(57)【要約】本発明は、βアミロイドペプチドの最小化されたリガンドとして有用なヒトα７ニコチン性受容体由来の天然および変性ペプチドを記述する。これらのペプチドは、α７ニコチン性受容体でβアミロイドペプチドとの相互作用を阻害する化合物を発見するのに有用であり、かつまたβアミロイドを測定するためのアッセイにおいても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＡＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１０）、ＳＡＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１１）、ＳＥＲＡＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１２）、ＳＥＲＦＡＥＣＣＫＥＰ（配列番号１３）、ＳＥＲＦＹＡＣＣＫＥＰ（配列番号１４）、ＳＥＲＦＹＥＡＣＫＥＰ（配列番号１５）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＡＥＰ（配列番号１６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＡ（配列番号１７）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号１８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ＨＳＶＴＹＳＣＣＰＤＴ（配列番号２１）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２２）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２３）、ＡＶＧＴＹＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩＹＰＤＩ（配列番号２４）、ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）およびＥＣＣＫ（配列番号２８）
よりなる群から選択される配列を含んで成るβアミロイドに結合するペプチド。
【請求項２】
ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）およびＥＣＣＫ（配列番号２８）
よりなる群から選択される配列を含んで成る請求項１に記載のβアミロイドに結合するペプチド。
【請求項３】
ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ−アミド（配列番号２５）およびＦＹＥＣ（配列番号２６）
よりなる群から選択される配列を含んで成る請求項２に記載のβアミロイドに結合するペプチド。
【請求項４】
ペプチドが最低１個のＤ−異性体のアミノ酸残基を含有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
別の配列に操作可能に連結される請求項１記載のβアミロイドに結合するペプチドを含んで成る融合タンパク質。
【請求項６】
段階：
（ａ）βアミロイドペプチドを、請求項１記載のβアミロイドに結合するペプチド、および推定の阻害化合物と、βアミロイド／結合ペプチド複合体をもたらすのに十分な時間の間、接触させること；ならびに
（ｂ）βアミロイド／結合ペプチド複合体の量の変化を測定すること
を含んで成る方法。
【請求項７】
段階：
（ａ）生物学的サンプルを、請求項１記載のβアミロイドに結合するペプチドと接触させて、それによりβアミロイドペプチドと結合ペプチドとの相互作用を可能にしてβアミロイドペプチド／結合ペプチド複合体を形成させること；
（ｂ）βアミロイドペプチド／結合ペプチド複合体を単離すること；および
（ｃ）βアミロイドペプチドを検出すること
を含んで成る診断方法。
【請求項８】
段階：
（ａ）生物学的サンプルを、βアミロイド親和性捕捉試薬と接触させて、それによりβアミロイドペプチドと親和性捕捉試薬との相互作用を可能にしてβアミロイドペプチド／親和性捕捉複合体を形成させること；
（ｂ）アミロイドペプチド／親和性捕捉複合体を単離すること；および
（ｃ）請求項１記載の標識されたβアミロイドに結合するペプチドでβアミロイドペプチドを検出すること
を含んで成る診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の交差引用）
本出願は、２０００年８月１４日出願の米国仮出願番号第６０／２２５，０４８号明細書（これにより引用することにより組み込まれる）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、βアミロイドペプチドの最小化されたリガンドとして有用なヒトα７ニコチン性受容体由来の天然および変性ペプチドを記述する。ヒトα７ニコチン性受容体由来のこれらの天然および変性ペプチドは、α７ニコチン性受容体とのβアミロイドペプチドの相互作用を阻害する化合物を発見するのに有用であり、また、βアミロイドペプチドのレベルを測定するためのアッセイにおいても有用である。ヒトα７ニコチン性受容体由来のさらなる天然および変性ペプチドは、アルツハイマー病および関係した神経変性性障害の治療に潜在的に治療上有用である。
【０００３】
（発明の背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）のような神経変性性障害は、大きな苦しみおよび財政的喪失を伴い人類を苦しめている。ＡＤは、神経原線維濃縮体、神経炎性斑および神経細胞死を特徴とする。ＡＤは家族性の早発性もしくは晩発性の形態のいずれかとして出現し、後者はより蔓延している。ＡＤは年齢に関係した痴呆および認識障害の主原因である（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｔ．：Ｇｈｉｓｏ，Ｊ．；Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ，Ｂ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅ　１９９７、４、３１３−３２８）。現在、ＡＤの診断の主たる手段は、患者のひどく減少された認識機能をモニターすることよりなる。該疾患の予後および進行を決定するための、ならびにアルツハイマー病を発症することがありそうであるかもしくは現在罹っている被験体に与えられる治療の治療的有効性をモニターするための感受性の高い生化学的方法を開発する必要性が存在する。
【０００４】
神経毒性のβ−アミロイドペプチド１−４２［Ａβ１−４２］は、アルツハイマー病（ＡＤ）の脳のアミロイド斑中に豊富に存在し、かつまた記憶および認識の神経生理学において決定的に重要であるコリン作動性の機能も調節する（Ａｕｌｄ，Ｄ．Ｓ．，Ｋａｒ，Ｓ．，Ｑｕｉｒｉｏｎ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１９９８；２１：４３−４９）。Ａβ１−４２は、神経の五量体の陽イオンチャンネル、α７ニコチン性アセチルコリン受容体に対する高親和性を伴い選択的に相互作用する（Ｗａｎｇ，Ｈ．−Ｙ．ら　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５、５６２６）。このペプチド−受容体相互作用は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のα−７のサブタイプの刺激がＡβの細胞傷害性に対してニューロンを保護する可能性があるという観察結果により、神経毒性であることがありそうである（Ｋｉｈａｒａ，Ｔ．ら　Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９７、４２、１５９）。また、とりわけα−７のサブタイプのｎＡＣｈＲを活性化する化合物は認識増強のモデルにおいてインビボの活性を有することが見出されている（１９９８年４月２１日公開の米国特許第５，７４１，８０２号明細書）。α７ニコチン性アセチルコリン受容体は、カルシウムの恒常性およびシナプス中でのアセチルコリン放出の調節に関与しており、それらの全部は認識機能において決定的に重要な事象である。β−アミロイドペプチドはＡＤのリンパ芽球中の細胞内遊離Ｃａ２＋を増大させ（Ｉｂａｒｒｅｔａら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ　Ｄｉｓ　Ａｓｓｏｃ　Ｄｉｓｏｒｄ　１９９７　Ｄｅｃ；１１（４）：２２０−７）、また、新たに調製されたヒトリンパ球中の分裂促進因子に誘発されるＣａ２＋応答を上昇させる（Ｅｃｋｅｒｔら、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　１９９４；５５（２５−２６）：２０１９−２９）。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は刺激に際してヒトリンパ球の細胞表面上で誘導されることができ（Ｂｕｌｌｉｄｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１９９６　Ａｕｇ　２１；１３１３（１）：５４−６２）、また、増大されたＡＰＰ−７７０アイソフォームが、ＡＤ患者からのリンパ球の検査に際して観察される（Ｅｂｓｔｅｉｎら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　１９９６　Ｊａｎ；３５（１−２）：２６０−８）。早発性および晩発性の家族性ＡＤを伴う患者からのリンパ芽球様細胞は、ＡＰＰのｍＲＮＡおよびタンパク質の増大された発現を示す（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９９３　Ｏｃｔ　１；２１７（１）：２１−７）。Ａβ１−４２およびα７ニコチン性アセチルコリン受容体の相互作用は、ＡＤにおいて観察される一連の病態生理学的事象を開始しそしてＡＤの顕著な特徴である神経毒性および認識機能不全をもたらすかもしれない。研究者らは、被験体集団間のｍＲＮＡレベルの局所分布の変化もしくは総量の変化を決定するために、正常およびＡＤを伴う患者の脳中のα７ニコチン性アセチルコリン受容体のｍＲＮＡレベルを測定した。α７ニコチン性アセチルコリン受容体のｍＲＮＡは、海馬（ＡＤの被験者は対照集団より高いｍＲＮＡレベルを表した）を除き、脳の全領域で等しく分布された。同様に、ＡＤ患者���らのリンパ球はα７ニコチン性アセチルコリン受容体の増大されたｍＲＮＡレベルを表した（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ−Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　１９９９　Ｍａｒ　２０；６６（１−２）：９４−１０３）。第二の報告において、ＡＤおよび対照被験体の脳中のニコチン性アセチルコリン受容体結合は有意の差異を示さなかった（Ｌａｎｇ，Ｗ．とＨｅｎｋｅ，Ｈ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　１９８３；２６７：２７１−２８０）。アルツハイマー病患者で観察される認識および記憶の欠損はコリン作動性ニューロンに対するＡβ１−４２の有害な影響の結果であると一般に考えられている（Ｋａｒ，Ｓ．ら　Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８；７０、２１７９−２１８７）。われわれは、β−アミロイドが、アルツハイマー病の病状に決定的にかつ緊密に関与しているかもしれない、ヒトの五量体のα７　ｎＡＣｈＲに高親和性を伴い結合する（２部位適合）ことを示した（Ｗａｎｇ，Ｈ．−Ｙ．ら　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００；２７５、５６２６−５６３２。）。われわれはまた、α７ｎＡＣｈＲタンパク質のレベルが、年齢に合致した非痴呆の対照に比較した場合にアルツハイマー病の脳で減少したことも示しており、これは診断もしくは疾患の進行のモニタリングのための生化学的アッセイの開発において有用かもしれない（Ｒｅｉｔｚらによりかつ１９９９年９月１２日公開のＷＩＰＯ公開第ＷＯ９９６２５０５号明細書）。
【０００５】
α７ｎＡＣｈＲのようなイオンチャンネル受容体を使用する高スループットの薬物発見結合アッセイの開発は、組換え細胞においてさえ、迅速なイオンチャンネルの脱感作および膜上での低い受容体密度から生じる問題のため困難であった。最近の研究は、げっ歯類のｎＡＣｈＲに由来するペプチドの伸長が、２個の結合部位を包含する小分子リガンドに対する天然のｎＡＣｈＲの完全な結合特徴を維持したことを示した（Ｌｅｎｔｚ，Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２６８、４８０−４８４）。本発明において、われわれは、β−アミロイドへの結合を包含する天然のα７　ｎＡＣｈＲの結合特徴を維持するのみならずしかしまたβ−アミロイドに媒介される生理学も調節するヒトα７　ｎＡＣｈＲから発する天然および変性ペプチドを記述する。これらのペプチドは、α７ニコチン性受容体とのβアミロイドペプチドの相互作用を阻害する化合物を発見するためのアッセイにおいて有用であり、また、βアミロイドを測定するためのアッセイにおいても有用である。
【０００６】
米国特許第５，８３７，４８９号明細書はヒトα７ニコチン性受容体を記述するが、しかしβアミロイドペプチドのリガンドとしてのそのフラグメントの使用に関して記載がない。本開示は、βアミロイドペプチド結合のためのリガンドとしてのα７ニコチン性受容体由来ペプチドの最初の既知の報告である。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、生物学的サンプル中のＡβ１−（４０）４２および関係したペプチドの測定を可能にする、ｈｕｍａ７へのＡβの結合を必要とするアルツハイマー病の診断方法に向けられる。本発明はまた、Ａβとのｈｕｍａ７の相互作用に基づきα７　ｎＡＣｈＲの調節物質を同定するための薬物発見アッセイの設計方法も記述する。最後に、ｈｕｍａ７のフラグメントは、ＡＤにおけるＡβ１−４２の生物学的影響を減弱させる治療薬を提供するかもしれない。
【０００８】
本発明は、
ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＡＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１０）、ＳＡＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１１）、ＳＥＲＡＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１２）、ＳＥＲＦＡＥＣＣＫＥＰ（配列番号１３）、ＳＥＲＦＹＡＣＣＫＥＰ（配列番号１４）、ＳＥＲＦＹＥＡＣＫＥＰ（配列番号１５）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＡＥＰ（配列番号１６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＡ（配列番号１７）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号１８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ＨＳＶＴＹＳＣＣＰＤＴ（配列番号２１）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２２）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２３）、ＡＶＧＴＹＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩＹＰＤＩ（配列番号２４）、ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）およびＥＣＣＫ（配列番号２８）
よりなる群から選択される配列を含んで成るβ−アミロイドに結合するペプチドにさらに向けられる。
【０００９】
（発明の詳細な記述）
定義
本明細書で使用されるところの「βアミロイドペプチド」という用語は、β−アミロイドペプチド１−４２、β−アミロイドペプチド１−４０、または、位置１のアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に改変される、もしくは位置３のグルタミン酸が残基１および２の切除を伴いピログルタミル残基に転化される（Ａβ３ｐＥ）ような酵素的に改変されたβ−アミロイドペプチドである。とりわけ好ましいＡβペプチドはβ−アミロイド１−４２およびＡβ３ｐＥよりなる群から選択される。
【００１０】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、治療、観察、生化学的スクリーニングもしくは実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
βアミロイドに結合するペプチド
本発明は、βアミロイドペプチドに結合するヒトα７　ｎＡＣｈＲ由来のペプチドを提供する。これらのペプチドの同定および特徴づけは、被験体におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の診断方法およびアルツハイマー病を治療するための小分子のスクリーニング方法の開発を可能にする。とりわけ、これらのペプチドは、βアミロイドに結合することによるＡＤの診断方法で使用することができ、従って、ＡＤ患者、またはＡＤの早期段階にあるもしくは今後ＡＤを発症するであろう者の生物学的組織もしくは体液中に存在する遊離のβ−アミロイド１−４２もしくはβ−アミロイド１−４０の測定を可能にする。これらのペプチドとβアミロイドとの間の結合反応は、限定されるものでないがアルツハイマー病および関係した障害のような神経変性性障害、パーキンソン病、疼痛、神経障害性疼痛、うつ、汎発性不安障害、強迫性障害、恐怖症、外傷後ストレス障害、パニック障害、分裂性障害および精神病、双極性障害、痴呆ならびに物質濫用を挙げることができる多様な障害を治療するための小分子のα７　ｎＡＣｈＲの調節物質の同定のための薬物スクリーニングアッセイ、とりわけ高スループットアッセイの開発にもまた使用することができる。
【００１１】
本発明のペプチドは治療上有効な作用物質でもまたあることができるか、もしくは、コンピュータに基づく分子モデリングを使用して小分子模倣物を創製するための原理的薬物設計の目的上、βアミロイドとの相互作用のモデル化するのに使用することができる。これらのコンピュータに基づく方法は２つの広範な分類、すなわちデータベース法およびデノボ設計法にある。データベース法においては、目的の化合物を化学構造のデータベース中に存在する全化合物と比較し、そしてその構造が目的の化合物に何らかの様式で類似である化合物を同定する。データベース中の構造は、ＮＭＲもしくはｘ線結晶学により生成される実験データ、または二次元（すなわち配列）データに基づくモデル化された三次元構造のいずれかに基づく。デノボ設計法において、その構造が目的の化合物に何らかの様式で類似である化合物のモデルを、既知の構造由来の情報、例えばｘ線結晶学により生成されたデータおよび／もしくは理論的規則を使用してコンピュータのプログラムにより生成させる。こうした設計方法は、原子単位の様式でもしくは記憶された小分子の断片を集成することによるかのいずれかで、所望の構造を有する化合物を構築することができる。
【００１２】
本発明は、ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＡＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１０）、ＳＡＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１１）、ＳＥＲＡＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１２）、ＳＥＲＦＡＥＣＣＫＥＰ（配列番号１３）、ＳＥＲＦＹＡＣＣＫＥＰ（配列番号１４）、ＳＥＲＦＹＥＡＣＫＥＰ（配列番号１５）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＡＥＰ（配列番号１６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＡ（配列番号１７）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号１８）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ＨＳＶＴＹＳＣＣＰＤＴ（配列番号２１）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２２）、ＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩ（配列番号２３）、ＡＶＧＴＹＮＴＲＫＹＥＣＣＡＥＩＹＰＤＩ（配列番号２４）、ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）およびＥＣＣＫ（配列番号２８）よりなる群から選択される配列を含んで成るβ−アミロイドに結合するペプチドに向けられる。
【００１３】
好ましいβアミロイドに結合するペプチドは、ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、環状ペプチドＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ｈｕｍａ７　ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）および環状ペプチドＥＣＣＫ（配列番号２８）よりなる群から選択される配列を含んで成るものである。
【００１４】
とりわけ好ましいβアミロイドに結合するペプチドは、ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、環状ペプチドＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ｈｕｍａ７　ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ−アミド（配列番号２５）およびＦＹＥＣ（配列番号２６）よりなる群から選択される配列を含んで成るものである。
【００１５】
本発明のペプチドは、好ましくはＮアセチル化およびＣ末端アミド化される。本発明のペプチドは、ＤもしくはＬ異性体のアミノ酸前駆体を利用して当該技術分野で公知の方法を使用して合成で製造してよい。本発明の治療的ペプチドは、好ましくはＤ−異性体のコンホメーションのそれらのアミノ酸残基の１個、数個もしくは全部を含有する。環状ペプチドは関連するアミノ酸の下線により示す。環状ペプチドは、配列中の２個の隣接するシスチンが酸化されてジスルフィド橋を形成したものである。われわれは、ジスルフィド結合を含有しない直鎖状配列と区別するために「環状」という用語を使用している。
【００１６】
本発明のペプチドはまた、小型ペプチドとして、標的ペプチドに融合される本発明の１種もしくはそれ以上のペプチドを含んで成る小型の合成融合タンパク質として組換え技術により製造してもよい。本明細書で使用されるところの「融合タンパク質」という用語は、ドメインもしくはリンカー領域の組合せられた機能の機能を得るという目的上複数のタンパク質ドメインもしくはリンカー領域を組合せることの結果であるタンパク質構築物を指す。これは、所望のタンパク質をコードする新たなポリヌクレオチド配列の創製をもたらすためのヌクレオチド配列の分子クローニングにより最もしばしば達成される。あるいは、融合タンパク質の創製は、２種のタンパク質を一緒に化学的に結合することにより達成してよい。本明細書で使用されるところの「リンカー領域」もしくは「リンカードメイン」という用語、または類似のこうした記述的用語は、クローニングベクターもしくは融合タンパク質の構築で使用されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の伸長を指す。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列中へのクローニング部位の導入、２種のタンパク質ドメイン間の可撓性の成分もしくは空間を創製する領域の導入、または特異的分子相互作用のための親和性標識の創製を包含することができる。リンカー領域は特定の目的なしに融合タンパク質に導入してよいが、しかしクローニングの間になされる選択から生じる。ターゲッティングペプチドは、細胞のオルガネラへのペプチドの指図された局在化、もしくは細胞の分泌経路へのペプチドの送達を可能にする。本発明のペプチドはまた融合遺伝子中の一成分であってもよい。例えば、本発明のペプチドは、ファージディスプレイ中でとして、もしくは免疫グロブリンの折り畳みの可変ループ中の置換として発現されてよい。これゆえに、本発明は、別の配列に操作可能に連結された：ＳＥＡＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号１）、ＳＥＲＦＹＥＣＡＫＥＰ（配列番号２）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＡＰ（配列番号３）、ＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫ（配列番号４）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰ（配列番号５）、ＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶ（配列番号６）、ＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号７）、ＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶＴＭＲ（配列番号８）、環状ペプチドＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰ（配列番号９）、ＹＥＣＣ（配列番号２０）、ｈｕｍａ７　ＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤＶＴＦＴＶ（配列番号２５）、ＦＹＥＣ（配列番号２６）、ＳＧＹＩＰＮＧＥＷＤＬＶＧＩＰＧＫＲＳＥＲＦＹＥＣＣＫＥＰＹＰＤ（配列番号２７）および環状ペプチドＥＣＣＫ（配列番号２８）よりなる群から選択されるβアミロイドに結合する配列を含有する融合タンパク質を提供するが、但し、本発明はα７ニコチン性アセチルコリン受容体として機能する融合タンパク質を除外する。
薬物スクリーニングアッセイ
本発明のペプチドは、βアミロイド／α７ニコチン性アセチルコリン受容体の相互作用の推定の阻害剤についてスクリーニングするために有用である。該アッセイは、段階：
（ａ）βアミロイドペプチド、βアミロイドに結合するペプチド、および推定の阻害化合物を、βアミロイド／結合ペプチド複合体をもたらすのに十分な時間の間、接触させること；ならびに
（ｂ）βアミロイド／結合ペプチド複合体の量の変化を測定すること
を含んで成る。
【００１７】
本発明の好ましい薬物スクリーニングアッセイは、相互作用の容易に測定可能なマーカー、例えば放射標識されたβアミロイドもしくは結合ペプチド、またはいずれかのペプチドの蛍光誘導体を利用する。測定は、放射ヌクレオチドの減衰、蛍光強度、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、もしくは異方性、質量分析、または適切に標識されたα７ｎＡＣｈＲリガンド、例えば１２５Ｉ−α−ブンガロトキシンを包含する当該技術分野で公知の方法を使用して行う。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「推定の阻害化合物」という用語は、βアミロイドとβアミロイドに結合するペプチドとの間の相互作用を混乱させる潜在能力を有する有機分子を指す。例えば、しかし本発明の範囲を制限することなく、化合物は、小有機分子、他の合成もしくは天然のアミノ酸ペプチド、タンパク質、または合成もしくは天然の核酸配列、あるいは前述のいかなる化学的誘導体も包含してよい。本発明の方法で有用な化合物の特定の例は、Ｒｅｉｔｚらによりかつ１９９９年９月１２日公開の第ＷＯ９９６２５０５号明細書に記述されるある種の化合物を包含する。
【００１９】
阻害剤Ａとして記述される化合物は、構造
【００２０】
【化１】
2004506650.tif 000002
【００２１】
を有し、そしてＲｅｉｔｚらによるＷＩＰＯ公開第ＷＯ９９／６２５０５号明細書に「化合物９」として記述される。
診断アッセイ
本発明のペプチドはまた、生物学的サンプル中のβアミロイドの存在を検出するための診断アッセイにおいても有用である。本明細書で使用されるところの「生物学的サンプルは、赤血球、白血球、血小板、腹水、尿、唾液、嗅神経上皮細胞、皮膚線維芽細胞、脳脊髄液、血漿、血清のようなβアミロイドペプチドを含有する生物学的物質、およびβアミロイドペプチドを含有するかもしれない身体の他の構成要素を指す。さらに、サンプルはより大きな組成物、例えば生検の組織切片中の成分であってよく、この場合、サンプルは生物学的液体の単離されない画分、または多様な細胞型の一領域のうちの１種もしくはそれ以上の細胞サブタイプであってよい。
【００２２】
本発明の診断アッセイは、段階：
（ａ）生物学的サンプルをβアミロイドに結合するペプチドと接触させること；
（ｂ）結合ペプチドを伴うβアミロイドペプチドを単離すること；および
（ｃ）βアミロイドペプチドを検出すること
を含んで成る。
【００２３】
あるいは、本発明のペプチドは、他の方法、例えばβアミロイド特異的抗体を使用することにより単離されるβアミロイドを検出するための標識された試薬として使用することができる。
【００２４】
βアミロイドペプチドのレベルは、限定されるものでないがイムノアッセイ技術、ＨＰＬＣ分析、ＨＰＬＣ／ＭＳ（質量スペクトル）分析、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／飛行時間）質量スペクトル分析、サイズ排除クロマトグラフィー、チオフラビン−Ｔもしくはコンゴーレッド染色、またはＥＳ／ＭＳ（電子スプレーイオン化質量スペクトル）分析を挙げることができる当該技術分野で既知の方法により測定する。正常の（対照）患者とβ−アミロイド１−４２もしくはＡβ３ｐＥのレベルを比較することにより、または、時間にわたっていずれかの特定の患者のβ−アミロイド１−４２もしくはＡβ３ｐＥのレベルを比較することにより、当業者は、ある患者がＡＤに罹っているか、もしくはＡＤを発症する危険にさらされているかどうかを決定することができ、また、ＡＤの進行をモニターすることができる。
【００２５】
とりわけ好ましい一アッセイ形式は親和性捕捉（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｐｔｕｒｅ）アッセイ形式であり、ここでは１種の親和性捕捉試薬を使用してβアミロイドペプチドを単離し、そして親和性標識試薬で検出するが、但し、これらの親和性試薬の１種は本発明のβアミロイドに結合するペプチドである。親和性捕捉もしくは親和性標識試薬は、類似の化合物の除外までのβアミロイドペプチドとの特異的相互作用が可能な化合物を含んで成る。これらの化合物は、例えば、他のタンパク質もしくはペプチドに比較してβアミロイドペプチドに対し約２０倍もしくはより大きな親和性をもつ、合成もしくは天然のアミノ酸ポリペプチド、タンパク質（抗体を包含する）、小型の合成有機分子またはデオキシもしくはリボ核酸配列を包含する。
【００２６】
サンプルからのβアミロイドペプチドの単離およびＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）によるようなβアミロイドペプチドのレベルのその後の分析に十分な実現可能な診断的決定に必要とされる成分の全部が一緒に包装される診断キットもまた本発明に包含される。イムノアッセイ診断キットの成分は、親和性捕捉試薬、例えば親和性被覆された樹脂、親和性標識試薬（ここで親和性試薬の１種は本発明のβアミロイドに結合するペプチドである）、および場合によってはイムノアッセイ対照試薬を包含する。イムノアッセイ対照試薬は、該アッセイ系の適正な機能を確認しかつサンプルの解釈を確認するのに役立つものである。陰性対照は親和性標識試薬からシグナルを生じないものであり、そしてしばしばアッセイ系の背景ノイズを決定するために使用されるか、もしくは当該技術分野で公知の計算を使用して陽性サンプルのＳ／Ｎ比を計算するのに使用される。陽性対照は親和性標識試薬からシグナルを生じるものであり、そしてアッセイ系を確認するかもしくはサンプルの状態を解釈するためにサンプルと比較するのに使用される。これは経験的に「はい／いいえ（ｙｅｓ／ｎｏ）」系を使用して行うことができるか、もしくは、既知の量のβアミロイドペプチドを含有する対照サンプルにより生成されるシグナルを試験サンプルと比較することにより定量的にすることができる。
【００２７】
以下の実施例は、しかしながらそれにそれを制限することなしに本発明を具体的に説明する。本明細書で使用されるところの「α−ＢＴＸ」という略語はα−ブンガロトキシンを意味する。
【００２８】
実施例１
βアミロイドペプチドとのα７　ｎＡＣｈＲ相互作用とのβアミロイドに結合するペプチドの競争
α７ｎＡＣｈＲ（ニコチン性アセチルコリン受容体）結合アッセイ：α７ｎＡＣｈＲを過剰発現する組換えＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ＃　ＨＴＢ−１０）からの膜（α７ＳＭ−Ｎ−ＭＣ）を、膜を徹底的に洗浄したことを除き標準的手順（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２７５、５６２６−５６３２、２０００）に従って調製した。各アッセイについて、膜（２０μｇ）を、０．０１％ＢＳＡ、２ｍＭ　Ｍｇ２＋、２ｍＭ　Ｃａ２＋およびプロテアーゼ阻害剤（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を含有する５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の小麦胚芽アグルチニンイットリウムＳＰＡビーズ（２５０μｇ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に前結合した。その後、ｈｕｍａ７および阻害剤Ａ（βアミロイドのフォールディングを阻害する小型有機分子）を包含する阻害剤、次いで１５０μｌの最終容量まで１２５Ｉ−β−アミロイド１−４０（２０ｐＭ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））をアッセイ混合物に添加した。インキュベーション（３０分）の終了時に、結合された放射活性をトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、コネチカット州メリデン）で測定した。データはＧｒａｐｈｐａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェア（グラフパッド　ソフトウェア　インコーポレイテッド（Ｇｒａｐｈｐａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））を使用して分析した。
【００２９】
ｈｕｍａ７ペプチドは、α７ＳＫ−Ｎ−ＭＣ膜への１２５Ｉ−β−アミロイド１−４０の結合を強力に阻害し、それがβアミロイドリガンドについて天然の受容体と競争することを示唆した（図１および表１）。
【００３０】
【表１】
2004506650.tif 000003
【００３１】
この阻害効果を表すｈｕｍａ７について考慮される１つの可能性は、１２５Ｉ−β−アミロイド１−４０リガンドへのペプチドそれ自身の結合ことである。この仮説を、固相吸着親和性アッセイを使用する、ペプチドを最初に固定しそしてその後リガンドと相互作用させた以下のアッセイで試験した。
ｈｕｍａ７結合アッセイ：ｈｕｍａ７ペプチド、ｈｕｍａ７ペプチドの誘導体もしくはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（１μｇ／ウェル）をポリソルブ（Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）９６穴プレートの表面に固定した。結合されないペプチドを除去し、そして、１０μＭのテトラペプチドＹＰＷＦ、ｈｕｍａ７、α−ブンガロトキシンおよび「阻害剤Ａ」のような阻害剤の存在下で１００μｌの最終容量まで１２５Ｉ−β−アミロイド１−４０（４０ｐＭ、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を添加した。２５℃で１時間のインキュベーション後に、結合されないリガンドを除去し、２５μｌのマイクロシント（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ）を各ウェルに添加し、そして結合された放射活性をＢ−プレート計数器で測定した。
【００３２】
結果は、１２５Ｉ−β−アミロイド１−４０リガンドに結合されたｈｕｍａ７および結合は、α７ｎＡＣｈＲアンタゴニスト、α−ブンガロトキシンもしくは阻害剤Ａにより阻害されることができることを示し（図２）、ｈｕｍａ７がβ−アミロイドの結合モチーフを含有することを示唆した。従って、ｈｕｍａ７ペプチドは、競争的阻害により天然の受容体へのβアミロイドの結合を阻害することがありそうである。
β−アミロイド沈着アッセイ：シンタロイド（Ｓｙｎｔｈａｌｏｉｄ）プレート（バイオソース　インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カリフォルニア州カマリロ）上のβ−アミロイド沈着を、小さな改変を伴い以前に記述された（Ｅｓｌｅｒ，Ｗ．Ｐ．ら　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　１９９７；１５、２５８−２６３）とおり実施した。０．００１％アジ化ナトリウム、０．１％卵アルブミンおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する１００μｌの１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中のフロ−β−アミロイド１−４２［アドバンスト　バイオコンセプツ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔｓ）、ケベック州モントリオール、５０ｎＭ］を、シンタロイド（Ｓｙｎｔｈａｌｏｉｄ）プレートの各ウェルに添加し、次いで阻害剤を添加しそして２５℃で５時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄して結合されないフロ−β−アミロイドを除去した。沈着されたβ−アミロイドを表す結合された蛍光を、ＬＪＬアナリスト（ＬＪＬ　Ａｎａｌｙｓｔ）の蛍光読取り器（ＬＪＬ　バイオシステムズ（ＬＪＬ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州サニーヴェイル）で測定した。
【００３３】
シンタロイド（Ｓｙｎｔｈａｌｏｉｄ）プレートへのβ−アミロイド沈着を阻害するｈｕｍａ７の能力を測定し、そして、期待されたとおり、ｈｕｍａ７はインビトロでβ−アミロイドの沈着を阻害した（図３）。
【００３４】
実施例２
βアミロイドに結合するペプチドの変異体を使用する生物学的アッセイ
モルモット海馬シナプトソームからのＡＣｈ放出：シナプトソーム（Ｐ２画分）を、以前に記述されたとおりモルモット海馬から調製し、そして０．１μＭ［メチル−３Ｈ］コリン塩化物（ＮＥＮ、マサチューセッツ州ボストン）を含有するクレブス−リンガー液に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。取り込まれないコリンを、洗浄することにより除去し、そしてシナプトソームを１０ｍｇ／ｍＬまでクレブス−リンガー液に再懸濁した。シナプトソームからのＡＣｈの放出は、より以前に記述された（Ｗａｎｇ，Ｈ．−Ｙ．ら　Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　１９９９；３３、１９７−２０５）ものに従って、平行表面灌流（ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）チャンバー（フーゴ　ザッハス　エレクトロニーク（Ｈｕｇｏ　Ｓａｃｈｓ　Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）、ドイツ・マルハ−フグシュテッテン）を使用して測定した。シナプトソームの懸濁物（２５０μＬ）を、ＧＦ／Ｂフィルター（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、英国）の２枚の円形片の間の表面灌流チャンバーのそれぞれに入れた。チャンバーは、０．５ｍＬ／分の流速で、１μＭフィゾスチグミンヘミサルフェートを含有する酸素化されたクレブス−リンガーで灌流した。表面灌流の開始を時間ゼロ（ｔ０）と定義した。ｔ０後３０分で開始して、流出物の画分を１０分間隔で１２回収集した。
【００３５】
組織をペプチドで処理し、そして６５ｍＭ　Ｋ＋−クレブス−リンガー（ＫＣｌでのＮａＣｌの等モル置換により作成された）で３０秒間表面灌流することによりＡＣｈ放出を惹起させた。３０分間隔で送達された４回の連続する脱分極刺激（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４）の間に、わずかな放出の有意の低下は観察されなかった。Ｋ＋刺激（Ｓ２、Ｓ３もしくはＳ４）の２０分前に、組織を多様な濃度の化合物を含有したクレブス−リンガー液もしくはベヒクル（対照）で３０分間表面灌流した。灌流後、５ｍＬのシントセーフ　プラス［Ｓｃｉｎｔｓａｆｅ　Ｐｌｕｓ］（商標）５０％（フィッシャー　サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を、シナプトソーム（フィルター上）および表面灌流物のアリコート（０．５ｍＬ）に添加した。表面灌流物サンプル中の３Ｈの量を液体シンチレーション分光測定法により測定した。
【００３６】
表面灌流物中へのトリチウムの流出を、それぞれの収集期間の開始でのシナプトソーム中の３Ｈ含量の画分として計算した。Ｋ＋刺激後に表面灌流物中に存在する３Ｈの量を計算するために、推定される基礎流出量（各刺激の直前および直後の１０分の画分の平均）を、３０秒のＫ＋刺激で開始した１０分の画分の間の総流出量から差し引いた。その後、この差異を使用してＡＣｈのＫ＋に惹起される放出のパーセントを計算した。
【００３７】
Ｋ＋に刺激される３Ｈの放出に対する１ｎＭのβ−アミロイド１−４２の存在下での化合物例えばｈｕｍａ７のインビトロの影響を定量するために、対照刺激（Ｓ１）により惹起されたものに対する所定のＫ＋刺激Ｓｎ（Ｓ２、Ｓ３もしくはＳ４）により放出された画分の比を決定した。データは画分の３Ｈ放出の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。処理間の統計学的差異は、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定、両側もしくは二元配置ＡＮＯＶＡにより適切なように検定した。用量−応答曲線中の個々の差異は、ニューマン−コイルス（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）の多重比較検定により評価した。
【００３８】
β−アミロイドと相互作用するｈｕｍａ７の効力を、動物の皮質シナプトソーム調製物を使用するＡＣｈ放出アッセイにより立証した。ｈｕｍａ７はカリウムに惹起されるＡＣｈ放出のβ−アミロイドに誘導される阻害を効率的に封鎖した（表２）。
【００３９】
【表２】
2004506650.tif 000004
【００４０】
実施例３
フロ−β−アミロイド１−４２結合アッセイ
ビオチニル化ｈｕｍａ７ペプチドを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０に溶解し、そして５０μＬ［１μｇ］を、９６穴ニュートルアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）被覆された黒色プレート［ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）］の各ウェルに分注し、そして２５℃で約２時間インキュベートした。過剰のペプチドはハンクス液で３回洗浄することにより除去した。プレート上の非特異的結合部位を、０．１％卵アルブミンを含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５により２５℃で３０分間封鎖した。内容物を廃棄し、そしてウェルをハンクス液で３回洗浄した。阻害剤もしくは試験化合物、次いで１００ｎＭのフロ−β−アミロイド１−４２［パーキン　エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）］を適切なウェルに添加し、そして２５℃で１時間インキュベートした。結合されないペプチドは、０．１％卵アルブミンを含有するハンクス液で３回洗浄することにより除去した。結合された蛍光をＬＪＬ蛍光読取り器で測定した。
【００４１】
上述された手順の後に、本発明の代表的ペプチドをアミロイド−β結合について試験し、結果は表３に列挙されるとおりであった。
【００４２】
【表３】
2004506650.tif 000005
【００４３】
実施例４
１２５Ｉ−α−ブンガロトキシン結合アッセイの手順
ビオチニル化ｈｕｍａ７ペプチドを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０に溶解し、そして５０μＬ［１μｇ］を９６穴ニュートルアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）被覆されたフラッシュ（Ｆｌａｓｈ）プレート［ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）］の各ウェルに分注し、そして２５℃で約２時間インキュベートした。過剰のペプチドはハンクス液で３回洗浄することにより除去した。プレート上の非特異的結合部位は、１０％ウシ胎児血清を含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５により２５℃で３０分間封鎖した。内容物を廃棄し、そしてウェルをハンクス液で３回洗浄した。阻害剤もしくは試験化合物、次いで１００ｐＭの１２５Ｉ−α−ブンガロトキシン［アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］を適切なウェルに添加し、そして２０時間インキュベートした。結合された放射活性をトップカウント（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ）［パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）］で測定した。
【００４４】
上述された手順の後に、本発明の代表的ペプチドをアミロイド−β結合について試験し、結果は表４に列挙されるとおりであった。
【００４５】
【表４】
2004506650.tif 000006
【００４６】
実施例５
チオフラビン−Ｔ［ＴＦＴ］アミロイド凝集アッセイの手順
β−アミロイド１−４２［パロマー　インク（Ｐａｌｏｍａｒ　Ｉｎｃ）］を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ８．５緩衝液に溶解し、そして９６穴黒色プレート［ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）］の各ウェルに分注する［０．００１％アジ化ナトリウムを含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中５０μＭ］。阻害剤もしくは試験化合物、次いでＴＦＴ［５０μＭ］を適切なウェルに添加し、そして蛍光を時間間隔でＬＪＬ蛍光読取り器で測定する。蛍光の増大はアミロイドの凝集を表す。
【００４７】
前述の明細は、具体的説明の目的上提供される実施例をもって本発明の原理を教示する一方、本発明の実務は、以下の請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内にあるところの通常の変形物、翻案および／もしくは改変の全部を包含することが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、ｈｕｍａ７ペプチドはα７−ＳＫ−Ｎ−ＭＣ膜への１２５Ｉ−βアミロイドの結合を阻害する。三角＝テトラペプチドＹＰＷＦ　四角＝阻害剤Ａ　丸＝ｈｕｍａ７ペプチド。
【図２】
発明にかかる、ｈｕｍａ７ペプチドは固定されたｈｕｍａ７ペプチドおよび関係するペプチド誘導体への１２５Ｉ−βアミロイドの結合を阻害する。（Ｈ７２０１−２２０＝配列番号６；Ｈ７２００−２１４＝配列番号４；Ｈ７２０１−２１８＝配列番号５；Ｈ７２０６−２１６＝配列番号７；ｈｕｍａ７＝配列番号２５）
【図３】
発明にかかる、ｈｕｍａ７ペプチドはシンタロイドプレート上への蛍光−βアミロイド１−４２の沈着を阻害する。
【図４】
発明にかかる、ビオチン−ｈｕｍａ７−５ペプチドへのフロ−Ａβ１−４２の結合。
【図５】
発明にかかる、約６時間での飽和を示す、ビオチニル化ｈｕｍａ７−５ペプチドへの１２５Ｉ−Ａβ４０の結合についての時間経過。
【図６】
発明にかかる、ｈｕｍａ７−５によるビオチニル化ｈｕｍａ７−５への１２５Ｉ−Ａβ４０の結合の阻害。
【国際公開パンフレット】
2004506650.tif 000007
2004506650.tif 000008
2004506650.tif 000009
2004506650.tif 000010
2004506650.tif 000011
2004506650.tif 000012
2004506650.tif 000013
2004506650.tif 000014
2004506650.tif 000015
2004506650.tif 000016
2004506650.tif 000017
2004506650.tif 000018
2004506650.tif 000019
2004506650.tif 000020
2004506650.tif 000021
2004506650.tif 000022
2004506650.tif 000023
2004506650.tif 000024
2004506650.tif 000025
2004506650.tif 000026
2004506650.tif 000027
2004506650.tif 000028
2004506650.tif 000029
2004506650.tif 000030
2004506650.tif 000031
2004506650.tif 000032
2004506650.tif 000033
2004506650.tif 000034
2004506650.tif 000035
2004506650.tif 000036
2004506650.tif 000037
2004506650.tif 000038
2004506650.tif 000039
2004506650.tif 000040
2004506650.tif 000041
2004506650.tif 000042
2004506650.tif 000043
2004506650.tif 000044
2004506650.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506650.tif 000046
【国際調査報告】
2004506650.tif 000047
2004506650.tif 000048
2004506650.tif 000049
2004506650.tif 000050
2004506650.tif 000051