(57)【要約】本発明は、穀物、例えば、トウモロコシおよびダイズの加工の新規方法であって、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを利用し、デンプンおよびタンパク質の抽出性および回収を高める方法を提供する。本発明はさらに、熱安定性チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを発現する新規トランスジェニック植物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉砕加工での穀物のデンプンおよびタンパク質成分を分離する方法であって、
（ａ）補足チオレドキシンレダクターゼの存在下で、穀物を上昇温度で浸漬するステップ、および
（ｂ）該チオレドキシンレダクターゼが真核細胞チオレドキシンレダクターゼである、該穀物のデンプンおよびタンパク質成分を分離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
該穀物が、チオレドキシンレダクターゼを発現するトランスジェニック植物由来の穀物を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該植物がトウモロコシである、請求項２の方法。
【請求項４】
核またはプラスチドゲノムに安定的に組みこまれた真核細胞チオレドキシンレダクターゼをコードするヘテロロガスＤＮＡを含む、トランスジェニック植物。
【請求項５】
該植物がトウモロコシまたはダイズである請求項４の植物。
【請求項６】
該チオレドキシンレダクターゼが、配列番号２５または配列番号２７を含む、請求項４の植物。
【請求項７】
植物で機能するプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された真核細胞チオレドキシンレダクターゼのコード領域を含む、キメラ発現カセット。
【請求項８】
該チオレドキシンレダクターゼが、配列番号２５または配列番号２７を含む、請求項７のキメラ発現カセット。
【請求項９】
増加レベルの真核細胞チオレドキシンレダクターゼを発現する穀物を生産する方法であって、請求項７の発現カセットで植物を形質転換することを含む方法。
【請求項１０】
増加レベルの真核細胞チオレドキシンレダクターゼを発現する穀物を生産する方法であって、請求項８の発現カセットで植物を形質転換することを含む方法。
【請求項１１】
増加レベルのチオレドキシンを発現する穀物を生産する方法であって：真核細胞チオレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、トランスアクチベーターに仲介されるプロモーターを含むヘテロロガス発現カセットを含む第１植物を、当該トランスアクチベーターに仲介されるプロモーターを調節することのできるトランスアクチベーターをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むヘテロロガス発現カセットを含む第２植物の花粉で受粉させるステップ；およびこうして受粉した植物から穀物を回収するステップを含む方法。
【請求項１２】
配列番号２４または配列番号２６を含む単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２の核酸分子に作動可能に連結された、植物で活性のあるプロモーターを含むキメラ遺伝子。
【請求項１４】
請求項１３のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１３のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック宿主細胞。
【請求項１６】
トランスジェニック植物細胞である、請求項１５のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１８】
トウモロコシまたはダイズである、請求項１７のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
請求項１３のキメラ遺伝子を含む請求項１７のトランスジェニック植物由来の種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、特にトウモロコシ湿式粉砕（ｃｏｒｎ ｗｅｔ ｍｉｌｌｉｎｇ）およびダイズ加工での、タンパク質およびデンプン回収を高めるための穀物加工（ｇｒａｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の改善された方法、並びにそのような加工で有用な新規トランスジェニック植物に関する。
【０００２】
チオレドキシン（ＴＲＸ）およびチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）は、ＮＡＤＰＨを使用してタンパク質中のジスルフィド結合を還元する酵素である。タンパク質ジスルフィド結合は、穀物加工効率に、および穀物加工から回収された産物の質において重要な役割を演じる。穀物のタンパク質ジスルフィド結合の程度を制限または減少させるための有効なやり方の開発は、加工効率を増加させる。加えて、穀物および穀物に由来する家畜飼料としての産物の成績はまた、分子内または分子間ジスルフィド結合の影響を受ける。穀物消化性、栄養利用性、および抗栄養性ファクター（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼインヒビター等）の中性化を、ジスルフィド結合の程度を減少させることによって増加させる（１９９９年１２月１５日に出願のＷＯ００／３６１２６参照）。
【０００３】
トウモロコシおよびダイズでの、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼのトランスジェニック発現、および穀物加工、例えば、湿式粉砕でのチオレドキシンの使用は、新規であり、そして産業的加工中のまたはそれに先立つ種子タンパク質中のジスルフィド結合を還元するための代替的方法を提供する。本発明はしたがって、変更された、貯蔵タンパク質の質を有する穀物、並びに産業的加工または動物での消化（両方を、次に「加工（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」と称する）中の通常な穀物と質的に異なる成績を有する穀物を提供する。
チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの送達の方法は、チオレドキシンの外生源および／または加工中での添加のためのチオレドキシンレダクターゼを開発する必要性を排除する。穀物を介してチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを供給する第２の利点は、種子インテグリティの物理的破壊が、加工または別の加工（ｅｘｔｒａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）工程に先立ち、種子の貯蔵またはマトリクスタンパク質との接触を酵素にもたらす必要がないことである。
【０００４】
穀物加工でのチオレドキシン利用の３様式を提供する：
１．収穫された穀物の組成および質を変更するための、種子発達中の発現および作用；
２．加工すると、産物の質を変更するための、種子発達中の発現（しかし活性ははない）；
３．加工中の添加によって他の穀物産物の質を変更するために使用される、穀物中のチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの生産。
【０００５】
ここに記載する本発明は、すべての穀物作物、特にトウモロコシ、ダイズ、コムギ、およびオオムギ、最も特にトウモロコシおよびダイズ、特にトウモロコシに適用可能である。穀物中でのトランスジェニックチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの発現は、穀物加工に通じる材料（種子）の質を変更し、穀物加工に由来する材料の質を変更し、加工中の特異的成分の収率を最大化し（効率を増加させること）、加工方法を変化させ、そして種子に由来する分画または粉砕流（ｍｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅａｍｓ）からの成分の新しい使用を創出する手段である。
【０００６】
本発明はこうして、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ、例えば、植物中で天然に発現されないチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを発現する植物、例えば、その核内またはプラスチドＤＮＡに安定的に組みこまれた、チオレドキシンをコードするヘテロロガスＤＮＡ配列を、このましくは誘導可能プロモーター、例えば、化学的に誘導可能なプロモーターの制御下、例えば誘導可能プロモーターに作動可能に連結されるか、またはトランスアクチベーターに調節されるプロモーターであって、ここで該対応するトランスアクチベーターが、誘導可能なプロモーターの制御下であるか、または該プロモーターが第２植物との雑種形成によって活性化されるように、第２植物中で発現されるプロモーターに制御されるプロモーターの制御下で、含む植物を提供し；ここで該チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼは好ましくは、熱安定性または真核細胞レダクターゼであり；そのような植物はまた、そのための種子であって、該種子は所望により処理され（例えばプライミングまたはコーティング）および／または包装され、例えば、使用についての指示のあるバッグ中に置かれ、および例えば前記の粉砕加工での使用のための、それから収穫された種子を含む。
【０００７】
本発明のトランスジェニック植物は所望によりさらに、チオレドキシンレダクターゼおよび／またはＮＡＤＰＨの高い生産のための遺伝子を含み得る。
本発明はさらに、前記のようなチオレドキシンを発現する植物を栽培することを含む、チオレドキシンを生産する方法；前記のような植物から収穫した種子からデンプンまたはタンパク質を抽出することを含む、デンプンおよび／またはタンパク質を生産する方法；および前記のようなチオレドキシンを発現する植物からの種子を浸漬する（ｓｔｅｅｐ）こと、およびそこからデンプンおよびタンパク質を抽出することを含む、湿式粉砕の方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼ、好ましくは好熱性生物、例えば、ａｒｃｈｅａから、例えば、Ｍｅｔｈａｎｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉまたはＡｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓから由来するチオレドキシンをコードする領域を含む植物発現可能発現カセットを提供し、例えば、以下に記載の通り、ここで、該コード領域は好ましくは、植物に好ましいコドンを含むよう最適化され、当該コード領域は、植物中で機能するプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結され、ここで該プロモーターは、好ましくは種子特異的プロモーターまたは誘導可能プロモーター、例えば、化学的誘導可能またはトランスアクチベーターに調節されるプロモーター；例えば、プロモーター、例えば、核内トランスアクチベーター（例えば、該トランスアクチベーターが、その発現が所望により誘導可能プロモーターの制御下にあるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼであるとき、Ｔ７プロモーター）によって調節される、トランスアクチベーターに仲介されるプロモーターを含むプラスチドまたは核内発現可能発現カセットである。
【０００９】
本発明はさらに、そのような植物発現可能発現カセットを含むベクターを提供する。
本発明はさらに、そのようなベクターで形質転換された植物、またはそのゲノム、例えば、核内またはプラスチドゲノム中に、そのような植物発現可能発現カセットを含む、トランスジェニック植物を提供する。
【００１０】
本発明はまた、高レベルのチオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを含む穀物を生産する方法であって、調節され、そしてチオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、トランスアクチベーターに仲介されるプロモーターを含むヘテロロガス発現カセットを含む第１植物であって、該第１植物は好ましくは、除雄され、または雄性不稔である第１の植物を、当該トランスアクチベーターに仲介されるプロモーターを調節することのできるトランスアクチベーターをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むヘテロロガス発現カセットを含む第２植物からの花粉で受粉させること、およびこうして受粉した植物から穀物を回収することを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、真核細胞アラビドプシスＮＡＤＰＨ＋依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、ここで、該ヌクレオチド配列は、単子葉植物中での発現のために最適化され、このましくはトウモロコシでの発現のために最適化されている。該ヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号２４のヌクレオチド配列であり、そして好ましくは配列番号２５のアミノ酸配列をコードする。
【００１２】
本発明はまた、真核細胞イネＮＡＤＰＨ＋依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離核（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子を提供する。該ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする。該ヌクレオチド配列は好ましくは、配列番号２５のヌクレオチド配列である。
【００１３】
配列表の簡単な説明
配列番号１：−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ｇｉｌ１５９１０２９）からのチオレドキシンのタンパク質配列。
配列番号２：−Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９９０３）からのチオレドキシンのタンパク質配列（ｔｒｘ−１）。
配列番号３：−Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９８３８）からのチオレドキシンのタンパク質配列（ｔｒｘ−２）。
配列番号４：−Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９２９５）からのチオレドキシンのタンパク質配列（ｔｒｘ−３）。
配列番号５：−Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４８３８９）からのチオレドキシンのタンパク質配列（ｔｒｘ−４）。
配列番号６：−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ｇｉｌ１５９２１６７）からのチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）のタンパク質配列。
配列番号７：−Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９００６）からのチオレドキシンレダクターゼのタンパク質配列（ｔｒｘＢ）。
配列番号８：−プライマーＮＭＤ１０９。
配列番号９；−プライマーＮＭＤ１１０。
配列番号１０：−プライマーＮＭＤ１０２。
【００１４】
配列番号１１：−プライマーＮＭＤ１０３．
配列番号１２：−プライマーＮＭＤ１２４Ａ。
配列番号１３：−プライマーＮＭＤ１２５Ａ。
配列番号１４：−プライマーＮＭＤ１２６。
配列番号１５：−プライマーＮＭＤ１２７。
配列番号１６：−プライマーＮＭＤ１２８。
配列番号１７：−プライマーＮＭＤ１２９。
配列番号１８：−プライマーＳＴＲＦ１Ａ。
配列番号１９：−プライマーＳＴＲＦ１Ｂ。
配列番号２０：−プライマーＳＴＲＦ２Ａ。
【００１５】
配列番号２１：−プライマーＳＴＲＦ２Ｂ。
配列番号２２：−プライマーＳＴＲ３Ａ。
配列番号２３：−プライマーＳＴＲ３Ｂ。
配列番号２４：−トウモロコシに最適化したアラビドプシスＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼコード配列。
配列番号２５：−配列番号２４によってコードされるアミノ酸配列。
配列番号２６：イネＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）コード配列。
配列番号２７：−配列番号２６によってコードされるアミノ酸配列。
配列番号２８：−プライマーＰ９。
配列番号２９：−プライマーＰ１０。
配列番号３０：−プライマーＰ４。
【００１６】
配列番号３１：−プライマーＰ１
配列番号３２：−プライマーＰ２
配列番号３３：−プライマーＰ５
配列番号３４：−プライマーＰ１２
配列番号３５：−プライマーＰ１１
配列番号３６：−プライマーＰ２７
配列番号３７：−プライマーＰ２８
配列番号３８：−プライマーＰ２９
配列番号３９：−プライマーＰ２６
配列番号４０：−プライマーＰ３１
配列番号４１：−プライマーＴｈｉｏｒｏｄｏｘｕｂｉ １６０３
配列番号４２：−プライマーＴｈｉｏｒｏｄｏｘ ２３６４
【００１７】
「と連関され（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）／作動可能に連結され（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、物理的にまたは機能的に関連づけられている２種の核酸配列を意味する。例えば、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は、もし該２種の配列が作動可能に連結され、または位置するならば、その結果該調節ＤＮＡ配列は、コードまたは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響する、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列「と連関され」る、というものとする。
【００１８】
キメラ遺伝子：プロモーター又は調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコードし、又はタンパク質として発現される核酸配列、に作動可能に連結され、又は、と連関され、その結果、該調節核酸配列が該連関されている核酸配列の転写又は発現を調節することができる。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出されるような連関核酸配列に通常は作動可能に連結されていない。
コード配列：ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに転写される核酸配列。好ましくは、ＲＮＡは次いで生物中で翻訳され、タンパク質を生産する。
【００１９】
相補的：は、逆平行ヌクレオチド配列中のその相補的塩基残基の間で水素結合を形成するとき、互いに対となることのできる逆平行ヌクレオチド配列を含む２種のヌクレオチド配列を意味する。
【００２０】
「ＤＮＡシャッフリング」は、ＤＮＡ分子中で突然変異または再編成を、好ましくはランダムに、急速に、容易におよび効率的に導入する、または２または三以上のＤＮＡ分子の間のＤＮＡ配列の交換を、好ましくはランダムに生成する方法である。ＤＮＡシャッフリングの結果のＤＮＡ分子は、少なくとも１種のテンプレートＤＮＡ分子に由来する天然に存在しないＤＮＡ分子である、シャッフルされたＤＮＡ分子である。該シャッフルされたＤＮＡ分子は、該テンプレートＤＮＡによってコードされる酵素について修飾された酵素をコードし、そして好ましくは該テンプレートＤＮＡによってコードされた酵素について変更された生物学的活性を有する。
【００２１】
「酵素／タンパク質活性」は、基質を産物に触媒する酵素（またはタンパク質）の能力をここでは意味する。酵素の基質は、該酵素の天然の基質を含むだけでなく、天然の基質であって該酵素によって産物へまたは産物の類似物へ変換されることもできる該酵素の基質の類似物を含む。該酵素の活性を、例えば、ある種の時間の期間後に該反応物中の産物の量を決定することによって、またはある種の時間の期間後に反応混合物中に残っている基質の量を決定することによって測定する。該酵素の活性をまた、ある種の時間の期間後に反応混合物中に残っている反応物の使用されないコファクターの量を決定することによって、またはある種の時間の期間後の反応混合物中の使用されたコファクターの量を決定することによって測定する。酵素の活性はまた、ある種の時間の期間後に反応混合物中に残っている、ドナーの遊離エネルギーまたはエネルギーに富む分子（例えばＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸塩（エステル）、アセチルリン酸塩（エステル）またはホスホクレアチン）の量を決定することによって、またはある種の時間の期間後の反応混合物中の使用されたドナーの遊離エネルギーまたはエネルギーに富む分子（例えばＡＤＰ、ピルビン酸塩（エステル）、酢酸塩（エステル）またはクレアチン）の量を決定することによって、測定する。
【００２２】
発現カセット：は、適当な宿主細胞中の特定のヌクレオチド配列の発現を指向することのできるＲＮＡ配列であって、終結シグナルに作動可能に連結されている、所望のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含むものである。それはまた典型的には、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に要求される配列を含む。該コード領域は通常、所望のタンパク質をコードするが、所望の機能性ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをセンスまたはアンチセンス方向で、またコードし得る。所望のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その構成要素の少なくとも一つがその他の構成要素の少なくとも一つについてヘテロロガスであることを意味する、キメラであり得る。
【００２３】
発現カセットはまた、天然に存在するが、ヘテロロガス発現のために有用である組換え体形態で取得されたものであり得る。典型的には、しかし、発現カセットは宿主についてヘテロロガスであり、すなわち発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中で天然に存在せず、そして形質転換事象によって宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入されるはずであった。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター又は宿主細胞がある特定に外部刺激にさらされるときにのみ、転写を開始する誘導可能プロモーターの制御下であり得る。多細胞生物、例えば昆虫の場合では、プロモーターはまた特定の組織、又は器官、又は発育の段階に特異的であることができる。
【００２４】
遺伝子：用語「遺伝子」は、生物的機能と連関された任意のＤＮＡのセグメントを意味するため広く使用する。こうして、遺伝子は、これらの発現に要求されるコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子はまた、非発現ＤＮＡセグメント、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成するセグメントを含む。遺伝子を、所望の源からのクローニングまたは既知または予測される配列情報から合成することを含む種々の源から取得することができ、そして望まれるパラメーターを含むように設計される配列を含み得る。
【００２５】
ヘテロロガスＤＮＡ配列：は、ここで使用するように、用語「ヘテロロガスＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」又は「ヘテロロガス核酸」がそれぞれ、特定の宿主細胞に対して外来性であるソースから起源する配列を意味し、もし同じ起源からであれば、本来の形態から修飾されているものである。こうして、宿主細胞中のヘテロロガス遺伝子は、特定の宿主細胞に対して外因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって修飾された遺伝子を含む。該用語はまた、天然には多重コピー存在しない天然に存在するＤＮＡ配列を含む。こうして、該用語は、細胞に対して外来又はヘテロロガスであるＤＮＡセグメント、又は細胞に対してホモロガスであるがそのエレメントが普通には見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを意味する。外因性ＤＮＡセグメントは発現され、外因性ポリペプチドをもたらす。
【００２６】
ホモロガスＤＮＡ配列：は、宿主細胞と天然に連関されるＤＮＡ配列である。
「ホモプラスチド性（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｉｄｉｃ）」は、植物、植物組織または植物細胞であって、ここでプラスチドのすべてが遺伝的に同一であるものを意味する。これは、該プラスチドが形質転換、突然変異、またはさもなくば遺伝的に変更されていないときは、植物の通常の状態である。異なる組織または発達の段階では、該プラスチドは、異なる形態、例えば、クロロプラスト、プロプラスチド、エチオプラスト、アミロプラスト、クロモプラスト、およびその他を取り得る。
【００２７】
単離され：は、本発明の文脈では、単離されたＤＮＡ分子又は単離された酵素は、人間の手によって、そのネイティブ環境から離れて存在するＤＮＡ分子又は酵素であり、したがって天然の産物ではない。単離されたＤＮＡ分子又は酵素は、精製形態で存在し、又は非ネイティブ環境、例えば、トランスジェニック宿主細胞中に存在し得る。
【００２８】
成熟タンパク質：は、タンパク質であって、細胞内オルガネラに通常はターゲティングされ、そしてそこから移行ペプチドが除去された、タンパク質である。最小プロモーター：は、不活性であるか、又は上流活性化の不存在下で大きく減少したプロモーター活性を有する、プロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントである。好適な転写ファクターの存在下、最小プロモーターは機能し、転写を可能とする。
【００２９】
修飾された酵素活性：昆虫に天然に存在する酵素活性（すなわち、ヒトによるそのような活性の直接または間接的操作の不存在下で天然に存在する酵素活性）と異なる酵素活性であって、天然に存在する酵素活性を阻害するインヒビターに耐性であるもの。
ネイティブ：は、未形質転換昆虫細胞のゲノム中に存在する遺伝子を意味する。
天然に存在する：用語「天然に存在する」は、人間によって人工的に生産されたものから明瞭であるとして天然に見出されることのできる対象を記載するために使用する。例えば、ある生物（ウイルスを含む）中に存在するタンパク質又はヌクレオチド配列であって、天然のソースから単離することができ、そして実験室の人間によって意図的に修飾されていないものは、天然に存在するものである。
【００３０】
核酸：用語「核酸」は、一本又は二本鎖形態である、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを意味する。特に限定しない限り、該用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドに類似する態様で代謝される天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を含む。特に指摘しないかぎり、特定の核酸配列はまた、同類に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列並びに明示的に指摘された配列を暗に含む。特に、縮重コドン置換は、１又は２以上の選択された第３位（又はすべての）コドンが混合塩基で及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１（１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ２６０５−２６０８（１９８５）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１−９８（１９９４））。用語「核酸」又は「核酸配列」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされたｍＲＮＡと相互交換可能に使用し得る。
【００３１】
植物：任意の発育段階の任意の植物、特に種子植物。
植物細胞：プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理学的単位。植物細胞は、単離単一細胞又は培養細胞の形態で、又は高度に組織された単位、例えば、植物組織、植物器官、又は全植物体（ｗｈｏｌｅ ｐｌａｎｔ）の一部としてあり得る。
植物細胞培養（物）：植物単位の培養（物）、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚のう、胞子体及び胚であって種々の発育段階にあるもの。
【００３２】
植物材料：葉、茎、根、花、又は花部分、果実、花粉、卵細胞、胞子体、種子、挿し木、細胞又は組織培養物、又は任意の他の植物の部分又は産物を意味する。
植物器官：明瞭でそして可視的に構成され、そして分化した植物の部分、例えば、根、茎、葉、花芽又は、胚。
【００３３】
植物組織：構造的及び機能的単位に組織化された植物細胞の群を意味するために使用する。インブランタ及び培養中の植物の任意の組織が含まれる。この用語は、全植物体、植物器官、植物種子、組織培養物及び構造的及び／又は機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群を含むがこれらに限定されない。前記の、又はむしろこの定義によって包含されるような、植物組織の任意の特定の型と組み合わせて、又は不存在でのこの用語の使用は、他のいかなる植物組織型を排除することを意図しない。
プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位を含み、そしてＤＮＡの転写を開始させる、コード領域の上流の非翻訳ＤＮＡ配列である。該プロモーター領域はまた、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他のエレメントを含み得る。
【００３４】
プロトプラスト：細胞壁を欠き、又は細胞壁の一部のみを有する単離された植物細胞である。
精製され：用語「精製され」は、核酸又はタンパク質に適用されるとき、該核酸又はタンパク質が、他の細胞性構成要素であって天然状態ではそれが連関がある（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ものが本質的にないことを意味する。それは均質状態であるのが好ましいが、それは乾燥又は水溶液状態であることができる。純粋及び均質は典型的には、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定する。調製物中に存在する卓越する種類であるタンパク質は、実質的に精製されている。用語「精製され」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に一つのバンドを生じることを意味する。特に、それは、該核酸又はタンパク質が少なくとも約５０％純粋、より好ましくは少なくとも約８５％純粋、及び最も好ましくは、少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
【００３５】
調節エレメント：ヌクレオチド配列の発現を制御することに関係がある配列を意味する。調節エレメントは、所望のヌクレオチド配列及び終結シグナルに作動可能に連結されているプロモーターを含む。これらはまた典型的には、ヌクレオチド配列の正確な翻訳のために要求される配列を含む。
【００３６】
有意な増加：測定技術における固有の誤差の幅より大きい酵素活性における増加であって、好ましくは阻害剤の存在下の野生型酵素の活性の約２倍又はより多い増加、より好ましくは約５倍又はより多い増加、そして最も好ましくは約１０倍又はより多い増加である。
【００３７】
２又はより３以上の核酸又はタンパク質配列の文脈では、用語「同一な」又はパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムのひとつを使用して、又は目視検査によって測定されるように、比較され、そして最大の一致にのためにアラインメントされるときに、同じである、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する、２又は３以上の配列又はサブ配列を意味する。
【００３８】
実質的に同一な：語句「実質的に同一な」は、２種の核酸又はタンパク質配列の文脈では、以下の配列比較アルゴリズムのひとつを使用して、又は目視検査によって測定されるように、比較され、そして最大の一致のためにアラインメントされるときに、少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０−９５％、そして最も好ましくは少なくとも９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２又は３以上の配列又はサブ配列を意味する。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長である、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域に渡り、そして最も好ましくは該配列が少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である、配列の領域にわたり存在する。最も好ましい実施態様では、配列は、コード領域の完全長に渡り実質的に同一である。さらに、実質的に同一な核酸又はタンパク質配列は、実質的に同じ機能を実施する。
【００３９】
配列比較のために、典型的には、ある配列は、試験配列が比較される対照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験及び対照配列をコンピューターに入力し、サブ配列コーディネイトを必要であれば指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムを次いで、対象配列と比較したときの試験配列（複数もある）についてのパーセント配列同一性を、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、計算する。
【００４０】
比較のために至適な、配列のアラインメントを例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター化手段（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ，及びＴＥＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）によって、又は目視検査（全般に以下のＡｉｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，参照）によって実行することができる。
【００４１】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムのある例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公衆に利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷのショートワードであって、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされるとき、これらがマッチし、又はある正の値の閾値スコアＴを満足するものを同定することによって、まず高スコア配列対（ＨＳＰｓ）を同定することに関係する。Ｔは近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。これらの当初近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを見出すためにサーチを開始するためのシードとして作用する。該ワードヒットは次いで、該累積的アラインメントスコアが増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方の方向で伸長する。
【００４２】
累積的スコアを、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（マッチする残基の対のためのリワードスコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチである残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列のために、スコアリングマトリックスを使用して、累積的スコアを計算する。累積的アラインメントスコアがその最大の達成された値から量Ｘによってフォールオフするとき、それぞれの方向でのワードヒットの伸長を停止し、１又はより多い負のスコア残基アラインメントの蓄積のために累積的スコアはゼロ以下になり、又はいずれかの配列の末端が到達される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸはアラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリグマトリクスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）参照）。
【００４３】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２種の配列の間の類似性の統計的分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性のある基準は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然に発生する確率の指摘を提供する。例えば、もし試験核酸配列の、対照核酸配列に対する比較における最小合計確率が、約０．１より少、より好ましくは約０．０１より少、そして最も好ましくは約０．００１より少であるならば、試験核酸配列は対照配列に類似であると考えられる。
【００４４】
２種の核酸配列は実質的に同一であるという別の指摘は、該２分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。語句「に特異的にハイブリダイズする」は、その配列が複雑な混合物（例えば総細胞性）ＤＮＡ又はＲＮＡ中に存在するとき、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列にのみへの、分子の結合、二本鎖形成、又はハイブリダイズすることを意味する。「実質的に結合する」は、プローブ核酸及び標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、そして標的核酸配列の望まれる検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地中のストリンジェンシーを減少させることによって達成できる少しのミスマッチを含む。
【００４５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザン及びノーザンハイブリダイゼーションの文脈では、配列に依存し、そして異なる環境パラメーター下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２’’Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ’’Ｅｌｓｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。典型的には、「ストリンジェント条件」下で、プローブはその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。
【００４６】
Ｔｍは、５０％の標的配列が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと同等であるように、選択される。サザン又はノーザンブロットのフィルター上の１００より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、終夜実施されるハイブリダイゼーションで、４２℃で１ｍｇのヘパリンとの５０％ホルムアミドである。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、約１５分間７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２ｘＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣバッファーの記載のための以下のＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー洗浄によって高ストリンジェンシー洗浄は先行される。例えば１００ヌクレオチドより多い二本鎖のために、中くらいのストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１ｘＳＳＣである。例えば１００より多いヌクレオチドの、二本鎖のための、低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４−６ｘＳＳＣである。
【００４７】
短いプローブ（例えば約１０ないし５０ヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件は、典型的にはｐＨ７．０ないし８．３で約１．０ＭのＮａイオンより低い塩濃度、典型的には約０．０１ないし１．０ＭのＮａ（又は他の塩）イオン濃度を含み、そして温度は典型的には、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドの添加で達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイでの関連のないプローブについて観察されるよりも２倍の（又はより高い）シグナル対ノイズ比率は、特定のハイブリダイゼーションの検出を指摘する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、もしそれらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならば、なお実質的に同一である。例えば、１コピーの核酸が、遺伝的コードによって許容される最大のコドン縮重を使用して創出されるときに、これは存在する。
【００４８】
以下は、本発明の対照ヌクレオチド配列に実質的に同一である、ホモロガスなヌクレオチド配列をクローニングするために使用し得る、ハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：対照ヌクレオチド配列は好ましくは７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で５０℃で、２ＸＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で５０℃の洗浄で、より望ましくは７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃で、１ＸＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃の洗浄で、より望ましくは７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃で、０．５ＸＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃の洗浄で、好ましくは７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃で、０．１ＸＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃の洗浄で、より好ましくは７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡで５０℃で、０．１ＸＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６５℃の洗浄である。
【００４９】
２種の核酸配列又はタンパク質が実質的に同一であるさらなる指摘は、第１の核酸によってコードされるタンパク質が、第２の核酸によってコードされるタンパク質と、免疫学的に交差反応性であり、又は特異的に結合することである。こうして、あるタンパク質は典型的には、第２のタンパク質と典型的に実質的に同一であり、ここで、該２種のタンパク質は同類置換によってのみ異なる。
【００５０】
語句「特異的に（又は選択的に）抗体に結合する」又は「と特異的に（又は選択的に）免疫反応性である」は、タンパク質又はペプチドに言及するとき、タンパク質及び他の生物製剤の不均質な集団の存在下でタンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。こうして、指定された免疫アッセイ条件下で、特定された抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質と有意な量では結合しない。そのような条件下で抗体に特異的に結合することは、その特異性について選択されている抗体に特定のタンパク質を要求し得る。例えば、本発明のいずれかの核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質へレイズされた抗体は、そのタンパク質に特異的と免疫反応性であり、そして多型変異体を除き、他のタンパク質と免疫反応性でない、抗体を取得するように選択することができる。
【００５１】
種々の免疫アッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、ウェスタンブロット、又は免疫組織化学をルーチンに使用し、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択する。特異的免疫反応性を決定するために使用することのできる免疫アッセイ形式及び条件の記載のために、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ’’Ｈａｒｌｏｗ ｎａｎｄ Ｌａｎｅ’’）を参照されたい。典型的には、特異的又は選択的反応を少なくとも２倍バックグラウンドシグナル又はノイズ、そしてより典型的には１０ないし１００倍バックグラウンドより多い。
【００５２】
特定の核酸配列の「同類に修飾された変異体」は、同一又は本質的に同一なアミノ酸配列をコードするそれらの核酸配列を意味し、又は該核酸配列が、アミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列を意味する。遺伝的コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸は、いずれかの所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＧ、及びＡＧＧはすべてアミノ酸アルギニンをコードする。こうして、アルギニンがコドンによって特定されるすべての位置で、該コドンはコードされるタンパク質を変化させることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化することができる。そのような核酸変異は、「同類に修飾された変異体」の１種である「サイレント変異」である。タンパク質をコードする、ここで記載されるすべての核酸配列はまた、すべての可能性のあるサイレント変異体を記載する。ただし、他に注記するときはこの限りでない。当業者は核酸中のそれぞれのコドン（ただし通常はメチオニンについての唯一のコドンであるＡＴＧはこの限りでない）は、標準的技術によって機能的に同一な分子を得るように修飾することができることを認識する。よって、あるタンパク質をコードする核酸のそれぞれの「サイレント変異」は、それぞれの記載された配列に内在している。
【００５３】
さらに、当業者は、コードされている配列中の単一のアミノ酸又は小パーセンテージのアミノ酸（典型的には５％より小、より典型的には１％より小）を変化させ、そして付加又は欠失する個々の置換欠失又は付加が、「同類に修飾された変異」であることを認識し、ここで、該変化は化学的に類似のアミノ酸との置換という結果となる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は、当業者に周知である。以下の５群はそれぞれ互いに同類置換であるアミノ酸を含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族；フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）である。またＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ参照。加えて、コードされている配列中のアミノ酸の単一アミノ酸又は小パーセンテージを変化、付加又は欠失させる、個々の置換、欠失又は付加はまた、「同類に修飾された変異」である。
【００５４】
「サブ配列」は、核酸又はアミノ酸（例えば、タンパク質）のより長い配列の部分を含む、核酸又はアミノ酸の配列をそれぞれ意味する。
核酸は、付加的ヌクレオチド（又は他の類似分子）が該核酸に組みこまれるとき、「延長され」である。最も共通には、これは、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、例えば、核酸の３’末端に配列を付加するポリメラーゼで実施される。
【００５５】
２種の核酸は、２種の核酸のそれぞれからの配列が後代核酸中で組み合わされているとき、「組換えられ」ている。２種の配列は、両方の核酸が組換えのための基質であるとき、「直接的に」組換えられている。２種の配列が、該配列が、乗り換えオリゴヌクレオチドのような中間体を使用して組換えられているとき、「間接的に組換えられ」ている。間接的な組換えのために、たった１の配列が組換えのための実際の基質であり、そしてある種の場合には、いずれもの配列が組換えのための基質ではない。
【００５６】
「合成の」は、天然配列中に存在しない構造的特徴を含むヌクレオチド配列を意味する。例えば、双子葉植物および／または単子葉植物遺伝子のより近いＧ＋Ｃ含量および正常のコドン分布に似ている人工配列は、合成であるという。
【００５７】
「トランスアクチベーター」は、それ自体または１または２以上の追加的タンパク質と組み合わせて、対応するトランスアクチベーターに仲介されるプロモーターの制御下で、コード領域の転写を引き起こすことのできるタンパク質である。トランスアクチベーター系の例は、ファージＴ７遺伝子１０プロモーターを含み、該転写活性化は、特異的ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ファージＴ７ポリメラーゼに依存する。該トランスアクチベーターは、典型的には、特定のプロモーターと相互作用し、該プロモーターを直接的に活性化することによって、またはレプレッサー遺伝子を不活性化することによって、例えば、レプレッサータンパク質の発現または蓄積を抑制することによって、転写を開始させることのできるＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ結合タンパク質である。該ＤＮＡ結合タンパク質は、適当な転写アクチベータードメインに連結された、結合領域（例えば、ＧＡＬ４結合領域）を含むキメラタンパク質であり得る。ある種のトランスアクチベーター系は、多重トランスアクチベーター、例えば、ポリメラーゼだけでなく、プロモーター認識、ＤＮＡ結合、または転写活性化のための特異的サブユニット（シグマ因子）もまた要するプロモーターを有し得る。該トランスアクチベーターは、好ましくは植物についてヘテロロガスである。
【００５８】
形質転換：ヘテロロガスＤＮＡを、細胞、組織又は昆虫に導入するためのプロセス。
形質転換細胞、組織、または昆虫は、形質転換プロセスの末端産物のみならず、またそのトランスジェニック後代を含むと理解される。
「形質転換され」、「トランスジェニック」及び「組換え（体）」は、ヘテロロガス核酸分子が導入された宿主生物、例えば細菌又は植物を意味する。該核酸分子を宿主のゲノムに安定的に組み込むことができ、又は該核酸分子はまた、染色体外の分子として存在することができる。そのような染色体外の分子は、自己複製することができる。形質転換された細胞、組織、又は植物は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、そのトランスジェニック後代もまた含むことが理解される。「非形質転換され」「非トランスジェニック」又は「非組換え体」宿主は、野生型生物、例えば、細菌又は植物であって、ヘテロロガス核酸分子を含まないものを意味する。
【００５９】
ヌクレオチドは、以下の標準的短縮形によりその塩基を指摘する：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）。アミノ酸は同様に、以下の標準的短縮形により指摘する：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｅｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さらに（Ｘａａ；Ｘ）は任意のアミノ酸を表す。
【００６０】
湿式粉砕（Ｗｅｔ ｍｉｌｌｉｎｇ）
湿式粉砕は、穀物、最もしばしば禾穀類、例えばトウモロコシのデンプン、タンパク質および油成分を分離する加工である。ここでそれを、単純に粉砕する乾式粉砕と区別する。トウモロコシの湿式粉砕は、トウモロコシのカーネルを浸漬、粉砕し、そしてカーネルの成分を分離することを含む。湿式粉砕の第１工程は、通常は浸漬であり、ここで該穀物を注意深く制御された条件下で水に浸し、該カーネルを柔らかくし、そして該成分の分離を容易化する。該カーネルを典型的には、約０．２重量％の濃度の二酸化硫黄を含有する約１２０°Ｆの水の向流（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｆｌｏｗ）の浸漬タンク中で浸漬する。該カーネルは、約２４ないし４８時間浸漬タンク中で残留する。該カーネルを次いで脱水し、そしてアトリション型ミルのセットの対象とする。アトリション型ミルの第１セットは、胚芽をはずし、そしてカーネルの残りからトウモロコシ油を放出しつつ、カーネルを破裂させる。遠心分離を使用し、胚芽をカーネルの残りから分離する。該油を有する胚は、水性溶液の表面に浮上し、そして除去する。
【００６１】
次に、加水および脱水、粉砕、ふるい分け、遠心分離および洗浄の工程によって、該デンプンをタンパク質から分離し、そして精製する。胚除去に続いて、デンプン、皮、繊維およびグルテンを含む残りのカーネル成分を、アトリションミルのもう１つのセットの対象とし、そして洗浄スクリーンのセットを経由して通過させ、デンプンおよびグルテンから繊維成分を分離する。該デンプンおよびグルテンはスクリーンを通過する一方、繊維は通過しない。遠心分離、または遠心分離に続く第３のすりつぶしを使用し、タンパク質からデンプンを分離する。遠心分離は、デンプン顆粒を含むスラリーを生産し、これを脱水し、新鮮な水で洗浄し、そして約１２％水分まで乾燥する。結果は、この態様でトウモロコシカーネルからの実質的に純粋なデンプンの分画の回収である。
【００６２】
重要な困難性は、タンパク質の入り組んだマトリクスおよび穀物の胚乳を作っている細胞壁材料からデンプン顆粒を緩めることである。この困難性の一つの理由は、分子間または分子内ジスルフィド結合であって、該タンパク質マトリクスをより可溶性ではなく、タンパク質溶解酵素により感受性でなくし、そしてデンプン顆粒の、該穀物のタンパク質マトリクスからの開放を阻害する、ジスルフィド結合の存在であると信じられている。現在、これらの結合を還元する第１の手段は、二酸化硫黄の存在下で穀物を浸漬することであるが、これは高価で、環境的に友好的ではなく、そして最適には有効ではない。該浸漬水は二酸化硫黄を含むから、それは毒性廃棄物であると考えられ、したがって、生成される体積を最小化することが有利である。代替的に、二酸化硫黄の必要性が排除される。
【００６３】
粉砕前の穀物調質に要する浸漬時間が減少することが、胚乳マトリクス中のジスルフィド結合の程度を減少させる追加的な利点である。ある種の突然変異は、トウモロコシカーネル胚乳のタンパク質マトリクス（ｆｌｏｕｒｙおよびｏｐａｑｕｅ）に有利な影響を働かせるが、カーネルのインテグリティを損なう。トランスジェニックチオレドキシン発現は、これらの突然変異と連関する、ある種のカーネルインテグリティ問題を創出することなく、ある種のこれらの利点を提供する。
【００６４】
チオレドキシンの、ポストハーベストで、または加工に依存する活性は、等しく有利な効果を有する。例えば、ある実施態様では、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ酵素を、細胞区画にターゲティングさせ、そして蓄積させる。種子の物理的破壊に続いて、タンパク質還元が起こる。別の実施態様では、静止胚乳チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを浸漬すると、活性化させる。好ましい実施態様では、本発明は、トランスジェニック熱安定性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ、例えば、超好熱性生物に由来するチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼを発現する植物を提供し、その結果該チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼは、高温（例えば、５０℃より高）を除いて顕著には活性ではない。ある実施態様では、熱安定性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼは、胚乳の他の熱安定性酵素の発現を経由する糖化と相互依存的である。
【００６５】
飼料への適用
穀物における、トランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現はまた、特に動物飼料において、消化性と連関する穀物特性を改良するため有用である。飼料タンパク質のプロテアーゼへの感受性は、時間のおよびタンパク質コンホメーションの関数である。カーネルクラッキングはしばしば、スチームフレーキングであるように飼料処方において使用される。これらの加工の両方を、カーネル消化を助けるように設計する。動物胃中で、インテグリティをより容易に破壊することのできる、より柔らかいカーネルが望ましい。タンパク質の間のコンホメーション的拘束および架橋は、プロテアーゼ感受性の主要な決定子である。これらの結合を、増加チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ発現によって修飾し、これによって消化を助ける。
【００６６】
トウモロコシ乾式粉砕／マーサ
タンパク質含量および質は、フレーキンググリット生産においておよびマーサ生産において、重要な決定子である。ジスルフィド結合の還元は、コーンフラワーの性質を変更し、その結果、それは、特に高タンパク質白色トウモロコシ品種から作成される、コムギ代替物としての使用について好適である。
【００６７】
ダイズ破砕
米国のダイズ作物の半分以上は、破砕または粉砕され、そして得られる低脂肪ダイズフラワーまたは脱脂ダイズフラワー（またはダイズミール）のタンパク質の質は、その後の加工のため重要である。ダイズ加工ストリームからのタンパク質収率および質は、経済的に重要であり、そしてタンパク質コンホメーションに大きく依存する。トランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現を通じてチオレドキシン活性を増加させることは、タンパク質可溶性を増加させ、こうして、水溶性タンパク質分画中の収率を増加させる。回収は、塩基性条件下で脱脂ダイズミールの水性抽出によって容易化する。トランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現を通じてチオレドキシン活性を高めることはまた、効率的抽出のため要するｐＨを減少させ、それによってカルシウムまたはナトリウム水酸化物の投入量を減少させ、並びにその後の酸沈殿のための酸投入量を低減化し、アルカリ損傷なくタンパク質の効率的な回収を可能とし、そして水の消費および植物廃棄物流出物（それは、実質的生物学的酸素要求負荷を含む）の処理を減少させる。
【００６８】
タンパク質酸化還元状態は、ダイズタンパク質によって供給される重要な機能的特性、例えば、可溶性、吸水、粘性、接着／固着、凍結および弾性に影響する。ダイズタンパク質濃縮物生産、およびプロテアーゼによるダイズタンパク質単離物加水分解中の繊維除去を、ここに記載のようにチオレドキシン活性を増加させることによって高める。同様に、トウモロコシについて前記の様に、トランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現を通じてチオレドキシン活性を増加させることは、酵素活性のあるダイズフラワーの機能性およびダイズミールフラクションおよび動物飼料中のストリームフレーキングフラクションの消化性を高める。
【００６９】
種子発育中および加工中のタンパク質の質の修飾を、両方提供し、ただしトランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼが、前記の様に、細胞区画にターゲティングされ、熱安定性であるのが好ましく、種子発育中にチオレドキシン活性の結果として恐らく遭遇する、貯蔵タンパク質蓄積への有意な不利な影響を回避する。代替的に、該チオレドキシンを、加工酵素として添加し得、というのは（トウモロコシ湿式粉砕に対して）ジスルフィド結合を破壊することは、穀物インテグリティを破壊する（破砕および油抽出）後まで必要ではないからである。
【００７０】
ヘテロロガス発現のためのチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの選択
チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼおよびタンパク質ジスルフィド結合（ＰＤＩ）遺伝子は、植物、ユーバクテリアを含む真核細胞、並びに超好熱性生物、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＡｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓを含む、ａｒｃｈｅａ中に見出される。特定の遺伝子の選択は、望まれる適用に一部依存する。本発明の方法のために、好ましいチオレドキシンは、以下の特徴を有する。
【００７１】
１．熱安定性−超好熱性生物からのチオレドキシンおよび関連タンパク質は高温（＞５０℃）での増加安定性および環境温度で比較的低活性を有すると見出される。超好熱性生物、例えば、ａｒｃｈｅａ、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉおよびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓまたは他の超好熱性生物からのチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現は、種子発育中の発現のために好ましく、その結果、該チオレドキシン活性は、穀物が上昇温度で浸漬または加工されるまで著しくは増加しない。ほとんどの穀物加工方法は、高温工程を含むか、それと両立する。熱安定性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼがしたがって好ましい。
【００７２】
熱安定性によって、該酵素は高温、例えば、湿式粉砕のために、４０℃より高い温度、最も好ましくは５０℃より高い温度、例えば４５−６０℃、またはなおより高い例えば、４５−９５℃で優先的に活性であることを意味する。
【００７３】
２．基質特異性−ある種のタンパク質、例えば、該マトリクス中の構造的タンパク質へ優先的に作用する、そして必須代謝酵素との低活性を有する、チオレドキシンの選択によって種子発育への望ましくない影響を減少させることがまた、可能である。種々のチオレドキシンが、酸化還元制御下である酵素との反応性において異なることが示された。
こうして望まれる標的上に本質的に作用し、発現にわたり望ましくない副作用を最小化する、チオレドキシンを選択することが可能である。
【００７４】
好適な熱安定性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼは、以下のものを含む：
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ｇｉｌ１５９１０２９）からのチオレドキシンのアミノ酸配列
【表１】
2004500885.tif 000002
（配列番号１）；
・Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９９０３）からのチオレドキシンのアミノ酸配列（ｔｒｘ−１）
【表２】
2004500885.tif 000003
（配列番号２）；
【００７５】
・Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９８３８）からのチオレドキシンのアミノ酸配列（ｔｒｘ−２）
【表３】
2004500885.tif 000004
（配列番号３）；
・Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９２９５）からのチオレドキシンのアミノ酸配列（ｔｒｘ−３）
【表４】
2004500885.tif 000005
（配列番号４）；
【００７６】
・Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４８３８９）からのチオレドキシンのアミノ酸配列（ｔｒｘ−４）
【表５】
2004500885.tif 000006
（配列番号５）；
・Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ｇｉｌ１５９２１６７）からのチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）のアミノ酸配列
【表６】
2004500885.tif 000007
（配列番号６）；および
【００７７】
・Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ｇｉｌ２６４９００６）からのチオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）のアミノ酸配列
【表７】
2004500885.tif 000008
（配列番号７）
【００７８】
本発明の使用のためのこれらのタンパク質をコードする遺伝子は、植物に好ましいコドンを使用する戻し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）によって好ましくは設計し、Ｇ−Ｃ含量を高め、そして有害な配列を除去し、以下に十分に記載の通りである。該タンパク質の活性は、以下に記載の通り、ＤＮＡシャッフリングまたは他の手段によって高め得る。本発明はしたがって、これらのタンパク質、特にチオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼ活性を保持する実質的に類似であるタンパク質に由来するタンパク質を含む。
【００７９】
穀物発育中の活性について種子中のチオレドキシン発現を改変するため、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの種子特異的発現を指向するプロモーターが好ましく、該貯蔵を標的し、その結果該酵素が貯蔵タンパク質に望ましい影響を有するからであり、これはある種の適用で望ましくあり得る。本発明では、しかし、穀物発育中の蓄積および不活性について種子中のチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼ発現を改変するのがより一般に好ましい。いくつかのストラテジーを実施し、通常の種子発育に有意な影響を有することなく、トランスジェニックチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを発現する種子を創出する。例えば：
【００８０】
（ｉ）活性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼが標的タンパク質と有意には相互作用しないように、例えば、アミロプラストへのターゲティングまたは発現によって、活性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼを区画化するため。プラスチドターゲティング配列を使用し、アミロプラスト中の蓄積を指向化する。代替的に、該チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを、分泌シグナルを使用して細胞壁中の細胞外位置へターゲティングさせる。または最終的に、単子葉植物の場合に、種子発達中のアリューロンのような細胞型での発現を使用し、胚乳の残りの貯蔵成分から、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを遠ざけておく。
【００８１】
（ｉｉ）好熱性生物からのチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの発現を改変するため。環境温度（例えば圃場での高くて３８−３９℃）でほとんどまたは全く活性のない酵素は、発育中に問題を引き起こすことがよりありそうにないよりありそうにない。好ましくは、したがって、該酵素は、湿式粉砕のために高温、例えば、４０℃より大きい、最も好ましくは４５−６０℃、またはより高い、例えば、４５−９５℃で原理的に活性である。
【００８２】
（ｉｉｉ）チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを、誘導可能プロモーター、例えば、化学的に誘導可能なプロモーター、傷誘導可能プロモーター、またはトランスアクチベーターを発現する植物で受粉されると活性化されるトランスアクチベーターに仲介されるプロモーターの制御下ににおくために。
【００８３】
（ｉｖ）チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼの活性がそれぞれ該適当なチオレドキシンレダクターゼまたはチオレドキシンの利用可能性を介して好適に調節されるように、特定のチオレドキシンレダクターゼの特異的要求を有するチオレドキシンを利用するために。例えば、該チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを種々の植物で発現させ、その結果該活性組み合わせは、相補的酵素を発現する植物によって受粉されると、その種子でのみ利用可能である。代替的に、該チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを細胞、例えば、前記の様にプラスチド、液胞、またはアポプラスト中で隔離し、その結果それは該穀物が加工されるまで利用可能とならない。
【００８４】
穀物の加工方法
本発明はこうして、チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを使用する、タンパク質マトリクスからのデンプンの分離を高める新規方法を提供する。第１の実施態様では、チオレドキシン活性は、湿式粉砕、乾式粉砕、油料種子加工、ダイズ加工、コムギ加工およびフラワー／ドウ質、最も特に、穀物、特にトウモロコシの湿式粉砕を含む、種々の種子加工適用で有用であると見出される。
【００８５】
よって、本発明は、粉砕効率を改善し、または粉砕収率を増加させ、デンプンおよびタンパク質の分離の効率を増加させ、穀物からのデンプンおよび可溶性タンパク質の収率を高め、または水および他の溶媒中のタンパク質可溶性を高め増加させる方法であって、補足チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンの存在下で穀物を浸漬すること、および穀物中のデンプンおよびタンパク質成分を分離することを含む方法を提供する。典型的には、浸漬は、粉砕の前にあるが、後にあってもよく、そして加工方法抽出中に、１より多い粉砕または浸漬工程があり得、そして浸漬中または浸漬後の時点での種子からのタンパク質収率を増加させ得る。好ましくは、該補足チオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを、穀物を収穫する植物中でのトランスジーンの発現によって提供する。
【００８６】
本発明はさらに：例えば前記のいずれかの方法において、粉砕効率を改良し、またはデンプンまたはタンパク質の粉砕収率を増加させる方法におけるチオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼの使用、穀物中のタンパク質からのデンプンの分離を容易化するのに有効なチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼの量を含む浸漬水；タンパク質からのデンプンの分離を容易化するのに有効な量のチオレドキシンに曝露した穀物；および前記の方法によって生産されたデンプンまたはタンパク質を提供する。
【００８７】
前記方法でのチオレドキシンの活性を、チオレドキシンレダクターゼおよび／またはＮＡＤＰＨで浸漬水を補足することによって高め得る。湿式粉砕のための浸漬水中に通常存在する他の成分はまた存在し得、例えば、乳酸を生産する細菌である。好ましくは、該浸漬を、約５２℃で２２−５０時間の期間実行し、だから該チオレドキシンはこれらの条件下で安定であるのが望ましい。
【００８８】
穀物は、双子葉植物種子、例えば、油料種子、例えば、ダイズ、ヒマワリまたはキャノーラ、好ましくはダイズであり得；または単子葉植物種子、例えば、禾穀類種子、例えば、トウモロコシ、コムギ、エンバク、オオムギ、ライムギ、またはイネ、最も好ましくはトウモロコシであり得る。
該チオレドキシンは、可逆的に酸化され、ジスルフィド結合を形成し、そしてチオレドキシンレダクターゼの存在下でＮＡＤＰＨによって還元されることのできるチオール基を有する任意のタンパク質であり得る。
【００８９】
好ましくは該チオレドキシンは、前記の好熱性生物に由来する。本発明での使用のためのチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼは、改変微生物、例えば、コウボまたはコウジカビ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）中で、または非常に高発現の可能な改変植物、例えば、モルト形成中活性であるプロモーター、例えば、高ｐＩアルファアミラーゼプロモーターまたは他のジベレリン依存性プロモーターの制御下である、例えば、オオムギ中で、好適には生産される。該チオレドキシン（排出または抽出形態で、またはプロデユーサー生物またはその一部と組み合わせた）を次いで、浸漬水に添加する。
【００９０】
浸漬水へのチオレドキシンの添加の代替または補足として、該酵素を粉砕されるべき種子中で直接的に発現させる。好ましくは、該酵素を穀物成熟中または調質加工中に発現させる。
よって更なる実施態様では、本発明は、以下のものを提供し、トランスジェニック生物、例えば、植物、例えば、禾穀類、例えば、オオムギ、またはトウモロコシ、または微生物例えば、コウボまたはコウジカビ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）で、チオレドキシンの産業規模での作成の方法であって、例えば該方法は、チオレドキシンを発現するキメラ遺伝子を有するトランジェニック生物を培養し、そして所望により、該チオレドキシンを単離または抽出することを含む方法；
【００９１】
種子成熟または発芽中のチオレドキシンの上昇された質を生産するトランスジェニック植物を使用し、その結果その種子中のタンパク質の質が、種子発育中または浸漬加工中に内生的に合成されるチオレドキシンによって影響を受け、それによって粉砕に先立つ外生的化学物質または酵素での調質のための必要性を排除または減少させる方法；
【００９２】
種子成熟または発芽中のチオレドキシンの上昇された質を生産するトランスジェニック植物を作成し、その結果その種子中のタンパク質の質が、種子発育中または浸漬加工中にチオレドキシンによって影響を受け、それによって粉砕に先立つ外生的化学物質または酵素での調質の必要性を排除または減少させる方法。
チオレドキシンを含むトランスジェニック種子を使用する穀物を粉砕し、より高いデンプンおよび可溶性タンパク質収率をもたらす方法。
【００９３】
本発明はさらに、プロモーターの作動可能な制御下での、熱安定性または真核細胞チオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼをコードするコード領域を含むキメラ発現カセットをゲノム中に有するトランスジェニック生物を含む。好ましくは、該トランスジェニック生物は、その種の植物中に天然には存在しない形態のチオレドキシンおよび／またはチオレドキシンレダクターゼを発現する、またはその種の植物中に天然に存在するよりもより高いレベルでチオレドキシンを発現する植物である。好ましくは、該チオレドキシンは、種子発育中の種子で発現され、したがって好ましくは種子特異的プロモーターの制御下である。所望により、チオレドキシンの発現を、誘導可能またはトランスアクチベーターに調節されるプロモーターの制御下に置き、その結果、発現は、化学的誘導または望まれるときトランスアクチベーターとのハイブリダイゼーションによって活性化される。
【００９４】
該チオレドキシンは、好適には、液胞ターゲティング配列との融合によって植物の液胞にターゲティングさせる。本発明では、チオレドキシンコード配列を、植物中で活性のプロモーターに融合させ、そして核内ゲノムまたはプラスチドゲノムに形質転換する。該プロモーターは好ましくは、種子特異的プロモーター、例えば、ｇａｎｎｍａ−ｚｅｉｎプロモーターである。該プロモーターは代替的に、化学的に誘導可能なプロモーター、例えば、タバコＰＲ−１ａプロモーターであり得；または化学的に誘導されるトランスアクチベーターに調節されるプロモーターであり得、ここで該トランスアクチベーターは、化学的に誘導されるプロモーターの制御下であり；ただし、ある種の状況では、構成的プロモーター、例えば、ＣａＭＶ　３５ＳまたはＧｅｌｖｉｎプロモーターを使用し得る。化学的に誘導可能なプロモーターについては、植物に形質転換されたチオレドキシン遺伝子の発現を、化学的インヂューサーの茎葉適用によって適当なときに活性化し得る。
【００９５】
代替的には、チオレドキシンコード配列は、トランスアクチベーターに調節されるプロモーターの制御下であり、そして発現を、この配列で形質転換された植物を、該トランスアクチベーターを発現する第２の植物と交雑することによって達成する。この方法の好ましい形態では、チオレドキシンコード配列を含む第１の植物が種子親であり、かつ雄性不稔であり、一方トランスアクチベーターを発現する第２の植物が、花粉親である。種子でのチオレドキシンの発現を、該第１および第２植物を混植することによって達成し、例えばその結果、該第１植物を、第２植物によって受粉させ、そしてチオレドキシンを、該第２親からのトランスアクチベーター遺伝子によって発現されるトランスアクチベーターで、該トランスアクチベーターに調節されるプロモーターを活性化することによって、第１植物の種子中で発現させる。
【００９６】
本出願で記載される核酸配列を、慣行組換えＤＮＡ技術を使用して植物細胞に取り込ませることができる。一般には、これは、本発明のコード配列を、当業界で既知の標準的クローニング手法を使用して、該コード配列がヘテロロガスである（すなわち通常存在しない）発現系へ挿入することに関係する。該ベクターは、挿入された、タンパク質をコードする配列の転写および翻訳のため必要なエレメントを含む。当業界で既知の多くの数のベクター系、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、および他の修飾ウイルスを使用できる。
【００９７】
好適なベクターは、ウイルスベクター、例えばラムダベクター系、λｇｔ１１、λｇｔ１０およびシャロン４；プラスミドベクター、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＲシリーズ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲＫ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＣＤＮＡＩＩ；および他の類似の系を含み得るがこれらに限定されない。該発現系の要素はまた、発現を増加させるように修飾し得る。例えば、トランケート配列、ヌクレオチド置換または他の修飾を実施し得る。ここで記載される発現系を使用し、好適な条件下で、有益に任意の作物植物細胞に形質転換できる。形質転換細胞を植物体に再生し、その結果本発明のヌクレオチド配列をトランスジェニック植物で発現させる。
【００９８】
コード配列および隣接配列の修飾
微生物性源に由来する遺伝子の植物でのトランスジェニック発現は、植物でのそれらの発現を達成および最適化するためのこれらの遺伝子の修飾を要し得る。特に、別の酵素をコードするが、該ネイティブ微生物の同じ転写物によってコードされるバクテリアＯＲＦは、別の転写物上で植物では最も良く発現される。これを達成するために、それぞれの微生物性ＯＲＦを個々に単離し、そして該ＯＲＦの５’末端の植物プロモーター配列および該ＯＲＦの３’末端の植物転写ターミネーターを提供するカセット内でクローン化する。
【００９９】
該単離されたＯＲＦ配列は好ましくは、開始ＡＴＧコドンおよび終結ＳＴＯＰコドンを含むが、該開始ＡＴＧコドンおよび該ＳＴＯＰコドンをこえて追加的配列を含み得る。加えて、該ＯＲＦはトランケートされるが、なお要求される活性を保持し得る；特に長いＯＲＦのために、活性を保持するトランケートバージョンが、トランスジェニック生物での発現のために好ましくあり得る。「植物プロモーター」および「植物転写ターミネーター」によって、植物細胞内で作動するプロモーターおよび転写ターミネーターを意味することを意図する。これは、非植物源、例えば、ウイルス（例はカリフラワーモザイクウイルスである）に由来し得るプロモーターおよび転写ターミネーターを含む。
【０１００】
ある場合には、該ＯＲＦコード配列および隣接配列への修飾が要求されない。所望のＯＲＦを含むフラグメントを単離し、そして植物プロモーターの下流にそれを挿入することで十分である。例えば、Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： ７５４−７５６（１９９３））は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎａｈＧ遺伝子を、ＣａＭＶ　３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ　ｔｍｌターミネーターの制御下で、首尾良く、該コード配列の修飾なく、および、ｎａｈＧ　ＯＲＦに、なお付着された該ＡＴＧの上流のｘ　ｂｐのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ遺伝子、およびなお付着された該ＳＴＯＰコドンの下流のｙ　ｂｐで、トランスジェニック植物で発現させた。好ましくは小さい隣接微生物性配列は、該ＡＴＧの上流におよび該ＳＴＯＰコドンの下流に付着されたままであるべきである。実際上は、そのような構成は、制限部位の利用可能性に依存し得る。
【０１０１】
他の場合では、微生物の源に由来する遺伝子の発現は、発現の問題を提供し得る。これらの問題は、当業界で良く特徴付けられ、そして特にＢａｃｉｌｌｕｓのようなある種の源に由来する遺伝子に共通する。これらの問題は、本発明のヌクレオチド配列に当てはまり得、そしてこれらの遺伝子の修飾を、現在当業界で周知の技術を使用して企てることができる。以下の問題に遭遇し得る：
【０１０２】
１．コドン用法
植物で好ましいコドン用法は、ある種の微生物での好ましいコドン用法と異なる。クローン化微生物性ＯＲＦ内でのコドンの用法の、植物遺伝子での（および標的植物からの特定の遺伝子での）用法との比較は、好ましくは変化されるべきＯＲＦ内でのコドンの同定を可能とする。典型的には、植物進化は、単子葉植物の第三の塩基位置のヌクレオチドＣおよびＧの強い優先性に向かう傾向を有し、一方双子葉植物はしばしば、この位置でヌクレオチドＡまたはＴを使用する。遺伝子を特定標的トランスジェニック種のため好ましいコドン用法を取り込ませるように修飾することによって、ＧＣ／ＡＴ含量および誤ったスプライシングについての、以下に記載の多くの問題を解消する。
【０１０３】
２．ＧＣ／ＡＴ含量
植物遺伝子は典型的には、３５％より多いＧＣ含量を有する。ＡおよびＴヌクエオチドに富むＯＲＦ配列は、植物で幾つかの問題を引き起こすことができる。第１に、ＡＴＴＴＡのモチーフは、伝令の脱安定化を引き起こすと信じられ、そして多くの短命ｍＲＮＡの３’末端で見出される。第２に、伝令内の不適当な位置でのポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＴＡＡＡの存在は、転写の未成熟トランケーションを引き起こすと信じられる。加えて、単子葉植物は、スプライシング位置（以下参照）としてＡＴに富む配列を認識し得る。
【０１０４】
３．開始メチオニンに隣接する配列
植物は、これらの伝令が定義されたリボゾーム結合部位を有しない点で微生物と異なる。むしろ、リボゾームが伝令の５’末端に付着し、翻訳を開始する最初に利用可能なＡＴＧを走査すると信じられている。にもかかわらず、ＡＴＧに隣接するある種のヌクレオチドについての優先性があり、そして微生物遺伝子の発現を、該ＡＴＧでの真核細胞コンセンサス翻訳イニシエーターの包含によって高めることができると信じられる。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（１９９３／１９９４ｃａｔａｌｇ，ｐａｇｅ ２１０）は、植物でのＥ． ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子の発現のコンセンサス翻訳イニシエーターとしてある配列を示唆した。
【０１０５】
さらに、Ｊｏｓｈｉ（ＮＡＲ １５：６６４３−６６５３（１９８７））は、ＡＴＧに隣接する多くの植物配列を比較し、そして別のコンセンサス配列を示唆した。植物中で微生物性ＯＲＦの発現において困難性が遭遇する状況では、開始ＡＴＧにこれらの配列のいずれかを含めることが、翻訳を改善し得る。そのような場合では、該コンセンサスの最後の３ヌクレオチドは、第２ＡＡ残基の修飾のため、修飾配列に含めるために適当ではないかもしれない。ＧｅｎＢａｎｋデータベース中にある１４のトウモロコシ遺伝子の概観は、以下の結果を提供した：
１４のトウモロコシの遺伝子中の開始ＡＴＧの前の位置
【表８】
2004500885.tif 000009
【０１０６】
この分析を、該ヌクレオチド配列が取りこまれる望まれる植物種、および好ましいヌクレオチドを取りこませるように修飾されたＡＴＧに隣接する配列についてなすことができる。
４．誤りのスプライシング部位の除去
非植物源からクローン化され、および植物での発現のために最適化されていない遺伝子はまた、植物で５’または３’スプライシング部位として認識され得るモチーフを含み得、そして切断され、こうしてトランケートまたは欠失伝令を生成する。これらの部位を当業界で周知の技術を使用して除去することができる。
【０１０７】
コード配列および隣接配列の修飾のための技術は、当業界で周知である。微生物性ＯＲＦの当初発現が低く、そして前記のように配列に変更を作成するのが適当だとみなされる場合、そのとき合成遺伝子の構築を、当業界で周知の方法にしたがって達成できる。これらは、例えば、公開特許開示ＥＰ０３８５９６２（Ｍｏｎｓａｎｔｏの）、ＥＰ０３５９４７２（Ｌｕｂｒｉｚｏｌの）およびＷＯ９３／０７２７８（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙの）に記載される。ほとんどの場合、トランスジェニック植物に移入する前に、一過性検定（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｓｓａｙ）プロトコル（これは当業界で周知である）を使用して、遺伝子構築物の発現をアッセイすることが好ましい。
【０１０８】
植物発現カセットの構築
トランスジェニック植物での発現の意図されるコード配列を、まず植物で発現可能な好適なプロモーターの後方の発現カセットにアセンブルする。発現カセットはまた導入遺伝子の発現のために要求又は選択された任意のさらなる配列を含み得る。そのような配列は、転写ターミネーター、発現を高めるｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ配列、例えば、イントロン、ｖｉｔａｌ配列、及び特定のオルガネラ及び細胞区画への遺伝子産物のターゲティングの意図される配列を含むがこれらに限定されない。これらの発現カセットを次いで以下に記載の植物形質転換ベクターに容易に送達することができる。以下は典型的な発現カセットの種々の構成要素の記載である。
【０１０９】
１．プロモーター
発現カセットで使用されるプロモーターの選択は、形質転換植物中の導入遺伝子の位置的かつ時間的な発現パターンを決定する。選択したプロモーターは、特定細胞型中（例えば、植物表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）又は特定組織または器官（例えば、根、葉又は花）において導入遺伝子を発現する。その選択は、遺伝子産物の蓄積の望まれる位置を反映する。又は、選択されたプロモーターは、種々の誘導条件の下で遺伝子の発現を駆動し得る。プロモーターは、その強度、即ち転写を促進する能力が多様である。 利用される宿主細胞系に依存して、その遺伝子ネイティブのプロモーターを含む、多くの好適なプロモーターの中のいずれかを利用する。以下は、発現カセット中で使用し得るプロモーターの非限定的な例である。
【０１１０】
ａ．構成的発現、ユビキチンプロモーター：
ユビキチンは、多くの細胞型で蓄積することが知られた遺伝子産物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物（例えば、ヒマワリ Ｂｉｎｅｔ ｅｔ ａ１．， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９： ８７−９４（１９９１）； トウモロコシ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２： ６１９−６３２（１９８９）；及びアラビドプシス−Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１： ８９５−９０６（１９９３））で使用するために幾つかの種からクローニングされた。トウモロコシのユビキチンプロモーターは、トランスジェニック単子葉植物系で開発され、そして単子葉植物の形質転換のために構築されたその配列及びベクターは、特許出願公開 ＥＰ ０ ３４２ ９２６ （Ｌｕｂｒｉｚｏｌの）に開示されている。Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２：４１９−４９５（１９９３））は、トウモロコシユビキチンプロモーター及び第一のイントロンを含むベクター （ｐＡＨＣ２５）、及びマイクロプロジェクタイルボンバードメントによって導入されるとき、多くの単子葉植物の細胞懸濁液中でのその高い活性を記載する。
【０１１１】
アラビドプシスユビキチンプロモーターは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用のために理想的である。ユビキチンプロモーターは、単子葉植物及び双子葉植物両方のトランスジェニック植物における遺伝子発現に好適である。好適なベクターは、ｐＡＨＣ２５又はこの出願で記載された形質転換ベクターの全ての誘導体であり、適当なユビキチンプロモーター及び／又はイントロン配列の導入によって修飾される。
【０１１２】
ｂ．構成的発現、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、特許出願公開 ＥＰ ０ ３９２ ２２５ （実施例 ２３）に記載されている。ｐＣＧＮ１７６１は、「ダブル」ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーター及びプロモーター及びｔｍｌ 転写ターミネーターを包含し、プロモーター及びターミネーターの間の独特なＥｃｏＲｌ部位とｔｍｌ転写ターミネーターを含み、そしてｐＵＣ型のバックボーンを有する。存在するＥｃｏＲＩ部位に加えてＮｏｔｌ及びＸｈｏｌ部位を含む、修飾ポリリンカーを有する、ｐＣＧＮ１７６１の誘導体を構築する。該誘導体はｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸと命名する。ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸは、ｃＤＮＡ 配列又はコード配列（微生物性ＯＲＦ 配列を含む）の、トランスジェニック植物における３５Ｓプロモーターの制御下でのその発現の目的のために、そのポリリンカー内でのクローニングのために有用である。そのような構築物の、完全な３５Ｓプロモーター−コード配列−ｔｍｌターミネーター・カセットを、以下に記載のもののような形質転換ベクターに移入するため、プロモーターの５’側のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｓａｌｌ及びＸｂａｌによって、及びターミネーターの３’側のＸｂａｌ、ＢａｍＨＩ及びＢｇＩＩによって切除することができる。
【０１１３】
さらに、ダブル３５Ｓプロモーターフラグメントは、別のプロモーターで置換するために、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、Ｓａｌｌ、ＸｂａｌもしくはＰｓｔｌで５’切除によって、そしてポリリンカー制限部位（ＥｃｏＲＩ、Ｎｏｔｌ又はＸｈｏｌ）の何れかで３’切除によって、除去することができる。所望であれば、クローニング部位の周辺の修飾は、翻訳を増強し得る配列の導入によって行い得る。これは特に、過剰発現が望まれる場合に有用である。例えば、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸを、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６３９，９４９の実施例３７で記載されるような翻訳開始部位の最適化によって修飾し得る。
【０１１４】
ｃ．構成的発現、アクチンプロモーター
アクチンの幾つかのアイソホームは、殆どの細胞型で発現することが知られ、そして結果的に、アクチンプロモーターは構成的プロモーターのためには良い選択である。特に、イネＡｃｔｌ遺伝子由来のプロモーターは、クローニングされ、そして特性把握されてきた（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： １６３−１７１（１９９０））。プロモーターの１．３ ｋｂフラグメントは、イネプロトプラストでの発現のために必要とされる全ての調節エレメントを含むことが見出された。さらに、Ａｃｔｌプロモーターを基にした多くの発現ベクターを、単子葉植物で使用するために特異的に構築した（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３１： １５０−１６０（１９９１））。これらは、Ａｃｔｌ−イントロン１、Ａｄｈｌ５’フランキング配列及びＡｄｈｌ−イントロン１（トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来）及びＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター由来の配列を取りこむ。非常に高い発現を示すベクターは、３５Ｓ及びＡｃｔｌイントロン又はＡｃｔｌ ５’フランキング配列及びＡｃｔｌイントロンの融合体であった。開始ＡＴＧ（ＧＵＳレポーター遺伝子の）周辺配列の至適化によっても発現が増強する。
【０１１５】
ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３１： １５０−１６０（１９９１）によって記載されたプロモーター発現カセットは、遺伝子発現のために容易に修飾することができ、そして単子葉植物宿主で使用するのに特に好適である。例えば、プロモーター含有フラグメントをＭｃＥｌｒｏｙ構築物から除き、ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸ中のダブル３５Ｓプロモーターを置換するために使用し、そのときこれは特定遺伝子配列の挿入に利用可能である。こうして構築した融合遺伝子を、適当な形質転換ベクターに移入することができる。別の報告では、その第一イントロンを有するイネＡｃｔｌプロモーターはまた、培養オオムギ細胞での高い発現を方向付けることが見出された （Ｃｈｉｂｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２：５０６−１０９（１９９３））。
【０１１６】
ｄ． 誘導可能発現、ＰＲ−１プロモーター
ｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸでのダブル３５Ｓプロモーターを、好適に高発現レベルを生じる任意の別の、選択のプロモーターで置換し得る。実施例の方法によって、Ｕ． Ｓ．特許番号 ５，６１４，３９５に記載された、化学的調節可能プロモーターの１つは、該ダブル３５Ｓプロモーターを置換し得る。選択のプロモーターは、制限酵素によって、その源から好ましくは切除するが、また適当な末端制限部位を有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅することも可能である。ＰＣＲ−増幅を行うなら、プロモーターは、標的ベクター内で増幅したプロモーターのクローニングの後、増幅エラーについてチェックするために、再び配列決定するべきである。化学的／病原体調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターを、プラスミド ｐＣＩＢ１００４から切断し（構築のために、ＥＰ ０ ３３２ １０４の実施例２１を参照）、プラスミド ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ （Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２）に移入した。ｐＣＩＢ１００４を、Ｎｃｏｌで切断し、そして線状フラグメントの、得られた３’オーバーハングを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって平滑にする。
【０１１７】
次いで、該フラグメントをＨｉｎｄｌｌｌで切断し、そして得られたＰＲ−１ａ プロモーター含有フラグメントをゲル精製し、そしてダブル３５Ｓ プロモーターを除いたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸへとクローニングする。これは、Ｘｈｏｌでの切断、Ｔ４ ポリメラーゼによる平滑末端化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）、その後のＨｉｎｄｌＩｌでの切断、そのなかにｐＣＩＢ１００４プロモーターフラグメントがクローニングされている、大ベクター−ターミネーターを含むフラグメントの単離によって行う。
【０１１８】
これによって、ＰＲ−１ａプロモーター及びｔｍｌ ターミネーター及び独特のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位のある介入ポリリンカーを有する、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体を生成する。選択されたコード配列を、このベクターに挿入することができ、そして該融合産物（即ち、プロモーター−遺伝子−ターミネーター）は以下に記載したものを含む、任意の選択された形質転換ベクターに連続的に移入することができる。Ｕ．Ｓ．特許番号５，５２３，３１１及び５，６１４，３９５に記載のベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸、及びサリチル酸化合物を含む、種々の化学的調節剤を使用し、本発明にしたがって形質転換された植物において、選択されたコード配列の発現を誘導し得る。
【０１１９】
ｅ． 誘導可能発現、エタノール誘導可能プロモーター
ある種のアルコール又はケトン、例えばエタノールによって誘導し得るプロモーターを使用し、本発明のコード配列の誘導可能発現を付与し得る。そのようなプロモーターは、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ 由来のａｌｃＡ 遺伝子プロモーターである（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６： １７７−１８０）。 Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓにおいて、ａｌｃＡ 遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼＩをコードし、この発現は化学的インデューサーの存在下でＡｌｃＲ転写因子によって調節される。本発明の目的のために、最小３５Ｓプロモーター（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６： １７７−１８０）に融合された、ａｌｃＡ遺伝子プロモーター配列を含んでいる、プラスミドｐａｌｃＡ：ＣＡＴ中のＣＡＴコード配列を、本発明のコード配列によって置換し、ａｌｃＡ遺伝子プロモーターの制御下での該コード配列を有する発現カセットを形成する。これは、当業界で周知の方法を使用して実施する。
【０１２０】
ｆ． 誘導性発現、グルココルチコイド−誘導可能プロモーター
ステロイドホルモンを基にした系を使用する本発明の核酸配列の発現の誘導も、考えられる。例えば、グルココルチコイドに介在される誘導系を使用し（Ａｏｙａｍａ ａｎｄ Ｃｈｕａ，（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １１： ６０５−６１２）、そして遺伝子発現を、グルココルチコイドの適用、例えば、合成グルココルチコイド、好ましくはデキサメタゾンを、好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの濃度、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲で誘導する。本発明の目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子配列を、本発明の核酸配列によって置換し、３５Ｓ最小プロモーターと融合したＧＡＬ４上流活性化配列の６コピーの制御下での本発明の核酸配列を有する発現カセットを形成する。これは、当業者には周知の方法で行われる。トランス作用因子は、ラットのグルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン（Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５４： １０７３−１０８０）に融合したヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｐ．２：７１８−７２９）のトランス活性化ドメインと融合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｋｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１： ６９９−７０４）を含む。融合タンパク質の発現は、当分野で既知の植物もしくは本明細書中に記載した植物中の発現に適する任意のプロモーターによって制御される。この発現カセットは、６ｘＧＡＬ４／最小プロモーターに融合した、本発明の核酸配列を含む植物中に含まれる。こうして、融合タンパク質の組織又は器官特異性が達成され、殺虫性毒物の誘導可能組織−または器官−特異性につながる。
【０１２１】
ｇ．根特異的発現
遺伝子発現の別のパターンは、根での発現である。好適な根のプロモータは、ｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ （ＦＥＢＳ ２９０： １０３−１０６（１９９１））によって、そしてまた特許公開出願ＥＰ ０ ４５２ ２６９においても記載されている。このプロモーターを、選択遺伝子の挿入のために好適なベクター、例えばｐＣＧＮ１７６１ ＥＮＸに移入し、そしてその後完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーター・カセットを注目の形質転換ベクターに移入する。
【０１２２】
ｈ． 傷誘導可能プロモーター
傷誘導可能プロモーターはまた、遺伝子発現のために好適である。そのような多くのプロモーターは、記載されており（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２： ５７３−５８８（１９９３）； Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： １５１−１５８（１９８９）； Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２：７８３−７９２（１９９３）； Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． ２２： １２９−１４２（１９９３）； Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３：１９１−２０１（１９９３）、そして全てのものは、本発明で使用するのに好適である。Ｌｏｇｅｍａｎｎらは、双子葉植物ジャガイモｗｕｎ１遺伝子の５’上流配列を記載する。Ｘｕ らは、双子葉植物ジャガイモ由来の傷誘導性プロモーター（ｐｉｎ２）が、単子葉植物のイネにおいて活性であることを示す。さらに、Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅは、傷に誘導され、そして標準的技術を使用して同類の（ｃｏｇｎａｔｅ）プロモーターを単離するために使用することができる、トウモロコシＷｉｐＩ ｃＤＮＡのクローニングを記載している。同様に、Ｆｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．及び Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．は、局所傷部位及び病原体侵入部位で発現される、単子葉植物Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来の傷に誘導される遺伝子を記載した。当業者に周知であるクローニング技術を使用して、これらプロモーターを好適なベクターに移入し、本発明に関する遺伝子に融合させ、そして植物傷部位でこれらの遺伝子を発現するために使用することが可能である。
【０１２３】
ｉ． 髄での好ましい発現：
特許出願ＷＯ ９３／０７２７８は、髄細胞で優先的に発現するトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の単離を記載する。転写開始点から１７２６塩基まで伸長する該遺伝子配列及びプロモーターが提示されている。標準的な分子生物学技術を使用して、このプロモーター又はその一部をベクター、例えば、ｐＣＧＮ１７６１に移入させることができ、ここで、それは３５Ｓプロモーターを置換し、そして髄に好ましい態様で外来遺伝子の発現を駆動することができる。実際、髄に好ましいプロモーター又はその一部を含むフラグメントを、任意のベクターに移入させ、そしてトランスジェニック植物で利用するために修飾し得る。
【０１２４】
ｊ． 葉特異的発現：
ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードするトウモロコシ遺伝子 が、Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａ （１９８９）によって記載されている（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ １２： ５７９−５８９（１９８９））。標準的分子生物学技術を使用して、この遺伝子のためのプロモーターを使用して、トランスジェニック植物において葉特異的な態様で任意の遺伝子の発現を駆動することができる。
【０１２５】
ｋ． 花粉特異的な発現：
ＷＯ ９３／０７２７８ は、花粉細胞で発現するトウモロコシのカルシウム依存性のタンパク質キナーゼ （ＣＤＰＫ） 遺伝子の単離を記載している。該遺伝子配列及びプロモーターは、転写開始点から１４００塩基まで伸長する。標準的分子生物学技術を用いて、このプロモーター又はその一部を、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに移入させることができ、ここでそれは３５Ｓプロモーターを置換し、そして花粉特異的な態様で、本発明のＮＩＭ１ホモログの発現を駆動する３５Ｓプロモーターを置換し、そして花粉特異的態様で本発明の核酸配列の発現を駆動するために使用することができる。
【０１２６】
２． 転写ターミネーター
種々の転写ターミネーターは、発現カセットでの使用ために利用できる。これらは、導入遺伝子を超える転写の終結とその正確なポリアデニル化に関与する。適当な転写ターミネーターは、植物で機能することが既知であるものであり、そしてＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーター、ｔｍｌターミネーター、 ノパリンシンターゼターミネーター及びエンドウｒｂｃＳ Ｅ９ ターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方で使用することができる。さらに、遺伝子のネガティブ転写ターミネーターを使用してもよい。
【０１２７】
３． 発現を高め又は調節するための配列
多くの配列は、転写ユニット内からの遺伝子発現を高めることが判っており、これらの配列は、トランスジェニック植物でそれらの発現を増加するために本発明の遺伝子と組み合わせて使用することも可能である。
【０１２８】
種々のイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を増加させることが示されている。例えば、トウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞中に導入する場合、その同類の（ｃｏｇｎａｔｅ）プロモーターの下で、野生型遺伝子の発現を顕著に高める。イントロン１は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築体において、発現を増加させ、特に有効であることが判った（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ １： １１８３−１２００（１９８７））。同じ実験系において、トウモロコシのｂｒｏｎｚｅ １ 遺伝子由来のイントロンは、発現を増加する点で、類似の効果を示した。イントロン配列は、植物の形質転換ベクター、典型的には非翻訳リーダー内にルーチンに取りこませる。
【０１２９】
ウイルスに由来する多くの非翻訳リーダー配列は、発現を高めることが知られ、そしてこれらは、特に双子葉植物細胞において有効である。特に、タバコモザイクウイルス （ＴＭＶ，「Ｗ−配列」）、トウモロコシ退緑斑紋ウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＣＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（Ａｌｆａｌｆａ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）からのリーダー配列が、発現を増加させる点で有効であることが示された （例えば、Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ８６９３−８７１１（１９８７）； Ｓｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １５： ６５−７９（１９９０））。
【０１３０】
４． 細胞内の遺伝子産物のターゲティング
遺伝子産物をターゲティングさせるための種々の機構が、植物中に存在することが知られ、そしてこれら機構の機能化を制御する配列は、いくらか詳細に特徴把握された。例えば、クロロプラストへ遺伝子産物をターゲティングさせることは、クロロプラストへの移入中に切断され、成熟したタンパク質を生成する、多様なタンパク質のアミノ酸末端に見出されているシグナル配列によって制御される（例えば、Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １５１０４−１５１０９（１９８８））。これらのシグナル配列は、ヘテロロガス遺伝子産物に融合され、ヘテロロガス産物のクロロプラスト内への移入をもたらすことができる （ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ３５８−３６３（１９８５））。適当なシグナル配列についてコードするＤＮＡを、クロロプラストに局在すると知られているＲＵＢＩＳＣＯ タンパク質、ＣＡＢ タンパク質、ＥＰＳＰ合成酵素、ＧＳ２ タンパク質及び多くの他のタンパク質をコードするｃＤＮＡｓの５’末端から単離することができる（Ｕ．Ｓ特許番号５，６３９，９４９の実施例３７の「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｗｉｔｈ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」の題名の章を参照）。
【０１３１】
他の遺伝子産物は、ミトコンドリア及びペルオキシソームのような他のオルガネラに局在化する（例えば、Ｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １３： ４１１−４１８（１９８９））。これらの産物をコードするｃＤＮＡは、これらのオルガネラにヘテロロガス遺伝子産物をターゲティングさせることをもたらすように操作することができる。そのような配列の例は、核コードＡＴＰａｓｅ及びミトコンドアについて特異的なアスパルテートアミノトランスフェラーゼ・アイソホームである。細胞性のタンパク質ボディをターゲティングさせることが、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ６５１２−６５１６（１９８５））によって記載されている。
【０１３２】
加えて、他の細胞区画に遺伝子産物をターゲティングさせることを引き起こす配列が特性分析された。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト、アリューロン細胞由来の細胞外分泌顆粒へのターゲティングに関与する（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ７６９−７８３（１９９０））。さらに、カルボキシ末端配列と組み合わされたアミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞へのターゲティングに関与する （Ｓｈｉｎｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １４： ３５７−３６８（１９９０））。
【０１３３】
所望の導入遺伝子配列への上記の適切なターゲティング配列の融合によって、任意のオルガネラ又は細胞区画に、導入遺伝子産物を方向付けることが可能である。クロロプラストへのターゲティングについて、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ 遺伝子、ＣＡＢ 遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、又はＧＳ２ 遺伝子由来のクロロプラストシグナル配列を、導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧに読み枠で融合させる。選択されたシグナル配列は既知の切断部位を含むべきであり、そして構築すべき融合体は、切断に必要な切断部位の後ろの任意のアミノ酸を考慮に入れるべきである。幾つかの場合において、この要件は、切断部位と導入遺伝子ＡＴＧ間の少ない数のアミノ酸の付加、又は導入遺伝子配列内の幾つのアミノ酸の置換によって満たされることもできる。
【０１３４】
クロロプラストへの移入のために構築された融合体を、Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ １０８１−１０９１（１９８２）中Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．によって記載された技術およびＷａｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０５：４４６−４５３（１９８６）を使用して、インビトロで転写された構築物のインビトロでの翻訳、次いでインビトロのクロロプラストの取り込みの効率について試験することができる。これらの構築技術は当業界で周知であり、そしてミトコンドリア及びペルオキシソムに等しく適用可能である。
【０１３５】
細胞性ターゲティングについての上記の機構を、それらの同類プロモーターと組み合わせてだけでなく、またヘテロロガスプロモーターと組み合わせて利用し、ターゲティングシグナルが由来するプロモーターの発現パターンと異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節下で、特異的細胞−ターゲティング目標をもたらすことができる。
【０１３６】
植物形質転換ベクターの構築
植物形質転換のために利用可能である多くの形質転換ベクターが、植物形質転換技術分野での通常の技術を有するものに既知であり、そして本発明に関係する遺伝子を、任意のそのようなベクターと組み合わせて使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術及び形質転換のための標的種に依存する。ある種の標的種のために、種々の抗生物質又は除草剤選択マーカーが好ましくあり得る。形質転換にルーチンに使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連する抗生物質に対する抵抗性を付与する、ｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ，Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８２）；Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４： １８４−１８７（１９８３））、除草剤ホスヒノスリシンに対する抵抗性を付与する、Ｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ／ Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ １８： １０６２（１９９０）； Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７９： ６２５−６３１（１９９０））、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する、ｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｌｅｍａｎｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４： ２９２９−２９３１）、およびメトトレキセートにたいする抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）： １０９９−１１０４（１９８３））及びグリフォサートに対する抵抗性を付与する、ＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許番号４，９４０，９３５及び５，１８８，６４２）、およびマンノースを代謝する能力を提供するマンノース−６−イソメラーゼ遺伝子（米国特許５７６７３７８および５９９４６２９）を含む。
【０１３７】
１．アグロバクテリウム形質転換に好適なベクター
多くのベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する形質転換に利用可能である。これらは典型的には、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を有し、そしてベクター例えばｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４））及びｐＸＹＺを含む。以下に、アグロバクテリウム形質転換に好適な、２種の典型的なベクターの構築を記載する。
【０１３８】
ａ．ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１：
バイナリーベクターｐｃＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１を、アグロバクテリウムでの使用のために組換え体ベクターの構築のために使用し、そして以下の態様で構築する。ｐＴＪＳ７５ｋａｎをｐＴＪＳ７５（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６４： ４４６−４５５（１９８５））のＮａｒＩ消化によって作出し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子の切除、次いでＮＰＴＩＩを有するｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩフラグメントの挿入をもたらす（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ， Ｇｅｎｅ １９： ２５９−２６８（１９８２）； Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４−１８７ （１９８３）； ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４： ２６６−２７６（１９９０））。ＸｈｏＩリンカーをレフト及びライトＴ−ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子及びｐＵＣポリリンカーを含むＰＣＩＢ７（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１（１９８７））のＥｃｏＲＶフラグメントにライゲートし、そしてＸｈｏＩ消化したフラグメントをＳａｌＩ消化ｐＴＪＳ７５ｋａｎにクローニングし、ｐＣＩＢ２００を作出する（ＥＰ ０ ３３２ １０４、実施例１９参照）。ｐＣＩＢ２００は、以下の独特なポリリンカー制限部位を含む：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、及びＳａｌＩ。
【０１３９】
ｐＣＩＢ２００１は追加的制限部位のポリリンカーへの挿入によって作出したｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー中の独特な制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＨｐａＩ及びＳｔｕＩである。これらの独特な制限部位を含むことに加えて、ｐＣＩＢ２００１は、また植物及び細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム介在形質転換のためのレフト及びライトＴ−ＤＮＡボーダー、Ｅ．ｃｏｌｉと他の宿主の間の移動のためのＲＫ−２に由来するｔｒｆＡ機能、及びまたＲＫ２からのＯｒｉＴ及びＯｒｉＶ機能を有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、植物発現カセット自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために好適である。
【０１４０】
ｂ．ｐＣＩＢ１０及びそのハイグロマイシン選択誘導体：
バイナリベクターｐＣＩＢ１０は、植物での選択のためのカナマイシン抵抗性をコードしている遺伝子及びＴ−ＤＮＡライト及びレフトボーダー配列を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ及びアグロバクテリウムでの複製をそれに可能とする広宿主範囲プラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組みこんでいる。その構築は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１（１９８７））に記載されている。ｐＣＩＢ１０の種々の誘導体を構築し、これらは、Ｇｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ２５： １７９−１８８（１９８３））によって記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのための遺伝子を組みこんでいる。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、又はハイグロマイシン及びカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）におけるトランスジェニック植物細胞の選択を可能とする。
【０１４１】
２．非アグロバクテリウム形質転換のために好適なベクター
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用しない形質転換は、選ばれた形質転換ベクター中のＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、そして結果的にこれらの配列を欠くベクターは、Ｔ−ＤＮＡ配列を含む前記のもののようなベクターに加えて利用することができる。アグロバクテリウムによらない形質転換技術は、パーティクルボンバードメント、プロトプラスト取り込み（例えば、ＰＥＧ及びエレクトロポレーション）及びマイクロインジェクションによる形質転換を含む。ベクターの選択は、大部分は形質転換される種について好ましい選択に依存する。以下に、非アグロバクテリウム形質転換のため好適な典型的なベクターを記載する。
【０１４２】
ａ．ｐＣＩＢ３０６４
ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（又はホスヒノスリシン）による選択と組み合わせた直接的遺伝子移入技術に好適な、ｐＵＣに由来するベクターである。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、Ｅ．ｃｏｌｉＧＵＳ遺伝子及びＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネーターへの作動可能な融合でＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含み、そしてＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている。このベクターの３５Ｓプロモーターは、開始部位の５’側に２つのＡＴＧ配列を含む。これらの部位は、そのＡＴＧを除き、そして制限部位ＳｓｐＩ及びＰｖｕＩＩを生成するようなやり方で、標準的ＰＣＲ技術を使用して突然変異されている。新しい制限部位は、独特なＳａｌＩ部位から９６及び３７ｂｐはなれ、及び実際の開始部位から１０１及び４２ｂｐはなれている。得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と命名する。次いでＧＵＳ遺伝子をＳａｌＩ及びＳａｃＩでの消化によってｐＣＩＢ３０２５から切除し、末端を平滑化し、そしてプラスミドｐＣＩＢ３０６０を生成する。
【０１４３】
プラスミドｐＪＩＴ８２をＪｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｎｏｒｗｉｃｈから取得し、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐのＳｍａＩフラグメントを切除し、そしてｐＣＩＢ３０６０（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ６： ２５１９−２５２３（１９８７））のＨｐａＩ部位に挿入する。これはｐＣＩＢ３０６４を生成し、これは除草剤選択のための、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びターミネーターの制御下のｂａｒ遺伝子、アンピシリン抵抗性の遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉでの選択のため）及び独特な制限部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＢａｍＨＩを有するポリリンカーを含む。このベクターは、これら自身の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングのために好適である。
【０１４４】
ｂ．ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５：
ｐＳＯＧ３５はメトトレキセートに対する抵抗性を付与する選択マーカーとしてＥ．ｃｏｌｉ遺伝子ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＦＲ）を利用する、形質転換ベクターである。ＰＣＲを使用し、３５Ｓプロモーター（−８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子からのイントロン６（−５５０ｂｐ）及びｐＳＯＧ１０からのＧＵＳ非翻訳リーダー配列の１８ｂｐを増幅する。Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロフォレートレダクターゼタイプＩＩ遺伝子をコードする２５０ｂｐフラグメントをまた、ＰＣＲによって増幅し、そしてこれら２種のＰＣＲフラグメントを、ｐＵＣ１９ベクターバックボーン及びノパリンシンターゼターミネーターを含むｐＢ１２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグメントとアセンブルする。これらのフラグメントのアセンブリによって、イントロン６配列、ＧＵＳリーダー、ＤＨＦＲ遺伝子及びノパリンシンターゼターミネーターと融合されている３５Ｓプロモーターを含む、ｐＳＯＧ１９を生成する。トウモロコシ退緑斑紋ウイルス（ＭＣＭＶ）からのリーダー配列でのＧＵＳリーダー配列の置換は、ベクターｐＳＯＧ３５を生成する。ｐＳＯＧ１９及びＰＳＯＧ３５は、アンシピリン抵抗性のｐＵＳ遺伝子を有し、そして外来物質のクローニングに利用可能なＨｉｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位を有する。
【０１４５】
３．クロロプラスト形質転換のため好適なベクター
本発明のヌクレオチド配列の植物プラスチドでの発現のために、プラスチド形質転換ベクターｐＰＨ１４３（ＷＯ９７／３２０１１、実施例３６）を使用する。該ヌクレオチド配列をｐＰＨ１４３に挿入し、それによってＰＲＯＴＯＸコード配列を置換する。このベクターを次いで、プラスチド形質転換およびスペクチノマイシン抵抗性のための形質転換体の選択のために使用する。代替的に、該ヌクレオチド配列を、ｐＰＨ１４３に挿入し、その結果それはａａｄＨ遺伝子を置換する。この場合に、形質転換体をＰＲＯＴＯＸインヒビターに対する抵抗性について選択する。
【０１４６】
形質転換
本発明の核酸配列が発現系の中にクローニングされると、これを植物細胞中に形質転換する。植物の形質転換及び再生の方法は当分野でよく知られている。例えば、Ｔｉプラスミドベクター、並びに直接的ＤＮＡ取り込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びマイクロプロジェクタイルが、外来ＤＮＡの送達に利用されてきた。さらに、アグロバクテリウム属の細菌を利用して植物細胞を形質転換することができる。以下は、双子葉植物及び単子葉植物の両者、並びに代表的プラスチド形質転換技術を形質転換するための代表的技術の記載である。
【０１４７】
１．双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は当分野でよく知られており、アグロバクテリウムに基づく技術及びアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非アグロバクテリウム技術は、プロトプラスト又は細胞による外因性遺伝的物質の直接取り込みを含むものである。これは、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションにより仲介される取り込み、パーティクルボンバードメント（粒子衝突）により仲介される送達、又はマイクロインジェクションによって達成できる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ３： ２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ： １９９：１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｓｈｎｏｌｏｇｙ ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７： ７０−７３（１９８７）により記載されている。それぞれの場合において、形質転換された細胞は、当分野で既知の標準技術を用いて全植物体に再生される。
【０１４８】
アグロバクテリウムにより仲介される形質転換は、その高い形質転換効率及び多くの異なる種に対する広範な用途の故に、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、興味の持たれる外来ＤＮＡを有するバイナリーベクター（例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１）を、共存するＴｉプラスミド上又は染色体のいずれかに宿主アグロバクテリウム菌株（例えば、ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１のための菌株ＣＩＢ５４２（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５： １５９−１６９（１９９３））が持っているｖｉｒ遺伝子の補完に依存する（ｄｅｐｅｎｄ ｏｆ）かも知れない適当なアグロバクテリウム菌株に、移入させることを含む。アグロバクテリウムへの組換えバイナリーベクターの移入は、組換えバイナリーベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを持ち、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム菌株に移動させることのできるヘルパーＥ．ｃｏｌｉ菌株を使用する、三元交配法によって達成する。別法として、この組換えバイナリーベクターは、ＤＮＡ形質転換によってアグロバクテリウムに移入させることができる（Ｈｏｅｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ９８７７（１９８８））。
【０１４９】
組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバクテリウムをその植物由来の外植体と共培養することを含み、当分野で周知のプロトコルに従うものである。形質転換された組織は、該バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダーの間に存在する抗生物質又は除草剤抵抗性マーカーを有する選択培地上で再生する。
或る遺伝子で植物細胞を形質転換するもう一つのアプローチは、不活性又は生物活性の粒子を植物組織及び細胞に推進させることを含む。この技術はすべてＳａｎｆｏｒｄの米国特許第４９４５０５０、５０３６００６、及び５１００７９２号に開示されている。一般に、この方法は、不活性又は生物活性粒子を、当該細胞の外表面を貫通させその内部への取り込みをもたらすのに有効な条件の下で、細胞へと推進させることを含む。不活性粒子を利用する場合、所望遺伝子を含むベクターで当該粒子を被覆することによって、このベクターを細胞内に導入することができる。別法として、ベクターによって標的細胞を取り巻き、その結果、該粒子の通り跡によってベクターを細胞内に運び入れることもできる。生物活性粒子（例えば、導入したいＤＮＡをそれぞれ含んでいる乾燥コウボ細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ）もまた植物細胞組織中に推進させることができる。
【０１５０】
２．単子葉植物の形質転換
殆どの単子葉植物種の形質転換もまた、現在では常法となっている。好ましい技術は、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション技術を用いるプロトプラスト中への直接的遺伝子導入、及びカルス組織中へのパーティクルボンバードメント（粒子衝突）を含む。形質転換は単一ＤＮＡ種又は多重ＤＮＡ種（即ち共形質転換）で企図することができ、これらの技術は共に本発明での使用に好適である。共形質転換は、完全なベクター構築を回避し、そして、所望の及び選択マーカーの遺伝子について連鎖していない遺伝子座を有するトランスジェニック植物を作出する利点を持ち得、それにより、もしそれが望ましいとされるならば、以後の世代で選択マーカーを除去することが可能となる。しかしながら、共形質転換を使用することの不利な点は、別々のＤＮＡ種が当該ゲノム中に組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Ｓｃｈｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： １０９３−１０９６（１９８６））。
【０１５１】
特許出願ＥＰ０２９２４３５、ＥＰ０３９２２２５、及びＷＯ９３／０７２７８は、選抜された近交系トウモロコシからのカルス及びプロトプラストの調製、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを用いるプロトプラストの形質転換、及び形質転換されたプロトプラストからのトウモロコシ植物の再生のための技術を記載している。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ６０３−６１８（１９９０））およびＦｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３−８３９（１９９０））は、パーティクルボンバードメントを用いるＡ１８８に由来するトウモロコシ系統の形質転換のための技術を公表している。さらに、ＷＯ９３／０７２７８及びＫｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １９４−２００（１９９３））は、パーティクルボンバードメントによる選抜近交系トウモロコシの形質転換の技術を記載している。この技術は、授粉の１４−１５日後のトウモロコシ雌穂から切り取った１．５−２．５ｍｍ長の未熟なトウモロコシ胚、及びボンバードメントのためのＰＤＳ−１０００Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ装置を利用するものである。
【０１５２】
イネの形質転換もまた、プロトプラスト又はパーティクルボンバードメントを利用する直接遺伝子導入技術によって実施することができる。プロトプラストにより仲介される形質転換が、Ｊａｐｏｎｉｃａ型及びＩｎｄｉｃａ型について記載されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ７： ３７９−３８４（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４−２７７（１９８９）； Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８； ７３６−７４０（１９９０））。いずれの型もパーティクルボンバードメントを使用して常法により形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７−９６２（１９９１））。さらに、ＷＯ９３／２１３３５は、エレクトロポレーションによるイネの形質転換技術を記載している。
【０１５３】
特許出願ＥＰ０３３２５８１は、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの生成、形質転換及び再生のための技術を記載している。これらの技術によりＤａｃｔｙｌｉｓ及びコムギの形質転換が可能となる。さらに、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞へのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換が、Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １５５３−１５５８（１９９２））によって、また、未熟な胚及び未熟な胚に由来するカルスのパーティクルボンバードメントを用いるコムギの形質転換がＶａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：６６７−６７４（１９９２））及びＷｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２： １０７７−１０８４（１９９３））により記載されている。しかしながらコムギの形質転換のための好ましい技術は、未熟な胚のパーティクルボンバードメントによるコムギの形質転換を含むものであって、遺伝子送達前の高シュクロース又は高マルトース段階のいずれかを含んでいる。ボンバードメントに先立ち、体細胞胚の誘導のため、３％シュクロース及び３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇａ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５： ４７３−４９７（１９６２））に任意の数の胚（長さ０．７５−１ｍｍ）を平板培養し、これを暗所で進める。選択されたボンバードメントの日に、胚を誘導培地から取り、浸透調節物質（即ち、所望濃度、典型的には１５％のシュクロース又はマルトースを含有する誘導培地）上に配置する。
【０１５４】
この胚を２−３時間原形質分離させ、次いでボンバードメントさせる。標的プレート当たり２０個の胚が典型的であるが、それが重要という訳ではない。適当な遺伝子を持つプラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）を、標準法を用いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈殿させる。胚の各プレートを、〜１０００ｐｓｉの爆発圧、標準８０メッシュスクリーンを用いるＤｕＰｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（商標）ヘリウム装置で撃つ。ボンバードメント後、この胚を暗所に戻し、約２４時間回復させる（依然として浸透調節物質上で）。２４時間後、胚を浸透調節物質から取り、誘導培地上に戻し、ここで再生の前に約１ヶ月間保持する。およそ１ヶ月後、発達しつつある胚形成性カルスを発達させる胚の外植体を、適当な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合１０ｍｇ／Ｌ ｂａｓｔａ、そしてｐＳＯＧ３５の場合２ｍｇ／Ｌのメソトレキサート）をさらに含有する再生培地（ＭＳ ＋ １ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、５ｍｇ／Ｌ ＧＡ）に移す。およそ１ヶ月後、発達した苗条を、半分の強度のＭＳ、２％シュクロース、及び同濃度の選択剤を入れた、「ＧＡ７」として知られる、より大きな無菌容器に移す。
アグロバクテリウムを使用する単子葉植物の形質転換もまた記載されている。ＷＯ９４／００９７７及び米国特許第５５９１６１６号を参照されたい。
【０１５５】
３．プラスチドの形質転換
別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列をプラスチドゲノムに直接的に形質転換する。プラスチド形質転換の主要な利益は、プラスチドが、実質的な修飾なく細菌遺伝子を一般に発現することの可能である点、およびプラスチドが単一のプロモーターの制御下で多重のオープンリーティングフレームを発現することが可能な点である。プラスチド形質転換技術は、米国特許５４５１５１３、５５４５８１７、および５５４５８１８に、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１６７８３、およびＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９１， ７３０１−７３０５に詳細に記載されている。クロロプラスト形質転換のための基本的技術は、選択可能マーカーの近傍のクローン化されたプラスチドＤＮＡの領域を、好適な標的組織に所望の遺伝子とともに、例えば、バイオリスチック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）またはプロトプラスト形質転換（例えば塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質転換）を使用して、導入することに関係する。ターゲティング配列と呼ばれる、１ないし１．５ｋｂの近傍領域は、プラスチドゲノムの相同的組換えを容易化し、こうしてプラストームの特異的領域の置換または修飾を可能とする。
【０１５６】
最初に、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンヘの抵抗性を付与する、クロロプラスト１６Ｓ　ｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子の点突然変異を、形質転換のための形質転換マーカーとして利用する（Ｓｖａｂ， Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ， Ｐ． ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８７， ８５２６−８５３０； Ｓｔａｕｂ， Ｊ． Ｍ． ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４， ３９−４５）。これは、標的葉の１００ボンバードメントあたり約１の頻度の安定的ホモプラスミック形質転換体という結果である。これらのマーカーの間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲティングベクターの創出を可能とする（Ｓｔａｕｂ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ６０１−６０６）。形質転換頻度の実質的な増加を、優性の選択可能マーカーである、スペクチノマイシン−解毒化酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌ａａｄＡ遺伝子で、劣性のｒＲＮＡまたはｒタンパク質抗生物質抵抗性遺伝子の置換によって取得する（Ｓｖａｂ， Ｚ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ９１３−９１７）。以前に、このマーカーを、緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのプラスチドゲノムの高頻度形質転換のために首尾良く使用した（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ， Ｍ． （１９９１）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４０８３−４０８９）。プラスチド形質転換のために有用な他の選択可能マーカーが当業界で既知であり、本発明の範囲に含まれる。
【０１５７】
典型的には、形質転換に続く、近似的に１５−２０細胞分裂周期が、ホモプラスチック状態に到達するために要求される。遺伝子が相同的組換えによってそれぞれの植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーのすべてに挿入されるプラスチド発現は、核内で発現される遺伝子を超える莫大なコピー数の利益を利用し、総可溶性植物タンパク質の１０％を容易に超えることができる発現レベルを可能とする。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列を、プラスチドターゲティングベクターに挿入し、そして望まれる植物宿主のプラスチドゲノムに形質転換する。本発明のヌクレオチド配列を含む、プラスチドゲノムについてホモプラスチックな植物を取得し、そして、該ヌクレオチド配列の高発現が好ましくは可能である。
【０１５８】
実施例
本発明はさらに、以下の詳細な例を引用して記載する。これらの例は、例示の目的のみで提供し、そして特段の特定がない限り、限定を意図しない。ここで使用した標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当業界で周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）； Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ＡＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）； ａｎｄ ｂｙ Ｔ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． Ｂｅｒｍａｎ， ａｎｄ Ｌ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８４）に記載されている。
【０１５９】
実施例１：熱安定性チオレドキシンでのトウモロコシの形質転換
配列番号１に示される配列を有する、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからの熱安定性チオレドキシンを発現する遺伝子を、種特異的ｇａｍｍａ−ｚｅｉｎプロモーターの制御下で、米国特許５６２５１３６に記載されるトウモロコシに好ましいコドン、およびｐＧＩＧＵＰプラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー（ｂｏｕｎｄｒｉｅｄ）の間に組み込まれた発現カセットを使用して調製する。
【０１６０】
菌株Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４、ｐＳＢ１）をこれらの実験で使用する。ｐＡＬ４４０４は、無毒化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ヘルパープラスミドである。ｐＳＢ１は、広宿主範囲プラスミドであり、ｐＧＩＧＵＰに相同の領域およびｐＴｉＢｏ５４２の感染性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）領域からの１５．２ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含む（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ７４５−７５０）。エレクトロポレーションによるＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４、ｐＳＢ１）への、該プラスミドｐＧＩＧＵＰの導入は、ｐＧＩＧＵＰおよびｐＳＢ１の共組み込みという結果である。このプラスミドのＴ−ＤＮＡは、ユビキチンプロモーターによって駆動される、マンノースを代謝する能力を提供する、マンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ、並びに前記のチオレドキシン遺伝子を含む。
【０１６１】
アグロバクテリウムを、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンおよび１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンで補足したＹＰ培地（５ｇ／ｌのコウボエキス、１０ｇ／ｌのペプトン、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌのアガー、ｐＨ６．８）で３日間成長させる。細菌を、ループで収集し、そして１０９ないし５　１０９細胞／ｍｌの範囲の密度でＮ６液体培地に懸濁する。アグロバクテリウム細胞をまた、ＹＰ培地中の終夜懸濁物から収集し、そしてＮ６液体培地に再懸濁することができる。
【０１６２】
トウモロコシ未成熟胚を、自殖の近似的に１０ないし１４日後に取得する。未成熟接合子胚を、プレートあたり約２５未成熟胚で、胚発生性カルス形成を誘導および支持することのできる培地を含む異なるプレート内で分割する。
【０１６３】
未成熟胚を、プレート上または液体中で、選択可能マーカー遺伝子を含むＴｉプラスミドを有するアグロバクテリウムを接種する。該未成熟胚を、アグロバクテリウム接種の前または直後に、硝酸銀（１０ｍｇ／ｌ）を含むカルスイニシエーション培地に置く。近似的に２５個の未成熟胚を、それぞれのプレートに置く。接種１６ないし７２時間後、未成熟胚を、硝酸銀およびセフォタキシムのあるカルスイニシエーション培地に移す。形質転換細胞の選択を、以下のように実施する：マンノースを、インビトロでの形質転換細胞を選択するために使用する。この選択は、接種２ないし２０日後、１ｇ／Ｌもの低濃度で適用し、そして全部で２ないし１２週間維持することができる。そのように取得した胚発生性カルスを、再生の標準的培地上でマンノースの存在または不存在下で再生する。すべての植物を、マンノース耐性についてのクロロフェノールレッド（ＣＲ）テストによって試験する。このアッセイは、どの細胞がマンノースの存在下で成長できるか示すためのｐＨ感受性インジケーター色素を利用する。成長する細胞は、培地のｐＨ変化を生み出し、そしてインジケーターＣｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄを黄色から赤色に変える。マンノースへの耐性を発現する植物を、この試験で容易に同定する。ＣＲテストによって陽性の植物を、マンノース遺伝子の存在についてＰＣＲによってアッセイする。ＰＣＲテストについて陽性である植物を、サザンブロットによって分析する。
【０１６４】
再生された植物を、チオレドキシンの発現についてアッセイする。該植物は、発育的には正常である。最高発現事象に由来する後代植物からのトウモロコシ穀物を、小規模湿式粉砕加工でアッセイし、デンプン抽出性を、チオレドキシン導入遺伝子のない同じ遺伝子型のトウモロコシと比較して測定する。チオレドキシン遺伝子を発現するトウモロコシは、同質遺伝子的な非質転換トウモロコシよりも、湿式粉砕加工における実質的により大きいデンプン利用性を示す。
【０１６５】
実施例２：熱安定性チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼによるトウモロコシの形質転換
実施例１に記載の手法を使用して、トウモロコシを、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからの、チオレドキシン（配列番号１）およびチオレドキシンレダクターゼ（配列番号６）の両方をコードする遺伝子で共形質転換する。両方の遺伝子は、種子特異的ｇａｍｍａ ｚｅｉｎプロモーターの制御下である。該２種の遺伝子は、連結され、そしてｐＧＩＧＵＰプラスミドのライトおよびレフトボーダーの間に位置し、両方の遺伝子が単一インサートとして植物のクロモソームに取りこまれる傾向を高める。
【０１６６】
再生された植物を、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの発現についてアッセイする。該植物は発育的に正常である。最高発現事象に由来する後代植物からのトウモロコシ穀物を、小規模湿式粉砕加工でアッセイし、そしてデンプン抽出性を、チオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼ導入遺伝子のない同じ遺伝子型のトウモロコシと比較して測定する。チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子を発現するトウモロコシは、実質的に同質遺伝子性の非形質転換トウモロコシよりも湿式粉砕加工において実質的により大きいデンプン利用可能性を示す。
【０１６７】
実施例３：チオレドキシン遺伝子のクローニングおよび植物形質転換ベクターの構築
イネおよびコムギチオレドキシン−ｈ　ｃＤＮＡ（ｔｒｘ−ｈ）を、それぞれ発芽したイネおよびコムギ種子からの総ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化する。ｔｒｘ　ｃＤＮＡの増幅を、イネについてプライマーＮＭＤ１０９−（５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＡＧ−３’（配列番号８））およびＮＭＤ１１０（５’―ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＴＡ ＧＧＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＧＡ ＴＧ―３’（配列番号９））を使用して、コムギについてＮＭＤ１０２（５’― ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＴＣＧ Ｇ―３’（配列番号１０））およびＮＭＤ１０３（５’― ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＴＡ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＴＧ Ｔ―３’（配列番号１１））を使用して取得する。該遺伝子の、植物発現ベクター、すなわち５’末端のＢａｍＨＩおよび３’末端のＳａｃＩへのクローニング要求される適当な制限部位の挿入は、またこの反応で達成される。正確なサイズのＰＣＲ産物を、ゲル精製し、そしてＴｏｐｏ　ＰＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してクローニングする。正確なインサートを含むコロニーを、制限分析に続いて配列決定する。イネｔｒｘ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ９２５４１に公開されるものとマッチする。該コムギｃＤＮＡ配列は、Ｔ． ａｅｓｔｉｖｕｍからのｔｒｘ−ｈ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６９９１５）とマッチする。γｚｅｉｎプロモーター：６７３ｂｐ　γｚｅｉｎプロモーターのクローニングは、Ｄｒ． Ｂｒｉａｎ Ｌａｒｋｉｎｓから取得したプラスミドｐＧＺ２７．３から増幅する。この配列は、また、ｏｐａｑｕｅ ２ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ５’領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７８７８０）並びに（Ｍａｒｚａｂａｌ ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：４１−５２）に正確にマッチする。該γｚｅｉｎプロモーターは、胚乳特異的であると示された（Ｔｏｒｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４：１３９−１４９）。
【０１６８】
ｐＮＯＶ３４０１：ＰＭＩ選択でのアグロバクテリウム形質転換ベクターにおける、トウモロコシユビキチンプロモーター、プラス、イントロン−イネｔｒｘ−ｈ−３５Ｓターミネーター：
イネｔｒｘ遺伝子を、トウモロコシユビキチンプロモーター、プラス、イントロンおよび３５Ｓターミネーターを含む植物発現ベクターにクローンニングする。得られた構築物ｐＮＯＶ３４００を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、アグロバクテリウム形質転換バイナリーベクターかセットｐＮＯＶ２１１７にサブクローニングし、ｐＮＯＶ３４０１を取得する。
ｐＮＯＶ３４０５：ＰＭＩ選択でのアグロバクテリウム形質転換ベクターにおける、γｚｅｉｎプロモーター−イネｔｒｘ−ｈ−３５Ｓターミネーター：
【０１６９】
ｐＮＯＶ３４０６：ＰＭＩ選択でのアグロバクテリウム形質転換ベクターにおける、γｚｅｉｎプロモーター−コムギｔｒｘ−ｈ−３５Ｓターミネーター：
イネおよびコムギ両方のｔｒｘ−ｈ遺伝子を、前記のγｚｅｉｎプロモーターおよび３５Ｓターミネーターを含む植物発現ベクターにクローニングする。得られた構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩで消化し、プロモーター、遺伝子、ターミネーターユニットを取得し、そしてアグロバクテリウムバイナリーベクターｐＮＯＶ２１１７にサブクローニングし、それぞれｐＮＯＶ３４０５およびｐＮＯＶ３４０６を得る。ｐＮＯＶ２１１７は、トウモロコシユビキチンプロモーター、プラス、イントロンにより駆動されるホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）の遺伝子およびＮＯＳターミネータを有するバイナリーベクターである。
【０１７０】
ｐＮＯＶ：３４０８：ＰＭＩ選択でのアグロバクテリウム形質転換ベクターにおける、γｚｅｉｎプロモーター−γｚｅｉｎシグナル配列−イネｔｒｘ−ｈ−γｚｅｉｎ３’末端−３５Ｓターミネーター：
イネチオレドキシンを、細胞の内膜系にターゲティングさせるために、該γｚｅｉｎ遺伝子のＮ末端およびＣ末端からのシグナル配列を使用する（Ｔｏｒｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔａ １９２：５１２−５１８）制限部位Ｅｃｏ４７ＩＩＩを、第１のＡＴＧの後にイネチオレドキシン遺伝子の５’末端に挿入し、そして制限部位ＮｈｅＩを突然変異誘発性プライマーＮＭＤ１２４Ａ（５’― ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＧＡＴＧ―３’（配列番号１２））およびＮＭＤ１２５Ａ（５’―ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＡ―３’（配列番号１３））を使用してＰＣＲ突然変異誘発によって３’末端に挿入する。すべての突然変異はサイレントである。該遺伝子を、ｔｏｐｏ　ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングし、そして配列決定する。該ｔｒｘフラグメントは、制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＮｈｅＩでの消化によって取得する。
【０１７１】
４種のオリゴヌクレオチドを作成し、これらはγｚｅｉｎシグナル配列およびＣ末端：ＮＭＤ１２６（５’―ＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴ ＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧ ＣＴＣＧＴＴＧＣＣＣ ＴＣＧＣＴＣＴＣＣＴ ＧＧＣＴＣＴＣＧＣＴ ＧＣＧＡＧＣＧＣＣＡ ＣＣＡＧＣ―３’（配列番号１４））；ＮＭＤ１２７（５’―ＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧ ＣＴＣＧＣＡＧＣＧＡ ＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧ ＡＧＣＧＡＧＧＧＣＡ ＡＣＧＡＧＣＡＡＣＡ ＣＣＣＴＣＡＴＧＧＴ Ｇ―３’（配列番号１５））；ＮＭＤ１２８（５’― ＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴ ＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧ ＡＣＴＣＣＡＴＧＣＣ ＣＣＴＡＣＧＣＴＧＣ ＴＧＣＣＧＧＣＧＧＴ ＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴ ＧＡＧＡＧＣＴ―３’（配列番号１６））；およびＮＭＤ１２９（５’― ＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧ ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧ ＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴ ＡＧＧＧＧＣＡＴＧＧ ＡＧＴＣＧＧＣＴＧＣ ＴＧＣＡＧＡＧＣＧ―３’（配列番号１７））をコードする。
【０１７２】
ＮＭＤ１２６および１２７およびＮＭＤ１２８および１２９のオリゴ対をハイブリダイズさせ、そして標準的プロトコルにしたがってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してホスホリル化する。これらの２種のハイブリダイズし、キナーゼ化されたオリゴ対を、４通りのライゲーション反応で、前記のＥｃｏ４７ＩＩＩ、ＮｈｅＩ消化したｔｒｘおよびγｚｅｉｎプロモーターおよび３５Ｓターミネーターを含む植物発現ベクターカセットとライゲートする。得られた構築物を、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＫｐｎＩで消化し、プロモーター、遺伝子、ターミネーターユニットを取得し、そしてトウモロコシユビキチンプロモーターによって駆動される選択可能マーカーホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含むアグロバクテリウムバイナリーベクターｐＮＯＶ２１１７へサブクローニングし、ｐＮＯＶ３４０８を得る。
【０１７３】
ｐＮＯＶ３４０１、ｐＮＯＶ３４０５、ｐＮＯＶ３４０６およびｐＮＯＶ３４０８をアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）に形質転換し、そして安定的トウモロコシ形質転換のために使用する。アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼは、インビトロでイネチオレドキシンを還元することにおいて活性であると見出される。したがってトウモロコシに最適化されたＮＴＲ遺伝子を構築する。
【０１７４】
実施例４：トウモロコシに最適化されたアラビドプシスＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の構築
アラビドプシスＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ遺伝子（ＮＴＲ）は、３５ｋＤａタンパク質である。合成遺伝子を設計するために、ＮＴＲ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２３１０９）の演繹されたペプチド配列を、トウモロコシ優先性コドン表（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７−４９８）を使用するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧグループのプログラムに見出される「Ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」プログラムを使用してバックトランスレートする。該「トウモロコシに最適化された」配列をさらに独特な部位を挿入して修飾し、クローニングを容易化する。該遺伝子を、３部分にクローニングするべく設計する。それぞれのフラグメントを、該遺伝子の両方の鎖を表す６０−７５ヌクレオチド長のオリゴマーの８−１０対のハイブリダイゼーションによって構築する。１５ヌクレオチドオーバーラップを、正確な方向およびアセンブリで一連のオリゴ対の間に設計する。オリゴを、Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｉｎｃ．，（Ｔｅｘａｓ）によって合成する。
【０１７５】
遺伝子のフラグメント１（ヌクレオチド１−３０５に対応する）を、該３０５ｂｐフラグメントを、Ｔａｑポリメラーゼおよび供給者に推奨される標準的条件、テンプレートとして等モル混合物の８オリゴマー、およびプライマー
【表９】
2004500885.tif 000010
を使用してＰＣＲによって増幅することによって構築する。該遺伝子の第２のフラグメントを、３４６ｂｐフラグメント（ヌクレオチド２９９−６４５）を、テンプレートとして１０オリゴマーの等モル量の混合物、およびプライマー
【表１０】
2004500885.tif 000011
を使用してＰＣＲによって増幅することによって構築する。遺伝子の第３のフラグメントを、３８２ｂｐフラグメント（ヌクレオチド６３９−１０２１）を、テンプレートとして１０オリゴマーの当モル混合物、およびプライマー
【表１１】
2004500885.tif 000012
を使用してＰＣＲによって増幅することによって構築する。ぞれぞれのフラグメントについて増幅したＤＮＡを、ｔｏｐｏＰＣＲ２．１Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。正確な配列のある遺伝子フラグメントを、オーバーラップ制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｈｏＩおよびＡａｔＩＩを使用して結合する。該トウモロコシに最適化したアラビドプシスＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼコード配列を、配列番号２４に示し、そしてコードされたアミノ酸配列を、配列番号２５に示す。完全な遺伝子を構築し、配列決定しそしてγｚｅｉｎプロモーターおよび３５Ｓターミネーターを含む植物発現ベクターカセットにサブクローニングする。該プロモーター、遺伝子、ターミネーターユニットを次いで、アグロバクテリウムトウモロコシ形質転換ベクター単独およびイネおよびコムギチオレドキシン遺伝子と組み合わせてサブクローニングする。
【０１７６】
実施例５：イネＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子　イネＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）コード配列を配列番号２６に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【０１７７】
実施例６：前記のアラビドプシスＮＴＲおよびイネ配列のアラインメント
アラインメントされる配列
リファレンス分子：ａｒａｂ ｔｒＰＧ（配列番号２５）、１−１００２（３３４ａａ）
配列２：ＴＲＣＯＮＡＡ．ＴＸＴ（配列番号２７）、１−３１０（３１０ａａ）
相同性　７０％
アラインメントタイプ：グローバルタンパク質
パラメーター：ミスマッチ２；オープンギャップ４；伸長ギャップ１；保存Ｎ
【表１２】
2004500885.tif 000013
【０１７８】
実施例７：植物形質転換ベクター
ＰＮＯＶ４１００−ＰＴＸ５’−ＡｔＰＰＯ−３５ＳＴ’およびＵｂｑ３（Ａｔ）−イントロン−ＮＯＳベクター：
ＰＢＨ２８（アラビドプシスＵｂｑ３ｉｎｔ−ＮＯＳ）を、ＥｃｏＲＩで消化し、４７５６ｂｐのバンドを単離し、クレノーで充填し、ｐＣＴＫ２（ＰＴＸ５’−ＡｔＰＰＯ−３５ＳＴ）にライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し−２３８６ｂｐのバンドを単離し、クレノーで充填する。ｐＮＯＶ４１００は、ＰＴＸ５’、ＡｔＰＰｏ、３５Ｓ’Ｔ、ａｍｐ、Ｕｂｑ３（Ａｔ）イントロンＰＯＳを含む。接合点を配列決定する。
【０１７９】
ＰＮＯＶ４１０１−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター−ダイズチオレドキシン−ＰＰＯベクターｐＮＯＶ４１００中のＮＯＳ：
ｐＮＯＶ４１００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。ダイズβ−コングリシニンα’サブユニットプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１３７５９）をダイズ葉ゲノムＤＮＡおよびオリゴＰ９（５’―ｇａｃ ｔａａ ｇｃｔ ｔａｃ ａａｔ ｔａｔ ｔａｔ ａｔｃ ａａａ ａｔｇ ｇｃ―３’（配列番号２８））およびＰ１０（５’―ｇｃｔ ｔｔｔ ｃｃｃ ａａｔ ａｃｇ ｃａａ ｔｇ ｃ―３’（配列番号２９））（Ｓｙｌｖａｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９：９３７−９４９）を使用してＰＣＲによってクローニングする。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングし、そして配列決定する。この構築物をオリゴＰ４（５’―ｇａｃ ｔａｇ ｃｇｃ ｔｇａ ｃａｇ ａａａ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔａ ｇｇａ ａ―３’（配列番号３０））およびＰ９（５’―ｇａｃ ｔａａ ｇｃｔ ｔａｃ ａａｔ ｔａｔ ｔａｔ ａｔｃ ａａａ ａｔｇ ｇｃ―３’（配列番号２８））でＰＣＲでテンプレートとして使用する。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化する。ダイズチオレドキシンを、ダイズの発芽した種子からの総ＲＮＡおよびオリゴＰ１（５’―ｃｇｔ ａｇｇ ａｔｃ ｃａｃ ｃａｔ ｇｇｃ ｔｇａ ａｇａ ａｇａ ｇｇｇ ｔｃａ ｇｇｔ ｔｇｔ ｃ―３’（配列番号３１））およびＰ２（５’― ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））を使用してＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングし、配列決定する。この構築物を、オリゴＰ２（５’― ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））およびＰ５（５’―ｇａｃ ｔａｇ ｃｇｃ ｔｇａ ａｇａ ｇｇｇ ｔｃａ ｇｇｔ ｔｇｔ ｃｇ―３’（配列番号３３））でＰＣＲでテンプレートとして使用する。Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。上記３フラグメントと３通りにライゲートし、配列を確認する。
【０１８０】
ＰＮＯＶ４１０２−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター−ダイズチオレドキシン−タバコキチナーゼ液胞シグナル配列−ＰＰＯベクターｐＮＯＶ４１００中のＮＯＳ。ｐＮＯＶ４１００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。ダイズ−βコングリシニンα’サブユニットプロモーターを、ダイズ葉ゲノムＤＮＡおよびオリゴＰ９（５’―ｇａｃ ｔａａ ｇｃｔ ｔａｃ ａａｔ ｔａｔ ｔａｔ ａｔｃ ａａａ ａｔｇ ｇｃ―３’（配列番号２８））およびＰ１０（５’― ｇｃｔ ｔｔｔ ｃｃｃ ａａｔ ａｃｇ ｃａａ ｔｇｃ―３’（配列番号２９））を使用してＰＣＲによってクローニングする。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングし、そして配列決定する。この構築物を、Ｐ４（５’―ｇａｃ ｔａｇ ｃｇｃ ｔｇａ ｃａｇ ａａａ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔａ ｇｇａ ａ―３’（配列番号３０））およびＰ９（５’― ｇａｃ ｔａａ ｇｃｔ ｔａｃ ａａｔ ｔａｔ ｔａｔ ａｔｃ ａａａ ａｔｇ ｇｃ―３’（配列番号２８）でＰＣＲでテンプレートとして使用する。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化する。ダイズチオレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＩ４４１５０５）を、ダイズの発芽した種子からの総ＲＮＡおよびオリゴＰ１（５’―ｃｇｔ ａｇｇ ａｔｃ ｃａｃ ｃａｔ ｇｇｃ ｔｇａ ａｇａ ａｇａ ｇｇｇ ｔｃａ ｇｇｔ ｔｇｔ ｃ―３’（配列番号３１））およびＰ２（５’―ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））を使用してＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングし、そして配列決定する。この構築物を、オリゴＰ２（５’―ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））およびＰ５（５’―ｇａｃ ｔａｇ ｃｇｃ ｔｇａ ａｇａ ｇｇｇ ｔｃａ ｇｇｔ ｔｇｔ ｃｇ―３’（配列番号３３）でのＰＣＲでテンプレートとして使用する。Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。前記３フラグメントと３通りライゲートし、そして配列を確認する。
【０１８１】
ＰＮＯＶ４１０３−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター、プラスβコングリシニンのプロペプチド部分−ダイズチオレドキシン−ＰＰＯベクターｐＮＯＶ４１００中のＮＯＳ。ダイズβコングリシニンα’サブユニットプロモータープラスβコングリシニンのプロペプチド部分を、ダイズ葉ゲノムＤＮＡおよびオリゴＰ９（５’―ｇａｃ ｔａａ ｇｃｔ ｔａｃ ａａｔ ｔａｔ ｔａｔ ａｔｃ ａａａ ａｔｇ ｇｃ―３’（配列番号２８）およびＰ１２（５’―ｃａｇ ｔａｇ ｇｃｔ ｔａａ ｇｇａ ｇｇｔ ｔｇｃ ａａｃ ｇａｇ―３’（配列番号３４））を使用するＰＣＲによってクローニングし、このフラグメントを、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローンニングする。この構築物（１２−４−４）を、ＳｔｕＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてダイズチオレドキシンを、このベクターにクローニングする。ダイズチオレドキシンのための制限部位を、ＰＣＲによって修飾する。オリゴＰ２（ＳａｃＩ）（５’―ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））およびＰ１１（ＰｖｕＩＩ）（５’―ｃａｇ ｔｃａ ｇｃｔ ｇａａ ｇａｇ ｇｇｔ ｃａｇ ｇｔｔ ｇｔｃ―３’（配列番号３５））。これはβコングリシニンンプロモータープラスプロペプチド＋ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中のチオレドキシンをもたらし、Ａ−６と呼ばれる。Ａ−６およびｐＮＯＶ４１００を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。Ａ−６からの１４５９ｂｐフラグメントをｐＮＯＶ４１００にライゲートする。
【０１８２】
ＰＮＯＶ４１０４−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター、プラス、βコングリシニンのプロペプチド部分−ダイズチオレドキシン−タバコキチナーゼ液胞シグナル配列−ＰＲＯベクターｐＮＯＶ４１００中のＮＯＳ。ダイズβコングリシニンプロモーター＋ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中のプロペプチド（１２−４−４）をＳｔｕＩおよびＳａｃＩで消化する。Ｐ１１（５’―ｃａｇ ｔｃａ ｇｃｔ ｇａａ ｇａｇ ｇｇｔ ｃａｇ ｇｔｔ ｇｔｃ―３’（配列番号３５））およびＰ２７（５’―ｃｔａ ｇｇａ ｇｃｔ ｃｔａ ｃａｔ ｇｇｔ ｇｔｃ ｃａｃ ｃａｇ ｃａｇ―３’（配列番号３６））、テンプレートＢＴＣ４（ダイズチオレドキシンおよびタバコキチナーゼ液胞シグナル配列を含むｐＢｌｕｒｓｃｒｉｐｔ）を使用してＰＣＲフラグメントを生成する。このフラグメントを、ＰｖｕＩＩおよびＳａｃＩで消化し、ＳｔｕＩ−ＳａｃＩフラグメントとライゲートする。これは、Ａ３−１０＝ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯとβコングリシニンプロモーター＋プロペプチド−ダイズチオレドキシン−ｔｏｂ．キチナーゼｖａｃ．シグナル配列をもたらす。Ａ３−１０を消化し、そしてｐＮＯＶ４１００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化しライゲートする。
【０１８３】
ＰＮＯＶ４１０５−Ｕｂｑ３（Ａｔ）−イントロン−タバコキチナーゼＥＲシグナル配列―ＮＯＳおよびＰＴＸ５’−ＡｔＰＰ０３５ＳＴ’。ＰＮＯＶ４１０５＝ｐＮＶ４１００をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、そしてＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＣＩＢからのタバコキチナーゼＥＲシグナル配列にライゲートする。このベクターは、Ｕｂｑ３プロモーターおよびイントロンとタバコキチナーゼＥＲシグナル配列を含む。
ＰＮＯＶ４１０６−Ｕｂｑ３（Ａｔ）−イントロン−タバコキチナーゼＥＲシグナル配列−ダイズチオレドキシン−タバコキチナーゼ液胞シグナル配列−ＰＰＯベクターｐＮＯＶ４１０５中のＮＯＳ。ＰＮＯＶ４１０５およびｐＮｏｖ４１０２を、Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。ｐＮＯＶ４１０２からの３８７ｂｐのバンドを、消化されたｐＮＯＶ４１０５にライゲートする。
【０１８４】
ＰＮＯＶ４１０７−Ｕｂｑ３（Ａｔ）−イントロン−タバコキチナーゼＥＲシグナル配列−ダイズチオレドキシン−ＰＰＯベクターｐＮＯＶ４１０５中のＮＯＳ。ｐＮＯＶ４１０５およびｐＮＯＶ４１０１をＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＳａｃＩで消化する。ｐＮＯＶ４１０１からの３６０ｂｐのバンドを、消化したｐＮＯＶ４１０５にライゲートする。
ＰＮＯＶ４１０８−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター−ダイズチオレドキシン−タバコキチナーゼ液胞シグナル配列−バイナリーベクターｐＣＩＢ２００中のＮＯＳ。ｐＣＩＢ２００をＸｂａＩで消化し、そしてクレノーで充填するｐＮＯＶ４１０１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そして該１６２６ｂｐバンドを消化されたｐＣＩＢ２００にライゲートする。
【０１８５】
ＰＮＯＶ４１０９−βコングリシニンα’サブユニットプロモータープラスβコングリシニンのプロペプチド部分−ダイズチオレドキシン−バイナリーベクターｐＣＩＢ２００中のＮＯＳ。ｐＣＩＢ２００をＸｂａＩで消化し、そしてクレーので充填する。ｐＮＯＶ４１０３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そして１７４８ｂｐバンドを消化されたｐＣＩＢ２００にライゲートする。
【０１８６】
ＰＮＯＶ４１１０−βコングリシニンα’サブユニットプロモーター−ダイズチオレドキシン−ＮＯＳ。ｐＣＩＢ２００をＸｂａＩで消化し、そしてクレノーで充填する。ｐＮＯＶ４１０２をＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そして該１８４３ｂｐバンドを消化されたｐＣＩＢ２００にライゲートする。
【０１８７】
ＰＮＯＶ４１１１−βコングリシニンα’サブユニットプロモータープラスβコングリシニンのプロペプチド部分−ダイズチオレドキシン−タバコキチナーゼ液胞シグナル配列−バイナリーベクターｐＣＩＢ２００中のＮＯＳ。ｐＣＩＢ２００をＸｂａＩで消化し、そしてクレノーで充填する。ｐＮＯＶ４１０４をＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡで平滑末端化し、そして該１９６９ｂｐバンドを消化されたｐＣＩＢ２００にライゲートする。
【０１８８】
ＰＮＯＶ４１１２−Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のダイズチオレドキシン。ダイズチオレドキシンを、ダイズ発芽種子からの総ＲＮＡおよびオリゴＰ１（５’― ｃｇｔ ａｇｇ ａｔｃ ｃａｃ ｃａｔ ｇｇｃ ｔｇａ ａｇａ ａｇａ ｇｇｇ ｔｃａ ｇｇｔ ｔｇｔ ｃ―３’（配列番号３１））およびＰ２（５’― ｃｇｔ ａｇａ ｇｃｔ ｃｔｃ ａａｇ ａａｇ ａａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃａｇ ａｔ―３’（配列番号３２））を使用してＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したｐＥＴ２９ａにクローニングする。該配列を確認する。
【０１８９】
ＰＮＯＶ４１１３−Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のイネチオレドキシン。ｐＮＯＶ３４００をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、イネチオレドキシン（３７８ｂｐ）を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化されているｐＥＴ２９ａにクローニングする。該配列を確認する。
ＰＮＯＶ４１１４−Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のコムギチオレドキシン。ｐＮＯＶ３４０６をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、コムギチオレドキシン（３８７ｂｐ）をＢａｍＨＩおよひＳａｃＩで消化されているｐＥＴ２９ａにクローニングする。該配列を確認する。
【０１９０】
ＰＮＯＶ４１１５−Ｅ． ｃｏｌｉタンパク質発現ベクターｐＥＴ２９ａ中のアラビドプシスＮＡＤＰＨチオレドキシンレダクターゼ。アラビドプシスＮＡＤＰＨチオレドキシンレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２３１０９）をＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）でアラビドプシスの葉から、製造者のプロトコルを使用して単離する。１μグラムの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ１ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）において使用し、１ステップでｃＤＮＡおよびＰＣＲ産物を生成する。プライマーＰ２８（５’― ｇｃａ ｃｇｇ ｃｔｔ ｇｇｔ ｇｇｔ ｇａａ ｔｃｃ―３’（配列番号３７））およびＰ２９（５’― ｃｔｃ ａｔｔ ｃｔｇ ｇｔｃ ｃａｔ ｃａａ ｔｇｔ ｃ―３’（配列番号３８））をこの反応で使用する。
【０１９１】
製造者のプロトコルは以下の通りである。得られたＰＣＲ産物を、１：１０に希釈し、そして１μリットルを、プライマーＰ２６（５’― ｇａｃ ｔｇｔ ｃｇａ ｃｔｃ ａａｔ ｃａｃ ｔｃｔ ｔａｃ ｃｔｔ ｇｃｔ ｇａｇ―３’（配列番号３９））およびＰ３１（５’― ｇａｃ ｔｇｇ ａｔｃ ｃａａ ｔｇｇ ｔｃｔ ｃｇａ ａａｃ ｔｃａ ｃａａ ｃ―３’（配列番号４０））でネスティッドＰＣＲ反応で使用する。該ネスティッドＰＣＲ産物（９９８ｂｐ）をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したｐＥＴ２９ａにクローニングする。該配列を確認する。ＰＮＯＶ４１０９−ｐＣＩＢ２００をＸｂａＩで消化し、クレノーで充填する。ｐＮＯＶ４１０３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、そして該１７４８ｂｐバンドを、ｐＣＩＢ２００にライゲートする。この構築物を、ダイズでの一過性発現分析並びにアラビドプシスおよびチオレドキシンと組み合わせる他の双子葉植物の安定的形質転換ために使用する。
ｐＮＯＶ４１０１、ｐＮＯＶ４１０２、ｐＮＯＶ４１０３、ｐＮＯＶ４１０４、ｐＮＯＶ４１０６、ｐＮＯＶ４１０７を、ダイズ子葉での一過性発現実験において使用する。
【０１９２】
ウェスタンブロット分析によって分析されるチオレドキシンの発現
ＰＮＯＶ４１０８、ＰＮＯＶ４１０９、ＰＮＯＶ４１１０、ＰＮＯＶ４１１１を安定的アラビドプシス形質転換実験において使用する。チオレドキシンの発現を、ウェスタンブロット分析によって分析する。チオレドキシンの種子特異的タンパク質の発現および活性に及ぼす効果を試験する。ＰＮＯＶ４１１２、４１１３および４１１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）における、それぞれダイズ、イネおよびコムギｔｒｘ−ｈ遺伝子を含む構築物である。これらの構築物を使用し、抗体の生産および生成のためのチオレドキシンタンパク質、並びにチオレドキシン酵素アッセイでの標準を調製する。
【０１９３】
実施例８：タンパク質発現および精製
以下の構築物をＥｃｏｌｉ．でのタンパク質発現のために使用する：ｐＮＯＶ４１１２（ｐＥＴ２９ａ中のダイズチオレドキシン）、ｐＮＯＶ４１１３（ｐＥＴ２９ａ中のイネチオレドキシン）、ｐＮＯＶ４１１４（ｐＥＴ２９ａ中のコムギチオレドキシン）およびｐＮＯＶ４１１５（ｐＥＴ２９ａ中のアラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ）。Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、それぞれの構築物で形質転換する。グリセロールストックからのアリコートを含む培養物、５０マイクログラム／ｍｌ　カナマイシン、３４マイクログラム／ｍｌ　クロラムフェニコールをＬＢ培地中で３７℃、で６００ｎｍで測定された光学的濃度が０．６に達するまで成長させる。該培養物を、次の日まで４℃で貯蔵する。これらの培養物を、スピンダウンし、そして該細胞を新鮮ＬＢに再懸濁する。大培養物を、２５ｍｌの大培養物あたり１ｍｌの小培養物を使用して開始する。
【０１９４】
該細胞を、５０マイクログラム／ｍｌのカナマイシン、３４マイクログラム／ｍｌのクロラムフェニコールと３７℃で、６００ｎｍでの光学的濃度が０．６に達するまで、ＬＢ中で成長させる。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を０．４ｍＭの最終濃度まで添加し、タンパク質の発現を誘導する。該培養物を、３７℃でさらに３時間成長させる。該培養物を３０００ｇで１０分間スピンさせ、そして該細胞を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中に、培養体積の１／２５に等しい量を使用して再懸濁する。ｍｌＢｕｇＢｕｓｔｅｒあたり５単位のＤＮＡアーゼを添加する。該細胞を、終夜−２０℃で置く。該細胞を融解させ、そして室温で３０分間回転インキュベートする。細胞残骸を、１４０００ｇで２０分間４℃で遠心分離によって除去する。
発現されたタンパク質を、該５’部位にＳ−Ｔａｇ（１５アミノ酸）およびトロンビン切断部位（６アミノ酸）を含む融合タンパク質である。該ｃＤＮＡの５’末端クローニング部位としてＢａｍＨＩ部位を使用して、追加的３１アミノ酸を、所望のタンパク質の５’末端に付加する。該融合タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーによって精製する。タンパク質エキストラクトは、Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇａｒｏｓｅスラリー（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）である。必要とされるＳ−タンパク質アガロースの量は、それぞれの実験について決定される。なぜなら、発現された融合タンパク質の量は、異なるからである。該収量は、０．５ｍｇ精製タンパク質／ｍｌレジンである。製造者のプロトコルに従う。Ｓ−Ｔａｇを除去するために、Ｓ−Ｔａｇ Ｔｈｒｏｍｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を製造者のプロトコルにしたがって使用する。
【０１９５】
実施例９：抗体の産生
ダイズチオレドキシン抗体産生：ダイズチオレドキシンを、Ｓ−タンパク質アガロースを使用してアフィニティクロマトグラフィによって精製し、そして該ＡＳ−Ｔａｇを前記の様に除去する。汚染タンパク質が調製物中に存在し、したがって該タンパク質を、４−２０％　トリス−グリシンゲンル（Ｎｏｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）上で稼動させ、そして該ダイズチオレドキシンバンドを、ゲルから切断する。該ゲルスライスを、標準的操作手法ＣＧ１’’Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｓｈｅｅｐ ＆ Ｇｏａｔｓ’’にしたがってヤギでの抗体生産のためにＤｕｎｃｒｏｆｔ， ｉｎｃ，（Ｌｏｖｅｔｔｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）に供給する。
【０１９６】
イネチオレドキシン−特異的抗体精製：イネチオレドキシンを、製造者のプロトコルにしたがってＳ−タンパク質アガロース（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）でアフィニティ精製する。該Ｓ−Ｔａｇは除去しない。
【０１９７】
Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−１０カラムの調製：精製したイネチオレドキシン（１ｍｇ）を、製造者の指示にしたがってＢｉｏ−ｒａｄ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０ゲルにカップリングする５時間前に２Ｌの０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３ｐＨ８．３に対して透析する。簡単には、近似的に２ｍｌのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０スラリーを、真空で付着させたガラス溶融ロウトに移し、該溶媒を除去し、そして該ゲルを氷温ｄＨ２Ｏで（少なくとも３ベッド体積で）２回洗浄する。湿潤ゲルケーキを、次いで、透析されたイネチオレドキシンを含む管に移し、そして回転軸上で４℃で終夜インキュベートする。すべての未占有活性部位が阻止され（ｂｌｏｃｋｅｄ）たことを確認するために、０．１ｍｌの１ＭエタノールアミンＨＣＬ（ｐＨ７．０）をゲルに添加し、そして１時間４℃で回転させる。該ゲルを次いで、カラムに移し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ　グリシン−ＨＣｌｐＨ２．５（０．４ｍｌ）でプレ溶出させ、そしてＰＢＳ中で平衡させる。該最終カラム体積は０．８ｍｌである。使用しないとき、該カラムを、０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で４℃で保存する。
【０１９８】
イネチオレドキシン特異的抗体の精製：ダイズチオレドキシンヤギ抗血清を、イネチオレドキシンのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０カラムを使用してイムノアフィニティ精製する。それぞれの稼動について、２ｍｌの血清を、重力でカラムに負荷する。該カラムを、Ａ２８０が＜０．０１５となるまでＰＢＳで洗浄し、それから０．４ｍｌの０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌｐＨ２．５で溶出させる。フラクション（１ｍｌ）を収集し、そして５０μｌの０．５Ｍ　トリスｐＨ８．５で中和する。Ａ２８０の０．０５またはより大のフラクションをプールする。
【０１９９】
実施例１０：チオレドキシンアッセイ
インスリン還元アッセイー（Ａｒｎｅ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：９６２７−９６３２）。このアッセイでは、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）がチオレドキシンを還元する。還元性チオレドキシンは次いで、インスリン中のジスルフィド結合を還元し、白色沈殿形成を生じる。沈殿の率を６５０ｎｍで記録する。新鮮に調製したインスリンの溶液（０．１Ｍのリン酸カリウムｐＨ６．５中の１ｍｇ／ｍｌ）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、および１００ｍＭ　ＤＴＴを氷上で維持する。該アッセイ混合物を、キュベット中で調製する。それぞれのキュベットは、７５０マイクロリットル１ｍｇ／ｍｌインスリン、３．３マイクロリットルＤＴＴ、プラス１ｍｌの最終体積まで水を含む。ブランクは、チオレドキシンを含まず、サンプルは、種々の量のチオレドキシン（アッセイのための最小量は１０マイクロモルである）を含む。サンプルを調製し、そして６５０ｎｍでの光学的濃度を読む前に室温で最低２０分間インキュベートする。
【０２００】
ＤＴＮＢ［５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）］アッセイー（Ｏｂｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７２７１−７２７７）。このアッセイでは、チオレドキシンレダクターゼおよびＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を使用し、チオレドキシンを還元し、ついでＤＴＮＢを還元する。４１２ｎｍでの光学的濃度変化を４分間監視する。新しく調製したＤＴＮＢの溶液（ＤＭＳＯジメチルスルホキシド中１００ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（Ｈ２Ｏ中２０ｍＭ）およびバッファー１００ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを要する。該アッセイ混合物を、キュベット中で調製する。１０マイクロリットルのＤＴＮＢ、１０マイクロリットル　ＮＡＤＰＨ、５マイクログラムのチオレドキシン、２マイクログラムのアラビドプシスまたはＥ．ｃｏｌｉチオレドキシンレダクターゼおよび１ｍｌの最終体積までバッファーをキュベットに添加する。該チオレドキシンを添加するやいなや、転回によって混合し、そしてすぐに４１２ｎｍでの光学的濃度の変化の測定を開始する。これは、ゆっくりした反応である。該Ｙ軸は、０ないし０．５Ａにセットするものとする。ブランクはチオレドキシンを含まない。
【０２０１】
実施例１１：アグロバクテリウムに仲介されるトウモロコシの形質転換
形質転換プラスミドおよび選択可能マーカー：形質転換のために使用した遺伝子を、トウモロコシ形質転換に好適なベクターにクローニングする。使用したベクターはホスホマンノ−イソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子を含み、マンノースでのトランスジェニック細胞の選択を可能とする。
Ａｇｒａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製：植物形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）を、ＹＥＰＣ（コウボエキス（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ（１．０２９ｇ／ｌ））固体培地上で適当な抗生物質（スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）、テトラサイクリン（１０ｍｇ／Ｌ））を含むもの上で２−４に置換２８℃で成長させる。近似的に０．７５ｘ１０８のアグロバクテリウムを、１００μＭアセトシリンゴンで補足したＬＳ修飾液体感染培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ｉｎ ｐｒｅｓｓ ：０．１ｘホスフェートで修飾）に懸濁する。バクテリアを、この培地で使用前に０．５−２時間にわたりプレ誘導する。バクテリア濃度を、６６０ｎｍでチェックし、そして光学的濃度を近似的に０．７５に調節する。
【０２０２】
接種：Ａ１８８、Ｈｉ−ＩＩまたはＡ１８８ＸＨｉ−ＩＩからの未成熟胚を、８−９日齢の雌穂から直接的に、１００μＭアセトシリンゴンで補足したＬＳ修飾液体感染培地を含む１．５ｍｌ遠心管に切除する。総切除時間は３０分である。胚を５秒間強撹拌し、安定化させ、そして感染培地を除去する。新鮮感染培地を添加する。胚を、ウォーターバス中に管を置くことによって、４５℃で５分間熱ショックに付す。感染培地を除去し、そしてアグロバクテリウム溶液で置換する。胚を３０秒間強撹拌し、そしてバクテリアと５分間安定化させるままとする。該バクテリア／胚溶液を、５００μＭアセトシリンゴンで補足した固形化ＬＳ修飾感染培地（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ． ｉｂｉｄ：０．１ｘ ホスフェートで修飾）上に注ぐ。バクテリア溶液を注意深くピペットでとり、そして胚をプレートの清浄な区画に移動させる。
【０２０３】
胚を胚盤側を上に置き、そして２−３日間２２℃で共培養する。
形質転換した細胞の選択および形質転換植物の再生：共培養に続いて、胚を、ＡｇＮＯ３および２００ｍｇ／Ｌのチカルシリンで補足した、ＪＭＳ培地（Ｓｕｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９１）３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｏｓｔｅｒ ＃９０５）上に、カルスイニシエーションのためにおく。チカルシニンをすべての継代培地で使用する。暗黒で２８℃の培養の１０日後に、胚発生性カルスがイニシエートした。カルスを、選択のために、銀を欠きそして１０ｇ／ｌ　マンノース、５ｇ／Ｌ　スクロースを有するＪＭＳ培地に移す。２−３週間後、生存しているカルスを、新しい選択倍地に移す。続く２−３週間、生存カルスを、再生のために（２８℃、暗黒、１０−１４日間）、２０ｇ／Ｌ　スクロース、５ｇ／Ｌ　マンノース、アンシミドール（０．２５ｍｇ／Ｌ）、カイネチン（０．５ｍｇ／Ｌ）およびＫＨ２ＰＯ４（１７０ｍｇ／Ｌ）で補足した、ＭＳＡＫ＋ＰＯ４培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ． １５：４７３−４３９）に移す。カルスを新鮮ＭＳＡＫ＋ＰＯ４培地に移しそして明所に移す（１６時間明／８時間暗）。１週間後、再生シュートを、ホルモンを欠き、２０ｇ／Ｌ　スクロースおよび５ｇ／Ｌ　マンノースで補足したＭＳ培地に移す。発根したシュートを、１０ｍｌ／ＬのＰｌａｎｔ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ Ｍｉｘｔｕｒｅ（登録商標）および１０ｇ／Ｌ　スクロースで補足した０．７５強度ＭＳ培地を有するＭａｇｅｎｔａ（登録商標）ＧＡ−７ボックスに、さらなる成長のために移す。分析をＧＡ−７ボックスから直接的に植物でまたは土壌に移した植物で実施する。
【０２０４】
実施例１２：ダイズ子葉一過性発現系
Ｓ３９１１ Ｎｏｖａｒｔｉｓ ｂｒｅｅｄｉｎｇ系統の滅菌種子を、５／プレートで、ＭＳ固体培地上で、６日間１６／８光周期で、２５℃で発芽させる。該子葉を外植し、そして１−２ｍｍキューブにスライスする。子葉の対からのキューブを、１ｍｇ／ｌ　ＢＡＰおよび０．５ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡを有するＭＳ培地を含むペトリプレートの真中に１−２ｃｍ直径の円状に配置する。該組織をＰＤＳ−１０００ヘリウムガンでＤｕＰｏｎｔマニュアルにしたがてボンバードする。それぞれのプレートを１５５０ｐｓｉラプチュアディスクを使用して２回撃つ。ＤＮＡを伴う金マイクロキャリアをマニュアルにしたがって調製する。０．６μｇの選択されたプラスミドＤＮＡをそれぞれのマイクロキャリアに適用する。ステンレススチールスクリーンを使用し、衝撃波を干渉させる。ボンバードメント後、プレートを１６／８光周期、２５℃に戻す。最初のサンプリングは４８時間である。
【０２０５】
実施例１３：ｐＮＯＶ３４０１で形質転換したトランスジェニック植物の分析
Ａ．ＰＣＲ：
サンプルをＧＡ−７ボックス中のトランスジェニック植物からとる。ＤＮＡを９６ウェル形式のＧｅｎｔｒａ ＤＮＡ抽出キットを使用して製造者の指示のように抽出する。ＰＣＲをＪｕｍｐｓｔａｒｔ Ｒｅｄｔａｑ Ｒｅａｄｙｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ）およびプライマーＴｈｉｏｒｏｄｏｘｕｂｉ １６０３（５’― ＧＣＧＧＴＣＧＴＴＣ ＡＴＴＣＧＴＴＣＴＡ―３’（配列番号４１））およびＴｈｉｏｒｏｄｏｘ ２３６４（５’― ＡＣＧＴＧＣＴＴＣＡ ＣＧＡＴＧＧＴＧＴＴ―３’（配列番号４２））を、それぞれ最終濃度２．５μＭで使用してなす。チオレドキシン遺伝子を含むとＰＣＲによって同定されたトランスジェニック植物を、グリーンハウスに移す。
【０２０６】
Ｂ．ノーザンブロット分析によるトランスジェニック植物からのチオレドキシンＲＮＡの分析
総ＲＮＡを、Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．；．（（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ８４： ７５４２−７５４６）に記載された方法によってトランスジェニック植物の葉および種子組織から調製する。プローブを、完全イネｔｒｘ−ｈ遺伝子から調製する。プラスミドｐＮＯＶ３４０１をＢａｍＨＩ−ＳａｃＩで消化し、３２７ｂｐフラグメントを取得し、これをゲル精製しそしてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．からのランダムプライマーラベリングキットを使用して３２Ｐα−ＣＴＰで標識する。
代表的トランスジェニック植物からの葉および種子ＲＮＡのノーザンブロット分析は、葉および種子組織中のチオレドキシンｍＲＮＡの発現を示す。
【０２０７】
Ｃ．トランスジェニック植物からのチオレドキシンタンパク質の分析
トウモロコシ葉サンプルのタンパク質抽出およびウェスタン分析：エッペンドルフのフタのサイズの小さい円盤を、それぞれの葉サンプルからパンチする。該組織を、エッペンドルフ管におき、そしてドライアイスで凍結する。小乳棒を使用し、エッペンドルフ管中の組織を磨砕する。４００マイクロリットルの１００ｍＭ　トリスｐＨ８．０を、磨砕した組織に添加し、該サンプルを、室温で３０分間回転させ、スピンダウンし、そして抽出物を保存する。すべてのサンプルを３０００ｍＷカットオフのセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓ）を使用して濃縮する。それぞれのサンプルの１２．５マイクロリットルを、トリス−グリシン−ＳＤＳ（２４ｍＭ　トリス５２ｍＭ　グリシン　１％　ドデシル硫酸ナトリウム）稼動バッファーと１６％のトリス−グリシン（Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）ミニゲル上で稼動させ、該タンパク質はＰＶＤＦに移動する。該ブロットを、室温で１５分間ＴＢＳ−２％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　３０ｍＭ　トリスｐＨ１０．２）中で阻止し、イネチオレドキシン抗体（ヤギ抗ダイズチオレドキシンからアフィニティ精製した）１マイクログラム抗体／１ミリリットルＴＢＳ−０．５％ｔｗｅｅｎと４℃で終夜インキュベートする。
【０２０８】
該ブロットを、ＴＢＳ−．０５％ｔｗｅｅｎで３回５分間洗浄し、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）ウサギ抗ヤギＩｇＧ（室温で１時間５０ナノグラム抗体／ミリリットルＴＢＳ−．０５％ｔｗｅｅｎと室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ−．０５％ｔｗｅｅｎで洗浄し、ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｆｅｍｔｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）と室温で５分間インキュベートする。該ブロットを、フィルムに対しておき、そして３０秒間曝露する。
【０２０９】
トウモロコシ種子サンプルのタンパク質抽出およびウェスタン分析：それぞれからの１の種子を、半分に切断し、半分をドライアイスで凍結し、乳鉢および乳棒によって磨砕し、１．５ミリリットル　トリスｐＨ８．０を粗ｒぞれに添加し、そして室温で３０分間回転しつつインキュベートする。サンプルを遠心し、そしてそれぞれからのタンパク質抽出物を、１００００ＭＷカットオフのセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓ）を使用して濃縮する。１２．５マイクロリットルのそれぞれのサンプルを、１６％トリス−グリシンゲル（葉サンプルと同じ条件）上で稼動させる。該ゲルをニトロセルロースに移し、ＴＢＳ−２％ｔｗｅｅｎで１５分間阻止しイネチオレドキシン抗体（１マイクログラム抗体／１ミリリットルＴＢＳ−．０５％ｔｗｅｅｎ）と、１．５時間室温でインキュベートし、洗浄し、前記の様にＨＲＰウサギ抗ヤギＩｇＧとインキュベートする。該ブロットを、ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ ｐｉｃｏ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）と、５分間室温でインキュベートする。該ブロットを、フィルムに対しておき、そして５分間曝露する。ウェスタンブロット分析は、葉および種子組織中のイネチオレドキシンタンパク質の発現を示す。ウェスタンブロット分析はまた、トランスジェニック植物で発現されるイネチオレドキシンが、同じゲル上に負荷されたコントロールイネチオレドキシンと比較したときに予測されるサイズを有することを示す。
【０２１０】
実施例１４：Ｅ． ｃｏｌｉで発現した組変えチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの酵素活性
Ｅ．ｃｏｌｉで発現された換えダイズチオレドキシンを、トロンビン切断によって除去されたＳ−タンパク質アガロースおよびＳ−Ｔａｇでのアフィニティクロマトグラフィによって精製する。このタンパク質を、前記の様にインスリン還元アッセイで試験する。４、２０、４０および８０マイクログラムのアフィニティ精製したチオレドキシン（１汚染タンパク質存在）を試験する。３１分後、６５０ｎｍでの光学的濃度の変化を測定する。
【表１３】
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【０２１１】
以下の組換えタンパク質を、ＮＡＤＰＨチオレドキシンレダクターゼＤＴＮＢアッセイにおいて試験する：Ｓ−ｔａｇを有するダイズチオレドキシン、Ｓ−ｔａｇを欠くダイズチオレドキシン調製物（ｐｒｅｐ）、Ｓ−ｔａｇを有するイネチオレドキシン、Ｓ−ｔａｇを有するコムギチオレドキシンおよびＳ−ｔａｇを欠くアラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ。Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンレダクターゼ（Ｔ−７９１５，Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまた、該アッセイで使用する。４１２ｎｍでの光学的濃度の変化を４分にわたり監視する。
【表１４】
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【０２１２】
アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼおよびＥ． ｃｏｌｉチオレドキシンレダクターゼは、Ｓ−ｔａｇを有するまたは有しないダイズチオレドキシンを還元することができる。アラビドプシスおよびＥ． ｃｏｌｉチオレドキシンレダクターゼはまた、イネチオレドキシンを還元することができる。コムギチオレドキシンは、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンレダクターゼによって還元されることができるが、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼによって還元されることができない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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