(57)【要約】本発明は、新規なヒトカルシウムチャネル輸送ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域を含む単離された核酸に関する。また、ベクター、宿主細胞、抗体およびヒトカルシウムチャネル輸送ポリペプチドを産生するための組換え方法が提供される。本発明はさらに、これらの新規なヒトカルシウムチャネル輸送ポリペプチドに関する障害を診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。本発明は、被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号Ｘに示されるポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号Ｙの生物学的に活性なポリペプチドフラグメント、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされる生物学的に活性なポリペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドエピトープをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つにストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、可溶性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｙとして同定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｘの全体のヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
遺伝子発現を制御する異種調節エレメントに作動可能に連結されている請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞からコードされたポリペプチドを発現する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、ポリペプチドの産生方法。
【請求項１１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号Ｙに示されるポリペプチド、またはｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
（ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント、またはｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド；および
（ｄ）配列番号Ｙの改変体、
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号Ｙを有するポリペプチドを含む、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項１４】
請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、組換え宿主細胞。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下：
（ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換え宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチド。
【請求項１７】
医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を決定する工程；および
（ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
被験体において病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）生物学的サンプルにおける請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナーを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；および
（ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載のポリペプチドの活性を改変する分子をスクリーニングする方法であって、以下：
（ａ）該ポリペプチドを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有すると疑われる化合物と接触させる工程；および
（ａ）該ポリペプチドの活性をアッセイする工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規のカルシウムチャネル輸送タンパク質に関する。より詳細には、新規のカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。新規のカルシウムチャネル輸送ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに結合する抗体が提供される。ヒトカルシウムチャネル輸送のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、ならびに組換え法および合成法もまた提供される。本発明はさらに、これらの新規のカルシウムチャネル輸送ポリペプチドに関連する障害を診断、処置、予防および／または予後診断をするために有用な、診断方法および治療方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの産生および機能を阻害するための方法および／または組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
カルシウムチャネル輸送タンパク質は、細胞外環境からの細胞へのカルシウムイオンの調節された輸送に関与するイオンチャネル輸送タンパク質である。これらのタンパク質は、カルシウムおよび他の二価カチオンに選択的な形質膜を通じたカルシウム選択性孔の開口よる脱分極に応答する異種のクラスの分子であり、細胞への内向き電流を産生する（Ｃｅｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．，２７４：５４８３−９０（１９９９））。それらの電気生理学的特性および薬理学的特性に基づいて、これらのタンパク質は、Ｔ，Ｌ，Ｎ，Ｐ，およびＱ型として、分類される（Ｄｕｎｌａｐら，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：８９−９８（１９９５））。さらに、機能的に特徴付けられたカルシウムチャネルタンパク質のすべての型は、少なくとも３つの異なるサブユニット（α１サブユニット、α２−δサブユニット、およびβサブユニットと称される）からなると考えされる。α１サブユニットは、カルシウム結合に関与する内在性膜貫通タンパク質であると考えられる。α２−δサブユニットおよびβサブユニットは、これらのプロセスの調節において役割を果たすと考えられる（Ｃｅｎｓら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．，２７４：５４８３−９０（１９９９））。細胞カルシウムレベルの維持において、カルシウムチャネルタンパク質は、カルシウムイオンについての高い選択性を示す（Ｈｅｓｓら．，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：４５３−６（１９８４））。
【０００３】
細胞へのカルシウムの流入は、広範な生理学的な機能（例えば、収縮、遺伝子発現、およびホルモン分泌）を誘発する。さらに細胞へのカルシウムの流入は、膜電位に影響し、例えばペースメーカーの活性および反復性の発火（ｆｉｒｉｎｇ）パターンに影響する。同様に、心臓細胞におけるカルシウムの過負荷は、不整脈および収縮性機能不全を生じ得る（Ｒａｖｅｎｓら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｓ，３９：１６７−７４（１９９９））。ベンゾチアゾールアミン　Ｒ５６８６５のようなカルシウムチャネル遮断薬は、カルシウムの過負荷の有害な影響から、特定の細胞を保護すると考えられる。
【０００４】
従って、上記のレセプターのような新規のカルシウムチャネル輸送タンパク質レセプターを同定し、そして利用することの明らかな必要性がある。それらは、特定の基質（例えば、カルシウムイオン）の異常な輸送から生じる疾患に寄与し得る。さらに、タンパク質のこのファミリーの新規なメンバーは、カルシウムチャネル輸送タンパク質によって媒介される活性を増強またはブロックし得る、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを同定するためのスクリーニングツールとして有用である。構造的に関連するが、これらのレセプターは、種々の細胞型および組織型において種々の機能および多機能を有するようである。レセプター型分子は、低分子およびその他のこのような薬理学的に有用な因子についての標的ベーススクリーニングにおいて有用であると立証するべきである。このようなレセプターに対して惹起されるモノクロナール抗体は、例えば、不整脈、筋肉収縮性機能不全、ペースメーカー機能不全、適切な神経伝達物質放出の疾患、ホルモン分泌、高血圧およびＨＩＶ誘導痴呆、ならびに診断また他の能力における治療剤として有用であると立証し得る。さらに、本明細書中に記載のレセプターは、癌または他の免疫無防備状態の疾患状態を有する患者における能動的または受動的な免疫療法的役割において有用であると立証し得る。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、配列表に開示され、そして／または表１に記載されかつＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたヒトｃＤＮＡプラスミドに含まれる、ポリヌクレオチド配列を含むか、または代替的に、その配列からなる単離された核酸分子を含む。これらの核酸分子のフラグメント、改変体、および誘導体もまた、本発明に含まれる。本発明はまた、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれらのポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。本発明は、これらのポリヌクレオチドによってコードされるカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをさらに含む。配列表に開示され、そして／または表１に記載されかつＡＴＣＣに寄託されたヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるようなカルシウムチャネル輸送ポリペプチドを含むか、または代替的にそれらのポリペプチドからなるアミノ酸配列が、さらに提供される。これらのポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。これらのアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメント、改変体、および誘導体もまた、これらのポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを結合する抗体をコードするポリヌクレオチドと同様に、本発明に含まれる。
【０００６】
（詳細な説明）
（表）
表１は、本願に関連してＡＴＣＣで成された寄託物のＡＴＣＣ寄託物、寄託日、およびＡＴＣＣ受託番号を要約する。表１はさらに、ｃＤＮＡクローンＩＤ、ｃＤＮＡクローンＩＤに含まれるベクターの種類、ヌクレオチド配列ＩＤ番号、開示される配列に含まれるヌクレオチド、開示された配列の開始コドンの５’ヌクレオチドの位置、アミノ酸配列ＩＤ番号、および開示された配列によってコードされるＯＲＦの最後のアミノ酸を含む、以下の各「遺伝子番号」に関する情報を要約する。
【０００７】
表２は、公のＥＳＴを示し、これらの少なくとも１、２、３、４、５、１０、またはそれより多くの任意の１以上は、必要に応じて、本発明の特定の実施形態から除外される。
【０００８】
（定義）
以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【０００９】
本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」状態であり得る。なぜなら、そのベクター、組成物、または特定の細胞は、そのポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、細胞全体の総ＲＮＡ調製物またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、そしてブロットへトランスファーされたものを含む）、剪断された細胞全体のゲノムＤＮＡ調製物をも、本発明のポリヌクレオチド／配列の識別する特徴がないことが当該分野で示されている他の組成物をもいわない。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、（表１の第５列に記載にされる）配列番号Ｘ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列を有する分子、または（表１の第３列に記載され、そしてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのプール内に含まれる）ｃＤＮＡプラスミドＺをいう。例えば、このポリヌクレオチドは、５’および３’非翻訳配列、天然または人工のシグナル配列を伴うかまたは伴わないコード領域、タンパク質コード領域、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含む、全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、広く定義される本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡに対応する配列のポリＡテールの翻訳から生じるポリフェニルアラニンペプチド配列もポリリジンペプチド配列も明らかに除く）によってコードされるアミノ酸配列を有する分子をいう。
【００１１】
本発明では、配列番号Ｘの配列を含む代表的プラスミドが、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託され、そして表１に記載されている。表１に示すように、各プラスミドは、ｃＤＮＡクローンＩＤ（識別番号）およびＡＴＣＣ受託番号（ＡＴＣＣ受託番号Ｚ）によって同定される。単一の寄託物としてプールし寄託したプラスミドは、同じＴＡＣＣ受託番号を有する。ＡＴＣＣは、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００１２】
本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、またはその相補体（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ以上の相補体）、および／またはＡＴＣＣに寄託されたライブラリー内の関連するｃＤＮＡプラスミドＺに含まれる配列（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ以上の相補体）にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄することをいう。
【００１３】
本発明の「ポリヌクレオチド」には、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変更は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じて達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ　ＮａＣｌ；０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％　ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１４】
上記の条件におけるバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／または置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の特許処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１５】
もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて生成される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のために改変された、１つ以上の改変された塩基またはＤＮＡ骨格もしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも５００または少なくとも１０００個連続するヌクレオチドであるが、長さが３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂまたは１ｋｂ以下である。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示されるようなコード配列の一部を含むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含まない。別の実施形態において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺伝子（すなわち、目的の遺伝子に対してゲノムにおいて５’側または３’側）のコード配列を含まない。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、または１より多いゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【００１８】
「配列番号Ｘ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘ）」とは、表１の第５列に記載されるポリヌクレオチド配列をいい、一方、「配列番号Ｙ」とは、表１の第１０列に記載されるポリペプチド配列をいう。配列番号Ｘは、表１の第６列において特定される整数によって同定される。ポリペプチド配列の配列番号Ｙは、ポリヌクレオチド配列番号Ｘによってコードされる、翻訳されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。ポリヌクレオチド配列は配列表に示され、すぐ後にすべてのポリペプチド配列が続く。従って、ポリヌクレオチド配列の配列番号２に対応するポリペプチド配列は、配列表に示される最初のポリペプチド配列である。以下、第２のポリペプチド配列は、配列番号３に示されるようなポリヌクレオチド配列に対応する、などとなる。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、改変され得る。このような改変は、基本書、およびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯＶＡＬＥＮＴ　ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリペプチドには、天然に存在する単離されたポリペプチド、組換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせによって産生されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドを調製するための手段は、当該分野で十分に理解されている。
【００２１】
そのポリペプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟型を含む）であり得るか、またはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質（以下を参照のこと））の一部であり得る。さらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。このアミノ酸配列としては、分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え産生の間の安定性のためのさらなる配列が挙げられる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは実質的に精製される。ポリペプチドの組換え的に産生されたバージョン（分泌ポリペプチドを含む）は、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の技術を使用して（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０（１９８８）において記載される１段階方法によって）、実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の技術（例えば、当該分野において周知である方法において本発明のポリペプチドに対して惹起された本発明の抗体）を使用して、天然の、合成の、または組換えの供給源から精製され得る。
【００２３】
「機能的活性」を示すポリペプチドによって、本発明の全長（完全）タンパク質に関連する１以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプチドが意味される。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合（または結合についてポリペプチドと競合）する能力］、免疫原性（本発明の特定のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドとマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、特定のアッセイ（例えば、生物学的アッセイ）において測定した場合に、用量依存性ありまたはなしで、本発明のポリペプチドの活性と類似の活性であるが、その活性と必ずしも同一でない活性を示すポリペプチド（成熟型を含む）をいう。用量依存性が存在する場合、用量依存性は、そのポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合の所定の活性における用量依存性と実質的に類似である（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較してより高い活性、または約１／２５以上、好ましくは１／１０以上、そして最も好ましくは、約１／３以上の活性を示す）。
【００２５】
そのポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【００２６】
例えば、全長ポリペプチドに対する抗体の結合について本発明の全長ポリペプチドと結合または競合する能力についてアッセイする１つの実施形態において、当該分野で公知の種々のイムノアッセイが使用され得、これらのアッセイ系としては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド状金、酵素標識または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を使用する競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が当該分野において公知であり、そして本発明の範囲内にある。
【００２７】
別の実施形態では、リガンドが同定される場合、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体が多量体化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質への本発明のポリヌクレオチドの生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００２８】
さらに、本明細書中に記載のアッセイ（例えば、実施例を参照のこと）および当該分野で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドおよびそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログが、ポリペプチドに関連した生物学的活性（インビトロまたはインビボのいずれかで）を惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。
【００２９】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
（遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、細胞外環境から、細胞内への制御させた、カルシウムイオンの流入を可能にするために重要であると考えられる、Ｒａｔｔｕｓ　Ｎｏｒｗｅｇｉｃｕｓ由来の電位型（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）カルシウムチャネル（Ｇｅｎｂａｎｋ登録　ＢＡＡ７６５５６を参照のこと）と配列相同性を共有する。
【００３０】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなる：ＲＱＩＦＱＳＬＰＰＦ（配列番号１２）。これらのポリペプチドのフラグメントおよび／または改変体（例えば、本明細書中に記載されるフラグメントおよび／または改変体）は、本発明によって包含される。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドはまた、これらのポリペプチドを結合する抗体のように本発明によって包含される。
【００３１】
ジャーカット細胞株に対して試験される場合、この遺伝子を含む細胞から除去された上清は、ＧＡＳアッセイを活性化した。従って、この遺伝子は、Ｔ細胞を、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を介して活性化しそうである。このガンマ活性化配列（ＧＡＳ）は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路に関する多くの遺伝子の上流に見出されるプロモーターエレメントである。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路は大きなシグナル伝達経路であり、細胞の分化および増殖に関する。従って、ＧＡＳエレメントの結合によってもたらされるＪａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関するタンパク質を示すために使用され得る。
【００３２】
開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第１２染色体上に位置すると考えられる。従って、本発明に関連するポリヌクレオチドは、例えば、第１２染色体についての連鎖分析におけるマーカーとしての使用を有する。
【００３３】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号７に、以下の残基：Ｐｒｏ−２４〜Ｔｙｒ−３０，Ｓｅｒ−５７〜Ｔｒｐ−６３，Ａｓｐ−９３〜Ｐｈｅ−９９，Ｇｌｎ−１２０〜Ｇｌｙ−１２５，Ｔｒｐ−１７８〜Ｔｒｐ−１８７，Ｌｅｕ−３１７〜Ａｓｎ−３２３，Ｇｌｙ−３９１〜Ａｓｎ−３９７，Ａｓｎ−４６３〜Ｖａｌ−４７３，Ｓｅｒ−５１３〜Ｇｌｎ−５１９，Ａｒｇ−５２８〜Ｓｅｒ−５３４，Ａｌａ−５５３〜Ｓｅｒ−５６３，およびＧｌｎ−５７１〜Ｔｈｒ−５８２として示される免疫原性エピトープの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２のすべてを含むか、あるいはこれらからなる。これらのポリペプチドのフラグメントおよび／または改変体（例えば、本明細書中に記載されるフラグメントおよび／または改変体）は、本発明によって包含される。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドはまた、これらのポリペプチドを結合する抗体のように本発明によって包含される。
【００３４】
この遺伝子は、主に精巣、筋肉および小脳組織において発現されることが発見されている。
【００３５】
従って、抗体を含む、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプルにおいて存在する組織または細胞型の示差的同定のため、および以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用である：生殖障害、筋肉障害および神経障害。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。上記組織または細胞、特に生殖系、筋肉系、および神経系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織の発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルでのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、生殖組織、神経組織、筋肉組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）の中で、検出され得る。
【００３６】
精巣組織および筋肉ならびに小脳組織における組織分布、およびラット電圧型カルシウムチャネルタンパク質に対する相同性は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物、および抗体が、神経系、筋肉系、神経筋系および生殖系の疾患の診断、検出および／または処置のために有用であることを示唆する。
【００３７】
小脳組織における組織分布は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚における障害を含む）のような神経変性疾患状態および行動障害の検出および／または処置に有用であることを示唆する。さらにこの遺伝子または遺伝子産物は、発生中の胚に関連する発生疾患、または伴性障害の処置および／または診断において、役割を果たし得る。
【００３８】
さらに、筋肉組織における組織分布は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、例えば、適切な神経伝達物質放出、筋肉の収縮、ペースメーカー活性およびホルモン分泌の疾患、ならびに高血圧およびＨＩＶ誘導痴呆のような、筋肉および神経筋障害の診断、検出および／または処置に有用であることを示唆する。
【００３９】
このタンパク質のファミリーのメンバーが、カルシウムイオンの細胞内濃度の調節に関与する際に、この遺伝子は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、特に低分子または抗体の優れた標的である。このアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、その同族リガンドによってレセプターの結合を増強するか、またはブロックする、あるいは、内因性タンパク質の活性を阻害するか、または増殖する（例えば、カルシウムチャネルブロッカーとして機能することによって）かのいずれかである。従って、好ましいのは、この遺伝子の翻訳産物の細胞外部分に特異的に結合する抗体およびまたは低分子である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストとして機能し得る、抗体または低分子をスクリーニングするために有用なこのような技術の例は、本明細書中に示される。
【００４０】
あるいは、精巣組織における組織分布は、このクローンのタンパク質産物が、適切な精巣機能（例えば、内分泌機能、精子成熟）、ならびに癌に関する状態の処置および診断に有用であることを示す。従って、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、雄性不妊症および／またはインポテンスの処置に有用である。この遺伝子産物はまた、結合因子（例えば、雄性避妊薬として有用な薬剤（アンタゴニスト））を同定するために設計されたアッセイに有用である。
【００４１】
同様に、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、精巣癌の処置および／または診断に有用である。これらの精巣はまた、体の他の組織において、特に低レベルで、発現され得る転写物の活性な遺伝子発現の部位である。従って、この遺伝子に対応する翻訳産物は、他の特定の組織または器官で発現され得、そこで他のプロセス（可能な標的適用をいくつか挙げるなら、例えば、造血、炎症、骨形成、および腎機能）における関連した機能的役割を果たし得る。さらに、この遺伝子の対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【００４２】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号２に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号２の１〜１８６８の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１８８２の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号２に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００４３】
（遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子の対応する翻訳産物は、ヒト破骨細胞輸送タンパク質（国際公開番号ＷＯ９７／４２３２１を参照のこと）ならびにマウス腎臓特異的カチオン輸送タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録　ＢＡＡ２３８７５を参照のこと）と配列相同性を共有する。この遺伝子の対応する翻訳産物に対するアンタゴニスト（例えば、抗体および／または低分子）は、骨粗しょう症および／または大理石骨病の処置に有用であり得る。相同性に基づき、これらのタンパク質は、少なくともいくつかの生物学的機能を共有すると考えられる。
【００４４】
この遺伝子は、肝細胞腫瘍組織において発現される。
【００４５】
従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに抗体は、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のために、および肝細胞腫瘍、ならびにこの遺伝子の発現が観察される他の組織の腫瘍を含むがこれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬として、有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。上記組織または細胞の（特に、肝臓系の）多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織または体液の発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルでのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、肝臓組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）または別の組織もしくはサンプル中で、従来的に検出され得る。
【００４６】
肝細胞腫瘍組織における組織分布、ならびに破骨細胞由来輸送タンパク質およびマウス腎臓特異的カチオン輸送タンパク質に対する相同性は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、肝細胞腫瘍、ならびにこの遺伝子の発現が観察された他の組織系の腫瘍の増殖および／または発達において、役割を果たし得ることを示す。従って、この遺伝子に対する翻訳産物は、その同族リガンドによるこのレセプタータンパク質の結合をブロックする、アンタゴニスト、特に低分子または抗体の優れた標的である。従って、好ましいのは、この遺伝子の翻訳産物の一部に特異的に結合する抗体およびまたは低分子である。また提供されるのは、肝細胞癌を検出するためのキットである。１つの実施形態において、このようなキットは、固体支持体に結合したこの遺伝子の対応する翻訳産物に特異的な抗体を備える。さらに提供されるのは、個体において肝細胞癌を検出する方法であり、この方法は、この遺伝子の対応する翻訳産物に特異的な抗体を、個体由来の体液（好ましくは血清）に接触させる工程、および抗体が、体液中に見出される抗原に結合するか否かを確認する工程を包含する。好ましくは、抗体は、固体支持体に結合され、そして体液は血清である。上記の実施形態、ならびに他の処置および診断試験（キットおよび方法）は、本明細書中の他において、より詳細に記載される。
【００４７】
この遺伝子に対応する翻訳産物は、カルシウムイオン、ならびに他のカチオンの細胞内濃度の調節に関与し得ることが意図される。従って、この遺伝子に対応する翻訳産物は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、特に低分子または抗体の優れた標的である。このアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、その同族リガンドによるレセプターの結合を増強するか、またはブロックするか、あるいは内因性タンパク質の活性を、（例えば、カルシウムチャネルブロッカーとして機能することによって）阻害するか、または増強するかのいずれかである。従って、再び好ましいのは、この遺伝子の翻訳産物の細胞外部分に特異的に結合する抗体およびまたは低分子である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストとして作用し得る抗体または低分子をスクリーニングするのに有用なこのような技術の例は、本明細書中、以後に示される。このようなアンタゴニストはさらに、例えば、適切な神経伝達物質放出、筋肉の収縮、ペースメーカー活性、およびホルモン分泌、ならびに高血圧およびＨＩＶ誘導性痴呆に関与する障害のような疾患および／または障害に有用であり得る。従って、この遺伝子の対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に列挙された組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【００４８】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号３の１〜１３０２の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１３１６の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号３に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００４９】
（遺伝子番号３によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、カルシウムチャネルの構造および／または機能に関与すると考えられるカルシウムチャネルα−２−δ−３カルシウムチャネルサブユニット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録　ＣＡＢ７５９６２を参照のこと）と配列相同性を共有する。相同性に基づいて、これらのタンパク質は、少なくともいくつかの生物学的活性を共有すると考えられる。
【００５０】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号９に、以下の残基：Ａｓｎ−６８〜Ｓｅｒ−７４，およびＰｈｅ−８６〜Ｇｌｕ−９３として示される免疫原性エピトープの１つ、２つまたはその両方を含むか、あるいはこれらからなる。例えば、本明細書中に記載されるフラグメントおよび／または改変体のような、これらのポリペプチドのフラグメントおよび／または改変体は、本発明によって包含される。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドはまた、これらのポリペプチドに結合する抗体と同様に、本発明によって包含される。
【００５１】
この遺伝子は、好中球において発現される。
【００５２】
従って、抗体を含む、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のため、および免疫系の疾患および／または障害を含むがこれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である。同様に、これらのポリペプチドに対するポリペプチドおよび抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織における発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルでのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織または細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）または別の組織またはサンプルの中で、慣習的に検出され得る。
【００５３】
好中球における組織分布、およびカルシウムチャネルα−２−δ−３サブユニットに対する相同性は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、免疫系の疾患および／または障害の診断、検出および／または処置のために有用であることを示す。
【００５４】
この遺伝子は、カルシウムチャネルα−２−δ−３サブユニットタンパク質に類似の様式で、膜チャネルタンパク質の構造および／または機能において機能し得る。この遺伝子に対応する翻訳産物は、カルシウムイオンならびに他のカチオンの細胞内濃度の調節に関与し得ることが意図される。従って、この遺伝子の対応する翻訳産物は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、特に低分子または抗体の優れた標的であり、このアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、その同族リガンドによるレセプターの結合を増強するか、またはブロックするか、あるいは、内因性タンパク質（例えば、カルシウムチャネルブロッカー）の活性を阻害するか、または増強するかのいずれかである。従って、再び好ましいのは、この遺伝子の翻訳産物の細胞外部分に特異的に結合する抗体およびまたは低分子である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストとして機能し得る抗体または低分子をスクリーニングするのに有用なこのような技術の例は、本明細書中に以後示される。このような抗体は、例えば、適切な神経伝達物質放出、筋肉の収縮、ペースメーカー活性、およびホルモン分泌の障害を含む、ならびに高血圧およびＨＩＶ誘導性痴呆のような疾患および／または障害にさらに有用であり得る。
【００５５】
さらに、この遺伝子の翻訳産物に対する抗体は、膜チャネルの形成の予防に、および／または、これらの翻訳産物の形成を阻害することによって、有用である。好中球における発現は、この遺伝子に対応する翻訳産物が、免疫系の適切な制御に関与し得ることを、さらに示唆する。例えば、好中球を含む重要な造血系統の活性化／分化に関与し得る。従って、この遺伝子産物は、障害のある免疫の処置において；自己免疫の補正において；免疫調節において；アレルギーの処置において；および炎症の調節において臨床的な関連性を有し得る。この遺伝子産物はまた、特異的な造血系統の分化に影響を与える際に役割を果たし得、そして造血幹細胞にまで、さらに影響し得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に列挙された組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【００５６】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号４に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号４の１〜１２０３の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１２１７の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号４に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００５７】
（遺伝子番号４によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、カルシウムチャネルの構造および／または機能に関与すると考えれるヒトカルシウムチャネルα２−δ３サブユニット（Ｇｅｎｂａｎｋ登録　ＣＡＢ７５９６２）と配列相同性を共有する。相同性に基づき、これらのタンパク質は、すくなくともいくつかの生物学的活性を共有すると考えられる。
【００５８】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１０において、以下の残基：Ａｓｐ−８０〜Ｈｉｓ−９５，およびＰｒｏ−１２４〜Ｉｌｅ−１３０として示される免疫原性エピトープの１、２、または両方を含むか、あるいはこれらからなる。例えば、本明細書中に記載されるフラグメントおよび／または改変体のような、これらのポリペプチドのフラグメントおよび／または改変体は、本発明によって包含される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、これらのポリペプチドに結合する抗体と同様に、本発明によって包含される。
【００５９】
この遺伝子は、胎児肝臓組織において発現される。
【００６０】
従って、抗体を含む、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示唆的同定のための、および免疫系の疾患および／または障害を含むが、これらに限定されない疾患および状態の診断のための、試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示唆的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織または体液における発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルでのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織または細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）あるいは別の組織またはサンプルの中で、慣習的に検出され得る。
【００６１】
胎児肝臓組織における組織分布、およびヒトカルシウムα２−δ３サブユニットに対する相同性は、この遺伝子の対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、免疫系の疾患および／または障害の診断、検出および／または処置に有用であることを示唆する。
【００６２】
この遺伝子は、カルシウムチャネルα−２−δ−３サブユニットタンパク質に類似の様式で、膜チャネルタンパク質の構造および／または機能において機能し得る。この遺伝子に対応する翻訳産物は、カルシウムイオンならびに他のカチオンの細胞内濃度の調節に関与し得ることが意図される。従って、この遺伝子の対応する翻訳産物は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、特に低分子または抗体の優れた標的であり、このアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、その同族リガンドによるレセプターの結合を増強するか、またはブロックするか、あるいは、内因性タンパク質（例えば、カルシウムチャネルブロッカー）の活性を阻害するか、または増強するかのいずれかである。従って、再び好ましいのは、この遺伝子の翻訳産物の細胞外部分に特異的に結合する抗体およびまたは低分子である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストとして機能し得る抗体または低分子をスクリーニングするのに有用なこのような技術の例は、本明細書中に以後示される。このようなアンタゴニストは、例えば、適切な神経伝達物質放出、筋肉の収縮、ペースメーカー活性、およびホルモン分泌を含む障害、ならびに高血圧およびＨＩＶ誘導性痴呆のような障害および／または障害にさらに有用であり得る。同様に、これらの翻訳産物に対する抗体は、膜チャネルの形成の予防において、これらの翻訳産物の機能を阻害することによって有用である。
【００６３】
造血の活性な部位（例えば、胎児肝臓）における、この遺伝子産物の発現は、造血幹細胞を含む造血細胞系統の増殖、分化、および生存の調節における役割を示唆する。従って、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、造血細胞系統の調節において；幹細胞自己再生において；幹細胞の拡大および動員において；免疫機能不全の処置において；自己免疫の補正において；免疫調節において；および炎症の制御において、臨床的な有用性を有し得る。従って、この遺伝子の対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【００６４】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつかは、配列番号５に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号５の１〜４８９の間の任意の整数であり、ｂは１５〜５０３の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号５に示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００６５】
【表１】
2004500034.tif 000002
表１は、上記の各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。「ヌクレオチドＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘ」として同定されるヌクレオチド配列は、表１において同定される「ｃＤＮＡクローンＩＤ」から、およびいくつかの場合において、さらなる関連のＤＮＡクローンから得られる部分的に相同な（「重複する」）配列から構築された。重複する配列は、高い重複性の単一の連続した配列に構築され（通常、各ヌクレオチド部位で３〜５個の重複する配列）、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ（配列番号）：Ｘとして同定される最終的な配列を得た。
【００６６】
ｃＤＮＡクローンＩＤは、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ受託番号Ｚおよび日付」において列挙される対応する受託番号が与えられた。寄託物のいくつかは、同じ遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」とは、ｃＤＮＡクローンＩＤにおいて含まれるベクターの型をいう。
【００６７】
「総ヌクレオチド配列」は、「遺伝子番号」によって同定されるコンティグにおけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたプラスミドは、これらの配列のすべてを含み、これらは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘの「クローン配列の５’ヌクレオチド」および「クローン配列の３’ヌクレオチド」として示されるヌクレオチドの位置によって反映される。推定メチオニン開始コドン（存在する場合）のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘのヌクレオチドの位置は、「開始コドンの５’ヌクレオチド」として同定される。同様に、推定シグナル配列（存在する場合）のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘのヌクレオチドの位置は、「シグナルペプチドの最初のアミノ酸の５’ヌクレオチド」として同定される。
【００６８】
翻訳されたアミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列の最初の翻訳コドンで始まり、「アミノ酸ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｙ」として同定されるが、他のリーディングフレームもまた、公知の分子生物学的技術を使用して容易に翻訳され得る。これらの選択的オープンリーディングフレームによって生成されるポリペプチドは、本発明によって特に意図される。
【００６９】
配列番号Ｘ（ここで、Ｘは、配列表に開示されたポリヌクレオチド配列のいずれかであり得る）および翻訳された配列番号Ｙ（ここで、Ｙは、配列表に開示されたポリペプチド配列のいずれかであり得る）は、十分に正確であり、そしてそうでなければ、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種々の使用に適切である。例えば、配列番号Ｘは、配列番号Ｘに含まれる核酸配列または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計する際における使用を含むが、これらに限定されない使用を有する。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学的方法、および診断方法を可能にする。同様に、配列番号Ｙから同定されるポリぺプチドは、表１において同定されたｃＤＮＡクローンによりコードされる分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を産生することを含むが、これらに限定されない使用を有する。
【００７０】
それにもかかわらず、配列決定反応によって生じるＤＮＡ配列は、配列決定のエラーを含み得る。エラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、または生じたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、生じたＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入または欠失）を超えて同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは異なる。
【００７１】
従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこれらの適用のために、本発明は、配列番号Ｘとして同定された作製されたヌクレオチド配列、および配列番号Ｙとして同定された推定の翻訳されたアミノ酸配列のみではなく、表１において記載されるような、ＡＴＣＣに寄託された本発明のヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。各々の寄託されたプラスミドのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託されたプラスミドの配列決定により容易に決定され得る。
【００７２】
次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さらに、特定のプラスミドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチド配列決定により、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現し、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することにより、直接的に決定され得る。
【００７３】
また、ｃＤＮＡプラスミドを含むベクターの名前を表１に提供する。各ベクターは、当該分野において、慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、利便性のために提供される。
【００７４】
ベクターＬａｍｂｄａ　Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ　ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１　Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を含む。ファージミドｐＢＳは、λＺａｐベクターおよびＵｎｉ−Ｚａｐ　ＸＲベクターから切り出され得、そしてファージミドｐＢＫは、Ｚａｐ発現ベクターから切り出され得る。両方のファージミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。
【００７５】
ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ　１．０、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ　２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０は、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ　２０８９７から得られた。全てのＳｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ　１５：５９（１９９３）を参照のこと。ベクターｌａｆｍｉｄ　ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ　Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１　Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００　Ｆａｒａｄａｙ　Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ　９２００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：（１９９１）を参照のこと。
【００７６】
本発明はまた、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／または寄託されたプラスミド（ｃＤＮＡプラスミド：Ｚ）に対応する遺伝子に関する。この対応する遺伝子は、本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅する工程を包含するが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知である手順は、本明細書中で開示された配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンからの情報を用いて、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライス改変体、全長コード部分、オルトログ、および／または種相同体を得るために使用され得る。例えば、対立遺伝子改変体および／または種相同体は、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改変体および／または所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングすることにより単離および同定され得る。
【００７８】
本発明は、配列番号Ｘの核酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚを含むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドを提供する。配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。本発明はさらに、配列番号Ｘの核酸配列の相補体、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡのコード鎖の相補体を含むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを包含する。
【００７９】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり、そして配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは、本出願の開示では過度に煩わしい。従って、好ましくは、配列番号Ｘは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号Ｘの１と配列番号Ｘの最終ヌクレオチド−１５との間の任意の整数であり、ｂは１５〜配列番号Ｘの最終ヌクレオチドの整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００８０】
（全長遺伝子の回収のためのＲＡＣＥプロトコル）
部分的ｃＤＮＡクローンは、Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）に記載されたｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）手順を利用することにより全長を作製し得る。５’末端または３’末端のいずれかが欠失しているｃＤＮＡクローンは、翻訳の開始コドンまたは終止コドンのそれぞれに伸長する欠失塩基対を含むように再構築され得る。いくつかの場合において、ｃＤＮＡは、そのために翻訳の開始を欠失している。以下に、この本来の５’ＲＡＣＥ手順の改変を簡単に記載する。ポリＡ＋または全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）およびｃＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスプライマーまたは相補的プライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応から除去する。次いで、第１鎖ｃＤＮＡを、ｄＡＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、連結する。このように、アンカー配列を産生し、これは、ＰＣＲ増幅のために必要である。第２鎖を、ｄＡ−テイル含有ＰＣＲ緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）、５’末端で３つの隣接制限部位（ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ）を含むオリゴｄＴプライマーならびにこれらの制限部位を適切に含むプライマーから合成する。この２本鎖ｃＤＮＡを同じプライマーならびにネスティッドｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーを用いて４０サイクルでＰＣＲ増幅する。このＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドアガロースゲル上でサイズ分離し、そして欠失しているタンパク質コードＤＮＡの推定サイズのｃＤＮＡ産物を含むゲルの領域を取り出す。ｃＤＮＡを、Ｍａｇｉｃ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩまたはＳａｌＩを用いて制限消化し、そしてプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位で連結する。このＤＮＡを細菌に形質転換し、そしてこのプラスミドクローンを配列決定して、正確なタンパク質コード挿入物を同定する。正確な５’末端を、推定的に同定された相同体を有するこの配列と部分的ｃＤＮＡクローンを有する重複を比較することにより確認する。当該分野において公知の同様の方法および／または市販のキットを使用して、増幅し、そして３’末端を回収する。
【００８１】
いくつかの、品質管理キットが購入のために市販されている。上記のそれらと同様の試薬および方法は、全長遺伝子を回収をするための５’　ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥの両方について、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからキットの形態で供給される。第２のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。このキットは、Ｄｕｍａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９：５２２７−３２（１９９１）により開発された、関連技術の改変（ＳＬＩＣ（一本鎖ｃＤＮＡへの、一本鎖の連結））である。手順における主な違いは、ＲＮＡを、逆転写後にアルカリ加水分解し、そしてＲＮＡリガーゼを使用して、第１鎖ｃＤＮＡに、制限部位を含むアンカープライマーを連結することである。これは、過去に配列決定をするのが困難なポリＴの伸長を生じるｄＡテーリング反応における必要性を除去する。
【００８２】
ＲＮＡからの５’ｃＤＮＡまたは３’ｃＤＮＡを産生する代替は、ｃＤＮＡライブラリー二本鎖ＤＮＡを使用することである。非対称性ＰＣＲ増幅アンチセンスｃＤＮＡ鎖は、アンチセンスｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプラスミドアンカープライマーを用いて合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称ＰＣＲ反応を、ネストしたｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミドアンカープライマーを用いて実施する。
【００８３】
（５’末端配列または３’末端配列を産生し、全長遺伝子を得るための、ＲＮＡリガーゼのプロトコル）
一旦、目的の遺伝子が同定されると、本来のｃＤＮＡプラスミド中には存在しないかもしれない遺伝子の５’部分または３’部分の同定のためのいくつかの方法が利用可能になる。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン富化、ならびに５’　ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥと類似および同一のプロトコル。全長遺伝子は、ライブラリー中に存在し得、そして探索によって同定され得るが、一方、５’末端または３’末端を生成するために有用な方法は、欠けている情報を生成するために、本来のｃＤＮＡからの既存の配列情報を、使用することである。５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長遺伝子の欠けている５’末端を生成するために利用可能である（この方法は、Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３）によって発表された）。簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をおそらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結し、そして連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全長遺伝子を生成し得る。この方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始し、この手順における必要条件ではないが、ポリＡ　ＲＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡの５’リン酸基を排除し得る。次いで、使用された場合、ホスファターゼを不活化し、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理する。この反応は、次いでＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。次いで、この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用し得る。次いで、第一鎖合成反応物を、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的のカルシウムチャネル輸送遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用し得る。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末端配列が関連するカルシウムチャネル輸送遺伝子に属することを確認する。
【００８４】
（ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリペプチドフラグメント）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（核酸）の、ポリヌクレオチドフラグメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドをいう：ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡの一部か、もしくはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部；配列番号Ｘもしくはその相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部；配列番号Ｙのポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列；あるいは配列番号Ｘによりコードされるポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列。本発明のヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔ、または少なくとも約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」のフラグメントは、例えばｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに含まれる配列または配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖由来の２０以上連続する塩基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとしての使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きなフラグメント（例えば、少なくとも１５０、１７５、２００、２５０、５００、６００、１０００または２０００のヌクレオチドの長さ）もまた、本発明に含まれる。
【００８５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列番号Ｘ、またはその相補鎖のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００，７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、および／または１８５１〜１８８２。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、その配列が一部であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの、機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条件下でこれらのフラグメントの１つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはフラグメントも同様に含まれる。
【００８６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００，７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、および／または１８５１〜１８８２。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、あるいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、プローブまたはプライマーとして使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下あるいはより低いストリンジェンシー条件下で１つ以上のこれらのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドまたはフラグメントによりコードされるポリペプチドもまた、含まれる。
【００８７】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれるアミノ酸配列の一部、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の一部、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列をいう。タンパク質（ポリペプチド）フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分または領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列番号Ｙのコード領域の、以下のおおよそのアミノ酸番号のアミノ酸配列を含むか、あるいは以下のおおよそのアミノ酸番号のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、２８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４０、３４１〜３６０、３６１〜３８０、３８１〜４００、４０１〜４２０、４２１〜４４０、４４１〜４６０、４６１〜４８０、４８１〜５００、５０１〜５２０、５２１〜５４０、５４１〜５６０、５６１〜５８０、および／または５８１〜５８４。さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（おおよそ）」とは、特に列挙された範囲または値、あるいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな、範囲または値を含む。これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００８８】
タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導すし、そして／またはその抗体に結合する、短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基が、Ｎ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および当該分野において公知の別の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つ程度に少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００８９】
従って、本発明のポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質ならびに成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失した残基を有する分泌タンパク質、もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意の数のアミノ酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の範囲）が、分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせは好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００９０】
本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のアミノ末端から、１つ以上の残基を欠失したポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式ｍ−ｑによって記載され得、ここでｑは、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミノ酸残基の総数を表す全整数であり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に含まれる。
【００９１】
さらに、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはこの抗体に結合する、短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の他の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫源性活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００９２】
従って、本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から、１つ以上の残基が欠失されたポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、一般式１−ｎによって記載され得、ここでｎは、６〜ｑ−１の範囲の任意の全整数であり、そしてここでｎは、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により含まれる。
【００９３】
さらに、上記のＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、Ｎ末端およびＣ末端欠失型ポリペプチドを産生し得る。本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上の欠失したアミノ酸を有するポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、一般的に、配列番号Ｘ（例えば、好ましくは配列番号Ｙとして開示されるポリペプチドを含むが、これに限定されない）および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡ、ならびに／あるいはそれらの相補鎖によってコードされるポリペプチドの、残基ｍ−ｎを有するものとして記載され得、ここでｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００９４】
配列番号Ｙのポリペプチドに含まれる任意のポリペプチド配列、配列番号Ｘとして記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、任意のポリペプチド配列、またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされる任意のポリペプチド配列は、そのポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するために、分析され得る。例えば、配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８　Ｓ．Ｐａｒｋ　Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ　５３７１５　ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）のデフォルトパラメーターを使用して、分析され得る。
【００９５】
ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを使用して慣用的に得られ得るポリペプチドの領域としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域。この点で、本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３または４））と組み合わされる領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがある。
【００９６】
さらに、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメターを使用して同定されるような、１．５より大きいか、または１．５に等しい抗原性指標を有する、４つ以上連続するアミノ酸を含む）は、抗原性に対する高い程度の潜在性を表すポリペプチドの領域を決定するために慣用的に使用されている。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始プロセスにおいて、抗原認識が生じ得る環境中のポリペプチドの表面上に曝されるようであるポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、ＤＮＡＳＴＡＲ分析によるデータから決定される。
【００９７】
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメントであるポリペプチド配列の、機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含むか、またはあるいは、これらからなるフラグメントである。「機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長タンパク質と関連した１つ以上の公知の機能的活性（例えば、前述のような、生物学的活性、抗原性、免疫原性、および／または多量体化など）を示し得るポリペプチドを意味する。
【００９８】
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントとは、本発明のポリペプチドの活性に対して、同一である必要はないが、類似する活性を示すフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望ましくない活性を含み得る。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチドの１、２、３、４、５以上の抗原性フラグメントか、またはその部分を含むか、またはあるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１００】
本発明は、以下のポリペプチドを含むか、またはあるいは以下からなるポリペプチドを含む：配列番号Ｙに示されるポリペプチド配列のエピトープ、またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号Ｘに開示される配列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条ハイブリダイゼーション件下で、この相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０１】
用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ましくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセイによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。
【０１０２】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生され得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０１０３】
本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１０４】
同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、本明細書で開示される免疫原性および２、３、４、５以上のこれらの免疫原性エピトープの任意の組合せを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を誘発するために提示され得るか、またはこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０個程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０１０５】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）により上昇し得る。
【０１０６】
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、本発明のポリペプチドおよびその免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原性エピトープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせ、およびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける半減期を増加し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。上皮の関門を横切っての免疫系への抗原の増強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたはＦｃフラグメント（例えば、ＰＣＴ公開　ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ　９９／０４８１３を参照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証されている。ジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇＧ部分ジスルフィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。
【０１０７】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ　４６４　５３３（カナダ国対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ　０２３２　２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得ることが望ましい。例えば、融合タンパク質が、免疫の抗原として使用される場合、そのＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。）
さらに、本発明のポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９　Ｅｔｏｎ　Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４））。
【０１０８】
従って、これら上記の任意の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて操作され得る。
【０１０９】
上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ　ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：８９７２−８９７（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質についての基質結合ドメインとしてはたらく。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１１０】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、このような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２４（２）：３０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１１１】
（ポリヌクレオチド改変体およびポリペプチド改変体）
本発明はまた、カルシウムチャネル輸送改変体を含む。本発明は、配列番号Ｘに開示されるポリヌクレオチド配列の改変体またはそれらに対する相補鎖の改変体、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中に含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
【０１１２】
本発明はまた、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド配列の改変体、配列番号Ｘのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列の改変体および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列の改変体を含む。
【０１１３】
「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるがそれらの特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【０１１４】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子か、あるいはその代わりに以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列表に示さるようなアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードし、そして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなアミノ酸配列を有する成熟カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされる完全アミノ酸配列を含むカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【０１１５】
本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらからなる、核酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または低いストリンジェンシー条件下でこれらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によって含まれ得る。
【０１１６】
本発明の別の局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる、単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列表に示されかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に示されかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有する成熟カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｃ）配列表に示されかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの抗原性フラグメントをコードする、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託物中に含まれるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによりコードされかつ表１に記載される完全アミノ酸配列を含むカルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによりコードされかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有する成熟カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによりコードされかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードする、ヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによりコードされかつ表１に記載されるアミノ酸配列を有するカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの抗原性フラグメントをコードする、ヌクレオチド配列；（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。
【０１１７】
本発明はまた、例えば、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、核酸分子に関する。これらの核酸分子によりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。別の実施形態において、本発明は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる、核酸分子を包含する。これらの核酸分子の相補体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含され、同様に、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも、本発明により包含される。
【０１１８】
本発明はまた、例えば、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｙに示されるポリペプチド配列、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘにおけるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列、ｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列、および／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる、ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相補体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含され、同様に、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも本発明により包含される。
【０１１９】
本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸によって、その核酸のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、表１に示される配列全体、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
【０１２０】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列とも呼ばれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．　Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ　Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ　Ｓｉｚｅ　Ｐｅｎａｌｔｙ　０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１２１】
対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’の塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【０１２２】
例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列に整列される。欠失が、対象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’の末端の塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、対象配列の５’または３’に問い合わせと一致／整列しない塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１２３】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、その対象ポリぺプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（インデル（ｉｎｄｅｌｓ））または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々にかまたは参照配列内の１個以上連続する群の状態かのいずれかで、散在する。
【０１２４】
実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘにおけるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメント、あるいはｃＤＮＡプラスミドＺにおけるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従来のように決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列とも呼ばれる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ　０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ　Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ　Ｓｉｚｅ　Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ　Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１２５】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアが、本発明の目的で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端側およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。
【０１２６】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。この１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端の残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１２７】
改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するがコードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含む、ポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、５０アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、あるいは５〜５０アミノ酸、５〜２５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、１〜５アミノ酸、または１〜２アミノ酸が、任意の組合せで置換、欠失、または付加されている改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のために、生成され得る。
【０１２８】
天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０１２９】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例えば、本明細書中に考察されるように、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３個、８個、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：１９９−２１６（１９８８））。
【０１３０】
さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ改変体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸位置で試験された。この研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生成した。
【０１３１】
さらに、本明細書中に議論されるように、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のＮ末端残基またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
【０１３２】
従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すポリペプチド改変体を含み、このポリペプチド改変体は、本発明のポリペプチドの改変体である。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
【０１３３】
本願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、Ｎ末端欠失および／またはＣ末端欠失のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、核酸分子に関し、これは、その核酸が機能的活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらない。これは、特定の核酸分子が機能的活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしてその核酸を使用する方法を、当業者はなお知っているからである。機能的活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、（１）ｃＤＮＡライブラリーにおいて遺伝子またはその対立遺伝子改変体もしくはスプライス改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体スプレッドに対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；ならびに特定の組織におけるｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が、挙げられる。
【０１３４】
しかし、好ましいのは、本発明のポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチドを実際にコードする、本明細書中に開示される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を有する、核酸分子である。
【０１３５】
当然、遺伝子コードの縮重が原因で、例えば、ｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡの核酸配列、表１に示される核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｘ）またはそれらのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を有する核酸分子の大多数が、「機能的活性を有する」ポリペプチドをコードすることを、当業者はただちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列のいずれかの縮重改変体はすべて同じポリペプチドをコードするので、多くの場合において、上記の比較アッセイを実施することなしでさえ、これは当業者には明らかである。縮重改変体でない核酸分子について、妥当な数がまた、機能的活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、下記にさらに議論されるように、タンパク質の機能にあまり影響しそうにないかまたは有意には影響しそうにないかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者が完全に承知しているからである。
【０１３６】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針が、Ｂｏｗｉｅら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｅｓｓａｇｅ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に提供され、この著者は、変化に対するアミノ酸配列の許容性を研究する２つの主なストラテジーが存在することを示している。
【０１３７】
第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の許容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存的アミノ酸が同定され得る。これらの保存的アミノ酸は、タンパク質の機能について重要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって許容されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って、アミノ酸置換を許容する位置は、タンパク質の生物学的活性をなおも維持しつつ改変され得る。
【０１３８】
第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（分子中のどの残基にも１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され得る。
【０１３９】
著者らが述べるように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示す。例えば、最も埋もれている（タンパク質の三次構造内の）アミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なアミノ酸置換以外に、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸残基での置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ　Ｆｃ融合領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であることが考えられる。
【０１４０】
例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での、荷電されたアミノ酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特徴（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性を減少し、かつクリアランスを増加する。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、なおより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましくは、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、ポリペプチドは、好ましさの増大する順番に、配列番号Ｙのポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号Ｘによりコードされるアミノ酸配列、および／または少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸置換を超えないアミノ酸置換を含むｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。特定の実施形態において、配列番号Ｙのアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフラグメント）、配列番号Ｘによりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメント、ならびに／あるいはｃＤＮＡプラスミドＸＺによりコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントにおける付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。本明細書中で議論されるように、本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２のタンパク質と融合される場合、抗原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は、ポリペプチドに結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出するために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナルに基づいて標的化するので、分泌されることが示されている本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０１４２】
本発明のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１４３】
特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ポリペプチドがＮ末端欠失変異体および／またはＣ末端欠失変異体である融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、本出願は、特定のＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）はまた、本発明により宇含まれる。
【０１４４】
さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改良するために操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性ならびに持続性を改良するためにポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ、そして慣用技術である。
【０１４５】
当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドおよび上記のエピトープ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組合わされ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ドメイン全体もしくはその部分の両方を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わせ）と融合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増大を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する（ＥＰ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８））。ＩｇＧに起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
【０１４６】
（ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。例えば、ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠損であり得る。後者の場合、一般にウイルス増殖は、宿主細胞を補完する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）際にのみ生じる。
【０１４７】
本発明のポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、ウイルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１４８】
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０１４９】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ登録番号２０１１７８））；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【０１５０】
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における使用のために好ましいベクターは、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なベクターは当業者に容易に明らかである。
【０１５１】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８６）のような多くの標準的な研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【０１５２】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。
【０１５３】
本発明のポリペプチドはまた、以下から回収され得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精製される産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることが、当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質においてＮ末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
【０１５４】
１つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞系において、本発明のポリペプチドを発現させるために使用される。Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素供給源として代謝し得るメチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝経路における主要な工程は、Ｏ２を使用してのホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成する。結果的に、主要な炭素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうちのおよそ３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ　５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）。従って、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチドなど）は、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において、指数関数的に高レベルで発現される。
【０１５５】
１つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において本質的に記載されるように、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中に示されるように本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによって、本発明のタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０１５６】
多くの他の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈａ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５）は、当業者が容易に理解するように、提案された発現構築物が必要とされる場合インフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望される場合）などの適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得る。
【０１５７】
別の実施形態において、異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチドなど）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺａｌｐｈａなど）中にクローニングし、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることによって達成され得る。
【０１５８】
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失または置換するように操作されており、そして／あるいは本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作され、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）ならびに内因性ポリヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ　９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ　９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として援用される）。
【０１５９】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発明のポリペプチド配列のフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１６０】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変される本発明のポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０１６１】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０１６２】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポリペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１６３】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０１６４】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ　０　４０１　３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってアミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
【０１６５】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリコールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１６６】
本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーである。
【０１６７】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、（本明細書中に記載されるポリペプチドの、フラグメント、改変体、および融合タンパク質を含む）歯合い列番号Ｙのアミノ酸配列または配列番号Ｘもしくは配列番号Ｘの相補体によってコードされるアミノ酸配列および／あるいはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるアミノ酸配列に対応するポリペプチドのみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１６８】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０１６９】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホモダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のタンパク質が、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、および／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、ポリぺプチド配列（例えば、配列番号Ｙに記載されるか、または配列番号Ｘによってコードされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中に含まれる配列）に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ　９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０１７０】
本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ　９４／１０３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成またはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０１７１】
本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製において用いられ得る。
【０１７２】
別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリぺプチド配列を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合する。
【０１７３】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）さらに、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に、１つ以上の分子間架橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のタンパク質は、このポリぺプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、当該分野で公知の技術が、１つ以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で公知技術は、本発明のマルチマーに含まれることを所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１７４】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１７５】
（抗体）
さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするための当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の配列番号Ｙの、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または改変体、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。
【０１７６】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（ｓｈｉｐ　ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号において記載のような）を含む。
【０１７７】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ　９３／１７７１５；同ＷＯ　９２／０８８０２；同ＷＯ　９１／００３６０；同ＷＯ　９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１７８】
本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチドの排除を可能にする抗体を含む。
【０１７９】
本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性および／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０１８０】
本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害する。
【０１８１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それに続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。
【０１８２】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ　９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ　１４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　８（１）：１４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１８３】
本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこと。
【０１８４】
以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチドまたは他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１８５】
本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１８６】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与され得、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。種々のアジュバントが、免疫学的応答を増加させるために使用され得、宿主種に依存し、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ　ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのような強力に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１８７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクローナル抗体が生成される方法ではない。
【０１８８】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体に対して産生およびスクリーニングする方法は、慣用的であり、そして当該分野において周知であり、実施例において詳細に議論される。非限定な例において、マウスを、本発明のポリペプチドまたはこのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫化し得る。一旦、免疫応答が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中に検出される）と、マウスの脾臓を回収し、そして脾細胞を単離する。次いで、脾細胞は、周知の技術によって、任意の適切なミエローマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）へ融合される。ハイブリドーマを、限定希釈により選択およびクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを本発明のポリペプチドを結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野に公知の方法によってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水を、ポジティブなハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫化することにより、産生し得る。
【０１８９】
従って、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を含む方法によって産生される抗体を、産生する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、ミエローマ細胞を有する本発明の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離された脾細胞を融合することにより、次いで、本発明のペプチドを結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、その融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることにより、産生される。
【０１９０】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により産生し得る。例えば、本発明のＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９１】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野に公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的な抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを、レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用し得る。目的の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、（例えば、標識化抗原、あるいは固体表面または固体ビーズへ結合または捕捉された抗原を使用して）選択または同定し得る。これらの方法において使用されるファージは、代表的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージである。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１８２：４１〜５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１８４：１７７〜１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ　１８７　９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開　ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開　ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、その全体が参考として援用される）。
【０１９２】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体、または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを作製するために単離および使用され得、そして例えば、以下に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得る。この方法は、例えば、以下に開示される方法である：ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ　３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０１９３】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ　９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体は、この抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２５：１９１−２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照のこと（これらは、本明細書中でその全体が参照として援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換され、抗原結合を改変（好ましくは、改善）する。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法により同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３（１９８８）（これらは本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、例えば、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：ＣＤＲ−グラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開　ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ　９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１９４】
完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得、これらの方法としては、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる上記のファージディスプレイ方法が挙げられる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０１９５】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。この改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを産生する。次に、このキメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部）を用いて通常の様式で免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間のトランスジェニックマウスの再編成によってかくまわれ（ｈａｒｂｏｒｅｄ）、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０　５９８　８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０１９６】
選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１９７】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するために順々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）および／または本発明のポリペプチドのリガンドに対する結合を競合的に阻害する抗体を用いて、このポリペプチドのマルチマー化および／または結合ドメインを「模倣し」、そして結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する抗イディオタイプを生成し得る。このような中和抗イディオタイプまたはこのような抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、治療レジメンにおいて使用されて、ポリペプチドリガンドを中和し得る。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドを結合し得るか、そして／またはそのリガンド／レセプターを結合し得、それによって、その生物学的活性をブロックし得る。
【０１９８】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記のような）、抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドへ特異的に結合する抗体）をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチド、に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１９９】
当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１７：２４２（１９９４）に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いでＰＣＲによるこの連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０２００】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））を、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって作製された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２０１】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位指向性変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。
【０２０２】
特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために、当該分野で周知の方法、例えば、他の重鎖および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列を比較して、配列超可変性領域を決定する方法、によって、調べられ得る。慣用的組換えＤＮＡ技術を使用して、一つ以上のＣＤＲが、フレームワーク領域内、例えば、上記のように、非ヒト抗体をヒト化させるためにヒトフレームワーク領域内に挿入され得る。このフレームワーク領域は、天然に存在、または共通するフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレームワーク領域の一覧については、例えばＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生成するポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上で考察したように、一つ以上のアミノ酸の置換は、フレームワーク領域内で起こり、そして好ましくは、このアミノ酸置換は、その抗原への抗体の結合を改善する。さらに、このような方法は、アミノ酸置換させるため、または鎖内ジスルフィド結合に参加している一つ以上の可変領域システイン残基を欠失させて、一つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠けた抗体分子を生成させるために、使用され得る。ポリペプチドに対する他の改変は、本発明および当該分野の技術によって達成される。
【０２０３】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングすることによる、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２−４５４（１９８５））の産生のために開発された技術が、使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物の種に由来する分子（例えばマウスｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子）であり、例えばヒト化抗体である。
【０２０４】
あるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３−４２（１９９８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５８７９−５８８３（１９９８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５４４−５４（１９８９））は、一本鎖抗体を産生するために適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介して、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結し、一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：１０３８−１０４１（１９９８））。
【０２０５】
（抗体産生の方法）
本発明の抗体は、抗体の合成について当該技術分野で公知の方法によって、特に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって、産生され得る。
【０２０６】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。本発明の、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの部分（好ましくは重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが一旦得られれば、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法は、例えば，インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。従って、本発明は、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはプロモーターに作動可能に連結された、重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、を含む複製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ　８６／０５８０７号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ　８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと。）、そして、この抗体の可変領域は、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクター内にクローニングされ得る。
【０２０７】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いでトランスフェクト細胞は、従来の技術によって本発明の抗体を産生するために培養される。従って、本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその重鎖もしくは軽鎖、または異種のプロモーターに作動可能に連結された、本発明の一本鎖抗体を含む宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記の詳細のように、免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞において共発現され得る。
【０２０８】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ　４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：２（１９９０））。
【０２０９】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２１０】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２１１】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２１２】
さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、または、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株を含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし得、細胞株に拡大され得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０２１４】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ　１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ　２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　１２：４８８−５０５；Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．　３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ　ａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ、１９９３年、ＴＩＢ　ＴＥＣＨ　１１（５）：１５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ　３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１５０：１（１９８１）（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２１５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２１６】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ　３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２１７】
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製を容易にする。
【０２１８】
本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成する抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって、特定の細胞型に対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ　８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
【０２１９】
本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ　３０７，４３４；ＥＰ　３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２２０】
上記で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配列番号Ｙの変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセイにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合体化され得る。さらに、配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合体化させて、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合または結合体化される本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ　Ａ　２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２２１】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９　Ｅｔｏｎ　Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定されない。
【０２２２】
本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合体化され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２２３】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ　ａｎｔｈｒａｃｉｎ　ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ　ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０２２４】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス性薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ　Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ　ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０２２５】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２６】
このような治療部分を抗体に結合体化する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｏｆ　Ｄｒｕｇｓ　Ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　Ｏｆ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ　Ｆｕｔｕｒｅ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｕｓｅ　Ｏｆ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　Ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２２７】
あるいは、抗体は第二の抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。
【０２２８】
単独、あるいは細胞傷害性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬として使用され得る。
【０２２９】
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
【０２３０】
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ　ｒｅｓｉｄｕａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖および／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可能にする。
【０２３１】
（抗体結合についてのアッセイ）
本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０２３２】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％　ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１％　デオキシコール酸ナトリウム、０．１％　ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％　Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２３３】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプルをそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％　ＢＳＡまたは脱脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２３４】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２３５】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２３６】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２３７】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２３８】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、あるいはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２３９】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒトの患者に投与される。
【０２４０】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２４１】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２４２】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２４３】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　１２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ　１１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２４４】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコードする配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラグメントを含む。
【０２４５】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクターに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子治療としてそれぞれ公知である。
【０２４６】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセプターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化により、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２４７】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ　８３：１４６７−１４７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
【０２４８】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染することができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ　６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２４９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２５０】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２５１】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法により実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないならば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ましくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２５２】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２５３】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２５４】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自己である。
【０２５５】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるように細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ　７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２５６】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能である。
【０２５７】
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２５８】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましくは本発明のペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０２５９】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２６０】
様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２６１】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２６２】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２６３】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ　８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ　Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２６４】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２６５】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０２６６】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２６７】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２６８】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２６９】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外插され得る。
【０２７０】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２７１】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２７２】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２７３】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０２７４】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２７５】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプチドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２７６】
被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するために必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ｍキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｉｎｃ．（１９８２）において、記載される。
【０２７７】
使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０２７８】
１つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施される（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断から１年後、など）。
【０２７９】
標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができる。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュータ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診断法を含むが、これらに限定されない。
【０２８０】
特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。
（キット）
本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープを含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、または一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２８１】
本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスクリーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトープは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さらに、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０２８２】
より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポーター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原への抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２８３】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キットは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポリペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノクロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を含み得る。
【０２８４】
１つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、および洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポーター標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２８５】
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０２８６】
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト抗体を備える。
【０２８７】
（ポリヌクレオチドの使用）
本明細書中で同定された各々のポリヌクレオチドは、試薬として多数の方法において使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０２８８】
本発明のポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんど利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するままである。各々の配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特に標的化され、そしてこの位置にハイブリダイズされ得る。従って、本発明の各々のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の技術を用いて染色体マーカーとして慣用的に使用され得る。
【０２８９】
簡単に言うと、配列は、配列番号Ｘで示される配列またはそれに対する相補体からＰＣＲプライマー（好ましくは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５ｂｐ））を調製することによって染色体にマッピングされ得る。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたがらないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して必要に応じて選択され得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０２９０】
同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用して１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグメントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ　ｆｌｏｗ　ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択、およびコンピューターマッピング技術（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１６：４５６−４５９（１９９８）など）を含む。
【０２９１】
ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して獲得され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチドを使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）を参照のこと。
【０２９２】
染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に（単一染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位および／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
【０２９３】
従って、本発明はまた、染色体の位置決定のための方法も提供し、この方法は、（ａ）表１におけるポリヌクレオチド配列および配列番号ＸからＰＣＲプライマーを調製する工程、ならびに（ｂ）個々の染色体を含む体細胞ハイブリッドをスクリーニングする工程を包含する。
【０２９４】
本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡＰＰＹマッピング、および長範囲制限マッピングに有用である。これらの技術および当該分野で公知の他の技術の概説について、例えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１〜６９４（１９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ　３：４８３〜４９２（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｒｅｓ．７：４０９〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ、Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２９５】
一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオチドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立する。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る。
【０２９６】
従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間での本発明のポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。まず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッドにおいて、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、正常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用され得る。
【０２９７】
さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現が、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。
【０２９８】
従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および測定された遺伝子発現レベルを標準のポリヌクレオチド発現レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０２９９】
なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性および／またはガン性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、このキットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー末端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０３００】
例えば、腫瘍の診断を含む、関連障害の診断が既に従来方法によって行われている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによって増強または抑制された本発明のポリヌクレオチドの発現を示す患者が、標準レベルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験する。
【０３０１】
「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは関連障害を有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当該分野で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になれば、これを、比較のための標準として反復して用い得る。
【０３０２】
「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたは対応するｍＲＮＡを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、本発明のポリペプチドを発現することが見出された組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０３０３】
上記で提供された方法は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載される、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、本発明のポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチドとの間の多型性を同定し得る。このような多型の知識（すなわち、その多型の位置、およびその多型の存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖性障害、ならびに／または癌性疾患および癌性状態）について、疾患遺伝子座を同定する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号および同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０３０４】
本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支持体、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立つ。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡアナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについてのモノマー単位が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４，１４９７（１９９７）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３６５，６６６（１９９３）によって開示されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、そしてヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合するよりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力が存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これによって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容易にする。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用いられ得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにおける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるからである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーションが、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減少させることを意味する。
【０３０５】
本発明は、哺乳動物におけるガンの検出を含むがこれらに限定されない用途を有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトである。
【０３０６】
病理学的細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の不適切な活性化に関連する（Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ　Ｅｔｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｃｕｔｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｖｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｖｉｒａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に転写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常な細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じると考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更された発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と関与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形成に関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例において増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０３０７】
例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’末端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタンパク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍＲＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起こすことが示されている（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７９（１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々の起源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞および組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０３０８】
前記に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、三重らせん形成を通して、またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において考察される。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）において考察される。両方の方法は、相補的ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが、インビボで発現されて本発明の抗原のポリペプチド産生を阻害し得るように細胞に送達され得る。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾患を処置するための試みにおいて、特に、増殖性疾患および／または状態の処置のために、アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０３０９】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主細胞中に新しい形質を生成することである。
【０３１０】
ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識票（Ｄｏｇ　ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとして使用され得る。
【０３１１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択されたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有するので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベースが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡していようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルからなされ得る。
【０３１２】
法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｓｐｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ　ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ　ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０３１３】
また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、前立腺または前立腺癌ポリヌクレオチドに特異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０３１４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の示差的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、本発明のポリペプチドに関するポリペプチドおよび抗体は、組織（例えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞学アッセイ）の示差的同定のための免疫学的プローブを提供するのに有用である。さらに、「標準」遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有しない個体からの健康組織の発現レベル）と比較して、上記の組織または細胞の多くの障害に対して、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの有意に高いかまたは低いレベルの遺伝子発現が、例えば、障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを発現する組織、および／または癌性組織および／または創傷組織）または体液（例えば、漿液、血漿、尿、滑液または髄液）において検出され得る。
【０３１５】
従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示す、工程。
【０３１６】
少なくとも、本発明のポリヌクレオドは、サザンブロットのゲル上の分子量マーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断プローブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するために、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答を惹起する抗原として使用され得る。
【０３１７】
（ポリペプチドの使用）
本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０３１８】
本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。
【０３１９】
抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サンプル中の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのレベルをアッセイし得る。（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０３２０】
生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識することにより抗体中に取り込まれ得る。
【０３２１】
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系の障害について検査されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３２２】
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０３２３】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連する本発明のポリペプチドを投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０３２４】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、２１３Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０３２５】
当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチド（抗体を含む）を標識化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定されない。
【０３２６】
従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体の細胞または体液における本発明のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイされたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に関しては、個体由来の生検された組織中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家がより早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる進行を防ぐことを可能にし得る。
【０３２７】
さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患または状態（例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。例えば、患者は、ポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドが投与され得る。
【０３２８】
同様に、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、疾患（上記、および本明細書中のどこかに記載されるような）を処置し得る。例えば、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを結合して、そして／またはポリペプチドを中和し、そして／またはポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【０３２９】
少なくとも、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ポリペプチドがまた用いられ、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用され、組換え細胞からのタンパク質発現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドが使用され、以下の生物学的活性を試験し得る。
【０３３０】
（遺伝子治療方法）
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のポリペプチドの発現を達成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの発現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
【０３３１】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、本発明のポリペプチドを用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８５：１０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作される細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０３３２】
以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る。
【０３３３】
１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０３３４】
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０３３５】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３３６】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３３７】
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０３３８】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。
【０３３９】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３４０】
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で公知である。
【０３４１】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達方法は、当該分野で公知である。
【０３４２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０３４３】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３４４】
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例えばＰＣＴ公開第ＷＯ　９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０３４５】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
【０３４６】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブを装備したＨｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　モデル３５０超音波処理器を使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得るか、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知でありそして利用可能である。
【０３４７】
このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７（１９８３）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
【０３４８】
一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までである。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までである。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３４９】
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカチオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
【０３５０】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５１】
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３５２】
このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３５３】
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイルスは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔ，Ａ．Ｒ．ら、（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）Ｃｅｌｌ　６８：１４３〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。
【０３５４】
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明において有用である。
【０３５５】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３５６】
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エキソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成するためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中ではない細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３５７】
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらはポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明のポリペプチドを発現する。
【０３５８】
遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３５９】
当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とともに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３６０】
このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ましくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３６１】
裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるようなリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、このプロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３６２】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現を駆動する。
【０３６３】
好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３６４】
その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０３６５】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域内部に直接注射により投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメートルで注射することを言う。
【０３６６】
局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオチド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこのポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはその構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３６７】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソームを含む。
【０３６８】
全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１１２８１、１９９２を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３６９】
送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康および病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３７０】
本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特にヒトが好ましい。
【０３７１】
（生物学的活性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストをアッセイに使用し、１つ以上の生物学的活性について試験し得る。本発明のこれらのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これらの分子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、このポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、関連した疾患を処置し得る。
【０３７２】
カルシウムチャネル輸送タンパク質は、細胞膜を横切るカルシウムカチオンの輸送に関連する生物学的活性に関与すると考えられる。従って、本発明の組成物（本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび改変体を含む）は、異常なカルシウムチャネル輸送体活性に関連した疾患および／または障害の診断、検出、および／または処置に使用され得る。このましい実施形態において、本発明の組成物（本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび改変体を含む）は、心臓血管障害（例えば、不整脈、高血圧、筋肉収縮性機能不全、ペースメーカー機能不全、および／または以下の「免疫活性」および「心臓血管障害」に記載されるもの）、ホルモン分泌障害、神経学的疾患（例えば、適切な神経伝達物質放出の障害、ＨＩＶ誘導性痴呆、および／または以下の「神経学的疾患」で記載されるもの）に関連する疾患および／または障害の診断、検出および／または処置に有用であり得る。従って、本発明のポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、以下を含むが、これらに限定されない活性に関連した疾患および／または障害の診断、検出および／または処置に有用である：ＨＩＶ誘導性痴呆、不整脈、高血圧、筋肉収縮性機能不全、ペースメーカー機能不全、適切な神経伝達物質放出の障害、ホルモン分泌障害。
【０３７３】
より一般的には、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体は、以下の系に関する障害および／または疾患の診断、検出および／または処置に有用であり得る。
【０３７４】
（免疫活性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の欠損または障害の処置において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠損または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０３７５】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞の欠損または障害の処置または検出において有用であり得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。免疫不全症候群の例としては、血液タンパク質の障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３７６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液凝固の障害（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板の障害（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置において、これらの分子は重要であり得る。
【０３７７】
自己免疫障害の処置または検出において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質として不適切に自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
【０３７８】
処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、類天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３７９】
同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る。さらに、これらの分子を使用し、抗原性分子に対するアナフィラキシー、過敏症または血液型不適合性を処置し得る。
【０３８０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用し、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介して宿主免疫細胞による移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
【０３８１】
同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調節し得る。例えば、このポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子を使用して、慢性の前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置し得る。
【０３８２】
（過剰増殖障害）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、新生物を含む過剰増殖障害を処置または検出し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、直接的または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、過剰増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０３８３】
例えば、免疫応答を増大させること、特に過剰増殖障害の抗原性の質を増大させることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、過剰増殖障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過剰増殖障害を処置する方法であり得る。
【０３８４】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置または検出され得る過剰増殖障害の例としては、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８５】
同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生物。
【０３８６】
本発明のポリヌクレオチドを利用する１つの好ましい実施形態は、本発明および／または融合タンパク質もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療によって、異常な細胞分裂を阻害することである。
【０３８７】
従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを異常に増殖している細胞に挿入することによって、細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、ここでこのポリヌクレオチドはこの発現を示す。
【０３８８】
本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖性障害を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の１以上の活性遺伝子コピーを異常に増殖している１つの細胞または複数の細胞に投与することを包含する。好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列の発現において有効な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルスベクター、またはより好ましくは、アデノウイルスベクターを用いて、処理されるべき細胞に挿入される（Ｇ　Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ　１９９９　９６：３２４−３２６（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。最も好ましい実施形態においては、ウイルスベクターは不完全であり、非増殖性細胞ではなく増殖性細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形態においては、単独、または他のポリヌクレオチドと組み合わされたかもしくは融合されたかのいずれかで増殖性細胞に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、次いで外部刺激（すなわち、磁気、特異的小分子、化学的、または薬物投与など）を介して調節され得、これはこのポリヌクレオチドの上流のプロモーターに作用し、コードされたタンパク質産物の発現を誘導する。このように、本発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明確に調節され得る（すなわち、本発明の発現を増加、減少、または阻害する）。
【０３８９】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の脈管形成タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパク質としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来の内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および一酸化窒素シンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９０】
本発明のポリヌクレオチドは、発癌遺伝子または抗原の発現の抑制において有用であり得る。「発癌遺伝子の発現の抑制」によって、遺伝子の転写の抑制、遺伝子転写物の分解（プレメッセージ（ｐｒｅ−ｍｅｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の予防、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害が意図される。
【０３９１】
異常に増殖している細胞への局所的投与のために、本発明のポリヌクレオチドは当業者に公知の任意の方法によって投与され得、この方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、またはビヒクル（例えば、リポソーム、リポフェクチン）中で、または裸のポリヌクレオチドとして、または本明細書を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子送達系（例えば、レトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ　３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５））または当業者に公知の他の有効なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１２（１９８５））があるが、これらに限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は、例示のみであり、本明細書中に参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂細胞を使わないために、当業者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野および本明細書中のいずれかに記載のような）送達系を使用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、組み込みのためにレトロウイルスＤＮＡを必要とし、レトロウイルスはそのライフサイクルに必要なレトロウイルス遺伝子を欠くために自己複製できないからである。このようなレトロウイルス送達系を本発明のポリヌクレオチドのために用いることによって、この遺伝子および構築物は異常に増殖している細胞を標的とし、そして非分裂正常細胞を使用しない。
【０３９２】
本発明のポリヌクレオチドは、注射針を疾患部位に直接導くために使用される画像化デバイスの使用によって、内部器管、体腔などにおける細胞増殖性障害／疾患部位へ直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的処置のときに疾患部位へ投与され得る。
【０３９３】
「細胞増殖性疾患」によって、器管、腔、または身体の部分の任意の１つまたは任意の組み合わせに影響を与える、任意のヒトまたは動物の疾患もしくは障害が意味され、これは良性であるか悪性であるかに関わらず、細胞、細胞の群、または組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる。
【０３９４】
本発明のポリヌクレオチドが処置される細胞の増殖に対して生物学的に阻害する効果を有する限り、本発明のポリヌクレオチドの任意の量が投与され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドの１つより多くを、同じ部位へ同時に投与することが可能である。「生物学的に阻害する」によって、細胞の部分的または全体的な増殖阻害および細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または成長（ｇｒｏｗｔｈ）の速度における減少が意味される。生物学的阻害用量は、組織培養物における標的悪性細胞増殖もしくは異常増殖細胞増殖、動物および細胞培養物における腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによって、または当業者に公知の任意の他の方法によって決定され得る。
【０３９５】
本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この治療は、１以上の記載された障害を処置するために、抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオチド抗体を哺乳動物（好ましくは、ヒト）患者に投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオチド抗体のポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体を生成するための方法は、本明細書中のいずれかに詳細に記載される。このような抗体は、当該分野において公知であるかまたは本明細書中に記載されるような薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３９６】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要旨は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体中で局所的もしくは全体的に、または抗体の直接的な細胞傷害性によって（例えば、相補細胞（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって媒介されるように）結合させる工程を包含する。これらのアプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教示によって、当業者は過度の実験なしで、本発明の抗体を診断目的、モニタリング目的または治療目的のために使用する方法を理解する。
【０３９７】
特に、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載されるような細胞増殖性障害および／または細胞分化障害を有しているかまたは発症している被験体を処置するために有用である。このような処置は、抗体もしくはフラグメント、誘導体またはそれらの結合体の単一または複数の用量を投与する工程を包含する。
【０３９８】
本発明の抗体は、例えば、他のモノクロナール抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、またはリンホカインもしくは造血成長因子と組み合わせて有利に使用され得、これは抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つ。
【０３９９】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して高親和性および／または強力なインビボ阻害および／または中和抗体、それらのフラグメントもしくは領域を、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に関するイムノアッセイおよびそれらに関連する障害の治療の両方のために使用することが好ましい。このような抗体、フラグメントまたは領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性としては、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍおよび１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを伴う結合親和性が挙げられる。
【０４００】
さらに、本明細書中のいずれかに記載されるように、本発明のポリペプチドは、単独で、融合タンパク質として、または他のポリペプチドと組み合わせて、直接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞または組織の新脈管形成の阻害において有用である。最も好ましい実施形態においては、この抗新脈管形成効果は、例えば造血性細胞、腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害を通して、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ　ＩＢら、Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指向する抗体はまた、直接的または間接的に新脈管形成の阻害を生じ得る（Ｗｉｔｔｅ　Ｌら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０４０１】
本発明のポリペプチド（融合タンパク質を含む）またはそのフラグメントは、アポトーシスの誘導を通した増殖性細胞または組織の阻害において有用であり得る。このポリペプチドは、デスドメインレセプター（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１およびレセプター２）の活性化において、直接的または間接的のいずれかで、増殖性細胞および組織のアポトーシスを誘導するために作用し得る（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ　Ｋら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の別の好ましい実施形態においては、このポリペプチドは、他の機構を通して（例えば、アポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化において）、あるいは単独または小分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガレクチン、チオレドキシン、抗炎症タンパク質）との組み合わせのいずれかで、このタンパク質の発現の刺激を通して、アポトーシスを誘導し得る（例えば、Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ　４００（１−２）：４４７−５５（１９９８）、Ｍｅｄ　Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８）、Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ　２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９８）、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８）、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）（これらはすべて本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０４０２】
本発明のポリペプチド（それとの融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含む）は、増殖性細胞または組織の転移の阻害において有用である。阻害は、ポリペプチド、または本明細書中のいずれかに記載されるようなこのポリペプチドを指向する抗体の投与の直接的な結果として、あるいは間接的に（例えば、転移を阻害することが知られているタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現の活性化）生じ得る（例えば、Ｃｕｒｒ　Ｔｏｐ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９８；２３１：１２５−４１（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明のこのような治療的効果は、単独、または小分子薬物もしくはアジュバントとの組み合わせのいずれかで達成され得る。
【０４０３】
別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する組成物（例えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合するポリペプチドまたはポリペプチド抗体を含有する組成物）を、本発明のポリペプチドを発現する標的細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド抗体は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合し得る。
【０４０４】
本発明のポリペプチド、それらとの融合タンパク質またはそれらのフラグメントは、直接的（例えば、本発明のポリペプチドが増殖性抗原および免疫原に応答するために、免疫応答を「ワクチン接種した」場合に起こるように）、または間接的（例えば、この抗原および免疫原に対する免疫応答を増強することが知られているタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現の活性化におけるように）のいずれかで、増殖細胞または組織の免疫原性および／または抗原性の増強において有用である。
【０４０５】
（心臓血管障害）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障害を処置し得る。
【０４０６】
心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ　ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｅａｒｔ　ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｖｅｓｓｅｌ　ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ　ｄｕｃｔｕｓ　ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ　ｓｅｐｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｓｅｐｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｈｅａｒｔ　ｓｅｐｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０４０７】
心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ　ｃａｒｄｉａｃ　ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ　ｃａｒｄｉａｃ　ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｈｅａｒｔ　ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられる。
【０４０８】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ　ＱＴ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ　ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｎｏｄａｌ　ｒｅｅｎｔｒｙ　ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ　ｎｏｄａｌ　ｒｅｅｎｔｒｙ　ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０４０９】
心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒ　ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０４１０】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられる。
【０４１１】
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０４１２】
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ　ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる。
【０４１３】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられる。
【０４１４】
動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０４１５】
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ　ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０４１６】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０４１７】
虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ　ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０４１８】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効である。
【０４１９】
ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。ポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０４２０】
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ　５６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０４２１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処置の必要な個体に投与する工程を包含する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置するために、局所送達され得る。
【０４２２】
なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
【０４２３】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０４２４】
例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイドに投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法が提供される。
【０４２５】
本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０４２６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０４２７】
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁されるようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０４２８】
特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物において一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、その純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０４２９】
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０４３０】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｃｈａｍｂｅｒ　ａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０４３１】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置され得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開始されるべきである。
【０４３２】
本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
【０４３３】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
【０４３４】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ　ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ　ｍｉｎａｌｉａ　ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
【０４３５】
出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ　ａｆｔｅｒ）」方法を提供する。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０４３６】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。
【０４３７】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
【０４３８】
本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手術後に適用される。
【０４３９】
本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０４４０】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０４４１】
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０４４２】
バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体のようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０４４３】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０４４４】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ　ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ　ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ　Ａｃｔｉｏｎｓ　３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０４４５】
（細胞レベルでの疾患）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアンタゴニストもしくはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０４４６】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。
【０４４７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４４８】
（創傷治癒および上皮細胞増殖）
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するためのプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激することにおいて臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０４４９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ　ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ　ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ　ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善するために使用され得る。
【０４５０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０４５１】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０４５２】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、表皮水疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置するために使用され得る。
【０４５３】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを使用して効果的に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防することを助け得る。
【０４５４】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０４５５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、その疾患の持続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
【０４５６】
（神経学的疾患）
本発明のなおさらなる局面に従って、治療目的のため、例えば、神経学的細胞増殖および／または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセスが提供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置および／または検出するために使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または障害のマーカーまたはディテクターとして使用され得る。
【０４５７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のような小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎のようなびまん性脳硬化、脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ　ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、室周白斑症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、群発性頭痛のような血管性頭痛、偏頭痛、エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ　ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ　ｐｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、大脳マラリア、クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）大脳トキソプラスマ症、テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１５　ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全、シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、部分聴覚欠失および大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語発達障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５　ｑ‐１３微少欠損、運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ　ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のような眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー、手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ‐ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および．家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
【０４５８】
（感染性疾患）
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０４５９】
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらに具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置するために使用される。
【０４６０】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、ＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状もしくは疾患のいずれかを処置または検出し得る。具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
【０４６１】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置または検出し得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、マラリアを処置するために使用される。
【０４６２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４６３】
（再生）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【０４６４】
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０４６５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０４６６】
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置され得る。
【０４６７】
（走化性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０４６８】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。
【０４６９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０４７０】
（結合活性）
本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに結合する分子、またはこのポリペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。このポリペプチドとこの分子との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０４７１】
好ましくは、この分子は、このポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、このポリペプチドが結合する天然のレセプター、または少なくとも、このポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０４７２】
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ポリペプチドを発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、このポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を、好ましくは、このポリペプチドまたはこの分子のいずれかの結合、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触させる。
【０４７３】
アッセイは、このポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへの結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０４７４】
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合する工程、ポリペプチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０４７５】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのポリペプチドとの競合によって、ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０４７６】
さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。このポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０４７７】
固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクトして、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０４７８】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセプター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィルムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され得る。微小配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０４７９】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」という）を利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、それによって本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。１つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの、所望の分子へのアセンブリを含む。別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施態様において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施態様において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施態様において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０４８０】
他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活性に類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活性を含み得る。
【０４８１】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合物および３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で組み合わせる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量と比較して、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この手順により同定され得る。
【０４８２】
別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポリペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングされるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答およびレセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８３】
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０４８４】
従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ポリペプチドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０４８５】
（標的化された送達）
別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のポリペプチドについてのレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０４８６】
本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０４８７】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４８８】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８９】
（薬物スクリーニング）
本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするために、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性をアッセイする工程を包含する。
【０４９０】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポリペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドとの間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０４９１】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペプチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤は、典型的には標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０４９２】
薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する化合物についての高処理能力スクリーニングを提供し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物は、本発明のポリペプチドと反応させられ、そして洗浄される。次いで、結合したポリペプチドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそれを固定し得る。
【０４９３】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出する。
【０４９４】
（アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト））
特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含まれる配列またはその相補鎖に対応する核酸、および／または表１において同定される関連するｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）で議論される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において議論される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０４９５】
例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害するためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーションすることによってインビトロで行われた。インビボ用途のための同様の手順は、ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡについてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位および３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ　ＴＲＩＳ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ＭＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ　ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レトロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される（ＷＯ９１／１５５８０）。
【０４９６】
例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。
【０４９７】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームのベクターのままであるか、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９８】
本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも本発明の遺伝子のＲＮＡ転写物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成する配列を意味し；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０４９９】
メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　３７２：３３３−３３５を参照のこと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５’−または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０５００】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変され、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０５０１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０５０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０５０３】
さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０５０４】
さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）。
【０５０５】
本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動ＤＮＡ合成機により（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）の使用などにより調製され得る。
【０５０６】
一方、コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０５０７】
本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して、ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）に、より十分に記載される。配列番号Ｘのヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０５０８】
アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得、そしてインビボにおいて発現する細胞に送達されるべきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入のための上記と同じ様式で細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌ　ＩＩＩまたはｐｌ　ＩＩプロモーターのような）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果、トランスフェクトした細胞は、内因性メッセージを破壊しそして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成する。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内濃度が効率のために必要とされる。
【０５０９】
アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織上での本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において）遅延または防止する。
【０５１０】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患をも阻害し得、そして水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ　ｃａｔａｒａｃｔ）手術後の上皮レンズ細胞の増殖をも防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求され得る。
【０５１１】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖をも防止し得る。
【０５１２】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患をも処置し得る。
【０５１３】
従って、本発明は、疾患、障害および／または状態（本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に関連する、本願の全体に渡って列挙される疾患、障害および／または状態が含まれるが、これらに限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたアンチセンス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたリボザイムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。
【０５１４】
（他の活性）
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
【０５１５】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた、傷害、熱傷、手術後組織修復、および瘢痕に起因する創傷の処置にも利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえダメージを受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０５１６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた使用して、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンのダメージを処置および予防し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０５１７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
【０５１８】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた、抜け毛を予防するためにも利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０５１９】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または始原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織を誘導するために利用され得る。
【０５２０】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストはまた、先に議論されるように、造血系統に加えて胚性幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。
【０５２１】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０５２２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０５２３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニストはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０５２４】
上記に列挙される用途は、広範な種々の宿主において使用される。このような宿主としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ　ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好ましい実施形態において、宿主は哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０５２５】
（他の好ましい実施形態）
本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺにおける少なくとも約５０の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含む。
【０５２６】
上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて同定される位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる核酸分子もまた好ましい。
【０５２７】
配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の、少なくとも約１５０連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５２８】
配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の、少なくとも約５００連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子は、さらに好ましい。
【０５２９】
さらに好ましい実施形態は、表１において配列番号Ｘについて同定された位置の範囲における配列番号Ｘのヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【０５３０】
さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘの完全ヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【０５３１】
配列番号Ｘのヌクレオチド配列もしくはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない。
【０５３２】
ｃＤＮＡプラスミドＺを含むＤＮＡ分子を含む組成物もまた、好ましい。
【０５３３】
ｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の少なくとも５０連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５３４】
少なくとも５０連続するヌクレオチドの上記配列が、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるオープンリーディングフレーム配列のヌクレオチド配列に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５３５】
ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列において少なくとも１５０連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５３６】
さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列中の少なくとも５００連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【０５３７】
さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされる完全ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【０５３８】
さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも５０連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を生物学的サンプルにおいて検出するための方法である：配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列。この方法は、上記群から選択される配列と上記サンプル中の少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列とを比較する工程、および上記サンプル中の上記核酸分子の配列が、上記選択配列に少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０５３９】
配列を比較する上記工程が上記サンプル中の核酸分子と上記群から選択される上記配列を含む核酸分子との間で核酸ハイブリダイゼーションの範囲を決定することを含む方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記工程が、上記群から選択される上記配列と上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列とを比較することにより行われる、上記方法もまた好ましい。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５４０】
さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列において少なくとも５０連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を（もしあれば）検出する工程を包含する、生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定するための方法である：配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるヌクレオチド配列。
【０５４１】
生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記の群から選択される配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である。
【０５４２】
配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、またはタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列の異常な構造または発現と関連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法もまた好ましく、この方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも５０連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を（もしあれば）上記被験体から得られた生物学的サンプルにおいて検出する工程を包含する：配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列。
【０５４３】
病的状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネル中にヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで、上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記の群から選択された配列中の少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である。
【０５４４】
単離された核酸分子を含む組成物がまた好ましく、ここで、上記核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネルを含み、ここで、上記パネル中の少なくとも１つの配列が、以下からなる群より選択される配列中の少なくとも５０個の連続ヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である：配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖およびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるヌクレオチド配列。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５４５】
配列番号Ｙのポリペプチド配列中の少なくとも約１０個の連続アミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドもまた好ましい。
【０５４６】
配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約３０個の連続アミノ酸の配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドもまた好ましい。
【０５４７】
配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１００個の連続アミノ酸の配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドはさらに好ましい。
【０５４８】
配列番号Ｙの完全アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドはさらに好ましい。
【０５４９】
ｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドの完全アミノ酸配列中の、少なくとも約１０個の連続アミノ酸の配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０５５０】
上記連続アミノ酸の配列が、ｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドの部分のアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチド；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび／または配列番号Ｙのポリペプチド配列がまた、好ましい。
【０５５１】
ｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の、少なくとも約３０個の連続アミノ酸の配列に、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドがまた、好ましい。
【０５５２】
ｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列における、少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５５３】
ｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５５４】
以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド。
【０５５５】
以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド；この方法は、このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、この群から選択される配列と比較する工程、およびこのサンプル中のこのポリペプチド分子の配列が、少なくとも１０の連続したアミノ酸のこの配列と少なくとも９０％同一であるかどうかを決定する工程を包含する。
【０５５６】
このサンプル中の少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、この群から選択される配列と比較する上記の工程が、このサンプル中のポリペプチドの、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む、上記の方法もまた、好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド。
【０５５７】
配列を比較する上記の工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定されたアミノ酸配列を、この群から選択される配列と比較することによって行われる、上記の方法もまた好ましい。
【０５５８】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、この方法は、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子（もし存在すれば）をこのサンプル中で検出する工程を包含する：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド。
【０５５９】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好ましく、この方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は、上記の群から選択される配列における少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０５６０】
被験体において、表１において同定された、ポリペプチドをコードする核酸配列の異常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましい。この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０の連続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド。
【０５６１】
これらの方法のいずれかにおいて、このポリペプチド分子を検出する工程は、抗体を使用することを包含する。
【０５６２】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましく、ここでこのポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドからなる群より選択される配列内の少なくとも１０連続するアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０５６３】
また好ましいのは、単離された核酸分子であり、ポリペプチドをコードするこの核酸配列は、原核生物宿主におけるポリペプチドの発現のために最適化されている。
【０５６４】
また好ましいのは、単離された核酸分子であり、このポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０５６５】
さらに好ましいのは、組換えベクターの作製方法であり、この方法は、上記の単離された核酸分子のいずれかをベクターに挿入する工程を包含する。また好ましいのは、この方法によって産生される組換えベクターである。また好ましいのは、組換え宿主細胞の作製方法であり、この方法は、ベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する。ならびに、この方法によって産生される組換え宿主細胞もまた好ましい。
【０５６６】
また好ましいのは、単離されたポリペプチドの作製方法であり、この方法は、このポリペプチドが発現され、そしてこのポリペプチドが収集される条件化で、この組換え宿主細胞を培養する工程を包含する。また好ましいのは、単離されたポリペプチドのこの作製方法であり、ここで組換え宿主細胞は、真核生物細胞であり、そしてこのポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはそれに対する相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトタンパク質である。この方法によって産生される単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５６７】
また好ましいのは、上昇したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置方法であり、この方法は、このような個体に治療剤（この個体における、このタンパク質活性のレベルを増加するのに有効な本発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、免疫原性フラグメントあるいはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗原結合フラグメントのある程度の量を含む）を投与する工程を包含する。
【０５６８】
また好ましいのは、減少したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置方法であり、この方法は、このような個体に治療物（この個体における、このタンパク質の活性のレベルを減少するのに有効な本発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、免疫原性フラグメントあるいはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗原結合フラグメントのある程度の量を含む）を投与する工程を包含する。
【０５６９】
本発明の特定の実施形態において、表２の第４欄に列挙された各「コンティグＩＤ」について、好ましく除かれるのは、表２の第５欄に参照されたヌクレオチド配列およびａ−ｂの一般式によって記載されたヌクレオチド配列（ここでａおよびｂは、表２の第３欄で参照される対応する配列番号Ｘについて独自に決定される）を含むか、あるいはこれらからなる１以上のポリヌクレオチドである。さらに、特定の実施形態は、表２の第５欄に参照される１、２、３、４、またはそれ以上の特異的ポリヌクレオチド配列を除くポリヌクレオチ配列に関する。この列挙が、一般式によって除かれ得る配列のすべてを含むわけではなく、代表的な例のみである。これらの登録を通じて利用可能なすべての参考文献は、それらの全体が、本明細書中で、参考として援用される。
【０５７０】
【表２】
2004500034.tif 000003
概して、本発明を記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによって容易に理解され、この実施例は例示の目的のために提供され、そして限定するように意図されない。
【０５７１】
（実施例）
（実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離）
引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中に含まれる。表１は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いられたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを構築するために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクターである。直下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各ファージベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクローンがベクター「Ｌａｍｂｄａ　Ｚａｐ」中に単離されていると表１に示される場合、対応する寄託クローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０５７２】
【表３】
2004500034.tif 000004
ベクターＬａｍｂｄａ　Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ　ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１　Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。ｐＢＳは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４形態で入荷する。ＳおよびＫとは、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そして「Ｋ」とは、ＫｐｎＩのことであり、これらは、それぞれのリンカーの各末端での最初の部位である）に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。「＋」または「−」とは、ある方向においてｆ１　ｏｒｉから開始される一本鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして他方においてアンチセンス鎖ＤＮＡを生成するようなｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の配向をいう。
【０５７３】
ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０をＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ　２０８９７から入手した。全てのＳｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ　１５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ　ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ　Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１　Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００　Ｆａｒａｄａｙ　Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ　９２００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、表１における特定のクローンについて同定されたファージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列を含まない。
【０５７４】
表１に引用される、任意の所定のｃＤＮＡクローンについてＡＴＣＣ受託番号を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、１つ以上のさらなるプラスミド（これは各々、その所定のクローンとは異なるｃＤＮＡクローンを含む）を含み得る。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表１に示される各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドを少なくとも含む。代表的には、表１に引用される各ＡＴＣＣ寄託物のサンプルは、ほぼ等量（重量で）の約５０個のプラスミドＤＮＡ（これは各々、異なるｃＤＮＡクローンを含む）の混合物を含む；しかし、このような寄託サンプルは、５０個よりも多いかまたは少ないｃＤＮＡクローン（約５００個までのｃＤＮＡクローン）のためのプラスミドを含み得る。
【０５７５】
表１における特定のクローンについて引用されるプラスミドＤＮＡの寄託サンプルからそのクローンを単離するために２つのアプローチが使用され得る。第一に、プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
【０５７６】
特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告されている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、３２Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用の方法に従って精製する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技術または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）を用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体（コロニー）の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリーニングについての慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０５７７】
あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表１に規定されるクローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラスミドを鋳型として用いて、所望のｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応混合物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０５７８】
寄託されたクローンに存在し得ない遺伝子の５’非コード部分または３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の５’末端の欠失を生成するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０５７９】
簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をおそらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全長遺伝子を生成し得る。
【０５８０】
この上記の方法は、所望の供給源から単離された全ＲＮＡを用いて開始するが、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。この反応は、次いでＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０５８１】
この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０５８２】
（実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離）
ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列について選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０５８３】
（実施例３：ポリペプチドの組織分布）
本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ３２で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ−１００ＴＭカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、この精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０５８４】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０５８５】
（実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング）
オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体または染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれかで分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０５８６】
（実施例５：ポリペプチドの細菌発現）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニングするために、好ましくはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限部位、ならびに必要な場合、開始／終止コドンを含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０５８７】
ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅されたフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持するｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を与えるプラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのＬＢプレート上で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認する。
【０５８８】
所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種するために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．６００）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーの不活化によりＰ／Ｏの活性化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
【０５８９】
細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬である６ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムにロードする（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手順で精製され得る（詳細については、Ｔｈｅ　ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）を参照のこと）。
【０５９０】
手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０５９１】
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ　ＮａＣｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ　ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０５９２】
上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含む、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日に寄託。）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレーター配列を合成的に作製する。
【０５９３】
ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によってベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対であるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。ＤＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコールに従って生成する。ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およびベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【０５９４】
操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を発現させるために容易に置換され得る。
【０５９５】
（実施例６：封入体からのポリペプチドの精製）
以下の代替的な方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０５９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そして１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ　Ｓｅｐａｔｅｃｈ）によって細胞を収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想される収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切な量（重量による）を、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含む緩衝溶液に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁液に分散させる。
【０５９７】
次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解する。次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ　ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を使用して再度洗浄する。
【０５９８】
得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０５９９】
不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭナトリウム、ｐＨ４．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保つ。
【０６００】
再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、予め調製した４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化された、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ　ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする。カラムを４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ　ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０６０１】
次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次いで希釈されたサンプルを、予め調製した強アニオン（Ｐｏｒｏｓ　ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱アニオン（Ｐｏｒｏｓ　ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２００ｍＭ　ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを、１０カラム容量の直線的勾配（０．２Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０から１．０Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲）を用いて溶出する。画分を、溶出液の定常Ａ２８０モニタリング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０６０２】
得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５％より高い純度を示すべきである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合、いかなる主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ夾雑物について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０６０３】
（実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングおよび発現）
この実施例では、ポリペプチドを発現するために、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用してポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子は、クローニングしたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と両側で隣接する。
【０６０４】
多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナルペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記のベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０６０５】
具体的には、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列を、適切な制限部位および開始／終止コドンを含むプライマーを用いて、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される標準的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改変され得る（ｐＡ２　ＧＰ）。
【０６０６】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再度１％アガロースゲルで精製する。
【０６０７】
プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する。
【０６０８】
フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて共に連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１またはＸＬ−１　Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換し、そして培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来のＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０６０９】
このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０６１０】
４日後、上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ　Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロースゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，によって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９−１０頁）の中に見出され得る）。適切なインキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁し、そして組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞に感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いで４℃で保存する。
【０６１１】
ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００　ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラジオグラフィーによって分析する。
【０６１２】
精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０６１３】
（実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現）
本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、および、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０６１４】
本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ　３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ　６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ　１細胞、Ｃｏｓ　７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０６１５】
あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０６１６】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）マーカーは、目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用である。（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）：Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０６１７】
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０（１９８５））のフラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位を有する複数のクローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロインシュリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０６１８】
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６は、適切な制限酵素によって消化され、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸化される。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０６１９】
本発明のポリヌクレオチドは、必要ならば適切な制限部位およ開始／終止コドンを有するプライマーを使用して、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅される。分泌のために必要な場合、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６２０】
増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ　１０１　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再度１％アガロースゲル上で精製する。
【０６２１】
次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクターを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１またはＸＬ−１　Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０６２２】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６を、リポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０６２３】
（実施例９：タンパク質融合物）
本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ　Ａ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：８４−８６（１９８８）もまた参照のこと）。これらのポリぺプチドはまた、分泌または細胞内往来（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）（例えば、ＫＤＥＬ）を促進するために、異種ポリぺプチド配列に融合され得る。さらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る。
【０６２４】
簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位および必要であれば開始／終止コドンを有するべきである。
【０６２５】
例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、ＢａｍＨＩによって再び制限処理され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載するＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、このＢａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０６２６】
天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ　９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６２７】
ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域：
ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号１）。
【０６２８】
（実施例１０：ポリペプチドの処方）
ポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、分泌ポリペプチド単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮により決定される。
【０６２９】
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるポリペプチドの合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、ポリペプチドを約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０６３０】
本発明のポリぺプチドを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６３１】
ポリペプチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに封入されたポリペプチドを包含する。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層状型であり、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適分泌ポリペプチド治療のために調整される。
【０６３２】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、分泌ポリペプチドは、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０６３３】
一般に、ポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０６３４】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、そしてこのような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０６３５】
ポリペプチドは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０６３６】
治療的投与に用いられる任意のポリペプチドは無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【０６３７】
ポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０６３８】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０６３９】
（実施例１１：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法）
個体におけるポリペプチドの標準の発現レベルまたは正常発現レベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態および／または可溶性形態において投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、このポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、このような個体に、このような個体でこのポリペプチドの活性レベルを増加させる量のポリペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０６４０】
例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、そのポリペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、そのポリペプチドは分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例１０に提供されている。
【０６４１】
（実施例１２：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法）
アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生を阻害する。この技術は、癌のような様々な病因に起因するポリペプチド（好ましくは、分泌形態）のレベルを低下させる方法の１つの例である。
【０６４２】
例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日で２１日間、静脈内投与する。この処置に対して十分に寛容化された場合は、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。このアンチセンスポリヌクレオチドの処方は、実施例１０に提供されている。
【０６４３】
（実施例１３：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０６４４】
この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間培養した後に、単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、さらに大きなフラスコにスケールアップする。
【０６４５】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製する。
【０６４６】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそれぞれ５’　末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、この５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そしてこの３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウス肉腫ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、この２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する。
【０６４７】
アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖させる。次に、その目的の遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージング細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０６４８】
形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、その線維芽細胞を分析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０６４９】
次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する。
【０６５０】
（実施例１４：内因性カルシウムチャネル輸送遺伝子を使用する遺伝子治療）　本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性カルシウムチャネル輸送遺伝子配列を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ　９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ　９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包含する。
【０６５１】
プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性カルシウムチャネル輸送遺伝子の５’非コード配列に相同である。この標的化配列は、カルシウムチャネル輸送遺伝子の５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０６５２】
この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消化した標的化配列を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製する。
【０６５３】
この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーションを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方法は、当該分野で公知である。
【０６５４】
一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモーターがこの内因性カルシウムチャネル輸送遺伝子配列に作動可能に連結される。これは、この細胞中におけるカルシウムチャネル輸送の発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０６５５】
線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．３、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、０．７ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸濁物は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直後に実施すべきである。
【０６５６】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、カルシウムチャネル輸送遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのカルシウムチャネル輸送非コード遺伝子配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のカルシウムチャネル輸送非コード配列（カルシウムチャネル輸送フラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａ部位を備えて増幅する；他方のカルシウムチャネル輸送非コード配列（カルシウムチャネル輸送フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびカルシウムチャネル輸送フラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；カルシウムチャネル輸送フラグメント１−ＸｂａＩ；カルシウムチャネル輸送フラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０６５７】
プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０６細胞を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０６５８】
エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
【０６５９】
次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。
【０６６０】
（実施例１５：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）カルシウムチャネル輸送配列の導入に関する。カルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるカルシウムチャネル輸送ポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　３（５）：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ　Ｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０６６１】
カルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入）によって送達され得る。カルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０６６２】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、カルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（１９９５）およびＡｂｄａｌｌａｈらＢｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　８５（１）：１−７（１９９５）で教示されたもの）中で送達され得る。
【０６６３】
この遺伝子治療方法において使用されるカルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６６４】
このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格である。
【０６６５】
裸のカルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のカルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０６６６】
インビボでの筋肉における注入カルシウムチャネル輸送ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のようにして決定する。カルシウムチャネル輸送ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための適切なカルシウムチャネル輸送鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。カルシウムチャネル輸送鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０６６７】
５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。カルシウムチャネル輸送鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【０６６８】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、カルシウムチャネル輸送タンパク質発現について組織化学的に染色する。カルシウムチャネル輸送タンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のカルシウムチャネル輸送ＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のカルシウムチャネル輸送ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【０６６９】
（実施例１６：抗体の産生）
（（ａ）ハイブリドーマ技術）
本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入される。
【０６７０】
カルシウムチャネル輸送ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドで、またはより好ましくは分泌カルシウムチャネル輸送ポリペプチド発現細胞で免疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養される；好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。
【０６７１】
このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８０：２２５−２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次いで、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、カルシウムチャネル輸送ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０６７２】
あるいは、カルシウムチャネル輸送ポリペプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞は、カルシウムチャネル輸送タンパク質特異的抗体に結合する能力がカルシウムチャネル輸送ポリペプチドによってブロックされ得る抗体を産生する、クローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、カルシウムチャネル輸送タンパク質に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるカルシウムチャネル輸送タンパク質に特異的な抗体の形成を誘導するために使用される。
【０６７３】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト化抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に考察される。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ　１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ　１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ　８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ　８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０６７４】
（（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのカルシウムチャネル輸送ポリペプチドに対して指向される抗体フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかまたは曝され得なかったカルシウムチャネル輸送ポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６７５】
（ライブラリーのレスキュー）
ＰＣＴ公開ＷＯ　９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約１０９個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０６７６】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグメントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）を有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ　８，４００ｒ．ｐ．ｍ．／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ　ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ　ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０１３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０６７７】
（ライブラリーのパニング）
Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで２０倍に増加する。
【０６７８】
（結合剤の特徴付け）
第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ　２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例えば、エピトープマッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗体／抗原結合をブロックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニスト活性または競合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る。
【０６７９】
本発明のカルシウムチャネル輸送タンパク質は、米国仮出願第６０／１４５，６５８号；同第６０／１４９，４４６号；および同第６０／１８９，０６４号；（これらは、その全体が、本明細書中で参考として援用される）において開示された。
本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０６８０】
発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出された配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し可能形態は、両方とも本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０６８１】
【表４】
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ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４１８
２頁
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０６８２】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６８３】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ　ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６８４】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０６８５】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０６８６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４１８
３頁
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６８７】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局ＴｅｍｐＴｅｍｐに対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ　Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ　ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ　Ｉのａｎｎｅｘ　Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６８８】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０６８９】
【表５】
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ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７７
２頁
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料のサンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければならない。
【０６９０】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６９１】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ　ａｄｄｒｅｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６９２】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｏａｒｄ　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。
【０６９３】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【０６９４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４７７
３頁
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６９５】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ　Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ　ＧｕｉｄｅのＶｏｌｕｍｅ　Ｉのａｎｎｅｘ　Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６９６】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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