(57)【要約】本発明は，ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）の手段により同定される，線虫の生存，成長または生殖に必要ないくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子および遺伝子産物，および他の線虫種に見いだされる前記遺伝子および遺伝子産物の機能的オルトログ，例えば，それらの生物学的に活性な誘導体に関する。本発明はまた，抗線虫剤または他の殺虫剤の開発，および線虫の感染または存在に伴う疾病の診断および治療の方法における，前記遺伝子および遺伝子産物の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子であって，以下の核酸配列：
ａ）  配列番号１，３，５，７，９，１１，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７または４９に記載される核酸配列およびそのフラグメントおよびその相補鎖；
ｂ）  配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８および５０からなる群より選択される配列のいずれかと，１００残基にわたり少なくとも２５％の配列同一性を示すか，および／または，ｂｌａｓｔ配列分析プログラムを用いるコンピュータ支援検索において最大で１０−３０のｅ値で検出可能であるポリペプチドをコードする核酸配列；
ｃ）  中／高ストリンジェンシーの条件下でａ）またはｂ）の核酸配列とハイブリダイズしうる核酸；
ｄ）  遺伝コードの結果としてａ），ｂ）またはｃ）に記載される配列のいずれかと縮重している核酸；
からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸配列を含むプローブであって，検出可能な標識を含む少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであるプローブ。
【請求項３】
請求項１記載の単離された核酸分子またはそのフラグメントが組み込まれている組換えベクターまたは核酸構築物。
【請求項４】
発現ベクターである，請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１記載の単離された核酸分子または請求項３記載の組換えベクターまたは核酸構築物を組み込むよう遺伝子工学的に改変されている宿主細胞。
【請求項６】
請求項４記載の発現ベクターが組み込まれている請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１記載の単離された核酸分子またはそのフラグメント，または請求項２記載のプローブを適当な容器中に含むアッセイキット。
【請求項８】
線虫，特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒト，家畜または植物に寄生する線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドを宿主細胞において製造する方法であって，
ａ）  請求項３記載の発現ベクターを適当な宿主細胞に移し，そして
ｂ）  工程ａの宿主細胞を，前記ポリペプチドまたはそのフラグメントの発現を可能とする条件下で培養し、そして
ｃ）  任意に、発現されたポリペプチドを培地に分泌させる
の各工程を含む方法。
【請求項９】
線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドを製造するための，請求項１記載の単離された核酸分子またはそのフラグメントの使用。
【請求項１０】
線虫の成長，生存または生殖を阻害するか，刺激するかまたは引き起こす薬剤のスクリーニングアッセイにおける，請求項１で定義される核酸配列または請求項２記載のプローブの使用。
【請求項１１】
線虫の感染または存在に伴うヒトまたは動物の疾病の診断または治療の方法における，請求項１で定義される核酸配列または請求項２記載のプローブの使用。
【請求項１２】
線虫が，Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ，Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ，Ｌｏａ  ｌｏａ，またはＯｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓからなる群より選択される線虫である，請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
疾病が，カラバル腫脹，リンパ性フィラリア症（象皮病）またはオンコセルコーマからなる群より選択される，請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
線虫の感染または存在に伴う植物疾病の診断または治療の方法における，請求項１で定義される核酸配列または請求項２記載のプローブの使用。
【請求項１５】
線虫が，Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ，例えば，Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ，Ｈ．ａｖｅｎａｅ，Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ，Ｈ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ，Ｈ．ｇｏｔｔｉｎｇｉａｎａ，Ｈ．ｃａｊａｎｉ，Ｈ．ｚｅａｅ；Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ，例えば，Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ，Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ，Ｇ．ｔａｂａｃｕｍ；Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ，例えば，Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ，Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ，Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ，Ｍ．ｈａｐｌａ，Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ；Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ，Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉ，Ｄ．ａｎｇｕｓｔｕｓ；Ａｎｇｕｉｎａ，例えば，Ａ．ｔｒｉｔｉｃｉ，Ａ．ａｇｒｏｓｔｉｓ，Ａｆｒｉｎａ／Ａｎｇｕｉｎａ  ｗｅｖｅｌｌｉ；Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｐ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ，Ｐ．ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ，Ｐ．ｃｏｆｆｅａｅ，Ｐ．ｚｅａｅ，Ｐ．ｇｏｏｄｅｙｉ，Ｐ．ｔｈｏｒｎｅｉ，Ｐ．ｖｕｌｎｕｓ；Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｓｉｍｉｌｉｓ；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ，例えば，Ｈ．ｏｒｙｚａｅ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔａ，Ｈ．ｓｐｉｎｉｃａｕｄａ；Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ，例えば，Ｈ．ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｈ．ｓｅｉｎｈｏｒｓｔｉ，Ｈ．ｉｎｄｉｃｕｓ；Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ；Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｔ．ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ；Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｈ．ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ，Ｈ．ｄｉｈｙｓｔｅｒａ，Ｈ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｂｕｓｔｕｓ；Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ，例えば，Ｃ．ｘｅｎｏｐｌａｘ，Ｃ．ａｘｅｓｔｉｓ，Ｃ．ｓｐｈａｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ；Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ，例えば，Ｘ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，Ｘ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ，例えば，Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ；Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ，例えば，Ｐ．ｍｉｎｏｒ；Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｓ，例えば，Ａ．ｆｒａｇａｒｉａｅ，Ａ．ｂｅｓｓｅｙｉ，Ａ．ｒｉｔｚｅｍａｂｏｓｉ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓからなる群より選択される線虫である，請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはそのフラグメントであって、
ａ）  配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８および５０に記載されるアミノ酸配列およびそのフラグメント；
ｂ）  ａ）の配列と１００残基にわたり少なくとも２５％の配列同一性を示すアミノ酸配列，および／またはｂｌａｓｔ配列分析プログラムを最大１０−３０のｅ値で用いるコンピュータ支援検索において検出可能なアミノ酸配列；
ｃ）  請求項１記載の核酸配列ｃ）−ｄ）のいずれかによりコードされるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項１７】
請求項１６記載のポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１６記載のポリペプチドまたはその免疫原性部分と特異的に結合しうる，ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，またはそのフラグメント。
【請求項１９】
請求項１６記載のポリペプチド，請求項１７記載の融合蛋白質，または，請求項１８記載の抗体を適当な容器中に含むアッセイキット。
【請求項２０】
線虫の生存，成長および／または生殖を阻害するか刺激するかまたは引き起こす相互作用薬剤のスクリーニングアッセイにおける，請求項１６記載のポリペプチド，請求項１７記載の融合蛋白質，または請求項１８記載の抗体の使用。
【請求項２１】
相互作用薬剤のスクリーニングアッセイが以下の工程：
１．  宿主細胞において前記ポリペプチドを組換え発現させ；
２．  工程１において組換え的に発現させたポリペプチドを単離し，および任意に精製し；
３．  前記ポリペプチドとの相互作用について試験される薬剤を任意に標識し，および／または，組換え的に発現させたポリペプチドを標識し；
４．  組換え的に発現させたポリペプチドを固相に固定化し；
５．  潜在的相互作用パートナーまたはその変種をポリペプチドに結合させ；
６．  任意に１回またはそれ以上洗浄し；
７．  特に，固相に結合したまま残る標識の量をバックグラウンドレベルに対してモニターすることにより，相互作用を検出および／または定量する
を含む，請求項２０記載のポリペプチドまたは抗体の使用。
【請求項２２】
線虫の感染または存在に伴うヒトまたは動物疾病の診断または治療の方法における，請求項１６記載のポリペプチド，請求項１７記載の融合蛋白質，または請求項１８記載の抗体の使用。
【請求項２３】
線虫が，Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ，Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ，Ｌｏａ  ｌｏａおよびＯｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓからなる群より選択される線虫である，請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
疾病が，カラバル腫脹，リンパ性フィラリア症（象皮病）またはオンコセルコーマからなる群より選択される，請求項２２記載の使用。
【請求項２５】
線虫の感染または存在に伴う植物疾病の診断または治療の方法における，請求項１６に記載のポリペプチド，請求項１７記載の融合蛋白質，または請求項１８記載の抗体の使用。
【請求項２６】
線虫が，Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ，例えば，Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ，Ｈ．ａｖｅｎａｅ，Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ，Ｈ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ，Ｈ．ｇｏｔｔｉｎｇｉａｎａ，Ｈ．ｃａｊａｎｉ，Ｈ．ｚｅａｅ；Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ，例えば，Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ，Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ，Ｇ．ｔａｂａｃｕｍ；Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ，例えば，Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ，Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ，Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ，Ｍ．ｈａｐｌａ，Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ；Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ，Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉ，Ｄ．ａｎｇｕｓｔｕｓ；Ａｎｇｕｉｎａ，例えば，Ａ．ｔｒｉｔｉｃｉ，Ａ．ａｇｒｏｓｔｉｓ，Ａｆｒｉｎａ／Ａｎｇｕｉｎａ  ｗｅｖｅｌｌｉ；Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｐ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ，Ｐ．ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ，Ｐ．ｃｏｆｆｅａｅ，Ｐ．ｚｅａｅ，Ｐ．ｇｏｏｄｅｙｉ，Ｐ．ｔｈｏｒｎｅｉ，Ｐ．ｖｕｌｎｕｓ；Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｓｉｍｉｌｉｓ；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ，例えば，Ｈ．ｏｒｙｚａｅ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔａ，Ｈ．ｓｐｉｎｉｃａｕｄａ；Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ，例えば，Ｈ．ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｈ．ｓｅｉｎｈｏｒｓｔｉ，Ｈ．ｉｎｄｉｃｕｓ；Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ；Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｔ．ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ；Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｈ．ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ，Ｈ．ｄｉｈｙｓｔｅｒａ，Ｈ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｂｕｓｔｕｓ；Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ，例えば，Ｃ．ｘｅｎｏｐｌａｘ，Ｃ．ａｘｅｓｔｉｓ，Ｃ．ｓｐｈａｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ；Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ，例えば，Ｘ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，Ｘ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ，例えば，Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ；Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ，例えば，Ｐ．ｍｉｎｏｒ；Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｓ，例えば，Ａ．ｆｒａｇａｒｉａｅ，Ａ．ｂｅｓｓｅｙｉ，Ａ．ｒｉｔｚｅｍａｂｏｓｉ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓからなる群より選択される，請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
コンピュータモデル，構造モデルまたは薬剤の結合および効力を評価するための他のモデルを開発するための，請求項１に記載の核酸配列または請求項１６に記載のアミノ酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００１】
第１の観点においては，本発明は，ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、線虫の生存，成長または生殖に必要なものとして同定されたいくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝子およびこれに対応する遺伝子産物に関する。
【０００２】
第２の観点においては，本発明は，他の線虫種において見いだされる前記遺伝子および遺伝子産物の機能的オルトログに関し，これには，これらの生物学的に活性な誘導体がすべて含まれる。
【０００３】
第３の観点においては，本発明はまた，抗線虫剤または他の殺虫剤の開発における，および線虫の感染または存在に伴う疾病の診断および治療方法における、前記遺伝子および遺伝子産物の使用を含む。
【０００４】
第４の観点においては，本発明は，前記遺伝子産物に対する抗体、および抗線虫剤の開発における，および線虫の感染または存在に伴う疾病の診断または治療方法における，それらの使用に関する。
【０００５】
第５の観点においては，本発明は，前記遺伝子および遺伝子産物を，薬剤の結合および効力を評価するための構造モデルまたは他のモデルを開発するために用いること，ならびに本明細書に記載される新たな機能から誘導され，本明細書の開示から当業者に明らかとなるであろう他のすべての用途を含む。
【０００６】
本発明は，ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）による特定の遺伝子の発現のサイレンシングに基づいて，線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの正常な成長，生存，または生殖に必要な遺伝子を同定することに関する。本明細書に記載されるように，植物およびヒト等の動物に寄生する多くの種類の線虫が存在する。
【０００７】
したがって，本発明の課題は，線虫の感染または侵入を制御するために，線虫の正常な成長，生存または生殖に必要な新たな潜在的標的遺伝子／蛋白質を同定することである。これらの標的遺伝子／蛋白質は，遺伝子産物を阻害するか引き起こし，したがって，有害であるかまたは疾病を引き起こす線虫の制御に有用である可能性を有する薬剤のスクリーニングに用いることができる。特に有用なものは，線虫以外では配列保存性をほとんどまたは全く示さない遺伝子である。実際，そのような遺伝子の産物を特異的に阻害する薬剤は，寄生性線虫の宿主である他の種，例えば，ヒト，動物，または植物にほとんど影響を及ぼさないであろう。
【０００８】
本発明は，ＲＮＡｉを用いて、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの正常な成長，生存，または生殖に必要な遺伝子をスクリーニングすることによりこの問題を解決する。さらに，本発明は，線虫疾病，感染または侵入を制御するための新たなアプローチの発見に有用であると確認された多数の新たな候補標的遺伝子を提供することによりこの問題を解決する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
最近，後生動物の遺伝子機能を決定するために，ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）と称される新たな手法が開発された（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１（１９９８））。この手法は，目的とするコーディング配列の一部に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を成虫に導入することにより媒介される，遺伝子発現の標的化された配列特異的阻害からなる。この方法と，入手可能なゲノム配列と，線虫の生存および生殖能力を判定する単純なアッセイの使用とを組み合わせることにより，多数の遺伝子を先例のない速度および効率をもって機能的に分析することができる（Ｇｏｎｃｚｙ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｅｍｂｒｙｏ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４，９２７−９４６（１９９９）；Ｓｕｌｓｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｃｈｉｅｒｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｇ．＆Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１００，６４−１１９（１９８３））。
【００１０】
したがって，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの染色体ＩＩＩの予測されたオープンリーディングフレームの２，２３２（すなわち９６％）についてＲＮＡｉ手法に基づく大規模なスクリーニングが行われた。これは，Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ＩＩＩ"，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，３３１−３３６（２０００）に詳細に記載される。この大規模なスクリーニングを行うために，個々のオープンリーディングフレームに対応する二本鎖ＲＮＡを作成し，成虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ両性個体にマイクロインジェクションした。２日後，Ｆ１幼虫が存在するか否か，およびその発達段階を立体顕微鏡で調べた。配列番号１−５０により与えられるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子は，線虫の生存，成長および／または生殖におけるこれらの遺伝子の機能的役割を示唆する表現型を生じさせる。
【００１１】
表１は，同定された特定のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子、およびその配列番号１−５０の配列が由来する対応するＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬデータバンク受託番号の一覧を提供する（Ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０１２−２０１８（１９９８））。ここに挙げられるすべての遺伝子について，入手可能なすべてのオンライン配列データベースを用いる種間の配列類似性のＢＬＡＳＴ分析は，線虫以外では有意な相同性がないことを示す。
【００１２】
表２は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ標的遺伝子の発現を特異的にサイレンシングするために設計され用いられたｄｓＲＮＡを生成するために用いた特定のプライマーの一覧を示す。
【００１３】
第１の観点においては，本発明は，線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし，以下の核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む単離された核酸分子に関する：
ａ）  配列番号１，３，５，７，９，１１，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７または４９で示される核酸配列およびそれらのフラグメントおよびそれらの相補鎖，
ｂ）  配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８または５０に記載されるいずれかの配列と１００残基にわたり少なくとも２５％の配列同一性を示すか，および／または，ｂｌａｓｔ配列分析プログラムを用いるコンピュータ支援検索において１０−３０のｅ値で検出しうるポリペプチドをコードする核酸配列，
ｃ）  中ストリンジェンシーの条件下でａ）またはｂ）の核酸配列とハイブリダイズしうる核酸，
ｄ）  遺伝コードの結果としてａ），ｂ）またはｃ）に記載される配列のいずれかと縮重している核酸。
【００１４】
ａ）：
ａ）で言及される，線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはそのフラグメントは，配列番号１，３，５，７，９，１１，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７または４９、およびそのフラグメントにより与えられる。
【００１５】
これらの推定されたアミノ酸配列は，配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８および５０により与えられる。
【００１６】
ｂ）：
さらに，本発明はまた，配列番号１，３，５，７，９，１１，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７または４９に開示される前記標的遺伝子の少なくとも１つに構造的におよび機能的に相同である対応物（特にオルトログ）である単離された核酸分子を含む。
【００１７】
これらの相同の核酸分子は，配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８または５０により与えられるいずれかの配列と，１００残基にわたり少なくとも２５％，好ましくは１００残基にわたり少なくとも３０％，より好ましくは１００残基にわたり少なくとも３５％，最も好ましくは１００残基にわたり少なくとも４０％の配列同一性を示すポリペプチドをコードすることができる。
【００１８】
本発明はまた，ＢＬＡＳＴ配列分析プログラムの１つを用いるコンピュータ支援検索において，最大１０−３０のｅ値，好ましくは最大１０−３５のｅ値，より好ましくは最大１０−４０のｅ値で，検出可能な単離された核酸分子を含む。
【００１９】
ＢＬＡＳＴ配列分析プログラムは，公共的に入手可能でありすべての当業者に知られる，配列分析に用いられるプログラムである。ＢＬＡＳＴ配列分析プログラムによって配列アライメントを行うと，これらのプログラムのほとんどは，"ｅ値"と称される値を計算して，比較した配列の間の相同性の等級を特徴づける。一般に，小さいｅ値は高い配列同一性／相同性を特徴づけ，より大きいｅ値はより低い配列同一性／相同性を特徴づける。
【００２０】
“相同性“とは，２つの既知の配列の間の同一性の程度を意味する。上述したように，配列同一性を意味する相同性は，当該技術分野において知られるコンピュータプログラムにより適切に決定することができる。配列変種について要求される相同性の程度は，配列の意図される用途によって異なるであろう。配列の機能を改良するか，または他の方法論的利点をもたらすよう設計された、変異，挿入および欠失を行うことは，十分に当業者の能力の範囲内である。
【００２１】
ｃ）：
本発明はさらに，中／高ストリンジェンシーの条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズすることができる、単離された核酸配列またはそのフラグメントに関する。
【００２２】
第１の核酸分子と第２の核酸分子との間の配列同一性の程度はまた，第１の核酸分子がある条件下で第２の核酸分子とハイブリダイズする能力により特徴づけることができる。
【００２３】
所定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が特定のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブと“ハイブリダイズ“するか否かを決定するための適当な実験条件は，ハイブリダイゼーションについて調べるべきＤＮＡまたはＲＮＡを含むフィルターを５ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）緩衝液中で１０分間予備浸漬し，５ｘＳＳＣ，５ｘデンハルト溶液，０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を含む溶液中でフィルターをプレハイブリダイゼーションし，次に，１０ｎｇ／ｍｌの濃度のランダムプライミングした（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３），３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した（比活性＞１ｘ１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含む同じ溶液中で約４５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行うことを含む。次にフィルターを２ｘＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中で，少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー），少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー），好ましくは少なくとも６５℃（中／高ストリンジェンシー），より好ましくは少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー），または最も好ましくは少なくとも７５℃（非常に高いストリンジェンシー）で，３０分間２回洗浄する。選択された条件下でプローブがハイブリダイズする分子をＸ線フィルムを用いて検出する。
【００２４】
ｄ）：
本発明はさらに，遺伝コードの結果として（ａ），（ｂ）または（ｃ）のいずれかの配列と縮重している、単離された核酸分子またはそのフラグメントに関する。
【００２５】
自動化遺伝子合成を適用することにより，天然に生ずる遺伝子の配列変種を生成する機会が得られる。例えば，本明細書において同定される天然に生ずるポリヌクレオチド配列に存在するコドンを同義のコドンで置き換えることにより，同じ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを生成しうることが理解されるであろう。そのような配列は，天然に生ずる配列と“縮重“していると称される。さらに，対応するアミノ酸配列の合成変種をコードするポリヌクレオチドを製造することができ，これは，例えば，１またはそれ以上のアミノ酸の置換，欠失または付加をもたらすであろう。また，所望の特徴，例えば，反応性基または検出可能な基を有する前記ヌクレオチド配列を与える１またはそれ以上の合成ヌクレオチド誘導体（モルホリノ類を含む）を含む核酸分子を製造することができる。望ましい特性を有する合成の誘導体はまた，対応するポリペプチド中に含めることができる。上で同定された遺伝子および遺伝子産物の、天然に生ずる配列の生物学的活性の少なくとも一部を示すか、または例えば，相同の遺伝子または遺伝子産物を同定するためのプローブとして用いるのに適当な、すべての誘導体およびフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
本明細書において，線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要な種々の遺伝子のヌクレオチド配列が与えられるため，遺伝子合成および／または増幅の自動化手法を用いて，インビトロで前記核酸分子を単離することができることが理解されるであろう。あるコーディング配列は，その長さのため，自動化合成の適用には，約３００ヌクレオチドの長さ以下の遺伝子の領域を個別に合成し，次に正しい順番でこれをライゲーションさせて，最終的に組み立てる段階的遺伝子構築が必要であるかもしれない。個々に合成された遺伝子領域は，組み立てる前に，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて増幅することができる。また，ＰＣＲ増幅の手法を用いて，最終遺伝子／核酸分子のすべてまたは一部を直接生成することができる。この場合，プライマーは，最終産物を１本としてまたは一緒にライゲーションすることができるいくつかの数本の部分として生成するＰＣＲ増幅をプライミングすることができるよう合成される。この目的のためには，ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかをＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いることができる。ｃＤＮＡテンプレートは，市販のまたは自分で構築したｃＤＮＡライブラリに由来するものであってもよい。
【００２７】
第２の観点においては，本発明は，上述の（ａ）−（ｄ）で特徴づけられる核酸配列を含む核酸プローブに関し，これは，検出可能な標識を含む少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであることができる。
【００２８】
これらの核酸プローブは，標準的な方法にしたがってＤＮＡ合成機を用いることにより，または，より長い配列については好ましくは選択されたテンプレート配列および選択されたプライマーを用いるＰＣＲ技術を用いることにより，合成することができる。ヌクレオチド配列をプローブとして用いる場合，当業者に知られる任意の適当な標識，例えば放射性標識および非放射性標識で特定のプローブを標識することができる。典型的な放射性標識には，３２Ｐ，１２５Ｉ，３５Ｓ等が含まれる。放射性同位体で標識したプローブは，ＤＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼを用いる慣用のニックトランスレーション反応によりＤＮＡテンプレートから構築することができる。非放射性標識には，例えば，ビオチンまたはチロキシン等のリガンド，または種々の発光または蛍光化合物が含まれる。プローブはまた，異なる種類の標識で両端を標識してもよく，例えば一方の端を同位体標識し，他方の端をビオチン標識することができる。次に，標識したプローブおよびサンプルをハイブリダイゼーション緩衝溶液中で混合し，アニーリングが生ずるまで適当な温度で保持することができる。
【００２９】
本発明はまた，上述の単離された核酸分子またはそのフラグメントまたは上述のプローブのいずれかを適当な容器中に含むアッセイキットを含む。
【００３０】
デュープレックスの形成および安定性は，ハイブリッドの２つの鎖の間の実質的な相補性によって異なり，ある程度のミスマッチが許容される。したがって，本発明の核酸分子およびプローブは，前記配列変種が，目的とする標的ヌクレオチド配列と安定なハイブリッドを形成することができるように，元の配列と実質的な配列相同性を有する限り，上述の配列の変異（単一および複数の），欠失，挿入およびこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３１】
線虫の生存および／または成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはその一部をコードする上述の核酸配列およびプローブは，広範な範囲の有用な用途を有するであろう。例えば，これらは，同じまたは異なる種の相同な遺伝子（特にオルトログ）を同定するために用いることができ，線虫の成長，生存または生殖を阻害，刺激または引き起こす相互作用薬剤スクリーニングアッセイにおいて用いることができ，コンピュータモデル，構造モデルまたは薬剤の結合および効力を評価するための他のモデルを開発するために用いることができ，そして，線虫関連疾病，特にカラバル腫脹，リンパ性フィラリア症（象皮病）またはオンコセルコーマの診断または治療の方法において用いることができる。
【００３２】
ヒトまたは動物疾病に関連する線虫の例としては，限定されないが，Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ，Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙａ，Ｌｏａ  ｌｏａおよびＯｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓが挙げられる。
【００３３】
植物疾病に関連する線虫の例としては，限定されないが，Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ，例えば、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ，Ｈ．ａｖｅｎａｅ，Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ，Ｈ．ｔｒｉｆｏｌｉｉ，Ｈ．ｇｏｔｔｉｎｇｉａｎａ，Ｈ．ｃａｊａｎｉ，Ｈ．ｚｅａｅ；Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ，例えば，Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ，Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ，Ｇ．ｔａｂａｃｕｍ；Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ，例えば，Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ，Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ，Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ，Ｍ．ｈａｐｌａ，Ｍ．ｃｈｉｔｗｏｏｄｉ；Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｄ．ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ，Ｄ．ｄｉｐｓａｃｉ，Ｄ．ａｎｇｕｓｔｕｓ；Ａｎｇｕｉｎａ，例えば，Ａ．ｔｒｉｔｉｃｉ，Ａ．ａｇｒｏｓｔｉｓ，Ａｆｒｉｎａ／Ａｎｇｕｉｎａ  ｗｅｖｅｌｌｉ；Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｐ．ｐｅｎｅｔｒａｎｓ，Ｐ．ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ，Ｐ．ｃｏｆｆｅａｅ，Ｐ．ｚｅａｅ，Ｐ．ｇｏｏｄｅｙｉ，Ｐ．ｔｈｏｒｎｅｉ，Ｐ．ｖｕｌｎｕｓ；Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｓｉｍｉｌｉｓ；Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａ，例えば，Ｈ．ｏｒｙｚａｅ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔａ，Ｈ．ｓｐｉｎｉｃａｕｄａ；Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ，例えば，Ｈ．ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｈ．ｓｅｉｎｈｏｒｓｔｉ，Ｈ．ｉｎｄｉｃｕｓ；Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ；Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ，例えば，Ｔ．ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ；Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，例えば，Ｈ．ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ，Ｈ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ，Ｈ．ｄｉｈｙｓｔｅｒａ，Ｈ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｂｕｓｔｕｓ；Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ，例えば，Ｃ．ｘｅｎｏｐｌａｘ，Ｃ．ａｘｅｓｔｉｓ，Ｃ．ｓｐｈａｒｏｃｅｐｈａｌｕｍ；Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ，例えば，Ｘ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，Ｘ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ；Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ，例えば，Ｌ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ；Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ，例えば，Ｐ．ｍｉｎｏｒ；Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｓ，例えば，Ａ．ｆｒａｇａｒｉａｅ，Ａ．ｂｅｓｓｅｙｉ，Ａ．ｒｉｔｚｅｍａｂｏｓｉ，Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。
【００３４】
第３の観点においては，本発明は，上述の核酸分子およびプローブを診断目的に使用することに関する。上述の核酸分子およびプローブのこの診断用途には，限定されないが，生物学的プローブ（好ましくは，限定されないが，細胞抽出物，体液など）における前記標的遺伝子の発現の定量的検出，特に上述の核酸配列（特に，ｃＤＮＡ，ＲＮＡ）を含む内因性核酸分子への定量的ハイブリダイゼーションによる検出が含まれる。線虫感染または先に定義した線虫の存在に伴う疾病はこのようにして診断することができる。
【００３５】
第４の観点においては，本発明は，上述の核酸分子，プローブまたはその対応するポリペプチドを治療目的で使用することに関する。
【００３６】
上述の核酸分子，プローブまたはその対応するポリペプチドのこの治療用途には，限定されないが，前記核酸分子およびその対応するポリペプチドを，前記標的遺伝子の発現の直接的または間接的な阻害，および／または前記標的遺伝子の機能の阻害のために使用することが含まれる。
【００３７】
特に，遺伝子治療ベクター，例えば，上述の配列を有するウイルス，または裸のまたは封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば，アンチセンスヌクレオチド配列）は，疾病または線虫の存在と関連するかまたは線虫感染により引き起こされる疾病に罹患した患者の体内に導入するのに適しているであろう。
【００３８】
上述の核酸分子またはプローブの特に好ましい治療用途は，特にヒトまたはヒト細胞における，ＲＮＡｉ手法の治療用途におけるこれらの使用に関連する。
【００３９】
二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，デュープレックス中のいずれかのＲＮＡ鎖に高度に相同な遺伝子の発現のサイレンシングを行う。最近の発見は，元々Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて発見されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されるこの効果が，細胞，特にヒト細胞においても観察されることを明らかにした。したがって，本発明はさらに，他の種の細胞，特にヒト細胞における線虫の生存および／または生殖に関与する遺伝子の発現の治療的サイレンシングのために，上述のヌクレオチド配列（ａ）−ｄ）に示される）を有する，好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの，より好ましくは少なくとも２０ｎｔの長さの二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いることを含む。この治療用途は，特に，線虫の存在または感染に伴う疾病，特にカラバル腫脹，リンパ性フィラリア症（象皮病）またはオンコセルコーマに罹患した個体の細胞に適用される。
【００４０】
第５の観点においては，本発明はさらに，（ａ）−（ｄ）に定義される核酸分子またはそのフラグメントが組み込まれている核酸構築物または組換えベクターを含む。
【００４１】
本明細書においては，“核酸構築物“とは，核酸配列が天然に生じないであろう様式で組み合わせられ並置されている任意の核酸分子であると定義され，一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ベクターは，組換えＤＮＡ方法に都合よく供することができる任意のベクターでありうる。ベクターの選択は，通常は，ベクターを導入すべき宿主細胞によって異なるであろう。ベクターは染色体外物質，すなわち，その複製が染色体の複製と独立しているもの，例えばプラスミドであってもよい。あるいは，ベクターは，宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞ゲノムにインテグレートされ，インテグレートされた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００４２】
ベクターは，好ましくは，目的とする蛋白質またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列が異種または同種の制御配列と動作可能なように連結されている発現ベクターである。本明細書において，“制御配列“との用語は，コーディング核酸配列の発現に必要であるか有利であるすべての成分が含まれるよう定義される。そのような制御配列には，限定されないが，プロモーター，リボソーム結合部位，翻訳開始および終止シグナル，および任意にリプレッサー遺伝子または種々のアクチベータ遺伝子が含まれる。制御配列は，これが目的とするコーディング核酸配列と天然に連結している場合には“同種“と称され，そうではない場合には“異種“と称される。“動作可能なように連結されている“との用語は，配列がその意図される目的，すなわち，所望の蛋白質の発現に協調して機能するように配置されていることを示す。
【００４３】
プロモーターは，選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ，宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子に由来することができる。
【００４４】
細菌宿主における転写を指示する適当なプロモーターの例としては，例えば，ファージラムダＰＲまたはＰＬプロモーター，Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ，ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ遺伝子またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルファアミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００４５】
哺乳動物細胞における転写を指示する適当なプロモーターの例としては，例えば，ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１（１９８１），８５４−８６４），ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２（１９８３），８０９−８１４）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターが挙げられる。
【００４６】
昆虫細胞において用いるのに適当なプロモーターの例としては，例えば，ポリヘドリンプロモーター（Ｖａｓｕｖｅｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔ  ３１１，（１９９２），７−１１），Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多面体塩基性蛋白質プロモーター（ＥＰ３９７４８５），またはバキュロウイルス極初期遺伝子１プロモーター（ＵＳ５，１５５，０３７，ＵＳ５，１６２，２２２）が挙げられる。
【００４７】
酵母細胞において用いるのに適当なプロモーターの例としては，例えば，酵母解糖系遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０），１２０３−１２０８０；Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１（１９８２），４１９−４３４）からのプロモーターおよびＡＤＨ２−４ｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４（１９８３），６５２−６５４）が挙げられる。
【００４８】
コーディング配列は，必要ならば，適当なターミネーター，例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ），またはポリアデニル化配列に動作可能なように連結されていてもよい。また，発現された蛋白質を分泌させるために，コーディング配列の前にシグナル配列を有していてもよい。
【００４９】
さらに，ベクターは，問題とする宿主細胞中でベクターが複製することを可能とするＤＮＡ配列を含むことができる。そのような配列の例は，プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０２の複製起源である。そのような配列の別の例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合），ＳＶ４０複製起源である。宿主細胞が酵母細胞である場合，ベクターが複製することを可能とする適当な配列は，酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製起源である。
【００５０】
ベクターは選択マーカーを含んでいてもよく，これは，例えば，宿主細胞における欠陥を補償する産物をコードする遺伝子（例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子），または薬剤（例えば，アンピリシン，カナマイシン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ネオマイシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子である。
【００５１】
原核生物または真核生物細胞における発現に適した多数のベクターが当該技術分野において知られており，そのうちのいくつかは市販されている。
【００５２】
適当ないくつかの市販の哺乳動物発現ベクターとしては，限定されないが，ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３），ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）が挙げられる。
【００５３】
第６の観点においては，本発明は，核酸構築物または組換えベクターがその中に導入される宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は，原核生物であっても真核生物であってもよく，例えば，限定されないが，細菌，真菌細胞，例えば酵母および糸状真菌；哺乳動物細胞，例えば，限定されないが，ヒト，ウシ，ブタ，サルおよび齧歯類起源の細胞株；および昆虫細胞，例えば，限定されないが，ショウジョウバエに由来する細胞株が含まれる。
【００５４】
適当な宿主細胞の選択は，当該技術分野において認識されている多数の因子に依存するであろう。これらには，例えば，選択されたベクターとの適合性，（副）生成物の毒性，所望の蛋白質またはポリペプチドの回収の容易性，発現特性，生物安全性およびコストが含まれる。
【００５５】
適当な原核生物細胞の例は，グラム陽性細菌，例えば，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ等，またはグラム陰性細菌，例えばＥ．ｃｏｌｉである。
【００５６】
酵母宿主細胞は，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種から選択することができ，例えば，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。有用な繊維状真菌は，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種から選択することができ，例えば，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【００５７】
適当な市販されている哺乳動物種由来の細胞株には，限定されないが，ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１），ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１），３Ｔ３（ＡＴＣＣＬ９２），ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８），ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＬ２），およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）が含まれる。
【００５８】
発現ベクターは，多数の手法のいずれにしたがって宿主細胞内に導入してもよく，例えば，限定されないが，トランスフォーメーション，トランスフェクション，プロトプラスト融合，およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【００５９】
次に，組換え宿主細胞を，適当な栄養培地中で，目的とする蛋白質の発現を許容する条件下で培養する。細胞を培養するのに用いられる培地は，宿主細胞の成長に適当な慣用の培地のいずれであってもよく，例えば，適当な補充物を含む最小培地または複合培地を用いることができる。適当な培地は，商業的供給元から入手可能であり，または公表されているレシピ（例えば，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）にしたがって調製することができる。
【００６０】
異種ポリペプチドを発現する宿主細胞クローンの同定は，いくつかの手段，例えば，限定されないが，特定の抗体との免疫学的反応性により行うことができる。
【００６１】
第７の観点においては，本発明は，宿主細胞において，線虫，特に，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒト，家畜，または植物に寄生する線虫の、生存，成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはそのフラグメントを製造する方法に関する。該方法は以下の工程を含む：
（ｉ）  上述の（ａ）−（ｄ）で定義された動作可能なように連結された核酸分子を有する発現ベクターを適当な宿主細胞中に移し，
（ｉｉ）  前記ポリペプチドまたはそのフラグメントの発現を許容しうる条件下で工程（ｉ）の宿主細胞を培養し，そして
（ｉｉｉ）  任意に，発現させたポリペプチドを培地中に分泌させる。
【００６２】
第８の観点においては，本発明は，以下のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む，線虫の生存，成長および／または生殖に必要なポリペプチドまたはそのフラグメントを含む：
ａ）  配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８または５０に記載されるアミノ酸配列およびそのフラグメント；
ｂ）  （ａ）の配列と，１００残基にわたり少なくとも２５％，好ましくは１００残基にわたり少なくとも３０％，より好ましくは１００残基にわたり少なくとも３５％，最も好ましくは１００残基にわたり少なくとも４０％の配列同一性を示すか，および／または，ＢＬＡＳＴ配列分析プログラムを用いるコンピュータ支援検索において，最大１０−３０のｅ値，好ましくは最大１０−３５のｅ値，および最も好ましくは最大１０−４０のｅ値で検出しうるアミノ酸配列；
ｃ）  （ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズしうる核酸分子によりコードされるか，または（ａ）または（ｂ）において定義される配列のいずれかに対して遺伝コードの結果として縮重している核酸分子によりコードされるアミノ酸配列。
【００６３】
異種ポリペプチドは，ポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ−末端またはＣ−末端に別のポリペプチドが融合している融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは，別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を本発明の核酸配列（またはその一部）に融合させることにより製造する。融合ポリペプチドを製造する手法は当該技術分野において知られており，コーディング配列を、インフレームとなるように，かつ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下であるように，ライゲーションすることを含む。
【００６４】
目的とするポリペプチドの発現はまた，インビトロで製造された合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡは，種々の無細胞系，例えば，限定されないが，小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物において効率的に翻訳することができ，ならびに，細胞に基づく系，例えば，限定されないが，カエル卵母細胞，好ましくはＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞へのマイクロインジェクションにおいて効率的に翻訳することができる。
【００６５】
第９の観点においては，本発明は上述のポリペプチドおよびその免疫原性フラグメントに対する抗体を含む。
【００６６】
本明細書において用いる場合，“抗体“との用語は，ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方，ならびに抗原またはハプテンに結合することができるそのフラグメント，例えば，Ｆｖ，ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを含む。本発明の抗体は，広範な有用な用途を有するであろう。これには，例えば，対応する免疫原性（ポリ）ペプチドのアフィニティー精製における使用，抗イディオタイプ抗体の製造における使用，ならびに種々のアッセイ，例えば，診断または薬剤スクリーニングアッセイにおける，または上で例示したような線虫に伴う疾病の治療の方法における、特異的結合剤としての使用が含まれる。特に，前記抗体またはその適当なフラグメントは，特にヒト化型で，線虫関連疾病の治療方法において治療剤として用いることができる。また，上述のポリペプチドの最も特徴的な部分に対する抗体を作成し，次にこれを用いて，他の起源からの構造的におよび／または機能的に関連するポリペプチド，ならびに上述のポリペプチドの変異体および誘導体を同定することができる。
【００６７】
本発明のポリペプチドに対する抗体を作成するためには，上述したように適当な宿主細胞において産生されるかまたは標準的なペプチド合成手法により製造される、ポリペプチド全体またはその免疫原性フラグメントを免疫原として用いることができる。
【００６８】
ポリクローナル抗体は，適当な濃度の目的とするポリペプチドまたはペプチドフラグメントで，免疫アジュバントとともにまたはそれなしで，動物，例えば，マウス，ラット，モルモット，ウサギ，ヤギ，ヒツジ，ウマなどを免疫することにより生じさせる。
【００６９】
許容しうる免疫アジュバントとしては，限定されないが，フロインド完全アジュバント，フロインド不完全アジュバント，アラム沈澱，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍおよびｔＲＮＡを含む油中水エマルジョンが挙げられる。
【００７０】
典型的な免疫プロトコルにおいては，最初の免疫において，各動物の多数の部位に皮下（ＳＣ），腹腔内（ＩＰ），皮膚内またはこれらの任意の組み合わせで約０．１μｇから約１０００μｇの免疫原を投与する。最初の注射の後，動物にブースター注射を投与してもよく投与しなくてもよい。ブースター投与を受ける動物には，一般に，最大のタイターが得られるまで、フロインド不完全アジュバント中の等量の免疫原を約３−４週間の間隔で同じ経路で投与する。各ブースター免疫の約７−１４日後，または１回の免疫の約１週間後に，動物を採血し，血清を回収し，アリコートを約−２０℃で保存する。
【００７１】
目的とするポリペプチドまたはペプチドフラグメントと反応性を有するモノクローナル抗体は，基本的にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの手法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））を用いて作成する。最初に，動物，例えば，Ｂａｌｂ／ｃマウスを，上述したものと類似するプロトコルを用いて免疫する。抗体陽性動物からのリンパ球，好ましくは脾臓細胞は，免疫した動物から、当該技術分野において知られる標準的な方法により脾臓を取り出すことにより得る。ハイブリドーマ細胞は，脾臓細胞を，安定なハイブリドーマの形成を可能とする条件下で，適当な融合パートナー，好ましくはミエローマ細胞と混合することにより製造する。融合パートナーとしては，限定されないが，マウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が挙げられる。融合したハイブリドーマ細胞は，選択培地における成長により選択し，抗体産生についてスクリーニングする。ポジティブのハイブリドーマを成長させ，例えば，腹水の製造のために，プリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスに注入する。細胞を移した約１−２週間後に腹水を回収し，当該技術分野において知られる手法によりモノクローナル抗体を精製する。あるいは，ハイブリドーマを適当な培地，例えばウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養し，当該技術分野において知られる手法によりｍＡｂを回収することにより，モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をインビトロで製造することが可能である。
【００７２】
回収した抗体は，次に，この目的のために確立されているリンカー手法を用いて，検出可能な標識，例えば，放射性標識，酵素標識，発光標識，蛍光標識等に共有結合的に結合させることができる。
【００７３】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体タイターは，種々の血清学的または免疫学的アッセイにより決定する。これらには，限定されないが，沈澱，受動的凝集，酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）手法およびラジオイムノアッセイ手法が含まれる。同様のアッセイを用いて，体液または組織および細胞抽出物における上述のポリペプチドまたはそのフラグメントの存在を検出することができる。
【００７４】
本明細書に記載される種々のアッセイを行うためのアッセイキットは，上述の遺伝子または遺伝子産物（標識されていてもされていなくてもよい）の適当な単離された核酸またはアミノ酸配列，および／またはこれに対する特異的リガンド（例えば抗体），および，適当でありかつ当該技術分野において知られる補助試薬を含むことができる。アッセイは，液相アッセイであってもよく，固相アッセイ（すなわち，支持体上に固定化された１またはそれ以上の試薬を用いる）であってもよい。
【００７５】
特に記載しない限り，核酸およびポリペプチド／蛋白質の操作は，分子生物学および免疫学の標準的な方法を用いて行うことができる（例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ“．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５を参照）。
【００７６】
本発明はさらに，上述のポリペプチドまたはそのフラグメント，または上述のポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントに対する抗体のいずれかを含むアッセイキットを含む。
【００７７】
組換えポリペプチドおよびそのフラグメント，ならびにこれらのポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントに対する抗体は広範な有用な用途を有するであろう。例えば，線虫の成長，生存または生殖を阻害するか刺激するかまたは引き起こす相互作用薬剤のスクリーニングアッセイにおけるこれらの使用，コンピュータモデル，構造モデルまたは薬剤の結合および効力を評価するための他のモデルを開発するためのこれらの使用，および線虫関連疾病，特にカラバル腫脹，リンパ性フィラリア症（象皮病）またはオンコセルコーマの診断または治療の方法におけるこれらの使用が挙げられる。
【００７８】
したがって，第１０の観点においては，本発明は，上述のポリペプチドまたはそのフラグメント，または前記ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントに対する抗体を，線虫の生存，成長および／または生殖を阻害，刺激または引き起こす相互作用薬剤についてのスクリーニングアッセイにおいて用いることを明示的に含む。
【００７９】
相互作用薬剤についてのそのようなスクリーニングアッセイは，限定されないが，特に，以下の工程を含む。
１．  前記ポリペプチドまたはその適当な誘導体を組換え発現させ，
２．  組換え的に発現させたポリペプチドまたはその誘導体を，特にアフィニティークロマトグラフィーにより単離し，任意に精製し，
３．  前記ポリペプチドまたはその誘導体との相互作用について試験する化学化合物を任意に標識し，および／または，組換え的に発現させたポリペプチドを標識し，
４．  組換え的に発現させたポリペプチドまたはその誘導体を固相に固定化し，
５．  潜在的相互作用パートナーまたはその変種を固定化したポリペプチドまたはその誘導体に結合させ，
６．  任意に１回またはそれ以上洗浄し，
７．  特に，固相に結合したまま残る標識の量をバックグラウンドレベルに対してモニターすることにより，相互作用を検出および／または定量する。
【００８０】
工程１は，上述のポリペプチドまたはその誘導体を、適当な発現系から，特に無細胞翻訳，細菌発現，または昆虫細胞におけるバキュロウイルス系発現から、組換え発現させることを含む。
【００８１】
工程２は，前記組換え的に発現させたポリペプチドを，当業者に知られる適当な生化学的手法を用いて，単離し，および次に任意に精製することを含む。
【００８２】
あるいは，これらのスクリーニングアッセイは，上述のポリペプチドの誘導体の発現を含んでいてもよい。これは，前記ポリペプチドを，融合蛋白質としてまたは修飾蛋白質として，特にＧＳＴ−融合蛋白質としてまたはいわゆる"タグ"配列を有する蛋白質として発現させることを含む。これらの"タグ"配列は短いヌクレオチド配列からなり，これを前記標的遺伝子のコーディング領域のＮ末端またはＣ末端のいずれかに’インフレーム’でライゲーションさせる。組換え的に発現させた遺伝子を標識するために用いられる最も一般的な"タグ"の１つは，ヒスチジンのみから構成されるホモポリペプチドをコードする"ポリ−ヒスチジン−タグ"である。この文脈においては，"ポリペプチド"との用語は，配列番号２，４，６，８，１０，１２，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８または５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのみならず，天然に生ずるこれらのホモログ，好ましくはオルトログ，およびこれらのポリペプチドの誘導体，特に融合蛋白質または"タグ"配列を含むポリペプチドも含む。
【００８３】
これらのポリペプチド，特に適当なタグ配列（例えばＨｉｓタグ）またはＧＳＴにより標識されたポリペプチドは，標準的なアフィニティークロマトグラフィーのプロトコルにより，特に抗−Ｈｉｓ−タグ−抗体または抗ＧＳＴ−抗体に結合させたクロマトグラフィー樹脂（いずれも市販されている）を用いることにより，精製することができる。抗−タグ−または抗−ＧＳＴ−抗体または他の”標識特異的”抗体を用いる代わりに，精製は前記ポリペプチドに対する抗体を使用するものであってもよい。上述した組換え的に発現させた標的遺伝子の精製工程（工程２）を含むスクリーニングアッセイは，本発明のこの観点の好ましい態様である。
【００８４】
第３の任意の工程においては，相互作用について試験する化合物を，放射性同位体の取り込みにより，または発光または蛍光化合物との反応により標識する。あるいは，または追加的に，組換え的に発現させたポリペプチドを標識してもよい。
【００８５】
第４の工程においては，組換え的に発現させたポリペプチドを固相，特に（限定されないが）クロマトグラフィー樹脂に固定化する。このことにより、固相への結合は，好ましくは共有結合の生成により確立される。
【００８６】
第５の工程においては，前記組換えポリペプチドまたはその多種複合体（特に薬剤ライブラリ）の潜在的相互作用パートナーであるかもしれない候補化学化合物を，固定化ポリペプチドと接触させる。
【００８７】
第６の任意の工程においては，１回または数回の洗浄工程を行うことができる。その結果，固定化ポリペプチドと強く相互作用する化合物のみが固体（固定化）相に結合したまま残る。
【００８８】
工程７においては，特に，固相と会合したまま残っている標識の量をバックグラウンドレベルと比較してモニターすることにより，ポリペプチドと特定の化合物との間の相互作用を検出する。
【００８９】
配列決定プロトコルの説明
配列番号１は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｄ２０４５．１（３０８１ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｄ２０４５．１（１０２６ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３９Ｂ５．２（１２３０ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３９Ｂ５．２（４０９ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号５は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２９Ｅ４．２（２７５４ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号６は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２９Ｅ４．２（９１８ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号７は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ０４Ｊ２１．３（２１６９ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号８は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｈ０４Ｊ２１．３（７２２ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号９は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３８Ｃ１０．４（１５７８ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３８Ｃ１０．４（５２５ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２２Ｂ７．１３（１５７８ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２２Ｂ７．１３（５２５ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２３９Ｇ１０．９（１７９ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｃ４．３（３４３８ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｃ４．３（１１４５ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ１２Ｈ４．５（２９４ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１７は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ１２Ｈ４．５（９７ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ１３Ｆ６．１（４５０ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ１３Ｆ６．１（１４９ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号２０，２２，２４は，３つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｗ０７Ｂ３．２アイソフォーム（それぞれ１６３８ｂｐ，１７０７ｂｐおよび１６２０ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１，２３，２５は，３つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｗ０７Ｂ３．２アイソフォーム（それぞれ５４５ａａ，５６８ａａおよび５３９ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ６６Ａ７Ａ．８（１５２４ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号２７は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ４９Ｅ１０．２２（７０２ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号２８は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ４９Ｅ１０．２２（２３３ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ３９Ｅ４Ｂ．１１（７３８ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号３０は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ３９Ｅ４Ｂ．１１（２４５ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ０２Ｆ２．７（１８１２ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号３２は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ０２Ｆ２．７（６０３ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ４５Ｇ９．５（９５１ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号３４は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ４５Ｇ９．５（３１６ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２３Ｈ１１．５（２９１ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号３６は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２３Ｈ１１．５（９６ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３２Ａ３．２（１０４１ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号３８は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ３２Ａ３．２（３４６ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ０４Ｇ７．１（１６７７ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４０は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ０４Ｇ７．１（５５８ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ１１Ｈ３．２（６８７ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４２は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｋ１１Ｈ３．２（２２８ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ１２Ｂ２．５（２３３４ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４４は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｒ１２Ｂ２．５（７７７ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ３９Ａ１Ａ．１３（１１６４ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４６は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｙ３９Ａ１Ａ．１３（３８７ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ１２３６．３（３００３ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号４８は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ１２３６．３（１０００ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２３Ｆ１２．２（１８６ｂｐ）のスプライシングされたＤＮＡ配列を示す。
配列番号５０は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ２３Ｆ１２．２（６１ａａ）の推定されたアミノ酸配列を示す。
【００９０】
以下の実施例は本発明を例証するが，本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９１】
実施例１：  ＲＮＡｉ実験
まず，オリゴヌクレオチドプライマーの対配列を選択し，標準的なＰＣＲ手法を用いて，目的とする遺伝子のコーディング領域の部分を増幅した。プライマーの対は，少なくとも５００塩基のコーディング配列，または５００塩基より短い遺伝子については最大のコーディング塩基を含むＰＣＲ産物が得られるよう選択した。次にＰＣＲ産物を両方のＤＮＡ鎖からのインビトロＲＮＡ転写反応においてテンプレートとして用いることができるようにするために，フォワードプライマーの５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーター配列"ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ"を，リバースプライマーの５’末端にＴ３ポリメラーゼプロモーター配列"ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ"を付加した。オリゴヌクレオチドプライマーの合成は，業者により行われた（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＵＫまたはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００９２】
ＰＣＲ反応は，５０μｌの容量中で，Ｔａｑポリメラーゼにより，０．８μＭのプライマーおよび約０．１μｇの野生型（Ｎ２株）ゲノムＤＮＡテンプレートを用いて行った。ＰＣＲ産物をＥｔＯＨ沈澱させ，７０％ＥｔＯＨで洗浄し，７．０μｌのＴＥに再懸濁した。１．０μｌのＰＣＲ反応物を，Ｔ３およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる５μｌの転写反応用の２つの新たなチューブのそれぞれにピペットで加えた。Ｔ３およびＴ７転写反応は製造元の指針にしたがって別々に行い（Ａｍｂｉｏｎ，Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット），それぞれ無ＲＮａｓｅ水で５０μｌに希釈し，次に合わせた。混合したＲＮＡは，ＲＮｅａｓｙキットを用いて製造元の指針（Ｑｉａｇｅｎ）にしたがって精製し，合計１３０μｌの無ＲＮａｓｅＨ２Ｏ中に溶出した。この５０μｌを１０μｌの６Ｘインジェクション緩衝液（４０ｍＭＫＰＯ４ｐＨ７．５，６ｍＭクエン酸カリウム，ｐＨ７．５，４％ＰＥＧ６０００）と混合した。ＲＮＡは，６８ｏＣで１０分間加熱し，３７ｏＣで３０分間保持することによりアニーリングさせた。ｄｓＲＮＡの最終濃度を測定したところ，０．１−０．３μｇ／μｌの範囲内であった。質の管理の目的で，ＰＣＲ反応の産物，Ｔ３およびＴ７転写反応の産物，ならびにｄｓＲＮＡ種を１％アガロースゲルに流して調べた。二本鎖形成の成功は，非変性ゲルに流したときの一本鎖ＲＮＡに対するゲル移動度のシフトを評点することにより評価した。
【００９３】
二本鎖ＲＮＡを野生型（Ｎ２株）若年成虫両性個体の両方の性腺の左右両側のシンシチウム部分に注入し，動物を２０℃で２４時間インキュベートした。
【００９４】
次に，ｄｓＲＮＡの注入の２４時間後に３匹の注入動物を新たなプレートに移し，２０℃で維持した。２日後，立体顕微鏡（合計倍率２０−４０ｘ）で，Ｆ１幼虫（Ｌ２−Ｌ４）の存在ならびにその発生段階を調べた。さらに２日後，Ｆ１成虫の存在について，ならびにその全体的な身体形態およびＦ２子孫の存在についてプレートを調べた。
【実施例２】
【００９５】
実施例２：  他の種において機能的オルトログを同定するためのプロトコル
本発明は，モデル生物であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓの生存および／または成長および／または生殖において必須の機能を有するものとして同定された遺伝子を記述する。モデル生物における研究を行うことの基礎は，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝子について新たに発見された機能が他の線虫種に変換されるであろうことである。多くの基本的な細胞機能は，進化の間に高度に保存されており，したがって，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子機能を発見し，その情報を用いて他の線虫種におけるオルトログ遺伝子についての機能を特性決定するかまたは割り当てるアプローチは十分に正当なものである。進化の間の遺伝子の保存には２つの主題がある。遺伝子配列が保存されていてもよい。これは，異なる種において遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列が非常に類似していることを意味し，次にこのことは，異なる種において遺伝子の機能が同じであることを示唆する。当業者には知られるように，配列同一性または相同性が特定のレベルより高いことは，異なる種の２つの遺伝子が同じ遺伝子産物および遺伝子機能をコードすることを明らかにする。相同な遺伝子は，典型的には，適当なソフトウエアを用いるｂｌａｓｔ分析を行うことにより，または他の方法により同定される。ｂｌａｓｔ検索に関しては，１０−３のｅ値は有意な相同配列を抜き出すであろう。さらなる系統発生分析を行って，抜き出された配列のいずれがオルトログであるかを同定する。
【００９６】
したがって，以下のようなオルトログの同定の例を示すことができる。ｂｌａｓｔ配列分析プログラムおよび１０−３のｅ値を用いてｂｌａｓｔ検索を行う。別のパラメータは，配列同一性のパーセンテージでありうる。１００残基にわたる３０％の配列同一性が相同の遺伝子を規定する。ｂｌａｓｔ検索が完了した後，適当なソフトウエア（例えば，ＣＬＵＳＴＡＬＷ）を用いて多重配列アライメントを実施し，隣接物を合わせて系統発生樹を作成する。当業者は，系統発生樹からオルトログを同定することができる。本質的に，樹の上で１回の種分化事象により隔てられているかまたは樹の上で最も密接に関連している配列は，おそらくオルトログであろう。
【００９７】
保存の第２の主題は，より大きな配列の相違でも遺伝子機能が保存されることができることである。本発明においては，この保存の主題は明らかにされていない。しかし，他の遺伝子が本発明のものと同じ遺伝子産物であるとして同定される遺伝子産物を生ずる機能を有することが発見されれば、本発明はそのような遺伝子にも適用される。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
【表２】
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【０１００】
【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004525612.tif 000042
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