(57)【要約】本発明は、核酸分析用の統合完全自動化システムを開発するための基盤技術としての核酸の多機能性担体物質に関するものである。本発明の複合核酸分析用の担体物質は、表面に少なくとも１つの共有結合膜が存在し、該膜は、該表面に統計的に分散して存在する少なくとも２つの異なる官能基を担持することを特徴とする。該官能基の少なくとも１つはマイナスに帯電し、そして、少なくとも１つの別の官能基は、プラスに帯電するかまたは化学反応性であるかまたは両性質を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合核酸分析用の担体物質であって、表面に少なくとも１つの共有結合膜が存在し、該膜は表面に統計的に分散して存在する少なくとも２つの異なる官能基を担持し、その際
−該官能基の少なくとも１つがマイナスに帯電し、
−少なくとも１つの別の官能基が、プラスに帯電するかまたは化学反応性であるかまたは両性質を有することを特徴とする複合核酸分析用の担体物質。
【請求項２】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電した官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項３】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つの化学反応性官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項４】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電もしていて化学反応性でもある官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項５】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電した官能基と少なくとも１つの化学反応性官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項６】
少なくとも１つのマイナスおよび／またはプラスに帯電した官能基が、イオン官能基であることを特徴とする請求項１ないし５のいづれか１の担体物質。
【請求項７】
表面に存在するマイナスに帯電した基が、カルボキシル基、スルホニル基、硫酸塩基およびリン酸塩基をもつ重合可能な化合物、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸とスチレンリン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸の誘導体および／またはそれらの混合物から形成されることを特徴とする請求項１ないし６のいづれか１の担体物質。
【請求項８】
プラスに帯電した官能基が、アミノ基、アンモニウム基、スルホニウム基またはホスホニウム基をもつ重合可能な化合物、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンの誘導体および／またはそれらの混合物から形成されることを特徴とする請求項１、２と４ないし７のいづれか１の担体物質。
【請求項９】
化学反応性官能基が、化学的および／または熱的および／または光化学的に活性可能であることを特徴とする請求項１と３ないし８のいづれか１の担体物質。
【請求項１０】
化学反応性官能基が、例えばケトン、特にベンゾフェノン、ベンゾイン、キサントンのような固定化増感剤かまたは脂肪族または芳香族アジドから成ることを特徴とする請求項１と３ないし９のいづれか１の担体物質。
【請求項１１】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、追加でＵＶ−ＶＩＳ吸収分光活性物質、特にフルオレセイン、ローダミン、アントラセン、ピレンのような色素かまたはそれらの誘導体を含むことを特徴とする請求項１と１０のいづれか１の担体物質。
【請求項１２】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、表面で開始されたラジカル重合の方法で表面を修飾することによって製造され、その際機能性が同時にかまたは任意の順に生じ、表面に共有結合されることを特徴とする請求項１ないし１１のいづれか１の担体物質。
【請求項１３】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、機能性モノマーの不均一光開始グラフト共重合によって製造されることを特徴とする請求項１ないし１２のいづれか１の担体物質。
【請求項１４】
Ｈ引抜き反応型の物質が光開始剤として、担体物質が補開始剤として使用され、開始が光開始剤の光励起によって起こることを特徴とする請求項１ないし１３のいづれか１の担体物質。
【請求項１５】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、機能性モノマーの化学開始重合によって表面に製造されることを特徴とする請求項１ないし１３のいづれか１の担体物質。
【請求項１６】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、開始剤として、物理または化学励起によって重合のためのラジカルかまたは別のプライマー種を発生する物質を含むことを特徴とする請求項１ないし１５のいづれか１の担体物質。
【請求項１７】
担体物質の表面の機能性が、例えばｐ−アジドベンゼンスルホン酸のような二機能性アジドが熱的または光化学的に活性化することによって得られることを特徴とする請求項１ないし１６のいづれか１の担体物質。
【請求項１８】
マイナスおよびプラスの官能基を、光開始剤、特にベンゾフェノンで予備処理した担体物質上に順に、特に例えばポリプロピレン膜のような担体物質を、アクリル酸と２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩の溶液を用いて、その都度続く露光による機能化を伴って順に被膜することによって取付けることを特徴とする請求項１ないし１７のいづれか１の担体物質。
【請求項１９】
マイナスおよびプラスの官能基を、光開始剤、特にベンゾフェノンで予備処理した担体物質上に同時に、特に例えばポリプロピレン膜のような担体物質を、アクリル酸と２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩を含む反応溶液を用いて、続く露光による機能化を伴って同時に被膜することによって取付けることを特徴とする請求項１ないし１７のいづれか１の担体物質。
【請求項２０】
担体物質として、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、セルロースおよびそれらの誘導体、ポリアミド、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミドのような有機重合体並びに該ポリマーの共重合体または混合物を使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２１】
担体物質として、ガラス、ケイ酸塩、セラミックのような無機の、特に鉱物材料かまたは金属並びにそれらの有機重合体との複合体を使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２２】
担体物質として、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、スライドガラス、繊維、空洞繊維、羊毛、布地、粉末、顆粒または粒子を、その都度反応空間に関して多孔かまたは非多孔で使用することを特徴とする請求項１ないし２１のいづれか１の担体物質。
【請求項２３】
担体物質として、対称または非対称孔構造と数ナノメートルから１０μｍの孔径を有する膜を使用することを特徴とする請求項１ないし２２のいづれか１の担体物質。
【請求項２４】
担体物質として、請求項２０ないし２３のいづれか１に挙げた物質を組み合わせて使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２５】
担体物質が、予め追加で機能化、例えば親水化されることを特徴とする請求項１ないし２４のいづれか１の担体物質。
【請求項２６】
担体物質の予備処理が、強塩基物質、好ましくは水酸化アルカリまたはアルカリアミドと、アルコール、好ましくはｉ−プロパノールから成る溶液を用いてアルカリ性で２４時間まで行われ、続いて該担体物質を洗浄水が中性になるまで洗浄し、その後乾燥することを特徴とする請求項１ないし２５のいづれか１の担体物質。
【請求項２７】
突然変異の検出、メチル化パターンの検出、ＳＮＰの検出および／または制限パターンの検出のような核酸を複合的および自動化可能で分析するための請求項１ないし２６のいづれか１の担体物質の使用。
【請求項２８】
必要な準備工程と分析工程、特に核酸の抽出、結合、操作および検出が、同時かまたは順に同じ担体物質で実施されることを特徴とする、生体物質、特に核酸の複合的および自動化可能な分析法。
【請求項２９】
検査される出発試料を担体物質で、溶菌緩衝液を用いて、場合によってはタンパク質分解酵素を取り入れて培養し、溶菌が起こった後に、場合によっては結合緩衝液を混合し、出発試料の核酸をマイナスに機能化した基に結合し、続いて洗浄し、次に緩衝液、特に低塩緩衝液を添加することによってプラスに機能化した基に結合することを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３０】
検査される出発試料を担体物質で、溶菌緩衝液を用いて、場合によってはタンパク質分解酵素を取り入れて培養し、溶菌が起こった後に、場合によっては結合緩衝液を混合し、出発試料の核酸をマイナスに機能化した基に結合し、続いて洗浄し、次に光作用および／または熱処理によって化学反応性基に結合することを特徴とする請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
担体物質に結合した核酸が、特に変性して、化学修飾で、複写で、選択的複写でかまたは制限酵素でこなして操作されることを特徴とする請求項２８ないし３０のいづれか１の方法。
【請求項３２】
担体物質に結合した核酸が、特殊のゾンデで混成されることを特徴とする請求項２８ないし３１のいづれか１の方法。
【請求項３３】
担体物質に結合した核酸が、操作後に特殊のゾンデで混成されることを特徴とする請求項２８ないし３２のいづれか１の方法。
【請求項３４】
使用したマークしたゾンデでの混成が、間接的に酵素により検出されることを特徴とする請求項２８ないし３３のいづれか１の方法。
【請求項３５】
混成が、ゾンデをマークすることにより直接検出されることを特徴とする請求項２８ないし３４のいづれか１の方法。
【請求項３６】
請求項１ないし２６のいづれか１の担体物質および／または請求項２８ないし３５のいづれか１の方法並びに核酸分析用のその他の反応成分が使用されることを特徴とする、生体物質、特に核酸の分析用試験用品一式。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、核酸分析用の統合完全自動化システムを開発するための基盤技術として核酸を複合操作する物質に関するものである。
【０００２】
考えられ得る適用分野は、医学診断学と司法診断学と食品診断学の分野、並びに隣接するその他の全ての学術分野での多数の分子生物学的に作業を行う研究室に該当する。
【０００３】
（背景技術）
核酸（ＲＮＡとＤＮＡ）の分析は益々その重要性を増している。これは分子生物工学で際立つ全学問分野に該当する。医学における分子に関する核酸分析の重点は、病理学的過程との因果関係が考察される医学的に興味のある遺伝子中の配列変化を立証することである。
検査すべき標的配列が大量であるがゆえに、その際益々「ハイ・スループット適用」（高スループット適用）がその価値を認められている。その際考えられ得る高スループット適用に関しては、ＤＮＡチップ（ＤＮＡ配列）に基づくプロセス処理が益々実験的な核酸分析に入り込んでいる。
この技術の原則は、異なる高さの数のオリゴヌクレオチド（ゾンデ）が、固相に向けて結合したか、ないしは初めから固相で合成されることにある。生じたＤＮＡチップは、それから各問題部位に応じて分析すべき試料核酸と共に培養される。分析すべき試料核酸としては、これまでマークを付けた全ＲＮＡが発現側面を検査するために、並びにＰＣＲ経由でマークして生じたＤＮＡ断片が配列決定（と配列移動）のために使用されてきた。（ＵＳ５８３７８３２、ＵＳ６０２７８８０）
それは、その都度存在する問題部位に応じてＤＮＡチップを特殊なオリゴヌクレオチドゾンデで覆い、続いて試料核酸で混成することを意味する。この混成化結果は蛍光検出を用いて読み取りおよび評価され、そのようにして存在する核酸配列に対する詳細な情報が供給される。
この技術を用いて、多数の配列情報を分析することが可能である。短所は、非常に高いコストと、チップに向けられたオリゴヌクレオチドゾンデを、その配列識別に関して正確に品質制御する問題である。
この方法のその他の大きい短所は、核酸標的を配列証明に関して分析するために、検査すべき標的を自由に使用できるようにしなければならないことにある。この必要性は、並んでいる関連試料から核酸を単離し、続いて検査すべき標的配列をＰＣＲを用いて増幅することを含む。増幅した標的配列を用いて初めて、限定してオリゴヌクレオチドを向けた決められたチップを混成することができる。
【０００４】
ＧＢ２、２７４、４０９Ａから、構造的にマイナスおよびプラスに帯電した領域を有する膜が周知である。これは、空間的に互いに区切られるプラスおよびマイナスに帯電した面積が存在することを意味する。そのような膜は、分離媒体として古典的な濾過法で多彩に使用されている。しかしながらプラスおよびマイナスに帯電した領域が空間的に分かれているがゆえに、核酸の洗浄、結合並びに検出を１つの場所で行うことができないので、この膜は核酸操作および核酸分析における複合進行には不適当である。
【０００５】
それ故本発明の課題は、複合的な核酸操作と核酸分析のための新種の基盤技術に対する新しい担体物質を提供することであった。
【０００６】
これは発明によって、これまで追求してきたチップに基づく技術をその機能原理から逆転させることによって達せられる。本発明は請求項によって実現され、従属請求項はより好ましい態様である。本発明は二または多機能化表面に関するもので、該表面ではこれまでの核酸分析（例えば配列決定）のために必要な全てのプロセスが実現される。
【０００７】
（発明の開示）
本発明の担体物質は、表面に少なくとも１つの共有結合膜が存在し、該膜は、該表面に統計的に分散して存在する少なくとも２つの異なる官能基を担持し、その際
−該官能基の少なくとも１つがマイナスに帯電し、
−少なくとも１つの別の官能基が、プラスに帯電するかまたは化学反応性であるかまたは両性質を有することを特徴とする。
官能基の統計的な分散については発明の意味において、これらの基は空間的に互いに分かれて存在するのではなく、担体表面に均一に分散して存在すると理解される。これは、全てのプロセス段階が、空間的に担体物質の１つの場所で起こり得るという大きい長所をもつ。
【０００８】
または多機能固相に対して特徴的なのは、固相（基板または担体物質）を化学反応性基と共に、少なくとも２つの異なって帯電した、たいていのイオン性の官能基かまたはマイナスかプラスに帯電した官能基で化学修飾することであり、その際化学反応性基は、精製を行った後に目標分子を共有結合させることを可能にする。この化学修飾で利用したプロセスは、相当する表面に存在する（カチオンの、アニオンの、共有結合を構成する能力のある）官能基の割合を変化させて調整し、それによって正確に決定することを可能にする。本発明の最も重要な特徴は、マイナスに帯電した官能基を、別のプラスに帯電した官能基および／または化学反応性官能基と組み合わせることであり、これは目標分子に共有結合させ、該目標分子に実施される全ての抽出、修飾および検出段階が同じ担体物質で実現されることを可能にする。本発明の担体物質の修飾は、以下に記載する処理によって達せられる。
本発明の担体物質の機能性は、同時にかまたは任意の順序で順に、以下に記載する方法によって生じる。
１．　マイナスに帯電した官能基が生じ、続いて（熱的または光化学的に不安定な官能基無しの）カチオン官能基でさらに修飾される。
２．　マイナスに帯電した官能基が、（熱的または光化学的に不安定な官能基無しの）カチオン機能性と同時に生じる。
３．　マイナスに帯電した官能基が生じ、続いてカチオン官能基でさらに修飾され、および第３段階で順にそれに続いて熱的または光化学的に不安定な官能基で機能化される。
４．マイナスに帯電した官能基が、カチオン機能性と同時に生じ、続いて熱的または光化学的に不安定な基で修飾される。
５．全ての（アニオンの、カチオンの、および熱的／光化学的に活性可能な）官能基で同時に機能化される。
１．　マイナスに帯電した官能基が生じ、続いて熱的または光化学的に不安定な官能基でさらに修飾される。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の担体の製造法を、以下により詳しく説明する。
強いマイナスの官能基を発生させるためには、第１プロセス段階で任意の担体物質を１分間から２時間、好ましくは１時間の間室温で、アルコール、好ましくはｉ−プロパノール１０００ｇ当たり０．１ｇないし５００ｇの苛性ソーダ、苛性カリまたはその他の強塩基物質の溶液中に浸す。続いてアルコール溶液から取り出した担体物質を、洗浄溶液が中性になるまで好ましくは水で洗浄し、好ましくは１００℃で３０分間乾燥する。
続く第２プロセス段階では、予備処理した担体に光開始剤を被膜する。開始剤用の溶媒としてはケトン、アルコール、エステルおよびエーテルが重要である。その際開始剤の濃度は、好ましくは０．０１ｇｌ−１ないし０．５ｇｌ−１となる。
予備処理して、開始剤で覆った担体物質をモノマー溶液に浸し、該モノマー溶液から取り出し、湿潤状態で露光する。モノマーとしては、重合可能なカルボン酸−、スルホン酸−およびリン酸誘導体、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸およびスチレンリン酸の誘導体ないしそれらの混合物も適する。モノマー用の溶媒としては、アルコール、ケトン、エステル、エーテルおよび特に水並びにそれらの混合物が使用される。モノマーの濃度は、好ましくは１ｇｌ−１ないし２００ｇｌ−１となり、特に５０ｇｌ−１のモノマー含有量の溶液が適当である。
露光源としては、好ましくは水銀灯、高圧水銀灯、ハロゲンランプ、タングステンランプおよび開始剤吸収領域で放射するレーザーが使用される。露光時間は、放射源の強さに依存し、各々その性能によって一瞬から数時間となる。
露光後にこの支持体物質を洗浄する。洗浄液としては、特にモノマー溶液の製造に使用した溶媒が適する。続いてこの感光担体を乾燥する。
弱いマイナスの官能基を発生させるために、第１段階を激しく短縮するかないしは省略できる。
【００１０】
続く第３段階では、予備修飾した担体に再び光開始剤を被膜する。開始剤用の溶媒としてはケトン、アルコール、エステルおよびエーテルが重要である。その際開始剤の濃度は、好ましくは０．０１ｇｌ−１ないし０．５ｇｌ−１となる。
予備修飾して、開始剤で覆った担体物質をモノマー溶液に浸し、該モノマー溶液から取り出し、湿潤状態で露光する。モノマーとしては、重合可能なアンモニウム−、スルホニウム−およびホスホニウム誘導体、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンおよびスチレンビニル化合物の誘導体ないしそれらの混合物も適する。モノマー用の溶媒としては、アルコール、ケトン、エステル、エーテルおよび特に水並びにそれらの混合物が使用される。モノマーの濃度は、好ましくは１ｇｌ−１ないし２００ｇｌ−１となり、特に５０ｇｌ−１のモノマー含有量の溶液が適当である。
【００１１】
露光源としては、好ましくは水銀灯、高圧水銀灯、ハロゲンランプ、タングステンランプおよび開始剤吸収領域で放射するレーザーが使用される。露光時間は、放射源の強さに依存し、各々その性能によって一瞬から数時間となる。
露光後にこの担体物質を洗浄する。洗浄液としては、特にモノマー溶液の製造に使用した溶媒が適する。続いてこの感光担体を乾燥する。
【００１２】
別の実施態様では、光化学修飾の際にすでにカチオンおよびアニオンモノマーの混合物を使用し、同時に重合する。そのために第１段階で予備処理した担体または予備処理していない担体に光開始剤を被膜する。開始剤用の溶媒としてはケトン、アルコール、エステルおよびエーテルが重要である。その際開始剤の濃度は、好ましくは０．０１ｇｌ−１ないし０．５ｇｌ−１となる。
予備処理したかまたは予備処理しないでも、および開始剤で覆った担体物質を、モノマー混合溶液に浸し、該溶液から取り出し湿潤状態で露光する。モノマーとしては、重合可能なカルボン酸−、スルホン酸−およびリン酸誘導体、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸およびスチレンリン酸の誘導体ないし、重合可能なアンモニウム−、スルホニウム−およびホスホニウム誘導体と混合したそれらの混合物も適する。
モノマーとしては二または多機能モノマーも重要である。
【００１３】
モノマー用の溶媒としては、アルコール、ケトン、エステル、エーテルおよび特に水並びにそれらの混合物が使用される。モノマーの濃度は、好ましくは１ｇｌ−１ないし２００ｇｌ−１となり、特に５０ｇｌ−１のモノマー含有量の溶液が適当である。
【００１４】
露光源としては、好ましくは水銀灯、高圧水銀灯、ハロゲンランプ、タングステンランプおよび開始剤吸収領域で放射するレーザーが使用される。露光時間は、放射源の強さに依存し、各々その性能によって一瞬から数時間となる。
露光後にこの担体物質を洗浄する。洗浄液としては、特にモノマー溶液の製造に使用した溶媒が適する。続いてこの感光担体を乾燥する。
【００１５】
光不安定かまたは熱的に不安定な官能基の取付けは、マイナスおよびプラスの官能基での先行した機能化の完了後最終段階としてかまたは、マイナス機能性かまたはマイナスまたは／およびプラス官能基と共に修飾した後すぐに行う。そのためにこの基板（または担体）に光開始剤を被膜する。開始剤用の溶媒としてはケトン、アルコール、エステルおよびエーテルが重要である。その際開始剤の濃度は、好ましくは０．０１ｇｌ−１ないし０．５ｇｌ−１となる。予備処理したかまたは予備処理していないでも、および開始剤で覆った担体物質を、モノマー混合溶液に浸し、該溶液から取り出し湿潤状態で露光する。
【００１６】
モノマーとしては、重合可能なラジカル発生剤（アジド、オニウム塩、過酸化物、ニトロ化合物、ケトン）ないしそれらの混合物も適しており、特に芳香族ビスアジドまたはベンゾフェノン誘導体が適し、これは適当な波長の場合の光化学的ラジカルないし熱的ラジカルおよびそのようにしてすでにイオン的に結合した核酸への共有結合を発生する。
【００１７】
モノマー用の溶媒としては、アルコール、ケトン、エステル、エーテルおよび特に水並びにそれらの混合物が使用される。モノマーの濃度は、好ましくは１ｇｌ−１ないし２００ｇｌ−１となり、特に５０ｇｌ−１のモノマー含有量の溶液が適当である。
【００１８】
露光源としては、好ましくは水銀灯、高圧水銀灯、ハロゲンランプ、タングステンランプおよび開始剤吸収領域で放射するレーザーが使用される。露光時間は、放射源の強さに依存し、各々その性能によって一瞬から数時間となる。
【００１９】
露光後にこの担体物質を洗浄する。洗浄液としては、特にモノマー溶液の製造に使用した溶媒が適する。続いてこの感光担体を乾燥する。
【００２０】
特に表面で開始したラジカル重合の方法で表面を修飾することによって製造され、その際機能性が同時にかまたは任意の順に生じ、表面に共有結合される、この表面に存在する膜によって、相応して機能化された担体物質は複合核酸分析の使用に傑出して適する。
【００２１】
本発明の担体物質は、試料準備、場合によっては固有増幅、場合によっては特殊な操作、および配列決定に必要な混成反応、並びに最終の検出の複合過程を、空間的に固定してただ１つの反応表面で進行させることを可能にする。これまでのチップ法では、試料準備、増幅および場合による操作の必要な全過程が常に空間的に分かれて進行するので、このことはこれまで適用してきた複合核酸分析技術に対して著しく有利である。
【００２２】
これまでのチップ技術の転換は、従来の技術とは逆にＤＮＡチップを発生させずに、本発明の媒体は固相として検査すべき試料核酸を固定化することに基づくものである。
【００２３】
これは、臨床関連試料を溶菌緩衝系と固相を用いて培養し、出発物質の溶菌実施後に場合によっては別の緩衝液を添加して、細胞の核酸を固相のマイナス官能基に結合することによって達せられる。その後固相を結合した核酸で洗浄し、次の工程で考えられ得る抑制剤を効率的に除去する。その他のプロセス経過では試料核酸の共有結合固定化を、固相を低塩緩衝系（例えば１０ｍＭトリスＨＣｌ）で培養することによって、核酸をマイナス官能基からはずすことによって行う。これは結果として、マイナス帯電から分かれた核酸が、そちら側で存在するマイナス性の故に固相のプラスの官能基と相互に作用し合うようになることを伴う。最終的に達せられた共有結合は、そちら側でＨ引抜き反応によって共有結合を結ぶ表面上で、ラジカルが化学的または光化学的に発生することで生じる。
【００２４】
今や共有結合で固定化した核酸は、次に任意の形で操作され得る。１つの実施態様では、例えばアルカリ変性によってＤＮＡ一本鎖が生じ、専門家に周知の混成方法を介して特殊オリゴヌクレオチドゾンデを用いて標的検出がなされ、その際混成結果は従来の技術により周知の方法を用いて決定される。
異なる検出マークを有する多重ゾンデを使用することによって、例えば非常に容易に多数の配列情報を決定することができる。さらに非常に厳格な洗浄工程を介して再びゾンデを除去し、続いて核酸試料中の他の標的配列を検出する方法が新たに始まる可能性も生じる。
この例から、根本的に核酸分析に関して興味のもたれる核酸の各操作を、本発明の方法を用いて実現できることが判明する。試料準備（核酸抽出）から検出反応までの全過程を１つの固相で統合することによって、核酸分析の複合自動化が容易に実現し、そのことから特に有利であるという結論になる。
本発明の担体物質の製造を以下に実施例で詳しく説明する。
【００２５】
【実施例】
膜、マイナスおよびプラス帯電（イオン性）
【００２６】
態様ａ）逐次修飾（順にマイナスおよびプラスに帯電した基）
ＤＩＮ　Ａ４標準規格（孔径０．２μｍ）のポリプロピレン膜を５分間ベンゾフェノン（光開始剤）のアセトン溶液１５０ｍＭに浸し、その後乾燥させる。続いて該膜をガラス槽内で、２０ｇ／ｌのアクリル酸／水から成る反応溶液で被膜する。ガラス槽はガラス板（深ＵＶフィルタ、λ＞３１０ｎｍ）で覆う。１０分後にＵＶ乾燥機（ベルトロン有限会社）で、１０分間半負荷で露光する。（露光領域を１０回通過）続いてこの膜をメタノールと水で抽出する。その後乾燥し、重量分析で修飾率を決定する。
【００２７】
すでにマイナス基で機能化した膜を、５分間ベンゾフェノン（光開始剤）のアセトン溶液１５０ｍＭに浸し、その後乾燥させる。続いて該膜をガラス槽内で、３０ｇ／ｌの２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩／水から成る反応溶液で被膜する。ガラス槽はガラス板（深ＵＶフィルタ、λ＞３１０ｎｍ）で覆う。１０分後にＵＶ乾燥機（ベルトロン有限会社）で、２０分間半負荷で露光する。（露光領域を２０回通過）続いてこの膜をメタノールと水で抽出する。その後乾燥し、重量分析で修飾率を決定する。
【００２８】
態様ｂ）同時修飾（マイナスとプラスに帯電した基を同時に）
ＤＩＮ　Ａ４標準規格（孔径０．２μｍ）のポリプロピレン膜を５分間ベンゾフェノン（光開始剤）のアセトン溶液１５０ｍＭに浸し、その後乾燥させる。続いて該膜をガラス槽内で、２０ｇ／ｌのアクリル酸／水と３０ｇ／ｌの２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩／水から成る反応溶液で被膜する。ガラス槽はガラス板（深ＵＶフィルタ、λ＞３１０ｎｍ）で覆う。１０分後にＵＶ乾燥機（ベルトロン有限会社）で、２０分間半負荷で露光する。（露光領域を２０回通過）続いてこの膜をメタノールと水で抽出する。その後乾燥し、重量分析で修飾率を決定する。
【００２９】
ＦＴＩＲ−ＡＴＲ分光法
１７２０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ原子価振動）カルボキシル基
１６５０ｃｍ−１（Ｃ＝Ｏ原子価振動）酸アミドＩ
１５４０ｃｍ−１（Ｎ−Ｈ−変角振動）酸アミドＩＩ
３３００ｃｍ−１（Ｎ−Ｈ−原子価振動）アミノ基（プロトン化）
【国際公開パンフレット】
2004508536.tif 000002
2004508536.tif 000003
2004508536.tif 000004
2004508536.tif 000005
2004508536.tif 000006
2004508536.tif 000007
2004508536.tif 000008
2004508536.tif 000009
2004508536.tif 000010
2004508536.tif 000011
2004508536.tif 000012
2004508536.tif 000013
2004508536.tif 000014
2004508536.tif 000015
2004508536.tif 000016
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508536.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成14年7月16日(2002.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末、顆粒または粒子の形で取り出された複合核酸分析用の担体物質であって、表面に少なくとも１つの共有結合膜が存在し、該膜は表面に統計的に分散して存在する少なくとも２つの異なる官能基を担持し、その際
−該官能基の少なくとも１つがマイナスに帯電し、
−少なくとも１つの別の官能基が、プラスに帯電するかまたは化学反応性であるかまたは両性質を有することを特徴とする複合核酸分析用の担体物質。
【請求項２】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電した官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項３】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つの化学反応性官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項４】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電もしていて化学反応性でもある官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項５】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、少なくとも１つのマイナスに帯電した官能基の他に、少なくとも１つのプラスに帯電した官能基と少なくとも１つの化学反応性官能基を含むことを特徴とする請求項１の担体物質。
【請求項６】
少なくとも１つのマイナスおよび／またはプラスに帯電した官能基が、イオン官能基であることを特徴とする請求項１ないし５のいづれか１の担体物質。
【請求項７】
表面に存在するマイナスに帯電した基が、カルボキシル基、スルホニル基、硫酸塩基およびリン酸塩基をもつ重合可能な化合物、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸とスチレンリン酸、アクリルアミドプロパンスルホン酸の誘導体および／またはそれらの混合物から形成されることを特徴とする請求項１ないし６のいづれか１の担体物質。
【請求項８】
プラスに帯電した官能基が、アミノ基、アンモニウム基、スルホニウム基またはホスホニウム基をもつ重合可能な化合物、特にアクリル酸、メタクリル酸、スチレンの誘導体および／またはそれらの混合物から形成されることを特徴とする請求項１、２と４ないし７のいづれか１の担体物質。
【請求項９】
化学反応性官能基が、化学的および／または熱的および／または光化学的に活性可能であることを特徴とする請求項１と３ないし８のいづれか１の担体物質。
【請求項１０】
化学反応性官能基が、例えばケトン、特にベンゾフェノン、ベンゾイン、キサントンのような固定化増感剤かまたは脂肪族または芳香族アジドから成ることを特徴とする請求項１と３ないし９のいづれか１の担体物質。
【請求項１１】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、追加でＵＶ−ＶＩＳ吸収分光活性物質、特にフルオレセイン、ローダミン、アントラセン、ピレンのような色素かまたはそれらの誘導体を含むことを特徴とする請求項１と１０のいづれか１の担体物質。
【請求項１２】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、表面で開始されたラジカル重合の方法で表面を修飾することによって製造され、その際機能性が同時にかまたは任意の順に生じ、表面に共有結合されることを特徴とする請求項１ないし１１のいづれか１の担体物質。
【請求項１３】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、機能性モノマーの不均一光開始グラフト共重合によって製造されることを特徴とする請求項１ないし１２のいづれか１の担体物質。
【請求項１４】
Ｈ引抜き反応型の物質が光開始剤として、担体物質が補開始剤として使用され、開始が光開始剤の光励起によって起こることを特徴とする請求項１ないし１３のいづれか１の担体物質。
【請求項１５】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、機能性モノマーの化学開始重合によって表面に製造されることを特徴とする請求項１ないし１３のいづれか１の担体物質。
【請求項１６】
表面に存在する少なくとも１つの膜が、開始剤として、物理または化学励起によって重合のためのラジカルかまたは別のプライマー種を発生する物質を含むことを特徴とする請求項１ないし１５のいづれか１の担体物質。
【請求項１７】
担体物質の表面の機能性が、例えばｐ−アジドベンゼンスルホン酸のような二機能性アジドが熱的または光化学的に活性化することによって得られることを特徴とする請求項１ないし１６のいづれか１の担体物質。
【請求項１８】
マイナスおよびプラスの官能基を、光開始剤、特にベンゾフェノンで予備処理した担体物質上に順に、特に例えばポリプロピレン膜のような担体物質を、アクリル酸と２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩の溶液を用いて、その都度続く露光による機能化を伴って順に被膜することによって取付けることを特徴とする請求項１ないし１７のいづれか１の担体物質。
【請求項１９】
マイナスおよびプラスの官能基を、光開始剤、特にベンゾフェノンで予備処理した担体物質上に同時に、特に例えばポリプロピレン膜のような担体物質を、アクリル酸と２−アミノエチルメタクリル酸アミド塩酸塩を含む反応溶液を用いて、続く露光による機能化を伴って同時に被膜することによって取付けることを特徴とする請求項１ないし１７のいづれか１の担体物質。
【請求項２０】
担体物質として、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、セルロースおよびそれらの誘導体、ポリアミド、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミドのような有機重合体並びに該ポリマーの共重合体または混合物を使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２１】
担体物質として、ガラス、ケイ酸塩、セラミックのような無機の、特に鉱物材料かまたは金属並びにそれらの有機重合体との複合体を使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２２】
担体物質として、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、スライドガラス、繊維、空洞繊維、羊毛または布地を、その都度反応空間に関して多孔かまたは非多孔で使用することを特徴とする請求項１ないし２１のいづれか１に記載の担体物質。
【請求項２３】
担体物質として、対称または非対称孔構造と数ナノメートルから１０μｍの孔径を有する膜を使用することを特徴とする請求項１ないし２２のいづれか１の担体物質。
【請求項２４】
担体物質として、請求項２０ないし２３のいづれか１に挙げた物質を組み合わせて使用することを特徴とする請求項１ないし１９のいづれか１の担体物質。
【請求項２５】
担体物質が、予め追加で機能化、例えば親水化されることを特徴とする請求項１ないし２４のいづれか１の担体物質。
【請求項２６】
担体物質の予備処理が、強塩基物質、好ましくは水酸化アルカリまたはアルカリアミドと、アルコール、好ましくはｉ−プロパノールから成る溶液を用いてアルカリ性で２４時間まで行われ、続いて該担体物質を洗浄水が中性になるまで洗浄し、その後乾燥することを特徴とする請求項１ないし２５のいづれか１の担体物質。
【請求項２７】
突然変異の検出、メチル化パターンの検出、ＳＮＰの検出および／または制限パターンの検出のような核酸を複合的および自動化可能で分析するための請求項１ないし２６のいづれか１の担体物質の使用。
【請求項２８】
必要な準備工程と分析工程、特に核酸の抽出、結合、操作および検出が、同時かまたは順に同じ担体物質で実施されることを特徴とする、生体物質、特に核酸の複合的および自動化可能な分析法。
【請求項２９】
検査される出発試料を担体物質で、溶菌緩衝液を用いて、場合によってはタンパク質分解酵素を取り入れて培養し、溶菌が起こった後に、場合によっては結合緩衝液を混合し、出発試料の核酸をマイナスに機能化した基に結合し、続いて洗浄し、次に緩衝液、特に低塩緩衝液を添加することによってプラスに機能化した基に結合することを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３０】
検査される出発試料を担体物質で、溶菌緩衝液を用いて、場合によってはタンパク質分解酵素を取り入れて培養し、溶菌が起こった後に、場合によっては結合緩衝液を混合し、出発試料の核酸をマイナスに機能化した基に結合し、続いて洗浄し、次に光作用および／または熱処理によって化学反応性基に結合することを特徴とする請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
担体物質に結合した核酸が、特に変性して、化学修飾で、複写で、選択的複写でかまたは制限酵素でこなして操作されることを特徴とする請求項２８ないし３０のいづれか１の方法。
【請求項３２】
担体物質に結合した核酸が、特殊のゾンデで混成されることを特徴とする請求項２８ないし３１のいづれか１の方法。
【請求項３３】
担体物質に結合した核酸が、操作後に特殊のゾンデで混成されることを特徴とする請求項２８ないし３２のいづれか１の方法。
【請求項３４】
使用したマークしたゾンデでの混成が、間接的に酵素により検出されることを特徴とする請求項２８ないし３３のいづれか１の方法。
【請求項３５】
混成が、ゾンデをマークすることにより直接検出されることを特徴とする請求項２８ないし３４のいづれか１の方法。
【請求項３６】
請求項１ないし２６のいづれか１の担体物質および／または請求項２８ないし３５のいづれか１の方法並びに核酸分析用のその他の反応成分が使用されることを特徴とする、生体物質、特に核酸の分析用試験用品一式。
【国際調査報告】
2004508536.tif 000018
2004508536.tif 000019
2004508536.tif 000020
2004508536.tif 000021
2004508536.tif 000022
2004508536.tif 000023