(57)【要約】本発明はリウマチ関節炎治療のためのプロディギオシンの新たな用途に関するもので、セラチア・マルセッセンス(Serratia  marcescence)から分離したプロディギオシン(prodigiosin)を有効成分として含有する組成物をコラーゲン−誘導リウマチ関節炎モデル動物であるDBA／1マウスに投与することにより、リウマチ関節炎の重要な病因であるサイトカインの体内生成が抑制されるため、本発明はリウマチ関節炎に対して優れた治療効果がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラチア・マルセッセンスB−1231(Serratia  marcescence  B−1231、KCTC  0386BP)から単離した下記化学式１のプロディギオシンを有効成分として含有するリウマチ関節炎治療用組成物。
【化１】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリウマチ関節炎治療用プロディギオシン組成物に関し、より詳細にはリウマチ関節炎を治療するためのセラチア・マルセッセンスから単離した免疫抑制物質であるプロディギオシンの新たな用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ関節炎は全体大人人口の約１％程が苦痛を受けている比較的に多い疾病で患者の90％以上が女性であり、その症状としては両側手首の関節が硬直することを挙げることができる。この疾病の診断は血検査を行いリウマチ因子(rheumatoid  factor)の有無を調査し、X線撮影を行い関節の間が狭くなったかまたは骨の磨耗があったかを確認することにより可能である。しかし、大部分の患者達は長期間の関節破壊に因る諸形態の関節変形を伴うが、特に手部位の関節変形が最も甚だしいため、外見上一目してリウマチ関節炎であると診断される場合もある。リウマチ関節炎は自己免疫疾患の一種でその病因が明確に明かされていない全身疾患である。この疾病は諸関節、特に手の関節に対称的に炎症を起こし数年乃至数10年に亘って関節を徐々に破壊し、たまには関節だけでなく肺・心臓・目・血管・神経など諸臓器を侵犯することもある。また、この疾病は主に30代前後の人生の活動期に発病して身体機能に障碍を誘発して生命を衰退させ作業能力を低下させて莫大な経済的損失を招来する。
【０００３】
去る10年間リウマチ関節炎の治療法には重要な変化と飛躍的な発展があった。このような発展はできる限り副作用を最小化し関節の破壊と疾病自体の進行を防止する方向へ為されている。関節炎治療に多く用いられた従来の消炎鎮痛剤は細胞でCOX(cyclooxygenase)という酵素によりプロスタグランジン(prostaglandin)生成代謝を抑制することにより消炎鎮痛効果を現す。COX酵素にはCOX1とCOX2の二つの種類がある。COX−1は炎症部位だけでなく正常的な人体の諸臓器と組織、即ち、胃腸管または腎臓などでプロスタグランジン類の物質の生成に広範囲に関与する。反面、COX−2は炎症を起こしている部位にのみ作用する酵素と知られている。既存の市販されている消炎鎮痛剤らはCOX−1とCOX−2を同時に抑制するか、または主にCOX−1を抑制するため、炎症性組織だけでなく肝・胃腸管または腎臓などの機能維持に必須的なプロスタグランジンを同時に抑制して多くの副作用を引き起こすものと知られている。最近開発されている選択的COX−2抑制剤(selective  COX−2  inhibitor)らは既存の消炎鎮痛剤効果をそのまま維持しながら副作用を大いに減少させることができるので、近年その使用が増加している趨勢である。
【０００４】
現在、リウマチ関節炎の治療剤として広く用いられている消炎鎮痛剤や副腎皮質ホルモン製剤は、効果はあるが副作用が少なくなく、根本的にリウマチ関節炎の進行を防止し得ないという短点がある。このような理由に因り抗リウマチ剤を投与することによりリウマチ関節炎が一時的に治療されても投薬を中断し得なく一定の維持量を継続投与しなければならない不便がある。それ故に、このような場合の患者達のために新たな免疫調節剤の導入が必要になった。最近、米国を中心としてレフルノミド(leflunomide)、低容量のシクロスポリン(cyclosporine)などがリウマチ関節炎治療のための代表的な薬剤としてその効果が立証された。リウマチ関節炎が免疫細胞の過度で異常な興奮により発生するということが知られており、免疫細胞相互間の作用を遮断する場合に治療効果があるであろうことに着目して免疫抑制剤の開発を試図するようになった。リウマチ関節炎は免疫細胞の異常に因り発病する自己免疫性炎症疾患と知られている。人間の免疫反応は主に大食細胞とリンパ球によりなされる。外部物質特に関節炎誘発因子(arthritogenic  factor)が人体に侵入すると抗原伝達細胞が処理する。すなわち抗原決定因子断片(ペプチド)を細胞表面でHLA遺伝子と結合して(ペプチド−遺伝子複合体)抗原特異的Tリンパ球にその情報を伝達するようになる。リウマチ関節炎は特定遺伝因子、即ち、人間のHLA−DR4またはDR1がこの遺伝子と親和力が強い外部物質、即ち、関節炎誘発因子と結合すると、この抗原特異的T細胞受容体と結合して免疫反応が異常に過多に起こり互いに興奮させる信号を与えるかまたはサイトカイン(cytokine)が分泌される。その結果、他の免疫細胞を呼び入れ免疫反応が増幅されて関節を攻撃するようになる疾病である。従って、関節炎誘発物質に対する特異的免疫反応を抑制する免疫抑制剤の開発は関節炎治療効果を永久に極大化し得るであろう。
【０００５】
ストレプトミセス(Streptomyces)またはセラチア(Serratia)属微生物らはピロリルピロメテン骨格の赤色物質らを生産するが、これら物質のうちにはプロディギオシン、メタシクロプロディギオシン、プロディギオセン、デスメトキシプロディギオシン、プロディギオシン25−Cなどが含まれている。これら物質らは抗菌効果および抗マラリア効果などがあるのが知られている。特に、プロディギオシン25−Cは免疫抑制作用があるのが知られている。
【０００６】
プロディギオシンの単離方法および免疫抑制効果は、本発明者達により既に報告された(韓国特許第252197号、登録日2000年1月17日；International  Journal  of  Immunopharmacology  20，１−13，1997)。
プロディギオシンの構造を下記化学式１に示した。
【化１】
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…(1)
【０００７】
前記文献で、プロディギオシンは、B細胞の抗体生成および増殖は抑制せずにT細胞の増殖および活性だけを強く抑制するT細胞に選択的な免疫抑制剤であり、免疫抑制が起こる濃度で毒性を現さないことを解明した。プロディギオシンは自家移植拒否反応および第１型糖尿病に対する治療効果があるが、これは異種移植拒否反応試験系およびNODマウスを利用した糖尿病試験系により解明した。本発明者達はセラチア・マルセッセンスから単離したプロディギオシンを利用した糖尿病治療効果を既に解明した(特許出願第7139号、出願日2000年2月15日)。前記文献で、プロディギオシンを10mg／kgの投与量で２日毎に腹腔投与することによりNODマウスの糖尿病発症が完全に抑制された。また、プロディギオシンは膵道(pancreatic  islet)への免疫細胞浸潤(Lymphocyte  infiltration)を抑制して膵道炎(insulitis)を抑制した。一方、プロディギオシンを10〜30mg／kgの濃度で16週間動物に投与しても毒性を現しなかったが、この結果からプロディギオシンの免疫抑制剤への開発可能性が非常に高いのが分かった。特に、リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果は未だ報告されていない。
【特許文献１】
韓国特許第252197号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者達は前記の如き問題を勘案して案出したもので、セラチア・マルセッセンスから単離したプロディギオシンを有効成分として含有する組成物のリウマチ関節炎に対する治療効果を解明することにより本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明の目的は副作用のないリウマチ関節炎治療用プロディギオシン組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の前記目的はセラチア・マルセッセンスから単離したプロディギオシンを有効成分として含有する組成物をコラーゲン−誘導リウマチ関節炎モデル動物であるDBA／1マウスに発病初期または発病以後に投与した後、治療効果及びサイトカインの生成抑制能を測定し、リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの薬理機構を解明することにより達成した。
【００１１】
リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果は、コラーゲン誘導リウマチ関節炎モデル動物を利用して検証した。関節炎の病態開始および初期症状に対する治療効果を測定するためにプロディギオシンを発病初期にのみ投与する実験を行った。また、進行性悪化病態に対する治療効果を測定するためにプロディギオシンを発病以後に投与する実験を別途に行った。プロディギオシンの薬理機構を解明するためにリウマチ関節炎を誘発する重要な病因であるサイトカインの発現度を測定した。
【００１２】
本発明に用いられたプロディギオシンは、本発明者達が発明した韓国特許第252197号に公知された方法によりセラチア・マルセッセンスB−1231寄託番号KCTC  0386BPから単離して用いた。本発明ではプロディギオシンを10mg／kgの濃度で2日毎に一度ずつ腹腔に投与したが、プロディギオシンの投与量・投与方法および投与期間は関節炎の症状によって調節することができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上、前記実施例で説明した通り、セラチア・マルセッセンスから単離したプロディギオシンは、初期リウマチ関節炎および進行性リウマチ関節炎を副作用なく治療し得るリウマチ関節炎治療剤である。したがって、本発明はリウマチ関節炎患者の疾患治療と関連した医薬産業上非常に有用な発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的な方法を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の権利範囲はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
コラーゲン誘導リウマチ関節炎モデル動物の準備
【００１６】
日本Charles  River  Japan社の６週齢雄DBA／1マウスを８〜12週齢まで馴化した後実験に用いた。実験開始第１日目にコラーゲン／complete  freund's  adjuvant  100μlをDBA／1マウスの尾に皮下注射した。コラーゲン／complete  freund's  adjuvant
は0.05M酢酸に2mg／ml濃度のコラーゲン(bovine  typr  2)を溶解させた後、同一の濃度のcomplete  freund's  adjuvantを混合したものである。
【００１７】
実験開始21日目にコラーゲン100μgを腹腔注射し、実験開始28日目にリポ多糖類(LPS)40μgを腹腔注射して関節炎発症を促進させた。リウマチ関節炎の発症程度は肉眼で観察し、これを臨床数値(clinical  index)で示した。即ち、０＝無発症、0.5＝足指が赤く腫れた状態、１＝軽症度の発症状態、1.5＝重症度の発症状態、２以上＝甚だしい発症および関節硬直が現れた状態を意味する。DBA／1マウスの４足に対するリウマチ関節炎発症度を検査し、０点から８点までの関節炎誘発程度を示した。リウマチ関節炎発病は実験開始28日目に腹腔注射したLPSにより促進されて実験開始29日目に肉眼で関節炎の病変が観察された。
【実施例２】
【００１８】
リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果
【００１９】
本発明ではリウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果を確認するために10mg／kgのプロディギオシンを、(１)リウマチ関節炎発病時点である実験開始29日から実験最終日である実験開始65日まで隔日毎に腹腔投与する場合、(２)リウマチ関節炎発病時点である実験開始29日から実験開始36日まで隔日毎に腹腔投与する場合、(３)リウマチ関節炎が進行中の実験開始36日から実験最終日である実験開始65日まで隔日毎に腹腔投与する場合に区分して実験を実施した。
【００２０】
本実施例２では前記実施例１で準備したコラーゲン誘導リウマチ関節炎DBA／1マウスに実験開始29日から実験開始65日まで隔日毎にプロディギオシン10mg／kgを腹腔投与した。前記方法によるプロディギオシン投与群DBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／１マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を図１に示した。プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスは３以上のリウマチ関節炎発症度を示した反面(閉じた円)、プロディギオシンを投与したDBA／1マウスは0.5以下の発症度を示した(開いた円)。前記結果からプロディギオシンはリウマチ関節炎の発症を強く抑制する効能がある治療剤であることが分かった。
【実施例３】
【００２１】
初期リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果
【００２２】
プロディギオシン投与中止後の変化および初期リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの影響を知るために前記実施例１で準備したコラーゲン誘導リウマチ関節炎DBA／1マウスに実験開始29日から実験開始36日までにのみ隔日毎にプロディギオシン10mg／kgを腹腔投与した。前記方法によるプロディギオシン投与群DBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を図２に示した。プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスは３以上のリウマチ関節炎発症度を示した反面(閉じた円)、プロディギオシンを投与したDBA／1マウスは実験開始38日頃まで0.5以下の発症度を示した(開いた円)。従って、プロディギオシンはリウマチ関節炎の発病抑制および治療効果があるのが分かった。一方、プロディギオシンの投与を中止した後の発症率が１程まで急激に増加したが、それ以上の深刻な増加は観察されなかった。
【００２３】
前記結果からプロディギオシンは関節炎の発病開始および初期症状を抑制するだけでなく、投与中止後にも症状が甚だしい悪化を予防することが分かった。これはプロディギオシンにより関節に対する自己免疫反応が抑制されたことを意味する。
【実施例４】
【００２４】
進行性リウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果
【００２５】
リウマチ関節炎が発病して進行した後のプロディギオシンの影響を知るために、前記実施例１で準備したコラーゲン誘導リウマチ関節炎DBA／1マウスに実験開始36日から実験開始65日まで隔日毎にプロディギオシン10mg／kgを腹腔投与した。前記方法によるプロディギオシン投与群DBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を図３に示した。プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスは実験開始36日頃に２程の発症度を示し、その後にも持続的に増加して実験開始65日頃には４程の発症度を見せた反面(閉じた円)、プロディギオシンを投与したDBA／1マウスは実験開始36日頃の２程の発症度からそれ以上増加しなかった(開いた円)。これはプロディギオシンにより関節組織に対する自己免疫反応が抑制されてリウマチ関節炎の進行が抑制されたことを意味する。
【実施例５】
【００２６】
病理検査結果
【００２７】
前記実施例３のプロディギオシン投与群DBA／1マウスおよびプロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの指骨間関節および膝関節に対する病理検査を実施した。プロディギオシン投与最終日に膝関節と指骨間関節を分離した後、ヘマトキシリン(hematoxylin)およびエオシン(eosin)染色を実施した。その顕微鏡写真図を図４に示した。プロディギオシン投与群DBA／1マウスの指骨間関節(A)および膝関節(C)では正常組織が観察された反面、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの指骨間関節(B)および膝関節(D)ではリウマチ関節炎の病変が観察された。また、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの指骨間関節(B)では関節内へのリンパ球の浸潤(Lymphocyte  infiltration)が観察されたが、プロディギオシン投与群DBA／1マウスの指骨間関節(A)では免疫細胞の浸潤が観察されなかった。プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの膝関節(D)では関節の破壊が観察されたが、プロディギオシン投与群DBA／1マウスの膝関節(C)では正常組織が観察された。
【実施例６】
【００２８】
プロディギオシンによるサイトカイン生成抑制
【００２９】
前記実施例３のプロディギオシン投与群DBA／1マウスおよびプロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの脾臓細胞を分離した後にRNAを分離した。その後、RT−PCR(Reverse  transcriptase  polymerase  chain  reaction)を利用してサイトカインの発現度を測定した。TNF−α、IL−１β、IL−６、IL−12といった炎症性サイトカイン；IL−２、IFN−γといったThl細胞由来のサイトカイン；IL−４、IL−10といったTh2細胞由来のサイトカインの発現度を測定した。その結果を図５に示した。プロディギオシンを投与することにより前記全ての種類のサイトカイン発現が減少した。前記結果からリウマチ関節炎に対するプロディギオシンの治療効果はリウマチ関節炎を誘発する重要な病因であるサイトカインの発現を抑制することにより達成されることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プロディギオシン10mg／kgを実験開始後29日から65日まで隔日毎に腹腔注射したDBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を示したグラフである。
【図２】プロディギオシン10mg／kgを実験開始後29日から36日まで隔日毎に腹腔注射したDBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を示したグラフである。
【図３】プロディギオシン10mg／kgを実験開始後36日から64日まで隔日毎に腹腔注射したDBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスのコラーゲン注射後の経過日によるリウマチ関節炎発症度を示したグラフである。
【図４】プロディギオシン10mg／kgを実験開始後29日から36日まで隔日毎に腹腔注射したDBA／1マウスの指骨間関節(A)および膝関節(B)と、プロディギオシンを投与しなかった対照群DBA／1マウスの指骨間関節(C)および膝関節(D)の顕微鏡写真図である。
【図５】プロディギオシン10mg／kgを実験開始後29日から65日まで隔日毎に腹腔注射したDBA／1マウスと、プロディギオシンを投与しなかった対象群DBA／1マウスに対するRT−PCRを利用したサイトカイン発現度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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