(57)【要約】本発明は、本明細書に開示の式（Ｉ）の化合物、およびこれらの化合物を含む薬学的組成物に関する。また、ＬＰＡ受容体の作用薬および拮抗薬としての活性を有するこれらの化合物の使用法についても開示する。このような方法は、ＬＰＡ受容体上でＬＰＡの活性を阻害する、ＬＰＡ受容体の活性を調節する、癌を治療する、細胞増殖を促進する、および創傷を治療することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）に記載の化合物：
【化１】
2004506604.tif 000126
ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−であり、Ｘ１およびＸ２が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−であるか、またはＸ１およびＸ３が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−ＮＨ−であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、Ｒ１−Ｙ１−Ａ−であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち２つがＲ１−Ｙ１−Ａ−であればそれぞれが同一であっても異なってもよく、またはＸ２とＸ３が互いに結合した−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−であり；
選択的にＸ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つがＨであり；
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、Ｙ１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−、
−Ｏ−、−Ｓ−、
【化２】
2004506604.tif 000127
または−ＮＲ２−であり、
Ｚ１が、ｍが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｍ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−、―ＮＨ−、−Ｏ−、もしくは−Ｓ−であり；
Ｚ２が、ｎが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、もしくは−Ｏ−であり；Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ４、＝Ｏ、Ｈおよび−ＮＲ５Ｒ６の組み合わせであり；
Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のそれぞれについてＲ１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
【化３】
2004506604.tif 000128
【化４】
2004506604.tif 000129
【化５】
2004506604.tif 000130
【化６】
2004506604.tif 000131
【化７】
2004506604.tif 000132
【化８】
2004506604.tif 000133
または
【化９】
2004506604.tif 000134
であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり、
ここで式（Ｉ）の化合物がリゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、環状ホスファチジン酸、アルケニルグリセロールリン酸、ジオクチルグリセロールピロリン酸、またはＮ−パルミトイル−Ｌ−セリンである。
【請求項２】
Ｑ１およびＱ２がいずれもＨ２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つが（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ２−であり、ここでＺ１とＺ２がＯであり、さらに、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つがＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでそれぞれＡが直接結合でＹ１がＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｑ１がＨ２であり、
Ｑ２が＝Ｏであり、
Ｘ１が（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−であり、ここでＺ１がＯであり、かつ
Ｘ２とＸ３がＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでそれぞれＡが直接結合でＹ１が−ＮＨ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ３が−ＮＨ２であり、Ｘ２が−ＮＨＲ１であり、ここでＲ１がＣ１４からＣ１８のアルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＣ１４アルキルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＣ１８アルキルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ３が−ＮＨＲ１であり、ここでＲ１がアセチル基であり、Ｘ２が−ＮＨＲ１であり、ここでＲ１がＣ１４アルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
Ｑ１が＝ＮＲ４であり、
Ｑ２がＨ２であり、
Ｘ１およびＸ２が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−であり、かつ
Ｘ３がＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでＡが直接結合しており、Ｙ１が−ＮＨ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｑ１およびＱ２がいずれもＨ２であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つが（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−であり、ここでＺ１がＯであり、かつ
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つがＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでＡが直接結合しており、Ｙ１が−Ｏ−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がＣ２１アルキルを含むアシルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１がＣ１８アルキルある、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体と請求項１に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項１３】
ＬＰＡ受容体上でＬＰＡ活性を阻害する方法であって、
ＬＰＡ受容体の拮抗薬としての活性を有する請求項１に記載の化合物を提供する段階、および
ＬＰＡによって誘導されるＬＰＡ受容体の活性を効果的に阻害する条件下でＬＰＡ受容体を化合物と接触させる段階を含む方法。
【請求項１４】
ＬＰＡ受容体が細胞表面に存在し、前記接触をインビトロで実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＬＰＡ受容体が細胞表面に存在し、前記接触をインビボで実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＬＰＡ受容体がＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＬＰＡ受容体活性を調節する方法であって、ＬＰＡ受容体作用薬もしくはＬＰＡ受容体拮抗薬のいずれかとしての活性を有する請求項１に記載の化合物を提供する段階、および
ＬＰＡ受容体の活性を効果的に調節する条件下でＬＰＡ受容体を化合物と接触させる段階を含む方法。
【請求項１８】
ＬＰＡ受容体が細胞表面に存在し、前記接触をインビトロで実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＬＰＡ受容体が細胞表面に存在し、前記接触をインビボで実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＬＰＡ受容体がＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、 ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
化合物がＬＰＡ受容体作用薬としての活性を有し、前記接触を、ＬＰＡ受容体活性を効果的に誘導する条件下で実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
化合物がＬＰＡ受容体拮抗薬としての活性を有し、前記接触を、ＬＰＡ受容体の活性を効果的に低下させる条件下で実施する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
癌の治療法であって、請求項１に記載の化合物を提供する段階、および
癌の治療に効果的な方法で化合物を効果的な量投与する段階を含む治療法。
【請求項２４】
癌が前立腺癌もしくは卵巣癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
化合物がＬＰＡ受容体拮抗薬であり、前記投与が、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害するＬＰＡ受容体に化合物が結合する癌細胞に化合物を送達する段階を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物を癌細胞に送達すると、癌細胞を破壊する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
細胞増殖を促進する方法であって、ＬＰＡ受容体の作用薬としての活性を有する請求項１に記載の化合物を提供する段階、および
細胞表面のＬＰＡ受容体をＬＰＡ受容体誘導型細胞増殖を促進するために効果的である方法で化合物と接触させる段階を含む方法。
【請求項２８】
ＬＰＡ受容体がＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞がインビトロである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
細胞がインビボである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
創傷の治療法であって、
ＬＰＡ受容体の作用薬としての活性を有する請求項１に記載の化合物を提供する段階、および
創傷治癒を促進する細胞のＬＰＡ受容体に化合物が結合する創傷部位に効果的な量の化合物を送達することによって、創傷治癒を促進するためにＬＰＡ受容体の作用薬により誘導される細胞増殖を刺激する段階を含む治療法。
【請求項３２】
送達が化合物と薬学的に許容される担体からなる組成物の創傷部位へ導入する段階を含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
創傷部位が体の外側のものであって、前記導入が組成物を創傷部位に局所的に投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の化合物を生成する方法であって、
（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１１−Ｚ１３もしくは（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１１−Ｚ１３を（ここで、Ｚ１１がｍが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｍ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−もしくは−Ｏ−であり；
Ｚ１２がｎが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、もしくは−Ｏ−であり；
Ｚ１３がＨもしくは第一の脱離基、もしくは第一の脱離基とともに形成している−Ｚ１１−Ｚ１３であり；
かつＹ２がＨもしくは保護基である）、式（ＶＩ）の中間体化合物と反応させ、
【化１０】
2004506604.tif 000135
ここで、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つが、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち二つがＲ１１−Ｙ１１−Ａ−もしくはである、またはＸ１２およびＸ１３が互いに結合して−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１１）−となっている場合にはそれぞれが同一であっても異なるものであってもよいＲ１１−Ｙ１１−Ａ−であり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つが、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨもしくは第二の脱離基であり；
選択的に、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３の１つがＨであり；
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、
Ｙ１１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−、−Ｏ−、
【化１１】
2004506604.tif 000136
−Ｓ−、または−ＮＲ１２−であり、
Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ１３、＝Ｏ、Ｈおよび−ＮＲ１４Ｒ１５の組み合わせであり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のそれぞれについてＲ１１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
【化１２】
2004506604.tif 000137
【化１３】
2004506604.tif 000138
【化１４】
2004506604.tif 000139
【化１５】
2004506604.tif 000140
【化１６】
2004506604.tif 000141
【化１７】
2004506604.tif 000142
または
【化１８】
2004506604.tif 000143
であり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１７が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキルを含むアリールアルキル、もしくは直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキルを含むアリールオキシアルキルであり、
反応後に、脱保護の工程を実施し、必要に応じて、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち１つまたは２つが（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−である式（Ｉ）に記載の化合物を生産するために効果的な条件の下で反応および脱保護の両方の工程を実施することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年３月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／１９０，３７０号に基づくものであり、その全文が本明細書に参照として組み入れられる。
【０００２】
本発明の一部は、米国国立保健研究所の助成金（助成金番号ＨＬ０７６４１−１２およびＧＭ４３８８０）および全米科学財団の助成金（助成金番号ＩＢＮ−９７２８１４７）によるものであった。米国政府が本発明の権利の一部を保有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、リゾホスファチジン酸（「ＬＰＡ」）誘導体であってＬＰＡ受容体に対し作用薬もしくは拮抗薬のいずれかとしての活性を示す該誘導体、およびその各種治療用途に関するものであり、治療用途には前立腺癌治療、卵巣癌治療および創傷治癒が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００４】
発明の背景
非形質転換細胞はいずれも、その生存および増殖に増殖因子を必要とする。ポリペプチド性の増殖因子のほかにも、増殖因子様の性質を有する脂質の新規のクラスが発見され、総称してリン脂質増殖因子（ＰＬＧＦ）と呼ばれている。ＰＬＧＦは、ほとんどの休止期の細胞を増殖誘導する際に、類似した性質を有しているが（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４ａ、Ｔｏｋｕｍｕｒａ １９９５、Ｍｏｏｌｅｎａａｒら、１９９７）、構造的にはさらに大まかな二つのカテゴリーに分類することができる。第一のカテゴリーには、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質伝達物質（ＧＰＭ）が含まれる。ＧＰＭの例としては、ＬＰＡ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、環状ホスファチジン酸（環状ＰＡ）、アルケニルグリセロールリン酸（アルケニルＧＰ）、およびリゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）が挙げられる。第二のカテゴリーには、スフィンゴシン塩基のモチーフを有するスフィンゴリン脂質伝達物質（ＳＰＭ）が含まれる。ＳＰＭの例としては、スフィンゴシン−１−リン酸（ＳＰＰ）、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸、スフィンゴシルホスフォリルコリン（ＳＰＣ）、およびスフィンゴシン（ＳＰＨ）が挙げられる。
【０００５】
ＬＰＡ（Ｔｉｇｙｉら、１９９１、ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２）、ＰＡ（Ｍｙｈｅｒら、１９８９）、アルケニルＧＰ（Ｌｉｌｉｏｍら、１９９８）、環状ＰＡ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９９）、ＳＰＰ（Ｙａｔｏｍｉら、１９９５）、およびＳＰＣ（Ｔｉｇｙｉら、２０００）については、血清中で検出された。これらの脂質伝達物質については、同定、特徴付けがなされている。血清および血漿中には未知のＰＬＧＦが存在し、これらは増殖因子様の性質を示す（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２）。ＬＰＡはおおよそ２０μＭの濃度であり、血清中で最も豊富に存在するＰＬＧＦである（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２、Ｊａｌｉｎｋら、１９９３）。
【０００６】
真核細胞では、ＬＰＡは主に小胞体（ＥＲ）膜で起こるリン脂質の生合成の初期段階における重要な中間体である（Ｂｏｓｃｈ、１９７４、ＢｉｓｈｏｐおよびＢｅｌｌ、１９８８）。ＬＰＡはＥＲにおいてグリセロール３リン酸に対するアセチルＣｏＡの作用によって生じ、さらにアセチル化されてＰＡとなる。ＬＰＡがアセチル化されてＰＡになる速度は大変速いため、生合成部位でＬＰＡが蓄積することはほとんどない（Ｂｏｓｃｈ、１９７４）。ＬＰＡはＥＲに限定されているため、その代謝中間体としての役割は、シグナル伝達分子としての役割とほとんど関連ないと考えられる。
【０００７】
ＬＰＡは血清の成分であり、そのレベルは低濃度のマイクロモル範囲（μＭ）にある（Ｅｉｃｈｏｌｔｚら、１９９３）。ＬＰＡは凝固過程において活性化血小板から放出されるので、このレベルが推測される。血清とは異なり、新鮮血や血漿では検出できない（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２、Ｅｉｃｈｏｌｔｚら、１９９３）。ＬＰＡは血清中でアルブミンと結合しており、全血清中において熱安定性で非透析性の生物学的活性の大部分を占めるものである（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９４）。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵細胞で内向き塩素電流を誘発させる血清中の活性成分は、ＬＰＡ（１８：０）であることが同定された（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２）。アルブミン結合ＬＰＡ（１８：０）の大部分は、リゾＰＣに対するリゾホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の作用によるものではなく、むしろ凝固過程で生産されるものである。後者の経路はヘパリンもしくはクエン酸とブドウ糖の作用によって脱凝固した「老化」血漿中でのＬＰＡの存在に関与している（Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９８６）。他に特記すべき点としては、ＥＤＴＡを用いた血漿にはＬＰＡが存在しない点である。このことは、血漿のリゾホスホリパーゼがＣａ２＋依存性であることを示している（Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９８６）。
【０００８】
アルブミンの役割は、血清中に存在するホスホリパーゼの作用からＬＰＡを保護することである（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２）。ティギ（Ｔｉｇｙｉ）とマイレディ（Ｍｉｌｅｄｉ）は、アルブミンが血流中でＬＰＡの担体として働いているだけでなく、生理学的半減期を延ばす役割もあることを示唆した。アフリカツメガエルの卵細胞で塩素電流を誘発させる際、血清中のＬＰＡの作用を模倣する血清アルブミンに存在する脂質伝達物質には未同定のものがある。
【０００９】
ＬＰＡ反応性の細胞種には、粘性糸状アメーバやアフリカツメガエルの卵細胞から哺乳動物の体細胞までに及ぶ。従って、ＬＰＡの供給源とその放出は活性化血小板のみに限定されない可能性が高いように思われる。最近の実験により、ペプチド性の増殖因子で刺激すると、哺乳動物の線維芽細胞は速やかにＬＰＡを産生し、細胞外培養液中に放出されることが示された（ＦｕｋａｍｉおよびＴａｋｅｎａｗａ、１９９２）。
【００１０】
卵巣癌の患者の腹水中には、どの細胞に由来するのか明らかではない生理活性ＬＰＡが比較的多量に存在することを示す証拠があり、このような患者の腹水が卵巣癌の細胞に対し細胞分裂活性を示すことが知られている（Ｍｉｌｌｓら、１９８８、Ｍｉｌｌｓら、１９９０）。これを細胞外の体液へと分泌するのが腫瘍細胞であるのか、白血球細胞であるのか、またはより複雑な脂質から各種のホスホリパーゼの作用により生成されるのかについては解っていない。
【００１１】
ＧＰＭよびＳＰＭは、系統樹にわたる多種多様な細胞応答を誘起する（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３ａ）。ＬＰＡは一過的なＣａ２＋シグナルを誘起させる。このようなＣａ２＋シグナルは、様々な細胞の細胞内貯蔵物に由来するものである。このような細胞としては、神経細胞（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３、Ｄｕｒｉｅｕｘら、１９９２）、血小板、正常および形質転換した線維芽細胞（Ｊａｌｉｎｋら、１９９０）、上皮細胞（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９８９、Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９１）、およびアフリカツメガエルの卵細胞（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２、Ｄｕｒｉｅｕｘら、１９９２、Ｆｅｒｎｈｏｕｔら、１９９２）等である。ＬＰＡは血小板凝集（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、１９７９、Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９８１、Ｇｅｒｒａｎｄら、１９７９、Ｓｉｍｏｎら、１９８２）、および平滑筋収縮（Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９８０、Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９９４）を誘起する。静脈内投与すると、血圧を種依存的に変化を誘導する（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、１９７９、Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９７８）。
【００１２】
休止期の線維芽細胞に添加した場合には、ＬＰＡはＤＮＡ合成と細胞分裂を刺激する（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９８９、ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９９２）。このようなＰＬＡの増殖因子様の効果には、ペプチド性増殖因子の存在は不要である。このような所見によれば、ＬＰＡは、細胞増殖を継続させるためにインシュリンもしくは上皮成長因子の存在を必要とするエンドテリンおよびバソプレッシンとは異なるものである（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９１）。特記すべき点は、Ｓｐ２ミエローマ細胞において、ＬＰＡがｃＡＭＰレベルの増加によって仲介される抗細胞分裂応答を担っていたという点である（Ｔｉｇｙｉら、１９９４、Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９８）。細胞分裂経路と異なり、抗細胞分裂経路は百日咳毒素（ＰＴＸ）によって影響を受けない。また、フォルスコリンおよびイソブチルメチルキサンチンを添加することによって、ＬＰＡのＳｐ２ミエローマ細胞に対する抗細胞分裂作用は付加的であっった（Ｔｉｇｙｉら、１９９４）。線維芽細胞における限局性接着およびストレス繊維の形成を含む各種の細胞の細胞骨格変化を、ＬＰＡは引き起こす（ＲｉｄｌｅｙおよびＨａｌｌ、１９９２）。ＬＰＡはまた、発生中の神経突起の収縮を誘起することにより神経芽細胞腫の分化の逆行および抑制を促進する（Ｊａｌｉｎｋら、１９９４ａ、Ｊａｌｉｎｋら、１９９４ｂ）。血清飢餓状態の神経芽細胞腫Ｎ１Ｅ−１１５細胞にＬＰＡをナノモル（ｎｍｏｌ）量で添加すると、即座に神経突起収縮が起こり、これは迅速ではあるが一過性の細胞体の球状化により行なわれた（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３ｂ）。継続的なＬＰＡの存在が提供される場合には、神経芽細胞腫の細胞は未分化形質に関しては保持しているが、細胞分裂できなくなる（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３ｂ）。細胞周期を進めるために、インシュリン様増殖因子等の他の因子が必要であった。一度、この細胞が形態的に分化すると、ＬＰＡの添加によってこの形態変化が逆戻りする。従って、ＬＰＡで誘導した神経突起収縮は、基層への接着の消失によるものであるよりもむしろ、アクチン細胞骨格の収縮によって起こるものである（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３ａ、Ｊａｌｉｎｋら、１９９４ｂ）。
【００１３】
他の生理学的な化学誘引物質（例えば、インターロイキン８）と同様にＬＰＡは、ヒト単球において走触的な機序による細胞遊走を誘起する（Ｚｈｏｕら、１９９５）。細胞遊走を誘導に加えて、ＬＰＡは、単層の中皮細胞に対する肝癌細胞および癌細胞の浸潤を促進する（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９３）。この浸潤の基礎になる機序は現在のところ不明であるが、細胞運動の亢進と細胞接着の増加によるも可能性がある。最後に、ＬＰＡが新生児の心筋細胞のアポトーシスを遮断することも知られている（Ｕｍａｎｓｋｙら、１９９７）。
【００１４】
環状ＰＡと名付けられた独特の天然のリン脂質は、細胞の種類に応じて、他のＧＰＭと類似したもしくは相反する作用を細胞に与えることが示された。アフリカツメガエルの卵細胞を用いて試験を行うと、他のＧＰＭと全く同様に塩素電流を誘発させたが、この応答はＬＰＡによって脱感作しなかった（Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９８）。ムカカミ−ムロフシ（Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ）ら（１９９３）は環状ＰＡが増殖を引き起こすＬＰＡとは異なり、抗増殖性の作用を示すことを報告していた。
【００１５】
ＰＬＧＦ受容体（ＰＬＧＦＲ）は、７回膜貫通型（７ＴＭ）グアニン・ヌクレオチド結合制御蛋白質（Ｇ蛋白質）結合型受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属している。７ＴＭ型ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇ蛋白質との相互作用による細胞応答を媒介する細胞表面受容体ファミリーである。ＬＰＡ受容体は複数同定されており、特にＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４が含まれる。これらのＬＰＡ受容体およびその他のものについて、関連を示す系統樹を図１に示す。
【００１６】
１９９６年に、ヘクト（Ｈｅｃｈｔ）らは、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法により、推定サーペンチン受容体をコードするｃＤＮＡをマウスの新皮質細胞株からクローニングした（Ｈｅｃｈｔら、１９９６）。この遺伝子は脳室領域遺伝子１（Ｖｚｇ−１）と名付けられた。この遺伝子は、皮質神経組織発生領域に発現し、分子量４１ｋＤａ（３６４アミノ酸）の蛋白質をコードしていた。Ｖｚｇ−１は、内皮分化遺伝子２（ＥＤＧ−２）と命名された未報告のヒツジの配列と非常に類似していた。同一のｃＤＮＡはマウスおよびウシのライブラリーからもオーファン受容体として単離されており、ｒｅｃ１．３として報告されたものであった（Ｍａｃｒａｅら、１９９６）。これはマウスの様々な組織に分布しており、脳と心臓で発現が最も高かった。
【００１７】
１９９６年に、グオ（Ｇｕｏ）らは、ＰＣＲによるプロトコールを用いて、別のＬＰＡ受容体と推定されるＰＳＰ−２４（３７２アミノ酸）をアフリカツメガエルの卵細胞から単離した（Ｇｕｏら、１９９６）。この受容体は、Ｖｚｇ−１／ＥＤＧ−２／ｒｅｃ１．３にほとんど類似性を示さなかった（Ｇｕｏら、１９９６）。ＥＤＧ−２ヒトＬＰＡ受容体のｃＤＮＡ配列を使用したスフィンゴ脂質受容体の配列検索によって、よく似た２種類のＧＰＣＲが得られ、ラットＨ２１８（ＥＤＧ−５、３５４アミノ酸）およびＥＤＧ−３（３７８アミノ酸）と命名された（Ａｎら、１９９７ａ）。ノーザン解析の結果、ＥＤＧ−３およびＥＤＧ−５でコードされるｍＲＮＡの発現は心臓組織で高いことが明らかとなった。
【００１８】
ＬＰＡの機能的受容体としてＥＤＧ−２が最近同定され、これをもとにアン（Ａｎ）らはＬＰＡ受容体の新規のサブタイプを配列検索した（Ａｎら、１９９８ａ）。ＧＰＣＲをコードするヒトのｃＤＮＡを得て、ＥＤＧ−４と名付けた（Ａｎら、１９９８ａ）。ノーザンブロット解析の結果、ＥＤＧ−２とＥＤＧ−４は共にＧＭＰ受容体として働き、組織における分布は非常に異なっていることが解った。ＥＤＧ−２とは異なり、ＥＤＧ−４は主に末梢血リンパ球細胞と精巣で発現していた（Ａｎら、１９９８ａ）。
【００１９】
ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡにより、ヒトのジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞からＥＤＧファミリーに属するがこれまで未知であったＧＰＣＲが同定された。同定されたこのＧＰＣＲはＥＤＧ−７と命名された。これは４０ｋＤａの分子量を有している（３５３アミノ酸）。ノーザンブロット解析を行い、ヒトの組織におけるＥＤＧ−７の発現を調べたところ、心臓、膵臓、前立腺、および精巣で発現していることが明らかとなった（Ｂａｎｄｏｈら、１９９９）。このように、２種類の異なるＰＬＧＦ受容体のファミリー、ＰＳＰ２４およびＥＤＧ、が存在する。合計では１０種類のＰＬＧＦＲである（図１）。このリストはさらに増え続けている。
【００２０】
以下の表１に示すように、これら各種の受容体はそのＧＰＭおよびＳＰＭに対するリガンド特異性を基に分類することができる。
【表１】リン脂質増殖因子受容体、長さおよび主なリガンド
2004506604.tif 000002
アフリカツメガエルのＰＳＰ２４およびマウスで発現するＰＳＰ２４は、特異的にＧＰＭ（ＬＰＡ、Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９８）により誘起される振動性塩素電流を媒介する。これらは構造的にはＥＤＧファミリーと相同ではない（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２、Ｆｅｒｎｈｏｕｔら、１９９２）。ＥＤＧファミリーは２種類の異なる亜群に分類されうる。第一の群は、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４およびＥＤＧ−７を含み、ＧＰＭのみに受容体として働き（Ｈｅｃｈｔら、１９９６、Ａｎら、１９９８ａ、Ｂａｎｄｏｈら、１９９９、Ａｎら、１９９８ｂ）、リガンド結合に応答して様々なシグナルを伝達する。第二の群は、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−５、ＥＤＧ−６およびＥＤＧ−８を含み、ＳＰＭに特異的である（Ａｎら、１９９７ａ、Ｉｍら、２０００、ｖａｎ Ｂｒｏｃｋｌｙｎら、１９９８、ｖａｎ Ｂｒｏｃｋｌｙｎら、２０００、ＳｐｉｅｇｅｌおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ ２０００）。各種ＰＬＧＦＲを発現する主な組織については、以下の図２に示す。
【表２】リン脂質増殖因子受容体のヒト組織における発現
2004506604.tif 000003
【００２１】
ＰＬＧＦは複数のＧ蛋白質媒介性シグナル伝達現象を活性化する。これらの過程は、ヘテロ三量体Ｇ蛋白質ファミリー、Ｇｑ／１１、Ｇｉ／０、およびＧ１２／１３により媒介される（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９７、ＳｐｉｅｇｅｌおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９５、Ｇｏｈｌａら、１９９８）。
【００２２】
Ｇｑ／１１経路はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化を担い、この活性化によって次にイノシトール３リン酸（ＩＰ３）の生成が誘導され、さらにＣａ２＋動員が多様な細胞で起こる（Ｔｏｋｕｍｕｒａ、１９９５）。この応答がＰＴＸ感受性である細胞もあり、このことは複数のＰＴＸ感受性および非感受性経路が関わっていることを示す（Ｔｉｇｙｉら、１９９６）。この経路はジアシルグリセロール（ＤＡＧ）媒介性のプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化も担っている。ＰＫＣは、ホスファチジルコリンの遊離のコリンとＰＡへの加水分解を担う細胞内ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）を活性化する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｎｄら、１９９２ａ）。また、特定の種類の細胞では、ＰＬＣは直接的に、もしくはＰＫＣのＤＡＧ活性化を経てＭＡＰキナーゼを活性化することができる（Ｇｈｏｓｈら、１９９７）。
【００２３】
細胞分裂のシグナル伝達経路はＧ蛋白質のヘテロ三量体Ｇｉ／０サブユニットによって媒介される。トランスフェクションを用いた研究は、αｉサブユニットよりむしろＧｉβγ二量体がＲａｓ−ＭＡＰキナーゼ活性化を担うことを示している。Ｒａｓの活性化は、ＥＧＦ（Ｃｕｎｎｉｃｋら、１９９８）やＰＤＧＦ受容体（Ｈｅｒｒｌｉｃｈら、１９９８）等の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のトランス活性化に先行される。トランス活性化したＲＴＫはＲａｓを活性化し、これによってＲａｆを経てＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１、２）が活性化される。ＰＴＸ感受性であるＧｉαサブユニットは、アデニルシクラーゼ（ＡＣ）を阻害し、その結果該受容体をリン酸化し脱感作するＧ蛋白質結合受容体キナーゼ（ＧＲＫ）にβγ二量体が結合する。βアレスチンによりリン酸化された受容体が補充され、ｓｒｃキナーゼを補充する。ｓｒｃキナーゼはＥＧＦ受容体をリン酸化し活性型の構造に変換する（Ｌｉｎら、１９９７、Ａｈｎら、１９９９、Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、１９９９）。トランス活性化されたＲＴＫは、次に、Ｒａｓを活性化し、これによりＲａｆを経てＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１、２）の活性化が起こる。ＰＴＸ感受性であるＧｉαサブユニットはＡＣを阻害し、その結果サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルが下がる。ＬＰＡによる逆方向の細胞の効果、すなわち、細胞分裂と抗細胞分裂は、ｃＡＭＰの第二メッセンジャー系に対する相反する効果によって起こる。細胞分裂はｃＡＭＰのレベルを下げるＧｉα経路によって媒介され（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９８９、ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９９２）、抗細胞分裂は非ＰＴＸ感受性でＣａ２＋依存的なｃＡＭＰレベルの上昇によって起こる（Ｔｉｇｙｉら、１９９４、Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９８）。
【００２４】
対照的に、アクチン細胞骨格の再構成を起こすＰＴＸ非感受性のＧＩ２／Ｉ３シグナル伝達経路に関してはほとんど何も解っていない。この経路にはＲＴＫのトランス活性化（Ｌｉｎら、１９９７、Ａｈｎら、１９９９、Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、１９９９、Ｇｏｈｋａら、１９９８）および小型ＧＴＰａｓｅ、Ｒｈｏへの収束（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９７）も含まれるものと考えられる。Ｒｈｏの下流のシグナル伝達に関してはもっとよくわかっている。なぜなら、各種の蛋白質パートナーが単離、同定されているからである。ＲｈｏはＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを活性化する。このＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼはミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣホスファターゼ）をリン酸化することによって阻害する（Ｋｉｍｕｒａら、１９９６）。この経路によりリン酸化型ＭＬＣの蓄積が起こり、神経突起の収縮等の細胞効果を与える細胞骨格応答（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２、Ｔｉｇｙｉら、１９９６、Ｄｙｅｒら、１９９２、Ｐｏｓｔｍａら、１９９６、Ｓａｔｏら、１９９７）、ストレス繊維の誘導（ＲｉｎｄｌｅｙおよびＨａｌｌ、１９９２、Ｇｏｎｄａら、１９９９）、走化性の刺激（Ｊａｌｉｎｋら、１９９３ａ）、細胞遊走（Ｚｈｏｕら、１９９５、Ｋｉｍｕｒａら、１９９２）、および腫瘍細胞浸潤（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９３、Ｉｍａｍｕｒａら、１９９６）を起こす。ＰＬＧＦ誘導性でＲｈｏ媒介性の腫瘍細胞浸潤はＡＤＰ依存的機序でＲｈｏを特異的にリボシル化するＣ． ボタリニウム（Ｃ． Ｂｏｔｕｌｉｎｉｕｍ）Ｃ３毒素により阻止される（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９６）。
【００２５】
Ｒｈｏはまた、休止期の線維芽細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する作用を有する（ＭａｒｃｈｅｓｋｙおよびＨａｌｌ、１９９６、Ｒｉｄｌｅｙ １９９６）。ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅの発現によって、初期遺伝子の転写を媒介する血清応答因子（ＳＲＦ）が活性化さる（Ｈｉｌｌら、１９９５）。さらに、ＰＬＧＦ（ＬＰＡ）は腫瘍細胞浸潤を誘導する（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９６）。しかし、これが細胞骨格の変化もしくは遺伝子の転写のいずれか、またはその両方に関与しているか否かは今のところ明らかではない。
【００２６】
多くの細胞内経路および増殖および／もしくは遊走等の細胞活性にＬＰＡ／ＬＰＡ受容体が関与していること、および創傷治癒および癌に関連があることから、上記の同定されたＬＰＡ受容体に対し、好ましくは選択的に拮抗薬もしくは作用薬として働くことのできる新規の化合物を同定することは重要であると考えられる。
【００２７】
現在のところ、ＬＰＡ受容体に対する合成もしくは内因性の阻害剤に既知のものはほとんどない。現在までに報告されている拮抗薬のうちで、最も効果のあるものはＳＰＨ、ＳＰＰ、Ｎ−パルミトイル−Ｌ−セリン（Ｂｉｔｔｍａｎら、１９９６）、およびＮ−パルミトイル−Ｌ−チロシン（Ｂｉｔｔｍａｎら、１９９６）であった。上記の化合物はアフリカツメガエルの卵細胞におけるＬＰＡ誘起性の塩素電流を阻害することが知られている（Ｂｉｔｔｍａｎら、１９９６、Ｚｓｉｒｏｓら、１９９６）。しかし、これらの化合物はすべての細胞系で調べられているわけではない。ＳＰＰも腫瘍細胞浸潤を阻害することが知られているが、ＳＰＰがＬＰＡの阻害剤であるためなのか、自身の受容体の作用によるためなのかについては明らかではない。Ｎ−パルミトイル−Ｌ−セリンおよびＮ−パルミトイル−Ｌ−チロシンもＬＰＡ誘導性の血小板凝集を阻害する（Ｓｕｇｉｕｒａら、１９９４）が、これらの化合物がＬＰＡ受容体に作用するか否かについては明らかではない。リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）はＬＰＡ作用をある程度阻害することが示された最初の脂質であった（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｎｄら、１９９２ｂ）。しかし、これは複数種類のＬＰＡ応答性細胞種に検出されなかった（Ｌｉｌｉｏｍら、１９９６）。これらの阻害剤は、いずれも特定のＬＰＡ受容体に選択的には作用することが示されているわけではなかった。
【００２８】
ポリスルホン化化合物であるスラミンは、可逆的および用量依存的にＬＰＡ誘導性ＤＮＡ合成を阻害することが示された。しかし、スラミンはＬＰＡ受容体に対し何らの特異性も持たず、非常に高いミリモル（ｍＭ）濃度でのみＬＰＡの作用を遮断することが示された（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９９２）。
【００２９】
現在のところＬＰＡ作用薬および拮抗薬に関してはこのように貧弱であるが、本発明はこれを克服することを目的とする。
【００３０】
発明の概要
本発明は下記の式（Ｉ）に係る化合物に関する。
【化１９】
2004506604.tif 000004
ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−であり、Ｘ１およびＸ２が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−であるか、またはＸ１およびＸ３が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−ＮＨ−であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、Ｒ１−Ｙ１−Ａ−であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち２つがＲ１−Ｙ１−Ａ−であればそれぞれが同一であっても異なっていてもよく、またはＸ２とＸ３が互いに結合した−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−であり；
選択的にＸ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つがＨであり；
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、Ｙ１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−、−Ｏ−、
【化２０】
2004506604.tif 000005
−Ｓ−、または−ＮＲ２−であり；
Ｚ１が、ｍが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｍ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−、―ＮＨ−、−Ｏ−、もしくは−Ｓ−であり；
Ｚ２が、ｎが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、もしくは−Ｏ−であり；
Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ４、＝Ｏ、もしくはＨと−ＮＲ５Ｒ６の組み合わせであり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のそれぞれについてＲ１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
【化２１】
2004506604.tif 000006
【化２２】
2004506604.tif 000007
【化２３】
2004506604.tif 000008
【化２４】
2004506604.tif 000009
【化２５】
2004506604.tif 000010
【化２６】
2004506604.tif 000011
または
【化２７】
2004506604.tif 000012
であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり；
ここで式（Ｉ）の化合物がリゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、環状ホスファチジン酸、アルケニルグリセロールリン酸、ジオクチルグリセロールピロリン酸、もしくはＮ−パルミトイル−Ｌ−セリンではない。
【００３１】
また、本発明の化合物と薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も開示される。
【００３２】
さらに本発明の一局面は、ＬＰＡ受容体拮抗薬としての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体のＬＰＡによって誘起される活性を効果的に阻害する条件下で、該化合物をＬＰＡ受容体と接触させる段階を含む、ＬＰＡ受容体のＬＰＡ誘導性活性を阻害する方法に関する。
【００３３】
本発明の別の一局面は、ＬＰＡ受容体の作用薬もしくは拮抗薬のいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体の活性を効果的に調節する条件下でＬＰＡ受容体に該化合物を接触させる段階を含む、ＬＰＡ受容体の活性を調節する方法に関する。
【００３４】
本発明のさらに別の局面は、本発明の化合物を提供する段階、および癌を効果的に治療する方法で患者に該化合物を効果的な量を投与する段階を含む、癌の治療法に関する。
【００３５】
本発明のさらに別の局面は、ＬＰＡ受容体の作用薬の活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体により誘導される細胞増殖の促進が効果的に起こる方法で細胞上のＬＰＡ受容体に該化合物を接触させる段階を含む細胞増殖を促進する方法に関する。
【００３６】
本発明のさらに別の局面は、ＬＰＡ受容体の作用薬の活性を有する本発明の化合物を提供する段階、および創傷治癒を促進する細胞のＬＰＡ受容体に該化合物が結合する創傷部位に効果的な量の該化合物を送達することによって、創傷治癒を促進するためにＬＰＡ受容体の作用薬により誘導される細胞増殖を刺激する段階を含む、創傷を治療する方法に関する。
【００３７】
本発明のさらに別の局面は、本発明の化合物を生成する方法に関する。本発明の化合物を生成する方法の１つには、
（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１１−Ｚ１３もしくは（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１１−Ｚ１３を（ここで、Ｚ１１がｍが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｍ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−もしくは−Ｏ−であり；
Ｚ１２がｎが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、もしくは−Ｏ−であり；
Ｚ１３がＨもしくは第一の脱離基、もしくは該第一の脱離基とともに形成している−Ｚ１１−Ｚ１３であり；
かつＹ２がＨもしくは保護基である）、式（ＶＩ）の中間体化合物と反応させ、
【化２８】
2004506604.tif 000013
ここで、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つが、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち二つがＲ１１−Ｙ１１−Ａ−もしくはである、またはＸ１２およびＸ１３が互いに結合して−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１１）−となっている場合には同一であっても異なるものであってもよいＲ１１−Ｙ１１−Ａ−であり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つが、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨもしくは第二の脱離基であり；
選択的に、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３の１つがＨであり；
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、
Ｙ１１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−、−Ｏ−、
【化２９】
2004506604.tif 000014
−Ｓ−、または−ＮＲ２−、であり；
Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ１３、＝Ｏ、Ｈおよび−ＮＲ１４Ｒ１５の組み合わせであり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のそれぞれについてＲ１１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に
【化３０】
2004506604.tif 000015
【化３１】
2004506604.tif 000016
【化３２】
2004506604.tif 000017
【化３３】
2004506604.tif 000018
【化３４】
2004506604.tif 000019
【化３５】
2004506604.tif 000020
または
【化３６】
2004506604.tif 000021
および１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０のアルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環または複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環または複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキルであり；
反応後に、脱保護工程を実施し、必要に応じて、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち１つまたは２つが、（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−、もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−である式（Ｉ）の化合物が効果的に得られる条件下で該反応と脱保護の段階の両方を実施する方法が挙げられる。
【００３８】
本明細書において１種類またはそれ以上のＬＰＡ受容体の作用薬もしくは拮抗薬として同定される本発明の化合物の用途は、ＬＰＡ受容体のシグナル伝達によって媒介される生化学的経路をそれぞれ阻害もしくは促進する用途が見出されている。ＬＰＡ受容体のシグナル伝達を調節することによる該作用薬もしくは拮抗薬の特異的かつ実質的な用途は、癌の治療および創傷治癒の促進である。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明の一局面は、式（Ｉ）に記載の化合物に関する。
【化３７】
2004506604.tif 000022
ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−であり、Ｘ１およびＸ２が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−であるか、またはＸ１およびＸ３が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−ＮＨ−であり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち少なくとも１つが、Ｒ１−Ｙ１−Ａ−であり、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうち２つがＲ１−Ｙ１−Ａ−である場合にはそれぞれが同一であっても異なってもよく、またはＸ２とＸ３が互いに結合した−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−であり；
選択的にＸ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つがＨであり；
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、Ｙ１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−であり、−Ｏ−、
【化３８】
2004506604.tif 000023
−Ｓ−、または−ＮＲ２−であり；
Ｚ１が、ｍが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｍ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｍ−、−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−、―ＮＨ−、−Ｏ−、もしくは−Ｓ−であり；
Ｚ２が、ｎが１〜５０の整数である−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、もしくは−Ｏ−であり；Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ４、＝ＯもしくはＨおよび−ＮＲ５Ｒ６の組み合わせであり；Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のそれぞれについてＲ１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
【化３９】
2004506604.tif 000024
【化４０】
2004506604.tif 000025
【化４１】
2004506604.tif 000026
【化４２】
2004506604.tif 000027
【化４３】
2004506604.tif 000028
【化４４】
2004506604.tif 000029
または
【化４５】
2004506604.tif 000030
であり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００４０】
上記のＲ基（例えば、Ｒ１−Ｒ８）のそれぞれについて、ｘが０〜２９である−（ＣＨ２）ｘＣＨ３の式を有する直鎖状アルキルであり、
一つまたはそれ以上のＣＨ２基が、ＣＨＷ基で置換される（ここでＷがアルキル側鎖である）ことを除き、直鎖状アルキルの上記に定義される式を有する分岐鎖アルキルであり、式 −（ＣＨ２） ｘａＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｘｂＣＨ３ （ここでｘａとｘｂはそれぞれ０〜２７であり、（ｘａ ＋ ｘｂ）が２７より小さい）を有する直鎖状アルケニルであり、一つまたはそれ以上のＣＨ２基がＣＨＷ基で置換されるもしくはＣＨ基がＣＷ基で置換される（ここでＷはアルキル側鎖である）ことを除き、直鎖状アルケニルの上記に定義される式を有する分岐鎖アルケニルを有する。
【００４１】
芳香族環もしくは複素環式芳香族環としては、フェニル、インデン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、 ピペラジン、チオフェン、フラン、ナフトール、ビフェニルおよびインドールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。該芳香族環もしくは複素環式芳香族環は、環がＲ１−Ｙ１−Ａ− 鎖のＹ１基に結合する場合に対して環のオルト位、メタ位もしくはパラ位に１、２もしくは３置換基を有していてもよい。環上の置換には、アルキル、アルコキシ、アミン（２級もしくは３級アミンを含む）、アルキルアミン、アミド、 アルキルアミド、酸、アルコール等を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
アシル基としては、上記のアルキル、アルケニル、もしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環のいずれかを含むことができる。
【００４３】
アリールアルキルおよびアリールオキシアルキル基は、Ｒ１−Ｙ１−Ａ−鎖のＹ１基に結合したアルキル基を有する上記の直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキル基 を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
上記の式（Ｉ）に記載の化合物の上記で特定された定義より、特に例外となるものとしては、以下に示す既知の内因性もしくは合成化合物が挙げられる。すなわち、リゾホスファチジン酸、ホスファチジン酸、環状ホスファチジン酸、アルケニルグリセロールリン酸、ジオクチル−グリセロールピロリン酸およびＮ−パルミトイル−Ｌ−セリンである。
【００４５】
式（Ｉ）に記載の化合物の例としては、以下の（ＩＩ）〜（Ｖ）に記載の化合物の下位集団が挙げられる。
【００４６】
式（ＩＩ）Ａおよび（ＩＩ）Ｂの構造において、Ｑ１およびＱ２がいずれもＨ２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の一つが、（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−であり、ここでＺ１およびＺ２がＯであり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つがＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでそれぞれＡが直接結合でありＹ１がＯである。Ｒ１のそれぞれが、上記の式（Ｉ）のように独立に定義される。
【化４６】
2004506604.tif 000031
【化４７】
2004506604.tif 000032
【００４７】
式（ＩＩＩ）の構造において、Ｑ１がＨ２であり、Ｑ２が＝Ｏであり、Ｘ１は （ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−（ここで、Ｚ１がＯである）であり、およびＸ２とＸ３がＲ１−Ｙ１−Ａ−（ここでそれぞれＡが直接結合でありＹ１が−ＮＨ−である）である。上記の式（Ｉ）同様、Ｒ１はそれぞれ独立に定義される。式（ＩＩＩ）の範囲内で好ましい種は、Ｘ３が−ＮＨ２であり、Ｘ２はＲ１がＣ１４〜Ｃ１８アルキルであり、さらに好ましくはＣ１４アルキルもしくはＣ１８アルキルのいずれかである−ＮＨＲ１であり、またはＸ３はＲ１がアセチル基である−ＮＨＲ１であり、Ｘ２はＲ１がＣ１４アルキルである−ＮＨＲ１である。
【化４８】
2004506604.tif 000033
【００４８】
式（ＩＶ）の構造において、Ｑ１が＝ＮＲ４であり、Ｑ２がＨ２であり、Ｘ１とＸ２が互いに結合した−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−であり、Ｘ３がＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでＡが直接結合でありＹ１が−ＮＨ−である。Ｒ１とＲ４が上記の式（Ｉ）で定義したものと同様である。
【化４９】
2004506604.tif 000034
【００４９】
式（Ｖ）Ａおよび（Ｖ）Ｂの構造において、Ｑ１およびＱ２がいずれもＨ２であり、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つが（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−であり、ここでそれぞれのＺ１がＯであり、またＸ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つはＲ１−Ｙ１−Ａ−であり、ここでＡが直接結合でＹ１が−Ｏ―である。Ｒ１は上記の式（Ｉ）で定義したものと同様である。式（Ｖ）Ａおよび（Ｖ）Ｂの範囲内で好ましい種は、Ｒ１がＣ２１アルキルを含むアシルである化合物、もしくはＲ１がＣ１８アルキルである化合物を含む。
【化５０】
2004506604.tif 000035
【化５１】
2004506604.tif 000036
【００５０】
式（Ｉ）の化合物ならびに式（ＩＩ）Ａ、（ＩＩ）Ｂ、（ＩＩＩ） 、（ＩＶ）、（Ｖ）Ａおよび（Ｖ）Ｂの化合物の亜種は、下記の合成スキームを用いて調製することができる。
【００５１】
一群のセリンアミド（ＳＡ）およびセリンアミドリン酸（ＳＡＰ）（式（ＩＩＩ））を合成する目的で、まず、前駆体であるｔ−Ｂｏｃ保護されたβ−ラクトン（２５）を合成した。市販のｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン（図２、２４）から出発して、ミツノボ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｏ）条件下でトリフェニルホスフィン酸（ＰＰｈ３）およびアジドジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）を導入し、化合物２５を約５０％の収量で得た（Ｓｕｎら、１９９６）。ヒドロキシアミド２６〜３４を得る目的で、各種一級アミンで化合物２５の非常に不安定なβ−ラクトンを開裂させるために、サン（Ｓｕｎ）らが開発した方法を用いた。しかしながら、様々な試薬（トリエチルアミン等）を用いたにもかかわらず成功には至らなかった。代わりに、β−ラクトンを有する一級アミンをＴＨＦ中で還流することにより、ｔ−Ｂｏｃで保護されたヒドロキシアミド２６〜３４を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィを用いて化合物２６〜３４を精製した。ｔ−Ｂｏｃ保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ではずし、化合物３５〜４３をＴＦＡ塩として得た。
【００５２】
化合物５５〜５９を合成する目的で、ｔ−Ｂｏｃで保護されたヒドロキシアミド２６〜３０をリン酸化した。最終的に得られた化合物を精査した結果、最終的に得られた化合物は高度に疎水性の領域と高度に親水性の領域を有することが示唆された。両領域とも、抽出過程および／もしくは精製過程でのカラムへの結合の際に問題を生じる可能性がある。これら潜在的な問題を克服するために、ホスホラミデート化学を使用した。ホスホラミデート化学を用いることによって、リン酸水酸基を保護して該分子を完全な疎水性にし、それによって円滑に精製を容易にしうると考えられた。
【００５３】
本質的には、複数の方法の組み合わせを用いて所望の産物（５５〜５９）を得た（Ｌｙｎｃｈら、１９９７； Ｂｉｔｔｍａｎら、１９９６； Ｌｉｕら、１９９９）。出発物質であるヒドロキシアミド（２６〜３０）を無水ピリジンで繰り返し洗浄し、高真空下で４８時間乾燥した。ピリジンで洗浄したヒドロキシアミドは、アルゴン雰囲気下で維持した。次に、１Ｈ−テトラゾールおよび蒸留したばかりのＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２の１：１混合物を添加した。リン酸化試薬ジベンジルジイソプロピルホスホラミデートを添加した。反応をＴＬＣでモニターした後、ホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、化合物５０〜５４をベンジル保護されたリン酸塩として得た。化合物５５〜５９（図３）を得るために、化合物５０〜５４を６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。化合物５６を無水酢酸と反応させ、化合物５６ａを調製した（図３）。
【００５４】
リン酸化法が一連のＳＡＰ（化合物５５〜５９）の合成に使用できることが解ったので、同様の方法により二リン酸塩（式（Ｖ）Ａおよび（Ｖ））（図４および５Ａ〜Ｂ）を合成した。市販のジオール６０〜６２を無水ピリジンで洗浄し、高真空下で４８時間乾燥した。これら乾燥したジオール（６０〜６２）を蒸留したばかりの１：１のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、１Ｈ−テトラゾールを添加した。この混合を撹拌して、これにジベンジルジイソプロピルホスホラミデートを添加した。反応混合物をＴＬＣでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、化合物６３〜６５をベンジル保護された二リン酸として得た。二リン酸化合物として化合物６６〜６８ を得るために、化合物６３〜６５を６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。化合物６６〜６８の合成に関する上記の方法と同様の方法で化合物８５〜９２を得た。
【００５５】
化合物８５〜９２は１，２−二リン酸であるが、図５Ｂには１，３−二リン酸の合成を示す。市販の２−フェノキシ−１，３−プロパンジオールを出発原料として用いた。出発化合物を、まず、メチルインドールの存在下でｔ−ＢｕＯＫによって保護し、触媒的水素化を行って中間体を得た後、ハロゲン化物（ＲＸ、ここでＲは上記のＲ１に関する定義と同様である）と反応させた。回収した中間体を、次にエチル−ＳＨの存在下でＡｌＣｌ３により処理して、骨格のＣ２位に結合したＲＯ基を有する１，３−ジオールを得た。回収した１，３−ジオールを蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、１Ｈ−テトラゾールを添加した。この混合物を撹拌し、これにジベンジルジイソプロピルホスホラミデートを添加した。該反応混合物をＴＬＣでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。該反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護された二リン酸化合物を得た。１，３−二リン酸化合物を得るために、６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて該化合物を触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００５６】
式（ＩＩ）Ａおよび（ＩＩ）Ｂのピロリン酸を合成する目的で、グリシダルトシル酸（（２Ｒ）（−）もしくは（２Ｒ）（＋））を出発物質として用いた（図６Ａ〜Ｂ）。アルコールの存在下ＢＦ３等のルイス酸触媒により環を開き、Ｃ１位をトシル化保護した中間体を調製した。次の工程では、過剰のＲ−トリフレートおよび２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジンを用いて、Ｃ２位のアルコールをＲ基（例えば、上記のＲ１）で置換し、ジエーテル中間体を得た。トリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）水素ピロリン酸でジエーテル中間体を処理によりトシル酸を求核攻撃し、ピロリン酸置換基でトシル酸のＣ１位を置換した。
【００５７】
式 （ＩＩ）Ｂのピロリン酸を得るために、トシル酸保護した中間体を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物および２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジンの存在下でベンジルアルコールを用いて処理し、中間体のＣ２位をベンジル化した。まず、１８−クラウン−６の存在下で過酸化カリウムの作用によりベンジレート中間体上のトシル酸保護基をはずし、過剰のＲ−トリフレートおよび２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジンを用いてＣ１位の水酸基をＲ基 （例えば、上記のＲ１）で置換した。得られたジエーテル中間体はＣ２位にベンジル保護基を有したままであった。ベンジル保護基を水素化によってはずし、次に、ピリジンおよびｐ−トルエンスルホニルクロリドの作用により水酸基をトシル化し、Ｃ２位にトシル基を含むジエーテルを作製した。トリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）水素ピロリン酸処理による求核攻撃でトシル基をはずし、トシル酸のＣ２位をピロリン酸置換基で置換した。
【００５８】
リン酸および 二リン酸（ならびにピロリン酸、ホスホネート等）を調製する別のスキームを 図１５および１６に示す。
【００５９】
図１５では、臭化グリシダルとアルコール（ＲＯＨ）を出発原料として用いていた。該反応条件においては、Ｋ２ＣＯ３で処理した後、Ｃ６Ｈ６ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）３Ｃｌ−のアンモニウム塩で処理し、臭素がＲ基で置換されることを含んでいた。次に、エーテル中の１ＭのＨＣｌおよびアルコール（Ｒ１ＯＨ）を用いてグリシダル中間体の環を開き、Ｃ２位に水酸基を有するジエーテル中間体を得た。ジエーテルを１Ｈ−テトラゾールと混合、撹拌した後、この混合物にジベンジルジイソプロピルホスホラミデートを添加した。反応混合物をＴＬＣでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護されたリン酸塩を得た。モノリン酸化合物を得るために、６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下で活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いてベンジルで保護されたリン酸を触媒的に還元し、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００６０】
図１６では、臭化グリシダルをアルコール（ＲＯＨ）と反応させる代わりにＣ３位の保護にＢｎＯＨを使用することを除き、同様の反応スキームを用いた。該反応条件においては、Ｋ２ＣＯ３で処理した後に、Ｃ６Ｈ６ＣＨ２Ｎ＋（Ｃ２Ｈ５）３Ｃｌ−アンモニウム塩による処理を行い、これにより、臭素がＢｎ基で置換されることを含んだ。次に、エーテル中の１ＭのＨＣｌおよびおよび無水ＢｎＯＨを用いてグリシダル中間体の環を開き、Ｃ１位を保護した。得られたジエーテル中間体はＣ２位に、水酸基を有している。ジエーテルを、Ｋ２ＣＯ３の水溶液に溶解したハロゲン化物塩（ＲＸ）と混合し、Ｃ２位においてエーテル結合を介して結合したＲ基を有する保護された中間体を得た。１，３−ジオールを得るために、６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて触媒的還元を行い、この中間体を脱保護した。ジオールを１Ｈ−テトラゾールと混合、撹拌し、この混合物にジベンジルジイソプロピルホスホラミデートに添加した。反応混合物をＴＬＣでモニターし、適当な時間でホスホネートをインサイチューで過酢酸により酸化してリン酸塩に変換した。該反応混合物をカラムクロマトグラフィで精製し、ベンジル保護されたリン酸塩を得た。１，３−二リン酸を得るために、６０ｐｓｉのＨ２雰囲気下で活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いてベンジルで保護したリン酸の触媒的還元を行い、エタノール中でベンジル保護基を外した。
【００６１】
図６Ａのようにして調製したジエーテル中間体（例えば、ＲとＲ１置換基を含む）を使用して、 トシル基を除くと複数の修飾リン酸およびホスホネートをＣ１位に結合させることができる。図７Ａに示すように、塩基性条件下で中間体をＸ４−Ｚ１−ＰＯ（Ｏ−保護基）２と反応させる。ここで、Ｚ１ は −（Ｒ３）ＣＨ−であり、Ｘ４は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾リン酸塩−Ｚ１−ＰＯ（Ｏ−保護基）２をＣｌ位に単結合させる。ＴＭＳＢｒ処理により保護基を外し、Ｃ１位が−（Ｒ３）ＣＨ−ＰＯ（ＯＨ）２基を得る。図７Ｂに示すように、トリス（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム）を用いた塩基性条件下で、中間体をＸ４−Ｚ１−ＰＯ（ＯＨ）−Ｚ２−ＰＯ（ＯＨ）２と反応させる。ここで、Ｚ１が−Ｏ−であり、Ｚ２が−ＣＨ２−、およびＸ４は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾ホスホネート−Ｚ１−ＰＯ（ＯＨ）−Ｚ２−ＰＯ（ＯＨ）２がＣ１位に単結合させる。酸性条件でＣＨ３ＣＮを用いて処理した場合には、−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２基がＣ１位に結合する。図７Ｃに示すように、塩基性条件下で中間体をＸ４−Ｚ１−ＰＯ（Ｏ−保護基）２と反応させる。ここで、Ｚ１が−ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｘ４は水素である。塩基性条件によって、トシル酸保護基を外し、修飾リン酸塩−Ｚ１−ＰＯ（Ｏ保護基）２がＣｌ位に単結合させる。コリジンに溶解したＴＭＳＢｒと水洗によって、保護基を外し、Ｃ１位が−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＰＯ（ＯＨ）２ 基となる。
【００６２】
構造的に束縛された式（ＩＩＩ）の環状リン酸化合物を調製する目的で、図１１に示す合成スキームにおいて、化合物２６〜３０を出発原料として用いた。化合物２６〜３０を１Ｈ−テトラゾールと反応させ、得られた産物をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジイソプロピルホスホラミデートで処理した。これにより、分子内環化が起こる。ホスホネートの過酢酸によるインサイチュー酸化により、環状リン酸中間体が得られた。ＴＦＡによる還元により、式（ＩＩＩ）の化合物が得られた。
【００６３】
他の構造的に束縛を受けた化合物も調製することができる。
【００６４】
図１２に示すのは、Ｘ１とＸ２が互いに−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−である環状リン酸を調製する別のスキームである。ベンジル保護された １，３−ジオール中間体をＰＯＣｌ３と反応させ、分子内環化させた。Ｈ２雰囲気下で活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いた処理（上記のように実施）により、Ｃ２位の炭素に結合した水酸基を有する環状リン酸を得る。 次に、環状中間体を過剰のＲ−トリフレートおよび２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジンで処理し、最終的な化合物を得た。
【００６５】
図１３に示すのは、Ｘ１とＸ３がともに−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）−ＮＨ−である環状リン酸を調製するスキームである。上記のようにして調製した中間体３５〜４３を出発原料として用い、トリス（１，２，４，−トリアゾール）リン酸による処理後、２％のＨＣｌで洗浄して、分子内環化させる。
【００６６】
図１４に示すのは、リン酸基が環の一部ではなく、具体的には、Ｘ２とＸ３がともに−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−である環状化合物を調製するスキームである。上記のようにして調製した中間体５０〜５４を出発原料として用い、無水 ＣＯＣｌ２で処理し、環化過程においてＣ２およびＣ３炭素に結合したアミン間にカルボニルを挿入する。 Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いてリン酸からベンジル保護基を外した（上記のように行った）。
【００６７】
ＬＰＡ受容体の作用薬もしくは拮抗薬として用いることのできる他の種類の化合物は、脂肪酸リン酸もしくは直鎖状リン酸である。 図８に示されるように、無水塩化メチレンは無水ｎ−アルカノールおよび１Ｈ−テトラゾールを溶解してもよい。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデートの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレン中の過酢酸を滴下し、ベンジル保護した脂肪酸リン酸１０１〜１０５を調製することができる。脂肪酸リン酸１０６〜１１０を得るために、Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて、無水メタノール中でベンジル保護基を外した（上記のように行った）。
【００６８】
脂肪酸リン酸を調製する代わりに、チオリン酸およびアミドリン酸を調製することもできる。図９に示されるように、例えば、ｎ−メルカプトアルカンおよび１Ｈ−テトラゾールを無水塩化メチレンに溶解してもよい。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデートの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレンに溶解した過酢酸を滴下し、ベンジル保護した脂肪酸チオリン酸を調製することができる。脂肪酸チオリン酸を得るために、Ｈ２雰囲気下で活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて無水メタノール中でベンジル保護基を外す（上記のように実施する）。図１０に示されるように、例えば、ｎ−アルキルアミンおよび１Ｈ−テトラゾールは、無水塩化メチレンに溶解することができる。無水塩化メチレンに溶解したジベンジル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデートの溶液を加えることができる。その後、無水塩化メチレンに溶解した過酢酸を滴下し添加し、ベンジル保護した脂肪酸アミドリン酸を得ることができる。脂肪酸アミドリン酸を得るために、Ｈ２雰囲気下活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）を用いて無水メタノール中で処理後にベンジル保護基を外した（上記のように実施した）。
【００６９】
上記の各々の反応スキームは、図１７〜２０に示す一級アミン基を攻撃することにより、さらに修飾されうる。例えば、ＴＦＡで処理してｔ−Ｂｏｃ保護基を外した化合物５０〜５４から中間体を調製し、リン酸を保護したままＣ２位を一級アミンを得る。
【００７０】
図１７においては、Ｃ２位に一級アミンを有する中間体化合物は、酸ハロゲン化物（例えば、Ｒ１ＣＯＣｌ）の攻撃を受け、これによって一級アミンがアミド（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１）に変換する。次に、Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）による処理（上記のように実施する）を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００７１】
図１８においては、Ｃ２位に一級アミンを有する中間体化合物が、ＰＯＣｌ３に溶解したＮ−アセチルイミダゾリンの攻撃を受け、このことによって一級アミンが２級アミン （−Ｎ（Ｈ）−イミダゾール）に変換する。また、置換されたイミダゾリンも用いることができる。次に、Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）による処理（上記のように実施する）を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００７２】
図１９においては、Ｃ２位に一級アミンを有する中間体化合物が、Ｒ１ＯＣ（Ｏ）Ｃｌの攻撃を受け、これによって一級アミンが　カルバメート （−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１）に変換する。次に、Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）による処理（上記のように実施する）を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００７３】
図２０においては、Ｃ２位に一級アミンを有する中間体化合物が、Ｒ１ＮＣＯもしくはＲ１ＮＣＳの攻撃を受け、これによって一級アミンをウラミド（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｒ１）もしくはチオウラミド（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｈ）−Ｒ１）のいずれかに変換する。次に、Ｈ２雰囲気下、活性炭−１０％パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）による処理（上記のように実施する）を用いてベンジルで保護されたリン酸を脱保護することができる。
【００７４】
従って、（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１１−Ｚ１３もしくは（Ｙ２Ｏ）２ＰＯ−Ｚ１２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１１−Ｚ１３を式（ＶＩ）に記載の中間体化合物と反応させた後、脱保護の工程を実施することによって、本発明の非環状化合物を調製することができる。ここで、Ｚ１１は、ｍが１〜５０の整数である −（ＣＨ２）ｍ−もしくは −Ｏ（ＣＨ２）ｍ−または−Ｃ（Ｒ３）Ｈ−もしくは−Ｏ−であり、 Ｚ１２は −（ＣＨ２）ｎ− もしくはｎが１〜５０の整数である −Ｏ（ＣＨ２）ｎ− または−Ｏ−であり、Ｚ１３はＨもしくは第一の脱離基または第一の脱離基とともに形成する−Ｚ１１−Ｚ１３であり、Ｙ２はＨもしくは保護基である。必要に応じて、反応と脱保護の両方の工程を、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの１つもしくは２つが（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ１−もしくは（ＨＯ）２ＰＯ−Ｚ２−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−Ｚ１−であり、Ｚ１およびＺ２が上記で定義される式（Ｉ）に記載の化合物が効果的に生成する条件下で実施する。
【００７５】
式（ＶＩ）の中間体化合物は次の構造を有する：
【化５２】
2004506604.tif 000037
ここで、Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つがＲ１１−Ｙ１１−Ａ−であり、Ｘ１１、Ｘ１２とＸ１３のうちの２つがＲ１１−Ｙ１１−Ａ−である場合にはそれぞれが同一であっても異なってもよく、またはＸ１２とＸ１３が互いに結合した−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１１）−であり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうち少なくとも１つがＯＨ、ＮＨ２、ＳＨもしくは第二の脱離基であり、
選択的にＸ１１、Ｘ１２およびＸ１３のうちの１つがＨであり、
Ａが、ｋが０〜３０の整数である直接的結合（ＣＨ２）ｋ、もしくはＯであり、
Ｙ１１が、ｌが１〜３０の整数である−（ＣＨ２）ｌ−、−Ｏ−、
【化５３】
2004506604.tif 000038
、−Ｓ−、または−ＮＲ２−であり、
Ｑ１およびＱ２が独立にＨ２、＝ＮＲ１３、＝Ｏ、Ｈおよび−ＮＲ１４Ｒ１５の組み合わせであり；
Ｘ１１、Ｘ１２およびＸ１３のそれぞれについてＲ１１が独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０のアルキルを含むアリールオキシアルキル、
【化５４】
2004506604.tif 000039
【化５５】
2004506604.tif 000040
【化５６】
2004506604.tif 000041
【化５７】
2004506604.tif 000042
【化５８】
2004506604.tif 000043
【化５９】
2004506604.tif 000044
または
【化６０】
2004506604.tif 000045
であり、
Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１７は、独立に水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、環に１、２もしくは３置換基を有するもしくは有していない芳香族環もしくは複素環式芳香族環、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルもしくは芳香族環もしくは複素環式芳香族環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキルを含むアリールアルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００７６】
本発明のＬＰＡ受容体作用薬および拮抗薬を調製し、この化合物を用いて本明細書中で後述する患者の治療に好適な薬学的組成物を調製することができる。それ故、本発明の別の局面は、薬学的に許容される担体と本発明の化合物を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は適当な賦形剤もしくは安定化剤を含み得るものでもあり、また錠剤、カプセル、粉末、 溶液、懸濁剤、エマルジョン等の固体もしくは液体状であってもよい。通常、該組成物は担体、賦形剤、安定化剤等と共に、有効な化合物を約０．０１〜９９％、好ましくは有効な化合物を約２０〜７５％含む。
【００７７】
固体である場合の単位剤形は通常の種類のものでよい。固体の剤形は、本発明の化合物および担体を含む通常のゼラチンタイプ等のカプセルであってもよく、担体としては、例えば、滑沢剤、およびラクトース、ショ糖、もしくはコーンスターチ等の挿入充填剤が挙げられる。別の態様においては、これらの化合物は、アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチン等の結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンもしくはアルギン酸等の崩壊剤、およびステアリン酸もしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤と組み合わせて、ラクトース、ショ糖、もしくはコーンスターチ等の従来の錠剤用基剤を用いて、錠剤化してもよい。
【００７８】
本発明の化合物は、薬学的担体を含む生理的に許容される希釈剤におけるこれらの原料からなる溶液もしくは懸濁剤によって注射可能もしくは局所に投与する剤形として投与することもできる。そのような担体としては、界面活性剤、および佐剤、賦形剤もしくは安定化剤を含む他の薬学的、生理学的に許容される担体が添加されているもしくはされていない、水および油等の滅菌された液体が挙げられる。油の例としては、石油、動物、植物、もしくは合成供給源に由来するものが挙げられ、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油もしくは鉱油が挙げられる。一般的に、 水、食塩水、ブドウ糖および類似の糖溶液、およびプロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に、注射可能な溶液のための担体として好適な液体担体である。
【００７９】
エアロゾルの用途であれば、溶液もしくは懸濁剤における本発明の化合物を加圧して、通常の佐剤とともに適当な噴射剤、例えば、プロパン、ブタンもしくはイソブタン等の炭化水素噴射剤を一緒にエアロゾル容器に充填することができる。本発明の物質を、噴霧器もしくは霧化器等で、非加圧的に投与することもできる。
【００８０】
治療効果に応じて、本発明の化合物は、経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔滴注、腔内もしくは膀胱内滴注、眼内、動脈内、病巣内に投与、もしくは鼻、喉、および気管支等の粘膜への適用によって投与することができる。
【００８１】
本発明の範囲に含まれる組成物は、所期の目的の達成に効果的な量の本発明の化合物を含むすべての組成物である。個々の必要量は異なるが、個々の成分の効果的な量の最適範囲の決定は、当技術分野内のものである。通常の用量は、体重ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約１００ｍｇを含む。好適な用量は、体重ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約１００ｍｇを含む。最適な用量は、体重ｋｇ当たり約１ｍｇから約１００ｍｇを含む。治療に用いる本発明の化合物の投与法についても、当業者であれば容易に決定できる。
【００８２】
本発明のある化合物はＬＰＡ受容体作用薬として有用であり、本発明の他の化合物はＬＰＡ受容体の拮抗薬として有用であることが解っている。活性の差異によって、各種化合物は異なる用途を見出されている。本発明の好ましい対象動物は哺乳動物（すなわち、哺乳類に属する個体）である。本発明は特にヒトを対象とした治療に特に有用である。
【００８３】
本発明の一局面は、ＬＰＡ受容体作用薬もしくはＬＰＡ受容体拮抗薬としての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体の活性を調節するために効果的な条件下で該化合物をＬＰＡ受容体と接触させる段階を含む、ＬＰＡ受容体の活性を調節する方法に関する。
【００８４】
ＬＰＡ受容体は、通常ＬＰＡ受容体を発現する細胞または特定のＬＰＡ受容体を発現するように形質転換した細胞の表面に存在する。好適なＬＰＡ受容体としては、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４受容体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。通常これらの受容体を発現する細胞を含む組織を、上記の表１に示す。細胞に本発明のＬＰＡ受容体作用薬もしくはＬＰＡ受容体拮抗薬を接触させる場合には、細胞残渣をインビトロで接触させることも、インビボで接触させることもできる。
【００８５】
通常は発現していない宿主細胞でこれらの受容体を異種的に発現させるためには、１種もしくは複数種類のこれら受容体をコードする核酸分子を、適当な転写および翻訳制御領域（すなわち、プロモーターおよび転写終結シグナル）を含む発現ベクターにセンス方向で挿入した後、宿主細胞を該発現ベクターで形質転換することができる。発現ベクターは、細胞ゲノムに組み込むこともでき、または単に染色体外核内物質として存在させることもできる。発現は構成的なものであっても誘導的なもののいずれでもよいが、構成的発現のほうが大方の目的には適している。
【００８６】
ＥＤＧ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アン（Ａｎ）ら（１９９７ｂ）が報告しており既知である。これはゲンバンクアクセッション番号Ｕ８０８１１に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。ＥＤＧ−２をコードする 核酸分子は、以下の配列番号１のヌクレオチド配列を有している。
2004506604.tif 000046
コードされるＥＤＧ−２受容体は、以下の配列番号２のアミノ酸配列を有する。
2004506604.tif 000047
【００８７】
ＥＤＧ−４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アン（Ａｎ）ら（１９９８ｂ）が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００４７２０に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。ＥＤＧ−４をコードする核酸分子は、以下の配列番号３のヌクレオチド配列を有している。
2004506604.tif 000048
コードされるＥＤＧ−４受容体は、以下の配列番号４のアミノ酸配列を有する。
2004506604.tif 000049
【００８８】
ＥＤＧ−７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、バンドー（Ｂａｎｄｏｈ）ら（１９９９）が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０１２１５２に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。ＥＤＧ−７をコードする核酸分子は、以下の配列番号５のヌクレオチド配列を有している。
2004506604.tif 000050
コードされるＥＤＧ−７受容体は、以下の配列番号６のアミノ酸配列を有する。
2004506604.tif 000051
【００８９】
ＰＳＰ−２４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、カワサワ（Ｋａｗａｓａｗａ）ら（２０００）が報告しており既知である。これは、ゲンバンクアクセッション番号ＡＢ０３０５６６に対応し、本明細書に参照として組み入れられる。ＰＳＰ−２４をコードする核酸分子は、以下の配列番号７のヌクレオチド配列を有している。
2004506604.tif 000052
コードされるＰＳＰ−２４受容体は、以下の配列番号８のアミノ酸配列を有する。
2004506604.tif 000053
【００９０】
ＬＰＡ受容体作用薬は、ＬＰＡ受容体からＬＰＡ様活性を誘導する特徴があり、これは、化学的（例えば、卵細胞におけるＣａ２＋ もしくはＣｌ−電流）、もしくは細胞形態、運動性、増殖等の変化を調べることのいずれかにより測定することができる。対照的に、ＬＰＡ受容体拮抗薬は、ＬＰＡ受容体に対してＬＰＡ様活性を阻害する特徴がある。これに関しても、化学的（例えば、卵細胞におけるＣａ２＋もしくはＣｌ− 電流）、もしくは細胞形態、運動性、増殖等の変化を調べることのいずれかにより測定することができる。
【００９１】
本発明の化合物はＬＰＡ受容体拮抗薬として働くので、本発明はまた、ＬＰＡで誘導されたＬＰＡ受容体上の活性を阻害する方法に関する。この方法は、ＬＰＡ受容体拮抗薬としての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体のＬＰＡによって誘起される活性を効果的に阻害する条件下で、該化合物をＬＰＡ受容体と接触させる段階を含む。ＬＰＡ受容体は上で定義されるものであってもよい。ＬＰＡ受容体は、通常受容体を発現する、もしくは異種的に受容体を発現する細胞の表面に存在する。ＬＰＡ受容体に本発明の化合物を接触させる場合には、インビトロで接触させることも、インビボで接触させることもできる。
【００９２】
上記のように、ＬＰＡは、上記のＬＰＡ受容体を含むＬＰＡ受容体に媒介されるシグナル伝達を含む複数の異なる細胞内経路に関与するシグナル伝達分子である。それ故、本発明の化合物は、ＬＰＡ受容体拮抗薬、もしくはＬＰＡ受容体作用薬のいずれかの作用で細胞動態に対するＬＰＡの効果を調節すると予想される。
【００９３】
本発明の一局面は、本発明の化合物を提供する段階、および癌を効果的に治療する方法で患者に効果的な量の該化合物を投与する段階を含む、癌の治療法に関する。本発明の化合物で治療することのできる癌の種類としては、癌細胞の挙動が少なくとも部分にはＬＰＡの媒介する活性によるものである癌細胞により特徴付けられるこれらの癌が挙げられる。 通常、この種の癌は１種類またはそれ以上のＬＰＡ受容体を発現する癌細胞として特徴付けられる。癌の形態の例としては、前立腺癌と卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
癌治療において特に有用である本発明の化合物はＬＰＡ受容体拮抗薬である。
【００９５】
本発明の化合物を投与する場合には、全身投与することもできるし、または、癌細胞が存在する特異的部位に直接投与することもできる。従って、該化合物の癌細胞への送達に効果的である方法で投与することができる。特定の理論に拘束されなくとも、ＬＰＡ受容体拮抗薬はＬＰＡ受容体に結合することによって、癌細胞の増殖もしくは転移を阻害する、または癌細胞を破壊すると考えられる。後述の実施例１２に示されるように、本発明の複数のＬＰＡ拮抗薬化合物は、上記の種類のＬＰＡ受容体を１種もしくは複数種類発現する前立腺癌細胞株に対し毒性を示した。
【００９６】
癌の治療の目的で、本発明のＬＰＡ拮抗薬化合物もしくは薬学的組成物を投与する場合には、薬学的組成物は、各種の癌の治療を目的とした現在既知であるもしくは今後開発される他の治療薬もしくは治療法を含む、もしくは共に投与することができる。
【００９７】
癌の浸潤は、個々の細胞もしくは細胞集団が原発腫瘍から脱離して、全身循環もしくはリンパ管に至り、異なる器官に広がる複雑な複数事象からなる過程である（Ｌｉｏｔｔａら、１９８７）。 この過程において、腫瘍細胞が毛細血管で止まり、管外に遊出し、組織の間質へと遊走して、二次的な病巣を形成する必要がある。第一に、腫瘍細胞は循環を停止させる内皮細胞のシグナルを認識する必要がある。第二に、腫瘍細胞は細胞表面のラミニン受容体により基底膜の糖蛋白質ラミニンに接着する必要がある。基底膜への接着後に、腫瘍細胞は基底膜を分解するプロテアーゼを分泌する。 接着および局所での分解後、浸潤の第三の段階は腫瘍細胞の遊走である。細胞の運動性が腫瘍細胞の浸潤および転移に中心的な役割を演じる。腫瘍細胞のインビトロでの運動性と動物実験における転移の挙動の関係は強い直接的な相関を示す（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｗｅｌｌｅｎｈｏｆら、１９９５）。ＰＬＧＦがインビトロにおける癌細胞の増殖を促進し、浸潤性を増加させることについては詳細な報告がある。イマムラ（Ｉｍａｍｕｒａ）らは、癌細胞の浸潤に血清因子が必要であることを見いだし（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９１）、その後ＬＰＡが血清を含まない系では腫瘍細胞の浸潤を完全に回復できる最も重要な血清成分であることが明らかになった（Ｘｕら、１９９５ａ； Ｉｍａｍｕｒａら、１９９３； Ｍｕｋａｉら、１９９３）。
【００９８】
ＰＬＧＦＲが卵巣癌細胞株、すなわち、ＯＣＣ１およびＨＥＹ細胞に発現することが示されている。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ解析より、ＥＤＧ−２およびＥＤＧ−７受容体がこれらの細胞株に存在することが示されている。最近、イム（Ｉｍ）ら（２０００）は、ＥＤＧ−７が前立腺癌細胞株、すなわち、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞に発現することを明らかにした。前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ株に関するＲＴ−ＰＣＲ解析から、ＥＤＧ−２、４、５およびＥＤＧ−７がこれら前立腺癌細胞株のいずれにおいても存在し、ＥＤＧ−３は前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５に存在することが示されている。
【００９９】
実施例に示されるように、本発明の複数のＬＰＡ受容体の拮抗薬は、特異的な前立腺癌細胞株および特異的な卵巣癌細胞株を標的化できる。従って、本発明のＬＰＡの拮抗薬は、前立腺癌および卵巣癌を含むＬＰＡが媒介する癌の別の治療法を提供する。
【０１００】
本発明の他の局面は、細胞増殖を促進する方法に関する。細胞増殖を促進するこの方法は、ＬＰＡ受容体の作用薬としての活性を有する本発明の化合物を提供する段階、およびＬＰＡ受容体誘導性の細胞増殖を効果的に促進する方法で細胞表面の該ＬＰＡ受容体を化合物と接触させる段階を含む。
【０１０１】
癌細胞の活性を調節する際のＬＰＡの役割に加えて、ＬＰＡが自然的創傷治癒において生理学的役割を果たしていることを強く示唆する所見がある。創傷部位では、活性化血小板に由来するＬＰＡは、他の血小板に由来する因子とおそらく同期して、少なくとも部分的には傷害および炎症部位における細胞の増殖刺激を担うと考えられる（Ｂａｌａｚｓら、２０００）。さらに、ＬＰＡそれ自身が血小板凝集を刺激する。これが、次に初期凝集応答の陽性フィードバック要素を惹起する因子となることができる（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、１９７９； Ｔｏｋｕｍｕｒａら、１９８１； Ｇｅｒｒａｒｄら、１９７９； Ｓｉｍｏｎら、１９８２）。
【０１０２】
ＬＰＡは細胞増殖に一定の役割を果たすので、ＬＰＡ受容体作用薬活性を有する化合物は、創傷治癒を促進する効果的な方法で使用することができる。従って、本発明の別の局面は、創傷の治療法に関する。この方法は、ＬＰＡ受容体の作用薬としての活性を有する本発明の化合物を提供し、創傷治癒を促進する細胞のＬＰＡ受容体に該化合物が結合する創傷部位に効果的な量の該化合物を送達することによって、創傷治癒を促進するためにＬＰＡ受容体の作用薬により誘導される細胞増殖を刺激することによって行なわれる。
【０１０３】
創傷治療の主な目標は、創傷の閉合である。開放性の皮膚創傷は、創傷の主要なカテゴリーの一つであり、火傷、 神経症性潰瘍、褥瘡、静脈性うっ血性潰瘍および糖尿性潰瘍を含む。開放性の皮膚創傷は、通常、以下の６つの主要な構成要件からなる過程を経て治癒する。すなわち、（１）炎症、（２）線維芽細胞の増殖、（３）血管造成、（４）結合組織の合成、（５）上皮化、および（６）創傷の縮小である。これらの構成要件のいずれか一つ、もしくはそのすべてが正常に機能しない場合には、創傷の閉合による治癒が起こらない。栄養不良、感染、薬物（例えば、アクチノマイシンおよびステロイド）、糖尿病および老化を含む多種の因子が創傷治癒に影響しうる（ＨｕｎｔおよびＧｏｏｄｓｏｎ、１９８８を参照のこと）。
【０１０４】
リン脂質が、細胞分裂（Ｘｕら、１９９５ｂ）、アポトーシス、細胞接着、および遺伝子発現の制御等の細胞活性に重要な制御因子であることが示されている。具体的には、例えば、ＬＰＡは細胞増殖（Ｍｏｏｌｅｎａａｒ、１９９６）および細胞遊走（Ｉｍａｍｕｒａら、１９９３）に対し増殖因子様の効果を誘起する。ＬＰＡは創傷治癒および再生に関係していることも示唆されている（ＴｉｇｙｉおよびＭｉｌｅｄｉ、１９９２）。
【０１０５】
一般的に、線維芽細胞、内皮および上皮細胞の創傷へのより迅速な流入を促す薬剤は創傷治癒の速度を増加させるべきものである。創傷の治療に有用である本発明の化合物は、複数のインビトロおよびインビボモデルにより同定、試験が可能である。
【０１０６】
創傷治癒の構成要件の異なるインビトロ系のモデルは、例えば、線維芽細胞（Ｖｅｒｒｉｅｒら、１９８６）、 内皮細胞 （Ｍｉｙａｔａら、１９９０）もしくは上皮細胞 （Ｋａｒｔｈａら、１９９２）等による、集密単層状態の組織培養細胞の「創傷」における細胞の回復が挙げられる。別の系を用いることによって、内皮細胞の遊走および／もしくは増殖の測定が可能となる（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８７； Ｓａｔｏら、１９８８）。
【０１０７】
創傷治癒のインビボモデルも当技術分野において公知であり、創傷を含む豚の表皮（Ｏｈｋａｗａｒａら、１９７７）もしくは薬剤によって誘導したハムスターの頬嚢の口腔粘膜病変（Ｃｈｅｒｒｉｃｋら、１９７４）が挙げられる。
【０１０８】
創傷治癒に効果的である本発明の化合物を組み合わせて投与することもできる。すなわち、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、鎮痛剤、鎮痒薬もしくはその組み合わせからなる群より選択される薬剤を本発明の薬学的組成物中に混合して、もしくは同時に異なる経路で投与することもできる。
【０１０９】
創傷治癒に関し、好適な投与形態は、局所的経路でなされる。しかしながら、択一的にもしくは同時に、該薬剤を非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは経皮的経路で投与してもよい。択一的にもしくは同時に、経口経路で投与することもできる。投与量は、投与を受ける者の年齢、健康状態、および体重、同時に実施している治療があればその治療法、治療頻度、およびに所望の効果の性質に依存すると考えられる。
【０１１０】
好適な局所投与に関しては、特に創傷を有するヒトおよび動物を治療する場合には、効果的な量の本発明の化合物を、例えば、皮膚表面等の創傷部位に投与することが好ましい。この量は通常、一回当たり約０．００１ｍｇから約１ｇの範囲であり、これは治療する面積、症状の重傷度および用いる局所賦形剤の性質に依存すると考えられる。好ましい局所製剤は、ＰＥＧ−１０００等の軟膏基剤１ｍｌ当たり約０．０１ｍｇから約５０ｍｇの有効成分が用いられる軟膏である。
【０１１１】
実施例
以下に実施例を示すが、これは例として示すものであって、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。
【０１１２】
方法と材料
融点（ｍｐ）はいずれもトーマス−フーバー毛細管融点（ｍｐ）装置を用いて測定したが、補正は行わなかった。
【０１１３】
１Ｈおよび１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ブルカ（Ｂｒｕｋｅｒ） ＡＸ ３００ 分光計（３００、７５．５ＭＨｚ）で記録した。化学シフト値（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で表した。ピークは次のように略記する。ｓは一重項、ｄは二重項、ｔは三重項、ｑは四重項、ｂｓはブロードな一重項、ｍは多重項である。
【０１１４】
プロトン、炭素１３およびリン３１磁気共鳴スペクトルは、ブルカ（Ｂｒｕｋｅｒ） ＡＸ ３００ 分光計を用いて得られた。プロトンおよび炭素１３化学シフトはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対する百万分率（　）として表す。リン３１スペクトルは、アセトン−ｄ６中の０．０４８５Ｍのトリフェニルリン酸を０ｐｐｍとした場合の相対的な百万分率（　）として表す。
【０１１５】
パーキン エルマー システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ） ２００−ＦＴＩＲを用いて、赤外（ＩＲ）スペクトルを記録した。
【０１１６】
マススペクトル（ＭＳ）は、ブルカ　エスクワイア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ） ＡＧもしくはブルカ　エスクワイア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｅｓｑｕｉｒｅ）ＬＣ／ＭＳ 分光計のいずれかを用いて、エレクトロスプレー インターフェイス（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）（ＥＳＩ）を使用した直接注入により陽性もしくは陰性モードのいずれかで記録した。スペクトルのデータは、割り当てられた構造と一致していた。
【０１１７】
元素分析はアトランティック マイクロラボ社（Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．） （Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）に依頼し、実測値は理論値の±０．４％以内であった。
【０１１８】
フラッシュカラムクロマトグラフィには、シリカゲル（Ｍｅｒｋ、２３０〜４００メッシュもしくは２００〜４２５メッシュ、６０Ａ０） を用いた。
【０１１９】
分析ＴＬＣは、アルミニウムの裏打ち（厚さ２００もしくは２５０ミクロン）を有するシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ）のシリカゲル６０Ｆ ２５４ＴＬＣシートを用いて実施した。
【０１２０】
試薬、溶媒、およびクロマトグラフィの媒体はいずれも、特記しない限り、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、フィシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）もしくはシグマ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のいずれかから購入したものであり、さらに精製することなく使用した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、ベンゾフェノンを指標として用い金属ナトリウムから蒸留によって乾燥を行った。無水塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、水素化カルシウム（ＣａＨ２）から蒸留した。モノグリセリドはいずれも、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ −Ｐｒｅｐ （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−セリンはフルカ（Ｆｌｕｋａ）から購入した。
【０１２１】
脂質はいずれもアバンティ ポーラー リピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。ＬＰＡ は使用前に、１ｍＭ ＥＧＴＡを含みＣａ２＋を含まないハンクス平衡塩溶液に溶解した１ｍＭのＢＳＡと１：１のモル比で混合した。他の脂質はいずれのアリコートも、ＭｅＯＨに溶解し、使用前にＬＰＡと混合した。もしくは、これ以外の場合には、特記した。
【０１２２】
サイトフェクテン トランスフェクション（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬は、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ； Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。フラ（Ｆｕｒａ）−２ＡＭはモレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から購入した。
【０１２３】
培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＧ４１８は、セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）から購入した。
【０１２４】
ヒトＥｄｇ−４を安定に発現するＲＨ７７７７細胞はケビン リンチ（Ｋｅｖｉｎ Ｌｙｎｃｈ）博士（バージニア大学、 Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）の好意により提供された。ヒト Ｅｄｇ−４およびＥｄｇ−７をコードするフラッグ（Ｆｌａｇ）タグの付加したｃＤＮＡはｐｃＤＮＡ３発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入されており、ジュンケン アオキ（Ｊｕｎｋｅｎ Ａｏｋｉ）博士（東京大学、東京、日本）の多大な提供によるものであった。ＲＨ７７７７およびＮＩＨ３Ｔ３細胞は、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＨＥＹ細胞は、リサ ジャニングス（Ｌｉｓａ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）博士（テネシー大学、Ｍｅｍｐｈｉｓ）から提供されたものである。細胞株はいずれも、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）成体から卵細胞を、既報（Ｔｉｇｙｉら、１９９９）のように調製した。
【０１２５】
安定トランスフェクション
ＲＨ７７７７細胞をヒト Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４、もしくはＥｄｇ−７をコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクションした後、サイトフェクテン トランスフェクション試薬を用いて供給元のプロトコールに従い、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローニングした。トランスフェクションした細胞を、１０％ＦＢＳおよび１ ｍｇ／ｍｌのジェンタマイシンを含むＤＭＥＭで選抜した。耐性細胞を回収して、限界希釈法によりサブクローニングした。次に、得られたクローンは機能アッセイ法およびＲＴ−ＰＣＲ解析を使用してスクリンーニングした。データは異なる３クローンの代表的なものを表す。
【０１２６】
一過性トランスフェクション
トランスフェクションの前日にポリリジンでコートしたカバーグラス（Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）にＲＨ７７７７細胞を蒔いた。次の日、６ μ ｌ のサイトフェクテンと混合した１ μ ｇ の プラスミドＤＮＡで細胞を一晩（１６〜１８時間）トランスフェクションした。次に、細胞をＤＭＥＭで二回洗い、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。次の日、細胞をＤＭＥＭでリンスし、最低でも細胞内カルシウムイオンのモニター２時間前に、血清を除いた。
【０１２７】
細胞内Ｃａ２＋の測定とデータ解析
既報に従い（Ｔｉｇｙｉら、１９９９）、蛍光Ｃａ２＋指示薬フラ（Ｆｕｒａ）−２ＡＭを用いて細胞内Ｃａ２＋変化をモニターした。細胞内Ｃａ２＋の測定データ点は、一過的に誘起したＣａ２＋のピークの全面積を表し、ＦＬウィンラボ（ＷｉｎＬａｂ）ソフトウエアー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で決定した。データ点は、少なくともの３回の測定の平均値±標準偏差を表す。データ点の有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて決定し、Ｐ ＜ ０．０５である場合に値を有意であるとした。
【０１２８】
アフリカツメガエル卵細胞における電気生理学的データ
ＬＰＡによって誘起された振動性Ｃｌ−電流を、既報（Ｔｉｇｙｉら、１９９９）に従い、電極電圧型クランプシステムを用いて記録した。
【０１２９】
ＥｄｇおよびＰＳＰ２４ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析
ＲＴ−ＰＣＲによるＥｄｇおよびＰＳＰ２４受容体のｍＲＮＡの同定は、既報（Ｔｉｇｙｉら、１９９９）に従い、以下のオリゴヌクレオチド配列を用いて実施した。
2004506604.tif 000054
【０１３０】
細胞増殖アッセイ法
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖は、 既報（Ｔｉｇｙｉら、１９９９）に従い、直接的に細胞を計数して評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％ＦＢＳ含有したＤＭＥＭの入った２４穴プレートに１０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。次の日、細胞をリンスし、ＤＭＥＭ中で６時間、血清飢餓状態にした。次に、脂質を２４時間添加した。細胞数をコールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）で計数し決定した。
【０１３１】
３Ｈチミジンの取り込み
ＲＨ７７７７細胞への３Ｈチミジンの取り込みは、既報（Ｔｉｇｙｉら、１９９４）に従い決定した。
【０１３２】
実施例１　Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ―セリン β−ラクトン、中間体化合物２５の合成
低温温度計および１００ｍｌ滴下漏斗を備えた５００ｍｌの３つ首フラスコを用いた。ガラス器具はいずれも、使用前にアルゴン（Ａｒ）下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。このフラスコにトリフェニルホスフィン（Ｐｈ３Ｐ）（１０ｇ、３８ｍｍｏｌ、真空下でＰ２Ｏ５により７２時間乾燥させた）および蒸留したばかりのＴＨＦ（１９０ｍｌ）を添加した。溶液をアルゴン下で冷却し、−７８℃で撹拌した（ドライアイス−アセトン浴）。激しく撹拌しながら、蒸留したばかりのジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）（６．２ｍｌ、３９．９ｍｍｏｌ）をシリンジで３０分かけて添加した。添加し終わった後、ミルク状の白色ペーストが得られるまで（約３０〜４０分）、混合物を撹拌した。蒸留したばかりのＴＨＦ（７５ｍｌ）中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン（２４） （７．７９ ｇ、 ３８ｍｍｏｌ、真空下でＰ２Ｏ５により７２時間乾燥した）の溶液を、反応混合物に４５分かけて滴下で添加した。アルゴン下で混合物を−７８℃で一晩撹拌し、０℃に暖めた（温度が−１０℃になった段階で、フラスコを氷浴に置いた）。約３０分後に、氷浴を水浴に換え、反応混合物を２時間撹拌し、３０℃で回転式蒸発装置を用いて淡黄色油状になるまで濃縮した。次に、この油状物質を２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１００ ｍｌ）で処理し、得られた白色固体を濾過によって除き、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２ ｘ ７０ ｍｌ）で洗浄した。ろ液を混合して濃縮し、残った油状物質を順次２５％（５００ｍｌ）および３０％ （１５００ｍｌ）ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いたシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィにかけた。
【０１３３】
適当な画分を混合して、白色固体３．４ｇ（４７％）を得た。
2004506604.tif 000055
【０１３４】
実施例２　化合物２６〜３４の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にＴＨＦを新たに蒸留した。
【０１３５】
化合物２６： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−（ノニルアミノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
デシルアミン（４９０ｍｇ、 ３．２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン βラクトン（３００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１３６】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して白色ワックス状粉末の化合物２６を２９０ｍｇ（５２％）得た。
2004506604.tif 000056
【０１３７】
化合物２７： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２−（テトラデシルアミノ）エチル］カルバミン酸
テトラデシルアミン（２７３ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン βラクトン（２００ ｍｇ、 １．０６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１３８】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末状の化合物２７を２４５ ｍｇ （５７％）得た。
2004506604.tif 000057
【０１３９】
化合物２８： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−（オクタデシルアミノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
オクタデシルアミン（５１６ ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ） のＴＨＦ溶液（６０ ｍｌ）に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン βラクトン（３００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ） を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１４０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末状の化合物２８を３００ｍｇ（４１％）得た。
2004506604.tif 000058
【０１４１】
化合物２９： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−｛１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２− ［４−（テトラデシルオキシ）アニリノ］エチル｝カルバミン酸
４−（テトラデシルオキシ）アニリン（１５０ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４０ ｍｌ）に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン β−ラクトン （９１ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で４８時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ（二回）、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１４２】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末の化合物２９を１１０ｍｇ（４５％）得た。
2004506604.tif 000059
【０１４３】
化合物３０： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−（４−メトキシアニリノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ｐ−アニシジン（１００ｍｇ、 ０．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液に、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン β−ラクトン（１５１ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１４４】
適当な画分をプールし、ＣＨＣｌ３／ヘキサンから結晶化して、白色粉末の化合物３０を１３５ｍｇ（５４％）得た。
2004506604.tif 000060
【０１４５】
化合物３１： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２−［３−（テトラデシルオキシ）アニリノ］エチル｝カルバミン酸
３−（テトラデシルオキシ）アニリン（１７９ ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン β−ラクトン （９１ｍｇ、０．４９０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で４８時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１４６】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色粉末の化合物３１を１０５ｍｇ（４３％）得た。
2004506604.tif 000061
【０１４７】
化合物３２： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−（３−メトキシアニリノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ｍ−アニシジン（１７１ｍｇ、 １．３８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍｌ）溶液に、 Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン βラクトン（２００ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で一晩還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１４８】
適当な画分をプールし、黄色油状の化合物３２を１５４ ｍｇ（４６％）得た。
2004506604.tif 000062
【０１４９】
化合物３３： ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２−［２−（テトラデシルオキシ）アニリノ］エチル｝カルバミン酸
２−（テトラデシルオキシ）アニリン （２００ ｍｇ、０．６５４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン β−ラクトン（１０２ｍｇ、０．５４５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で４８時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１５０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して黄色油状の化合物３３を３３ｍｇ （＜ １０％）得た。
2004506604.tif 000063
【０１５１】
化合物３４： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−（ヒドロキシメチル）−２−（２−メトキシアニリノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ｏ−アニシジン （２３８ｍｇ、 １．９３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍｌ）溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリン βラクトン（２００ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で４８時間還流した。反応混合物を回転式蒸発装置で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１５２】
適当な画分をプールし、ＣＨＣｌ３／ヘキサンから結晶化して黄色粉末の化合物３４を１５０ｍｇ（４５％）得た。
2004506604.tif 000064
【０１５３】
実施例３　化合物３５〜４３の合成
化合物３５： Ｎ−１−ノニル−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸　化合物２６（２０ｍｇ、 ０．０５８０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２ （１ ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（１ ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物３５を１９ｍｇ（９５％）得た。
2004506604.tif 000065
【０１５４】
化合物３６： Ｎ−１−テトラデシル−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物２７（５０ ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（１．５ ｍｌ）溶液にＴＦＡ（１．５ ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体状の化合物３６を４８ｍｇ（９４％）得た。
2004506604.tif 000066
【０１５５】
化合物３７： Ｎ−１−オクタデシル−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物２８（２５ｍｇ、０．０５４７ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）溶液にＴＦＡ（１ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物３７を２３ｍｇ（９２％）得た。
2004506604.tif 000067
【０１５６】
化合物３８： Ｎ−１−［４−（テトラデシルオキシ）フェニル］ −２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物２９（５４ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（０．０５０ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（０．０５０ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、白色固体の化合物３８を５５ｍｇ（９９％）得た。
2004506604.tif 000068
【０１５７】
化合物３９： Ｎ−１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物３０（５０ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（０．０４９ｍｌ）溶液にＴＦＡ（０．０４９ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空で乾燥して、白色固体の化合物３９を５０ｍｇ（９６％）得た。
2004506604.tif 000069
【０１５８】
化合物４０： Ｎ−１−［３−（テトラデシルオキシ）フェニル］ −２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物３１（４５ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）の冷却した （０℃、氷 浴）ＣＨ２Ｃｌ２（０．０６２ｍｌ）溶液にＴＦＡ（０．０６２ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、黄色味を帯びた緑色の固体の化合物４０を４５ｇ（９９％）得た。
2004506604.tif 000070
【０１５９】
化合物４１： Ｎ−１−（３−メトキシフェニル）−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物３２（１２０ｍｇ、０．３８６ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２ （１ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物４１を１２３ｍｇ（９８％）得た。
2004506604.tif 000071
【０１６０】
化合物４２： Ｎ−１−［２−（テトラデシルオキシ）フェニル］ −２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物３３（２１ｍｇ、 ０．０４４ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物４２を２１ｍｇ（９５％）得た。
2004506604.tif 000072
【０１６１】
化合物４３： Ｎ−１−（２−メトキシフェニル）−２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンアミドトリフルオロ酢酸
化合物３４（８０ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）の冷却した（０℃の氷浴）ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍｌ）をアルゴン雰囲気下で滴下し添加した。添加が終了した後、反応物を室温で３時間撹拌した。室温減圧下で濃縮した後、真空ポンプで乾燥し、灰色がかった白色固体の化合物４３を８１ｍｇ（９７％）得た。
2004506604.tif 000073
【０１６２】
実施例４　中間体化合物５０〜５４の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し（３時間）、乾燥した（高真空度下で、４８時間）。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を新たに蒸留した。
【０１６３】
化合物５０： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−｛（［ジベンジルオキシ］ホスホリル）オキシ｝メチル］−２−（ノニルアミノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質２８（２５２ｍｇ、０．５５１ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール （２３１ｍｇ、３．３１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（１．１４ｇ、３．１３ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２ を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ３０ｍｌ）、水（２ｘ３０ｍｌ）および鹹水（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１６４】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、無色の油状である化合物５０を１９５ｍｇ（４９％）得た。
2004506604.tif 000074
【０１６５】
化合物５１： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−｛（［ジ（ベンジルオキシ）ホスホリル］オキシ）メチル｝−２−オキソ−２−（テトラデシルアミノ）エチル］カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質２７（３０５ｍｇ、０．７６１ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（３１９ ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（１．５７ｇ、４．５６ｍｍｏｌ）を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ３０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ４０ｍｌ）、水（２ｘ３５ｍｌ）および鹹水（２ｘ３５ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１６６】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色ワックス状の固体である化合物５１を４５１ｍｇ（８９％）得た。
2004506604.tif 000075
【０１６７】
化合物５２： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−｛（［ジ（ベンジルオキシ）ホスホリル］オキシ）メチル｝−２−（オクタデシルアミノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質２６（２７０ｍｇ、０．７８３ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（３２９ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（１．６２ｇ、４．７０ｍｍｏｌ） を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ２５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ２５ｍｌ）、 水（２ｘ２５ｍｌ）および鹹水（２ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１６８】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物５２を１３５ｍｇ（２８％）得た。
2004506604.tif 000076
【０１６９】
化合物５３： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−｛１−｛（［ジ（ベンジルオキシ）ホスホリル］オキシ）メチル｝−２−オキソ−２−［４−（テトラデシルオキシ）アニリノ］エチル｝カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質２９（３１０ｍｇ、０．６４７ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（４５０ｍｇ、６．４２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（２．２１ｇ、６．４２ｍｍｏｌ） を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３ （２ｘ３５ｍｌ）、 水（２ｘ３５ｍｌ）および鹹水（２ｘ３５ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１７０】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物５３を８１ｍｇ（１７％）得た。
2004506604.tif 000077
【０１７１】
化合物５４： ｔｅｒｔ−ブチル Ｎ−［１−｛（［ジ（ベンジルオキシ）ホスホリル］オキシ）メチル｝−２−（４−メトキシアニリノ）−２−オキソエチル］カルバミン酸
ピリジンで洗浄した出発物質３０（２２５ｍｇ、０．７２５ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（２４５ｍｇ、３．６２５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（１．２５ｇ、３．６２５ｍｍｏｌ）を添加し、次に、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、生成物が形成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。回転式蒸発装置によりＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ１５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ２５ｍｌ）、 水（２ｘ２５ｍｌ）および鹹水（２ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１７２】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色固体状の化合物５４を１９５ｍｇ（４７％）得た。
2004506604.tif 000078
【０１７３】
実施例５　化合物５５〜５９の合成
化合物５５： ２−アミノ−３−（ノニルアミノ）−３−オキソプロピル二水素リン酸
化合物５０（１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。５０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物５５を４８ｍｇ（９０％）得た。
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【０１７４】
化合物５６： ２−アミノ−３−オキソ−３−（テトラデシルアミノ）プロピル二水素リン酸
化合物５１（１４５ｍｇ、 ０．２１９ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。４５ｐｓｉで３時間水素化した。３時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物５６を７５ｍｇ（９０％）得た。
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【０１７５】
化合物５６ａ： ２−（アセチルアミノ）−３−オキソ−３−（テトラデシルアミノ）プロピル二水素リン酸
化合物５６（２０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）の０．５ｍｌピリジン試料に、大過剰の無水酢酸を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。過剰のピリジンと無水酢酸を回転式蒸発装置にかけた。得られた混合物を２０ｍｌのＨＣｌ水溶液と混ぜ、撹拌した。この酸性混合物をＥｔＯＡｃ（２ｘ２５ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を水（２ｘ２５ｍｌ）および鹹水（２ｘ２５ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、ゴム状の固体である化合物５６ａを１５ｍｇ（７１％）得た。
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【０１７６】
化合物５７： ２−アミノ−３−（オクタデシルアミノ）−３−オキソプロピル二水素リン酸
化合物５２（１１７ｍｇ、 ０．１６４ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。５０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物５７を７０ｍｇ（９８％）得た。
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【０１７７】
化合物５８： ２−アミノ−３−オキソ−３−［４−（テトラデシルオキシ）アニリノ］ プロピル二水素リン酸塩
化合物５３（４０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。５０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物５５を２２ｍｇ（８８％）得た。
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【０１７８】
化合物５９： ２−アミノ−３−（４−メトキシアニリノ）−３−オキソプロピル二水素リン酸
化合物５４（１２５ｍｇ、 ０．２１９ ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。４５ｐｓｉで２時間水素化した。２時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色粉末の化合物５９を８２ｍｇ（９６％）得た。
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【０１７９】
実施例６ 中間体化合物６３〜６５の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し（３回）、高真空度下で、４８時間乾燥した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を新たに蒸留した。
【０１８０】
化合物６３： １，２−（３−オクタデシルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のｄｌ−バチルアルコール（化合物６０、２２５ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（２２９ｍｇ、３．２６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（１．１２ｇ、３．２６ｍｍｏｌ） を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ３０ｍｌ）、水（２ｘ３０ｍｌ）および鹹水（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１８１】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物６３を３０３ｍｇ（５３％）得た。
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【０１８２】
化合物６４： １，２−（３−ドデシルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のｄｌ−３−Ｏ−ｎ−ドデシル−１，２−プロパンジオール（化合物６１、４００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（６４５ｍｇ、 ９．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（３．１８ｇ、 ９．２ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（８０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ３５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ４０ｍｌ）、水（２ｘ３０ｍｌ）、および鹹水（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１８３】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物６４を１００ｍｇ（＜１０％）得た。
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【０１８４】
化合物６５： １，２−（３−ヘキサデシルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のｄｌ−３−Ｏ−ｎ−ヘキサデシル−１，２−プロパンジオール（化合物６２、５００ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（６６４ｍｇ、９．４７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりの１：１混合のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を添加した。 １０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（３．２７ｇ、９．４７ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（８０ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ３５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ４０ｍｌ）、水（２ｘ３０ｍｌ）および鹹水（２ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１８５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物６５を２０５ｍｇ（１５％）得た。
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【０１８６】
実施例７　化合物６６〜６８の合成
化合物６６： １，２−（３−オクタデシルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物６３（１３５ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物６６を７０ｍｇ（８９％）得た。
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【０１８７】
化合物６７： １，２−（３−ドデシルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物６４（７０ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ） のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物６７を３５ｍｇ（９４％）得た。
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【０１８８】
化合物６８： １，２−（３−ヘキサデシルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物６５（１３８ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、透明なワックス状の化合物６８を７５ｍｇ（９６％）得た。
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【０１８９】
実施例８　中間体化合物７７〜８４の合成
用いたガラス器具はアルゴン雰囲気下で炎光乾燥した後、室温まで冷却した。出発物質のアルコールは、無水ピリジンで洗浄し（３回）、高真空度下で、４８時間乾燥した。アルゴン雰囲気下で反応を行った。使用の前にＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を新たに蒸留した。
【０１９０】
化合物７７： １，２−（３−テトラデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノミリスチン（化合物６９、８００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（１．０１ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４５ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（５．０２ｇ、 １４．５ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ７５ｍｌ）、 水（２ｘ５０ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１９１】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物７７を６００ｍｇ（２８％）得た。
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【０１９２】
化合物７８： １，２−（３−ペンタンデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノペンタデカノイン（化合物７０、８００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（９７０ｍｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４５ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．８０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１００ｍｌ）、水（２ｘ５０ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１９３】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物７８を７４１ｍｇ（３５％）得た。
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【０１９４】
化合物７９： １，２−（３−ヘキサデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノパルミチン（化合物７１、８００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ） に１Ｈ−テトラゾール（１．００ｇ、 １４．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４５ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．９０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１００ｍｌ）、水（２ｘ５０ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１９５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物７９を７８６ｍｇ（３８％）得た。
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【０１９６】
化合物８０： １，２−（３−ヘプタデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノヘプタデカノイン（化合物７２、８００ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（９８０ｍｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．８１ｇ、１３．９ｍｍｏｌ） を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１００ｍｌ）、水（２ｘ５０ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１９７】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物８０を１．４８ｇ（７４％）得た。
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【０１９８】
化合物８１： １，２−（３−オクタデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノステアリン（化合物７３、８００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（１．００ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．９２ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１００ｍｌ）、水（２ｘ５０ｍｌ））および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０１９９】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物８１を８７０ｍｇ（４５％）得た。
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【０２００】
化合物８２： １，２−（３−ノナデカノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノノナデカノイン（化合物７４、８００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）に１Ｈ−テトラゾール（９７７ｇ、 １３．９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．８１ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３ （２ｘ１２５ｍｌ）、水（２ｘ７５ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０２０１】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物８２を１．４７ｇ（７８％）得た。
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【０２０２】
化合物８３： １，２−（３−イコサノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノアラキジン（化合物７５、８００ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ） に１Ｈ−テトラゾール（１．００ｇ、 １４．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（４．９２ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１２５ｍｌ）、 水（２ｘ７５ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０２０３】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、透明な油状の化合物８３を１．３９ｇ（７４％）得た。
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【０２０４】
化合物８４： １，２−（３−ドコサノイルオキシプロパン）−ビス（ジベンジルリン酸）
ピリジンで洗浄した出発物質のモノベヘーニン（化合物７６、８００ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ） に１Ｈ−テトラゾール（１．００ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、蒸留したばかりのＴＨＦ（４０ｍｌ）を添加した。１０分後、ジベンジルジイソプロピルホスホラミデート（５．１４ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下で反応物を９０分間撹拌した。反応混合物をＴＬＣで調べた結果、産物が生成していることが分かった。この混合物を、０℃（氷浴）まで冷却し、大過剰の過酢酸を加えた。混合物をさらに３５分間撹拌した後、過剰の過酢酸を除去するためにメタ重亜硫酸ナトリウムを加えた。ＴＨＦを減圧下で除去した。濃縮物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で処理し、メタ重亜硫酸ナトリウム （２ｘ５０ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（２ｘ１２５ｍｌ）、 水（２ｘ７５ｍｌ）および鹹水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。ＮａＳＯ４で有機部分を乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、異なる組成のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。
【０２０５】
適当な画分をプールし、真空中で濃縮乾燥して、白色ワックス様の化合物８４を１．２７ｇ（７１％）得た。
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【０２０６】
実施例９　化合物の合成８５〜９２
化合物８５： １，２−（３−テトラデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物７７（３８５ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物８５を２１０ｍｇ（９８％）得た。
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【０２０７】
化合物８６： １，２−（３−ペンタンデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物７８（４５１ｇ、０．５３８ｍｍｏｌ） のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（触媒作用量）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物８６を２５０ｍｇ（９７％）得た。
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【０２０８】
化合物８７： １，２−（３−ヘキサデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物７９（５６１ｇ、０．６５９ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（６１０ｍｇ）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物８７を３００ｍｇ（９２％）得た。
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【０２０９】
化合物８８： １，２−（３−ヘプタデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物８０（６３６ｍｇ、 ０．７３６ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（７２４ｍｇ）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物８８を３６５ｍｇ（９８％）得た。
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【０２１０】
化合物８９： １，２−（３−オクタデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物８１（５３０ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）のエタノール（１５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（６１７ｍｇ）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物８９を３０５ｍｇ（９７％）得た。
2004506604.tif 000103
【０２１１】
化合物９０： １，２−（３−ノナデカノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物８２（９５２ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（１ｇ）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物９０を５５５ｍｇ（９８％）得た。
2004506604.tif 000104
【０２１２】
化合物９１： １，２−（３−イコサノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物８３（７１１ｍｇ、０．７８４ｍｍｏｌ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（８１３ｍｇ）を添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物９１を４１９ｍｇ（９７％）得た。
2004506604.tif 000105
【０２１３】
化合物９２： １，２−（３−ドコサノイルオキシプロパン）−ビス（二水素リン酸塩）
化合物８４（６６３ｍｇ、０．７０９ｍｍｏｌ） のエタノール（２５ｍｌ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（７１０ｍｇを添加した。６０ｐｓｉで４時間水素化した。４時間後にＴＬＣで反応終結を調べ、反応混合をセライトで濾過した。溶出液を減圧下で濃縮し、白色ワックス状の化合物９２を４００ｍｇ（９８％）得た。
2004506604.tif 000106
【０２１４】
実施例１０　アフリカツメガエルの卵細胞アッセイ法
ＰＳＰ２４ ＰＬＧＦＲを内因的に発現するアフリカツメガエルの卵細胞を用いて、ＬＰＡ阻害活性に関する新たに設計、合成した化合物のスクリーニングを実施した。
【０２１５】
無菌状態でアフリカツメガエル（Ｘｅｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）成体（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）をキシラジンで麻酔し、卵細胞を得て、実験に用いた。Ｃａ２＋を含まない卵巣用リンゲル−２溶液（（ＯＲ−２） ８２． ５ ｍＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨでｐＨ ７． ５に調整）中で１．４ｍｇ／ｍｌ のＡ型コラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ＩＮ）を用いた処理で段階Ｖ−ＶＩの卵細胞を卵胞細胞層から除去した。１７〜２０℃のインキュベータ内で、卵細胞をバース溶液中で維持し、単離後２〜７日間用いた。
【０２１６】
−６０ ｍＶ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ ５００、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ）の膜電位を有する標準２電極電位クランプ増幅器を使用して電気生理学的記録を行った。試験化合物はメタノールに溶解し、脂肪酸を含まないＢＳＡと混合した。これをカエル用Ｎａ＋リンゲル溶液（１２０ ｎＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ； ｐＨ ７．０）で希釈した。これを５ｍｌ／分の流速で灌流しながら卵細胞に添加した。ＮＩＣ−３１０デジタルオシロスコープ（Ｎｉｃｏｌｅｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で膜電流を記録した。適当な洗浄除去と脱感作からの回復が可能となるように、１５分（最小）間隔で添加した。
【０２１７】
図２１〜２７は、ＬＰＡ誘導性の塩素電流に対する化合物５６、５７、６６および９２による用量依存的阻害を示している。
【０２１８】
非リン酸化誘導体のなかでは、化合物３６が最も好適な阻害剤であった。この阻害効果が細胞表面への作用によるものであるか否か、もしくは阻害が細胞内への作用の結果であるのか否かを調べるために化合物３６を細胞内注入したところ、化合物３６の細胞内添加では、そこが作用部位であることを示唆する結果は何も得られなかった。従って、遊離型水酸基を有する化合物（３５〜４３）から出発して、細胞中に入らずに細胞表面で相互作用するようなリン酸化化合物（５５〜５９）を合成した。
【０２１９】
化合物５６、５７、６６および９２は、アフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡ誘導性塩素電流の阻害剤であった。化合物５６、５７、６６および９２は、ＬＰＡの作用を用量依存的に阻害することが可能であった。さらに、アフリカツメガエル卵細胞を洗うことにより、ＬＰＡ応答は完全に回復した。この実験は、化合物５６、５７、６６および９２がＬＰＡ誘導性塩素電流を可逆的に阻害可能であったことを示している。化合物６６は、５μＭでアフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡの効果を完全に消失させ、このときＩＣ５０は約１．２μＭであった（図２３および２４）。さらに、化合物６６を細胞内に微量注入し（矢印、図２３Ｂ）、細胞外にＬＰＡ（１０ｎＭ）を添加した場合、ＬＰＡ応答を阻害しなかった。この実験は、化合物６６の阻害作用が細胞外的であることを示唆する。
【０２２０】
アフリカツメガエル卵細胞を用いて、化合物３５、および３７〜４３を試験したが、結果は決定的ではなかった。化合物５５は１μＭで弱い阻害（２ｎＭ ＬＰＡに対し３８％）を示した。ＳＡＰ系では、化合物５８および５９については、アフリカツメガエル卵細胞でのアッセイ法による試験されるべきである。二リン酸系では、化合物８９はＬＰＡ誘導性応答を阻害した（２ｎＭのＬＰＡに対して５９％）。しかしながら、 化合物６７（閾値〜１μＭ）、６８（閾値〜１０ｎＭ）および８５（閾値〜１００ｎＭ）は、応答のみを誘起する。化合物８６、８７、８８、９０および９１については、さらに評価を行った。化合物５６ａを設計、合成し、遊離アミノ基の重要性について試験を行った。アフリカツメガエル卵細胞によるアッセイ法で化合物５６ａを評価した場合、ＬＰＡと組み合わせて適用すると化合物５６ａはＬＰＡ応答を促進した。化合物５６ａは、２μＭでは応答を誘起しなかった（データは示してはいない）が、１０μＭでは化合物５６それ自身で応答を誘起することが可能であった（図２６）。この実験は、阻害活性に遊離アミノ基が必要であることを示唆する。
【０２２１】
実施例１１　ＨＥＹ卵巣細胞の遊走
ＨＥＹ卵巣癌細胞は、２種のＬＰＡ受容体、ＥＤＧ−２およびＥＤＧ−７を発現していることが知られている。そこで、ＬＰＡで誘導される細胞運動性に対する阻害能に関し、化合物５６、５６ａおよび６６の評価を行った（化合物濃度：０．１μＭのＬＰＡ 濃度に対する１μＭ）。
【０２２２】
ＨＥＹ卵巣細胞は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ） および１０％ウシ胎児血清を加えた（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。細胞はいずれも、２日間集密状態に増殖することによってＧ０／Ｇ１期に同期させた。再度、細胞を蒔き、フラスコ中で約５０〜６０％の集密度になったところで実験用に回収した。フラスコから細胞を取り出した後、ＰＢＳ中で３７℃にて０．５３ｍＭのＥＤＴＡに５分間曝露した。等量の２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０により、ＥＤＴＡを中和した。細胞を８００ｒｐｍで室温１０分間、遠心分離した。回収した細胞を２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０で二回洗浄し、１ｍｌあたり１ｘ１０６ 個の細胞密度で再懸濁した後、３７℃に１時間放置した。
【０２２３】
改変定量的細胞遊走アッセイ法 （カタログ番号ＥＣＭ５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）を用いて、細胞の運動性を試験した。ケミコンチャンバー膜は、ファイブロネクチンを含む直径８ミクロンの細孔でコートした。阻害剤を含まない、もしくは阻害剤（１μＭ）を含む４００μｌのＲＰＭＩ／２ｍＭ Ｌ−グルタミンを下のチャンバーにピペットで添加した。ＲＰＭＩ１６４０／２ｍＭ Ｌ−グルタミン中の約５ｘ１０４個の細胞を上のチャンバーに添加した。挿入容器を含む２４穴プレートを５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて３７℃で４時間インキューベートした。インキュベーションの終わりに、チャンバーを取り出し、新しい２４穴プレートと交換した。内部チャンバー中の細胞を何回も塗布することによってはがし、調製した細胞染色液中に室温で３０分間浸した。インキュベーションの終わりに、細胞染色液をウェルから除去した。チャンバーをウェルあたり１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄後、チャンバーを調べて、適当な細胞形態であるかを確かめ、接着細胞数を倒立顕微鏡下で計数した。
【０２２４】
合成したばかりの化合物のＨＥＹ卵巣癌細胞のＬＰＡ誘導性遊走に対する効果を図２７に示す。化合物６６は、ＬＰＡ誘導性の細胞の運動性を、約７０％阻害した。しかしながら、化合物５５ （僅かに）および５６ａはＬＰＡ誘導で誘導される細胞の運動性を高める。
【０２２５】
実施例１２　化合物の細胞毒性
イム（Ｉｍ）ら（２０００）およびＲＴ−ＰＣＲのデータにより、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰにはＰＬＧＦＲが存在することが示された。アフリカツメガエル卵細胞におけるアッセイ法および細胞運動性アッセイ法では確実に阻害的活性を示したので、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰに対する増殖阻害効果を複数の化合物について調べた。
【０２２６】
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０もしくはダルベッコ改変イーグル培地を含む１５０ｃｍ２フラスコでＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞を増殖させた。トリプシンを用いて細胞をストックフラスコから剥がし、遠心分離を行い新鮮な培地に再懸濁した。これをウェル当たり約２，０００細胞の密度で９６穴培養プレートに蒔いた。薬剤の最終濃度は０．０５μＭから１０μＭもしくは５０μＭの範囲であった。薬剤を添加しない対照実験（陰性対照）および５−フルオロウラシルを添加した対照実験（陽性対照）も平行して実施した。実験中の薬剤分解の影響を最小限に抑えるため、４８時間で培地を除去し置換した。薬剤曝露９６時間後に、５０％の冷トリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）を添加して細胞を固定し、４℃で１時間インキュベーションした。固定した細胞をスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）で染色し、５４０ｎｍの吸光度における、細胞数対吸光度の標準曲線と比較し細胞数を決定した。同一の実験を二回繰り返した。対照（未処理のウェル）に対する％で表した細胞数を、薬剤濃度に対してプロットし、細胞増殖を５０％（ＩＣ５０）阻害した濃度を非線形回帰法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により決定した。
【０２２７】
参照化合物５Ｆ−ウラシル、ＬＰＡ （１８：１）、ＳＰＨ （１３：０）、ＳＰＰ（１３：０）および Ｎ−パルミトイル Ｌ−セリン リン酸（１５：０）を用い、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰの細胞毒性に関する試験を行った。これを表３に示す。
【表３】合成化合物の前立腺癌細胞株における細胞毒性
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Ｘ対照（未処理のウェル）に対し％で表した細胞数を薬剤濃度に対してプロットした。濃度および細胞増殖を５０％阻害した濃度（ＩＣ５０）を非線形回帰法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で決定した。
ＷＡ＝弱い活性、ＮＡ＝無活性、？＝最大阻害は５０％。
【０２２８】
化合物５５、５６、５６ａ、６６および８５は一定範囲の増殖阻害活性を示した。化合物５６は、５−フルオロウラシルよりもＤＵ−１４５およびＰＣ−３の細胞増殖に対しより強い阻害剤であった。興味深いことに、化合物５６ａは、ＤＵ−１４５細胞の増殖を選択的に阻害したが、ＰＣ−３細胞に対してはさほどつよいものではなかった。化合物５５はＤＵ−１４５およびＰＣ−３細胞の増殖に比べＬＮＣａＰ細胞の増殖に対してより強い阻害剤であった。化合物６６は、ＬＮＣａＰ細胞の増殖を選択的に阻害したが、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞に対しては活性を示さなかった。二リン酸 （ｓｎ−１ アシル）のなかでは、化合物８５が最大の活性を有していた。
【０２２９】
実施例１〜１２の考察
３種類の化合物群を特異的に合成し分析した（化合物３５〜４３、５５〜５９、６６〜６８、および８５〜９２）。第一および第二の組は内在的阻害剤ＳＰＨおよびＳＰＰの合成阻害剤Ｎ−パルミトイルＬ−セリンリン酸による汞化反応を含むものであるが、第三の系列は二リン酸を含む。化合物５６、５７、６６および９２は、アフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡ誘導性塩素電流アッセイ法では阻害剤であった。また、（ｓｎ−１）部位の鎖長がより短い二リン酸はアフリカツメガエル卵細胞に塩素電流を誘起することが可能であった（化合物６７（閾値〜１ｎＭ）、化合物６８（閾値〜１０ｎＭ）および化合物８５（閾値〜１００ｎＭ））。化合物６６が、ＨＥＹ卵巣癌細胞株のＬＰＡ誘導性細胞運動を阻害することが示された。上記の合成化合物のＤＵ−１４５、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株に対する増殖阻害効果の評価を行なうと、３種類の強力で選択的な化合物（化合物５６、５６ａおよび６６）が発見された。
【０２３０】
上記のデータ（表３）は、以下を示唆する。すなわち、（１）リン酸を含まずアルコールを含む化合物の活性はより低い（化合物２７対５６）、（２）保護されたリン酸部分を有する化合物の活性はより低い（化合物５１対５６）、（３） アミンのアルキル化によって活性は低下しない（化合物５６ａ）、（４）最も強力な二リン酸はｓｎ−１位にエーテル結合を有する、（５）ＳＡＰ系列について鎖長を短くするとＤＵ−１４５およびＰＣ−３に対する効力は低下する（化合物５５対５６）（しかしながら、ＬＮＣａＰ細胞に対してはより有効であった）、（６）二リン酸（ｓｎ−１アルキル）化合物の鎖長を短くすると、ＬＮＣａＰ細胞に対する選択性は残るが効力は低下する、および（７）ｓｎ−１位の置換（アシル対アルキル）は、効力を高めることはなかった。これら分子の標的部位は細胞膜上であると可能性が高い（例えば、膜貫通型受容体）。なぜなら、極性リン酸誘導体は容易に細胞膜を通過するとは考えにくい（能動輸送系がある可能性も存在するが）からである。これらの結果は、ＰＬＧＦＲにおける差もしくは下流のシグナル伝達で起こる現象がこれらの化合物の増殖への阻害的性質における重要な役割を果たす可能性を示唆する【０２３１】
実施例１３　Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４および Ｅｄｇ−７を発現する安定な細胞株の調製と特徴付け
Ｅｄｇ−２、４および７受容体に対する選択的拮抗薬を開発する試みにおいて、候補化合物をスクリーニングする系をはじめて確立した。モデル系としてＲＨ７７７７細胞を選んだ。なぜなら、各種の細胞アッセイ法でＬＰＡ非応答性であることが報告されており、既知のいずれのＥｄｇ受容体についてもｍＲＮＡがないことがわかったためである（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９９８）。ＲＨ７７７７細胞において、ＥＤＧ受容体でトランスフェクションした安定細胞株および挿入断片を含まないベクターでトランスフェクションした対照の細胞株を樹立した。
【０２３２】
得られたクローンを、細胞内Ｃａ２＋の過渡応答をモニターすることおよびＲＴ−ＰＣＲにより、スクリンーニングした。このスクリーニングにより、少なくとも３種類のＥｄｇ−２および−７を発現する陽性細胞株の同定に至ったが、Ｅｄｇ−４を発現する陽性細胞は全く同定できなかった。ベクターをトランスフェクションした細胞は、ＬＰＡ応答性を示さないことも分かった。Ｅｄｇ−４を発現する安定なクローンは単離されなかったが、Ｅｄｇ−４の一過性発現によってＬＰＡ媒介性の細胞内内Ｃａ２＋濃度の過渡応答の増加が起こった。このことは、該構築物がこれらの細胞において活性を示すことを示唆した。これらの実験に用いた安定Ｅｄｇ−４ 細胞株は、イム（Ｉｍ）らが単離し特徴付けを行ったものであり、同クローンは彼らの好意によって提供されたものである（Ｉｍら、２０００）。
【０２３３】
候補拮抗薬のスクリーニングに関する適当なアッセイ法を特定する試みにおいて、さらに該細胞株の特徴付けを行った。Ｅｄｇ−２を発現する細胞株、および一過的にＥｄｇ−４を発現する細胞において、ＬＰＡ誘起性のＥＲＫ１／２の活性化が見られたが、Ｅｄｇ−７を発現する細胞では、ＥＲＫ１／２は活性化されなかった。Ｅｄｇ−２、−４および−７を発現する安定な細胞株のいずれにおいても、ＬＰＡは細胞内Ｃａ２＋濃度の一過性増加を誘起した。用量反応曲線から、ＥＣ５０値はＥｄｇ−２、−４、−７を発現する細胞において、それぞれ３７８±５３、９９８±６７、および２１４±２６ｎＭであることがわかった（図２８Ａ〜Ｃ）。安定Ｅｄｇ−４クローンについて決定されたＥＣ５０値は以前に報告されているものと異なっていたので、ＥＣ５０値が１８６±３９である一過的にＥｄｇ−４を発現する細胞（図２８Ｂ、Ａｎら、１９９８ａ； Ａｎら、１９９８ｂ）についても用量反応曲線を作成した。
【０２３４】
安定細胞株においてＬＰＡのＤＮＡ合成刺激能を、３Ｈチミジンの取り込みにより測定することにより調べた。野生型ＲＨ７７７７細胞もベクターをトランスフェクションした ＲＨ７７７７細胞も、１０μＭのＬＰＡと２４時間のインキュベーションしても３Ｈチミジンの取り込みの増加を示さなかった。この結果は、既報でこれらの細胞においてＬＰＡが分裂促進性であることを示した所見と対照的である。Ｅｄｇ−２が発現する細胞では、３Ｈチミジンの取り込みが１．８倍増加を示したが、Ｅｄｇ−４および−７ を発現する細胞では、対照の細胞と比較して３Ｈチミジンの取り込みの増加が見られなかった。
【０２３５】
実施例１４　Ｅｄｇ−２およびＥｄｇ−７受容体に対する短鎖ホスファチジン酸の活性
Ｃａ２＋濃度の過渡応答がＥｄｇ−２、−４および−７を発現する安定な三種類の細胞株のいずれにおいても誘起されたので（図２８Ａ〜Ｃ）、このアッセイ法を用いて候補拮抗薬のスクリーニングを実施した。ＬＰＡで活性化されるＥｇｄ受容体ファミリーの構成員、Ｅｄｇ−２、−４および−７に対する選択的拮抗薬を同定する試みにおいて、ＬＰＡファルマコフォアの構造的特徴が出発点として信頼された。短鎖（８：０）ＬＰＡ、もしくはＬＰＡ（８：０）とＬＰＡ（１８：１）の混合物を、Ｅｄｇ−２、−４もしくは−７の阻害剤として試験した。細胞をＬＰＡ８：０とＬＰＡ１８：１の混合物を用いて行なってみたが、３種類の安定細胞株のいずれにおいてもＣａ２＋応答は起こらなかった（図３０Ａ〜Ｃ、３１Ａ〜Ｃおよび３２Ａ〜Ｂを参照のこと）。１０μＭの濃度で用いた場合、ＬＰＡ８：０単独では、いずれの細胞においてもＣａ２＋応答を誘起することはできなかった。
【０２３６】
これらの結果に基づいて、本出願人らは、立体的に脂肪酸鎖の可動性を拘束するＬＰＡファルマコフォアの修飾はリガンドの性質にも効果を与えるのではないかと考えた。このような理由で、ｓｎ−２位に第二の短鎖脂肪酸を有する化合物についても試験を行った。このような短鎖ホスファチジン酸は、対応する短鎖ＬＰＡと比較して疎水性が増加する。これにより、受容体のリガンド結合ポケットとの相互作用に束縛を与える。
【０２３７】
ホスファチジン酸（ＰＡ）およびジアシルグリセロールピロリン酸（ＤＧＰＰ）はイオン性リン酸基および脂肪酸鎖を有し、ＬＰＡファルマコフォアと共通する重要な化学的性質を持った天然の脂質である。これらはいずれもＥｄｇ受容体の作用薬ではない（以下を参照のこと）。この類似性に注意しながら、短鎖ＤＧＰＰを調製し、Ｅｄｇ−２、−４もしくは−７の阻害剤として試験を行った。安定細胞株において１０倍過剰のＤＧＰＰ（８：０）がＬＰＡ誘起性Ｃａ２＋応答に与える効果を、図２９Ａ〜Ｄに示す。Ｅｄｇ−２を発現する細胞におけるＣａ２＋応答は、おおよそ５０％阻害されたが（図２９Ａ）、Ｅｄｇ−７を発現する細胞における応答は完全に消失することはなかった（図２９Ｃ）。対照的に、Ｅｄｇ−４を発現する細胞におけるＣａ２＋応答に対しＤＧＰＰ８：０は影響を与えなかった（図２９Ｂ）。Ｅｄｇ−４の安定なおよび一過的な発現においてはＥＣ５０値に矛盾があるため（図２９Ｂ）、一過的にＥｄｇ−４でトランスフェクションした細胞について同様にＤＧＰＰ８：０の試験を実施した。安定細胞の実験で得られた結果と同様に、一過的にＥｄｇ−４を発現する細胞においてＤＧＰＰ８：０はＣａ２＋応答に影響を与えなかった（図２９Ｄ）。ＤＧＰＰ８：０に関する上記のアッセイ法それぞれについて、ＰＡ８：０を用いた場合でも同様な所見が得られた（以下を参照のこと）。
【０２３８】
研究される受容体に関して、ＬＰＡ濃度をＥＣ５０で一定に保ちながらＤＧＰＰ８：０濃度を増加させて、Ｅｄｇ−２および−７を発現する細胞に対する阻害曲線を作製した。Ｅｄｇ−７に関するＩＣ５０値は２８５±２８ｎＭ であり（図３０Ａ）、Ｅｄｇ−２に関するＩＣ５０値は１１．０±０．６８μＭであった（図３１Ａ）。これは該曲線を用いて決定した。ＩＣ５０値（Ｅｄｇ−７について２５０ｎＭ、Ｅｄｇ−２について３μＭ）近傍の一定量のＤＧＰＰ８：０を用いた場合には、Ｅｄｇ−７ （図３０Ｂ）および Ｅｄｇ−２ （図 ３１Ｂ）に関する用量反応曲線はいずれも右にシフトした。このことは阻害が競合的メカニズムであることを示した。
【０２３９】
ＤＧＰＰに関して構造活性相関をより明確にする目的で、ＬＰＡ、ＤＧＰＰ、ＰＡおよびＤＡＧのＤＧＰＰ、短鎖（８：０）および長鎖（１８：１）種をＥｄｇ−２および−７を発現する細胞株を用いて試験した。図３０Ｃは、ＬＰＡ１８：１をこれらの脂質のそれぞれと組み合わせて曝露した場合Ｃａ２＋応答に対するこれら脂質の効果を示す。これらの実験では、試験脂質はＤＧＰＰ８：０のＩＣ５０と同等の濃度で添加したが、ＬＰＡはその濃度がＥＣ５０付近になるように選択した。ＬＰＡ８：０はＥｄｇ−７に何らの効果も示さなかったが、ＤＧＰＰ８：０およびＰＡ８：０は５０％および５６％と有意にＣａ２＋応答を阻害した。対照的に、ＤＡＧ８：０はＣａ２＋応答を有意に亢進させた。ＤＧＰＰおよびＰＡの鎖長を１８：１と長くすると、これらの類似体はもはやＥｄｇ−７の阻害剤ではなくなった（図３０Ｃ）。同様に、ＤＡＧ１８：１はＥｄｇ−７に対する阻害効果を示さなかった。
【０２４０】
同様の一揃いの脂質群について、Ｅｄｇ−２を発現する細胞に関する試験を行った（図３１Ｃ）。ＤＧＰＰ、ＰＡおよびＤＡＧのオクチル鎖長の類似体を１０μＭで用いた場合には、いずれも該応答を、それぞれ対照の５０％、１９％および６４％に減少させた。鎖長が１８：１と長くなった場合には、ＤＧＰＰおよびＤＡＧは阻害的効果を示さなくなったが、ＰＡ１８：１では、中程度の阻害効果を保持しており、Ｃａ２＋応答は１８％低下した。同様の脂質群パネルについて、Ｅｄｇ−４を発現する細胞に関して試験を行った（図３２Ａ〜Ｂ）。Ｅｄｇ−４を発現する安定な細胞株に対してこれらの脂質をアッセイした場合には、短鎖もしくは長鎖脂質はいずれも阻害効果を示さなかったが、ＰＡ８：０および１８：１は、それぞれ対照の１６２％および１３７％と、いずれもＣａ２＋応答を有意に亢進させた。安定クローンで得られた結果を確認する目的で、一過的にＥｄｇ−４を発現する細胞を用いて該脂質群を試験した（図 ３２Ｂ）。再び、ＤＧＰＰもしくはＰＡの短鎖のもの、長鎖のもの、いずれもＣａ２＋応答に対する阻害効果を示さず、安定細胞株を用いて得られた結果と一致した。安定なＥｄｇ−４クローンとは対照的に、Ｅｄｇ−４を一過的に発現する細胞において、いずれのＰＡ類似体もＣａ２＋応答を促進することはなかった。安定にもしくは一過的にＥｄｇ−４を発現する細胞において、単独で添加したいずれのＰＡも、１０μＭまでの濃度では、応答を誘起しなかった。
【０２４１】
ＬＰＡ受容体内因的に発現する細胞に対するＤＧＰＰ８：０の効果も調べた。ＩＣ５０　が９６±２１ｎＭの場合に、ＤＧＰＰ８：０がアフリカツメガエル卵細胞におけるＣａ２＋媒介性でＬＰＡ誘起性である卵内部へのＣｌ−電流を阻害することを見いだした （図３３Ａ）。２００ｎＭ濃度のＤＧＰＰ８：０の存在下では、ＬＰＡ１８：１の用量反応曲線は右にシフトした。このことは、Ｅｄｇ−２および−７クローンにおいて作用機序が競合的であることを示している（図３３Ｂ）。ＤＧＰＰ８：０が細胞内もしくは細胞外の機序で働くのか否かを調べる目的で、ＤＧＰＰ８：０を細胞内に注入し、卵細胞をＬＰＡ１８：１に曝露した。＞３００ｎＭ濃度に達すると推定されたＤＧＰＰ８：０の細胞内注入後、５ｎＭのＬＰＡ１８：１細胞外に適用すると、対照と同等の規模の応答が誘起することを、図３２Ｃは示している。これに比べて、ＬＰＡ１８：１によって通常誘起される応答は、ＤＧＰＰ８：０を細胞外に適用した場合、完全に阻害された（図３３Ｃ）。１０分間の洗浄後には応答が対照のレベルまで回復するので、ＤＧＰＰ８：０の阻害効果は可逆的であった（図３３Ｃ）。
【０２４２】
卵細胞に発現するＬＰＡ受容体に対するＤＧＰＰ８：０の特異性を明確にする目的で、ラットの脳に由来するポリＡ＋の付加したｍＲＮＡを注入することによって該神経伝達物質受容体の発現を誘導した。この結果、非注入卵細胞では発現していないＧ蛋白質結合のセロトニンおよびアセチルコリン受容体の発現が起こった。これらの神経伝達物質は、ＬＰＡが活性化するイノシトール３リン酸−Ｃａ２＋シグナル伝達の経路と同一の経路を活性化する（Ｔｉｇｙｉら、１９９０）。これらの卵細胞では、ＤＧＰＰ８：０は、セロトニンもしくはカルバコール誘起性の応答に関してはいずれも阻害せず、このことはＤＧＰＰ８：０がＬＰＡ受容体に対して特異性を有していることを示した。同様な濃度で用いたＰＡ８：０も、卵細胞におけるＬＰＡ誘起性の応答を阻害する効果があった。
【０２４３】
ＬＰＡ受容体を内因的に発現する哺乳動物系において、ＬＰＡ誘起性の応答に対するＤＧＰＰ８：０の効果も調べた。ＥｄｇおよびＰＳＰ２４受容体のｍＲＮＡの存在に関し、ＲＴ−ＰＣＲでＮＩＨ３Ｔ３細胞をスクリンーニングした。図３４Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、Ｅｄｇ−２、−５および ＰＳＰ２４のｍＲＮＡ転写産物が検出されたことを示している。ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ誘起性Ｃａ２＋応答を特異的に阻害するがＳＩＰ誘起性のＣａ２＋応答は阻害しないことを示すために、１０μＭのＤＧＰＰ８：０の存在下で１００ｎＭのＬＰＡもしくはＳＩＰにＮＩＨ３Ｔ３細胞を曝露した。図３４Ｂに示されるように、ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ誘起性のＣａ２＋応答を有意に阻害したが、ＳＩＰ誘起性の応答には効果を示さなかった。
【０２４４】
ＬＰＡが卵巣癌で産生しある役割を果たしていることが示されている（Ｘｕら、１９９５ａ）。それ故、治療上適切な標的に対する効果示すか否かを調べるために、ＨＥＹ卵巣癌細胞に関してもＤＧＰＰ８：０の試験を実施した。図３４Ｄは、ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ誘起性Ｃａ２＋応答を対照の１２％まで阻害したが、ＤＧＰＰ１８：１は無効果であることを示している。同様に、ＰＡ８：０は対照の６％までＣａ２＋応答を阻害したが、ＰＡ１８：１は効果を示さなかった。ＨＥＹはＥｄｇ−１、−２、−５および−７受容体のｍＲＮＡ転写産物を発現している（図３４Ｃ）。
【０２４５】
実施例１５　ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害
増殖因子の際だった効果は細胞増殖を誘起できることである。ＬＰＡは異なる種類の各種細胞について増殖を刺激することが判明しているので（Ｇｏｅｔｚｌら、２０００）、ＤＧＰＰ８：０のＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に対する阻害能を調べた。図３５は、ＤＧＰＰ８：０はＮＩＨ３Ｔ３細胞のＬＰＡ誘導性の増殖を有意に阻害し、細胞数を対照のレベルまで低下させるが、溶媒で処理した対照の細胞には効果を示さないことを示している。ＤＧＰＰ８：０の阻害効果に関する構造活性の相関を明らかにする目的で、短鎖および長鎖のＤＧＰＰ、ＰＡおよびＤＡＧをアッセイ法に組み込んだ。図３５に示されるように、溶媒で処理した対照の細胞には、被検パネルに組み込まれる脂質は、いずれも有意な阻害的もしくは促進的効果を示さなかった。ＤＧＰＰ８：０だけが、 ＬＰＡ誘導性増殖を阻害した。ＤＧＰＰ１８：１も長鎖および短鎖のＰＡおよびＤＡＧもＬＰＡ誘導性増殖に効果がなかった。興味深いことに、このアッセイ法でＰＡ８：０は有意な阻害を示さなかった。
【０２４６】
実施例１３〜１５の考察
Ｅｄｇ−２、−４および−７ 受容体を異種的に発現するＲＨ７７７７細胞を用いて、候補拮抗薬のスクリーニングを行った。本発明者らの計算機による既存のＥｄｇ受容体のモデル化（Ｐａｒｒｉｌｌら、２０００）および利用可能な構造活性に関するデータ （Ｊａｌｉｎｋら、１９９５）に基づき、上記の実験結果から短鎖ホスファチジン酸ＤＧＰＰ８：０は、ＩＣ５０値が２８５±２８ｎＭであり、Ｅｄｇ−７の選択的、競合的拮抗薬であることが示される。同一の分子は、Ｅｄｇ−２に関してはＩＣ５０値が１１．０±０．６８μＭとＥｄｇ−２の阻害剤としては弱いものであるが、Ｅｄｇ−４については阻害を起こさないことが見出された。ＤＧＰＰ８：０はアフリカツメガエル卵細胞における内因性のＬＰＡ応答を阻害し、ＩＣ５０値は９６±２１ｎＭであった。ＰＡ８：０も同様の阻害的性質を示した。それ故、これら短鎖ホスファチジン酸はＥｄｇ−２よりもＥｄｇ−７に対して４０〜１００倍の高い選択性を示す。
【０２４７】
アシル鎖の長さが１２個の炭素もしくはそれ以下であるＬＰＡがＥｄｇ−２、−４もしくは−７を発現する昆虫細胞における応答を誘起しないことを示したバンドー（Ｂａｎｄｏｈ）ら（２０００）の結果が、短鎖ホスファチジン酸に関する上記の結果によって確認される。上記のように、哺乳動物発現系において、ＬＰＡ８：０はＥｄｇ−２、−４もしくは−７の作用薬でも拮抗薬でもなかった。Ｅｄｇ−７はｓｎ−１ 位よりもｓｎ−２位にエステル化した脂肪酸鎖を有するＬＰＡに１０倍選択性が高い（Ｂａｎｄｏｈら、２０００）。それ故、リン酸部分から距離炭化水素鎖までの相対的距離によって、受容体との結合活性が消失することはなく、受容体の活性化が消失することもない。Ｅｄｇ−７はまた、飽和脂肪酸と比較して長鎖不飽和脂肪酸に対する選択性を有する。エーテル結合もしくはビニルエーテル側鎖があっても、ＥＣ５０が２桁減少する（Ｂａｎｄｏｈら、２０００）。さらに、炭化水素の最適鎖長は１８個の炭素であるが、２０炭素からなる類似体はこれより弱い作用薬であった。Ｅｄｇ−７に関するこれらの薬理学的性質は、受容体の活性化が鎖長および側鎖の柔軟性（エステル結合対エーテル結合）に依存していることを示す。
【０２４８】
Ｅｄｇ−１受容体の計算機モデル化から、リガンド結合に必要な３つの荷電性残基が同定されている。これらの残基のうちの一つであるアルギニン１２０は、リン酸基と相互作用すると予測され、Ｅｇｄファミリーの構成員すべてにおいて保存されている。第二の残基アルギニン２９２は、Ｅｄｇ−８を除くＥｇｄファミリーの構成員すべてにおいて近傍に正電荷性の残基を有する位置に現れる。第三の残基グルタミン酸１２１はＬＰＡ特異的Ｅｄｇ受容体間で保存されてはおらず、Ｅｄｇ−２、−４および−７では対応する部位がグルタミンになっている。このグルタミン残基は、ＬＰＡの水酸基部分と相互作用すると予測されている。この残基をアラニンに置換すると、リガンド結合および受容体活性化が消失し、このことはＰＬＧＦファルマコフォアの荷電性部位とこれら３つの残基間のイオン相互作用がＥｄｇ−１のリガンド結合に必要であることを示唆している（Ｐａｒｒｉｌｌら、２０００）。 さらに、受容体と炭化水素鎖それ自身との間の相互作用は、リガンド結合と活性化にとって充分ではない（Ｐａｒｒｉｌｌら、２０００）。それ故、イオン性のアンカーおよび疎水性尾部の両方をふくむ相互作用の組み合わせが作用薬の活性化に必要であると考えられた。このような仮定を支持するものとして、上記の結果は、短鎖ＬＰＡ８：０がＥｄｇ−２、−４もしくは−７を活性化し得なかったことを示す。これは疎水性尾部とリガンド結合ポケットとの相互作用が重要性であることを意味する。そこで、ＰＬＧＦファルマコフォアの「スイッチ」領域として疎水性尾部を設計した。これらの受容体による該脂肪酸のｓｎ−１およびｓｎ−２置換は許容度のために、切断された炭化水素鎖が短いため受容体を活性化できないと考えられる短鎖ホスファチジン酸に注目した。ホスファチジン酸中のアシル鎖の構造的な可動性は、隣接する脂肪酸部分によっても制限を受ける。本出願人らは、ピロリン酸部分の効果についても調べた。この部分は、アンカー領域の負に荷電する特質を変化させることはないが、むしろ荷電を増加させる。
【０２４９】
Ｅｄｇ−２、−４および−７ 受容体を発現する細胞株クローンを用いて、このような概念に基づく薬剤設計の試験を行った。ＤＧＰＰ８：０およびＰＡ８：０の薬理学的性質は、３種の受容体間で大きく異なることが解った。いずれの分子とも、Ｅｄｇ−７を効果的に阻害したが、Ｅｄｇ−２に関してその効果は一桁以上低かった。いずれの分子もＥｄｇ−４に関しては無効果であった。ＤＧＰＰ８：０はＥｄｇ−２および−７の双方に対して競合的阻害剤となることも解った。用量反応曲線を右にシフトさせ、両受容体に対するＬＰＡのＥＣ５０値が増加した。ＰＡおよびＤＧＰＰの長鎖に対応した作用薬活性の欠如により、結合ポケットへの束縛を目立たさせる。ＤＡＧ８：０による阻害の欠失により、結合ポケットへのリガンドの結合におけるイオン性アンカーが重要性が支持されているが、その細胞内効果はＰＣＫ等の他の分子標的への細胞内作用と区別が付かない可能性が高い。
【０２５０】
ＰＡおよびＤＧＰＰのいずれも天然のリン脂質である。ＤＧＰＰ（８：０）は１９９３年に植物の新規脂質として発見された。これはホスファチジン酸キナーゼによるＰＡのリン酸化産物である（ＷｉｓｓｉｎｇおよびＢｅｈｒｂｏｈｍ、１９９３； Ｍｕｎｎｉｋら、１９９６）。ＤＧＰＰは細菌、酵母菌および植物で同定されているが、哺乳動物細胞では同定されていない。最近の研究によれば、ＤＧＰＰはマクロファージを活性化し、細胞質内ホスホリパーゼＡ２の活性化を通じてプロスタグランジン生産を刺激することが示された。このことは、炎症反応におけるＤＧＰＰの役割を示唆している（Ｂａｌｂｏａら、１９９９； Ｂａｌｓｉｎｄｅら、２０００）。この著者らは、これらの効果がＬＰＡ受容体によって媒介される可能性を除外していた。長鎖ＤＧＰＰおよびＰＡ類似体を用いた上記の結果はこのことを確認した。すなわち、Ｅｇｄ受容体を発現する細胞株においてこれらの化合物は１０μＭまでの濃度では作用薬としての性質を持たなかった。
【０２５１】
３種の異なる細胞に内因的に発現するＬＰＡ受容体に対する短鎖ホスファチジン酸の効果についても調べた。ＤＧＰＰ８：０ およびＰＡ８：０は、アフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡ誘起性のＣｌ− 電流に対し効果的な阻害剤であることが解った。作用部位を明らかにするために、ＤＧＰＰ８：０を卵細胞に注入し、ＬＰＡを細胞外に添加した。ＤＧＰＰ８：０は、細胞外に適用した場合ＬＰＡ誘起性のＣｌ− 電流を唯一効果に阻害した。このことは、拮抗薬としての効果が細胞表面において起こることを示すものであった。卵細胞および ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ受容体に対して特異性を示した。これらの細胞においては、ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ誘起性Ｃａ２＋応答に唯一効果的な阻害を示し、ＳＩＰ、アセチルコリンもしくはセロトニンによって誘起された応答には効果がなかった。
【０２５２】
ＲＴ−ＰＣＲ解析によれば、Ｅｄｇ−２だけがＮＩＨ３Ｔ３細胞に発現し、Ｅｄｇ−４もしくは−７は発現していないことが明らかになった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞においては、１００倍過剰のＤＧＰＰ８：０でのみＣａ２＋応答が４０％阻害された。この阻害の程度は、弱い阻害剤として働くＥｄｇ−２を発現する安定な細胞株において見られる阻害の程度と同等である。ＨＥＹ卵巣癌細胞についてＬＰＡに対し１０倍過剰量で短鎖ＤＧＰＰおよびＰＡを評価したところ、いずれも効果的な阻害を示したが、長鎖はいずれの分子も効果を示さなかった。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＨＥＹ細胞で主要なｍＲＮＡはＥｄｇ−７であるが、Ｅｄｇ−２ ｍＲＮＡに関しては痕跡程度しか検出されなかったことを示された。この阻害の程度は、ＤＧＰＰ８：０およびＰＡ８：０のいずれもが効果的阻害剤として働くＥｄｇ−７を発現する安定な細胞株において見られる阻害の程度と同等である。
【０２５３】
ＬＰＡ誘導性のＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に対する遮断能に関し、それぞれの短鎖ホスファチジン酸の評価を行った。ＤＧＰＰ８：０はＬＰＡ誘導性増殖を効果的に阻害したが、長鎖ＤＧＰＰは阻害しなかった。ＰＡ８：０はＣａ２＋応答を効果的に阻害するが、細胞増殖を効果的に阻害することはない。これらの結果は、ＰＡ（１２：０）がＰＡ１８：１の細胞分裂を促す効果を阻害しないことを示した既報と一致する（ｖａｎ Ｃｏｒｖｅｎら、１９９２）。脂質ホスファターゼは拮抗薬を不活性化するので、分子の安定性に関する長期的アッセイ法が関心対象となる。ＰＡおよびＤＡＧのいずれもが増殖を阻害しなかったことは、このアッセイ期間中はＤＧＰＰ８：０がより安定である可能性が高いことを。ＤＧＰＰの安定性は、ＤＧＰＰが実験中に代謝されなかったことを示すバルボア（Ｂａｌｂｏａ）ら （１９９９）の報告によっても示されていた。
【０２５４】
Ｅｄｇ受容体のみならず他のＰＬＧＦ受容体に関する研究分野においても、ＤＧＰＰ８：０は重要な新しいツールを提供する。Ｅｄｇファミリーの計算機モデル化に由来するＰＬＧＦファルマコフォアのイオン性アンカーおよび疎水性スイッチの概念は、新規の阻害剤の設計、合成を支援すべきである。
【０２５５】
実施例１６　 直鎖状リン酸中間体１０１〜１０５の合成
化合物１０１： リン酸ジベンジルエステルブチルエステル
無水 ｎ−ブタノール７４ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）と１Ｈ−テトラゾール３６５ｍｇ （５．１７ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの丸底フラスコ中の３４ｍｌ無水塩化メチレンに溶解した。０．８９５ｇ （２．５８ｍｍｏｌ）のジベンジル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデートを５ｍｌの無塩化メチレンに溶かした溶液を、撹拌しながらアルゴン雰囲気下でシリンジを用いて添加した。該反応物を室温で２時間撹拌した。次に、反応混合物をイソプロピルアルコール／ドライアイス浴で〜３８℃に冷却した。２８ｍｌの無水塩化メチレンに溶かした０．８１５ｇ（３．４３ｍｍｏｌ）の３２％過酢酸を添加漏斗で滴下した。添加後、反応混合物を氷浴で〜０℃まで暖めた。反応混合物を氷浴で１時間撹拌した。反応混合物を分液漏斗に移し、２００ｍｌの塩化メチレンで希釈した。有機層を１０％メタ重亜硫酸ナトリウム（２ｘ４０ｍｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ４０ｍｌ）、水（３０ｍｌ）および鹹水（４０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。これを濃縮し、真空下で乾燥した。次に、未精製産物を溶出液として１：１混合のヘキサン／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物１０１を得た（３０９ｍｇ、これは過剰のリン酸化試薬に由来する微量の不純物を含んでいた）。
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【０２５６】
化合物１０２： リン酸ジベンジルエステルオクチルエステル
無水ｎ−オクタノールを１３０ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）を用い、化合物１０１に関して用いた方法と類似の方法で実施した。未精製産物を、溶出液として７：３混合のヘキサン／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物１０２を得た（３５１ｍｇ、９０％）。
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【０２５７】
化合物１０３： リン酸ジベンジルエステルドデシルエステル
無水 ｎ−ブタノール１８６ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）を使用し、化合物１０１に関して用いた方法と類似の方法を用いた。未精製産物を、溶出液として７：３混合のヘキサン／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、透明な油状の化合物１０３を得た（３６１ｍｇ、８１％）。
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【０２５８】
化合物１０４： リン酸ジベンジルエステルオクタデシルエステル
オクタデカノール２７０ｍｇ （１．００ｍｍｏｌ）を使用し、化合物１０１に関して用いた方法と同様の方法を用いた。未精製産物を、溶出液として７：３混合のヘキサン／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、吸湿性の白色固体として化合物１０４を得た（４７４ｍｇ、８９％）。
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【０２５９】
化合物１０５： リン酸ジベンジルエステルドコサニルエステル
ドコサノール３２７ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ） を用い、化合物１０１に関して用いた方法と類似の方法で実施した。未精製産物を、溶出液として７：３混合のヘキサン／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィで精製し、吸湿性の白色固体として化合物１０５を得た（５１６ｍｇ、８８％）。
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【０２６０】
実施例１７　直鎖状リン酸化合物１０６〜１１０の合成
化合物１０６： リン酸モノブチルエステル
厚壁圧力容器で２００ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）の化合物１０１を３０ｍｌの無水メタノールに溶解した。該容器にアルゴンを吹き込み１０％Ｐｄ／Ｃを約２００ｍｇ添加した。該容器に水素化装置をつなぎ、室温で反応容器の内部を〜５０ｐｓｉの水素雰囲気に８時間維持した。次に、反応混合物を減圧下でセライトパッドにより濾過し、メタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸発し、黄色油状の化合物１０６を７０ｍｇ（８６％）得た。
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【０２６１】
化合物１０７： リン酸モノオクチルエステル
２００ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）の化合物１０２を使用し、化合物１０６に関して用いた方法と類似の方法を用いた。白色／黄色粘着性固体として化合物１０７を１００ｍｇ（９３％）単離した。
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【０２６２】
化合物１０８： リン酸モノドデシルエステル
２００ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）の化合物１０３を使用し、化合物１０６に関して用いた方法と類似の方法を用いた。白色固体状の化合物１０８を１１２ｍｇ（９４％）得た。
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【０２６３】
化合物１０９： リン酸モノオクタデシルエステル
２００ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）の化合物１０４を使用し、化合物１０６に関して用いた方法と同様の方法を用いた。白色固体状の化合物１０９を１０４ｍｇ（７９％）得た。
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【０２６４】
化合物１１０： リン酸 モノドコシルエステル
２００ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ）の化合物１０５をを使用し、化合物１０６に関して用いた方法と同様の方法を用いた。白色固体状の化合物１１０を９８ｍｇ（７１％）得た。
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【０２６５】
実施例１８　直鎖状リン酸化合物１０６〜１１０
ＰＳＰ２４ ＰＬＧＦＲを内因的に発現するアフリカツメガエル卵細胞を用いて、化合物１０６〜１１０のＬＰＡ阻害的活性に関するスクリーニングを実施した。無菌状態でキシラジンを用いて麻酔したアフリカツメガエル （Ｘｅｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）成体（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）から卵細胞を得て、実験用に調製した。Ｃａ２＋を含まない卵巣用リンゲル−２溶液（（ＯＲ−２） ８２． ５ ｍＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨでｐＨ ７． ５に調整）中で１．４ｍｇ／ｍｌ のＡ型コラゲナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ＩＮ））を用いた処理で段階Ｖ〜ＶＩの卵細胞の卵胞細胞層を除去した。１７〜２０℃のインキュベータ内で、卵細胞をバース溶液中で維持し、単離後２〜７日間を用いた。
【０２６６】
−６０ ｍＶ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ ５００、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ）の膜電位を有する標準２電極電位クランプ増幅器を使用して電気生理学的記録を行った。試験化合物はメタノールに溶解し、脂肪酸を含まないＢＳＡと混合した。これをカエル用Ｎａ＋リンゲル溶液（１２０ ｎＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ； ｐＨ ７．０）で希釈した。これを５ｍｌ／分の流速で灌流しながら卵細胞に添加した。ＮＩＣ−３１０デジタルオシロスコープ（Ｎｉｃｏｌｅｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で膜電流を記録した。適当な洗浄除去と脱感作からの回復が可能となるように、１５分（最小）間隔で添加した。
【０２６７】
図３６は、ＬＰＡ誘導性の塩素電流に対する化合物１０６〜１１０による用量依存的阻害を示している。化合物１０８が最適な阻害剤であり、ＩＣ５０値が約８．１ｎＭであった。より短いもしくはより長い直鎖アルキル基を有する化合物では、ＬＰＡ誘導性の塩素電流を阻害する効果が減少したが、化合物１０７は、ＩＣ５０値が約１０．２ｎＭであり、効果は同等であったことを示した。図３７にはＥＣ５０値の比較を示す。陽性対照溶液（ＬＰＡ単独）では２５ｎｍであり、ＬＰＡと１００ｎＭの化合物１０８を含む溶液では３４３ｎＭであった。従って、化合物１０８は、アフリカツメガエル卵細胞においてＰＳＰ２４受容体によるＬＰＡのシグナル伝達を効果的に阻害する。
【０２６８】
上記の結果に基づき、化合物１０８が、異種的に個々の受容体を発現するＲＨ７７７７細胞における、Ｅｄｇ−２、―４および−７受容体の拮抗薬として効果的であるか否かについても調べた。
【０２６９】
図３８には、ＬＰＡ１８：１および化合物１０８組み合わせに対して曝露した場合の、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４およびＥｄｇ−７を発現する細胞におけるＣａ２＋応答に対する化合物１０８の効果示す。これらの実験に関して、ＬＰＡ濃度はＥＣ５０付近となるように選択した。化合物１０８はＣａ２＋応答を有意に阻害し、Ｅｄｇ−２およびＥｄｇ−７を発現する細胞株において、それぞれ対照の約６３％および５６％に低下させた。対照的に、Ｅｄｇ−４ 発現する細胞株では、化合物１０８はＣａ２＋応答を有意に亢進し、対照の約１４８％まで高めた。
【０２７０】
それ故、直鎖状リン酸はＥｄｇ−２およびＥｄｇ−７ 活性をインビボで選択的に阻害し、Ｅｄｇ−４ 活性をインビボで選択的に促進すると予想される。
【０２７１】
参考文献一覧
以下に示す参考文献は、ここにそれぞれその全文が本出願の明細書に参照として組み入れられる。
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【０２７２】
本明細書には好ましい態様が示され詳細に記述されているが、本発明の精神を逸脱することなく各種の改変、付加、置き換え等が可能であることは関連の技術分野の当業者であれば容易に理解できると思われる。従って、これらも、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれるものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＰＡ受容体のＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４、ＥＤＧ−７およびＰＳＰ−２４（α、β）を含む１０種類のリン脂質増殖因子受容体の分類と関連を示す系統樹である。
【図２】セリンアミド化合物３５〜４３の調製に用いる合成スキームを示す。
【図３】セリンリン酸アミド化合物５５〜５９の調製に用いる合成スキームを示す。
【図４】二リン酸化合物６６〜６８の調製に用いる合成スキームを示す。
【図５】２リン酸化合物の合成を示す。図５Ａは１，２−二リン酸化合物８５〜９２の調製に用いる合成スキームを示す。図５Ｂは１，３−二リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図６】ピロリン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図７】置換されたモノリン酸、およびトシル酸で保護された二エーテル中間体由来のモノリン酸の調製に用いる合成スキームを示す。
【図８】直鎖状脂肪酸リン酸化合物１０６〜１１０の調製に用いる合成スキームを示す。
【図９】直鎖状チオリン酸モノアルキルエステルの合成を示す。
【図１０】直鎖状リン酸アルキルアミドの合成を示す。
【図１１】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１２】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１３】構造的に束縛を受ける環状リン酸化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１４】遊離リン酸部分を有し構造的に束縛を受ける化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１５】２−モノリン酸の調製に用いる別の合成スキームを示す。
【図１６】１，３−二リン酸化合物の調製に用いる別の合成スキームを示す。
【図１７】Ｘ３が−Ｎ（Ｈ）−アシル基を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１８】Ｘ３が−Ｎ（Ｈ）−イミダゾール基を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図１９】Ｘ３が−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図２０】Ｘ３が−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｓ）−Ｒ７を有する化合物の調製に用いる合成スキームを示す。
【図２１】化合物５６（ＳＡＰ、１４：０）を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にＬＰＡで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２２】化合物５７（ＳＡＰ、１８：０）を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にＬＰＡで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２３】化合物６６（ＭＡＧＤＰ、１８：０）を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にＬＰＡで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。矢印は５μＭの化合物６６を細胞内に注入し、ＬＰＡを細胞外に添加した場合の時間を示すグラフである。
【図２４】化合物６６（ＭＡＧＤＰ、１８：０）の用量依存的阻害効果を示すグラフである。一定量のＬＰＡ（５ｎＭ）とともに化合物６６の量を増加させながら卵細胞に添加した。各データの点は、測定した塩素電流のピーク振幅値を表す。
【図２５】化合物９２（ＭＡＧＤＰ、２２：０）を細胞外に添加すると、アフリカツメガエルの卵細胞にＬＰＡで誘起される塩素電流が用量依存的に阻害されることを示すグラフである。
【図２６】アフリカツメガエルの卵細胞に対する化合物５６ａ（ＳＤＡＰ、１４：０／２：０）の用量依存的効果を示すグラフである。
【図２７】ＬＰＡで誘起されるＨＥＹ細胞の遊走に対する化合物５６（ＳＰＡ、１４：０）、５６ａ（ＳＤＡＰ、１４：０／２：０）、および６６（ＭＡＧＤＰ、１８：０）の効果を示す棒グラフである。試験化合物の濃度は１μＭであり、ＬＰＡ濃度は０．１μＭであった。
【図２８】Ｅｄｇ−２（２８Ａ）、Ｅｄｇ−４（２８Ｂ）、もしくはＥｄｇ−７（２８Ｃ）を異種的に発現するＲＨ７７７７細胞における、Ｃａ２＋応答に対する用量応答の関係を示すグラフである。各データ点は少なくとも３回の測定の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２９】Ｅｄｇ−２、およびＥｄｇ−７を発現するがＥｄｇ−４を発現していないＲＨ７７７７細胞におけるＬＰＡによるＣａ２＋応答のＤＧＰＰ８：０による阻害を示すグラフである。Ｅｄｇ−２、−４もしくはＥｄｇ−７を発現しているＲＨ７７７７細胞を、１００ｎＭのＬＰＡ１８：１および１μＭのＤＧＰＰ８：０からなる混合物に曝露した。対照の細胞は１００ｎＭのＬＰＡ１８：１に曝露した。Ｅｄｇ−２（２９Ａ）、Ｅｄｇ−４（２９Ｂ）、およびＥｄｇ−７（２９Ｃ）を安定に発現する細胞、もしくはＥｄｇ−４（２９Ｄ）を一過的に発現する細胞について代表的なＣａ２＋応答を示す。
【図３０】Ａ〜Ｃは、Ｅｄｇ−７を発現するＲＨ７７７７細胞（Ｅｄｇ−７細胞）におけるＤＧＰＰ８：０によるＬＰＡ応答の阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。ＤＧＰＰ８：０の濃度を増加させながら２５０ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１と混合し、この混合液に細胞を曝露した。得られたＣａ２＋応答のピーク部分の面積を測定した（３０Ａ）。また、ＬＰＡ１８：１の濃度を増加させながら５００ｎＭ濃度のＤＧＰＰ８：０と混合し、この混合液に細胞を曝露した（３０Ｂ）。Ｅｄｇ−７細胞を、表記の脂質５００ｎＭと混合した２５０ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１に曝露した（３０Ｃ）。Ｃａ２＋応答のピーク部分の面積を、最低でも３回の測定から得られた平均値±ＳＤで表している。
【図３１】Ｅｄｇ−２を発現するＲＨ７７７７細胞（Ｅｄｇ−２細胞）におけるＤＧＰＰ８：０によるＬＰＡ応答の阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。ＤＧＰＰ８：０の濃度を増加させながら２５０ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１と混合し、この混合液に安定なＥｄｇ−２細胞を曝露した。Ｃａ２＋応答のピーク部分の面積を測定した（３１Ａ）。ＬＰＡ１８：１の濃度を増加させながら１０μＭ濃度のＤＧＰＰ８：０と混合し、この混合液にＥｄｇ−２細胞を曝露した（３１Ｂ）。Ｅｄｇ−２細胞を、表記の脂質１０μＭ濃度と混合した２５０ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１に曝露した（３１Ｃ）。応答を、最低でも３回の測定から得られた平均値±ＳＤで表している。
【図３２】Ｅｄｇ−４を発現するＲＨ７７７７細胞におけるＤＧＰＰの構造活性相関を示すグラフである。安定なＥｄｇ−４細胞を、表記の脂質５μＭ濃度と混合した５００ｎＭのＬＰＡ１８：１に曝露した（３２Ａ）。Ｅｄｇ−４を一過的に発現する細胞を、表記の脂質１μＭと混合した１００ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１に曝露した（３２Ｂ）。Ｃａ２＋応答のピーク部分の面積を測定し、最低でも３回の測定から得られた平均値±Ｓ．Ｄ．で表している。
【図３３】アフリカツメガエルの卵細胞にＬＰＡで誘起される塩素イオン電流に関して、ＤＧＰＰ８：０の薬理学的特徴付けを示すグラフである。ＤＧＰＰ８：０の濃度を増加させながら５ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１と混合し、この混合液に卵細胞を曝露した。得られた振動性Ｃｌ−電流のピーク振幅値を測定した（３３Ａ）。ＬＰＡ１８：１の濃度を増加させながら２００ｎＭ濃度のＤＧＰＰ８：０と混合し、この混合液に卵細胞を曝露した（３３Ｂ）。データ点は、最低でも３回の測定から得られた平均値±Ｓ．Ｄ．で表した。表記のように、卵細胞を、５ｎＭのＬＰＡ１８：１、もしくは５ｎＭのＬＰＡ１８：１と１μＭのＤＧＰＰ８：０の混合物で処理した（３３Ｃ）。１μＭのＤＧＰＰ８：０の細胞内注入に関しては矢印で示されている。
【図３４】ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびＨＥＹ卵巣癌細胞におけるＬＰＡ誘導性Ｃａ２＋応答ＤＧＰＰ８：０による阻害を示すグラフである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＥｄｇおよびＰＳＰ２４受容体転写産物に関するＲＴ−ＰＣＲ解析である（３４Ａ）。１０μＭ濃度のＤＧＰＰ８：０と混合した１００ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１もしくはＳＩＰにＮＩＨ３Ｔ３細胞を曝露した（３４Ｂ）。ＨＥＹ細胞のＥｄｇおよびＰＳＰ２４転写産物の存在に関するＲＴ−ＰＣＲ解析である（３４Ｃ）。１μＭ濃度のＤＧＰＰ８：０と混合した１００ｎＭ濃度のＬＰＡ１８：１もしくはＳＩＰにＨＥＹ細胞を曝露した（３４Ｄ）。得られたＣａ２＋応答のピーク部分の面積を測定し、最低でも３回の測定から得られた平均値±Ｓ．Ｄ．で表している。
【図３５】ＬＰＡで誘起されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖のＤＧＰＰ８：０による阻害を示すグラフである。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を６時間血清飢餓状態におき、表記の脂質１０μＭ濃度と混合した５μＭ濃度のＬＰＡ１８：１に曝露した。対照細胞に関しては、ＬＰＡ１８：１の代わりに溶媒（ＢＳＡ）を用いた。細胞を該脂質とともに２４時間インキュベートし、細胞数を計測した。データは３回の実験を示している。
【図３６】アフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡ応答の直鎖状脂肪酸リン酸化合物１０６〜１１０による阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。
【図３７】アフリカツメガエル卵細胞におけるＬＰＡ応答の直鎖状脂肪酸リン酸化合物１０８による阻害に関する薬理学的特徴付けを示すグラフである。
【図３８】個々にＥｄｇ−２、Ｅｄｇ−４、およびＥｄｇ−７を発現するＲＨ７７７７細胞を直鎖状脂肪酸リン酸化合物１０８に曝露した後の、それぞれの細胞において作用薬もしくは拮抗薬で誘起する応答の薬理学的特徴付けを示すグラフである。Ｃａ２＋応答のピーク部分の面積を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506604.tif 000324
【国際調査報告】
2004506604.tif 000325
2004506604.tif 000326
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