(57)【要約】本発明は、インターフェロン−α投与によりアップレギュレートされる遺伝子の同定に関し、特にジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）で指定されたｇ４５８６４５９、ｇ２３４２４７６、ｇ３３２７１６１およびｇ４５２９８８６中のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子に関する。これらの遺伝子の発現生成物の測定は、インターフェロン−αや１型インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンに対する応答性を予測するのに有用であるとされている。同じ遺伝子によりコードされるタンパク質の治療的使用も企図される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは非ヒト動物の治療で使用するための、以下を含む単離されたポリペプチド：
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列；
（ｉｉ）免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性から選択された実質的に同様の機能を有するその変種；または
（ｉｉｉ）免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性から選択された、実質的に同様の機能を保持する（ｉ）または（ｉｉ）で定義した配列の断片。
【請求項２】
ヒトまたは非ヒト動物の治療で使用するための、請求項１で定義されたポリペプチドのインビボでの発現を指令する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号７の核酸またはそのコード配列；
（ｂ）（ａ）で定義した配列に相補的な配列とハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として、（ａ）または（ｂ）で定義した配列に縮重している配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列と、少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む配列を、該配列によりコードされるポリペプチドがインビボで発現できるように含む、上記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項５】
１型インターフェロンで治療可能な疾患の治療に使用するための、請求項４に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、薬剤学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療に使用するための薬剤の調製における、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの有効量を、患者に投与することを含んでなる、１型インターフェロンで治療可能な疾患を有する患者の治療方法。
【請求項９】
１型インターフェロンによる治療に対する患者の応答性を予測する方法であって、該患者の細胞試料中の、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載の配列により定義されるタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質、およびその天然に存在する変種、または１つ以上の対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなり、該試料は、１型インターフェロンの投与後に該患者から得られるか、または該測定の前に１型インターフェロンによりインビトロでの処理される、上記方法。
【請求項１０】
試料を得る前に投与されるか、またはインビトロで該試料を処理するために使用されるインターフェロンは、治療で企図されるインターフェロンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者の血液試料から単離される末梢血単核細胞を含む試料は、１型インターフェロンでインビトロで処理される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
測定は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載の配列により定義されるタンパク質、または該タンパク質の天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトまたは非ヒト動物の治療で使用するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８で定義されるアミノ酸配列のコード配列、または該コード配列の天然に存在する変種に対するアンチセンス配列を、インビボで発現することができるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ヒトまたは動物の体の治療で使用するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）投与によりアップレギュレートされる遺伝子の同定に関する。すなわちこれらの遺伝子の発現生成物の検出は、ＩＦＮ−αや１型（Ｔｙｐｅ１）インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンに対する応答性を予測するのに有用である。同じ遺伝子によりコードされるタンパク質の治療的使用も企図される。
【０００２】
（発明の背景）
ＩＦＮ−αは、多くの疾患の治療に広く使用されている。ＩＦＮ−αを使用して治療される疾患には、新生物疾患、例えば白血病、リンパ腫、および固形腫瘍、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、およびウイルス感染症（例えば、慢性肝炎）がある。ＩＦＮ−αはまた、自己免疫疾患、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）疾患、神経変性疾患、寄生体疾患およびウイルス疾患の治療のために、口腔粘着経路による投与が提唱されている。特にＩＦＮ−αは、例えば多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、肝炎ＢとＣ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、およびＨＳＶ−１と２の治療について提唱されている。またこれは、関節炎、ループス（ｌｕｐｕｓ）および糖尿病の治療について示唆されている。新生物疾患、例えば、多発性骨髄腫、ヘアリーセル（ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ）白血病、慢性骨髄性白血病、低グレード（ｌｏｗ ｇｒａｄｅ）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド（ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）腫瘍、子宮頚癌、肉腫（例えばカポジ肉腫）、腎腫瘍、癌（腎細胞癌、肝細胞癌、上咽頭癌、血液癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、喉頭パピローマ、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、および脳腫瘍を含む）もまた、口腔粘着経路（すなわち、経口および鼻内経路）によるＩＦＮの投与により治療可能であることが示唆されている。
【０００３】
ＩＦＮ−αは、１型インターフェロンファミリーのメンバーであり、１型インターフェロン受容体との相互作用を介して、その特徴的な生物活性を示す。他の１型インターフェロンには、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、およびＩＦＮ−τがある。
【０００４】
残念ながら、インターフェロン−αのような１型インターフェロンによる治療の必ずしもすべての患者（例えば、慢性ウイルス肝炎、新生物疾患、および再発性弛緩性多発性硬化症の患者）が、１型インターフェロン療法に良好に応答せず、応答する者のうちほんの一部のみが長期的効果を示す。医師が１型インターフェロンの治療の結果を自信を持って予測できないことは、そのような治療のコスト−利益比に関して、治療の膨大な生物薬学的時間と失われた時間の無駄と、患者が受ける重大な副作用の点から、重大な問題を提起している。さらに、ＩＦＮ−αの異常産生は、多くの自己免疫疾患を引き起こすことが証明されている。これらの理由のために、１型インターフェロンは、多くの遺伝子の発現を調節して治療作用を示すため、１型インターフェロン応答性遺伝子の同定に大きな関心が寄せられている。実際、患者が治療にうまく応答するか否かを決定するのは、１型インターフェロン治療により誘導される遺伝子発現の特異的パターンである。
【０００５】
（発明の要約）
ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）で割り当てられた受け入れ番号ｇ４５８６４５９、ｇ２３４２４７６、ｇ３３２７１６１およびｇ４５２９８８６中のｃＤＮＡ配列に対応するヒト遺伝子は、口腔粘着経路または静脈内投与によるＩＦＮ−αの投与によりアップレギュレートされるマウス遺伝子に対応することが証明されている。従ってこれらのヒト遺伝子は、ＩＦＮ−αアップレギュレート性遺伝子とも呼ばれる。
【０００６】
ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｃＤＮＡであるｇ４５８６４５９、ｇ２３４２４７６、ｇ３３２７１６１およびｇ４５２９８８６に対応するタンパク質は、割り当てられた機能はなかった。これらのタンパク質（それぞれＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３およびＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質と呼ばれる）およびその機能性変種は、治療薬、特に抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤としての使用が企図される。例えばこれらは、自己免疫疾患、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）疾患、神経変性疾患、寄生体疾患またはウイルス疾患、関節炎、糖尿病、ループス、多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、肝炎ＢまたはＣ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１または２、または新生物疾患例えば、多発性骨髄腫、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、低グレードリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、肉腫（カポジ肉腫を含む）、腎腫瘍、癌（腎細胞癌、肝細胞癌、上咽頭癌、血液癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、喉頭パピローマ、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、または脳腫瘍を含む）の治療にも使用される。すなわち、このようなタンパク質は、１型インターフェロンで治療可能な疾患を治療するのに使用できるかも知れない。
【０００７】
例えば口腔粘着経路または静脈内経路で、１型インターフェロンで治療される患者（例えば、ＩＦＮ−αで治療される患者）の細胞試料中のＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質またはその天然に存在する変種、または対応するｍＲＮＡのレベルの測定もまた、そのような治療に対する応答性を予測するのに使用できる。さらに、このような応答性は、代替的におよびより好ましくは、例えばヒト末梢血単核細胞の試料をインビトロで１型インターフェロンで処理し、同じ遺伝子に対応する発現生成物（好ましくはｍＲＮＡ）のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを探すことにより、判定されることがわかった。
【０００８】
本発明の第１の面において、ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するための、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための：
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列；
（ｉｉ）実質的に同様の機能（例えば、免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性）を有するその変種；または
（ｉｉｉ）実質的に同様の機能（例えば、免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性）を保持する（ｉ）または（ｉｉ）の断片
を含む、単離されたポリペプチドが提供される。上記したように、このような使用は、１型インターフェロンで治療可能な疾患を包含する。
【０００９】
本発明の別の面において、ヒトまたは非ヒト動物の治療のための、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための、上記で定義したポリペプチドのインビボ発現を指令する、例えば発現ベクターの形の単離されたポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドは、典型的には：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の核酸またはそのコード配列；
（ｂ）例えば厳密性条件下で、（ａ）で定義した配列に相補的な配列とハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として、（ａ）または（ｂ）で定義した配列に縮重している配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列と、少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む配列を、該配列によりコードされるポリペプチドがインビボで発現できるように、含む。
【００１０】
さらなる面において本発明は、１型インターフェロンによる治療、例えばＩＦＮ−α治療（例えば、口腔粘着経路または非経口経路、例えば静脈内、皮下または筋肉内経路によるＩＦＮ−α治療）に対する患者の応答性を予測する方法であって、該患者の細胞試料、例えば血液試料中の、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載の配列により定義されるタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質、およびその天然に存在する変種（例えばアレレ変種）、または１つ以上の対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなり、該試料は、１型インターフェロンの投与（例えば、口腔粘着経路または静脈内投与によるＩＦＮ−α）後に該患者から得られるか、または該測定の前に１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）によりインビトロで処理される、上記方法を提供する。そのような測定は、その発現が、１型インターフェロン投与（例えばＩＦＮ−α投与）によりヒト細胞中で影響を受けることが知られている、任意の他のタンパク質またはｍＲＮＡの測定と組合せられる。
【００１１】
本発明はまた、以下を提供する：
−  上記で定義したように、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載のアミノ酸配列により定義されるタンパク質、またはその機能性変種と、薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む医薬組成物；
−  １型インターフェロンで治療可能な疾患を有する被験体を治療する方法であって、該患者にそのようなタンパク質の有効量を投与することを含む方法；
−  抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療で使用するための、さらに詳しくは１型インターフェロンで治療可能な疾患の治療で使用するための、薬剤の製造における、そのようなタンパク質の使用；
−  上記で定義されるポリヌクレオチドと薬剤学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物；
−  １型インターフェロンで治療可能な疾患を有する被験体の治療法であって、そのようなポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することを含む方法；
−  抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療で使用するための、さらに詳しくは１型インターフェロンで治療可能な疾患の治療で使用するための、薬剤（例えば、ベクター調製物）の製造における、そのようなポリヌクレオチドの使用；
−  ヒトおよび非ヒト動物の治療で使用するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８により定義されるアミノ酸配列のコード配列、または該コード配列の天然に存在する変種に対する、アンチセンス配列をインビボで発現することができるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを薬剤学的に許容される担体または希釈剤とともに含む医薬組成物；
−  ヒトまたは動物の体の治療で使用するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に記載のアミノ酸配列により定義されるタンパク質に対する抗体、および対応する医薬組成物。
【００１２】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトのタンパク質ＨｕＩＦＲＧ−１のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡである。
配列番号２は、ＨｕＩＦＲＧ−１タンパク質のアミノ酸配列単独である。
配列番号３は、ヒトのタンパク質ＨｕＩＦＲＧ−２のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡである。
配列番号４は、ＨｕＩＦＲＧ−２タンパク質のアミノ酸配列単独である。
配列番号５は、ヒトのタンパク質ＨｕＩＦＲＧ−３のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡである。
配列番号６は、ＨｕＩＦＲＧ−３タンパク質のアミノ酸配列単独である。
配列番号７は、ヒトのタンパク質ＨｕＩＦＲＧ−４のアミノ酸配列とそれをコードするｃＤＮＡである。
配列番号８は、ＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質のアミノ酸配列単独である。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
上記したように、ヒトタンパク質ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４およびその機能性変種は、治療上有効な物質、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤と企図される。
【００１４】
この目的のためのＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の変種は、天然に存在する変種であり、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質と実質的に同じ機能活性を有し、かつＩＦＮ−αの投与（例えば、ＩＦＮ−αの口腔粘着経路または静脈内投与）に応答してアップレギュレートされる、天然に存在する変種（アレレ変種もしくは種変種）でもよい。あるいは、治療用途のＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の変種は、配列番号２とは異なるヒトではない突然変異体である配列を含有してもよい。
【００１５】
「機能性変種」という用語は、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の同じ基本的な性質または基礎的機能を有するポリペプチドを意味する。ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の基本的な性質は、免疫調節ポリペプチドであると考えられる。機能性変種ポリペプチドは、追加のまたは代替の抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を示すかも知れない。
【００１６】
所望の抗ウイルス活性は、例えば以下のように試験される。試験される変種をコードする配列は、ウイルスパッケージングシグナルψおよび薬剤耐性マーカーを含有するモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）から得られるレトロウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター中にクローン化される。ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する向汎性パッケージング細胞株は、次に組換えレトロウイルスベクターおよびプラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する）で同時トランスフェクトして、高力価感染性複製−無能力ウイルスを産生する（バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ５２３２−５２３６）。次に感染性組換えウイルスを使用して、インターフェロン感受性繊維芽細胞またはリンパ芽球細胞をトランスフェクトして、次に変種タンパク質を安定に発現する細胞株を選択し、標準的インターフェロン生物測定法でウイルス感染に対する耐性について試験する（トベイ（Ｔｏｖｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ２７１， ６２２−６２５， １９７８）。標準的増殖測定法（モスマン・ティー（Ｍｏｓｓｍａｎｎ， Ｔ．）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６５， ５５−６３， １９８３）を使用する増殖阻害、および標準法を使用するＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原の発現も測定される。
【００１７】
ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の所望の機能性変種は、基本的に配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の配列からなってよい。配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の機能性変種は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列と、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも１００個の連続的アミノ酸、または全長にわたって、少なくとも６０％〜７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％〜少なくとも９０％、および特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％のインサートを有するポリペプチドでもよい。タンパク質の同一性を測定する方法は、当該分野で公知である。
【００１８】
アミノ酸置換は、例えば１、２または３から１０、２０または３０個の置換でもよい。保存的置換は、例えば以下の表に従って作成される。第２欄の同じブロック内のおよび好ましくは第３欄の同じ行のアミノ酸は、互いに置換可能である。
【００１９】
2004500821.tif 000002
【００２０】
本発明の治療で使用される変種ポリペプチド配列は、より短いポリペプチド配列でもよく、例えば少なくとも２０アミノ酸または最大５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００アミノ酸の長さのペプチドは、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質の適切な生物活性を保持するなら、本発明の範囲内にあると考えられる。特に（しかし、排他的ではない）、本発明のこの面は、変種が完全な天然に存在するタンパク質配列の断片である時を包含する。
【００２１】
本発明の治療的用途の変種ポリペプチドは、化学的に修飾、例えば翻訳後に修飾されてよい。例えば、これらは、グリコシル化されるかおよび／または修飾アミノ酸残基を含有してもよい。これらはまた、Ｎ末端および／またはＣ末端で配列の付加により修飾されてよい。本発明の治療的用途のポリペプチドは、合成法または組換え法で作成される。そのようなポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸）を含むように修飾してもよい。本発明で使用するための変種ポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボでの安定性を上昇させるような修飾を有してもよい。ポリペプチドが合成法で産生される時、そのような修飾は、産生中に導入される。ポリペプチドはまた、合成または組換え産生により修飾してもよい。
【００２２】
タンパク質修飾の分野で多くの側鎖修飾が公知であり、本発明の治療的用途の変種中に存在してもよい。そのような修飾には、例えば、アルデヒドとの反応による還元アルキル化と次のＮａＢＨ４による還元、メチルアセトイミデートによるアミド化、または無水酢酸によるアシル化による、アミノ酸の修飾を含む。
【００２３】
本発明で使用されるポリペプチドは、実質的に単離された型である。ポリペプチドは、ポリペプチドの目的を妨害しない担体または希釈剤と混合されることもあり、この場合も実質的に単離されていると見なされることは、理解されるであろう。
【００２４】
ポリヌクレオチド療法
上記のＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質、またはその機能性変種の投与の代替法として、単離したポリヌクレオチドが、例えば発現ベクター（例えばウイルスベクター）の形で、投与され、これは、所望のポリペプチドのインビボでの発現を指令する。従って上記したように、さらなる実施態様において本発明は、単離したポリペプチドを提供し、これは、上記のポリペプチドのインビボでの発現を指令し、このポリヌクレオチドは、ヒトまたは非ヒト動物の治療で使用するための、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号７の核酸、またはそのコード配列；
（ｂ）例えば厳密性条件下で、（ａ）で定義した配列に相補的配列となハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として、（ａ）または（ｂ）で定義した配列に縮重している配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列と、少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む配列を含む。
【００２５】
好ましくはそのようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質のコード配列またはその変種は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配列により提供される。適切なコード配列を含むポリヌクレオチドは、ヒト細胞または合成により、当該分野で公知の方法に従って、例えばサムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）、モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載のように、単離することができる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、その中に合成または修飾ヌクレオチドを含有してもよい。ポリヌクレオチドへの多くの異なる型の修飾が当該分野で公知である。それらには、メチルホスフォネートおよびホスホチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端のアクリジンまたはポリリジン鎖の付加がある。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性の上昇または寿命の延長のために行われる。
【００２７】
典型的には、本発明で使用されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの配列を含有し、これは好ましくは、ヌクレオチドの連続的配列であり、これは、選択的条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のコード配列の相補体にハイブリダイズすることができる。そのようなハイブリダイゼーションは、バックグランドより有意に高いレベルで起きる。バックグランドハイブリダイゼーションは、例えばｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡのために起きる。所望のコード配列と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のコード配列の相補体との相互作用により生成されるシグナルレベルは、典型的には他のポリヌクレオチドと標的配列との間の相互作用の強さと、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えばプローブ結合のために選択される核酸を３２Ｐで放射能標識することにより測定される。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には低厳密性（約４０℃で０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中厳密性（例えば、約５０℃で０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、または高厳密性（約６０℃で０．０３Ｍ塩化ナトリウムと０．００３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を使用して行われる。
【００２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のコード配列は、上記したようにヌクレオチド置換により、例えば１、２または３から１０、２５、５０または１００個の置換により、ポリヌクレオチド中に取り込まれて修飾される。例えば縮重置換が行われるか、および／または、例えば上記したように修飾配列が翻訳されると、保存的アミノ酸置換が起きる。配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のコード配列は、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質と比較して適切な機能活性を有するポリペプチドをコードするなら、代替的にまたは追加的に、１つ以上の挿入および／または欠失および／または伸長により、一端または両端で修飾されてよい。
【００２９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７の相補体に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、または少なくともそのコード配列は、そのようなＤＮＡ配列に一般的に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、およびさらに好ましくは少なくとも９５％または９７％相同的である。相同性は典型的には、該ＤＮＡ配列の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０、または１００またはそれ以上の連続的ヌクレオチドの領域にわたる。
【００３０】
上記程度の相同性と最小サイズの任意の組合せは、所望のコード配列を含む核酸を定義するのに使用され、より厳密な組合せ（すなわち、より長い領域にわたってより高い相同性）が好ましい。すなわち例えば、２５好ましくは３０ヌクレオチドにわたって少なくとも８０％相同的なポリヌクレオチドが適しており、４０ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％相同的なポリヌクレオチドが適している。
【００３１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の同族体は、相同性計算の固定の手段によって決定され、例えばタンパク質相同性は、アミノ酸同一性（時に「ハード（ｈａｒｄ）相同性」と呼ばれる）に基づき計算される。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するのに使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ３８７−３９５）。例えばアルツチュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．）（１９９３） Ｊｏ． Ｍｏ． Ｅｖｏｌ． ３６； ２９０−３００；アルツチュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．）ら （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５；４０３−１０に記載のように、相同性またはラインアップ配列を計算するのにまたは同等のまたは対応する配列を計算するのに、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを、そのデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）設定に基づき使用することができる。
【００３２】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの単語と並べた時、ある正の閾値スコアＴに一致するかまたは満足する問題の配列中の長さＷの短い単語を同定することにより、まず高スコア配列対（ＨＳＰｓ）を同定する。Ｔは、近隣単語スコア閾値と呼ばれる（アルツチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、前述）。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含むＨＳＰ＝ｓを見つける検索を開始するための元になる。単語ヒットは、累積整列スコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向の単語ヒットは、以下の時停止する：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下した時；１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ以下になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルト値として、単語長さ（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １０９１５−１０９１９）整列（Ｂ）が５０、予測（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００３３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計解析を行う；例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルツチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最も小さい和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然起きる確率を示す。例えば第１の配列と第２の配列との比較における最も小さい和確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満なら、その配列は別の配列と同様であると見なされる。
【００３４】
上記したように、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質またはその機能性変種の直接投与の代わりに本発明で使用されるポリヌクレオチドは、好ましくは発現ベクターの形である。発現ベクターは、分子生物学の分野で一般的な方法に従って構築され、例えばプラスミドＤＮＡの使用を含み、特定のイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素（例えば、必要であり、かつ正しい配向で位置しているポリアデニル化シグナル）を含有して、タンパク質発現を可能にする。そのようなベクターは、ウイルスベクターでもよい。適当なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクター、複製欠損レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＰＶウイルス（例えば、ＨＰＶ−１６とＨＶＰ−１８）および弱毒化インフルエンザウイルスベクターがある。他の適当なベクターは、当業者に公知である。この点でさらなる例として、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら１９８９（前述）を再度参照されたい。
【００３５】
ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するための配列番号２で定義されるアミノ酸配列のコード配列に対するアンチセンス配列をインビボで発現することができるポリヌクレオチド、またはその天然に存在する変種もまた、本発明の追加の面を構成すると考えられる。再度、そのようなポリヌクレオチドは、好ましくは発現ベクターの形である。そのようなポリヌクレオチドは、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質のアップレギュレーションに関連する疾患の治療で使用されるであろう。
【００３６】
ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質に対する抗体およびその抗原結合断片が、同様の用途を有することは理解されるであろう。
【００３７】
医薬組成物
本発明のポリペプチドは典型的には、薬剤学的に許容される担体または希釈剤とともに投与するように製剤化される。この薬剤学的に許容される担体または希釈剤は、例えば等張溶液でもよい。例えば固体経口剤は、活性化合物とともに、希釈剤、例えば乳糖、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチまたはジャガイモデンプン；滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはナトリウムデンプングリコレート；発泡剤；色素；甘味剤；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；および一般的に、製剤で使用される非毒性かつ薬学的不活性な物質を含有してもよい。そのような医薬調製物は、公知の方法で製造され、例えば混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルムコーティングプロセスで製造される。
【００３８】
経口投与用の液体分散剤は、シロップ剤、乳剤および懸濁剤でもよい。シロップ剤は、担体として、例えばサッカロース、またはグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールとともにサッカロースを含有してもよい。
【００３９】
懸濁剤と乳剤は、担体として例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射のための懸濁剤または溶液剤は、活性化合物とともに、薬剤学的に許容される担体、例えば無菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および所望であれば、適切な量の塩酸リドカインを含有してもよい。
【００４０】
静脈内注射または点滴用の溶液は、担体として例えば無菌水を含有してもよく、または好ましくはこれらは、無菌、水性、等張の食塩水の形でもよい。
【００４１】
本発明で使用されるポリペプチドの用量は、種々のパラメータ、特に使用される物質；治療される患者の年齢、体重および症状；投与経路；および必要な処方によって決定される。医師が特定の患者の必要な投与経路や用量を決定するであろう。典型的な１日当たりの用量は、特異的活性化合物の活性、治療される被験体の年齢、体重および症状、および投与の頻度と経路に従って、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは１日当たりの用量レベルは、５ｍｇ〜２ｇである。
【００４２】
本発明で使用されるポリヌクレオチドはまた、典型的には薬剤学的に許容される担体または希釈剤と共に投与するために製剤化されるであろう。そのようなポリヌクレオチドは、インビボで所望のポリペプチドの発現が達成される任意の公知の方法により投与される。例えばポリヌクレオチドは、皮内、皮下または筋肉内に投与される。あるいはポリヌクレオチドを、皮膚を通して粒子介在送達装置を使用して投与してもよい。本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、鼻内または経口投与により、投与される。
【００４３】
本発明で使用される非ウイルスベクターは、リポソームまたは界面活性剤中にパッケージングされる。本発明で使用される核酸構築体の取り込みは、いくつかのトランスフェクション法（例えばトランスフェクション物質の使用を含むもの）により増強される。これらの物質の例には、陽イオン性物質、例えばリン酸カルシウム、およびＤＥＡＥデキストラン、リポフェクタント（例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタム）がある。投与される核酸の用量は変化してもよい。典型的には核酸は、１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは粒子介在遺伝子送達には１ｐｇ〜１０μｇ核酸、そして他の経路には１０μｇ〜１ｍｇの範囲で投与されるであろう。
【００４４】
１型インターフェロン応答性の予測
また前記したように、さらに別の面において本発明は、１型インターフェロンによる治療（例えば、口腔粘膜経路または静脈内経路によるＩＦＮ−α治療のようなＩＦＮ−α治療）に対する患者の応答性を予測する方法であって、患者の細胞試料中の１つ以上のＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３、ＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質またはその天然に存在する変種、１つ以上の対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなり、該試料は、１型インターフェロンが投与された後に該患者から得られるか、または該測定前に１型インターフェロンでインビトロで処理される、上記方法を提供する。
【００４５】
好ましくは、応答性を試験するための１型インターフェロンは、治療用に選択された１型インターフェロンであろう。これは、提唱された治療経路および提唱された治療用量で投与される。好ましくは、以後の分析される試料は、例えば血液試料または血液試料から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の試料である。
【００４６】
より便利で好ましくは、血液から単離したＰＢＭＣｓを含む患者から得られた試料を、インビトロで１型インターフェロン（例えば、約１〜１０，０００ＩＵ／ｍｌの用量範囲）で処理する。そのような処理は、数時間（例えば、約７〜８時間）の長さである。そのようなインビトロ試験の好適な処理条件は、正常ドナーから取ったＰＢＭＣｓを同じインターフェロンで試験し、適切な発現生成物のアップレギュレーションを調べることにより決定される。再度、使用される１型インターフェロンは、好ましくは患者の治療に提唱された１型インターフェロン（例えば、組換えＩＦＮ−α）である。そのような試験のＰＢＭＣｓは、従来法で血液試料からフィコール−ヒペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配を使用して単離される。１型インターフェロン応答性のそのようなインビトロ試験の適切なプロトコールの例を、以下の例６に示す。
【００４７】
試料は、１型インターフェロンによるインビトロ処理の後に、適宜ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質またはその天然に存在する変種のレベルについて分析される。これは、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質およびその天然に存在する変種（例えば、そのアレレ変種）の１つ以上に特異的に結合することができる１つまたは複数の抗体を使用して行われる。しかし好ましくは試料は、ＨｕＩＦＲＧ−１、ＨｕＩＦＲＧ−２、ＨｕＩＦＲＧ−３またはＨｕＩＦＲＧ−４タンパク質またはその天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡについて分析される。そのようなｍＲＮＡ分析は、ｍＲＮＡの検出について公知の任意の方法（例えば、ノーザンブロット検出またはｍＲＮＡ差別ディスプレイ）を使用する。検出前に、試料中に存在する目的のｍＲＮＡまたはその一部を増幅するのに、種々の公知の核酸増幅プロトコールが使用できる。目的のｍＲＮＡまたは対応する増幅核酸は、固体支持体に結合した核酸プローブを使用して、プローブ結合してもよい。そのような固体支持体は、１型インターフェロンでアップレギュレートされた遺伝子（例えばＩＦＮ−αの口腔粘膜または静脈内投与に応答してアップレギュレートされたとして同定された遺伝子）に対応する、さらなるｍＲＮＡまたはその増幅生成物のレベルを測定するためのプローブを有する前記のミクロアレイでもよい。そのようなミクロアレイ（一般に、核酸、プローブまたはＤＮＡチップとも呼ぶ）を構築する方法は、公知である（例えば、アフィマックス・テクノロジーズ・エヌ・ブイ（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）とのＥＰ−Ｂ０４７６０１４号および０６１９３２１号と、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 増刊、１９９９年、標題「チッピング予測（Ｃｈｉｐｐｉｎｇ Ｆｏｒｅｃａｓｔ）」を参照されたい）。
【００４８】
以下の例は本発明を例示する。
【００４９】
例
例１
正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して、５μｌのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は、同じ方法で適用された１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。
【００５０】
６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュート社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）から購入した１０μｇの組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）によりリンパ組織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー（Ｌａｎｇ． Ｐ．）とパルディー・エー・ビー（Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−９７１）。
【００５１】
差別ディスプレイ分析
差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の「メッセージクリーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｃｌｅａｎ）」と「ＲＮＡイメージ（ＲＮＡ ｉｍａｇｅ）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮＡａｓｅで処理し、１μｇを、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのいずれかを使用して、１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべて試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する１０μｌのアンピシリン混合物中のわずかに１μｌのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞれと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダイズするプローブとしてさらに使用した。
【００５２】
クローニングと配列決定
差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｆｒ１部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴＡクローニングにより単離した。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。
【００５３】
ヒトｃＤＮＡの同定
差別ディスプレイスクリーニングから同定された差別的に発現されたマウス３’配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに使用した。
【００５４】
そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｃＤＮＡ配列ｇ４５８６４５９に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列ｇ４５８６４６０であり、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のどの機能にも割り当てられなかった。
【００５５】
上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に対応してリンパ組織中でアップレギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答してマウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの静脈内投与を以下の例５に記載のように行うと、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ｇ４５８６４５９により同定されるヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子について、同様の結果が予測される。
【００５６】
さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレートされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することがわかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例６に記載のようにＩＦＮ−αで処理すると、配列番号１に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果が予測される。
【００５７】
例２
正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して、５μｌのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は、同じ方法で適用された１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。
【００５８】
６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュート社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）から購入した１０μｇの組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）によりリンパ組織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー（Ｌａｎｇ． Ｐ．）とパルディー・エー・ビー（Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−９７１）。
【００５９】
差別ディスプレイ分析
差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の「メッセージクリーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｃｌｅａｎ）」と「ＲＮＡイメージ（ＲＮＡ ｉｍａｇｅ）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮＡａｓｅで処理し、１μｇを、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのいずれかを使用して、１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべて試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する１０μｌのアンピシリン混合物中のわずかに１μｌのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞれと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダイズするプローブとしてさらに使用した。
【００６０】
クローニングと配列決定
差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｆｒ１部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴＡクローニングにより単離した。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。
【００６１】
ヒトｃＤＮＡの同定
差別ディスプレイスクリーニングから同定された差別的に発現されたマウス３’配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに使用した。
【００６２】
そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｃＤＮＡ配列ｇ２３４２４７６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列ｇ２３４２４７７であり、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のどの機能にも割り当てられなかった。
【００６３】
上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に対応してリンパ組織中でアップレギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答してマウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの静脈内投与を以下の例５に記載のように行うと、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ｇ２３４２４７６により同定されるヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子について、同様の結果が予測される。
【００６４】
さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレートされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することがわかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例６に記載のようにＩＦＮ−αで処理すると、配列番号３に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果が予測される。
【００６５】
例３
正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して、５μｌのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は、同じ方法で適用された１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。
【００６６】
６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュート社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）から購入した１０μｇの組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）によりリンパ組織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー（Ｌａｎｇ． Ｐ．）とパルディー・エー・ビー（Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−９７１）。
【００６７】
差別ディスプレイ分析
差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の「メッセージクリーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｃｌｅａｎ）」と「ＲＮＡイメージ（ＲＮＡ ｉｍａｇｅ）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮＡａｓｅで処理し、１μｇを、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのいずれかを使用して、１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべて試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する１０μｌのアンピシリン混合物中のわずかに１μｌのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞれと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダイズするプローブとしてさらに使用した。
【００６８】
クローニングと配列決定
差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｆｒ１部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴＡクローニングにより単離した。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。
【００６９】
ヒトｃＤＮＡの同定
差別ディスプレイスクリーニングから同定された差別的に発現されたマウス３’配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに使用した。
【００７０】
そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｃＤＮＡ配列ｇ３３２７１６１に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列ｇ３３２７１６２であり、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のどの機能にも割り当てられなかった。
【００７１】
上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に対応してリンパ組織中でアップレギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答してマウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの静脈内投与を以下の例５に記載のように行うと、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ｇ３３２７１６１により同定されるヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子について、同様の結果が予測される。
【００７２】
さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレートされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することがわかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例６に記載のようにＩＦＮ−αで処理すると、配列番号５に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果が予測される。
【００７３】
例４
正常な成体マウスの各鼻孔に、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して、５μｌのクリスタルバイオレットを適用すると、ほとんど直後に口咽頭腔の全表面にわたって色素が分布することが、以前の実験で証明されている。口咽頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は、同じ方法で適用された１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。
【００７４】
６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュート社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）から購入した１０μｇの組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）によりリンパ組織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー（Ｌａｎｇ． Ｐ．）とパルディー・エー・ビー（Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７−９７１）。
【００７５】
差別ディスプレイ分析
差別ディスプレイ分析は、ゲンフンター・コーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の「メッセージクリーン（Ｍｅｓｓａｇｅ Ｃｌｅａｎ）」と「ＲＮＡイメージ（ＲＮＡ ｉｍａｇｅ）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡単に説明すると、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮＡａｓｅで処理し、１μｇを、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのいずれかを使用して、１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべて試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する１０μｌのアンピシリン混合物中のわずかに１μｌのみの逆転写試料を用いて、増幅を行った。８０の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞれと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、オートラジオグラフィーに暴露した。推定の差別的に発現されたバンドを切り取り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダイズするプローブとしてさらに使用した。
【００７６】
クローニングと配列決定
差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｆｒ１部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴＡクローニングにより単離した。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）を使用して、ＤＮＡを配列決定した。
【００７７】
ヒトｃＤＮＡの同定
差別ディスプレイスクリーニングから同定された差別的に発現されたマウス３’配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムなヒトの発現配列標識物（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに使用した。
【００７８】
そのようなｃＤＮＡの１つは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｃＤＮＡ配列ｇ４５２９８８６に対応することがわかった。対応するポリペプチド配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列ｇ４５２９８８８であり、、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のどの機能にも割り当てられなかった。
【００７９】
上記したようにＩＦＮ−αの口腔粘着投与に対応してリンパ組織中でアップレギュレートされた他のマウス遺伝子もまた、ＩＦＮ−αの静脈内投与に応答してマウスの脾臓中でアップレギュレートされることがわかっている。ＩＦＮ−αの静脈内投与を以下の例５に記載のように行うと、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ｇ４５２９８８６により同定されるヒト遺伝子に対応するマウス遺伝子について、同様の結果が予測される。
【００８０】
さらに、ＩＦＮ−αの口腔粘着および静脈内投与に応答してアップレギュレートされることがわかったマウス遺伝子のヒト遺伝子類似体に対応するｍＲＮＡは、ＩＦＮ−αのインビトロの処理後にヒトの末梢血単核細胞中で増加することがわかっている。ヒト末梢血単核細胞を以下の例６に記載のようにＩＦＮ−αで処理すると、配列番号７に示すｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡについて、同じ結果が予測される。
【００８１】
例５
ＩＦＮ−αの静脈内投与
オスのＤＢＡ／２マウスに、２００μｌのＰＢＳ中のライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスＩＦＮαを静脈内注射したか、または等量のＰＢＳのみで処理した。８時間後、頚部脱臼により動物を屠殺し、通常の方法で脾臓を取り出した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）により総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μｇの総ＲＮＡを、グリオキサールの存在下でノーザンブロッティングを行い、ダンドイ−ドロン（Ｄａｎｄｏｙ−Ｄｒｏｎ）ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９８） ２７３， ７６９１−７６９７）が記載したように、目的のｍＲＮＡについてｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをまず、オートラジオグラフィーに暴露し、次にホスホルマージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒ）を使用して製造業者の説明書に従って定量した。
【００８２】
例６
１型インターフェロン応答性のインビトロの試験
正常ドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ヒペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配を使用して単離し、ＰＢＳ中１０，０００ＩＵの組換えヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウ（Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）からのイントロンＡ）または等量のＰＢＳのみでインビトロ処理した。８時間後、細胞を遠心分離（８００×ｇで１０分）し、細胞ペレットを回収した。上記例５に記載のように、チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法により細胞ペレットから総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μｇの総ＲＮＡを、ノーザンブロッティングを行った。
【００８３】
同じ操作を使用して、１型インターフェロンで治療する予定の患者から取ったＰＢＭＣを使用して、１型インターフェロン応答性を予測することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500821.tif 000057
2004500821.tif 000058
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