(57)【要約】プラストーム上で形質転換されており、かつ選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞を生成する方法であって、（ａ）ＤＮＡを用いて植物又は植物細胞の色素体を形質転換するステップであって、このＤＮＡが、（ｉ）植物細胞中でこのＤＮＡの複製をもたらすヌクレオチド配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの目的配列と、（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの目的配列を色素体ゲノムに安定に組み込むのに必要な前記少なくとも１つの目的配列に隣接する配列と、（ｉｖ）この目的配列に隣接する配列の外側にある選択マーカーとを含むものである上記ステップと、（ｂ）この少なくとも１つの目的配列を選択圧の存在下でプラストームに組み込むステップと、（ｃ）選択圧を解除することによってこの選択マーカー配列を消失させるステップと、（ｄ）プラストーム上で遺伝的に形質転換されており、かつ前記選択マーカーを欠く細胞及び／又は植物を回収するステップとを含む上記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラストーム上で形質転換されており、かつ選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＤＮＡを用いて植物又は植物細胞の色素体を形質転換するステップであって、前記ＤＮＡが、
（ｉ）植物細胞中で前記ＤＮＡの複製をもたらすヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つの目的配列と、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの目的配列を色素体ゲノムに安定に組み込むのに必要な前記少なくとも１つの目的配列に隣接する配列と、
（ｉｖ）前記目的配列に隣接する前記配列の外側にある選択マーカーとを含むものである上記ステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの目的配列を選択圧の存在下でプラストームに組み込むステップと、
（ｃ）選択圧を解除することによって前記選択マーカー配列を消失させるステップと、
（ｄ）プラストーム上で遺伝的に形質転換されており、かつ前記選択マーカーを欠く細胞及び／又は植物を回収するステップとを含む上記方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、色素体において前記ＤＮＡの複製をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複製が、前記ＤＮＡをプラストームに可逆的に組み込むことによって非自律的にもたらされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
可逆的な組込みが、相同組換えのためのプラストームの配列に十分相同である前記ＤＮＡの組込み配列によってもたらされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組込み配列が、前記少なくとも１つの目的配列に隣接する配列（ｉｉｉ）及び／又は前記フランキング配列以外の１つ又は複数の別の配列に含まれている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、前記色素体において複製開始点として機能し、したがって前記ＤＮＡに自己複製をもたらす配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記色素体において複製開始点として機能する別の配列を含むヌクレオチド配列であり、複製をもたらすヌクレオチド配列を前記ＤＮＡがさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、植物色素体の外側にある前記ＤＮＡの自己複製を起こし、それによってその後色素体に移動する前記ＤＮＡの複数のコピーを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記目的配列が、形質転換されたプラストームを含む細胞の視覚識別を可能にする配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
形質転換すべき植物又は植物細胞が、容易に識別可能な表現型をもたらす突然変異をプラストーム中に含み、前記方法が前記容易に識別可能な突然変異表現型を修復し、それによって形質転換された細胞の識別が可能になる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
先行する１ステップにおいて、光合成関連遺伝子が機能不全になる又は除去される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記光合成関連遺伝子が、以下の群、すなわちｒｐｏＡ、ｐｅｔＡ、ｙｃｆ３、ｙｃｆ９及びｒｐｏＢから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが、前記形質転換のポジティブ選択を可能にするために機能する前記光合成関連遺伝子を含む、請求項１１から請求項１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
選択マーカーが、細菌のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼＡ−６である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
プラストームのヌクレオチド配列が欠失している、請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡが目的配列を含まず、プラストームの欠失させるべき前記ヌクレオチド配列に隣接するプラストーム配列に前記フランキング配列（ｉｉｉ）が相同である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
点突然変異がプラストームにおいて生じる、請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）及び／又は（ｄ）が、各々特定のタイプのプラストームを含む葉セクターの分離を可能にすることを含む、請求項１から請求項１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
植物色素体の遺伝的形質転換方法、特に前記請求項のいずれか一項に記載の植物色素体の遺伝的形質転換方法であって、
（ａ）ＤＮＡを含む植物色素体を用意するステップであって、前記ＤＮＡが
（ｉ）植物細胞中で前記ＤＮＡの自己複製をもたらすヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）少なくとも１つの目的配列を含み、
（ｉｉｉ）
（α）前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始及び／又は停止制御エレメントを欠くか、又は
（β）前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写停止制御エレメントを欠くが、前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始制御エレメントを含む、
転写用ＤＮＡである上記ステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡの複製を可能にするステップと、
（ｃ）遺伝的に形質転換された色素体を有する細胞及び／又は植物を回収するステップとを含む上記方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、植物色素体において前記ＤＮＡの自己複製を起こす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的配列の転写が停止しない、請求項２０に記載の方法
【請求項２２】
前記転写によって、転写された目的配列の複数の単位を含むｍＲＮＡが生成する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、植物色素体の外側にある前記ＤＮＡの自己複製を起こし、それによってその後色素体に移動する前記ＤＮＡの複数のコピーを生成する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡが、形質転換された植物、細胞又は色素体の選択を可能にする１つ又は複数の配列をさらに含む、請求項１９から請求項２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
先行する１ステップにおいて、光合成関連遺伝子が機能不全になる又は除去される、請求項１９から請求項２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記光合成関連遺伝子が、以下の群、すなわちｒｐｏＡ、ｐｅｔＡ、ｙｃｆ３、ｙｃｆ９及びｒｐｏＢから選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡが、前記形質転換のポジティブ選択を可能にするために機能する前記光合成関連遺伝子を含む、請求項２５から請求項２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが、前記ＤＮＡの少なくとも一部を色素体ゲノムに安定に組み込むことを可能にする配列をさらに含む、請求項１９から請求項２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡの少なくとも一部を色素体ゲノムに導入した後、組換えによって望ましくない配列をそれが含まなくなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡの前記少なくとも一部が、前記少なくとも１つの目的配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡの前記少なくとも一部の色素体ゲノムへの組込みによって、色素体ゲノムに組み込まれない前記ＤＮＡの別の部分に対する選択を可能にする配列が残る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡの前記少なくとも一部を色素体ゲノムへ導入した後、選択圧を解除して、選択を可能にする前記配列を消失させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記植物色素体中に前記ＤＮＡを維持するのに選択圧を必要とするように前記ＤＮＡを設計する、請求項１９から請求項２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの目的配列又はその発現産物と色素体ゲノム又は色素体ゲノムの発現産物との相互作用によって、所望の機能が発揮される、請求項１９から請求項３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１の（ａ）項に定義される形質転換ベクター、及び任意選択で請求項４から請求項９までのいずれか一項にさらに定義される形質転換ベクター。
【請求項３６】
請求項１から請求項３４までのいずれか一項に記載の方法によって生成されるトランスプラストミック植物細胞又は植物及びそれらの子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に植物のバイオテクノロジーに関し、より詳細には、色素体の形質転換のための新規な方法及びベクターに関する。具体的には、本発明は、植物色素体の遺伝的形質転換方法、その方法のためのベクター、及び本発明の方法によって得られ得る植物又は植物細胞を提供する。また、本発明は、本発明の方法に有用な複製能力、好ましくは自己複製能力をもたらす配列を含むベクターに関する。本発明は、プラストーム（ｐｌａｓｔｏｍｅ）上で形質転換されており、選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞の生成方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に認められている知識によれば、２つのクラスの細胞小器官、すなわち色素体及びミトコンドリアは、初期には独立していたが、別個の内共生現象によって今日の真核細胞の先祖に取り込まれた、原核生物に由来する（Ｇｒａｙ、１９９１）。したがって、これらの小器官は、それら自体のＤＮＡと、メッセンジャーＲＮＡ、リボソーム及び遺伝情報の解読に要する少なくともいくつかの必要なｔＲＮＡの形のＤＮＡ転写物を含んでいる（Ｍａｒｅｃｈａｌ−Ｄｒｏｕａｒｄ等、１９９１）。
【０００３】
内共生による取り込み直後は、これらの小器官は、原核生物の生命維持に必要な要素すべてを含むので遺伝的に自律しているが、遺伝情報を細胞核に伝達することによって進化の間にこの自律性が低下した。それでも、それらの遺伝情報は十分複雑であり、現代の細胞小器官を遺伝子工学の魅力的なターゲットにしている。色素体は特にそうであり、それは植物細胞内部でそれらの主要な機能である光合成に必要なタンパク質の約５０％を依然としてこれらの小器官がコードしているからである。色素体は、それらのリボソームＲＮＡ、それらのｔＲＮＡの大部分、及びリボソームタンパク質もコードしている。合計すると、プラストーム中の遺伝子の数は１２０程度である（Ｐａｌｍｅｒ、１９９１）。しかし、色素体中にあるタンパク質の大部分は、核／サイトゾルの遺伝区画から移入されたものである。
【０００４】
色素体は遺伝的に形質転換することができる
分子クローニング技術全般の発達にともない、まもなく形質転換により高等植物を遺伝的に改変することが可能になった。植物の形質転換において主に強調されるのは、以前も今も核の形質転換であり、それは遺伝子（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の場合約２６，０００であり、その完全な配列が最近発表された（Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ、２０００））の大部分が細胞核に存在するからである。核の形質転換は、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）などの生物学的ベクターが利用可能であり、それを改変して核の効率的な形質転換が可能であるので、容易に実施することができた（Ｇａｌｖｉｎ、１９９８）。また、核では外来の核酸をより直接的に利用することができ、一方、小器官は一般にＤＮＡなどの巨大分子を通さない２つのエンベロープ膜に包囲されている。
【０００５】
色素体を形質転換できることは極めて望ましいものである。というのは、導入遺伝子を極めて高いレベルで発現する可能性を有するこれらの小器官において、色素体が大きな遺伝子量を利用できるからである。また、色素体によってコードされた形質が花粉伝播性でなく、したがって、導入遺伝子が不注意によりトランスジェニック植物の近縁野生種に洩れる潜在的リスクが大いに減少するので、色素体の形質転換は魅力的である。色素体形質転換の他の潜在的な利点は、ポリシストロン単位として複数遺伝子の同時発現が可能なこと、位置効果の解消、核の形質転換を次に生じ得る遺伝子のサイレンシングなどである。
【０００６】
色素体の安定な形質転換を可能にする方法を、高等植物に対して実際に開発することができた。これまで、異なる２つの方法、すなわち組織、特に葉組織の微粒子銃打込み（Ｓｖａｂ等、１９９０）、及び適切な形質転換ベクターの存在下でのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるプロトプラストの処理（Ｋｏｏｐ等、１９９６）が利用可能である。どちらの方法も、２つのエンベロープ膜を通って小器官のストロマにプラスミドＤＮＡが移動するのを仲介するものである。
【０００７】
従来の色素体形質転換技術はＨｅｉｆｅｔｚ、２０００及びＫｏｏｐ等、１９９６に記載されている。
【０００８】
従来の色素体形質転換ベクターは、通常、少なくとも２つの目的にかなう必要がある。すなわち、（１）色素体の遺伝機構（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって発現される１つ又は複数の所望の外来遺伝子の導入、及び（２）阻害剤選択による、かつ／又は検出可能な表現型に対するスクリーニングによる、形質転換されたプラストームを含む細胞の選択である。色素体形質転換ベクターは、通常、４つの作動可能に連結されたエレメント、すなわちプロモーター配列、５’非翻訳領域、コード領域及び３’非翻訳領域からなる完全な遺伝子カセットを含む。
【０００９】
しかし、これらのカセットは、単一プロモーターの制御下でオペロン中のいくつかの遺伝子を同時発現する潜在能力を利用できない。
【００１０】
選択阻害剤（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する耐性をもたらす突然変異遺伝子で、完全な常在性の色素体遺伝子を置換することによって（米国特許第５４５１５１３号）、又は酵素による阻害剤の不活性化をもたらす完全な発現カセットを導入することによって（米国特許第５８７７４０２号）、選択が実施される。非形質転換細胞の膨大なバックグラウンドからトランスジェニック植物細胞を選択するのに必要であるこれらのマーカー遺伝子は、抗生物質又は除草剤耐性遺伝子をコードするものである。色素体耐性遺伝子の例は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与するａａｄＡ（Ｓｖａｂ  ＆  Ｍａｌｉｇａ、１９９３）又はカナマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ（Ｃａｒｒｅｒ等、１９９３）である。これらのマーカー遺伝子は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）と共にゲノム中に安定に組み込まれるので、ＧＯＩの機能には必要ではないがホモプラストミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｏｍｉｃ）トランスジェニック植物中に留まることになる。これらの残留マーカー遺伝子は、病原体の抗生物質耐性又は雑草の除草剤耐性を理論的には増加し得るので、植物のバイオテクノロジーに関する批判の主要な問題となっている。したがって、トランスジェニック植物に耐性遺伝子をもたらさない選択システムの構築が大いに望まれる（ｌａｍｔｈａｍ及びＤａｙ、２０００）。
【００１１】
２つ以上の遺伝子カセットに加え、形質転換ベクターは、通常、操作した配列を２つの相互的な相同組換え現象によってプラストームに安定に導入するのに必要な挿入部位のフランキング領域を含む。このために、葉緑体形質転換ベクターは、相同なフランクとして役立つ葉緑体ゲノム配列を含む。異種の葉緑体ゲノムはそれらの配列も異なるので、種特異的形質転換ベクターを使用しなければならない。このため、形質転換ベクターをクローニングするときには多大な労力が必要であり、核の形質転換における状況とは対照的である。
【００１２】
従来すべての形質転換ベクターにおいて、選択マーカーには、色素体ＤＮＡに相同な配列が隣接し、したがって、目的とする配列の所望の機能には必要ではないが、プラストーム中に安定に組み込まれる。これらの残留マーカー遺伝子は、選択有利性が付与されることによって他の生物に理論的には伝播し得る。病原体の抗生物質耐性が強くなると、臨床治療において問題が生じる恐れがある。したがって、選択マーカーを含まないトランスプラストミック（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｍｉｃ）植物を生成する系の開発が大いに望まれている。このような系のさらなる利点は、有効な選択マーカーの数が限定されているために現在では困難である後続の形質転換に対して同じマーカー遺伝子を再利用できる可能性があることである。
【００１３】
また、プラストーム分子に安定に組み込まれた任意の導入遺伝子のコピー数が、プラストームのコピー数を決して超えることができないのは明らかであり、したがって、可能な導入遺伝子発現レベルは一定範囲に限定される。したがって、導入遺伝子のコピー数は、染色体外のエレメント上にあるときにはさらに増加し得る。
【００１４】
米国特許第５，６９３，５０７号には、異種ＤＮＡを葉緑体に導入するための方法が開示されており、それによれば異種ＤＮＡは作動可能に結合した制御エレメントを含み、葉緑体中で発現することができる。米国特許第５，６９３，５０７号による方法は、色素体中に異種ＤＮＡを長期的に維持するものではない。また、色素体における異種ＤＮＡの発現は、実際に適用するには不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の一目的は、遺伝的に安定なトランスジェニック植物を生産することができる植物色素体の効率的かつ汎用性のある遺伝的形質転換方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、形質転換植物が安定して得られ、導入遺伝子が極めて高いレベルで発現し得る、植物色素体の遺伝的形質転換方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、複数の目的遺伝子の発現（ポリシストロン性発現）が可能な、植物色素体の遺伝的形質転換方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を含まないトランスジェニック植物を生成する、植物色素体の新規な遺伝的形質転換方法を提供することである。
【００１９】
本発明の更に別の目的は、ベクターの複製回数が調節可能であり、植物細胞中、好ましくは色素体中で複製可能なベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、細胞中、好ましくは前記細胞の色素体中で複製可能であるＤＮＡ又はベクターを用いて植物又は前記植物細胞を形質転換することによって植物又は植物細胞を色素体形質転換する方法を提供する。前記色素体における前記ＤＮＡの複製は、前記ＤＮＡに複製をもたらすヌクレオチド配列を前記ＤＮＡに入れることによって実施可能である。
【００２１】
本発明者らは、植物細胞、特に色素体における前記ＤＮＡの複製が、以下の２つの機序のうち少なくとも１つの機序によって起こり得ることを見出した。
（ｉ）相同組換えによってプラストームへの前記ＤＮＡの可逆的組込みが起こるのに十分な程度に、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列を、プラストーム配列に相同にすることができる。したがって、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを、前記プラストームによって間接的又は非自律的に複製することができる（図２参照）。前記組込みは可逆的なので、プラストームから前記ＤＮＡを切り出すことができ、それによって間接的に複製されたＤＮＡが作製される。
（ｉｉ）複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、プラストーム複製とは無関係に前記ＤＮＡの自己複製を起こす複製開始点を含むことができる。
機序（ｉｉ）が有効であるとき、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列及び／又は前記複製開始点が、機序（ｉ）による可逆的組込みのためのプラストーム配列に十分相同であれば、機序（ｉ）による複製も同時に有効になり得る。
【００２２】
上記機序に基づいて、本発明の発明者らは、極めて広範囲な複製回数を有するベクターを作製することが可能であり、すなわち所望の目的に適したレベルになるようにベクターの複製回数を設計できることを見出した。前記範囲の複製回数において、最低複製回数は、複製開始点機能を有する配列を欠いた、複製をもたらすヌクレオチド配列を機序（ｉ）に従って用いることによって達成される。前記ＤＮＡの複製は、好ましくは、プラストームへの組込み、前記プラストームによる複製及び前記プラストームからの前記ＤＮＡの切り出し（単一の相同フランクを介した組換えによって媒介される可逆的組込み）によって行われる。したがって、機序（ｉ）において、前記ＤＮＡ（又は前記ベクター）の複製回数は、プラストームの複製回数によって制限される。
【００２３】
前記ＤＮＡの複製回数は、自己複製をもたらすヌクレオチド配列、たとえば形質転換される細胞、特に色素体において機能する複製開始点を前記ＤＮＡに入れることによって増加させることができる。一般に、前記ＤＮＡ中で機能する複製開始点は、前記プラストームの天然の複製開始点と相同性を有し、それによってプラストームへの前記ＤＮＡの可逆的な組込みを媒介することが可能である。したがって、前記ＤＮＡの自己複製と非自律的な複製の両方が同時に活性となり得る。自己複製回数は、所望の活性を有する複製開始点を選択することによって調節することができる。最高自己複製回数は、前記細胞中で有効な最も活性な既知の複製開始点によって得られる。あるいは、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、プラストームと相同性を持たない複製開始点を有することができる。このような複製開始点によって、機序（ｉ）が有効でなく、機序（ｉｉ）に従う自己複製が可能になる。
【００２４】
本発明は、極めて多い複製回数が望ましい実施形態を開示する。また、複製回数が少ない、たとえばもっぱら非自律的な複製が起こる実施形態も開示する。これら両極端の範囲内で、前記ＤＮＡの複製回数を具体的な例の諸要件に合わせることができる。
【００２５】
本発明は、
（ａ）ＤＮＡを含む植物色素体を用意するステップであって、このＤＮＡが
（ｉ）植物細胞中で前記ＤＮＡの自己複製をもたらすヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）少なくとも１つの目的とする配列を含み、
（ｉｉｉ）
（α）前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始及び／又は停止制御エレメントを欠くか、又は
（β）前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写停止制御エレメントを欠くが、前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始制御エレメントを含む、
転写用ＤＮＡである上記ステップと、
（ｂ）前記ＤＮＡの複製を可能にするステップと、
（ｃ）遺伝的に形質転換された色素体を有する細胞及び／又は植物を回収するステップとを含む、植物色素体の遺伝的形質転換方法を提供する。
【００２６】
本発明の方法は、少なくとも１つの目的配列を例外的に高いレベルで発現することができる。同時に、本発明の方法によって、複数の目的配列の発現が可能になる（ポリシストロン性発現）。
【００２７】
本発明によれば、このＤＮＡは、植物細胞中の前記ＤＮＡに好ましくは自己複製をもたらし前記ＤＮＡの多数のコピーを生成するヌクレオチド配列を含む。複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、植物細胞中、好ましくは色素体中の前記ＤＮＡの複製を可能にする任意の配列とすることができる。このような配列の例は、色素体複製開始点ｏｒｉＡ及びｏｒｉＢである。別の例は、色素体中での複製をもたらす配列番号１及び配列番号２の新規ヌクレオチド配列である。前記ＤＮＡの自己複製とは、前記細胞中の他のＤＮＡの複製とは無関係に植物細胞内部で、特にプラストームに組み込まれずに、前記ＤＮＡを複製できることを意味する。
【００２８】
本発明の方法は、目的配列のプラストームへの組込みが望ましい場合（ケースα）に使用することができ、前記組込みは安定なものであることが好ましい。このためには、（ベクターの）ＤＮＡが、前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始及び／又は停止制御エレメントを欠いていることが好ましい。この場合、前記目的配列の転写は、プラストーム中にすでに存在する（開始及び停止用）制御エレメントに完全に依拠することができる（プラストーマル（ｐｌａｓｔｏｍａｌ））。あるいは、転写開始用制御エレメントのみをプラストーマルとし、一方、停止用制御エレメントを（ベクターの）ＤＮＡ中に設けることができる。あるいは、転写停止用制御エレメントのみをプラストーマルとし、一方、開始用制御エレメントを（ベクターの）ＤＮＡ中に設けることもできる。いずれにしても、（ベクターの）ＤＮＡは、転写制御エレメントの少なくとも１つを欠く。これによって、ケース（α）の形質転換がより効率的で安定になる。
【００２９】
本発明の方法は、目的配列のプラストームへの組込みが望ましくない場合（ケースβ）にも使用することができる。このためには、（ベクターの）ＤＮＡが、前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写停止制御エレメントを欠くが、前記少なくとも１つの目的配列に作動可能に結合する転写開始制御エレメントを含むことが好ましい。この場合、転写は自律的なＤＮＡを用いて、組込みを行わずに進行する。したがって、転写開始エレメントをＤＮＡ中に設け、目的配列に作動可能に結合させる。しかし、前記目的配列に作動可能に結合する転写停止エレメントは前記ＤＮＡ中には設けない。これは、転写が「ローリングサークル」形式で起こり、停止が停止制御エレメントではなく、統計ベースで起こることを意味する。
【００３０】
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１つの目的配列は、作動可能に結合する転写停止用制御エレメントを持たない。前記ＤＮＡ又はその一部は、プラストームに組み込まれていないことが好ましい。前記ＤＮＡ又は目的配列の転写が始まると、停止しないか、停止がほとんど起こらない。これによって、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡの複数の単位、又は好ましくは転写された目的配列の複数の単位を含む極めて長い転写物がもたらされる。その結果、前記目的配列の転写物の量は、作動可能に結合した転写ターミネーターを目的配列が有する従来の例よりも増加する。したがって、翻訳も同様に促進される。
【００３１】
特徴（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の存在は相乗的（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ）であり、それによって前記目的配列の発現レベルが増す。また、複数の目的配列が同一プロモーターによって前記ＤＮＡから発現される。
【００３２】
少なくとも１つの目的配列は、植物細胞の任意の成分、好ましくは色素体ゲノムや色素体ゲノムの発現産物などの色素体成分と相互作用して所望の機能を発揮することができる。あるいは、前記少なくとも１つの目的配列の発現産物は、上記相互作用によって所望の機能を発揮することができる。このような相互作用を用いて、２成分のトランスジェニック植物発現系を構築することができる。これらは、トランスジェニック植物の生物学的安全性に多大な寄与をする。というのは、２つの人工成分が同一植物に存在する場合にのみ発現が起こるからである。
【００３３】
発現は少なくとも転写を含み、これはたとえばＲＮＡが所望の産物である場合（たとえば、アンチセンス技術）である。発現は、転写及び翻訳を含み、ポリペプチド又はタンパク質を産生することが好ましい。ポリペプチドの発現の場合、「目的配列」は好ましくはポリペプチドのコード部分に関係する。
【００３４】
前記ＤＮＡは環状であることが好ましい。好ましくは、自己複製できるべきである。複製は、色素体中及び／又は色素体外で起こり得る。発現すべき目的配列が１つの場合、この配列は、作動可能に結合する転写開始エレメントを含むが、転写停止エレメントを含まないことが好ましい（ケースβ）。一般に、目的配列がいくつかある場合、わずか１つ、好ましくは最初の目的配列が転写開始エレメントを含み、停止エレメントは存在しないことが好ましい。あるいは、いくつか又はすべての目的配列は、開始エレメントを含むことができるが、転写停止エレメントを含まない。したがって、開始エレメントが存在し、停止エレメントが存在しないことが好ましい。
【００３５】
翻訳を効率的にするために、各目的配列は、好ましくはリボソーム結合部位を有する。翻訳エンハンサーなど翻訳を促進する他の配列を、１つ又は複数の目的配列に作動可能に結合させることができる。
【００３６】
本発明によれば、植物色素体は、前記ＤＮＡを含む色素体を用意することによって、ＤＮＡ（ベクター）により遺伝的に形質転換される。前記ＤＮＡを含む色素体を用意することは、間接的でも直接的でもよい。前記ＤＮＡを間接的に用意する例は、前記ＤＮＡが色素体の外部で（たとえば、細胞核中で）自己複製され、したがって前記ＤＮＡの複数のコピーが産生する場合である。これらのコピーを、その後色素体に移すことができる。前記ＤＮＡを含む色素体を用意することが直接的であり、前記ＤＮＡが色素体中で自己複製されることが好ましい。前記ＤＮＡの複製をもたらすために使用するヌクレオチド配列のタイプは、前記ＤＮＡの自己複製が起こると考えられる区画に合わせることが好ましい。たとえば、色素体中での自己複製の場合、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は色素体中で機能しなければならない。
【００３７】
前記ＤＮＡの自己複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、任意の既知の複製開始点又は自己複製をもたらす機能を有する他の任意のヌクレオチド配列とすることができる。具体的な実施形態に応じて、前記ヌクレオチド配列の複製をもたらす能力を調節することが有利であろう。たとえば、（複製回数が多い）極めて活性な複製開始点によって、前記ＤＮＡを維持するために選択を行うことなく植物細胞中の前記ＤＮＡを維持することが可能になり得る。複製をもたらす能力が不十分な複製開始点では、選択圧を解除すると、植物細胞から前記ＤＮＡを取り出すことができる。前記能力又は前記回数の調節は、このようなヌクレオチド配列を適切な植物種から選択することによって実施することができる。あるいは、所与の実施形態又は目的に適した複製をもたらす能力を達成するために、たとえば、突然変異、切断、結合、複数の複製開始点の混合及び組換えなどによって所与の複製開始点を改変することができる。
【００３８】
前記ＤＮＡは、形質転換された植物、植物細胞又は色素体の選択を可能にする１つ又は複数の配列（選択マーカー）をさらに含むことができる。このような選択マーカーは、抗生物質又は阻害剤耐性遺伝子であってもよい。あるいは、特定条件下での増殖に必要とされる色素体遺伝子を機能しなくする、又は先行するステップで除去することもできる。前記形質転換のポジティブ選択が可能になるように機能する形で前記ＤＮＡに前記色素体遺伝子を入れて選択マーカーとして使用することができる。このような遺伝子の例は、光合成に直接又は間接的に関係するｒｐｏＡ、ｐｅｔＡなどの遺伝子である。後者の手順は、抗生物質耐性遺伝子を植物に導入することなく本発明の方法を実施することができるという大きな利点を有する。
【００３９】
本発明の一般的な一実施形態において、前記ＤＮＡは色素体中で自己複製する。すなわち、前記ＤＮＡは色素体中の染色体外又はエピソームエレメントである。前記ＤＮＡは、好ましくは、目的配列に作動可能に結合する転写停止エレメントを含まず、したがって、複数の目的遺伝子のポリシストロン性発現が可能である。自己複製プラスミドのコピー数がプラストーム分子のコピー数を大きく超え、前記少なくとも１つの目的配列の遺伝子量が増えるので、この方法は、従来の色素体形質転換戦略に比べ、極めて高い発現レベルになり得る。この実施形態において、プラストームとの組換えのために相同フランクを使用する必要がないので、種特異的ではないベクターを構築することができる。したがって、ベクターのクローニングのための労力が大いに軽減され、本方法の大きな利点となっている。また、プラストーム配列に相同な配列がほとんどないため、得られるトランスジェニック植物は遺伝的に極めて安定である。
【００４０】
ベクター又は複製開始部位（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅｓ）として役立つ前記ＤＮＡ含有プラストーム配列エレメントは、適切な選択がなされる場合、又は染色体外ＤＮＡの複製回数がそれぞれのプラストーム分子の複製回数を超える場合、色素体中に維持される。
【００４１】
プラスミドの複製回数がプラストームの複製回数よりも少なければ、自己複製エレメントは選択なしに消失することは明らかである。その複製回数がプラストームの複製回数よりも少なくても、自己複製ＤＮＡの存在を維持するために、選択可能なマーカーを前記ＤＮＡと共に入れることができる。上述したように、形質転換の第１のステップで、光合成に関係する遺伝子（たとえばｐｅｔＡ）をプラストームから除去することができ、又は機能しないようにすることができる。第２のステップにおいて、本発明の方法に従い自己複製エレメントを用いて欠損遺伝子を補うことができる。この手順を用いて、土壌で成長する植物に「強制的に」導入したエレメントを維持させる。前記第２のステップの効率は、前記ＤＮＡ上の選択可能なマーカー及び適切な選択圧を用いて改善することができる。それにより前記マーカーは、相同フランクの外側に位置し、以下に詳細に記述するように消失させることができる。この手順によって、抗生物質耐性又は除草剤耐性マーカー遺伝子を持たないトランスプラストミック高等植物を生成することが可能になる。
【００４２】
本発明の第２の一般的な実施形態において、前記ＤＮＡは、相同組換えにより前記ＤＮＡの少なくとも一部をプラストームへ安定に組み込むことを可能にする配列をさらに含む。前記ＤＮＡをシャトルとして用いて、前記ＤＮＡの配列部分、好ましくは目的配列をプラストームに導入することができる。現在、色素体形質転換は、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を使用することに依存しており、抗生物質耐性遺伝子は、望ましくなく議論の多い副作用物として最終産物に保持されている。この問題を解決するために、プラストーム組込みカセット、すなわち安定な組込みを可能にする配列（プラストームの一部に相同な配列）が隣接しているプラストームに組み込むべき配列を、前記ＤＮＡに入れることができる。前記ＤＮＡの選択マーカー遺伝子は、この組込みカセットの外側に位置することが好ましい。選択は、好ましくは、組み込むべき配列（好ましくは目的配列）が十分な数のプラストームコピーに安定に組み込まれるまで継続される。次いで、選択を解き、選択マーカーを含む自己複製ＤＮＡを消失させ、それによってマーカーのないトランスプラストミック植物の生成が可能になる。自己複製染色体外プラスミドを確実に消失させるために、プラスミド（ＤＮＡ）は、妥当な回数、すなわち前記ＤＮＡの消失が妨害されないようにあまり多くない回数で自己複製をもたらす配列を含むことが好ましい。複製をもたらすこのような配列を、本明細書に記載する、多数の自己複製をもたらす配列（配列番号１及び配列番号２）の明確に定義された部分を用いて容易に作製することができる。
【００４３】
マーカーのない形質転換体を得る別の方法は、本明細書に記載されており、組込み不可能なマーカー遺伝子に隣接しているプラスミドベクター配列のダイレクトリピートによって媒介される相同組換えを用いて、シャトルプラスミドから選択マーカーを除去するものである。
【００４４】
本発明は、さらに、上述の方法のためのベクターを提供する。特に、植物色素体中で自己複製する能力をもたらすヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。前記ヌクレオチド配列は、以下の群、すなわち
（ａ）配列番号１の配列又は機能が保存された変異体又はそれらの一部と、
（ｂ）配列番号２の配列又は機能が保存された変異体又はそれらの一部と、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で配列（ａ）又は（ｂ）に相補的である配列とハイブリッド形成する配列と、
（ｄ）前記ＤＮＡに自己複製をもたらす前記能力を低下又は増大させるために選択した突然変異を含む（ａ）又は（ｂ）の配列と、
（ｅ）配列番号１又は配列番号２と少なくとも８０％が同一である配列と、
（ｆ）配列番号１又は配列番号２又はそれらの一部の配列にオーソロガスな配列と、から選択される。
【００４５】
驚くべきことに、配列番号１又は配列番号２の配列は、植物色素体においてＤＮＡの効率的な複製を可能にすることが見出された。最も驚くべきことに、前記配列は、既知の色素体複製開始点を含まない。配列番号１又は配列番号２の配列又はそれらの変異体は、たとえば、ＤＮＡに自己複製能力を付与するプロセスに使用することができる。これらの配列が自己複製をもたらす回数は、上述のように調節することができる。特に、他の生物からの相同配列又はオーソロガスな配列をこのような方法に使用することができる。
【００４６】
本発明は、さらに、プラストーム上で形質転換されており、選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞を生成する方法を提供する。この方法は以下のステップ、すなわち、
（ａ）ＤＮＡを用いて植物又は植物細胞の色素体を形質転換するステップであって、前記ＤＮＡが、
（ｉ）植物細胞中で前記ＤＮＡの複製をもたらすヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）少なくとも１つの目的配列と、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの目的配列を色素体ゲノムに安定に組み込むのに必要な前記少なくとも１つの目的配列に隣接する配列と、
（ｉｖ）前記目的配列に隣接する前記配列の外側にある選択マーカーとを含むものである上記ステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの目的配列を選択圧の存在下でプラストームに組み込むステップと、
（ｃ）選択圧を解除することによって前記選択マーカー配列を消失させるステップと、
（ｄ）プラストーム上で遺伝的に形質転換されており、前記選択マーカーを欠く細胞及び／又は植物を回収するステップ
とを含む。
【００４７】
この方法によって、選択マーカーを欠くトランスジェニック植物の生成が可能になる。このような方法は、生物学的安全性の理由から、また、抗生物質耐性遺伝子を封じ込めるために極めて望ましいものである。適用可能であり、かつ以下で別段の指定のない限り、上で与えた情報がこの方法に適用される。トランスジェニック植物を生成する前記方法には、相同組換えにより前記少なくとも１つの目的配列をプラストームへ安定に組み込むのに必要な配列に隣接している少なくとも１つの目的配列を含む色素体組込みカセットを有するＤＮＡによる色素体の形質転換が必要である。前記ＤＮＡは、選択マーカー、たとえば好ましくは前記ＤＮＡを色素体中で確実に維持するために使用される抗生物質耐性遺伝子をさらに含む。前記選択マーカーは、前記組込みカセットの外側に位置する。したがって、前記選択マーカーはプラストームに組み込まれておらず、特に安定には組み込まれていない。組込み後、選択圧を解除することによって安定に組み込まれていないＤＮＡが消失する。前記ＤＮＡは、前記ＤＮＡの複製をもたらし前記ＤＮＡの増殖を可能にするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【００４８】
前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列によって、植物色素体の外部（たとえば、核内又は細胞質内）で前記ＤＮＡを複製し、その後色素体に移入することができる。しかし、前記ヌクレオチド配列は、色素体中で前記ＤＮＡを複製することが好ましい。
【００４９】
前記複製、特に色素体中での複製は、プラストームへの前記ＤＮＡの可逆的な（又は一過性の）組込みによって非自律的にすることができる。この場合、前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列によって、プラストームへの前記ＤＮＡの可逆的な組込みが可能になる。前記可逆的な組込みは、好ましくはプラストームへの完全なベクター（前記ＤＮＡ）の組込みをもたらす相同組換えにおいてプラストームの配列に十分相同である前記ＤＮＡの組込み配列によって提供することができる。プラストームへ組み込むと、前記ＤＮＡをプラストームと共に複製することができる。組換えの逆（図２の２ａ参照）を行うとベクターを切り出すことができる。前記組込み配列の機能は、前記目的配列（ｉｉｉ）に隣接する前記配列の１つ又は両方によって、あるいは前記フランキング配列以外の別の配列によって付与することができる。組込み配列として機能し得る別の配列は、好ましくは、前記目的配列に隣接する前記配列の外側に位置する。したがって、前記ＤＮＡは、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列の機能を潜在的に発揮することができる少なくとも２つの配列を含む。また、前記ＤＮＡは、前記機能を有する１つ又は複数の別の配列を含むことができる。
【００５０】
また、前記複製は、自律的にすることができる。この場合、前記ＤＮＡの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、前記色素体中に複製開始点を有する。前記複製開始点は、前記目的配列に隣接する前記配列の１つ又は両方に含ませることができる。前記ＤＮＡは、前記ＤＮＡの複製をもたらし、かつ複製開始点を含む１つ又は複数の別のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。前記１つ又は複数の別のヌクレオチド配列は、前記目的配列に隣接する前記配列の外側に好ましくは位置する。
【００５１】
選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞を生成する方法は、多種多様な目的に使用することができる。この方法は、１つ又は複数の導入遺伝子を植物色素体に導入するために、たとえば、植物に有用な形質を付与するために使用することができる。この場合、前記目的配列は、ポリペプチドをコードする配列を、場合によっては前記コード配列の発現に必要になり得る調節エレメントと共に含むことができる。
【００５２】
前記方法を用いて、１つ又は複数の突然変異を色素体ゲノムに導入し、たとえば、色素体によってコードされたタンパク質若しくはＲＮＡの諸特性を変え、又は色素体遺伝子の制御配列を変えることもできる。このような突然変異は、前記ＤＮＡを用いて導入することができ、前記目的配列は、前記目的配列に隣接する前記配列が隣接するプラストームにおいて変化する塩基からなる。前記方法を用いて、前記目的配列が単一の塩基からなり得る標的プラストーム中の単一の塩基を変えることができる。好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つの塩基が突然変異し、前記目的配列はそれぞれこれら少なくとも２つ又は３つの塩基からなることができる。
【００５３】
また、前記方法を用いてプラストームの所望の配列を欠失させることができる。これは、目的配列の同時挿入（配列置換）により、又は同時配列挿入なしで実施することができる。後者の場合、前記ＤＮＡは、目的配列を含まなくてもよく、前記フランキング配列は、欠失させるプラストームの前記ヌクレオチド配列に隣接するプラストーム配列に相同である。
【００５４】
前記目的配列は、形質転換されたプラストームを含む細胞の視覚識別を可能にする配列、たとえばＧＦＰをさらに含むことができる。前記方法のステップ（ｄ）は、それぞれ特定のタイプのプラストームを含む葉領域を分離させることを含むことができる。視覚的に識別された葉領域を用いて選択することができ、これによってホモプラストミック状態に到達するプロセス及びトランスジェニック植物を再生するプロセスが加速される。
【００５５】
本発明は、このような植物に由来する産物を含めて、本発明の方法によって得られる又は得られ得る色素体を含む植物又は植物細胞にも関する。目的配列、色素体ゲノムに前記目的配列を安定に組み込むために必要な前記目的配列に隣接する配列、及び前記目的配列に隣接する前記配列の外側にある選択マーカーを含むさらなるベクターを提供する。
【００５６】
定義
３’−ＵＴＲ：              （→）コード領域下流の（→）遺伝子の転写されたが翻訳されていない領域；
５’−ＵＴＲ：              （→）コード領域上流の（→）遺伝子の転写されたが翻訳されていない領域；（→）色素体（→）遺伝子において、５’−ＵＴＲはその３’末端に近い翻訳開始のための配列情報（リボソーム結合部位、（→）ＲＢＳ）を含む；
ａａｄＡ：                  抗生物質（→）選択阻害剤スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンを解毒する、頻繁に使用されるタンパク質である細菌アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼの（→）コード領域；
ａｐｈＡ−６：              抗生物質（→）選択阻害剤カナマイシンを解毒するタンパク質である、細菌アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼＡ−６の（→）コード領域；
葉緑体：                    クロロフィルを含有する（→）色素体；
コード領域：                ａ）ポリペプチドのアミノ酸配列又はｂ）機能性ＲＮＡのヌクレオチドに対する情報を含むヌクレオチド配列；コード領域は、場合によっては、１つ又は複数の（→）イントロンで中断される；
所望の遺伝子（配列）：      改変又は新しく導入した配列：（→）形質転換を試行する目的；
フランク、フランキング領域：（→）色素体（→）形質転換（→）ベクター中の挿入断片の５’末端及び３’末端のＤＮＡ配列であり、二重相互（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）（→）相同組換えによってフランク間にある配列を標的（→）プラストームへ組み込むのを媒介する。同じ機序によって、配列を改変し、又は標的（→）プラストームから取り出すことができる。したがって、（→）色素体（→）形質転換（→）ベクターのフランクによって、標的（→）プラストーム中の変化が（→）形質転換によりどの場所で発生するかが決定される。
遺伝子発現：                配列情報を機能に変えるプロセス；ポリペプチドをコードする（→）遺伝子において、遺伝子発現には、ＲＮＡポリメラーゼの活動を開始し誘導する（→）プロモーターの作用が必要であり、それによってメッセンジャーＲＮＡが形成され、続いてポリペプチドに翻訳される；ＲＮＡをコードする（→）遺伝子においては、（→）プロモーターによって媒介されるＲＮＡポリメラーゼの活動によって、コードされたＲＮＡが生成する；
遺伝子：                    機能、たとえば発現を独立して確実にするのに必要なエレメントのすべてをコードするヌクレオチド配列；遺伝子は、少なくとも１つの完全な（→）コード領域を含む（→）オペロン中に構成される；ポリペプチドをコードする（→）遺伝子において、これらのエレメントは、（１）（→）プロモーター、（２）５’非翻訳領域（（→）５’−ＵＴＲ）、（３）完全な（→）コード領域、（４）３’非翻訳領域（（→）３’−ＵＴＲ）である；ＲＮＡをコードする（→）遺伝子においては、（→）５’−ＵＴＲ及び（→）３’−ＵＴＲが欠損している；２つ以上の（→）コード領域からなる（→）オペロンにおいて、２つの後続の完全な（→）コード領域は（→）スペーサーによって分離され、（→）プロモーター、（→）５’−ＵＴＲ及び（→）３’−ＵＴＲの各エレメントは、（→）オペロンの（→）コード領域によって共有されている；
ゲノム：                    細胞核又は細胞小器官の完全なＤＮＡ配列；
ＧＦＰ：                    緑色蛍光タンパク質
相同組換え：                （→）ゲノム中の標的部位に十分相同な配列を含む（→）フランクの存在によって配列の交換、挿入又は欠失がもたらされるプロセス；
イントロン：                （→）コード領域を中断する配列；
オペロン：                  プロモーターを共有するいくつかの（→）遺伝子の組織構造；
植物：                      その細胞中に（→）色素体を含む生物；本発明は特に多細胞（→）植物に関係する；これらには（マツ、エゾマツ、モミなどの）裸子植物及び（単子葉作物トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ライムギ、ライコムギ、モロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシなど及び非作物単子葉植物及び双子葉類作物タバコ、ジャガイモ、トマト、アブラナ、テンサイ、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタなどの）被子植物及び非作物双子葉類、並びにシダ類、ゼニゴケ類、コケ類及び多細胞緑藻類、紅藻類及び褐藻類のグループが含まれる；
色素体：                    （→）植物細胞中にそれら自体の遺伝機構（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を有する小器官であり、機能及び形態の異なる様々な形式、たとえばアミロプラスト、（→）葉緑体、有色体、エチオプラスト、ゲロントプラスト（ｇｅｒｏｎｔｏｐｌａｓｔｓ）、白色体、原色素体などとして存在する；
プラストーム：              （→）色素体の完全なＤＮＡ配列；
プロモーター：              転写を開始し調節する機能を果たすヌクレオチド配列；
ＲＢＳ、リボソーム結合部位：リボソーム結合及びそれぞれのＲＮＡ転写物からの翻訳開始を媒介する、（→）コード領域の（→）翻訳開始コドンの上流のＤＮＡ配列エレメント；ＲＢＳエレメントは、（→）５’−ＵＴＲ又は（→）スペーサーの一部である；
選択阻害剤：                形質転換された細胞又は小器官よりも形質転換されていない細胞又は小器官の増殖及び成長を強く抑制する化合物；
目的配列：                  改変した又は新しく導入した任意の長さの配列：（→）形質転換を試行する目的；配列の導入を意図しない場合、目的配列の長さをゼロとすることができ、すなわち目的配列を持たないことを目的とすることができる；
停止：                      本発明の記述において、「停止」はＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写の中断に関係する；
ターミネーター：            （→）停止の原因となる配列エレメント；
形質転換ベクター：          （→）ゲノムの（→）形質転換を媒介するために作製したクローン化ＤＮＡ分子；
形質転換：                  少なくとも１つの（→）形質転換ベクターの使用を含めた（→）植物又は植物細胞の処置によってＤＮＡ配列を導入し、切り出し、又は改変する方法；
導入遺伝子（トランスジーン）：                １つの（→）ゲノムに由来し、別のゲノムに導入されるＤＮＡ配列；
ｕｉｄＡ：                  頻繁に使用されるレポータータンパク質である細菌βグルクロニダーゼの（→）コード領域。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
従来の色素体形質転換ベクターは共通構造を共有する
ＤＮＡを色素体に導入する方法の開発に加え、色素体形質転換を実施するにはさらに２つの要件を満たさなければならない。すなわち、遺伝子発現を制御する色素体配列エレメントの使用、及び新規な配列又は相同組換えによって改変した配列の部位特異的な組込みを可能にすることである。従来の色素体形質転換ベクターは、標的挿入部位の上流及び下流のプラストーム配列に由来するフランクを含んでいる（Ｚｏｕｂｅｎｋｏ等、１９９４）。これらの諸要件の結果、高等植物色素体のプラストームに外来遺伝子を導入するために使用する色素体形質転換ベクターは、以下のエレメント、すなわち、（１）５’フランク、（２）プロモーター配列、（３）５’非翻訳領域、（４）タンパク質遺伝子又は（ＲＮＡ遺伝子などの）非タンパク質遺伝子の完全な配列をコードするコード領域、（５）３’非翻訳領域及び３’フランクを共有する。また（７）色素体複製開始点は、プラストームへの配列の組込みを促進すると推論された（米国特許第５６９３５０７号）。
【００５８】
この一般的な構造は、これらのベクターの使用にいくつかの制限を課すものである。すなわち、（１）これらのベクターは種特異的である、（２）選択マーカーはトランスプラストミック植物中に残留する、（３）ターミネーターエレメントのため、遺伝子ごとに、別々のプロモーターから転写しなければならない、（４）いくつかの遺伝子を同時に発現させるために必要とされる様々な色素体制御エレメントは、望ましくない相同組換え現象のために、遺伝的不安定性を招く恐れがある、（５）導入遺伝子のコピー数は、プラストームのコピー数を決して超えることができない。
【００５９】
本発明は、上述の制限を克服する、色素体形質転換のための新しい方法を記述するものである。
【００６０】
本発明の新規ベクターは、複製開始部位「複製開始点」として役立つプラストーム配列エレメントを使用する。
高等植物色素体染色体の複製に関する理解は以下のように要約することができる。すなわち、環状二本鎖分子（約１３０〜１５０ｋｂｐ）は、「大きな単一コピー領域」、「反復Ａ」、「小さな単一コピー領域」及び反復Ａと配列は同一であるが向きが逆である「反復Ｂ」の４つの領域からなる。複製は、「ｏｒｉ  Ａ」及び「ｏｒｉ  Ｂ」と呼ばれる配列エレメントから開始されると推定される。これらのエレメントは、タバコプラストームにおいて反復領域内に位置するので、エレメント各々の２つのコピーが存在する。初期の複製の特徴は「置換ループ」である。これらは、複製の進行につれ「ローリングサークル」に転化される（Ｋｕｎｎｉｍａｌａｉｙａａｎ及びＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７による総説）。
【００６１】
色素体複製開始配列を含むが外来配列が葉緑体ゲノムに安定に組み込まれないベクターは、適切な選択にかけられる場合又は染色体外プラスミドの複製回数がプラストーム分子それぞれの複製回数を超える場合、色素体中に維持することができる。実際、このようなプラスミド様構造が文献に報告されている。Ｓｔａｕｂ及びＭａｌｉｇａ（１９９４）は、葉緑体形質転換実験を実施し、最初に使用した形質転換ベクターよりも極めて小さなプラスミド様分子である「ＮＩＣＥ１」の自発的な形成を認めた。適切な細菌複製シグナルと共に供給すれば、大腸菌と高等植物葉緑体のシャトルベクターとして使用することさえできる。選択圧を取り除くと、ＮＩＣＥ１エレメントは消失した。シャトルベクター上の配列は、プラストーム中の相同配列と組換えを起こした（Ｓｔａｕｂ及びＭａｌｉｇａ  １９９５）。すなわち、この観察から、これらのエレメントが自己複製するのではなく、組換え現象によって複製され切り出される間プラストームに組み込まれているという説明が支持される。この解釈は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ葉緑体において、色素体形質転換の予期せぬ結果として見出された高コピー染色体外エレメントの場合にもほぼ当てはまる（Ｓｕｚｕｋｉ等  １９９７）。これらのエレメントは、プラストームの再配列を伴い、シャトルベクターのベースとして使用することができなかった。すなわち、第２の形質転換では、これらのエレメントの出現が不安定になった。
【００６２】
「ｏｒｉ」配列エレメントを色素体形質転換に使用することは、別の文献にも記載されている（Ｄａｎｉｅｌｌ等  １９９０；米国特許第５，６９３，５０７号）。そこでは、エンドウマメ「ｏｒｉＡ」エレメントを含む配列が、培養タバコ細胞における短期間（最高１２０時間）の発現試験に使用された。この試験は主にインビトロで実施された。しかし、葉緑体遺伝子技術の考え方は、外来遺伝子のインビボでの長期で安定な発現を必要とする。
【００６３】
本発明者らは、今回驚くべきことに、形質転換した組織においてプラスミドが長期間（１年以上、選択圧の存在下で葉の外植片から最高９サイクルの反復再生）維持されることを観察した（実施例７参照）。形質転換組織から抽出したすべてのＤＮＡを用いて細菌を形質転換すると、葉緑体形質転換ベクターと大きさ及び制限パターンが同じプラスミドが得られる。形質転換ベクターは組込みカセットを含んでいたので、プラストームの予想部位に配列が組み込まれたことが、サザン分析並びにプラスミド様分子の存在によって示された。サザン分析から、プラストーム分子のコピー数よりもプラスミドのコピー数が増加したことが明らかになった。
【００６４】
染色体外プラスミドの維持に係わる配列を同定することができた。驚くべきことに、長期維持に必須と考えられる配列は、いかなる既知の色素体複製開始配列も含まないことが判明した。本発明者らは、いかなるターミネーター又は３’−ＵＴＲ構造も持たないベクターを使用し、長いポリシストロン性転写単位を作製した。
【００６５】
本発明の新規なベクターによって、ポリシストロン性遺伝子発現が可能になる。
本発明に記載するベクターは、プラスミドによってコードされる遺伝子に対する転写停止及び／又は開始配列を含まない。それらはターミネーター配列を欠くことが好ましい。いくつかの遺伝子を人工オペロンとして１つの機能プロモーターから転写することができる。ポリシストロン性転写物のすべての単一目的配列を確実に効率的に翻訳するために、適切なリボソーム結合部位が、好ましくは、それぞれの目的配列を分離するスペーサーエレメント中に挿入されている。発現カセットを構築するためのクローニングの労力は実質的に軽減される。また、染色体外エレメントは環状であるので、（「ローリングサークル」様の）連続転写を起こすことができ、目的配列の発現レベルがより高くなる。
【００６６】
余分な相同配列は遺伝的不安定性をもたらす−本発明の新規ベクターは余分な相同配列がない
導入遺伝子の発現に必要な相同配列は、遺伝的不安定性を引き起こす恐れがあり、特に、形質転換されたプラストームと形質転換されていないプラストームが同じ小器官内に共存する限りそうである（Ｅｉｂｌ等、１９９９）。
【００６７】
新規ベクターは、従来の色素体形質転換ベクターよりも少ないエレメントからなる。その結果、より少ない相同配列を使用するために、本発明では、より安定な色素体改変が可能になり、それらを機能的に受け継ぎ、安定な細胞系及び植物に組み込むことができる。
この戦略は、組込みカセットを含有する「脱着可能なシャトル」ベクターにも適用することができる（以下を参照）。
【００６８】
本発明の新規ベクターは、コピー数が多い
遺伝子発現は、プロモーター強度、ＲＮＡ安定性、翻訳効率及びタンパク質ターンオーバーを含めた膨大な数のパラメータの影響を受ける。他の重要なパラメータは、ＤＮＡコード配列のコピー数である。コピー数と発現の直線的な依存関係をある程度想定することができる。本発明で使用するプラスミドは、プラストーム分子よりもコピー数がかなり増加する（２〜５倍の増加）。したがって、これらのプラスミドベクターは、色素体における極めて高い導入遺伝子発現レベルの最適な基盤を提供するものである。組換え遺伝子の発現レベルが極めて高いことは、タンパク質ベースの薬剤物質、生分解性原料又は他の任意のタンパク質の色素体コンパートメントにおける製造などいくつかの用途で極めて有用になり得る。強力な調節エレメントと高コピー数の両方を使用して、色素体中の染色体外プラスミドは、従来の植物形質転換方法では達成できない、並外れて高い濃度の外来タンパク質をもたらすことができる。
【００６９】
本発明の新規ベクターは種特異的でない
従来の葉緑体形質転換ベクターは、相同組換えを介する導入遺伝子の組込みのための相同フランクとして役立つ、標的植物種から単離された葉緑体ゲノム配列を含む。通常、発現カセットには、所望の組込み部位からの２つのプラストーム配列が隣接する。異なる種のプラストームは、全般的な構造と配列の両方ともかなり変動するので、形質転換ベクターの設計上、種特異的フランクを使用することが必要となる。また、ほとんどの植物種の色素体ＤＮＡ配列及び遺伝子配列はまだ知られていない。このため、様々な植物種に対するクローニング形質転換ベクターの構築を通じてさらに労力が必要になる。本発明に記載する新規方法では、少なくともいくつかの実施形態において、導入遺伝子を安定に挿入するためにフランクのクローンを作る必要性が回避される。また、色素体ＤＮＡへの組込みは、調節エレメントを含むことができるいわゆる遺伝子間配列を標的にする場合でも、色素体遺伝子発現に望ましくない効果を及ぼす結果になる恐れがある。
【００７０】
本明細書に記載する新規な色素体形質転換方法は、いくつかの利点の組合せである
いくつかの実施形態において、本発明は、（１）相同組換えのための色素体フランクを本質的に含まない、（２）ＤＮＡ鋳型のコピー数を増すことによって、かつ、ターミネーターエレメントのない「ローリングサークル様」ポリシストロン性の転写を使用することによって著しく高い発現レベルを可能にし、（３）少なくともいくつかの実施形態において、トランスジェニック植物中のマーカー遺伝子の存在が回避される、ベクターを用いた新しい色素体形質転換方法の使用について記述する。
【００７１】
本発明の教示を用いて、安定に又は不安定に形質転換された色素体を含む植物細胞及び植物を生成することができる。多数の異なる植物種の色素体を形質転換することができる。本発明は、単子葉植物でも双子葉植物でも適用可能である。作物植物は特に好ましい。このような作物植物の例は、トウモロコシ、イネ、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、ダイズ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、ピーナッツ、サツマイモ、アルファルファ、モロコシ、エンドウマメ及びワタである。
【００７２】
選択マーカーを欠くトランスプラストミック植物の生成
植物バイオテクノロジーの１つの主要な批判は、形質転換した植物中に（ほとんどが細菌の）抗生物質マーカー遺伝子が存在することである。このような遺伝子は、環境中に制御なしに放出されると、望ましくない異系統交配を通して野生種に出現し、又は土壌細菌が媒介する遺伝子水平転移を介して出現し得る懸念がある。第１のシナリオ（異系統交配）は、大部分が母性遺伝のプラストーム導入遺伝子では起こりそうにないが、後者（遺伝子水平転移）を完全に排除することはできない。したがって、抗生物質マーカーのないトランスジェニック植物を生じる遺伝子導入方法を確立することが大いに望まれている。この目標を達成する１つの可能性は、以前に（ｌａｍｔｈａｍ及びＤａｙ、２０００）によって示された。彼らは、形質転換ベクター上の反復エレメントによって媒介される切り出し現象をスクリーニングすることによって、プラストーム形質転換体から抗生物質マーカーを除去できることを示した。本発明において、抗生物質選択マーカーを含まないトランスプラストームを生成するいくつかの異なる手順を記述する。
【００７３】
選択マーカーのないトランスジェニック植物を生成する本方法の好ましい実施形態は、プラストームへの１つ又は複数の目的配列を安定に挿入することを含む。本願で設計される形質転換ベクターは、従来の色素体形質転換ベクターと同様に、色素体ＤＮＡ配列によって隣接された目的配列を含んでいる。しかし、これに対し、選択マーカー配列は隣接色素体ＤＮＡ配列の外側に位置する（図２）。両方のフランクにおける二重相互組換えによって、プラストームへの目的配列のみの挿入が可能になる。しかし、このようなプラストームを含む細胞は、選択マーカーを含まないので選択することができない。したがって、トランスジェニック植物を生成する前記方法において、本発明は、選択マーカーの一過性のプラストーム組込みを利用する。完全な形質転換ベクター配列が単一の相同領域を介してプラストーム中に組み込まれると、選択マーカーの組込みが不安定になる。本発明者らは、従来の形質転換ベクターで形質転換されたプラストームを分析することによって、完全な形質転換ベクターの組込みが極めて高頻度で起こることを示すことができた（実施例１）。この知見から、本発明において利用する技術に対するモデルが提供される：選択マーカーは、好ましくは、単一の組換え現象を経て、完全な形質転換ベクター配列を組み込むことによってもっぱら維持されるので（図２）、形質転換ベクターを使用した後、細胞又は組織を選択圧下に維持することによってこの組換え現象を選択する；選択マーカーを含む細胞のみが、細胞系又は植物再生体を増殖させ産生することができる。したがって、組込みを担うベクターの配列によって、特にプラストームへの一過性の組込みを介して、ベクターが複製される。完全な形質転換ベクターが組み込まれたプラストーム分子では、ベクター中の相同フランクとして使用される配列が、近傍で２回出現する（形質転換ベクター及び最初の色素体ＤＮＡ配列それぞれからの１コピー、図２参照）。これによって、葉緑体の極めて活性な組換え系による反復配列間の相同組換えが起こるので、不安定な状況が生じる；このような組換え現象によって、プラストームから選択マーカー配列が切り出される。したがって、完全な形質転換ベクター配列を含むプラストームを有する第１の形質転換体が樹立された後、第２の組換え現象を示すプラストームの増殖を可能にするために選択圧を取り除く。２通りの組換えが起こる可能性がある（図２）：第１の組換え現象の（形質転換ベクターが組み込まれた）部位である色素体配列の２つのコピー間の組換えによって、第１の組換えの逆、すなわち完全な形質転換ベクターの切り出しが起こる。それによって、最初のプラストーム配列が回復し、間接的に複製されたベクターが産生される。しかし、第２のフランクの２つのコピー間の組換えが起こる第２の可能性が存在する。この第２の組換え現象では、選択マーカーを含めたベクター配列が切り出されるのに対し、目的配列はプラストーム内の２つのフランク間にある標的部位に残る。このようなプラストームを含む細胞を再生することによって、プラストームの任意所望の改変を含むが選択マーカー遺伝子を欠く植物を生成することができる。色素体及び細胞の分裂中にプラストームがランダムに分離されて、分子分析によって特定することができ植物の再生に使用できる１タイプのプラストームのみを含むセクター（ホモプラスミック（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）セクター）が生じる。本明細書に記載する形質転換ベクターの場合のように、また、一般的に従来の形質転換ベクターの場合のように、２つの色素体ＤＮＡフランクがほぼ同じサイズの場合、２つの可能な組換え現象はほぼ同じ確率で起こる。したがって、分析したセクターの約５０％が所望のプラストームを含むことになり、効率的な識別が可能になる。効率を上げるために、本発明は、所望のプラストームを含む細胞の視覚識別を可能にする技術をさらに記述する（以下を参照）。
【００７４】
本発明の別の実施形態は、選択マーカーの一過性の組込みが目的遺伝子の組込み部位以外の別の部位で起こり得る技術を提供する。このために、形質転換ベクターは、色素体ＤＮＡに相同な追加の組込み配列を含み、プラストームを用いて完全な形質転換ベクターを組み込むための組換え用の別の部位が用意される。第２のターゲティング部位に組み込まれる選択マーカーのコピー（前記追加の組込み配列）によって、選択中の耐性を付与することができる。したがって、第１のターゲティング部位（たとえば、前記目的配列に隣接する前記配列）に、マーカーを組み込まずに目的配列を安定に組み込むことができる。また、組み込まれた形質転換ベクターのコピーによって、目的配列の組込みカセットに対する長期ソースが提供され得る。十分な数のプラストームに目的配列が安定に組み込まれるまで選択を継続することができる。選択圧を取り除くと、形質転換ベクターの第２のターゲティング部位における不安定な組込みは消失する。２つの異なるターゲティング部位（第１のターゲティング部位：前記目的配列に隣接する前記配列；第２のターゲティング部位：追加の組込み配列）のために、この切り出しには、安定に組み込まれた目的配列は関係しない。この実施形態の適用例を実施例３及び４に記載する。
【００７５】
もはや必要でない配列を除去するために、当初のプラストームの配列を用いた前記ＤＮＡ配列（形質転換ベクター）の組換えを利用する原理は完全に新規なものである。形質転換ベクター上の選択マーカーに隣接する短い配列の反復を用いてプラストーム組込み後のマーカー切り出しを媒介するｌａｍｔｈａｍ及びＤａｙ（２０００）（国際公開第０１８１６００号）によって記述された方法とは対照的に、本明細書に記載する原理では、それよりも極めて長い相同領域が許容される。したがって、組換えがそれよりも極めて高い確率で起こり得る（Ｍａｌｉｇａ等、１９９３；Ｚｏｕｂｅｎｋｏ等、１９９４）。また、第２の相同領域がプラストーム上に位置するので、プラストーム組込みが成功した後、特にプラストーム組込みが成功した後だけ、選択マーカーの消失が起こる。
【００７６】
選択マーカーを欠くプラストーム突然変異体の生成
本発明は、プラストームに挿入すべき目的配列がない場合、たとえば選択マーカー遺伝子を欠くプラストーム欠失突然変異体の生成にも適用することができる。この場合、プラストーム中で欠失させるべき配列に隣接する２つの色素体ＤＮＡ配列は、形質転換ベクター上の直近に位置する。従来の欠失ベクターにおいては欠失させるべき配列は選択マーカーで置換されるが、本発明者らの系においては選択マーカーには色素体ＤＮＡ配列が隣接しない。マーカーのない突然変異体の生成は、選択マーカーの一過性の組込みを用いる上述したのと同じ原理によって達成することができる：第１の形質転換体は選択圧下で樹立され、したがって隣接色素体ＤＮＡ配列の１つを介する第１の組換え現象によって完全な形質転換ベクターが組み込まれたプラストームを含む。選択圧を取り除いた後、第２の色素体ＤＮＡセグメントの２コピー間での第２の組換え現象によって、選択マーカーを含むベクター配列が切り出される。この技術によって、プラストーム配列を置換するよりも純粋な欠失が可能になる。また、突然変異体植物は選択マーカーを含まないので、同じ選択マーカーを用いてさらに形質転換を行うことができる。また、同じ技術をさらに用いてアミノ酸変化（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）や改変調節エレメントなど既存のプラストーム配列の改変を導入することができる。
【００７７】
光合成に機能上直接的又は間接的に関与する内在性色素体遺伝子を選択マーカーとして使用することができる。光合成に直接関与する遺伝子の例は、光合成電子伝達に必須なｐｅｔＡである（光合成に間接的に関与する遺伝子の例は、色素体によってコードされたＲＮＡポリメラーゼをコードするｒｐｏＡである。ｒｐｏＡのノックアウト突然変異体は、光合成に直接関与する遺伝子の転写が遮断されるので、光合成を行うことができない）。第１のステップにおいて、光合成に関連する遺伝子を中断することができる。次いで、この材料を第２の色素体形質転換のためのレシピエント系として用いる。ここで、形質転換ベクターを含む色素体の選択は、回復した光合成機能をマーカーとして用いて実施される。この新規なタイプの「マーカー」は、組込み用のいかなる相同配列も隣接せず、色素体中の好ましくは自己複製するプラスミド上に残る。光合成は土壌での植物の生長に必須であるので、光合成関連機能を有するプラスミドを維持するために常に選択がある。１つ又は複数の目的遺伝子の転写を可能にするため、また、「ローリングサークル様」転写による極めて高い発現レベルを達成するために、それぞれの光合成遺伝子はターミネーターエレメントと融合しない。
【００７８】
別の手順（実施例１１参照）では、目的遺伝子の組込みを媒介するが、選択マーカーの組込みは媒介しないシャトルベクターとして自己複製プラスミドを使用する。選択マーカーは、相同配列が隣接していないので自己複製プラスミドベクター上に残る。形質転換された植物材料がホモプラストミック状態に到達した後に選択圧を取り除くと、ベクターは消失するが、目的遺伝子はプラストームに安定に組み込まれる。完全なエレメントは望ましくない多数の複製を媒介するので、この手順は自己複製をもたらす改変配列に基づいている。プラストーム複製回数を超える複製回数は、選択圧の非存在下でもプラスミドを安定化する（このような多数の複製は、本明細書に記載する自己複製をもたらすエレメントによって媒介される）。したがって、選択圧の非存在下でのプラスミドの消失は、好ましくは、記述した配列エレメントの欠失突然変異体を用いて、複製速度を低下させることによって実施される。
【００７９】
この方法の変形方法によって、極めて多数の複製を媒介するエレメントを使用する場合でも、選択マーカーのない形質転換体を生成することが可能になる：マーカーカセット（たとえば、実施例１１のａａｄＡ遺伝子）には、プラストームに対して非相同である配列のダイレクトリピートが隣接する。実施例１１では、細菌ベクターから生じる配列エレメントによってダイレクトリピートがベクターに含まれる。相同組換えによって、マーカー遺伝子がシャトルプラスミドから切り出される。この手順は、ｌａｍｔｈａｍ及びＤａｙ（２０００）によって記述されたマーカー除去にやや類似している。しかし、これに対し、マーカー遺伝子は組込み現象後プラストームから除去されず、自己複製プラスミドから切り出される。
【００８０】
追加配列の挿入による所望のトランスプラストミック材料の視覚的識別
本発明は、さらに、一過性のマーカー組込みの方法によって生成される形質転換体をより効率的に識別するための技術を提供する。１つの考えられる方法は、形質転換体の視覚的識別を可能にする配列を挿入することである。このような配列の例は、実施例６に記載するように、色素体において発現され得る緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列である。この配列は、色素体ＤＮＡフランク間の形質転換ベクター中に目的配列と共に挿入され、したがってプラストームに安定に組み込まれた状態にすることができる。ＧＦＰを発現する色素体は緑色蛍光を示すので（Ｋｈａｎ及びＭａｌｉｇａ、１９９９；Ｓｉｄｏｒｏｖ等、１９９９）、このような色素体を含む細胞又はセクターは容易に識別することができる。第２の組換え現象が完全な形質転換ベクター配列を除去する場合、ＧＦＰコード配列も除去され、このようなプラストームを含むセクターはもはや蛍光を示さなくなる。これに対し、所望の第２の組換え現象（選択マーカーを含むベクター配列の切り出し及び目的配列の組込み）を示すプラストームは、依然として蛍光性の表現型を生じる。したがって、選択マーカーのないトランスプラストミック細胞又は組織の識別が極めて簡単になる。この手順は、前記配列を含むセクターの視覚的識別を可能にする任意の配列を用いて実施することができる。ＧＦＰ遺伝子のような遺伝子は形質転換材料に選択上の優位性を付与しないので、遺伝子水平転移による制御のない伝播のリスクが大いに軽減される。また、このような遺伝子は、万一制御されずに伝播しても、ヒト、他の生物又は環境一般に対してなんら予測し得るリスクを含んでいない。
【００８１】
突然変異表現型の回復による所望のトランスプラストミック材料の視覚的識別
さらに、本発明は、トランスプラストミック植物に残留する唯一の外来配列が目的配列である方法も提供する。この方法は、２つの形質転換を要する２段階手順に基づいている。第１のステップでは、容易に識別可能な表現型を示す色素体突然変異体が産生される。この表現型は、改変された着色によって生じることが好ましい。このような突然変異体の例は、ｒｐｏＡ遺伝子機能が欠損して白色表現型を示す植物（実施例５参照）又はｐｅｔＡ遺伝子機能が欠損して強いクロロフィル蛍光（ｈｃｆ）を伴う淡緑色表現型を示す植物（実施例２参照）である。別の例は、ｙｃｆ３（実施例３）及びｙｃｆ９それぞれの不活性化突然変異体である。遺伝子機能の破壊は、たとえば、遺伝子又はその一部の破損又は欠失によって起こり得る。このような突然変異体の生成は、好ましくは、上述した一過性の選択マーカーが組み込まれ、選択マーカーを欠いた植物が生じる方法を用いた色素体形質転換によって実施される。細胞の突然変異表現型によって、分離後選択なしで所望の植物材料を視覚的に識別することができる。このような突然変異体植物から得られる材料を、今度は第２の形質転換のための基質として使用することができ、１つ又は複数の目的配列がプラストームに導入される。この目的のための形質転換ベクターは、本発明において上述したのと同じ構造を有するが、突然変異体の破壊された遺伝子機能を修復する配列をさらに含む。この修復配列は、目的配列と共に色素体ＤＮＡフランク間の形質転換ベクターに挿入することができ、一方、選択マーカー配列はこのフランクの外側にある。形質転換されたプラストームを含む細胞は、野生型の表現型を示すので容易に識別することができる。完全な形質転換ベクターが第２の組換え現象によって切り出される場合、突然変異遺伝子型が再度形成され、その結果、このようなプラストームを含むセクターは突然変異表現型を示す。これに対し、所望の第２の組換え現象（選択マーカーを含むベクター配列の切り出し及び目的配列の組込み）を示すプラストームは野生型の表現型を有し、それによって所望のトランスプラストームを含む組織の識別が簡単になる。また、この方法によって産生されるトランスプラストミック植物は、所望の目的配列から離れたいかなる追加の配列も含まない。この方法に適したプラストーム突然変異体が生成されると、それは増殖し、任意所望の目的配列の導入に使用することができる；したがって、この方法は新しい目的配列ごとに２度の形質転換を必要とせず、単一の形質転換ステップで所望のトランスプラストミック植物を生成することができる。
【００８２】
高等植物の色素体形質転換用ａｐｈＡ−６を用いる方法
これまでのところ、ａａｄＡ及びｎｐｔＩＩが高等植物の色素体形質転換のために日常的に使用できる唯一の選択マーカー遺伝子である。したがって、高等植物の色素体形質転換のためのさらなる選択マーカーが求められている。
本発明は、以下のステップ、すなわち、
（ａ）細菌アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼＡ−６（ａｐｈＡ−６）をコードする配列を選択マーカーとして含むＤＮＡを用いて前記多細胞植物の細胞又はプロトプラストの色素体を形質転換すること、
（ｂ）前記形質転換された細胞又はプロトプラストの増殖を、前記増殖細胞又はプロトプラストを所定濃度のアミノグリコシド抗生物質に曝す条件下で可能にすること、
（ｃ）所定濃度のアミノグリコシド抗生物質に曝す条件下での反復再生サイクル中に、形質転換されたプラストーム及び形質転換されていないプラストームの分離、並びに形質転換された色素体又は形質転換されていない色素体の分離を可能にすること、及び
（ｄ）それらのプラストームにおいて遺伝的に形質転換された細胞及び／又は植物を回収することにより、プラストーム中で形質転換されたトランスジェニック多細胞多色素体（ｍｕｌｔｉ−ｐｌａｓｔｉｄａｌ）植物又はそれらの細胞を生成する方法を提供することによってこの問題を解決する。この方法を、好ましくは、ＰＥＧによって媒介された高等植物のプロトプラストの形質転換と組み合わせて実施する。上記方法は、すべての多細胞多色素体植物又はそれらの細胞に適用可能である。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種が最も好ましい。
【００８３】
遺伝子ａｐｈＡ−６は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉに由来する（Ｂａｔｅｍａｎ及びＰｕｒｔｏｎ、２０００；Ｍａｒｔｉｎ等、１９８８）。これは、以前、単細胞藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの色素体形質転換のために使用された（Ｂａｔｅｍａｎ及びＰｕｒｔｏｎ、２０００）。今回驚くべきことに、本明細書に開示するように十分に制御された抗生物質濃度を用いる同化選択（ｅｌａｂｏｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）手順を使用する場合、高等植物の色素体形質転換に対してａｐｈＡ−６が使用できることを見出した。抗生物質として、アミノグリコシド抗生物質を使用する。最も好ましい抗生物質はカナマイシンである。
この方法で使用すべきアミノグリコシド抗生物質濃度、特にカナマイシン濃度は、形質転換方法に応じて２０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２５〜２５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｍｌである（実施例１２参照）。
【００８４】
本明細書では、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉの前記ヌクレオチド配列を使用することができる。また、遺伝コードの縮重に従ってＡ．ｂａｕｍａｎｉｉのａｐｈＡ−６と同じアミノ酸配列をコードする配列を使用することができる。また、Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ  ａｐｈＡ−６アミノ酸配列に少なくとも５０％、好ましくは７５％相同な配列を有するａｐｈＡ−６変異体をコードするヌクレオチド配列を使用することができる。Ａ．ｂａｕｍａｎｉｉ  ａｐｈＡ−６アミノ酸配列に少なくとも５０％、好ましくは７５％同一な配列を有するａｐｈＡ−６変異体をコードするヌクレオチド配列を使用することが最も有利である。また、中間の条件下、好ましくは高いストリンジェンシー条件下でＡ．ｂａｕｍａｎｉｉ  ａｐｈＡ−６コード配列とハイブリッド形成する配列を使用することができる。
【００８５】
ｎｐｔＩＩ遺伝子（ａｐｈＡ−２）などのａｐｈＡ−６遺伝子は、異なる原核生物から生じるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼファミリーに属する酵素をコードする（Ｓｈａｗ等  １９９３、Ｗｒｉｇｈｔ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ  １９９９）。どちらの酵素も類似の触媒活性を有するが、ａｐｈＡ−６遺伝子産物は、カナマイシン及び他の普通のアミノグリコシドだけでなく、アミカシンなど他のものも解毒することができる広範な耐性プロファイルを有することによって識別される。
【００８６】
本明細書では、本発明者らは、高等植物、特にタバコにおいて、ａｐｈＡ−６が汎用の効率的で再現性のある色素体形質転換用マーカーであることを示す（実施例１２）。ａｐｈＡ−６遺伝子を用いた全体の形質転換効率はａａｄＡ遺伝子を用いて日常的に得られる値よりも低いものの、トランスジェニック色素体形質転換体を日常的に生成するのには十分高い。葉へのａａｄＡ構築物の打ち込み（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）からの公表された結果は、１ショット当たり０．５〜５形質転換体である。グリッド打ち込み（ｇｒｉｄ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によるａｐｈＡ−６遺伝子を用いて、本発明者らは２ショットごとに１形質転換体を得た。ＰＥＧ形質転換とａａｄＡ遺伝子による形質転換効率は、０．５×１０６処理済みプロトプラスト当たり１０〜４０形質転換体である（Ｋｏｏｐ等  １９９６、Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓ−Ｍａｃｉｏｓｓｅｋ等  １９９９）のに対し、本発明者らはＰＥＧ形質転換ごとに約５形質転換体を得た。これに対し、ｎｐｔＩＩでは、２５葉の打ち込みごとにわずか１色素体形質転換体しか得られなかった。また、多数の核形質転換体がｎｐｔＩＩを用いて再生された系において見られたのに対し、ａｐｈＡ−６を用いた本明細書では、３０ＰＣＲ試験系のうち２９が陽性色素体形質転換体であり、核形質転換体は検出されなかった。この効率の向上は、まったく驚くべきことである。それに寄与する要因としては、よりストリンジェントな選択システム、プロトプラスト誘導標的組織、別のカナマイシン解毒酵素の使用などが挙げられる。
【００８７】
本発明者らは、一般に使用されているａａｄＡ遺伝子に加えて、有用な抗生物質色素体マーカーを初めて樹立した。本発明者らの研究の別の重要な態様は、タバコプラストーム用の３つの新しい挿入部位の記載である。２つのケースにおいて、キメラａｐｈＡ−６発現カセットを、遺伝子ｔｒｎＲ−ｔｒｎＮと遺伝子ｐｅｔＡ−ｏｒｆ９９の間の遺伝子間領域にそれぞれ中立的に（ｎｅｕｔｒａｌｌｙ）導入した。第３のケースにおいて、両方の遺伝子が最終的にｙｃｆ３調節エレメントの制御下にあるように人工オペロンを生成するｙｃｆ３コード配列の前にａｐｈＡ−６コード領域を導入した。
【００８８】
カナマイシン耐性が変動することが、異なる色素体プロモーターの制御下にあるａｐｈＡ−６遺伝子を含む植物において認められた。耐性の上限は、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター又はｙｃｆ３調節エレメントの制御下にあるａｐｈＡ−６遺伝子を含む形質転換体それぞれに対して、５００ｍｇ／ｌ及び５０ｍｇ／ｌカナマイシンであった。これに対し、新しく作製されたａｐｈＡ−６−ｙｃｆ３オペロンを有する植物から得られるＴ１子孫は、２００ｍｇ／ｌカナマイシンで正常に出芽することができた。外植片と実生のこの明らかなカナマイシンに対する差異は、カナマイシン取り込みの生理的な違い又はｙｃｆ３調節エレメントからのａｐｈＡ−６遺伝子の発現における変動によって説明することが可能である。
【００８９】
本明細書において、ａｐｈＡ−６遺伝子が、高等植物における色素体形質転換のための新しいドミナントな選択マーカーとして使用できることが示される。順応性のあるマーカーが追加されることは、色素体工学戦略にとって、特にマーカーの再利用と組み合わせた外来遺伝子の段階的なプラストームへの挿入が必要である場合に有用であることが明らかになるはずである。
実施例
【実施例１】
【００９０】
色素体ゲノムへの（１フランクを介する）完全なベクターの組込みのＰＣＲ分析
色素体形質転換ベクターｐＫＣＺ
ｐＫＣＺは、相同組換えに使用される２つのフランクの間に選択マーカーがクローン化された従来の色素体形質転換ベクターである。このベクターは、タバコ色素体ゲノムの逆方向反復領域中のｔｒｎＲとｔｒｎＮの間に中立的に挿入されるように設計されている（Ｚｏｕ、２００１）。ｐＫＣＺは、相同組換えのための（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ０００４４のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍプラストーム配列３１１０６〜１３２２７７及び１３２２７８〜１３３３９６に対応する）２つのフランキング配列及び１６ｓ  ｒＲＮＡプロモーターの制御下にあるａａｄＡ色素体発現カセットを含む（Ｋｏｏｐ等、１９９６）。図３にプラスミド構築物の概略図を示す。
【００９１】
第１の形質転換体の生成及びその後のホモプラストミック系の選択
微粒子銃によって媒介される色素体形質転換及びその後の選択を実施例３のように実施した。形質転換体の選択は、ａａｄＡ遺伝子産物によって付与される抗生物質スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性を基にした。形質転換された色素体ゲノムを増幅し野生型ゲノムを除去するために、第１の形質転換体（サイクル０）を、スペクチノマイシンを含有する選択培地上でいくつかの追加の（小さな葉の外植片からの）再生ラウンドに供した（以下、サイクルＩ、サイクルＩＩなどと称する）。
【００９２】
第１の形質転換体のＰＣＲによる分析
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離したＤＮＡすべてを使用してＰＣＲにより色素体形質転換体（サイクル０）を同定した。ａａｄＡ遺伝子の有無を決定するために、プライマーｏＳＨ８１（５’−ＣＴＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＴＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。ＰＣＲプログラムを以下のようにした：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。その結果、（打ち込んだ６つの葉の）５４分析からの４８系が５０４ｂｐの予想増幅産物を与えた。タバコプラストームにａａｄＡカセットが正確に組み込まれたことを証明するために、プライマーｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。プライマーｏＳＨ５８は、タバコプラストーム中のｐＫＣＺの右フランク外側（下流）に位置し、ｏＦＣＨ６０と組み合わせて逆方向反復におけるｔｒｎＲとｔｒｎＮの間にあるａａｄＡ発現カセットの組込みから予想される２１０６ｂｐの産物のみを生成することができる。ＰＣＲプログラムを以下のようにした：９４℃５分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３．５分、３５サイクル；最終伸張７２℃７分。ａａｄＡ  ＰＣＲ陽性系のうち全４８個が予想された２１０６ｂｐの右フランクａａｄＡ産物を与えた。
サイクル０形質転換体のうち１０個（１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、２：１、２：４、２：５、２：６及び２：７）を選択してさらに分析を進めた。
【００９３】
完全に組み込まれたベクターを含む形質転換体ＰＣＲ分析
通常、安定な色素体形質転換体の産生は、（図１に示すように）形質転換分子の左右各フランクとプラストームの間で起こる２つの同時組換え現象を経て起こると考えられる。図４に、従来の色素体形質転換ベクターｐＫＣＺを用いた別の機序を例として示す。ここで、仮想の不安定中間体を生成する結果となる１つの（左又は右）フランクのみとプラストームの組換えによるｐＫＣＺベクターの完全な組込みが始めに起こる。続いて、さらなる組換え現象がこの分子のフランク対間で起こり、野生型の状態（ケースＩ）又は安定に組み込まれたａａｄＡカセット（ケースＩＩ）を生成することができる。図４にｐＫＣＺの左フランクを介した組換えから得られる状態のみを示す。ただし、右フランクを完全なベクター組込みに使用した場合も同様な状態が起こり得る。この可能性を試験するためにプライマーｏＳＨ３（５’−ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧ−３’）及びｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）を用いてＰＣＲを実施した。プライマーｏＳＨ３はｐＫＣＺ（ｐＵＣ１８）のベクターバックボーン中に存在し、プライマーｏＳＨ５８はタバコプラストーム中のｐＫＣＺの右フランク外側（下流）に位置する。図４に示すように完全なｐＫＣＺ組込みが起きたとき、これら２つのプライマーを用いて２６３８ｂｐの産物のみを得ることができる。ｏＳＨ３の結合部位がないので、（左及び右フランクを含む）野生型プラストーム断片からは予想サイズのＰＣＲ産物が得られないはずである。ＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃５分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３．５分、３５サイクル；最終伸張７２℃７分。分析した１０個のサイクル０形質転換体のうち９個が２．６ｋｂのＰＣＲ産物を示し、これらの系内の色素体ゲノムへのｐＫＣＺの完全な組込みと一致した（図５Ａ）。野生型コントロール又は試料１：１においては正確なサイズの産物は認められなかった。ｐＫＣＺの完全な組込みは不安定中間体が生成する結果となるので、時間の経過とともにこの分子のフランク対間のさらなる組換え現象によって、野生型の状態（ケースＩ）又は安定に組み込まれたａａｄＡカセット（ケースＩＩ）がもたらされると予想される。そのため、サイクルＩ及びサイクルＩＩ植物材料から調製されるＤＮＡ試料を、プライマーｏＳＨ３及びｏＳＨ５８を用いてＰＣＲで分析した。図４に示すモデルが正しい場合、プライマーｏＳＨ３及びｏＳＨ５８が２６３８ｂｐバンドを増幅できる確率は、選択の各再生サイクルによって減少するはずである。その結果、分析した１０個のサイクルＩ系のうちわずか５個のみが予想サイズの強いＰＣＲ産物を与えたことから（図５Ｂ）、このことは実際に当てはまることが示唆された。また、サイクルＩＩでは、予想された２６３８ｂｐバンドが明確に増幅される系の数はさらに減少した。
図４に示すモデルから、完全なベクター組込みに対して陰性であるサイクルＩＩの系すべてが、先に記述した分子再配列のために、安定に組み込まれたａａｄＡカセット（ケースＩＩ）と一致するＰＣＲシグナルを依然として示すはずであることも予想される。タバコプラストームへのａａｄＡカセットの組込を証明するために、プライマーｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃５分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３．５分、３５サイクル；最終伸張７２℃７分。サイクルＩＩ形質転換体のうち１０個すべてが予想された２１０６ｂｐの右フランクａａｄＡ産物を示し（図５Ｄ）、図４に示すケースＩＩシナリオと一致した。
【実施例２】
【００９４】
光合成遺伝子の不活性化及び再構成に基づく選択システムの構築
色素体ｐｅｔＡ遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターｐｌＣＦ５５８の構築
Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９に記載された標準手順を用いてすべてのクローニング手順を実施した。
ベクターｐｌＣＦ５５８は、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ０００４４のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍプラストーム配列６３３３５〜６４３３４及び６５５９８〜６６５９７に対応する）２つのフランキング配列及びその間のａａｄＡカセット（ｐＵＣ１６ＳａａｄＡ  Ｓｍａ  ｖｏｌｌｓｔ、Ｋｏｏｐ等、１９９６）を含む。組換え用相同フランクはｐｅｔＡ遺伝子の各１ｋｂの５’及び３’配列であった。ｐｅｔＡ遺伝子（９６２ｂｐ）及びｐｅｔＡ  ３’領域の３００ｂｐをａａｄＡカセットで置換した。
以下のオリゴ対をプライマーとして用いて、ＰＣＲにより両方のフランキング断片を増幅した。すなわち、ｏＳＫ１３（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡ−３’）とｏＳＫ１４（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡ−３’）により断片末端にＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位を形成し、ｏＳＫ１５（５’−ＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧ  ＴＣＡＡＡＴＴＴＧ−３’）とｏＳＫ１６（５’−ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＧＣＴＣ−３’）により断片末端にＳｍａＩ及びＳｐｈＩ部位を形成した。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃１．５分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。消化された断片（左／右フランク）及びＳｍａＩ断片としてａａｄＡカセットを１段でクローン化してｐＵＣ１９ベクターとし、これをＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで開いてベクターｐｌＣＦ５５８を作製した。構築物ｐｌＣＦ５５８を制限消化によって分析し、ＰＣＲ増幅断片の配列を決定してフランキング領域の配列が正確かどうかを試験した。形質転換ベクターｐｌＣＦ５５８を図６及び８に示す。
【００９５】
形質転換ベクターｐｌＣＦ８２０の構築
ｐｅｔＡ遺伝子の欠失を修復し同時に新しい目的遺伝子（ｕｉｄＡ）を導入する第２の形質転換のために、ベクターｐｌＣＦ８２０を構築した。すなわち、ｐｅｔＡコード配列及び（５’／３’調節エレメントを含む）遺伝子カセットを、（ベクターｐｌＣＦ５５８の場合に用いたのと同じく）左／右フランキング各配列の間にクローン化した。さらに、ａｐｈＡ−６発現カセットを、一過性の発現のためにベクターバックボーン中にクローン化した。１ｋｂ左フランク、ｐｅｔＡ遺伝子配列（９６２ｂｐ）及びｐｅｔＡ遺伝子３’領域の３００ｂｐを含む約２．２ｋｂの断片を、以下のオリゴ対をプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した。すなわち、ｏＳＫ１３（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡ−３’）とｏＳＫ７１（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＧ−３’）により断片末端にＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位を形成した。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。（ベクターｐｌＣＦ５５８におけると同じく）この断片及び右フランクを一緒にクローン化してＮｄｅＩ／ＳｐｈＩで開かれたｐＵＣ１９ベクターとし、ベクターｐｌＣＦ５６１を得た。このベクターは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍプラストーム配列６３３３５〜６６５９７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ０００４４）に対応する１ｋｂ左フランク、ｐｅｔＡコード配列、ｐｅｔＡ  ３’領域の３００ｂｐ及び１ｋｂ右フランクを含む。
【００９６】
目的遺伝子（ｕｉｄＡ）を、両方のフランキング断片の間、より正確にはｐｅｔＡコード配列の３００ｂｐ下流の（５’／３’調節エレメントを含む）遺伝子カセットとして、プライマーによって形成されたＳｍａＩ部位に導入した。ｕｉｄＡ−カセットをＳｍａＩ断片としてベクターｐｌＣＦ５６２（「ｐＵＣ１６ＳＲＢＳｕｉｄＡ３’ｒｂｃＬ」、Ｋｏｏｐ等、１９９６）から取り出し、ベクターｐｌＣＦ５６１の単一のＳｍａＩ部位にクローン化してベクターｐｌＣＦ５９７を得た。ａｐｈＡ−６発現カセットをｐｌＣＦ５９９（ｕｉｄＡコード配列の代わりにａｐｈＡ−６コード配列を含むベクターｐｌＣＦ５９７の既存の誘導体）からＳｍａＩ断片として得て、ベクターｐｌＣＦ５９７のバックボーン中の平滑末端化され脱リン酸化されたＢｇｌＩ部位に連結してベクターｐｌＣＦ８２０を得た。
構築物すべてを制限消化によって分析し、ＰＣＲ増幅断片の配列を決定してフランキング領域の配列が正確かどうかを試験した。形質転換ベクターｐｌＣＦ８２０を図７及び９に示す。
【００９７】
第１の形質転換及びホモプラストミックΔｐｅｔＡ突然変異体の選択
ベクターｐｌＣＦ５５８を用いた微粒子銃による色素体形質転換及び選択を実施例３に記載したように実施した。ＰＥＧによって媒介される、ベクターｐｌＣＦ５５８を用いた色素体形質転換及び選択を実施例３に記載したように実施した。形質転換体の選択を、ａａｄＡ遺伝子産物によって付与されるスペクチノマイシン／ストレプチノマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）耐性に基づいて行った。
【００９８】
第２の形質転換及びΔｐｅｔＡ突然変異体からのホモプラストミック再構築野生型植物の選択
ベクターｐｌＣＦ８２０を用いた微粒子銃による色素体形質転換を実施例３に記載したように実施した。ＰＥＧによって媒介される、ベクターｐｌＣＦ８２０を用いた色素体形質転換を実施例３に記載したように実施した。第２の形質転換体の選択を、形質転換色素体におけるａｐｈＡ−６遺伝子の一過性発現のため、カナマイシン含有培地（２５ｍｇ／ｌ）上で実施した（完全なベクター組込みによって、カナマイシンマーカーの短期発現が促進される；図９参照）。ａｐｈＡ−６の発現によって付与されたカナマイシン耐性に加えて、形質転換体は、ｐｅｔＡ遺伝子の再構成を示す濃緑色野生型様表現型を示す。濃緑色再生体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）を選択培地から取り出し、第１のシュートをＢ５培地に移して、発根させ生長させた。再構成系は、Ｂ５培地上で正常に生長するのに対し、ΔｐｅｔＡ突然変異体はＢ５培地上での生長が極めて不十分であり発根しない。
【００９９】
第１の形質転換後のＰＣＲ及びサザンブロットによる形質転換体の分析
植物ＤＮＡを単離するため、ＰＣＲ分析及びサザンブロッティング標準手順を実施例３に記載したように用いた。ａａｄＡ遺伝子の有無を決定するために、プライマーｏＦＣＨ５９（５’−ＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＣＧ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を用いた。ａａｄＡカセットが正確に挿入されたことを証明するために、プライマーｏＦＣＨ６０及びｏＳＫ１１６（５’−ＡＡＡＡＴＡＧＡＴＴＣＡＴＴＡＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣ−３’）を用いた。プライマーｏＳＫ１１６は、左フランクの上流に位置する。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。ＰＣＲの結果から４４の再生系が正確にプラストーム挿入されたａａｄＡ遺伝子を有することが示された（２４打ち込み）。
【０１００】
ほとんどのΔｐｅｔＡ系で、完全に組み込まれた形質転換ベクターｐｌＣＦ５５８の存在を示すことが可能であることがさらに分析して証明された。これは、ｏＳＨ２（ベクターバックボーン中に位置する５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣ  ＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’）とｏＳＫ１１６又はｏＳＨ３（ベクターバックボーン中に位置する５’−ＧＧＣＡＴＣＡＧ  ＡＧＣＡＧＡＴＴＧ−３’）とｏＳＫ２５３（ｐｅｔＡコード領域の３’末端に位置する５’−ＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＡＡ  ＴＴＣＡＴＴＴＣＧＧＣＣＡＡＴＴＧ−３’）のプライマーの組合せを用いたＰＣＲによっても同様に行われた。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。
【０１０１】
サザンブロッティングによりさらに分析して、ａａｄＡカセットの組込みに対して形質転換系がホモプラストミックとヘテロプラストミックのどちらであるかが示された。ＤＮＡブロット分析を、実施例３に記載したように実施した：植物ＤＮＡすべてをＮｃｏＩ又はＢｇｌＩＩで消化し、断片をゲルで分離し、メンブレン上にブロットした。プロービングのために、ＤＩＧ標識断片（形質転換ベクターからの左又は右フランク）を用いて野生型と形質転換プラストームを識別した。
【０１０２】
第２の形質転換後のＰＣＲ及びサザンブロットによる形質転換体の分析
植物ＤＮＡを単離するため、ＰＣＲ分析及びサザンブロッティング標準手順を実施例３に記載したように用いた。ｕｉｄＡ遺伝子の有無を決定するために、プライマーｏＳＭ６１（５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）及びｏＳＭ６２（５’−ＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’）を用いた。ｕｉｄＡカセットが正確に挿入されたことを証明するために、プライマーｏＳＭ６１及びｏＳＫ１３８（５’−ＡＡＴＣＧＴＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＡＣＴＧＧ−３’）を用いた。プライマーｏＳＫ１３８は、右フランクの下流に位置する。ｐｅｔＡ遺伝子の再構成は、プライマーｏＳＫ１１６及びｏＳＭ６２を用いたＰＣＲにより証明することができ、欠失ｐｅｔＡ遺伝子／ｐｅｔＡ  ３’ＵＴＲ及び新しい挿入ｕｉｄＡ遺伝子の各配列を含むＰＣＲ増幅断片が示された。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２〜３分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。
ほとんどの場合、形質転換ベクターｐｌＣＦ８２０を完全に組み込むことが可能であることがさらに分析して証明された。これは、ｏＳＨ２／ｏＳＫ１１６又はｏＳＨ３／ｏＳＫ１３８のプライマー組合せを用いたＰＣＲによっても同様になされた。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。
サザンブロッティングによりさらに分析して、形質転換された系がホモプラストミックとヘテロプラストミックのどちらであるかかが示された。ＤＮＡブロット分析を、実施例３に記載したように実施した：植物ＤＮＡすべてをＮｃｏＩ又はＢｇｌＩＩで消化し、断片をゲルで分離し、メンブレン上にブロットした。プロービングのために、ＤＩＧ標識断片（形質転換ベクターからの左又は右フランク）を用いて野生型と形質転換プラストームを識別した。
【実施例３】
【０１０３】
ｙｃｆ３の不活性化／再活性化及び１フランクによって媒介されるａｐｈＡ−６遺伝子組込みのための一過性選択によるＧｕｓ遺伝子の安定導入
ｙｃｆ３は、最近、タバコにおいて光化学系Ｉ（ＰＳＩ）複合体を安定に蓄積するために必要であることが示された（Ｒｕｆ等、１９９７）。この遺伝子が破壊されると、明るいところで条件的な色素欠乏表現型になる。ホモプラスミックΔｙｃｆ３植物は、標準照度条件（３．５〜４Ｗ／ｍ２）下、薬物及び植物ホルモンを含まない培地上で再生すると完全な白色表現型を示し、一方、低照度条件（０．４〜０．５Ｗ／ｍ２）下では表現型はそれよりもかなり改善（ライトグリーン）される。
【０１０４】
ｙｃｆ３遺伝子の標的不活性化のための形質転換ベクターｐｌＣＦ５７７の構築
ｙｃｆ３の（プラストームヌクレオチド４６０４２〜４６２０６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ０００４４．１による位置番号）に対応する）第１のエキソン及びスプライシング部位をａａｄＡコード領域で置換することによってｙｃｆ３遺伝子を不活性にするように設計された形質転換ベクターを構築した。このベクターは、（ａａｄＡマーカー遺伝子用だけでなく、内在性のｙｃｆ３又はｔＲＮＡ遺伝子用の）いかなる３’調節エレメントも含まない。また、プロモーターエレメントは導入されず、ａａｄＡ遺伝子は内在性のｙｃｆ３上流調節エレメントによって転写及び翻訳されると予想された。
【０１０５】
このベクターは、以下の２対のプライマー、すなわち、ｏＦＣＨ７６（５’−Ｎｃｏ  Ｉ−ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６９〜４６２８８でアニーリング）とｏＦＣＨ７７（５’−Ｓｍａ  Ｉ−ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＣ−３’、プラストームヌクレオチド４７２０５〜４６１８５でアニーリング）；ｏＦＣＨ７８（５’−Ｓｐｈ  Ｉ−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド４５０３３〜４５０５３でアニーリング）とｏＦＣＨ７９（５’−Ｐｓｔ  Ｉ−ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６０４１〜４６０２１でアニーリング）を用いてＰＣＲによってタバコ葉緑体ゲノムから増幅された５’及び３’相同配列が隣接したａａｄＡコード領域を含む。
【０１０６】
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃２分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。ｙｃｆ３開始コドン上流の９３６ヌクレオチドを含む増幅された５’相同断片（プラストームヌクレオチド４６２６９〜４７２０５に対応）を、Ｓｍａ  Ｉ及びＮｃｏ  Ｉで消化し、次いでＥｃｏ  ＲＩで消化したｐＵＣ１６ＳａａｄＡプラスミド（Ｋｏｏｐ等、１９９６）に連結し、続いてＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて平滑化（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応に供し、次いでＮｃｏ  Ｉで消化してｐｌＣＦ５６５を生成した。ｙｃｆ３遺伝子の１０００ヌクレオチドを含む増幅した３’相同断片（プラストームヌクレオチド４５０３３〜４６０４１に対応）をＰｓｔ  Ｉ及びＳｐｈ  １で消化し、次いでＰｓｔ  Ｉ及びＳｐｈ  Ｉで切断したｐｌＣＦ５６５に連結し、最終的に形質転換ベクターｐｌＣＦ５７７を得た（図１０及び１１）。プラスミド挿入断片のアイデンティティーを、配列決定（ＭＷＧ、Ｍｕｎｉｃｈ）によって確認した。
【０１０７】
第１の形質転換及びホモプラストミックΔｙｃｆ３突然変異体の選択
タバコの種子（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ）の表面を滅菌し（７０％エタノール中１分、５％Ｄｉｍａｎｉｎ  Ｃ（Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１０分）、無菌水中で１０分間３回洗浄し、Ｂ５培地（調製については下記参照）上に置いた。２５℃、１６時間明／８時間暗サイクル（０．５〜１Ｗ／ｍ２、Ｏｓｒａｍ  Ｌ８５Ｗ／２５  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｗｈｉｔｅ蛍光灯）で植物を生長させた。
【０１０８】
４週齢無菌生長Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎｎａ植物から５枚の葉を切り、ＲＭＯＰ培地（調製については下記参照）上に移した。金懸濁液（０．６ミクロン、Ｂｉｏｒａｄ、Ｍｕｎｃｈｅｎ；６０ｍｇ／ｍｌエタノール）３５μｌを無菌Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆカップ（Ｔｒｅｆｆ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｇｏｌｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、遠心分離により回収し、無菌水１ｍｌで洗浄した。金の沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）を無菌水２３０μｌに再懸濁し、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ２５０μｌ及びＤＮＡ（形質転換ベクターｐｌＣＦ５７７）２５μｇを添加した。混合物を完全に再懸濁した後、０．１Ｍスペルミジン５０μｌを添加し、混合し、１０分間氷上でインキュベートした。次いで金を遠心分離（１分、１００００ｒｐｍ）により回収し、エタノール（１００％、ｐ．Ａ．）６００μｌで２回洗浄した。金を遠心分離（１分、１００００ｒｐｍ）により回収し最後にエタノール（１００％、ｐ．Ａ．）７２μｌに再懸濁した。マクロキャリア（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）をマクロキャリアホルダーに挿入し金懸濁液５．４μｌを塗布した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ粒子送達システムを用いて以下のパラメータで打ち込みを実施した。
−  破裂板９００ｐｓｉ（６．２ＭＰａ）
−  ヘリウム圧力１１００ｐｓｉ（７．６ＭＰａ）
−  真空度２６〜２７  ｉｎｃｈｅｓ  Ｈｇ（８８〜９１ｋＰａ）
−  マクロキャリア：トップレベル
−  葉片：第３レベル
６葉片それぞれに金懸濁液５．４μｌを打ち込んだ。打ち込み後、葉片をＲＭＯＰ培地上で２日間２５℃でインキュベートした。
【０１０９】
打ち込みから２日後、葉を小片（約３×３ｍｍ）に切り、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌを含有する固体ＲＭＯＰ培地に移した。２週後、次いで３週ごとにさらなる再生体が出現しなくなるまで、葉片をさらに切って新鮮な培地に移した。第１のΔｙｃｆ３形質転換体は、スペクチノマイシン耐性を示し、明かりの中で緑色表現型を示したが、依然としてヘテロプラストミックであった。形質転換された色素体ＤＮＡ分子を増幅し野生型ゲノムを排除するために、第１の形質転換体を選択培地上でさらに３ラウンドの再生に供した。分離によって白色及び緑色の各セクターが出現したので、ホモプラストミック突然変異形質転換体を得るために、白色セクターからの材料を非選択培地上でさらにいくつかの再生ラウンドに供した。ホモプラストミック形質転換系を固体ＶＢＷ培地（Ａｖｉｖ及びＧａｌｕｎ、１９８５）に根付かせ生長させた。
ＲＭＯＰ（ＫＯＨでｐＨ５．８）：ＮＨ４ＮＯ３（１６５０μｇ／ｍｌ）、ＫＮＯ３（１９００μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４４０（μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．８３μｇ／ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（６．２μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（２２．３μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（８．６μｇ／ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、チアミンＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ベンジルアミノプリン（１μｇ／ｍｌ）、ナフタレン酢酸（０．１μｇ／ｍｌ）、スクロース（３００００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（８０００μｇ／ｍｌ）。
Ｂ５（ＫＯＨでｐＨ５．７）：ＫＮＯ３（２５００μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１５０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２５０μｇ／ｍｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（１５０μｇ／ｍｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１３４μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１０μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（１μｇ／ｍｌ）、スクロース（２００００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（７０００μｇ／ｍｌ）。
ＶＢＷ（ＫＯＨでｐＨ５．８）：ＮＨ４ＮＯ３（１６５０μｇ／ｍｌ）、ＫＮＯ３  １９００（μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７０μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）Ｎａ（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＩ（０．８３μｇ／ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（６．２μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（２２．３μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（８．６μｇ／ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（１００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（０．５μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、グリシン（２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（０．５μｇ／ｍｌ）、インドリル酢酸（２μｇ／ｍｌ）、キネチン（０．２μｇ／ｍｌ）、スクロース（３００００μｇ／ｍｌ）、カゼイン加水分解物（５００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（７０００μｇ／ｍｌ）。
【０１１０】
ＰＣＲ及びサザンブロッティングによる分析
色素体形質転換体をＰＣＲ増幅によって同定した。２４独立系の第１の再生体から単離したＤＮＡすべてをＰＣＲ用の鋳型として用いた。２セットのプライマー（配列は実施例３を参照）、すなわちｏＦＣＨ５９とｏＦＣＨ６０、ｏＦＣＨ５２とｏＦＣＨ５３を用いてトランスプラストミック植物を分析した。ｏＦＣＨ５２とｏＦＣＨ５３によって、野生型プラストームから９００ｂｐの増幅産物が生成し、形質転換プラストームから１４７６ｂｐの産物が生成するはずであるのに対し、ｏＦＣＨ５９とｏＦＣＨ６０では、形質転換植物から４８０ｂｐの増幅産物が生成し、野生型からは産物は生成しないはずである。その結果、１４系の形質転換体が色素体ゲノム中に正確なａａｄＡ挿入断片を有していることがわかる。データはそれぞれの系の表現型にも一致し、色素欠乏がｙｃｆ３の欠失と相関することが示されている。
【０１１１】
ＤＮＡゲルブロット分析によってホモプラスミーを確認した。低照度条件下で生長させたΔｙｃｆ３突然変異体の若葉から単離したゲノムＤＮＡ（第４の再生サイクル）を、ＤＮＡゲルブロット分析に使用した。詳細な手順は以下のとおりである。すなわち、分析植物当たり合計４μｇの植物ＤＮＡを制限酵素Ｘｍａ  ＪＩで消化し、ＴＡＥ−アガロースゲル（０．８％）上で分離した。Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９９）が記述したように、このＤＮＡを変性し、正に帯電したナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。このフィルターを、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中のジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションシグナルをＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。このメンブレンを室温で２時間Ｘ−ＯＭＡＴ  ＬＳフィルムに曝した。
【０１１２】
ＤＩＧ標識プローブを調製するため、タバコゲノムＤＮＡを鋳型として使用し以下のプライマー対、すなわち、ｏＦＣＨ６９（タバコプラストーム配列４７１４９〜４７１６９に対応する５’−ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ−３’）とｏＦＣＨ６４（タバコプラストーム配列４７６６７〜４７６４７に対応する５’−ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  Ｃ−３’）を用いて５２０ｂｐ断片を増幅した。ＲｏｃｈｅのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃２分、１サイクル；９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて増幅断片をゲル精製し、次いでハイブリダイゼーションに使用した。このプローブによって、形質転換されたプラストームから２７８０ｂｐのシグナルが得られ、野生型プラストームから２１９８ｂｐのシグナルが得られるはずである。その結果、６つの試験突然変異体系すべてで野生型色素体ＤＮＡが検出されないことがわかった。
【０１１３】
ｙｃｆ３遺伝子再構成用形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１１の構築
ｙｃｆ３遺伝子を再構成し、ａａｄＡ遺伝子を除去し、同時にｕｉｄＡ遺伝子を導入し、１フランク組込みによってカナマイシン耐性を付与するａｐｈＡ−６遺伝子を一過性に導入する目的で、突然変異Δｙｃｆ３系を形質転換するように形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１１を設計した。
【０１１４】
ｙｃｆ３の上流位置にｕｉｄＡコード領域を導入するために、断片末端の所望の制限部位（ＳｐｈＩ／ＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ／ＳｍａＩ）と、新たに形成された人工オペロンとして再構成ｙｃｆ３遺伝子を翻訳するシグナルとして役立つ短いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列とを付加するＰＣＲにより、２つのフランク（プラストームヌクレオチド４５０３３〜４６２６６及び４６２６９〜４７２０５）を増幅した。ｕｉｄＡ遺伝子及びｙｃｆ３をｙｃｆ３  ５’調節エレメントの制御下で同一方向に転写する。以下の２対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｏＦＣＨ１３９（５’−Ｐｓｔ  Ｉ−ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ（リボソーム結合部位）−ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＡＡ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６６〜４６２４７でアニーリング）とｏＦＣＨ７８（５’−Ｓｐｈ  Ｉ−ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド４５０３３〜４５０５３でアニーリング）；ｏＦＣＨ７６（５’−Ｎｃｏ  Ｉ−ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴ−３’、プラストームヌクレオチド４６２６９〜４６２８８でアニーリング）とｏＦＣＨ７７（５’−Ｓｍａ  Ｉ−ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＣ−３’、プラストームヌクレオチド４７２０５〜４６１８５でアニーリング）である。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃２分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。２つのフランクを対応する酵素で消化し、（ＰｓｔＩ／ＮｃｏＩ断片として調製される）ｇｕｓコード領域と共にＳｍａＩ／ＳｐｈＩで線形化したｐＵＣ１９に連結してｐｌＣＦ６０１を得た。
【０１１５】
色素体ゲノム中に１相同フランクを介してａｐｈＡ−６発現カセットを一過性に導入するために、ベクターＢ１（Ｍｕｈｌｂａｕｅｒ等、２００２）のａａｄＡコード領域及び付属の３’ＵＴＲをＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで消化して除去し、ベクターｐｌＣＦ６０６（Ｈｕａｎｇ等、２００２）のａｐｈＡ−６コード領域及び隣接する３’ＵＴＲで置換してベクターｐｌＣＦ７４６を得た。ベクターｐｌＣＦ７４６から左フランク及びａｐｈＡ−６発現カセットをＰｍａＣＩ／ＫｐｎＩ断片として取り出し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端化し、（子ウシ腸アルカリホスファターゼ処理によって脱リン酸化した）ベクターｐｌＣＦ６０１の単一ＳｃａＩ制限部位に連結して最終的に形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１１を得た（図１２及び１３）。
【０１１６】
Δｙｃｆ３突然変異体系の色素体形質転換及びホモプラストミック系の選択
プロトプラストへのＰＥＧ媒介膜貫通ＤＮＡ導入は、高等植物の色素体形質転換のための再現性のよい方法である（Ｇｏｌｄｓ等、１９９３；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ等、１９９３）。最近、Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ等、１９９８によってプロトプラスト再生が最適化された。
Ａ．プロトプラスト単離：低照度条件下の固体ＶＢＷ培地で生長させた無菌ホモプラストミックΔｙｃｆ３突然変異体からの葉を１ｍｍ細片に切り、Ｆ−ＰＩＮ培地に溶解した０．２５％セルラーゼＲ１０及び０．２５％ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ１０（Ｙａｋｕｌｔ、Ｈｏｎｓｈａ  Ｊａｐａｎ）と共に終夜インキュベートした。ろ過、浮遊及び沈降の各標準操作（Ｋｏｏｐ等、１９９６）に従って、プロトプラストを形質転換培地に再懸濁し、プロトプラストの総数を決定し、密度を５×１０６プロトプラスト／ｍｌに調整した。
Ｆ−ＰＩＮ媒体（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、浸透圧モル濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＫＮＯ３（１０１２μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７０μｇ／ｍｌ）、コハク酸アンモニウム（１０ｍｌの２Ｍ保存溶液）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）・Ｎａ−塩（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＪ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（２００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（２μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ビオチン（０．０２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（１μｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、両性バッファー７４（１０ｍｌ）、スクロース（〜１３００００μｇ／ｍｌ）。
変換媒体（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、浸透圧モル濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（３０５０μｇ／ｍｌ）、ＭＥＳ（１０００μｇ／ｍｌ）、マンニトール（〜８００００μｇ／ｍｌ）。
【０１１７】
Ｂ．色素体形質転換及びプロトプラスト包埋：ＤＮＡ（形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１）５０μｇ、Ｆ−ＰＣＮ７μｌ及びプロトプラスト懸濁液１００μｌ（５００，０００細胞）を４０％ＰＥＧ溶液１２５μｌに添加し、慎重に混合し、７．５分間インキュベートした。さらにＦ−ＰＣＮ１２５μｌを添加し、混合し、２分間インキュベートした。（Ｆ−ＰＣＮで）体積を３ｍｌにし、Ｆ−アルギン酸培地３ｍｌを添加した。プロトプラスト−アルギン酸混合物６２５μｌをＣａ２＋培地表面上のプロピレングリッドに塗布することによって薄層アルギン酸包埋を実施する。凝固グリッドを取り除き、平衡用液体Ｆ−ＰＣＮ培地に反転して置いた後（１０ｍｌ、６０分間）、Ｆ−ＰＣＮ２ｍｌを含む新しいペトリ皿に移した。包埋したプロトプラストを暗所でまず２０時間、次いで低照度条件に移してインキュベートした（通常の１６時間昼／８時間夜サイクル）（Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏ等、１９９８）。
Ｆ−ＰＣＮ媒体（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、浸透圧モル濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＫＮＯ３（１０１２μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（４４０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３７０μｇ／ｍｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１７０μｇ／ｍｌ）、コハク酸アンモニウム（１０ｍｌの２Ｍ保存溶液）、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩＩ）・Ｎａ−塩（４０μｇ／ｍｌ）、ＫＪ（０．７５μｇ／ｍｌ）、Ｈ３ＢＯ３（３μｇ／ｍｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（１０μｇ／ｍｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２μｇ／ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．２５μｇ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．０２５μｇ／ｍｌ）、イノシトール（２００μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン−ＨＣｌ（２μｇ／ｍｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１μｇ／ｍｌ）、ビオチン（０．０２μｇ／ｍｌ）、ニコチン酸（２μｇ／ｍｌ）、ＢＡＰ（１μｇ／ｍｌ）、ＮＡＡ（０．１μｇ／ｍｌ）、両性バッファー  ７４（１０ｍｌ）、スクロース（〜２００００μｇ／ｍｌ）、グルコース（６５０００μｇ／ｍｌ）。
Ｆ−アルギン酸媒体（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、浸透圧モル濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭＥＳ（１３７０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２５００μｇ／ｍｌ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２０４０μｇ／ｍｌ）、マンニトール（７７０００μｇ／ｍｌ）、アルギン酸（２４０００μｇ／ｍｌ）。
Ｃａ２＋−媒体（ｐＨ５．８（ＫＯＨ）、浸透圧モル濃度：５５０ｍＯｓｍ）：ＭＥＳ（１９５０μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２９４０μｇ／ｍｌ）、マンニトール（８２０００μｇ／ｍｌ）、精製寒天（１００００μｇ／ｍｌ）。
【０１１８】
形質転換から１週後に、包埋したプロトプラストをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体ＲＭＯＰ培地に移し、低照度条件で２週間培養した。その後、さらなる再生体が出現しなくなるまで、２週ごとにグリッドを新鮮な培地に移し、強光条件で培養した。第１の緑色再生体は６週後に出現し、それらを個別にペトリ皿に移した。予想したように、第１のｙｃｆ３再構成形質転換体はカナマイシン耐性を示し、光の下で分離した表現型を示したが、依然としてヘテロプラストミックであった。ｙｃｆ３再構成色素体ＤＮＡ分子を増幅し、ｙｃｆ３欠失ゲノムを除去し、ａｐｈＡ−６マーカー遺伝子を除去するために、抗生物質を含まないＢ５培地に形質転換体を移して分離させた。緑色セクターが培養の３週目に出現した。緑色セクターからの材料を非選択培地上でさらに継代培養し、マーカーのないホモプラストミックｙｃｆ３再構成形質転換体を得るためにさらにいくつかの再生サイクルに供した。得られた緑色表現型を示す系を生長用温室に移した後、固体Ｂ５培地に根付かせた。
【０１１９】
第２のトランスプラストミック植物の分子分析
色素体形質転換体をＰＣＲ増幅により同定した。緑色表現型を示し光独立栄養的に生長可能である第１の形質転換体から単離したＤＮＡすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、ｏＳＭ６１（ｕｉｄＡコード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）、ｏＳＭ６２（ｕｉｄＡコード領域の３’部分由来の５’−ＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’）、ｏＦＣＨ２７（５’−ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ−３’、プラストームヌクレオチド４４７９９〜４４８１９でアニーリング）、ｏＳＭ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’、プラストームヌクレオチド１０９１３８〜１０９１５７でアニーリング）、ｏＦＣＨ１６８（ａｐｈＡ−６コード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴ−３’）及びｏＦＣＨ１６９（ａｐｈＡ−６コード領域の３’部分由来の５’−ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’）を用いるＰＣＲ分析の鋳型として使用した。再構成植物から５００ｂｐの増幅産物を生成し、未変化の第１のラウンドの形質転換体からは産物を生成しないはずであるｏＳＭ６１及びｏＳＭ６２を、ｕｉｄＡ遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＦＣＨ２７とｏＳＭ６１の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約３０００ｂｐの産物を増幅することによって、第２のラウンドの形質転換体が正確なｇｕｓ挿入断片を有するか否かを決定することができる。ｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９を、ａｐｈＡ−６遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＳＭ５８及びｏＦＣＨ１６９を、１相同フランクを介した（ａｐｈＡ−６遺伝子を含む）完全なベクター配列の組込みを検出するために用いた。合計２つの独特なｙｃｆ３再構成タバコ色素体形質転換体が、１つのＰＥＧ形質転換実験から得られた。データから、ｕｉｄＡ遺伝子が２つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに組み込まれるのに対し、ａｐｈＡ−６遺伝子が１つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
【０１２０】
正確な組込み及びホモプラストミック遺伝子型の別の証拠は、ＤＮＡゲルブロット分析から得られた。無菌生長植物から単離したゲノムＤＮＡをＸｍａ  ＪＩで消化した。使用したプローブは、Δｙｃｆ３突然変異体の場合と同じであった（ＤＮＡブロッティング及びハイブリダイゼーションの詳細手順は上記を参照されたい）。プローブは、野生型プラストームに対して２２１９ｂｐのシグナル、第２のラウンドにおいて正確に形質転換されたプラストームに対して４１２３ｂｐのシグナル、及び未変化の第１のラウンドの形質転換体に対して２７９３ｂｐのシグナルを生成する。
【０１２１】
ａａｄＡマーカー及びａｐｈＡ−６マーカーが除去されたことを確認するために、このブロットのさらなるハイブリダイゼーション（以前のプローブは、ストリッピング操作によって除去されている）を、ａａｄＡ遺伝子の４８０ｂｐ断片及びａｐｈＡ−６遺伝子の５００ｂｐ断片をプローブとして用いて実施した。プローブを作製するために、供給元（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従ってａａｄＡ用プライマーｏＦＣＨ５９及びｏＦＣＨ６０、ａｐｈＡ−６用プライマーｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９をＰＣＲ  ＤＩＧ標識化反応に用いた。
【実施例４】
【０１２２】
１フランクによって媒介されるａｐｈＡ−６遺伝子組込みのための一過性選択によるプラストームへのＧｕｓ遺伝子の安定導入
形質転換及びカナマイシン耐性形質転換体の選択
形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１１（構築については実施例３を参照）を、ＰＥＧ媒介方法（詳細は実施例３を参照）によって野生型タバコに形質転換した。
【０１２３】
形質転換から１週後に、包埋したプロトプラストをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体ＲＭＯＰ培地に移した。さらなる再生体が出現しなくなるまで、２週ごとにグリッドを新鮮な培地に移した。第１の緑色再生体は６週後に出現し、それらをペトリ皿に個別に移した。ホモプラストミック形質転換体を得るために、第１の形質転換体を、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＲＭＯＰ培地上でさらにいくつかの再生サイクルに供した。ａｐｈＡ−６マーカー遺伝子を切り出す場合、マーカーのない形質転換体を得るために、ホモプラストミック形質転換体を非選択培地上でいくつかの追加の再生ラウンドに供した。得られた緑色表現型を示す系を固体Ｂ５培地に根付かせ、次いで温室に移して生長させた。
【０１２４】
ＰＣＲ及びサザンブロッティングによる分析
色素体形質転換体をＰＣＲ増幅によって同定した。緑色表現型及びカナマイシン耐性を示す第１の形質転換体から単離したＤＮＡすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、ｏＳＭ６１（ｕｉｄＡコード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）、ｏＳＭ６２（ｕｉｄＡコード領域の３’部分由来の５’−ＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’）、ｏＦＣＨ２７（５’−ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＣ−３’、プラストームヌクレオチド４４７９９〜４４８１９でアニーリング）、ｏＳＭ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’、プラストームヌクレオチド１０９１３８〜１０９１５７でアニーリング）、ｏＦＣＨ１６８（ａｐｈＡ−６コード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴ−３’）及びｏＦＣＨ１６９（ａｐｈＡ−６コード領域の３’部分由来の５’−ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’）を用いるＰＣＲ分析の鋳型として使用した。形質転換体から５００ｂｐの増幅産物を生成し、野生型からは産物を生成しないはずであるｏＳＭ６１及びｏＳＭ６２を、ｕｉｄＡ遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＦＣＨ２７とｏＳＭ６１の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約３０００ｂｐの産物を増幅することによって、形質転換体が正確なｕｉｄＡ挿入断片を有するか否かを決定することができる。ｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９を、ａｐｈＡ−６遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＳＭ５８及びｏＦＣＨ１６９を、１相同フランクを介した（ａｐｈＡ−６遺伝子を含む）完全なベクター配列の組込みを検出するために用いた。合計２つのタバコ色素体形質転換体が、１つのＰＥＧ形質転換実験から得られた。データから、ｕｉｄＡ遺伝子が２つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに安定に組み込まれるのに対し、ａｐｈＡ−６遺伝子が１つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
【０１２５】
正確な組込み及びホモプラストミック遺伝子型の別の証拠は、ＤＮＡゲルブロット分析から得られた。無菌生長植物から単離したゲノムＤＮＡをＸｍａ  ＪＩで消化した。使用したプローブは、Δｙｃｆ３突然変異体の場合と同じであった（ＤＮＡブロッティング及びハイブリダイゼーションの詳細な手順は実施例３を参照されたい）。プローブは、野生型プラストームに対して２２１９ｂｐのシグナル、正確に形質転換されたプラストームに対して４１２３ｂｐのシグナルを生成する。ａｐｈＡ−６マーカーが除去されたことを確認するために、このブロットのさらなるハイブリダイゼーション（以前のプローブは、ストリッピング操作によって除去されている）を、ａｐｈＡ−６遺伝子の５００ｂｐ断片をプローブとして用いて実施した。プローブを作製するために、供給元（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従ってａｐｈＡ−６用プライマーｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９をＰＣＲ  ＤＩＧ標識化反応に用いた。
【実施例５】
【０１２６】
ｒｐｏＡの不活性化／再活性化及び１フランクによって媒介されるａｐｈＡ−６遺伝子組込みのための一過性選択によるインターフェロン遺伝子の安定導入
色素体染色体は、４つのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、すなわち、真正細菌の３つのＲＮＡポリメラーゼコア遺伝子に類似している設計されたｒｐｏＡ、Ｂ、Ｃ１及びＣ２をコードする。ｒｐｏＢ、Ｃ１及びＣ２の遺伝子は（ＮＥＰによって転写された）オペロン中に整列し、一方、ｒｐｏＡの遺伝子は、リボソームタンパク質を主にコードする大きな遺伝子クラスター中に位置する。ＰＥＰ（色素体によってコードされるポリメラーゼ）突然変異体においてはｒｐｏＡ遺伝子のセンス転写物レベルが減少するので（Ｋｒａｕｓｅ等、２０００）、ｒｐｏＡはＰＥＰによって転写されている可能性がある。
【０１２７】
色素体ゲノムからのｒｐｏＡの欠失は、色素欠乏表現型をもたらす（Ｄｅ  Ｓａｎｔｉｓ−Ｍａｃｉｏｓｓｅｋ等、１９９９）。色素欠乏ΔｒｐｏＡ植物（白色植物）は、光独立栄養的に生長することができない。しかし、光合成の欠損を補うためにスクロース含有培地上に維持すると、それらは野生型植物よりも遅いが正常に生長する。
【０１２８】
ｒｐｏＡ遺伝子の標的不活性化（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）のための形質転換ベクターｐｌＣＦ８３６の構築
（プラストームヌクレオチド８１３５９〜８１４６８に対応する）ｒｐｏＡコード領域の第１の１１０ｂｐをｕｉｄＡコード領域で置換することによってｒｐｏＡ遺伝子を不活性化するように設計した形質転換ベクターを構築した。このベクターは、いかなる３’調節エレメントも含まない。また、プロモーターエレメントは導入されず、Ｇｕｓ遺伝子は内在性のｒｐｏＡ上流調節エレメントによって転写され翻訳されると予想される。
【０１２９】
このベクターは、以下の２対のプライマー、すなわち、ｏＦＣＨ１１２（５’−Ｎｃｏ  Ｉ−ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣ−３’、プラストームヌクレオチド８１４７１〜８１４９０でアニーリング）とｏＦＣＨ１１３（５’−Ｓｍａ  Ｉ−ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド８２４７０〜８２４５０でアニーリング）；ｏＦＣＨ２９５（５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＴＡＡ−３’、プラストームヌクレオチド８０４５５〜８０４７５でアニーリング）とｏＦＣＨ２９６（５’−Ｐｓｔ  Ｉ−ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド８１３５８〜８１３３９でアニーリング）を用いたＰＣＲによってタバコ葉緑体ゲノムから増幅された５’及び３’相同配列が隣接するｕｉｄＡコード領域を含む。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃２分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。対応する酵素で２つのフランクを消化し、（Ｐｓｔ  Ｉ／ＮｃｏＩ断片として調製した）ｕｉｄＡコード配列と共に、Ｓｍａ  Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩで線形化したｐＵＣ１９に連結してｐｌＣＦ８３５を得た。
【０１３０】
ａｐｈＡ−６遺伝子を一過性に導入するために、ａｐｈＡ−６カセットをＸｍａ  Ｉ断片として調製し、Ｘｍａ  Ｉで線形化したｐｌＣＦ８３５に連結して最終的に形質転換ベクターｐｌＣＦ８３６（図１４）を得た。ａｐｈＡ−６カセットは、相同フランクの外側に位置する。
【０１３１】
第１の形質転換及びホモプラストミックΔｒｐｏＡ突然変異体の選択
形質転換ベクターｐｌＣＦ８３６を、ＰＥＧ媒介方法（詳細は実施例３を参照）によって野生型タバコに形質転換した。
【０１３２】
形質転換から１週後に、包埋したプロトプラストをカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含む固体ＲＭＯＰ培地に移した。さらなる再生体が出現しなくなるまで、２週ごとにグリッドを新鮮な培地に移した。第１の緑色再生体は６週後に出現し、それらを個別にペトリ皿に移した。予想されたように、第１のｒｐｏＡ−形質転換体はカナマイシン耐性を示し、光の下で緑色表現型を示したが、依然としてヘテロプラストミックであった。ａｐｈＡ−６マーカー遺伝子を分離し切り出すため、阻害剤を含まないＲＭＯＰ培地に形質転換体コロニーを移した。白色セクターが培養の３〜５週目に出現した。白色セクターからの材料を非選択培地上でさらに継代培養し、マーカーのないホモプラストミック突然変異形質転換体を得るためにさらに５サイクルの再生に供した。得られた系は白色表現型を示した。このトランスプラストミック系を固体ＶＢＷ培地に根付かせ生長させて第２の形質転換用の突然変異体植物材料を得た。
【０１３３】
ＰＣＲ及びサザンブロッティングによる分析
色素体形質転換体をＰＣＲ増幅によって同定した。カナマイシン耐性を示す第１の形質転換体から単離したＤＮＡすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、ｏＳＭ６１（ｕｉｄＡコード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＣＧ−３’）、ｏＳＭ６２（ｕｉｄＡコード領域の３’部分由来の５’−ＡＴＴ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣ−３’）、ｏＦＣＨ１２１（タバコプラストーム配列８０２４０〜８０２５９に対応する５’−ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＴＣ−３’）、ｏＦＣＨ１６８（ａｐｈＡ−６コード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴ−３’）及びｏＦＣＨ１６９（ａｐｈＡ−６コード領域の３’部分由来の５’−ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’）を用いるＰＣＲ分析のための鋳型として使用した。形質転換体から５００ｂｐの増幅産物を生成し、野生型からは産物を生成しないはずであるｏＳＭ６１及びｏＳＭ６２を、ｕｉｄＡ遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＦＣＨ１２１とｏＳＭ６１の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約１６２０ｂｐの産物を増幅することによって、形質転換体が正確なｇｕｓ挿入断片を有するか否かを決定することが可能である。ｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９を、約５００ｂｐの産物を増幅することによってａｐｈＡ−６遺伝子の存在を検出するために用いた。合計４つのタバコ色素体形質転換体が、１つのＰＥＧ形質転換実験から得られた。その結果、ｕｉｄＡ遺伝子が２つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに安定に組み込まれるのに対し、ａｐｈＡ−６遺伝子が１つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。このデータは、それぞれの系の表現型にも一致し、色素欠乏がｒｐｏＡの欠失と相関することが示された。
【０１３４】
正確な組込み及びホモプラストミック遺伝子型の別の証拠は、ＤＮＡゲルブロット分析によって得られた。無菌生長植物から単離したゲノムＤＮＡをＥｃｏ  ＲＩで消化した。ＤＩＧ標識プローブを調製するために、タバコゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、以下のプライマー対、すなわち、ｏＦＣＨ２０６（タバコプラストーム配列８１９７１〜８１９９０に対応する５’−ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴ−３’）とｏＦＣＨ１１３（５’−ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド８２４７０〜８２４５０でアニーリング）を用いて５２０ｂｐ断片を増幅した。ＲｏｃｈｅのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用した。ＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃２分、１サイクル；９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて増幅断片をゲル精製し、次いでハイブリダイゼーションに使用した。ＤＮＡブロッティング及びハイブリダイゼーションの詳細な手順は実施例３を参照されたい。このプローブによって、形質転換されたプラストームから３１３３ｂｐのシグナル、野生型プラストームから２３８４ｂｐのシグナルが生成するはずである。その結果、４つの試験突然変異体系すべてにおいて野生型色素体ＤＮＡを検出できないことが示された。ａｐｈＡ−６マーカーが除去されたことを確認するために、このブロットのさらなるハイブリダイゼーション（以前のプローブは、ストリッピング操作によって除去されている）を、ａｐｈＡ−６遺伝子の５００ｂｐ断片をプローブとして用いて実施した。プローブを作製するために、供給元（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従ってａｐｈＡ−６用プライマーｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９をＰＣＲ  ＤＩＧ標識化反応に用いた。
【０１３５】
ｒｐｏＡ遺伝子の再構成及びインターフェロン遺伝子の導入のための形質転換ベクターｐｌＣＦ８３８の構築
ｒｐｏＡ遺伝子を再構成し、同時にインターフェロン遺伝子を導入し、カナマイシン耐性を付与するａｐｈＡ−６遺伝子を一過性に導入する目的で、突然変異体ΔｒｐｏＡ系を形質転換するように形質転換ベクターｐｌＣＦ８３８を設計した。
【０１３６】
Ｐｒｒｎ１６Ｓプロモーター、Ｔ７Ｇ１０リーダー及びインターフェロンコード領域をｒｐｏＡの上流位置に導入するために、断片末端の所望の制限部位と、新たに形成された人工オペロンとして再構成ｒｐｏＡ遺伝子を翻訳するシグナルとして役立つ短いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列とを付加するＰＣＲにより、２つのフランク（プラストームヌクレオチド８１４７１〜８２４７０及び８０４５５〜８１４６８）を増幅した。インターフェロン遺伝子及びｒｐｏＡをＰｒｒｎ１６Ｓプロモーターの制御下で同一方向に転写する。以下の２対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。すなわち、ｏＦＣＨ２９７（５’−Ｐｓｔ  Ｉ−ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＧＡＴ−３’、プラストームヌクレオチド８１４６９〜８１４８９でアニーリング）とｏＦＣＨ２９８（５’−Ｈｉｎ  ｄＩＩＩ−ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ−３’、プラストームヌクレオチド８２４７０〜８２４５０でアニーリング）；ｏＦＣＨ２９９（５’−Ｅｃｏ  ＲＩ−ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＴＡＡ−３’、プラストームヌクレオチド８０４５５〜８０４７５でアニーリング）とｏＦＣＨ３００（５’−Ｓａｃ  Ｉ−ＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ（ＲＢＳ）ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＣ−３’、プラストームヌクレオチド８１４６８〜８１４４９でアニーリング）である。Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９４℃２分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。
Ｐｒｒｎ１６Ｓプロモーター−インターフェロン断片を、まずＰｓｔ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉを用いてｐｌＣＦ７８１−３から切断し、次いでＰｓｔ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉを用いて線形化したｐＵＣ１９に連結してｐｌＣＦ８３４を得た。２つの増幅されたフランクを対応する酵素で消化し、Ｐｒｒｎ１６Ｓプロモーター−インターフェロン断片と共にｐｌＣＦ８３４に逐次連結してｐｌＣＦ８３７を得た。
【０１３７】
ａｐｈＡ−６遺伝子を一過性に導入するために、ａｐｈＡ−６カセットをＳｍａ  Ｉ断片として調製し、Ｓｃａ  Ｉを用いて線形化したｐｌＣＦ８３７に連結して最終的に形質転換ベクターｐｌＣＦ８３８（図１５）を得た。ａｐｈＡ−６カセットは、相同フランクの外側に位置する。
【０１３８】
ΔｒｐｏＡ突然変異体系の色素体形質転換及びホモプラストミック系の選択
形質転換ベクターｐｌＣＦ８３８を、ＰＥＧ媒介方法（詳細は実施例３参照）によってΔｒｐｏＡ突然変異体系に形質転換した。
【０１３９】
形質転換後、包埋したプロトプラストを暗所で培養した。１週後、包埋したプロトプラストをカナマイシン１５μｇ／ｍｌを含む固体ＲＭＯＰ培地に移し、低照度条件で２週間培養した。その後、さらなる再生体が出現しなくなるまで、２週ごとにグリッドを新鮮な培地に移し正常な生長条件で培養した。第１の緑色再生体は６週後に出現し、それらをペトリ皿に個別に移した。予想したように、第１のｒｐｏＡ再構成形質転換体はカナマイシン耐性を示し、光の下で分離した表現型を示したが、依然としてヘテロプラストミックであった。ｒｐｏＡ再構成色素体ＤＮＡ分子を増幅し、ｒｐｏＡ欠失ゲノムを排除し、ａｐｈＡ−６マーカー遺伝子を除去するために、抗生物質を含まないＢ５培地に形質転換体を移して分離させた。緑色セクターが培養の３週目に出現した。緑色セクターからの材料を非選択培地上でさらに継代培養し、マーカーのないホモプラストミックｒｐｏＡ再構成形質転換体を得るためにいくつかのさらなる再生サイクルに供した。得られた緑色表現型を示す系を固体Ｂ５培地に根付かせ、温室に移して生長させた。
【０１４０】
第２のトランスプラストミック植物の分子分析
色素体形質転換体をＰＣＲ増幅により同定した。緑色表現型を示し光独立栄養的に生長可能である第１の形質転換体から単離したＤＮＡすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、ｏＭＦ２２８（インターフェロンコード領域の５’部分由来の５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧ−３’）、ｏＭＦ２２９（インターフェロンコード領域の３’部分由来の５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣ−３’）、ｏＦＣＨ１２１（タバコプラストーム配列８０２４０〜８０２５９に対応する５’−ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＴＣ−３’）、ｏＦＣＨ１６８（ａｐｈＡ−６コード領域の５’部分由来の５’−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＴ−３’）及びｏＦＣＨ１６９（ａｐｈＡ−６コード領域の３’部分由来の５’−ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’）を用いるＰＣＲ分析の鋳型として使用した。再構成植物から５００ｂｐの増幅産物を生成し、未変化の第１のラウンドの形質転換体からは産物を生成しないはずであるｏＭＦ２２８及びｏＭＦ２２９を、インターフェロン遺伝子の存在を検出するために用いた。ｏＦＣＨ１２１とｏＭＦ２２８の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約１７３０ｂｐの産物を増幅することによって、第２のラウンドの形質転換体が正確なインターフェロン挿入断片を有するか否かを決定することが可能である。ｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９を、ａｐｈＡ−６遺伝子の存在を検出するために用いた。合計１１個の独特なｒｐｏＡ再構成タバコ色素体形質転換体が、１つのＰＥＧ形質転換手順から得られた。データから、インターフェロン遺伝子が２つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに組み込まれるのに対し、ａｐｈＡ−６遺伝子が１つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
【０１４１】
正確な組込み及びホモプラストミック遺伝子型の別の証拠は、ＤＮＡゲルブロット分析から得られた。無菌生長植物から単離したゲノムＤＮＡをＥｃｏ  ＲＩ／Ｐｓｔ  Ｉで消化した。使用したプローブは、ΔｒｐｏＡ突然変異体の場合と同じであった（ＤＮＡブロッティング及びハイブリダイゼーションの詳細な手順は実施例３を参照されたい）。このプローブは、野生型プラストームに対して２３８４ｂｐのシグナル、第２のラウンドにおいて正確に形質転換されたプラストームに対して１２４７ｂｐのシグナル、及び未変化の第１のラウンドの形質転換体に対して３１２７ｂｐのシグナルを生成する。
【０１４２】
ａｐｈＡ−６マーカーが除去されたことを確認するために、このブロットのさらなるハイブリダイゼーション（以前のプローブは、ストリッピング操作によって除去されている）を、ａｐｈＡ−６遺伝子の５００ｂｐ断片をプローブとして用いて実施した。プローブを作製するために、供給元（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従ってプライマーｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９をＰＣＲ  ＤＩＧ標識化反応に用いた。
【実施例６】
【０１４３】
１フランクによって媒介されるａｐｈＡ−６遺伝子の組込みのための一過性選択によるプラストームへのインターフェロン遺伝子の安定導入
本実施例は、分離中の形質転換組織の視覚識別がＧＦＰ発現によって補助される、一過性のマーカー組込みを用いた、抗生物質耐性遺伝子を欠くトランスプラストミック植物の生成について記述する。本実施例に記載する形質転換ベクター（ｐｌＣＦ８４６）は、ｒｐｏＡ再構成ベクターｐｌＣＦ８３８（実施例５参照）を基にしている。すなわち、このベクターは、突然変異体の再構成だけでなく、野生型植物の形質転換にも使用でき、それによってプラストーム中のｒｐｏＡの上流に目的配列（この場合、インターフェロンコード配列）が挿入される。形質転換体の視覚識別を可能にするために、ＧＦＰをコードする配列を、インターフェロンとｒｐｏＡコード配列の間に挿入する。この目的のために、人工リボソーム結合部位（Ｅｉｂｌ等、１９９９）、タバコｒｂｃＬ遺伝子から下流のボックス及びＧＦＰコード配列からなるカセットをプラスミドｐｌＣＦ８３７（実施例５参照）のＫｐｎＩ制限部位に挿入する；その後、上述したように（実施例５）、ａｐｈＡ−６マーカーカセットをフランキング領域外側のＳｃａＩ部位に挿入する。
【０１４４】
形質転換ベクターｐｌＣＦ８４６を、実施例３に記載したＰＥＧ媒介方法による野生型タバコの形質転換に使用する。形質転換体の選択は、実施例４に記載したように、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを用いて実施する。形質転換体の緑色蛍光は、ハンドランプによって与えられるＵＶ光又は適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡により視覚化することができる。抗生物質耐性マーカーの切り出しを可能にするために、ホモプラストミック形質転換体を、非選択培地上でいくつかの追加の再生ラウンドに供する。目的配列を含めて完全な形質転換ベクターの切り出しは、緑色蛍光の消失によって容易に確認することができる。蛍光を維持する植物材料のａｐｈＡ−６遺伝子が消失したかどうかを分析する。選択マーカーが完全に消失した材料を増殖させる。
【実施例７】
【０１４５】
組込みカセットを提供する自己複製色素体形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１
色素体形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１の構築
タバコｒｒｎ１６プロモーターの制御下にあり大腸菌に由来するアミノグリコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）からなるカセットを、以下のようにクローン化した。すなわち、ｒｒｎ１６プロモーターを含むＤＮＡ断片を、プライマー「５−２４」（５’−ｃｃｇａａｔｔｃｇｃｃｇｔｃｇｔｔｃａａｔｇａｇ−３’）及び「３−２１」（５’−ｃａｃｇａｔａｔｃｇｃｃｃｇｇａｇｔｔｇ−３’）を含むタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ）ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。増幅断片をＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで切断した。
タバコｒｂｃＬ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むリンカーＤＮＡ断片を、プライマー「５−ｒｂｓ」（５’−ｃｔｃｇａｔａｔｃａｃｔａｇｔｔｇｔａｇｇｇａｇｇｇａ−３’）及びプライマー「３−ｒｂｓ」（５’−ｇｔｇｃｃａｔｇｇａｔｃｃｃｔｃｃｔ−３’）をアニールすることによって構築した。ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼでオーバーハングを平滑末端化し、断片をＥｃｏＲＶ及びＮｃｏＩで切断した。
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｒｂｃＬ下流領域の４４０ｂｐ断片に融合した細菌ａａｄＡコード配列を含む（Ｄｒ．Ｍ．Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ、１９９１によって提供された）プラスミドｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤを、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで切断して本来のプロモーター断片を除去した。ＥｃｏＲＶ及びＮｃｏＩで処理したＲＢＳ断片並びにＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで処理したｒｒｎ１６プロモーター断片を、プロモーターのないｐＵＣ−ａｔｐＸ−ＡＡＤベクターに同時に挿入して、プラスミドｐＵＣ１６ＳａａｄＡを得た。リンカーオリゴヌクレオチド（ｇａａｔｔｃｃｃｇｇｇａａｔｔｃ）をＥｃｏＲＩ部位（ｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａ）に挿入することによって、ｒｒｎ１６プロモーター上流にさらにＳｍａＩ／ＸｍａＩ部位を作製した。
【０１４６】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ）色素体ＤＮＡ配列１１２０６１〜１１３０５８（受託番号Ｚ０００４４）を、単離したタバコＤＮＡから、プライマーｂ１−１（５’−ｇｇｇｇｔａｃｃｇａａｔｔｔｇａｔｔｃａｃａａａｇｔｔｇ−３’）及びｂ１−２（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｔｇｇｔａｔｔｃｃａｃｃｔｃｔｔｇｃ−３’）を用いてＰＣＲにより増幅した。得られた断片をＫｐｎＩ及びＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａの（ａａｄＡ遺伝子下流の）対応部位に挿入した。第２のタバコ色素体ＤＮＡ断片（１０９９８６〜１１１１１２）をプライマーｂ１−３（５’−ｔｃｃｃｃｃｃｇｇｇｃｔｃａｇａｇｇａｔｔａｇａｇｃａｃｇ−３’）及びｂ１−４（５’−ｔｃｃｃｃｃｃｇｇｇａｇｔｃｃｇａｃｃａｃａａｃｇａｃｃ−３’）を用いて増幅し、ＸｍａＩで切断し、ｒｒｎ１６プロモーターに隣接する断片のｂ１−４末端と共に上記プラスミドのキメラａａｄＡ遺伝子上流の対応部位に挿入した。得られた形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１（図１）において、ａａｄＡカセットには、キメラ遺伝子をプラストームへ組み込み、プラストーム配列１１１１１３〜１１２０６０の置換を可能にする色素体配列が隣接している。また、このベクターを、形質転換された葉緑体中で完全なプラスミドとして維持することができる。
【０１４７】
微粒子銃送達によるＮ．ｔａｂａｃｕｍ色素体の形質転換
タバコの種子（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ）の表面を滅菌し（７０％エタノール中１分、５％Ｄｉｍａｎｉｎ  Ｃ（Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中１０分）、無菌水中で１０分間３回洗浄し、Ｂ５培地（下記参照）上に置いた。２５℃、１６時間明／８時間暗サイクル（０．５〜１Ｗ／ｍ２、Ｏｓｒａｍ  Ｌ８５Ｗ／２５  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｗｈｉｔｅ蛍光灯）で植物を生長させた。
【０１４８】
４週齢無菌生長Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ植物から６枚の葉を切り、固体ＲＭＯＰ培地（調製については下記参照）上に移した。金懸濁液（０．６ミクロン、Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ；６０ｍｇ／ｍｌエタノール）３５μｌを無菌反応管（Ｔｒｅｆｆ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｇｏｌｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、遠心分離により回収し、無菌水１ｍｌで洗浄した。金の沈殿物を無菌水２３０μｌと２．５Ｍ  ＣａＣｌ２  ２５０μｌに再懸濁し、プラスミドＤＮＡ（形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１）２５μｇを添加した。混合物を完全に再懸濁した後、０．１Ｍスペルミジン５０μｌを添加し、混合し、１０分間氷上でインキュベートした。被覆された金粒子を遠心分離（１分、１００００ｒｐｍ）により回収し、エタノール６００μｌで２回洗浄し、最後にエタノール７２μｌに再懸濁した。打ち込みをする葉１枚当たり５．４μｌの金懸濁液をマクロキャリアに塗布した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ粒子送達システムを用いて以下のパラメータで打ち込みを実施した。
破裂板９００ｐｓｉ（６．２ＭＰａ）；ヘリウム圧力１１００ｐｓｉ（７．６ＭＰａ）；真空度２６〜２７  ｉｎｃｈｅｓ  Ｈｇ（８８〜９１ｋＰａ）；マクロキャリア  トップレベル；葉片  第３レベル
【０１４９】
打ち込みから２日後、葉を小片（約３×３ｍｍ）に切り、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌを含有するＲＭＯＰ培地に移した。２週後、次いで３週ごとにさらなる再生体が出現しなくなるまで、葉片をさらに切って新鮮な培地に移した。緑色再生体を回収して個別のプレートに移した。スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＲＭＯＰ培地上で新しい再生体を形成する小さな葉片を切断することによって、この系を繰り返しのシュート生成サイクルにかけた。スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＢ５培地上で、選択した再生体を発根させた。
【０１５０】
色素体形質転換体の分子分析
植物ＤＮＡの単離
ミキサーミルＭＭ  ３００（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、１個の３ｍｍタングステンカーバイドビーズを含む１．５ｍｌマイクロ遠心管に入れて、ＡＰ１緩衝液（ＤＮｅａｓｙ植物ミニキット、ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）２００μｌと試薬ＤＸ（発泡抑制、ＱＩＡＧＥＮ）１μｌ中で新鮮な葉組織１００ｍｇを粉砕した（２×１分２５Ｈｚ）。次いで、ＤＮｅａｓｙ植物ミニキットを用いてＤＮＡを精製した。
【０１５１】
サザン分析
分析植物当たり合計１μｇの植物ＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、１％アガロースゲルで分離した。標準手順（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９９９：Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、第４版、ユニット２．９Ａ）に従い、ＤＮＡを変性させ、正に帯電したナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）に移した。メンブレンを２５０ｍＭリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中６５°でα３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズし、同じ温度で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＢＡＳ  １５００）を用いて検出した。
【０１５２】
タバコプラストーム配列１０９９８６〜１１１１１２（及び１３１５１４〜１３２６４０）に対応する、プラスミドｐｌＣＦＢ１由来の１１３１ｂｐ  ＳｍａＩ断片を、野生型プラストーム、形質転換プラストーム及び染色体外形質転換ベクターを検出するためのプローブとして用いた。この断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲル精製し、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ及びランダムプライマーで標識した。逆方向反復Ａ又はＢ中の配列の２つのコピーにそれぞれ対応する野生型色素体ＤＮＡ中の１７８３６ｂｐ及び７０５５ｂｐの各ＮｃｏＩ断片に、このプローブをハイブリダイズする（図１７、レーン１）。相同組換えにより標的遺伝子座にａａｄＡカセットが組み込まれたプラストーム分子では、新しいＮｃｏＩ部位のため、７０５５ｂｐ断片の代わりに４７６１ｂｐ断片が検出される（図１７、レーン２及び３）。染色体外形質転換ベクターがその線形化された形で検出される（６２１１ｂｐ  ＮｃｏＩ断片、図１７、レーン２及び３）。このバンドの標識が強いことは、染色体外エレメントがプラストームよりも多いコピー数で存在することを示す。染色体外エレメントは、５サイクルの繰り返しシュート再生後も消失しなかった（図１７、レーン３）。
【０１５３】
トランスプラストミック植物からのｐｌＣＦＢ１の回収
植物中での増殖後における形質転換ベクターの完全性を試験するために、トランスプラストミック植物系２３９−２（３サイクルの繰り返しシュート再生）から単離した植物ＤＮＡを用いて大腸菌の形質転換を行った（標準ＣａＣｌ２法）。この形質転換によって、アンピシリン耐性細菌コロニーが生成し、これを用いて標準アルカリ溶解法に従ってプラスミドを調製した。これらのコロニーから単離したプラスミドの制限分析から、最初の色素体形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１と同じ制限パターンが得られ（図１８）、プラスミドが組換え再配列（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｙ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）なしにトランスプラストミック植物中で増殖し、当初の形質転換ベクターとして回収できることが実証された。
【実施例８】
【０１５４】
自己複製色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ６５２、ｐｌＣＦ６５３、ｐｌＣＦ６５４、ｐｌＣＦ６５５
フランキング相同組換え現象によってプラストーム中にそれらの一部が組み込まれるのを防止する自己複製色素体形質転換ベクターを構築するために、プラスミドｐｌＣＦＢ１を１本の色素体配列のみを含むように改変した。また、キメラａａｄＡ遺伝子のターミネーター配列を除去して環状プラスミドを廻る連続転写を可能にした。
プラスミドｐｌＣＦＢ１（実施例７参照）をＰｓｔＩで切断し、続いて再連結することによって、ターミネーターのないａａｄＡ配列と共にｐｌＣＦＢ１の左色素体ＤＮＡフランク（図１９）のみを含む形質転換ベクターｐｌＣＦ６５２を作製した。
ｐｌＣＦＢ１から右フランクをＳａｃＩ及びＸｂａＩを用いて切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した１．１ｋｂ断片をプラスミドｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａに挿入し（実施例７参照）、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してターミネーター配列を除去することによって、ターミネーターのないａａｄＡ配列と共にｐｌＣＦＢ１の右フランク（図２０）のみを含む形質転換ベクターｐｌＣＦ６５３を作製した。連結によって２つの向きに挿入断片を有する２つの異なるプラスミド、すなわちｐｌＣＦ６５３１及びｐｌＣＦ６５３２が生じ、これら両方を植物形質転換に使用した。
ターミネーターのないａａｄＡ配列と共にｐｌＣＦＢ１の右フランクの部分のみを含む形質転換ベクターｐｌＣＦ６５４及びｐｌＣＦ６５５（図２１及び２２）を、ｐｌＣＦＢ１からの０．３ｋｂ  ＳｃａＩ−ＸｂａＩ断片（ｐｌＣＦ６５４の場合）又は０．８ｋｂ  ＳａｃＩ−ＳｃａＩ断片（ｐｌＣＦ６５５の場合）を使用する以外はｐｌＣＦ６５３と同様にして構築した。
色素体における自己複製に必須のエレメントを規定するために、得られたプラスミドを用いて、実施例７に記載したようにタバコの形質転換を行った。
形質転換された植物系の色素体における自己複製色素体形質転換ベクターの有無及び相対的なコピー数を、実施例７に記載したように、３サイクルの繰り返しシュート再生後に検討する。
【実施例９】
【０１５５】
自己複製色素体発現ベクター
実施例８に従って同定した、色素体において自己複製をもたらす断片を選択して導入遺伝子発現カセットを構築する。これらの発現カセットにおいて、翻訳をもたらす５’上流配列を含む目的遺伝子を、ターミネーターのないａａｄＡカセットの下流に挿入する。この目的のために、タバコｒｐｓ１９／ｒｐｌ２２遺伝子間領域（ｃｔｇｃａｇａｔａａａａａａａａｔｃｔａｃａｔｇｃｔｔａｔｇａｔｔｃａｇｔａｇｔａｇｇａｇｇｃａａａｃｃ）の非コード配列からの５２ｂｐ断片と組み合わせたｕｉｄＡコード配列を、プラスミドｐｌＣ５８２（実施例１１参照）からＰｓｔＩ及びＫｐｎＩを用いて切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化する。この断片を、ｐｌＣＦ６５２のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したＰｓｔＩ部位に挿入して、色素体発現ベクターｐｌＣＦ６５２−ＧＵＳを得る。同様に、この断片を、ｐｌＣＦ６５３及びｐｌＣＦ６５５のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ＫｐｎＩ部位にも挿入して、それぞれ色素体発現ベクターｐｌＣＦ６５３−ＧＵＳ及びｐｌＣＦ６５５−ＧＵＳを作製する。色素体発現ベクターｐｌＣＦ６５４−ＧＵＳを構築するため、実施例８に記載したように、前記断片を０．３ｋｂ  ＳｃａＩ−ＸｂａＩ断片と共にＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａに連結する。発現カセットの正確な向きを制限分析によって決定する。得られたプラスミドを用いて、実施例７に記載したように、タバコを形質転換する。
【実施例１０】
【０１５６】
光独立栄養に基づく選択を用いた自己複製色素体形質転換ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３及びｐｅｔＡＯｒｉ４
プラスミドｐｅｔＡＯｒｉ１−４は、選択マーカーとしてｐｅｔＡ遺伝子が用いられる以外は、実施例８の実験で定義したのと同じ複製エレメントを含む。これらのベクターは、ｐｅｔＡ欠乏植物を形質転換して、光独立栄養生長能力を回復するように設計されている。ａａｄＡカセットによりｐｅｔＡコード配列が欠失するｐｌＣ５５８の形質転換によって、ＰｅｔＡ欠乏タバコ植物を作製した。ベクターｐｅｔＡＯｒｉ０は、５’調節エレメント、ｐｅｔＡコード配列、スペーサー（ＲＢＳ）及び目的遺伝子のコード配列（ｕｉｄＡ）で構成されるジシストロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）オペロンを含む。このベクターから、自己複製をもたらす追加のＤＮＡ断片を含む４つの誘導体が構築される（ｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４）。
【０１５７】
色素体によってコードされるｐｅｔＡ遺伝子を不活性化するための形質転換ベクターｐｌＣ５５８の構築
すべてのクローニング手順を、実施例７及びＡｕｓｕｂｅｌ等、１９９９に記載された標準手順を用いて実施した。
ベクターｐｌＣ５５８は、ａａｄＡカセット（ｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａ、Ｋｏｏｐ等、１９９６、実施例７参照）に隣接するタバコプラストームから誘導される２つのフランキング配列を含む。相同配列は、ｐｅｔＡ遺伝子の各１ｋｂの５’領域及び３’領域である。ａａｄＡカセットによって、ｐｅｔＡ遺伝子（９６２ｂｐ）及びｐｅｔＡ３’領域の３００ｂｐが置換される。
プライマーとして以下のオリゴヌクレオチド対、すなわち、末端にＮｄｅＩ及びＳｍａＩ部位を生じるｏＳＫ１３（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡ−３’）とｏＳＫ１４（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＡＡＴＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡ−３’）、及び断片末端にＳｍａＩ及びＳｐｈＩ部位を生じるｏＳＫ１５（５’−ＴＴＣＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡ  ＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＧ−３’）とｏＳＫ１６（５’−ＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＴＴＡＧＣＴＣ−３’）を用いてＰＣＲによって両方のフランキング断片を増幅した。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃１．５分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。消化した断片（左／右フランク）及びＳｍａＩ断片としてａａｄＡカセットを、ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに１段でクローン化した。構築物ｐｌＣ５５８を制限実験により分析した。ＰＣＲ増幅断片の配列を決定し、フランキング領域の配列が正確なことを証明した。
【０１５８】
第１の形質転換及びホモプラストミックΔｐｅｔＡ突然変異体の選択
ベクターｐｌＣ５５８を用いた微粒子銃による色素体形質転換及び選択を実施例７に記載したように実施した。ホモプラストミックｐｅｔＡ欠乏植物を、ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４を用いた色素体形質転換の標的として使用することができる。
形質転換体候補の分析を実施例７に記載したように実施した。
【０１５９】
色素体形質転換ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４の構築
ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４の構築を以下のように実施した。すなわち、５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を生じるプライマー「ｐｅｔＡｆｏｒ」（５’ａａａａｇｇａｒｃｃａｔｇｃａａａｃｔａｇａａａｔｇｃｔｔｔｔｔｃｔｔｇ３’）及び「ｐｅｔＡｒｅｖ」（５’ｃｔａｇａａａｔｔｃａｔｔｔｃｇｇｃｃａａｔｔｇａａ３’）を用いてＰＣＲによってｐｅｔＡコード配列を増幅した。使用したＰＣＲプログラムは以下のとおりであった：９４℃３分、１サイクル；９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃１．５分、３０サイクル；最終伸張７２℃１０分。ベクターｐＵＣ１６ＳａａｄＡ−Ｓｍａ（Ｋｏｏｐ等、１９９６、実施例７参照）の５’調節エレメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化によって切り出した。増幅したｐｅｔＡ遺伝子断片及び５’調節エレメントを、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａｉで消化したベクターｐＵＣ１９に１段でクローン化した。
ｐｅｔＡ遺伝子に対して下流にあるＲＢＳ及びｕｉｄＡ遺伝子をクローン化するために、ＲＢＳ及びｕｉｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ１６ＳＲＢＳｕｉｄＡ（Ｋｏｏｐ等、１９９６）からＫｐｎＩ及び部分的なＥｃｏＲＶ消化によって切り出した。単離した断片を平滑末端化し、ｐｅｔＡコード配列及び５’調節エレメントを含むベクターに連結した。この連結のためのクローニング部位として、同様に平滑末端化したＸｂａＩ部位を用いた。
この構築物を制限実験によって分析し、ＰＣＲ増幅ｐｅｔＡコード配列の配列を決定して、配列が正確であることを証明した。
このベクターｐｅｔＡＯｒｉ０を使用してベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４を構築した。すなわち、ｐｅｔＡＯｒｉ０をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、その付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端化した。ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１を構築するために、ベクターｐｌＣＦＢ１（実施例７参照）の左フランクをＳｍａＩで消化して切り出し、ベクターｐｅｔＡＯｒｉ０の平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。ベクターｐｅｔＡＯｒｉ２を構築するために、ベクターｐｌＣＦＢ１の右フランクをＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。ベクターｐｅｔＡＯｒｉ３を構築するために、ベクターｐｌＣＦＢ１の右フランクの０．３ｋｂ断片をＳｃａＩ／ＸｂａＩで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。ベクターｐｅｔＡＯｒｉ４を構築するために、ベクターｐｌＣＦＢ１の右フランクの０．８ｋｂ断片をＳａｃＩ／ＳｃａＩで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。
これらの構築物を制限実験で分析して、クローニングが正確であることを証明した。色素体形質転換ベクターｐｅｔＡＯｒｉ０を図２３に示す。
【０１６０】
第２の形質転換及び再構成ホモプラストミックΔｐｅｔＡ突然変異体の選択
ベクターｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３、ｐｅｔＡＯｒｉ４を用いた色素体形質転換のための標的としてホモプラストミックｐｅｔＡ欠乏植物を使用することができる。これらのベクターを用いた微粒子銃による色素体形質転換を実施例７に記載したように実施する。形質転換体の選択を、ＲＭＯＰ培地上でスクロース含量を削減して（０．３％）実施する。ｐｅｔＡが再構成された形質転換体は、生長のために光合成エネルギーを利用することができる。再生サイクルの増加中に形質転換体はｈｃｆ（高いクロロフィル蛍光）の減少も示すはずである。形質転換体候補の分析を実施例７に記載したように実施する。
【実施例１１】
【０１６１】
自己複製シャトルベクターｐｌＣＭＦｌ１
１つ又は複数の目的遺伝子をプラストームに安定に組み込むシャトルベクターを構築するために、色素体において（実施例８に従って同定された）自己複製を媒介する断片を選択した。
【０１６２】
拡張マルチクローニング部位を有するクローニングベクタープラスミドｐｌＣＦ５６７の構築
ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ各認識部位間にあるプラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニング部位を、合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＧ−３’で置換し、プラスミドｐｌＣＦ５６７を得た。
【０１６３】
プロモーターのない色素体形質転換ベクタープラスミドｐｌＣＦ５８２の構築
プラスミドｐｌＣＦ５６７をＢｓｐ１２０Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。２６４１ｂｐのベクター断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、断片ｐｌＣＦ５６７−Ｂ／Ｈを得た。ｂｐ３５７〜１３３５のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストームｐｓｂＡ  ３’領域をプライマー５’−ＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣ−３’及び５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣ−３’を用いＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａから単離したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ｂｐ１５５３９４〜３５３のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストームｒｐｌ２  ３’領域をプライマー５’−ＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＡＧＴＡＴＴＣ−３’及び５’−ＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧ−３’を用いＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａから単離したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。増幅されたｐｓｂＡ  ３’領域をＢｓｐ１２０Ｉ及びＰｓｔＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰＣＲ精製キットを用いて精製し、左フランクＢ／Ｐを得た。増幅されたｒｐｌ２  ３’領域をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰＣＲ精製キットを用いて精製し、右フランクＰ／Ｈを得た。３つの断片ｐｌＣＦ５６７−Ｂ／Ｈ、左フランクＢ／Ｐ及び右フランクＰ／ＨをＴ４リガーゼにより同時に連結してプラスミドｐｌＣＦ５６９を得た。
大腸菌ａａｄＡ遺伝子を、プライマー５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧ−３’及び５’−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＣＴＣ−３’を用いてプラスミドｐＦａａｄＡ  ＩＩ（Ｋｏｏｐ等、１９９６）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じ制限酵素で予め消化したｐｌＣ５６７に連結して、ｐｌＣＦ５０６を得た。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｒｐｌ３２  ３’−ＵＴＲを、プライマー５’−ＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＴＡＡＴＴ−３’及び５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ−３’を用いて、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｒｐｌ３２  ３’−ＵＴＲをＳａｃＩ及びＸｈｏＩで消化し、同じ制限酵素で予め消化したｐｌＣＦ５０６に連結して、ｐｌＣＦ５１９を得た。
大腸菌ａａｄＡ配列及びＮ．ｔａｂａｃｕｍ  ｒｐｌ３２−３’−ＵＴＲを、プライマー５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧ−３’及び５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧ−３’を用いてＰＣＲにより増幅した。大腸菌ｕｉｄＡ配列を、プライマー５’−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’及び５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡ−３’を用いて、プラスミドｐＲＡＪ２７５（Ｍｉｋｅ  Ｂｅｖａｎ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０２４５６．１）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。各ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットで精製してそれぞれａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２及びｕｉｄＡを得た。６ｐｍｏｌのａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２及び５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣ−３’をＴａｑポリメラーゼと０．２ｍＭ  ｄＮＴＰを含有する１×Ｔａｑ緩衝液（ＭＢＩ）中、７２℃で２０分間インキュベートした。得られた断片は５’ＲＢＳ領域を含み、ＲＢＳ＋ａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２が得られた。これをＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化してＲＢＳ＋ａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２−Ｋ／Ｘを得た。ＰＣＲ産物ｕｉｄＡをＫｐｎＩ及びＮｃｏＩで消化してｕｉｄＡ−Ｎ／Ｋを得た。プラスミドｐｌＣＦ５６７をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で精製した。２６９０ｂｐにおけるベクター断片を精製し、ｐｌＣＦ５６７−Ｐ／Ｘを得た。ｐｌＣＦ５６７−Ｐ／Ｘ  ０．６ｐｍｏｌ及び３００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドＳｒｐｓ１９／ｒｐｌ２２（５’−ＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＡＡＴＣＡＴＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡ−３’）をＴ４リガーゼと共にインキュベートし、続いて第２の鎖をＴａｑポリメラーゼを用いて７２℃で平滑化した。得られた産物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化してｐｌＣＦ５６７−Ｎ／Ｘを得た。ｐｌＣＦ５６７−Ｎ／Ｘ  ２５ｆｍｏｌ、ｕｉｄＡ−Ｎ／Ｋ  ２５ｆｍｏｌ及びＲＢＳ＋ａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２−Ｋ／Ｘ  ２５ｆｍｏｌをＴ４リガーゼを用いて連結して、ベクターｐｌＣＦ５７６を得た。
プラスミドｐｌＣＦ５７６をＰｓｔＩ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化した。ＳｐｓａＡ／Ｂ＋ｕｉｄＡ＋ＲＢＳ＋ａａｄＡ＋Ｔｒｐｌ３２を含む断片をアガロースゲル上で精製し、ＰｓｔＩを用いて予め線形化したｐｌＣＦ５６９に連結して、プラスミドｐｌＣＦ５８２を得た。
【０１６４】
マーカーのない組込み用ベクターｐｌＣＭＦｌ１の構築
ｐｌＣＦ５８２からのａａｄＡ遺伝子をＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化して除去した。Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて突出末端を除去し、Ｔ４リガーゼを用いてベクターを移して（ｒｅｌｅｇａｔｅ）、ｐｌＣＦ５８２Ａを得た。異種ｕｉｄＡ遺伝子を含めたｐｓｂＡ−ｒｐｌ２各フランクをｐｌＣＦ５８２ＡからＢｓｐ１２０Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて除去した。ｐｓｂＡ−ｕｉｄＡ−ｒｐｌ２断片末端をＫｌｅｎｏｗ断片で平滑化し、予めＮｄｅＩで線形化しＫｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化したプラスミドｐｌＣＦ６５２１に連結し（実施例８参照）、ｐｌＣＭＦ１を得た。
【０１６５】
マーカーのない組込み用ベクターｐｌＣＭＦｌ２の構築
ｐｌＣＦ６５２１の代わりにｐｌＣＦ６５３１（実施例８参照）を用いた以外はｐｌＣＭＦｌ１に対して記述したのと同様に構築を実施した。
【０１６６】
組換えによるマーカー除去用ベクターｐｌＣＭＦＲの構築
ａａｄＡに先行するベクター領域を、プライマー５’−ｇａｔｃｇｇｔａｃｃａｔｇｔｔｃｔｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔａｔ−３’及び５’−ｇａｔｃｇｇｔａｃｃａａａｇｔｇｔａａａｇｃｃｔｇｇｇｇｔｇ−３’を用いてＰＣＲによりｐｌＣＭＦ２から増幅した。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化し、ＫｐｎＩを用いて予め線形化したｐｌＣＭＦｌ２に連結した。得られたプラスミドの配列を決定し、ａａｄＡの組み込まれたＰＣＲ産物３’の向きがａａｄＡの鋳型領域５’の場合と同じであるプラスミド（ｐｌＣＭＦＲ）を選択して、ａａｄＡ配列をダイレクトリピートに隣接させる。したがって、これら２つの配列エレメント間の相同組換えによってａａｄＡカセットを切り出すことができる。
【実施例１２】
【０１６７】
高等植物の色素体形質転換用選択マーカーとしてのａｐｈＡ−６
ベクタークローニング
ａ）形質転換ベクターｐｌＣＦ６０６１及びｐｌＣＦ６０６２の構築
逆方向反復領域中のｔｒｎＮとｔｒｎＲの遺伝子間に外来配列を導入するためのベクターは、相同組換え用タバコフランク（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ０００４４によるプラストームヌクレオチド１３１１０６〜１３２２７７及び１３２２７８〜１３３３９６）を含むベクターｐＫＣＺ（Ｚｏｕ、２００１）に基づく。これらのフランク間のａａｄＡ発現カセット（Ｋｏｏｐ等、１９９６）をＮｏｔＩ消化により除去し、中間体構築物（ｐｌＣＦ６０３）からＢｓｐ１２０Ｉ／ＮｏｔＩ断片として得られるａｐｈＡ−６発現カセットで置換する。Ｂｓｐ１２０ＩとＮｏｔＩは互換性があるので、２つのクローン、すなわちｐｌＣＦ６０６１（右フランクの近位にある１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター）及びｐｌＣＦ６０６２（左フランクの近位にある１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター）が得られる。発現カセットを、ＰＣＲ増幅色素体調節エレメントの１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター（プラストームヌクレオチド１０２５７１〜１０２６５９）、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ（１５９８〜１６８０）、ｒｐｌ３２  ３’ＵＴＲ（１１５２２１〜１１５５１１）及びａｐｈＡ−６コード配列（ｐＳＫ．ＫｍＲ、Ｂａｔｅｍａｎ及びＰｕｒｔｏｎ  ２０００）から構築する。
【０１６８】
ｂ）形質転換ベクターｐｌＣＦ５９９の構築
大きな単一コピー領域中のｐｅｔＡとｏｒｆ９９の遺伝子間にａｐｈＡ−６発現カセットを導入するため、２つのフランク（プラストームヌクレオチド６３３３５〜６５５９７及び６５５９８〜６６５９７）をＰＣＲにより増幅して、断片末端（ＮｄｅＩ／ＳｍａＩ及びＳｍａＩ／ＳｐｈＩ）に所望の制限部位を付加した。両方のフランクを対応する酵素で消化し、（ＳｍａＩｌ断片として調製した）ａｐｈＡ−６カセットと共に、ＮｄｅＩ／ＳｐｈＩを用いて線形化したｐＵＣ１９に連結してｐｌＣＦ５９９を得た。このプラスミド中の発現ユニットは、タバコ色素体１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター、合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ、ａｔｃａｃｔａｇｔｔｇｔａｇｇｇａｇｇｇａｔｃｃ、Ｋｏｏｐ等  １９９６）、ａｐｈＡ−６コード配列、及びｐｅｔＡ遺伝子と同じ読み取り方向のｒｐｌ３２  ３’−ＵＴＲを含んでいる。ａｐｈＡ−６カセットは、ｐＵＣ１６Ｓ−ａａｄＡ−ＳｍａＩ（完全なカセット切り出しのための追加のＳｍａＩ部位を含む改変ｐＵＣ１６Ｓ−ａａｄＡ、Ｋｏｏｐ等  １９９６）に基づく中間体構築物から、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化及び再連結後にＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来するａａｄＡコード配列及びｒｂｃＬ−３’−ＵＴＲをベクターｐｌＣＦ６０６に由来するａｐｈＡ−６コード配列及びｒｐｌ３２  ３’−ＵＴＲで置換して得られた。
【０１６９】
ｃ）形質転換ベクターｐｌＣＦ６３７の構築
大きな単一コピー領域中のｙｃｆ３コード領域の上流位置にａｐｈＡ−６コード配列を導入するために、２つのフランク（プラストームヌクレオチド４５０３３〜４６２６６及び４６２６９〜４７２０５）をＰＣＲにより増幅して断片末端に所望の制限部位を付加した（ＳｐｈＩ／ＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ／ＳｍａＩ）。また、合成ＲＢＳ（ａｔｃａｃｔａｇｔｔｇｔａｇｇｇａｇｇｇａｔｃｃ、Ｋｏｏｐ等  １９９６）をＰｓｔＩ部位とｙｃｆ３遺伝子用翻訳シグナルとして働くｙｃｆ３コード領域の間にＰＣＲにより導入した。両方のフランク断片を対応する酵素で消化し、（ｐＳＫ．ＫｍＲからのＰｓｔＩ／ＮｃｏＩ断片として調製した）ａｐｈＡ−６コード配列と共に、ＳｍａＩ／ＳｐｈＩにより線形化したｐＵＣ１９に連結してｐｌＣＦ６３７を得た。したがって、ａｐｈＡ−６及びｙｃｆ３遺伝子の各コード配列は、内在性ｙｃｆ３上流調節エレメントの制御下に同じ方向に転写されて、形質転換されたプラストーム中に新しい人工オペロンが形成される。
【０１７０】
植物材料
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａの表面を滅菌した種子を、２％スクロース及び０．６％寒天を含むＢ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ等  １９６８）上で出芽させた。Ｂ５培地１００ｍｌを含む７００ｍｌガラス瓶に実生を移した。蓋に作製した発泡栓インサート（ｆｏａｍ  ｐｌｕｇ  ｉｎｓｅｒｔ）により追加の空気を供給した。培養条件は、２７±１℃で日長１６時間（約０．５〜１．０Ｗ／ｍ−１、Ｓｙｌｖａｎｉａ標準Ｆ５８Ｗ／１２５−Ｔ８  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｗｈｉｔｅランプ）であった。
【０１７１】
プロトプラスト単離及びグリッド包埋
プロトプラスト単離及びアルギン酸包埋を、基本的にＤｏｖｚｈｅｎｋｏ等（１９９８）及びＫｏｏｐ等（１９９６）に記載されたものにわずかな改変を加えて行った。包埋の前にプロトプラストをＦ−ＰＣＮに密度１．７×１０５プロトプラスト／ｍｌで再懸濁し、次いで等体積のアルギン酸と混合して最終プレーティング密度５．５×１０４／グリッドとした。
【０１７２】
選択条件
グリッド打ち込み及びＰＥＧ形質転換後にカナマイシン耐性再生体を選択するための諸条件を、アルギン酸包埋した８日齢のミクロコロニーを含むグリッドをＲＭＯＰ培地上に置き様々な濃度のカナマイシン（０、１０、２５、５０、７５、１００ｍｇ／ｌ）で選択試験を行い決定した。培養室で４週間インキュベーションした後に、適切な選択条件を評価した。
【０１７３】
形質転換及び選択
ａ）葉打ち込み：３〜４週齢のタバコ葉（約４５×５５ｍｍ）をＲＭＯＰ培地上で１日前培養し、次いでＤｕＰｏｎｔ粒子銃を用いてＭｕｈｌｂａｕｅｒ等（２００２）に記載されたＤＮＡ被覆金粒子を打ち込んだ。打ち込みから２日後、葉を小片（２×２ｍｍ）に切断し、選択培地（ＲＭＯＰ＋２５〜５０ｍｇ／ｌカナマイシン）に移した。新鮮な培地への移動を、３〜４週ごとに定期的に実施した。
ｂ）グリッド打ち込み：アルギン酸包埋プロトプラストを３２〜６４細胞期に到達するまで液体培地（Ｆ−ＰＣＮ）中で６〜７日間培養した。グリッドを排液した後、それらを固体培地（ＲＭＯＰ）に移し、１日前培養してから打ち込みに使用した。金の充填、打ち込み及び選択を上述のとおり実施した。
ｃ）ＰＥＧ形質転換：ポリエチレングリコールによって媒介される葉緑体へのＤＮＡ移動をＫｏｏｐ等（１９９６）及びＫｏｆｅｒ等（１９９８）に記載されたとおりに実施した。形質転換から７日後に、アルギン酸包埋プロトプラストを２５〜５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含み寒天で凝固したＲＭＯＰ培地に移すことによって、形質転換された細胞の選択を開始した。新鮮な培地への移動を、最長１２週の選択全期間にわたり３週ごとに実施した。
【０１７４】
形質転換したプラストームを増幅し、野生型プラストームを除去するために、第１の形質転換体（サイクル０）を、サイクル１、サイクル２などと称する選択培地上でのいくつかの追加の再生ラウンド（小葉外植片、２×２ｍｍ）に供した。
【０１７５】
ＤＮＡ単離
プラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の手順に従ってベクターＤＮＡを単離した。さらに、ＰＥＧ形質転換用に調製したＤＮＡを、酢酸Ｎａ／エタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液ｐＨ５．６に溶解した。全植物ＤＮＡを植物ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ）を用いて単離した。カルス又は葉組織（１００〜２００ｍｇ）を１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管にＭｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３００（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｈａａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びタングステンカーバイドビーズ（３ｍｍ）を用いて製造者の手順書に記載されたとおりに浸軟した。１００μｌ溶出緩衝液でＤＮＡを溶出させ、蛍光光度計（ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ、Ｂｉｏｒａｄ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及び蛍光ＤＮＡ定量化キット（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて濃度を測定した。
【０１７６】
形質転換体及び子孫におけるカナマイシン耐性濃度の決定
無菌コルクボーラー（直径５ｍｍ）を用いて葉を円板状に切り、様々な濃度のカナマイシン（０〜２００ｍｇ／ｌ）を含むＲＭＯＰ培地にそれらを置くことによって、様々な形質転換体のカナマイシン耐性濃度を決定した。培養の４週後に外植片の生長を評価した。
ガラス温室内で生長した野生型及び自家受粉の形質転換体から採取した種子を用いて子孫の分析（Ｔ１）を実施した。複数のさやからの種子を、表面を滅菌し、寒天凝固Ｂ５培地又はカナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むＢ５培地上で出芽させた。標準培養条件下での培養２週後に実生が出現するかどうか評価した。
【０１７７】
結果
大腸菌中でのａｐｈＡ−６遺伝子の発現
植物形質転換前に、すべてのベクターの機能性を大腸菌において試験した。プラスミドｐｌＣＦ５９９、ｐｌＣＦ６０６１／２（１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターの制御下にあるａｐｈＡ−６遺伝子）は少なくとも５０ｍｇ／ｌのカナマイシンに対する耐性をもたらし、一方、ｐｌＣＦ６３７はわずか２５ｍｇ／ｌのカナマイシン耐性しかもたらさなかった（ｙｃｆ３プロモーターによって制御されるａｐｈＡ−６遺伝子）。
【０１７８】
カナマイシン選択条件の決定
アルギン酸包埋プロトプラスト由来のミクロコロニーに対して適切なカナマイシン選択濃度を決定するために、様々な濃度のカナマイシン（０〜１００ｍｇ／ｌ）を含むＲＭＯＰ培地上にグリッドを置いた。２５ｍｇ／ｌ未満のカナマイシン濃度は生長を抑えるには不十分であるのに対し、５０ｍｇ／ｌを超える濃度は過酷過ぎて、広範な褐変をもたらし、コロニー増殖を抑制した。したがって、グリッドの打ち込み後に、まず２５ｍｇ／ｌ濃度のカナマイシンを用いて形質転換体を選択した。１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターによって制御されるａｐｈＡ−６遺伝子が最高２００〜５００ｍｇ／ｌカナマイシンの耐性をもたらし得ることが証明された後、選択濃度を５０ｍｇ／ｌカナマイシンに増加した。類似のカナマイシン濃度でＰＥＧ処理プロトプラストを選択した。
【０１７９】
カナマイシン耐性再生体の回収
ａ）グリッド打ち込み
カナマイシン選択と組み合わせたａｐｈＡ−６遺伝子を用いて、プロトプラストに由来するミクロコロニーの打ち込みを実施した。この技術を成功させるために極めて重要なことは、グリッドが正確な発生段階（３２〜６４細胞）のミクロコロニーを含むこと、及びプレーティング効率が高いことである。表２に、ａｐｈＡ−６遺伝子を選択マーカーとして用いたすべての形質転換実験から得られた結果を要約する。カナマイシン耐性再生体は、打ち込み後１２週の選択期間にわたって得られた。わずか培養２４日後に早期の現象が見られることもあった。
ｂ）ＰＥＧ形質転換
ＰＥＧによって媒介されるＤＮＡ送達後にカナマイシン耐性形質転換体を回収するためにａｐｈＡ−６遺伝子を使用した。ｐｌＣＦ５９９を用いてなされた２つの実験から、いくつかの再生体が、カナマイシン２５ｍｇ／ｌでのグリッドの選択後に得られた（表２参照）。耐性再生体が出現するのに要する期間は、グリッド打ち込みに対して記載した期間にほぼ類似する。
【０１８０】
カナマイシン２５ｍｇ／ｌを用いた初期のグリッド選択実験で直面する１つの問題は、いくつかの形質転換されていない逸脱物（ｅｓｃａｐｅ）の再生であった。形質転換されていない系を分析する問題を回避するために、緑色再生体すべてをグリッドから取り出し、新鮮な選択培地上で培養することによって前もって選択した。形質転換された系は緑色のまま正常に生長し、一方、逸脱物は急速に退色した。より高いカナマイシン濃度５０ｍｇ／ｌでは、著しく少ない再生体が一般に観察された。
【０１８１】
ＰＣＲ分析
グリッド打ち込み及びＰＥＧ形質転換からの材料を用いて、ＰＣＲ分析による緑色再生体の第１の分析を実施した（プライマー配列は表１を参照されたい）。ａｐｈＡ−６遺伝子の有無を示すために、プライマーｏＦＣＨ１６８及びｏＦＣＨ１６９を用いて最初の分析を行った。２０の試験系のうち１９が予想された４８０ｂｐの断片を与えた。ａｐｈＡ−６遺伝子が様々なプラストーム挿入部位に正確に組み込まれたことを証明するために、１つの内部ａｐｈＡ−６プライマー及び相同組換えに使用したフランクの１つの外側に位置する第２のプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ｐｌＣＦ６０６１及びｐｌＣＦ６０６２は、フランキング配列に対して異なる向きにクローン化されている同じａｐｈＡ−６発現カセットを含む。このため、２つの異なるプライマーの組合せ（ｏＳＨ５８とｏＦＣＨ１６９、ｏＳＨ５８とｏＦＣＨ１６８）が、タバコプラストーム中のｔｒｎＮとｔｒｎＲの間の組込みを示すのに必要であった。再生体Ｔ１０１−１及びＴ１７７−１（ｐｌＣＦ６０６１形質転換体）の分析の場合、ｏＳＨ５８とｏＦＣＨ１６９のプライマー組合せを用いて、両方の例で１９７８ｂｐの予想されたバンドが得られた。逆向きの場合、再生体Ｔ３４９−１（ｐｌＣＦ６０６２形質転換体）をプライマーｏＳＨ５８及びｏＦＣＨ１６８を用いて分析し、２２９７ｂｐの正確な産物が得られた。ｐｅｔＡとｏｒｆ９９の間にａｐｈＡ−６遺伝子が導入されたことが、再生体Ｔ３３０−２及びＴ３３０−４（ｐｌＣＦ５９９形質転換体）で示されている。これを分析するために、プライマーｏＳＫ１１６及びｏＦＣＨ１６９を用い、２９６１ｂｐの断片を得た。第３の挿入部位に関して、プラストーム組込みが正確であると、ｙｃｆ３調節エレメントの制御下にあるａｐｈＡコード領域を含む人工オペロンが形成される。ｏＦＣＨ２７とｏＦＣＨ１６８のプライマーの組合せを用いて再生体Ｔ１０９−１、Ｔ１０９−２及びＴ１０９−３（ｐｌＣＦ６３７形質転換体）を分析し、予想された２２３９ｂｐの断片を得た。野生型植物から調製したＤＮＡを用いた上述のプライマー組合せの各々を用いて、コントロール反応を実施した。
【０１８２】
７回の形質転換実験において、３５個の打ち込みグリッドから合計１８個の独立した形質転換体、すなわち、２グリッドごとに平均１形質転換体が回収された。２つのＰＥＧ形質転換実験において、１８個のグリッドから合計９個の形質転換体、すなわち、平均して２グリッドごとに１形質転換体が得られた。重要なことは、本明細書に記載した新しいプラストーム挿入部位のうち３つすべてが、本発明者らがすべての例で形質転換体を得ることができるように機能することである。４つのベクターの各々を用いた一般的な形質転換効率は、形質転換ベクターではなくプラストーム中に存在する調節エレメントによってａｐｈＡ−６コード領域の発現が制御されるｐｌＣＦ６３７が関与する実験を含めても、同等であった。
【０１８３】
サザン分析
全３つの挿入部位のＰＣＲ陽性系をサザンハイブリダイゼーションによりさらに分析して予想されたプラストーム組込みを確認した。これらの系における非形質転換プラストームと形質転換プラストームの比を推定するために、形質転換プラストームと野生型プラストームの両方にハイブリダイズするプローブを選択した。ｐｌＣＦ６０６１形質転換体及び形質転換されていないコントロールからの全ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、左フランク（１１１７ｂｐ）を覆うプローブＰ１とハイブリダイズした。コントロールが７０７６ｂｐの断片を示したのに対し、両方の形質転換体（Ｔ１０１−１、Ｔ１７７−１）では、追加のＢａｍＨＩ部位を有するａｐｈＡ−６発現カセットのために、予想された２７５３ｂｐの断片が得られた。ｐｌＣＦ５９９形質転換体を分析するために、全ＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断し、左フランクの３００ｂｐ断片であるプローブＰ２にハイブリダイズした。野生型コントロールは、７６６１ｂｐの断片を示したのに対し、ａｐｈＡ−６発現カセットにおけるＢｇｌＩＩ部位の存在のために４４２６ｂｐのシグナル（Ｔ３３０−２及びＴ３３０−４系）がトランスジェニックプラストームから生成された。第３の例では、ｐｌＣＦ６３７形質転換体及び形質転換されていないコントロールからの各ＤＮＡをＸｍａＪＩで消化し、右フランクの外側に位置する５１８ｂｐ断片であるＰ３でプローブすることによって分析した。野生型コントロールが２１９８ｂｐのバンドを示したのに対し、３つの形質転換された系Ｔ１０９−１、Ｔ１０９−２及びＴ１０９−３すべてにおいて、ａｐｈＡ−６コード配列が挿入されたために、３０２８ｂｐのより大きな断片が認められた。
【０１８４】
選択による再生サイクル数に応じて、形質転換プラストームと非形質転換プラストームの比に違いが見られる。ｐｌＣＦ５９９形質転換体である形質転換系Ｔ３３０−４の場合、サイクル０からの植物組織をサザンブロットで分析すると、それ自体としては野生型プラストーム含量に関して明らかにヘテロプラストミックであるのに対し、系Ｔ３３０−２（サイクルＩ）においては野生型プラストームがほとんど検出されない。６ヶ月以上培養状態にあるその後のサイクル（サイクルＩＶ、ｐｌＣＦ６３７形質転換体及びサイクルＶ、ｐｌＣＦ６０６１形質転換体）から分析される形質転換体も、野生型に匹敵するサイズのかすかなシグナルを依然として示した。この期間は、ホモプラストミック系を産生するのには十分である。
【０１８５】
ａｐｈＡ−６発現試験
各系におけるトランスジェニックプラストーム含量がサザン分析に基づいて同等であるように選択により再生された植物を用いて、葉外植片におけるａｐｈＡ−６発現試験を実施した。ｙｃｆ３調節エレメントの制御下にあるａｐｈＡ−６を有する形質転換体（ｐｌＣＦ６３７形質転換体）に比べて、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターによって制御されたａｐｈＡ−６遺伝子を含む形質転換体（ｐｌＣＦ６０６１形質転換体）はカナマイシン耐性に関して変動が認められた。カナマイシン０、２５及び２００ｍｇ／ｌを含むＲＭＯＰ培地上に葉外植片を置き、４週後に評価した。ｐｌＣＦ６０６１からの形質転換体は、すべての試験濃度で同等に生長した。これとは対照的に、ｐｌＣＦ６３７形質転換体は、最高濃度のカナマイシンでは生長できなかったが、２５ｍｇ／ｌでは生長した。１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターは、現在まで記述された最も強力な色素体プロモーターであるのに対し、ｙｃｆ３発現を制御するプロモーターの強度は未知である。野生型葉からのコントロール外植片は、選択したカナマイシン濃度のいずれでも生長することができなかった。追加の実験において、カナマイシン耐性の上限が決定され、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター制御ａｐｈＡ−６遺伝子を有する植物の場合は耐性濃度が５００ｍｇ／ｌであり、ｙｃｆ３調節エレメントの制御下にあるａｐｈＡ−６マーカーを有する植物の場合５０ｍｇ／ｌであった。
【０１８６】
子孫の分析
複数サイクルのカナマイシン選択後インビトロで選択したトランスプラストミック植物を、ガラス温室に移して自家受粉させた後種子を回収した。野生型種子はＢ５培地上で正常に出芽したが、カナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むＢ５培地上では発芽後退色した。これとは対照的に、ｐｌＣＦ５９９及びｐｌＣＦ６３７の各形質転換体からの種子は出芽し、カナマイシン２００ｍｇ／ｌでも緑色のままであったが、非選択培地に蒔いたトランスジェニック種子よりはわずかに育ちが悪かった。形質転換された系のいずれもカナマイシン耐性に関して偏りを示さず、いずれもホモプラストミックであることが示された。
【０１８７】
【表１】
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【０１８８】
【表２】
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【０１８９】
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【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】従来の色素体形質転換における組換え現象、すなわち相同な２つのフランキング領域における二重組換えを示す図である。ベクター配列のない選択マーカー及び目的配列の組込み。下部：図１及び図２で使用するパターンの定義。
【図２】一過性のマーカーを組み込むための組換え現象：相同フランク外側の選択マーカー、両フランクの間の目的配列を示す図である。  １）第１の組換え：１相同領域による完全なベクター配列の組込み  ２）ダイレクトリピートによる第２の組換え：ａ）ベクター配列の切り出し（第１の組換えの逆）。ｂ）選択マーカー及びベクターバックボーンの切り出し；目的配列はプラストーム中に残る。
【図３】色素体形質転換ベクターｐＫＣＺの地図である
【図４】色素体ゲノムへの完全なｐＫＣＺベクターの組込みを示す概略図である。不安定な中間体は、重複したフランクから得られる２つの組換え産物候補、野生型（ケースＩ）又は安定に組み込まれた選択カセット（ケースＩＩ）を生じることがある。ＰＣＲ分析に使用されるプライマーの位置を黒の三角で示す。
【図５】ｐＫＣＺを含むタバコ形質転換体のＰＣＲ分析を示す図である。ゲルＡ（サイクル０）、ゲルＢ（サイクルＩ）及びゲルＣ（サイクルＩＩ）は、完全なｐＫＣＺ組込みを特異的に検出するプライマーｏＳＨ３及びｏＳＨ５８を用いて得られる産物を示す。ゲルＤは、プライマーｏＦＣＨ６０及びｏＳＨ５８の組合せによって、サイクルＩＩの系のすべてが完全なベクター挿入現象を有さずとも、そのすべてが依然としてａａｄＡ選択カセットを含むことを示している。
【図６】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ５５８の地図である。
【図７】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ８２０の地図である。
【図８】ベクターｐｌＣＦ５５８を用いた色素体形質転換を説明する概略図である。
【図９】ベクターｐｌＣＦ８２０を用いた色素体形質転換を説明する概略図である。
【図１０】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ５７７の地図である。
【図１１】ベクターｐｌＣＦ５７７の概略図である。
【図１２】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ７６１１の地図である。
【図１３】ベクターｐｌＣＦ７６１１の概略図である。
【図１４】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ８３６の地図である。
【図１５】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ８３８の地図である。
【図１６】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１の地図である。
【図１７】ｐｌＣＦＢ１を用いて形質転換された植物のサザン分析を示す図である。ＮｃｏＩ制限全スプラント（ｓｐｌａｎｔ）ＤＮＡを、１％アガロースゲル上で分離し、タバコプラストーム配列１０９９８６〜１１１１１２に対応する標識プローブとハイブリダイズした。レーン１：形質転換されていない植物（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ））由来のＤＮＡ；レーン２：１サイクルのシュート再生後のトランスプラストミック系２３９−１由来のＤＮＡ；レーン３：５サイクルのシュート再生後のトランスプラストミック系２３９−１由来のＤＮＡ。
【図１８】トランスプラストミック植物から回収したｐｌＣＦＢ１の制限分析を示す図である。レーン１：９５６、１２６８、１４８９、１８８２、２２０５、２４１９、２６９０、３４７２、４２５４、５０９０、６２２３、７７４３、９８２４、１９３２９及び２６２８７ｂｐの断片を示すＤＮＡ標準ラムダＤＮＡ／Ｅｃｏ１３０Ｉ−Ｍｌｕｌ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）；レーン２：１２７６、１５０７及び３４２８ｂｐの断片を示す色素体形質転換ベクターｐｌＣＦＢ１、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限；レーン３〜５：トランスプラストミック植物系２３９−２から単離したＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換した後に得られた３つの個別のコロニーからのＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限プラスミドＤＮＡ。
【図１９】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ６５２の地図である。
【図２０】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ６５３の地図である。
【図２１】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ６５４の地図である。
【図２２】色素体形質転換ベクターｐｌＣＦ６５５の地図である。
【図２３】色素体形質転換ベクターｐｅｔＡＯｒｉ０を示す図である。  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位は、４つの誘導体ｐｅｔＡＯｒｉ１、ｐｅｔＡＯｒｉ２、ｐｅｔＡＯｒｉ３及びｐｅｔＡＯｒｉ４のクローニング部位である。
【図２４】色素体形質転換ベクターｐｌＣＭＦｌ１を示す図である。
【図２５】配列番号１及び配列番号２を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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