(57)【要約】新規な抗原線維形成性薬剤および同物質を含む組成物、アミロイド原線維形成を抑制するために抗原線維形成性薬剤および組成物を使用する方法、ならびに例えば、アルツハイマー病および糖尿病の進行を防ぐまたは遅らせるための効果的治療法について開示する。2004517050.tif 000053
2004517050.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2004517050.tif 000042
、それの異性体、それの逆もしくは逆−反転異性体、それのペプチド様作用物質またはそれの塩からなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための抗原線維形成性薬剤。
【請求項２】
ペプチドが
2004517050.tif 000043
である、請求項１記載の抗原線維形成性薬剤。
【請求項３】
ペプチドが
2004517050.tif 000044
である、請求項１記載の抗原線維形成性薬剤。
【請求項４】
薬剤がペプチドの全−［Ｄ］異性体である、請求項１記載の抗原線維形成性薬剤。
【請求項５】
薬剤がペプチドの全−［Ｌ］異性体である、請求項１記載の抗原線維形成性薬剤。
【請求項６】
薬剤がペプチドの［Ｌ］異性体および［Ｄ］異性体の混合物を含む、請求項１記載の抗原線維形成性薬剤。
【請求項７】
ペプチドが
2004517050.tif 000045
；それの異性体、それの逆もしくは逆−反転異性体、それのペプチド様作用物質またはそれの塩からなる群より選択される配列を含む、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチド。
【請求項８】
ペプチドが
2004517050.tif 000046
である、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドが
2004517050.tif 000047
である、請求項７記載のペプチド。
【請求項１０】
ペプチドが
2004517050.tif 000048
からなる群より選択される配列に結合し、該結合において、原線維形成および／またはアミロイドーシスが阻止される、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチド、それの異性体、それの逆もしくは逆−反転異性体、それのペプチド様作用物質、またはそれの塩。
【請求項１１】
配列が
2004517050.tif 000049
である、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
配列が
2004517050.tif 000050
である、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１３】
アミロイドーシスがＩＡＰＰ関連である、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１４】
アミロイドーシスがＩ型またはＩＩ型糖尿病である、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体と連合して請求項７記載のペプチドの治療的有効量を含む、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための組成物。
【請求項１６】
化合物が請求項７記載のペプチドと結合する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための化合物。
【請求項１７】
化合物が結合するまたはそのペプチドの発現を制御する酵素である、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
化合物がそのペプチドに結合する抗体である、請求項１６記載の化合物。
【請求項１９】
抗体がそのペプチドに特異的に結合する、請求項１８記載の化合物。
【請求項２０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
化合物が塩である、請求項１６記載の化合物。
【請求項２２】
下記の式Ｉの複合体を含む、アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための標識された複合体：
2004517050.tif 000051
式中、ｚは０または１であり；Ａｔは請求項１記載の抗原線維形成性薬剤であり；Ａｌｎｋはリンカー部分であり；およびＡｌａｂはインビボでの画像化を可能にする標識部分である。
【請求項２３】
薬剤が全−［Ｄ］異性体ペプチドである、請求項２２記載の標識された複合体。
【請求項２４】
薬剤が全−［Ｌ］異性体ペプチドである、請求項２２記載の標識された複合体。
【請求項２５】
Ａｌａｂが放射性標識部分である、請求項２２記載の標識された複合体。
【請求項２６】
Ａｌａｂが
2004517050.tif 000052
からなる群より選択される、請求項２５記載の標識された複合体。
【請求項２７】
アミロイド沈着物がＩＡＰＰアミロイドを含む、請求項２５記載の標識された複合体。
【請求項２８】
アミロイド沈着物がＩ型またはＩＩ型糖尿病に関連する、請求項２５記載の標識された複合体。
【請求項２９】
請求項２２記載の標識された複合体の治療的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための組成物。
【請求項３０】
請求項１記載の抗原線維形成性薬剤の治療的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、患者におけるアミロイドーシス疾患の治療のための組成物。
【請求項３１】
請求項１記載の抗原線維形成性薬剤の治療的有効量を患者に投与することを含む、患者におけるアミロイドーシス疾患の治療のための方法。
【請求項３２】
アミロイドーシス疾患がＩＡＰＰ関連である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
アミロイドーシス疾患がＩ型またはＩＩ型糖尿病である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
請求項３０記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、患者におけるアミロイドーシス疾患の治療のための方法。
【請求項３５】
アミロイドーシス疾患がＩＡＰＰ関連である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
アミロイドーシス疾患がＩ型またはＩＩ型糖尿病である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
組成物がインスリン、スルホニル尿素およびグルコース増感剤からなる群より選択されるもう一つの薬剤と共に投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
アミロイド沈着物形成を抑制するために請求項１記載の抗原線維形成性薬剤にインビトロで細胞を接触させることを含む、細胞がアミロイド沈着物を形成する能力がある、哺乳動物への移植に適する細胞の調製のための方法。
【請求項３９】
抗原線維形成性薬剤がアミロイド沈着物の崩壊を引き起こし、該沈着物が接触の前に細胞により形成されている、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
細胞が抗原線維形成性薬剤の存在下で培養される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
アミロイド沈着物がＩＡＰＰアミロイドを含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
アミロイド沈着物がＩ型またはＩＩ型糖尿病に関連する、請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
細胞が治療の前にアミロイド沈着物を形成しやすい、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
細胞が治療の前にアミロイド沈着物を形成する、請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
請求項３８記載の方法により調製された、哺乳動物への移植に適する細胞。
【請求項４６】
アミロイド沈着物形成およびアミロイドーシスを抑制する、阻止する、および／または低減するために請求項１記載の抗原線維形成性薬剤をインビボで患者へ投与する段階を含む、移植後のＩ型糖尿病患者を治療するための方法。
【請求項４７】
アミロイド沈着物形成および／またはアミロイドーシスがＩＡＰＰ関連である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
組成物がインスリン、スルホニル尿素、およびグルコース増感剤からなる群より選択されるもう一つの薬剤と共に投与される、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
請求項１記載の抗原線維形成性薬剤の治療的有効量を対象に投与することを含み、該抗原線維形成性薬剤がアミロイド沈着を阻止するまたは低減する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための方法。
【請求項５０】
抗原線維形成性薬剤が細胞治療または遺伝子治療により投与され、細胞が該抗原線維形成性薬剤を産生しかつ分泌するように改変されている、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
細胞がエクスビボで改変されている、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
細胞がインビボで改変されている、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
アミロイドーシスまたはアミロイド沈着がＩＡＰＰ関連である、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
アミロイドーシスまたはアミロイド沈着がＩ型またはＩＩ型糖尿病である、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
組成物がインスリン、スルホニル尿素、およびグルコース増感剤からなる群より選択されるもう一つの薬剤と共に投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５６】
アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための、請求項１、２、３、４、５、または６に定義される抗原線維形成性薬剤の使用。
【請求項５７】
アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための医薬品の製造を目的とする、請求項１、２、３、４、５、または６に定義される抗原線維形成性薬剤の使用。
【請求項５８】
アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための、請求項７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に定義されるペプチドの使用。
【請求項５９】
アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための医薬品の製造を目的とする、請求項７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に定義されるペプチドの使用。
【請求項６０】
アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための、請求項２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に定義される標識された複合体の使用。
【請求項６１】
アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための組成物の製造を目的とする、請求項２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に定義される標識された複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、同時係属中の２０００年９月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／２３３，４８２号の３５ Ｕ． Ｓ． Ｃ． １１９（ｅ）による優先権の恩典を主張するものであり、それの全内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
本発明は、新規な抗原線維形成性薬剤、同物質を含む組成物、およびアミロイド原線維形成を抑制するためにこれらの新規な抗原線維形成性薬剤を使用する方法に関する。
【０００３】
アミロイドーシスとは、アミロイド線維の存在を特徴とする病理学的状態を指す。アミロイドは、多数の異なる疾患において見られる、多様だが特殊なタンパク質沈着物群（細胞内および／または細胞外）を指す総称的用語である。それらの発生においては多様であるが、すべてのアミロイド沈着物は、共通の形態学的性質、特定の色素（例えば、コンゴレッド）での染色をもち、染色後の偏光において特徴的な赤−緑の複屈折現象を示す。それらはまた、共通の超微細構造的性質ならびに共通のＸ線回折および赤外スペクトルを共有する。
【０００４】
アミロイド関連疾患は、一つの器官に限定されるかまたはいくつかの器官に及ぶかのいずれかでありうる。一番目の例は「限局性アミロイドーシス」と呼ばれ、二番目の方は「全身性アミロイドーシス」と呼ばれる。
【０００５】
一部のアミロイド性疾患は特発性でありうるが、これらの疾患のほとんどは、以前に存在していた疾患の合併症として現れる。例えば、原発性アミロイドーシスは、どんな他の症状もなく現れる、またはプラズマ細胞障害もしくは多発性骨髄腫の結果として起こりうる。続発性アミロイドーシスは、通常、慢性感染症（結核のような）または慢性炎症（関節リウマチのような）に付随して見られる。続発性アミロイドーシスの家族性型はまた、家族性地中海熱（ＦＭＦ）に見られる。この家族性型アミロイドーシスは、家族性アミロイドーシスの他の型の１つのように、遺伝的に受け継がれ、特定の個体群に見出される。これらのアミロイドーシスの２つの型において、沈着物はいくつかの器官で見出され、従って全身性アミロイド疾患とみなされる。全身性アミロイドーシスのもう一つの型は、長期血液透析の患者に見出される。これらの症例のそれぞれにおいて、アミロイド沈着物には、異なるアミロイド形成性タンパク質が関与している。
【０００６】
「限局性アミロイドーシス」とは、単一の器官系を含む傾向にあるものである。異なるアミロイドはまた、沈着物に存在するタンパク質の型により特徴づけられる。例えば、スクレイピー、ウシ海綿状脳炎、クロイツフェルトヤコブ病などのような神経変性疾患は、中枢神経系において、プロテアーゼ耐性型プリオンタンパク質（ＡＳｃｒまたはＰｒＰ−２７と呼ばれる）の出現および蓄積を特徴とする。同様に、アルツハイマー病、もう一つの神経変性疾患であるが、神経突起のプラークおよび神経原線維変化を特徴とする。この症例において、プラークおよび血管アミロイドは、原線維のＡβアミロイドタンパク質の沈着により形成される。成人期発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）のような他の疾患は、膵臓におけるアミロイドの限局的蓄積を特徴とする。死後でのインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の９６％に及ぶ患者の膵島において、アミロイド沈着物が存在している。これらの原線維蓄積は、アミリンとしても知られている、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の凝集に起因する。
【０００７】
いったんこれらのアミロイドが形成されたならば、インサイチューでその沈着物を有効的に溶解する公知の広く容認された治療または処置はない。
【０００８】
各アミロイド形成性タンパク質は、β−シートへと組織化しかつ細胞外または細胞内に沈着される不溶性原線維を形成する能力をもつ。各アミロイド形成性タンパク質は、アミノ酸配列において異なるが、原線維を形成することならびにプロテオグリカン、アミロイドＰおよび補体成分のような他の要素に結合することの同じ性質をもつ。さらに、各アミロイド形成性タンパク質は、異なってはいるが、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）部分に結合する能力を有する領域（ＧＡＧ結合部位と呼ばれる）および、β−シート形成を促進するものと思われる他の領域のような類似点を示すであろうアミノ酸配列を有する。
【０００９】
これは、アミロイド原線維が、類似したタンパク質の誤った折り畳み経路により形成されており、それゆえ、それらの折り畳みを制御するような治療的処置がすべてのアミロイドタンパク質にとって有益である可能性があることを示唆する。その関連するタンパク質は、ＡＤにおけるアミロイド−β（Ａβ）タンパク質およびＩＩ型糖尿病における島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）である。ＡＤおよびＩＩ型糖尿病の両方において、アミロイドは、プラーク形成の阻止が意義深い治療的恩典をもたらすであろうことを示唆する重要な役割を果たしている。
【００１０】
特別な症例において、アミロイド性原線維は、いったん沈着されると、周囲の細胞に毒性となりうる。実例により、老人斑として器質化されたＡβ原線維は、アルツハイマー病の患者において、死んだ神経細胞および小神経膠細胞症と関連していることが示された。インビトロで試験された場合、Ａβペプチドは、小神経膠細胞（脳マクロファージ）の活性化工程を誘発することができることが示され、アルツハイマー病の患者の脳において見出される小神経膠細胞症および脳炎症の存在を説明するものと思われた。
【００１１】
ＩＩ型糖尿病の患者、および移植後のＩ型糖尿病の患者に見られるアミロイドーシスのもう一つの型において、アミロイド形成性タンパク質ＩＡＰＰは、インビトロで、β−島細胞毒性を引き起こすことが示された。このゆえに、ＩＩ型およびＩ型糖尿病患者の膵臓におけるＩＡＰＰ原線維の出現は、β島細胞（ランゲルハンス）の損失および臓器機能障害の一因となりえた。
【００１２】
アルツハイマー病に罹っている人々は、脳における３つの主な構造的変化：脳の多数の部分における神経細胞の広汎性損失；神経原線維変化と名付けられる細胞内タンパク質沈着物の蓄積；およびゆがんだ神経終末（ジストロフィーの神経突起）により囲まれた、アミロイドまたは老人斑と名付けられる細胞外タンパク質沈着物の蓄積を伴って、成人期において進行性痴呆を発生する。これらのアミロイドプラークの主な成分は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）、β−アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生成される４０個〜４２個のアミノ酸のタンパク質である。アルツハイマー病について対症療法は存在するが、現在のところ、この疾患を予防することも治療することもできない。
【００１３】
アミロイド−βおよびアルツハイマー病
アミロイド−βタンパク質（Ａβ）原線維の沈着は、ＡＤの不変的性質であり、神経細胞の死および臨床的痴呆に主に寄与する要因であると考えられている。Ａβは、β−アミロイド前駆タンパク質（βＡＰＰ）のタンパク分解性断片であり、老人斑として神経網に、および脳血管内に蓄積する。これらの異常な糸状の沈着物は、ジストロフィーの神経突起および反応性神経膠症と共に局在化される。同様に、複合的血液脳関門の脳血管アミロイド破壊が、神経細胞機能障害を引き起こす有害な炎症反応を誘発するにおいて重要な要因である可能性がある。Ａβプロセシングおよび沈着は、ＡＤの病気の発生における中心的な工程であるように思われ、多数の証拠の筋道により裏付けられている。最も強く関連するのは、異常なＡＰＰプロセシングを示しかつ早期発症および疾患進行の加速を先導するＡＰＰ遺伝子またはプレセニリン遺伝子のいずれかにおける突然変異に起因する家族性ＡＤの症例によって提供される。
【００１４】
１０年前、Ａβのシーケンシングがアルツハイマーの研究にとっての触媒的役割を果たし、急いでコード遺伝子のクローニングへと導かれた。Ａβは、大きな細胞外ドメイン、単一の膜貫通ヘリックスおよび短い細胞質尾部へと組織化される膜関連アミロイド−β前駆タンパク質（ＡＰＰ）の内部配列を表す。Ａβは、細胞外−膜貫通界面の２８残基のＮ末端および１２〜１４残基の膜貫通ドメインを構成する。
【００１５】
以前の研究で、合成Ａβおよびその様々な断片が自発的に集合してアミロイド様原線維を構築するであろうことが明らかにされた。
【００１６】
インビトロでのペプチド研究により、凝集および原線維形成を促進する、Ａβ配列内の重要なドメインを同定した。例えば、１３位および１４位のヒスチジン残基は、β−コンホメーションのｐＨ依存により示されるように、原線維形成において決定的な役割を果たしているように思われる（Ｆｒａｓｅｒ， Ｐ． Ｅ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４４（１）：６４〜７３， １９９４； およびＷｏｏｄら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：４０８６〜４０９２， １９９６）。さらに、切断および変異されたペプチドから、Ａβは、α−ターンにより連結されることが可能な残基１０位〜２５位および３０位〜４２位にわたる２つの主要なβ−シートドメインを有することが示された。その１０位〜２５位配列由来の小ペプチド（ＫＬＶＦＦＡ（配列番号：２５）；残基１６位〜２１位）が原線維形成を抑制できるという観察により例証されるように、両方のドメイン間相互作用は、凝集を促進することにとって不可欠である。ＡＤ組織由来のアミロイドプラークの電子顕微鏡法研究により、原線維Ａβは、「プロトフィラメント」と名付けられた、構成のさらなるレベルを有することが明らかにされた（Ｓｅｒｐｅｌｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３００：１０３３〜１０３９， ２０００）。これらの小さい原線維下部構造が側方に凝集して、最終的なアミロイド原線維を生成する。
【００１７】
Ｃ末端配列は広範囲に調査され、Ａβ１位〜４０位およびＡβ１位〜４２位のアイソフォーム間において有意な違いが観察された（Ｊａｒｒｅｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：４６９４〜４６９７， １９９３； ならびにＪａｒｒｅｔおよびＬａｎｓｂｕｒｙ， Ｃｅｌｌ ７３：１０５５〜１０５６， １９９３）。最後の２残基（Ｌｅｕ４１−Ｖａｌ４２）を含むペプチドは、凝集の増大および原線維形成へのより強い性向を示す。Ａβ４２アイソフォームの重要性は、さらに、それの家族性型ＡＤとの関連により実証される。早期発症型ＡＤに関連する、ＡＰＰ遺伝子またはプレセニリン遺伝子のいずれかにおける突然変異は、すべて、Ａβ４２のレベルを著しく上昇させる結果となり、Ａβ重合を開始する核をなす「種」に相当する可能性がある。
【００１８】
島アミロイドポリペプチドおよび糖尿病
死後でのインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の９６％に及ぶ患者の膵島において、アミロイド沈着物が存在している。これらの原線維蓄積は、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）またはアミリンの凝集に起因し、そのポリペプチドは、より大きい前駆ペプチド、ｐｒｏ−ＩＡＰＰ由来の３７個のアミノ酸のペプチドである。ＩＡＰＰは、β細胞分泌促進物質に応じて、インスリンと共に局在化し、かつ共に分泌される。この病理学的性質は、インスリン依存性糖尿病とは関係がなく、ＮＩＤＤＭとして診断された異種の臨床的表現型について統一する特徴である。島アミロイドーシスについての偶然の要因および疾患過程におけるそれの役割はまだ決定されなければならない。しかしながら、ネコにおける長期的研究およびサルにおける免疫細胞化学的調査により、島アミロイドでの累進的な増加が、インスリン分泌のβ細胞の集団の劇的な減少およびその疾患の重症度の増加に関連することが示された。さらに最近、トランスジェニック方法により、ＩＡＰＰプラーク形成およびβ細胞の機能障害の関連性が強化され、アミロイド沈着がＩＩ型糖尿病における主な要因であることが示されている。
【００１９】
島ヒアリン症（アミロイド沈着）は、最初、１世紀以上前、重篤な高血糖症の患者の膵臓における線維性タンパク質の凝集の存在として記載された（Ｏｐｉｅ， ＥＬ．， Ｊ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ５：３９７〜４２８， １９９０）。今日、島アミロイドが、主に島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、すなわちアミリンから構成されるのだが、ＩＩ型糖尿病のすべての症例の９０％以上における、特徴的な組織病理学的マーカーである。
【００２０】
成熟したＩＡＰＰ分子は、膵臓で合成される３７残基のペプチドであり、β細胞有芯分泌顆粒に、インスリンと共に局在化される。ＩＡＰＰはインスリンと共に分泌されることから、ＩＡＰＰがインスリン分泌を制御することにより血糖を調節することに役割を果たしていることが示唆されていた。血漿中の可溶性ＩＡＰＰの存在自身は普通、問題のあることではない。しかしながら、ＩＩ型糖尿病の患者において、膵臓のＩＡＰＰの蓄積は、不溶の線維性沈着物としてのＩＡＰＰ−アミロイドの付着へと導かれ、ついには、島のインスリン生成β細胞に戻されて、その結果、β細胞の欠乏および不全を生じる（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ， Ｐ．， Ｇｒｉｍｅｌｉｕｓ， Ｌ．， Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｃａｎｄ， ｓｅｃｔ． Ａ． ８１：２９１〜３００， １９７３； ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ， ＥＪＰ．ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３６：３７８〜３８４， １９９３； およびＬｏｒｅｎｚｏ， Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：７５６〜７６０， １９９４）。
【００２１】
ＩＡＰＰ原線維の凝集が重篤なＩＩ型糖尿病およびβ細胞不全の患者の膵臓に存在しているという事実は明らかである。しかしながら、原線維ＩＡＰＰがβ細胞に対して毒性であるかどうかに加えて、このペプチドの凝集へと導く条件を決定することが、現今、大いに関心のある分野である。異なるレベルでのグリコシル化により、より凝集に巻き込まれやすいペプチドのプールを導きうることが示唆された。他の研究より、ＩＩ型糖尿病において、プロホルモンコンバターゼＰＣ２によるその前駆体ｐｒｏ−ＩＡＰＰからＩＡＰＰの不完全な酵素的プロセシングが、アミロイド原線維の「接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）」にとって必要とされる凝集可能なペプチドのレベルを供給している可能性があることが示唆された。さらに他の研究では、典型的なアミロイド原線維を形成しない齧歯類のＩＡＰＰと比較して、凝集を起こしやすくさせるヒトＩＡＰＰのアミノ酸配列に含まれる性質を調べた（Ｊｏｈｎｓｏｎ， ＫＨ．ら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ ３２１：５１３〜５１８， １９８９； およびＭｏｒｉａｒｔｙ， ＤＦ．， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＤＰ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１８１１〜１８１８， １９９９）。
【００２２】
ＩＡＰＰアミロイドは、アルツハイマー病においてアミロイド−β（Ａβ）ペプチドから形成される脳のアミロイドと共通した多くの性質をもつ。どちらのアミロイド疾患も、進行性であり、かつ年齢関連性であり、かつ細胞機能における不可逆的変質に関連している。どちらの病理学的条件もペプチドの突然変異型の合成を必要とせず、どちらの成分ペプチドも、より大きな前駆体に由来し、かつ形態学的に類似したアミロイド原線維を形成する。
【００２３】
ＩＡＰＰは、原線維形成に寄与する３つの主なドメインを含む。これらのドメインは、異なるペプチド断片を調べることにより、およびまたアミロイド原線維を形成しない齧歯類の配列におけるプロリンの変異の効果を通して、同定された。最初のＮ末端ドメインのジスルフィド架橋（残基２位と７位）は、アミロイド原線維形成に不可欠ではない。
【００２４】
細胞の特定の型の死または機能障害により引き起こされる疾患は、関連する細胞型の健康な細胞を患者へ移植することにより治療されうる。この方法は、Ｉ型糖尿病患者に対して用いられてきた。しばしば、これらの細胞は、それらの数を増やすため、単離工程後にそれらを回収できるようにするため、またはそれらの免疫原性を低下させるために、移植前にインビトロで培養される。しかしながら、多くの実例において、移植された細胞の死により、移植は不成功である。この悪い成功率についての一つの理由は、原線維を形成することができかつインビトロでその細胞に対して毒性となるＩＡＰＰである可能性がある。さらに、ＩＡＰＰ原線維は、細胞が移植された後も増殖し続けて、細胞の死または機能障害を引き起こす可能性が高い。これは、その細胞が健康な供与者由来である場合およびその移植を受けた患者が原線維の存在を特徴とする疾患をもたない場合でさえも、起こりうる。
【００２５】
発明の概要
本発明は、とりわけ、インビトロおよびインビボでのアミロイド原線維形成の抑制剤に関する。これらの抑制剤は、例えば、ＩＡＰＰ凝集およびアミロイド形成を制御することができるペプチドである。この性質は、本明細書に開示されているように、本発明の他の態様において有効に使用されうる。
【００２６】
一つの態様において、ペプチドは、
2004517050.tif 000003
またはそれらの異性体、逆（ｒｅｔｒｏ）もしくは逆−反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）異性体、ペプチド様作用物質、または塩でありうる。薬剤はまた、そのペプチドの全−［Ｄ］異性体、全−［Ｌ］異性体、または［Ｌ］および［Ｄ］異性体の混合物でもありうる。
【００２７】
これらの抗原線維形成性薬剤は、例えば、Ｉ型糖尿病患者の治療のために移植前にインビトロで培養された膵島細胞の処理において、例えば移植後にその移植された細胞での原線維形成を阻止または抑制するために、有効に使用されうる。
【００２８】
本発明の抗原線維形成性薬剤および方法は、特に糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）について、進行を防ぐまたは遅らせることにおいて、およびアミロイドタンパク質の折り畳みまたは沈着を制御するための原線維形成の抑制剤として、有効に使用されうる。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチド；またはそれらの異性体、逆もしくは逆−反転異性体、ペプチド様作用物質、または塩に関する。そのようなペプチドは、
2004517050.tif 000004
でありうる。
【００３０】
本発明はまた、ペプチドが
2004517050.tif 000005
より選択される配列に結合する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチドを提供する。その配列に結合することにより、原線維形成およびアミロイドーシスが阻止される。ペプチドは、望ましくは、
2004517050.tif 000006
でありうる。
【００３１】
本発明はまた、下記の式Ｉの複合体を特徴とする、アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための標識された複合体に関連する：
2004517050.tif 000007
式中、ｚは０または１であり；Ａｔは上記で定義される抗原線維形成性薬剤であり；Ａｌｎｋはリンカー部分であり；およびＡｌａｂは前記のインビボでの画像化を可能にする標識部分である。望ましくは、Ａｌａｂは、放射性標識部分であり、より好ましくは、
2004517050.tif 000008
である。標識された複合体はまた、アミロイド沈着物のインビボでの画像化のための組成物として製剤化されうる。そのような組成物は、薬学的に許容される担体と連合して、上記で定義される標識された複合体の治療的有効量を含みうる。
【００３２】
本発明はまた、薬学的に許容される担体と共に上記で定義される抗原線維形成性薬剤の治療的有効量を含む、患者におけるアミロイドーシス疾患の治療のための組成物、および抗原線維形成性薬剤の治療的有効量をそのような治療を必要とする患者へ投与する、患者におけるアミロイドーシス疾患の治療のための方法を含む。態様において、本発明の組成物は、例えば糖尿病の治療において、インスリンと組み合わせて、またはスルホニル尿素およびグルコース増感剤と組み合わせて投与されうる。
【００３３】
細胞がアミロイド沈着物を形成する能力、またはいったん移植されると内因性アミロイド沈着を誘起する能力がある、哺乳動物への移植に適した細胞を調製するための方法もまた、開示されている。方法は、そのような細胞をインビトロで抗原線維形成性薬剤に接触させることを含む。抗原線維形成性薬剤は、アミロイド沈着物の崩壊を引き起こす（その沈着物は、抗原線維形成性薬剤に接触することになる前に細胞により形成されていた）。細胞の生存を最適化するために、望ましくは、細胞を抗原線維形成性薬剤の存在下で培養してもよい。
【００３４】
本発明はさらに、移植後のＩ型糖尿病患者を治療するための方法を含み、アミロイド沈着物形成およびアミロイドーシスが抑制、阻止、および／または低減されるように、本発明の抗原線維形成性薬剤がＩ型糖尿病患者に投与される。
【００３５】
上記の様々な方法のための、または上記の様々な方法における使用のための医薬品もしくは組成物を製造するための、上記の抗原線維形成性薬剤、同物質もしくは化合物を含む組成物の使用もまた、開示されている。
【００３６】
発明の詳細な説明
本開示の目的のために、次の用語は下記に定義される。
【００３７】
用語「ペプチド様作用物質」とは、ペプチドの構造的または機能的性質を模倣する非ペプチド化合物を含む。
【００３８】
用語「アミロイド関連疾患」とは、一つの器官に限定されうる「限局性アミロイドーシス」またはいくつかの器官に広がりうる「全身性アミロイドーシス」のいずれかであるアミロイドの蓄積に関連する疾患を含む。続発性アミロイドーシスは、慢性感染症（結核のような）または慢性炎症（関節リウマチのような）に関連すると考えられ、家族性地中海熱（ＦＭＦ）にも見られる続発性アミロイドーシスの家族性型、および長期血液透析患者に見出される全身性アミロイドーシスのもう一つの型を含む。限局性型アミロイドーシスは、これに限定されないが、糖尿病ＩＩ型および任意のそれの関連疾患、スクレイピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、アルツハイマー病、脳アミロイド血管障害のような神経変性疾患、およびプリオンタンパク質関連疾患を含む。この用語はまた、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、遺伝性の全身性アミロイドーシス、老人性の全身性アミロイドーシス、脳アミロイドーシス、透析関連アミロイドーシス、およびホルモン由来型アミロイドーシスを含む。
【００３９】
「逆異性体」とは、例えば、そのペプチドのバックボーンの方向の逆転を有するペプチドなどの分子を含む。
【００４０】
「ペプチド」とは、それらの異性体；それらの逆もしくは逆−反転異性体；それらのペプチド様作用物質；それらの全−［Ｄ］異性体；それらの全−［Ｌ］異性体；それらの［Ｌ］異性体および［Ｄ］異性体の混合物；またはそれらの塩を含む。
【００４１】
「反転異性体」とは、例えば、そのペプチドを作製するために使用されるアミノ酸のキラリティーの反転を有するペプチドなどの分子を含む。
【００４２】
「逆−反転異性体」とは、そのペプチドのバックボーンの方向およびそのアミノ酸のキラリティーの両方の逆転を有するペプチドなどの分子を含む。
【００４３】
「抗原線維形成活性」とは、アミロイド形成性タンパク質が原線維を形成するのを遮断するまたは阻止する能力を含み、好ましくは、それがそのβ−プリーツコンホメーションの形をとるのを阻止すること、プロトフィラメント相互作用を崩壊させること、ならびに／または凝集および原線維形成のために必要であると考えられている、折り畳まれたペプチド間の側鎖相互作用に干渉することによる。
【００４４】
用語「細胞保護作用」または「細胞保護活性」とは、例えば、アミロイド誘発性毒性から細胞を保護する能力を有するペプチドなどの分子を含む。
【００４５】
用語「抗原線維形成性薬剤」および「原線維形成の抑制剤」は、本明細書で交換可能に用いられる。
【００４６】
本発明は、アミロイドタンパク質の折り畳みまたは沈着を制御するための新規な抗原線維形成性薬剤または原線維形成の抑制剤を提供する。本発明はまた、糖尿病および他のアミロイドーシス疾患の進行を防ぐまたは遅らせるための方法を提供する。本発明はさらに、抑制性性質を有する小さなペプチドを提供し、そしてＩＡＰＰ凝集およびアミロイド形成を制御することができる薬剤を提供する。
【００４７】
2004517050.tif 000009
のようなペプチドを含む、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための本発明の抗原線維形成性薬剤を提供する。好ましくは、ペプチドは、
2004517050.tif 000010
である。
【００４８】
本発明の一態様において、ペプチドが
2004517050.tif 000011
より選択される配列を有する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチドを提供する。
【００４９】
本発明のもう一つの態様は、ペプチドが
2004517050.tif 000012
より選択される配列に結合し、かつペプチドがその配列に結合することにより、原線維形成およびアミロイドーシスを阻止する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のためのペプチドに関する。
【００５０】
抗原線維形成性薬剤は、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための組成物として製剤化でき、薬学的に許容される担体と連合して本発明の抗原線維形成性薬剤の治療的有効量を含む。
【００５１】
本発明のもう一つの態様は、上記で定義されるペプチドと結合する、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のための化合物に関する。化合物は、例えば、結合するもしくはそのペプチドの発現を制御する酵素、またはそのペプチドに結合する抗体でありうる。そのような抗体は、そのペプチドに特異的であると考えられ、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかでありうる。
【００５２】
本発明の薬剤は、アミロイド沈着物を形成する能力があり、哺乳動物への移植に適した細胞、例えば島細胞、のエクスビボでの調製のため、例えば培養において使用してもよく、移植される細胞の調製において、その細胞を抗原線維形成性薬剤に接触させる。抗原線維形成性薬剤はアミロイド沈着物の崩壊を引き起こす（その沈着物は、抗原線維形成性薬剤に接触することになる前に細胞により形成されていた）。
【００５３】
本発明の薬剤は、移植後のＩ型糖尿病患者を治療することにおいて有効に使用することができ、抗原線維形成性薬剤は、アミロイド沈着物形成およびアミロイドーシスを抑制、阻止および／または低減するためにＩ型糖尿病患者へ投与される。抗原線維形成性薬剤は、インスリンと組み合わせて投与されてもよい。
【００５４】
抗原線維形成性薬剤はまた、アミロイドーシスを抑制するためおよび／または細胞保護作用のために使用することができ、抗原線維形成性薬剤がアミロイド沈着を阻止または低減するように、抗原線維形成性薬剤の治療的有効量が対象に投与される。抗原線維形成性薬剤は、望ましくは、細胞がその抗原線維形成性薬剤を産生しかつ分泌するように改変されている細胞治療または遺伝子治療により投与されうる。そのような細胞は、エクスビボまたはインビボで改変されうる。
【００５５】
本発明の抗原線維形成性薬剤はまた、プラークを画像化するために使用することができ、その場合において、抗原線維形成性薬剤、例えばペプチドは、次の式のアミロイドターゲッティング画像化剤である：
2004517050.tif 000013
式中、ｚは０または１であり；Ａｔは本明細書に記載されるＩＡＰＰ原線維形成の抗原線維形成性薬剤であり；Ａｌｎｋはリンカー部分であり；およびＡｌａｂは標識部分である。
【００５６】
標識部分Ａｌａｂは、そのアミロイドターゲッティング画像化剤を、いったんインビボのターゲット部位に到達させれば、ＣＴ、ＭＲＩ、超音波、放射線同位元素または蛍光検出のような計測手段により可視化を可能にする。標識部分は、外部からあてがわれたエネルギーを調節するかまたは検出可能なそれ自身のエネルギーを発生するかのいずれかである。標識部分は、超音波対比試薬の場合には音波発生物質、ＭＲＩ対比試薬の場合には常磁性金属キレート、放射性核種画像化試薬の場合には放射性原子（例えば、放射性フッ素）もしくはキレート化放射性金属イオン（例えば、Ｉｎ−１１１）、Ｘ線対比試薬としては放射線不透過性キレートもしくは化合物（例えば、ポリヨウ化芳香族）、または光学画像化対比試薬の場合には蛍光性もしくは有色色素でありうる。一つの態様において、標識部分Ａｌａｂは、金属キレート化剤でありうる。好都合の態様においては、Ａｌａｂは放射性核種（金属イオンのキレートまたは単一の原子のいずれか）または常磁性金属イオンキレートである。本発明の一つの局面に従い、標識化ターゲッティング分子−キレート化剤複合体は、アミロイド−ターゲッティング部分Ａｔに直接的に付着した標識部分Ａｌａｂ（例えば、放射性核種）を含み、それゆえリンカー部分の使用を必要としない。
【００５７】
好ましくは、Ａｌａｂは、
2004517050.tif 000014
より選択される放射性核種を含む。
【００５８】
画像化剤として、Ａｌａｂは、好ましくは、ＴｃおよびＲｅからなる群より選択される放射性核種を含む。より好ましくは、Ａｌａｂは、放射性または常磁性の金属イオンの金属キレートである。
【００５９】
ＡＤおよびＩＩ型糖尿病の両方において、アミロイドは重要な役割を果たしている。本発明の抗原線維形成性薬剤は、アミロイド形成に関与するアミロイド形成性ペプチド、例えば、ＩＡＰＰペプチドの場合における
2004517050.tif 000015
の一方または両方の領域に相互作用または干渉する、ペプチド、ペプチド様作用物質、抗体または他の化合物でありうる。抗原線維形成性薬剤はまた、結合するまたはアミロイド形成性ペプチドの発現を制御する酵素でもよい。
【００６０】
抗原線維形成性薬剤がペプチドである場合、全−［Ｄ］ペプチド、全−［Ｌ］ペプチドならびに［Ｌ］および［Ｄ］異性体の混合物であるペプチドが含まれる。本発明がどのように操作されたかという特定の理論または解釈に限定されることを望まないが、抗原線維形成性薬剤は、結合してアミロイド形成的β−シートコンホメーションへの折り畳みを崩壊すること、プロフィラメント相互作用を崩壊すること、ならびに／または凝集および原線維形成に必要である折り畳まれたペプチド間の側鎖相互作用に干渉することにより、アミロイド形成性ペプチドに「干渉」すると考えられている。
【００６１】
本発明の抗原線維形成性薬剤は、ペプチドであってもよく、修飾または置換された類似体であることができる。いくつかの類似体はまた、非天然型アミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含む。非天然型アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、α，α−二置換のアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、δ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−フォルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ω−Ｎ−メチルアルギニン、およびイソアスパラギン酸を含む。
【００６２】
次の用語は２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記載するために用いられる：「実質的同一性」、「比較ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「参照配列」。「参照配列」とは、配列比較のための基本として用いられる定義された配列である；参照配列は、例えば、配列表中に提供された完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントとしてのより大きな配列のサブセットであってもよく、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含んでもよい。一般的に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）その２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の部分）を含みうる、および（２）その２つのポリヌクレオチド間で互いに異なる配列をさらに含みうるため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似の局所的領域を同定および比較するための「比較ウインドウ」を通してその２つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより行われる。本明細書に用いられる「比較ウインドウ」とは、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドの参照配列と比較でき、かつその比較ウインドウにおけるそのポリヌクレオチド配列の部分が、その２つの配列の最適なアラインメントとしてその参照配列（付加または欠失を含まない）と比較される時、２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる、少なくとも１８個の連続的ヌクレオチド位置の概念的セグメントを指す。比較ウインドウを整列させるための最適な配列のアラインメントは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびバンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、ペアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（ウィスコンシンジェネティックスソフトウエアパッケージリリース７．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０）、ジェネティックスコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５ サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）博士、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化方法、または洞察により行うことができ、様々な方法により作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウを通して相同性の最も高いパーセンテージを生じる）が選択される。
【００６３】
用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウを通して一致している（すなわち、１ヌクレオチドずつをベースとして）ことを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較のウインドウを通して２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列に存在している位置の数を決定して整合されている位置の数を出し、その整合されている位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、およびその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことにより計算される。本明細書に用いられる用語「実質的同一性」とは、ポリヌクレオチドが、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウを通して、しばしば、少なくとも２５〜５０個のヌクレオチドのウインドウを通して参照配列と比較される時、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常的には、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、配列同一性のパーセンテージは、比較のウインドウを通して総計すると参照配列の２０パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含みうるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することにより計算される。
【００６４】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」とは、デフォルトギャップウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔｓ）を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるような、最適に整列された場合、２つのペプチド配列が少なくとも８０パーセント配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセント配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列同一性またはそれ以上（例えば、９９パーセント配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、一致しない残基の位置は、保存されたアミノ酸置換により異なる。保存されたアミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の可換性を指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸グループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループは、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸グループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループは、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；およびイオウ含有側鎖を有するアミノ酸グループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存されたアミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００６５】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、無傷の抗体およびそれらの結合性フラグメントを含めて用いられる。典型的には、フラグメントは、それらが由来する無傷の抗体と抗原フラグメントへの特異的結合において競合し、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’ Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または無傷免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により作製される。用語「抗体」はまた、化学的に結合される、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現される１つまたは複数の免疫グロブリン鎖を含む。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法により作製されうる。例えば、ソングシビライ（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ）＆ラハマン（Ｌａｃｈｍａｎｎ）、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５〜３２１ （１９９０）； コステルニー（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８， １５４７〜１５５３ （１９９２）を参照。２つの実体間の特異的結合とは、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９ Ｍ−１、または１０１０ Ｍ−１の親和力を意味する。１０８ Ｍ−１以上の親和力が好ましい。
【００６６】
「薬学的組成物」とは、哺乳動物の個体への投与に適する化学的または生物学的組成物を指す。そのような組成物は、限定されるものではないが、経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内などを含む多数の経路の１つまたは複数による投与のために特別に製剤化されうる。「薬学的賦形剤」または「薬学的に許容される賦形剤」とは、その中に活性のある治療的ペプチドが製剤化されるところの担体、通常では液体である。賦形剤は、一般的に、化学的および／または生物学的安定性、放出性特性などを与えうるが、その製剤に対して少しの薬理学的活性も与えない。典型的製剤は、例えば、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１９版、グレンナロ， Ａ．（Ｇｒｅｎｎａｒｏ， Ａ．）編、１９９５に見出すことができる。
【００６７】
そのようなペプチド、タンパク質または断片、類似体および他のアミロイド形成性ペプチドは、当技術分野においてよく知られている標準的方法に従って、固相ペプチド合成もしくは組換え発現により合成されうる、または天然資源から得られうる。自動ペプチド合成機を使用してもよく、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；フォスターシティ、カルフォルニア）のような多数の製造会社から商業的に入手可能であり、合成ペプチドを調製するための方法は当技術分野において公知である。
【００６８】
本発明の抗原線維形成性薬剤はまた、天然に存在する配列における１つまたは複数の残基の置換によるペプチド由来でもよい。もう一つの態様において、薬剤は、ペプチドのペプチド様作用物質である。薬剤は、１つもしくは複数のアミノ酸残基を除去または挿入することにより、または１つもしくは複数のアミノ酸残基を、他のアミノ酸、もしくはチエニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、およびフェニルグリシンのような非アミノ酸断片で置換することにより、改変されうる。
【００６９】
抗原線維形成性薬剤、例えば、ペプチドは、免疫後患者が、抗体がそれに対して生じたところのそのペプチド配列を認識する抗体を産生するように、患者に能動的に免疫化するために使用されうる。または、本発明のペプチド抗原線維形成性薬剤は、受動免疫化のために患者に投与される抗体を製造するために使用されうる。投与される抗体（受動免疫化の場合）または患者により産生される抗体（能動免疫化の場合）は、プラーク形成を抑制するまたは低減するために、その抗体がそれに対して生じたところのその配列に対応するＩＡＰＰ上の配列を認識するものと思われる。
【００７０】
一つの例示的態様において、一連の小さなヘキサペプチドは、ｈＩＡＰＰのアミロイド形成性領域、残基２０位〜２９位をターゲットするように作製され、β−シート形成および原線維集合におけるそれらの効果を試験した。ペプチド
2004517050.tif 000016
は、ｈＩＡＰＰ（２０位〜２９位）の近位の末端をターゲットするのだが、β−シート形成の強い抑制剤であることが見出された。円二色性分析により、ＩＡＰＰと１：１のモル比で使用される場合でさえ、これらのペプチドは、ｈＩＡＰＰ（１位〜３７位）をランダムコイルコンホメーションとして維持されることが明らかになった。ネガティブ染色電子顕微鏡法により、いくらかの半−原線維が凝集することが明らかになり、典型的なＩＡＰＰ原線維の高密度は見られなかった。ｈＩＡＰＰ（２０位〜２９位）の内部セクション由来のペプチド
2004517050.tif 000017
は、抑制性ではなく、むしろｈＩＡＰＰによる原線維形成をわずかに促進させた。結果として、原線維形態は、ＩＡＰＰ単独よりもより高密度かつ複雑であった。ｈＩＡＰＰ２０位〜２９位の遠位部分由来のペプチド
2004517050.tif 000018
は、より高いモル比で使用される場合、β−シートへのコンホメーションの変化を阻止した。
【００７１】
非限定的な本発明の有用性の実証として、アミロイドーシスの次の型をより詳細に下記に記載する。
【００７２】
ＡＡ（反応性）アミロイドーシス
一般的に、ＡＡアミロイドーシスは、持続性急性の応答を誘発する多数の疾患の徴候である。そのような疾患には、慢性炎症性疾患、慢性局所性または全身性微生物感染症、および悪性腫瘍を含む。
【００７３】
ＡＡ原線維は、一般的に、血清アミロイドＡタンパク質（ａｐｏＳＳＡ）、ＨＤＬ複合体に存在しかつＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦのようなサイトカインに対する応答において肝細胞に合成される循環しているアポリポタンパク質のタンパク分解性切断により形成される８０００ダルトンの断片（ＡＡペプチドまたはタンパク質）から構成される。沈着は、実質性器官を優先して、身体中に広がりうる。脾臓が通常、沈着部位であり、腎臓もまた冒されうる。沈着はまた、心臓および胃腸管においてもありがちである。
【００７４】
ＡＡアミロイド疾患は、これらに限定されるものではないが、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節症、ライター症候群、成人性スティル病、ベーチェット症候群、およびクローン病のような、炎症性疾患を含む。ＡＡ沈着物はまた、ライ病、結核、気管支拡張症、褥瘡性潰瘍、慢性腎盂腎炎、骨髄炎、およびウィッペル病のような慢性微生物感染症の結果としても生成される。若干数の悪性腫瘍もまた、結果として、ＡＡ原線維アミロイド沈着物を生じうる。これらは、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、腸、肺および泌尿生殖器管の癌、基底細胞癌、ならびに毛様細胞性白血病のような状態を含む。
【００７５】
ＡＬアミロイドーシス
ＡＬアミロイド沈着は、一般的に、プラズマ細胞の悪性腫瘍（多発性骨髄腫）から良性モノクローナル免疫グロブリン血症にわたるＢリンパ球系列の何らかの障害のほとんどに関連している。時々、アミロイド沈着物の存在が、潜在する障害の一次指標でありうる。
【００７６】
ＡＬアミロイド沈着物の原線維は、モノクローナル免疫グロブリン軽鎖またはそれらのフラグメントから構成される。より具体的には、そのフラグメントは、軽鎖（κまたはλ）のＮ末端領域由来であり、かつそれの可変（ＶＬ）ドメインのすべてまたは部分を含む。沈着物は、一般的に、間葉組織に生じ、末梢性および自律性神経障害、手根管症候群、巨大舌、拘束性心筋症、大関節の関節症、免疫疾患、骨髄腫、および潜在的障害を引き起こす。しかしながら、ほとんどのどんな組織、特に心臓のような内臓器官も含まれうることを留意すべきである。
【００７７】
遺伝性の全身性アミロイドーシス
多くの型の遺伝性の全身性アミロイドーシスがある。それらは比較的まれな状態であるが、症状の成人期発症およびそれらの遺伝パターン（通常、常染色体優性）により、一般的個体群においてそのような疾患の残存へと導かれる。一般的に、その症候群は、様々なアミロイド形成性ペプチドまたはタンパク質の生成へと導く、前駆タンパク質における点突然変異に起因しうる。表１は、これらの疾患の典型的型の原線維組成を要約している。
【表１】
2004517050.tif 000019
2004517050.tif 000020
＊タン（Ｔａｎ） ＆ ペピーズ（Ｐｅｐｙｓ）、Ｈｉｓｔｏｐａｈｏｌｏｇｙ， ２５（５）：４０３〜４１４， １９９４から引用されたデータ
【００７８】
表１に提供されるデータは、典型的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。例えば、トランスサイレチン遺伝子における４０以上の別々の点突然変異が記載されており、それらすべて、家族性アミロイド多発性神経障害の臨床的に類似した型を生じさせる。
【００７９】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、時々、プレアルブミンとも呼ばれる１４キロダルトンのタンパク質である。それは、肝臓および脈絡叢により生成され、甲状腺ホルモンおよびビタミンＡを輸送することにおいて機能する。それぞれ１個のアミノ酸変化により特徴付けられる、そのタンパク質の少なくとも５０個の変異型は、家族性アミロイド多発性神経障害の様々な型の原因である。例えば、５５位のロイシンの代わりにプロリンの置換は、神経障害の著しい進行性型を引き起こす；１１１位のロイシンの代わりにメチオニンの置換は、デンマーク人の患者において重篤な心臓病を引き起こした。全身性アミロイドーシスの患者の心臓組織から単離されたアミロイド沈着物について、その沈着物が、ひとまとめにしてＡＴＴＲと呼ばれ、それの完全長配列が特徴付けられている、ＴＴＲおよびそれの断片の異成分混合物から構成されていることが明らかになった。ＡＴＴＲ原線維成分は、そのようなプラークから抽出することができ、それらの構造および配列は、当技術分野において公知の方法に従って決定されうる。
【００８０】
分子アポリポタンパク質ＡＩにおける点突然変異（例えば、Ｇｌｙ→Ａｒｇ２６； Ｔｒｐ４→Ａｒｇ５０； Ｌｅｕ→４ Ａｒｇ６０）を有する人は、タンパク質アポリポタンパク質ＡＩまたはそれの断片（ＡＡｐｏＡＩ）の沈着物を特徴とするアミロイドーシスの型（「オスターターク（？ｓｔｅｒｔａｇ）型」）を示す。これらの患者は、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を有し、末梢神経障害または腎不全を示す。
【００８１】
酵素リソチームのα鎖における突然変異（例えば、Ｉｌｅ→Ｔｈｒ５６またはＡｓｐ→Ｈｉｓ５７）は、イギリス民族において報告されているオスターターク（？ｓｔｅｒｔａｇ）型非神経障害の遺伝性アミロイドーシスのもう一つの型の根拠である。この場合、その変異リソチームタンパク質（Ａｌｙｓ）の原線維が沈着され、患者は一般的に、腎機能障害を示す。このタンパク質は、たいていの本明細書に記載される原線維形成性タンパク質とは違って、通常、全体（非断片化）の形で存在する。
【００８２】
β−アミロイドペプチド（Ａβ）は、ベータアミロイド前駆タンパク質（βＡＰＰ）として知られている大きなタンパク質からタンパク分解により引き出された３９個〜４３個のアミノ酸のペプチドである。βＡＰＰにおける突然変異は、下記でさらに詳細に記載されているが、Ａβ原線維および他の成分から構成される脳のプラーク沈着を特徴とする、家族型アルツハイマー病、ダウン症候群、および／または老人性痴呆を引き起こす。公知のアルツハイマー病に関連するＡＰＰにおける突然変異は、β−セクレターゼもしくはγ−セクレターゼの切断部位に近接して、またはＡβ内に起こる。例えば、７１７位は、ＡβへのプロセシングにおけるＡＰＰのγ−セクレターゼ切断の部位に近接しており、６７０位／６７１位は、β−セクレターゼ切断の部位に近接している。これらの残基のいずれにおける突然変異も、おそらくＡＰＰから生成されるＡβの４２／４３個のアミノ酸型の量の増加を引き起こすことにより、アルツハイマー病を発症させる可能性がある。様々な長さのＡβペプチドの構造および配列は、当技術分野においてよく知られている。そのようなペプチドは、当技術分野において公知の方法に従って、作製されうる（例えば、ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １２９：８８５〜８９０， １９８４； ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １２２：１１３１〜１１３５， １９８４）。さらに、ペプチドの様々な型が商業的に入手可能である。
【００８３】
シヌクレイン（Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）は、アポリポタンパク質に似ているシナプス関連タンパク質であり、神経細胞の細胞質ゾルおよびシナプス前終末において豊富にある。ＮＡＣと名付けられたα−シヌクレイン由来のペプチド断片はまた、アルツハイマー病のアミロイドプラークの成分である。この成分はまた、下記に詳述されているように、本発明の免疫学的に基づく治療に対するターゲットとしての役目も果たす。
【００８４】
ゲルゾリンは、断片およびアクチンフィラメントに結合するカルシウム結合タンパク質である。そのタンパク質の１８７位での突然変異（例えば、Ａｓｐ→Ａｓｎ； Ａｓｐ→Ｔｙｒ）は、遺伝性の全身性アミロイドーシスの１つの型を引き起こし、通常、フィンランド出身の患者、およびオランダまたは日本の血統の人々にも見出される。苦しめられている個体において、ゲルゾリン断片（Ａｇｅｌ）から形成された原線維は、通常、アミノ酸１７３位〜２４３位（６８ ｋＤａのカルボキシ末端断片）からなり、血管および基底膜に沈着され、結果として、角膜異栄養症ならびに末梢神経障害、異栄養性皮膚変化、および他の臓器での沈着へと進行する脳神経障害を生じる。
【００８５】
突然変異体フィブリノーゲンのα鎖（ＡｆｉｂＡ）および突然変異体シスタチンＣ（Ａｃｙｓ）のような他の突然変異型タンパク質も原線維を形成し、特有の遺伝性疾患を生じる。ＡｆｉｂＡ原線維は、腎臓疾患についての非神経障害的遺伝性アミロイドに特有な沈着物を形成する；Ａｃｙｓ沈着物は、アイスランドで報告されている遺伝性脳アミロイド血管障害の特性を示している。少なくともいくつかの症例において、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）の患者は、βタンパク質と結合して非突然変異型のシスタチンＣを含むアミロイド原線維を有することが示された。
【００８６】
プリオン疾患の若干数の型は、現在は遺伝性であると考えられ、症例の１５％まで占めており、以前は天然において優勢的に感染性であると考えられていた（Ｂａｌｄｗｉｎら、「アルツハイマー病および関連疾患における研究の進歩（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｅｄｅｒｓ）」、ジョンウイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９５）。そのようなプリオン疾患において、患者は、正常プリオンタンパク質の異常アイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）から構成されるプラークを発生する。優勢な突然変異体アイソフォーム、ＰｒＰＳｃは、ＡＳｃｒとも呼ばれるが、そのプロテアーゼ分解に対する耐性、界面活性剤抽出後の不溶性、二次リソソームでの沈着、翻訳後の合成、および高β−プリーツシート含有量の点で、正常な細胞タンパク質と異なる。遺伝連鎖は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインケル（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）（ＧＳＳ）、および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）を引き起こす少なくとも５つの突然変異について立証された（Ｂａｌｄｗｉｎ、前記）。スクレイピー原線維から原線維ペプチドを抽出する、配列を決定するおよびそのようなペプチドを作製するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＧＳＳの１つの型はコドン１０２位でのＰｒＰ突然変異に関連づけられ、一方、終脳ＧＳＳはコドン１１７位での突然変異で分離する。コドン１９８位および２１７位での突然変異は、アルツハイマー病に特有な神経突起プラークがＡβペプチドの代わりにＰｒＰを含むＧＳＳの１つの型を引き起こす。家族性ＣＪＤの若干数の型は、コドン２００位および２１０位での突然変異と関連があった；コドン１２９位および１７８位での突然変異は、家族性ＣＪＤおよびＦＦＩの両方に見出された（Ｂａｌｄｗｉｎ、前記）。
【００８７】
老人性の全身性アミロイドーシス
アミロイド沈着、全身性も限局性のいずれも、年齢と共に増加する。例えば、野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）の原線維は、高齢者個体の心臓組織において、一般に見出される。これらは、無症候性、臨床的沈黙である場合があり、または心不全を引き起こす場合がある。無症候性の原線維限局性沈着物はまた、脳（Ａβ）、前立腺のアミロイド小体（Ａβ２ミクログロブリン）、関節および精嚢にも生じうる。
【００８８】
脳アミロイドーシス
アミロイドの局所的沈着は、脳、特に高齢者個体においてよくあることである。脳におけるアミロイドの最も高頻度の型は、主にＡβペプチド原線維から構成され、痴呆または散発性（非遺伝性）アルツハイマー病を引き起こす。実際、散発性アルツハイマー病の発生率は、遺伝性であると示された型を大幅に越えている。これらのプラークを形成する原線維ペプチドは、遺伝型アルツハイマー病（ＡＤ）に関しての上記のそれと非常に類似している。
【００８９】
透析関連アミロイドーシス
β２ミクログロブリン（Ａβ２Ｍ）原線維から構成されるプラークは、長期血液透析または腹膜透析を受けている患者において、一般に発生する。β２ミクロブロブリンは、１１．８キロダルトンのポリペプチドであり、すべての有核細胞に存在するクラスＩのＭＨＣ抗原の軽鎖である。正常な環境下では、それは、絶えず、細胞膜から脱落し、腎臓により正常に濾過される。腎臓機能障害の症例のようなクリアランスの不全は、腎臓および他の部位において（主に関節のコラーゲンに富む組織において）、沈着を引き起こす。他の原線維タンパク質とは違って、Ａβ２Ｍ分子は、一般的に、原線維において断片化されていない形で存在する。
【００９０】
ホルモン由来型アミロイドーシス
内分泌器官には、特に老齢の個体において、アミロイド沈着物が潜んでいる可能性がある。ホルモン分泌性腫瘍はまた、原線維がカルシトニン（甲状腺の髄様癌）、島アミロイドポリペプチド（アミリン；ＩＩ型糖尿病のほとんどの患者に発生する）、および心房性ナトリウム利尿ペプチド（孤立性心房性アミロイドーシス）のようなポリペプチドホルモンで構成される、ホルモン由来型アミロイドプラークを含む。これらのタンパク質の配列および構造は、当技術分野においてよく知られている。
【００９１】
種々のアミロイドーシス
アミロイドの限局性沈着物として普通に現れているアミロイド疾患の他の型にも様々ある。一般的に、これらの疾患は、おそらく、限局化された生成および／もしくは特定の原線維前駆体の異化作用の欠如、または原線維沈着についての特定の組織（関節のような）の疾病素質の結果である。そのような特発性沈着の例には、結節性ＡＬアミロイド、皮膚性アミロイド、内分泌性アミロイド、および腫瘍関連性アミロイドを含む。
【００９２】
本発明は、特定の態様において、糖尿病、例えば、アミロイド関連性糖尿病の治療のために特に有用である。次の記述はこれをより詳細に示す。
【００９３】
ＩＩ型糖尿病およびＩＡＰＰ
ＩＡＰＰの一次構造および原線維形成
原線維を形成する可能性を有するヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）の３つの領域がある。当初はアミロイド形成性領域として記載された、領域２０位〜２９位（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２５１：２６１〜２６４， １９８９）および原線維を形成するｈＩＡＰＰ３０位〜３７位の最近の報告（Ｎｉｌｓｓｏｎ ＆ Ｒａｌｅｉｇｈ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９４：１３７５〜１３８５， １９９９）に加えて、本データは、ｈＩＡＰＰ８位〜２０位もまた原線維を形成することを示している。これらのより最近の知見より、２０位〜２９位はその配列の唯一のアミロイド形成性領域ではないことが示唆されている。さらに、１８位にアルギニンを有するが、他の点ではｈＩＡＰＰ８位〜２０位と相同的である断片、ラットのＩＡＰＰ８位〜２０位は、水溶性培地において原線維を形成した。
【００９４】
他の研究より、ｈＩＡＰＰの断片が水溶性培地において急速に原線維を形成することが示されたが、本発明のデータは、不確定の可溶性の調製というよりむしろ、開始物質としての「種」を含有しないｈＩＡＰＰの調製を利用して得られた（Ｈｉｇｈａｍら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：４９９８〜５００４， ２０００）。これらの条件下で、すべてのペプチド断片は、ＣＤで調べられた場合、初期にはランダムなコンホメーションであり、かつＥＭにより調べられた場合、原線維構造を示さなかった。これは、ペプチドコンホメーションにおける、折り畳まれていない状態からオリゴマー形成および原線維の形成への変化に対するｐＨおよび対イオンの効果の試験を可能にする。以前の研究では、人工的らせん状コンホメーションにおいてＩＡＰＰを安定化させるためにＨＦＩＰを使用し、またはコンホメーションの変化を生じさせるために種を使用したが（Ｋａｙｅｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８７：７８１〜７９６， １９９９）、インビボの状態を反映していない可能性がある。前もって形成されている種を使用することにより、インビボでのアミロイドの発生において重要な最初の凝集期の形成が排除されることになりえた。
【００９５】
アミロイド形成の可能性を有するｈＩＡＰＰの３つの隣接するドメインは、分子間結合、オリゴマー形成および原線維形成、加えて分子内のβ−シートを形成するための相互作用において役割をもっている可能性がある。これは、原線維を形成するラットＩＡＰＰ（ラットＩＡＰＰ８位〜２０位）の断片についての最初の報告である。ラットＩＡＰＰの３０位〜３７位の領域は、アミノ酸構造においてｈＩＡＰＰと同一であり、それゆえ、原線維形成の能力があるため、これらの２つのβ−鎖が相互作用し、かつラットＩＡＰＰが原線維を形成するはずであると予測することが可能だった。ラットＩＡＰＰからの原線維形成の欠如は、ラットＩＡＰＰの２５位、２８位および２９位でのプロリン置換により、そのペプチドのこの領域においてβ−鎖形成が妨げられていることを示唆している；これらのプロリン置換は、分子間β−シート形成および原線維を抑制するだけでなく、原線維形成へと導くであろう分子内構造を崩壊させる。
【００９６】
Ａβにおける１３位でのヒスチジン残基は、原線維集合にとって重要である。ヒスチジン残基を含有しないＡβの突然変異型は、プロトフィラメントより大きい構造を形成しない。齧歯類において、ＩＡＰＰに生じているＡｒｇ１８Ｈｉｓ−置換と同じ様式で、ＡβのＨｉｓ１３がアルギニン残基で置換されている。この置換が、齧歯類におけるＡβアミロイドの欠如に寄与しているものと考えられている。
【００９７】
ｈＩＡＰＰ１位〜３７位の原線維形成は、形態学的には異なるが、ｐＨに依存しなかった。緩衝液に存在する対イオンは、その形態に加え、原線維形成の速度にも影響した。ヒトＩＡＰＰ１位〜３７位は、水および１１ ｍＭ 酢酸ナトリウムにおいては同じような速度で、ならびに２ ｍＭ トリス緩衝液においてはより短い時間尺度で原線維を形成した。これは、ＣＤ分析により測定されるように、ランダムからβ−シートコンホメーションへの転換を伴った。ヒトＩＡＰＰ１位〜３７位は、ＣＤ信号が減少して、２ ｍＭ ホウ酸、クエン酸およびリン酸緩衝液から急速に沈澱した。酢酸およびクエン酸緩衝液ならびにトリスおよびリン酸緩衝液は、イオン強度において類似しており、かつｐＨについて釣り合っているため、効果における違いは、緩衝液イオンの電荷または形に起因した。クエン酸およびリン酸は、酢酸およびトリスのそれぞれよりもより高密度に電荷がある。
【００９８】
Ａβペプチドにおける亜鉛のヒスチジン残基への結合は、原線維集合のための重要な要因として提案された。ＩＡＰＰ原線維形成における亜鉛の役割は、ＩＡＰＰの折り畳みに影響しうるβ−細胞分泌顆粒において高濃度の亜鉛が存在していることから、調べられた。ラットＩＡＰＰ８位〜２０位もまた原線維を形成したため、Ｈｉｓ １８の存在は不可欠ではないことが示された。しかしながら、亜鉛の存在下で、断片１８位〜２９位および２０位〜２９位が、より長くよりゆるく詰め込まれた原線維を形成した。これらの結果より、亜鉛が、Ｈｉｓ１８と持ちうるどんな相互作用にも依存せず、プロトフィラメントへのペプチド断片の詰め込みおよび原線維へのプロトフィラメントの集合に作用することができることが示唆される。高く荷電された亜鉛イオンは、側面の凝集を妨げる疎水性残基と相互作用しているものと思われる。
【００９９】
ｈＩＡＰＰの二次構造の性向
高濃度で可溶性状態のｈＩＡＰＰを得ることの困難さのため、結晶構造は決定されていない。二次構造予測を調べた以前の研究より、ｈＩＡＰＰについて様々な可能性のあるコンホメーションが生み出された（Ｈｕｂｂａｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２７５：７８５〜７８８， １９９１； Ｓａｌｄａｎｈａ ＆ Ｍａｈａｄｅｖａｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ４：５３９〜５４４， １９９１）。
【０１００】
構造予測は、α−ヘリックスがｈＩＡＰＰのＮ−末端に存在しているはずであることを示している。しかしながら、本研究におけるＣＤデータは、ｈＩＡＰＰが通常、ランダムコイル状態、β−シート、または溶液から沈澱しているかのいずれかにおいて見出されることを示している（Ｈｉｇｈａｍら、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ ４７０：５５〜６０， ２０００）。ヘリックス促進溶剤（ＴＦＥ、ＨＦＩＰ）の存在下でのみ、α−ヘリックスの性質を現す（Ｈｉｇｈａｍａら、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ ４７０：５５〜６０， ２０００）。これは、ｈＩＡＰＰがインビトロでその自然の構造を保持していないか、またはｈＩＡＰＰが構造化されず、適切な条件下で、他のコンフォメーションよりもより容易にβ−シート構造を呈するかのいずれかを示唆する。または、インビボでのｈＩＡＰＰは、ランダムコイル構造として存在して、安定性を維持するために担体に結合して循環している可能性もある。アルゴリズムにより予測される二次構造は既知の構造に基づいているが、分子コンフォメーションが動態学的に接近できて、それゆえインビトロまたはインビボで到達することが可能であるかどうか、予測できない。
【０１０１】
ペプチドの異なるドメインについて別々に決定されたコンフォメーションより、断片化以来無傷の分子として存在することが三次的接触を除去するとは示されえず、完全長配列が原線維を形成しない条件下で、別々の断片の原線維形成が起こりうる。ラットＩＡＰＰ８位〜２０位は原線維を形成するだろうが、完全長ラットＩＡＰＰは形成しない。しかしながら、二次構造予測および断片からの構造の推論の困難さの両方の限界にも関わらず、これらの方法はペプチドのモデルを作製するために使用されうる。
【０１０２】
ｈＩＡＰＰ原線維形成のためのモデルの提案
ｈＩＡＰＰ配列における２つ／３つのβ−鎖の存在は、小さいβ−シートが単量体構造のコアにあることを示唆する。これは、アスパラギンおよび／またはグルタミン残基の無電荷の極性側鎖間の側鎖水素結合により安定化されているものと思われる。
【０１０３】
ｈＩＡＰＰの原線維形成は、ｐＨおよび対イオンに依存せず、疎水的相互作用により操作される。ｈＩＡＰＰ配列において、３７残基のうち１１個は、疎水性である。ｈＩＡＰＰ原線維形成の初期段階の間で疎水性の増加が実証され（Ｋａｙｅｄら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８７：７８１〜７９６， １９９９）、プロトフィラメントおよび原線維集合が疎水性基を露出させることを示唆している。グルタミン、セリン、アスパラギンおよびスレオニンのような無電荷の極性残基が、側鎖水素結合に関わる。グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）ら、（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２：３５３９〜３５４， １９９５）は、２０位〜２９位の断片として調べた場合、残基２４位〜２７位が高次に配列された逆平行のβ−シート構造を形成することを示唆した。
【０１０４】
ｈＩＡＰＰの新規アミロイド形成性ドメインは、一連の重複しているペプチド断片を使用して同定された。これらの結果は、アミロイド原線維形成に重要な分子配列への新しい洞察を提供する。ｈＩＡＰＰ２０位〜２９位ドメインは明らかに重要であるが、分離して作用する可能性は低く、他のＩＡＰＰ領域がβ−シートコンフォメーションの形成／安定化ならびに付随的な凝集および原線維形成に寄与しなければならない。
【０１０５】
本明細書に提出された結果より、原線維形成に関係するＩＡＰＰの少なくとも２つの領域があり、１つはβ−プリーツシート領域（ＩＡＰＰ２０位〜２９位）および１つは以前には機能が未知の領域（ＩＡＰＰ８位〜２０位）であることが示される。本発明の抗原線維形成性薬剤は、一方または両方の領域に相互作用または干渉することにより作用することができる。
【０１０６】
ｈＩＡＰＰの原線維形成能力は、ｐＨ非感受性であり、インビボでβ細胞分泌顆粒（ｐＨ ５．５）から細胞外間隙（ｐＨ ７．４）へのＩＡＰＰの移行は、そのペプチドのコンフォメーションに有意な効果をもつものではないことを示唆した。ＩＩ型糖尿病に独特である、顆粒成分または細胞外環境における変化が、原線維形成の起こるのを可能ならしめるということがより可能性が高い。β細胞顆粒は、３０以上の同定されたタンパク質を含み、亜鉛およびカルシウムの両方を高濃度に有する。細胞内分子のクラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）は、ｈＩＡＰＰのその自然のコンフォメーションでの維持または凝集の抑制のために不可欠であるものと思われる。アミロイド形成性断片の「接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）」または無傷のｈＩＡＰＰ１位〜３７位のコンフォメーションの再編成を促進する変化は、分泌性ＩＡＰＰのアミロイド沈着物としての累進的沈着およびインスリン分泌性細胞の破壊を惹起する。同様に、β細胞からの分泌過多によるＩＩ型糖尿病の初期における細胞外間隙でのクラウディング効果は、結果として、ｈＩＡＰＰの濃度の増加および原線維形成へ導く凝集を生じるものと思われる。
【０１０７】
本発明の最終的目標は、アルツハイマー病、糖尿病または他のアミロイドーシス疾患の進行を防ぐ、遅らせるまたは逆戻りさせるように疾患過程を調節することである。限定ではないアミロイドーシス疾患の例には、脳血管障害、続発性アミロイドーシス、家族性地中海熱、マックル−ウェルズ（Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ）症候群、原発性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発性神経障害、遺伝性脳溢血、長期血液透析関連アミロイドーシス、ならびにクロイツフェルト−ヤコブ病およびゲルストマン−シュトロイスラー−シャインケル（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群のようなプリオン疾患である。
【０１０８】
本発明に従って、一連のＩＡＰＰ由来ペプチド断片は同定された。これらの断片は、完全長タンパク質に結合し、かつ通常の折り畳みおよびアミロイド原線維形成を阻止する能力をもつ。これらの抑制剤の活性は、下文に詳述されているように、タンパク質分光学、蛍光アッセイ法および電子顕微鏡法を含む一連の生物物理学的技術を用いて、評価された。
【０１０９】
次の項は、特に、本発明者らにより言及されてきた活性のある抗原線維形成性薬剤を記載し、それらは、変異の分析を用いてさらに精密化され、重要な残基を同定し、かつ最小の活性ドメインを限定した。
【０１１０】
例証／実験的
図１は、アミロイド−β（Ａβ）ペプチドの配列およびその提案される構造ドメインを図示する。Ａβについて用いられるのと同様のペプチドに基づく方法（Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１２６０１〜１２６０５， １９９７）は、図２に示されるように、８位〜２０位および２０位〜２９位の配列の初めの範囲にわたるＩＡＰＰにおける２つの重要なドメインをターゲットするために用いられた。これらのペプチドは、Ａβペプチドとして示されてきたものだが、完全長ＩＡＰＰペプチドに結合し、かつ原線維形成を変化させることができる。ペプチドは、アミロイド形成的β−シートコンフォメーションへの折り畳みを崩壊させること、プロトフィラメント相互作用を崩壊させること、ならびに／または凝集および原線維形成に必要である折り畳まれたＩＡＰＰ内の側鎖相互作用に干渉することにより、原線維形成を崩壊させる。調べられたペプチド（図２に示される）は、ＩＡＰＰの主要な配列ドメインに対応する小さな、合成ヘキサペプチドであった。これらのペプチドは、インビトロで評価され、最も活性のある配列が同定された。インビトロアッセイ法には以下のものを含んだ：アミロイド形成的β−シートの折り畳みにおける変化を見るための円二色性（ＣＤ）；原線維形態における変化および相対的密度を調べるためのネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）；および原線維形成の定量的評価を与えるＴｈＴ蛍光アッセイ法。
【０１１１】
本出願においては、次の実験方法が用いられた。
【０１１２】
ペプチド合成および供給
合成ヒトＩＡＰＰ（１位〜３７位）は、ＢＡＣＨＥＭ（トレンス、ＣＡ）から購入され、ＩＡＰＰ８位〜２０位および１９位〜３１位の領域に及ぶ合成ペプチド（図３）は、固相ペプチド合成方法論に基づく標準的ＦＭＯＣ（フルオロエニルメトキシカルボニル（Ｆｌｕｏｒｏｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ））を用いてトロント大学のペプチド合成研究所（ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により合成された。ペプチドは、ＰＯＲＯＳ ２０Ｒ２カラムにおいて、０．１％ トリフルオロ酢酸で緩衝された水／アセトニトリル混合物を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製された。合成ペプチドを、１１０％ ＨＦＩＰ（１ ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、濾過し（０．２ μｍ）、等分し、そして凍結乾燥した（Ｈｉｇｈａｍ， ＣＥら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４７０：５５〜６０， ２０００）。等分部分は、必要とされる時に、２０ ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ６．５中で元に戻された。
【０１１３】
円二色性分光分析法（ＣＤ）
ＣＤは、原線維形成に関連するペプチドのコンフォメーションの変化を測定するために用いられた。ＣＤ実験は室温で行われ、スペクトル（５スキャンの平均値）は、Ｊａｓｃｏ Ｊ７２０分光偏光計および１ ｍｍの経路の長さをもつ水晶キュベットを使用して集められた。
【０１１４】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ＴＥＭは、インビトロの集合した原線維の構造的分析のために用いられた。一定分量（４ μｌ）をピオロフォームおよび炭素被覆のグリッドへ載せた。試料は、グリッド上で、３分間、室温でインキュベートし、過剰材料を吸い取り、そして１％ ホスホタングステン酸（ＰＴＡ）で染色した。過剰ＰＴＡを吸い取り、試料を風乾させておいた。すべての試料は、ヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）７０００電子顕微鏡を使用して、７５ ｋＶの加速的電圧で調べた。
【０１１５】
沈降アッセイ法
凍結乾燥されたｈＩＡＰＰ１位〜３７位の一定分量を２０ ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ ６．５）に溶解して１１ μＭにし、全容量５００ μｌにおいて室温でインキュベートした。チロシン発光スペクトルは、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ５３０分光光度計に各試料について時間０で集められた（発光波長２７５ ｎｍ）。室温での２４時間インキュベーション後、各試料中の可溶性および凝集されたペプチドは１６，０００ ｇで２０分間の遠心分離により分離され、その発光スペクトルは可溶性画分上で測定された。その後、試料をボルテックスして各チューブの全内容物を再懸濁し、さらに２４時間インキュベートした。この工程は、インキュベーションの総計７２時間、繰り返された。同時インキュベーション実験として、ｈＩＡＰＰを、１０倍過剰濃度（１１０ μＭ）の抑制性ペプチド
2004517050.tif 000021
と共にインキュベートした。
【０１１６】
予備的実験において、一連のペプチドを、２０位〜２９位ドメインから合成し、ＣＤ、ＥＭおよびＴｈＴ蛍光により、完全長ＩＡＰＰ残基１位〜３７位と比較して２つのモル比（１：１０および１：２０）で調べた。次のデータ（図５Ａ〜５Ｄ、図６Ａ〜６Ｃおよび図７Ａ〜７Ｂ）が得られた。
【０１１７】
結果
２０ ｍＭ 酢酸緩衝液に溶解される場合、完全長ｈＩＡＰＰは、ランダムコイル構造として特有なＣＤスペクトルを示す。ランダムコイルからβ−シートへのコンフォメーションの変化は、室温での４８時間のインキュベーション後に測定された（図３Ａ）。１：１０（断続線）または１：２０（点線）のモル比でのペプチド
2004517050.tif 000022
の添加は、時間０で信号の減弱を生じず、これらのペプチドがＩＡＰＰの最初のランダム構造に影響を及ぼさなかったことを実証し（図３Ｂ）、従って、これらのペプチドは、凝集に続くＩＡＰＰの沈澱による信号の減弱を生じなかったことを示唆した。ＳＳＮＮＦＧ（配列番号：１０）についての時間０のデータを示す。他のペプチドとは対照的に、１０倍過剰量のＮＦＧＡＩＬ（配列番号：１９）とのＩＡＰＰのインキュベーションは、図３Ｃに示されるように、時間０でコンフォメーションの変化を引き起こし（断続線）、２０倍過剰量（点線）では、ランダムコイルからβ−シートへのコンフォメーションの変化を生じることによる、より明白な効果を及ぼした。それゆえ、ペプチドＮＦＧＡＩＬ（配列番号：１９）は、ランダムコイル構造からランダムコイルとβ−シートとの間の中間のコンフォメーションへと、時間０でＣＤスペクトルにおける即時の変化を引き起こした。このデータは、ペプチドＮＦＧＡＩＬ（配列番号：１９）が、抑制性性質をもつというよりむしろ、実際にはＩＡＰＰ原線維形成を促進している可能性があること、およびこのペプチド配列内に含まれる領域がＩＡＰＰのアミロイド形成的性質の内因性である可能性があることを示唆する。図３Ａでは、２０ ｍＭ 酢酸緩衝液ｐＨ ６．５でインキュベートされたｈＩＡＰＰ（１位〜３７位）が時間０でランダムコイルとして現れた（実線）。４８時間のインキュベーション後、ランダムコイル構造はβ−シートへの移行をうけた（断続線）。
【０１１８】
個々のヘキサペプチドとの延長したインキュベーション後に、ＩＡＰＰについてのＣＤスペクトルにおける変化を調べた。ＩＡＰＰを、図４Ａ〜４Ｄに示される各ペプチドと共にインキュベートした。ＣＤスペクトルを２４時間〜７２時間、記録した。以前の研究より、ＩＡＰＰ原線維形成が、酸性から中性ｐＨのｐＨ値範囲にわたって起こりうることが実証されていた。それゆえ、β細胞分泌顆粒の酸性ｐＨ（ｐＨ ５．５）と細胞外間隙（ｐＨ ７．４）との中ほどである、ただ一つの条件（ｐＨ ６．５）をこれらの実験のために選択した。簡潔にするため、標準的インキュベーション期間として４８時間のインキュベーションを用いて、選んだいくつかのペプチドからのデータを示すものとする。ペプチド
2004517050.tif 000023
は、ｈＩＡＰＰ（１位〜３７位）がβ−シートを形成する能力に対してほとんど影響を及ぼさなかった（図４Ａ）。ＣＤスペクトルより、１０倍モル過剰量のＮＮＦＧＡＩ（配列番号：１２）の存在下において、溶液からそのペプチドの沈澱が示された。１０倍モル過剰量のＮＮＦＧＡＩ（配列番号：１２）とのＩＡＰＰのインキュベーションは、このように、ｈＩＡＰＰの凝集または沈澱に影響を及ぼさなかった（断続線）。実際、図４Ａにおいて、ＮＮＦＧＡＩ（配列番号：１２）のような若干数のペプチドは、ＩＡＰＰ（１位〜３７位）の４８時間のインキュベーション後にβ−シートを形成する能力にほとんど影響を及ぼさなかった。ＩＡＰＰについてのＣＤスペクトルより、そのペプチドの凝集に続く溶液からのそのペプチドの沈澱が示された（実線）。ＩＡＰＰをランダムコンフォメーションに維持するために、このペプチドの２０倍モル過剰量が必要とされ（点線）、ＮＮＦＧＡＩ（配列番号：１２）は、たとえ抑制性性質を有するとしても、わずかであることを示唆した（図４Ａ）。ペプチド
2004517050.tif 000024
は、ＩＡＰＰをランダムコンフォメーションに維持することができた。両方のペプチドは、低濃度で使用される場合でさえも、有効な抑制剤であった（図４Ｂ）。ペプチド
2004517050.tif 000025
は、ＩＡＰＰの沈澱による信号の減弱を妨げることができた（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【０１１９】
図４Ｃおよび４Ｄにおいて、ペプチド
2004517050.tif 000026
は、両方とも、１：２０（点線）または１：１０（断続線）のモル比のいずれかで使用される場合、ＩＡＰＰβ−シート移行およびその付随的凝集の非常に強い抑制剤であった。
【０１２０】
ヘキサペプチドとのインキュベーション後、ＩＡＰＰの形態は、ネガティブ染色電子顕微鏡法により調べられた。図５Ａにおいて、抑制性ペプチドは、完全長ＩＡＰＰ（１位〜３７位）原線維である。完全長ｈＩＡＰＰ（１位〜３７位）は、複数の前原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）から構成される原線維集合体を形成する（図５Ａ）。これらの構造は、網状形態をもつＩＡＰＰ原線維の高密度集合体により定義される。ペプチド
2004517050.tif 000027
の添加は、ＩＡＰＰ原線維凝集体の形態に影響を及ぼさなかった。ペプチドＮＦＧＡＩＬ（配列番号：１９）（２０倍モル過剰量）は、より複雑およびより高密度な網状原線維へと導くＩＡＰＰ凝集を促進するように思われた（図５Ｂ）。図５Ｃおよび図５Ｄにおいて、抑制性ペプチド
2004517050.tif 000028
（図５Ｄ）は、ＩＡＰＰ原線維構造の崩壊を引き起こした。１０倍または２０倍のモル過剰量の
2004517050.tif 000029
のいずれとのＩＡＰＰのインキュベーションも、完全には原線維形成を阻止しなかった。ＣＤ分析より、これらの抑制剤の存在下でインキュベートされる場合、これらの試料中のＩＡＰＰの大部分はランダムコンフォメーションに維持されたことが実証された。これらのペプチドとインキュベートされた時に形成されたｈＩＡＰＰ原線維凝集体は外観上は変化した（図５Ｃおよび５Ｄ）。その原線維は、数はより少なく、よりほっそりした。さらに、典型的な高密度凝集は観察されず、どうにか形成したその凝集体がさらなる原線維形成のための核として働かなかったことを示唆した。図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｄにおいて、スケールバーは１ μｍを表し、図５Ｃにおいてはスケールバーは０．５ μｍを表す。
【０１２１】
ＣＤスペクトル分析の結果として、ペプチド
2004517050.tif 000030
がＩＡＰＰ原線維形成の最も強い抑制を示した。それゆえ、さらなる実験は、より低い濃度でのそれらの相対的抑制を測定するために行われた。ペプチドＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）は、ＩＡＰＰに対して５倍モル比（点線）または等モル濃度（断続線）まで引き下げられた場合、その抑制性性質を保持した。これは、ランダムコイルからのＩＡＰＰβ−シートコンフォメーションの変化を阻止するその能力により実証された（図６Ａ）。ペプチドＧＡＩＬＳＳ（配列番号：１４）もまた、低下された濃度で使用された場合、非常に強い抑制剤であった（図６Ｂ）。ＧＡＩＬＳＳ（配列番号：１４）は、濃度が５倍過剰量（点線）または１：１モル比（断続線）のいずれかまで引き下げられた場合も同等の抑制性であったという点において、ＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）と同様の性質を示した。対照的に、ペプチドＡＩＬＳＳＴ（配列番号：１５）は、５倍モル過剰量（点線）で使用された場合、ｈＩＡＰＰをランダムコイルペプチドとして維持することができたが、濃度が１：１モル比（断続線）までさらに低下された場合、もはや抑制性ではなかった（図６Ｃ）。これらのデータに一致して、抑制剤濃度が引き下げられた場合でさえ、ＩＡＰＰ原線維形態は変化した（図６Ａ〜６Ｃ）。ペプチド
2004517050.tif 000031
は、両方とも、通常のＩＡＰＰ原線維凝集の有効な抑制剤であった。これらのペプチドの存在下でまれに形成する原線維構造は、細長くリボン状であり、それらはＩＡＰＰ単独として見られる高密度の網状構造へと集合しなかった。
【０１２２】
沈降アッセイ法は、ペプチド
2004517050.tif 000032
のＩＡＰＰ原線維形成を抑制する能力について、ＣＤおよび電子顕微鏡分析（図７Ａおよび７Ｂ）からの結果を確認するために行われた。ｈＩＡＰＰ（１１ μＭ）は、７２時間、２０ ｍＭ 酢酸緩衝液中で単独、またはそのペプチドの１０倍過剰量（１１０ μＭ）と共にインキュベートした。
【０１２３】
図７Ａおよび７Ｂにおいて、ＩＡＰＰは、それぞれ１：１
2004517050.tif 000033
または１：５
2004517050.tif 000034
の濃度でペプチドと共に４８時間インキュベートした。図７Ａにおいて、スケールバーは０．５ μｍを表し、図７Ｂにおけるスケールバーは１ μｍを表す。
【０１２４】
チロシンスキャンは、７２時間インキュベーション後の溶液に残存する可溶性ｈＩＡＰＰの量を測定するために用いられた。図８に示されるように、時間０での溶液中のｈＩＡＰＰ単独の量は１１０％に設定され、すべての他の状態はこの値に対して標準化された。２４時間のインキュベーション後、可溶性ｈＩＡＰＰの量は８％まで低下した。しかしながら、ｈＩＡＰＰがペプチドＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）の存在下でインキュベートされた場合、溶液中に残存するＩＡＰＰの量は約１５％であり、かつペプチドＧＡＩＬＳＳ（配列番号：１４）の存在下では、ｈＩＡＰＰの８０％以上が溶液中に残存していた。４８時間までには、単独でインキュベートされたｈＩＡＰＰはもはや溶解できず、チロシンスキャンを用いて検出できなかった。しかしながら、いずれかのペプチドと共に同時インキュベートされた場合、ｈＩＡＰＰの約２５％がまだ測定された。同様に、７２時間後、ペプチド
2004517050.tif 000035
と共に同時インキュベートされた試料中に、ｈＩＡＰＰの約２０％がまだ溶解していた。
【０１２５】
前に詳述されているように、ｈＩＡＰＰ２０位〜２９位の近位の末端由来のヘキサペプチド
2004517050.tif 000036
は、β−シート形成の強い抑制剤であった。１：５または１：１の濃度のいずれかのＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）とのｈＩＡＰＰ（１位〜３７位）のインキュベーションは、β−シート形成を阻止するのに十分であった。さらに、この断片は完全には原線維形成を抑制することができなかったとはいえ、形成された凝集体は変化した形態を見せ、ゆるく結合されたリボン状構造として現れた。これは、これらのペプチドの末端のセリンおよびアスパラギン残基とのｈＩＡＰＰの相互作用が通常の原線維集合を変化させた。他のペプチドと比較した場合（図２を参照）、いったんこれらの残基が除去されれば、抑制の大部分は失われるものと思われる。それゆえ、これらの残基がＩＡＰＰ原線維形成に対して影響を及ぼしている可能性が高い。
【０１２６】
ｈＩＡＰＰが、その配列（２０位〜２９位）のより遠位の部分をターゲットするペプチドと共にインキュベートされた時、これらの断片がβ−シート形成の強い抑制剤であることが見出された。ペプチド
2004517050.tif 000037
は、両方とも、１：５または１：１のように低いモル比でさえも、ｈＩＡＰＰの大部分をランダムコイルのコンフォメーションに維持することができた。これらのペプチドの存在下で形成された原線維の形態は、変化していた；ｈＩＡＰＰが単独でインキュベートされた場合に観察される高密度に詰め込まれた原線維群とは対照的に、形成された原線維は、数がより少ないことに加え、伸長した細い糸のようであった。
【０１２７】
ＩＩ型糖尿病の患者において、分泌後のＩＡＰＰのクリアランスの欠如（Ｃｌｏｄｉ， Ｍ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７４：Ｅ９０３〜Ｅ９０８， １９９８）および／またはｐｒｏ−ＩＡＰＰの不完全なプロセシングが、原線維形成を促進する環境を提供する可能性があることが示唆されてきた（Ｈｉｇｈａｍ， ＣＥら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：４９９８〜５００４， ２０００）。一つの可能性は、ＩＡＰＰの過剰が原線維の集合および凝集のための「種」として働くのではないかということである（Ｈｉｇｈａｍ， ＣＥ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：４９９８〜５００４， ２０００； Ｋａｈｎ， ＳＥ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６：１７２５〜１７２７， １９９７； およびＣｌａｒｋ， Ａ．ら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３６：Ａ１３６， １９９３）。ｈＩＡＰＰが抑制性ペプチド
2004517050.tif 000038
の存在下でインキュベートされた場合、形態への他の変化に加えて、追加の原線維集合のための種として働きうる原線維凝集体が存在しないことが観察された。これらのデータはまた、抑制性ペプチド
2004517050.tif 000039
がより長い時間、可溶性の形でＩＡＰＰを維持することができ、かつそれにより、原線維凝集体の形成を減ずることを実証する沈降実験により支持された。その原線維が不溶性ｈＩＡＰＰの典型的な高密度の網状を形成する可能性が低いだけでなく、これらの核をなす種の非存在下においてｈＩＡＰＰ凝集体が形成することが全くより困難でありうるため、これはそのヘキサペプチドの追加の抑制性効果として考えられるものと思われる。この接種仮説のさらなる支持は、ＩＡＰＰが短いペプチドＮＦＧＡＩＬ（配列番号：１９）とインキュベートされた場合に観察された。この短いペプチドの存在下で原線維の発生における即時の増加は、特定のペプチドの原線維形成を促進する能力を実証する。
【０１２８】
ＩＡＰＰ毒性アッセイ法
ＲＩＮ−１０５６Ａ細胞は、５％ ウシ胎児血清（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））、１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））、および１００ Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））で補充されたダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））（ギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））において、２ ｘ １０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートへ蒔かれた。培養の最初の２４時間後、細胞は、１０ μＭ ｈＩＡＰＰもしくはラットＩＡＰＰ単独を含む新鮮な培地を、または２００ μＭ ＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）と組み合わせて、受けた。対照ウェルの細胞は新鮮な培地のみ受けた。細胞は、３７℃、５％ ＣＯ２で、２４時間、ペプチドとインキュベートされ、その後、アラマーブルー（ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）（１／１０ｔｈ 容量）が各ウェルへ添加された。細胞は、アラマーブルー（ＭＥＤＩＣＯＲＰ、モントリオール）の存在下で、８時間、インキュベートされ、データは２時間間隔で収集された。試料の蛍光は、スペクトルＭＡＸジェミニＸＳマイクロプレート分光蛍光計（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（モレキュラーデバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて、５４４ ｎｍの励起波長および５９０ ｎｍの発光波長で測定された。データは、マッキントッシュ用ソフトマックスプロ（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ）３．１ソフトウェアを用いて収集された。
【０１２９】
結果
膵臓のβ細胞系におけるｈＩＡＰＰ原線維の毒性は、十分考証されてきた。実験は、抑制性ペプチドＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）が原線維形成を抑制できるだけでなく、膵臓のβ細胞におけるｈＩＡＰＰ原線維の細胞毒性効果を減少させることができるかどうかを決定するために行われた。ＲＩＮ１０５６細胞は、１０ μＭ ｈＩＡＰＰ単独の存在下またはペプチドＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）の存在下において、２４時間インキュベートされた。細胞の増殖を定量的に測定する、および培養物への様々な添加物の細胞毒性効果を比較するために、アラマーブルーアッセイ法が用いられた。図２５Ａに示されるように、ＲＩＮ１０５６細胞へのｈＩＡＰＰの添加は、培地単独での細胞（対照）と比較して、細胞生存度において３５％〜４０％の減少を生じた。ペプチドＳＮＮＦＧＡ（配列番号：１１）のｈＩＡＰＰとの同時インキュベーションの結果として、ｈＩＡＰＰ単独と比較して細胞生存度における有意な向上を生じた。さらに、このペプチドは培養において膵臓のβ細胞への直接的な毒性はないことも観察された（図２５Ｂ）。
【０１３０】
ＩＡＰＰの８位〜２０位領域由来ペプチド
前に詳述されているように同様の実験を次のＩＡＰＰの８位〜２０位領域由来ペプチドで実施した（図２を参照）：
2004517050.tif 000040
【０１３１】
これらのペプチドは、コンフォメーションに対するそれらの効果について試験された。円二色性結果から、および図９Ａ〜１６Ｂに見られうるように、ペプチドＦＲＡ−０１２、ＦＲＡ−０１６、ＦＲＡ−０１９、ＦＲＡ−０１７、およびＦＲＡ−０１８のみが抑制活性を有する。実際には、ＦＲＡ−０１２は、より高い濃度で限定された抑制を示した。ＦＲＡ−０１３は、１０倍モル過剰量でβ−シートコンフォメーションの形成の促進を示したが、より高い濃度ではランダムコイルの可能性を示した；しかしながら、信号は大きく減衰し、ゆえにこれはより高い濃度での大量の沈澱の結果であると思われる。ＦＲＡ−０１４は、ＦＲＡ−０１３について見られたのと同様の挙動を示した。ＦＲＡ−０１５は、ＦＲＡ−０１３およびＦＲＡ−０１４と同様の側面の凝集（リボン構造）の促進を示した。ＦＲＡ−０１６は、１０倍モル過剰量でＩＡＰＰペプチドの大部分のランダムコイルとしての保持により示されるように、比較的強い抑制を示した。しかしながら、ＦＲＡ−０１６は、より高い濃度でより強い活性を示した。ＦＲＡ−０１９は、ランダムコイル抑制を維持し、活性に関してＬＡＮＦＬＶ（配列番号：６）（ＦＲＡ−０１６）に類似しているように思われる。ＦＲＡ−０１７は、限定された抑制活性を示した。ＦＲＡ−０１８は、幾分穏やかな抑制を示した（ＦＲＡ−０１９およびＦＲＡ−０１７と比較して）。
【０１３２】
ＣＤの調査結果は、ネガティブ染色電子顕微鏡法により確認され、そのペプチドが定義されたグループへ分類されることが実証された（図１７Ａ〜２４Ｂを参照）。
【０１３３】
凝集を増加または減少させるそれらの能力について試験された場合、ＦＲＡ−０１３、ＦＲＡ−０１４、およびＦＲＡ−０１５は、著しく凝集を促進し、かつ大きくねじれた構造である原線維を生じた。これらは、対照ＩＡＰＰにおいては観察されず、Ａβの場合におけるグリコサミノグリカンの添加について典型的に見られるものと類似していた。ＦＲＡ−０１２およびＦＲＡ−０１７は、形成された原線維の密度および形態に対して限定された効果のみを及ぼした。
【０１３４】
ＦＲＡ−０１６のＥＭは、切断された半−原線維の凝集体のみを生じるという、１０倍過剰量での通常の原線維の崩壊を実証した（図２１Ａおよび図２１Ｂを参照）。いくつかの原線維は、２０倍モル比でも見られた。
【０１３５】
ＦＲＡ−０１９について、抑制（図２２Ａおよび図２２Ｂを参照）は、ＩＡＰＰ原線維のより低い密度で確認され、形態はかなり細い前原線維からなり、ＣＤ結果と一致している。
【０１３６】
本明細書に記載される特定の手順に対して多数の等価なものを当業者は認識している、またはただ通常の実験だけで確かめることができるものと思われる。そのような等価なものは、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲により網羅される。本出願を通して引用されるすべての文献、発行された特許、および公開された特許出願の内容は、参照として本明細書に組み入れられている。それらの特許、出願および他の文書の適切な成分、工程、および方法を本発明およびそれの態様のために選択してもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】アミロイド−β（Ａβ）ペプチドの配列およびその提唱される構造ドメインを示す。
【図２】調べられるヘキサペプチドおよびそれらのＩＡＰＰの一次配列に対応するものを示す。
【図３Ａ〜図３Ｃ】タンパク質分光法により評価されたＩＡＰＰペプチドのコンホメーションを示す。
【図４Ａ〜図４Ｄ】ペプチド断片とのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図５Ａ〜図５Ｄ】抑制性ペプチドとの４８時間のインキュベーション後のＩＡＰＰの電子顕微鏡写真を示す。
【図６Ａ〜図６Ｃ】抑制剤濃度の作用として、ＩＡＰＰにおけるコンホメーションの変化を示す。
【図７Ａおよび図７Ｂ】2004517050.tif 000041
とのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図８】可溶性および不溶性ＩＡＰＰの相対的量を測定するための沈降アッセイ法を示す。
【図９Ａおよび図９Ｂ】ＦＲＡ−０１２ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１０Ａおよび図１０Ｂ】ＦＲＡ−０１３ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１１Ａおよび図１１Ｂ】ＦＲＡ−０１４ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１２Ａおよび図１２Ｂ】ＦＲＡ−０１５ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１３Ａおよび図１３Ｂ】ＦＲＡ−０１６ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１４Ａおよび図１４Ｂ】ＦＲＡ−０１９ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１５Ａおよび図１５Ｂ】ＦＲＡ−０１７ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１６Ａおよび図１６Ｂ】ＦＲＡ−０１８ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰのコンホメーションにおける変化を示す。
【図１７Ａおよび図１７Ｂ】１：１０（図１７Ａ）または１：２０（図１７Ｂ）の希釈でＦＲＡ−０１２ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図１８Ａおよび図１８Ｂ】ペプチドの１：１０の希釈について５０００Ｘ（図１８Ａ）または２０，０００Ｘ（図１８Ｂ）に拡大された、ＦＲＡ−０１３ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図１９Ａおよび図１９Ｂ】１：１０希釈（図１９Ａ；拡大２０００Ｘ）または１：２０希釈（図１９Ｂ；拡大２０，０００Ｘ）でＦＲＡ−０１４ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２０Ａおよび図２０Ｂ】１：１０希釈（図２０Ａ）または１：２０希釈（図２０Ｂ）でＦＲＡ−０１５ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２１Ａおよび図２１Ｂ】１：１０希釈（図２１Ａ）または１：２０希釈（図２１Ｂ）でＦＲＡ−０１６ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２２Ａおよび図２２Ｂ】１：１０希釈（図２２Ａ）または１：２０希釈（図２２Ｂ）でＦＲＡ−０１９ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２３Ａおよび図２３Ｂ】１：１０希釈（図２３Ａ）または１：２０希釈（図２３Ｂ）でＦＲＡ−０１７ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２４Ａおよび図２４Ｂ】１：１０希釈（図２４Ａ）または１：２０希釈（図２４Ｂ）でＦＲＡ−０１８ペプチドとのインキュベーション後のＩＡＰＰ原線維の電子顕微鏡写真を示す。
【図２５Ａおよび図２５Ｂ】本発明のペプチドの毒性を示す。
【図１】
2004517050.tif 000054
【図２】
2004517050.tif 000055
【図３】
2004517050.tif 000056
【図４Ａ】
2004517050.tif 000057
【図４Ｂ】
2004517050.tif 000058
【図４Ｃ】
2004517050.tif 000059
【図４Ｄ】
2004517050.tif 000060
【図５Ａ】
2004517050.tif 000061
【図５Ｂ】
2004517050.tif 000062
【図５Ｃ】
2004517050.tif 000063
【図５Ｄ】
2004517050.tif 000064
【図６】
2004517050.tif 000065
【図７】
2004517050.tif 000066
【図８】
2004517050.tif 000067
【図９】
2004517050.tif 000068
【図１０】
2004517050.tif 000069
【図１１】
2004517050.tif 000070
【図１２】
2004517050.tif 000071
【図１３】
2004517050.tif 000072
【図１４】
2004517050.tif 000073
【図１５】
2004517050.tif 000074
【図１６】
2004517050.tif 000075
【図１７】
2004517050.tif 000076
【図１８】
2004517050.tif 000077
【図１９】
2004517050.tif 000078
【図２０】
2004517050.tif 000079
【図２１】
2004517050.tif 000080
【図２２】
2004517050.tif 000081
【図２３】
2004517050.tif 000082
【図２４】
2004517050.tif 000083
【図２５】
2004517050.tif 000084
【国際公開パンフレット】
2004517050.tif 000085
2004517050.tif 000086
2004517050.tif 000087
2004517050.tif 000088
2004517050.tif 000089
2004517050.tif 000090
2004517050.tif 000091
2004517050.tif 000092
2004517050.tif 000093
2004517050.tif 000094
2004517050.tif 000095
2004517050.tif 000096
2004517050.tif 000097
2004517050.tif 000098
2004517050.tif 000099
2004517050.tif 000100
2004517050.tif 000101
2004517050.tif 000102
2004517050.tif 000103
2004517050.tif 000104
2004517050.tif 000105
2004517050.tif 000106
2004517050.tif 000107
2004517050.tif 000108
2004517050.tif 000109
2004517050.tif 000110
2004517050.tif 000111
2004517050.tif 000112
2004517050.tif 000113
2004517050.tif 000114
2004517050.tif 000115
2004517050.tif 000116
2004517050.tif 000117
2004517050.tif 000118
2004517050.tif 000119
2004517050.tif 000120
2004517050.tif 000121
2004517050.tif 000122
2004517050.tif 000123
2004517050.tif 000124
2004517050.tif 000125
2004517050.tif 000126
2004517050.tif 000127
2004517050.tif 000128
2004517050.tif 000129
2004517050.tif 000130
2004517050.tif 000131
2004517050.tif 000132
2004517050.tif 000133
2004517050.tif 000134
2004517050.tif 000135
2004517050.tif 000136
2004517050.tif 000137
2004517050.tif 000138
2004517050.tif 000139
2004517050.tif 000140
2004517050.tif 000141
2004517050.tif 000142
2004517050.tif 000143
2004517050.tif 000144
2004517050.tif 000145
2004517050.tif 000146
2004517050.tif 000147
2004517050.tif 000148
2004517050.tif 000149
2004517050.tif 000150
2004517050.tif 000151
2004517050.tif 000152
2004517050.tif 000153
2004517050.tif 000154
2004517050.tif 000155
2004517050.tif 000156
2004517050.tif 000157
2004517050.tif 000158
2004517050.tif 000159
2004517050.tif 000160
2004517050.tif 000161
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517050.tif 000162
【国際調査報告】
2004517050.tif 000163
2004517050.tif 000164
2004517050.tif 000165
2004517050.tif 000166
2004517050.tif 000167
2004517050.tif 000168