(57)【要約】近赤外色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤とを含有する組成物、および試料材料を処理するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
近ＩＲ色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％より多い界面活性剤とを含有する組成物であって、該組成物が約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理において安定である組成物。
【請求項２】
近ＩＲ色素がジイミニウム色素またはシアニン色素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項３】
酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
酵素がポリメラーゼまたはリガーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
界面活性剤が脂肪酸類および多価アルコール類のエステル類、脂肪酸アルカノールアミド類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル類、エトキシル化グリセリド類、ＥＤＴＡとのエトキシル化ブロックコポリマー類、エトキシル化環状エーテル付加物、エトキシル化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシル化アミン付加物、エトキシル化メルカプタン付加物、アルキルフェノール類によるエトキシル化凝縮物、エトキシル化窒素ベース疎水性物質、エトキシル化ポリオキシプロピレン類、高分子シリコーン類、フッ化界面活性剤、重合可能な界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される非イオン界面活性剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
界面活性剤がアルキルアミドベタイン類およびそのアミンオキシド類、アルキルベタイン類およびそのアミンオキシド類、スルホベタイン類、ヒドロキシスルホベタイン類、アンホグリシネート類、アンホプロピオネート類、平衡アンホポリカルボキシグリシネート類、アルキルポリアミノグリシネート類、およびそれらの混合物の群から選択される双性イオン界面活性剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
色素が少なくとも約０．００５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
界面活性剤が約２０質量％以下の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ジヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
基準色素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗酸化剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
近ＩＲ色素が光分解能を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
界面活性剤が抗酸化剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
近ＩＲ色素と；
非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される少なくとも約１質量％の界面活性剤と；
ポリメラーゼ酵素と；
ジヌクレオチド三リン酸と、を含む組成物であって；
ここで前記組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理において安定である、組成物。
【請求項１６】
シアニン色素、ジイミニウム色素、およびそれらの混合物の群から選択される近ＩＲ色素と、少なくとも１質量％の非イオン界面活性剤と、ポリメラーゼ酵素と、ジヌクレオチド三リン酸とを含む組成物であって、ここで前記組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理において安定である組成物。
【請求項１７】
シアニン色素、ジイミニウム色素、およびそれらの混合物の群から選択される近ＩＲ色素と；
脂肪酸類および多価アルコール類のエステル類、脂肪酸アルカノールアミド類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル類、エトキシル化グリセリド類、ＥＤＴＡとのエトキシル化ブロックコポリマー類、エトキシル化環状エーテル付加物、エトキシル化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシル化アミン付加物、エトキシル化メルカプタン付加物、アルキルフェノール類によるエトキシル化凝縮物、エトキシル化窒素ベース疎水性物質、エトキシル化ポリオキシプロピレン類、高分子シリコーン類、フッ化界面活性剤、重合可能な界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される少なくとも約１質量％の非イオン界面活性剤と；
ポリメラーゼ酵素と；
ジヌクレオチド三リン酸と、を含む組成物であって；
ここで前記組成物が約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理において安定である、組成物。
【請求項１８】
約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理における近ＩＲ色素を含む組成物を安定化させる方法であって、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％より多い界面活性剤を組成物に添加するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記組成物が酵素をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素がポリメラーゼ酵素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記界面活性剤が非イオン界面活性剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
加熱処理を行う方法であって、
生体材料と；
近ＩＲ色素と；
非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤と、を含む試料混合物を提供するステップと；
第１の温度よりも高い第２の温度に試料混合物を直接加熱するステップと、を含み；
ここで前記近ＩＲ色素が約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理下に安定である、方法。
【請求項２３】
前記試料混合物を冷却し、熱サイクル処理において前記試料混合物を直接、再加熱するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
水素結合分子を変性させる方法であって、
水素結合分子と、近ＩＲ色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤と、を含む試料混合物を提供するステップと；
前記水素結合分子を変性させるのに有効な第１の温度よりも高い第２の温度に試料混合物を直接加熱するステップと、を含み；
ここで前記近ＩＲ色素が約５０℃と約９５℃との間のサイクルを含む熱サイクル処理下に安定である、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多くの異なる化学的、生化学的、および他の反応には熱サイクルが含まれる。遺伝子増幅の分野における加熱処理の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サンガーシークエンシング等が挙げられるがこれらに限定されない。反応は含まれる材料の温度に基づき増強され、または抑制されうる。試料を個別に処理し、正確な試料／試料相互間の結果を得ることが可能でありうるが、個別の処理は時間がかかり、費用がかかる。
【０００２】
多数の試料を加熱処理する時間および費用を減少させる１つの方法は、１つの試料の異なる部分または異なる試料を同時に処理することができる複数の室を含む装置を用いることである。しかし、複数の反応が異なる室内で行われる場合、１つの重要な問題は室／室相互間の温度の均一性を正確に制御することである。正確な温度制御の必要は、各室内の所望温度を維持する必要として現れるとみられ、または温度の変化、例えば、各室内の温度を所望設定値に上昇または低下させることを含みうる。温度の変化を含む反応においては、各室内で温度が変化する速度またはレートも問題となりうる。例えば、ゆっくりな温度推移は望ましくない副反応が中間温度で生じる場合に問題となりうる。あるいは、急速すぎる温度推移は他の問題の原因となりうる。その結果、遭遇しうる別の問題は、同等の室／室相互間の温度推移レートである。
【０００３】
熱サイクルが必要である反応において遭遇しうる別の問題は、処理全体の全体にわたる速度である。例えば、高低の温度間の複数の推移が必要でありうる。あるいは、３つ以上の所望温度間の種々の推移（上方および／または下方）が必要でありうる。一部の反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、熱サイクルを３０回以上まで反復する必要がある。しかし、室／室相互間の温度の均一性および同等の室／室相互間の温度推移レートの諸問題に取り組むことを試みる典型的な熱サイクル装置および方法は通常、全体にわたる速度の欠如を被り、結果として処理時間が延び、これが最終的に方法のコストを上げることになる。
【０００４】
上記の問題の１つまたは複数は、種々の化学的、生化学的、および他の処理に結びつけられうる。正確な室／室相互間の温度制御、同等の温度推移レート、および／または温度間の急速な推移を必要としうる一部の反応の例としては、例えば、遺伝子コードの解読に役立つ核酸試料の操作が挙げられる。例えば、Ｊ．サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）とＤ．Ｗ．ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、分子クローニング、実験マニュアル第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（２００１年）を参照。核酸操作法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅法；自己保持配列複製（３ＳＲ）などの標的ポリヌクレオチド増幅法；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）などのプローブＤＮＡの増幅に基づく方法；ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの転写に基づく方法；および修復連鎖反応（ＰＣＲ）およびサイクルプローブ反応（ＣＰＲ）などの種々の他の増幅法が挙げられる。
【０００５】
上述した問題のすべてが結びつけられる反応の１つの一般的な例はＰＣＲ増幅である。ＰＣＲを行うための従来の熱サイクル装置では、金属ブロック内の穴に個別に挿入される高分子マイクロキュベットが用いられる。次いで、試料温度は低温と高温、例えば、ＰＣＲ処理用に５５℃と９５℃との間でサイクルされる。従来の方法による従来の装置を用いる場合、熱サイクル装置（一般的に金属ブロックおよび加熱カバーブロックを含む）の高熱質量およびマイクロキュベットに用いられる高分子材料の比較的低い熱伝導性の結果として、処理には通常のＰＣＲ増幅を完了するために２時間、３時間、またはそれ以上の時間を必要とする場合がある。
【０００６】
未加工の試料材料（例えば、血液、組織等）からのヒト、動物、植物、または細菌起源の完成試料（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等などの例えば核酸材料の単離または精製試料）の調製において経験される別の問題は、所望最終生成物（例えば、精製核酸材料）を得るために行う必要がある加熱処理ステップおよび他の方法の数である。ある場合には、ろ過および他の処理ステップのほかに、多くの異なる加熱処理を行って所望完成試料を得る必要がある。
【０００７】
１つの例は、出発試料（例えば、血液、細菌ライセート等など未加工試料）からの完成試料（例えば、精製核酸材料）の調製におけるものである。高濃度で所望材料の精製試料を得るには、例えばＰＣＲ用に出発試料を調製し、その後にＰＣＲ処理を行って所望ＰＣＲ生成物を得る。次いで、ＰＣＲ生成物をシークエンシング、ライゲーション、電気泳動分析等など別の操作にかける。
【０００８】
従来の熱サイクル処理を改善する１つの方法は、電磁放射線、および放射線を吸収し、それを熱エネルギーに変換するエネルギー吸収性色素類の使用を伴う。電磁放射線吸収剤の使用は、酵素の使用を伴う反応に干渉しうる。酵素は非活性化し、それによって所望生成物、例えばＰＣＲ増幅生成物の形成を阻止することができる。したがって、所望反応生成物の形成に対する有害な影響なしに電磁放射線および色素類など吸収剤の使用を可能にする方法が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、酵素、および近赤外（近ＩＲまたはＮＩＲ）色素などの色素の使用を伴う種々の組成物および方法を提供する。このような組成物および方法は、生体材料を含む試料混合物を処理するために用いられることが好ましい。好ましい方法は、電磁エネルギーの適用による生体材料および酵素を含む試料材料の熱サイクルの使用を伴う。色素を用いて電磁エネルギーを熱エネルギーに変換し、界面活性剤を用いて酵素と色素間の相互作用を抑制する（すなわち、減少させ、阻止し、かつ／または逆転する）。本願明細書では、酵素と色素間の相互作用を抑制することは、界面活性剤が存在しない場合の同じ系に比べ相互作用を減少させることを含む。酵素と色素間の相互作用を抑制することは、このような相互作用を発生させること、および／または実質的に完全に逆転することから相互作用を防ぐことを含むことが好ましい。
【００１０】
本発明は、近赤外色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤とを含有する組成物を提供し、ここで組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理において安定である。この組成物は、ポリメラーゼまたはリガーゼである酵素をも含むことが好ましい。
【００１１】
本発明は、近ＩＲ色素、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される少なくとも約１質量％の界面活性剤、ポリメラーゼ酵素、およびヌクレオチド三リン酸を含む組成物も提供し、ここで組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理において安定である。近ＩＲ色素はシアニン色素またはジイミニウム（ｄｉｉｍｍｉｎｉｕｍ）色素であることが好ましい。
【００１２】
本発明の好ましい組成物は、ジイミニウム色素、シアニン色素、およびそれらの混合物の群から選択される近ＩＲ色素、少なくとも約１重量％の非イオン界面活性剤、ポリメラーゼ酵素、およびジヌクレオチド三リン酸を含み、ここで組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理において安定である。
【００１３】
本発明の別の好ましい組成物は、シアニン色素、ジイミニウム色素、およびそれらの混合物の群から選択される近ＩＲ；脂肪酸類および多価アルコール類のエステル類、脂肪酸アルカノールアミド類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル類、エトキシル化グリセリド類、ＥＤＴＡとのエトキシル化ブロックコポリマー類、エトキシル化環状エーテル付加物、エトキシル化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシル化アミン付加物、エトキシル化メルカプタン付加物、アルキルフェノール類によるエトキシル化凝縮物、エトキシル化窒素ベース疎水性物質、エトキシル化ポリオキシプロピレン類、高分子シリコーン類、フッ化界面活性剤、重合可能な界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される少なくとも約１質量％の非イオン界面活性剤；ポリメラーゼ酵素；およびジヌクレオチド三リン酸を含み；ここで組成物は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理において安定である。
【００１４】
本発明は、約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理において近ＩＲ色素を含む組成物を安定化する方法も提供する。この方法は、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される少なくとも約１重量％の界面活性剤を組成物に添加するステップを含む。本願明細書において、重量パーセンテージは組成物の総重量に基づく。組成物は酵素、好ましくは、ポリメラーゼ酵素も含むことが好ましい。界面活性剤は非イオン界面活性剤であることが好ましい。
【００１５】
本発明は、加熱処理を行う方法も提供する。この方法は、生体材料と、近ＩＲ色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤とを含む試料混合物を提供するステップ；および試料混合物を第１の温度よりも高い第２の温度に直接加熱するステップを含み；ここで近ＩＲ色素は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理下に安定である。この方法はさらに、試料混合物を冷却し、熱サイクル処理で試料混合物を直接、再加熱するステップを含む。
【００１６】
さらに別の方法は、水素結合分子を変性させるステップを含むものである。この方法は、水素結合分子と、近ＩＲ色素と、非イオン界面活性剤、双性イオン界面活性剤、およびそれらの混合物の群から選択される約０．５質量％超の界面活性剤とを含む試料混合物を第１の温度で提供し；水素結合分子を変性させるのに有効な第１の温度よりも高い第２の温度に試料混合物を直接加熱するステップを含み；ここで近ＩＲ色素は約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理下に安定である。
【００１７】
本発明と関連して用いられる「加熱処理」（およびそのバリエーション）は、所望反応を得るために試料材料の温度を制御すること（例えば、維持し、上昇させ、または低下させること）を意味する。加熱処理の１つの形態として、「熱サイクル」（およびそのバリエーション）は、所望反応を得るために２つまたはそれ以上の設定値間に試料材料の温度を連続して変更することを意味する。熱サイクルは、例えば、低い方の温度と高い方の温度との間のサイクル、低い方、高い方、および少なくとも１つの中間温度等の間のサイクルを含みうる。
【００１８】
本願明細書で用いられる試料材料を「直接」加熱するということは、外部源（例えば、加熱容器）からの熱エネルギーの移動時に加熱するのとは反対にその内部から加熱することを意味する。
【発明の効果】
【００１９】
色素を含有する組成物は、その色素が対照、すなわち熱サイクル処理にさらされていない同じ組成物に対して約２０％以下の吸光度の低下を示す場合は、（界面活性剤の存在により）熱サイクル処理において「安定」である。
【００２０】
本発明の方法および組成物のこれらおよび他の特徴や利点を本発明の例示的および好ましい実施形態に関して、以下に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、近赤外（近ＩＲまたはＮＩＲ）色素などの色素、および界面活性剤の使用を含む種々の組成物および方法を提供する。一部の実施形態には色素および界面活性剤と併せて酵素の使用が含まれる。このような組成物および方法は、生体材料を含む試料混合物（好ましくは、流体試料）を処理するために用いられることが好ましい。本発明の好ましい実施形態は、加熱処理を伴う方法、例えば、ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己保持配列複製、酵素動態試験、均質リガンド結合アッセイのほか、酵素を使用し、正確な熱制御および／または急速な熱変動を必要とするさらに複雑な生化学的または他の処理など、ポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素の使用を伴う高感度化学処理を伴う方法を提供する。これらの方法は、急速かつ正確な電磁エネルギーベースまたはエネルギー由来の試料材料の加熱処理を促進する近赤外色素などの吸収性色素類の使用を含む。
【００２２】
通常、電磁エネルギーを熱エネルギーに変換するために用いられる吸収性色素類は、酵素反応において不活性ではない。有利には、界面活性剤（または界面活性剤類の混合物）、好ましくは非イオンまたは双性イオン界面活性剤、およびより好ましくは、非イオン界面活性剤を用いて、酵素（または酵素類の混合物）と色素（または色素類の混合物）との間の相互作用を抑制することができる。本願明細書で用いられる酵素と色素との間の相互作用を抑制することには、界面活性剤が存在しない場合の同じ系と比べた相互作用を減少させることを含む。好ましくは、酵素と色素との間の相互作用の抑制は、このような相互作用を発生させ、および／または実質的に完全に逆転することから相互作用を防ぐことを含む。
【００２３】
通常、電磁エネルギーを熱エネルギーに変換するために用いられる吸収性色素類、特に近ＩＲ色素類は、加熱処理（例えば、熱サイクル処理）において安定ではない。有利には、界面活性剤（または界面活性剤類の混合物）、好ましくは非イオンまたは双性イオン界面活性剤、およびより好ましくは、非イオン界面活性剤を用いて、約５０℃と約９５℃との間のサイクル（好ましくは、少なくとも約１０サイクル、およびより好ましくは少なくとも約４０サイクル）を含む熱サイクル処理における近ＩＲ色素を含有する組成物を安定化することができる。好ましくは、近ＩＲ色素はジイミニウム色素またはシアニン色素である。
【００２４】
本発明の一般的な方法は、流体（例えば、液体）試料混合物、好ましくは生体材料を含むものなど試料混合物の加熱処理を含む。これらの方法は一般に第１の温度（好ましくは、約０℃〜約５０℃の範囲内、より好ましくは、約２０℃〜約５０℃の範囲内）で試料混合物を提供し、第１の温度よりも高い第２の温度（好ましくは、約５０℃〜約９５℃の範囲内）に試料混合物を直接加熱するステップを含む。これらの方法は、試料混合物を冷却し、好ましくは少なくとも約２５サイクルを含む熱サイクル処理で試料混合物を直接、再加熱するステップをさらに含むことが好ましい。
【００２５】
従来の系では、容器を包囲する媒体（例えば、空気、アルミニウムブロック、流体）を加熱することによって試料混合物を加熱する。対照的に、本発明の方法は、以下の利点の１つまたは複数を提供する：周囲の容器を必ずしも加熱することなく流体混合物が直接加熱される非接触加熱；熱勾配を最小限にし、支持構造物または加熱要素類（例えば、抵抗性加熱要素類、熱電モジュール類等）を不要にするために吸光係数を修正する能力；および加熱ブロックとの十分な接触または整合が不要であり、ブロックの特性（例えば、寸法、材料特性、伝導率、幾何構造）が本質的に重要ではない。さらに、「加熱要素」は溶液中にあるため、局部加熱は周囲構造物を必ずしも加熱することなく急速に起こりうる。また、周囲の構造物は加熱されないため、拡散によって流体区画からの熱の除去を促進する。追加の利点は、溶液中の近ＩＲ吸収剤の濃度を調整することによって加熱速度を制御できることである（次に、これにより流体区画内に吸収されるエネルギーの量の調節が可能となる）。同様に、吸収剤の濃度を調節し、ウェル内に起こる熱勾配を最小限にすることができる。色素の波長最大値は特定化することができるため、色素の最大限の吸収波長を非接触加熱するための大きな選択肢の光源（白色光、ＵＶ光、近ＩＲレーザー）を利用することができる。
【００２６】
最近の刊行物により、おそらく光の近ＩＲ内容を用いてウォーターバンドを加熱する白色光を用いて流体を直接加熱するプロトタイプ系が示されている。これらの系においては、吸収係数を特定化することができないため、加熱の最適化（急速な最小限の熱勾配）が困難である。
【００２７】
高濃度の吸収性色素類によって不利な影響を受けることがある代表的な酵素類としては、ポリメラーゼ類、制限エンドヌクレアーゼ類、および修飾酵素類（アガラーゼ類、グリコリザース類（ｇｌｙｃｏｌｙｓａｓｅｓ）、キナーゼ類、リガーゼ類、メチラーゼ類、ヌクレアーゼ類、プロテアーゼ類、逆転換酵素類、トピソメラーゼ類（ｔｏｐｉｓｏｍｅｒａｓｅｓ）、および転移酵素類）が挙げられるが、これらに限定されない。酵素はポリメラーゼまたはリガーゼであることが好ましく、より好ましくは、ポリメラーゼであり、その例は当業者には周知である。
【００２８】
上述した酵素類の多くは高濃度の吸収性色素類によって不利な影響を受けるが、一部の酵素類は不利な影響を受けることはない。酵素が色素によって不利な影響を受けることがないような組合せのために、本願明細書に記載された界面活性剤の使用は色素と酵素との間の不利な相互作用を減少させ、阻止し、および／または逆転するために必ずしも必要ではないが、しかし、界面活性剤はそれでもやはり色素の熱分解に関して利点を提供しうる。
【００２９】
本発明の方法に有利に用いることができる適切な吸収性色素類としては、好ましくは、少なくとも約４００ｎｍの波長、より好ましくは、少なくとも約７００ｎｍの波長、最も好ましくは、少なくとも約７８０ｎｍの波長でエネルギーを吸収するものが挙げられる。本発明の方法において有利に用いることができる適切な吸収性色素類としては、好ましくは、約２０００ｎｍ以下の波長、より好ましくは、約１３００ｎｍ以下の波長、および最も好ましくは、約１０００ｎｍ以下の波長でエネルギーを吸収するものが挙げられる。電磁スペクトルのこれらの部分としては、可視部分および近赤外（近ＩＲ）部分が挙げられる。他の適切な吸収性色素類としては、蛍光色素類が挙げられる。色素は近ＩＲ色素（例えば、シアニン色素またはジイミニウム色素）、紫外／可視（ｕｖ／ｖｉｓ）色素（例えば、ジクロロフェノール、インドフェノール、サフラニン（ｓａｆｆｒａｎｉｎ）、クリスタルバイオレット、および市販の食品着色料）、蛍光色素（例えば、オリグリーン（ｏｌｉｇｒｅｅｎ）、またはそれらの混合物であることが好ましい。色素は近ＩＲ色素であることがより好ましい。近赤外（近ＩＲまたはＮＩＲ）領域は通常、約７００ｎｍ〜約２０００ｎｍであり、約７８０ｎｍ〜約１３００ｎｍの領域が特に重要である。
【００３０】
適切な吸収性色素類のクラスとしては、アクリジン色素類、キサンテン色素類、キノン−イミン色素類、アントラキノン色素類、カルテノイド色素類、ニトロ色素類、ジアゾニウム色素類、テトラゾリウム色素類、およびジアリル・トリアリルメタン色素類が挙げられる。ＮＩＲ色素類（すなわち、ＮＩＲ吸収剤）のクラスとしては、ニトロソ色素類、シアニン色素類、ニグロシン色素類、トリフェニメタン色素類、イミニウム色素類、ジイミニウム色素類、スクアリリウム（ｓｑｕａｒｉｌｉｕｍ）色素類、クロコニウム色素類、ニッケルジチオレン色素類、キノン色素類、フタロシアニン色素類、アゾ色素類、インドアニリン色素類、イオウ含有色素類、バット（ｖａｔ）色素、などが挙げられる。適切な色素類の特殊な例としては、メチレンブルーチアジン色素類、サフラニン−キノンイミン色素類、クリスタルバイオレット−トリアリルメタン色素類、ジクロロフェノールインドフェノール−キノンイミン色素類、および表１に記載したもの等が挙げられるが、これらに限定されない。色素はシアニン色素またはジイミニウム色素であることが好ましい。
【００３１】
本発明の組成物および方法においては、電磁エネルギーの適用時に組成物を加熱するのに有効な量で色素（または色素類の混合物）が用いられる。この量は組成物中の他の成分によって変動する。通常、このような色素類は、０．００５ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）色素以上の量で用いた場合には酵素反応に不利な影響を及ぼすことがある。有効な加熱のためには、色素が少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で反応混合物中に存在することが好ましい。
【００３２】
色素類は使用前に簡単に水性混合物として調製されることが好ましい。ある場合には、１週間以上保存された色素類の水溶液は、酵素の不活性化に関して界面活性剤の添加による利点を示すことはないが、界面活性剤は色素の熱分解を抑制しうる。しかし、界面活性剤に添加し、同じ時間保存すると、色素の水溶液は界面活性剤の添加による利点を示す。したがって、色素による酵素不活性化の有効な抑制のためには、新しく調製した水溶液を使用することが望ましい場合が多い。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
本発明の組成物および方法の一部の実施形態において利点を提供する適切な界面活性剤としては、所望生成物（例えば、ＰＣＲ生成物）を形成できるように、色素と酵素との間の相互作用を少なくとも減少させるものが挙げられる。界面活性剤が実質的にこのような相互作用を阻止し、かつ／またはこのような相互作用を逆転することが好ましい。本発明の組成物および方法の一部の実施形態において利点を提供する他の適切な界面活性剤類としては、色素を安定化するものが挙げられる。好ましい界面活性剤としては、非イオン界面活性剤および双性イオン界面活性剤が挙げられる。
【００３５】
非イオン界面活性剤の例としては、脂肪酸類および多価アルコール類のエステル類、脂肪酸アルカノールアミド類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪酸類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化脂肪アルコール類、エトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル類、エトキシル化グリセリド類、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）とのエトキシル化ブロックコポリマー類、エトキシル化環状エーテル付加物、エトキシル化アミドおよびイミダゾリン付加物、エトキシル化アミン付加物、エトキシル化メルカプタン付加物、アルキルフェノール類によるエトキシル化凝縮物、エトキシル化窒素ベース疎水性物質、エトキシル化ポリオキシプロピレン類、高分子シリコーン類、フッ化界面活性剤、重合可能な界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。フッ化界面活性剤の例としては、ＦＬＵＯＲＡＤ−ＦＳ  ３００の商品名（ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチャリング・カンパニー（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏ．）（ミネソタ州、セントポール）およびＺＯＮＹＬの商品名（デュポン・ド・ヌムール・カンパニー（Ｄｕｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏ．）（デラウェア州、ウィルミントン）で入手可能なものが挙げられる。重合可能な（反応性）界面活性剤の例としては、ＳＡＭ  ２１１（ＭＡＺＯＮの商品名（ＰＰＧインダストリーズ株式会社（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（ペンシルベニア州、ピッツバーグ）で入手可能な硫酸アルキレンポリアルオキシ界面活性剤）が挙げられる。双性イオン界面活性剤の例としては、アルキルアミドベタイン類およびそのアミンオキシド類、アルキルベタイン類およびそのアミンオキシド類、スルホベタイン類、ヒドロキシスルホベタイン類、アンホグリシネート類、アンホプロピオネート類、平衡アンホポリカルボキシグリシネート類、およびアルキルポリアミノグリシネート類が挙げられる。タンパク質類は、ｐＨによって電荷され、または無電荷される能力を有し；したがって、適切なｐＨでは、好ましくは、約８〜９のｐＩ（ｐＨ）によって、化工ウシ血清アルブミンまたはキモトリプシノーゲンなどのタンパク質は、双性イオン界面活性剤として機能しうる。具体的な例としては、以下の表２に示したものが挙げられる。望まれる場合は、界面活性剤の種々の混合物を用いることができる。
【００３６】
界面活性剤は、所望結果（例えば、酵素の不活性化を抑制し、または色素を安定化する）を得るのに有効な量で用いられる。界面活性剤は、少なくとも約０．５質量％、より好ましくは、約０．５質量％超、さらにより好ましくは、少なくとも約１質量％、および最も好ましくは、約１質量％以上で用いられることが好ましい。色素と酵素との間の相互作用を有効に減少させるために、好ましくは、約２０質量％以下、より好ましくは、約４質量％以下の界面活性剤が必要とされる。かかるパーセンテージは通常、試料混合物の体積当たりの質量に基づく。
【００３７】
【表２】
2004525644.tif 000003
【００３８】
任意選択で、かつ好ましくは、本発明の組成物および方法において有利にラジカルスカベンジャー類を用いることができる。通常、連続的なサイクルは色素の退色化をひき起こし（例えば、酸化または分解の結果）、その色を失い、したがって、電磁放射線の吸収におけるその効率を失う。これは（近ＩＲ吸収が望ましくは破壊され、その結果として近ＩＲタグにより標識されたＤＮＡ／ＲＮＡからの蛍光シグナルを問い合わせる能力となる場合など）有利に用いることができるが、一般には望ましくない。抗酸化剤などラジカルスカベンジャーの使用が色素のこの光分解（すなわち、光学的分解）を抑制しうることが見出されている。
【００３９】
適切な抗酸化剤類としては、アノキソマー（ａｎｏｘｏｍｅｒ）、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキノン、乳酸カルシウム、クエン酸、クローバエキス、コーヒー豆エキス、ジラウリルチオ二プロピオン酸塩、二ナトリウムＥＤＴＡ、没食子酸ドデシル、エデト酸、エリトロビン酸（ｅｒｙｔｈｒｏｂｉｃ  ａｃｉｄ）、６エトキシ−１，２−ジヒドロ−２，２，４−トリメチルキノリン、ユーカリノキエキス、フマル酸、没食子酸、ゲンチアナエキス、グアヤク脂、ｎ−へプチル−ｐ−オキシ安息香酸塩、へプチルパラベン、へスペルスチン（ｈｅｓｐｅｒｓｔｉｎ）、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジ−ｔ−ブチルフェノール、クエン酸イソプロピル、レシチン、ノルジヒドログアイレ酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、没食子酸オクチル、オリザーノール、ホスファチジルコリン、ピメントエキス、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、プロピレングリコール、アブラナ油、米ぬかエキス、セージエキス、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｒｔａｒａｔｅ）、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一スズ、ショ糖、トコフェロール、トリヒドロキシブチロフェネンのほか、ビタミンＡおよびその誘導体類、ビタミンＣおよびその誘導体類、ビタミンＥおよびその誘導体類、フェノール類およびヒンダードフェノール類、植物エキス、没食子酸および誘導体類、キニーネ類、およびレシチン類が挙げられるが、これらに限定されない。２５マイクロリットル反応中の少なくとも約５マイクログラム（すなわち、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ）の添加により色素が退色から保護されることが好ましい。
【００４０】
ある場合には、界面活性剤と色素は同一でありうる。例えば、色素分子をポリエチレングリコールのような親水性鎖に共有結合的に付着しうる。これにより界面活性剤状の特性を有する分子が得られる。あるいは、色素を直接界面活性剤分子に共有結合的に付着しうる。
【００４１】
ある場合には、界面活性剤と抗酸化剤は同一でありうる。例えば、ビタミンＥ（疎水性）などの抗酸化剤をポリエチレングリコールなどの親水性部分に付着することができる。このような化合物の例がビタミンＥ−ＴＰＧＳ（コハク酸トコフェロールポリエチレングリコール）であろう。
【００４２】
本発明の組成物および方法に包含しうる他の薬剤類としては、緩衝剤、基準色素、および他のＰＣＲ反応剤類が挙がられ、これらは以下でさらに詳細に述べられる。適切な緩衝剤類は通常、ｐＨが８〜９であるトリス−ＨＣｌなど、約４〜約９のｐＨを有する。適切な基準色素類としては、ＲＯＸ（カルボキシローダミン）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレシエン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｅｎ））、および蛍光色素であるテキサスレッドが挙げられる。このような基準色素類は通常、加熱目的（例えば、上述したＮＩＲ色素類）に用いられる色素類よりも低い濃度で用いられる。
【００４３】
方法は種々の装置において用いることができるが、好ましい装置の種々の例示的な実施形態が２０００年６月２８日に出願され、加熱処理装置および方法と称する米国特許出願第６０／２１４，５０８号に記載されている。他の有用な装置構成物は、例えば、２０００年１１月１０日に出願され、試料処理装置の遠心充填と称する米国特許出願第０９／７１０，１８４号に見出すことができる。
【００４４】
特異的装置にかかわらず、処理室内の流体試料（例えば、溶液）を（望まれる場合は）選択された波長の電磁エネルギーによって問い合わせることができる。適切な電磁エネルギーは、処理室源内の流体（例えば、溶液）を直接加熱する電磁エネルギー源によって供給され、装置から離れていること、すなわち装置上に配置されていないことが好ましい。一部の適切な電磁エネルギー源の例としては、レーザー類、広帯域の電磁エネルギー源（例えば、白色光）等が挙げられるが、これらに限定されない。電磁エネルギー源は種々の因子、例えば、試料材料の所望温度、各処理室から熱エネルギーを除去する速度、温度変化の所望速度、処理室が反射成分等を含むかどうかに基づき連続的に、または断続的に供給することができる。電磁エネルギー源がサイクルされ、または変動する場合は、整合系を用いて選択された量のエネルギーを選択された処理室に送達し、流体源、例えば、加圧空気または他の適切な流体の形で任意選択の追加の温度制御機構を装置の表面に方向づけることができる。これらは２０００年６月２８日に出願され、加熱処理装置および方法と称する米国特許第６０／２１４，５０８号で考察されている。
【００４５】
電磁吸収性色素（例えば、近赤外、可視色素）などの電磁エネルギー受容性材料を用いる利点は、装置内の試料材料を装置との物理的接触の非存在下に、容器を直接加熱することなく加熱することができることである。例えば、電磁エネルギー受容性が高周波（ＲＦ）放射線に対して感受性である場合は、処理室がＲＦ域内に所望加熱を得るために十分な時間常駐しているように回転させることができる。同様の非接触加熱は、マイクロ波放射線等で得ることができる。しかし、電磁放射線が提供される形態は試料材料および処理室内に配置された所望反応と適合性であるべきと理解されよう。
【００４６】
本願明細書に記載された方法は、装置の処理室に含まれる試料の熱サイクルを必要とする種々の異なる処理において用いることができる。一部のこのような処理の例は、試料の化学反応、例えば、核酸増幅を含む。例えば、試料をポリヌクレオチド、ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、ヌクレオシド三リン酸、試料ポリヌクレオチドとハイブリッド形成可能な第１のプライマー、およびポリヌクレオチドに対して相補的な配列とハイブリッド形成可能な第２のプライマーと混合することができる。必要な試薬の一部または全部が製造された装置内に存在してもよく、それらを試料導入直前の処理室に充填し、または処理室に充填する前に試料と混合することができる。
【００４７】
ＰＣＲによるポリヌクレオチド増幅は本願明細書で最も詳しく記載されているが、それらを用いる装置および方法は、加熱処理における色素類（および好ましくは、酵素類）の使用を含む種々の他の系、特にポリヌクレオチド増幅反応、リガンド結合アッセイ、または水素結合分子の変性を含むものに用いることができる。
【００４８】
好ましい反応は、ＰＣＲなど、交互の上下の温度間で熱サイクルすることができ、または単一の温度で、例えば、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を行うことができる。各反応では、ＤＮＡリガーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、および／または逆転写酵素類等を含めて種々の増幅試薬類や酵素類を用いることができる。本発明の方法を用いて行うことができるポリヌクレオチド増幅反応としては、ａ）自己保持配列複製（３ＳＲ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの標的ポリヌクレオチド増幅法；ｂ）「分岐鎖」ＤＮＡ増幅など、標的ポリヌクレオチドに付着したシグナルの増幅に基づく方法；ｃ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）などのプローブＤＮＡの増幅に基づく方法；ｄ）ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの転写に基づく方法；およびｅ）修復連鎖反応（ＰＣＲ）およびサイクルプローブ反応（ＣＰＲ）などの種々の他の増幅法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の装置および方法のために可能な使用法のうちＰＣＲはそのような使用法の重要な１つであるが、本発明はＰＣＲ増幅に限定されるものではないことを理解すべきである。ＰＣＲは、増幅される変性分子の領域のフランキング能力、および遊離デオキシヌクレオシド三リン酸類（ｄＮＰＴｓ）の存在下にポリメラーゼ酵素（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなど）の作用によってプライマーからのヌクレオチドの添加による核酸分子の拡張能力を有する過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてきわめて少量の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の分析が可能であり、その結果として出発標的核酸分子の二重複製が生じる。核酸分子は再び変性するように加熱処理され、処理はＰＣＲ増幅生成物（ＰＣＲ単位複製配列とも呼ばれる）を形成するように反復される。
【００５０】
一部の実施形態では、特異的装置の製造中に処理室内にＤＮＡプライマーおよびプローブが提供される。次いで、ＤＮＡ標的試料が処理室に導入され、ＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅を行う。標的試料としては、例えば、標的ＤＮＡ、緩衝剤、およびポリメラーゼ酵素が挙げられる。
【００５１】
標的試料が（処理室に前充填されたプライマーおよびプローブを含有する）処理室に分配された後、各処理室内の材料の温度を選択された基礎温度（例えば、６０℃）に上昇させ、ＰＣＲ増幅を開始することができる。レーザーまたは他の電磁エネルギーを用いて各処理室内の試料材料の温度を、例えば、ＤＮＡの変性が起こる高い標的温度に上昇させることができる。
【００５２】
標的温度に達した後、試料材料は基礎温度に戻される。これは種々の方法によって行うことができる。本発明の１つの方法では、装置が回転すると対流性冷却によって基礎温度に達することができる。対流性冷却のみ、または流体ジェット等を衝突させる基礎プレートを用いる伝導性冷却と組み合せて、試料材料の急速な冷却を供給した後、急速に加熱して標的温度まで戻すことが好ましい。急速な加熱および冷却は、所望数の熱サイクルを比較的短い時間で完了することができるという点で有利である。本願明細書に記載した方法は、ＰＣＲまたは他の方法に関係なく、熱サイクル処理が好ましくは少なくとも約２５サイクルを含み、好ましくは約５０℃と約９５℃の温度間での加熱を含むことが好ましい。
【００５３】
好ましい方法は、２０００年６月２８日に出願され、加熱処理装置および方法と称する米国特許出願第６０／２１４，５０８号に示されているような複数の処理室アレイを有する装置の使用を含む。各処理室アレイは、（遠心力が室から室へ連続して流体を移動させることができるように）装置上に好ましくは略放射状に配置された多数の室を含む。各アレイ内の室は、一部の実施形態では、必要に応じて移動を制御する弁構造物を含みうるチャネル類または導管類を用いて流体連通されている。
【００５４】
このような装置を用いて、出発試料材料、例えば、溶解血球が充填室に提供される。充填室から第１の処理室へ移動するときに出発試料材料をろ過するフィルタが提供されることが好ましい。第１の処理室は、供給されているとおり、例えば、各室内でふいて乾かされる適切なＰＣＲプライマーを含むことが好ましい。各室は、出発試料材料で行われる調査の性質によって同じプライマーまたは異なるプライマーを含みうる。試料を充填する前に処理室にプライマーを提供する１つの代替案は、（存在する場合は、フィルタをプライマーが通過することが可能であるという条件で）出発試料材料を有する充填室に適切なプライマーを添加することである。
【００５５】
出発試料材料および必要なプライマーを処理室に配置した後、処理室内の材料は選択された遺伝子材料のＰＣＲ増幅に適した条件下に熱サイクルされる。
【００５６】
ＰＣＲ増幅法の完了後、第１処理室のそれぞれにおける材料を別のフィルタ室（各処理室用に１つのフィルタ室）を通じて移動させ、増幅材料、例えば、ＰＣＲプライマーから望ましくない材料、フィルタ等によって除去されない出発材料内の望ましくない材料を除去することができる。フィルタ室は、例えば、浸透ゲル類、ビード類等（例えば、アマシャム・ファルマシア・バイオテク株式会社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）（スウェーデン、ウプサラ）より入手可能なマイクロスピンまたはセファデックス）などのサイズ排除物質を含有しうる。
【００５７】
フィルタ室内の試料材料の浄化後、第１の処理室のそれぞれからろ過されたＰＣＲ増幅生成物は、例えば、第２の処理室内で遭遇される熱状態の適切な制御を通じて第１の処理室内で増幅される遺伝子材料のサンガーシークエンシングのために一対の多重第２処理室に移動される。
【実施例】
【００５８】
本発明の対象および利点をさらに以下の実施例によって説明するが、これらの実施例に開示された特定の材料およびその量のほか、他の条件および詳細は本発明を過度に制限すると解釈すべきではない。
【００５９】
実施例１：ＮＩＲ色素および界面活性剤を含有する混合物の調製
通常、水に不溶性の近赤外色素（ＮＩＲ色素）５ミリグラム（ｍｇ）の新鮮原液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５０マイクロリットル（μＬ）中に溶解し、水中で最終体積を１ミリリットル（ｍＬ）とした。次いで、これを種々の濃度の色素に希釈した。次いで、希釈色素（通常、０．２ｍｇ／ｍＬ）を界面活性剤溶液（通常、４質量％）に添加し、複合物を形成した。この複合物をＰＣＲ反応に添加した。試験した色素類および界面活性剤類をそれぞれ表１および表２に示す。
【００６０】
実施例２：界面活性剤の存在下でのＰＣＲ生成物の形成
アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製のプライマー発現プログラム、およびＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼ反応混液（アプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォースターシティ）より市販）を用いてデザインされ、サーモサイクラー（９７００、アプライド・システムズ社）でサイクルされたＰＥＲＶプロテアーゼフラグメント、フォワードプライマー、およびリバースプライマーを含有するプラスミドを用いたブタ内因性レトロウイルスのゲノムのプロテアーゼ領域における保存配列（３２７ｂｐ）用にＰＣＲ反応を構成した。ＰＣＲ反応は通常、２５μＬの量で行った。ＮＩＲ色素／界面活性剤混合物をＰＣＲ反応混液に添加し、総量２５μＬで色素および界面活性剤の所望濃度を得た。通常のＰＣＲ反応混液は１０倍の緩衝剤、２．５μＬ；ｄＮＴＰｓ、２．０μＬ（それぞれ２００μＭ）；フォワードプライマー、０．５μＬ（２００ｎＭ）；リバースプライマー、０．５μＬ（２００ｎＭ）；テンプレートＤＮＡ、１．０（１ｎｇ／μＬ）；Ａｍｐｌｉｔａｑ、０．２５μＬ（１．２５単位）；滅菌水、１８．２５μＬを含有する。
【００６１】
臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上にＰＣＲ反応の生成物を移動させ、ＡＬＰＨＡ  ＩＭＡＧＥＲ（アルファ・イノテック社（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ）（カリフォルニア州、サン・レアンドロ）を用いて視覚化した。例えば、最初の実験では、色素７８５ＷＳについて０．００５ｍｇ／ｍＬ以上の最終色素濃度がＰＣＲを抑制することがわかった。しかし、有効な加熱のためには高濃度の色素（０．１ｍｇ／ｍＬ）が必要であった。したがって、その後のＰＣＲ実験すべてには、０．１ｍｇ／ｍＬ以上の色素濃度を用いた。色素／界面活性剤の混合物とのＰＣＲ反応の結果は、色素のみはＰＣＲを抑制するが、界面活性剤の添加はＰＣＲの活性を回復することを示した。異なるメーカー（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）（ウィスコンシン州、マジソン）；ロシュ・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社（インディアナ州、インディアナポリス）；エッペンドルフ、サイエンティフィック株式会社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）（ニューヨーク州、ウェストベリー）；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社（ミズーリ州、セントルイス））のＴａｑポリメラーゼを試験し、すべてのＴａｑポリメラーゼは７８５ＷＳおよびＳＤＡによって抑制された。界面活性剤（ＰＬＵＲＯＮＩＣまたはＴＷＥＥＮ）の添加により酵素の活性が回復した。
【００６２】
ＳＤＡ８０８０（０．２ｍｇ／ｍＬ）および７８５ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）に対するＴａｑＭａｎプローブまたはＳｙｂｒグリーンを用いた定量ＰＣＲの結果は、色素のみはアッセイを抑制するが、界面活性剤、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７またはＴＷＥＥＮ−２０の添加は両方の場合でアッセイの活性を回復することを示した。この実験は、色素／界面活性剤の混合物がＴａｑＭａｎプローブの蛍光測定、およびポリメラーゼ活性に加えてＴａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に干渉しないことを示した。
【００６３】
ＮＩＲ色素（７８５ＷＳおよびＳＤＡ８０８０）によるＰＣＲに対する界面活性剤の最適な濃度を見出すために、ＰＣＲ反応における界面活性剤の濃度を０．１重量％〜４重量％で変動させた。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザーＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント株式会社（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ）（カリフォルニア州、パロアルト））における２１００ＤＮＡ７５００ラブチップ（Ｌａｂｃｈｉｐ）キットを用いて、形成されたＰＣＲ生成物を定量化した。表３に示した結果は、色素に対して界面活性剤の濃度を上昇させることによりＰＣＲ生成物の形成が補助されることを示している。
【００６４】
【表３】
2004525644.tif 000004
【００６５】
【表４】
2004525644.tif 000005
【００６６】
実施例３．酵素と色素との間の相互作用は界面活性剤を用いて可逆性となる。
ＮＩＲ色素によるＰＣＲの抑制の理由を理解するために、２つの別々の実験を行った。第１の実験（実施例３Ａ）では、Ｔａｑポリメラーゼを室温で２５分間、７８５ＷＳ色素（４０マイクログラム（μｇ））と相互作用させた。第２の実験（実施例３Ｂ）では、テンプレートＤＮＡを同じ条件下に同じ色素と相互作用させた。両方の実験において、溶液をＣＥＮＴＲＩＳＥＰカラム（プリンストン・セパレーションズ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）社（ニュージャージー州、アデルフィア））に通過させることによって酵素またはＤＮＡから色素を除去した。次いで、ＴａｑポリメラーゼまたはテンプレートＤＮＡを実施例２に記載したＰＥＲＶプロテアーゼフラグメントを増幅するために別々の反応（２５μＬ）で用いた。ＰＣＲ反応混液中の最終色素濃度を１．６ｍｇ／ｍＬとした。実施例３ＡにおけるＰＣＲ法の結果は、Ｔａｑポリメラーゼが色素に曝露されることによって不活性化し、その結果として増幅が生じないことを示した。実施例３Ｂから、ＰＣＲ法の結果は、テンプレートからの色素の除去の結果として期待されるフラグメントの増幅が生じるため、色素がＤＮＡテンプレートに対する影響を有さないことを示した。上記の実験から、酵素が色素によって抑制されていることは明らかであった。別々の実験において、ＴａｑポリメラーゼをＮＩＲ色素（７８５ＷＳについては０．２ｍｇ／ｍＬ、ＳＤＡ８０８０については０．３ｍｇ／ｍＬ）と１５分間、室温下に反応させ、異なる界面活性剤（４質量％）を含有するＰＣＲ反応混液に酵素／色素混合物を添加した。実施例２に記載したようにＰＥＲＶプロテアーゼフラグメントを増幅するように反応を構成し、反応の生成物をアガロースゲル電気泳動法によって分析した。ＰＣＲ法の結果は、酵素に対する色素の影響が界面活性剤の添加によって可逆性であることを示した。ＰＣＲ生成物の量は対照と同等であった。
【００６７】
実施例４：ＲＮＡポリメラーゼ活性は界面活性剤の添加によって回復する。
Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを含有する線形化プラスミドテンプレートを用いたＴ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（エピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（ウィスコンシン州、マジソン）を用いてＲＮＡポリメラーゼ反応を構成した。メーカーの指示に従って試薬を用いた。反応生成物は１％アガロースゲル上にあり、結果は、ＮＩＲ色素７８５ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）は両方の酵素の活性を抑制するが、界面活性剤（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  ４質量％）の添加は酵素活性を回復することを示した。色素ＳＤＡ８０８０は、０．２ｍｇ／ｍＬでは両方の酵素の活性を抑制することはなかった。
【００６８】
実施例５：ＤＮＡリガーゼ活性は界面活性剤の添加によって回復する。
線形化プラスミドテンプレート（ｐＥＴ２１ａ、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社（ウィスコンシン州、マジソン））およびＤＮＡインサートを用いたＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）株式会社（メリーランド州、ゲイザーバーグ））を用いてＤＮＡライゲーション反応を構成した。メーカーの指示に従って試薬を用いた。大腸菌ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞をライゲートされた生成物で形質転換し、形質転換された細胞を適切な抗生物質（５０ｍｇ／ｍＬでのアンピシリン）を有するＣｌｏｎｄｉｓｃ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社（カリフォルニア州、パロアルト））上にプレーティングした。プレートを３７℃で１６時間〜１８時間インキュベーションした後、結果として生じるコロニー数を計算し、ミニプレップおよび制限消化によってプラスミドを分析した。ＮＩＲ色素７８５ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびＳＤＡ８０８０（０．２ｍｇ／ｍＬ）は、色素を含有するライゲーション混合物でプレーティングしたプレート上にコロニーが検出できなかったため、リガーゼ活性を抑制した。界面活性剤（７８５ＷＳについては４質量％ＰＬＵＲＯＮＩＣ、ＳＤＡ８０８０については４重量％ＴＷＥＥＮ−２０）の添加は、対照ライゲーション混合物（界面活性剤を含有し、または含有しない）および色素／界面活性剤の組合せを含有するライゲーション混合物においてほぼ同じ数のコロニーが確認されたため、リガーゼの活性を回復した。また、これらのプレートから単離されたプラスミドのすべては、制限消化およびＤＮＡシークエンシングによって検証されるように同じインサートを含有した。
【００６９】
ライゲーション混合物による形質転換およびプレーティングのほか、プラスミドテンプレート上のインサートＤＮＡをフランキングするプライマー（Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマー、ノバジェン）を含有するＰＣＲ反応におけるＤＮＡテンプレートとしてライゲートされた生成物を用いた。ＰＣＲ後、反応生成物を１％アガロースゲル上に移動させ、結果は、期待されるＤＮＡフラグメントの存在が、対照のライゲーション混合物および色素／界面活性剤の組合せを含有するライゲーション混合物からは示されたが、色素のみ（７８５ＷＳまたはＳＤＡ８０８０）を含有する混合物からは示されなかった。
【００７０】
実施例６：界面活性剤の添加による種々の色素の利点
種々の色素類（ＩＲ７８２、ＩＲ７６８、ＳＤＡ２１４１、ＳＤＡ８３２７、ＩＲ８３０ＷＳなどのＮＩＲ色素、オリゴグリーンのような蛍光色素類、およびジクロロフェノール、インドフェノール、サフラニン、クリスタルバイオレットのほか、市販の食品着色料のような可視色素類）を０．１または０．２ｍｇ／ｍＬの通常の濃度で４質量％ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７と相互作用させ、各混合物をＰＣＲ反応混液に添加した。実施例２に記載したようにＰＥＲＶプロテアーゼフラグメントを増幅するように反応を構成し、アガロースゲル電気泳動法によって反応生成物を分析した。ＰＣＲ法の結果は、これらの色素のそれぞれがＰＣＲを抑制するが、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７のような界面活性剤類の添加は反応に対する色素の影響を抑制することを示した。
【００７１】
実施例７：界面活性剤が色素を安定化し、熱分解予防を補助する。
色素ＳＤＡ８０８０および７８５ＷＳをＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７、ＴＷＥＥＮ−２０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、ＢＲＩＪ−９７など種々の界面活性剤と混合し、サーモサイクラー（９７００、アプライド・バイオシステムズ社）でサイクルした。吸光度読取値をＨＰ  Ｃｈｅｍ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＨＰ  ８４５３、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（カリフォルニア州、パロアルト））を用いて、７８５ＷＳ色素については７８５ｎｍで、ＳＤＡ８０８０色素については１０４０ｎｍで熱サイクルの開始および終了時点で得た。それぞれの結果は、界面活性剤なしの色素が有効な加熱を提供することがないレベルに熱分解すると同時に、色素／界面活性剤の混合物は顕著に少ない分解を起こした。したがって、界面活性剤は色素の熱分解を保護するのに役立つ。データを表４に示す。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【００７４】
実施例８：ＮＩＲ色素は界面活性剤で効率的に水を加熱する。
この実験は、色素／界面活性剤の混合物がＰＣＲ適合性である濃度できわめて効率的に加熱しうることを示す。１．２Ｗ（１．９Ａ）での８１３ｎｍダイオードレーザー源（オプト・パワー社（Ｏｐｔｏ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｏｒｐ．）（アリゾナ州、ツーソン））を用いて、ある濃度（７８５ＷＳについては０．１ｍｇ／ｍＬ、ＳＤＡ８０８０については０．２ｍｇ／ｍＬ）で１０μＬの量の近ＩＲ色素を加熱し、３５℃の温度上昇を得た。レーザーは１０μＬウェル中の温度が３５℃に上昇するのに十分に長く手動でオンにし（１〜３秒）、同レベルが達成された場合に手動でオフにした。ウェル内の熱電対を用いて温度データを得るとともに、その信号がデジタル化され、グラフで解釈されるパワーメーターによって透過率データを得た。
【００７５】
ＰＣＲ熱サイクルは通常、６０℃から９５℃への温度の急上昇を必要とする。一連の実験では、６０℃から９４℃への３５℃の温度上昇が５秒で得られることが示された。これはＰＣＲサイクルに対する熱要件がＤＮＡ増幅を可能とする色素および界面活性剤の濃度で満たされうることを示す。
【００７６】
別の実験では、１０μＬウェルを用いて、色素／界面活性剤の混合物が３０サイクルの期間にわたってレーザーサイクルに耐えうるかどうか確認した。レーザーパワーは、３０回、６０℃から９４℃へ整然と変化した。図１は、繰り返しサイクルされるＳＤＡ８０８０を示す。
【００７７】
レーザーパワーはサイクル経過中に大きく変化することはなかった。これはＳＤＡ８０８０色素が３０サイクルの期間にわたって顕著な程度に退色しないことを示した。
【００７８】
実施例９：抗酸化剤がＮＩＲ色素の光退色を減少させる。
実施例８と異なり、一部の色素／界面活性剤の複合物はレーザー光に曝露されると光分解を起こす。アスコルビン酸のようなＰＣＲ適合性ラジカルスカベンジャー類を組入れることにより、これらの色素類の一部に対する光分解が顕著に減少しうる。７８５ＷＳで試験した界面活性剤類の実質的にすべてにアスコルビン酸を添加することにより、光退色が顕著に減少した。具体的には、７８５ＷＳ／ＢＲＩＪ−９７の場合、アスコルビン酸（通常、５ｍｇ／ｍＬ）の添加は、３０サイクル後に１００％から２０％への光退色の量の減少に役立った。ある状況では、急速な／コントロールされた光分解が望まれる。ＳＤＡ８０８０の場合、アスコルビン酸の添加により色素の可視および近ＩＲ領域の光吸収が破壊される。これによりＰＣＲ反応の終了時にＤＮＡタグ（蛍光またはｖｉｓ／ＩＲ）のモニタリングが可能となる。
【００７９】
ビタミンＥ−ＴＰＧＳは界面活性剤および抗酸化剤の両方の特性を有する。したがって、７８５ＷＳ（０．１ｍｇ／ｍＬ）へのビタミンＥ−ＴＰＧＳ（４質量％）の添加は、３０サイクルのレーザー曝露後に光安定性が顕著に増大したため、抗酸化剤の特性が明らかになったことを示した。
【００８０】
上記の説明は例示を意図し、限定を意図したものではないと理解すべきである。本発明の種々の修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく前記の説明から当業者には明らかになるとともに、本発明は本願明細書に記載された例示的な実施形態に過度に限定されるものではないと理解すべきであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＮＩＲ色素および界面活性剤を用いたレーザーサイクル実験の温度対時間を示すグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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