(57)【要約】本発明は、核酸、核酸を含むベクター、形質転換細胞、ジベレリン生合成の調節方法及びジベレリン生合成の調節を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２として示されるアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有するジベレリンＡ４デサチュラーゼ酵素をエンコードする遺伝子を含む単離された核酸。
【請求項２】
ジベレラ属の種から単離される請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ジベレラ属の種がジベレラ・フジコリである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１として示されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
配列番号１として示されるヌクレオチド配列の残基９８４〜２００９に対応するヌクレオチド配列を有する請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号２として示されるアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を有する単離されたジベレリンＡ４デサチュラーゼ酵素タンパク質。
【請求項７】
ジベレラ属の種から単離される請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ジベレラ属の種がジベレラ・フジコリである、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
形質転換された宿主細胞において組換えＤＮＡ技術によって製造される、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記宿主細胞が菌類である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記宿主細胞が細菌である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質として発現される請求項６に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項６に記載のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントであって、前記生物学的活性がジベレリンＡ４デサチュラーゼ活性であるフラグメント。
【請求項１５】
請求項６に記載のタンパク質の免疫原性フラグメント。
【請求項１６】
融合タンパク質として発現される請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１７】
融合タンパク質として発現される請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項６に記載のタンパク質に対して特異的な抗体。
【請求項１９】
ジベレリンＡ４デサチュラーゼをエンコードする核酸配列で、配列番号１として示される核酸の残基９８４〜２００９に対応する核酸配列を有する核酸を含む核酸ベクター。
【請求項２０】
核酸調節エレメントをさらに含む、請求項１９に記載の核酸ベクター。
【請求項２１】
前記調節エレメントがプロモーターである、請求項２０に記載の核酸ベクター。
【請求項２２】
形質転換された宿主細胞において複製し得る、請求項１９に記載の核酸ベクター。
【請求項２３】
前記宿主細胞が細菌である、請求項２２に記載の核酸ベクター。
【請求項２４】
前記宿主細胞が菌類である、請求項２３に記載の核酸ベクター。
【請求項２５】
前記宿主細胞が哺乳動物性である、請求項２４に記載の核酸ベクター。
【請求項２６】
選択マーカーをさらに含む、請求項１９に記載の核酸ベクター。
【請求項２７】
前記ベクターは形質選択宿主細胞のゲノム核酸との相同的組換えを行うことができ、その結果、前記ベクターに由来する外因性の核酸セグメントと、前記形質転換宿主細胞のゲノム核酸に由来する内因性の核酸セグメントとの交換が行われる、請求項１９に記載の核酸ベクター。
【請求項２８】
交換された核酸セグメントに選択マーカーをさらに含む、請求項２７に記載の核酸ベクター。
【請求項２９】
より大きい核酸の制限酵素切断フラグメントである、請求項２８に記載の核酸ベクター。
【請求項３０】
ベクターｐＯＲＦ３−ＧＲのＳａｌＩフラグメントである、請求項２９に記載の核酸ベクター。
【請求項３１】
前記ジベレリンＧＡ４デサチュラーゼをエンコードする核酸が破壊されている、請求項１９に記載の核酸ベクター。
【請求項３２】
前記破壊が点変異によるものである、請求項３１に記載の核酸ベクター。
【請求項３３】
前記破壊が、前記ジベレリンＧＡ４デサチュラーゼをエンコードする核酸のオープンリーディングフレームを変化させることによるものである、請求項３１に記載の核酸ベクター。
【請求項３４】
前記破壊が外因性核酸の挿入によるものである、請求項３３に記載の核酸ベクター。
【請求項３５】
前記外因性核酸が選択マーカーをエンコードする、請求項３４に記載の核酸ベクター。
【請求項３６】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項３５に記載の核酸ベクター。
【請求項３７】
ｐＯＲＦ３−ＧＲとして特定される、請求項３６に記載の核酸ベクター。
【請求項３８】
前記破壊が核酸の一部分の欠失によるものである、請求項３３に記載の核酸ベクター。
【請求項３９】
前記破壊が、阻害性調節エレメントを取り込むことによるものである、請求項３４に記載の核酸ベクター。
【請求項４０】
請求項１９に記載の核酸ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４１】
Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ２３として特定される、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ３３として特定される、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４３】
Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ５５として特定される、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４４】
破壊されたＰ４５０−３をエンコードする遺伝子をさらに含む、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４５】
前記破壊が、同様な条件のもとで野生型Ｐ４５０−３酵素と比較したとき、低下した酵素活性を有するＰ４５０−３酵素をもたらす、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
細菌細胞である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４７】
菌類細胞である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４８】
６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ１として特定される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ２として特定される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５０】
６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ８として特定される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項５１】
哺乳動物細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
ジベレリン産生細胞におけるジベレリン生合成を調節するための方法であって、請求項１９に記載の核酸ベクターで前記細胞を形質転換すること、および前記形質転換細胞をジベレリン産生条件のもとで培養することを含む方法。
【請求項５３】
前記細胞がＳ１（アクセション番号ＩＭＩ５８２８９）として特定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ジベレリン産生細胞が、破壊されたＰ４５０−３をエンコードする遺伝子をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記破壊が、同様な条件のもとで野生型Ｐ４５０−３酵素よりも低い活性を有するＰ４５０−３酵素の発現をもたらす点変異を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が６３１４として特定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
単離されたＧＡ４Ｄタンパク質の酵素活性の阻害剤を同定するための方法であって、ＧＡ４Ｄタンパク質の酵素活性に好適な条件のもとでＧＡ４Ｄタンパク質を候補阻害剤と接触させること、および前記酵素活性の何らかの低下を検出することを含む方法。
【請求項５８】
前記候補阻害剤が、小さい化学分子、複合体化合物、タンパク質および抗体からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
インビトロで行われる請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
細胞内で行われる請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
リポソーム内または赤血球ゴースト内で行われる請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５７に記載の方法によって同定される候補阻害剤。
【請求項６３】
化合物のコンビナトリアル化学ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される、請求項６２に記載の候補阻害剤。
【請求項６４】
請求項６２に記載の候補阻害剤に対応する阻害剤。
【請求項６５】
請求項５７に記載の方法によって同定される阻害剤。
【請求項６６】
請求項４０に記載の宿主細胞によって産生され得るジベレリンＡ１。
【請求項６７】
請求項４１に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ１。
【請求項６８】
請求項４２に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ１。
【請求項６９】
請求項４３に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ１。
【請求項７０】
請求項４０に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７１】
請求項４１に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７２】
請求項４２に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７３】
請求項４３に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７４】
請求項４８に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７５】
細胞が最適化培地において培養された、請求項７４に記載のジベレリンＡ４。
【請求項７６】
前記培地が、１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む、請求項７５に記載のジベレリンＡ４。
【請求項７７】
請求項４９に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項７８】
細胞が最適化培地において培養された、請求項７７に記載のジベレリンＡ４。
【請求項７９】
前記培地が、１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む、請求項７８に記載のジベレリンＡ４。
【請求項８０】
請求項５０に記載の宿主細胞によって産生されるジベレリンＡ４。
【請求項８１】
細胞が最適化培地において培養された、請求項８０に記載のジベレリンＡ４。
【請求項８２】
前記培地が、１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む、請求項８１に記載のジベレリンＡ４。
【請求項８３】
請求項５２に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ１。
【請求項８４】
請求項５５に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ１。
【請求項８５】
請求項５６に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ１。
【請求項８６】
請求項５２に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ４。
【請求項８７】
請求項５５に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ４。
【請求項８８】
請求項５６に記載の方法により作製される宿主細胞によって産生される単離されたジベレリンＡ４。
【請求項８９】
細胞が最適化培地において培養された、請求項８８に記載のジベレリンＡ４。
【請求項９０】
前記培地が、１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む、請求項８９に記載のジベレリンＡ４。
【請求項９１】
１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む培養培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、新規な核酸および組換えＤＮＡ技術、ジベレリン生合成の調節、ならびに生合成酵素の阻害剤の同定を使用する形質転換細胞からのジベレリン製造の分野に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ジベレリン（ＧＡ）はイソプレノイド植物ホルモンの大きいファミリーであり、そのいくつかは、種子発芽、茎伸長および開花を制御する生物活性な成長調節因子である。イネ病原体であるジベレラ・フジクロイ（イネ馬鹿苗病菌）（接合性集団Ｃ）は、多量の様々なＧＡを産生することができ、特に、生物活性な化合物であるジベレリン酸（ＧＡ３）ならびにその前駆体のジベレリンＡ４（ＧＡ４）およびジベレリンＡ７（ＧＡ７）を産生することができる（Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，Ｂ．１９９９、「ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成：生分子的局面」、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２（３）：２９８〜３１０）。ジベレリンの病原性作用の１つは、ジベレラ・フジクロイのジベレリン産生がイネの超伸長（馬鹿苗）病を誘導するということである。
【０００３】
子嚢菌系菌類のジベレラ・フジクロイにおけるＧＡ３のジベレリン生合成経路には、ＧＡ３が主生成物として最終的に生じる前に、前駆体のジベレリンＡ１４（ＧＡ１４）が中間体のＧＡ４に変換され、次いでＧＡ７に変換されることが含まれる。ＧＡ４のジベレリンＡ１（ＧＡ１）への別の変換に由来する二次的な副生成物もまた同時に生じる。
【０００４】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）はイソプレノイド経路の最初の特異的な酵素であり、必須ステロールおよびキノンの生合成ならびにジベレリンなどの二次代謝産物に必要な前駆体であるメバロン酸の産生に関与している。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの構造遺伝子がジベレラ・フジクロイから単離され、特徴づけられた（Ｗｏｉｔｅｋ，Ｓ．他、１９９７、「ジベレラ・フジクロイの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子：単離および特徴づけ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３１（１）：３８〜４７）。
【０００５】
ジベレリンは、イソプレノイド生合成経路によって合成されるジテルペノイド化合物である。ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＤＳ）はイソプレノイド生合成における重要な酵素である。ＧＧＤＳ酵素により、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）が生じる。ジベレラ・フジクロイのＧＧＤＳ遺伝子が単離され、ファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子に連鎖しない単一コピー遺伝子として特徴づけられた（Ｍｅｎｄｅ，Ｋ．他、１９９７、「ジベレラ・フジクロイのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子：単離および発現」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５５（１）：９６〜１０５）。
【０００６】
ジベレリン経路の最初の遺伝子は、ジベレリン経路がゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）において一般的なイソプレノイド生合成経路から分岐するので、ジベレリン経路の最初の特異的な段階を触媒するテルペンシクラーゼであるコパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＤＳ）遺伝子である。この遺伝子はジベレラ・フジクロイから単離され、他の知られている植物ＣＰＳとの比較によって特徴づけられた。ジベレラ・フジクロイのＣＰＤＳは、最適化されたジベレリン生合成の条件下では非常に高められるが、多量のアンモニアが培地に存在するときには低下する（Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，Ｂ．、１９９８、「ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成：コパリル二リン酸シンターゼ遺伝子のクローニングおよび特徴づけ」、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３４（３）：２３４〜２４０）。
【０００７】
ジベレラ・フジクロイｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルスクリーニングを使用して、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼの保存されたヘム結合モチーフを有する遺伝子がクローン化され、同定された。相同的なプローブを用いたゲノムライブラリーのその後のスクリーニングにより、別の遺伝子が最初の遺伝子に密接に連鎖することが明らかにされた。さらなる染色体ウォーキングにより、仮想的なＧＧＤＳ遺伝子、ＣＰＤＳ遺伝子、そして３番目のＰ４５０遺伝子が突き止められた。ジベレラ・フジクロイのＰ４５０−１およびＰ４５０−２およびＰ４５０−３の遺伝子産物、１３−ヒドロキラーゼは、すべてがジベレリン酸生合成経路に関係した（Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，Ｂ．、Ｈｏｌｔｅｒ，Ｋ．、１９９８、「ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成経路：遺伝子クラスターの証拠」、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２５（３）：１５７〜７０）。
【０００８】
現在、ジベレリンを得る最も一般的な方法では、ジベレラ・フジクロイに主に由来する細胞培養物から精製することによる単離が用いられている。培養培地、反応条件またはジベレリン収量における改善が、ジベレリンを大量に経済的かつ商業的に製造するためには望ましく、かつ有用である。
【０００９】
この目的のために、アンモニウムおよび硝酸塩が、ジベレリン製造に対する阻害剤として同定されている（Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，Ｂ．他、１９９９、「ジベレラ・フジクロイのａｒｅＡ窒素調節遺伝子の単離、特徴づけおよび破壊」；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．他、１９９７、「ジベレラ・フジクロイにおける硝酸塩によるジベレリン生合成の阻害」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４１３（１）：３５〜９）。通気を大きくすることは増殖を増大させ、そしてビカベリンおよびジベレリンの産生を増大させることが報告された（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｗ．、Ｄｏｍｅｎｅｃｈ，ＣＥ．、１９９９、「通気はジベレラ・フジクロイにおける酢酸塩の行き先を変化させる」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８０（１）：１１１〜６）。流動床バイオリアクターの使用は、液中発酵装置および固体発酵装置について報告されているよりも３倍大きいジベレリン酸産生をもたらすことが報告されていた。ｐＨおよび温度の影響もまた、炭素対窒素比と同様に研究された（Ｅｓｃａｍｉｌｌａ，ＥＭ．他、２０００、「流動床バイオリアクターにおける固定化ジベレラ・フジクロイ菌糸によるジベレリン酸製造の最適化」、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６（２−３）：１４７〜５５）。
【００１０】
新しく有用な方法、構築物、細胞、生成合成経路の新しい酵素成分の同定、および組換え核酸を利用する生合成経路の遺伝学的操作が、本発明によって教示される。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、ジベレリン生合成経路に関与する酵素をエンコードする本明細書中ではｏｒｆ３と呼ばれる新しい遺伝子を提供する。このｏｒｆ３遺伝子の産物は、二重結合をＧＡ４の炭素原子１と炭素原子２との間に導入することによってＧＡ４をＧＡ７に変換する酵素（図１）であり、本明細書中ではＧＡ４デサチュラーゼ（ＧＡ４Ｄ）と呼ばれる。「ＧＡ４デサチュラーゼ」および「ジベレリンＡ４デサチュラーゼ」は以降、均等な用語として見なされることを理解しなければならない。
【００１２】
本発明は、配列番号１として示される核酸配列（図２）に対応するヌクレオチド配列を有する単離された核酸を提供する。従って、本発明には、配列番号１として図２に示される核酸配列のタンパク質コードドメインセグメント（ＣＤＳ）に対応するヌクレオチド配列を含む単離された核酸が包含される。具体的には、本発明は、図２に核酸残基１〜１０２６として示される核酸配列（配列番号１に示される核酸配列の核酸残基９８４〜２００９（２００９を含む））に対応するヌクレオチド配列を有する単離された核酸を提供する。従って、本発明には、配列番号１として示されるヌクレオチド配列の残基９８４〜２００９として示されるヌクレオチド配列を有する核酸が包含される。
【００１３】
本発明はまたＧＡ４Ｄタンパク質を提供する。好ましい実施形態において、ＧＡ４Ｄタンパク質は本発明の核酸によってエンコードされる。従って、本発明には、配列番号２として示されるアミノ酸残基配列（図２）に対応するアミノ酸残基配列を含むタンパク質が包含される。具体的には、本発明には、配列番号２として示されるアミノ酸残基配列（図２）に対応するアミノ酸配列を有する３４２アミノ酸長のタンパク質が包含される。本発明のＧＡ４Ｄには、配列番号２として示される完全なアミノ酸配列よりも短いが、完全なタンパク質のＧＡ４デサチュラーゼ酵素活性の少なくとも一部を依然として保持する、ＧＡ４Ｄタンパク質の生物学的に活性なフラグメントが包含されることもまた考えられる。
【００１４】
本発明には、本発明のＧＡ４Ｄタンパク質を１つ以上の他のポリペプチドまたはタンパク質と組み合わせる融合タンパク質が包含される。他のポリペプチドまたはタンパク質には、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質などの、融合タンパク質産物を可視化するための様々なマーカータンパク質（これらに限定されない）を挙げることができる。他のポリペプチドまたはタンパク質にはまた、融合タンパク質産物の単離に有用なポリペプチドまたはタンパク質（これらに限定されない）を挙げることができ、例えば、ビオチン／アビジン、プロテインＡまたは他の免疫結合体、ラミニン結合ドメインなど（これらに限定されない）を挙げることができる。
【００１５】
本発明はまた、本発明の核酸の少なくとも一部を含む核酸ベクターまたは構築物を提供する。
具体的には、本発明は、本発明の無傷の発現可能な核酸を調節核酸配列と機能的に連結する核酸ベクターを提供する。
【００１６】
本発明にはまた、破壊されたｏｒｆ３遺伝子を含む核酸ベクターも包含される。
あるいは、本発明の核酸ベクターは、得られるタンパク質の酵素活性に負の影響を及ぼすコード配列内の変異を含有するｏｒｆ３遺伝子、または得られるタンパク質の発現に負の影響を及ぼすコード配列内の変異を含有するｏｒｆ３遺伝子などを含むことができる。
【００１７】
従って、本発明は、阻害されたＧＡ４Ｄタンパク質を発現する核酸ベクター、またはＧＡ４Ｄタンパク質の阻害された発現を示す核酸ベクターを包含する。
阻害されたＧＡ４Ｄタンパク質によって、ＧＡ４Ｄタンパク質が、類似する培養条件のもとで比較されたとき、野生型タンパク質の活性の約５０％未満を有することが意味される。
【００１８】
ＧＡ４Ｄタンパク質の阻害された発現によって、ＧＡ４Ｄタンパク質が、類似する培養条件のもとで比較されたとき、阻害されていないＧＡ４Ｄを発現する細胞において見出される量の約５０％未満の量で発現することが意味される。
【００１９】
本発明は、細胞のジベレリン生合成経路を選択的に改変する方法で、内因性ｏｒｆ３遺伝子の発現を調節することを含む方法を提供する。そのような調節のために使用される方法および核酸構築物は、所望する効果によって決定される。
【００２０】
第１の事例では、本発明は、所望する調節が、ＧＡ４Ｄタンパク質のより大きい産生をもたらし、従って増大したＧＡ７産生をもたらすｏｒｆ３遺伝子発現の増大である方法を提供する。そのような調節は、無傷のＧＡ４Ｄタンパク質を発現し得る本発明の核酸ベクターで標的細胞をトランスフェクションすることによって達成することができる。増大したｏｒｆ３遺伝子発現は、多数コピーの遺伝子を標的細胞にこのような様式で導入することによって達成することができる。遺伝子発現のさらなる増大は、より高活性なプロモーターまたは他のそのような調節エレメントを使用することによって達成することができる。
【００２１】
別の事例では、本発明は、所望する調節が、ＧＡ４Ｄタンパク質の少ない産生または非産生をもたらし、従って低下したＧＡ７産生および増大したＧＡ４Ｄ蓄積をもたらすｏｒｆ３遺伝子発現の低下である方法を提供する。そのような調節は、相同的組換えによってｏｒｆ３遺伝子を破壊し得る本発明の核酸ベクターで標的細胞をトランスフェクションすることによって達成することができる。この方法では、標的細胞の内因性の無傷の遺伝子は、そのすべてではないが、そのほとんどが、トランスフェクションされた核酸ベクターに由来する破棄されたｏｒｆ３遺伝子で置換される。
【００２２】
本発明はまた、所望する調節が、標的の形質転換細胞における低下したＧＡ４Ｄタンパク質活性をもたらし、従って低下したＧＡ７産生および増大したＧＡ４蓄積をもたらす阻害されたＧＡ４Ｄタンパク質の発現である方法を提供する。そのような調節は、阻害されたＧＡ４Ｄタンパク質をエンコードするｏｒｆ３遺伝子を含む本発明の核酸ベクターで標的細胞を相同的組換えによりトランスフェクションすることによって達成することができる。この方法では、標的細胞の内因性の無傷の遺伝子は、そのすべてではないが、そのほとんどが、トランスフェクションされた核酸ベクターに由来するｏｒｆ３遺伝子で置換される。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明は、前駆体分子のその後の生成物への酵素的変換を低下させるために、またはそのような酵素的変換を阻止するためにジベレリン生合成経路を操作することによって、ジベレリンの産生および特にＧＡ４またはＧＡ７またはＧＡ３の量を調節する方法を提供する。具体的には、本発明には、ジベレリン産生細胞におけるｏｒｆ３遺伝子の破壊または欠失を含む調節方法が包含される。最も好ましい実施形態において、本発明には、ジベレリン産生細胞における、外因性の破壊されたｏｒｆ３遺伝子との置換による内因性ｏｒｆ３遺伝子の破壊または欠失を含む調節方法が包含される。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態において、本発明には、破壊または阻害されたＰ４５０−３遺伝子を有するジベレリン産生細胞におけるｏｒｆ３遺伝子の破壊または欠失を含む調節方法が包含される。Ｐ４５０−３遺伝子の発現を破壊したとき、ＧＡ４からＧＡ１への１３−ヒドロキシル化およびＧＡ７からＧＡ３への１３−ヒドロキシル化に対する破壊が生じ、ＧＡ７の増大した産生がもたらされた。ｏｒｆ３遺伝子における変異を変異させたＰ４５０−３遺伝子と組み合わせることにより、ＧＡ４産生が増大した。
【００２５】
最も好ましい実施形態においては、本発明には、破壊または阻害されたＰ４５０−３遺伝子を有するジベレリン産生細胞における、外因性の破壊されたｏｒｆ３遺伝子との置換による内因性ｏｒｆ３遺伝子の破壊または欠失を含む調節方法が包含される。
【００２６】
ある局面では、破壊または阻害されたＰ４５０−３遺伝子は、１３−ヒドロキシラーゼをエンコードする遺伝子が、類似する条件のもとでの野生型ジベレリン産生細胞の場合よりも低いレベルで発現する場合の遺伝子である。さらに、破壊または阻害されたＰ４５０−３遺伝子は、その遺伝子が、類似する条件のもとで野生型Ｐ４５０−３酵素の場合よりも低い酵素活性を有する改変されたＰ４５０−３タンパク質を発現する場合の遺伝子であり得る。ｏｒｆ３に関して議論されたように、破壊されたＰ４５０−３遺伝子は、機能的なＰ４５０−３タンパク質の発現性または得られるタンパク質の酵素活性を変化させる単一点変異、多数の点変異、挿入または欠失のような核酸コード配列の変異を含むことができる。
【００２７】
本発明は、破壊されたＧＡ４Ｄタンパク質の発現を細胞が有するように、内因性のｏｒｆ３遺伝子を破壊することによってＧＡ４の産生を増大させるために改変された形質転換細胞を提供する。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも１つのさらなる発現可能なｏｒｆ３遺伝子でのトランスフェクションによりＧＡ７の増大した産生のために改変された形質転換細胞を提供する。本発明のこのような方法において使用される好適な細胞は、内因性ジベレリンを産生する細胞であるか、またはジベレリンを産生させるために不可欠なタンパク質をエンコードする別の遺伝子で形質転換された細胞である。好適な細胞は細菌または菌類または哺乳動物性であり得る。ジベレリン産生細胞は菌類細胞であることが好ましい。ある好ましい実施形態においては、ジベレリン産生細胞はジベレラ・フジコリ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｏｒｉ）由来の細胞である。好ましい実施形態において、細胞は、Ｓ１（ＩＭＩ５８２８９）、６３１４、６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ１、６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ２、６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ８、Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ２３、Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ３３またはＳ１Δｏｒｆ３−Ｔ５５として特定される細胞菌株に由来する。
【００２９】
同様に、本発明はまた、より多くのＧＡ４Ｄタンパク質が発現されるように、より高活性な調節核酸配列によって調節されるｏｒｆ３遺伝子でのトランスフェクションによりＧＡ７の増大した産生のために改変された形質転換細胞を提供する。本発明はまた、内因性ｏｒｆ３遺伝子が、より多くのＧＡ４Ｄタンパク質が発現されるように、より高活性な調節核酸配列での調節によるＧＡ４Ｄの増大した産生のために改変されたｏｒｆ３遺伝子によって全体または一部が置換されている形質転換細胞を提供する。この場合、そのような置換は、トランスフェクションされたベクターとの相同的組換えによるものであり、そのためより多くのＧＡ４Ｄタンパク質が発現する。
【００３０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、細胞の内因性のｏｒｆ３遺伝子を破壊することによりＧＡ４Ｄの増大した産生のために改変された形質転換細胞を提供する。好ましい方法のある実施形態では、内因性遺伝子の破壊は、トランスフェクションベクターの外因性の破壊された遺伝子による内因性遺伝子の置換がもたらされる、破壊されたｏｒｆ３遺伝子を有するトランスフェクションベクターとの相同的組換えによって達成される。
【００３１】
最も好ましい実施形態において、本発明は、破壊されたｏｒｆ３遺伝子および破壊されたＰ４５０−３遺伝子を含むジベレリン産生細胞を提供する。
本発明の構築物および形質転換細胞により、ジベレリン生合成の調節因子に関する検出方法、特徴づける方法およびスクリーニング方法が、インシトゥー、インビトロおよびインンビボで可能になる。
【００３２】
本発明は、ＧＡ４Ｄタンパク質活性の化学的阻害剤を検出するための単離されたＧＡ４Ｄタンパク質の使用を提供する。化学的阻害剤は、小さい化学分子、複合体化合物、タンパク質、抗体などであり得る。
【００３３】
ＧＡ４Ｄタンパク質を使用して、ＧＡ４Ｄ酵素活性の阻害について候補物質をスクリーニングする様々な方法を、インビボ細胞アッセイとして、あるいはリポソームもしくは赤血球ゴーストなどの脂質二重層反応容器、および／または拡大・縮小した反応チャンバーなどを利用するインビトロ無細胞アッセイとして行うことができる。そのような方法により、ＧＡ４Ｄ酵素活性の阻害剤の同定が可能になる。
【００３４】
本発明の形質転換細胞は、ｏｒｆ３遺伝子活性の存在下または非存在下でのジベレリン生合成の調節因子に関するスクリーニングを可能にする。
本発明の方法は、ＧＡ４Ｄの生物学的活性（すなわち、ジベレリンＧＡ４デサチュラーゼ酵素の生物学的活性）を調節する能力について候補物質のスクリーニングを可能にする。
【００３５】
従って、ＧＡ４Ｄ酵素活性の阻害剤として同定された化学物質を特徴づけることができ、そして選択することができる。そのような方法は、化合物のコンビナトリアル化学ライブラリーのスクリーニングのために、そして化学物質の好適なＧＡ４Ｄ阻害プールを同定するためのこれらの化合物の混合物の繰り返される連続限界スクリーニングのために容易に適合化することができる。従って、本発明はまた、そのようなスクリーニング方法により同定される化学物質、またはそのようなスクリーニング方法により同定され得る化学物質、またはそのようなスクリーニング方法により同定される化学物質に対応する化学物質を提供する。
【００３６】
本発明のさらなる局面には、請求項に記載される発明の細胞によって産生される特定のジベレリン、または請求項に記載される発明の形質転換方法によって作製される細胞によって産生される特定のジベレリンが包含される。具体的には、本発明には、本発明の細胞から単離されるか、またはジベレリン産生を調節するために本発明の方法によって形質転換された細胞によるジベレリンＡ１、ジベレリンＡ４およびジベレリンＡ７が包含される。ジベレリンタンパク質は、この分野で知られている方法を使用してジベレリン産生細胞から単離および精製することができる。
【００３７】
本発明はまた、ジベレラ・フジコリの培地においてジベレリンを製造するための最適化されたジベレリン製造用培養培地を提供する。この場合、前記培地は、１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地を含む。
（発明の詳細な説明）
本発明およびその実施形態は、図面を参照してさらによく理解される。
【００３８】
本発明は、ジベレリンを通常的に産生する細胞におけるジベレリンの産生を、細胞内のジベレリン生合成経路を操作することによって調節するための核酸および方法を提供する。関連する実施形態において、本発明は、核酸ベクター、およびジベレリン産生の調節のためにそのようなベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３９】
本明細書中および上記において使用されるように、用語「調節核酸配列」は、発現可能な核酸の発現を調節する核酸配列を包含することが意味される。そのような調節核酸配列には、エンハンサー、プロモーター、プロモーター結合配列など（これらに限定されない）が含まれる。この場合、調節は誘導的または構成的のいずれかであり得る。
【００４０】
「機能的に連結する」により、核酸の発現が調節核酸配列の作動によって制御されるように、発現可能な核酸の読み枠が調節核酸配列の機能と対応していることが意味される。
【００４１】
「無傷の発現可能な」により、本発明の核酸が発現し、機能的なＧＡ４Ｄタンパク質またはそのフラグメントをもたらし得ることが意味される。
「破壊された」遺伝子は、コードドメインセグメントのオープンリーディングフレームが変化している本発明の核酸を含む。例えば、そしてそれにより限定されないが、破壊された遺伝子は、核酸残基の欠失を含有し、かつ／または核酸残基の挿入、もしくは発現したタンパク質の酵素活性に負の影響を及ぼす点変異を含有するように変化している。従って、破壊された遺伝子は、発現可能なタンパク質を生じさせることができず、あるいは阻害された酵素または不活性な酵素またはそれらのフラグメントの発現を生じさせることができる。
【００４２】
一般に、組換えＤＮＡ技術を使用する核酸の操作およびベクター製造のために本明細書中で使用されているような技術はこの分野では十分に知られている。記載された基本的な分子生物学的操作を行うための方法および材料の多くはこの分野では知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ他、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（１９８６）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）；Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１）；Ｇｕｔｈｒｉｅ他、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ他、ＰＣＲ  第１巻、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ他、ＰＣＲ  第２巻、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．他、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）のような参考文献に見出すことができる。
【００４３】
本出願において使用されている分類学的または命名法的な用語「ジベレラ・フジコリ」には、この分野のどこかで使用され得るようなすべての変化体または等価な命名法的用語が包含されることを理解しなければならない。代替的な命名法的用語を含むジベレラ・フジコリ種群の総説は、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ他、１９９８、「ジベレラ・フジクロイ種群の分子分類学および系統地理学」、Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ、９０（３）、４６５〜４９３に見出される（この総説は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００４４】
ジベレリン産生の調節
図１に示されるジベレリン生合成経路を参照すると、ｏｒｆ３遺伝子の単離および特徴づけにより、ＧＡ４またはＧＡ７などの特定のジベレリン中間体の操作および選択的な増大した産生が、通常の主要な最終生成物ＧＡ３の産生を犠牲にして可能になる。
【００４５】
図１から理解され得るように、ＧＡ４とＧＡ１（マイナーな最終生成物）との間の酵素的段階はＰ４５０−３遺伝子産物の活性により調節される。ＧＡ７と主要な最終生成物ＧＡ３との間の酵素的段階もまた、ＧＡ７およびＧＡ４の両方の１３−ヒドロキシル化を触媒するＰ４５０−３遺伝子産物の活性により調節される。
【００４６】
ｏｒｆ３調節段階における生合成経路の遮断、すなわち、ＧＡ４Ｄ活性の破壊は、ＧＡ４およびマイナーな最終生成物ＧＡ１の蓄積をもたらす。Ｐ４５０−３により調節されるＧＡ４からＧＡ１への変換の遮断と一緒になったｏｒｆ３調節段階の遮断は、ＧＡ１の産生を犠牲にして、ＧＡ４の収量をさらに増大させる。
【００４７】
Ｐ４５０−３により調節される細胞内の変換の遮断は、ｏｒｆ３の遮断が存在しないときには、ＧＡ１およびＧＡ３の両方の産生が阻害されるので、ＧＡ７の蓄積をもたらす。
【００４８】
野生型細胞におけるｏｒｆ３で調節されるジベレリン生合成段階の遮断
ＧＡ３を産生する野生型のジベレラ・フジクロイのＳ１株（アクセション番号ＩＭＩ５８２８９、ＩＭＩ、Ｅｇｈａｍ、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）を入手して、ｏｒｆ３遺伝子を破壊されたｏｒｆ３で置換した。形質転換体から、さらなる特徴づけのために、３つの菌株を選択し、単離して、２０％ＩＣＩ培地で１０日間培養した。Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ２３、Ｓ１Δｏｒｆ３−Ｔ３３およびＳ１Δｏｒｆ３−Ｔ５５。
【００４９】
下記の表１には、単離されたｏｒｆ３破壊Ｓ１株のジベレリン産生に対する分析結果が記載される。データは、特定のジベレリン生成物のｍｇ／Ｌとして報告される。
【００５０】
【表１】
2004517625.tif 000002
【００５１】
従って、ｏｒｆ３調節段階の遮断は形質転換細胞におけるＧＡ１およびＧＡ４の蓄積をもたらす。
【００５２】
Ｐ４５０−３点変異細胞におけるｏｒｆ３調節されるジベレリン生合成段階の遮断
ＧＡ３を産生する野生型のジベレラ・フジクロイのｍ５６７株（Ｆｕｎｇａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｗｅｉｍａｒ、ドイツ）を入手し、これにＵＶ照射を行った。処理された細胞を、欠損したＰ４５０−３活性についてスクリーニングし、選択した。単離菌株６３１４は、発現酵素に低い酵素活性をもたらす点変異をＰ４５０−３遺伝子に有する。従って、菌株６３１４の細胞は、Ｐ４５０−３により調節されるジベレリン生合成段階が阻害されるために多量のＧＡ７を産生する（約１０００ｍｇ／ＬまでのＧＡ７および約５％〜１０％にすぎないＧＡ３）。
【００５３】
菌株６３１４の細胞を用いて、内因性のｏｒｆ３遺伝子を、Ｓ１細胞の場合のように、置換ベクターを使用して破壊されたｏｒｆ３で置換した。形質転換体から、さらなる特徴づけのために、３つの菌株を選択し、単離して、２０％ＩＣＩ培地で１０日間培養した。６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ１、６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ２および６３１４Δｏｒｆ３−Ｔ８。
【００５４】
下記の表２には、単離されたｏｒｆ３破壊菌株６３１４のジベレリン産生に対する分析結果が記載される。データは、特定のジベレリン生成物のｍｇ／Ｌとして報告される。
【００５５】
【表２】
2004517625.tif 000003
【００５６】
従って、Ｐ４５０−３調節段階の阻害と一緒になったｏｒｆ３調節段階の遮断は、選択された形質転換細胞におけるＧＡ１およびＧＡ４、また主としてＧＡ４、の蓄積をもたらす。
【００５７】
形質転換細胞からのＧＡ４産生の最適化
培養培地の改変を、ジベレリンの産生を最適化するために試みた。１５ｇ／Ｌのコーンスチープ固体、１．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６０ｇ／Ｌのヒマワリ油および１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含有する植物油培地が最も良い結果をもたらすことが見出された。
従って、適切なジベレリン産生条件下での本発明の形質転換細胞の培養は、培養培地をさらに操作することによって最適化することができる。
【００５８】
下記の表３には、ｍｇ／Ｌ単位でのジベレリン収量に関して、最適化培地を使用した結果がまとめられている。データは、比較的純粋な単離されたジベレリンＧＡ４が、破壊されたｏｒｆ３遺伝子で形質転換され、かつ低い活性のＰ４５０−３を有する細胞から、最適化された培養条件のもとで製造および単離され得ることを示している。
【００５９】
【表３】
2004517625.tif 000004
【００６０】
置換ベクターの構築
ジベレリンデサチュラーゼ（ＧＡ４Ｄ）をエンコードするｏｒｆ３遺伝子を破壊するために、遺伝子置換ベクターを構築した。
【００６１】
図３に図示されるように、ｏｒｆ３とＰ４５０−３の一部（これはｏｒｆ３の右側に位置する）とをエンコードする核酸セグメントをベクターｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．、Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．、１９８５、Ｇｅｎｅ、３３：１０３〜１１９）にクローン化した。この新しいベクターはｐＯＲＦ３−ＧＲと呼ばれる。内部のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメントを、ベクターｐＧＰＣ１（Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ  ＡＥ他、１９９２、「ジベレラ・プリカリス（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｐｕｌｉｃａｒｉｓ［フザリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）］）によるセスキテルペンフィトアレキシンの解毒およびジャガイモ塊茎における毒性に対するその重要性」、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：２０１〜２１１）に由来するヒグロマイシン耐性カセットによって置換した。この抗生物質耐性カーカーの挿入により、ｏｒｆ３遺伝子のオープンリーディングフレームの破壊が生じ、同時に、成功した形質転換体に対するスクリーニング用の選択マーカーが提供される。
【００６２】
変異したｏｒｆ３遺伝子（ｐＯＲＦ３−ＧＲ由来）を有するＳａｌＩフラグメントをジベレラ属の菌株Ｓ１および菌株６３１４に形質転換した。この制限酵素切断フラグメントは、破壊されたｏｒｆ３遺伝子および挿入された抗生物質耐性マーカーを含む。他の様々な好適な菌類用選択マーカー（例えば、フレオマイシン、ベノミル、ヌルセオトリシンおよびＢＡＳＴＡ（グルホシナート）など）がこの分野では知られており、これらは、本明細書中の実施例により例示される具体的なヒグロマイシン抗生物質耐性カセットの代わりに使用することができる。
【００６３】
抗生物質支配下での拡大培養および選択の後、１００個のヒグロマイシン耐性形質転換体を単離して、破壊されたｏｒｆ３遺伝子の相同的組み込みについてサザンブロット分析によって分析した。選択された形質転換体は、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによってｏｒｆ３活性の喪失について選択された。
【００６４】
図４には、ジベレリン産生菌類からのタンパク質産生の典型的なサザンブロット分析の結果が図示される。野生型Ｓ１（ＩＭＩ５８２８９）、ｏｒｆ３が破壊された形質転換Ｓ１のＳ１−Ｔ２３株およびＳ１−Ｔ５５株、Ｐ４５０−３阻害株６３１４、ｏｒｆ３が破壊された形質転換６３１４の６３１４−Ｔ２株および６３１４−Ｔ８株が示される。ｏｒｆ３が破壊された遺伝子のすべてにおいて、ｏｒｆ３遺伝子の野生型コピーに対応する約７ｋｂのバンドが失われている。
【００６５】
すべての菌株が、単一胞子単離およびジベレリン産生培地（２０％ＩＣＩ）での培養によって純化された。ジベレリンの様々な化学種の産生を、タンパク質生成物のＧＡスペクトルについてＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによってモニターすることができる。図５には、野生型ｍ５６７（上段）、変異体６３１４（中段）および形質転換された６３１４のｏｒｆ３破壊株（下段）を示す代表的なＨＰＬＣ−クロマトグラムが示される。ピークは、示された矢印により同定される
ジベレラ・フジクロイの形質転換
プロトプラストの調製
０．８％ＮａＣｌ溶液において安定化剤として下記の酵素を添加した：１％カタツムリ酵素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．５％ノボザイム２３４（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、０．１％ドリセラーゼ（Ｓｉｇｍａ）および０．１％リチカーゼ（Ｓｉｇｍａ）。この酵素液を遠心分離し、上清をろ過滅菌した。
【００６６】
菌類をＣＭ培地において１６時間〜１８時間、一晩成長させ、そしてろ過し、０．８％ＮａＣｌで洗浄した菌糸の約０．５ｇを、１０ｍｌの酵素液で、３０℃において攪拌器（１００ｒｐｍ）で２時間〜３時間インキュベーションした。プロトプラストを、ガラスフィルター（Ｇ２）でのろ過によって菌糸から分離して、０．８％ＮａＣｌで洗浄し、その後、０．５ｍｌ〜１．０ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１．３Ｍソルビトール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁した。菌類の約１０７個のプロトプラスト（５０μｌ）が約１０μｇの調製された形質転換ベクターで形質転換された。
【００６７】
形質転換
５０μｌのプロトプラストを約５ｘ１０８個／ｍｌの濃度でＳＴＣ緩衝液に含有する混合物に、１０μｇのＤＮＡ形質転換ベクター（変異ｏｒｆ３およびヒグロマイシン耐性選択マーカーカセットを含有する２．７ｋｂのＳａｌＩフラグメント）および５０μｌのポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ溶液、２５％ＰＥＧ６０００／ＳＴＣ）を加えた。この形質転換混合物を氷上で２５分間インキュベーションし、その後、さらに２ｍｌのＰＥＧ溶液を加えた。混合物を混合して、室温で１０分間保ち、その後、４ｍｌのＳＴＣ緩衝液を加えた。その後、この形質転換混合物を、１２５μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ、ドイツ）を含有する１００ｍｌの液化再生培地（０．０５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、０．７Ｍスクロースおよび２％寒天）に加えた。
【００６８】
個々の形質転換体が２８℃での約３日間〜４日間のインキュベーションの後に現れた。選択された形質転換体を、１２５μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢが補充されたＣＭ寒天に移した。さらなる純化および単離のために、単一ミクロ分生子コロニーを単離して、再びヒグロマイシン耐性について試験した。
【００６９】
ブダペスト条約に基づく生物学的寄託
下記の具体的な菌株は、ブダペスト条約に基づき、国際寄託局のカナダ保健省微生物学局（ＢＭＨＣ）（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ、Ｒｏｏｍ  Ｈ５１９０、１０１５  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、カナダ  Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２）に寄託されている。
【００７０】
【表４】
2004517625.tif 000005
【００７１】
本発明は、ジベレリン生合成を調節するための核酸、核酸含有ベクター、形質転換細胞、方法、そして形質転換細胞の培養物からの制御されたジベレリン製造のために新規かつ有用であるジベレリン生合成の調節因子を同定するための方法を提供する。
【００７２】
本発明は、その局面の多くにおいて十分に記載され、かつ本明細書中に特許請求されているが、本明細書中の教示に従って当業者によって、過度な実験を行うことなく行うことができ、かつ達成することができる。本発明の組成物および方法が上記に例として記載されているが、多くの変化および改変が、本発明の概念および精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および方法に対して適用され得ることは当業者には明かである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ジベレリン生合成経路の略図である。
【図２】ｏｒｆ３遺伝子をエンコードする核酸の核酸配列（配列番号１）、および示された核酸のタンパク質コードドメインセグメント（ＣＤＳ）によってエンコードされる翻訳ＧＡ４Ｄタンパク質（配列番号２）を示す。
【図３】ジベレラ・フジクロイのＧＡ４デサチュラーゼをエンコードする遺伝子ｏｒｆ３の物理的地図および遺伝子置換ベクターの構築を示す概略図である。
【図４】ジベレリン産生菌類からのタンパク質産生の典型的なサザンブロット分析の結果を図示する。野生型Ｓ１（ＩＭＩ５８２８９）、ｏｒｆ３が破壊された形質転換Ｓ１のＳ１−Ｔ２３株およびＳ１−Ｔ５５株、Ｐ４５０−３阻害株６３１４、ｏｒｆ３が破壊された形質転換６３１４の６３１４−Ｔ２株および６３１４−Ｔ８株が示される。
【図５】野生型（Ｓ１）、ＧＡ７産生変異体６３１４およびｏｒｆ３ノックアウト変異体６１３４Δｏｒｆ３−Ｔ１のＨＰＬＣクロマトグラム分析（ＧＡスペクトル）を示す。ピークは、示された矢印により同定される（ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４およびＧＡ７）。
【図１】
2004517625.tif 000006
【図２】
2004517625.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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