(57)【要約】本発明は、哺乳類における前新生物状態および新生物状態を同定するための方法、特にＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現の違いに基づいて細胞および組織内の前新生物および新生物を同定する方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するための方法。
【請求項２】
哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するための方法。
【請求項３】
哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における発癌の病因を決定するための方法。
【請求項４】
哺乳類がヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスである請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類がヒトである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞および/または組織が前立腺、乳腺、皮膚または他の上皮細胞素材由来である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前新生物状態または新生物状態が前立腺の前癌病変または前立腺癌であり、前立腺細胞または前立腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の増加を、先の請求項で定義したように、正常な前立腺細胞または前立腺組織の発現プロフィールと比較して前立腺の前癌病変または前立腺癌の存在を診断する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前新生物状態または新生物状態が乳腺の前癌病変または乳癌であり、哺乳類由来の乳腺細胞および/または乳腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な乳腺由来の乳腺細胞および/または乳腺組織の発現プロフィールと比較して乳腺の前癌病変または乳癌の存在を診断する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前新生物状態または新生物状態が皮膚の前癌病変または皮膚癌であり、哺乳類由来の皮膚細胞および/または皮膚組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な皮膚由来の皮膚細胞および/または組織の発現プロフィールと比較して皮膚の前癌病変または皮膚癌の存在を診断する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
皮膚癌が悪性黒色腫、扁平上皮癌または基底細胞癌である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールがＰ２Ｙ2，Ｐ２Ｙ4および/またはＰ２Ｙ6の受容体の発現プロフィールである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールがＰ２Ｙ2受容体の発現プロフィールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前新生物状態が、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが細胞の核内で変化する初期の前新生物状態である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前新生物状態が進行した前新生物状態であり、当状態においてＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールが、Ｐ２Ｙ受容体が細胞質および/または側方の膜および/または基底膜中に存在するプロフィールを示す、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前新生物状態が、Ｐ２Ｙ受容体が上皮細胞膜頂端側に存在するプロフィールを、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが示す状態である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールを他のマーカーの発現プロフィールと組み合わせる、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールをＰ２Ｘ受容体の発現プロフィールと組み合わせる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールをＰ２Ｘ1および/またはＰ２Ｘ2の発現プロフィールと組み合わせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールを免疫組織化学的方法、またはウェスタンブロット法もしくはノーザンブロット法により検出する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールをＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検出する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールを比色分析により検出する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体であって、前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別することができる当該抗体。
【請求項２３】
抗体がＰ２Ｙ2、Ｐ２Ｙ4および/またはＰ２Ｙ6の受容体に特異的である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体がＰ２Ｙ2受容体に特異的である請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２２から２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体がポリクローナル抗体である請求項２２から２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２７】
少なくとも１つの他の抗体と組み合わせる請求項２２から２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２８】
少なくとも１つの他の抗体がＰ２Ｙ受容体特異抗体またはＰ２Ｘ受容体特異抗体である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
Ｐ２Ｘ受容体の抗体がＰ２Ｘ1またはＰ２Ｘ2の受容体特異抗体である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項３０】
少なくとも１つの他の抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
少なくとも１つの他の抗体がポリクローナル抗体である、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項２２から３１のいずれか１項に記載の抗体を含む一組のＰ２Ｙ抗体。
【請求項３３】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法で使用する際の、請求項２２から３１のいずれか１項に記載の抗体または請求項３２に記載の一組の抗体。
【請求項３４】
前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別するために使用する際の、請求項２２から３１のいずれか１項に記載の抗体または請求項３２に記載の一組の抗体。
【請求項３５】
細胞および/または組織を生検により得る請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
生検材料を細針吸引により、体液から、または前立腺の細胞および/または組織の場合には直腸からの触診による滲出液または精液から採取する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
相補的な検査と併用しての請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
相補的な検査が悪性度のための検査である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
悪性度のための検査が、ヒトのテロメラーゼタンパク質１（ｈＴＰ１）に特異的な抗体を使用する抗テロメラーゼ抗体検査または抗テネイシン検査である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２２から３１のいずれか１項に記載のＰ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体または請求項３２に記載の一組の抗体と結合させた、単離された哺乳類の細胞または組織試料。
【請求項４１】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するためのキット。
【請求項４２】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するためのキット。
【請求項４３】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における発癌の病因を決定するためのキット。
【請求項４４】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段が、請求項２２から３１のいずれか１項に記載の抗体または請求項３２に記載の一組の抗体である、請求項４１から４３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４５】
前記哺乳類由来の細胞および/または組織が前新生物細胞または新生物細胞の近位にあり、前新生物または新生物そのものではない、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における前新生物状態および新生物状態を同定するための方法、特にＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現の違いに基づいて細胞および組織内の前新生物および新生物を同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌を診断する際、生検サンプルの細胞の特徴、例えば癌細胞のサイズおよび形の多様性の程度、活動的に分裂している細胞の比率、および周辺構造への浸潤について考慮される。一般に使用される組織学的染色は、細胞内要素を区別して標識するヘマトキシリン（一次染色）およびエオシン（カウンター染色）である。他の診断法としては顕微鏡分析用に視覚化することのできる、細胞または組織の内部（細胞内エピトープにより）または表面上（細胞外エピトープにより）の特定の診断分子、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の抗体を用いる。いくつかの具体的な例について以下に述べる。
【０００３】
前立腺癌
西洋における前立腺癌の発症率は驚くべき速度で増加しており、過去５年間で２倍以上になっている。これはあらゆる新生物の中で最も高い発生率を有し、世界全体の男性の癌死亡の最も一般的な原因として肺癌に次いで第二位であり、オーストラリアの癌死亡の主要な原因である［非特許文献１］。良性前立腺過形成（benign prostatic hyperplasia: ＢＰＨ）は５０歳以上の男性に一般的であり、それ自体が前立腺癌の前駆体である前立腺上皮内新生物（prostatic intraepithelial neoplasia: ＰＩＮ）の前駆体となり得る。検死の研究は７０％の男性が８０歳に達するまでに前立腺に悪性細胞を有することを示している［非特許文献２］。
【０００４】
この症状の重大さにもかかわらず、診断法はわずかしかなくまた正確ではない。予後を評価する現行の方法、例えば直腸からの触診（digital rectal examination: ＤＲＥ）、超音波、前立腺性酸性ホスファターゼ濃度、アンドロゲン遮断、前立腺特異抗原（prostate specific antigen: ＰＳＡ）の比重、ＰＳＡの速度、ＰＳＡの年齢特異的基準範囲、およびGleasonの組織病理学的分類は、前立腺癌との臨床結果に関する信頼できる予測情報を提供できるとは言えない［非特許文献３］。例えば複数の試験によりＤＲＥ３では３６．９％の偽陰性率を生じることが示された［非特許文献４］。ＰＳＡは、前立腺の他にも多数の組織に関与する３３ｋＤａのセリンプロテアーゼで［非特許文献５］、アンドロゲン、グルココルチコイドおよびプロゲスチンによりアップレギュレートされ、成長因子の制御に関与すると考えられている。残念ながら血清ＰＳＡ濃度では、偽陰性２３％および偽陽性３６．７％の診断を生じる。新たにスクリーニングで検出される症例の半数以上が、実際には偽陽性であることさえ示唆されている［非特許文献６］。付加的な検査、例えばＰＳＡの比重、速度および年齢特異的基準範囲の導入によるスクリーニング法を改善する試みは疑わしい。ある試験は、年齢特異的ＰＳＡ基準範囲を適用すると、ＰＳＡ正常上限が４．５ｎｇ/ｍＬに上昇し、臨床的に重要なかなりの数の癌が検出できなくなることを示した［非特許文献７］。この不確実さゆえに悪性かどうかの確定には前立腺の生検がしばしば行われるが、この検査もまた新生物への変化の部位を直接サンプリングしていないことに起因する、２３％の偽陰性の診断というかなり不満足な値を示す［非特許文献８］。
【０００５】
治療の選択は、組織切片の顕微鏡分析に基づく臨床的なステージ分類に大きく依存する［非特許文献９］。この技術は組織学的外観を臨床結果に関連づける上で、判定とかなりの経験に依存する。残念ながら前立腺癌組織が不均一であることは周知であり、生細胞の診断の特徴が検査する切片で見過ごされやすい可能性がある。状況をさらに複雑にすることには、手術および放射線療法の結果を調査する無作為試験およびコントロール試験がまだ行われていない［非特許文献２］。治療の選択には、根治的前立腺切除、放射線療法、アンドロゲン遮断、および“注意深い待機”が挙げられる。“注意深い待機”か根治的介入かを問う確実な回答は、前立腺癌の介入−対−観察に関する試験［非特許文献１０］の結論を待たなければならない。これらの決定が患者に及ぼす結果は重大である。例えば根治的前立腺切除はしばしば失禁、インポテンス、膀胱頚狭窄、疼痛および鬱に至る［非特許文献１１］。
【０００６】
その他の癌、例えば乳癌または皮膚癌の場合、サンプルは幾つかの理由で誤診を招く可能性がある。乳腺の腫瘍の場合、局在する腫瘍の境界をうまく定義することはできず、同様に皮膚癌の場合も（Ｈ＆Ｅ染色で決定されるような）組織学的に明らかな癌と正常組織との境界は多様である。正常な組織はいずれにしても多かれ少なかれ、所望する以上にこれら腫瘍周囲を削除されることになる。
【０００７】
参考文献
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【非特許文献１８】Lynch KJ, Touma E, Niforatos W, Kage KL, Burgard EC, van Biesen T, Kowaluk EA および Jarvis MF, 1999  ヒトＰ２Ｘ（２）受容体の分子的特徴づけおよび機能的特徴づけ。Mol. Pharmacol. 56, 1171-1181。
【非特許文献１９】Garcia-Guzman M, Stuhmer W および Soto F, 1997  ヒトＰ２Ｘ３プリン受容体の分子的および薬理学的特性。Brain Res. Mol. Brain Res. 47, 59-66。
【非特許文献２０】Garcia-Guzman M, Soto F, Gomez-HermandezJM, Lund PE および Stuhmer W, 1997  ヒトＰ２Ｘ４受容体の組み換え体の特徴づけにより、ラットの相同体との薬理学的差異を明らかにする。Mol. Pharmacol. 51, 109-118。
【非特許文献２１】Le KT, Paquet M, Nouel D, Babinski K および Seguela P, 1997  脳システムおよび免疫システム由来の自然に切断されたヒトＰ２Ｘ  ＡＴＰ受容体サブユニットの１次構造および発現。FEBS Lett. 418, 195-199。
【非特許文献２２】Urano T, Nisimori H, Han H, Furuhata T, Kimura Y, Nakamura Y および Tokino T, 1997  ｐ５３により制御される新規ヒトＰ２Ｘ受容体遺伝子であるＰ２ＸＭのクローニング。Cancer Res. 57, 3281-3287。
【非特許文献２３】Buell GN, Talabot F, Gos A, LorenzJ, Lai E, Morris MA および Antonarakis SE, 1998  ヒトＰ２Ｘ７受容体の遺伝子構造および染色体の位置づけ。Recept. Channels 5, 347-354。
【非特許文献２４】Dutton J, Hansen M, Balcar J, Barden J および Bennett MR, 1999  ラット膀胱における神経の静脈瘤様腫瘍に関する平滑筋細胞のＰ２Ｘ受容体群の発達。J. Neurocytol. 28, 3-15。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、前新生物細胞および/または新生物細胞を同定する方法を提供することであり、これにより先行技術の欠点の少なくとも一部を克服または大幅に改善し、あるいは有用な代替法を提供することとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概略
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と結合する、Ｇタンパク質共役型組織受容体で、一部のＰ２Ｙ受容体サブタイプはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）と結合する。哺乳類においてＰ２Ｙ受容体の発現パターンを前新生物および新生物の診断に使用できることが、驚くことに発見された。
【００１０】
哺乳類における前癌および癌のステージは、成長、細胞外マトリックス、代謝因子および神経支配因子の著明な差、ならびに上皮下のカルシウムイオンおよび微小管の増加を伴う。本発明の新規抗体を用いると、Ｐ２Ｙ受容体を免疫細胞化学的方法により十分に視覚化することができ、それらが異なる発現パターンで、例えば細胞表面、尿細管および点状に標識されて存在することが示された。これらの発現パターンを用いて癌の発達の異なるステージを同定することができ、すなわち完全に正常な組織に始まり、一例として前立腺のＰ２Ｙ受容体の発現が、個々に冒された腺房内の核に最初に現れる前新生物状態を経て進行するという経過を示す。より進行した前新生物状態であってまだ疾患の形態学的徴候が表れていないものにおいて、受容体は核を離れて腺房内の細胞質および側方の膜および基底膜に拡散し、その後上皮細胞の頂端側細胞膜に沈着するが、この沈着は初期癌に伴う形態学的変化に同調して起こる。これらのステージでは明らかに腫瘍と形態学的に定義される領域以上に、事実上全体に及んでいるため、診断は目下の腫瘍領域を直接サンプリングすることに限定されることなく、ある程度距離を置いて腫瘍の存在を検出することができる。
【００１１】
したがって本発明は、前癌症状（例えば過形成）を診断し、癌をステージ分類し、発癌の基礎的な生理学および病因学を調べるための、新たな手段を提供する。
第１の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するための方法を提供する。
【００１２】
第２の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するための方法を提供する。
【００１３】
第３の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における発癌の病因を決定するための方法を提供する。
【００１４】
好ましくは哺乳類はヒトであるが、当該方法はウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスを含むあらゆる適切な哺乳類に適用することができる。
好ましくは細胞および/または組織は、前立腺、乳腺または皮膚由来である。しかし当該方法は他の上皮細胞を含む他の細胞のタイプにもまた有用となり得ることを、当業者は理解するだろう。
【００１５】
前新生物状態または新生物状態が前立腺の前癌病変または前立腺癌である場合、前立腺細胞または前立腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の増加を、先に定義したように、正常な前立腺細胞または前立腺組織の発現プロフィールと比較して、前立腺の前癌病変または前立腺癌の存在を診断する。
【００１６】
前新生物状態または新生物状態が乳腺の前癌病変または乳癌である場合、哺乳類から採取した乳腺細胞および/または乳腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な乳腺由来の乳腺細胞および/または乳腺組織の発現プロフィールと比較して、乳腺の前癌病変または乳癌の存在を診断する。
【００１７】
前新生物状態または新生物状態が皮膚の前癌病変または皮膚癌である場合、哺乳類由来の皮膚細胞および/または皮膚組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な皮膚由来の皮膚細胞および/または組織の発現プロフィールと比較して、皮膚の前癌病変または皮膚癌の存在を診断する。
【００１８】
好ましくは皮膚癌は、悪性黒色腫、扁平上皮癌または基底細胞癌である。したがって本発明により、例えば上述のように皮膚癌の状態を、角化棘細胞腫およびその他の良性病巣、例えば光線性角化症と区別することができる。
【００１９】
好ましくはＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールは、Ｐ２Ｙ2，Ｐ２Ｙ4および/またはＰ２Ｙ6受容体の発現プロフィールであり、より好ましくはＰ２Ｙ2受容体の発現プロフィールである。当業者は過度の実験作業をせずに、行おうとする特定の方法にどのＰ２Ｙが最適かを確認することができる。一般に正常な細胞または組織と比較して、前新生物または新生物の細胞または組織との発現プロフィールの強度差に最もコントラストのある、これらＰ２Ｙ受容体が最も望ましい。
【００２０】
１つの態様において前新生物状態は、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが細胞の核内で変化した初期の前新生物状態である。あるいはもう１つの態様において前新生物状態は進行した前新生物状態であり、この場合Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールは、Ｐ２Ｙ受容体が細胞質および/または側方の膜および/または基底膜中に存在するプロフィールを示す。
【００２１】
もう１つの態様において前新生物状態は、Ｐ２Ｙ受容体が上皮細胞の頂端側膜上に存在するというプロフィールを、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが示す状態である。
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールを他のマーカーの発現プロフィールと組み合わせることができることは、当業者には明らかであろう。特にＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールはＰ２Ｘ受容体の発現プロフィール、そして好ましくはＰ２Ｘ1および/またはＰ２Ｘ2の発現プロフィールと組み合わせることができる。
【００２２】
好ましくはＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールの検出は、免疫組織化学的方法による。しかし細胞または組織のサンプル源および利用できる試薬により、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは類似の免疫学的技術を含むその他の手段でもＰ２Ｙ受容体を検出できることは、当業者には明らかであろう。好ましくはＰ２Ｙ受容体は、比色分析、例えばＤＡＢ（ジアミノベンジジン）またはＬＳＡＢ法（標識ストレプトアビジン−ビオチン法）、第二抗体検出キット（Ｄａｋｏ）により検出する。
【００２３】
標準的なウエスタンブロット法および標準的なノーザンブロット法によるＰ２Ｙプリン作動性受容体のｍＲＮＡの検出もまた、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールの決定に有用となり得ることは、当業者には明らかであろう。
【００２４】
第４の側面により本発明はＰ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体を提供するが、同抗体は前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別することができるものとする。
【００２５】
好ましくは抗体は、Ｐ２Ｙ2受容体、Ｐ２Ｙ4受容体および/またはＰ２Ｙ6受容体に特異的である。最も好ましくは抗体は、Ｐ２Ｙ2受容体に特異的である。
Ｐ２Ｙ受容体特異抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよいことは、当業者には明らかであろう。Ｐ２Ｙ受容体特異抗体を他の抗体、特に１つまたはそれ以上のＰ２Ｘ受容体特異抗体と組み合わせてもよいこともまた、当業者には明らかであろう。Ｐ２Ｘ受容体特異抗体もまたモノクローナルでもポリクローナルでもよい。好ましい態様においてＰ２Ｘ受容体の抗体は、Ｐ２Ｘ1および/またはＰ２Ｘ2の受容体特異抗体である。
【００２６】
第５の側面により本発明は、第４の側面による抗体を含む一組の抗体を提供する。
第６の側面により本発明は、前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別するために使用する場合、第４の側面によるＰ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体、または第５の側面による一組の抗体を提供する。
【００２７】
第７の側面により本発明は、第４の側面によるＰ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体、または第５の側面による一組の抗体と複合させた、哺乳類の単離細胞または単離組織のサンプルを提供する。
【００２８】
本発明に使用する細胞および/または組織は生検（特に乳腺組織では例えば細針吸引、）により得ることができるが、体液または、前立腺細胞および/または組織の場合には直腸からの触診による滲出液または精液を含む、その他のあらゆる手段で得ることもできる。
【００２９】
本発明の方法およびＰ２Ｙ受容体特異抗体は、例えば悪性度の検査を含む他のあらゆる相補的な検査と組み合わせて使用できることは、当該技術分野の業者には明らかであろう。悪性度の検査は、ヒトテロメラーゼタンパク質１（ｈＴＰ1）に特異的な抗体を使用する抗テロメラーゼ抗体検査、または他のあらゆる適切なアッセイまたは抗テネイシン検査のような検査とすることができる。
【００３０】
第７の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するためのキットを提供する。
【００３１】
第８の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するためのキットを提供する。
【００３２】
第９の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における発癌の病因を決定するためのキットを提供する。
好ましくはＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する同手段は、第４の側面による抗体または第５の側面による一組の抗体である。
【００３３】
好ましくは同キットは、第１から第３の側面のいずれか１つによる方法において使用する。
本発明の内容において、“新生物細胞”および“新生物組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、新生物細胞または新生物組織の特徴的な性質、例えば過形成および/または肥大の成長パターンおよび、異常な細胞の形およびサイズおよび核のサイズを際立たせるヘマトキシリンおよびエオシン染色（すなわちＨ＆Ｅ）による特徴的な染色を有する細胞または組織を含むが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の内容において、“前新生物細胞”および“前新生物組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、過形成または肥大し得る細胞または組織を含むが、これに限定されない。しかしこのような細胞または組織は、新生物細胞または新生物組織の特徴的な性質、例えば異常な細胞の形およびサイズおよび核のサイズを際立たせるＨ＆Ｅによる特徴的な染色は有していない。
【００３５】
本発明の内容において、“正常細胞”および“正常組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、Ｐ２Ｙ発現プロフィールが、前新生物または新生物のいずれもない個体由来の細胞で観察されるプロフィールと実質的に変わらない、細胞または組織を含む。本発明の内容において前立腺の症状に関する場合、“正常細胞”という用語は、例えば良性前立腺過形成の前立腺由来の細胞もまた含む。
【００３６】
本発明の内容において“一組の抗体”という用語は、同一抗原または異なる抗原に特異的な数種の異なる抗体を含み、各受容体のサブタイプを特異的に識別することのできるポリクローナル抗体を含む。抗体がモノクローナルの場合“一組の抗体”という用語は、各受容体  例えばＰ２ＹおよびＰ２Ｘ、または受容体のサブタイプ  例えばＰ２Ｙ2およびＰ２Ｙ4を特異的に識別することのできる一群の抗体もまた含む。
【００３７】
本発明の内容において“発現プロフィール”の検出には、発現のパターンまたは強度の検出を含む。
本発明の内容で他に明確な要求がなければ、本説明および本請求項を通して “含む”“含んでいる”等の言葉は、除外または除外的な意味の対局として、包含的な意味；すなわち“含んでいるが限定されない”という意味で解釈されるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の説明
本発明は、前新生物細胞および新生物細胞はＰ２Ｙプリン作動性受容体を他と区別して発現するという所見に基づいている。したがってこの区別の目安となる発現を用いて、前新生物細胞または新生物細胞を同定することができる。さらにＰ２Ｙプリン作動性受容体は、前新生物および新生物の異なるステージの細胞内では異なって分配されるため、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを用いて、前新生物状態および新生物状態のステージを分類することができる。Ｐ２Ｙの異なる発現パターンを用いて、発癌の病因の決定することもできる。さらに本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、前新生物状態および/または新生物状態を診断するためのキット；Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するためのキット；およびＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、発癌の病因を決定するためのキットを含む。
【００３９】
本発明の好ましい態様をあくまで一例としてここに記述することにする。
【実施例１】
【００４０】
実施例１−抗体の作成
クローニングされたヒトＰ２Ｙ2［非特許文献１２］、ヒトＰ２Ｙ4［非特許文献１３］、およびヒトＰ２Ｙ6［非特許文献１４］受容体のコンセンサス配列について、Hansen ら［非特許文献１５］の行ったアプローチに従って適切なエピトープを検討した。Ｐ２Ｙ2のセグメントLeu226-Lys242に相応する非相同性のエピトープを、Ｐ２Ｙ4(Arg226-Arg242)およびＰ２Ｙ6(Cys220-Lys236)のこれに当たる配列と共に使用した。Ｐ２Ｙ2およびＰ２Ｙ4のエピトープにはＮ末端にCysを付加して、マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの架橋物質を介して、各々にジフテリアトキソイドを結合させた。すべての合成はＡＢＩ合成機にて標準的なｔ−ＢＯＣ法を用いて行った［非特許文献１６］。ペプチド−抗原結合体を水に５ｍｇ/ｍＬで懸濁させ、分注して完全フロインドアジュバントと共に混合することにより乳化させた。２ｍｇペプチドを含む１ｍＬ量のエマルジョンを筋注し、その後２週間隔で不完全フロインドアジュバントを用いて、２回、３回、４回および５回の免疫感作を続けて行った。各エピトープに対して使用したウサギまたはヒツジに適当な抗体価が得られたことが確立された後、静脈穿刺による最終採血を１０−１２週に行った。血液を３７℃で３０分間インキュベーションして４℃で１５時間保存し、その後遠心して血清を分離し、少量ずつ分注して−２０℃に保存した。各ペプチドに特異的な抗体についてＥＬＩＳＡ法により血清の検査を行った。ＥＬＩＳＡ法で吸光度がバックグラウンドより１．０高くなる血清希釈倍数の逆数と定義された抗体価は、免疫前サンプルの２２５±２５に比して７５，０００±４，０００の範囲であった。各抗体は特定のサブタイプに対して特異的であることが認められた。
【００４１】
この抗体に特異的なエピトープに対して各抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、同じ標識傾向を示しているにもかかわらずバックグラウンドを低下することができた。マウスの同じＰ２Ｙ2エピトープに対して作成されたモノクローナル抗体でも、同じ結果が得られた。
【実施例２】
【００４２】
実施例２−免疫組織化学的方法
８μｍ厚の切片を、固定していない凍結組織からReichert Jung 2800 Frigocutクリオトームにて作成するか、あるいはまたパラフィン包埋した組織から切片を作成した。切片は室温で１時間空気乾燥し、アセトン中で−２０℃で１２時間固定し、抗体標識前に１時間室温で空気乾燥した。これを次に抗Ｐ２Ｙ2のモノクローナルのマウス、ウサギまたはヒツジのいずれかの第一抗体と共に室温にてインキュベーションした。洗浄後、次に切片を第二抗体中で３０分間インキュベーションした：第二抗体はマウスの第一抗体に対してはＨＲＰ標識ヤギ抗マウス第二抗体(Dako)、ウサギの１次抗体に対してはＨＲＰ標識抗ウサギ第二抗体、またはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒツジ第二抗体の１：３０希釈液とした。スライドグラスを再度洗浄し、次に１５％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(ＤＡＢ-Sigma)に１０分間浸した。切片を洗浄し、空気乾燥してＤＰＸ(Merk)にのせて標本とした。コントロールのスライドグラスは、最初のインキュベーション時に希釈液中でインキュベーションした後、実験のスライドグラスと同じ方法で処理した。ネガティブコントロールスライドグラスは、第一抗体を非免疫血清に置き換えた以外は、実験のスライドグラスと同じ方法で処理した。
【００４３】
すべての抗体に対して個々の特異性を示された。
【実施例３】
【００４４】
実施例３−ヒト癌組織（前立腺）におけるＰ２Ｙ受容体
正常４０例およびヒト前立腺癌の４０症例の研究において、Ｐ２Ｙ2サブタイプはヒト前立腺癌組織中で著明に増加していた。正常組織/良性前立腺過形成では標識は観察されなかった。癌組織のＰ２Ｙ2の標識パターンは特に有益で、前立腺疾患の各ステージに伴って標識された腺房上皮細胞の比率が増加し、新生物の変化とＰ２Ｙ2の腺房の標識領域との直接の相関を示した。標識は核内に始まり（ステージ１；図１）、核外または細胞質に点在する標識へと進行し（ステージ２；図２）、そしてステージ３ではまた形態学的な変化も伴うさらに進んだ症例では上皮細胞頂端側および側方への沈着へと進行する（ステージ３；図３）。
【００４５】
Ｐ２ＹおよびＰ２Ｘの受容体の抗体の組み合わせ
Ｐ２Ｘはイオン、特にカルシウムイオンに対して細胞を開口する、すばやく作用するリガンド（ＡＴＰ）開閉イオンチャンネルである。Ｐ２Ｙ受容体は、ＡＴＰまたはＵＴＰまたはＡＤＰさえにもよる活性化後、Ｇタンパク質共役型の活性化カスケードを引き起こすことで細胞内カルシウム貯留に作用する、ずっと緩やかに作用する代謝型受容体であり、したがってその機能はＰ２Ｘ受容体とは全く異なる。
【００４６】
Ｐ２Ｘ受容体の抗体をＰ２Ｙ受容体の抗体と組み合わせて使用したところ、Ｐ２Ｙ受容体の抗体単独で使用した場合と類似のパターンが得られた。特にＰ２Ｙ2受容体サブタイプの抗体を、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2受容体サブタイプのいずれか一方または双方の抗体と共に使用しての前立腺細胞/組織の標識は、Ｐ２Ｙ2受容体の抗体を単独に使用して得られた結果を増幅した。
【００４７】
Ｐ２Ｘ抗体は以下のように作成した：
ヒトＰ２Ｘ1［非特許文献１７］、  ヒトＰ２Ｘ2［非特許文献１８］、ヒトＰ２Ｘ3［非特許文献１９］、ヒトＰ２Ｘ4［非特許文献２０］、ヒトＰ２Ｘ5［非特許文献２１］、ヒトＰ２Ｘ6［非特許文献２２］およびヒトＰ２Ｘ7［非特許文献２３］のコンセンサス配列について、ラット抗体［非特許文献１５，２４］に用いたアプローチに従って適切なエピトープを検討した。Ｎ末端にCysを付加したＰ２Ｘ1ではセグメントLys68-Val184に相応する非相同性エピトープを使用した。Ｐ２Ｘ2からはHis209-Cys226を選択した。Ｐ２Ｘ3からはAsn185-Cys203を選択した。Ｐ２Ｘ4からはCys270--Glu285を選択した。Ｐ２Ｘ5からはCys272-Ser288を選択した。Ｐ２Ｘ6からはAsn200-Cys218を選択した。Ｐ２Ｘ7からはＣ末端にCysを付加したVal165-Lys81を選択した。ジフテリアトキシンに架橋するためマレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを介して、すべてのエピトープをジフテリアトキシンに結合させた。抗体はウサギおよびヒツジで作製し、Ｐ２Ｙ抗体について上述のように精製した。
【００４８】
図４は、Ｐ２Ｙ2抗体、Ｐ２Ｘ1抗体およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて使用した、ステージ３の症例（明らかな癌）の前立腺組織の標識を示す。
その他のＰ２Ｘサブタイプ、例えばＰ２Ｘ3およびＰ２Ｘ7を使用しても、前立腺サンプルでは同様の結果が得られた。
【実施例４】
【００４９】
実施例４−ヒト癌組織（乳癌および皮膚癌）におけるＰ２Ｙ受容体
その他の癌、例えば乳癌（単一病巣および複数病巣）および悪性黒色腫を含む皮膚癌では、標識パターンが逆転した。これらの組織において、Ｐ２Ｙ2抗体による正常細胞の標識は濃く表れる（正常組織におけるＰ２Ｙ2の発現が比較的高いことを意味する）が、癌組織ではＰ２Ｙ2抗体の標識は観察されなかった。Ｐ２Ｘ受容体の抗体、特にＰ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2サブタイプの抗体をＰ２Ｙ2受容体の抗体と組み合わせて使用することにより結果は増幅された（図５から１０）。
【実施例５】
【００５０】
実施例５−Ｐ２Ｙ受容体の抗体による診断と他の検査との併用
上述のＰ２Ｙ（およびＰ２Ｘ）受容体の抗体による診断を相補的な検査と併用することができることは明らかである。このような検査は癌の性質に関するさらなる情報を提供することができ、例えば悪性に関する検査、例えば抗テロメラーゼ抗体検査、および/または抗テネイシン検査は治療方針を考える上で有用となり得る。
【００５１】
本発明を具体的な実施例を参照して述べたが、本発明を多くの他の形で提示できることは当該技術分野の技術者により理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】前新生物の第１のステージである、Ｐ２Ｙ2抗体にて標識された顕著な（prominent）上皮細胞核を示す。
【図２】今度は標識が点状のパターン（矢印）を形成し核内は染色されていないが、一方癌の形態学的エビデンスはまだ表れていない、前新生物の典型的なステージ２の染色を示す。
【図３】染色は、進行癌に伴う形態学的変化のエビデンスを示す組織において、上皮細胞の頂端側（矢印）にＰ２Ｙ2が集まっていることを示す。
【図４】ステージ３の症例（明らかな癌）由来の前立腺組織の、Ｐ２Ｙ2抗体、Ｐ２Ｘ1抗体およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせての標識を示す。
【図５】Ｐ２Ｙ2、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて標識した、非癌性乳腺組織（線維腺腫）を示す。標識を組み合わせることにより、標識強度のわずかな改善が観察される。
【図６】極めて類似する染色を示すＰ２Ｙ2の標識による非癌性線維腺腫の類似の一連の切片を示す。
【図７】Ｐ２Ｙ2、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて標識した乳癌組織を示す。癌組織は標識されていない。
【図８】陽性染色と極めて類似する欠如部分を示す、Ｐ２Ｙ2で標識された乳癌組織を示す。
【図９】顕著な核（prominent nuclei: ＰＮ）の標識を伴う、Ｐ２Ｙ2抗体で標識された正常な皮膚の良性病巣生検例を示す。
【図１０】Ｐ２Ｙ2抗体で標識された悪性黒色腫の生検切片を示し、正常なサンプルで視覚化されていたすべての標識が黒色腫では欠如している。正常な標識は黒色腫から２ｍｍ以内に認められる。上で使用した抗体の組み合わせでも等しい結果が得られる。
【図９】
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【国際公開パンフレット】
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2004520025.tif 000035
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月18日(2003.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２２】
前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別するために使用する際の、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４０】
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法で使用する際の、単離された哺乳類の細胞または組織試料。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４１】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するために使用する際のキット。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４２】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するために使用する際のキット。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４３】
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における発癌の病因を決定するために使用する際のキット。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における前新生物状態および新生物状態を同定するための方法、特にＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現の違いに基づいて細胞および組織内の前新生物および新生物を同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌を診断する際、生検サンプルの細胞の特徴、例えば癌細胞のサイズおよび形の多様性の程度、活動的に分裂している細胞の比率、および周辺構造への浸潤について考慮される。一般に使用される組織学的染色は、細胞内要素を区別して標識するヘマトキシリン（一次染色）およびエオシン（カウンター染色）である。他の診断法としては顕微鏡分析用に視覚化することのできる、細胞または組織の内部（細胞内エピトープにより）または表面上（細胞外エピトープにより）の特定の診断分子、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の抗体を用いる。いくつかの具体的な例について以下に述べる。
【０００３】
前立腺癌
西洋における前立腺癌の発症率は驚くべき速度で増加しており、過去５年間で２倍以上になっている。これはあらゆる新生物の中で最も高い発生率を有し、世界全体の男性の癌死亡の最も一般的な原因として肺癌に次いで第二位であり、オーストラリアの癌死亡の主要な原因である［非特許文献１］。良性前立腺過形成（benign prostatic hyperplasia: ＢＰＨ）は５０歳以上の男性に一般的であり、それ自体が前立腺癌の前駆体である前立腺上皮内新生物（prostatic intraepithelial neoplasia: ＰＩＮ）の前駆体となり得る。検死の研究は７０％の男性が８０歳に達するまでに前立腺に悪性細胞を有することを示している［非特許文献２］。
【０００４】
この症状の重大さにもかかわらず、診断法はわずかしかなくまた正確ではない。予後を評価する現行の方法、例えば直腸からの触診（digital rectal examination: ＤＲＥ）、超音波、前立腺性酸性ホスファターゼ濃度、アンドロゲン遮断、前立腺特異抗原（prostate specific antigen: ＰＳＡ）の比重、ＰＳＡの速度、ＰＳＡの年齢特異的基準範囲、およびGleasonの組織病理学的分類は、前立腺癌との臨床結果に関する信頼できる予測情報を提供できるとは言えない［非特許文献３］。例えば複数の試験によりＤＲＥ３では３６．９％の偽陰性率を生じることが示された［非特許文献４］。ＰＳＡは、前立腺の他にも多数の組織に関与する３３ｋＤａのセリンプロテアーゼで［非特許文献５］、アンドロゲン、グルココルチコイドおよびプロゲスチンによりアップレギュレートされ、成長因子の制御に関与すると考えられている。残念ながら血清ＰＳＡ濃度では、偽陰性２３％および偽陽性３６．７％の診断を生じる。新たにスクリーニングで検出される症例の半数以上が、実際には偽陽性であることさえ示唆されている［非特許文献６］。付加的な検査、例えばＰＳＡの比重、速度および年齢特異的基準範囲の導入によるスクリーニング法を改善する試みは疑わしい。ある試験は、年齢特異的ＰＳＡ基準範囲を適用すると、ＰＳＡ正常上限が４．５ｎｇ/ｍＬに上昇し、臨床的に重要なかなりの数の癌が検出できなくなることを示した［非特許文献７］。この不確実さゆえに悪性かどうかの確定には前立腺の生検がしばしば行われるが、この検査もまた新生物への変化の部位を直接サンプリングしていないことに起因する、２３％の偽陰性の診断というかなり不満足な値を示す［非特許文献８］。
【０００５】
治療の選択は、組織切片の顕微鏡分析に基づく臨床的なステージ分類に大きく依存する［非特許文献９］。この技術は組織学的外観を臨床結果に関連づける上で、判定とかなりの経験に依存する。残念ながら前立腺癌組織が不均一であることは周知であり、生細胞の診断の特徴が検査する切片で見過ごされやすい可能性がある。状況をさらに複雑にすることには、手術および放射線療法の結果を調査する無作為試験およびコントロール試験がまだ行われていない［非特許文献２］。治療の選択には、根治的前立腺切除、放射線療法、アンドロゲン遮断、および“注意深い待機”が挙げられる。“注意深い待機”か根治的介入かを問う確実な回答は、前立腺癌の介入−対−観察に関する試験［非特許文献１０］の結論を待たなければならない。これらの決定が患者に及ぼす結果は重大である。例えば根治的前立腺切除はしばしば失禁、インポテンス、膀胱頚狭窄、疼痛および鬱に至る［非特許文献１１］。
【０００６】
その他の癌、例えば乳癌または皮膚癌の場合、サンプルは幾つかの理由で誤診を招く可能性がある。乳腺の腫瘍の場合、局在する腫瘍の境界をうまく定義することはできず、同様に皮膚癌の場合も（Ｈ＆Ｅ染色で決定されるような）組織学的に明らかな癌と正常組織との境界は多様である。正常な組織はいずれにしても多かれ少なかれ、所望する以上にこれら腫瘍周囲を削除されることになる。
【０００７】
参考文献
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【非特許文献１５】Hansen MA, Barden JA, Balcar VJ, Keay KA および Bennett MR, 1997  Ｐ２Ｘ受容体の細胞外ドメインの構造的モチーフおよび特徴づけ。Biochem. Biophys. Res. Comm. 236: 670-675。
【非特許文献１６】Barden JA, Cuthbertson RM, Jia-Zhen W, Moseley JM および Kemp BE, 1997  １５位のＩｌｅがＡｌａで置換されているタンパク質（残基１−３４）（ＰＴＨｒＰ［Ａｌａ１５］−（１−３４））に関する副甲状腺ホルモンの溶液構造。J. Biol. Chem. 272: 29572-29578。
【非特許文献１７】Valera S, Talabot F, Evans RJ,Gos A, Antonarakis SE, Morris MA および Beull GN, 1995  膀胱由来のヒトＰ２Ｘ受容体の特徴づけおよび染色体上の位置づけ。Recept. Channels 3, 283-289。
【非特許文献１８】Lynch KJ, Touma E, Niforatos W, Kage KL, Burgard EC, van Biesen T, Kowaluk EA および Jarvis MF, 1999  ヒトＰ２Ｘ（２）受容体の分子的特徴づけおよび機能的特徴づけ。Mol. Pharmacol. 56, 1171-1181。
【非特許文献１９】Garcia-Guzman M, Stuhmer W および Soto F, 1997  ヒトＰ２Ｘ３プリン受容体の分子的および薬理学的特性。Brain Res. Mol. Brain Res. 47, 59-66。
【非特許文献２０】Garcia-Guzman M, Soto F, Gomez-HermandezJM, Lund PE および Stuhmer W, 1997  ヒトＰ２Ｘ４受容体の組み換え体の特徴づけにより、ラットの相同体との薬理学的差異を明らかにする。Mol. Pharmacol. 51, 109-118。
【非特許文献２１】Le KT, Paquet M, Nouel D, Babinski K および Seguela P, 1997  脳システムおよび免疫システム由来の自然に切断されたヒトＰ２Ｘ  ＡＴＰ受容体サブユニットの１次構造および発現。FEBS Lett. 418, 195-199。
【非特許文献２２】Urano T, Nisimori H, Han H, Furuhata T, Kimura Y, Nakamura Y および Tokino T, 1997  ｐ５３により制御される新規ヒトＰ２Ｘ受容体遺伝子であるＰ２ＸＭのクローニング。Cancer Res. 57, 3281-3287。
【非特許文献２３】Buell GN, Talabot F, Gos A, LorenzJ, Lai E, Morris MA および Antonarakis SE, 1998  ヒトＰ２Ｘ７受容体の遺伝子構造および染色体の位置づけ。Recept. Channels 5, 347-354。
【非特許文献２４】Dutton J, Hansen M, Balcar J, Barden J および Bennett MR, 1999  ラット膀胱における神経の静脈瘤様腫瘍に関する平滑筋細胞のＰ２Ｘ受容体群の発達。J. Neurocytol. 28, 3-15。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、前新生物細胞および/または新生物細胞を同定する方法を提供することであり、これにより先行技術の欠点の少なくとも一部を克服または大幅に改善し、あるいは有用な代替法を提供することとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概略
Ｐ２Ｙプリン作動性受容体は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と結合する、Ｇタンパク質共役型組織受容体で、一部のＰ２Ｙ受容体サブタイプはウリジン三リン酸（ＵＴＰ）と結合する。哺乳類においてＰ２Ｙ受容体の発現パターンを前新生物および新生物の診断に使用できることが、驚くことに発見された。
【００１０】
哺乳類における前癌および癌のステージは、成長、細胞外マトリックス、代謝因子および神経支配因子の著明な差、ならびに上皮下のカルシウムイオンおよび微小管の増加を伴う。本発明の新規抗体を用いると、Ｐ２Ｙ受容体を免疫細胞化学的方法により十分に視覚化することができ、それらが異なる発現パターンで、例えば細胞表面、尿細管および点状に標識されて存在することが示された。これらの発現パターンを用いて癌の発達の異なるステージを同定することができ、すなわち完全に正常な組織に始まり、一例として前立腺のＰ２Ｙ受容体の発現が、個々に冒された腺房内の核に最初に現れる前新生物状態を経て進行するという経過を示す。より進行した前新生物状態であってまだ疾患の形態学的徴候が表れていないものにおいて、受容体は核を離れて腺房内の細胞質および側方の膜および基底膜に拡散し、その後上皮細胞の頂端側細胞膜に沈着するが、この沈着は初期癌に伴う形態学的変化に同調して起こる。これらのステージでは明らかに腫瘍と形態学的に定義される領域以上に、事実上全体に及んでいるため、診断は目下の腫瘍領域を直接サンプリングすることに限定されることなく、ある程度距離を置いて腫瘍の存在を検出することができる。
【００１１】
したがって本発明は、前癌症状（例えば過形成）を診断し、癌をステージ分類し、発癌の基礎的な生理学および病因学を調べるための、新たな手段を提供する。
第１の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するための方法を提供する。
【００１２】
第２の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するための方法を提供する。
【００１３】
第３の側面により本発明は、哺乳類由来の細胞および/または組織のＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールの検出、および予め決定しておいた正常な細胞および/または組織の発現プロフィールと前記プロフィールとの比較を含む、前記哺乳類における発癌の病因を決定するための方法を提供する。
【００１４】
好ましくは哺乳類はヒトであるが、当該方法はウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスを含むあらゆる適切な哺乳類に適用することができる。
好ましくは細胞および/または組織は、前立腺、乳腺または皮膚由来である。しかし当該方法は他の上皮細胞を含む他の細胞のタイプにもまた有用となり得ることを、当業者は理解するだろう。
【００１５】
前新生物状態または新生物状態が前立腺の前癌病変または前立腺癌である場合、前立腺細胞または前立腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の増加を、先に定義したように、正常な前立腺細胞または前立腺組織の発現プロフィールと比較して、前立腺の前癌病変または前立腺癌の存在を診断する。
【００１６】
前新生物状態または新生物状態が乳腺の前癌病変または乳癌である場合、哺乳類から採取した乳腺細胞および/または乳腺組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な乳腺由来の乳腺細胞および/または乳腺組織の発現プロフィールと比較して、乳腺の前癌病変または乳癌の存在を診断する。
【００１７】
前新生物状態または新生物状態が皮膚の前癌病変または皮膚癌である場合、哺乳類由来の皮膚細胞および/または皮膚組織のＰ２Ｙ2プリン作動性受容体の発現プロフィールの強度の低下を、正常な皮膚由来の皮膚細胞および/または組織の発現プロフィールと比較して、皮膚の前癌病変または皮膚癌の存在を診断する。
【００１８】
好ましくは皮膚癌は、悪性黒色腫、扁平上皮癌または基底細胞癌である。したがって本発明により、例えば上述のように皮膚癌の状態を、角化棘細胞腫およびその他の良性病巣、例えば光線性角化症と区別することができる。
【００１９】
好ましくはＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールは、Ｐ２Ｙ2，Ｐ２Ｙ4および/またはＰ２Ｙ6受容体の発現プロフィールであり、より好ましくはＰ２Ｙ2受容体の発現プロフィールである。当業者は過度の実験作業をせずに、行おうとする特定の方法にどのＰ２Ｙが最適かを確認することができる。一般に正常な細胞または組織と比較して、前新生物または新生物の細胞または組織との発現プロフィールの強度差に最もコントラストのある、これらＰ２Ｙ受容体が最も望ましい。
【００２０】
１つの態様において前新生物状態は、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが細胞の核内で変化した初期の前新生物状態である。あるいはもう１つの態様において前新生物状態は進行した前新生物状態であり、この場合Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールは、Ｐ２Ｙ受容体が細胞質および/または側方の膜および/または基底膜中に存在するプロフィールを示す。
【００２１】
もう１つの態様において前新生物状態は、Ｐ２Ｙ受容体が上皮細胞の頂端側膜上に存在するというプロフィールを、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールが示す状態である。
Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールを他のマーカーの発現プロフィールと組み合わせることができることは、当業者には明らかであろう。特にＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールはＰ２Ｘ受容体の発現プロフィール、そして好ましくはＰ２Ｘ1および/またはＰ２Ｘ2の発現プロフィールと組み合わせることができる。
【００２２】
好ましくはＰ２Ｙ受容体の発現プロフィールの検出は、免疫組織化学的方法による。しかし細胞または組織のサンプル源および利用できる試薬により、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは類似の免疫学的技術を含むその他の手段でもＰ２Ｙ受容体を検出できることは、当業者には明らかであろう。好ましくはＰ２Ｙ受容体は、比色分析、例えばＤＡＢ（ジアミノベンジジン）またはＬＳＡＢ法（標識ストレプトアビジン−ビオチン法）、第二抗体検出キット（Ｄａｋｏ）により検出する。
【００２３】
標準的なウエスタンブロット法および標準的なノーザンブロット法によるＰ２Ｙプリン作動性受容体のｍＲＮＡの検出もまた、Ｐ２Ｙ受容体の発現プロフィールの決定に有用となり得ることは、当業者には明らかであろう。
【００２４】
第４の側面により本発明は、前新生物または新生物の細胞および/または組織と、正常な細胞および/または組織とを区別するために使用する際の、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体特異抗体を提供する。
【００２５】
好ましくは抗体は、Ｐ２Ｙ2受容体、Ｐ２Ｙ4受容体および/またはＰ２Ｙ6受容体に特異的である。最も好ましくは抗体は、Ｐ２Ｙ2受容体に特異的である。
Ｐ２Ｙ受容体特異抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよいことは、当業者には明らかであろう。Ｐ２Ｙ受容体特異抗体を他の抗体、特に１つまたはそれ以上のＰ２Ｘ受容体特異抗体と組み合わせてもよいこともまた、当業者には明らかであろう。Ｐ２Ｘ受容体特異抗体もまたモノクローナルでもポリクローナルでもよい。好ましい態様においてＰ２Ｘ受容体の抗体は、Ｐ２Ｘ1および/またはＰ２Ｘ2の受容体特異抗体である。
【００２６】
第５の側面により本発明は、第４の側面による抗体を含む一組の抗体を提供する。
第６の側面により本発明は、第１の側面による方法で使用する際の、単離された哺乳類の細胞または組織試料を提供する。
【００２７】
本発明に使用する細胞および/または組織は生検（特に乳腺組織では例えば細針吸引、）により得ることができるが、体液または、前立腺細胞および/または組織の場合には直腸からの触診による滲出液または精液を含む、その他のあらゆる手段で得ることもできる。
【００２８】
本発明の方法およびＰ２Ｙ受容体特異抗体は、例えば悪性度の検査を含む他のあらゆる相補的な検査と組み合わせて使用できることは、当該技術分野の業者には明らかであろう。悪性度の検査は、ヒトテロメラーゼタンパク質１（ｈＴＰ1）に特異的な抗体を使用する抗テロメラーゼ抗体検査、または他のあらゆる適切なアッセイまたは抗テネイシン検査のような検査とすることができる。
【００２９】
第７の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態を診断するために使用する際のキットを提供する。
【００３０】
第８の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するために使用する際のキットを提供する。
【００３１】
第９の側面により本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、哺乳類における発癌の病因を決定するために使用する際のキットを提供する。
【００３２】
好ましくはＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する同手段は、第４の側面による抗体または第５の側面による一組の抗体である。
好ましくは同キットは、第１から第３の側面のいずれか１つによる方法において使用する。
【００３３】
本発明の内容において、“新生物細胞”および“新生物組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、新生物細胞または新生物組織の特徴的な性質、例えば過形成および/または肥大の成長パターンおよび、異常な細胞の形およびサイズおよび核のサイズを際立たせるヘマトキシリンおよびエオシン染色（すなわちＨ＆Ｅ）による特徴的な染色を有する細胞または組織を含むが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の内容において、“前新生物細胞”および“前新生物組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、過形成または肥大し得る細胞または組織を含むが、これに限定されない。しかしこのような細胞または組織は、新生物細胞または新生物組織の特徴的な性質、例えば異常な細胞の形およびサイズおよび核のサイズを際立たせるＨ＆Ｅによる特徴的な染色は有していない。
【００３５】
本発明の内容において、“正常細胞”および“正常組織”という用語は通常の意味で解釈されるものとし、Ｐ２Ｙ発現プロフィールが、前新生物または新生物のいずれもない個体由来の細胞で観察されるプロフィールと実質的に変わらない、細胞または組織を含む。本発明の内容において前立腺の症状に関する場合、“正常細胞”という用語は、例えば良性前立腺過形成の前立腺由来の細胞もまた含む。
【００３６】
本発明の内容において“一組の抗体”という用語は、同一抗原または異なる抗原に特異的な数種の異なる抗体を含み、各受容体のサブタイプを特異的に識別することのできるポリクローナル抗体を含む。抗体がモノクローナルの場合“一組の抗体”という用語は、各受容体  例えばＰ２ＹおよびＰ２Ｘ、または受容体のサブタイプ  例えばＰ２Ｙ2およびＰ２Ｙ4を特異的に識別することのできる一群の抗体もまた含む。
【００３７】
本発明の内容において“発現プロフィール”の検出には、発現のパターンまたは強度の検出を含む。
本発明の内容で他に明確な要求がなければ、本説明および本請求項を通して “含む”“含んでいる”等の言葉は、除外または除外的な意味の対局として、包含的な意味；すなわち“含んでいるが限定されない”という意味で解釈されるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の説明
本発明は、前新生物細胞および新生物細胞はＰ２Ｙプリン作動性受容体を他と区別して発現するという所見に基づいている。したがってこの区別の目安となる発現を用いて、前新生物細胞または新生物細胞を同定することができる。さらにＰ２Ｙプリン作動性受容体は、前新生物および新生物の異なるステージの細胞内では異なって分配されるため、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを用いて、前新生物状態および新生物状態のステージを分類することができる。Ｐ２Ｙの異なる発現パターンを用いて、発癌の病因の決定することもできる。さらに本発明は、Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、前新生物状態および/または新生物状態を診断するためのキット；Ｐ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、前新生物状態および/または新生物状態のステージを分類するためのキット；およびＰ２Ｙプリン作動性受容体の発現プロフィールを検出する手段を含む、発癌の病因を決定するためのキットを含む。
【００３９】
本発明の好ましい態様をあくまで一例としてここに記述することにする。
【実施例１】
【００４０】
実施例１−抗体の作成
クローニングされたヒトＰ２Ｙ2［非特許文献１２］、ヒトＰ２Ｙ4［非特許文献１３］、およびヒトＰ２Ｙ6［非特許文献１４］受容体のコンセンサス配列について、Hansen ら［非特許文献１５］の行ったアプローチに従って適切なエピトープを検討した。Ｐ２Ｙ2のセグメントLeu226-Lys242に相応する非相同性のエピトープを、Ｐ２Ｙ4(Arg226-Arg242)およびＰ２Ｙ6(Cys220-Lys236)のこれに当たる配列と共に使用した。Ｐ２Ｙ2およびＰ２Ｙ4のエピトープにはＮ末端にCysを付加して、マレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの架橋物質を介して、各々にジフテリアトキソイドを結合させた。すべての合成はＡＢＩ合成機にて標準的なｔ−ＢＯＣ法を用いて行った［非特許文献１６］。ペプチド−抗原結合体を水に５ｍｇ/ｍＬで懸濁させ、分注して完全フロインドアジュバントと共に混合することにより乳化させた。２ｍｇペプチドを含む１ｍＬ量のエマルジョンを筋注し、その後２週間隔で不完全フロインドアジュバントを用いて、２回、３回、４回および５回の免疫感作を続けて行った。各エピトープに対して使用したウサギまたはヒツジに適当な抗体価が得られたことが確立された後、静脈穿刺による最終採血を１０−１２週に行った。血液を３７℃で３０分間インキュベーションして４℃で１５時間保存し、その後遠心して血清を分離し、少量ずつ分注して−２０℃に保存した。各ペプチドに特異的な抗体についてＥＬＩＳＡ法により血清の検査を行った。ＥＬＩＳＡ法で吸光度がバックグラウンドより１．０高くなる血清希釈倍数の逆数と定義された抗体価は、免疫前サンプルの２２５±２５に比して７５，０００±４，０００の範囲であった。各抗体は特定のサブタイプに対して特異的であることが認められた。
【００４１】
この抗体に特異的なエピトープに対して各抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、同じ標識傾向を示しているにもかかわらずバックグラウンドを低下することができた。マウスの同じＰ２Ｙ2エピトープに対して作成されたモノクローナル抗体でも、同じ結果が得られた。
【実施例２】
【００４２】
実施例２−免疫組織化学的方法
８μｍ厚の切片を、固定していない凍結組織からReichert Jung 2800 Frigocutクリオトームにて作成するか、あるいはまたパラフィン包埋した組織から切片を作成した。切片は室温で１時間空気乾燥し、アセトン中で−２０℃で１２時間固定し、抗体標識前に１時間室温で空気乾燥した。これを次に抗Ｐ２Ｙ2のモノクローナルのマウス、ウサギまたはヒツジのいずれかの第一抗体と共に室温にてインキュベーションした。洗浄後、次に切片を第二抗体中で３０分間インキュベーションした：第二抗体はマウスの第一抗体に対してはＨＲＰ標識ヤギ抗マウス第二抗体(Dako)、ウサギの１次抗体に対してはＨＲＰ標識抗ウサギ第二抗体、またはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒツジ第二抗体の１：３０希釈液とした。スライドグラスを再度洗浄し、次に１５％ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(ＤＡＢ-Sigma)に１０分間浸した。切片を洗浄し、空気乾燥してＤＰＸ(Merk)にのせて標本とした。コントロールのスライドグラスは、最初のインキュベーション時に希釈液中でインキュベーションした後、実験のスライドグラスと同じ方法で処理した。ネガティブコントロールスライドグラスは、第一抗体を非免疫血清に置き換えた以外は、実験のスライドグラスと同じ方法で処理した。
【００４３】
すべての抗体に対して個々の特異性を示された。
【実施例３】
【００４４】
実施例３−ヒト癌組織（前立腺）におけるＰ２Ｙ受容体
正常４０例およびヒト前立腺癌の４０症例の研究において、Ｐ２Ｙ2サブタイプはヒト前立腺癌組織中で著明に増加していた。正常組織/良性前立腺過形成では標識は観察されなかった。癌組織のＰ２Ｙ2の標識パターンは特に有益で、前立腺疾患の各ステージに伴って標識された腺房上皮細胞の比率が増加し、新生物の変化とＰ２Ｙ2の腺房の標識領域との直接の相関を示した。標識は核内に始まり（ステージ１；図１）、核外または細胞質に点在する標識へと進行し（ステージ２；図２）、そしてステージ３ではまた形態学的な変化も伴うさらに進んだ症例では上皮細胞頂端側および側方への沈着へと進行する（ステージ３；図３）。
【００４５】
Ｐ２ＹおよびＰ２Ｘの受容体の抗体の組み合わせ
Ｐ２Ｘはイオン、特にカルシウムイオンに対して細胞を開口する、すばやく作用するリガンド（ＡＴＰ）開閉イオンチャンネルである。Ｐ２Ｙ受容体は、ＡＴＰまたはＵＴＰまたはＡＤＰさえにもよる活性化後、Ｇタンパク質共役型の活性化カスケードを引き起こすことで細胞内カルシウム貯留に作用する、ずっと緩やかに作用する代謝型受容体であり、したがってその機能はＰ２Ｘ受容体とは全く異なる。
【００４６】
Ｐ２Ｘ受容体の抗体をＰ２Ｙ受容体の抗体と組み合わせて使用したところ、Ｐ２Ｙ受容体の抗体単独で使用した場合と類似のパターンが得られた。特にＰ２Ｙ2受容体サブタイプの抗体を、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2受容体サブタイプのいずれか一方または双方の抗体と共に使用しての前立腺細胞/組織の標識は、Ｐ２Ｙ2受容体の抗体を単独に使用して得られた結果を増幅した。
【００４７】
Ｐ２Ｘ抗体は以下のように作成した：
ヒトＰ２Ｘ1［非特許文献１７］、  ヒトＰ２Ｘ2［非特許文献１８］、ヒトＰ２Ｘ3［非特許文献１９］、ヒトＰ２Ｘ4［非特許文献２０］、ヒトＰ２Ｘ5［非特許文献２１］、ヒトＰ２Ｘ6［非特許文献２２］およびヒトＰ２Ｘ7［非特許文献２３］のコンセンサス配列について、ラット抗体［非特許文献１５，２４］に用いたアプローチに従って適切なエピトープを検討した。Ｎ末端にCysを付加したＰ２Ｘ1ではセグメントLys68-Val184に相応する非相同性エピトープを使用した。Ｐ２Ｘ2からはHis209-Cys226を選択した。Ｐ２Ｘ3からはAsn185-Cys203を選択した。Ｐ２Ｘ4からはCys270--Glu285を選択した。Ｐ２Ｘ5からはCys272-Ser288を選択した。Ｐ２Ｘ6からはAsn200-Cys218を選択した。Ｐ２Ｘ7からはＣ末端にCysを付加したVal165-Lys81を選択した。ジフテリアトキシンに架橋するためマレイミドカプロイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを介して、すべてのエピトープをジフテリアトキシンに結合させた。抗体はウサギおよびヒツジで作製し、Ｐ２Ｙ抗体について上述のように精製した。
【００４８】
図４は、Ｐ２Ｙ2抗体、Ｐ２Ｘ1抗体およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて使用した、ステージ３の症例（明らかな癌）の前立腺組織の標識を示す。
その他のＰ２Ｘサブタイプ、例えばＰ２Ｘ3およびＰ２Ｘ7を使用しても、前立腺サンプルでは同様の結果が得られた。
【実施例４】
【００４９】
実施例４−ヒト癌組織（乳癌および皮膚癌）におけるＰ２Ｙ受容体
その他の癌、例えば乳癌（単一病巣および複数病巣）および悪性黒色腫を含む皮膚癌では、標識パターンが逆転した。これらの組織において、Ｐ２Ｙ2抗体による正常細胞の標識は濃く表れる（正常組織におけるＰ２Ｙ2の発現が比較的高いことを意味する）が、癌組織ではＰ２Ｙ2抗体の標識は観察されなかった。Ｐ２Ｘ受容体の抗体、特にＰ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2サブタイプの抗体をＰ２Ｙ2受容体の抗体と組み合わせて使用することにより結果は増幅された（図５から１０）。
【実施例５】
【００５０】
実施例５−Ｐ２Ｙ受容体の抗体による診断と他の検査との併用
上述のＰ２Ｙ（およびＰ２Ｘ）受容体の抗体による診断を相補的な検査と併用することができることは明らかである。このような検査は癌の性質に関するさらなる情報を提供することができ、例えば悪性に関する検査、例えば抗テロメラーゼ抗体検査、および/または抗テネイシン検査は治療方針を考える上で有用となり得る。
【００５１】
本発明を具体的な実施例を参照して述べたが、本発明を多くの他の形で提示できることは当該技術分野の技術者により理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】前新生物の第１のステージである、Ｐ２Ｙ2抗体にて標識された顕著な（prominent）上皮細胞核を示す。
【図２】今度は標識が点状のパターン（矢印）を形成し核内は染色されていないが、一方癌の形態学的エビデンスはまだ表れていない、前新生物の典型的なステージ２の染色を示す。
【図３】染色は、進行癌に伴う形態学的変化のエビデンスを示す組織において、上皮細胞の頂端側（矢印）にＰ２Ｙ2が集まっていることを示す。
【図４】ステージ３の症例（明らかな癌）由来の前立腺組織の、Ｐ２Ｙ2抗体、Ｐ２Ｘ1抗体およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせての標識を示す。
【図５】Ｐ２Ｙ2、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて標識した、非癌性乳腺組織（線維腺腫）を示す。標識を組み合わせることにより、標識強度のわずかな改善が観察される。
【図６】極めて類似する染色を示すＰ２Ｙ2の標識による非癌性線維腺腫の類似の一連の切片を示す。
【図７】Ｐ２Ｙ2、Ｐ２Ｘ1およびＰ２Ｘ2抗体を組み合わせて標識した乳癌組織を示す。癌組織は標識されていない。
【図８】陽性染色と極めて類似する欠如部分を示す、Ｐ２Ｙ2で標識された乳癌組織を示す。
【図９】顕著な核（prominent nuclei: ＰＮ）の標識を伴う、Ｐ２Ｙ2抗体で標識された正常な皮膚の良性病巣生検例を示す。
【図１０】Ｐ２Ｙ2抗体で標識された悪性黒色腫の生検切片を示し、正常なサンプルで視覚化されていたすべての標識が黒色腫では欠如している。正常な標識は黒色腫から２ｍｍ以内に認められる。上で使用した抗体の組み合わせでも等しい結果が得られる。請求項２２、請求項４０〜４３、明細書８〜９頁（明細書段落番号「００２４」乃至「００３２」を補正した。




【国際調査報告】
2004520025.tif 000037
2004520025.tif 000038
2004520025.tif 000039