(57)【要約】本発明は修飾されたオリゴヌクレオチドの製造および結合反応へのそれらの使用に関する。本発明はさらにアセタールとして保護されたアルデヒドを含むアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドを製造するための試薬および方法に関する。前記アセタールはいったんオリゴヌクレオチドに結合すれば、オリゴヌクレオチドはアルデヒドに変換し、結合に使用される。結合反応は遊離オリゴヌクレオチドまたは基質上に固定されているオリゴヌクレオチドにより行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌ、ｖはお互いに独立して０または１であり、そしてａは１ないし５の整数である、式（Ｉ）の反応性単量体：
【化１】
2004500403.tif 000016
式中、
Ｘはオリゴヌクレオチド合成に適切な反応性リン含有基であり、
Ｖは少なくとも３つの結合パートナーを有する、原子または分子からなる分枝単位であり、
Ａは式（ＩＶ）のアセタールであり：
【化２】
2004500403.tif 000017
ここでラジカルＹおよびＺはお互いに独立して同一であるか、または異なって分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和もしくは不飽和の１から１８までの炭素原子を有する炭化水素であり、ラジカルＹおよびＺはお互いに結合することも可能であり、
そして式中、
ＬはＸをＡにまたはＸをＶに、そしてＶをＡに結合するために適切なリンカーである。
【請求項２】
リン含有基Ｘがホスホロアミダイト（ＩＩ）またはホスホネート（ＩＩＩ）である、請求項１に記載の反応性単量体：
【化３】
2004500403.tif 000018
式中、Ｒ２およびＲ３はお互いに独立してアルキルラジカルであり、該アルキルは分枝しているか、もしくは分枝していないＣ１からＣ５までのラジカルであり、好ましくはイソプロピルであり、そしてＲ１はメチル、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、または好ましくはβ−シアノエチル（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）である。
【請求項３】
分枝単位Ｖが窒素原子、炭素原子またはフェニル環である、請求項１または２に記載の反応性単量体。
【請求項４】
ラジカルＹおよびＺがお互いに独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、２−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、とりわけ好ましくはエチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の反応性単量体。
【請求項５】
ＹおよびＺが一緒になって構造（Ｖ）または（ＶＩ）のラジカルである請求項１から３のいずれかに記載の反応性単量体：
【化４】
2004500403.tif 000019
式中、置換基Ｒ４はお互いに独立してＨ、メチル、フェニル、分枝しているか、分枝していないかもしくは環状で、飽和、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素、または構造（ＶＩＩ）のラジカルであり、
【化５】
2004500403.tif 000020
そして置換基Ｒ５はお互いに独立してＨ、メチル、アルキル、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、またはアルキルであり、アルキルは分枝しているか、分枝していないかもしくは環状で、飽和、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素ラジカルである。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の反応性単量体であって、
式中、リンカーＬは分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和されているか、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素、好ましくは（ＣｎＨ２ｎ）アルキルラジカル（式中、ｎは０ないし１８，好ましくは３ないし８の整数である）であるか、またはポリエーテル−（ＣＨ２）ｋ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｍ］ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｋ、ｍ、ｐはお互いに独立して０ないし４、好ましくは２の整数であり、そしてｏは０ないし８まで、好ましくは２ないし４の整数である）であるか、またはアミン−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｕ−（式中、ｗおよびｕはお互いに独立して０ないし１８、好ましくは３ないし６の整数である）であるか、またはアミド−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−（ＣＨ２）ｒ−もしくは−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｑおよびｒはお互いに独立して０ないし１８、好ましくは１ないし５の整数である）であり、リンカーＬは酸素ブリッジによりＶに結合することも可能である。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項以上に記載の、以下の構造式：
【化６】
2004500403.tif 000021
【化７】
2004500403.tif 000022
【化８】
2004500403.tif 000023
【化９】
2004500403.tif 000024
を有する反応性単量体。
【請求項８】
少なくとも１アセタール基により修飾されている、モノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１つの式（Ｉ）の反応性単量体をモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドの末端にを結合することにより得られる、請求項８に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１０】
式ＶＩＩＩ：
【化１０】
2004500403.tif 000025
に対応する請求項８および９のいずれかに記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド：
式中、（Ｍ）ｓはいずれかの配列のｓ単量体単位であり、ここでｓは１以上であり、（Ｍ）ｓは分枝していても、または分枝していなくてもよく、そしてＸ′は式（ＩＸ）：
【化１１】
2004500403.tif 000026
のリン含有基であり、モノ、オリゴまたはポリヌクレオチドの末端に結合し、
式中、ＵはＯまたはＳ、ＷはＯＨ、ＳＨまたはＨであり、そしてＱはＯまたはＮＨであり、そして式中ｚは１以上であり、ｌ、ｖ、ａ、Ｌ、ＶおよびＡは先に記載した意味を有する。
【請求項１１】
ランダム配列中の天然に存在するヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ、および／またはランダム配列中の非天然ヌクレオチド、例えば化学的に修飾されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはホスホロジチオエート、メチルホスホネート、２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、２′−Ｏ−アリルＲＮＡ、２′−フルオロＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡｐ−ＲＮＡ、ホモＤＮＡ、ｐ−ＤＮＡ、ＣＮＡを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖が２から１０，０００単量体単位、好ましくは５から３０単量体単位を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１３】
共有結合により、または安定して非共有結合的により結合した分子部分、好ましくは蛍光染料、ペプチド、蛋白質、抗体、ポリマー、アプタマー、有機分子、無機分子、他のオリゴもしくはポリヌクレオチド、および／または被覆されているか、もしくは被覆されていない固体の支持物質の共有結合的に、または安定して非共有結合的に結合した表面を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１４】
少なくとも１アルデヒド基により修飾されていて、ヌクレオチド鎖がｐ−ＲＮＡ、ホモ−ＤＮＡ、ｐ−ＤＮＡまたはＣＮＡを含む、モノ、オリゴ、およびポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の反応性単量体をオリゴヌクレオチドにカップリングすること、および
ｂ）アルデヒドを生成するために酸または光で処理することを含む、アルデヒドにより修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドを製造するための方法。
【請求項１６】
アルデヒド基をさらなる結合反応、好ましくはアミン、ヒドラジンと、または末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、有機分子と結合反応させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴまたはポリヌクレオチドの製造が完全に、または部分的に固相オリゴヌクレオチド合成の条件下で行われる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴもしくはポリヌクレオチド合成、またはオリゴもしくはポリヌクレオチド複製のための、とりわけホスホロアミダイト法またはＰＣＲにおける、請求項１から７のいずれか一項に記載の反応性単量体、または請求項８から１３のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
【請求項１９】
請求項１６に記載の結合反応のための請求項１４に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのアセタールまたはアルデヒド基により修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそのような修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを製造するための方法、およびそれらに必要な新規単量体ビルディングブロックに関する。
【０００２】
アルデヒドは、例えば、生体分子に例えば、蛍光団、レポーター基、蛋白質、核酸および他の生体分子、小分子（例えば、ビオチン）を結合させるためか、さもなければ表面に生体分子を固定するために使用される反応性基である（例として：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　１９９６；Ｔｉｍｏｆｅｅｖ，Ｅ．Ｎ．；Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｖ．；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．；Ｆｌｏｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２４（１９９６）３１４２を参照されたい）。蛋白質も核酸もそれらの天然の形状ではアルデヒドを有することができないので、後者は生体分子の特殊な修飾にとりわけ適切である。糖質は本質的にアルデヒドであるが、たいていは（環状）アセタールまたはヘミアセタールとして存在し、そしてこの形状ではどちらも典型的なアルデヒド反応性を有しない。したがって、それらは同様にアルデヒドとの指向性結合に使用することができる。生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の例は、図１の反応ＡおよびＢに記載されている。
【０００３】
現在、オリゴヌクレオチドにアルデヒドを導入する種々の方法が利用可能であり、それらのすべてはアルデヒドまたはビス−アルデヒドを得るための過ヨウ素酸ナトリウムによるビシナルジオールの酸化に基づく。
【０００４】
初めに、３′−末端リボヌクレオチドを使用したオリゴヌクレオチドの酸化について記載する（このことについては、Ｔｉｍｏｆｅｅｖ，Ｅ．Ｎ．Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｖ．；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．；Ｆｌｏｒｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４（１９９６）３１４２；Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．；Ｂａｙａｒｄ，Ｂ．；Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１９８７）６４８）を参照されたい）。このようにして、オリゴヌクレオチドの３′−末端を形成するリボヌクレオチドは過ヨウ素酸塩により酸化されてビス−アルデヒドが得られる。このアルデヒドは次にアミンまたはヒドラジドと共に環状付加物（モルホリン構造）を形成し、それを結合に使用することができる。
【０００５】
この方法は、オリゴヌクレオチドの３′−末端のヌクレオチドがいつも結合のために犠牲にならなければならないという決定的な不利益を有する。さらに、この方法はオリゴヌクレオチドと結合パートナー間の距離を変化させる可能性を提供しない。
【０００６】
第２の可能性は、保護されたビシナルジオールのホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合させることである（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．；Ｂａｙａｒｄ，Ｂ．；Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１９８７）６４８）。ここで、保護されたビシナルジオール基を有する、特に製造されたビルディングブロックはオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合する。オリゴヌクレオチドを合成、脱保護および後処理すると、過ヨウ素酸塩により同様に酸化されることでアルデヒドが得られる、ビシナルジオール基が現れる。
【０００７】
さらに、アルデヒド基をオリゴヌクレオチドに導入するための側鎖上に保護されたビシナルジオールを有する、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の使用は最先端の技術である（Ｄｅｃｈａｍｐｓ，Ｍ．；Ｓｏｎｖｅａｕｘ，Ｅ．，Ｎｕｃｒｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１４（１９９５）８６７；Ｄｅｃｈａｍｐｓ，Ｍ．；Ｓｏｎｖｅａｕｘ，Ｅ．，Ｎｕｃｒｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１７（１９９８）６９７；Ｔｒｅｖｉｓｉｏｌ，Ｅ．：Ｒｅｎａｒｄ，Ａ．；Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｅ．；Ｌｈｏｍｍｅ，Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３８（１９９７）８６８７）。しかし、この方法はかなり複雑な合成を必要とする。
【０００８】
３種すべての方法では共通して、過ヨウ素酸ナトリウムによりビシナルジオールを酸化することにより、アルデヒドが生成されなければならない。この試薬はその後、結合反応の前に除去されなければならない。さらに、この方法は他の過ヨウ素酸塩に酸化されることが可能な基を有する分子には適用できない。したがって、例えばＲＮＡ鎖の５′−末端を、オリゴヌクレオチドの３′−末端が酸化されることなく、特異的に修飾することも不可能である。
【０００９】
このことは、過ヨウ素酸塩に酸化されることなしにアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドを得るには代わりとなる方法が必要であるということに帰着する。
【００１０】
さらに、アルデヒドは反応種であるため、それらの貯蔵安定性は無制限ではないということを考慮にいれなければならない。とりわけ、空気中での自然酸化はそれらの分解を導く。したがって、アルデヒドは使用の直前に製造することが好都合である。この点に関して、できるだけ簡単で容易に実施可能で、あまり複雑でなく、貯蔵が安定な反応物質から出発する、それらの製造のための方法が好都合であろう。
【００１１】
したがって、本発明の目的はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成の条件に一致する反応性単量体を提供すること、および扱い易く、アルデヒド基を含む対応する誘導体に容易に変換することができる、修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドを製造し、提供することである。
【００１２】
かかる目的は、貯蔵が非常に容易で、アルデヒドに修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドの容易な入手法である、新規単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにより達成される。さらに、本発明の単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、オリゴおよびポリヌクレオチド合成、および例えば、ホスホロアミダイト法またはＰＣＲのようなオリゴおよびポリヌクレオチド複製のための標準法の条件、ならびに共通の保護基の導入および除去のための反応条件に安定である。
【００１３】
したがって、本発明は式（Ｉ）：
【００１４】
【化１２】
2004500403.tif 000002
【００１５】
の反応性単量体に関し、式中ｌ、ｖはお互いに独立して０または１であり、およびａは１ないし５、好ましくは１ないし３の整数であり、
そして式中
Ｘは例えば、お互いに独立してアルキルであるＲ２およびＲ３を有するホスホロアミダイト（ＩＩ）またはホスホネート（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化１３】
2004500403.tif 000003
【００１７】
のような、オリゴヌクレオチド合成のための反応性リン含有基であり、
式中、アルキルは分枝しているか、もしくは分枝していないＣ１からＣ５ラジカル、好ましくはイソプロピルであり、そしてＲ１はメチル、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、または好ましくはβ−シアノエチル（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）であり、
そして式中、
Ｖは少なくとも３種の結合パートナー、例えば、原子または原子基、好ましくは窒素原子、炭素原子またはフェニル環を有する分枝単位であり、
そして式中、Ａは式（ＩＶ）：
【００１８】
【化１４】
2004500403.tif 000004
【００１９】
のアセタールであり、
ここでＹおよびＺはお互いに独立して、同一であるかまたは異なって、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、Ｃ１からＣ１８までの炭化水素、好ましくはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、２−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、とりわけ好ましくはエチルであるか、または式中ＹおよびＺが一緒に構造（Ｖ）または（ＶＩ）のラジカルであり、ここでＲ４はお互いに独立して同一であるか、または異なり、そしてそれはＨ、メチル、フェニル、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、Ｃ１からＣ１８までの炭化水素、または構造（ＶＩＩ）のラジカルであり、そしてＲ５は同一であるかまたは異なり、そしてＨ、メチル、アルキル、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、またはアルキルであり、ここでアルキルは分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、Ｃ１からＣ１８までの炭化水素であり、
【００２０】
【化１５】
2004500403.tif 000005
【００２１】
そして式中、
Ｌは、例えば、分枝しているかまたは分枝していないか、飽和または不飽和で、適切ならば環状の、Ｃ１からＣ１８までの炭化水素、例えばアルキル−（ＣｎＨ２ｎ）−（式中、ｎは０ないし１８，好ましくは３ないし８の整数である）であるか、またはポリエーテル−（ＣＨ２）ｋ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｍ］ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｋ、ｍ、ｐはお互いに独立して０ないし４、好ましくは２の整数であり、そしてｏは０ないし８、好ましくは２ないし４の整数である）であるか、またはアミン−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−（式中、ｗおよびｕはお互いに独立して０ないし１８、好ましくは３ないし６の整数である）であるか、またはアミド−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−（ＣＨ２）ｒ−もしくは−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｑおよびｒはお互いに独立して０ないし１８、好ましくは１ないし５の整数である）である、ＸとＡまたはＸとＶおよびＶとＡの結合に適切なリンカーである。この点に関して、リンカーＬは酸素原子により分枝単位Ｖに結合していてもよい。
【００２２】
この種の反応性単量体の個々の好ましい例としては：
【００２３】
【化１６】
2004500403.tif 000006
【００２４】
【化１７】
2004500403.tif 000007
【００２５】
【化１８】
2004500403.tif 000008
【００２６】
が挙げられる。
本発明はさらに、少なくとも１つのアセタール基により修飾されている、いずれかの配列のモノ、オリゴおよびポリヌクレオチドにも関する。
【００２７】
少なくとも１つの式（Ｉ）の本発明の反応性単量体を使用することにより得ることができるモノ、オリゴ、およびポリヌクレオチドがとりわけ好ましい。
得ることができる例としては、ランダム配列を有し、そして少なくとも１つのアセタール基により修飾されている式ＶＩＩＩの物質が挙げられ、
【００２８】
【化１９】
2004500403.tif 000009
【００２９】
式中（Ｍ）ｓはｓが１以上である、お互いに結合したｓ単量体単位であり、Ｘ′は式（ＩＸ）
【００３０】
【化２０】
2004500403.tif 000010
【００３１】
（式中ＵはＯまたはＳであり、ＷはＯＨ、ＳＨまたはＨであり、そしてＱはＯまたはＮＨである）のリン含有基であり、そしてｚは１以上であり、
そしてｌ、ｖ、ａ、Ｌ、ＶおよびＡは先に記載した意味を有する。
【００３２】
本発明の反応性単量体を好ましくはＸ′のホスホジエステル、Ｈ−ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデート基によりモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドに結合すると
【００３３】
【化２１】
2004500403.tif 000011
【００３４】
を形成する。
この点に関して、式（Ｉ）の反応性単量体をとりわけ末端に結合することができる。したがって、ｚはヌクレオチド鎖の分枝の程度に依存し、好ましくは１ないし１０，そしてとりわけ好ましくは１または２である。本発明の別の利点は反応性単量体を選択的にＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチドの３′および／または５′末端に、またはｐ−ＤＮＡもしくはｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはｐ−ＤＮＡもしくはｐ−ＲＮＡポリヌクレオチドの２′および／または４′末端に結合するという可能性である。これとは対照的に、遊離ジオール基は過ヨウ素酸塩により反応中に完全に酸化される。
【００３５】
有効なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはすべて天然に存在するか、さもなければ分子認識または対合ができる合成ポリマーであり、そして主にリン酸ジエステルブリッジを含む反復構造を有する。前記分子認識または対合は選択的、安定および可逆的であること、そして例えば温度、ｐＨおよび濃度により影響を受けてもよいという事実により特徴付けられる。例えば、分子認識はそれのみではないが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの規則に従って、プリンおよびピリミジン塩基対合により成し遂げられる。天然に存在するヌクレオチド鎖の例としてはＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡがあり、それらにおいては２−デオキシ−Ｄ−リボースまたはＤ−リボースにＮ−グリコシル結合している複素環塩基を含むヌクレオシドが、リン酸ジエステルにより結合している。非天然オリゴおよびポリヌクレオチドの好ましい例としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡの化学的に修飾された誘導体、例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、メチルホスホネート類、２′−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２′−Ｏ−アリル−ＲＮＡ、２′−フルオロ−ＲＮＡ、それらのＬＮＡ、またはＰＮＡのようなＤＮＡおよびＲＮＡと対合できる分子（Ｓａｎｇｈｉｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｐ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　１９９４）、さもなければｐ−ＲＮＡ、ホモＤＮＡ、ｐ−ＤＮＡ、ＣＮＡ（ドイツ特許第１９７４１７１５号，ドイツ特許第１９８３７３８７号およびＷＯ９７／４３２３２）のような、例えば特定の対合性により分子認識ができる分子が挙げられる。
【００３６】
請求項１に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖長範囲は、好ましくは２から１００００までの単量体単位であり、そして５から３０までの単量体単位の鎖長がとりわけ好ましい。
【００３７】
オリゴまたはポリヌクレオチドを製造するために使用できる適切な単量体単位は、とりわけデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのような天然に存在するヌクレオチドである。しかし、天然に存在しない合成ヌクレオチドを使用することも可能である。
【００３８】
合成単量体単位の好ましい例としては２′−デオキシリボフラノシルヌクレオチド類、リボフラノシルヌクレオシド類、２′−デオキシ−２′−フルオロリボフラノシルヌクレオシド類、２′−Ｏ−メチルリボフラノシルヌクレオシド類、ペントピラノシルヌクレオチド類、３′−デオキシペントピラノシルヌクレオチド類が挙げられる。これらのヌクレオチドに適切な複素環塩基はとりわけ：プリン、２，６−ピアミノプリン、６−プリンチオール、ピリジン、ピリミジン、アデノシン、グアノシン、イソグアノシン、６−チオグアノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、シトシン、イソシトシン、インドール、トリプタミン、Ｎ−フタロイルトリプタミン、ウラシル、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、ベンゾトリアゾールまたはアクリジンおよび、さらに共有結合的に結合した官能基を有する前記複素環体の誘導体も挙げられる。
【００３９】
天然および非天然のアミノ酸、ＰＮＡ単量体およびＣＮＡ単量体のような他の単量体単位を使用することも同様に可能である。
本発明と一致したオリゴおよびポリヌクレオチドはまた、分子認識に必要な単位に加えて、さらに、例えば検出、他の分子単位との結合、表面上もしくは他のポリマー上への固定、スペーシングまたはヌクレオチド鎖の分枝のような他の目的に役立つ分子部分を含む、分子をも含む。それらはとりわけ、オリゴヌクレオチドと蛍光染料、化学ルミネセンス分子、ペプチド、蛋白質、抗体、アプタマー、有機および無機分子との共有結合的、または安定な非共有結合的結合体、および異なる対合様式を有する２以上の対合システムの結合体を意味し、それらの結合体の例としては、ＤＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したｐ−ＲＮＡと、ＲＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したｐ−ＲＮＡ、ＤＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したｐ−ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したｐ−ＤＮＡ、ＤＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したＣＮＡ、ＲＮＡまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したＣＮＡが挙げられる。しかし、例えばガラス、シリコン、プラスチック、金またはプラチナのような支持物質表面上への固定はとりわけ興味深い。表面はまた、１以上の被覆層、好ましくはポリリシン、アガロースまたはポリアクリルアミドのような高分子被覆物を含んでいてもよい。被覆物は複数のスタガード層か、さもなければ配列されていない層を含んでいてもよい。この点において、個々の層は単分子層の形状であってもよい。
【００４０】
本発明に関して、結合は分子、オリゴもしくはポリヌクレオチド、超分子複合体、またはポリマーのような成分と、１以上の他の、異なるもしくは同一の成分との共有結合または非共有結合を意味し、その結果それらは、それらの使用に必要な条件下で、安定な単位、結合体を形成する。この点に関して、結合は必ずしも共有結合である必要はないが、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌｓ相互作用、双極相互作用、とりわけ水素結合、またはイオン相互作用のような超分子力によって行なわれてもよい。
【００４１】
さらに生物学的活性を有する有機または無機分子との結合体はとりわけ興味深い。
この点に関して記載することができる分子としては、医薬品、作物保護剤、錯化剤、酸化還元系、フェロセン系誘導体、レポーターグループ、ラジオアイソトープ、ステロイド、ホスフェート、トリホスフェート、ヌクレオシドトリホスフェート、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）構造の誘導体、遷移状態の類似体、脂質、複素環体、とりわけ窒素複素環体、糖質、分枝しているか、もしくは分枝していないオリゴまたはポリサッカライド、糖蛋白質、糖ペプチド、受容体もしくはその機能的部分、例えば膜結合受容体の細胞外ドメイン、代謝産物、メッセンジャー、病的変化の場合にヒトおよび動物体内で産生される物質、抗体もしくはその機能的部分、例えばＦｖフラグメント、１本鎖ＦｖフラグメントもしくはＦａｂフラグメント、酵素、線維成分、ウイルス、カプシドのようなウイルス成分、ウイロイド、およびそれらの誘導体、例えばアセテート、構造的に異なる化合物の集団のような物質ライブラリー、好ましくはオリゴマーもしくはポリマーペプチド、ペプチドイド、糖質、核酸、エステル、アセタールまたは複素環体のような単量体、脂質、ステロイドもしくは医薬品が作用する構造、好ましくは医薬品受容体、イオンチャンネル、とりわけ電位依存的イオンチャンネル、トランスポーター、酵素または微生物の生合成単位が挙げられる。
【００４２】
本発明は同様にアルデヒドに修飾されたｐ−ＲＮＡおよびｐ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびｐ−ＲＮＡおよびｐ−ＤＮＡポリヌクレオチドに関し、それらは特定のアセタールから、例えば水性酸の手段によるか、または光化学的に容易に製造できる。
【００４３】
アセタールオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造は出発物質として式（Ｉ）のアセタール類を使用することにより達成される。例としては、１以上のアセタール基を有する慣用のホスホロアミダイトを使用することが可能である。これらは固相合成の標準法によりオリゴまたはポリヌクレオチドに統合されてもよい（図２はこれを図に表示する）。
【００４４】
そのようなアセタール基含有反応性単量体ビルディングブロックは、例えばアミノアセタール（２ａ、２ｂ、６）とカプロラクトンを反応させることにより合成される（図３）（例えばＺｈａｎｇ，Ｊ．；Ｙｅｒｇｅｙ，Ａ．；Ｋｏｗａｌａｋ，Ｊ．：Ｋｏｖａｃ，Ｐ．；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　５４（１９９８）１１７８３に記載）。得られたヒドロキシアセタール３ａ、３ｂまたは７は次に、適切なリン試薬との反応により、オリゴヌクレオチド合成のための反応性単量体に変換される（この例としては、Ｉ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４９（１９９３）を参照されたい）。
【００４５】
代わりとなるものとしては、適切なヒドロキシアセタールをＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ反応によりそのハライドから、またはアセタール化によりヒドロキシアルデヒドおよびアルコール成分から製造することが可能である。その後、反応型への変換は再び対応するリン試薬との反応により行われる。
【００４６】
Ｏ−ニトロフェニル基を有する環状アセタールもとりわけ興味深い、なぜなら、それらは酸だけでなく、光の照射によりアルデヒドに変換できるからである。
その後、アセタールはオリゴヌクレオチド固相合成の標準法に従ってオリゴヌクレオチドに結合される（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．；Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔａｈｅｄｒｏｎ　４９（１９９３）６１２３；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ａ．Ｄ．；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｄｏｄｄｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ｆ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．；Ｓｔａｂｉｎｋｓｙ，Ｚ．；Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４（１９８７）２８７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．；Ｂｅａｔｏｎ，Ｇ．；Ｗｕ，Ｊ．Ｖ．；Ｗｉｅｓｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１（１９９２）３）。
【００４７】
アセタールは、例えばホスホロアミダイト法のような一般的なオリゴヌクレオチド合成法のすべての反応条件に不活性である。
したがって、例えばテトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、塩酸ピリジニウムなどによる活性化、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールによるキャッピング、例えばヨウ素／水による酸化に対して不活性である。それらは同様に、ピバロイルクロリドによる活性化のような、Ｈ−ホスホネート法の反応条件に不活性である。
【００４８】
さらに、アセタールはオリゴヌクレオチド脱保護のための塩基性反応条件に安定である。それらは慣例的に使用される濃縮水性アンモニア溶液（５５℃、２〜１０時間）に損なわれずに耐え、特定の場合に使用される代わりとなる試薬（エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン）のいずれにも攻撃されない（Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｒ．Ｉ．；Ｖｇｈｅｆｉ，Ｍ．Ｍ．；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｍ．Ａ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｍ．；Ａｒｎｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．Ｊｒ．，Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１（１９９３）２０３１）。
【００４９】
アルデヒド官能基は、アセタールオリゴヌクレオチドを水性酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸など）と反応させることにより、または光の照射（このためには、図２の表示を参照されたい）によりアセタールから容易に遊離される（例としては、実施例８〜１１）。両者の場合、アルデヒドオリゴヌクレオチドを過ヨウ素酸ナトリウムのような試薬から除去することは必要でない。いつも必要ではないが、酸で中和することで十分である。もし酸を中和した塩の量がアルデヒドの変換を妨害するなら、例えばゲル濾過、透析、逆相抽出のような一般的な方法により除去してもよい。
【００５０】
このようにして得られたアルデヒドオリゴまたはポリヌクレオチドは参考文献に記載されたすべての結合反応に使用してもよい（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　１９９６；Ｔｉｍｏｆｅｅｖ、Ｅ．Ｎ．，Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｖ．，Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．：Ｆｌｏｒｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４（１９９６）３１４２）。蛋白質およびペプチド、蛍光染料、他のオリゴヌクレオチドとオリゴおよびポリヌクレオチドの結合、ならびに表面および他のポリマー上にオリゴまたはポリヌクレオチドを固定することはとりわけ興味深い。
【００５１】
さらに、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドは、それらのＮ末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合のための図１のＣに示された反応を使用することを可能にする。この場合、一定のアルデヒドの化学構造とともに、さらに改変が可能なチアゾリジン誘導体が形成される（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．Ａ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６（１９９８）５０６；Ｌｉｕ，Ｃ．−Ｆ．；Ｒａｏ，Ｃ．；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８（１９９６）３０７）。この反応は低い反応物質濃度およびｐＨで起こるという利点を有する。
【００５２】
アルデヒドの保護基としてのアセタールの使用はさらにオリゴまたはポリヌクレオチドを結合するためのとりわけ簡単な方法：支持物質上への結合を可能にする。
【００５３】
この目的のために、オリゴヌクレオチド固相合成の支持物質上に固定されたままの、完全にまたは部分的に保護されたままのアセタールオリゴヌクレオチドまたはアセタールポリヌクレオチドは、対応するアルデヒドオリゴヌクレオチドまたはアルデヒドポリヌクレオチドに変換される。水性酸または光の照射により可能になるこの反応が、支持物質からオリゴまたはポリヌクレオチドを除去しないということは重要である。次に支持物質に結合したアルデヒド−ヌクレオチド鎖を適切な反応パートナーと反応させる（その例として、図１を参照されたい）。その後、オリゴまたはポリヌクレオチド結合体は水性アンモニアまたは代わりの試薬（例えば、エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン）により支持物質から除去され、残りの保護基、ＤＮＡの場合は、例えば塩基の環外アミノ基上のベンゾイルおよびイソブチリル保護基が除去される。図１の例として記載された生成物の場合に、結合反応中に形成される結合が上記の脱保護条件に対して安定なことが前提条件である。支持物質に結合したオリゴまたはポリヌクレオチドの結合反応は、過剰の結合成分および例えば、還元剤のような他の試薬が単純な洗浄により除去できるという利点を有する。したがって、特有の不安定性のために直接オリゴヌクレオチド固相合成が利用できない分子とオリゴまたはポリヌクレオチドの結合体を得ることも可能である。
【００５４】
代表的な態様：
一般的な予備的注意：
特記しない限り、Ａｌｄｒｉｃｈの試薬およびＲｉｅｄｅｌ（ｐ．ａ．）の溶媒を使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はシリカゲル　６０　Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）を含むプレート上で行った。カラム−クロマトグラフィーによる分離はシリカゲル　６０（Ｍｅｒｃｋ、２３０〜４００メッシュ）上で行った。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ　ＤＲＸ　４００スペクトロメーターを使用して４００ＭＨｚで測定し、化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するδ値として表した。ＩＲスペクトルはＧｒａｓｅｂｙ　Ｓｐｅｃａｃ　１０５００　ＡＴＲ　ｕｎｉｔを備えたＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｐａｒａｇｏｎ　１０００ＦＴ−ＩＲを使用して測定した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　８９０５を使用してホスホロアミダイト法に従って製造した。アセタールホスホロアミダイトおよびＤＮＡアミダイトは乾燥アセトニトリル中で０．１Ｍ溶液として使用した。カップリングは活性化剤としてテトラゾールを使用して行った。ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドには、以前に記載した合成条件を使用した（ドイツ特許第１９７４１７１５号）。エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ―ＭＳ）はＦｉｎｎｉｇａｎ　ＬＣＱ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して陰性イオン化モードで測定した。
【００５５】
個々の物質に示された番号付けは図３から５までに使用される数字を表す。
図３は例として、アセタールホスホロアミダイトの合成を記載し、図４は、ＤＮＡアセタールおよびＤＮＡアルデヒドの例を示し、図５はｐ−ＲＮＡアセタールおよびｐ−ＲＮＡアルデヒドの例を示す。
【００５６】
【実施例】
反応性単量体の合成
実施例１：Ｎ−（２，２−ジメトキシエチル）−６−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト］−ヘキサミド　５ａの合成：
２．１９ｇ（１０ｍｍｏｌ、［２１９．２８］）のＮ−（２，２−ジメトキシエチル）−６−ヒドロキシヘキサミド　３ａを５．１７ｇ（４０ｍｍｏｌ、４等量、［１２９．２５］）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（Ｈｕｎｉｇｓ　Ｂａｓｅ）と一緒に４０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解する。２．６ｇ［１１ｍｍｏｌ、１．１等量，［２３６．６８］］モノ（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト　４を１５分かけて滴下して加える。１時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン２：１）は完全な変換を示す。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：１）で溶出し、無色オイルとして化合物　５ａ（Ｃ１９Ｈ３８Ｎ３Ｏ５Ｐ；［４１９．５１］）２．４８ｇ（５９％）を得る。
【００５７】
【化２２】
2004500403.tif 000012
【００５８】
【化２３】
2004500403.tif 000013
【００５９】
実施例２：Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−６−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト］−ヘキサミド　５ｂ：
２．４７ｇ（１０ｍｍｏｌ、［２４７．３４］）のＮ−（２，２−ジエトキシエチル）−６−ヒドロキシヘキサミド　３ｂを５．１７ｇ（４０ｍｍｏｌ、４等量、［１２９．２５］）のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（Ｈｕｎｉｇｓ　Ｂａｓｅ）と一緒に４０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解する。５ｍｌ　ジクロロメタンに溶解した２．６ｇ（１１ｍｍｏｌ、１．１等量，［２３６．６８］）のモノ（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト　４を３０分かけて滴下して加える。さらに３０分後、ＴＬＣ（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン２：１）は完全な変換を示す。溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、残渣は酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）に溶解する。沈殿した塩酸は吸引により濾過し、濾液は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１：１）で溶出し、無色オイルとして化合物　５ｂ（Ｃ２１Ｈ４２Ｎ３Ｏ５Ｐ；［４１９．５１］）２．９６ｇ（６６％）を得る。
【００６０】
【化２４】
2004500403.tif 000014
【００６１】
実施例３：Ｎ−（２，２−ジエトキシブチル）−６−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト］−ヘキサミド　８：
１．７５ｇ（６．３５ｍｍｏｌ、［２７５．３９］）のＮ−（２，２−ジエトキシブチル）−６−ヒドロキシヘキサミド　７を１．６４ｇ（１２．７ｍｍｏｌ、４等量、［１２９．２５］）のＮ−エチルジイソプロピルアミン（Ｈｕｎｉｇｓ　Ｂａｓｅ）と一緒に３０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解する。２ｍｌ　ジクロロメタンに溶解した１．６５ｇ（６．９９ｍｍｏｌ、１．１等量，［２３６．６８］）のモノ（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト　４を４０分かけて滴下して加える。さらに３０分後、ＴＬＣ（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン１０：１）は反応物の完全な消費を示す。反応はメチノールで停止し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去する。残渣は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１０：１）で溶出し、無色オイルとして化合物　８（Ｃ２３Ｈ４６Ｎ３Ｏ５Ｐ；［４７５．６１］）１．８７ｇ（６２％）を得る。
【００６２】
【化２５】
2004500403.tif 000015
【００６３】
アセタールおよびアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドの合成：
アセタールによるアルデヒドの導入はＤＮＡおよびｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの両方に対して示される。図４および５はオリゴヌクレオチドの例の配列を示す。
【００６４】
実施例４：ジエチルアセタール　５ｂ由来のＤＮＡアセタール　９（Ｋ３１９４／３１９６　Ｏ４）
オリゴヌクレオチド合成は装置の製造業者に提供されたプロトコルに従って、１μｍｏｌのスケールで行う。ホスホロアミダイト　５ｂの０．１Ｍ溶液は標準条件下で最後の単量体として結合させる。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドを除去し、２５％水性アンモニア溶液、８０℃、１０時間の処理により脱保護する。支持物質を除去後、溶液を減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解する。オリゴヌクレオチドはＲＰ−ＨＰＬＣカラムにより精製する。カラム：Ｍｅｒｃｋ　ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ　ＲＰ　１８，１０μＭ、分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流速＝１．０ｍｌ／分、セミ分取用：１０ｘ２５０，流速＝３．０ｍｌ／分；バッファー：Ａ：水中、０．１Ｍ  トリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）ｐＨ＝７．０、Ｂ：アセトニトリル／水（９５：５）中、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ｐＨ＝７．０；グラジエント：分析用および分取用分離のために１００分で０％  Ｂから１００％  Ｂ。保持時間  ＤＮＡアセタール  ９：２２．８分；ＭＳ：計算値［６１９３］、実測値［６１９５］
【００６５】
実施例５：ジエチルアセタール　８由来のＤＮＡアセタール　１１（Ｋ３２０８／３２１４／３２１８　Ｏ１６）
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例４に記載のように行う。保持時間　ＤＮＡアセタール　１１：２３．４分；ＭＳ：計算値［６２２２］、実測値［６２２１］
【００６６】
実施例６：ジエチルアセタール　５ｂ由来のｐ−ＲＮＡアセタール　１３（Ｋ３１６８　１６）
オリゴヌクレオチド合成は実施例４に記載のように行う。このプロトコルから逸脱して、ｐ−ＲＮＡにはより長い結合時間および活性化剤塩酸ピリジニウムが使用された。この場合、活性化剤として塩酸ピリジニウムを使用して、アセタールホスホロアミダイトも結合させる。初めに、ジクロロメタン中のジエチルアミン１．５％（ｗ／ｖ）溶液を支持物質に添加し、混合物を暗所で振とうしながら室温で一晩（１５時間）インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２、アセトン、水それぞれについて３回ずつ洗浄する。次にｐ−ＲＮＡをＣＰＧ支持物質から除去し、水性２４％ヒドラジン水和物を４℃で１８時間処理することにより脱保護する。ヒドラジンはＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（０．５ｇ  Ｗａｔｅｒｓ，Ｎｏ．２０５１５；アセトニトリル  １０ｍｌによる活性化、５倍容積のトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファー（ＴＥＡＢ）  ｐＨ＝７．０により希釈されたヒドラジン溶液の結合、ＴＥＡＢによる洗浄およびＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２）によるオリゴヌクレオチドの溶出）を使用して固相抽出により除去する。オリゴヌクレオチド含有画分を合わせ、減圧下で濃縮して乾燥する。分析および分取用精製は実施例４に記載のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより行う。保持時間  ＤＮＡアセタール  １３：２２．０分；ＭＳ：計算値［２７１９］、実測値［２７１８］
【００６７】
実施例７：ジエチルアセタール　８由来のｐ−ＲＮＡアセタール　１５（Ｋ３２０８／３２１４／３２１８　Ｏ１６）
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例６に記載のように行う。保持時間　ｐ−ＲＮＡアセタール　１５：２４．０分；ＭＳ：計算値［２７４７］、実測値［２７４７］
アセタールオリゴヌクレオチドからアルデヒドオリゴヌクレオチドへの変換
一般的プロトコル：
アセタールオリゴヌクレオチドは水に溶解し、過剰の水性酸（例えばＨＣｌ）と混合する。このようにして得られた反応溶液中のオリゴヌクレオチド濃度は通常２０および６０μＭであり、大過剰の酸（５ｘ１０４ｍｏｌ等量）が使用される。溶液は室温でインキュベートし、反応の進行はＨＰＬＣでモニターする。アセタールオリゴヌクレオチドの完全な変換後、溶液を水性ＮａＯＨで中和する。このようにして得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液は直接結合反応に使用するか、またはゲル濾過もしくは固相抽出のような常法により脱塩してもよい（実施例６参照）。
【００６８】
実施例８：ＤＮＡアセタール　９由来のＤＮＡアルデヒド　１０
２６ｎｍｏｌのアセタール　１０は１ｍｌの１Ｍ水性ＨＣｌと混合し、室温で６．５時間インキュベートする。反応の進行は実施例４で示された条件下で、ＲＰ−ＨＰＬＣにより追跡できる。酸は１Ｎ　水性ＮａＯＨを添加することにより中和する。このようにして得られたＤＮＡ−アルデヒド溶液は直接結合反応に使用するか、またはＲＰ−ＨＰＬＣにより精製してもよい。保持時間　ＤＮＡアルデヒド１０：２０．６分。
【００６９】
実施例９：ＤＮＡアセタール　１１由来のＤＮＡアルデヒド　１２
１２０ｎｍｏｌのアセタール　１１は実施例８に記載のように２ｍｌの１Ｍ　水性ＨＣｌと反応させ、ＤＮＡアルデヒド　１２を得る。保持時間　２１．５分；ＭＳ：計算値：［６１４８］、実測値：［６１４７］。
【００７０】
実施例１０：ＤＮＡアセタール　１３由来のｐ−ＲＮＡアルデヒド　１４
１６ｎｍｏｌのアセタール　１３は実施例８に記載のように４００μｌの０．５Ｍ　水性ＨＣｌと反応させ、ＤＮＡアルデヒド　１４を得る。保持時間　１９．２分；ＭＳ：計算値：［２６４５］、実測値：［２６４５］。
【００７１】
実施例１１：ＤＮＡアセタール　１５由来のｐ−ＲＮＡアルデヒド　１６
５０ｎｍｏｌのアセタール　１５は実施例８に記載のように１ｍｌの１Ｍ　水性ＨＣｌと反応させ、ＤＮＡアルデヒド　１６を得る。保持時間　２０．０分；ＭＳ：計算値：［２６７３］、実測値：［２６７２］。
【００７２】
アルデヒドオリゴヌクレオチドの結合反応：
一般的プロトコルＡ（溶液中の結合）：
（Ｉ）ヒドラジンまたはアミン（５〜２０ｍＭ）の溶液１０μＬおよび１００ｍＭ　水性ＮａＣＮＢＨ４溶液１０μＬを酢酸バッファー（ｐＨ５）で５００μＬに希釈する。これに、数μＬの水に溶解した１〜５ｎｍｏｌのアルデヒドオリゴヌクレオチドを添加する。室温で２時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体をＨＰＬＣにより精製する。
（ＩＩ）代わりとして、酸を中和することにより得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液（ｃｆ．３．１．３）を１００ｍｏｌｅ等量のヒドラジドまたはアミンおよび１０００ｍｏｌｅ等量のＮａＣＮＢＨ４と混合してもよい。混合物は必要ならば、酢酸バッファーｐＨ５で希釈する。室温で２時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体はＨＰＬＣにより精製する。
【００７３】
一般的プロトコルＢ（固相上の結合）：
初めに、アセタールオリゴヌクレオチドは実施例４および実施例６に記載のように固相合成により製造する。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドは次にジクロロメタン中のジエチルアミン１．５％（ｗ／ｖ）溶液と初めに混合し、暗所で振とうしながら室温で一晩（１５時間）インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒：ＣＨ２Ｃｌ２、アセトン、水それぞれについて３回ずつ洗浄する。支持物質に結合したアセタールオリゴヌクレオチドは、支持物質を０．１から１Ｍの水性酸（例えばＨＣｌ）で２時間、室温で処理することにより、支持物質に結合したアルデヒドオリゴヌクレオチドに変換する。次に濾液が中性になるまで水で洗浄する。結合反応のために、数時間、室温で振とうしながら、酢酸バッファー中のヒドラジドまたはアミンおよびＮａＣＮＢＨ４とのインキュベーションを行う。次に結合体を支持物質から除去し、ヒドラジンまたはアンモニアによる処理により脱保護する（実施例４および６参照）。後処理および精製は実施例６に記載のように行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アルデヒドオリゴヌクレオチドの反応を示した図である。ＡおよびＢは、生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の反応例であり、Ｃは、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドのＮ末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合反応の例である。
【図２】図２は、アセタールからのアルデヒドオリゴヌクレオチドの製造についての反応経路を示す図である。
【図３】図３は、アセタールホスホロアミダイトの合成についての反応経路を示す図である。
【図４】図４は、ＤＮＡアセタールおよびＤＮＡアルデヒドの例を示す図である。
【図５】図５は、ｐ−ＲＮＡアセタールおよびｐ−ＲＮＡアルデヒドの例を示す図である。
【図１】
2004500403.tif 000027
【図２】
2004500403.tif 000028
【図３】
2004500403.tif 000029
【図４】
2004500403.tif 000030
2004500403.tif 000031
【図５】
2004500403.tif 000032
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【国際公開パンフレット】
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2004500403.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】平成14年1月14日(2002.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌ、ｖはお互いに独立して０または１であり、そしてａは１ないし５の整数である、式（Ｉ）の反応性単量体：
【化１】
2004500403.tif 000072
式中、
Ｘはホスホロアミダイト（ＩＩ）であり、
【化２】
2004500403.tif 000073
式中、Ｒ２およびＲ３はお互いに独立して分枝しているか、分枝していないＣ１からＣ５までのアルキルラジカルであり、そしてＲ１はメチル、アリルまたはβ−シアノエチルであり、
Ｖは少なくとも３つの結合パートナーを有する、原子または分子からなる分枝単位であり、
Ａは式（ＩＶ）のアセタールであり：
【化３】
2004500403.tif 000074
ここでラジカルＹおよびＺはお互いに独立して同一であるか、または異なって分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和もしくは不飽和の、１から１８までの炭素原子を有する炭化水素であり、ラジカルＹおよびＺはお互いに結合することも可能であり、
そして式中、
ＬはＸをＡにまたはＸをＶに、そしてＶをＡに結合するために適切なリンカーである。
【請求項２】
リン含有基Ｘがホスホロアミダイト（ＩＩ）である、請求項１に記載の反応性単量体：
式中、Ｒ２およびＲ３はお互いに独立してイソプロピルラジカルである。
【請求項３】
分枝単位Ｖが窒素原子、炭素原子またはフェニル環である、請求項１または２に記載の反応性単量体。
【請求項４】
ラジカルＹおよびＺがお互いに独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、２−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルである請求項１から３のいずれか一項に記載の反応性単量体。
【請求項５】
ＹおよびＺが一緒になって構造（Ｖ）または（ＶＩ）のラジカルである請求項１から３のいずれかに記載の反応性単量体：
【化４】
2004500403.tif 000075
式中、置換基Ｒ４はお互いに独立してＨ、メチル、フェニル、分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素、または構造（ＶＩＩ）のラジカルであり、
【化５】
2004500403.tif 000076
そして置換基Ｒ５はお互いに独立してＨ、メチル、アルキル、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、またはアルキルであり、アルキルは、分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素ラジカルである。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の反応性単量体であって、
式中、リンカーＬは分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和、もしくは不飽和のＣ１からＣ１８までの炭化水素からなる基、またはポリエーテル−（ＣＨ２）ｋ−〔Ｏ−（ＣＨ２）ｍ〕ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｋ、ｍ、ｐはお互いに独立して０ないし４の整数であり、そしてｏは０ないし８の整数である）である基、またはアミン−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−（式中、ｗおよびｕはお互いに独立して０ないし１８の整数である）である基、またはアミド−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−（ＣＨ２）ｒ−もしくは−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｑおよびｒはお互いに独立して０ないし１８の整数である）である基からなるグループから選択され、リンカーＬは酸素ブリッジによりＶに結合することも可能である。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の反応性単量体であって、
式中、リンカーＬは（ＣｎＨ２ｎ）−アルキルラジカル（式中、ｎは１ないし１８の整数である）からなる基、またはポリエーテル−（ＣＨ２）ｋ−〔Ｏ−（ＣＨ２）ｍ〕ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−（式中、ｋ、ｍ、ｐはお互いに独立して２であり、そしてｏは２ないし４の整数である）である基、またはアミン−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−（式中、ｗおよびｕはお互いに独立して３ないし６の整数である）である基、またはアミド−（ＣＨ２）ｑ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ−（ＣＨ２）ｒ−もしくは−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｒ−（式中、ｑおよびｒはお互いに独立して１ないし５の整数である）である基からなるグループから選択され、リンカーＬは酸素ブリッジによりＶに結合することも可能である。
【請求項８】
以下の構造：
【化６】
2004500403.tif 000077
【化７】
2004500403.tif 000078
【化８】
2004500403.tif 000079
を有する、請求項１から７のいずれか一項以上に記載の反応性単量体。
【請求項９】
少なくとも一つの式（Ｉ）の１反応性単量体：
【化９】
2004500403.tif 000080
をモノ、オリゴ、またはポリヌクレオチドの末端に結合することにより得られるモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド：
式中、ｌ、ｖはお互いに独立して０または１であり、そしてａは１ないし５の整数であり、ここで
Ｘはホスホロアミダイト（ＩＩ）またはホスホネート（ＩＩＩ）：
【化１０】
2004500403.tif 000081
であり、式中Ｒ２およびＲ３はお互いに独立して、分枝しているか、もしくは分枝していないＣ１からＣ５までのアルキルラジカルであり、そしてＲ１はメチル、アリル、またはβ−シアノエチルであり、
Ｖは少なくとも３つの結合パートナーを有する、原子または分子からなる分枝単位であり、
Ａは式（ＩＶ）：
【化１１】
2004500403.tif 000082
のアセタールであり、ここでラジカルＹおよびＺはお互いに独立して同一であるか、または異なって分枝しているか、分枝していない、もしくは環状で、飽和もしくは不飽和の、１から１８までの炭素原子を有する炭化水素であり、ラジカルＹおよびＺはお互いに結合することも可能であり、
そして式中、
ＬはＸをＡにまたはＸをＶに、そしてＶをＡに結合するために適切なリンカーである。
【請求項１０】
式ＶＩＩＩに対応する請求項９に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド：
【化１２】
2004500403.tif 000083
式中、（Ｍ）ｓはいずれかの配列のｓ単量体単位であり、ここでｓは１以上であり、（Ｍ）ｓは分枝していても、分枝していなくてもよく、そしてＸ′は式（ＩＸ）：
【化１３】
2004500403.tif 000084
のリン含有基であり、モノ、オリゴまたはポリヌクレオチドの末端に結合し、
式中、ＵはＯまたはＳ、ＷはＯＨ、ＳＨまたはＨであり、そしてＱはＯまたはＮＨであり、そして式中ｚは１以上であり、ｌ、ｖ、ａ、Ｌ、ＶおよびＡは先に記載した意味を有する。
【請求項１１】
いずれかの配列の天然に存在するヌクレオチドおよび／または非天然のヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または化学的に修飾されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの形状のヌクレオチドを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、２′−Ｏ−アリルＲＮＡ、２′−フルオロＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡｐ−ＲＮＡ、ホモＤＮＡ、ｐ−ＤＮＡ、ＣＮＡヌクレオチドからなる基由来の非天然ヌクレオチドを含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項９に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖が２から１０，０００単量体単位を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項９に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖が５から３０単量体単位を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１６】
蛍光染料、ペプチド、蛋白質、抗体、ポリマー、アプタマー、有機分子、無機分子、他のオリゴまたはポリヌクレオチドからなる基由来の、共有結合的により、または安定な非共有結合的により結合した分子部分、および／または被覆されているか、または被覆されていない固体の支持物質の共有結合的に、または安定な非共有結合的に結合した表面を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも１つのアルデヒド基により修飾されていて、およびヌクレオチド鎖がｐ−ＲＮＡ、ホモＤＮＡ、ｐ−ＤＮＡ、またはＣＮＡを含む、モノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載の反応性単量体をオリゴヌクレオチドにカップリングすること、および
ｂ）アルデヒドを生成するために酸または光で処理すること、
を含むアルデヒドにより修飾されたモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドを製造するための方法。
【請求項１９】
アルデヒド基ががさらなる結合反応に供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アルデヒド基がアミン、ヒドラジンと、または末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、有機分子とともにさらなる結合反応に供される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴまたはポリヌクレオチドの製造が完全に、または部分的に固相オリゴヌクレオチド合成の条件下で行われる請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴもしくはポリヌクレオチド合成、またはオリゴもしくはポリヌクレオチド複製のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の反応性単量体、または請求項９から１７のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
ホスホロアミダイト法またはＰＣＲにおける、請求項１から８のいずれか一項に記載の反応性単量体、または請求項９から１７のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
請求項１９または２０に記載の結合反応のための、請求項１７に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
アルデヒドは、例えば、生体分子に例えば、蛍光団、レポーター基、蛋白質、核酸および他の生体分子、小分子（例えば、ビオチン）を結合させるためか、さもなければ表面に生体分子を固定するために使用される反応性基である（例として：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　１９９６；Ｔｉｍｏｆｅｅｖ，Ｅ．Ｎ．；Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｖ．；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．；Ｆｌｏｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２４（１９９６）３１４２を参照されたい）。蛋白質も核酸もそれらの天然の形状ではアルデヒドを有することができないので、後者は生体分子の特殊な修飾にとりわけ適切である。糖質は本質的にアルデヒドであるが、たいていは（環状）アセタールまたはヘミアセタールとして存在し、そしてこの形状ではどちらも典型的なアルデヒド反応性を有しない。したがって、それらは同様にアルデヒドとの指向性結合に使用することができる。生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の例は、図１の反応ＡおよびＢに記載されている。
アルデヒドの他に、生体分子の結合に適切な別の反応性基はすでに知られている。ホスホロアミダイト誘導体によりオリゴヌクレオチドを機能性にするための方法の大要は、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．１０，１９９３，１９２５〜１９６３ページに記載されている。さらに、Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，ＧＢ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１５　Ａｕｇｕｓｔ　３，１９９５，１７４１〜１７４４ページまたは日本特許第５８１５２０２９　Ａ号に記載のリン酸エステルまたはリン酸化アセタール（Ｒａｚｕｍｏｖ，Ａ．Ｉ．ｅｔ　ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１５，Ｏｃｔｏｂｅｒ　９，１９７８，ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ．１９６０４）は、オリゴヌクレオチドへのアルデヒド基の導入にいままで何の役割も果たしてこなかった。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
第２の可能性は、保護されたビシナルジオールのホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合させることである（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．；Ｂａｙａｒｄ，Ｂ．；Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１９８７）６４８）。ここで、保護されたビシナルジオール基を有する、特に製造されたビルディングブロックはオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合する。オリゴヌクレオチドを合成、脱保護および後処理すると、過ヨウ素酸塩により同様に酸化されることでアルデヒドが得られる、ビシナルジオール基が現れる。そのようなビシナルジオールは同様にヨーロッパ特許第０　５２３　０７８　Ａ１号に記載されている。




【国際調査報告】
2004500403.tif 000085
2004500403.tif 000086
2004500403.tif 000087
2004500403.tif 000088
2004500403.tif 000089
2004500403.tif 000090
2004500403.tif 000091
2004500403.tif 000092
2004500403.tif 000093
2004500403.tif 000094