(57)【要約】本願発明は、細胞の電気的活性を決定するために使用され得る細胞膜抵抗、電気伝導度及び電気容量を測定するための装置に関する。殊に本願発明は、細胞の電気的性質（例えば、細胞膜状態）を調節する種々の化合物、リガンド又は細胞プロセスの高速処理に使用され得る装置を提供する。このような自動化装置はイオンチャンネル活性の正確な決定、及びこの活性を変える化合物、リガンド又は細胞プロセスの高速同定に使用され得る。本願発明は、ここに提供される装置を利用する細胞の電気的性質の測定方法も提供する。
2004514417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ） 上部表面と底部表面を含み、１以上の穴を含み、その際材料の上部表面は物質の穴を囲み、細胞と接触する、１以上の細胞付着部位を含み、そしてその際、材料の穴が、細胞付着部位で接触した細胞と電気的にしっかりしたシールを形成する能力を有する、非電気伝導性材料を含む第１層と、そしてｉｉ） 細胞支持膜の第１層と接触する、非孔性で、非電気伝導性、密封性材料を含む第２層、を含む１つ以上の細胞を保持する様に作製された細胞支持膜組成物を含む細胞の電気的状況を測定する装置。
【請求項２】
細胞の電気的状態がトランスメンブラン電位、電気的容量、抵抗、及び電気伝導度からなる群から選ばれる請求項１の装置。
【請求項３】
細胞支持膜組成物の第１層がガラス、プラスチック、ラバー、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン／ガラス、ポリエチレンテレフタレート、及びポリカーボネイトから選ばれる材料を含む請求項１の装置。
【請求項４】
細胞支持膜組成物の第２層がポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン／ガラス、ポリエチレンテレフタレート、及びポリカーボネイトから選ばれる材料を含む請求項１の装置。
【請求項５】
細胞支持膜組成物の第２層がポリヒドロキシブチレイト、ポリアクテイト、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、セルロース、デンプン、及びコラーゲンから選ばれる材料を含む請求項１の装置。
【請求項６】
細胞支持膜組成物の第２層が染料を含む請求項１の装置。
【請求項７】
細胞支持膜組成物の第２層がソルベント ブルー１４を含む請求項６の装置。
【請求項８】
細胞支持膜組成物の第１層の細胞付着部位が細胞付着を容易にする分子を含む組成物で処理された請求項１の装置。
【請求項９】
該分子はゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、コラーゲン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる請求項８の装置。
【請求項１０】
細胞付着部位の外側の細胞支持膜組成物の第１層の領域が細胞付着を阻止する分子を含む組成物で処理された請求項１の装置。
【請求項１１】
分子がシラン、シリコン及びテフロン（登録商標）からなる群から選ばれる請求項１０の装置。
【請求項１２】
細胞支持膜組成物の第１層が少なくとも４個の穴を表示する請求項１の装置。
【請求項１３】
細胞支持膜組成物の第１層が１個の穴を表示する請求項１の装置。
【請求項１４】
細胞支持膜組成物の第１層の穴の直径が０．２μｍ−２μｍである請求項１の装置。
【請求項１５】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞、及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項１の装置。
【請求項１６】
原発性神経細胞が海馬、背面足節及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項１の装置。
【請求項１７】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するよう指図されたＤＮＡ構築を含む請求項１の装置。
【請求項１８】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項１の装置。
【請求項１９】
細胞が以下の１つと接触することによって浸透化される請求項１の装置。
ｉ） アンホテリシン及びナイスタチンからなる群から選択される抗生物質；ｉｉ） ジギトニン及びサポニンからなる群から選択される洗浄剤；又はｉｉｉ） 高電圧界（ｆｉｅｌｄ）。
【請求項２０】
第２層が細胞支持膜組成物の第１層の下に位置し、そして細胞と接する穴と接している細胞支持膜組成物の第２層の領域が選択的に除去される請求項１の装置。
【請求項２１】
細胞支持膜組成物の第２層の領域が顕微鏡補助下、写真除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）により除去される請求項２０の装置。
【請求項２２】
顕微鏡が共焦点顕微鏡である請求項２１の装置。
【請求項２３】
写真除去がフラシュランプで行なわれる請求項２１の装置。
【請求項２４】
写真除去がレーザーで行なわれる請求項２１の装置。
【請求項２５】
レーザーがアルゴン、ヘリウム／ネオン、クリプトン、ＹＡＧ及びチタニウム−サファイヤレーザーである請求項２４の装置。
【請求項２６】
第２層が細胞支持膜組成物の第１層の上に位置し、そして細胞と接する穴と接している細胞支持膜組成物の第２層の領域が選択的に除去される請求項１の装置。
【請求項２７】
細胞支持膜組成物の第２層の領域が細胞によって分泌されるプロテアーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ及びデポリメラーゼからなる群から選択される酵素により除去される請求項２６の装置。
【請求項２８】
更に、上部領域と底部領域を含む細胞支持膜組成物を保持する部屋、但し該細胞支持膜組成物の細胞付着部位が該部屋の上部領域に面している、を含んでいる請求項１の装置。
【請求項２９】
更に、細胞支持膜組成物の第１及び第２層と接触する電解質溶液を含んでいる請求項２８の装置。
【請求項３０】
更に、電解質溶液に設置された２つの電極、電極１と電極２を含み、電極１が接地電極であり、電極２は電流−通過（ｐａｓｓｉｎｇ）／電圧−測定電極であり、２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の上部表面に面し、そして２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の底部表面に面している２つの電極を含む請求項２９の装置。
【請求項３１】
更に、局部的プレ−アンプ回路と電圧クランプ、電流クランプ及びロックインアンプを含む請求項３０の装置。
【請求項３２】
上部表面と底部表面を含み、１以上の穴を含み、その際 ｉ）該材料の上部表面は該材料の穴を囲み、細胞と接触する、１以上の細胞付着部位を含み、ｉｉ） 該材料の穴が、細胞付着部位で接触した細胞と電気的にしっかりしたシールを形成する能力を有し、そしてｉｉｉ） 細胞でシールされていない穴が該材料の上部表面に１つの組成物を加えることによって、そして穴において相互作用して非電気伝導的個体物質を形成するような他の１つの組成物を材料の底部表面に加えることによって塞がれる、非電気伝導性材料を含む１つ以上の細胞を保持する様に作製された細胞支持膜組成物を含む細胞の電気的状況を測定する装置。
【請求項３３】
細胞の電気的状態がトランスメンブラン電位、電気容量、抵抗及び電気伝導度からなる群から選ばれる請求項３２の装置。
【請求項３４】
１つの組成物が酵素を含み、そして他の１つの組成物が該酵素の基質を含む請求項３２の装置。
【請求項３５】
１つの組成物が子牛のアルカリ性ホスホターゼを含み、そして他の１つの組成物が５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェイトｐ−トルイジン及びニトロ−ブルーテトラゾニウムを含む請求項３２の装置。
【請求項３６】
細胞支持膜組成物を含む物質がガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン／ガラス、ポリエチレンテレフタレイト及びポリカーボネイトからなる群から選ばれる請求項３２の装置。
【請求項３７】
細胞支持膜組成物の細胞付着部位が細胞付着を容易にする分子を含む組成物で処理される請求項３２の装置。
【請求項３８】
分子がゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、コラーゲン及びフィブリノーゲンからなる群から選ばれる請求項３２の装置。
【請求項３９】
細胞付着部位の外側領域が細胞付着を阻止する分子を含む組成物で処理される請求項３２の装置。
【請求項４０】
分子がシラン、シリコン及びテフロン（登録商標）からなる群から選ばれる請求項３９の装置。
【請求項４１】
細胞支持膜組成物が少なくとも４個の穴を表示する請求項３２の装置。
【請求項４２】
細胞支持膜組成物が１個の穴を表示する請求項３２の装置。
【請求項４３】
穴の直径が０．２μｍ−２μｍである請求項３２の装置。
【請求項４４】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項３２の装置。
【請求項４５】
原発性神経細胞が海馬、背面足節、及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項４４の装置。
【請求項４６】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するよう指示されたＤＮＡ構築を含む請求項３２の装置。
【請求項４７】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項３２の装置。
【請求項４８】
細胞が以下の１つと接触することによって浸透化される請求項３２の装置。
ｉ） アンホテリシン及びナイスタチンからなる群から選択される抗生物質；ｉｉ） ジギトニン及びサポニンからなる群から選択される洗浄剤；又はｉｉｉ） 高電圧界（ｆｉｅｌｄ）。
【請求項４９】
更に、上部領域と底部領域を含む細胞支持膜組成物を保持する部屋を含み、その際に該細胞支持膜組成物は細胞支持膜組成物の細胞付着部位が該部屋の上部に面しているように部屋に位置している請求項３２の装置。
【請求項５０】
更に、細胞支持膜組成物の第１層と第２層と接触している電解質溶液を含む請求項４９の装置。
【請求項５１】
更に、電解質溶液に設置された２つの電極、電極１と電極２を含み、電極１が接地電極であり、電極２は電流−通過（ｐａｓｓｉｎｇ）／電圧−測定電極であり、２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の上部表面に接し、そして２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の底部表面に接している２つの電極を含む請求項５０の装置。
【請求項５２】
更に、プレ−アンプ回路と電圧クランプ、電流クランプ及びロックインアンプを含む請求項５１の装置。
【請求項５３】
上部表面と底部表面を含み、１以上の穴を含み、その際、ｉ）材料の上部表面は該材料の穴を囲み、細胞と接触する、１以上の細胞付着部位を含み、ｉｉ）該材料の穴が、細胞付着部位で接触した細胞と電気的にしっかりしたシールを形成する能力を有し、そしてｉｉｉ）細胞がアトラクタントで穴に誘導される非電気伝導性材料を含む、細胞を保持する様に作製された細胞支持膜組成物を含む細胞の電気的状況を測定する装置。
【請求項５４】
細胞の電気的状態がトランスメンブラン電位、電気容量、抵抗及び電気伝導度からなる群から選ばれる請求項５３の装置。
【請求項５５】
アトラクタントがケモアトラクタントである請求項５３の装置。
【請求項５６】
ケモアトラクタントが生長因子、ケモカイン及び栄養（ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）からなる群から選ばれる請求項５５の装置。
【請求項５７】
ケモアトラクタントが２０−ヒドロキシロイコトリエンＢ４である請求項５６の装置。
【請求項５８】
アトラクタントが電気的フィールド（ｆｉｅｌｄ）である請求項５３の装置。
【請求項５９】
細胞が密度勾配に再懸濁される請求項５３の装置。
【請求項６０】
密度勾配がパーコル、フイコル及びメトリザミドからなる群から選ばれる懸濁液である請求項５９の装置。
【請求項６１】
細胞支持膜組成物を含む材料がガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン／ガラス、ポリエチレンテレフタレイト及びポリカーボネイトからなる群から選ばれる請求項５３の装置。
【請求項６２】
細胞支持膜組成物の細胞付着部位が細胞付着を容易にする分子を含む組成物で処理される請求項５３の装置。
【請求項６３】
分子がゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、コラーゲン及びフィブリノーゲンからなる群から選ばれる請求項６２の装置。
【請求項６４】
細胞付着部位の外側の領域が細胞付着を阻止する分子を含む組成物で処理される請求項５３の装置。
【請求項６５】
分子がシラン、シリコン及びテフロン（登録商標）からなる群から選ばれる請求項６４の装置。
【請求項６６】
細胞支持膜組成物が少なくとも４個の穴を表示する請求項５３の装置。
【請求項６７】
細胞支持膜組成物が１個の穴を表示する請求項５３の装置。
【請求項６８】
穴の直径が０．２μｍ−２μｍである請求項５３の装置。
【請求項６９】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項５３の装置。
【請求項７０】
原発性神経細胞が海馬、背面足節及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項６９の装置。
【請求項７１】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するよう指図されたＤＮＡ構築を含む請求項５３の装置。
【請求項７２】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項５３の装置。
【請求項７３】
細胞が以下の１つと接触することによって浸透化される請求項５３の装置。
ｉ） アンホテリシン及びナイスタチンからなる群から選択される抗生物質；ｉｉ） ジギトニン及びサポニンからなる群から選択される洗浄剤；又はｉｉｉ） 高電圧界（ｆｉｅｌｄ）。
【請求項７４】
更に、上部領域と底部領域を含む細胞支持膜組成物を保持する部屋を含み、その際に該細胞支持膜組成物は細胞支持膜組成物の細胞付着部位が該部屋の上部に面している請求項５３の装置。
【請求項７５】
更に、細胞支持膜組成物の第１層と第２層と接触している電解質溶液を含む請求項７４の装置。
【請求項７６】
更に、電解質溶液に設置された２つの電極、電極１と電極２を含み、電極１が接地電極であり、電極２は電流−通過（ｐａｓｓｉｎｇ）／電圧−測定電極であり、２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の上端表面に面し、そして２つの電極のうち１つが細胞支持膜組成物第１層の底部表面に面している２つの電極を含む請求項７５の装置。
【請求項７７】
更に、プレ−アンプ回路と電圧クランプ、電流クランプ及びロックインアンプを含む請求項７６の装置。
【請求項７８】
上部表面と底部表面を含む非電気伝導物質で、その物質の上端表面が個々の細胞に接触するようなサイズにされ、そして電極鉛／シグナルモディファイイング回路と結合した細胞付着部位を含んでいる物質、を含む細胞を保持する様に適用されたミクロチップ組成物を含む細胞電気的状態の測定用装置。
【請求項７９】
細胞の電気的状態がトランスメンブラン電位、電気容量、抵抗及び電気伝導度からなる群から選ばれる請求項７８の装置。
【請求項８０】
ミクロアレイ組成物の材料がガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン／ガラス、ポリエチレンテレフタレイト及びポリカーボネイトからなる群から選ばれる請求項８０の装置。
【請求項８１】
細胞付着部位が細胞付着を容易にする分子を含む組成物で処理される請求項７８の装置。
【請求項８２】
分子がゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、コラーゲン及びフィブリノーゲンからなる群から選ばれる請求項８１の装置。
【請求項８３】
細胞付着部位の外側の領域が細胞付着を阻止する分子を含む組成物で処理される請求項７８の装置。
【請求項８４】
分子がシラン、シリコン及びテフロン（登録商標）からなる群から選ばれる請求項８３の装置。
【請求項８５】
細胞付着部位が接触細胞に浸透するサイズにされたてピンを含み、その各ピンがｈｅａｄｓｔａｇｅ増幅器に結合した電極を収容しているピンを含む請求項７８の装置。
【請求項８６】
細胞付着部位が接触細胞に適合する様にサイズ化されたピットを含む請求項７８の装置。
【請求項８７】
ミクロチップ組成物の上部表面が少なくとも９細胞付着部位を表示する請求項７８の装置。
【請求項８８】
細胞付着部位の直径が１５μｍと２０μｍの間である請求項７８の装置。
【請求項８９】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項７８の装置。
【請求項９０】
原発性神経細胞が海馬、背面足節及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項８９の装置。
【請求項９１】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するよう指示されたＤＮＡ構築を含む請求項７８の装置。
【請求項９２】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項７８の装置。
【請求項９３】
細胞が高電圧界と接触することによって浸透化される請求項７８の装置。
【請求項９４】
細胞付着部位が独立の接地電極に隣接し、独立の測定電極に結合している請求項７８の装置。
【請求項９５】
更に、上部領域と底部領域を含む細胞支持膜組成物を保持する部屋を含み、その際にミクロチップ組成物がミクロチップ組成物の細胞付着部位が該部屋の上部に面している請求項７８の装置。
【請求項９６】
更に、ミクロチップ組成物の上部表面と接触している電解質溶液を含む請求項９５の装置。
【請求項９７】
更に、局地プレ−アンプ回路と電圧クランプ、電流クランプ及びロックインアンプを含む請求項９６の装置。
【請求項９８】
ｉ）請求項３１、５２、７７及び９７のいずれかに従う複数の装置に細胞を付着させ、ｉｉ） 電解質溶液と接触した細胞の電気的活性を測定し、ｉｉｉ） 検体を含有する電解質溶液とその細胞を接触させ、ｉｖ） 検体と接触した細胞の電気的活性を測定し、そしてｖ） 工程（ｉｉ）で測定された電気活性と工程（ｉｖ）で測定した電気活性の差を評価する、ことからなる細胞の電気的活性に影響する試験薬を検知し、検定するための高処理スクリーニング法。
【請求項９９】
細胞の電気的活性が電位、抵抗、電気伝導度及び電気容量からなる群から選ばれる請求項９８の方法。
【請求項１００】
装置の部屋が多ウエル板で備えられている請求項９８の方法。
【請求項１０１】
多ウエル板がコンピュター制御装置でプロセスされる請求項９８の方法。
【請求項１０２】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項９８の方法。
【請求項１０３】
原発性神経細胞が海馬、背面足節及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項１０２の方法。
【請求項１０４】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するよう指図されたＤＮＡ構築を含む請求項９８の方法。
【請求項１０５】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項９８の方法。
【請求項１０６】
細胞が以下の１つと接触することによって浸透化される請求項９８の方法。
ｉ） アンホテリシン及びナイスタチンからなる群から選択される抗生物質；ｉｉ） ジギトニン及びサポニンからなる群から選択される洗浄剤；及びｉｉｉ） 高電圧界（ｆｉｅｌｄ）。
【請求項１０７】
試験物質がニューロトランスミッター、ニューロトランスミッター類似体、酵素阻害剤、イオンチャンネル調節剤、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、輸送阻害剤、ホルモン、ペプタイド、トキシン、抗体、薬物及び化学品からなる群から選ばれ請求項９８の方法。
【請求項１０８】
試験物質がプリン作動性薬、コリン作動性薬、セロトニン作動性薬、ドパミン作動性薬、麻酔薬、ベンゾジアゼピン、バルビツレイト、ステロイド、アルコール、金属カチオン、カンナビノイド、コレシストキニン、サイトカイン、興奮性アミノ酸、ＧＡＢＡ作動性薬、ガングリオサイド、ヒスタミン作動性薬、メラトニン、ニューロペプチド、ニューロトキシン、エンドテリン、ＮＯ化合物、オピオイド、シグマレセプターリガンド、ソマトスタチン、タキキニン、アンジオテンシン、ボンベシン、ブラヂキニン及びプロスタグランジンからなる群から選ばれ請求項９８の方法。
【請求項１０９】
ｉ）請求項３１、５２、７７及び９７のいずれかに従う複数の装置に細胞を付着させ、ｉｉ） 休止状態にある細胞の電気的活性を測定し、ｉｉｉ） 細胞のプロセスを開始し、ｉｖ） 該プロセスに関与した細胞の電気的活性を測定し、そしてｖ） 工程（ｉｉ）で測定された電気活性と工程（ｉｖ） で測定した電気活性の差を評価する、ことを含む細胞の電気的活性に影響する細胞プロセスを検知し、検定するための高処理スクリーニング法。
【請求項１１０】
細胞の電気的活性が電位、抵抗、電気伝導度及び電気容量からなる群から選ばれる請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
装置の部屋が多ウエル板で備えられている請求項１０９の方法。
【請求項１１２】
多ウエル板がコンピュター制御装置でプロセスされる請求項１０９の方法。
【請求項１１３】
細胞がＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、原発性神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、免疫細胞、上皮細胞、及び内皮細胞からなる群から選ばれる請求項１０９の方法。
【請求項１１４】
原発性神経細胞が海馬、背面足節及び上方頚管節細胞からなる群から選ばれる請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
細胞がイオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び蛋白フォスホターゼからなる群から選ばれる分子を発現するように指図されたＤＮＡ構築を含む請求項１０９の方法。
【請求項１１６】
細胞がナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩素からなる群から選ばれるイオンに特異的であるイオンチャンネルを発現する請求項１０９の方法。
【請求項１１７】
細胞が以下の１つと接触することによって浸透化される請求項１０９の方法。
ｉ） アンホテリシン及びナイスタチンからなる群から選択される抗生物質；ｉｉ） ジギトニン及びサポニンからなる群から選択される洗浄剤；及びｉｉｉ） 高電圧界（ｆｉｅｌｄ）。
【請求項１１８】
試験物質がニューロトランスミッター、ニューロトランスミッター類似体、酵素阻害剤、イオンチャンネル調整剤、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、輸送阻害剤、ホルモン、ペプタイド、トキシン、抗体、薬物及び化学品からなる群から選ばれ請求項１０９の方法。
【請求項１１９】
試験物質がプリン作動性薬、コリン作動性薬、セロトニン作動性薬、ドパミン作動性薬、麻酔薬、ベンゾジアゼピン、バルビツレイト、ステロイド、アルコール、金属カチオン、カンナビノイド、コレシストキニン、サイトカイン、興奮性アミノ酸、ＧＡＢＡ作動性薬、ガングリオサイド、ヒスタミン作動性薬、メラトニン、ニューロペプチド、ニューロトキシン、エンドテリン、ＮＯ化合物、オピオイド、シグマレセプターリガンド、ソマトスタチン、タキキニン、アンジオテンシン、ボンベシン、ブラヂキニン及びプロスタグランジンからなる群から選ばれ請求項１０９の方法。
【請求項１２０】
細胞−細胞相互作用、細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜リサイクリング 及び膜リガンド相互作用からなる群から選ばれ請求項１０９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本願発明は、イオンチャンネル活性、イオン輸送活性、又は細胞間の相互作用、細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、細胞膜リサイクリング又は細胞膜リガンド相互作用に起因する細胞膜の性質の変化に使用され得る、細胞膜電位、抵抗、電気伝導度及び電気容量を測定するための装置に関する。殊に本願発明は、細胞の電気的性質を調節する種々の化学品、化合物、リガンド又は細胞プロセスの高速処理に使用され得る装置に関する。このような装置はイオンチャンネル活性の正確な決定、及びこの活性を変える化学品、化合物、リガンド又は細胞プロセスの高速同定に使用され得る。本願発明は、また細胞の電気的性質の測定方法及びここに提供される装置の利用方法にも関する。
【０００２】
関連出願
本願は２０００年７月７日付アメリカ特許出願（出願番号６０／２１６，９０３）の優先権主張に基づく出願である。
【０００３】
（背景技術）
イオンチャンネルは生物学的膜において穴を形成し、イオンの一方から他方への移動を許すトランスメンブラン蛋白である（Ｂ． Ｈｉｌｌｅ （Ｅｄ）， １９９２， Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｓｉｎａｕｅｒ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡでレビューされている。）。いくつかのイオンチャンネルが全ての生理学的膜状況のもとで開いている（所謂リークチャンネル）が、多くのチャンネルは特定の刺激に応じて、開口する所謂「ゲイト：門（ｇａｔｅ）」を有する。例えば、電圧−門チャンネルが膜を横切る電位の変化に反応し、機械的−門チャンネルがその膜の機械的刺激に反応し、そしてリガンド−門チャンネルが特定の分子の結合に反応する。種々のリガンド−門チャンネルが、ニューロトランスミッター（トランスミッター−門チャンネル）のような細胞外因子、又はイオン（イオン−門チャンネル又は核酸（核酸−門チャンネル））ような細胞内因子に応じて開口し得る。なお他のイオンチャンネルは、Ｇ−蛋白（Ｇ−蛋白結合レセプター）のような蛋白との相互作用により調節される。
【０００４】
大抵のイオンチャンネル蛋白は１つの顕著なイオン種の浸透を媒介している。例えば、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、塩素（Ｃｌ−）及びカルシウム（Ｃａ２＋）チャンネルは同定されている。更に１つのイオンの浸透に特異的であるイオンチャンネルは、それぞれの電気的及び／又は化学的（薬理学的）刺激に対する応答に基づき、種々のサブカテゴリー又はチャンネルタイプに更に分類し得る。特に、電圧−門カルシウムチャンネルは、異なった性質、薬理及び組織分布を示すＬ−タイプ、Ｎ−タイプ、Ｔ−タイプ、Ｒ−タイプ及びＰ／Ｑ−タイプチャンネルを含む（Ｇ． Ｖａｒａｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４：１８１−２１４）。イオンチャンネルはイオン輸送蛋白の他のタイプと明らかに異なっている。例えば、他の輸送蛋白は濃度勾配においてイオンを上昇（ｕｐｈｉｌｌ）させるが、イオンチャンネルは電気化学的勾配において、イオンを下降（ｄｏｗｎ）させる（上記Ｈｉｌｌｅｒ 参照）。
【０００５】
イオンチャンネルは、細胞膜の反対側の電気荷電において異なる細胞膜電位を形成する責（ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ）がある（Ｂ． Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， ３ｒｄ ｅｄ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹでレビューされている。）。動物細胞において、Ｎａ＋−Ｋａ＋ＡＴＰアーゼはＮａ＋の細胞内濃度を低く保ち、Ｋａ＋の細胞内濃度を高く保つ。そのＮａ＋−Ｋａ＋ＡＴＰアーゼと異なって、Ｋ＋リークチャンネルはＫ＋イオンがＫ＋濃度勾配を下降し細胞外へ出ることを許す。他のイオン輸送因子はＣｌ−−イオン勾配のようなイオン性勾配を維持する責がある（Ｙ． Ｋａｋａｚｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９：２８４３−５１）。この方法で、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−チャンネルを含むいくつかのイオンチャンネルが細胞膜電位の形成に共通して貢献している。
【０００６】
電圧−門イオンチャンネルは、大抵の筋肉及び神経細胞を含め、電気的に励起する細胞において、細胞膜作用ポテンシアル（電位）を起す責がある（上記 Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ）。活動電位は細胞膜非極化によって引き起こされ、それが電圧−門Ｎａ＋チャンネルを通じてＮａ＋の流入で引き起こされる。電圧−門Ｃａ２＋チャンネルはまた、いくらかの電気的活性細胞において活動電位を生みだし得る。しかし、イオンチャンネルは励起細胞に限定されないことに注意すべきである。事実、電圧−門Ｎａ＋、 Ｋ＋、又はＣａ２＋ チャンネルが通常励起し得ると考えられないある細胞タイプに現れる（上記 Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ）。
上に示したよううに、イオンチャンネル活性は、神経輸送因子、核酸、及びＧ−蛋白を含む種々のリガンドと蛋白によって調節され得る。その様なリガンドはリガンド−門イオンチャンネルに結合し、そしてそれによってイオンチャンネル活性を変えることが示されてきた。特に、Ｇ−蛋白−門Ｋ＋チャンネル活性がそれと同種のＧ−蛋白結合レセプターに結合しているＧ−蛋白と相互作用して、調節される（Ｎ． Ｄａｓｃａｌ， １９９７， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ９：５５１−７３； Ｊ．Ｌ． Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｄｖ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． ３３： １７９−２０１）。更に電圧−門Ｃａ２＋チャンネルはＧ−蛋白依存性パスウエイによって制御されている（Ｇ． Ｗ． Ｚａｍｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ８：３５１−６）。細胞膜状態（例えば、電気的容量）が細胞間相互作用、細胞間融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜リサイクリング 及び膜−リガンド相互作用を含む種々の細胞プロセスによってまた、調節され得る（Ｋ． Ｌｏｌｌｉｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３２： １１１−２０）。
【０００７】
多くの化学品、化合物、及びリガンドはイオンチャンネル活性に影響を与えることが知られている。更に、イオンチャンネル活性を調節している物質（ａｇｅｎｔ）は色んな病気、障害、症状の処置に使用されるかもしれない薬剤組成物に調剤され得る（Ｓ．Ａ．Ｎ． Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎｅｕｒｏｎ １６：９１３−９１９）。例えば、Ｃａ２＋チャンネルの活性を調節している物質はテンカン、不安及びアルツハイマー病の処置に使用され得る。更にＮａ＋チャンネルの活性を調節する薬剤は筋肉痙攣、斜頚、震顫、学習障害、脳腫瘍及びアルツハイマー病の処置に使用され得る。Ｎａ＋チャンネルをスローにブロックする物質は局所麻酔剤として使用され得る。上皮Ｎａ＋チャンネルを調節する物質は嚢胞性線維症、喘息及び高血圧症の処置に使用され得る。更にＫ＋チャンネルの活性を調節する物質は無酸素の又は虚血性の異常及び高血圧のダメージ的効果を中和し、そしてマラリアや鎌状細胞のダメージに対する赤血球細胞の保護に使用し得る（Ｊ． Ｒ． Ｅｎｆｅｉｌｄ， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗｓ ２：２３−２７）。
【０００８】
イオンチャンネル活性はパッチ−クランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）分析という技術を用いて測定できる（Ｅ． Ｎｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ３７５：２１９−２８； Ｏ．Ｐ． Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９４：４６２−４）。この技術によれば、１つの細胞をマイクロピペットの先端に付着させ、吸引を行なう。マイクロピペットと細胞膜の領域の間で１−１０ ｇｉｇａｏｈｍｓ（１０９ オーム）に相当する高抵抗シールが達成されると、マイクロピペットを通じて電流の流れがマイクロピペットの先にシールされた膜を通じた電流の流れで確認される。この所謂 ｇｉｇａｓｅａｌ は、もし既知の電圧が膜を横切って適用されると、高速溶解電流の測定（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）することを可能にする。この方法でパッチ−クランプ分析は該膜の電気的状況とイオンチャンネルの対応する活性を決定するために使用され得る。
【０００９】
パッチ−クランプ分析は全細胞膜（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｍｏｄｅ）又は細胞膜の小さな領域（ｅｘｃｉｓｅｄ−ｐａｔｃｈ 又は ｃｅｌｌ−ａｔｔａｃｈｅｄ ｍｏｄｅｓ） に適用され得る。パッチ又は全細胞分析の間に、個々のイオンチャンネル サブタイプの活性が細胞膜を横切って”電圧−クランプ”を置くことにより、更に解決される。電圧−クランプは帰還（フイードバック）ループの使用により該膜を横切って電圧勾配を課し、そして全体のイオンチャンネル活性を制限して分離したイオンチャンネルサブタイプの解明（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を許す。その様な実験において、ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ は通常ｓｕｂ−ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｒａｎｇｅ に入る。更に、ｃｕｒｒｅｎｔ−ｃｌａｍｐ 又は ｌｏｃｋ−ｉｎ 増幅技術は、細胞のトランスメンブラン電位又は細胞電気容量の変化を測定するために、それぞれ使用される。この様な技術は、パッチ−クランプ技術と類似の細胞への電気的アクセスを確立するための器具と条件を使用する。
【００１０】
パッチ−クランプ技術の開発は生物学的、医学的研究に顕著な進展を可能にしてきた。殊に、パッチ−クランプ技術は種々の被験物質のイオンチャンネル応答の研究を可能にした。更に、パッチ−クランプ記録は他の技術より更に感度がよく、より高い解決を示すので、パッチ−クランプ技術は膜分析のたの技術（例えば、フルオレスセンスに基づく膜分析）より勝っている。しかし、パッチ−クランプ及び関連分析形態は、今日まで、極端に速く、かつ正確な高処理スクリーニングのために成功裏に採用されたことがなかった。その様な高処理スクリーニングはイオンチャンネル活性を調節する物質の探索と同定に計り知れない価値を与えるであろう。見返りに、その様な物質は種々の病気、侵害、及び症状（上記参照）の処理に有用であろう。しかし、標準的パッチ−クランプ技術は実験当たり少量の物質の試験に限定されている。更に、この標準的技術は、試料交換率がスローで、そしてパッチ−クランプピペットで要求される空間的正確さで制限される。従って、パッチ−クランプ分析の処理能力を増加させるいくつかの試みがなされてきた。
【００１１】
ＷＯ９６／１３７２１文献は、通常はＨＰＬＣ分析に使用される自動試料採取器を利用したパッチ−クランプ装置を開示している。その自動試料採取器はパッチ−クランプ必要液量を減らし、細胞及びパッチのための液変化の率を増やすことを意図している。この装置の問題点は、試験化合物の供給の装置を半自動化しているが、しかしパッチ−クランプ分析ための装置を自動化していないことである。特に、ＷＯ９６／１３７２１の装置はなお、データの直線的処理を必要（即ち、データは１度に１細胞のみから収集される。）としており、そしてそれ故、被験物質の比較的スロー速度に限定される。この様にＷＯ９６／１３７２１の装置は実際の高処理装置とはみなし得ない。
【００１２】
もう一つの文献、ＷＯ９９／６６３２９は、イオンチャンネル又は対象の輸送因子を含み、そして多孔性又は穴あき基質に高抵抗シールで接着された生物学的膜分析のための自動化装置を記載している。そのＷＯ９９／６６３２９の装置はイオンチャンネル又はイオン輸送因子活性を調節している物質の高処理スクリーニングを意図したものである。特に、その装置は１つ以上の被験物質の存在下、生物学的膜の抵抗と電気伝導を測定するために使用し得る。この装置はＷＯ９６／１３７２１の装置の問題のいくつかを解決しているが、顕著な欠点も有する。特に、細胞膜抵抗値の測定値を得るために、ＷＯ９９／６６３２９の装置は基質における各穴と全ての穴が生物学的膜でシールされることを必要性とする。基質の開口穴又はホール（ｈｏｌｅ）（即ちミスか不完全に付着した細胞膜に起因して生じる。）が装置を機能せしめなくなる。
【００１３】
この様に、細胞膜状態の速くて、しっかりとして、正確な測定をするために使用され得る電気生理学的分析のための装置、方法の技術の必要性が存する。その様な装置や方法は、イオンチャンネル又は輸送因子活性を調節している物質や細胞プロセスの高速処理スクリーニングために使用される得る。従って、本願出願はその様な方法、及びその様な方法を実施する装置を提供する。
【００１４】
発明の要約
イオンチャンネル活性の測定のための装置を提供することが本願発明の１つの目的である。ここで開示している様に、該装置は細胞膜電位、セルイオンチャンネル活性や細胞膜活性（例えば、細胞間相互作用、細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜リサイクリング 及び膜−リガンド相互作用）を決定するために使用され得る電気抵抗、電気伝導度及び電気容量を測定するために使用し得る。
本願発明で提供される１つの装置は、細胞を保持するために作製された「多孔性細胞支持膜」組成物を含む。細胞支持膜組成物の上部表面（ｃｉｓ）は細胞と接触し、接地（ｇｒｏｕｎｄ） 電極に接している。細胞支持膜組成物の底部の表面（ｔｒａｎｓ）は電流−パッシング／電圧測定用電極に接している。細胞支持膜組成物のｃｉｓ とｔｒａｎｓ の両方が電解液と接触している。好ましくは、細胞支持膜組成物は、多孔性の、非伝導性材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む第１層と非多孔性、非伝導性密封材料を含む第２層を含む。更に好ましくは、細胞支持膜組成物の第１層の穴は、個々の細胞と接触するサイズで、接触した細胞の細胞膜としっかりとしたシールを形成できる。最も好ましくは、細胞支持膜組成物の第１層は、穴を取り囲む細胞付着部位を含む。細胞付着部位は、付着を容易にする材料、物質、及び／又は織地（ｔｅｘｔｕｒｅ）を含み、一方の細胞付着部位を取り囲んでいる表面は、付着を阻害する材料、物質、及び／又は織地を含む。
【００１５】
本願発明で提供される他の装置は、細胞を保持するように作製されたミクロファブリケイト チップ組成物を含み、それは細胞膜抵抗、電気伝導度、電位、及び電気容量を決定するのに使用され得る。好ましくは、そのミクロチップ組成物はシリコン、ガラス、又はポリマー物質を含み、接地電極及び電極鉛／シグナルモディファイイング電気回路明細図にはめ込まれている。更に好ましくは、ミクロチップ組成物のｃｉｓ 表面は特定の部位での細胞付着を増進する１つ以上の形態（例えば、ピット、ピン、織地又は細胞付着物質）を含む。一方これらの部位を囲んでいる領域は細胞付着を阻害する材料、物質、及び／又は織地を含む。最も好ましくは、独立電極がミクロチップ組成物の各細胞付着部位に付着され、そして、電極鉛／シグナルモディファイイング電気回路明細図に結合されている。
【００１６】
イオンチャンネル活性を測るための自動化装置を提供することももう１つの本願発明の目的である。該自動化装置は、化学品、化合物、リガンド、又は細胞膜状況（例えば、イオンチャンネル活性又は膜電気容量）を調節するプロセスの高処理分析のために作製される開示の細胞支持膜又はミクロチップ組成物を含む。
ここに述べた細胞支持膜及び／又はミクロチップ組成物を利用して、細胞性イオンチャンネル活性、又は輸送因子活性を測る方法を提供することももう１つの本願発明の目的である。この方法はイオンチャンネルと輸送因子の活性を調節する化合物を同定するために有用である。
【００１７】
更なる本願発明の目的は、ここに述べた細胞支持膜及び／又はミクロチップ組成物を利用して、細胞プロセス（例えば、細胞間相互作用、細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜リサイクリング 及び膜−リガンド相互作用）を測る方法を提供することにある。
更なる本願発明の目的は、細胞膜状況（例えば、イオンチャンネル活性又は膜電気容量）を調節する化合物又は細胞プロセスの高処理分析方法を提供することにある。この方法はここに開示した自動装置を利用する。
更なる本願発明の目的は、ここで提供される装置を利用して細胞膜浸透性のリアル−タイム測定方法を提供することにある。この方法は、例えばＣａｃｏ−２細胞における、薬物の往来を研究するために使用し得る。
本願発明で提供される他の目的及び利点はここで挙げた詳細な説明及び実施例から明らかとなろう。
【００１８】
図面の説明
添付の図面は発明を更に記述し、そして種々の局面の説明を通してその理解の手助けのために提示される。
図１は、部屋に設置した多孔性、非伝導性細胞支持膜（ＣＳＭ）の１例を示す。膜は接地電極と測定電極を分離している。細胞は細胞支持膜の上部（ｃｉｓ）表面に加えられ、膜の穴を塞ぎ、しっかりとした封（〜１Ｇ Ｏｈｍ）をする。この様に配置することで、細胞付着記録技術を利用して、細胞の電気的性質の直接の測定を可能にする。全細胞の測定は細胞支持膜の底部（ｔｒａｎｓ）表面に抗生物質又は洗浄剤を加え、細胞の浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、又は電気浸透法によって、得ることができる。裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）パッチ測定は空気−水界面に細胞支持膜のｃｉｓ 表面を晒すことによって得ることができる。
【００１９】
図２は、付着した細胞で多孔性細胞支持膜表面下側の非伝導性密封層を選択的に破壊するために使用される直立のレーザースキャンニング顕微鏡の１例である。細胞は、細胞形態又は緑色蛍光蛋白のようなマーカーの発現に基づいて、エピフルオレスセント又は移送ライトイメージングを用いて、選択される。選択された細胞の下側の非伝導性密封層が焦点を合わせたレーザー光線で除去（ａｂｌａｔｅ）される。ついで、細胞の電気的性質は図１で記載した技術を用いて測定される。
図３は、１個以上の細胞を独立して、或いは同時に電気的測定をするためにデザインされた３つのミクロチップ形態を示している。各ミクロチップ形態は、ミクロチップのｃｉｓ 表面上の細胞でのしっかりとした密封（〜１Ｇ Ｏｈｍ）形成を必要とする。細胞付着、裏返し又は全細胞モード測定は図１に記載の様にして得ることができる。各形態は、はめ込まれた独立の測定電極と局部共通基盤を持った細胞付着領域を含む。細胞付着領域の外の領域は、細胞付着を拒絶する物質で被覆されている。ピット形態は単一細胞とほぼ同じサイズの奥まった領域を利用する。そのピットの内側は細胞付着とシール形成を促進する物質で被覆されている。ピン形態においては、測定電極が細胞付着から突き出し、細胞膜を貫通する。織地形態においては、細胞付加部位は細かく織られ、細胞付着とシール形成を促進する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本願発明は細胞における膜抵抗、電気伝導度、電位及び電気容量の迅速且つ正確な測定を可能にする装置と方法を提供する。該装置と方法は化合物、リガンド、又は細胞膜活性、例えばイオンチャンネル活性の効果、及びエンドサイトーシス、エクソサイトーシス及び細胞融合のようなプロセスから生じる細胞膜電気容量の変化のためのプロセスの高速処理スクリーニングのために利用される。本願発明は、パッチ−クランプ、細胞内電極、又は細胞の位置付けに必要な高い程度の空間的正確さの要求を除去した点で、現在手に入る電気生理学的装置と異なる。本願発明のいくつかの態様はまた、各細胞の電気的状態の独立した測定を可能にし、そしてこれらの測定を平行して処理する。これは上に述べた技術で可能にしたものよりより早く、より正確に電気的状態を読み取ることを可能にする。この様に、本願発明は、我々が本願発明が電気生理学的技術を薬品発見戦略に応用し得る能力において重要な優越性を示す。
【００２１】
細胞支持膜組成物
本願発明によれば、細胞支持膜組成物及びミクロチップ組成物は細胞を保持するために作製され、細胞の電気的性質（例えば細胞膜状態）の測定を可能にする。このような組成物は、細胞から離れて面しているｔｒａｎｓ 表面のみならず、細胞に面しているｃｉｓ 表面（図１）を含んでいる。好ましくは、細胞支持膜組成物及びミクロチップ組成物は、ガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ／ガラス、及び／又はポリエチレンテレフテレート（ＰＥＴＰ）及びポリカーボネートを含み、これに限定されない非伝導性物質から製造される。特に、ＰＴＦＥ及びＰＥＴＰ物質は高い絶縁恒数を有し、そして極端に薄いシートに製造でき、それが装置において、最少シリーズ抵抗を減少する。
【００２２】
本願発明の細胞支持膜組成物は、好ましくは穿孔され、そのサイズは１−２ｍｍから１−１０ｃｍの範囲である。好ましくは、細胞支持膜組成物の直径は２−５ｍｍである。細胞支持膜組成物の穴は、その組成物上に置かれる細胞よりも直径でより小さい様にデサインされる。その穴はそれによって、付着した細胞の細胞膜でしっかりとしたシール（即ち、０．５ ｇｉｇａ ｏｈｍｓ より大きい最大抵抗値）を形成することができる。好ましくは、穴の直径は０．１−５μｍである。更に好ましくは、穴の直径は０．２−２μｍである。最も好ましくは、穴の直径は０．１−０．５μｍである。細胞支持膜組成物の穴の数は平行記録の統計学的に許容される数を可能にするために最大限にされる。ある目的のために、１つの穴を表示するために細胞支持膜組成物を構築するのが好ましいかもしれない。好ましくは、細胞支持膜組成物は４穴以上を表示する。より好ましくは、細胞支持膜組成物は４−１０穴を表示する。細胞支持膜組成物における穴は、細胞支持膜表面のレーザー切開、写真エッチング、キャスティング、小粒子爆破、及び物理的穿孔を含む種々の方法で製造できる。代りに、本願発明のいくつかの具体化物のための高多孔性物質は市販の製品（例えば、多孔性ラバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＯ．， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）、及びＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌｓ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））から得られる。
【００２３】
細胞支持膜組成物の各穴は、細胞膜でシールされることが必須であるが故に、本願発明は、細胞／穴シールの形成の可能性を増加するようにデザインされた細胞支持膜組成物のいくつかの具体例を提供する。好ましくは、細胞支持膜組成物は、穴を囲み、そして細胞付加とシール形成を促進する材料、物質、織地、及び／又は電気的又は化学的誘引剤を含む細胞付着部位を含む。該細胞付着部位は該膜（即ち、直径１−３０μｍ）の上に置かれる細胞に適合するように寸法を合わせられる。特に、細胞付着部位は哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）に適合するために直径１５−２０μｍであり得る。対照的に、細胞付着部位を囲む細胞支持膜の表面は細胞付着を阻止する材料、物質、及び／又は織地を含む。細胞の付着を促進する材料はプラスマ、又はポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、及び／又は他の細胞外マトリックス蛋白のような分子を含む一種以上の物質で処理した標準的組織培養プラスチックを含む。細胞付着を阻止する材料は、Ｃ１８シラン、シリコン、テフロン（登録商標）のような分子を含む疎水性の物質で処理されたプラスチックを含む。この様な材料及び物質は当業者によく知られており、市場から入手し得る。例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｒｅａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＯ．）、及び Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標） ｃｏｌｌａｇｅｎ １−、ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ− 又はｇｅｒａｔｉｎ− 処理Ｃｅｌｌｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）参照。
【００２４】
更に、細胞は電気的、化学的誘引剤で細胞支持膜組成物の穴に誘引され得る。例えば、生長因子、ケモカイン、又はヌートリエントのようなケモアトラクタントが穴又は穴のｔｒａｎｓ 表面を漬けた溶液にアプライされ得る。この方法で、ケモアトラクタントは穴を通じて拡散し、穴に集中した濃度勾配を形成し得る。この濃度勾配は細胞の移住を促進し、穴を蔽うか、部分的に穴に浸透し、かくしてｇｉｇａｓｅａｌ の形成を促進する。代りに、電界（ｅｌｅｃｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）が電気電気泳動法による細胞を誘引するために、穴を横切って適用できる（Ｊ．Ｂａｕｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７２２：５５−５９）。特に、１００ｍＶ の電界は哺乳動物の細胞を誘引するためにアプライされ得る。しかし、最大電界は研究される特定のセル−タイプのために決定されてよい。電気泳動中に穴の領域外の部位に細胞が重力により沈着する（ｓｅｔｔｌｅ）のを防ぐために、細胞が細胞と同じ密度の等張液に懸濁され得る。例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）やメトリザミドのような低浸透圧活性を有する懸濁液を含有するの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３（〜２９０ ｍＯｓｍ）含有等張液が使用され得る。適切な密度勾配は特定のセル−タイプと必要な実験で決められる。特に、１．０７−１．１０ｇ／ｍｌ パーコールを含有する密度勾配は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ）のために好ましく使用される。
【００２５】
細胞付着に引き続いて、本願発明の細胞支持膜組成物は、細胞膜を横切る抵抗をモニターして電気的に検査できる。もし１個以上の穴が開くか、部分的に開いたままだと、穴の一方の側に組成物Ａを加え充填し、そして穴の反対側に組成物Ｂを加えて満たし得る。これらの組成物は、穴の中で反応し、高電気抵抗を持ったプラグを形成し、そしてそれによって穴をシールする。例えば、組成物Ａは酵素でもよく、そして組成物Ｂは該酵素のための非−細胞透過性基質でもよい。該酵素及び基質は反応し、非溶解性、非伝導性沈殿又はポリマーを形成し、かくして穴を塞ぐ。例えば、子牛アルカリ性ホスフォターゼが組成物Ａとして使用することができ、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３’−ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｓａｌｔ）及びＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ−ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）が組成物Ｂとして使用することができる。特に、１Ｕ／ｍｌ子牛腸アルカリ性ホスフォターゼ、１６５μｇ／ｍｌ ＢＣＩＰ及び３３０μｇ／ｍｌ ＮＢＴが使用され得る。しかし、該酵素と基質の最適濃度は該実験によって決定される。他の例として、組成物Ａが非−細胞透過性組成物Ｂと反応し、穴を塞ぐ非伝導性沈殿又はポリマーを形成する非−細胞透過性化合物でもよい。
【００２６】
本願発明の更なる態様において、細胞支持膜は、ここで記載のような多孔性、非伝導性材料を含む層と非多孔性、非伝導性密封材料を含む層を含む２つの組成を含む。該密封性材料は、多孔性層を製造するために使用されるポリマーなどの、細胞を浴する溶液に不溶である非伝導性物質を含むことができる。好ましくは、密封剤は編んだポリエステルを含む。更に好ましくは、密封剤は、酵素又はレーザー光線に曝した時に多孔層の穴と接触する領域で除去、可溶化、又は伝導化され得る。必要とされるように、密封層は、細胞でシールされている穴の上部、底又は内部から、選択的に除去し得る。これは細胞支持膜中の開口或いは部分的開口穴の問題を解決する。明らかに、密封層は該実験条件のもとで、およそ１ ｇｉｇａｏｈｍ のトータル細胞支持膜抵抗を創造すると予期される。密封剤が穴のチャンネルを塞ぐことを妨げるために、穴は密封層の適用前に、シュガー（例えば蔗糖、マルトースなど）組成物のような可溶性組成物で満たし得る。この充填剤は、後程、水、生理食塩水等の液で細胞支持膜を培養することによって除去され得る。
【００２７】
本願発明の好ましい態様において、密封層は細胞膜支持の多孔性層のｃｉｓ 表面に位置される。密封層は、ついで、付着細胞のプラズマ膜の外部表面に付着している酵素で消化されて、穴の開口から選択的に除去される。別の好ましい態様において、密封層は細胞膜支持の多孔性層のｔｒａｎｓ 表面に位置される。密封層は、ついで付着細胞によって分泌される酵素で消化されて、穴の開口から選択的に除去される。酵素と接触して除去され得る密封剤は、不溶性糖ポリマー（例えばセルロース／レイヨン）、生体分解性ポリエステル、ポリヒドロキシブチレイト、ポリアクテイト、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、及び細胞外マトリックス（コラーゲンなど）を含む。適当な酵素としては、これらに限定されないが、蛋白や糖ポリマーを消化する酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ及びデポリメラーゼなどが挙げられる。この様な酵素をコードしている遺伝子のいくつかは同定され、単離されている（Ｇ． Ｓｍａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ４９０６−１１； Ｋ． Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５４：１３１−４２； Ｔ． Ｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． ２５：１６９−７６参照）。特に膜会合プロテアーゼは当業界でよく知られている。
【００２８】
好ましくは、該酵素は酵素をコードしている遺伝子を含み、付着細胞で保持されている発現ベクターから製造される。例示としては、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｂｉａｚｏｔｅａ からのカルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）遺伝子（Ｓ． Ｐａｒｖｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （Ｐｒａｈａ．） ３９：２５１−４）がクローンされ、発現され、細胞で分泌され、そして細胞支持膜のセルロース（レイヨン）密封層の消化のために使用される。別に、ＣＭＣアーゼ をコードしている配列が単一膜間ドメイン（ＴＤ）コーディング配列（例えばＩＬ−１レセプターのＴＤ）に融合され、セルロース（レイヨン）密封層を消化するために使用し得る、膜会合融合蛋白（ＣＭＣアーゼ−ＴＤ）を製造することができる。他の例として、膜会合セルラーゼ（例えば、ｅｎｄｏ−１， ４−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ； Ｆ． Ｎｉｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ＥＭＢＯ Ｊ． １７： ５５６３−７６）が使用し得る。遺伝子のクローンと発現の技術及び融合構築は、当業者によく知られている（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； 下記参照）。
【００２９】
更に好ましくは、密封層は多孔性層の下に配置され、顕微鏡補助写真ａｂｌａｔｉｏｎ（除去）によって、多孔性層の穴の開口から除去される。例えば、写真ａｂｌａｔｉｏｎは光（フラッシュやレーザーなど）源を介して行なわれる。特に、レーザーはコンピューターと顕微鏡の管理下置かれる（図２）。これにより細胞と穴の視覚による検知を可能にし、レーザー源を穴／細胞付着部位の直接の下の、密封層の領域に導くよう使用し得る。更に、この技術によって、細胞形態学及び／又は緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のようなマーカーの発現に基づく調査のための特定のセルタイプ同定とターゲッテングを可能にする。必要により、密封剤はレーザーの発射を吸収する染料を染込ませ、それによりレーザー除去を促進する。例えば、ソルベント ブルー１４（ｏｉｌ ｂｌｕｅ Ｎ）は最大限６３７ｎｍでの光を吸収し、ヘリウム／ネオン レーザーの６３２．８ｎｍ線と一緒に使用され得る。色素の正確な選択は、該実験のために使用されるレーザー光線の波長の選択に依存する（染料の他の例、Ｆ．Ｊ． Ｇｒｅｅｎ， １９９０， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｙｅｓ， Ｓｔａｉｎｓ， ａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ， Ａｌｄｏｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ。参照）。
【００３０】
写真（例えば、レーザー）除去用の顕微鏡は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ 装置（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）のような直立又は転倒スキャンニング共焦点顕微鏡であり得る。この顕微鏡装置に使用され得る適切なレーザー源は、限定されないが、ＹＡＧ、アルゴン、ヘリウム／ネオン、クリプトン ガスレーザー、又は多光子励起（ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）用ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ パルス チタニウム−サアファイア レーザーが挙げられる。透過光線又はエピフルオレスセント光線顕微鏡検査を利用した細胞の同定方法及び焦点レーザー光線の適用方法は当業界で公知である。レーザー光線の最適強度と持続は当該シールした層のために実験的に決定される。最適レーザー照射時間と強度の予測は、細胞不存在下細胞支持膜密封層の試験照射で決定し得る。細胞支持膜からの密封層の成功的除去は、細胞支持膜の抵抗の測定された増加とそれに続くレーザー照射で、決定され得る。
【００３１】
細胞の電気的性質の測定を可能にするために、細胞支持膜のｃｉｓ（又はｔｒａｎｓ）表面は接地電極に接している。一方、細胞支持膜組成物のｔｒａｎｓ（又は ｃｉｓ）表面は電流−通過（ｐａｓｓｉｎｇ）／ 電圧測定（ｖｏｌｔａｇｅ−ｍｅａｓｕｒｅｉｎｇ）電極に接している（図１）。電気生理学的装置用の電極製造と配置は当業界で公知である（Ｂ． Ｓａｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｅ． Ｎｅｈｅｒ， １９９５， Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）。その組成物のｃｉｓ 及びｔｒａｎｓ の両表面は、例えばＨＥＰＥＳ緩衝等張生理食塩液（１４０ ｍＭ ＮａＣｌ， ２．５ｍＭ ＫＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ２， １ｍＭ ＭｇＣｌ２， １０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３； 〜２９０ ｍＯｓｍ）を含む電解質溶液と接触している。この配置は、種々の電気的配置、例えば、細胞に付着、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ、 ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ、全細胞、電圧クランプ、電流クランプ、及びｌｏｃｋ−ｉｎ 増幅測定機 等を使用して、細胞支持膜組成物の穴に付着している細胞の細胞膜電位、抵抗、電気伝導度及び電気容量の測定を可能にしている（Ｍ． Ｌｉｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ４１１：１３７−４６； Ｋ．Ｄ． Ｇｉｌｌｓ， Ｅ． Ｎｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６７１２−６）。
【００３２】
ミクロチップ組成物
本願発明のミクロチップ組成物は、シリコン、ガラス、又はポリマー物質を含む。より好ましくは、ミクロチップ組成物のｃｉｓ 表面は、特定の細胞付着部位での細胞の接触とシール形成を促進させるために、１種以上の形態（ｆｅａｔｕｒｅｓ） （例えば、ピット、織地、ピン、又は細胞付着物質）を含む。一方これらの部位を囲む領域は細胞の付着を阻止する材料又は物質を含む（図３）。ミクロチップ組成物上の細胞付着部位の直径は、研究対象の細胞の直径とほぼ同じである（例えば直径１−３０μｍ）。特に、細胞付着部位は、哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）に適合する直径１５−２０μｍであり得る。更に、細胞付着部位の数は、最高、平行記録の統計的に許容される数まで許容される。好ましくは、ミクロチップ組成物は９以上の細胞付着部位を表示する。更に好ましくは、そのミクロチップ組成物は９−２５の細胞付着部位を表示する。
【００３３】
本願発明によれば、ピット、又はくぼんだ部位は、ミクロチップ組成物表面のレーザーエッチング、フォートエッチング、キャスチング及び物理的インデントを含む種々の方法によるミクロチップの細胞付着部位で取り囲まれた領域内に形成され得る。ピットの深さは好ましくは、１−５μｍ、更に好ましくは１−２μｍである。ピンは細胞付着部位で囲まれた領域の中央に位置され得る。好ましくは、ピンはミクロチップの電極と連結され（下記参照）、そしてミクロチップのｃｉｓ 表面の穴を通して突出するようにデザインされ、そして付着細胞に穴をあける。ピンの長さは好ましくは０．１−１μｍ、より好ましくは、０．５−１μｍである。細胞付着を促進或いは阻害する物質は、上記の細胞支持膜組成物のために述べた。ミクロチップ組成物のサイズは１−２ｍｍから１−１０ｃｍの範囲である。各ミクロチップは、物理的に、電気的に互いに分離され、試験化合物の分析を可能にする１つ以上の細胞付着領域を含んでいてもよい。
【００３４】
細胞の電気的性質の測定を可能にするために、ミクロチップ組成物を接地電極及び電極鉛／シグナルモディファイイング回路に取りこませる。好ましくは、独立した接地及び測定電極はミクロチップ組成物の各細胞付着部位に隣接しそして付着して備え付けられ、そして電極鉛／シグナルモディファイイング回路に結合される。重要なことは、この配置は、ミクロチップ組成物の細胞付着部位に付着している各細胞の細胞膜電位、抵抗、電気伝導度、電気容量の独立した測定を可能にする。各細胞付着部位は別々の電極に結合されているので、空の又は部分的に充填された部位に結合されている電極は、細胞の電気的性質の測定の間に、停止され得る。これは１つの細胞ですべての細胞付着部位を充填する必要性を除去する。更に、電極は互いに独立しているので、所望の電気的性質を示している細胞は、研究（試験）のために選択される。一方、残りの細胞は対応する電極を不活性化することにより除去され得る。更に、ミクロチップ組成物のデザインはその組成物のｔｒａｎｓ 表面の電解質溶液の必要性を除去する。そのため、ミクロチップ組成物は電気生理学的装置のデザインにおいて重要な利点を示す。
【００３５】
自動電気生理学的装置
本願発明の他の態様において、細胞支持膜及びミクロチップ組成物は、自動電気生理学的記録装置の使用のために用いられる。自動化は、マニュアル操作及び波形分析に伴うエラーを減少させながら、電気生理学的実験の速度と処理量を増やす。特に、自動化は試料の適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、化学品、化合物、リガンドの添加）の正確な時間を可能にし、そして不慮のエラー、異なった研究者間のプロトコールにおける特異的変動、及びマニュアル操作によるノイズの導入を減少させることによって、実験データの質を改善する。更に、自動化波形分析は、結果のリアルタイムの評価を可能にしながら、実験データの分析に必要な後処理時間のみならず、測定エラーを減少させる。試験の能率と速度が増加されるので、自動化は大量の化学品、化合物、又はリガンド ライブラリーの大規模で、平行スクリーニングを可能にする。これは特に、細胞の電気的性質（例えば、細胞膜状態）に影響する物質のスクリーニングに有利である。
【００３６】
本願発明の好ましい態様において、該組成物が多−ウエル板記録装置の中に組み込まれる。好ましくは、この装置は９６−３８４ウエル板を有する。更に好ましくは、この多−ウエル板は高密度ウエルを有す。これは、試験中に必要な試験化学品、化合物、又はリガンドの量を減少させる。この多−ウエル板を処理するために、市販のロボットとｐｌａｔｅ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ を接続するようデザインされたｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ が利用され得る。別に、処理は、板処理、液の変化及び記録能力を提供する十分に統合されたｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ 装置によって行ない得る。この装置は、自動化多−ウエル液体処理装置とロボットが市場から入手し得るので、特に有利である。
【００３７】
多−ウエル板記録装置は、機器制御ソフトウエアを利用した多くのコンピューターの１つを使って制御し得る。そのようなソフトウエアはデータ入手と機器制御のために使用され得る実際上の機器の開発を促進する特異的グラフィカル環境を提供する。好ましくは、ソフトウエア又は自動化ルーチンは、画面上のマウス由来のインターフェイスを通して、試験化学品、化合物、又はリガンド配給、器具制御、データ入手、及び波形分析を統合する。この方法で、電気的生理学的記録期間の全ての点が、器具制御を調節するためのマウスを使用して画面上のインターフェイスを通じて制御され得る。例えば、自動的プロトコールは容量レスポンス、リバーサル電位、変調効果及びシングルキープレスを用いた繰り返し適用実験を開始し、実行するために展開され得る。更に、波形分析ルーチンは、応答アンプリチュード（振幅）、オンセット時間及び脱感さ時間コンスタントのようなパラメーターを自動的に測定でき、そして、ついで直接のディスクへのこの情報を蓄える。自動化細胞電気的生理学的装置を制御し、モニターするためのコンピューターソフトウエアは、詳細に記載されており（例えば、Ｆａｒｂ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６０４８７２２ 参照）、そして当業界で公知である。
【００３８】
電気生理学的装置のためのデータ入手
本願発明によれば、開示の電気生理学的装置はｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｅａｄｓｔａｇｅ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ を用い、細胞支持膜又はミクロチップ組成物の電極の全てから同時的記録を入手し得る。好ましくは、電気生理学的装置は、マルチチャンネル データを処理し、同時的記録を容易にするようデザインされた増幅器を利用する（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６０４８７２２ ｔｏ Ｆａｒｂ ｅｔ ａｌ．）。これらの増幅器は、細胞支持膜のｃｉｓ 又はｔｒａｎｓ 表面のすぐ近くに位置する電極、或いはミクロチップに埋め込まれたミクロ電極に連結され得る。電流、電圧、及び電気容量の記録は、各増幅器から得られ、データ濾過とジギタル処理へのアナログは適用され、そしてデータはコンピューターに蓄えられる。データ獲得についで、自動ルーチンは、同業界でよく確立された方法を使用して、各記録上の波形分析を行なう。
【００３９】
電気生理学的組成物と装置で使用のための細胞
本願発明によれば、沢山のセルタイプがここに述べる電気生理学的組成物と装置に使用される。セルタイプの非限定的例示は、海馬、背面足節、上方頚管節組織、骨格筋、平滑筋、心筋、免疫系、上皮及び内皮組織、由来細胞などのプライマリー神経細胞組織が挙げられる。特に、細胞の抵抗性、電気容量性、電気伝導性、又はトランスメンブラン電圧性質を変えるかもしれない因子（例えば、イオンチャンネル蛋白、イオン輸送因子、Ｇ−蛋白、Ｇ−蛋白リガンド、Ｇ−蛋白調節因子、Ｇ−蛋白リセプター、膜リセプター、蛋白キナーゼ及び／又は蛋白フォスホターゼ）の発現を指図する１以上のＤＮＡ構造で安定的に、一時的に形質転換（トランスフェクト）されるＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３細胞株のような細胞株が使用される。好ましくは、細胞膜イオンチャンネル（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及び塩素電圧−門イオンチャンネル）を示す細胞が使用される。本願発明の装置は、以前の電気生理学的装置が互いにしっかりした連結の形成の研究のための細胞を必要としない点において、同時的に多細胞の電気的活性を測定するためにデザインされた以前の電気生理学的装置より明らかな利点を提供することが注目される。
【００４０】
細胞の電気的性質を調節する因子の発現を指図するＤＮＡ構造は、確立した方法（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）を用いて構築することができる。この様な構築は、少なくとも１つの調節（レギュラトリー）配列に実施可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）なように結合された少なくとも１つの因子をコードする核酸を含む。”Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ” とは、その核酸配列が、核酸配列の発現を可能にするような方法で調節配列に結合されることを意味することが意図される。調節配列は当業界で公知であり、適切な宿主細胞で所望の蛋白を発現を指揮するよう選択される。従って、調節配列には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素を含む（Ｄ．Ｖ． Ｇｏｅｄｄｌｅ， １９９０， Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：３−７ 参照）。発現ベクターのデザインは形質転換されるべき宿主の選択及び／又は発現が望まれるポリペプチド又はペプチドのタイプのようなファクターに依拠されると理解されるべきである。
【００４１】
非限定的バクテリアのプロモーターの例としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ） プロモーター、ａｒａＢＡＤ （アラビノース）オペロンプロモーター、ダムダ−誘導Ｐ１プロモーター、Ｎ遺伝子リボゾーム結合部位及びｔｒｐ とｌａｃ ＵＶ５ プロモーターの配列由来のハイブリドｔａｃ プロモーターが挙げられる。非限定的酵母プロモーターの例としては、３‐ホスフォグリセレイト キナーゼ プロモーター、グリセルアルデヒド−３−フォスフェイト デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１） プロモーター、ガラクトエピメラーゼ プロモーター、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＶＨ１） プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞用の好ましいプロモーターは、非限定的に、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０ （ＳＶ４０）、 Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ）、 ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ （ＡＤＶ）、 ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ （ＣＭＶ）、 ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ （ＢＰＶ） のようなウイルス由来のプロモーターが挙げられる。好ましいレプリコンと遺伝システムとしてはＭ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ、 ｌａｍｄａ、 ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、 ＣＥＮ ＡＲＳ、 ２μｍ ＡＲＳ 等が挙げられる。
【００４２】
真核細胞はまた、遺伝子発現を調節する、ターミネイター配列、ポリアデニル化配列、及びエンハンサー配列を必要とする。遺伝子の増幅を引き起こす配列がまた、望ましい。これらの配列は当業界で公知である。更に、非限定的にバクテリア、酵母、及び動物細胞を含む細胞から組換え産物の分泌を容易にする配列，例えば分泌シグナル配列及び／又はプレ蛋白、プロ蛋白配列がまた、含まれる。その様な配列は先行文献に開示されている。ある目的のために、目的の因子の配列と外因性のコーデング配列からなる融合構造を作製することが望ましい。特に、外因性配列は、融合蛋白が視覚に映る様に、例えばＧＦＰ、ルシフェラーゼ、或いは融合蛋白の局在化（例えば、核局在シグナル、分泌シグナル、トランスメンブラン ドメイン）を可能とするように、外因性のコーデング配列が付加され得る。
【００４３】
原核性及び真核性ベクターと宿主細胞を使用してよい。ベクター、宿主細胞、及び翻訳システムの特定の選択は、発明の実施に決定的要因でない。ＤＮＡ配列は、欲すれば、使用宿主生物で一層効率的発現するために、最大限に利用される。例えば、コドンは、使用宿主の好ましいコドン利用に適合するか、或いは当業界で通常実施されている技術を使用したセルフリー翻訳システムに適合する様に修正され得る。非限定的に、適切な発現ベクターの例としてはｐＵＣ、 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ｐＥＴ （Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、及びｐＲＥＰ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）プラスミドが挙げられる。ベクターは、クローニングや発現用の１つ以上の複製と遺伝システム、宿主における選択用の１つ以上のマーカー、例えば抗生物質抵抗性、及び１つ以上の発現カセットを含むことができる。挿入されるコドン配列は、常法で合成され、天然資源から単離され、或いはハイブリドとして作製される。コドン配列の転写調整要素（例えば、プロモター、エンハンサー、及び／又は絶縁体など）及び／又は他のアミノ酸配列への結合は確立した方法で実施できる。
【００４４】
組換えクローニングベクター用の宿主細胞としては、バクテリア、原生バクテリア（ａｒｃｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）、カビ、植物、昆虫及び動物細胞、殊に哺乳動物細胞が挙げられる。大腸菌、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ． ｐｏｍｂｅ、Ｎ． ｃｒａｓｓａ、ＳＦ９、Ｃ１２９、２９３、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＯＳ 及びＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ が特に興味がある。このような細胞は、適切に、電気泳動、ＣａＣｌ２−、ＬｉＣｌ−、ＬｉＡｃ／ＰＥＧ−、ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔｉｎｇ−、Ｃａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポゾーム媒介ＤＮＡ摂取、注射、ミクロインジェクション、ミクロプロジェクタイル ボンバードメント、又は他の確立された方法を含む適当な方法で、形質転換、形質導入される。発現ベクターを含んでいる宿主細胞を確認するために、選択し得るマーカーを含む遺伝子が目的の遺伝子に沿って、宿主細胞に一般的に導入される。好ましい選択用マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキセイト、又はアンピシリンのような薬剤に耐性を与えるものが含まれる。選択されるマーカーは、目的の遺伝子と同じプラスミドに導入され得る。目的の遺伝子を含有する宿主細胞は、薬剤抵抗マーカーを有する細胞が対応する薬剤を含む増殖培地で生存するので、薬剤選択で確認し得る。残存する細胞は組換えファクター又はその融合体を産生させるために、スクリーニングされる。
【００４５】
本願発明の１つの態様は、ＤＮＡ構造を有し、有さざる細胞が浸透され、細胞の内部に接近し、それにより内部の電気的状態の測定を可能にする。浸透することにより、全細胞電圧クランプ、及び電流クランプ電気生理学的技術の使用を可能にする。更に、浸透は細胞ゾルの化学的組成物を種々の試験液と交換を可能にする。１例として、細胞が抗生物質（例えばアンホテリシン又はナイスタチン）と接触して浸透される。代表的には、２４０μｇ／ｍｌのアンホテリシンが標準的電気生理学的装置で哺乳類細胞の穿孔されたパッチ記録のために使用される。しかし、抗生物質の最適濃度は、使用のセルタイプと実験のために、経験的に決定され得る。他に、細胞は、洗浄液（例えば、ジギトニン又はサポニン）、高電圧磁場を用いる物理的破壊（電気的浸透化）、又は細胞膜の領域の酵素的消化で浸透され得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｘｏｎ．ｃｏｍ／ ＭＲ−Ａｘｏｎ−Ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍｌ 参照）。電気的浸透化は、ミトコンドリア又は小胞体膜のインテグリティに影響するすることなく、プラスマ膜を浸透するために使用され得る。更に、電気的浸透技術が正確に制御され、そして浸透化に次いで溶液の変換を必要としない。
【００４６】
電気生理学的装置を使用する方法
本願発明によれば、ここに開示の電気生理学的装置及び方法は、細胞の電気的性質に影響する物質と方法を同定するためのスクリーンに使用される。同定され得る物質の非限定的例としては、ニュロトランスミッター、その類似体、酵素阻害剤、イオンチャンネル調節剤、Ｇ−蛋白とそのリガンド、調節剤、及びレセプター、輸送阻害剤、ホルモン、ペプタイド、トキシン、抗体、薬物、化学品、及びそれらの組合せが挙げられる。興味ある特定の薬剤としては、プリン作動性薬、コリン作動性薬、セロトニン作動性薬、ドパミン作動性薬、麻酔薬、ベンゾジアゼピン、バルビツレイト、ステロイド、アルコール、金属カチオン、カンナビノイド、コレシストキニン、サイトカイン、興奮性アミノ酸、ＧＡＢＡ作動性薬、ガングリオサイド、ヒスタミン作動性薬、メラトニン、ニューロペプチド、ニューロトキシン、エンドテリン、ＮＯ化合物、オピオイド、シグマレセプターリガンド、ソマトスタチン、タキキニン、アンジオテンシン、ボンベシン、ブラヂキニン、プロスタグランジン、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００４７】
ここで開示のスクリーンで同定され得る細胞プロセスには、細胞−細胞相互作用、細胞融合、ウイルス感染、エンドサイトーシス、エクソサイトーシス、膜リサイクリング、及び膜リガンドが含まれる。全ての膜プロセスは細胞の１つ以上の電気的性質の測定し得る変化を来し得るので、本願発明はいかなるどのプロセスの研究にも使用し得る。同様に、この研究は細胞プロセスを調節する化合物を発見するために使用され得る。
１つの態様では、本願発明のスクリーンは、ｉ） 細胞支持膜又はミクロチップ組成物に細胞を付着する。但し、その組成物は多−ウエル板の内側にあり、各ウエルは接地電極と記録装置に連結されている；ｉｉ） 生理学的に許容される溶液と細胞を接触させる；ｉｉｉ） 必要に応じて、細胞を浸透化液と接触させ、ついでその細胞を生理学的に許容される溶液で洗浄する；ｉｖ） １つ以上の被験物質を含有する溶液と細胞を接触させ、ついで生理学的に許容される溶液で細胞を洗浄する；そしてｖ） 記録とレファレンス電極で決定された電気抵抗、電位、電気伝導度、電気容量値を測定する；これらの工程を含む方法を利用する。
【００４８】
好ましくは、本願発明に従うスクリーンは、自動化されたコンピューター制御装置を介して作動される。例えば、スクリーンは、市販の９６ウエル板とこの板をプロセスするためのコンピューター制御装置を利用してもよい。更に好ましくは、本願発明によるスクリーンは、多電圧−クランプ増幅器によってデータ獲得装置に複式化された多重記録エレメントを利用する。その様な増幅器はまた、電流クランプ、又はフェーズロックド増幅モードで使用され得る。この配置は極端に高いｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ を供給し、全ての細胞からの実質的に同時測定を可能にする。最も好ましくは、スクリーンは非常に少ない量の液を使用し、細胞（５０−５００μｌ）に付着している細胞支持膜又はミクロチップ組成物と接触する。これは浸透化あるいは被験物質の溶液の追加前後洗浄工程を速くし、スクリーンに必要な被験物質の量を最少にする。その様なスクリーンは１週間当たり１５０，０００以上の試験に使用され得ると考えられる。
【００４９】
本願発明の他の態様では、ここに記載した方法は、前もって同定された細胞膜又は細胞イオンチャンネル活性の機能（即ち、活性の増加、減少）に影響する被験物質を同定するために使用され得る。被験物質は、本願発明の細胞支持膜又はミクロチップ組成物に付着する細胞に添加され、細胞の電気的性質へのそれらの影響を決定する。被験物質を含有する溶液はピペットされ、細胞支持膜組成物のｃｉｓ 及びｔｒａｎｓ 表面上に潅流される。ミクロチップ組成物については、被験物質含有溶液はピペットされ、該組成物のｃｉｓ 及びｔｒａｎｓ 表面上に潅流される。
【００５０】
本願発明の装置と方法は、電気的測定のいくつかの異なるタイプを得るために使用されることが注目される。細胞付着状況は図１に示される。穿孔パッチ全細胞記録状況は浸透溶液（例えばアンホテリシンＢ）を細胞支持膜又はミクロチップ組成物のｔｒａｎｓ 表面上に添加して得られる。標準的全細胞状況は高電圧パルスを細胞膜に適用し、穴／電極を塞いでいる膜の部位を破壊して得られる。内部のパッチ状況は空気−水インターフェイスで細胞を消化し、穴／電極と接している膜のパッチを放置して得られる。
本願発明の方法と装置は、既に存在している電気生理学的装置に比べ、いくつかの利点があることに更に注目される。具体的には、本願発明は、ｉ） 細胞付着部位から反対の密封層の写真（例えば、レーザー）除去、ｉｉ） 細胞付着部位の密封層の酵素消化、或いはｉｉｉ） 開示の組成物の添加によって穴を塞ぐことによって、細胞支持膜における開いた又は部分的に開いた穴を阻止するための戦略を提供する。更に、本願発明は、各細胞付着部位で個々の電極を採用しているミクロチップ組成物を提供することによる細胞密封穴の必要性を除去する。
【００５１】
重要なことは、開示された装置は、電極の位置どり、或いはガラスピペットの作製のための空間的正確さを必要としない。これは電気的測定の迅速でトラブルのない体制を可能にする。更に、開示の方法は、温度及び雰囲気を制御した環境で実施し得る。これは、研究用細胞に必要な生理学的緩衝液、ガス交換、及び温度の概算を一層正確にする。更に、開示の装置は、電気生理学的記録方法に対する電気的安定性のより多くの程度を提供する。これは、活発に鼓動している心臓筋細胞のような、従来から研究することが難しい細胞の分析を可能にする標準ベンチ−トップ器具の利用を可能にする。更に、開示の装置と方法は種々の化学品、物質、又はリガンドライブラリーの多チャンネル記録と高情報処理スクリーニングを可能にするマルチプレクッス化に理想的に適合している。
【００５２】
実施例
本願発明は以下の実施例で例示されるが、これらによって限定されない。本願を通じて、引用される全ての文献と公開された特許出願の内容はレファレンスでここに合体される。
実施例１
細胞支持膜組成物は、ポリカーボネイトからなり、直径２−５ｍｍ、厚さ１−２０μｍ、直径０．２−２μｍの穴、直径１５−２０μｍの細胞付着部位を有する。直径２ｍｍの細胞支持膜は３８４のウエルミクロタイター板に適合する様に寸法を合わせられる。一方直径５ｍｍの細胞支持膜は、９６のウエルミクロタイター板に適合する様に寸法を合わせられる。細胞支持膜は、膜表面２ｍｍ当たり１０穴の密度で粒子衝撃で穿孔される。細胞支持膜のｃｉｓ 表面上の細胞付着部位はポリ−Ｌ−リジン（０．０１％）で処理され、穴への細胞付着を容易にする。細胞支持膜の残存ｃｉｓ 表面はＣ１８シラン（９９．８％）で処理され、細胞付着部位の外側への細胞付着を阻止する。
【００５３】
実施例２
細胞支持膜組成物は、ミクロタイターウエルに入れられ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３ を含有する電解溶液を細胞支持膜のｃｉｓ 及びｔｒａｎｓ 表面に置く。２つの電極は、最初の電極が細胞支持膜のｃｉｓ 表面に面し、一方第２の電極が細胞支持膜のｔｒａｎｓ 表面に面するように、電解溶液を接触すべく、位置取りされる。これらの電極は細胞支持膜に近接しているヘッドステージプリアンプに結合させる。電圧クランプ、電流クランプ、及びロックインアンプ組成物を細胞支持膜に会合しているヘッドステージプリアンプから離れるように構築する。ロックインアンプ（前記Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ． 参照）が細胞間相互作用、ウイルス細胞相互作用、リガンド−膜相互作用、細胞融合、エンドサイトシス、エクソサイトシス及び細胞リサイクリングのようなプロセスから結果として生じる細胞容量の変化の測定を可能にするよう合体される。ＣＨＯ細胞は、全ての穴が細胞で塞がれる機会を最大限にするために、電解質溶液に再懸濁され、高密度（７０−８０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で細胞支持膜のｃｉｓ 表面に置かれる。細胞支持膜の穴のサイズと密度は、細胞が穴とシールを形成し、電気的にしっかりした連結（５００Ｍ オーム以上）を可能にする。
【００５４】
実施例３
細胞支持膜組成物は実施例１及び２に記載の様にして構築、製造される。１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１０ｎＭ ２０−ヒドロキシロイコトリエンＢ４ （ケモアトラクタント、Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３４２：７９−８５）含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３ を含有する電解溶液を細胞支持膜のｔｒａｎｓ 表面に置く。その２０−ヒドロキシロイコトリエンＢ４が細胞支持膜の穴を通して拡散し、そしてその膜のｃｉｓ 表面の穴での細胞付着を容易にする。ロイコトリエン（上記Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，） を発現しているＣＨＯ−ＧＦＰ１０細胞を細胞支持膜のｃｉｓ 表面に置き、７０−８０％の合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を得る。細胞が穴とシールを形成し、電気的にしっかりした結合を生み出す（５００Ｍ オーム以上）。
【００５５】
実施例４
細胞支持膜組成物は実施例１及び２に記載の様にして構築、製造される。ＣＨＯ細胞は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ グルコース、１．０７−１．１０ｇ／ｍｌ ｐｅｒｃｏｌｌ 含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３ を含有する電解溶液に再懸濁される。再懸濁された細胞が細胞支持膜のｃｉｓ 表面に設置され、７０−８０％ の合流を得る。細胞支持膜のｔｒａｎｓ 表面に接している電極が、穴を通して拡散する１００ｍＶの電圧を供給するために使用される。電界が細胞を誘引し、細胞が穴に付着し、電気的にしっかりした結合を生み出す（５００Ｍ オーム以上）。
【００５６】
実施例５
細胞支持膜組成物は、実施例１、２、３又は４に記載のようにして、構築、製造される。付着細胞でシールされていない穴は、細胞支持膜のｃｉｓ 表面に１Ｕ／ｍｌ 子牛の腸のホスファターゼを添加し、そして細胞支持膜のｔｒａｎｓ 表面に、１６５μｇ／ｍｌ ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェイトｐ−トルイジン塩）と３３０μｇ／ｍｌ ＮＢＴ（ニトロ−ブルーテトラゾリウムクロライド）を添加して、塞がれる。添加された組成物が反応し、穴の内部に沈殿を形成し、そしてその沈殿が穴のチャンネルを通して電流の流出を阻止する。
【００５７】
実施例６
細胞支持膜組成物が、穴のサイズが０．２μｍである、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ から構築される。細胞支持膜ｔｒａｎｓ 表面は、１ｍＭ ソルベント ブルー（Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｂｌｕｅ）１４ （ｏｉｌ ｂｌｕｅ Ｎ） をしみ込ませたポリエステル密閉剤でシールされる。細胞支持膜は、ついで実施例２に記載の様にプロセスされる。ＣＨＯ−ＧＦＰ１０ 細胞が電解質溶液に再懸濁され、懸濁された細胞が細胞支持膜のｃｉｓ 表面に置かれ、７０−８０％の合流を得る。細胞付着に次いで、細胞支持膜のｃｉｓ 表面が転倒構造のＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ 顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ）を用いて観察される。細胞支持膜の穴に接触しているＣＨＯ−ＧＦＰ１０ 細胞が光及び蛍光顕微鏡で確認される。細胞接触穴のｔｒａｎｓ 表面上の密閉剤は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ 顕微鏡装置（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｉｎｃ）の観察下で６３２．８ｎｍ ヘリウム／ネオン レーザーで照射され、除去（ａｂｌａｔｅ）される。
【００５８】
実施例７
細胞支持膜組成物は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔ から構築される。細胞支持膜ｔｒａｎｓ 表面は、細胞支持膜の穴をブロックするセルロース（ｒａｙｏｎ）密封剤で処理される。ＣＨＯ細胞は、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｂｉａｚｏｔｅａ （Ｓ． Ｐａｒｖｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （Ｐｒａｈａ．） ３９：２５１−４）からのカルボキシメチルセルラーゼ遺伝子で形質転換され、それがｐＳ１哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ１）にクローされる。形質転換されたＣＨＯ細胞は、細胞支持膜のｃｉｓ 表面に置かれ、７０−８０％ の合流を得る。細胞が細胞支持膜の穴に付着した場合に、分泌された酵素分子が穴を通して拡散し、セルロース密封剤層と接触、それを消化、そしてそれを除去する。このことが付着細胞の電気的測定を可能にする。
【００５９】
実施例８
ミクロチップ組成物は、シリコンから直径５ｍｍであるように作製され、２５の電極（細胞付着部位当たり１電極）に結合された２５細胞付着部位を含む。ミクロチップのｃｉｓ 表面の細胞付着部位は、直径１５−２０μｍであるように作製され、実施例１で記載のポリ−Ｌ−リジンで処理される。細胞付着部位を囲っているミクロチップのｃｉｓ 表面は、実施例１で記載のＣ１８シランで処理される。電極は、ミクロチップの必須部分として作製されるので、各電極は単一細胞とインターフェイスする。電気伝導トラックのネットワークは、サンドウィッチ製造技術により、ミクロチップの湿潤領域から抽出される。各トラックは適当な外部コネクターで終結され、電気的シグナルの適用と感知を可能にするように、デザインされる。局在化した、電気的抵抗性、及び電気容量性組成物は、合体され、各電極が個々に活性化又は同調されることを可能にする。活性半導体スウィッチング又は整流素子が合体され、電極のアクチブ制御及びスキャンニングを可能にする。ローカルプレ−アムプ 回路が合体され、増強されたシグナルの感知を可能にする。ロック−インアンプ（前記Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ． 参照）が合体され、細胞プロセスから生じる細胞電気容量の変化の測定を可能にする。ロックインアンプ、電流クランプアンプ、及び電圧クランプアンプ組成物は、ミクロチップ組成物と合体したヘッドステージプレアンプから遠くなる様に構成される。ＣＨＯ細胞は、実施例２で記載の電解溶液に再懸濁される。再懸濁化された細胞はミクロチップのｃｉｓ 表面に置かれ、７０−８０％ の合流を得る。ＣＨＯ細胞の付着に次いで、電極は、走査され、細胞が細胞付着部位で高抵抗（０．５Ｇ オーム以上）シールを形成している部位を感知する。
【００６０】
実施例９
ミクロチップ組成物は、実施例８に記載の様にシリコンから作製される。細胞付着部位は、深さが１−５μｍで、実施例２に記載の個々のＣＨＯ細胞を保持するようデザインされた直径１５−２０μｍのピットを含む。
実施例１０
ミクロチップ組成物は、実施例６に記載の様にシリコンから作製される。細胞付着部位は、４００ｍＶの電圧を用いる細胞の電気的浸透化に続く、実施例２に記載の個々のＣＨＯ細胞を浸透するようデザインされた長さ０．５μｍのピンを含む。
本願発明の範囲及び精神から逸脱せずに、上記組成物及び方法の種々の変形が可能であるので、上記の記述に含まれ、添付の図面、又は添付のクレームで定義された全ての主題は、限定的でない例示として解釈されることが意図される。
ここに引用した全ての特許、特許出願、公告論文、本、レファレンス マニュアル、テキスト及び抄録の内容は、本願発明が付随する技術の状態を更に十分に記述するために、それらの全部においてここにレファレンスにより一体化される。
【図面の簡単な説明】
【図１】部屋に設置した多孔性、非伝導性細胞支持膜（ＣＳＭ）の１例を示す。
【図２】付着した細胞で多孔性細胞支持膜表面下側の非伝導性密封層を選択的に破壊するために使用される直立のレーザースキャンニング顕微鏡の１例である。
【図３】１個以上の細胞を独立して、或いは同時に電気的測定をするためにデザインされた３つのミクロチップ形態を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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