(57)【要約】本発明は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子を同定する方法、および該遺伝子の単離されたペプチド産物に関する。該遺伝子のインヒビター、および該ペプチド産物に結合する抗体も提供される。さらなる実施態様は、該産物をコードするＤＮＡおよびＲＮＡベクター、該遺伝子またはペプチド産物の少なくとも１つの活性が改変されている弱毒化マイコバクテリア、マイコバクテリア感染に対するワクチン、およびマイコバクテリア感染を検出する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア核酸プロモーター配列を同定する方法であって、
マクロファージ標的細胞にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞を感染させる工程であって、該宿主細胞が、該プロモーターの下流に位置するリポーター遺伝子のコード配列に作動可能に連結される推定マイコバクテリアプロモーター配列を有する核酸構築物を含む、工程；
該マクロファージを、マイコバクテリアのビルレンスを維持する条件下で培養する工程；および
該リポーター配列の発現を検出することによって、ビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるプロモーター配列を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記誘導またはアップレギュレートされるプロモーター配列が、マイコバクテリアのビルレンスを促進しない条件下で培養された場合の対応する発現のレベルと比較して、マイコバクテリアのビルレンスを維持する条件下での前記リポーター遺伝子の発現の増加によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記推定プロモーター配列が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｂｏｖｉｓ由来である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リポーター配列が、グリーン蛍光タンパク質をコードする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
マイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるプロモーターを有するマイコバクテリア宿主細胞が、蛍光活性化セルソーティングによって他の宿主細胞と分離される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
発現がマイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法であって、
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリアプロモーター配列を同定する工程であって、該宿主細胞が、該プロモーター配列を含む核酸構築物を含み、該プロモーターには、その下流に位置するリポーター遺伝子のコード配列が作動可能に連結されている、工程；
該プロモーターの該核酸配列を、同じマイコバクテリア種について公表された核酸配列データとの配列相同性によってアラインする工程；および
該プロモーターの制御下で該会合した核酸コード配列を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかの項に記載の方法によって得られ得る単離されたマイコバクテリアプロモーターであって、該プロモーターが、配列番号１、１８、３７、５４、５７、６６、７１、７４、７７、８４、９１、９６、９９、または１０２の核酸配列を有する、プロモーター。
【請求項８】
請求項６に記載の方法によって得られ得る単離された核酸コード配列であって、該コード配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５６、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７３、７６、７９、８１、８３、８６、８８、９０、９３、９５、９８、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、または１１８の核酸配列を有する、配列。
【請求項９】
単離されたマイコバクテリアペプチドあるいはそのフラグメントまたは誘導体または改変体であって、該ペプチドは、遺伝子の発現が該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、マイコバクテリア遺伝子によってコードされる、ペプチドあるいはそのフラグメントまたは誘導体または改変体。
【請求項１０】
ペプチドあるいはそのフラグメントまたは誘導体または改変体を含む薬学的組成物であって、該ペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択される、薬学的組成物。
【請求項１１】
マイコバクテリアペプチドのインヒビターであって、該ペプチドは、遺伝子の発現が該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、マイコバクテリア遺伝子によってコードされ、そして該インヒビターが、該マイコバクテリアペプチドがその天然の生物学的機能または効果を発揮することを実質的に抑制または阻害し得る、インヒビター。
【請求項１２】
前記誘導またはアップレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子またはその遺伝子産物をターゲティングし得る抗生物質；および前記誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンスまたは三重鎖形成核酸配列からなる群より選択される、請求項１１に記載のインヒビター。
【請求項１３】
遺伝子によってコードされるペプチドに、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体であって、遺伝子の発現が、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、抗体。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
遺伝子が改変されている弱毒化マイコバクテリアであって、該遺伝子の発現が、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされ、それによって該マイコバクテリアを実質的に非病原性にする、弱毒化マイコバクテリア。
【請求項１６】
前記改変される遺伝子が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５６、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７３、７６、７９、８１、８３、８６、８８、９０、９３、９５、９８、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８からなる群の１つに対応する野生型コード配列を有する、請求項１５に記載の弱毒化マイコバクテリア。
【請求項１７】
遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む、弱毒化微生物キャリアであって、該遺伝子の発現が、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、弱毒化微生物キャリア。
【請求項１８】
前記ペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択される、請求項１７に記載の弱毒化微生物キャリア。
【請求項１９】
前記弱毒化微生物キャリアが、弱毒化サルモネラ、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化Ｍ．ｂｏｖｉｓ（例えば、ＢＣＧ株）である、請求項１７または１８に記載の弱毒化微生物キャリア。
【請求項２０】
プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびマイコバクテリア遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む、ＤＮＡプラスミドであって、該遺伝子の発現が、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされ、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結される、ＤＮＡプラスミド。
【請求項２１】
前記遺伝子のコード配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５６、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７３、７６、７９、８１、８３、８６、８８、９０、９３、９５、９８、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８からなる群より選択される、請求項２０に記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項２２】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターからなる群より選択され、そして前記ポリアデニル化シグナルが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルからなる群より選択される、請求項２０または２１に記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項２３】
マイコバクテリア遺伝子のコード配列または該コード配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ配列であって、該遺伝子の発現が、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、単離されたＲＮＡ配列。
【請求項２４】
請求項２３に記載のＲＮＡ配列および宿主細胞の染色体への組込み部位を含む、ＲＮＡベクター。
【請求項２５】
マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項９または１０に記載のペプチドあるいはフラグメントまたは改変体または誘導体、請求項１１または１２に記載のインヒビター、請求項１３または１４に記載の抗体、請求項１５または１６に記載の弱毒化マイコバクテリア、請求項１７から１９のいずれかに記載の弱毒化微生物キャリア、遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる該遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列あるいは該ＤＮＡ配列のフラグメントまたは改変体または誘導体、請求項２０から２２のいずれかに記載のＤＮＡプラスミド、請求項２３に記載のＲＮＡ配列、および／または請求項２４に記載のＲＮＡベクターの使用。
【請求項２６】
マイコバクテリア感染を同定するための診断試薬の製造における、請求項９または１０に記載のペプチドあるいはフラグメントまたは改変体または誘導体、請求項１３または１４に記載の抗体、または少なくとも８ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブであって遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる該遺伝子の少なくとも一部に結合するプローブの使用。
【請求項２７】
マイコバクテリアペプチドあるいは該ペプチドのフラグメントまたは誘導体または改変体を調製するための組換え方法であって、該ペプチドは、発現が遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる、マイコバクテリア遺伝子によってコードされ、該方法が、該遺伝子のコード配列に対応する核酸配列または該核酸配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を、宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法、該遺伝子の単離されたペプチド産物、該遺伝子のインヒビター、該ペプチド産物に結合する抗体、該産物をコードするＤＮＡおよびＲＮＡベクター、該遺伝子またはペプチド産物の少なくとも１つの活性が改変されている弱毒化マイコバクテリア、マイコバクテリア感染に対するワクチン、およびマイコバクテリア感染を検出する方法に関する。
【０００２】
多くの微生物は、細胞内感染を形成し得る。これらとしては、サルモネラ属、エルシニア属、赤痢菌属、カンピロバクター属、クラミジア属、およびマイコバクテリア属の種によって引き起こされる感染が挙げられる。これらの感染のいくつかは、もっぱら細胞内であり、他は細胞内および細胞外の両方の成分を含む。しかし、細菌感染の細胞内生存サイクルが、疾患の進行を助長する主な要因と思われる。
【０００３】
一般に、これらの微生物は、体内、例えば、血流中で自由に循環せず、そしてしばしば薬物療法に従わない。薬物が利用可能である場合、この問題は、多剤耐性微生物の出現によって悪化している。
【０００４】
微生物の薬物耐性の問題には、多くの要因が寄与している。その１つは、時間をかけての変異の蓄積、およびそれに続く他の生物への変異した遺伝子の水平および垂直転移である。したがって、特定の病原体について、あらゆる種類の抗生物質が不活性になっている。さらなる要因は、近年、新しい種類の抗生物質が存在しないことである。多剤耐性病原性細菌の出現は、公衆衛生に重大な脅威を示し、そして新しい形態の治療が緊急に必要とされる。
【０００５】
同様の理由により、ワクチン療法は、このような細胞内微生物に対する有効性が証明されていない。また、細胞内でのバイオアベイラビリティーを改善するために抗生物質の全身濃度を上昇させることによって、重篤な副作用が生じ得る。
【０００６】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよび密接に関連する種は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体（ＭＴＣ）として知られるマイコバクテリアの小群を形成する。この群は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍの４種を含み、これらは全世界中の結核（ＴＢ）症例の大多数における原因因子である。
【０００７】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、世界中で１年に３００万人以上の死亡の原因である。他のマイコバクテリアもまた、ヒトおよび動物において病原性であり、例えば、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは反芻動物においてジョーンズ病を引き起こし、Ｍ．ｂｏｖｉｓはウシにおいて結核を引き起こし、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅは免疫不全患者（例えば、ＡＩＤＳ患者、および骨髄移植患者）において結核を引き起こし、そしてＭ．ｌｅｐｒａｅはヒトにおいて癩病を引き起こす。
【０００８】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、体内のマクロファージ細胞、特に、肺において肺胞マクロファージに感染する。マクロファージ感染後すぐに、ほとんどのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細菌が細胞ファゴソーム小胞内に侵入し、存続し、そして複製し、そこで細菌は宿主防衛および細胞外要因から隔離される。
【０００９】
細菌感染の細胞内生存および増殖または複製が、マイコバクテリア疾患進行を助長する主な要因と思われる。
【００１０】
多くの薬物療法では、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染と戦うことが提案されており、そして、薬物イソニアジドを含む現在の組み合わせ治療が最も効果的であることが示されている。しかし、このような治療法の１つの問題は、これらが長期間であり、そしてこのような治療を完結できないと、多剤耐性微生物の発生を促進し得ることである。
【００１１】
さらなる問題は、治療すべき細胞内に薬物の適切なバイオアベイラビリティーを提供することである。薬物の全身濃度を（例えば、より高投与量を投与することによって）上昇させることは可能であるが、これは、上昇した薬物濃度によって引き起こされる重篤な副作用を生じ得る。
【００１２】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するワクチン防御の有効性は、大きく変化する。現在のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓワクチンであるＢＣＧは、Ｍ．ｂｏｖｉｓの弱毒化株である。これは小児におけるＴＢの重篤な合併症に対して効果的であるが、成人、特に民族間で、その有効性は大きく変化する。ＢＣＧワクチン接種は、結核性髄膜炎を予防するために使用されており、肺外部位へのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの広がりを抑制することを助けるが、感染を予防しない。さらに、ワクチンから生じる全身性疾患の危険性のため、免疫不全個体、特にＴＢと思われる群には投与され得ない。
【００１３】
ＢＣＧの限られた効力およびＴＢの世界的な流行により、新しくより効果的なワクチンを生成する国際的な努力が行われる。現在のパラダイムは、その防御がＴｈ１免疫応答の刺激によって媒介されることである。
【００１４】
ヒトにおけるＢＣＧワクチン接種は、最初に導入されたときは経口投与であったが、この経路は、胃通過中の生存ＢＣＧの損失および頻繁な頚部腺症のため、中止された。実験動物種において、ＢＣＧのエアロゾルまたは気管内送達は、有害な作用なく達成されたが、霊長類、マウス、およびモルモットにおいては、効率は大きく変化し、非経口接種よりも優れた防御を達成するものから、他の研究において皮下経路を超えるような明らかな有利点がないものまであった。
【００１５】
したがって、マイコバクテリア感染と戦うための改善されたおよび／または代替のワクチンまたは治療薬剤の必要性がある。
【００１６】
この必要性は、本発明により示される。
【００１７】
第１の局面によれば、本発明は、マイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア核酸プロモーター配列を同定する方法を提供し、該方法は、
マクロファージ標的細胞にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞を感染させる工程であって、該宿主細胞が、該プロモーターの下流に位置するリポーター遺伝子のコード配列に作動可能に連結される推定マイコバクテリアプロモーター配列を有する核酸構築物を含む、工程；
該マクロファージを、マイコバクテリアのビルレンスを維持する条件下で培養する工程；および
該リポーター配列の発現を検出することによって、ビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるプロモーター配列を同定する工程、
を含む。
【００１８】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、高封じ込め病原体であり、したがってこの微生物の使用は、好ましくは危険病原体についての諮問委員会（ＡＣＤＰ）３条件下で行われる。
【００１９】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、細胞内感染の経路が追い求められ、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの行動には他の病原体と比較していくつか相違点がある。したがって、他の細菌、たとえ他のマイコバクテリアであっても、感染中の核酸発現プロファイルは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染中に生じる一連の変化を正確には反映しない。
【００２０】
例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、サルモネラ種が行うような、宿主細胞の行動を変化させるためにエフェクター分子を注入するＩＩＩ型分泌システムを使用しないだけでなく、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染で見られるような、ファゴソーム小胞から逃れるためにリステリオリシンのような孔形成毒素も利用しない。
【００２１】
病原性マイコバクテリアは、宿主細胞との相互作用に応じて密に調節される遺伝子産物のレパートリーに依存するようであり、その多くはまだ同定されていない。
【００２２】
他のマイコバクテリア病原体と比較して、Ｍ．ｌｅｐｒａｅおよびＭ．ｍａｒｉｎｕｍのような種は、屈熱性を有するようであり、この場合、代表的な３７℃の中心体温よりも低い温度である体の末梢において感染が現れる。Ｍ．ｌｅｐｒａｅはまた、神経細胞のミエリン鞘を標的にし、そして疾患の病理学は、この組織屈性を反映する。
【００２３】
Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍは、限定感染を引き起こし、自己制限し得る皮膚に表面病変を生じる。
【００２４】
Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅのような他の病原体は、代表的には、免疫不全個体において感染を引き起こし、そして健康な被験者に疾患を引き起こす能力を通常は有さない。
【００２５】
Ｍ．ｂｏｖｉｓは、通常、汚染ミルク製品の摂取によって感染し、リンパ節に感染し、そしてリンパ腺症になる。
【００２６】
感染後、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、休止状態に入り、潜在性感染になり得る。この潜在性感染は、数十年持続し得、再活性化により進行性の活性な疾患を生じ得る。
【００２７】
他のマイコバクテリア種は、普通は、保存されたビルレンスメカニズムのいくつかの成分をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと共有し得る。しかし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒａｅについてのゲノム配列の刊行物、および他の部分的に完成したゲノム配列（例えば、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）の刊行物では、最終的に病原体として結果を定義する異なるマイコバクテリア病原体と、それらが引き起こす疾患の病理学の特徴との間に、著しい差があることが明らかである。
【００２８】
このように、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、代表的には吸入によって広がる特殊な細菌病原体である。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、その宿主との複雑な相互作用を有し、宿主マクロファージとの最初の接触以後、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、進行性の活性な疾患、または持続性の潜在性感染、もしくはおそらく宿主によって取り除かれるか無限に含まれる限定感染のいずれかへ導くように、それ自体を有利に操作する。
【００２９】
マイコバクテリアビルレンスは、マイコバクテリアの天然の標的細胞へのマイコバクテリアによる感染に関連する１以上の事象を含む。例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの天然の標的細胞はマクロファージであり、そしてこの細菌および標的細胞に関するビルレンスは、マクロファージによる食菌作用または代替経路による細菌の取込み、ファゴソームの形成、ファゴソーム内での細菌の複製、ファゴソーム／宿主細胞の溶解、および二次部位への病変の広がり（例えば、血行性の広がり）を含む、一連の事象中に関連する任意の事象を含む。したがって、ビルレンス条件は、マイコバクテリアについて、マイコバクテリアの天然の標的細胞の感染中にインビボで正常に発現される少なくとも１つの遺伝子を発現するために役立つ培養条件である。
【００３０】
１つの実施態様では、推定プロモーター配列は、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、およびＭ．ｓｈｉｍｏｉｄｅｉの種から選択される。特に重要には、ＭＴＣのメンバーであり、好ましくはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｂｏｖｉｓである。
【００３１】
他の実施態様では、リポーター遺伝子は、遺伝子発現のサイレントマーカーであり、そして検出工程中に適用される選択的圧力を必要としない。これは、他のマーカーとは逆であり、例えば、抗生物質耐性マーカーは、所望の形質転換体の選択を可能にするために抗生物質の存在を必要とする。選択圧力の存在は、この圧力がそれ自体を誘導するかまたは他の遺伝子のアップレギュレートを引き起こし得、あるいは一次的に発現したプロモーターの損失を生じるので、望ましいことではない。他の遺伝子、例えば、増殖関連遺伝子、の誘導またはアップレギュレートは、バックグラウンドのマイコバクテリアの増殖を増大させ、そして偽陽性を含まない所望の形質転換体の同定に問題を引き起こし得る。
【００３２】
本発明の方法で用いられるリポーター配列は、それ自体のプロモーターを有さず、そのため、その発現をもたらすための推定プロモーター配列の活性に頼る。したがって、ビルレンス条件下でマイコバクテリア宿主細胞を培養することによって、リポーター配列の発現を検出することによってビルレンス条件下で活性であるプロモーターについて選択することが可能である。
【００３３】
リポーター遺伝子は、好ましくは、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰｍｕｔ１、２、または３のような適切なＧＦＰは、「Ｃｏｒｍａｃｋら （１９９６） Ｇｅｎｅ， １７３， ｐｐ．３３−３８」に記載されている。好ましい実施態様では、ＧＦＰはＧＦＰｍｕｔ２である。
【００３４】
リポーター配列が蛍光タンパク質をコードする実施態様では、所望のマイコバクテリア宿主細胞形質転換体は、リポーター配列の発現による蛍光が可能である。
【００３５】
したがって、好ましい実施態様では、ビルレンス中に活性なプロモーターは、例えば、Ｖａｌｄｉｖｉａ， Ｒ．Ｈ．およびＦａｌｋｏｗ， Ｓ （１９９７）「Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．２７７， １９９７年９月２６日， ｐｐ．２００７−２０１１」に記載のようなディファレンシャル蛍光誘導方法（ＤＦＩ）によって検出され、そしてこのプロモーターを含む所望の形質転換した宿主細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって単離され得る。
【００３６】
使用する場合、マイコバクテリア宿主細胞は、インビトロでマクロファージに感染する。その後、マイコバクテリアを回収する場合（例えば、ＦＡＣＳ分析のために）、この細菌を含むファゴソーム小胞が回収され、そして小胞全体が分析される（すなわち、ソートされる）。あるいは、マクロファージおよび内部に含まれるファゴソーム小胞が両方とも破壊され、そして放出された細菌がＦＡＣＳによって分析される。
【００３７】
適切なマクロファージ細胞としては、ヒト急性単球白血病細胞株のマクロファージ系統：ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋（ＴＨＰ−Ｉ）、マウス骨髄由来マクロファージ細胞株、およびマウスＢＡＬＢ／ｃ腫瘍由来マクロファージ単球細胞株（例えば、ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−６７、およびＡＴＣＣ　ＴＩＢ−７１）が挙げられる。
【００３８】
本明細書の実施例３には、本発明の１つの好ましいマクロファージアッセイが記載されている。しかし、多くの従来のマクロファージ感染アッセイのいずれも、本発明において用いられ得る。
【００３９】
非ビルレンス条件下でマイコバクテリアを培養するために適切な培地は、Ｗａｙｎｅ， Ｌ．Ｇ． （１９９４）「Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ： Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ７３−８３」に記載されている。これらとしては、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９培地［Ｂａｒｋｅｒ， Ｌ．Ｐ．ら （１９９８） Ｍｏｌｅｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．２９（５）， ｐｐ．１１６７−１１７７、および本出願人によるＷＯ００／５２１３９を参照のこと］が挙げられる。
【００４０】
使用する場合、誘導またはアップレギュレートされたプロモーターは、マイコバクテリアのビルレンスを促進しない培養条件下でのリポーター配列の発現と比較したときに、マクロファージ感染中にリポーター配列の発現が増加することを検出することによって同定される。これは、構成的に発現される推定プロモーターを含むマイコバクテリア宿主細胞を同定する危険性を最小にする。
【００４１】
マイコバクテリアビルレンスを促進しない適切な培養条件（すなわち、非ビルレンスを維持する条件）としては、実質的にマクロファージを含まないマイコバクテリア培養条件が挙げられる。
【００４２】
１つの実施態様では、非ビルレンス培養条件は、マイコバクテリア宿主細胞培養物の好気的増殖（例えば、ｐＨ、温度、および利用可能な栄養）に関して実質的に限定がない。したがって、マイコバクテリア宿主細胞培養物は、好ましくは、１８〜２６時間の倍加時間を可能にする従来の条件下で培養される。
【００４３】
使用する場合、マイコバクテリア宿主細胞培養物は、バッチで培養され得、そして好ましくは中期〜後期対数期の間に採取される。あるいは、増殖期におけるこの時点は、μｍａｘに近づく定常状態増殖速度を用いる連続培養条件下で模倣され得、約１８〜２４時間の世代時間を提供する。
【００４４】
本発明で用いられる好ましい培養方法は、バッチ発酵培養の方法である。この方法は、ｐＨ、温度、利用可能な栄養、および溶存酸素圧（ＤＯＴ）のような増殖培養パラメータの注意深いモニタリングを可能にする。特に、温度およびＤＯＴは、厳密に制御され得る。
【００４５】
構成的に発現されるプロモーターを含む形質転換された宿主細胞の同定は、ビルレンス条件中に発現されたプロモーターの同定の前または後に行われ得る。好ましい実施態様では、構成的に発現したプロモーターは、ビルレンス中に発現した誘導またはアップレギュレートされたプロモーターの同定後に同定される。
【００４６】
増加した発現は、マイコバクテリア宿主細胞がビルレンス条件下で培養される場合にリポーター配列の発現の結果として検出されるシグナルが、宿主細胞が非ビルレンス条件下で培養される場合に検出されるシグナルよりも少なくとも１．３倍大きいことを意味する。１つの実施態様では、シグナルは、宿主細胞がビルレンス条件下で培養される場合よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍大きい。他の実施態様では、シグナルは、宿主細胞がビルレンス条件下で培養される場合よりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、および特に好ましくは少なくとも３０倍大きい。
【００４７】
天然には、マイコバクテリア宿主細胞における所定の遺伝子についての発現プロファイルは、感染の経過中に変化し得る。例えば、遺伝子は、感染の初期段階中に最も強く誘導またはアップレギュレートされ得る。したがって、用語「増加した発現」とは、ビルレンス条件対非ビルレンス条件下で所定のリポーター遺伝子について得られる最大シグナルをいう。
【００４８】
１つの実施態様では、「増加した発現」は、マクロファージ感染後の最初の４日以内、好ましくはマクロファージ感染後の最初の２日以内に得られる最大シグナルに関する。
【００４９】
他の実施態様では、感染のより後の段階でスイッチが入ったまたはアップレギュレートされた遺伝子が目的であり、この場合、マクロファージ感染後４日目の最大シグナルが好ましい。例えば、感染後１１〜１２日目までの最大シグナルが好ましい。しかし、マクロファージにおけるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の侵襲性および破壊性の性質のため、４〜６日の間の感染後期間が特に好ましい。
【００５０】
本発明における使用のための推定マイコバクテリアプロモーター配列を得るために、多くの方法が用いられ得る。これらとしては、核酸消化酵素の使用による推定プロモーター配列のライブラリーの生成（実施例１を参照のこと）；および他の微生物における公知のビルレンスまたはこれまで関連したビルレンス配列に対する核酸配列相同性を同定すること（実施例２を参照のこと）が挙げられる。
【００５１】
上記の相同性同定方法の適用において、（ライブラリーから生成した構築物の選択よりもむしろ）単一のプロモーター構築物が調製され、そしてプロモーター−リポーターユニットが構築される。次いで、ビルレンス条件対非ビルレンス条件下で培養されたマイコバクテリア宿主の直接比較により（例えば、ＦＡＣＳにより）プロモーター活性を評価することが可能である。単一のプロモーター−リポーター構築物のみが用いられるので、宿主細胞を別途スクリーニングする必要はない。
【００５２】
本発明の方法は、ビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるプロモーターの同定を可能にする。一旦所望のプロモーター配列の核酸配列および配向が決定されると、正確な位置が、関連のマイコバクテリア種の公表された配列について行われる一般的な核酸相同性検索コンピュータソフトウエア（例えば、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸ）の使用によってマッピングされ得る。したがって、同定されたプロモーターの制御下の遺伝子またはオペロンが同定され得る。
【００５３】
したがって、本発明の第２の局面は、発現がマイコバクテリアのビルレンス中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法を提供し、この方法は、
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリアプロモーター配列を同定する工程であって、該宿主細胞が、該プロモーター配列を有する核酸構築物を含み、該プロモーターには、その下流に位置するリポーター遺伝子のコード配列が作動可能に連結されている、工程；
該プロモーターの該核酸配列を、同じマイコバクテリア種について公表された核酸配列データとの配列相同性によってアラインする工程；および
該プロモーターの制御下で該会合した核酸コード配列を同定する工程、
を含む。
【００５４】
本明細書全体を通して「遺伝子」とは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する。
【００５５】
本発明の第３の局面によれば、単離されたマイコバクテリアペプチドあるいはそのフラグメントまたは誘導体または改変体が提供され、該ペプチドは、マイコバクテリア遺伝子によってコードされ、その遺伝子の発現が、該マイコバクテリア遺伝子を有するＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００５６】
本発明の第１および第２の局面について記載した種々の実施態様は、本発明の第３およびその後の局面に同様に適用される。
【００５７】
用語「単離された」、「実質的に純粋」、および「実質的に均一」は、天然に随伴する成分から分離されているペプチドを記述するために交換可能に用いられる。ペプチドは、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一のペプチド配列を示す場合に実質的に純粋である。実質的に純粋なペプチドは、代表的には、約６０〜９０％ｗ／ｗ、より通常は約９５％のタンパク質試料を含み、そして好ましくは約９９％以上純粋である。ペプチドの純度または均一性は、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、次いで、ゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを可視化することによって示され得る。あるいは、例えば、ＨＰＬＣを用いることによってより高解像度が提供され得る。
【００５８】
ペプチドは、その天然の状態で随伴する夾雑物から分離される場合に単離されたと考えられる。したがって、化学的に合成されるかまたは天然に由来する細胞とは異なる細胞システムで合成されるペプチドは、天然に随伴する成分を実質的に含まない。
【００５９】
本発明は、マイコバクテリアから精製され得るペプチド、ならびにこれらのペプチドをコードする組換え核酸で形質転換した他のタイプの細胞から精製され得るペプチドを提供する。
【００６０】
所望であれば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質配列決定方法によって決定され得る。
【００６１】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、交換可能に用いられ、そして特定の長さの産物をいうわけではない。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化のような翻訳後修飾を包含する。
【００６２】
用語「フラグメント」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチドの少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、および最も好ましくは少なくとも３５アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、問題の遺伝子産物の少なくとも１つのエピトープを含む。
【００６３】
用語「改変体」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチドと、少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチド「フラグメント」を意味する。「改変体」の例は、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）、あるいは置換された結合を含む誘導／アップレギュレートされた遺伝子のペプチドまたはペプチドフラグメントである。用語「相同性」および「同一性」は、本明細書において同義語と見なされる。さらなる実施態様では、「改変体」は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣物であり得、この模倣物は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを複製する。この模倣物は、例えば、核酸模倣物、好ましくはＤＮＡ模倣物であり得る。
【００６４】
配列比較について、代表的には、１つの配列が参照配列の役をし、次いでこれに対してテスト配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列は、コンピュータに入力され、続いて座標が示され、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが示される。次いで、配列比較アルゴリズムは、示されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する１つまたは複数のテスト配列についての配列同一性の割合を算出する。
【００６５】
比較するための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ ［Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８４ （１９８１）］ の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）］の類似性方法についての検索によるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ ［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０）］のアルゴリズムによって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ − Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ． ５３７０５）のコンピュータ実行によって、または目視検査［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｂｅｌら編， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．との共同事業体（１９９５ 追補） Ａｕｓｂｕｂｅｌを参照のこと］によって、行われ得る。
【００６６】
配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム［Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ｐｐ． ４０３−４１０；およびｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／」を参照のこと］である。
【００６７】
好ましい相同性比較において、同一性は、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３５アミノ酸の長さである配列の領域にわたって存在する。
【００６８】
用語「誘導体」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチド（あるいはそのフラグメントまたは改変体）を含むタンパク質を意味する。したがって、誘導体は、問題のペプチド、および１以上の追加のエピトープを導入し得るさらなるペプチド配列を含み得る。さらなるペプチド配列は、好ましくは、問題のペプチドの基本的なフォールディングおよびこのようなコンフォメーション構造を妨害するべきではない。「誘導体」の例は、融合タンパク質、結合体、およびグラフトである。したがって、２以上のペプチド（あるいはフラグメントまたは改変体）は、一緒に連結して誘導体を形成し得る。あるいは、ペプチド（あるいはフラグメントまたは改変体）は、無関係の分子（例えば、第２の無関係のペプチド）に連結され得る。誘導体は、化学的に合成され得るが、代表的には、組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド成分のような追加の成分が含まれ得る。
【００６９】
「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」というすべての分子は、共通の抗原性交差反応性、および／またはそれらが由来する問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のペプチド産物と実質的に同じインビボ生物学的活性を有する。例えば、フラグメント、改変体、または誘導体に結合し得る抗体はまた、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物に結合し得る。フラグメント、改変体、および誘導体がそれぞれ、問題の誘導またはアップレギュレートされたペプチドであるペプチドの活性部位を有することが、好ましい特徴である。あるいは、本発明のペプチドの上記の実施態様のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再生応答」を誘導する共通の能力を共有する。
【００７０】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択される。
【００７１】
本発明の第４の局面は、マイコバクテリアペプチドのインヒビターを提供し、該ペプチドは、遺伝子の発現が、該マイコバクテリア遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子によってコードされ、そして該インヒビターは、該マイコバクテリアペプチドがその天然の生物学的機能または効果を発揮することを実質的に抑制または阻害し得る。
【００７２】
マイコバクテリアペプチドの阻害は、核酸レベル（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）で、あるいはペプチドレベルでもたらされ得る。
【００７３】
さらなる実施態様では、インヒビターは、誘導またはアップレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子またはそのペプチド産物をターゲティングし得る抗生物質であり得る。抗生物質は、好ましくは、遺伝子および／またはペプチド産物に特異的である。
【００７４】
本発明のインヒビターは、本明細書に記載の配列情報を利用して調製され得る。例えば、これは、ペプチドを過剰発現させ、ペプチドを精製し、次いで精製したペプチドにおいてＸ線結晶解析を行うことによって行われ得、その分子構造を得る。次に、ペプチドまたはその基質の全体または一部と類似の分子構造を有する化合物を生成する。次いで、化合物をペプチドと組み合わせ、そしてその生物学的活性の１つ以上をブロックするようにペプチドに結合する。
【００７５】
マイコバクテリア染色体の領域に結合する単離されたまたは組換えポリヌクレオチド（例えば、プロモーターまたはコード領域）、またはその転写産物も本発明の範囲内に包含され、これらは、アンチセンスおよび三重鎖形成ポリヌクレオチドを含む、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによるマクロファージ感染中にマイコバクテリア遺伝子の誘導／アップレギュレーションと関連する配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「結合」とは、水素結合または他の分子間力によって媒介される、オリゴヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列との間の相互作用または複合体生成をいう。用語「結合」は、より詳細には、塩基−塩基水素結合によって媒介される２つのタイプのヌクレオチド間結合をいう。第１のタイプの結合は「ワトソン−クリックタイプ」結合相互作用であり、アデニン−チミン（またはアデニン−ウラシル）およびグアニン−シトシン塩基対が塩基間の水素結合によって形成される。このタイプの結合の例は、ＤＮＡ二本鎖ヘリックスおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドで伝統的に関連する結合であり；このタイプの結合は、通常、ハイブリダイゼーション手順によって検出される。
【００７６】
第２のタイプの結合は、「三重鎖結合」である。一般に、三重鎖結合は、ワトソン−クリック様式で既に対になっている二重鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）との第３のポリヌクレオチド鎖の塩基−塩基水素結合の任意のタイプである。
【００７７】
好ましい実施態様では、インヒビターは、誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸配列であり得る。
【００７８】
インヒビターは、核酸配列の形態である場合、使用する場合に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを含む。
【００７９】
第５の局面では、遺伝子によってコードされるペプチドに、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体が提供され、この遺伝子の発現は、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００８０】
抗体は、好ましくは、問題のペプチドに対する特異性を有し、そしてそのペプチドに結合した後、該ペプチドを発現するマイコバクテリアのコーティングを開始し得る。細菌のコーティングは、好ましくは、そのオプソニン化を導く。これは、次に、細菌を破壊するようになる。抗体が、ターゲティングするマイコバクテリア（例えば、種および／または株）に特異的であることが好ましい。
【００８１】
抗体によるオプソニン化は、マクロファージにおけるレセプター媒介侵入および複製を抑制または調節することによって、食菌作用および非食菌作用の細胞におけるマイコバクテリアの細胞侵入および広がりに影響を及ぼし得る。
【００８２】
本発明のペプチド、フラグメント、改変体、または誘導体は、ポリクローナルおよびモノクローナルを含む抗体を産生するために使用され得る。ポリクローナル抗体を所望する場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）に、免疫原性ポリペプチドを免疫する。免疫した動物からの血清を収集し、そして公知の手順で処理する。所望のマイコバクテリアエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【００８３】
あるいは、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体を作成するための一般的な方法論が採用され得、これには、例えば、細胞融合による不死化抗体産生細胞株の調製、あるいは腫瘍形成性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションのような他の技法が含まれる。
【００８４】
本発明のこの局面で用いられる抗体は、任意の抗体イソタイプファミリーに属し得、またはその誘導体または模倣物であり得る。本明細書全体を通して抗体というときは、組換え産生した抗体、およびマイコバクテリア抗原に結合し得る抗体の任意の部分を包含する。
【００８５】
１つの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡイソタイプファミリーに属する。
【００８６】
好ましい実施態様では、抗体は、ＩｇＡイソタイプファミリーに属する。本明細書全体を通してＩｇＡイソタイプというときは、この抗体の分泌形態（すなわち、ｓＩｇＡ）を包含する。ｓＩｇＡの分泌成分（ＳＣ）は、インビトロまたはインビボで付加され得る。後者の場合、患者の天然のＳＣ標識機構の使用が採用され得る。
【００８７】
１つの実施態様では、抗体は、ＭＴＣのメンバー由来のペプチドに対して、好ましくはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対して惹起され得る。
【００８８】
好ましい実施態様では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択されるペプチド（あるいはそのフラグメント、改変体、または誘導体）に結合し得る。本発明の抗体は、好ましくは、単離された形態で用いられる。
【００８９】
さらなる実施態様では、抗原は、マイコバクテリア桿菌の露出した成分である。他の実施態様では、抗原は、マイコバクテリア桿菌の細胞表面成分である。
【００９０】
本発明の抗体は、ポリクローナルであり得るが、好ましくはモノクローナルである。
【００９１】
理論に縛られることなく、マクロファージのマイコバクテリア感染後、マクロファージは殺されそして桿菌が放出されることが可能である。この段階では、マイコバクテリアは、抗体の攻撃に対して最も傷つけられやすいと考えられる。したがって、本発明の抗体は、マクロファージの死後に放出された桿菌に作用し、そしてそれによって感染後の効果を発揮することが可能である。
【００９２】
本発明の受動防御局面（すなわち、抗体の送達）は、マイコバクテリア桿菌上の抗原への本発明の抗体の接近を増強することによって促進され得る。抗体の結合が、そのオリゴマー構造の立体障害または破壊によってマクロファージ感染をブロックし得ることはあり得る。したがって、感染して殺されたマクロファージから放出されたマイコバクテリア桿菌に作用する抗体は、新鮮なマクロファージへの再感染の広がりを妨害し得る。この仮説は、抗体と感染後初期に作用する細胞傷害性Ｔ細胞、例えば、γδおよびＮＫ Ｔ細胞との間の相乗作用を含むが、後者はＣＤ８およびＣＤ４細胞傷害性Ｔ細胞も含み得る。
【００９３】
本発明の第６の局面によれば、遺伝子が改変されている弱毒化マイコバクテリアが提供され、その遺伝子の発現は、該マイコバクテリア遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされ、それによって該マイコバクテリアを実質的に非病原性にする。
【００９４】
用語「改変される」とは、マイコバクテリアを実質的に非病原性にするまたはマクロファージ感染を実質的に不可能にする、核酸または核酸配列の置換、欠失、または挿入などの任意の遺伝子操作をいう。１つの実施態様では、誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の全体が欠失され得る。
【００９５】
１つの実施態様では、改変は、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子またはその転写産物に対するアンチセンス核酸配列をコードする核酸配列によって行われ得る。したがって、マイコバクテリアに、例えば、プラスミドの形態で、このような核酸配列を含むことによって、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のペプチド産物の発現は、減少するかまたは実質的に阻害され得る。
【００９６】
好ましい実施態様では、改変される遺伝子は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５６、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７３、７６、７９、８１、８３、８６、８８、９０、９３、９５、９８、１０１、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８からなる群の１つに対応する野生型コード配列を有する。
【００９７】
野生型配列が、用いられるデータベースに依存して小さな変動を含み得ることが理解される。野生型というときは、単に、問題の配列が天然に存在することを意味する。
【００９８】
本発明の第７の局面は、遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む、弱毒化微生物キャリアを提供し、該遺伝子の発現は、該遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００９９】
使用する場合、ペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）は、キャリアの表面に少なくとも一部が露出されるか、またはペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）の少なくとも一部が、宿主の免疫系に別に露出されるようにキャリアがインビボで分解されるかのいずれかである。
【０１００】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６４、６７、６９、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７からなる群より選択される。
【０１０１】
１つの実施態様では、弱毒化微生物キャリアは、弱毒化サルモネラ、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化Ｍ．ｂｏｖｉｓ（例えば、ＢＣＧ株）からなる群より選択される。
【０１０２】
本発明の第８の局面によれば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびマイコバクテリア遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む、ＤＮＡプラスミドが提供され、該遺伝子の発現は、該マイコバクテリア遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされ、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。
【０１０３】
本発明で用いられる用語ＤＮＡ「フラグメント」は、通常少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７〜１５コドン、および好ましくは少なくとも約３５コドンを含む。このヌクレオチド数は、通常、このような配列とうまく特異的にハイブリダイズするプローブに必要とされるほぼ最小の長さである。
【０１０４】
好ましい実施態様では、ＤＮＡ「フラグメント」は、対応する誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、およびより好ましくは少なくとも８０％であるヌクレオチド長を有する。
【０１０５】
用語ＤＮＡ「改変体」とは、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と実質的な相同性または実質的な類似性を有するＤＮＡ配列を意味する。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチド挿入または欠失とともに）最適にアラインした場合、他に対して「実質的に相同」（または「実質的に類似」）であり、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性がある。相同性決定は、ペプチドに対して上述したように行われる。
【０１０６】
あるいは、ＤＮＡ「改変体」は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る場合、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と実質的に相同（または実質的に類似）である。ハイブリダイゼーションの選択性は、ハイブリダイゼーションが生じる場合に存在し、特異性の全体的な損失よりも実質的により選択的である。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約６５％相同性、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％である場合に生じる。Ｋａｎｅｈｉｓａ （１９８４） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：２０３−２１３を参照のこと。記載のように、相同性を比較する長さは、より長いストレッチであり得、そしてある実施態様では、しばしば、少なくとも約１７ヌクレオチドのストレッチにわたり、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドである。
【０１０７】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に容易に理解されるように、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）、温度、または有機溶媒のような条件、さらに、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数によって影響を受ける。好ましくは、ストリンジェント温度条件が用いられ、そして一般には３０℃を超える、代表的には３７℃を超える、および好ましくは４５℃を超える温度が含まれる。ストリンジェント塩条件は、通常は１０００ｍＭ以下、代表的には５００ｍＭ以下、および好ましくは２００ｍＭ以下である。ｐＨは、代表的には７．０と８．３との間である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの尺度よりも非常に重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤａｖｉｄｓｏｎ （１９６８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：３４９−３７０を参照のこと。
【０１０８】
用語ＤＮＡ「誘導体」とは、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列（またはそのフラグメントもしくは改変体）と、コード配列に対応するＤＮＡ配列とは天然に関連しない追加のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡポリヌクレオチドを意味する。上述のペプチド誘導体についてのコメントも、ＤＮＡ「誘導体」に適用する。「誘導体」は、例えば、マクロファージ感染中に誘導されるマイコバクテリアオペロンの２以上のコード配列を含み得る。したがって、コード配列間の非コード領域の存在または不在に依存して、このような「誘導体」の発現産物は、融合タンパク質、または個々のコード領域にコードされる別々のペプチド産物であり得る。
【０１０９】
上記の用語ＤＮＡ「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、得られるペプチド産物が対応する野生型ペプチドと実質的に同一の交差反応性抗原性特性を有することが互いに共通する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡ分子実施態様のペプチド産物のすべては、野生型ペプチドにも結合する抗体に結合する。あるいは、上記ペプチド産物のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再生応答」を誘導し得る。
【０１１０】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、遺伝子が真核生物細胞で発現されることを確実にするように選択される。強力なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０１１１】
関連の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ分子を提供する。
【０１１２】
「単離された」ＲＮＡは、天然では目的の配列を随伴する他のマイコバクテリア成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、ならびにＤＮＡおよび他の染色体配列のような他のマイコバクテリアポリヌクレオチド、と実質的に分離されるＲＮＡである。
【０１１３】
上記ＲＮＡ分子は、宿主細胞に、例えば、ワクチンの成分として、直接導入され得る。
【０１１４】
あるいは、ＲＮＡ分子は、投与前にＲＮＡベクターに組み込まれ得る。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）としては、天然に存在する環境から取り出されている核酸配列、ならびに組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学合成されたアナログまたは異種システムによって生物学的に合成されたアナログが挙げられる。
【０１１６】
本明細書で用いる場合、用語「組換え体」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、あるいは合成起源のポリヌクレオチドを意図し、これは、その起源または操作によって、（１）天然において関連しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連しない；または（２）天然において連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結する；および（３）天然に存在しない。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段または核酸の単離されたセグメントの人工的操作のいずれかによって、例えば、遺伝子工学技法によって行われる。これは、通常、あるコドンを同じアミノ酸または保存的アミノ酸をコードする縮重コドンに置換するために行われるが、代表的には、配列認識部位を導入または除去する。あるいは、所望の機能の核酸セグメントとともに連結して、所望の機能の組み合わせを創出する。
【０１１７】
本発明の実施態様では、ポリヌクレオチドは、マクロファージ感染中に誘導またはアップレギュレートされるペプチドをコードし得る。核酸は、天然のままの状態でまたは操作されたときに、転写および／または翻訳されてペプチドあるいはそのフラグメントまたは改変体または誘導体を産生し得るならば、ペプチドを「コードする」という。このような核酸のアンチセンス鎖も、配列をコードするという。
【０１１８】
目的のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも本発明の範囲内であることが意図される。発現ベクターは、一般に、適切な転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結されるペプチドをコードする複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターに通常含まれる調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および停止配列である。これらの調節エレメントは、翻訳される配列に作動可能に連結される。核酸配列は、他の核酸配列と機能的関係を有するように配置される場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が隣接し、そして２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合は、隣接しておよびリーディングフレーム内にあることを意味する。ビルレンス因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに用いられる調節エレメントは、発現に用いられる宿主細胞において機能的である。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段によって調製され得る。例えば、大量のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞での複製によって産生され得る。所望のフラグメントをコードする天然または合成ＤＮＡフラグメントは、原核生物または真核生物細胞への導入およびそこでの複製可能な組換え核酸構築物、代表的にはＤＮＡ構築物に組み込まれる。通常、ＤＮＡ構築物は、酵母または細菌のような単細胞宿主において自律的複製に適切であるが、培養した昆虫、哺乳動物、植物、または他の真核生物細胞株のゲノム内への導入および組込みも意図され得る。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、化学合成によって、例えば、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって調製され得、そして市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で調製され得る。二本鎖フラグメントは、化学合成の一本鎖産物から、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖を一緒にアニールすること、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を添加することのいずれかによって得られ得る。
【０１２１】
原核生物または真核生物宿主への導入のために調製したＤＮＡ構築物は、代表的には、宿主によって認識される複製システムを含み、これは、所望のペプチドをコードする目的のＤＮＡフラグメントを含み、そして好ましくは、ポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写停止配列、およびｍＲＮＡ安定化配列のような必要なプロセシング情報部位を含み得る。選択された宿主細胞から分泌されるポリペプチド由来の分泌シグナルも、適切ならば含まれ得、したがって、タンパク質が細胞膜を横断するおよび／または細胞膜に留まることを可能にし、そしてその機能的トポロジーを達成するかまたは細胞から分泌される。
【０１２２】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主において機能的であるように選択され、そして適切な場合、マイコバクテリア遺伝子と天然に関連している配列を含み得る。ｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、および解糖酵素プロモーターなどのプロモーターは、原核生物宿主で使用され得る。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ、または他の解糖酵素（エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素などのプロモーター領域が挙げられる。
【０１２３】
適切な非天然哺乳動物プロモーターとしては、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス、マウスモロニー白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルス、またはポリオーマ由来のプロモーターが挙げられ得る。さらに、構築物は、高コピーの遺伝子が作成され得るように、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結され得る。
【０１２４】
このような発現ベクターは、自律的に複製し得るが、これらは宿主細胞のゲノムに挿入されることによって、好ましくはほとんど複製し得ない。
【０１２５】
発現およびクローニングベクターは、おそらく、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である、選択可能マーカーを含む。この遺伝子の存在は、この挿入物を発現する宿主細胞のみの増殖を確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を付与し；（ｂ）栄養要求欠失を補い；または（ｃ）複合培地から利用可能ではない必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードし、例えば、桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択可能マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。
【０１２６】
目的の核酸を含むベクターは、インビトロで転写され得、そして得られたＲＮＡは宿主細胞に（例えば、注入によって）導入され、あるいはベクターは、細胞宿主のタイプに依存する種々の方法によって宿主細胞に直接導入され得る。この方法としては、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ここでは、ベクターは感染剤であり、例えば、レトロウイルスゲノム）が挙げられる。上記の核酸が導入されている細胞は、このような細胞の子孫も含むことを意図する。
【０１２７】
本発明の大量の核酸およびペプチドは、ベクターまたは適合可能な原核生物または真核生物宿主細胞中の他の発現ベヒクルにおいて核酸またはその一部を発現させることによって調製され得る。最も普通に用いられる原核生物宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの菌株であるが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのような他の原核生物も使用され得る。
【０１２８】
哺乳動物または他の真核生物宿主細胞、例えば、酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類の種の細胞はまた、本発明のタンパク質の産生に有用であり得る。培養における哺乳動物細胞の増殖は、それ自体が周知である。通常用いられる哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、例えば、より高発現の所望のグリコシル化パターンを得るためには、他の細胞株が適切であり得る。
【０１２９】
ベクター構築の態様に依存するマーカーを用いることによって、クローンが選択される。マーカーは、同じまたは異なるＤＮＡ分子、好ましくは同じＤＮＡ分子上にあり得る。形質転換体は、当該技術分野で周知の手段のいずれかによって、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性によって、スクリーニングまたは好ましくは選択され得る。
【０１３０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、形質転換、形質導入、およびエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞に挿入され得る。本明細書で使用する場合、「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および微生物または単細胞体として培養される高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得るまたは使用されている細胞をいい、そして形質転換されている元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫が、天然、偶然、または意図的な変異のため、元の親と、形態学的にまたはゲノムもしくは全体のＤＮＡ量が完全に同一である必要はあり得ない。本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合、またはエレクトロポレーションなどの挿入に使用される方法にかかわりなく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主細胞ゲノムに組込まれ得る。
【０１３１】
１つの実施態様では、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクターは、ペプチドでチャレンジした後の免疫応答に特異的な免疫系の成分をコードし得、このペプチドは、マイコバクテリア遺伝子を含むＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ宿主細胞によるマクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子によってコードされる。
【０１３２】
このような成分の例は、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のペプチド産物に対する抗体である。したがって、この実施態様では、核酸配列（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクター）は、この抗体をコードする。
【０１３３】
本発明の第９の局面は、マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、本発明の、ペプチド、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターの使用を提供する。
【０１３４】
用語「治療する」とは、マイコバクテリア感染の感染後治療および改善を含む。
【０１３５】
用語「予防する」とは、マイコバクテリア感染の重篤度／強度、または開始の減少を含む。
【０１３６】
関連の局面では、マイコバクテリア感染を治療または予防する方法が提供され、この方法は、本発明の、ペプチド、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターからなる群より選択される医薬品の患者への投与を含む。
【０１３７】
医薬品は、従来の経路、例えば、静脈内、腹腔内、鼻内経路によって投与され得る。
【０１３８】
本発明のペプチドのエピトープの免疫原性は、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原と結合しているような粒子形成タンパク質と融合またはアセンブリした哺乳動物または酵母系においてエピトープを調製することによって増強され得る。ワクチンは、本発明の１以上の免疫原性ペプチドから調製され得る。
【０１３９】
代表的には、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能物質として調製され；注射前の液体への溶解または懸濁に適切な固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化され得、あるいはリポソーム中にカプセル化されたペプチドであり得る。活性な免疫原性成分は、しばしば、薬学的に受容可能でありそして活性成分と適合可能な賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および／またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含み得る。有効であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩ、これは、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳化液中に、細菌から抽出した３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む。
【０１４０】
ワクチンは、従来、注射によって、例えば、皮下または筋肉内のいずれかに、非経口的に投与される。投与の他の態様に適切である追加の処方物としては、座剤、およびある場合には、経口処方物、またはエアロゾルのような分布に適切な処方物が挙げられる。座剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとして、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；このような座剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物としては、例えば、医薬品品質のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤が挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または粉末剤の形態をとり、そして１０％〜９５％の活性成分、好ましくは２５％〜７０％を含む。
【０１４１】
ペプチドは、中性のまたは塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などのような有機酸とともに形成される。遊離のカルボキシル基とともに形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【０１４２】
ワクチンは、投与処方物に適合可能な様式で、および予防的および／または治療的に有効な量で投与される。投与すべき量は、一般に、１回の投与につき５マイクログラム〜２５０マイクログラムの抗原の範囲であり、これは、治療される被験者、被験者の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、主治医の判断に依存し得、そして各被験者に特有であり得る。
【０１４３】
ワクチンは、単回投与スケジュールで、または好ましくは多回投与スケジュールで投与され得る。多回投与スケジュールは、ワクチン接種の初回のコースが１〜１０の別々の用量であり得るスケジュールであり、続いて他の用量が免疫応答を維持および／または補強するために必要とされるその後の時間間隔、例えば、２回目の投与については１〜４カ月で、および必要であれば、引き続き数カ月後の投与で、投与される。投与法も、少なくとも一部は、個体の必要によって決定され、そして主治医の判断に依存する。
【０１４４】
さらに、１または複数の免疫原性マイコバクテリア抗原を含むワクチンは、他の免疫調節剤、例えば、免疫グロブリンまたはサイトカイン、ならびに抗生物質とともに投与され得る。
【０１４５】
抗体含有組成物の投与結果は、感染部位への抗体の伝播効率に依存し得る。マイコバクテリア呼吸器感染（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染）の場合、これは、肺への抗体の効率的な伝播によって容易になり得る。
【０１４６】
１つの実施態様では、医薬品は、鼻内に（ｉ．ｎ．）投与され得る。この送達の態様は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の送達の経路に対応し、そして抗体送達の場合、細菌が細胞内に入る前および細胞間に広がる期間中にも、抗体が細菌と戦うために感染部位に存在することを確実にする。
【０１４７】
鼻内組成物は、１００〜５０００μｍ、好ましくは５００〜４０００μｍ、より好ましくは１０００〜３０００μｍの範囲のおよその直径を有する液滴形態で投与され得る。あるいは、容量の点で、この液滴は、０．００１〜１００μｌ、好ましくは０．１〜５０μｌ、より好ましくは１．０〜２５μｌのおよその範囲である。
【０１４８】
鼻内投与は、鼻内に液滴を適用することによってまたは鼻内スプレーによって達成され得る。
【０１４９】
鼻内液滴の場合、液滴は、代表的には、約１０００〜３０００μｍの直径および／または１〜２５μｌの容量を有し得る。
【０１５０】
鼻内スプレーの場合、液滴は、代表的には、約１００〜１０００μｍの直径および／または０．００１〜１μｌの容量を有し得る。
【０１５１】
抗体のｉ．ｎ．送達後の、肺への抗体の移動は、粘膜分泌物の逆流によって呼吸気管における粘液線毛の作用が肺から粘膜内の粒子を除くと考えられるにもかかわらず、促進され得る。いくつかの抗体の、肺における比較的長い持続、胆汁からの速いクリアランス、および唾液への輸送の欠如は、粘膜部位特異的なメカニズムの役割を示唆する。
【０１５２】
異なる実施態様では、医薬品は、エアロゾル処方物で送達され得る。エアロゾル処方物は、粉末、懸濁液、または溶液の形態をとり得る。
【０１５３】
エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力に関連する１つの要因である。したがって、より小さい粒子は、より大きな粒子よりも、肺胞に向かって気道をさらに下へ移動し得る。１つの実施態様では、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、および肺胞の全体の長さに沿って送達を容易にするように直径分布を有する。あるいは、粒子サイズ分布は、気道の特定の部分、例えば、肺胞をターゲティングするように選択され得る。
【０１５４】
エアロゾル粒子は、噴霧吸入器または鼻内スプレーによって送達され得る。
【０１５５】
医薬品のエアロゾル送達の場合、粒子は、約０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜２５μｍ、より好ましくは１〜５μｍの範囲の直径を有し得る。
【０１５６】
本発明の医薬品のエアロゾル処方物は、必要に応じて、噴射剤および／または界面活性剤を含み得る。
【０１５７】
患者に投与すべき液滴のサイズを本発明の所定の範囲内に制御することによって、肺胞への不注意による抗原送達を回避／最小にし、そのため肺の炎症および線維症瘢痕化のような肺胞に関連する病理学的な問題を回避できる。
【０１５８】
ｉ．ｎ．ワクチン接種は、他の粘膜関連リンパ様組織とは異なる鼻および気管支関連粘膜組織におけるＴ細胞およびＢ細胞の両方が媒介するエフェクターメカニズムを保証する。
【０１５９】
鼻内投与経路によって誘起された防御メカニズムとしては、優先的肺ホーミングでのＴリンパ球の活性化；同時刺激性分子、例えば、Ｂ７．２のアップレギュレーション；および／またはマクロファージまたは分泌性ＩｇＡ抗体の活性化が挙げられる。
【０１６０】
抗原の鼻内送達は、Ｔ細胞応答において抗体産生を助けるＴｈ２表現型へのシフトによって好都合になる粘膜抗体応答を容易にし得る。粘膜応答は、ＩｇＡ産生の増強によって特徴づけられ、そしてＴｈ２応答は、ＩＬ−４産生の増強によって特徴づけられる。
【０１６１】
マイコバクテリア抗原の鼻内送達は、呼吸器系の粘膜下Ｂ細胞への抗原のターゲティングを可能にする。これらのＢ細胞は、哺乳動物における主要な局所ＩｇＡ産生細胞であり、そして鼻内送達は、マイコバクテリア抗原に対するこれらの細胞によるＩｇＡ産生の迅速な増加を容易にする。
【０１６２】
１つの実施態様では、マイコバクテリア抗原を含む医薬品の投与は、ＩｇＡ抗体産生を刺激し、そしてＩｇＡ抗体は、マイコバクテリア抗原に結合する。他の実施態様では、粘膜および／またはＴｈ２免疫応答が刺激される。
【０１６３】
他の実施態様では、モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、防御が所望される感染性因子の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、マイコバクテリア感染の治療、ワクチン接種、および／または診断に有用であり得る。
【０１６４】
第１０の局面によれば、本発明のペプチド（そのフラグメント、誘導体、および改変体を含む）およびそれに対する抗体は、生物学的試料中のマイコバクテリアに対する抗体の存在またはビルレンス関連抗原の存在を検出するためのイムノアッセイに有用である。
【０１６５】
イムノアッセイの設計は、非常に多くの変動を受け、そして多くの形式が当該技術分野で公知である。イムノアッセイは、本発明のペプチドに由来する少なくとも１つのエピトープを利用し得る。１つの実施態様では、イムノアッセイは、このようなエピトープの組み合わせを使用する。これらのエピトープは、同じまたは異なる細菌ペプチドに由来し得、そして別々の組換えまたは天然のペプチド、または共に同じ組換えペプチドであり得る。
【０１６６】
イムノアッセイは、例えば、１または複数のビルレンス関連ペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのマイコバクテリア抗原の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるマイコバクテリア抗原のエピトープに対するモノクローナル抗体、同じ抗原に対するポリクローナル抗体、または異なる抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得る。
【０１６７】
プロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチタイプアッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、あるいは免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識した抗体またはポリペプチドの使用を含み；標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射活性、または染料分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素で標識および媒介されたイムノアッセイである。
【０１６８】
代表的には、ペプチドに対する１または複数の抗体のイムノアッセイは、生物学的試料のような抗体を含むと思われるテスト試料を選択および調製する工程、次いで抗原−抗体複合体を形成させる条件下で１または複数の抗原性（すなわち、エピトープ含有）ペプチドとともにインキュベートする工程、およびこのような複合体の形成を検出する工程を含む。イムノアッセイは、標準または競合タイプであり得る。
【０１６９】
ペプチドは、代表的には、インキュベーション後のペプチドからの試料の分離を容易にするために、固体支持体に結合される。使用され得る固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば、メンブランまたはマイクロタイターウェル形態で）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートで）、ポリビニリジンフルオリド（Ｉｍｍｕｌｏｎとして公知）、ジアゾ化紙、ナイロンメンブラン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎマイクロタイタープレートまたは６０ｍｍ直径のポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａｌｌ）が使用され得る。抗原性ペプチドを含む固体支持体は、代表的には、テスト試料から分離した後に、および結合した抗体の検出の前に洗浄される。
【０１７０】
抗体（または競合アッセイの場合は、ある量の競合抗体）を含む形成された複合体は、形式に依存して、多くの公知の技法のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の標識されていない抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗異種Ｉｇの結合体を用いて検出され得る。
【０１７１】
ペプチドが被分析物であるイムノアッセイにおいて、テスト試料、代表的には、生物学的試料は、抗原−抗体複合体を形成させる条件下でペプチドに対する抗体とともにインキュベートされる。細菌成分と思われる成分を遊離させるために生物学的試料を処理してからテストすることが望ましい。種々の形式が採用され得る。例えば、「サンドイッチアッセイ」が採用され得、この場合、固体支持体に結合した抗体を、テスト試料とともにインキュベートし；洗浄し；被分析物に対する二次標識抗体とともにインキュベートし、そして支持体を再度洗浄する。被分析物は、二次抗体が支持体に結合したかどうかを決定することによって検出される。競合形式では、テスト試料を、通常、抗体とともにインキュベートし、そして標識した競合抗原も、連続してまたは同時にインキュベートする。
【０１７２】
本発明の実施態様として、本発明の１以上のペプチド、または該ペプチドに対する１以上の抗体、および緩衝剤を含む、適切な容器にパッケージされたイムノアッセイキットも包含される。
【０１７３】
本明細書で使用する場合、「生物学的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試料をいい、例えば以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、および尿生殖器管の外切片、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、器官、およびインビトロ細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中の細胞の増殖から得られる条件培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞成分を含むがこれらに限定されない）。
【０１７４】
関連の診断アッセイにおいて、本発明は、マイコバクテリア感染を検出するための核酸プローブを提供する。
【０１７５】
主成分として本発明のポリヌクレオチドを使用して、約８ヌクレオチド以上のオリゴマーが、組換えポリヌクレオチドからの切り出しまたは合成のいずれかによって調製され得、これは、マイコバクテリア配列とハイブリダイズし、そしてマイコバクテリアの同定に有用である。
【０１７６】
プローブは、ハイブリダイゼーションによって誘導またはアップレギュレートされた配列の検出を可能にする長さである。６〜８ヌクレオチドが実行可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、そして少なくとも約２０ヌクレオチドが最適なようである。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含むルーチンの方法を用いて調製され得る。プローブとして使用するために、完全な相補性が所望されるが、フラグメントの長さが増加する場合はその必要はなくてもよい。
【０１７７】
診断にこのようなプローブを使用するために、血液または血清のような分析すべき生物学的試料は、所望であれば、そこに含まれる核酸を抽出するために処理され得る。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ分離技法に付され得；あるいは、核酸試料は、サイズ分離することなくドットブロットされ得る。プローブは、通常標識される。適切な標識、およびプローブを標識する方法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼ操作によって組込まれた放射活性標識、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プローブが挙げられる。次いで、試料から抽出された核酸は、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標識したプローブで処理される。
【０１７８】
プローブは、ビルレンスをコードするポリヌクレオチドに完全に相補的に作成され得る。したがって、通常、偽陽性を抑制するために高ストリンジェンシー条件が望ましい。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーション中および洗浄手順中の多くの要因によって決定される。
【０１７９】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅技法を使用することが所望であり得る。このような技法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法が挙げられる。
【０１８０】
プローブは、診断キットにパッケージされ得る。診断キットは、標識され得るプローブＤＮＡを含み；あるいは、プローブＤＮＡは、非標識であり得、そして標識用の成分が、別の容器でキットに含まれ得る。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な他の適切にパッケージされた試薬および物質、例えば標準物質、ならびにテストを行うための指示書を含み得る。
【０１８１】
好ましい実施態様では、本発明のペプチド（あるいはフラグメントまたは改変体または誘導体）は、患者においてマイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の存在を検出するための診断アッセイに使用される。
【０１８２】
より詳細には、特定の抗原に既に曝露されているＴリンパ球は、同じ抗原によるその後のチャレンジで活性化される。この活性化は、マイコバクテリア感染の陽性診断を同定するための手段を提供する。逆に、同じ活性化は、特定の抗原に予め曝露されていないＴリンパ球によって達成されない。
【０１８３】
上記のＴリンパ球の「活性化」は、時々、「再生応答」といい、そして例えば、活性化Ｔリンパ球からのインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）の放出を決定することによって測定され得る。したがって、患者におけるマイコバクテリア感染の存在は、本発明のペプチド（あるいはフラグメントまたは改変体または誘導体）でのＴリンパ球のインビトロチャレンジ後の所定の期間の後の、Ｔリンパ球からの最小濃度のインターフェロンの放出によって決定され得る。
【０１８４】
使用する場合、Ｔリンパ球を含む生物学的試料は、患者から採取され、次いで本発明のペプチド（あるいはそのフラグメント、改変体、または誘導体）でチャレンジされる。
【０１８５】
上記Ｔリンパ球診断アッセイは、問題の患者によって発現される少なくとも１つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み得る。ＡＰＣは、生物学的試料中に元来提供され得、あるいは外因的に添加され得る。１つの実施態様では、Ｔリンパ球はＣＤ４Ｔリンパ球である。
【０１８６】
実施例１−推定プロモーターライブラリーの生成
採用されるルーチンの分子生物学方法は、標準的な参考プロトコルに記載されるとおりであった（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．， Ｂｒｅｎｔ Ｒ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ．Ｅ．， Ｍｏｏｒｅ Ｄ．Ｄ．， Ｓｅｉｄｍａｎ Ｊ．Ｇ．， Ｓｍｉｔｈ Ｊ．Ａ．およびＳｔｒｕｈｌ Ｋ． （１９９２）． 「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）。
【０１８７】
プロモーターライブラリーを、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒｖ染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ部分消化（Ｓａｕ ３Ａ１）によって調製した。消化したＤＮＡをサイズ分画し、そして１〜２ｋｂのサイズのフラグメントを、Ｑｉａｅｘ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を用いて回収した。
【０１８８】
回収したフラグメントを、Ｂｇｌ ＩＩで線状化したベクターｐＣＲＥＰ８ＧＦＰＴＴＬにライゲートし、そして脱リン酸化した。ベクターｐＣＲＥＰ８ＧＦＰＴＴＬは、Ｄｒ Ｐ Ｏ’Ｇａｏｒａ， ＩＣＳＭ， Ｌｏｎｄｏｎによって提供されたベクターｐＣＲＥＰ８に基づき、これはそれ自身がｐＮＧ２レプリコン（ＲａｄｆｏｒｄおよびＨｏｄｇｓｏｎ， １９９１， Ｐｌａｓｍｉｄ ２５： １４９−１５３）に基づいている。
【０１８９】
ｐＣＲＥＰ８ＧＦＰＴＴＬを生成するためのｐＣＲＥＰ８の改変には、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする領域をＧＦＰｍｕｔ２をコードする遺伝子で置換することを含む（Ｃｏｒｍａｃｋ， ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ． Ｇｅｎｅ． １９９６， １７３： ３３−３８）。さらに、ＣｅｌＡ（Ｃ． ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｕｍ由来）からの転写ターミネーターおよびフェレドキシン（Ｃ． ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来）遺伝子を、それぞれＧＦＰｍｕｔ２遺伝子の上流および下流に挿入した。最後に、ＧＦＰｍｕｔ２遺伝子のＡＴＧ開始コドンの直前にある、Ｂｇｌ ＩＩクローニング部位とリボソーム結合部位との間にリンカーを挿入することによって、翻訳停止部位を、すべての３つのリーディングフレームに導入した。
【０１９０】
ライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして得られた形質転換体を９６ウェルプレートに入れて、２３，０４０の個々のクローンを得た。大スケールのプラスミド単離を、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐｓ （Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を用いて４８０クローンのプールで行った。
【０１９１】
実施例２−配列相同性によって同定した推定プロモーター
分泌されたタンパク質、表面に露出したタンパク質、および公知のビルレンス要因との相同性を有するまたはテキスト検索を用いてマイコバクテリアビルレンスに既に関連があるタンパク質について、注釈をつけたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍ＿ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／またはｈｔｔｐ：／／ｐｅｄａｎｔ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ／）を、スクリーニングすることによって、ターゲティングした融合物についてのプロモーター領域を選択した。
【０１９２】
この方法では、ターゲティングした融合物についての多くの候補が単離され得る。プロモーターを同定した後、周囲の遺伝子構造の機構を調べ、そして可能な場合、プロモーターを同定した。
【０１９３】
マイコバクテリアプロモーターには、代表的な−３５および−１０配列がない［Ｄａｓ Ｇｕｐｔａ ＳＫ， Ｂａｓｈｙａｍ ＭＤおよびＴｙａｇｉ ＡＫ （１９９３）． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５： ５１８６−５１９２］。
【０１９４】
この場合、目的の遺伝子またはオペロンのすぐ上流の領域を、尾をつけたプライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＲＥＰ８ＧＦＰＴＴＬのＢｇｌ ＩＩ部位に直接クローニングした。ＧＦＰｍｕｔ２ベクターを上記のように使用し、１０％ ＯＡＤＣおよび０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ１３３９（合成マイコバクテリア培養培地）を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９、またはＤＭＥＭ中で、マクロファージ細胞株Ｊ７７４．１のインビトロ培養物を増殖した。
【０１９５】
表１に、このような多くのプロモーターを挙げる。
【０１９６】
【表１】
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【０１９７】
実施例３−Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのマクロファージ感染、採取、ＦＡＣＳ分析およびソーティング、および回収のためのプロトコル
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのバッチ培養試料でのマクロファージ感染。ウェルを感染後２４時間、４８時間、および７２時間の間隔で採取した。
【０１９８】
材料
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１（例えば、ＥＣＡＣＣから入手可能）を、６ウェルプレートにおいて、ウェル当たり５×１０５細胞で播種した。
【０１９９】
組織培養培地−２００ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１０％ウシ胎児血清（γ線照射）、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地。
【０２００】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのバッチ培養試料を、中後期対数増殖期（ＯＤ６０００．６〜０．８）まで増殖した。
【０２０１】
液体Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９培地（Ｄｉｆｃｏ）は、１０％ ＯＡＤＣ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｄｉｆｃｏ）および０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ１３３９を補充し、またはマクロファージを除くＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの増殖については、生物を、１０％ ＯＡＤＣ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｄｉｆｃｏ）を補充した固体Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０培地（Ｄｉｆｃｏ）で培養した。
【０２０２】
手順
１．マクロファージを、コンフルエントまで増殖した（ウェル当たり４×１０６細胞）。
【０２０３】
２．細菌試料を、以下の手順を用いて調製した：
２〜３週齢のコロニーを、７Ｈ１０＋ＯＡＤＣ寒天プレートから掻きとり、そして１０ｍｌの７Ｈ９＋ＯＡＤＣ＋Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ１３３９に再懸濁した。１０ｍｌの７Ｈ９＋ＯＡＤＣ＋Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ１３３９を含むユニバーサル試験管（２２ｍｍ直径×９０ｍｍ高さ）に、５００μｌの細菌懸濁液を接種した。細菌を、旋回式振盪機（２００ｒｐｍ）で３７℃にて７日間増殖した。
【０２０４】
５００μｌの細菌培養物を、１０ｍｌの７Ｈ９＋ＯＡＤＣ＋Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ１３３９ １ｍｌを含むユニバーサル試験管（２２ｍｍ直径×９０ｍｍ高さ）に接種した。細菌を、旋回式振盪機（２００ｒｐｍ）で３７℃にて５日間増殖した（ＯＤ６０００．６〜０．８）。
【０２０５】
細菌試料を、１×１０７／ｍｌの細胞密度になるまでＤＭＥＭで希釈した−約２：１（細菌対細胞）以下の多重度が好ましい。
【０２０６】
３．組織培養培地を、各組織培養ウェルから除去した。
【０２０７】
４．１ｍｌの細菌懸濁液を各ウェルに加え、そして空気中５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃にて３時間インキュベートした。
【０２０８】
５．接種懸濁液を除去し、そして各ウェルを予め３７℃に温めた１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。
【０２０９】
６．３ｍｌの新鮮な予め温めたＤＭＥＭを、各ウェルに加えた。
【０２１０】
７．感染した単層を、空気中５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃にて、１、２、または３日の期間インキュベートした。
【０２１１】
８．各試料についてのウェルを、適切な時点で以下のように採取した：
ｉ）培養培地をアスピレーションによって除去し、そして単層を予め温めたＰＢＳで洗浄してあらゆる外部細菌を除去した。
【０２１２】
ｉｉ）ＰＢＳ緩衝液を除去し、そして１ｍｌの０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液に置換した。
【０２１３】
ｉｉｉ）単層を２５分間インキュベートして、ｐａｓｔｅｔｔｅで単層を破壊して、マクロファージから細菌を放出させた。
【０２１４】
ｉｖ）試料を、ＦＡＣＳチューブに移し、そして高蛍光細菌（代表的には１０３ｌｏｇ以上の蛍光）を収集するＣａｔ ＩＩＩでＦＡＣＳスキャナー／ソーターを用いて検査した。
【０２１５】
９．ソートした懸濁液を０．２μＭフィルターを通過させることによって細菌を回収した。
【０２１６】
１０．フィルターメンブラン上に回収した細菌を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０＋ＯＡＤＣ寒天プレート上で培養し、そして３７℃にて２週間増殖した。
【０２１７】
１１．細菌を、フィルターメンブランから１０ｍｌの７Ｈ９＋ＯＡＤＣ培地に掻きとり、そして５〜７日間（３７℃、２００ｒｐｍ）増殖した。
【０２１８】
注釈：
ｉ）マクロファージ感染アッセイおよびソーティングを、所望のレベルの蛍光細菌の富化が達成されるまで繰り返した。
【０２１９】
ｉｉ）マクロファージ環境の外部で非常に活性なＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓプロモーターを有する細菌を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９＋ＯＡＤＣ培地中で培養し、次いでＦＡＣＳソーティングすることによって除去して、非蛍光細菌を収集した。（この選択手順を、繰り返しマクロファージ感染ラウンドの継代１と継代２との間で行った）。
【０２２０】
実施例４−代替のマクロファージアッセイ手順
１）Ｔｒｉｃｃａｓ， Ｊ．Ａ．ら （１９９９）． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５， ２９２３−２９３０。
【０２２１】
手順
マクロファージ細胞を、２４ウェルプレート中ウェル当たり２×１０５で播種し、そして５％ＣＯ２中３７℃にて７日間インキュベートした。マクロファージ単層を、１：１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）で細菌に感染させた。感染の４時間後、細胞外細菌を、ＰＢＳで４回洗浄することによって除去し、そして５％ＣＯ２中でインキュベーションを続けた。
【０２２２】
感染の５〜６日後、感染したマクロファージをＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌ ＰＢＳ中に掻きとり、そしてＦＡＣＳによって分析した。細菌を回収するために、ソートしたマクロファージを遠心分離し、そして水＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０に溶解した。回収した細菌を、７Ｈ９培地中で７日間増殖し、そして所望のレベルのマクロファージ／蛍光細菌の富化が達成されるまで、マクロファージ感染およびソーティングを繰り返した。
【０２２３】
増強された細胞内発現でクローンを選択するために、マクロファージ感染を上記のように行ったが、次いでマクロファージをＴｗｅｅｎ ８０で溶解して、細菌を放出した後、ＦＡＣＳソーティングにかけた。
【０２２４】
２）Ｋｒｅｍｅｒ， Ｌ．ら （１９９５）． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７， ９１３−９２２。
【０２２５】
手順（マクロファージ感染のみ）
Ｊ７７４Ａ．１マクロファージを、８チャンバー培養スライドに播種し、そして５％ＣＯ２中３７℃にて一晩インキュベートした。感染の直前、単層をＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。組換えＢＣＧを、マクロファージ当たり１〜５細菌のｍ．ｏ．ｉ．で加えた。
【０２２６】
５％ＣＯ２の存在下３７℃での一晩の感染後、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄して、可能性のある細胞外細菌を除去した。次いで、マクロファージを、蛍光顕微鏡を用いて検査した。
【０２２７】
３）Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉ， Ｓ．ら （１９９５）．　Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １７， ９０１−９１２。
【０２２８】
手順
マクロファージを、１００ｍｍ組織培養ペトリディッシュに播種した（５×１０６）。５％ＣＯ２の存在下３７℃での一晩の付着後、マクロファージに、マクロファージ当たり１細菌のｍ．ｏ．ｉで感染させた。感染の１時間後、単層を予め温めたＰＢＳで３回洗浄して、非摂取細菌を除去し、そしてＤＭＥＭを置換した。
【０２２９】
マクロファージを、ＰＢＳで洗浄することによって感染後６日目に採取し、次いでディッシュから掻き取った。マクロファージを遠心分離によって回収し、そして２３ゲージ針を２０〜３０回通過させることによって破壊した：未処理の細胞および核をペレットにし、そして細菌を含む上清を収集した。次いで、細菌をペレットにし、ＰＢＳで洗浄し、そして再度遠心分離した。最終の細菌ペレットを、ＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳに懸濁した。
【０２３０】
４）Ｖｉａ， Ｌ． Ｅ．ら （１９９６）． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ３３１４−３３２１。
【０２３１】
手順
Ｊ７７４マクロファージ単層を、１００ｍｍ直径の組織培養ペトリディッシュ当たり７．５×１０６細胞の密度で播種した。５％ＣＯ２の存在下３７℃での一晩の付着後、マクロファージに、マクロファージ当たり１０〜２０細菌のｍ．ｏ．ｉで感染させた。感染の１時間後、予め温めたＰＢＳで３回洗浄してあらゆる細胞外細菌を除去し、次いで新鮮なＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを加えた。
【０２３２】
培地を、培養の３〜４日ごとに置換した。感染したマクロファージを、１０分間、３日間、７日間、および１１日間インキュベートして採取した（ＦＡＣＳ分析を、１０分、７日目、および１１日目の試料で行った）。採取時に、単層をＰＢＳで３回洗浄し、ディッシュから掻きとり、遠心分離し、次いで２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）−２５０ｍＭスクロースでホモジナイズした。ＦＡＣＳのために、ホモジネートを３回の遠心分離にかけて未破壊のマクロファージおよびマクロファージ破片を除去し、最終の細菌ペレットをＰＢＳに懸濁した。ＦＡＣＳ分析およびソーティングを、上記参考文献３に記載のように行った。
【０２３３】
５）Ｂａｒｋｅｒ Ｌ． Ｐ．ら （１９９８）．　Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９， １１６７−１１７７。
【０２３４】
手順
マクロファージを、２×１０５細胞／ｍｌ総容量の濃度で組織培養ディッシュに播種した。マクロファージを、半コンフルエンシーにまで増殖させ、細菌をマクロファージ当たり１〜５細菌のｍ．ｏ．ｉ．で添加した。５％ＣＯ２の存在下３７℃で４時間増殖した後、培地を除去し、そしてアミカシン１００μｇ／ｍｌを補充した新鮮なＤＭＥＭを添加して、細胞外生物を殺した。
【０２３５】
３２℃にて２４時間後、アミカシンの濃度を、２０μｇ／ｍｌまで低下させた。感染の３日後（ほとんどのファゴソーム小胞が１つの生物のみを含む時点）、マクロファージをＰＢＳで洗浄し、ディッシュから掻きとり、そして核膜に欠陥を生じることなく細胞膜を破壊する非常に穏やかでかつ制御された溶解を行った。
【０２３６】
次いで、細菌を含む小胞を、遠心分離によって単離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ分析のためにＰＢＳで希釈した。非蛍光小胞および非蛍光生物を含む小胞からソートされた蛍光細菌クローンを、共焦点顕微鏡を用いてさらにスクリーニングした。
【０２３７】
細胞内で蛍光を現わすが７Ｈ１０寒天上または組織培養培地中で示さないこれらのクローンを、再度マクロファージに継代した。増殖の３〜４日後、ＰＢＳ中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで５分間マクロファージを溶解することによって、細菌をマクロファージから採取し、その後、デタージェントを９倍容量のＰＢＳで希釈し、ＦＡＣＳ分析に用いた。
【０２３８】
実施例５−同定されたプロモーターの転写制御下でのマイコバクテリア核酸コード配列の説明
ＤＦＩは、結核の病因における重要な工程である、マクロファージの感染中に誘導またはアップレギュレートされるプロモーターの同定を可能にする。
【０２３９】
一旦プロモーター領域のＤＮＡ配列および配向が決定されると、正確な位置は、公表されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲｖゲノムについてのＤＮＡ相同性検索（例えば、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／を参照のこと）を行うことによってマッピングされて、同定されたプロモーター領域の制御下の遺伝子またはオペロンが明らかにされ得る。
【０２４０】
次いで、同定されたプロモーターの制御下の１または複数の遺伝子のノックアウト変異体を、ビルレンスに必須であるかどうかを調べるために調製し得る。遺伝子が感染中に発現またはアップレギュレートされるという事実は、（適切なモデルにおいてノックアウト変異体をテストすることによって証明されるので）これが生物のビルレンスに必須であり得ることを意味する。
【０２４１】
これらのデータは、ａ）宿主免疫応答がターゲティングされ得る潜在的なワクチン候補物；ｂ）不活性化される場合、生ワクチンとして適切であると考えられ得る生物を実質的に弱毒化する遺伝子；ｃ）新しい抗生物質の開発のための標的、を同定することを助ける。
【０２４２】
同定されたオペロンにおける１以上の遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含む適切なプラスミドＤＮＡベクター（Ｔａｓｃｏｎ ＲＥら １９９６ Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：８ ８８８−８９２； Ｈｕｙｇｅｎ Ｋら １９９６ Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：８ ８９３−８９８）は、予め存在するＴＢワクチンと比較してＤＮＡワクチンとしてテストされ得る。同様に、その遺伝子産物は、モルモット防御モデルにおいてワクチンとしてテストされ得る。
【０２４３】
実施例６−免疫原性を保持しながらそのビルレンスを弱毒化するためのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の１以上の遺伝子の欠失
同定される１以上の遺伝子は、対立遺伝子交換を用いて破壊され得る。簡単に言えば、目的の遺伝子を、いずれかの側で隣接する１〜２ｋｂのＤＮＡでクローニングし、そしてコード領域の一部の欠失およびハイグロマイシンのような抗生物質耐性マーカーの挿入によって不活性化する。
【０２４４】
次いで、操作したフラグメントを、適切な自殺ベクター、例えばｐＰＲ２３に移し、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの野生型の親株に形質転換する。変異体を、抗生物質耐性株について選択することによって回収する。遺伝子型分析（目的の遺伝子に特異的なフラグメントでのサザンブロッティング）を、選択した株について行って、遺伝子が破壊されていることを確認する。
【０２４５】
次いで、変異体株を調査して、表現型における遺伝子破壊の効果を決定する。これをワクチン候補物として使用するために、弱毒化したビルレンスを証明することが必要である。これは、モルモットまたはマウスのいずれかの感染モデルを用いて行われ得る。動物に変異体株を感染させ、そして疾患の進行を、種々の器官、特に肺および脾臓において、感染後の特定の時点で、代表的には１６週まで、細菌負荷量を決定することによってモニタリングする。
【０２４６】
種々の器官において著しくより高い細菌負荷量を有する野生型株に感染させた動物に対して比較を行う。長期生存研究および組織病理学も、ビルレンスおよび病因を評価するために使用し得る。
【０２４７】
一旦弱毒化したビルレンスが樹立されると、防御および免疫原性研究は、その株の潜在力をワクチンとして評価するために行われ得る。ＴＢ変異体の対立遺伝子交換および調製についての適切な参考文献は、ＭｃＫｉｎｎｅｙら， ２０００およびＰｅｌｉｃｉｃら， １９９７，［１、２］である。
【０２４８】
実施例７−免疫原性であるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を選択し、そしてその全体の免疫原性を増強するためにＢＣＧまたはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの弱毒化株にその遺伝子を入れること
目的の遺伝子を、ＰＣＲによってＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムから増幅する。増幅した産物を精製し、マイコバクテリオファージＬ５［３］についての付着部位（ａｔｔＢ）でマイコバクテリアゲノムに特異的に部位を組込むプラスミド（ｐＭＶ３０６）にクローニングする。
【０２４９】
ＢＣＧを、エレクトロポレーションによってプラスミドで形質転換し、これは、高電圧の電気的パルスで細胞エンベロープに傷害を与えることを含み、その結果、ＤＮＡの取り込みを行う。プラスミドは、ａｔｔＢ部位でＢＣＧ染色体に組込まれ、安定な組換え体を生成する。組換え体は選択され、そしてＰＣＲまたはサザンブロッティングによってチェックされて、遺伝子が組み込まれていることを確実にする。次いで、組換え体株を、防御研究に使用する。
【０２５０】
実施例８−ＴＢ遺伝子を発現および提示するために、弱毒化サルモネラおよびワクシニアウイルスのような組換え体キャリアを使用すること
このタイプのアプローチの最良の例の１つは、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）［４］の使用である。目的の遺伝子を、ワクシニアウイルスシャトルベクター、例えばｐＳＣ１１にクローニングする。次いで、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞に野生型ＭＶＡを感染させ、そして組換えシャトルベクターでトランスフェクトする。次いで、組換えウイルスを、適切な選択マーカーおよびウイルスプラークを用いて選択し、そして精製する。
【０２５１】
組換えウイルスは、正常には、プライム−ブースト方法の一部として送達され、この場合、動物は、構成的プロモーターの制御下で目的のＴＢ遺伝子をコードするＤＮＡワクチンで最初にワクチン接種される。免疫応答は、少なくとも２週後に目的の遺伝子を有する組換えＭＶＡを動物に投与することによってブーストされる。
【０２５２】
実施例９−単一ペプチド／タンパク質またはタンパク質の組み合わせを含むサブユニットワクチン
１以上のペプチドまたはタンパク質を有するサブユニットワクチンを調製するために、まず第１に、ワクチンを調製するためのタンパク質またはペプチドの供給を得ることが必要である。現在まで、これは、主として、マイコバクテリア研究においてＴＢ培養物から目的のタンパク質を精製することによって行われてきた。しかし、目的の遺伝子をクローニングしそして組換えタンパク質を産生することが、より普通になってきている。
【０２５３】
目的の遺伝子のコード配列を、Ｎ末端およびＣ末端に挿入した制限部位を用いてＰＣＲによって増幅して、ｐＥＴ−１５ｂのようなタンパク質発現ベクターにインフレームでクローニングする。遺伝子を、ｌａｃＺのような誘導可能プロモーターの後ろに挿入する。次いで、ベクターを、培養物中で増殖したＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。組換えタンパク質を過剰発現させ、そして精製する。
【０２５４】
普通の精製方法の１つは、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有する組換えタンパク質を産生することである。次いで、このタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにおいて金属イオンに対するＨｉｓタグの親和性に基づいて精製し得、その後、Ｈｉｓタグを切断する。次いで、精製したタンパク質を、適切なアジュバント中で動物に投与する［５］。
【０２５５】
実施例１０−１以上の同定された遺伝子を有するプラスミドＤＮＡワクチン
特異的な遺伝子をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、精製し、そしてｐＶＡＸ１のようなワクチン開発のために開発された特殊化ベクターに挿入する。これらのベクターは、真核生物細胞において導入したＤＮＡ（候補抗原をコードする）の強力な発現を指示するプロモーター配列（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）、およびポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０またはウシ成長ホルモン）を含み、ｍＲＮＡ転写物を安定化する。
【０２５６】
ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして形質転換体を、プラスミドによってコードされた、カナマイシン耐性のようなマーカーを用いて選択する。次いで、プラスミドを、形質転換したコロニーから回収し、そして配列決定して、目的の遺伝子が存在しそしてＰＣＲで生じる変異なしに適切にコードされることをチェックする。
【０２５７】
次いで、大量のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で産生し、そしてプラスミドを回収し、そして市販のキットを用いて精製する（例えば、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）。次いで、ワクチンを、例えば、アジュバントの存在下または不在下で筋肉内注射によって動物に投与する。
【０２５８】
実施例１１−ＤＮＡ発現ベクターの調製
ＤＮＡワクチンは、細菌プラスミドにクローニングされた本発明の核酸配列からなる。プラスミドベクターｐＶＡＸ１は、ＤＮＡワクチンの調製に普通に用いられる。このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高コピー数複製およびほとんどの哺乳動物細胞において目的のペプチドの高レベルの一過性発現を容易にするように設計される（詳細については、ｐＶＡＸ１の製造業社のプロトコルを参照のこと（カタログ番号Ｖ２６０−２０ ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ））。
【０２５９】
ベクターは、以下のエレメントを含む：
＊種々の哺乳動物細胞における高レベル発現のためのヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター
＊センス配向でのインビトロ転写およびインサートによって配列決定することを可能にするためのＴ７プロモーター／プライミング部位
＊効率的な転写停止およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル
＊Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
＊多重クローニング部位
＊Ｅ．ｃｏｌｉにおける高コピー数複製および増殖のためのｐＵＣ起点
＊インサートによって配列決定することを可能にするためのＢＧＨ逆プライミング部位。
【０２６０】
ベクターは、当該技術分野で公知である標準的な組換え技法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって調製され得る。ワクチンの調製において重要な段階は、以下のとおりである：
＊目的の遺伝子は、多重クローニング部位の１つを介してｐＶＡＸ１にライゲートされる。
＊ライゲーション混合物は、次いでコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＴＯＰ１０）に形質転換され、そして５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートを用いて形質転換体を選択する。
＊クローンが選択され、そして目的の遺伝子の存在および配向を確認するために配列決定され得る。
＊一旦遺伝子の存在が確認されると、ベクターは、タンパク質発現をチェックするために哺乳動物細胞株をトランスフェクトするために用いられ得る。トランスフェクションのための方法は当該技術分野で公知であり、そして例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、およびリポフェクションが挙げられる。
＊一旦ペプチド発現が確認されると、大量のベクターが産生され、そして適切な細胞宿主、例えばＥ．ｃｏｌｉから精製され得る。
【０２６１】
ｐＶＡＸ１は、宿主染色体に組込まれない。すべての非必須配列が除去されて、組込みの可能性を最小にする。特異的なベクターを構築する場合、真核生物細胞内で発現される場合にコードされたタンパク質の分泌を指示するように、リーダー配列が含まれ得る。
【０２６２】
使用されているベクターの他の例は、Ｖ１Ｊｎｓ．ｔＰＡおよびｐＣＭＶ４（Ｌｅｆｅｖｒｅら， ２０００；およびＶｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒら， ２０００）である。
【０２６３】
宿主のゲノム中に組込む発現ベクターが用いられ得るが、組込まないベクターを用いることがより普通でありそしてより好ましい。ｐＶＡＸ１の例は組込まない。組込みは、他の問題を生じる遺伝学的に改変された宿主の生成を導く。
【０２６４】
実施例１２−ＲＮＡワクチン
米国特許ＵＳ ５，７８３，３８６の１５頁に記載されるように、１つのアプローチは、宿主中にＲＮＡを直接導入することである。
【０２６５】
したがって、ベクター構築物（実施例１１）は、インビトロでＲＮＡを生成するために使用され得、そして精製されたＲＮＡは、次いで宿主に注入される。次いで、ＲＮＡは、宿主細胞における翻訳のためのテンプレートとして働く。この実施態様では、組込みは生じない。
【０２６６】
他の選択肢は、目的の遺伝子に対応するＲＮＡを有するレトロウイルスゲノムのような感染性因子を使用することである。この実施態様では、宿主ゲノムへの組込みが生じる。
【０２６７】
他の選択肢は、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルスのようなウイルスベクターに由来し得るＲＮＡレプリコンワクチンの使用である。これらのワクチンは、自己複製および自己制限し、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与され得、これは次いでインビボでＲＮＡレプリコンに転写される。ベクターは、最終的には、トランスフェクトされた細胞の溶解を引き起こし、それによって宿主ゲノムへの組込みについての問題が減少する。ＲＮＡワクチン構築のためのプロトコルは、Ｃｈｅｎｇら （２００１）に詳述される。
【０２６８】
実施例１３−Ｔ細胞応答を評価することに基づく診断アッセイ
Ｔ細胞応答を評価することに基づく診断アッセイについて、患者からの血液の試料を得ることが十分である。単核細胞（単球、ＴおよびＢリンパ球）は、Ｆｉｃｏｌｌグラジエントのような密度グラジエントを用いて血液から分離され得る。
【０２６９】
単球およびＢリンパ球の両方とも、抗原を提示することが可能であるが、樹状細胞のような専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）よりも効率的ではない。後者は、リンパ様組織により多く局在する。
【０２７０】
最も単純なアプローチは、分離した単核細胞に抗原を加え、そして１週間インキュベートし、次いで増殖の量を評価することである。個体が予め感染によって抗原に曝露されている場合、抗原に特異的に密集するＴ細胞は、試料中により広がるべきであり、そして応答すべきである。
【０２７１】
Ｔ細胞対ＡＰＣの比を制御することが所望であるならば、異なる細胞集団を分離することも可能である。
【０２７２】
このタイプのアッセイの他のバリエーションは、応答の尺度として応答するリンパ球によるサイトカイン産生を測定することである。以下の実施例１４に記載のＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、このバリエーションの適切な例である。
【０２７３】
実施例１４−潜在するマイコバクテリアの検出
結核の制御のための主な問題は、結核菌に感染した多くの無症候性の保有者の個体の存在である。休止状態の桿菌は、第一線の薬物に対してより抵抗性である。
【０２７４】
潜在性のマイコバクテリア関連抗原の存在は、血液試料中の抗原特異的抗体またはＴ細胞のいずれかを検出することによって間接的に検出され得る。
【０２７５】
以下の方法は、Ｌａｌｖａｎｉら （２００１）に記載の方法に基づき、そこでは、分泌された抗原、ＥＳＡＴ−６が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体のメンバーによって発現されると同定されたが、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧワクチン株およびほとんどの環境中のマイコバクテリアには存在しない。親の６０〜８０％もまた、ＥＳＡＴ−６に対する強い細胞性免疫応答を有する。エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、ＥＳＡＴ−６特異的Ｔ細胞を検出した。
【０２７６】
本発明への適用：
９６ウェルプレートを、サイトカイン（例えば、インターフェロン−（ＩＬ−２）−特異的抗体でコーティングする。次いで、末梢血単球を、患者の全血から単離し、そしてウェルにアプライする。
【０２７７】
抗原（すなわち、本発明のペプチド、フラグメント、誘導体、または改変体の１つ）を添加して、存在し得る特異的なＴ細胞を刺激し、そしてプレートを２４時間インキュベートする。抗原は、特異的抗体に結合して、サイトカイン産生を刺激する。
【０２７８】
プレートを洗浄して、抗原特異的Ｔ細胞が存在するフットプリントを残す。
【０２７９】
次いで、適切な検出システム、例えば酵素、とカップリングした二次抗体を、添加し、そして適切な基質を添加した後、スポットの数を数える。
【０２８０】
それぞれ単一の抗原特異的Ｔ細胞に対応するスポットの数は、最初に加えた細胞の総数と関連する。
【０２８１】
上記の実施例も、ＴＢ感染した個体をＢＣＧワクチン接種した個体と区別するために使用され得る抗原の使用を記載する。これは、より差別的な診断アッセイに使用され得る。
【０２８２】
以下の表２〜４に、好ましいプロモーター、ペプチド、および本発明の対応するＤＮＡコード配列を挙げる。
【０２８３】
【表２】
2004514451.tif 000003
【０２８４】
【表３】
2004514451.tif 000004
【０２８５】
【表４】
2004514451.tif 000005
【０２８６】
参考文献：
１．ＭｃＫｉｎｎｅｙ， Ｊ．Ｄ．ら， Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ ｓｈｕｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ ［コメントを参照のこと］． Ｎａｔｕｒｅ， ２０００． ４０６（６７９７）： ｐ． ７３５−８；
２．Ｐｅｌｉｃｉｃ， Ｖ．ら， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９７． ９４（２０）： ｐ． １０９５５−６０；
３．Ｌｅｅ， Ｍ．Ｈ．ら， Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｌ５： ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ− ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， ａｎｄ ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９１． ８８（８）： ｐ． ３１１１−５；
４．ＭｃＳｈａｎｅ， Ｈ．ら， Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＤ４（＋） ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， ２００１． ６９（２）： ｐ． ６８１−６；
５．Ｍｏｖａｈｅｄｚａｄｅｈ， Ｆ．， Ｍ．Ｊ． Ｃｏｌｓｔｏｎ， およびＥ．Ｏ． Ｄａｖｉｓ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＬｅｘＡ： ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｈｅｏ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ−ｔｙｐｅ ＳＯＳ） ｂｏｘ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９７． １４３（Ｐｔ ３）： ｐ． ９２９−３６。
【０２８７】
追加の参考文献：
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Ｌｅｆｅｖｅｒ， Ｐ．， Ｏ． Ｄｅｎｉｓ， Ｌ． Ｄｅ Ｗｉｔ， Ａ． Ｔａｎｇｈｅ， Ｐ． Ｖａｎｄｅｎｂｕｓｓｃｈｅ， Ｊ． Ｃｏｎｔｅｎｔ， およびＫ． Ｈｕｙｇｅｎ． ２０００． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ２２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ６８：１０４０−１０４７；
Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒ， Ｈ． Ｍ．， Ｐ． Ｊ． Ｃｏｃｋｌｅ， Ａ． Ｏ． Ｗｈｅｌａｎ， Ｓ． Ｒｈｏｄｅｓ， Ｍ． Ａ． Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｄ． Ｃｌｉｆｆｏｒｄ， Ｋ． Ｈｕｙｇｅｎ， Ｒ． Ｔａｓｃｏｎ， Ｄ． Ｌｏｗｒｉｅ， Ｍ． Ｊ． Ｃｏｌｓｔｏｎ， およびＲ． Ｇ． Ｈｅｗｉｎｓｏｎ． ２０００． Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ＭＰＢ８３ ａｎｄ ＭＰＢ７０ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ． Ｖａｃｃｉｎｅ． １９：１２４６−１２５５；
Ｃｈｅｎｇ， Ｗ．， Ｃ． Ｈｕｎｇ， Ｃ． Ｃｈａｉ， Ｋ． Ｈｓｕ， Ｌ． Ｈｅ， Ｃ． Ｒｉｃｅ， Ｍ． Ｌｉｎｇ， およびＴ． Ｗｕ． ２００１． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｇｅｎｅ ｔｏ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：６２１８−６２２６；
Ｌａｌｖａｎｉ， Ａ．ら， ２００１． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｎｔａｃｔ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５７：２０１７−２０２１。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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