(57)【要約】分泌タンパク質を産生する細胞を同定および単離する方法。この方法は、個々の細胞の表面上で分泌タンパク質を一過的に捕捉することによる、分泌タンパク質の特異的な特徴または発現レベルに基づき、不均一な集団からの稀な細胞クローンの選択を可能にする。所望のレベルの分泌タンパク質もしくは特定の特徴の分泌タンパク質を産生する細胞、およびこのような細胞を保有する生物を作製するためのこの方法の使用もまた提供される。特に、この方法は、高発現組換え抗体産生細胞株の迅速な単離を可能にするか、または特定のハイブリドーマの迅速な単離もしくは抗体産生トランスジェニック動物の単離に直接適用され得る。この方法は、タンパク質を分泌する任意の細胞について適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の目的の分泌タンパク質（ＰＯＩ）を産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該ＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子を一過的もしくは安定的に発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）ＰＯＩをコードする第二の核酸を用いて、該細胞を同時もしくは連続的にトランスフェクトする工程であって、ここで、このようなＰＯＩは分泌される、工程；
ｃ）該ＰＯＩに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたＰＯＩを検出する工程；
ｄ）該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質または増殖因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的のタンパク質が、抗体、Ｆａｂ、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、これらのフラグメント、または抗体定常領域と融合した全てのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖因子が、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦレセプター、融合タンパク質、および動物細胞において作製される全ての認可された治療剤からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＯＩをコードする核酸が、ＤＮＡライブラリーから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ＳｃＦｖ、これらのフラグメント、抗体定常領域と融合した全てのもの、ならびにファージディスプレイまたはペプチドライブラリー由来のペプチドおよび前記ＰＯＩに結合する誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞表面捕捉分子が、Ａｎｇ１、Ａｎｄ２、ＶＥＧＦ、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲＩ（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲ−α、サイトカインレセプター成分、２つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物、またはこれらの任意のフラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体結合タンパク質が、Ｆｃレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンＳｃＦｖ、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、プロテインＨまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはＧＰＩ連結である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の工程（ｄ）に記載の単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはその誘導体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された２つの分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞表面捕捉分子またはＰＯＩに結合するブロッキング分子が、隣接細胞に対する該ＰＯＩの結合を減少させるために添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散、および該ＰＯＩの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
【請求項２３】
任意の目的の分泌タンパク質（ＰＯＩ）を産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該ＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子を一過的もしくは安定的に発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）該細胞表面捕捉分子を発現する、工程（ａ）由来の細胞を検出する工程；
ｃ）工程（ｂ）において検出された細胞を、単離および培養する工程；
ｄ）ＰＯＩをコードする第二の核酸を用いて、工程（ｃ）の細胞を同時もしくは連続的にトランスフェクトする工程であって、ここで、このようなＰＯＩは分泌される、工程；
ｅ）該ＰＯＩに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたＰＯＩを検出する工程；
ｆ）該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質または増殖因子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的のタンパク質が、抗体、ＳｃＦｖ、これらのフラグメント、または抗体定常領域と融合した全てのものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖因子が、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦレセプター、融合タンパク質、および動物細胞において作製される全ての認可された治療剤からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＯＩをコードする核酸が、ＤＮＡライブラリーから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ＳｃＦｖ、これらのフラグメント、抗体定常領域と融合した全てのもの、ならびにファージディスプレイまたはペプチドライブラリー由来のペプチドおよび前記ＰＯＩに結合する誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞表面捕捉分子が、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲＩ（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、サイトカインレセプター成分または２つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体結合タンパク質が、Ｆｃレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンＳｃＦｖ、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、プロテインＨまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはＧＰＩ連結である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｆ）における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはその誘導体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｂ細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された２つの分子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散を減少させるために添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散、および該ＰＯＩの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２３に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
【請求項４４】
請求項２３に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
【請求項４５】
ＰＯＩを産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該細胞表面捕捉分子を高収量で発現する細胞を検出する工程；
ｂ）工程（ａ）で検出された細胞を単離および培養する工程；
ｃ）工程（ｂ）の細胞を、ＰＯＩをコードする核酸を用いてトランスフェクトする工程であって、このようなＰＯＩは分泌される、工程；
ｄ）該ＰＯＩに結合する検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたＰＯＩを検出する工程；
ｅ）該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質、増殖因子または抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記増殖因子が、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦβからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＯＩをコードする核酸が、ＤＮＡライブラリーから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンドまたは抗体結合タンパク質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞表面捕捉分子が、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲＩ（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、サイトカインレセプター成分または２つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体結合タンパク質が、Ｆｃレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンＳｃＦｖ、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、プロテインＨまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはＧＰＩ連結である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ｆ）における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはその誘導体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｂ細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された２つの分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散を減少させるために添加される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散、および該ＰＯＩの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４５に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
【請求項６５】
請求項４５に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
【請求項６６】
高レベルのＰＯＩを産生する細胞を検出および単離する方法であって、該方法は、以下の工程；
ａ）該ＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株を、このような細胞表面捕捉分子をコードする核酸を用いて該細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）該細胞表面捕捉分子を高収量で発現する、工程（ａ）由来の細胞を検出する工程；
ｃ）工程（ｂ）で検出された細胞を単離および培養し、そして該細胞が該ＰＯＩを分泌するのに十分な時間放置する工程；
ｄ）検出分子に該細胞を接触させることによって、表面提示されたＰＯＩを検出する工程であって、１以上の該検出分子は、該ＰＯＩに結合する、工程；
ｅ）該検出分子に基づいて、細胞を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
前記目的のタンパク質が、リガンド、可溶性レセプタータンパク質、増殖因子または抗体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記増殖因子が、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エリスロポイエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦβからなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、ならびにこれらの種々のサブタイプからなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＰＯＩをコードする核酸が、ＤＮＡライブラリーから選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞表面捕捉分子が、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンドまたは抗体結合タンパク質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞表面捕捉分子が、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲＩ（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、サイトカインレセプター成分または２つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体結合タンパク質が、Ｆｃレセプター、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリンＳｃＦｖ、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、プロテインＨまたはこれらの機能的フラグメントである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
タンパク質に膜アンカーを付加する工程をさらに包含し、その結果、該タンパク質が、細胞膜に固定され、該細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能し続ける、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記膜アンカーが、膜貫通アンカーまたはＧＰＩ連結である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記膜アンカーが、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
シグナル配列が、タンパク質のアミノ末端に付加され、その結果、該タンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記シグナル配列が、該細胞に対してネイティブ、組換え、または合成であり得る、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
工程（ｆ）における前記単離された細胞が、不死化細胞と融合した抗体産生細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体産生細胞が、Ｂ細胞またはその誘導体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｂ細胞誘導体が、プラスマ細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項８２】
前記検出分子が、互いに結合し、かつ差示的に標識された２つの分子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散を減少させるために添加される、請求項６６に記載の方法。
【請求項８４】
前記発現細胞から隣接細胞への前記ＰＯＩの拡散、および該ＰＯＩの隣接細胞に対する接着が、培地の粘度を増大させることによって減少される、請求項６６に記載の方法。
【請求項８５】
請求項６６に記載の方法によって産生される細胞を含む、非ヒト生物。
【請求項８６】
請求項６６に記載の方法によって産生される細胞を含む非ヒト生物であって、前記細胞表面捕捉分子は、抗体に特異的である、非ヒト生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１月１６日に出願された、米国仮特許出願番号６０／２６１，９９９に対する優先権を主張する。この出願の全体を通じて、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体が、本出願において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、分泌タンパク質を産生する細胞を同定および単離するための方法である。この方法は、個々の細胞の表面上の分泌タンパク質を一時的に捕捉し、不均一な集団からの希少な細胞クローンの選択を可能にすることによる、分泌タンパク質の特定の特徴または発現レベルに基づく。この分野はまた、所望のレベルの分泌タンパク質または特定の特徴の分泌タンパク質を生じる細胞、ならびにこのような細胞を保有する生物を作製するための、この方法の使用を包含する。詳細には、この方法は、高発現組換え抗体産生細胞株の迅速な単離を可能にするか、あるいは特定のハイブリドーマの迅速な単離、または抗体産生トランスジェニック動物の単離に直接適用され得る。この方法は、タンパク質を分泌する任意の細胞に適用可能である。
【０００３】
（導入）
本発明の方法は、タンパク質分泌細胞の単離および同定のための現在の方法を超える、かなりの利点を提供する。記載される方法は、より効率的であり、より正確であり、そしてより広範に適用可能である。詳細には、タンパク質を分泌する任意の細胞は、本発明の方法により単離され得る。この局面は、多くの治療用タンパク質が分泌される場合に、とくに重要である。さらに、分泌タンパク質産生細胞は、タンパク質の特徴に基づいて単離され得る。例えば、抗体を分泌する細胞は、所望の特異性、アビディティー、またはアイソタイプに基づいて、迅速かつ便利に単離され得る。さらに、産生される分泌タンパク質の量は、従来技術の多くの方法（ここで、分泌タンパク質の産生は、間接的に定量される）と異なり、直接定量され得る。
【０００４】
従って、本発明は、タンパク質分泌細胞を系統的に単離するための、迅速、簡便、そして正確な方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
潜在的に薬学的価値のある、多くのタンパク質は、分泌タンパク質であり、これらとしては、増殖因子、可溶性レセプタードメイン、および最も重要なものとしてモノクローナル抗体が挙げられる。これらのタンパク質および他のタンパク質を産生するための組換えＤＮＡ技術を用いる産生方法は、宿主細胞および発現ベクターを用いる遺伝子発現系を使用する。
【０００６】
発現ベクターは、細胞に導入される、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を保有する。これらの発現ベクターは、ＧＯＩを含む遺伝子情報（これは、宿主細胞自身の遺伝物質へと組込まれる）を導入する。目的の遺伝子（ＧＯＩ）の安定な組込みの後の、高発現細胞を単離するための標準的な方法は、細胞プールの収集、プレートからのコロニーの選別、限界希釈による単一細胞の単離、または当該分野で公知の他の方法を含み得る。次いで、プールまたは個別のクローンは、増殖され、そしてＰＯＩ活性の直接的な測定によってか、ＰＯＩの免疫学的検出によってか、または他の適切な技術によって、目的のタンパク質（ＰＯＩ）の産生についてスクリーニングされる。これらの手順は、面倒であり、非能率的であり、高価であり、そして分析され得るクローンの数が、通常、数百個に制限される。
【０００７】
安定な組込みの後の細胞によるタンパク質発現におけるより高い程度の不均一性は、たとえ安定な高発現産生細胞株が生じたとしても、稀な組込みを同定するための努力において、多くの個別のクローンがスクリーニングされることを要求する。この要求は、最も高いレベルのタンパク質産生を発現する細胞の迅速な同定および単離を可能にする方法を要求する。さらに、クローンプールの収集（すなわち、選別したコロニー）は、低発現細胞をより速く増殖させるために、高発現細胞（これは、頻繁に、より遅く増殖する）を損失する危険性がある。従って、分泌ＰＯＩの高発レベル発現を可能にする個別の細胞の迅速なスクリーニングおよび単離を可能にする方法の必要性が存在する。
【０００８】
安定な発現細胞株の単離のために用いられる方法に用いられる方法へのフローサイトメトリーの組込みは、多数の個別のクローンをスクリーニングし得る可能性を改善したが、現在利用可能な方法は、様々な理由のために、依然として不適切なままである。規定された特異性（Ｐａｒｋｓら（１９７９）ＰＮＡＳ  ７６：１６６２、およびＰａｌｌａｖａｃｉｎｉら（１９８９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１７：９９）、アイソタイプ（ＤａｎｇｌおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５２：１）、またはアビディティー（Ｊａｎｔｓｃｈｅｆｆら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１６２４）を有するハイブリドーマの同定および単離に対するフローサイトメトリーの初期の適用は、全て、細胞表面に非特異的に結合された抗体の検出に依存していた。これらの方法は、表面結合の量と分泌された抗体の量との間の相関関係を仮定していた。異なる特徴の細胞間のＰＯＩの拡散もまた問題であった。最近、フローサイトメトリーを利用する２つのさらなる方法が、安定な高発現細胞株の高スループット単離のために開発された。
【０００９】
第１の方法は、ＧＯＩ  ｍＲＮＡについての転写読出しを含むための、発現プラスミドの改変に関する。これは、最も頻繁には、内部リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、およびそのタンパク質産物がフローサイトメトリーにより容易にモニターされる遺伝子、最も頻繁には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、ＧＯＩの停止コドンと末端ポリＡ部位との間に、挿入することにより達成される（Ｍｅｎｇら、（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４２：２０１）。ＩＲＥＳの存在は、ＰＯＩおよびＧＦＰが同じｍＲＮＡから転写されることを可能にする。従って、ＧＦＰ遺伝子の発現レベルは、ＧＯＩについてのｍＲＮＡレベルに間接的に関連する。高いレベルでＧＦＰを蓄積するクローンは、フローサイトメトリーにより単離され、次いで、ＰＯＩ産生についてのスクリーニングされる。この方法は、組換え構築物におけるＩＲＥＳの使用による、レポーター遺伝子に対するＧＯＩ発現の連関に依存するので、ハイブリドーマの単離に対しては適用可能ではない。
【００１０】
発現クローンの単離におけるフローサイトメトリーの使用は、高スループット形式において、多数のクローンの迅速な分析を可能にする。さらに、フローサイトメトリーの使用は、細胞の直接的な取り扱いを有意に減少させる。残念なことに、ＧＦＰ産生のレベルは、ＰＯＩの産生レベルの直接的な測定ではない。種々の機構が、選択したＰＯＩの産生を、ＧＦＰの蓄積から分離し得る。ＰＯＩとＧＦＰレポーターとの産生における差異は、２つの遺伝子の翻訳効率、ＰＯＩの分泌効率、または多シストロン性ｍＲＮＡの安定性における差異から生じ得る。
【００１１】
発現クローンを単離するためにフローサイトメトリーを用いる別の方法は、アガロースマイクロドロップ（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）内への細胞のカプセル化に関する（Ｗｅａｖｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：２３４）。この方法において、ＰＯＩに特異的なビオチン化抗体は、分泌されたＰＯＩが、マイクロドロップ内に捕捉および保持されるように、ストレプトアビジンを介してビオチン化アガロースに結合される（Ｇｒａｙら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：１５５）。捕捉されたＰＯＩは、ＰＯＩに特異的な抗体を用いる免疫染色により検出される。カプセル化しているアガロースが、隣接する細胞から分泌されたＰＯＩを吸収することを減らすために、細胞は、低浸透性培地に置かれる。包埋しているアガロースにおいて、最も高い抗体染色のＰＯＩを有する細胞は、フローサイトメトリーにより同定および単離される。ゲルマイクロドロップアプローチは、ＧＯＩ  ｍＲＮＡの発現について間接的にスクリーニングするよりもむしろ、ＰＯＩを分泌する能力について直接細胞をスクリーニングするが、分泌されたＰＯＩを捕捉および染色するために適切な抗体のアベイラビリティーを必要とし、そしてこの手順は、アガロースゲルマイクロドロップを生成するための特別な装置を必要とする。さらに、いくつかの細胞は、カプセル化プロセスに対して感受性があり得る。
【００１２】
この方法のバリエーションは、ＰＯＩに対して特異的な抗体を、細胞表面に直接的に結合することにより、マトリクス中に細胞を包埋する必要性を回避する（Ｍａｎｚら、１９９５，ＰＮＡＳ  ９２：１９２１−１９２５）。この方法において、細胞表面タンパク質のビオチンヒドロキシスクシンイミドエステルを用いる非特異的ビオチン化は、次いで、ＰＯＩを結合し得るストレプトアビジン結合体化抗体と接触される。ＰＯＩを分泌する細胞は、ＰＯＩで飾られ、次いで、ＰＯＩは、適切に標識された二次抗体を用いて検出される。しかし、隣接する細胞の間のＰＯＩの拡散は問題であり、そしてこの方法はまた、発現細胞から離れたＰＯＩの拡散を減少させるために、高粘度の培地を必要とする。これらの高粘度培地は、細胞を区別するために必要とされるので、細胞は、所望される場合、洗浄されそして細胞選別に適切な培地中に置かれなければならない。
【００１３】
高発現組換え細胞株の同定および単離に関係する問題は、特に、目的の抗体を発現するハイブリドーマの単離に当てはまる。しかし、有用なハイブリドーマの同定は、いくつかのさらなる問題を含む：これらは、初めに、抗原結合活性についてスクリーニングされ、次いで、免疫グロブリンアイソタイプについてスクリーニングされなければならない。さらに、ＧＦＰベースの方法は、ハイブリドーマの同定および単離に適用可能ではない。なぜならば、ハイブリドーマの構築は、抗体遺伝子の発現が、ＧＦＰのような転写レセプターに関連し得るような組換え構築物を含まないからである。ハイブリドーマスクリーニングは、時間のかかる、骨の折れる努力である。このスクリーニングにおいて、スクリーニングされるクローンの数が既存の技術により制限される。
【００１４】
同様の問題は、異なる抗体、ＳｃＦｖ、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを発現する細胞の不均一な集団からの、特定の抗原に対する、所望の特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する、抗体、ＳｃＦｖ、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを産生する希少な細胞の選択を含む。
【００１５】
従って、細胞の大きな集団から、種々の分泌ＰＯＩを発現する細胞を同定および単離する迅速かつ効率的な方法についての要求がある。最も望ましいのは、ｍＲＮＡよりむしろタンパク質の発現レベルを測定する方法である。なぜならば、ｍＲＮＡの測定は、しばしば最終的に産生されるタンパク質のレベルを正確には反映しないからである。さらに、特定の抗体を産生する細胞を同定するために、当該分野で現在利用可能である方法よりも、より効率的な方法についての要求がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、ＰＯＩについての直接的なスクリーニングによる、タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための、高スループットスクリーニング法を記載する。本発明はまた、製造プロセスの間に、単一細胞基準でのＰＯＩ発現の簡便なモニタリングを可能にする。さらに、この技術は、抗体産生細胞のスクリーニングに直接適用され得る。
【００１７】
本発明は、種々の分泌されたＰＯＩを結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株の構築、およびＰＯＩを分泌する細胞を同定および単離するためのそれらの使用に関する。本発明の方法による細胞の単離は、ＰＯＩの発現レベルまたはＰＯＩの特定の特徴に基づき得る。このような細胞の構築または使用を介して、任意の分泌タンパク質は、分泌タンパク質と細胞表面捕捉分子との間に対応する親和性が存在する限り、細胞表面捕捉分子により捕捉され得る。
【００１８】
さらに説明されるように、任意の分子は、細胞表面捕捉分子として使用され得るように操作され得る。従って、本発明は、タンパク質を分泌する任意の細胞を単離するために利用され得る。さらに、多くの細胞は、分泌タンパク質を産生するようにトランスフェクトされ得、従って、そのネイティブの状態ではタンパク質を分泌しない細胞でさえ、本発明の適用を通じて分泌タンパク質産生細胞（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）として単離され得る。
【００１９】
提示されたＰＯＩを有する細胞の検出は、提示されたＰＯＩを直接的または間接的に結合し得る任意の分子の使用を介して達成され得る。このような検出分子は、ＰＯＩを提示する細胞の検出および／または単離を容易にし得る。1つの実施形態では、お互いに結合し、そして示差的に標識される、２つの分子が利用される。検出および／または単離は、当該分野で公知の標準的な技術お介して達成され得る。
【００２０】
さらに、本発明は、抗体産生細胞の単離に適用され得る。詳細には、抗体産生細胞は、ＰＯＩを結合する細胞表面捕捉分子（この場合において抗体である）を発現する固定された抗体に融合され得る。抗体産生細胞は、Ｂ細胞またはその誘導体（例えば、形質細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞）であり得る。本発明はまた、所望のレベル、詳細には、高レベルの、組換え抗体またはそのフラグメントを発現する、細胞の単離のために用いられ得る。本発明はまた、様々な結合特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する抗体遺伝子のライブラリーを発現する不均一な細胞の集団から、特定の抗原に対する、所望の特異性、アイソタイプ、およびアビディティーを有する、抗体、ＳｃＦｖ、そのフラグメント、または抗体定常領域に融合されたものを発現する希少な細胞の単離を可能にする。さらに詳細には、本発明は、所望の特異性およびアイソタイプの分泌抗体、ならびに所望のエピトープに特異的である抗体を発現する、抗体産生細胞の同定に関する。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、細胞表面捕捉分子を発現するトランスジェニック動物が、作製され得る。次いで、このようなトランスジェニック動物由来の細胞は、ＰＯＩの産生について直接スクリーニングされ得る。
【００２２】
本発明はまた、任意の分泌される目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
ａ）そのＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でその細胞株をトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）ＰＯＩをコードする第２の核酸で、その細胞を同時にかその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなＰＯＩが分泌される、工程；
ｃ）そのＰＯＩに結合する検出分子とその細胞を接触させることによって、表面に提示されるＰＯＩを検出する工程；
ｄ）その検出分子に基づいて細胞を単離する工程；
を包含する。
【００２３】
本発明は、さらに、任意の分泌されるＰＯＩを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
ａ）そのＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子を一過性発現または安定発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）その細胞表面捕捉分子を発現するａ）からの細胞を検出する工程；
ｃ）（ｂ）において検出された細胞を単離および培養する工程；
ｄ）その細胞を、ＰＯＩをコードする第２の核酸で同時にかまたはその後にトランスフェクトする工程であって、そのようなＰＯＩが分泌される、工程；
ｅ）表面に提示されるＰＯＩを、その細胞を検出分子と接触させることにより検出する工程であって、その検出分子のうちの１つ以上がそのＰＯＩに結合する、工程；
ｆ）その検出分子に基づいて細胞を単離する工程；
を包含する。
【００２４】
本発明はなおさらに、任意の分泌されるＰＯＩを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
ａ）細胞表面捕捉分子を一過性にかまたは安定に高収量で発現する細胞を検出する工程；
ｂ）（ａ）において検出された細胞を、単離および培養する工程；
ｃ）ＰＯＩをコードする核酸で（ｂ）における細胞をトランスフェクトする工程であって、そのようなタンパク質が分泌される、工程；
ｄ）その細胞を検出分子と接触させることによって、表面に提示されるＰＯＩを検出する工程であって、その検出分子のうちの１つ以上がそのＰＯＩと結合する、工程；
ｅ）その検出分子に基づいて細胞を単離する工程；
を包含する。
【００２５】
本発明はさらに、任意の分泌されるＰＯＩを産生する細胞を検出および単離する方法に関し、この方法は、
ａ）そのＰＯＩと結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞株を、そのような細胞表面捕捉分子をコードする核酸でトランスフェクトすることによって構築する工程；
ｂ）その細胞表面捕捉分子を高収量で発現する（ａ）からの細胞を検出する工程；
ｃ）（ｂ）において検出された細胞を単離および培養し、そして十分な時間その細胞にそのＰＯＩを分泌させる工程；
ｄ）その細胞を検出分子と接触させることによって表面に提示されるＰＯＩを検出する工程であって、その検出分子のうちの１つ以上がＰＯＩと結合する、工程；
ｅ）その検出分子に基づいて細胞を単離する工程；
を包含する。
【００２６】
本発明は、これらの方法により生成される細胞を含む、非ヒト生物に関する。具体的には、そのような非ヒト生物は、抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を有する細胞を含み得る。
【００２７】
さらに、本発明は、タンパク質に、そのタンパク質が細胞膜中に固定されたままであり、その細胞の外側に露出され、そして細胞表面捕捉分子として機能するように、膜アンカーを付加することを企図する。そのような膜アンカーは、膜貫通アンカーまたはＧＰＩリンクであり得、そしてその細胞に対してネイティブであっても、組換え体であっても、または合成であってもよい。
【００２８】
本発明はまた、タンパク質のアミノ末端に、そのタンパク質が細胞表面に輸送され、そして細胞表面捕捉分子として機能するように、シグナル配列を付加することを具体化する。そのようなシグナル配列は、その細胞に対してネイティブであっても、組換え体であっても、または合成であってもよい。
【００２９】
別の実施形態において、その細胞表面捕捉分子と結合するブロッキング分子が、ＰＯＩ発現細胞から近隣の細胞へのＰＯＩの拡散を減少するために付加される。さらなる実施形態において、ＰＯＩ発現細胞から近隣細胞へのＰＯＩの拡散および細胞へのＰＯＩの接着は、培地の粘度を増加させることによって減少される。
【００３０】
本発明はさらに、分泌タンパク質（リガンド、可溶性レセプター分子、増殖因子、および抗体を含む）を発現する細胞の同定および選択に関する。そのような分泌されるタンパク質は、組換え生成されてもまたは天然に存在してもよい。さらに、ＰＯＩをコードする核酸は、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない）から選択され得る。
【００３１】
１つの実施形態において、そのような増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エリスロポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦレセプター、融合タンパク質、ならびに動物細胞においてなされる承認されたすべての治療からなる群より選択され得る。
【００３２】
別の実施形態において、その抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、ならびにこれらのうちの種々のサブタイプからなる群より選択される。
【００３３】
なお別の実施形態において、本発明は、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、または抗体結合タンパク質を、ＰＯＩに結合する細胞表面捕捉分子として使用する。そのような細胞表面捕捉分子は、組換え産生されてもまたは天然に存在するのであってもよい。
【００３４】
１つの実施形態において、その細胞表面捕捉分子は、ＰＯＩと結合する、リガンド特異的レセプター、レセプター特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体、ＳｃＦｖ、それらのフラグメント、抗体の定常領域に融合された任意のもの、およびファージディスプレイライブラリーもしくはペプチドライブラリー由来のペプチド、ならびに誘導体である。別の実施形態において、その細胞表面捕捉分子は、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、サイトカインレセプター成分、または２つ以上のサイトカインレセプター成分の融合物からなる群より選択される。
【００３５】
さらに、本発明は、所望の特異性、親和性、またはアイソタイプの分泌抗体を発現する、Ｂ細胞およびその誘導体、またはハイブリドーマの同定に関する。本発明はまた、所望のレベルの抗体または抗体フラグメントを発現する細胞の単離のために、使用され得る。
【００３６】
本発明はさらに、抗イムノグロブリン抗体、抗イムノグロブリン、ＳｃＦｖ、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）、を、ＰＯＩと結合する細胞表面捕捉分子として使用することに関し、そのＰＯＩは、分泌抗体である。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、分泌タンパク質を生成する細胞を同定および単離する新規かつこれまで未知の方法を記載する。本発明は、細胞表面に位置した、ＰＯＩに結合する分子を発現する細胞の生成に基づく。次いで、細胞表面に提示されたＰＯＩは、種々の検出分子で標識されることにより検出され得る。特定の条件下で細胞表面に提示されたＰＯＩの量は、分泌されたＰＯＩの総量の直接的な尺度である。次いで、ＰＯＩ産生細胞は、非産生細胞から単離され得、生成レベルまたはＰＯＩ特徴が識別され得る。本発明の利点は、ｍＲＮＡを間接的に測定するのではなく、分泌ＰＯＩを直接定量することである。
【００３８】
本発明は、ＰＯＩを生成する同じ細胞における種々の分泌ＰＯＩを結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞の構築またはその使用に関する。細胞がＰＯＩを分泌すると、これらの細胞表面捕捉分子は、ＰＯＩを結合するか、またはＰＯＩと細胞表面捕捉分子との複合体が細胞内に形成し得、次いでこの複合体が分泌され得る。結合は、オートクライン様式にて結合し得るかまたは分泌されると同時に生じ得る。次いで、分泌ＰＯＩを生成する細胞が、同定および単離され得る。このような同定および単離は、ＰＯＩの特徴、ＰＯＩの生成またはその欠如、あるいは特定された生成レベルに基づき得る。この細胞表面捕捉分子および／またはＰＯＩは、ネイティブな状態で細胞により生成されてもよいし、細胞表面捕捉分子および／またはＰＯＩが組換え生成されてもよい。細胞表面捕捉分子とＰＯＩとの間に対応する親和性が存在するのであれば、このような細胞の構築または使用を通じて、任意の分泌タンパク質が、細胞表面捕捉分子により捕捉され得る。さらに説明すると、細胞表面捕捉分子として使用され得るように、任意の分子が操作され得る。従って、本発明は、タンパク質を分泌する任意の細胞を単離するために利用され得る。
【００３９】
ほとんど全てのタンパク質は、本発明により記載されるような細胞表面捕捉分子として機能する能力を有する。必要なものは、所望のタンパク質が細胞膜に固定され、細胞外空間に露出される能力である。所望の細胞が、シグナル配列を有する場合、細胞表面捕捉分子が、細胞の外側に露出される細胞膜に固定されたままであるように、膜アンカー（膜貫通アンカーまたはＧＰＩ連結シグナルが挙げられるが、これらに限定されない）のみが、その細胞表面捕捉分子に付加される必要がある。さらに、所望のタンパク質がシグナル配列を欠く場合、所望のタンパク質分子が細胞表面に移行されるように、シグナル配列が所望のタンパク質のアミノ末端に付加され得る。シグナル配列および膜アンカーは、細胞に対してネイティブであってもよいし、組換えであってもよいし、合成であってもよい。
【００４０】
細胞は、しばしば、内因的にまたは組換えＤＮＡを導入した後に、広範な種々のタンパク質を分泌する。任意の分泌タンパク質が同定され得、この分泌タンパク質を生成する細胞が、本発明の方法に従って、単離され得る。このような分泌タンパク質としては、増殖因子、増殖因子レセプター、リガンド、可溶性レセプター成分、抗体、およびペプチドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。このような分泌タンパク質は、組換えタンパク質であっても、そうでなくてもよい。すなわち、所望の細胞に由来する目的のいくつかのタンパク質の分泌は、さらなるヌクレオチド配列の導入を必要としないかもしれない。例えば、Ｂ細胞またはプラスマ細胞からの抗体の分泌は、Ｂ細胞またはプラスマ細胞への組換えヌクレオチド配列の導入の結果ではない。組換え分泌タンパク質は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術により生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻、第２巻および第３巻，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。これらの分泌タンパク質は、多くの商業目的および研究目的のために有用である。本発明は、本発明の方法論を通じてこのような分泌タンパク質を生成することを包含する。提示されたＰＯＩを有する細胞の検出は、提示されたＰＯＩを直接的または間接的に結合し得る任意の分子を使用することにより達成され得る。このような検出分子は、ＰＯＩを提示する細胞の検出および／または単離を容易にし得る。
【００４１】
本発明は、特に、ａ）細胞表面捕捉分子としてリガンド特異的レセプターを使用することによるリガンド産生細胞の単離、ｂ）細胞表面捕捉分子として表面結合レセプター特異的リガンドを使用することによる可溶性レセプター産生細胞の単離、またはｃ）細胞表面捕捉分子として抗体結合タンパク質を使用することによる抗体産生細胞の単離、に適用可能である。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、細胞表面捕捉分子としてリガンド特異的レセプターを使用することによるリガンド産生細胞の単離に適用可能である。より具体的には、増殖因子またはサイトカインを結合し得る細胞表面捕捉分子を発現する細胞を使用または構築し得る。これらの細胞表面捕捉分子としては、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦＲＩ（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲＩＩ（Ｆｌｋ１）、サイトカインレセプター成分、または２以上のサイトカインレセプター成分の融合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。このようなレセプターは、ＰＯＩ（例えば、サイトカインまたは増殖因子）を結合し得る。そのサイトカインおよび増殖因子としては、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、繊毛神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＮＴＦ）、エリスロポエチン、脈管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポイエチン１、アンギオポイエチン２、ＴＮＦ、インターフェロン-γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＧＦβが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、細胞表面捕捉分子として抗体結合タンパク質を使用することによる抗体産生細胞の単離に適用可能である。１つの実施形態において、抗体産生細胞は、ＰＯＩ（この場合には、抗体である）を結合する細胞表面捕捉分子を発現する不死化細胞に融合され得る。このような抗体産生細胞としては、Ｂ細胞およびその誘導体（特にプラスマ細胞）、ハイブリドーマ（例えば、ＮＳ０）、骨髄腫細胞（例えば、ＳＰ２／０）、組換え細胞（例えば、組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞）、または抗体フラグメント（例えば、ＩｇＧ由来のＦｃフラグメント）からなる融合タンパク質を生成する他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＯＩは、このような細胞から生成される抗体であり得る。このような抗体としては、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ならびにこれらの種々のサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。抗体を結合するために使用され得る細胞表面捕捉分子としては、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ）、抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ、およびプロテインＨ、またはこれらの機能的フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
抗体産生細胞の単離に適用される場合、本発明を使用して、所望の特異性、アイソタイプおよびアビディティを有する抗体を発現する細胞を同定および単離し得た。さらに、ペプチドまたはタンパク質フラグメントでの検出によって、所望のエピトープに対して特異的な抗体を発現する抗体産生細胞の同定および単離が可能になる。
【００４５】
本発明の方法論に従って、細胞は、分泌型ＰＯＩを結合し得る細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて、このような細胞表面捕捉分子が発現される条件下で、最初にトランスフェクトされる。次いで、このような細胞表面捕捉分子の適切な産生細胞であるトランスフェクト細胞は、検出および単離され、そしてこのような細胞は、培養される。これらの細胞は、ＰＯＩを天然に産生し得るか、またはＰＯＩが組み換え的に発現され得るかのいずれかである。これらの細胞が天然にＰＯＩを産生する場合、これらの細胞は、検出および単離が可能である。ＰＯＩが組み換え的に産生される場合、次いで、特定の細胞表面捕捉分子を発現する単離および培養された細胞は、分泌型ＰＯＩをコードする第２のヌクレオチド配列を用いて、分泌型ＰＯＩが発現される条件下でトランスフェクトされる。発現に際して、分泌型ＰＯＩは、細胞表面捕捉分子に結合し、そして結合したＰＯＩを提示する細胞は、検出および単離される。
【００４６】
ＰＯＩが細胞によって天然に産生される場合、細胞は、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされない。ゆえに、本発明のこの局面は、ＰＯＩを産生する細胞のいずれかまたは全てに適用可能である。さらに、細胞表面捕捉分子が、細胞によって天然に産生される場合、細胞は、細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされる必要がない。ゆえに、本発明のこの局面は、細胞表面捕捉分子を産生する細胞のいずれかまたは全てに対して適用可能である。
【００４７】
トランスフェクションおよび発現は、異なる発現カセットおよびプロモーター（構成的かまたは調節型のいずれか）を含有する種々のベクターの使用を介してもたらされ、このベクターはまた、エンハンサー、転写ターミネーター、スプライシングドナー部位およびアクセプター部位、ならびに他のヌクレオチド配列を含み得る（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７）。
【００４８】
これらのベクターは、一般に市販されているか、または当該分野において公知の標準的な技術によって容易に調製され得、そして、染色体外エレメントとしての維持または宿主ゲノムへの組み込みのいずれかによって宿主における発現を提供する。哺乳動物宿主について、ウイルス複製系（例えば、シミアンウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、エプスタインバーウイルス、レトロウイルスなど）に基づく広範な種々のベクターが、公知である。これらのベクターは、転写および翻訳の開始シグナルおよび終止シグナルが存在し、そして１つ以上の制限部位がＧＯＩの単離に利用可能である場合、発現ベクターとして使用され得る。さらに、ベクターは、通常には１つ以上のマーカーを有し、このマーカーによって、発現ベクターを含む宿主細胞の選択が可能になる。このマーカーは、栄養要求性の宿主に対する原栄養；殺生物性耐性（例えば、抗生物質（例えば、Ｇ４１８）に対する耐性）；または重金属（例えば、銅）などを提供し得る。所望ならば、発現ベクターは、種々の成分を連結することによって調製され得る。例えば、複製系、マーカー、そしてＧＯＩと連結する転写調節の開始シグナルおよび終止シグナルならびに翻訳調節の開始シグナルおよび終止シグナル。しばしば、ベクターは、原核生物複製系を含み、これによって、所望のＤＮＡ配列のクローニング、操作、精製および伸長が可能になる。
【００４９】
広範な種々の転写調節配列および翻訳調節配列が、宿主の特性に依存して使用され得る。転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス供給源（例えば、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなど）由来であり得、ここで、この調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。あるいは、哺乳動物発現産物（例えば、アクチン、コラーゲンおよびミオシン）由来のプロモーターが、使用され得る。抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルが、選択され得、その結果、融合された遺伝子の発現が、調節され得る。調節シグナルは、天然の供給源由来であっても、調節シグナルを有する配列が異なる供給源由来であり得るキメラであってもよい。
【００５０】
さらに、ベクターの調製に使用される核酸配列は、種々の供給源由来であり得る。これらの供給源としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの組み合わせが挙げられる。ゲノムＤＮＡは、天然に存在するイントロンを含んでも含まなくてもよい。天然の供給源から得られるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡと呼ばれる）は、種々の方法で得られ得る。所望の配列をコードする宿主細胞が単離され得、ゲノムＤＮＡが、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによって都合よくフラグメント化され得、そして生じたフラグメントは、目的のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の存在についてのプローブを用いてクローニングおよびスクリーニングされ得る。一旦、所望のＤＮＡ配列を含むクローニングされたフラグメントが同定されると、このフラグメントはさらに、以下のために操作され得る：不要なＤＮＡを除去する、
一端または両端を改変する、介在配列（イントロン）の全てまたは一部を除去するなど。
【００５１】
一旦、ベクターが発現のために調製されると、ベクターは、適切な宿主中に導入され得る。種々の技術（以下が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、宿主細胞中に核酸分子を導入し得る：リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ポリブレン媒介トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、リポフェクション、ＤＮＡマイクロインジェクション、および微小弾（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）媒介遺伝子移入（Ｋｅｏｗｎら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７）。
【００５２】
当業者は、ＧＯＩの安定な組込み、引き続くさらなる用途のために同定および単離されるべきタンパク質の発現を誘導する周知技術が当該分野において存在することを知っている。Ｋａｕｆｍａｎら（（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７）は、いくつかの形質転換プロトコルを総説する。このような技術は、多くの異なる条件（当該分野において認識される種々のベクター、多くの細胞株および多様な培養条件が挙げられるがこれらに限定されない）を利用する。
【００５３】
広範な種々の宿主細胞が、トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、真核生物起源または原核生物起源のいずれであってもよい。これらの細胞は、しばしば不死化された真核細胞であり、特に哺乳動物細胞（たとえば、サル腎細胞（ＣＯＳ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）、白血球、骨髄腫および胚性幹細胞である。これらの細胞はまた、非哺乳動物細胞であり得、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられるがこれらに限定されない）を含む。全ての細胞は、適切な条件下での培養トレイ媒体中、または相乗作用的宿主中で増殖し得る。最も所望される細胞は、培養し得る哺乳動物細胞である。
【００５４】
細胞表面捕捉分子に結合した分泌型ＰＯＩは、当該分野において公知の種々の技術によって検出および単離され得る。分泌型ＰＯＩを提示する培養細胞は、分泌型ＰＯＩを直接的または間接的に結合し得る分子と接触され得、ここで、このような検出分子は、色素形成標識、蛍光（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）標識、着色標識、蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）標識または磁気標識のような検出標識を含み得る。検出分子に結合した標識が検出され得、そして種々の方法を使用して、細胞が単離され得る。最も好ましくは、細胞集団において、標識が検出され、そして、細胞が、フローサイトメトリーを利用して単離される。
【００５５】
あるいは、検出分子は、ＰＯＩを提示する細胞の直接的な単離のために使用され得る。これは、検出分子を、培養プレート、常磁性分子、または任意の他の粒子もしくは固体支持体に結合体化することによって達成され得る。さらに、提示されるＰＯＩは、検出分子またはＰＯＩの特性によって直接検出され得る。
【００５６】
１つの実施形態において、互いに結合し差示的に標識されている２つの検出分子を使用して、相互作用をブロックする提示された分泌型ＰＯＩを検出する。細胞が、第１の検出分子を結合しかつ第１の検出分子と第２の検出分子との間の相互作用をブロックする分泌型ＰＯＩを提示する場合、その細胞は、その表面上での第１の検出分子のみの存在に基づいて単離され得る。他方では、細胞が、第１の検出分子を結合するが第１の検出分子と第２の検出分子との間の相互作用をブロックしない分泌型ＰＯＩを提示する場合、その細胞は、その表面上での両方の検出分子の存在に基づいて単離され得る。例えば、レセプター−リガンド複合体の形成を特異的にブロックするかまたはブロックしない抗体を発現する抗体産生細胞が同定され得る。これらの検出分子がレセプターおよび差示的に標識されているそのリガンドである場合、次いで、レセプター−リガンド複合体が形成することをブロックする抗体を発現する抗体産生細胞は、その表面上での一方の標識の存在によって検出され得るが、レセプター−リガンド複合体が形成することをブロックしない抗体を発現する抗体産生細胞は、その表面上での両方の標識の存在によって検出され得る。
【００５７】
実施形態のいずれかにおいて、および発現しない細胞またはほとんど発現しない細胞から発現細胞を単離する事に関して、ＰＯＩが分泌型タンパク質である場合、基本的困難性の１つは、隣接細胞間にＰＯＩが拡散することである。よって、細胞表面上に分泌型ＰＯＩを捕捉するように設計されるいずれの系も、発現細胞から隣接細胞へのＰＯＩの拡散、およびＰＯＩの隣接細胞への接着を妨げるべきであることは、重要である。拡散が生じ得、そして隣接細胞が分泌型ＰＯＩで装飾される場合、ＰＯＩ装飾の程度に基づく細胞の分離によって、高度に発現する細胞を、低い発現レベルを有する細胞から識別し損ない、そして発現しない細胞から発現する細胞を効率的に単離し損ない得る。
【００５８】
従って、本発明の１つの局面は、隣接細胞間での分泌型ＰＯＩの拡散をブロックすることである。これは、細胞表面捕捉分子またはＰＯＩのいずれかを結合し細胞表面捕捉分子に対する分泌型ＰＯＩの結合を妨げるブロッキング分子の添加によって達成され得る。この局面において、検出分子は、ブロッキング分子を結合しない。例えば、細胞表面レセプターがｈＦｃγＲＩであり、そして分泌型ＰＯＩがヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントを有する場合、次いで、隣接細胞間での分泌型ＰＯＩの拡散は、外因性ラットＩｇＧの培養培地への添加によってブロックされ得る。分泌型ＰＯＩを提示するがラットＩｇＧを結合しない細胞の検出は、ラットＩｇＧを認識しないヒトＩｇＧ  Ｆｃに対して特異的な抗体の使用によって達成される。
【００５９】
本発明の別の局面において、隣接細胞間での分泌型ＰＯＩの結合は、培地の粘性を増加させることにより低減される。
【００６０】
本発明の別の局面において、分泌型ＰＯＩは、媒体中に蓄積し得ない。これは、分泌型ＰＯＩおよび／または細胞表面捕捉分子の発現を調節し、その結果、ＰＯＩの短い発現は、細胞表面捕捉分子を結合するに十分であるが拡散するには十分ではない量のＰＯＩを生じることにより達成され得る。
【００６１】
本発明のなお別の局面において、細胞は、蓄積したＰＯＩを含有する培地から取り出され得、この細胞に結合したＰＯＩははがされ、そしてＰＯＩ発現は、制限された時間にわたって続き得、その結果、分泌型ＰＯＩは、培地中に蓄積しない。タンパク質は、当該分野において公知の方法（例えば、低ｐＨ緩衝液での細胞の洗浄）によってはがされる。
【００６２】
本発明に従って、ほとんどの検出分子を結合する細胞集団中のこれらの細胞はまた、ほとんどの分泌型ＰＯＩを発現する。実際に、個々の細胞がＰＯＩをより多く分泌するほど、より多くのＰＯＩが細胞表面上に提示される。その細胞での表面提示ＰＯＩの量とＰＯＩの発現レベルとのこの相関は、所望の相対的発現レベルを有する細胞を細胞集団から迅速に同定することを可能にする。
【００６３】
１つの実施形態において、ＤＮＡライブラリーを使用して、細胞表面捕捉分子によって細胞表面上に提示され得る分泌型タンパク質を発現し得る。例えば、ＤＮＡライブラリーはまた、免疫された動物から単離されたＢ細胞由来の抗体可変ドメインのコード領域から生成され得る。次いで、ＤＮＡライブラリーは、抗体に対して特異的な細胞表面捕捉分子を発現する細胞中に発現され得、その結果、所望の特異性、アイソタイプまたはアビディティのクローンが、本発明の方法によって同定および単離され得る。
【００６４】
別の実施形態において、トランスジェニック哺乳動物が、作製され得る。この動物は、１つ以上の細胞型において特定の細胞表面捕捉分子を発現する。次いで、このようなトランスジェニック哺乳動物由来の細胞は、ＰＯＩの産生について直接スクリーニングされ得る。例えば、プラズマ細胞において、抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を発現することが所望され得る。従って、免疫化したマウス由来のプラズマ細胞が回収され得、そして所望の抗原に特異的な抗体を産生する細胞が、本発明の方法によって単離され得る。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態において、抗体産生は、ＰＯＩである特定の抗体を結合するヒトＦｃγＲ１レセプター（ＦｃγＲ１）を発現するＣＨＯ細胞株の使用を介して測定される。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
ｐＴＥ０８４の構築：ｐＴＥ０８４を、ヒトＦｃγＲＩ（ｈＦｃγＲＩ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２１０９１）をコードするｐＣＡＥ１００由来の１，４３６ｂｐ  ＸｂａＩフラグメントを、ｐＲＧ８２１のＸｂａＩ部位に連結することにより、構築した。連結から生じる所望のプラスミドにおけるｈＦｃγＲＩの方向を、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＳｔｕＩを用いる制限マッピングにより試験した。ｐＴＥ０８４をｈＦｃγＲＩ（ヒトＩｇＧのＦｃドメインについての高親和性細胞表面レセプター）の高レベル発現のために設計した。それは、２つの独立した発現カセットを含む。１つのカセットは、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターにより駆動されるｈＦｃγＲＩ遺伝子であり、そして第二のカセットは、ＳＶ４０後期プロモーターにより駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ）遺伝子（これは、Ｇ４１８に対する耐性を与える）である。
【００６７】
ｈＦｃγＲＩを発現するＣＨＯ  Ｋ１誘導体の構築：
ＣＨＯ  Ｋ１細胞（４×１０６）を、リポフェクタミンＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて製造業者の示唆に従ってｐＴＥ０８４でトランスフェクトした。細胞を、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培養培地（１０％ウシ胎児血清、９０％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２，２ｍＭ  Ｌグルタミン；すべての試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから得た）中に１５日間配置した。Ｇ４１８選択で生存した細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてＦＩＴＣ結合体化ヒトＩｇＧ，Ｆｃフラグメント（ＦＩＴＣ−ｈＦｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で染色した。簡単に説明すると、１０ｃｍ培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含まないダルベッコ燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。０．２５％  トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の３ｍｌを各プレートに添加した。プレートを、細胞がプレートから脱離するまで旋回させた。１０ｍｌ培養培地を、脱離した細胞の各プレートに即時に添加した。次いで、細胞を、１，０００×ｇで４分間の遠心分離によって採集した。上清の除去後、細胞を、培養培地中に希釈した２μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ｈＦｃの４ｍｌ中に再懸濁した。次いで、細胞をプラットフォームシェーカー上に配置し、そして室温で１時間染色した。未結合ＦＩＴＣ−ｈＦｃを除去するために、細胞を２０ｍｌ  ＰＢＳで２回洗浄した。細胞に対するＦＩＴＣ−ｈＦｃ標識の程度をＭｏｆｌｏセルソーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）においてフローサイトメトリーによって測定した。ＦＩＴＣ−ｈＦｃは、模擬トランスフェクト親ＣＨＯ  Ｋ１細胞を染色しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）が、Ｇ４１８耐性のｐＴＥ０８４トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた（図２Ｃ）。選択されたプール由来の上部の１％の最も蛍光のある細胞を、フローサイトメトリーにより１細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に配置した。９日後、９６ウェルプレート中の８８細胞クローンを、２４ウェルプレートに増殖した。３日後、個々のウェル中の細胞を１ｍｌ  ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍｌの２μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ−ｈＦｃで１時間染色し、１ｍｌ  ＰＢＳで２回洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で細胞表面染色について調べた。３３の最も蛍光のあるクローンを選択し、増殖し、次いでフローサイトメトリーによってスクリーニングした。１つのこのようなクローンＲＧＣ３のＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色を図２Ｄに示す。
【００６８】
細胞間の発現細胞と非発現細胞との間の分泌タンパク質の拡散は、ＩｇＧを添加することによりブロックされた：
ｈＦｃγＲＩクローナル細胞株中の全ての細胞が細胞表面ｈＦｃγＲＩを発現するので、それらは、全てＩｇＧまたはＩｇＧのＦｃドメインからなる融合タンパク質を結合する能力を有する。ｈＦｃγＲＩは、種々の種由来のＩｇＧを結合する（ｖａｎ  ｄｅ  ＷｉｎｋｅｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９１）ので、動物ＩｇＧのパネルを、ｈＦｃγＲＩ発現細胞へのヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃタグ（４ＳＣ６２２）を含むタンパク質の結合をブロックする能力について試験した。４ＳＣ６２２は、ｈＩＬ−４Ｒγ細胞外ドメインに融合され、次いでｈＩＧ−１Ｆｃドメインに融合されたＩＬ−２Ｒγ細胞外ドメインからなるキメラ分子である。この実験において、ＲＧＣ１の培養物、ｐＴＥ０８４で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ  Ｋ１細胞から選択されたｈＦｃγＲＩ発現細胞株を、１μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２と、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて、１ｍｇ／ｍｌの異なる種由来のＩｇＧの存在または不在下で、１８時間、インキュベートした。４ＳＣ６２２の細胞表面結合を、洗浄細胞を、ＦＩＴＣ−ｈＦｃでの細胞染色について概説された手順に従って、４ＳＣ６２２のｈＩＬ−２Ｒγ成分に特異的なフィコエリトリン結合体化マウスＩｇＧ１モノクローナルＡＧ１８４（ＰＥ−ＡＧ１８４）（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した後、フローサイトメトリーにより決定した。図３は、ｈＩｇＧが、４ＳＣ６２２がＲＧＣ１の表面上で発現したｈＦｃγＲＩに結合することを完全にブロックしたことを示す。ラット、ウサギ、およびイヌに由来するＩｇＧもまた結合を有効にブロックしたが、ウシおよびヒツジに由来するＩｇＧはブロックしなかった。外因的に添加したラットＩｇＧが、外因的に添加したｈＩｇＧ１  Ｆｃ−タグ化タンパク質（４ＳＣ６２２）の細胞表面ｈＦｃγＲＩへの結合をブロックすることができる（図４）ことは、ラットＩｇＧもまた、異なるレベルでｈＩｇＧ１  Ｆｃタグ化タンパク質を発現する細胞間の移動をブロックし得ることを示唆する。このことを試験するために、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の存在または不在により区別され得る２つの細胞株を、ＲＧＣ１から生成させた。簡単に説明すると、ＲＧＣ１細胞をＥＧＦＰでマーキングするために、２×１０６のＲＧＣ１細胞を、０．５μｇ  ＰＴＥ０７３（これは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードする）および５μｇ  ｐＲＧ８１６−ＥＧＦＰ（これは、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターにより駆動されるＥＧＦＰ遺伝子をコードする）で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、２週間、選択した。緑色蛍光細胞をフローサイトメトリーによって単離した。１つのＥＧＦＰおよびｈＦｃγＲＩ発現クローン、ＲＧＣ２を細胞混合実験において使用した。これらの実験において使用した他の細胞株ＲＧＣ４は、プラスミドｐＥＥ１４．１−６２２でのＲＧＣ１の安定なトランスフェクションにより生成した。ｐＥＥ１４．１−６２２は、４ＳＣ６２２の発現がＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターにより駆動��れるプラスミドであり、そして、グルタミンシンセターゼミニ遺伝子を含む。このグルタミンシンセターゼミニ遺伝子は、アナログメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）に対する耐性を付与し、安定な組み込み事象の選択を可能にする。ＲＧＣ４細胞は、細胞表面上にｈＦｃγＲＩを発現させ、ｈＩｇＧ１  Ｆｃタグ化タンパク質４ＳＣ６２２を分泌する。５０％ＲＧＣ２細胞および５０％ＲＧＣ４細胞で構成される混合細胞の１プレートを、１８時間、１ｍｇ／ｍｌラットＩｇＧとインキュベートし、その後ＰＥ−ＡＧ１８４で染色し、次いでフローサイトメトリーによって調べた。図５Ａは、ＲＧＣ２細胞のＥＧＦＰ蛍光を示し、そして図５Ｂは、ＲＧＣ２細胞もまた、ＰＥ−ＡＧ１８４蛍光の増加により示されるように、外因的に添加された４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）を結合することを示す。図５Ｃは、ＲＧＣ４がＥＧＦＰゲートにおいて蛍光しなかったことを示す。有意には、外因的に添加されたラットＩｇＧは、細胞表面４ＳＣ６２２についてポジティブに染色したＲＧＣ４細胞のパーセントを減少しなかった（図５Ｄ）。このことは、このタンパク質が細胞表面に移行中である間に、ｈＦｃγＲＩへの４ＳＣ６２２の結合が生じたことを示唆する。ＲＧＣ２細胞およびＲＧＣ４細胞を混合した場合（図５Ｅ）、ＲＧＣ４細胞から分泌された４ＳＣ６２２タンパク質が、培地中に蓄積し、そしてＲＧＣ２細胞のほとんどを結合した。しかしながら、１ｍｇ／ｍｌラットＩｇＧの添加は、４ＳＣ６２２を結合したＲＧＣ２細胞のパーセントを有意に減少した（図５Ｆ）。このことは、ラットＩｇＧが発現細胞から非発現細胞への分泌ｈＩｇＧ１  Ｆｃタグ化タンパク質の移動をブロックしたことを実証する。
【００６９】
（実施例２）
細胞表面蛍光は４ＳＣ６２２の発現レベルと相関する：
ＲＧＣ１細胞（４×１０６）をｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクト体のプールを１０％透析ウシ胎児血清、９０％無グルタミンダルベッコ改変イーグル培地，１×ＧＳ補充，および２５μＭ  ＭＳＸで構成される培地中での２週間の選択後に得た（全ての試薬はＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳから得た）。ラットＩｇＧを、免疫染色の１８時間前に１ｍｇ／ｍｌまで培養培地に添加した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、そして、１．５μｇ／ｍｌのポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、室温で１時間、実施例１においてＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色について記載したような手順に従って染色した。次いで、細胞染色をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光の分布は、選択されたプールが広範な４ＳＣ６２２発現レベルを有する細胞を含有することを示唆した（図６）。それらの免疫蛍光に関して上部の３％（Ｒ３階層（ｂｒａｃｋｅｔ））、７〜１１％（Ｒ５階層）、および１５〜１９％（Ｒ７階層）における細胞を、３つの異なるプールに分別し、そして９日間増殖させた。プールについての細胞当たりの平均４ＳＣ６２２産生を、免疫に基づくＰａｎｄｅｘアッセイ（Ｉｄｅｘｘ；Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）により、製造者の推奨に従って、３日増殖後の培地中の細胞数および４ＳＣ６２２レベルを測定することにより決定した。Ｐａｎｄｅｘアッセイにおいて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ，γ鎖特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）でコートしたフルオリコンポリスチレンアッセイ粒子を用いて、培地から４ＳＣ６２２を捕捉し、そしてＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃ特異的（Ｓｉｇｍａ）を用いてビーズ結合４ＳＣ６２２を検出した。既知量の精製４ＳＣ６２２を、較正のためにアッセイ中に含ませた。上部の３％、７〜１１％、および１５〜１９％プール中の細胞はそれぞれ、１．４２ｐｇ／細胞／日、０．３６ｐｇ／細胞／日、および０．２２ｐｇ／細胞／日で４ＳＣ６２２を産生することが見出された。従って、細胞表面４ＳＣ６２２染色と特異的タンパク質産生との間には相関があった。この結果は、高レベルで４ＳＣ６２２を発現する個々の細胞が、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにより最も明るく染色した細胞を単離することにより、得られ得ることを示唆する。
【００７０】
（実施例３）
ＲＧＣ１における発現クローンの単離：
ＩＬ−４トラップ。本発明者らの方法により高レベルの分泌タンパク質産生を伴うクローナル細胞株を生成することにおける効率を直接的に示すために、クローナル４ＳＣ６２２産生細胞株をＲＧＣ１から生成した。ＲＧＣ１細胞（４×１０６）をｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトし、そし２５μＭ  ＭＳＸを用いて２週間選択し、安定なトランスフェクト体のプールを得た。ＭＳＸ耐性細胞をプールし、ＰＥ−ＡＧ１８４での染色前に、１８時間、１ｍｇ／ｍｌ  ヒトＩｇＧとインキュベートした。細胞表面４ＳＣ６２２染色のフローサイトメトリー分析により決定された上部の５％ゲート由来の６つの細胞を、単離し、そして増殖させた。６つのクローナル株からの４ＳＣ６２２産生を決定し、そして選択コロニーのハンドピッキング、次いで希釈クローニングおよび増幅により得られたクローンからの４ＳＣ６２２産生と比較した。１つのＲＧＣ１由来クローンＲＧＣ４は、１２ｐｇ／細胞／日で４ＳＣ６２２を産生した（図７）。このレベルは、２，７００クローンのハンドピッキングおよび分析により単離された最良の４ＳＣ６２２産生細胞のレベルに類似する。従って、コロニーのハンドピッキングと比較して、本発明において概説された方法は、高い産生細胞のスクリーニングおよびクローニングにおいてずっとより効率的であることがわかる。
【００７１】
ＶＥＧＦトラップ。プラスミドｐＴＥ０８０およびｐＴＥ０８１は、ＶＥＧＦトラップであるｈＶＥＧＦＲ１Ｒ２およびｈＶＥＧＦ−Ｒ１Ｒ３の遺伝子をコードする。ｈＶＥＧＦ−Ｒ１Ｒ２は、ｈＶＥＧＦＲ１の第一のＩｇドメインが、ｈＶＥＧＦＲ２の第二のＩｇドメインに融合され、次いでｈＩｇ１ＦＣドメインに融合されたものからなる、キメラ分子である。ｈＶＥＧＦＲ１Ｒ３は、ｈＶＥＧＦＲ１の第一のＩｇドメインが、ｈＶＥＧＦＲ３の第二のＩｇドメインに融合され、次いでｈＩｇ１ＦＣドメインに融合されたものからなる、キメラ分子である。これらのプラスミドにおいては、ＶＥＧＦトラップの遺伝子は、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって駆動され、そしてグルタミンシンセターゼミニ遺伝子（これは、ＭＳＸに対する耐性を付与する）は、安定な組み込み事象の選択のために発現される。ＲＧＣ１細胞を、これらのプラスミドのいずれかでトランスフェクトし、そして２５μＭ  ＭＳＸを含有する培地中で２週間増殖させ、プラスミドが安定に組み込まれた細胞について選択した。ＭＳＸ耐性細胞を０．１μｇ／ｍｌ  Ｉｇ２ａおよびマウスＩｇＧ３と１８時間、インキュベートし、その後１．５μｇ／ｍｌ  ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色した。細胞を、１時間染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、その後フローサイトメトリーを行った。シングル細胞を、その蛍光が最も高い１％にある細胞のプールから、９６ウェル組織培養プレート中に分別した。個々のウェル中の細胞を増殖し、そしてそれらの産生性をＰａｎｄｅｘアッセイによって決定した。図７は、ｈＶＥＧＦＲ１Ｒ２およびｈＶＥＧＦＲ１Ｒ３の両方を発現するＲＧＣ由来クローンが、より高い特異的生産性を有し、そして最高に発現するハンドピッキングされたＭＳＸ耐性コロニーに比較して、より少ないクローンをスクリーニングすることにより単離されたことを示す。
【００７２】
（実施例４）
細胞表面結合ｈＩｇＧ１  Ｆｃタグ化タンパク質は、ＲＧＣ１によってインターナライズされる：
ｈＦｃγＲＩは、その細胞表面結合リガンドのインターナライゼーションを誘導することが知られている。ＲＧＣ１細胞が細胞表面結合４ＳＣ６２２をインターナライズできるか否かを分析するために、１μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２をＲＧＣ１細胞に１時間添加し、次いで、この細胞を、ＰＥ−ＡＧ１８４での４ＳＣ６２２免疫染色およびフローサイトメトリー分析のために即時に加工した。細胞の９３％が細胞表面４ＳＣ６２２についてポジティブに染色した（図８Ｂ）。あるいは、１μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２をＲＧＣ１細胞に１時間添加し、次いでこの細胞を洗浄し、そして４ＳＣ６２２を含まない培養培地中で、ＰＥ−ＡＧ１８４とともに、１８時間、インキュベートした。４ＳＣ６２２についての免疫染色後のフローサイトメトリー分析は、細胞の９％が、細胞表面上に４ＳＣ６２２を保持することを示した（図８Ｃ）。表面結合４ＳＣ６２２の損失をさらに特徴付けるために、精製された４ＳＣ６２２タンパク質をＲＧＣ１および親ＣＨＯ  Ｋ１細胞の培地に添加し、次いで培地中の４ＳＣ６２２のレベルを経時的に測定した。図９は、２μｇ／ｍｌまで１０ｃｍプレート中の培養培地に添加した４ＳＣ６２２が、３日のインキュベーション後、ＲＧＣ１馴化培地において、ＣＨＯ  Ｋ１コントロールに比較して有意に低かったことを示す。これらの結果は、培養培地中の４ＳＣ６２２の濃度が細胞表面上のｈＦｃγＲＩの存在によって減少されることを示す。これらの結果は、培地からの４ＳＣ６２２の涸渇が、ｈＦｃγＲＩ−４ＳＣ６２２複合体のインターナライゼーションの結果であったことを示唆する。レセプター−リガンド複合体のこのインターナライゼーションは、１８時間ブロッキング工程の間ＩｇＧのブロッキングの存在下で非発現細胞から全ての４ＳＣ６２２を有効に除去することを容易にし得る。
【００７３】
（実施例５）
誘導性ｈＦｃγＲＩ発現を有するＣＨＯ  Ｋ１細胞株の構築：
ｈＦｃγＲＩを用いるフローサイトメトリーに基づく自系分泌トラップ法は、高発現クローンの迅速な単離を可能にする。しかし、ｈＦｃγＲＩがＦｃタグ化タンパク質のターンオーバーを媒介する場合、操作されたｈＦｃγＲＩ発現細胞による分泌タンパク質の実現産生は、ｈＦｃγＲＩ発現が産生期の間に阻害され得る場合により高い。このために、ｈＦｃγＲＩの発現がテトラサイクリンまたはアナログのドキシサイクリンによって誘導されるＣＨＯ  Ｋ１細胞株を構築した。この系において、まず、ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するように操作し、そしてｈＦｃγＲＩを、その活性がＴｅｔＲによって調節されるプロモーターの転写制御下に配置した。２つの直列のＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）をｐＴＥ０８４においてＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置し、ｐＴＥ１５８を生成した（図１０）。ｐＴＥ１５８におけるＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターからのｈＦｃγＲＩの転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の適切なインデューサーの不在下でＴｅｔＲによってブロックされた。インデューサーの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質は、ＴｅｔＯに結合し得ず、ｈＦｃγＲＩの転写が生じる。
【００７４】
ＣＨＯ  Ｋ１細胞をｐｃＤＮＡ６／ＴＲでトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ６／ＴＲは、ブラスチシジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）に対する耐性を付与するプラスミドであって、ここでは、ＴｅｔＲの発現がＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターから生じる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。２．５μｇ／ｍｌブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での選択の二週間後、安定なトランスフェクト体をプールした。次いで、このプールをｐＴＥ１５８でトランスフェクトした。ｐＴＥ１５８は、Ｇ４１８に対する耐性を付与するプラスミドであって、ここでは、ｈＦｃγＲＩの発現がＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯハイブリッドプロモーターに依存する。ｐｃＤＮＡ６／ＴＲおよびｐＴＥ１５８で続けてトランスフェクトした細胞を、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および２．５μｇ／ｍｌブラスチシジンで１２日間選択し、次いでプールした。このプールを、１μｇ／ｍｌドキシサイクリンの添加により２日間誘導し、次いでＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、ｈＦｃγＲＩを発現する細胞を同定した。ｈＦｃγＲＩを発現する細胞の上部の５％をプールとして採集し、ドキシサイクリンの不在下で６日間増殖させ、そしてｈＦｃγＲＩの存在についてＦＩＴＣ−ｈＦｃで再度染色した。ｈＦｃγＲＩについて染色しなかった細胞を採集し、３日間、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含有する培養培地中で増殖させた。次いで、このプールをｈＦｃγＲＩの存在について染色し、そしてフローサイトメトリーによって単離した。最も高いレベルのｈＦｃγＲＩを発現した細胞（上部の１％）を１ウェルあたり１細胞で９６ウェルプレート上に分別した。これらの細胞は、おそらく、低い非誘導発現レベルのＦｃＲ１および高い誘導レベルのＦｃＲ１を有する細胞を含んだ。発現後、２０クローン中のドキシサイクリンによるｈＦｃγＲＩの誘導を、ＦＩＴＣ−ｈＦｃでの免疫染色およびフローサイトメトリーにより確認した。１つのクローンを、さらなる特徴づけのために選択し、そしてこれをＲＧＣ１０と名付けた。図１１は、ＲＧＣ１０が、ドキシサイクリンの不在下では、検出可能なレベルのｈＦｃγＲＩを発現しなかったが、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで３日間誘導した細胞においては、高レベルのｈＦｃγＲＩが観察されたことを示す。ＲＧＣ１０細胞の平均蛍光は、ドキシサイクリンによる誘導後、１０００倍より多く増大した。
【００７５】
（実施例６）
ＲＧＣ１０からの４ＳＣ６２２産生細胞株の単離：
ＲＧＣ１０細胞をｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトし、そしてＭＳＸ耐性細胞を、２５μＭ  ＭＳＸでの２週間の選択後プールした。ｈＦｃγＲＩの発現を、培養培地への１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの３日間の添加により誘導した。１ｍｇ／ｍｌラットＩｇＧを、ドキシサイクリンを含有する培養培地に添加し、１８時間後に、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。最も高いレベルの４ＳＣ６２２を発現した細胞（上部の１％）を、１ウェルあたり１細胞で９６ウェルプレート中に分別した（図１２Ｃ）。図１２Ｂは、ドキシサイクリンによるｈＦｃγＲＩ発現の誘導なしでは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでの染色は、細胞表面結合４ＳＣ６２２を検出できないことを示す。６０クローンを、ドキシサイクリンの不在下で増殖させた。図１３は、Ｐａｎｄｅｘアッセイにより決定されたような１３の最も高い産生細胞の特異的生産性を示す。クローン１Ｃ２の特異的生産性は、１７．８ｐｇ／細胞／日であり、未調節のｈＦｃγＲＩ細胞株ＲＧＣ１を用いて以前に単離された最良の４ＳＣ６２２細胞株について観察された１２ｐｇ／細胞／日よりも有意に良好であった。
【００７６】
（実施例７）
Ｓｐ２／０骨髄腫細胞は、細胞表面捕捉タンパク質を発現するように操作され得る：
本実施例では、Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫細胞株を、ｈＦｃγＲＩを安定に発現するように操作し、自系分泌トラップ法がＣＨＯ以外の細胞株に適用可能であることを実証した。ｈＦｃγＲＩの遺伝子をレトロウイルス感染により骨髄腫細胞に導入した。プラスミドｐＬＸＲＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（これは、目的の遺伝子が上流Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス長末端反復（ＭｏＭｕＳＶ  ＬＴＲ）プロモーターから発現され得るレトロウイルスＤＮＡベクターである）を用いて、ｈＦｃγＲＩ遺伝子をコードするレトロウイルスを生成した。ヒトＦｃγＲＩ遺伝子をコードする、ｐＴＥ０８４由来の１，３６３ｂｐ  ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＬＸＲＮのＸｈｏＩ部位にクローニングした。ｈＦｃγＲＩ  ｃＤＮＡ発現がＭｏＭｕＳＶ  ＬＴＲに依存するプラスミドを選択し、そしてｐＴＥ２５５と名付けた（図１４）。
【００７７】
ｈＦｃγＲＩの発現のための汎親和性レトロウイルスを、製造者の指針に本質的に従って生成した。パッケージング細胞株ＧＰ−２９３（ウイルスｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３ベースの細胞株）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、各々１０μｇのｐＶＳＶ−ＧおよびｐＴＥ２５５で同時トランスフェクトした。プラスミドｐＶＳＶ−Ｇは、感染性粒子に対して広い宿主範囲を付与するウイルスエンベロープタンパク質ＶＳＶ−Ｇの発現を可能にする。
【００７８】
（Ｓｐ２−ｈＦｃγＲＩ−４の構築）
汎親和性ｈＦｃγＲＩレトロウイルスを使用して、１×１０７のＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１細胞当たり約１０の多重度の感染性粒子で感染させた。感染の３日後に、細胞を１時間染色し、次いでフローサイトメトリーで分析する前に、ＰＢＳで２回洗浄した。結合したＦＩＴＣ−ｈＦｃによって示されるようなｈＦｃγＲＩ発現細胞を、フローサイトメトリーによって、プールとして収集した。このプールを１３日間増殖させ、次いでＦＩＴＣ−ｈＦｃで再び染色し、そしてｈＦｃγＲＩ発現細胞を、フローサイトメトリーによってプールとして収集した。これらの分別された細胞を１０％ウシ胎仔血清、４．５ｇ／ｌ  グルコースおよび４ｍＭ  グルタミンを含む９０％ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で３週間培養し、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、そして集団中の上位１％の平均蛍光を有する細胞を、単一細胞分別によってクローン化した。増殖後、２４個のクローンをｈＦｃγＲＩの発現についてフローサイトメトリーによって上記のように試験し、１つのクローン（Ｓｐ２−ｈＦｃγＲＩ−４）を、さらなる特徴付けのために選択した（図１５）。
【００７９】
（４ＳＣ６２２タンパク質を発現するＳｐ２−ｈＦｃγＲＩ−４細胞の単離）
Ｓｐ２−ｈＦｃγＲＩ−４細胞（１×１０７）を、ｐＴＥ２０９（このプラスミドは、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターからの４ＳＣ６２２タンパク質の構成的発現を可能にし、そしてハイグロマイシンに対する耐性を付与する）でトランスフェクトした（図１６）。トランスフェクトした細胞を、１０％ＦＣＳ、９０％Ｄ−ＭＥＭおよび４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有する培地中に１４日間配置した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでの染色の前に、１ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベートした。細胞を１時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前に、ＰＢＳで２回洗浄した。標識細胞を、上記のように、フローサイトメトリーによってプールとして収集し、次いで５日間培養しそして分別した。次いで、最もＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと結合した、増殖したプール由来の細胞（上位１％集団）を、単一細胞分別によってクローン化した（図１７）。１０個のクローンからの４ＳＣ６２２の産生を、ＥＬＩＳＡによって分析し、そして１０個全てのクローンが４ＳＣ６２２を発現することが見出された：クローン５Ｈ１１は、１日当たり、０．５ｐｇ／細胞の４ＳＣ６２２を産生した。これらのデータは、４ＳＣ６２２を分泌するクローンが、自系分泌トラップ法によって、ｐＴＥ２０９を用いたＳｐ２−ｈＦｃγＲＩ−４細胞の安定なトランスフェクションに由来する細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを示した。
【００８０】
４ＳＣ６２２が、４ＳＣ６２２およびｈＦｃγＲＩの両方を発現する骨髄腫細胞の表面上に自系的に提示されたことを確認するために、クローン５Ｈ１１を、１ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベーションし、次いでＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色して、細胞表面４ＳＣ６２２を提示することを見出した。分泌タンパク質を、栄養共生がウサギＩｇＧによってブロックされる条件下でディスプレイさせ、４ＳＣ６２２の自系ディスプレイを実証した。これらのデータは、上記の自系分泌トラップ法が、ＣＨＯ細胞に限定されず、骨髄腫および他の細胞型にも同様に拡大され得ることを実証した。
【００８１】
（実施例８）
プロテインＧキメラタンパク質は、細胞表面捕捉タンパク質として機能し得る。
【００８２】
ｈＦｃγＲＩ以外の細胞表面捕捉タンパク質に対する自系分泌トラップ法の適用を実証するために、プロテインＧ発現細胞株を構築した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ株Ｇ４１８由来のプロテインＧは、全てのヒトおよびマウスのＩｇＧサブクラスに結合し、そして抗体またはＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を発現する組換え細胞の単離について有用性を有する。プロテインＧ  ＩｇＧ  Ｆｃ結合ドメインが、全てのヒトおよびマウスのＩｇＧサブクラスに結合し得る細胞表面捕捉タンパク質として使用され得ることを実証するために、本発明者らは、ｈＦｃγＲＩの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合したプロテインＧのＦｃ結合ドメインからなるキメラタンパク質を発現するＣＨＯ株を構築した（図１８）。プロテインＧのＦｃ結合ドメインは、３個の５５アミノ酸長の相同反復を含み（Ｇｕｓｓら（１９８６）ＥＭＢＯ  ５：１５６７およびＳｊｏｂｒｉｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３９９）、そして各反復は、１つのＩｇＧ  Ｆｃを結合し得る。ＣＨＯ細胞におけるこのキメラタンパク質の発現を改善するために、本発明者らは、マウスＲＯＲ１遺伝子由来のシグナル配列が、プロテインＧ（登録番号Ｘ０６１７３）のＦｃ結合ドメイン（アミノ酸３０３〜４９７）に融合された合成ＤＮＡを構築した。この合成ＤＮＡを、オリゴヌクレオチドアニーリング、ギャップフィリングおよびＰＣＲ増幅の組み合わせによって作製した。次いで、この合成ＤＮＡを、ＰＣＲによって、ｈＦｃγＲＩ（登録番号Ｍ２１０９１）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン（アミノ酸２７９〜３７４）をコードするＤＮＡに融合させた。プロテインＧ／ｈＦｃγＲＩキメラタンパク質をコードする得られたＤＮＡを、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの下流で、ｈＦｃγＲＩをコードする遺伝子を置換して、ｐＴＥ１５８中にクローニングし、プラスミドｐＴＥ３００を得た（図１９）。
【００８３】
無血清培地中での増殖のために適合されたＣＨＯ  Ｋ１細胞株であるＲＧＣ１４を、ｐＴＥ３００でトランスフェクトし、３日後に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を培養培地に添加して、ｐＴＥ３００の安定な組込みについて選択した。選択開始の２週間後、細胞をＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色して、ｈＦｃγＲＩを発現する細胞を同定した。これらの細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、そしてｈＦｃγＲＩ発現細胞をプールとして収集した（図２０）。細胞を１０日間増殖させ、そしてｈＦｃγＲＩ発現細胞集団を、フローサイトメトリーによって再び単離した。細胞を再び増殖させ、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色し、高レベルのプロテインＧ／ｈＦｃγＲＩキメラタンパク質を発現する単一細胞を、フローサイトメトリーによって単離した。ＦＩＴＣ−ｈＦｃ結合についてポジティブに染色された単一細胞を、１０％ウシ胎仔血清、９０％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８からなる培地中に分別した。２週間のインキュベーション後、４８個のクローンを、培養培地中に存在するウシＩｇＧに対する結合について、ＦＩＴＣ結合体化抗ウシＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色することによって試験した。この抗体によってポジティブに染色された１つのクローン（ＲＧＣ１８）を、さらなる特徴付けのために選択した。
【００８４】
（ＲＧＣ１８における発現クローンの単離）
ＲＧＣ１８細胞（６×１０６）を、ｐＴＥ２０９でトランスフェクトし、そして４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン中で１８日間増殖させることによって、プラスミドの組込みについて選択した。ハイグロマイシン耐性細胞を、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでの染色の前に、１ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベートした。細胞を１時間染色し、次いでフローサイトメトリーによる分析の前にＰＢＳで２回洗浄した（図２１）。最も蛍光の細胞（上位５％）を、単一細胞分別によって単離し、そして３週間増殖させた。１０個のクローンを、４ＳＣ６２２分泌について試験した。試験した全てのクローンが、高レベルで４ＳＣ６２２を分泌し、そして最良のクローン（ＲＧＣ１９）は、一日当たり６．４ｐｇ／細胞の特異的生産性を有した。この結果は、４ＳＣ６２２発現細胞が、自系分泌トラップ法によって、ｐＴＥ２０９でのＲＧＣ１８の安定なトランスフェクション由来の細胞の不均一なプールから、効率的に単離されたことを実証した。さらに、これらのデータは、プロテインＧのフラグメントが、シグナル配列および膜貫通ドメインを含むように操作され得、そして細胞表面捕捉タンパク質として機能し得ることを明らかに実証した。
【００８５】
４ＳＣ６２２が、プロテインＧ／ｈＦｃγＲＩキメラタンパク質および４ＳＣ６２２を共に発現するＲＧＣ１９細胞の表面上に、自系的にディスプレイされることを確認するために、ＲＧＣ１９を、１ｍｇ／ｍｌのウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。ＲＧＣ１９細胞は、栄養共生がウサギＩｇＧによってブロックされる条件下で、細胞表面４ＳＣ６２２を保有することが見出されており、このことは、４ＳＣ６２２の自系的ディスプレイを示唆する（図２２）。ウサギＩｇＧは、ＲＧＣ１８細胞に対する外因性４ＳＣ６２２タンパク質の結合を効果的にブロックしたが、４ＳＣ６２２発現細胞の細胞表面上の４ＳＣ６２２のディスプレイをブロックしなかった。これらのデータは、プロテインＧ／ｈＦｃγＲＩキメラタンパク質の特性が、細胞表面捕捉タンパク質としてのｈＦｃγＲＩの特性と類似することを実証し、そして自系分泌トラップ法が、細胞表面捕捉タンパク質として他のタンパク質を使用し得ることを示唆した。
【００８６】
（実施例９）
（ＲＧＣ１０からの抗体産生細胞の単離）
組換え抗体を発現するＣＨＯ細胞の単離についての自系分泌トラップ法の有用性を実証するために、本発明者らは、ＫＤ５ハイブリドーマ由来の可変領域軽鎖遺伝子および可変領域重鎖遺伝子をコードするＤＮＡをクローニングした。ＫＤ５は、ヒトＴｉｅ−２レセプターに特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。
【００８７】
マウスＩｇＧの定常領域の遺伝子配列は、５００ｎｇのマウス脾臓ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からクローニングした。一本鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、５０ｎｇのランダムヘキサマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ、Ｃａｒｉｓｂａｄ、ＣＡ）でプライムして合成した。マウスκ軽鎖定常領域ＤＮＡ配列（登録番号Ｚ３７４９９）を、プライマー５’ｍＣＬＫ１（Ｚ３７４９９）（５’−ＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣ−３’）および３’ｍＣＬＫ１（Ｚ３７４９９）（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧ−３’）を使用するＰＣＲによって、このｃＤＮＡから増幅した。マウスＩｇＧ２ａ定常領域ＤＮＡ配列（登録番号ＡＪ２９４７３８）もまた、プライマー５’ｍＣＨ２ａ（ＡＪ２９４７３８）（５’−ＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣ−３’）および３’ｍＣＨ２ａ（ＡＪ２９４７３８）（５’−ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＣＧ−３’）を使用するＰＣＲによって、このｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｉｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングし、そしてこの定常領域の配列を確認した。
【００８８】
ＫＤ５可変領域遺伝子を、ＫＤ５ハイブリドーマｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の重鎖および軽鎖可変領域プライマー混合物を使用して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローニングした。可変重鎖遺伝子を、プライマー５’ＢｓｐＭＩ／ＫＤ５ＶＨ  Ｎ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴ−３’）および３’ＢｓｐＭＩ／ＫＤ５ＶＨ  Ｃ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴ−３’）と共にテンプレートとしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングされた可変領域を使用するしてＰＣＲ増幅し、ＢｓｐＭＩで消化し、そしてＢｓａＩ消化した、プライマー５’ＢｓａＩ／ＣＨ２ａ  Ｎ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧ−３’）および３’ＢｓａＩ／ＣＨ２ａ  Ｃ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡ−３’）を用いて増幅したＩｇＧ２ａ定常重鎖遺伝子ＰＣＲフラグメントに連結した。次いで、このフラグメントを、ｐＲＧ８８２のＢｓｐＭＩ部位およびＮｏｔＩ部位に連結した。得られたプラスミドｐＴＥ３１７は、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター由来のｍＲＯＲ１シグナル配列に融合した、ＫＤ５組換え重鎖遺伝子を発現し得た。可変軽鎖遺伝子を、プライマー５’ＢｓｍＢＩ／ＫＤ５ＶＬ  Ｎ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＣＧＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’）および３’ＢｓｍＢＩ／ＫＤ５ＶＬ  Ｃ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＣＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ−３’）と共にテンプレートとしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングされた可変領域を使用してＰＣＲ増幅し、ＢｓｍＢＩで消化し、そしてＢｓａＩ消化した、プライマー５’ＢｓａＩ／ＣＬＫ  Ｎ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣ−３’）および３’ＢｓａＩ／ＣＬＫ  Ｃ−ｔｅｒｍ（５’−ＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣ−３’）で増幅したκ定常軽鎖遺伝子ＰＣＲフラグメントに連結した。次いで、このフラグメントを、ｐＲＧ８８２のＢｓｐＭＩ部位およびＮｏｔＩ部位に連結した。得られたプラスミドｐＴＥ３１６は、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターから、ｍＲＯＲ１シグナル配列に融合した、ＫＤ５組換え軽鎖遺伝子を発現し得た。
【００８９】
ＫＤ５重鎖遺伝子をコードする、ｐＴＥ３１７由来の１４５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＲＧ９８０（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与し、そしてＵｂＣプロモーターについての組換え遺伝子の発現を可能にするベクターである）のＥｃｏＲＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＴＥ３２２を得た。同様に、ＫＤ５軽鎖遺伝子をコードする、ｐＴＥ３１６由来の７５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＲＧ９８５（これは、プロマイシンに対する耐性を付与し、そしてＵｂＣプロモーターについての組換え遺伝子の発現を可能にするベクターである）のＥｃｏＲＩ部位およびＮｏｔＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＴＥ３２４を得た。
【００９０】
ＲＧＣ１０細胞（５×１０６）を、３μｇのｐＴＥ３２２および３μｇのｐＴＥ３２２でトランスフェクトし、そして２０μｇのプロマイシンおよび４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む、１０％ウシ胎仔血清を補充したＦ１２培地中で１４日間増殖させることによって、プラスミドの組込みについて選択した。ｈＦｃγＲＩの発現を、培養培地中に１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを添加することによって、３日間誘導した。二重耐性細胞を、ヤギポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）での染色の前に、１ｍｇ／ｍｌウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベートした。細胞を１時間染色し、次いでフローサイトメトリーで分析する前に、ＰＢＳで２回洗浄した。最も蛍光の細胞（上位５％）を、プールとして単離し、そして１０日間増殖させ、その後、このプロトコルを繰り返したが、上位１％の最も蛍光の細胞を、プールとして単離した。このプールを１０日間増殖させ、次いで上位０．１％の最も蛍光の細胞を、９６ウェルプレート中に、単一細胞として単離した。クローンを、抗体発現についてＥＬＩＳＡによって分析し、そして７個のクローンを、分析した５３個のクローンから選択した。これらのクローンの平均特異的生産性は、３５ｐｇ／細胞／日であり、最良のクローンは、５４ｐｇ／細胞／日で組換えＫＤ５モノクローナル抗体を発現した。
【００９１】
上記発明は、例示および例によっていくらか詳細に記載されてきたが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神からも範囲からも逸脱することなく、本発明の教示に対してなされ得ることが、当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、上流ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターからのヒトＦｃγＲＩの構成的発現のために設計された、ｐＴＥ０８４の構築を示す。
【図２】図２Ａは、非染色ＣＨＯ  Ｋ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図２Ｂは、ＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色ＣＨＯ  Ｋ１のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図２Ｃは、ｐＴＥ０８４トランスフェクション後のＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色Ｇ４１８耐性ＣＨＯ  Ｋ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図２Ｄは、ＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色ＲＧＣ３細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。
【図３】図３は、４ＳＣ６２２がＲＧＣ１細胞に結合するのをブロックするための、種々の動物種由来のＩｇＧの能力をまとめる。
【図４】図４Ａは、非染色ＲＧＣ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図４Ｂは、ＰＥ−ＡＧ１８４結合により示される、ＦｃγＲ１発現ＲＧＣ１細胞への４ＳＣ６２２結合のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図４Ｃは、ＰＥ−ＡＧ１８４結合の喪失により示される、ＲＧＣ１細胞への４ＳＣ６２２の結合をブロックするラットＩｇＧのフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。
【図５】図５Ａは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色された、ｈＦｃγＲＩ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を発現するＲＧＣ２細胞のフローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図５Ｂは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色される前に１μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２とともに１８時間インキュベートされた、ｈＦｃγＲＩ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を発現するＲＧＣ２細胞のフローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図５Ｃは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色された、ｈＦｃγＲＩ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を発現するＲＧＣ４細胞のフローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図５Ｄは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色される前に１８時間ラットＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともにインキュベートされた、ｈＦｃγＲＩ遺伝子および４ＳＣ６２２遺伝子を発現するＲＧＣ４細胞のフローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図５Ｅは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色される前に混合されそして一緒に１８時間インキュベートされた、ｈＦｃγＲＩ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を発現するＲＧＣ２細胞と、ｈＦｃγＲＩ遺伝子および４ＳＣ６２２遺伝子を発現するＲＧＣ４細胞との混合物の、フローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図５Ｆは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色される前に混合されそして一緒に１８時間１ｍｇ／ｍｌのラットＩｇＧとともにインキュベートされた、ｈＦｃγＲＩ遺伝子およびＧＦＰ遺伝子を発現するＲＧＣ２細胞と、ｈＦｃγＲＩ遺伝子および４ＳＣ６２２遺伝子を発現するＲＧＣ４細胞との混合物の、フローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。
【図６】図６は、ｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトされたＲＧＣ１細胞のＭＳＸ耐性プールのフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。トップ３％ゲート（Ｒ３）の細胞、７〜１１％ゲート（Ｒ５）の細胞、および１５〜１９％ゲート（Ｒ７）の細胞を、収集し、増殖させ、そしてその４ＳＣ６２２の生産性を免疫染色により定量した。
【図７】４ＳＣ６２２発現細胞株である、ｐＥＥ１４．１−６２２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１、ｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１の選択された安定なＭＳＸ耐性クローン、およびｐＥＥ１４．１−６２２でのＲＧＣ１細胞のトランスフェクション後のＭＳＸ耐性４ＳＣ６２２産生クローンの比生産性の比較をまとめる。
【図８】図８Ａは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色されたＲＧＣ１細胞のフローサイトメトリーの２パラメータヒストグラムを示す。図８Ｂは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色する前に１時間１μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２とともにインキュベートされた、ＲＧＣ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図８Ｃは、ＰＥ−ＡＧ１８４で染色する前に１時間１μｇ／ｍｌの４ＳＣ６２２とともにインキュベートされその後１８時間、４ＳＣ６２２を含まない培地中でインキュベートされたＲＧＣ１細胞の、フローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。
【図９】培養培地からの４ＳＣ６２２の損失を生じるｈＦｃγＲＩ遺伝子の発現を示す。ＲＧＣ１細胞またはＣＨＯ  Ｋ１親細胞が、２μｇ／ｍｌ  ４ＳＣ６２２を含む培地中でインキュベートされた。その培地中に残る４ＳＣ６２２の濃度が、２４時間インキュベーションおよび７２時間インキュベーションの後に、免疫染色により定量された。
【図１０】ヒトＦｃγＲＩのＴｅｔＲ調節発現を可能にするように設計された、ｐＴＥ１５８の構築を示す。ｔｅｔオペレーター配列（ＴｅｔＯ）の２回反復が、ｐＴＥ１５８中のＣＭＶプロモーターのすぐ下流に存在する。
【図１１】図１１Ａは、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色したＣＨＯ  Ｋ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図１１Ｂは、ＦＩＴＣで染色されたＲＧＣ１０細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図１１Ｃは、ＦＩＴＣ−ｈＦｃで染色される前に３日間１μｇ／ｍｌドキシサイクリンで誘導された、ＲＧＣ１０細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。
【図１２】図１２Ａは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色された、ＣＨＯ  Ｋ１細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図１２Ｂは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色される前に、ｐＥＥ１４．１−６２２でトランスフェクトされそして１８時間ラットＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともにインキュベートされた、ＭＳＸ耐性ＲＧＣ１０細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。図１２Ｃは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色される前に、１μｇ／ｍｌドキシサイクリンで３日間誘導されその後ラットＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートされた、ＭＳＸ耐性ＲＧＣ１０細胞のフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムを示す。
【図１３】図１３は、ｐＥＥ１４．１−６２２細胞でトランスフェクトされたＲＧＣ１０細胞の、安定なＭＳＸ耐性クローンの比生産性をまとめる。
【図１４】図１４は、上流ＭｏＭｕＳＶ  ＬＴＲプロモーターからのヒトＦｃγＲＩの構成的発現のために設計された、ｐＴＥ２５５の構築を示す。
【図１５】図１５Ａは、染色していないＳｐ２／０細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１５Ｂは、Ｃｙ５−ｈＦｃ染色したＳｐ２／０細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１５Ｃは、染色していないＳｐ２／０−ＦｃＲ−４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１５Ｄは、Ｃｙ５−ｈＦｃ染色したＳｐ２／０−ＦｃＲ−４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図１６】図１６は、上流のＣＭＶ  ＭＩＥプロモーターからの４ＳＣ６２２の構成的発現のために設計されたｐＴＥ２０９の構造を示す。
【図１７】図１７Ａは、ｐＴＥ２０９でトランスフェクトした、染色していないハイグロマイシンＢ耐性Ｓｐ２／０−ＦｃＲ−４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１７Ｂは、ｐＴＥ２０９でトランスフェクトし、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、ハイグロマイシンＢ耐性Ｓｐ２／０−ＦｃＲ−４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１７Ｃは、図４Ｂにおける上位１％の最も蛍光性の細胞から増殖した、染色していない細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１７Ｄは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、図４Ｂにおける上位１％の最も蛍光性の細胞から増殖した細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１７Ｅは、染色していないクローン５Ｈ１１細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。図１７Ｆは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、クローン５Ｈ１１細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図１８】図１８は、ｐＴＥ３００においてコードされた、プロテインＧおよびプロテインＧ／ｈＦｃγＲＩ融合タンパク質のドメインの模式図を示す。
【図１９】図１９は、上流のＣＭＶ  ＭＩＥプロモーターからの、ＲＯＲＩシグナル配列、プロテインＧのＦｃ結合ドメイン、ならびにｈＦｃγＲＩの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、キメラタンパク質の発現のために設計されたｐＴＥ３００の構築の概要である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、染色していないＲＧＣ１４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色したＲＧＣ１４細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ｐＴＥ３００でトランスフェクトした、染色していないＧ４１８耐性ＲＧＣ１４細胞プールのフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ｐＴＥ３００でトランスフェクトした、ＦＩＴＣ−ｈＦｃ染色したＧ４１８耐性ＲＧＣ１４細胞プールのフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、染色していないＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、１０％ウシ胎仔血清とともに２時間インキュベートした、ＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、ｐＴＥ２０９でのトランスフェクション後の、ＲＧＣ１８由来の、染色していないハイグロマイシンＢ耐性細胞プールのフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ｐＴＥ２０９でトランスフェクションし、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした後の、ＲＧＣ１８細胞由来のハイグロマイシンＢ耐性細胞プールのフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、染色していないＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした、ＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）およびウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした、ＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、ＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）とともに２時間インキュベートし、その後４ＳＣ６２２（１μｇ／ｍｌ）およびウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、ＲＧＣ１８細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、ｐＴＥ２０９でのトランスフェクションによるＲＧＣ１８細胞に由来する、染色していないＲＧＣ１９細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｇ】図２２Ｇは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色したＲＧＣ１９細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図２２Ｈ】図２２Ｈは、ポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで染色する前に、ウサギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに１８時間インキュベートした、ＲＧＣ１９細胞のフローサイトメトリーの１パラメーターヒストグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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