(57)【要約】１検出器／多数放射線源構造において、単一の検出器が複数の放射線源につながっているマルチチャネル生物分離検出方法及び装置である。各放射線源は、単一の分離チャネルの検出帯に放射線を導き、そして複数の分離チャネルの検出帯から放射される光を検出する為に単一の検出器が用いられている。所定の順序及び更なる周期的態様で前記光源が放射線を検出帯に導く。そしてコントローラーによって検出器出力が光源と同期化される。生物分離は全てのチャネルにおいて同時に並行して行われて良く、光源に関して時差式及び／又は時分割検出が行われて良い。ある実施態様において、低コストの発光ダイオードが光源として用いられて良い。他の観点において、マルチチャネル電気泳動装置にいて放射線が誘導する蛍光を検出する為の検出機構が設定される。
2004521334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物分離が同時に行われる複数の分離チャネルを有する生物分離装置の為の検出システムであって:
検体の為の検出帯を画定する、各分離チャネルに沿う検出部;
それぞれが分離チャネルに連結された、複数の放射線源;
検体が検出帯を通過する際に、検出帯へ放射線源からの励起放射線を導く為の励起手段;
放射線の放射を検出する為の検出手段;
所定の順番でそれぞれの分離チャネルの検出帯へ励起放射線が導かれて各分離チャネルの検出帯からの放射線の放射が時差／時分割（time multiplexed）態様で検出されるような態様において放射線源及び検出手段を調節する為の調節手段;
を含んで成る検出システム。
【請求項２】
前記検出手段が複数の放射線源と連結された単一の検出器を含んで成る、請求項１に記載の検出システム。
【請求項３】
前記調節手段は放射線源間での継続的なパルスを起動するように複数の放射線源を調節する、請求項１に記載の検出システム。
【請求項４】
隣接する分離チャネルにおける放射された放射線の時間のずれを考慮して、前記調節手段は放射線源のパルシング及び検出サンプリングの速度及び時間の同期化をはかり、そうすることによって、分離チャネルの為の所望の検出が、連結された放射線源が検出手段に対してオンである時間のみを網羅する、請求項３に記載の検出システム。
【請求項５】
前記調節手段は、分離チャネル間での所望の放射線の放射シグナルの分離を供することでクロストークを減らす速度及び時間において、複数の分離チャネルからの放射線の放射をサンプリングするように検出手段を調節する、請求項４に記載の検出システム。
【請求項６】
前記調節手段は、所定の検出サイクルで複数の分離チャネルからの放射線の放射の検出が行われるように放射線源及び検出手段を調節し、ここにおいて、各々の検出サイクルが、所望の検出解像度を供する周波数で繰り返される、請求項１に記載の検出システム。
【請求項７】
前記調節手段は、前記分離チャネルの検出帯に渡り、繰り返しスキャンニング態様で検出が行われるように放射線源及び検出手段を調節する、請求項１に記載の検出システム。
【請求項８】
前記放射線源が複数の波長の励起放射線を生産する、請求項１に記載の検出システム。
【請求項９】
前記検体が励起放射線の存在下で蛍光を発する物質を含んで成り、そして前記検出手段が当該物質の蛍光の放射を検出する手段を含んで成る、請求項１に記載の検出システム。
【請求項１０】
前記放射線の放射が、少なくとも:
蛍光;
化学発光;及び
リン光;
のうちの１つである、請求項１に記載の検出システム。
【請求項１１】
複数の分離チャネル;
分離チャネルにおいて試料を検体へと同時に分離する手段;並びに
検体の為の検出帯を画定する、各分離チャネルに沿う検出部;
それぞれが分離チャネルに連結された、複数の放射線源;
検体が検出帯を通過する際に、検出帯へ放射線源からの励起放射線を導く為の励起手段;
放射線の放射を検出する為の検出手段;
所定の順番でそれぞれの分離チャネルの検出帯へ励起放射線が導かれて各分離チャネルの検出帯からの放射線の放射が時差／時分割態様で検出されるような態様において放射線源及び検出手段を調節する為の調節手段;
を含んで成る検出システム:
を含んで成る生物分離装置。
【請求項１２】
前記分離チャネルがキャピラリーカラムにより画定され、そして試料を分離する為の手段が電気泳動によって当該試料の分離を行うように設定されている、請求項１１に記載の生物分離装置。
【請求項１３】
生物分離が同時に行われる複数の分離チャネルを有する生物分離装置において検体を検出する方法であって:
各分離チャネルに沿って検体の為の検出帯を画定し;
それぞれが分離チャネルに連結された、複数の放射線源を提供し;
検体が検出帯を通過する際に、検出帯へ複数の放射線源からの励起放射線を導き;
放射線の放射を検出する検出器を提供し;
所定の順番でそれぞれの分離チャネルの検出帯へ励起放射線が導かれて各分離チャネルの検出帯からの放射線の放射が時差／時分割態様で検出されるような態様において放射線源及び検出器を調節する;
段階:
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
この出願は、２００１年１月２６日に提出された米国仮出願特許第６０／２６４，５５３号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
１．  相互参照
２００２年１月２８日に平行して提出されたMulti−Channel Bio−Separation Cartridgeという名称の米国特許第 号は、当該発明の譲受人である、Bio Cal Technology Inc.に与えられており、そしてそれは本明細書中に全体を参考文献として組み込まれている。
【０００３】
２．  発明の分野
本発明は生物分析における検出技術、特にマルチチャネル生物分離システムにおける光学的検出に関連し、そして一層詳細には電気泳動に基づきマルチチャネルキャピラリーにおける放射線の励起による放射検出に関連する。本発明は更に、本発明の検出機構を備える生物分離器械に関連する。
【背景技術】
【０００４】
３．  関連技術の説明
生物分析、例えばDNA分析などは、精度ついての純粋な科学的探究から、証明された高い信頼性をもって日常的手順へと急速に移り変わっている。医療研究者、薬理学者、及び法医学調査団らは全て、彼らの仕事を遂行するのにDNA分析を用いる。しかし、DNA試料を検出及び測定する装置が複雑であり、そして試料を調製するのが困難である為に、既存のDNA分析手順は往々にして時間がかかり且つ高価である。従って、装置の大きさを縮小し、構成部品の数を減らし、そしてコストを下げ、作業中の試料の扱いを簡単にし、そして一般に、簡素化された、低コストで、高感度の検出器を備える装置であることが望ましい。
【０００５】
あるタイプのDNA分析装置は、電気泳動に依存することによってDNA分子を分離する。電気泳動技術を用いて、ヒトの同一性試験、発現解析、病原体検出、変異原検出、及び薬理学的研究などゲノタイピングの用途の為に、DNAの断片を分離することが出来うる。用語、電気泳動とは、電場の影響を受けて電荷を帯びた分子が移動することを意味する。電気泳動を用いて、等しい電荷／質量の比を持つが質量が異なる分子を分離することができる。かかる分子の例はDNA断片である。
【０００６】
DNA試料を分析する為に電気泳動を使用する、商業的に入手可能な様々な器械がある。かかる一つの例には、マルチレーンスラブゲル電気泳動装置があり、それは名前が示すように、DNA試料がその上に置かれるゲルのスラブを用いる。ゲルスラブ全体に電荷が加えられ、それによりDNA試料が様々な質量のDNA断片に分離される。
【０００７】
他の種類の電気泳動装置は、キャピラリー電気泳動(CE)装置である。CEとは、非常に強い電場を用い（一般に内径２０〜１００μmの）狭い口径のキャピラリー内で分子を分離する類縁の分析技術のシステム系統をいう。CE技術は一見したところ、産業及び学術の用途において制限がない。ゲル及びポリマー網にもとづくCEにより、核酸の研究の大変革を起こした。その用途には、DNA配列決定、核酸の定量化、及び突然変異／多形解析などが挙げられる。緩衝溶液を担持するフューズドシリカキャピラリーカラム中での電気泳動を適用することによって、要求される試料の大きさは有意に小さくなり、そして分離の速度及び解像度を、スラブゲル電気泳動法に比べて何倍にも向上させることができうる。これらDNA断片は、CEにおいて往々にして、蛍光物質で標識された試料から分離した成分に、キャピラリーの壁を通して光を当て、そして入射光によって誘起される蛍光発光を検出することによって検出される。放射の強度が試料の成分の濃度、量及び／又はサイズを表す。
【０００８】
CEに基づく器械及びCE分析プロトコルを設計することにおいて、試料検出技術に関連するいくつかの課題がある。蛍光検出の場合では、例えば、放射線源、光学的検出、感度及び検出の信頼性、光学検出部(detection optics)構造のコスト及び信頼性、に対する多くの設計の検討がなされた。
【０００９】
蛍光方法を使用するCEによりDNA解析の為の高い検出感度が供される。往々にして、蛍光検出は、往々にしてゲノミクス及びプロテオミクスの分野における選り抜きの検出方法である。その理由は、他の検出方法に比べて、蛍光検出法の際立った感度にある。共焦点レーザー誘起蛍光(LIF)法及びシースフロー検出器が二つの広く行われている検出方法である。
【００１０】
シースフロー検出器の主な欠点は、信頼できるシースフローを確立する為には非常に精巧なフローシステムが要求されることである。エンドユーザーの厳しい要求に見合う為、光学的構成部品及び機械的構成部品の許容基準についての極端な要求が課される。この装置の感度は非常に良いが、この方式の蛍光検出が、ハイスループットでしかも低コストなDNA解析に適切であることには疑念がある。走査型共焦点検出器は光学システムをスキャンニングすることに基づいている。器械の簡便さ、ローバスト性及びより低いコストを考えた場合、可動構成部品の使用は理想的ではない。顕微鏡対物の焦点深度が浅いことも機械構成部品及び光学的構成部品の許容基準に対して厳しい要求を課す。更に、光学的走査方式により負荷サイクル／キャピラリーが低下し、このことにより、非常にハイスループットな目的の為に更に器械をスケールアップした場合、感度が損なわれうる。
【００１１】
LIF検出器を有する商業的に入手可能な多くのCE装置の為の最も高価なハードウェア構成部品の一つは、一般に、蛍光励起光源である。それは、ガスディスチャージランプ(水銀もしくはキセノン)又はレーザー(ガス、第２高調波発生（second harmonic generation）する固体状態、色素、もしくは半導体)であり、かさ高く、高価であり、非効率であり、そしてある光出力を光ファイバーへと結びつけることが困難であり、したがって、光学検出システムを小さくすることの妨げになる。これらの光源により、小さな、ハイスループット且つ費用効果が高い、迅速な検出の為に好都合な分析器械の開発が妨げられる。
【００１２】
ゲルで満たされたキャピラリーを用いてサイズによってDNA断片を分離することは、スピードと解像度の観点において、スラブゲルに基づく古典的な分離法を超える利点を有する。しかし、商業的に最も入手可能なCE装置にはキャピラリーが１つしかなく、そうすると一度に１つの検体のみが分析されうる。(例えば、実際のBiosystem３７７装置など)1つのスラブゲルシステムを用いる商業上自動化されたDNAシークエンサーにおいては、３６個の試料が同時に分析されて良い。キャピラリー電気泳動に基づくDNA断片分析装置を、スループットに基づくのものに匹敵させる為に、同時に複数の試料を流すことができる装置を開発することが必要である。単一のキャピラリー装置を用いるDNA断片解析装置(例えば、Beckman CoulterのPACE５０００LIF、PACE MDQ LIF)の方式は、マルチキャピラリーシステムへ拡張されて良い。しかしながら、LIFを基本とする検出光学システムを利用するマルチキャピラリーDNA解析装置(即ち、Beckman Coulterの８キャピラリーEQTM２０００XL装置)の設計は、古典的なスラブゲルを基本とするシステムよりも非常にコストがかかり且つ複雑である。商業的に入手できるマルチキャピラリーCE装置の他の例としては、SpectrumMedix 及びPharmeciaによって開発されたABIがあり、それらは類似する欠点を共に持つ。
【００１３】
他の蛍光検出法は、同時に複数のキャピラリーの内部を照らし、そしてそれから放射される光を収集するものである。米国特許第５,７９０,７２７号にあるように、平行なアレーのキャピラリーが導光板を形成する。この導光板において、柱面での屈折により、アレーの面に向けられた照光がアレーの隣のキャピラリーそれぞれの中心を照らすことを制限する。しかし、照明の為に用いられる光源は１つのみなので、キャピラリーにより画定された異なる分離チャネル間でのクロストークがある。散乱光の存在により、クロストークは避けられず、そして蛍光放射におけるノイズが理由により、検出されるシグナルのコントラスト比は悪くなるであろう。更に、マルチチャネルの為の先行技術の単一照明源は、複数波長LIF検出を一層複雑にする。
【００１４】
従って、先行技術における制限を破るだろう、生物分離の為の低コストのハイスループットマルチチャネル検出機構を開発することが望ましい。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、先行技術の欠点を解消する、生物分離の為の簡素化された、低コストで、効率的な、高感度且つハイスループットなマルチチャネル検出形態（CEなど）を提供する。本発明は、複数放射線源／共有検出器形態に基づき、検出が、チャネルに対して時差的及び／又は時分割的（time multiplexed）に行われるマルチチャネル検出機構を提供する。１検出器／複数放射線源形態で、単一の検出器が多数の放射線源とつながっている。各放射線源が放射線を単一分離チャネルの１つの検出帯に導き、そして単一の検出器が用いられて、複数のチャネルの検出帯からの光放射が検出される。検出システム全体には複数の検出器があって良く、それぞれは複数の放射線源を担う。
【００１６】
生物分離が全てのチャネルにおいて同時に並行して行われて良く、そして検出が光源に対して時差的及び／又は時分割的に行われて良い。光源が放射線を検出帯に周期的な態様で所定の順序で導き、そしてコントローラーによって、検出器出力が光源に同調される。放射線源及び検出器は、時分割態様で同期パルス化される。所定の検出周期において複数の分離チャネルからの放射線の放射の検出が行われるように、コントローラーにより検出器及び放射線源の調節がなされる。ここで各検出周期は、所望の検出時間を担う頻度で繰り返される。時差式検出では、分離チャネルの検出帯に渡り、繰り返しスキャンニング態様で検出を行う態様において、コントローラーが放射線源及び検出器を調節する。本発明により、チャネル間のクロストークは事実上除かれる。光源を導く又は検出する為の可動構成部品は不要である。
【００１７】
ある実施態様において、高価な高出力レーザーの代わりに、低コスト発光ダイオード(LED)(超高輝度(super bright)LEDなど)又はレーザーダイオードが光源として用いられて良い。もう一つには、低エネルギーレーザーが用いられて良い。光源からの入射光線は、光ファイバーを用いることで、検出マルチチャネル検出帯へ別々に向けられて良い。マルチチャネル検出帯から放射された光は、光ファイバーを用いることで１又は複数の共有の検出器の方に向けられて良い。可動構成部品が不要なので、構成部品の数を減らすことができうる。チャネル間のクロストークを除く又は減らすことによって、光学検出システムの設計が一層簡単になって良い。従って、器械のコスト、信頼性、及び利用しやすさが改善される。
【００１８】
本発明の特定の実施態様において、本発明の検出機構は、マルチチャネル生物分離装置において、放射線により誘起された蛍光を検出する為に設定されている。他の実施態様において、検出機構は、キャピラリー電気泳動装置において、放射線により誘起された蛍光を検出する為に設定されている。
【００１９】
本発明の他の観点において、本発明は、本発明の検出機構を組み入れた生物分離装置を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施例の詳細な説明
本発明は、図を参照に、様々な実施態様に関して以下に記載される。本発明は本発明者の目的を達成する最良の形態の観点において記載されているとはいえ、これらの技術の観点から本発明の精神又は範囲を逸脱することなく変化版が達成されて良いことが当業者には明らかであろう。
【００２１】
本発明は、新規検出形態に関する。この新規検出形態において、複数の光源は、対応の光ファイバーを通して励起光を時分割態様で複数の流体試料中の対応の流体試料に対して放射し;各流体試料では励起光に対応して、その光が試料に届く時間に対応する様々な時間で蛍光が生じ;そして単一の試料からの蛍光が検出器へと伝わり、検出器が、検出された蛍光光の強度に比例するシグナルを出力する。故に、複数の光放射装置からの光を検出するのに単一の検出器が用いられる。本発明の原理を図示する目的でであり、そして限定する目的はなく、CE、放射線により誘起される蛍光、及び複数の分離チャネルに関する実施態様を参照にすることにより、本発明が記載されている。本発明の範囲は蛍光型の放射の検出に制限されるものではないが、他の型の放射性放射、例えば、リン光、発光及び化学発光などを検出することにも適用可能であることが理解される。
【００２２】
電気泳動及び放射線により誘起される蛍光のメカニズムは、単独で考察された場合本発明の範囲外である。完全を期すためには、図１及び図２を参考にしてマルチチャネルCEシステム(２００)に関してCEを簡潔に記載することで十分になる。図１に示すように、一般にCEシステム(２００)は、分離チャネル及び検出帯(４０６)を特徴とする検出部を伴う１つ以上のキャピラリー分離カラム(１４０)を含んで成る。前記分離チャネルは、単に、ランニングバッファー又は当業界で公知のシービングゲルマトリクスであって良い分離支持媒体で満たされている。放射線により誘起される蛍光を検出する為に、前記ゲルマトリクスにはエチヂウムブロミドなどの公知の発蛍光団が含まれる。
【００２３】
実施に際して、本発明の一部ではない多くの任意の方法(試料リザーバーからの動電学的注入又はシリンジポンプを用いることでの物理的な圧力による注入など)によって、調製済みの生物試料(DNA試料など)が、検出帯(４０６)から離れたキャピラリーカラム(１４０)の遠端に導入される。この試料は発蛍光団に対して結合する。電極(１１１及び１１２)の間にDC電位が適用された場合、前記試料は、適用された電位の下で分離チャネルに沿って移動して試料成分のバンドに分かれる。分離の程度及び分離チャネルに沿って移動する距離の程度は多くの因子に依存する。その因子とは例えば、試料成分の移動可動性(migration mobility)、試料成分の質量及びサイズ又は長さ、並びに分離支持媒体である。分離チャネルにおいて試料を分離する為の駆動力は、電気泳動、圧力、又は電気浸透流(EOF)の手段でありうる。
【００２４】
試料が検出帯(４０６)に到達した場合、励起放射線が光源(４０２)から励起ファイバー(４２２)を介して検出帯に向けられる。試料成分は、それぞれの試料成分の濃度に比例した輝度(蛍光標識物質の量に比例する)の蛍光を発する。入射放射線のものとは異なる波長で、放射された蛍光が、検出ファイバー(４２８)により収集されて検出器(４５０)に向けられる。
【００２５】
図２に関して、本発明のある実施態様において、本発明と合わせて用いられる為のマルチチャネルカートリッジ(１００)及びCEシステム(２００) (本発明の譲受人であるBioCal Technologyに対して与えられ、本明細書中に参考文献として組み込まれており、更に詳細には、ゲルで満たされたマルチキャピリーカートリッジ及び当該カートリッジが用いられることを意図したCE装置の様々な実施態様に関する、２００２年１月２８日に平行して提出された(代理人整理番号:第１０３１／２０８号)Multi−Channel Bio−Separation Cartrideという名称の米国特許第 号)が概略的に示されている。完全自動化されたDNA分析装置(２００)は、支持ブラケット(１６４)上で支持されたマルチキャピラリーカートリッジ(１００)と関連して２つの９６ウェルのミクロタイタープレート(７０及び７２)を移動させる、モジュラーX−Z試料取り扱いトレイ機構(７６)を支える台座(７４)を有する。前記システム(２００)により、マルチチャネル分離カラムの操作が容易になり、そしてCE装置(２００)の光検出部に対する前記検出帯の簡単な光学連結が可能になる。
【００２６】
カートリッジ(１００)には、使い捨て及び／又は持ち運び可能、交換可能なカートリッジアセンブリ(１００)の一部として、試料の分離及び検出の為に用いられる１２本のチャネルフェーズドシリカキャピラリーアレイを含む。マルチチャンネルキャピラリーアレイには、カートリッジ(１００)においてミクロチャネルにより画定される１２個の検出帯が含まれる。図２に示されるマルチチャネルカートリッジ(１００)は長さ１２〜１６cmのキャピラリー(１４０)を最大で１２本有する。マルチチャネルカートリッジ(１００)は、上方で、全部のキャピラリー(１４０)が共有する流出バッファーリザーバー(１２４)と一体化されている。流出バッファーリザーバー(１２４)は、モジュラー空圧ポンプ(７８)に対して直接連結されている。圧力ポンプ(７８)により、リザーバー(１２４)に入っているシービングゲルで全１２キャピラリーを満たす為に必要な空圧が提供される。ゲルの粘度によっては、ゲルが満たされたリザーバー(１２４)を介しキャピラリー(１４０)に対して最大で４０PSIの圧力が適用されて良い。前記カートリッジゲルリザーバー(１２４)には、装置(２００)の内部に設置された場合に電気泳動の為に高圧電源(８０)に自動的に連結される全１２本のキャピラリーに共通する電極(陽極:示されていない)が内蔵して装備されている。カートリッジ(１００)に隣接する、支持ブラケット(１６４)上のファン又はPeltierクーラーにより当該カートリッジの温度調節がなされる。試料の注入は動電学的方法によって達成される。DNA断片の動電学的注入及び分離をする為に、ゲルで満たされたキャピラリーに対して０〜２０kVの電場を送る為に高圧電源(８０)が用いられる。１２個のLEDの広帯域光エネルギー(FWHM＝４７nm)はそれぞれ、分離されたDNA断片を励起する為にカートリッジ(１００)内部のキャピラリーの検出帯のそれぞれに対して個別の光を伝達する光ファイバー(マルチモードシリカ又はマルプラスチックの２００ミクロンコアファイバー、N.A.０．２２)に依存する。電源(６６)によりCEシステム(２００)に対するDC電力が提供される。カートリッジ(１００)及びCEシステム(２００)の更なる詳細は、本明細書中に参考文献として組み込まれている同時係属特許出願を参照のこと。
【００２７】
図３には、カートリッジ(１００)(簡素化した図で示されている)がCEシステム(２００)に取り付けられた場合の、光検出部及びカートリッジ(１００)との関係の概略が示されている。ここにおいて、カートリッジが用いられる為の設計をされているCEシステム（２００）にカートリッジが装着される場合、ミクロチャネルに一体化される励起ファイバー(４２２)(即ち、マルチモードシリカ又プラスチックファイバー、N.A.０．２２)がキャピラリー(１４０)の検出帯(４０６)に向けられている。各チャネルは個別にLED(４２０)に連結されている。
【００２８】
電気泳動中、シービングゲルを介して分離された成分又は検体が移動する速度は、それらの質量に反比例する。断片が検出帯(４０６)に近づくにつれ、LEDモジュール(４３３)で支えられている１２個のLED(４２０)のそれぞれからの励起光エネルギーが、個々の光を伝達する光ファイバー(４２２)(例えば、バンドル(４２３)でまとまっている)によって送られ、分離された成分又は検体が検出帯(４０６)で照射される。励起光はミクロレンズを利用する又は利用することなく直接、対応する１２本のキャピラリーに対して送られる。LEDとファイバー間の光学的つながりを向上させる為に、ミクロレンズによって励起ファイバー(４２２)が各々のLED(４２０)に連結されて良い。マウントモジュール又はマウントブロック(４３１)によってファイバー(４２２)が、キャピラリーに対して支えられて並べられている。分離された成分又は検体がシービングゲル(又は線状ポリマー溶液)を介して移動するにつれ、シービングゲル内で色素(エチヂウムブロミド)が相互作用することにより、分離された成分又は検体を、光により誘起される蛍光によって検出することが可能になる。
【００２９】
次いで、キャピラリーの検出帯(４０６)から放射された蛍光光は、ファイバーマウントブロック(４３１)において支えられて位置合わせされているいくつかの高N.A.(開口数)ミクロレンズ(４３６)(例えば、高屈折率サファイアマイクロレンズ)によって収集される。その後、励起光よりも高い波長(ストークシフトが大きい)の収集された蛍光光は、１２本のキャピラリーの各検出帯(４０６)から１２本のより大きなコアの光ファイバー (OD３７０μm、N.A.０．２２のファイバー、しかし、OD１００〜１０００μm、N.A.０．１２〜０．５の範囲のものであっても良い) (４２８)を経由し、単一の二股束アセンブリ(４５２)により単一の検出器(R５９８４Hamamatsu光電子増倍管)(４５０)に至る。一本の、例えば５７０〜６３０nmロングパス(long pass)光フィルター(４５４)(OG−５９０)は、検出の前に用いられ、 (各ファイバーの) ファイバー束アセンブリ(４２８)の出力から放出されたシグナルをろ過(filter)する。
【００３０】
様々な時間に光が放射される(即ち、被変調)ようにLED(４２０)が操作される。故に、LEDモジュール(４３３)の唯一のLED(４２０)からの光は単一のキャピラリー(１４０)に任意の所定の時間で送られ、そして検出される蛍光放射の強度に比例したシグナルを出力する検出器(４５０)によって検出される。キャピラリー(１４０)で全ての検出帯(４０６)に関して、光が誘起する蛍光の検出は、LED(４２０)の起動と同期化して所定の順番と周期的な方法で進む。故に、複数の放射線を放射する装置からの蛍光放射を検出する為に単一の検出器(４５０)が用いられる。
【００３１】
１２個のLED(４２０)は検出器に対して時分割的な態様でのパルス化／変調を受ける。LEDがパルス化され、そして類似して検出器もパルス化される。検出器は時差的態様で１つのLED又は１つのチャネルを読み込む。LEDがパルス化されて、全チャネルを通じて並行して流されている分離されたDNA断片を標識している発蛍光団が継続的に励起するように、検出器も時差的態様時間で、１つのチャネルを抽出又は読み込む。本質的に、検出は、キャピラリー(１４０)の検出帯のアレイに渡り、繰り返しのスキャンニング態様で行われる。単一のファイバー束(fiber bundle)アセンブリ(又はそれらは単一の検出器に全て組み合わされている個々の放射収集ファイバーであって良い)によって、１２個の放射シグナルが時差的態様で単一のPMT(４５０)に届くだろう。これらの検出ファイバーは、１×１２本のファイバー束アセンブリ形態である必要はない。それらは、それらを１２本の、密閉された丸い包装(closed round packed)形態又は直線状の並びで包装された(linear array packed)形態でまとめ、そして全１２個の放射シグナルをカートリッジから単一のPMTへと送ることができるように、単一のメカニカルブロックによって単一の検出器モジュールに対してそれぞれが取り付けられている１２本の個々のファイバーであって良い。発光ダイオード(４２０)は数百Hzでパルス化するが、遅延により互いに別々のパルス化された光を放射させる為に動作される。
【００３２】
一般に、パルス化LEDのパルシングは本発明の実施態様により下記の順番で行われる。LED１がオンになると、次いで、検出器がオンになる又はLED１に関する放射光を検出し、その後、LED１は次の１１回に渡ってオフになる。何故なら、そこには全部で１２個のチャネルがあるからだ。従って、LEDのパルシングは、サンプルとホールドの機構で終わる検出器と連動する。サンプリング周波数は１００Hz／チャネルであって良く、従って、全１２チャネルについての全変調周波数は１２００Hzであり、それは２つの連続したチャネルの為の周波数であり、１／１２の負荷サイクルを伴う。LEDの時間分割及び時差型の検出機構が守られている限り、このサンプリング周波数は様々であって良い。ソフトウェアのデータ収集処理速度は、調節可能な上がり時間(adjustable rise time)(即ち、０．１秒〜１秒)をもって１０Hzに設定されて良い(類似するサンプリング周波数を持つ為に、１００Hzの代わりに１０Hzのサンプリング周波数が用いられて良く、サンプリング周波数及びデータ収集処理速度は互いに独立している)。ひいては、１／１２の負荷サイクルでは、LEDが約１０ミリ秒でオンになり、そして１００ミリ秒でオフになって良い(この負荷サイクルはキャピラリーの数が増加又は減少するにつれ変わりうる)。
【００３３】
図５にはLEDのパルシング、及び類似して本発明の時差／時分割検出機構のある実施態様に従う検出器のタイミング図を示す。これは下記の例のタイミング図である。LEDのパルシングは１／１２負荷サイクルでのものである。LEDがオンになる場合、それは１／１２回に渡ってオン(８．３％)であり、そして１１回に渡ってオフである。サンプリング周波数は１００Hz／チャネルである。１／１２の負荷サイクルでは、１００Hzは１０ミリ秒(T＝１／f＝１／１００Hz＝１０ミリ秒)であり、LEDは約０．８３ミリ秒又は約１ミリ秒に渡りオンになる。１２個のLEDは全て、時差態様において時分割化されている。従って１２個のチャネル全てについて、それは１．２kHz(１，２００Hz)である。LEDがオンの時間の駆動電流は約１５〜３５mAである。ソフトウェアのサンプリング周波数及びデータ処理速度は互いに独立していて良い。
【００３４】
図５に見られるように、LEDの時分割の為のパルシングトレイン(pulsing train)は、１サイクルで時間T迄最大で進み、そしてそれが再度繰り返される。同じ考え方を検出側に当てはめられる。LEDのパルシングと検出器は同期化されている。そしてLED１がオンになるにつれて、生産(収集／検出)される放射シグナルのサンプルとホールドが始まり、そしてこれは全１２シグナル／LEDについて繰り返され、従って、時差式検出となる。負荷サイクルが短い場合、又はLEDが短時間でオンになる場合には、それは検出されるシグナルにおいてピークが高いパルスを生産しうる。パルシングモード中のLEDのオフ時間が一定のオン／DC動作に対して長い場合、それはLEDの寿命が長くなることを意図する。何故なら、冷却時間(期間)が長いからである。当業者はLEDのこのパルシングモード動作を利用して、より高い輝度又は最大出力を生じさせる為に、より高い(１００mA程度の)駆動電流を使用できる。そして、当業者はより高い最大出力を出す為にLEDを冷却し、より過酷に駆動させることさえもできる。従って、LEDのパルシングはLEDの寿命延長、及び最大出力／輝度を高めるのに役立つ。
【００３５】
本発明により、CE装置(２００)における電気泳動による断片の分離は、パルスLEDがオン時の秒／ミリ秒で行われることが分かっている。パルシング周波数が実際の断片ピーク分離よりもかなり高いので、本発明の時差／時分割検出機構が検出解像度の感度及び性能に悪影響を及ぼすことはない。検出結果の分解(検出されるシグナルのピークなど)は、ゲルマトリックス濃度、分離内径、長さ及び検出帯(４０６)を移動する速度にある程度依存する。本発明の検出機構を用いることで良い解像度を伴う検出感度が１００ng／ml(０．０２ngのDNA断片)で達成されることが実験により示されてきた。
【００３６】
一例として、φX１７４DNA断片を含んで成る試験試料に関しては、７５μmで１６cmのキャピラリーに、３００V／cmの電位で、２７１／２８１塩基対に対するベースライン解像度を達成できうる。本発明のある実施態様に従い単一色時分割蛍光検出法を用いることで、標準マーカーによる個々のDNA同定型分離においてSTR座はおよそ４塩基対の分離解像度を示す。並行して作動する全１２チャネルに関する分離時間は１０分未満であり、シグナル／ノイズ率は良い(最も長い断片に関して、ピーク間ノイズに基づき、S／N＝１５０である)。
【００３７】
放射線源のパルシング及び検出サンプリングの速度及び時間が同期化されているべきであり、そうすることによって、分離チャネルの為の所望の検出が、連結されている放射線源が検出器に対してオンである時間のみを網羅する。
【００３８】
光ファイバー(４２２)を介して入射放射線をキャピラリーに向けるソースLEDが上記の実施態様により示されるが、短い光ファイバー(４２７)のアライメントを用いることで検出帯に対して入射光を整列させること又は光ファイバーを全く使用せずに(例えばLEDからの入射放射線を整列させ直接キャピラリーの検出帯(４０６)へと導くミクロレンズを配置する事などにより)放射線源、例えばLED、を検出帯(４０６)に隣接して置くことは本発明の範囲及び精神に含まれる。
【００３９】
好適な実施態様において、図４に示されるように、そこにはコントローラー(３００)が示されており、それはCPU(１２０)、PMT(４５０)からの検出シグナルを対応するデジタルシグナルに転換するA／Dコンバーター(２１２)、及びCPU(２１０)からの指示によってCE装置(２００)の対応する部分からのシグナルを伝達及び受容しするI／Oインターフェース(２１４)を含んで成る。温度コントローラー(６５)により、ミクロチャネル／キャピラリーアレイカートリッジ(１００)の為に電気泳動チャンバーの温度を調節するファン又はPeltierクーラー(６３)を調節する。前記I／Oインターフェース(２１４)は温度コントローラー(６５)とつながっており、それはCE装置(２００)の試料注入及び電気泳動機能の為の高圧電源、LED(４２０)を変調する為の回路(４２１)、センサー、エアポンプ、エアバルブ、及びCE装置(２００)のX−Zステージの為のモーターをも調節する。CPU(２１０)は更に、順にデータの処理をする又はCE装置(２００)の為の更なる調節機能を実行する外付けのパーソナルコンピューター(２１８)につながれて良い。前記CPU(２１０)及び／又はPC(２１８)は、自動化マルチチャンネルDNAアナライザー(２００)の様々な特性と機能を調節する為にNational Instrument Corporationから入手できるLabVIEW(登録商標)ソフトウェアによって書かれた調節機能をプログラムされて良い。
【００４０】
PC(２１８)を除いて、コントローラー(３００)の構成部品は、CEシステム(２００)に搭載され、電子基盤(６４)(図２)及び冷却ファン(６２) としてまとめられて良く、そしてシリアルポート(示されていない)を介して電気的にPC(２１８)につながれる、あるいはそれらは、CEシステム(２００)の外部の個別のコントローラーモジュールの一部分であって良い。前記CPU(２１０)及び／又はPC(２１８)は、CEシステム(２００)の為の様々な調節(即ちユーザーインターフェース)機能及び特性を達成する為のプログラムがなされている。ある実施態様において、前記PC(２１８)は、装置(２００)の為のフロントパネル調節を供する設定ができる。そして基盤(６４)は時差／時分割検出コントロールを供する設定がなされて良い。本明細書中で開示された機能及び特性を与えるプログラムコードを実行することは当業者にとっては明らかであろう。A／C電力フィルター／スイッチ(６８)(図２)が装置(２００)に備わっている。
【００４１】
検出をする為の入射放射線は検出帯に向けられていて良く、そして／又は検出帯からの放射線の放射は、分離媒体に沿って軸の方向に出力されて良い(本発明の譲受人であるBioCal Technologyに対して同一に与えられ、本明細書中に参考文献として組み込まれた、２００２年６月２２日に全て提出された、Optical Detection in Bio−Separation Device Using Axial Radiation Inputという名称の米国特許第０９／８８７，８７１号; Optical Detection in Bio−Separation Device Using Axial Radiation Ouputという名称の米国特許第０９／８８７，９５３号;及び Optical Detection in Bio−Separation Device Using a Winded Detection Zoneという名称の米国特許第０９／８８７，８７２号に言及される)。
【００４２】
本発明は、励起源として低コスト且つ小型のLEDを使用する。他方、非同期式の、広帯域の光源(即ち、キセノンランプ、D２ランプ、水銀ランプ、アークランプ)を用いることもできうる。検出帯からの放射は、検出カラー(detection collar)外部又は内部からのファイバーデリバリーシステムを有するミクロ光学レンズによって収集される。
【００４３】
超高輝度LED(即ち、青、緑などの色のAglentのInGaN LED)は本発明の検出機構において用いる為の安価な、小型の、低出力光源の候補である。InGaN材料技術に基づくこれらの超高輝度LED(Agilentから入手したHLMP−CB１５及びHLMP−CM１５)は２．５〜３mWの平均光出力を有する。４７０nm及び５３０nmのピーク波長並びに３０〜５０nmの半値幅のスペクトル特性を有するこれらの青−緑InGaN LEDは、４５０〜５５０nmの範囲の励起スペクトルの色素(例えば、フルオレシン、ローダミン、エチヂウムブロミド、チアゾールオレンジ)を励起する為に用いられる良い候補である。パルス化できうる全ての固体状態光源も任意の色素又は発蛍光団と共にこの類の時分割検出の為に用いることができうる。これらのLEDの応答時間は非常に長い(１Hz〜１００MHzの範囲の周波数で数百ナノ秒)ので、それらをより大きな順電流(forward current)(１５〜３０ｍAなどだが、このパルスモード動作では最大で１００mA迄の順電流が可能である)でパルス化させ、高い放射ピークを得ることができうる。LEDのパルス化動作は一般に、トランジスター駆動回路によって達成できる。有意により高いピークのLED光出力が、DC動作よりも低い負荷サイクルで、大駆動電流(large drive current)により実現されて良い。他の例は、低コストCE装置の蛍光検出の為の励起光源としても適用できうる緑の５２４nmのLEDからなるLEDアレイモジュールである。
【００４４】
上記の実施態様において、複数の放射線源は同じ波長であるが、複数の放射線源を様々な波長に設定すること、特異的な試料、試料に基づく検出手段及びゲルの化学的性質を、異なるキャピラリーにおいて補足することは本発明の精神及び範囲内である。異なる化学的性質のゲル及び／又は蛍光標識を伴う二つの隣接するキャピラリー中で、同一の試料の分離を行い、試料中の分離された様々な成分又は分離された更なる成分の測定をする為に検出結果の比較をする事を可能にする為、又は検出結果を正当化する礎として、例えば、隣接する放射線源が交互波長(alternating wavelength)を有して良い。他の例として、隣接する４本のキャピラリーの集団が同じ試料の為の４つの異なる波長の放射線を投射されて良い(従って、上記の１２チャネルシステムにおいて、４つのチャネルのグループが３つあって良い)。上記の時差及び／又は時分割的な態様で同じ波長の放射線が投射されるチャネルからの放射を検出する為に、同様のものが適用されて良い。もう一つには、同じもしくは異なる性能及び／もしくは検出特性の複数の検出器があり、そのそれぞれは、上記時差及び／又は時分割的な態様で同じ波長の放射線が投射されるチャネルからの放射を検出する為に適用される。他の変化版は本発明の範囲及び精神に含まれる。
【００４５】
本発明は、単一チャネルに対して複数の波長励起及び検出があるシステムに迄及びうる。マルチチャネルシステムにおいて単一分離チャネルに対して様々な波長の複数の放射線源が適用されて良く、そして上記の単一波長励起放射線に類似して、時差及び／もしくは時分割的態様でチャネルからの同じもしくは異なる波長の放射性放射を検出する為に、同じ又は異なる検出特性の１又は複数の検出器が適用されて良い。複数の波長励起及び検出も、本発明の譲受人であるBioCal Technologyに対して同一に与えられ、本明細書中に参考文献として組み込まれた、２００１年１０月１９日に提出された(代理人整理番号:第１０３１／２０７号)、A portable Multi−Color Multiplexed Analysis Electrophoretic Deviceという名称の米国特許仮出願第 号に言及される。
【００４６】
革新的な検出方法には既存の市販用のCE装置を超える多くの利点がある。この検出システムは、蛍光型検出の為の光源として安価な発光ダイオード(LED)を利用する。光源としてのLEDの魅力的な特性は、それらが低コストであり、大きさが小さく、寿命が長く、ノイズが低く輝度が安定しており、そして直接電気変調(direct electronic modulation)が可能なことである。これらのより小さい固体状態励起光源によりファイバーの連結が容易になり、それは光検出部の小型化をもたらす。複数のLEDの多重化による時差検出方法を用いることで、可能性としてはマルチチャネル検出の為の検出器(PMTなど)の数が１個に減る多大な利益が供される。構成部品数を減らすことによって、そして光学検出システムの設計を簡素化することによって、装置のコスト、信頼性及び使いやすさが向上する。分離チャネル間のクロスロークは、ごく僅かにある又は無い。
【００４７】
本発明は好適な実施態様を参考にして詳細に示されているが、方法と詳細の変更は本発明の精神、範囲並びに教示を逸脱しないことは当業者によって理解されるだろう。励起放射線源は、例えば、LED、レーザーダイオード(半導体固体状態レーザー)、パルスレーザー(固体状態レーザー、ガスレーザー、色素レーザー、ファイバーレーザーなど)、又は他の放射線源などであって良い。LED(緑、５２４ｎｍ)は低コスト、超高輝度、及び大きさが小さい(small package)ことを伴う。本発明の為の比較的安価な別の光源は、可視の、UV及び／又は赤外領域のレーザーダイオードであって良い。例えば、４００〜９００ｎｍの領域、そして更に詳細には４００〜６００ｎｍの領域のレーザーダイオードなどが用いられて良い。
【００４８】
本発明の本質を含む装置もDNA分子以外の生体分子を分析する為に用いられて良いことは当業者によって明らかであるだろう。例えば、本システムは、分離ゲル又はバッファーを換えることによって、タンパク質、炭水化物、及び脂質など生体分子を分析する為にも改変できうる。
【００４９】
本発明の検出機構はCE及び放射線が誘導する蛍光の検出と関連して、例によってそして限定を意図したものではなく記載されている。本発明は、電気泳動以外の生物分離現象に基づき分離される検体の検出、及び蛍光放射以外の放射性放射の検出にも使用できることが理解される。従って、開示された発明は単なる例示であると考えられ、添付のクレームに特定するだけの範囲で制限されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
本発明の性質及び利点の理解、並びに好適な利用の形態を十分にする為に、付随する図面に読まれる伴い次の詳細な説明が参照されるべきである。以下の図面において、参照番号は、図面全体の同じ又は類似する部分を示す。
【図１】本発明の光検出の概念を組み込むマルチチャネル生物分離システムの例の概略図である。
【図２】本発明の実施態様に従い、本発明の光学検出機構を組み込むマルチチャネルCEシステムの概略図である。
【図３】本発明の実施態様に従う、キャピラリーカートリッジに関連する光検出部の簡略図である。
【図４】入射放射線と放射検出システムの為の調節システムのブロック線図である。
【図５】本発明の実施態様に従う、放射線源を時分割する為のパルシングを示すタイミング図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521334.tif 000034
2004521334.tif 000035
【国際調査報告】
2004521334.tif 000036
2004521334.tif 000037
2004521334.tif 000038