(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの健康な心筋細胞を提供するかまたは単離し、適切なホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインを用いて、前記の単離された心筋細胞を刺激し、そして少なくとも１つのシグナル分子を位置決定することにより、病的に修飾された心筋細胞（類）を検出することによって、健康な心臓組織から産生することが可能な、病的に修飾された心筋細胞に関する。本発明はまた、心臓活性物質を検出するかまたは同定する方法を含む、前記の病的に修飾された心筋細胞を産生する方法およびその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
健康な心臓組織及び／又は少なくとも１種類の健康な心筋細胞から、
（ａ）少なくとも１種類の健康な心筋細胞を用意する又は単離する工程；及び　（ｂ）単離された心筋細胞を、適当なホルモン、ホルモン類似体及び／又はサイトカンによって刺激する工程
を含む方法によって産生されうる病的に修飾された心筋細胞。
【請求項２】
健康な心臓組織が鳥、特にニワトリから又は哺乳動物、特にヒト、げっ歯類、好ましくはラット、若しくはウサギから得られることを特徴とする、請求項１記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項３】
心筋細胞を少なくとも２種類、特に３種類の異なるホルモン、ホルモン類似体及び／又はサイトカインによって本質的に同時に刺激することを特徴とする、請求項１又は２に記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項４】
ホルモン、ホルモン類似体及び／又はサイトカインがＥＴ−１、ＩＳＯ、ＰＥ及び／又はＬＩＦから選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項５】
本質的な同時刺激が種々なホルモン、ホルモン類似体及び／又はサイトカインによって、細胞の少なくとも部分的に異なるレベルのシグナル伝達カスケードを介して行なわれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項６】
本質的な同時刺激が少なくとも２種類、特に少なくとも３種類の受容体を介して、好ましくはＧｑ−結合受容体、特に、ＥＴ−１受容体を介して及び／又はβ−アドレナリン作動性受容体、特に、ＩＳＯによって刺激されうる受容体及び／又はサイトカイン受容体、特にＬＩＦ受容体（ＧＰ１３０）を介して行なわれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項７】
シグナル伝達カスケードの本質的な同時刺激が受容体刺激を受けやすいレベルにおいて、好ましくはホルボールエステルによって行なわれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の、健康な心臓組織及び／又は少なくとも１種類の健康な心筋細胞から病的に修飾された心筋細胞を産生する方法であって、下記工程：
（ｉ）少なくとも１種類の健康な心筋細胞を用意する又は単離する工程；
（ｉｉ）単離された心筋細胞を、適当なホルモン、ホルモン類似体及び／又はサイトカンによって刺激する工程；及び適当である場合には、
（ｉｉｉ）サルコメア中の少なくとも１種類のシグナル分子、好ましくは少なくとも１種類のタンパク質の局在を測定することによって、少なくとも１つの病的に修飾された心筋細胞を検出する工程
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項９】
工程（ｉｉｉ）における前記タンパク質の局在が単細胞レベルにおいて行なわれることを特徴とする、請求項８記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉｉ）における前記タンパク質の局在がサルコメアのＺ線及び／又はＭ線において測定されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉｉ）における前記タンパク質がサルコメアの構造、特にＭ線又はＺ線と会合して、サルコメアタンパク質、特にＭ線タンパク質又はＺ線タンパク質の特徴的な修飾、好ましくはチロシン、セリン及び／又はトレオニンのリン酸化を生じることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉｉ）における前記タンパク質がトロポモジュリンの構造的特徴、特にトロポミオシン結合ドメインを有することを特徴とする、請求項８〜１１のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉｉ）における前記タンパク質が配列番号：１に示されたアミノ酸配列、又はその機能的変異形、特に少なくとも１つの突然変異及び／又は欠失を有することを特徴とする、請求項８〜１２のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１４】
前記機能的変異形が少なくとも約５０％、特に少なくとも約６０％、とりわけ少なくとも約７０％の配列番号：１との相同性を有することを特徴とする、請求項１３記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１５】
配列番号：１に示されたアミノ酸配列又はその機能的変異形が核酸によって、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡによって、特に好ましくはｃＤＮＡによってコードされることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の病的に修飾された心筋細胞の産生方法。
【請求項１６】
心臓に作用する１種類以上の物質を検出する又は同定する方法であって、下記工程：
（ｉ）請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも１種類の心筋細胞を用意する又は単離する工程；
（ｉｉ）該心筋細胞に１種類以上の試験物質を接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）心臓に作用する１種類以上の物質を、サルコメア中の少なくとも１種類のシグナル分子、好ましくは少なくとも１種類のタンパク質の局在の測定によって検出又は同定する工程
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１７】
心筋細胞が請求項１〜７のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞であることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記試験物質が製薬的に有効な物質であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験物質が毒性物質であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験物質が、サルコメア中への、特にＭ線又はＺ線中へのシグナル分子の局在を減ずる及び／又は本質的に防止する、低分子量の無機若しくは有機の分子、発現可能な核酸、好ましくはタンパク質、天然若しくは合成のペプチド又はこれらの複合体であることを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記試験物質が、サルコメア中への、特にＭ線又はＺ線中へのシグナル分子の局在を支持する及び／又は本質的に誘発する、低分子量の無機若しくは有機の分子、発現可能な核酸、好ましくはタンパク質、天然若しくは合成のペプチド又はこれらの複合体であることを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
心臓に作用する１種類以上の物質を検出するため及び／又は同定するための、請求項１〜７のいずれかに記載の病的に修飾された心筋細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの健康な心筋細胞の単離；適切なホルモン、ホルモン類似体（ａｎａｌｏｇ）および／またはサイトカインによる、単離された心筋細胞の刺激；およびサルコメアにおける少なくとも１つのシグナル分子、好ましくは少なくとも１つのタンパク質の局在測定を通じた、少なくとも１つの病的に（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）修飾された心筋細胞の検出によって、健康な心臓組織から産生することが可能な、病的に修飾された心筋細胞に関する。本発明はさらに、病的に修飾された心筋細胞を産生する方法、心臓に作用する物質を検出するかまたは同定する方法、および病的に修飾された心筋細胞の使用に関する。
【０００２】
中心要素としての心臓に加え、心臓血管系は、定義された配置の大血管および中血管、並びに必要に応じて生じ、そして退行する、多くの小血管および極小血管からなる。心臓血管系は、自己制御（恒常性）を受け、これによって末梢組織は酸素および栄養素を供給され、そして代謝産物が運び去られる。心臓は筋肉性の中空の器官であり、心房および心室の交互の収縮（収縮期）および弛緩（弛緩期）を通じて、血管を通じた連続血流を維持する仕事を持つ。
【０００３】
心臓の筋肉、心筋は、横紋筋細胞で構成され、そして結合組織に包埋される細胞の機能的集合（シンシチウム）である。各細胞は核を有し、そして形質膜、筋細胞膜によって結合される。心臓の収縮実体は、非常に組織化された、長くそして平行な細胞構成要素、筋原線維によって形成され、筋原線維は、筋形質によって不規則に分離される。各筋原線維は、複数の同一の構造的および機能的単位、サルコメアに分割される。サルコメアは次に、主にアクチン、トロポミオシンおよびトロポニンからなる薄いフィラメント、並びに主にミオシンからなる厚いフィラメントで構成される。各サルコメアの中心は、Ｍ線と称され、ここで反対向きの厚いフィラメントが互いに出会う。サルコメアは、Ｚ線（Ｚ ｂａｎｄ）によって結合され、これは薄いフィラメントの係留を確実にし、そして次のサルコメアへの結合を示す。
【０００４】
筋収縮の分子機構は、アクチンフィラメントによる、球状のミオシン頭部の周期性の付着および脱離に基づく。心筋の電気刺激に際し、筋小胞体からＣａ２＋が放出され、これは、アロステリック反応を通じて、トロポニン複合体およびトロポミオシンに影響を及ぼし、そしてこの方式で、ミオシン頭部でのアクチンフィラメントの接触を可能にする。付着はミオシンのコンホメーション変化を引き起こし、これがその後、それ自体に沿って、アクチンフィラメントを引っ張る。コンホメーション変化を逆転させ、そして収縮周期の出発点に戻るにはＡＴＰが必要とされる。
【０００５】
心筋活性は、短期では、神経およびホルモン制御機構によって、特定の血流要求（灌流要求）に適応することが可能である。このようにして、収縮力および収縮速度両方を増加させることが可能である。張りが長くなると、心筋は、主に筋原線維の増加によって特徴付けられる生理学的再編成（筋細胞肥大）を経る。
【０００６】
心筋が損傷されると、元来の生理学的な適応機構は、しばしば、長期では、病態生理学的状態を導き、慢性心不全（心機能不全）を生じ、そして通常、急性心不全に終わる。機能不全が重症であり、そして慢性であると、心臓はもはや変化した出力要求に適切に反応不能であり、そして軽度の肉体的活動であっても消耗および息切れにつながる。
【０００７】
心筋に対する損傷は、血液の枯渇（虚血）から生じ、これは心臓障害、細菌またはウイルス感染、毒素、代謝異常、自己免疫疾患または遺伝的欠損によって引き起こされる。現在の療法手段は、収縮力を強化し、そして代償的ニューロン機構およびホルモン代償機構を調節することにねらいを定める。この処置にもかかわらず、心機能不全と診断された後の死亡率は、それでも高い（診断後、最初の５年以内に３５から５０％）。これは世界中で、死亡の主な原因である。現在適用される唯一の原因療法は、費用がかかる心臓移植であり、これは患者にとってのかなりのリスクと関連する。
【０００８】
新規の原因療法を開発するため、心筋障害の進展および進行に関連する、心筋細胞の細胞再編成を詳細に理解することが必要である。現在、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を用いた細胞培養実験から、細胞受容体によって外部シグナルがピックアップされ、そしてシグナル伝達経路またはネットワークまたはカスケードを介して細胞内部に伝達されることが知られる。シグナル分子による受容体の活性化は、Ｃａ２＋バランス、細胞のエネルギー状態、遺伝子発現およびタンパク質生合成を制御する、細胞内酵素カスケードの開始を生じる。
【０００９】
心筋細胞における特定のシグナル伝達を調べ、そして心臓疾患に対するそれらの影響を解明するため、主に新生ラット心筋細胞が用いられてきている。このモデル系の補助で、心筋細胞におけるいくつかのシグナル伝達経路を同定することが可能であったが、この中で、少なくとも４つの異なる受容体種が重要である：ｉ）アドレナリン受容体またはエンドセリン受容体などのＧタンパク質結合受容体；
ｉｉ）ＩＧＦ−１受容体などの受容体チロシンキナーゼ；
ｉｉｉ）インターロイキン−６ファミリーのサイトカインの受容体などのサイトカイン受容体および
ｉｖ）ＴＧＦ−β受容体などのセリン／スレオニン受容体キナーゼ。
【００１０】
ｉ）に関し、第一のグループの受容体は、アドレナリン受容体を含むＧタンパク質結合受容体である。アドレナリン受容体は、α１、α２およびβ型に分化し、各型は、次に、３つのサブタイプを含む。すべてのβ−アドレナリン受容体は、三量体Ｇタンパク質のＧα５サブユニットを介して、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度を増加させるが、α−アドレナリン受容体は、多様なＧタンパク質構成要素を活性化し、これは次に、ｃＡＭＰ含量を減少させることが可能である（ＳｅｌｂｉｅおよびＨｉｌｌ，（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １９，  ｐ．８７）。増加したｃＡＭＰ濃度は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化し、これは次に、とりわけ、Ｃａ２＋バランスの制御に関与する（Ｈｅｆｔｉら（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２９，  ｐ．２８７３）。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアイソフォームもまた、この経路を介して活性化されることが可能である（ＣａｓｔｅｌｌａｎｏおよびＢｏｈｍ（１９９７）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２９，  ｐ．７１５）。ＰＫＣがｒａｆ−ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化因子であり、そして細胞培養系において、細胞増殖および細胞分裂両方を刺激するのを示すことが、さらに可能であった（Ｈｏら（１９９８）ＪＢＣ  ２７３，  ｐ．２１７３０）。
【００１１】
エンドセリン受容体は、同様に、Ｇタンパク質結合受容体に属し、そしてＥＴＡおよびＥＴＢ型として生じ、少なくともこのうちいくつかは、異なる仕事を行う（ＭｉｙａｕｃｈｉおよびＭａｓａｋｉ（１９９９）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６１，  ｐ．３９１）。ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体は、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）の活性化も導くシグナル分子ＥＴ−１によって刺激することが可能である。活性化されたＰＬＣγは、続いて、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール三リン酸（ＩｎｓＰ３）へのホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）の変換を触媒する（Ｄｏｒｎら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｍｅｄ．  ９，  ｐ．２６）。ＤＡＧは次に、ＰＫＣファミリーのアイソフォームを活性化し、一方、ＩｎｓＰ３は、細胞内Ｃａ２＋貯蔵からＣａ２＋の放出を引き起こす。
【００１２】
心筋細胞中の増加したＣａ２＋濃度は、収縮に影響を及ぼし、そして例えばＰＫＣのアイソフォームなどのさらなるシグナル伝達タンパク質を活性化する（ＮａｋａｍｕｒａおよびＮｉｓｈｉｚｕｋａ（１９９４），  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１５，  ｐ．１０２９）。
【００１３】
ｉｉ）に関し、細胞シグナル伝達の別の重要なグループは、例えば、アダプタータンパク質Ｇｒｂ２、ＡＰＳまたはＳｈｃなどのいくつかのシグナル伝達分子を活性化する受容体チロシンキナーゼであり、アダプタータンパク質は、次に、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼまたはｒａｓに陽性の影響を有する。これらの活性化されたタンパク質によって、ＭＡＰキナーゼカスケードにスイッチが入り、増加したタンパク質生合成および細胞増殖を導く（Ｈｏら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，  ｐ．３３５）。
【００１４】
ＭＡＰキナーゼカスケード内では、ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫキナーゼシグナル伝達経路と称される、３つのシグナル伝達経路間の区別がなされる。細胞培養実験から、ＰＫＣが主にＥＲＫシグナル伝達経路を活性化し、これがタンパク質生合成および細胞分裂を促進することが知られる（Ｓｕｇｄｅｎら（１９９８）Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．  ３８，  ｐ．８７）。収縮によるｐ３８シグナル伝達経路は、プログラム細胞死（アポトーシス）と関連すると考えられ、そして内毒素、サイトカイン、および生理学的ストレスによって、細胞において誘導することが可能である（Ｗａｎｇら（１９９８）ＪＢＣ，  ２７３，  ｐ．２１６１）。ＪＮＫキナーゼシグナル伝達経路は、同様に、ストレス因子によって誘導され、ＰＫＣ、ＭＡＰ−ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫＫ）およびＳｅｋキナーゼを介して活性化が進行し、そして同様に、増加した遺伝子転写を導く（Ｌａｚｏｕ（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３３２，  ｐ．４５９）。
【００１５】
ｉｉｉ）に関し、用語、サイトカイン受容体に含まれる、第三のグループの受容体は、それ自体のキナーゼ活性を含まないという独特の特徴によって区別される。サイトカイン受容体には、ＬＩＦ受容体が含まれ、これは、インターロイキン−６ファミリーに割り当てられる。ＬＩＦ受容体は、リガンド特異的構成要素およびＧＰ１３０サブユニットで構成される。活性化状態のＧＰ１３０は、ＪＡＫおよびＴｙｒキナーゼを誘引する、シグナル伝達を引き起こす。これらのキナーゼは、ＳＴＡＴタンパク質（シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子）をリン酸化し、このタンパク質は、こうして、細胞核への進入のため、準備される。細胞核で、ＳＴＡＴタンパク質は、遺伝子発現に影響を及ぼす（Ｔｅｔｓｕｙａ  Ｔａｇａ（１９９７）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５，  ｐｐ．７９７−８１９“サイトカインのＧＰ１３０およびインターロイキン−６ファミリー”に要約される）。
【００１６】
ｉｖ）に関し、最後のグループの受容体、セリン／スレオニン受容体キナーゼは、最近になってようやく、注目が増してきている。これには、細胞内ＳＭＡＤタンパク質に細胞外シグナルを伝達するＴＧＦ−β受容体が含まれ、ＳＭＡＤタンパク質は次に、リン酸化される。リン酸化後、ＳＭＡＤタンパク質は、能動的に細胞核に移動し、そこでＤＮＡに結合し、そして特異的に遺伝子転写を活性化する（Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９８）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０，  ｐ．１８８）。
【００１７】
シグナル伝達経路に関与する多くの仲介因子、並びに経路および仲介因子間の関係が、現在、知られている。これらの結果に基づき、初期の研究は、病的に修飾された心臓に関する言及を行うことが可能であるように、行われてきた。
【００１８】
したがって、例えば、特定の遺伝子の改変された発現の測定、一般的なタンパク質生合成の増加の測定、または心臓の性能（形態）の測定に本質的に基づく、心筋細胞の肥大の度合いを測定する試験系が知られる。この実験アプローチは、健康な心臓に比較し、疾患心臓において、特異的に上方または下方制御されている可能性があるシグナル伝達経路を考慮に入れないという、深刻な不都合を有する。
【００１９】
既知の実験アプローチにおいて、心筋細胞の状態を決定するため、最もしばしば用いられるパラメーターは、ＡＮＰ発現（心房性ナトリウム利尿因子）の増加であるが、ＡＮＰ増加および肥大の間の機能的な関連は、現在まで、説明されていない。さらに、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎまたはｅｒｇ−１などの転写因子の発現速度の増加が、心筋細胞の肥大を記載するのに用いられる。肥大中に増加した発現を示す第三のグループの遺伝子は、収縮器官の構造的構成要素であり、すべての場合で、肥大の進展との直接の関連は不明である（Ｌｏｗｅｓ  Ｂ．Ｄ．ら（１９９７）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００，  ｐｐ．２３１５−２３２４；  Ｓｈｕｂｅｉｔａ  Ｈ．Ｅ．ら（１９９０）ＪＢＣ  ２６５，  ３３，  ｐｐ．２０５５５−６２；  Ｉｗａｋｉ  Ｋ．ら（１９９０）ＪＢＣ  ２６５，  ２３，  ｐｐ．１３８０９−１７；  Ｄｏｎａｔｈら（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９１，  ｐｐ．１６８６−１６９０）。
【００２０】
収縮器官の構成要素の増加した発現は、総タンパク質合成速度の増加に本質的に寄与しており、これは、心筋細胞の体積の測定可能な増加を生じる。これは肥大のさらなる指標として用いて、そして細胞の固定および染色後の表面面積の増加として測定するか、または細胞の長さおよび幅の変化の比の決定を通じて評価する（ＵＳ  ５，８３７，２４１；  Ｗｏｌｌｅｒｔ  Ｋ．Ｃ．（１９９６）ＪＢＣ  ２７１，  １６，  ｐｐ．９５３５−４５）。
【００２１】
記載される方法のいずれも、個々の遺伝子の増加した発現速度および心筋細胞の肥大の間の明白な相関が説明されていないため、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況のヒトをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激するのに適していない。
【００２２】
本発明はこのように、その補助により、ｉｎ  ｖｉｖｏで心臓疾患につながる分子変化を調べることが可能であり、そしてその補助により、心臓患者の予防および療法に関するその有効性に関して、物質を発見することが可能である、病的に修飾された心筋細胞を提供する目的に基づく。
【００２３】
現在、驚くべきことに、細胞培養における、ホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインでの新生ラット心筋細胞の刺激が、未刺激心筋細胞に比較して、心筋細胞のサルコメアにおける少なくとも１つのシグナル分子の局在の改変を導くことが見出されている。シグナル分子の遺伝子は、ヒト心臓組織のｃＤＮＡバンクから単離されており、そして健康な心臓組織におけるより、機能不全心臓組織において、この遺伝子のより強い発現があるのを示すことが可能であり、この遺伝子発現および観察される心機能不全の間に、原因となる関連が示唆された。心筋細胞の肥大に関連する心臓疾患、特に拡張型心筋症（ＤＣＭ）との関連のため、該シグナル分子の遺伝子産物は、ＤＣＭＡＧ−１タンパク質と称される。そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。適切なホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインによる、単離された心筋細胞の刺激に際し、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物は、特に心筋細胞のサルコメアで検出可能であり、一方、未刺激心筋細胞では、細胞質に均一に分布する。ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物の細胞下局在のこの相違はまた、健康な人々に比較し、ＤＣＭ患者由来の心臓生検でも検出可能である。さらに、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物の局在における同じシフトが、収縮速度の増加によって誘導される、ＤＣＭの動物実験で、誘導可能であった。
【００２４】
したがって、疾患心臓において、障害経過の進行の判定基準として、Ｚ線とＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物の関連の増加を用いることが可能である。心臓疾患中のＺ線の再編成と関連する、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物の局在におけるこのシフトは、Ｚ線の構造が、現在まで、静的であるとみなされてきており、そしてしたがってほとんど注意を払われていなかったため、非常に驚くべきことである（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｒ．Ｗ．ら（１９９７）Ｈｕｒｓｔの“Ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ”，  第９版，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ中，  ｐ．７４）。さらに、現在まで、平行から連続配置への完全なサルコメアの再編成のみが認められてきており、そのため、疾患心臓でより強く発現される特定の遺伝子産物の局在のシフト、およびＤＣＭなどの心臓疾患の間の関連を推測することは不可能であった。
【００２５】
本発明の１つの側面は、したがって：
（ａ）少なくとも１つの健康な心筋細胞の提供または単離；
（ｂ）適切なホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインによる、単離された心筋細胞の刺激
の工程を含む方法によって、健康な心臓組織および／または少なくとも１つの健康な心筋細胞から産生することが可能な、病的に修飾された心筋細胞である。
【００２６】
用語「健康な心臓組織または健康な心筋細胞」は、本発明の目的のため、臨床的に注目されない心臓組織またはそこから単離された細胞を意味する。心筋細胞は、そのドナーが心筋細胞の肥大と関連する慢性心機能不全のいかなる徴候も示さない生検材料から単離した。さらなる可能性は、幹細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって、健康な心筋細胞を得ることである。この種の方法は、例えば、Ｋｏｌｏｓｓｏｖ  Ｅ．ら（１９９８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２８；１４３（７），  ｐｐ．２０４５−２０５６によって記載される。
【００２７】
したがって、用語「病的に修飾された心筋細胞」は、本発明の目的のため、心臓疾患、例えば機能不全の患者の生検材料から単離された心筋細胞を意味する。この用語はさらに、本発明にしたがって刺激されて、そしてこうした病的な心筋細胞の組織病理学的外見を有する心筋細胞を意味する。これは、このように、細胞質からサルコメアへの、例えばＭ線またはＺ線への特定のシグナル分子の局在のシフトを示す、心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激によって、達成することが可能である。このシフトは、機能不全の患者の心臓から得られる心筋細胞に明らかなものと同様である。
【００２８】
したがって、用語「シグナル分子」は、本発明の目的のため、特に心筋細胞で生じ、そして、ホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカイン刺激後、健康な出発細胞と比較して、心筋細胞内での局在が変化する、細胞性内因性分子またはタンパク質を意味する。これに関連し、「シグナル分子」は、特に、心筋細胞のサルコメアのタンパク質を意味する。
【００２９】
用語「適切な」ホルモンは、本発明の目的のため、特に、それらの誘導体を含む、ホルモン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３、アンギオテンシンＩおよびＩＩ、インスリン（ＩＮ）、ＩＧＦ−１およびミオトロフィンを意味する。好ましく用いられる「適切な」ホルモン類似体は、例えば、イソプロテレノール（ＩＳＯ）およびフェニレフリン（ＰＥ）などのカテコールアミン誘導体である。「適切な」サイトカインは、本発明の目的のため、特に、ＬＩＦ、カルディオトロフィン−１（ＣＴ−１）、インターロイキン−６および１１（ＩＬ−６および１１）、オンコスタチンＭおよび毛様体神経栄養性因子を意味する。
【００３０】
病的に修飾された心筋細胞を産生するための健康な出発材料は、トリ、特にニワトリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）に、または哺乳動物に由来してもよい。哺乳動物の場合、ヒト心臓組織、並びにウサギおよびげっ歯類由来の心臓組織が特に好ましく、後者の場合、特にラット由来のものが好ましい。
【００３１】
心筋細胞の刺激は、記載されるホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインで、本質的に同時に行われる。したがって、多様な刺激剤を共に混合し、これによって、それらの使用を絶対的に同時に行うことが可能である。「本質的に同時」の刺激は、同様に、即時連続して、多様な刺激剤を使用することを意味する。
【００３２】
ホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインは、（ｉ）から（ｉｖ）下にすでに記載されており、そしてそのうちの少なくともいくつかが異なるシグナル伝達カスケードを介して、特に、心筋細胞上のまたは心筋細胞内の多様な受容体を介して作用する。
【００３３】
さらなる好ましい態様において、前記ホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインは、受容体を介してでなく、受容体にさらされるカスケードに直接作用することによって、シグナル伝達カスケードを活性化する。こうした刺激は、例えば、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などのホルボールエステルによって、達成することが可能である。このように、ホルボールエステルが、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に直接結合し、そしてこのためにいかなる受容体も必要としないことが知られる。直接相互作用は、ＰＫＣ、特に慣用的なＰＫＣアイソフォームα、βＩ、βＩＩおよびγのキナーゼ活性を活性化する。ホルボールエステルおよびＰＫＣの間の相互作用は非常に感受性であり、そして１ｎＭホルボールエステルであっても、有意なＰＫＣ刺激を導くことが可能である（Ｇｓｃｈｗｅｎｄｔら（１９９１）ＴＩＢＳ，  １６，  ｐ．１６７）。ホルボールエステルによるＰＫＣの刺激は、ＰＫＣの受容体仲介刺激とちょうど同じように、遺伝子転写、タンパク質生合成および細胞増殖の増加を導く。
【００３４】
本発明のさらなる側面は、健康な心臓組織から、および／または少なくとも１つの健康な心筋細胞から、本発明の心筋細胞を産生する方法であって、方法が、以下の工程：
（ｉ）少なくとも１つの健康な心筋細胞の提供または単離；
（ｉｉ）適切なホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインによる、単離された心筋細胞の刺激；および適切な場合
（ｉｉｉ）サルコメアにおいて、少なくとも１つのシグナル分子、好ましくは少なくとも１つのタンパク質の局在を測定することによる、少なくとも１つの病的に修飾された心筋細胞の検出
を含む場合である。
【００３５】
好ましくはタンパク質であるシグナル分子の局在の検出は、好ましくは、単細胞レベルで行う。用語「単細胞レベル」は、本発明の目的のため、例えば、特定の特性に関連する単細胞の顕微鏡的検査を意味する。大きさまたは形状などの細胞の形態学的特徴は、この場合、性質決定に貢献する可能性がある。単細胞レベルで、シグナル分子、特にタンパク質を調べる、特に好ましい方法は、免疫蛍光による顕微鏡的検出である。この方法では、タンパク質は、その細胞構造内の既知のタンパク質との共局在によって検出される。この用語はまた、例えばサルコメアなどの細胞下構造の電子顕微鏡による検査も意味する。
【００３６】
したがって、例えば、刺激後、α−アクチニンなどの既知のＺ線タンパク質とサルコメアタンパク質の関連は、免疫蛍光によって、Ｚ線の構成要素として同定することが可能である。ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物は、未刺激でそして健康な心筋細胞において、細胞質に均一に分布しているが、刺激されそして病的な心筋細胞において、Ｚ線にα−アクチニンと共に共局在していることをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで示すことが可能であったため、該遺伝子産物が特に適している。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｚ線局在だけでなく、Ｍ線の染色も観察することが可能である。ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物は、当業者に既知の方法を用いて、例えば特異的抗体によって標識し、そしてそれに続いて免疫蛍光によって検出することが可能である。単細胞レベルでの、タンパク質の共局在のさらなる免疫学的検出法は、同様に当業者に知られる、免疫電子顕微鏡観察である。
【００３７】
ラット心筋細胞に関し、ホルボールエステルによる刺激が、サルコメアのＭ線中央へのＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物のシフトを引き起こすのを示すことがさらに可能であった。
【００３８】
単細胞レベルでタンパク質を検出するさらなる可能性は、例えばＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物およびマーカータンパク質の間の融合タンパク質を使用することである。こうしたマーカータンパク質の例は、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のガラクトシダーゼに由来してもよい、原核ペプチド配列である。さらなる可能性は、バクテリオファージＭ１３などのウイルスペプチド配列を用いることであり、これは、この方法で、当業者に知られるファージディスプレー法のための融合タンパク質を産生するためである（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２，  ｐｐ．４３３−４５５）。同様に、マーカータンパク質として適しているのは、蛍光色に応じて、Ｂ−、Ｃ−、Ｇ−、Ｒ−またはＹＦＰ（青色、藍色、緑色、赤色または黄色蛍光タンパク質）と称される、いわゆる蛍光タンパク質である。蛍光融合タンパク質は、また、単細胞レベルでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するためにも、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法を介して使用することが可能である。
【００３９】
単細胞レベルで、特定のタンパク質の局在のシフトを検出するさらなる方法は、サルコメアタンパク質、特にＭ線タンパク質またはＺ線タンパク質の特徴的な修飾である。この場合、特異的抗体の使用を通じた検出のため、セリン、スレオニンおよび／またはチロシン残基に対するリン酸化などの翻訳後修飾を用いることが可能である。例えば、特定のセリン、スレオニンおよび／またはチロシン残基でのＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物のリン酸化および／または脱リン酸化は、Ｚ線タンパク質への会合および結合に原因がある可能性がある。
【００４０】
ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物のタンパク質配列をタンパク質データベースと比較すると、タンパク質トロポモジュリンと、一定の配列相同性が明らかになった。トロポモジュリンは、ニワトリ心筋細胞において、筋原線維の発生に、そして細胞の収縮性に影響を有するタンパク質として知られる（Ｇｒｅｇｏｒｉｏら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，  ｐｐ．８３−８６）。このタンパク質は、まず、トロポミオシンに結合し、そして次にアクチンフィラメントに結合するが、それ自体の活性は制御されない。ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物は、例えばトロポミオシン結合ドメインなど、トロポモジュリンのいくつかの構造的特徴を、同様に有する。トロポモジュリンと対照的に、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物は、チロシンキナーゼによるタンパク質の活性の制御を示す、さらなる構造的特徴を有する。
【００４１】
用語ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物のアミノ酸配列の「機能的変異体」は、本発明の目的のため、本発明のタンパク質と機能的に関連する、すなわち同様に心筋細胞の収縮性の制御可能調節因子と称することが可能であり、横紋筋、好ましくは心筋、そしてその特に心筋細胞で発現され、例えば１以上のトロポミオシン結合ドメインなどのトロポモジュリンの構造的特徴を有し、そして／またはその活性がチロシンキナーゼによって制御されることが可能である、タンパク質を意味する。
【００４２】
「機能的変異体」の例は、ヒト以外の生物、特に非ヒト哺乳動物に由来する、対応するタンパク質である。
より広い意味では、これはまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物と、配列相同性、特に約５０％、好ましくは約６０％、特に約７０％の配列同一性を有するタンパク質も意味する。これらには、例えば、非心臓特異的組織、例えば骨格筋組織から単離される核酸にコードされるが、心臓特異的細胞での発現後、同定される機能を有するポリペプチドが含まれる。これらはまた、約１−６０、好ましくは約１−３０、特に約１−１５、特に約１−５アミノ酸の領域のポリペプチドの欠失も含む。これらはまた、上述のタンパク質を含むさらなる融合タンパク質であって、融合タンパク質自体が、すでに心筋細胞の収縮性の制御可能調節因子の機能を有するか、または融合部分の除去後に初めて、特定の機能を獲得することが可能であるものも含む。
【００４３】
「機能的変異体」はまた、特に、約１−２００、好ましくは約１−１５０、特に約１−１００、特に約１−５０アミノ酸の、特に非心臓特異的配列の部分を持つ、融合タンパク質も含む。非心臓特異的タンパク質配列の例は、例えば大腸菌のガラクトシダーゼ、または本明細書で後に記載される２ハイブリッド系で使用するための転写因子のＤＮＡ結合ドメインに由来していてもよい、原核タンパク質配列である。言及してもよい非心臓特異的タンパク質配列のさらなる例は、既に言及されている、ファージディスプレー法で使用するためのウイルスペプチド配列である。
【００４４】
本発明のタンパク質をコードする本発明の核酸は、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡである。一般的に、二本鎖ＤＮＡが、相当する遺伝子の発現のため、好ましい。
【００４５】
本発明のさらなる側面は、心臓に作用する１以上の物質を検出するかまたは同定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）少なくとも１つの心筋細胞の提供または単離；
（ｉｉ）１以上の試験物質と心筋細胞との接触；および
（ｉｉｉ）サルコメアにおける少なくとも１つのシグナル分子、好ましくは少なくとも１つのタンパク質の局在測定を通じた、心臓に作用する１以上の物質の検出または同定
を含むことで特徴付けられるものである。
【００４６】
特に好ましい態様において、適切なホルモン、ホルモン類似体および／またはサイトカインでの刺激を通じて、病的に修飾された心筋細胞の臨床的外見を示す、本発明の心筋細胞の使用がある。
【００４７】
用語「試験物質」は、本発明の目的のため、適切な条件下で、本発明の心筋細胞と相互作用することが可能である分子、化合物および／または組成物および物質の混合物を意味する。可能な試験物質は、低分子量、有機または無機分子または化合物、好ましくは約１０００まで、特に約５００の相対分子量を有する分子または化合物である。試験物質はまた、既知のベクターおよび／または方法による、心筋細胞への感染またはトランスフェクションによってもたらされる、発現可能核酸であってもよい。適切なベクターの例は、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター、または非ウイルスベクター、特にリポソームである。適切な方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションである。用語「発現可能核酸」は、第一に、オープンリーディングフレームからなり、そして第二に、核酸の転写および転写物の翻訳を確実にするシス活性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｖｅ）配列、例えばプロモーターまたはポリアデニル化シグナルを含む、核酸を意味する。
【００４８】
試験物質はまた、天然および合成ペプチド、例えば約１０００までの、特に約５００までの相対分子量を有するペプチド、およびタンパク質、例えば約１０００より大きい、特に約１００００より大きい相対分子量を有するタンパク質、またはそれらの複合体も含んでもよい。ペプチドはさらに、好ましくは遺伝子バンクまたは核酸ライブラリー由来の選択されたまたはランダムな核酸にコードされてもよく、ペプチドは、配列の天然または人工的発現によって得られる。同様にこれに含まれるのが、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤およびその誘導体である。試験物質は、その相互作用のため、刺激後、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物の局在のシフトを減少させる／妨げるかまたは支持する／引き起こす可能性がある。
【００４９】
本発明のさらなる側面は、心臓に作用する１以上の物質の検出または同定のための、病的に修飾された心筋細胞、好ましくは本発明の病的に修飾された心筋細胞の使用である。
【００５０】
試験物質を同定するのに適した試験系は、いわゆる２ハイブリッド系との機能上の相互作用の同定に基づく（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ，（１９９４），  ＴＩＧＳ  １０，  ｐｐ．２８６−２９２；  ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ，（１９９８）ＴＩＢＴＥＣＨ  １６，  ｐｐ．３５５−３６３）。この試験では、ＤＣＭＡＧ−１遺伝子産物、およびＧａｌ４またはＬｅｘＡなどの転写因子のＤＮＡ結合ドメインで構成される融合タンパク質を発現する発現ベクターで、細胞を形質転換する。形質転換された細胞は、さらに、そのプロモーターが対応するＤＮＡ結合ドメインの結合部位を持つ、レポーター遺伝子を含む。例えばＧａｌ４またはヘルペスウイルスＶＰ１６の活性化ドメインを持つ、既知のまたは未知のポリペプチドで構成される第二の融合タンパク質が本発明のポリペプチドと機能的に相互作用する場合、第二の融合タンパク質を発現する別の発現ベクターの形質転換によって、レポーター遺伝子の発現を非常に増加させることが可能である。この発現増加は、例えば第二の融合タンパク質の構築のため、目的の相互作用因子をコードするｃＤＮＡライブラリーを産生することによって、新規の相互作用因子を同定するのに利用することが可能である。
【００５１】
さらに、この試験系は、本発明のポリペプチドおよび機能的相互作用因子間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングするのに利用することが可能である。こうした物質は、本発明のポリペプチドおよび相互作用因子の融合タンパク質を発現する細胞において、レポーター遺伝子の発現を減少させる（ＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ，（１９９９），  ＴＩＢＳ  １７，  ｐｐ．３７４−８１）。したがって、心臓に作用し、そして毒性であり、かつ薬学的に有効である可能性がある新規物質を、迅速に同定するかまたは検出することが可能である。
【００５２】
図および以下の実施例は、本発明を制限することなく、より詳細に説明することを意図する。
配列番号１はＤＣＭＡＧ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００５３】
【実施例】
１．健康なヒト心筋細胞および疾患ヒト心筋細胞におけるＤＣＭＡＧ−１の局在
移植に適さないドナー心臓由来のヒト心臓組織および外植された疾患患者の心臓（ＤＣＭ）は、外植直後、−８０℃で超低温凍結した。５つの異なるＤＣＭ心臓および５つの異なる健康なドナー心臓から、厚さ４μｍのクリオスタット切片を調製した。組織切片を、３％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、そしてその後、α−アクチニンに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗ＤＣＭＡＧ−１抗体とインキュベーションした。抗体とのインキュベーションは、本明細書中、以後、（抗体）染色と称される（実施例３に記載されるとおり）。蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ　１００Ｓ、Ｃｙ３フィルターセット、Ｚｅｉｓｓ、ゲッティンゲン）下で評価を行った。
【００５４】
健康な心臓およびＤＣＭ心臓のα−アクチニン染色は、Ｚ線タンパク質に典型的であり、そして筋原線維の方向に対して平行な溝をつけて横断する鋭い条線を持つパターンを示す。健康な心臓のＤＣＭＡＧ−１染色は、筋形質の均一で分散した染色を示すが、ＤＣＭ心臓では、α−アクチニンの染色と相関する横断条線パターンが明らかである。これは、健康な心臓およびＤＣＭ心臓の比較に際し、ＤＣＭＡＧ−１タンパク質が、その細胞内局在を変化させ、そして筋形質からＺ線に移動して、そのため、Ｚ線の分子変換がＤＣＭの病的状態と関連して起こることを示す。
【００５５】
２．ウサギにおける、心臓ペースメーカー誘導心機能不全の生成
チンチラ（ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ）交配ウサギ（２．５−３ｋｇ）は、通常の飼育条件下で飼育し、そして任意に飲食を許した。ペースメーカー移植のため、実験動物に、メデトミジン（１０μｇ／ｋｇ）をあらかじめ注射し、そしてその後、プロポフォール（５ｍｇ／ｋｇ／時間）で麻酔した。鎮痛のため、フェンタニル（１０μｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。ウサギに制御された換気をうけ、そして血圧、ＥＣＧおよび血液酸素負荷を連続して監視した。無菌手術条件下で、右外部頚静脈を介して、右心室腔に２Ｆｒペースメーカープローブ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ）を進め、そして係留した。その後、針を介して、ペースメーカープローブを、あらかじめ作成した外背側皮下ポケットに、皮下的に出し、そしてそこで、心臓ペースメーカー装置（Ｄｉａｍｏｎｄ　ＩＩ、Ｖｉｔａｔｒｏｎ、オランダ・ライデン、ユーザー限定ソフトウェア付き）に連結した。外科縫合材料で、皮膚の切開を閉じた。心臓刺激は、ペースメーカー移植１週間後に、３２０心拍／分で開始した。ペースメーカー速度は、各週、２０心拍／分ずつ増加させた。さらに、心機能不全の進展を監視するため、左心室の分割短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を心エコー検査法によって測定した。制御されたペーシングを３週間続けた後、実験動物を屠殺し、そして組織学的検査のため、クリオスタット中で心臓切片を作成した（厚さ４μｍ）。
【００５６】
心臓の組織切片を３％パラホルムアルデヒドで固定した。抗体染色（α−アクチニンおよびＤＣＭＡＧ−１）は、実施例３に記載されるように行った。蛍光顕微鏡下で評価を行った。
【００５７】
心臓の組織切片に基づくＤＣＭＡＧ−１の細胞下局在の比較によって、対照ウサギにおいて、分散した筋形質染色が示され、一方、誘導された心機能不全を持つウサギでは、筋細胞のはっきりした横断条線が明らかであることが示される。この横断条線は、同様に、α−アクチニン染色で見られ、したがって、ＤＣＭＡＧ−１は、この動物モデルでもまた、心機能不全の心臓において、Ｚ線と会合する。
【００５８】
この実験は、３つの異なる試験および対照動物に対して行った。すべての動物は、各場合で、対照においても、そしてまた心機能不全を持つ群においても、同一の局在パターンを示した。
【００５９】
３．新生ラット心筋細胞の採取
一次心筋細胞を新生ラットから単離し、肥大実験を行った。ラットは、１から７日齢であり、そして頚椎脱臼によって屠殺した。心筋細胞を単離するため、収縮している心臓の心室を除去し、そして「新生心筋細胞単離系」（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州レークウッド）を用いて解離した。この目的のため、心室は、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（ＣＭＦ　ＨＢＢＳ）で２回洗浄し、約１ｍｍ３の大きさになるまでメスで切断し、そして冷トリプシン処理（２−１０℃）に一晩さらした。翌日、トリプシン阻害剤を添加することによってトリプシン処理を停止し、そしてその後、３７℃で４５分間、コラゲナーゼ処理を行った。ピペッティングによって細胞を解離させ、「細胞漉し器」（７０μｍ）を通過させ、そして６０ｘｇで２回、５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを２０ｍｌの慣用的な接着培地（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）中にとった。植付け（ｓｅｅｄｉｎｇ）は、ゼラチンコーティング（Ｓｉｇｍａ、ダイゼンホッフェン）組織培養プレートまたはカバーガラス上に、６ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で行った。翌日、吸引によって培地を除去し、そしてＤＭＥＭ（慣用的細胞培地）で２回洗浄した後、培養培地で置き換えた。
【００６０】
接着培地：ＤＭＥＭ／Ｍ−１９９（４／１）；１０％ウマ血清；５％ウシ胎児血清；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ
培養培地：ＤＭＥＭ／Ｍ−１９９（４／１）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム
【００６１】
４．単離新生心筋細胞の刺激
細胞は培地交換２から６時間後に刺激した。これは、多様な刺激剤または刺激剤の組み合わせ（表１を参照されたい）で心筋細胞を４８時間処理することによって行い、その後、解析を行った。細胞の形態学的変化（肥大）に基づき、単一の刺激の進行を観察することが可能であった。形態学的変化に加え、免疫蛍光解析もまた用いて、肥大パラメーター（ＤＣＭＡＧ−１リクルートメント）を測定した。
【００６２】
５．刺激された新生心筋細胞の免疫蛍光解析
免疫蛍光解析のため、刺激された心筋細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒド溶液で２０分間固定した。再び冷ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ中の１００ｍＭ塩化アンモニウムと細胞を、２回、それぞれ１０分間、室温でインキュベーションした。その後、冷ＰＢＳでのさらなる洗浄工程を行い、そして室温で５分間、ＰＢＳ中の０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００とインキュベーションした。ＰＢＳ中の０．１％ゼラチンで２回洗浄した後、当業者に既知の「湿度チャンバー」中、３７℃で、一次抗体とインキュベーションした。一次抗体（ＤＣＭＡＧ−１の第二のドメインに対するもの）は、インキュベーション溶液（ＰＢＳ中の０．５％　Ｔｗｅｅｎ−２０；０．５％　ＢＳＡ）で１／５００に希釈した。その後、１時間後に、室温でそれぞれ５分間のＰＢＳでの洗浄工程を３回行った。二次抗体（ヤギから得たもの、ウサギに対して向けられる、Ｃｙ３結合；Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ）は、インキュベーション溶液で１／２００に希釈し、そして同様に、３７℃で１時間、固定した細胞とインキュベーションした。室温でそれぞれ５分間のＰＢＳでの洗浄工程をさらに３回行い、そして脱イオン水に簡単に浸した後、調製をＨｉｓｔｏｓａｆｅ（Ｌｉｎａｒｉｓ、ウェルトハイム−ベッティンゲン）の層で覆い、そしてスライドに適用した。顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ　１００Ｓ、Ｃｙ３フィルターセット、Ｚｅｉｓｓ、ゲッティンゲン）下で評価を行った。
【００６３】
未刺激心筋細胞は、ＤＣＭＡＧ−１に関して分散した筋形質染色を示す（図１）。ＤＣＭＡＧ−１は同様に、ＰＥまたはＬＩＦ単独で刺激された細胞の筋形質上に、均一に分布するが、ＬＩＦ刺激細胞は、伸長した形状を示す。ＥＴ−１刺激細胞は、フィラメント状の構造中にＤＣＭＡＧ−１を示す。ＥＴ−１およびＰＥで二重に刺激された細胞は、弱い筋形質パターンを示し、一方、ＥＴ−１、ＩＳＯおよびＬＩＦで三重に刺激された細胞は、明らかに可視の線の一定のパターンを示す（図２）。
【００６４】
したがって、これらの刺激実験の定量的評価のため、サルコメアへのＤＣＭＡＧ−１のリクルートメントを測定し、そして以下のように分類した：
（−）カバーグラスあたり２細胞より少ない
（＋）カバーグラスあたり２から５細胞
（＋＋）総細胞の約１０％
（＋＋＋）総細胞の１０％より大
表１
【００６５】
【表１】
2004500065.tif 000002
表１に関する注：単一投薬量：ＰＥ：１００μＭ；ＬＩＦ：１ｎｇ／ｍｌ；ＥＴ−１：１０ｎＭ；ＩＳＯ：１０μＭ；ＩＮ：１００ｎＭ
表１に要約される刺激実験の結果は、単一刺激がＤＣＭＡＧ−１のサルコメアへのリクルートメントを実質的にまったく引き起こさないことを示す。高濃度のＩＳＯで、わずかな影響があるに過ぎない（第一列を参照されたい）。２つの刺激剤での刺激は、特にＥＴ−１およびＰＥの組み合わせで、ＤＣＭＡＧ−１のサルコメアへの一定のリクルートメントを導く。２つの刺激剤の他の組み合わせは、わずかな影響しか示さないかまたはまったく影響を示さない（第二列を参照されたい）。ＤＣＭＡＧ−１のサルコメアへの最大のリクルートメントは、ＥＴ−１、ＬＩＦおよびＩＳＯでの三重刺激によって達成される。サルコメアへのＤＣＭＡＧ−１のリクルートメントを示すすべての刺激実験で、Ｚ線と共にＭ線においてＤＣＭＡＧ−１の局在を観察することが可能であった。
【００６６】
６．ホルボールエステルによる、単離新生心筋細胞の刺激
上述の受容体刺激剤に加え、驚くべきことに、ＰＫＣ活性化因子、ホルボールミリステート−１２，１３アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）との新生ラット心筋細胞のインキュベーションが、筋形質からサルコメア構造へのＤＣＭＡＧ−１の転位を引き起こすことがさらに見出された。これらの実験において、心筋細胞は上述のように調製され、そしてカバーグラス上に植え付けられた。多様な濃度のＰＭＡでの刺激を４８時間行い、そして細胞を上述のように固定し、染色し、そしてＤＣＭＡＧ−１転位に関して調べた。細胞を視覚的に分類して、そして計数した。
【００６７】
６つの独立の実験の計数により（±ＳＥＭ）、ＤＣＭＡＧ−１の局在に関して、以下のデータが生じた：
表２
【００６８】
【表２】
2004500065.tif 000003
表２に列挙されるデータは、ＤＣＭＡＧ−１タンパク質が、非常に少量の１ｎＭのＰＭＡでもサルコメアに転位することを示す。さらに、ＬＩＦ／ＩＳＯ／ＥＴ−１での三重刺激後よりも、ＰＭＡ刺激後に、より多くの細胞がサルコメアにＤＣＭＡＧ−１を示す。
【００６９】
７．ＰＭＡまたは三重刺激後のＤＣＭＡＧ−１の局在
ＰＭＡが、３つのシグナル伝達経路のそれらの受容体を介した活性化とちょうど同じように、サルコメアへのＤＣＭＡＧ−１の転位を引き起こすため、ＰＭＡまたは三重刺激でＤＣＭＡＧ−１が転位されるサルコメア構造を調べた。この目的のため、共局在実験を行った。ラット心筋細胞は、上述のようにカバーグラス上に植え付け、そして同様に刺激し、固定して、そして染色した。染色と共に、抗ＤＣＭＡＧ−１抗体（ポリクローナル）をモノクローナルα−アクチニン（Ｓｉｇｍａ、１：５００）またはモノクローナル抗ミオシン（重鎖、ＭＨＣ、Ｓｉｇｍａ、１：５００）いずれかと混合した。用いた二次抗体は、ＦＩＴＣ抗マウス（１：２５０）およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ抗ウサギ（１：５０；共にＤｉａｎｏｖａ）であった。
【００７０】
評価は、蛍光顕微鏡、Ｆｕｊｉ−ＣＣＤカメラおよびＡｉｄａソフトウェアの補助で、または共焦点顕微鏡（ＺｅｉｓｓのＰａｓｃａｌ）およびＬＳＭソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）の補助で行った。これから、ＥＴ−１／ＬＩＦ／ＩＳＯでの三重刺激が、ＤＣＭＡＧ−１染色の点および縞のパターンを生じることが明らかになり、ＤＣＭＡＧ−１は、サルコメア沿いにビーズの数珠つなぎのように配置されていた。同様に点および縞のパターンを示すアクチニン染色と比較し、ＤＣＭＡＧ−１に関して、アクチニンの２倍の点／縞があり、点／縞１つおきに共局在している。アクチニンは、Ｚ線を特異的に染色するため、この三重刺激後、ＤＣＭＡＧ−１は、Ｚ線およびＭ線に見出されているはずである。
【００７１】
一方、ＰＭＡでの心筋細胞の刺激は、色パターンに改変を引き起こした。α−アクチニンおよびＤＣＭＡＧ−１での二重染色は、交互に赤および緑の横縞を導き、これは、この場合、α−アクチニンおよびＤＣＭＡＧ−１の共局在はなかったことを意味する。ＭＨＣおよびＤＣＭＡＧ−１の二重染色は、黒い線、緑のバンド、黄色い線、緑のバンド、そして最後にもう１つの黒い線の順序として記載することが可能な画像を導く。この種の単位は、ビーズの数珠つなぎのように配置され、そして筋形質に浸透した。これは、ＤＣＭＡＧ−１がＰＭＡ刺激後にＭ線と共局在し、そしてさらに、各場合でＭ線の中央に見出されるはずであることを示す。したがって、ＰＭＡでの刺激後、ＤＣＭＡＧ−１は、Ｍ線に転位する（共焦点顕微鏡：ＺｅｉｓｓのＡｘｉｏｖｅｒｔ　１００およびＬＳＭ　４１０ソフトウェアでの評価）。
【００７２】
ＤＣＭＡＧ−１は、したがって、作用する刺激剤に応じ、サルコメア中の異なる構造で見出されることが可能である。
【００７３】
８．新生ラット由来の心筋細胞における免疫蛍光試験でのＤＣＭＡＧ−１転位に対する阻害剤の影響の測定
新生ラット心筋細胞は、実施例３におけるように調製し、そして１．５ｃｍウェル（細胞培養プレート中の反応チャンバー）あたり１ｘ１０５細胞の密度で植え付けた。細胞培養プレートは、１％ゼラチン溶液でコーティングした１．５ｃｍカバーグラス（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ｕｎｄ  Ｗｅｉｓｓ）を含んだ。細胞を２４時間後、ＤＭＥＭとインキュベーションし、そして続いて、刺激因子（ＬＩＦ／ＩＳＯおよびＥＴ−１、単一投薬量に関して上述のような濃度）を含むまたは含まない維持培地中で４８時間インキュベーションした。
【００７４】
ＤＣＭＡＧ−１の転位に必要なシグナル伝達経路を決定するため、刺激された細胞を阻害剤、すなわち３０μＭ  ＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＳＢ  ２０３５８０（Ｓｉｇｍａ）、１５ｎＭ  Ｇｏｅ  ６９７６（Ａｌｅｘｉｓ）または５０μＭ  ＰＤ９８０５９（ＮＥＢ）と４８時間インキュベーションした（阻害剤の活性は、水性溶液中で２４時間までに制限されるため、２４時間後、培地および阻害剤を新しくした）。
【００７５】
４８時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理し、そして抗ＤＣＭＡＧ（ポリクローナル、自ら産生、１：５００）またはα−アクチニン（対照として、Ｓｉｇｍａ、１：５００）で染色し、そして抗マウスまたは抗ウサギＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、米国）で免疫蛍光中、視覚化した。阻害剤の影響を測定するため、細胞は、視覚的に分類し、そして計数した。
【００７６】
６つの独立の実験を計数し（±ＳＥＭ）、ＤＣＭＡＧ−１の局在に関して、以下のデータを生じた：
表３
【００７７】
【表３】
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　刺激＝ＬＩＦ、ＩＳＯおよびＥＴ−１で刺激
ＬＹ＝ＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ）を添加
ＳＢ＝ＳＢ　２０３５８０（Ｓｉｇｍａ）を添加
Ｇｏｅ＝Ｇｏｅ　６９７６（Ａｌｅｘｉｓ）を添加
ＰＤ＝ＰＤ９８０５９（ＮＥＢ）を添加
計数細胞総数＝５０９２；
表３に要約される阻害実験は、多様な物質がサルコメアへのＤＣＭＡＧ−１の転位を減少させるのに適しており（ＬＹ、ＰＤ、Ｇｏｅに関して、最後の列を参照されたい）、そして物質の組み合わせが転位をほぼ完全に妨げるのに適している（ＬＹ＋ＰＤ、ＬＹ＋Ｇｏｅ、ＳＢ＋ＰＤ）ことを示す。この試験系はしたがって、サルコメアへのＤＣＭＡＧ−１の転位を減少させるかまたは妨げるための活性成分または活性成分の組み合わせを探すのに適している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポリクローナル抗ＤＣＭＡＧ−１抗体で、そしてＣｙ３結合二次抗体で染色されている、未刺激の新生ラット心筋細胞の免疫蛍光を示す。
【図２】図２は、ポリクローナル抗ＤＣＭＡＧ−１抗体で、そしてＣｙ３結合二次抗体で染色されている、ＥＴ−１／ＩＳＯ／ＬＩＦ刺激した新生ラット心筋細胞の免疫蛍光を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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