(57)【要約】ヘテロポリマーの３重鎖および４重鎖ならびにこれらを作製する方法、これらを作製するための陽イオンなど加速剤の使用、これらを検出するための蛍光インターカレーターおよび蛍光プローブが結合した非インターカレート型物質の使用。
2004534541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸多重鎖を作製する方法であって、
１）水、ワトソン‐クリック２重鎖、該ワトソン‐クリック２重鎖を含む多重鎖を形成するのに十分な数の１本鎖混合塩基配列分子、および多重鎖の形成速度または量を増加させる加速剤からなる混合物を作成する工程であって、前記多重鎖が３重鎖または４重鎖であり、１つまたは複数の前記１本鎖分子が、多重鎖内にある場合に、ワトソン‐クリックの塩基対法則または相同的結合の塩基対法則に従った接着によって多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられるように選択される工程と、
２）前記混合物をインキュベートして、多重鎖の各鎖が塩基対法則に従った接着によって該多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられた多重鎖を形成させる工程と
からなり、ただし該多重鎖内において工程（１）で加えたワトソン‐クリック２重鎖がＧＣ含量１０％〜９０％のヘテロポリマーである方法。
【請求項２】
作製される前記多重鎖が３重鎖であり、工程（１）における１本鎖分子の前記十分な数は１であり、工程（２）で前記３重鎖が形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２重鎖がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記１本鎖分子が該２重らせん構造の溝内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１本鎖分子が、ワトソン‐クリックの塩基対法則によって前記２重鎖のうち一方の鎖と結合しており、相同的結合の塩基対法則によって前記２重鎖のうちの他方の鎖と関係付けられている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２重鎖がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記１本鎖分子が該２重らせん構造の溝内に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多重鎖内で、工程（１）で加える前記ワトソン‐クリック２重鎖は、１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであり、さらに、そのうちのプリン‐ピリミジン２量体およびピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞中に存在しない核酸鎖および／または２重鎖を用いて工程（１）および（２）を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質を使用せずに工程（２）を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（１）で、混合物の最終体積のうち体積基準で少なくとも５０％を水が占めるように水を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（１）で、混合物の最終体積のうち体積基準で少なくとも８０％を水が占めるように水を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）で、体積基準で前記混合物に加える液体のすべてとなるように水を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記水性溶液の凝固点を超え、８５℃を超えない１つまたは複数の温度で工程（２）を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
５℃〜３０℃の１つまたは複数の温度で工程（２）を実施する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１５℃〜２５℃の１つまたは複数の温度で工程（２）を実施する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（１）で陽イオンを前記加速剤として加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記陽イオンが、５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で提供されるＮａ＋である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記陽イオンが、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｎ＋２、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｇ＋２、および２０ｍＭの濃度で提供されるＮｉ＋２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程（１）でインターカレーターを加速剤として加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記インターカレーターが蛍光インターカレーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光インターカレーターが、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、ＹＯＹＯ‐３、ＴＯＴＯ‐３、ＰＯＰＯ‐１、ＢＯＢＯ‐１、ＰＯＰＯ‐３、ＢＯＢＯ‐３、ＬＯＬＯ‐１、ＪＯＪＯ‐１、シアニン２量体、ＹＯ‐ＰＲＯ‐１、ＴＯ‐ＰＲＯ‐１、ＹＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐５、ＰＯ‐ＰＲＯ‐１、ＢＯ‐ＰＲＯ‐１、ＰＯ‐ＰＲＯ‐３、ＢＯ‐ＰＲＯ‐３、ＬＯ‐ＰＲＯ‐１、ＪＯ‐ＰＲＯ‐１、シアニン単量体、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジン・オレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム‐アクリジン・ヘテロ２量体、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１、ＳＹＢＲ色素、ピコ・グリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７‐アミノアクチノマイシンＤからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記加速剤が非インターカレート型フルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記非インターカレート型フルオロフォアが、ビオチン、ローダミン、アレクサ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ビオチン・コンジュゲート、チオール反応性プローブ、フルオレセイン、および、ケージドプローブ、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、ＱＳＹ色素を含むがこれらに限定はされない誘導体からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（１）で、前記加速剤が前記ワトソン‐クリック２重鎖の副溝および主溝のうち少なくともいずれかに結合するインターカレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（１）で、前記加速剤が２５℃では液体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（１）で、前記加速剤が水溶性の有機液体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（１）で、前記ワトソン‐クリック２重鎖に対する凝縮剤である加速剤を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
工程（１）で、前記ワトソン‐クリック２重鎖に対する脱凝縮剤である加速剤を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２の方法からなり、さらに３重鎖を検出する追加の工程（３）からなる、３重鎖を検出する方法。
【請求項２９】
作製される前記多重鎖は４重鎖であり、工程（１）における前記ワトソン‐クリック２重鎖は第１のワトソン‐クリック２重鎖であり、また工程（１）における１本鎖分子の十分な数は２であって、これらの１本鎖分子は第２のワトソン‐クリック２重鎖内にあり、工程（２）で前記第１および第２の２重鎖から４重鎖が形成される、請求項１に記載の方法。好ましくは、２本の該１本鎖分子が既に第２のワトソン‐クリック２重鎖内に存在している状態で工程（１）を実施する。
【請求項３０】
請求項２９の方法からなり、さらに４重鎖を検出する追加の工程（３）からなる、４重鎖を検出する方法。
【請求項３１】
２本鎖核酸標的に結合した１本鎖プローブからなる３重鎖であって、前記プローブがヘテロポリマーの核酸またはヘテロポリマーの核酸類似体からなり、前記３重鎖のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されたメンバーである３重鎖。
【請求項３２】
前記２本鎖核酸標的がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記へテロポリマーの核酸または類似体が該２重らせん構造の溝の中に存在する、請求項３１に記載の３重鎖。
【請求項３３】
前記へテロポリマーの核酸および類似体がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有する、請求項３１に記載の３重鎖。
【請求項３４】
前記２本鎖核酸標的がその２重らせん構造を実質的に保っており、前記へテロポリマーの核酸または類似体が該２重らせん構造の溝の中に存在する、請求項３３に記載の３重鎖。
【請求項３５】
第１の核酸塩基配列を含む第１鎖と、
第２の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第１鎖と会合している第２鎖と、
第３の核酸塩基配列を含む第３鎖と、
第４の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第２鎖および第３鎖と会合している第４鎖と
からなる４重鎖。
【請求項３６】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項３７】
（１）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項３８】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項３７に記載の４重鎖。
【請求項３９】
（１）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項４０】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項３９に記載の４重鎖。
【請求項４１】
（１）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項４２】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項４１に記載の４重鎖。
【請求項４３】
（１）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（２）前記第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、または（３）前記第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、前記第２鎖および３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであるか、のいずれかである請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項４４】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項４３に記載の４重鎖。
【請求項４５】
前記第１鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第３鎖上の隣接する塩基、および前記第３鎖の塩基が結合している前記第４鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用する、請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項４６】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項４５に記載の４重鎖。
【請求項４７】
前記第２鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第４鎖上の隣接する塩基、および前記第４鎖の塩基が結合している前記第３鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用する、請求項３５に記載の４重鎖。
【請求項４８】
前記４本の鎖がそれぞれ１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーである、請求項４７に記載の４重鎖。
【請求項４９】
３重鎖を検出する工程（３）からさらになる、請求項２に記載の方法。
【請求項５０】
４重鎖を検出する追加の工程（３）からさらになる、請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記３重鎖内の前記２重鎖と前記１本鎖分子との間の、塩基対法則との完全一致、１塩基の不一致または欠失、および２塩基の不一致または欠失を識別する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のワトソン‐クリック２重鎖と第２のワトソン‐クリック２重鎖の間の、塩基対法則との完全一致、１塩基の不一致または欠失、および２塩基の不一致または欠失を識別する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
３重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列からなる標的２本鎖核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなるプローブを提供すること、
加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的配列および前記加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなる３重鎖複合体を含む試験試料を提供することと、前記複合体のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されるメンバーであることと、
前記試験試料を励起放射で照射して、該試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一アッセイである方法。
【請求項５４】
３重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなる２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック３重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一アッセイである方法。
【請求項５５】
４重鎖を検出する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなる２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック４重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列の一致度を決定すること、
からなり、前記標的配列または前記プローブにシグナル消光剤を与えずに実施する均一アッセイである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸多重鎖に関し、より詳細にはそれを３重鎖および４重鎖として作成する方法、さらに特定の核酸を検出するためのアッセイでそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２本の相補的な塩基配列の１本鎖核酸分子が互いに特異的に結合し得る能力は、強力な研究用ツールならびに強力な診断用ツールの基盤となっている。１本鎖分子が２本鎖標的に結合し得る能力および２本鎖分子が２本鎖標的に結合し得る能力は、このような「従来のハイブリダイゼーション」ほど十分に研究されていない。２本鎖標的に結合し得る能力は、従来のハイブリダイゼーションに勝る潜在的な利点を有している。これは、一部には、２本鎖標的が変性されず、より「穏やかな」ハイブリダイゼーション条件が可能になり、標的が完全にランダムなコイルになり難いことに起因し得る。これはまた、一部には、塩基対形成の機構が従来のハイブリダイゼーションと少なくとも部分的に異なるため、反応速度論的により好ましく、ハイブリダイゼーション反応混合物中に必要なプローブ量を低減可能とすることに起因し得る。
【０００３】
多重鎖の作製に関する従来の研究には、
１）細菌タンパク質ＲｅｃＡおよび他の生物内にある類似の機能のタンパク質によって媒介される相同組換えプロセスの一部としての３重鎖の形成、
２）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの際の３本鎖構造の作製（たとえば、特許文献１）、および
３）フーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）型の結合に依存している３本鎖または４本鎖の複合体、
が含まれていた。
【０００４】
この従来の研究では、多重鎖形成の潜在性は完全には発揮されていない。ＲｅｃＡに媒介されるプロセスではタンパク質が必要である。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのプロセスは、２本鎖の細胞内標的がその２本鎖構造を局所的に開き、従来のハイブリダイゼーション原理に従ってハイブリダイズする１本鎖標的を提供するという原理に基づいている。フーグスタイン型のポリマーに依存すると報告されている複合体は、真のヘテロポリマーでない構造に限られている。というよりも、該複合体には、所定の鎖がポリプリンまたはポリピリミジン、あるいはそれに非常に近いものであることが必要である。（たとえば、非特許文献１参照。）
３重鎖核酸の場合と同様に、４重鎖核酸に関する従来の知識は、比較的極端な条件下、比較的限られた種類の核酸についてのみ、このような特異な構造が存在するということであった。具体的には、（非特許文献２）では、グアニンに富んだオリゴヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然に自己構築して４本鎖のヘリックスになり得ることが開示された。（非特許文献３）では、これら４本鎖の複合体がさらに会合して８、１２、または１６個のオリゴマーからなる超構造になり得ることが開示されている。
【０００５】
（非特許文献４）および（非特許文献５）では、一部のグアニンに富んだオリゴヌクレオチドが、位置のずれた平行な配置に構築されて長い「Ｇ‐ワイヤー」を形成し得ることも開示されている。これらの高次構造は、平面上に配置され、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型塩基対によってともに保持された、４個のグアノシン残基からなるＧ‐４量体（Ｇ‐ｑｕａｒｔｅｔ）によって安定化されている。（非特許文献３）によれば、これらの高次構造が形成されるためには、少なくとも３個の連続したグアニンがオリゴマー内にあることが重要である。
【０００６】
ＨＩＶ−１インテグラーゼの阻害（非特許文献６）、減数分裂における対合の形成（非特許文献２）、テロメアの維持（非特許文献７および８）など様々な生物学的プロセスにおいて、４本鎖のＤＮＡが役割を果たすことが示唆されている。
【０００７】
グアニンに富んだ４重鎖の生成の制御が、このような生物学的プロセスを制御する鍵となっているかもしれないことがさらに示唆されている。たとえば（特許文献２）では、グアニン４量体の形成を阻害する薬物によってテロメラーゼ活性を制御し得るかもしれないことが示唆されている。
【０００８】
（特許文献３）には、Ｇ‐４量体に基づく４重鎖が核酸を検出するアッセイで使用可能であることが開示されている。Ｇ‐４量体構造は、相補オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする際に展開または直線化され、これによりＧ‐４量体構造の様々な部分にあるドナーとアクセプターとの間の距離が増大してその相互作用が低下し、この構造から発せられるシグナル（たとえば蛍光シグナル）に検出可能な変化が生じる。
【０００９】
（特許文献４）は、合成オリゴヌクレオチドが所望の完全長オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、それに伴って４重鎖ＤＮＡなど多量体の集合体を形成する、合成オリゴヌクレオチドを精製する方法を開示している。その後、サイズ排除の技法を使用して、精製するオリゴヌクレオチドを含んだ多量体の集合体を単離する。
【００１０】
前述の諸開発にもかかわらず、４重鎖核酸の潜在性全体は、十分に理解されても、十分に利用されてもいない。
２本鎖標的を用いてハイブリダイゼーション型の実験を実施する問題には、それらの標的を検出する手段が関連している。数十年来、核酸を検出および定量するために蛍光色素が使用されてきた。蛍光強度に基づくアッセイは、その最も基本的な形では、通常、フルオロフォアを含むプローブと標的とを接触させること、結合したプローブから結合していないプローブをすべて除去すること、および洗浄した試料中の蛍光を検出することを含んでいた。均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）は、洗浄工程または液体でない相の支持体の提供が必要でないため、このような基本的なアッセイより改良されている。
【００１１】
たとえば、（特許文献５）および（特許文献６）は、溶液状のオリゴヌクレオチドプローブを使用した、蛍光に基づく均一系のヌクレオチド配列アッセイを開示している。しかし、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブから発生したシグナルとハイブリダイズしていないプローブから発生したシグナルとを識別するために、消光剤をレポーター試薬（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と組み合わせて使用することが必要である。また、（特許文献５）では、その開示された方法において酵素の使用を必要としている。消光剤および酵素により、これらの方法の煩雑さや費用が増大する。
【００１２】
（特許文献７）は、少なくとも２つのフルオロフォア部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むプローブを使用した、溶液中のヌクレオチド配列を検出する方法を開示している。これらのフルオロフォアは、そのスペクトルの波長依存性を変化させるために、十分近づいた際に電気的に相互作用するように選択しなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハイブリダイズしたプローブに比べてはるかに柔軟性があり、その結果、プローブがハイブリダイズされている場合に比べてプローブがハイブリダイズされていない場合の方が、各プローブ上の２つのフルオロフォア部分が互いに近づいている可能性が高い。したがって、遊離プローブと相関付けた発光波長の変化を、試料中の遊離プローブ量の指標としてモニターすることが可能である。
【００１３】
（特許文献８）も、核酸を検出するための蛍光に基づく均一系アッセイを開示している。
蛍光強度を検出する前述の発展に加えて、蛍光偏光アッセイの利点を喧伝する者もいた。しかし、偏光に基づくアッセイには著しい欠点がある。結合の関数としての偏光の変化の度合は予測不可能となる可能性があり、一貫性のないデータを理論的な予想と対応させるためのデータ解釈は、特にこの方法を自動化しようとする場合は、分析方法において望みうる以上の労力を要する可能性がある。さらに、蛍光偏光アッセイでその運動を評価する分子の分子量から生じる制約もある。
【特許文献１】
ブレッサー（Ｂｒｅｓｓｅｒ）他、米国特許第５，７０７，８０１号
【特許文献２】
ハーディン（Ｈａｒｄｉｎ）他、米国特許第６，０１７，７０９号
【特許文献３】
ピットナー（Ｐｉｔｎｅｒ）他、米国特許第５，８８８，７３９号
【特許文献４】
アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）他、米国特許第５，９１２，３３２号
【特許文献５】
リヴァック（Ｌｉｖａｋ）他、米国特許第５，５３８，８４８号
【特許文献６】
マッジオ（Ｍａｇｇｉｏ）、米国特許第４，２２０，４５０号
【特許文献７】
キッドウェル（Ｋｉｄｗｅｌｌ）、米国特許第５，３３２，６５９号
【特許文献８】
ウー（Ｗｕ）他、米国特許第５，８４６，７２９号
【特許文献９】
ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他、米国特許第５，５３９，０８２号
【特許文献１０】
１９９８年１２月３１日出願の米国特許出願第０９／２２４，５０５号
【特許文献１１】
セン（Ｓｅｎ）他、米国特許第５，９４８，８９７号
【非特許文献１】
フローリス（Ｆｌｏｒｉｓ）他、”Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｕｒｉｎｅ‐ｐｕｒｉｎｅ‐ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｘｅｄ‐ｖａｌｅｎｃｅ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２６０巻、８０１‐８０９（１９９９）
【非特許文献２】
セン（Ｓｅｎ）他、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、３６４‐３６６（１９８８）
【非特許文献３】
セン（Ｓｅｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、６５‐７０（１９９２）
【非特許文献４】
マーシュ（Ｍａｒｓｈ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、１０７１８‐１０７２４（１９９４）
【非特許文献５】
マーシュ（Ｍａｒｓｈ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２３巻、６９６‐７００（１９９５）
【非特許文献６】
マズムダー（Ｍａｚｕｍｄｅｒ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、１３７６２‐１３７７１（１９９６）
【非特許文献７】
ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）他、Ｃｅｌｌ、第５９巻、８７１‐８８０（１９８９）
【非特許文献８】
バラン（Ｂａｒａｎ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻、２９７‐３０３（１９９７）
【非特許文献９】
ブイ  ビー  ジュールキン（Ｖ．Ｂ．Ｚｈｕｒｋｉｎ）他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２３９巻、１８１‐２００（１９９４）
【非特許文献１０】
デルヴァン（Ｄｅｒｖａｎ）他、上記
【非特許文献１１】
エグホルム（Ｅｇｈｏｌｍ）他、Ｎａｔｕｒｅ、第３６５巻、５６６（１９９３）
【非特許文献１２】
トマック（Ｔｏｍａｃ）他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１８巻、５５４４（１９９６）
【非特許文献１３】
サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，”  第２巻（１９８９）
【非特許文献１４】
ヨハンセンおよびジェイコブセン（Ｊｏｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓｅｎ）（１９９８）
【非特許文献１５】
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｔｒｕｃｔ．ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、第１６巻、２０５‐２２２ページ（１９９８）
【非特許文献１６】
Ｎａｔｕｒｅ、第３８０巻、２０７（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、核酸多重鎖を提供することであり、より詳細にはそれを３重鎖および４重鎖として作成する方法、さらに特定の核酸を検出するためのアッセイでそれらを使用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明を、３重鎖および４重鎖を検出する目的で蛍光分子の特性を利用する種々の重要な実施形態として示す。
本明細書中で引用したすべての参照文献は、その全体を本願明細書に援用する。
【００１６】
（多重鎖を作製する方法）
一般的な一態様では、本発明は、核酸多重鎖を作製する方法であって、
１）水、ワトソン‐クリック２重鎖、ワトソン‐クリック２重鎖を含む多重鎖を形成するのに十分な数の１本鎖混合塩基配列分子、および多重鎖の形成速度または量を増加させる加速剤からなる混合物を作成する工程であって、前記多重鎖が３重鎖または４重鎖であり、１つまたは複数の前記１本鎖分子が、多重鎖内にある場合に、ワトソン‐クリックの塩基対法則または相同的結合（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の塩基対法則に従った接着によって多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられるように選択される工程と、
２）前記混合物をインキュベートして、多重鎖の各鎖が塩基対法則に従った接着によって多重鎖内の他のすべての鎖と関係付けられた多重鎖を形成させる工程と
からなり、ただし多重鎖内において工程（１）で加えたワトソン‐クリック２重鎖がＧＣ含量１０％〜９０％のヘテロポリマーである方法である。
【００１７】
本方法の具体的な一態様では、作製される多重鎖は３重鎖であり、工程（１）における１本鎖分子の十分な数は１であり、工程（２）で３重鎖が形成される。本方法の具体的な一態様では、この３重鎖内において、１本鎖分子は、ワトソン‐クリックの塩基対法則によって２重鎖のうち一方の鎖と関係付けられており、相同的結合の塩基対法則によって２重鎖の他方の鎖と関係付けられている。さらなる具体的な態様では、この２重鎖はその２重らせん構造を実質的に保っており、１本鎖分子がその２重らせん構造の溝の中に存在する。これらの３重鎖もすべて、本発明の態様である。
【００１８】
本方法の別の具体的な態様では、作製される多重鎖は４重鎖であり、工程（１）におけるワトソン‐クリック２重鎖が第１のワトソン‐クリック２重鎖であり、また工程（１）における１本鎖分子の十分な数は２であって、これらの１本鎖分子は第２のワトソン‐クリック２重鎖内にあり、工程（２）で前記第１および第２の２重鎖から４重鎖が形成される。好ましくは、２本の１本鎖分子が既に第２のワトソン‐クリック２重鎖内に存在している状態で工程（１）を実施する。
【００１９】
（３重鎖を検出する方法）
３重鎖を検出する追加の工程（３）を追加することによって、３重鎖を作製する方法を、３重鎖を検出する方法となるように適合させることが可能である。
【００２０】
（４重鎖を検出する方法）
４重鎖を検出する追加の工程（３）を追加することによって、４重鎖を作製する方法を、４重鎖を検出する方法となるように適合させることが可能である。
【００２１】
（３重鎖）
別の一般的な態様では、本発明は、２本鎖核酸標的に結合した１本鎖プローブからなる３重鎖（３重鎖複合体）であって、前記プローブがヘテロポリマーの核酸またはヘテロポリマーの核酸類似体からなり、前記３重鎖のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されたメンバーである３重鎖である。
【００２２】
（４重鎖）
別の態様では、本発明は、
第１の核酸塩基配列を含む第１鎖と、
第２の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第１鎖と会合している第２鎖と、
第３の核酸塩基配列を含む第３鎖と、
第４の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第２鎖および第３鎖と会合している第４鎖と
からなる４重鎖である多重鎖構造である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を、図面と関連づけて説明する。図面中、同様の参照番号は同様の要素を示す。
（用語解説および定義）
個々のヌクレオチドの一部分を形成する塩基を示す１文字のコードは、Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｕ：ウラシルである。また、これらの文字は、その個々のヌクレオチドを表すためにも使用される。
【００２４】
２重鎖のＧＣ含量は、Ｇ‐Ｃ塩基対の数を、Ｇ‐Ｃ塩基対の数とＡ‐Ｔ（またはＡ‐Ｕ）塩基対の数との和で除して１００を乗じたものであり、百分率で表される（たとえば、２０％）。
【００２５】
本明細書では、加速剤とは、「前記３重鎖または４重鎖の形成の速度または量を増大させる」ものであると理解される。速度は、それぞれ異なる時点でのわずか２回の測定値を用いて得ることが可能である。量とは、形成された３重鎖または４重鎖の数を言う。
【００２６】
用語「加速剤」は、用語「プロモーター」および「プロモーター剤」と互換的に使用される（プロモーターが特に遺伝子プロモーターを言う場合を除く）。
核酸、３重鎖、４重鎖などの用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびワトソン‐クリック２重鎖など類似の構造を形成する能力があるそれらの類似体、ならびに本発明中で形成される３重鎖および４重鎖を含む分子を指すものとする。
【００２７】
「核酸塩基」とは、塩基Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、Ｔおよびワトソン‐クリックの塩基対法則に従い得るそれらの類似体を言う。
Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ、およびＴの類似体とは、ワトソン‐クリックの塩基対法則に従い得る類似体である。
【００２８】
ワトソン‐クリック２重鎖とは、２本の鎖が逆平行（ａｎｔｉ‐ｐａｒａｌｌｅｌ）、すなわちそれらの５’→３’方向が逆向きの２本鎖の分子または分子セグメントである。この２重鎖の全体的な構造は２重らせん構造である。鎖は水素結合および疎水性相互作用によって結合される。塩基対の相補性があり、Ａは２つの水素結合によってＴと対合しており（または、ＲＮＡの場合ＡはＵと対合している）、Ｇは３つの水素結合によってＣと対合している。したがって、塩基対法則とは、ＡがＴと対合し、ＡがＵと対合し、ＧがＣと対合することである。
【００２９】
３本鎖の核酸分子は必ずしも１本の３重鎖である必要はなく、３本鎖分子の全てのセグメントが必ず３重鎖である必要もない。任意の鎖の中のいずれの領域においても、その鎖が２本以上の他の鎖と結合していないことも可能である。単純な例は、鎖１および２が基部を形成し、鎖１および３が左上枝を形成し、鎖２が一本鎖の右上枝を形成しているＹ型分子であろう。
【００３０】
３重鎖の例は、１本の鎖（鎖１と命名する）が、鎖２および鎖３のいずれとの間でもワトソン‐クリックの塩基対法則（Ａ‐Ｔ、Ａ‐Ｕ、およびＧ‐Ｃ）に従う、３本鎖核酸分子または分子セグメントである。鎖１および２は、ワトソン‐クリック２重鎖の構造またはそれに近い構造を形成する。鎖３は、その２重鎖の主溝内に存在する。このような３重鎖の例は、参照により本願明細書に援用する（非特許文献９）に詳しく述べられているものである（特にこの参考文献の図２を参照）。このような３重鎖の安定化の一端として、鎖３は、以下の塩基対法則によって他の２本の鎖に結合している。
【００３１】
鎖３上のＡが、鎖１上のＡと鎖２上のＴのどちらとも対合していること、
鎖３上のＧが、鎖１上のＧと鎖２上のＣのどちらとも対合していること、
鎖３上のＣが、鎖１上のＣと鎖２上のＧのどちらとも対合していること、
鎖３上のＴが、鎖１上のＴと鎖２上のＡのどちらとも対合していること。
ジュールキン（Ｚｈｕｒｋｉｎ）モデルのどの変異体（ＣまたはＣ＋またはＣ’、ＴまたはＴ’）を考慮するかに関係なく、これらの塩基対法則は満たされている。
【００３２】
用語「塩基対法則」とは、２個の核酸分子が互いに特異的に結合する場合における、一方の核酸分子と他方の核酸分子との間の特異性を定義する法則である。例としては、ワトソン‐クリックの塩基対法則（Ｇ‐Ｃ、およびＡ‐ＴまたはＡ‐Ｕ）および相同的結合（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の塩基対法則（Ａ‐Ａ、Ｔ‐Ｔ、Ｇ‐Ｇ、Ｃ‐Ｃ、Ｕ‐Ｕ）である。
【００３３】
２重鎖の「脱凝縮（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）」とは、２重鎖のらせん状繰り返し単位（ｈｅｌｉｃａｌ  ｒｅｐｅａｔ）全体の長さの増大として定義される。たとえば、Ｂ型立体構造の２重鎖は、らせん状繰り返し単位全体の長さが１０塩基対である。１０６°の脱凝縮により、その繰り返し単位の長さが１３塩基対になる。
【００３４】
ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリアミド類似体を表す。（たとえば、特許文献９参照。）
（本発明の具体的な実施形態および代替様式）
「課題を解決するための手段」のセクションに記載した本発明は、具体的な実施形態および所定の好ましい実施形態を有する。これらの実施形態はこの出願の全体にわたって記載されている。しかし、便宜上、その多くを本セクションで要約する。同様に、「課題を解決するための手段」のセクションで要約する本発明は、本発明の一部の変形形態を表すが発明の本質については相当の重複を保ったままの代替様式でも表現し得る。本発明のこのような代替様式も、このセクションに含まれる。
【００３５】
（Ａ）多重鎖を作製する方法
「課題を解決するための手段」のセクションで一般的に記載した３重鎖または４重鎖を作製する方法は、任意選択で以下のうち１つまたは複数をこの方法に組み込むことによって実施可能である。
【００３６】
多重鎖内で、工程（１）で加えるワトソン‐クリック２重鎖は、ＧＣ含量２５％〜７５％のヘテロポリマーであること、
多重鎖内で、工程（１）で加えるワトソン‐クリック２重鎖は、ＧＣ含量１０％〜９０％のヘテロポリマーであり、さらに、そのうちのプリン‐ピリミジン２量体とピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超えること（配列の５’末端から始めて、３’末端に達するまで１塩基ずつ進行しながら２量体を同定する、たとえば、配列５’‐ＡＡＡＧＧＧＴは、１つのプリン‐ピリミジン２量体（ＧＴ）を有し、ピリミジン‐プリン２量体は有さないので、それらの合計頻度は１／６である）
細胞中に存在しない（かつウイルス中にも存在しない）核酸鎖および／または２重鎖を用いて工程（１）および／または（２）を実施すること、
タンパク質（ｒｅｃＡまたは同様の機能のタンパク質など）を使用せずに工程（２）を実施すること、
工程（１）で、混合物の最終体積の少なくとも５０体積％を水が占める（より好ましくは最終体積の少なくとも８０％を占める、最も好ましくは、工程（１）では混合物に加える液体は水だけである）ように水を加えること、
工程（１）で、タンパク質を全く加えないこと、
水性溶液の凝固点を超え、８５℃を超えない１つまたは複数の温度（より好ましくは５℃〜３０℃、最も好ましくは１５℃〜２５℃）で工程（２）を実施すること、
工程（１）で、陰イオン、またはより好ましくは、陽イオンを加速剤（１価、２価または多価、たとえば金属陽イオンまたは陽イオンペプチド）として加えること、
前記陽イオンは、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、遷移金属陽イオン、Ｃｏ（ＮＨ３）６＋３、３価スペルミジンおよび４価スペルミンからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーであること、
前記陽イオンが、５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で提供されるＮａ＋であること、
前記陽イオンが、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｎ＋２、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されるＭｇ＋２、および２０ｍＭの濃度で提供されるＮｉ＋２からなる群から選択されること、
工程（１）で、インターカレーターを加速剤として加えること（特に蛍光インターカレーター、好ましくはビス・インターカレーター）
工程（１）で、前記加速剤が、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、ＹＯＹＯ‐３、ＴＯＴＯ‐３、ＰＯＰＯ‐１、ＢＯＢＯ‐１、ＰＯＰＯ‐３、ＢＯＢＯ‐３、ＬＯＬＯ‐１、ＪＯＪＯ‐１、シアニン２量体、ＹＯ‐ＰＲＯ‐１、ＴＯ‐ＰＲＯ‐１、ＹＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐５、ＰＯ‐ＰＲＯ‐１、ＢＯ‐ＰＲＯ‐１、ＰＯ‐ＰＲＯ‐３、ＢＯ‐ＰＲＯ‐３、ＬＯ‐ＰＲＯ‐１、ＪＯ‐ＰＲＯ‐１、シアニン単量体、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジン・オレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム‐アクリジン・ヘテロ２量体、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ１、ＳＹＢＲ色素、ピコ・グリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７‐アミノアクチノマイシンＤからなる群から選択されるインターカレート型フルオロフォア（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）であること、
工程（１）で、前記加速剤が非インターカレート型フルオロフォアであり（特に、ビオチン、ローダミン、アレクサ色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ビオチン・コンジュゲート、チオール反応性プローブ、フルオレセインおよび誘導体（ケージド（閉じ込められた：ｃａｇｅｄ）プローブ）、オレゴン・グリーン、ローダミン・グリーン、ＱＳＹ色素を含む）からなる群から選択されたもの）、前記強度が３重鎖または４重鎖の形成と逆相関を示していること、
工程（１）で、前記加速剤が、前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖のうち少なくとも１つに結合していること、
工程（１）で、ワトソン‐クリック２重鎖（または２つのワトソン‐クリック２重鎖のうち少なくとも１つ）の副溝に結合するインターカレーターである加速剤を加えること、
工程（１）で、２５℃では液体である加速剤（特に、ジメチルホルムアミド、エタノール、およびグリセロールなど水溶性の有機液体）を加えること、
工程（１）で、２つ以上の加速剤を加えること、
工程（１）で、ワトソン‐クリック２重鎖に対する凝縮剤または脱凝縮剤である加速剤を加えること、
工程（１）で、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧの類似体である加速剤を加えること、
工程（１）で、レクチンおよび多糖からなる群から選択される加速剤を加えること、
工程（１）および（２）で、ｐＨ約５〜約９で混合物を緩衝させること、
Ｃ‐Ｇ‐ＣまたはＧ‐Ｃ‐Ｇの少なくとも１つの塩基トリプレット内の１つのシトシンが正に帯電していること、
それぞれのＣ‐Ｇ‐ＣおよびＧ‐Ｃ‐Ｇ塩基トリプレット内の１つのシトシンが正に帯電していること、
工程（２）で、インキュベーション時間は約２時間を超えないこと（より好ましくは１時間を越えず、いずれかの時間枠内に、あり得る多重鎖のうち好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％が形成されている）、
前記少なくとも１つの加速剤が、インターカレートしない形で、少なくとも１０３Ｍ−１の結合定数で結合する、核酸副溝結合分子（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であること、
この多重鎖が電気回路の一部であること。（あるいは、本発明は多重鎖構造を含む電気回路であること）。
【００３７】
当業者には、前述の具体的な条件は、４重鎖を作製する以下の方法にもあてはまることが明らかであろう。
代替表現形式では、４重鎖を形成する方法は以下のことからなる。
【００３８】
（１）第１鎖、第２鎖、第３鎖、第４鎖、水、緩衝剤および少なくとも１種の加速剤からなるハイブリダイゼーション媒体を提供すること、
（２）第１の核酸塩基配列を含む第１鎖と、
第２の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第１鎖と会合している第２鎖と、
第３の核酸塩基配列を含む第３鎖と、
第４の核酸塩基配列を含み、ワトソン‐クリック結合によって前記第２鎖および前記第３鎖と会合している第４鎖と
からなる多重鎖構造を提供するために、前記第２鎖を前記第４鎖にハイブリダイズさせるのに有効な時間、前記ハイブリダイゼーション媒体をインキュベートすること。
【００３９】
４重鎖を形成する方法の詳細な実施形態では、以下のことが単独で、または組み合わせて適用される（以下の説明では、４本の別々の鎖を指定して４重鎖を作製する方法における用語を利用するが、これらは、出発材料の１つまたは２つとしてワトソン−クリック２重鎖を指定する方法にも適用し得る）。
【００４０】
前記第１鎖および前記第２鎖のうち少なくとも１つがさらに薬剤を含み、前記第２鎖が前記第４鎖にハイブリダイゼーションすることにより、前記薬剤が、前記第３鎖、前記第４鎖、または前記第３鎖および前記第４鎖のうち少なくとも１つと会合した別の分子上の標的から有効な距離に配置されること、
前記薬剤が、臨床的に重要な遺伝子の遺伝子プロモーター配列に結合するように設計された核酸、臨床的に重要な遺伝子に結合するように設計された核酸、および病原体の複製起点に結合するように設計された核酸からなる群から選択されるメンバーであること、
前記第３鎖および前記第４鎖が、前記第１鎖および前記第２鎖より前に前記ハイブリダイゼーション媒体中に提供され、前記第１鎖および前記第２鎖は、脱水された形で提供された後、前記ハイブリダイゼーション媒体と接触することによって再水和されること、
前記第１鎖および前記第２鎖のうち少なくとも１つが、インターカレート型でないフルオロフォアで共有結合的に標識され、前記強度が前記結合親和性と逆相関を示していること、
少なくとも１つの加速剤がインターカレート型フルオロフォアであり、前記多重鎖構造を含む試験媒体の蛍光強度が、前記第４鎖に対する前記第２鎖の結合親和性と直接相関を示すこと、
前記第４鎖への前記第２鎖のハイブリダイゼーションが、蛍光、化学発光、電気化学発光または電気のシグナルの変化として検出されること、
前記シグナルの強度が、前記第２鎖と前記第４鎖の間の結合親和性と相関を示すこと、
前記第２鎖が前記第４鎖にハイブリダイズすることにより、前記第３鎖および前記第４鎖のうち少なくとも１つに関連する活性が不活性化されること。
【００４１】
（Ｂ）３重鎖を検出する方法
「課題を解決するための手段」のセクションで一般的に記載した３重鎖を検出する方法は、任意選択で以下のうち１つまたは複数をこの方法に組み込むことによって実施可能である。
【００４２】
工程（３）中またはその前に、３重鎖の一部でない１本鎖分子を３重鎖を含む管または容器とは別の管または容器に入れずに、この方法を均一アッセイとして実施すること、
３重鎖内の２重鎖と１本鎖分子の間の、塩基対法則への完全一致、１塩基の不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）（または欠失）、および２塩基の不一致（または欠失）を識別する検出方法を使用すること（この方法は、好ましくは、既知の不一致を含む分子を用いてこの方法を較正することを含む）、
インターカレーターの結合の程度（たとえば、蛍光の増大によって示される）を３重鎖の形成の指標として使用すること、
インターカレーションの際に前記インターカレート型フルオロフォアが発する蛍光波長が第２の波長にシフトし、前記波長と前記第２の波長の差が、前記プローブと前記標的との複合体が２重鎖であるかそれとも３重鎖であるか、および前記標的がＤＮＡであるかそれともＲＮＡであるかを示すこと、
プローブが非インターカレート型フルオロフォアで共有結合により標識され、前記強度が前記結合親和性と逆相関を示していること（特に、前記インターカレート型でないフルオロフォアが、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセインからなる群から選択されたメンバーである）、
フルオロフォアで標識した１本鎖分子を、１本鎖分子として使用すること、
この方法が、前記標的配列（すなわち２重鎖内）または前記プローブ（すなわち１本鎖分子）上にシグナル消光剤を提供せず、かつ／または前記標的配列を事前に変性させず、かつ／または前記標的配列のＰＣＲ増幅を行わずに実施する均一アッセイであること、
前記方法が、前記標的配列または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに実施する均一系アッセイであること、
プローブが、部分的に帯電しているかまたは帯電していない骨格を有すること、
プローブが、ＰＮＡ配列を含み、かつ／またはパラレル合成によって調製されたｓｓＰＮＡであること、
プローブと前記標的配列が同じ長さであること、
プローブが、５〜３０ヌクレオチド長であること、
蛍光を励起する照射が、アルゴン・イオン・レーザーから約２００〜約１０００ｎｍの波長で放出されること、
試験試料が、約２０マイクロリットルの体積を有し、約１０フェムトモルの標的配列および約１０フェムトモルのプローブを含むこと、
前記試料中の標的配列の濃度が５×１０−１０Ｍを超えないこと、
試料中のプローブの濃度が５×１０−１０Ｍを超えないこと、
この方法をバイオチップ上で実施すること、
前記プローブを含まず、前記標的配列を含まない形で、インターカレート型フルオロフォアを媒体に加えること、
インターカレート型フルオロフォアが、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２およびアクリジンからなる群から選択されるメンバーであること。
【００４３】
代替表現態様では、本発明は、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列からなる標的２本鎖核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなるプローブを提供すること、
加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的配列および前記加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなる３重鎖複合体を含む試験試料を提供することと、前記複合体のすべての塩基トリプレットがＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されるメンバーであることと、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列との一致の程度を決定すること、
からなる検出方法である。
【００４４】
別の代替表現関連態様では、この方法は、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列からなる２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック３重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列との一致の程度を決定すること、
を含み、前記標的配列または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに実施する均一系アッセイである。
【００４５】
（Ｃ）４重鎖を検出する方法
「課題を解決するための手段」のセクションで一般的に記載した４重鎖を検出する方法は、任意選択で以下のうち１つまたは複数をこの方法に組み込むことによって実施可能である。
【００４６】
工程（３）中またはその前に、４重鎖の一部でない核酸分子を４重鎖を含む管または容器とは別の管または容器内に入れず、この方法を均一系アッセイとして実施すること、
この方法が、前記標的配列または前記プローブ（すなわち第２ワトソン‐クリック２重鎖）上にシグナル消光剤を提供せず、かつ／または前記標的配列を事前に変性させず、かつ／または前記標的配列のＰＣＲ増幅を行わずに実施する均一系アッセイであること、
第１ワトソン‐クリック２重鎖と第２ワトソン‐クリック２重鎖の間の、塩基対法則への完全一致、１塩基の不一致（または欠失）、および２塩基の不一致（または欠失）を識別する検出方法を使用すること（好ましくは、既知の不一致を含む分子を用いてこの方法を較正することによる）、
インターカレーターの結合の程度を４重鎖の形成の指標として使用すること（特に、蛍光インターカレーターを使用して、増大した蛍光を指標として使用することによる）、
前記プローブを含まず、前記標的配列を含まない形で、インターカレート型フルオロフォアを媒体に加えること、
インターカレート型フルオロフォアが、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２およびアクリジンからなる群から選択されるメンバーであること、
インターカレーションの際に前記インターカレート型フルオロフォアが発する蛍光波長が第２の波長にシフトし、前記波長と前記第２の波長との差が、前記プローブと前記標的との複合体が２重鎖であるかそれとも３重鎖であるか、および前記標的がＤＮＡであるかそれともＲＮＡであるかを示すこと、
プローブが非インターカレート型のフルオロフォアで共有結合により標識され、前記強度が前記結合親和性と逆相関を示していること（特に、前記非インターカレート型のフルオロフォアが、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセインからなる群から選択されたメンバーである）、
フルオロフォアで標識した１本鎖分子を第２ワトソン‐クリック２重鎖の一部に使用すること、
該方法が、結合親和性を定量することをさらに含むこと、
プローブが、部分的に帯電しているかまたは帯電していない骨格を有すること、
プローブが、ＰＮＡ配列からなりかつ／またはパラレル合成によって調製されたｓｓＰＮＡであること、
プローブと前記標的配列が同じ長さであること、
プローブが、５〜３０ヌクレオチド（または塩基対）長であること、
蛍光を励起する照射が、アルゴン・イオン・レーザーから約２００〜約１０００ｎｍの波長で放出されること、
試験試料が、約１０フェムト・モルの標的配列および約１０フェムト・モルのプローブを含む、約２０マイクロ・リットルの体積を有すること、
前記試料中の標的配列の濃度が５×１０−１０Ｍを超えないこと、
試料中のプローブの濃度が５×１０−１０Ｍを超えないこと、
前記第１鎖および前記第２鎖と、前記第３鎖および前記第４鎖の比が約１０：１であること、
前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖のそれぞれの濃度が５×１０−１０Ｍを超えないこと、
この方法をバイオチップ上で実施すること。
【００４７】
代替表現関連態様では、この方法は、
少なくとも１つのプリン塩基および少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する、標的核酸または核酸類似体を提供すること、
核酸配列または核酸類似体配列を含む２本鎖プローブを提供すること、
ハイブリダイゼーション加速剤を提供すること、
前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーション加速剤を媒体に加えて、前記標的配列に結合した前記プローブからなるワトソン‐クリック４重鎖を含む試験試料を提供すること、
前記試験試料を励起放射で照射して、試験試料から蛍光放射を放出させること、
前記プローブおよび前記標的配列の結合親和性との相関を有する、前記蛍光放射の強度を検出すること、ならびに
前記強度から、前記プローブと前記標的配列との一致の程度を決定すること
を含み、前記標的配列または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに実施する均一系アッセイである。
【００４８】
（Ｄ）３重鎖
「課題を解決するための手段」のセクションで一般的に記載した３重鎖は、任意選択で以下の特徴のうち１つまたは複数を有し得る。
【００４９】
各鎖が、２５％〜７５％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであること、
各鎖が、１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであり、さらに、そのうちのプリン‐ピリミジン２量体とピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超えること、
細胞中に存在しない（かつウイルス中にも存在しない）こと、
７．６を超えるｐＨ（だがｐＨ９未満）で安定であること、
７．６を超えるｐＨ（および好ましくはｐＨ９未満）の媒体中に存在すること、
１本鎖核酸または核酸類似体が５〜３０塩基長（ｍｅｒ）であり、２本鎖核酸標的が８〜３．３×１０９塩基対長であること、
標的配列がヘテロポリマーであり、２５％〜７５％のプリン塩基および７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含むこと（好ましくは、プリン‐ピリミジン２量体およびピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超える）、
プローブ（すなわち１本鎖分子）が、２本鎖核酸切断剤に共有結合していること、
プローブが、化学療法剤に共有結合していること、
プローブが、標識（たとえば、多分子性シグナル形成複合体、酸化還元対、化学発光剤、電気化学発光剤、または、好ましい実施形態では、フルオロフォア、特に複合体の蛍光強度がプローブと標的配列との結合親和性に相関しているフルオロフォア）に共有結合していること、
１本鎖核酸分子の塩基対法則が、２重鎖の一方の鎖に関しては、ワトソン‐クリックの塩基対法則（Ｇ‐ＣおよびＡ‐ＴまたはＡ‐Ｕのどちらか）であり、２重鎖の他方の鎖に関しては、Ａ‐ＡとＴ‐ＴまたはＵ‐Ｕのどちらかであること、
２重鎖はそのワトソン‐クリック２重らせん構造を実質的に保っており、１本鎖分子がその２重らせんの溝の中に存在すること、
加速剤が、２重鎖の一部と１本鎖核酸分子の一部との間に結合を形成すること、
加速剤が、１本鎖核酸分子に共有結合していること、
ワトソン‐クリック２重鎖のどちらの鎖もＤＮＡであること（特に、３重鎖のすべての鎖がＤＮＡであること）、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖内の、１本鎖核酸分子内の塩基が結合する塩基に結合すること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖内の、３重鎖の一部ではない塩基に結合すること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖のリン酸骨格に結合すること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖上の２つ以上の部位に結合し、各部位が前記２重鎖のリン酸骨格の塩基上または該骨格上の場所にあること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖上の１つの部位に結合し、該部位が前記２重鎖の塩基上またはリン酸骨格上にあること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖内の塩基および１本鎖核酸分子内の塩基に結合すること、
加速剤が、１本鎖核酸分子内の塩基に結合すること。
【００５０】
（Ｅ）４重鎖
「課題を解決するための手段」のセクションで一般的に記載した４重鎖は、任意選択で以下の特徴のうち１つまたは複数を有し得る。
【００５１】
前記４本の鎖のそれぞれが、１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであること、
第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂａｓｅ‐ｐａｉｒｉｎｇ  ｒｕｌｅｓ）に従うものであること、
第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであること、
第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであること、
第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第２鎖および第４鎖が３’から５’の平行方向に整列し、前記第２鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、第１鎖および第３鎖が５’から３’の平行方向に整列し、前記第１鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであり、さらに、第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合がワトソン‐クリックの塩基対法則に従うものであること、
第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであること、
第２鎖および第３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、これら２本の鎖間の結合が相同的塩基対法則に従うものであること、
第１鎖および第４鎖がそれぞれ５’から３’および３’から５’の逆平行方向に整列し、前記第１鎖および第４鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであり、さらに、第２鎖および３鎖がそれぞれ３’から５’および５’から３’の逆平行方向に整列し、前記第２鎖および第３鎖の間の結合が相同的塩基対法則に従うものであること、
前記第１鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第３鎖上の隣接する塩基、および前記第３鎖の塩基が結合している前記第４鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用すること、
前記第２鎖の相互作用する塩基のそれぞれが、前記第４鎖上の隣接する塩基、および前記第４鎖の塩基が結合している前記第３鎖上の塩基のどちらとも特異的に相互作用すること、
単離精製された、人工または合成４重鎖であること、
各鎖が、２５％〜７５％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであること、
各鎖が、１０％〜９０％のＧＣ含量を有するヘテロポリマーであり、さらに、そのうちのプリン‐ピリミジン２量体およびピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超えること、
細胞中に存在しない（かつウイルス中にも存在しない）こと、
前記鎖が、それぞれ独立してヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体からなること、
前記鎖が、それぞれ独立にＤＮＡまたはＲＮＡからなること、
前記鎖が、それぞれ独立に、帯電していないまたは部分的に帯電した骨格を含むヘテロポリマー核酸類似体からなること、
前記第２鎖または前記第４鎖のうち一方がＤＮＡからなり、前記第２鎖または前記第４鎖のうち他方がＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｃＤＮＡからなること、
第２鎖および前記第４鎖が、互いに平行で相同であること、
前記第１鎖および前記第２鎖の主溝が、前記第３鎖および前記第４鎖の副溝内に配置されていること、
第２鎖および前記第４鎖が、互いに平行で相補的であること、
前記第１鎖および前記第２鎖の主溝が、前記第３鎖および前記第４鎖の副溝内に配置されていること、
各核酸塩基が他の３つ以上の核酸塩基と結合しないこと、
どの鎖も別の鎖と連続していないこと、
多重鎖構造が実質的にフーグスティーン結合を含まないこと、
多重鎖構造が実質的にＧ‐Ｇ４量体を含まないこと、
第１鎖および前記第２鎖が５〜５０塩基対長であること、
第３鎖および前記第４鎖がゲノムＤＮＡであること、
第３鎖および前記第４鎖が、ゲノムＤＮＡ中のハプロタイプを含むこと、
第３鎖および第４鎖が、ＰＣＲで増幅した産物であること、
前記多重鎖構造が固体支持体を含まないこと、
多重鎖構造が固体支持体に結合していること（固体支持体は、電気伝導性であるかまたは電気伝導性でない）
多重鎖構造が、前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖のうち少なくとも１つに結合した治療剤、予防剤または診断剤をさらに含むこと、
第１鎖および前記第２鎖がそれぞれ５〜３０塩基長であり、前記第３鎖および前記第４鎖がそれぞれ８〜３．３×１０９塩基対長であること、
第４鎖の配列が２５％〜７５％のプリン塩基および７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含むこと（好ましくは、プリン‐ピリミジン２量体およびピリミジン‐プリン２量体の合計頻度が２５％を超える）、
第１および第２のワトソン‐クリック２重鎖（「課題を解決するための手段」のセクションの４重鎖を作製する方法を参照）がそれぞれ、３０〜７０％のＧＣ含量を有すること、
第１のワトソン‐クリック２重鎖のどちらの鎖もＤＮＡであること（特に、４重鎖のすべての鎖がＤＮＡであること）、
加速剤が、第１のワトソン‐クリック２重鎖内の、第２の２重鎖内の塩基が結合する塩基に結合すること、
加速剤が、第１または第２のワトソン‐クリック２重鎖内の、４重鎖の一部ではない塩基に結合すること、
加速剤が、第１または第２のワトソン‐クリック２重鎖のリン酸骨格に結合すること、
加速剤が、第１または第２のワトソン‐クリック２重鎖のうち１つに存在する２つ以上の部位に結合し、各部位が塩基上またはリン酸骨格上のいずれかにあること、
加速剤が、ワトソン‐クリック２重鎖上の１部位に結合し、前記部位が塩基上またはリン酸骨格上にあること、
加速剤が、第１のワトソン‐クリック２重鎖内の塩基および第２のワトソン‐クリック２重鎖上の塩基に結合すること、
加速剤が、第１および／または第２のワトソン‐クリック２重鎖の副溝に結合すること、
加速剤が、第１のワトソン‐クリック２重鎖の一部と第２のワトソン‐クリック２重鎖の一部との間に結合を形成すること。
【００５２】
（本発明のさらなる態様）
本発明は、２本鎖核酸標的に結合した１本鎖プローブからなる３重鎖複合体であって、プローブがヘテロポリマー核酸またはヘテロポリマー核酸類似体からなり、複合体のすべての塩基トリプレットが、Ａ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐ＧおよびＣ‐Ｇ‐Ｃからなる群から選択されるメンバーである複合体を提供する。
【００５３】
従来技術で開示されたある種のフーグスティーン３重鎖とは異なり、本発明の３重鎖は７．６を超えるｐＨ値で安定である。さらに、本発明の３重鎖は従来技術のある種の３重鎖において必要なホモピリミジン配列やホモプリン配列の存在を必要としない。たとえば、標的配列は、２５％〜７５％のプリン塩基および７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含み得る。
【００５４】
好ましくは、３重鎖の１本鎖核酸または核酸類似体は５〜３０塩基長であり、２本鎖核酸標的は８〜３．３×１０９塩基対長である。
本発明による３重鎖の形成は、様々な用途に適している。たとえば、２本鎖核酸切断剤に共有結合したプローブは、２本鎖核酸の標的配列を特異的に切断するのに使用し得る。化学療法剤に共有結合したプローブは、２本鎖核酸の標的配列を特異的に処置するのに使用し得る。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明は、標的が核酸配列または核酸類似体配列からなり、プローブが核酸配列または核酸類似体配列からなる、２本鎖標的と１本鎖プローブの間の結合を検定するための、迅速な、高感度の、環境に優しい、安全な方法を提供する。
【００５６】
一部の従来技術のアッセイとは異なり、本発明は特異的なプローブ‐標的結合の存在を検出するだけでなく、プローブと標的との相互作用の性質に関する定性的および定量的な情報も提供する。したがって、本発明により、実行者がプローブと２本鎖標的の鎖の塩基配列間に生じる完全一致、１塩基対の不一致、２塩基対の不一致、３塩基対の不一致、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失、および３塩基対の欠失を識別することが可能になる。
【００５７】
本発明の諸実施形態は、第１のプローブ‐標的混合物で測定されたシグナル（たとえば蛍光強度）を、同じ標的と混合した、それぞれ少なくとも１塩基が第１のプローブと異なっている他のプローブにより示される同種のシグナルに対して較正することを含む。
【００５８】
測定されたシグナル（たとえば蛍光強度）の大きさが標的とプローブの間の結合親和性の関数である、較正曲線を作成することが可能である。標的と多数の異なるプローブとの間の結合親和性は、不一致な塩基の数、不一致の性質（Ａ‐Ｇ対Ａ‐Ｃ対Ｔ‐Ｇ対Ｔ‐Ｃなど）、３重鎖内の不一致のある位置などによって変動し得るので、本発明のアッセイを標的の配列を決定するために使用することが可能である。
【００５９】
諸実施形態において、測定されるシグナルは試験試料中に含まれるフルオロフォアの蛍光強度であり得る。このような実施形態では、フルオロフォアがシグナル消光とシグナル増幅のどちらによってハイブリダイゼーションのシグナルを示すかに応じて、プローブと標的の間の結合親和性は、強度と直接相関または逆相関を示し得る。選択された条件下では、インターカレート剤によって生じた蛍光強度はプローブ‐標的の結合親和性と直接相関を示し得るが、プローブに共有結合された非インターカレート型のフルオロフォアを使用する好ましい実施形態の蛍光強度は、プローブ‐標的の結合親和性と逆相関を示し得る。好ましくは０〜２塩基の不一致および／または欠失を含む範囲、より好ましくは０〜３塩基の不一致および／または欠失を含む範囲にわたりプローブと標的との一致の程度が上昇するにしたがって、非インターカレート型のフルオロフォアでは蛍光強度が低下する。
【００６０】
本発明により、プローブと標的の間の結合親和性を定量することが可能となる。このような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬剤の設計を含む様々な用途において役に立ち得る。
【００６１】
従来技術の方法とは異なり、本発明のアッセイは好ましくは均一系アッセイである。このアッセイは、測定されるシグナルの大きさを検出する前にプローブ‐標的複合体を遊離のプローブおよび標的から分離せずに、実施することが可能である。このアッセイにはゲル分離工程は必要なく、したがって、試験の処理能力が大きく高まり得る。定量分析は単純で正確である。その結果、この結合アッセイにより多くの時間および費用が節約され、またこのアッセイは容易に自動化し得る。さらに、このアッセイにより、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブおよび標的配列の相対濃度、インターカレーター濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、ならびに考えられるコファクターの必要量などの結合変数の迅速な決定が可能となる。
【００６２】
このアッセイを、たとえばウェル内の溶液中、不透過性の表面上、またはバイオチップ上で実施することが可能である。
さらに、本発明のアッセイは、好ましくは標的またはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに実施する。
【００６３】
本発明者らは以前にハイブリダイゼーション用の蛍光強度アッセイの利点を開示しているが（たとえば、特許文献１０参照）、本発明のアッセイではプローブと２本鎖標的との３重鎖が特異的に検出されるので、標的を変性させる必要性がなくなる。核酸（および核酸類似体）プローブは特定の限られた部類の標的と３重鎖を形成することが知られているが（たとえば、非特許文献１、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２参照）、プローブと標的の間の相互作用が、たとえば（非特許文献１０）の３重鎖ハイブリダイゼーションの非常に限定されたフーグスティーン・モデルではなく、（少なくともＡがＴ（またはＲＮＡの場合はＵ）に結合し、ＧがＣに結合するという意味では）ワトソン−クリック塩基対合に基づいている場合に、本発明者らが１本鎖核酸（たとえばｓｓＤＮＡやＲＮＡ）プローブと２本鎖核酸（たとえばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された３重鎖を特異的にアッセイすることが可能であったことは、驚くべきことである。本明細書中で使用する用語「ワトソン‐クリック３重鎖」は、１本鎖プローブと２本鎖標的の間の塩基対合の性質をＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐Ｇおよび／またはＣ‐Ｇ‐Ｃ（Ｃ＋‐Ｇ‐Ｃおよび／または任意の他のイオン化された塩基種を含む）に限定することによって、これらの違いを具体化することを意図している。３つのメンバーを含むこれらのグループを、本明細書中では以降ワトソン‐クリック塩基トリプレットと表し、生じた構造をワトソン‐クリック３重鎖と表す。
【００６４】
本発明のアッセイでの使用に適したプローブには、たとえばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび他の帯電していないまたは部分的に帯電した骨格を有する核酸類似体が含まれる。原核細胞および真核細胞の最も小さい一義的ＤＮＡ配列が８〜２０塩基の範囲内であるので、８〜２０塩基の間の任意の長さのプローブ配列が好ましい。ヒトゲノム中の最も小さい一義的配列の長さが１２〜１８塩基であるので、１２〜１８塩基のプローブが特に好ましい。諸実施形態において、５〜３０塩基のプローブが最も好ましい。しかし、複数のより短いプローブを使用して、互いにあいまってヌクレオチド配列を一義的に同定する複数の一義的でない標的配列をその内部に有するヌクレオチド配列を検出することが可能である。プローブの長さは、標的の長さに一致するように選択し得る。
【００６５】
本発明者らは、１本鎖核酸（たとえば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＰＮＡおよび他のＤＮＡまたはＲＮＡ類似体）プローブと２本鎖核酸（たとえば、ｄｓＤＮＡ）標的との間の、ワトソン‐クリック塩基対に依存した様式で形成された多種多様な３重鎖を特異的にアッセイし得るという、驚くべき新事実を発見した。本発明者らは、３重鎖の形成および／または安定化が、被験試料中にインターカレート剤が存在することによって高められることを発見した。
【００６６】
本発明者らは、ワトソン‐クリック３重鎖の形成および／または安定化が、被験試料中に陽イオンが存在することによって高められることを発見した。適切な陽イオンには、Ｎａ＋（好ましくは５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度）、Ｋ＋、および他のアルカリ金属イオンなどの１価の陽イオン；アルカリ土類金属イオン（たとえばＭｇ＋２やＣａ＋２）などの２価の陽イオンおよび２価の遷移金属イオン（たとえばＭｎ＋２、Ｎｉ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２およびＺｎ＋２）；ならびにＣｏ（ＮＨ３）６＋３、３価のスペルミジンおよび４価のスペルミンなどの少なくとも３価の正電荷を帯びている陽イオンが含まれる。Ｍｎ＋２は、好ましくは１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で提供される。Ｍｇ＋２は、好ましくは１５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で提供される。Ｎｉ＋２は、好ましくは約２０ｍＭの濃度で提供される。諸実施形態において、Ｍｇ＋２およびＭｎ＋２がそれぞれ１０ｍＭ、それぞれ１５ｍＭ、またはそれぞれ２０ｍＭ（すなわち、それぞれ１０〜２０ｍＭ）の濃度で組み合わせて提供される。
【００６７】
３重鎖を形成する媒体に加える陽イオンの量は、陽イオンの性質、プローブの濃度、標的の濃度、追加の陽イオンの存在、ならびにプローブおよび標的の塩基含有率を含めたいくつかの要素に依存している。好ましい陽イオンの濃度および混合比は、ごく普通に実験的に見いだすことが可能である。
【００６８】
本発明は、危険な、扱いが面倒で時間のかかる、常に再生させなければならない放射性プローブの使用を必要としない。本発明のプローブは、好ましくは安全に使用でき、何年もの間安定である。したがって、プローブを大量に作製または注文して保管しておくことが可能である。
【００６９】
諸実施形態において、多分子シグナル形成複合体もしくは酸化還元対を用いて、または化学発光もしくは電気化学発光特性を示す標識を用いてプローブを標識する。
プローブまたは標的（好ましくはプローブ）に蛍光標識が共有結合されていることが好ましい。この標識は、好ましくは非インターカレート型のフルオロフォアである。このような実施形態では、フルオロフォアはプローブのいずれかの末端に結合していることが好ましい。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミンおよびフルオレセイン、ならびに励起エネルギーで照射した際に蛍光を発する他のマーカーが含まれる。
【００７０】
使用するフルオロフォアの最大励起に相当するように、（日常的な実験および／または従来の知識によって）励起波長を選択するが、これは好ましくは２００〜１０００ｎｍである。２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するようにフルオロフォアを選択することが好ましい。好ましい実施形態では、アルゴン・イオン・レーザーを使用してフルオロフォアを４００〜５４０ｎｍの範囲の波長を有する光で照射し、５００〜７５０ｎｍの範囲で蛍光発光を検出する。
【００７１】
本発明のアッセイを、広範囲の温度、たとえば５〜８５℃などで実施することが可能である。従来技術のある種のアッセイでは、温度を上昇させることが必要であり、これによりアッセイの費用と遅延時間が増大する。それに対して、本発明は室温またはそれ未満（たとえば２５℃未満の温度）で実施し得る。
【００７２】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニンおよびシトシン含量に依存しない。Ｇ‐Ｃ塩基対は３つの水素結合を形成し、Ａ‐Ｔ塩基対は２つの水素結合しか形成しないので、より高いＧまたはＣ含量を有する標的およびプローブ配列はより安定であり、より高い融解温度を有することになる。したがって、ハイブリダイズしたプローブ標的領域のＧＣ含量を、完全一致したハイブリッド中に存在するものよりも高い値に増加させる塩基対不一致は、プローブの不一致に関連した結合の弱さを相殺するかもしれない。プローブと標的との間に、あらゆる可能な塩基対不一致を含む３重鎖は、インターカレート型フルオロフォアを使用した場合、完全にマッチした３重鎖より不安定であり、常に完全に相補的なハイブリッドより低い蛍光強度を生じることが判明している。
【００７３】
本発明のアッセイは感度が非常に高いので、標的をＰＣＲ増幅する必要性がなくなる。たとえば、１０フェムト・モルの標的および約１０フェムト・モルのプローブを含む、約２０マイクロリットルの体積を有する試験試料をアッセイすることが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度で標的をアッセイするのに十分に高感度である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度のプローブを使用するのに十分高感度である。言うまでもなく、前述の値は、本方法がより高い濃度を検出できないことを示唆するものではない。
【００７４】
３重鎖がその中で形成される媒体は、ヌクレオチドの保存に適することが知られる任意の従来の媒体であり得る。たとえば、非特許文献１３を参照されたい。たとえば、液体媒体は、ヌクレオチド、水、緩衝剤および標準的な塩濃度を含み得る。３重鎖の形成を促進するためにもっぱら２価の陽イオンを使用する場合は、反応混合物中にＥＤＴＡやＥＧＴＡなどキレート剤を含めるべきでない。
【００７５】
相補的な塩基間の特異的な結合は、温度、塩濃度、静電強度、および緩衝剤の組成が多様な広範囲の条件下で起こる。これらの条件およびそれを適用させる方法の例は、当分野で周知である。
【００７６】
約７．６より高いｐＨレベルで不安定または存在できない多くのフーグスティーン型３重鎖とは異なり、本発明のワトソン‐クリック３重鎖は、広範囲のｐＨレベル、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９で安定である。
【００７７】
約５℃〜約２５℃の温度で、約１時間またはそれ未満で３重鎖が形成されることが好ましい。より長い反応時間は必須ではないが、ほとんどの場合、２４時間までのインキュベーションは３重鎖に有害な影響を与えなかった。本発明のワトソン‐クリック３重鎖の速い結合時間は、フーグスティーン３重鎖に基づいたアッセイにおけるはるかに長い結合時間と対照的である。
【００７８】
必須ではないが、陽イオンに加えてある種の試薬を使用することによって溶液中での３重鎖の形成を促進することが可能である。これら試薬の好ましい例には、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１本鎖結合タンパク質などの１本鎖結合タンパク質、核酸の主溝または副溝に結合するタンパク質、ビオロゲン、ならびにエチジウムブロマイド、アクチノマイシンＤ、ソラレン、アンゲリシンなどインターカレート物質が含まれる。このような促進試薬は、極限の操作条件、たとえば異常なｐＨレベルや極めて高い温度において有用であるかもしれない。
【００７９】
本発明のアッセイは、たとえば折りたたまれたヌクレオチド配列中の接近可能な領域を同定すること、ハイブリダイゼーション複合体中の不一致な塩基対の数を決定すること、およびゲノムをマッピングすることに使用し得る。
【００８０】
本発明者らは時に、本明細書中で、プローブが２重鎖標的にハイブリダイズすることによってワトソン‐クリック３重鎖が生じると示唆することがある。プローブに結合されたフルオロフォアは、ワトソン‐クリックの相補塩基の鎖を含む２重鎖標的に曝した際に何らかの結合現象が起こったことを示す蛍光発光の消光を生じたが、本発明者らは、ワトソン‐クリック３重鎖中で起こることが、ワトソン‐クリック２重鎖の形成に従来関連付けられていた意味でのハイブリダイゼーションとして最もよく記述されると確信しているわけではない。本明細書中では、ワトソン‐クリック３重鎖の形成を時にハイブリダイゼーション現象と呼ぶが、これは単に便宜上のために過ぎず、ワトソン‐クリック３重鎖の形成を最も良く特徴付け得る方法に関して、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】
上の「背景技術」セクションで論じた４重鎖とは異なり、本発明の好ましい多重鎖構造は、従来のワトソン‐クリック結合法則に従って結合された少なくとも４本の核酸の鎖を含む。
【００８２】
本明細書中で使用する用語「ワトソン‐クリック結合」とは、一致した対向する塩基を介した、対向する核酸（および／または核酸類似体）鎖の対の間の特異的な会合を定義することを意図する。ワトソン‐クリック４重鎖の形成を本明細書中で時にハイブリダイゼーション現象と呼ぶが、これは単に便宜上のために過ぎず、ワトソン‐クリック４重鎖の形成を最も良く特徴付け得る方法に関して、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
本発明の多重鎖構造は好ましくは４重鎖である。多重鎖の各鎖が独立して核酸または核酸類似体を含む。適切な核酸には、たとえばＤＮＡやＲＮＡが含まれる。好ましい核酸類体は、帯電していないまたは部分的に帯電した骨格（すなわち、天然のＤＮＡ骨格のような負の電荷ではない電荷を有する骨格）を含む。
【００８４】
特定の実施形態では、４本鎖の４重鎖内の第２鎖および第４鎖のうち一方がＤＮＡを含み、第２鎖および第４鎖のうち他方がＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、第２鎖および第４鎖は互いに平行で相同である。これらの実施形態では、第１鎖と第２鎖の主溝が第３鎖と第４鎖の副溝内に配置される。
他の実施形態では、第２鎖および第４鎖は互いに平行で相補的である。「入れ子型相補性（ｎｅｓｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」を有するこれらの実施形態では、第１鎖と第２鎖の主溝が第３鎖と第４鎖の副溝内に配置される。
【００８６】
特定の実施形態では、各核酸塩基は２つ以上の他の核酸塩基と結合しない。これらの実施形態の一部では、第２鎖の塩基が（ワトソン‐クリック法則によって）第１鎖の一致塩基および第４鎖の一致塩基に特異的に結合し、第４鎖の塩基が（ワトソン‐クリック法則によって）第３鎖の一致塩基および第２鎖の一致塩基に特異的に結合し、第１鎖および第３鎖の塩基はそれぞれ１つ以上の他の塩基に結合しない。したがって、このような実施形態には、従来のワトソン‐クリック塩基対に加えてＡ‐Ｔ‐Ａ、Ｔ‐Ａ‐Ｔ、Ｕ‐Ａ‐Ｔ、Ｔ‐Ａ‐Ｕ、Ａ‐Ｕ‐Ａ、Ｕ‐Ａ‐Ｕ、Ｇ‐Ｃ‐Ｇおよび／またはＣ‐Ｇ‐Ｃ（Ｃ＋‐Ｇ‐Ｃおよび／または任意の他のイオン化された塩基の種を含む）のワトソン‐クリック塩基トリプレットが含まれる。
【００８７】
特定の実施形態では、（ａ）第１鎖および第２鎖の対向塩基の結合、（ｂ）第３鎖および第４鎖の対向塩基の結合、ならびに（ｃ）第２鎖および第４鎖の対向塩基の結合、に加えて、第１鎖および第３鎖の対向塩基も互いに結合すると考えられている。
【００８８】
本発明の多重鎖構造の特定の実施形態では、どの鎖も別の鎖に連続していない。すなわち、少なくとも４本の別々の鎖が存在する。折りたたみ立体構造など（たとえばヘアピンターンなど）は本発明の範囲内にあるが、１本鎖の折りたたみ部分があっても、その鎖は、最小限４本の別々の鎖となるように２本以上には数えられない。
【００８９】
フーグスティーン結合および／またはＧ‐Ｇ４量体がわずかに存在していてもよいが、本発明の多重鎖構造は、多重鎖構造を維持するためにフーグスティーン結合やＧ‐Ｇ４量体に依存しないことが好ましい。すなわち、本発明の多重鎖構造は、実質的にフーグスティーン結合を含まず、実質的にＧ‐Ｇ４量体を含まないことが好ましい。
【００９０】
特定の実施形態では、多重鎖の第１鎖および第２鎖は５〜５０塩基長（より好ましくは５〜３０塩基長）であり、第３鎖および第４鎖は８〜３．３×１０９塩基対長である。たとえば、第１鎖および第２鎖は２本鎖プローブを構成し得、第３鎖および第４鎖はハプロタイプを含み得るゲノムＤＮＡなど２本鎖標的を構成し得る。
【００９１】
諸実施形態において、第３鎖および第４鎖はＰＣＲで増幅した産物である。
本発明の多重鎖は、溶液中、固体の支持体上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで存在し得る。固体の支持体は、導電性（たとえば電極）または非導電性であり得る。
【００９２】
本発明による４重鎖の形成は、様々な用途に適している。たとえば、２本鎖核酸の標的配列を特異的に切断するために、２本鎖核酸切断剤に共有結合させた２本鎖プローブを使用し得る。２本鎖核酸の標的配列を特異的に処置するために、化学療法剤に共有結合させた２本鎖プローブを使用し得る。したがって、本発明は、第１鎖、第２鎖、第３鎖および第４鎖のうち少なくとも１つに結合された治療剤、予防剤、または診断剤をさらに含む多重鎖構造を包含する。
【００９３】
さらに、本発明の多重鎖は、分子（すなわちナノスケールの）レベルに電気回路を与えるためなどナノエンジニアリングでの使用に適している。核酸を用いたナノエンジニアリングに関するさらなる詳細は、（特許文献１１）およびそれに引用されている参考文献に出ている。
【００９４】
本発明の多重鎖構造は、第１鎖、第２鎖、第３鎖、第４鎖、水、緩衝剤および促進剤を含むハイブリダイゼーション媒体を提供すること、ならびに第２鎖を第４鎖にハイブリダイズさせるのに十分なインキュベーション時間、ハイブリダイゼーション媒体をインキュベートすることを含む方法によって提供し得る。
【００９５】
ハイブリダイゼーション媒体は、ヌクレオチドの保存に適切であることが知られている任意の従来の媒体を含み得る。たとえば、非特許文献１３を参照されたい。たとえば、媒体には、ヌクレオチド、水、緩衝剤、および標準的な塩濃度を含めることが可能である。４重鎖の形成を促進するためにもっぱら２価の陽イオンを使用した場合は、ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどキレート剤を反応混合物中に含めるべきでない。
【００９６】
相補的な塩基間の特異的な結合は、温度、塩濃度、静電強度、および緩衝剤の組成が多様な広範囲の条件下で起こる。これらの条件およびそれを適用させる方法の例は、当分野で周知である。
【００９７】
約７．６より高いｐＨレベルで不安定または存在できない多くのフーグスティーン型多
重鎖とは異なり、本発明のワトソン‐クリック多重鎖は、広範囲のｐＨレベル、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９で安定である。
【００９８】
さらに本発明の多重鎖は、一部の従来技術の４重鎖のようにホモピリミジン配列やホモプリン配列の存在を必要としない。たとえば、この標的配列は２５％〜７５％のプリン塩基および７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含み得る。
【００９９】
約５℃〜約２５℃の温度で、約２時間またはそれ未満で多重鎖が形成されることが好ましい。インキュベーション時間は、室温でも５分未満であることが好ましい。より長い反応時間は必須ではないが、ほとんどの場合で２４時間までのインキュベーションは４重鎖に有害な影響を与えなかった。本発明のワトソン‐クリック４重鎖の速い結合時間は、フーグスティーン４重鎖におけるはるかに長い結合時間とは対照的である。
【０１００】
ハイブリダイゼーション媒体中の促進剤は、インターカレート剤または陽イオンであることが好ましい。インターカレート剤は、たとえば、ＹＯＹＯ‐１、ＴＯＴＯ‐１、エチジウムブロマイド、エチジウム・ホモ２量体‐１、エチジウム・ホモ２量体‐２、およびアクリジンからなる群から選択されるメンバーなどフルオロフォアであり得る。
【０１０１】
適切な陽イオンには、Ｎａ＋（好ましくは５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で）、Ｋ＋、および他のアルカリ金属イオンなど１価の陽イオン；アルカリ土類金属イオン（たとえばＭｇ＋２やＣａ＋２）および２価の遷移金属イオン（たとえばＭｎ＋２、Ｎｉ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２およびＺｎ＋２）など２価の陽イオン；ならびにＣｏ（ＮＨ３）６＋３、３価のスペルミジンおよび４価のスペルミンなど少なくとも３価の正電荷を帯びている陽イオンが含まれる。Ｍｎ＋２は、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｍｇ＋２は、１０ｍＭ〜４５ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｎｉ＋２は、約２０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。諸実施形態において、Ｍｇ＋２およびＭｎ＋２がそれぞれ１０ｍＭ、それぞれ１５ｍＭ、それぞれ２０ｍＭ、それぞれ２５ｍＭ、それぞれ３０ｍＭ、それぞれ３５ｍＭ、またはそれぞれ４０ｍＭ（すなわち、それぞれ１０〜４０ｍＭ）の濃度で組み合わせて提供される。
【０１０２】
多重鎖を形成する媒体に加える陽イオンの量は、陽イオンの性質、プローブの濃度、標的の濃度、追加の陽イオンの存在、ならびにプローブおよび標的の塩基含有率を含めたいくつかの要素に依存している。好ましい陽イオンの濃度および混合比を、ごく普通に実験的に見いだすことが可能である。
【０１０３】
必須ではないが、他の促進剤には、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１本鎖結合タンパク質など１本鎖結合タンパク質、核酸の主溝または副溝に結合するタンパク質、ビオロゲン、および、アクチノマイシンＤ、ソラレン、アンゲリシンなど追加のインターカレート物質が含まれる。このような促進試薬は、極限の操作条件、たとえば異常なｐＨレベルや極めて高い温度において有用であるかもしれない。
【０１０４】
また、本発明により、第２鎖が第４鎖にハイブリダイゼーションすることにより第３鎖および第４鎖のうち少なくとも１つに関連する活性を不活性化させる方法が可能となる。したがって、第１鎖および第２鎖のうち少なくとも１つがさらに薬剤を含み、第２鎖が第４鎖にハイブリダイゼーションすることにより、薬剤が、第３鎖、第４鎖、または第３鎖および第４鎖のうち少なくとも１つと会合した別の分子上の標的に対して有効な距離に配置される。この薬剤は、臨床的に重要な遺伝子のプロモーター配列に結合するように設計された核酸、臨床的に重要な遺伝子に結合するように設計された核酸、および病原体の複製起点に結合するように設計された核酸からなる群から選択されるメンバーであることが
好ましい。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本発明は、標的が核酸配列または核酸類似体配列を含み、プローブが核酸配列または核酸類似体配列を含む、１本鎖標的または２本鎖標的と２本鎖プローブとの間の結合を検定するための、迅速な、高感度の、環境に優しい、安全な方法を提供する。
【０１０６】
本発明のアッセイを、たとえば折りたたまれたヌクレオチド配列中の接近可能な領域を同定すること、ハイブリダイゼーション複合体中の不一致な塩基対の数を決定すること、およびゲノムをマッピングすることに使用し得る。
【０１０７】
本発明は、特異的なプローブ‐標的結合の存在を検出するだけでなく、プローブと標的との相互作用の性質に関する定性的および定量的な情報も提供する。したがって、本発明により、実行者が２本鎖プローブの配列と２本鎖標的の配列との間に生じる完全一致、１塩基対の不一致、２塩基対の不一致、３塩基対の不一致、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失、および３塩基対の欠失を識別することが可能になる。
【０１０８】
本発明の実施形態は、第１のプローブ‐標的混合物で測定されたシグナル（たとえば蛍光、化学発光、電気化学発光、または電気的な特性）を、同じ標的と混合したそれぞれ少なくとも１塩基が第１のプローブと異なる他のプローブによって示される同種のシグナルに対して較正することを含む。
【０１０９】
測定されたシグナル（たとえば蛍光強度）の大きさが標識とプローブとの間の結合親和性の関数である較正曲線を作成することが可能である。標的と多数の異なるプローブとの間の結合親和性は、不一致な塩基の数、不一致の性質（Ａ‐Ｇ対Ａ‐Ｃ対Ｔ‐Ｇ対Ｔ‐Ｃなど）、４重鎖内の不一致の位置などによって変動し得るので、本発明のアッセイを標的の配列を決定するために使用することが可能である。
【０１１０】
様々な実施形態中では、測定されるシグナルは試験試料中に含まれるフルオロフォアの蛍光発光強度であり得る。このような実施形態では、フルオロフォアがシグナル消光とシグナル増幅のどちらによってハイブリダイゼーションのシグナルを示すかに応じて、プローブと標的との間の結合親和性は、発光強度と直接相関または逆相関を示し得る。選択された条件下では、インターカレート剤によって生じた蛍光発光強度はプローブ‐標的結合親和性と直接相関を示し得るが、プローブに共有結合された非インターカレート型のフルオロフォアを使用する好ましい実施形態の発光強度は、プローブ‐標的結合親和性と逆相関を示し得る。好ましくは０〜２塩基の不一致および／または欠失を含む、より好ましくは０〜３塩基の不一致および／または欠失を含むプローブと標的との一致の程度が上昇するに従って、非インターカレート型のフルオロフォアでは蛍光発光強度が低下する。
【０１１１】
本発明により、プローブと標的との間の結合親和性を定量することが可能となる。このような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬剤の設計を含む様々な用途において役に立ち得る。
【０１１２】
本発明のアッセイは、均一系アッセイであることが好ましい。このアッセイは、測定されるシグナルの大きさを検出する前にプローブ−標的複合体を遊離プローブおよび遊離標的から分離せずに、実施することが可能である。このアッセイにはゲル分離工程は必要なく、したがって、試験の処理能力が大きく高まり得る。定量分析は単純で正確である。その結果、この結合アッセイにより多くの時間および費用が節約され、またこのアッセイは容易に自動化し得る。さらに、このアッセイにより、緩衝剤、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブおよび標的配列の相対濃度、インターカレーター濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、ならびに考えられるコファクター（たとえば促進剤）の必要量など結合変数の迅速な決定が可能となる。
【０１１３】
このアッセイを、たとえばウェルまたはマイクロチャネル内の溶液中、不透過性の表面上、あるいはバイオチップ上で実施することが可能である。一部の実施形態では、第３鎖および第４鎖を第１鎖および第２鎖より前にハイブリダイゼーション媒体中に提供し、第１鎖および第２鎖は、脱水された形で提供した後でハイブリダイゼーション媒体と接触することによって再水和する。
【０１１４】
さらに、本発明のアッセイは、標的またはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに実施することが好ましい。
本発明者らは以前にハイブリダイゼーション用の蛍光強度アッセイの利点を開示しているが（たとえば、特許文献１０参照）、本発明の特定の実施形態ではプローブおよび２本鎖標的の４重鎖が特異的に検出されるので、標的を変性させる必要性がなくなる。プローブと標的の間の相互作用が、たとえば（特許文献３）の極めて限定された４重鎖ハイブリダイゼーションのフーグスティーン・モデルではなく、（少なくともＡがＴ（またはＲＮＡの場合はＵ）に結合し、ＧがＣに結合するという意味では）ワトソン−クリック塩基対合に基づいている場合に、本発明者らが２本鎖プローブと２本鎖標的の間に形成された４重鎖を特異的にアッセイすることが可能であったことは、驚くべきことである。
【０１１５】
本発明のアッセイでの使用に適したプローブには、たとえばｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＰＮＡ、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび他の帯電していないまたは部分的に帯電した骨格を有する２本鎖核酸類似体が含まれる。原核細胞および真核細胞の最も小さい一義的ＤＮＡ配列が８〜２０塩基の範囲内であるので、８〜２０塩基の任意の長さのプローブ配列が好ましい。ヒトゲノム中の最も小さい一義的配列の長さが１２〜１８塩基であるので、１２〜１８塩基のプローブが特に好ましい。諸実施形態において、５〜３０塩基のプローブが最も好ましい。しかし、複数のより短いプローブを使用して、互いにあいまってヌクレオチド配列を一義的に同定する、複数の一義的でない標的配列をその内部に有するヌクレオチド配列を検出することが可能である。プローブの長さは、標的の長さに一致するように選択され得る。
【０１１６】
本発明は、危険な、扱いが面倒で時間のかかる、常に再生させなければならない放射性プローブの使用を必要としない。本発明のプローブは、好ましくは安全に使用でき、何年もの間安定である。したがって、プローブを大量に作製または注文して保管しておくことが可能である。
【０１１７】
諸実施形態において、多分子シグナル形成複合体または酸化還元対を用いて、あるいは化学発光または電気化学発光特性を示す標識を用いてプローブを標識する。
蛍光インターカレーターがハイブリダイゼーション媒体中に存在しない場合は、プローブまたは標的（好ましくはプローブ）に蛍光標識が共有結合されていることが好ましい。この標識は、好ましくは非インターカレート型のフルオロフォアまたはインターカレート型フルオロフォアである。このような実施形態では、フルオロフォアはいずれかの末端でプローブに結合していることが好ましい。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミン、アクリジンおよびフルオレセイン、ならびに励起エネルギーを放射した際に蛍光を発光する他のマーカーが含まれる。
【０１１８】
使用するフルオロフォアの最大励起に相当するように、（日常的な実験および／または従来の知識によって）励起波長を選択するが、これは好ましくは２００〜１０００ｎｍである。２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するようにフルオロフォアを選択することが好ましい。好ましい実施形態では、アルゴン・イオン・レーザーを使用してフルオロフォアを４００〜５４０ｎｍの範囲の波長を有する光で照射し、５００〜７５０ｎｍの範囲で蛍光発光を検出する。
【０１１９】
本発明のアッセイを、広範囲の温度、たとえば５〜８５℃などで実施することが可能である。従来技術のある種のアッセイでは、温度を上昇させることが必要であり、これによりアッセイの費用と遅延時間が増大する。それに対して、本発明は、室温またはそれ未満（たとえば２５℃未満の温度）で実施し得る。
【０１２０】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニンおよびシトシン含量に依存しない。Ｇ‐Ｃ塩基対は３つの水素結合を形成し、Ａ‐Ｔ塩基対は２つの水素結合しか形成しないので、より高いＧまたはＣ含量を有するプローブ配列がより安定であり、より高い融解温度を有することになる。したがって、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量を、完全に一致したハイブリッド中に存在するものより高い値に増加させる塩基対の不一致は、不一致なプローブの結合の弱さを相殺するかもしれない。
【０１２１】
本発明のアッセイは感度が非常に高いので、標的をＰＣＲ増幅する必要性がなくなる。たとえば、１０フェムトモルの標的および約１０フェムトモルのプローブを含む、約２０マイクロリットルの体積を有する試験試料をアッセイすることが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度で標的をアッセイするのに十分に高感度である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度のプローブを使用するのに十分高感度である。言うまでもなく、前述の値は、本方法がより高い濃度を検出できないことを示唆するものではない。
【０１２２】
プローブ（たとえば第１鎖および第２鎖）と標的（たとえば第３鎖および第４鎖）の比は３０：１〜１：１、好ましくは約１０：１である。
実施例では、副溝に挿入される周知の２重鎖ＤＮＡインターカレーターであるＹＯＹＯ‐１が、ＤＮＡオリゴと２重鎖標的との３重鎖会合または結合を促進してシグナル形成し得ることが示され、これはオリゴの塩基と２重鎖標的中の相補配列とのワトソン‐クリック塩基対の認識に基づいた相補性度合の指標である。
【０１２３】
ホモピリミジン複合体は強い酸性条件を要するので、観察される３重鎖結合は、文献中で十分に特徴付けられているホモピリミジン３重鎖モチーフの一種ではありえない。同様に、本発明の典型的な野生型の３３％のＧＣ含量を有する１５塩基長のオリゴを２重鎖標的中の「プリンに富んだ鎖」の結合パートナーとして評価した場合、ホモプリン３重鎖モチーフの要件により、本発明のオリゴはオリゴ配列または標的２重鎖のプリンに富んだ鎖上の推定結合部位のどちらかにおいて、９塩基の不一致を有することになる。
【０１２４】
ＹＯＹＯ‐１インターカレーターは、ＮＭＲスペクトル分析研究に基づいて、２重鎖ＤＮＡの副溝内に挿入されると報告されている（非特許文献１４）。また、ＹＯＹＯ‐１が局所的に作用して２重鎖ＤＮＡのＢ型立体構造を１０６°脱凝縮させ、らせん繰り返し単位全体が、Ｂ型立体構造のらせん繰り返し単位で通常みられる１０塩基対に対して、１３塩基対になることも報告されている。
【０１２５】
フルオロフォアとして、ＹＯＹＯ‐１の発光は、２重鎖標的を含む媒体に相補性オリゴを加えることによって大いに高まった。オリゴと２重鎖の相互作用に関連する発光の増大は、ＹＯＹＯ‐１が２重鎖の副溝内に挿入されてオリゴと２重鎖が接触した際に光をより強く発すること、またはオリゴと２重鎖内の相補鎖のそれぞれの塩基が互いに接触した際にＹＯＹＯ‐１が自身の位置すべき第２の適切な場所を該オリゴと２重鎖内の該相補鎖によって形成された溝内に見つけることのどちらかに帰することが可能である。両方の現象が起こっていることも可能である。Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲスペクトル分析などさらなる研究により、ＹＯＹＯ‐１が存在する可能性がある位置およびＹＯＹＯ‐１と天然の３重鎖との間に存在し得る相互作用が確立されるであろう。
【０１２６】
（非特許文献１４）では、２重鎖ＤＮＡの１０６°の脱凝縮は、ポリプロピレン・アミン・リンカー鎖が２重鎖の副溝内にとどまったままでＹＯＹＯ‐１発色基のビスインターカレートが起こることによって引き起こされると結論付けた。これは、標的が１０６°脱凝縮される、すなわちＹＯＹＯ‐１の相互作用部位から両方向に弛緩が生じる機構の一部であるかもしれない。また、２重鎖の骨格の間の副溝内に位置するＹＯＹＯ‐１の＋４の陽イオン性性質がＹＯＹＯ‐１結合部位のすぐ近くのリン酸の陰イオン電荷同士の反発を緩和し、それによりＹＯＹＯ‐１の近傍で骨格の鎖が互いに近づいている可能性もある。オリゴと相補鎖が副溝内で互いに接触する際にそれらにより形成された溝に挿入されることによって、第２のＹＯＹＯ‐１が２重鎖の副溝内に存在しているＹＯＹＯ‐１の近くに位置する場合、このＹＯＹＯ‐１もオリゴ骨格と骨格の相補配列領域との陰イオン性の反発を軽減するように作用するであろう。
【０１２７】
本発明者らは、２重鎖ＤＮＡを凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓｅ）させる試薬が３重鎖の形成を促進する能力を有することを観察した。１価、２価、および多価の陽イオンが２重鎖ＤＮＡを凝縮させる周知の能力に加えて、本発明者らの結果は、陽イオンがオリゴ内の塩基と２重鎖の相補鎖内の塩基との結合を可能にする架橋を形成することを示唆している。本発明者らは、まず陽イオンによって促進される３重鎖の形成と、続くこの架橋構造の破壊とによってこれを示した。陽イオンおよび３重鎖が存在していた媒体を連続的にレーザー照射した結果、すべての３重鎖構造が迅速に消失した。
【０１２８】
ＹＯＹＯ‐１によって促進された３重鎖に関する本発明者らの経験では、これらは室温で容易に形成され、形成された後は何時間も持続する。長時間にわたって不一致なオリゴは変わらず下方レベルの蛍光を発し続け、３重鎖形成が同じレベルにあることが示唆された。他方で、陽イオンは３重鎖または４重鎖の形成に役立つ一過性の状態をもたらすようである。陽イオンには、ＹＯＹＯ‐１などインターカレーター、ＭｇＣｌ２など金属の中心陽イオン、またはスペルミジンなど陽イオン性ペプチドが含まれ、これらはすべて、２重鎖ＤＮＡ標的の立体構造の改変をもたらす負の帯電との相互作用によって、立体構造に作用する。結果は陽イオンの種類、濃度、または様々な濃度の複数種の存在によって変わった。
【０１２９】
本発明者らは、３重鎖の発生を可能にする標的２重鎖ＤＮＡの改変が、適切な濃度の有機溶媒によって可能になることを示した。
３重鎖および４重鎖形成のほとんどにおける一過性の性質は、２重鎖ＤＮＡから配列情報を入手することを含む多くの過程が容易に可逆的、すなわち活性化され停止される、という生物体の要件に合致している。それにもかかわらず、このような形成は診断および他のアッセイをこれに基づいて行うのに十分安定である。
【０１３０】
したがって、本発明者らは、オリゴ上の少なくとも１つの塩基と２重鎖標的の相補鎖内の塩基とを接触させるのに十分なオリゴと相補配列の認識を可能にするのは、何らかの手段による２重鎖ＤＮＡの凝縮または脱凝縮であることを発見した。らせん状繰り返し単位の大きさを凝縮または脱凝縮によって改変した場合、おそらくは、通常は配列中の隣接する塩基対によって占められている位置からいくつかが離脱する。改変らせんにおける積み重ねられた塩基対の再整列により、改変されていない２重らせんの積み重ね塩基内に存在する電子軌道が十分変化する可能性が最も高くなり、第３鎖の相補鎖への結合開始が可能性となる。
【０１３１】
凝縮または脱凝縮のいずれかによる２重鎖の改変は、ｄｓＤＮＡ中および近傍のすべての陰イオン電荷に概ね同時に作用してかなり均一に起こる可能性があるが、あるいは改変は局所的に起こるかもしれない。後者の場合は、改変される座位から離れた場所で、一連の非常に多様な改変が、ＤＮＡ塩基対および骨格中で進行的に起こる。どちらの場合でも、オリゴ上の塩基と２重鎖の相補鎖内の塩基とが結合して３重鎖対合が生じる条件を作り出すことが可能である。このような結合が開始された後は、オリゴ上の塩基の２つのフランキング配列がどのように２重鎖の相補鎖のフランキング配列内の塩基に結合する位置に移動するかは理解可能であろう。
【０１３２】
本発明者らの実験ではＹＯＹＯ‐１によって促進された３重鎖の優れた安定性が示されるが、多くの他の試薬も２重鎖ＤＮＡの立体構造に影響を与えて天然の３重鎖が一過的に形成される。これらの３重らせん構造は３重鎖の維持に不利な立体構造へと進行し続け、その結果３重鎖構造が失われる。
【０１３３】
標的ｄｓＤＮＡの立体構造を改変させる作用を有するどのような作用剤も、選択した温度、ｐＨなどの条件に適した濃度およびインキュベーション時間を確立するために、その経時的な効果をモニターしなければならない。本出願は、このような試薬を評価する多くの方法であって、本明細書中の教示内容を実行するための、当分野の技術者によって使用可能または改変可能な方法を教示している。
（実施例）
以下の実施例を参照しながら本発明をより詳細に例示するが、本発明がこれだけに限定されないことを理解されたい。
【０１３４】
以下の実施例を参照しながら本発明をより詳細に例示するが、本発明がこれだけに限定されないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１３５】
実施例１では、陽イオン性ＤＮＡインターカレーター、ＹＯＹＯ‐１（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）［米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在］）が存在する場合に、本発明のアッセイによって、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と、１ｂｐ、２ｂｐおよび３ｂｐの不一致または欠失を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体とが識別可能であることを実証する。ＹＯＹＯ‐１とｄｓＤＮＡとの間の相互作用機構のＮＭＲ分光分析により、ＹＯＹＯ‐１のインターカレーションによってｄｓＤＮＡらせんの１０６°の局所的な脱凝縮がもたらされ、らせん状繰り返し単位全体が、非凝縮状態のＢ型立体構造のｄｓＤＮＡの通常の１０塩基対らせん状繰り返し単位に対して、１３塩基対になることが示された（非特許文献１５）。
【０１３６】
ヒト嚢胞性繊維症遺伝子のエキソン１０由来の相補的なセンスおよびアンチセンスの５０塩基長ｓｓＤＮＡ標的配列（非特許文献１６）を、ＤＮＡ合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で合成し、ＨＰＬＣで精製した。等モル量の相補オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間加熱し、１．５時間かけて温度を２１℃まで冷やしながら徐々にアニーリングさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｄＨ２Ｏに溶かして１ｐｍｏｌ／μｌの濃度とした。
【０１３７】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ‐３’であった。
【０１３８】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ‐３’であった。
【０１３９】
配列番号２は、野生型のセンス鎖配列ＣＡＴがＣ［Ｇ］Ｔに変化したアミノ酸５０７位における１塩基対の変異（［］内）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【０１４０】
配列番号２のセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  Ｃ［Ｇ］Ｔ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ‐３’であった。
【０１４１】
配列番号２のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ［Ｃ］ＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ‐３’であった。
【０１４２】
配列番号３は、野生型のセンス鎖配列ＣＡＴが［ＡＣ］Ｔに変化したアミノ酸５０６位および５０７位における連続２塩基対の変異（［］内）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【０１４３】
配列番号３のセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ［ＡＣ］Ｔ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ‐３’であった。
【０１４４】
配列番号３のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ［ＧＴ］Ａ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ‐３’であった。
【０１４５】
配列番号４は、野生型のセンス鎖配列ＣＡＴが［ＡＣＧ］に変化したアミノ酸５０６位および５０７位における連続３塩基対の変異（［］内）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【０１４６】
配列番号４のセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ［ＡＣＧ］  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ‐３’であった。
【０１４７】
配列番号４のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧ［Ｃ  ＧＴ］Ａ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ‐３’であった。
【０１４８】
配列番号５は、野生型のセンス鎖配列ＣＴＴが欠失したアミノ酸５０７位および５０８位における連続３塩基対の欠失（３つの点によって示した）以外は野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同一である、４７塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【０１４９】
配列番号５のセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ・・・  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＡ‐３’であった。
【０１５０】
配列番号５のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡ・  ・・Ａ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＣＡ‐３’であった。
【０１５１】
プローブ番号１は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチド長のセグメントに完全に相補的であるように設計された、アミノ酸５０５位〜５１０位に重なる１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブであった（非特許文献１５）。プローブのキラリティーは、標的のセンス鎖のものとは逆または逆平行であった。プローブ番号１をＤＮＡ合成機で合成し、ＨＰＬＣで精製し、ｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度１ｐｍｏｌ／μｌとした。
プローブ番号１の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０１５２】
ハイブリダイゼーション反応混合物（１２０μｌ）には、６ｐｍｏｌの標的ｄｓＤＮＡ、６ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）［米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在］）を含めた。この反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベット内に入れ、加熱したチャンバ内で、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して温度が時間とともに上昇する間の蛍光発光を繰り返しモニターした。試料の同時温度測定は、各試料内に直接配置した、ソフトウェア制御の温度プローブによって行った。分析した各試料について、最大蛍光強度を温度の関数としてプロットした。
【０１５３】
図１は、野生型の５０塩基長の非変性ｄｓＤＮＡ標的配列（配列番号１）を１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブ番号１と、３０℃〜８５℃で反応させた場合に最も高い蛍光強度が得られたことを示している。５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡのＴｍである６５℃未満の温度ではｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成され、これはＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１によって促進された。温度が上昇して６５℃を超えるにつれて、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体がｓｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体に変換された。明らかに、ＹＯＹＯ‐１はどちらの複合体種でもインターカレートして効率よく蛍光を発することが可能であった。
【０１５４】
それとは対照的に、１ｂｐの不一致（配列番号２＋プローブ番号１）、連続２ｂｐの不一致（配列番号３＋プローブ番号１）、連続３ｂｐの不一致（配列番号４＋プローブ番号１）および３ｂｐの欠失（配列番号５＋プローブ番号１）を生じる相補性が不完全なプローブと標的の組み合わせでは、完全に一致した配列で観察された蛍光強度に比べてそれぞれ３０℃で５７％、９４％、９７％および９８％低く、６５℃で４７％、７９％、９２％および９１％低い蛍光強度がもたらされた（図１）。５０塩基長のｄｓＤＮＡ標的と５００ｎＭのＹＯＹＯ‐１とを含む対照試料では、３ｂｐが不一致の複合体において３０℃で観察される蛍光レベルと同じまたはそれ以下の蛍光レベルが示された（データ示さず）。ｓｓＤＮＡプローブ番号１と５００ｎＭのＹＯＹＯ‐１との試料から放出される蛍光レベルは、ＹＯＹＯ‐１単独で放出されるものと同一であった（データ示さず）。温度が上昇して６５℃を超えると、完全一致と塩基対の不一致の識別の度合が低下するが、これは、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ構造が徐々に崩壊していることを示している。８５℃では、１ｂｐの不一致、２ｂｐの不一致、３ｂｐの不一致および３ｂｐの欠失によって得られる蛍光強度は、完全一致によって得られる蛍光強度より４０％、６３％、９２％および８３％低かった（図１）。すべての温度で、各複合体から放出される蛍光の特徴的なレベルを経時的にモニターしたところ、５分〜２４時間まで安定であった。
【０１５５】
ＤＮＡ脱凝縮剤であるＹＯＹＯ‐１の存在により、ｄｓＤＮＡ標的を事前に変性させる必要性なしに、ｓｓＤＮＡプローブを使用して、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と、１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐの不一致または欠失を含む複合体とを区別することが可能となった。
【実施例２】
【０１５６】
ＤＮＡ脱凝縮剤、ｓｓＤＮＡプローブ、および非変性ｄｓＤＮＡ標的を使用した蛍光強度アッセイが、劇的に異なるＧＣ含量（および潜在的に異なるアニーリング温度）を有するプローブおよび標的ＤＮＡに適用し得るようにするために、上記のように新しい１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブおよび５０塩基長のｄｓＤＮＡ標的配列を合成し、精製し、アニーリングさせた。ｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的のどちらも、ｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度１ｐｍｏｌ／μｌとした。
【０１５７】
配列番号６は、ＧＣ含量を３０％から５２％に変化させた、配列番号１を改変した５０塩基長のｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号６）のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１５８】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号６）のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１５９】
配列番号７は、センス鎖配列ＣＴＣがＣＴ［Ｔ］に変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号７のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴ［Ｔ］  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１６０】
変異配列番号７のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡ［Ａ］  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１６１】
配列番号８は、センス鎖配列ＣＡＴがＣ［Ｇ］Ｔに変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号８のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  Ｃ［Ｇ］Ｔ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１６２】
変異配列番号８のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ［Ｃ］ＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１６３】
配列番号９は、センス鎖配列ＣＡＴがＣ［Ｔ］Ｔに変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号９のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  Ｃ［Ｔ］Ｔ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１６４】
変異配列番号９のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ［Ａ］ＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１６５】
配列番号１０は、センス鎖配列ＣＴＣがＣ［Ｃ］Ｃに変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１０のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  Ｃ［Ｃ］Ｃ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１６６】
変異配列番号１０のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ［Ｇ］ＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１６７】
配列番号１１は、センス鎖配列ＣＴＣがＣ［Ｇ］Ｃに変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１１のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  Ｃ［Ｇ］Ｃ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１６８】
変異配列番号１１のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ［Ｃ］ＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１６９】
配列番号１２は、センス鎖配列ＣＡＴが［ＡＣ］Ｔに変化した連続２塩基対の変異（［］内）以外は配列番号６と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１２のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ［ＡＣ］Ｔ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ‐３’であった。
【０１７０】
変異配列番号１２のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ［ＧＴ］Ａ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１７１】
配列番号１３は、ＧＣ含量を３０％から７２％に変化させた、配列番号１を改変した５０塩基長のｄｓＤＮＡ標的配列であった。
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ‐３’であった。
【０１７２】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１７３】
配列番号１４は、センス鎖配列ＣＧＴがＣ［Ａ］Ｔに変化した１塩基対の変異（［］内）以外は配列番号１３と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
変異配列番号１４のセンス鎖の配列番号は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  Ｃ［Ａ］Ｔ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ‐３’であった。
【０１７４】
変異配列番号１４のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ［Ｔ］ＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１７５】
配列番号１５は、センス鎖配列ＣＧＴが［ＡＴ］Ｔに変化した連続２塩基対の変異（［］内）以外は配列番号１３と同一である、５０塩基長の変異ｄｓＤＮＡ標的配列であった。
【０１７６】
変異配列番号１５のセンス鎖の配列は、
５’‐ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ［ＡＴ］Ｔ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧ‐３’であった。
【０１７７】
変異配列番号１５のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ［ＡＴ］Ａ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ‐３’であった。
【０１７８】
プローブ番号２は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号６）のセンス鎖の１５ヌクレオチド長のセグメントに完全に相補的であるように設計された、１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブであった。プローブのキラリティーは、標的内のセンス鎖と逆または逆平行であった。
プローブ番号２の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ‐３’であった。
【０１７９】
プローブ番号３は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のセンス鎖の１５ヌクレオチド長のセグメントに完全に相補的であるように設計された、１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブであった。プローブのキラリティーは、標的内のセンス鎖と逆または逆平行であった。
【０１８０】
プローブ番号３の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ‐３’であった。
ハイブリダイゼーション・アッセイ条件は、実施例１に記載したものと同一であった。
【０１８１】
ｓｓＤＮＡプローブ番号２（５３％のＧＣ含量を有する）を、５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号８および配列番号１２）と反応させた場合に、低温度、非変性条件下でｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成された（図２Ａ）。完全一致したＤＮＡ複合体で最も高い蛍光強度が得られたが、１ｂｐの不一致（配列番号８＋プローブ番号２）および連続した２ｂｐの不一致（配列番号１２＋プローブ番号２）を有する相補性が不完全な複合体では、完全一致した配列について３０℃で観察された蛍光強度に比べてそれぞれ６３％および９５％低い蛍光強度が生じた（図２Ａ）。温度が上昇するにつれて、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が徐々に崩壊し、その結果、蛍光強度が低下して完全一致と塩基対不一致の識別能力が低下した。８５℃では、完全一致した配列と塩基対不一致を含む配列との間で、僅かな蛍光の差しか見られなかった（図２Ａ）。
【０１８２】
同様に、ＹＯＹＯ‐１の存在下では、ｓｓＤＮＡプローブ番号３（７３％のＧＣ含量を有する）を、対応する５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１３）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１４および配列番号１５）と反応させた場合に、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が形成された。１ｂｐが不一致のＤＮＡ複合体（配列番号１４＋プローブ番号３）および連続した２ｂｐが不一致のＤＮＡ複合体（配列番号１５＋プローブ番号３）の蛍光強度は、完全一致した配列について３０℃で得られる蛍光強度よりそれぞれ４８％および６４％低かった（図２Ｂ）。温度が３０℃から８５℃に上昇するにつれて、すべての試料の蛍光が低下したが、これは、ＹＯＹＯ‐１結合が低減したこと、およびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体が崩壊したことを示している。
【０１８３】
ｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的のＧＣ含量にかかわらず、ＹＯＹＯ‐１は非変性条件下でｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成を促進することができ、完全に相補的な配列と１または２ｂｐの変異を含む配列とを正確に識別することが可能であった。
【実施例３】
【０１８４】
以下の実施例では、非変性ｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブを用いた複合体の形成を促進し安定化させる、様々なＤＮＡ凝縮剤を利用したアッセイの特異性を実証する。
【０１８５】
プローブ番号４は、５’位に結合したフルオレセイン部分を有すること以外はプローブ番号１と同一である、１５塩基長の逆平行ｓｓＤＮＡプローブであった。プローブ番号４をＤＮＡ合成機で合成し、ＨＰＬＣで精製し、ｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度１ｐｍｏｌ／μｌとした。
プローブ番号４の配列は、
５’‐Ｆｌｕ‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０１８６】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ番号４、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０ｍＭ〜１２５ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。事前にｄｓＤＮＡ標的を変性させずにこの反応混合物を室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベット内に入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して蛍光発光をモニターした。最大の蛍光強度は、フルオレセインの発光波長である５２５ｎｍの波長で生じた。分析した各試料について、蛍光発光の強度を波長の関数としてプロットした。
【０１８７】
ＮａＣｌが存在しない場合、あるいは１０ｍＭまたは２５ｍＭのＮａＣｌが存在する場合、ｄｓＤＮＡ標的と逆平行ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブとの結合は検出されなかった（データ示さず）。
【０１８８】
５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で１時間インキュベーションした後、完全に相補的な配列（配列番号１＋プローブ番号４）からなるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体がすぐに形成され、対照プローブ番号４（標識したｓｓＤＮＡ‐Ｆ）によって放出される蛍光発光強度に比べて４９％の減少がもたらされた（図３）。それとは対照的に、１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致を含む（配列番号２＋プローブ番号４）、相補性が不完全なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体では、プローブ番号４の対照試料が示す蛍光発光強度に比べて１１％の減少が得られた。
【０１８９】
反応混合物中に７５ｍＭ、１００ｍＭおよび１２５ｍＭのＮａＣｌが存在する結果、やはり完全一致した配列番号１の標的と逆平行プローブ番号４との間での有意な量の複合体形成に適合する蛍光発光の消光がもたらされるが、１ｂｐのＧ‐Ｔが不一致な配列番号２の標的およびプローブ番号４が存在していた場合は消光が有意に低減され、５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で観察される蛍光強度と類似の蛍光強度が生じた（データ示さず）。
【０１９０】
周知のＤＮＡ凝縮剤である１価の陽イオンを使用すると、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識された逆平行ｓｓＤＮＡプローブとの間のＤＮＡ複合体形成が促進され、完全に相補的なＤＮＡ配列と単一の１ｂｐの不一致を含む配列との確実な識別が可能になった。この反応は、室温で１時間以内のインキュベーションで、プローブと標識の比１０：１で起こった。この実施例中で使用したｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡプローブは、３３％のＧＣ含量を含んでいたが、ＤＮＡのホモプリン配列またはホモピリミジン配列は含まなかった。１５ヌクレオチドのｓｓＤＮＡプローブ内に分散された６個のピリミジン塩基の存在にもかかわらず、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は配列特異的な様式で容易に形成された。
【実施例４】
【０１９１】
陽イオンなどＤＮＡ凝縮剤の存在下で５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブおよび非変性ｄｓＤＮＡ標的を使用する蛍光強度アッセイが、劇的に異なるＧＣ含量（および潜在的に異なるアニーリングの優先傾向）を有するプローブおよび標的ＤＮＡに適用し得るようにするために、（多様なＧＣ含量を有する）１５塩基長のｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブおよび５０塩基長のｄｓＤＮＡ標識配列を合成し、精製し、上記のようにアニーリングさせた。ｓｓＤＮＡ‐ＦプローブとｄｓＤＮＡ標的のどちらもｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度を１ｐｍｏｌ／μｌとした。
【０１９２】
プローブ番号５は、５’位にフルオレセイン部分（ｍｏｉｅｔｙ）が結合している以外はプローブ番号２と同一である、１５塩基長の逆平行ｓｓＤＮＡプローブであった。
プローブ番号５の配列は、
５’‐Ｆｌｕ‐ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ‐３’であった。
【０１９３】
プローブ番号６は、５’位にフルオレセイン部分が結合している以外はプローブ番号３と同一である、１５塩基長の逆平行ｓｓＤＮＡプローブであった。
プローブ番号６の配列は、
５’‐Ｆｌｕ‐ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＣＧ‐３’であった。
【０１９４】
反応混合物中に１価の陽イオンを加えることによって実施例３で実施したアッセイを促進させた。様々なＧＣ含量を有するｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブを用いた複合体形成を促進するために（１価の陽イオンの代わりに）２価の陽イオンを利用して、このアッセイの特異性をさらに調査した。
【０１９５】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５および５ｍＭ〜３０ｍＭのＭｎＣｌ２または５ｍＭ〜３０ｍＭのＭｇＣｌ２または５ｍＭ〜３０ｍＭのＮｉＣｌ２を含んでいた。事前にｄｓＤＮＡ標的を変性させずにこの反応混合物を室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベット内に入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して蛍光発光をモニターした。最大の蛍光強度は、フルオレセインの発光波長である５２５ｎｍの波長で生じた。分析した各試料について、蛍光発光の強度を波長の関数としてプロットした。
【０１９６】
１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下でｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５（５３％のＧＣ含量を有する）を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７〜配列番号１２）と共にインキュベートした場合に、非変性条件下、室温でｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体が形成された。完全一致したＤＮＡ複合体は最大の蛍光強度の低下（１時間のインキュベーション後に４３％の低下）をもたらしたが、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号７＋プローブ番号５）を含むより不安定なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は、１時間のインキュベーション後にプローブ番号５単独で観察された蛍光強度より２０％低い蛍光強度を生じた（図４）。１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致（配列番号８＋プローブ番号５）、１ｂｐのＴ‐Ｔ不一致（配列番号９＋プローブ番号５）、１ｂｐのＣ‐Ａ不一致（配列番号１０＋プローブ番号５）ならびに連続２ｂｐのＡ‐ＧおよびＣ‐Ｔ不一致（配列番号１２＋プローブ番号５）を生じたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体はすべて、完全一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号６＋プローブ番号５）より不安定であり、プローブ番号５単独で観察された蛍光強度と完全一致したＤＮＡ複合体で観察された蛍光強度の中間の蛍光強度をもたらした（データ示さず）。最も不安定であった（１時間後に蛍光強度が５％しか低下しなかった）、１ｂｐのＴ‐Ｔ不一致のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体を除き、他の不一致なＤＮＡ複合体はすべて非常に類似した蛍光強度を生じた。１ｂｐのＧ‐Ａ不一致（配列番号１１＋プローブ番号５）を含んだｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体だけが、完全一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体によって生じる蛍光強度より低い蛍光強度を生じた（データ示さず）。
【０１９７】
ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号６（７３％のＧＣ含量を有する）を対応する５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１３）および変異ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１４）と１時間反応させた場合、２０ｍＭのＭｇＣｌ２または２０ｍＭのＭｎＣｌ２または２０ｍＭのＮｉＣｌ２を含めることによっても、やはりｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が促進された（データ示さず）。予測どおり、完全一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は最大の蛍光強度の低下をもたらしたが、１ｂｐのＡ‐Ｃ不一致のより不安定なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号１４＋プローブ番号６）は、中程度の蛍光を生じた（データ示さず）。
【０１９８】
完全一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（３３％のＧＣ含量を有する）（配列番号１＋プローブ番号４）は１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で１時間以内に容易に形成され、プローブ番号４単独による発光に比べて蛍光強度が５７％低下した（データ示さず）。これらの反応条件は１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号２＋プローブ番号４）にとって非常に不利であり、プローブ番号４単独によって観察された蛍光より増大した蛍光が生じた（データ示さず）。
【０１９９】
ｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡプローブのＧＣ含量にかかわらず、Ｍｎ＋２、Ｍｇ＋２またはＮｉ＋２など２価の陽イオンを加えることにより非変性条件下でのｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成が促進され、完全に相補的な配列と１ｂｐの変異を含む配列とを正確に識別することが可能になる。
【実施例５】
【０２００】
実施例３および実施例４のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体形成アッセイは、１種類の１価または２価の陽イオンの存在下で行った。以下の実施例では、複合体形成の促進剤として２価の陽イオンの組合せを使用した場合のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体における完全一致と１ｂｐの不一致とを区別する際の本発明のアッセイの信頼性を実証する。
【０２０１】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５ならびにそれぞれ５ｍＭ〜２０ｍＭのＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含んでいた。事前にｄｓＤＮＡ標的を変性させずにこの反応混合物を室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベット内に入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光強度を波長の関数としてプロットした。
【０２０２】
２０ｍＭのＭｇＣｌ２および２０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で逆平行ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号６（７３％のＧＣ含量を有する）を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１３）と１時間インキュベートした場合に、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体が効率的に形成され、プローブ番号６単独による発光に比べて蛍光が４６％低下した（図５Ａ）。これらの反応条件は１ｂｐのＡ‐Ｃ不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号１４＋プローブ番号６）にとって非常に不利であり、プローブ番号６単独によって観察されたものに比べて蛍光の低下は３％であった（図５Ａ）。１０ｍＭのＭｇＣｌ２と１０ｍＭのＭｎＣｌ２、または１５ｍＭのＭｇＣｌ２と１５ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で同じ試料を１時間インキュベートした場合にも非常に類似した結果が得られた（データ示さず）。５ｍＭのＭｇＣｌ２と５ｍＭのＭｎＣｌ２の添加では、１時間のインキュベーション後に逆平行ｓｓＤＮＡ−Ｆプローブ番号６と試験したすべてのｄｓＤＮＡ標的との間に複合体を形成させるのには不十分であった（データ示さず）。
【０２０３】
１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２存在下で逆平行ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号４（３３％のＧＣ含量を有する）を野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）または変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２および配列番号３）と共にインキュベートした場合、最少のＤＮＡ複合体形成が観察された（データ示さず）。しかし、１５ｍＭのＭｇＣｌ２および１５ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で１時間インキュベートした場合、プローブ番号４によって得られる蛍光強度に比べて観察された蛍光強度が４９％低下したことから証明されるように（図５Ｂ）、完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ（配列番号１＋プローブ番号４）複合体の形成が促進された。１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致（配列番号２＋プローブ番号４）または３ｂｐの欠失（配列番号３＋プローブ番号４）を生じたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は、１５ｍＭのＭｇＣｌ２および１５ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で非常に不安定であり、プローブ番号４単独による発光に比べてそれぞれ２％低下および５％増大した蛍光が得られた（図５Ｂ）。２０ｍＭのＭｇＣｌ２および２０ｍＭのＭｎＣｌ２を用いた１時間の処置により、プローブ番号４単独で観察される蛍光に比べて、完全一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体、および１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致または３ｂｐの欠失を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体で蛍光がそれぞれ６８％、４８％、および６％低下した（データ示さず）。
【０２０４】
図５Ｃに示すように、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下では、５３％のＧＣ含量を有し、かつ完全に相補的な配列（配列番号６＋プローブ番号５）または１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号７＋プローブ番号５）を有するｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は、１時間のインキュベーション後に、逆平行プローブ番号５単独によって発光される蛍光強度よりそれぞれ６８％および２０％低い蛍光強度を生じた。
【０２０５】
１５ｍＭのＭｇＣｌ２および１５ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で逆平行ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５（５３％のＧＣ含量を有する）を１時間、５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）と共にインキュベートした場合、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体が非常に効率的に形成され、プローブ番号５単独で得られる蛍光に比べて蛍光が７４％低下した（図５Ｄ）。それとは対照的に、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号７＋プローブ番号５）を含んだｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は１５ｍＭのＭｇＣｌ２および１５ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下ではるかに不安定であり、１時間のインキュベーション後にプローブ番号５単独による発光に比べて蛍光の低下は１５％であった（図５Ｄ）。同様に、１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致（配列番号８＋プローブ番号５）、１ｂｐのＣ‐Ａ不一致（配列番号１０＋プローブ番号５）、１ｂｐのＧ‐Ａ不一致（配列番号１１＋プローブ番号５）、および連続２ｂｐのＡ‐ＧおよびＣ‐Ｔの不一致（配列番号１２＋プローブ番号５）を生じるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体もすべて、完全一致したＤＮＡ複合体よりはるかに不安定であった（データ示さず）。プローブ番号５（５３％のＧＣ含量を含む）をｄｓＤＮＡ標的の配列番号３（３３％のＧＣ含量を含む）と反応させた場合、プローブ番号５単独で得られた蛍光に比べて３％の増大が観察され（図５Ｄ）、ＤＮＡ複合体が形成されなかったことが示された。このプローブと標的の組合せでは５ｂｐの不一致が生じることを考慮すれば、この結果は予想通りであった。
【０２０６】
実施例３、４および５は全体として、１価の陽イオンまたは２価の陽イオンなど凝縮剤を（単独でまたは組み合わせて）加えることにより、劇的に異なるＧＣ含量を有するｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識したｓｓＤＮＡプローブの間でＤＮＡ複合体形成が促進され、完全に相補的な配列と様々な１ｂｐの変異を含む配列とを識別する正確で確実な識別が可能になることが実証された。
【実施例６】
【０２０７】
ＹＯＹＯ‐１によって促進されたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、室温で５分以内のインキュベーションで容易に形成され、何時間もの間同じレベルの強度で蛍光発光を生じる。塩基対の不一致を含む複合体も同様に持続した蛍光シグナルを発し、これは長時間にわたる同じレベルの複合体形成を示す。陽イオンなど凝縮剤の存在下で形成させたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度を調査するために、経時的実験を実施した。
【０２０８】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの非変性標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５ならびに１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２を含んでいた。この反応混合物を室温（２１℃）で１分間〜２時間の範囲の様々な時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を石英キュベット内に入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で１回照射して蛍光発光をモニターした。次いで指定した時間において、複数回のレーザー照射後の同一試料を蛍光測定した（図６）。分析した各試料について、蛍光の強度を時間の関数としてプロットした。
【０２０９】
標的ｄｓＤＮＡが存在しない場合に４ｐｍｏｌのプローブ番号５ならびに１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２を含む対照試料から発せられる蛍光は、わずか５分間のインキュベーションのうちに劇的に３分の１に減少し（データ示さず）、その後の数時間で、はるかに遅い速度で着実に低下していった（図６Ａ）。本発明者らは、この効果を「陽イオン性消光」と呼ぶ。ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブと特定の陽イオンとのインキュベーション時間の増加に伴うこの蛍光阻害は、２価の陽イオンの存在下では日常的に起こったが、１価の陽イオンの存在下ではそうではなかった（データ示さず）。この観察から、ある実験の試験試料を反応させる条件と全く同じ条件下で実験の対照試料をインキュベートすることの重要性が明らかになる。さまざまなインキュベーション時間後に各々のｓｓＤＮＡ‐Ｆ対照試料を複数回レーザー照射することにより、フルオロフォアのさらなる消光現象が阻害され、その後は安定した蛍光レベルがもたらされた（図６Ａ）。この結果は、まったく予期しないものであった。
【０２１０】
１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で逆平行ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）と共にインキュベートした場合、１５分後にｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が明らかとなり、これは対照プローブ番号５の進行中の陽イオン性消光より６％大きい、蛍光の低下をもたらした（図６Ｂ）。１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で配列番号６をプローブ番号５と３０分間および６０分間インキュベートした後、複合体の形成がはっきりと示され、陽イオンによって消光されたプローブ番号５単独によって達成された蛍光に比べてそれぞれ７６％および６１％の蛍光の低下が生じた（図６Ｂ）。１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で９０分間および１２０分間インキュベートした後は、複合体形成のシグナルは生じなかった（図６Ｂ）。９０分および１２０分で見られた蛍光発光のレベルは、陽イオン性消光効果に完全に帰すことが可能である（図６Ａと図６Ｂを比較）。
【０２１１】
それとは対照的に、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号５）は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で形成されたときより遅い速度で形成され、はるかに不安定であった。１ｂｐがＴ‐Ｇ不一致の複合体は、３０分間のインキュベーション後に最初に観察され、６０分間のインキュベーション後に除去されたように見えた（図６Ｃ）。この場合も、プローブは２重鎖内の相補鎖に逆平行であった（図６Ｃ）。
【０２１２】
１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で３０分間または６０分間インキュベーションした後に形成された完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号６＋プローブ番号５）を複数回レーザー照射すると、逆平行ｓｓＤＮＡプローブを含むＤＮＡ複合体に特徴的な速度のこれら複合体の崩壊と合致する蛍光発光を生じた（図６Ｂ）。その後、完全に相補的な複合体を３０分の時点でレーザー照射した後４５分の時点で測定した場合、発光強度レベルは１８６９であり、複合体が迅速に崩壊した証拠となった（データ示さず）。複数回のレーザー照射後、蛍光発光のレベルは複合体でないプローブ番号５単独の対照で観察された、陽イオンによって消光される値に戻った（図６Ａおよび図６Ｂを比較）。唯一の例外は、１５分間のインキュベーション後に形成されその後も繰り返し照射された完全一致の複合体である（図６Ｂ）。この場合、１５分間のインキュベーション後に複数回照射した場合はプローブ番号５のさらなる陽イオン性消光が完全に阻害されていたにもかかわらず（図６Ａ）、蛍光発光は複合体の崩壊とは矛盾していた（図６Ｂ）。１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号７＋プローブ番号５）を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体も、複数回のレーザー照射によって同様に崩壊したように見えた（図６Ｃ）。
【０２１３】
複合体における複数回レーザー照射の効果の基盤を決定するために実験を行った。２回レーザー照射した反応混合物に新しい陽イオンを加えた場合、ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブによる蛍光発光において陽イオン性消光の阻害を逆転させることができず、さらにインキュベートしてもさらなる陽イオン性消光は起こらないことが判明し、これにより、ｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブはまだ知られていない機構に従って複数回の照射により不活性化されることが強く示唆された（データ示さず）。同様に、２回レーザー照射した反応混合物に新しいｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブを加えた場合、新しいプローブにより増大した蛍光発光について正規化した後、反応混合物をさらにインキュベートしてもその後に漸増的な陽イオン性消光は観察されず、レーザー照射を受けた陽イオンが何らかの形で無効化されたことが強く示唆された（データ示さず）。
【実施例７】
【０２１４】
実施例１〜６では、ＹＯＹＯ‐１などのＤＮＡ脱凝縮剤と１価もしくは２価の陽イオンなどのＤＮＡ凝縮剤のどちらかによって促進される、ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡプローブの間の配列特異的な様式のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成が実証された。以下の実施例では、様々な陽イオンの存在下で形成されるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度を調査する。これらの実施例では、陽イオンの様々な種類、各陽イオンの濃度、および様々な濃度の様々な陽イオンの組合せが、形成されるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度にどのように影響を与えるかを示す。
【０２１５】
相補的なセンスおよびアンチセンスの１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブ配列をＤＮＡ合成機で合成し、ＨＰＬＣで精製した。等モル量の相補オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間加熱し、１．５時間かけて温度を２１℃まで冷やしながら徐々にアニーリングさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度１ｐｍｏｌ／μｌとした。
【０２１６】
プローブ番号７は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号６）の１５ｂｐのセグメントと完全に相同であるように設計された、各５’位にフルオレセイン部分（ｍｏｉｅｔｙ）が結合した１５ｂｐのｄｓＤＮＡプローブであった。プローブ番号７のアンチセンス鎖はプローブ番号５と同一であった。
【０２１７】
プローブ番号７のセンス鎖の配列は、
５’‐Ｆｌｕ‐ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号７のアンチセンス鎖の配列は、
５’‐Ｆｌｕ‐ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ‐３’であった。
【０２１８】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの非変性標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７０ｍＭ〜９０ｍＭのＫＣｌおよび０ｍＭ〜２０ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。この反応混合物を室温（２１℃）で１分間〜２時間の範囲の様々な時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で１回照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光の強度を時間の関数としてプロットした。
【０２１９】
標的ｄｓＤＮＡが存在しない場合に４ｐｍｏｌのプローブ番号７および９０ｍＭのＫＣｌを含む対照試料から発せられる蛍光は、１２０分間のインキュベーションの間比較的一定に維持され、１価のＫＣｌの存在下ではｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブの陽イオン性消光は起こっていなかったことが示される（図７Ａ）。９０ｍＭのＫＣｌの存在下でｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）と共にインキュベートした場合、室温の非変性条件下で、わずか１５分以内のインキュベーションのうちにｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体が形成され、少なくとも１２０分間持続した（図７Ａ）。完全一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体と１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体との間の最大識別能は、９０ｍＭのＫＣｌの存在下で３０分間および４５分間のインキュベーション後に観察され、プローブ番号７単独による発光に比べて３０分後ではそれぞれ２７％および３％低い蛍光強度、４５分後ではそれぞれ３４％および１５％低い蛍光強度が生じた（図７Ａ）。
【０２２０】
７０ｍＭのＫＣｌおよび２０ｍＭのＮａＣｌの存在下では、完全に一致した配列を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号６＋プローブ番号７）または１ｂｐの不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）は、プローブ番号７単独で達成される蛍光強度に比べて３０分後ではそれぞれ４７％および１９％低い蛍光強度、４５分後ではそれぞれ３５％および１４％低い蛍光強度を生じた（図７Ｂ）。７０ｍＭのＫＣｌおよび２０ｍＭのＮａＣｌの存在下で、ｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７対照試料の陽イオン性消光が１２０分間のインキュベーションにわたって少量観察された（図７Ｂ）。この最少の陽イオン性消光は、単独で存在する場合にプローブ番号７で同様の漸増的蛍光消光を引き起こすＮａＣｌを含めることによって引き起こされていた（データ示さず）。
【０２２１】
８０ｍＭのＫＣｌおよび１０ｍＭのＮａＣｌの存在により野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）とｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７との間の完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が優先的に促進され、その結果、３０分、４５分および６０分のインキュベーション後において、対照プローブ番号７試料による同時間の蛍光発光に比べてそれぞれ１８％、４８％および３４％の蛍光発光の低下がもたらされた（図７Ｃ）。それとは対照的に、１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）の形成は、プローブ番号７によって示される蛍光に比べてこれら不一致の複合体で観察される蛍光の低下がわずかに１％〜５％であることによって証明されるように、８０ｍＭのＫＣｌおよび１０ｍＭのＮａＣｌの存在下で行った１２０分間のインキュベート中ずっと非常に非効率的であった（図７Ｃ）。
【０２２２】
したがって、生理的濃度に近い濃度のＫＣｌやＮａＣｌなど１価の陽イオンを含めることによって、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識ｄｓＤＮＡプローブの間でのＤＮＡ複合体の形成が促進された。複合体の形成は相同な塩基対の認識に基づいて起こり、完全に一致した相同な２重鎖間の複合体形成が測定可能で有意に多かった。この反応は室温、１５分間〜６０分間の比較的短いインキュベーション時間で、プローブと標的の比１０対１で生じた。この実施例で使用したｄｓＤＮＡ標的およびｄｓＤＮＡプローブは相同であり、ＧＣ含量は５３％であり、どのＤＮＡ鎖にもホモプリン配列またはホモピリミジン配列を含まなかった。本発明のアッセイによって、ｄｓＤＮＡプローブを使用して完全に一致したｄｓＤＮＡ配列および１対の不一致な塩基を含む配列を同定することが可能であった。
【実施例８】
【０２２３】
実施例７で実施したアッセイは、反応混合物中に１価の陽イオンを加えることによって促進された。本実施例では、２価の陽イオンの存在下で形成されるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度が実証される。反応条件は、ＫＣｌおよびＮａＣｌを各３０ｍＭ〜４０ｍＭのＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２に換えた以外は実施例７に記載したものと同一であった。
【０２２４】
対照のｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７試料は、３０ｍＭのＭｇＣｌ２と３０ｍＭのＭｎＣｌ２（図８Ａ）または４０ｍＭのＭｇＣｌ２と４０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で（図８Ｂ）、インキュベーション時間の増加に伴う蛍光の漸次低下を示した。この陽イオン性消光は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下でｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５について観察されたもの（図６Ａ）と同様である。
【０２２５】
３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下でｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）と共にインキュベートした場合、６０分間のインキュベーション後にはｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が明らかであり、対照プローブ番号７の漸増的陽イオン性消光より１３％大きい、蛍光の低下が生じた（図８Ａ）。３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で配列番号６をプローブ番号７と７５分間インキュベートした後、複合体の形成がはっきりと示され、陽イオンによって消光されたプローブ番号７単独によって達成される蛍光に比べて８１％の低下が生じた（図８Ａ）。３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で６０分間および７５分間インキュベートした後、１ｂｐの不一致を含んだｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）も形成され、陽イオンによって消光されたプローブ番号７単独によって達成される蛍光に比べてそれぞれ１６％および３０％の低下が生じた（図８Ａ）。３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で９０分間および１２０分間インキュベートした後、複合体形成の徴候は生じなかった（図８Ａ）。９０分後では、観察された蛍光のレベルは、陽イオン性消光効果に完全に帰すことが可能である（図８Ａ）。
【０２２６】
４０ｍＭのＭｇＣｌ２および４０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下では、完全に一致した配列を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号６＋プローブ番号７）または１ｂｐの不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）は、陽イオンによって消光されたプローブ番号７単独により発光される蛍光強度より６０分後ではそれぞれ１７％低いおよび４％高い、７５分後ではそれぞれ３６％および２２％低い、ならびに９０分後ではそれぞれ５７％低いおよび０．２％高い蛍光強度を生じた（図８Ｂ）。４０ｍＭのＭｇＣｌ２および４０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で１２０分間のインキュベーション後、複合体形成の徴候は生じなかった（図８Ｂ）。
【０２２７】
ＭｇＣｌ２やＭｎＣｌ２など２価の陽イオンを加えることにより、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識ｄｓＤＮＡプローブの間でのＤＮＡ複合体の形成が促進され、完全に一致した相同配列と１ｂｐの変異を含む配列とを正確に識別することが可能となった。ｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成には、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成に必要な濃度の約２倍のＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２が必要であった。ｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成速度は、１価の陽イオンが存在する場合に比べて２価の陽イオンが存在する場合の方が遅かった。２価の陽イオンで誘導されたｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体は、一度形成された後、安定な時間がより短いように見えた。
【実施例９】
【０２２８】
次に、１価および２価の陽イオンの存在下で形成されるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度を調査した。ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．４ｐｍｏｌの非変性標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｄｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６０ｍＭ〜８０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭ〜２０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２を含んでいた。この反応混合物を室温（２１℃）で１分間〜１５０分間の範囲の様々な時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で１回照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光の強度を時間の関数としてプロットした。
【０２２９】
様々な濃度のＫＣｌおよびＮａＣｌと共に３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２が存在することによって、対照のｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７の蛍光について、２価の陽イオンのみの存在下で観察されるもの（図８）と非常に類似している陽イオン性消光が生じた（図９）。１価の陽イオンを含めることによっては、２価の陽イオンによるｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブの陽イオン性消光は影響を受けなかったと考えられる。
【０２３０】
６０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下でｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７を５０塩基長の野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号７）と共にインキュベートした場合、室温の非変性条件下でわずか１５分以内のインキュベーションの後にｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体が形成され、少なくとも１５０分間持続した（図９Ａ）。完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体と１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の間の最大識別能は、３０分間、４５分間および１５０分間のインキュベーション後に観察され、陽イオンによって消光されたプローブ番号７単独による発光に比べて３０分後ではそれぞれ４３％および１６％低い蛍光強度、４５分後ではそれぞれ３８％および１６％低い蛍光強度、１５０分後ではそれぞれ６５％および１％低い蛍光強度が生じた（図９Ａ）。
【０２３１】
７０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で、完全に一致した配列を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号６＋プローブ番号７）または１ｂｐの不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）は、陽イオンによって消光されたプローブ番号７単独によって達成される蛍光発光に比べて６０分後ではそれぞれ１７％および１％低い、７５分後ではそれぞれ４８％および１１％低い、９０分後ではそれぞれ２２％および３％低い、１２０分後ではそれぞれ３４％および２％低い蛍光強度を生じた（図９Ｂ）。
【０２３２】
８０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在により、３０分間〜１２０分間のインキュベーション後に野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）とｄｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号７との間の完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が優先的に促進された。完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体は、陽イオンによって消光されたプローブ番号７試料による蛍光発光に比べて、６０分間、７５分間、９０分間および１２０分間のインキュベーション後にそれぞれ２７％、４３％、２９％および５２％の蛍光発光の低下を生じた（図９Ｃ）。それとは対照的に、１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号７）の形成は、陽イオンによって消光されたプローブ番号７によって示される蛍光に比べ、これら不一致の複合体で観察された蛍光についての低下がわずか２％〜３％であることによって証明されるように、８０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２および３０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で行った４５分間〜９０分間のインキュベート後において非常に非効率的であった（図９Ｃ）。１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体のわずかな形成が、１２０分間のインキュベーションの後に起こり、陽イオンによって消光されたプローブ番号７による発光にくらべて１４％の蛍光の低下がもたらされた。
【０２３３】
１価および２価の陽イオンをどちらも存在させることにより、２価の陽イオンのみの場合に比べてｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ複合体の形成がより早い速度で促進された。一度形成された後は、両方の種類の陽イオンで促進された複合体は、１価の陽イオンまたは２価の陽イオンのどちらかで別々に促進された複合体より長い時間持続した。完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体と１ｂｐが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ‐Ｆ複合体との最大識別能は、１価および２価の陽イオンのいずれも存在している場合により長い時間間隔で観察された。したがって、生理的濃度のＫＣｌ、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２は、相同な塩基対の認識に基づいて、完全に一致した相同２重鎖間の複合体形成を優先的に促進した。
【実施例１０】
【０２３４】
実施例３〜６では、１価または２価の陽イオンなどＤＮＡ凝縮剤によって促進される、ｄｓＤＮＡ標的とｓｓＤＮＡプローブとの間の配列特異的な様式のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成が実証された。次の実施例では、やはりＤＮＡを凝縮させる能力がある多価の陽イオン、スペルミジン（＋３の電荷を有する）の存在下で形成されるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度を調査する。
【０２３５】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．２ｐｍｏｌの非変性標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭのスペルミジンを含んでいた。この反応混合物を室温（２１℃）で１分間〜２時間の範囲の様々な時間インキュベートした。インキュベーションの後に、試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で１度照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光の強度を時間の関数としてプロットした。
【０２３６】
対照のｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５は、１ｍＭのスペルミジンの存在下でインキュベーション時間の増加に伴う蛍光の漸次低下を示した（図１０）。この陽イオン性消光は、特にインキュベーションの最初の５分以内に、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で同じプローブをインキュベートした際に観察されたもの（図６Ａ）ほど顕著ではなかった。
【０２３７】
ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）とｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５との間の完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成では、１ｍＭのスペルミジンの存在下におけるわずか１５分間および３０分間のインキュベーションの後、陽イオンによって消光されたプローブ番号５単独によって得られる蛍光に比べてそれぞれ１１％および２０％の蛍光の低下が生じることが示された（図１０）。１ｍＭのスペルミジンの存在下における４５分間のインキュベーション後には、わずかな複合体形成の徴候が生じた（図１０）。
【０２３８】
陽イオンによって消光されたプローブ番号５で１５分間および３０分間のインキュベーションの後に観察された蛍光に比べてそれぞれ１１％および７％の蛍光の増大によって証明されるように（図１０）、１ｍＭのスペルミジンを含めることは１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号５）の形成にとって非常に不利であった。１ｍＭのスペルミジンの存在下では、相補性の不完全な配列を含む複合体のわずかな形成が７５分間インキュベートした後で初めて現れ、１２０分には消失していた。
【０２３９】
ＤＮＡ凝縮剤であるスペルミジンを加えることにより、非変性条件下における完全に一致した配列間での迅速なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成が促進され、完全に相補的な配列と１ｂｐの変異を含む配列の区別が可能になる。
【実施例１１】
【０２４０】
陽イオン以外の多くの様々な作用剤がｄｓＤＮＡを凝縮させる能力を有している。実施例１１では、別の種類のＤＮＡ凝縮剤であるエタノールの存在下で形成されるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体の形成速度、安定性および解離速度が実証される。
【０２４１】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、０．２ｐｍｏｌの非変性標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌの５’‐フルオレセイン標識ｓｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０％のエタノールを含んでいた。この反応混合物を室温（２１℃）で１分間〜９０分間の範囲の様々な時間インキュベートした。インキュベーションの後に、試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光の強度を時間の関数としてプロットした。
【０２４２】
２価または多価の陽イオンとは異なり、１０％のエタノールを加えることによって対照のｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５によって発せられる蛍光の消光はもたらされず、実際にはプローブの蛍光が経時的にわずかに増大した（図１１）。
【０２４３】
１０％のエタノールの存在により、１５分間〜６０分間のインキュベーション後に野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号６）とｓｓＤＮＡ‐Ｆプローブ番号５との間の完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成が優先的に促進された（図１１）。それとは対照的に、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体（配列番号７＋プローブ番号５）の形成は、１０％のエタノールの存在下でこのインキュベーション時間内では非常に非効率的であった。完全に一致した複合体および１ｂｐが不一致の複合体によって生じた蛍光強度は、プローブ番号５の対照によって発せられる蛍光強度より１５分後でそれぞれ１１％および２％、３０分後でそれぞれ１２％および１％、４５分後でそれぞれ２５％および２％、ならびに６０分後でそれぞれ１３％および７％低かった（図１１）。１０％のエタノールの存在下では、７５分のインキュベーションの後、有意なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ‐Ｆ複合体の形成は観察されなかった。
【０２４４】
低濃度のエタノールを加えることにより、非変性ｄｓＤＮＡ標的と蛍光標識ｓｓＤＮＡプローブとの間のＤＮＡ複合体の形成が促進され、完全に相補的な配列と１ｂｐの変異を含む配列とを識別することが可能になる。
【実施例１２】
【０２４５】
実施例１２では、陽イオン性ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１の存在下において、本発明のアッセイが、完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体と可能なすべてのタイプの１ｂｐ不一致を含むｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体とを識別し得ることを実証する。
【０２４６】
相補的なセンスおよびアンチセンスの１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブをＤＮＡ合成機で合成し、ＨＰＬＣで精製し、ｄｄＨ２Ｏに溶かして濃度１ｐｍｏｌ／μｌとした。プローブ番号１は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチドのセグメントに完全に相補的であり、アミノ酸５０５位〜５１０位に重なるように設計された１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブである（非特許文献１６）。プローブのキラリティーは、標的中のセンス鎖と逆または逆平行であった。変異プローブ（プローブ番号８〜プローブ番号１６）は、１塩基の変異（［］内）以外はプローブ番号１と同一の配列であった。
【０２４７】
プローブ番号１の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
プローブ番号８の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ［Ａ］ＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０２４８】
プローブ番号９の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ［Ｇ］ＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
プローブ番号１０の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  Ａ［Ｃ］Ａ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０２４９】
プローブ番号１１の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡ［Ｔ］  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
プローブ番号１２の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡ［Ｇ］  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０２５０】
プローブ番号１３の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡ［Ｃ］  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
プローブ番号１４の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ［Ｃ］ＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０２５１】
プローブ番号１５の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ＣＡＡ  Ａ［Ａ］Ａ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
プローブ番号１６の配列は、
５’‐ＣＡＣ  ［Ａ］ＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ‐３’であった。
【０２５２】
プローブ番号１７は、５０塩基長の野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンス鎖の１５ヌクレオチドのセグメントに完全に相補的であり、アミノ酸５０５位〜５１０位に重なるように設計された１５塩基長のｓｓＤＮＡプローブである（非特許文献１６）。プローブのキラリティーは、標的中のアンチセンス鎖と逆または逆平行であった。変異プローブ（プローブ番号１８〜プローブ番号２６）は、１塩基の変異（［］内）以外はプローブ番号１７と同一の配列であった。
【０２５３】
プローブ番号１７の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号１８の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣ［Ｔ］  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
【０２５４】
プローブ番号１９の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴ［Ｃ］  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号２０の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  Ｔ［Ｇ］Ｔ  ＴＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
【０２５５】
プローブ番号２１の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ［Ａ］ＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号２２の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ［Ｃ］ＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
【０２５６】
プローブ番号２３の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ［Ｇ］ＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号２４の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣ［Ｇ］  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
【０２５７】
プローブ番号２５の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  Ｔ［Ｔ］Ｔ  ＴＴＧ  ＧＴＧ‐３’であった。
プローブ番号２６の配列は、
５’‐ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴ［Ｔ］  ＧＴＧ‐３’であった。
【０２５８】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は、２ｐｍｏｌの標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌのｓｓＤＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１を含んでいた。事前にｄｓＤＮＡ標的を変性させずにこの反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、波長４８８ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光で照射して蛍光発光をモニターした。分析した各試料について、蛍光発光の強度を波長の関数としてプロットした。
【０２５９】
５０塩基長の野生型の非変性ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）を、１５塩基長の野生型アンチセンスｓｓＤＮＡプローブ番号１および可能なすべてのタイプの１ｂｐ不一致を生じる様々な１塩基変異を有する１５塩基長のアンチセンスｓｓＤＮＡプローブ（プローブ番号８〜プローブ番号１６）と反応させた。予想通り、最も高い蛍光発光強度は、完全に相補的な配列からなるｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体（配列番号１＋プローブ番号１）によって生じた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。１ｂｐのＡ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号８）、１ｂｐのＧ‐Ｇ不一致（配列番号１＋プローブ番号９）、１ｂｐのＣ‐Ｃ不一致（配列番号１＋プローブ番号１０）、１ｂｐのＴ‐Ｔ不一致（配列番号１＋プローブ番号１１）、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号１＋プローブ番号１２）、１ｂｐのＴ‐Ｃ不一致（配列番号１＋プローブ番号１３）、１ｂｐのＡ‐Ｃ不一致（配列番号１＋プローブ番号１４）、１ｂｐのＣ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号１５）、および１ｂｐのＧ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号１６）を生じたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体よりそれぞれ６３％、６６％、５０％、４７％、４９％、７９％、５７％、５１％および７１％低い蛍光発光強度を生じた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０２６０】
３本鎖アッセイも、５０塩基長の野生型の非変性ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）を、１５塩基長の野生型センスｓｓＤＮＡプローブ番号１７および可能なあらゆる種類の１ｂｐ不一致を生じる、様々な１塩基変異を有する１５塩基長のセンスｓｓＤＮＡプローブ（プローブ番号１８〜プローブ番号２６）と反応させることによって評価した。センス鎖プローブを含む完全に相補的なｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ３本鎖複合体（配列番号１＋プローブ番号１７）（図１２Ｃおよび１２Ｄ）は、アンチセンス鎖プローブを含む完全に相補的な３本鎖複合体（配列番号１＋プローブ番号１）（図１２Ａおよび１２Ｂ）と類似の効率で形成された。１ｂｐのＴ‐Ｔ不一致（配列番号１＋プローブ番号１８）、１ｂｐのＣ‐Ｃ不一致（配列番号１＋プローブ番号１９）、１ｂｐのＧ‐Ｇ不一致（配列番号１＋プローブ番号２０）、１ｂｐのＡ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号２１）、１ｂｐのＣ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号２２）、１ｂｐのＧ‐Ａ不一致（配列番号１＋プローブ番号２３）、１ｂｐのＧ‐Ｔ不一致（配列番号１＋プローブ番号２４）、１ｂｐのＴ‐Ｇ不一致（配列番号１＋プローブ番号２５）、および１ｂｐのＴ‐Ｃ不一致（配列番号１＋プローブ番号２６）を生じたｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体は、完全に一致したｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体よりそれぞれ６３％、６７％、７６％、５９％、５４％、５７％、５９％、５６％および８２％低い蛍光発光強度を生じた（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。
【０２６１】
様々な１ｂｐ不一致の間で観察される蛍光発光強度の変動性は、変異型３本鎖配列のＧＣ含量の変化よりも特定の塩基対の不一致に依存していた（図１２）。図１２の結果により、ＤＮＡ脱凝縮剤ＹＯＹＯ‐１の存在下でアンチセンスまたはセンスｓｓＤＮＡプローブを非変性ｄｓＤＮＡ標的と反応させた場合の、可能なあらゆる１ｂｐ不一致を高い精度で同定する３本鎖アッセイの信頼性が確認された。
【０２６２】
本発明を、本発明の具体的な例に関して詳細に記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変化および改変を本発明に加え得ることは、当分野の技術者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】温度、ＧＣ含量、および塩基対の一致度の関数として蛍光強度を示す図。
【図２Ａ】温度、ＧＣ含量、および塩基対の一致度の関数として蛍光強度を示す図。
【図２Ｂ】温度、ＧＣ含量、および塩基対の一致度の関数として蛍光強度を示す図。
【図３】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図４】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図５Ａ】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図５Ｂ】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図５Ｃ】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図５Ｄ】波長、塩基対の一致度、および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図６Ａ】レーザー照射プロトコルおよび陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図６Ｂ】レーザー照射プロトコルおよび陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図６Ｃ】レーザー照射プロトコルおよび陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図７Ａ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数としての蛍光強度を示す図。
【図７Ｂ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図７Ｃ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図８Ａ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図８Ｂ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図９Ａ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図９Ｂ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図９Ｃ】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図１０】４重鎖に関して、塩基対の一致度および陽イオンの関数として蛍光強度を示す図。
【図１１】エタノールを含む溶液中における塩基対の一致度の関数として蛍光強度を示す図。
【図１２Ａ】陽イオン性ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１の存在下、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体中で完全一致する塩基対および不完全一致する塩基対について波長の関数として蛍光強度を示す図。
【図１２Ｂ】陽イオン性ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１の存在下、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体中で完全一致する塩基対および不完全一致する塩基対について波長の関数として蛍光強度を示す図。
【図１２Ｃ】陽イオン性ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１の存在下、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体中で完全一致する塩基対および不完全一致する塩基対について波長の関数として蛍光強度を示す図。
【図１２Ｄ】陽イオン性ＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ‐１の存在下、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ複合体中で完全一致する塩基対および不完全一致する塩基対について波長の関数として蛍光強度を示す図。
【図１】
2004534541.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2004534541.tif 000009
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2004534541.tif 000012
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534541.tif 000151
【国際調査報告】
2004534541.tif 000152
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