(57)【要約】Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンを製造する方法において、バイオ触媒として、アルカン若しくは脂環族炭化水素を分解するバクテリア、又は該バクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する原核宿主生物、又はそれから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素を使用することにより、酸素原子が、対応するＮ−置換されたピペリジンに位置選択的に挿入されるところの方法。バクテリアは、例えば、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からの種から選ばれ得、これは、４〜２０個の炭素原子を有するｎ−アルカンを分解することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンを製造する方法において、アルカン若しくは脂環族炭化水素を分解するバクテリア、又は該バクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する原核宿主生物、又はそれから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素をバイオ触媒として使用することにより、酸素原子が、対応するＮ−置換されたピペリジンに位置選択的に挿入されるところの方法。
【請求項２】
バクテリアが、４〜２０個の炭素原子を含むｎ−アルカンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項１記載の方法。
【請求項３】
バクテリアが、ｎ−オクタンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項２記載の方法。
【請求項４】
バクテリアが、分離体Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＨＸＮ−２００、 ＨＸＮ−１００、ＨＸＮ−１４００、ＨＸＮ−１５００、ＰＮ３、ＰＮ２１、ＰＮ２６、ＰＮ２７、ＰＮ３２、Ｓ６９、Ｓ７０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ１、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＧＰｏ１（ＡＴＣＣ　２９３４７）より成る群から選ばれるところの請求項３記載の方法。
【請求項５】
バクテリアが、ｎ−ヘキサンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項２記載の方法。
【請求項６】
バクテリアが、ｎ−デカンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項２記載の方法。
【請求項７】
バクテリアが、ｎ−ドデカンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項２記載の方法。
【請求項８】
バクテリアが、ｎ−テトラデカンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項２記載の方法。
【請求項９】
バクテリアが、４〜２０個の炭素原子を含むモノ脂環族化合物を分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項１記載の方法。
【請求項１０】
バクテリアが、シクロヘキサンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項９記載の方法。
【請求項１１】
バクテリアが、シクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５であるところの請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
バクテリアが、シクロペンタンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項９記載の方法。
【請求項１３】
バクテリアが、シクロヘプタンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項９記載の方法。
【請求項１４】
バクテリアが、シクロオクタンを分解するバクテリアより成る群から選ばれるところの請求項９記載の方法。
【請求項１５】
バイオ触媒が、アルカン又は脂環族炭化水素を分解するバクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する組換体バクテリアであるところの請求項１記載の方法。
【請求項１６】
バイオ触媒が、組換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．菌株であるところの請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
バイオ触媒が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７） であるところの請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
バイオ触媒として、休止しているバクテリア細胞、成長しているバクテリア細胞、又はその両方が使用されるところの請求項１記載の方法。
【請求項１９】
バイオ触媒として、未精製の細胞抽出物、又は精製された、若しくは部分的に精製された酵素製品が使用されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２０】
バイオ触媒が、水不溶性担体又は支持体系の上又は中に固定化されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２１】
バイオ触媒反応が、水性媒体中で実行されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２２】
バイオ触媒反応が、下記のもの、即ち、固相、水性相、有機相、及び気相の二つ以上を含む多相媒体中で実行されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２３】
５個以上の炭素原子を持つアルカン、４個以上の炭素原子を持つジアルキルエーテル、４個以上の炭素原子を持つカルボン酸エステル、又は芳香族若しくはヘテロ芳香族式炭化水素の一つ以上を含む有機相（ここで、上記化合物はいずれも置換基を持っていてもよい）が使用されるところの請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
反応温度が５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃であるところの請求項１記載の方法。
【請求項２５】
媒体のｐＨが４〜１０、好ましくは６〜８であるところの請求項１記載の方法。
【請求項２６】
生成物が、支持体として使用される無機、有機又は合成の吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにより分離されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２７】
生成物が抽出により分離され、ここで、まず基質がより小さな極性の溶媒での抽出により反応混合物から回収され、残りの反応混合物がｐＨ＝１０〜１２に調節され、そして生成物がより大きな極性の溶媒により抽出されるところの請求項１記載の方法。
【請求項２８】
使用される抽出剤が、５個以上の炭素原子を持つアルカン、４個以上の炭素原子を持つジアルキルエーテル、３個以下の炭素原子を持つ塩素含有アルカン、７〜１０個の炭素原子を持つアルキル芳香族、及び３個以上の炭素原子を持つカルボン酸エステルより成る群から選ばれるところの請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
生成物が膜ろ過の使用により分離されるところの請求項１記載の方法。
【請求項３０】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピロリジンが、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピロリジンであるところの請求項１記載の方法。
【請求項３１】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピロリジンが、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピロリジンであるところの請求項１記載の方法。
【請求項３２】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピロリジンが、Ｎ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピロリジンであるところの請求項１記載の方法。
【請求項３３】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピロリジンが、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピロリジンであるところの請求項１記載の方法。
【請求項３４】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピロリジンが、Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピロリジンであるところの請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、いくつかの医薬品及び農薬の製造のための中間体として有用であるところのＮ−置換された４−ヒドロキシピペリジンを製造する方法に関し、ここで、酸素原子は、バイオ触媒の使用により対応するＮ−置換されたピペリジンに位置選択的に挿入される。
【０００２】
【従来の技術】
４−ヒドロキシピペリジン及びＮ−置換された４−ヒドロキシピペリジンは、いくつかの医薬品、農薬等の合成のための有用な中間体である。
【０００３】
実際、所望されないなら、Ｎ−保護された形態の４−ヒドロキシピペリジンを使用することがしばしば有利である。
【０００４】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンが、カルボキシエチル化、縮合、及び脱カルボキシル化［Ｇｒｏｂ，Ｃ．Ａ．；Ｂｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９５８年，第４１号，第１１８４頁、Ｂｒｏｏｋｅｓ，Ｐ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５７年，第７９号，第３１７３〜３１７５頁、ＭｃＥｌｖａｉｎ，Ｓ．Ｍ．；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４９年， 第７１号，第９０１〜９０６頁、Ｋｕｅｔｔｅｌ，Ｇ．Ｍ．；ＭｃＥｌｖａｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９３１年， 第２６９２〜２６９６頁、Ｂｏｌｙａｒｄ，Ｎ．Ｗ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９３０年，第５２号，第１０３０頁、Ｄｉｃｋｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｃ．；Ｌｉｎｄｗａｌｌ，Ｈ．Ｇ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９４９年，第１４号，第５３０〜５３６頁］を経てエチルアクリレート及びアルキルアミンから合成された対応するＮ−置換された４−ピペリドンの還元［２７７６２９３（１９５７年１月１日）、米国特許第２７６７１９０号明細書（１９５６年１０月１６日）、英国特許第６２９１９６号公報、ハンガリー国特許第２０４０３５号公報、Ｏｋａｎｏ，Ｔ．；Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．；Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．；Ｋｉｊｉ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９８７年、第１８１〜１８４頁、Ｋｏｓｔｏｃｈｋａ，Ｌ．Ｍ．；Ｂｅｌｏｓｔｏｔｓｋｉｉ，Ａ．Ｍ．；Ｓｋｏｌｄｉｎｏｖ，Ａ．Ｐ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．ＵＳＳＲ（英語翻訳），１９８２年，第１８号，第２３１５〜２３１６頁、ＭｃＥｌｖａｉｎ，Ｓ．Ｍ．；ＭｃＭａｈｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４７年，第７１号，第９０１〜９０６頁、Ｂｏｌｙａｒｄ，Ｎ．Ｗ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９３０年，第５２号，第１０３０頁］により製造され得ることは公知である。そのような方法は多段階合成を含み、かつ夫々の段階において分離の問題を有している。
【０００５】
４−ヒドロキシピペリジン及びＮ−置換されたヒドロキシピペリジンは夫々、４−ヒドロキシピリジン［Ｓｃｈａｅｆｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｋｏｏｎｔｚ，Ｆ．Ｈ．；Ｔｉｅｔｚ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ．，１９５９年，第４０号，第３７７頁、Ｈａｌｌ，Ｊｒ．，Ｈ．Ｋ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５８年，第８０号，第６４１２〜６４２０頁、フランス国特許第１４９１１２７号公報（１９６７年８月４日）］及びＮ−置換された１Ｈ−ピリジン‐４‐オン［Ｃｏａｎら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５６年，第７８号，第３７０１頁］の水素化により製造され得ることがまた公知である。しかし、収率は低い。
【０００６】
４−ヒドロキシピペリジンは、水素化及び環化を経て３−ヒドロキシ−グルタロニトリルから製造され得る［Ｂｏｗｄｅｎ；Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５６年， 第７８号，第３７０頁］。Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンはベンジル−ブト‐３−エニル‐アミンとホルムアルデヒドから製造されることができ［ＭｃＣａｎｎ，Ｓ．Ｆ．；Ｏｖｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７年，第１０９号，第６１７０〜６１１４頁］、かつそれはまた、Ｎ−ベンジルアンモニウムトリフルオロアセテート、アリル‐トリメチル‐シラン、及びホルムアルデヒドから製造され得る［Ｌａｒｓｅｎ，Ｓ．Ｄ．；Ｇｒｉｅｓｏ，Ｐ．Ａ．；Ｆｏｂａｒｅ，Ｗ．Ｆ．，　Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６年，第１０８号，第３５１２〜３５１３頁］。しかし、全てのそのような製造は大規模のために実際的でない。
【０００７】
４−ヒドロキシピペリジンは、Ｃ＝Ｃ結合のヒドロキシル化を経てＮ−トリメチルシラニル‐１，２，５，６−テトラヒドロピリジンから合成されることができる［Ｄｉｃｋｏ，Ａ．；Ｍｏｎｔｕｒｙ，Ｍ．；Ｂａｂｏｕｌｅｎｅ，Ｍ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，１９８７年，第２８号，第６０４１〜６０４４頁］が、３−ヒドロキシピペリジンが主生成物として得られた。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル‐１，２，５，６−テトラヒドロピリジンにおけるＣ＝Ｃ結合のヒドロキシル化は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えたが、３−ヒドロキシル化化合物がまた形成された［Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｐｒａｓａｄ，Ｊ．Ｖ．Ｎ．Ｖ． Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６年，第１０８号，第２０４９〜２０５４頁、Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｐｒａｓａｄ，Ｊ．Ｖ．Ｎ．Ｖ．；Ｚｅｅ，Ｓ．Ｈ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８５年，第５０号，第１５８２〜１５８９頁］。
【０００８】
Ｎ−置換されたピペリジンの位置選択的ヒドロキシル化は、Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンを製造するための簡単な方法を提供することができた。しかし、この反応は古典的な化学的方法により実行されることができない。
【０００９】
菌によるピペリジンの酵素ヒドロキシル化は公知である。即ち、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｓｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ　７１５９によるＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化は、６．５％［Ａｒｃｈｅｌａｓ，Ａ．；Ｆｕｒｓｔｏｓｓ，Ｒ．；Ｓｒａｉｒｉ，Ｄ．；Ｍａｕｒｙ，Ｇ．，Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｆｒ．１９８６年，第２３４〜２３８頁］、１９％ ［Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｈｅｒｒ，Ｍ．Ｅ．；Ｍｕｒｒａｙ，Ｈ．Ｃ．；Ｆｏｎｋｅｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６８年、第３１８７頁、英国特許第１１４００５５公報（１９６９年１月１５日）］、及び２０％［Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｈ．Ｌ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｔ．Ａ．；Ｎａｖａ，Ｐ．Ｊ．；Ｚａｂｉｃ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９９年，第５５号，第７４４１〜７４６０頁］のＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。他の報告［ソ連国特許第１８２２８８６号公報（１９９３年６月２３日）、Ｐａｒｓｈｉｋｏｖ，Ｉ．Ａ．；Ｍｏｄｙａｎｏｖａ，Ｌ．Ｖ．；Ｄｏｖｇｉｌｉｖｉｃｈ，Ｅ．Ｖ．；Ｔｅｒｅｎｔｅｖ，Ｐ．Ｂ．；Ｖｏｒｏｂｅｖａ，Ｌ．Ｉ．；Ｇｒｉｓｈｉｎａ，Ｇ．Ｖ．Ｃｈｅｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｏｍｐｄ．（英語翻訳），１９９２年，第２８号，第１５９〜１６２頁］において、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａ　ＶＫＭ　Ｆ−３１１１ＤによるＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化は、４−ヒドロキシ及び３−ヒドロキシピペリジンの混合物をもたらし、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍによるヒドロキシル化は、４−ヒドロキシ及び２−ヒドロキシピペリジンの混合物を与え、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ　ＶＫＰＭ　Ｆ−４３０、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　ＶＫＭ　Ｆ−７５８、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＶＫＭ　Ｆ−１１１９によるヒドロキシル化は夫々、１９％、３４％、及び８０％のＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｓｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ　７１５９によるＮ−ベンジルオキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化は公知であり、３３％のＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた［Ａｉｔｋｅｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｇｒｏｇａｎ，Ｇ．；Ｃｈｏｗ，Ｃ．Ｓ．Ｙ．；Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．；Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ　ｔｒａｎｓ．１，１９９８年、第３３６５〜３３７０頁、Ｆｌｉｔｓｃｈ，Ｓ．Ｌ．；Ａｉｔｋｅｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｃｈｏｗ，Ｃ．Ｓ．Ｙ．；Ｇｒｏｇａｎ，Ｇ．；Ｓｔａｉｎｅｓ，Ａ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９年，第２７号，第８１〜９０頁］。Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｓｕｌｆｕｒｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ　７１５９によるＮ−アリールピペリジンのヒドロキシル化は、２０〜６６％の対応するＮ−アリール‐４−ヒドロキシピペリジンを与えた［Ｆｌｏｙｄ，Ｎ．；Ｍｕｎｙｅｍａｎａ，Ｆ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．；Ｗｉｌｌｅｔｔｓ，Ａ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ　ｔｒａｎｓ，第１号，１９９３年，第８８１頁］。しかし、低収率及び副生成物の形成の問題に加えて、��成物の濃度が余りに低く（＜０．１グラム／リットル）、反応時間が余りに長く（３〜６日間）、及び菌によるバイオトランスホーメーション混合物からの生成物の分離が非常に困難である故に、バイオ触媒としての菌による全てのそのような方法は実用的ではない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンの実用的な製造方法を提供し、ここで、アルカン若しくは脂環族炭化水素を分解するバクテリア、又は該バクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する原核宿主生物、又はそれから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素を使用することにより、酸素原子が、対応するＮ−置換されたピペリジンに位置選択的に挿入される。
【００１１】
より詳細には、使用されるバクテリアは、ｎ−アルカン又はモノ脂環族を分解する菌株より成る群から選ばれる。Ｎ−アルカンを分解する菌株、例えば、分離体Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＨＸＮ−２００、ＨＸＮ−１００、ＨＸＮ−１４００、ＨＸＮ−１５００、ＰＮ３、ＰＮ２１、ＰＮ２６、ＰＮ２７、ＰＮ３２、Ｓ６９、Ｓ７０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ１、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＧＰｏ１（ＡＴＣＣ　２９３４７）、並びにモノ脂環族を分解する菌株、例えば、シクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５が好ましい。本発明は、アルカン又は脂環族炭化水素を分解する菌株から誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する組換体バクテリアの使用を含む。組換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ菌株、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐ ＧＥｃ４７）が好ましい。
【００１２】
バイオトランスホーメーションは、バイオ触媒としての休止している細胞により生体内で、バイオ触媒としての成長している細胞により生体内で、又はバイオ触媒としての未精製の細胞抽出物又は精製若しくは部分的に精製される酵素製品により生体外で実行される。
【００１３】
バイオ触媒は水不溶性担体又は支持体系の上又は中で固定化され得る。
【００１４】
バイオトランスホーメーションは、水性媒体又は、次のもの、即ち、固相、水性相、有機相、若しくは気相の二つ以上を多分含む多相媒体中で達成される。
【００１５】
反応温度は、５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、かつ媒体のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜８である。
【００１６】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンの単離は、抽出、分離技術、例えば、支持体として使用される無機、有機、若しくは合成吸着剤を持つクロマトグラフィー、又は膜ろ過により達成される。
【００１７】
好ましい実施態様において、Ｎ−ベンジル−、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−、Ｎ−フェノキシカルボニル−、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル−、及びＮ−ベンゾイル−４−ヒドロキシピペリジンは夫々、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＨＸＮ−２００、若しくはＨＸＮ−１００、若しくはＨＸＮ−１４００、若しくはＨＸＮ−１５００、若しくはＰＮ３、若しくはＰＮ２１、若しくはＰＮ２６、若しくはＰＮ２７、若しくはＰＮ３２、若しくはＳ６９、若しくはＳ７０、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ１、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＧＰｏ１（ＡＴＣＣ　２９３４７）、又はシクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５、又は４個以上の炭素原子を含むｎ−アルカン若しくはモノ脂環族を分解する他のバクテリア、又は該バクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する原核宿主生物、又はそれから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素の使用により、Ｎ−ベンジル−、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−、Ｎ−フェノキシカルボニル−、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル−、及びＮ−ベンゾイル−ピペリジンに酸素原子を位置選択的に挿入することにより製造された。
【００１８】
この方法により得られるＮ−置換された４−ヒドロキシピペリジンは、脱保護により４−ヒドロキシピペリジンに容易に転化され得る。
【００１９】
従って、ここで本発明はＮ−置換された４−ヒドロキシピペリジン及び４−ヒドロキシピペリジンの製造のための有用な方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
ここで我々は、Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンの実用的な製造方法を開発した。ここで、アルカン若しくは脂環族炭化水素を分解するバクテリア、又は該バクテリアから誘導される、ヒドロキシル化のために必要な遺伝子を有する原核宿主生物、又はそれから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素を使用することにより、酸素原子が、対応するＮ−置換されたピペリジンに位置選択的に挿入される。
【００２１】
この反応のための適切なバイオ触媒を見出すために、我々は、マイクロタイタープレート上の小型化されたスクリーニングシステムの使用により多くのバクテリアをスクリーニングした。実施例１において実証されたスクリーニング手順において、９６のアルカンを分解する菌株が、３〜６日間、マイクロタイタープレート上で寒天に基づいた鉱物成長培地中でｎ−ヘキサン／ｎ−オクタン／ｎ−デカン／ｎ−ドデカン／ｎ−テトラデカン（１：１：１：１：１）の混合物の蒸気において成長された。細胞は、マイクロタイタープレート上で１〜２％のグルコースを含む５０ミリモルのホスフェートバッファー（ｐＨ＝７．２）の１５０マイクロリットル中に集められかつ再縣濁された。Ｎ−置換されたピペリジン（０，１〜１．０ミリモル）が加えられ、そして該混合物は、２時間、２００ｒｐｍかつ２５℃において振とうされた。Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンの形成は、ＭＳ検出を結合された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定された。
【００２２】
多くのアルカン分解バクテリアはＮ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化を位置選択的に触媒作用し得て、対応する４−ヒドロキシピペリジンを与えることが分かった。これらのバクテリアの例は、表１に示されているように、分離体Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＨＸＮ−２００、ＨＸＮ−１００、 ＨＸＮ−１４００、ＨＸＮ−１５００、ＰＮ３、ＰＮ２１、ＰＮ２６、ＰＮ２７、ＰＮ３２、Ｓ６９、Ｓ７０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ１、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＧＰｏ１（ＡＴＣＣ　２９３４７）である。
【００２３】
脂環族炭化水素を分解する菌株の多くは、Ｎ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化を位置選択的に触媒作用し得て、対応する４−ヒドロキシピペリジンを与えることが分かった。これらのバクテリアの一例はシクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５である。
【００２４】
バイオ触媒は、アルカン又は脂環族炭化水素を分解する菌株からの、ヒドロキシル化にために必要な遺伝子を有する原核宿主生物であり得ることがまた分かった。組換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７）は例えば、Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンを与えるＮ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化のための適切な触媒である。
【００２５】
Ｎ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化は、該バクテリアから誘導されるヒドロキシル化活性を有する酵素により触媒作用され得て、対応する４−ヒドロキシピペリジンを与えることが分かった。
【００２６】
バイオトランスホーメーションは、バイオ触媒としての休止している細胞により生体内で、バイオ触媒としての成長している細胞により生体内で、又はバイオ触媒としての精製された酵素若しくは未精製の細胞抽出物により生体外で実行され得る。
【００２７】
バイオ触媒は、水不溶性担体又は支持体系の上又は中に固定化され得る。
【００２８】
バイオトランスホーメーションは水性媒体中で実行され得る。それはまた、次のもの、即ち、固相、水性相、有機相、又は気相の二つ以上を多分含む多相媒体中で達成され得る。高いＬｏｇＰ値を持つ有機溶媒が有機相として使用され得る。これは、５個以上の炭素原子を持つアルカン、４個以上の炭素原子を持つジアルキルエーテル、４個以上の炭素原子を持つカルボン酸エステル、及び芳香族炭化水素を含む。適切な有機溶媒の例はヘキサデカンである。
【００２９】
酵素ヒドロキシル化は、それが重要なパラメーターではないけれども、５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度において実行され得る。圧力は広い範囲内で変化し得る。実際、バイオトランスホーメーションは大気圧で実行される。反応媒体のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜８であり得る。
【００３０】
生成物は、支持体として使用される無機、有機、又は合成吸着剤を持つクロマトグラフィー技術により分離され得る。適切な吸着剤は例えば、酸化アルミニウム及びシリカゲルである。生成物はまたメンブレンろ過により単離され得る。
【００３１】
生成物はまた抽出により分離され得る。ここで、基質がまず、より小さな極性の溶媒での抽出により反応混合物から回収され、残りの反応混合物がｐＨ＝１０〜１２に調節され、そして生成物がより大きな極性の溶媒により抽出される。使用される適切な抽出剤は、５個以上の炭素原子を持つアルカン、４個以上の炭素原子を持つジアルキルエーテル、３個以下の炭素原子を持つ塩素含有アルカン、７〜１０個の炭素原子を持つアルキル芳香族、及び３個以上の炭素原子を持つカルボン酸エステルより成る群から選ばれる。とりわけ適した抽出剤の例は、非極性及び極性溶媒として夫々ヘキサン及び酢酸エチルである。
【００３２】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンは、（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＳｔｕｔｔｇａｒｔにおいてＰｌａｇｇｅｍｅｉｅｒ，Ｔｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．； Ｅｎｇｅｓｓｅｒ，Ｋ．により単離された、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物中にある）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ＨＸＮ−２００の使用により対応するＮ−置換されたピペリジンに酸素原子を位置選択的に挿入することにより製造され得る。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　ＨＸＮ−２００の細胞は、炭素源としてのｎ−オクタン又は炭素源としてのグルコースのいずれかによりＥ２培地中で成長させ、次いで、ジシクロプロピルケトン（ＤＣＰＫ）又はｎ−オクタンによりアルカン酸化系を誘導することにより大規模に製造された。該細胞は、数ヶ月間、−８０℃で貯蔵され得、かつ休止している細胞によるバイオ転化において通常の化学試薬として使用され得る。
【００３３】
ＨＸＮ−２００の休止している細胞によるバイオ転化において、Ｎ−置換されたピペリジン（２〜１０ミリモル）が、グルコース（０又は２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中の１０ミリリットルの細胞縣濁物（４．０グラム／リットル）に加えられ、そして該混合物は５時間３０℃において振とうされた。該反応の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。即ち、試料が異なるときに反応混合物から直接的に取り出され、細胞が遠心分離により取り除かれ、かつ上澄みが分析用ＨＰＬＣにより分析された。
【００３４】
ＨＰＬＣ分析法は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＢＤＳ−Ｃ１８（５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ）カラム、溶出液としてのアセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）の混合物、１．０ミリリットル／分での流れ、及び２１０、２２５、及び２５４ｎｍにおける検出の使用により確立された。Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は３．０分間であり、Ｎ−ベンジルピペリジンの保持時間は５．２分間である［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）１５：８５］。Ｎ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．９分間であり、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルピペリジンの保持時間は８．５分間である［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。Ｎ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．７分間であり、Ｎ−フェノキシカルボニルピペリジンの保持時間は６．６分間である［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．５分間であり、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジンの保持時間は５．６分間である［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．４分間であり、Ｎ−ベンゾイルピペリジンの保持時間は４．９分間である［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）３０：７０］。
【００３５】
標準作成手順が確立された。即ち、細胞は遠心分離により取り除かれ、上澄みはＫＯＨの添加によりｐＨ＝１０〜１２に調節され、続いて酢酸エチルにより抽出された。有機相はＭｇＳＯ４により乾燥され、濾過され、そして溶媒が蒸発された。
【００３６】
生成物は酸化アルミニウム又はシリカゲルのいずれかにおいてカラムクロマトグラフィーにより精製された。それらの構造は、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲ及びＭＳスペクトルにより同定された。
【００３７】
ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４グラム／リットル）によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化は高い活性を与えた。表２に示されているように、最初の３０分間における平均活性は、５〜１０ミリモルのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化のために１９〜２０Ｕ／グラムＣＤＷに達する。反応混合物における２％グルコースの添加は収率を増加させることが分かった。２％グルコースの存在下における休止している細胞によるＮ−ベンジルピペリジン（５ミリモル）のヒドロキシル化は５時間で１００％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンをもたらした。
【００３８】
ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４グラム／リットル）でのＮ−ベンジルオキシカルボニルピペリジン（４〜５ミリモル）のヒドロキシル化は１２〜１４ Ｕ／グラムＣＤＷの活性を与えたことが分かった。表３に示されているように、２％グルコースの添加は、４ミリモル及び５ミリモルのＮ−ベンジルオキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化のために夫々、２４％から５７％及び３４％から５７％にＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの５時間における収率を増加した（表３）。
【００３９】
表４に示されているように、ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４グラム／リットル）でのＮ−フェノキシカルボニルピペリジン（５〜８ミリモル）のヒドロキシル化は１８〜２０ Ｕ／グラムＣＤＷの活性を与えた。９５％のＮ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンは、２％グルコースの存在下における８ミリモルのＮ−フェノキシカルボニルピペリジンの５時間におけるヒドロキシル化により形成された。
【００４０】
２％グルコースの存在下におけるＨＸＮ−２００の休止している細胞（４グラム／リットル）によるＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジン（５〜８ミリモル）のヒドロキシル化は５時間において５１〜９４％のＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えたことが分かった。活性は非常に高い、即ち、２１〜３０ Ｕ／グラムＣＤＷである。
【００４１】
表６に示されているように、２％グルコースの存在下におけるＨＸＮ−２００の休止している細胞（４グラム／リットル）によるＮ−ベンゾイルピペリジン（２〜４ミリモル）の５時間のヒドロキシル化は、２．７〜４．８ Ｕ／グラムＣＤＷの活性を伴って５７〜９９％のＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００４２】
［Ｅｇｇｉｎｋ，Ｇ．らによりＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７年、第２６２号、第１７７１２頁に開示されている、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物中にある］Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ　ＧＰｏ１からの多成分アルカンヒドロキシラーゼのための遺伝子を有する組換体菌株は、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化を触媒作用することが分かった。実施例３において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７）は、Ｍ９培地中でグルコースにおいて成長され、続いてＤＣＰＫにより誘導された。細胞は、グルコース（２％ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．２）中に２．５グラム／リットルに集められかつ再縣濁された。５時間、３０℃におけるこれらの細胞によるＮ−ベンジルピペリジン（２ミリモル）のバイオ転化は、８０％のＮ−ベンジル−３，４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００４３】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンは、振とうフラスコ中で対応するＮ−置換されたピペリジンのバイオヒドロキシル化により容易に製造され得ることが分かった。実施例４は、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）の１００ミリリットル中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ベンジルオキシカルボニルピペリジン（４３．８ミリグラム、０．２０ミリモル）のヒドロキシル化を実証した。３時間、２００ｒｐｍ及び３０℃でのバイオトランスホーメーションは９６％のＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを形成した。標準作成及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１２、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）は７０．２％（３３．０ミリグラム）のＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００４４】
同様に、実施例５において実証されたように、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）におけるＮ−フェノキシカルボニルピペリジン（１４３．５ミリグラム、０．７０ミリモル）のバイオ転化が、４時間、２００ｒｐｍ及び３０℃において振とうした後に、Ｎ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンへの９１％の転化率を与えた。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１１、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）は、８３．２％（１４３．６ミリグラム）のＮ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００４５】
実施例６において、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジン（９２．５ミリグラム、０．５０ミリモル）のヒドロキシル化が、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）の１００ミリリットル中のＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）により行われた。２時間、２００ｒｐｍ及び３０℃における振とうが９６％のＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを形成した。６９．５％（６９．３ミリグラム）の純粋な生成物が、標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．２０、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）の後に得られた。
【００４６】
同様に、Ｎ−ベンゾイルピペリジンのバイオ転化が、５時間、２００ｒｐｍ及び３０℃において５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＨＸＮ−２００の細胞縣濁物（４．０グラム／リットル）の１００ミリリットルにおいて実行された。Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンへの８３％及び６２％転化率が、夫々、３７．８ミリグラム（０．２０ミリモル）及び５６．７ミリグラム（０．３０ミリモル）のＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化において達成された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１４、酢酸エチル）は、実施例７及び８において実証されたように、夫々、７１．５％（２９．３ミリグラム）及び５２．２％（３２．１ミリグラム）を与えた。
【００４７】
対応するＮ−置換された４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−置換されたピペリジンのバイオ転化は、バイオリアクターにおいて容易に達成され得ることが分かった。実施例９に示されているように、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造は、２リットル規模においてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化により実行された。４時間のＮ−ベンジルピペリジン（１．７５グラム、１０ミリモル）のヒドロキシル化はほぼ１００％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを形成した。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．２０、酢酸エチル／ＭｅＯＨ ８：２）は、白色粉末として８３％（１．５０グラム）の純粋な生成物を与えた。白色結晶は、酢酸エチル／ヘキサン（１／３）から結晶化により得られた。
【００４８】
生成物濃度は、より高い密度を持つ細胞縣濁物の使用により容易に増加され得ることが分かった。実施例１０において、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造は、バイオリアクター中で１リットル規模において１０．２グラム／リットルの密度を持つＨＸＮ−２００の細胞縣濁物によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化により達成された。５．２時間のＮ−ベンジルピペリジン（２．６３グラム、１５ミリモル）のバイオ転化は、９８％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを形成した。標準作成手順及びカラムクロマトグラフィーは、白色粉末として２．０７グラム（７２％）の純粋なＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００４９】
Ｎ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化は、バイオ触媒としての成長している細胞により容易に実行され得ることが分かった。実施例１１は、１リットル規模においてＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の成長している細胞によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化を実証した。細胞は、まずグルコースそして次いでｎ−オクタンにおいてＥ２培地中で６．２グラム／リットルの細胞密度に成長された。Ｎ−ベンジルピペリジン（０．８７５グラム、５ミリモル）が加えられ、該混合物は、２リットル／分における空気導入を伴って３０℃において１５３６ｒｐｍで攪拌された。バイオ転化の間に、ｎ−オクタン蒸気が更に導入され、そして細胞が更に成長された。更なる基質が、３０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）、６０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）、及び９０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）で加えられた。８５％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンが２時間で形成され、かつ２．８６６グラム（７５％）の純粋な生成物が、標準作成手順及びカラムクロマトグラフィーの後にもたらされた。
【００５０】
Ｎ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化はバイオ触媒としての無細胞抽出物により実行され得ることが分かった。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の無細胞抽出物によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化は実施例１２において実証された。ＨＸＮ−２００の細胞は、２０グラム／リットルの密度に１０ミリリットルのトリス‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．５）中に縣濁された。３回フレンチプレスを通した後に、細胞破片は４５分間、４５０００ｒｐｍで遠心分離により取り除かれて、膜たんぱく質を含まない可溶性の無細胞抽出物を与えた。この無細胞抽出物に、ＮＡＤＨ（５ミリモル）及びＮ−ベンジルピペリジン（５ミリモル）が加えられた。該混合物は１時間、２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされて、９０％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。これはまた、この反応を触媒作用するＨＸＮ−２００における酵素が膜結合されないことを実証する。
【００５１】
Ｎ−置換された４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−置換されたピペリジンのヒドロキシル化は脂環族炭化水素を分解する菌株により触媒作用され得ることが分かった。実施例１３は、（Ｌｉ，　Ｚ．及びＤｅｕｔｚ，Ｗ．，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈにより単離された、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物中にある）シクロヘキサン分解バクテリアＬＤ−５によるＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化を立証した。菌株は、１／４のＥｖａｎｓ培地中で空気により１０倍に希釈されたシクロヘキサンの蒸気において成長された。細胞は、グルコース（２％ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．２）中で５グラム／リットルに集められかつ再縣濁された。２時間、３０℃におけるＮ−ベンジルピペリジン（５ミリモル）のバイオ転化は６０％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００５２】
本明細書において与えられている特定の実施例は、本発明の説明として単に意図されており、かつ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５３】
【実施例】
【実施例１】
微小規模におけるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化のためのバイオ触媒のスクリーニング
【００５４】
アルカンを分解する菌株が、３〜６日間、マイクロタイタープレート上で寒天に基づいたＥｖａｎｓ培地中でｎ−ヘキサン／ｎ−オクタン／ｎ−デカン／ｎ−ドデカン／ｎ−テトラデカン（１：１：１：１：１）の混合物の蒸気において成長された。該細胞は、マイクロタイタープレート上で１００ミリモルのグルコース及び１５０マイクロモルのＮ−ベンジルピペリジンを含む５０ミリモルのホスフェートバッファー（ｐＨ＝７．２）の１５０マイクロリットル中に再縣濁された。該混合物は、２時間、２００ｒｐｍ及び２５℃で振とうされた。細胞が遠心分離により取り除かれ、かつ上澄みが、ＨＰＬＣ−ＭＳによりＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの形成について分析された。
【００５５】
ＨＰＬＣ−ＭＳのための条件：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１００−５　Ｃ１８　予備カラム；アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）１／９で２分間、次いで、５分間まで４６／５４に徐々に変化させた、１．０ミリリットル／分での流れ、１７６及び１９２でのＭＳ検出、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間１．４分間、Ｎ−ベンジルピペリジンの保持時間３．６分間である。結果は表１に要約された。
【００５６】
【表１】
表１：いくつかのアルカン分解バクテリアによるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000002
１　菌株１〜１２は、炭素源としてｎ−ヘキサン又はｎ−オクタンを使用することにより単離される。全ての菌株は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物中にある。
２　活性は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の活性と比較された。
【００５７】
【実施例２】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞によるＮ−ベンジル−、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−、Ｎ−フェノキシカルボニル、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル、及びＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化
【００５８】
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物にある、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＳｔｕｔｔｇａｒｔにおいてＰｌａｇｇｅｍｅｉｅｒ，Ｔｈ．；Ｓｃｈｍｉｄ，Ａ．；Ｅｎｇｅｓｓｅｒ，Ｋ．により単離された）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００が、炭素源としてのｎ−オクタンの蒸気により２リットルのＥ２培地中に接種されかつ３０℃で成長された。該細胞は、２〜１０グラム／リットルの細胞密度で集められそして−８０℃で貯蔵された。
【００５９】
通常の手順において、Ｎ−置換されたピペリジン（２〜１０ミリモル）が、グルコース（０又は２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＨＸＮ−２００の１０ミリリットルの細胞縣濁物（４．０グラム／リットル）に加えられた。該反応の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。即ち、試料が異なるときに反応混合物から直接的に取り出され、細胞が遠心分離により取り除かれ、かつ上澄みが分析用ＨＰＬＣにより分析された。
【００６０】
ＨＰＬＣ分析は、溶出液としてアセトニトリル／１０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）の混合物、１．０ミリリットル／分における流れ、並びに２１０、２２５、及び２５４ｎｍにおけるＤＡＤ検出によるＨｙｐｅｒｓｉｌ　ＢＤＳ−Ｃ１８（５μｍ、１２５ｍｍ×４ｍｍ）カラムにおいて達成された。
【００６１】
Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は３．０分間であり、Ｎ−ベンジルピペリジンの保持時間は５．２分間であった［アセトニトリル／１０ミリモルＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）１５：８５］。
【００６２】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．９分間であり、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルピペリジンの保持時間は８．５分間であった［アセトニトリル／１０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。
【００６３】
Ｎ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．７分間であり、Ｎ−フェノキシカルボニルピペリジンの保持時間は６．６分間であった［アセトニトリル／１０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。
【００６４】
Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．５分間であり、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジンの保持時間は５．６分間であった［アセトニトリル／１０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）４５：５５］。
【００６５】
Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンの保持時間は１．４分間であり、Ｎ−ベンゾイルピペリジンの保持時間は４．９分間であった［アセトニトリル／１０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．０）３０：７０］。
【００６６】
未精製の生成物が標準作成手順により得られた。即ち、細胞が遠心分離により取り除かれ、上澄みがＫＯＨの添加によりｐＨ＝１０〜１２に調節され、続いて、酢酸エチルにより抽出された。有機相がＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、そして溶媒が蒸発された。
【００６７】
生成物は、酸化アルミニウム又はシリカゲルのいずれかにおけるカラムクロマトグラフィーにより精製され、そしてこれらの構造は、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲ並びにＭＳスペクトルにより同定された。結果は表２〜６に挙げられている。
【００６８】
【表２】
表２： ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ベンジル−４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000003
１　活性は、最初の３０分間に亘って測定された。
【００６９】
【表３】
表３： ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ベンゾキシカルボニル−４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンゾキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000004
１　活性は、最初の３０分間に亘って測定された。
【００７０】
【表４】
表４：ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−フェノキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000005
１　活性は、最初の３０分間に亘って測定された。
【００７１】
【表５】
表５： ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニル−４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000006
１　活性は、最初の３０分間に亘って測定された。
【００７２】
【表６】
表６： ＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）によるＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンへのＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化
2004508831.tif 000007
１　活性は、最初の３０分間に亘って測定された。
【００７３】
【実施例３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７） でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００７４】
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物にある、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７年，第２６２号，第１７７１２頁にＥｇｇｉｎｋ，Ｇらにより開示されている）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＧＥｃ１３７（ｐＧＥｃ４７）が、炭素源としてのグルコースによりＭ９培地中で接種されかつ０．２グラム／リットルの細胞密度に１０時間、３７℃において成長された。次いで、２ミリモルの濃度にＤＣＰＫを加えることにより誘導された。細胞は、０．３グラム／リットルの細胞密度において集められ、かつグルコース（２％ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．２）中で２．５グラム／リットルに再縣濁された。Ｎ−ベンジルピペリジン（２ミリモル）が加えられ、かつ該混合物は５時間、３０℃で振とうされた。分析及び単離手順は上記と同じである。８０％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンが得られた。
【００７５】
【実施例４】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞でのＮ−ベンジルオキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００７６】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルピペリジン（４３．８ミリグラム、０．２０ミリモル）が、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされ、かつバイオ転化の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。該反応は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンへの９６％転化率を伴って３時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１２、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）は、３３．０ミリグラム（７０．２％）のＮ−ベンジルオキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００７７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３７〜７．１２（ｍ，５Ｈ，芳香族Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２）、３．９７〜３．７９（ｍ，３Ｈ，ＨＡ−Ｃ（２），ＨＡ−Ｃ（６），及び），Ｈ−Ｃ（４））、３．２１〜３．０８（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．６，９．４，及び３．５Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（２），ＨＢ−Ｃ（６））、１．９１〜１．８２（ｍ，２Ｈ，ＨＡ−Ｃ（３），ＨＡ−Ｃ（５））、１．５７〜１．３９（ｄｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１３．０，９．０，及び４．１Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（３），ＨＢ−Ｃ（５））、１．６５ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）
【００７８】
１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１５５．２８（ｓ，ＣＯ）；１３６．８０（ｓ），１２８．５０（ｄ），１２８．００（ｄ）， １２７．８６（ｄ）（芳香族Ｃ），６７．４１（ｄ，Ｃ−４）；６７．１３（ｔ，ＯＣＨ２Ｐｈ）；４１．３５（ｔ，Ｃ−２，Ｃ−６）；３４．０６ｐｐｍ（ｔ，Ｃ−３，Ｃ−５）
【００７９】
ＭＳ（８０ｅＶ）：ｍ／ｅ２３６（１００％，Ｍ＋１），２２２（１７％），１９２（７６％），１４４（８％），１０２（１７％）
【００８０】
【実施例５】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞でのＮ−フェノキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００８１】
Ｎ−フェノキシカルボニルピペリジン（１４３．５ミリグラム、０．７０ミリモル）が、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされ、かつバイオ転化の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。該反応は、Ｎ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンへの９１％転化率を伴って４時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１１、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）は、１４３．６ミリグラム（８３．２％）のＮ−フェノキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０〜７．０６（ｍ，５Ｈ，芳香族Ｈ）、４．１０〜３．８５（ｍ，３Ｈ，ＨＡ−Ｃ（２），ＨＡ−Ｃ（６），Ｈ−Ｃ（４）） 、３．２８（ｓ，ｂｒ．，２Ｈ，ＨＢ−Ｃ（２），ＨＢ− Ｃ（６））、１．９８〜１．８５（ｍ，２Ｈ，ＨＡ−Ｃ（３），ＨＡ−Ｃ（５））、１．６６〜１．４８（ｄｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１３．０，８．８，及び４．１Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（３），ＨＢ−Ｃ（５））、１．８１ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）
【００８３】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１５３．７５（ｓ，ＣＯ）；１５１．４２（ｓ），１２９．２６（ｄ），１２５．２５（ｄ）， １２１．７３（ｄ）（芳香族Ｃ）、６７．０８（ｄ，Ｃ−４）、４１．６２（ｔ，Ｃ−２，Ｃ−６）、３３．９７ｐｐｍ（ｔ，Ｃ−３，Ｃ−５）
【００８４】
ＭＳ（８０ｅＶ）：ｍ／ｅ２２２（１００％，Ｍ＋１），２０６（２４％）
【００８５】
【実施例６】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞でのＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００８６】
Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニルピペリジン（９２．５ミリグラム、０．５０ミリモル）が、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされ、かつバイオ転化の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。該反応は、Ｎ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンへの９６％転化率を伴って２時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．２０、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：１）は、６９．３ミリグラム（６９．５％）のＮ−ターシャリー−ブトキシカルボニル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．８７〜３．７８（ｍ，３Ｈ，ＨＡ−Ｃ（２），ＨＡ−Ｃ（６），Ｈ−Ｃ（４））、３．０７〜２．９８（ｄｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１３．５，９．７，及び３．４Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（２），ＨＢ−Ｃ（６））、２．０３（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．８９〜１．６６（ｍ，２Ｈ，ＨＡ−Ｃ（３），ＨＡ−Ｃ（５））、１．５２〜１．３８ｐｐｍ（ｍ，１１Ｈ，ＨＢ−Ｃ（３）， ＨＢ−Ｃ（５）、及び３ＣＨ３）
【００８８】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１５４．８６（ｓ，ＣＯ）；７９．５７（ｓ，ＯＣ（ＣＨ３）３）；６７．６９（ｄ，Ｃ−４）； ４１．２６（ｔ，Ｃ−２，Ｃ−６）；３４．１７ｐｐｍ（ｔ，Ｃ−３，Ｃ−５）；２８．４４ｐｐｍ（ｑ，ＣＨ３）
【００８９】
ＭＳ（８０ｅＶ）：ｍ／ｅ２０２（７％，Ｍ＋１），１４６（２４％），１０２（１００％）
【００９０】
【実施例７】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞でのＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００９１】
Ｎ−ベンゾイルピペリジン（３７．８ミリグラム、０．２０ミリモル）が、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされ、かつバイオ転化の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。該反応は、Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンへの８３％転化率を伴って５時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．１４、酢酸エチル）は、２９．３ミリグラム（７１．５％）のＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４５〜７．３６（ｍ，５Ｈ，芳香族Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ，ＨＡ−Ｃ（２又は６）） 、３．９２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４））、３．６６（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１３．８，４．５Ｈｚ，ＨＡ−Ｃ（６又は２））、３．３２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＨＢ−Ｃ（２又は６））、３．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．７，９．３，及び３．３Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（６又は２））、２．９０（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、１．９５（ｍ，１Ｈ，ＨＡ−Ｃ（３又は５））、１．８０（ｍ，１Ｈ，ＨＡ−Ｃ（５又は３））、１．６０（ｄｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０，９．０，及び４．０Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（３又は５））、１．４６ｐｐｍ（ｄｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１２．７，９．０，及び３．９Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（３））
【００９３】
１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１７０．６２（ｓ，ＣＯ）；１３５．７０（ｓ）、１２９．９１（ｄ）、１２８．７１（ｄ）、１２６．８０（ｄ）（芳香族Ｃ）；６６．８３（ｄ，Ｃ−４）； ４５．２０（ｔ）、３９．６２（ｔ）、（Ｃ−２，Ｃ−６）； ３４．４２（ｔ）、３３．７６ｐｐｍ（ｔ）、（Ｃ−２，Ｃ−５）
【００９４】
ＭＳ（８０ｅＶ）：ｍ／ｅ２０６（１００％，Ｍ＋１）
【００９５】
【実施例８】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞でのＮ−ベンゾイルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００９６】
Ｎ−ベンゾイルピペリジン（５６．７ミリグラム、０．３０ミリモル）が、５００ミリリットルの振とうフラスコ中で、グルコース（２％）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物の１００ミリリットル（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされ、かつバイオ転化の後に分析用ＨＰＬＣが続いた。該反応は、Ｎ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンへの６２％転化率を伴って５時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーは、３２．１ミリグラム（５２．２％）のＮ−ベンゾイル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【００９７】
【実施例９】
２リットル規模におけるＨＸＮ−２００の休止している細胞（４．０グラム／リットル）でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【００９８】
Ｎ−ベンジルピペリジン（１．７５グラム、１０ミリモル）が、３リットルのバイオリアクター中で、グルコース（２％、ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）の２リットル中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物（４．０グラム／リットル）に加えられた。該混合物は、１リットル／分における空気導入の下、１５００ｒｐｍ及び３０℃で攪拌された。バイオトランスホーメーションは、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへのほぼ１００％転化率を伴って４時間で停止された。標準作成手順及びシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ＝０．２、酢酸エチル／ＭｅＯＨ８：２）は、白色粉末として１．５０グラム（８３％）の純粋な生成物を与えた。白色結晶は酢酸エチル／ヘキサン（１／３）から結晶化により得られた。
【００９９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（ｓ，２Ｈ，芳香族Ｈ）、７．３０（ｓ，２Ｈ，芳香族Ｈ）、７．２９〜７．２１（ｍ，１Ｈ，芳香族Ｈ）、３．６８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４））、３．５０（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２）、２．７５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６，４．０Ｈｚ，ＨＡ−Ｃ（２），ＨＡ−Ｃ（６））、２．１４（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１２．２，２．８Ｈｚ，ＨＢ−Ｃ（２），ＨＢ− Ｃ（６））、１．９１〜１．８２（ｍ，２Ｈ，ＨＡ−Ｃ（３）， ＨＡ−Ｃ（５））、１．７８（ｓ，ｂｒ．，１Ｈ，ＯＨ）、１．６４〜１．５２ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ，ＨＢ−Ｃ（３），ＨＢ−Ｃ（５））
【０１００】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１３８．４１（ｓ）、１２９．０８（ｄ）、１２８．１５（ｄ）、１２６．９５（ｄ）（芳香族Ｃ）；６８．０７（ｄ，Ｃ−４）；６２．９２（ｔ，ＰｈＣＨ２）；５０．９９（ｔ，Ｃ−（２），Ｃ−（６））；３４．４９（ｔ，Ｃ−（３），Ｃ−（５））
【０１０１】
ＭＳ（８０ｅＶ）：ｍ／ｅ１９２（１００％，Ｍ＋１）
【０１０２】
【実施例１０】
１リットル規模におけるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の休止している細胞（１０．２グラム）でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【０１０３】
Ｎ−ベンジルピペリジン（２．６３グラム、１５ミリモル）が、３リットルのバイオリアクター中で、グルコース（２％、ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ８．０）の１リットル中のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞縣濁物（１０．２グラム／リットル）に加えられた。該混合物は２リットル／分における空気導入の下、１５００ｒｐｍ及び３０℃で攪拌された。バイオトランスホーメーションは、Ｎ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへの９８％転化率を伴って５．２時間で停止された。標準作成手順は、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）及びメタノール／酢酸エチル（２０／８０）を用いる酸化アルミニウムでのカラムクロマトグラフィーに供されたところの未精製の生成物（９８％純度）を与えた。これは、白色粉末として２．０７グラム（７２％）の純粋なＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【０１０４】
【実施例１１】
１リットル規模におけるＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の成長している細胞でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【０１０５】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の細胞が、１リットルのＥ２培地中でまずグルコースそして次いでｎ−オクタン上で６．２グラム／リットルの細胞密度に成長された。Ｎ−ベンジルピペリジン（０．８７５グラム、５ミリモル）が加えられ、そして該混合物が２リットル／分における空気導入の下、１５３６ｒｐｍ及び３０℃で攪拌された。ｎ −オクタン蒸気がバイオ転化の間に更に導入され、そして細胞が成長された。追加の基質が３０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）、６０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）、及び９０分間（０．８７５グラム、５ミリモル）において加えられた。該反応の後に分析用ＨＰＬＣが続き、かつＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンへの８５％転化率を伴って２時間で停止された。標準作成手順及び酢酸エチル／ヘキサン（１：１）及びメタノール／酢酸エチル（２０／８０）を用いる酸化アルミニウムでのカラムクロマトグラフィーは２．８６６グラム（７５％）の純粋な生成物を与えた。
【０１０６】
【実施例１２】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＨＸＮ−２００の無細胞抽出物でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンの製造
【０１０７】
ＨＸＮ−２００の細胞が、２０グラム／リットルの密度に１０ミリリットルのトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．５）中に縣濁された。フレンチプレスを３回通過した後、細胞破片は４５分間、４５０００ｒｐｍで遠心分離（Ｒｏｔｏｒ　Ｔｙｐｅ　５０．２　Ｔｉ）により取り除かれて、膜たんぱく質を含まない可溶性の無細胞抽出物をもたらした。この無細胞抽出物に、ＮＡＤＨ（５００ミリモルの水性溶液の１００マイクロモル、０．０５ミリモル）及びＮ−ベンジルピペリジン（８．８ミリグラム、０．０５ミリモル）が加えられた。該混合物は１時間、２００ｒｐｍ及び３０℃で振とうされて、９０％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンを与えた。
【０１０８】
【実施例１３】
シクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５の休止している細胞でのＮ−ベンジルピペリジンのヒドロキシル化によるＮ−ベンジル−４−ヒドロキシピペリジンの製造
【０１０９】
（Ｌｉ，Ｚ．及びＤｅｕｔｚ，Ｗ．，ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈにより単離された、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＥＴＨ　Ｚｕｒｉｃｈの菌株収集物中にある）シクロヘキサンを分解する菌株ＬＤ−５は、炭素源なしに１／４のＥｖａｎｓ培地中で接種されかつ３日間、室温で空気により１０倍に希釈されたシクロヘキサンの蒸気において成長された。細胞は、グルコース（２％ｗ／ｖ）を含む５０ミリモルのＫ−ホスフェートバッファー（ｐＨ７．２）中で５グラム／リットルに集められかつ再縣濁された。Ｎ−ベンジルピペリジンは５ミリモルの濃度まで加えられ、かつ該混合物は２時間、３０℃で振とうされた。６０％のＮ−ベンジル４−ヒドロキシピペリジンが与えられた。
【国際公開パンフレット】
2004508831.tif 000008
2004508831.tif 000009
2004508831.tif 000010
2004508831.tif 000011
2004508831.tif 000012
2004508831.tif 000013
2004508831.tif 000014
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2004508831.tif 000016
2004508831.tif 000017
2004508831.tif 000018
2004508831.tif 000019
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2004508831.tif 000022
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2004508831.tif 000026
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2004508831.tif 000028
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2004508831.tif 000031
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2004508831.tif 000033
2004508831.tif 000034
2004508831.tif 000035
【国際調査報告】
2004508831.tif 000036
2004508831.tif 000037
2004508831.tif 000038
2004508831.tif 000039