(57)【要約】シリコンマイクロチップ上の電子的回路構成を利用する一塩基多型（ＳＮＰ）検出の迅速なアッセイが開示される。該方法は，電子的に補助されたＤＮＡの移動，濃縮，および選択された電極（テスト部位）への結合により，増幅されたＤＮＡサンプルの正確な識別を提供する。テスト部位は，野生型およびミスマッチ配列を含む二重標識レポーターの内部対照を用いることにより区別されるサンプルの組織化されたアレイを構成し，ＳＮＰ遺伝子型が確認される。この方法を用いて，マンノース結合蛋白質の複雑な４アレルＳＮＰを識別する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のテスト部位を有する電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いて一塩基多型を検出する方法であって，
ｉ．少なくとも１つのＳＮＰを含む，目的とする少なくとも１つの標的核酸を含む少なくとも１つのサンプルを提供し；
ｉｉ．任意に，前記標的を増幅反応に供して増幅生成物を形成し；
ｉｉｉ．前記標的または前記増幅生成物を前記マイクロチップ上の特定されたテスト部位に電子的にアドレシングし；
ｉｖ．前記標的または前記増幅生成物を前記テスト部位上に捕獲し；
ｖ．ＳＮＰ特異的プローブを提供し，前記プローブを前記標的または前記増幅生成物に電子的にハイブリダイズさせてハイブリダイズした複合体を形成し；
ｖｉ．前記ハイブリダイズした複合体に電子的ストリンジェンシーを実施して，前記標的または増幅生成物と前記プローブとの間に少なくとも１つのミスマッチを含むハイブリダイゼーション複合体を不安定化させ；そして
ｖｉｉ．（ｖｉ）の電子的ストリンジェンシーの後に安定に残るハイブリダイゼーション複合体を検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが，（１）マンノース結合蛋白質，（２）Ｆｃ−ガンマレセプター，（３）主要組織適合遺伝子複合体，（４）インターロイキン１β，（５）リンホトキシン，および（６）腫瘍壊死因子αをコードする核酸からなる群より選択される，目的とする標的核酸を含む，請求項１記載の方法。
【請求項３】
一塩基多型の前記検出が，目的とする核酸配列を含む多数の患者サンプルからのＳＮＰのマルチプレックスアッセイによるものである，請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記患者サンプルが，互いに連続的な関係で提供される，請求項３記載の方法。
【請求項５】
一塩基多型の前記検出が，１つの患者サンプルに由来する異なる遺伝子からの多数のＳＮＰを同時にスクリーニングする能力を含む，請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記電子的アドレシングおよび／または前記電子的ストリンジェンシーが，種々の段階の電子的ハイブリダイゼーションおよび電子的ストリンジェンシーを実時間でモニターする能力を含み，このことによりアッセイの間に確実な制御を提供することを特徴とする，請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＮＰが，目的とする標的核酸の多重アレル遺伝子複合体に由来する，請求項１記載の方法。
【請求項８】
各患者サンプルについて複数のテスト部位を有する電子的にアドレス可能なマイクロチップの１つの捕獲部位を用いて，少なくとも１つの患者サンプル起源からの，目的とする標的核酸中の多数の一塩基多型を検出する方法であって，
ｉ．目的とする前記標的核酸のそれぞれの中に少なくとも１つのＳＮＰを含む少なくとも１つのサンプルを提供し；
ｉｉ．任意に前記標的核酸を増幅反応に供して増幅生成物を形成し；
ｉｉｉ．前記標的核酸または前記増幅生成物を前記マイクロチップ上の特定されたテスト部位に電子的にアドレシングし；
ｉｖ．前記標的核酸または前記増幅生成物を少なくとも１つのテスト部位上に捕獲し；
ｖ．ＳＮＰ特異的プローブを提供し，前記プローブを前記標的核酸または前記増幅生成物に電子的にハイブリダイズさせてハイブリダイズした複合体を形成し；
ｖｉ．前記ハイブリダイズした複合体上で電子的ストリンジェンシーを実施して，前記標的核酸または増幅生成物と前記プローブとの間に少なくとも１つのミスマッチを含むハイブリダイゼーション複合体を不安定化し；そして
ｖｉｉ．（ｖｉ）の電子的ストリンジェンシーの後に安定に残るハイブリダイゼーション複合体を検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項９】
それぞれの患者サンプルについて，複数のテスト部位を有する電子的にアドレス可能なマイクロチップの少なくとも１つの捕獲部位で，多数の患者サンプル源の標的核酸中の一塩基多型を検出する方法であって，
ｉ．目的とする前記標的核酸のそれぞれの中に少なくとも１つのＳＮＰを含む前記サンプルを提供し；
ｉｉ．任意に，前記標的核酸を増幅反応に供して増幅生成物を形成し；
ｉｉｉ．前記標的核酸または前記増幅生成物を前記マイクロチップ上の特定されたテスト部位に電子的にアドレシングし；
ｉｖ．前記標的核酸または前記増幅生成物を少なくとも１つのテスト部位上に捕獲し；
ｖ．ＳＮＰ特異的プローブを提供し，前記プローブを前記標的核酸または前記増幅生成物に電子的にハイブリダイズさせてハイブリダイズした複合体を形成し；
ｖｉ．前記ハイブリダイズした複合体上で電子的ストリンジェンシーを実施して前記標的核酸または増幅生成物と前記プローブとの間に少なくとも１つのミスマッチを含むハイブリダイゼーション複合体を不安定化し；そして
ｖｉｉ．（ｖｉ）の電子的ストリンジェンシーの後に安定に残るハイブリダイゼーション複合体を検出する，
の各工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は，一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出に関する。より詳細には，本発明は，電子的にアドレス可能なマイクロチップを用いてＳＮＰｓを検出することに関する。
【０００２】
背景
以下の記述は，本発明に関連する情報の概要を提供する。ここに提要される情報のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではなく，特定してまたは暗に引用される刊行物のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０００３】
一塩基多型（ＳＮＰｓ）は，最も普通のタイプの遺伝的変種を構成する点突然変異であり，ヒトゲノム中の１０００塩基対に０．５−１０の割合で見いだされる。ＳＮＰｓは，ヒトの疾患に寄与する因子であることができ，また遺伝子マーカーとして作用することもできる，安定な突然変異である。多数の遺伝子と環境との間の複雑な相互作用のため，疾患の発生および進行におけるＳＮＰｓの寄与を解明するためには，大きな集団においてＳＮＰｓを追跡することが必要である。現在，高密度アレイ，質量スペクトル，分子ビーコン，ペプチド核酸，および５’ヌクレアーゼアッセイを用いる大規模マッピングのプロジェクトにより，ヒトＳＮＰｓを同定する努力が進められている。しかし，これらの技術は，研究および臨床の状況ではまだ広く用いられていない。
【０００４】
ＳＮＰ遺伝子型タイピングの慣用的な方法は，（１）例えばＫｏｒｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ．Ｖ．２４，ｐｐ．７２−７７（１９９７）により記載される，ＰＣＲ増幅物質のゲルに基づく配列決定，（２）例えばＡ．Ｊ．Ｊｅｆｆｒｅｙｓ（Ｃｅｌｌ  Ｖ．１８，ｐｐ．１−１０（１９７９）により記載される，制限断片長多型（ＲＦＬＰ），（３）例えばＭａｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｖ．５０，ｐｐ．２０２−２０５（１９９６）により記載される，アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を用いるドットブロットハイブリダイゼーション，または（４）Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖ１５，ｐｐ．３３−３９（１９９５）により記載される，一本鎖コンフォメーショナル多型（ＳＳＣＰ），のいずれかによって行う。配列決定方法は，有効ではあるが，時間を消費し，二次構造に起因する偽信号が生ずるかもしれない。ＲＦＬＰは，一般に，ＳＮＰ多型のサブセットのみを包含する。ＡＳＯは，保護された熱変性工程を必要とし，ＳＳＣＰは，自動化にはあまり適合性がない。高密度オリゴヌクレオチドアレイに対する受動ハイブリダイゼーションは，ＳＮＰｓの大規模遺伝子型タイピングを成し遂げた。しかし，慣用的なＤＮＡアレイの部位を個々に制御することができず，アレイ全体について同じプロセス工程を実施しなければならない。
【０００５】
本発明者らは，マイクロエレクトロニクスと分子生物学技術とを統合することにより，ＳＮＰ検出の技術を前進させる方法を示す。該方法においては，マイクロチップ上での電界の操作により，指定されたテスト部位におけるＤＮＡ分子の迅速な濃縮，ハイブリダイゼーション，および検出が可能である。この新規な方法は，さらに，１塩基対ミスマッチオリゴヌクレオチドを変性するために，テスト部位において極性反転を使用し，ならびに，多様なテスト部位の配置を使用して，目的の遺伝子の迅速なスループットのスクリーニングのための設計の融通性を利用する。
【０００６】
発明の概要
本発明は１つのアレルまたは多重アレルの遺伝子複合体および他のＳＮＰ含有核酸における一塩基多型（ＳＮＰｓ）の検出において，バイオエレクトロニック・マイクロチップを核酸ハイブリダイゼーションとともに使用することを含む好ましい態様の，多くの観点を提供する。これには，核酸の同じハプロタイプ中の多数の多型部位の存在，マンノース結合蛋白質の複雑な４アレルＳＮＰ，Ｆｃ−ガンマレセプター，主要組織適合遺伝子複合体，およびインターロイキン１βのＳＮＰタイピングが含まれるが，これらに制限されない。
【０００７】
別の態様においては，本発明は，目的とする核酸配列を含む多数の患者サンプルからのＳＮＰｓのマルチプレックスアッセイ，例えば，オンデマンド形式で遺伝子のサブセットについて多数のサンプルのＳＮＰ遺伝子型を迅速にタイピングする能力を含む。
【０００８】
別の態様においては，本発明は，一人の患者のサンプルに由来する異なる遺伝子からの多数のＳＮＰｓを同時にスクリーニングする能力を含む。
【０００９】
さらに別の態様においては，本発明は，アレル特異的プローブの使用を含み，ここで，多型識別は，多型ヌクレオチドがアレル特異的プローブ中の５’，中心，または３’のいずれに存在するかにかかわらず，同等に良好に得られる。
【００１０】
別の態様においては，本発明の方法は，増幅された標的核酸の１つの鎖を標識することを含み，ここで，標識（ビオチンを含有する標識を含むが，これに限定されない）は，増幅反応に用いる増幅プライマー中に組み込んで，前記標的核酸を増幅する。
【００１１】
さらに別の態様においては，本発明の方法は，標識した標的増幅産物を電子的にアドレス可能なマイクロチップ上の特定のテスト部位に結合させることを含む。
【００１２】
さらに別の態様においては，本発明の方法は，電子的ハイブリダイゼーションおよび電子的ストリンジェンシーの種々の段階を実時間でモニターする能力を含み，このことにより，アッセイの間に確実な制御を提供することができる。
【００１３】
別の態様においては，本発明の方法は，負または正であると評点される任意のシグナルが，それぞれ正または負について観察されるＭＦＩの強度に対して統計学的に明らかに下または上であるように，正および負のサンプルの間のシグナルの差異の程度を比較する基準を含む平均蛍光強度／秒（ＭＦＩ／ｓ）値に基づく，蛍光ハイブリダイゼーションパターン評点法を用いる。また，個々のサンプルに適用したときに，負および正のレポータープローブの結合に起因するシグナルから得られるＭＦＩ／ｓを比較することにより，可変性の評点基準も実施することができる。この場合，サンプル中の特定の標的にハイブリダイズするよう設計された少なくとも２つの異なるレポータープローブを用いてサンプルを試験する。評点から得られる結果はまた，浸透層の性質およびその中の機能性成分の密度（例えばアビジンまたは他の結合成分の濃度）または浸透層の組成（例えばアガロースまたはヒドロゲル）にも依存する。
【００１４】
さらに，本発明の方法は，アドレス可能なマイクロチップの，受動アレイ技術より優れた利点をさらに含む。利点としては，以下のものが挙げられる：
【００１５】
ａ．テスト部位を個々に制御することができ，このことにより，試験の直前に試験アレイを注文に応じた配置とすることができる；
ｂ．核酸分子を数秒間の時間で電子的にアドレシング（すなわち輸送），濃縮，およびハイブリダイズすることができる；
ｃ．特定されたテスト部位において電子的ストリンジェンシーを制御することができ，このことにより，同じオープンアレイ・マイクロチップ上で無関係な分子を同時に使用することができる；
ｄ．開示される方法論を，数百のテスト部位を含むアレイについて自動化装填器の使用に適用することができる；および
ｅ．開示される技術を，限定された数の細胞中でのＲＮＡの発現を分析するのに用いることができる。
【００１６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いる場合，“平均蛍光強度”（ＭＦＩ）とは，カメラ積分時間（ｃａｍｅｒａ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）を１秒として標準化した，目的とする領域全体にわたるピクセル計数値の平均である。値の範囲は，浸透層の構成に従って変化するであろう。
【００１７】
本明細書において用いる場合，“蛍光ハイブリダイゼーション評点”とは，ストリンジェンシー後のハイブリダイゼーションパターンの名称であり，ここで評点は，浸透層およびその機能的成分の性質に従って変化するであろう基準に基づく。本発明の１つの態様においては，基準は以下のことを特定する：（１）ミスマッチプローブは１０ＭＦＩ／秒より低い；（２）２５ＭＦＩ／ｓより低いアレル特異的レポーターは，負であると評点する；そして（３）３０ＭＦＩ／ｓより高いレポーターは正であると評点する。この評点基準は，電子的ドットブロットアッセイを用いて一塩基多型を同定するために，どのようにシグナルパラメータを用いるかの一例であり，いかなる意味においても本発明を限定することを意図するものではない。正または負の評点の設計におけるＭＦＩ／ｓの大きさは，種々の基準に依存して，検出の異なるレベルについて適切なように適当なレベルに定めることができる。
【００１８】
さらに，１つのサンプルについて，多重レポーターハイブリダイゼーションの使用（または内部重複）を設計して，複製または対照サンプルとの比較によらずに，遺伝子型の決定を行うことができる。
【００１９】
詳細な態様
本発明は，種々の観点の１つとして，多重アレル遺伝子複合体および他のＳＮＰ含有核酸中の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出する高スループットアッセイを実施する方法を提供する。これには，電子的にアドレス可能なバイオエレクトロニック・マイクロチップを用いる，同じハプロタイプの核酸中の多数の多型部位の存在，マンノース結合蛋白質の複雑な４アレルＳＮＰ，Ｆｃ−ガンマレセプター，主要組織適合遺伝子複合体，およびインターロイキン１βのＳＮＰ−タイピングが含まれるが，これらに限定されない。本明細書において説明するように，マイクロエレクトロニクスと核酸ハイブリダイゼーションとの統合により，ＳＮＰ配列どうしを迅速かつ正確に識別することができる。実際，本発明の二重蛍光電子的ドットブロットアッセイは，２２のブラインドＭＢＰ４アレルサンプル，およびＤアレルについて増強された１３のブラインドサンプルにおけるＳＮＰｓの検出に関して，１００％の正確性を有することが証明された。この正確性は，新たにミスマッチオリゴヌクレオチドを使用して，電子的マイクロ環境を確認することによって得られ，その結果，ヘテロ接合体配列の正確な識別および個々のサンプル中のＳＮＰ配列を確認するｃｙ３およびｃｙ５標識レポーターにより与えられる内部重複が得られる。オンデマンド方式で遺伝子のサブセットについて多数のサンプルを迅速にＳＮＰ遺伝子タイピングするこの能力は，現存する方法論よる優れた顕著な利点である。
【００２０】
さらに，核酸の移動および濃縮に半導体マイクロエレクトロニクスを使用することは，受動アレイ技術より優れたいくつかの利点を与える。利点としては以下のものが挙げられるが，これらに限定されない：（１）柔軟性，すなわち，オープン・アーキテクチャおよびテスト部位を個々に制御する能力は，試験の直前に各アレイを注文に応じた配置とすることを可能とする；（２）迅速性，すなわち，電子的アドレシングおよび電子的ハイブリダイゼーションにより，ＤＮＡ分子を数時間ではなく数秒間で輸送，濃縮およびハイブリダイゼーションすることが可能となる；（３）マルチプレックス化，すなわち，電子的ストリンジェンシーを個々のテスト部位において制御する能力により，無関係な分子を同じマイクロチップ上で同時に使用することが可能となる；（４）有効性，すなわち，電子的ハイブリダイゼーションおよび電子的ストリンジェンシーを種々の段階で実時間でモニターする能力は，アッセイの間により確実な制御を提供する；（５）チップ上実験室技術，すなわち，エレクトロニクスの適用は，細胞をマイクロチップ上で直接濃縮，破壊し，核酸を濃縮／増幅する手段として誘電電気泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いることにより，自動化して，時間を消費する重要な工程を排除する手段を提供することができる；（６）自動化，すなわち，１００パッドおよび４００パッド半導体チップ用の自動装填器を用いて，高スループットのパラメータを達成することができる；および（７）遺伝子発現，すなわち，本明細書に記載される技術は，少数の細胞からのＲＮＡの発現の分析に適用することができる。
【００２１】
実施例１　ＭＢＰアレル検出
ヒトマンノース結合蛋白質（ＭＢＰまたはＭＢＬ２）は，先天的免疫系の重要な成分であり，病原性微生物にオプソニンを作用させることができる。ＭＢＰは，まだ多くの病原体に対する免疫を発達させていない子供においては特に重要である。ＭＢＰのいくつかのありふれた変種型のいずれかの遺伝により，免疫抑制の期間の間に増強されうる潜行性免疫的欠陥が生じる。ＭＢＰ遺伝子の４つの別々のアレルが同定されている。この配列は，ＭＢＰが臨床的に意味がある可能性があり，遺伝的に複雑であるため，本発明の方法による分析の適切な標的である。
【００２２】
本発明の方法は，Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により製造された電子的にアドレス可能なマイクロチップを使用する。マイクロチップは，酸化シリコンウエハー上で標準的加工技術を用いて加工された。高周波スパッタリング方法を用いて，２０ｎｍのチタンおよび１００ｎｍの白金でウエハーを金属被覆した。標準的写真平板技術を用いて金属層をパターン形成しエッチングして電極アレイを形成した。次に，プラズマ増強化学蒸着により，ウエハー全体に酸化シリコン絶縁層を蒸着した。露出する電極直径は８０μｍであり，中心間距離は２００μｍである。ウエハーをホトレジストで被覆し，１ｃｍ平方のチップに切断した。現在の例では，１ｃｍ平方のチップは，５ｘ５のアレイに配置された２５個の微少電極を含む（図１）。各電極もしくはテスト部位は，分子をテスト部位へまたはテスト部位から移動させ濃縮するために，個々に正に，負に，または中性に帯電させることができる。
【００２３】
ストレプトアビジンを含有するアガロース浸透層を用いて，電極を含有するチップ表面をコーティングし，このことにより，サンプルの生物学的材料を電極近くの苛酷な電気化学的環境から分離することができ，さらに，サンプルのビオチン化核酸を電極の上方のチップ表面に結合させることができる。
【００２４】
グリオキサールアガロース（ＦＭＣ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ　ＭＥ）をストレプトアビジン（５ｍｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と組み合わせて２％アガロースおよび１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン混合物とし，これを用いて浸透層コーティングを塗布した。チップをストレプトアビジン−アガロース溶液でスピンコートし，シッフ塩基結合を０．２Ｍシアノホウ水素化ナトリウム／０．３Ｍホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０で６０分間還元する。
【００２５】
問題とするＭＢＰ遺伝子中の多重ＳＮＰは，遺伝子の１７塩基対の領域中で生ずる。ＭＢＰ遺伝子の野生型配列はアレルＡと定義され，ＳＮＰアレル型は，アレルＢ，Ｃ，およびＤと定義される。図３に示されるように，この多型領域を包含する１２３塩基のフラグメントは，患者のゲノム核酸サンプルから増幅して，本発明の方法において用いることができる。図２は，本発明の方法のアッセイ工程の１つの態様を示す。
【００２６】
ＭＢＰ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＨＳＭＢＰ１Ａ−Ｘ１５９５４）を増幅するためのプライマーは，センス鎖プライマーがヌクレオチド配列：５’−ＴＧＡＴＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２）からなり，逆プライマーがヌクレオチド配列：ビオチン−５’−ＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＣＡＧＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３）（すなわち，逆プライマーの５’末端はビオチン化されている）からなるように設計した。
【００２７】
この実施例の方法においては，患者のゲノムＤＮＡサンプルからＰＣＲにより１２３塩基のフラグメントを増幅し，ここで，反応混合物は，１００μｌ反応液中，２−４μｌのＤＮＡ，１ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ），１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，２００μＭ  ｄＮＴＰｓ，２０μＭの各プライマー，２．０ＵのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ），および２８０ｎＭのＴａｑ  Ｓｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を含有していた。反応混合物は，９７００  サーもサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）中で，９５°Ｃで１０分間，（１サイクル），９５°Ｃで３０秒間，５８°Ｃで６０秒間，および７２°Ｃで１２０秒間を３５サイクル，続いて７２°Ｃで１２分間インキュベートするサイクルに供した。各ＤＮＡサンプルは，Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製し，水中に再懸濁し，ＤＮＡ質量ラダーコントロール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて，ゲル電気泳動により定量した。ＤＮＡサンプルは，１００ｍＭヒスチジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に濃度２．５−１０ｎＭで再懸濁した。
【 ００２８】
サンプル（容量約４０−４００μｌ）を９５°Ｃで２−１０分間熱変性し，氷上で急冷した。３５μｌのサンプルをマイクロチップに適用し，正のバイアス直流を用いて，４つの正に荷電したテスト部位のカラムに，４００ｎＡ／テスト部位，１２０秒間で，電子的に移動（アドレス）させた。ヒスチジン緩衝液で洗浄することにより，結合していないＤＮＡを除去した。この工程を，各サンプルについて繰り返した。完全にアドレシングされたアレイを処理する随意の方法は，０．５ＸＳＳＣ，ｐＨ１１．５で５分間，続いて水およびヒスチジンによる十分な洗浄であり，より高いハイブリダイゼーションシグナルが得られる。アドレシングされたアンプリコンは，あらかじめ浸透層に埋め込まれたストレプトアビジンとの相互作用により，それぞれのテスト部位に結合したままであった。
【００２９】
次に，各テスト部位の核酸を，蛍光標識したアレル特異的レポーターオリゴヌクレオチドプローブの混合物に，電子的ハイブリダイゼーションによりハイブリダイズさせた。レポータープローブ（表１を参照）は，５’末端に結合したｃｙ３またはｃｙ５蛍光団（Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）のいずれかを用いて合成した。電子的ハイブリダイゼーションは，野生型およびＳＮＰのｃｙ３およびｃｙ５レポーター基が，１００ｍＭヒスチジン緩衝液中でそれぞれ７５−１２５ｎＭの範囲で再懸濁されるように，実施した。各アレル群の２つのｃｙ３標識ミスマッチレポーターを３７．５ｎＭで同等に混合し，緩衝液中で合わせて７５ｎＭとした。各レポーター基（２０−３５μｌ）をマイクロチップに適用し，捕獲されたアンプリコンの列に４７５ｎＡ／テスト部位で１５秒間ハイブリダイズさせた。１００ｍＭヒスチジンで洗浄することにより，過剰のレポーターを除去した。第２，第３および第４のレポーター基を同じ列方式で適用した。ハイブリダイゼーションの後，チップを２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭトリス塩基，ｐＨ９．５（２０／２０緩衝液）で電子的ストリンジェンシーのために洗浄した。
【００３０】
次に，１塩基対ミスマッチレポータープローブを，個々のテスト部位においてアンペア数を増加させ荷電極性を逆転させることにより，選択的に変性した（電子的ストリンジェンシー）。０．５μＡ／テスト部位の０．１秒間オン，０．２秒間オフのパルス電流を１５０サイクル（または０．１秒間オン，０．１秒間オフ，５０サイクル）を各テスト部位に印加した。チップを２０／２０緩衝液中で洗浄して，変性したレポーターを除去し，ＩＰＬａｂソフトウエアで画像化した。アンペア数を完了まで上げて，画像および蛍光を定量した。詳細には，０．６μＡ／テスト部位，０．７μＡ／テスト部位，０．８μＡ／テスト部位，０．９μＡ／テスト部位，および１．０μＡ／テスト部位の電流を用いた。ＴＰＭＴのコドン４６０多型にまたがるビオチン化アンプリコンを非特異的バックグラウンド対照として用いた。各画像は，ＭＦＩ／ｓに対して標準化し，最終的な定量のためには，各ＭＢＰテスト部位から非特異的計数を減じた。正のテスト部位は，ミスマッチ対照より高い顕著なシグナルを維持した。
【００３１】
この実施例に示される本発明の方法は，マイクロマニュピレータ６０００（Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＣａｒｓｏｎＣｉｔｙ，ＮＶ）上に装着されたエポキシリングプローブカード（Ｃｅｒｐｒｏｂｅ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）によりマイクロチップへの電子的接続が形成される器機を用いた。電源（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  ２３６；Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）は，その末端とリレーのアレイとの間に固定電位差または固定電流のいずれかを与えた（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。コンピュータハードウエア（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ，Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）およびＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  バージョン３．１．１ソフトウエア（Ｓｉｇｎａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）により，個々のアレイ位置におけるグラフィックユーザーメニュー制御が可能となった。レーザー励起は，ＨｅＮｅ  ６３３ｎｍレーザー（８ｍ  Ｗｏｕｔｐｕｔ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）および周波数２倍化ダイオードポンプ固相レーザー（５ｍＷ出力；Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ，Ｍｏｓｃｏｗ）により，５３２ｎｍで行った。蛍光は，５７５ｎｍ（ｃｙ３について）または６７０ｎｍ（ｃｙ５について）の帯フィルターを備えた８ｘ対物レンズ（口径数０．１５）により観察した（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）。蛍光シグナルをスキャンし，電荷結合素子カメラにより集めた（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）。スキャンした画像は，ＩＰＬａｂ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍソフトウエアにより定量した。
【００３２】
表１に示されるように，野生型，特にＳＮＰアレル配列に特異的なまたは野生型およびＳＮＰのミスマッチのレポータープローブを合成した。野生型およびＳＮＰレポーターは，ｃｙ３（１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびｃｙ５（１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホネートカリウム塩ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の両方で標識した。ｃｙ３で標識した野生型プローブは，ｃｙ５で標識した野生型プローブと別に保存した。ＳＮＰプローブは同様に処理した。ただし，野生型およびＳＮＰ標識レポーターを組み合わせて２種類のプローブ混合物とした。詳細には，これらの混合物もしくは群は，（１）野生型−ｃｙ３／ＳＮＰ−ｃｙ５，および（２）野生型−ｃｙ５／ＳＮＰ−ｃｙ３であった。異なるように標識したプローブを混合することにより，各テスト部位においてこれらを増幅した患者ＤＮＡサンプルに同時にハイブリダイゼーションし，それぞれのハイブリダイゼーション事象を二重に記録することができる。各ＳＮＰアレルについて，野生型およびＳＮＰの両方の異なるミスマッチを取り込んだ２つの追加のレポーター・オリゴヌクレオチドプローブを作成した。これらはｃｙ３でのみ標識した。この実験においては，実験の都合により任意にＣｙ３を選択した。しかし，アレルを区別する目的のために，どのような標識を結合させてもよい。これらのミスマッチプローブも，組み合わせて，ｃｙ５で標識した真の野生型またはＳＮＰプローブのいずれかを有する同じモル濃度の２つの群とした（（１）野生型−ｃｙ５／ミスマッチ−ｃｙ３および（２）ＳＮＰ−ｃｙ５／ミスマッチ−ｃｙ３）。これらの追加のレポーター対により，野生型およびＳＮＰ配列の両方が同じサンプル中に存在する場合であっても（ヘテロ接合体），マッチしたプローブ配列とミスマッチのプローブ配列との間の相互作用を比較することができる。
【００３３】
【表１】
2004500020.tif 000002
これらのアッセイ条件を用いて，標準的配列決定技術によりあらかじめ決定された既知のＭＢＰ配列のゲノムＤＮＡサンプルについて，ブラインド実験を行った。試験したサンプルのうち，１つの組は，４つの別々のアレルについてホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれかであると同定されており，これを対照とした。残りのサンプル（２２サンプル）の遺伝子型は未知であった。これらの２２のサンプルを本発明の方法においてブラインドで試験した。さらに，第２の組の１３のブラインドサンプルをＤアレル部位の存在について試験した。
【００３４】
各ブラインドアンプリコンを４つのテスト部位のカラムに電子的にアドレシングした。すなわち，２５−部位マイクロチップアレイを，４つの異なる患者サンプルおよび非特異的対照アンプリコンに適合させることができる。サンプルの各列を４つのプローブミックスの１つとハイブリダイズさせた（すなわち，（１）Ａｃｙ３／Ｂｃｙ５，（２）ミスマッチ−ｃｙ３／Ａｃｙ５，（３）ミスマッチ−ｃｙ３／Ｂｃｙ５，および（４）Ｂｃｙ３／Ａｃｙ５のレポーター基））。各レポーター基は，一塩基ミスマッチで異なるｃｙ３標識およびｃｙ５標識ＳＮＰアレル特異的オリゴヌクレオチド対からなるものであった。上述したＭＢＰのＡまたはＢアレルに特異的な４つのｃｙ３／ｃｙ５標識レポーター基とハイブリダイゼーションした後の，４つのブラインドサンプル（ＮＣ４７，ＮＣ４８，ＮＣ４９，およびＮＣ５０）を含有する代表的なマイクロチップの画像が図４Ａ−Ｄに示される。ミスマッチ対照（ミスマッチ−ｃｙ３）がバックグラウンドのレベルまで除去されるまで，電子的ストリンジェンシーを適用した（図４Ｃ）。
【００３５】
３つの可能な遺伝子型（Ａ／Ａ，Ａ／Ｂ，およびＢ／Ｂ）を表す明確な蛍光パターンが図４Ａ−Ｄに描かれている。サンプルＮＣ４７（カラム１）の分析は，ｃｙ３画像（図４Ｃ）中で第４のレポーター基（第４列）で，およびｃｙ５画像（図４Ｄ）中で第１（第１列）および第３（第３列）のレポーター基で，別々のシグナルを示した。全体として，シグナルは，Ｂアレル特異的プローブ（真のマッチを表す）を含有するレポーター基のハイブリダイゼーションと一致した。電子的ストリンジェンシーは，Ａアレル特異的プローブからのシグナルをバックグラウンドまで減少させた。
【００３６】
ブラインドサンプルＮＣ４８（図４Ｃ，カラム２）は，第１のレポーター基で（第１列）ｃｙ３シグナルを，第２および第４のレポーター基で（第２列および第４列）ｃｙ５シグナルを示した（図４Ｄ）。各シグナルは，Ａアレル特異的レポーターのハイブリダイゼーションと相関していた。同様に，サンプルＮＣ４９を含有するカラム（カラム４）は，ｃｙ３画像（図４Ｃ，第１列）およびｃｙ５画像（図４Ｄ，第２列および第４列）において，Ａアレル特異的レポーターでシグナルを示した。図４Ｃの第２列および第３列の各テスト部位から放出される蛍光は，バックグラウンドの強度まで減少していることに注目されたい。これらのテスト部位を，ＡおよびＢアレル配列に関してミスマッチであることが知られているミスマッチ−ｃｙ３標識レポーターとハイブリダイズさせた。ミスマッチのシグナルがないことにより，ＳＮＰ識別について適当なレベルの電子的ストリンジェンシーが得られたこと，および残存するレポーターシグナルが完全なマッチを構成することが確認された。
【００３７】
各パネル（図４）におけるブラインドサンプルＮＣ５０（カラム５）の評価は，ｃｙ３画像（図４Ｃ，列１および４）およびｃｙ５画像（図４Ｄ，列１−４）において，ＡおよびＢアレル特異的結合の両方を示した。ミスマッチｃｙ３レポーターとハイブリダイズしたテスト部位にシグナルがないことから（図４Ｃ，列２−３），電子的ストリンジェンシーの完了が確認され，ＮＣ５０アンプリコン中にＡおよびＢアレル配列の両方が存在することが同定された。
【００３８】
上述の画像を各サンプルから放出された蛍光の定量についてさらに識別した。電子的ハイブリダイゼーション後，ＭＢＰレポーターの非特異的アンプリコン（ＮＳ）への結合は，全ｃｙ５蛍光強度の約４％であり，ストリンジェンシーの前のｃｙ３標識レポーターの２倍から４倍高かった。ＮＣ４９は，Ａアレルレポーター間の平均強度でＢアレルおよびミスマッチレポーターより１０倍より高い識別を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。すなわち，ＮＣ４９は，Ｂ部位について，Ａ／Ａホモ接合体であると評点された。同様に，サンプルＮＣ４８は，Ｂ部位に関してＡ／Ａホモ接合体であると同定された（データ示さず）。
【００３９】
Ａ／Ｂであると評点されたブラインドサンプルＮＣ５０の定量化（図６Ａおよび６Ｂ）は，ＡおよびＢアレル特異的ｃｙ３レポーターおよびｃｙ５−標識レポーターの両方について，捕獲されたアンプリコンに顕著なシグナルが結合したまま残ることを示した（約７０ＭＦＩ／ｓ）。すなわち，ＮＣ５０アンプリコンは，Ｂ部位に関して，Ａ／Ｂヘテロ接合体であると評点された。
【００４０】
ＮＣ４７サンプル蛍光を定量した（図７Ａおよび７Ｂ）。これは，ミスマッチおよびＡアレルレポーターがバックグラウンド強度まで減少したことを示す。それにもかかわらず，Ｂアレルレポーターでは，１００ＭＦＩ／ｓより高いシグナルが維持された。同様に，ｃｙ５画像（図７Ｂ）の分析から，Ａアレルシグナルの減少（すなわち，２５ＭＦＩ／ｓより低い）およびＢアレルシグナルの確かな保持（すなわち，１００ＭＦＩ／ｓより高い）が明らかとなった。すなわち，ＮＣ４７は，Ｂ／Ｂホモ接合体であると評点された。
【００４１】
ＳＮＰアレルに関してＡ／Ａであると評点された患者からの異なるブラインドサンプルの分析（サンプル数＝１８）は，Ａ−ｃｙ３レポーターのＡ／Ａサンプルへの結合が，ミスマッチｃｙ３レポーターと比較して１００倍高く，ＢまたはＣアレルｃｙ３標識ＳＮＰレポーターの結合より２６倍高いことを示した（プローブ：平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）；Ａ−ｃｙ３：２００±３６．２ＭＦＩ／ｓ，ＳＮＰ−ｃｙ３：７．６±１．８ＭＦＩ／ｓ，ミスマッチ−ｃｙ３：１．９±０．３ＭＦＩ／ｓ）。逆に，ヘテロ接合体と評点された７つの異なるブラインドサンプルの分析は，ｃｙ３標識ＡアレルおよびＳＮＰプローブの両方ともほぼ等しい強度でサンプルに結合し，ミスマッチプローブは２０倍低い強度で結合することを示した（プローブ：平均±ＳＥＭ；Ａ−ｃｙ３：１８８．３±４４．４ＭＦＩ／ｓ，ＳＮＰ−ｃｙ３：１５０．１±４２．３ＭＦＩ／ｓ，ミスマッチ−ｃｙ３：７±２．２ＭＦＩ／ｓ）。マッチの対とミスマッチの対の同等の比率をｃｙ５標識プローブについて記録した（データ示さず）。
【００４２】
２２のブラインドサンプルの各々を，ＢおよびＣアレル位置で評点した。各位置のヌクレオチド配列およびＡ，Ｂ，およびＣ遺伝子型を，標準的な配列決定の結果と比較した（表２を参照）。表に示されるように，マイクロチップアッセイは，ＢおよびＣ部位における４４のＳＮＰ評点のうち４４で（２２のＡ／Ｂ判定および２２のＡ／Ｃ判定）配列決定の結果と一致した。これまでのところ，同じハプロタイプ中でＢおよびＣアレル配列が生じることは記載されていない。Ｂ／Ｂ遺伝子型については，ストリンジェンシーの後に，完全にマッチしたＢおよびＣアレルプローブのみが結合したまま残る。したがって，混成のヘテロ接合体を決定する前に，これらをＢおよびＣレポーターの両方について評点しなければならなかった。多数の可変部位にまたがるプローブは遺伝子型を正確に区別することができるであろうが，同じハプロタイプ中に多重の多型部位が存在することは，このようにして実施される識別を混乱させるであろう。そのような場合，各多型部位について別々のプローブ（１０−２４ヌクレオチド）の組が有利であろう。本明細書において示されるように，多型ヌクレオチドがアレル特異的プローブ中の５’，中心，または３’のいずれに存在しているかにかかわらず，多型識別は同等に良好に得られた。
【００４３】
次に，この２２のサンプルを，再びブラインド化し，Ｄアレルの存在について評点した（表２）。本発明の電子的アッセイは，２２のサンプル中に存在するＤアレルサンプル（ＮＣ５２−Ａ／Ｄ）のみを正確に同定した。Ｄアレルの出現頻度は低く，ＳＮＰ識別アッセイの有効性は低頻度のアレルを同定するその能力であるため，第２の組の１３のブラインドサンプル（Ｄアレル系の確認のために重み付けされている，サンプルＬＭ１，ＬＭ１０，ＬＭ１１，ＬＭ１８，ＬＭ２０，ＬＭ２７，ＬＭ２９，ＬＭ３０，ＬＭ３１，およびＬＭ３２）を，Ｄアレルレポータープローブを用いる電子的アッセイにより試験した。Ｄアレルについての両方の群のサンプル（サンプル数＝３５）の電子的アッセイでの評点は，配列決定の結果と１００％一致した。１３のブラインドサンプルの１０個からのマイクロチップ画像が図８Ａおよび８Ｂに示される。
【００４４】
【表２】
2004500020.tif 000003
実施例２　インターロイキン１βの検出
ＳＮＰを検出する本発明の適用可能性を，二アレル性インターロイキン１β（ＩＬ−１β）多型についてさらに説明する。ＩＬ−１β配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ（ＸＯ４５００）から入手し，これは５８８８位にＣからＴへのＳＮＰ転移を含む。ＰＣＲ増幅において用いるプライマー配列は，センス鎖ヌクレオチド配列，５’−ＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＡＣＧ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１６）および逆鎖ヌクレオチド配列，ビオチン−５’−ＡＧＴＣＣＣＧＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１７）（すなわち，逆鎖はビオチン化されている）を含有していた。
【００４５】
この実施例においては，上述したように，野生型（Ｃ）およびＳＮＰ変種（Ｔ）アレルを同定するために，ｃｙ３およびｃｙ５標識レポーター基を設計した（合成はＢｉｏｓｅｒｖｅ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤによる）（表３を参照）。電子的ストリンジェンシーの増加の後の蛍光の消失は，既知のホモ接合体Ｔ／Ｔビオチン化アンプリコンを含むテスト部位からの非−Ｃ／非−Ｔミスマッチ（ｍｉｓ−ｃｙ３）レポーターの変性を示す（図９−１０）。同様に，ｃｙ３およびｃｙ５Ｃアレルレポーターは，Ｔ／Ｔアンプリコンに対するストリンジェントなハイブリダイゼーションの証拠を示さなかった。これに対し，ｃｙ３標識Ｔアレルレポーター（図９Ａ）およびｃｙ５標識レポーター（図１０Ａ）とのハイブリダイゼーションから１００ＭＦＩ／ｓより大きい，区別しうるシグナルが放出された。すなわち，配列決定技術によりＴ／Ｔホモ接合体であることが知られているアンプリコンは，電子的フォーマットにより同様にＴ／Ｔホモ接合体であると評点された。一般に，ｃｙ３およびｃｙ５レポーターの両方について，電子的ストリンジェンシーの間の全体的シグナル強度の漸次的減少が観察された（データ示さず）。
【００４６】
実施例５に示されるように，実験は，ＭＢＰ，ＩＬ−１β，およびＴＮＦαのマルチプレックスサンプルからＳＮＰ識別が得られたことを示す。ここでは，マイクロチップを電子的に剥離し，二重鎖中の第２の遺伝子の遺伝子型タイピングのために再プローブする。
【００４７】
【表３】
2004500020.tif 000004
実施例３　リンホトキシン遺伝子検出
リンホトキシン遺伝子を用いて観察されたＳＮＰの検出により，本発明をさらに説明する。リンホトキシン配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｍ１６４４１）から入手し，これは１０６９位においてＡからＧへのＳＮＰ転移を有していた。ＰＣＲ増幅において用いたプライマー配列は，センス鎖ヌクレオチド配列，５’−ＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２２）および逆鎖ヌクレオチド配列，ビオチン−５’−ＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２３）（すなわち逆鎖はビオチン化されている）からなる。
【００４８】
この実施例においては，リンホトキシン遺伝子中の１０６９位にＡまたはＧの一塩基多型を含む遺伝的変異を同定するために，ｃｙ３およびｃｙ５レポーター基を設計した（レポーターオリゴヌクレオチドの合成はＢｉｏｓｅｒｖｅ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤによる）（表４を参照）。電子的ストリンジェンシーの増加後の蛍光の消失，サンプルＮＣ５０については既知のホモ接合体Ａ／Ａビオチン化アンプリコンを，およびサンプルＮＣ４３については既知のホモ接合体Ｇ／Ｇビオチン化アンプリコンを含むテスト部位からの，非−Ａ／非−Ｇミスマッチ（ｍｉｓ−ｃｙ３）のレポーターの変性を表す（図１１ＡおよびＢ）。したがって，配列決定技術によりそれぞれＡ／ＡおよびＧ／Ｇホモ接合体であることが知られているサンプルＮＣ５０およびＮＣ４３からのアンプリコンは，電子的フォーマットにより，同様に，それぞれＡ／ＡおよびＧ／Ｇホモ接合体であると評点された。
【００４９】
【表４】
2004500020.tif 000005
実施例４　腫瘍壊死因子検出
ＳＮＰを検出する本発明の応用を示すさらに別の例は，腫瘍壊死因子遺伝子のプロモーター中で観察された。腫瘍壊死因子ゲノムＤＮＡ配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｘ０２９１０）から入手し，これは３０８位においてＧからＡへのＳＮＰ転移を有していた。ＰＣＲ増幅において用いたプライマー配列は，センス鎖ヌクレオチド配列，５’−ＧＴＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２８）および逆鎖ヌクレオチド配列，ビオチン−５’−ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＴＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２９）（すなわち，逆鎖はビオチン化されている）を含有した。
【００５０】
この実施例においては，腫瘍壊死遺伝子のプロモーター中にＧまたはＡの一塩基多型を含む遺伝的変種を同定するために，ｃｙ３およびｃｙ５レポーター基を設計した（レポーターオリゴヌクレオチド合成はＢｉｏｓｅｒｖｅ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤによる）（表５を参照）。本発明の改良された形態においては，２つのレポーター基のみを用いてＧまたはＡのいずれかのアレルを検出する。電子的ストリンジェンシーをサンプルＮＣ３９およびＮＣ４０ならびに非特異的アンプリコンであるＴＰＭＴからのアンプリコンを含むテスト部位に適用した。電子的ストリンジェンシーは，サンプルＮＣ３９については，ＤＮＡ配列決定により決定された既知のＡ／Ｇヘテロ接合体がＡ／Ｇヘテロ接合体であることを明らかにした。さらに，サンプルＮＣ４０については，ＤＮＡ配列決定により決定された既知のＧ／Ｇホモ接合体がＧ／Ｇホモ接合体であることが同定された（図１２Ａ）。評点の目的で，残りの電子的にハイブリダイズしたレポーターシグナルを最大ＭＦＩ／ｓｅｃについて標準化し，結果を非特異的対照ＴＰＭＴについてのものと比較した。この実施例は，ＳＮＰの同定における本発明の適用のみならず，特定の接合体の特徴を同定するのに必要なレポーターシグナルの数を減少させるスクリーニング方法論をも示す。
【００５１】
【表５】
2004500020.tif 000006
実施例５　マルチプレックス分析
実験はまた，ＴＮＦａ，ＭＢＰ，およびＩＬ−１ｂマルチプレックス化サンプルからのＳＮＰ識別を示す。ここでは，マイクロチップを電子的に剥離し，三重鎖中の次の遺伝子の遺伝子型タイピングのために再プローブした。３つのアンプリコン，すなわち，ＭＢＰＡ／Ａホモ接合体（Ｍ），ＩＬ−１Ｔ／Ｔホモ接合体（Ｉ），およびＴＮＦＧ／Ｇホモ接合体（Ｔ）を別々に２５パッドの溶液プロセスチップ上の１：１：１三重鎖混合物（Ｔ＋Ｍ＋Ｉ）として捕獲負荷した（図１３Ａ）。ＴＮＦα特異的Ｃｙ３／Ｃｙ５標識レポーター基でチップを二重にハイブリダイズさせた（１３Ｂ）。アレル特異的多型は，増加する電子的ストリンジェンシーを適用することにより得た（１３ＣおよびＤ）。マルチプレックス中のＴＮＦの遺伝子型を得た後，高温で（４２°Ｃ），０．５ｘＳＳＣ，ｐＨ１１．５中で２分間洗浄することにより，電子的ストリンジェンシーを適用し，チップを標識レポーターから剥離した。次に，剥離したチップをヒスチジン中でよく洗浄し，ベースライン画像を得た（１３Ｅ）。次にチップをＭＢＰアレル特異的Ｃｙ３／Ｃｙ５レポーターセットと再ハイブリダイズさせ（１３Ｆ），電子的ストリンジェンシーの適用により遺伝子型を得た（１３ＧおよびＨ）。遺伝子型を決定したチップを電子的に剥離し（再び），ベースライン画像を得て（１３Ｉ），ＩＬ−１アレル特異的レポーターグループをマルチプレックスにハイブリダイズさせた（１３Ｊ）。電子的ストリンジェンシーにより遺伝子型が得られた（１３ＫおよびＬ）。これらの結果は，電子的ドットブロットアッセイのスループットパラメータが，１つの捕獲負荷事象を必要とするパッド上の多数の遺伝子を遺伝子型タイピングする能力により増加するかもしれないことを示す。
【００５２】
上述するように，サンプルのマルチプレックス化はいくつかの方法により行うことができる。１つのフォーマットにおいては，一人の患者サンプルから得ることができる多重標的を１つのオープンアレイマイクロチップ上で試験することができる。さらに，各標的を，マイクロチップ上の別々の位置に，または同じ捕獲パッド上に捕獲することができる。マルチプレックス化はまた，１つのマイクロチップアレイ上の多数の患者サンプルにも適合する。この場合，各患者の個々の標的種を，別々の捕獲部位，または各患者について部位の群または１つの部位のいずれかで，分析のために捕獲することができる。
【００５３】
上述は，本発明の態様を例示することを意図しており，いかなる意味においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明を特定の改変に関して記述してきたが，その詳細は限定であると解釈すべきではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の等価物，変更および改変が可能であることが明らかであろう。そのような等価の態様も本発明に含まれることが理解されるべきである。すべての刊行物および特許出願は，それぞれの個々の刊行物または出願が特異的にかつ個々に本明細書の一部としてここに引用されていることと同じ程度に，本明細書の一部としてここに引用されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，１つのマイクロ電子的アレイ設計フォーマットの顕微鏡写真である。
【図２】図２は，電子的ドットブロットアッセイのスキームである。
【図３】図３は，野生型ヒトマンノース結合蛋白質（ＭＢＰ）のセンス鎖の，ヌクレオチド１００１から１１５８までのＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１）を示し，これはアレルＡと表示される。アレルＢ，Ｃ，およびＤのＳＮＰ塩基および位置が示される。図はまた，正（ＭＢＬＦ）および逆（Ｒ−１１２０）増幅プライマーの位置を示す（矢印）。各レポータープローブは，ｃｙ３またはｃｙ５のいずれかで標識して合成した。
【図４】図４Ａ，４Ｂ，４Ｃおよび４Ｄは，マイクロチップ上のＳＮＰ検出の結果の顕微鏡写真である。ここでは，４つの捕獲部位の各列に，４つのブラインド増幅ＭＢＰサンプル（ＮＣ４７，ＮＣ４８，ＮＣ４９，またはＮＣ５０）の１つを負荷した。真中の第５の列には，非特異的（ＮＳ）チオプリン　Ｓ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）アンプリコンを負荷した。図は，電子的ストリンジェンシーの前（図４Ａおよび４Ｂ）および後（図４Ｃおよび４Ｄ）に，ｃｙ３またはｃｙ５のいずれかで標識したアレル特異的レポータープローブのハイブリダイゼーションを示す。図４Ａおよび４Ｃではｃｙ３蛍光を検出したのに対し，図４Ｂおよび４Ｄではｃｙ５蛍光を検出した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは，図４のｃｙ３画像（図５Ａ）およびｃｙ５画像（図５Ｂ）について，サンプルＮＣ４９から放出された蛍光の定量を示すグラフである。サンプルＮＣ４９は，Ａ／Ａホモ接合体であると同定された。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは，図４のｃｙ３画像（図６Ａ）およびｃｙ５画像（図６Ｂ）について，サンプルＮＣ５０から放出された蛍光の定量を示すグラフである。サンプルＮＣ５０は，Ａ／Ｂヘテロ接合体であると同定された。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは，図４のｃｙ３画像（図７Ａ）およびｃｙ５画像（図７Ｂ）について，サンプルＮＣ４７から放出された蛍光の定量を示すグラフである。サンプルＮＣ４７は，Ｂ／Ｂホモ接合体であると同定された。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは，ＡおよびＤＭＢＰアレルを含有するサンプルについての，マイクロチップ上でのｃｙ５検出結果を示す顕微鏡写真である。サンプルＬＭ１８はＤ／Ｄホモ接合体である。サンプルＬＭ２７はＡ／Ｄヘテロ接合体である。示される残りのサンプルはＡ／Ａホモ接合体である。
【図９】図９Ａは，電子的ストリンジェンシーのアンペア数の増加に対する，アレルＣ，アレルＴ，およびミスマッチレポーター基とハイブリダイズしたＩＬ−１βＴ／Ｔアンプリコンの，ｃｙ３標識の検出による定量を示すグラフである。図９Ｂは，図９Ａに示される最後のストリンジェンシーについての検出結果を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０Ａは，電子的ストリンジェンシーのアンペア数の増加に対する，アレルＣおよびアレルＴ基とハイブリダイズしたＩＬ−１βＴ／Ｔアンプリコンのｃｙ５標識の検出による定量を示すグラフである。図１０Ｂは，図１０Ａに示される最後のストリンジェンシーについての検出結果を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図１１ＡおよびＢは，それぞれリンホトキシン遺伝子のＡ／ＡおよびＧ／Ｇホモ接合体を有するプローブの正および負のシグナルを示す棒グラフである。
【図１２】図１２ＡおよびＢは，腫瘍壊死因子α遺伝子中の標的を有するプローブの正，負および対照シグナルを示す棒グラフである
【図１３】図１３Ａ−Ｌは，マルチプレックス分析に関する本発明を説明するマイクロアレイの一連の写真を示す。
【図２】
2004500020.tif 000007
【図３】
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【図４Ａ】
2004500020.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2004500020.tif 000019
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図１０Ａ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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