(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる疾患の治療に使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物又はその薬学的に許容し得る塩を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減用医薬の製造に使用する方法。
【請求項２】
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物又はその薬学的に許容し得る塩を、過剰な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減用医薬の製造に使用する方法。
【請求項３】
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物は、一般式（Ｉ）
【化１】
2004520396.tif 000005
｛式中、
Ｒ2 は−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを示し、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は相互に独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シア  ノ、ニトロ、トリフルオロメチル、−ＣＯ2 Ｒ1 又は−ＣＯＲ1 （式中、Ｒ1 は水素又は
アルキルである。）を示し、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15及びＲ15のうちの１つはトリフルオロメチルを示し、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15及びＲ15のうちの他の４つは水素を示す。｝
で表わされる化合物又はその薬学的に許容し得る塩である、請求項２記載の使用する方法。
【請求項４】
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物は、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニル−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−クロロフェネチ−２−イル）−３−トリフルオロメチルアニリン、
［Ｎ−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
１−［３−（２−アミノ−ピリド−５−イル）−フェン−１−イル］−５−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
５−ホルムアミジル−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−アミノフェニル−３−フェン−１−イル）−２−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−５−メトキシ−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
γ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−（３−トリフルオロメチルアセトアニリド）、
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−フェネチ−２−イル）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−アニリン、
［Ｎ−（５−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（２−ナフチル）−トロパン、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−尿素、
７，８−ジクロロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
７−ニトロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
５−アミノ−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，８Ｒ）−３−（４−クロロフェニル）−７−アザトリシクロ［５．３．０．０］デカン−５−オキシム、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−［３−（２−チエニル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］−３−（２−ナフチル）−トロパン、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−トロパン、［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（４−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（３−ニトロフェニル）］尿素、
（１Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，８Ｒ）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−７−アザトリシクロ［５．３．０．０］デカン−５−オキシム、
（１Ｒ、２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）−トロパン又は
これらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる、請求項２記載の使用する方法。
【請求項５】
過剰の細胞死によって特徴づけられる疾患が神経変性障害又は虚血、たとえば大脳虚血である、請求項２〜４のいずれか１つに記載の使用する方法。
【請求項６】
過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減方法において、この方法がカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物又はその薬学的に許容し得る塩の治療上有効な量を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項７】
過剰な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減方法において、この方法がカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物又はその薬学的に許容し得る塩の治療上有効な量を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項８】
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニル−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−クロロフェネチ−２−イル）−３−トリフルオロメチルアニリン、
［Ｎ−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
１−［３−（２−アミノ−ピリド−５−イル）−フェン−１−イル］−５−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
５−ホルムアミジル−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−アミノフェニル−３−フェン−１−イル）−２−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−５−メトキシ−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
γ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−（３−トリフルオロメチルアセトアニリド）、
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−フェネチ−２−イル）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−アニリン、
［Ｎ−（５−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（２−ナフチル）−トロパン、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−尿素、
７，８−ジクロロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
７−ニトロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
５−アミノ−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−［３−（２−チエニル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］−３−（２−ナフチル）−トロパン、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−トロパン、（１Ｒ、２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）−トロパン又は
これらの薬学的に許容し得る塩である新規化合物。
【請求項９】
請求項８記載の化合物又はその薬学的に許容し得る付加塩の治療上有効な量を少なくとも１種の薬学的に許容し得るキャリヤー、賦形剤又は希釈剤と共に含有する薬学的調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合（the association)を調節する化合物を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる疾患の治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス、すなわち細胞消滅（programmed cell death)は、多くの生理学的プロセスで重要な役割を果たす細胞自己死であり、そしてその解除（deregulation) が多くの疾患に寄与する。成熟動物において、細胞は組織交代の間にアポトーシスによって、そして免疫応答の最後に死滅する。アポトーシスの解除は種々の疾患、たとえば細胞死が著しい神経変性疾患及びアポトーシスが阻止されている癌で観察される。
【０００３】
システインプロテアーゼのファミリー、カスパーゼはすべてのアポトーシス性細胞死が起こる原因となっていると信じられてきた。カスパーゼは腫瘍ネクロシスファクター（ＴＮＦ）ファミリーの細胞表面レセプターによってか（外部アポトーシス経路（an extrinsic apoptosis pathway) ）又はたとえば成長因子喪失、虚血又はいくつかの抗がん剤によって誘発されるミトコンドリアからのサイトゾルへのチトクロムｃ漏出によって活性化することができる（内部（intrinsic)アポトーシス経路）。
【０００４】
外部アポトーシス経路は細胞表面レセプターのサブファミリー、デスレセプターによって活性化される。このレセプターは腫瘍ネクロシスファクター（ＴＮＦ）スーパーファミリーのサブセットである。ＴＮＦは多機能サイトカインであり、これはアポトーシス、炎症及びストレス応答を含むいくつかの生物学的応答を誘い出す。ＴＮＦの非常に多くの生物学的効果は２つの異なる細胞表面レセプター、ＴＨＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２を介してシグナル化される。前者はほとんどの細胞中で主要なシグナルレセプターである。ＴＮＦ−Ｒ１はＴＮＦ結合しながら三量化され、これが引き続きの補充(recruitment) 及びデスドメイン相互作用による蛋白質含有の他の細胞内デスドメインの結合に至る。カスパーゼ−８はレセプター複合体に補充された時に活性化され、その結果としてエフェクターカスパーゼ（略してカスパーゼ−３）を、ついでアポトーシスを活性化することができる。
【０００５】
ミトコンドリアは内部アポトーシス経路の中心である。種々の刺激に応じて、ミトコンドリアはチトクロムｃをサイトゾルに漏出する。サイトゾルにおいて、チトクロムｃは“アポトソーム(apoptosome)”と呼ばれる蛋白質複合体のＡＴＰ／ｄＡＴＰ依存形成を増加させる。アポトソームはＡｐａｆ−１（アポトーシス性プロテアーゼ活性化ファクター１）、カスパーゼ−９及びチトクロムｃからなる。この複合体のうち、カスパーゼ−９を活性化して分解し、ついでエフェクターカスパーゼ、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７を活性化する。
【０００６】
結果として、治療的行為によるカスパーゼ活性の調節は過剰の又は不十分な細胞死によって特徴づけられる疾患の治療に有用であると証明される。
【０００７】
発明の要旨
本発明によれば、本発明者はカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物が過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる疾患の治療に使用することができることを見出した。
【０００８】
したがって、その第一の観点において、本発明はカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物又はその薬学的に許容し得る塩を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減用医薬の製造に使用する方法に関する。
【０００９】
他の観点で、本発明はカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害することができる新規化合物に関する。
【００１０】
この化合物は、特にどのようにアポトーシスが細胞レベルで調節されるかを理解するための特別の検査ツールとしてインビトロで使用することもできる。
【００１１】
本発明のその他の目的は下記の詳細な説明及び実施例から当業者に明らかである。
【００１２】
発明の詳細な説明
その第一の観点で、本発明はカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物又はその薬学的に許容し得る塩を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減用医薬の製造に使用する方法を提供する。
【００１３】
第二の観点で、本発明はカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物又はその薬学的に許容し得る塩を、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減用医薬の製造に使用する方法を提供する。
【００１４】
第三の観点で、本発明は、過剰な又は不十分な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減方法において、この方法がカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物又はその薬学的に許容し得る塩の治療上有効な量を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１５】
別の観点で、本発明は、過剰な細胞死によって特徴づけられる、患者の疾患の治療、予防又は軽減方法において、この方法がカスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物又はその薬学的に許容し得る塩の治療上有効な量を上記患者に投与することを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１６】
更に別の観点で、本発明は、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニル−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−クロロフェネチ−２−イル）−３−トリフルオロメチルアニリン、
［Ｎ−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
１−［３−（２−アミノ−ピリド−５−イル）−フェン−１−イル］−５−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
５−ホルムアミジル−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−アミノフェニル−３−フェン−１−イル）−２−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−５−メトキシ−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
γ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−（３−トリフルオロメチルアセトアニリド）、
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−フェネチ−２−イル）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−アニリン、
［Ｎ−（５−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（２−ナフチル）−トロパン、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−尿素、
７，８−ジクロロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
７−ニトロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
５−アミノ−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−［３−（２−チエニル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］−３−（２−ナフチル）−トロパン、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−トロパン、（１Ｒ、２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）−トロパン又は
これらの薬学的に許容し得る塩である新規化合物を提供する。
【００１７】
別の観点で、本発明は上記の新規化合物又はその薬学的に許容し得る付加塩の治療上有効な量を少なくとも１種の薬学的に許容し得るキャリヤー、賦形剤又は希釈剤と共に含有する薬学的調合物に関する。
【００１８】
ある実施態様において、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物はノンペプチド化合物である。
【００１９】
第二の実施態様において、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物は、一般式（Ｉ）
【００２０】
【化１】
2004520396.tif 000002
｛式中、
Ｒ2 は−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを示し、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は相互に独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、−ＣＯ2 Ｒ1 又は−ＣＯＲ1（式中、Ｒ1 は水素又はアルキルである。）を示し、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15及びＲ15のうちの１つはトリフルオロメチルを示し、
Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15及びＲ15のうちの他の４つは水素を示す。｝
で表わされる化合物又はその薬学的に許容し得る塩である。
【００２１】
一般式Ｉで表わされる化合物の特定の実施態様において、Ｒ2 は−ＯＨを示す。別の実施態様において、Ｒ2 は−ＣＯＯＨを示す。また別の実施態様において、Ｒ4 はヒドロキシを示す。別の実施態様において、Ｒ4 はニトロである。また別の実施態様において、Ｒ5 は−ＣＯＲ1 （式中、Ｒ1 はアルキル、たとえばメチルである。）を示す。別の実施態様において、Ｒ5 はハロゲン、たとえばクロライドを示す。
【００２２】
別の実施態様において、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物は、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニル−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−クロロフェネチ−２−イル）−３−トリフルオロメチルアニリン、
［Ｎ−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
１−［３−（２−アミノ−ピリド−５−イル）−フェン−１−イル］−５−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
５−ホルムアミジル−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−アミノフェニル−３−フェン−１−イル）−２−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−５−メトキシ−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
γ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−（３−トリフルオロメチルアセトアニリド）、
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−フェネチ−２−イル）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−アニリン、
［Ｎ−（５−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（２−ナフチル）−トロパン、
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−尿素、
７，８−ジクロロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
７−ニトロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、
５−アミノ−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、
［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
（１Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，８Ｒ）−３−（４−クロロフェニル）−７−アザトリシクロ［５．３．０．０］デカン−５−オキシム、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−［３−（２−チエニル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］−３−（２−ナフチル）−トロパン、
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−トロパン、［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（４−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、
［Ｎ−（２−カルボキシ−５−クロロフェニル）−Ｎ’−（３−ニトロフェニル）］尿素、
（１Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，８Ｒ）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−７−アザトリシクロ［５．３．０．０］デカン−５−オキシム、
（１Ｒ、２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）−トロパン又は
これらの薬学的に許容し得る塩から選ばれる。
【００２３】
また別の実施態様において、過剰の細胞死によって特徴づけられる疾患は、神経変性障害又は虚血、たとえば大脳虚血である。特定の実施態様において、過剰の細胞死によって特徴づけられる疾患は神経変性障害である。別の特定の実施態様において、過剰の細胞死によって特徴づけられる疾患は虚血、たとえば大脳虚血である。
【００２４】
本発明にしたがって治療される患者はこのような治療を必要とする生体、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００２５】
本明細書に記載された実施態様の２つ以上のすべての可能な組み合わせは本発明の範囲内にある。
【００２６】
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物
カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を調節する化合物として作用する特定の化合物の能力を標準インビトロアッセイ、たとえば“試験法”で記載されるアッセイを用いて測定することができる。
【００２７】
ある実施態様において、ＤＥＶＤase アッセイ（方法１）で試験した場合、カスパーゼ−９のＡｐａｆ−１への結合を阻害する化合物は５０％より多くの阻害率、好ましくは６０％より多くの阻害率、より好ましくは７０％より多くの阻害率、そしてさらにより好ましくは８０％より多くの阻害率を示す。
【００２８】
新規化合物
本発明の新規化合物は通常の化学合成方法によって製造することができる。すべてのＮ，Ｎ’−ジアリル尿素をトルエン中で対応するアリル尿素及びアリルイソシアネートを混合することによって製造する。
【００２９】
本明細書に記載した反応の最終生成物を常法で、たとえば抽出、結晶化、蒸留、クロマトグラフィー等々によって単離することができる。
【００３０】
次の新規化合物は常法、たとえば種々の公開された本出願人の特許出願明細書に記載された方法を用いて製造される：
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシカルボニル−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、融点１０１−１０２℃。
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−［３−（２−チエニル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］−３−（２−ナフチル）−トロパン塩酸塩、融点１４９−１５０℃。
Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−クロロフェネチ−２−イル）−３−トリフルオロメチルアニリン塩酸塩、融点１８２℃。
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（３，４−ジクロロフェニル）−トロパン塩酸塩、融点１５０℃。
［Ｎ−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、融点１７９−１８０℃。
１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、融点１５３−１５４℃。
１−［３−（２−アミノ−ピリド−５−イル）−フェン−１−イル］−５−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール塩酸塩、融点２９２−２９４℃。
５−ホルムアミジル−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、融点１６９−１７０℃。
１−（３−アミノフェニル−３−フェン−１−イル）−２−トリフルオロメチル−ベンズイミダゾール、融点４８−５０℃。
１−（３−ビフェニル）−５−メトキシ−ベンズイミダゾール、融点１１１−１１２℃。
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、融点２２０−２２２℃。
γ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−（３−トリフルオロメチルアセトアニリド）、融点１４８−１５０℃。
（１Ｒ、２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ノルメチル−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（４−クロロフェニル）−トロパン塩酸塩、融点１８５−１８７℃。
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−フェネチ−２−イル）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−アニリン、融点９２−９５℃。
［Ｎ−（５−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、融点２０１−２０３℃。
（１Ｒ，２Ｓ，３Ｓ）−２−（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−３−（２−ナフチル）−トロパン塩酸塩、無定形化合物。
［Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−Ｎ’−（３−トリフルオロメチルフェニル）］尿素、融点１６０−１６２℃。
Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシ−５−トリフルオロメチルフェニル）−尿素、融点１７５−１７６℃。
７，８−ジクロロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、融点１６４−１６７℃。
７−ニトロ−１，２，４−オキサジアゾロ［３，４−ｄ］ベンズ［ｂ］−１，４−ジアジン−１−オン、融点２１８℃。
５−アミノ−１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール塩酸塩、融点１４７−１４９℃。
１−（３−ビフェニル）−ベンズイミダゾール、油状物。
【００３１】
薬学的に許容し得る塩
本発明の化合物を、意図される投与に適するすべての形態で提供することができる。適する形態は薬学的に（すなわち生理学的に）許容し得る塩及び本発明の化合物のプレドラッグ形及びプロドラッグ形を含む。
【００３２】
薬学的に容認された付加塩の例としては、以下のものに限定されないが、非毒性無機- 及び有機酸付加塩、たとえば塩酸に由来する塩酸塩、臭化水素酸に由来する臭化水素酸塩、硝酸に由来する硝酸塩、過塩素酸に由来する過塩素酸塩、リン酸に由来するリン酸塩、硫酸に由来する硫酸塩、ギ酸に由来するギ酸塩、酢酸に由来する酢酸塩、アコニチン酸に由来するアコニチン酸塩、アスコルビン酸に由来するアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸に由来するベンゼンスルホン酸塩、安息香酸に由来する安息香酸塩、ケイヒ酸に由来するケイヒ酸塩、クエン酸に由来するクエン酸塩、エンボン酸(embonic acid)に由来するエンボン酸塩、エナンチン酸(enanthic acid) に由来するエナンチン酸塩、フマル酸に由来するフマル酸塩、グルタミン酸に由来するグルタミン酸塩、グリコール酸に由来するグリコール酸塩、乳酸に由来する乳酸塩、マレイン酸に由来するマレイン酸塩、マロン酸に由来するマロン酸塩、マンデル酸に由来するマンデル酸塩、メタンスルホン酸に由来するメタンスルホン酸塩、ナフタレン-2- スルホン酸に由来するナフタレン-2- スルホン酸塩、フタル酸に由来するフタル酸塩、サリチル酸に由来するサリチル酸塩、ソルビン酸に由来するソルビン酸塩、ステアリン酸に由来するステアリン酸塩、コハク酸に由来するコハク酸塩、酒石酸に由来する酒石酸塩、トルエン-p- スルホン酸に由来するトルエン-p- スルホン酸塩を含む。この様な塩は技術上公知の方法及びで製造することができる。
【００３３】
他の酸、たとえばシュウ酸──これ自体、薬学的に容認されない──は、本発明の化合物及びその薬学的に許容し得る酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の製造に適している。
【００３４】
本発明の化合物の金属塩はアルカリ金属塩、たとえばカルボキシ基を含有する本発明の化合物のナトリウム塩を含む。
【００３５】
本発明の範囲いおいて、Ｎ−含有化合物の“オニウム塩”も薬学的に容認された塩として考慮される。好ましい“オニウム塩”はアルキル−オニウム塩、シクロアルキル−オニウム塩及びシクロアルキルアルキル−オニウム塩を含む。
【００３６】
本発明の化合物は薬学的に容認された溶剤、たとえば水、エタノール等々と共に溶解可能な形又は溶解不可能な形で提供されてよい。溶解可能な形はまた水和形、たとえば一水和物、二水和物、ヘミ水和物、三水和物、四水和物等々を包含することができる。一般に、溶解可能な形は本発明の目的にとって溶解不可能な形に相当するものと考えられる。
【００３７】
プロドラッグ
本発明の化合物をそのまま又は適当なプロドラッグの形で投与することができる。
【００３８】
用語“プロドラッグ”は薬物の前駆体であり、そして投与及び吸収後にある代謝プロセスを経て生体内に薬物を放出する化合物を意味する。
【００３９】
特に好ましい薬物は、本発明の化合物のバイオアベイラビリティを増加させる化合物であるか（たとえば経口投与された化合物をより速く血液中に吸収させることによって）又は特定の生物学的コンパートメント（たとえば脳又はリンパ系）への源化合物（the parent compound)の運搬を増加させる化合物である。
【００４０】
本発明の物質の適するプロドラッグの例は、源化合物の反応性又は誘導化される基１個以上で変化された化合物を含む。カルボキシル基、ヒドロキシル基又はアミノ基で変化された化合物が特に重要である。適当な誘導体の例はエステル又はアミドである。
【００４１】
立体異性体
本発明の化合物は(+)-及び(-) 形並びにラセミ形（±）で存在することができる。これらの異性体のラセミ化合物及び個々の異性体それ自体は本発明の範囲内にある。
【００４２】
ラセミ形は公知の方法及び処理で光学対掌体に分割することができる。そのジアステレオマー塩を分離する一つの方法は、光学的に活性な酸を使用し、次いで塩基で処理して光学的に活性アミン化合物を遊離することにある。ラセミ化合物の光学対掌体への他の分割法は、光学的活性なマトリックス上でのクロマトグラフィー法に基づく。本発明のラセミ化合物は、たとえばｄ- 又はｌ- 塩 (酒石酸塩、マンデル酸塩、又はカンファースルホン酸塩）の分別結晶によって、その光学的対掌体に分割することができる。
【００４３】
本発明の化合物はまた、本発明の化合物と光学的活性に活性化されたカルボン酸、たとえば（＋）又は（−）フエニルアラニン、（＋）又は（−）フエニルグリシン、（＋）又は（−）カンフアン酸に由来するカルボン酸とを反応させてジアステレオマーアミドを生成させることによって、あるいは本発明の化合物と光学的活性なクロロギ酸塩等々とを反応させてジアステレオマーカルバミン酸塩を生成させることによって分割することができる。
【００４４】
その他の光学的異性体分割法は技術上周知である。このような方法は、Jaques J. Collet A, 及び Wilen S, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley 及び Sons,ニューヨーク(1981)中に記載された方法を含む。
【００４５】
また、光学的活性化合物も光学的活性出発化合物から製造することができる。
置換基の定義
本発明の範囲において、ハロゲンはフッ素- 、塩素- 、臭素- 又はヨウ素原子を示す。
【００４６】
アルキル基は直鎖状又は分枝状の炭素原子１〜６個の鎖を示し、これらに限定されないがメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、及びヘキシルを含む。メチル、エチル、プロピル及びイソプロピルが好ましい基である。
【００４７】
薬学的調合物
本発明の化合物を治療で使用するにあたり、そのまま化合物として投与することもできるが、有効成分を場合により生理学的に許容し得る塩の形で、１種以上の佐剤、賦形剤、キャリア、希釈剤、緩衝剤、及び（又は）その他の慣用の薬学的助剤と共に薬学的調合物の形で提供するが好ましい。
【００４８】
好ましい具体例において、本発明は、更に本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩又は誘導体を薬学的に容認されたキャリヤー１種以上及び場合により他の治療及び（又は）予防成分と共に含有する薬剤を提供する。このキャリヤーは、製剤中の他の成分と適合しかつこれに投与される患者に有害でないという意味で“許容し得”なければならない。
【００４９】
本発明の薬学的調合物は経口、直腸、鼻腔、局所（バッカル及び舌下を含めて）、経皮、膣又は腸管外（皮膚−、皮下−、筋肉内−、腹腔内−、静脈内−、動脈内−、脳内−、眼内注射又は注入）投与に適するものであるか、あるいは粉末及び液体エアゾール投与を含む吸入又はガス注入による又は徐放システムによる投与に適する形のものであってよい。徐放システムの適当な例は、本発明の化合物を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス────そのマトリックスは製品の形で、たとえばフィルム又はマイクロカプセルであってよい────を含む。
【００５０】
通常の佐薬、キャリヤー又は希釈剤と共に、本発明の化合物を、薬剤及びその単位投薬形とすることができる。このような形態は固体、特に錠剤又は充填カプセル、又は液体、たとえば溶液、懸濁液、エマルジョンン、エリキシル又はこれによって充填されたカプセル、経口使用するためのすべての形で、直腸投与様坐剤の形で又は非経口用滅菌注射溶液の形で使用する。この様な薬剤及びその単位投薬形は通常の成分を通常の割合で、別の有効物質又は成分の存在下又は不存在下に含有し、この様な単位投薬形は、有効成分の適する有効量を、使用される、計画された一日投薬範囲に相応して含有することができる。
【００５１】
本発明の化合物を、多種の経口及び非経口投薬形で投与することができる。下記の投薬形は、有効成分として本発明の化合物又は本発明の化学物の薬学的に容認された塩のどちらかを含有してよいことは当業者に明らかである。
【００５２】
本発明の化合物から薬剤を製造することに関して薬学的に容認されたキャリヤーは固体又は液体のどちらかである。固形薬剤として粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カッシェ、坐剤及び分散可能な顆粒が挙げられる。固体キャリヤーは、希釈剤、風味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料として作用してもよい物質１種又はそれ以上であることができる。
粉末中に、キャリヤーは微粉砕された固体であって、これは微粉砕された有効成分との混合物中にある。
【００５３】
錠剤中に、有効成分は適する割合で必要な結合容量を有するキャリヤーと混合され、所望の形態と大きさに圧縮される。
【００５４】
粉末及び錠剤は有効物質約５又は１０〜約７０％を含有する。適するキャリヤーは炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、でんぷん、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ロウ、カカオバター等々である。“製造”なる言葉は、キャリヤー含有又は不含で有効物質を有効物質と関連するキャリヤーによって含有するカプセルを供給するキャリヤーとしてカプセル化材料を用いる有効物質の調製を含む。同様にカッシェ及びロゼンジも含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カッシェ及びロゼンジを経口投与に適する固形で使用することができる。
【００５５】
坐剤を製造するために、低融点ロウ、たとえば脂肪酸グリセリド又はカカオバターの混合物を先ず融解し、有効成分をこれ中に均一に攪拌によって分散する。次いで融解された均一な混合物を通常のサイズの型に注ぎ、冷却し、それによって固化する。
【００５６】
膣投与に適する製剤を、有効成分に加えて従来公知の適するキャリヤーを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレーとして製造する。
【００５７】
液剤としては、溶液、懸濁液及びエマルジョン、たとえば水又は水- プロピレングリコール溶液が挙げられる。たとえば非経口注射液剤をポリエチレングリコール水溶液中の溶液として調製することができる。
【００５８】
本発明の化合物を非経口投与（たとえば注射、たとえばボルス注射液又は連続注入による）のために調製し、そして単位投薬形でアンプル、前もって充填された注射器、少量の注入剤中に又は多様な投薬容器中に添加される保存剤と共に存在する。製剤を油状又は水性賦形剤中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとなし、調製剤、たとえば懸濁剤、安定剤及び（又は）分散剤を含有する。あるいは有効成分は、無菌固体の無菌単離によって又は使用前に適する賦形剤、たとえば発熱性物質不含無菌水を溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形であってよい。
【００５９】
経口使用に適する水溶液を、水中に有効成分を溶解し、所望に応じて適する着色剤、風味剤、安定剤及び増粘剤を加えて製造することができる。
【００６０】
経口使用に適する水性懸濁液を、微粉砕された有効成分を水中で粘性物質、たとえば天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、又は他のよく知られた懸濁液と共に懸濁化することによって製造することができる。
【００６１】
使用する少し前に、経口投与のために液状形製剤に変えられる固形製剤も挙げられる。この様な液状形として溶液、懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。これらの製剤は、有効成分に加えて、着色剤、風味剤、安定剤、緩衝物質、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等々を含有する。
【００６２】
表皮への局所投与のために、本発明の化合物を軟膏、クリーム又はローションとして又は経皮吸収パッチとして調製する。軟膏及びクリームをたとえば適する増粘剤及び（又は）ゲル化剤の添加して水性又は油性ベースを用いて調製する。ローションを水性又は油性ベースを用いて調製し、これは一般に１種又はそれ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤を含有する。
【００６３】
口中での局所投与に呈する薬剤としては風味ベース、通常ショ糖及びアカシア又はトラガント中に有効成分を含有するロゼンジ、不活性ベース、たとえばゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアカシア中に有効成分を含有するパスチル、及び適する液体キャリヤー中に有効成分を含有する洗口剤が挙げられる。
【００６４】
溶液又は懸濁液を鼻腔に通常の手段、たとえば点滴器、ピペット又はスプレーによって直接に投与する。薬剤は単一又は多様- 投薬形で供給される。
【００６５】
呼吸器官への投与はエアゾール製剤によって達成される。このエアゾール中に有効成分を適する噴射剤、たとえばクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適するガスで加圧パックして供給する。エアゾールはまた界面活性剤、たとえばレシチンを通常含有する。薬剤の投薬量は計量バルブの供給によって調節される。
【００６６】
あるいは有効成分を、乾燥粉末の形でたとえば適する粉末ベース、たとえば乳糖、でんぷん、でんぷん誘導体、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中の化合物の粉末混合物の形で供給する。通常、粉末キャリヤーは鼻腔内でゲルを形成する。粉末製剤は、単位投薬形の形で、たとえばゼラチンのカプセル又はカードリッジ、又は発泡パックの形で存在し、これから粉末を吸入器によって投与する。
【００６７】
呼吸器官への投与を意図する製剤（鼻腔製剤を含む）中で、化合物はたとえば５ミクロン又はそれ以下の大きさの小粒サイズを一般に有する。この様な粒子サイズは従来公知の方法、たとえば微粒子への細砕化によって得られる。
【００６８】
所望の場合、有効成分の遊離を維持する適した製剤を使用する。
【００６９】
薬学的調合物は、単位投薬形であるのが好ましい。この様な形で、薬剤を有効成分の適する量を含有する単位投薬形に再分割する。単位投薬形は、包装された薬剤、薬剤の別々の量を含有するパッケージ、たとえば包装された錠剤、カプセル、及び小瓶又はアンプル中の粉末であってよい。単位投薬形はまたカプセル、錠剤、カッシェ又はロゼンジそれ自体であるか又は包装された形でこれらのいずれかの適する数であってもよい。
【００７０】
経口投与用錠剤又はカプセル及び静脈内投与用液体及び連続注入剤が好ましい製剤である。
【００７１】
製剤及び投与方法に関する更に詳しい説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版中に見出される。
【００７２】
治療上有効な薬用量とは、症状又は状態を改善する有効成分のその量を意味する。治療上の有効性及び毒性、たとえばＥＤ50及びＬＤ50、は細胞培養又は実験動物において標準の薬理処理方法によって測定することができる。治療効果と毒性効果の薬用量割合は治療指標であって、比率ＬＤ50／ＥＤ50によって表わすことができる。大きい治療指標を示す薬学的調合物が好ましい。
【００７３】
投与される薬用量は、当然のことながら治療される患者の年齢、体重及び状態並びに投与経路、投薬形態及び投薬治療プログラム（regimen)、及び所望される結果に慎重に適合されねばならず、正確な薬用量は当然医師によって決定されねばならない。
【００７４】
実際の薬用量は治療される疾患の性質及び過酷さ及び投与経路に依存し、更にその量は医師の裁量にまかされており、所望の治療効果を生じるために本発明の特定の状況に薬用量を適合させることによって変化させることができる。単位投薬形あたり有効成分約０．０１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約１〜約１０ｍｇを含有する調合物が治療的処置に適当であると現在考えられている。
【００７５】
有効成分を、１日１回又は数回の薬用量で投与することができる。満足のいく結果は、ある場合、０．０１μｇ／ｋｇ（静脈内）及び０．１μｇ／ｋｇ（腹腔内）ほどの低い薬用量で得ることができる。薬用量範囲の上限は約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）であると現在見なされる。好ましい範囲は、一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及び約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）である。
【００７６】
実施例
次の例によって本発明を詳述するが、これらが請求項に記載される本発明の範囲に何らの限定を与えることを意図するものではない。
【００７７】
試験法
方法１
ＤＥＶＤａｓｅの阻害
この実験で、神経栄養活性を有する化合物（以下、化合物と略称する。）のＤＥＶＤａｓｅ（カスパーゼ−３−様プロテアーゼ）の阻害への影響を判定する。
【００７８】
細胞抽出物の製造：
ヒーラ細胞をサブコンフルエンシー(subconfluency) まで大きなペトリ皿中で増殖させる。ついで細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄する。
【００７９】
細胞ペレットを氷冷された等張溶解緩衝液(isotonic lysisbuffer)（ＳＣＡ；２０ｍＭ  ヘペス−ＫＯＨ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 ，１ｍＭ  ＤＥＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２５０ｍＭ  ショ糖、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１μｇ／ｍｌ  ロイペチン、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１００μｇ／ｍｌ  ペタ−ブロック）の同一容量に懸濁し、３０分間氷上でインキュベートし、ダウンスホモジナイザー（dounce homogenizer) の約３０ストロークによって溶解させる。
【００８０】
ついで細胞溶解物を７５０ｇで１０分間遠心分離し、その上澄みを１０、０００ｇで１０分間、ついで２０，０００ｇで３０分間遠心分離する。澄明化された上澄みを慎重に除き、−８０℃でいくつかに分割して貯蔵する。
【００８１】
ＤＥＶＤａｓｅの試験管内活性化
エンド遺伝子カスパーゼの活性化を、１ｍＭ  ｄＡＴＰ及び１μＭ  馬の心臓のサイトクロムをサイトソル抽出物（蛋白質濃度；５−１０ｍｇ／ｍｌ）にＤＥＶＤ−ＡＦＣ及び化合物（最終濃度１００μＭ）の存在下に添加して誘発する。活性化されたＤＥＶＤ’ａｓｅ( ＡＦＣ放出）を３７℃で９６−ウエルプレート中で蛍光計測法で測定する。測定の終了後、２×ＬＳＢ−メカプトエタノールを免疫ブロット分析によるカスパーゼプロセシングの評価のためのサンプルに添加する。
【００８２】
阻害率を次のように計算する：
2004520396.tif 000003
最大活性をサイトクロムｃ／ｄＡＴＰによって誘発されたＤＥＶＤａｓｅ活性（Ｖmax ）として定義し、最小活性をサイトクロムｃ／ｄＡＴＰ刺激＋０．１μＭ  ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又は１μＭ  ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（２個の公知のカスパーゼ阻害剤）によって誘発されたＤＥＶＤａｓｅ活性（Ｖmin ）として定義する。
【００８３】
実施例
次の例によって本発明を詳述するが、これらが請求項に記載される本発明の範囲に何らの限定を与えることを意図するものではない。
【００８４】
例１
本発明の化合物をＤＥＶＤａｓｅの阻害へのその影響をテストする（試験法１）。多くの化合物に対するテスト結果を以下にあげる：
2004520396.tif 000004
例２
インビトロカスパーゼ活性化系でのＤＥＶＤａｓｅの阻害はカスパーゼ−９，−３又は−７活性の直接阻害によるか又はアポトソーム(apoptosome)形成によるはずである。化合物ａ，ｆ及びｇが特定のカスパーゼ阻害剤であるかどうかをテストするために、組換えカスパーゼ−３及びカスパーゼ−９を３つの化合物と共にインキュベートし、カスパーゼの酵素活性を、カスパーゼ−３基質ＤＥＶＤ−ＡＦＣ又はカスパーゼ−９基質ＬＥＨＤ−ＡＦＣそれぞれの分解（cleavage) を分析することによって追跡する。２５〜１００μＭの濃度で３つの化合物すべては、組換えカスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性を著しく阻害することができない。これに反して０．１μＭ  ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又は１μＭ  ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（２つの公知のカスパーゼ阻害剤）は、ほとんど全体的な阻害を与える。
【００８５】
次に、本発明の化合物がインビトロモデル系でカスパーゼ及びカスパーゼ基質の処理に影響を与えることをウエスタン  ブロッティングによって分析する。カスパーゼ−９，カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７をＣｃ／ｄＡＴＰに対するｐ３５、ｐ１７、及びｐ２０活性フラグメント、それぞれに加工処理する。したがってＣｃ／ｄＡＴＰはＤＥＶＤａｓｅ活性及びカスパーゼ−３−基質の分解で３倍の誘発を誘発する。細胞抽出物を化合物ｆの存在下にＣｃ／ｄＡＴＰで刺激した場合、カスパーゼ−９，−３及び−７処理並びにＤＦＦ４５／ＩＣＡＤ及びＰＡＲＰ分解が観察される。
【００８６】
これはＤＥＶＤａｓｅ活性の薬用量−依存性阻害を伴う。カスパーゼ−９の処理は化合物ｆ  １００μＭによってほとんど完全に阻害されるが、１０μＭでさえ賦形剤コントロールと比べた場合僅かに多いプロカスパーゼ−９が未処理のまま残る。薬用量−依存性阻害は、化合物ａ及びｇでも観察された。
【００８７】
この結果は、化合物ｆがカスパーゼ−９活性化のＣｃ／ｄＡＴＰ−誘発されたカスパーゼ活性化上流を阻害することを示唆する。
【００８８】
例３
次に、化合物ｆがＣｃ／ｄＡＴＰに対するアポトソームの形成を妨げるかどうかをテストする。細胞抽出物をＣｃ／ｄＡＴＰと共にカスパーゼ−９の免疫沈降（ＩＰ）の前に１時間化合物ｆ  １００μＭ又はｚＶＡＤ−ｆｍｋ１μＭの存在又は不在下でインキュベートする。カスパーゼ−９抗体は特に細胞抽出物中に存在するすべてのカスパーゼ−９を沈降させ、そして予期されるようにＡｐａｆ−１をｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在下でさえカスパーゼ−９と共に効率的に共免疫沈降する。化合物ｆはカスパーゼ−９を沈降させるカスパーゼ−９抗体の能力に何ら影響を与えないが、Ａｐａｆ−１及びカスパーゼ−９の共免疫沈降を著しく阻害する。Ｈｓｐ９０（これはＡｐａｆ−１と結合すると提案されてきた、そしてオリゴマー化及びカスパーゼ−９補充を妨げる）はカスパーゼ−９と共免疫沈降されない。
【００８９】
例４
細胞死を阻害する化合物ｆの能力を、ＭＣＦ−ｎｅｏ及びＭＣＦ−ｃａｓｐ３細胞で調べる。ＭＣＦ−ｎｅｏ及びＭＣＦ−ｃａｓｐ３細胞双方のＴＮＦ−誘発された死をｚＶＡＤ−ｆｍｋ  ５０μＭを用いる細胞の処理によって完全に遮断する。ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、すなわちカスパーゼ−３様プロテアーゼの阻害剤はＴＮＦ  １ｎｇ／ｍｌによって誘発された細胞死を遮断し２００μＭの濃度でＴＮＦ  ５ｎｇ／ｍｌに対する著しい保護を与える。ＴＮＦ  １ｎｇ／ｍｌによってＭＣＦ−ｎｅｏ及びＭＣＦ−ｃａｓｐ３細胞中で誘発された細胞死は化合物ｆ  ５０μＭによって完全に遮断され、そしてその保護はＴＮＦ  ５ｎｇ／ｍｌで処理された後まだ著しい。細胞をＴＮＦ  １０ｎｇ／ｍｌで処理した場合、化合物ｆによる阻害はまったく観察されなかった。生きている細胞中で化合物ｆの作用メカニズムを分析するために、ＭＣＦ−ｃａｓｐ３細胞を化合物ｆ  ５０μＭの存在下にＴＮＦ（５ｎｇ／ｍｌ）で処理し、カスパーゼ−３様プロテアーゼの活性をＤＥＶＤａｓｅ酵素アッセイによって測定する。化合物ｆはＴＮＦ誘発されたＤＥＶＤａｓｅ活性を著しく減少させる。
【００９０】
最後に、化合物ｆ処理がＷＥＨＩ−Ｓフィブロサルコーマ細胞のＴＮＦ誘発されたカスパーゼ非依存性細胞死を阻害するかどうかを調べる（Foghsgaad 等、Journal of Cell Biology, Volume 153, Number 5, May 28, 2001, pp999-1009 に記載されているように）。ＴＮＦ誘発された細胞死の阻害は化合物ｆ（５０−１０μＭ）と共にインキュベートした場合、まったく観察されなかった。これは化合物ｆがカスパーゼ非依存性細胞死を阻害しないことを示唆する。
【国際公開パンフレット】
2004520396.tif 000006
2004520396.tif 000007
2004520396.tif 000008
2004520396.tif 000009
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【国際調査報告】
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