(57)【要約】筋組織への血管形成因子をコードする遺伝子のデリバリーのための組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用を開示する。本発明は、前述のデリバリー方法、並びに心筋虚血のような虚血状態の治療方法をも説明する。前記方法は、筋中による筋へのｒＡＡＶウイルスの直接的なデリバリー、及びその筋に血液を供給する血管中への注入による筋への間接的なデリバリーを含む。本発明を、それに続いて、定量化できる治療的な血管形成因子遺伝子を導き、続いて、定量化できる治療効果を導く、すなわち、新しい血管の形成を増加させ、結果として虚血筋組織への血流を増加させる、ｒＡＡＶビリオンによりデリバリーされた血管形成因子遺伝子に発現を得るために提供する。
2004506658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋への組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンのデリバリー方法であって、以下の：
ａ）　血管形成因子をコードする遺伝子を含み、かつ、野生型ＡＡＶビリオン及びヘルパーウイルスを含まないｒＡＡＶビリオンを作製し；
ｂ）　上記ｒＡＡＶビリオンを哺乳動物の筋に導入し；そして
ｃ）　上記血管形成因子を発現させる、
を含み、上記血管形成因子の発現が治療効果をもたらす、前記デリバリー方法。
【請求項２】
前記の筋が、骨格筋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の筋が、心筋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の筋が、平滑筋である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血管形成因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、アンギオポイエチン−１、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記血管形成因子が、ＶＥＧＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ１６５である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血管形成因子が、ＦＧＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血管形成因子が、アンギオポイエチン−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療効果が、前記筋への新しい血管の形成である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療効果が、前記筋への血流の増加である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
虚血症状の治療方法であって、以下の：
血管形成因子をコードする少なくとも１の遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを筋にデリバリーすることを含み、ここで、上記血管形成因子が発現されて、そして治療効果が達成される、前記治療方法。
【請求項１３】
前記血管形成因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、アンギオポイエチン−１、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）から成る群から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管形成因子が、ＶＥＧＦである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ１６５である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管形成因子が、ＦＧＦである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記血管形成因子が、アンギオポイエチン−１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記の筋が、骨格筋である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記の筋が、心筋である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記の筋が、平滑筋である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療効果が、新しい血管の形成である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療効果が、血流の増加である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
筋への注射を通じて前記ｒＡＡＶビリオンを導入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
筋に血液を供給する血管内へのカテーテルによる注入を介して前記ｒＡＡＶビリオンを導入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
約１０１０〜約１０１５のｒＡＡＶビリオンを、デリバリーする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも２種類の血管形成因子遺伝子を、デリバリーする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
ＶＥＧＦをコードする遺伝子、及びアンギオポイエチン−１をコードする遺伝子を、前記ｒＡＡＶビリオンによりデリバリーする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＶＥＧＦをコードする遺伝子、及びＦＧＦ−２をコードする遺伝子を、前記ｒＡＡＶビリオンによりデリバリーする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
筋への血管内皮細胞増殖因子のデリバリー方法であって、以下の：
ａ）　血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含む、少なくとも１のｒＡＡＶビリオンを筋に導入し；そして
ｂ）　上記血管内皮細胞増殖因子を発現させる、
を含み、上記発現が治療効果をもたらす、前記デリバリー方法。
【請求項３０】
前記の筋が、心筋である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記の筋が、骨格筋である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記の筋が、平滑筋である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療効果が、新しい血管の形成である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療効果が、血流の増加である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
筋への血管内皮細胞増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子のデリバリー方法であって、以下の：
ａ）　血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子、及び繊維芽細胞増殖因子をコードする遺伝子を含む、少なくとも１のｒＡＡＶビリオンを筋に導入し；そして
ｂ）　上記血管内皮細胞増殖因子、及び上記繊維芽細胞増殖因子を発現させる、を含み、上記発現が治療効果をもたらす、前記デリバリー方法。
【請求項３６】
前記の筋が、心筋である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記の筋が、骨格筋である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記の筋が、平滑筋である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療効果が、新しい血管の形成である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療効果が、血流の増加である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
治療効果を提供するために筋にｒＡＡＶビリオンをデリバリーするための薬剤の製造における、血管形成因子をコードする遺伝子を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用であって、上記ｒＡＡＶビリオンが、野生型ＡＡＶビリオン及びヘルパーウイルスを含まない上記使用。
【請求項４２】
治療効果を提供するために筋にデリバリーすることにより虚血症状を治療するための薬剤の製造における、血管形成因子をコードする遺伝子を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用。
【請求項４３】
治療効果を提供するために筋にｒＡＡＶビリオンをデリバリーするための薬剤の製造における、血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用。
【請求項４４】
治療効果を提供するために筋にｒＡＡＶビリオンをデリバリーするための薬剤の製造における、血管内皮細胞増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子をコードする遺伝子を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、筋組織への組み換えアデノ随伴ウイルス・ビリオンのデリバリーに関する。より特に、本発明は、虚血性と非虚血性筋への血管形成因子をコードした導入遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンのデリバリーに関する。本発明は、虚血性の疾患の治療に関する。
【０００２】
本発明の背景
冠状動脈疾患は、西側諸国の心不全の最も一般的な原因である。アメリカ合衆国で、冠状動脈疾患をアメリカの男性及び女性の一番の殺人者にしている、毎年５００，０００人以上の死者を出し、約７００万人の人々がこの苦痛の種で苦しんでいる。加えて、さらに約７００，０００人のアメリカ人が、多くの場合、回復できない心臓損傷が結果として起こる一般的な臨床転帰をかなりの罹患率で伴う、非致命的な心臓発作を経験する。心臓組織へのこの損傷は、虚血によって引き起こされる。心筋虚血は、心筋が十分な血液供給を受け取ることができず、よって酸素及び栄養素の必要不可欠なレベルを失った時に生じる。引き続く低酸素及び低栄養の状態が直されなければ、心臓の組織壊死が生じる；すなわち、心筋梗塞が進行して、十分に重症であれば心停止をもたらす。
【０００３】
心筋虚血性、アテローム硬化症の最多の原因は、心筋に血流を提供する冠状動脈の狭窄及び硬化によりもたらされる。狭窄及び硬化は、冒された動脈を完全にふさぐのには十分に執拗になることができる。冠状動脈の閉塞を引き起こすことが知られている他の因子は、血栓塞栓症（アテローム硬化症の不存在において）及び先天的な解剖的な異常を含む。
【０００４】
心筋虚血性に対する現在の治療上の戦略は、薬学の介在、冠状動脈バイパス術、及び非外科的血管内技術（例えば、経皮経管的動脈形成術、血管内ステント）を含む。標準の薬学的治療は、心筋に血液供給を増やすか、あるいは心筋の酸素と栄養素の需要を減少させるかのいずれかを含む戦略に基づく。虚血性性心疾患の外科療法は、戦略的に配置されたバイパス・グラフトによる疾患動脈の分節のバイパスに基づく。非外科の血管内技術は、疾患冠状動脈における狭窄を減らすためのカテーテル又はステントの使用に基づく。これらの戦略の全てが、虚血性症状の出現の回数を減らすか、あるいは除くために使用されるが、全て様々な制限を持っている。より効果的な治療上の戦略を開発することの必要性は、虚血性症状の出現の生き残った犠牲者が、多くの場合で致命的である、後に来る虚血の症状の出現に関する実質的に大きな危険性を持つという事実に基づく。
【０００５】
心に加えて、虚血性が、脳梗塞、深部静脈血栓症、肺の塞栓、及び腎不全を導く、脳、末端にある四肢、肺、及び腎臓生じるかもしれない。末梢動脈の疾患、すなわち非心筋虚血性を、アメリカ合衆国において約８００万〜１千万の人々が冒される。しばしばそれは、知覚及び運動神経が悪影響を受ける、末梢ニューロパシーをもたらす。これらの危険因子を持つ患者の予後は、心筋梗塞、脳梗塞、及び心血管の死の大きな危険のために限定されている。多くの場合、末梢及び心筋虚血の両者を一緒に治療する必要がある。
【０００６】
虚血性疾患の治療上の多くの新しい治療の戦略は、血管形成過程として知られている新しい血管の発生を促すことに注目している。血管形成、又は新しい毛細血管の増殖は、組織の正常な成長及び発生に必要な基本的な過程である。血管樹の発生及び分化のため、並びに様々な種類の、他の生理学的過程のためにそれが要求である。これらと一緒に、血管形成が、体の修復機構の一部として、例えば傷の治癒において生じる。
【０００７】
毛細血管は、血管内皮細胞と周皮細胞から成る。これらの２つの細胞型は、管、枝、及び毛細管のネットワーク全体を形成するために必要な遺伝情報を担持する。特定の分子が、この過程を開始させうる。血管形成の生理学的な重要性の観点から、多くの努力が、血管形成を刺激することができる因子及びそれを行う相当数のポリペプチドの単離、特徴づけ、及び精製に捧げられた。
【０００８】
血管内皮細胞に特異的に結合し、そして活性化するそのような血管形成因子の１つが、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。ＶＥＧＦは、強力な血管作用タンパク質である。ＶＥＧＦの４つの異なる分子の変異型が記載されている。１６５アミノ酸変異型は、正常な細胞及び組織で見つかった支配的な分子の形式である。１１６位〜１５９位の４４アミノ酸の欠失を持つより短い形式（ＶＥＧＦ１２１）、１１６位に２４の塩基性残基の挿入を持つ長い形式（ＶＥＧＦ１８９）、及びＶＥＧＦ１８９に見られる２４のアミノ酸の挿入を含む、４１のアミノ酸の挿入を持つ他のより長い形式（ＶＥＧＦ２０６）が知られている。ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１８９は可溶性タンパク質である。ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６は、たいていの細胞に関連しているように思われる。ＶＥＧＦのバージョンの全てが生物学的に活性である。
【０００９】
ＶＥＧＦの様々な形式は、同じ遺伝子によってコードされて、メッセンジャーＲＮＡの選択的スプライシングから生じる。この結論は、制限パターンがＶＥＧＦ１６５、又はＶＥＧＦ２０６中の挿入物を含むもののいずれかに対するプローブを使って同定することで示したヒトのゲノムＤＮＡのサザンブロット解析によって裏付けられている。推定のメッセンジャーＲＮＡスプライシングの領域内のゲノム・クローンの解析は、選択的スプライシングから成るイントロン／エクソン構造を示しもする。最近、ＶＥＧＦ−２と呼ばれているＶＥＧＦの新しいアイソフォームが説明された。その発現特性は、ＶＥＧＦに類似し、血小板由来成長因子によって誘発された血管平滑筋細胞への増殖刺激効果を抑えながら、血管内皮細胞の増殖を刺激することが示された。
【００１０】
ＶＥＧＦは、それが見つかる特定の生物学的な状況に依存する様々な影響を与えることができる。ＶＥＧＦは、強力な内皮細胞分裂誘発因子で、そして正常な発生又は創傷治癒の間の内皮細胞増殖を促進することによって直接的に生体内で血管形成の誘導に寄与する。ＶＥＧＦの最も顕著な性質は、その特異性である。それは、生体外において１ ｎｇ／ｍＬで毛細血管、及びヒト臍静脈内皮細胞に対して細胞分裂誘発性であるが、しかし副腎皮質細胞、角膜、若しくはレンズ上皮細胞、血管平滑筋細胞、角膜内皮細胞、顆粒膜細胞、ケラチン生成細胞、ＢＨＫ−２１線維芽細胞、３Ｔ３細胞、ラット胚線維芽細胞、ヒト胎盤線維芽細胞、並びにヒト肉腫細胞でそうではない。ＶＥＧＦの標的細胞特異性は、血管内皮細胞に制限されるように思われる。その受容体（内皮細胞表面チロシンキナーゼ受容体）への結合により、ＶＥＧＦは、血管形成をもたらす事件の全手順を誘発し、そして虚血の様々な動物モデルの毛細血管の増殖を促しうることが示された。それは小さな、又は大きな血管から分離された内皮細胞の増殖を刺激することができる。ＶＥＧＦ発現は、内皮細胞増殖及び血管形成が特に刺激されると思われるような虚血領域における低酸素血により引き起こされる。
【００１１】
比較的によく特徴づけられている他のいた他の血管形成因子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である。ＦＧＦ−１（あるいは、酸性ＦＧＦと呼ばれる）からＦＧＦ−９までのＦＧＦファミリーの少なくとも９種類のメンバーが存在し、その全てが血管形成に関係するわけではない。ＦＧＦ−２は、基本的ＦＧＦとしても知られ、血管形成過程において最も広く特徴づけられたタンパク質の１つである。例えば、研究は、冠動脈閉塞症の間の成犬冠状動脈中へのＦＧＦ−２の注射が新しい血管形成、伝えられるところでは心筋機能不全の減少をもたらすことを明らかにした。同様な結果が、心筋虚血の他の動物モデルで報告されている。細胞ベースのアッセイにおいて、ＦＧＦ−２は、内皮細胞増殖を毛細血管に似た構造に誘発するＶＥＧＦとの相乗作用を持っていることが示されている。生体内において、ＶＥＧＦと同じく、ＦＧＦ−２が血管形成を誘発することが示されている。細胞表面チロシンキナーゼ受容体であるということで、ＦＧＦ受容体は、ＶＥＧＦ受容体に類似している。リガンド結合が、本質的なチロシンキナーゼ活動を引き起こす構造変化を誘発することによって受容体を活性化し、それが遺伝子発現に影響するシグナル伝達カスケードを導き、そして結局内皮細胞増殖をもたらす。
【００１２】
最近発見された血管形成因子、アンギオポイエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）は、血管形成後期へのその関与によって最初に同定された。例えば、研究は、ＶＥＧＦとアンギオポイエチン−１が一緒に血管形成アッセイに導入される時、単独のＶＥＧＦ処置と相対的により大きく、よりおびただしい数の、そしてより高度に分岐した血管が形成されたことを示した。他の研究は、アンギオポイエチン−１が、ＶＥＧＦ非存在下で内皮細胞増殖、及び毛細血管の増殖を誘発したこと、並びにこれらの新しい血管が、漏れやすい新しい血管の形成を誘発するＶＥＧＦと異なり「漏れやす」くなかったことを示した。同じ研究は、ＶＥＧＦとアンギオポイエチン−１の同時発現が新しい血管形成の相加効果をもたらして、そしてこれらの新しい血管が漏れやすくなかったことを証明した。
【００１３】
しかし、これらのタンパク質による血管形成効果を達成するための必要条件は、タンパク質の繰り返し、あるいは長期のデリバリーを必要とし、これが臨床の場面における血管形成を刺激するためのこれらのタンパク質の直接的な注射の有用性を制限する。従って、血管形成因子発現の長期、かつ、維持されたレベルを可能にする、そして規定の治療の終了点を達成する、血管形成因子の繰り返される注射及び注入に頼らないアプローチが虚血性疾患の治療の潜在的利益を提供する。いくつかの遺伝子治療方法が、現在この終了点を達成するために開発されている。
【００１４】
理想的に、そのような遺伝子治療方法は、患者への特異的なタンパク質（あるいは、他の治療上の分子）の維持されたレベルのデリバリーを可能にする。核酸分子は、患者（ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療）、患者から分離された細胞、その後、続いて患者に戻されるドナー（ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療）の中に直接的に導入されうる。次に、導入された核酸は、患者自身の細胞、あるいはグラフトされた細胞に所望の治療上の産物を産生するように命令する。遺伝子治療は、臨床医が、治療のために特定の臓器又は細胞の標的（例えば、筋、血球、脳細胞など）を選ぶことを可能にする。
【００１５】
核酸は、ウイルスを介した介在遺伝子デリバリー、ネイキッドＤＮＡデリバリー、及びトランスフェクション法を含むいくつかの方法により患者の細胞に導入されうる。ウイルスを介した遺伝子デリバリーは、多数の遺伝子治療実験に使用された。最も一般に遺伝子治療実験（並びに前臨床試験）の中で使用された組み換えウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、疱瘡ウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとしたものである。あるいは、トランスフェクション法が、遺伝子デリバリーのために使用されうる。トランスフェクション法は、生体内の遺伝子デリバリーに一般的にふさわしくないが、それらは、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入のために利用される。そのような方法は、リン酸カルシウム沈殿物及びリポソームを介したトランスフェクションのような化学的なトランスフェクション法、並びに電気穿孔法のような物理的なトランスフェクション法を含む。
【００１６】
ＡＡＶを介した遺伝子治療
ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属しているパルボウイルス、ＡＡＶは、他のウイルスには見られないいくつかの特徴を持つ。これらの特徴が、それを遺伝子治療の用途に特にうまく適している。例えば、ＡＡＶは、無分裂細胞を含む広い範囲の宿主細胞に感染することができる。さらに、ＡＡＶは、さまざまな種からの細胞に感染することができる。重要なことに、ＡＡＶは、ヒト又は動物の疾患に関係していないため、形質導入上の宿主細胞の生理学的な性質を変えると思われない。最後に、ＡＡＶは、広い範囲の物理的及び化学的な条件で安定していて、ＡＡＶは、自身を産生、保存、及び転移の要求に適合させる。
【００１７】
約４７００のヌクレオチド（ＡＡＶ−２ゲノムは、４６８１ヌクレオチドから成り、ＡＡＶ−４ゲノムは、４７６７）を含む線状の一本鎖ＤＮＡ分子である、ＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）によって各末端で挟まれた内部の非反復セグメントを含む。このＩＴＲｓは、（ＡＡＶ−１は、１４３ヌクレオチドのＩＴＲｓを持つ）約１４５ヌクレオチドの長さでで、複製起点、及びウイルス・ゲノムのパッケージング・シグナルとして働くことを含んだ複数の機能を持っている。
【００１８】
ゲノムの内側の非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）及びキャプシド（ｃａｐ）部位として知られている、２つの大きな読み取り枠（ＯＲＦｓ）を含む。これらのＯＲＦｓは、完全なＡＡＶビリオンの複製、組立て、及びパッケージングを可能にするコードする複製及びキャプシド遺伝子産物をコードする。より特に、少なくとも４のウイルス性タンパク質のファミリーが、ＡＡＶ ｒｅｐ部位から発現される：Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０、その全てが、見かけ上の分子量から名づけられている。ＡＡＶ ｃａｐ部位は、少なくとも３種類のタンパク質をコードする：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３．
ＡＡＶは、ヘルパーに依存したウイルスである、すなわち、機能上完璧なＡＡＶビリオンを形成するためにヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクチニアウイルス）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの同時感染を欠くことで、ＡＡＶは、ウイルスのゲノムを宿主細胞染色体中に挿入するか、又はエピソーム形式の潜伏している状態を確立するが、しかし、感染性のビリオンは生産されない。ヘルパーウイルスによる引き続く感染が、複製、及びウイルス・キャプシド中にパッケージされ、それによって、感染性のビリオンを再編成することを可能にする、統合されたゲノムを「救う」。ＡＡＶが異なる種からの細胞に感染することができる一方、ヘルパーウイルスは宿主細胞と同じ種でなくてはならない。このように、例えば、ヒトＡＡＶは、犬のアデノウイルスと一緒に同時感染した犬の細胞で複製する。
【００１９】
異種の核酸配列を含む感染性組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）を産生するために、好適な宿主細胞系は、異種の核酸配列を含むが、しかしＡＡＶヘルパー機能遺伝子、Ｒｅｐ及び ｃａｐを欠くＡＡＶベクターによりトランスフェクトされうる。次に、ＡＡＶヘルパー機能遺伝子は、別個のベクターで提供されることができる。ＡＡＶ生産に必要なヘルパーウイルス遺伝子（すなわち、補助的な機能遺伝子）は、複製の能力があるヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクチニア）を提供するよりむしろ、ベクター上に提供されうる。あるいは、ＡＡＶヘルパー機能は、ヘルパーウイルス・ゲノム、好ましくは複製不全にされているものに組み入れられることができる。例えば、ＡＡＶ ｃａｐは、アデノウイルス・ゲノム、例えばアデノウイルス血清型５内に組み込まれ、次に、アデノウイルスが宿主細胞に感染して、そしてＣａｐタンパク質ヘルパー機能、並びに必要なヘルパーウイルスの補助的な機能を提供しうる。
【００２０】
共同で、ＡＡＶヘルパー機能遺伝子（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）、及び補助的な機能遺伝子は、１以上のベクターにより提供されうる。その後、ヘルパー、及び補助的な機能遺伝子産物は、それらが異種の核酸配列を含むｒＡＡＶベクター上のｉｎ ｔｒａｎｓで働く宿主細胞中で発現されうる。次に、異種の核酸配列を含むｒＡＡＶベクターは、複製されて、そしてあたかも野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムかのようにパッケージされ、組み換えビリオンを形成する。患者の細胞が得られたｒＡＡＶビリオンにより感染される時、異種の核酸配列は、入り込み、そして患者の細胞中で発現される。患者の細胞はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに補助的な機能遺伝子を欠いているので、ｒＡＡＶは、それらのゲノムをさらに複製して、パッケージすることができない。しかも、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の源なしに、ｗｔＡＡＶは、患者の細胞内で形成されることができない。
【００２１】
６種類の既知のＡＡＶ血清型、ＡＡＶ−１からＡＡＶ−６までが存在する。ＡＡＶ−２は、ヒト集団の中で最も蔓延している血清型である；ある研究は、総人口の少なくとも８０％がｗｔＡＡＶ−２に感染されていると見積もった。ＡＡＶ−３及びＡＡＶ−５も、最大６０％の感染率でヒト集団に蔓延している。ＡＡＶ−１及びＡＡＶ−４は、サルで単離され、どちらの血清型もヒト細胞を変換しうる。６種類の既知の血清型で、ＡＡＶ−２が、最も良く特徴づけられたものである。例えば、ＡＡＶ−２は、幅広くたくさんの生体内の形質導入実験で使用されて、多くの異なる組織型を変換することが示されている。研究者は、多くの異なる組織特異的な導入遺伝子をデリバリーするためにＡＡＶ−２の幅広い組織親和性を利用した。
【００２２】
様々な虚血性疾患の治療上の新しい治療上の戦略を開発する必要性は、そのような不調で苦しめられている個対数によって明白である。虚血及び続いて心筋梗塞に進行する冠状動脈疾患は、西側世界の成人の間の主な死因である。酸素欠乏組織への血流を増加させる新しい血管増殖（血管形成）を刺激することは、心筋梗塞の数を減らす１のそのような目新しい治療上の戦略である。血管形成を刺激するために使用される現在の実験的な技術（例えば、プラスミドＤＮＡによる一過性の低レベル発現、又はアデノウイルスによる潜在的な炎症）における固有な制限を克服するために、血管形成因子を虚血性組織にデリバリーするためにＡＡＶを使用する方法を開発し、そしてここに説明する。
【００２３】
本発明の概要
本発明により、組み換えのＡＡＶビリオンを使用した、筋組織への遺伝子の効率的な移動を可能にする方法、及び使用のためのベクトルが提供される。前記方法は、移された遺伝子の長期で、安定した発現をもたらす。
【００２４】
野生型（ｗｔ） ＡＡＶビリオンを欠いているｒＡＡＶビリオン、及び（アデノウイルスのような）ヘルパーウイルスの使用は、安全で、効率的な遺伝子導入を容易にする。それ故に、本発明は、治療効果を引き起こすために血管形成因子をコードしている遺伝子を筋組織に届けるために、ｗｔ−ＡＡＶ及びアデノウイルス（あるいは、他のヘルパーウイルス）を含まない含まないｒＡＡＶビリオンの使用を広範に含む。本発明の１の態様において、前記血管形成因子はＶＥＧＦである。好ましい態様において、前記ＶＥＧＦはＶＥＧＦ１６５である。他の態様において、前記血管形成因子はＦＧＦである。さらに他の態様において、前記血管形成因子はアンギオポイエチン−１である。本発明の１の側面における、治療効果は、新しい血管形成の増加である。他の側面において、治療効果は、血流の増加である。
【００２５】
筋への新しい血管の増殖と血流の増加を容易にするために、筋に血管形成因子遺伝子を届け、そして効率的な遺伝子発現を達成するやり方でする必要がある。それ故に、１つの態様において、ｒＡＡＶビリオンデリバリーは、筋組織中への直接的な注射を通じてである。１の側面において、前記筋組織は骨格筋組織である。他の側面において、前記筋組織は心筋組織である。さらに他の側面において、前記筋組織は平滑筋組織である。
【００２６】
他の態様において、ｒＡＡＶビリオンデリバリーは、筋に血を供給する血管に挿入されたカテーテルを経由してである。１の側面において、前記筋は骨格筋である。他の側面において、前記筋は心筋である。さらに他の側面において、前記筋は平滑筋である。
【００２７】
本発明は、虚血性疾患の治療の方法をも開示する。１の態様において、ｗｔ−ＡＡＶ及びヘルパーウイルスを含まず、かつ、血管形成因子のために遺伝子をコードしたｒＡＡＶビリオンが筋組織にデリバリーされ、ここで、前記遺伝子は発現され、そして治療効果が達成される。１の側面において、前記血管形成因子はＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ１６５である。他の側面において、前記血管形成因子はＦＧＦである。さらに他の側面において、前記血管形成因子はアンギオポイエチン−１である。１の側面における、治療効果は、新しい血管形成の増加である。他の側面において、治療効果は、虚血性筋組織への血流の増加である。
【００２８】
新しい血管の増殖、及び虚血性筋への血流の増大は、血管形成因子遺伝子が適切な部位に届けられて、効率的な遺伝子発現が達成されるようなやり方で達成される時に実現される。それ故に、１つの態様において、筋虚血の治療は、血管形成因子を遺伝子をコードした遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンの虚血に直面している筋中への直接注射としてである。１の側面において、前記筋は骨格筋である。他の側面において、前記筋は心筋である。さらに他の側面において、前記筋は平滑筋である。
【００２９】
他の態様において、筋虚血の治療は、血管形成因子をコードする遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンの、筋に血液を供給する血管に挿入されるカテーテルによるカテーテル・デリバリーによってである。１の側面において、前記カテーテルは、虚血筋に血液を供給する血管に直接的に挿入されて、ｒＡＡＶビリオンの注射がそこで生じる。他の側面において、前記カテーテルは、末梢血液血管に挿入されて、その後血管系を介して虚血筋に血液を供給している血管まで進め、ここでｒＡＡＶビリオンの注射が生じる。１の側面において、前記筋は骨格筋である。他の側面において、前記筋は心筋である。さらに他の側面において、前記筋は平滑筋である。
【００３０】
対象発明のこれらの、及び他の態様は、本明細書中での開示を受けて当業者に容易に思いつく。
【００３１】
本発明の詳細な説明
本発明は、組み換えＡＡＶビリオンをヒトを含めた哺乳動物にデリバリーする方法を提供する。より特に、それは、血管形成因子をコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンのデリバリーに関与する。「組み換えＡＡＶビリオン」又は「ｒＡＡＶビリオン」は、１以上のＡＡＶ ＩＴＲｓによって挟まれた異種核酸配列を封入したＡＡＶタンパク質殻（すなわち、キャプシド）から構成された感染性ウイルスを意味する。封入された「異種核酸配列」は、自然状態では、通常互いに関連性が見られない、一緒につながれた核酸配列を含む。例えば、異種核酸配列は、自然状態では、そのコード配列と関連性が見られない配列によって挟まれたコード配列を含むことができた。異種核酸配列の他の例は、天然に見つからないコード配列である（例えば、天然の遺伝子と異なるコドンを持つ合成配列である）。
【００３２】
好ましくは、組み換えＡＡＶビリオンは、米国特許第６，００１，６５０号及び同第６，００４，７９７号に記載された三重トランスフェクション系を使って製造される。この系は、補助的な機能ベクター、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及びｒＡＡＶベクターを含めたｒＡＡＶビリオンの製造のための３つのベクターの使用に関係する。補助的な機能ベクター、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及び組み換えＡＡＶベクターは、慣習の組み換え技術を使って設計されうる。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ｃａｌｉｆ．、及び当業者に周知の他の起源から商業的に入手可能なもののような構築物中に１以上の所望のヌクレオチド配列を挿入することによって、同じか、又はいずれかの所望の順序ですぐに組み立てられたウイルス・ゲノム、又はベクターから切り出されうる。
【００３３】
三重トランスフェクション法は、ｐｌａｄｅｎｏ５、補助的な機能ベクター（米国特許第６，００４，７９７号に記載）、ＡＡＶヘルパー機能ベクターｐＨＬＰ１９（米国特許第６，００１，６５０号に記載）、及び血管形成因子をコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターを使用しうる。しかし、当業者は、これらのベクターによってコードされた核酸配列が、様々な組み合わせの２以上のベクターで提供されうることを認識する。
【００３４】
あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶの補助的な機能遺伝子をヘルパーウイルス・ゲノム、例えばアデノウイルス血清型５、好ましくは複製不全にされているヘルパーウイルス、より好ましくは複製機能不全のものの中に組み入れることにより製造される。一度、ＡＡＶヘルパー機能遺伝子（例えば、ｃａｐ）がヘルパーウイルスのゲノムに組み入れられると、このヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスは、その後宿主細胞に感染して、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質ヘルパー機能、並びにヘルパーウイルスの補助的な機能を提供しうる。
【００３５】
本明細書中に使用されるとき、用語「ベクター」は、適切な制御要素に関係している時複製ができ、そして遺伝子配列を細胞間で移動することができる全ての遺伝子要素、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工的な染色体、ウイルス、ビリオンなどを含む。このように、前記用語は、クローニング、及び発現媒体、並びにウイルス・ベクターを含む。
【００３６】
ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ｉｎ ｔｒａｎｓにおける増殖性のＡＡＶ複製及びキャプシッド封入のために機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及び ｃａｐ）をコードする。米国特許第６，００１，６５０号に記載のとおり、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能な野生型又は偽野生型ＡＡＶを生じることのない、効率的なｒＡＡＶビリオン製造を容易にする；その結果、三重トランスフェクション系は、検出可能な野生型又は偽野生型ＡＡＶビリオンを生じることのない、ｒＡＡＶビリオンの製造を可能にする。「検出可能」は、ＰＣＲ（前記の米国特許第６，００１，６５０号に記載のとおり）、又は同じか、又は類似する感度、及び特異性を持つ同等技術を用いた野生型、又は偽野生型ＡＡＶ ＤＮＡのいずれかの検出を意味する。
【００３７】
補助的な機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する、非ＡＡＶ由来のウイルス性、及び／又は細胞性の機能（すなわち「補助的な機能」）に関するヌクレオチド配列をコードする。前記補助的な機能は、制限されることなく、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化に関与しているそれらの部分、発生段階依存的ＡＡＶメッセンジャーＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、Ｃａｐ発現産物の合成、並びにＡＡＶキャプシド組立てを含むＡＡＶ複製のために必要とされているそれらの機能を含む。ウイルスをベースにした補助的な機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス・タイプ−１以外）、及びワクチニアウイルスのような既知のヘルパーウイルスのいずれかから誘導されうる。結果として、補助的な機能ベクターは、あらゆるヘルパーウイルスの使用を伴わない、効率的なＡＡＶベクター製造を容易にし、それで、三重トランスフェクション系を使って製造したｒＡＡＶビリオンは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルスなどを含まない。
【００３８】
「ＡＡＶベクター」は、制限されることなく、ＡＡＶ−１、、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６などを含むいずれかのＡＡＶ血清型から誘導されたベクターである。ＡＡＶベクターは、全体又は一部、すなわちｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失された、１以上のｗｔ−ＡＡＶ遺伝子を持ちうるが、しかしＡＡＶビリオンの救出、複製、及びパッケージングに必要な少なくとも１の機能的なフランキングＩＴＲ配列を維持する。このように、ＡＡＶベクターは、少なくともウイルス複製及びパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲｓ）のためのｃｉｓで必要とされるそれらの配列を含むことが本明細書中に定義される。ＩＴＲｓは、野生型ヌクレオチド配列を必要とせず、そして機能的救出、複製、及びパッケージングを提供する配列に限り、例えばヌクレオチドの挿入、削除、あるいは置換によって変更されうる。さらに、ＡＡＶヘルパータンパク質、すなわちＲｅｐ及びＣａｐは、ＩＴＲｓと同じ血清型から誘導しなくてもよい。例えば、周知の本技術分野の技術を使用することによって、当業者は、ｗｔ−ＡＡＶ−２からのＩＴＲｓを使ってベクターを構築し、ｗｔ−ＡＡＶ−６、又はＡＡＶ−２からのｒｅｐ及びＡＡＶ−６からのｃａｐからヘルパー機能（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）を提供することができた。あるいは、当業者は、特定のｗｔ−ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ−２の配列に基づいた変更されたＩＴＲｓ、及び他のＡＡＶ血清型からのヘルパー機能を使用することができた。当業者は、完全な、及び機能的なｒＡＡＶビリオンの構築に使用することができるＩＴＲｓとヘルパー機能タンパク質のさまざまな可能な組み合わせが分かる。ＡＡＶベクターは、「ｒＡＡＶベクター」を定義する、機能的なＡＡＶ ＩＴＲｓにより挟まれた１以上の異種核酸配列のを含むことができる。
【００３９】
組換え型ＡＡＶビリオンは、塩化セシウム密度遠心沈殿又はカラムクロマトグラフィーのような本技術分野で周知の種々の精製技術を使って精製されうる。いったん精製されれば、ｒＡＡＶビリオンは、例えば哺乳動物の対象へのデリバリーのための、例えば国際公開番号第００／３２２３３号に記載の安定した医薬組成物中に処方されうる。
【００４０】
本発明は、１以上の治療上のヌクレオチド配列のデリバリーを意図する。特に、本発明は、既知の血管形成因子のいずれかをコードするＡＡＶベクターを含み、上記因子は、本発明の方法を用いてヒトのそれを含む哺乳動物の筋細胞にデリバリーされる。このように、本発明は、以下を含む：末梢及び心筋虚血の治療上のＶＥＧＦのデリバリー、末梢及び心筋虚血の治療上のＦＧＦのデリバリー、並びに末梢及び心筋虚血性の治療上のアンギオポイエチン−１のデリバリー。各々の血管形成因子は、単独で、あるいは組み合わされてデリバリーされうる。例えば、新しい血管形成を刺激して、血流を高めるためにＶＥＧＦは単独でデリバリーされうるか、あるいは新しい血管形成を刺激して、血流を高めるためにＶＥＧＦは、ＦＧＦ及び／又はアンギオポイエチン−１と一緒にデリバリーされうる。
【００４１】
しかも、本発明は、これらの血管形成因子の様々な活性型のいずれかのデリバリーを含む。例えば先に記載のとおり、ＶＥＧＦの４つの異なる生物学的に活性なスプライシング変異型が知られている。例えば、Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９１） ２６６：１１９４７−１１９５４、ＶＥＧＦ１６５（配列番号１及び２、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２１２２１をも参照のこと）、ＶＥＧＦ１２１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２１４５７０をも参照のこと）、及びＶＥＧＦ１９８の配列を記載；並びにＨｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． （１９９１） ５：１８０６−１８１４、ＶＥＧＦ２０６の配列を記載、を参照のこと。ＶＥＧＦ１６５は、１６５のアミノ酸を持っていて、正常な細胞及び組織で見つかった支配的な分子型である。ＶＥＧＦ１２１は、たくさんの喪失が存在する、１１６位〜１５９位の４４アミノ酸の欠失を持つより短い形式である。ＶＥＧＦ１８９は、１１６位に２４の塩基性残基の挿入を持つ長い形式であり、そしてＶＥＧＦ２０６は、ＶＥＧＦ１８９に見られる２４のアミノ酸の挿入を含む、４１のアミノ酸の挿入を持つ他のより長い形式である。本発明は、虚血症状の治療、又は筋への既知の血管形成因子のデリバリーの他の目的のために有用でもある。例えば、血管形成遺伝子であると考えられる未知の遺伝子を、本明細書中に記載の方法を用いて発現しうる。例として、既知の血液凝固因子「Ｙ」と高頻度のヌクレオチド配列の同一性（例えば、＞７０ ％）を持つバイオインフォマティックスで発見された未知の遺伝子「Ｘ」は、推測上の血管形成因子の遺伝子としてＸを確認するに足りることが想定されうる。この場合、Ｘ遺伝子は、ＡＡＶベクター中にクローン化されることができ、それにより新しいベクターｒＡＡＶ−Ｘを作成し、そして本発明を使って、新しい血管形成、及び／又は血流の増加がＸの発現によりもたらされるかどうかを究明するためにｒＡＡＶ−Ｘが発現されうる。ＸとＹの機能が同じものか、又は似通っているのかどうかを決定するために同じものがＹについても行われる。従って、本発明は、機能的なゲノムの分野の発展に使用されることができる。
【００４２】
本発明は、米国特許第４，９８０，２８１号、及び同第５，６８８，６５５号に記載の検定に幾分類似したやり方の薬のスクリーニング・アッセイの確立に有用でもある。例えば、（例えば、癌調査研究において）血管形成過程の阻害剤を所望の場合には、本発明は、１以上の血管形成因子を哺乳動物へのデリバリーに使用されることができて、新しい血管増殖を刺激するための血管形成因子を発現することができて、そして、そのような新薬候補分子がｒＡＡＶにデリバリーされた血管形成因子（ｓ）によって刺激された新しい血管増殖を抑えるかどうかのテストの目標を持って、様々な新薬候補分子が哺乳動物に投与される。
【００４３】
異種核酸配列の発現は、プロモーター／制御的な配列のコントロール下にある。「プロモーター／制御的な配列」は、発現のために必要とされるＤＮＡ塩基配列を意味する。ある例において、プロモーター／制御的な配列は、コア・プロモーター配列であるかもしれず、他の例で、プロモーター／制御的な配列は、エンハンサー配列及び／又は異種の核酸配列の発現を高める他の制御的な配列を含むかもしれない。前記プロモーターは、構造性、又は誘導性であるかもしれない。異種核酸配列の一定の発現が望まれれば、構造性プロモーターが使用される。周知の構造性プロモーターの例は、早期−初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターなどを含む。構造性プロモーターの多数の他の例が本技術分野で周知であり、本発明の実施に利用されうる。
【００４４】
異種の核酸配列の制御された発現が望まれれば、誘導性プロモーターが使用されるかもしれない。非誘導状態において、誘導性プロモーターは「サイレント」である。「サイレント」は、誘導物質の非存在下、わずかか、又は全く異種核酸の発現が検出されず；しかし、誘導物質の存在下、異種核酸発現が生じることを意味する。多くの場合、当業者は、誘導物質の濃度を変えることによって発現のレベルを制御しうる。例えば、誘導性プロモーターがより強く、あるいはより弱く刺激されるように、誘導物質の濃度を変えることによる、発現の制御によって、当業者は、異種核酸配列の転写産物の濃度に影響を及ぼしうる。異種核酸配列が遺伝子をコードする場合、当業者は、合成されるタンパク質の量を制御しうる。この方法で、治療上の産物の濃度を変えることが可能である。周知の誘導性プロモーターの例は：エストロゲン、又はアンドロゲン・プロモーター、金属結合性タンパク質プロモーター、あるいはエクジソン感受性プロモーターである。多数の他の例が本技術分野で周知であり、本発明の実施に利用されうる。
【００４５】
（幅広い種類の細胞又は組織型で働ク傾向にある）構造性、及び誘導性プロモーターに加えて、組織特異性プロモーターが、異種核酸配列の組織又は細胞に特異的な発現を達成するために使用されうる。いくつかの筋特異性プロモーターを含む、組織特異性プロモーターの周知の例は：骨格のα−アクチン・プロモーター、心臓のアクチン・プロモーター、骨格のトロポニンＣプロモーター、遅筋心臓のトロポニンＣプロモーター、及びクレアチン・キナーゼ・プロモーター／エンハンサーである。多数の筋特異性プロモーターが、本技術分野で周知であり、そして本発明の実施に利用されうる（筋特異性プロモーターの論評については、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：１９１−１９６を参照のこと）。
【００４６】
いったん届けられれば、ｒＡＡＶビリオン内に含まれている異種核酸配列は発現され、治療効果を発現する。「治療効果」は、多くの場合、徴候又は疾患に関連している症状又は不調の改良によって反映される、患者の疾患又は不調が改良を示すように、所望の成果又は終点の方向に疾患（又は不調）の構成要素を変えるのに十分な異種核酸配列の発現のレベルを意味する。
【００４７】
本発明は、ヒトの虚血の治療の方法をも提供する。前記方法は、血管形成因子をコードする異種核酸配列（すなわち、異種遺伝子）を含むｒＡＡＶビリオンのデリバリーを含み、その発現は、治療効果をもたらす。前記ｒＡＡＶビリオンは、いくつかの技術を使って哺乳動物に導入されうる。例えば、直接的な筋中注射が使用されうる。１つの態様において、ｒＡＡＶビリオンが筋に注射される。他の態様において、末梢動脈（例えば、大腿動脈）に導入されたカテーテルが、着目の筋に血液を提供する動脈（例えば、心臓に血液を提供する冠状動脈）を介したｒＡＡＶビリオンを着目の筋（例えば、心筋）にデリバリーするために使用されうる。１つの好ましい態様において、虚血性患者は、血管形成因子の１つをコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンを少なくとも一度筋組織に注射される。１の側面において、得られた治療効果は、血管形成の増加である。他の側面において、虚血組織への血流の増加が達成される。当業者は、他の臨床指標が治療効果が達成されたかどうかを決定するために計測されうることを認識している。
【００４８】
特定の治療効果を達成するために必要とされているｒＡＡＶビリオンの投与量、例えば哺乳動物の対象に導入されるｒＡＡＶビリオンの総数は、制限されることなく：哺乳動物の種、ｒＡＡＶビリオン投与の経路、治療効果を達成するために必要な異種核酸配列の発現レベル、治療される特定の疾患又は不調（例えば、末梢又は心筋虚血）、ｒＡＡＶビリオンに対する宿主免疫応答、異種核酸配列発現産物に対する宿主免疫応答、及び発現産物の安定性を含むいくつかの因子に基づいて変化しうる。当業者は、前述の因子、並びに他の因子に基づいて、特定の疾患又は不調を持っている患者の治療のためのｒＡＡＶビリオンの投与量の範囲レンジ容易に決定することができる。虚血の治療に関して、所望の治療効果を達成するために、少なくとも１０１０のｒＡＡＶビリオン、好ましくは約１０１０〜１０１５、より好ましくは約１０１１〜１０１４、そして最も好ましくは約１０１２〜１０１３のｒＡＡＶビリオンの投与量が提供される。
【００４９】
本発明は、異種核酸配列の治療上の発現をもたらす成功したｒＡＡＶビリオン形質導入の方法を提供する。明確性の目的、及び本発明のベスト・モードを例証するために、以下の論議は、哺乳動物へのＶＥＧＦのｒＡＡＶビリオンデリバリーを例証する。
【００５０】
下記は、本発明を実施するための特定の態様の実施例である。実施例は、説明を目的としてのみ提供されて、どのような形でも本発明の範囲を制限するものではない。
【００５１】
実施例１
組み換えＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ベクターの構築、製造、及び精製
組み換えアデノ随伴ウイルスヒト血管内皮細胞増殖因子１６５ベクター（ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５）を、本技術分野で周知の標準的な分子生物学技術を使って構築した。要するに、ベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）をｒＡＡＶ−ＬａｃＺベクター（ｒＡＡＶ−ＬａｃＺは、米国特許第５，８５８，３５１号に記載されている）から取り出し、そしてＣＭＶプロモーターで駆動され、その３’末端にＳＶ４０ポリアデニル化配列が隣接する完全長のヒトＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡにより置き換えた。次に、組み換えＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ビリオンを、前記米国特許第６，００１，６５０号、及び同第６，００４，７９７号に記載の三重トランスフェクション法を使って製造し、そして同様に前記米国特許第６，００１，６５０号、及び同第６，００４，７９７号に記載の技術を使って精製した。
【００５２】
実施例２
生体外のＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ラット心筋細胞アッセイ
心筋細胞を生後１日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの心室から準備した。０．２５％のトリプシン中で解離の後に、細胞懸濁液を、１０％のＦＣＳ （Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）を補ったＤＭＥＭ （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で洗浄し、そして５００ ｇで１０分間遠心分離した。次に、１０％のＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中にこの細胞ペレットを再懸濁した。心筋細胞の選択的な濃縮のために、解離した細胞を、１時間、前もって蒔き、その間に非筋細胞はすぐに培養皿の底に付着した、。得られた筋細胞の懸濁液を、４ ｘ １０５細胞／ウェルの密度で２４ウェル・ディッシュ上に蒔いた。蒔いて７２時間後に、この培養ラットの心筋細胞を、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ビリオン（５ ｘ １０３ビリオン／細胞）により２４時間、形質導入した。形質導入ラット心筋細胞のサイトゾル中のＶＥＧＦを検出するために、イムノブロッティング法を実施した。形質導入ラット心筋細胞を、氷冷ＰＢＳですすぎ、溶解バッファー（１％のＮｏｎｉｄｉｔ Ｐ−４０、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭのＮａＣｌ、２００ Ｕ／ｍＬのアプロチニン、１ ｍＭのＰＭＳＦ）中に再懸濁した。３０分間、氷上でインキュベート後に、細胞抽出物を遠心分離し、そして細胞残屑を取り除いた。次に、この細胞ライセート（１５ μｇのタンパク質）を、７．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ポリビニリデン・ジフルオリド膜上でブロットした。膜をＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ：２０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）、及び４％の脱脂乳中、室温で１時間インキュベートした。次に、その膜を、１：１０００希釈の抗ヒトＶＥＧＦ１６５抗体（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と一緒にＴＢＳＴ中４℃で一晩インキュベートした。抗体の特異的な結合を、製造業者の指図に従いＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）によって可視化した。ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５形質導入ラット心筋細胞において、ＶＥＧＦがイムノブロットによって検出された。組み換えＡＡＶ−ＬａｃＺを陰性対照として使用した；ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入ラット心筋細胞において、ＶＥＧＦは検出されなかった（ｒＡＡＶ−ＬａｃＺベクターの構築は、前記米国特許第５，８５８，３５１号に完全に記載されている。）図１は、イムノブロット結果を表す。
【００５３】
ラット心筋細胞組織におけるＶＥＧＦの存在を計測するために、免疫組織化学染色を実施した。形質導入ラット心筋細胞を２度ＴＢＳですすぎ、そしてＴＢＳ中に１：５に希釈した正常なウサギ血清により４５分間ブロックした。この細胞を、抗ヒトＶＥＧＦ１６５抗体（２μｇ／ｍＬ）と一緒に一晩にインキュベートし、続いてウサギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ抱合と一緒に１時間インキュベートした（希釈率１：５０； １０％の免疫前ラット血清及び３ ％のウシ血清アルブミンと一緒に４℃で一晩、予備吸収した）。抗体結合を、０．０１％のＨ２Ｏ２含有０．１ ＭのＴｒｉｓバッファー，ｐＨ ７．２中、３，３−ジアミノベンジジン・テトラヒドロクロライド（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ）により可視化した。陰性対照実験は、インキュベーション培地からのベクターの除去から成った。図２は、結果を表す。
【００５４】
ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５形質導入ラット心筋細胞の約６０％がＶＥＧＦについて陽性染色され （図２Ａ）、それに対しｒＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入ラット心筋細胞は、ＶＥＧＦについての染色を示さなかった（ＦＩＧ． ２Ｂ）。
【００５５】
形質導入ラット心筋細胞の培地中のＶＥＧＦ分泌を計測するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を、ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に含まれる製造業者の指図に従って実施した。筋細胞を、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５と一緒に２４時間インキュベートした後に、この筋細胞を２度ＰＢＳですすぎ、無ＦＣＳ培地中でインキュベートした。培地交換の２４時間後に、培地中のＶＥＧＦ濃度を計測した。図３は結果を表す。培地中のＶＥＧＦ濃度は、ベクター用量依存的な様式で増加した。分泌ＶＥＧＦの最大濃度は、５ ｘ １０３のベクター量で生じて、６ ｎｇ／ｍＬであると計測された。非形質導入ラット心筋細胞とｒＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入ラット心筋細胞からの培地は検出可能なＶＥＧＦを含んでいなかった。
【００５６】
実施例３
生体内のマウスｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５虚血心臓アッセイ
虚血心臓筋を製造するために、成体マウスの気管を、首の正中線切開により露出し、次に適当なサイズの厳密に言えば大きさによって分けられた血管カテーテル（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎから入手可能なもの）を使用することによってチューブを気管内に配置し、そしてこのチューブをベンチレータ（例えば、Ｈａｒｖａｒｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ， Ｍｏｄｅｌ ６８３， Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ， Ｓｏｕｔｈ Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡから入手可能なＳｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｖｏｌｕｍｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ）に接続する。ベンチレータ制御の呼吸を確立した後に、開胸切開を第２肋間腔に施し、そして小さいリトラクターを心臓をさらすために切開部に配置した。次に、前下行冠状動脈を、外科用縫合糸で結紮した。５０ μＬのＰＢＳに含まれる約１０１０〜１０１５のｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ビリオンを虚血部位の周りの左心室壁の心筋のいくつか部位に直接注射した。ｒＡＡＶビリオンの接種後に、注射器に接続された小さい管を、胸腔の空気を排出して陰圧を回復させるために、切開部の閉鎖の前に切開部に配置した。自発的な呼吸が回復された後に、気管内チューブを、優しく引き抜き、次に、首の切開部を閉じた。組み換えＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ビリオンを虚血部位の周りのいくつかの部位で心筋に注射した。次に、心臓を、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５の接種の２ヶ月後に収集し、そして同じ様式でデリバリーされた同じ量のｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ビリオンを受けた対照群のマウス（すなわち、外科的に虚血にしていないマウス）と比較した。１の実験動物群あたり少なくとも２の心臓を収集した。小さい血管の数を、ｘ２０の対物レンズを用いた顕微鏡によりカウントした。
【００５７】
実施例４
ラット骨格筋へのＡＡＶ−ＬａｃＺベクターの投与
雄Ｓｐｒｅｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ ｇ）をジエチル・エーテルで麻酔した。約５ ｍｍの長さの皮膚切開を、前脛骨筋上に行い、そして筋膜を確認した。組み換えＡＡＶベクターを、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝化食塩液中に希釈し、そして注射部位の追跡を可能にするためにカーボン・ブラック（Ｐｅｌｉｋａｎ Ｉｎｋ， Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｗａｒｇｎｅｒ）を加えた。ＡＡＶ−ＬａｃＺ （１０１３ビリオン／２００μＬ）を含むｒＡＡＶベクター懸濁液、２００ μＬを、前脛骨筋中に２９ゲージの針を用いて直接注射した。Ｘ−Ｇａｌの組織学化学的着色が、注射領域の筋繊維の大部分でのβ−ガラクトシダーゼ発現を明らかにして、このパターンは、１２週間の研究期間の間、変わることなく維持された。
【００５８】
実施例５
ラット虚血後肢及び対側後肢へのｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５の投与
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをペントバルビタール・ナトリウム（５０ ｍｇ／ｋｇ）の腹膜内注射により麻酔した。縦方向の切開を右大腿部に行い、その後、右大腿動脈を肢虚血を誘発するために外科的に摘出した。次に、ラットを、虚血後肢内の部位に、及び対側肢内の部位にも筋注射を介してｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ （２ ｘ １０１３のビリオン；ｎ＝８）により形質導入した。ベクター懸濁液（１００ μＬ／部位）を、主な大腿筋（四頭筋及び内転筋）の４の別個の部位に注射された。３匹のラットを、血行力学検査の予備評価のために偽手術に供した。ＶＥＧＦ発現を確認し、そしてＶＥＧＦが遠隔の組織で発現された可能性を判断するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。メッセンジャーＲＮＡレベルでの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０ （ＴＥＴ−ＴＥＳＴ， Ｉｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， Ｔｅｘ）を使って筋組織と遠隔の組織（例えば、脳、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、精巣）の全細胞ＲＮＡを分離した。抽出したＲＮＡを、ＤＮＡの夾雑を除くためにＤＮアーゼＩ （Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により処理した。第１鎖ｃＤＮＡの合成を、ＰｒｏＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．）で推薦された条件下で実施した。ヒトＶＥＧＦ特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施した（センス：５’−ＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧＡＡＧＴ−３’；アンチセンス：５’−ＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡ−３’）。ＧＡＰＤＨメッセンジャーＲＮＡが内部標準として働いた。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウム染色した２．０％のアガロースゲルで電気泳動した。ＶＥＧＦ遺伝子発現は、注射後の４、及び１０週間観察された（図４に結果を示す）。一方、ＶＥＧＦ遺伝子発現は、ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入筋には見られなかった。ＶＥＧＦ遺伝子発現は、注射後４週間のｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５処理ラットの脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、及び精巣では見られなかった（図４）。
【００５９】
実施例６
形質導入ラット骨格筋からのＶＥＧＦ分泌
形質導入した虚血後肢及び対側後肢の筋からのＶＥＧＦ分泌を調べた。組み換えＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５を注射した前脛骨筋を摘出し、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。ＥＬＩＳＡキットを、筋培養上清ＶＥＧＦ濃度を決定するために使用した。ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の１０週間後、最大５．３±１．５ ｎｇ／ｇ組織／２４ ｈのＶＥＧＦを、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ （１．８ ｘ １０１３ビリオン／部位）の培養上清で検出した（図５）。ＥＬＩＳＡ計測は、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射後、１、２、４、及び８週間でラットの末梢血管から採取した血液中にＶＥＧＦを全く示さなかった。
【００６０】
実施例７
血流測定及びサーモグラフィー
ｒＡＡＶ−ＶＥＧＦ１６５遺伝子導入の６週間後に、各々のラットを腹膜内注射により再び麻酔し、下半身の毛を剃った。ラット後肢の皮膚温度を赤外線サーモグラフィー（ＴＨ３１０６ＭＥ， ＮＥＣ Ｓａｎ−ｅｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）により計測した。脛骨後部の動脈の血流を、血管周囲のフロー・プローブ（ｆｌｏｗｐｒｏｂｅ）を使って、輸送時間超音波流量計（Ｔ２０６ Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｉｔｈａｃａ， Ｎｅｗ ｙｏｒｋ）によって計測した（代表的なグラフを図６Ａに表す）。脛骨後部の動脈を、障害物をなくすように解剖し、そして血管周囲のフロー・プローブを製造業者の指図に従って配置した。虚血肢及び対側肢の両者の血流を同時に記録し、対側肢の％として表した。ＡＡＶ−ＬａｃＺ及びｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の６週間後に、血流を計測した。図６Ｂで示されるように、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５形質導入虚血後肢の平均血流（７８．２±１１．３ ％）は、ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入虚血肢のそれ（４１．５±５．４ ％）よりはるかに高かった。赤外線サーモグラフィーを用いた計測は、同程度の実質的な増加を示した（代表的なサーモグラフィー像を図７Ａに表した）。ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入虚血肢の皮膚温度は、対側肢のそれより約２℃低かった。しかし、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５形質導入虚血肢の皮膚温度は、正常体温に回復した（図７Ｂ）。
【００６１】
実施例８
組織学的評価
ＡＡＶ−ＬａｃＺ及びｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の６週間後に、虚血筋組織を、血行力学アッセイ後のラット虚血後肢の四頭筋及び内転筋から横断面として得た。冷凍切片を、毛細血管内皮細胞を検出するためにインドキシル−テトラゾリウム法を用いてアルカリホスファターゼにより染色した（図８Ａは、この方法を用いたラット筋組織の代表的な像である）。毛細血管の密度を、１の筋切片の５の無作為に選ばれた領域の組織学的調査によって評価し、そして毛細血管の数をカウントした（１ ｍｍ２あたり毛細血管の平均数）。図８Ｂに示されるように、毛細血管の密度は、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５を注射した筋（１０６２±７５／ｍｍ２）で、ＡＡＶ−ＬａｃＺを注射した筋組織のそれ（５３２±２４／ｍｍ２）よりはるかに高かった。血管腫に似た構造、又は炎症細胞浸潤は、虚血肢又は対側肢で観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５形質導入ラットの心臓筋細胞のイムノブロットを示す。心臓筋細胞をｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５又はｒＡＡＶ−ＬａｃＺ （５ ｘ １０３のビリオン／細胞）により形質導入した。形質導入の２４時間後に、この細胞を溶解した。ライセート中のＶＥＧＦタンパク質を７．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分け、膜上にブロットした。４２ ｋＤａのＶＥＧＦタンパク質の発現は、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５−形質導入筋細胞（レーン２）で明白であったが、一方ＶＥＧＦタンパク質は、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ−形質導入の心臓筋細胞（レーン３）で検出されなかった。レーン１は、ヒト組み換えＶＥＧＦ１６５（３ ｎｇ／レーン）を示して、正の対照となる。
【図２】形質導入ラット心臓筋細胞のＶＥＧＦについての免疫組織化学染色の結果を示す。細胞を、５ ｘ １０３ビリオン／細胞で２４時間、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５ （Ａ）又はｒＡＡＶ−ＬａｃＺ （Ｂ）により形質導入し、続いて抗ヒトＶＥＧＦ１６５抗体を用いて染色した。原物の倍率ｘｌ００。
【図３】ラット心臓筋細胞の培地中のＶＥＧＦ濃度を示す。筋細胞は、ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５又はｒＡＡＶ−ＬａｃＺの増加した投与量に晒した。形質導入の４８時間後に、ＶＥＧＦ濃縮をＥＬＩＳＡによって計測した。データを、３の別個の実験を代表する、平均値±ＳＥＭ （ｎ＝４）として表した。
【図４】ベクターを注射された筋組織及び臓器におけるＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡの発現を示す。筋中注射後の様々な時点での全ＲＮＡを筋組織及び臓器から抽出した。ＤＮアーゼＩ処理後、ヒトＶＥＧＦ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを実施した。ラットＧＡＰＤＨとヒトＶＥＧＦについてのＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ７４７ ｂｐと５３１ ｂｐだった。ＶＥＧＦ発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＶＥＧＦ）を正の対照として使用した。ＧＡＰＤＨメッセンジャーＲＮＡは、内部標準として働いた。ＰＣＲ産物を、臭化エチジウム染色０．２ ％ アガロースゲルで電気泳動した。３つの独立した実験で同一の結果を得た。
【図５】ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５を注射された前脛骨筋からのＶＥＧＦ分泌を表す。注射の１０週間後に、筋組織を摘出して、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。ＥＬＩＳＡキットを培養上清ＶＥＧＦ濃度の計算に使用した。ＶＥＧＦ濃度を１枚の皿あたりのタンパク質含量に正規化して、２の別個の実験を代表する、１の実験（ｎ＝４）からの計測の平均値±ＳＥＭとして示した（ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入筋の値と比べてｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の６週間後、輸送時間超音波流量計により計測したラット後肢の血流を表す。麻酔後に、虚血と対側の肢の両方の血流を、偽手術（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）（ｎ＝３）、ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入（１．５ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝８）、及びｒＡＡＶ−ＶＥＧＦ１６５形質導入（２．０ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝８）ラットで同時に記録した。６Ａ：血流の代表的な記録。
【図６Ｂ】ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の６週間後、輸送時間超音波流量計により計測したラット後肢の血流を表す。麻酔後に、虚血と対側の肢の両方の血流を、偽手術（ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）（ｎ＝３）、ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入（１．５ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝８）、及びｒＡＡＶ−ＶＥＧＦ１６５形質導入（２．０ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝８）ラットで同時に記録した。６Ｂ：虚血肢の平均血流。値は、対側肢の％として表され、そして平均値±ＳＥＭとして示される（ｐ＜０．０１）。
【図７】ｒＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５注射の６週間後に実施したラット後肢のサーモグラフィーを表す。ラットに麻酔をかけて、それらの下半身の毛を剃った。各々のラット後肢の皮膚温度を赤外線サーモグラフィーで計測した。７Ａ：赤外線サーモグラフィー像。Ｒ；虚血肢、Ｌ； 対側肢。７Ｂ：ＡＡＶ−ＬａｃＺ−（１．５ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝４）、又はＡＡＶ−ｈＶＥＧＦ１６５−（２．０ ｘ １０１３の粒子／体；ｎ＝４）形質導入ラットにおける虚血及び対側の後肢の平均皮膚温度（℃）（ｐ＜０．０５）。
【図８】８Ａ：アルカリホスファターゼについての組織化学染色を用いたラット筋組織像を表す。８Ｂ：ラット筋組織中の毛細血管の密度。筋組織を、ＡＡＶ−ＬａｃＺ形質導入（ｎ＝４）、及びＡＡＶ−ＶＥＧＦ形質導入ラット（ｎ＝４）の虚血肢から得た。毛細血管の数を１つの筋切片の５の別個の領域でカウントし、そして毛細血管の密度を計算した。データを平均値±ＳＥＭとして示す（ｐ＜０．００１）。
【図３】
2004506658.tif 000003
【図４】
2004506658.tif 000004
【図５】
2004506658.tif 000005
【図６Ａ】
2004506658.tif 000006
【図６Ｂ】
2004506658.tif 000007
【図７】
2004506658.tif 000008
【図８】
2004506658.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2004506658.tif 000010
2004506658.tif 000011
2004506658.tif 000012
2004506658.tif 000013
2004506658.tif 000014
2004506658.tif 000015
2004506658.tif 000016
2004506658.tif 000017
2004506658.tif 000018
2004506658.tif 000019
2004506658.tif 000020
2004506658.tif 000021
2004506658.tif 000022
2004506658.tif 000023
2004506658.tif 000024
2004506658.tif 000025
2004506658.tif 000026
2004506658.tif 000027
2004506658.tif 000028
2004506658.tif 000029
2004506658.tif 000030
2004506658.tif 000031
2004506658.tif 000032
2004506658.tif 000033
2004506658.tif 000034
2004506658.tif 000035
2004506658.tif 000036
2004506658.tif 000037
2004506658.tif 000038
2004506658.tif 000039
2004506658.tif 000040
2004506658.tif 000041
2004506658.tif 000042
2004506658.tif 000043
2004506658.tif 000044
2004506658.tif 000045
2004506658.tif 000046
2004506658.tif 000047
2004506658.tif 000048
2004506658.tif 000049
2004506658.tif 000050
2004506658.tif 000051
2004506658.tif 000052
2004506658.tif 000053
2004506658.tif 000054
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506658.tif 000055
【国際調査報告】
2004506658.tif 000056
2004506658.tif 000057
2004506658.tif 000058
2004506658.tif 000059