(57)【要約】本願発明によって、標的核酸における、変更または変更がないことを検出するための方法が提供される。本発明の方法は、疾患または疾患の素因を示す変異を検出および同定することについて有用である。本発明の方法は、一連のプローブを標的核酸にアニーリングして、そして、１つのプローブがアニーリングしなければ、上記の標的核酸における変異の存在を検出し、それによって、分解を受ける一本鎖のストレッチの核酸を露出させることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルの中で存在すると疑われる、標的核酸における変更を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）標的核酸を含むことが疑われる生物学的サンプルに対して、該標的核酸の領域が変更のない場合に該領域に連続的にハイブリダイズする複数の一本鎖ペプチド核酸を添加する工程；
ｂ）生物学的サンプルに対して、一本鎖核酸を分解する薬剤を添加する工程；
ｃ）該標的核酸の該領域の中の分解から生じた、工程ａ）およびｂ）に由来する分解産物の存在として、該標的核酸における変更を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記変更が疾患関連変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患が癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸における該変更の同一性を決定する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の一本鎖ペプチド核酸のうちの少なくとも１つのメンバーが検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプル中に存在することが疑われる標的核酸が検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、蛍光タグ、放射線同位体、および分子量マーカーからなる群より選択される、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の一本鎖ペプチド核酸の各メンバーが約８〜約３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の一本鎖ペプチド核酸の各メンバーが、前記標的核酸とおおよそ等しいハイブリダイゼーション融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸が固体支持体に結合されている、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸の５’末端が前記固体支持体に結合されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸の３’末端が前記固体支持体に結合されている、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルが、組織または体液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、Ｓ１、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、およびヤエナリヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が化学的薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記変更が、ヌクレオチドの、挿入、欠失、再配置、トランジション、翻訳、トランスバージョン、および置換からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織または体液が、痰、膵液、胆汁、リンパ液、血漿、尿、髄液、精液、唾液、母乳、膿、生検組織、胎児細胞、および羊水からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織または体液が便サンプルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記変更が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記変更が、遺伝性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記変更が外因性サンプルにおける部分集団として存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の一本鎖ペプチド核酸のうちの少なくとも１つのメンバーがドナーを有する末端およびクエンチャ−を有する末端を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、以下の工程：
ｄ）生物学的サンプルを希釈する工程；および
ｅ）該生物学的サンプルを別個のサンプル分画に分離する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルの中で存在すると疑われる、標的核酸における変更を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）標的核酸を含むことが疑われる生物学的サンプルに対して、該標的核酸の領域が変更のない場合に、該領域にハイブリダイズする複数のプローブを添加し、その結果、ギャプによって隣接するハイブリダイズされたプローブを分離される、工程；
ｂ）該生物学的サンプルに対して、該ギャップのサイズよりも長い、一本鎖核酸を分解する条件下で、薬剤を添加する工程；
ｃ）該標的核酸の該一本鎖領域の中の分解から生じた、工程ａ）およびｂ）に由来する分解産物の存在として、該標的核酸における変更を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
生物学的サンプルの中で存在すると疑われる、多型標的核酸における変更を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）多型標的核酸を含むことが疑われる生物学的サンプルに対して、複数のプローブを添加する工程であって、該複数のものは、該標的核酸の多型性改変体の各々に対して相補的であるプローブを含み、その結果、前記標的核酸の領域が変更のない場合に、該プローブが該領域に連続的ハイブリダイズする、工程；
ｂ）該生物学的サンプルに対して、一本鎖核酸を分解する薬剤を添加する工程；
ｃ）該標的核酸の該領域の中の分解から生じた、工程ａ）およびｂ）に由来する分解産物の存在として、該標的核酸における変更を検出する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、標的核酸における変更を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多くの疾患が、ゲノムの不安定性に関連する。その結果、不安定性マーカが、診断剤として提案されてきた。例えば、変異は、種々の疾患についての価値あるマーカーであると考えられ、そして、スクリーニングアッセイについての基礎を形成してきた。特定の変異が、特定の型の癌における初期ステージの分子スクリーニングアッセイについての基礎であり得る。例えば、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１０２〜１０５（１９９２）を参照のこと。例えば、ＢＲＣＡ遺伝子における変異は、乳癌のマーカーとして提案さてきており、そしてｐ５３細胞周期調節遺伝子における変異は、多くの型の癌の発生に関連してきている。
【０００３】
初期の変更の検出によって、初期の疾患診断が可能になり、従って、この検出によって、治癒が容易に得られない場合、転移後にしばしば生じて疾患の症状が提示される前の介入に処置する対して、その達成方法を提供する。しかし、遺伝的変異または他の変更の検出は、特定のサンプル型においては、困難あるか、または不可能である。例えば、複雑な異種サンプルからＤＮＡを単離することの困難性によって、初期ステージの変異の同定を困難にする。
【０００４】
従って、生物学的サンプル中の標的核酸における、特定の遺伝的変異または他の変更の存在または非存在を決定するための効率的な方法に対して当該分野において必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ０９／８０９，７１３（２００１年３月１５日出願）おおよびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／９８８，４９１（２００１年１１月２０日出願）（これらの開示は、本明細書中において全体が参考として援用される）の優先権およびその利益を主張する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、生物学的サンプル中の標的核酸における変更を検出する方法を提供する。本発明に従って、野生型標的ＤＮＡの連続した領域に対して相補的な一連の核酸プローブが、標的を含むことが疑われるサンプルに対して曝露される。プローブは、連続的な様式でこの標的に対してハイブリダイズして、この標的およびこの標的にそって「タイル化（ｔｉｌｅ）」した連続したプローブを含む二重鎖を形成するように設計される。この二重鎖の例は、図１に示される。変異または他の変更がこの標的において存在する場合、連続的なタイル化（ｔｉｌｉｎｇ）が中途妨害され、二重鎖が存在しない一本鎖標的の領域を生じる。これは、図２に示されいる。この標的における１以上の一本鎖領域の同定によって、その領域におけるプローブのハイブリダイゼーションを妨げる、標的における変異または他の変更が示される。本発明の目的のために、「タイル化配列（ｔｉｌｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ））」または「タイル化」は、一本鎖配列によって分離されていても、分離されていなくても、標的領域に対するプローブの連続的なハイブリダイゼーションをいう。
【０００７】
従って、本発明の方法において、一本鎖標的核酸を含むサンプルが複数の核酸プローブに曝露される。好ましい実施形態において、複数のプローブは、それらの標的の異なる位置に相補的なプローブを含み、その結果、野生型標的との複数のメンバーとのハイブリダイゼーションによって、この標的が野生型標的である場合に、この標的配列の少なくとも一部分にそって連続した一連のプローブを生じる。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブは、標的核酸にハイブリダイズするために使用され得る。連続鎖を形成するために一連のプローブを連結することは、必ずしも必要ではないが、ライゲーション（連結）が、使用者の判断で実施され得る。
【０００８】
標的が野生型配列であるときに、プローブがタイル化される領域において一本鎖部分は存在し得ない。しかし、変異または他の変更が、プローブが指向される標的の領域に存在する場合に、１以上のプローブがハイブリダイズできないため、標的領域の１以上の一本鎖部分を生じ得る。この一本鎖領域の同定は、本発明に従う場合、その標的おける変異または変更についてのポジティブアッセイ（陽性アッセイ）である。
【０００９】
好ましい実施形態において、標的における変異を示す一本鎖領域は、この標的を、プローブハイブリダイゼーションの後で、一本鎖核酸を選択に切断する薬剤に曝露することによって検出される。変異した標的において、本発の方法は、１より多い「タイル化」した二重鎖を標的領域中に生成する。複数の二本鎖タイル化した二重鎖は、任意のプローブがハイブリダイズをできなかった一本鎖領域におけるその領域の切断から生じる。一本鎖核酸を選択的に切断または分解する多くの切断酵素が公知である（例えば、Ｓ１、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、およびヤエナリヌクレアーゼ）。選択的な切断試薬または分解試薬に対する曝露に基づく、標的および連続したタイル化プローブを含む単一の連続した二重鎖の同定によって、野生型（変異していない）標的領域が示される。あるいは、切断の生成物が測定され、例えば、この生成物の分子量が、単一の連続した二重鎖から期待される分子量と異なるか否かが決定される。
【００１０】
本発明に従って、一本鎖核酸が生成され得、当該分野で公知の標準的な方法によってその標的を形成し得る。このような方法は、二本鎖核酸を変性させる工程および／またはインビトロの酵素で触媒された反応中で一本鎖核酸を生成する工程を包含し、ここで、過剰な１つの鎖が生成される。好ましい方法は、固体支持体または半固体支持体上に一本鎖の標準的標的核酸を捕捉する工程を包含する。
【００１１】
また、好ましい実施形態において、上述のアッセイは、複数の標的を同時に問い合わせるために多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）される。その結果、特定の変異した標的を同定するために特定の二本鎖切断産物を探索し得るか、あるいは、複数の切断生成物（これは、上述のように、「タイル化標的」における介在性の一本鎖領域から生じる）を問合された標的のうちの１つにおける変異の証拠として容易に同定し得る。例えば、その各々が癌における変異についての所謂「ホットスポット」を含む複数の標的は、問合され、タイル化後の、一本鎖標的領域の生成は、癌または前癌状態についてのポジティブスクリーニングを生じるのに十分である。
【００１２】
また、さらに別の好ましい実施形態において、異種サンプルは、緩衝液、例えば、サンプル緩衝液またはアッセイ緩衝液を添加することによって希釈され、次いで、この希釈されたサンプルは、画分に分離される。好ましい画分は、オリジナルの異種サンプルからの平均１〜５核酸分子を含む。別個のサンプル画分は、好ましくは、例えば、ＰＣＲによって増幅され、これによって、標的核酸の別個のサンプル画分の各々を濃縮する。結果として、各別個の画分は、オリジナルの異種サンプルに存在する核酸分子のサブセットについて濃縮された。従って、この野生型配列に相補的なプローブが、別個のサンプル画分の各々に添加された場合に、これらの別個の画分のうちの１つにおいて濃縮された変異が、増強されたシグナルとして検出され得る。このような方法が、例えば、そのサンプル中でまれに起こる事象を検出するために使用され得る。
【００１３】
本発明の方法はまた、標的の末端における非ハイブリダイズ領域を検出するのに有用である。標的が野生型標的であるときに、末端のタイルがハイブリダイズする標的の領域において変異が生じる場合に、一本鎖末端の得られた分解によって、上述したように、介在性の一本鎖領域を示す複数の二重鎖産物は生成されない。代りとして、末端の１本領域は切断されるか、または分解され、インタクトな標的のタイル化された部分が放出される。その場合、末端の変異は、そのタイル化された標的の推定分子量の低下によってか、またはその分解剤（例えば、エキソヌクレアーゼ）の活性によって同定される。
【００１４】
あるいは、標的の末端における変異または他の変更はまた、その標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を評価することによって検出され得る。本発明の方法に従って、その標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、同じそれぞれの末端によって固体支持体に結合され；例えば、その標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、その５’末端で固体支持体に結合される。従って、その標的の結合されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、溶液中で問合される。例えば、センス鎖の未結合の３’末端における末端の変異は、検出されないが、その変異は、そのアンチセンス鎖の結合された５’末端の近くの変異部位から切断される二重鎖を提供する。その固体支持体が除去され、そしてアンチセンス鎖から切り離された二重鎖は依然として溶液中に残ると、変異が検出される。センス鎖のみが試験された場合、この変異が検出されず、従って、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を試験することより、これらの鎖のうちの１つに基づく末端変異によって生じる偽陰性が回避される。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、変更に対して偽陽性として既知の多型を検出することを避ける方法を提供する。１以上の多型が、標的核酸の領域において存在し得る。その場合、複数のプローブが、その標的領域に存在することが既知である多型改変体の各々に対してハイブリダイズするように設計される。その標的内に存在するこの多型改変体に相補的なプローブは、その多型の領域にハイブリダイズする。関連する多型に相補的な改変体の範囲を提供することによって、この多型領域が「タイル化」され、そして、検出される任意の陽性シグナルが、標的核酸上の関連する多型の外の変更の存在を示すことを確実にする。
【００１６】
本発明の方法はまた、標的核酸上の１以上の多型の、集団内での、存在を検出するのに有用である。複数の核酸プローブが、多型を含む標的配列の第１の改変体に相補的であり、その結果、多型改変体を含む、この標的と複数のメンバーとのハイブリダイゼーションは、標的のうちの少なくとも一部分に沿った連続した一連のプローブを生じる。１以上の他の多型改変体が、プローブが標的に指向される領域において存在する場合に、そのプローブのうちの少なくとも１つが、他の多型改変体の部位にハイブリダイズできない。ハイブリダイゼーション後に、その標的領域の一本鎖部分は、例えば、第２の多型改変体の部位で、露出される。選択的に一本鎖核酸を分解する薬剤に対する露出に基づいて、この多型改変体は、例えば、第２の多型改変体の部位から切出された二重鎖を提供する。従って、切断産物の検出は、標的における、変更についての陽性アッセイ（この場合、１以上の他の多型改変体）である。
【００１７】
別の局面において、プローブは、ギャップが１以上のハイブリダイズしたプローブを互いから分離するように標的にハイブリダイズするために設計される。本発明のこの局面に従って、一本鎖標的核酸を含むサンプルが、複数の核酸プローブに曝露される。この複数のものは、その標的核酸上の異なる位置に対する相補的なプローブを含み、その結果、その複数のうちのメンバーと野生型標的とのハイブリダイゼーションは、少なくとも一部分の標的配列に沿った、一連のプローブを生じ、そのうちのいくつかはギャプによって分離され得る。従って、好ましいギャプ分離は、そのプローブよりも短い（すなわち、このプローブはそのギャップより多くの塩基対を有する）。好ましくは、それらのギャップは、分解剤がそのギャップで切断することを防ぐほどに十分な短さである。好ましい実施形態において、これらのギャップ分離は、約１塩基対と約３塩基対との間の長さに及ぶ。あるいは、ギャップは、約３塩基対と約１５塩基対との間の長さであり得る。本発明に従って、検出アッセイは、複数のプローブを使用して実施され得、それらのプローブのいくつかがギャップによって分離され、そして、そのプローブのうちのいくつかはその標的核酸に対してハイブリダイズされていない場合は、分離されない。
【００１８】
本発明のこの局面に従って、選択される分解剤あるいはその薬剤とともに使用される条件によって、一本鎖分離ギャップにおける標的核酸は切断されない。いくつかの実施形態において、任意の一本鎖ギャップ分解を回避するより緩い分解条件が使用され得る。例えば、使用される分解剤単位の数は、タイル間の一本鎖ギャップ分離を維持するのに適切な温度および時間で実施される。この分解剤の条件は、同時に、１以上のプローブが標的における変更に起因してハイブリダイズできない大きい一本鎖領域を分解する。このギャップ分離が分解されないので、プローブ間のギャップ分離によって生じる偽陽性は回避される。しかし、この条件が、このプローブがハイブリダイズしない標的領域の分解を可能にし、そして、偽陽性を回避する。従って、本発明に従って、標的核酸における変更についての陽性アッセイは、標的にハイブリダイズするギャップ分離相補プローブを含み得る。ギャップがプローブ間に存在する場合に、この選択された分解剤は、使用された薬剤の単位、温度および露出時間が選択されて、一本鎖ギャップ分離を維持し、かつプローブがハイブリダイズしない一本鎖変更領域を同時に切断する条件を提供する。立体的な阻害がまた、ギャップでの切断を防ぐのに使用され得る。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、このプローブは、これらのプローブの隣接するハイブリダイズしたプローブが、安定化効果を生み出すことを妨害するように設計され、その結果、標的核酸領域の変更部位においてプローブがハイブリダイズする。従って、これらのプローブ自体は、１以上のプローブの５’末端および／または３’末端で約１と約１０との間の塩基部位（Ａｂａｓｉｃ  ｓｉｔｅ）を含む。同様に、これらのプローブは、５’末端および／または３’末端において標的核酸とマッチせず、かつこのプローブがその相補的な標的にハイブリダイズすることを妨げない、約１と約１０との間のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド核酸を置くように変更され得る。
【００２０】
好ましい実施形態において、標的核酸は、５’末端または３’末端のいずれかで固体支持体に結合している。相補性のプローブが上述の標的の長さに沿って、タイル化される。サンプルが分解剤で処理された後で二本鎖ハイブリダイゼーション生成物が溶液中で検出された場合に、変異が示され、そして、１以上のタイル化プローブが変異に起因して標的にハイブリダイズしないことを示している。１つよりも多くの供給源由来の１以上の標的核酸は、複数の標的核酸をを固体支持体に結合させることによって同時にスクリーニングされ得る。また、本発明に従った二本鎖核酸は、例えば、昇温によって溶解され得る。
【００２１】
変異が標的核酸において検出される場合、変異の同一性は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、配列決定、質量分光器およびその他）によって決定される。
【００２２】
好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下標的ＤＮＡに相補的なプローブに曝露させ、その結果、プローブの各々は野生型標的核酸にのみハイブリダイズする。このような条件は、当該分野で周知である（例えば、２  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ，＆  Ｄａｖｉｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１０章、（第３版、２００１年）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。１つの実施形態において、各プローブのハイブリダイゼーション溶解温度は、ほぼ同じである。別の実施形態において、これらのプローブは、約８ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長の間で存在する。１つの好ましい実施形態において、各プローブは、同じ長さである（すなわち、同じ数のヌクレオチドで構成される）。
【００２３】
好ましい生物学的サンプルは、痰、膵液、胆汁、リンパ液、血漿、尿、脳脊髄液、精液、唾液、母乳（ｂｒｅａｓｔ  ｎｉｐｐｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、膿、生検組織、胎児細胞、羊水、および糞便である。
【００２４】
別の実施形態において、少なくとも１つのタイル化プローブは、検出可能な標的を含む。各プローブは、異なる検出可能な標識を含み、そして、このプローブの異なる検出を可能にする（すなわち、例えば、異なるプローブが、異なる放射線同位体、蛍光タグ、または分子量改変単位を含むヌクレオチドを含み得る）。異なるプローブ標識化は、変異の場合にその標的にアリーリングしないプローブの同定を可能にする。プローブまたはプローブのサブセットの各々は、標識され得、そして／または、全てか、または一部分の標的核酸は標識され得る。好ましい実施形態において、全てのプローブが標識される。より好ましい実施形態において、標的核酸は、固体支持体に結合され、そして、標的、プローブまたは、それらの両方のいずれかに配置されている標識は遠位にあり、好ましくは、変更の位置に対して最も遠位にある（すなわち、未結合端）。
【００２５】
別の実施形態において、その標的核酸は、変異が疑われる領域において検出可能な標識を含む。疑われる変異が標的に存在する場合、どのプローブも標的に対してハイブリダイズするものがなく、そして検出可能な標識を含む変異は、依然として一本鎖である。一本鎖核酸を切断する薬剤に曝露されると、この一本鎖は、その標的から分解される。分解生成物中の標識の非存在は、検出可能な標識の領域における変異の存在を示す。
【００２６】
別の実施形態において、クエンチャーは、１つの末端に位置付けられ、そして、レポーターが、各プローブの他の末端に位置付けられ、その結果、１つのプローブのハイブリダイゼーションの非存在は、クエンチされない隣接プローブのレポーター生じる。従って、変更は、レポーターのシグナルで検出される。このレポーターは、蛍光プレートリーダーを介してか、また、あるいは、蛍光検出装置が備えつけられたゲル装置をを用いて検出され得る。
【００２７】
さらに別の実施形態において、触媒が、１つの末端に位置付けられ、そして、インヒビターがそれらの各プローブの他の末端に位置付けられ、その結果、１つのプローブのハイブリダイゼーションの非存在によって、無抑制触媒の曝露を生じる。従って、無抑制触媒によって触媒作用を及ぼされた酵素の添加によって生成される、シグナル（例えば、蛍光）により、変更が検出される。酵素はシグナルの酵素増幅を触媒し得る。
【００２８】
さらに別の実施形態において、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が、本発明に従って使用され得る。ドナー色素分子およびアクセプター色素分子は、標的核酸に沿った異なる点および／または標的サンプルに相補的な１以上プローブに沿った異なる点で、結合し得る。ＦＲＥＴに従って、ドナー色素分子が、アクセプター色素分子からの距離で光励起され、蛍光がこのドナーから生じる。距離が長くなると、蛍光は、ドナーから排他的に生じる。ドナー色素分子とアクセプター色素分子との間の空間が小さくなるので、蛍光はアクセプター色素分子に移動し；このアクセプター色素分子に移動した蛍光は、距離が減少するに従い増大する。ドナー色素分子からアクセプター色素分子へのいくつの蛍光源における移動によって、例えば、蛍光の強度または波長の変化に起因する検出シグナルを提供する。
【００２９】
変更の同定手段（例えば、プローブ標識化、例えば、固体支持体に対するプローブ調製を含む）、疾患関連変異、サンプル供給源、分解剤、および他の実施形態ならびに例示的な実施例が、本明細書中に開示される変更検出法の全てに適用され得る。例えば、蛍光標識プローブは、連続様式で標的に対して標的にハイブリダイズし得、この蛍光標識プローブは、ギャップによって分離され得、またはその蛍光標識プローブが標的内に存在する多型改変体に対して相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）であり得る。別の実施形態において、固体支持体に結合する標的は、プローブに曝露され得る：これは、連続様式でこの標的にハイブリダイズし、ギャップ分離を伴って標的にハイブリダズするか、または標的に存在する多型改変体にハイブリダイズする。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、異なる患者サンプルは、患者サンプルの異なる画分、またはそれらの組み合わせは、同時に、例えば、本発明の方法を使用して、マルチウェルプレートのような二次元アレイにおいて分析される。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明の方法は、疾患（例えば、Ｋ−ＲＡＳ、ｐ５３、ＡＰＣ、ＤＣＣ、またはＢＡＴ２６）に関連する遺伝子座で変異を検出する工程を包含する。好ましい実施形態において、この変異は、癌（例えば、結腸癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、またはリンパ腫）に関連する。
【００３２】
本発明の特定の実施形態の詳細な説明は、以下に提供される。本発明のさらなる局面および利点は、以下の図面、明細書、および特許請求の範囲を考慮することに基づくことにより明らかである。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ゲノム不安定性を示す標的核酸中の遺伝的変更を検出するための方法を提供する。例えば、本発明の方法は、変異または疾患（例えば、癌および他の病理学的な遺伝的状態、障害または症候群）に関連する他の変更を検出および／または同定するために有用である。このような変異としては、ヌクレオチドの挿入、欠失、再編成、転移、翻訳、トランスバージョン、多型および置換が挙げられる。本発明は、遺伝した変異または他の変更（例えば、誘導されたかまたは自然発生的な散在性の変異）を同定するために使用され得る。しかし、一般に、変更としては、標的核酸中の任意の変化（例えば、変異、異型接合性の喪失またはゲノム不安定性の他の印）が挙げられる。
【００３４】
本発明の方法は、複数のプローブの使用に依存しており、各プローブは、一本鎖核酸を含み、そして各プローブは、標的核酸の連続領域の異なる部分に相補的である。本発明に従って、各プローブは、標的核酸上のその相補的領域とハイブリダイズする。変異も他の変更も標的中に存在しない場合、複数のプローブは、標的領域の長さにわたって、連続「タイル」を形成する。標的の一部が変異または他の変更を含む事象において、この標的は、その領域において一本鎖のままである。なぜなら、その他の点で相補的プローブは、変異の存在下ではハイブリダイズできないからである。一本鎖領域の同定は、変異または他の変更を示す。
【００３５】
好ましい実施形態において、変異または他の変更を示す一本鎖領域は、タイルされた標的を、一本鎖核酸を優先的に分解または切断する薬剤に曝露し、そして分解産物を分析することによって検出される。例示的な分解剤としては、化学的薬剤および酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＭｕｔＹヌクレアーゼ、ＭｕｔＳヌクレアーゼおよびマングマメヌクレアーゼ）が挙げられる。１本のインタクトな二本鎖核酸産物の存在は、標的核酸のいずれの領域にも変異が存在しない（すなわち、一本鎖部分の非存在に起因して、標的の切断は起こらない）ことを示す。２本以上の二本鎖産物の存在は、標的核酸の１以上の領域に変異または他の変更が存在すること（変異を含む一本鎖領域における、明らかな標的の切断）を示す。
【００３６】
本発明において有用な生物学的サンプルは、標的核酸が存在する患者由来の任意のサンプルを含む。このようなサンプルは、任意の組織、細胞または体液から調製される。生物学的細胞供給源の例としては、血球、結腸細胞、頬細胞、腟頸管細胞、子宮由来の上皮細胞、胎児細胞または生検によって獲得される組織中に存在する細胞が挙げられる。例示的な組織または体液としては、痰、膵液、胆汁、リンパ、血漿、尿、脳脊髄液、精液、唾液、乳汁吸引液（ｂｒｅａｓｔ  ｎｉｐｐｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、膿、羊水および便が挙げられる。有用な生物学的サンプルとしては、患者から単離された核酸がまた挙げられる。核酸は、当該分野で標準的な多数の方法のいずれかを使用して、任意の組織、細胞または体液から単離され得る。特定の核酸単離方法は、患者サンプルの供給源に依存する。
【００３７】
標的核酸を含む生物学的サンプルは、さらなる調製も精製もなしに、本発明の方法によって分析され得る。好ましい実施形態において、標的核酸中に存在する１以上の特定の領域は、例えば、ＰＣＲによって増幅され得る。増幅によって標的核酸を濃縮することは、サンプル中のバックグラウンドノイズを減少させることにより、正確さを改善する。
【００３８】
１つの実施形態において、この標的核酸は、固相または半固相のマトリックスに結合する。支持体結合は、異なる供給源由来の複数の核酸サンプルの同時処理およびスクリーニングを可能にし、そして液相中での分解産物の比較を可能にする。本発明における使用に適切な例示的マトリックスとしては、ニトロセルロースまたはナイロンのフィルタ、ガラスビーズ、親和性捕捉のための薬剤でコーティングされた磁性ビーズ、処理または未処理のマイクロタイタープレート、ポリマーゲル、アガロースなどが挙げられる。核酸がマトリックスに結合される方法が、使用される特定のマトリックスに依存することは、当業者に理解される。例えば、ニトロセルロースへの結合は、フィルタへの核酸の単純な吸着、そしてその後、減圧下で７５〜８０℃で２５分間〜２時間にわたってこのフィルタをベーキングすることによって達成され得る。あるいは、結合した核酸のさらなる処理を全く必要としない荷電したナイロン膜が使用され得る。アビジンでコーティングされたビーズおよびマイクロタイタープレートが使用されて、ビオチンが（例えば、ビオチン結合体化ＰＣＲプライマーの使用によって）結合された標的核酸に結合し得る。さらに、抗体が、表面を抗体でコーティングし、そして標的核酸中に抗体特異的ハプテンを組み込むことによって、上記固体支持体のいずれかに標的核酸を結合するために使用され得る。過剰な結合剤は、適切な緩衝液で洗浄することによって、結合した標的核酸から除去される。
【００３９】
本発明の実施の際に、固相または半固相のマトリックスに優先的に結合する標的核酸は、複数の核酸プローブと共にインキュベートされる。個々のプローブの長さは、８〜１００ヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態において、個々のプローブは、８〜３０ヌクレオチド長である。より好ましい実施形態において、プローブは、約１７ヌクレオチド長である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブが使用されて、標的核酸にハイブリダイズし得る。これらのプローブは、当該分野で標準的な方法によって、例えば、市販の自動化合成機を使用して、化学的に合成され得る。１以上のプローブは標識され得る。例えば、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣまたはローダミン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチンまたは他の周知の標識化化合物が、直接または間接的に結合され得る。あるいは、これらのプローブは、放射活性的に標識され得るか（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを使用する、３２Ｐでの末端標識）、または他の一般に使用される標識またはレポーター分子に結合体化され得る。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは、プローブの各々を独自に同定する分子量改変実体（ＭＷＭＥ）を用いてマークされ得る。
【００４０】
Ｓｈｕｂｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：１５３−１５８（１９９３）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、ハイブリダイゼーション反応は、異なる核酸配列を有するプローブがその相補的ＤＮＡに等価な強さでハイブリダイズする条件下で実行され得る。これは、以下によって達成される：１）等価な長さのプローブを使用すること；および２）同一の長さであるがグアノシン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が異なるプローブ間での融点（Ｔｍ）の差異を除外する１以上の薬剤の、適切な濃度のハイブリダイゼーション混合物中に含めること。従って、これらの条件下で、複数の一本鎖核酸の各メンバーのハイブリダイゼーション融点（Ｔｍ）は、ほぼ等価である。この目的のために使用され得る薬剤としては、第四級アンモニウム化合物（例えば、テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）が挙げられる。
【００４１】
ＴＭＡＣは、Ｇ−Ｃ対間の水素結合エネルギーを減少させる。同時に、ＴＭＡＣは、Ａ−Ｔ対間の水素結合の熱安定性を増大させる。これらの相反する影響は、三重に水素結合したＧ−Ｃ対と二重に水素結合したＡ−Ｔ対との間の通常の結合強度の差異を減少させる。ＴＭＡＣはまた、各プローブについての融解曲線の傾きを増加させる。一緒に、これらの効果は、単一塩基の差異が解明され得、そして非特異的ハイブリダイゼーションが最小化される点にまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが増大するのを可能にする。例えば、Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１５８５（１９８５）（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。これらの特性を示す任意の薬剤が、本発明の実行の際に使用され得る。このような薬剤は、漸増濃度の薬剤の存在下および非存在下で、異なる試験プローブについての融解曲線を決定することによって容易に同定される。このことは、標的核酸を固体マトリックス（例えば、ナイロンフィルタ）に結合させ、同一の長さであるがＧ＋Ｃ含量が異なる放射性標識プローブを、フィルタに個々にハイブリダイズさせ、このフィルタを漸増温度で洗浄し、そして各温度においてフィルタに結合した放射性標識プローブの相対量を測定することによって、達成され得る。上記のハイブリダイゼーション工程および洗浄工程中に存在する場合、異なるオリゴヌクレオチドについて、ほぼ重ね合わせ可能な、急な融解曲線を生じる任意の薬剤が使用され得る。
【００４２】
本発明の実施の際に、標的核酸およびプローブは、十分な時間にわたって、かつ特定のハイブリダイゼーションを最大化し、そして非特異的ハイブリダイゼーションを最小化するのに適切な条件下で、インキュベートされる。考慮されるべき条件としては、各プローブの濃度、ハイブリダイゼーション温度、塩濃度および無関係の核酸の存在または非存在が挙げられる。
【００４３】
各プローブの濃度は、一般に、約０．０２５〜約０．２ｐｍｏｌ／ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌの範囲である。１つの実施形態において、各プローブは、同数のヌクレオチドを含む。プローブ配列は、標的核酸配列の連続した隣接領域にハイブリダイズするように設計される。各プローブについての最適濃度は、各プローブのシグナル対ノイズの比（すなわち、特異的結合  対  非特異的結合）が、漸増濃度の標識プローブで測定される、試験ハイブリダイゼーションによって決定され得る。
【００４４】
ハイブリダイゼーションについての温度は、使用されているプローブの長さについて最適化され得る。これは、上記の融解曲線決定手順を使用して、実験的に決定され得る。最適な時間、温度、プローブ濃度、塩の型、および塩濃度のハイブリダイゼーション条件決定は、一斉に行われるはずであることが、当業者によって理解される。
【００４５】
本発明の方法に従って、タイリングプローブは、標的核酸上のその相補的な領域にのみハイブリダイズする。従って、標的核酸は、変異が存在する任意の座位で一本鎖のままである。なぜなら、この座位では、プローブがハイブリダイズしないからである。例示的な変更としては、単一ヌクレオチド多型が挙げられる。ハイブリダイゼーション後、必要に応じて、未結合のプローブが、完全に一致した標的核酸：プローブハイブリダイゼーション産物を保存する条件下で洗浄することによって除去される。洗浄条件（例えば、温度、洗浄時間、塩の型および塩濃度）は、上記のように実験的に決定される。
【００４６】
本発明の方法はまた、変更について偽陽性として検出される既知の多型を回避する。１以上の多型が標的核酸のある領域に関連する場合、複数のプローブ（各々、多型改変体の１つにハイブリダイズするように設計されている）が提供される。標的上の多型改変体に相補的なプローブは、多型の領域にハイブリダイズする。従って、この方法によれば、プローブは、多型改変体をブロックするように設計され、その結果、標的が他の点では変更されていない場合、これらのプローブは、標的核酸のある領域に連続的にハイブリダイズする。従って、各多型改変体に相補的なプローブを提供することは、多型領域が「タイルされ」、そしてこの方法によって検出される任意の一本鎖領域が、関連する多型改変体以外の変更がこの標的核酸上に存在することを示すことを確実にする。
【００４７】
別の局面において、プローブは、標的にハイブリダイズするように設計され、その結果、ギャップが、１以上のハイブリダイズしたプローブを分離する。本発明のこの局面に従って、一本鎖標的核酸を含むサンプルが、複数の核酸プローブに曝露される。複数の中には、標的核酸の異なる位置に相補的なプローブが含まれ、その結果、野生型標的との複数のメンバーのハイブリダイゼーションは、一本鎖核酸のギャップによって分離された、標的核酸の少なくとも一部に沿って、一連のプローブを生じる。これらのギャップは、プローブがギャップ分離よりも長いようにサイズ決めされる。すなわち、これらのプローブは、ギャップよりも多い数の塩基対を有する。いくつかの実施形態において、これらのギャップは、約１塩基対長と約３塩基対長との間の範囲である。あるいは、これらのギャップは、約３塩基対長と約１５塩基対長との間の範囲である。
【００４８】
本発明のこの局面に従って、選択される薬剤あるいはこの薬剤と共に使用される条件は、一本鎖ギャップ分離において、標的核酸を切断しない。いくつかの実施形態において、弱い分解剤が、一本鎖ギャップ分離の分解を回避するために選択された条件下で使用される。例えば、薬剤マングマメヌクレアーゼは、約１０分間の時間にわたって、約３７℃の温度で曝露される。ギャップ分離がプローブ間に存在する場合、選択された分解剤、使用される薬剤のユニット数、温度および曝露時間が、核酸中の一本鎖ギャップ分離を維持する（すなわち、切断しない）条件を提供するために選択される。しかし、標的中の変更に起因して１以上のプローブがハイブリダイズできない場合、選択された条件は、核酸の一本鎖領域を分解する。ギャップ分離は分解しないので、プローブ間のギャップ分離によって形成される偽陽性は回避される。しかし、これらの条件は、プローブがハイブリダイズできない場合に、標的上の一本鎖核酸領域の分解を可能にし、偽陽性を回避する。従って、本発明によれば、標的核酸中の変更についての陽性アッセイは、標的にハイブリダイズした相補的プローブを分離する、標的上の一本鎖ギャップを含み得る。
【００４９】
１つの実施形態において、標的核酸は、各個々のプローブよりも高濃度で存在し、これらのプローブのうち少なくとも１つは、例えば、分光光度計の光源からの特定の吸収波長での励起によって検出され得る蛍光標識（蛍光レポーター）によって標識される。ハイブリダイゼーション産物は、溶液から除去され、そしてこの溶液は、蛍光について評価される。標的核酸中に変異が存在しない場合、全ての標識プローブが標的核酸に結合するので、標識プローブは溶液中に残らないはずである。従って、標的核酸中に変異が存在しないことは、溶液が感知できるレベルで蛍光を発しない場合に示される。あるいは、標的核酸が固体支持体に結合している場合、分解剤に曝露された後の溶液中のハイブリダイズした核酸の蛍光は、標的核酸中に変異が存在することを示す。
【００５０】
別の実施形態において、このプローブは、放射活性的に標識されるか、または化学発光プローブが使用され、そして標的核酸中の変異の存在は、Ｘ線フィルムへの曝露によって決定される。あるいは、またはさらに、プローブは、各プローブについて独自の分子量改変実体（ＭＷＭＥ）を保有し得る。このような実体は、任意の多数の方法による相対分子量の決定によって、分離されたプローブを直接同定することを可能にする。
【００５１】
標的核酸の固定化は一般的に好ましいが、いくつかの実施形態において、タイリングプローブを溶液中の標的核酸にハイブリダイズさせることが所望され得る。溶液中のハイブリダイゼーション産物を、一本鎖核酸を優先的に分解する分解剤に曝露した後、分解産物を、当該分野の方法（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析器、クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーション捕捉などを含む）によって分析する。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）；Ｗｕ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ＩＩ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。
【００５２】
変異の検出後、変異が存在する標的核酸中の領域または遺伝子座は、標的核酸にハイブリダイズできない特定のプローブの同定によって決定され得る。例えば、１つの実施形態において、ハイブリダイゼーション産物は、一本鎖核酸を優先的に分解する分解剤での処理の際に、２つの別個の二本鎖核酸に切断される。２つの核酸は、当該分野で公知の方法に従って分離および配列決定される。次いで、標的核酸に首尾よくハイブリダイズするプローブの相対位置および正体が決定され得る。除外プロセスによって、ハイブリダイズできない１以上のプローブおよび標的核酸中のその相対位置が同定され得る。変異を有する遺伝子座は、ハイブリダイズできないプローブに相補的な、対応する野生型を有する。
【００５３】
図１は、本発明の実施形態を例示するフローチャート図を示す。図１に示されるように、標的核酸において変異が存在しないことは、その標的核酸が２つ以上の二本鎖フラグメントに切断されない場合に決定される。一般的概略において、この方法は、以下の工程を包含する：結合した標的核酸を複数のプローブに曝露する工程；この標的核酸およびプローブの混合物を、一本鎖核酸を優先的に分解する薬剤に曝露する工程；ならびにこの分解剤への曝露後にサンプル中に唯一のインタクトな二本鎖核酸産物が存在する場合に、標的核酸において変異が存在しないことを決定する工程。
【００５４】
より詳細には、標的核酸（６）は、固相または半固相マトリックス（１０）に結合される。この標的核酸は、例えば蛍光分子で標識された複数のプローブ（２）に曝露される。標的核酸（６）および複数のプローブ（２）は、最適な時間、温度、プローブ濃度、塩の種類、および塩濃度の条件下でインキュベートされる。結合エネルギーの対称性を改善することおよび各プローブについて類似した融解温度を与えることにより特異的ハイブリダイゼーションを最大化するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が使用される。これらのハイブリダイゼーション条件は、相補的なプローブのみが標的核酸にハイブリダイズすることを可能にする。次いで、この標的核酸（６）およびプローブ（２）の混合物は、一本鎖核酸を優先的に分解する分解剤に曝露される。この薬剤は、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼであり得る。
【００５５】
次いで、標的核酸およびプローブを含むハイブリダイゼーション産物（１８）は、その結合末端により溶液から取り出される。結合した標的核酸の使用は、溶液から結合した部分を取り出し（例えば、結合した標的を含有する反応混合物から上清を除去することにより）、次いでその溶液相を、変異の指標である分解産物について分析することにより、多数のサンプルを同時にスクリーニングすることを可能にする。
【００５６】
図２Ａは、本発明の実施形態を例示するフローチャート図を示す。一般的概略において、この方法は、以下の工程を包含する：変異が存在する領域を有する結合した標的核酸を複数のプローブに曝露する工程；ハイブリダイズした標的核酸およびプローブの混合物を、一本鎖核酸を優先的に分解する分解剤に曝露する工程；ならびに一本鎖領域が分解された場合に標的核酸において変異が存在することを決定する工程。
【００５７】
より詳細には、変異（２２）を含む領域を有する標的核酸（８）は、固相または半固相マトリックス（１０）に結合される。この標的核酸（８）は、例えば、蛍光で標識される複数のプローブ（２）に曝露される。この標的核酸（８）および複数のプローブ（２）は、最適な時間、温度、オリゴヌクレオチド濃度、塩の種類、および塩濃度の条件下でインキュベートされる。結合エネルギーの対称性を改善することおよび各プローブについて類似の融解温度を与えることにより特異的ハイブリダイゼーションを最大化するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が使用される。このハイブリダイゼーション条件は、相補的なプローブのみが標的核酸にハイブリダイズすることを可能にする。変異（２２）を有する領域に相補的なプローブはないので、ハイブリダイゼーションは、その領域では起こらず、そしてこの領域は、一本鎖のままである。
【００５８】
一本鎖核酸を優先的に分解する分解剤への曝露後に、ハイブリダイゼーション産物は、その結合した末端により溶液から取り出される。結合した標的核酸の使用は、結合した部分を溶液から取り出し、次いで、その溶液相を、標的核酸における変異の存在の指標であるハイブリダイズした（すなわち、二本鎖の）分解産物（２６）のセグメントについて分析することにより、多数のサンプルを同時にスクリーニングすることを可能にする。溶液中のハイブリダイズした分解産物（２６）の１つ以上のセグメントの存在は、その標的核酸が、分解剤により分解された変異（２２）を有する領域を含むことを示す。この変異は、特定の吸収波長で分光光度計において光源にその溶液を曝露すること（これにより、感知される量の、変異（２２）の指標である蛍光を発する分解産物（２６）が明らかになる）により検出される。
【００５９】
図２Ｂは、本発明の方法の実施形態を例示し、ここで変異は、標的核酸サンプル中に存在しない。この実施形態において、この標的核酸は、固相または半固相マトリックス（１０）に結合される。この標的核酸は、ギャップが１つ以上のハイブリダイズしたプローブを分離するように標的にハイブリダイズするように設計された複数のプローブ（４）に曝露される。マトリックス（１０）に対して最も遠位の領域の標的核酸にアニールするように設計されたプローブ（４）は、レポーター（１２）（例えば、放射性核種または蛍光団）で標識される。
【００６０】
標的核酸および複数のプローブ（４）は、最適な時間、温度、プローブ濃度、塩の種類、および塩濃度の条件下でインキュベートされる。複数のプローブ（４）は、標的核酸の異なる位置に対して相補的であり、その結果、野生型標的との複数のメンバーのハイブリダイゼーションは、少なくとも一部の標的核酸と共に、一本鎖核酸のギャップで隔てられた一連のプローブ（４）を生じる。結合エネルギーの対称性を改善することおよび各プローブについて類似した融解温度を与えることにより、特異的ハイブリダイゼーションを最大化するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、好ましくは使用される。これらのハイブリダイゼーション条件により、相補的なプローブのみが標的核酸にハイブリダイズすることが可能となる。
【００６１】
次いで、標的核酸およびプローブ（４）のハイブリダイゼーション産物（１８）は、薬剤あるいはこの薬剤を用いる条件に曝露され、この薬剤は、一本鎖ギャップ分離部分において標的核酸を切断しないが、１つ以上のプローブがハイブリダイズしていない一本鎖ギャップ領域を分解する。次いで、この標的核酸およびプローブを含むハイブリダイゼーション産物（１８）は、その結合した末端により溶液から取り出される。結合した標的核酸の使用は、結合した部分を溶液から取り出し、次いで溶液相を、変異の指標である分解産物について分析することにより、多数のサンプルを同時にスクリーニングすることを可能にする。溶液に残留しているレポーター（１２）が存在しないことは、その標的核酸中に変異が存在しないことを示す。
【００６２】
図２Ｃは、本発明の実施形態を例示するフローチャート図を示し、ここで変異は、サンプル中の標的核酸に存在する。この実施形態によれば、変異（２２）を有する標的核酸（８）は、固相または半固相マトリックス（１０）に結合される。この標的核酸（８）は、標的（８）にハイブリダイズするように設計された複数のプローブ（４）に曝露され、その結果、ギャップが、１つ以上のハイブリダイズしたプローブを分離し、そしてマトリックス（１０）に対して最も遠位の領域の標的核酸（８）に相補的であるように設計されたプローブが、レポーター（１２）で標識される。
【００６３】
標的核酸（８）および複数のプローブ（４）は、上記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートされる。この条件により、標的核酸の異なる位置に相補的な複数のプローブ（４）が可能となり、その結果、野生型標的との複数のメンバーのハイブリダイゼーションは、少なくとも一部の標的配列（８）と共に、一本鎖核酸のギャップにより隔てられた一連のプローブ（４）を生じる。このストリンジェントなハイブリダイゼーション条件により、相補的なプローブのみが標的核酸にハイブリダイズすることが可能となる。
【００６４】
次いで、標的核酸（８）およびプローブ（４）のハイブリダイゼーションは、薬剤あるいはこの薬剤を用いる条件に曝露され、この薬剤は、一本鎖ギャップ分離部分において標的核酸を切断しないが、１つ以上のプローブがハイブリダイズしていない一本鎖ギャップ領域を分解する。次いで、標的核酸およびプローブを含むハイブリダイゼーション産物は、その結合した末端により溶液から取り出される。溶液中に残っている、標識されたレポーター（１２）を含むハイブリダイズした分解産物（２８）の１つ以上のセグメントの存在は、標的核酸（８）における変異（２２）の存在を示す。なぜなら、変異（２２）の一本鎖領域は、分解剤により分解されていたからである。
【００６５】
以下の実施例は、便から調製されたサンプル中のＡＰＣの変異クラスター領域における変異を検出するために有用な本発明の方法を例示する。
【００６６】
（実施例１：ＡＰＣ変異クラスター領域における変異検出）
本発明の方法を使用して、ｈｔｔｐ：／／ｐｅｒｓｏ．ｃｕｒｉｅ．ｆｒ／Ｔｈｉｅｒｒｙ．Ｓｏｕｓｓｉ／ＡＰＣ．ｈｔｍｌ（２００１年２月２０日最終アクセス）において、ＡＰＣ変異クラスター領域におけるコドン１４５０でのＣ→Ｔ点変異を検出する。ＡＰＣを含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これらとしては、例えば、便サンプルが挙げられる。便サンプルの分析のために好ましい本発明の方法は、米国特許第５，７４１，６５０号および同第５，９５２，１７８号（両方とも本明細書中に参考として援用される）に教示されるように、排泄された便の少なくとも断面または周辺部分を得る工程を包含する。便の断面または周辺部分が望ましいが、本明細書において提供される方法は、排泄された便から得られた無作為のサンプル（スミアまたは切屑を含む）に対して実施される。一旦得られると、その便標本は、均質化される。均質化に好ましい緩衝液は、同時係属中の共有に係る米国特許出願第０９／４９１，０９３号（本明細書中に参考として援用される）に教示されるように、少なくとも１６ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する緩衝液である。少なくとも１６ｍＭのＥＤＴＡ、および好ましくは１００ｍＭのＥＤＴＡまたはそれより多くを使用することが、便からの核酸の収率を改善することが発見されている。従って、便均質化に好ましい緩衝液は、リン酸緩衝化生理食塩水、２０〜１００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、少なくとも１６ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに必要に応じて界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）およびプロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を含む。
【００６７】
均質化の後、核酸は、好ましくは便サンプルから単離される。核酸の単離または抽出は、本発明の全ての方法では必要とされない。なぜなら、本発明の方法は、核酸の単離なしで均質化された便において適切に実行され得るからである。しかし、好ましい実施形態において、均質化された便は、核酸、タンパク質、脂質、および他の細胞片を含有する上清を生成するために遠心分離される。この上清は、界面活性剤、およびタンパク質を分解するためのプロテイナーゼで処理され、そして核酸は、フェノール−クロロホルム抽出される。この抽出された核酸は、次いでアルコールを用いて沈殿される。他の技術を使用して、サンプルから核酸を単離し得る。このような技術としては、ハイブリッド補足、および均質化された便からの直接的な増幅が挙げられる。核酸は、使用されるスクリーニングアッセイに必要とされる程度まで精製および／または単離され得る。
【００６８】
次いで、核酸は、ストレプトアビジンでコーティングされたＤｙｎａｌビーズ（これが、固相マトリックスを提供する）と混合される。核酸およびビーズの混合物は、ボルテックスされ、そしてインキュベートされ、これによりビーズを核酸に結合する。この核酸は、ＰＣＲにより増幅され得、このＰＣＲは、結合緩衝液および洗浄緩衝液と混合される核酸テンプレートを必要とする。この核酸混合物をボルテックスする。その上清を取り出し、そして緩衝液を加える。次いで、これらの工程を、多数回繰り返す。
【００６９】
既知のＡＰＣ変異クラスター領域の保存領域に相補的であるように設計された核酸プローブを使用する。このプローブは、長さが均一であり、そして蛍光標識される。このプローブおよびコドン１４５０に点変異を含む標的核酸は、ハイブリダイゼーション選択性を最大にする条件下でインキュベートされる。プローブ融解温度の不均衡がなくなり、ハイブリダイゼーション温度、時間、プローブ濃度、塩の種類および塩濃度の条件の適切な組合せが使用される場合、選択性が改善される。ＴＭＡＣは、ハイブリダイゼーション選択性を改善するように選択される薬剤である。
【００７０】
プローブは、ＡＰＣ変異クラスター領域におけるコドン１４５０での変異を検出するように設計される。これらの選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、変異クラスター領域における単一の変異の存在は、相補的プローブがハイブリダイズすることを妨害し、その結果この領域の部分は、一本鎖のままである。
【００７１】
連続的な相補プローブは、野生型ＡＰＣ変異クラスター領域にハイブリダイズするように設計され、こここでその領域の５’末端は、
【００７２】
【化１】
2004521630.tif 000002
である。
【００７３】
この実験において、各プローブは、１７個のヌクレオチドを含み、そしてコドン１４５０の領域のために設計された相補的プローブの５’末端は、
【００７４】
【化２】
2004521630.tif 000003
である。コドン１４５０点変異領域の上流の相補的プローブは、
【００７５】
【化３】
2004521630.tif 000004
である。１４５０点変異領域の下流の相補的プローブは、
【００７６】
【化４】
2004521630.tif 000005
である。これらのプローブ、および変異クラスター領域におけるコドン１４５０において点変異を含む標的核酸サンプルは、ハイブリダイゼーション選択性を最大にする条件下でインキュベートされる。野生型領域に対して相補的なプローブ（配列番号２）は、コドン１４５０における点変異（コドン１４５０点変異におけるＣ→Ｔ）を含む配列
【００７７】
【化５】
2004521630.tif 000006
にハイブリダイズしない。コドン１４５０における点変異は、ハイブリダイゼーションを防止し、そして変異を含むＡＰＣ領域の部分は、一本鎖のままである。
【００７８】
ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしていないプローブは、核酸：プローブハイブリッドを保存する、時間、温度、塩の種類、および塩濃度の条件下で、核酸混合物を洗浄することにより除去される。酵素Ｓ１への曝露により、相補的プローブがハイブリダイズしていない、コドン１４５０における点変異を含む一本鎖領域において標的核酸は切断される。
【００７９】
分解産物は、ゲル電気泳動により分離され、そして分光光度計を使用して分析される。変異の存在は、適切な分光光度計の波長で励起される際に蛍光を発する二本鎖核酸を各々が含む１つ以上の分解産物の存在により検出される。
【００８０】
（実施例２：コドン１４９３における多型改変体をブロックするプローブ）
一般的に、一塩基多型は、１，０００個のヌクレオチド塩基対を有する各々の領域に関連する。本発明の方法によれば、関連する多型改変体は、関連する多型が「ブロックされ」、そしてその他の変更が検出され得るようなプローブ設計の因子となる。
【００８１】
多型改変体を、標的核酸に対する偽陽性として検出することを回避することが可能である。このことは、このような標的に対する新規な変更検出のための機会を提供する。図３は、新規な検出を可能にする、ＡＰＣ変異クラスター領域のコドン１４９３におけるＧ→Ａ多型をブロックするするために使用される本発明の方法を図示する。
【００８２】
関連する多型を含む任意の生物学的サンプルが使用され得る（例えば、組織サンプル、便サンプルまたは血液サンプル）。この分析のために、６個体からの血液サンプルを別々に試験した。このサンプルセットは、コドン１４９３において多型改変塩基を含んでいた。この実験におけるコントロールの目的のために、図３に例示される分析を行う前に６個体のサンプルに対して遺伝子型配列決定を行った。コントロール配列により、試験されるサンプルセットが、２つのＧ塩基を有する２つのホモ接合個体、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つのホモ接合個体、ならびに２つのＡ塩基を有する２つのホモ接合個体を含むことが確認された。
【００８３】
各個体のサンプルを、以下のように分析した。核酸を、各個体血液サンプルから抽出した。次いで、この核酸を、磁気ストレプトアビジンコーティングしたＤｙｎａｌビーズ（これは、固相マトリックスを提供した）と混合した。この核酸およびビーズの混合物をボルテックスし、そしてビーズをこの核酸に結合させるためにインキュベートした。その後、この核酸をＰＣＲにより増幅し、このＰＣＲは、結合緩衝液および洗浄緩衝液と混合される核酸テンプレートを必要とした。ＰＣＲプロセスの間、逆方向ＰＣＲプライマーを、ビオチン化した。このＰＣＲ産物を、変性して一本鎖にした。この核酸混合物をボルテックスした。上清を除去し、そして緩衝液を加えた。
【００８４】
核酸プローブを、ＡＰＣ変異クラスター領域のコドン１４９３における多型改変体を含む標的核酸に相補的であるように設計した。このプローブは、長さが均一であり、１７塩基対長である。プローブを、ハイブリダイゼーション後に、標的核酸の自由末端（すなわち、標的核酸のビーズに結合していない末端）から２番目に位置付けられるプローブがＰ３２レポーターをその５’末端に有するように設計する。このプローブおよび標的核酸を、５９℃で１時間ハイブリダイズする。このハイブリダイズ溶液は、３モルの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）；５×のＤｅｎｈａｒｄｔｓ溶液；０．０４ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ；この混合物の０．１％のＳＤＳ；および約０．０４マイクロモルと約０．６４マイクロモルとの間のプローブ混合物の混合物であった。この管を、磁気ビーズを引きつける磁石に曝し、そしてこのビーズに結合した標的核酸を保持し、上清を除去する。
【００８５】
ハイブリダイゼーション後、核酸：プローブハイブリッドを保存する条件下でこの核酸混合物を洗浄することにより、ハイブリダイズしていないプローブを除去した。ハイブリダイゼーション溶液を、時間および温度の条件を変化させて連続した回数洗浄した。この洗浄溶液は、３モルの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ）；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）；およびこの混合物の０．１％のＳＤＳを含んでいた。各洗浄後、この管を磁気ビーズを引きつける磁石に曝し、そしてこのビーズに結合した標的核酸を保持し、そして上清を除去する。第１の洗浄の際に、ハイブリダイゼーション溶液を、５９℃で１５分間洗浄溶液と混合した。その後、第２の洗浄の際に、このハイブリダイゼーション溶液を、室温（約２２℃）で１分間洗浄溶液と混合した。第３の洗浄の際に、このハイブリダイゼーション溶液を、室温（約２２℃）で約１分間洗浄溶液と混合した。
【００８６】
試験管中で、切断反応系１マイクロリットルあたり５０ｍＭの酢酸ナトリウム、２８０ｍＭのＮａＣｌ、および４．５ｍＭのＺｎＳＯ４を含有する緩衝液中で、標的核酸を、１μｌあたり０．０１５単位の酵素Ｓ１に、３０分間室温（約２２℃）で曝露した。この反応系は、１００マイクロリットルの反応系である。酵素Ｓ１への曝露により、標的核酸の任意の一本鎖領域が切断される。この管を、磁気ビースを引きつける磁石に曝し、そしてこのビーズに結合した標的核酸を保持する。上清をピペットによりこの管から取り出し、そして負荷色素（ｌｏａｄ  ｄｙｅ）と混合する。
【００８７】
上清を、１，２００ボルト時間の速度で６％の非変性アクリルアミドゲルで泳動する。このゲルを、放射能を収集する即時画像装置に曝す。フラグメントのサイズについてこのゲルを分析し、そして標的核酸中の任意の切断を、ゲル上の生成物のサイズによって決定し得る。
【００８８】
図３を参照して、泳動１は、試験された６つのサンプルが、コドン１４９３がＧである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝された場合の実験結果を示す。これらの６つのサンプルは、２つのＧ塩基を有する２つの個体、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体、ならびに２つのＡ塩基を有する２つの個体を含む。２つのＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプルを参照して、ゲル上の生成物は、薬剤Ｓ１への曝露が、標的を切断しなかったことを示す。標的核酸は、切断されなかった。なぜなら、コドン１４９３がＧである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブは、２つのＧ塩基を有する２つの個体の標的核酸にハイブリダイズしたからである。泳動１を再び参照して、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプルは、コドン１４９３がＧである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝された。このプローブは、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体のＧ改変体にハイブリダイズした。しかし、コドン１４９３がＡである標的サンプルの多型改変体に対してプローブはハイブリダイズせず、そして薬剤Ｓ１に曝した際に、コドン１４９３の一本鎖領域は切断されて、ゲル上で生成物を生成した。最後に、泳動１において、２つのＡ塩基を有する２つの個体由来のサンプルを、コドン１４９３がＧである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝した。２つのＡ塩基を有する２つの個体の多型改変体に対して、プローブはハイブリダイズせず、そして薬剤Ｓ１への曝露は、その標的を多型改変体の領域で切断し、ゲル上で生成物を生成した。
【００８９】
図３を参照して、泳動２は、試験された６つのサンプルが、コドン１４９３がＡである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝された場合の実験結果を示す。同様に、これらの６つのサンプルは、２つのＧ塩基を有する２つの個体、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体、ならびに２つのＡ塩基を有する２つの個体を含む。２つのＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプルを参照して、ゲル上の生成物は、薬剤Ｓ１への曝露が、多型改変体の領域で標的を切断し、ゲル上に生成物を残すことを示す。標的核酸は、切断された。なぜなら、コドン１４９３がＡである多型改変体を含むプローブは、２つのＧ塩基を有する２つの個体の標的核酸にハイブリダイズできなかったからである。泳動２を再び参照して、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプルは、コドン１４９３がＡである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝された。このプローブは、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体のＡ改変体にハイブリダイズした。しかし、コドン１４９３がＧである標的サンプルの多型改変体にプローブはハイブリダイズせず、そして薬剤Ｓ１に曝された際に、コドン１４９３の一本鎖領域が、切断されて、ゲル上で生成物を生成した。最後に、泳動２において、２つのＡ塩基を有する２つの個体由来のサンプルは、コドン１４９３がＡである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブに曝された。ゲル上の生成物は、薬剤Ｓ１への曝露が標的を切断しなかったことを示す。標的核酸は、切断されなかった。なぜなら、コドン１４９３がＡである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブが、２つのＡ塩基を有する２つの個体の標的核酸にハイブリダイズしたからである。
【００９０】
図３を参照して、泳動３は、試験された６つのサンプルが、２つの異なるプローブのセット（一方は、コドン１４９３がＡである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブ、もう一方は、コドン１４９３がＧである多型改変体に相補的であるように設計されたプローブ）に曝された場合の実験結果を示す。同様に、これらの６つのサンプルは、２つのＧ塩基を有する２つの個体、Ａ塩基およびＧ塩基を有する２つの個体、ならびに２つのＡ塩基を有する２つの個体を含む。泳動３を再び参照して、多型改変体Ａおよび多型改変体Ｇの両方に相補的であるように設計されたプローブセットへの曝露は、全ての６つのサンプルにおけるコドン１４９３領域のブロッキングに成功する。従って、両方の多型改変体プローブが、試験された標的核酸における多型改変体を好首尾にブロックし、そして本発明の方法に従って、標的上の任意の他の変更が、検出され得る。
【００９１】
最後に、図３を参照して、泳動４は、同様に、６つのサンプル（２つのＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプル、Ａ塩基をおよびＧ塩基を有する２つの個体由来のサンプル、ならびに２つのＡ塩基を有する２つの個体由来のサンプル）を試験した実験結果を示す。試験した６つのサンプルを、プローブにさらし、ここでプローブは、それら６つのサンプル中に存在する多型改変体に相補的であるように設計されていない。泳動４を再び参照して、薬剤Ｓ１への曝露の際に、コドン１４９３がＡである多型改変体およびコドン１４９３がＧである多型改変体の両方に対して、コドン１４９３の一本鎖領域は、切断され、ゲル上に生成物を生成する。従って、本発明の方法に従って、プローブは、ＡＰＣのコドン１４９３においてＧ→Ａの多型をブロックするように設計され得、標的核酸中の他の変更を検出し得る。
【００９２】
（実施例３：プローブレポーティング部分のシグナルによる、変異の検出）
別の実施形態において、図４Ａを参照して、一方のプローブのハイブリダイゼーションが存在しないと隣接するプローブのレポーターがクエンチされずにレポーターシグナル（３５）を生じるように、クエンチング部分（３４）を一端に配置し、レポーティング部分（３２）を各プローブ（３０）の他方の末端に配置する。従って、変更は、プローブ（３０）がその変更部位において標的にハイブリダイズできない場合に生じるレポーティング部分（３２）のシグナル（３５）によって検出される。このレポーティング部分（３２）またはレポーターは、蛍光プレートリーダーを介して検出され得るか、あるいは、蛍光検出が装備されたゲル装置を用いて検出され得る。本発明の方法において標的核酸の変異の存在または非存在を検出するために、分解剤は必要とされない。従って、連続分析は、本発明の方法を用いることによって回避され得る。
【００９３】
図４Ｂは、第２プローブ（３０）のクエンチング部分（３４）にアニーリングされた第１プローブ（３０）のレポーティング部分（３２）を示す。このクエンチング部分（３４）は、レポーティング部分（３２）のシグナル（３５）をクエンチまたは抑制する。このクエンチング部分（３４）は、そのプローブ（３０）の一方の端上のアームに結合され、そしてこのレポーティング部分（３２）は、そのプローブ（３０）の他方の端上のアームに結合され、そして各々のアームが、配列を含み得る。１つの実施形態において、クエンチング部分（３４）に結合されたアーム上の配列は、任意のレポーティング部分（３２）に結合されたアームにアニーリングされるように設計される。１つの実施形態において、アーム上の配列は、標的核酸に相補的な配列に対して、特異的ではない。各アーム上の配列は、約１塩基対と約７塩基対との間の範囲であり得る。
【００９４】
図４Ｃは、レポーティング部分（３２）およびクエンチング部分（３４）を有するプローブを用いる本発明の方法を例示するフローチャート図を示し、ここで、変異は、標的核酸中に存在しない。この方法に従って、図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、一連のプローブ（３０）が、例えば、溶液中で一緒に混合され、各クエンチング部分（３４）に結合したアームは、各レポーティング部分（３２）に結合したアームにアニーリングする。従って、各レポーティング部分（３２）は、各隣接するクエンチング部分（３４）によってクエンチされ、そして溶液中のプローブ（３０）混合物は、レポーティングシグナルを表さない。
【００９５】
従って、標的核酸（６）は、プローブ（３０）混合物にさらされて、ハイブリダイゼーション生成物（２０）を形成する。この方法に従って、ハイブリダイゼーション条件は、相補的プローブのみが標的核酸（６）にハイブリダイズすることを可能にする。ハイブリダイゼーション生成物（２０）がいかなるシグナルも示さない場合、標的核酸（６）中の変異の非存在が検出される。
【００９６】
図５は、レポーティング部分（３２）およびクエンチング部分（３４）を有するプローブを用いる本発明の方法を例示するフローチャート図を示し、ここで、変異（２２）は、標的核酸（８）中に存在する。この方法に従って、図４Ａ〜図４Ｃを参照して上記で記載されるように、プローブ（３０）の混合物が調整され、そしてこのプローブ（３０）混合物は、レポーティングシグナル（３５）を示さない。
【００９７】
従って、標的核酸（８）は、このプローブ（３０）混合物に曝されて、ハイブリダイゼーション生成物（２０）を形成する。ハイブリダイゼーション条件は、相補的プローブ（３０）のみが標的核酸（８）にハイブリダイズすることを可能にする。いずれのプローブ（３０）も、変異（２２）を有する領域に対して相補的でないので、ハイブリダイゼーションは、変異（２２）領域で生じず、そしてこの変異領域は、一本鎖のままである。プローブ（３０）が変異（２２）の領域にハイブリダイズしない場合、次いで変異（２２）を有する領域に隣接したレポーティング部分（３２）は、シグナル（３５）を表し、このシグナル（３５）は、変異（２２）の存在を示す。
【００９８】
上記に記載の実施例において、標的核酸が変異を含まない本発明の実施形態は、標的核酸が変異を含む本発明の実施形態と別々に記載される。しかし、本発明に従って、サンプルは異成分であり得、そして変異も変更もされていない標的核酸分子に加えて、変異または変更された標的核酸分子を含み得る。
【００９９】
本発明の方法は、変異も変更もされていない標的核酸を含む異成分混合物中の、変異または変更された標的核酸を検出するのに有用である。なぜなら、変異も変更もされていない核酸は、変異または変更された核酸の存在に起因してシグナルの生成を妨害することはないからである。好ましい実施形態において、本発明の検出アッセイは、本明細書中に記載される方法または当該分野で公知の方法を用いて、変異または変更された標的核酸が富化されたサンプルまたはサンプル画分に対して実行される。
【０１００】
（等価物）
本発明が、本発明の精神または基本的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って、上記の実施形態は、本明細書中に記載される本発明に対する限定というよりも、全ての事項において本明細書中に記載される本発明の例示とみなされるべきである。従って、本発明の範囲は、上記の説明よりも、添付の特許請求の範囲によって示され、そしてその特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内に入る全ての変更は、その特許請求の範囲の中に含まれることが意図される。
【０１０１】
（参考としての援用）
上記の本明細書中に言及される全ての特許、特許出願、および科学刊行物は、その全体が本出願に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、標的核酸サンプル中の変異の非存在を検出する、本発明の方法の１実施形態を例示するフローチャートの図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、標的核酸サンプル中の変異の存在を検出するための、本発明の方法の１実施形態を例示するフローチャートの図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、標的核酸サンプル中の変異の非存在を検出するための、本発明の方法の別の実施形態を例示する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、標的核酸サンプル中の変異の存在を検出するための、本発明の方法の別の実施形態を例示するフローチャートの図を示す。
【図３】図３は、多型改変体プローブが、標的核酸サンプルの多型改変体をブロックするために選択的に使用される、ゲルからの結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、レポーティング部分およびクエンチング部分を有するプローブを例示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、第二のプローブのクエンチング部分にアニールした図４Ａの第一のプローブのレポーティング部分を例示する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、標的核酸サンプル中の変異の非存在を検出するための、本発明の方法の別の実施形態を例示するフローチャートの図を示す。
【図５】図５は、標的核酸サンプル中の変異の存在を検出するための、本発明の方法の別の実施形態を例示するフローチャートの図を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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