(57)【要約】本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の種々のエキソンに対応する核酸、および新規な全長のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードするｃＤＮＡに関する。本発明はまた、一般的な多型の検出のための手段、および特にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子、またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の対立遺伝子形態により産生される対応するタンパク質における突然変異の検出のための手段に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも８つ連続したヌクレオチドを含む単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８０％同一のヌクレオチドを含む単離された核酸。
【請求項４】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、８５％、９０％、９５％、または９８％同一のヌクレオチドを含む請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１〜４および９〜１２６のいずれ１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つに特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項８】
配列番号１２７〜１４４のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ５遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項９】
配列番号１４７〜１７２のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ６遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１０】
配列番号１７３〜２０３のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ９遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１１】
配列番号２０４〜２１７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、ＡＢＣＡ１０遺伝子に特異的なヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１２】
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、第１のヌクレオチドプライマーが核酸の５′位の領域にハイブリダイズし、そして第２のヌクレオチドプライマーが核酸の３′位の領域にハイブリダイズする２つのヌクレオチドプライマーと核酸を接触させ、そして
ｂ）この増幅された核酸領域を検出する工程、
を含む請求項１に記載の核酸領域を増幅する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載される核酸領域を増幅する方法であって、ここで２つのヌクレオチドプライマーが、
ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマー、
ｂ）請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドプライマー、
ｃ）配列番号１２７〜２１７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的配列を有する核酸を含むヌクレオチドプライマー、
からなる群より選択される、上記の方法。
【請求項１４】
ａ）ハイブリダイゼーション位置が、核酸の領域のそれぞれ５′および３′に位置する２つのヌクレオチドプライマー；および必要に応じて、
ｂ）増幅反応に必要な試薬、
を含む請求項１に記載の核酸を増幅するためのキット。
【請求項１５】
２つのヌクレオチドプライマーが、
ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマー、
ｂ）請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドプライマー、
ｃ）配列番号１２７〜２１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列またはその相補的配列を有する核酸を含むヌクレオチドプライマー、
からなる群より選択される請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
マーカー化合物を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドプローブまたはプライマー。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸を検出する方法であって、
ａ）以下の群：
１）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブ、
２）請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドプローブ、
３）配列番号１２７〜２１７のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプローブ
より選択されるヌクレオチドプローブと、核酸を接触させ、
ｂ）核酸とプローブとの間で形成される複合体を検出する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項１８】
プローブが支持体上に固定される、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の核酸を検出するキットであって、
ａ）以下からなる群より選択されるヌクレオチドプローブ：
１）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブ、
２）請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヌクレオチドプローブ、
３）配列番号１２７〜２１７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプローブ、および必要に応じて
ｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬、
を含む、キット。
【請求項２０】
プローブが支持体上に固定される請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
請求項１に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項２２】
アデノウイルスである請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２６に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２９】
ａ）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、および
ｃ）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに相同なポリペプチド、
からなる群より選択される単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２９に記載の単離されたポリペプチドに対して向けられる抗体。
【請求項３１】
抗体が検出可能な化合物を含む請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
ａ）請求項３１に記載の抗体とポリペプチドを接触させ、そして
ｂ）ポリペプチドと抗体との間で形成される抗原／抗体複合体を検出する工程、を含む、ポリペプチドを検出する方法。
【請求項３３】
ａ）請求項３１に記載の抗体、および
ｂ）ポリペプチドと抗体との間に形成される抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、
を含む、ポリペプチドを検出するための診断キット。
【請求項３４】
請求項１に記載の核酸および生理学的に適合性を有する添加剤を含有する医薬組成物。
【請求項３５】
請求項２１に記載の組換えベクターおよび生理学的に適合性を有する添加剤を含有する医薬組成物。
【請求項３６】
コレステロールの逆輸送における機能不全に罹患した被験者の予防および／または治療のために意図された医薬の製造のための請求項１に記載の核酸の使用。
【請求項３７】
親油性物質輸送における機能不全に罹患した被験者の予防および／または治療に対する医薬の製造のための請求項２１に記載の組換えベクターの使用。
【請求項３８】
親油性物質輸送における機能不全に罹患した被験者の予防および／または治療のために意図された医薬の製造のための、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含む単離されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの使用。
【請求項３９】
配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列および生理学的に適合性を有する賦形剤を含むポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項４０】
親油性物質輸送における機能不全から生じる疾患の予防または治療に活性な成分をスクリーニングするため、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む単離されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの使用。
【請求項４１】
親油性物質輸送における機能不全から生じる疾患の予防または治療に活性な成分をスクリーニングするための、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを発現する組換え宿主細胞の使用。
【請求項４２】
コレステロール代謝に活性な化合物、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
ａ）ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの少なくとも１つおよび検出可能なマーカーを含む脂質基質を含む膜小胞を調製し、
ｂ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ａ）で得られた小胞をインキュベートし、
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出を定性的および／または定量的に測定し、
ｄ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に予めインキュベートされていなかった膜小胞による標識された脂質基質の放出の測定値と、工程ｂ）で測定された脂質基質の放出を比較する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項４３】
コレステロール代謝に活性な化合物、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
ａ）検出可能なマーカーで標識されたアニオンと共に、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの少なくとも１つを発現する細胞をインキュベートし、
ｂ）細胞に浸透していない過剰な標識されたアニオンを取り除くために工程ａ）の細胞を洗浄し、
ｃ）工程ｂ）で得られた細胞を、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つについてのアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共にインキュベートし、
ｄ）細胞からの標識されたアニオンの流出を測定し、そして
ｅ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と予めインキュベートしていない細胞により測定された標識されたアニオンの流出と、工程ｄ）で測定された標識されたアニオンの流出を比較する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項４４】
請求項２３に記載の組換え宿主細胞を含む移植片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子に対応する新規な核酸、ならびに新規なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードするｃＤＮＡに関する。本発明はまた、一般に多型、ならびに特にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子の対立遺伝子型により産生される対応するタンパク質における突然変異の検出手段に関する。
【０００２】
ＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット輸送体）遺伝子スーパーファミリーは、活性な輸送体タンパク質をコードし、そしてバクテリアからヒトへの進化の間に極めてよく保存されたタンパク質のファミリーを構成する（Ａｍｅｓ および Ｌｅｃａｒ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １９９２，６，２６６０−２６６６）。ＡＢＣタンパク質は、さまざまな基質（例えばイオン、アミノ酸、ペプチド、糖、ビタミンまたはステロイドホルモン）の細胞外および細胞内膜輸送に関係している。この４０個の特徴づけられたヒトメンバーのうち１１のメンバーが、ヒトの疾患と関連するとして記載され、例えばなかでも、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）およびＡＢＣＣ７（ＣＦＴＲ）は、それぞれタンジール病（Ｂｏｄｚｉｏｃｈ Ｍら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９，２２ （４）、 ３４７−３５１、 Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， １９９９， ２２ （４）， ３３６−３４５、 Ｒｕｓｔ Ｓら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９９，２２，３５２−３５５； Ｒｅｍａｌｅｙ Ａ Ｔら）、スタルガルト病（Ｌｅｗｉｓ Ｒ Ａら， Ａｍ． Ｊ Ｈｕｍｇｅｎｅｔ．， １９９９，６４，４２２４３４）、および嚢胞性繊維症（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＭら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４５，１０６６−１０７３）に関係していると考えられている。これらの関連性は、ＡＢＣ遺伝子ファミリーの機能的な役割の重要性を明らかにし、そして新規なファミリー遺伝子メンバーの発見は、ヒトの疾患の生理病理学に新規な洞察を提供するはずである。
【０００３】
プロトタイプＡＢＣタンパク質は、細胞膜を横切るさまざまな分子の輸送を駆動するために、ＡＴＰを結合して、ＡＴＰ加水分解からのエネルギーを使用する。機能的なタンパク質は、２つのＡＴＰ−結合ドメイン（ヌクレオチドバインディングフォールド、ＮＢＦ）および２つの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含む。この遺伝子は、概して、各ドメインの２つを含む完全な輸送体または各ドメインのうちの１つだけを有する半分の輸送体として構成される。大部分の完全な輸送体は、ＴＭ−ＮＢＦ−ＴＭ−ＮＢＦ形態に配置される（Ｄｅａｎら， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ， １９９５，５，７９−７８５）。
【０００４】
ＡＴＰ−結合ドメインのアミノ酸配列アラインメントの分析によって、ＡＢＣ遺伝子がサブファミリーに分けられた（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ， １９９６，５，１６４９−１６５５）。現在、最近のＨＵＧＯ分類法によれば、ＡＢＣ（Ａ〜Ｇ）と名付けられた７つのＡＢＣ遺伝子サブファミリーが、ヒトゲノム（ＡＢＣ１、ＣＦＴＲ／ＭＲＰ、ＭＤＲ、ＡＢＣ８、ＡＬＤ、ＧＣＮ２０、ＯＡＢＰ）において示され、１つ（ＯＡＢＰ）を除いて全てが複数のメンバーを含む。ほとんどの場合、これらのサブファミリーは、膜貫通ドメインの配列においてかなりの保存性もまた示す遺伝子を含み、類似した遺伝子構成を有する。しかし、ＡＢＣタンパク質は、非常にさまざまな基質を輸送し、そして異なるサブファミリーのいくつかのメンバーは、同じサブファミリーの範囲内のタンパク質より、基質認識においてより高い類似性を共有することを示した。サブファミリーのうちの５つが、酵母ゲノムにおいても示され、このことからこれらの群が、真核生物の進化の初期に存在し、そして保たれたことが示唆される（Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， １９９７，１３７−４５、 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら， １９９５， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。ヒトにおいて同定されたいくつかのＡＢＣ輸送タンパク質は、さまざまな疾患と関係している。例えば、嚢胞性繊維症は、ＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス制御因子）遺伝子の突然変異によって生じる（Ｒｉｏｒｄａｎ ＪＭら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９，２４５，１０６６−１０７３）。さらに、腫瘍細胞におけるいくつかの多剤耐性表現型は、ＭＤＲ（多剤耐性）タンパク質をコードしている遺伝子と関係し、これはまた、ＡＢＣ輸送体構造を有する（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １９９９ Ａｐｒ、 １４（２）： １１５−３１）。他のＡＢＣ輸送体は、ニューロンおよび腫瘍の状態に関係しているか（米国特許第５，８５８，７１９号）、または金属のホメオスタシスの欠陥によって生じる疾患に潜在的に関係している（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９９ Ｄｅｃ ６、 １４６１（２）： １８−４０４）。同様に、ＰＦＩＣ２と称される他のＡＢＣ輸送体は、進行性の家族性肝内胆汁鬱滞に関係していると思われ、このタンパク質は、ヒトにおける胆汁酸塩の搬出に潜在的に関係していると思われる（Ｓｔｒａｕｔｎｉｅｋｓ Ｓ Ｓら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， １９９８，２０，２３３−２３８）。
【０００５】
ＡＢＣサブファミリーの中で、ＡＢＣＡ遺伝子サブファミリーは、おそらく最も進化的な複合体である。ＡＢＣＡ遺伝子およびＯＡＢＰは、酵母ゲノムにおいて、同定可能なオルソログを有しないＡＢＣ遺伝子の２つだけのサブファミリーを表す（ＤｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓおよびＧｏｆｆｅａｕ， １９９７、 ＭｉｃｈａｅｌｉｓおよびＢｅｒｋｏｗｅｒ， １９９５）。しかし、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ（ｃｅｄ−７）の中で少なくとも１つの、およびショウジョウバエの中でいくつかのＡＢＣＡ関連遺伝子が存在する。このように、ＡＢＣＡ遺伝子は、真核生物が多細胞になり、そしてより高度な輸送条件を発達させたあと、分岐したように思われる。現在まで、ヒトＡＢＣＡサブファミリーの１１のメンバーが記載され、このようなもっとも大きな群になった。
【０００６】
ＡＢＣＡサブファミリーの４つの遺伝子の完全な配列が表され、複雑なエキソン−イントロン構造を明らかにしている。もっともよく特徴づけられたＡＢＣＡ遺伝子は、ＡＢＣＡ４およびＡＢＣＡ１である。哺乳類において、ＡＢＣＡ１遺伝子は、マクロファージおよび単核細胞において高く発現し、そしてアポトーシス細胞の取り込みと関係している（Ｌｕｃｉａｎｉら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９４） ２１，１５０−９、 Ｍｏｙｎａｕｌｔら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ（１９９８） ２６，６２９−３５、 Ｗｕら， Ｃｅｌｌ（１９９８） ９３，９５１−６０）。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓにおけるＡＢＣＡ１のオルソログであるｃｅｄ−７遺伝子は、アポトーシス細胞の認識および取り込みの役割を果たし、保存された機能を示唆する。最近、ＡＢＣＡ１は、タンジール病、末しょう組織の高レベルのコレステロールおよび非常に低レベルのＨＤＬにより特徴づけられる障害、ならびに家族性低アルファリポ蛋白血症（ＦＨＤ）の原因となる遺伝子であることが示された（Ｂｏｄｚｉｏｃｈら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９） ２２，３４７−５１、 Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９） ３３６−４５、 Ｒｕｓｔら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９） ２２，３５２−５、 Ｍａｒｃｉｌら， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（１９９９） ３５４，１３４１−４６）。ＡＢＣＡ１タンパク質は、ＨＤＬ組織のアポリポタンパク質１（ＡｐｏＡ−１）との相互作用を介した末しょう組織からのコレステロールの逆輸送に機能することが提唱される（Ｗａｎｇら， ＪＢＣ（２０００））。ＡＢＣＡ２遺伝子が脳において、そしてＡＢＣＡ３遺伝子が肺において高く発現されるが、これらの遺伝子座に起因する機能は知られていない。ＡＢＣＡ４遺伝子は、網膜の桿体光受容体でもっぱら発現され、そしてその突然変異は、ヒトの眼のいくつかの病理、例えば網膜変性障害レチノイドの原因となる（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７） ２７７，１８０５−１８０７、 Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９７） １５， ２３６−２４６、 Ｓｕｎら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９９） ８２６９−８１、 Ｗｅｎｇら， Ｃｅｌｌ（１９９９） ９８，１３−２３、 Ｃｒｅｍｅｒｓら， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（１９９８） ７，３５５−３６２、 Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｉｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９７） ４０，１４２−１４６）。ＡＢＣＡ４は、桿体光受容体外節円板から細胞質までレチナールおよび／またはレチナールリン脂質複合体を輸送し、光伝達を促進すると考えられている。
【０００７】
したがって、ＡＢＣＡサブファミリー由来の新規な遺伝子の特徴づけは、膜脂質輸送のためのトランスロカーゼ活性を有し、ヒトの病理に主要な役割を果たし得る生物学上重要な輸送体を与える可能性がある。
【０００８】
脂質は、水不溶性有機生体分子であり、これは、エネルギーの貯蔵、輸送および代謝ならびに膜構造および流動性を含む多様な生物学的機能の必須成分である。脂質は、ヒトおよび他の動物では２つの供与源に由来し：いくつかの脂質は、食餌性脂肪および食餌性オイルとして摂取され、そして他の脂質はヒトまたは動物によって生合成される。哺乳類において、体重の少なくとも１０％は脂質であり、その大半がトリアシルグリセロールの形である。
【０００９】
トリグリセリドおよびトリアシルグリセリドとしてもまた公知のトリアシルグリセロールは、グリセリンに対してエステル化された３つの脂肪酸から構成される。食餌性トリアシルグリセロールは、エネルギー源として脂肪組織に貯蔵されるか、またはトリアシルグリセロールリパーゼ（この中でもっとも重要なのが膵臓リパーゼである）によって消化管において加水分解される。トリアシルグリセロールは、リポタンパク質の形で組織間に輸送される。
【００１０】
リポタンパク質は、血漿で見出されるミセル様集合体であって、様々な比率の脂質およびタンパク質の異なるタイプ（アポタンパク質と呼ばれる）を含む。血漿リポタンパク質の５つの主要なクラスがあり、その主な機能が脂質輸送である。これらのクラスは、密度が増す順に、キロミクロン、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）である。多くの種類の脂質が、各々のリポタンパク質クラスと関連して見出されるが、各々のクラスが主に１つのタイプの脂質を輸送する：トリアシルグリセロールは、キロミクロン、ＶＬＤＬおよびＩＤＬにおいて輸送され、一方、リン脂質およびコレステロールエステルが、それぞれＨＤＬおよびＬＤＬにおいて輸送される。
【００１１】
リン脂質はグリセリンリン酸のジ脂肪酸エステルであり、これはまた、そのリン酸エステルに連結された極性基を含む。リン脂質は、細胞膜の重要な構造成分である。リン脂質は、ホスホリパーゼと呼ばれている酵素によって加水分解される。ホスファチジルコリン（典型的なリン脂質）は、大部分の真核細胞膜の主要成分である。
【００１２】
コレステロールは、細胞膜の基本的構成要素であることに加え、ステロイドホルモンおよび胆汁酸の代謝前駆体である。ヒトおよび他の動物において、コレステロールは食餌において摂取され、また肝臓および他の組織により合成される。コレステロールは、ＬＤＬおよび他のリポタンパク質におけるコレステリルエステルの形で組織間で輸送される。
【００１３】
膜は、あらゆる生細胞を囲んで、細胞内および細胞外区画間の障壁として役立つ。膜はまた、真核生物の核を囲み、小胞体を形成し、そして例えば軸索を囲む髄鞘においてのように特殊化された機能に役に立つ。典型的な膜は、約４０％の脂質および６０％のタンパク質を含むが、かなりのバリエーションが存在する。主要な脂質成分はリン脂質であり、特にホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ならびにコレステロールである。膜の生理化学的性質、例えば流動性は、リン脂質またはコレステロール含量のいずれかの脂肪酸プロフィールの変更によって変化できる。膜脂質の組成および構成を調整することはまた、膜に依存する細胞機能、例えば受容体活性、エンドサイトーシスおよびコレステロールフラックスを調整する。
【００１４】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血漿中を循環しているリポタンパク質の５つの主要なクラスのうちの１つである。これらのリポタンパク質は、さまざまな代謝経路、例えば脂質輸送、胆汁酸の生成、ステロイド産生、細胞増殖に関係し、そしてさらに血漿プロテイナーゼ系に干渉する。
【００１５】
ＨＤＬは、完全な遊離のコレステロール受容体であり、そしてコレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝性リパーゼ（ＨＬ）およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のような酵素活性と組み合わされて、コレステロールの逆輸送、すなわち末梢細胞中の過剰コレステロールを胆汁酸の形で身体から除去するための肝臓への輸送に重要な役割を果たす。ＨＤＬが末しょう組織から肝臓までのコレステロールの輸送において中心的な役割を果たすことが証明されている。
【００１６】
タンジール、ＦＨＤ疾患およびＬＣＡＴ欠損症を含むＨＤＬ欠損に関係があるさまざまな疾患が記載されている。さらに、ＨＤＬコレステロール欠損が、マラリアおよび糖尿病を患っている患者において観察された（Ｋｉｔｔｌら， １９９２． Ｗｅｉｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ １０４： ２１−４、 Ｎｉｌｓｓｏｎら， １９９０， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．， ２２７： １５１−５、 Ｄｊｏｕｍｅｓｓｉ， １９８９， Ｐａｔｈｏｌ Ｂｉｏｌ．， ３７： ９０９−１１、 Ｍｏｈａｎｔｙら， １９９２． Ａｎｎ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ８６： ６０１−６、 Ｍａｕｒｏｉｓら， １９８５， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．， ６７： ２２７−３９、 Ｇｒｅｌｌｉｅｒら， １９９７． Ｖｏｘ Ｓａｎｇ． ７２： ２１１−２０、 Ａｇｂｅｄａｎａら， １９９０， Ａｎｎ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．， ８４： ５２９−３０、 Ｅｒｅｌら， １９９８， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ， Ｂｕｄａｐ， ２９： ２０７−１２、 Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒら， １９９０， Ｍｅｄ Ｔｒｏｐ， ５０： ９１−５、 Ｃｈａｎｄｅｒら， １９９８， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ ＥＸＰ Ｂｉｏｌ．， ３６： ３７１−４、 Ｅｆｔｈｉｍｉｏｕら， １９９２， Ｗｅｉｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．， １０４： ７０５−６、 Ｂａｐｔｉｓｔａら， １９９６． Ｐａｒａｓｉｔｅ， ３： ３３５−４０、 Ｄａｖｉｓら， １９９３， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． ２６： ２７９−８５、 Ｄａｖｉｓら， １９９５， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． ３１： １８１−８、 Ｐｉｒｉｃｈら， １９９３， Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．， １９： １３８−４３、 ＴｏｍｌｉｎｓｏｎおよびＲａｐｅｒ， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４： ７１７−２１、 ＨａｇｅｒおよびＨａｊｄｕｋ， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８２３−６、 Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ， １９９５， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．， ７４８： ３１３−３０、 Ｓｙｖａｎｎｅら １９９５， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９２： ３６４−７０、およびＳｙｖａｎｎｅら， １９９５， Ｊ． ＬＩＰＩＤ Ｒｅｓ．， ３６： ５７３−８２）。タンジールおよび／またはＦＨＤ疾患に関係している欠損は、ＨＤＬの分解の原因となり、そしてリポタンパク質代謝の崩壊を招く細胞性コレステロールの輸送における細胞性欠陥につながる。
【００１７】
アテローム性動脈硬化は、血管壁、特に大きい動脈（大動脈、冠状動脈、頸動脈）における脂質および他の血液誘導体の沈着物（脂質またはフィブロリピッドプラーク（ｆｉｂｒｏｌｉｐｉｄ ｐｌａｑｕｅ））によって、組織学的用語で規定される。アテローム性動脈硬化過程の進行の程度によって、大なり小なりで硬化したこれらのプラークは、損傷に結合し、そして基本的にコレステロールエステルからなる脂肪性沈澱物の血管での蓄積と結びつく。これらのプラークは、血管壁の肥厚、平滑筋の肥大、泡末細胞（補充されたマクロファージによるコレステロールの無制御の取込みにより生じる脂質でいっぱいの細胞）の出現および繊維組織の蓄積を伴う。アテロームのプラークが血管壁から顕著に飛び出し、アテローム、血栓症または塞栓症による血管閉塞の原因となる狭窄特徴をその血管壁に与えるが、このことはひどく冒されている患者で生じる。これらの病変は、深刻な心血管病理、例えば心筋梗塞、突然死、噴門機能不全および卒中に至ることがあり得る。
【００１８】
リポタンパク質代謝で役割を果たす遺伝子内の突然変異が確認された。特定的には、アポリポタンパク質ａｐｏＡ−Ｉ遺伝子において、いくつかの突然変異が特徴づけられた。これらの突然変異はまれで、ａｐｏＡ−Ｉの産生の不足に至る可能性がある。ＬＰＬまたはそのアクチベータのａｐｏＣ−ＩＩをコードしている遺伝子の突然変異は、重症の過トリグリセリド血症およびＨＤＬ−Ｃレベルの実質的減少と関係している。酵素ＬＣＡＴをコードしている遺伝子の突然変異はまた、重症のＨＤＬ欠損を伴う。
【００１９】
さらに、コレステロールの逆輸送の機能不全は、ＨＤＬによって受容される細胞内小胞から表層膜までの貯蔵されたコレステロールの輸送における、一つまたはそれ以上の工程に影響を及ぼす生理学的欠陥によって引き起こされる可能性がある。
したがって、コレステロールおよび／またはリポタンパク質の代謝工程のいずれかに関係している遺伝子、および特に末梢細胞から肝臓へのコレステロールの逆輸送における機能不全と関連した遺伝子を同定する必要性の増大が、本技術の分野において存在する。
【００２０】
本出願人は、ＡＢＣＡタンパク質サブファミリーに属する、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０と称され４つの新規な遺伝子を含む遺伝子クラスターを発見し、そして特性を明らかにした。これらの新規な遺伝子は、特にＡＴＰ結合ドメインに、さらにとりわけＣ末端ＡＴＰ結合ドメインにおいて、他のＡＢＣＡサブファミリーメンバー、例えばＡＢＣＡ１およびＡＢＣＡ８に密接に関連しているようである。この新しく発見された遺伝子はまた、特に膜貫通領域（ＴＭ）およびＡＴＰ結合領域（ＮＢＤ）の範囲内で、アミノ酸配列の相当な保存を示し、そして類似した遺伝子構成を有する。
【００２１】
驚くべきことに、本出願人は、これらの遺伝子が、類似したイントロン／エキソン構成を有する頭部−尾部形態（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ｆａｓｈｉｏｎ）で染色体１７ｑ２４上に単一の大きいクラスタで構成されていることを見出したが、このことはそれらが縦列複製から生じ、そしてＡＢＣＡサブファミリーと異なる機能群を形成し得ることを示唆している。
さらに、発見された遺伝子の各々は、組織特異的分布を伴って転写されるが、異質な発現パターンを示し、対応するタンパク質の領域的かつおそらく機能的特殊化を示唆する。
【００２２】
【発明の開示】
本発明は、コレステロールの逆輸送と、同様に親油性分子、殊にプロスタグランジンおよびプロスタサイクリンのような炎症仲介物質の膜輸送、または或る病理であって、その候補染色体領域が染色体１７、より正確には１７ｑアーム、さらにより正確には１７ｑ２４遺伝子座に位置するもの、におそらく関係しているであろうさまざまなヒトのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子に対応する核酸に関する。
すなわち、本発明の第一の主題は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸である。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の少なくとも８つ連続したヌクレオチドを含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、およびさらにより好ましくは９８％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸に関する。
本発明はまた、全長ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする核酸、特にｃＤＮＡ分子に関する。従って、本発明は、配列番号１〜４のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号１〜４に表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００２５】
本発明によれば、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号５のアミノ酸配列を含む１６４２個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ５ポリペプチドをコードする。
本発明によれば、配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含む１６１７個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ６ポリペプチドをコードする。
本発明によれば、配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号７のアミノ酸配列を含む１６２４個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ９ポリペプチドをコードする。
本発明によれば、配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号８のアミノ酸配列を含む１５４３個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする。
【００２６】
従って、本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
従って、本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００２７】
本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つに表されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
本発明はまた、一般的に多型、ならびに特にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子またはこれらの遺伝子の対立遺伝子型により産生される対応するタンパク質における突然変異を検出する手段に関する。
他の態様によれば、本発明はまた、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失のような、少なくとも１つの２対立遺伝子多型を含むＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子のヌクレオチド配列に関する。
【００２８】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０核酸のいずれか１つの領域に位置する核酸配列（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）であって、特に突然変異または多型のいずれか１つを含む核酸配列、とハイブリダイズするヌクレオチドプローブおよびプライマーに関する。
本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも８つ連続したヌクレオチドを含む。
【００２９】
好ましくは、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明による核酸、特には配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の、１０，１２，１５，１８または２０〜２５，３５，４０，５０，７０，８０，１００，２００，５００，１０００，１５００の長さの連続したヌクレオチドを有する。
あるいは、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明による核酸、より詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の、１２，１５，１８，２０，２５，３５，４０，５０，１００，２００、５００，１０００，１５００の長さの連続したヌクレオチドを有する断片からなるかおよび／またはそれらの断片を含む。
【００３０】
従って、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーの定義は、上記で規定される高ストリンジェント条件下で、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明による好適なプローブおよびプライマーは、配列番号１２７〜２１７のいずれか１つを含むヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の全体または一部を含む。
【００３１】
本発明によるヌクレオチドプライマーは、本発明による核酸およびより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸のいずれか１つを増幅するために使用することができる。
本発明によれば、ＡＢＣＡ５遺伝子に特異的ないくつかのヌクレオチドプライマーは、配列番号１を含む核酸を増幅するために使用することができ、そして配列番号１２７〜１５０のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明はまた、ＡＢＣＡ６遺伝子に特異的であり、配列番号２および９〜４７のいずれか１つを含む核酸を増幅するために使用することができ、そして配列番号１５１〜１７７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドプライマーに関する。
【００３３】
本発明はさらに、ＡＢＣＡ９遺伝子に特異的なヌクレオチドプライマーに関し、配列番号３および４８〜８６のいずれか１つを含む核酸を増幅するために使用することができ、そして配列番号１７８〜２０９のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。
本発明はさらに、ＡＢＣＡ１０遺伝子に特異的なヌクレオチドプライマーに関し、配列番号４および８７〜１２６のいずれか１つを含む核酸を増幅するために使用することができ、そして配列番号２１０〜２１７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
本発明の他の主題は、本発明による核酸、およびより詳しくは、試料中に含まれる、ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列、その相補的ヌクレオチド配列、またはｂ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列、もしくはその相補的ヌクレオチド配列、を含む核酸を増幅する方法に関し、この方法は、
ａ）増幅反応に必要な試薬の存在下で、標的核酸の存在が推測される試料を、ハイブリダイゼーション位置が増幅の求められる標的核酸の領域のそれぞれ５′側および３′側にあるヌクレオチドプライマー対と接触させ、
ｂ）この増幅された核酸を検出する工程、を含む。
【００３５】
本発明はまた、試料中における、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つの核酸断片もしくは変異体、またはその相補的ヌクレオチド配列の存在を検出する方法に関し、この方法は、１）本発明による１つまたはそれ以上のヌクレオチドプローブを、試験されるサンプルと接触させ、
２）試料中に存在するプローブと核酸との間で形成された複合体を検出する工程、を含む。
【００３６】
本発明による検出方法の特定の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドプローブは、支持体上に固定される。
他の態様によれば、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なマーカーを含む。
【００３７】
本発明の他の主題は、ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列、またはｂ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列、を含む核酸の全部または一部を増幅するためのボックスまたはキットであって、このボックスまたはキットは、
１）ハイブリダイゼーション位置が、増幅の求められる標的核酸のそれぞれ５′側および３′側に位置する１対の本発明によるヌクレオチドプライマー、
２）ハイブリダイゼーション反応のために必要な試薬、を含む。
【００３８】
このような増幅ボックスまたはキットは、上記の通りに好ましくは少なくとも一対のヌクレオチドプライマーを含む。
本発明はまた、試料中で本発明による核酸の存在を検出するボックスまたはキットに関し、このボックスまたはキットは、
ａ）本発明による１つまたはそれ以上のヌクレオチドプローブ、
ｂ）ハイブリダイゼーション反応に必要な適当な試薬、を含む。
【００３９】
第１の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが支持体に固定されていることを特徴とする。
第２の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含むことを特徴とする。
上記した検出キットの特定の実施態様によれば、このようなキットは、関心ある標的核酸を検出するため、あるいは本発明による核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用できる、本発明による複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含む。本発明の好ましい実施態様によれば、標的核酸は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。あるいは、その標的核酸は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の核酸断片または変異体である。
他の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーは、一般に、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つまたはその相補的配列の全体または一部を含む。
【００４０】
本発明はまた、本発明による核酸を含む組換えベクターに関する。好ましくは、このような組換えベクターは、以下の群から選択される核酸を含む：
ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸；
ｂ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸；
ｃ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも８つ連続したヌクレオチドを有する核酸；
ｄ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸；
ｅ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と８５％、９０％、９５％、または９８％同一なヌクレオチドを有する核酸、
ｆ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸；および
ｇ）配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
【００４１】
第１の実施態様によると、本発明による組換えベクターは、そのベクターに挿入された核酸を、所望の細胞宿主の形質転換またはトランスフェクションの後、増幅するために使用される。
第２の実施態様によると、本発明による組換えベクターは、本発明による核酸に加えて、核酸の転写および／または翻訳を導くかまたは制御する調節シグナルまたはヌクレオチド配列およびその核酸にコードされるｍＲＮＡを含む発現ベクターに相当する。
【００４２】
好ましい実施態様によると、本発明による組換えベクターは、特に以下の成分を含む：
（１）挿入される核酸の発現を調節するためのエレメントまたはシグナル（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー配列；
（２）（１）に記載される調節エレメントまたはシグナルと一緒に配置され、上記ベクター中に挿入される本発明による核酸内に含まれるヌクレオチドコード領域、
（３）（２）に記載される核酸のヌクレオチドコード領域の転写の開始および終止のために適切な核酸。
【００４３】
本発明はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードしているｃＤＮＡ核酸を含む不完全組換えウイルスに関し、そしてこのポリペプチドは、親油性物質、特に炎症のメディエータの輸送、または候補染色体領域が第１７染色体、より正確には１７ｑアーム、さらにより正確には１７ｑ２４遺伝子座に位置する病理に関係する。
【００４４】
本発明の他の好ましい実施態様において、不完全組換えウイルスは、親油性物質、炎症性親油性物質（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の輸送に関係する、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードするｇＤＮＡ核酸を含む。好ましくは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、それぞれ配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
他の好ましい実施態様として、本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする核酸を含む不完全組み換えウイルスに関し、これらのポリペプチドは、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下における炎症性親油性物質の輸送に関係する。
【００４６】
特定の実施態様によれば、本発明による核酸を、宿主細胞、特に哺乳動物から得られた宿主細胞にインビボで導入する方法は、製薬上適合性を有するベクターおよび本発明による「裸の」核酸を含む調製物が、選択された組織、例えば平滑筋組織のレベルでの局所注入により導入され、「裸の」核酸がこの組織の細胞により吸収される工程を含む。
【００４７】
本発明の特定の実施態様によれば、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボでの産生のための組成物が、提供される。この組成物は、生理学的に許容され得るビヒクルおよび／または添加剤の溶液中で、適切な調節配列の制御下に配置されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００４８】
従って、本発明は、配列番号５〜８から選択されるアミノ酸を含むＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む組成物に関し、ここで核酸は、適当な調節エレメントの制御下に配置される。従って、本発明はまた、コレステロールの逆輸送またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む炎症性親油性物質の輸送における機能不全を患う患者または被験者の予防または処置のために意図され、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有する添加剤と組み合わされた医薬組成物に関する。
【００４９】
好ましくは、このような組成物は、適当な調節性エレメントまたはシグナルの制御下に配置された、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸含む。
さらに、本発明は、コレステロールの逆輸送または炎症を媒介する親油性物質の輸送における機能不全を患う患者または被験者の予防または治療のために意図され、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有する添加剤と組み合わされた医薬組成物に関し、上記医薬組成物は、本発明による組み換えベクターを含む。
【００５０】
本発明はまた、種々の形態における動脈硬化の予防、またより詳しくはコレステロールの逆輸送または炎症を媒介する親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の治療のために意図された医薬品の製造のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする本発明による核酸の使用に関する。
本発明はまた、種々の形態における動脈硬化の予防、またより詳しくはコレステロールの逆輸送または炎症を媒介する親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の治療のために意図された医薬品の製造のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む本発明による組換えベクターの使用に関する。
従って、本発明の主題はまた、コレステロールの代謝または炎症を媒介する親油性物質の輸送に関係するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質またはポリペプチドのいずれか１つをコードする本発明による核酸を含む組換えベクターである。
【００５１】
本発明はまた、炎症のシグナルを出す親油性物質の欠損またはコレステロールの逆輸送もしくは炎症性親油性物質の輸送の欠損に関連する疾患または状態の治療および／または予防のために意図された医薬組成物の調製のための組み換えベクターの使用に関する。
本発明はまた、このような本発明による組み換えベクターによりエキソビボで遺伝的に改変された細胞、または組み換えベクターを産生する細胞の使用に関し、ここでこの細胞は、インビボに移植され、生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのインビボでの持続的かつ有効な発現を可能にする。
【００５２】
本発明はまた、コレステロール逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の予防および／または治療のために意図された医薬品の製造のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする本発明による核酸の使用に関する。
本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の予防および／または治療のために意図された医薬品の製造のための、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む本発明による組み換えベクターの使用に関する。
【００５３】
本発明はまた、本発明による組み換え宿主細胞の使用に関し、上記宿主細胞は、コレステロールの逆輸送の機能不全を患う被験者の予防および／または治療のために意図された医薬品の製造のための、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む。
本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質輸送の機能不全に関連した病理の治療および／または予防のための医薬組成物の薬剤のための、本発明による組み換えベクター、好ましくは不完全組み換えウイルスの使用に関する。
【００５４】
本発明は、コレステロールの逆輸送の機能不全に関連した心血管疾患の治療および／または予防のために意図された医薬組成物の薬剤のための、上記組換えベクターまたは不完全組み換えウイルスの使用に関する。このように、本発明はまた、本発明による１つまたはそれ以上の組み換えベクターを含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明によるウイルスによりエキソビボで遺伝的に改変された細胞、またはこのようないウイルスを産生する細胞の使用に関し、上記細胞は、体内に移植され、生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボでの持続的かつ効果的な発現を可能にする。
【００５５】
本発明は、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸をウイルス性ベクターに組み込むことが可能であり、そしてこれらのベクターが、生物学的に活性で成熟したポリペプチドを効果的に発現することを可能にすることを示す。より詳しくは、本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボでの発現が、アデノウイルスの直接投与により、または産生細胞もしくはこのような核酸を組み込んだアデノウイルスによりまたはレトロウイルスにより遺伝的に改変された細胞の移植により、得ることができることを示す。
【００５６】
この点に関して、本発明の別の主題は、本発明による１つまたはそれ以上の不完全な組換えウイルスに感染した任意の哺乳動物細胞に関する。より詳しくは、本発明は、これらのウイルスに感染したヒト細胞の任意の集合に関する。これらは、特に、血液起源の細胞（全能性幹細胞または前駆体）、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、ケラチン合成細胞、平滑筋細胞および内皮細胞、グリア細胞などであり得る。
【００５７】
本発明の他の主題は、本発明による１つまたはそれ以上の不完全組換えウイルスにより感染した哺乳動物細胞、または組換えウイルスを産生する細胞、および細胞間マトリックスを含む移植組織に関する。好ましくは、発明による移植組織は、１０５〜１０１０個の細胞を含む。より好ましくは、それらは１０６〜１０８個の細胞を含む。
より詳しくは、本発明の移植組織において、細胞間マトリックスは、ゲル化している化合物、および場合により細胞の固着を可能にする支持体を含む。
【００５８】
本発明はまた、本発明の核酸、およびより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列含む核酸、を含む組換え宿主細胞に関する。
本発明はまた、本発明の核酸、およびより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸、を含む組換え宿主細胞に関する。
【００５９】
他の態様によれば、本発明はまた、本発明による組み換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。したがって、本発明はまた、本発明の核酸、およびより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列のいずれか１つを含む核酸、を含む組換え宿主細胞に関する。
詳しくは、本発明は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含んだ組み換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含んだ組換え宿主細胞にも関する。
本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含んだ組み換えベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。
【００６０】
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのペプチド断片もしくは変異体の生産のための方法に関し、この方法は、
ａ）適当なベクターに上記ポリペプチドをコードする核酸を挿入し、
ｂ）適当な培地で、工程ａ）の組換えベクターにより予め形質転換された細胞またはトランスフェクトした宿主細胞を培養し、
ｃ）調製培地を回収するかまたは例えば音波処理によるかもしくは浸透圧ショックにより宿主細胞を溶解し、
ｄ）上記培地から、または工程ｃ）において得られた溶解物から上記ポリペプチドを分離かつ精製し、そして
ｅ）必要に応じて、産生された組換えポリペプチドを特徴づける工程、を包含する。
【００６１】
配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。このような相同ポリペプチドは、等価なアミノ酸によるアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、特に１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドである。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明による抗体は、
１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド：２）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドに対して向けられたものである。このような抗体は、Ｋｏｚｂｏｒらによって記載されるトリオーマ技術またはハイブリドーマ技術を用いて産生される（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（４（１９８３））：７２）。
【００６４】
このように、本発明の主題は、さらに、試料中の本発明によるポリペプチドのいずれか１つの存在を検出する方法に関し、この方法は、
ａ）試験される試料を、１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、３）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドに対して向けられた抗体と接触させ、そして
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出する工程、を含む。
【００６５】
本発明はまた、診断のため、または試料中における本発明によるポリペプチドのいずれか１つの存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、このボックスまたはキットは、
ａ）１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体、または３）配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」なポリペプチド、に対して向けられる抗体、および
ｂ）形成される抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、を含む。
【００６６】
本発明はまた、本発明による核酸を含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含有する医薬組成物ならびにコレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の欠損に関連する疾患の治療のために意図される本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを含有する医薬品組成を提供する。
【００６７】
本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の欠損に関連した病理の治療のための新規の治療手段に関し、上記手段は、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸をインビボで導入および発現することを含む。
このように、本発明は、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の異常に関連した病理の治療および／または予防のための新規の手段を提供する。詳しくは、本発明は、患者または被験者におけるコレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送を回復または改善を促進するための方法を提供する。
【００６８】
従って、本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の予防および／または治療のために意図された医薬組成物に関し、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含むものである。
【００６９】
本発明の特定の実施態様によれば、組成物は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボでの産生を提供する。この組成物は、生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤の溶液中、適当な調節配列の制御下に配置される、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む。
したがって、本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組成物に関し、ここで上記核酸は、適当な調節性エレメントの制御下に配置される。
【００７０】
好ましくは、このような組成物は、適当な調節性エレメントの制御下に配置される、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全を患う被験者の予防または治療のために意図された医薬組成物に関し、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされた本発明による組み換えベクターを含むものである。
別の態様によれば、本発明の主題はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の欠損により引き起こされる疾患を処置する予防的または治療的治療方法であり、この方法は、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を患者に投与することを含み、上記核酸は、１つまたはそれ以上の生理学的に適当なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【００７１】
本発明は、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全を患う患者または被験者の予防および／または治療のための医薬組成物に関し、１つまたはそれ以上の生理学的に適当なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされ、配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの治療的有効量を含むものである。
特定の実施態様によれば、インビボで、本発明による少なくとも１つの核酸を宿主細胞、特に哺乳動物から得られた宿主細胞に導入する方法は、製薬上適合性を有するベクターおよび適当な調節配列の制御下に配置される本発明による「裸の」核酸を含む調製物が、選択された組織、例えば平滑筋組織のレベルに局所注入されることにより導入され、「裸の」核酸がこの組織の細胞に吸収される工程を含む。
【００７２】
さらにもう一つの態様によれば、本発明の主題はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の欠損によって引き起こされる疾患を処置する予防的または治癒的治療方法であり、この方法は、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９またはＡＢＣＡ１０ポリペプチドの少なくとも１つの治療的有効量を患者に投与することを含み、上記ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の生理学的に適当なビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【００７３】
本発明はまた、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送を回復するかまたは改善を促進し、その機能不全を効果的に治癒し、そして予防することができるようなポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するのに、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つに作用する小分子および化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全に起因した疾患の治療における治療的使用のための小分子および化合物を同定するのに有用である。
【００７４】
したがって、本発明はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つまたはまたは本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞の、コレステロールの逆輸送または炎症性親油性物質の輸送の機能不全から生じる疾患の予防および／または治療のための活性成分をスクリーニングするための使用に関する。
【００７５】
本発明はまた、化合物または小分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法に関し、この方法は、
ａ）ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つならびに検出マーカーを含む脂質基質を含んだ膜小胞を調製し、
ｂ）工程ａ）で得られた小胞をアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に培養し、
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出を定性的および／または定量的に測定し、そして
ｄ）工程ｂ）で得られた放出測定値と、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と予め培養していない小胞による標識された脂質基質の放出の測定値とを比較する工程、を含む。
【００７６】
第一の特定の実施態様において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、それぞれ配列番号５〜８を含む。
【００７７】
本発明はまた、化合物または小分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）細胞、例えば、天然にかまたはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０をコードする核酸のいずれか１つを用いたトランスフェクション後のいずれかに、対応するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドを発現する細胞系を得て、
ｂ）検出可能なマーカーで標識されたアニオンの存在下、工程ａ）の細胞を培養し、
ｃ）これらの細胞に入りこまなかった標識されたアニオンの過剰分を取り除くために工程ｂ）の細胞を洗浄し、
ｄ）工程ｃ）で得られた細胞をＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに対するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共に培養し、
ｅ）標識されたアニオンの流出を測定し、そして
ｆ）工程ｅ）で測定された標識されたアニオンの流出の値を、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに対するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で前もって培養しなかった細胞により測定された標識されたアニオンの流出の値と比較する工程、を含む。
【００７８】
第一の特定の実施態様において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、それぞれ配列番号５〜８を含む。
本発明はまた、化合物または小分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの活性なアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）精製されたヒトアルブミンの存在下、適当な培養培地中にヒト単核球系の細胞を培養し、
ｂ）同時にＩＬ−１βの産生を刺激する化合物およびアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下に、工程ａ）の細胞を培養し、
ｃ）適当な濃度のＡＴＰの存在下、工程ｂ）で得られた細胞を培養し、
ｄ）細胞培養上清に放出されたＩＬ−１βを測定し、そして
ｅ）工程ｄ）において得られたＩＬ−１βの放出の値を、アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で前もって培養していない細胞の培養上清に放出されたＩＬ−１βの値と比較する工程、を含む。
【００７９】
【発明の詳述】
一般の定義
本発明は、全長を含む本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードするヒト遺伝子、またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０の天然に存在する形態のものならびにそれらの任意の抗原性断片の、任意の動物、特に哺乳動物または鳥、より詳しくはヒトである出所源からの単離を意図する。
【００８０】
本発明では、従来の分子生物学、微生物学および公知技術の組換えＤＮＡ技術が使用される。このような技術は、文献において十分に説明されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら， １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． 第２版． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｐｒａｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ＬＴＤ．．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ． Ｋ．； ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ， １９８５， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ； ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ， １９８４， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， １９８６， Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＰｅｒｂａｌ， １９８４， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）。
【００８１】
ここで使用しているように、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合をいい、そしてｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。
用語「単離された」は本発明の目的のため、そのもともとの環境（天然に存在した環境）から取り出された生物学的物質（核酸またはタンパク質）を表す。
例えば、植物または動物において自然な状態に存在するポリヌクレオチドは、単離されていない。植物または動物のゲノムに天然に挿入されている隣接した核酸から分離された同一のヌクレオチドは、「単離されている」と考えられる。
このようなポリヌクレオチドは、ベクターに含まれてもよく、そして／またはこのようなポリヌクレオチドは、組成物中に含まれてもよく、それでもなおベクターまたは組成物がその天然の環境を構成していないという事実から、単離された状態のままにある。
【００８２】
用語「精製された」は、他の化合物の存在を排除して、絶対的純度を示す形態で存在する物質を要しない。それはむしろ相対的な定義である。
ポリヌクレオチドは、出発物質または天然物の精製の後では、少なくとも１桁の規模、好ましくは２桁または３桁および好ましくは４桁または５桁の規模での「精製された」状態にある。
この明細書のために、「ヌクレオチド配列」の表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸のいずれかを示すために使用することができる。「ヌクレオチド配列」の表現は、遺伝物質自体を包含し、従ってその配列に関する情報に制限されない。
【００８３】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、１本鎖形態または２重鎖、２本鎖形態のいずれかで、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはｃＤＮＡ配列またあるいはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を包含する。
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合サブユニットからなる重合化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、そしてその両方が、１本鎖または２本鎖であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、センス配列またはコード配列と呼ばれる。
【００８４】
用語「ヌクレオチド」は、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）ならびに少なくとも１つの修飾、例えば、（１）プリンのアナログ、（２）ピリミジンのアナログ、または（３）類似した糖、を含む修飾されたヌクレオチドの両方を表し、このような修飾されたヌクレオチドの例は、例えばＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９５／０４  ０６４に記載される。
【００８５】
本発明のために、第１のヌクレオチドの各塩基が、方向が逆の第２のポリヌクレオチドの相補的塩基と対になる場合、その第１のポリヌクレオチドは、その第２のポリヌクレオチドに「相補的」であるとみなされる。相補的塩基は、ＡおよびＴ（もしくはＡおよびＵ）またはＣおよびＧである。
「異種」ＤＮＡは、自然にはその細胞、またはその細胞の染色体部位には存在しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは、その細胞に対して外来のＤＮＡを含む。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、すべての文法上の形式およびスペルのバリエーションにおける用語「相同」は、スーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種由来の相同タンパク質（例えばミオシン軽鎖等）を含む、「共通の進化起源」を有するタンパク質との間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋら，１９８７， Ｃｅｌｌ ５０： ６６７）。このようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、配列類似性のそれらの高い程度によって反映されるように、配列相同性を有する。
【００８７】
したがって、その全ての文法上の形式における用語「配列類似性」は、共通の進化起源を共有し得るかまたはし得ないタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度をいう。しかし、一般的な用法および即時の応用において、用語「相同性」は、「高度な」のような副詞によって修飾される場合、配列の類似性をいい、共通の進化起源をいわない。
【００８８】
特定の実施態様において、２つのＤＮＡ配列は、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、およびより好ましくは少なくとも約９０％または９５％）のヌクレオチドが規定された長さのＤＮＡ配列に対して一致する場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクまたは例えばその特定の系のために定められるようなストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験に利用可能な標準的ソフトウェアを使用して配列を比較することにより、同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは、公知技術の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，前出 ； Ｇｌｏｖｅｒら（１９８５． ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ． Ｋ．）； Ｈａｍｅｓ および Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を参照のこと。
同様に、特定の実施態様において、２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の３０％を超えて同一であるか、または約６０％を超えて類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実施的に類似」である。好ましくは、類似または相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ７， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用したアランメントによって識別される。
【００８９】
本発明の目的のために、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列との間の「同一性の割合」は、比較のためのウインドウによって、最適に並べられた２つの配列を比較することにより測定することができる。
従って、比較のためのウインドウにおけるヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（例えば、ギャップ）を含み、２つの配列の最適なアラインメントを得ることができる。
【００９０】
百分率は、比較される２つの配列（核またはペプチド）に関して同一の核の塩基または同一のアミノ酸残基が観察される位置の数を測定することにより、次いで比較のためのウインドウにおける位置の数の合計により２つの塩基またはアミノ酸残基との間の同一性が存在する位置の数を割ることにより、次いでその結果に１００をかけることにより算出され、百分率の配列同一性を得る。
比較に最適の配列アランメントは、会社ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥ、ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｏｃｔｏｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩＳＣＯＮＳＩＮからのパッケージに含まれる公知のアルゴリズムを用いたコンピュータを使用して達成することができる。
【００９１】
実例として、デフォルトパラメータ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０，． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９−３４０２）をもっぱら使用して、ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎｓ ＢＬＡＳＴ １．４．９ ｏｆ Ｍａｒｃｈ １９９６， ＢＬＡＳＴ ２．０．４ ｏｆ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９８ ａｎｄ ＢＬＡＳＴ ２．０．６ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９８）を用いて配列同一性の百分率を出すことが可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌほかのアルゴリズムを用いて、ＢＬＡＳＴは、参照「リクエスト」配列に類似／相同な配列を調査する。リクエスト配列および使用されるデータベースは、ペプチドまたは核型であり得、任意の組み合わせが可能である。
【００９２】
用語「対応」は、正確な位置が類似性または相同性が測定される分子と同一または異なるか否かは関係なく、類似または相同な配列をいうために本明細書中で使用される。核酸またはアミノ酸配列アランメントは、スペースを含む可能性がある。従って、用語「対応」は、配列の類似性をいい、そしてアミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けをいうものではない。
【００９３】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにかかわらず、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする遺伝子は、任意の供給源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離することができる。遺伝子を得るための方法は、上記のように周知の技術である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００９４】
したがって、任意の動物細胞は、潜在的にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つの分子クローニングのための核酸供与源として役立つことができる。ＤＮＡは、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から公知技術の標準的方法により得ることができ、そして好ましくはタンパク質および／または転写物の高レベルの発現を有する組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、またはゲノムＤＮＡもしくはその断片のクローニングにより得られ、所望の細胞から精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２版． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ． Ｋを参照のこと）。
【００９５】
ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コード領域に加えて調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含むことができ、ｃＤＮＡに由来するクローンは、イントロン配列を含まない。供与源が何であれ、この遺伝子は、この遺伝子の増殖のために適切なベクターに分子的にクローニングされるべきである。
【００９６】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片が産生され、これらのいくつかが、所望の遺伝子をコードする。このＤＮＡは、さまざまな制限酵素を使用して特定の部位で切断され得る。あるいは、マンガンの存在下でＤＮＡ分解酵素を使用し、ＤＮＡを断片化するか、またはＤＮＡを例えば超音波処理によって物理的に切ることができる。次いで、線形ＤＮＡ断片を、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびにカラムクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない標準的技術によって、大きさに従い分離することができる。
【００９７】
一旦ＤＮＡ断片が産生されると、所望のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片の同定が、多くの方法で達成され得る。例えばある量の、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子もしくはその特定のＲＮＡの１つの一部分、またはそれらの断片が利用可能であり、そして精製しそして標識されることができる場合、その生成されたＤＮＡ断片は、標識されたプローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる（Ｂｅｎｔｏｎ および Ｄａｖｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）， １９６： １８０； Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．（１９７５）７２： ３９６１）。例えば、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０タンパク質について得られる部分的なコード配列情報に対応したオリゴヌクレオチドのセットが調製されて、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードするＤＮＡに対するプローブとして使用され、同様に以下の特定の例において、またはｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡについてのプライマー（例えば、ＲＴ−ＰＣＲのためのポリ−Ｔプライマーと組み合わされる）として使用され得る。好ましくは、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０核酸またはポリペプチドの１つに対して極めて固有である断片が、選択される。プローブに対して実質的な相同性を有するそれらのＤＮＡ断片が、ハイブリダイズする。上記したように、相同性の程度が大きければそれだけ、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、使用され得る。特定の実施態様において、さまざまなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、相同なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子を同定するために用いられる。
【００９８】
更なる選択が、例えば、遺伝子が本明細書中で開示されるようなＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のうちの１つの、等電的、電気泳動的アミノ酸組成物、または部分的アミノ酸配列を有するタンパク質産物をコードする場合、この遺伝子の特性に基づいて実施され得る。このように、遺伝子の存在は、その発現された産物の物理的、化学的、または免疫学的特性に基づくアッセイによって検出されることができる。例えば、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０について知られている、類似または同一の、電気泳動の移動、等電点電気泳動もしくは非平衡性ｐＨゲル電気泳動挙動、タンパク質分解地図、または抗原特性を有するタンパク質を産生する、適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するｃＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンが選択され得る。
【００９９】
本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子はまた、ｍＲＮＡ選択、すなわち核酸ハイブリダイゼーションに引き続くインビトロ翻訳によって同定され得る。この手順によれば、ヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離するために用いられる。このようなＤＮＡ断片は、利用可能な、精製されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ ＤＮＡを意味し得るか、または部分的なコード配列情報から設計された合成オリゴヌクレオチドであってもよい。単離されたｍＲＮＡの産物のインビトロ翻訳産物の免疫沈降分析または機能的アッセイ（例えば、チロシンホスファターゼ活性）により、ｍＲＮＡ、従って所望の配列を含む相補的ＤＮＡ断片を同定する。さらに、特定のｍＲＮＡは、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに対して特異的に向けられた固定された抗体に対する、細胞から単離されたポリソームの吸着により選択されることができる。
【０１００】
放射標識されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡは、鋳型として（吸着されたポリソームから）選択されたｍＲＮＡを使用して合成することができる。次いで、放射標識されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが、他のゲノムＤＮＡ断片の中から相同なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ ＤＮＡ断片を同定するためにプローブとして使用することができる。
【０１０１】
本発明による核酸の「変異体」は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つまたはそれ以上の塩基によって異なる核酸を意味することが理解される。変異体核酸は、天然起源、例えば天然に存在する対立形質の変異体であり得るか、または例えば突然変異誘発性技術によって得られる非天然の変異体であり得る。
【０１０２】
一般に、参照（一般的に野生型）核酸と変異体核酸との間の相違は小さく、参照核酸および変異体核酸のヌクレオチド配列は非常に類似していて、多くの領域で同一である。変異体核酸に存在するヌクレオチド修飾はサイレントでもよく、これはそれらが上記変異体核酸によってコードされるアミノ酸配列を変更しないことを意味する。
しかし、変異体核酸のヌクレオチドの変化はまた、参照核酸によってコードされるポリペプチドと比較して、変異体核酸によりコードされるポリペプチドにおいて置換、付加または欠失を生じ得る。さらに、コード領域におけるヌクレオチド修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列において保存的または非保存的置換を生じることができる。
【０１０３】
好ましくは、本発明による変異体核酸は、参照核酸のポリペプチドと同じ機能または生物学的活性、あるいは当初の参照核酸によりコードされるポリペプチドに対して向けられる抗体により認識される能力を実質的に保存するポリペプチドをコードする。
従って、いくつかの変異体核酸は、ポリペプチドの突然変異形態をコードし、この計画的研究が、問題となっているタンパク質の構造−活性関係を演繹することを可能にする。研究される疾患に関連したこれらの変異体の知識は、病理の分子的原因を理解することを可能にすることから、必須不可欠なものである。
【０１０４】
「断片」は、参照核酸と比較して長さが短く、かつ共通部分（ｃｏｍｍｏｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）上に参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明によるこのような核酸の「断片」は、必要な場合に構成成分であるより多きいポリヌクレオチド中に含まれることができる。このような断片は、本発明による核酸の、８，１０，１２，１５，１８，２０〜２５，３０，４０，５０，７０，８０，１００、２００，５００，１０００または１５００の連続的なヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる。
【０１０５】
「核酸分子」は、１本鎖形態または２本鎖へリックスのいずれかであるリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルの重合体形態のもの、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルをいう。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡへリックスが可能である。核酸分子の用語、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、１次構造及び２次構造の分子のみをいい、そして任意の特定の３次形態に限定されない。このように、この用語は、なかでも線形または環状ＤＮＡ分子で見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば制限断片）、プラスミド、及び染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論することにおいて、配列は、ＤＮＡの非転写の鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿った５′〜３′方向の配列のみを与える通常の規則に従って本明細書中に記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【０１０６】
核酸分子は、核酸分子の１本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニール化され得る場合、他の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）にハイブリダイズする（前出Ｓａｍｂｒｏｏｋほかを参照のこと）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸のための事前のスクリーニングに関し、５５°のＴｍに相当する低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が使用できる（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％の乳汁、およびホルムアミド無し；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。適度なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ（例えば、５×または６×ＳＣＣを含む４０％のホルムアミド）に相当する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ（例えば、５０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣ）に相当する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの如何によっては、塩基間のミスマッチが起こりうるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。核酸をハイブリダイズするための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、変数は周知である。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければそれだけ、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定度（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドに関して、Ｔｍを算出するための方程式が導き出された（前出Ｓａｍｂｒｏｏｋほかを参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリッドに関して、ミスマッチの位置がより重要となり、そしてそのオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（前出Ｓａｍｂｒｏｏｋほかを参照）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸のための最小の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド；およびより好ましくは長さが少なくとも約２０個のヌクレオチドである。
【０１０７】
特定の実施態様において、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは、５５℃のＴｍをいい、そして前述のような条件を利用する。好ましい実施態様において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施態様では、Ｔｍは６５℃である。
【０１０８】
本発明の目的のための「高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」は、以下の条件を意味することが理解される：
１−膜競合（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）およびプレハイブリダイゼーション。
−混合：４０μｌサケ精液ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
＋４０μｌヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
−９６℃で５分間変性し、次いで氷中に混合物を浸漬する。
−２×ＳＳＣを取り除いて、４ｍｌのホルムアミドミックスを膜を含むハイブリダイゼーション管に注入する。
−２つの変性ＤＮＡの混合物を加える。
−４２℃で５〜６時間、回転しながらインキュベートする。
【０１０９】
２−標識プローブの競合：
−  リピートの量に従って、標識および精製されたプローブに１０〜５０μｌのＣｏｔ Ｉ ＤＮＡを添加する。
−  ９５℃で７〜１０分間変性させる。
−  ２〜５時間、６５℃でインキュベートする。
３−ハイブリダイゼーション：
−  プレハイブリダイゼーションミックスを除去する。
−４０μｌのサケ精子ＤＮＡ＋４０μｌのヒト胎盤ＤＮＡを混合し、９６℃で５分間変性し、次いで氷中に浸漬する。
−４ｍｌのホルムアミドミックス、２つのＤＮＡの混合物および変性標識プローブ／Ｃｏｔ Ｉ ＤＮＡをハイブリダイゼーション管に添加する。
−４２℃で１５〜２０時間回転しながらインキュベートする。
【０１１０】
４−洗浄および露光：
−すすぎのために２×ＳＳＣ中、室温で１回洗浄する。
−２回、５分、室温で２×ＳＳＣおよび６５℃で０．１％ＳＤＳ。
−２回、１５分、６５℃で０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ。
−透明なプラスチックラップ中に膜を包んで、そして露光する。
【０１１１】
上記したハイブリダイゼーション条件は、高いストリンジェンシー条件下で、２０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドまで長さが変化する核酸の分子のハイブリダイゼーションに適応される。上記したハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知の技術に従って、ハイブリダイゼーションが求められる核酸または選択された標識の型の関数として調整されることは言うまでもない。適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５、前出）によるマニュアルに含まれる教示によって調整することができる。
【０１１２】
本明細書中で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」は一般的に少なくとも１５個のヌクレオチドの核酸をいい、本発明による核酸にハイブリダイズ可能である。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチドまたはビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドを用いて標識することができる。１つの実施態様において、標識オリゴヌクレオチドは、本発明のＡＢＣＡ５−６、９−１０ポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するためにプローブとして使用することができる。もう一つの実施態様では、オリゴヌクレオチド（標識することができる一方または両方）が、ＰＣＲプライマーとして、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０核酸のいずれか１つの全長または断片をクローニングするため、またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードする核酸の存在を検出するためのいずれかのために使用することができる。
【０１１３】
さらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０  ＤＮＡ分子のいずれか１つを用いてトリプルヘリックスを形成することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸シンセサイザによって合成的に調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合のような非自然的に生じたホスホエステルアナログ結合によって調製され得る。
【０１１４】
「相同組換え」は、染色体におけるベクターの外来ＤＮＡ配列の挿入をいう。好ましくは、ベクターは、相同組換えのための特定の染色体部位を標的化する。特定の相同組換えのために、ベクターは、染色体の配列に対して十分に長い相同領域を含み、染色体へのベクターの相補的結合および取り込みを可能にする。相同領域が長ければ長いほど、および配列類似性の程度が大きければ大きいほど、相同組換えの効率を増加することができる。
【０１１５】
ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列の制御下におかれた場合インビトロまたはインビボの細胞中でポリペプチドに転写および翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５′（アミノ）末端の開始コドンおよび３′（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列をも含むことができるが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、通常、コード配列に対して３′に位置する。
【０１１６】
転写および翻訳制御配列は、ＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネータなどであり、宿主細胞のコード配列の発現を提供する。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは、制御配列である。
【０１１７】
「調節領域」は、核酸の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、本来、特定の核酸（相同領域）を発現させる役割を果たす配列を含むか、または異なる起源の配列（異なるタンパク質または合成タンパク質さえ発現させる役割を果たす）を含むことができる。特に、この配列は、特異的もしくは非特異的様式ならびに誘導性もしくは非誘導性の様式において遺伝子の転写を刺激するかまたは抑制する、真核もしくはウイルス遺伝子の配列、または誘導された配列であり得る。調節領域は、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、エンハンサー、転写終結配列、標的細胞の分泌経路へポリペプチドを導くシグナル配列、及びプロモーターを含む。
【０１１８】
「異種供給源」由来の調節領域は、発現される核酸と自然には関係しない調節領域である。異種調節領域中に含まれるのは、異なる種由来の制御領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列および自然に存在しないが当業者により設計される調節配列である。
【０１１９】
「カセット」は、特定の制限部位でベクターに挿入されることができるＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡのセグメントは関心のあるポリペプチドをコードし、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のための適当な読み枠のカセットの挿入を確実にするよう設計される。
【０１２０】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして下流の（３′方向の）コード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な、塩基またはエレメントの最少限の数を含むプロモーター配列は、転写開始部位により３′末端に結合され、そして上流（５′方向）に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることにより都合よく規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【０１２１】
コード配列は、ＲＮＡポリメレラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、ついでｔｒａｎｓ−ＲＮＡがスプライシングされてコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される場合、細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【０１２２】
「シグナル配列」がタンパク質のコード配列の最初に含まれ、細胞の表面上で発現される。この配列は、成熟ポリペプチドのＮ末端にあるシグナルペプチドをコードし、これは宿主細胞に、ポリペプチドを転移するよう導く。用語「転移シグナル配列」は、シグナル配列の種類をいうために本明細書中で使用される。転移シグナル配列は、真核生物および原核生物に固有の種々のタンパク質に関連していることが見出され、そしてしばしば両方のタイプの生物において機能的である。
「ポリペプチド」は、共有結合のアミノ酸残基を含む重合化合物である。
【０１２３】
アミノ酸は、以下の一般的構造を有する：
【化１】
2004521620.tif 000002
【０１２４】
アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族化合物側鎖、（２）ヒドロキシ（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合されたイミノ酸。
【０１２５】
「タンパク質」は、生細胞において構造的および機能的な役割を果たすポリペプチドである。
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化または、非グリコシル化され得る。
【０１２６】
「相同性」は、共通の進化起源を反映した配列の類似性を意味する。ポリペプチドまたはタンパク質は、それらのアミノ酸の実質的な数が（１）同一であるかまたは（２）化学的に類似のＲ側鎖を有するいずれかの場合、相同性または類似性を有するといえる。それらのヌクレオチドの実質的な数が同一である場合、核酸は相同性を有するといえる。
【０１２７】
「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、その天然状態でそこに通常結合されるそれらの化合物の実質的に遊離のポリペプチドまたはタンパク質である（例えば他のタンパク質またはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質）。「単離された」は、他の化合物との人工的もしくは合成混合物、または生物学的活性を妨げず、そして例えば不完全な精製、安定剤の添加、または製薬上許容され得る製剤中への混合に起因して存在し得る不純物の存在を除くことを意味しない。
【０１２８】
本発明によるポリペプチドの「断片」は、アミノ酸配列が参照ポリペプチドのアミノ酸配列より短く、そしてこれらの参照ポリペプチドを含む全体の部分に同一アミノ酸配列を含むポリペプチドを意味することが理解される。このような断片は、場合によって、それらが一部であるより大きいポリペプチド中に含まれることができる。本発明によるポリペプチドのこのような断片は、５，１０，１５，２０，３０〜４０，５０，１００，２００または３００のアミノ酸の長さを有することができる。
【０１２９】
本発明によるポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の、１つもしくはそれ以上の置換、付加または欠失を含むポリペプチドを主に意味することが理解され、そしてアミノ酸置換が保存的または非保存的のいずれかであり得ることが理解される。
【０１３０】
ポリペプチドまたはタンパク質の「変異体」は、ポリペプチドまたはタンパク質に由来し、そしてそのポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する任意のアナログ、断片、誘導体、または突然変異体である。ポリペプチドまたはタンパク質の異なる変異体は、天然に存在することができる。これらの変異体は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における違いにより特徴付けられた、対立遺伝子の変異体であっても、または差示的スプライシングまたは翻訳後修飾を伴ってもいい。変異体としてはまた、実質的に同じ生物学的活性を有するが、異なる種から得られる関連するタンパク質が挙げられる。
【０１３１】
当業者は、１つであるかまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を有する変異体を作成することができる。これらの変異体は、なかでも：（ａ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸によって置換されている変異体、（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されている変異体、（ｃ）アミノ酸の１つまたはそれ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および（ｄ）ポリペプチドまたはタンパク質が血清アルブミンのような他のポリペプチドと融合している変異体を含むことができる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的、および酵素的技術を含むこれらの変異体を得るための技術は、当業者にとって公知である。
【０１３２】
他のｍＲＮＡスプライシング型および他の翻訳後修飾型を含む、このような対立遺伝子変異、アナログ、断片、誘導体、突然変異体および修飾が、ポリペプチドの任意の生物学的特性を保有するポリペプチドの誘導体を生じる場合、それらは本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【０１３３】
「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントが付随のセグメントの複製をもたらすように付随することができるプラスミド、ウイルス、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自動化ユニット、すなわちそれ自体の制御下で複製が可能なユニットとして機能する任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【０１３４】
本発明はまた、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣ１０ポリペプチドの任意のアナログおよび誘導体をコードする遺伝子を含むクローニングベクターに関し、これは、他の種由来のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０ポリペプチドおよびそれらのホモログと同じであるかまたは相同の機能活性を有する。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０に関する誘導体およびアナログの産生および使用は、本発明の範囲内にある。特定の実施態様において、誘導体またはアナログは、機能的に活性であり、すなわち、本発明の全長、野性型ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドと関連する１つまたはそれ以上の機能活性を示すことが可能である。
【０１３５】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、付加または欠失によってコードしている核酸配列を変えることにより作製することができる。好ましくは、生来のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０と比較して強化または増化した機能活性を有する誘導体が作製される。あるいは、このような誘導体は、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの天然のリガンドに対する同じかまたはより大きい親和性を有する、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０細胞外ドメインの可溶な断片をコードすることができる。このような可溶な誘導体は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０と結合しているリガンドの強力なインヒビターであってもよい。
【０１３６】
ヌクレオチドコード配列の縮重のために、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子のそれと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、本発明の実施において使用することができる。これらとしては、対立遺伝子、他の種由来の相同遺伝子、および配列内に同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変えられ、従ってサイレント変化を生じる、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣ１０遺伝子の全てまたは一部を含むヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。同様に、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０誘導体は、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基が保存的なアミノ酸置換を生じる配列内の残基と置換される変えられた配列を含む、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の全てか一部を含む誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。例えば、配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用し、サイレントな変更を生じる類似した極性の他のアミノ酸によって置換され得る。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性の）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。芳香族の環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。中性の極性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって定まる見かけの分子量に影響を及ぼすとは思われない。
【０１３７】
特に好適な置換は、以下の通りである：
−正電荷が維持されるように、ＡｒｇをＬｙｓに、およびその逆；
−負電荷が維持されるように、ＡｓｐをＧｌｕに、およびその逆；
−遊離−ＯＨが維持されるように、ＴｈｒをＳｅｒに；および
−遊離ＣＯＮＨ２が維持されるように、ＡｓｎをＧｌｎに。
【０１３８】
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するために導入することができる。例えば、Ｃｙｓは、他のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的部位として導入することができる。Ｈｉｓは、特に「触媒」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、そして生化学触媒作用の最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、その特に平面的な構造のために導入され、これはタンパク質構造中にｂ−ターンを誘導することができる。
【０１３９】
本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０誘導体およびアナログをコードする遺伝子は、公知技術の種々の方法により産生することができる。それらの産生を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローニングされたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０配列は、公知技術の任意の多数の戦略によって修飾することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか（１９８９）前出）。配列は、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断され、その後さらに所望され、単離され、そしてインビトロで連結される場合、酵素で修飾することができる。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つの誘導体またはアナログをコードする遺伝子の産生は、修飾された遺伝子がＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子と同じ翻訳解読枠内に維持され、所望の活性がコードされる領域で翻訳終止シグナルによって中断されないことを確実にしなければならない。
【０１４０】
さらに、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０−コード核酸を、インビトロまたはインビボで突然変異させ、翻訳、開始、および／もしくは終結配列を作成および／もしくは破壊し、あるいはコード領域において変異を作成および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するかもしくは既存の部位を破壊し、インビトロでの修飾をさらに容易にすることができる。好ましくは、このような突然変異は、突然変異したＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子産物の機能的な活性を強化する。公知技術の突然変異誘発のいかなる技術も使用することができ、なかでも、インビトロでの部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，（１９７８）Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３： ６５５１； ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，（１９８４）ＮＡ， ３： ４７９−４８８； Ｏｌｉｐｈａｎｔら，（１９８６）Ｇｅｎｅ ４４： １７７； Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８３： ７１０； Ｈｕｙｇｅｎら，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）： ８９３−８９８）およびＴＡＢリンカーの使用（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。ＰＣＲ技術は、部位特異的突然変異誘発のために好まれる（Ｈｉｇｕｃｈｉ， １９８９， 「Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ」， ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｈ． Ｅｒｌｉｃｈ，編， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， 第６章， 頁６１−７０）。
【０１４１】
次いで、同定されかつ単離されたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子は、適当なクローニングベクターに挿入することができる。公知技術の多数のベクター−宿主系が、使用され得る。可能なベクターとしては、プラスミドまたは修飾されたウイルスを含むがこれらに限定されず、ベクター系は、使用される宿主細胞と共存できなければならない。ベクターの例としては、大腸菌、λ誘導体のようなバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣプラスミド誘導体のようなプラスミド、例えばｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ等が挙げられるがこれらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着端を有するクローニングベクターに、ＤＮＡ断片を結合することにより達成され得る。しかし、ＤＮＡを断片化するために用いられる相補的制限部位が、クローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端は、酵素的に修飾することができる。あるいは、所望されるいかなる部位も、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することにより産生され；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等を介して宿主細胞に導入することができ、その結果遺伝子配列の多くのコピーが生成される。好ましくは、クローン化遺伝子は、シャトルベクタープラスミド上に含まれ、このことは、クローニング細胞、例えば大腸菌の拡大、および適当な発現細胞系への後の挿入のための容易な生成をこのようなことが望まれるならば提供する。例えば、複数のタイプの生物において複製することができるベクターであるシャトルベクターは、大腸菌およびサッカロミケスの両方の複製ために、大腸菌プラスミド由来の配列を、酵母２ｍプラスミド由来の配列と結合することにより作製することができる。
【０１４２】
代替方法では、所望の遺伝子を同定し、適切なクローニングベクターへの「ショットガン」アプローチでの挿入後、単離することができる。例えばサイズ分画による所望の遺伝子についての富化は、クローニングベクターへの挿入前にすることができる。
【０１４３】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドまたはそれらの抗原性断片、誘導体もしくはアナログ、またはそれらのキメラタンパク質を含む機能的に活性な誘導体をコードするヌクレオチド配列は、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。このようなエレメントは、本明細書中で「プロモーター」と呼ばれる。従って、本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする核酸は、本発明の発現ベクターにおけるプロモーターと操作上結合される。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方が、クローニングされ、そしてこのような調節配列の制御下で発現され得る。発現ベクターはまた、好ましくは複製起点を含む。
【０１４４】
必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に提供され得るか、またはそれらはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０をコードする生来の遺伝子および／またはそのフランキング領域により供給され得る。
【０１４５】
潜在的な宿主−ベクター系としては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡによって形質転換されたバクテリアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において異なる。利用される宿主−ベクター系に従い、多くの適切な転写および翻訳エレメントのいずれか１つが、使用され得る。
【０１４６】
本発明の組換えＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質、またはそれらの機能的断片、誘導体、キメラ構築物、もしくはアナログが、組換えによるコード配列の組み込み後、染色体に発現され得る。この点に関しては、多くの増幅系のいずれも、安定な遺伝子発現の高水準を達成するために使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９前出を参照）。
【０１４７】
本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む組換えベクターが導入された細胞が、その細胞によってＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの発現を提供する条件下で適当な細胞培養培地中で培養される。
【０１４８】
クローニングベクターへのＤＮＡ断片の挿入について以前に記載されている任意の方法が、適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するために用いられ得る。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え（遺伝子組換え）を含むことができる。
【０１４９】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの発現は、公知技術である任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択される宿主において機能的でなければならない。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子発現を制御するために用いることができるプロモーターとしては、以下が挙げれるが、これらに制限されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１ Ｎａｔｕｒｅ ２９０： ３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３′長末端反複に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０ Ｃｅｌｌ ２２： ７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ７８： １４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２ Ｎａｔｕｒｅ ２９６： ３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら， １９７８ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ７５： ３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら， １９８３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８０： ２１−２５）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， １９８０，２４２： ７４−９４における「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」もまた参照のこと；酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ ４、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用さされる、動物の転写調節領域：膵臓の腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら， １９８４ Ｃｅｌｌ ３８： ６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚら， １９８６ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０： ３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７）；膵臓のβ細胞において活性であるインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５ Ｎａｔｕｒｅ： ３１５： １１５−１２２）、リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， １９８４ Ｃｅｌｌ ３８： ６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓら， １９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１８： ５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， １９８７ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： １４３６−１４４４）、精巣細胞、胸部細胞、リンパ細胞、およびマスト細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら， １９８６ Ｃｅｌｌ ４５： ４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， １９８７ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １： ２６８−２７６）、肝臓において活性なアルファ胎仔タンパク質遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， １９８５ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： １６３９−１６��８； Ｈａｍｍｅｒら， １９８７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５： ５３−５８）、肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら， １９８７ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １： １６１−１７１）、ミエロイド細胞において活性なβ‐グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら， １９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１５： ３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓら， １９８６ Ｃｅｌｌ ４６： ８９−９４）、脳中の希突起こう細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， １９８７ Ｃｅｌｌ ４８： ７０３−７１２）、ミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ， １９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２８３−２８６）、および視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出遺伝子（Ｍａｓｏｎら， １９８６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４： １３７２−１３７８）。
【０１５０】
本発明のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、５つの一般的アプローチ：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特異的なｍＲＮＡのポリメレラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在または非存在、（ｄ）適当な制限エンドヌクレアーゼを用いた分析、および（ｅ）挿入された配列の発現によって同定され得る。第１の方法において、核酸は、増幅された産物の検出を提供するためにＰＣＲによって増幅することができる。第２の方法において、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第３の方法において、組み換えベクター／宿主系は、ベクター中の外来遺伝子の挿入により生じる特定の「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルス中の閉塞体形成（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等の存在または非存在に基づいて同定され、かつ選択され得る。他の例では、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸は、ベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入される場合、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０核酸挿入物を含む組換え体は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０遺伝子機能の非存在により同定され得る。第４の方法において、組換え発現ベクターは、適当な制限酵素を用いた消化により同定される。第５の方法において、組換え発現ベクターは、組換え体により発現された遺伝子産物の活性、生物化学的または免疫学的特性をアッセイすることによって同定することができる。
【０１５１】
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせは、本発明の核酸を発現させることに使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体性、非染色体性および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることができる。適切なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌性プラスミドの誘導体、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら， １９８８， Ｇｅｎｅ ６７： ３１−４０）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージ１の多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、ならびに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および糸状性一本鎖ファージＤＮＡ；２ｍプラスミドのような酵母プラスミドまたはその誘導体；真核細胞に有用なベクター、例えば昆虫または哺乳動物細胞に有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するために修飾されたプラスミド等が挙げられる。
【０１５２】
例えば、バキュロウイルス発現系において、非融合性（ｎｏｎ−ｆｕｓｉｏｎ）トランスファーベクターおよび融合性トランスファーベクターの両方が使用され得、非融合性トランスファーベクターとしては、例えばｐＶＬ９４１（ＢａｍＨｌクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨｌ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲｌ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩクローニング部位； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨｌクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（青／白組換えスクリーニング可能な、ＢａｍＨｌ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるがこれらに限定されず、そして融合性トランスファーベクターとしては、例えばｐＡｃ７００（ＢａｍＨｌおよびＫｐｎＩクローニング部位、ここでＢａｍＨｌ認識部位は開始コドンから始まる； Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（異なる読み枠を有するｐＡｃ７００と同じもの）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの下流、ＢａｍＨｌクローニング部位３６塩基対； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨｌ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、およびプラークの青／白組換えスクリーニングを伴う３つの異なる読み枠； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０））が、使用され得るがこれらに限定されない。
【０１５３】
本発明における使用のために意図される哺乳動物発現ベクターとしては、誘導性プロモーターを有するベクター、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、例えばＤＨＦＲ発現ベクターを有する任意の発現ベクター、またはＤＨＦＲ／メトトレキセート同時増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、ここでベクターは、クローニングさらた遺伝子およびＤＨＦＲを両方発現するベクターを伴う；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６．１２（１９９１）を参照）が挙げられる。あるいは、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシイミン同時増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、ここでベクターは、グルタミ合成酵素およびクローニングされた遺伝子を発現する； Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）。もう一つの実施態様では、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームの発現を導くベクターを使用することができる（例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨｌ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成性ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨｌ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩおよびＫｐｎＩクローニング部位、構成性ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択可能マーカー； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導性メタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨｌ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択可能マーカー； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローノング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択可能マーカー； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択可能マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を介して精製可能で、そしてエンテロキナーゼによって切断されるＮ末端ペプチド； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。本発明に用いられる選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩおよびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびその他が挙げられる。本発明により用いられるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１，前出を参照）としては、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩク���ーニング部位、ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が挙げられる。
【０１５４】
酵母発現系はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを発現するために本発明により使用することができる。例えばちょうど２つ挙げてみると、非融合性ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または融合性ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨｌ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製され、エレテロキナーゼによって切断されるＮ末端ペプチド； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、本発明により使用することができる。
【０１５５】
一旦、特定の組換えＤＮＡ分子が同定および単離されると、公知技術のいくつかの方法がその増幅のために使用され得る。一旦適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターが多量に増幅および調製され得る。前に説明したように、使用することができる発現ベクターとしては、ほんの少し例を挙げれば、以下のベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ヒトまたは動物ウイルス（例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【０１５６】
さらに、挿入された配列の発現を調節するかまたは所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を、選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後の、プロセシングおよび修飾（例えばシグナル配列のグリコシル化、切断）のために特徴的でかつ特異的機構を有する。適当な細胞株または宿主系を、発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。例えば、細菌系の発現は、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生するために使用することができる。しかし、細菌中で発現される膜貫通ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０タンパク質は、適切に折りたたまれることができない。酵母における発現により、グリコシル化産物を産生することができる。真核細胞における発現は、異種タンパク質の「ネイティブな」グリコシル化および折りたたみの可能性を増加し得る。さらに、哺乳動物細胞における発現は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０活性を再構成または構成するための手段を提供し得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる範囲まで、プロセシング反応、例えばタンパク質分解性切断に影響を及ぼし得る。
【０１５７】
ベクターは、公知技術の方法によって所望の宿主細胞に導入される（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（ライソソーム融合）、遺伝子銃またはＤＮＡベクター輸送体の使用（例えばＷｕら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ９６３−９６７； ＷｕおよびＷｕ， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １４６２１−１４６２４； Ｈａｒｔｍｕｔら， １９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願番号第２，０１２，３１１号を参照）。
【０１５８】
外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞はこのようなＤＮＡにより「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型変化をもたらす場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換」されている。好ましくは、形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを形成している染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合される）べきである。
【０１５９】
必須膜タンパク質として発現される組換えマーカータンパク質は、標準的方法により、単離および精製され得る。通常、必須膜タンパク質は、界面活性剤（例えば以下に限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ポリオキシエチレンエステル、Ｉｐａｇｅｌ／ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（オクチルフェノキシ）−ポリエトキシエタノール、ジゴキシン、デオキシコール酸ナトリウム等、それらの混合物を含む）を用いて膜を溶解させることにより得られる。可溶化は、懸濁物の超音波処理によって高めることができる。タンパク質の可溶型は、培養液を回収するかまたは封入体を例えば上記のように、界面活性剤を用いた処理、および所望の場合超音波処理または他の機械的処理により可溶化することにより得ることができる。可溶化されるかまたは可溶なタンパク質は、さまざまな技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の相違、免疫沈降）を用いて、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準技術により単離することができる。
【０１６０】
あるいは、本発明による核酸またはベクターは、リポフェクションによりインビボで導入され得る。過去１０年の間、インビトロでの核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用は増加してきた。リポソーム仲介トランスフェクションが直面する問題点および危険を避けるために設計された合成陽イオン脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボでのトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７． ＰＮＡＳ ８４／７４１３）； Ｍａｃｋｅｙら（１９８８． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−８０３１）； Ｕｌｍｅｒら（１９９３． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １７４５−１７４８）。陽イオン脂質の使用は、負に荷電した核酸のカプセル化を促進することができ、更にまた負に荷電した細胞膜との融合を促進することができる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，（１９８９． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７： ３８７−３８８））。
【０１６１】
核酸の導入のために特に有用な化合物および組成物は、国際特許公開ＷＯ９５／１８８６３およびＷ０９６／１７８２３、ならびに米国特許番号５，４５９，１２７号に記載されている。インビボでの特定器官への外因性遺伝子導入のためのリポフェクションの使用は、特定の実質的利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的は、利点をもつある領域を表す。特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、細胞異種性（例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳）を有する組織において特に好ましいことは明らかである。脂質は、標的化を目的とするために他の分子に化学的に結合することができる［Ｍａｃｋｅｙらを参照、前出］。標的とされたペプチド、例えばホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合することができる。
【０１６２】
他の分子はまた、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用である（例えば陽イオンオリゴペプチド（例えば国際特許公開番号ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来したペプチド（例えば国際特許公開番号ＷＯ９６／２５５０８）、または陽イオンポリマー（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）。
【０１６３】
またインビボにベクターを裸のＤＮＡプラスミドとして導入することが可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号を参照）。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、公知技術の方法（例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用（Ｗｕら， １９９２，前出； ＷｕおよびＷｕ， １９８８前出； Ｈａｒｔｍｕｔら， １９９０年３月１５日に出願されたカナダ特許出願番号第２，０１２，３１１号； Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ２７２６−２７３０を参照）によって所望の宿主細胞に導入され得る。受容体仲介ＤＮＡ輸送方法もまた使用することができる（Ｃｕｒｉｅｌら， １９９２， Ｈｕｍｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３： １４７−１５４； ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： ４４２９−４４３２）。
【０１６４】
「製薬上許容され得るビヒクルまたは添加剤」としては、投与方法のために製薬上許容され、無菌であり、そして適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して処方される水性または油性懸濁液である希釈剤および充填剤が挙げられる。特定の製薬上許容され得る担体および担体と活性化合物との比率は、組成物の可溶性および化学的特性、投与の特定様式、ならびに標準的な薬務により決定される。
【０１６５】
本発明の任意の核酸、ポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞が、製薬上許容され得るビヒクルまたは添加剤においてインビボに好ましく導入される。句「製薬上許容され得る」は、ヒトに投与される場合、生理学的に許容され得るもので、代表的にはアレルギーまたは類似した厄介な反応、例えば胃不調、めまい等を生じない分子単位および組成物をいう。好ましくは、本願明細書において使われるように、用語「製薬上許容され得る」は、動物において、特にヒトにおいての使用のため、連邦または州政府の監査機関による承認を得るかまたは米国薬局方もしくは一般に認識された薬局方に記載されていることを意味する。用語「添加剤」は、化合物と共に投与される、希釈剤、アジュバント、添加剤または担体をいう。このような医薬担体は、無菌の液体、例えば水および油であり得、石油、動物、植物または合成物起源の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、胡麻油などを含む。水または水溶液、食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセリン水溶液が、特に注射可能溶液のために添加剤として使用される。適切な医薬品添加剤は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【０１６６】
当然、本発明は、遺伝子治療の応用のために、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの治療的有効量を発現させるベクターの送達を意図する。句「治療的有効量」は、本願明細書において、宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠損を、少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％まで緩和し、そしてさらにより好ましくは防止するのに十分な量を意味するために使用される。あるいは、治療的有効量は、宿主において臨床的に重要な状態の改善を生じるのに十分なものである。
【０１６７】
「脂質プロフィール」は、ヒトまたは他の動物の体における、コレステロール、トリグリセライド、リポタンパク質コレステロールおよび他の脂質の一組の濃度を意味する。
「望ましくない脂質プロフィール」は、コレステロール、トリグリセライドまたはリポタンパク質コレステロールの濃度が、年齢および性別に応じた基準の外にある状態である。通常、総コレステロールの濃度＞２００ｍｇ／ｄｌ、血漿トリグリセライドの濃度＞２００ｍｇ／ｄｌ、ＬＤＬコレステロールの濃度＞１３０ｍｇ／ｄｌ、ＨＤＬコレステロールの濃度＜３９ｍｇ／ｄｌ、または総コレステロール対ＨＤＬコレステロールの比率＞４．０が、望ましくない脂質プロフィールであると考えられる。望ましくない脂質プロフィールは、高脂血症、糖尿病、高コレステロール血症、動脈硬化および冠状動脈疾患の他の型を含む様々な病的状態と関係している。
【０１６８】
ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、Ａ１０遺伝子の核酸
出願人は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０と称される遺伝子の新規なヒトＡＢＣＡ様クラスターを同定した。出願人はまた、新規な遺伝子が接近して間隔を置いて配置され、染色体１７ｑ２４の同じ領域にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ１０、ＡＢＣＡ６、およびＡＢＣＡ９の順番でヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）で配置され、そして完全な輸送体をコードすることを決定した。
出願人はまた、各々のＡＢＣＡ遺伝子が固有の発現パターンを有し、対応するタンパク質が組織で特殊化された機能を果たすことを示唆する（実施例３）ものであることを決定した。
【０１６９】
結果において、発現パターンは、６．５ｋｂのＡＢＣＡ５転写産物が、ほぼユビキタスであるが、最も強い発現は、精巣、骨格筋、胎児の腎臓および胎児の肝臓で見出されることを示した。６ｋｂのＡＢＣＡ９転写産物は、心臓で見出され、そして弱いシグナルが、卵巣、小腸および精巣において検出された。７ｋｂ−長のＡＢＣＡ６転写産物は、肝臓および胎児の肝臓において強いシグナルによって検出され、より弱いシグナルは、心臓、腎臓（胎児および成体）、肺（胎児および成体）、大腸、小腸、卵巣および精巣において検出された。シグナルは、脳（胎児および成体）、膵臓、胎盤、骨格筋、白血球、膵臓、脾臓、胸腺の同じ条件においては検出されなかった。６．５ｋｂのＡＢＣＡ１０転写産物は、骨格筋および心臓において強くかつ特異的に検出された（図４）。
また、インサイチュハイブリダイゼーションでは、内皮細胞、脈管平滑筋およびシュワン細胞においてＡＢＣＡ９遺伝子の最も強い発現を示し、そしてＡＢＣＡ１０遺伝子のもっとも強い発現が、マクロファージ、リンパ球のサブセット、および神経のシュワン細胞において常に認められた。
【０１７０】
出願人は、さらに、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９およびＡＢＣＡ１０の完全なコード配列（ＣＤＳ）に対応し、そして本発明によるＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９遺伝子が３９エキソンおよび３８イントロンを含み、そして本発明によるＡＢＣＡ１０遺伝子が少なくとも４０エキソンおよび３９イントロンを含む、転写産物の配列を決定した。以下の表１は、スプライスドナースコアおよびアクセプタースコア（Ｒｉ、ｂｉｔｓ）を示し、このスコアは、他の哺乳動物遺伝子におけるエキソンのそれと一致する（Ｒｏｇａｎら， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ（１９９８）１２，１５３−１７１）。エキソンは、全ての遺伝子において正確に同じ位置にあるが、いくつかのエキソンの長さは変化する。さらに、これらの遺伝子間のエキソンサイズに関する高い相関係数（０．９９０−０．９９７）およびイントロンサイズおよびＲｉ値のいくつかの比較に関する重要な相関（０．２７−０．６４）が存在し、１７ｑ２４クラスター由来の遺伝子が共通祖先から重複によって生じたことを明らかに示唆する。
【０１７１】
【表１】
2004521620.tif 000003
【０１７２】
従って、出願人は、ヒトの新規なエキソン配列、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子を特徴づけたが、これは、試料中の対応するＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子またはヌクレオチド発現産物の検出の種々の手段の作成のため、本発明に従って特に有用である。
ＡＢＣＡ６遺伝子のいくつかのエキソンは、そのヌクレオチド配列により特徴付けられ、そして表２において同定される。
【０１７３】
【表２】
2004521620.tif 000004
【０１７４】
従って、本発明はまた、配列番号９〜４７のいずれか１つまたはその相補的配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号９〜４７のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号９〜４７のいずれか一つの少なくとも８つの連続ヌクレオチドを含む核酸に関する。
さらに、本発明の主題はまた、配列番号９〜４７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸である。
本発明はまた、配列番号９〜４７のいずれか１つを含む核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そしてさらにより好ましくは９８％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
本発明はまた、高いストリンジェント条件下で配列番号９〜４７のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸に関する。
ＡＢＣＡ９遺伝子のいくつかのエキソンは、それらのヌクレオチド配列により特徴付けられ、そして表３において同定される。
【０１７５】
【表３】
2004521620.tif 000005
【０１７６】
従って本発明はまた、配列番号４８〜８６のいずれか１つまたはその相補的配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号４８〜８６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号４８〜８６のいずれか１つの少なくとも８つの連続ヌクレオチドまたは相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
さらに、本発明の主題は、配列番号４８〜８６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸である。
本発明はまた、配列番号４８〜８６のいずれか１つを含む核酸と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％およびさらにより好ましくは９８％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
本発明はまた、高いストリンジェンシー条件下で配列番号４８〜８６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸に関する。
ＡＢＣＡ１０遺伝子のいくつかのエキソンは、それらのヌクレオチド配列により特徴付けられ、そして表４において特定される。
【０１７７】
【表４】
2004521620.tif 000006
【０１７８】
従って本発明はまた、配列番号８７〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号８７〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列、またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号８７〜１２６のいずれか１つの少なくとも８つの連続ヌクレオチドまたは相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
さらに、本発明の主題は、配列番号８７〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸である。
本発明はまた、配列番号８７〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％およびさらにより好ましくは９８％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
本発明はまた、高いストリンジェンシー条件下で配列番号８７〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸に関する。
【０１７９】
全長ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子
出願人はさらに、ヒトＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、およびＡ１０遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列および全コード配列を決定し、これは同じ第１７染色体クラスターに属し、そして全長ヒト対応タンパク質をコードする（実施例２）。
表５は、各遺伝子のｍＲＮＡ長、コーディングヌクレオチド配列長、ならびにタンパク質サイズを要約する。
【０１８０】
【表５】
2004521620.tif 000007
【０１８１】
ｃＤＮＡ配列ＡＢＣＡ５は、６５２５個のヌクレオチドからなり、そして１６４２個のアミノ酸（ａａ）のＡＢＣＡ５ポリペプチドに対応する４９２９個のヌクレオチドコード配列を含み、このポリペプチドは、コレステロール逆輸送または炎症性脂質メディエーター輸送と関連する障害に罹患していない被験者により産生される。配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する新規なヒトＡＢＣＡ５遺伝子のｃＤＮＡ分子は、１０１１位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始まり５９３９位のヌクレオチド（ＴＧＡ終止コドンの塩基Ａ）までのオープンリーディングフレームを含む。
【０１８２】
本発明によれば、配列番号１を含むＡＢＣＡ５ ｃＤＮＡは、配列番号５のアミノ酸配列を含む１６４２個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ５ポリペプチドをコードする。
配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する新規なヒトＡＢＣＡ６遺伝子のｃＤＮＡ分子は、１７６位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始まり５０２９位のヌクレオチド（ＴＡＡ終止コドンの２番目の塩基Ａ）までのオープンリーディングフレームを含む。ポリアデニル化シグナル（配列ＡＡＴＡＡＡ）が存在し、配列番号２の配列の５２８４位のヌクレオチドから始まる。
【０１８３】
本発明によれば、配列番号２を含むＡＢＣＡ６ ｃＤＮＡは、５２９６個のヌクレオチドからなり、そして配列番号６のアミノ酸配列を含む１６１７個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ６ポリペプチドをコードする４８５４個のヌクレオチドコード配列を含む。
配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する新規なヒトＡＢＣＡ９遺伝子のｃＤＮＡ分子は、１４４位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始まり５０１８位のヌクレオチド（ＴＡＡ終止コドンの２番目の塩基Ａ）までのコード配列を含む。
【０１８４】
本発明によれば、配列番号３を含むＡＢＣＡ９ ｃＤＮＡは、５９５９個のヌクレオチドからなり、そして配列番号７のアミノ酸配列を含む１６２４個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ９ポリペプチドをコードする４８７５個のヌクレオチドコード配列を含む。
配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する新規なヒトＡＢＣＡ１０遺伝子のｃＤＮＡ分子は、８８０位のヌクレオチド（翻訳開始のためのＡＴＧコドンの塩基Ａ）から始まり５５１１位のヌクレオチド（ＴＡＡ終止コドンの２番目の塩基Ａ）までのコード配列を含む。
【０１８５】
本発明によれば、配列番号４を含むＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡは、６１８１個のヌクレオチドからなり、そして配列番号８のアミノ酸配列を含む１５４３個のアミノ酸の全長ＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする４６３２個のヌクレオチドコード配列を含む。
従って、本発明は、配列番号１〜４またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【０１８６】
本発明はまた、配列番号１〜４に表されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明はまた、配列番号１〜４の少なくとも８個の連続したヌクレオチドまたはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
本発明の主題はまた、配列番号１〜４のヌクレオチドを含む核酸またはその相補的ヌクレオチド配列を有する核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸である。
【０１８７】
本発明はまた、配列番号１〜４のヌクレオチドを含む核酸またはその相補的ヌクレオチド配列を有する核酸と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そしてさらにより好ましくは９８％同一なヌクレオチドを有する核酸に関する。
本発明の別の主題は、高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜４のヌクレオチドを含む核酸またはその相補的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸に関する。
【０１８８】
本発明はまた、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明はまた、配列番号５〜８に表されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明はまた、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
本発明はまた、配列番号５〜８に表されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
本発明は、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも８０％同一なアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのペプチド断片に関する。
本発明はまた、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％およびさらにより好ましくは９８％同一なアミノ酸を有するポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含む本発明によるポリペプチドの４、５〜１０、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００または２００の連続するアミノ酸長を有する。
【０１８９】
４５〜６６％のアミノ酸配列の同一性を示すＡＢＣＡ１およびＡ４輸送体のように、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質もまた、表６〜１０に示されるように高い保存性を示す（図２）。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のアミノ酸配列のアラインメントは、配列全体に沿って４３〜６２％にわたる同一性を明らかにする（表６）。特に、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質は、それぞれ、Ｎ末端（表７）およびＣ末端（表８）膜貫通ドメイン（ＴＭＡおよびＴＭＮ）において３２〜６０％および３４〜４８％の同一性、ならびにＡＴＰ結合ドメインにおいて５６〜７７％の同一性を示す（ＮＢＤ１およびＮＢＤ２；表９および１０）。
【０１９０】
【表６】
2004521620.tif 000008
【０１９１】
【表７】
2004521620.tif 000009
【０１９２】
【表８】
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【０１９３】
【表９】
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【０１９４】
【表１０】
2004521620.tif 000012
【０１９５】
ＡＴＰ結合ドメインの系統発生分析は、Ｎ−およびＣ−末端ドメインが別々の枝を形成することを示す（図３）。１７ｑ２４遺伝子のＣ末端ＡＴＰ結合ドメインは、同じタンパク質のＮ末端ドメインに関するより他のＡＢＣ１様遺伝子のＣ末端ドメインに、より密接に関連する。従って、ＡＢＣ１サブファミリー全体は、単一の祖先の完全な輸送体遺伝子から生じたようである。しかし、１７ｑ２４クラスターにおける遺伝子は、ＡＢＣ１サブファミリー内で別個の群を形成する。
【０１９６】
ヌクレオチドプローブおよびプライマー
本発明による核酸（ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｃＤＮＡ）とハイブリダイズするヌクレオチドおよびプライマーもまた、本発明の一部を形成する。
本発明に従って、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つを含むポリヌクレオチドに由来する核酸断片またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸断片は、試料中において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１コピーまたはそれらの断片もしくは変異体（突然変異もしくは多形を含む）の存在を検出するのに有用である。
本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つを含むヌクレオチド配列、またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。
本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の少なくとも８個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１９７】
好ましくは、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明による核酸、特に配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の１０、１２、１５、１８または２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続する長さのヌクレオチドを有する。
あるいは、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーは、本発明による核酸、より詳しくは、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００個の連続する長さのヌクレオチドを有する断片からなり、および／またはそれらを含む。
【０１９８】
従って、本発明によるヌクレオチドプローブまたはプライマーの定義は、上記の高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを包含する。
好ましい実施態様によれば、本発明によるヌクレオチドプライマーは、配列番号１２７〜１４４のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的核酸配列を含む。
ＡＢＣＡ５遺伝子の種々の領域を増幅可能にするプライマーおよびプライマー対の例は、以下の表１１に示される。配列番号１内にある配列番号１２７〜１４４の各プライマーの位置およびそのハイブリダイズ領域が、表１１に示される。
略語「Ｃｏｍｐ」は、相補的核酸配列をいう。
【０１９９】
【表１１】
2004521620.tif 000013
【０２００】
好ましい実施態様によれば、本発明によるヌクレオチドプライマーは、配列番号１４５〜１７２のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補的核酸配列を含む。
ＡＢＣＡ６遺伝子の種々の領域を増幅可能にするプライマーおよびプライマー対の例は、以下の表１２に示される。配列番号１内にある配列番号１４５〜１７２の各プライマーの位置およびそのハイブリダイズ領域が、表１２に示される。  略語「Ｃｏｍｐ」は、相補的核酸配列をいう。
【０２０１】
【表１２】
2004521620.tif 000014
【０２０２】
【表１３】
2004521620.tif 000015
【０２０３】
好ましい実施態様によれば、本発明によるヌクレオチドプライマーは、配列番号１７３〜２０３のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補的核酸配列を含む。
ＡＢＣＡ９遺伝子の種々の領域を増幅可能にするプライマーおよびプライマー対の例は、以下の表１３に示される。配列番号１内にある配列番号１７３〜２０３の各プライマーの位置およびそのハイブリダイズ領域が、表１３に示される。
略語「Ｃｏｍｐ」は、相補的核酸配列をいう。
【０２０４】
【表１４】
2004521620.tif 000016
【０２０５】
【表１５】
2004521620.tif 000017
【０２０６】
好ましい実施態様によれば、本発明によるヌクレオチドプライマーは、配列番号２０４〜２１７のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補的核酸配列を含む。
ＡＢＣＡ１０遺伝子の種々の領域を増幅可能にするプライマーおよびプライマー対の例は、以下の表１４に示される。配列番号４内にある配列番号２０４〜２１７の各プライマーの位置およびそのハイブリダイズ領域が、表１４に示される。
略語「Ｃｏｍｐ」は、相補的核酸配列をいう。
【０２０７】
【表１６】
2004521620.tif 000018
【０２０８】
本発明による好ましいプローブおよびプライマーの特定の実施態様によれば、それらは、配列番号１２７〜２１７のいずれか１つを含むヌクレオチド配列またはその相補的核酸配列を有する核酸の全てもしくは一部を含む。
本発明によるヌクレオチドプライマーまたはプローブは、当業者に周知の任意の適切な方法により調製することができ、この方法としては、クローニングおよび制限酵素の作用による方法、またはＮａｒａｎｇら（１９７９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ６８：９０−９８）もしくはＢｒｏｗｎら（１９７９， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６８：１０９−１５１）によるホスホジエステル方法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， ２２： １８５９−１８６２）によるジエチルホスホラミダイト方法、もしくは欧州特許番号ＥＰ ０，７０７，５９２号に記載される固相支持体に関する技術のような技術に従う直接的化学合成による方法が挙げられる。
【０２０９】
上記オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを含む本発明による核酸の各々は、所望の場合、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段により検出され得るマーカーを組み込むことにより標識することができる。例えば、このようなマーカーは、放射性同位体（３２Ｐ，３３Ｐ，３Ｈ，３５Ｓ）、蛍光分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）またはビオチンのようなリガンドからなる。プローブの標識は、好ましくは、プライマーの伸長によるポリヌクレオチドへの標識された分子の組み込みにより、あるいは５′または３′末端への付加により実施される。核酸断片の非放射性標識の例は、特に仏特許第７８ １０９ ７５号において、またはＵｒｄｅａら（１９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１： ４９３７−４９５７）もしくはＳａｎｃｈｅｚｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２６（１０）： １９３４−１９３８）による論文に記載される。
【０２１０】
好ましくは、本発明によるヌクレオチドプローブおよびプライマーは、Ｕｒｄｅａら（１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ．， ２４： １９７−２００）によるか、あるいは欧州特許第ＥＰ−０，２２５，８０７（ＣＨＩＲＯＮ）に記載されるプローブのような、シグナルの増幅を可能にさせるタイプの構造的特徴を有し得る。
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、対応する転写産物の発現を試料中で追跡する場合、特にゲノムＤＮＡを用いたサザンタイプハイブリダイゼーション、あるいは対応するメッセンジャーＲＮＡを用いたノザンタイプハイブリダイゼーションにおいて用いることができる。
本発明によるプローブおよびプライマーはまた、ＰＣＲ増幅の産物の検出のため、あるいはミスマッチの検出のためにも用いることができる。
本発明によるヌクレオチドプローブおよびプライマーは、固体支持体上に固定することができる。このような固体支持体は、当業者に周知であり、マイクロタイタープレートのウェル、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースバンドまたはラテックス粒子のような微粒子、の表面を含む。
【０２１１】
従って、本発明はまた、試料中の、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列の核酸断片もしくは変異体の存在を検出する方法に関し、この方法は、以下の工程、
１）本発明による１つまたはそれ以上のヌクレオチドプローブまたはプライマーを試験される試料と接触させ、
２）試料中に存在するプローブおよび核酸との間で形成した複合体を検出する工程、を含む。
【０２１２】
本発明による検出方法の特定の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、支持体上に固定される。
別の態様によると、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、検出可能なマーカーを含む。
さらに、本発明は、試料中に本発明による核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、このボックスまたはキットは、
ａ）上記のような１つまたはそれ以上のヌクレオチドプローブまたはプライマー、
ｂ）適当な場合、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬、を含む。
【０２１３】
第１の態様によると、検出ボックスまたはキットは、プローブまたはプライマーが支持体上に固定される点で特徴付けられる。
第２の態様によると、検出ボックスまたはキットは、オリゴヌクレオチドプローブが検出可能なマーカーを含む点で特徴付けられる。
上記の検出キットの特定の実施態様によれば、このようなキットは、所定標的核酸を検出するか、あるいは本発明による核酸、より詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用することができる本発明による複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含む。
従って、支持体上に固定された本発明によるプローブは、「ＤＮＡチップ」のようなマトリックスに配列され得る。このような配列されたマトリックスは、特に米国特許第５，１４３，８５４号、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９０／１５０７０およびＷＯ ９２／１００９２に記載されている。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドプローブが高密度で固定された支持体マトリックスは、例えば、米国特許第５，４１２，０８７号および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ ９５／１１９９５に記載される。
本発明によるヌクレオチドプライマーは、本発明による核酸のいずれか１つ、およびより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列、または相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を増幅するために使用することができる。
特定の実施態様において、本発明によるヌクレオチドプライマーは、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つを含む核酸、または配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるような核酸、またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸を増幅するために使用することができる。
【０２１５】
本発明の別の主題は、本発明による核酸、およびより詳しくは試料中に含まれる、ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列、もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸、ｂ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列、もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を増幅する方法に関し、この方法は、
ａ）標的核酸の存在が疑われる試料を、増幅反応に必要な試薬の存在下で、ハイブリダイゼーション位置が、増幅が求められる標的核酸の５′側および３′側領域それぞれに位置する１対のヌクレオチドプライマーと接触させ、そして
ｂ）増幅された核酸を検出する工程、を含む。
上記のような増幅方法を実施するために、好ましくは、上記ヌクレオチドプライマーのいずれかが利用される。
【０２１６】
さらに、本発明の主題は、本発明による核酸、およびより詳しく配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列、もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列、もしくはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を増幅するためのボックスまたはキットであり、このボックスまたはキットは、
ａ）ハイブリダイゼーション位置が、増幅を求める標的核酸の５′側および３′側にそれぞれ位置する本発明による１対のヌクレオチドプライマー；および場合により
ｂ）増幅反応のために必要な試薬、を含む。
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、上記のような少なくとも１対のヌクレオチドプライマーを含む。
【０２１７】
さらに、本発明の主題は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の全てまたは一部を増幅するためのボックスまたはキットであり、このボックスまたはキットは、
１）ハイブリダイゼーション位置が、増幅を求める標的核酸の５′側および３′側それぞれに位置する１対のヌクレオチドプライマー；および場合により、
２）増幅反応に必要な試薬、を含む。
このような増幅ボックスまたはキットは、好ましくは、上記のような少なくとも１対のヌクレオチドプライマーを含む。
【０２１８】
本発明はまた、試料中における本発明による核酸の存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、このボックスまたはキットは、
ａ）本発明による１つまたはそれ以上のヌクレオチドプローブ
ｂ）適切な場合、ハイブリダイゼーション反応に必要な試薬、を含む。
第１の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが支持体上に固定される点で特徴付けられる。
第２の態様によれば、検出ボックスまたはキットは、ヌクレオチドプローブおよびプライマーが検出可能なマーカーを含む点で特徴付けられる。
【０２１９】
上記検出キットの特定の実施態様によれば、このようなキットは、関心のある標的核酸を検出するか、あるいは本発明による核酸のコード領域または非コード領域における突然変異を検出するために使用することができる本発明による複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを含む。本発明の好ましい実施態様によれば、標的核酸は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的核酸配列を含む。あるいは、標的核酸は、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸の核酸断片または変異体である。
本発明によれば、本発明によるプライマーは、一般的に、配列番号１２７〜２１７のいずれか１つまたはその相補的配列の全てもしくは一部を含む。
【０２２０】
本発明によるヌクレオチドプライマーは、特に、被験者を遺伝子決定する方法およびまたは集団を遺伝子決定する方法に有用であり、特に被験者における特定の対立遺伝子形態または対立遺伝子（ハプロタイプ）の群の特定の形態とこれらの被験者における特定の表現型（特徴）の存在との間の関係の研究、例えばコレステロール逆輸送および炎症シグナル脂質の欠損に関連した疾患を発症するこれらの被験者の傾向、あるいは候補染色体領域が染色体１７、より正確には１７ｑアームおよびさらにより正確には１７ｑ２４座に位置する病状を発症するこれら被験者の傾向の研究との関連で有用である。
【０２２１】
組換えベクター
本発明はまた、本発明による核酸を含む組換えベクターに関する。本発明の目的のために「ベクター」は、１本鎖または２本鎖形態のいずれかである環状または線形ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味することが理解される。
好ましくは、このような組換えベクターは、以下の核酸、
ａ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸、
ｂ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに表されるようなヌクレオチド配列含む核酸またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸、
ｃ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列含む核酸またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸の少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する核酸、
ｄ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸と少なくとも８０％同一なヌクレオチドを有する核酸、
ｅ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列の核酸と８５％、９０％、９５％、または９８％同一なヌクレオチドを有する核酸、
ｆ）配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸と、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸、
ｇ）配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
ｈ）配列番号５〜８から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、から選択される核酸を含む。
【０２２２】
第１の実施態様によれば、本発明による組換えベクターは、所望の細胞性宿主の形質転換またはトランスフェクションの後、そこで挿入される核酸を増幅するために使用される。
第２の実施態様によれば、本発明による組換えベクターは、本発明による核酸に加え、この核酸およびそのコードされたｍＲＮＡの転写および／または翻訳を導くかまたは制御する調節シグナルまたはヌクレオチド配列を含む発現ベクターに対応する。
【０２２３】
好ましい実施態様によれば、本発明による組換えベクターは、特に以下の成分、
（１）挿入される核酸の発現を調節するエレメントまたはシグナル、例えばプローブおよび／またはエンハンサー配列、
（２）このようなベクターに挿入される本発明による核酸内に含まれる、（１）に記載される調節エレメントまたはシグナルと一緒に配置されるヌクレオチドコード領域、および
（３）（２）に記載される核酸のヌクレオチドコード領域の転写の開始および終止のための適切な核酸、を含む。
【０２２４】
さらに、本発明による組換えベクターは、それらの増幅またはそれらの発現が求められる細胞宿主中における複製のための１つまたはそれ以上の起点、マーカーまたは選択マーカーを含むことができる。
一例として、細菌性プロモーターは、ＬａｃＩまたはＬａｃＺプロモーター、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λファージＰＲまたはＰＬプロモーターであり得る。
真核細胞についてのプロモーターは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ウイルスチミジンキナーゼプロモーターあるいはマウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターを含む。
【０２２５】
一般的に、適切なプロモーターの選択に関して、当業者は、好ましくは、上記で引用されるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． 第２版． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）による本、またはＦｕｌｌｅｒら（１９９６， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎ ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら（編））により記載される技術を参考にすることができる。
【０２２６】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つのゲノム配列の発現が求められる場合、好ましくは、大きい挿入配列を含むことが可能なベクターの利用がなされる。特定の実施態様において、バクテリオファージベクター、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９２， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， ８： １−１６； １９９４， Ｍａｍｍｇｅｎｏｍｅ， ５： ３９７−４０４）に記載される例えばＰＩバクテリオファージベクター（例えばベクターｐ１５８またはベクターｐ１５８／ｎｅｏ８）が好ましくは使用される。
本発明による好ましい細菌ベクターは、例えばベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）あるいはｐＡＡ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）のようなベクターである。
【０２２７】
他の市販のベクター、例えばベクターｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）もまた挙げられる。
それらにはまた、バキュロウイルス型のベクター、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来するＳｆ９系（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７１１）の細胞にトランスフェクトするために使用されるベクターｐＶＬ１３９２／１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）もある。
それらにはまた、２または５型のヒトアデノウイルスのようなアデノウイルスベクターもあり得る。
【０２２８】
本発明による組換えベクターはまた、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり得る。このようなアデノ随伴ベクターは、例えばＦｌｏｔｔｅら（１９９２， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ７： ３４９−３５６）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３： ３８２２−３８２８）、またはＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＢＡら（１９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍｇｅｎｅｔ．， ５９： ５６１−５６９）に記載される。
本発明によるポリヌクレオチドを発現させるために、後者が、宿主細胞に導入されなければならない。宿主細胞への本発明によるポリヌクレオチドの導入は、プライマー培養において、または細胞系の形態においてのいずれかで、細胞を形質転換するかまたは細胞にトランスフェクトするために、当業者に周知の技術により、インビトロで実施される。ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、およびＡ１０欠損に関連する疾患の予防または治療のために、インビボまたはエキソビボで本発明によるポリヌクレオチドの導入を実施することが可能である。
【０２２９】
宿主細胞への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを導入するために、当業者は、好ましくは、種々の技術、例えばリン酸カルシウム沈殿技術（Ｇｒａｈａｍら， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２： ４５６−４５７； Ｃｈｅｎら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ７： ２７４５−２７５２）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５： １１８８−１１９０）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ， １８９６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｌ．， ６： ７１６−７１８； Ｐｏｔｔｅｒら， １９８４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．， ８１（２２）： ７１６１−５）、直接微量注入法（Ｈａｒｌａｎｄら， １９８５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０１： １０９４−１０９５）、ＤＮＡを充填したリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕら， １９８２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｒｎｏｌ．， １４９： １５７−７６； Ｆｒａｌｅｙら， １９７９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ３３４８−３３５２）を参照することができる。
【０２３０】
一旦、ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されると、安定して細胞のゲノムに組み込まれ得る。組込みは、ゲノムの正確な部位での相同組換えにより達成されるか、またはランダムに組み込まれ得る。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、エピソーム断片の形態で宿主細胞において安定に維持され、このエピソームは、独立に、または細胞周期と同調した様式のいずれかで、その後者の保持および複製を可能にする配列を含む。
【０２３１】
特定の実施態様によれば、宿主細胞、特に哺乳動物から得られた宿主細胞に、インビボで本発明によるポリヌクレオチドを導入する方法は、適当な調節配列の制御下に置かれる、製薬上適合性を有するベクターおよび本発明による「裸の」ポリヌクレオチドを含む製剤が、選択される組織レベル、例えば心筋組織における局所注入により導入され、「裸の」ポリヌクレオチドがこの組織のミオサイトにより吸収される工程を含む。
【０２３２】
「裸の」ポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボにおける使用のための組成物は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９５／１１３０７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｓｅｒｍ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ）ならびにＴａｃｓｏｎら（１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）： ８８８−８９２）およびＨｕｙｇｅｎら（１９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２（８）： ８９３−８９８）による論文に記載される。
【０２３３】
本発明の特定の実施態様によれば、組成物は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボにおける産生を提供する。この組成物は、生理学的に許容され得るベクターの溶液中に、適当な調節配列の制御下に置かれたＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２３４】
選択される宿主生物に注入されるベクターの量は、注入部位により変わる。１つの指針として、約０．１と約１００μｇの間のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、動物の体に、好ましくは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０欠損に関連する疾患を発症しそうな患者に注入することができる。従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０欠損を患う患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物に関し、この組成物は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸と、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有する添加剤とを組み合わせて含むものである。
【０２３５】
好ましくは、このような組成物は、配列番号１〜４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸を含有し、ここでこの核酸は、適当な調節エレメントまたはシグナルの制御下に置かれる。
さらに、本発明の主題は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０欠損を患う患者または被験者の予防または治療を意図した医薬組成物であり、この組成物は、本発明による組換えベクターと、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有する添加剤とを組み合わせて含有する。
【０２３６】
本発明はまた、種々の形態の動脈硬化症の予防を意図した医薬の製造のため、またはより詳しく、コレステロール逆輸送または炎症性親油性物質輸送の機能不全を患う被験者の治療のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする本発明による核酸の使用に関する。
本発明はまた、種々の形態の動脈硬化症の予防を意図した医薬の製造のため、またはより詳しくコレステロール逆輸送または炎症性親油性物質輸送の機能不全を患う被験者の治療のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む、本発明による組換えベクターの使用に関する。
従って、本発明の主題はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質またはポリペプチドのいずれか１つをコードする本発明による核酸を含む組換えベクターである。
【０２３７】
本発明はまた、コレステロール逆輸送または炎症性の親油性輸送の機能不全と関連する疾患または状態の治療および／または予防を意図した医薬組成物の製剤化のための上記組換えベクターの使用に関する。
本発明はまた、本発明によるこのような組換えベクターを用いてエキソビボで遺伝的に修飾された細胞、または組換えベクターを産生する細胞の使用に関し、ここでこの細胞は、体内に移植され、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのインビボでの持続的かつ有効な発現を可能にする。
体遺伝子治療（ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の方法に有用なベクター、およびこのようなベクターを含む組成物。
【０２３８】
本発明はまた、ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、およびＡ１０欠損に関連した病状の治療のための新規な治療の取り組み方に関する。遺伝子治療による病理ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０欠損を治療する可能性を示すことにより、親油性物質の輸送に関係するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つをコードする遺伝子のインビボでの導入および発現による、公知技術の不都合に対する有利な解法を提供する。したがって、本発明は、例えば、動脈硬化症、炎症、心欠陥疾患、代謝疾患、親油性物質関連病理のような関連する病理の特異的かつ有効な治療を可能にする簡便な手段を提供する。
【０２３９】
遺伝子治療は、欠損または異常（突然変異、異常発現等）を直し、そして遺伝情報を影響を受けている細胞または器官に導入することにより、治療上関心のあるタンパク質の発現を引き起こすことにある。この遺伝情報は、器官から採取された細胞にエキソビボで導入され、次いでこの修飾された細胞が体に再導入されるか、または適当な組織にインビボで直接導入されるかのいずれかで導入される。この第２の場合、種々の技術、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐａｇａｎｏら（１９６７． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １： ８９１）の複合体、ＤＮＡおよび核タンパク質の複合体（Ｋａｎｅｄａら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ３７５）、ＤＮＡおよび脂質の複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら， １９８７， ＰＮＡＳ ８４： ７４１３）、リポソームの使用（Ｆｒａｌｅｙら， １９８０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５： １０４３１）等が関係するトランスフェクション技術が存在する。より最近では、遺伝子の導入のためのベクターとしてウイルスの使用が、これらの物理的なトランスフェクション技術の将来有望な代替技術として現われた。この関連で、種々のウイルスが、特定の細胞集団に感染する能力について試験された。特に、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびアデノウイルスである。
【０２４０】
従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードする遺伝子を導入し、そしてインビボで発現させることからなる、ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、またはＡ１０欠損に関連する病理の治療に関する新規な治療の仕方に関する。特に好ましいやり方では、出願は、少なくとも１つのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターを構築し、これらの組換えベクターをインビボに投与することが可能であり、そしてこの投与が、細胞病理学的効果を有さず、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のインビボでの安定かつ有効な発現を可能にすることを見出した。
【０２４１】
アデノウイルスは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つの導入および発現に特に有効なベクターを構成する。ベクターとしての組換えアデノウイルスの使用は、所望の治療的効果を生じるために十分な、この遺伝子の高レベルな発現を得ることを可能にする。遺伝子の安定な発現を可能にし得るレトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のような他のウイルスベクターもまた、特許請求の範囲内にある。
従って、本発明は、ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、およびＡ１０欠損の治療および予防の新規な取り組み方をおそらく提供するだろう。
そうであるから、本発明の主題はまた、親油性物質の代謝に関係する少なくとも１つのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質またはポリペプチドをコードする本発明による核酸を含む欠損組換えウイルスである。
【０２４２】
本発明はまた、ＡＢＣＡ５、Ａ６、Ａ９、またはＡ１０欠損の治療および／または予防のための使用であり得る医薬組成物の製造のためのこのような欠損組換えウイルスの使用に関する。
本発明はまた、本発明によるこのような欠損組換えウイルスを用いたエキソビボでの遺伝的に修飾された細胞、または欠損組換えウイルスを産生する細胞の使用に関し、そこでこの細胞が体内に移植され、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのインビボでの持続的かつ有効な発現を可能とする。
本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の発現に通常は関与しない器官におけるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の調節された発現を誘導し、かつ副作用を伴わないことから、特に有利である。特に、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の有意な放出が、本発明のベクターを産生する細胞、または本発明のベクターをエキソビボで感染させた細胞の移植により得られる。
【０２４３】
本発明に関連して産生されるこれらのＡＢＣタンパク質輸送体の活性は、ヒトまたは動物のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０型の活性であり得る。本発明に関連して使用される核酸配列は、例えば、１つまたはそれ以上のイントロン（ｇＤＮＡ）が挿入されるかもしれないｃＤＮＡからなる、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（レトロウイルスの場合）またハイブリッド構築物であり得る。また、合成または半合成配列であり得る。特に有利な方法においてはｃＤＮＡまたはｇＤＮＡが使用される。特に、ｇＤＮＡの使用は、ヒト細胞におけるより良好な発現を可能とする。本発明によるウイルスベクターへの取り込みを可能にするために、これらの配列は、好ましくは、特に適当な制限部位の挿入のため、部位指向性の突然変異誘発により修飾される。先行技術に記載される配列は、本発明による使用のために実際に構築されておらず、そして実質的な発現を得るために、事前の適応が必要であることがわかる。本発明の関連において、ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列の使用が好ましい。さらに、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つの誘導体をコードする構築物を使用することが可能である。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つの誘導体は、例えば、ネイティブな配列に関連した突然変異、欠失および／または付加により得られ、そして親油性物質輸送活性を保持する産物をコードする任意の配列を含む。これらの修飾は、当業者に公知の技術により行い得る（以下の一般的な分子生物学的技術を参照）。次いで、このようにして得られた誘導体の生物学的活性が、特に細胞からの基質の流出の測定例で示されるように、容易に測定することができる。本発明のための誘導体はまた、ネイティブな配列またはその断片をプローブとして使用して、核酸ライブラリーからのハイブリダイゼーションにより得ることができる。
【０２４４】
これらの誘導体は、特に、それらの結合部位に対する対するより高い親和性を有する分子、プロテアーゼに対するより大きい抵抗性を示す分子、より高い治療効果もしくはより少ない副作用、または場合により新しい生物学的特性を有する分子である。誘導体としてはまた、インビボでの発現を改善させる修飾されたＤＮＡ配列が挙げられる。
【０２４５】
第一の実施態様によれば、本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードするｃＤＮＡを含む欠損組換えウイルスに関する。本発明の好ましい別の実施態様において、欠損組換えウイルスは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードするゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。好ましくは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、それぞれ配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
本発明のベクターは、種々のウイルス型から調製することができる。好ましくは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはレトロウイルスに由来するベクターが使用される。直接投与のためもしくは移植を目的とする細胞のエキソビボでの修飾のためのアデノウイルス、または産生細胞の移植のためのレトロウイルスを使用することが好ましい。
【０２４７】
本発明によるウイルスは、欠損があり、つまりそれらは標的細胞において独立して複製することが不可能である。一般的に、従って、本発明の関連において使用される欠損ウイルスのゲノムは、感染した細胞における上記ウイルスの複製に必要な配列をとにかく欠いている。これらの領域は、除去されるか（完全にもしくは部分的に）または非機能的にされ、あるいは他の配列および特にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列で置換される。好ましくは、欠損ウイルスは、それにもかかわらずウイルス粒子のカプセル化に必要なゲノムの配列を保持する。
【０２４８】
より詳しくアデノウイルスに関しては、構造および特性が幾分変わる種々の血清型が特徴付けられている。これらの血清型の中には、２型もしくは５型（Ａｄ ２もしくはＡｄ ５）のヒトアデノウイルスまたは動物起源のアデノウイルス（出願番号ＷＯ ９４／２６９１４を参照）が、好ましくは本発明の関連において使用される。本発明の関連において使用することができる動物起源のアデノウイルスの中には、イヌ、ウシ、ネズミ（例：Ｍａｖｌ， Ｂｅａｒｄら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０） ８１）、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが記載されている。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルスである［例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］。好ましくは、ヒトまたはイヌまたは雑種起源のアデノウイルスが、本発明の関連で使用される。好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスは、ＩＴＲ、カプセル化を可能にする配列ならびにＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする配列を含む。好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、とにかくＥ１領域が非機能的にされる。さらにより好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子およびＥ２、Ｅ４およびＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つが非機能的である。考慮されるウイルス遺伝子は、当業者に公知の任意の技術により、そして特に完全抑制より、置換により、部分的欠失によりまたは考慮される遺伝子における１つまたはそれ以上の塩基の付加により、非機能的にすることができる。このような修飾は、例えば、遺伝子操作技術手段により、または突然変異誘発剤の手段による処理によりインビトロ（単離されたＤＮＡに関して）またはインサイチュで得ることができる。他の領域、特にＥ３（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）およびＬ５（ＷＯ９５／０２６９７）領域もまた、修飾され得る。好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノウイルスは、Ｅ１およびＥ４領域において欠失を含み、そしてＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードする配列が、不活性化されたＥ１領域のレベルで挿入される。別の好ましい実施態様によると、Ｅ１領域に欠失を含み、このレベルでＥ４領域およびＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードする配列（仏特許出願ＦＲ９４ １３３５５）が挿入される。
【０２４９】
本発明による欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の技術により調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら， １９９１ Ｇｅｎｅ １０１； ＥＰ １８５ ５７３；およびＧｒａｈａｍ， １９８４， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３： ２９１７）。特に、それらは、アデノウイルスと、特に、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を運ぶプラスミドとの間での相同組換えにより調製することができる。相同組換えは、適当な細胞株への上記アデノウイルスおよびプラスミドの同時トランスフェクションの後に起こる。使用される細胞株は、好ましくは、（ｉ）上記エレメントによる形質転換が可能であり、そして（ｉｉ）好ましくは組換えの危険を回避するために組込み形態において欠損アデノウイルスゲノムの一部を補うことが可能な配列を含んだほうがよい。細胞株の一例として、特に、ゲノムに組み込まれたＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左部分（１２％）を含むヒト胚腎臓株２９３（Ｇｒａｈａｍら， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３６： ５９）、または特に出願番号ＷＯ ９４／２６９１４およびＷＯ ９５／０２６９７に記載されるようなＥ１およびＥ４機能を補うことが可能な株が挙げられる。
【０２５０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関して、それらは比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスであり、安定かつ部位特異的方法でそれらが感染する細胞のゲノムに組み込まれる。それらは、細胞成長、形態、または分化に関して任意の効果を誘導することなく、細胞の広範な感染を可能にする。さらに、それらは、ヒトにおける病理に関与しないようである。ＡＡＶのゲノムがクローニングされ、配列決定され、そして特徴付けられた。約４７００個の塩基を含み、各末端に約１４５個の塩基の逆位反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはウイルスのための複製起点として働く。このゲノムの残りは、カプセル化機能を運ぶ２つの必須領域に分けられる。すなわちウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分とウイルスカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右側部分である。
【０２５１】
インビトロおよびインビボにおける遺伝子の導入のためのＡＡＶに由来するベクターの使用が、文献に記載されている（特にＷＯ ９１／１８０８８； ＷＯ ９３／０９２３９；ＵＳ ４，７９７，３６８， ＵＳ５，１３９，９４１， ＥＰ ４８８ ５２８を参照）。これらの出願は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が関心のある遺伝子により欠失および／または置換された、ＡＡＶに由来する種々の構築物、ならびにインビトロ（培養中の細胞において）もしくはインビボ（生物に直接）での上記関心のある遺伝子の導入のための使用を記載する。しかし、これらの文献には、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つのインビボもしくはエキソビボにおける導入および発現に関する組換えＡＡＶの使用、またはこのような導入の利点を記載または示唆のいずれもしていない。本発明による欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆位反復領域（ＩＴＲ）に隣接するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする配列を含むプラスミド、ならびにＡＡＶカプセル化遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を運ぶプラスミドの、ヒトヘルペスウイルス（例えばアデノウイルス）に感染された細胞株中への同時トランスフェクションにより調製され得る。次いで、産生された組換えＡＡＶは、従来技術により精製される。
【０２５２】
ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに関して、組換えベクターの構築は、文献に十分記載されている：特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら（１９９１． Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ， ３： ２０３）； ＥＰ ４５３２４２， ＥＰ１７８２２０， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（１９８５）； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，（１９８５． ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３： ６８９）等を参照のこと。
【０２５３】
特に、レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）である。レトロウイルスのゲノムは、基本的に２つの長い末端反復（ＬＴＲｓ）、カプセル化配列および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。レトロウイルスに由来する組換えベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、完全にかまたは部分的に欠失しているのが一般的で、関心のある異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、以下の種々のタイプのレトロウイルスから産生することができる：特に、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」；ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーヴェイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）またはフレンドウイルス。
【０２５４】
本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、特にＬＴＲ、カプセル化配列および上記コード配列を含むプラスミドが、一般に構築され、次いでいわゆるカプセル化細胞株にトランスフェクトするために使用され、伝達において（ｉｎ ｔｒａｎｓ）プラスミドにおけるレトロウイルスの機能欠損を提供することが可能である。従って、一般的に、カプセル化株は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現することが可能である。このようなカプセル化株は、先行文献に記載されており、そして特にＰＡ３１７株（ＵＳ  ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣＲＩＰ株（ＷＯ ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２株（ＷＯ ８９／０７１５０）である。さらに、組換えレトロウイルスは、転写活性を抑制するためにＬＴＲのレベルに修飾、ならびにｇａｇ遺伝子（Ｂｅｎｄｅｒら， １９８７， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ６１： １６３９）の一部を含む伸長されたカプセル化配列を含み得る。次いで産生される組換えレトロウイルスは、従来の技術により精製される。
【０２５５】
本発明を実施するために、欠損組換えアデノウイルスを使用するのが好ましい。アデノウイルスの特に有利な特性は、親油性基質の輸送活性を有するタンパク質のインビボでの発現に対して好ましい。本発明によるアデノウイルスベクターは、精製された懸濁剤のインビボでの直接投与、または移植を考慮して、細胞、特に自家細胞のエキソビボでの形質転換に特に好ましい。さらに、本発明によるアデノウイルスベクターは、特に非常に高い感染効率のようなさらに重要な利点を示し、これは、少量のウイルスの懸濁剤を使用して感染を実施することを可能にする。
【０２５６】
本発明の別の特に好ましい実施態様によれば、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする配列を含むレトロウイルスベクターを産生する株が、インビボでの移植のために使用される。この目的に使用することができる株は、特に修飾されたＰＡ３１７（ＵＳ ４，８６１，７１９）、ＰｓｉＣｒｉｐ（ＷＯ ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＵＳ ５，２７８，０５６）細胞であり、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸配列を含むレトロウイルスの産生を可能にする。例えば、全能性幹細胞、血液細胞株の前駆体が、被験者から採取かつ単離される。次いで、これらの細胞は、培養されるときに、ウイルスプロモーター、非ウイルスプロモーターもしくはマクロファージに特異的な非ウイルスプロモーターの制御下、またはそれ自体のプロモーターの制御下で、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする配列を含むレトロウイルスベクターにより感染させることができる。次いで、これらの細胞が、被験者に再導入される。これらの細胞の相違は、少なくとも１つのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質を発現する血液細胞に原因がある。
【０２５７】
好ましくは、本発明のベクターにおいて、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つをコードする配列は、感染された細胞中での発現を可能にするシグナルの制御下に置かれる。これらのシグナルは、相同または非相同である発現シグナルであり得、すなわち、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の発現に自然的に関与するものと異なるシグナルであり得る。それらはまた、特に他のタンパク質の発現に関与する配列、または合成配列である。特に、それらは、真核生物遺伝子もしくはウイルス遺伝子の配列、または誘導された配列であり、特定の様式またはその逆の様式および誘導性の様式またはその逆の様式で、遺伝子の転写を刺激または抑制する。１例として、それらは感染のために所望される細胞のゲノム、またはウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列、および特にアデノウイルスのＥ１ Ａもしくは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲ等であり得る。真核生物プロモーターの中で、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）、治療遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたはＶＩＩＩ型因子等）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸管タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞αアクチンのプロモーター、肝臓に特異的なプロモーター；Ａｐｏ ＡＩ、Ａｐｏ ＡＩＩ、ヒトアルブミン等）、または刺激に応じたプロモーター（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体等）もまた挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列等の付加により修飾することができる。さらに、挿入された遺伝子が発現配列を含まない場合、その遺伝子は、このような配列の欠損ウイルス下流のゲノムに挿入され得る。
【０２５８】
特定の実施態様において、本発明は、ＲＳＶ−ＬＴＲまたはＣＭＶ初期プロモーターから選択されるプロモーターの制御下にＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む欠損組換えウイルスに関する。
上記のように、本発明はまた、親油性基質の輸送に関連した病理の治療および／または予防のため、医薬組成物の調製のための上記のようなウイルスの任意の使用に関する。
【０２５９】
本発明はまた、上記のような１つまたはそれ以上のの欠損組換えウイルスを含有する医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内、静脈内、筋内、皮下、眼内または経皮的経路等による投与のために製剤化され得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射可能製剤のため、特に患者の門脈内のような静脈内注射のための、製薬上許容され得るビヒクルまたは生理学的に適合性を有する添加剤を含有する。これらは、特に、等浸透圧滅菌溶液または乾燥、特に、凍結乾燥組成物に関し、これはさらに、滅菌水または生理食塩水が添加される場合に、注射可能溶液の調製を可能にする。患者の門脈への直接的な注射は、肝臓のレベルでの感染を目的とし、従ってこの器官のレベルでの治療効果を高めることが可能なことから、好ましい。
【０２６０】
注射に使用される欠損組換えウイルスの投与量は、種々のパラメーターの関数として調整され、そして特にウイルスベクター、使用される投与の様式、関連する病理または治療の所望の持続性の関数として調整される。一般的に、本発明による組換えアデノウイルスは、１０４と１０１４ｐｆｕ／ｍｌとの間、および好ましくは、１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの投与量の形式で製剤化され、かつ投与される。用語「ｐｆｕ」（プラーク形成単位）は、ウイルス溶液の感染力に対応し、そして適当な細胞培養物に感染させ、そして一般的に４８時間後、感染した細胞の溶解物から生じるプラークの数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ滴定量を決定する技術は、文献に十分記述されている。
【０２６１】
レトロウイルスに関して、本発明による組成物は、移植を目的として産生細胞を直接含むことができる。
これに関して、本発明の別の主題は、本発明による１つまたはそれ以上の欠損組換えウイルスにより感染された任意の哺乳動物細胞に関する。さらに詳しくは、本発明は、このようなウイルスに感染したヒト細胞の任意の集合に関する。これらは、特に、血液起源（全能幹細胞または前駆体）、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、ケラチノサイト、平滑筋、および内皮細胞、グリア細胞等であり得る。
【０２６２】
本発明による細胞は、一次培養物から得られ得る。これらは、当業者に公知の任意の技術により回収することができ、次いで増殖を可能にする条件下で培養され得る。より詳しくは繊維芽細胞に関して、これらは、例えばＨａｍ（１９８０）により記載される技術に従って、容易にバイオプシーから得ることができる。これらの細胞は、ウイルスによる感染のために直接使用することができるか、または後の使用を考慮して、自家ライブラリーの確立のために例えば凍結により貯蔵することができる。本発明による細胞は、例えば事前に確立されたライブラリーから得られる二次培養物であることができる（例えば、ＥＰ ２２８４５８， ＥＰ ２８９０３４， ＥＰ ４０００４７， ＥＰ ４５６６４０を参照）。
【０２６３】
次いで培養中の細胞を、本発明による組換えウイルスで感染させ、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質を産生する能力をその細胞に与える。感染は、当業者に公知の技術によりインビトロで実施される。特に、使用される細胞の型および細胞あたりのウイルスの所望のコピー数によって、当業者は、多数の感染および場合により、生じる感染サイクルの数を調整することができる。これらの工程は、細胞がインビボでの投与を目的とする場合、適当な滅菌条件下で実施しなければならないことが、明らかに理解される。細胞の感染のために使用される組換えウイルスの用量は、所望の目的によって当業者により調整することができる。インビボでの投与のために上記の条件が、インビトロでの感染に適用され得る。レトロウイルスによる感染のために、本発明による組換えレトロウイルスを産生する細胞と、感染されるべき細胞との共培養もまた可能である。これは、レトロウイルスの精製を省略することを可能にする。
本発明の別の主題は、本発明による１つまたはそれ以上の欠損組換えウイルスに感染した哺乳動物細胞または組換えウイルスを産生する細胞、および細胞外マトリックスを含む移植片に関する。好ましくは、本発明による移植片は、１０５〜１０１０個の細胞を含む。より好ましくは、本発明による移植片は、１０６〜１０８個の細胞を含む。
【０２６４】
より詳しくは、本発明の移植片において、細胞外マトリックスは、ゲル化化合物および場合により細胞の固定が可能な支持体を含む。
本発明による移植片の調製のために、種々のタイプのゲル化剤が使用できる。ゲル化剤は、適当な場合、ゲルの構成を有するマトリックスにおける細胞の封入のため、および支持体上の細胞の固定を促進するために使用される。従って、種々の細胞接着剤が、ゲル化剤として使用することができ、例えば特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチン等である。好ましくは、コラーゲンが、本発明の関連で使用される。これは、ヒト、ウシまたはマウス起源である。より好ましくは、Ｉ型コラーゲンが使用される。
【０２６５】
上記のように、本発明による組成物は、好ましくは、細胞の固定を可能にする支持体を含む。用語、固定は、支持体への差いぼうの接着および／または付着のを生じる生物学的および／または化学的および／または物理的相互作用の任意の形を示す。さらに、細胞は、使用される支持体を被覆しても、もしくは支持体の内部にまで侵入してもそのいずれでもよく、または両方であってもよい。本発明の関連で、固体、非毒性および／または生物学的適合性を有する支持体を使用することが好ましい。特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維または生物学的起源の支持体を使用することが可能である。
従って、本発明は、親油性基質の輸送に関連した病理の治療または予防に非常に有効な手段を提供する。
さらに、この治療は、ヒトおよび任意の動物、例えばヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコ等）、ウマ、魚等の両方に適用することができる。
【０２６６】
組換え宿主細胞
本発明は、本発明の核酸およびより詳しくは、配列番号１〜４および９〜１２６から選択されるヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含んだ組換え宿主細胞に関する。
本発明はまた、本発明の核酸、ならびにより詳しくは配列番号１〜４および９〜１２６に示されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含んだ組換え宿主細胞に関する。
別の態様によれば、本発明はまた、本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。従って、本発明はまた、本発明の任意の核酸、ならびにより詳しくは、配列番号１〜４および９〜１２６から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含んだ組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【０２６７】
本発明はまた、配列番号１〜４および９〜１２６のいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列を含む核酸を含む組換えベクターを含んだ組換え宿主細胞に関する。
【０２６８】
本発明による好ましい宿主細胞は、例えば、以下である：
ａ）原核生物宿主細胞：大腸菌（株ＤＨ５−ａ）、枯草菌、ネズミチフス菌の株、またはシュードモナス、ストレプトミセスおよびブドウ球菌のような属の株；ｂ）真核生物宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、Ｃｖ １細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５０）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７１１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）。
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドを生産する方法
【０２６９】
本発明はまた、配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドの生産方法に関し、この方法は、
ａ）適当なベクターに上記ポリペプチドをコードする核酸を挿入し、
ｂ）適当な培地で、予め形質転換された宿主細胞を培養するか、または工程ａ）の組換えベクターにより宿主細胞をトランスフェクトし、
ｃ）馴化培地を回収するかまたは例えば超音波処理によるかまたは浸透圧ショックにより宿主細胞を溶解し、
ｄ）上記培地から、あるいは工程ｃ）において得られる溶解物から上記ポリペプチドを分離かつ精製し、そして
ｅ）適当な場合、産生された組換えポリペプチドを特徴づける工程、を含む。
【０２７０】
本発明によるポリペプチドは、このポリペプチドに対してまたはその断片もしくは変異体に対して向けられた抗体を予め固定させた免疫親和性クロマトグラフィーカラムに結合することにより特徴付けることができる。
別の態様によると、本発明による組換えポリペプチドは、当業者に公知であり、そして例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ． Ｙ）に記載される方法に従って、適当な一連のクロマトグラフィーカラムにそれを通すことにより精製することができる。
【０２７１】
本発明によるポリペプチドはまた、均質溶液中でかまたは固相中でのいずれかの従来の化学合成技術により調製することができる。例示のために、本発明によるポリペプチドは、Ｈｏｕｂｅｎ Ｗｅｙｌ（１９７４， Ｍｅｕｔｈｏｄｅ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｅ． Ｗｕｎｓｃｈ Ｅｄ．， １５−Ｉ ： １５−ＩＩ）に記載される均質溶液またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６５， Ｎａｔｕｒｅ， ２０７（９９６）： ５２２−５２３； １９６５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５０（６９３）： １７８−１８５）により記載される固相合成技術のいずれかの技術により調製することができる。
【０２７２】
配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。このような相同ポリペプチドは、配列番号５〜８の等価なアミノ酸によるアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を保有するアミノ酸配列を含む。
【０２７３】
本発明による「等価なアミノ酸」は、当業者に周知の技術により、例えばＤ系の残基によるＬ系の残基の置換またはピロ−グルタミン酸によるグルタミン酸（Ｅ）の置換を意味することが理解される。１例として、Ｄ系の少なくとも１つの残基を含むペプチドの合成が、Ｋｏｃｈ（１９７７）により記載される。別の態様によれば、同じクラスに属する２つのアミノ酸、すなわち２つの荷電していない極性アミノ酸、非極性アミノ酸、塩基性アミノ酸または酸性アミノ酸もまた、等価なアミノ酸として考えられる。
【０２７４】
レトロインバース（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ）結合（ＮＨＣＯ）、カルバ（ｃａｒｂａ）結合（ＣＨ２ＣＨ２）、ケトメチレン結合（ＣＯ−ＣＨ２）のような少なくとも１つの非ペプチド結合を含むポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。
好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失、置換を含む本発明によるポリペプチドは、非修飾ポリペプチドに対して向けられた抗体により認識される能力を保持する。
【０２７５】
抗体
本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチド、特に１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドが、抗体の調製ため、特に患者の標準または変化した形態のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの産生を検出するために使用することができる。
【０２７６】
配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドに対して向けられる抗体はまた、本発明の一部を形成する。このような抗体は、配列番号５〜８の等価なアミノ酸によるアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を保有するアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドに対して向けられる。
本発明のための「抗体」は、特にポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体もしくは断片（例えばＦ（ａｂ）′２断片およびＦａｂ断片）または本発明による標的ポリペプチドもしくは標的ポリペプチド断片を認識する初期抗体のドメインを含む任意のポリペプチドを意味することが理解される。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７）により記載される技術によるハイブリドーマから調製される。
【０２７７】
本発明によれば、組換え的にかもしくは化学合成により産生されたポリペプチド、および融合タンパク質を含むその断片または誘導体またはアナログは、イムノゲンとして使用され、本発明によるポリペプチドを認識する抗体を生産する。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗−ＡＢＣＡ５、抗−ＡＢＣＡ６、抗−ＡＢＣＡ９、および抗−ＡＢＣＡ１０抗体は、交差反応性であることができ、例えば、それらは、異なる種からの対応するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドを認識し得る。ポリクローナル抗体は、交差反応性の可能性がより大きい。あるいは、本発明の抗体は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つの単一の形態に特異的であり得る。好ましくは、このような抗体は、ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つに特異的である。
【０２７８】
公知技術の種々の手順が、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つまたはその誘導体もしくはアナログに対するポリクローナル抗体の産生のために使用することができる。抗体の産生のために、種々の宿主動物が、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドまたはその誘導体（例えば、断片もしくは融合タンパク質）のいずれか１つの注入により免疫され得、その動物としては、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。１つの実施態様において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチド、またはその断片のいずれか１つは、イムノゲン担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合体化することができる。種々のアジュバントは、宿主種に依存して免疫学的応答を増加するために使用することができ、アジュバントとしてはフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルヴムが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２７９】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つ、またはそれらの断片、アナログもしくは誘導体に向けられたモノクローナル抗体の調製に関して、培養における連続継代細胞系による抗体分子の生産を提供する任意の技術を使用することができる。これらとしては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５４９７）によりもとは開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４： ７２； Ｃｏｔｅら １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８０： ２０２６−２０３０）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら， １９８５， Ｉｎ ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， 頁７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生され得る（ＷＯ ８９／１２６９０）。実際に、本発明によると、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに特異的なマウスの抗体分子からの遺伝子をつなぎ合わせることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５９： ８７０； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ４５２−４５４）が使用され得、このような抗体は、本発明の範囲内にある。このようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体は、ヒト疾患または障害（以下に記載される）の治療における使用に好ましい。なぜなら、ヒト抗体またはヒト化抗体は、異種発生抗体より、それ自体の免疫応答、特にアレルギー応答の誘導をずっと起こしづらいと思われるからである。
【０２８０】
本発明によれば、単鎖抗体の産生について記載された技術（Ｈｕｓｔｏｎに対する米国特許第５，４７６，７８６号および同第５，１３２，４０５号；米国特許第４，９４６，７７８号）は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチド特異的単鎖抗体を産生するために合わせることができる。本発明のさらなる実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載される技術（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１）を利用し、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つ、またはその誘導体もしくはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にする。
【０２８１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は、公知の技術により生成することができる。例えば、このような断片としては、抗体分子のペプシン消化により産生することができるＦ（ａｂ′）２断片、Ｆ（ａｂ′）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ′断片、およびパパインおよび還元剤により抗体分子を処理することで生成することができるＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８２】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、公知の技術、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫放射定量測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチュ免疫測定（例えばコロイダルゴールド、酵素標識または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット法、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光検査法、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動法アッセイ等により達成され得る。１つの実施態様において、結合した抗体は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、一次抗体は、一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる実施態様において、二次抗体が標識される。免疫測定における結合を検出するための多くの手段が公知であり、本発明の範囲内にある。例えば、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの特異的エピトープを認識する抗体を選択するため、このようなエピトープを含むＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチド断片のいずれか１つに結合する産物のための生成されたハイブリドーマを検定することができる。動物の特定の種由来のＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに特異的な抗体の選択のために、その動物種の細胞により発現または単離されるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つとのポジティブ結合に基づいて選択することができる。
【０２８３】
前述の抗体は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの局在および活性に関係する公知技術の方法において、例えばウェスタンブロッティング、適当な生理学的試料におけるそのレベルを測定するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドインサイチュ等、上記または公知技術の検出技術のいずれかを使用するため、用いることが出来る。
【０２８４】
特定の実施態様において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする抗体が、生成され得る。このような抗体は、リガンドを同定するために以下記載されるアッセイを使用して試験することができる。
【０２８５】
本発明は、１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片または変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドもまた、本発明の一部を形成し、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， ２（１） ： ７−１６）により記載されるトリオーマ技術またはハイブリドーマ技術において産生される。
【０２８６】
本発明による抗体はまた、米国特許第４，９４６，７７８号またはＭａｒｔｉｎｅａｕら（１９９８， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２８０（１） ： １１７１２７）により記載される単鎖Ｆｖ抗体断片（ＳｃＦｖ）に関する。
本発明による抗体はまた、Ｒｉｄｄｅｒら（１９９５， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）， １３（３）： ２５５−２６０）により記載されるファージライブラリーを用いて得られる抗体断片またはＲｅｉｎｍａｎｎら（１９９７， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １３（１１）： ９３３−９４３）およびＬｅｇｅｒら（１９９７， Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ８（１） ： ３１６）により記載されるヒト化抗体を含む。
本発明による抗体調製物は、試料中に存在する抗原の存在および／または量の同定のために意図される免疫学的検出試験に有用である。
本発明による抗体は、さらに、同位体または非同位体の検出マーカー、例えば蛍光を含むことができ、または、当業者に周知の技術に従って、ビオチンのような分子に結合することができる。
【０２８７】
従って、本発明の主題は、さらに、試料中の本発明によるポリペプチドの存在を検出する方法であり、この方法は、
ａ）試料を、１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドに対して向けられる抗体と接触させ、そして
ｂ）形成された抗原／抗体複合体を検出する工程、を含む。
【０２８８】
本発明はまた、診断のため、または試料中における本発明によるポリペプチドの存在を検出するためのボックスまたはキットに関し、このボックスは、
ａ）１）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、２）配列番号５〜８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドのポリペプチド断片もしくは変異体、または３）配列番号５〜８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに「相同」と呼ばれるポリペプチドに対して向けられる抗体、および
ｂ）形成される抗原／抗体複合体の検出を可能にする試薬、を含む。
【０２８９】
治療の医薬組成物および治療方法
本発明はまた、コレステロールまたは炎症性の脂質物質の輸送における欠損の予防および／または治療を目的とする医薬組成物に関し、この組成物は、これらがＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の機能的ポリペプチド、特に配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの有効量の産生を生じることが可能な、治療的有効量のポリヌクレオチドを含む点で特徴付けられる。
本発明はまた、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含有する医薬組成物およびコレステロールまたは炎症性の脂質物質の輸送における欠損に関連する疾患の予防および／または治療を目的とした本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを含有する医薬組成物を提供する。
【０２９０】
本発明はまた、親油性物質の輸送に関連した病理の治療のための新規な治療的方法に関し、この方法は、本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つをコードする核酸をインビボで導入および発現させることを含む。
従って、本発明は、親油性物質の輸送の異常に関連した病理の治療および／または予防のための新規なアプローチを提供する。
従って、本発明はまた、親油性物質における機能不全を患う被験者の予防または治療を目的とした医薬組成物に関し、これは、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つをコードする核酸を含む。
【０２９１】
本発明の特定の実施態様によれば、組成物が、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つのインビボでの産生のために提供される。この組成物は、生理学的に許容されるビヒクルおよび／または添加剤の溶液中で、適当な調節配列の制御下に置かれるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む。
従って、本発明はまた、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組成物に関し、ここでこの核酸は、適当な調節エレメントの制御下に置かれる。
【０２９２】
好ましくは、このような組成物は、適当な調節エレメントの制御下に置かれた配列番号１〜４のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
別の態様によれば、本発明の主題はまた、親油性物質の輸送における欠損により引き起こされる疾患を治療する予防的および／または治療的治療方法であり、このような方法は、患者における本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸をこの患者に投与する工程を包含し、上記核酸は、適当な場合、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤と組み合わせられる。
【０２９３】
本発明はまた、親油性物質の輸送における機能不全を患う被験者の予防または治療を目的とした医薬組成物に関し、この医薬組成物は、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有する添加剤と組み合わせて、本発明による組換えベクターを含む。
特定の実施態様によると、宿主細胞、特に哺乳動物から得られた宿主細胞に、インビボで本発明による核酸を導入する方法は、製薬上適合性を有するベクターおよび適当な調節配列の制御下に配置された本発明による「裸の」核酸を含む調製物が、選択された組織、例えば平滑筋組織のレベルでの局所注入により導入され、その「裸の」核酸がこの組織の細胞により吸収される工程を含む。
【０２９４】
本発明はまた、種々の形態の予防および／または治療を目的として医薬の製造のため、またはより詳しくは親油性物質の輸送における機能不全を患う被験者の治療のための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする本発明による核酸の使用に関する。
本発明はまた、本発明による組換えベクターの使用に関し、このベクターは、親油性物質の輸送における機能不全を患う被験者の予防および／または治療を目的として医薬の製造のため、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む。
上記のように、本発明はまた、親油性物質の輸送に関連した病理の治療および／または予防のための医薬組成物の調製のための、本発明による欠損組換えウイルスの使用に関する。
【０２９５】
本発明は、親油性物質の輸送に関連した欠損の治療および／または予防を目的とした医薬組成物の調製のための、このような欠損組換えウイルスの使用に関する。従って、本発明はまた、本発明による１つまたはそれ以上の欠損組換えウイルスを含有する医薬組成物に関する。
【０２９６】
本発明はまた、少なくとも１つの生物学的に活性なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のインビボでの持続的かつ有効な発現を可能にし、体内に移植される、本発明によるウイルスによりエキソビボで遺伝的に修飾された細胞、またはウイルスのような産生細胞の使用に関する。
【０２９７】
本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸をウイルスベクターに組込むことが可能であり、そしてこれらのベクターが生物学的に活性な成熟形態を有効に発現することを可能にすることを示す。より詳しくは、本発明は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のいずれか１つのインビボでの発現が、アデノウイルスの直接投与によりあるいは産生細胞またはこのようなＤＮＡを取り込んだアデノウイルスによりもしくはレトロウイルスにより遺伝的に修飾された細胞の移植により、得られ得る。
【０２９８】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤のため、特に例えば、患者の門脈への静脈内注射のために、製薬上許容され得るビヒクルまたは生理学的に適合性を有する添加剤を含有する。これらは、特に、等浸透圧滅菌溶液または乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物に関し、これはさらに、滅菌水または生理食塩水が添加される場合に、注射可能溶液の調製を可能にする。患者の門脈への直接的な注射は、肝臓のレベルでの感染を目的とし、従ってこの器官のレベルでの治療効果を高めることを可能にすることから、好ましい。
【０２９９】
「製薬上許容され得るビヒクルまたは添加剤」としては、投与方法に対して
製薬上許容され得、無菌で、そして適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して製剤化された水性または油性懸濁液であり得る。特定の製薬上許容され得る担体および担体に対する活性化合物の比が、組成物の溶解性および化学的特性、投与の特定の様式、および標準的な薬務により決定される、希釈剤および充填剤が挙げられる。
【０３００】
好ましくは、本発明の任意の核酸、ポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞は、製薬上許容され得るビヒクルまたは添加剤において、インビボで導入される。句「製薬上許容され得る」とは、ヒトに投与された場合、生理学的に許容され得るもので、そして概してアレルギーまたは類似する有害な反応、例えば、異常亢進、目眩等を生じない分子実体および組成物をいう。好ましくは、本明細書中で使用されるように、用語「製薬上許容され得る」は、動物、およびより詳しくはヒトにおける使用のために、連邦もしくは州政府の監査機関による承認を得るかまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に記載されたものを意味する。用語「添加剤」は、化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、添加剤、またはビヒクルをいう。このような医薬担体は、水および油のような滅菌液体であり、油としては、石油、動物性、植物性、または合成起源の油であって、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。水または水溶液、生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロース水溶液が、添加剤、特に注射可能溶液として好ましくは使用される。適切な医薬添加剤は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【０３０１】
本発明による医薬組成物は、経口、直腸、非経口、静脈内、皮下、皮内経路により等しく良好に投与され得る。
【０３０２】
別の態様によれば、本発明の主題はまた、コレステロールまたは炎症性の脂質物質の輸送における欠損により引き起こされる疾患の治療の予防的および／または治療的治療方法であり、この方法は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を患者または被験者に投与することを含み、上記核酸は、１つまたはそれ以上の生理学的に適合性を有するビヒクルおよび／または添加剤と組み合わされる。
【０３０３】
別の実施態様において、本発明による核酸、組換えベクター、および組成物は、ビヒクル、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９： １５２７−１５３３； Ｔｒｅａｔら， １９８９， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 頁３５３−３６５；ならびにＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， １９８９， Ｉｎ： Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 頁３１７−３２７を参照）。
【０３０４】
さらなる態様において、本発明による核酸により形質転換され、そして本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドを高レベルに発現する組換え細胞が、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを必要とする被験者に移植され得る。好ましくは、本発明による核酸をコードするＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つにより形質転換された自家細胞が、拒絶を回避するために移植され；あるいは、免疫認識および拒絶を防ぐポリマーマトリックス内に可溶性因子を産生する非自家細胞を保護する技術が利用可能である。
【０３０５】
本発明による核酸、ポリペプチド、組換えベクター、組換え宿主細胞および組成物の投与が実施される被験者は、好ましくはヒトであるが、任意の動物であることができる。従って、当業者に容易に認識され得るように、本発明の方法および医薬組成物は、任意の動物、特に哺乳動物への投与に特に適し、この動物としては、飼いならされた動物、例えばネコまたはイヌの被験者、家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、およびブタの被験者、野生動物（野生であろうと動物園にいようと）、研究動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等、トリ種、例えばニワトリ、七面鳥、鳴禽等が挙げられるが限定されず、すなわち、獣医学における使用に適する。
好ましくは、上記のような核酸、組換えベクター、または組換え宿主細胞を含有する医薬組成物が、患者または被験者に投与される。
【０３０６】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドについてのアゴニストまたはアンタゴニスト化合物のスクリーニング方法
別の態様によれば、本発明はまた、コレステロールまたは炎症性の脂質物質の輸送における欠損に起因した疾患の治療に有用である治療的使用のための化合物または低分子をスクリーニングする種々の方法に関する。
従って、本発明はまた、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０欠損における機能不全から生じる疾患の予防および／または治療のための活性成分をスクリーニングするための、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの使用またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞の使用に関する。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つの触媒部位およびオリゴペプチドまたは免疫原性断片が、全範囲の既存の技術による産物のライブラリーをスクリーニングするために役立ち得る。このタイプのスクリーニングに使用されるポリペプチド断片は、溶液中で遊離でき、細胞表面または細胞において固体支持体に結合される。次いで、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つと試験される因子との間の結合複合体の形成が測定され得る。
【０３０７】
関心のあるタンパク質に対して親和性を有する産物に接近できるハイフラックススクリーニングに使用され得る別の産物スクリーニング技術が出願番号ＷＯ８４／０３５６４に記載される。ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つに適用されるこの方法で、種々の産物が固体表面上で合成される。これらの産物が、対応するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質またはその断片と反応し、そしてその複合体が洗浄される。次いで、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つを結合する産物が当業者に公知の方法により検出される。非中和抗体もまた、支持体上にペプチドを捕捉し、そして固定するために使用することができる。
【０３０８】
別の可能性は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０中和競合抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のいずれか１つ、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つおよびＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つを潜在的に結合する産物を使用した産物スクリーニング方法を実施することである。この方法で、抗体が、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドまたはタンパク質のいずれか１つと共通の抗原単位を有するペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【０３０９】
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のいずれか１つの活性を増大させる能力について評価される産物のうち、特に分子の活性に関係するキナーゼ特異的ＡＴＰホモログ、ならびに上記キナーゼから生じる脱リン酸化を回避することができるホスファターゼが挙げられ得る。特にホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）テオフィリンのインヒビターおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン型またはアデニルシクラーゼフォルスコリンアクチベーターが挙げられる。
【０３１０】
従って、本発明は、全ての合成型または細胞性型、すなわちＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０をコードする核酸のいずれか１つを構成的に発現するかまたはこれらを取り込んだ哺乳動物、昆虫、細菌、または酵母等の型における、膜または小胞との間のコレステロールまたは親油性物質の移動の方法に基づく、産物、すなわち化合物、低分子等のスクリーニングの任意の方法の使用に関する。この趣旨で、標識される親油性物質アナログが使用され得る。さらに、多数の輸送体の破壊が記載されているかもしれないが（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈａｚｅｌら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７４： １９３４−４１）、特徴的な表現型を有する細胞性突然変異体を使用することを考慮し、そしてＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の少なくとも１つによりその機能を補い、そしてスクリーニング目的のためにその全部を使用することが可能である。
【０３１１】
本発明はまた、親油性物質の輸送に活性な化合物または低分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの少なくとも１つおよび検出可能なマーカーを含む脂質基質を含有する膜小胞を調製し、
ｂ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と、工程ａ）で得られた小胞をインキュベートし、
ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出を定性的および／または定量的に測定し、そして
ｄ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と予めインキュベートされていない小胞による標識された親油性基質の放出の測定値とを工程ｂ）で得られた放出測定値を比較する工程、を含む。
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドは、配列番号５〜８から選択されたアミノ酸配列を含む。
上記スクリーニング方法の第一の態様によると、膜小胞は、当業者に周知の技術に従って調製され得る合成脂質小胞である。この特定の態様によると、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質は、組換えタンパク質であり得る。
【０３１２】
第２の態様によると、膜小胞は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの少なくとも１つを発現する細胞に由来する原形質膜の小胞である。これらは、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを天然に発現する細胞または少なくとも１つのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドをコードする核酸もしくはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む組換えベクターでトランスフェクトされた細胞であり得る。
上記スクリーニング方法の第３の態様によると、脂質基質は、プロスタグランジンまたはプロスタサイクリンから選択される。
上記スクリーニング方法の第４の態様によると、脂質基質は、コレステロールまたはホスファチジルコリンから選択される。
【０３１３】
第５の態様によると、脂質基質は、例えば３Ｈまたは１２５Ｉから選択されるアイソトープにより放射性標識される。
第６の態様によると、脂質基質は、ＮＢＤまたはピレンのような蛍光化合物で標識される。
第７の態様によると、この標識された親油性基質を含む膜小胞およびＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを含む膜小胞は、工程ｂ）の前に固体支持体の表面に固定される。
第８の態様によると、蛍光または小胞により放出される放射活性の測定は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つによる脂質基質輸送の活性を直接的に反映する。
【０３１４】
本発明はまた、コレステロールまたは脂質物質の輸送に活性な化合物または低分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）細胞、例えば、天然に、またはＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０をコードする核酸のいずれか１つを細胞にトランスフェクトさせた後のいずれかで、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つを発現する細胞株を得て、
ｂ）検出可能なマーカーで標識されたアニオンの存在下、工程ａ）の細胞をインキュベートし、
ｃ）これらの細胞に浸透していない標識された過剰のアニオンを除去するために工程ｂ）の細胞を洗浄し、
ｄ）工程ｃ）で得られた細胞を、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つに関するアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と共にインキュベートし、
ｅ）標識されたアニオンの流出を測定し、
ｆ）工程ｅ）で測定された標識されたアニオンの流出の値を、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で予めインキュベートされていない細胞を用いて測定された標識されたアニオンの流出の値とを比較する工程、を含む。
【０３１５】
第１の特定の実施態様において、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つは、配列番号５〜８のアミノ酸配列を含む。
第２の態様によれば、上記のスクリーニング方法に用いられる細胞は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドを、天然には発現しないかあるいは低レベルで発現する細胞であり得、上記細胞は、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸の発現を導くことが可能な本発明による組換えベクターを用いてトランスフェクトされる。
【０３１６】
第３の態様によると、細胞は、アニオン輸送に自然的な欠損を有する細胞、またはベラパミルまたはテトラエチルアンモニウムのような１つまたはそれ以上のアニオンチャネルインヒビターで前処理された細胞であり得る。
上記スクリーニング方法の第４の態様によると、アニオンは、塩Ｋ１２５ＩまたはＮａ１２５Ｉのような放射活性標識されたヨウ化物である。
標識されたアニオンの流出の測定は、実験の間、長期にわたり定期的に測定され、従ってこの流出の動態測定を確立することもまた可能にさせる。
第６の態様によると、標識されたアニオンの流出の値は、細胞培養上清中、処置の時間に存在する標識されたアニオンの量を測定することに決定される。
第７の態様によると、標識されたアニオンの流出の値は、細胞溶解物に見出される放射性活性と細胞培養上清中に見出される放射性活性の和に対応する合計の放射性活性に関して、細胞培養上清に見出される放射性活性の割合として測定される。
【０３１７】
本発明の主題はまた、親油性物質の代謝に活性な化合物または低分子、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドのいずれか１つのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法に関し、この方法は、
ａ）精製されたヒトアルブミンの存在下で、適当な培養培地でヒトミオサイト株の細胞を培養し、
ｂ）インターロイキンおよびアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の産生を刺激する化合物の存在下で、同時に工程ａ）の細胞をインキュベートし、
ｃ）ＡＴＰの適当な濃度の存在下で、工程ｂ）で得られた細胞をインキュベートし、
ｄ）細胞培養上清中に放出されたインターロイキンを測定し、そして
ｅ）アゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物の存在下で予めインキュベートされていない細胞の培養上清に放出されたインターロイキンの値と、工程ｄ）で得られたインターロイキンの放出の値を比較する工程、を含む。
【０３１８】
上記のスクリーニング方法の第１の態様によれば、使用される細胞は、ヒトまたはマウスミオサイトに属する。
スクリーニング方法の第２の態様によると、インターロイキンの産生を刺激する化合物は、リポ多糖類である。
この方法の第３の態様によると、これらの細胞による全てのインターロイキンおよびＴＮＦαの産生もまた、定性的および／または定量的に決定される。
第４の態様によると、インターロイキンをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現のレベルもまた、決定される。
以下の例は、さらに本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。
【０３１９】
【実施例】
実施例１：ゲノムデータベースにおけるヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の検索
Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら（Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ， １９９６，５，１６４９−１６５５）により記載されたＡＢＣＡ１様遺伝子の発現された配列タグ（ＥＳＴ）は、ＢＬＡＳＴ２を使用して、ＧｅｎｂａｎｋおよびＵｎｉＧｅｎｅヌクレオチド配列データベースを検索するために使用された（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３３８９−３４０２）。スクリーニングされる主なタンパク質配列データベースは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＧｅｎｐｅｐｔおよびＰＩＲであった。
ゲノムＤＮＡ分析は、いくつかの遺伝子検出プログラム、例えばＧＥＮＳＣＡＮ（ＢｕｒｇｅおよびＫａｒｌｉｎ， １９９７， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ； ２６８（１）： ７８− ９４）、ＦＧＥＮＥＨ／ＦＥＸＨ（ＳｏｌｏｖｙｅｖおよびＳａｌａｍｏｖ， １９９７， Ｉｓｍｂ ； ５： ２９４−３０２）、ならびにＸＰＯＵＮＤ（ＴｈｏｍａｓおよびＳｋｏｌｎｉｃｋ， １９９４， Ｊ Ｍａｔｈ Ａｐｐｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．； １１（１）： １−１６）の組み合わせにより実施された。異なるツールの組み合わせは、感度および特異度の増大をもたらす。ゲノムＤＮＡ分析における第２工程は、ＥＳＴおよびタンパク質データベースにおける相同性検索である。データベース検索を実施するソフトウエアおよびエキソン／イントロン予測のためのソフトウエアの組み合わせは、最も優れた感度および特異度の結果を与える。配列アセンブリーおよび分析は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）配列分析ソフトウエアパッケージを使用して実施された。
【０３２０】
複数のアラインメントが、ＧＣＧパッケージからのＧＡＰソフトウエアならびにＤｉａｌｉｇｎ２プログラム（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ； ９３（２２）： １２０９８−１０３）、ＦＡＳＴＡ３パッケージ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．； ８５（８） ： ２４４４−８）およびＳＩＭ４（Ｆｌｏｒｅａら， １９９８， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９８ Ｓｅｐ ； ８（９）： ９６７−７４）により作成された。本発明者らのプロセスにおいて使用される特異的ＡＢＣＡモチーフは、文献（Ｂｒｏｃｃａｒｄｏら， １９９９）に記載されるＴＭＮ、ＴＭＣ、ＮＢＤ１およびＮＢＤ２であった。これは、ＡＢＣＡ１における、Ｎ末端について６３０〜８４６残基（ＴＭＮ＝エキソン１４−１６）およびメンブランスパナ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｅｒ）のＣ末端セットについて１６４７〜１８７７残基（ＴＭＣ＝エキソン３６−４０）に対応する。ＮＢＤは、伸長したヌクレオチド結合ドメインに対応し、すなわち、ＡＢＣＡ１において、Ｎ末端についてアミノ酸８８５〜１１５２（ＮＢＤ１＝エキソン１８−２２）およびＣ末端について１９１８−２１３２（ＮＢＤ＝エキソン４２−４７）にわたる。
【０３２１】
マイクロサテライトマーカーＤ１７Ｓ９４０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号； ＡＣ００５４９５，ＡＣ００５９２２）を含む２つの重複ＢＡＣクローンを有する候補ＡＢＣＡ ＥＳＴ間の配列比較は、驚くべきことに、全てのこれらのＥＳＴがこの３２５，０００ｂｐ内に位置することを明らかにした。電子的イントロン／エキソン予測は、ＡＣ００５４９５およびＡＣ００５９２２ＢＡＣ配列を使用することにより実施され、そしてＡＢＣＡ６およびＡＢＣＡ９の全長コード配列（ＣＤＳ）に対応することが予測される転写配列を提供した。ＡＢＣＡ５遺伝子配列は、それぞれ３′および５′末端としてＢＡＣのコンティグに部分的に含まれることが見出された。さらに、この配列の分析は、ＡＢＣＡ１０遺伝子を明らかにした。
【０３２２】
ＡＢＣＡ５についてのさらなる配列情報が、３′および５′末端の両方における上記ＢＡＣコンティグ（ＡＣ００５４９５およびＡＣ００５９２２）と、重複するワーキングドラフトＢＡＣを使用することにより得られた。次いで、追加のＢＡＣワーキングドラフト、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００７７６３が、５′末端で同定された。異なるＧｅｎｂａｎｋの細目およびＵｎｉＧｅｎｅ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓにおける特異的モチーフ検索に基づく、並行データベースマイニング法は、ＢＡＣ ＃ ＡＣ００７７６３の２つの断片と一致する２つのこれらの配列（一方はＴＭＣモチーフを含み、もう一方はＮＢＤ１ドメインを含む）の同定をもたらした。
これらの遺伝子のエキソン−イントロン配列を使用して、本発明者らは、ＢＡＣ（ＡＣ００５４９５、ＡＣ００５９２２およびＡＣ００７７６３）のゲノム配列とｃＤＮＡの配列を比較し、そしてＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の適当なゲノムサイズおよびそれぞれの方向性を確立した。
【０３２３】
実施例２：ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡの５′伸長
この例は、全長ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の単離および同定を記載する。部分的なＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡ配列の５′伸長は、肝臓、心臓または精巣における５′ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲの組み合わせを使用することにより実施された。
他のファミリーメンバーから新規なＡＢＣＡ５〜６および９〜１０遺伝子を区別することを可能にするオリゴヌクレオチドプライマーは、ゲノム配列のエキソン／イントロンを利用して設計され、そして種々のヒト組織からのＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲにより、特異的ｃＤＮＡ転写物を同定するために使用された。さらなるクローニング工程を必要とするＡＢＣＡ１０を除いて、全てのＲＴ−ＰＣＲ産物が直接配列決定された。ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の場合、５′ＲＡＣＥ工程もまた、イニシエーターＡＴＧコドンを確認するために実施された。ＡＢＣＡ５の全ＣＤＳの同定が、ＲＴ−ＰＣＲおよび直接的な配列決定により転写物の３つの可能性のある断片を連結することにより得られた。最終的に、同じ第１７染色体クラスターに属するこれらの新規な遺伝子の全ＯＲＦ配列が決定された。
【０３２４】
逆転写
全量１１．５μｌにおいて、５００ｎｇのオリゴｄＴと混合した５００ｎｇのｍＲＮＡポリ（Ａ）＋（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、７０℃で１０分間変性させ、次いで氷上で冷ました。１０単位のＲＮＡｓｉｎ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔファーストストランド緩衝液および２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の添加の後、この反応物を４５分間、４２℃でインキュベートする。本発明者らは、ＡＢＣＡ９については肝臓、心臓、脳および肺から、ＡＢＣＡ５については精巣から、ＡＢＣＡ１０については精巣および心臓からのポリ（Ａ）ｍＲＮＡを使用した。
【０３２５】
ＰＣＲ
各ポリメラーゼ連鎖反応は、４００μＭの各ｄＮＴＰ、２単位のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、０．５μＭの各プライマー、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ＰＣＲ緩衝液および５０ｎｇのＤＮＡ、もしくは約２５ｎｇのｃＤＮＡ、または１／５０ｅのプライマリーＰＣＲ混合物を含んだ。反応は、９６穴マイクロタイタープレートで、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００サーマルサイクラーにおいて３０サイクル実施された。９４℃、１０分間の最初の変性の後、各サイクルが、３０秒（９４℃）の変性工程、３０秒のハイブリダイゼーション工程（６４℃で２サイクル、６１℃で２サイクル、５８℃で２サイクルおよび５５℃で２８サイクル）、および１分／ｋｂ（７２℃）の伸長工程からなる。ＰＣＲは、７分の最終７２℃の伸長で終了する。ＲＴ−ＰＣＲの場合、逆転写酵素なしのコントロール反応およびｃＤＮＡの代わりに水を含んだ反応を全試料について実施した。
【０３２６】
ＤＮＡ配列決定
ＰＣＲ産物がアガロースゲル電気泳動により分析かつ定量され、Ｐ１００カラムを用いて精製された。精製されたＰＣＲ産物が、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定された。この配列反応混合物が、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ）を用いて精製された。配列決定反応は、製造者プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従って、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において分析される。
【０３２７】
ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５′高速増幅
５′ＲＡＣＥ分析は、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて実施された。ヒト精巣、肝臓および心臓ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、製造者指示書に従って、５′ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡライブラリーを生成するための鋳型として使用した。第１の増幅プライマーおよび内側のプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）が、ｃＤＮＡ配列から設計された。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲのアンプライマーをクローン化した。特異的なクローンの挿入が、ユニバーサルプライマー（Ｒｅｖおよび−２１）を用いたＰＣＲにより増幅され、そして両方の鎖に関して配列決定される。プライマーＡＢＣ−Ａ６＿Ｌ１、Ｌ２、ＡＢＣ−Ａ９＿Ｌ１、Ｌ２、およびＡＢＣ−Ａ１０＿Ｌ１、Ｌ２を、それぞれＡＢＣ−Ａ６、ＡＢＣ−Ａ９、およびＡＢＣ−Ａ１０の５′末端を同定するために使用した。
プライマー
オリゴヌクレオチドが、ＧＣＧパッケージまたはＯｌｉｇｏ ４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）ソフトウエアからのプライムを用いて選択された。プライマーを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄから注文し、そして更なる生成なしに使用した（表１５）。
【０３２８】
【表１７】
2004521620.tif 000019
【０３２９】
【表１８】
2004521620.tif 000020
【０３３０】
実施例３：本発明によるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の転写物の組織分布
本発明によるポリヌクレオチドの発現のプロフィールは、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第２編． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により記載される逆転写ＰＣＲおよびノザンブロット分析についてのプロトコールに従って決定される。
例えば、逆転写による分析の場合、上記のプライマー対が、ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のｃＤＮＡから合成され得る。このプライマー対は、対応するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡを検出するために使用され得る。
このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、レトロ転写されたポリＡ＋ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対応するｃＤＮＡ鋳型上で実施される。ｃＤＮＡに対する逆転写が、製造者により記載された条件に従って酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施される。ポリメラーゼ連鎖反応は、２５ｎｇのｃＤＮＡ調製物を含む２０μｌの反応混合物中で、標準的条件に従って実施される。反応混合物は、４００μＭの各ｄＮＴＰ、２単位のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、０．５μＭの各プライマー、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびＰＣＲ緩衝液からなる。３４回のＰＣＲサイクル［９４℃、３０秒の変性、３４サイクルの間に以下のように分けられた３０秒のアニーリング：６４℃（２サイクル）、６１℃（２サイクル）、５８℃（２サイクル）、および５５℃（２８サイクル）、および７２℃で１キロベースあたり１分の伸長］が、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ９７００サーモサイクラーを使用して、９４℃、１０分間の変性の第１工程の後に実施される。このＰＣＲ反応は、電気泳動によりアガロースゲル上で可視化される。得られたｃＤＮＡ断片は、ノザンブロット分析のためのプローブとして使用され得、そしてまたヌクレオチド配列の正確な決定のために使用され得る。
【０３３１】
ノザンブロット分析
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のｍＲＮＡ発現を研究するために、ヒトＭＴＮ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロット（Ｈｕｍａｎ ＩＩ ７７５９−１、Ｈｕｍａｎ ７７６０−１、およびｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ＩＩ ７７５６−１， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が、２つのアンプライマー：ＡＢＣ−Ａ５についてＡＢＣＡ５＿Ａ−ＡＢＣＡ５＿Ｂおよび４４５１８８＿Ｃ−４４５１８８＿Ｄ、ＡＢＣ−Ａ６についてＡＢＣＡ６＿Ａ−ＡＢＣＡ６＿ＢおよびＡＢＣＡ６＿Ｓ−ＡＢＣＡ６＿Ｔ、ＡＢＣ−Ａ９についてＡＢＣＡ９＿Ａ−ＡＢＣＡ９＿ＢおよびＡＢＣＡ９＿Ｍ１−ＡＢＣＡ９＿Ｎ１からなるプローブの特異的プールとハイブリダイズされた。ＡＢＣＡ１０＿Ｉ−ＡＢＣＡ１０＿Ｂとの間で得られた固有のＲＴ−ＰＣＲ産物が、ＡＢＣ−Ａ１０について使用された（表１５）。
【０３３２】
プローブの調製
ＰＣＲ産物が、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製された。１０〜２０ｎｇの精製されたＰＣＲ産物が、製造者プロトコールに従ってランダムプライミング方法（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ｋｉｔ； Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、［α３２Ｐ］ ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ； ６０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， １０ ｍＣｉ／ｍｌ）を用いて放射性標識された。組み込まれていない放射活性ヌクレオチドを、Ｇ５０ミクロカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるろ過により標識されたプローブから分離した。プローブを、５０μｇの変性ヒトＣｏｔ１ ＤＮＡと、２時間、６５℃で競合させた。
【０３３３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２．５％のＤｅｘｔｒａｎ、０．５％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４０μｇ変性ヒトＤＮＡ）を用いてノザンブロット（４２℃で６時間）のプレハイブリダイゼーションを行った後、放射性標識されたプローブ（２．１０６ｃｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーション溶液）および４０μｇの変性ヒトＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、２×ＳＳＣ中に３０分間室温で洗浄し、２×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳ中に１０分間６５℃で２回、および１×ＳＳＣ−０．１％のＳＤＳで１０分間６５℃で２回洗浄した。ノザンブロットを、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）において一晩照射した後、分析した。ヒトトランスフェリンプロ−ブを、膜の各レーンにおけるＲＮＡの量を調整するために使用した。
【０３３４】
実施例４：哺乳動物細胞におけるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の完全なｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０遺伝子が、哺乳動物細胞において発現され得る。代表的な真核生物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写を開始させるプロモーター、タンパク質をコードする配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含む。それはまた、エンハンサーのようなさらなるシグナル、Ｋｏｚａｋ配列およびｍＲＮＡのスプライシングに必要な配列も含む。有効な転写は、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、レトロウイルスＬＴＲまたはＣＭＶウイルス初期プロモーターの初期および後期エレメントを用いて得られる。しかし、アクチンプロモーターのような細胞性エレメントもまた、使用され得る。多くの発現ベクターが、本発明を実施するために使用され得、このようなベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０３３５】
実施例５：標準および変異したＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０ポリペプチドの産生
その単離が実施例２において記載される対応する完全長ｃＤＮＡによりコードされる標準ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、もしくはＡＢＣＡ１０ポリペプチド、またはこれもまた完全長ｃＤＮＡが実施例２に記載される技術に従って得られる変異したＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、もしくはＡＢＣＡ１０ポリペプチドが、バキュロウイルスベクターを用いた細菌もしくは昆虫細胞発現系において、またはワクシニアウイルスベクターの有無に関わらず哺乳動物細胞において、容易に産生され得る。全ての方法が、現在までに詳しく記載され、そして当業者に公知である。その詳述が、例えばＦ． Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ｈｉｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ． Ｙ）において見出される。
【０３３６】
実施例６：変異したＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドの１つに対して向けられた抗体の産生
本発明における抗体は、種々の方法（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ． Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， Ｄａｖｉｄ Ｄ． Ｍｏｏｒｅ， Ｊ． Ｇ． Ｓｅｉｄｍａｎ， Ｊｏｈｎ Ａ． Ｓｍｉｔｈ， Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌにより編集されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１巻、第１１章、１９８９）により調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドを発現する細胞は、抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に注射される。記載される方法の１つにおいて、タンパク質が、汚染を回避するために調製かつ精製される。次いで、このような調製物は、より高い活性を有するポリクローナル抗血清を産生することを目的として動物に導入される。
【０３３７】
好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用することにより調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら， １９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５； Ｋｏｅｈｌｅｒら， １９７６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２； Ｋｏｅｈｌｅｒら， １９７６， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６： ５１１； Ｈａｍｍｅｌｉｎｇら．， １９８１， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， 頁５６３−６８１）。一般に、このような方法は、ポリペプチドを用いて、さらによくはポリペプチドを発現する細胞を用いて、動物（好ましくはマウス）を免疫することを含む。これらの細胞は、適当な組織培養培地において培養することができる。しかし、１０％胎児ウシ血清（５６℃で不活性化された）が補充され、かつ約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、１０００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたイーグル培地（修飾されたＥａｒｌｅ）中で細胞を培養することが好ましい。
【０３３８】
これらのマウスの脾臓細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。しかし、ＡＴＣＣから利用可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞が、ＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら（１９８１， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ８０： ２２５−２３２）により記載されるような限界希釈法によりクローニングされる。このような選択後に得られたハイブリドーマ細胞が、ポリペプチドに結合可能なクローン分泌抗体を同定するために試験される。
【０３３９】
さらに、ポリペプチドに結合可能な他の抗体が、抗イディオタイプ抗体を使用して、２ステージ手順に従って産生され得、このような方法は、抗体が、それ自体抗原であり、結果的に別の抗体を認識する抗体を得ることが可能である事実に基づく。この方法に従って、タンパク質に特異的な抗体が、動物、好ましくはマウスを免疫するために使用される。次いで、この動物の脾臓細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そして後者は、特異的な抗体−タンパク質複合体に結合する能力が、ポリペプチドによりブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。これらの抗体は、タンパク質に特異的な大量の抗体の形成を誘導するための、動物を免疫するために使用され得る。
【０３４０】
本明細書中に記載される方法に従って本発明の抗体の、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ′）２断片ならびに他の断片を使用することが好ましい。このような断片は、代表的には、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）２断片を産生するため）のような酵素を用いてタンパク質分解切断により産生される。そうでなければ、タンパク質を認識する分泌断片は、組換えＤＮＡまたは合成化学技術を応用することにより産生され得る。
【０３４１】
ヒトにおける抗体のインビボでの使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい。このような抗体は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当業者に公知である（総説のために、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２）； Ｏｉら．， （１９８６， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ４： ２１４）； Ｃａｂｉｌｌｙら．， 米国特許第４，８１６，５６７号； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら．， ＥＰ １７１４９６； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら．， ＥＰ １７３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら．， ＷＯ ８６０１５３３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎら．， ＷＯ ８７０２６７１； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら；（１９８４， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６４３）； およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒら．，（１９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ２６８）を参照のこと）。
【０３４２】
実施例７：ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０遺伝子における多型／突然変異の決定
ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０遺伝子の転写物の配列またはゲノム配列における多型または突然変異の検出が、種々のプロトコールにより実施され得る。好ましい方法は、直接シーケンスである。
ｍＲＮＡ調製物を得ることが可能である患者に対し、好ましい方法は、ｃＤＮＡを調製し、そして直接それらを配列決定することである。ＤＮＡのみ利用可能な患者に対し、そして対応する遺伝子の構造が未知または部分的に既知である転写物の場合、対応する遺伝子のゲノム配列はもちろんそのイントロン−エキソン構造も正確に決定することが必要である。従って、第１の例においてこれは、研究される転写物に対応するゲノムＤＮＡ ＢＡＣまたはコスミドクローンを単離し、対応するクローンの挿入物を配列決定し、そしてそのｃＤＮＡ配列を得られたゲノムＤＮＡの配列と比較することによりイントロン−エキソン構造を決定することを含む。
【０３４３】
直接シーケンスによる突然変異の検出技術は、その疾患についてのホモ接合体からまたは少なくとも８個体（研究される病理に罹患した４個体および罹患していない４個体）または研究される集団とは関係しない少なくとも３２個体から得られる、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０遺伝子のゲノム配列を比較することからなる。配列の多様性は、多型を構成する。野生型タンパク質のアミノ酸配列を修飾した全てのものが、家系における突然変異および疾患（示される遺伝子型−表現型の関連）の共分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の研究、または薬理ゲノム学研究もしくは散発性の病気の分析のためのケース／コントロール関連の研究における、治療分子に対する薬理学的応答の研究のために、より詳しく検討することが好ましい上記タンパク質の機能に影響することが可能な突然変異であり得る。
【０３４４】
実施例８：原因突然変異（ｃａｕｓａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または転写の相違によるコレステロールおよび炎症性の脂質物質の輸送における欠損に関連した疾患についての原因遺伝子の同定
実施例７に記載される方法により同定される突然変異の中で、疾患表現型に関連した全ての突然変異が、原因であり得る。これらの結果の検証が、罹患した全ての個体およびそれらの親族（ＤＮＡが利用可能である）における遺伝子を配列決定することによりなされる。
さらに、実施例２に記載される方法により、ノザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ分析が、罹患個体または罹患していない個体に特異的なＲＮＡを使用することにより、研究される遺伝子の発現レベル、特にその遺伝子の転写物の非存在における顕著な変異を検出することが可能となる。
【０３４５】
実施例９：ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸を含む組換えベクターの構築
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、またはＡＢＣＡ１０タンパク質のいずれか１つをコードする核酸の合成
ヒト細胞から単離された総ＲＮＡ（５００ｎｇ）（例えば、胎盤組織，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ、またはＴＨＰ１細胞）が、ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のｃＤＮＡの合成のための供給元として使用され得る。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は、周知の技術である。例えば、システム「ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔワンステップＲＴ−ＰＣＲ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を使用し得る。
配列番号１２７〜２１７のいずれかに示される配列を含む、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが、この目的のために使用され得る。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＢＩ ３９４型のＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）におけるホスホラミダイト方法により合成され得る。
【０３４６】
制限酵素ＮｏｔＩにより認識される部位は、増幅されるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡに組み込まれ、２００μＭの各上記ジデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｉｎｃ． Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）の存在下で、鋳型として５０ｎｇのヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡ、ならびに５′末端に、制限酵素ＮｏｔＩ（５′−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３′）により認識される部位を含む上記で使用される０．２５μＭのＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する第２の増幅工程により、組換えベクターへの挿入に所望されるｃＤＮＡ領域を隣接し得る。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ（Ｃｅｔｕｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ， ＵＳＡ）のためのサーマルサイクラー装置において、１分間、９５℃での変性工程、１分間、５０℃の再生工程および２分間、７２℃の伸長工程を各々含む３０サイクル以上実施され得る。
【０３４７】
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の、発現ベクターへのｃＤＮＡのクローニング：
次いでヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡ挿入物が、ｐＡＢＣＡ５、ｐＡＢＣＡ６、ｐＡＢＣＡ９、およびｐＡＢＣＡ１０と称される発現ベクターを産生するために、発現ベクター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターおよびエンハンサー配列ならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｂｅｇら．， １９９０， ＰＮＡＳ， ８７： ３４７３； Ａｐｐｌｅｂａｕｍ−Ｂｏｄｅｎ， １９９６， ＪＣＩ ９７）を含むｐＣＭＶベクターのＮｏｔＩ制限部位にクローニングされ得る。
クローニングされたｃＤＮＡの配列は、ＡＢＩ ３１０型のキャピラリーシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）における反応セット「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡにより販売される）を使用した２本鎖の配列決定により確認され得る。
【０３４８】
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターの構築：
発現ベクターｐＣＭＶ−βの修飾：
発現ベクターｐＣＭＶ−β（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ， Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ登録番号ＵＯ２４５１）のβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩを用いた消化により除去され、そして５′末端〜３′末端まで、ＮｏｔＩ制限部位の領域でクローニングされる以下の部位：ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＲｓｒＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｗａＩ、およびＮｏｔＩを含む複数のクローニング部位により置換され得る。この複数のクローニング部位の配列は、
５′−ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧ−３′
である。
修飾された発現ベクターｐＣＭＶのＥｃｏＲＩ部位とＳａｎＩ部位との間のＤＮＡ断片が単離され、そしてシャトルベクターｐＸＣＸＩＩの修飾されたＸｂａＩ部位にクローニングされ得る（ＭｃＫｉｎｎｏｎら．， １９８２， Ｇｅｎｅ， １９： ３３； ＭｃＧｒｏｒｙら．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３： ６１４）。
【０３４９】
シャトルベクターｐＸＣＸＩＩの修飾：
配列：５′−ＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣ−３′を有するＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｆｉＩ、ＰｍｅＩ、ＮｈｅＩ、Ｓｒｆｌ、ＰａｃＩ、ＳａｌＩおよびＸｂａＩの制限部位を、５′末端〜３′末端に含む複数のクローニング部位は、ベクターｐＸＣＸＩＩのＸｂａＩ部位（３３２９位のヌクレオチド）のレベルに挿入され得る（ＭｃＫｉｎｎｏｎら．， １９８２， Ｇｅｎｅ １９： ３３； ＭｃＧｒｏｒｙら．， １９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３： ６１４）。
次いで、ＣＭＶプロプロモーター／エンハンサー、ＦＶ４０のドナーおよびアクセプタースプライシング部位ならびにＦＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む修飾されたベクターｐＣＭＶ−βから単離されるＥｃｏＲＩ−ＳａＩＩ ＤＮＡ断片は、ｐＣＭＶ−１１と称される修飾されたシャトルベクターｐＸＣＸのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングされ得る。
【０３５０】
シャトルベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡの調製：
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡは、上記のＲＴ−ＰＣＲ反応により得られ、そしてＮｏｔＩ部位のレベルにおいてベクターｐＣＭＶ−１２にクローニングされ、ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ５、ｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ６、ｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ９、およびｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ１０が得られる。
【０３５１】
ＡＢＣ１組換えアデノウイルスの構築：
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスは、ＭｃＧｒｏｒｙら（１９８８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６３： ６１４）に記載される技術に従って構築され得る。
簡単には、ベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣＡがＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（１９８７， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７： ２７４５−２７５２）の技術に従ってベクターｔＧＭ１７と共に同時トランスフェクトされる。
同様に、ベクターｐＡＤ１２−ルシフェラーゼが構築され、そしてベクターｐＪＭ １７と共に同時トランスフェクトされた。
組換えアデノウイルスは、ＰＣＲ増幅により同定さら、そしてヒト胚腎臓細胞株ＨＥＫ ２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）における大規模増幅前に、２回の精製サイクルにかけられる。
感染させた細胞を、アデノウイルスベクターを用いたそれらの感染後４８〜７２時間後に回収し、５回の凍結−融解の溶解サイクルにかける。
粗溶解物を、Ｆｒｅｏｎ（Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎｅ １１３， Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ， Ｓｃａｕｃｕｓ， Ｎ． Ｊ． ＵＳＡ）を用いて抽出し、０．２％マウスアルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）が補充された塩化セシウム中で２回沈殿させ、そして１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ ＣａＣｌ２からなる緩衝液に対して大規模に透析する。
組換えアデノウイルスを、−７０℃で貯蔵し、そして動物へのそれらの投与または培養細胞とのそれらのインキュベーション前に滴定する。
野生型が混ざったアデノウイルスの非存在が、欠失領域の構造部分に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ増幅を用いたスクリーニングにより確認される。
【０３５２】
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡの発現の検証：
ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、配列番号５〜８に記載されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含む、ＡＢＣＡ１タンパク質に由来する合成ポリペプチド断片を注入することにより、ウサギおよびニワトリにおいて上記のように調製され得る。これらのポリクローナル抗体は、免疫ブロット法および／または免疫検出法により細胞モデルおよび動物モデルにおけるヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子の発現を検出および／または定量化するために使用される。
ＡＢＣＡ５〜６、９〜１０の生物学的活性は、コレステロールと共に取り込まれたベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＩによりトランスフェクトされた細胞を用いて、ａｐｏＡ−Ｉにより誘導されるコレステロール流出を定量化することによりモニターされ得る（Ｒｅｍａｌｅｙら．， １９９７， ＡＴＶＢ， １７： １８１３）。
【０３５３】
細胞におけるヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡのインビトロでの発現：
ＨＥＫ２９３株およびＣＯＳ−７株の細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＵＳＡ）、ならびにタンジール病患者または低アルファリポタンパク血症に罹患した患者に由来する初代培養における繊維芽細胞が、リポフェクタミン（ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いるかまたは塩化カルシウムを用いた共沈法（Ｃｈｅｎら．， １９８７， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７： ２７４５−２７５２）により、発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ５、ｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ６、ＣＭＶ−ＡＢＣＡ９、およびｐＣＭＶ−ＡＢＣＡ１０（５〜２５μｇ）を用いてトランスフェクトされる。
これらの細胞もまた、ベクターｐＡＢＣＡ５−ＡｄＶ、ｐＡＢＣＡ６−ＡｄＶ、ｐＡＢＣＡ９−ＡｄＶ、およびｐＡＢＣＡ１０−ＡｄＶ（Ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＭＯＩ＝１０）により感染し得る。
ヒトＡＢＣＡ５〜６、９〜１０の発現は、免疫ブロット法により、ならびにトランスフェクトおよび／または感染された細胞を使用してａｐｏＡ−１により誘導されたコレステロールの流出の定量化によりモニターされ得る。
【０３５４】
種々の動物モデルにおけるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子のインビボでの発現
１０８〜１０９個の溶解プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む精製された組換えアデノウイルス（ｐＡＢＣＡ−ＡｄＶまたはｐＬｕｃｉｆ−ＡｄＶ）を含んだ培地の適当量（１００〜３００μｌ）が、実験０日にマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、コントロールマウスおよびトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスのモデル）の伏在静脈に注入される。
コレステロールまたは炎症性の脂質物質の輸送におけるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０タンパク質の生理学的役割の評価は、アデノウイルスの投与前（０日）および投与後（２、４、７、１０、１４日）にコレステロールまたは炎症性の脂質物質の総量を測定することにより実施される。
放射活性標識された産物を用いた動態研究が、コレステロールおよび炎症性の脂質物質の輸送におけるＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の発現の効果を評価するために、ベクターｒＬｕｃｉｆ−ＡｄＶおよびｒＡＢＣＡ−ＡｄＶの投与の５日後に実施される。
さらに、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックマウスおよびウサギが、例えばＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０のような内因性プロモーター、またはＣＭＶもしくはａｐｏＥの制御下で、ヒトＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０ ｃＤＮＡを含む構築物を用いて、Ｖａｉｓｍａｎ（１９９５）およびＨｏｅｇ（１９９６）の教示に従って産生され得る。
炎症の媒介に関係する脂質の動態に関するＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣＡ９、およびＡＢＣＡ１０の発現の長期効果の評価が、上記のように実施され得る。
【０３５５】
実施例１０：ＡＢＣＡ９遺伝子の同位体インサイチュハイブリダイゼーション研究
インサイチュハイブリダイゼーション実験は、配列番号３のヌクレオチド配列のヌクレオチド１〜３３０に対応する３３０ｂｐの放射性標識されたｃＲＮＡプローブを用いて実施された。３３０ｂｐの挿入物は、３５Ｓ−ウリジン５′−トリホスフェートの存在下で、Ｔ７（アンチセンス）およびＳＰ６（センス）ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでサブクローニングおよび転写された。転写後、プローブをカラム精製し、そして５％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離して大きさおよび純度を確認した。
連続的な動脈および心臓組織切片を、プロテイナーゼＫを用いて消化し、そしてプローブを用いて適当な３．４×１０７ｄｐｍ／ｍｌの濃度で、１８時間、５５℃にてプローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、スライドを、ＲＮＡｓｅ Ａを用いて処理し、そして０．１×ＳＳＣにおいて、６０℃、２時間、ストリンジェントに洗浄した。次いで、スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ−２エマルションを用いて被覆し、１４日間、４℃で露光し、Ｋｏｄａｋ Ｄ−１９ディベロッパーおよびフィクサーを用いて現像した。スライドを、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、そしてＮｉｋｏｎマイクロスコープに連結したＤＶＣ １３１０Ｃカメラを用いて画像化した。
【０３５６】
２つのコントロールプローブを、これらの研究において使用した。全ての組織を、β−アクチンｍＲＮＡについてのプローブを用いて最初にスクリーニングし、ＲＮＡがアーカイバル（ａｒｃｈｉｖａｌ）パラフィン試料内に保存されることを確実にした。隣接する連続切片をまた、アンチセンスプローブとして遺伝子の同じ領域に由来するセンスコントロールリボプローブとハイブリダイズした。これらのハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシーにおいて、このセンスコントロールプローブは、特定の細胞型に関係なく、そしてそのセンスプローブの組織への非特異的付着に起因するようであるバックグラウンドシグナルを、全ての組織中で生じる傾向がある。アンチセンスプローブにより産生される非特異的バックグラウンドは、センスプローブで観察されるバックグラウンドを超えず、そして添付の報告書に記載される陽性アンチセンスシグナルは、特異的に細胞に関連し、そして非反応性の細胞型に存在するバックグラウンドシグナルより高い。
【０３５７】
図５は、腎臓細胞悪性腫瘍を有する８０歳女性から、腎摘出術において得られた標準の腎臓動脈切片であり、動脈および静脈両方における中膜平滑筋の弱いハイブリダイゼーションを示す。外膜神経は、シュワン細胞においてまばらで弱い陽性を示した（図６）。また、隣接するガングリオンにおいて、ガングリオン細胞およびシュワン細胞の両方が、弱い陽性であった（図７）。
図８および９は、腎盂尿管移行部の先天性狭窄を有する２４歳男性から、腎摘出術において得られた標準の腎臓動脈切片を示し、そして回収した腺上皮および尿細管上皮それぞれにおけるハイブリダイゼーションを示す。
図１０は、死因が頸部の癌である４１歳女性から得られた標準の心臓切片であり、そして心筋細胞の中程度に陽性のハイブリダイゼーションを示した。
図１１は、死因が非小肺がんである６０歳男性から得られた標準の心臓切片であり、そして内皮細胞が間質血管においてときどき陽性であることを示した。
【０３５８】
実施例１１：ＡＢＣＡ１０遺伝子の同位体インサイチュハイブリダイゼーション研究
インサイチュハイブリダイゼーション実験は、アーカイバルパラフィン試料からの連続の動脈、心筋、および骨格組織切片を使用して実施された。
組織切片は、ヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド１３８３〜１７８７に対応する４０５ｂｐの放射性標識されたｃＲＮＡプローブとハイブリダイズし、次いでこれがＰＣＲ増幅された。次いで、ＰＣＲ産物が、３５Ｓ−ウリジン５′−トリホスフェートの存在下において、Ｔ７（アンチセンス）およびＳＰ６（センス）ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写された。転写の後、このプローブをカラム精製し、そして５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより分離し、大きさおよび純度を確認した。組織切片を消化し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションを実施例１０に記載されるように実施した。
【０３５９】
動脈組織のインサイチュハイブリダイゼーションを示す図１２および１３は、最も強いハイブリダイゼーションがマクロファージ、リンパ球の一部、および神経のシュワン細胞において常に同定された。
心筋組織切片を示す図１４は、粥腫におけるマクロファージの陽性シグナルを示した。ガングリオンを含む組織の隣接切片において、シュワン細胞の一部は、中程度に陽性であり、そしてガングリオン細胞は、弱いハイブリダイゼーションを示した（図１５）。
図１６は骨格組織の切片を示し、散在するマクロファージがかすかな中程度の陽性であった。図１７は、神経におけるシュワン細胞の中程度のハイブリダイゼーションを示した。
【０３６０】
本発明は、本明細書中に記載された特定の実施態様により範囲を限定されるものではない。実際、本明細書中に記載される発明に加え、本発明の種々の改変が、上記説明および添付の図面から当業者に明らかであろう。このような改変は、特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＡＢＣＡ５，６，８〜１０遺伝子を含む１７ｑ２４領域の地図を表す。５つのＡＢＣＡ遺伝子を含む染色体１７ｑ２４の一部の物理的地図が示される。マイクロサテライトマーカーＤ１７Ｓ９４０遺伝子座の位置が、ＢＡＣクローンｈＲＰＫ．２３５＃Ｉ＃１０およびｈＲＰＫ．２９３＃Ｋ＃２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＡＣ００５４９５， ＡＣ００５９２２）の境界と共に示される。遺伝子配向が矢印によって表示され、そして対応する転写産物の大きさおよび位置が地図の下に示される。・が、開始コドンを示し、｜が、終止コドンを表し、−−−が、ワーキングドラフト配列を表す。
【図２Ａ】
ＡＢＣ１様遺伝子のアランメントを表す。全長ＡＢＣＡ６，８，９および１０のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列アランメント、およびＡＢＣＡ１に対して並べられたＡＢＣＡ５およびＡＢＣＡ１０の部分配列が示される。
【図２Ｂ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｄ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｅ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｆ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｇ】
図２Ａの続きである。
【図２Ｈ】
図２Ａの続きである。
【図３】
ＡＢＣ１様遺伝子の最大の最節約樹である。系統樹は、隣接結合および最節約法によって、Ｎ−およびＣ末端ＡＴＰ−結合ドメイン配列のアランメントによって構築された。
【図４】
２０個のヒト組織：膵臓（レーン１）、腎臓（２）、骨格筋（３）、肝臓（４）、肺臓（５）、胎盤（６）、脳（７）、心臓（８）、白血球（９）、大腸（１０）、小腸（１１）、卵巣（１２）、精巣（１３）、前立腺（１４）、胸腺（１５）、脾臓（１６）、胎児の腎臓（１７）、胎児の肝臓（１８）、胎児の肺（１９）および胎児の脳（２０）由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノザンブロット分析。ＡＢＣＡ５（Ａ）、ＡＢＣＡ６（Ｂ）、ＡＢＣＡ９（Ｃ）、およびＡＢＣＡ１０（Ｄ）の特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション。
【図５】
中膜平滑筋を示している標準の腎動脈切片における、アンチセンスＡＢＣＡ９ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図６】
血管外膜神経およびシュワン細胞を示している標準の腎動脈切片上のアンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図７】
隣接した神経節およびシュワン細胞を示している標準の腎動脈切片（６０Ｘ）における、アンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す。
【図８】
集合管上皮を示している隣接した腎臓切片における、アンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図９】
腎臓尿細管上皮を示す隣接した腎臓切片上のアンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１０】
心筋細胞を示している標準の心臓切片における、アンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１１】
介在性の血管内皮細胞および繊維芽細胞を示している標準の心臓切片における、アンチセンスＡＢＣＡ９ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ９タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１２】
隣接した結節、リンパ球およびマクロファージを示す動脈組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１３】
神経におけるシュワン細胞を示している動脈組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１４】
アテロームにおける筋内膜（ｍｙｏｉｎｔｉｍａｌ）細胞を示している心筋組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１５】
神経節およびシュワン細胞を示す心筋組織に隣接した組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１６】
マクロファージを示す骨格組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１７】
神経中のシュワン細胞を示す骨格組織切片における、アンチセンスＡＢＣＡ１０ ＲＮＡプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーションによって、ＡＢＣＡ１０タンパク質をコードする遺伝子の発現パターンを示す（６０Ｘ）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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