(57)【要約】（ａ）プラスチドゲノム中の遺伝子の機能を改変又は破壊して、選択可能な又は認識可能な表現型を生じさせる段階、（ｂ）前記表現型を発現しているプラスチドを有する植物又は細胞を分離又は選択する段階、（ｃ）前記機能を修復することができる修復配列を有する少なくとも１つの形質転換ベクターを用いて、前記分離した又は選択した植物、植物器官、植物組織の前記プラスチドゲノムを形質転換させる段階、及び（ｄ）前記修復された機能を発現しているプラスチドを有する、前記形質転換された植物、植物器官、植物組織を分離又は選択する段階によって、プラストームが形質転換された多細胞植物、植物器官、植物組織を生成する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プラスチドゲノム中の遺伝子の機能を改変又は破壊して、選択可能な又は認識可能な表現型を生じさせる段階、
（ｂ）前記表現型を発現している植物又は細胞を分離又は選択する段階、
（ｃ）前記機能を修復することができる修復配列を有する少なくとも１つの形質転換ベクターを用いて、前記分離した又は選択した植物、植物器官、植物組織の前記プラスチドゲノムを形質転換させる段階、および
（ｄ）前記修復された機能を発現しているプラスチドを有する、前記形質転換された植物、植物器官、植物組織を分離又は選択する段階
によって、プラストームが形質転換された多細胞植物、植物器官、植物組織を生成する方法。
【請求項２】
段階（ｃ）の形質転換で前記機能が修復されるとともに少なくとも１つの追加の機能が導入される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）の形質転換で前記機能が修復されるとともにプラスチドゲノムの所望の追加の遺伝的改変が引き起こされる、請求項１又は請求項２の一項に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｃ）の形質転換でさらに、既に存在する機能が排除される請求項１から請求項３までの一項に記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）の前記改変又は破壊が自然突然変異又は誘導突然変異によって得られる請求項１から請求項４までの一項に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）の前記改変又は破壊が遺伝的形質転換によって得られる請求項１から請求項５までの一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的形質転換の結果、同時に少なくとも１つの追加の機能の少なくとも１つの追加の配列が導入される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の機能が阻害剤耐性機能であり、段階（ｂ）を対応する阻害剤の存在下で実施する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）で最初にだけ阻害剤を加える請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）と（ｂ）で栄養性型を改変又は破壊し、段階（ｃ）と（ｄ）で栄養性型を修復する、請求項１から請求項９までの一項に記載の方法。
【請求項１１】
修復される栄養性型が光栄養性である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ａ）と（ｂ）で導入した阻害剤耐性又は非感受性を段階（ｃ）と（ｄ）で元に戻す請求項１から請求項１１までの一項に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ａ）及び／又は（ｃ）で使用したベクター（又は複数のベクター）が、相同組換えに十分な、宿主プラスチド配列に対する相同性を有する配列を含む、請求項１から請求項１２までの一項に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｂ）で植物、植物器官、植物組織を混合栄養性で成長させるか又は培養する、請求項１から請求項１３までの一項に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ａ）の前記改変又は破壊により色素欠損表現型が生じる請求項１から請求項１４までの一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記色素欠損表現型がクロロフィル欠損である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
段階（ａ）で改変又は破壊された遺伝子が、プラストームにコードされた、転写又は翻訳に必要なプラスチド遺伝子、特にＲＮＡポリメラーゼである請求項１から請求項１６までの一項に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）で改変又は破壊された遺伝子がプラスチドｒｐｏＡ遺伝子又はｒｐｏＢ遺伝子である請求項１から請求項１７までの一項に記載の方法。
【請求項１９】
外部の成長条件に応じて、段階（ａ）で生じる表現型が２つ又は複数の外見を交互に示すことができる、請求項１から請求項１４までの一項に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ａ）で改変又は破壊された遺伝子が、通常の光条件下で黄白色表現型を生じ、低い光条件下で薄緑色表現型を生じる、プラスチドｙｃｆ３遺伝子である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ａ）で改変又は破壊された遺伝子が、改変又は破壊されると高クロロフィル蛍光表現型を生じるプラスチド遺伝子、好ましくはｐｅｔＡである請求項１から請求項１５までの一項に記載の方法。
【請求項２２】
効果を示すには光合成の活性が必要とされる阻害剤を段階（ｂ）で使用する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記阻害剤がパラコート、モルファムコート（ｍｏｒｐｈａｍｑｕａｔ）、ジクワット、ジフェンゾコート、及び／又はサイパーコート（ｃｙｐｅｒｑｕａｔ）である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ｄ）で光混合栄養条件を使用する、請求項１から請求項２３までの一項に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ａ）で導入された配列と段階（ｃ）で導入された配列とが相まって追加の機能を生じる請求項１から請求項２４までの一項に記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｄ）が阻害剤耐性によって支援される請求項１から請求項２５までの一項に記載の方法。
【請求項２７】
プラスチドゲノムにコードされた破壊された機能を修復することができる修復配列と、前記破壊された機能の修復を相同組換えにより行える程度に前記プラスチドゲノムの形質転換させるべき配列部分と相同な少なくとも１つの配列とを含む、多細胞植物又はその細胞のプラスチドゲノムを形質転換させるためのベクター。
【請求項２８】
少なくとも１つの追加の機能を導入するための少なくとも１つの追加の配列を有する請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記プラスチドゲノムの所望する追加の遺伝的改変を引き起こす配列をさらに含む、請求項２７又は請求項２８の一項に記載のベクター。
【請求項３０】
前記プラスチドゲノムの所定の配列部分が削除可能なように配置されている前記相同配列（又は複数の配列）を有する、請求項２７から請求項２９までの一項に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１から請求項２６までの一項に記載の方法によって得ることができる多細胞植物、植物組織又はその種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、植物分子生物学に関し、より詳細にはプラスチドを形質転換させる新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に受け入れられている認識によると、２つのクラスの細胞オルガネラ、すなわちプラスチド及びミトコンドリアは、元々独立していた原核生物に由来し、別々の内部共生現象によって現在の真核生物の祖先に取り込まれた（Ｇｒａｙ、１９９１）。したがって、これらオルガネラはそれぞれのＤＮＡ、伝令ＲＮＡの形のＤＮＡ転写物、リボソーム、及び、遺伝情報を解読するのに必要な多少の何らかの形の必須ｔＲＮＡを含んでいる（Ｍａｒｅｃｈａｌ−Ｄｒｏｕａｒｄ他、１９９１）。
【０００３】
内部共生による取り込みのすぐ後は、これらオルガネラは原核生命を営むのに必要なすべての要素を含んでいたので遺伝的に自律していたが、進化の過程で遺伝情報が細胞核に移動することにより、この自律性は低減した。それにもかかわらず、その遺伝情報は十分複雑であり、現在の細胞オルガネラは遺伝子工学の魅力的な標的となる。プラスチドの場合、これらオルガネラが植物細胞内でのその主な機能である光合成に必要なタンパク質の約５０％を依然としてコードしているので、特にそうである。プラスチドはまた、そのリボソームＲＮＡ並びにそのｔＲＮＡ及びリボソームタンパク質のほとんどをコードしている。全体で、プラストーム中の遺伝子数は１２０程度である（Ｐａｌｍｅｒ、１９９１）。しかし、プラスチド中に存在するタンパク質の大部分は、核／細胞基質の遺伝子区画から輸送されている。
【０００４】
プラスチドを遺伝的に形質転換させることができる
一般的な分子クローン化技術の発達に伴って、やがて形質転換によって高等植物を遺伝的に改変させることが可能になった。最近その完全な配列が発表されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（シロイヌナズナゲノムイニシアチブ（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）、２０００）の場合、遺伝子の大部分、約２６，０００個が細胞核に存在するので、植物形質転換における主な重点は、昔も今も核の形質転換にある。核の形質転換が効率的に行えるように改変することができる、アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）など生物ベクターを利用することができたので、核の形質転換を実現することがより容易であった（Ｇａｌｖｉｎ、１９９８）。さらに、オルガネラは一般に、ＤＮＡなど高分子を透過させない２重の包膜に囲まれているが、核は外来核酸とより直接に接近することができる。
【０００５】
プラスチドを形質転換させることができると、非常に高い導入遺伝子発現レベルの潜在能力を有する、これらオルガネラ中の莫大な遺伝子量（１個の細胞あたり１００００コピー以上のプラストームが存在し得る）が使用可能となるので、非常に望ましい。さらに、プラスチド形質転換では、プラスチドにコードされている形質が花粉によって伝播されず、したがって、導入遺伝子を、意図せずに遺伝子導入植物の野生の類縁体に逃してしまう潜在的な危険性が大幅に減少するので、魅力的である。プラスチド形質転換の他の潜在的な利点には、複数遺伝子をポリシストロン性単位として同時に発現させるのが実現可能なこと、核の形質転換に続いて起こる可能性のある位置効果及び遺伝不活化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）が排除されることがある。
【０００６】
実際に、高等植物のプラスチドの安定した形質転換を可能にする方法を開発することができる。現在のところ、２つの異なる方法が使用可能である。すなわち、組織、特に葉組織のパーティクルボンバードメント（Ｓｖａｂ他、１９９０）、及び、適切な形質転換ベクターの存在下でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いたプロトプラストの処理（Ｋｏｏｐ他、１９９６）である。これらの方法はいずれも、プラスミドＤＮＡが２重の包膜を突き抜けてオルガネラのストロマ内に導入されるのを媒介する。
【０００７】
現在使用されている多細胞植物の形質転換手順のすべてにおける１つの顕著な欠点は、遺伝子導入植物内にマーカー遺伝子が存在することである。形質転換されていない細胞の莫大なバックグラウンドから遺伝子導入された植物細胞を選択するのに必要であるこれらマーカー遺伝子は、抗生物質耐性又は除草剤耐性の遺伝子をコードしている。プラスチドの耐性遺伝子の例は、スペクチノマイシン耐性又はストレプトマイシン耐性を与えるａａｄＡ（Ｓｖａｂ及びＭａｌｉｇａ、１９９３）や、カナマイシン耐性を与えるｎｐｔＩＩ（Ｃａｒｒｅｒ他、１９９３）である。これらのマーカー遺伝子は目的の遺伝子（ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＧＯＩ）と一緒にゲノムに安定に組み込まれており、ＧＯＩの機能に必要でないにもかかわらず、ホモプラストミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｏｍｉｃ）遺伝子導入植物内に留まる。残ったこれらマーカー遺伝子は、理論的には病原体の抗生物質耐性や雑草の除草剤耐性を増強する可能性があるので、植物生物工学に対する主な非難の的となっている。したがって、遺伝子導入植物内に耐性遺伝子をもたらさない選択システムの構築が強く望まれている（Ｉａｍｔｈａｍ及びＤａｙ、２０００）。
【０００８】
プラスチド形質転換における別の問題は、使用できる選択マーカー遺伝子の不足である。通常使用される選択マーカー遺伝子はａａｄＡ遺伝子だけしかなく（Ｈｅｉｆｅｔｚ、２０００）、高等植物のプラスチド形質転換において機能すると分かっている代替物はｎｐｔＩＩ遺伝子だけである（Ｃａｒｒｅｒ他、１９９３）。ａａｄＡ遺伝子もｎｐｔＩＩ遺伝子も、すべての場合に使用できるわけではないので、プラストームが形質転換された高等植物種の数は依然として非常に少ない（Ｈｅｉｆｅｔｚ、２０００）。現在、高等植物のプラスチド形質転換を、その可能性の最大限まで活かすことができていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、抗生物質耐性遺伝子や除草剤耐性遺伝子などの選択に必要とされる外来遺伝子を含まず、プラストームが形質転換された、遺伝的に安定な多細胞植物、植物器官、植物組織を生成する、単純であるが用途が非常に広い方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、以下の諸段階によって、プラストームが形質転換された多細胞植物、植物器官、植物組織を生成する方法によって達成される。
（ａ）プラスチドゲノム中の遺伝子の機能を改変又は破壊して、選択可能な又は認識可能な表現型を生じさせる段階、
（ｂ）前記表現型を発現するプラスチドを含む植物又は細胞を分離又は選択する段階、
（ｃ）前記機能を修復することができる修復配列を有する少なくとも１つの形質転換ベクターを用いて、前記分離した又は選択した植物、種、細胞、又はプラスチドの前記プラスチドゲノムを形質転換させる段階、
（ｄ）前記修復された機能を発現するプラスチドを有する、前記形質転換された植物又は細胞を分離又は選択する段階。
【００１１】
好ましい実施形態は、従属請求項で定義されている。
【００１２】
多細胞植物、植物器官、植物組織はそれぞれの細胞中に複数のプラスチドを含み、プラストームレベル、プラスチドレベル、細胞レベルでの遺伝子型の分離が必要とされるので、本発明の新しい方法がこれらに簡単に適用できることは、驚くべきことである。この新しい方法では、成長中に簡単に分離するので、高等植物の組織に非常に効率的であることが分かった。したがって、適切な実施形態では、単に視覚的に検査し手動で操作することによって分離が可能である。阻害剤を用いた選択の場合（段階（ｂ））は、多細胞植物、植物器官、植物組織の場合、阻害剤を再分化プロセス中ずっと使用する必要はなく、最初だけ適用すればよいので、この選択プロセスを素早く実施することができる。（もちろん、上に説明したように、阻害剤を完全に用いないことも可能である。）このことは、多細胞性と形質転換方法の緊密な複合効果を表す。
【００１３】
本発明の方法によって植物組織を形質転換させる場合、遺伝子の改変又は破壊は、その遺伝子が中心的に重要な遺伝子、たとえば代謝経路の遺伝子である場合、単離された単一の細胞の場合にはしばしば致死的となる可能性があるが、この改変又は破壊の結果は、単一の形質転換された細胞が分離しておらず、むしろ、代謝産物が互いに交換可能である細胞集団の一部であることによって緩和される。
【００１４】
数多くの異なるプラスチド遺伝子を、本発明の目的のために改変又は破壊することができる。このような遺伝子は、改変又は破壊によって選択可能又は認識可能な表現型を生じるという意味で、プラスチドの機能にとって重要なものであるべきである。このような機能は、プラスチドにコードされるどの機能であってもよい。この機能は光合成に直接又は間接的に関与するものであることが好ましい。光合成に間接的に必要な機能の例は、プラスチド遺伝子の転写及び／又は翻訳に必要な任意の機能である。光合成に直接関与する機能の例は、少なくとも選択条件下では光合成に必須である任意のタンパク質である。
【００１５】
前記認識可能な表現型は容易に識別できることが好ましい。前記機能は、光合成に直接又は間接的に関連していることが好ましいので、容易に認識可能な表現型は色素欠損とすることができ、最も好ましくはクロロフィル欠損又は蛍光変化（ａｌｔｅｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）である。その後、形質転換させた植物を従属栄養下で成長させ、形質転換させた植物、植物器官、植物組織を分離又は選択の対象とすることができる。分離は、形質転換された組織領域の視覚的認識によって手動で行うことができる。選択は、本発明の方法の段階（ａ）で導入した耐性遺伝子に基づく阻害剤耐性を用いて行うことができる。或いは、阻害剤耐性が、前記改変された又は破壊された機能自体の結果であってもよい。
【００１６】
数ラウンドの再分化中の分離によってホモプラストミック状態に達した後、遺伝子導入植物、植物器官、植物組織に２度目の形質転換をさせて（段階（ｃ））、改変された又は破壊された機能を修復し、マーカー遺伝子があればそれを取り除く。次いで、修復された表現型たとえば光栄養性を有する、形質転換させた植物、植物器官、植物組織を分離又は選択する。
【００１７】
段階（ａ）及び／又は段階（ｃ）で、たとえば所望の遺伝子を発現させるため、有用な形質を与えるため、又はプラストームの他の任意所望の改変を行うために、追加の目的配列又は遺伝子を導入することができる。
【００１８】
さらに、段階（ａ）及び段階（ｃ）で導入した配列が相まって、追加の機能を生じることがある。この実施形態の例には以下のことが含まれる。すなわち、多サブユニットタンパク質の異なるサブユニットをコードする配列を段階（ａ）と段階（ｃ）で導入すること、段階（ｃ）又は段階（ａ）で導入されたコード配列を発現可能にする制御配列を、それぞれ段階（ａ）又は段階（ｃ）で提供すること、生化学経路のタンパク質をコードする配列を段階（ａ）及び段階（ｃ）で導入することなどである。
【００１９】
破壊すべき機能の具体的な例は、ｒｐｏＡ又はｒｐｏＢのノックアウトである。これらの遺伝子はそれぞれ、プラスチドにコードされるプラスチドＲＮＡポリメラーゼのαサブユニット及びβサブユニットをコードする。これらの遺伝子を欠くプラスチドは、光合成を行うことができず、白色表現型を示し、光栄養では成長することができない。形質転換の第２ラウンドでｒｐｏＡ及びｒｐｏＢを修復した後、遺伝子導入植物は光中で光合成により成長することができ、緑色表現型を示す。
【００２０】
段階（ａ）の標的遺伝子の別の例は、ｙｃｆ３のノックアウトであろう。この遺伝子は通常の光条件下では必須ではない（Ｒｕｆ他、１９９７）。それにもかかわらず、ｙｃｆ３ノックアウト変異体を強い光の下に置くと、白色表現型を生じ、光合成成長条件下で成長が抑圧される。ｙｃｆ３遺伝子を修復した植物は、強い光条件下で、光栄養で成長することができる。したがってこの場合、第２の形質転換の淘汰圧を、光強度によって調節することができる。したがって、ｒｐｏＡ又はｒｐｏＢを使用した例とは対照的に、低光条件で維持すれば緑色の正常に成長している植物変異体を用いて第２の形質転換を実施することができ、再分化後に、単に光強度を増加させることによって淘汰圧を上げることができる。形質転換には植物材料の状態が重要であるので、この方法は白色材料の形質転換より優れている。
【００２１】
改変又は破壊すべき機能の別の例は、形質転換の最初のラウンド（段階（ａ））でのｐｅｔＡのノックアウトである。ｐｅｔＡはチトクロムｂ／ｆ複合体のサブユニットをコードする。ｐｅｔＡノックアウト変異体は、高クロロフィル蛍光表現型（ｈｉｇｈ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ｈｃｆ）を示し、光合成を行うことができない。したがって、これらは光栄養で成長することができない。形質転換の第２のラウンド（段階（ｃ））でｐｅｔＡが修復されると、光中での光栄養成長も回復する。
【００２２】
（定義）
本発明の明細書中で使用する特定の用語の意味を明確にするために、以下の定義を示す。
【００２３】
３’−ＵＴＲ    （→）遺伝子の転写されるが翻訳されない領域であり、（→）コード領域の下流にある。（→）プラスチド（→）遺伝子では、３’−ＵＴＲａ．ｏ．は、エキソヌクレアーゼによる３’から５’方向の分解に対してｍＲＮＡを安定化させる働きをする。
【００２４】
５’−ＵＴＲ    （→）遺伝子の転写されるが翻訳されない領域であり、（→）コード領域の上流にある。（→）プラスチド（→）遺伝子では、５’−ＵＴＲはその３’末端付近に翻訳開始の配列情報（リボソーム結合部位、（→）ＲＢＳ）を含む。
【００２５】
ａａｄＡ    抗生物質（→）選択的阻害剤スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンを解毒する、頻繁に使用されるタンパク質、細菌アミノグリコシドアデニル転移酵素の（→）コード領域である。
【００２６】
葉緑体    クロロフィルを含む（→）プラスチドである。
【００２７】
コード領域    ａ）ポリペプチドのアミノ酸配列、又はｂ）機能性ＲＮＡのヌクレオチドの情報を含むヌクレオチド配列である。コード領域は場合により１つ又は複数の（→）イントロンによって中断される。
【００２８】
所望の遺伝子（配列）    改変した又は新しく導入した配列であり、（→）形質転換の試みの目標である。
【００２９】
フランク（ｆｌａｎｋ）、フランキング領域    （→）プラスチド（→）形質転換（→）ベクターの挿入断片の５’末端及び３’末端にあるＤＮＡ配列であり、フランクの間にある配列が二重相互（→）相同組換えによって標的（→）プラストームに組み込まれるのを媒介する。同じ機構で、配列を改変する又は標的（→）プラストームから取り除くことができる。したがって、（→）プラスチド（→）形質転換（→）ベクターのフランクは、標的（→）プラストームのどこに（→）形質転換による変更を引き起こすかを決定する。
【００３０】
遺伝子発現    配列情報を機能させるプロセスである。ポリペプチドをコードする（→）遺伝子では、遺伝子発現は（→）プロモーターの活性化を必要とするが、これはＲＮＡポリメラーゼ活性化を開始させ指示し、後にポリペプチドに翻訳される伝令ＲＮＡの形成をもたらす。ＲＮＡをコードする（→）遺伝子では、（→）プロモーターに媒介されるＲＮＡポリメラーゼの活性が、コードされたＲＮＡを生成する。
【００３１】
遺伝子    それぞれ独立に機能を確保するのに必要であるすべての要素をコードするヌクレオチド配列である。
遺伝子は、少なくとも１つの完全な（→）コード領域を含む（→）オペロンとして組織化される。
ポリペプチドをコードする（→）遺伝子では、これらの要素は、（１）（→）プロモーター、（２）５’非翻訳領域（（→）５’−ＵＴＲ）、（３）完全な（→）コード領域、（４）３’非翻訳領域（（→）３’−ＵＴＲ）である。
ＲＮＡをコードする（→）遺伝子では、（→）５’−ＵＴＲ及び（→）３’−ＵＴＲは存在しない。
１つより多くの（→）コード領域からなる（→）オペロンでは、前後する２つの完全な（→）コード領域が、（→）スペーサーによって分離されており、（→）プロモーター、（→）５’−ＵＴＲ、（→）３’−ＵＴＲ要素は、その（→）オペロンの（→）コード領域によって共用される。
【００３２】
ゲノム    細胞核又は細胞オルガネラの完全ＤＮＡ配列である。
【００３３】
ｈｃｆ    高クロロフィル蛍光である。ｈｃｆ変異体は特徴的な光合成欠損表現型を示す。
【００３４】
ヘテロプラストミック（ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｔｏｍｉｃ）プラスチド／細胞    遺伝的に異なるプラストームを有する（→）プラスチド又は細胞である。
【００３５】
相同組換え    （→）ゲノムの標的部位に対して十分な配列相同性を有する（→）フランクの存在により、配列の交換、挿入、除去をもたらすプロセスである。
【００３６】
ホモプラストミックプラスチド／細胞    遺伝的に異なるプラストームを有する（→）プラスチド又は細胞である。
【００３７】
挿入部位    新規の配列が導入される、（→）プラストーム中の位置である。
【００３８】
遺伝子間領域    （→）ゲノム内の２つの（→）遺伝子の間の配列である。このような領域は、（→）オペロン間領域又は（→）オペロン内領域として存在し、後者の場合は（→）スペーサーとも呼ばれる。
【００３９】
遺伝子内領域    （→）遺伝子内の配列である。
【００４０】
イントロン    （→）コード領域を中断する配列である。
【００４１】
器官      植物器官とは、特別な生物機能を果たし、１つ又は複数の特徴的な（→）組織からなる構造物であり、その例は、根、茎、葉、花、雄ずい、子房、果実などである。
【００４２】
オペロン    （→）遺伝子の組織的構造体である。
【００４３】
ｐｅｔＡ    光合成電子伝達に関与するチトクロムｆタンパク質の（→）プラスチド（→）遺伝子の（→）コード領域である。
【００４４】
植物    細胞中に（→）プラスチドを含む生物である。本発明は多細胞（→）植物に関し、これには裸子植物群（たとえばマツ、エゾマツ、モミなど）、被子植物群（たとえば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ライムギ、ライコムギ、モロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシなど単子葉類作物や作物でない単子葉類、タバコ、ジャガイモ、トマト、アブラナ、サトウダイコン、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、シトルス種（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタなど双子葉類作物）、作物でない双子葉類、並びにシダ類、ゼニゴケ類、コケ類、多細胞性の緑藻類、紅藻類、褐藻類が含まれる。
【００４５】
プラスチド    それ自体の遺伝機構を有する（→）植物細胞中のオルガネラであり、様々な機能的に及び形態学的に異なる形、たとえばアミロプラスト、（→）葉緑体、有色体、エチオプラスト（ｅｔｉｏｐｌａｓｔ）、ゲロントプラスト（ｇｅｒｏｎｔｏｐｌａｓｔ）、白色体、原プラスチドなどで存在する。
【００４６】
プラストーム    （→）プラスチドの完全なＤＮＡ配列である。
【００４７】
プロモーター    転写を開始させかつ制御するように機能するヌクレオチド配列である。
【００４８】
ＲＢＳ、リボソーム結合部位    （→）コード領域の（→）翻訳開始コドンの上流にあるＤＮＡ配列要素であり、リボソーム結合及び対応するＲＮＡ転写物からの翻訳開始を媒介する。ＲＢＳ要素は、（→）５’−ＵＴＲ又はスペーサーの一部である。
【００４９】
ｒｐｏＡ／Ｂ／Ｃ    プラスチドにコードされるＲＮＡポリメラーゼ（ｐｌａｓｔｉｄ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ＲＮＡ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＥＰ）の、（→）プラスチド（→）遺伝子の（→）コード領域である。
【００５０】
選択阻害剤    形質転換されていない細胞又はオルガネラの成長及び／又は発育を、形質転換された細胞又はオルガネラより強く減少させる化学物質である。
【００５１】
組織    植物組織は、同様又は同一の構造及び機能を有するいくつかの細胞からなる。植物組織中の細胞は原形質連絡によって連結され、その例は、カルス、柵状柔組織、海綿状柔組織、形成層、表皮、髄、胚乳、師部、木部などである。
【００５２】
形質転換ベクター    （→）ゲノムの（→）形質転換を媒介するために作成されたクローン化ＤＮＡ分子である。
【００５３】
形質転換    （→）植物又は植物細胞の処理によってＤＮＡ配列の導入、切出し、改変をもたらすプロセスであり、少なくとも１つの（→）形質転換ベクターを使用することを含む。
【００５４】
導入遺伝子    ある（→）ゲノムに由来し、別のゲノムに導入されるＤＮＡ配列である。
【００５５】
翻訳開始コドン    ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする配列要素である。
【００５６】
翻訳終止コドン    翻訳の中止を引き起こす配列要素である。
【００５７】
ｕｉｄＡ    頻繁に使用されるレポータータンパク質、細菌性βグルクロニダーゼの（→）コード領域である。
【００５８】
ｙｃｆ３    ＰＳＩの組立に関与するタンパク質の（→）コード領域である。Δｙｃｆ３系は、通常の光条件下（３．５〜４Ｗ／ｍ2）で栽培した場合に蒼白色の表現型及び成長の低下を示す。低い光条件下（０．４〜０．５Ｗ／ｍ2）では、この表現型はそれほど目立たない。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明のベクターは選択中の可視マーカーを提供する
植物細胞を死滅させないが成長をある程度まで阻害する致命的でない阻害剤濃度を、プラスチド形質転換で用いることができる。細胞１個あたり最高１００００個もあるプラストームコピーのうち、１個又は数個のみが、最初の形質転換現象の後に組換え体となるとみなされる。形質転換されたプラストームのコピー数は低いので、形質転換させた後に、培養した細胞又は組織を致死的な阻害剤濃度で処理すると、中程度の耐性を発現するヘテロプラストミック細胞の回収ができなくなる。選択及び分離によって、野生型とトランスプラストミック組織の両方が生じる。形質転換されたプラスチドが野生型のプラスチドを覆い隠してしまう可能性があるので、このプロセス中に野生型と遺伝子導入組織を識別することは大きな課題である。ＫｈａｎとＭａｌｉｇａ（１９９９）は、ａａｄＡ及びＧＦＰコード領域を含む蛍光抗生物質耐性マーカーを使用して、紫外光下でプラスチド形質転換体の分離を追跡した。本発明では、裸眼で検出することができる、トランスプラストミック組織領域の可視マーカーを提示する。野生型及び組換えプラスチドを選別する段階的なプロセスは容易にモニターすることができ、したがって加速させることができる。変異表現型の白色背景上での緑色領域の出現は、簡単に検出することができる。
【００６０】
本発明のベクターは再分化効率の改善をもたらす
従来の葉緑体形質転換戦略は、阻害剤たとえばスペクチノマイシンに対する耐性の選択性に基づいている。阻害剤の施用を形質転換させた後に開始し、ホモプラストミックな遺伝子型を得るのに必要な反復再分化プロセスの間中ずっと施用し続けなければならない。阻害剤の施用には、再分化の可能性を減少させる欠点がある。単一のプロトプラスト又は葉の小片から植物全体を再分化させることは、特にこの方法を種に広げる場合、確立され信頼できる再分化プロトコルは存在しないので、葉緑体形質転換における重要な段階である。最初の形質転換後の短い期間だけ阻害剤を利用すればよいかもしれないことは、本発明の主な利点である。本発明の新規な方法を使用すると、ホモプラストミック状態を得るための反復再分化中で、また第２の形質転換段階の全体で阻害剤の施用を省くことができる。
【００６１】
本発明のベクターは遺伝的に安定なプラストーム形質転換体の生成を可能にする
プラスチドの相同組換えは、高効率で起こることが知られている。その結果、抗生物質耐性マーカーの調節要素と内在性調節要素との間の望ましくない組換え現象により、遺伝的な不安定さがもたらされる可能性がある（Ｅｉｂｌ他、１９９９）。第２の形質転換段階の後、トランスプラストミック植物はどのようなマーカー発現カセットも含まない。その結果、最終的な形質転換体に含まれる相同領域は、従来のプラスチド形質転換体に比べて少ない。形質転換体の遺伝的な安定性が増強され、配列の望まない損失（Ｅｉｂｌ他、１９９９）が回避される。
【００６２】
本発明によって、抗生物質を使用せずに、光合成に関連する高等植物の葉緑体形質転換を選択する新規のシステムが提供される。この新しいシステムは、可視マーカーを利用し、白色又は蒼白表現型を与えるｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｙｃｆ３、ｐｅｔＡなどの遺伝子の不活性化に基づくものとすることができる。第２の段階では、変異系のそれぞれの欠損遺伝子を修復することができ、また１つ又は複数の導入遺伝子を挿入することができる。結果として生じるトランスプラストミック植物は、抗生物質耐性遺伝子を含まないことがあり得る。
【００６３】
本発明のプロセスの段階（ａ）において標的にすることができる他の機能は、プラスチドにコードされる、光合成に直接又は間接的に必要な任意の機能である。下記の特定の適用方法以外に、多数の光合成に関連する標的遺伝子たとえばｐｓｂＡなどの不活性化及び修復を、本発明に従って行うことができる。
【００６４】
プラスチド染色体は、真性細菌の３つのＲＮＡポリメラーゼコア遺伝子に類似した、ｒｐｏＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２と命名した４つのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をコードする。ｒｐｏＢ、Ｃ１、Ｃ２の遺伝子は１つのオペロンに配置され（ＮＥＰ、核にコードされたプラスチドＲＮＡポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｌａｓｔｉｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によって転写される）、ｒｐｏＡの遺伝子は主にリボソームタンパク質をコードする、大きな遺伝子クラスターに配置される。ｒｐｏＡ遺伝子のセンス転写物のレベルがＰＥＰ（プラスチドにコードされたプラスチドＲＮＡポリメラーゼ（ｐｌａｓｔｉｄ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｌａｓｔｉｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）欠損変異体内で減少するので（Ｋｒａｕｓｅ他、２０００）、ｒｐｏＡはＰＥＰによって転写されるのかもしれない。
【００６５】
プラスチドゲノムからｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１を除去すると、色素欠損の表現型が生じる（Ａｌｌｉｓｏｎ他、１９９６、Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓ−Ｍａｃｉｏｓｓｅｋ他、１９９９）。色素欠損のΔｒｐｏＡ、ΔｒｐｏＢ、ΔｒｐｏＣ１植物（白色植物）は、光独立栄養的に成長することができなかった。しかし、光合成の欠落を補償するためにショ糖を含む培地中で維持すると、野生型植物に比べて遅い速度であるが正常に成長する。
【００６６】
タバコの光化学系Ｉ（ＰＳＩ）複合体の安定な集積にｙｃｆ３が必須であることが最近示された（Ｒｕｆ他、１９９７）。この遺伝子の破壊は、光中で条件的色素欠損表現型をもたらす。ホモプラスミックｙｃｆ３植物は、薬剤及び植物ホルモンを含まない培地で通常の光条件下（３．５〜４Ｗ／ｍ2）で再分化させると、完全に白い表現型を示し、低い光条件下（０．４〜０．５Ｗ／ｍ2）ではこの表現型はそれほど目立たない（薄緑）。
【００６７】
ｈｃｆ（高クロロフィル蛍光）と呼ばれる変異植物表現型がよく知られている。この表現型は、光合成に関連する遺伝子（核又はプラストームのどちらかにコードされた遺伝子、Ｂｏｃｋ他、１９９４、Ｍｏｎｄｅ他、２０００、Ｍｏｎｄｅ他、２０００ｂ）の発現及び／又はプロセスにおける変異による。これら変異体は特徴的な光合成欠損表現型、すなわち温室条件下で成長の障害、淡緑色の葉、紫外光照明下で高クロロフィル蛍光（赤色蛍光）を示す。ｈｃｆは、光合成電子伝達鎖が遮断されたとき（「電子テールバック（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔａｉｌｂａｃｋ）」に生じる。ｈｃｆ表現型を得るための１つの方法は、光合成電子伝達に関与するチトクロムｂ／ｆ複合体のサブユニットをコードするプラスチドｐｅｔＡ遺伝子を不活性化させることである。
【００６８】
たとえばΔｒｐｏ、Δｙｃｆ３、ΔｐｅｔＡ植物など色素欠損又は光合成を欠いた表現型を活用して、第２ラウンドの形質転換を実施することができる。すなわち、欠損を修復するための基質として第１ラウンドの色素欠損形質転換体を使用し、もしあれば第１ラウンドの選択マーカーがあればそれを取り除き、任意で目的配列を同時に導入することができる。野生型遺伝子を色素欠損変異体のプラストームに送達することによって緑色植物に戻すことができる。したがって、このような二次形質転換体は、光合成性成長の能力を取り戻し、ｈｃｆ表現型の場合は緑色表現型及び／又は正常クロロフィル蛍光を示す。この特徴を、形質転換させた組織を選択するのに使用することができる。したがって、この第２段階には抗生物質による選択は必要ない。さらに重要なことに、形質転換の第１ラウンドで使用した選択マーカーを第２ラウンドで取り除き、マーカーを含まないトランスプラストミック植物を得ることができる。
【００６９】
プラスチド遺伝子の形質転換は、相同組換えに基づいている。これは、当技術分野で周知の、プラストームの標的部位と十分な相同性があるフランキング領域を有する形質転換ベクターを使用することで実現することができる。本発明では、当技術分野で周知のどのような方法によって形質転換を実施してもよい。現在、２つのこのような周知の方法、すなわちパーティクルガンボンバードメントによる形質転換とＰＥＧに媒介される形質転換とがある。本発明では、パーティクルガンによる形質転換が好ましい。本発明のプロセスの段階（ａ）及び（ｃ）はいずれも、同時形質転換、すなわち２つ以上の形質転換ベクターを使用することによって成すことができる。
【００７０】
本発明の教示は、任意の多細胞植物に適用させることができる。好ましい植物は単子葉及び双子葉の作物植物である。作物植物の具体的な例は、本明細書中の「定義」部分の項目「植物」に記載してある。
【００７１】
選択可能な又は認識可能な表現型を生じるという条件で、段階（ａ）でプラスチド遺伝子の機能を改変又は破壊するいくつかの手段がある。この例には、前記遺伝子又は前記遺伝子の発現に必要な、たとえばプロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、開始コドンなど機能性要素のコード領域を部分的又は完全に除去することが含まれる。これら要素の機能もまた、これら要素又はコード領域に外来配列を挿入する或いはコード領域に終止コドンを挿入することによって、改変又は破壊することができる。また、上記の手段を組み合わせることもできる。段階（ａ）で耐性マーカー遺伝子を導入した場合、マーカー遺伝子を前記外来配列として使用することが好ましい。段階（ａ）では、任意の追加の目的配列を同時に挿入することができる。
【００７２】
本発明のプロセスの段階（ａ）は、遺伝子の形質転換によって実施することが好ましい。代替実施形態では、段階（ａ）は自然突然変異又は誘導突然変異によって起こる、或いは既に起こっていてもよい。これは、本発明の段階（ｃ）で使用した植物（又は植物器官、植物組織）が、本発明に従って又は本発明の目的のために得た自然突然変異体又は遺伝子導入植物でなくてもよいことを意味し、本発明の目的は主に、マーカー遺伝子を含まない遺伝子導入植物を生産することである。
【００７３】
本発明のプロセスの段階（ｂ）では、目的の表現型を発現するプラスチドを有する植物、植物器官、植物組織を、従属栄養性の成長を支援する培地上で分離又は選択する。選択は、段階（ａ）で導入した選択的マーカー遺伝子と適切な抗生物質又は阻害剤とを使用することによって行うことができる。代わりに、下記でより詳細に説明する光化学系Ｉ受容体の除草剤を使用して、本発明の新規な方法を適用してもよい。後者の場合、段階（ａ）で耐性遺伝子を導入する必要がない。上に記載のように、最初の形質転換後に、短期間、分離を支援するためにのみ阻害剤又は抗生物質を利用し、このような薬剤の使用を完全に使用しないようにすることもできる。成長及び数回の細胞分裂の後、分離によって色素存在量又は蛍光が異なる区域の形成がもたらされる。このような区域の組織を手動で分離し、さらなる再分化ラウンドに使用する。
【００７４】
本発明のプロセスの段階（ｃ）では、段階（ａ）で改変又は破壊された機能を修復することができる修復配列を有するベクターを用いて、先の段階で得られた植物のプラストームを形質転換させる。前記修復は、段階（ａ）の改変又は破壊がどのように行われたかに応じて、いくつかの方法によって実施することができる。挿入された配列は除去し、置換された配列は本来の完全に機能的な配列で再置換し、除去された配列は再挿入することができる。同時に、段階（ａ）で挿入した耐性遺伝子を除去し又はその機能を破壊することができ、プラストームに追加の遺伝的改変を行い又は追加の機能を導入することができる。この例には、追加の目的配列又は遺伝子の導入、いくつかの遺伝子の導入、既存の機能又は配列の排除などが含まれる。
【００７５】
段階（ｄ）では、前記修復された機能を発現するプラスチドを有する植物、植物器官、植物組織を、抗生物質を含まない培地上で分離又は選択する。選択は、少なくとも部分的に光栄養での成長によって実施し、形質転換させた植物は修復された表現型によって認識することができる。成長すると、分離により色素存在量の異なる区域の形成がもたらされる。緑色区域を手動で分離し、さらなる再分化ラウンドに使用する。本発明では、段階（ｄ）で使用した条件は好ましくは混合栄養性である。これは、光合成能力を取り戻した、形質転換されたプラストームを含むプラスチドや形質転換されたプラスチドを含む細胞が、強い光の下で選択的成長の優位性を有するように、培地の炭水化物含量を可能な限り少なくすることを意味する。このような混合栄養条件は段階（ｄ）を加速させる可能性がある。
【００７６】
実施形態１：ｒｐｏＡ又はｒｐｏＢ遺伝子の不活性化及び修復に基づく、プラスチド形質転換体の選択方法
ｒｐｏＢ遺伝子機能の標的破壊のために、ｒｐｏＢプロモーター及びその開始コドンをたとえばａａｄＡマーカー遺伝子又は別のマーカー遺伝子で置換することができる。ａａｄＡマーカーの場合、ボンバードした葉組織を、スペクチノマイシンを含む培地上での一時的選択下で再分化させることができる。形質転換体は、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず、抗生物質耐性を示し、最初は光中で緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は野生型と形質転換された葉緑体ゲノムの両方の混合物を含む。緑色のヘテロプラストミックな材料を非選択的培地に移す。分離により、白色領域、混合領域、及び緑色領域がもたらされる。ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、白色領域からの材料で、非選択的培地上で数回の追加の再分化ラウンドを行った。
【００７７】
第２の形質転換では、ｒｐｏＢ遺伝子を再構成し、マーカー遺伝子を取り除き、好ましくは目的の遺伝子（又は複数の遺伝子）を導入することが同時にできるように設計されたベクターを用いてホモプラストミックΔｒｐｏＢ植物を形質転換させる。処理した葉組織は、ショ糖減培地（抗生物質を含まない）上で選択下で、強い光の下で再分化させることができる。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択することができる。
【００７８】
ｒｐｏＡ遺伝子の破壊及び再活性化も同様の方法で実施することができる。
【００７９】
実施形態２：ｙｃｆ３遺伝子の不活性化及び修復に基づく、プラスチド形質転換体の選択方法
ｙｃｆ３遺伝子の破壊は、５’制御要素とｙｃｆ３の最初のエキソンをａａｄＡマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子で置換することによって実施することができる。形質転換ベクターは、たとえば微粒子銃プロトコル又はＰＥＧで媒介する形質転換を使用してタバコプラスチドに導入することができる。微粒子銃プロトコルの場合、ボンバードした葉組織は、阻害剤又は抗生物質、ａａｄＡ遺伝子の場合はスペクチノマイシンを含む培地での選択下で再分化させる。形質転換体は阻害剤耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず通常の光条件（３．５〜４Ｗ／ｍ2）で最初は緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は通常、野生型及び形質転換された葉緑体ゲノムの混合物を含む。抗生物質を含まない培地に移した後、分離により、黄色−白色区域及び緑色区域（通常の光条件下、上記参照）が出現する。ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で、白色区域からの材料で、数回の追加の再分化ラウンドを行った。光中で蒼白な、ほとんど白色の表現型を有する他は、この変異体は成長が抑制されていた。第２の形質転換段階用に十分な材料を得るために、変異植物系を低い光条件に移すことができる。これらの条件下（０．４〜０．５Ｗ／ｍ2）では、植物はそれほど目立たない表現型を示し、たとえばパーティクルガンによる形質転換のための適切な供与材料を得ることができる。この第２の形質転換では、ｙｃｆ３遺伝子を再構成し、マーカー遺伝子を取り除き、好ましくは目的の遺伝子（又は複数の遺伝子）を導入することが同時にできるように設計されたベクターを用いてホモプラストミックΔｙｃｆ３植物を形質転換させる。ボンバードした葉組織は、ショ糖減培地（抗生物質を含まない）での選択下で、強い光の下で再分化させることができる。正常な緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択することができる。
【００８０】
実施形態３：ｐｅｔＡ遺伝子の不活性化及び修復に基づく、プラスチド形質転換体の選択方法
ｐｅｔＡ遺伝子の標的破壊のために、コード領域をマーカー遺伝子たとえばａａｄＡマーカー遺伝子で置換することができる。パーティクルボンバードメントによる形質転換の場合、ボンバードした葉組織は、抗生物質を含む培地での選択下で再分化させることができる。形質転換体は抗生物質耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で最初は緑色表現型を示す。これら一次形質転換体は通常、野生型及び形質転換された葉緑体ゲノムの混合物を含む。抗生物質を含まない培地に移した後、分離により、紫外光照明下で検出することができるｈｃｆ表現型を示す区域が出現する。ホモプラストミック変異体材料を得るために、非選択的培地上で、変異体区域からの材料で、数回の追加の再分化ラウンドを実施することができる。
【００８１】
第２の形質転換では、ΔｐｅｔＡ遺伝子を再構成し、マーカー遺伝子を取り除き、好ましくは目的の遺伝子（又は複数の遺伝子）を導入することが同時にできるように設計された形質転換ベクターを用いたボンバードメントによって、ホモプラストミックΔｐｅｔＡ植物を形質転換させる。ボンバードした葉組織は、ショ糖減培地（抗生物質を含まない）での選択下で、強い光の下で再分化させることができる。正常な緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択することができる。
【００８２】
実施形態４：不活性化変異体が新規な方法によって選択される、ｐｅｔＡ遺伝子の不活性化及び修復に基づくプラスチド形質転換体の選択方法
この方法は、光合成に欠陥があるすべての変異体で用いることができる。実施形態３と同様に、プラスチド形質転換体の選択は、ｐｅｔＡ遺伝子の不活性化及び修復に基づいて行うことができる。対照的に、ΔｐｅｔＡ変異体の選択は、有効であるには光合成の活性が必要とされる除草剤たとえば除草剤パラコートを含む培地で実施することができる。ｐｅｔＡ遺伝子が少しでも完全に不活性化されていれば、このような除草剤に対する変異植物系の耐性が野生型に比べて増大する可能性がある。重要なことに、第１の形質転換段階でどのような抗生物質又は除草剤耐性マーカーの導入も省略することができる。
【００８３】
本発明のベクターは第１又は第２の形質転換段階中に新規の機能を導入する手段を提供する
形質転換の第１又は第２の段階或いはその両方中に目的の遺伝子又は配列を導入することができる。したがって、複数の遺伝子又は機能的なオペロンを標的植物内に導入することができる。多くの新規な遺伝子及び／又は制御因子をプラストームに組み込まなければならないことがあるので、とりわけ、これはトランスプラストミック植物における新しい代謝経路を生成する際に特に関心が持たれている。
【００８４】
同様に、所望の配列を、たとえばプラスチド遺伝子発現パターンを操作するために、導入又は取り除くことができる。
【００８５】
本発明のベクターは選択マーカーを再利用する手段を提供する
本発明で説明した２つの段階の戦略のさらなる応用は、選択マーカーを第２の段階でゲノムから取り除いた後、同じ選択マーカーを別の形質転換で再利用する方法である。その後、選択マーカーを再度取り除き、このプロセスを繰り返すことができる。これは、同じマーカー遺伝子を使用して、潜在的に無限数の遺伝子又は機能的オペロンをプラスチドゲノムに挿入する手段を提供する。これは、プラスチド遺伝子の形質転換における選択マーカーの不足を打開するのに向けた重要な一歩である。
【００８６】
本発明のベクターは、依存しない部位に目的の配列を挿入することを可能にする
記載した方法（たとえばそれぞれｒｐｏＡ、ｙｃｆ３、ｐｅｔＡを標的部位として利用した実施形態１、２、３）の様々な組合せを使用することによって、目的の遺伝子をプラストーム内の様々な標的部位に導入することができる。本明細書中に記載する方法はまた、光合成に関連する他の標的遺伝子たとえばｐｓｂＡの不活性化及び修復を利用して機能する。したがって、多数の潜在的な標的部位が存在する。相同組換えを使用して、マーカー遺伝子に依存しない部位に新規機能を導入することもできる。
【００８７】
本発明のベクターは新規な選択スキームを提供する
通常使用される選択マーカー遺伝子はａａｄＡ遺伝子だけしかなく（Ｈｅｉｆｅｔｚ、２０００）、高等植物のプラスチド形質転換において機能すると分かっている代替物はｎｐｔＩＩ遺伝子だけである（Ｃａｒｒｅｒ他、１９９３）。本発明のベクターは選択マーカー遺伝子の不足を打開する。本明細書中に記載する、プラスチド形質転換の新規な選択的阻害剤には、パラコート、モルファムコート、ジクワット、ジフェンゾコート、サイパーコートが含まれる。これらの物質は光化学系Ｉ受容体除草剤のグループに属する（Ｈｏｃｋ及びＥｌｓｎｅｒ、１９９５）。これらは光化学系Ｉの阻害剤ではないが、フェレドキシンやＮＡＤＰではなく光化学系Ｉによって還元される。還元された阻害剤の自動酸化は、有害性の高い活性酸素を生成する。したがって、これらの除草剤の有害性は光と酸素に依存する。
【００８８】
光化学系Ｉを通る電子伝達が、光化学系Ｉの重要な遺伝子又はチトクロムｂ／ｆ複合体（たとえばｐｅｔＡ）のいずれかの除去によって妨げられた場合、これら変異植物はパラコートなど光化学系Ｉ受容体除草剤に対して、野生型植物よりも耐性がある。したがって、このような除草剤はこれら遺伝子のノックアウトに適した選択剤となり得る。すべての白色種がこれら阻害剤に非感受性である。したがって、光合成の欠損をもたらすどのような破壊も、この方法で選択することができる。
【００８９】
本発明の一実施形態では、阻害剤耐性によって段階（ｄ）を支援することができる。阻害剤耐性は、段階（ｃ）で阻害剤又は抗生物質を安定に又は一時的に導入することによって行うことができる。好ましくは、最終的な結果として選択マーカーを含まないトランスプラストミック植物を作成するために、段階（ｃ）で導入する阻害剤耐性は一時的なものである。たとえばＦｉｓｃｈｅｒ他（１９９６）やＩａｎｔｈａｍ及びＤａｙ（２０００）が記載する当技術分野で周知の方法によって、阻害剤耐性遺伝子を取り除くことができる。さらに、上に記載した段階（ｂ）と同様に、阻害剤又は抗生物質は段階（ｄ）の最初だけに施用することができる。後の段階で阻害剤を使用しないことにより、段階（ｃ）で導入した耐性遺伝子をなくすことができる。この実施形態では本発明の原理に従って、段階（ｃ）及び（ｄ）で識別可能な表現型の再分化を活用するが、より効率的に段階（ｄ）でホモプラスミック状態を得ることができる。
【００９０】
（実施例）
本発明を、以下の詳細な実施例を参照することによってさらに説明する。これらの実施例は例示目的でのみ提供し、別段の指定がない場合は限定的なものとしない。本発明で使用する通常の組換えＤＮＡ及び分子クローン化技術は当技術分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９９、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９、Ｓｉｌｈａｖｙ他、１９８４に記載されている。
【００９１】
実施例１：ｒｐｏＢ遺伝子の不活性化に基づく選択システムの構築
ｒｐｏＢ遺伝子を不活性化させるための形質転換ベクターｐｌＣ５７１の構築
タバコ植物の葉を液体窒素下で粉砕し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）の「ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」を使用して全ＤＮＡ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ）を単離した。
【００９２】
この全ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、タバコ葉緑体ゲノム中のｒｐｏＢ及びｔｒｎＡ７遺伝子を含む領域をＰＣＲで増幅した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーの組を使用した。すなわち、ｐ３８  ５’−ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＧ−３’（プラストームヌクレオチド２５９６７〜２５９８６とアニーリング、位置番号はジーンバンク登録番号Ｚ０００４４．１に従う）と、ｐ３９  ５’−ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＣＧ−３’（プラストームヌクレオチド２９６１６〜２９５９７とアニーリング）である。Ｔａｑポリメラーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用したＰＣＲ増幅を以下のように実施した。すなわち、９５℃で６０秒間、１サイクル；９４℃で３０秒間、５５℃で６０秒間、７２℃で２４０秒間、３２サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。単一の断片しか検出されなかった。これは予想されていたサイズ３．６５ｋｂｐを示した。この断片を供給者のプロトコルに従ってベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にライゲーションし、プラスミドｐＣＲ  ｒｐｏＢ０１を得た。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（Ｔｏｐｌａｂ、ミュンヘン）。
【００９３】
プラスチドｒｐｏＢオペロンを不活性化させるために、選択可能ａａｄＡマーカーカセットで、６９９ｂｐのＡｖａＩ断片で表される５’上流領域とｒｐｏＢの翻訳開始とを置換すべきである（プラストームの位置２７５０８〜２８２０６）。あらかじめ、複数あるプラスミドｐＣＲ  ｒｐｏ０１のクローニング部位内の余分なＡｖａＩ制限部位を取り除く必要があった。これは、プラスミドを酵素Ｘｈｏ  Ｉで切断し、次いでクレノウポリメラーゼ及びヌクレオチドを使用してフィルイン反応を行った。その後、直鎖断片を再度ライゲーションし、細菌に形質転換させた。その結果、生じたプラスミドｐＣＲ  ｒｐｏＢ  ΔＸｈｏは、上で述べた２つのＡｖａＩ部位しか含んでいなかった。
【００９４】
プラスミドｐＣＲ  ｒｐｏＢ  ΔＸｈｏをＡｖａＩで消化した。生じた２つの断片（６８６１ｂｐと６９９ｂｐ）のうち大きい方を、キアゲンのゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから単離した。ＡｖａＩ処理によって生じた６８６１ｂｐ断片の粘着末端を、クレノウ酵素及びヌクレオチドを使用して平滑末端に変換した。後の段階での自己ライゲーションを抑制するために、生じたＤＮＡを子ウシアルカリホスファターゼ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、マンハイム、ドイツ）で処理した。
【００９５】
最後に、ベクターｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａ（Ｋｏｏｐ他、１９９６）由来のａａｄＡ発現カセットを含む１４１２ｂｐのＳｍａＩ断片を、６８６１ｂｐのＡｖａＩ断片内にライゲーションさせた。ライゲーション産物で細菌を形質転換させた。生じた細菌クローンのプラスミドを、ａａｄＡ挿入物の存在及び方向の分析対象とした。７個の陽性クローンが、ｒｐｏＢ遺伝子に対してセンス方向にａａｄＡカセットが挿入されたことを示した。プラスミドをｐｌＣ５７１（ｐＣＲ  ｒｐｏＢ  ａａｄＡ−Ｉ）と命名した（図１）。キアゲンのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを使用して大量のｐＣＲ  ｒｐｏＢ  ａａｄＡ−ＩプラスミドＤＮＡを単離した。
【００９６】
一次形質転換及びホモプラストミックΔｒｐｏＢ変異体の選択
ＰＥＧに媒介された、ＤＮＡのプロトプラストへの膜貫通移送は、高等植物のプラスチド形質転換における再現性のある方法である（Ｇｏｌｄｓ他、１９９３、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ他、１９９３）。Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ他、１９９８によると、プロトプラストの再分化は最近最適化された。
【００９７】
Ａ．プロトプラストの単離。約３週齢のタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎｎａ）の葉を１ｍｍの細片に切り、０．２５％セルラーゼＲ−１０及び０．２５％マセロチームＲ−１０（ヤクルト、本社日本）を溶かしたＦ−ＰＩＮ培地と一緒に終夜インキュベートした。通常の濾過、浮遊、沈降手順（Ｋｏｏｐ他、１９９６）に続いて、プロトプラストを形質転換培地に再懸濁させ、プロトプラストの総数を測定し、密度が１ｍｌあたり５×１０6個のプロトプラストになるように調整した。
【００９８】
Ｆ−ＰＩＮ培地（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、モル浸透圧濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＫＮＯ3（１０１２μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（１７０μｇ／ｍｌ）、コハク酸ＮＨ4（２Ｍストックの１０ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）・Ｎａ塩（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＪ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ3ＢＯ3（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（２００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（２μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ビオチン（０．０２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（１μｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、Ｐｏｌｙｐｕｆｆｅｒ  ７４（１０ｍｌ）、ショ糖（約１３００００μｇ／ｍｌ）。
【００９９】
形質転換培地（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、モル浸透圧濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（３０５０μｇ／ｍｌ）、ＭＥＳ（１０００μｇ／ｍｌ）、マンニトール（〜８００００μｇ／ｍｌ）。
【０１００】
Ｂ．プラスチドの形質転換及びプロトプラストの包埋：５０μｇのＤＮＡ（形質転換ベクターｐｌＣ５７１）、７μｌのＦ−ＰＣＮ、１００μｌ（５００，０００個の細胞）のプロトプラスト懸濁液を１２５μｌの４０％ＰＥＧ溶液に加え、丁寧に混合し、７．５分間インキュベートした。Ｆ−ＰＣＮをもう１２５μｌ加え、混合し、２分間インキュベートした。体積を３ｍｌまで（Ｆ−ＰＣＮを用いて）フィルアップし、３ｍｌのＦ−アルギネート培地を加えた。薄層へのアルギネート包埋は、６２５μｌのプロトプラスト−アルギネート混合物を、Ｃａ2+培地の表面に置いたポリプロピレン格子に施用することによって実施した。固化後、格子を取り外し、液体Ｆ−ＰＣＮ培地に上下逆にして置いて平衡化させ（２×１０ｍｌ、各３０分間）、２ｍｌＦ−ＰＣＮを入れた新しいペトリ皿に移した。包埋したプロトプラストを暗所でまず２０時間、その後通常の１６時間昼／８時間暗サイクルでインキュベートした。
【０１０１】
Ｆ−ＰＣＮ培地（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、モル浸透圧濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＫＮＯ3（１０１２μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（１７０μｇ／ｍｌ）、コハク酸ＮＨ4（２Ｍストックの１０ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）・Ｎａ塩（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＪ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ3ＢＯ3（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（２００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（２μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ビオチン（０．０２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（１μｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、Ｐｏｌｙｐｕｆｆｅｒ  ７４（１０ｍｌ）、ショ糖（約２００００μｇ／ｍｌ）、グルコース（６５０００μｇ／ｍｌ）。
【０１０２】
Ｆ−アルギネート培地（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、モル浸透圧濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭＥＳ（１３７０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（２５００μｇ／ｍｌ）、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（２０４０μｇ／ｍｌ）、マンニトール（〜７７０００μｇ／ｍｌ）、アルギネート（２４０００μｇ／ｍｌ）。
【０１０３】
Ｃａ2+培地（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、モル浸透圧濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭＥＳ（１９５０μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（２９４０μｇ／ｍｌ）、マンニトール（〜８２０００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（１００００μｇ／ｍｌ）。
【０１０４】
形質転換の一週間後、包埋したプロトプラストを、それぞれ５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及びストレプトマイシンを含む固形のＲＭＯＰ培地に移した（実施例３参照）。３週間毎に、それ以上の再分化体が現れなくなるまで、格子を新しい培地に移した。最初の緑色再分化体は５週間後に現れ、シングルペトリ皿に移した。予想通り、一次ΔｒｐｏＢ形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドＤＮＡ分子を増幅し野生型ゲノムを除去するために、形質転換体のコロニーを阻害剤を含まないＲＭＯＰ培地に移した。３〜５週間の培養後に白色区域が現れた。白色区域からの材料を、非選択的培地でさらに継代培養し、ホモプラストミックな変異形質転換体を得るためにさらに５サイクル再分化させた。生じた系は白色表現型を示した。二次形質転換用の変異植物材料を得るために、トランスプラストミック系を固形ＶＢＷ培地（実施例参照）に根付かせ増殖させた。
【０１０５】
ＰＣＲ及びサザンブロット法による分析
変異ΔｒｐｏＢトランスプラストミック植物の葉を液体窒素下で粉砕し、キアゲン「ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」を使用して全ＤＮＡ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ）を単離した。
【０１０６】
ＰＣＲ増幅によってプラスチド形質転換体を分析した。いくつかの独立した系の再分化体から単離した全ＤＮＡを、個別のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。トランスプラストミック植物を分析するために２組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｏＦＣＨ５９  ５’−ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＡＣＧ−３’（ａａｄＡコード領域の５’部分由来）とｏＦＣＨ６０  ５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ−３’（ａａｄＡコード領域の３’部分由来）を使用してａａｄＡ遺伝子の存在を検出し、ｐ４２  ５’−ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＴＡＡ  ＴＴＧ  Ｃ−３’（プラストームヌクレオチド２９０８１〜２９１０２とアニーリング）とｏＦＣＨ６０を使用して、ａａｄＡ遺伝子の正しい組込みを検出した。
【０１０７】
正しい組込み及びホモプラストミックな遺伝子型は、ＤＮＡゲルブロット分析によってさらに証明された。無菌的に成長させた植物から単離したゲノムＤＮＡをＤＮＡゲルブロット分析に使用した。詳細な手順は以下のとおりである。分析した各植物につき３μｇの全植物ＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、ＴＡＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９９）に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに７５分間露出させた。ハイブリダイゼーションプローブの調製では、３９８ｂｐ  ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプラスミドｐＣＲ  ｒｐｏＢ０１から切り出し、アガロースゲルで精製し、Ｄｉｇ  ｐｒｏｂｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ）を使用して標識した。
【０１０８】
ｒｐｏＢ遺伝子の再構成のための形質転換ベクターｐｌＣ５５４の構築
この選択システムの原理の証明のために、ｒｐｏＢ制御領域の除去を再構成し同時にマーカー制限部位を導入する、形質転換ベクターを構築した。この追加のマーカー制限部位は、対応する領域内の組換えプラストーム断片の区別を可能にし、残存野生型プラストームコピーの潜在的な選択（変異系が完全にホモプラストミックでない場合）を可能にするものである。
【０１０９】
プラスミドｐｌＣ５７１（ｐＣＲ  ｒｐｏＢ０１）をＸｍａＩで切断した。クレノウポリメラーゼ及びヌクレオチドを使用して、直鎖断片の末端を平滑な形に変換した。生じたＤＮＡを再ライゲーションし、細菌に形質転換させた。細菌クローンのプラスミドを、ＳｍａＩ制限部位がないことを確認するためにスクリーニングした。生じたｐｌＣ５５４（ｐＣＲ  ｒｐｏＢ−１−ΔＳｍａ）（図２）からのＤＮＡを、プラスチド形質転換のために単離した。
【０１１０】
プラスミドｐｌＣ５７１のＳｍａＩ制限部位は、プラスチドで発現させる任意の外来遺伝子の簡単なワンステップの組込みを可能にする。
【０１１１】
ΔｒｐｏＢ変異系のプラスチド形質転換及びホモプラストミック系の選択
第２の形質転換の目的は、ｒｐｏＢ遺伝子の制御領域（翻訳開始点を含む）を再構成すること、ａａｄＡカセットを取り除くこと、マーカー制限部位を導入することを同時に行うことである。ＶＢＷ培地で成長させた無菌ホモプラストミックΔｒｐｏＢ変異体から採った若い葉を、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、プラスミドｐｌＣ５５４でコーティングした金粒子を用いてボンバードした（詳細な手順は実施例３参照）。ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、固形のショ糖減ＲＭＯＰ培地（３ｇ／リットルのショ糖を含む）に移した。３週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し、光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るためにショ糖減ＲＭＯＰ培地上でさらに追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミックトランスプラストミック系を固形Ｂ５培地上で根付かせ、増殖させた。
【０１１２】
二次トランスプラストミック植物の分子分析
二次形質転換から回収した、無菌的に成長させた植物から単離した全ＤＮＡを使用してＤＮＡゲルブロット分析を行った。
【０１１３】
詳細な手順は以下のとおりである。分析した各植物につき３μｇの全植物ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで消化し、ＴＡＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９９）に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム）に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに７５分間露出させた。
【０１１４】
３９８ｂｐのＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をプラスミドｐＣＲ  ｒｐｏＢ０１から切り出し、アガロースゲルで精製し、Ｄｉｇ  ｐｒｏｂｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロシュ）を使用して標識して、ハイブリダイゼーションプローブを調製した。このプローブは、二次形質転換プラストームからの３６２９ｂｐのシグナルを生じるはずである。野生型に由来する潜在的なバンドはたった１６２８ｂｐのシグナルであるはずなので、これは、形質転換ベクターの組換え断片が組み込まれたことの明確な証拠となる。３６２９ｂｐ断片の存在はまた、ａａｄＡマーカーカセットが除去されたことも示す。
【０１１５】
ａａｄＡマーカーの除去を確認するために（前のプローブはストリップ手順により取り除かれている）、ａａｄＡ遺伝子の４８０ｂｐ断片をプローブとして使用してブロットの二次ハイブリッド形成を行った。プローブの生成には、ＰＣＲ  Ｄｉｇ  ｌａｂｅｌｉｎｇ反応で供給者（ロシュ）のプロトコルに従って、プライマーｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０（上記参照）を使用した。
【０１１６】
実施例２：ｒｐｏＡ遺伝子の不活性化に基づく選択システムの構築
ｒｐｏＡ遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターｐＧＥＭ−ｒｐｏＡ−ｄｅｌの構築
タバコ葉緑体ゲノム（プラストームヌクレオチド７９４０１〜８２４７０に対応）内のｒｐｏＡ読み枠を含む領域を、タバコの葉組織から単離したゲノムＤＮＡから、Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン）を使用したＰＣＲによって増幅した。以下の組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｐ７８  ５’−ＳｐｈＩ−ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧ−３’（プラストームヌクレオチド７９４０１〜７９４２０とアニーリング）と、ｐ７７  ５’−ＳｍａＩ−ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ−３’（プラストームヌクレオチド８２４７０〜８２４５０とアニーリング）である。
【０１１７】
使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりである。すなわち、９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。この断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））内にライゲーションさせた。次いで、ＤｒａＩ及びＳｃａＩを用いた消化によって、完全なｒｐｏＡコード領域（プラストームヌクレオチド８０４５５〜８１４６８に対応）を除去した。葉緑体形質転換体の選択を容易にするために、ｐＵＣ１６ＳａａｄＡ（ｐＵＣ１６ＳａａｄＡの詳細な記載はＫｏｏｐ他、１９９６を参照）からＳｍａＩ断片として切り出したキメラａａｄＡ遺伝子を、ｒｐｏＡの代わりに挿入した。ｒｐｏＡと逆の方向でａａｄＡ遺伝子を保有するプラスミドクローンにより、形質転換ベクターｐＧＥＭ−ｒｐｏＡ−ｄｅｌを得た（図３）。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）。
【０１１８】
一次形質転換及びホモプラストミックΔｒｐｏＡ変異体の選択
無菌タバコ植物からの若い葉（栽培は実施例１参照）を、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、プラスミドｐＧＥＭ−ｒｐｏＡ−ｄｅｌでコーティングした金粒子でボンバードした（詳細な手順は実施例３参照）。ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む固形のＲＭＯＰ培地に移した。２週間後に再度葉片を切り新しい培地に移し、その後３週間毎にそれ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。一次ΔｒｐｏＡ形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドＤＮＡ分子を増幅し、野生型ゲノムを排除するために、一次形質転換体を用いて選択培地上で追加の３ラウンドの再分化を行った。分離により白色区域及び緑色区域の発生がもたらされるので、ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で、白色区域からの材料でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、固形ＶＢＷ培地上に根付かせ増殖させた（Ａｖｉｖ及びＧａｌｕｎ、１９８５、実施例１参照）。
【０１１９】
サザン分析による潜在的なプラスチド形質転換の分子分析
分析した各植物につき３μｇの全植物ＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、ＴＢＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９９に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム）に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに露出させた。
【０１２０】
野生型と形質転換されたプラストームを識別するのに適した断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用してゲル精製し、ロシュのＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを使用してジゴキシゲニンで標識し、ハイブリッド形成に使用した。
【０１２１】
ｒｐｏＡ遺伝子の再構成のための形質転換ベクターの構築
記載の選択システムを使用して任意の目的の遺伝子が挿入できることを実証するために、ｒｐｏＡコード領域の除去を再構成し、同時にｇｕｓマーカー遺伝子を導入する形質転換ベクターを構築した。
【０１２２】
このベクターはｒｐｏＡコード領域とｇｕｓ遺伝子を含み、以下の２組のプライマーを使用したＰＣＲによってタバコ葉緑体ゲノムから増幅した５’及び３’の相同配列によって隣接されている。すなわち、ｏＦＣＨ１１２  ５’−ＮｃｏＩ−ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣ−３’（プラストームヌクレオチド８１４７１〜８１４９０とアニーリング）とｏＦＣＨ１１３  ５’−ＳｍａＩ−ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ−３’（プラストームヌクレオチド８２４７０〜８２４５０とアニーリング）、及びｏＦＣＨ１１４  ５’−ＳｐｈＩ−ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧ−３’（プラストームヌクレオチド７９４０１〜７９４２０とアニーリング）とｏＦＣＨ１３７  ５’−ＰｓｔＩ−ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＣ−３’（プラストームヌクレオチド８１４６８〜８１４４９とアニーリング）である。増幅した５’相同断片（プラストームヌクレオチド８１４７１〜８２４７０に対応）は、ｒｐｏＡ開始コドンの上流の１０００個のヌクレオチドを含む。増幅した３’相同断片（プラストームヌクレオチド７９４０１〜８１４６８に対応）は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ｒｐｏＡコード領域、及びｒｐｏＡ終止コドンの下流の１０５４個のヌクレオチドを含む。５’及び３’の相同断片はプラスミドｐＵＣ１６ＳＲＢＳｕｉｄＡ３’ｒｂｃＬ（Ｋｏｏｐ他、１９９６）内にサブクローニングされ、形質転換ベクターｐｌＣ５９８を再生する。このベクターの構築を図４に示す。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）
【０１２３】
ΔｒｐｏＡ変異系のプラスチド形質転換及びホモプラストミック系の選択
第２の形質転換の目的は、ｒｐｏＡコード領域を再構成し、同時にａａｄＡカセットを取り除き、同時にｇｕｓマーカー遺伝子を導入することである。ＶＢＷ培地で成長させた無菌ホモプラストミックΔｒｐｏＡ変異体から採った若い葉を、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、プラスミドｐｌＣ５９８でコーティングした金粒子でボンバードした（詳細な手順は実施例３参照）。ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、固形のショ糖減ＲＭＯＰ培地（３ｇ／リットルのショ糖を含む）に移した。３週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し、光独立栄養的に成長することができる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るためにショ糖減ＲＭＯＰ培地上でさらにいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミックトランスプラストミック系を固形Ｂ５培地上で根付かせ、増殖させた。
【０１２４】
サザン分析による潜在的なプラスチド形質転換の分子分析
分析した各植物につき３μｇの全植物ＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、ＴＢＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９９に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム）に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに露出させた。
【０１２５】
野生型と形質転換されたプラストームを識別するのに適した断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用してゲル精製し、ロシュＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを使用してジゴキシゲニンで標識し、ハイブリッド形成に使用した。
【０１２６】
実施例３：ｙｃｆ３遺伝子の不活性化に基づく白色／緑色選択システムの構築
ｙｃｆ３の標的不活性化のための形質転換ベクターｐｌＣ５５３の構築
タバコ葉緑体ゲノム中のｙｃｆ３読み枠を含む領域を、タバコの葉組織から単離したゲノムＤＮＡから、Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン）を使用したＰＣＲによって増幅した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーの組を使用した。すなわち、ｏＦＣＨ６３（５’−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＣ−３’、プラストームヌクレオチド４５０３３〜４５０５３とアニーリング）とｏＦＣＨ６４（５’−ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  Ｃ−３’、プラストームヌクレオチド４７６６７〜４７６４７とアニーリング）である。
【０１２７】
使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりである。すなわち、９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。この断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）内にライゲーションさせ、ｐｌＣ５１７を再生した。次いで、ＢｂｒＰＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉを用いた消化によって、ｙｃｆ３の第１エキソン及び５’制御要素を除去した。Ｂｓｔ１１０７Ｉはｙｃｆ３開始コドン（ヌクレオチドの位置４６２６６）の３７３ヌクレオチド上流を切断する。ＢｂｒＰＩ部位はｙｃｆ３のイントロン１内に位置する（第１エキソンの末端近く）。キメラａａｄＡ遺伝子をｐＵＣ１６ＳａａｄＡ（ｐＵＣ１６ＳａａｄＡの詳細な記載はＫｏｏｐ他、１９９６を参照）からＳｍａＩ断片として切り出した。これを、ｙｃｆ３を置き換え、プラスチド形質転換体の選択を容易にするために挿入した。ｙｃｆ３と逆の方向でａａｄＡ遺伝子を保有するプラスミドクローンにより、形質転換ベクターｐｌＣ５５３を得た（図５）。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）。
【０１２８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の電気的形質転換
電気的コンピテント細胞の調製：１リットルのＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）カゼイン加水分解物、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）を、新鮮な終夜培養した大腸菌ＪＭ１０９細胞（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて１：１００で接種した。細胞を３７℃で、２２０ｒｐｍで振盪しながら、６００ｎｍで最適密度である０．５にした。細胞を２０分間氷冷し、１５分間遠心した（４０００ｒｐｍ、４℃）。上清を取り除き、ペレットを１リットルの氷冷無菌１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁させた。細胞を上記のように２回遠心し、それぞれ５００ｍｌ及び２０ｍｌの氷冷無菌１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁させた。細胞をもう一度遠心し、ペレットを２ｍｌの氷冷無菌１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁させた。この懸濁液を８０μｌのアリコットで凍結し、−８０℃で保存した。
【０１２９】
バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＭｉｃｒｏ  Ｐｕｌｓｅｒ電気穿孔装置を使用した電気的形質転換：電気的コンピテント細胞を氷上で解凍する。４０μｌの細胞懸濁液を２μｌのライゲーション混合物と混合し、事前に冷やしておいた、０．２ｃｍの滅菌キュベット（バイオラッド）に移した。この懸濁液を底から混ぜ、キュベットをチャンバースライド内に置いた。チャンバースライドをチャンバー内に押し込み、細胞を２．５ｋＶでパルスさせる。キュベットをチャンバーから取り出し、細胞を１ｍｌのＳＯＣ培地（２％（ｗ／ｖ）カゼイン加水分解物、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭグルコース）に懸濁させた。この懸濁液を１時間３７℃で振盪し、懸濁液１００μｌを１５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢプレートに植えた。
【０１３０】
一次形質転換及びホモプラストミックΔｙｃｆ３変異体の選択
タバコの種子（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ）の表面を滅菌し（７０％エタノールに１分間、５％Ｄｉｍａｎｉｎ  Ｃ、バイエル（Ｂａｙｅｒ）、レバークーゼン、ドイツ）、滅菌Ｈ2Ｏで３回１０分間洗浄し、Ｂ５培地上に置いた（調製法は下記参照）。植物を２５℃で１６時間光／８時間暗サイクルで成長させた（０．５〜１Ｗ／ｍ2、オスラム（Ｏｓｒａｍ）Ｌ８５Ｗ／２５  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｗｈｉｔｅ蛍光ランプ）。
【０１３１】
無菌的に成長させた４週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ植物から採った６枚の葉を切り、ＲＭＯＰ培地に移した（調製法は下記参照）。３５μｌの金懸濁液（０．６ミクロン、バイオラッド、ミュンヘン、エタノール１ｍｌあたり６０ｍｇ）を滅菌エッペンドルフカップ（トレフ、フィッシャーサイエンティフィック、インゴルシュタット、ドイツ）に移し、遠心で回収し、１ｍｌの滅菌Ｈ2Ｏで洗浄した。金のペレットを２３０μｌの滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁させ、２５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2、２５μｇのＤＮＡ（形質転換ベクターｐｌＣ５５３）を加えた。混合液をしっかり再懸濁させた後、５０μｌの０．１Ｍスペルミジンを加え、混合し、氷上で１０分間インキュベートした。その後、遠心によって金を回収し（１分、１００００ｒｐｍ）、６００μｌのエタノール（１００％、ｐ．Ａ．）を用いて２回洗浄した。遠心によって金を回収し（１分、１００００ｒｐｍ）、最後に７２μｌのエタノール（１００％、ｐ．Ａ．）に再懸濁させた。マクロキャリアをマクロキャリアホルダーに挿入し、５．４μｌの金懸濁液を施用した。以下のパラメータ、すなわち
−ラプチャーディスク  ９００ｐｓｉ
−ヘリウム圧  １１００ｐｓｉ
−真空  ２６〜２７インチＨｇ
−マクロキャリア、トップレベル
−葉片、第３レベル
を使用して、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ボンバードメントを行った。６枚の葉片をそれぞれ５．４μｌの金懸濁液でボンバードした。ボンバードメント後、葉片を２日間２５℃でＲＭＯＰ培地上でインキュベートした。
【０１３２】
ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む固形のＲＭＯＰ培地に移した。２週間後に再度葉片を切り新しい培地に移し、その後３週間毎にそれ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。一次Δｙｃｆ形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドＤＮＡ分子を増幅し、野生型ゲノムを排除するために、一次形質転換体を用いて選択培地上で追加の３ラウンドの再分化を行った。分離により白色区域、混合区域、緑色区域の発生がもたらされるので、ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で白色区域からの材料でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、低い光条件下で固形ＶＢＷ培地（Ａｖｉｖ及びＧａｌｕｎ、１９８５）（調製法は下記参照）上に根付かせ増殖させ、野生型類似Δｙｃｆ３変異体（薄緑表現型を示す）を得た。
【０１３３】
ＲＭＯＰ（ＫＯＨでｐＨ５．８）：ＮＨ4ＮＯ3（１６５０μｇ／ｍｌ）、ＫＮＯ3（１９００μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ  ４４０（μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（１７０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．８３μｇ／ｍｌ）、Ｈ3ＢＯ3（６．２μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ（２２．３μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（８．６μｇ／ｍｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ベンジルアミノプリン（１μｇ／ｍｌ）、ナフタレン酢酸（０．１μｇ／ｍｌ）、ショ糖（３００００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（８０００μｇ／ｍｌ）。
【０１３４】
Ｂ５（ＫＯＨでｐＨ５．７）：ＫＮＯ3（２５００μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ（１５０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（２５０μｇ／ｍｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4×Ｈ2Ｏ（１５０μｇ／ｍｌ）、（ＮＨ4）2ＳＯ4（１３４μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ3ＢＯ3（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１０μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（１μｇ／ｍｌ）ショ糖（２００００μｇ／ｍｌ）精製寒天（７０００μｇ／ｍｌ）。
【０１３５】
ＶＢＷ（ＫＯＨでｐＨ５．８）：ＮＨ4ＮＯ3（１６５０μｇ／ｍｌ）、ＫＮＯ3  １９００（μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（１７０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．８３μｇ／ｍｌ）、Ｈ3ＢＯ3（６．２μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ（２２．３μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ（８．６μｇ／ｍｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（０．５μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、グリシン（２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（０．５μｇ／ｍｌ）、インドール酢酸（２μｇ／ｍｌ）、キネチン（０．２μｇ／ｍｌ）、ショ糖（３００００μｇ／ｍｌ）、カゼイン加水分解物（５００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（７０００μｇ／ｍｌ）。
【０１３６】
ＰＣＲ及びサザンブロット法による分析
ＰＣＲ増幅によってプラスチド形質転換体を同定した。４０個の独立した系の最初の再分化体から単離した全ＤＮＡを、個別のＰＣＲ反応の鋳型として使用した。使用した方法は以下のとおりである。新しいタバコの葉組織１００ｍｇを、ｍｉｘｅｒ  ｍｉｌｌ  ＭＭ３００（レッチェ（Ｒｅｔｓｃｈ））を使用して、２００μｌのＡＰ１緩衝液（ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、キアゲン）／１μｌのＤＸ試薬（起泡性の阻害、キアゲン）中で、３ｍｍのタングステンカーバイドビーズを用いて１．５ｍｌミクロ遠心チューブに入れて、破壊した（２×２５Ｈｚで１分間）。その後、ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用してＤＮＡを精製した。トランスプラストミック植物を分析するために、５組のプライマー（配列を表１に示す）、すなわちｏＦＣＨ５９とｏＦＣＨ６０、ｏＦＣＨ５２とｏＦＣＨ５３、ｏＦＣＨ５２とｏＦＣＨ６０、ｏＦＣＨ５３とｏＦＣＨ５９、ｏＦＣＨ６０とｏＦＣＨ２７を利用した。ｏＦＣＨ５２及びｏＦＣＨ５３は、野生型プラストームからは９００ｂｐの、形質転換されたプラストームからは１７００ｂｐの増幅産物を生じるはずであるが、ｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０は、形質転換された植物からは４８０ｂｐの増幅産物を生じ、野生型からはまったく生じないはずである。同様に、ｏＦＣＨ５２、ｏＦＣＨ６０、及びｏＦＣＨ５３、並びにｏＦＣＨ５９は、形質転換された植物のみからそれぞれ８６７ｂｐ並びに１３６８ｂｐの産物が増幅されるはずである。ｏＦＣＨ６０とｏＦＣＨ２７の組合せでは、正しく形質転換されたプラストームからの２５４１ｂｐの産物を増幅することによって、形質転換体が正しい挿入物を保有しているかどうかを判定することができる。
【０１３７】
2004520038.tif 000002
【０１３８】
ＰＣＲの結果により、形質転換体の２４個の系がプラスチドゲノムが正しく挿入されたａａｄＡ遺伝子を保有していたことが示されたが、第１の再分化サイクルでは、依然としてヘテロプラストミックであった。このデータはまた、対応する系の表現型の出現と矛盾しておらず、これにより、色素欠損がｙｃｆ３の除去と関連していることが示された。
【０１３９】
ＤＮＡゲルブロット分析によってホモプラスミーを確認した。低い光条件下で成長させた、再分化の第４サイクルに由来する植物から採った若い葉から単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮＡゲルブロット分析で使用した。詳細な手順は以下のとおりである。分析した各植物につき４μｇの全植物ＤＮＡを制限酵素ＸｍａＪＩで消化し、ＴＢＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９９）に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに８０分間露出させた。
【０１４０】
ＤＩＧ標識プローブの調製では、以下の組のプリマ−を使用して５２０ｂｐの断片を増幅するのに、プラスミドｐｌＣ５２２（下記参照）を鋳型として使用した。すなわち、ｏＦＣＨ６９（５’−ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ−３’、タバコプラストーム配列４７１４９〜４７１６９に対応）とｏＦＣＨ６４（５’−ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  Ｃ−３’、タバコプラストーム配列４７６６７〜４７６４７に対応）である。ロシュのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、３５サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。増幅した断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用してゲル精製し、その後ハイブリッド形成に使用した。このプローブは、形質転換させたプラストームからは２９９８ｂｐのシグナルを、野生型のプラストームからが２１９８ｂｐのシグナルを生じるはずである。結果、検査した１０個の変異系すべてで、野生型プラスチドＤＮＡが検出されないことが示された。
【０１４１】
ｙｃｆ３遺伝子の再構成のための形質転換ベクターｐｌＣ５２６の構築
形質転換ベクターｐｌＣ５２６は、ｙｃｆ３遺伝子を再構成すること、ａａｄＡカセットを除去すること、ＧＦＰ遺伝子を挿入することを同時に行うことを目的として、変異Ｄｙｃｆ３系を形質転換させるように設計された。
【０１４２】
ｙｃｆ３の第１エキソン及び５’制御要素（５７１ｂｐ）を含むタバコ葉緑体ゲノムの領域を、ＰＣＲによって、タバコの葉組織から単離したゲノムＤＮＡから増幅した。以下の組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｏＦＣＨ４８  ５’−ＳｍａＩ−ＤｒａＩ−ＫｐｎＩ−ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＧＡＣ−３’（プラストームヌクレオチド４６０７０〜４６０９０とアニーリング）とｏＦＣＨ４９  ５’−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ−ＢｂｒＰＩ−ＮｈｅＩ−ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＴＧ−３’（プラストームヌクレオチド４６６３７〜４６６１８とアニーリング）である。ＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。断片をＳｍａＩで消化し、ＢｂｒＰＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉで消化したプラスミドｐｌＣ５１７（構築法は上を参照）内にライゲーションさせた。ｙｃｆ３の第１エキソン及び５’制御要素を正しい方向で保有するプラスミドクローンにより、クローン化プラスチドＤＮＡと一緒に追加の５箇所の制限部位を含むプラスミドｐｌＣ５２２が再生された。
【０１４３】
ＧＦＰのコード領域を、ＰＣＲによって、プラスミドｐＫＣＺ−ＧＦＰ（図６）から以下の組のプライマーを使用して増幅した。すなわち、ｏＦＣＨ２５（５’−ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＴＡＧ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＴ−３’とｏＦＣＨ２６  （５’−ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ−３’）である。ＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。増幅したＧＦＰ断片をＳｍａＩ及びＮｈｅＩで切断し、ＢｂｒＰＩ及びＮｈｅＩで切断したｐｌＣ５２２にライゲーションし、ｐｌＣ５２６を生成した（図３）。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）。
【０１４４】
Ｄｙｃｆ３変異系のプラスチド形質転換及びホモプラストミック系の選択
第２の形質転換の目的は、ｙｃｆ３遺伝子を再構成すること、ａａｄＡマーカーを取り除くこと、ｇｆｐ遺伝子を導入することを同時に行うことであった。固形ＶＢＷ培地上で、低い光条件下で成長させた無菌ホモプラストミックＤｙｃｆ３変異体から採った若い葉を、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して（詳細な手順は上記参照）、プラスミドｐｌＣ５２６でコーティングした金粒子を用いてボンバードした。ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、固形のショ糖減ＲＭＯＰ培地（３ｇ／リットルのショ糖を含む）に移し、２週間の間低い光条件下で培養した。３週間毎に再度葉片を切り新しい培地に移し強い光条件下で培養し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長できる形質転換体を選択し、ホモプラストミック組織を得るために、ショ糖減ＲＭＯＰ培地上でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、強い光条件下で固形Ｂ５培地上に根付かせ増殖させた。
【０１４５】
二次トランスプラストミック植物の分子分析
ＰＣＲ増幅によってプラスチドの形質転換を確認した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができた一次形質転換体から単離した全ＤＮＡを、以下のプライマーの組を使用したＰＣＲ分析の鋳型として使用した。すなわち、ｏＦＣＨ７６（５’−ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６９〜４６２８８とアニーリング）とｏＦＣＨ５３（５’−ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＣＴＣ−３’、プラストームヌクレオチド４６８１２〜４６７９２とアニーリング）である。このオリゴヌクレオチドプライマーの組は、野生型プラストームからは５４０ｂｐの、第２ラウンドで正しく形質転換されたプラストームからは１４００ｂｐの増幅産物を生じ、改変されていない第１ラウンドの形質転換体からはまったく生じないはずである（ｐ７６アニーリングの部位が除去されているので）。
【０１４６】
ＤＮＡゲルブロット分析によってホモプラスミーを確認した。ゲノムＤＮＡは、強い光条件下で成長させた、再分化の第４ラウンド由来の植物から採った若い葉から単離し、ＡｖａＩで消化した。使用したプローブはＤｙｃｆ３変異体で使用したものと同じである（ＤＮＡブロット及びハイブリッド形成の詳細な手順は上記参照）。このプローブは、野生型プラストームからは１２１２ｂｐのシグナル、第２ラウンドで正しく形質転換されたプラストームからは２０１５ｂｐのシグナル、改変されていない第１ラウンドの形質転換体からは６８５２ｂｐのシグナルを生じる。
【０１４７】
ａａｄＡマーカーの除去を確認するために、ａａｄＡ遺伝子の４８０ｂｐ断片をプローブとして使用して、ブロットの第２のハイブリッド形成を行った（前のプローブはストリップ手順により取り除かれている）。プローブの作成には、ＰＣＲ  Ｄｉｇ  ｌａｂｅｌｉｎｇ反応で供給者（ロシュ）のプロトコルに従って、プライマーｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０（上記参照）を使用した。
【０１４８】
実施例４：光合成関連遺伝子の不活性化に基づく選択システムの構築
プラスチドにコードされるｐｅｔＡ遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターｐｌＣ５５８の構築
すべてのクローン化手順は、実施例１及びＡｕｓｕｂｅｌ他、１９９９に記載の通常のプロトコルを使用して実施した。
【０１４９】
ベクターｐｌＣ５５８は、タバコプラストームに由来する２つのフランキング配列と、その間にａａｄＡカセット（ｐＵＣ１６Ｓ  ａａｄＡ  Ｓｍａ  ｖｏｌｌｓｔ、Ｋｏｏｐ他、１９９６）を含む。相同配列はｐｅｔＡ遺伝子の５’領域及び３’領域であり、それぞれ１ｋｂである。ａａｄＡカセットはｐｅｔＡ遺伝子（９６２ｂｐ）及びｐｅｔＡ３’領域の３００ｂｐと置き換わる。
【０１５０】
どちらのフランキング断片も、以下のオリゴの組をプライマーとして使用するＰＣＲによって増幅した。すなわち、末端でＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位を生じるｏＳＫ１３（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡ−３’）とｏＳＫ１４（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡ−３’）、並びに断片の末端でＳｍａＩ及びＳｐｈＩ部位を生じるｏＳＫ１５（５’−ＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＧ−３’）とｏＳＫ１６（５’−ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＧＣＴＣ−３’）である。ＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で３分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１．５分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。消化した断片（左／右フランク）及びＳｍａＩ断片としてのａａｄＡカセットを、ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化したｐＵＣ１９ベクター内にワンステップでクローニングした。ｐｌＣ５５８構築体を制限酵素実験によって分析した。ＰＣＲで増幅した断片を配列決定し、フランキング領域の配列が正しいことを証明した。
【０１５１】
形質転換ベクターｐｌＣ５５８を図８及び図９に示す。
【０１５２】
ｐｅｔＡ遺伝子の再構成のための形質転換ベクターｐｌＣ５９７、ｐｌＣ５９９、ｐｌＣ６００の構築
第２の形質転換の目的は、ｐｅｔＡの不活性化を修復し、同時にプラストームに新しい目的遺伝子（ｕｉｄＡ又はａｐｈＡ−６、潜在的にｎｐｔＩＩ）を挿入することである。したがって、ｐｅｔＡ遺伝子及び遺伝子カセット（５’／３’制御要素を含む）を、左／右フランキング配列の間にクローニングした。ベクターｐｌＣ５９７（ｕｉｄＡカセット）は、ベクターｐｌＣ５５８、ｐｅｔＡ遺伝子、ｕｉｄＡ遺伝子カセットと同じフランキング配列を含む。
【０１５３】
１ｋｂの左フランク、ｐｅｔＡ遺伝子配列（９６２ｂｐ）、ｐｅｔＡ遺伝子の３’領域の３００ｂｐを含む〜２．２ｋｂの断片を、プライマーとして以下のオリゴ組を使用したＰＣＲによって増幅した。すなわち、断片末端でＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位を生じるｏＳＫ１３（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡ−３’）とｏＳＫ７１（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＧ−３’）である。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で３分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で３分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。この断片と右フランクを、一緒にｐＵＣ１９にクローニングした。このベクターｐｌＣ６５１（「ｐｅｔＡ＋１ｋｂ５’＋１．３ｋｂ３’」）は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍプラストーム配列６３，３３５〜６６，５９７に対応する１ｋｂの左フランク、ｐｅｔＡコード配列、３’領域の３００ｂｐ、１ｋｂの右フランクを含む。
【０１５４】
新しい目的遺伝子（ｕｉｄＡ、Ｋｏｏｐ他；１９９６、ａｐｈＡ−６、ベクターｐＳＫ．ＫｍＲ、Ｂａｔｅｍａｎ及びＰｕｒｔｏｎ、２０００；ｎｐｔＩＩ、Ｔｏｐｆｅｒ他、１９８７のいずれか）を、遺伝子カセット（５’／３’制御要素を含む）として両方のフランキング断片の間に挿入した。（ＳｍａＩ断片としての）ｕｉｄＡカセットは、ベクターｐｌＣ５６２（「ｐＵＣ１６ＳＲＢＳｕｉｄＡ３’ｒｂｃＬ」、Ｋｏｏｐ他、１９９６）からとった。遺伝子ａｐｈＡ−６及びｎｐｔＩＩを、それぞれがｕｉｄＡ遺伝子を置き換えるようにベクターｐｌＣ５６２にクローニングした。このクローニングステップの後に、ａｐｈＡ−６カセット及びｎｐｔＩＩカセットをそれぞれＳｍａＩ消化によって単離することができる。これらのカセットをｐｅｔＡの３’領域（挿入部位はｐｅｔＡの３００ｂｐ下流）内にクローニングした。これらのベクターを「ｐｅｔＡ修復プラスミド」と命名した（ｕｉｄＡを有するｐｌＣ５９７、ａｐｈ６を有するｐｌＣ５９９、ｎｐｔＩＩを有するｐｌＣ６００）。
【０１５５】
構築体を制限酵素実験によって分析し、ＰＣＲで増幅した断片を配列決定してフランキング領域の配列が正しいことを証明した。
【０１５６】
３つのベクターの略図を図１０に示す。形質転換ベクターｐｌＣ５９７を図１１に示す。
【０１５７】
一次形質転換及びホモプラストミックＤｐｅｔＡ変異体の選択
ベクターｐｌＣ５５８を用いたパーティクルガンによるプラスチド形質転換及びその選択を、実施例３に記載のように実施した。ベクターｐｌＣ５５８を用いたＰＥＧに媒介されるプラスチド形質転換を、実施例１に記載のように実施した。
【０１５８】
再構成されたホモプラストミックＤｐｅｔＡ変異体の二次形質転換及び選択
ベクターｐｌＣ５５８を用いたパーティクルガンによるプラスチド形質転換及びその選択を、実施例３に記載のように実施した。ベクターｐｌＣ５８８を用いたＰＥＧに媒介されるプラスチド形質転換を、実施例１に記載のように実施した。形質転換体の選択は以下のように実施した。
ａ）減少させたショ糖含量（０．３％）のＲＭＯＰ培地上で実施した。ｐｅｔＡノックアウトの再構成を用いた形質転換体は、成長エネルギーとして光合成を利用できるはずである。
ｂ）選択剤としてカナマイシンを含むＲＭＯＰ培地上で実施（ａｐｈ−６及びｎｐｔＩＩの遺伝子産物はカナマイシンを解毒する）。
形質転換体は、再分化の反復サイクル中、ｈｃｆ（高クロロフィル蛍光）の減少を示した。
【０１５９】
ＰＣＲ及びサザンブロット法による一次形質転換後の形質転換体の分析
植物ＤＮＡの単離、ＰＣＲ分析及びサザンブロットのため、実施例１に記載のように通常のプロトコルを使用した。ａａｄＡ遺伝子を決定するために、プライマーｏＦＣＨ５９−ａａｄＡ４８０−ｌｉとｏＦＣＨ６０−ａａｄＡ４８０−ｒｅ（５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＣＣ−３’）を使用した。形質転換体が正しい挿入物を有するかどうかを決定するために、プライマーｏＦＣＨ６０−ａａｄＡ４８０−ｒｅとｏＳＫ１１６−ｐｅｔＡ−ｒｅ（５’−ＡＡＡＡＴＡＧＡＴＴＣＡＴＴＡＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣ−３’）を使用した。プライマーｏＳＫ１１６−ｐｅｔＡ−ｒｅは、５’フランキング断片の上流（外側）に位置する。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で３分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。
【０１６０】
最初のＰＣＲの結果により、形質転換体の１２個の系が、プラスチドゲノムに正しく挿入されたａａｄＡ遺伝子を保有していることが示された。系がホモプラストミックかヘテロプラストミックかを示すために、さらなる検査及びサザン分析を実施例１に記載のように実施した。
【０１６１】
ＰＣＲ及びサザンブロット法による二次形質転換後の形質転換体の分析
植物ＤＮＡの単離、及びＰＣＲ分析のため、実施例１に記載のように通常のプロトコルを使用した。ｕｉｄＡ遺伝子を決定するために、プライマーｏＳＭ６１−ＧＵＳ−Ｎ（５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）とｏＳＭ６２−ＧＵＳ−Ｃ（５’−ＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’）を使用した。形質転換体が正しい挿入物を有するかどうかを決定するために、プライマーｏＳＭ６１−ＧＵＳ−Ｎ（５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）とｏＳＫ１３８−ｐｅｔＡ−３’−ｒｅ（５’−ＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＡＧＴＣ  ＴＣＴＡＣＴＧＧ−３’）を使用した。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で３分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。
【０１６２】
ａｐｈ−６遺伝子及びｎｐｔＩＩ遺伝子の検出には、特異的プライマーを使用した。形質転換体が正しい挿入物を保有しているかどうかを決定するために、１個の遺伝子特異的なプライマーとプライマーｏＳＫ１３８−ｐｅｔＡ−３’−ｒｅを使用した。
【０１６３】
実施例１に記載のように、通常のプロトコルに従って、サザンブロット分析を実施した。
【０１６４】
実施例５：パラコート耐性の選択
植物の形質転換及びパラコート耐性の選択
実施例４に記載のように、４つの葉片をそれぞれ１μｇのｐｌＣ５５８（図８）を用いて形質転換させた。ボンバードメントの後、葉片を２５℃で２日間、ＲＭＯＰ培地上でインキュベートした。
【０１６５】
ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、新しいＲＭＯＰ培地に移し、暗所、２５℃で１０日間インキュベートした。その後、葉片を再度切り、５ｍｇ／ｌのパラコートを含む新しい培地に移し、光中で、２５℃で１０日間インキュベートした。葉片を再度切り、８ｍｇ／ｌのパラコートを含む新しい培地に移し、光中で、２５℃で１２日間インキュベートした。底側の緑色の再分化体を採取し、８ｍｇ／ｌのパラコートのＲＭＯＰを含む個別のプレートに移した。小葉片を切ることによって、系のシュート再生（ｓｈｏｏｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を反復サイクルで実施し、これにより、８ｍｇ／ｌのパラコートを含むＲＭＯＰ培地上に新しい再分化体が形成される。
【０１６６】
サザン分析による、潜在プラスチド形質転換体の分子分析
分析した各植物につき３ｍｇの全植物ＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、ＴＢＥアガロースゲル（１％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他、１９９９：分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｗｉｌｅｙ、第４版、ユニット２．９Ａに記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム）に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに露出させた。
【０１６７】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用して野生型プラストームと形質転換されたプラストームとを識別するのに適した断片をゲル精製し、ロシュのＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを使用してジゴキシゲニンで標識し、ハイブリッド形成に使用した。
【０１６８】
実施例６：カナマイシン選択を使用したｙｃｆ３の再構成
ｙｃｆ３遺伝子の標的不活性化のための形質転換ベクターｐｌＣ５７７の構築
ｙｃｆ３の第１エキソンとスプライシング部位（プラストームヌクレオチド４６０４２〜４６２０６に対応）をａａｄＡコード領域で置き換えることによってｙｃｆ３遺伝子を不活性化させるように設計された形質転換ベクターを構築した。このベクターはどのような３’制御配列も含まない（ａａｄＡマーカー遺伝子も内在ｙｃｆ３遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子も含まない）。さらに、どのようなプロモーター要素も導入されず、ａａｄＡ遺伝子は内在ｙｃｆ３上流制御要素によって転写及び翻訳されるものと期待される。
【０１６９】
このベクターは、タバコ葉緑体ゲノムから以下の２組のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した、５’及び３’相同配列に隣接されたａａｄＡコード領域を含む。すなわち、ｏＦＣＨ７６（５’−ＮｃｏＩ−ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６９〜４６２８８とアニーリング）とｏＦＣＨ７７（５’−ＳｍａＩ−ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＣ−３’、プラストームヌクレオチド４７２０５〜４６１８５とアニーリング）、及びｏＦＣＨ７８（５’−ＳｐｈＩ−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド４５０３３〜４５０５３とアニーリング）とｏＦＣＨ７９（５’ＰｓｔＩ−ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６０４１〜４６０２１とアニーリング）である。
【０１７０】
Ｐｆｕポリメラーゼ（プロメガ）を使用したＰＣＲ増幅を以下のように実施した。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。ｙｃｆ３開始コドンの上流９３６ヌクレオチドを含む、増幅した５’相同断片（プラストームヌクレオチド４６２６９〜４７２０５に対応）を、ＳｍａＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＵＣ１６ＳａａｄＡプラスミド（Ｋｏｏｐ他、１９９６）にライゲーションさせ、それをＥｃｏ  ＲＩで消化し、次いでクレノウポリメラーゼ（プロメガ）を用いてフィルイン反応を行い、その後ＮｃｏＩで消化し、ｐｌＣ５６５を生じた。ｙｃｆ３遺伝子の１０００ヌクレオチドを含む、増幅した３’相同断片（プラストームヌクレオチド４５０３３〜４６０４１に対応）をＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで消化し、ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで切断したｐｌＣ５６５内にライゲーションさせ、最終的な形質転換ベクターｐｌＣ５７７を得た（図１２及び図１３）。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）。
【０１７１】
一次形質転換及びホモプラストミックΔｙｃｆ３変異体の選択
無菌タバコ植物（培養は実施例３参照）から採った若い葉を、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、プラスミドｐｌＣ５７７でコーティングした金粒子でボンバードした（詳細な手順は実施例３参照）。ボンバードメントの２日後、葉を小片に切り（約３×３ｍｍ）、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む固形のＲＭＯＰ培地に移した。２週間後に再度葉片を切り新しい培地に移し、その後３週間毎にそれ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。一次Δｙｃｆ３形質転換体はスペクチノマイシン耐性を示し、ヘテロプラストミックであるにもかかわらず光中で緑色表現型を示した。形質転換されたプラスチドＤＮＡ分子を増幅し、野生型ゲノムを排除するために、選択培地上で一次形質転換体で３回の追加の再分化ラウンドを行った。分離により白色区域、緑色区域の発生がもたらされるので、ホモプラストミック変異形質転換体を得るために、非選択的培地上で白色区域からの材料でいくつかの追加の再分化ラウンドを行った。ホモプラストミック形質転換系を、固形ＶＢＷ培地（Ａｖｉｖ及びＧａｌｕｎ、１９８５、実施例３参照）上に根付かせ増殖させた。
【０１７２】
ＰＣＲ及びサザンブロット法による分析
ＰＣＲ増幅によってプラスチド形質転換体を同定した。２４個の独立した系の最初の再分化体から単離した全ＤＮＡを、ＰＣＲの鋳型として使用した。２組のプライマー（配列は実施例３を参照）、すなわちｏＦＣＨ５９とｏＦＣＨ６０、ｏＦＣＨ５２とｏＦＣＨ５３を利用して、トランスプラストミック植物を分析した。ｏＦＣＨ５２及びｏＦＣＨ５３は、野生型プラストームからは９００ｂｐの、形質転換されたプラストームからは１４７６ｂｐの増幅産物を生じるはずであるが、ｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０は、形質転換された植物からは４８０ｂｐの増幅産物を生じ、野生型からはまったく生じないはずである。結果は、１４系列の形質転換体がプラスチドゲノム中に正しいａａｄＡ挿入物を保有することを示している。このデータはまた、色素欠損はｙｃｆ３の除去と関連していることを示す、それぞれ系の表現型の出現と矛盾しない。
【０１７３】
ＤＮＡゲルブロット分析によってホモプラスミーを確認した。低い光条件下で成長させた、Δｙｃｆ３変異体（第４再分化体）から採った若い葉から単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮＡゲルブロット分析で使用した。詳細な手順は以下のとおりである。分析した各植物につき４μｇの全植物ＤＮＡを制限酵素ＸｍａＪＩで消化し、ＴＡＥアガロースゲル（０．８％）で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ他（１９９９）に記載のように、ＤＮＡを変性させ、正に帯電させたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移した。ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュダイアグノスティクス有限責任会社、マンハイム、ドイツ）中でフィルターをジゴキシゲニンで標識したプローブとハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ）を使用して検出した。室温で膜をＸ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに２時間暴露させた。
【０１７４】
ＤＩＧ標識プローブの調製では、以下の組のプリマ−を使用して５２０ｂｐ断片を増幅するために、タバコゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。すなわち、ｏＦＣＨ６９（５’−ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ−３’、タバコプラストーム配列４７１４９〜４７１６９に対応）とｏＦＣＨ６４（５’−ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  Ｃ−３’、タバコプラストーム配列４７６６７〜４７６４７に対応）である。ロシュのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりである。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間、３５サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。増幅した断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用してゲル精製し、その後ハイブリッド形成に使用した。このプローブは、形質転換させたプラストームからは２７８０ｂｐのシグナルを、野生型のプラストームからが２１９８ｂｐのシグナルを生じるはずである。結果、検査した６個の変異系すべてで、野生型プラスチドＤＮＡが検出されないことが示された。
【０１７５】
ｙｃｆ３遺伝子の再構成のための形質転換ベクターｐｌＣ６３７の構築
形質転換ベクターｐｌＣ６３７は、ｙｃｆ３遺伝子を再構成すること、ａａｄＡ遺伝子を除去すること、カナマイシン耐性を与えるａｐｈＡ−６遺伝子を挿入することを同時に行うことを目的として、変異Δｙｃｆ３系を形質転換させるように設計された。
【０１７６】
ａｐｈＡ−６遺伝子は、ｙｃｆ３の発現又は内在ｙｃｆ３上流制御要素の機能のどちらも破壊せずに、ｙｃｆ３の上流位置に導入される。短いＲＢＳ（リボソーム結合部位）配列が、再構成されたｙｃｆ３遺伝子を翻訳する、新しく形成された人工オペロンとして働く。ａｐｈＡ−６遺伝子及びｙｃｆ３は、ｙｃｆ３  ５’制御要素の制御下で同一方向に転写される。
【０１７７】
ｙｃｆ３のＮ末端（これは最初の形質転換ラウンドで除去される）を含むタバコ葉緑体ゲノムの領域（プラストームヌクレオチド４５０３３〜４６２６６に対応）を、タバコの葉組織から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。以下の組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｏＦＣＨ１３９（５’−ＰｓｔＩ−ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ（リボソーム結合部位）−ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＡＡ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６６〜４６２４７とアニーリング）とｏＦＣＨ７８（５’−ＳｐｈＩ−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド４５０３３〜４５０５３とアニーリング）である。Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ）を使用したＰＣＲ増幅を以下のように実施した。９４℃で２分間、１サイクル；９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間、３０サイクル；最終伸長、７２℃で１０分間。断片をＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで消化し、ＰｓｔＩ及びＳｐｈＩでｐｌＣ５７７にライゲーションさせ、ｐｌＣ６３６を生じた。
【０１７８】
ａｐｈＡ−６遺伝子のコード領域を、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩを使用してプラスミドｐＳＫ．ＫｍＲ（英国、ロンドン大学生物学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ）のＳａｕｌ  Ｐｕｒｔｏｎ博士から得た）から切り出し、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断したｐｌＣ６３６内にライゲーションさせ、最終的な形質転換ベクターｐｌＣ６３７（図１４及び図１５）を得た。プラスミドに挿入されたものが何であるかは、配列決定によって確認した（ＭＷＧ、ミュンヘン）。
【０１７９】
Δｙｃｆ３変異系のプラスチド形質転換及びホモプラストミック系の選択
第２の形質転換の目的は、ｙｃｆ３遺伝子を再構成すること、ａａｄＡマーカーを取り除くこと、カナマイシン耐性を与えるａｐｈＡ−６遺伝子を導入することを同時に行うことであった。低い光条件下で、固形ＶＢＷ培地上で成長させた無菌ホモプラストミックΔｙｃｆ３変異体から単離した、包埋したプロトプラストを、バイオラッド（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して（詳細な手順は実施例３を参照）、プラスミドｐｌＣ６３７でコーティングした金粒子を用いてボンバードした。ボンバードメントの２日後、格子を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む固形ＲＭＯＰ培地に移し、２週間の間低い光条件下で培養した。その後、２週間毎に格子を新しい培地に移し強い光条件下で培養し、それ以上の再分化体が現れなくなるまで繰り返した。カナマイシン耐性を示し、緑色表現型を示す形質転換体を選択し、強い光条件下で固形Ｂ５培地に供して、ｙｃｆ３が再構成されたプラストームを増幅させた（ｙｃｆ３欠損プラストームは、Ｂ５培地上で強い光条件下で成長している場合には増幅されない）。
【０１８０】
二次トランスプラストミック植物の分子分析
ＰＣＲ増幅によってプラスチド形質転換を確認した。緑色表現型を示し光独立栄養的に成長することができた一次形質転換体から単離した全ＤＮＡを、以下の２組のプライマーを使用したＰＣＲ分析の鋳型として使用した。すなわち、ｏＦＣＨ１６８（５’−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴ−３’、ａｐｈＡ−６コード領域の５’部分に由来）とｏＦＣＨ１６９（５’−ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’、ａｐｈＡ−６コード領域の３’部分に由来）、及びｏＦＣＨ２７（５’−ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ−３’、プラストームヌクレオチド４４７９９〜４４８１９とアニーリング）とｏＦＣＨ１６８である。ｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９は、再構成された植物からは５００ｂｐの増幅産物を生じ、改変されていない第１ラウンドの形質転換体からはまったく生じないはずである。ｏＦＣＨ２７とｏＦＣＨ１６８の組合せでは、正しく形質転換されたプラストームからの約２３００ｂｐの産物を増幅することによって、第２形質転換体が正しいａｐｈＡ−６挿入物を保有しているかどうかを判定することができる。３グリッドボンバードメントから、合計５個の独特のｙｃｆ３再構築タバコプラスチド形質転換率が得られた。
【０１８１】
ＤＮＡゲルブロット分析によってホモプラスミーを確認した。Ｂ５培地上で強い光条件下で成長させた、ｙｃｆ３が再構成された植物の若い葉からゲノムＤＮＡを単離し、ＨｉｎｃＩＩで消化した。使用したプローブはΔｙｃｆ３変異体で使用したものと同じである（ＤＮＡブロット法及びハイブリッド形成の詳細な手順は上記参照）。このプローブは、野生型プラストームでは３２５７ｂｐのシグナル、第２ラウンドで正しく形質転換されたプラストームでは２０４６ｂｐのシグナル、改変されていない第１ラウンドの形質転換体では３８５７ｂｐのシグナルを生じる。
【０１８２】
ａａｄＡマーカーの除去を確認するために、ａａｄＡ遺伝子の４８０ｂｐ断片をプローブとして使用して、ブロットの第２のハイブリッド形成を行った（前のプローブはストリップ手順により取り除かれている）。プローブの作成には、ＰＣＲ  Ｄｉｇ  ｌａｂｅｌｉｎｇ反応で供給者（ロシュ）のプロトコルに従って、プライマーｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０（上記参照）を使用した。
【０１８３】
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【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】ベクターｐｌＣ５７１の概略図である。
【図２】ベクターｐｌＣ５５４の概略図である。
【図３】ベクターｐＧＥＭ〜ｒｐｏＡ〜ｄｅｌ及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図４】ベクターｐｌＣ５９８及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図５】ベクターｐｌＣ５５３の概略図である。
【図６】ベクターｐＫＣＺ〜ＧＦＰの概略図である。
【図７】ベクターｐｌＣ５２６の概略図である。
【図８】ベクターｐｌＣ５５８及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図９】ベクターｐｌＣ５５８の概略図である。
【図１０】ベクターｐｌＣ５９７、ｐｌＣ５９９、ｐｌＣ６００、及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図１１】ベクターｐｌＣ５９７の概略図である。
【図１２】ベクターｐｌＣ５７７の地図である。
【図１３】ベクターｐｌＣ５７７及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図１４】ベクターｐｌＣ６３７の地図である。
【図１５】ベクターｐｌＣ６３７及び標的のプラストーム領域の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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