頻度を推定する方法は、この開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、または以下に特定される単独または任意の組み合わせの方法を包含する；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、前記ハプロタイプ決定方法は、不斉ＰＣＲ増幅、特定対立遺伝子の二重ＰＣＲ増幅、Ｃｌａｒｋアルゴリズムまたは予測最大化アルゴリズムによって実施される。
【０４１２】
［連鎖不平衡分析］
連鎖不平衡は、２つ以上の遺伝子座における対立遺伝子の非無作為関連であり、そして、疾患形質に関与している遺伝子地図を作成するための強力な手段を提供する（Ajioka，R．S．ら、1997参照）。二対立遺伝子マーカーはヒトゲノムにおいて密度に分散しており、そして、他の型の遺伝子マーカー（たとえば、RFLPまたはVNTRマーカー）よりも多くの数で遺伝子型を決定し得るので、二対立遺伝子マーカーは、連鎖不平衡に基づく遺伝子分析においてとくに有用である。
【０４１３】
疾患変異が集団に最初に導入される場合（新たな変異により、あるいは変異キャリアの転位により）、それは必然的に単一染色体上にあって、したがって、連結されたマーカーの単一の「経歴」または「祖先」のハプロタイプ上にある。結果として、これらマーカーと疾患変異との間の完全な不平衡が存在する。すなわち、マーカー対立遺伝子の特定の組の存在下でのみ疾患変異が見出される。その後の世代の組換えにより、事象は疾患変異とこれらのマーカー多型との間で生じ、かつ、不平衡は次第に消散する。この消散のペースは組換え頻度の機能であり、そのため、疾患遺伝子にもっとも近いマーカーは、さらに離れているものよりも高いレベルの不平衡を示す。組換えにより破壊されない場合、「祖先」ハプロタイプ、および異なる遺伝子座におけるマーカー遺伝子間の連鎖不平衡は、系統によってのみならず、集団によっても追跡することができる。連鎖不平衡は、通常、１つの遺伝子座にある１つの特定の対立遺伝子と、第２の遺伝子座にある別の特定の対立遺伝子との間の関連として理解される。
【０４１４】
疾患とマーカー遺伝子座との間の不平衡のパターンまたは曲線は、疾患遺伝子座で生じる最大値を示すことが予期される。結果として、疾患対立遺伝子と密接に連結されている遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡の量は、疾患遺伝子の位置に関する価値のある情報を生じ得る。疾患遺伝子座の緻密なスケールの地図作成に関しては、研究された領域のマーカー間に存在する連鎖不平衡のパターンのいくつかの知識を有することが有用である。前記のように、連鎖不平衡の分析により達成される地図作成解像度は、連鎖研究のそれよりもずっと高いものである。連鎖不平衡分析と組み合わせる二対立遺伝子マーカーが高密度であることは、緻密なスケールの地図作成には強力な手段を提供する。連鎖不平衡を算定するための異なる方法は、「統計的方法」という題名の下で以下に記載される。
【０４１５】
［形質−マーカー関連の集団ベースの患者対象研究］
前記のように、同一の染色体上の異なる遺伝子座にある特定の対立遺伝子の対の発生は無作為ではなく、そして、無作為からの偏差は連鎖不平衡と呼ばれる。関連研究は集団頻度に焦点を当て、そして、連鎖不平衡の現象による。所定の遺伝子における特定の対立遺伝子が特定の形質の原因となることに直接関与している場合、形質陰性集団における、または無作為対照集団における、頻度と比較されると、その頻度は、罹患している（形質陽性）集団において、統計的に上昇される。連鎖不平衡の存在の結果として、形質原因対立遺伝子を保持するハプロタイプに存在する全ての他の対立遺伝子の頻度もまた、形質陰性個体または無作為対照と比較して、形質陽性個体においては上昇される。したがって、形質原因対立遺伝子との連鎖不平衡における形質と任意の対立遺伝子（とくに二対立遺伝子マーカー対立遺伝子）との間の関連は、その特定の領域における形質関連遺伝子の存在を示唆するのに十分なものである。患者対照集団は、形質原因対立遺伝子を狭い領域で位置付ける関連を同定するために、二対立遺伝子マーカーについて、遺伝子型が決定され得る。形質に関連する１つの所定のマーカーによって連鎖不平衡状態にある任意のマーカーは、形質と関連される。連鎖不平衡により、形質原因対立遺伝子を見出すために、全ての可能性のある機能的な多型をスクリーニングすることに対する１つの代替として分析される遺伝子多型（とくに、二対立遺伝子マーカー）の限定された数の患者対照集団における相対的な頻度が計算可能となる。関連研究は、家族歴のない患者対照集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度を比較し、そして複雑な形質の分析のための強力な手段を提供する。
【０４１６】
［患者対照集団（包括的基準）］
集団ベース関連研究は、家族遺伝に関するものではなく、患者対照集団において、特定の遺伝子マーカー、またはマーカーの組の罹患率を比較するものである。これら研究は、家族歴のない患者（罹患または形質陽性）個体と家族歴のない対照（非罹患、形質陰性または無作為）個体の比較に基づく患者対照研究である。好ましくは、対照群は非罹患または形質陰性個体から構成される。さらに、対照群は患者集団に民族的に一致している。さらに、対照群は、好ましくは、研究中の形質に関する主要な公知の混乱因子（たとえば、年齢依存形質に関しては年齢一致）について、患者集団に一致している。理想的には、２つの試料における個体は、それらの疾患状態においてのみ異なると予期されるような方法で、対にされる。用語「形質陽性集団」、「患者集団」および「罹患集団」は、本明細書中で互換可能に用いられる。
【０４１７】
関連研究を用いた複雑な形質の分析における重要な工程は、患者対照集団の選択である（LanderおよびSchork，1994参照）。患者対照集団の選択における主要な工程は、所定の形質または表現型の臨床上の定義である。任意の遺伝的形質は、本明細書に提案されている関連方法により、形質陽性および陰性形質表現型群に含まれる個体を注意深く選択することにより、分析され得る。４つの基準：臨床的表現型、発症年齢、家族歴および重篤度がしばしば有用である。連続的または量的形質（たとえば、血圧など）に対する選択手順は、研究中の形質の表現型分布の反対端にある個体が、非重複表現型のこれらの形質陽性および形質陰性集団の個体に含まれるように選択する工程を含む。好ましくは、患者対照集団は、表現型として均質な集団からなる。形質陽性および形質陰性集団は、それぞれ、研究中の合計集団の１〜９８％、好ましくは１〜８０％、より好ましくは１〜５０％、およびより好ましくは１〜３０％、もっとも好ましくは、１〜２０％を示す個体の表現型として均一な集団からなり、そして、好ましくは、非重複表現型を示す個体から選択される。２つの形質表現型間の差が明確であれば、二対立遺伝子マーカーとの関連の検出の確率は高くなる。劇的に異なるが、比較的均一な表現型のこれらの個体の選択により、研究中の集団の試料の大きさが有意に十分であれば、関連研究における有効な比較および遺伝子レベルでの著しい差の潜在的な検出が可能となる。
【０４１８】
好ましい実施態様において、５０〜３００の形質陽性個体、好ましくは、約１００の個体の第１群は、それらの表現型にしたがい補充される。対照個体の同様の数がこのような研究に含まれる。
【０４１９】
［関連分析］
本発明はまた、遺伝子型と表現型との間の関連を検出する方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）本発明の遺伝子型決定方法により、形質陽性集団における少なくとも１つのＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの頻度を測定する工程；ｂ）本発明の遺伝子型決定方法により、対照集団における前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーの頻度を測定する工程；およびｃ）統計的に有意な関連が、前記遺伝子型と前記表現型との間に存在するか否かを測定する工程。さらに、本発明の遺伝子型および表現型との間の関連を検出する方法は、この開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、または以下に特定される単独または任意の組み合わせの方法を包含する；任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、対照集団は、形質陰性集団または無作為集団であり得る；任意に、遺伝子型決定工程ａ）およびｂ）のそれぞれが、前記集団のそれぞれから得られるプールされた生物学的試料に対して実施され得る；任意に、前記遺伝子型決定工程ａ）およびｂ）のそれぞれが前記集団またはそのサブ試料中の各個体から得られた生物学的試料に対して個々に実施される；任意に、前記形質は、癌または異常な細胞分化に関連する障害に感受性がある。
【０４２０】
候補遺伝子を保持する領域から得られた二対立遺伝子マーカーを用いる関連研究を実施するための一般的な方策は、個体の２つの群（患者対照集団）において、本発明の二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を測定しかつ統計的に比較するために、両群をスキャンすることである。
【０４２１】
形質との統計的に有意な関連が、分析された二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つ以上について同定される場合は、以下のことを仮定し得る：関連対立遺伝子が形質の直接の原因である（すなわち、関連対立遺伝子は形質原因対立遺伝子である）か、または、関連対立遺伝子が、形質原因対立遺伝子を伴なう連鎖不平衡状態にあるかのいずれかである。候補遺伝子機能に対する関連対立遺伝子の特定の特徴は通常、関連対立遺伝子と形質との間の関係（原因となるもの、または連鎖不平衡にあるもの）にさらに識見を提供する。証拠が、候補遺伝子内の関連対立遺伝子が、形質原因対立遺伝子のとなることはおそらくないが、真の形質原因対立遺伝子を伴う連鎖不平衡状態にあることを示している場合、形質原因対立遺伝子は、関連マーカーの近傍の配列決定、および反復様式で明らかにされる多型に関するさらなる関連研究を実施することによって見出され得る。
【０４２２】
関連研究は通常、２つの連続的な工程で行われる。第１相において、候補遺伝子由来の減少された数の二対立遺伝子マーカーの頻度が、形質陽性および対照集団において測定される。分析の第２相において、所定の形質の原因である遺伝子座の位置が、関連領域由来の非常に密度の高いマーカーを用いてさらに精緻化される。しかし、研究中の候補遺伝子が比較的短い長さである場合、ＰＧ−３に関する場合と同様に、単一相が、有意な関連を確立するのに十分であり得る。
【０４２３】
［ハプロタイプ分析］
前記のように、変異かまたは転位かのいずれかの結果として、疾患対立遺伝子を保持する染色体が最初に集団において現れる場合、変異対立遺伝子が、連結されるマーカーの組を有する染色体（祖先ハプロタイプ）上に必然的に存在する。このハプロタイプは、集団により追跡され得、そして、所定の形質とのその統計的な関連が分析され得る。単一点（対立遺伝子）関連研究を、ハプロタイプ研究といわれる複数点関連研究で補足することにより、関連研究の統計的な力は増加する。したがって、ハプロタイプ関連研究により、祖先キャリアハプロタイプの頻度および型を定義することが可能となる。ハプロタイプ分析は、それが個体のマーカーを含む、分析の統計的な力を増加させるという点で重要である。
【０４２４】
ハプロタイプ頻度分析の第１段階では、本発明の同定された二対立遺伝子マーカーの種々の組合せに基づく可能なハプロタイプの頻度が測定される。ついで、ハプロタイプ頻度は、形質陽性および対照個体の別個の集団について比較される。統計的に有意な結果を得るためにこの分析に供されるべき形質陽性個体の数は、通常３０〜３００の範囲であり、個体の好ましい数としては、５０〜１５０の範囲である。同じ配慮が、本研究の中で用いられる非罹患個体（または無作為対照）の数に適用される。この最初の分析の結果により、患者対照集団におけるハプロタイプ頻度が提供され、各評価されたハプロタイプ頻度に関しては、ｐ値およびオッズ比が算定される。統計的に有意な関連が見出される場合、研究中の形質により罹患される所定のハプロタイプを保持する個体についての相対的な危険は、おおよその算定を行い得る。
【０４２５】
本発明のさらなる実施態様は、ハプロタイプと表現型との間の関連の検出方法を包含し、それは、以下の工程を包含する：ａ）ハプロタイプの頻度を推定するための本発明の方法により、形質陽性集団における少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する工程；ｂ）ハプロタイプの頻度を推定するための本発明の方法により、対照集団における前記ハプロタイプの頻度を推定する工程；およびｃ）前記ハプロタイプと前記表現型との間に統計的に有意な関連が存在するか否かを測定する工程。さらに、本発明のハプロタイプと表現型との間の関連を検出する方法は、この開示に記載される任意のさらなる限定を有する方法、または以下の方法を包含する：任意に、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択され、または、任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ５およびＡ８〜Ａ８０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、ここで、前記ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーは、Ａ６およびＡ７ならびにそれらの相補鎖からなる群から選択され、または任意に、それらを用いる連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーである；任意に、対照集団は、形質陰性集団または無作為集団であり得る；任意に、前記方法は、工程ｃ）の前に、前記形質陽性および前記対照集団において表現型を測定するさらなる工程を含む；任意に、前記形質は、癌または異常な細胞分化に関連する障害に感受性がある。
【０４２６】
［相互作用分析］
本発明の二対立遺伝子マーカーはまた、多遺伝子相互作用から生じる検出可能な形質と関連する二対立遺伝子マーカーのパターンを同定するために用いられ得る。非連結遺伝子座にある対立遺伝子間の遺伝的相互作用の分析は、本明細書中に記載の技術を用いて個体の遺伝子型を決定することを必要とする。適当なレベルの統計的な有意性を有する二対立遺伝子マーカーの選択された組における対立遺伝子相互作用の分析は、ハプロタイプ分析として考慮され得る。相互作用分析は、第１の遺伝子座に関して、所定のハプロタイプに対する患者対照集団を階層化し、そして各サブ集団の第２の遺伝子座に関するハプロタイプ分析を実施することにある。
【０４２７】
関連研究において用いられる統計的方法はさらに以下に記載される。
【０４２８】
［関連の存在下での連鎖に関する試験］
本発明の二対立遺伝子マーカーはさらに、ＴＤＴ（伝達／不平衡試験）において用いられ得る。ＴＤＴは連鎖および関連の両方について試験され、そして、集団階層化によって影響されない。ＴＤＴは、罹患個体およびそれらの両親に関するデータ、または、両親からのデータの代わりに、罹患していない親族からのデータが必要となる（Spielmann  S．ら、1993；Schaid  D．J．ら、1996；Spielmann  S．およびEwens  W．J．，1998参照）。このような組合せ試験は一般的に、別個の分析によって生じる偽陽性誤差を軽減する。
【０４２９】
［統計的方法］
一般に、形質と遺伝子型とが統計的に有意な相関関係を示すかどうかを試験するために当技術分野において公知の任意の方法が用いられ得る。
【０４３０】
１）連鎖解析における手法
連鎖解析に有用な統計的手法およびコンピュータープログラムは当業者に周知である（Terwilliger J. D. and Ott J., 1994; Ott J., 1991参照）。
【０４３１】
２）集団におけるハプロタイプの頻度を推定する方法
前記のように、遺伝子型が記録される際、ハプロタイプの頻度が容易に推測できないように、ヘテロ接合体を見分けることはたいてい不可能である。配偶子相（gametic phase）が未知の場合、ハプロタイプ頻度は多遺伝子座の遺伝子型データから推定することができる。当業者に公知の任意の方法がハプロタイプ頻度の推定に使用され得る（Lange K., 1997; Weir, B. S., 1996参照）。好ましくは、最尤ハプロタイプ頻度は、予想−極大化（Expectation Maximization）（ＥＭ）アルゴリズムを用いて計算される（Dempster et al., 1977; Excoffier L. and Slatkin M., 1995参照）。この手法は、配偶子相が未知の場合に多遺伝子座の遺伝型データからハプロタイプ頻度の最尤推定値を得ることを目的とする反復法である。ハプロタイプ推定は通常、たとえばＥＭ−ＨＡＰＬＯプログラム（Hawley M. E. et al., 1994）またはアルルカン（Arlequin）プログラム（Schneider et al., 1997）を用いて、ＥＭアルゴリズムを適用することによって行われる。ＥＭアルゴリズムは推定のための汎用反復最尤アプローチであり、以下に簡単に説明する。
【０４３２】
本節「集団におけるハプロタイプの頻度を推定する方法」において、表現型は不明なハプロタイプ相を有する多遺伝子座遺伝子型をいい、遺伝子型は既知のハプロタイプ相を有する多遺伝子座遺伝子型をいうことに留意する必要がある。
【０４３３】
Ｋマーカーに対してタイプ分けされたＮ非関連個体の試料を有する場合を仮定する。観測されたデータは、Ｆ相違表現型で分類することができる不明な相Ｋ−遺伝子座表現型である。さらに我々はＨ予想ハプロタイプ（Ｋ二対立遺伝子マーカーの場合、我々は予想ハプロタイプＨ＝２Kの最大数に対して有する）を有すると仮定する。
【０４３４】
ｃｊ予想遺伝子型を伴う表現型ｊに対して、我々は方程式１を有する。
【０４３５】
【数１】
2004520055.tif 000003
【０４３６】
式中、Ｐjはｊth表現型の確率であり、Ｐ（ｈk，ｈl）は、ハプロタイプｈkおよびｈlからなるｉth遺伝子型の確率である。ランダムマッチング（すなわちハーディー−ワインバーグ（Hardy-Weinberg）平衡）のもと、Ｐ（ｈk，ｈl）は、
【０４３７】
【数２】
2004520055.tif 000004
【０４３８】
として表わされる。
【０４３９】
Ｅ−Ｍアルゴリズムは以下の工程からなる。初めに、遺伝子型頻度を一組のハプロタイプ頻度の初期値から推定する。これらのハプロタイプ頻度はＰ1(0)、Ｐ2(0)、Ｐ3(0)、・・・、ＰH(0)で表示される。ハプロタイプ頻度の初期値は乱数発生器から、またはいくつかの当該分野で公知の他の方法で得られ得る。この工程は予想工程という。この方法における次の工程は、最大化工程と呼ばれ、遺伝子型頻度に対する推定値を使用し、ハプロタイプ頻度を再計算することからなる。第１の反復ハプロタイプ頻度推定値はＰ1(1)、Ｐ2(1)、Ｐ3(1)、・・・、ＰH(1)で表示される。一般に、Ｓth反復での予想工程は、先の反復のハプロタイプ頻度に基づき各表現型を異なる予想遺伝子型に置く確率を計算することから構成される。
【０４４０】
【数３】
2004520055.tif 000005
【０４４１】
式中、ｎjはｊth表現型を有する個体数であり、Ｐ（ｈk，ｈl）（ｓ）は表現型ｊにおける遺伝子型ｈk，ｈlの確率である。遺伝子計測法（Smith, 1957）と等価である最大化工程において、ハプロタイプ頻度は遺伝子型推定値に基づき再推定される。
【０４４２】
【数４】
2004520055.tif 000006
【０４４３】
式中、δitは、ハプロタイプｔがｉth遺伝子型に存在する発生数を数える指示変数であり、値０、１および２をとる。
【０４４４】
Ｅ−Ｍ反復法は、以下の判定基準が到達されると中止する。最尤推定（ＭＬＥ）理論を用いることにより、表現型ｊが多項的に分配されると仮定する。各反復ｓで、尤度関数Ｌを計算することができる。２つの連続反復間のｌｏｇ最尤の差が、多少小さな数、好ましくは１０-7より小さい場合に収束する。
【０４４５】
３）マーカー間の連鎖不平衡を計算する方法
ある２つの遺伝子の位置の間の連鎖不平衡を計算するために、数多くの方法を使用することができる。とくに、連鎖不平衡は、集団から得られたハプロタイプデータに統計的関連試験を適用することによって測定される。
【０４４６】
マーカーＭiで対立遺伝子（ａi／ｂi）およびマーカーＭjで対立遺伝子（ａj／ｂj）を有する本発明の二対立遺伝子マーカー（Ｍi，Ｍj）の少なくとも１つを含む一対の二対立遺伝子マーカー間の連鎖不平衡は、以下のピアッツァ（Piazza）の式にしたがいすべての対立遺伝子の組合せ（ａi，ａj；ａi，ｂj；ｂi，ａjおよびｂi，ｂj）に対して計算される。
【０４４７】
【数５】
2004520055.tif 000007
【０４４８】
θ４＝−−＝Ｍiでａiの対立遺伝子を有さず、Ｍjでａjの対立遺伝子を有さない遺伝子型の頻度
θ３＝−＋＝Ｍiでａiの対立遺伝子を有さず、Ｍjでａjの対立遺伝子を有する遺伝子型の頻度
θ２＝＋−＝Ｍiでａiの対立遺伝子を有し、Ｍjでａjの対立遺伝子を有する遺伝子型の頻度
【０４４９】
二対立遺伝子マーカー（Ｍi，Ｍj）の対の間の連鎖不平衡（ＬＤ）はまた、ウェアー（Weir B. S., 1996）により説明されているように、デルタ（コンポジット遺伝子型不平衡係数）に対する最尤推定（ＭＬＥ）にしたがいすべての対立遺伝子の組合せ（ａi，ａj；ａi，ｂj；ｂi，ａjおよびｂi，ｂj）に対して計算される。コンポジット連鎖不平衡に対するＭＬＥは、
Ｄaiaj＝（２ｎ1＋ｎ2＋ｎ3＋ｎ4／２）／Ｎ−２（ｐｒ（ａi），ｐｒ（ａj））
であり、式中、ｎ1＝Σ表現型（ａi／ａi，ａj／ａj）、ｎ2＝Σ表現型（ａi／ａi，ａj／ｂj）、ｎ3＝Σ表現型（ａi／ｂi，ａj／ａj）、ｎ4＝Σ表現型（ａi／ｂi，ａj／ｂj）およびＮは試料中の個体数である。
【０４５０】
この式は、遺伝子型のデータのみが使用でき、かつハプロタイプのデータが使用できない場合に、対立遺伝子間の連鎖不平衡を推定することを可能とする。
【０４５１】
マーカー間の連鎖不平衡を計算するもう１つの手段は以下の通りである。一対の二対立遺伝子マーカー、Ｍi（ａi／ｂi）およびＭj（ａj／ｂj）に対して、ハーディー−ワインバーグ平衡を適合することによって、前述のアプローチにしたがって与えられた集団において４つの予想ハプロタイプ頻度が推定できる。
【０４５２】
ａｉおよびａｊ間の配偶子不平衡の推定は、単純に、
【０４５３】
【数６】
2004520055.tif 000008
【０４５４】
である。
【０４５５】
式中、ｐｒ（ａi）は対立遺伝子ａiの確率であり、ｐｒ（ａj）は対立遺伝子ａjの確率であり、ｐｒ（ハプロタイプ（ａi，ａj））は前記方程式３において推定される。
【０４５６】
一対の二対立遺伝子マーカーに関して、不平衡のただ１つの指標（measure）がＭiとＭjとの間の関連を説明するために必要である。
【０４５７】
ついで、前記の標準化された値が以下のように計算される。
【０４５８】
Ｄaiaj＜０で、Ｄ’ aiaj＝Ｄaiaj／最大（−ｐｒ（ａi）．ｐｒ（ａj），−ｐｒ（ｂi）．ｐｒ（ｂj））
Ｄaiaj＞０で、Ｄ’ aiaj＝Ｄaiaj／最大（ｐｒ（ｂi）．ｐｒ（ａj），ｐｒ（ａi）．ｐｒ（ｂj））
【０４５９】
当業者は、他の連鎖不平衡計算方法が使用できることを容易に理解するであろう。
【０４６０】
適当な異型接合性率を有する一組の二対立遺伝子マーカーの間の連鎖不平衡は、５０および１００間の非関連個体、好ましくは７５および２００間の、より好ましくはおおよそ１００の非関連個体の遺伝子型を特定することにより決定することができる。
【０４６１】
４）関連性についての試験
表現型と遺伝子型との間の相関関係の統計的有意性を決定するための方法は、二対立遺伝子マーカーの１つの対立遺伝子またはそのような対立遺伝子で構成されるハプロタイプの場合、当該分野で公知の任意の統計的試験によって、および要求される統計的有意性の任意の認められる閾値で決定され得る。特定の方法および有意性の閾値の適用は、当業者の範囲内である。
【０４６２】
関連性についての試験は、患者対照集団における二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度を決定し、そして、それらが研究における形質と二対立遺伝子マーカー対立遺伝子との間の相関性を示す頻度の統計的な有意差かどうかを決定するためにそれらの頻度を統計的試験と比較することにより行われる。同様に、ハプロタイプ分析は、ケースおよび対照集団における所定の１組二対立遺伝子マーカーに対するすべての予想ハプロタイプを推定することおよびそれらが研究におけるハプロタイプと表現型（形質）との間の統計的に有意な相関かどうかを決定するためにそれらの頻度を統計的試験と比較することにより行なわれる。遺伝子型と表現型との間の統計的に有意な関連性についての試験に有用であるあらゆる統計的ツールが使用され得る。好ましくは、用いられる統計的試験は、１つの自由度を伴うカイ二乗検定である。Ｐ−値が計算される（Ｐ−値は、観測されたものと同じくらいまたはそれより大きな統計値が予期せず生じるであろう確率である）。
【０４６３】
［統計的有意性］
好ましい態様において、診断に対する有意性は、さらなる診断試験に関する陽性基準か、または早期の予防的治療のための準備開始点かのどちらかとして意図する。二対立遺伝子マーカー関連性に関連付けられたｐ値は、単一の二対立遺伝子マーカー分析については、好ましくは約１×１０-2以下、より好ましくは約１×１０-4以下、２つ以上のマーカーの関係するハプロタイプ分析については、約１×１０-3以下、さらにより好ましくは１×１０-6以下、最も好ましくは約１×１０-8以下である。これらの値は単一または多重マーカーの組合せに関連する何らかの関連性の研究に適用可能であると思われる。
【０４６４】
当業者は、本発明の二対立遺伝子マーカーにより関連性研究を実行するために開始点として前記に設定した範囲の値を使用できる。そうすることで本発明の二対立遺伝子マーカーと形質との間の有意な関連性が明らかにされ、診断および薬物スクリーニングの目的に使用できる。
【０４６５】
［表現型の置換］
前述の第１段階のハプロタイプ分析の統計的有意性を確認するために、患者−対照個体からの遺伝子型を決定するデータがプールされ、形質表現型について無作為化されるさらなる分析を行なうことが適切であり得る。各個体の遺伝子型を決定するデータは無作為に２つの群に割り振られ、それらは、第１段階で得られたデータを集計するために使用される患者−対照集団と同じ数の個体を含む。第２段階のハプロタイプ分析は、好ましくはこれらの人工的な群で、好ましくは第１段階分析の最も高い相対危険率係数（relative risk coefficient）を示すハプロタイプに含まれるマーカーに対して実行される。これらの実験は、好ましくは少なくとも１００〜１００００回の間で繰り返される。繰り返し反復法（repeated iterations）により、期せずして試験ハプロタイプを得る確率を決定することができる。
【０４６６】
［統計的関連性の査定］
偽陽性の問題を解決するために、無作為のゲノム領域において同じ患者−対照集団を用いて同様の分析を行なっても良い。「検出可能な形質に関連したゲノムを含むゲノム領域を同定するための方法、ソフトウェアおよび装置」という名称でＵＳシリアル番号６０／１０７，９８６の１９９８年１１月１０日に出願された同時係属ＵＳ分割特許出願、および、また「検出可能な形質に関連したゲノムを含むゲノム領域を同定するための方法、ソフトウェアおよび装置」という名称で米国出願番号第６０／１４０，７８５号明細書の１９９９年７月２３日に出願された第２のＵ．Ｓ．分割特許出願に記載されているように、無作為の領域と候補領域との結果が比較される。
【０４６７】
５）危険因子の評価
危険因子（遺伝的免疫学において、危険因子はマーカー遺伝子座でのある特定の対立遺伝子もしくはハプロタイプが存在することまたは存在しないことである）と疾患との間の関連は、オッズ比（ＯＲ）によって、および相対危険率（ＲＲ）によって評価される。Ｐ（Ｒ+）をＲを有する個体に対する疾患が発症する確率とし、Ｐ（Ｒ-）を危険因子を有さない個体に対する確率とすると、相対危険率は単純にこの２つの確率の比である。すなわち、
ＲＲ＝Ｐ（Ｒ+）／Ｐ（Ｒ-）
である。
【０４６８】
患者−対照研究において、相対危険率の直接的な測定は、標本設計のため得ることができない。しかしながら、オッズ比により低い発生率の疾患に対する相対危険率のより良い近似が可能となり、計算することができる。
【０４６９】
【数７】
2004520055.tif 000009
【０４７０】
Ｆ+は患者における危険因子への暴露の頻度であり、Ｆ-は対照における危険因子への暴露の頻度である。Ｆ+およびＦ-は、研究の対立遺伝子の、またはハプロタイプの頻度を用いて計算され、さらに、背景となる遺伝的モデル（優性、劣性、付加・・・）に依存する。
【０４７１】
所定の危険因子のため形質を示す集団における個体の割合を説明する寄与危険度（ＡＲ）をさらに推定することができる。この測定は、疾患の原因学における特定因子の役割を定量化するのに重要であり、また危険因子の公衆衛生への影響力という点からも重要である。この測定の公衆衛生に対する関与は、危険に曝されることがない場合に妨げられ得る、集団における疾患のケースの割合を推定することにある。ＡＲは以下のように決定する。
【０４７２】
ＡＲ＝ＰE（ＲＲ−１）／（ＰE（ＲＲ−１）＋１）
ＡＲは、二対立遺伝子マーカー対立遺伝子または二対立遺伝子マーカーハプロタイプに対する寄与危険度である。ＰＥは、全体として集団内での対立遺伝子またはハプロタイプへの暴露の頻度であり；ＲＲは、一般的な集団において研究中の形質が相対的に低い発生率を有する場合、オッズ比で近似される相対危険率である。
【０４７３】
［本発明の二対立遺伝子マーカーでの連鎖不平衡における二対立遺伝子マーカーの同定］
いったん第１の二対立遺伝子マーカーが目的のゲノム領域において同定されると、熟練の当業者は、本発明の教示により、この第１のマーカーとの連鎖不平衡における付加的な二対立遺伝子マーカーを容易に同定できる。前述したように、形質に関連する第一のマーカーとの連鎖不平衡におけるマーカーはいずれも、形質に関連するであろう。したがって、いったん所定の二対立遺伝子マーカーと形質との間に関連性が証明されると、その形質と関連する付加的な二対立遺伝子マーカーの発見は、この特定の領域における二対立遺伝子マーカーの密度を増加させるために大変興味深い。原因となる遺伝子または変異は、形質との高い相関関係を示すマーカーまたはマーカーのセットの近傍において見出されるであろう。
【０４７４】
所定のマーカーとの連鎖不平衡における付加的マーカーの同定は、（ａ）複数の個体由来の第１の二対立遺伝子マーカーを含むゲノム断片の増幅、（ｂ）該第１の二対立遺伝子マーカーを有するゲノム領域における第２の二対立遺伝子マーカーの同定、（ｃ）該第１の二対立遺伝子マーカーと第２の二対立遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡解析の実施、および（ｄ）該第１のマーカーとの連鎖不平衡に存在するものとしての第２の二対立遺伝子マーカーの選択を必要とする。工程（ｂ）および（ｃ）とを含むサブコンビネーションもまた考慮される。
【０４７５】
二対立遺伝子マーカーを同定する方法、および連鎖不平衡解析を実施するための方法は本明細書中に記載され、当業者によって過度の実験なしに実施され得る。本発明はまた、二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０との連鎖不平衡に存在し、所定の形質とのそれらの各関連性という点で同様の特徴を示すことが予想される二対立遺伝子マーカーに関する。
【０４７６】
［機能的変異の同定］
検出可能な表現型または形質の原因となっているＰＧ−３遺伝子における変異は、形質陽性および対照個体由来のＰＧ−３遺伝子の配列を比較することにより同定され得る。いったん、陽性関連が本発明の二対立遺伝子マーカーにより確かめられると、同定された遺伝子座は変異についてスキャニングされ得る。好ましい実施態様では、ＰＧ−３遺伝子のエクソンおよびスプライシング部位、プロモーター、および他の調節領域などの機能的領域が変異に関してスキャニングされる。好ましい実施態様では、ＰＧ−３遺伝子の配列が、形質陽性および対照個体において比較される。好ましくは、形質陽性個体はその形質と関連することが示されるハプロタイプを保持し、そして形質陰性個体はそのハプロタイプまたはその形質との関連する対立遺伝子は保持しない。検出可能な形質または表現型は変更されたＰＧ−３機能の種々の発現物を含み得る。
【０４７７】
変異検出手法は、二対立遺伝子マーカーの同定に用いられたのと本質的に同様のものである。このような変異を検出するのに用いられる方法は、一般的に、以下の工程を包含する：
本明細書に開示される方法のいずれかを用いて、形質陽性患者および形質陰性対照者のＤＮＡ試料由来の形質に関連する二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカーの群を含むＰＧ−３遺伝子の領域を増幅する工程；
前記増幅された領域を配列決定する工程；
形質陽性および対照個体由来のＤＮＡ配列を比較する工程；
形質陽性患者に特異的な変異を決定する工程。
【０４７８】
１つの実施態様では、前記二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される。ついで、候補多型は、任意の遺伝子型決定手法（たとえば、本明細書中に記載されている手法）によって、好ましくは、個別の試験様式におけるマイクロ配列決定技術を用いて、患者および対照の大きな集団をスクリーニングすることにより、証明されることが好ましい。多型は、予期された関連結果と適合する頻度で患者および対照に存在する場合、候補変異と考えられる。多型は、検出可能な表現型と統計的に有意な相関関係を示す場合、候補「形質原因」変異と考えられる。
【０４７９】
［遺伝子診断の方法における本発明の二対立遺伝子マーカー］
本発明の二対立遺伝子マーカーはまた、特異的な遺伝子型の結果として、検出可能な形質を発現する個体、または、その後に検出可能な形質を発症する危険にそれらの個体をさらす遺伝子型を有する個体を同定し得る診断試験を開発するのに用いられ得る。本診断法を用いて分析される形質は、癌または異常な細胞分化に関連する障害などの疾患を含む、任意の検出可能な形質であり得る。このような診断法は、疾患の病期分類、継続監視、予後診断および／または予防もしくは治癒療法において有用であり得る。
【０４８０】
本発明の診断技術は、試験被験体が、検出可能な形質を発症するという増大した危険に関連する二対立遺伝子マーカーパターンを有するか否か、または、家族歴研究、単一精液ＤＮＡ分析または体細胞ハイブリッドなどのハプロタイプ型決定に関する個体の染色体の分析を可能にする方法を含む特定の変異の結果として、検出可能な形質にその個体が罹患しているか否かを決定するための種々の方法を使用し得る。
【０４８１】
本発明は、個体が疾患を発症する危険があるか否か、またはＰＧ−３遺伝子における変異または多型から生じる疾患に罹患しているか否かを決定するための診断方法を提供する。本発明はまた、個体が癌または異常な細胞分化に関連する障害などの疾患に感受性を有しているか否かを決定する方法を提供する。
【０４８２】
これらの方法には、個体からの核酸試料を入手すること、およびその形質を発症させる危険を示す、または個体が特定のＰＧ−３多型または変異（形質原因対立遺伝子）を保有する結果として形質を発現することを示す、少なくとも１つの対立遺伝子または少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーハプロタイプを核酸試料が含むか否かを決定することが含まれる。
【０４８３】
好ましくは、このような診断方法においては、核酸試料が、個体から入手され、そして、この試料は「二対立遺伝子マーカーについてＤＮＡ試料の遺伝子型を決定する方法」において前記されている方法を用いて遺伝子型が決定される。診断方法は、単一の二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカーの群に基づき得る。
【０４８４】
これらの方法のそれぞれにおいて、核酸試料は試験被験者から入手され、そして１つ以上の対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０の二対立遺伝子マーカーパターンが決定される。
【０４８５】
１つの実施態様では、ＰＣＲ増幅が、検出可能な表現型に関連する多型が同定されている領域を増幅するために、核酸試料に対して実施される。個体が、検出可能な表現型に関連する１つ以上のＰＧ−３多型を保持するか否かを決定するために、増幅産物が配列決定される。増幅産物を生成するのに用いられるプライマーは、表１にあげられているプライマーを含み得る。あるいは、核酸試料は、個体がＰＧ−３遺伝子における変異または多型から生じる検出可能な表現型に関連する１つ以上のＰＧ−３多型を保持するか否かを決定するために、前記のマイクロ配列決定反応に供される。マイクロ配列決定反応に用いられるプライマーは、表４にあげられたプライマーを含み得る。別の実施態様では、核酸試料は、検出可能な表現型に関連する１つ以上のＰＧ−３対立遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと接触される。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられるプローブは、表３にあげられているプローブを含み得る。別の実施態様では、核酸試料は増幅反応において対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとともに用いられる場合、増幅産物を産生し得る第２のＰＧ−３オリゴヌクレオチドと接触される。増幅反応における増幅産物の存在は、個体が検出可能な表現型に関連する１つ以上のＰＧ−３対立遺伝子を保持することを示す。
【０４８６】
好ましい実施態様では、Ａ１〜Ａｎおよびその相補鎖からなる群から選択される少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドの同一性が決定され、そして検出可能な形質は、癌または異常な細胞分化に関連する障害などの疾患である。診断キットは、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０４８７】
これらの診断方法は、一定の環境下で、予防的処置を開始するのに、または、有意なハプロタイプを保持する個体が少数の症状などの警戒すべき兆候を予見することを可能にするのに用いられ得るため、きわめて価値の高いものである。
【０４８８】
薬剤に対する反応、または薬剤に対する副作用を分析しかつ予見する診断法は、個体を特定の薬剤により治療すべきか否かを決定するのに用いられ得る。たとえば、診断法は、個体が、特定の薬剤により治療に対して積極的に反応する可能性を示す場合は、薬剤は個体に投与され得る。反対に、診断法は、個体が特定の薬剤による治療に対して消極的に反応する可能性を示す場合は、治療の代替的な過程が指示され得る。否定的な反応は、効果的な反応がないか、または毒性副作用が存在するかのいずれかの場合として定義することができる。
【０４８９】
薬剤の臨床治験は、本発明のマーカーに関する別の適用を示す。疾患、好ましくは、癌または異常な細胞分化に関連する障害に対して作用する薬剤に反応するか、または疾患、好ましくは、癌または異常な細胞分化に関連する障害に対して作用する薬剤に対する副作用に対する反応かのいずれかを示す１つ以上のマーカーは、前記の方法を用いて同定され得る。その後は、このような薬剤の臨床治験における潜在的な参加者が、薬剤に好ましく反応するもっとも可能性があるこれらの個体を同定し、かつ、副作用を経験する可能性があるこれらの個体を除外するためにスクリーニングされ得る。このように、薬剤治療の効果は、その研究において積極的に反応する可能性がない個体を包括させる結果として、その測定値を低下させることなく、かつ、所望でない安全性の問題で危険に陥れることなく、薬剤に対して積極的に反応する個体において測定され得る。
【０４９０】
［組換えベクター］
用語「ベクター」は、２本鎖または１本鎖であり、かつ、細胞宿主または単細胞または多細胞宿主生体においてトランスフェクションされるように追求される目的の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、環状または線状のＤＮＡまたはＲＮＡ分子かのいずれかを意味するように本明細書中で用いられる。
【０４９１】
本発明は、ＰＧ−３ゲノム配列から得られた調節ポリヌクレオチド、および／またはＰＧ−３ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列かのいずれか由来のコードポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを包含する。
【０４９２】
一般的には、本発明の組換えベクターは、上で定義されているように、調節配列、コード配列およびポリヌクレオチド構築物ならびに任意のＰＧ−３プライマーまたはプローブを含む、本明細書中に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。とくに、本発明の組換えベクターは、「ＰＧ−３遺伝子ゲノム配列」節、「ＰＧ−３  ｃＤＮＡ配列」節、「コード領域」節、「ポリヌクレオチド構築物」節、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」節に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０４９３】
第１の好ましい実施態様では、本発明の組換えベクターは、配列番号１のＰＧ−３ゲノム配列、またはＰＧ−３  ｃＤＮＡ（たとえば、適切な細胞宿主における配列番号２のｃＤＮＡ）由来の挿入ポリヌクレオチドを増幅するのに用いられる。このポリヌクレオチドは、組換えベクターが複製されるごとに増幅される。
【０４９４】
本発明にしたがう組換えベクターの第２の好ましい実施態様は、本発明の調節ポリヌクレオチドかまたはコード核酸かのいずれか、またはその両方を含む発現ベクターを含む。特定の実施態様において、発現ベクターは、その後に精製され、かつ、たとえば、リガンドスクリーニングアッセイに用いられ得、またはＰＧ−３タンパク質に対して指向される特定の抗体を惹起するために免疫原として用いられ得るＰＧ−３ポリペプチドを発現するのに用いられる。他の実施態様では、発現ベクターはトランスジェニック動物を構築するために、そして、また遺伝子治療のために用いられる。発現には、適切なシグナルがベクター内に提供され、該シグナルが、宿主細胞における目的の遺伝子の発現を推進するウイルスおよび哺乳動物起源の両方由来のエンハンサー／プロモーターなどの種々の調節要素が含まれることが必要となる。産物を発現する永久安定細胞クローンを確立するための優性薬剤選択マーカーは、薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現につなげる要素であるので、一般的に、本発明の発現ベクターに含まれる。
【０４９５】
とくに、本発明は、ＰＧ−３タンパク質、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列のＰＧ−３タンパク質、またはその変異体もしくはそのフラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【０４９６】
本発明はまた、ＰＧ−３コード配列の発現に有用な組換え発現ベクターに関し、ここで、ベクターは、配列番号２の核酸を含む。
【０４９７】
ＰＧ−３関連二対立遺伝子マーカーを含む核酸を含む組換えベクターもまた、本発明の一部である。好ましい実施態様では、前記二対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ８０およびその相補鎖からなる群から選択される。
【０４９８】
本発明のベクターにおいて見出され得る要素のいくつかは、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０４９９】
本発明はまた、以下のように遺伝子工学的に処理された脊椎動物起源、好ましくは、哺乳動物起源、とくにヒト起源の一次、二次、および固定された相同組換え宿主細胞である：ａ）外因性（非相同性）ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内因性染色体ＤＮＡに挿入する工程；ｂ）内因性染色体ＤＮＡを欠失する工程；および／またはｃ）内因性染色体ＤＮＡを外因性ポリヌクレオチドで置換する工程。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は、標的遺伝子のコード配列、および／または調節領域（たとえば、標的遺伝子に作動可能に関連させたプロモーターおよびエンハンサー配列）に対してであり得る。
【０５００】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボで相同組換え宿主細胞を作製する方法に関し、ここで、細胞内では通常は発現されない標的遺伝子の発現が変更される。好ましくは、変更は、正常な増殖条件下または標的遺伝子によりコードされるポリペプチドを産生するのに適切な条件下で、標的遺伝子の発現を引き起こす。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）細胞をインビトロまたはインビボにてポリヌクレオチド構築物によりトランスフェクションする工程であって、該ポリヌクレオチド構築物は（ｉ）標的配列；（ii）調節配列および／またはコード配列；および（iii）必要な場合は、対になっていないスプライシングドナー部位を含み、それによってトランスフェンション細胞が作製される、工程；およびｂ）相同組換えに適切な条件下でインビトロまたはインビボで、トランスフェクションされた細胞を維持する工程。
【０５０１】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボにて細胞における標的遺伝子の発現を変更する方法に関し、ここで、この遺伝子は、細胞内で正常には発現されない。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ポリヌクレオチド構築物により、インビトロまたはインビボにて細胞をトランスフェクションする工程であって、該ポリヌクレオチド構築物は（ｉ）標的配列；（ii）調節配列および／またはコード配列；および（iii）必要な場合は、対になっていないスプライシングドナー部位を含み、それによってトランスフェンション細胞が作製される、工程；および（ｂ）相同組換えに適切な条件下でインビトロまたはインビボで、トランスフェクションされた細胞を維持する工程であって、それによって相同組換え細胞を作製する工程；ならびに（ｃ）遺伝子の発現に適切な条件下でインビトロまたはインビボにて相同組換え細胞を維持する工程。
【０５０２】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボにて細胞における標的内因性遺伝子の発現を変更することによって、本発明のポリペプチドを作製する方法に関し、ここで、この遺伝子は細胞内では正常には発現しない。この方法は、以下の工程を包含する；ａ）ポリヌクレオチド構築物により、インビトロにて細胞をトランスフェクションする工程であって、該ポリヌクレオチド構築物は（ｉ）標的配列；（ii）調節配列および／またはコード配列；および（iii）必要な場合は、対になっていないスプライシングドナー部位を含み、それによってトランスフェンション細胞が作製される、工程；（ｂ）相同組換えに適切な条件下でインビトロまたはインビボで、トランスフェクションされた細胞を維持する工程であって、それによって相同組換え細胞を作製する工程；および（ｃ）遺伝子の発現に適切な条件下でインビトロまたはインビボにて相同組換え細胞を維持する工程であって、それによって、該ポリペプチドを作製する工程。
【０５０３】
本発明はさらに、遺伝子が正常には発現されない細胞型において標的遺伝子の発現を変更するポリヌクレオチド構築物に関する。これは、ポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体ＤＮＡに挿入されると生じる。ここで、該ポリヌクレオチド構築物は以下を含む；ａ）標的配列；ｂ）調節配列および／またはコード配列；およびｃ）必要な場合は、対になっていないスプライシングドナー部位。前記のようなポリヌクレオチド構築物がさらに含まれる。ここで、この構築物はさらにポリペプチドをコードし、かつ染色体ＤＮＡによる相同組換えを行った後に標的内因性遺伝子とインフレームであるポリヌクレオチドを含む。
【０５０４】
この構成物は、当該分野で公知の技術（たとえば、米国特許第６，０５４，２８８号明細書；同第６，０４８，７２９号明細書；同第６，０４８，７２４号明細書；同第６，０４８，５２４号明細書；同第５，９９４，１２７号明細書；同第５，９６８，５０２号明細書；同第５，９６５，１２５号明細書；同第５，８６９，２３９号明細書；同第５，８１７，７８９号明細書；同第５，７８３，３８５号明細書；同第５，７３３，７６１号明細書；同第５，６４１，６７０号明細書；同第５，５８０，７３４号明細書；国際公開第９６／２９４１１号パンフレット、同第９４／１２６５０号パンフレット；およびKollerら、1989を含む科学文献に記載の技術）によって、産生され得、そして、方法が実施され得る。
【０５０５】
［１．本発明の発現ベクターの一般的な性質］
本発明による組換えベクターは、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド、または染色体、非染色体、半合成、および合成ＤＮＡからなり得る線状ＤＮＡでさえも含むが、これらに限定されない。このような組換えベクターは、以下のものから構成される構築を含む転写単位を含み得る：
（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝子要素または要素（たとえば、プロモーターまたはエンハンサー）。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ作用要素であり、通常、転写を増加させるようにプロモーターに対して作用する約１０〜３００ｂｐ長である；
（２）ｍＲＮＡに転写され、そして最終的にはポリペプチドの中に翻訳される構造またはコード配列。該構造またはコード配列は（１）に記載される調節要素に作動可能に連結される；および
（３）適切な転写開始配列および終結配列。酵母または真核細胞発現系で用いられることが意図されている構造単位は、好ましくは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質は、リーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、それにはＮ末端残基が含まれ得る。この残基は、最終産物を供給するために、発現組換えタンパク質から後になって切断されてもされなくてもよい。
【０５０６】
一般的には、組換え発現ベクターには、複製起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、および下流の構造配列の転写を指向する高度に発現された遺伝子由来のプロモーターが含まれる。非相同構造配列は、翻訳開始配列および終結配列とともに、適切な段階で構築され、そして好ましくは、リーダー配列は、ペリプラズム空間または細胞外培地に翻訳タンパク質の分泌を指向し得る。ベクターが哺乳動物宿主細胞において所望の配列をトランスフェクションおよび発現するのに適応される特定実施態様において、好ましいベクターは、所望の宿主における複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライシングドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、たとえば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルが、必要とされる非転写遺伝子要素を提供するのに用いられ得る。
【０５０７】
配列番号３のＰＧ−３ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ発現は、宿主生体におけるネイティブ遺伝子の発現、または生物学的に不活性なＰＧ−３タンパク質の産生に関連する遺伝子欠陥を補正するために有用であり得る。
【０５０８】
結果として、本発明はまた、処置される患者の生体における適切な遺伝子物質の導入による、配列番号３のＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体のインビボ産生のために主に設計された組換え発現ベクターに関する。この遺伝子物質は、生体から予め抽出された細胞にインビトロで導入され得、その修飾細胞は、その後、適切な組織にインビボで直接、前記生体内に再導入される。
【０５０９】
［２．調節要素］
［プロモーター］
本発明による発現ベクターにおいて用いられる適切なプロモーター領域は、非相同遺伝子が発現されるべきである細胞宿主を考慮に入れながら選択される。目的の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞における核酸の発現を指向し得るかぎり、重要なものとは考えられない。したがって、ヒト細胞が標的にされる場合は、核酸コード領域を、たとえば、ヒトまたはウイルスプロモーターなどのヒト細胞内で発現させることができるプロモーターに隣接して、かつ当該プロモーターの制御下に位置させることが好ましい。
【０５１０】
適切なプロモーターは核酸に対して非相同であり得る。この核酸について、プロモーターが発現を制御するか、または代替的には、発現されるべきコード配列を含むネイティブポリヌクレオチドに対して内因性であり得る。さらに、プロモーターは、一般的には、構築プロモーター／コード配列が挿入されている組換えベクター配列に対して非相同である。
【０５１１】
プロモーター領域は、たとえば、ＣＡＴ（クロラムフェ二コールトランスフェラーゼ）ベクター、ならびにより好ましくは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７ベクターを用いる任意の所望の遺伝子から選択され得る。
【０５１２】
好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモーター（欧州特許第００３６７７６号明細書）、多角体プロモーター、またはバキュロウイルス由来のｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ  Ｎｏｖａｇｅｎ）（Smithら、1983；O'Reillyら、1992）、ラムダＰＲプロモーターまたはまた、ｔｒｃプロモーターである。
【０５１３】
真核細胞プロモーターとしては、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、マウスメタロチオネイン−Ｌがあげられる。好都合なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に、当業者のレベルの範囲内である。
【０５１４】
プロモーターの選択は、十分に、遺伝子工学の分野の当業者の能力の範囲内である。たとえば、Sambrookら（1989）の書籍、またはFullerら（1996）により記載された手法を参照し得る。
【０５１５】
［他の調節要素］
ｃＤＮＡ挿入物が用いられる場合、代表的に、遺伝子転写の適切なポリアデニル化を効果的にするために、ポリアデニル化シグナルを含むことを所望する。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾よい実施に非常に重要であるとは考えられておらず、そして、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの任意のこのような配列が用いられ得る。また、ターミネーターが、発現カセットの要素として考えられる。これらの要素は、メッセージレベルを向上させ、かつ、カセットから他の配列まで読み通すことを最小にする役割を果たし得る。
【０５１６】
［３．選択可能なマーカー］
このようなマーカーは、発現構築物を含む細胞の容易な同定を可能にする細胞に対して同定可能な変化を与える。形質転換宿主細胞の選択に対する選択可能なマーカー遺伝子は、好ましくは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはに対するネオマイシン耐性、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのためのＴＲＰ１、あるいはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン、リファンピシリンまたはアンピシリン耐性、あるいはマイコバクテリアのためのレバンサッカラーゼであり、この後者マーカーは陰性選択マーカーである。
【０５１７】
［４．好ましいベクター］
［細菌ベクター］
代表的なものであるが、非限定的な例としては、細菌使用に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカーおよびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含む市販のプラスミド由来の細菌の複製起点を含み得る。このような市販のベクターとしては、たとえば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia, Uppsala, Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Biotec, WI, USA）があげられる。
【０５１８】
以下の細菌ベクターなどの数多くのその他の適切なベクターが、当業者に公知であり、かつ市販されている：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；ｐＱＥ−３０（QIAexpress）。
【０５１９】
［バクテリオファージベクター］
Ｐ１バクテリオファージベクターには約８０〜約１００ｋｂの範囲にある大きな挿入フラグメントを含み得る。
【０５２０】
ｐ１５８またはｐ１５８／ｎｅｏ８などのＰ１バクテリオファージベクターの構築は、Stenberg（1992，1994）により顕著に記載されている。ＰＧ−３ヌクレオチド配列を含む組換えＰ１クローンは、４０ｋｂよりも大きい、大きなポリヌクレオチドを挿入するために設計され得る（Lintonら、1993）。トランスジェニック動物を用いる実験のためのＰ１  ＤＮＡを生成するために、好ましいプロトコルは、McCormickら（1994）により記載されているプロトコルである。簡潔には、Ｐ１プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ（好ましくは、株ＮＳ３５２９）はカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む適切な培養培地中で一晩増殖される。Ｐ１  ＤＮＡは、製造業者の取扱説明書により、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてアルカリ溶解によりＥ．ｃｏｌｉから調製される。Ｐ１  ＤＮＡは、キットに含まれている洗浄および希釈緩衝液を用いて、２つのＱｉａｇｅｎチッブ５００カラム上で細菌溶解物から精製される。ついで、フェノール／クロロホルム抽出を実施し、その後、７０％エタノールによりＤＮＡを沈殿させる。ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１  ｍＭ  ＥＤＴＡ）の中でＤＮＡを安定化させた後に、ＤＮＡの濃度が分光光度計により評価される。
【０５２１】
目的が、トランスジェニック動物において、代表的には、トランスジェニックマウスにおいて、ＰＧ−３ヌクレオチド配列を含むＰ１クローンを発現させることである場合には、たとえば、Ｐ１ポリリンカー（ＳｆｉＩ，ＮｏｔＩまたはＳａｌＩ）内のレアカッティング部位でＰ１  ＤＮＡを切断することにより、Ｐ１  ＤＮＡフラグメントからベクター配列を取り出すことが望ましい。Ｐ１挿入物はその後、ＹＡＣからＤＮＡの分離のための当初報告された方法（Schedlら、1993a；Petersonら、1993）に類似の方法を用いて、パルスフィールド電気泳動アガロースゲル上にあるベクター配列から精製される。この段階では、得られた精製挿入ＤＮＡは、必要な場合、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ−３０，０００分子量が限度）上で濃縮され得、ついで、マイクロ透析膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ、ｔｙｐｅ  ＶＳ，０．０２５μＭ）上に１００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０μＭスペルミン、７０μＭスペルミンを含有するマイクロインジェクション緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；２５０μＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析される。精製Ｐ１  ＤＮＡ挿入物の完全性が、１％アガロース（Ｓｅａ  Ｋｅｍ  ＧＴＧ；ＦＭＣ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）パルスフィールドゲル上における電気泳動および臭化エチジウムでの染色により評価される。
【０５２２】
［バキュロウイルスベクター］
配列番号３のｐＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはその改変体の発現に適切なベクターは、昆虫細胞および昆虫細胞株において伝播され得るバキュロウイルスベクターである。とくに適切な宿主ベクター系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来するＳＦ９細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ  １７１１）をトランスフェクションするのに用いられるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス転移ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
【０５２３】
バキュロウイルス発現系における配列番号3の前記PG−3ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはその改変体の発現に適切な他のベクターとしては、Chaiら（1993），Vlasakら（1983）およびLenhardら（1996）に記載のベクターがあげられる。
【０５２４】
［ウイルスベクター］
１つの特定実施態様では、ベクターはアデノウイルスに由来するものである。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、FeldmanおよびSteg（1996）またはOhnoら（1994）に記載のベクターである。本発明のこの特定の実施態様による別の好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスタイプ２または５（Ａｄ２またはＡｄ５）あるいは動物起源のアデノウイルス（仏国特許出願第ＦＲ−９３．０５９５４号明細書）である。
【０５２５】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、一般的には、インビボにて外因性ポリヌクレオチドの、とくにヒトを含む哺乳動物への転移のための選択の組換え遺伝子送達系であると理解される。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率的な送達を提供し、そして、転移核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。
【０５２６】
本発明のレトロウイルスインビトロまたはインビボ遺伝子送達ビヒクルの調製または構築のためのとくに好ましいレトロウイルスとしては、ミンク細胞病巣誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスがあげられる。とくに好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−５９０）、Ｒａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−９９８）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−１９０；国際公開第９４／２４２９８号パンフレット）があげられる。とくに好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、Ｒｒｙａｎ高力価（ＡＴＣＣ寄託番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８）があげられる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Ｒｏｔｈら（１９９６）、国際公開第９３／２５２３４号パンフレット、同第９４／０６９２０号パンフレット、Ｒｏｕｘら（１９８９）、Ｊｕｌａｎら（１９９２）およびＮｅｄａら（１９９１）に記載されているものがあげられる。
【０５２７】
本発明によって考慮されるなお別のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に含まれている。アデノ関連ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを、効率的な複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする天然に存在する欠損ウイルスである（Muzyczkaら、1992）。そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込み得、かつ、安定した組み込みの高い頻度を示すわずかなウイルスもまた、ウイルスの１つである（Flotteら、1992；Samulskiら，1989；Mclaughlinら、1989）。ＡＡＶの１つの有利な性質は、形質転換細胞に対して、一次細胞に形質導入するためのその減少した効果から得られる。
【０５２８】
［ＢＡＣベクター］
細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローニング系（Shizuaら、1992）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるゲノムＤＮＡ（１００〜３００ｋｂ）の大きなフラグメントを安定に維持するように開発された。好ましいＢＡＣベクターは、Kimら（1996）に記載のｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターからなる。ＢＡＣライブラリーは、ベクター内のＢａｍＨＩ部位かまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位かのいずれかへの連結を可能にする酵素を用いて部分的に消化されている大きさを選択したゲノムＤＮＡを用いて、このベクターを用いて調製される。隣接しているこれらのクローニング部位は、ＲＮＡ転写かまたはＰＣＲ法かのいずれかにより、末端プローブを生成するのに用いられ得るＴ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＢＡＣライブラリーを構築した後、ＢＡＣ  ＤＮＡは、スーパーコイルサークルとして宿主細胞から精製される。これらの環状分子を線状形態に変換することにより、大きさの決定およびＢＡＣの受容細胞への導入の両方が進められる。クローニング部位は２つのＮｏｔＩ部位に隣接しており、ＮｏｔＩ消化によりベクターからのクローン化セグメントの切り出しが可能となる。あるいは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターに含まれるＤＮＡ挿入物は、独特なｃｏｓＮ部位での切断につながる市販の酵素ラムダターミナーゼによりＢＡＣベクターを処理することによって線状化され得るが、しかしこの切断方法は、挿入ＤＮＡ配列およびＢＡＣ配列の両方を含む完全長ＢＡＣクローンを生じる。
【０５２９】
［５．組換えベクターの送達］
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物の発現をもたらすために、これらの構築物は、細胞に送達されるべきである。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手法におけるように、インビトロで、または特定の疾患状態の治療におけるように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。
【０５３０】
１つの機構は、発現構築物が感染ウイルス微粒子に被包される場合、ウイルス感染である。
【０５３１】
培養哺乳動物細胞にポリヌクレオチドを転移させるためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明により考慮される。そして、それらの方法としては、リン酸カルシウム沈殿法（Grahamら、1973；Chenら，1987）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal，1985）、エレクトロポレーション（Tur−Kaspaら、1986；Potterら、1984）、直接マイクロインジェクション法（Harlandら、1985）、ＤＮＡ負荷リポソーム法（Nicolauら、1982；Fraleyら、1979）、および受容体媒介トランスフェクション（WuおよびWu、1987；1988）があげられるが、これらに限定されない。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボ用途に首尾よく適合され得る。
【０５３２】
いったん、発現ポリヌクレオチドが細胞に送達されると、その受容細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組換え（遺伝子置換）を介して同系位置および配向にあり得る、または、無作為、非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施態様では、核酸は、別個のＤＮＡのエピソームセグメントとして細胞内に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソ−ム」は、宿主細胞周期とは独立して、または同時化して、維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。
【０５３３】
インビボで脊椎動物の細胞の内部にタンパク質またはペプチドを送達する方法についての１つの特定の実施態様は、生理学的に受容可能なキャリアおよび細胞を含む組織の間隙に、目的のポリペプチドを作動可能にコードする裸ポリヌクレオチドを含む調製物を導入する工程含み、それによって、その裸ポリヌクレオチドが、細胞の内部に取り込まれ、そして生理学的な効果を得る。これは、とくにインビトロでの転移に適用可能であるが、インビボでも同様に適用され得る。
【０５３４】
「裸（の）」ポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボで用いられる組成物は、国際公開第90／11092号パンフレット（Vical Inc,）および同第95／11307号パンフレット（Institute  Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa）ならびにacsonら（1996）およびHuygenら（1996）の刊行物に記載されている。
【０５３５】
本発明のなお別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む本発明の裸ポリヌクレオチドの、細胞への転移は、微粒子ボンバードメント（biolistic）により進められ得、前記微粒子は、Kleinら（1987）に記載されているもののように、高速に加速され、細胞膜を貫通しかつ細胞を殺滅することなく細胞内に入ることが可能であるＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイル（DNA-coated microprojectiles）である。
【０５３６】
さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはリポソーム内に取り込まれ得る（GhoshおよびBacchawat，1991；Wongら、1980；Nicolauら、1987）。
【０５３７】
特定の実施態様では、本発明は本明細書中に記載されているＰＧ−３タンパク質またはポリペプチドのインビボ産生のための組成物を提供する。それは、生理学的に受容可能なキャリアにおける溶液中にあって、このポリペプチドを作動可能にコードする裸ポリヌクレオチドを含み、かつ、組織の細胞が前記タンパク質またはポリペプチドを発現させるように、組織に導入するのに適している。
【０５３８】
所望の宿主生体に注入されるベクターの量は、注入の部位により変化する。指示用量としては、ベクター０．１〜１００μｇが動物の体内、好ましくは、哺乳動物の体内、たとえば、マウスの体内に注入される。
【０５３９】
本発明によるベクターの別の実施態様では、宿主細胞、好ましくは、処置される動物から予め採取した宿主細胞において、およびより好ましくは、筋肉細胞などの体細胞においてインビトロで導入され得る。その後の工程では、所望のＰＧ−３ポリペプチドまたは所望のそのフラグメントをコードするベクターにより形質転換されている細胞が、体内に、局所的にかまたは全身的にかのいずれかで組換えタンパク質を送達するために、動物体内に再導入される。
【０５４０】
［細胞宿主］
本発明の別の目的は本明細書中に記載されているポリヌクレオチドの１つにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞からなり、そして、とくに、ポリヌクレオチドは、ＰＧ−３調節ポリヌクレオチドか、または配列番号１および２からなる群から選択されるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくはその改変体におけるＰＧ−３ポリペプチドのためのコード配列かのいずれかを含む。組換えベクター（たとえば、前記の組換えベクターのうちの１つ）を用いて、形質転換（原核細胞）またはトランスフェクション（真核細胞）される宿主細胞もまた含まれる。とくに、本発明の細胞宿主は、「ＰＧ−３遺伝子ゲノム配列」節、「ＰＧ−３  ｃＤＮＡ配列」節、「コード領域」節、「ポリヌクレオチド構築物」節、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」節に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０５４１】
本発明によるさらなる組換え細胞宿主はＡ１〜Ａ８０およびそれらの相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドを含む。
【０５４２】
本発明によるさらなる組換え細胞宿主は、本明細書中に記載されるベクターのいずれか、とくに「組換えベクター」節に記載されるベクターのいずれかを含む。
【０５４３】
本発明の発現ベクターのための受容体として用いられる好ましい宿主細胞は、以下である：
ａ）原核宿主細胞：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（Ｉ．Ｅ．ＤＨ５−α株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓなどの種由来の株。
【０５４４】
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２；ＣＣＬ２．１；ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６５０；ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−６１）、ヒト腎臓２９３（ＡＴＣＣ寄託番号４５５０４；ＣＲＬ−１５７３）、およびＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ寄託番号８４１００５０１；８４１１１３０１）。
【０５４５】
ｃ）その他の哺乳動物宿主細胞。
【０５４６】
哺乳動物細胞、代表的には、ヒト細胞におけるＰＧ−３遺伝子発現は、欠陥にならしめ、または代替的には、発現は、本発明によるＰＧ−３ポリヌクレオチドによる動物細胞のゲノムにおけるＰＧ−３遺伝子対応物の置換での、ＰＧ−３ゲノムまたはｃＤＮＡ配列の挿入によって提供され得る。これらの遺伝子変更は、上で記載した特定のＤＮＡ構築物を用いて相同組換え事象によって生成され得る。
【０５４７】
用いられ得る１種類の細胞宿主は、マウス接合体などの哺乳動物の接合体である。たとえば、マウス接合体は、目的の精製ＤＮＡ分子（たとえば、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０μＭスペルミン、７０μＭスペルミジンを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０μＭ  ＥＤＴＡに中に、ＢＡＣ挿入物に関しては、１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ１バクテリオファージ挿入物に関しては、３ｎｇ／μｌの濃度範囲で予め調節された精製ＤＮＡ分子）により、マイクロインジェクションを実施し得る。マイクロインジェクションが行われるＤＮＡが大きなサイズを有する場合は、Schedlら（1993b）に記載されているように、ポリアミンおよび高塩濃度を、このＤＮＡの機械的な破壊を回避するために用いられ得る。
【０５４８】
本発明のポリヌクレオチド（本明細書中に記載されているＤＮＡ構築物を含む）のいずれか１つは、胚幹（ＥＳ）細胞株、好ましくは、マウスＥＳ細胞株に導入され得る。ＥＳ細胞株は、着床前胚胞の内細胞塊の多能性中立細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞株は以下である：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１９３４およびＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１１１１６）。ＥＳ細胞を中立状態に維持するために、それらの細胞を、この胚の表現型を保存し、かつＥＳ細胞付着用のマトリクスとして役立てるために、適切なシグナルを提供する増殖が阻害された支持細胞の存在下で培養される。好ましい支持細胞は、Abbondanzoら（1993）により記載されているように、培地で維持される、実質的に任意のマウス株の１３日目、１４日目の胚芽の組織から確立される一次胚性線維芽細胞からなる。そして、Robertson（1987）により記載されているように放射能によって、または、PeaseおよびWilliams（1990）により記載されているようにLIFの阻害濃度の存在下では、増殖が阻害される。
【０５４９】
宿主細胞における構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生するために慣用的な様式で用いられ得る。
【０５５０】
適切な宿主の形質転換および適切な細胞濃度への宿主の増殖の後、選択されたプロモーターが、温度シフトまたは化学的誘導などの適切な手段により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【０５５１】
細胞は、代表的には、遠心分離法により収集され、物理的または化学的手段により破壊され、そして、得られる粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。
【０５５２】
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、任意の都合のよい方法（凍結融解サイクル、超音波、機械的な破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により破壊させ得る。このような方法は当業者に周知である。
【０５５３】
［トランスジェニック動物］
本明細書中で用いられている用語「トランスジェニック動物」または「宿主動物」は、本発明による核酸の１つを含むように、遺伝子工学的にかつ人工的に操作されたそのゲノムを有する動物を意味する。好ましい動物は非ヒト哺乳動物であって、そして本発明により核酸の挿入により人工的に、かつ遺伝子工学的に変更されたそのゲノムを有するＭｕｓ（たとえば、マウス）、Ｒａｔｔｕｓ（たとえば、ラット）およびＯｒｙｃｔｏｇａｌｕｓ（たとえば、ウサギ）から選択された属に属する動物を含む。１つの実施態様では、本発明は非ヒト宿主哺乳動物およびノックアウトベクターによる相同組換えにより破壊された本発明の組換えベクターまたはＰＧ−３遺伝子を含む動物を包含する。
【０５５４】
本発明のトランスジェニック動物には全て、クローン化された組換えＤＮＡ配列または合成ＤＮＡ配列、とくに、本明細書に記載されているような、ＰＧ−３コード配列、ＰＧ−３調節ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、またはアンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む精製または分離された核酸の１つがその複数の細胞内に含まれる。
【０５５５】
一般的には、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明に記載されているポリヌクレオチド、組換えベクターおよび細胞宿主のいずれか１つを含む。とくに、本発明のトランスジェニック動物は、「ＰＧ−３遺伝子ゲノム配列」節、「ＰＧ−３  ｃＤＮＡ配列」節、「コード領域」節、「ポリヌクレオチド構築物」節、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」節、「組換えベクター」節および「細胞宿主」節に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０５５６】
本発明によるさらなるトランスジェニック動物には、その体細胞および／またはその生殖系列細胞において、Ａ１〜Ａ８０およびその相補鎖からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドを含む。
【０５５７】
第１の好ましい実施態様では、これらのトランスジェニック動物は、細胞分化に関する多様な病理を研究するための良好な実験モデルであり得る。とくに、ネイティブＰＧ−３タンパク質または代替的には変異ＰＧ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つまたはいくつかの複製物が挿入されているゲノムを有するトランスジェニック動物に関する。
【０５５８】
第２の好ましい実施態様では、これらトランスジェニック動物は、目的のこのタンパク質の合成において良好な収率と、最終的には、目的のこのタンパク質の組織特異的発現につながる、ＰＧ−３遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で、目的の所望のポリペプチドを発現し得る。
【０５５９】
本発明のトランスジェニック動物の設計は、当業者に周知の慣用的な技術によって作製され得る。トランスジェニック動物、とくに、トランスジェニックマウスの生産に関しては、１９８９年１０月１０日に発行された米国特許第４，８７３，１９１号明細書；１９９５年１１月７日に発行された米国特許第５，４６４，７６４号明細書；および１９９８年８月４日に発行された米国特許第５，７８９，２１５号明細書が参照され得る（これらの文献は、トランスジェニックマウスを生産する方法を開示する）。
【０５６０】
本発明のトランスジェニック動物は、外因性遺伝子物質を組み込んだゲノムを有する動物を生じる手法の適用により産生され得る。この手法には、本明細書に記載のような、ＰＧ−３コード配列、ＰＧ−３調節ポリヌクレオチドまたはＰＧ−３アンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列のいずれかをコードする遺伝子物質またはその一部を得る工程が含まれる。
【０５６１】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、胚芽またはＥＳ細胞株に挿入される。挿入は好ましくは、Thomasら（1987）により記載されているような、エレクトロポレーションを用いてなされる。エレクトロポレーションに供される細胞は、好ましくは相同組換え事象により、そのゲノムに外因性組換えポリヌクレオチドを組み込んだ陽性細胞を見出すために、スクリーニングされる（たとえば、選択可能なマーカーによる選択により、ＰＣＲにより、またはサザンブロット分析により）。本発明により用いられ得る例示的な陽性−陰性選択手法が、Mansourら（1988）により記載されている。
【０５６２】
ついで、Bradley（1987）により記載されているように、陽性細胞は分離され、クローン化され、そして、マウスから得た３．５日齢の胚胞に注入される。ついで、胚胞は雌の宿主動物に挿入され、かつ、期限まで増殖することが許容される。
【０５６３】
あるいは、陽性ＥＳ細胞は、Woodら（1993）またはNagyら（1993）により記載されているように、２．５日齢の８〜１６細胞期（桑実胚）で胚芽と接触させ、ＥＳ細胞は、生殖系列を生じる細胞を含む胚胞を広くコロニー化するように取り込まれる。
【０５６４】
雌の宿主の子孫は、たとえば、挿入された外因性ＤＮＡ配列を含めて、どの動物がトランスジェニックか、そしてどの動物が野生型かを決定するために試験される。
【０５６５】
このように、本発明はまた、本発明による核酸、組換え発現ベクター、または組換え宿主細胞を含むトランスジェニック動物に関する。
【０５６６】
［本発明のトランスジェニック動物に由来する組換え細胞株］
本発明のさらなる目的は、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞からなる。１つの実施態様では、本発明は、本発明の非ヒト宿主哺乳動物および本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターによる相同組換えにより破壊されたＰＧ−３遺伝子を含む動物由来の細胞を包含する。
【０５６７】
組換え細胞株は、たとえば、Chou（1989）およびShayら（1991）により記載されているように、ＳＶ４０ラージＴ抗原などのｏｎｃ遺伝子を発現するベクターにより一次培養細胞のトランスフェクションにより、本発明によるトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られた細胞からインビトロにて確立され得る。
【０５６８】
［ＰＧ−３ポリペプチドと相互作用する物質をスクリーニングする方法］
本発明の目的に関して、リガンドとは、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体にのうちの１つに結合し得るタンパク質、ペプチド、抗体またはいずれかの合成化学的化合物などの分子を意味し、ＰＧ−３をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくは改変体の発現を調節する分子を意味する。これらの分子は、治療組成物、好ましくは、癌または異常な細胞分化に関連する障害に対して作用する治療組成物に用い得る。
【０５６９】
本発明によるリガンドスクリーニング法において、生物学的試料またはＰＧ−３タンパク質の推定リガンドとして試験される定義された分子は、対応する精製ＰＧ−３タンパク質、たとえば、このタンパク質と試験される推定リガンド分子との間で複合体を形成するために、上で述べたような、組換え細胞宿主により産生された対応する精製組換えＰＧ−３タンパク質と接触させる。
【０５７０】
例証的な例として、ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００もしくは８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントの相互作用を研究するために、コンビナトリアルケミストリー手法、Wangら（1997）に記載のＨＰＬＣ法に接続されるマイクロ透析、またはBushら（1997）に記載のアフィニティキャピラリー電気泳動法により生成される分子などの薬剤または低分子を用いる。
【０５７１】
さらなる方法において、ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントと相互作用するペプチド、薬剤、脂肪酸、リポタンパク質、または低分子は、以下のようなアッセイを用いて同定され得る。結合に関して試験される分子は、蛍光、放射活性または酵素タグなどの検出可能な標識により標識され、そして、特異的結合が生じるのを可能にする条件下で固定されたＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメントと接触される。非特異的結合分子を除去した後、結合分子は適切な手段を用いて検出させる。
【０５７２】
本発明の別の目的は、ＰＧ−３ポリペプチドと相互作用する候補物質のスクリーニング用の方法およびキットからなる。
【０５７３】
本発明は、ＰＧ−３タンパク質またはその１つのフラグメントもしくは改変体と相互作用する目的の物質をスクリーニングする方法に関する。ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体に共有結合または非共有結合する能力によって、これらの物質または分子はインビトロおよびインビボの両方で有利に用いられ得る。
【０５７４】
インビトロで、前記相互作用分子は、試料において、好ましくは生物学的試料において、ＰＧ−３タンパク質の存在を同定するために、検出手段として用いられ得る。
【０５７５】
候補物質のスクリーニングのための方法は、以下の工程を包含する：
ａ）ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントからなるポリペプチドを提供する工程；
ｂ）候補物質を得る工程；
ｃ）該ポリペプチドを該候補物質と接触させる工程；
ｄ）該ポリペプチドと該候補物質との間で形成される複合体を検出する工程。
【０５７６】
本発明はさらに、ＰＧ−３ポリペプチドと相互作用する候補物質のスクリーニングのためのキットに関し、ここで、該キットは以下を包含する：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むペプチドフラグメント；
ｂ）任意には、ＰＧ−３タンパク質またはそのペプチドフラグメントもしくは改変体と候補物質との間で形成される複合体を検出するのに有用な手段。
【０５７７】
前記キットの好ましい実施態様では、検出手段は、ＰＧ−３タンパク質またはそのペプチドフラグメントもしくは改変体に対して指向されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【０５７８】
種々の候補物質または分子は、ＰＧ−３ポリペプチドとの相互作用に関してアッセイされ得る。これらの物質または分子としては、ポリペプチドなどの天然もしくは合成有機化合物または生物学的起源の分子があげられるが、これらに限定されない。候補物質または分子がポリペプチドからなる場合、このポリペプチドは、ファージベースの無作為ペプチドライブラリーに属するファージクローンの得られる発現産物であり得、または代替的には、ポリペプチドはツーハイブリッドスクリーニングアッセイを実施するのに適切なベクターにクローン化されるｃＤＮＡライブラリーの得られる発現産物であり得る。
【０５７９】
本発明はまた、本明細書でこれまでに記載されたスクリーニング方法を実施するために有用なキットに関する。好ましくは、このようなキットは、ＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体、および任意には、ＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体と、候補物質との間で形成される複合体を検出するのに有用な手段を含む。好ましい実施態様では、検出手段は、対応するＰＧ−３タンパク質またはそのペプチドフラグメントもしくは改変体に対して指向されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
【０５８０】
［Ａ．無作為ペプチドライブラリーから得られた候補リガンド］
スクリーニング方法の１つの特定の実施態様では、推定リガンドは、ファージベクターに含まれているＤＮＡ挿入物の発現産物である（ParmleyおよびSmith，1988）。とくに、無作為ペプチドファージライブラリーが用いられる。無作為ＤＮＡ挿入物は、８〜２０アミノ酸長のペプチドをコードする（Oldenburg  K．R．ら、1992；Valadon  P.ら、1996；Lucas  A．H．，1994；Westerink  M.A.J，1995；Felici  F.ら、1991）。この特定の実施態様によると、固定されたＰＧ−３タンパク質に結合するタンパク質を発現する組換えファージが保持され、そして、ＰＧ−３タンパク質と組換えファージとの間に形成された複合体は、ＰＧ−３タンパク質に対して指向されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体により、その後に免疫沈降され得る。
【０５８１】
いったん、組換えファージにおいてリガンドライブラリーが構築されたら、ファージ集団が固定されたＰＧ−３タンパク質と接触させられる。ついで、非特異的に結合した組換えファージを除去するために、複合体の調製物は洗浄される。ＰＧ−３タンパク質に特異的に結合するファージは、ついで、緩衝液（酸ｐＨ）により溶出されるか、またはハイブリドーマ抗ＰＧ−３により産生されるモノクローナル抗体により免疫沈降される。そして、このファージ集団はその後、細菌（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の過剰感染により増幅される。選択工程は、より特異的な組換えファージクローンを選択するために、数回、好ましくは２〜４回繰り返えされ得る。最後の工程は、感染細菌における発現および単離、別の宿主−ベクター系におけるファージ挿入物の発現か、または選択された組換えファージに含まれる挿入物の配列決定かのいずれかによって、選択された組換えファージクローンにより作り出されたペプチドを特徴付けることにある。
【０５８２】
［Ｂ．競合実験により得られた候補リガンド］
代替的には、ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントに結合するペプチド、薬剤もしくは低分子は、競合実験において同定され得る。このようなアッセイでは、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントは、プラスチックプレートなどの表面に固定される。ペプチド、薬剤、または低分子の増加量が、検出可能に標識された公知のＰＧ−３タンパク質リガンドの存在下で、固定ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントと接触させられる。たとえば、ＰＧ−３リガンドは、蛍光、放射活性、または酵素タグにより検出可能に標識され得る。ＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメントを結合する試験分子の能力は、試験分子の存在下に、検出可能に標識された公知の結合リガンドの量を測定することにより測定される。試験分子が存在している場合は、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントに結合される公知のリガンドの量における減少は、試験分子が、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントに結合し得ることを示す。
【０５８３】
［Ｃ．アフィニティクロマトグラフィーにより得られた候補リガンド］
ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントと相互作用するタンパク質または他の分子はまた、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントを含むアフィニティカラムを用いて見出され得る。ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントは、当業者に精通のアガロース、Ａｆｆｉ  Ｇｅｌ（登録商標）、またはその他のマトリックスなどの適切なカラムマトリックスに化学的に結合することを含む慣用的な技術を用いてカラムに結合され得る。この方法のいくつかの実施態様において、アフィニティカラムは、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されるキメラたんぱく質を含む。前記のように、細胞タンパク質の混合物または発現タンパク質のプールは、アフィニティカラムに適用される。カラムに結合されるＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントと相互作用するタンパク質または他の分子は、ついで、Ramunsenら（1997）に記載のように、２−Ｄ電気泳動ゲル上で分離かつ分析され得る。あるいは、アフィニティカラム上に保持されているタンパク質は、電気泳動のベースの方法により精製され、かつ配列決定され得る。同じ方法は、抗体を単離し、ファージディスプレイ産物をスクリーニングまたはファージディスプレイヒト抗体をスクリーニングするのに用いられ得る。
【０５８４】
［Ｄ．光学バイオセンサ法により得られる候補リガンド］
ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントと相互作用するタンパク質はまた、ＥｄｗａｒｄｓおよびＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ（１９９７）ならびにＳｚａｂｏら（１９９５）にも記載のように、光学バイオセンサを用いることよりスクリーニングされ得る。この技術は、標識分子を必要とせずに、実時間での分子間の相互作用の検出を可能にする。この技術は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づく。簡潔には、試験すべき候補リガンド分子は、表面（たとえば、カルボキシメチルデキストランマトリックス）に結合される。光ビームが試験すべき試料を含んではいない表面の側に向けて指向され、かつ該表面によって反射される。ＳＰＲ現象は角度および波長の特定の関連を有する反射光の強度の減少を引き起こす。候補リガンド分子の結合は、変化がＳＰＲシグナルにおける変化として検出される、表面上の屈折率の変化を引き起こす。ＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメントと相互作用し得る候補リガンド分子または物質のスクリーニングについて、ＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメントは表面上に固定化される。この表面は、アッセイされる候補分子がその中をとおって流れる細胞の一方の側からなる。ＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメント上への候補分子の結合は、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。試験される候補分子は、コンビナトリアルケミストリーにより生成されたタンパク質、ペプチド、糖質、脂質、または低分子であり得る。この技術はまた、その表面にある内在性または組換え発現ＰＧ−３タンパク質を示す真核細胞もしくは原核細胞または脂質ビヒクルを固定化することにより実施され得る。
【０５８５】
方法の主な利点は、それによって、ＰＧ−３タンパク質とＰＧ−３タンパク質と相互作用する分子との間の関連率の測定が可能である点にある。したがって、強力なまたは反対に弱い関連定数により、ＰＧ−３タンパク質またはそのフラグメントと相互作用するリガンド分子を特異的に選択することが可能となる。
【０５８６】
［Ｅ．ツーハイブリッドスクリーニングアッセイにより得られる候補リガンド］
酵母ツーハイブリッド系は、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を研究するように設計され（FieldsおよびSong，1989）、そして酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへのベイトタンパク質の融合に依存している。この技術はまた、米国特許第５，６６７，９７３号明細書および同第５，２８３，１７３号明細書に記載されている。
【０５８７】
ツーハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般的な手順は、Harperら（1993）により記載されているように、またはChoら（1998）、またはFromont−Racineら（1997）により記載されているように、実施され得る。
【０５８８】
ベイトタンパク質またはポリペプチドは、ＰＧ−３タンパク質、または配列番号３の、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸の連続した範囲を含むフラグメントからなる。
【０５８９】
より正確には、ＰＧ−３ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードするヌクレオチド配列は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合され、融合ヌクレオチド配列は、たとえば、ｐＡＳ２またはｐＭ３に適切な発現ベクターに挿入される。
【０５９０】
ついで、ヒトｃＤＮＡ挿入物がＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクターにおけるヌクレオチド配列に融合されるように、ヒトｃＤＮＡライブラリーが特別に設計されるベクターに構築される。好ましくは、用いられるベクターはｐＡＣＴベクターである。ヒトｃＤＮＡライブラリーのヌクレオチド挿入物によってコードされるポリペプチドは「プレイ」ポリペプチドと呼ばれる。
【０５９１】
第３ベクターは、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインの両方を含む完全なＧａｌ４タンパク質の結合に対して反応する調節配列の制御下に置かれているベータガラクトシダーゼ遺伝子またはＣＡＴ遺伝子などの検出可能なマーカー遺伝子を含む。たとえば、ベクターｐＧ５ＥＣを用い得る。
【０５９２】
２つの異なる酵母株もまた用いられる。例示的なものであって、限定的な例ではないが、２つの異なる酵母株は以下のものであり得る：
Ｙ１９０，その表現型は（ＭＡＴａ，Ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−１２，ｔｒｐ１−９０１，ｈｉｓ３−Ｄ２００，ａｄｅ２−１０１，ｇａｌ４Ｄｇａｌ１８０Ｄ  ＵＲＡ３  ＧＡＬ−ＬａｃＺ，ＬＹＳ  ＧＡＬ−ＨＩＳ３，ｃｙｈr）；
Ｙ１８７，その表現型は（ＭＡＴａ  ｇａｌ４  ｇａｌ８０  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１−９０１  ａｄｅ２−１０１  ｕｒａ３−５２  ｌｅｕ２−３，−１１２  ＵＲＡ３  ＧＡＬ−ＬａｃＺｍｅｔ-），これは、Ｙ１９０の反対一致型である。
【０５９３】
簡潔には、ｐＡＳ２／ＰＧ−３を２０μｇと、ｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリーの２０μｇが、酵母株Ｙ１９０の中に共形質転換される。形質転換体は、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠失するが、ヒスチジン合成阻害剤３−ＡＴ（５０ｍＭ）を含む最少培地上での増殖のために選択される。陽性コロニーがフィルターリフトアッセイによりベータガラクトシダーゼに関してスクリーニングされる。二重陽性コロニー（Ｈｉｓ+，ベータ−ｇａｌ+）がその後に、ｐＡＳ２／ＰＧ−３プラスミドは欠失するが、ｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリープラスミドは保持するクローンについて選択するために、ヒスチジン、ロイシンは欠失するが、トリプトファンおよびシクロへキシミド（１０ｍｇ／ｍｌ）は含むプレート上で増殖される。得られるＹ１９０株は、Ｈａｒｐｅｒら（１９９３）により、および、Ｂｒａｍら（１９９３）により記載されているように、Ｇａｌ４融合体として、ＰＧ−３またはシクロフィリンＢ、ラミン、またはＳＮＦ１などの非関連制御タンパク質を発現するＹ１８７株と接合させ、かつ、フィルターリフトアッセイによりベータガラクトシダーゼに関してスクリーニングされる。制御Ｇａｌ４融合体との接合後のベータｇａｌ−である酵母クローンは擬陽性であると考えられる。
【０５９４】
本発明によるツーハイブリッド法の別の実施態様では、ＰＧ−３またはそのフラグメントもしくは改変体と、細胞タンパク質の相互作用が、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（カタログ番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて評価され得る。Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（カタログ番号Ｋ１６０４−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添付されているマニュアルに記載されているように、それらの核酸が酵母転写活性化因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、ＰＧ−３タンパク質またはその一部をコードする核酸が発現ベクターに挿入される。所望のｃＤＮＡ、好ましくはヒトｃＤＮＡが、それらがＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、第２の発現ベクターに挿入される。２つの発現プラスミドは、酵母に形質転換され、そして、その酵母は、発現ベクターのそれぞれ上の選択可能なマーカーの発現およびＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現について選択する選択培地上に置かれる。ヒスチジンを欠く培地上で増殖し得る形質転換体が、ＧＡＬ４依存性ｌａｃＺ発現についてスクリーニングされる。ヒスチジン選択およびｌａｃＺアッセイの両方で陽性であるこれらの細胞は、ＰＧ−３と、最初に選択されたｃＤＮＡ挿入物によりコードされるタンパク質またはペプチドとの間の相互作用が含まれる。
【０５９５】
［ＰＧ−３遺伝子の調節配列と相互作用する物質のスクリーニング方法］
本発明はまた、たとえば、プロモーターまたはエンハンサー配列などのＰＧ−３遺伝子の調節配列と相互作用し得る物質または分子をスクリーニングする方法に関する。
【０５９６】
ＰＧ−３遺伝子の調節配列と相互作用し得るタンパク質をコードする核酸、とくに、５’および３’調節領域のポリヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは改変体、および好ましくは、本発明の二対立遺伝子マーカーの１つを含む改変体は、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍキット（カタログ参照番号Ｋ１６０３−１）に同梱されている小冊子に記載されているように、１つのハイブリッドシステムを用いて同定され得る。簡潔には、標的ヌクレオチド配列は、選択可能なリポーター配列の上流にクローン化され、そして、得られたＤＮＡ構築物は、酵母ゲノム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に統合される。そのゲノムにリポーター配列を含む酵母細胞はその後、ＰＧ−３遺伝子の調節配列上に結合するための候補タンパク質をコードするｃＤＮＡと、ＧＡＬ４などの酵母転写因子の活性化因ドメインをコードする配列との間の融合分子からなるライブラリーにより形質転換される。組換え酵母細胞は、リポーター配列を発現する細胞を選択するための培養液に置かれる。このように選択された組換え酵母細胞には、ＰＧ−３遺伝子の標的調節配列上に結合し得る融合タンパク質を含む。ついで、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは配列決定され、そして、インビトロで発現または転写ベクターにクローン化され得る。ＰＧ−３遺伝の標的調節配列へのコードされたポリペプチドの結合は、ゲル遅延アッセイまたはＤＮアーゼ保護アッセイなどの当業者に精通の技術により確かめられ得る。
【０５９７】
ゲル遅延アッセイはまた、FriedとCrothers（1981）、GarnerとRevzin（1981）およびDentとLatchman（1993）により記載されているように、ＰＧ−３遺伝子の調節配列と相互作用し得る候補分子をスクリーニングするために、個別に実施され得る。これらの技術は、タンパク質に結合されるＤＮＡフラグメントが同じ非結合ＤＮＡフラグメントよりも遅く移動することによる原理に基づく。簡潔には、標的ヌクレオチド配列は標識される。ついで、標識された標的ヌクレオチド配列は、転写因子を含む細胞からの全核抽出物か、または、試験される異なる候補分子かのいずれかと接触させる。ＰＧ−３遺伝子の標的調節配列と、候補分子または転写因子との間の相互作用が、移動における遅延により、ゲルまたはキャピラリー電気泳動後に検出される。
【０５９８】
［ＰＧ−３遺伝子の発現を調節するリガンドをスクリーニングする方法］
本発明の別の目的は、ＰＧ−３タンパク質の発現を調節する分子をスクリーニングする方法である。このようなスクリーニング方法は以下の工程を包含する：
ａ）それ自体が有するプロモーターの制御下に置かれて、ＰＧ−３タンパク質またはその改変体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列によりトランスフェクションされた原核細胞または真核細胞を培養する工程；
ｂ）試験される分子と培養細胞を接触させる工程；
ｃ）ＰＧ−３タンパク質またはその改変体もしくはフラグメントの発現を定量する工程。
【０５９９】
実施態様において、ＰＧ−３タンパク質またはその改変体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０およびその相補鎖のうち少なくとも１つの対立遺伝子を含む。
【０６００】
当業者には周知のＤＮＡ組換え技術を用いて、ＤＮＡ配列をコードするＰＧ−３タンパク質が、そのプロモーター配列の下流で、発現ベクターに挿入される。例証的な例として、ＰＧ−３遺伝子のプロモーター配列が５’調節領域の核酸に含まれる。
【０６０１】
ＰＧ−３タンパク質の発現の定量化をｍＲＮＡ値か、またはタンパク質の値かのいずれかで実現され得る。後者の場合では、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、たとえば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイにおいて、産生されているＰＧ−３タンパク質の量を定量化するのに用いられ得る。
【０６０２】
好ましい実施態様では、ＰＧ−３  ｍＲＮＡの定量化は、ＰＧ−３に特異的なプライマー対を用いて、培養されたＰＧ−３トランスフェクションされた宿主細胞の総ｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡの定量的なＰＣＲ増幅により実現される。
【０６０３】
本発明はまた、ＰＧ−３遺伝子の発現のレベルを増加させる、またはそれとは対照的に減少させることができる物質または分子をスクリーニングする方法に関する。このような方法により、当業者であれば、ＰＧ−３遺伝子の発現レベルに対して調節効果を発揮する物質を選択することが可能となり、これは、癌または異常な細胞分化に関連する障害に罹患している患者を治療するための製薬組成物に含まれる活性成分として有用であり得る。
【０６０４】
したがって、本発明の別の態様は、ＰＧ−３遺伝子の発現を調節する能力に関して候補物質または分子をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む：
ａ）核酸を含有する組換え細胞宿主を提供する工程であって、ここで、該核酸は、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置している、５’調節領域またはその調節活性フラグメントもしくは改変体のヌクレオチド配列を含む、工程；
ｂ）候補物質を得る工程；
ｃ）検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節する候補物質の能力を測定する工程。
【０６０５】
さらなる１つの実施態様では、５’調節領域、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体のヌクレオチド配列を含む核酸としてはまた、配列番号２の、ＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ領域、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体の１つがあげられる。
【０６０６】
検出可能なタンパク質をコードする好ましいポリヌクレオチドの中には、ベータガラクトシダーゼ、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびクロラムフェ二コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするポリヌクレオチドがあげられ得る。
【０６０７】
本発明はまた、本明細書に記載されているスクリーニング方法を実施するために有用なキットに関する。好ましくは、このようなキットは、上流に位置しており、かつ、検出可能なタンパク質、あるいはＰＧ−３タンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される、５’調節領域またはその調節活性フラグメントもしくは改変体のヌクレオチド配列の発現を可能にする組換えベクターを含む。
【０６０８】
ＰＧ−３遺伝子の発現を調節する能力に関して、候補物質または分子のスクリーニングのための方法の別の実施態様において、方法は以下の工程を含む：
ａ）核酸を含有する組換え宿主細胞を提供する工程であって、ここで、該核酸は、配列番号２のＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体を含み、５’ＵＴＲ配列またはその調節活性フラグメントもしくは改変体は、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合される、工程；
ｂ）候補物質を得る工程；および
ｃ）検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節する候補物質の能力を測定する工程。
【０６０９】
前記スクリーニング方法の特定な実施態様では、配列番号２のＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体の１つを含む核酸としては、ＰＧ−３  ５’ＵＴＲ配列に対して内在性であるプロモーター配列があげられる。
【０６１０】
前記スクリーニング方法の別の特定な実施態様では、配列番号２のＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体の１つを含む核酸としては、本明細書中に定義されるＰＧ−３  ５’ＵＴＲ配列に対して内在性であるプロモーター配列があげられる。
【０６１１】
さらに好ましい実施態様では、配列番号２のＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、またはその調節活性フラグメントを含む核酸としては、Ａ１〜Ａ８０からなる群から選択される二対立遺伝子マーカーまたはその相補鎖があげられる。
【０６１２】
本発明はさらに、ＰＧ−３遺伝子の発現を調節する能力に関して候補物質のスクリーニングのためのキットを包含する。ここで、該キットは、配列番号２のＰＧ−３  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、またはその調節活性フラグメントもしくは改変体のうち１つを含む核酸を含む組換えベクターを含み、５’ＵＴＲ配列またはその調節活性フラグメントもしくは改変体は、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。
【０６１３】
前記スクリーニング法を実施するために有用である適切な組換えベクターの設計に関しては、本発明の好ましい組換えベクターが記載されている本明細書の節が適当である。
【０６１４】
ＰＧ−３の発現レベルおよびパターンは、国際特許公開第９７／０５２７７号明細書に記載のように、長いプローブを用いて溶液ハイブリダイゼーションにより分析され得る。簡潔には、前記のＰＧ−３ｃＤＮＡもしくはＰＧ−３ゲノムＤＮＡ、またはそのフラグメントは、アンチセンスＲＮＡを算出するために、バクテリオファージ（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流にあるクローニング部位に挿入される。好ましくは、ＰＧ−３挿入物は、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の少なくとも１００以上の連続ヌクレオチドを含む。プラスミドは線状化され、かつ、修飾リボヌクレオチド（すなわち、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）を含むリボヌクレオチドの存在下で転写される。この二重に標識されたＲＮＡの余剰分が、目的の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡと溶液中でハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは標準的なストリンジェント条件（８０％ホルムアミド、０．４Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７〜８において４０〜５０℃で１６時間）下で実施される。非ハイブリダイズされたプローブは、一本鎖ＲＮＡ（すなわち、ＲＮアーゼＣＬ３、Ｔ１、Ｐｈｙ  Ｍ、Ｕ２またはＡ）に特異的なリボヌクレアーゼを用いる消化によって除去される。ビオチン−ＵＴＰ修飾の存在は、ストレプトアビジンで被膜されたマイクロ力価プレート上でのハイブリッドの捕獲が可能となる。ＤＩＧ修飾の存在は、アルカリホスファターゼに結合された抗ＤＩＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡによりハイブリッドを検出かつ定量化することが可能となる。
【０６１５】
ＰＧ−３遺伝子発現の定量分析はまた、アレイを用いて実施され得る。本明細書中で用いられる場合、用語アレイは、それにハイブリダイズし得るｍＲＮＡの発現の特異的な検出を可能にするのに、十分な長さの複数の核酸の一次元、二次元または多次元の配置を意味する。たとえば、アレイには、その発現レベルが評価される遺伝子から得られた複数の核酸が含まれ得る。アレイには、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡ、ＰＧ−３  ｃＤＮＡ配列、またはそれに相補的な配列もしくはそのフラグメント、とくに、本発明による二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つ、好ましくは、二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０の少なくとも１つを含むそれらが含まれ得る。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長である。他の実施態様では、フラグメントは少なくとも２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様では、フラグメントは少なくとも５０ヌクレオチド長である。より好ましくは、フラグメントは少なくとも１００ヌクレオチド長である。別の好ましい実施態様では、フラグメントは１００よりも大きいヌクレオチド長である。ある実施態様では、フラグメントは５００よりも大きいヌクレオチド長である。
【０６１６】
たとえば、ＰＧ−３遺伝子発現の定量分析は、Schenaら（1995および1996）により記載されているように、相補的ＤＮＡマイクロアレイにより実施され得る。完全長ＰＧ−３  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントはＰＣＲにより増幅され、かつ高速ロボットを用いて９６ウェルマイクロタイタープレートからシリル化顕微鏡スライド上に配列される。プリントされたアレイは湿潤なチャンバーにおいて、アレイの構成要素の再水和化を可能にするためにインキュベートされ、かつ０．２％ＳＤＳで１分間１回、水で１分間２回、およびナトリウムホウ水化物溶液の中で５分間１回リンスされる。アレイは９５℃で２分間水の中に浸され、０．２％ＳＤＳに１分間移されて、水で２回洗浄され、風乾され、そして暗所に２５℃で保存される。
【０６１７】
細胞または組織ｍＲＮＡは単離されるか、または商業的に入手され、そして、プローブは逆転写の単一ラウンドで調製される。プローブは６０℃で６〜１２時間、１４×１４ｍｍガラスカバー片下で１ｃｍ2マイクロアレイにハイブリダイズされる。アレイは低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）において２５℃で５分間洗浄され、その後、室温にて１０分間高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）において洗浄される。アレイはカスタムフィルターセットで適合した蛍光レーザースキャニングデバイスを用いて０．１×ＳＳＣにおいてスキャニングされる。正確な示差発現測定値が、２つの個別のハイブリダイゼーション比率の平均をとることにより得られる。
【０６１８】
ＰＧ−３遺伝子発現の定量分析は、また、Pietuら（1996）により記載されているように、相補的ＤＮＡアレイにある完全長ＰＧ−３  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて実施され得る。完全長ＰＧ−３  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、ＰＣＲ増幅され、そして、膜上にスポットされる。その後、さまざまな組織または細胞に起源を有するｍＲＮＡが放射性ヌクレオチドにより標識される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を制御条件下で実施した後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡがホスホ画像またはオートラジオグラフィーにより検出される。二重に実験が実施され、そして、示差的に発現したｍＲＮＡの定量分析がその後に実施される。
【０６１９】
あるいは、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡ、ＰＧ−３  ｃＤＮＡ、またはそのフラグメントを用いた発現分析は、Lockhartら（1996）とSosnowskiら（1997）により記載されているように、高密度ヌクレオチドアレイにより実施し得る。ＰＧ−３ゲノムＤＮＡ配列、ＰＧ−３  ｃＤＮＡ配列、とくに、本発明による二対立遺伝子マーカーの少なくとも１つを含む配列、好ましくは、Ａ１〜Ａ８０からなる群から選択される少なくとも１つの二対立遺伝子マーカーまたはそれに相補的な配列由来の１５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが、チップ上で直接合成され（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、前出）、または合成され、その後にチップにアドレスされる（Sosnowskiら、前出）。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチド長である。
【０６２０】
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光色素などの適切な化合物で標識されたＰＧ−３  ｃＤＮＡプローブは、適切なｍＲＮＡ集団から合成され、その後、無作為に、５０〜１００ヌクレオチドの平均的な大きさにフラグメント化される。このプローブはその後、チップにハイブリダイズされる。Ｌｏｃｋｈａｒｔら、前出に記載されているように洗浄し、そして、異なる電界の適用後（Sosnowskiら、1997）、色素または標識化合物が検出され、かつ定量化される。二重にハイブリダイゼーションが実施される。異なるｃＤＮＡ試料において同一の標的オリゴヌクレオチド上にあるｃＤＮＡプローブに起源を有するシグナルの強度の比較分析は、ＰＧ−３  ｍＲＮＡの示差発現を示す。
【０６２１】
［ＰＧ−３遺伝子の発現を阻害する方法］
本発明による他の治療成分は、対応するＰＧ−３遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールまたはトリプルへリックスツールとして、ＰＧ−３の核酸配列のオリゴヌクレオチドフラグメントを有利に含む。ＰＧ−３の核酸配列の好ましいフラグメントは、二対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ８０の少なくとも1つの対立遺伝子を含む。
【０６２２】
［アンチセンス手法］
アンチセンス手法においては、ｍＲＮＡに相補的な核酸配列が細胞内でｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現をブロックする。遺伝子治療において用いられるアンチセンス核酸分子は、ＤＮＡ配列かまたはＲＮＡ配列のいずれかであり得る。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いる好ましい方法は、ScZakielら（1995）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）により記載された手順である。
【０６２３】
好ましくは、アンチセンスツールは、ＰＧ−３  ｍＲＮＡ、より好ましくは、ＰＧ−３  ｍＲＮＡの５’末端に相補的であるポリヌクレオチド（１５〜２００ｂｐ長）の中から選択される。別の実施態様では、所望の標的遺伝子の異なる部分に相補的な異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組合せが用いられる。
【０６２４】
本発明による他の好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンＡＴＧを含むＰＧ−３  ｍＲＮＡの配列か、またはスプライシングドナーまたはアクセプター部位を含むＰＧ−３ゲノムＤＮＡの配列かのいずれかに相補的な配列である。
【０６２５】
好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、自己切断リボザイム配列で置換された３’ポリアデニル化シグナルを有し、そのため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物はその３’末端でポリ（Ａ）なしで産生され、これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、Liuら（1994）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）の文献に記載されているように、核から移出することができない。好ましい実施態様では、これらのＰＧ−３アンチセンスポリヌクレオチドはまた、リボザイムカセット内に、３’−５’エキソヌクレオチド分解に対して切断転写物を安定させるために、Ecknerら（1991）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）によって記載されている構造などのヒストンステムループ構造を含む。
【０６２６】
アンチセンス核酸は、二本鎖におけるＰＧ−３  ｍＲＮＡの発現を阻害するのに十分な安定性を有する細胞内二本鎖の形成を許容するのに十分な長さと融解温度を有するべきである。遺伝子治療に用いるのに適切なアンチセンス核酸を設計するための方策が、Greenら（1986）およびIzantとWeintraub（1984）（それらの開示は、参考として本明細書中に援用される）に開示されている。
【０６２７】
いくつかの方策においては、アンチセンス分子は、細胞において通常転写されるものから、その反対の鎖を転写するように、プロモーターに対して、ＰＧ−３コード領域の配向を逆転することにより得られる。アンチセンス分子は、転写物を生成するために、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼを用いる系などのインビトロ転写系を用いて転写され得る。別の手法には、適切な発現ベクターにおいて、アンチセンス配列を含むＤＮＡをプロモーターに作動可能に連結することにより、インビボでのＰＧ−３アンチセンス核酸の転写が含まれる。
【０６２８】
あるいは、細胞において、通常であれば転写される鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドは、インビトロで合成され得る。したがって、アンチセンス核酸は、相当するｍＲＮＡに対して相補的であり、そして、二本鎖を作り出すために、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る。いくつかの実施態様では、アンチセンス配列は、安定性を増加させ、かつ、それらのＲＮアーゼ活性に対する感受性を減少させるために、修飾糖リン酸骨格が含まれ得る。アンチセンス方策に用いるのに適切な修飾の例には、２’Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびタンパク質−核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、例としては、Ｒｏｓｓｉら（１９９１）（開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載されている。
【０６２９】
ＰＧ−３  ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの配列に相補的な種々の型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられ得る。１つの好ましい実施態様では、国際出願第９４／２３０２６号パンフレット（参考として本明細書中に援用される）に記載されている安定および準安定アンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる。これらの分子においては、３’末端または３’と５’末端の両方が、相補的な塩基対の間の分子間水素結合にかかわっている。これら分子は、エキソヌクレアーゼ攻撃によりよく耐えることができ、そして、慣用的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに比較して安定性が高いことを示している。
【０６３０】
別の好ましい実施態様では、国際出願第９５／０４１４１号パンフレット（参考として本明細書中に援用される）に記載されている単純疱疹ウイルスタイプ１および２に対してアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが用いられる。
【０６３１】
なお別の好ましい実施態様では、国際出願第９６／３１５２３号パンフレット（参考として本明細書中に援用される）に記載されている共有結合的に架橋されているアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる。これらの二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ、１つ以上の、オリゴヌクレオチド間、またはオリゴヌクレオチド内共有結合架橋を含み、ここで、結合が一本の鎖の第一級アミン基と、もう一本の鎖または同じ鎖のカルボキシル基との間のアミド結合からなり、第一級アミン基は、鎖ヌクレオチド単糖環の２’位置に直接置換され、そして、カルボキシル基は、もう一本の鎖または同じ鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体上で置換される脂肪族スペーサ基によりそれぞれ保有される。
【０６３２】
国際出願第９２／１８５２２号パンフレット（参考として援用される）に開示されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた用いられ得る。これらの分子は分解に対して安定であり、かつタンパク質を制御するように結合する少なくと１つの転写制御認識配列を含み、そして、そのためにデコイとして効果的である。これらの分子は、「ヘアピン」構造、「ダンベル」構造、「修飾ダンベル」構造、「架橋」デコイ構造および「ループ」構造を含み得る。
【０６３３】
別の好ましい実施態様では、欧州特許出願第０５７２２８７Ａ２号（参考として本明細書中に援用される）に記載されているサイクリック二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられる。これらの結合オリゴヌクレオチド「ダンベル」には、転写因子のための結合部位が含まれ、そして因子を隔離することにより転写因子の制御下で、遺伝子の発現を阻害する。
【０６３４】
国際出願第９２／１９７３２号パンフレット（参考として本明細書中に援用される）に開示されている閉鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用もまた、考慮される。これら分子は、自由端を有していないため、それらは、エキソヌクレアーゼによる分解に対して、慣用的なオリゴヌクレオチドよりも耐性がある。これらのオリゴヌクレオチドは多機能性であり、標的ｍＲＮＡに隣接していないいくつかの領域と相互作用し得る。
【０６３５】
遺伝子発現を阻害するのに必要とされるアンチセンス核酸の適切なレベルは、インビトロ発現分析を用いて、測定され得る。アンチセンス分子は、当業者には公知の手順を用いて、拡散、注入、感染またはトランスフェクションにより、細胞の中に導入され得る。たとえば、アンチセンス核酸は、体内に、剥き出しのまたは裸のオリゴヌクレオチド、脂質の中にカプセル化されて入れられたオリゴヌクレオチド、ウイルスタンパク質であるキャプシドによって包まれているオリゴヌクレオチド配列として、または、発現ベクターの中に含まれるプロモーターに作動可能に連結されているオリゴヌクレオチドとして、導入され得る。発現ベクターは、レトロウイルスもしくはウイルスベクター、染色体外複製ができるベクター、または組込みベクターを含む、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれかであり得る。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０６３６】
アンチセンス分子は、好ましくは、１×１０-10Ｍ〜１×１０-4Ｍの多数の異なる濃度で細胞試料上に導入される。いったん、十分に遺伝子発現を制御できる最少濃度が同定されると、その最適化投与量が、インビボで用いられるのに適切な投与量に翻訳される。たとえば、１×１０-7という培養における阻害濃度は、およそ０．６ｍｇ／ｋｇ体重の等量に翻訳される。１００ｍｇ／ｋｇ体重かそれ以上に近いオリゴヌクレオチドの値は、実験動物でオリゴヌクレオチドの毒性を試験した後であれば、可能となり得る。さらに、脊椎動物から細胞が取り出され、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されて、そして、脊椎動物に再導入されることが考慮される。
【０６３７】
本発明の好ましい適用では、遺伝子によりコードされたポリペプチドが最初に同定され、そのため、翻訳に対するアンチセンス阻害の効果が、それらに限定されるわけではないが、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ、機能性アッセイ、または放射性標識などの抗体媒介試験を含む技術を用いてモニタされ得る。
【０６３８】
本発明により用いられるアンチセンス技術に対する代替技術は、その相補的ポリヌクレオチドテイルにより標的配列に結合し、かつ、その標的部位を加水分解することにより（すなわち、「ハンマーヘッドリボザイム」）により対応するＲＮＡを切断するリボザイムを用いる工程を含む。簡潔には、ハンマーヘッドリボザイムの単純化サイクルは、（１）相補的なアンチセンス配列により標的ＲＮＡに特異的に結合する配列；（２）標的鎖の切断可能なモチーフの部位特異的加水分解；および（３）別の触媒サイクルを生じる切断産物の放出を含む。実際には、長鎖アンチセンスポリヌクレオチド（少なくとも３０塩基長）または長いアンチセンス腕を有するリボザイムの使用は有利である。アンチセンスリボザイムに対する好ましいデリバリーシステムは、これらアンチセンスリボザイムを脂肪親和性基に共有結合的に結合することにより、またはリポソームを都合のよいベクターとして用いるために、達成される。本発明による好ましいアンチセンスリボザイムは、Rossiら（1991）およびSczakielら（1995）により記載されているように、調製され、その特定の調製手順はこの文献（参考として本明細書中に援用される）に記載されている。
【０６３９】
［トリプルへリックス手法］
ＰＧ−３ゲノムＤＮＡはまた、細胞内トリプルへリックス形成に基づくＰＧ−３遺伝子の発現を阻害するのに用いられ得る。
【０６４０】
トリプルへリックスオリゴヌクレオチドは、ゲノムからの転写を阻害するのに用いられる。それが特定の遺伝子と関連している場合、細胞活性の変更を研究するのにとくに有用である。
【０６４１】
同様に、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡの一部は、細胞内でＰＧ−３転写を阻害する効果を研究するのに用いることができる。伝統的には、ホモプリン配列はトリプルへリックス方策にはもっとも有用なものであると考えられていた。しかし、ホモピリミジン配列はまた、遺伝子発現を阻害し得る。このようなホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列にある主要溝に結合する。したがって、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡからの配列の両方の型は、本発明の請求範囲内にあると考えられる。
【０６４２】
トリプルへリックス手法を用いて遺伝子治療法を実施するためには、ＰＧ−３発現を阻害するために、トリプルへリックスをベースにした方策に用いることができる１０マー〜２０マーのホモピリミジンまたはホモプリンストレッチを同定するために、ＰＧ−３ゲノムＤＮＡの配列が最初にスキャニングされる。候補ホモピリミジンまたはホモプリンストレッチの同定に続いて、ＰＧ−３発現を阻害する際の効果は、候補配列を含むオリゴヌクレオチドの種々の量を、ＰＧ−３遺伝子を発現する組織培養細胞の中に導入することにより評価される。
【０６４３】
オリゴヌクレオチドは、それらに限定されるわけではないが、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム媒介トランスフェクション法または自然摂取法を含む、当業者に公知の種々の方法を用いて、細胞の中に導入され得る。
【０６４４】
処理された細胞は、改変細胞機能または減少ＰＧ−３発現について、オリゴヌクレオチドで処理された細胞の中のＰＧ−３遺伝子の転写レベルをモニタするために、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼ保護アッセイ、またはＰＣＲベースの方策などの技術を用いて、モニタされる。
【０６４５】
組織培養細胞の中での遺伝子発現を阻害する際に効果的であるオリゴヌクレオチドは、その後、アンチセンス手法において記載されているように、インビトロの結果に基づく計算された投与量で、アンチセンス手法の中で上述されている技術を用いて、インビボで導入され得る。
【０６４６】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより耐性にするために、オリゴヌクレオチド単位の天然（ベータ）アノマーは、アルファアノマーと置換され得る。さらに、臭化エチジウムなどの挿入剤は、トリプルへリックスを安定させるために、アルファオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させることができる。トリプルへリックス形成に適切なオリゴヌクレオチドの生成についての情報に関しては、Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９８９）（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０６４７】
［コンピュータ関連実施態様］
本明細書中で用いられる場合、用語「本発明の核酸コード」は、以下のいずれか１つを含む、いずれか１つから本質的になる、またはいずれか１つからなるヌクレオチド配列を包含する：ａ）配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、配列番号１の以下のヌクレオチド位置の少なくとも１、２、３、５または１０を含む：１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−２４０８２５）；ｂ）配列番号２の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖；およびｃ）前出のヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列。
【０６４８】
「本発明の核酸コード」はさらに、以下に相同なヌクレオチド配列を包含する：ａ）配列番号１の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲（ここで、この連続した範囲は、配列番号１の以下のヌクレオチド位置の少なくとも１、２、３、５または１０を含む：１−９７９２１、９８５１７−１０３４７１、１０３６０３−１０８２２２、１０８３９０−１０９２２１、１０９３２４−１１４４０９、１１４５３８−１１５７２３、１１５９５７−１２２１０２、１２２２２５−１２６８７６、１２７０３３−１５７２１２、１５７８０８−２４０８２５）；ｂ）配列番号２の、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００もしくは１０００ヌクレオチドの連続した範囲またはその相補鎖；およびｃ）前出のヌクレオチド配列の全てに相補的なヌクレオチド配列。相同配列とは、これらの連続した範囲に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の相同性を有する配列をいう。相同性は、デフォルトパラメーターを用いる、または任意の修飾パラメーターを用いるＢＬＡＳＴ２Ｎを含む、本明細書中に記載されている任意の方法を用いて測定され得る。相同配列にはまた、本発明の核酸コードの中のウリジンがチミンで置換されているＲＮＡ配列を含み得る。本発明の核酸コードは、伝統的な単一文字様式で（Stryer，Lubert，1995の内側バックカバーを参照）、または配列におけるヌクレオチドの同一性を記録する任意の他の様式またはコードで表わすことができることは理解されるであろう。
【０６４９】
本明細書中で用いられる場合、用語「本発明のポリぺプチドコード」は、配列番号３の、少なくとも６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００アミノ酸の連続した範囲を含むポリペプチド配列を包含する。本発明のポリペプチドコードは、伝統的な単一文字様式もしくは３文字様式で（Stryer，Lubert，1995の内側バックカバーを参照）、または配列におけるポリペプチドの同一性を記録する任意の他の様式またはコードで表わすことができることは理解されるであろう。
【０６５０】
本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードは、コンピュータにより読み込み、かつアクセスされ得る任意の媒体上に保存し、記録し、そして、操作され得る。本明細書中で用いられる場合、語「記録される（する）」および「保存される（する）」は、コンピュータ媒体上に情報を保存するためのプロセスである。当業者は、本発明の核酸コードの１つ以上、または本発明のポリペプチドコードの１つ以上を含む製造品を生成するために、コンピュータが読み取り可能な媒体上に情報を記録するための現在公知の方法のいずれかを容易に適応し得る。本発明の別の態様は、その上に記録される本発明の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０または５０の核酸コードを有するコンピュータが読み取り可能な媒体である。本発明の別の態様は、その上に記録される本発明の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０または５０のポリペプチドコードを有するコンピュータが読み取り可能な媒体である。
【０６５１】
コンピュータ読み取り可能な媒体には、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体および磁気／光学媒体が含まれる。たとえば、コンピュータ読み取り可能な媒体は、当業者に公知の他の媒体の他のタイプとともに、ハードディクス、フレキシブルディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、無作為アクセスメモリ（ＲＡＭ）または読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）であり得る。
【０６５２】
本発明の実施態様には、システム、とくに、本明細書中に記載されている配列情報を保存し、かつ操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム１００の１つの例は、図１にブロック図で例証される。本明細書中で用いられる場合、「コンピュータシステム」とは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列、または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列を分析するのに用いられるハードウェア部品、ソフトウェア部品、およびデータ記憶部品をいう。１つの実施態様では、コンピュータシステム１００はＳｕｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  １０００サーバー（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。コンピュータシステム１００は、好ましくは、配列データを処理し、アクセスし、かつ操作するためのプロセッサを含む。プロセッサ１０５は、Ｉｎｔｅｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩＩ、またはＳｕｎ、Ｍｏｔｏｒｏｌａ、ＣｏｍｐａｑまたはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｓｉｎｅｓｓ  Ｍａｃｈｉｎｅｓの同様のプロセッサなどの中央演算装置のいずれかの周知の型であり得る。
【０６５３】
好ましくは、コンピュータシステム１００は、プロセッサ１０５およびデータを保存するための１つ以上の内部データ記憶コンポーネント１１０ならびにデータ記憶コンポーネント上に記憶させたデータを検索するための１つ以上のデータ検索装置を含む汎用システムである。当業者であれば、現在入手可能なコンピュータシステムのいずれのものでも適切なものであることは容易に理解し得る。
【０６５４】
１つの特定の実施態様では、コンピュータシステム１００には、メインメモリ１１５（好ましくはＲＡＭとして実行可能なもの）に接続されるバスに接続されたプロセッサ１０５ならびにハードドライブおよび／またはそこに記録されたデータを有するその他のコンピュータ読み取り可能な媒体などの１つ以上の内部データ記憶装置１１０が含まれる。いくつかの実施態様では、コンピュータシステム１００には、さらに、内部データ記憶装置１１０上に記憶されたデータを読み出すための１つ以上のデータ検索装置１１８が含まれる。
【０６５５】
データ検索装置１１８は、たとえば、フレキシブルディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブなどを示し得る。いくつかの実施態様では、内部データ記憶装置１１０は、制御ロジックおよび／またはそこに記録されるデータを含む、フレキシブルディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどの取り外し可能なコンピュータ読み取り可能な媒体である。コンピュータシステム１００は、データ検索装置の中にいったんは挿入されたデータ記憶部品からの制御ロジックおよび／またはデータを読み出すための適切なソフトウェアを有利に含む、またはそれらによって有利にプログラムされ得る。
【０６５６】
コンピュータシステム１００には、コンピュータ使用者に対して出力を表示するのに用いられるディスプレイ１２０が含まれる。コンピュータシステム１００は、コンピュータシステム１００に集中アクセスを提供するネットワークまたは広範な領域ネットワークおけるその他のコンピュータシステム１２５ａ−ｃに接続され得ることにまた、留意すべきである。
【０６５７】
本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列にアクセスしかつ処理するためのソフトウェア（検索ツール、比較ツール、およびモデリングツールなど）は、実行時には、メインメモリ１１５に入っているのがよい。
【０６５８】
いくつかの実施態様では、コンピュータシステム１００はさらに、コンピュータ読み取り可能な媒体上に保存されているヌクレオチドまたはポリペプチドの基準配列に対して、コンピュータ読み取り可能な媒体上に保存されている本発明の前記核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードを比較するための配列比較装置を含み得る。「配列比較装置」とは、それらには限定されるわけではないが、データ記憶手段内に保存されるペプチド、ペプチド模倣物、および化学品を含む他のヌクレオチドもしくはポリペプチド配列および／または化合物と、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列を比較するために、コンピュータシステム１００上で実行される１つ以上のプログラムをいう。たとえば、配列比較装置は、相同性、生物学的機能おいて示されるモチーフ、または構造モチーフを同定するために、コンピュータ読み取り可能媒体上に保存された基準配列に対して、コンピュータ読み取り可能媒体上に保存された本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列が比較され得る。本特許明細書の他所で確認されている種々の配列比較装置プログラムは本発明の本態様に用いることがとくに考慮される。
【０６５９】
図２は、新しい配列とデータペースにある配列との間の相同性レベルを測定するために、配列のデータベースと、新しいヌクレオチドまたはタンパク質配列を比較するためのプロセス２００の一実施態様を図示説明している流れ図である。配列のデータベースは、コンピュータシステム１００内に保存されている私的なデータベース、またはインターネットを通じて利用可能なＧＥＮＢＡＮＫ、ＰＩＲＯＲ  ＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどの公的なデータベースであり得る。
【０６６０】
プロセス２００はスタート状態２０１で始まり、ついで、比較すべき新しい配列がコンピュータシステム１００内のメモリに保存されると、状態２０２に移動する。前記で議論されるように、メモリは、ＲＡＭまたは内部記憶装置を含むメモリのいずれの型のものでも可能である。
【０６６１】
プロセス２００は、ついで、状態２０４に移動し、ここで、配列のデータベースが、分析と比較のために開かれる。プロセス２００は、ついで、状態２０６に移動し、ここで、データベースに保存された第１配列が、コンピュータ上のメモリ内に読み取られる。比較は、ついで、状態２０１で実施され、第１配列が第２の配列と同じであるかどうかを測定する。この工程は、データベース内の新しい配列と第１配列との間の正確な比較を行うことに限定されないことに留意することが重要である。それらが同一ではない場合であっても、２つのヌクレオチドまたはタンパク質配列を比較するための周知の方法は当業者に公知である。たとえば、ｇａｐは、２つの試験された配列の間の相同性レベルを上げるために１つの配列中に導入され得る。ｇａｐまたは他の性質を比較時に配列中に導入するかどうかを制御するパラメータは通常は、コンピュータシステムの使用者により入れられる。
【０６６２】
いったん、２つの配列の比較が状態２０１で実施されると、２つの配列が同一か否かは、決定状態２１０で決定される。当然、用語「同一」は、完全に同一である配列に限定されるものではない。使用者により入れられた相同性パラメータ内にある配列は、プロセス２００で「同一」として印が付けられることになる。
【０６６３】
２つの配列が同一であると決定された場合は、プロセス２００は状態２１４に移動する。ここで、データベースからの配列の名称が使用者に対して表示される。この状態は使用者に対して、表示された名称をつけた配列が、入れられた相同性の制約を満たしていることを通知する。いったん保存された配列の名称が使用者に対して表示されると、プロセス２００は判定状態２１８に移動し、そこで、さらなる配列がデータベース中に存在しないのかどうかについての判定が行われるる。それ以上配列がデータベース内には存在しない場合、プロセス２００は状態２２４に移動し、そこでは、新しい配列と比較し得るように、ポインタが次の配列に移動する。このような方法で、新しい配列が整列され、そして、データベース内の全ての配列と比較される。
【０６６４】
配列が相同性がないということが判定状態２１２で判定されると、任意の他の配列が比較のためのデータベース中で入手できるかどうかを判定するために、プロセス２００が即座に判定状態２１８に移動する。
【０６６５】
したがって、本発明の１つの態様は、プロセッサと、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードをそこに記憶させたデータ記憶装置と、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードに比較する基準ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を検索可能に有するデータ記憶装置と、比較を行うための配列比較装置とからなるコンピータシステムである。配列比較装置は、比較される配列の間の相同性レベルを示すか、または本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコード中の構造モチーフを同定することができ、またはこれら核酸コードとポリペプチドコードに比較されている配列中の構造モチーフを同定し得る。いくつかの実施態様では、データ記憶装置は、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードの少なくとも2、5、10、15、20、25、30または50の配列をその上に保存し得る。
【０６６６】
本発明の別の態様は、本発明の核酸コードと、基準ヌクレオチド配列との間の相同性のレベルを測定するための方法であって、相同レベルを測定するコンピュータプログラムの使用により、核酸コードと基準ヌクレオチド配列を読み取る工程ならびにコンピュータプログラムにより、核酸コードと基準ヌクレオチド配列との間の相同性を測定する工程を包含する。コンピュータプログラムは、相同性レベルを決定するための多くのコンピュータプログラム（本明細書中にとくに列挙されるプログラム（デフォルトパラメータを有するか、または任意の修飾パラメータを有するＢＬＡＳＴ２Ｎを含む）を含む）のいずれかであり得る。この方法は、上述されているコンピュータシステムを用いて実行され得る。この方法はまた、コンピュータプログラムの使用により、本発明の前記核酸コードの２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０を読み出し、そして核酸コードと基準ヌクレオチド配列との間の相同性を決定することによって実施され得る。
【０６６７】
図３は、２つの配列が相同であるかどうかを測定するためのコンピュータ中のプロセス２５０の１つの実施態様を図示説明している流れ図である。プロセス２５０は、スタート状態２５２で開始し、そして、その後に状態２５４に移動し、そこでは、比較すべき第１配列がメモリに保存される。比較すべき第２配列はその後に状態２５６でメモリに保存される。プロセス２５０はその後に状態２６０に移動し、そこでは、第１配列中の第１の文字が読み出され、その後に状態２６２に移動し、そこでは、第２配列の第１の文字が読み出される。なお、もし配列がヌクレオチド配列である場合、その場合は、文字は通常、Ａ，Ｔ，Ｃ，ＧまたはＵのいずれかである。もし配列がタンパク質配列である場合、その場合は、第１と第２配列が容易に比較できるように、単一文字のアミノ酸コードで読み出されるべきところである。
【０６６８】
ついで、２つの文字が同一か否かは、判定状態２６４で判定される。文字が同一である場合、プロセス２５０が状態２６８に移動し、そこでは、第１および第２配列の中の次の文字が読み出される。次の文字が同一か否かが、ついで、判定される。文字が同一である場合、プロセス２５０が２つの文字が同一ではなくなるまで、このループを続ける。次の２つの文字が同一ではないと判定されると、プロセス２５０は判定状態２７４に移動し、読み出すべきどちらかの配列に文字があるかどうかを判定する。
【０６６９】
読み出すべき文字がもはやない場合、その場合は、プロセス２５０は状態２７６に移動し、そこでは、第１と第２配列との間の相同性のレベルが使用者に表示される。相同性のレベルは、第１配列の中にある配列総数のうち同一であった配列間の文字の比率を計算することにより判定される。したがって、第１の１００ヌクレオチド配列中の全ての文字が、第２配列中の全ての文字と合致していた場合、その相同性レベルは１００％ということになる。
【０６７０】
あるいは、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードが１つ以上の位置で、基準核酸配列とは異なっているか否かを判定するために、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を、基準ヌクレオチド配列と比較するコンピュータプログラムである。任意には、このようなプログラムは、基準ポリヌクレオチドかまたは本発明の核酸コードのいずれの配列に対して、挿入、欠失、または置換されたヌクレオチドの長さとの同一性を記録する。１つの実施態様では、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列に対して、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでいるか否かを判定するプログラムである。これらの一塩基多型は、それぞれ単一塩基の置換、挿入または欠失を含み得る。
【０６７１】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドコードと基準ポリペプチド配列との間の相同性レベルを測定するための方法であって、この方法は、相同性レベルを測定するコンピュータプログラムの使用により、ポリペプチドコードと基準ポリペプチド配列を読み取る工程、およびコンピュータプログラムにより、ポリペプチドコードと基準ポリペプチド配列との間の相同性を測定する工程を包含する。
【０６７２】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の核酸コードが、基準ヌクレオチド配列とは、１つ以上のヌクレオチドで異なるか否かを測定するための１つの方法であって、この方法は、核酸配列間の差を同定するコンピュータプログラムの使用により、核酸コードと基準ヌクレオチド配列を読み取る工程、およびコンピュータプログラムにより核酸コードと基準ヌクレオチドとの間の差を同定する工程を包含する。いくつかの実施態様では、コンピュータプログラムは一塩基多型を同定するプログラムである。この方法は、上述されているコンピュータシステムにより実行することができ、そして、この方法は図３に図示説明されている。この方法はまた、コンピュータプログラムの使用により、本発明の上述の核酸コードの２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０を読み取り、そして、核酸コードと基準ヌクレオチド配列との間の差を同定することにより実施され得る。
【０６７３】
他の実施態様では、コンピュータベースのシステムはさらに、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列内または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内にある性質を同定するための識別子を含む。
【０６７４】
「識別子」は、本発明の核酸コードの前記ヌクレオチド配列内または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内にある一定の性質を同定する１つ以上のプログラムをいう。１つの実施態様では、識別子は、本発明のｃＤＮＡコード中のオープンリーディングフレームを同定するコンピュータプログラムを含み得る。
【０６７５】
図４は、配列中の性質の存在を検出するための識別子プロセス３００の１つの実施態様を図示説明する流れ図である。プロセス３００は開始状態３０２で開始され、ついで、状態３０４に移動し、そこでは、性質に関してチェックするべき第１配列がコンピュータシステム１００中にあるメモリ１１５に保存される。プロセス３００は、ついで、状態３０６に移動し、そこでは、配列の性質のデータベースが開かれる。このようなデータベースには、性質の名称とともに各性質の属性のリストが含まれる。たとえば、性質の名称は「Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｄｏｎ（開始コドン）」、そして、その属性が「ＡＴＧ」となる場合もある。別の例では、性質名称が「ＴＡＡＴＡＡ  Ｂｏｘ」であり、そして、特徴属性が「ＴＡＡＴＡＡ」となる。このようなデータベースの例は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ）により作成されている。
【０６７６】
いったん、性質のデータベースを状態３０６で開くと、プロセス３００は状態３０８に移動し、そこでは、第１の性質がデータベースから読み取られる。第１配列と第１の性質の属性の比較は、ついで、状態３１０で行われる。性質の属性が、第１配列で見出されたか否かを判定状態３１６で判定される。その属性が見出された場合、プロセス３００は状態３１８に移動し、そこでは、見出された性質の名称が使用者に表示される。
【０６７７】
プロセス３００は、ついで、判定状態３２０に移動し、そこでは、性質がデータベースに存在しているかどうかを判定する。性質がもはやない場合、プロセス３００は最終状態３２４で停止する。しかし、さらに性質がデータベースになければ、プロセス３００は状態３２６で次の配列の性質を読み出し、ループは状態３１０に戻り、そこでは、次の特徴の属性が第１配列に対して比較される。
【０６７８】
性質属性が、判定状態３１６で第１配列で見出されない場合は、プロセス３００は、何らかの性質がさらにデータベースに存在するか否かを判定するため、直接判定状態３２０に移動する。
【０６７９】
別の実施態様では、識別子は本発明のポリぺプチドコードの３次元構造を測定する分子モデリングプログラムを含み得る。いくつかの実施態様では、分子モデリングプログラムは、公知の３次元タンパク質構造にある残基の構造的な環境を提示するプロフィールともっとも適合性がある標的配列を同定する（たとえば、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９９５年７月２５日に発行された米国特許第５，４３６，８５０号明細書）。別の技術では、与えられたファミリーのタンパク質の公知の３次元構造が、そのファミリーの構造的に保存領域を規定するように重なり合っている。このタンパク質モデリング技術はまた、本発明のポリペプチドコードの構造をほぼ同じものにするために、相同タンパク質の公知の３次元構造を用いる（たとえば、１９９６年９月１７日に発行されたSrinivasanら、米国特許第５，５５７，５３５号明細書を参照）。従来の相同性モデリング技術は、プロテアーゼと抗体のモデルの構築するのに慣用的に使用されていた（Sowdhaminiら、1997）。比較手法もまた、目的のタンパク質が鋳型タンパク質に対して弱い同一性しか有していない場合は、３次元タンパク質モデルを確立させるのに用いることができる。いくつかのケースでは、タンパク質は、非常に弱い配列同一性しか有していないにもかかわらず、類似の３次元構造中に折り畳まれる。たとえば、数多くのらせん状サイトカインの３次元構造が、弱い配列相同性にもかかわらず、類似の３次元トポロジー中に折り畳まれる。
【０６８０】
折り畳み方法の最近の発達により、現在では、標的と鋳型（複数）との間の構造上の関連性が配列レベルでは検出できない多くの状況では、可能性のある折り畳みパターンの同定が可能になっている。折り畳み認識を、複数配列折り畳み（Ｍｕｌｅｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）（ＭＳＴ）を用いて実施しているハイブリッド法では、低い解像度のモデルを構築するために、距離幾何学プログラムＤＲＡＧＯＮを用いてその折り畳み出力から構造上の等価性が推測され、完全原子表示がＱＡＵＡＮＴＡなどの分子モデリングパッケージを用いて構築される。
【０６８１】
この３工程手法によると、候補鋳型は、最初に、１つ以上の３Ｄ構造上に複数の整列させた配列の同時折り畳みが実施され得る、新規の折り畳み認知アルゴリズムＭＳＴを用いることにより同定される。第２の工程では、ＭＳＴ出力から得られた構造上の等価が残基間距離抑制に変換され、二次的な構造の予見から得られた補助的な情報とともに距離幾何学プログラムＤＲＡＧＯＮ中に供給される。プログラムは、偏りのない様式で抑制を組合わせて、急速に低解像度のモデルの確定したものを数多く生成する。第３の工程では、これらの低い解像度モデルの確定したものは、完全原子モデルに変換され、分子モデリングパッケージであるＱＵＡＮＴＡを用いて、エネルギー最小化に供される（たとえば、Aszodiら、1997参照）。
【０６８２】
分子モデリング分析の結果はその後に、本発明のポリペプチドコードの活性を修飾する薬剤を同定するために合理的な薬剤設計技術において用いることができる。
【０６８３】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の核酸コード内にある性質または本発明のポリペプチドコード内の性質を同定する方法であって、この方法は、その性質を同定するコンピュータプログラムを用いて、核酸コード（複数）またはポリペプチドコード（複数）を読み取る工程、および、コンピュータプログラムを用いて、核酸コード（複数）またはポリペプチドコード（複数）内の性質を同定する工程を包含する。１つの実施態様では、コンピュータプログラムはポリペプチド配列中の構造上のモチーフを同定する。さらなる実施態様では、コンピュータは、ポリペプチド配列における構造的なモチーフを同定する。別の実施態様では、コンピュータプログラムは、分子モデリングプログラムを含む。この方法は、コンピュータプログラムを用いて、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードの単一配列、または、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０を読み取り、そして、コンビュータプログラムを用いて、核酸コードまたはポリペプチドコード内の性質を同定することにより、実施され得る。
【０６８４】
本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードが、保存され、そして、種々の様式で種々のデータプロセッサプラグラムで操作されることが可能である。たとえば、マイクロソフトのワード、またはワードパーフェクトまたは、ＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥ、またはＯＲＡＣＬＥなどの当業者に精通している種々のデータベースプログラムのＡＳＣＩＩファイルなどの言語処理ファイル中にあるテキストとして保存され得る。さらに、数多くのコンピュータプログラムおよびデータベースは、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードに比較される本発明の配列比較装置、識別子、または基準ヌクレオチドまたはポリペプチド配列として用いられ得る。以下のリストは、本発明を制限することを意図していないが、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードを用いることが有用であるプログラムおよびデータベースに対する案内を提供することを意図している。用いられる可能性のあるプログラムとデータベースには、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｌｏｏｋ（ＭｏｌｅｃｕＩａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＭａｃＬｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇら、１９９０）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｃｅｒｉｕｓ2．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＨｙｐｏＧｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ，）、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ）、ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ）、ＩＳＩＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＳｅｑＦｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＥＭＢＬ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｅｉｎデータベース、ＭＤＬ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベース、ＭＤＬ  Ｄｒｕｇ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔデータベース、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙデータベース、Ｄｅｒｗｅｎｔｓ’ｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｄｅｘデータベース、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅデータベース、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース、ＧｅｎｓｅｑｎデータベースおよびＧｅｎｓｅｑｐデータベース。その他の多くのプログラムおよびデータベースは、本開示を与えられた当業者に明らかである。
【０６８５】
前記プログラムを用いて検出され得るモチーフには、ロイシンジッパーをコードする配列、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファへリックス、ベータシート、コード化タンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位が含まれる。
【０６８６】
本出願を通じて、種々の公表物、特許および公表された特許出願が引用されている。本出願において参考にされるこれらの公表物、特許、公表されている特許明細書は、本発明が関係する最新技術をさらに完全に説明するために、本開示に、参考として本明細書中に援用される。
【実施例１】
【０６８７】
二対立遺伝子マーカーの同定−ＤＮＡ抽出
提供者には家族歴がなく、そして健康であった。彼らは、フランス人の非相同な集団の代表である十分な多様性を示した。１００個体からのＤＮＡを、二対立遺伝子マーカーの検出のために抽出および試験した。
【０６８８】
３０ｍｌの末梢静脈血を、ＥＤＴＡの存在下で各提供者から採取した。細胞（ペレット）を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、採集した。赤血球を、溶解溶液（５０ｍｌ（最終容量）：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって溶解した。溶解溶液中のペレットの再懸濁後、その溶液を、上清に存在する残存している赤血球を除くために必要に応じて何度も遠心分離（１０分、２０００ｒｐｍ）した。
【０６８９】
白血球のペレットを、以下からなる３．７ｍｌの溶解溶液を用いて、４２℃で一晩溶解した：
３ｍｌ  ＴＥ１０−２（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ）／ＮａＣｌ  ０．４Ｍ
２００μｌ  ＳＤＳ  １０％
５００μｌ  Ｋ−プロテイナーゼ（ＴＥ１０−２／ＮａＣｌ  ０．４Ｍ中２ｍｇ  Ｋ−プロテイナーゼ）
【０６９０】
タンパク質の抽出のために、１ｍｌ  飽和ＮａＣｌ（６Ｍ）（１／３．５  ｖ／ｖ）を添加した。強く撹拌した後、溶液を１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【０６９１】
ＤＮＡの沈殿のために、２〜３容量の１００％エタノールを、先の上清に添加し、そして、その溶液を２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ＤＮＡ溶液を、７０％エタノールで３回リンスし、塩を除去し、そして２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを３７℃で乾燥し、そして、１ｍｌＴＥ１０−１または１ｍｌ水中に再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおけるＯＤ（１単位ＯＤ＝５０μｇ／ｍｌＤＮＡ）を測定することによって評価した。
【０６９２】
ＤＮＡ溶液中のタンパク質の存在を決定するために、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を決定した。１．８〜２のＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を有するＤＮＡ調製物のみを、以下に記載する後の実施例において用いた。
【０６９３】
プールを、各個体由来の均等な量のＤＮＡを混合することによって構成した。
【実施例２】
【０６９４】
二対立遺伝子マーカーの同定：ゲノムＤＮＡのＰＣＲによる増幅
実施例１のＤＮＡ試料の特定のゲノム配列の増幅を、あらかじめ得られたＤＮＡのプールに対して実施した。さらに、５０個体の試料を、同様に増幅した。
【０６９５】
以下のプロトコルを用いてＰＣＲアッセイを行った。
【０６９６】
最終容量                                                  ２５μｌ
ＤＮＡ                                                    ２ｎｇ／μｌ
ＭｇＣｌ2                                                    ２ｍＭ
ｄＮＴＰ（各々）                                          ２００μＭ
プライマー（各々）                                        ２．９ｎｇ／μｌ
Ampli Taq Gold DNA polymerase                            ０．０５単位／μｌ
ＰＣＲ緩衝液                                              １ｘ
(10ｘ＝0.1Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ8.3、0.5Ｍ  ＫＣｌ)
【０６９７】
第１のプライマーの各対を、本明細書中で開示されるＰＧ−３遺伝子の配列情報およびＯＳＰソフトウェア（HillierおよびGreen、1991）を用いて設計した。このプライマーの第１の対は約２０ヌクレオチド長であり、そして、表１においてＰＵおよびＲＰと標識された欄に開示される配列を保持していた。
【０６９８】
【表２−１】
2004520055.tif 000010
【０６９９】
【表２−２】
2004520055.tif 000011
【０７００】
好ましくは、プライマーは、配列決定に有用である増幅のために標的化された特定の塩基の一般的なオリゴヌクレオチドテール上流を含んだ。
【０７０１】
プライマーＰＵは、以下の付加的ＰＵ５’配列を含む：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ：プライマーＲＰは、以下のＲＰ５’配列を含む：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ。付加的ＰＵ５’配列を含むプライマーは、配列番号４に列記される。付加的ＲＰ５’配列を含むプライマーは、配列番号５に列記される。
【０７０２】
これらのプライマーの合成を、ＧＥＮＳＥＴ  ＵＦＰＳ  ２４．１合成装置で以下のホスホラミダイト法で実施した。
【０７０３】
ＤＮＡ増幅を、ＧｅｎｉｕｓＩＩサーモサイクラーで実施した。９５℃で１０分間加熱した後、４０サイクルを実施した。各サイクルは、９５℃で３０秒、５４℃で１分、および７２℃で３０秒から構成される。最後の伸張について、７２℃で１０分で増幅を終了した。得られた増幅産物の量を、９６ウェルマイクロタイタープレート上で、フルオロメーターおよびインターカラント（intercalant）試薬としてＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて決定した。
【実施例３】
【０７０４】
二対立遺伝子マーカーの同定−増幅されたゲノムＤＮＡの配列決定および多型の同定
実施例２で得られた増幅ＤＮＡの配列決定を、ＡＢＩ  ３７７シークエンサーで実施した。増幅産物の配列を、ダイターミネーターサイクル配列決定プロトコルを用いて、自動ジデオキシターミネーター配列決定反応により決定した。配列決定反応の産物を配列決定ゲル上で泳動させ、そして、配列をゲルイメージ分析を用いて決定した（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（２．１．２バージョン））。
【０７０５】
配列データを、さらに、増幅断片内の二対立遺伝子マーカーの存在を検出するために評価した。多型検索は、前記されたのと同じ位置に存在する異なる塩基から生じる電気泳動パターンにおいて重複されたピークの存在に基づいた。
【０７０６】
増幅の５２フラグメントにおいて、８０の二対立遺伝子マーカーを検出した。これらの二対立遺伝子マーカーの位置付けは表２に示すとおりである。
【０７０７】
【表３−１】
2004520055.tif 000012
【０７０８】
【表３−２】
2004520055.tif 000013
【０７０９】
【表３−３】
2004520055.tif 000014
【０７１０】
ＢＭは「二対立遺伝子マーカー」をいう。ａｌｌ１およびａｌｌ２は、それぞれ二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１および対立遺伝子２をいう。
【０７１１】
【表４−１】
2004520055.tif 000015
【０７１２】
【表４−２】
2004520055.tif 000016
【０７１３】
【表４−３】
2004520055.tif 000017
【実施例４】
【０７１４】
マイクロ配列決定による多型の評価
実施例３において同定された二対立遺伝子マーカーをさらに確認し、そして、それらそれぞれの頻度をマイクロ配列決定により決定した。マイクロ配列決定を、実施例１に記載の各個体のＤＮＡ試料について実施した。
【０７１５】
個体のゲノムＤＮＡからの増幅を、同一の組のＰＣＲプライマー（表１）を用いて、二対立遺伝子マーカーの検出のために前記のようにＰＣＲによって実施した。
【０７１６】
マイクロ配列決定において用いた好ましいプライマーは、約１９ヌクレオチド長であり、そして検討される多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズした。本発明にしたがって、マイクロ配列決定において用いたプライマーを表４に詳述する。
【０７１７】
【表５−１】
2004520055.tif 000018
【０７１８】
【表５−２】
2004520055.tif 000019
【０７１９】
【表５−３】
2004520055.tif 000020
【０７２０】
Ｍｉｓ１およびＭｉｓ２は、それぞれ、ＰＧ−３遺伝子の非コード鎖またはＰＧ−３遺伝子のコード鎖とハイブリダイズしたマイクロ配列決定プライマーをいう。
【０７２１】
マイクロ配列決定反応は、以下のとおり実施した。
【０７２２】
増幅産物の精製の後、マイクロ配列決定反応混合物を、製造業者の推奨する方法を受けて、最終容量２０μｌの以下からなる溶液に添加することによって調製した：１０ｐｍｏｌ  マイクロ配列決定オリゴヌクレオチド、１Ｕ  サーモシークエナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｅ７９０００Ｇ）、１．２５μｌ  サーモシークエナーゼ緩衝液（２６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ９．５、６５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、および試験される各二対立遺伝子マーカーの多型部位のヌクレオチドに相補的な２つの適切な蛍光ｄｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｔ  ４０１０９５）。９４℃で４分後、５５℃で１５秒、７２℃で５秒、および９４℃で１０秒の２０回のＰＣＲサイクルを、Ｔｅｔｒａｄ  ＰＴＣ−２２５  サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において実施した。ついで、組み込まれていないダイターミネーターを、エタノール沈殿によって除去した。試料を、最終的に、ホルムアミド−ＥＤＴＡローディング緩衝液に再懸濁して、そして９５℃で２分間加熱した。その後、ポリアクリルアミド配列決定ゲルにロードした。データを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーによって収集し、そして、ＧＥＮＥＳＣＡＮソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理した。
【０７２３】
ゲル分析後、データを、各増幅フラグメントに存在する二対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の決定を可能にするソフトウェアを用いて自動的に処理した。
【０７２４】
ソフトウェアは、前記配列決定方法から得られるシグナルの強度が弱いか、標準的か、もしくは飽和かのいずれか、またはこのシグナルが不明瞭か否かなどの因子を評価する。さらに、ソフトウェアは、（形状および高さの基準にしたがって）有意なピークを同定する。有意なピーク間で、標的部位に対応するピークは、それらの位置に基づいて同定される。２つの有意なピークが同じ位置について検出された場合、各試料は、高さ比にもとづいてホモ接合性型またはヘテロ接合性型としての分類に分類される。
【実施例５】
【０７２５】
ＰＧ−３タンパク質に対する抗体組成物の調製
実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを、ＰＧ−３タンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェクト細胞または形質転換細胞から単離する。最終調製物中のタンパク質濃度を、たとえば、Ａｍｉｃｏｎフィルター装置上での濃縮によって、数μｇ／ｍｌのレベルに調整する。ついで、タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、以下のとおり調製し得る。
【０７２６】
Ａ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
ＰＧ−３タンパク質またはその一部におけるエピトープに対するモノクローナル抗体を、Kohler, G.およびMilstein, C.（1975）の古典的な方法またはその誘導方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製し得る。Harlow, E.およびD. Lane．1988もまた参照のこと。
【０７２７】
簡潔には、マウスに、数週間の期間にわたり、数μｇのＰＧ−３タンパク質またはその一部を繰り返し接種する。ついで、そのマウスを屠殺し、そして脾臓の抗体産生細胞を単離した。脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞とポリエチレングリコールを用いて融合し、そして、過剰な非融合細胞をアミノプテリン含有選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の増大によって破壊した。首尾よく融合した細胞を希釈し、そしてその希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに置いた。ここで、培養液の増殖を継続した。抗体産生クローンを、免疫アッセイ方法（たとえば、当初、Engvall（1980）によって記載されたＥＬＩＳＡ、およびその誘導方法）によって、ウェルの上清液体中の抗体の検出によって同定する。選択した陽性クローンを増殖し得、そして、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために収集した。モノクローナル抗体産生のための詳細な方法は、Davis, L.ら（1986）に記載されている。
【０７２８】
Ｂ．免疫化によるポリクローナル抗体産生
ＰＧ−３タンパク質またはその一部における非相同なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を、ＰＧ−３タンパク質またはその一部で、免疫原性を増強するために修飾されていても、されていなくてもよい適切な非ヒト動物を免疫化することによって調製し得る。適切な非ヒト動物は、好ましくは、非ヒト哺乳動物（通常は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマ）が選択される。あるいは、ＰＧ−３濃度について富化された粗調製物を用いて、抗体を産生することができる。このようなタンパク質、フラグメントまたは調製物は、当該分野で公知の適切なアジュバンド（たとえば、水酸化アルミニウム、ＲＩＢＩなど）の存在下で非ヒト哺乳動物に導入される。さらに、タンパク質、フラグメントまたは調製物は、当該分野で公知の、たとえば、メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、およびキーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）などの抗原性を増大させる薬剤で前処理され得る。免疫化した動物由来の血清は、公知の方法にしたがって、収集、処理および試験される。血清が所望されないエピトープに対するポリクローナル抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は免疫アフィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。
【０７２９】
効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関係する多くの因子によって影響される。また、宿主動物は、接種の部位と、結果として低い力価の抗血清を生じる抗原の、不十分な用量または過剰な用量の双方での用量とに応じて異なる。複数の皮内部位において投与された少ない用量（ｎｇレベル）の抗原が、もっとも信頼性があると考えられる。ポリクローナル抗血清を産生および処理する技術は当該分野で公知であり、たとえば、MayerおよびWalker（1987）を参照のこと。ウサギについての効果的な免疫化プロトコルは、Vaitukaitis，J.ら（1971）において見出され得る。
【０７３０】
ブースト注射が、規則的な間隔で与えられ得、そしてたとえば、既知の濃度の抗原に対する寒天での二重免疫拡散法によって、半定量的に決定されるその抗体力価が、範囲内に入る場合、抗血清が収集され得る。たとえば、Ouchterlony, O.ら（1973）を参照のこと。抗体の水平濃度は、通常、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの血清（約１２μＭ）の範囲内である。抗原についての抗血清のアフィニティは、たとえば、Fisher, D.（1980）によって記載される競合的結合曲線を作成することによって決定される。
【０７３１】
モノクローナルプロトコルまたはポリクローナルプロトコルのいずれかにしたがって調製される抗体調製物は、生物学的試料における抗原保有物質の濃度を決定する定量的な免疫アッセイにおいて有用であり；それらの抗体調製物はまた、生物学的試料における抗原の存在を同定するために半定量的または定量的に用いられ得る。抗体はまた、タンパク質を発現する細胞を殺滅するためまたは体内のタンパク質のレベルを低減するための治療組成物において用いられ得る。
【０７３２】
本発明の好ましい実施態様を例証および記載してきたが、種々の変更は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく当業者によって本発明の範囲内でなされ得ることが理解される。
【０７３３】
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【図面の簡単な説明】
【０７３４】
【図１】図１は、典型的なコンピュータシステムのブロック図である。
【図２】図２は、新規ヌクレオチド配列またはタンパク質配列とデータベースの配列との間のホモロジーレベルを決定するために、新規配列と配列のデータベースとを比較するためのプロセス２００の一実施態様を例証する流れ図である。
【図３】図３は、２つの配列が相同であるか否かを決定するコンピュータにおけるプロセス２５０の一実施態様を例証する流れ図である。
【図４】図４は、配列中の特徴の存在を決定する識別子プロセス３００の一実施態様を例証する流れ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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