(57)【要約】本発明は細菌を用いてマンニトールと１種以上のホモ多糖類を製造する方法に関する。本発明に従う細菌はマンニトール−２−デヒドロゲナーゼ活性と１種以上のスクラーゼ活性を示す。前記細菌は好適には乳酸菌であり、より好適には、前記細菌を乳酸桿菌属、ロイコノストック属および連鎖球菌属から選択する。本発明は、また、前記細菌をマンニトールと１種以上のホモ多糖類の生産で用いることにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンニトールおよび／または１種以上のホモ多糖類を製造する方法であって、
ａ）マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ活性と１種以上のスクラーゼ活性を示す細菌を用いてスクロースを発酵させ、
ｂ）その培地からマンニトールまたはホモ多糖類または両方を回収する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記細菌が乳酸菌である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が乳酸桿菌属、ロイコノストック属および連鎖球菌属から選択される請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ細菌コレクションにそれぞれアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３４９、ＬＭＧ  Ｐ−１８３９０、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８８、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８９、ＬＭＧ  Ｐ−２０３４８およびＬＭＧ  Ｐ−２０３５０の下で寄託されている、ラクトバチルス  ｓｐ．３３、ラクトバチルス・レウテリ株３５−５、ラクトバチルス・レウテリ株１２１、ラクトバチルス・レウテリ株１８０、ラクトバチルス・レウテリ株５４およびロイコノストック  ｓｐ．８６から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記発酵を１０−２００ｇ／ｌ、好適には５０−１５０ｇ／ｌ、より好適には８０−１２０ｇ／ｌのスクロース濃度で２０−４５℃、好適には３２−４３℃、より好適には３５−３９℃の温度において（半）嫌気性条件下で実施する前請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
１種以上のフルクタンスクラーゼ活性が欠失または低下していて１種以上のグルカンスクラーゼ活性を示す細菌を用いる前請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
スクロースの発酵によりマンニトールおよび１種以上のホモ多糖類を製造するためのマンニトール−２−デヒドロゲナ−ゼ活性と１種以上のスクラーゼ活性を示す細菌の使用。
【請求項８】
前記細菌が乳酸菌である請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記細菌が乳酸桿菌属、ロイコノストック属および連鎖球菌属から選択される請求項７または８記載の使用。
【請求項１０】
前記細菌が、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ細菌コレクションにそれぞれアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３４９、ＬＭＧ  Ｐ−１８３９０、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８８、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８９、ＬＭＧ  Ｐ−２０３４８およびＬＭＧ  Ｐ−２０３５０の下で寄託されている、ラクトバチルス  ｓｐ．３３、ラクトバチルス・レウテリ株３５−５、ラクトバチルス・レウテリ株１２１、ラクトバチルス・レウテリ株１８０、ラクトバチルス・レウテリ株５４およびロイコノストック  ｓｐ．８６から選択される、請求項７−９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
前記細菌における１種以上のフルクタンスクラーゼ活性が欠失または低下している請求項７−１０のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、特に乳酸菌の発酵分野である。本発明は、特に、マンニトールの製造方法およびこの産物を生成し得る細菌株を用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖アルコール（またポリオールとも呼ばれる）は、ヒドロキシル基（および炭素原子）の数に応じてテトリトール、ペンチトール、ヘキシトールおよびヘプチトールなどとして分類分けされる化合物の大きな群を構成している。このような化合物は大部分が水溶性で結晶性であり、水の中で小さい旋光を示し、その味は若干甘いから非常に甘い。糖アルコールはいろいろな分野で用いられており、そのような分野には、食品、薬剤、化粧品、織物および重合体が含まれる。
【０００３】
あらゆる糖アルコールの中でソルビトールおよびマンニトールが産業的に最も大きな重要度を有し、マンニトールが糖アルコール市場の約１３％を占めている。現実にはマンニトールが普及している。これは木および低木、例えばプラタナス、マンナの木およびオリーブの木などの抽出液に存在する。これはまたいろいろな植物の果実、葉および他の部分にも存在し、そのような植物には、カボチャ、ヘッジパセリ（ｈｅｄｇｅ  ｐａｒｓｌｅｙ）、タマネギ、セロリ、イチゴ、カカオ豆、イネ科植物、やどりぎ、ライラックおよび地衣類が含まれる。その上、これは海洋藻、特に褐色の海草、数種の菌・カビおよびキノコの菌糸体の中にも存在し得る。
【０００４】
マンニトールはとりわけ圧縮ミント、ソフトキャンディー、咳用ドロップ、チューインガム、糖剤および糖衣、ジャムおよびゼリーに入れる食品添加剤として用いられる。マンニトールを食品で用いる時の付随する利点は、大部分の口内細菌がマンニトールを代謝することができず、従って、歯の崩壊を助長しないこと、そして更に、マンニトールが吸収される速度は遅く、その結果として、血液のグルコースおよびインシュリン反応が上昇する度合が有意に低い点にある。その上、マンニトールを細菌学的培地および血液に添加しておくとそれがそれらを貯蔵中に保護し、かつそれを利尿剤として用いて静脈内投与することができる。しかしながら、マンニトールの主な使用は薬剤用途である。これはビタミン、制酸薬、アスピリンおよび他の薬剤のかみ砕くことができる圧縮多層被覆錠剤に入れる基材として用いられる、と言うのは、それは甘い味を与え、滑らかに崩壊しかつ薬剤の不快な味を隠すからである。それ以外に、マンニトールは薬剤によく使われる添加剤である、と言うのは、これは低い吸湿性を示しかつ水の吸蔵に抵抗することから特に水分に敏感な薬剤にとって優れた添加剤であるからである。
【０００５】
マンニトールの商業的生産は主に転化糖の水添で行われる。アルカリ性培地の中でグルコース、フルクトースおよびマンノースに相互変換を受けさせる（ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）。次に、生じたマンノースの全部に還元を受けさせてマンニトールを生じさせることができる。このような生産方法の欠点は、ソルビトールが同時に生じることから単離および精製段階を導入する必要がある点にある。マンニトールの生産をまた澱粉加水分解物に水添をラネーニッケル存在下のアルカリ性媒体中で受けさせることで実施することも可能であり、かつまた、海草に抽出を受けさせることでそれを得ることも可能である。
【０００６】
その上、微生物がマンニトールを生成し得ることも知られており、そのような微生物には菌・カビおよび細菌が含まれる。例えば、韓国の発酵食品であるキムチを発酵させている時に単離されたラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）  ｓｐ．Ｙ−１０７およびロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）  ｓｐ．Ｙ−００２と表示される乳酸菌がマンニトールを生成することが確認された（非特許文献１を参照）。両方の菌株ともこれらをスクロースとフルクトースを基に増殖させている時にマンニトールを生成し得る。フルクトースをただ１つの炭素源として用いた時に最大のマンニトール生成が得られた。
【０００７】
乳酸菌はＧＲＡＳ（食品グレード）の資格を有する有機体であることから、それらは近年大きな注目を受けている。それらは多種多様なエキソ多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（ＥＰＳ）を生成する。そのような多糖類は前生物的な基質、栄養剤（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、コレステロール低下剤または免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｎｔｓ）として働くことで人の健康に寄与すると考えられている。ある種の乳酸菌は細胞外スクラーゼである酵素を用いてホモ多糖類類（ｈｏｍｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、即ちグルカン類およびフルクタン類などを合成し得る。スクラーゼには、フルクタンスクラーゼ（またフルクトシルトランスフェラーゼとも呼ばれる）、例えばそれぞれイヌリンおよびレバンを合成するイヌロスクラーゼ（例えばＥ．Ｃ．２．４．１．９）およびレバンスクラーゼ（例えばＥ．Ｃ．２．４．１．１０）およびいろいろなグルカンを合成するグルカンスクラーゼ（またグルコシルトランスフェラーゼとも呼ばれる）などが含まれる。
【０００８】
グルカンスクラーゼの命名法はむしろ混乱を招く。ロイコノストック種に由来する酵素は一般にデキストランスクラーゼと呼ばれているが、連鎖球菌の酵素はグルコシルトランスフェエラーゼと呼ばれる。他のグルカンスクラーゼは例えばアルテルナンスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎｓｕｃｒａｓｅｓ）（Ｅ．Ｃ．２．４．１．１４０）、アミロスクラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．４）、ムタン（ｍｕｔａｎ）を合成する連鎖球菌のグルコシルトランスフェエラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．−）、およびα−（１−４）およびα−（１−６）グルコシド結合を有する特殊な高分枝グルカンを合成するラクトバチルス・レウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）に由来するグルカンスクラーゼである。スクロースはグルカンスクラーゼおよびフルクタンスクラーゼの両方の基質である一方、ラフィノースはフルクタンスクラーゼのみの基質である。そのようなスクラーゼ酵素はスクロースからグルカンまたはフルクタンを合成し、それによって、それぞれフルクトースまたはグルコースを放出する。また、そのようなスクラーゼ酵素はスクロースに加水分解を受けさせてグルコースとフルクトースを生じさせる能力も有する。例えば、ラクトバチルス・レウテリ株ＬＢ  １２１はスクロースをただ１つの炭素源として用いてそれを増殖させた時にグルカンとフルクタンの両方を生成するが、ラフィノースをただ１つの炭素源として用いてそれを増殖させるとフルクタンのみを生成することが確認された（非特許文献２）。別の報告によれば、ラクトバチルス・レウテリ株ＬＢ  １２１の自然突然変異体であるラクトバチルス・レウテリ株ＬＢ  ３５−５は、スクロースをただ１つの炭素源として用いてそれを増殖させるとグルカンのみを生成した（非特許文献３）。
【非特許文献１】
Ｙｕｎ，Ｊ．Ｗ．およびＫｉｍ，Ｄ．Ｈ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）８５、２０３−２０８
【非特許文献２】
ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ，Ｇ．Ｈ．他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）５０、６９７−７０３
【非特許文献３】
ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ，Ｇ．Ｈ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９９）６５、３００８−３０１４
【０００９】
（発明の要約）
驚くべきことに、ホモ多糖類を合成し得る乳酸菌は同時にまたマンニトールも多量に生成することをここに見いだした。また、そのようなマンニトールを生成する過程は公知の細菌がマンニトールを生成する過程よりも費用効果的であることも見いだした、と言うのは、スクロースが価値有る２成分、即ちマンニトールとホモ多糖類に変換され、これらは両方とも食品産業ばかりでなく非食品産業のいくつかの製品および工程で使用可能であるからである。従って、本発明は、１種以上のスクラーゼ活性を包含することに加えて１種以上のホモ多糖類を生成する細菌を用いてマンニトールを生産する方法に関する。その上、本発明は、そのような細菌をマンニトールの生産で用いることにも関する。
（発明の説明）
本発明は、マンニトールと１種以上のホモ多糖類を生産する方法に関する。好適には、マンニトールと１種以上のホモ多糖類を同時に生産する。前記方法は、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ活性と１種以上のスクラーゼ活性を示す細菌を用いてスクロースを発酵させ、そしてその培地からマンニトールまたはホモ多糖類または両方を回収する段階を含んで成る。そのようなホモ多糖類類には、フルクタン類、例えばイヌリンまたはレバンなど、グルカン類または両方が含まれる。そのようなグルカン類は例えばα−１，６−連結（デキストラン型）、またはα−１，３−連結、または混合および／または分枝α−１，３／１，６−連結（ムタン型またはアルテルナン型など）、または混合および／または分枝α−１，４／１，６連結（グリコーゲンまたはアミロペクチンまたは高１，６型）している可能性がある。一例として、グルカン類はモル比が１．１：２．７：２．５：１．０の末端、４−置換、６−置換および４，６−二置換α−グルコースで構成されている構造を含んで成り得る。本発明の方法で用いるべき細菌は、好適には、マンニトールの生成でスクロースのフルクトース単位を利用しかつ追加的にグルカンの生成でスクロースのグルコース単位を利用する。別法として、本発明に従う方法では、フルクタンの生成でいくつかのフルクトース単位を利用することも可能である。本発明の方法では、本方法で用いる細菌がＤ−マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ活性を示すことによってマンニトールを生産する。本明細書では、Ｄ−マンニトール−２−デヒドロゲナーゼを、ＮＡＤＨを酸化させてＮＡＤ＋を生じさせそして／またはＮＡＤＰＨを酸化させてＮＡＤＰ＋を生じさせながらＤ−フルクトースからＤ−マンニトールへの変換に触媒作用を及ぼす酵素であるとして定義する（それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．６７およびＥ．Ｃ．１．１．１．１３８）。
【００１０】
スクラーゼは、グルコシルトランスフェエラーゼの群に属する細胞内酵素である。本発明の方法に従うスクラーゼには、フルクタンスクラーゼ、例えばスクロースからそれぞれイヌリンおよびレバンを合成するイヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼおよびいろいろなグルカンを合成するグルカンスクラーゼなどが含まれる。本発明の方法に従う細菌は好適には１種以上のグルカンスクラーゼ活性を含むが、これは追加的にまた１種以上のフルクタンスクラーゼ活性も含んでいてもよい。
【００１１】
本発明に従う方法で用いるべき細菌は、マンニトール−２−ゲヒドロゲナーゼ活性を示しかつ追加的に１種以上のスクラーゼ活性を示し得る如何なる細菌であってもよい。本発明に従う方法の好適な態様における細菌は乳酸菌、特に乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）および連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）またはラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）から成る群から選択した乳酸菌である。そのような細菌はまた本技術でも公知であるか、或は乳酸菌株をスクラーゼ遺伝子の存在および／またはホモ多糖類類（特にグルカン類）をスクロースから生成する能力に関して分析することでそのような細菌を見つけだすことができる。好適な細菌は乳酸桿菌種の菌株、例えばＬ．レウテリ、Ｌ．サケ（Ｌ．ｓａｋｅ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．パラブクネリ（Ｌ．ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）または関連種、またはロイコノストック種の菌株、例えばＬｃ．メセンテロイデス（Ｌｃ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌｃ．シトレウム（Ｌｃ．ｃｉｔｒｅｕｍ）または関連種である。
【００１２】
本発明に従う方法の具体的な態様における乳酸菌は、２００１年５月２日付けでＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクション、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｔ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−９０００  Ｇｅｎｔ、ベルギーにアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３５０の下で寄託した菌株であるロイコノストック  ｓｐ．８６である。
【００１３】
本発明に従う方法の好適な具体的態様では乳酸菌をそれぞれ２００１年５月２日、２００１年５月８日、２００１年５月８日、２００１年５月８日および２００１年５月２日付けでＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧにそれぞれアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３４９、ＬＭＧ  Ｐ−１８３９０、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８８、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８９およびＬＭＧ  Ｐ−２０３４８の下で寄託した菌株であるラクトバチルス  ｓｐ．３３、ラクトバチルス・レウテリ株３５−５、Ｌ．レウテリ株１２１、Ｌ．レウテリ株１８０およびＬ．レウテリ株５４から選択する。
【００１４】
本発明に従う方法では、発酵を好適には１０−２００ｇ／ｌ、好適には５０−１５０ｇ／ｌ、より好適には８０−１２０ｇ／ｌのスクロース濃度で２０−４５℃、好適には３２−４３℃、より好適には３５−３９℃の温度において（半）嫌気性条件下で実施する。本発明における半嫌気性条件は、発酵中に酸素および／または空気を全く供給しない条件を指す。本発明に従う方法では、発酵をとりわけバッチ様式、フェド−バッチ様式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｍｏｄｅ）、連続、半連続およびスクロース供給（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｆｅｅｄｉｎｇ）で操作することができる。
【００１５】
本発明に従う方法は、好適には、また、本技術分野で公知の適切な分離および精製技術を用いてマンニトールおよびホモ多糖類を発酵培地から分離することも含んで成る。マンニトールとホモ多糖類の分離を、好適には、その両者の分子量に大きな差があることを基にして行う。従って、この二者を便利には透析、超遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーで分離してもよい。また、溶媒、例えばアルコールまたは水とアルコールまたは他の水溶性もしくは水混和性溶媒、例えばアセトン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの混合物などを用いた選択的沈澱を場合により上述した方法と組み合わせて用いることも可能である。
【００１６】
本発明に従う方法の具体的な態様では、１種以上のフルクタンスクラーゼ活性が欠失または低下している細菌を用いる。前記細菌は好適には１種以上のグルカンスクラーゼ活性を示す。細菌、例えば乳酸菌などは、スクロースから放出されるフルクトースを用いてフルクタン類、例えばイヌリンおよび／またはレバンなどを生成するフルクタンスクラーゼ活性を含んでいる可能性がある。１種以上のフルクタンスクラーゼ活性を欠失または低下させると、マンニトール生成に関与する酵素がそのような欠失または低下段階後にフルクトース単位をより容易に利用するようになることからマンニトール生成がより高い度合でもたらされ得る。本技術分野で公知の方法を用いてフルクタンスクラーゼ活性を欠失または低下させることができ、そのような方法には、これらに限定するものでないが、フルクタンスクラーゼ活性を有する酵素をコード化するＤＮＡに変異を誘発する欠失、挿入または置換を起こさせてフルクタンスクラーゼの活性を低下またはなくさせる方法、アンチセンスＲＮＡ技術、阻害剤を用いた処理、興味の持たれる細菌をフルクタンスクラーゼ活性を含む酵素が発現しないような条件下で増殖させる方法、またはフルクタンスクラーゼ活性が欠失しているか或は低下したフルクタンスクラーゼ活性を含む自然突然変異体を連続培養物の中から選択する方法が含まれる。
【００１７】
本発明は、更に、マンニトール−２−デヒドロゲナーゼ活性と１種以上のスクラーゼ活性を示す細菌をスクロースの発酵によるマンニトールと１種以上のホモ多糖類の生産で用いることにも関する。この細菌は本明細書の上に定義した如き細菌である。そのような細菌は好適には乳酸菌、特に乳酸桿菌属、ロイコノストック属および連鎖球菌属から成る属の群から選択した乳酸菌である。
【００１８】
本発明の好適な態様において、本発明に従う乳酸菌はＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３５０の下で寄託されている菌株であるロイコノストック  ｓｐ．８６である。
【００１９】
本発明の別の好適な態様では、本発明に従う乳酸菌をＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにそれぞれアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３４９、ＬＭＧ  Ｐ−１８３９０、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８８、ＬＭＧ  Ｐ−１８３８９およびＬＭＧ  Ｐ−２０３４８の下で寄託されている菌株であるラクトバチルス  ｓｐ．株３３、ラクトバチルス・レウテリ株３５−５、Ｌ．レウテリ株１２１、Ｌ．レウテリ株１８０およびＬ．レウテリ株５４から選択する。
【００２０】
本発明に従う細菌の具体的な態様では、この上に記述した技術を用いて、前記細菌が示すフルクタンスクラーゼ活性を欠失または低下させる。そのような細菌が好適には１種以上のグルカンスクラーゼ活性を示すようにする。
【実施例】
【００２１】
菌株
ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにＬＭＧ  Ｐ−２０３４９として２００１年５月２日付けで寄託されたラクトバチルス  ｓｐ．３３、ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにＬＭＧ  Ｐ−１８３９０として２００１年５月８日付けで寄託されたラクトバチルス・レウテリ株３５−５、ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにＬＭＧ  Ｐ−１８３８８として２００１年５月８日付けで寄託されたラクトバチルス・レウテリ株１２１、ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにＬＭＧ  Ｐ−１８３８９として２００１年５月８日付けで寄託されたラクトバチルス・レウテリ株１８０、ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにＬＭＧ  Ｐ−２０３４８として２００１年５月２日付けで寄託されたラクトバチルス・レウテリ株５４、ＢＣＣＭ（商標）／ＬＭＧ細菌コレクションにアクセッション番号ＬＭＧ  Ｐ−２０３５０の下で２００１年５月２日付けで寄託されたロイコノストック  ｓｐ．８６。あらゆる菌株がＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｔ、Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ３５、Ｂ−９０００  Ｇｅｎｔ、ベルギーに寄託された。
生成条件
スクロースを１００ｇ／ｌ添加しておいたＭＲＳ培地［ｄｅ  Ｍａｎ他（１９６０）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２３、１３０−１３５］（この培地には一般にグルコースを２０ｇ／ｌ存在させているが、それの代わりに）を１リットルのフラスコに入れて、この中で前記菌株を３７℃の嫌気条件下で増殖させた。１６−７２時間増殖させた後、冷エタノールを２倍体積用いて沈澱を起こさせることで多糖類を単離した。その沈澱物を１倍体積の水で洗浄し、再び２倍体積の冷エタノールを用いて多糖類を沈澱させた後、乾燥させた。その培養物の上澄み液に入っている生じたマンニトールをカチオン交換カラム（スルホン化スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）が用いられているＨＰＬＣ装置で分析した。前記カラムの温度を８５℃にしそして溶離剤としてＣａ−ＥＤＴＡを１００ｐｐｍ用い、溶離速度を０．４ｍｌ／分にし、そしてＲＩ検出器を用いた。
結果
表１：数種の乳酸菌株を用いたマンニトールと多糖類の生産
2004536609.tif 000002
【国際公開パンフレット】
2004536609.tif 000003
2004536609.tif 000004
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2004536609.tif 000010
2004536609.tif 000011
2004536609.tif 000012
【国際調査報告】
2004536609.tif 000013
2004536609.tif 000014
2004536609.tif 000015