(57)【要約】本発明は、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中に発現され、乳中において例えばダイマー等の活性形態で存在する遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦのような、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦに関する。また、本発明は、トランスジェニックＰＤＧＦを作成する方法、ＰＤＧＦを発現できるトランスジェニック動物、および、例えば乳腺特異的プロモーターの制御下でＰＤＧＦをコードするＰＤＧＦ−Ｂ核酸配列のようなＰＤＧＦをコードする核酸配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を作成する方法であって、
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦをコードする核酸配列をその体細胞および生殖細胞が含む、トランスジェニック哺乳動物を提供し；さらに
前記トランスジェニック動物から乳を得る；各工程を含んで成り、前記乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％がダイマーであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記核酸配列がＰＤＧＦ Ａ鎖をコードし、かつ乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％がＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列がＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードし、かつ乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％がＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列が、ＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列および前記ＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列が同じプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列が、前記ＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列とは異なるプロモーターに作動可能に結合していることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジェニック動物が、ＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列を包含することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
乳中に活性ＰＤＧＦ分子を発現できるトランスジェニック哺乳動物を作る方法であって、
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦをコードする核酸配列を細胞に導入し；さらに
前記細胞をトランスジェニック哺乳動物に発生させる；各工程を含んで成り、前記トランスジェニック哺乳動物がその乳中にＰＤＧＦを発現し、かつ該ＰＤＧＦの少なくとも３０％が活性形態で乳中に存在することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記細胞が卵母細胞であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が体細胞であり、該体細胞または該体細胞の核が卵母細胞に導入されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
乳中に活性ＰＤＧＦ分子を発現できるトランスジェニック哺乳動物を作る方法であって、
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列を細胞に導入し；
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列を前記細胞に導入し；さらに
前記細胞をトランスジェニック哺乳動物に発生させる；各工程を含んで成り、前記トランスジェニック動物がその乳中にＰＤＧＦを発現し、かつ該ＰＤＧＦの少なくとも３０％が活性形態で乳中に存在することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記細胞が卵母細胞であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が体細胞であり、該体細胞または該体細胞の核が卵母細胞に導入されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
乳中に活性ＰＤＧＦ分子を発現できるトランスジェニック哺乳動物を作る方法であって、
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列をその生殖細胞および体細胞が含むトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞を提供し；
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列を前記細胞に導入し；さらに
前記細胞をトランスジェニック哺乳動物に発生させる；各工程を含んで成り、前記トランスジェニック哺乳動物がその乳中にＰＤＧＦを発現し、かつ該ＰＤＧＦの少なくとも３０％が活性形態で乳中に存在することを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記細胞が卵母細胞であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が体細胞であり、該体細胞または該体細胞の核が卵母細胞に導入されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターに作動可能に結合した少なくとも１つのＰＤＧＦ鎖をコードする核酸配列をそのゲノムが含むトランスジェニック動物から得られた乳調製物であって、前記ＰＤＧＦ鎖がトランスジェニック哺乳動物の乳腺上皮細胞において発現され、かつＰＤＧＦの少なくとも３０％がダイマーとして乳中に存在することを特徴とする乳調製物。
【請求項１８】
前記ＰＤＧＦ鎖がＰＤＧＦ Ａ鎖であり、かつＰＤＧＦの少なくとも３０％がＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとして乳中に存在することを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項１９】
前記ＰＤＧＦ鎖がＰＤＧＦ Ｂ鎖であり、かつＰＤＧＦの少なくとも３０％がＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして乳中に存在することを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項２０】
前記トランスジェニック哺乳動物のゲノムが、乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ Ａ鎖をコードする核酸配列と、乳腺上皮細胞における発現を導くプロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードする核酸配列とを含むことを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項２１】
ＰＤＧＦの少なくとも３０％がＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーとして乳中に存在することを特徴とする請求項２０記載の乳調製物。
【請求項２２】
前記ＰＤＧＦがヒトＰＤＧＦであることを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項２３】
前記トランスジェニック哺乳動物がヤギであることを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項２４】
少なくとも１ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含むことを特徴とする請求項１７記載の乳調製物。
【請求項２５】
非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺におけるＰＤＧＦの発現を導くことができる制御配列に作動可能に結合した生物学的に活性なＰＤＧＦまたはその相同物をコードする核酸配列を含む単離核酸
【請求項２６】
前記核酸配列がＰＤＧＦ Ａ鎖をコードすることを特徴とする請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】
前記核酸配列がＰＤＧＦ Ｂ鎖をコードすることを特徴とする請求項２５記載の核酸。
【請求項２８】
前記核酸配列がＰＤＧＦ Ｂ鎖をさらにコードすることを特徴とする請求項２６記載の核酸。
【請求項２９】
ＰＤＧＦをコードする前記核酸配列が、モノシストロン性またはジシストロン性であることを特徴とする請求項２５記載の核酸。
【請求項３０】
前記核酸配列がジシストロン性であることを特徴とする請求項２５記載の核酸。
【請求項３１】
前記核酸が、発現カセットＢＣ７０１またはＢＣ７３４を含むことを特徴とする請求項２５記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年６月１９日出願の米国仮特許出願第６０／２１２，４０６号（その内容の全てが本願に組み込まれている）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
増殖因子は、特定の受容体と相互作用するポリペプチドホルモン様分子である。それら増殖因子は、創傷治癒過程が観察され得る組織において、ナノグラム量で存在するであろう。実際に、創傷治癒過程は以下の増殖因子によって制御および調節されている：
（ａ）それ自体が細胞増殖を促進させるマイトジェン活性を有する増殖因子；
（ｂ）脈管形成活性を有し、従って新しい血管の成長を促進させる増殖因子；
（ｃ）炎症性細胞および繊維芽細胞を創傷部位に引き付ける走化性活性を有する増殖因子；
（ｄ）隣接細胞によるサイトカインおよび増殖因子の合成に影響を及ぼす増殖因子；
（ｅ）細胞外マトリックスの作成および分解をもたらす増殖因子。
【０００３】
血小板由来増殖因子（以下ＰＤＧＦと称する）は、血清中に存在するが血漿中には存在しない主要なマイトジェン増殖因子である（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ． ７２（１９７５）， ２６３５−２６３９； Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌ， Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ． １４（１９７８）， ２０３−２１０）。上記のことは、繊維芽細胞のインビトロ増殖の刺激において、血清が血漿よりも優れていることの観察に基づいて発見された（Ｂａｌｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｖｏｌ． ７０（１９７３）， ６７５−６７９）。ＰＤＧＦは、結合組織細胞ならびにほとんどの間充織細胞のためのマイトジェンであり（Ｐｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｍｕｓｔｏｅ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． ４６（１９９５）， ４６７−４８１）、さらに、好中球、単球および繊維芽細胞の走化性因子としても作用する（Ｌｅｐｉｓｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ２６（１９９４）， ２６７−２７２）。ＰＤＧＦの走化性活性のせいで創傷に遊走する循環単球および繊維芽細胞は、組織マクロファージに成熟し、それ自体がＰＤＧＦを分泌できる。走化性効果の他に、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ヒトの抹消血単球において、凝固カスケードのイニシエーターである組織因子の発現を誘導することが分かっている（Ｅｒｎｏｆｓｓｏｎ Ｍ．， ａｎｄ Ｓｉｅｇｂａｈｎ， Ａ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ８３（１９９６）， ３０７−３２０）。
【０００４】
ＰＤＧＦは、ヒアルロン酸およびフィブロネクチンの産生を含む、細胞外マトリックス合成の誘導も仲介する（Ｒｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ｃ． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ． Ｒｅｇ．， ｖｏｌ．５， １２−１７）。創傷の再生に重要なタンパク質であるコラゲナーゼも、ＰＤＧＦに反応して産生される（Ｓｔｅｅｄ， Ｄ．Ｌ． Ｓｕｒｇ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．， ｖｏｌ． ７７（１９９７）， ５７５−５８６）。
【０００５】
ＰＤＧＦは、例えば腫瘍形成、動脈硬化、リウマチ性関節炎、肺線維症、骨髄線維症、または異常な創傷修復のような病的状態にも関連し（Ｂｏｒｎｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ７６６（１９９５）， ４１６−４３０； Ｈｅｌｄｉｎ， Ｃ．Ｈ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ｖｏｌ． ４１０（１９９７）， １７−２１）、さらに、骨芽細胞の増殖を促進させる骨細胞のマイトジェンとしても作用する（Ｈｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ， ｖｏｌ．１９（１９９６）， ３５３−３６２）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、部分的に、トランスジェニック動物の乳中にＰＤＧＦが産生され得ることの発見に基づく。ＡおよびＢと称される２つのペプチド鎖の各々のホモダイマーまたはヘテロダイマーの組合せである、ＰＤＧＦの３つの公知のアイソフォームがある。ＰＤＧＦの３つのダイマー（二量体）アイソマーは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＤＧＦ−ＢＢである。ＰＤＧＦは、ホモダイマーまたはヘテロダイマーの何れかのダイマーとして活性を有する。トランスジェニック動物の乳中に産生されるＰＤＧＦは、活性な例えばダイマー形態であることが分かった。
【０００７】
従って、１つの態様において、本発明は、トランスジェニックＰＤＧＦまたはトランスジェニックＰＤＧＦ調製物を作成する方法に関する。本方法は：
乳腺特異的プロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦをコードする核酸配列を含む核酸配列を包含するトランスジェニック非ヒト動物（例えばトランスジェニック非ヒト哺乳動物）を提供し；さらに
前記トランスジェニック動物の乳中にＰＤＧＦを発現させ、それによってトランスジェニックＰＤＧＦを作成する；各工程を含む。
【０００８】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部は活性形態であり、例えばトランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部はダイマーの形態である。
【０００９】
好ましい実施形態において、本方法は、トランスジェニック動物の乳から、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦまたは遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦの調製物を回収する工程をさらに含む。
【００１０】
別の好ましい実施形態において、本方法は：
ＰＤＧＦをコードする核酸配列および必要に応じて乳腺特異的プロモーターを含む核酸を細胞に導入し、その細胞をトランスジェニック動物に発生させる工程をさらに含む。例えば受精卵母細胞のような卵母細胞、または例えば繊維芽細胞のような体細胞にその核酸配列を導入して差し支えない。
【００１１】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は：反芻動物；有蹄動物；家畜；および乳用動物；よりなる群から選択される。好ましい哺乳動物として、ヤギ、ヒツジ、マウス、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ、およびウサギが挙げられる。
【００１２】
好ましい実施形態において、好ましくはトランスジェニック動物において作成されたような遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、グリコシル化されている。好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦは、そのグリコシル化パターンにおいて、自然に生じる非トランスジェニック起源において認められまたはそれらから単離されたような、あるいは細胞培養において遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００１３】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸はＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは乳中にダイマーとして発現され、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００１４】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸はＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは乳中にダイマーとして発現され、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００１５】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方を含んでいて差し支えない。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方の発現を導く１つの乳腺特異的プロモーター；一方がＰＤＧＦ−Ａをコードする配列の発現を導き、もう一方がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の発現を導くような、２つの乳腺特異的プロモーター；をさらに含んでいて差し支えない。核酸配列が２つの乳腺特異的プロモーターを含む場合、それら乳腺特異的プロモーターは同じ乳腺特異的プロモーターであっても、または異なる乳腺特異的プロモーターであっても差し支えない。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、一方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ａをコードする配列で、他方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列という、２つの別々の核酸配列を含んでいて差し支えない。ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターは、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターと同じであって差し支えなく（例えば両方の核酸配列がβ―カゼインプロモーターを含んでいて差し支えない）、あるいはＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列とは異なる乳腺特異的プロモーターに作動可能に結合していて差し支えない（例えば、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がβ−カゼインプロモーターに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列はβ−カゼインプロモーターとは異なる乳腺特異的プロモーターに結合している）。
【００１７】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む場合、トランスジェニック動物の乳は、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー；ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；それらの混合物；を含む。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーのようなダイマーの形態である。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。さらに別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。
【００１８】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列およびＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列を有するトランスジェニック動物の乳は：１、２、３、４、５より大きな、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのような全ホモダイマーの比を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーがより多く存在するような；あるいは例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーがより多く存在するような、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は：ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；あるいは、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；を有する。
【００１９】
好ましい実施形態において、乳腺特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターであって差し支えない。
【００２０】
好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、その活性において、例えば酵母細胞培養のような細胞培養で遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦにおいて認められまたはそれらから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００２１】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは哺乳動物または霊長類ＰＤＧＦであり、好ましくはヒトＰＤＧＦである。
【００２２】
好ましい実施形態において、その調製物は、少なくとも１、５、１０、１００、または５００ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳中にＰＤＧＦを含むトランスジェニック調製物を提供する方法に関するものであり：
乳腺上皮細胞においてＰＤＧＦをコードする配列の発現をもたらしそれによって哺乳動物の乳中にＰＤＧＦを分泌させて調製物を提供するプロモーター配列に作動可能に結合したＰＤＧＦをコードする核酸配列をその生殖細胞系に導入されたトランスジェニック哺乳動物から乳を得る工程を含む。
【００２４】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部は活性形態であり、例えばトランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部はダイマーの形態である。
【００２５】
好ましい実施形態において、本方法は、トランスジェニック動物の乳から、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦまたは遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦの調製物を回収することをさらに含む。
【００２６】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は：反芻動物；有蹄動物；家畜；および乳用動物；よりなる群から選択され得る。好ましい哺乳動物として、ヤギ、ヒツジ、マウス、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ、およびウサギが挙げられる。
【００２７】
好ましい実施形態において、好ましくはトランスジェニック動物において作成されたような遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、グリコシル化されている。好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦは、そのグリコシル化パターンにおいて、自然に生じる非トランスジェニック起源において認められまたはそれらから単離されたような、あるいは細胞培養において遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００２８】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸はＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは乳中にダイマーとして発現され、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００２９】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸はＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは乳中にダイマーとして発現され、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００３０】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方を含んでいて差し支えない。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方の発現を導く１つの乳腺特異的プロモーター；一方がＰＤＧＦ−Ａをコードする配列の発現を導き、もう一方がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の発現を導くような、２つの乳腺特異的プロモーター；をさらに含んでいて差し支えない。核酸配列が２つの乳腺特異的プロモーターを含む場合、それら乳腺特異的プロモーターは同じ乳腺特異的プロモーターであっても、または異なる乳腺特異的プロモーターであっても差し支えない。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、一方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ａをコードする配列で、他方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列という、２つの別々の核酸配列を含んでいて差し支えない。ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターは、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターと同じであって差し支えなく（例えば両方の核酸配列がβ―カゼインプロモーターを含んでいて差し支えない）、あるいはＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列とは異なる乳腺特異的プロモーターに作動可能に結合していて差し支えない（例えば、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がβ−カゼインプロモーターに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列はβ−カゼインプロモーターとは異なる乳腺特異的プロモーターに結合している）。
【００３２】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む場合、トランスジェニック動物の乳は、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー；ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；それらの混合物；を含む。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーのようなダイマーの形態である。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。さらに別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。
【００３４】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列およびＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列を有するトランスジェニック動物の乳は：１、２、３、４、５より大きな、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのような全ホモダイマーの比を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーがより多く存在するような；あるいは例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーがより多く存在するような、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は：ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；あるいは、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；を有する。
【００３５】
好ましい実施形態において、乳腺特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターであって差し支えない。
【００３６】
好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、その活性において、例えば酵母細胞培養のような細胞培養で遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦにおいて認められまたはそれらから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００３７】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは哺乳動物または霊長類ＰＤＧＦであり、好ましくはヒトＰＤＧＦである。
【００３８】
好ましい実施形態において、その調製物は、少なくとも１、５、１０、１００、または５００ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は、例えばこの中にに記載のＰＤＧＦ調製物のような、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物に関する。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦはトランスジェニック哺乳動物の乳から得られ、トランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部は活性形態であり、例えばトランスジェニック動物の乳中のＰＤＧＦの全てまたは一部は、さらなるダイマー化（二量化）プロセシング無しに、ダイマーの形態である。
【００４１】
好ましい実施形態において、好ましくはトランスジェニック動物において作成されたような遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、グリコシル化されている。好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦは、そのグリコシル化パターンにおいて、自然に生じる非トランスジェニック起源において認められまたはそれらから単離されたような、あるいは細胞培養において遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００４２】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは乳中にダイマーとして発現され、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーまたはＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーまたはＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーのようなダイマーの形態である。別の好ましい実施形態において、トランスジェニック哺乳動物の乳は、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー；ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；それらの混合物；を含む。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーのようなダイマーの形態である。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。さらに別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。
【００４３】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列およびＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列を有するトランスジェニック動物の乳は：１、２、３、４、５より大きな、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーがより多く存在するような；あるいは例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーがより多く存在するような、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は：ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；あるいは、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；を有する。
【００４４】
好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦ調製物は、その活性において、例えば酵母細胞培養のような細胞培養で遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦにおいて認められまたはそれらから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。
【００４５】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは哺乳動物または霊長類ＰＤＧＦであり、好ましくはヒトＰＤＧＦである。
【００４６】
好ましい実施形態において、その調製物は、少なくとも１、５、１０、１００、または５００ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦを含む。
【００４７】
別の態様において、本発明は、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中にタンパク質の分泌をもたらす乳腺特異的プロモーター配列のような組織特異的プロモーターに作動可能に結合したＰＤＧＦをコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関する。
【００４８】
好ましい実施形態において、プロモーターは、例えば乳漿タンパク質プロモーターまたはカゼインプロモーターのような乳腺特異的プロモーターである。乳腺特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸タンパク質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターであって差し支えない。
【００４９】
好ましい実施形態において、核酸配列は、哺乳動物または霊長類ＰＤＧＦ、好ましくはヒトＰＤＧＦをコードする。
【００５０】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦをコードする配列は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする配列；ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列である。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする配列とを含む。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方の発現を導く１つの乳腺特異的プロモーター；一方がＰＤＧＦ−Ａをコードする配列の発現を導き、もう一方がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の発現を導くような、２つの乳腺特異的プロモーター；をさらに含んでいて差し支えない。核酸配列が２つの乳腺特異的プロモーターを含む場合、それら乳腺特異的プロモーターは同じ乳腺特異的プロモーターであっても、または異なる乳腺特異的プロモーターであっても差し支えない。
【００５２】
別の態様において、本発明は、トランスジェニックＰＤＧＦ（好ましくはヒトＰＤＧＦ）を発現し、それからトランスジェニックＰＤＧＦ調製物を得ることができるような、例えばトランスジェニック哺乳動物のようなトランスジェニック動物に関する。
【００５３】
好ましくは、トランスジェニック動物はトランスジェニック哺乳動物である。適切な哺乳動物として、反芻動物；有蹄動物；家畜；および乳用動物が挙げられる。特に好ましい動物として、ヤギ、ヒツジ、マウス、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ、およびウサギが挙げられる。トランスジェニックタンパク質がトランスジェニック動物の乳中に分泌される場合、その動物は、少なくとも１リットル／年、より好ましくは少なくとも１０または１００リットル／年の乳を産生することができる。
【００５４】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、その乳中にＰＤＧＦを分泌する。
【００５５】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、グリコシル化ＰＤＧＦを産生する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、そのグリコシル化パターンにおいて、自然に生じる非トランスジェニック起源において認められまたはそれらから単離されたような、あるいは細胞培養において遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦから単離されたようなＰＤＧＦとは異なるＰＤＧＦを産生する。
【００５６】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする配列を含む核酸配列を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、その乳中にダイマーとしてＰＤＧＦを発現し、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、その動物がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードするＰＤＧＦコード配列を有する場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００５７】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする配列を含む核酸配列を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、その乳中にダイマーとしてＰＤＧＦを発現し、例えばＰＤＧＦは乳中にＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして発現される。好ましい実施形態において、その動物がＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードするＰＤＧＦコーディング配列を有する場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーのようなダイマーの形態である。
【００５８】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方を含んでいて差し支えない。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方の発現を導く１つの乳腺特異的プロモーター；一方がＰＤＧＦ−Ａをコードする配列の発現を導き、もう一方がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の発現を導くような、２つの乳腺特異的プロモーター；をさらに含んでいて差し支えない。核酸配列が２つの乳腺特異的プロモーターを含む場合、それら乳腺特異的プロモーターは同じ乳腺特異的プロモーターであっても、または異なる乳腺特異的プロモーターであっても差し支えない。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、一方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ａをコードする配列で、他方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列という、２つの別々の核酸配列を含んでいて差し支えない。ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターは、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターと同じであって差し支えなく（例えば両方の核酸配列がβ―カゼインプロモーターを含んでいて差し支えない）、あるいはＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列とは異なる乳腺特異的プロモーターに作動可能に結合していて差し支えない（例えば、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がβ−カゼインプロモーターに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列はβ−カゼインプロモーターとは異なる乳腺特異的プロモーターに結合している）。
【００６０】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む場合、トランスジェニック動物の乳は、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー；ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；それらの混合物；を含む。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーのようなダイマーの形態である。好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の好ましい実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。さらに別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーである。別の実施形態において、乳中のＰＤＧＦダイマーの９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満が、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーである。
【００６１】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列およびＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列を有するトランスジェニック動物の乳は：１、２、３、４、５より大きな、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーがより多く存在するような；あるいは例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーよりも例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーがより多く存在するような、例えばＰＤＧＦ−ＡＢのようなヘテロダイマーに対する例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢのようなホモダイマーの比を有する。別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の乳は：ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー；あるいは、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーおよび／またはＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーよりも多くのＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマー；を有する。
【００６２】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、その乳中に、少なくとも１、５、１０、１００、または５００ｍｇ／ｍｌＰＤＧＦのレベルでＰＤＧＦを発現する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、治療的効果量のトランスジェニックＰＤＧＦまたはトランスジェニックＰＤＧＦ調製物と、薬剤的に許容される担体とを含む薬剤組成物に関する。
【００６４】
トランスジェニックＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ調製物は、例えばこの中に記載の任意の方法または動物によって作成できる。
【００６５】
トランスジェニックＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ調製物は、例えばこの中に記載の任意のものであって差し支えない。
【００６６】
別の態様において、本発明は、例えばこの中に記載の任意のＰＤＧＦのような遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦを、ＰＤＧＦを必要とする被験者に供給する方法に関する。本方法は、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦまたはトランスジェニックＰＤＧＦ調製物を被験者に投与することを含む。
【００６７】
好ましい実施形態において、被験者は、例えばＰＤＧＦを必要とする患者のようなヒトである。
【００６８】
例えば、本発明は、被験者における創傷治癒を促進または高める方法に関する。創傷は、軟組織または例えば骨のような硬組織におけるものであって差し支えない。好ましい実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦは、１つ以上のＰＤＧＦの生物活性によって創傷治癒を促進または高める。ＰＤＧＦの生物活性として以下のものが挙げられる：１）例えば細胞外マトリックス合成の誘導のような調節；２）例えばヒアルロン酸およびフィブロネクチン産生の上昇のような調節；３）例えばコラゲナーゼ産生の上昇のような調節；４）結合組織および／または間充織細胞へのマイトジェン効果；５）例えば好中球および／または単球のような血液細胞の遊走を高めまたは低下させるような調節；６）例えば繊維芽細胞の遊走を高めまたは低下させるような調節；７）例えば凝固カスケードを開始させる組織因子の発現を誘導する、凝固カスケードの誘導のような調節；８）例えばアクチンの再組織化を高めるような調節；９）例えば骨芽細胞の増殖を調節する（例えば高める）ような、骨細胞へのマイトジェン効果。
【００６９】
治療若しくは予防効果、または安定性（たとえばｅｘ ｖｉｖｏ保存性若しくはｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強させる等の目的のために、あるいは動物の健康状態を最適にするために、トランスジェニックＰＤＧＦの構造を改変させて差し支えない。そのような改変ＰＤＧＦは、天然のＰＤＧＦの少なくとも１つの活性を維持するように設計されている場合、この中でより詳細に説明されているＰＤＧＦの機能的等価物と考えられる。そのような改変ペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失、または付加によって作成できる。
【００７０】
この中で用いられる調製物とは、２つ以上の分子のＰＤＧＦを称する。調製物は、１匹以上のトランスジェニック動物によって産生されて差し支えない。調製物は、異なるグリコシル化分子を含んでいて差し支えなく、あるいはその点において同質であっても差し支えない。
【００７１】
この中で用いられている、精製調製物、ポリペプチドの実質的に純水な調製物、または単離ポリペプチドは、遺伝子導入によって作成されたポリペプチドの場合、トランスジェニック動物または例えば乳のような体液中にポリペプチドと共に生じる少なくとも１つの他のタンパク質、脂質、または核酸、あるいはトランスジェニック動物によって産生される他の物質から、分離されているポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドを精製するのに用いられる、抗体または例えばポリアクリルアミドの等のゲルマトリックスのような物質から分離される。ポリペプチドは、好ましくは、精製調製物の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０、または９５乾燥重量％を構成する。好ましくは、調製物は：タンパク質の配列決定を可能とするのに十分なポリペプチド；少なくとも１、１０、１００μｇのポリペプチド；少なくとも１、１０、または１００ｍｇのポリペプチドを含む。
【００７２】
この中で用いられているように、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）は、それが導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して部分的にまたは完全に異種すなわち外来性であるが、それが挿入される細胞のゲノムを改変させる（例えば、天然遺伝子とは異なる位置に挿入され、あるいはその挿入がノックアウトをもたらす）ように動物ゲノム中に挿入されることが設計されまたは挿入された、核酸配列（例えば１つ以上のＰＤＧＦポリペプチドをコードする）を意味する。導入遺伝子は、１つ以上の転写調節配列、および例えばイントロンのような、例えば乳腺におけるＰＤＧＦをコードする特定の核酸の最適な発現および分泌に必要と思われる、特定のＰＤＧＦ核酸に作動可能に結合した任意の他の核酸を含んでいて差し支えなく、さらには、エンハンサー配列を含んでいて差し支えない。
【００７３】
この中で用いられているように、「トランスジェニック細胞」は、外来遺伝子を包含する細胞を称する。
【００７４】
この中で用いられているように、「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞の１つ以上および好ましくは実質的に全てが、例えば当業界で公知のトランスジェニック技術のようなヒトの介入によって導入された異種核酸を包含する非ヒト動物である。例えばマイクロインジェクションまたは組換えウィルスの感染のような計画的な遺伝子操作によって、直接的にまたは細胞の前駆体への導入によって間接的に、細胞に導入遺伝子を導入させることができる。
【００７５】
哺乳動物は、この中で、乳腺を有しかつ乳を産生するヒト以外の全ての動物として定義される。
【００７６】
「薬剤的に許容される組成物」の用語は、１つ以上の薬剤的に許容される担体と共に配合された治療効果量のトランスジェニックＰＤＧＦを含む組成物を称する。
【００７７】
この中で用いられているように、「被験者」の用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を含むことが意図されている。
【００７８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。
【００７９】
図面の簡単な説明
図１は、発現ベクターｐＢＣ７３４のＰＤＧＦ−ＡＢ挿入物の核酸配列を示す。その配列は、ヒトＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列、ＩＲＥＳ、およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含む。その２ｋｂの挿入物を乳腺発現ベクターｐＢ４５０（核酸配列が提供されている）に連結させて、発現カセットｐＢＣ７３４を作成した。発現ベクターｐＢＣ７０１のＰＤＧＦ−Ｂ挿入物の核酸配列も提供する。その挿入物を乳腺発現ベクターｐＢ４５０（核酸配列が提供されている）に連結させて、発現カセットｐＢＣ７０１を作成した。
【００８０】
発明の詳細な説明
トランスジェニック哺乳動物
非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作る方法は当業界で公知である。そのような方法は、哺乳動物の生殖細胞系にＤＮＡ構築物を導入して、トランスジェニック哺乳動物を作ることを含んでいて差し支えない。例えば、標準的トランスジェニック技術によって、その構築物の１または複数のコピーを哺乳動物の胚のゲノム中に導入する。さらには、ドナー細胞として体細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作ることもできる。体細胞のゲノムを卵母細胞に挿入し、その卵母細胞を融合および活性化させて再構築胚を形成する。例えば、体細胞を用いてトランスジェニック動物を作る方法は、国際公開第ＷＯ９７／０７６６９号； Ｂａｇｕｉｓｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ｖｏｌ． １７（１９９９）， ４５６−４６１； Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ３８０（１９９６）， ６４−６６； Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．２８０（１９９８）； Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．２８２（１９９８）， ２０９５−２０９８； Ｓｃｈｎｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．２７８（１９９７）， ２１３０−２１３３； Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ３９４（１９９８）， ３６９−３７４； Ｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ｖｏｌ．５７（１９９７）： ３８５−３９３に記載されている。
【００８１】
ヤギは遺伝子組換え細胞の好ましい起源であるが、他の非ヒト哺乳動物を用いても差し支えない。好ましい非ヒト哺乳動物は、例えば雌ウシ、ヒツジ、またはヤギのような反芻動物である。例えば、アルプス、ザーネンおよびトゥゲンブルグ（Ｔｏｇｇｅｎｂｕｒｇ）系統のヤギのようなスイス起源のヤギがこの中で記載の方法において有用である。好ましいヒト以外の動物の別の例示として、雄ウシ、ウマ、ラマおよびブタが挙げられる。遺伝子組換え細胞の供給源として用いられる哺乳動物は、本発明の方法（例えば、ヤギゲノムをヤギの機能的除核卵母細胞に導入するような）によって得られるようなトランスジェニック哺乳動物に依存するであろう。
【００８２】
好ましくは、クローニングに関して、本発明において用いられる体細胞は、トランスジェニックヤギから得られる。トランスジェニックヤギを作る方法は当業界で公知である。例えば、マイクロインジェクションによってヤギの生殖細胞に導入遺伝子を導入して差し支えない（例えば、参照によってこの中に組み込まれるＥｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ６９９を参照）。
【００８３】
導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞系に導入することによって、遺伝子組換え体細胞の供給源として用い得る他の非ヒトトランスジェニック動物を作ることができる。導入遺伝子を導入するために、様々な発生期にある標的の胚細胞を用いることができる。標的の胚細胞の発生期に依存して異なる方法が用いられる。本発明を実施するのに用いられる任意の動物の特定の系統は、全身的な健康状態が良いこと、胚の収率が良いこと、胚における前核の視認性が良いこと、および生殖適応性がよいことに基づいて選択される。さらには、ハプロタイプが重要な因子である。
【００８４】
核酸導入細胞株
遺伝子組換え細胞株を用いてトランスジェニック動物を作ることができる。従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって細胞に核酸構築物を導入することができる。この中で用いられている「トランスフェクション」および「形質転換」の用語は、宿主細胞に導入遺伝子配列を導入するための種々の技術を含み、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーション等が挙げられる。さらには、以下に記載のように、例えばウィルスベクターのような生物ベクターを用いることも可能である。宿主を形質転換しまたはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）、および他の適切な実験マニュアルに記載されている。
【００８５】
２つの有用な方法は、エレクトロポレーションとリポフェクションである。各方法の簡単な例示を以下に記載する。
【００８６】
以下のプロトコルを用いて、エレクトロポレーションによってドナー体細胞株に、ＤＮＡ構築物を安定に導入することができる：例えば線維芽細胞（例えば胚性線維芽細胞）のような体細胞を約４ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁液させる；線状ＤＮＡ（５０μｇ）を細胞懸濁液（０．５ｍｌ）に添加し、その懸濁液を０．４ｃｍの電極間隙キュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に設置する；Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（２５ｍＡ、１０００マイクロファラッドおよび無限抵抗で３３０ボルトパルス）を用いてエレクトロポレーションを実施する；選択のためにＤＮＡ構築物がネオマイシン耐性遺伝子を包含する場合は、３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に１５日間インキュベートした後、ネオマイシン耐性クローンを選択する。
【００８７】
以下のようなプロトコルを用いて、リポフェクションによってドナー体細胞にＤＮＡ構築物を安定に導入することができる：約２ｘ１０５の細胞を３．５シミアメーター（ｃｍｉａｍｅｔｅｒ）に設置し、さらにＬｉｐｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて線状ＤＮＡ（２μｇ）をトランスフェクションする；トランスフェクションの４８時間後、細胞を１：１０００および１：５０００に希釈し、選択のためにＤＮＡ構築物がネオマイシン耐性遺伝子を包含する場合は、Ｇ４１８を最終濃度０．３５ｍｇ／ｍｌとなるように添加する；ネオマイシン耐性クローンを単離し、さらに低温保存ならびに核移植のために増殖させる。
【００８８】
タンパク質の組織特異的発現
例えばＰＤＧＦのような異種タンパク質をトランスジェニック動物の特定組織または体液（例えば乳）中に発現させることが望ましい場合が多い。異種タンパク質が発現されている組織または体液からそれらタンパク質を回収することができる。例えば、乳中に異種タンパク質を発現させるのが望ましい場合が多い。乳腺特異的プロモーターの制御下において異種タンパク質を産生させる方法が以下に記載されている。さらには、他の組織特異的プロモーターならびに他の調節要素（例えばシグナル配列および非分泌タンパク質の分泌を高める配列）を以下に記載する。
【００８９】
乳腺特異的プロモーター
有用な転写プロモーターは、好ましくは哺乳動物の上皮細胞において活性化されるプロモーターであり、カゼイン、βラクトグロブリン（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ４８７−４９２）、乳漿酸タンパク質（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５： １１８３−１１８７）およびラクトアルブミン（Ｓｏｕｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ２９７： １３） のような乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するようなプロモーターが挙げられる。カゼインプロモーターは、任意の哺乳動物のα、β、γまたはκカゼイン遺伝子に由来していて差し支えなく；好ましいプロモーターはヤギβカゼイン遺伝子に由来する（ＤｉＴｕｌｌｉｏ， （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７４−７７）。プロモーターは、ラクトフェリンまたはブチロフィン由来であっても差し支えない。乳腺特異的タンパク質プロモーターまたは乳腺組織において特異的に活性化されるプロモーターは、ｃＤＮＡに由来していてもまたはゲノム配列に由来していても差し支えない。好ましくは、ゲノムに由来する。
【００９０】
１つ以上、およびしばしばいくつかの生物における上記の乳腺特異的遺伝子のＤＮＡ配列情報を利用できる。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６， ５２６−５３２ （１９８１）（ラットα−ラクトアルブミン）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ８６８５−８６９７ （１９８４）（ラットＷＡＰ）；Ｊｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０， ７０４２−７０５０ （１９８５）（ラットβ−カゼイン）；Ｙｕ−Ｌｅｅ ＆ Ｒｏｓｅｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８， １０７９４−１０８０４ （１９８３）（ラットγ−カゼイン）；Ｈａｌｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２４２， ７３５−７４２ （１９８７）（ヒトα−ラクトアルブミン）；Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３８９ （１９８４）（ウシαｓ１およびκカゼインｃＤＮＡｓ）；Ｇｏｒｏｄｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６６， ８７−９６ （１９８８）（ウシβカゼイン）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７８， ３９５−４０１ （１９８８）（ウシκカゼイン）；Ｂｒｉｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １８８， ４８−５５ （１９７７）（ウシαＳ２カゼイン）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６１， ８５−９０ （１９８７）， Ｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３６９， ４２５−４２９ （１９８８）， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７， ６７３９ （１９８９）（ウシβラクトグロブリン）；Ｖｉｌｏｔｔｅ  ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９， ６０９−６２０ （１９８７）（ウシαラクトアルブミン）を参照。種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能が、Ｍｅｒｃｉｅｒ ＆ Ｖｉｌｏｔｔｅ， Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７６， ３０７９−３０９８ （１９９３）（全ての目的のために参照によってその全てが組み込まれる）によって概説されている。追加のフランキング配列が異種タンパク質の発現を最適化するのに有用である場合、既存の配列をプローブとして用いて、そのような配列をクローン化することができる。例えば、核酸配列はエンハンサー配列も含んでいて差し支えない。プローブとして公知の同起源のヌクレオチド配列または同起源のタンパク質に対する抗体を用いてそのような生物からのライブラリーをスクリーニングすることによって、様々な生物由来の乳腺特異的調節配列を得ることができる。
【００９１】
シグナル配列
有用なシグナル配列は乳特異的シグナル配列、あるいは真核生物または原核生物のタンパク質の分泌をもたらすような他のシグナル配列である。好ましくは、シグナル配列は、乳特異的シグナル配列から選択され、すなわち、乳中に分泌される産物をコードする遺伝子に由来する。最も好ましくは、乳特異的シグナル配列は、そのＤＮＡ構築物において用いられている乳腺特異的プロモーター（以下に記載されている）に関連する。シグナル配列のサイズは重要でない。要求されることは、その配列が、例えば乳腺組織に所望の組換えタンパク質の分泌をもたらすのに充分なサイズであることでのみである。例えば、例えばα、β、γまたはκカゼインのようなカゼイン、βラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質およびラクトアルブミンをコードする遺伝子からのシグナル配列を用いて差し支えない。好ましいシグナル配列は、ヤギのβ―カゼインシグナル配列である。
【００９２】
例えば腎細胞、膵細胞または肝細胞によって分泌されるタンパク質のような他の分泌タンパク質からのシグナル配列を用いても差し支えない。好ましくは、シグナル配列は、例えば尿または血液中にタンパク質の分泌をもたらす。シグナル配列が由来し得る他の遺伝子の例として、血清アルブミン（ヒト、ウシ、マウス、ヤギ、ヒツジ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ヒト、ウシ、マウス、ヤギ、ヒツジ）、α−１抗トリプシン（ヒト、ウシ、マウス、ヤギ、ヒツジ）、成長ホルモン（ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット）、およびイムノグロブリンが挙げられる。任意のそれらまたは他のシグナル配列を本発明の核酸中に挿入して差し支えない。
【００９３】
分泌タンパク質のアミノ末端領域
非分泌タンパク質が分泌されるようなやり方で（例えば、分泌されるべきタンパク質中に、通常分泌されるタンパク質のコード配列の全てまたは一部を挿入することによって）、非分泌タンパク質を改変させることができる。好ましくは、通常分泌されるタンパク質の全配列がそのタンパク質の配列中に含まれるのではなく、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端のタンパク質の分泌をもたらすのに充分な部分のみが含まれる。例えば、通常分泌されるタンパク質のアミノ末端部分に、通常分泌されないタンパク質を融合させる（通常そのアミノ末端において）。
【００９４】
１つの態様において、通常分泌されるタンパク質は、通常乳中に分泌されるタンパク質である。そのようなタンパク質として、乳腺上皮細胞によって分泌されるタンパク質である、例えばカゼイン、ラクトグロブリン、乳漿酸タンパク質、ラクトフェリン、ブチロフィリン、およびラクトアルブミンのような乳タンパク質が挙げられる。カゼインタンパク質は、任意の哺乳動物のα、β、γまたはκカゼイン遺伝子を含む。好ましいタンパク質は例えばヤギβカゼインのようなβカゼインである。分泌タンパク質をコードする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノム配列の何れに由来しても差し支えない。好ましくは、その配列はゲノムに由来し、１つ以上のイントロンを包含する。
【００９５】
他の組織特異的プロモーター
特定組織における発現をもたらす他の組織特異的プロモーターを用いても差し支えない。組織特異的プロモーターは、他の組織におけるよりも特定組織においてより強く発現されるプロモーターである。組織特異的プロモーターは実質的に特定組織においてのみ発現されることが多い。
【００９６】
用い得る組織特異的プロモーターとして：神経特異的プロモーター（例えばネスティン、Ｗｎｔ−１、Ｐａｘ−１、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２、Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）；肝特異的プロモーター（例えばアルブミン、α−１抗トリプシン）；筋肉特異的プロモーター（例えばミオゲニン、アクチン、ＭｙｏＤ、ミオシン）；卵母細胞特異的プロモーター（例えばＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３）；精巣特異的プロモーター（例えばプロタミン、ファーチリン、対合複合体タンパク質−１）；血液特異的プロモーター（例えばグロブリン、ＧＡＴＡ−１、ポルホビリノゲンデアミナーゼ）；肺特異的プロモーター（例えば界面活性プロテインＣ）；皮膚または毛特異的プロモーター（例えばケラチン、エラスチン）；内皮特異的プロモーター（例えばＴｉｅ−１、Ｔｉｅ−２）；および骨特異的プロモーター（例えばＢＭＰ）が挙げられる。
【００９７】
さらには、いくつかの組織における発現のために一般的プロモーターを用いても差し支えない。一般的プロモーターとして、β−アクチン、ＲＯＳＡ−２１、ＰＧＫ、ＦＯＳ、ｃ−ｍｙｃ、Ｊｕｎ−Ａ、およびＪｕｎ−Ｂが挙げられる。
【００９８】
他の調節配列
核酸は、３’調節配列としてこの中で称されているＰＤＧＦコード配列の３’ＤＮＡ配列を含んでいて差し支えない。３’調節配列は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および／または３’フランキング配列を含んでいて差し支えない。３’ＵＴＲおよび３’フランキング配列は、同じ遺伝子または異なる遺伝子に由来するものであっても、あるいは同じ種または異なる種に由来するものであって差し支えない。好ましい実施形態において、３’調節配列は哺乳動物の乳遺伝子に由来する。
【００９９】
インシュレーター配列
トランスジェニック動物を作るのに用いられるＤＮＡ構築物は、１つ以上のインシュレーター配列を包含していて差し支えない。「インシュレーター」、「インシュレーター配列」および「インシュレーター要素」の用語は、この中で互換的に用いられている。インシュレーター要素は、その作用範囲内に位置する遺伝子の転写を分離するが、正にも負にも遺伝子発現を変動させない制御要素である。好ましくは、転写されるＤＮＡ配列のどちらかの末端にインシュレーター配列を挿入する。例えば、インシュレーターは、プロモーターから５’側約２００ｂｐ−約１ｋｂ、または、関心遺伝子の３’末端でかつプロモーターから少なくとも約１ｋｂ−５ｋｂの位置に存在していて差し支えない。当業者は、その構築物中において用いられる関心遺伝子、プロモーターおよびエンハンサーの相対的サイズに基づき、プロモーターおよび関心遺伝子３’末端からのインシュレーターの距離を特定することができる。さらに、１つ以上のインシュレーター配列が、プロモーターの５’側または導入遺伝子の３’末端に位置していて差し支えない。例えば、２つ以上のインシュレーター配列が、プロモーターの５’側に位置していて差し支えない。導入遺伝子の３’末端にあるインシュレーターは、関心遺伝子の３’末端、あるいは、例えば３’非転写領域（ＵＴＲ）または３’フランキング配列等の３’調節配列の３’末端に位置していて差し支えない。
【０１００】
好ましいインシュレーターは、ニワトリβ−グロビン遺伝子座の５’末端を包含し、かつニワトリ５’構成性過敏性部位（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）（国際公開第ＷＯ９４／２３０４６号に記載されており、その内容は参照によってこの中に組み込まれる）に対応するＤＮＡ断片である。
【０１０１】
ＤＮＡ構築物
例えば乳腺上皮細胞のような特定組織のためのプロモーター（例えばヤギβカゼインプロモーターのようなカゼインプロモーター）、乳特異的シグナル配列（例えばβカゼインシグナル配列のようなカゼインシグナル配列）、および異種タンパク質をコードするＤＮＡを包含する構築物として、異種タンパク質をコードするカセットを組み立てることができる。
【０１０２】
また、その構築物は非分泌タンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流にある３’非翻訳領域を含んでいて差し支えない。そのような領域は、発現系のＲＮＡ転写を安定化させ、従ってその発現系からの所望のタンパク質の収率を高めることができる。本発明で用いるための構築物において有用な３’非翻訳領域は、ポリＡシグナルをもたらす配列である。そのような配列は、例えばＳＶ４０スモールｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域または当業界で周知の他の非翻訳領域に由来していて差し支えない。１つの態様において、３’非翻訳領域は乳特異的タンパク質に由来する。３’非翻訳領域の長さは重要ではないが、そのポリＡ転写の安定化効果は発現配列のＲＮＡを安定化させるのに重要であろう。
【０１０３】
必要に応じて、構築物は、プロモーターとシグナル配列をコードするＤＮＡ配列との間に５’非翻訳領域を包含する。そのような非翻訳領域は、プロモーターと同じ調節領域に由来して差し支えなく、あるいは例えば他の合成の、半合成のまたは天然の供給源に由来する等、異なる遺伝子に由来していて差し支えない。この場合も、その特定の長さは重要でないが、それら非翻訳領域は発現のレベルを改善するのに重要であろう。
【０１０４】
また、構築物は、好ましくは乳腺上皮細胞において発現される遺伝子のＮ末端コード領域の約１０％、２０％、３０％またはそれ以上を包含する。例えば、Ｎ末端コード領域は、用いられるプロモーターに対応させることができ、例えばヤギβカゼインＮ末端コード領域である。
【０１０５】
当業界で公知の方法を用いて構築物を調製できる。大きなプラスミドの一部として構築物を調製できる。そのような調製物は、効率的な方法での正確な構築物のクローニングおよび選択を可能とする。所望の哺乳動物に組み込むために残りのプラスミド配列から容易に単離できるように、プラスミド上の都合のよい制限酵素部位の間に構築物を配置させることができる。
【０１０６】
例えば乳腺特異的プロモーターを含むプラスミドのような乳腺発現プラスミド中に、ＰＤＧＦをコードする核酸配列を導入して差し支えない。乳腺発現プラスミドの例は、以下の実施例に記載のＢＣ７０１およびＢＣ７３４である。ＢＣ７０１およびＢＣ７３４乳腺発現カセットの構成を図１に示す。両方のカセットにおいて、導入遺伝子は（両側の）ＮｏｔＩ制限酵素部位によって挟まれている。
【０１０７】
ＰＤＧＦをコードする配列を含む発現プラスミドは、１つ以上の複製起点および／または選択マーカーも含んでいて差し支えない。
【０１０８】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ならびにその断片およびアナログ
この中で用いられている「ＰＤＧＦ」は、少なくとも１つのＰＤＧＦの生物活性を有する増殖因子タンパク質、あるいはその断片またはアナログを称する。以下の活性の１つ以上を有する場合に、そのポリペプチドはＰＤＧＦ生物活性を有する：１）例えば細胞外マトリックス合成の誘導のような調節；２）例えばヒアルロン酸およびフィブロネクチン産生の上昇のような調節；３）例えばコラゲナーゼ産生の上昇のような調節；４）結合組織および／または間充織細胞へのマイトジェン効果；５）例えば好中球および／または単球のような血液細胞の遊走を高めまたは低下させるような調節；６）例えば繊維芽細胞の遊走を高めまたは低下させるような調節；７）例えば凝固カスケードを開始させる組織因子の発現を誘導する、凝固カスケードの誘導のような調節；８）例えばアクチンの再組織化を高めるような調節；９）例えばＰＤＧＦ αおよび／またはβ受容体のようなＰＤＧＦ受容体に対する結合のような作用；１０）例えば骨芽細胞の増殖を調節（例えば高める）するような、骨細胞へのマイトジェン効果。ＰＤＧＦが上記のような生物活性の何れかを有するか否かを分析するために、例えば細胞増殖またはチミジン取込みバイオアッセイ（Ｓｈｉｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． ４４， ７１０−７１６）のような様々な測定法を利用できる。例えば、当業界で公知の多くの方法によって、ＰＤＧＦのその受容体への結合を明らかにすることができる。そのような方法は、ＰＤＧＦの断片またはアナログのその受容体への結合力を特定するために、ヨウ化（１<>２５Ｉ）ＰＤＧＦを用いる競合アッセイ（Ｈｕｎｔｅｒ， Ｗ．Ｍ． ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ， Ｆ．Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． １９４（１９６２）， ４９５−４９６）を含んでいて差し支えない。
【０１０９】
ＡおよびＢと称される２つのペプチド鎖の各々のホモダイマーまたはヘテロダイマーの組合せである、ＰＤＧＦの３つの公知のアイソフォームＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢがある（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｉｎｇｏｌｄ ａｎｄ Ｅｉｃｈｎｅｒ， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ｖｏｌ． １９（１９９５）， ３８９−３９８）。Ａ鎖および／またはＢ鎖をコードする核酸は、ＰＤＧＦ鎖をコードするｃＤＮＡであってもあるいはゲノム配列であっても差し支えない。他の実施形態において、ＰＤＧＦ Ａ鎖および／またはＢ鎖をコードするゲノムＤＮＡは、ゲノムＰＤＧＦ遺伝子中に自然に存在するイントロンの全てでは無いが、少なくとも１つを含んでいて差し支えない。
【０１１０】
この中で用いられているＰＤＧＦ−Ａ鎖は、完全長のＰＤＧＦＡ鎖、または例えば自然に生じる変異体のようなその変異体を称する。例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ産生細胞中において、様々な転写物が検出されている。それら転写物は、１１０アミノ酸（ＡＳ）のショート（Ｓ）プロセシングタンパク質および１２５アミノ酸の（ＡＬ）ロング（Ｌ）プロセシングタンパク質をもたらす、ＰＤＧＦ−Ａの単一の７エキソン遺伝子の選択的なスプライス変異体である。より短い転写物はエキソン６を欠き、６９塩基対を含む。ＰＤＧＦ−ＡＳ鎖の特徴は、例えばＭａｔｏｓｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ９（１９８９）， ３１４８−３１５０に記載されている。エキソン６によってコードされている配列は、明らかに、産生細胞からのＰＤＧＦの分泌を調節する。エキソン６含有変異体は産生細胞中に保持されるのに対して、エキソン７をコードする配列を含むショートスプライス変異体（ＡＳ）は効率的に分泌される（Ｆｅｙｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ｖｏｌ． ２７２（１９９７）， ５５１８−５５２４）。この中で用いられているＰＧＤＦ−Ａは、ＰＤＧＦ−ＡＳまたはＰＤＧＦ−ＡＬを称する。ＰＤＧＦ−ＡＳおよびＰＤＧＦ−ＡＬをコードする核酸配列は公知であり、例えばＲｏｒｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．８（２）（１９８８）， ５７１−５７７に記載されている。
【０１１１】
この中で用いられているＰＤＧＦ−Ｂ鎖は、例えば、Ｏｅｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １１８（１９９２）， ５０９−５１９に記載されている１０９アミノ酸配列、ならびに、例えばその自然に生じる変異体のような変異体を称する。ＰＤＧＦ−Ｂをコードする核酸配列は公知であり、例えばＲａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ８３（８）（１９９６） ２３９２−２３９６に記載されている。
【０１１２】
この中に記載の核酸配列は、ヒトＰＤＧＦまたは他の哺乳動物（例えば雌ウシ、サル、ブタ、ヤギ、ウサギ等）のＰＤＧＦをコードし得る。ＰＤＧＦをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡであってもゲノムＤＮＡ配列であっても差し支えない。通常、ゲノムＤＮＡ配列の方がトランスジェニック動物において良好に発現される（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．３（１９９４）， ３６５； Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ｖｏｌ．１（１９９１）， ３）。驚くべきことに、本発明は、ｃＤＮＡ配列を用いてＰＤＧＦの高い発現を達成した。
【０１１３】
ＰＤＧＦをコードする配列は、ＰＤＧＦのＡおよび／またはＢアイソフォームをコードしていて差し支えない。核酸中に挿入されるＰＤＧＦアイソフォームの配列に依存して、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ、または３つ全てのアイソフォーム（−ＡＡ、−ＢＢ、および−ＡＢ）の混合物を得ることができる。例えば、核酸配列がＰＤＧＦ−Ａをコードする（例えば核酸配列がＰＤＧＦ−Ａ鎖の発現に関してモノシストロン性である）場合、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとして乳中に発現され得る。好ましくは、ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、ＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーの形態である。あるいは、例えば、核酸配列がＰＤＧＦ−Ｂをコードする（例えば核酸配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖の発現に関してモノシストロン性である）場合、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーとして乳中に発現され得る。ＰＤＧＦをコードする核酸配列がＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする場合、乳中のＰＤＧＦの少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは全てが、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーの形態である。
【０１１４】
トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖をコードする核酸配列およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸配列を含んでいても差し支えない。そのような動物を用いて、ＰＤＧＦホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を作成することができる。核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列とＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方を含んでいて差し支えなく、例えば、核酸配列は、ＰＤＧＦの発現に関して、例えばジシストロン性（ｄｉｃｉｔｔｒｏｎｉｃ）のようなポリシストロン性であって差し支えない。ＰＤＧＦのポリシストロン性発現構築物は、例えば国際公開第ＷＯ９４／２９４６２号およびＷＯ９４／０５７８６号に記載されており、その内容の全てが参照によってこの中に組み込まれる。そのような発現構築体を用いて、それらポリペプチドの発現が哺乳動物の乳腺に方向付けられるようにＰＤＧＦ−Ａ鎖およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖をコードする核酸を包含する、トランスジェニック動物を作ることができる。従って、核酸配列は、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列およびＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の両方の発現を導く１つの乳腺特異的プロモーター（例えば核酸配列は１つの乳腺特異的プロモーターおよびＩＲＥＳを含んでいて差し支えない）、あるいは、一方がＰＤＧＦ−Ａをコードする配列の発現を導き、もう一方がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列の発現を導くような、２つの乳腺特異的プロモーターをさらに含んでいて差し支えない。核酸配列が２つの乳腺特異的プロモーターを含む場合、それら乳腺特異的プロモーターは同じ乳腺特異的プロモーターであっても、または異なる乳腺特異的プロモーターであっても差し支えない。
【０１１５】
あるいは、トランスジェニック動物は、一方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ａをコードする配列を含み、他方は乳腺特異的プロモーターの制御下にあるＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列を含む、２つの別々の核酸配列を包含していて差し支えなく、例えば、トランスジェニック動物は、ＰＤＧＦ−Ａ鎖の発現に関してモノシストロン性である核酸配列と、ＰＤＧＦ−Ｂの発現に関してモノシストロン性である核酸配列とを共発現することができる。ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターは、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列に結合した乳腺特異的プロモーターと同じであって差し支えなく（例えば両方の核酸配列がβ―カゼインプロモーターを含んでいて差し支えない）、あるいはＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列とは異なる乳腺特異的プロモーターに作動可能に結合していて差し支えない（例えば、ＰＤＧＦ−Ａをコードする配列がβ−カゼインプロモーターに結合し、ＰＤＧＦ−Ｂをコードする配列はβ−カゼインプロモーターとは異なる乳腺特異的プロモーターに結合している）。
【０１１６】
ＰＤＧＦの意図された用途に依存して、例えばＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、またはそれらの混合物の何れかのような、特定のＰＤＧＦアイソフォームを作成することが望ましい場合もある。ＰＤＧＦアイソフォームの各々は、他のアイソフォームと比較して、特定の細胞型への高められた効果および／または増強されたまたは異なるＰＤＧＦ活性を有するであろう。例えば、異なるアイソフォームに対する細胞の反応性は、公知のＰＤＧＦ受容体の発現によって調節される。ＰＤＧＦのアイソフォームであるＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−ＡＢは、様々な細胞型において差別的に発現される（Ｐｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｍｕｓｔｏｅ， １９９５）。ＰＤＧＦの効果は、２つの別個の受容体を介して仲介される。それら受容体は、この中でα ＰＤＧＦ受容体およびβ ＰＤＧＦ受容体として称されている。それら受容体のさらなる議論のために、例えば、Ｇｒｏｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ｖｏｌ． ８５（１９８８）， ３４３５−３４３９； Ｂｏｎｎｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｖｏｌ． ７３７（１９９４）， ３２４−３３８を参照。α受容体は、高い親和性でＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーには低い活性で結合し、さらにＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーには結合しない（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２４０（１９８８）， １５２９−１５３１）。
【０１１７】
両方のＰＤＧＦ受容体は、かなり類似の構造特性を有する高い相同性を有するチロシンキナーゼである。ダイマー化（二量化）はＰＤＧＦ受容体の活性化において重要であり、複合体における２つの受容体間の転化におけるリン酸化を可能とする。ＰＤＧＦ受容体へのＰＤＧＦアイソフォームの結合は研究されており、いくつかのアミノ酸残基がその相互作用に関与していることが特定されている。例えば、受容体結合部位に相補的な残基である、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖のアルギニン２７およびイソロイシン３０は、受容体結合およびＰＤＧＦ−Ｂの活性化に重要であるように思われる（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， ｖｏｌ．１０（１９９１）， ４１１３）。さらには、受容体における自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）部位が、情報伝達分子の結合部位を提供することが分かっている。
【０１１８】
同じ量のα−およびβ−受容体を有する細胞において、ＰＤＧＦ−ＡＢは、ホモダイマーアイソフォームよりも強いマイトジェン効果および走化性効果を有することが分かっている（Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ｖｏｌ． １３７８（１９９８）， Ｆ７９−１１３）。しかしながら、ほとんどの細胞は、α−受容体よりも多くのβ−受容体を有する（Ｓｔｅｅｄ， Ｄ．Ｌ．， Ｃｌｉｎ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ， ｖｏｌ．２５（１９９８）， ３９７−４０５）。β−受容体のホモダイマー化は、ＰＤＧＦ−ＢＢアイソフォームによってのみ誘導され得るため、いくつかの実施形態において、ＰＤＧＦ−ＢＢアイソフォームのみを産生させることが好ましいであろう。β−受容体とは対照的に、α−受容体はＰＤＧＦのＡ−鎖およびＢ−鎖に結合できる。しかしながら、α受容体において、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＢＢへの結合領域は、構造的に同時には生じない（Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０１１９】
両方の受容体はいくつかの機能的特性を共有する。例えば、両方ともマイトジェン反応またはアクチン再組織化を誘導する。他の観点において、２つの受容体は機能的特性を共有しない。例えば、ＰＤＧＦ β−受容体は走化性の促進を仲介し得るが、α−受容体はある細胞型の遊走を阻害する（例えばＨｅｌｄｉｎ， Ｃ．Ｈ．， １９９７を参照）。従って、作成されるべきトランスジェニックＰＤＧＦアイソフォームは、ＰＤＧＦ調製物の所望の用途に基づいて特定できる。
【０１２０】
１つのアイソフォームが他のアイソフォームよりも好ましいような状況が以下に議論されている。ＰＤＧＦ−ＢＢはヒト繊維芽細胞においてβ−受容体を介する走化性反応を仲介することが分かっているが、ＰＤＧＦ−ＢＢによるα−受容体の活性化は遊走性を阻害することが分かっている（Ｖａｓｓｂｏｔｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ｖｏｌ． ２６７（１９９２）， １５６３５−１５６４１）。ＰＤＧＦ−ＡＡアイソフォームは、創傷修復反応の急性段階の間、創傷部位に存在する主な形態である（Ｓｏｍａ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ， ｖｏｌ．６（１９９２）， ２９９６−３００１）。外因性組換えＰＤＧＦ−ＢＢによる慢性創傷の治療は、２週間までに毛細血管内にＰＤＧＦ−ＡＡの出現をもたらし、治癒表現型に関連した（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ｖｏｌ．９６（１９９５）， １３３６−１３５０）。ＰＤＧＦ−ＡＡスプライス変異体は、独自の生物活性を有し、修復工程の間における出現時間において異なっている（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。初期の創傷治癒において、ＰＤＧＦ−ＡＡＬは最大量で存在するが、治癒している創傷の成熟肉芽組織ではＰＤＧＦ−ＡＡＳが優勢であることが分かっている。ＰＤＧＦアイソフォームは創傷治癒において多くの効果を共有するが、それでもなお、ラット創傷治癒に対するＰＤＧＦ−ＢＢのより高い効能が対応する用量のＰＤＧＦ−ＡＡの使用に照らして示された。さらには、ヘテロダイマー形態のＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）は、ラットの実験的創傷において、用量依存的に肉芽組織形成を促進させる（Ｌｅｐｉｓｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ２６（１９９４）， ２６７−２７２）。従って、意図されたＰＤＧＦの用途に基づいて、ＰＤＧＦの特定アイソフォームまたはそれらの混合物を産生させることができる。
【０１２１】
この中に記載のトランスジェニック動物によって産生されるＰＤＧＦは、少なくとも１つのＰＤＧＦの生物活性を保持しているＰＤＧＦの断片またはアナログであって差し支えない。ＰＤＧＦ断片およびアナログは、天然ＰＤＧＦ配列に関連する核酸配列の組換え発現によって得ることができる。例えば、公知のＰＤＧＦ核酸配列を改変させることによって、ＰＤＧＦの断片またはアナログをコードする核酸配列を調製することができる。そのような改変として、任意の数のヌクレオチドの付加、置換および／または欠失が挙げられる。他のＰＤＧＦのアナログとして、以下の１つ以上において、組織から単離されるＰＤＧＦとは異なるポリペプチドが挙げられる：グリコシル化、リン酸化、または他の翻訳後修飾。１つの実施形態において、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦは、そのグリコシル化パターンにおいて、自然に生じる非トランスジェニック起源において認められまたはそれらから単離されたような、あるいは細胞培養において遺伝子組換えによって作成されたＰＤＧＦから単離されたようなＰＤＧＦとは異なっている。ＰＤＧＦのグリコシル化パターンは、ＰＤＧＦの活性に重要な役割を果たす。例えば、高グリコシル化ＰＤＧＦは、非グリコシル化ＰＤＧＦと比べて、２から４倍高い活性を有する（国際公開第ＷＯ９１／１６３３５を参照）。ＰＤＧＦをコードする配列の自然に生じる相同物として、サル肉腫ウィルスから単離されたｖ−ｓｉｓ遺伝子が挙げられる。ｖ−ｓｉｓ遺伝子は、ＰＤＧＦのＢ鎖に相同な広範囲の配列を有しかつホモダイマーとしてヒトＰＤＧＦ受容体に結合可能であるタンパク質をコードする（ＥＰ １７７ ９５７）。好ましくは、ＰＤＧＦ−Ａ鎖およびＰＤＧＦ−Ｂ鎖の断片およびアナログは、例えばホモダイマーまたはヘテロダイマーのようなダイマーを形成する能力を保持する。
【０１２２】
当業者は、当業界で公知な方法および以下に記載の方法によって、そのような改変された核酸を調製できる。
【０１２３】
ＰＤＧＦの断片およびアナログの作成
当業者は、断片およびアナログを作成することによって、開示されたＰＤＧＦの構造を変えることができ、さらには、新たに作成された構築物を活性に関して試験することができる。断片およびアナログの作成および試験を可能とする先行の方法の例について以下に議論する。それらまたはそれら以外の方法を用いて、ＰＤＧＦポリペプチドの断片およびアナログを作成およびスクリーニングすることができる。
【０１２４】
ＰＤＧＦ断片の作成
タンパク質分解性消化によって、または化学合成によって、例えば組換え等のいくつかの方法においてタンパク質の断片を作成することができる。ポリペプチドをコードする核酸の一方の末端（末端断片のため）または両方の末端（内部断片のため）から１つ以上のヌクレオチドを除去することによって、ポリペプチドの内部断片または末端断片を作成することができる。突然変異ＤＮＡの発現は、ポリペプチド断片をもたらす。「末端を少しずつ削り取る（ｅｎｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼでの消化によって、一連の断片をコードするＤＮＡを作成することができる。ランダムな剪断、制限酵素消化、または上記の方法の組合せによって、タンパク質の断片をコードするＤＮＡも作成できる。
【０１２５】
また、例えば従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーのような当業界で公知の技術を用いて、断片を化学的に合成することもできる。例えば、本発明のペプチドを、任意に、全く断片の重複の無い所望の長さの断片に分割し、あるいは所望の長さの重複する断片に分割することができる。
【０１２６】
ＰＤＧＦアナログの作成：ランダム法による改変ＤＮＡおよびペプチド配列の作成
タンパク質あるいはタンパク質の特定ドメインまたは領域をコードするＤＮＡのランドム突然変異誘発によって、タンパク質のアミノ酸配列変異体を調製することができる。有用な方法として、ＰＣＲ突然変異誘発および飽和突然変異誘発が挙げられる。また、一連の縮重オリゴヌクレオチド配列の合成によって、ランダムアミノ酸配列変異体のライブラリーを作成することができる（変異体のライブラリー中のタンパク質をスクリーニングする方法はこの中の他の箇所に記載されている）。
【０１２７】
ＰＣＲ突然変異誘発
ＰＣＲ突然変異誘発において、Ｔａｑポリメラーゼの低下した忠実性を利用して、ＤＮＡのクローン化断片にランダム突然変異を導入させる（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １： １１−１５）。この方法は、ランダム突然変異誘発を導入する非常に強力でかつ比較的迅速な方法である。例えばｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ比５を用いかつＰＣＲ反応系にＭｇ２＋を添加する等、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実性を低下させるような条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、突然変異を誘発されるべきＤＮＡ領域を増幅させる。増幅されたＤＮＡ断片のプールを適当なクローニングベクター中に挿入してランダム突然変異体ライブラリーを提供する。
【０１２８】
飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発は、クローン化ＤＮＡ断片に、多くの数の単一塩基置換を迅速に導入することを可能とする（Ｍａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２４２）。この技術は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの一本鎖ＤＮＡの化学処理または照射等による突然変異の誘発、および相補ＤＮＡ鎖の合成を含む。処理の厳しさを変えることによって変異頻度を変えることができ、実質的に全ての可能な塩基置換が得られる。本方法は、突然変異断片の遺伝的選択を含まないため、中立置換、ならびに機能を変化させる置換の両方が得られる。点突然変異の分布は、保存配列要素に偏っていない。
【０１２９】
縮重オリゴヌクレオチド
一連の縮重オリゴヌクレオチド配列から相同物のライブラリーを作ることもできる。自動ＤＮＡ合成機において縮重配列の化学合成を実施し、その後、合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列の合成は当業界で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ｅｄ． ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３； Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８： １０５６； Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７を参照。そのような技術は他のタンパク質の有向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）においても用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ３８６−３９０； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９： ２４２９−２４３３； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ８７： ６３７８−６３８２；米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号、および第５，０９６，８１５号を参照）。
【０１３０】
アナログの作成：有向突然変異誘発（ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）による改変ＤＮＡおよびペプチド配列の作成
非ランダムまたは有向突然変異誘発技術とを用いて、特定配列、または特定領域における突然変異をもたらすことができる。それら技術を用いて、タンパク質の公知アミノ酸配列の残基の例えば欠失、挿入または置換等を含む変異体を作成することができる。（１）最初に保存アミノ酸を置換し、次に、得られた結果に基づいてより根本的な選択で置換する；（２）標的残基を欠失させる；または（３）同じまたは異なるクラスの残基を特定部位に隣接して挿入する；あるいは１−３の組合せによって、個々にまたは連続して変異部位を変えることができる。
【０１３１】
アラニン走査突然変異誘発
アラニン走査突然変異誘発は、突然変異誘発に好ましい位置又はドメインである所望のタンパク質の特定残基または領域の特定のための有用な方法である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９）。アラニン走査において、残基または標的残基群を特定し（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕのような荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。アミノ酸の置換は、細胞内または細胞外における周囲の水性環境とアミノ酸との相互作用をもたらすことができる。置換部位にまたは置換部位に対して、さらにまたは他の変異を導入することによって、置換に対する機能的感受性を示すそれらドメインをさらに細かく検討する。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め特定されるが、変異自体の特性を予め特定する必要はない。例えば、特定部位における変異の遂行を最適化するため、標的コドンまたは領域でアラニン走査突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を実施し、最適な組合せの所望の活性に関して、発現された所望のタンパク質サブユニット変異体をスクリーニングする。
【０１３２】
オリゴヌクレオチド−介在突然変異誘発
オリゴヌクレオチド−介在突然変異誘発は、ＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体を調製するための有用な方法である（例えば、Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ２： １８３， １９８３を参照）。簡単に説明すると、所望のタンパク質の非改変または天然のＤＮＡ配列を含む一本鎖形態のプラスミドまたはバクテリオファージであるＤＮＡ鋳型に、変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、所望のＤＮＡを改変させる。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、そのオリゴヌクレオチドプライマーが組込まれかつ所望のタンパク質ＤＮＡにおける特定の改変をコードするであろう、鋳型の完全な第２相補鎖を合成する。通常、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。最適なオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドの何れかの側に鋳型に完全に相補的である１２から１５のヌクレオチドを有するであろう。それによって、確実に、オリゴヌクレオチドが適切に一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズする。例えばＣｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７５： ５７６５（１９７８）に記載のような当業界で公知の技術を用いて、オリゴヌクレオチドを迅速に合成できる。
【０１３３】
カセット突然変異誘発
変異体を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５（１９８５）に記載の技術に基づく。開始材料は、変異を導入されるべきタンパク質サブユニットＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異を導入されるべきタンパク質サブユニットＤＮＡにおけるコドンが特定される。特定された変異部位の各側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在することが必要である。そのような制限酵素部位が全く存在しない場合には、上述したオリゴヌクレオチド−介在突然変異誘発法を用いて所望のタンパク質サブユニットＤＮＡにおける適当な位置に制限酵素部位を導入して、制限酵素部位を作成することができる。制限酵素部位がプラスミドに導入された後、それら制限酵素部位でプラスミドを切断して線状にする。制限酵素部位の間のＤＮＡ配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが標準的方法で合成される。２本の鎖を別々に合成し、その後標準的技術を用いてそれらをハイブリダイズさせる。そのような二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。カセットは、プラスミドに直接連結できるように、線状プラスミドの末端に対応する３’および５’末端を有する。その結果、プラスミドは、変異が導入されたタンパク質サブユニットＤＮＡ配列を含む。
【０１３４】
コンビナトリアル突然変異誘発
コンビナトリアル突然変異誘発も変異を導入するのに用いることができる。例えば、一群の相同物または他の関連タンパク質のアミノ酸配列を整列させて、好ましくは可能な最も高い相同性を見つけ出す。コンビナトリアル配列の縮重セットを作成するために、整列配列の所定の位置に現れるアミノ酸の全てを選択することができる。変異体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって作成され、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされている。例えば、可能性のある配列の縮重セットが個々のペプチドとして、あるいは一連の縮重配列を含む一連の大きな融合タンパク質として発現されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に遺伝子配列に連結させる。
【０１３５】
卵母細胞
動物の生殖サイクルの間の様々な時期に、トランスジェニック動物を作るのに用いられる卵母細胞を得ることができる。細胞周期の様々な期の卵母細胞を得て、さらに減数分裂の特定期に入るようにｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することができる。例えば、低血清培地中で培養した卵母細胞は、中期において停止するようになる。さらには、血清活性化によって、停止卵母細胞が終期に入るように誘導できる。
【０１３６】
再構築胚を形成するために用いる前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで卵母細胞を成熟化させることができる。その工程は、通常、哺乳動物の卵母細胞（例えばヤギの卵母細胞）から得た未成熟卵母細胞を採取し、さらにその卵母細胞が所望の減数分裂期（例えば中期または終期）に達するまで、除核前に培地中において卵母細胞を成熟化させることを必要とする。さらには、再構築胚を形成するために、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟化された卵母細胞を用いても差し支えない。
【０１３７】
過剰排卵の間に雌の哺乳動物から卵母細胞を採取する。簡単に説明すると、雌のドナーの卵管から卵母細胞をフラッシングすることによって卵母細胞（例えばヤギ卵母細胞）を外科的に回収することができる。ヤギにおいて過剰排卵を誘発する方法およびヤギ卵母細胞を採取する方法はこの中に記載されている。
【０１３８】
再構築胚の移植
再構築胚をレシピエントの雌動物に移植して、クローンまたはトランスジェニック哺乳動物に発生させることができる。例えば、線毛を介して、各レシピエントの雌動物の卵管に再構築胚を移植することができる。さらには、レシピエント哺乳動物に胚を移植する方法は当業界で公知であり、例えばＥｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ６９９に記載されている。
【０１３９】
乳からのＰＤＧＦの精製
当業界で公知の標準的タンパク質精製法を用いて、ＰＤＧＦを乳から単離することができる。例えば、乳を最初に清澄化させる。標準的な清澄化プロトコルは以下の工程を含むであろう：
（ａ）２．０Ｍのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）で２：１に乳を希釈する；
（ｂ）４−８℃で約２０分、遠心分離機で希釈試料を回転させる；
（ｃ）約５分間氷上で試料を冷却して最上層に脂肪を位置させて凝固させる；
（ｄ）ピペットチップを用いて最上層から脂肪が詰まった部分（ｆａｔ ｐａｄ）を「吸引（ｐｏｐｐｉｎｇ）」することによって除去する；
（ｅ）上清を清潔なチューブに注ぎいれる。
【０１４０】
ＰＤＧＦのさらなる精製は、例えば、当業界で公知のＰＤＧＦの精製のための標準的クロマトグラフィー法を用いて達成できる。有効な精製プロトコルは、例えば、Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３１９（１９８６）， ５１１−５１４に記載されている。簡単に説明すると、続くクロマトグラフィー工程において、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００， Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１５０およびＨＰＬＣ（ＲＰ−８）カラムを用いて、細胞培養上清からＰＤＧＦを単離する。細胞培養上清からの高い収率（５０％を越える）でのＰＤＧＦの精製に関する別の例は、Ｅｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． １８５（１９８９）， ｐ．１３５−１４０に開示されており、その中で、制御されたポアガラス、硫安沈殿、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ １００クロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣを用いて、生まれたばかりのハムスターの腎細胞から分泌されるＰＤＧＦ−ＡＡを単離した。
【０１４１】
あるいは、またはさらに、ＰＢＳで試料をさらに１：７に希釈し（それによって試料の伝導率を下げ、試料をアフィニティーカラムに装填することを可能とする）、さらにシリンジおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＨＶ ０．４５μｍフィルターユニットを用いて試料を濾過することによって、清澄化試料をさらに精製しても差し支えない。高純度ＰＤＧＦを得るために、その後、アフィニティーカラムに試料を装填しても差し支えない。
【０１４２】
使用
ＰＤＧＦを含む薬剤組成物をトランスジェニック非ヒト動物の乳から得ることができる。そのような組成物を用いて、ＰＤＧＦを必要とする被験者を治療することができる。例えば、軟組織または硬組織（例えば骨）における創傷のような創傷の治癒の進行を促進させまたは増強させるために、ＰＤＧＦを用いることができる。特に、糖尿病性の足の潰瘍、褥瘡性潰瘍、および静脈鬱滞性潰瘍のような創傷治癒が損なわれた患者を、トランスジェニック動物から得たＰＤＧＦで治療することができる。さらには、歯周再建（Ｇｉａｎｎｏｂｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ． Ｒｅｓ．， ｖｏｌ．３１（１９９６）， ３０１−３１２）、骨形成の促進（Ｖｉｋｊａｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒａｌ Ｓｃｉ．， ｖｏｌ．１０５（１９７９）、眼の病気、または人工代用血管の回復（Ｏｍｂｒｅｌｌａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｏｌｌ． Ｓｕｒｇ．， ｖｏｌ． １８４（１９９７）， ４９−５７）に、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦを適用することができる。
【０１４３】
さらには、創傷治癒を促進させまたは増強させるための薬剤の調製に、トランスジェニック動物から得られたＰＤＧＦを用いることができる。例えば、創傷被覆材、クリーム、軟膏、またはスプレーでの使用にＰＤＧＦを適用して差し支えない。創傷被覆材は、線維質、シート、顆粒またはフレークの形態を有していて差し支えない。多糖類から調製された創傷処理救援物質（ｗｏｕｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｉｄｓ）に、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦを導入しても差し支えない。例えばＤ−グルカン、セルロース、デキストラン、（１−３）−β−Ｄ−グルカン、キチン、キチノサン、アルギン酸、ヒアルロン酸のような多糖類、ならびに例えば硫酸化多糖類または複合多糖類のようなそれらの誘導体が、様々な細胞における受容体と相互作用しそれによって創傷修復および治癒の進行を促進させる能力に関して公知である（Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ｖｏｌ． ３７（１９９８）， ３１５−３２２）。創傷被覆材としての使用のため、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、または繊維の形態に調製された多糖類中に、遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＦを導入させることができる。ＰＤＧＦは、例えば膜、ビーズ、スポンジ、またはデボー製剤のような生体吸収性物質の一部であっても差し支えない。トランスジェニック動物から得られるＰＤＧＦは、さらに、生物活性物質を含有する生体分解性ミクロスフェア−から成るアルケルメス（Ａｌｋｅｒｍｅｓ）デボー製剤中の生物活性分子として使用することができる。生体分解性ミクロスフェア−は、一般的医用高分子のポリ−（ＤＬ−ラクチド−ゴグリコライド（ｐｏｌｙ−（ＤＬ）−ｌａｃｔｉｄｅ−ｇｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）（ＰＬＧＡ）のマトリックスから作られる。アルケルメスはＰｒｏＬｅａｓｅ（登録商標）として市販されている。
【０１４４】
遺伝子導入によって作成されたＰＤＧＬは、例えば細胞培地のための補足物または診断キットの構成要素としてのような、医療用以外の用途にも使用できる。
【０１４５】
実施例
実施例１．発現ベクター構築
ｐＳＢＣ−ＰＤＧＦ−Ａ／−Ｇ−Ｂから単離された配列を用いて、２つの発現カセットＢＣ７０１（ＰＤＧＦ−Ｂ）およびＢＣ７３４（ＰＤＧＦ−Ａ−ＩＲＥＳＧ−ＰＤＧＦ−Ｂ）を構築した。その発現プラスミドは、米国特許第５，６６５，５６７号に詳細に記載されており、参照によってその内容の全てがこの中に組み込まれる。
【０１４６】
ＢＣ７０１を作成するため、最初に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いてベクターｐＳＢＣ−ＰＤＧＦ−Ａ／−Ｇ−Ｂを部分的に切断し、自己アニーリング付着リンカーＨＩＮＸＨＯ（配列：ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧ）に連結させた。そのリンカーの組込みによって、ＨｉｎｄＩＩＩＩ部位が破壊され、その場所にＸｈｏ Ｉ部位が作られる。制限酵素マッピングを用いて、ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子の３’末端に位置するＨｉｎｄＩＩ部位に組み込まれたＨＩＮＸＨＯの１つのコピーを有するプラスミドｐＡＢ２１を同定した。次に、プラスミドｐＡＢ２１を制限酵素ＥｃｏＲＩで部分的に切断し、自己アニーリング付着リンカーＥＣＯＸＨＯ（配列：ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ）に連結させた。そのリンカーのＥｃｏＲＩ部位への組込みは、Ｘｈｏ Ｉ部位を作る。制限酵素マッピングを用いて、ＰＤＧＦ−Ｂ遺伝子の５’末端にちょうど位置するＥｃｏＲＩ部位に組み込まれたＥＣＯＸＨＯの１つのコピーを有するプラスミドｐＡＢ２３を同定した。制限酵素Ｘｈｏ ＩでのｐＡＢ２３の完全消化は、ＰＤＧＦ−Ｂ１９０遺伝子の全配列を含む約７５０ｂｐ断片を切り出す。ＰＤＧＦ−Ｂ１９０は、欧州特許第６５８ １９８号に詳細に記載されている特異的遺伝子構築物である。それは、完全にプロセシングされた成熟ＰＤＧＦ−ＢＢと同一である翻訳産物（ＰＤＧＦ−ＢＢ）をコードする。その構築物において、ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質の位置１９２に終始コドンを導入した。結果、非完全なプロセシング形態の保持を担うＰＤＧＦ−Ｂのカルボキシ末端部分は発現されない。
【０１４７】
その断片（ＰＤＧＦ−Ｂ１９０：配列番号１に相当）を単離し、乳腺発現ベクターｐＢＣ４５０のＸｈｏ Ｉ部位にクローニング化して、ＰＤＧＦ−Ｂ発現カセットｐＢＣ７０１を作成した（図１Ａを参照）。
【０１４８】
乳腺発現ベクターｐＢＣ４５０は、ニワトリβ−グロブリンインシュレーター配列 （Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ｖｏｌ．７４（１９９３）， ５０５−５１４）、ならびにヤギ−β−カゼインプロモーター（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ｖｏｌ．１２１（１９９２）， ２５５） をコードするヌクレオチド配列を含む。ｐＢＣ４５０のそれら配列を配列番号２に提供する。
【０１４９】
ＰＤＧＦ−Ａ−ＩＲＥＳＧ−ＰＤＧＦ−Ｂ発現カセットを作成するため、まず、中間ベクターｐＡＢ２１を制限酵素ＮｏｔＩで完全に消化した。クレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を満たし、得られた断片を自己連結させた。得られたプラスミドｐＡＢ２において、ＩＲＥＳ／Ｇ配列中に位置する制限酵素部位ＮｏｔＩが破壊されている。次に、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて中間ベクターｐＡＢ２を部分的に切断し、自己アニーリング付着リンカーＥＣＯＮＯＸＨＯ（配列：ＡＡＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣ）に連結させた。そのリンカーのＥｃｏＲＩ部位への組込みは、Ｘｈｏ Ｉ部位を作り、ＥｃｏＲＩ部位を破壊する。制限酵素マッピングを用いて、ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の５’末端にちょうど位置するＥｃｏＲＩ部位に組み込まれたＥＣＯＮＯＸＨＯの１つのコピーを有するプラスミドｐＡＢ３３を同定した。制限酵素Ｘｈｏ ＩでのｐＡＢ３３の完全消化は、ＰＤＧＦ−Ａ遺伝子の完全配列、ならびにＰＤＧＦ−Ｂ１９０遺伝子の全配列を含む約２ｋｂｐ断片を切り出す；両方の遺伝子は、ＩＲＥＳＧによって分離された。その２ｋｂ断片を単離し、乳腺発現ベクターｐＢＣ４５０に連結して、発現カセットｐＢＣ７３４を作成した（図１を参照）。
【０１５０】
両方の導入遺伝子（ｐＢ７０１およびｐＢＣ７３４）の挿入物を完全に配列決定し、マイクロインジェクション前に確認した。ｐＢ７３４挿入物（ＰＤＧＦＢ−ＩＲＥＳＧ−ＰＤＧＦＡ）の完全配列を配列番号３に示す。
【０１５１】
実施例２：注射断片の調製
「ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）」法を用いて、マイクロインジェクション用にＢＣ７０１およびＢＣ７３４ ＰＤＧＦ発現カセットを調製した。その場合、制限酵素ＮｏｔＩで消化に消化することによって、ベクター骨格からプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）を分離した。次に、ランニングバッファーとして１ｘＴＡＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８２）を用い、アガロースゲルで消化物を電気泳動した。発現カセットに対応するＤＮＡ断片を含むゲルの領域を紫外線（長波）の下で可視化した。関心ＤＮＡを含む断片を切り出し、透析バッグに移し、１ｘＴＢＥでの電気溶出によってＤＮＡを単離した。
【０１５２】
電気溶出の後、ＤＮＡ断片を濃縮し、「ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＤＮＡクリーンアップシステム」（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃａｔ＃Ａ７２８０）を用いてそのプロトコルに従って清浄化した。１２５ｍｌのマイクロインジェクションバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５， ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）中にＤＮＡを溶出させた。比較アガロースゲル電気泳動によって断片の濃度を評価した。最終濃度が１．５ｎｇ／ｍｌになるように、前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ）注入の前にＤＮＡストックを希釈した。
【０１５３】
実施例３：マイクロインジェクション：
ＣＤ１雌マウスを過剰排卵させ、その卵管から受精卵を採取した。マイクロインジェクションバッファーで希釈したＤＮＡを雄の前核にマイクロインジェクションした。
【０１５４】
Ｃｈａｔｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ， ｖｏｌ．８６（１９８９）， ６７９−６８８に従って調製されたＣＺＢ培地中においてマイクロインジェクション胚を培養し、あるいは偽妊娠レシピエントＣＦ１雌マウスの卵管に直接移植した。２０から３０までの２細胞あるいは４０から５０までの１細胞の胚を各レシピエント雌動物に移植し、妊娠満期まで継続させた。
【０１５５】
実施例４：初代動物の特定
イソプロパノールを用いた沈降によって尾組織からゲノムＤＮＡを単離し、ニワトリβ−グロビンインシュレーターＤＮＡ配列の存在に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。ＰＣＲ反応のために、Ｔａｑポリメラーゼ（２．５ ｕｎｉｔｓ）含有ＰＣＲバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭデオキシヌクレオチド３リン酸、および６００ｎＭの各プライマー）（５０ｍｌ）でゲノムＤＮＡ（約２５０ｎｇ）を希釈し、以下の温度プログラムを用いて反応を進めた：
１サイクル      ９４℃            ６０秒
５サイクル      ９４℃            ３０秒
５８℃            ４５秒
７４℃            ４５秒
３０サイクル    ９４℃            ３０秒
５５℃            ３０秒
７４℃            ３０秒
以下のプライマーセットを用いた：
ＧＢＣ３３２：ＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１）
ＧＢＣ３８６：ＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＡＣＡＣＡＴＧＴ（配列番号２）
【０１５６】
ＢＣ７０１構築物で形質転換された２５８６の胚を７６匹の偽妊娠レシピエントマウスに移植した。全部で５８５匹の初代マウスが生まれ（移植された胚の２２．５％）、インシュレーター配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって分析した。全部で３８匹のトランスジェニック初代マウスが特定され、その内の２３匹が交配させるのに選択された。
【０１５７】
実施例５：初代動物の繁殖
２３匹のＢＣ７０１初代マウス（動物番号４５、４７、１５７、３６５、４３１、４３４、４４３、４８３、４８４、４９０、５１９、５５６、５７６、５７８、５９０、５９４、６０４、６１５、６２１、６２２、６４７、６４９、６７３）を交配させた。次の世代への導入遺伝子の継代が１８系列で観察された。雌４４３、４９０、５１９、および６１５は次の世代に導入遺伝子を伝えなかった（おそらく導入遺伝子モザイク）。１８のトランスジェニック系列（４５、４７、１５７、３６５、４３１、４３４、４８３、４８４、５５６、５７６、５７８、５９０、５９４、６０４、６２１、６２２、６４９、６７３）からの第１世代子孫を交配させ、何匹かの雌マウスから乳を採取した。表１は各ＢＣ７０１系列の繁殖を概説する：
【表１】
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【０１５８】
実施例６：トランスジェニックマウスからの乳の採取
雌マウスに自然にその子供を分娩させ、通常、分娩後６から１２日の間に２回搾乳した。搾乳手順の前約１時間の間、マウスをその子供から離した。その１時間の待機期間の後、滅菌リン酸緩衝生理食塩水中の５ｉ．Ｕ．のオキシトシンを２５ゲージの針を用いてマウスに腹腔内注射して、乳分泌するように誘導した。オキシトシンの効果を発揮させるため、１から５分間の待機期間の後、ホルモン注射を行った。
【０１５９】
２本の１８ゲージの針が挿入されたゴム栓を有する１５ｍｌの円錐チューブから成り、１本の針の受け口がヒトの搾乳機に接続されたゴム管に挿入されている、吸引採取システムを搾乳に用いた。マウスをケージの一番上に置き、その尾のみによって捕らえ、それ以外は制限または限定しなかった。１５ｍｌの円錐チューブ中に置かれた個々のエッペンドルフチューブ中に乳を採取するために、他方の針の受け口をマウス乳首（１度に１つ）に付けた。各試料採取の後、エッペンドルフチューブを変えた。少なくとも１５０μｌの乳が得られるまで搾乳を続けた。採取の後、マウスをその子供達のところへ戻した。
【０１６０】
乳からＰＤＧＦを単離する方法は、乳の清澄化を含む。清澄化プロトコルは以下の工程を含む：
（ａ）２．０Ｍのアルギニン−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）で２：１に乳を希釈する；
（ｂ）４−８℃で約２０分、遠心分離機で希釈試料を回転させる；
（ｃ）約５分間氷上で試料を冷却して最上層に脂肪を位置させて凝固させる；
（ｄ）ピペットチップを用いて最上層から脂肪が詰まった部分（ｆａｔ ｐａｄ）を「吸引（ｐｏｐｐｉｎｇ）」することによって除去する；
（ｅ）上清を清潔なチューブに注ぎいれる。
【０１６１】
試料をＰＢＳでさらに１：７に希釈し（それによって試料の伝導率を下げ、試料をアフィニティーカラムに装填することを可能とする）、さらにシリンジおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＨＶ ０．４５μｍフィルターユニットを用いて試料を濾過することによって、清澄化試料をさらに精製する。その後、アフィニティーカラムに試料を装填する。
【０１６２】
ＰＤＧＦのさらなる精製は、当業界で公知のＰＤＧＦの精製のための標準的クロマトグラフィー法を用いて達成することができる。
【０１６３】
実施例７：タンパク質分析
トランスジェニック動物の乳から単離されたＰＤＧＦを用いて、ＰＤＧＦウェスタンブロットおよび生物活性分析を実施した。
【０１６４】
より詳細には、第１抗体としてウサギ抗ＰＤＧＦ−Ｂポリクロナール抗体（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍから購入）を用い、第２抗体としてヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ結合体を用いるＥＬＩＳＡ法によってウェスタンブロットを試験した。取扱説明書に基づいて、ＥＣＬ化学発光システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出を行った。
【０１６５】
Ｗｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ｖｏｌ．２（１９９０）， ３１３−３２０またはＫｌａｇｓｂｒｕｎ ＆ Ｃｈｉｎｇ，ＰＮＡＳ， ｖｏｌ．８２（１９８５）， ８０５−８０９に基づいて、ＢＡＬＢｃ／３Ｔ３細胞においてＤＮＡ合成またはチミジン取込みを測定するようなバイオアッセイによって生物活性分析を実施した。
【０１６６】
ＰＤＧＦ−Ｂウェスタンブロットおよび活性測定法によって、ＢＣ７０１トランスジェニック雌から採取した乳試料を分析した。初代雌６４７の乳では約２−４ｍｇ／ｍｌのレベルで、さらに４８４雌の乳では０．５−１ｍｇ／ｍｌのレベルまで、ＰＤＧＦ−Ｂが発現されることが特定された。
【０１６７】
このことは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺におけるＰＤＧＦの発現を導くことができる調節配列に作動可能に結合した生物学的に活性なＰＤＧＦをコードするＤＮＡ配列を含む核酸で形質転換させた動物の乳から、生物学的に活性な組換えＰＤＧＦを高レベルで得ることができることを実証する。
【０１６８】
この中で挙げられている全ての特許および引例は、参照によってその全てが込みこまれている。他の実施形態も以下の請求項に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、発現ベクターｐＢＣ７３４のＰＤＧＦ−ＡＢ挿入物の核酸配列
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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