(57)【要約】本発明は糖特にサッカロース輸送体をコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクター及び宿主細胞並びに上記の核酸分子及びベクターで形質転換した植物細胞及び植物に関する。また発明は植物の糖特にサッカロース輸送の改変方法に関する。
2004500827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織中の糖フラックス及び／又は糖濃度の改変方法であって、少なくとも１つの植物細胞を少なくとも１つのベクターで形質転換し、そこから組織に改変糖フラックス及び／又は改変糖濃度が存在する植物を再生し得ることによって、高い糖輸送容量と低い糖親和性を有する糖輸送体の活性を改変し、ベクターが発現により糖輸送体の輸送活性を改変するヌクレオチド配列を有するものである、方法。
【請求項２】
ベクターがＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列、その一部又は相補的配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクターがＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列、その一部又は相補的配列を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ベクターがＳＵＴ１コーディング・ヌクレオチド配列、その一部又は相補的配列を含む請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
コーディング・ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列である請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
コーディング・ヌクレオチド配列の葉特異的過剰発現をもたらす少なくとも１つのベクターで植物細胞を形質転換する、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
孔辺細胞のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的過剰発現をもたらす少なくとも１つのベクターで植物細胞を形質転換する請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
孔辺細胞のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的発現又は突然変異誘発をもたらす少なくとも１つのベクターで植物細胞を形質転換し、共抑制、突然変異誘発、ＲＮＡ二本鎖阻害又はアンチセンス発現により少なくとも１つの内因的に存在するＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列の発現を減少させる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
シンク組織及び／又は柔組織のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的過剰発現をもたらす少なくとも１つのベクターで植物細胞を形質転換する請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
シンク細胞のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的発現又は突然変異誘発をもたらす少なくとも１つのベクターにより植物細胞を形質転換し、共抑制、突然変異誘発、ＲＮＡ二本鎖阻害又はアンチセンス発現により少なくとも１つの内因的に存在するＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列の発現を減少させる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
葉のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的発現又は突然変異誘発をもたらす少なくとも１つのベクターにより植物細胞を形質転換し、共抑制、突然変異誘発、ＲＮＡ二本鎖阻害又はアンチセンス発現により少なくとも１つの内因的に存在するＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列の発現を減少させる請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
コーディング・ヌクレオチド配列の種子特異的過剰発現をもたらす少なくとも１つのベクターにより植物細胞を形質転換する請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
葉肉及び／又は葉皮のコーディング・ヌクレオチド配列の特異的過剰発現をもたらす少なくとも１つのベクターにより植物細胞を形質転換する請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
コーディング・ヌクレオチド配列が、原核及び／又は真核細胞のＲＮＡの発現をもたらす少なくとも１つの調節エレメントの機能的な制御下にある請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
コーディングヌクレオチド配列がセンス又はアンチセンス配向で少なくとも１つの調節エレメントの機能的な制御下にある請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記の少なくとも１つの調節エレメントがプロモーターである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロモータがＧＡＳ、ＳＵＣ２、ＳＵＴ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、ｒｏｌＣ、増強ＰＭＡ４、ＫＡＴ１、ＳｔＬＳ１／Ｌ７００、ＰＦＰ、パタチンＢ３３、ＡＡＰ１又はビシリンプロモータである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
糖がサッカロースである請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
下記のグループ
ａ） 配列番号１、２又は２７に示されたヌクレオチド配列、その一部又はその相補鎖を含む核酸分子、
ｂ） 配列番号５、６又は２８に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、ならびに
ｃ） ａ）及びｂ）に挙げた核酸分子の１つとハイブリダイズする核酸分子
から選ばれ、糖親和性が低く糖輸送容量が高い糖輸送体をコードする核酸分子。
【請求項２０】
糖輸送体がサッカロース輸送体、特にＳＵＴ４である請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
下記のグループ
ａ） 配列番号３、４、２４、２６又は２９に示されたヌクレオチド配列、その一部又は相補鎖を含む核酸分子、
ｂ） 配列番号７、８又は３０に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、ならびに
ｃ） ａ）及びｂ）に挙げた核酸分子の１つとハイブリダイズする核酸分子
から選ばれ、植物の糖輸送体特にサッカロース輸送体又はその一部、特にＳＵＴ２のレギュレーター及び／又はセンサーをコードする核酸分子。
【請求項２２】
配列番号２２及び２５に示されたＳＵＴ１の少なくともＮ末端領域をコードする核酸分子。
【請求項２３】
分子がＤＮＡ又はＲＮＡ分子である請求項１８〜２２のいずれか１つに記載の核酸分子。
【請求項２４】
ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
キメラタンパク質をコードし、核酸のコーディング領域の５’末端領域がＳＵＴ２タンパク質のＮ末端領域、残りの領域がサッカロース代謝及び／又は輸送に関係する遺伝子のコーディング領域を表す核酸分子。
【請求項２６】
キメラタンパク質をコードし、核酸のコーディング領域の５’末端領域がＳＵＴ１遺伝子のＮ末端領域、残りの領域がサッカロース代謝及び／又は輸送に関係する遺伝子のコーディング領域を表す核酸分子。
【請求項２７】
キメラ核酸分子を表し、キメラタンパク質をコードし、そのＮ末端領域がＳＵＴ２の、残りの領域がＳＵＴ１のコーディング配列である核酸分子。
【請求項２８】
キメラ核酸分子を表し、キメラタンパク質をコードし、そのＮ末端領域がＳＵＴ１の、残りの領域がＳＵＴ２のコーディング配列である核酸分子。
【請求項２９】
キメラ核酸分子を表し、キメラタンパク質をコードし、膜領域ＶＩ及びＶＩＩの間にある中心細胞質ドメインがＳＵＴ２によりコードされ、他の領域が他のサッカロース輸送体遺伝子、特にＳＵＴ１又はＳＵＴ４でコードされる核酸分子。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３１】
さらに糖輸送体コーディング・ヌクレオチド配列、その一部又はその相補的ヌクレオチド配列を含む請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
核酸分子が、原核及び／又は真核細胞のＲＮＡの発現を保証する少なくとも１つの調節エレメントと機能的に連結されている請求項３０ないし３１のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項３３】
調節エレメントがプロモータである請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
プロモーターがＧＡＳ、ＳＵＣ２、ＳＵＴ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、ｒｏｌＣ、増強ＰＭＡ４、ＫＡＴ１、ＳｔＬＳ１／Ｌ７００、ＰＦＰ、パタチンＢ３３、ＡＡＰ１又はビシリンプロモーターである請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項１９〜２９のいずれか１つに記載の核酸分子及び／又は糖輸送体コーディング・ヌクレオチド配列又はその一部が少なくとも１つの調節エレメントに対して機能的アンチセンス配向で配列されている請求項３０〜３４のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか１つに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
植物細胞、細菌細胞又は酵母細胞である請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１９又は２０のいずれか１つに記載の核酸分子によりコードされ、低い糖親和性と高い糖輸送率を有する糖輸送体。
【請求項３９】
請求項２１に記載の核酸分子によりコードされ、糖輸送レギュレーター及び／又はセンサーの生物学的活性を有するタンパク質。
【請求項４０】
請求項２５〜２９のいずれか１つに記載の核酸分子の１つによりコードされたキメラタンパク質。
【請求項４１】
請求項１９〜２９のいずれか１つに記載の核酸分子若しくは請求項２９〜３４のいずれか１つに記載のベクターの１つで形質転換された又はこのような細胞に由来する形質転換植物細胞。
【請求項４２】
ＳＵＴ／ＳＵＣコーディング、とりわけＳＵＴ１コーディング・ヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換した、又はこのような細胞に由来する請求項４１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４３】
ＳＵＴ／ＳＵＣ遺伝子ファミリーの少なくとも２つの安定的に組込まれた改変遺伝子をゲノムに含む形質転換植物細胞。
【請求項４４】
ＳＵＴ１／ＳＵＴ２；ＳＵＴ１／ＳＵＴ４、ＳＵＴ２／ＳＵＴ４及びＳＵＴ１／ＳＵＴ２／ＳＵＴ４からなるグループから選ばれた少なくとも２つの安定的に組込まれた改変遺伝子がゲノムに含まれている形質転換植物細胞。
【請求項４５】
請求項４１、４２、４３又は４４に記載の少なくとも１つの植物細胞を含む、又は請求項１〜１８に記載の方法の１つで調製された形質転換植物。
【請求項４６】
植物がイネ（ｇｒａｍｉｎａｅ）、ピニダエ（ｐｉｎｉｄａｅ）、モクレン（ｍａｇｎｏｌｉｉｄａｅ）、キンポウゲ（ｒａｎｕｎｃｕｌｉｄａｅ）、ナデシコ（ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉｄａｅ）、バラ（ｒｏｓｉｄａｅ）、キク（ａｓｔｅｒｉｄａｅ）、アリダエ（ａｒｉｄａｅ）、ユリ（ｌｉｌｉｉｄａｅ）、ヤシ（ａｒｅｃｉｄａｅ）及びツユクサ（ｃｏｍｍｅｌｌｉｎｉｎｄａｅ）の亜網の中から選ばれた請求項４５に記載の形質転換植物。
【請求項４７】
植物がテンサイ、サトウキビ、キクイモ、シロイヌナズナ、ヒマワリ、トマト、タバコ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、イネ、ジャガイモ、ナタネ、カッサバ、チシャ、ホウレンソウ、ブドウ、リンゴ、コーヒーノキ、チャ、バナナ、ココヤシ、ヤシ、エンドウマメ、ビーン、マツ、ポプラ、ユーカリ等からなるグループから選ばれた請求項４５に記載の形質転換植物。
【請求項４８】
請求項４１、４２、４３又は４４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの植物細胞を含む請求項４５、４６又は４７のいずれか１つに記載の植物の繁殖物質又は収穫産物。
【請求項４９】
植物の糖輸送のモジュレーター、特に阻害剤の同定のための請求項１９又は２０のいずれか１つに記載の、特にＳＵＴ４のヌクレオチド配列の使用。
【請求項５０】
糖輸送に作用させるためにも利用される相互作用因子の同定のための請求項１９又は２０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項５１】
阻害剤がソース器官における篩部の負荷及び／又はシンク器官における篩部の放出を阻害する請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
植物の糖輸送のモジュレーター、特に阻害剤の同定のための請求項２１に記載の、特にＳＵＴ２のヌクレオチド配列の使用。
【請求項５３】
阻害剤が糖輸送系のレギュレート又はセンサー機能を阻害する請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
交雑計画のための分子マーカーとしての請求項１９〜２９のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項５５】
特にＳＵＴ／ＳＵＣタンパク質ファミリーの任意のタンパク質の基質特にサッカロースに対する親和性の改変のための、ＳＵＴ／ＳＵＣ遺伝子ファミリーの遺伝子のタンパク質コーディング領域の５’末端ヌクレオチド配列の使用。
【請求項５６】
遺伝子がＳＵＴ１、ＳＵＴ２又はＳＵＴ４である請求項５４に記載の使用。
【請求項５７】
Ｎ末端ヌクレオチド配列が配列番号２４又は２５に示されたヌクレオチド配列である請求項５４又は５５に記載の使用。
【請求項５８】
特に糖代謝でのレギュレート又はシグナルトランスダクションためのＳＵＴ２の中心細胞原形質ループの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は糖特にサッカロース輸送体をコードする核酸分子、この核酸分子を含むベクター及び宿主細胞並びに上記の核酸分子及びベクターで形質転換した菌、植物細胞及び植物に関する。また発明は植物の糖特にサッカロース輸送の改変方法に関する。
【０００２】
高級植物は独立栄養組織から炭水化物を供給される従属栄養組織を有する。炭水化物の主要な輸送形態はサッカロースとその誘導体である。従属栄養組織への供給は篩部を介して行われる。篩部は過剰の光同化物即ち炭水化物を供給し、これを輸出することができる器官、即ちいわゆるソース器官と、正味収支で光同化物を輸入しなければならない器官、即ちいわゆるシンク器官を連絡する。ソース器官は例えば成長した葉及び発芽する種子である。シンク器官は例えば若い葉、若い塊茎、根、実、花及びその他の生殖器官である。篩部は様々な種類の細胞、例えば篩要素、伴細胞、柔細胞及び篩部繊維細胞で構成される。篩要素内では光同化物の転流が輸出部位から輸入部位へ移動する。その場合篩部の光同化物の負荷も放出も原則としてアポプラストルート及びシンプラストルートで行われ、浸透条件、濃度勾配、通過すべき原形質膜等の多数の要因が負荷及び放出に影響する。従って光同化物の篩部への負荷もシンク器官への供給も、明らかに多数の密接に連結され調節された輸送段階を含む極めて複雑な過程である。これらの輸送段階は様々な原形質膜タンパク質特に輸送タンパク質が関与して行われる。例えば様々な科の植物のサッカロース輸送体ファミリーの幾つかのメンバー、例えばＳＵＴ１（スクロース輸送体）が知られている。ＳＵＴ遺伝子は、１２の膜貫通ドメインをもち、ヘキソース輸送体ファミリーのメンバーから明らかに区別することができる疎水性タンパク質をコードする。Ｌａｌｏｎｄｅら（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ（１９９９年）１１、７０７−７２６）は、ＳＵＴファミリーのメンバーが高いサッカロース親和性をもつと推測させる。その場合特にトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）及びジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のサッカロース輸送体ＳＵＴ１が篩部での長距離輸送を受け持つと考えられる（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、Ｐａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９３年）５、１５９１−１５９８）。国際公開第９４／００５７４号明細書はホウレンソウとジャガイモのＳＵＴ１のＤＮＡ及びアミノ酸配列を開示する。例えば形質転換したジャガイモ及びタバコ植物のアンチセンス阻害試験で示されるように（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９４年）１３、１−７）（Ｌａｌｏｎｄｅら、前掲書）、篩部の篩要素の原形質膜に配置されたこのサッカロース輸送体は篩部サッカロースの長距離輸送のための必須成分である。ＳＵＴ１の発現パターン、特に全篩部での発現は、ＳＵＴ１が負荷帯と放出帯（葉又はシンク器官）のあいだのサッカロースの濃度勾配の維持を受け持つことを証明する。従ってＳＵＴ１はシンク器官の篩部の（最初の）負荷よりは、むしろ篩部から出て行ったサッカロースの返送を受け持つようである。またこの機能は比較的高い親和性と、それに関連する低い輸送容量で証明される。このようにＳＵＴ１はごく少量のサッカロースをアポプラストから篩部へ（逆）輸入することができ、こうしてアポプラスト濃度を低く保つ。ＳＵＴ１はこの僅かな濃度で働くから、高い輸送率を受け持つことはできない。葉のサッカロース吸収速度は上記の高親和性（Ｋｍ２．７ｍＭ）��低容量（Ｖｍａｘ０．７ｎｍｏｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１）の吸収をはっきり示している（      Ｄｅｔｒｏｔ及びＢｏｎｎｅｍａｉｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８１年）６７、５６０−５６４）。この系はＨＡＳ（ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ／ｌｏｗ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍ）とも呼ばれる。ところがサッカロース輸送の全輸送・調節系へのＳＵＴ１の関与はまったく不明である（Ｗａｒｄら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ（１９９８年）１７８、４１−７１、        Ｋｕｅｈｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．（１９９９年）、５０、９３５−９５３）。このことは場合によって存在する第２の速度成分ＨＣＳ（ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ／ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を受け持つ（一次）負荷担体の同定にも当てはまる。しかも種々の植物種のあいだでサッカロース輸送機構に大きな相違がある可能性が高く（Ｌａｌｏｎｄｅら、前掲書）、転写及び転写後レベルに対して多数の潜在的調節機構及び影響要因がある（Ｋｕｅｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７年）２７５、１２９８−１３００）。Ｌａｌｏｎｄｅら（前掲書）ではサッカロース輸送体のほかにその他の機能エレメント、例えば調節エレメント及びセンサーエレメントがサッカロース輸送に関与していると推測する。ところがサッカロース輸送機構がはなはだしく複雑であるため、特定の性質に関して改善された植物を得る目的で糖特にサッカロース輸送に体系的に干渉することができるように、構造を体系的に機能に割り当て、その相互作用を予測することはこれまで不可能であった。このことは、ＳＵＴ１の過剰発現が同化物の配分に何ら変化をもたらさず、開花特性への影響を示すだけであるという事実から極めて明瞭である（米国特許第６，０２５，５４４号；ドイツ国特許出願公開第Ｐ４４３９７４８．８号）。
【０００３】
そこで本発明の根底にある問題は、改善された性質、例えばシンク器官、特に収穫器官において高い糖含量を有する植物を生産することができるように、植物の糖特にサッカロース輸送流に制御干渉することを可能にする、遺伝子工学的に改変された植物の調製のための方法及び手段を提供することである。
【０００４】
本発明は糖親和性が低く糖輸送容量が高い改変された糖輸送体活性が植物に生じるように植物組織の糖フラックス及び／又は糖濃度、特にサッカロースフラックス及び／又は濃度を改変する方法を提供することによって、この問題を解決する。本発明における教示は、糖親和性が低く糖輸送容量が高い糖輸送体活性を改変することによって種々の植物組織の糖フラックス及び糖濃度を体系的に調節、即ち改変する手段及び方法を初めて提供する。この方法の過程で改変植物が作り出される。本発明は特に植物の微小脈管で発現されるＨＣＳ系、即ちサッカロース輸送容量が高くサッカロース親和性が低いサッカロース輸送系をはじめて提供する。
【０００５】
本発明に関連して糖輸送、特にサッカロース輸送体の活性の改変とは、野生種活性に対して通常存在する活性を改変すること、例えば完全な抑制、減少又は活性増加を意味する。この活性増加はタンパク質自体の活性の改変によるものであり、例えばホスホリル化又は脱ホスホリルのような転写後改変によって生じる。また活性増加はコーディング遺伝子の発現率の変化、生じるｍＲＮＡ等の安定性又は翻訳率の変化等、即ち組織に存在する糖輸送体の量の変化にも由来する。糖輸送体の活性の改変は糖輸送体の活性を制御又はレギュレートするエレメント、例えばセンサー又はレギュレータータンパク質の活性の改変によって行うこともできる。
【０００６】
好ましい実施形態で糖とはサッカロース、糖輸送体とはサッカロース輸送体、別に指示しなければ特にＳＵＴ４（スクロース輸送体４）、即ちサッカロースに対して親和性が低く、サッカロースの輸送容量が高い輸送体のことである。
【０００７】
本発明の意味で少ない又は低い親和性とは、ＳＵＴ１親和性より低い、例えばＳＵＴ１より５０％、好ましくは８０％、１００％、２００％、３００％又は４００％低い親和性、例えばＫｍ＞２．７ｍＭ、好ましくは＞４ｍＭ、＞６ｍＭ、＞８ｍＭ、＞１０ｍＭ、＞１５ｍＭ、＞２０ｍＭ、さらに好ましくは＞２５ｍＭ特に好ましくは２６ｍＭの親和性である。本発明の意味で高い輸送容量とは、ＳＵＴ１の輸送容量より高い輸送容量、例えばＳＵＴ１より５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％高い輸送容量である。Ｖｍａｘ＞０．７、特に＞１、＞１．５、＞２、＞３、＞３．５、より好ましくは３．６ｎｍｏｌ・ｃｍ−２・ｍｉｎ−１の輸送容量が好ましい。
【０００８】
本発明の根底にあるのは、上記の糖輸送体の場合によってはもっぱら内因的に存在する活性が技術的特に遺伝子工学的手段で調節され、又はこのような活性が植物に導入されるという認識及びこれから導き出された教示である。
【０００９】
本発明に関連してシンク器官という語は、正味収支で光同化物を輸入しなければならない植物器官又は組織を意味する。このような植物器官又は組織は若い葉、塊茎、実、根、花、生殖器官、木部、支持組織、芽、種子、根茎等である。
【００１０】
本発明に関連してソース器官という語は、正味収支で過剰の光同化物を有し、これを輸出することができる植物器官又は組織を意味する。ソース器官は例えば成長した葉及び発芽する種子、塊茎及び球茎である。
【００１１】
例えば伴細胞及び／又は篩要素の、本発明に基づき改変した糖輸送体の高い発現率又は高い輸送率が、特に高い光強度又はＣＯ２濃度のもとで篩部の糖特にサッカロースの負荷を著しく増加し、それによって好都合なことに高いサッカロース含量を有する収穫器官をもつ植物が得られることを本発明に基づき示すことができた。このようにして本発明は植物組織の糖フラックス及び／又は糖濃度の改変方法を提供することによって問題を解決する。その場合糖輸送体の改変を可能にするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターで少なくとも１つの植物細胞を形質転換することによって、糖親和性が低く糖輸送容量が高い糖輸送体の活性が改変され、安定的に組込まれたこのヌクレオチド配列を含む植物細胞が植物に再生され、その組織には野生種植物即ち本発明に基づき形質転換されていない植物と比較して改変された糖フラックス及び／又は改変された糖濃度が存在する。このようにして本発明は、高い糖輸送容量と低い糖親和性を有する糖輸送体を意図的に改変し、この改変を植物の遺伝子工学的操作によって達成する教示を提供するものである。
【００１２】
これは本発明に基づき糖輸送体のコーディングヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターで植物細胞を形質転換することによって行うことができる。とりわけ形質転換細胞のゲノムにヌクレオチド配列を安定的に組込んだ後、ベクターは形質転換組織で糖輸送体の過剰発現を可能にする。
【００１３】
本発明に基づき使用される上記糖輸送体のヌクレオチド配列の、例えば篩要素又は伴細胞での過剰発現は、篩部のサッカロース負荷の増強をもたらす。本発明の方法により作り出された植物はシンク器官、例えば根、実、芽、花又は種子に高い炭水化物含量を有する。特に多くの場合シンク器官である植物の収穫器官の高い炭水化物含量は好都合である。本発明の特に有利な実施形態で本発明方法を含油植物例えばアブラナ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）に使用すれば、収穫器官の高い含油量を確認することができる。植物当りの収穫器官の個数を増加し、その重量を増大することもできるという観察は特に有利である。
【００１４】
ソース器官での上記の種類の糖輸送体の本発明に基づき行われる過剰発現は、形質転換植物の開花時期を変える利点がある。
【００１５】
篩部の糖輸送と篩部のアミノ酸輸送とはしばしば相互に関連しているので、本発明によりもたらされる篩部の糖含量の増加はまた、シンク器官、例えばジャガイモの塊茎又はテンサイの主根の望ましくないアミノ酸の含量を引き下げることができる。最終的には、本発明の方法は、植物に内在する物質又は外来的に植物に適用される物質（例えば除草剤又は農薬等の生体内異物など）のグリコシル化速度を速めて、それによりその移動度を増大させることができる。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ソース特異的プロモーター、特に葉特異的及び／又は伴細胞特異的プロモーターの制御下となるように、ＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列をベクターにクローニングし、それを少なくとも１つの植物細胞にて形質転換し、好ましくは植物細胞のゲノムに安定的に組込むことによって、ソース器官の上記の過剰発現が達成される。
【００１７】
発明の別の実施形態では構成性発現プロモーター、例えば３５ＳＣａＭＶプロモーター、アグロバクテリウム属の伴細胞特異的なｒｏｌＣプロモーター又は増強ＰＭＡ４プロモーター（Ｍｏｒｉａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ（１９９９年）１９、３１−４１）を使用することができる。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、葉肉組織及び／又は葉表皮での過剰発現により糖輸送体の活性を修飾することによって、糖輸送体の修飾を行う。これらの組織でのＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列の特異的発現は、篩要素において活性を有する内因性糖輸送体に対して競合的効果をもたらし、葉の炭水化物含量を増加させる。このようにして作出された植物はより大きな葉を有し、これはさらに病原体に対する防御能を高める。これは、１つには、防御機能を担う遺伝子が、糖含量が高まることにより活性化されるためである。さらに、より厚いクチクラと高含量の二次代謝生成物とが生じ、それらはとりわけ生分解性プラスチック、例えばＰＨＡ（ポリヒドロキシアルカノエート）の製造のための前駆物質として利用されうる。この好ましい実施形態においてもたらされる葉肉及び葉表皮での発現は、ＳＴＵ４コーディング・ヌクレオチド配列の発現のために特に好ましい実施形態では、ＳｔＬＳ１／Ｌ７００プロモーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９年）１、８０５−８１３）、その他の表皮特異的プロモーター又はＰＦＰプロモーター（柵状組織）（国際公開第９８／１８９４０号明細書）の使用によって達成される。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施形態では、糖輸送体の過剰発現は、特に植物のシンク細胞又は器官、特に植物内で発生中の種子においてもたらされる。その結果、種子の炭水化物含量と油含量はともに増加するので、特に発芽率の改善がなされる。
【００２０】
種子組織でのＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列の発現のために本実施形態で好適に使用される組織特異的プロモーターは、例えばエンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）のビシリンプロモーターである（Ｎｅｗｂｉｇｉｎら、Ｐｌａｎｔａ（１９９０年）１８０、４６１−４７０）。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態では上記の方法を適用して、シンク器官の表皮及び柔組織に対して組織特異的調節要素を使用することによって糖輸送体の過剰発現を生じさせる。本発明に基づき使用される糖輸送体のシンク器官での発現の増強は、糖取り込み能とシンク組織への糖フラックスを増加させる。従って本発明に基づき作出される植物は、例えば大型であり、よりカラフルであり及び／又は多数の花、大きな種子、大きな塊茎又は大きな主根を有する。またシンク器官は高含量の炭水化物及び油、改善された構造、特に強度、迅速な成長及び／又は場合によっては高含量の浸透活性物質により改善された耐寒性をも有する。また開花の時期及び期間並びに果実の発達を調節することが可能である。
【００２２】
発明の特に好ましい実施形態ではシンク表皮及び柔組織での上記過剰発現のためにＡＡＰ−１（アミノ酸透過酵素１）プロモーター、例えばシロイヌナズナ・プロモーターＡｔＡＡＡｐ１（胚乳における初期胚発生時の発現）又はＡｔＡＡＰ２（珠柄の篩部での発現）（Ｈｉｒｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８年）１４、５３５−５４４）、Ｂ３３（パタチン）プロモーター（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８年）８、２３−２９）（登録番号：Ｘ１４４８３；ここに挙げるすべての登録番号は別に指示しない限り、下記の遺伝子バンクに関するものである：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４，ＵＳＡ）、特に塊茎及び主根にはエンドウのビシリン（貯蔵タンパク質）プロモーター（Ｎｅｗｂｉｇｉｎら、Ｐｌａｎｔａ（１９９０年）１８０、４６１−４７０）（登録番号：Ｍ７３８０５）及び／又は種子及び花特異的プロモーターを使用する。
【００２３】
また発明は高い糖輸送容量と低い糖親和性を有する糖輸送体、特にサッカロース輸送体の活性を、抑制又は減少、特に阻害又は共抑制することを特徴とする植物組織の糖輸送体活性の修飾に関する。
【００２４】
特に好ましい実施形態では、本発明において使用される糖輸送体コーディング・ヌクレオチド配列、又はアンチセンス抑制のために十分なその一部を、プロモーターに対してアンチセンス配向で有し、植物細胞のゲノムに安定的に優先して組込まれるベクターを使用して、植物細胞を形質転換することにより、糖輸送体の活性を抑制又は減少することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現が上記の内在する糖輸送体の生成を抑制又は減少させることから、この輸送体によって生じる糖フラックスを操作することができる。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、植物に導入される共抑制効果によりこの糖輸送体の活性を減少又は抑制することができる。好ましい実施形態では、この共抑制効果を得るために、糖輸送体コーディング・ヌクレオチド配列又はその一部を有するベクターの複数のコピーを、少なくとも１つの植物細胞に、好ましくはそのゲノムに安定的になるように導入して、それによりそのコピーをゲノムに組込む。
【００２６】
別の実施形態では、好ましくは本発明に基づき使用される糖輸送体の組織特異的な内在性ヌクレオチド配列、即ち形質転換していない野生型にすでに存在しているヌクレオチド配列を、例えばトランスポゾン突然変異誘発により突然変異誘発することによって、糖輸送体の活性を抑制又は減少させることができる。
【００２７】
最後に、本発明に基づき、ＲＮＡ二本鎖阻害により糖輸送体の活性又は発現を減少又は抑制することができる。
【００２８】
本発明の特に好ましい実施形態では、サッカロース親和性が低くサッカロース輸送容量が高い糖輸送体の活性を抑制又は減少させる上記技術を用いて、例えば、ソース組織（例えば葉）において高含量の炭水化物、特に高含量のサッカロースを生産することができる。本発明の特定の実施形態では、ソース器官の糖輸送体容量を上記のように減少又は抑制することによって、これを達成することができる。これによってシンク器官の構造と強度が減少し、ソース器官ではサッカロース又は炭水化物含量が増大する。この方法によって葉が食品として利用される特定の植物、例えばチシャ又はホウレンソウのソース器官の高い甘味を得ることができる。また葉肉及び葉表皮での糖輸送体の過剰発現について前述したような、競合により得られる利点が得られる。最後に、植物の茎におけるサッカロースフラックスの減少により、その植物長を減少させることができる。この方法は、特に特定のリンゴ品種等の場合に、植物の矮性種を作出するために特に望ましい。
【００２９】
別の実施形態では、例えば孔辺細胞で、糖輸送体をコードする内在性ヌクレオチド配列の突然変異誘発を行い、共抑制効果、ＲＮＡ二本鎖阻害、又はアンチセンス構築物を用いることにより、孔辺細胞の糖輸送体活性を抑制又は減少させることができる。糖輸送過程を修飾し、それに伴う孔辺細胞のエネルギー及び浸透圧性物質の取り込み能を変化させることにより、気孔の開閉能力を変化させ、特に増加又は減少させることができる。高い気孔開口率はＣＯ２供給を増大させて、それにより光合成速度を向上させる。本発明に基づき気孔の開口を妨げるか又はその開口頻度を減少させることにより、植物において高い耐乾燥性を得ることができる。上記の効果を得るために、本発明に基づき使用される糖輸送体コーディング・ヌクレオチド配列を、センス又はアンチセンス配向で、例えば孔辺細胞特異的なプロモーター例えばＫＡＴ１プロモーター（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉ−ｏｌ．（１９９５年）１０９、３７１−３７４）により制御されるように含むベクターを使用することが特に好ましい。
【００３０】
糖輸送体ＳＵＴ４はシンク器官でも発現されるので、シンク細胞もしくは器官、又は好ましくは特定のシンク細胞もしくは器官、特に好ましくは花における糖移入を減少させることができる。これにより他の合成経路に役立つ炭水化物をソース細胞又は器官に蓄積させ、個々のシンク細胞における比活性を他のシンク細胞側へと変化させて、収量を量的・質的に改善することができる。
【００３１】
また本発明の特に好ましい実施形態では、本発明で使用される糖輸送体、好ましくはサッカロース輸送体、特に好ましくはＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列に加えて、又はその代わりに、植物組織のサッカロース濃度及びサッカロースフラックスと機能的に関連する別のヌクレオチド配列を形質転換のために使用して、上記の方法を実施することができる。
【００３２】
特に好ましい実施形態ではＳＵＴ１又はＳＵＴ２をコードするこのヌクレオチド配列は、例えばゲノムヌクレオチド配列又はｃＤＮＡヌクレオチド配列である。
【００３３】
ＳＵＴ１ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列は、例えば国際公開第９４／００５７４号明細書（ジャガイモ、ホウレンソウ）、Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、前掲書（ジャガイモ）、Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９２年）１１、４７０５−４７１３（ホウレンソウ））、Ｂｕｅｒｋｌｅら、（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８年）１１８、５９−６８（タバコ））、Ｈｉｒｏｓｅら、（Ｐｌａｎｔ        Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７年）３８、１３９８−１３９６（イネ））、Ｗｅｉｇ及びＫｏｍｏｒ（Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６年）１４７、６８５−６９０（ヒマ））、Ｗｅｂｅｒら、（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９７年）９、８９５−９０８（ソラマメ））、Ｓｈａｋｙａ及びＳｔｕｒｍ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８年）１１８、１４７３−１４８０（ニンジン））、Ｔｅｇｅｄｅｒら、（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９９年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９  １８、１５１−１６１（エンドウ））、Ｎｏｉｒａｕｄら、（Ｐｏｓｔｅｒ  ａｂｓｔｒｕｃｔ  １１ｔｈＩｎｔｅｒ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（１９９８年）（セロリ））、Ｐｉｃａｕｄら、（Ｐｏｓｔｅｒ  ａｂｓｔｒｕｃｔ  １１ｔｈＩｎｔｅｒ．Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ    Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（１９９８年）（ブドウ））及びテンサイ（登録番号：Ｘ８３８５０）に開示されている。これらはＳＵＴ１のヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びその取得に関して本明細書の開示内容に完全に組み入れられており、本明細書との関連のもとに特許権による保護を請求するものである。本発明に基づき使用されるＳＵＴ１コーディング・ヌクレオチド配列及びそれから得られるアミノ酸配列は、配列番号２２及び２３に示されており、同じく本発明の主題に包含される。ＳＵＴ１はサッカロース親和性が高くサッカロース輸送容量が低いサッカロース輸送体である。サッカロースに対する親和性が異なるサッカロース輸送体を、同一の組織、例えば篩要素で共発現することによって、植物に実際に存在する条件を考慮した制御された方法でのサッカロースフラックス操作が可能である。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態ではＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列を含有するベクターが少なくとも１つの植物細胞の形質転換のために使用される。本発明によれば、ＳＵＴ２は特にレギュレーター及びセンサーとして機能する。さらにＳＵＴ２は低親和性サッカロース輸送を引き起こす生物学的活性を有する。ＳＵＴ２の輸送率も同じく遅い。理論によって限定するものではないが、ＳＵＴ２はサッカロース輸送体のレギュレーター及び／又はセンサーであり、特にその固有の輸送活性を決定付けており、場合によっては仲介することもできる。一方ではその輸送活性をセンサー活性の機能的構成要素とみなすことができ、他方ではそのセンサー活性を輸送活性の構成要素とみなすことができる。本発明によれば、サッカロース親和性が低いＳＵＴ２はフラックスセンサーである。このフラックスセンサーは、おそらく基質、即ちサッカロースを輸送することができ、輸送率を調節するシグナルカスケードを使用するか、又はその構成要素をなすものである。ＳＵＴ２のサッカロース親和性はＳＵＴ４より低い。本発明の特に好ましい実施形態では、ＳＵＴ／ＳＵＣ遺伝子ファミリーのタンパク質のＮ末端が、基質、特にサッカロースに対する修飾された親和性をもたらすことが示された。特にＳＵＴ２のＮ末端、さらにはＳＵＴ１のＮ末端は、修飾されたサッカロース親和性、即ちＳＵＴ２の場合はサッカロース低親和性、ＳＵＴ１の場合はサッカロース高親和性をもたらす。
【００３５】
そこで本発明は、植物のサッカロース輸送又はサッカロース感知を修飾するため、特に植物におけるサッカロースに対し修飾された親和性を有する修飾サッカロース輸送体及びセンサーを生産するための、サッカロース輸送体又はこれをコードするヌクレオチド配列、特に植物サッカロース輸送体のＮ末端の使用に関する。
【００３６】
また本発明は特に例えば植物又は真菌細胞のＳＵＴ４及び／又はＳＵＴ１活性の調節のための、サッカロース輸送のレギュレーター及びセンサーとしてのＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ２コーディングＤＮＡ配列、特にＳＵＴ２ループの使用に関する。さらに本発明は、ＳＵＴ２がサッカロースにより誘導されることを示した。ＳＵＴ２は同じ細胞型、例えば篩要素に存在するサッカロース輸送体の比活性を調節する。特にＳＵＴ２は、サッカロース親和性が高いが輸送容量が低いサッカロース輸送体ＳＵＴ１、及び輸送容量が高いがサッカロース親和性が低いＳＵＴ４サッカロース輸送体の活性を調節する。この調節は例えばタンパク質改変による発現及びタンパク質活性の制御、又はｍＲＮＡもしくはタンパク質の代謝回転速度の制御によって行なわれ、活性を増加又は減少させることができる。ＳＵＴ２は植物において、特に成熟葉の大葉脈、花及びシンク器官で発現される。
【００３７】
そこで本発明はＳＵＴ／ＳＵＣ遺伝子ファミリー由来タンパク質、特にＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４のタンパク質の上記のＮ末端及び中央ループ並びにそれらの領域をコードするヌクレオチド配列にも関する。好ましい実施形態ではこれらの配列は配列番号２４、２５及び２６に示されているものである。ＬｅＳＵＴ２（トマト）及びＳｔＳＵＴ２（ジャガイモ）のＮ末端はそれらのタンパク質の最初の６２個のアミノ酸からなり、配列番号４（トマト）又は配列番号２９（ジャガイモ）のそれぞれのヌクレオチド１〜１８６にコードされている。ＬｅＳＵＴ２の中央ループは配列番号４のヌクレオチド８４４ないし１１３１によって、ＳｔＳＵＴ２の中心ループは配列番号２９のヌクレオチド８４７〜１１３４によってコードされる。
【００３８】
特に好ましい実施形態では、好ましくはベクター中に配列されるＳＵＴ１、ＳＵＴ４及び／又はＳＵＴ２コーディング配列を、少なくとも１つの調節要素、特にプロモーター（該プロモーターは所望する組織特異性に応じたものである）に対してセンス又はアンチセンス配向で配置したものであり、それを植物細胞に形質転換する。その際のゲノムへの組込み及びその産物の発現により、共形質転換された及び／又は内在性ＳＵＴ４の活性が修飾される。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明は、ＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列を、調節要素、特にプロモーターの機能的制御下となるように、好ましくはセンス又はアンチセンス配向で含むベクターを用いて、植物細胞を形質転換する上記の方法に関する。その場合、ＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列を含むベクターを、例えばＳＵＴ４又はＳＵＴ１コーディング・ヌクレオチド配列を含む別のベクターを用いることなく、形質転換することができる。本発明の内容、すなわちＳＵＴ２は特に上記の輸送体の性質をもつサッカロース濃度センサー及びレギュレーターであり、かつサッカロースフラックスセンサー及びレギュレーターであることに基づけば、ＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列の形質転換、組込み及び発現は、形質転換植物でのサッカロース輸送体の活性、特に内在性サッカロース輸送体即ちＳＵＴ４及び／又はＳＵＴ１の活性の修飾をもたらす。この調節は転写レベル又は転写後レベルで、例えば直接的なタンパク質相互作用によって、又は間接的にシグナルトランスダクションにより生じる。
【００４０】
もちろん本発明はＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列又はその断片、特にＮ末端タンパク質領域をコードする該ヌクレオチド配列を、植物細胞の形質転換に使用することにも関し、それによりその細胞をＳＵＴ１及び／又はＳＵＴ４コーディング・ヌクレオチド配列とともに形質転換することができる。このような場合もＳＵＴ２の過剰発現、共抑制又はアンチセンス抑制はＳＵＴ１及び／又はＳＵＴ４の活性を修飾し、すなわちそれらの活性を増加又は減少させることができる。本発明の特に好ましい実施形態では、サッカロース輸送体の生物学的活性を有するタンパク質をコードし、かつ例えばＮ末端としてＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列を有し、また中心領域とＣ末端に他のサッカロース輸送体例えばＳＵＴ１又はＳＵＴ４のヌクレオチド配列を有するキメラ遺伝子構築物として、ＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列の一部、特にＳＵＴ２のＮ末端タンパク質領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）又は中央細胞質性ループをコードするヌクレオチド配列（配列番号２６）を使用することができる。ＳＵＴ２又はＳＵＴ２の一部を含むこのようなＳＵＴ２ヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内に包含され、修飾ＳＵＴ２ヌクレオチド配列とも呼ばれる。
【００４１】
レギュレーターとしてＳＵＴ２は他のタンパク質、特にレギュレーター、シグナルトランスダクション因子及び他のサッカロース輸送体と相互作用する。従ってＳＵＴ２を利用して、相互作用クローニングにより別のレギュレーターを同定することができる。このさらなるレギュレーターについても特許権による保護を請求するものである。
【００４２】
また本発明はとりわけ単離精製されたレギュレータータンパク質及びセンサータンパク質、ＳＵＴ２の中央細胞質性ループを含む前記タンパク質（特にキメラタンパク質）をコードするヌクレオチド配列、並びに他のサッカロース輸送体のＮ及びＣ末端領域を有する核酸又はそれをコードする各ヌクレオチド配列に関する。このキメラタンパク質又は核酸はＳＵＴ２の中央ループを含む。中央細胞質性ループには、調節要素及び／又はセンサー及び／又はシグナルトランスデューサーとしての生物学的活性を有する。
【００４３】
したがって、発明の一実施形態は、サッカロース親和性が低くサッカロース輸送容量が高いサッカロース輸送体の活性を修飾する上記方法であって、公知の又は修飾されたＳＵＴ４、ＳＵＴ１及び／又はＳＵＴ２コーディング・ヌクレオチド配列を使用して修飾を行い、改良された形質転換植物を得る方法に関する。
【００４４】
また発明の別の実施形態は、上記のサッカロース輸送体の修飾された活性を示す形質転換改変植物であって、好適には安定的にゲノムに組込まれた修飾ＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４ヌクレオチド配列を含む前記植物の作製方法に関する。また本発明は上記のサッカロース輸送体が修飾されていることを特徴とし、サッカロース輸送体のヌクレオチド配列、特に例えばＳＵＴ及びＳＵＣ遺伝子等の遺伝子、とりわけ修飾形態のＳＵＴ１；ＳＵＴ２；ＳＵＴ４；ＳＵＴ１及びＳＵＴ２；ＳＵＴ１及びＳＵＴ４；ＳＵＴ２及びＳＵＴ４；ＳＵＴ１及びＳＵＴ２及びＳＵＴ４遺伝子からなるグループから選ばれる上記のヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む、上記方法で作出された形質転換植物、植物細胞、器官、又は器官及び植物の一部に関する。本発明における修飾ヌクレオチド配列とは、野生型配列（特に野生型遺伝子）と異なるヌクレオチド配列、例えばヌクレオチドの挿入、転移、欠失、置換、付加等による変異を意味する。例えば修飾ヌクレオチド配列は野生型由来のコーディング・ヌクレオチド配列を含む遺伝子であって、このコーディング・ヌクレオチド配列が異種プロモーター、例えば組織特異的又は構成性発現プロモーターと、センス又はアンチセンス配向で機能しうるように連結されているものを言う。本発明では、野生型配列とまったく一致するが、コピー数が天然の数より多いか又は／及び天然に現われる配列と異なるゲノム部位にある場合でも、修飾ヌクレオチド配列という。
【００４５】
天然に内在するヌクレオチド配列が突然変異誘発例えばトランスポゾン突然変異誘発により改変された場合も、修飾ヌクレオチドである。本発明において修飾遺伝子とは、調節及び／又はタンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列に野生型配列と比較して、変異、例えば挿入、付加、欠失、置換等を含むものをいい、突然変異体、誘導体又は機能的等価体とも呼ぶことができる。また修飾ヌクレオチド配列又は修飾遺伝子は、キメラ・ヌクレオチド配列又は遺伝子、例えば２つ以上のヌクレオチド配列で構成された天然には共に現われることがないタンパク質コーディング領域であってもよく、例えばＮ末端ヌクレオチド配列としてＳＵＴ２コーディング配列（配列番号２４）、中央及び３’末端領域としてＳＵＴ１コーディング配列を有する構築物であってよい。また本発明において修飾遺伝子は５’コーディング領域としてＳＵＴ１遺伝子（例えば配列番号２５）の配列、中間領域又は／及び３’領域としてＳＵＴ２遺伝子の配列を含む遺伝子を意味する。
【００４６】
従って修飾遺伝子は例えば野生型コーディング配列と異種プロモーター（例えば他の生物又は他の遺伝子由来のもの）とを含んでいてもよい。
【００４７】
本発明において遺伝子とは、少なくとも１つの調節要素の機能的な制御下にあるタンパク質コーディング・ヌクレオチド配列を意味する。
【００４８】
また本発明は、サッカロース輸送の修飾のための手段に関する。この手段は糖親和性が低く、糖（特にサッカロース）に対する輸送容量が高いサッカロース輸送体をコードする核酸分子、又はその一部であって、
ａ） 配列番号１、２又は２７に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子、その一部又はその相補鎖、
ｂ） 配列番号５、６又は２８に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、
ｃ） ａ）及びｂ）に挙げた核酸分子のいずれか１つとハイブリダイズする核酸分子
からなるグループから選ばれるものである。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、糖輸送体はサッカロース輸送体、特に例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，Ａｔ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，Ｌｅ）又はジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，Ｓｔ）由来のＳＵＴ４である。上記の核酸分子はＳＵＴ４コーディング配列とも呼ばれる。
【００５０】
また本発明は植物のサッカロース輸送に対するセンサー及び／又はレギュレーターをコードし、輸送率の遅い低親和性サッカロース輸送体の性質を有する核酸分子又はその一部であって、
ａ） 配列番号３、４、２４、２６又は２９に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子、その一部又はその相補鎖、
ｂ） 配列番号７、８又は３０に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、及び
ｃ） ａ）及びｂ）で挙げた核酸分子とハイブリダイズする核酸分子
からなるグループから選ばれるものである。
【００５１】
特に好ましい実施形態では糖センサー及び／又は糖レギュレーターは、例えばジャガイモ、トマト又はシロイヌナズナ由来のサッカロースセンサー及び／又はレギュレーター、特にＳＵＴ２である。上記の核酸分子はＳＵＴ２コーディング配列とも呼ばれる。
【００５２】
本発明に係る又は本発明に基づき使用される核酸分子は、天然の供給源、とりわけジャガイモから単離精製することができるが、又は公知の方法で合成することもできる。慣用の分子生物学的技術を用いて、様々な種類の突然変異を本発明に係る又は本発明に基づき使用される既知の核酸分子に導入することが可能であり、それによって改変された生物学的性質を有するタンパク質を合成することができる。このタンパク質も本発明の主題に包含される。また本発明における突然変異とは、短縮されたタンパク質を生じるすべての欠失変異をいう。例えば、他の分子機構、例えば挿入、重複、転位、遺伝子融合、ヌクレオチド交換により、また異なる微生物株の間での遺伝子移入等により、タンパク質の活性及び／又は調節の修飾を行うことができる。このようにして例えば異なる輸送容量もしくはサッカロース親和性を有し及び／又は細胞に通常存在する調節機構がもはや働かないかもしくは改変された形で働く突然変異タンパク質を作製することができる。さらに、本発明に基づき、改変された安定性、基質特異性又は改変された作用パターン若しくは修飾された活性、温度、ｐＨ値及び／又は濃度プロフィルを有する突然変異タンパク質を作製することができる。また本発明の内容は、改変された活性タンパク質濃度、翻訳前及び翻訳後修飾、例えばシグナル及び／もしくは輸送ペプチド並びに／又は別種の官能基を有するタンパク質に関する。
【００５３】
また本発明は本発明に係る上記の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子に関する。本発明の背景において、ハイブリダイゼーションとは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８９年）に記載されているような慣例のハイブリダイゼーション条件、好ましくはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。本発明においては、２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより５２℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で１５分間、好ましくは０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにより５２℃、好ましくは６０℃、より好ましくは６５℃で１５分間洗浄の後に陽性のハイブリダイゼーションシグナルが観察されるならば、ハイブリダイゼーションという用語が用いられる。このような洗浄条件下で配列表に示されたヌクレオチド配列の１つとハイブリダイズするヌクレオチド配列は、本発明に係るヌクレオチド配列である。
【００５４】
このような核酸分子の同定と単離は本発明に係る核酸分子もしくはこれらの分子の一部又は相補鎖を使用して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーションサンプルとして、厳密に配列番号１、２、３又は４に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子又はこれらの配列に本質的に対応する核酸分子又はこれらの配列の一部を有する核酸分子を使用することができる。ハイブリダイゼーションサンプルとして断片を使用する場合は、このような断片は慣用の合成技術で調製され、その配列が本発明の核酸分子の配列に本質的に対応する合成断片であってもよい。本発明に係る核酸分子とハイブリダイズする分子は、断片、誘導体及び本発明に係るタンパク質をコードする上記の核酸分子の対立遺伝子変異体も包含する。「断片」という用語は、上記のタンパク質をコードするのに十分な長さの核酸分子の一部を意味すると理解される。本発明に関連して用いられる場合の「誘導体」という表現は、この分子の配列が１以上の位置で上記の核酸分子の配列と異なるが、これらの配列に対して高度の相同性を有することを意味する。相同性とは、核酸レベルで少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％、９５％、９７％もしくは９９％超の同一性を意味する。これらの核酸分子でコードされるタンパク質は配列番号５、６、７又は８に示されたアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、９５％、９７％及び９９％超の配列同一性を有する。また上記の核酸分子からの偏向が、例えば失欠、置換、挿入又は組換えによって生じうる。これらの変異は、天然に存在するものであってよく、例えば他の生物由来の配列又は突然変異であり、ここで突然変異は天然の手段によって、又は意図的な突然変異誘発（紫外線もしくはＸ線照射、化学薬品等）により生じさせることができる。さらに、変異は合成的に生産された配列を含み得る。
【００５５】
対立遺伝子変異体は、天然に存在する変異体、ならびに合成的に調製された又は組換えＤＮＡ技術によって生産した変異体であってもよい。本発明に係る核酸分子の種々の変異体がコードするタンパク質は特定の共通の特性、例えば活性、活性タンパク質濃度、翻訳後改変、官能基、分子量、免疫学的反応性、立体配座及び／又は物理的性質、例えばゲル電気泳動での移動挙動、クロマトグラフィー挙動、沈降係数、溶解度、分光的性質、安定性、最適ｐＨ値、等電ｐＨ値、最適温度及び／又はその他を有する。
【００５６】
本発明に係る核酸分子はＤＮＡ及びＲＮＡ分子であることが可能である。本発明に係るＤＮＡ分子は例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子である。
【００５７】
また本発明は本発明に係る核酸分子を含むベクターに関する。
【００５８】
本発明に関連してベクターは例えばプラスミド、リポソーム、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、シャトルベクター及び遺伝子技術で慣用のその他のベクターであってよい。ベクターは、宿主生物でのベクターの安定化及び／又は複製をもたらし又はそれに寄与する付加的な機能単位をもつことができる。
【００５９】
また本発明の好ましい実施形態には、そのベクターに含まれる核酸分子が原核細胞及び／又は真核細胞において翻訳可能な核酸分子の転写及び合成を生じさせる少なくとも１つの調節エレメントと機能しうる形で結合されているベクターも含まれる。このような調節エレメントはプロモーター、エンハンサー、オペレーター及び／又は転写終結シグナルであることができる。もちろんまたベクターは抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、従って例えば選択マーカーを含んでいてもよい。
【００６０】
好ましい実施形態において、また本発明は、少なくとも１つの調節エレメントの制御下にあり、本発明に係るＳＵＴ４及び／又はＳＵＴ２をコードする核酸配列に加えて、また少なくとも１つの調節エレメントの制御下にある、ＳＵＴ１をコードする核酸配列を含む上記のベクターに関する。従ってこのようなベクターはサッカロース輸送体に関与する少なくとも２つのタンパク質についての遺伝情報を有する。このようなベクターによって植物のサッカロース輸送系を制御されかつ包括的な方法において簡単に改変することができる。
【００６１】
また本発明は、本発明に係る核酸分子の１つ又は本発明に係るベクターの１つを安定的に組込み、又は上記分子もしくはベクターを一時的に含み、あるいはこれらによって形質転換され、好ましくはＳＵＴ４及び場合によってはＳＵＴ１及び／又はＳＵＴ２を発現することができる宿主細胞に関する。また本発明は、本発明に係る核酸分子又は本発明に係るベクターによって形質転換された宿主細胞の子孫である宿主細胞に関する。従って本発明は本発明に係る核酸分子又はベクターを含む宿主細胞に関する。ここでは、宿主細胞とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換え核酸分子を受容し、場合によっては本発明に係る核酸分子でコードされたタンパク質を合成することができる生物を意味すると理解される。これらの細胞は原核細胞又は真核細胞であることが好ましい。とりわけ本発明は、本発明に係るベクター、誘導体又はベクターの一部を含み、これらがサッカロース輸送活性をもつタンパク質を合成することを可能にする微生物に関する。また本発明に係る宿主細胞は、本発明に従って導入される本発明の核酸分子が形質転換細胞に対して異種であること（即ちこの細胞に天然に生じないことを意味する）、又は天然に存在する対応配列と異なる部位もしくは異なるコピー数でゲノムに配置されているという事実によって特徴づけることができる。
【００６２】
本発明の一実施形態では、従って、この宿主細胞は原核細胞、好ましくはグラム陰性原核細胞、より好ましくは腸内細菌細胞である。外因的核酸配列による原核細胞の形質転換は分子生物学の技術分野の当業者の熟知するところである。
【００６３】
しかし本発明のさらなる実施形態では、本発明に係る細胞は真核細胞、例えば植物細胞、真菌細胞（例えば酵母）又は動物細胞であることも可能である。外因的核酸配列による真核細胞の形質転換又はトランスフェクションの各々の方法は分子生物学の技術分野の当業者の熟知するところである。
【００６４】
また本発明は、本発明に係る宿主細胞の少なくとも１つを有する細胞培養物又はカルス組織に関する。その場合、本発明に係る細胞培養物又はカルスは特にサッカロース輸送活性を有するタンパク質を生産することができる。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるヌクレオチド配列は、ベクターにおいてタンパク質を種々の細胞区画又は原形質膜へ輸送するための機能的シグナル配列をコードする核酸分子と連結されている。この改変は例えば高等植物に由来するＮ末端配列の付加からなることができるが、コードされたタンパク質に配列を融合させるその他の改変も本発明の目的に含まれる。
【００６６】
原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば酵母）での本発明に係る核酸分子の発現は、例えばこの分子でコードされるタンパク質の活性のより厳密な特徴づけがこの方法で可能になるという点で興味深い。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に係るヌクレオチド配列でコードされ、好ましくは配列番号５〜８、２３〜２６、２８又は３０のアミノ酸配列を有し、好ましくはサッカロース輸送体の活性、好ましくはサッカロース親和性が低くサッカロース輸送容量が高いサッカロース輸送体の活性を有し、およびサッカロース輸送センサー又はレギュレーターの活性を有する、好ましくは精製及び単離されたペプチド又はタンパク質、ならびに本発明に係る宿主細胞をタンパク質合成が可能である条件下で培養し、続いて培養された細胞及び／又は培地からタンパク質を分離する、上記ペプチド又はタンパク質の調製方法を含む。
【００６８】
さらに本発明は、これらのタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に関する。
【００６９】
本発明に係る核酸分子を調製することによって、任意の植物組織のサッカロース輸送を、植物における慣例の方法（例えば育種によって）では可能ではなかった方法で遺伝子工学的方法を用いて改変し、および特定の植物組織でサッカロース濃度を選択的に変化させるために用いることができるように該輸送を改変することが可能である。例えば適当な核酸分子の過剰発現により本発明に係るタンパク質の活性を高めることによって、あるいは細胞特有の調節機構によってもはや制御されず、及び／又は活性に関して異なる温度依存性を有する突然変異体を提供することによって、このように遺伝子工学的に改変した植物における収量を増加することが可能である。こうして対応するサッカロース輸送体の活性を高めるために、本発明に従って使用される核酸分子を植物細胞において発現させることができ、又は通常このタンパク質を発現しない細胞で該タンパク質を発現することが可能である。さらに、細胞特有の調節機構にもはや支配されないか、又は改変された温度依存性もしくは基質／産物特異性を有する本発明に係るタンパク質を得るために、当業者に公知の方法を用いて、本発明に従って使用される核酸分子を改変することができる。また本発明により、合成タンパク質を植物細胞の任意の区画又は原形質膜に局在させることが可能である。特定の区画又は原形質膜における局在を達成するために、コーディング領域をそれぞれの区画又は原形質膜における局在を達成するＤＮＡ配列と連結する必要がある場合がある。このような配列は公知である（例えばＢｒａｕｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９２年）１１、３２１９−３２２７；Ｗｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８年）８５、８４６−８５０；Ｓｏｎｎｅｗａｌｄら、Ｐｌａｎｔ Ｓ．（１９９１年）１、９５−１０６を参照）。
【００７０】
従って、本発明は、本発明に係る１以上の核酸分子又は本発明に従って使用される１以上の核酸分子で形質転換したトランスジェニック植物細胞ならびにこのような形質転換細胞の子孫であるトランスジェニック植物細胞に関する。このような細胞は、本発明に係る１以上の核酸分子または本発明に従って使用される１以上の核酸分子を含んでおり、上記１以上の核酸分子は植物細胞での転写を生じさせる調節ＤＮＡエレメント、特にプロモーターと連結されていることが好ましい。また本発明は、ゲノムがＳＵＴ及び／又はＳＵＣ遺伝子を含むファミリーに由来する少なくとも２つの安定的に組込まれた改変遺伝子を含むトランスジェニック植物細胞に関する。このような細胞は、該細胞において天然に生じない少なくとも１つの本発明に係る核酸分子又は本発明に従って使用される核酸分子を含むこと、又は上記分子が通常天然には生じない細胞のゲノム部位に組込まれている、即ち通常天然に生じるものとは異なるゲノム環境又は異なるコピー数で存在するという点で、天然に存在する植物細胞と異なる。トランスジェニック植物細胞は当業者が熟知する技術を用いて植物全体を生じるように再生することができる。本発明に係るトランスジェニック植物細胞の再生によって得られる植物も同本発明の範囲に含まれる。また本発明は、本発明に係るベクター系またはその誘導体もしくは断片、あるいは本発明に従って使用されるベクター系またはその誘導体もしくは断片を含み、かつ上記ベクター系、その誘導体又は一部を含有することに基づいて、改変されたサッカロース輸送活性、特にＳＵＴ４活性を生じさせるタンパク質を合成することが可能である、少なくとも１つの細胞、好ましくは複数の細胞を含む植物に関する。従って、本発明により、上記の特性を有する様々な種、属、科、目及び綱の植物を生産することが可能となる。理論的には、トランスジェニック植物は任意の植物種の植物であってよく、即ち単子葉植物及び双子葉植物、例えばイネ科（ｇｒａｍｉｎａｅ）、ピニダエ（ｐｉｎｉｄａｅ）、モクレン亜網（ｍａｇｎｏｌｉｉｄａｅ）、キンポウゲ亜網（ｒａｎｕｎｃｕｌｉｄａｅ）、ナデシコ亜網（ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉｄａｅ）、バラ亜網（ｒｏｓｉｄａｅ）、キク亜網（ａｓｔｅｒｉｄａｅ）、アリダエ（ａｒｉｄａｅ）、ユリ亜網（ｌｉｌｉｉｄａｅ）、ヤシ亜網（ａｒｅｃｉｄａｅ）及びツユクサ亜網（ｃｏｍｍｅｌｌｉｎｉｎｄａｅ）ならびに裸子植物、藻類、苔類、シダ類、又はカルス、植物細胞培養物など、ならびにその断片、器官、組織、収穫物又は繁殖物質である。好ましくは植物は、農業植物、特にデンプン合成又はデンプン蓄積植物、例えばコムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、キクイモ（ｔｏｐｉｎａｍｂｕｒ）、テンサイ、サトウキビ又はジャガイモである。しかしながら、また本発明は、その他の植物、例えばトマト、シロイヌナズナ、エンドウ、ナタネ、ヒマワリ、タバコ、ライムギ、オートムギ、カッサバ、チシャ（ｌｅｔｔｕｃｅ）、ホウレンソウ、ブドウ、リンゴ、コーヒー、チャ、バナナ、ココナッツ、ヤシ、ビーン、マツ、ポプラ、ユーカリ等に関する。また本発明は、本発明に係る植物に由来する繁殖物質及び収穫産物、特に花、果実、種子、塊茎、根、葉、主根、芽、シュートなどに関する。
【００７１】
例えば植物細胞においてセンス又はアンチセンス配向で本発明に係る核酸分子又は本発明に従って使用される核酸分子を発現するために、前記分子を植物細胞での転写を達成する調節ＤＮＡエレメントと連結する。これらのエレメントとしては、特にプロモーターが挙げられる。一般に、植物で活性のあるいずれのプロモーターも、ＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４コーディングヌクレオチド配列を発現するために用いることができ、例えば、構成的に発現するプロモーター、または植物の発育の特定の時期もしくは外部要因で決まる時期に特定の組織でだけ発現するプロモーターが挙げられる。植物に関しては、プロモーターは同種でも異種であってもよい。使用することができるプロモーターの中には、例えば構成的発現のためのカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡプロモーター及びトウモロコシ由来のユビキチンプロモーターがあり、ジャガイモでの塊茎特異的発現にはｐａｔａｔｉｎ遺伝子プロモーターＢ３３（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら、前掲書）、又は光合成に関して活性のある組織でだけ発現が生じることを確実にするプロモーター、例えばＳＴ−ＬＳ１−プロモーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７年）８４、７９４３−７９４７；Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８９年）８、２４４５−２４５１）、または内乳特異的発現にはコムギに由来するＨＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーターもしくはトウモロコシ由来のゼイン遺伝子のプロモーターが特に好ましい。また終結配列がベクターに存在してもよい。この配列を用いることで、転写を正確に終結する。ポリ−Ａ−テイルを転写物に付加することで転写物を安定化することができる。このようなエレメントは、文献（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９年）８、２３−２９）に記載されており、完全に交換することができる。さらなるプロモーターは前述のとおりである。
【００７２】
多数のクローニングベクターが高等植物に外因遺伝子を導入するために利用可能である。これらのベクターは、大腸菌用の複製シグナル及び形質転換細菌細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含む。このようなベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、Ｍ１３ｍｐ系列、ｐＡＣＹＣ１８１などが挙げられる。所望の配列を適当な制限切断部位でベクターに導入することができる。得られたプラスミドは例えば大腸菌細胞の形質転換のために使用される。形質転換した大腸菌細胞を適当な培地で培養し、続いて回収し、溶解し、さらにプラスミドを回収する。得られたプラスミドＤＮＡを特徴づけるために一般に用いられる分析方法は、制限分析、ゲル電気泳動及びその他の生化学的／分子生物学的方法である。各操作後に、プラスミドＤＮＡを溶解し、得られたＤＮＡ断片を他のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミドＤＮＡ配列を同じ又は異なるプラスミドにクローニングすることができる。植物宿主細胞へのＤＮＡの導入のために様々な技術が利用可能である。これらの技術には、形質転換ベクターとしてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いるＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、原形質体の融合、ＤＮＡのインジェクション、エレクトロポレーション、およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｓｃｈ）法を用いたＤＮＡの組込みならびにその他の方法が含まれる。植物細胞におけるＤＮＡのインジェクション及びエレクトロポレーションの場合は、使用するプラスミドに対して基本的に特別な要件はない。単純なプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体を使用することができる。しかしこのように形質転換した細胞から植物全体を再生しようとするときは、選択可能なマーカーが存在すべきである。
【００７３】
植物細胞へのＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４コーディングヌクレオチド配列の挿入に用いられる方法に応じて、付加的なＤＮＡ配列が必要である場合がある。例えば、植物細胞の形質転換のためにＴｉ又はＲｉプラスミドを使用する場合、側部領域としてＴｉ及びＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界配列、但し多くの場合は左および右の境界配列を、導入すべき遺伝子に結合しなければならない。形質転換のためにアグロバクテリア菌を使用する場合、導入すべきＤＮＡを特定のプラスミド、即ち中間ベクター又はバイナリ−ベクターにクローニングしなければならない。Ｔ−ＤＮＡ中の配列と相同な配列に基づき、中間ベクターを相同組換えによってアグロバクテリア菌のＴｉ又はＲｉプラスミドに組込むことができる。またこのプラスミドはＴ−ＤＮＡの導入のために必要なｖｉｒ領域を含む。中間ベクターはアグロバクテリア菌において複製することはできない。ヘルパープラスミドを用いることで、中間ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入することができる。バイナリーベクターは大腸菌ならびにアグロバクテリア菌で複製することができる。バイナリーベクターは選択マーカー遺伝子及びリンカー又はポリリンカーを含む。これらは右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域によって適合される（ｆｒａｍｅｄ）。バイナリーベクターはアグロバクテリア菌に直接に形質転換することができる（Ｈｏｌｓｔｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９７８年）１６３、１８１−１８７）。宿主細胞として機能するアグロバクテリア菌は、ｖｉｒ領域をもつプラスミドを含むべきである。付加的なＴ−ＤＮＡが存在してもよい。このように形質転換したアグロバクテリア菌は植物細胞の形質転換のために使用される。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用はＥＰ−Ａ−１２０ ５１６；Ｈｏｅｋｅｍａ：Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｆｆｓｅｔｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ．Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ（１９８５年）、第Ｖ章；Ｆｒａｌｅｙら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．，４、１−４６及びＡｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５年）４、２７７−２８７に記載されている。植物細胞へのＤＮＡの導入のために、植物外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスとともに共培養することができる。形質転換細胞の選択のために抗生物質又は生物致死剤を含む適当な培地において、感染した植物材料、例えば葉片、茎断片、根、さらには原形質体又は懸濁培養した植物細胞から、再び植物全体を再生することができる。次いで、こうして得られた植物を、導入されたＤＮＡの存在について分析することができる。バイオリスティック法又は原形質体の形質転換を用いた外因ＤＮＡを導入するためのその他の方法は公知である（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、１９９３年 Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ、Ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｏｌｕｍｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ（Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ，Ｇ．Ｒｅｅｄ，Ａ．Ｐｕｈｌｅｒ，Ｐ．Ｓｔａｄｌｅｒ編集）、第２巻、６２７−６５９、ＶＣＨ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：Ｎｅｗ ���ｏｒｋ， Ｂａｓｅｌ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。単子葉植物の形質転換のための別の系は、電気的又は化学的に誘導される原形質体のＤＮＡ取り込み、部分的に透過した細胞のエレクトロポレーション、花序へのＤＮＡのマクロインジェクション（ｍａｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、小胞子及び原芽体へのＤＮＡのマイクロインジェクション、花粉を成長させることによるＤＮＡ取り込み及び膨潤による胚へのＤＮＡ取り込みである（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ（１９９０年）、２６９−２７３）。アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用したＴｉプラスミドベクター系を用いた双子葉植物の形質転換は確立された技術であるが、一方で最近の研究は単子葉植物もアグロバクテリア菌に基づくベクターを用いて形質転換できることを示唆する（Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３年）２２、４９１−５０６；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９４年）６、２７１−２８２；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８７年）８４、５３４５−５３４９；Ｒａｉｎｅｒｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０年）８、３３−３８；Ｇｏｕｌｄら、Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１年）９５、４２６−４３４；Ｍｏｏｎｅｙら、Ｐｌａｎｔ，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．＆Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．（１９９１年）２５、２０９−２１８；Ｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２年）２０、１０３７−１０４８）。引用した形質転換系の幾つかは種々の穀物で確立されている：組織のエレクトロポレーション、原形質体の形質転換ならびにパーティクルボンバードメントによる再生可能な組織及び細胞へのＤＮＡ導入（Ｊａｈｎｅら、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５（１９９５年）、３５−４４）。コムギの形質転換が文献（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５年）１４（２）、１４９−１７８）に、トウモロコシの形質転換がＢｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７年）９４、７３７−７４８）及びＩｓｈｉｄａら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６年）１４、７４５−７５０）に記載されている。
【００７４】
また本発明は、サッカロース代謝のモジュレーター、好ましくは潜在的な農薬及び除草剤の同定および／またはスクリーニング方法に関する。その場合、ＳＵＴ４及び／又はＳＵＴ２を発現する細胞又は組織、特に本発明に係る宿主細胞又は植物、例えば本発明に係る酵母又は植物細胞を、試験されるべき潜在的なモジュレーター（例えば、農薬又は除草剤）と接触させ、潜在的なモジュレーター（例えば、農薬又は除草剤）のＳＵＴ１、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４の活性に及ぼす作用、特に阻害作用を定量的又は定性的に測定する。同様に、ＳＵＴ２及び／又はＳＵＴ４を使用して、農薬動員の改善を可能にする系を開発することができる。低親和性サッカロース輸送体（例えば、ＳＵＴ４）を発現し、又は他のサッカロース輸送体の組合せ（例えば、ＳＵＴ４とＳＵＴ２又はＳＵＴ２とＳＵＴ１又はＳＵＴ４とＳＵＴ１）を共発現する酵母の成長を特異的に阻止する物質について化学ライブラリーを系統的にスクリーニングすることによって、阻害剤を同定することができる。これらの阻害剤を除草剤として、又は新しい除草剤に対する前駆体としても使用することができる。また試験に基づいて、これらの輸送体により植物内で移動し、こうしてより効果的に標的部位に到達することができる潜在的な除草剤を同定することができる。
【００７５】
また本発明は、混合オリゴヌクレオチドを使用したキメラプラスティー（ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔｙ）への影響、即ち植物における輸送体活性への影響に関する。その場合、混合オリゴヌクレオチドによってサッカロース輸送体の活性が増加され、低減され、またはサッカロース輸送体の生化学的性質が改変される。このタイプの方法は、国際公開第９９／０７８６５号に記載され、上記はこの方法に関して本教訓の開示内容に全面的に取り入れられており、本発明の範囲において請求される。
【００７６】
また本発明は、サッカロース輸送のモジュレーター、特に誘導物質、活性化因子又は阻害剤の同定、特に植物のサッカロース輸送のセンシング及び／又は調節のための、ＳＵＴ２コーディングヌクレオチド配列又はＳＵＴ２の使用に関する。その場合、ＳＵＴ２コーディングヌクレオチド配列でコードされたタンパク質の活性が潜在的なモジュレーターの存在及び不在下で検出される。ＳＵＴ２によって調節されるサッカロース輸送体、例えばＳＵＴ１又はＳＵＴ４の活性を、ＳＵＴ２の活性の代わりに同定することができる。
【００７７】
また本発明は、植物におけるサッカロース輸送活性のモジュレーター、特に篩部へのサッカロースの低親和性高容量負荷の阻害剤を同定するための、ＳＵＴ１コーディングヌクレオチド配列（特に配列番号２２）及び／又はＳＵＴ４コーディングヌクレオチド配列及び／又はＳＵＴ１及び／又はＳＵＴ４の使用に関する。その場合、ＳＵＴ４ヌクレオチド配列でコードされたタンパク質の活性が潜在的なモジュレーターの存在及び不在下で検出される。
【００７８】
また本発明は、他の植物、例えばｃＤＮＡ又はゲノムバンクに由来する植物における相同遺伝子を同定するための、本発明に係るＳＵＴ１、ＳＵＴ２及びＳＵＴ４ヌクレオチド配列の使用に関する。
【００７９】
また本発明は、交差プログラムのための分子マーカーとしての遺伝子及び周辺領域の使用に関する。ジャガイモ塊茎において、ＳＵＴ２遺伝子座およびＳＵＴ４遺伝子座の双方はより高い炭水化物含量とより高い収穫のためにＱＴＬ遺伝子座の領域に配置される。従って双方は、野生型又は高性能品種を含めた育種プログラムにおいて、適当な染色体断片を交差して、このようにして収穫の改善を生じる植物を得るために使用することに適している。
【００８０】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、従属請求項において挙げられている。
【００８１】
配列表は下記のものを含む：
配列番号１：シロイヌナズナに由来するＳＵＴ４遺伝子のコーディングＤＮＡ配列
配列番号２：トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来のＳＵＴ４遺伝子のコーディングＤＮＡ配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＳＵＴ２遺伝子のコーディングＤＮＡ配列  配列番号４：トマト由来のＳＵＴ２遺伝子のコーディングＤＮＡ配列
配列番号５：シロイヌナズナ由来のＳＵＴ４のアミノ酸配列
配列番号６：トマト由来のＳＵＴ４のアミノ酸配列
配列番号７：シロイヌナズナ由来のＳＵＴ２のアミノ酸配列
配列番号８：トマト由来のＳＵＴ２のアミノ酸配列
配列番号９：Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマー
配列番号１０：ＳＵＴ４特異的プライマー
配列番号１１：ＳＵＴ４特異的プライマー
配列番号１２〜１５はさらなるＳＵＴ４プライマーを示す。
【００８２】
配列番号１６及び１７はＬｅＳＵＴ４の断片のアミノ酸配列を示す。
【００８３】
配列番号１８〜２１はクローニングプライマーを示す。
【００８４】
配列番号２２：ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のＳＵＴ１遺伝子のコーディングＤＮＡ配列
配列番号２３：ジャガイモ由来のＳＵＴ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ヌクレオチド１〜２３９を有する、ＳＵＴ２のＮ末端領域をコードする配列番号３からのＤＮＡ配列
配列番号２５：ヌクレオチド１〜１４９を有する、ＳＵＴ１のＮ末端領域をコードする配列番号２２のＤＮＡ配列
配列番号２６：ヌクレオチド８４３〜１１３０を有する、中心ループをコードする配列番号３のＤＮＡ配列
配列番号２７：ジャガイモ由来のＳＵＴ４遺伝子のコーディングＤＮＡ配列
配列番号２８：ジャガイモ由来のＳＵＴ４のアミノ酸配列
配列番号２９：ジャガイモ由来のＳＵＴ２のコーディングＤＮＡ酸配列
配列番号３０：ジャガイモ由来のＳＵＴ２のアミノ酸配列
下記の実施例と添付した図面に基づき本発明を詳述する。
【００８５】
実施例１
ＳＵＴ４  ｃＤＮＡの分離
ＳＵＴ１に対して遠隔相同性を有し、これまで確認されていなかった配列をデータバンク（遺伝子バンク）で同定した。
【００８６】
ゲノム配列：ＡｔＳＵＴ４  ＡＣ０００１３２
シロイヌナズナ苗バンクのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した（Ｍｉｎｅｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９２年）２、４１７−４２２）。ゲノム配列（５’−ｇａｃｔｃｔｇｃａｇｃｇａｇａａａｔｇｇｃｔａｃｔｔｃｃｇ、配列番号１２、５’−ｔａａｃｃｔｇｃａｇｇａｇａａｔｃｔｃａｔｇｇｇａｇａｇｇ、配列番号１３）をベースとするプライマーを設計した。プライマーはそれぞれＰｓｔＩ制限部位（下線を付す）を含み、ＡｔＳＵＴ４の全コーディング配列が増幅されるように設計されている。１５６６ｂｐの予想した大きさの産物をＰｓｔＩで切断し、ベクターｐＢＣ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＰｓｔＩ部位に結合した。ＡｔＳＵＴ４をｐＤＲ１９６のＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。ｐＤＲ１９６のＡｔＳＵＴ４−ｃＤＮＡの配列を両方向で決定した。Ｃｏｌｕｍｂｉａ及びＬａｎｄｓｂｅｒｇ　ｅｒｅｃｔａのＳＵＴ４遺伝子の生態型の相違をＬａｎｄｓｂｅｒｇ　ｅｒｃｔａのＡｔＳＵＴ４の配列決定により検証した。
【００８７】
トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　ｃｖ．ＵＣ８２ｂ）ｃＤＮＡバンク（花）をゲノムタバコクローンＮｔＳＵＴ３（Ｌｅｍｏｉｎｅら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（１９９９年）４５４、３２５−３３０）の３００ｂｐのＥｃｏ−ＲＩＢｇｌＩＩ断片で、ストリンジェンシーを低下させて検索した。ＬｅＳＵＴ１から独立の、３つの異なるクローンが分離され、ＬｅＳＵＴ４と称した。ＬｅＳＵＴ４配列のプライマーでＰＴ−ＰＣＲによりオーソロガス配列がジャガイモから分離され、ＳｔＳＵＴ４と称した。ＳｔＳＵＴ４をＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＢＣ　ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ断片として酵母発現ベクターｐＤＲ１９５にサブクローニングした。ｐＤＲ１９５はＵＲＡ３マーカー、ＰＭＡ１プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーターを有する（Ｒｅｎｔｓｃｈら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（１９９５年）３７０、２６４−２６８）。ＳｔＳＵＴ４（ＯＲＦ，＝ｃＤＮＡ配列）を増幅するために、５’−ＳＵＴ４−ＰｓｔＩ（５’−ＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１４））及び５’−ＳＵＴ４−ＮｏｔＩ（　５’−ＴＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号１５））を使用した。
【００８８】
実施例２
ＳＵＴ２　ｃＤＮＡの分離
ＳＵＴ１に対して遠隔相同性を有し、これまで確認されていなかった配列をデータベース（遺伝子バンク）で同定した。
【００８９】
ゲノム配列：ＡｔＳＵＴ２　ＡＣ００４１３８
詳しい配列比較に基づいて、他の公知の相同プライマー配列を同定した。この配列により葉のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲで潜在的ｃＤＮＡ配列をクローニングすることが可能である。ゲノム配列（５’−ＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＡＧＧＡＣＧ、配列番号２０、５’−ＡＧＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＣＧ、配列番号２１）をベースとするプライマーを設計した。プライマーはＥｃｏＲＩ又はＸｈｏＩ制限部位（下線を付す）を含み、ＡｔＳＵＴ２の全コーディング配列が増幅されるように設計されている。１７８５ｂｐの予想した大きさの産物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、方向づけしてベクターｐＤＲ１９６に結合した。
【００９０】
実施例３
ＳＵＴ４の機能分析
酵母株ＳＵＳＹ７／ｕｒａ３はＳＵＳＹ７の変異体である（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９９２年）１１、４７０５−４７１３）。これはＵＲＡ３遺伝子の一部の欠失を含み、それによってウラシル栄養要求性による選択が可能である。サッカロース培地上の酵母成長の分析のために、１．７ｇ／ｌの酵母アミノ酸非含有窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ）、アミノ酸なし、２％サッカロース、２０ｍｇ／ｌのトリプトファン及び１．５％アガロース、ｐＨ５．０を含む培地を使用した。
【００９１】
サッカロース取込みテストのために、グルコースを含む液状最小培地で培養し、ＯＤ６２３の約０．８までの酵母を遠心分離して細胞を回収し、２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄し、同じ緩衝液中でＯＤ６２３で２０となるように懸濁した。１４Ｃサッカロースの添加の１分前に、グルコースを最終濃度１０ｍＭまで酵母細胞に加えることによって取込みテストを開始した。３０℃で攪拌しつつインキュベートした後、ガラス繊維フィルタで真空ろ過して細胞を回収し（１−５分）、４ｍｌの１０ｍＭサッカロースで（氷点で）２回洗浄し、液体シンチレーションカウンターで放射能を検出した。ＡｔＳＵＴ４発現はサッカロースで酵母を増殖させた。ＡｔＳＵＴ４及びＳｔＳＵＴ４は機能的なサッカロース輸送体であることが判明した。ＡｔＳＵＴ４又はＳｔＳＵＴ４発現酵母の１４Ｃ−サッカロース取込みの時間的経過を図５Ａに示す。ベクター制御との重要な相違が明らかである。
【００９２】
ＳＵＴ４の反応速度分析のためのデータはミカエリス・メンテンの式により取込み測定の非線形回帰から得た。Ｋｍは、３つの独立の形質転換体を使用して８回の決定の平均±標準偏差として示した。シロイヌナズナのＳＵＴ４について測定されたサッカロースのＫｍ値は、１１．６±０．６ｍＭ（ｐＨ５．５）及び５．９±０．８ｍＭ（ｐＨ４．０）である。ジャガイモ由来のＳＵＴ４のＫｍ値は６．０±１．２ｍＭ（ｐＨ４．０）であった（図５Ｂを参照）。
【００９３】
ＳＵＴ４の１４Ｃサッカロース取込みのグルコースによる刺激及び電子伝達阻害剤による阻害（アンチマイシンＡ及びプロトノホアＣＣＣＰを図５Ｃに示す）。図６はＳＵＴ４誘導によるサッカロース輸送の最適ｐＨを示す。
【００９４】
実施例４
ＳＵＴ４挿入変異体の調製（シロイヌナズナ）
１２，８００のＴ−ＤＮＡ突然変異シロイヌナズナ植物（１９，２００の挿入過程に相当）の種子をデュポン社及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＢＲＣ）、オハイオ州立大学から得た。植物を１００体ずつのグループに分けて研究した。植物を無菌培地で生長させ、ゲノムＤＮＡを分離した。植物１００体ずつの１４０のグループのＤＮＡを１４の上級グループ（スーパープール）にまとめ、Ｋｒｙｓａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６年）９３、８１４５−８１５０）の方法でスクリーニングし、その際遺伝子特異的及びＴ−ＤＮＡ特異的プライマーを使用した。鋳型としてスーパープールＤＮＡを用い、Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマー（ＬＢ、左境界領域、配列番号９）及び遺伝子特異的プライマー（ＡｔＳＵＴ４ｒ２、配列番号１０）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、帯電ナイロン膜に移した。膜を、鋳型としてのＷＳ（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ）ゲノムＤＮＡ並びにプライマーＡｔＳＵＴ４ｒ２（上記を参照）及びＡｔＳＵＴ４ｆ２（ＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＣＣＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＧＴＣ、配列番号１１）から調製した２．４６ｋｂ長のＰＣＲ産物でハイブリダイズさせた。このプローブを３２Ｐ−ＣＴＰで標識した。
【００９５】
標識プローブをブロットにハイブリダイズすることによりスーパープールを同定した。続いてスーパープールを構成する１００体の植物のプールから得られたＤＮＡを同様に検索した。即ち鋳型としての１００体のプールから得られたＤＮＡ並びにプライマーとしてのＡｔＳＵＴ４ｒ２及びＬＢによりＰＣＲを行い、増幅産物の検出のためにＡｔＳＵＴ４ゲノムプローブ（２．４６ｋｂ）でＤＮＡブロットハイブリダイゼーション行った。
【００９６】
１００のＴ−ＤＮＡ突然変異ラインからなるプールＣＳ２１６５で正のハイブリダイゼーションが観察された。ＣＳ２１６５の個々の植物を培養し、ゲノムＤＮＡを調製した。個々の植物のＤＮＡを前述のように検索した。鋳型として個々の植物のＤＮＡ並びにプライマーとしてＡｔＳＵＴ４ｒ２及びＬＢを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムで染色してアガロースゲル上ではっきり分かるようにした。配列プライマーとしてのＡｔＳＵＴ４ｒ２及びＬＢでＰＣＲ産物の配列を決定した。ＡｔＳＵＴ４遺伝子と同じ配列はＡｔＳＵＴ４遺伝子へのＴ−ＤＮＡ挿入を示唆する。
【００９７】
Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマー（ＬＢ、５’−ＧＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＣ）（配列番号９）でも、ＳＵＴ４特異的プライマー（ＡｔＳＵＴ４ｒ２、５’−ＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣ）（配列番号１０）でも正の結果を生じる植物がグループＣＳ２６１５（オハイオ州立大学、ＡＢＲＣ）で得られた。個々の植物を分離し、Ｔ−ＤＮＡの挿入部位の配列を決定し、その際ＳＵＴ４遺伝子のＡＴＧの約４８０塩基対上流にＴ−ＤＮＡの左境界配列があることを示すことができた。突然変異体をＷＳ（Ｗａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ）で２回戻し交雑した。その際２．９：１（４２７：１４７）の割合でカナマイシン耐性を分離したことを示すことができた。このことは単一の標識遺伝子座の存在を示す。ホモ接合体植物を得た。これらの植物はＷＳ野生型より著しく多いデンプンを含んでいた。このことは、ＫＩ（ヨウ化カリウム）染色で検証することができた。また植物は光のもとで著しいシュート成長を示した。２つの結果は、ＡｔＳＵＴ４がソース器官、即ち葉からのサッカロース送出において重要な役割を果たすことをはっきり示している。ＲＴ−ＰＣＲが示すところでは、突然変異体にＳＵＴ４のｍＲＮＡがあり、従って突然変異体は「ノックアウト」植物ではない。
【００９８】
実施例５
分離及びリボヌクレアーゼ保護分析
温室で栽培したトマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，ｃｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）の種々の器官からシュヴァッケの方法（Ｓｃｈｗａｃｋｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９９年）１１、３７７−３９２）でＲＮＡを分離した。α−３２Ｐ  ＵＴＰを使用して、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔＴＭＳＰ６／Ｔ７  ｉｎ　ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で逆転写を行った。３４０ｂｐのＬｅＳＵＴ４断片を含むｐＳｐｏｒｔから６００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。この断片を鋳型として使用した。プローブはそれ以上精製せず、試料ごとに３００，０００ＣＰＭをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは２０μｇのＲＮＡを用いて一晩４５℃で行った。ＲＮＡ消化の後、保護されたＲＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル（１３ｘ１５ｃｍ）上で１５０ｍＶで分離した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムにさらした。
【００９９】
ＲＮＡブロッティング分析でも、ＲＮＡ保護分析でもシンク器官−葉、茎、子葉及び未熟の実にＳＵＴ４の極めて強い発現が認められた。ソース器官−葉では僅かな発現しか検出できなかった。
【０１００】
実施例６
抗ＳＵＴ４抗血清の調製及び免疫限局
ＬｅＳＵＴ４のＮ末端（ＭＰＥＩＥＲＨＲＴＲＨＮＲＰＡＩＲＥＰＶＫＰＲ、配列番号１６）又は中心ループ（ＧＳＳＨＴＧＥＥＩＤＥＳＳＨＧＱＥＥＡＦＬＷ、配列番号１７）に相当する、ＫＬＨと結合した合成ペプチドでウサギに免疫付与した。前述のように（Ｋｕｅｈｎら、（１９９７年）前掲書）合成ペプチドとＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組合せにより抗血清の親和精製を行った。ペプチドアフィニティークロマトグラフィーの代わりにタンパク質Ａセファロース（ＢｉｏＲａｄ）を使用した点を除き、同じ方法で前免疫血清を精製した。
【０１０１】
ジャガイモとトマトのＳＵＴ４の蛍光免疫検出を前述のように（Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９５年）７、１５４５−１５５４）、但し後述のように変更して行った。トマト又はジャガイモの茎から手で切断した切片（１ｍｍ）を０．１％グルタールアルデヒドと６％ホルムアルデヒドを含むＭｏｐｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ６．９、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で一晩真空で固定した。氷上でＭｏｐｓ緩衝液により３回洗浄した後、エタノール系列中でインキュベートし、続いて９６％エタノール中で２回インキュベートして断片を脱水した。１：１エタノール：メチルアクリレート混合物（７５％［ｖ／ｖ］ブチルメチルアクリレート、２５％［ｖ／ｖ］メチルメタクリレート、０．５％ベンゾインエチルエーテル、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中で一晩インキュベートした後、材料を１００％メチルアクリレート混合物に入れた。一晩４℃で紫外光（３６５ｎｍ）のもとで重合を行った。予熱したＨｉｓｔｏｂｏｎｄ載物ガラス（Ｃａｍｏｎ）に半薄の切片（１μｍ）を被着して、５０℃で乾燥した。
【０１０２】
切片からメチルアクリレートを除去するために、載物ガラスをアセトン中で３０秒間インキュベートし、エタノール系列で再水化し、ＰＢＳ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中２％のＢＳＡで１時間ブロック化した。親和精製した抗体をＬｅＳＵＴ４ともに一晩インキュベートした後、載物ガラスをＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤を含むＰＢＳ）で２回、ＰＢＳで３回洗浄し、続いて抗ウサギ共役ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（フルオレシンイソチオシアナート）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ、ＰＢＳ及び蒸留水による３つの洗浄段階の後に蛍光位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓ、Ａｘｉｐｈｏｔ）及び４５０−４９０ｎｍの励起光により撮影した。
【０１０３】
篩要素でだけ蛍光シグナルを検出することができた（トマト及びジャガイモ）。
【０１０４】
実施例７
形質転換植物の調製
ＡｔＳＵＴ２過剰発現構築物（ｏＡｔＳＵＴ２３５Ｓ）
ＡｔＳＵＴ２  ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した−産物はＡＴＧ（位置１）からＴＧＡ（位置１７８５）に至る本発明のコーディング領域に相当する１，７８５ｂｐの長さがあった。ｐＢｉｎＡｒのＥｃｏ−ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｈｏｅｆｇｅｎ及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃ．（１９９０年）６６、２２１−２３０）として分離された３５Ｓプロモーター発現カセット（ｐＢｉｎＡｒ３５Ｓ）に断片をセンス配向でクローニングした。この構築物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断ｐＧＴＰＶ−ｂａｒにクローニングした（Ｂｅｃｋｅｒら、前掲書、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２年）２０、１１９５−１１９７）。植物を形質転換した。
【０１０５】
ＡｔＳＵＴ２アンチセンス構築物（αＡｔＳＵＴ２３５Ｓ）
ＡｔＳＵＴ２  ｃＤＮＡ（アクセス番号ＡＴＴＳ５０３４ＥＳＴ）をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ｐＢｉｎＡｒ３５Ｓ発現カセットにアンチセンス配向でクローニングした。この構築物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断ｐＧＰＴＶ−ｂａｒにクローニングした（Ｂｅｃｋｅｒら、前掲書）。植物が形質転換された。
【０１０６】
ＡｔＳＵＴ４過剰発現構築物（ｏＡｔＳＵＴ４ＡｔＳＵＣ２）
ＡｔＳＵＴ４  ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲにより１，５３３ｂｐ断片が本発明のＡｔＳＵＴ４ｃＤＮＡ配列の位置１で始まり、ＴＡＧ位置１５３３で終わる。シロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型）ゲノムＤＮＡからＳＵＣ２プロモーターを次のプライマーにより分離した（ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＡＴＴＴＧＡＣ、配列番号１８及びｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＣ、配列番号１９）。１，５３３ｋｂ断片をＡｔＳＵＣ２プロモーター（Ｘ７９７０２）の後方でセンス配向でクローニングした。この構築物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断ｐＧＰＴＶ−ｂａｒにクローニングした（Ｂｅｃｋｅｒら、前掲書）。植物が形質転換された。
【０１０７】
ＬｅＳＵＴ４アンチセンス構築物（αＬｅＳＵＴ４３５Ｓ）
ＬｅＳＵＴ４  ｃＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、１．３ｋｂ断片を得た。これを平滑にして、ｐＢｉｎＡＲのＳｍａＩ切断部位にクローニングした（Ｂｅｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８３年）１２、８７１１−８７２１）。
【０１０８】
図１ないし４は上記の構築物を示す。
【０１０９】
実施例８
８．１   ＡｔＳＵＴ２とＳｔＳＵＴ１のキメラタンパク質の調製
ＡｔＳＵＴ２のオープンリーディングフレームをＲＴ−ＰＣＲによりシロイヌナズナ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型）の葉から分離し、酵母発現ベクターｐＤＲ１９６（Ｂａｒｋｅｒら、（２０００年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ：１１５３−１１６４）にクローニングした。ＳｔＳＵＴ１のオープンリーディングフレームをｐＤＲ１９５（Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら、（１９９３年）前掲書）のＳｔＳＵＴ１  ｃＤＮＡで増幅し、その際ＳｍａＩ及びＸｈｏＩ制限切断部位を有するプライマーを使用した。オープンリーディングフレームを酵母発現ベクターｐＤＲ１９６に結合した。
【０１１０】
ＡｔＳＵＴ２のＮ末端、即ち本発明のＳＵＴ２−Ｎ末端領域（配列番号２４）がＳｔＳＵＴ１の当該のＮ末端ドメイン（配列番号２５）、即ち本発明のＳＵＴ１−Ｎ末端領域と交換されたキメラ構築物、及びその逆のキメラ構築物を作成した。その際、ＰＣＲによりＡｔＳＵＴ２及びＳｔＳＵＴ１の第１の膜貫通ドメインの保存領域内に制限切断部位を作成した。続いてＮ末端領域及び配列の残りの部分のＰＣＲ断片を酵母発現ベクターｐＤＲ１９６にクローニングし、その際Ｎ末端領域には切断部位ＳｍａＩ及びＰｓｔＩを用い、またオープンリーディングフレームの残りの領域にはＰｓｔＩ（ＡｔＳＵＴ２に対してＳｄａＩ）及びＸｈｏＩを使用した。これらのキメラ構築物を以下ではＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１−Ｎ及びＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２−Ｎと呼び、図７に示す。
【０１１１】
構築物ＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２−Ｎは配列番号２２に示したＳｔＳＵＴ１のヌクレオチド１５０ないし１５４８に融合した配列番号３のヌクレオチド１ないし２３９を有し、構築物はクローニング技術的条件の結果として、ｔがｃに置換されたヌクレオチドを有する。次に構築物の融合領域の配列を示す。なお小文字はＳＵＴ２の配列、大文字はＳＵＴ１の配列である（上側の行：置換なし、下側の行：置換あり）。
【０１１２】
・・・ｔｇｇｇｃａｔｔｇｃａ／ＧＣＴＣＴＣＴＴ・・・
・・・ｔｇｇｇｃａｃｔｇｃａ／ＧＣＴＣＴＣＴＴ・・・
ＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１−Ｎは配列番号３に示したＡｔＳＵＴ２のヌクレオチド２４０ないし１７８５に融合した配列番号２２に示すＳｔＳＵＴ１のヌクレオチド１ないし１４９を有する。クローニング技術的条件の結果として、構築物は野生型配列に比して３つのヌクレオチド置換を有する。次に融合領域を示す。即ち上の行に理論的に得られる構築物、下の行に実際に作られた融合領域を示す。大文字はＳＵＴ１の配列、小文字はＳＵＴ２の配列に関するものである。
【０１１３】
・・・ＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＡ／ａｃｔｔｔｃｔ・・・
・・・ＴＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡ／ｇｇｔｔｔｃｔ・・・
また配列番号２６に示すＡｔＳＵＴ２の中心細胞原形質領域、特にループがＳｔＳＵＴ１の小さな細胞原形質領域、特にループと置換されたキメラ構築物、及びその逆のキメラ構築物を作成した。その場合膜貫通領域ＶＩ及びＶＩＩの保存領域内のＰＣＲによる制限部位を使用した。Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＰＣＲによりオープンリーディングフレームのＮ末端の半分、細胞原形質ループ及びＣ末端の半分を増幅し、ＡｔＳＵＴ２とＳｔＳＵＴ１ループにはＳａｃＩ及びＢｃｌＩ／ＢｃｌＩＩ、ＳｔＳＵＴ１とＡｔＳＵＴ２ループにはＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩを使用して初めの３つの断片を結合することにより、酵母発現ベクターにクローニングした。さらにＳｍａＩ及びＸｈｏＩを使用して、キメラＤＮＡを酵母発現ベクターｐＤＲ１９６に結合させた。これらのキメラ構築物を以下でＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１ループ及びＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２ループと呼び、図７に示す。
【０１１４】
構築物ＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１ループはＡｔＳＵＴ２のヌクレオチド１ないし８４２（配列番号３）、ＳｔＳＵＴ１のヌクレオチド７５０ないし８９３（配列番号２２）及びＡｔＳＵＴ２のヌクレオチド１１３１ないし１７８５（配列番号３）を有する。次に使用する大文字と小文字の表示は上記の使用と同じである。同様に上の列は理論的に得られる構築物の配列を、下の列はクローニング技術的条件の結果として実際に得られる構築物の配列を示す。
【０１１５】
１．融合部位
・・・ｔｇｃｔａａａｇａｇａｔ／ＣＣＣＧＧＡＧＡ・・・
・・・ｔｇｃｔａａａｇａｇｃｔ／ＣＣＣＧＧＡＧＡ・・・
２．融合部位
・・・ＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧ／ｇｔｔａｔｃｃｔｇｇ・・・
・・・ＧＴＴＴＧＡＡＣＴＴ／ｇａｔｃｔｃｃｔｇｇ・・・
構築物ＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２ループはＳｔＳＵＴ１のヌクレオチド１ないし７４９（配列番号２２）、ＡｔＳＵＴ２のヌクレオチド８４３ないし１１３０（配列番号３）及びＳｔＳＵＴ１のヌクレオチド８９４ないし１５４８（配列番号２２）を有する。
【０１１６】
１．融合部位
・・・ＡＡＣＧＡＧＣＴ／ｔｃｃｔｔｔｔａ・・・
・・・ＡＡＣＧＡＧＣＴ／ｃｃｃｔｔｔｔａ・・・
２．融合部位
・・・ｃｔｃｔｔａｃａｔｇ／ＧＡＴＣＧＣＧＴ・・・
・・・ｃｔｃｔｔａｃａｔｇ／ＧＡＴＣＴＣＧＴ・・・
８．２  ＡｔＳＵＴ２及びキメラタンパク質の機能分析
サッカロース取込みテストのために、発現ベクターｐＤＲ１９６に当該のｃＤＮＡを有する酵母株ＳＥＹ６２１０（Ｂａｎａｋａｉｔｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６年）８３、９０７５−９０７０）を使用した。１４Ｃ−サッカロースの取込みを前述のように行った（Ｗｅｉｓｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２０００年）１２、１３４５−１３５５）。酵母のタンパク質発現分析は調べたすべてのタンパク質で比較可能な量を明らかにした。
【０１１７】
ＡｔＳＵＴ２を発現する酵母細胞によるサッカロース取込みはテストの最初の５分間は線形であることを示すことができた。この時間に１０８の細胞に０．１ｎｍｏｌのサッカロースが蓄積した。ＡｔＳＵＴ２によるサッカロース取込みは、空のベクターｐＤＲ１９６しか発現しない酵母細胞より著しく高かった（ｐ＜０．０５）。それと対照的にＳｔＳＵＴ１発現細胞の輸送率はＡｔＳＵＴ２発現細胞の４００倍であった。速度論的研究はサッカロースに対するＡｔＳＵＴ２の親和性が著しき低いことを明らかにした。ミカエリス・メンテンの式と非線形回帰を使用して、ｐＨ値４でＡｔＳＵＴ２に対して１１．７±１．２ｍＭ（Ｖｍａｘ＝１．５ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）のＫｍ値を決定した。これと対照的にＳｔＳＵＴ１はサッカロースに対して１．７ｍＭ（Ｖｍａｘ＝２１０．２ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）という１０分の１のＫｍ値を示した。
【０１１８】
ＡｔＳＵＴ２によるサッカロース取込みはｐＨ依存性であり、ｐＨ値４．０で最高の取込み率が測定された。サッカロース取込みはアルカリ性のｐＨ値で急激に低下し、ｐＨ値６でもはやサッカロース取込みを測定することができなかった。ＡｔＳＵＴ２の基質特異性を決定するために、他の糖及び糖アルコールによるサッカロース吸収（１ｍＭサッカロース）を競合的に測定した。テストした物質（サッカロース、マルトース、イソマルツロース、グルコマンニトール、グルコソルビトール、ラフィノース、ガラクトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、グルコース）のうちサッカロース及び僅かながらマルトースだけが１４Ｃ−サッカロースと有意に競合した。ＡｔＳＵＴ２によるサッカロース輸送は、ＣＣＣＰ及びミトコンドリアＡＴＰ形成の阻害剤、アンチマイシンＡで阻害された。これらのデータはＡｔＳＵＴ２の輸送機構がプロトンと結びついていることを証明する。
【０１１９】
８．５  キメラタンパク質のサッカロース取込みにおけるサッカロース取込み速度
ＡｔＳＵＴ２、ＳｔＳＵＴ１及びキメラタンパク質についての結果を以下の表に示す。
【０１２０】
表１：
サッカロース輸送体ＳｔＳＵＴ１及びＡｔＳＵＴ２並びにＮ末端領域又は中心細胞原形質ループが２つの輸送体の間で交換されたキメラタンパク質のサッカロースに対するＫｍ値。値は少なくとも３回の異なる測定から決定した平均値±標準誤差として示した。種々の文字は有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【０１２１】
【表１】
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キメラ構築物ＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１−Ｎでコードされるキメラタンパク質は、ＡｔＳＵＴ２と比較してサッカロースに対するＫｍ値が３．４±１．６ｍＭ（Ｖｍａｘ＝０．３ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）と著しく小さい。それに対して、キメラ構築物ＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２−Ｎでコードされるキメラタンパク質は、ＳｔＳＵＴ１と比べてサッカロースに対するＫｍ値が８．０８±１．４ｍＭ（Ｖｍａｘ＝７２．９ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）と著しく高かった。ＡｔＳＵＴ２／ＳｔＳＵＴ１ループはサッカロースに対するＫｍ値が高い（６．７５±１．９ｍＭ）（Ｖｍａｘ＝０．４ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）が、ＳｔＳＵＴ１／ＡｔＳＵＴ２ループはサッカロースに対するＫｍ値が低い（１．４±０．３ｍＭ）（Ｖｍａｘ＝５．５ｎｍｏｌ・ｍｉｎ−１・１０８細胞−１）。
【０１２２】
８．６．  サッカロース輸送体のＮ末端の意義
酵母のキメラタンパク質の上記の発現試験から次のように推論することができる。高親和輸送体ＳｔＳＵＴ１のＮ末端を低親和ＡｔＳＵＴ２のＮ末端に置き換えると、Ｋｍ値が１．７ｍＭから８．１ｍＭに増加した（ｐ＜０．０５）。ＳｔＳＵＴ１のＮ末端はＡｔＳＵＴ２の高親和性を付与した。このことは１１．７ｍＭから３．４ｍＭに減少したＫｍ値で読み取られる（ｐ＜０．０５）。従って、ＳｔＳＵＴ１とＡｔＳＵＴ２のあいだのＮ末端の構造的相違が基質親和性の差の大部分をもたらすと思われる。おそらくサッカロース輸送体のＮ末端は他の細胞質ゾルドメインとの分子間相互作用により、又は第１の膜貫通位置の制御により、サッカロースに対する親和性に影響するのである。この結論は、理論上制約されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に従って使用される遺伝子構築物の構造の概略図を示す。
【図２】
図２は、本発明に従って使用される遺伝子構築物の構造の概略図を示す。
【図３】
図３は、本発明に従って使用される遺伝子構築物の構造の概略図を示す。
【図４】
図４は、本発明に従って使用される遺伝子構築物の構造の概略図を示す。
【図５】
図５は、ＳＵＴ４のタンパク質活性のグラフを示す。
【図６】
図６は、ＳＵＴ４のタンパク質活性のグラフを示す。
【図７】
図７は、ＳＵＴ２とＳＵＴ１とのキメラ遺伝子構築物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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