(57)【要約】本発明は、ＮＨＥＪを実施する方法及びＮＨＥＪのアッセイ；ＮＨＥＪを調節し、治療上有用な化合物のためのアッセイ；ＤＮＡ−ＰＫ及び関連タンパク質キナーゼを調節し、治療上有用な化合物のためのアッセイ；前記アッセイ及び方法を実施するのに有用な組成物及びキット；並びにＮＨＥＪを調節する方法を開発するために、これらの観察を使用する。本発明はまた、ＤＮＡのＮＨＥＪを調節する方法、及びＤＮＡのＮＨＥＪを増大または減少する治療方法に関する。本発明はまた、患者がＤＮＡ修復または細胞周期チェックポイントコントロールにおける欠損を有するまたは有する疑いがあるかどうかを測定するための、患者におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の測定方法に関する。
2004500849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を刺激化する方法であって、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下でＤＮＡのＮＨＥＪを実施する工程を含む方法。
【請求項２】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）のアッセイであって、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸を含むアッセイ。
【請求項３】
ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸が、外因性のＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸である、請求項１記載の方法または請求項２記載のアッセイ。
【請求項４】
ＮＨＥＪがｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１から３のいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
【請求項５】
ＤＮＡのＮＨＥＪが、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ及び適切なＤＮＡ基質を含むＮＨＥＪ反応混合物で実施される、請求項１から４のいずれか一項記載の方法またはアッセイ。
【請求項６】
ＤＮＡの非相同的末端結合を刺激化するための、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の使用。
【請求項７】
ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸、並びにＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ及び適切なＤＮＡ基質の一つ以上を含むパーツのキット。
【請求項８】
イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸、並びにＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４及びＤＮＡリガーゼＩＶの一つ以上を発現する宿主細胞を含むパーツのキット。
【請求項９】
ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４及びＤＮＡリガーゼＩＶの一つ以上が、組換え核酸分子から発現される、請求項８記載のパーツのキット。
【請求項１０】
プロテインキナーゼのアッセイであって、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸を含むアッセイ。
【請求項１１】
プロテインキナーゼ、及びイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸を含むパーツのキット。
【請求項１２】
前記プロテインキナーゼが、組換え核酸分子から発現される、請求項１１記載のパーツのキット。
【請求項１３】
前記プロテインキナーゼに対する基質をさらに含む、請求項１０記載のアッセイまたは請求項１１記載のパーツのキット。
【請求項１４】
イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸、及びプロテインキナーゼを発現する宿主細胞を含むパーツのキット。
【請求項１５】
前記プロテインキナーゼが、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒ドメインと類似であるドメインを有するプロテインキナーゼである、請求項１０記載のアッセイまたは請求項１１から１４のいずれか一項記載のパーツのキット。
【請求項１６】
前記プロテインキナーゼが、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＦＲＡＰ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子産物Ｔｅｌ１ｐ、Ｍｅｃ１ｐ、Ｔｏｒ１ｐ若しくはＴｏｒ２ｐ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子産物Ｒａｄ３のいずれか一つである、請求項１５記載のアッセイまたはパーツのキット。
【請求項１７】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を刺激化する点で、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法であって、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下でＤＮＡのＮＨＥＪを実施する工程、及びＤＮＡのＮＨＥＪに対する試験化合物の効果を測定する工程を含む方法。
【請求項１８】
ＤＮＡのＮＨＥＪがｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１７記載の方法またはアッセイ。
【請求項１９】
ＤＮＡのＮＨＥＪが、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ及び適切なＤＮＡ基質を含むＮＨＥＪ反応混合物で実施される、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を刺激化する点で、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法であって、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で、ＮＨＥＪ反応混合物中の前記成分の間の相互作用に対する試験化合物の効果を測定する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記ＮＨＥＪ反応の成分が、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（またはＫｕ７０／８０ヘテロダイマーまたはそのサブユニットのようなその成分）、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、適切なＤＮＡ基質、ＡＴＰ及びＭｇ２＋である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡの非相同的末端結合を調節する化合物の同定方法であって、ＤＮＡの非相同的末端結合に対するイノシトールリン酸またはその誘導体の効果を測定する工程を含む方法。
【請求項２３】
プロテインキナーゼに対するイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法であって、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で、プロテインキナーゼの触媒活性、または別の成分と相互作用するプロテインキナーゼの能力に対する試験化合物の効果を測定する工程を含む方法。
【請求項２４】
プロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定方法であって、試験化合物が、前記プロテインキナーゼまたはそのサブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む方法。
【請求項２５】
前記プロテインキナーゼが、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒ドメインと類似であるドメインを有するプロテインキナーゼである、請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテインキナーゼが、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＦＲＡＰ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子産物Ｔｅｌ１ｐ、Ｍｅｃ１ｐ、Ｔｏｒ１ｐ若しくはＴｏｒ２ｐ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子産物Ｒａｄ３のいずれか一つである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテインキナーゼがＤＮＡ依存性プロテインキナーゼである、請求項２３から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットと、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはその適切なＤＮＡ基質の間の相互作用に対する試験化合物の効果が測定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記サブユニットが、ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマー、またはそのＫｕ７０サブユニット、またはそのＫｕ８０サブユニットである、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマー、またはそのＫｕ７０サブユニット、またはそのＫｕ８０サブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定する方法であって、試験化合物が、前記ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマー、またはそのＫｕ７０サブユニット、またはそのＫｕ８０サブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む方法。
【請求項３１】
ＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定方法であって、試験化合物が、前記ＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む方法。
【請求項３２】
前記試験化合物がイノシトール誘導体である、請求項１７から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記試験化合物が、ホスホイノシチド、またはイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）の類似体、または別の刺激性イノシトールリン酸の類似体である、請求項１７から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を模倣するまたは調節する試験化合物が、さらなる研究のために選択される、請求項１７から３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
ガンの治療、ガンの放射線療法及び／または化学療法の摂生への増強、遺伝子治療摂生の改良、相同的組換えの促進、レトロウイルス感染の治療、及び免疫系の調節のための薬剤の開発において有用である化合物の同定するために使用される、請求項１７から２２及び２８から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸を模倣または調節する試験化合物を選択する工程、及びガンの治療、ガンの放射線療法及び／または化学療法の摂生への増強、遺伝子治療摂生の改良、相同的組換えの促進、レトロウイルス感染の治療、及び免疫系の調節のための薬剤としての適格性についてのさらなるスクリーニングにおいて試験化合物を試験する工程をさらに含む、請求項１７から２２及び２８から３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
プロテインキナーゼ活性または相互作用を調節するために薬剤の開発において使用される、請求項２３から２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテインキナーゼがＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲまたはＦＲＡＰのいずれか一つであり、前記方法が、細胞周期チェックポイントのコントロールを調節する化合物を同定するために使用される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項１７から３８のいずれか一項記載の方法によって同定可能な化合物。
【請求項４０】
請求項１７から３８のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項４１】
医薬における使用のための請求項３９または４０記載の化合物。
【請求項４２】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を減少する方法であって、ＮＨＥＪ反応におけるイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の量を減少する工程、またはその刺激効果を阻害する工程を含む方法。
【請求項４３】
ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を促進する方法であって、ＮＨＥＪ反応におけるイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の量を増大する工程、またはその刺激効果を促進若しくは模倣する工程を含む方法。
【請求項４４】
ＮＨＥＪの減少が細胞内において存在する、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、ＤＮＡのＮＨＥＪの減少の必要のあるヒトまたは動物において存在する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ガンの治療、ガンの放射線療法及び／または化学療法の摂生への増強、遺伝子治療摂生の改良、相同的組換えの促進、レトロウイルス感染の治療、及び免疫系の調節のための、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＮＨＥＪの促進が細胞内において存在する、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が、ＤＮＡのＮＨＥＪの促進の必要のあるヒトまたは動物において存在する、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
損傷した細胞周期チェックポイントのコントロールのため、免疫寛容化されたまたはガンに対する疑いのある患者を治療するための、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
プロテインキナーゼの活性または相互作用を調節する方法であって、プロテインキナーゼと共に存在するイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の量を変化する工程、またはプロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を阻害または促進する工程を含む方法。
【請求項５１】
前記プロテインキナーゼが、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒ドメインと類似であるドメインを有するプロテインキナーゼである、請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
前記プロテインキナーゼが細胞において存在する、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、プロテインキナーゼ活性または相互作用の調節の必要のあるヒトまたは動物において存在する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテインキナーゼが、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲまたはＦＲＡＰのいずれか一つであり、前記方法が、細胞周期チェックポイントのコントロールを調節するためのものである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
患者が、ＤＮＡ修復または細胞周期チェックポイントのコントロールにおける欠損を有するまたはその素因を有するかを測定する方法であって、（１）患者からサンプルを得る工程、（２）サンプル中のイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の濃度または細胞内局在を測定する工程、及び（３）スタンダードとその結果を比較する工程を含む方法。
【請求項５６】
ここに記載されるＤＮＡの非相同的末端結合を調節するいずれかの新規なスクリーニングアッセイまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）経路の成分を含むアッセイ及び薬剤スクリーニングシステムに関し、ＤＮＡ−ＰＫ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ）として既知のプロテインキナーゼ、並びにＡＴＲ、ＡＴＭ及びＦＲＡＰのような関連プロテインキナーゼを使用するスクリーニングシステムに関する。本発明はまた、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）、イノシトールペンタキスリン酸（ＩＰ５）、イノシトールテトラキスリン酸（ＩＰ４）、ジホスホイノシトールペンタキスリン酸（ＩＰ７）、及びビスジホスホイノシトールテトラキスリン酸（ＩＰ８）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復は、ゲノム安定性の維持に必須である。ＤＳＢを修復しないことは、遺伝的情報の欠失、染色体転座、及び細胞死を導き得る。ＤＳＢの修復のための二つのメカニズムが記載されており、それは相同的組換えまたは非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを含む。相同的組換えは、切断が娘染色分体から遺伝的情報を使用して修復できる場合のＳ期で特に有効であり、一方でＮＨＥＪは細胞周期の全ての時点で有効であると解される（Ｅｓｓｅｒｓ等， ２０００； Ｔａｋａｔａ等， １９９８）。ＮＨＥＪはまた、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの間のＤＳＢ修復において重要な役割を果たす（Ｂｌｕｎｔ等， １９９５； Ｔａｃｃｉｏｌｉ等， １９９３）。
【０００３】
非相同的末端結合による二本鎖切断の修復は、ＸＲＣＣ４、ＸＲＣＣ５、ＸＲＣＣ６及びＸＲＣＣ７遺伝子の産物を必要とする（Ｃｈｕ， １９９７； Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗ及びＪａｃｋｓｏｎ， １９９８； Ｗｅａｖｅｒ， １９９６にレビューされている）。ＸＲＣＣ４は、ＤＮＡリガーゼＩＶとへテロダイマーを形成するタンパク質（ＸＲＣＣ４）をコードし、ＸＲＣＣ５及びＸＲＣＣ６は、ＤＮＡ末端結合タンパク質Ｋｕの７０及び８０ＫＤａサブユニットをコードし、ＸＲＣＣ７は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼＤＮＡ−ＰＫｃｓの触媒サブユニットをコードする。ＤＮＡ−ＰＫｃｓの正確な標的は未知であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＸＲＣＣ４をリン酸化し、そのＤＮＡ結合活性を調節することが示されている（Ｌｅｂｅｒ等， １９９８； Ｍｏｄｅｓｔｉ等， １９９９）。
【０００４】
ＤＮＡ−ＰＫｃｓは大きなタンパク質であり（〜３５００アミノ酸、分子量〜４６５Ｄａ）（Ｓｍｉｔｈ及びＪａｃｋｓｏｎ， １９９９）、そのカルボキシル末端は、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）キナーゼファミリーで見出されるものと関連する触媒ドメインを含む（Ｈａｒｔｌｅｙ等， １９９５）。この相同性は最初、ＤＮＡ−ＰＫｃｓがイノシトールリン脂質をリン酸化することができることを示唆したが、そのような活性は検出されていない。ＰＩ３キナーゼ関連ファミリーの他のメンバーは、毛細血管拡張性運動失調において欠損したタンパク質であるＡＴＭ、及びＡＴ関連性疾患を導く場合に欠損しているＡＴＲを含む（Ｋｅｉｔｈ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ， １９９５； Ｓｍｉｔｈ及びＪａｃｋｓｏｎ， １９９９）。これらのタンパク質が、ホスファチジルイノシトールキナーゼの特徴的なタンパク質モチーフを維持している理由は、謎のままである。
【０００５】
ＷＯ ９０／０００５７は、細胞有糸分裂の病的に上昇した速度を有する生体哺乳動物組織における細胞有子分裂の速度を調節する方法に関し、その方法は、イノシトールヘキサリン酸（または塩）及びイノシトール（または塩）のソースで細胞を還流し、細胞有子分裂の上昇した速度を調節することを含む。この方法は疑わしくも、ＮＫ細胞活性が変化しているヒト及び哺乳動物疾患、例えば腫瘍、白血病を含む他のガン、免疫抑制患者、並びにウイルス、真菌、または原生動物感染において有用であるらしい。
【０００６】
ＷＯ ９５／０５３８０は、セレクチンに結合する有効量のイノシトールポリアニオン（イノシトールへキサキスリン酸を含む）を投与することによる、セレクチンの調節方法に関する。セレクチン結合は、微生物での感染、悪性腫瘍、または炎症及び自己免疫疾患を含む他の疾患と明らかに関連している。
【０００７】
ＷＯ ９８／３０９０２は、細胞ＤＮＡ修復活性に作用する、ＸＲＣＣ４とＤＮＡリガーゼＩＶ、並びにＸＲＣＣ４とＤＮＡ−ＰＫの相互作用の調節（タンパク質及び／または天然若しくは合成起源の化合物を使用する）を介したＮＨＥＪシステムの調節に関する。それはまた、ＸＲＣＣ４及び／またはＤＮＡリガーゼＩＶが欠失した疾患に対する素因を有する患者のスクリーニングに関する。
【０００８】
ＷＯ ９９／０４２６６は、ＡＴＭ並びにＡＴＲ及びＤＮＡ−ＰＫのような関連プロテインキナーゼとのｐ５３の相互作用、及びそれらによるｐ５３のリン酸化に関する。当該タンパク質の活性は、ＤＮＡの存在で増大することが示されている。当該タンパク質と、ｐ５３または同様なリン酸化部位を有する他のタンパク質の間での相互作用によるリン酸化のモジュレーターのためのアッセイが提供されている。ＡＴＭまたはＡＴＲを生成するための方法もクレームされている。
【０００９】
ＷＯ ００／００６４４は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼサブユニットの発現を防止するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによる、ＤＮＡ損傷剤に対する細胞の感受性を増大する方法に関する。この発明は、患者における腫瘍を治療する方法にも関し、その方法は、患者にアンチセンスＤＮＡ−ＰＫオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
【００１０】
Ｉｓｈｉｋａｗａ等 （１９９９） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９， ３７４９−３７５２は、ＩＰ６をマウスに経口で与えた場合、それが皮膚ガンの発達の開始を遅延するがそれを促進はしないことを示唆している。
【００１１】
Ｓａｒｋａｒｉａ等 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ４３７５−４３８２は、放射線感作剤であるウォルトマンニンによるホスホイノシチド３−キナーゼ関連キナーゼ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＡＴＲ及びＡＴＭのような）の阻害を記載する。
【００１２】
Ｋａｒａｎｊａｗａｌａ等 （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ９， １５０１−１５０４は、ＮＨＥＪが一次線維芽細胞における染色体安定性に重要であることを示す。
【００１３】
Ｈｏｅｋｓｔｒａ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ７， １７０−１７５は、ＡＴＭプロテインキナーゼファミリーによるＤＮＡ損傷に対する応答及び細胞周期チェックポイントの調節をレビューしている。
【００１４】
Ｈａｌｌ−Ｊａｃｋｓｏｎ等 （１９９９） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８， ６７０７−６７１３は、ＡＴＲがＤＮＡ−ＰＫとは別個の基質特異性を有するカフェイン感受性ＤＮＡ活性化プロテインキナーゼであることを示している。
【００１５】
Ｇａｏ等 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０４， ８９７−９００は、腫瘍生成、ゲノム安定性及び発達におけるｐ５３及びＸＲＣＣ４の相互作用を記載している。
【００１６】
Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ （１９９９） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８０， １４−１９は、ＤＮＡ−ＰＫ、並びにＤＮＡ修復及びゲノム完全性の維持におけるその役割をレビューしている。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
非相同的末端結合のスキームが、図１に示されている。切断末端は、Ｋｕヘテロダイマーによって認識され、それはＤＮＡ−ＰＫＣＳを集合し、それによってそのキナーゼ活性を活性化すると解されている。この大きな複合体は、ヌクレアーゼの攻撃からＤＮＡ末端を保護するように機能し、一方でＸＲＣＣ４／ＤＮＡリガーゼＩＶヘテロダイマーの集合を容易にする。末端架橋がどのような達成されるかは現在まで明らかではないが、これらの反応は、ＤＮＡの再ライゲーションを引き起こし、ＤＮＡの完全性を回復する。
【００１８】
ＮＨＥＪのメカニズムを分子的に詳細に規定する試みでは、末端結合についてのｉｎ ｖｉｔｒｏシステムが最近開発された（Ｂａｕｍａｎｎ及びＷｅｓｔ， １９９８）。この反応は、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、Ｋｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、及びＤＮＡリガーゼＩＶについての見かけの必要性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏの必要性と一致した。しかしながら、予備的な分画化及び相補アッセイでは、これらの因子が有効な末端結合については不十分であること、及びこの反応の他の成分が同定されることが残っていることが明らかとなった。ここで記載された研究では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相補アッセイが、ＮＨＥＪ反応のさらなる成分を精製するために使用されている。用語、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０及びＫｕ７０／８０は、他に示唆するところがなければ、Ｋｕ７０とＫｕ８０の間のヘテロダイマーを指すように互換的に使用される。
【００１９】
リンＮＭＲ、マススペクトロスコピー、及び強力なアニオン交換クロマトグラフィーの組み合わせを使用して、我々はこの因子をイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）と同定する。精製されたＩＰ６は、ＤＮＡ−ＰＫ依存性末端結合を特異的に刺激し、ＤＮＡ−ＰＫによって結合される。ＤＮＡ−ＰＫ依存性ＮＨＥＪにおけるイノシトールリン酸の関与は、ＤＮＡ−ＰＫＣＳの触媒ドメインが、ホスファチジルイノシトール３（ＰＩ３）キナーゼファミリーにおいて見出されるものと同じであるため、特に興味深い。
【００２０】
かくして、ＤＮＡのＮＨＥＪの我々の継続的な調査で、驚くべきことに、イノシトールヘキサキスリン酸（ＩＰ６）及びイノシトールペンタキスリン酸ピロリン酸（ＩＰ７）のような高度にリン酸化したイノシトール誘導体が、ＮＨＥＪを刺激することが見出された。ＤＮＡのＮＨＥＪに対する刺激効果を介在するものに関するいずれかの理論によって結びつけられることを希望しないが、我々の結果は、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＨＥＪの刺激を引き起こすＤＮＡ−ＰＫにおける構造的変化のようなＤＮＡ−ＰＫの関与を示唆している。特に我々の研究は、ＩＰ６及びＩＰ７がＫｕ７０／８０ヘテロダイマーを結合し、それがＤＮＡ−ＰＫの触媒ユニット（ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）と組み合わさってＤＮＡ−ＰＫを作製することを示す。ＩＰ６はＴ４ ＤＮＡリガーゼ活性に対する効果を有さない。ＩＰ６はＫｕ７０サブユニットまたはＫｕ８０サブユニットを結合することが可能である。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＮＨＥＪを実施する方法及びＮＨＥＪのアッセイ；ＮＨＥＪを調節し、治療上有用な化合物のためのアッセイ；ＤＮＡ−ＰＫ及び関連タンパク質キナーゼを調節し、治療上有用な化合物のためのアッセイ；前記アッセイ及び方法を実施するのに有用な組成物及びキット；並びにＮＨＥＪを調節する方法を開発するために、これらの観察を使用する。
【００２２】
本発明はまた、ＤＮＡのＮＨＥＪを調節する方法、及びＤＮＡのＮＨＥＪを増大または減少する治療方法に関する。本発明はまた、患者がＤＮＡ修復または細胞周期チェックポイントコントロールにおける欠損を有するまたは有する疑いがあるかどうかを測定するための、患者におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の測定方法に関する。
【００２３】
本発明の第一の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）の刺激方法を提供し、この方法は、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下でＤＮＡのＮＨＥＪを実施する工程を含む。典型的に、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸は、ＤＮＡの結合を刺激化するためにＮＨＥＪ反応に添加される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
「非相同的末端結合」は、ＤＮＡ末端のライゲーション、典型的には分子間ライゲーションである。それは、互いにほとんどまたは全く相補性を示さないＤＮＡ末端の結合（つまり典型的に各末端は互いにハイブリダイズしない）を含み、いかなる場合も、ここで参照される論文及び特許出願の多くものでのその使用によって証明されている当該技術分野で周知の用語であり、これらの文献は参考としてここに取り込まれる。典型的に、ＮＨＥＪ反応は、適切なＤＮＡ基質、及びＤＮＡ末端結合する反応を進める適切な成分を必要とする。適切なＤＮＡ基質は、典型的に直鎖状ＤＮＡ分子であるものであり、その長さはＮＨＥＪに関与する因子に適応するのに十分な長さのみ必要である。完全には、結合される各ＤＮＡ断片は、独立に少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも７０ｂｐ、より好ましくは少なくとも１００ｂｐであるが、より長くとも良い。ＮＨＥＪ反応の観察に関し、特にスクリーニングアッセイにおいて、結合されるＤＮＡ分子（またはＤＮＡ末端）の一方または両方が、放射性ラベルされたリン酸または蛍光ラベルでというように検出可能にラベルされる。ＮＨＥＪにおいて結合される二つの別個のＤＮＡ分子を使用することが簡便であるが、直鎖状プラスミドの末端のように同じ分子の二つの末端を結合することができる。ＮＨＥＪは典型的に、哺乳動物細胞を含む脊椎動物細胞のような真核生物細胞で生じる（原核生物でもある環境では生じ得るが）が、Ｂａｕｍａｎｎ ＆ Ｗｅｓｔ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， １４０６６−１４０７０に詳細に記載されているように、そこに記載されたようにヒト細胞から得られたもののようなセルフリー抽出物でも生じ得る。セルフリー系における分子間ライゲーションは、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４、及びＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ；これは触媒サブユニットＤＮＰ−ＰＫＣＳ（ＸＲＣＣ７遺伝子によってコードされる）と、ＤＮＡ結合に関与すると解される二つのさらなるサブユニット、特にＫｕ７０及びＫｕ８０サブユニット（それぞれＸＲＣＣ６及びＸＲＣＣ５遺伝子によってコードされる）から作製されるヘテロダイマーである）に正確に依存することが見出された。しかしながら、ＤＮＡ−ＰＫの不存在下でＤＮＡリガーゼＩＶとＸＲＣＣ４で、低レベルのＮＨＥＪを得ることができるが、より高い度合いのＮＨＥＪは、ＤＮＡリガーゼＩＶ及びＸＲＣＣ４がＫｕ７０とＫｕ８０と共に存在する場合に得られ、またさらなるＮＨＥＪは、ＤＮＡ−ＰＫの触媒サブユニットが存在する場合に達成される。本発明者が提供した研究に引き続き、ＮＨＥＪはＩＰ６の存在下でかなりより達成でき、ＩＰ７の存在下でさらにより達成できることが示されている。
【００２５】
用語、「ＮＨＥＪを刺激化する」は、ＩＰ６が存在せず、反応混合物は同じである場合の速度と比較して、ＮＨＥＪ反応混合物におけるＩＰ６の存在によりＤＮＡのＮＨＥＪの速度が増大することを意味することを含む。刺激化は限界レベルに到達し、典型的に本発明の方法による刺激化は、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸が、ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸が以前に添加されていないＮＨＥＪ反応に含まれる場合に達成されることが予測されるであろう。いずれかの理論に結びつけられるものではないが、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の存在はＮＨＥＪに必須であり、そのためＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸が、結合が存在しないものから基質ＤＮＡの結合のいくらかの存在までのＮＨＥＪ反応を刺激するであろう。ヒトセルフリー抽出物は、Ｂａｕｍａｎｎ ＆ Ｗｅｓｔ （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， １４０６６−１４０７０に記載されているように、ＩＰ６の添加なしで適切な基質の存在下でＮＨＥＪを実施できることに注意すべきである；しかしながらこの場合では、このセルフリー抽出物は、すでに少量のＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含んでいるであろう。このセルフリー抽出物を部分的精製の間で分画化すると、関連するタンパク質成分を含んでいるのにも関わらず、ＮＨＥＪを効率的に実施する能力を失うことを示した。ＩＰ６またはＩＰ５またはＩＰ４のヒトセルフリー抽出物から由来するこの分画（実施例１で「ＰＣ−Ｃ」と称される）への添加は、ＤＮＡのＮＨＥＪを刺激化することが示された。いずれかの理論に結びつけられるものではないが、化学的性質によって、ＩＰ６（または他のイノシトールリン酸）は、ＰＣ−Ｃ分画の調製において使用されるホスホセルロースカラムからフロースルーし、ＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４及びＤＮＡリガーゼＩＶからそれを分離すると解される（実施例１参照）。
【００２６】
かくして好ましい実施態様では、ＮＨＥＪ反応混合物は、必要なタンパク質性分を含むが、いずれの天然の刺激性イノシトールリン酸もが除去されていない半精製細胞抽出物を含む。次いでこの半精製細胞抽出物は、ＮＨＥＪを刺激化するために、ＩＰ６のような適量の刺激性イノシトールリン酸で補われる。
【００２７】
用語、「他の刺激性イノシトールリン酸」は、実施例１における反応条件を使用する、定義されたＮＨＥＪの刺激化に対するＩＰ６と質的に同様な効果であるＮＨＥＪの刺激化に対する効果を有する、いずれかの他のイノシトールリン酸またはイノシトールリン酸の誘導体（一つ以上のピロリン酸を有する誘導体のような）を含む。典型的に、刺激性イノシトールリン酸は、ＩＰ６の刺激活性の少なくとも２％、好ましくは実施例１に記載されたものと同様な条件下でモルベースでＩＰ６の刺激活性の少なくとも５％または少なくとも１０％を有するであろう。特定の刺激性イノシトールリン酸は、ＩＰ６より高い刺激活性を有しても良い；かくして刺激性イノシトールリン酸は、ＩＰ６とほぼ同じ刺激活性を有しても良く、またはＩＰ６の刺激活性の１５０％若しくは３００％若しくは５００％若しくは１０００％といったより大きい活性を有しても良い。実施例に記載された実験は、ＩＰ７（つまり５個の位置がリン酸残基によって占められ、一つがピロリン酸残基によって占められているイノシトール）が、ＩＰ６より優れたＮＨＥＪの刺激性を有することを示す。ＩＰ８（即ち４個の位置がリン酸残基によって占められ、二つがピロリン酸残基によって占められるイノシトール）も、「刺激性イノシトールリン酸」として含まれる。
【００２８】
刺激性イノシトールリン酸は典型的に、イノシトールポリリン酸である（即ちそれははいくつかのリン酸基を有する）。イノシトールリン酸は、イノシトールリン酸部分が適切なリンカーによって結合しているイノシトールリン酸部分のオリゴマーまたはポリマーであっても良い。このオリゴマーまたはポリマーは、ホモ−オリゴマー／ポリマーであっても良く、その場合各イノシトールリン酸部分は同じであり、またはヘテロ−オリゴマーであっても良く、その場合少なくともいくつかのイノシトールリン酸部分は異なっても良い。
【００２９】
ＮＨＥＪを刺激化するために、刺激性イノシトールリン酸の混合物を使用することができる。
【００３０】
「刺激性イノシトールリン酸」は、一つ以上のリン酸基がホスホン酸基によって置換されているイノシトールリン酸誘導体であっても良い。
【００３１】
ＩＰ６は、ＤＮＡ−ＰＫと相互作用する場合、変性またはさらにリン酸化（例えばピロリン酸形態に）することができる。いずれかのそのような変性は、もし定義されたような刺激性イノシトールリン酸を導くのであれば、本発明の範囲内に含まれる。
【００３２】
イノシトールリン酸の誘導体は、イノシトールリン酸部分が、例えば遊離ヒドロキシル位置を通じた（もし存在すれば）またはリン酸基を通じた結合によって別の部分に結合している誘導体を含む。
【００３３】
典型的な刺激性イノシトールリン酸は、天然に存在しているイノシトールリン酸またはその誘導体である。好ましくは刺激性イノシトールリン酸は、ＩＰ６、ＩＰ５またはＩＰ４のいずれか一つである。
【００３４】
用語、「ＩＰ６」は、イノシトールへキサキスリン酸のいずれかの立体異性体を含む。ＩＰ６はｍｙｏ−イノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキスリン酸であることが好ましい。
【００３５】
用語、「ＩＰ５」は、イノシトールペンタキスリン酸のいずれかの立体異性体を含む。ＩＰ５はｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５，６−ペンタキスリン酸であることが好ましい。
【００３６】
用語、「ＩＰ４」は、イノシトールテトラキスリン酸のいずれかの立体異性体を含む。ＩＰ６はｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５−テトラキスリン酸であることが好ましい。
【００３７】
前述のように、刺激性イノシトールリン酸は、ＩＰ７またはＩＰ８またはさらなるリン酸残基を有するイノシトールリン酸であって良い。
【００３８】
用語、「ＩＰ７」は、ジホスホイノシトールペンタキスリン酸のいずれかの立体異性体を含む。ＩＰ７はｍｙｏ−５−ジホスホイノシトール１，２，３，４，６−ペンタキスリン酸（ＩＰ７−ｐｐ５）またはｍｙｏ−６−ジホスホイノシトール１，２，３，４，５−ペンタキスリン酸（ＩＰ７−ｐｐ６）であることが好ましい。
【００３９】
用語、「ＩＰ８」は、ビス−ジホスホイノシトールテトラキスリン酸のいずれかの立体異性体を含む。
【００４０】
これらの化合物は、Ｓｉｇｍａ及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍのような化学供給者から広く入手可能である。Ｓｈｅａｒｓ等 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １０４８９−１０４９７は、ビス−ジホスホイノシトールテトラキスリン酸の合成を開示している。Ｆａｌｃｋ等 （１９９５） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７， １２１７２−１２１７５及びＲｅｄｄｙ等 （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８， ４９５１−４９５２は、各種のＩＰ７のアイソマーの合成を開示している。放射性ラベル化イノシトールリン酸は、ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮから入手可能である。
【００４１】
他のイノシトールリン酸、特に４、５または６のリン酸基を有するものは、ｍｙｏ−イノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキスリン酸と実質的に同じＮＨＥＪにおける刺激効果を有しても良く、当業者は実施例に記載された方法を使用してこれを測定できるであろう。
【００４２】
それ故本発明の方法及びアッセイは、実質的に同じ刺激効果を有するそのようなイノシトールリン酸の使用を含む。疑念を避け且つ本発明の目的のために、ｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５，６ペンタキスリン酸及びＤ−ｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５テトラキスリン酸は、ｍｙｏ−イノシトール１，２，３，４，５，６ヘキサキスリン酸と実質的に同じ刺激効果を有すると考慮されるが、それらは特定のＩＰ６ほどＮＨＥＪの刺激化において有効ではない。ＩＰ７はＮＨＥＪの刺激化において特定のＩＰ６より有効である。
【００４３】
イノシトールヘキサ硫酸（ＩＳ６）は、末端結合を刺激化できない；ｍｙｏ−イノシトール１，４，５−トリリン酸は、末端結合を阻害することが示された。
【００４４】
本発明の第二の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）のアッセイを提供し、このアッセイは、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸を含む。
【００４５】
このアッセイは、ＤＮＡのＮＨＥＪを実施するために十分な成分を含む。特にＮＨＥＪの典型的なアッセイは、Ｂａｕｍａｎｎ ＆ Ｗｅｓｔ， 上記参照において記載されたようなｉｎ ｖｉｔｒｏで実施できるものである。セルフリー系におけるＮＨＥＪは、Ｌａｂｈａｒｔ （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５， ８４９−８６１にも記載されており、それは参考としてここに取り込まれる。ＮＨＥＪの再構成は、組換え的に発現されたタンパク質成分（バキュロウイルス系を使用して発現されたような）を使用することによって達成されても良い；典型的にそのような再構成された系は、ＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、適切なＤＮＡ基質、及びＩＰ６のような刺激性イノシトールリン酸を含む。このアッセイは、例えばＶ（Ｄ）Ｊ結合を観察するためにデザインされたＤＮＡ基質を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで実施されても良い（例えばＳｍｉｔｈ等 （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８１， ８１５−８２５参照）。
【００４６】
本発明の第一の特徴点の方法、または本発明の第二の特徴点のアッセイについては（及び、実際にアッセイまたは方法においてＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸に依存する本発明の全ての特徴点については）、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸が外因的に加えられることが好ましいが、ＩＰ６刺激性イノシトールリン酸が、細胞または細胞抽出物に存在するソースから放出されることも可能である。典型的に、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸は、ＮＨＥＪ反応の開始で加えられる。好ましくは、この反応における刺激性イノシトールリン酸の濃度は、１０ｎＭから５０μＭの間である；より好ましくは５０ｎＭから１０μＭの間である；さらにより好ましくは１００ｎＭから１μＭの間である。これらの範囲は特にＩＰ６について好ましい。
【００４７】
ＩＰ７についての好ましい範囲は０．１から１μＭである。
【００４８】
本発明の第一の特徴点の方法、または本発明の第二の特徴点のアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏで実施されて良いが、もしそれがｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されるのであれば好ましい；ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は、以下に詳細に記載される薬剤スクリーニング方法について特に適している。
【００４９】
本発明の第一の特徴点の方法、及び本発明の第二の特徴点のアッセイにおけるＤＮＡのＮＨＥＪは典型的に、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（好ましくはその全ての成分、特にＤＮＡ−ＰＫＣＳ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０）、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切なＤＮＡ基質を使用する。好ましくは、ＮＨＥＪ反応はこれらの成分の全てを含む。それはまた、この反応に必要なまたはこの反応を促進する、あるいは結合したＤＮＡ産物の検出をより容易に検出する他の成分をも含んで良い。そのような成分は、実施例１に記載されているようにＡＴＰ及びＭｇ２＋を含む。あるプロセッシングが結合の前に予測されるであろうため、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の存在は、非相補的ＤＮＡ末端を使用するＮＨＥＪ反応に必要である。
【００５０】
本発明の各種の特徴点で有用なポリペプチドのアミノ酸及び核酸配列は、以下の登録番号の下でＧｅｎＢａｎｋから入手可能である：ヒトＫｕ７０−Ｊ０４６１１；ヒトＫｕ８０−Ｍ３０９３８；ヒトＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｘ８３４４１；ヒトＸＲＣＣ４−Ｕ４０６２２；ヒトＤＮＰ−ＰＫＣＳ−Ｕ４７０７７；Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｕ７０−Ｘ７０３７９；Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｋｕ８０−Ｚ４９７０２；Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＮＡリガーゼＩＶ−Ｚ７４９１３。
【００５１】
この情報は、当該技術分野で周知の標準的組換え法を使用してコードされたタンパク質を生産するために使用されて良いことが予測されるであろう。かくして、再構成化ＮＨＥＪ反応混合物を使用する方法及びアッセイは、容易に入手可能な組換え的に生産されたポリペプチド成分を適切に使用して良い。
【００５２】
各種の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングと発現のためのシステムが周知である。適切な宿主細胞は、最近、哺乳動物及び酵母のような真核生物細胞、並びにバキュロウイルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎細胞、Ｃｏｓ細胞、及び多くの他のものを含む。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００５３】
プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び適切な他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターが選択または構築できる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば適切なファージ若しくはファージミドであって良い。さらなる詳細については、例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”：第２版， Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照。核酸の操作、例えば核酸構築物の調製、ミュータジェネシス、配列決定、細胞内へのＤＮＡの導入と遺伝子発現、及びタンパク質の分析における多くの既知の技術及びプロトコールが、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ等編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２に詳細に記載されている。
【００５４】
ポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法を使用して宿主細胞から精製され単離できる。
【００５５】
ＮＨＥＪ反応混合物のポリペプチド成分はヒトである（例えばヒト細胞から抽出される、またはヒト細胞において発現されてもされなくても、ヒトコード配列から組換え法によって生産される）が、それらは例えば他の哺乳動物または他の脊椎動物からといった、いずれの適切なソースから得られても良い。哺乳動物におけるＮＨＥＪ反応の保存的な性質のため、前記成分は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのような下等真核生物から由来しても良い。所定のＮＨＥＪ反応混合物におけるポリペプチド成分の全ては、同じソース（例えば全てヒトである）であることが好ましいが、前記成分がＤＮＡのＮＨＥＪを実施できることを条件に、一つのソースから得たＤＮＡリガーゼＩＶ、及び他のソースから得たＤＮＡ−ＰＫＣＳを使用することによって、成分を「混合して適合する」ことが可能であって良い。
【００５６】
ＮＨＥＪ反応混合物のポリペプチド成分は、天然で見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有して良い、またはそれはＮＨＥＪ反応における使用のための必要な活性を維持するその変異体でも良いことが予測されるであろう。タンパク質キナーゼを議論する場合（以下）、変異体は、そのタンパク質キナーゼ活性（即ち、触媒活性及び／または別の成分と相互作用する能力）を維持するものである。変異体は、一つ以上のアミノ酸が挿入、欠失、または置換されている変異体を含む。特に有用な変異体は、精製を容易にする別のペプチドまたはポリペプチドで当該ポリペプチドの融合物である。そのようなポリペプチドは、周知のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。文脈が他に示すところがなければ、ポリペプチドに対する参照は、定義された変異体に対する参照を含む。疑念を避けるために、用語、変異体は、所定の活性を維持する断片を含む。プロテインキナーゼ、特に以下に記載されるＰＩ３−キナーゼ関連キナーゼに関しては、適切な断片は、ＰＩ３−キナーゼと同等なＣ末端ドメインのようなドメインを維持するものを含む。このファミリーのタンパク質におけるＰＩ３キナーゼ関連ドメインの部分は、Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ （１９９９） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８０ （Ｓｕｐｐｌ １）， １４−１９に詳細に記載されている。
【００５７】
本発明はまた、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸に加えて、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切なＤＮＡ基質の少なくとも一つ（好ましくはこれらの全部）を含む水性組成物を含み、ここでＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸は、少なくとも１０ｎＭ、好ましくは少なくとも５０ｎＭ、より好ましくは少なくとも１００ｎＭ、さらにより好ましくは少なくとも１μＭの濃度で存在すると予測されよう。少なくともヒトから由来する成分では、ＩＰ６についてのＫｄの粗い見積もりは１μＭ程度であり、簡便にはシステムを飽和するために、１０μＭのＩＰ６が使用されて良い。この濃度では、ＩＰ６の増大は、ＮＨＥＪにおけるさらなる増大を引き起こさないようである。ＩＰ７についてのＫｄの見積もりは１００ｎＭであり、１μＭで飽和が生じる。
【００５８】
もし水性組成物のポリペプチド成分が、ＮＨＥＪのための特異的な成分のみからなり、ＮＨＥＪの促進に必要ではない細胞抽出物から由来するもののような他のポリペプチド成分を含まなければ、特に好ましい。
【００５９】
水性組成物の各ポリペプチド成分は、組換え的に生産され精製されることが好ましい。
【００６０】
本発明の第三の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合を刺激するためのＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の使用を提供する。本発明の前に、且つＮＨＥＪの過度の研究に関わらず、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸がＮＨＥＪを刺激できる（またはＮＨＥＪに必須でさえあろう）ことは認識されていなかったと予測されるであろう。本発明はまた、いずれでも良い手段によってＮＨＥＪを調節する成分についてのアッセイ、及びいずれでも良い手段によってＮＨＥＪを調節する方法における、ＩＰ６及び他の刺激性イノシトールリン酸の使用を提供する。このアッセイは、ＮＨＥＪ活性の変化、ＮＨＥＪ成分による基質の認識の変化。及び／またはＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４若しくはＤＮＡリガーゼＩＶのようなＮＨＥＪ反応の成分の細胞内局在の変化を含んでも良い。
【００６１】
前述の本発明の方法及びアッセイを実施するために、ＮＨＥＪにおいて使用される他の成分と、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を組み合わせることが簡便である。かくして、本発明の第四の特徴点は、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸、並びに一つ以上のＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（またはその構成部分であるＤＮＡ−ＰＫＣＳ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０）、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切な基質を含むパーツのキットを提供する。典型的にこのパーツのキットは、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸、並びにＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切なＤＮＡ基質のそれぞれを含む。このパーツのキットはまた、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋、及びある環境ではｄＮＴＰのようなＮＨＥＪアッセイを実施するために必要な他の成分を含む。
【００６２】
典型的に、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４、及びＤＮＡリガーゼＩＶは、実施例１に記載されたような分画といったセルフリー抽出物から得られる分画として提供される。それらはまた、組換え手段による個々の成分の発現によって提供されても良い。この方法は特に、ＮＨＥＪが精製された成分から再構成されたものである場合に好ましい。
【００６３】
前述の本発明の方法及びアッセイを実施する際に、ＮＨＥＪ反応に必要なポリペプチド成分を発現する組換え細胞と組み合わせて、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を提供することも簡便である。かくして、本発明の第五の特徴点は、イノシトールヘキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸、並びにＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＸＲＣＣ４及びＤＮＡリガーゼの一つ以上を発現する宿主細胞を含むパーツのキットを提供する。前述のＮＨＥＪ反応混合物を一つ以上のポリペプチド成分を発現する宿主細胞は、標準的な組換え法、及び当該技術分野で周知の成分をコードする適切な遺伝子／ｃＤＮＡを使用して生産されて良い。
【００６４】
ＩＰ７、ＩＰ６、ＩＰ５、及びＩＰ４がＮＨＥＪを刺激することを示すのに加えて、驚くべきことに、ＩＰ６及びＩＰ７がプロテインキナーゼと相互作用し、プロテインキナーゼの活性を調節できることを我々は示した。我々が気付いている範囲では、ＩＰ６及びＩＰ７（または定義されているいずれかの他の刺激性イノシトールリン酸）がこの効果を有することは以前に示されていない。以下に記載されているように、ＩＰ６及びＩＰ７またはＩＰ８のような他の刺激性イノシトールリン酸と、プロテインキナーゼの組み合わせは、薬剤スクリーニングアッセイ等において有用である。
【００６５】
本発明の第六の特徴点は、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含む、プロテインキナーゼのアッセイを提供する。プロテインキナーゼのアッセイは前記プロテインキナーゼ、並びにプロテインキナーゼの触媒活性が測定されている場合、適切なリン酸化可能な基質（前記プロテインキナーゼの標的またはそれから由来するリン酸化可能なペプチドのような）及びＡＴＰまたは転移可能なγ−リン酸基を有するその類似体のような適切なホスファートドナーを含む。前記プロテインキナーゼの別の巨大分子成分（別のタンパク質またはＤＮＡのような）に結合する能力がアッセイされている場合、前記アッセイはプロテインキナーゼ及び他の成分を含む。プロテインキナーゼは、そのタンパク質基質及び他の成分と相互作用することが既知である。これらの他の成分はアロステリックはエフェクターであっても良く、それらは他のタンパク質またはＤＮＡのような巨大分子成分であっても良い。
【００６６】
本発明の第七の特徴点は、プロテインキナーゼ、及びＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含むパーツのキットを提供する。典型的にプロテインキナーゼは、組換えＤＮＡ法から発現される。
【００６７】
本発明の第六の特徴点のアッセイ、及び本発明の第七の特徴点のパーツのキットでは、プロテインキナーゼは、それが天然で会合する他の成分を実質的に含まないことが好ましい。
【００６８】
本発明はまた、少なくとも一つのプロテインキナーゼ（好ましくは、例えば組換え発現によって生産されるように、それが天然で会合する他の成分を実質的に含まないもの）、及びＩＰ６またはＩＰ７のような刺激性イノシトールリン酸を含む水性組成物を含む。好ましくはアッセイ、パーツのキット、または水性組成物に含まれるプロテインキナーゼは、実質的に純粋である（例えば少なくとも９０％の純度である）。
【００６９】
本発明の第八の特徴点は、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸、及びプロテインキナーゼを発現する宿主細胞を含むパーツのキットを提供する。
【００７０】
プロテインキナーゼは、当該技術分野で周知のように組換え的に発現できる。例えば、プロテインキナーゼのクローニング、発現、及び単離は、前述の方法体系を使用して実施できる。
【００７１】
我々は、ＤＮＡ−ＰＫがＩＰ６及びＩＰ７を結合するが、ＩＰ３を結合しないことを示した。とりわけ我々は、ＩＰ６及びＩＰ７が、ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマー部分を結合することを示した。ＩＰ６またはＩＰ７は、Ｋｕ７０サブユニットまたはＫｕ８０サブユニットに結合して良い。触媒ユニット（ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）の存在は、Ｋｕ７０／８０に対するＩＰ６またはＩＰ７の結合に必要ではない。ＡＴＭ、ＡＴＲ及びＦＲＡＰと共にＤＮＡ−ＰＫは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒ドメインと類似である、好ましくはＣ末端ドメインであるドメインを有するプロテインキナーゼである、関連するプロテインキナーゼのファミリーに属する。ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ及びＦＲＡＰは、イノシトール末端基結合ドメインを有する。このファミリーの他のメンバーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子産物Ｔｅｌ１ｐ、Ｍｅｃ１ｐ、Ｔｏｒ１ｐ及びＴｏｒ２ｐ、並びにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｕｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子産物Ｒａｄ３を含む。本発明の第六、第七、または第八の特徴点におけるプロテインキナーゼは、このファミリーのメンバー、好ましくはＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＲ、ＡＴＭまたはＦＲＡＰの一つであることが好ましい。
【００７２】
ＡＴＭは、ヒト毛細血管拡張性運動失調においてミューテートされた遺伝子（または他の主における同等な遺伝子）によってコードされるタンパク質である。
【００７３】
配列分析により、ヒトＡＴＭ遺伝子は、〜３５０ｋＤａポリペプチドをコードすると明らかにされている（Ｓａｖｉｔｓｋｙ等 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８， １７４９−１７５； Ｓａｖｉｔｓｋｙ等 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ４， ２０２５−２０３２）。
【００７４】
前述のように、このファミリーに含まれるものは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｔｏｒ１ｐ及びＴｏｒ２ｐ、並びにそれらの哺乳動物ホモローグであるＦＲＡＰであり、それらはＳ期への進行を制御し、及び少なくとも部分的に翻訳を調節することによって機能する（Ｂｒｏｗｎ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ （１９９６） Ｃｅｌｌ ８６， ５１７−５２０）。またこのファミリーにおいては、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＰ−ＰＫ）触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）は、ＩＲに対する感受性を及び部位特異的Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを実施することの不能を導く欠陥を導く（Ｊａｃｋｓｏｎ及びＪｅｇｇｏ （１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ ２０， ４１２−４１５； Ｊａｃｋｓｏｎ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ６， １９−２５にレビューされている）。同定されているＰＩ３−キナーゼファミリーのＡＴＭサブグループの他のメンバーは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｔｅｌ１ｐ及びＭｅｃ１ｐ、並びにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ （ｒａｄ３）、Ｄｒｏｃｏｐｈｉａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ （ｍｅｉ−４１）及びヒトＦＲＰ１／ＡＴＲのＭｅｃ１ｐホモローグを含む（Ｋｅｉｔｈ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ５０−５１； Ｚａｋｉａｎ （１９９５） Ｃｅｌｌ ８２， ６８５−６８７； Ｊａｃｋｓｏｎ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ６， １９−２５）。ＡＴＭと同様に、これらのタンパク質の欠失は、ゲノム不安定性、ＤＮＡ損傷剤に対する超感受性、及びＤＮＡ損傷誘導性細胞周期チェックポイントのコントロールの欠損を導く。
【００７５】
各種のこれらのタンパク質キナーゼをコードするｃＤＮＡに対するＧｅｎ Ｂａｎｋ登録番号は以下の通りである：
ＦＲＡＰヒトｃＤＮＡ ＮＭ＿００４９５８
ＡＴＲヒトｃＤＮＡ ＮＭ＿００１１８４及びＵ７６３０８
ＡＴＭヒトｃＤＮＡ ＮＭ＿００００５１
ＴＥＬ１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｚ３５８４９ Ｙ１３１３４
ＭＥＣ１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｕ３１１０９
ＭＥＩ−４１ Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ Ｕ３４９２５
ＲＡＤ３ Ｓ． ｐｏｍｂｅ Ｕ７６３０７
【００７６】
ＷＯ ９９／０４２６６は参考としてここに取り込まれるが、ＡＴＭ及びＡＴＲを精製する方法を記載する。
【００７７】
このファミリーのメンバー（それらはＰＩ３キナーゼ関連キナーゼと称されて良い）は、そのＣ末端で、ＤＮＡ−ＰＫＣＳのＣ末端ドメインと少なくとも２５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも３０％または３５％または４０％または５０％または７０％または９０％の配列同一性を有すると解される。ＡＴＭのＰＩ３キナーゼドメインと比較すると、ＤＮＡＰＫは２８％のホモロジーを示し、ＲＡＤ３は３９％を示す（Ｈｕｎｔｅｒ （１９９５） Ｃｅｌｌ ８３， １−４参照）。関連タンパク質のカルボキシ末端は、Ｋｅｉｔｈ ＆ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ５０−５１で比較されている。
【００７８】
二つのポリペプチドの間のパーセント配列同一性は、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムといった適切なコンピュータープログラムを使用して測定されて良く、パーセント同一性が、最適にアライメントされている配列を有するポリペプチドに対して計算されることを予測するであろう。
【００７９】
このアライメントは別法として、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実施されても良い（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等， １９９４）。使用されるパラメーターは、以下の通りである。
【００８０】
ファーストペアワイズアライメントパラメーター：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップ項の数；５、スコアリング法；ｘパーセント。複数アライメントパラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップ伸長ペナルティー；０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００８１】
ＮＨＥＪは多くの重要な生物学的工程に関与し、ＮＨＥＪの調節は、数多くの医学的実践に関連して提案されている。これらの工程を調節する化合物は、潜在的な薬剤として、またはＮＨＥＪのさらなる研究のため有用であって良い。かくしてこれらの化合物は、各種の目的のいずれかにとって有用であって良い。
【００８２】
一つの目的は、抗腫瘍または抗ガン治療、特に放射線療法または化学療法の増強である。電離放射線及び放射線様薬剤は、ＤＮＡ損傷を課すことによってガンを治療するために一般的に使用されている。ＤＮＡ修復において欠損している細胞は、電離放射線及び放射線様薬剤に超感受性である。化学療法は、トポイソメラーゼＩＩ毒素、及びＤＮＡコントロールに関与する他の化合物の使用を含む。別の目的は、遺伝子標的化及び遺伝子治療の増強である。ＮＨＥＪの調節は、遺伝子標的化の効率を増大するために使用されて良く、遺伝子治療における興味ある且つ究極の使用を目指しても良い。
【００８３】
高等真核生物細胞における自発的対立遺伝子組換えの頻度は非常に低く、その治療能力に主要な制限を加える。それ故、ｉｎ ｖｉｖｏまたはＥｘ ｖｉｖｏ遺伝子標的化による遺伝子治療は、標的化効率の劇的な改良が達成できなければ、実施不可能なままであろう。多くの遺伝子治療の応用について、宿主ゲノムの特異的なローカスにトランスジーンの挿入を標的化できることが所望されている。ＮＨＥＪの阻害を通じた標的細胞における相同的組換えの頻度の増大は、相同的組み換えによる標的化された遺伝子挿入のための細胞を準備しても良い。
【００８４】
ＸＲＣＣ４及びＤＮＡリガーゼＩＶといった成分を含むようなＤＮＡ修復経路は、宿主細胞のゲノム内へのレトロウイルス及びレトロトランスポゾン挿入に影響することに関与するため、さらなる関連する目的は抗レトロウイルス治療である。レトロウイルスは、ヒト及び動物の健康に重大な危険を有するものであり、とりわけ各種のガン及びヒト成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫を引き起こす。ゲノム内へのレトロウイルスＤＮＡの挿入は、効率的なウイルス増殖のために必須であり、ＤＮＡ修復経路の成分の阻害によって標的化されて良い。
【００８５】
さらに、ＮＨＥＪの調節剤は、部位特異的Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによる成熟免疫グロブリン及びＴ細胞レセプター遺伝子の生成に必要であるため、この因子は免疫系の機能の調節に使用されて良い。
【００８６】
かくして、そのような化合物を同定するためのさらなる方法は、製薬産業にとって有用である。
【００８７】
本発明の第九の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を刺激するイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法を提供し、この方法はイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下でＤＮＡのＮＨＥＪを実施する工程、及びＤＮＡのＮＨＥＪに対する試験化合物の効果を測定する工程を含む。
【００８８】
典型的に前記方法は、例えば実施例１に記載され足せるフリー抽出物から得た適切な分画を使用して、または前記記載のＮＨＥＪに対する再構成化システムを使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。前記方法はまた、前記記載のようにｉｎ ｖｉｖｏで実施されても良い。
【００８９】
典型的にＤＮＡのＮＨＥＪは、ＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切なＤＮＡ基質を含むＮＨＥＪ反応混合物で実施される。好ましくは、ＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４、及びＤＮＡリガーゼＩＶは、反応混合物の唯一のポリペプチド成分である。好ましくは、ＤＮＡ−ＰＫ、ＸＲＣＣ４、及びＤＮＡリガーゼＩＶは、組み合わされる前にそれぞれ実質的に純粋である（例えば少なくとも９０％の純度である）。
【００９０】
好ましい実施態様では、ＮＨＥＪは実施例１に記載された方法を使用して測定される。特にＮＨＥＪ反応によって結合されるＤＮＡ基質は好ましくは放射性活性でラベルされており、前記結合は、ＤＮＡをサイズ分離することによって、例えばアガロースゲル電気泳動によって測定され、前記ＤＮＡは燐光イメージングによって検出される。ハイスループットスクリーニングアッセイが開発されても良く、その例が実施例２に示されている。
【００９１】
典型的にＮＨＥＪは、二つの直鎖状ＤＮＡ分子のライゲーションに基づく（直線化プラスミドのライゲーション／環状化を測定しても良いが）。ハイスループットスクリーニングは、固相に固定化された第二のＤＮＡ分子に対するライゲーションに引き続き、固相に対するラベル化（例えば放射性ラベル化または蛍光的ラベルされた）ＤＮＡ分子のリテンションの検出に基づいて良い。ライゲーション接合部を横切るＰＣＲ増幅（それ故ライゲーションに引き続いた産物のみを生産する）が使用されても良い。
【００９２】
典型的に、非特異的な効果を有する化合物よりもむしろ、ＤＮＡのＮＨＥＪに対する刺激性イノシトールリン酸の効果を特異的に調節または模倣する化合物であることを確認（または否定）するために、試験化合物の効果を評価する一連の反応が実施される。かくして例えば、試験化合物は、添加の順序がＮＨＥＪ反応に対する効果を有するかを測定するために、ＩＰ６またはＩＰ７のような他の刺激性イノシトールリン酸の添加の前または後のいずれかで、ＮＨＥＪ反応に添加されて良い。別法としてまたは加えて、試験化合物を含み、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含む反応と、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含まず、試験化合物を含まない反応の間で比較をしてみても良い。
【００９３】
ＮＨＥＪにおける刺激性イノシトールリン酸の効果を特異的に促進する化合物は、典型的に増大したＮＨＥＪ活性を導く一方で、ＮＨＥＪにおける刺激性イノシトールリン酸の効果を特異的に減少する化合物は典型的に減少したＮＨＥＪ活性を導く。構造的な意味で刺激性イノシトールリン酸を模倣する化合物は、もしその模倣体が機能的類似体であるならＮＨＥＪを増大しても良いが、もしその模倣体が機能的類似体でなければＮＨＥＪ活性を減少して良い。
【００９４】
本発明の第九の特徴点の方法は、ＮＨＥＪ反応の触媒性（即ちＤＮＡ結合活性）に対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物を同定するのに適している。本発明はまた、そのような調節がＤＮＡ結合活性の変化を直接的に導くかどうか、ＮＨＥＪ反応の成分の間で相互作用を調節する化合物の同定を含む。かくして本発明の第十の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を刺激する、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法を提供し、この方法は、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で、ＮＨＥＪ反応の成分の間の相互作用に対する試験化合物の効果を測定する工程を含む。
【００９５】
本発明の好ましい実施態様では、相互作用が測定されるＮＨＥＪ反応の成分は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（またはその成分、即ちＤＮＡＰＫＣＳ、Ｋｕ７０及びＫｕ８０）、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び適切なＤＮＡ基質のいずれか一つ以上である。他の相互作用は、それ自体が複合体（Ｍｒｅ１１／ＭＢＳ／Ｒａｄ５０）を形成するＭｒｅ１１、ＮＢＳ及びＲａｄ５０のいずれか一つと、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ及びＤＮＡ基質のいずれか一つの相互作用を含む。Ｍｒｅ１１／ＮＢＳ／Ｒａｄ５０複合体は、ＤＮＡ末端のプロセッシングにおいてＤＮＡ−ＰＫの上流で最終的に機能すると解される。Ｍｒｅ１１／ＮＢＳ／Ｒａｄ５０複合体のさらなる詳細は、Ｌａｂｈａｒｔ （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５， ８４９−８６１に見出される。
【００９６】
我々は実施例４において、ＩＰ６及びＩＰ７のような他の刺激性イノシトールリン酸は、ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマーに結合することを測定したため、このへテロダイマーが存在し、それと他のＮＨＥＪ成分の間の相互作用が測定されることが特に好ましい。Ｋｕ７０／８０及びＤＮＡの間の相互作用でも良いが、Ｋｕ７０／８０及びＤＮＡ−ＰＫＣＳの間の相互作用が測定されても良い。これらの相互作用のいくつかはまた、ＤＮＡの存在を必要とする。例えば、Ｋｕ−７０／８０−ＩＰ６及びＤＮＡ−ＰＫＣＳは、超複合体を形成するためにＤＮＡを必要とするであろう（図１０参照）。ヘテロダイマーにおけるＫｕ７０及びＫｕ８０サブユニットの間の相互作用が測定されても良い。
【００９７】
タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、及びタンパク質−小分子相互作用のような成分の間の相互作用を測定する方法の詳細は、他のプロテインキナーゼに関する本発明の特徴点の議論に引き続き以下に記載される。しかしながら、本発明のこの特徴点に関して、簡便には、非特異的な効果を有する化合物よりもむしろ、ＮＨＥＪ反応の成分の間の相互作用に対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を特異的に調節または模倣する化合物であることを確認（または否定）するために、試験化合物の効果を評価する一連の測定がなされる。かくして例えば、前記試験化合物は、添加の順序が成分の間の相互作用に対する効果を有するかを測定するために、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の添加の前または後のいずれかで、測定される相互作用を有するＮＨＥＪ反応の成分を含むサンプルに添加されて良い。別法としてまたは加えて、試験化合物、及びＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含む、測定される相互作用を有するＮＨＥＪ反応の成分を含むサンプルにおける相互作用と、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含まず、または試験化合物を含まない同等なサンプル（ＮＨＥＪ成分に関して）における相互作用の間での比較がなされても良い。
【００９８】
刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物は、刺激性イノシトールリン酸の存在下である場合、前記成分の相互作用を調節または模倣する活性によって選択できる。
【００９９】
本発明のこの特徴点の好ましい実施態様は、ＤＮＡ−ＰＫとそのＤＮＡエフェクター；ＤＮＡ−ＰＫと共基質（ＡＴＰのような）；ＤＮＡ−ＰＫとＸＲＣＣ４；ＤＮＡ−ＰＫとＤＮＡリガーゼＩＶ；ＸＲＣＣ４とＤＮＡリガーゼＩＶ；並びにＤＮＡリガーゼＩＶとそのＤＮＡ基質及び／またはＡＴＰのような共基質の間で相互作用（ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で）を測定する。本発明のこの特徴点のさらに好ましい実施態様は、Ｋｕ７０／８０とＤＮＡ−ＰＫＣＳの相互作用（ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で）、並びにＫｕ７０とＫｕ８０の間の相互作用（ＤＮＡ−ＰＫＣＳの存在下または不存在下で）を測定する。Ｋｕ７０／８０とＤＮＡ−ＰＫＣＳの間の相互作用は、ＤＮＡを必要としても良い。
【０１００】
これらの成分のいずれか一つと、Ｍｒｅ１１／ＮＢＳ／Ｒａｄ５０複合体の成分のいずれか一つの間での相互作用が測定されても良い。
【０１０１】
これらの成分の特定のものの間での相互作用の測定はＷＯ ９８／３０９０２に記載されており、これらの測定法は参考としてここに取り込まれる。前述のように、ＤＮＡのＮＨＥＪ、及びＮＨＥＪに必要とされる成分の間の相互作用におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の重要性に関してＷＯ ９８／３０９０２には何の認識も存在しないことに注意すべきである。本発明のこの特徴点では、もしこの方法が、ＤＮＡ−ＰＫの別の成分（そのエフェクターＤＮＡまたはＤＮＡリガーゼＩＶまたはＸＲＣＣ４またはその同系ＤＮＡまたは基質若しくは共基質のような）との相互作用を改変することによって、あるいはＤＮＡ−ＰＫの成分（即ちＤＮＡ−ＰＫＣＳ及びＫｕ７０及び／またはＫｕ８０）の間の相互作用を改変することによって、ＮＨＥＪを刺激することにおけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物を同定するために使用されるのであれば特に好ましい。
【０１０２】
本発明の第十一の特徴点は、プロテインキナーゼに対するイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物の同定方法を提供し、前記方法は、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の存在下で、プロテインキナーゼの触媒活性、またはプロテインキナーゼの別の成分と相互作用する能力に対する試験化合物の効果を測定する工程を含む。
【０１０３】
プロテインキナーゼは、一般的に特異的な態様で、ＡＴＰからタンパク質にγ−リン酸基を転移することによって、ヒドロキシル含有アミノ酸残基（セリン、トレオニンまたはチロシン）においてタンパク質をリン酸化する。プロテインキナーゼに対する基質は典型的に同系タンパク質であるが、簡便にはそれは、そのタンパク質から由来し、リン酸化可能なアミノ酸残基を含む合成ペプチドであっても良い。プロテインキナーゼはまた、自己リン酸化可能である。
【０１０４】
典型的にプロテインキナーゼは、ホスホイノシチド３−キナーゼの触媒ドメインと類似であるドメイン、好ましくはＣ末端ドメインを有するプロテインキナーゼである。簡便にはプロテインキナーゼは、ＤＮＡ修復応答に関与するもののような、ゲノム安定性の維持に関与するプロテインキナーゼである。好ましくはプロテインキナーゼは、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＦＲＡＰ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子産物Ｔｅｌ１ｐ、Ｍｅｃ１ｐ、Ｔｏｒ１ｐ若しくはＴｏｒ２ｐ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ遺伝子産物Ｒａｄ３のいずれか一つである。もしプロテインキナーゼがＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＲ、ＡＴＭまたはＦＲＡＰのいずれか一つであれば特に好ましくは、もしプロテインキナーゼがＤＮＡ−ＰＫであれば最も好ましい。
【０１０５】
ＤＮＡ−ＰＫはＸＲＣＣ４をリン酸化することが既知であり、それ故ＸＲＣＣ４は適切な基質である。ＸＲＣＣ４のペプチド部分はまた、基質として適切であって良い。
【０１０６】
ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＲ、ＡＴＭ及びＦＲＡＰのそれぞれは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｐ５３をリン酸化できる。このリン酸化は、ＡＴＭ、ＡＴＲ及びＤＮＡ−ＰＫについてｐ５３のおけるＳｅｒ１５にマップされており、そのためｐ５３のＮ末端ペプチドは基質として使用されて良い（Ｈａｌｌ−Ｊａｃｋｓｏｎ等 （１９９９）及びそれに引用されている文献）。Ｙａｒｏｓｈ等 （２０００） Ｊ． Ｉｎｖｅｒｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１４， １００５−１０１０は、ＦＲＡＰがＵＶ誘導性損傷と関連するＤＮＡ依存性プロテインキナーゼであることを示している。ＦＲＡＰはまた、ＰＨＡＳ−１をリン酸化する（Ｂｒｕｎｎ等 （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７， ９９−１０１）。
【０１０７】
ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＲ、ＡＴＭまたはＦＲＡＰのようなプロテインキナーゼの触媒活性は、ＡＴＰからの転移に引き続く基質における放射性ラベル化リン酸基の取り込みの測定によるような、当該技術分野で周知の方法を使用して容易に測定できる。典型的に、非特異的な効果を有する化合物よりもむしろ、プロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣する化合物であることを確認（または否定）するために、試験化合物の効果を評価する一連の反応が実施される。かくして例えば試験化合物は、添加の順序が触媒活性に対する効果を有するかを測定するために、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の添加の前または後のいずれかで、プロテインキナーゼ反応に添加されて良い。別法としてまたは加えて、試験化合物及びＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含む反応と、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含まず、あるいは試験化合物を含まない反応の間での比較がなされても良い。
【０１０８】
プロテインキナーゼの触媒活性は、ＡＴＰから基質（それは自己自身を含む、即ち自己リン酸化であって良い）へのγ−リン酸の転移によって評価できる。典型的にγ−リン酸は放射性ラベルされ、そのため基質のリン酸化は、放射性活性を検出することによって検出できる（例えばシンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィーまたは燐光イメージング）。別法として、それは非リン酸化基質からリン酸化基質を分離することによって、または例えば蛍光によるようなホスホタンパク質特異的抗体を使用することによって検出できる。
【０１０９】
プロテインキナーゼと別の成分との間の相互作用に対する試験化合物の効果が測定される場合、もしプロテインキナーゼがＤＮＡ−ＰＫの触媒サブユニット（即ちＤＮＡ−ＰＫＣＳ）であり、別の成分がＫｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４またはそれらの適切なＤＮＡエフェクターであれば特に好ましい。好ましくはプロテインキナーゼがＤＮＡ−ＰＫである場合、他の成分はＸＲＣＣ４である。
【０１１０】
ＤＮＡ−ＰＫと同様に、プロテインキナーゼＡＴＭ及びＡＴＲは、ＤＮＡによって活性化される。ＦＲＡＰは、ＤＮＡ損傷応答によって刺激化できる。かくしてさらに好ましい実施態様では、プロテインキナーゼはＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲまたはＦＲＡＰであり、そのエフェクターＤＮＡとの相互作用が測定される。
【０１１１】
典型的に、非特異的な効果を有する化合物よりもむしろ、プロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を特異的に調節または模倣する化合物であることを確認（または否定）するために、試験化合物の効果を評価する一連の反応が実施される。かくして例えば試験化合物は、添加の順序が成分間の相互作用に対する効果を有するかを測定するために、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の添加の前または後のいずれかで、プロテインキナーゼ及びそれが相互作用する化合物（その基質であるがＡＴＰの不存在下でといった、またはＤＮＡ−ＰＫまたはＡＴＲまたはＡＴＭまたはＦＲＡＰの場合であればエフェクターＤＮＡといった）を含むサンプルに添加されて良い。別法としてまたは加えて、試験化合物及びＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含むサンプルである、プロテインキナーゼ及びそれが相互作用する成分を含むサンプルにおける相互作用と、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸を含まず、あるいは試験化合物を含まない同等なサンプル（プロテインキナーゼ及び相互作用する成分の観点で）における相互作用の間での比較がなされても良い。
【０１１２】
プロテインキナーゼが相互作用する成分は、ＡＴＰまたは当該技術分野で周知の加水分解できない類似体といったＡＴＰの類似体を含む。
【０１１３】
本発明のさらなる特徴点は、プロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定方法を提供し、前記方法は、試験化合物が前記プロテインキナーゼまたはそのサブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む。
【０１１４】
プロテインキナーゼのサブユニットは、ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／Ｋｕ８０ヘテロダイマーであることが特に好ましい。
【０１１５】
刺激性イノシトールリン酸（ＩＰ６のような）のプロテインキナーゼまたはそのサブユニットとの相互作用（会合）、及びそれらからの解離は、当該技術分野で周知の方法を使用して測定されて良い。典型的にプロテインキナーゼは固定化され、検出可能にラベルされた刺激性イノシトールリン酸の結合が測定される。典型的にＩＰ６のような刺激性イノシトールリン酸は、放射性ラベルまたは蛍光的にラベルされる。以下に記載されるようにシンチレーション近接アッセイが、結合アッセイにおいて特に有用である。
【０１１６】
我々は、ＩＰ６及びＩＰ７がＤＮＡ−ＰＫに結合することを示した。とりわけＩＰ６及びＩＰ７は、ＤＮＡ−ＰＫの一部を形成するＫｕ７０／８０ヘテロダイマーに結合することが示されている。かくして、プロテインキナーゼは、ホスホイノシチド３−キナーゼの触媒ドメインと類似であるドメイン、好ましくはＣ末端ドメインを有するプロテインキナーゼであることが特に好ましい。プロテインキナーゼは好ましくは、前述のプロテインキナーゼのファミリーのメンバーのいずれか一つである。もしそれがＤＮＡ−ＰＫであるが特に好ましい。ＤＮＡ−ＰＫは三つのサブユニットから作製されることに注意すべきである。結合アッセイは、前述のようにＤＮＡ−ＰＫＣＳ、Ｋｕ７０またはＫｕ８０のいずれか一つ、ＩＰ６のような刺激性イノシトールリン酸に対する結合部位を維持したそれらのいずれかの機能的変異体（例えば断片）を使用して良い。好ましくは結合アッセイは、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０ヘテロダイマーを使用する。
【０１１７】
本発明のまたさらなる特徴点は、ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマーまたはそのＫｕ７０サブユニット若しくはそのＫｕ８０サブユニットに対する、ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定方法を提供し、その方法は、試験化合物が、前記Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーまたはそのＫｕ７０サブユニット若しくはそのＫｕ８０サブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む。
【０１１８】
好ましくは、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０ヘテロダイマーが使用される。
【０１１９】
一つの実施態様では、イノシトールリン酸（例えばＩＰ５またはＩＰ６またはＩＰ７）は固体の基体（ミクロタイタープレートの床及び／または壁のような）に固定化され、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーがそれに結合する。競合的結合アッセイが試験化合物で実施される。使用されるＫｕ７０／８０は、イノシトールリン酸に結合したＫｕ７０／８０の存在または不存在（または枯渇）が容易に検出できるように、適切に検出可能にラベルされて良い。
【０１２０】
さらにまたは別法として、Ｋｕ７０／８０（またはその成分のいずれか）に選択的に結合する検出可能にラベルされた抗体が、イノシトールリン酸に結合したＫｕ７０／８０の存在または不存在（または枯渇）を検出するために使用されて良い。適切な抗体は、Ｎｅｏ Ｍａｒｋｅｒｓ， ＬａｂＶｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ４７７９０ Ｗｅｓｔｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ ９４５３９， ＵＳＡから市販で入手可能である。
【０１２１】
本発明では、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーまたはそのＫｕ７０サブユニット若しくはそのＫｕ８０サブユニットが、ＤＮＡ−ＰＫＣＳの存在を必要としないことが予測されるであろう。Ｋｕタンパク質（ＤＮＡ−ＰＫＣＳとは独立に）はテロメア生物学に関与し、特にＰｅｔｅｒｓｏｎ等 （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２７， ６４−６７は、テロメアＲＮＡにおけるステムループの機能がＤＮＡ修復タンパク質Ｋｕにリンクしていることを指摘する。かくして、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーまたはそのＫｕ７０サブユニット若しくはそのＫｕ８０サブユニットに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物は、テロメアまたはテロメアーゼ機能を調節しても良い。
【０１２２】
好ましくは前記化合物は、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節するものである。
【０１２３】
本発明のまたさらなる特徴点は、ＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を調節する化合物の同定方法を提供し、前記方法は、試験化合物が、前記ＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の結合を減少または増大するかを測定する工程を含む。
【０１２４】
ＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対する刺激性イノシトールリン酸の結合は、プロテインキナーゼに対する結合と類似の方法を使用して実施できる。
【０１２５】
本発明のスクリーニング方法またはアッセイに添加されて良い試験化合物または物質の量は、使用される化合物または方法のタイプに依存して試行錯誤によって通常決定されるであろう。典型的に試験化合物は、約０．０１ｎｍから１００μＭの濃度で使用されて良い。試験化合物として使用されて良い化合物は、天然または合成化合物であって良い。いくつかの特徴付けされたまたはされていない化合物を含んで良い植物の抽出物もまた使用されて良く、「試験化合物」と考慮される。
【０１２６】
ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイが特に好ましいことが予測されるであろう。例としては、細胞ベースのアッセイ及びタンパク質−タンパク質結合アッセイが含まれて良い。ＳＰＡベース（シンチレーション接近アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のシステムが使用されても良い。例えば、プロテインキナーゼの活性を調節可能な化合物の同定のためのアッセイは、以下のように実施されて良い。シンチラント及びリン酸化されるポリペプチドを含むビーズを調製する。プロテインキナーゼ及び３２Ｐ−ＡＴＰまたは３３Ｐ−ＡＴＰを含むサンプルと、試験化合物とこのビーズを混合する。簡便にはこれは９６穴ウェルフォーマットで実施される。次いでこのプレートを、３２Ｐまたは３３Ｐ ＳＰＡアッセイについての既知のパラメーターを使用して、適切なシンチレーションカウンターを使用して計測する。シンチラントに対して接近している３２Ｐまたは３３Ｐのみが、即ちポリペプチドに結合したもののみが検出される。そのようなアッセイの変形例、例えばポリペプチドが抗体に対する結合を介してシンチラントビーズに固定化されたものが使用されても良い。
【０１２７】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する方法は、イオンスプレーマススペクトロスコピー／ＨＰＬＣ法または他の物理的及び分析的方法での超濾過を含む。例えば当業者に周知である、互いに非常に近接した場合に蛍光ラベルの相互作用を測定することによって、二つの蛍光ラベル化分子の結合が測定される、蛍光エネルギー共鳴転移（ＦＲＥＴ）法が使用されても良い。
【０１２８】
例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及びリン脂質といった巨大分子に対するポリペプチドの結合を検出する別法は、例えばＰｌａｎｔ等 （１９９５） Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２６（２）， ３４２−３４８に記載されたような表面プラスモン共鳴アッセイを含む。方法は、例えば放射性活性または蛍光ラベルでラベルされたポリペプチドを使用しても良い。
【０１２９】
酵母トゥーハイブリッドシステムが、ポリペプチドの間の相互作用を検出するために使用されても良い。
【０１３０】
酵母トゥーハイブリッドシステムの使用の例は、ＮＨＥＪ反応混合物の二つの成分のような二つの化合物の使用であり、それらはＮＨＥＪを調節する化合物の同定を容易にするために、ＮＨＥＪに関与する複合体を形成するように相互作用する。これらの化合物は、ここに記載される使用について当該技術分野で周知の酵母トゥーハイブリッド発現システムを採用することによって検出される。転写活性化アッセイを介してタンパク質相互作用の検出を可能にするこれらのシステムは、Ｇｙｕｒｉｓ等， Ｃｅｌｌ ７５： ７９１−８０３ （１９９３）及びＦｉｅｌｄｓ ＆ Ｓｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３４０： ２４５−２４６ （１９８９）に一般的に記載されており、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から市販で入手可能である。酵母トゥーハイブリッドアッセイは、ＮＨＥＪに対するＩＰ６の効果を調節または模倣する化合物を同定するために、ＩＰ６の存在下で実施される。
【０１３１】
このアプローチでは、例えばＫｕ７０と相互作用する、例えばＤＮＡ−ＰＫＣＳの領域が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販で入手可能であるＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍキット（カタログ番号Ｋ１６０５−１）で提供される、発現ベクターｐＧＢＴ９内にＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ断片をサブクローン化することによって、ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合される。Ｋｕ７０の領域とＧＡＬ４活性化ドメインの融合物（それはＤＮＡ−ＰＫＣＳの領域と相互作用する）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈキットで提供される発現ベクターＰＧＡＤ４２４内にＫｕ７０ドメインコード化ＤＮＡ断片をサブクローン化することによって生成される。同様な発現ベクターもまた使用可能である。酵母トランスフォーメーション及びコロニーリフトフィルターアッセイは、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍの方法及び当該技術分野で既知の各種の方法に従って実施される。コロニーフィルターアッセイの前に、トランスフォーム化酵母が、候補化合物で、及び適切なようにＮＨＥＪを調節する能力についてスクリーニングされるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸で処理されて良い。次いで、酵母システムと組み合わせた候補化合物を使用して得られる相互作用の結果が、全ての他の因子（例えば細胞タイプ及び培養条件）が等しいものである、候補化合物で処理されていない（またはＩＰ６で処理されていない）酵母システムで観察された結果と比較されて良い。ＮＨＥＪを調節可能な化合物は、ＤＮＡ−ＰＫＣＳとＫｕ７０の間の相互作用を改変できる。
【０１３２】
このアプローチの別の実施態様では、Ｋｕ７０に対するＤＮＡ−ＰＫＣＳの結合を破壊することによってＮＨＥＪを減少可能な化合物は、前述のような改変された酵母トゥーハイブリッドシステムを使用して単離されても良く、そこではレポーター遺伝子は、酵母に対して毒性であるリシンのようなタンパク質をコードする。そのようなリシンレポーターを含む酵母細胞は、もしＫｕ７０に対するＤＮＡ−ＰＫＣＳの結合が破壊されなければ死亡する。ＤＮＡ−ＰＫＣＳ／Ｋｕ７０相互作用を破壊する化合物で処理された酵母細胞は生存コロニーを形成し、この結果から、化合物がＮＨＥＪを減少可能であり、おそらく阻害可能であることが推論されても良い。再言するとこのアッセイは、化合物がＮＨＥＪに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を調節または模倣するものであることを測定するために、適切なようにＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸と実施される。
【０１３３】
類似の反応が、他の成分とのプロテインキナーゼ相互作用の観点で実施できることが予測されよう。
【０１３４】
前記記載から、本発明が薬剤またはリード化合物に対するスクリーニング方法に関することが予測されよう。
【０１３５】
当業者に周知にの用語である、薬剤スクリーニング方法であっても良い、前記記載の方法では、スクリーニングに引き続いて選択された化合物は、薬剤様化合物、または薬剤様化合物の開発のためのリード化合物であっても良いことが予測されるであろう。
【０１３６】
用語、「薬剤様化合物」は当業者に周知であり、例えば医薬における活性成分として、医薬における使用に適したものとして良い特徴を有する化合物の意味を含んで良い。かくして例えば薬剤様化合物は、有機化学の方法によって合成されて良い分子であって良いが、分子生物学または生化学の方法によるのはあまり好ましくなく、好ましくは５０００ドルトン未満であり、水溶性であって良い小分子である。薬剤様化合物は、さらに特定のタンパク質と選択的に相互作用する特徴を示しても良く、生体利用可能であり、及び／または標的細胞膜を浸透可能であって良いが、これらの特徴は必須でないことが予測されよう。
【０１３７】
薬剤様化合物は、例えばＩＰ６より増大した安定性と低い毒性を有して良い。それはまた、ＩＰ６と比較して改良された刺激プロフィールを有して良い。
【０１３８】
用語、「リード化合物」は同様に当業者に周知であり、その化合物は、それ自体としては使用に適切ではない（例えばそれは企図された標的に対して弱い強さのみ有し、作用の点で非選択的であり、不安定であり、あまり可溶性ではなく、合成が困難であり、または微弱な生体利用可能性を有するため）が、より所望される特徴を有する他の化合物のデザインのための開始点を提供するという意味を含む。
【０１３９】
本発明のスクリーニング方法において見出される化合物の化学的性質に関しては、いずれかの理論によって結びつけられるものではないが、試験化合物がイノシトール誘導体であれば好ましく、より好ましくはイノシトールリン酸である。特に試験化合物は、ホスホイノシチドまたはＩＰ６の類似体であって良い。試験化合物は、適切なアッセイに取り込むことができることを条件に、いずれの試験化合物であっても良い。試験化合物のライブラリーは、ＩＰ６の一般的構造及び電荷分布を参考にしてデザインされて良く、化合物のライブラリーは、当該技術分野で周知であるコンビナトリアルケミストリー法を使用して合成されても良い。試験化合物は、アッセイに存在する刺激性イノシトールリン酸ではないことが予測されるであろう。例えばＩＰ６に対して同様な空間的構造及び／または電荷分布を有する化合物を選択するように、例えばコンピューターで補助されたデザインを使用することによって、本発明のアッセイ及び方法におけるスクリーニングのための試験化合物を選択することが可能であって良い。
【０１４０】
本発明のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、それら自体で医学的治療において有用であっても良く、または医学的治療のための薬剤を開発するために有用であっても良い。特に、本発明のスクリーニング方法によって同定される化合物は、ＤＮＡの異常なまたは不適切な非相同的末端結合が存在する疾患の治療のための薬剤の開発において有用であって良い。前記化合物は、ガンを治療するため、放射線療法及び／または化学療法摂生に増強するため、遺伝子治療摂生を改良するため、相同的組換えを促進するため、レトロウイルス感染を治療するため、並びに免疫系を調節するための薬剤の開発において有用であって良い。
【０１４１】
本発明の第九及び第十のスクリーニング方法に引き続き、ＮＨＥＪ反応におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を模倣または調節するものである化合物は、さらなる研究のため選択される。ＤＮＡ−ＰＫ（またはそのサブユニット）またはＸＲＣＣ４またはＤＮＡリガーゼＩＶに対する刺激性イノシトールリン酸（ＩＰ６のような）の結合を調節する化合物も、さらなる研究のため選択されて良い。簡便には、次いでこれらの化合物は、ガンの治療、ガン放射線療法及び／または化学療法摂生の改良、遺伝子治療摂生の改良、相同的組換えの増強、レトロウイルス感染の治療、または免疫系の調節に適した化合物の選択のためにデザインされる別のスクリーニングにおいてさらに試験される。典型的に前記スクリーニングは、問題となる疾患に関連した最終時点で見られる細胞ベースのアッセイを含むものである。細胞ベースのスクリーニング及び動物モデルは、ガン、ガンの放射線療法及び／または化学療法の増強、遺伝子治療、相同的組換え、レトロウイルス感染、及び免疫系の調節の少なくともいくつかに利用可能である。
【０１４２】
本発明の第十一の特徴点のスクリーニング方法に引き続き、化合物は、プロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を模倣または調節するものである。簡便には、次いでこれらの化合物は、プロテインキナーゼまたはその相互作用を調節する薬剤の選択のためにデザインされた別のスクリーニングで試験される。本発明の好ましい実施態様では、プロテインキナーゼはＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲまたはＦＲＡＰのいずれか一つであり、本発明の方法は、細胞周期チェックポイントコントロールを調節する薬剤の開発において有用である化合物を同定するために使用される。簡便には、本発明の第十一の特徴点の方法において選択される化合物のためのさらなるスクリーニングは、細胞周期チェックポイントコントロールを調製する薬剤を同定するために特別にデザインされるスクリーニングを含む。
【０１４３】
本発明の第十二の特徴点は、本発明のスクリーニング方法によって同定可能な化合物を提供する。本発明の第十三の特徴点は、本発明のスクリーニング方法によって同定される化合物を提供する。そのような化合物は、、特に前述の疾患における医薬において有用である。前記化合物は、医薬における使用のために実装され提示されても良く、ＤＮＡの非相同的末端結合の調節から、またはプロテインキナーゼの機能の調節から得られる利益を患者に与える疾患の治療のための医薬の製造において使用されても良い。例えば、前記スクリーニングにおいて得られる化合物は、ＤＮＡ−ＰＫ−ＩＰ６相互作用を破壊し、それによってＮＨＥＪを破壊することによる治療（例えばガンの化学療法または放射線療法）に対して細胞を感受性にしても良い。
【０１４４】
本発明の第十四の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を減少する方法を提供し、前記方法は、ＮＨＥＪ反応におけるイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の量を減少する工程、またはその刺激効果を阻害する工程を含む。
【０１４５】
前述のように、ｍｙｏ−イノシトールトリリン酸（ＩＰ３）はＮＨＥＪにおいて阻害的であり、ＮＨＥＪを減少するために使用されて良い。
【０１４６】
本発明の第十五の特徴点は、ＤＮＡの非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）を促進する方法を提供し、前記方法は、ＮＨＥＪ反応におけるイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の量を増大する工程、またはその刺激効果を促進若しくは模倣する工程を含む。
【０１４７】
前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで使用されても良いが、もしそれらがｉｎ ｖｉｖｏ、例えばＤＮＡのＮＨＥＪの減少または促進が所望されている細胞において使用されたならば特に好ましい。もしＤＮＡのＮＨＥＪの減少または促進が本発明の方法に従って生じている細胞が、ＤＮＡのＮＨＥＪの減少または促進の必要のあるヒトまたは動物における細胞であれば好ましい。前述のように、動物またはヒトにおけるＤＮＡのＮＨＥＪの減少が所望される疾患は、ガン、ガンの放射線療法及び／または化学療法の増強、遺伝子治療、相同的組換え、レトロウイルス感染、及び免疫系の調節を含む。かくして本発明は、これらの疾患を治療する方法、またはこれらの方法を実施する方法を含み、前記方法は、ＮＨＥＪ反応におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の量を減少する、またはその刺激効果を促進する化合物の有効量を患者に投与する工程を含む。本発明はまた、ＤＮＡのＮＨＥＪの減少が所望される疾患の治療のための医薬の製造における、ＮＨＥＪ反応におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の量を減少する、またはその刺激効果を促進する化合物の使用を含む。
【０１４８】
相同的組換えによる二本鎖切断修復を促進するためにＮＨＥＪを減少し、より効率的な遺伝子標的化を導くことが望ましい。
【０１４９】
ヒスタミンは、細胞におけるＩＰ６レベルに影響することが示されている（Ｓａｋｕｍａ等 （１９８８） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２４７， ４６６−４７２）。
【０１５０】
抗イノシトールリン酸抗体は、ＩＰ６のような刺激性イノシトールリン酸の量を減少するため、またはその刺激効果を阻害するために使用されても良い。抗イノシトールリン酸抗体は、免疫原（またはハプテン）としてイノシトールリン酸を使用して、または合成抗体ディスプレーライブラリー（例えばファージディスプレーライブラリー）をスクリーニングするためにそれを使用することによって、当該技術分野で周知の方法を使用して調製されて良い。用語、「抗体」は、抗体の抗原結合断片または合成抗体のような抗体様分子を含む。かくして用語、抗体は、当該技術分野で周知のようなＦａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ等を含む。ＩＰ３に対する抗体は、Ｓｈｉｅｈ ＆ Ｃｈｅｎ （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１１， １００９−１０１４及びＧｏａ等 （１９９４） Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２， ７−１３に記載されており、ＩＰ６に対する抗体は類似の方法によって調製されて良い。
【０１５１】
本発明のスクリーニング方法は、ＤＮＡ−ＰＫ結合部位に対してＩＰ６と特異的に競合する高アフィニティーＩＰ６類似体を同定するために使用されても良い。
【０１５２】
細胞におけるＩＰ６レベルは、合成酵素（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＩＰＫ１）またはＩＰ６ターンオーバーに関与する酵素（例えばホスファターゼ）を標的化することによって上流または下流調節されて良い。当該技術分野で周知であり、特定のヌクレオチド配列（例えばＩＰ６合成酵素若しくはＩＰ６ホスファターゼをコードするｍＲＮＡまたは遺伝子）を参考にしてデザインされても良いアンチセンス化合物が使用されて良い。
【０１５３】
ＮＨＥＪの促進は、ガンの傾向を有する患者、または免疫寛容化された患者において所望されて良い。それはＡ−Ｔ患者においても所望されて良い。かくして本発明はまた、これらの疾患の治療方法を含み、前記方法は、ＮＨＥＪ反応におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の量を増大する、またはその刺激効果を促進または模倣する化合物の有効量を患者に投与する工程を含む。本発明はまた、ＤＮＡのＮＨＥＪの促進が所望される疾患を治療するための医薬の製造における、ＮＨＥＪ反応におけるＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の量を増大する、またはその刺激効果を促進または模倣する化合物の使用を含む。
【０１５４】
前述のように、ヒスタミンは細胞におけるＩＰ６レベルに影響することが示されており、抗体は刺激性イノシトールリン酸の量を減少する、またはその刺激効果を阻害するために使用されて良い。
【０１５５】
本発明の第十六の特徴点は、プロテインキナーゼの活性または相互作用を調節する方法を提供し、前記方法は、プロテインキナーゼで、イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシチオールリン酸の量を変化する工程、またはプロテインキナーゼに対するＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の効果を阻害若しくは促進する工程を含む。
【０１５６】
典型的にプロテインキナーゼは、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの触媒ドメインと同様な、好ましくはＣ末端ドメインであるドメインを有するプロテインキナーゼである。
【０１５７】
前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで使用されて良いが、もしそれがｉｎ ｖｉｖｏ、例えばプロテインキナーゼの活性または相互作用を調節することが望ましい細胞において使用されたならば特に好ましい。典型的にプロテインキナーゼの調節は、そのような調節の必要のあるヒトまたは動物の身体における細胞において生じる。
【０１５８】
本発明のこの特徴点の好ましい実施態様では、プロテインキナーゼは、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＲ、ＡＴＭまたはＦＲＡＰのいずれか一つであり、前記方法は細胞周期チェックポイントのコントロールを調節するためにある。
【０１５９】
さらに好ましい実施態様では、プロテインキナーゼはＡＴＭまたはＡＴＲである。ここで同定されるＡＴＭまたはＡＴＲのモジュレーターは、毛細血管拡張性運動失調（Ａ−Ｔ）の治療；免疫系の調節（ＡＴＭは十分に機能的な免疫系の生成のために必要なようである）；テロメアの長さの調節（Ａ−Ｔ患者の細胞は、正常な患者より迅速にそのテロメアを失う）−これは有用な加齢である、ＡＩＤＳ及び他の疾患；所用／ガンの治療；及びガンの放射線療法または化学療法の増強におけるような、各種の目的のいずれかを処理するのに有用であって良い。
【０１６０】
本発明の前述の化合物またはその製剤は、経口及び非経口（例えば皮下または筋肉内）の注射を含むいずれかの従来法によって投与されて良い。前記治療は、単一の投与量または一定期間の複数の投与量からなって良い。
【０１６１】
本発明の化合物を単独で投与することが可能である一方で、一つ以上の許容可能なキャリアーと共に、製薬製剤としてそれを提供することが好ましい。キャリアーは、本発明の化合物と適合可能で、その受容者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的に前記キャリアーは、滅菌され病原体を含まない水または塩水であろう。
【０１６２】
本発明の第十七の特徴点は、患者が、ＤＮＡ修復または細胞周期チェックポイントのコントロールにおける欠損を有する、またはその素因を有する稼働かを測定する方法を提供し、前記方法は、（１）患者からサンプルを得る工程、（２）サンプル中のイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）または他の刺激性イノシトールリン酸の濃度または細胞内局在を測定する工程、及び（３）スタンダードとその結果を比較する工程を含む。
【０１６３】
患者から得られたサンプルは、いずれの適切なサンプルでも良い。典型的にサンプルは、皮膚のような、ＤＮＡ損傷または細胞周期チェックポイントコントロールの欠損が生じていると知られている組織のサンプル、及び腫瘍サンプルである。ＩＰ６または他の刺激性イノシトールリン酸の濃度または細胞内局在は、いずれの適切な方法によって測定されても良い。例えば抗ＩＰ６抗体は、ＩＰ６を精製し、且つ例えば適切な染色及び共焦点顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡のような顕微鏡的方法を使用することによって、並びに免疫組織化学によって、その細胞内局在を検出するために使用されて良い当該技術分野で周知の方法を使用して調製されて良い。別法として、定義されるようなＩＰ６及び他の刺激性イノシトールリン酸は、ＥＬＩＳＡのような適切な分析的方法によって測定できる。細胞内局在は、例えば細胞質抽出物と比較した核抽出物におけるＩＰ６を測定することによって比較できる。
【０１６４】
本発明はまた、イノシトールリン酸またはそのアイソマーの有効な調節量の存在下で、ＤＮＡ修復を実施する工程を含む、ＤＮＡ修復活性の調節方法に関連して考慮されて良い。好ましくはイノシトールリン酸はＩＰ６である。
【０１６５】
ここで使用されるように、いずれのイノシトールリン酸に対して言及されている場合も、それはその塩、特に生理学的に許容可能な塩に対する言及を含む。
【０１６６】
本発明は、以下の実施例及び図面を参考にしてより詳細に記載されるであろう。
【０１６７】
【実施例】
実施例１：イノシトールリン酸によるＤＮＡ−ＰＫ依存性非相同的末端結合の刺激化
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ末端結合を刺激化する因子の精製
以前の研究では、ＤＮＡ末端結合を促進可能なセルフリー抽出物が、ホスホセルロースクロマトグラフィーによって分画化された（Ｂａｕｍａｎｎ及びＷｅｓｔ， １９９８）。一つの分画（ＰＣ−Ｃと称される）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＨＥＪに必要であることが知られている全ての成分（Ｋｕ７０／８０、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ）を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ末端を結合する制限された能力のみを示した。しかしながら末端結合を促進する能力は、第二の分画（ＰＣ−Ａと称される）の添加によって回復できた。この相補アッセイは、我々がここで刺激因子Ａ（ＳＦＡ）と名付けるＰＣ−Ａにおける刺激因子の精製のための基礎を与えた。
【０１６８】
ＨｅＬａ細胞の核及び細胞質分画への細胞内分画化は、細胞質にＳＦＡが豊富であることを示した（データ示さず）。比較によって、比較的低いレベルのＳＦＡが、核抽出物で検出された。しかしながら、ＮＨＥＪに関与する因子に対して競合できる核抽出物中の切断された染色体ＤＮＡの存在は、これらの二つの細胞内区画における相対的なレベルのＳＦＡを正確に評価することを困難にした。核の除去が、混在するＤＮＡの量を最小化するであろうと考慮して、我々は３００ＬのＨｅＬａ細胞の細胞質分画からＳＦＡを調製するように選択した。
【０１６９】
予備的結合試験は、ｍｏｎｏ ＳまたはＳＰ−セファロースのようなカチオン交換樹脂が、ＳＦＡを結合しないことを示した。それ故、各種の強度のアニオン交換樹脂を、精製スキームを通じて使用した（図２）。精製の間で、ＳＦＡが熱安定性であり、フェノールでの処理に対して非感受性であり、ＣＨＣｌ３に不溶性であることを発見して、我々は幾分驚いた。ＵＶ吸収スペクトロスコピーは、濃縮したＳＦＡのサンプルが２８０ｎｍで吸収しないことを示し、芳香族アミノ酸が存在しないことを示した（データ示さず）。プロテアーゼ（トリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、及びプロテイナーゼＫ＋ＳＤＳ）を使用するＳＦＡを切断する全ての試みは失敗した（データ示さず）。以上よりこれらの観察は、以前にＮＨＥＪにおけるタンパク質関与者であると推定されていたＳＡＦが、ポリペプチドではないことを示唆する。
【０１７０】
ＳＦＡが核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であるかもしれない可能性を調査するために、ＳＦＡを、ＲＮアーゼ、ＮａＯＨ（６０℃で０．１−１．０Ｍ）、ＤＮアーゼＩ、または単球菌ヌクレアーゼのそれぞれで処理した。これらの処理は、末端結合を刺激化するＳＦＡの能力に対して何の効果も有さなかった（データ示さず）。ＵＶ吸収スペクトロスコピーは、濃縮したＳＦＡのサンプルが２６０ｎｍで吸収しないことを示し、サンプル中にプリンまたはピリミジン部分が存在しないことを示した（データ示さず）。これらのデータは、ＳＦＡが核酸ではないことを示す。
【０１７１】
ＳＦＡの化学的分析
ＳＦＡ中に活性成分を同定するために、サンプルをＮＭＲ及びマススペクトロスコピーにかけた。プロトン脱共役リンＮＭＲスペクトル（図３Ａ）は、リン酸スタンダードに近似する４個のピーク（１：２：２：１の比）を明らかにし、６個のリン酸基を示唆した。ピーク強度の１：２：２：１の比は、二つの独立のセットの等価のリン酸、並びに二つの不等価な個々のリン酸を示唆する。プロトンリン共役スペクトル（図３Ｂ）は、リンプロトンダブレットを明らかにし、それぞれのリン酸基が炭素−水素結合に関与する炭素に結合していることと一致した。これらのデータは、ＳＦＡサンプルがそれぞれ（−ＣＨ）基に直接結合した６個のリン酸を含む有機リン化合物を含むことを示唆する。
【０１７２】
ＳＦＡの分子量を、マススペクトロスコピーによって測定した（図３Ｃ）。巨大分子、ポリペプチド、またはポリマー状核酸と一般的に関連する範囲で有意なシグナルは観察されない一方、ＳＦＡサンプルは、数多くの低分子量の種を含むことが見出された。ＳＦＡサンプルは不均一であることが見出されたが、はっきりとしたピークが６６０．９Ｄａの分子量で検出された。さらに、元の６６０．９Ｄａのピークからは２２Ｄａ（ナトリウムＮａ＋の分子量）ごとに異なっているピークの整列が、６６０．９Ｄａのピークの下流に観察された。これらの分子量は、６６０．９Ｄａの種の＋１（Ｎａ＋）、＋２（Ｎａ＋）及び＋３（Ｎａ＋）の塩に対応すると思われる。
【０１７３】
ＳＦＡの活性成分のＩＰ６としての同定
イノシトールは、モノからヘキサキスリン酸の範囲の数多くのリン酸化状態で見出される十分にヒドロキシル化した６の炭素環である。イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）（図４Ａ）は、ＳＦＡと同じ分子量（６５９．９Ｄａ）を有し、同じリン含量を有する。ＩＰ６における６個のリン酸の存在、及び水溶液におけるそれらの構造（Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ及びＭｕｒｔｈｙ， １９９６； Ｃｏｓｔｅｌｌｏ等， １９７６； Ｅｍｓｌｅｙ及びＮｉａｚｉ， １９８１）は、ＳＦＡの得られたプロトン脱共役３１Ｐ ＮＭＲスペクトルで維持されて存在し、それはＩＰ６のモノイオン形態についてのプロトン脱共役３１Ｐスペクトルとマッチする。さらに、ＩＰ６の各リン酸基は、炭素−水素結合に関与する炭素に結合しており、それはプロトン共役リンＮＭＲスペクトルと一致する（図３Ｂ）。これらの結果は、マススペクトロスコピーによって検出された６６０．９Ｄａ種が、ＩＰ６のプロトン化形態（［６５９．９＋１］＋１Ｄａ）であり、前述のピークの整列が、ＩＰ６での通常形成されるであろうナトリウム塩を表すことを示す。ＳＦＡにおける活性成分が実際にＩＰ６であることを確認するために、市販で入手可能なＩＰ６を、ＰＣ−Ｃによる末端結合を刺激化する能力についてアッセイした。図４Ｂに示されるように、ＩＰ６は１００ｎＭの領域の濃度で末端結合を刺激化し、その刺激化は１μＭで最大であった。
【０１７４】
ＩＰ６に対するＮＨＥＪの特異性を評価するために、他のイノシトールリン酸（ＩＰ５、ＩＰ４及びＩＰ３）と、末端結合の刺激化についてのＩＰ６の能力を比較した。さらにイノシトールヘキサ硫酸（ＩＳ６）−ＩＰ６のものと同様な電荷分布を提供する一方で、リン酸基よりも硫酸基を提示するイノシトール化合物−をも評価した。ＩＳ６は末端結合を刺激化できないことが見出され、リン酸基の明らかな必要性を示した（図４Ｃ）。実際我々は、ＩＰ６が試験されたものと比較して最も有効なイノシトールリン酸であることを証明した。ＩＰ５及びＩＰ４も末端結合を刺激化可能であるが、この刺激化の能力はＩＰ６に対して減少していた。これらのデータは、末端結合がリン酸化イノシトール種を必要とすること、及びＮＨＥＪの刺激化がリン酸化の度合いに直接関連していることを示す。
【０１７５】
ＩＰ６がＳＦＡにおける活性成分であるというさらなる証拠は、イノシトールリン酸のような非常に荷電した分子を分離するために一般的に使用される樹脂を使用する、強力なアニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって得られた。ＳＦＡにおけるＮＨＥＪ刺激化活性がＩＰ６と共分画化するかを測定するために、等量のＳＦＡを微量の３Ｈ−ＩＰ６でスパイクし、混合物をＡＧ１−Ｘ８樹脂でクロマトグラフィーにかけた。相補アッセイをＳＦＡの存在を検出するために実施し、３Ｈ−ＩＰ６含量をシンチレーションカウンティングにより評価した。図５に示されるように、ＳＦＡのピークとの３Ｈ−ＩＰ６ピークは一致した。
【０１７６】
ＩＰ６は小さな分子サイズ（６６０Ｄａ）であるが、分子量に対する高い荷電の比、及びリン酸基の間で観察される水素結合（Ｅｍｓｌｅｙ及びＮｉａｚｉ， １９８１）は、低いイオン強度で水溶液においてより大きな見かけの分子サイズを生ずる。これは、低いイオン強度で透析膜によるＩＰ６のリテンション、及び高いイオン強度で同じ膜を通じたＩＰ６の通過によって観察されている（データ示さず）。平衡透析試験を、透析膜（１２−１４ｋＤａのカットオフ）を横切るＳＦＡ及び３Ｈ−ＩＰ６の移動を比較するために実施した。ＳＦＡと３Ｈ−ＩＰ６の両者は、低いイオン強度で平衡透析膜の間で維持され、高いイオン強度では、ＳＦＡと３Ｈ−ＩＰ６の両者が透析膜を通過した（データ示さず）。これらの観察は、ＳＦＡ及びＩＰ６によって共有される物理的特性のリストに加えられる。
【０１７７】
ＤＮＡ−ＰＫ依存性末端結合に対するＩＰ６の特異性
前述のデータは、ＨｅＬａ細胞から精製された刺激因子がイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）であることを示す。多くの物質（例えばＰＥＧ、ＰＶＡ）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡリガーゼの有効性に対する非特異的な刺激効果を有するので、我々は次に、ＩＰ６がＤＮＡ−ＰＫによって介在されるＮＨＥＪに対して特異的であるかを測定した。これを実施するために我々は、ＩＰ６の存在下または不存在下でのＰＣ−Ｃ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼのライゲーション有効性を比較した。ＩＰ６はＰＣ−Ｃによる末端結合を刺激化する一方で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーションの効力は影響されないことが見出された（図６）。
【０１７８】
ＤＮＡ−ＰＫによる３Ｈ−ＩＰ６の結合
ＤＮＡ−ＰＫＣＳの触媒ドメインは、イノシトールリン脂質をリン酸化するＰＩ３−キナーゼで見出されたものに関連する。以前の研究は、ＰＩ３−キナーゼにおいては、イノシトール末端基の認識が、この保存されたドメイン内の所定の配列によって介在されることが示されている（図７Ａ）（Ｂｏｎｄｅｖａ等， １９９８）。ＮＨＥＪがＤＮＡ−ＰＫに依存的であり、ＩＰ６の添加によって刺激化されると考慮すると、この刺激効果が、ＩＰ６とＤＮＡ−ＰＫの間の物理的相互作用のためであることが推測された。
【０１７９】
３Ｈ−ＩＰ６とＤＮＡ−ＰＫを使用するゲル濾過分析を、ＩＰ６と相互作用するＤＮＡ−ＰＫのの応力を評価するために実施した。図７Ｂに示されるように、３Ｈ−ＩＰ６はＤＮＡ−ＰＫの不存在下でゲル濾過媒体によって維持され、溶出プロフィールにおいて遅い分画で観察された。この実験では、３Ｈ−ＩＰ６のリテンションは、溶出プロフィールの質を確立し、３Ｈ−ＩＰ６の移動度に対して効果を有さない選択非特異的なタンパク質を提供するように機能するタンパク質サイズスタンダードの存在下で観察された。ＤＮＡ−ＰＫの存在下では、３Ｈ−ＩＰ６は、ＤＮＡ−ＰＫ活性のピークに対応する溶出プロフィールの早期の分画でも観察された。ＤＮＡ−ＰＫの存在下でのゲル濾過媒体による３Ｈ−ＩＰ６の改変されたリテンション、及び３Ｈ−ＩＰ６とＤＮＡ−ＰＫ活性の共分画化は、ＤＮＡ−ＰＫがＩＰ６を結合可能であることを示す。
【０１８０】
ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の結合の特異性を評価するために、我々は別のイノシトールリン酸を結合するＤＮＡ−ＰＫの能力を調べた。ＩＰ３はＮＨＥＪを刺激化しないことを考慮して（図４Ｃ）、我々はこの比較のために３Ｈ−ＩＰ３を選択した。３Ｈ−ＩＰ６とは対照的に、ゲル濾過マトリックスによる３Ｈ−ＩＰ３のリテンションは、ＤＮＡ−ＰＫの存在によって改変されなかった（図７Ｃ）。さらに、実質的なＤＮＡ−ＰＫ活性を示す分画は、バックグランドレベルの３Ｈ−ＩＰ３のみを含む。これは、ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の観察された結合が、ＤＮＡ−ＰＫとＩＰ６の複数のリン酸基の間の非特異的な相互作用によるものであるという可能性に反論している。図７に示されたデータを合わせると、全てのイノシトールリン酸に亘るものではないＤＮＡ−ＰＫとＩＰ６の間の物理的相互作用を示す。
【０１８１】
議論
我々は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＨＥＪを刺激化する因子を単離し、この因子をイノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）と同定した。ＮＨＥＪにおけるＩＰ６の役割は何であろうか？ＩＰ６は１０μＭ以上の濃度でホスファターゼインヒビターとして機能することが示されている（Ｌａｒｓｓｏｎ等， １９９７）。ＩＰ６がこの濃度の１％でＮＨＥＪを刺激化可能であることを考慮すると、ＩＰ６がホスファターゼのインヒビターとしてＮＨＥＪにおいて機能するようではない。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによる末端結合をＩＰ６が促進できないことは、ＩＰ６が容量の排除による巨大分子集合のような非特異的なメカニズムを介してＮＨＥＪを刺激化する可能性に反論している。より可能性のあるのは、ＩＰ６が末端結合を刺激化できる低い濃度（１００μＭ）は、刺激化が末端結合装置のいくつかの成分との、直接的または間接的のいずれかの、ＩＰ６の相互作用から生じていることを示す。
【０１８２】
我々は、ＩＰ５及びＩＰ４もまたより少ない程度ではあるが末端結合を刺激化できることを見出したため、ＮＨＥＪを刺激化する能力は、ＩＰ６に制限されるものではないようである。実際、刺激化の効率は、イノシトールリン酸のリン酸化の度合いに直接比例するようである。この相関関係は、ＩＰ６が、リガンドとして機能し、リガンド結合種によって結合されるモデルにフィットする。そのようなモデルでは、リガンドの構造における小さい改変（この場合、ＩＰ６からＩＰ５またはＩＰ４への変化）が、リガンド結合相互作用のアフィニティーまたは安定性の大きな減少を引き起こすと予測されるであろう。もしリガンド結合が末端結合に必須であれば、リガンドの構造におけるこれらの小さい改変は、末端結合の効率の大きな減少として表されるであろう。このモデルによってなされる重要な予測は、ＩＰ６に結合し且つＮＨＥＪに関与する種が、ＰＣ−Ｃ分画に存在するに違いないことである。我々は、このＩＰ６結合種をＤＮＡ−ＰＫと同定した。
【０１８３】
ＮＨＥＪにおけるＩＰ６の明らかな必要性は、ＤＮＡ−ＰＫが非結合状態で不活性なＮＨＥＪにある態様で存在し、ＮＨＥＪ活性種を引き起こすリガンド（ＩＰ６）結合の差異に転移が存在することを示唆する。従って、ＩＰ６の結合は、ＮＨＥＪ装置の他の成分と相互作用するＤＮＡ−ＰＫの能力に影響するかもしれない。
【０１８４】
ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６結合の結果は、おそらくＩＰ６との会合に際したアロステリックなシフトにより天然で構成的であろう。別法として、ＩＰ６の結合は、単にＤＮＡ−ＰＫの表面電荷分布を変更するであろう。そのような局所的静電ポテンシャルの改変は、ホスホグリセラートムターゼに対するＩＰ６の結合で観察されている（Ｒｉｇｄｅｎ等， １９９９）。この場合、リガンド結合は、水素結合相互作用と、活性部位の裂け目の強力なポジティブ静電ポテンシャルの両者によって介在された。ＩＰ６によるこの高度に荷電した裂け目の占有は、溶媒に対していくつかのリン酸をさらし、それが非結合状態に対して局所的静電ポテンシャルに対する重大な効果を有する。この種の別のものは、ＤＮＡ−ＰＫのＮＨＥＪ不活性状態からＮＨＥＪ活性状態に、より激しい転移を引き起こすであろう。もちろんこれらの二つの可能性は相互に排他的ではなく、両者のメカニズムが、ＤＮＡ−ＰＫの基質特異性、並びに大規模なタンパク質複合体に関与する能力に影響するであろう。
【０１８５】
我々が気付いた範囲では、ＤＮＡ−ＰＫは、ＩＰ６を結合することが示されているＮＨＥＪに関与することが既知の唯一のタンパク質である。ＤＮＡ−ＰＫは、ＡＴＭ及びＡＴＲと同様に、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）関連キナーゼのメンバーである。全ての３種のタンパク質は、特にホスファチジルイノシトールのホスホイノシトール末端を結合してリン酸化する触媒コアドメインにおいて、ＰＩ３−キナーゼに対して強力な配列ホモロジーを示す。しかしながら、脂質基質のリン酸化は、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、またはこのＰＩ３Ｋ−関連キナーゼのファミリーの他のメンバーによっては観察されていない（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びＣａｎｔｌｅｙ， １９９６； Ｈｕｎｔｅｒ， １９９５； Ｋｅｉｔｈ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒ， １９９５； Ｗｙｍａｎｎ及びＰｉｒｏｌａ， １９９８）。
【０１８６】
ＰＩ３Ｋ−関連キナーゼが、プロテインキナーゼと脂肪キナーゼ機能の両者を有する共通の先祖から由来することを仮定する傾向にある。ＰＩ３Ｋ触媒ドメインのミューテーションは、脂質キナーゼ活性の損失を引き起こす一方で、ホスホイノシトール末端に対するアフィニティーを維持しているのであろう。この仮説は、ＰＩ３Ｋγの推定のホスホイノシトール末端相互作用部位の置換が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂質キナーゼ活性を改変または破壊できる一方で、プロテインキナーゼ機能は影響されないままにするということを示すＢｏｎｄｅｖａ等（Ｂｏｎｄｅｖａ等， １９９８）による研究で支持されている。明らかに、ＮＨＥＪとＰＩ３Ｋ−関連キナーゼの両者の調査における重要な次の工程は、ＤＮＡ−ＰＫとＩＰ６の間の相互作用を特徴付けすること、及びこの結合現象の重要性を調べることであろう。
【０１８７】
実験法
物質
ｍｙｏ−イノシトール１，４，５−トリリン酸（ＩＰ３）、Ｄ−ｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５−テトラキスリン酸（ＩＰ４）、ｍｙｏ−イノシトール１，３，４，５，６−ペンタキスリン酸（ＩＰ５）、及びイノシトールヘキサ硫酸（ＩＳ６）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ｍｙｏ−イノシトール１，２，３，４，５，６−ヘキサキスリン酸（ＩＰ６）は、Ｓｉｇｍａから購入し、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからも購入した。３Ｈ−ＩＰ６（１０−３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＮＥＮから購入した。
【０１８８】
ＰＣ−Ｃの精製及び相補アッセイ
ＨｅＬａ全細胞抽出物を調製し、記載されたようにホスホセルロースに対して段階的に分画化した（Ｂａｕｍａｎｎ及びＷｅｓｔ， １９９８）。ＰＣ−Ｃ分画を、Ｌバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＫＯＡｃ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に対して２時間透析し、−８０℃で貯蔵した。末端結合反応物（１０μｌ）を、２−３μｌ（３−５μｇ）のＰＣ−Ｃ及びＨｉｎｄＩＩＩ直線化５’−３２Ｐラベル化ｐＤＥＡ７Ｚ ＤＮＡ（１０ｎｇ）を含む、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、４０ｍＭ ＫＯＡｃ、０．５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡにおいて実施した。インキュベーションを３７℃で１時間実施した。３２Ｐラベル化ＤＮＡ産物を脱タンパク質処理し、０．６％アガロースゲルで電気泳動し、引き続きオートラジオグラフィーによって分析した。結合効率の定量を、燐光イメージングによって実施し、他に述べるところがなければ、データは（％全末端結合サンプル）−（％全末端結合ＰＣ−Ｃ）として表される。イノシトールリン酸のアッセイのため、水溶液を末端結合反応物に直接加えた。カラム分画のスクリーニングのため、０．５−１μｌの希釈（Ｌバッファーで）または非希釈カラム分画を加えた。
【０１８９】
細胞質抽出物の調製
３００ＬのＨｅＬａ細胞を、５×１０５細胞／ｍｌの密度に懸濁液中で培養し、遠心分離によって回収し、ＰＢＳで二度洗浄し、液体窒素で瞬間冷凍し、−８０℃で貯蔵した。必要な場合は、２のパックした細胞容量の低張性溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）を加え、細胞を氷上で２０分維持した。細胞を、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭ ＰＭＳＦ、２．２ｎｇ／ｍｌアプロチニン、１ｎｇ／ｍｌロイペプチン、１ｎｇ／ｍｌペプスタチンＡ、及び１ｎｇ／ｍｌキモスタチン）の存在下で穏やかなホモジェナイゼーション（「Ｂ」棒で３５回のストローク）によって開かせた。精製したホモジェネートを１０，０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、膜細胞破片と完全な核をペレット化した。精製した細胞質分画を、Ｌバッファーで４℃で２時間透析し、次いでＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ４５ローターで４℃で４５，０００ｒｐｍで４５分遠心分離した。全ての透析工程を、１２−１４ｋＤａの分子量カットオフでチュービングにおいて実施した。
【０１９０】
ＳＦＡの精製
細胞質抽出物（１００Ｌの培養細胞の等量物から得た）を、４℃で３０分穏やかに揺り動かすことによって、１／３容量のホスホセルロース（Ｗｈａｒｍａｎ Ｐ−１１）に吸収することによってバッチで最初に分画した。遠心分離に引き続き、非結合分画を保存した。樹脂を等量のＬバッファーで二度洗浄した。非結合分画と２回の洗浄物をプールし、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ４５ローターで４℃で４５，０００ｒｐｍで４５分遠心した。次いで上清を、Ｌバッファーで平衡化した５×１０ｃｍホスホセルロースカラムに乗せた。フロースルーを、同じバッファーで平衡化した５×１０ｃｍアフィゲルブルーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に直接通過させた。フロースルーをＬバッファーで平衡化した１．６×３９ｃｍ ＤＥＡＥ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に乗せ、それをＬバッファー中の１５カラム容量の０−０．５Ｍ ＫＣｌ直線勾配で溶出した。０．２−０．２５Ｍ ＫＣｌで溶出する活性分画をプールし（ＤＥＡＥ ＳＦＡと称する）、全ての３００Ｌの等量物のＨｅＬａ細胞細胞質が分画化されるまで−８０℃で貯蔵した。
【０１９１】
ＤＥＡＥ−ＳＦＡ分画を、１５−２０分間沸騰することによって熱変性し、次いでＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ４５ローターで４℃で４５，０００ｒｐｍで４５分遠心分離し、不溶性の凝集物を除去した。上清をＬバッファーで６時間透析し、同じバッファーで平衡化した２．６×３７ｃｍアフィゲルヘパリンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用し、１５カラム容量のＬバッファー中の０−１．０Ｍ ＫＣｌ直線勾配で溶出した。０．２８−０．３３Ｍ ＫＣｌの間で溶出した活性分画をプールし、Ｌバッファーで６時間透析し、次いでＭｏｎｏ Ｐ Ｈｒ５／２０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に乗せた。カラムを５カラム容量のＬバッファーで洗浄し、次いで１４容量のポリバッファー７４−ＨＣｌ（ｐＨ４．０）で洗浄し、最後に５０カラム容量の０−２．０Ｍ ＫＣｌ直線勾配で溶出した。１．２−１．３５Ｍ ＫＣｌの間で溶出する活性分画をプールし、フェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、Ｌバッファーで６時間透析し、Ｌバッファーで平衡化したＭｏｎｏ Ｑ Ｈｒ ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に乗せ、３０カラム容量のＬバッファー中の０−１．０Ｍ ＫＣｌ直線勾配で溶出した。０．１８−０．２３Ｍ ＫＣｌの間でカラムから溶出する活性分画をプールし、ｄＨ２Ｏで４℃で一晩透析し、−２０℃で貯蔵した。
【０１９２】
強力なアニオン交換クロマトグラフィー
ＡＧ １−Ｘ８樹脂（２００−４００メッシュ、ホルマート形態、ＢｉｏＲａｄ）を、５容量の１．０Ｍ ギ酸で洗浄し、次いで１５カラム容量のｄＨ２Ｏで洗浄した。ＳＦＡを４℃で一晩ｄＨ２Ｏで透析した。微量（４ｎＭ）の３Ｈ−ＩＰ６を加え、サンプルをｄＨ２Ｏで平衡化した１．０×１．３ｃｍ ＡＧ １−Ｘ８カラムに適用した。カラムを１０カラム容量のｄＨ２Ｏで洗浄し、次いで３０カラム容量の０．１Ｍギ酸中の０−２．７５Ｍギ酸アンモニウム直線勾配で溶出した。
【０１９３】
マススペクトロメトリー
ＳＦＡナトリウム塩を、約ｐＨ２．０に１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、１等量の７０％メタノール／３０％ギ酸で希釈し、１０μｌのサンプルをカーボン被膜化ナノスプレーキャピラリー針（Ｐｒｏｔａｎａ）に乗せ、分子量をイオントラップ（ＬＣＱ Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）を使用してマススペクトロメトリーによって測定した。
【０１９４】
ＮＭＲ
ＳＦＡを凍結乾燥し、Ｄ２Ｏに再懸濁した。プロトン３１Ｐスペクトロスコピー（１００ｍｍブロードバンドプローブにおいて５ｍｍサンプル）に対して３００．１３Ｍｈｚで、及びブロードバンドプロトン脱共役（複合パルス）で１２１．４９７Ｍｈｚで操作する、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＡＣ−３００パルスＦｏｕｒｉｅｒトランスフォームＮＭＲスペクトロメーターを使用して測定を実施した。リファレンス３１Ｐシグナルを、＋／−５０ｐｐｍウインドウで検出した。
【０１９５】
平衡透析
低イオン強度での分析のため、サンプル（１ｍｌ）を攪拌しながら４℃で２１時間０．５Ｌ ｄＨ２Ｏで透析した。高イオン強度のため、サンプルを４℃で４８時間０．２５Ｌの２．５Ｍ ＮａＣｌで透析した。１２−１４ｋＤａの分子量カットオフでの透析チュービングを使用した。
【０１９６】
Ｔ４ ＤＮＡライゲーションアッセイ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を含む反応（１０μｌ）を、イノシトールリン酸の存在下及び不存在下で２５℃で１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（ＮＥＢ）で実施した。反応を停止し、脱タンパク質化し、アガロースゲル電気泳動によって産物を分析した。
【０１９７】
ＤＮＡ−ＰＫに結合する３Ｈ−ＩＰ６のゲル濾過分析
結合反応（５５μｌ）を、３０分４℃で、５０００ユニットのＤＮＡ−ＰＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）または１．８ｍｇ／ｍｌのゲル濾過用のタンパク質サイズスタンダード（ＢｉｏＲａｄ）、及び１００ｎＭ ３Ｈ−ＩＰ６または３Ｈ−ＩＰ３を含む、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．１％ ＮＰ−４０で実施した。複合体を、４０μｌ／分で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、４０ｍＭ ＫＯＡｃ、０．１Ｍ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴにおいてＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ３．２／３０カラムを稼働して分離した。５０μｌの分画を回収した；各分画の２０μｌのサンプルを、３Ｈシンチレーションカウンティング（５ｍｌ ＥｃｏｓｃｉｎｔＡにおいて１０分／サンプル）に対して使用し、１０μｌをＳｉｇｎａＴＥＣＴ ＤＮＡ−ＰＫアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＤＮＡ−ＰＫキナーゼ活性についてアッセイした。
【０１９８】
実施例１に対する参考文献
【参考文献】
2004500849.tif 000003
2004500849.tif 000004
2004500849.tif 000005
2004500849.tif 000006
【０１９９】
実施例２：ＮＨＥＪについてのハイスループットスクリーニングアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイと同様に機能するミクロタイタープレート（９６穴）アッセイを使用する。「標的」二本鎖ＤＮＡを、プレートに接着する（相補的で露出した非変性末端を有するオリゴ１及び２の配列と称される）。細胞抽出物を、「検出」二本鎖ＤＮＡと混合する。それは直鎖状二本鎖−相補的であるオリゴ３及び４−であり、一つの露出した非変性末端（標的ＤＮＡにライゲートされる）を有し、他の末端はビオチンによって５’及び３’の両方がブロックされている；オリゴ３は５’がビオチン化され、オリゴ４は３’がビオチン化されている。ビオチン部分は二つの機能を果たす：１）ＤＮＡの末端をブロックし、マルチマー形成と活性の非直線状の記録を引き起こすであろうさらなるライゲーションを防止する、及び２）検出用。ＩＰ６を含むＮＨＥＪ反応成分を、検出ＤＮＡ（及びバッファー及びＭｇ＋＋及びＡＴＰ）の存在下でプレート（標的二本鎖を提示する）でインキュベートする。プレートを洗浄してタンパク質と過剰な検出ＤＮＡを除去する。検出ＤＮＡをプレートに維持する唯一の方法は、標的ＤＮＡとのライゲーションによる。検出二本鎖の存在はＮＨＥＪを示す−このリテンションは定量的であるはずである。ビオチンの検出／定量は、アビジン結合酵素と発色性酵素基質を使用するＥＬＩＳＡアッセイで実施されて良い。
【０２００】
実施例３：ＩＰ７はＩＰ６よりＮＨＥＪを刺激化する
ＩＰ６はＩＰ７へとさらにリン酸化できる。これは、イノシトール環の一つの炭素でリン酸化された種で生じる。我々は、これらのリン酸化イノシトールがＰＣ−ＣによってＮＨＥＪを刺激化するかどうか調べるために、ＩＰ７ｐｐ５及びＩＰ７−ｐｐ６を試験した。図８に示されるように、両者のＩＰ７種はＰＣ−Ｃによる末端結合を刺激化し、この刺激化はＩＰ６で達成されるものより約１０倍優れている。これらのデータは、ＩＰ６がＮＨＥＪの刺激化に非常に有効である一方で、ＩＰ６はイノシトールリン酸の中でＮＨＥＪの結いイルの生物学的に関連するエフェクターではないことを示唆する。
【０２０１】
実施例４：ＤＮＡ−ＰＫのＫｕ７０／８０ヘテロダイマーは特異性を持ってＩＰ６に結合する
以前に記載されたように、ＤＮＡ−ＰＫ（Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーとＰＩ−３様キナーゼＤＮＡ−ＰＫＣＳからなる）は、特異性を持ってＩＰ６に結合する。我々は、このへテロダイマーの中で、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーがこの結合活性に関与していることを決定した。さらに、Ｋｕ−ＩＰ６複合体は、より高い次元の複合体を形成するＤＮＡを結合できる。最後に、Ｋｕ、ＩＰ６、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ及びＤＮＡを含む超複合体が形成できる。
【０２０２】
ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６認識の特異性は、イノシトールヘキサ硫酸（ＩＳ６）を使用した競合試験によって評価された。図９に示されるように、トリチウム化ＩＰ６（３Ｈ−ＩＰ６）は、ゲル濾過カラムを矯正するために使用される分子量スタンダード（ｄｉａｍｏｎｄｓ， ＳＴＤｓ）のいずれによっても結合されず、カラムプロフィールの後期で溶出する遠い場所に含まれる容量で検出される。ＤＮＡ−ＰＫの添加は、複合体形成を示す３Ｈ−ＩＰ６の移動度の増大を引き起こす。１０から１００倍モル過剰で提供されるＩＳ６は、ＤＮＡ−ＰＫによって結合される３Ｈ−ＩＰ６の量に効果を有さない。これらのデータは、３Ｈ−ＩＰ３を使用する結合試験と合わせると、ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の特異的結合を示す。
【０２０３】
Ｋｕ７０／８０及びＤＮＡ−ＰＫＣＳが均一に精製され、ＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の結合を調べるために使用された。３Ｈ−ＩＰ６がこれらの結合実験で使用され、図１０に表される曲線は、各種の条件下のゲル濾過カラムに沿った３Ｈ−ＩＰ６の分布を表す。１７ｋＤより低いピークで観察された３Ｈ−ＩＰ６は、非結合３Ｈ−ＩＰ６を表す。精製されたＫｕ７０／８０（±ＤＮＡ−ＰＫＣＳ）の存在下では、３Ｈ−ＩＰ６は１５０ＭＷの時点に近いカラムから早期に溶出する。これらの曲線は、ＤＮＡ−ＰＫＣＳの存在が、ゲル濾過カラムに沿ったＫｕ−３Ｈ−ＩＰ６）複合体の移動度を改変しないという事実を強調するために、図１１に重ねられている。これは、１）Ｋｕが３Ｈ−ＩＰ６を結合すること、及び２）ＤＮＡ−ＰＫＣＳが３Ｈ−ＩＰ６またはＫｕ−ＩＰ６複合体のそれぞれと相互作用しないことを示唆する。ＤＮＡ−ＰＫはＤＮＡにアセンブリーし、ＤＮＡの不存在下では、Ｋｕ及びＤＮＡ−ＰＫＣＳは溶液中に分離すると解されている。Ｋｕ−３Ｈ−ＩＰ６複合体に対するＤＮＡの添加は、ゲル濾過カラムからの溶出プロフィールのシフトを生じる−そのピークはより広くなり（おそらくＤＮＡの移動度のためであろう）、より早期の開始時点を有する。このデータは、Ｋｕ−３Ｈ−ＩＰ６−ＤＮＡ複合体が、溶液中で形成できることを示唆する。最後に、Ｋｕ−ＩＰ６−ＤＮＡ合体に対するＤＮＡ−ＰＫＣＳの添加は、ゲル濾過カラムに沿った移動度のさらなる増大を引き起こす。この種は非常に大きい−６７０ｋＤ近い−ようであり、それはＫｕ７０／８０、３Ｈ−ＩＰ６、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、及びＤＮＡを含むものと一致する。
【０２０４】
ゲル濾過を、ＤＮＡの存在下または不存在下でＤＮＡ−ＰＫ＋３Ｈ−ＩＰ６で実施し、図１２における曲線を精製した。これらの分画のウエスタンブロット分析を、カラム分画中のＤＮＡ−ＰＫＣＳまたはＫｕ７０／８０の存在を検出するために実施した。図１１に示されるように、３Ｈ−ＩＰ６のピークは、Ｋｕ７０／８０のピークと一致するが、ＤＮＡ−ＰＫＣＳのピークとは一致しない。しかしながらＤＮＡの存在下では、全ての３つのピーク（３Ｈ−ＩＰ６、Ｋｕ７０／８０、及びＤＮＡ−ＰＫＣＳ）は一致し、それはＫｕ７０／８０、３Ｈ−ＩＰ６、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、及びＤＮＡを含む超複合体と一致する。
【０２０５】
ＫｕによるＩＰ６結合の特異性を、ＩＰ３、ＩＰ６及びＩＰ７を使用して競合分析によって調べた（図１３）。図１３に示されるように、１モル等量のＩＰ６またはＩＰ７は３Ｈ−ＩＰ６結合における約５０％の損失を引き起こす一方、３倍モル過剰のＩＰ３は何の効果も有さなかった。さらに、ＩＰ６及びＩＰ７がＫｕによって等しく認識されることは、Ｋｕによるイノシトールポリリン酸（ＩＰ））の結合が、ＩＰ７で観察されたＮＨＥＪ刺激化の１０倍の増大のソースではないことを示す。これらの発見は、ＩＰ６がＫｕによって結合される一方、ＮＨＥＪに対するＩＰ６の刺激効果は、おそらくＩＰ６−Ｋｕ複合体の形成によって調節されるさらなる相互作用から生じるであろうという推測に拡大されるであろう。
【０２０６】
実施例５：イノシトールリン酸結合種を調べるために使用されるスピンカラム
ゲル濾過は、複合体形成に関する豊富な情報を提供できる一方で、それは時間を浪費し、単一のサンプルでの調査に制限される。Ｋｕ−ＩＰ相互作用の研究を容易にするために、Ｋａｖｒａｎ等 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ３０４９７−３０５０８の研究に基づくスピンカラム法が開発された。ＩＰ６の高い分子量に対する電荷の比は、水溶液において大きな見かけの分子サイズをそれに与える。そのためこの方法は、４０ｋＤの分子排除サイズを有するＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を使用する。このスピンカラム法を使用する特異性試験の結果が図１４に提示されている。明らかに、これらのスピンカラムを使用して観察される特異性のレベルは、図９及び１３に示されるものと同一である。この方法は、ＩＰ結合種の調査を容易にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、非相同的末端結合による二本鎖切断の修復を表す模式図である。この模式図では、放射線または化学的攻撃のいずれかのよって引き起こされる二本鎖切断（ＤＳＢ）が、Ｋｕヘテロダイマー（Ｋｕ７０／８０）及びＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット、ＤＮＡ−ＰＫＣＳによって結合される。結合は、ヌクレアーゼの攻撃から遊離末端を保護し、同時にＮＨＥＪ装置のアセンブリーを開始する。まだ定義されていない工程を通じてＤＮＡ末端は架橋され、ＸＲＣＣ４／ＤＮＡリガーゼＩＶ複合体が、修復に作用するＤＳＢに集合する。
【図２Ａ】図２ＡはＳＦＡの精製を示す図である。ＨｅＬａ細胞質抽出物からＳＦＡを精製するために採用されたクロマトグラフィー工程の模式的説明図である。
【図２Ｂ】図２ＢはＳＦＡの精製を示す図である。ＰＣ−Ｃに対する非希釈ＤＥＡＥ分画の添加によるＤＮＡ末端結合の完成を示す図である。サンプルはゲル電気泳動によって分析され、３２Ｐ−ラベル化ＤＮＡがオートラジオグラフィーによって視覚化された。
【図２Ｃ】図２ＣはＳＦＡの精製を示す図である。ｍｏｎｏ Ｑから溶出した分画がＬバッファーで１：５０に希釈され、ＰＣ−Ｃによる末端結合を完成する能力についてアッセイされた。ＰＣ−Ｃ単独（−）、及び各カラム溶出プロフィールの選択された領域による末端結合が示されている。直鎖状、ダイマー状、及びトリマー状ＤＮＡ種の移動度が示されている。
【図３Ａ】図３ＡはＳＦＡの物理的特徴を示す図である。プロトン脱共役リンスペクトルは、１．４９０９ｐｐｍ（強度２．５８２）、１．０００３ｐｐｍ（強度５．４６５）、０．５５５４ｐｐｍ（強度６．００２）及び−０．０８５０ｐｐｍ（強度２．９２７）でのリン酸レファレンスに近接する４個のピーク（割合１：２：２：１）を明らかにし、リン酸基を示唆し、リン酸−リン酸共役の証拠を示さなかった。
【図３Ｂ】図３ＢはＳＦＡの物理的特徴を示す図である。プロトンリン共役スペクトルは、炭素水素結合に結合したリンと一致するリンプロトンダブレットを明らかにした。
【図３Ｃ】図３ＣはＳＦＡの物理的特徴を示す図である。イオントラップスペクトルは、６６０．９Ｄａの分子量を明らかにし、それは［ｍａｓｓ＋１］＋１−イオンまたは［６５９．９＋１］＋１−イオンを表す、引き続き６８２．９Ｄａ（＋１Ｎａ＋）、７０４．９Ｄａ（＋２Ｎａ＋）、７２６．９Ｄａ（＋３Ｎａ＋）で関連する一連のナトリウム塩を表す。
【図４Ａ】図４Ａは、イノシトールリン酸によるＤＮＡ−ＰＫ依存性末端結合の刺激を表す図である。ＩＰ６の模式図を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、イノシトールリン酸によるＤＮＡ−ＰＫ依存性末端結合の刺激を表す図である。ＩＰ６によるＰＣ−Ｃの完成を表す図である。末端結合アッセイが、増大する量のＩＰ６で補われたＰＣ−Ｃを使用して実施された。
【図４Ｃ】図４Ｃは、イノシトールリン酸によるＤＮＡ−ＰＫ依存性末端結合の刺激を表す図である。ＤＮＡ−ＰＫ依存性ＮＨＥＪに対するイノシトールリン酸の効果を現す図である。イノシトールへキサキスリン酸（ＩＰ６）、イノシトールペンタキスリン酸（ＩＰ５）、イノシトールテトラキスリン酸（ＩＰ４）、イノシトールトリキスリン酸（ＩＰ３）、またはイノシトールヘキサ硫酸（ＩＳ６）が、ＰＣ−ＣによるＤＮＡ末端結合を刺激するそれらの能力についてアッセイされた。
【図５】図５は、強力なアニオン交換クロマトグラフィーによるＳＦＡ及びＩＰ６の共分画化を示す図である。微量（４ｎＭ）の３Ｈ−ＩＰ６を、１ｍｌの等量のＳＦＡに添加した。精製したサンプルを、ＡＧ１−Ｘ８樹脂に適用し、物質と方法に記載されたように溶出した。上図、シンチレーションカウンティングによって測定された３Ｈ−ＩＰ６の溶出プロフィール。下図、ＰＣ−Ｃ介在性末端結合の完成によって測定されたＳＦＡの溶出プロフィール。
【図６Ａ】図６Ａは、ＤＮＡ−ＰＫ介在性の末端から末端のライゲーションに対するＩＰ６の特異性を示す図である。ＰＣ−Ｃによって触媒されるＤＮＡ末端結合反応が、２μＭのＩＰ６の存在下または不存在下で分析された。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＤＮＡ−ＰＫ介在性の末端から末端のライゲーションに対するＩＰ６の特異性を示す図である。ＰＣ−Ｃの代わりにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（０．１ｕ／μｌ）を使用して、同様な反応が実施された。
【図７Ａ】図７ＡはＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の結合を示す図である。ＤＮＡ−ＰＫＣＳの模式図を示す。グレーの棒は、ＰＩ３−キナーゼの触媒ドメインと類似である配列を有するＣ末端３８０ａａを表し（Ｈａｒｔｌｅｙ等， １９９５）、黒い棒はは、ＰＩ３−キナーゼの推定のイノシトールリン酸末端結合ドメインの位置を示す（Ｗｙｍａｎｎ等， １９９８）。ウォルトマニン相互作用の標的と解されるリジン（Ｋ）残基が示され、同様にプロテインキナーゼのＡＴＰ結合活性部位に位置すると解される二つのアスパラギン酸（Ｄ）残基が示される。
【図７Ｂ】図７ＢはＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の結合を示す図である。ＤＮＡ−ＰＫによる３Ｈ−ＩＰ６結合のゲル濾過分析を示す。上図、非特異的タンパク質の存在下（１．８ｍｇ／ｍｌ）での３Ｈ−ＩＰ６の溶出プロフィール。中図、ＤＮＡ−ＰＫの存在下での３Ｈ−ＩＰ６の溶出プロフィール。下図、Ｂの中図に示された分画のＤＮＡ−ＰＫキナーゼ活性の溶出プロフィール。
【図７Ｃ】図７ＣはＤＮＡ−ＰＫによるＩＰ６の結合を示す図である。ＤＮＡ−ＰＫによる３Ｈ−ＩＰ３のゲル濾過分析を示す。上図、タンパク質サイズスタンダード（１．８ｍｇ／ｍｌ）での３Ｈ−ＩＰ３の溶出プロフィール。中図、ＤＮＡ−ＰＫでの３Ｈ−ＩＰ３の溶出プロフィール。下図、Ｃの中図に示された分画のＤＮＡ−ＰＫキナーゼ活性の溶出プロフィール。
【図８】図８は、ＩＰ７−ｐｐ５及びＩＰ７−ｐｐ６の両者がＰＣ−ＣによってＮＨＥＪを刺激し、この刺激化がＩＰ６によって達成されたものより約１０倍優れていることを示す図である。
【図９】図９は、ＩＳ６がＤＮＡ−ＰＫに対する結合においてＩＰ６と競合しないことを示す図である。
【図１０】図１０は、各種の条件の下でのゲル濾過カラムに沿った３Ｈ−ＩＰ６の分布を示す図である。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過、５０μｌ分画、シンチレーションカウンティング２０μｌ／分画１００ｎＭ３Ｈ−ＩＰ６、１００ｎＭ Ｋｕ、１００ｎＭ ＤＮＡ （２００ｎＭ ＤＮＡ末端）、１００ｎＭ ＰＫＣＳ。ランニングバッファー：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ８．０、４０ｍＭ ＫＯＡｃ、１０％グリセロール、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ。
【図１１】図１１は、図１０から得たＫｕ＋３Ｈ−ＩＰ６及びＫｕ＋ＤＮＡ−ＰＫＣＳ＋３Ｈ−ＩＰ６の曲線を重ねた図であり、ＤＮＡ−ＰＫＣＳの存在が、図１０から得たＫｕ−３Ｈ−ＩＰ６曲線の移動度を変更しないことを強調し、ＤＮＡ−ＰＫＣＳの存在が、ゲル濾過カラムに沿ったＫｕ−３Ｈ−ＩＰ６複合体の移動度を変更しないことを強調する。
【図１２】図１２は、ＤＮＡの存在下または不存在下でのＤＮＡ−ＰＫ＋３Ｈ−ＩＰ６で実施されたゲル濾過の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＩＰ３、ＩＰ６及びＩＰ７を使用するＫｕによるＩＰ６結合の競合分析の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、スピンカラム法を使用する特異性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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