(57)【要約】本発明は、アデノウイルスＤＮＡ中への異種性ポリヌクレオチドのインビトロクローニングのための２コンポーネントシステムを提供する。第一のコンポーネントは、異種性ポリペプチドをコードする異種性ポリヌクレオチドを含む挿入ドナーである。第二のコンポーネントは、アデノウイルスゲノムおよび発現カセットを含むベクタードナーである。挿入ドナーおよびベクタードナーは、適当な組換えメディエータタンパク質またはタンパク質群の存在下、アデノウイルス発現クローンをインビトロで形成し得る発現カセット中に異種性ポリヌクレオチドを挿入するためのλファージ由来の組換え部位を用いる部位特異的組換えに適応される。本発明は、組換えアデノウイルスの作成方法およびその方法における第一および第二のコンポーネントの使用をも提供する。
2004513638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスＤＮＡ中への異種性ポリヌクレオチドのインビトロクローニングのための２コンポーネントシステムであって、
ｉ）異種性ポリペプチドをコードする異種性ポリヌクレオチドを含む挿入ドナーである第一のコンポーネント、および
ｉｉ）アデノウイルスゲノムおよび発現カセットを含むベクタードナーである第二のコンポーネント
を含み、ここで、
挿入ドナーおよびベクタードナーは、適当な組換えメディエータタンパク質またはタンパク質群の存在下、アデノウイルス発現クローンをインビトロで形成し得る発現カセット中に異種性ポリヌクレオチドを挿入するための部位特異的組換えに適応される、
当該システム。
【請求項２】
部位特異的組換えが、ファージλ由来の組換え部位を使用する、請求項１のシステム。
【請求項３】
発現カセットが、異種性ポリペプチドと同じｍＲＮＡからの発現のため、内部リボゾーム結合サイトの下流に蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１または２のシステム。
【請求項４】
少なくとも以下のうちの１つを含む、請求項１から３の何れかのシステム：
ｉ）発現カセット中のＣＭＶプロモーター；
ｉｉ）複製欠損のアデノウイルス５型ゲノム；
ｉｉｉ）ｃｃｄＢ遺伝子を含むベクタードナー；
ｉｖ）選択可能マーカーを含む挿入ドナー；
ｖ）選択可能マーカーを含むベクタードナー；
ｖｉ）ａｔｔＰを伴うファージλａｔｔＢまたはａｔｔＲを伴うファージλａｔｔＬの何れかに基づく部位特異的組換え部位。
【請求項５】
当該エレメントｉ）からｖｉ）のすべてを含む、請求項４のシステム。
【請求項６】
組換えアデノウイルスの作成方法であって、
ｉ）発現クローンを形成するように、適当な組換えメディエータタンパク質またはタンパク質群の存在下、請求項１−５の何れかの第一のコンポーネントを請求項１−５の何れかの第二のコンポーネントとインビトロで混合すること、
ｉｉ）発現クローン複製に適当な宿主生体中にｉ）由来の産物の形質転換、
ｉｉｉ）アデノウイルス複製に適当な宿主中にｉｉ）由来の産物のトランスフェクション、
を含む、当該方法。
【請求項７】
第一および第二のコンポーネントが請求項５に記載のものであり、発現クローン複製のための宿主生体はＥ． ｃｏｌｉであり、アデノウイルス複製のための宿主生体はＨＥＫ２９３細胞である、請求項６の方法。
【請求項８】
請求項１−５の何れかに記載の第二のコンポーネント。
【請求項９】
請求項６または７に記載の方法における、請求項１−５の何れかに記載の第一のコンポーネントの使用。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の方法における、請求項１−５の何れかに記載の第二のコンポーネントの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
アデノウイルスは、一般的にヒト呼吸器疾患、結膜炎および幼児の胃腸炎の軽度の感染の原因となり得るＤＮＡウイルスのグループである。細胞培養中で容易に増殖するため、アデノウイルスは、長年にわたって広く研究されてきた（例えば、ＲＮＡスプライシングはアデノウイルス感染細胞で最初に述べられた）。１００％までの効率でヒト細胞に感染するアデノウイルスの能力によって、細胞培養中およびヒト体内（遺伝子治療）中の両方において外来（組換え）ＤＮＡを導入するベクターとして使用されることとなった。組換えアデノウイルスは、一般的には、特定領域のＤＮＡが欠失している（例えば、複製に必要なＥ１領域、宿主の免疫回避に必要なＥ３）。この目的には、２つの面がある。第一に、不必要のＤＮＡ領域の除去により、アデノウイルスＤＮＡとしてパッケージされ、その後、ヒト細胞中に導入され得る外来ＤＮＡの導入のための領域（ｓｐａｃｅ）が得られる（付加ＤＮＡをゲノム中に、感染力に影響することなく挿入するための幾分の余裕がある）。第二に、Ｅ１領域の除去により、組換えウイルスは、ヒト細胞に感染し得るが、複製できない（これは、安全性を考慮すると重要なことである）ことを決定づける。組換えアデノウイルスを作成し複製するため、ＤＮＡを、ゲノム中に設計されたＥ１領域を有する細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３）にトランスフェクトさせる（すなわち、その細胞系により、組換えアデノウイルスで欠失している複製機構が提供される）。
【０００２】
組換えアデノウイルス技術は、しばしば、ヒトアデノウイルス５型あたりに基づいている。Ａｄ５のゲノムは、３５．９３５ｋｂである。この全体配列をプラスミドベクター中にクローニングし、Ｅ． ｃｏｌｉ中で複製し得る。しかし、アデノウイルス配列の長さゆえ、そのベクター中への直接のクローニングに利用できる適当な制限酵素部位が非常に少ない。この問題の回避のため、２つのベクターアプローチが採用されている。一つのベクターは、完全なアデノウイルス配列からＥ１およびＥ３配列を除いたものを含んでいる。第二のベクターは、クローニング部位（外来ＤＮＡの挿入のための部位）の上流に真核生物のプロモーター（例えば、ＣＭＶ）を、および転写ＲＮＡの安定化に必要なポリアデニル化配列を含んでいる。この発現カセットに隣接するのは、第一のベクターのアデノウイルス配列と共通のアデノウイルスＤＮＡの２つの領域である。そのため、第二のベクター由来の発現カセットは、相同組換えの過程により、第一のベクター中のアデノウイルス配列中に導入され得る。この単調な、正確で時間を要する方法は、従来、ＨＥＫ２９３細胞で行われていた。作成されるウイルスは、精製し、増殖させ、望ましい組換えＤＮＡが導入されていることを確信するため試験したプラークでなければならない。
【０００３】
最近の、組換えアデノウイルス産生の進展、「ＡｄＥａｓｙ（商標）」システム（Ｈｅ， Ｔ−Ｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ９５， １９９８， ２５０９−２５１４）によって、限定的な組換えが可能なＥ． ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３でのプラスミド組換えステップを行うことにより手順が簡単になった。
【０００４】
組換えアデノウイルスＤＮＡは、制限酵素消化およびＥ． ｃｏｌｉ中で調製したクローンアデノウイルスＤＮＡにより同定され得る。クローンアデノウイルスＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、アデノウイルスを作成し、それによって、効率的にプラーク精製の必要が除かれる。この方法は、現在、商品化されている（Ｑ−ｂｉｏｇｅｎｅ： Ａｄｅａｓｙ（商標））。このシステムの更なる改善は、組換えアデノウイルスが、第二のＣＭＶプロモーターからの緑色蛍光タンパク質を共発現することである。これにより、感染は効率的となり（その結果、遺伝子送達が効率的となる）、評価が簡単となる。Ａｄｅａｓｙ（商標）システムでの我々の経験から、組換え手順に困難性があることが判った。これには、発現ベクターからの高いバックグラウンド、予測不可能な組換えイベントおよび低い組換え効率が含まれ得る。そのため、組換えアデノウイルス産生には更なる改善の必要がある。
【０００５】
本発明のある態様により、
ｉ）異種性ポリペプチドをコードする異種性ポリヌクレオチドを含む挿入ドナーである第一のコンポーネント、および
ｉｉ）アデノウイルスゲノムおよび発現カセットを含むベクタードナーである第二のコンポーネント
を含むアデノウイルスＤＮＡ中への異種性ポリヌクレオチドのインビトロクローニングのための２コンポーネントシステムであって、
当該システムでは、挿入ドナーおよびベクタードナーは、適当な組換えメディエータタンパク質またはタンパク質群の存在下、アデノウイルス発現クローンをインビトロで形成し得る発現カセット中に異種性ポリヌクレオチドを挿入するための部位特異的組換えに適応される。
【０００６】
好ましくは、部位特異的組換えは、λファージ由来の組換え部位を使用する。λの組換えの論評として、読者には、以下のものが言及される：Ｌａｎｄｙ （１９８９） Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５８， ９１３およびＰｔａｓｈｎｅ （１９９２） Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｗｉｔｃｈ， Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。当該読者には、挿入ドナーおよびベクタードナー部分を用いる部位特異的組換えの更なる技術的詳細としてＵＳ５８８８７３２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が言及される。使用において、組換えメディエータタンパク質が挿入ドナー中の異種性ポリヌクレオチドの左および右で切断し、ベクタードナー中にライゲーションされ、それによりアデノウイルス発現クローンが形成されるように、組換え反応により、高い特異的な切断およびライゲーション反応が生じる。
【０００７】
好ましくは、発現カセットは、異種性ポリペプチドと同じｍＲＮＡからの発現のため、内部リボゾーム結合サイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の下流に蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
好ましくは、本明細書に記載のシステムは、少なくとも以下のうちの１つを含む：
ｉ）発現カセット中のＣＭＶプロモーター；
ｉｉ）複製欠損のアデノウイルス５型ゲノム；
ｉｉｉ）ｃｃｄＢ遺伝子を含むベクタードナー；
ｉｖ）選択可能マーカーを含む挿入ドナー；
ｖ）選択可能マーカーを含むベクタードナー；
ｖｉ）ａｔｔＰを伴うファージλａｔｔＢまたはａｔｔＲを伴うファージλａｔｔＬの何れかに基づく部位特異的組換え部位。
【０００９】
より好ましくは、当該システムは、エレメントｉ）からｖｉ）のすべてを含む。ａｔｔＢ×ａｔｔＰ反応は、タンパク質ＩｎｔおよびＩＨＦが仲介する（Ｃｌｏｎａｓｅ ＢＰ（商標）， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ａｔｔＬ×ａｔｔＲ反応は、タンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓが仲介する（Ｃｌｏｎａｓｅ ＬＲ（商標）， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＩｎｔおよびＸｉｓはλ由来である；ＩＨＦはＥ． ｃｏｌｉ由来である。ここで、「ｘ」は、組換えを示す。ＵＳ５８８８７３２に記載されたような野生型配列を超える効率的または特異的な利点を供与する工学組換え部位をも予想される。
【００１０】
本発明の他の態様により、
ｉ）発現クローンを形成するように、適当な組換えメディエータタンパク質またはタンパク質群の存在下、本明細書で定義のような第一のコンポーネントを本明細書に定義のような第二のコンポーネントとインビトロで混合すること、
ｉｉ）発現クローン複製に適当な宿主生体中にｉ）由来の産物の形質転換、
ｉｉｉ）アデノウイルス複製に適当な宿主中にｉｉ）由来の産物のトランスフェクション、
を含む、組換えアデノウイルスを作成する方法を提供する。
【００１１】
好ましくは、当該方法は、上記エレメントｉ）からｖｉ）で定義されるような第一および第二のコンポーネントを使用し、発現クローン複製のための宿主生体はＥ． ｃｏｌｉであり、アデノウイルス複製のための宿主生体はＨＥＫ２９３細胞である。
【００１２】
本発明の他の態様により、本明細書で定義のような第二のコンポーネントを提供する。
【００１３】
本発明の他の態様により、本明細書で定義のような方法中、本明細書で定義のような第一のコンポーネントの使用を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様により、本明細書で定義のような方法中、本明細書で定義のような第二のコンポーネントの使用を提供する。
【００１５】
本発明は、以下の制限されない実施例で解説される：ここで、
図１は、ベクタードナーを示しており、ここで、１＝蛍光タンパク質、２＝ＩＲＥＳエレメント、３＝ａｔｔＲ２、４＝ｃｃｄＢ＋ｃｍＲ、５＝ａｔｔＲ１、６＝アデノウイルス配列（ΔＥ１／ΔＥ３）、７＝複製起点、８＝アンピシリン耐性、９＝プラスミドバックボーンの切除のための制限酵素部位、１０＝アデノウイルスＬＩＴＲ配列、および１１＝ＳＶ４０ＰＡ；
【００１６】
図２は、挿入ドナーを示しており、ここで、１＝目的遺伝子、２＝ａｔｔＬ２、３＝カナマイシン耐性、４＝複製起点、５＝ａｔｔＬ１；
【００１７】
図３は、アデノウイルス発現クローン中へのｌａｃＺのインビトロクローニングを示し、ここで、
Ａ＝挿入ドナー（ここで、１＝目的遺伝子（ｌａｃＺ）、２＝ａｔｔＬ２、３＝Ｋｎｒ、４＝ｏｒｉ、５＝ａｔｔＬ１）、
Ｂ＝ベクタードナー（ここで、１＝蛍光タンパク質、２＝ＩＲＥＳ、３＝ａｔｔＲ２、４＝ｃｃｄＢ、５＝ａｔｔＲ１、６＝ＣＭＶプロモーター、７＝アデノウイルス配列、８＝ｏｒｉ、９＝Ａｍｐｒ、１０＝ＳＶ４０ＰＡ）、
Ｃ＝発現クローン（Ａｍｐｒ）（ここで、１＝蛍光タンパク質、２＝ＩＲＥＳ、３＝ＡｔｔＢ２、４＝ｌａｃＺ、５＝ＡｔｔＢ１、６＝ＣＭＶプロモーター、７＝アデノウイルス配列、８＝ｏｒｉ、９＝Ａｍｐ２、１０＝ＳＶ４０ＰＡ）、
Ｄ＝Ｂｉ−産物（ｋａｎａｒ）（ここで、１＝ｃｃｄＢ、２＝ＡｔｔＰ２、３＝Ｋｎｒ、４＝ｏｒｉ、５＝ＡｔｔＰ１）、
Ｅ＝Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓタンパク質、
Ｆ＝アンピシリン上またはＥ． ｃｏｌｉＤＨ５α（ｃｃｄＢ致死）中では、増殖しない
Ｇ＝Ｅ． ｃｏｌｉ（例えば、ＤＨ５α）に形質転換し、アンピシリンプレート上での選択により間違えなくクローンを同定し、ウイルスを作成するためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする
【００１８】
一般的な、分子生物学的技術は、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， １９９８により出版された“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ １−３， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ ＦＭ Ａｓｕｂｅｌ， Ｒ Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｒ Ｅ Ｋｉｎｇｓｔｏｎに記載されている。
【００１９】
実施例１
我々は、組換えアデノウイルス作成をより簡単により効率的に行うために、インビトロクローニングシステムを使用した。また、我々は、感染マーカーとして蛍光タンパク質（Ｍａｔｚ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７， ９６９−９７３； Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ２５８７−２５８８２）を組み込んだ。
【００２０】
端的には、完全アデノウイルスゲノム（Ｅ１およびＥ３は除く）；ＣＭＶプロモーターａｔｔＲ１−クロラムフェニコール耐性−ｃｃｄＢ−ａｔｔＲ２、内部リボゾーム結合サイト（ＩＲＥＳ）、蛍光タンパク質配列およびＳＶ４０ポニアデニル化配列を含む発現カセットを含む、ベクターを作成した。
【００２１】
このベクターはベクタードナーである。挿入ドナー中の任意の配列は、インビトロ組換えを介しこのベクタードナー中に直接、効果的にクローニングすることが出来る。Ｅ． ｃｏｌｉ中のｃｃｄＢ遺伝子毒性のため、バックグランドは、零にまで減少する（ベクタードナーＤＮＡは、ｇｙｒＡ変異を有しｃｃｄＢに対し耐性がある、Ｅ． ｃｏｌｉ株ＤＢ３．１中で増大する）。そのため、挿入ドナー中の目的遺伝子による、ベクタードナー中へのインビトロ組込み、その後の、ベクタードナーの選択に使用するＥ． ｃｏｌｉＤＨ５ａの形質転換によって（ベクタードナー アンピシリン耐性、挿入ドナー カナマイシン耐性）、ｃｃｄＢ遺伝子が毒性であることから、組換えアデノウイルスＤＮＡのみが生ずる。次いで、ＤＮＡを消化し、プラスミドバックボーンを取除き、ＨＥＫ２９３細胞中に直接トランスフェクトし、組換えウイルスを作成する。
【００２２】
我々は、このシステムを用い、ｌａｃＺを含む挿入ドナーからｌａｃＺを発現する組換え体を作成した。それは、迅速で効率的であり、我々は、現在のＡｄＥａｓｙシステムを相当超える利点を有すると考えている。また、これらの構成物は、ＩＲＥＳエレメントから蛍光タンパク質を発現する。これは、それらは、組換え遺伝子と同じ転写メッセンジャーＲＮＡから発現することを意味する。「ＡｄＥａｓｙ（商標）」を用い、緑色蛍光タンパク質が、第二の別のＣＭＶプロモーターから発現する。この場合、蛍光タンパク質の発現は、組換え遺伝子転写を保証しない。
【００２３】
６つのヒスチジン残基をコードする配列後にＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子の全コード領域を含む３１６８塩基対フラグメントを、制限酵素消化（ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ）によりｐＺｅｏＳＶ２／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から単離した。ｌａｃＺ ＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳動、ゲルからの切除およびＧｅｎｅｃｌｅａｎ（商標）Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを用い精製することにより、プラスミドバックボーンから分離した。次いで、単離フラグメントを挿入ドナーｐＥＮＴＲ１１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ中にクローニングした。端的に、ｐＥＮＴＲ１１を、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ゲル切除により精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化した。次いで、ｌａｃＺフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いインビトロでｐＥＮＴＲ１１にライゲーションし、Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセル（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に形質転換した。カナマイシンプレート上で一晩増殖させた後、ｌａｃＺを含むｐＥＮＴＲ１１クローンをプラスミドＤＮＡの制限消化により同定した。そのため、このクローンは、１バクテリオファージａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位が隣接するｌａｃＺコーディング配列を含んでいた。ｌａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスＤＮＡの作成として、以下を含むベクタードナーを調製した：
（ｉ）アデノウイルスＤＮＡ配列（Ｅ１およびＥ３領域を除く）
（ｉｉ）切除可能なプラスミドバックボーン（アンピシリン耐性）
（ｉｉｉ）哺乳類細胞中の異種性遺伝子の発現のためのＣＭＶプロモーター
（ｉｖ）１バクテリオファージａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位が隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子およびＥ． ｃｏｌｉｃｃｄＢ遺伝子
（ｖ）内部リボゾーム結合サイト（ＩＲＥＳ）エレメント
（ｖｉ）蛍光タンパク質コード配列
（ｖｉｉ）ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０ポリアデニル化配列。
【００２４】
このベクタードナーを、組換えメディエータタンパク質、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓ（ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（商標）， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む緩衝液中で挿入ドナー（ｐＥＮＴＲ１１／ｌａｃＺ）と共にインキュベーションした。この得られたＤＮＡを、Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセル中に形質転換し、アンピシリンプレート上にプレートした。１５クローンを、数千の存在の中から選択し、調製プラスミドＤＮＡの制限消化により分析した。これらのうち、１４（９３％）が、望ましいアデノウイルスｌａｃＺ構成物を含み、１のみが望ましい構成物を含んでいなかった。
【００２５】
アデノウイルス発現ｌａｃＺおよび蛍光タンパク質の産生として、アデノウイルスｌａｃＺプラスミドＤＮＡを、ＰａｃＩで消化し、プラスミドバックボーンを取除き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いＨＥＫ２９３中にトランスフェクトした。１２日のインキュベーション後、ウイルス増殖は明白となり、ウイルスを細胞ライゼートから回収した。
【００２６】
比較例１
Ｅ． ｃｏｌｉＢＪ５１８３で“ＡｄＥａｓｙ（商標）”相同組換えを用いる組換えアデノウイルスＤＮＡ作成は、実施例１のインビトロの方法よりも産生および効率は低かった。一般的に、相当少ないコロニーが得られ（数千で比較すると、トランスフェクションあたり２０未満）、これら僅かのコロニーが望ましい組換え体であった（典型的に１０−３０％）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ベクタードナーを示している。
【図２】図２は、挿入ドナーを示している。
【図３】図３は、アデノウイルス発現クローン中へのｌａｃＺのインビトロクローニングを示している。
【国際公開パンフレット】
2004513638.tif 000003
2004513638.tif 000004
2004513638.tif 000005
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2004513638.tif 000012
2004513638.tif 000013
2004513638.tif 000014
2004513638.tif 000015
2004513638.tif 000016
【国際調査報告】
2004513638.tif 000017
2004513638.tif 000018
2004513638.tif 000019