(57)【要約】酸化されない、臭素又はヨウ素で停止された炭素、シリコン、及びゲルマニウム基板上の化学的に修飾された表面が開示される。可視光線は、臭素、ヨウ素、又は他の官能基で停止された炭素、シリコン、又はゲルマニウム表面と、（好ましくは）保護化されてω修飾された、α−不飽和のアミノアルケンとの反応を仲介する。保護基の除去は、アミノアルカンで修飾されたシリコン表面を生成する。これらのアミノ基は、二官能性のクロスリンカーを用いて末端が修飾されたオリゴヌクレオチドに結合でき、それによって修飾された表面とアレイの調製を可能にする。基板に付加される、分子の表面密度を制御する方法がまた開示される。
2004508030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アルキル部分で置換された、介在する酸素原子の不在において、基板に対して直接結合された修飾された前記基板を生成するために、酸化されていない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板に置換された直鎖、枝分かれ、又は環式アルケンの反応
によって特徴とされる、修飾された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面の生成方法。
【請求項２】
前記段階（ａ）において、前記反応はフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記段階（ａ）において、前記反応は紫外線を使用してフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記段階（ａ）において、前記反応は紫外線に対する前記基板の選択的な露出によってパターン化されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（ａ）において、前記基板は、アミノアルケン、カルボキシアルケン、及びチオアルケンから構成されるグループから選択される置換されたアルケンと反応することを特徴とする、前述までの請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記段階（ａ）において、前記アルケンの前記置換体は保護されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記段階（ａ）において、前記基板は保護化されたアミノアルケンと反応することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記段階（ａ）において、前記基板はｔ−ＢＯＣで保護化された１０−アミノデカ−１−エンと反応することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記段階（ａ）において、前記アルケンはαオレフィンであり、前記置換体は前記アルケンのω炭素に位置することを特徴とする、請求項１乃至４までの何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）前記基板に結合した前記置換したアルキル部分に対して分子を付加し、それによって前記基板に固定された前記分子を有する修飾された表面を生成する段階を前記段階（ａ）の後にさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至４までの何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記段階（ｂ）において、ＤＮＡ及びＲＮＡから構成されるグループから選択される分子が、前記置換されたアルキル部分に付加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記段階（ｂ）において、前記分子は二官能性のクロスリンカーを使用して前記置換されたアルキル部分に付加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記段階（ｂ）において、ＳＳＭＣＣはクロスリンカーとして使用されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
酸化されない、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を形成するために、前記酸化されない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を臭素、ヨウ素を含有する反応物質と接触し、次いで前記段階（ａ）のように前記酸化されておらず、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を反応する段階を段階（ａ）の前にさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至４までの何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記段階（ａ）の前に、前記基板は臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記段階（ａ）の前に、前記基板は、ベンゼンに溶解した臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記段階（ａ）において、前記反応は、５１４ｎｍの波長を有する可視光線でフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記段階（ａ）において、前記基板を可視光線に対して選択的に当てることによって前記基板の所定位置で前記反応がフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
酸化されない炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面上に修飾された表面を生成する方法であって、該方法は、
（ａ）介在する酸素原子の不在において、基板に共有的に結合した、保護化した、アミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルカン分子の表面を生成するために、酸化されていない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板とアミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されて、さらに保護化されたアルケンとの反応段階と、
（ｂ）前記段階（ａ）の前記修飾されたアルカン分子が脱保護化され、それによって前記基板に結合した未保護で修飾されたアルカン分子の表面を生成する段階と、
（ｃ）前記段階（ｂ）の前記脱保護化された修飾アルカンは、クロスリンカーと反応して、それによって前記クロスリンカーは前記修飾されたアルカン分子に付加される段階と、及び
（ｄ）前記段階（ｃ）のクロスリンカーに分子を付加し、それによって前記基板に固定された分子表面を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
酸化されない、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を形成するために、前記酸化されない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を臭素、ヨウ素を含有する反応物質と接触し、次いで前記段階（ａ）のように前記酸化されておらず、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を反応する段階を段階（ａ）の前にさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ａ）の前に、前記基板は臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ａ）の前に、前記基板は、ベンゼンに溶解した臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ａ）において、前記反応は、５１４ｎｍの波長を有する可視光線でフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記段階（ａ）において、前記基板を可視光線に対して選択的に当てることによって前記基板の所定位置で前記反応がフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記段階（ａ）において、前記基板はωアミノ、ωカルボキシ、又はωチオールで修飾されて保護されたアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記段階（ａ）において、前記基板はアミノ、カルボキシ、又はチオールで修飾されて保護されたαアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記段階（ａ）において、前記基板はωアミノ、ωカルボキシ、又はωチオールで修飾されて保護されたαアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記段階（ｃ）において、前記クロスリンカーはＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記段階（ｄ）において、核酸が付加されることを特徴とする、請求項１９又は２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１、１４、１９又は２０に記載の何れか一項により生成される修飾された炭素、シリコン、又はゲルマニウム表面。
【請求項３１】
酸化されておらず、水素で停止された炭素、シリコン、及びゲルマニウムから構成されるグループから選択される基板と、
介在する酸素分子の不在において、前記基板に直接的に結合されて、アミノを含む置換体、カルボキシルを含む置換体、及びチオールを含む置換体から構成されるグループから選択される置換体が前記基板に付加された、置換されたアルカン分子の層と、
を含むことを特徴とする、修飾された炭素、シリコン又はゲルマニウム基板。
【請求項３２】
前記置換されたアルカン分子の前記層に結合された架橋分子の層をさらに含むことを特徴とする、請求項３１に記載の修飾された基板。
【請求項３３】
前記架橋分子はＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項３２に記載の修飾された基板。
【請求項３４】
前記置換体は、前記アルカンのω炭素で前記置換されたアルカンに付加されることを特徴とする、請求項３１乃至３３の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３５】
前記修飾されたアルカンの前記置換体に結合された分子の層をさらに含むことを特徴とする、請求項３１乃至３３の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３６】
前記分子は核酸であることを特徴とする、請求項３５に記載の修飾された炭素基板。
【請求項３７】
前記置換されたアルカン分子の前記層に結合された架橋分子の層と、前記架橋分子に結合された分子の層をさらに含むことを特徴とする、請求項３１乃至３３の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３８】
前記架橋分子に結合された前記分子の層は、核酸であることを特徴とする、請求項３７に記載の修飾された基板。
【請求項３９】
前記架橋分子はＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項３８に記載の修飾された基板。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、修飾された炭素、シリコン及びゲルマニウム表面（炭素、シリコン及び／又はゲルマニウムの任意の組み合わせを含んでいる合金の修飾された表面を含む）を導く。特に、本発明は、酸化していない表面に対して様々な他の化学的な部分を固着することができるリンカー部分を結合する、修飾された水素−、臭素−、又はヨウ素−で末端化された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面を導く。それらの修飾された表面は、２つ以上のかかる表面を含む核酸及び核酸アレイの結合表面を含んでいる、表面に結合している化学物質の構成において適している。
【０００２】
従来技術の記載
核酸を固定するための適切な表面は、近年において次第に重要な生物学的ツールになってきている。二重鎖の一部として、又は短い、一本鎖のオリゴヌクレオチドとして、何れかの核酸分子のアレイは、薬剤の開発、遺伝子スクリーニング、医学的な診断、核酸とリガンドの結合研究及びＤＮＡコンピュータ１−２１において活用されている。それらの用途において表面と結合したオリゴヌクレオチドを使用する主な利点は、容易な精製、物質と試薬の保存、オリゴヌクレオチド間の干渉の削減、容易にされたサンプルの取り扱いを含む１２。核酸の固定において既に探求された表面は、ラテックスビーズ５、ポリスチレン１、炭素電極２２−２５、金１７、２３、２６−２８、及び酸化されたシリコン又はガラス３、８、１１、２９−３２を含む。
【０００３】
これらの基板に関連した表面の化学は、しかしながら、理想的な表面における所望の多くの特徴を有しない。それら理想的な表面の特徴は、表面の平調及び均一、表面の特質の制御、熱安定性及び化学的安定性、再現性、並びに核酸の固定及び生化学的操作への従順性を含む。より最近では、集積回路３３においてバイオセンサーとして固定された核酸を使用する望みは、小型電子装置の構成に統合の従順な表面を要求するだろう。従来の表面と付加の化学的性質の制限は、理想により近い、代替となる基板における必要性を示す。ここに記載のように、酸化されていない結晶炭素、シリコン、ゲルマニウム、それらの同素体、及びそれらの合金は、それらの高純度、高度に組織化された結晶構造及び強固さのために、核酸、及び同様であるか又は相似性の反応性を有する、他の化学物質、を固定するための基板としての利点を提供する。小型電子装置産業でのユビキタスな使用により、シリコンが特に好ましい。
【０００４】
しかしながら、例えば、在来のシリコン表面は、酸化シリコンの薄い表面層を形成するために常温状態で空気と反応する。この酸化シリコン表面はガラスと化学的に同じであり、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ及びＳｉ−ＯＨ結合の相対的な数における不均質性及び可変性と呼ばれる、同一の欠点に悩まされる。この不均質性、及びそれが発生させる同時の化学的な可変性は、結果となる化学修飾表面の再現性と均一性における困難さを導き、特に、そのような表面に結合するために一般的に採用されるシランの化学的性質はそれ自体に安定問題の傾向があり、重合工程における制御が困難である３４、３５。
【０００５】
酸化層を備えないシリコン基板の直接の機能化における化学的な径路は、高度に制御された核酸の付加における新規な可能性を広げる。かかる新規な付加方法は、直接の炭素−シリコン結合１９、３６−４２による修飾されたシリコン表面を提供し、メチル−、塩素−、エステル−、又は酸で停止された基板３６、３９、４０、４３、４４となる。Ｗａｇｎｅｒ等１９が１７５２塩基のＤＮＡの二重鎖断片を固定するＮヒドロキシスクシンイミジルエステルで停止したシリコン表面を用いることを記載しているが、この文献は、一般的に、化学的に修正されたシリコン表面又は、特に核酸で修飾されたシリコン表面の何れも系統的で、再現性のある方法を開示していない。
【０００６】
シリコン表面とωアルケンの反応は、紫外線照射１９、４１による過酸化ジアシル３６によって仲介されるか、又は直接の熱活性３９によって仲介され、従来技術に記載されている。使用されるωアルケンは、エステル、酸３９、４４、及び塩化物３６を含有する様々な官能基を含んでいる。
【０００７】
さらに、シリコンを基にした半導体における、化学的な不動態化剤としてのハロゲンの使用は以前から記載されている５２、５３。
【０００８】
発明の概要
ここに、我々は修飾された炭素、シリコン及びゲルマニウム表面の方法を記載する。かかる方法は、アルキル部分で置換された、介在する酸素原子の不在において、基板に対して直接結合された修飾基板を生成するために、酸化されていない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板に置換された直鎖、枝分かれ、又は環式アルケンの反応を含む。本発明の第一の実施態様において、反応は、水素で停止されたシリコン、炭素、又はゲルマニウム表面との直接的な作用を含む。したがって、本発明の第一の実施態様は、修飾された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面の生成方法を導き、かかる方法は、アルキル部分で置換された、介在する酸素原子の不在において、基板に対して直接結合された修飾基板を生成するために、酸化されていない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板に置換された直鎖、枝分かれ、又は環式アルケンの反応によって特徴とされる。
【０００９】
しかしながら、Ｓｉ−Ｈ結合（さらに、Ｃ−Ｈ及びＧｅ−Ｈ結合における）強度は、Ｓｉ−Ｂｒ又はＳｉ−Ｉ結合（又は、対応するＣ−Ｂｒ／Ｉ若しくはＧｅ−Ｂｒ／Ｉ結合）の何れかよりも良好である。したがって、Ｓｉ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、又はＧｅ−Ｈ結合を破壊するためにデザインされたフォトイニシエーションされた反応（ａ　ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、紫外線（ＵＶ）を使用するべきである。しかしながら、紫外線照射は、潜在的にあるサンプル（例えば、短波光か又は活性粒子による低下に感受性である、特定の生物学的サンプル及び他の分子システム）を損傷する。したがって、本発明の第二の実施態様において、Ｓｉ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、又はＧｅ−Ｈ結合は、Ｓｉ−Ｂｒ／Ｉ、Ｃ−Ｂｒ／Ｉ、Ｇｅ−Ｂｒ／Ｉ結合と最初に置き換わる。これらの結合はより簡単に破損され、したがって、置き換わるためのわずかなエネルギーを必要とする。
【００１０】
したがって、本発明の第二の実施態様は、アルキル部分で置換された、介在する酸素原子の不在において、基板に対して直接結合された修飾基板を生成するために、臭素又はヨウ素で停止された炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板に置換された直鎖、枝分かれ、又は環式アルケンの反応を含む、修飾された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面の生成方法を導く。
【００１１】
本発明の好ましい第二の実施態様は、臭素−又はヨウ素で停止された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面（ヨウ素が好ましい）の修飾された表面の生成方法を導き、かかる方法は、介在する酸素原子の不在において基板に共有的に結合した、保護化した、アミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルカン分子の表面を生成するために、臭素−、又はヨウ素で停止された炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板とアミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾及び保護化されたアルケンとの第一反応を含む。第一段階の修飾されたアルカン分子は、（必要であれば）脱保護化され、それによって基板に結合した未保護で修飾されたアルカン分子の表面を生成する。次に、必要であれば、脱保護化された修飾アルカンは、クロスリンカーと反応して、それによってクロスリンカーは修飾されたアルカン分子に付加される。最後に、核酸又はタンパク質などの分子は、前の段階にクロスリンカーに付加され、それによって基板に固定された分子表面を生成する。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施態様は、酸化していない炭素、シリコン及びゲルマニウム表面に修飾された表面を生成する方法である。かかる方法は、下記の段階によって特徴づけられる。最初に、ヨウ素又は臭素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を形成するために酸化していない炭素、シリコン及びゲルマニウム基板とヨウ素又は臭素との反応を行ない、次いで、アミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルケンがヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板上に置かれる。次いで、介在する酸素分子の不在において基板に共有的に結合するアミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルカン分子の表面を生成するために、ヨウ素又は臭素が基板から除去され、アミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルケンが基板と反応するように、アミノ−、カルボキシ−、又はチオール修飾されたアルケンが可視光線に当てられる。次いで、修飾されたアルカン分子はクロスリンカーと反応されて、それによってクロスリンカーは修飾されたアルカン分子に付加される。最後に、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリペプチドなどの分子は、クロスリンカーに付加され、それによって基板に固定された分子の表面を生成する。
【００１３】
臭素−又はヨウ素で停止された基板の表面と修飾されたアルケンの反応はフォトイニシエーションされるので、可視光線に対して表面を選択的に当てることによって基板の表面上に所望のパターンを生成するように、反応部位は事前に選択できる。
【００１４】
本発明はまた、それらの方法にしたがって生成される、修飾された基板を導く。
【００１５】
本方法の好ましい実施態様において、可視光線は、臭素−又はヨウ素で停止されたシリコンと任意で保護化されて、ω−不飽和のアミノアルケン、ヒドロキシアルケン、カルボキシアルケン、又はチオールアルケン（最も好ましいのはｔ−ＢＯＣで保護化された１０−アミノデカ−１−エン）との反応を仲介する。保護基の除去は、アミノアルカンで修飾されたか、ヒドロキシアルカンで修飾されたか、カルボキシアルカン若しくはチオールアルカンで修飾された、シリコン表面を生成する。次いで、それらの反応性末端基（アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、チオ）は、直接的であるか、又は異質二官能性クロスリンカーである、好ましくはＳＳＭＣＣを用いて修飾されたオリゴヌクレオチド又は他の生体分子（ポリペプチド、脂質、リン脂質など）に結合され、それによって、不活性でなければ基板上に生体分子アレイの調製を可能にする。
【００１６】
好ましい実施態様の主要な利点は、基板のフォトパターン化が室温で実行されて、熱、電子、イオン、又は感受性を有する生物学的サンプルを破壊する、エネルギーの他の形態に対する露出を必要としない。フォトパターン化は、真空処理を必要とせずに周辺圧力で実行できる。フォトパターン化は、適度な強度（ほぼ１平方センチメートル当たり２乃至５ミリワット）の可視光線を使用して実行される。
【００１７】
これは本発明の第一の実施態様と対照的であり、ここにおいて、水素で停止したシリコン、炭素、又はゲルマニウム基板を使用するフォトイニシエーションされた反応が使用される。それらの反応は、末端水素を除去するために高エネルギーの紫外線を用いることを必要とする。しかしながら、サンプルが紫外線によって悪影響を及ぼされない場合は、第一実施態様は、基板が臭素又はヨウ素での処理を必要としない際に非常に有用である。
【００１８】
本発明の別の主要な利点は、不活性で無機で酸化されない基板のオリゴヌクレオチドアレイを含んでいる、確定された表面密度の高オーダーの生体分子アレイを形成するために使用できることである。
【００１９】
本発明の別の明白な利点は、アレイの生体分子の表面密度が用意に制御でき、操作できることである。表面密度の制御は、２つの手法で提供されており、第一のアプローチにおいて、保護化されたω−不飽和のアミノアルケンとドデセンの２成分の混合物は、初期の可視光線で仲介される結合反応で利用される。ここで、２成分の混合物のω−不飽和のアミノアルケンのモル分画とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の密度との間の線形関係が判明された。第二のアプローチにおいて、保護基の部分だけが脱保護化反応を可能にする時間を制限することによってアルカンで修飾された基板表面から除去されて、それによってオリゴヌクレオチド付加における結合部位の有用な数を制限する。
【００２０】
本発明の別の利点は、アレイの安定化である。本発明を活用して形成されたオリゴヌクレオチドで修飾された表面は非常に安定であり、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで良好に実行する。これらの表面は、半導体物質に対する生体分子認識素子の結合のための手法と同様に、核酸アレイにおけるオリゴヌクレオチドの表面固定のための金又はガラスの基板に対する代案を提供する。
【００２１】
修飾された表面又はアレイ内の生体分子に密度の制御を可能にすることによって、ここに記載された本発明はまた、再現性が可能であり、十分に定義された生体分子アレイの調製において重要な態様である、疎水性の制御、及び機能的なシリコン、ゲルマニウム又は炭素表面の同時の湿潤特性を可能にする。
【００２２】
図面の簡単な記載
図１Ａは、アミンで修飾されたシリコン（００１）ウェハー上にＤＮＡを固定する反応スキームを示す。ウェハーに対して保護化されたアミンの薄層を適用し、低圧水銀灯からの紫外線にそれを感光させることによって、ｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンの層が表面に結合された。脱保護化は、２５％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で１時間の表面処理に続き、１０％ＮＨ４ＯＨの５分間の洗浄で表面を処理することによって成された。ＳＳＭＣＣのクロスリンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルによる遊離アミンに結合することによって、表面に付加された。次いで、チオール化ＤＮＡがＳＳＭＣＣのマレイミドグループに結合された。
【００２３】
図１Ｂは、アミンで修飾されたシリコン（００１）ウェハー上にＤＮＡを固定する反応スキームを示す。ウェハーに対して保護化されたアミンの薄層を適用し、アルゴンレーザーからの紫外線にそれを感光させることによって、ｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンの層が表面に結合された。脱保護化は、２５％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で１時間の表面処理に続き、１０％ＮＨ４ＯＨの５分間の洗浄で表面を処理することによって成された。ＳＳＭＣＣのクロスリンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルによる遊離アミンに結合することによって、表面に付加された。次いで、チオール化ＤＮＡがＳＳＭＣＣのマレイミドグループに結合された。
【００２４】
図２ａは、シリコン基板に固定されたｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンのＸ線の光電子スペクトルを示すグラフである。窒素のスペクトルは４００．５ｅＶにおける単一ピークを示す。２５％ＴＦＡで１時間処理した後、２つのピークが記録された（図２ｂ）。ＮＨ３＋と一次アミンは、４０１．９と４００．２ｅＶにそれぞれのピークをアサインされた。２５％ＴＦＡで処理されて、続いて１０％ＮＨ４ＯＨで５分間洗浄処理された表面は、４００．３ｅＶでの一つのピークだけを示す（図２ｃ）。これは、ＮＨ３＋窒素が完全に脱プロトン化したことを示す。ｔ−ＢＯＣ−保護化アミンの炭素のスペクトルは、ｔ−ＢＯＣグループのカルボニル炭素にアサインされた２８９．７ｅＶでのピークと同様に、バルク炭素にアサインされた２８５ｅＶで強烈なピークを示す（図２ｄ）。カルボニルピークは、ＴＦＡ（図２ｅ）とＮＨ４ＯＨ（図２ｆ）での脱保護化の後におよそ７０％減少される。２８７．２ｅＶの肩は、ｔ−ブチル炭素に起因する。
【００２５】
ＤＮＡが修飾されたシリコンの画像が、モレキューラダイナミクスの“ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）”ブランドのフルオレセイン画像化装置を用いて得られた。２つの異なるオリゴヌクレオチドは、直径がほぼ２ｍｍの２つのスポットで表面に付着された。上のスポットの蛍光性の相補鎖とのハイブリダイゼーションは、予期された画像を示す（図３ａ）。下のスポットへの変性とハイブリダイゼーションはまた、予期された画像を示す（図３ｂ）。両者の相補鎖との変性及びハイブリダイゼーションは、両方のスポットが視覚化されることを可能にする（図３ｃ）。
【００２６】
図３ｄは、ヨウ素で末端化されたシリコン基板にω−ウンデシレン酸メチル・エステルのグループを付加するフォトイニシエーション後における、実施例の基板の写真を示す。
【００２７】
図４のグラフは、１０−アミノデカ−１−エンとドデセンの二成分の混合物を使用してオリゴヌクレオチド密度を制御することを示す。ｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンとドデセンの異なる比率を含有する混合物は、可視光線を用いて表面に付加された。蛍光性の相補鎖でのハイブリダイゼーションが後続するＳＳＭＣＣ及びチオール化ＤＮＡの脱保護化と付加は、シグナル定量化を可能にした。得られた蛍光性のシグナルと表面に付加されたアミンの比率との直線形の関係が観察された（ｙ＝０．００８１ｘ＋０．１６６４；Ｒ２＝０．９０４５）。
【００２８】
図５のグラフは、脱保護化条件に対して異なる処理時間で本発明により調製された表面を露出することによって実証されたオリゴヌクレオチド密度の制御を示す。表面が脱保護化され、ＳＳＭＣＣ及びチオール化ＤＮＡで修飾された。“ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ”ブランドのフルオレセイン画像化装置での画像化が後続する、蛍光性の相補鎖とのハイブリダイゼーションは、シグナルの定量化を可能にした。ＴＦＡに対する迅速な露出は、表面のアミンを生じるｔ−ＢＯＣ−修飾の１０−アミノデカ−１−エン分子を脱保護する。
【００２９】
図６は、蛍光的にタグ付けされたオリゴヌクレオチドで共有結合的に修飾されたシリコン表面の安定性を示す。ＤＮＡが修飾されたシリコン表面は、５´末端にフルオレセインが付加され、３´末端がチオール化されたＤＮＡを用いて、本発明により調製された。表面はＨＢにおいてオーバーナイトで保存され、次いで、“ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ”ブランドの画像化装置でスキャンされた。１時間ほどのスキャンは、表面のフルオレセイン強度を記録した。観察されたフルオレセインシグナルは、実験を通して安定である（ｙ＝−０．００４１ｘ＋０．９３９５）。
【００３０】
図７は、１５回のハイブリダイゼーションと変性サイクルにおける、本発明により調製された表面の安定性を示す。ハイブリダイズされたＤＮＡとフルオレセインでタグ付けされたＤＮＡの両者から測定されたフルオレセインシグナルは、各ハイブリダイゼーションサイクルにおいて約１％減少する。蛍光性の相補鎖の完全な除去を実証する各変性段階後において、表面は画像化された。変性後は、相補鎖からのフルオレセインのシグナルは観察されなかった（ハイブリダイズされたＤＮＡ強度、ｙ＝−０．００９７ｘ＋１．００５９；フルオレセインがタグ付けされたＤＮＡ；ｙ＝−０．０１１３ｘ＋１．０２４１）。
【００３１】
本発明の詳細な記載
略語：
下記の略語は本明細書にわたって使用される。
【００３２】
“アルカン”は、Ｃ２−Ｃ２４の直線であるか、枝分かれであるか、又は環式アルカン，及びアルキル基に対応する。
【００３３】
“アルケン”及び“α−アルケン”は、Ｃ３−Ｃ２４の直線であるか、枝分かれであるか、又は環式アルケン，モノ−若しくはポリ−不飽和であり、シス若しくはトランス或いはそれらの組み合わせと、及びアルケニル基に対応する。α−アルケンは、分子の末端炭素原子で不飽和で存在する、一つの不飽和を有するアルケンである。
【００３４】
“生体分子”は、下記に限定されるわけではないが、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、リン脂質などの細胞壁構成成分、並びに、標識された生体分子及び組換体生体分子などの列記したものの修飾形態及び合成形態を含んで、生物的な物質で見られる分子である。
【００３５】
“クロスリンカー”は、分子間結合を形成するために利用可能である、反応的な２つの部分を有する、化学的な架橋剤である。かかる反応的な２つの部分は、同一であるか、又は異なる。
【００３６】
“Ｆｍｏｃ”は、９−フルオレニルメトキシカルボニルである。
【００３７】
“ＨＢ”は、２´ＳＳＰＥ／０．２％ＳＤＳバッファー（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び７ｍＭ　ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．４）と同義であるハイブリダイゼーションバッファーであるか、又は等価の機能性を有する任意のバッファーである。
【００３８】
“異質二官能性クロスリンカー”は、二つの反応部分が互いに異なっている、分子間結合を形成するために利用可能である、反応的な２つの部分を有する、化学的な架橋剤である。
【００３９】
“修飾されたアルケン”及び“ω−修飾されたアルケン”。“修飾されたアルケン”は、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、又はチオール部分などの化学的な反応性部分の付加によって修飾されたアルケンである。反応性部分は、アルケニル炭素を除いて、アルケンの何れの部位に位置する。“ω−修飾されたアルケン”は、反応性部分がアルケン鎖の末端炭素に位置する、アルケンである。
【００４０】
“核酸”は、下記に限定しないが、標識された（放射性、蛍光性など）核酸、及びチオール又はビオチンタグなどの結合部分を含むために修飾された核酸を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びペプチド核酸、それらの修飾された形態である。“核酸”は、標準塩基のＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、及びＵと、並びにモノ−、又はジメチル化塩基、ジデオキシ塩基などのそれらの修飾塩基から構成されるＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチドの両者を含む。
【００４１】
“保護基”は、反応性部位でない部位の化学的な要素の操作を可能にするために反応性部位に対する選択的な付加、及び反応性部位からの除去が可能である化学的な部分である。保護基のホストは、かかる分野において周知である。下記に限定しないが、実例となる保護基は、メチル、ホルミル、エチル、アセチル、ｔ−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンゾイル、４−メチルベンゾイル、チオアニジル、チオクレシル、ベンゾイルオキシメチル、４−ニトロフェニル、ベンゾイルオキシカルボニル、２−ニトロベンゾイル、２−ニトロフェニルスルフェニル、４−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、及び２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６‐スルホニルを含む。
【００４２】
“ＳＳＭＣＣ”は、スルホスクシンイミジル４−Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン−１−カルボキシラートである。
【００４３】
“ｔＢＯＣ”は、保護基のｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
【００４４】
“ＴＦＡ”は、トリフルオロ酢酸である。
【００４５】
“ＵＶ”は、紫外線である。
【００４６】
反応チャンバー
ここに記載の方法において、ω修飾及び保護化されたアルケンは、基板に対して共有的に結合される保護化されたω修飾のアルカン分子のアレイを生じるために、炭素、シリコン、又はゲルマニウムの基板と反応される。本発明の第一の実施態様において、アルケンが基板と接触し、次いでかかるアルケンと基板の２つを紫外線の適切な波長、例えば２５４ｎｍに対して露出することによって、この反応がフォトイニシエーションされることが好ましい。この目的において、フォトイニシエーションされる化学反応を伝導するために設計された反応チャンバーが活用されうる。かかる反応チャンバーは周知であり、多くのメーカーによって構成できるか、又は購入できる。本発明で使用するための適切な反応チャンバーは、実施例７に詳細に記載される。
【００４７】
本発明方法の初期の反応がフォトイニシエーションされるので、光が基板／アルケン反応物に当たる場所を制御することによって、付加点はフォトパターン化できる。パターン化された表面を生成する方法は、かかる方法が所望のパターンを確実に生じる限り重要ではないが、紫外線のフォトパターン化は、パターン化された表面を生成することが好ましい。例えば、小型接触の印刷方法は、パターン化された表面を生成するために使用できる。ＵＶパターン化を使用することで、表面は、遮蔽された位置における反応の発生を防ぐ、適切なＵＶの不透明なマスクにより紫外線に当てられる。
【００４８】
フォトパターン化後、残存の反応物を除去するために、基板の表面は穏やかに洗浄される。
【００４９】
当然のこととして、フォトパターン化は任意である。共有的に付加されたω修飾されたアルカンで均一にコーティングされた基板を生成するために、基板全体が紫外線に当てられる。光反応性の部分は、シリコン基板の場合にＣ−Ｓｉの共有結合の付加を生じる反応で消費される、二重結合のアルケンであることを注意する。
【００５０】
基板表面の調製
本発明の好ましい実施態様において、シリコン基板が使用される。簡潔にするために、続く開示は、シリコン基板が使用されると仮定する。しかしながら、本方法は、基板としてゲルマニウム又は炭素を使用して、十分に等価な同じ方法で機能する。半導体産業におけるシリコン基板のユビキタス性のために、シリコン基板が好ましい。
【００５１】
好ましい実施態様において、シリコンウェハーは、水素分子で停止された基板表面を生じる数多の修飾３９，４１を用いるＳｉｅｖａｌの手法と同様に処理される。ウェハーはアセトンで５分間超音波処理されて、次いでメタノールで５分間処理された。次いで、ウェハーは、過酸化水素−アンモニア−水（１：１：４）の槽に７５℃で５分間浸された。次いで、ウェハーは、シリコン元素を水素で停止するために、２％のフッ化水素酸に簡単に浸漬された。
【００５２】
水素で停止した表面を臭素又はヨウ素で停止した表面に置き換え
基板が初期の水素で停止した表面を生成する処理がなされた後、水素原子が基板表面から除去され、臭素又はヨウ素の何れか（あるいはそれらの組み合わせ）が基板表面に化学的に結合される。これは、基板表面から水素原子を確実に除去し、さらに臭素若しくはヨウ素原子に置き換える、試薬又は試薬の組み合わせを使用してなされうる。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、水素で停止した基板ウェハーは、水素をヨウ素と置き換えるために、ヨウ素／ベンゼン溶液に浸される（又は、臭素での置き換えが望ましい場合は、臭素／ベンゼン溶液に浸される）。この処理は、ヨウ素又は臭素と基板表面との間に介在する酸素結合が存在しない場合において、末端のヨウ素又は臭素分子に結合された基板分子（それらはシリコン、炭素、若しくはゲルマニウム）によって基板表面が均一にされる、表面を生じる。
【００５４】
基板と修飾されたアルケンを反応
基板分子が臭素又はヨウ素の何れかで停止するように、一旦基板表面が調製されると、調製された基板は、好ましくはフォトイニシエーションされる反応を受け、臭素が取り除かれ、基板分子は修飾されたアルケンのアルケン基と反応して、それによって、反応部分を有するアルキル基（又は、修飾されたアルケンが一つ以上の不飽和を含む場合はアルケニル基）が共有して付加された特徴の表面を産する。下記の記載で完全に記述されるように、修飾されたアルケンが単一のα位置の二重結合と単一のω位置の化学的な反応性部分を含むことが好ましい。
【００５５】
好ましい実施態様において、修飾されたアルケンの薄膜はヨウ素で停止された基板ウェハーに位置付けされ、次いでウェハーは可視光線（好ましくは５１４ｎｍ）に当てられる。可視光線はヨウ素を除去する。可視光線はまた、修飾されたアルケンの二重結合とシリコン表面間の反応を介してＳｉ−Ｃ結合の形成を開始する。
【００５６】
本発明の最も好ましい実施態様において、ω修飾及び保護化されたαアルケンは、基板に共有的に結合された、保護化されてω修飾されたアルケン分子のアレイを生成するように、炭素、シリコン、又はゲルマニウムと反応される。この反応は、アルケンと基板を接触することによってフォトイニシエーションされて、次いで、それら２つのアルケンと基板を可視光線の適切な波長、例えば５１４ｎｍに露出する。この目的において、フォトイニシエーションされる化学反応を伝導するために設計された反応チャンバーが活用されうる。かかる反応チャンバーは周知であり、多くのメーカーによって構成できるか、又は購入できる。
【００５７】
ヨウ素又は臭素で停止された基板表面と修飾されたアルケンの反応がフォトイニシエーションされるので、光が基板／アルケン反応物に当たる場所を制御することによって、付加点はフォトパターン化できる。パターン化された表面を生成する方法は、かかる方法が所望のパターンを確実に生じる限り重要ではないが、フォトパターン化は、パターン化された表面を生成することが好ましい。例えば、小型接触の印刷方法は、パターン化された表面を生成するために使用できる。ＵＶパターン化を使用することで、一つ以上の修飾されたアルケンでコーティングされた基板表面は、遮蔽された位置で発生する反応を防ぐ、光不透明なマスクにより可視光線に当てられる。
【００５８】
フォトパターン後、残存の反応物を除去するために、基板の表面は穏やかに洗浄される。
【００５９】
当然のこととして、フォトパターン化は任意である。共有的に付加された修飾部分で均一にコーティングされた基板を生成するために、基板全体が可視光線に当てられる。あるいは、基板表面は望ましいスポットのアレイを生じるようにフォトパターン化され、各スポットは同一であるか又は異なる付加された部分を含む。好ましい実施態様において、α−アルケンが使用され、光反応性の部分は、シリコン基板の場合にＣ−Ｓｉの共有結合の付加を生じる反応で消費される、二重結合のアルケンであることを注意する。
【００６０】
ω−修飾されたアルケン
反応性部分、及び好ましい末端（すなわち、ω位置）の反応性部分を有するアルケンは、アルケンの付加後に基板表面に分子をさらに付加する手段を提供するように本反応において活用される。反応性部分は、アルケニル炭素以外の修飾アルケンのどこにでも位置付けされる。反応性部分がアルケンの末端に付加される場合、アルケンは、ω修飾されたアルケンとして定義される。アルケンは３乃至２４の炭素数で、アルケンの末端炭素又はその近くに単一の不飽和を有することが最も好ましい。アルケンは、一つ以上の不飽和を有し、線形、枝分かれ、又は環式でありうる。
【００６１】
アルケンに対する修飾は、基板表面に対して付加された後のアルケンに成される、さらなる共有結合を可能にする、任意の部分の付加でありうる。定義で記載したように、修飾はさらなる反応において容易に利用可能となるので、非常に好まれるが、修飾は必ずしもアルケンの物理的な末端に位置する必要がない。かかる修飾は、下記に限定しないが、アルケン鎖のω炭素若しくはその近隣に対して、アミンを含んでいる基、カルボキシルを含んでいる基、又はチオールを含んでいる基の付加を含む。
【００６２】
修飾自体が反応性であるため、基板に対するアルケンの第一反応において修飾は保護される必要がある。しかしながら、すべての反応性修飾が保護を必要とされるわけではない。例えば、多くのカルボキシを含んでいる基は、基板にアルケンを付けるために使用される好ましい光化学的特性によって悪影響を及ぼされず、したがって保護される必要はない。一般的に、アルケンで反応性修飾を保護することは、選択される反応性修飾に適する、任意のタイプの保護基で成されうる。適切な保護基の実例となるリストは、定義において提供される。要するに、使用される保護基の選択は、アルケンに成される修飾の形態に依存する。修飾がカルボキシル基の付加である場合、保護基の必要性はまったくないか、又はカルボキシ保護基が使用されうる。同様にして、修飾がアミノ又はチオール基の付加である場合、アミノ又はチオール保護基がそれぞれ使用されうる。アミン、カルボキシ、及びチオールの機能性などの多くの反応部分における、多数の保護基は、当該技術分野において周知である。ほとんどは疎水性である。アミノで停止したアルケンにおいて、ｔ−ＢＯＣが最も好ましい。ｔ−ＢＯＣは、共通の酸の不安定保護基である。他の酸の不安定保護基は、当該技術分野において周知である。
【００６３】
シリコン基板とアミノ修飾された、ｔ−ＢＯＣ−保護化アルケンとのフォトイニシエーション反応の実例となる実施例は、図１に示される。ここで、保護化された、アミノ修飾されたアルケンは、ヨウ素で停止されたシリコン基板と接触され、５１４ｎｍの可視光線に当てられる。これは、アルケンの末端の二重結合に酸化していないシリコン基板の共有のＳｉ−Ｃ結合を形成させる。
【００６４】
一旦、保護化されたアルケンが基板と反応されると、（すべての）保護基は除去される。除去は化学的に成され、選択された保護基のタイプに多大に依存する。かかる脱保護の方法は、当該技術において周知である。ｔ−ＢＯＣ保護基において、ＴＦＡでの処理は、反応性の一次アミン基を生じるように、保護基を除去する。
【００６５】
本発明で使用するための好ましい修飾されたアルケンは、単一のα不飽和、直鎖若しくは枝分かれ型アルケンよりも好ましい環式アルケンを有する、ω−アミノ−Ｃ３−Ｃ２４−アルケンであり、最も好ましいω修飾アルケンは、１０−アミノデカ−１−エンである。上に注意したように、アミノ修飾されたアルケンにおける好ましい保護基はｔ−ＢＯＣである。
【００６６】
表面との結合部分への分子の付加
一旦、基板表面が、基板の表面に結合した修飾アルカン（又は修飾アルケンが一つ以上の不飽和を含む場合、アルケン）の形態で反応性部分の単層を含むように修飾されると、次いで、分子は周知の手段によって修飾部に結合される。分子は、修飾部に直接的に付加できるか、又は表面に結合されたアルカンの修飾部と付加される、入ってくる分子との間に置かれたクロスリンカーを介して付加できる。
【００６７】
アルケンへの修飾部がカルボキシ又はアミノ部分の何れかである場合、ポリペプチドの固体状合成で使用される広範囲にわたる化学的な特徴は、表面に結合したアルカンのω修飾に対して、タンパク質、又は生体分子を有する他のカルボキシ若しくはアミノ基をリンクするために活用できる。
【００６８】
要約すると、固体状態の反応において、基板に結合される、入ってくる分子における反応性部分は、付加位置としての役割をする、一つ以上の部分を除いて、保護化される。ある実例において、所望の付加位置に存在する部分は、入ってくる分子と表面と結合したアルカンの修飾部との間に反応を引き起こすために活性化しなければならない。例えば、カルボキシ基を有する分子を活性化することによって、例えば、ジクロロへキシルカルボジイミドで反応することによって、入ってくる分子は、活性化されたカルボキシ部分で露出されたアミノ基に結合するだろう。一方、ペプチド合成において、追加的なアミノ酸を付加するために処理は何度も反復され、ここにおいて、唯一単独の結合反応は、アルカンでカバーされた表面に入ってくる分子をリンクするために採用される。
【００６９】
しかしながら、クロスリンカーを使用することがより好ましく、さらに分子とアルカンで覆われた基板間にリンクを提供するために異質二官能性のリンカーを使用することがより好ましい。最も好ましいリンカーは、ＳＳＭＣＣである。ＳＳＭＣＣは、チオールの反応性のマレイミド部分と同様に、アミンの反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。この二官能性は、チオール修飾された核酸をアルカン修飾された基板に結合する性能により、ＳＳＭＣＣを好ましいリンカーにさせる。かかるリンカーは、図１Ａ及び１Ｂに描写される、最終反応段階で示される。チオール修飾は、Ｓ−トリチル−６‐メルカプトへキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト及び１−Ｏ−ジメチルオキシトリチル−へキシル−二硫化物、１´−｛（２−死アノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）｝−ホスホルアミダイトなどの周知の試薬を用いて核酸に成される。
【００７０】
他の適切な架橋する部分は、他のタイプの修飾において周知である。例えば、ジアミン、ジアルデヒド、ジカルボン酸、アミノ酸、及び同等のものは架橋剤として使用できる。
【００７１】
核酸を修飾された、基板と結合した部分に付加するために、脱保護された表面は、ＳＳＭＣＣのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部分を結合したアルカンの反応性部分（好ましくはアミノ基）と反応させるために、ＳＳＭＣＣと十分な時間接触される。未反応のＳＳＭＣＣを除去するために基板は穏やかに洗浄される。ＳＳＭＣＣで修飾された基板は、次いで、シリコン基板に核酸の面又はアレイを形成するためにチオール修飾された核酸と反応する。次に、核酸が修飾された表面は、蒸留水で洗浄され、核酸の非特異的に結合した鎖を除去するために３７℃のハイブリダイゼーションバッファーで保存される。
【００７２】
修飾されたアルケンとの初期の反応、クロスリンカーとの反応、又は核酸などの入ってくる分子との反応の質を確証するために、各反応段階は、ＰＭ−ＦＴＩＲＲＡＳ、ＸＰＳ、接触角度測定等を用いてモニターされる。
【００７３】
Ｘ線光電子測定
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）は、脱保護の度合いを測定するために、保護化及び脱保護された表面で実行される。シリコン基板に結合した、ｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンのＸ線光電子スペクトルは、図２ａに示される。窒素のスペクトルは、４００．５ｅＶでの単一ピークを示す。１時間の２５％ＴＦＡ処理後（図２ｂ）、２つのピークが記録された。ＮＨ３＋と一次アミンは、４０１．９と４００．２ｅＶにそれぞれのピークをアサインされた。２５％ＴＦＡで処理されて、続いて１０％ＮＨ４ＯＨで５分間洗浄処理された表面は、４００．３ｅＶでの一つのピークだけを示す（図２ｃ）。これは、ＮＨ３＋窒素が完全に脱プロトン化したことを示す。ｔ−ＢＯＣ−保護化アミンの炭素のスペクトルは、ｔ−ＢＯＣグループのカルボニル炭素にアサインされた２８９．７ｅＶでのピークと同様に、バルク炭素にアサインされた２８５ｅＶで強烈なピークを示す（図２ｄ）。カルボニルピークは、ＴＦＡ（図２ｅ）とＮＨ４ＯＨ（図２ｆ）での脱保護化の後におよそ７０％減少される。２８７．２ｅＶの肩は、ｔ−ブチル炭素に起因する。
【００７４】
残念にも、ｔ−ＢＯＣ保護化表面の窒素１ｓピークは、一次アミン表面の窒素ピークとほぼ同等である（図２ａ及び２ｃを参照）。水酸化アンモニウムで洗浄される前のアミン塩のＸＰＳは、２つの窒素ピーク（図２ｂ）を明白に示す。４０１．９ｅＶの結合エネルギーのピークは、ＮＨ３＋を表すと考えられる一方で、４００．２ｅＶでのピークは一次アミンの窒素にアサインされる。ＴＦＡ溶液に露出された後に窒素が完全にプロトン化されないことは興味深いことである。水酸化アンモニウムでの洗浄後、４００．３ｅＶの単一ピークが現れる（図２ｃ）。保護化表面の炭素１ｓスペクトルは、ｔ−ＢＯＣ基のカルボニル炭素にアサインされた２８９．７ｅＶでのピークを示す。このピークは、脱保護化条件において劇的に減少して、ほとんどのｔ−ＢＯＣ基が除去されたことを示す（図２ｅ及び２ｆ）。ｔ−ＢＯＣ基のほぼ７０％を示すＩＧＯＲを用いるピークの適合（ｐｅａｋ　ｆｉｔｔｉｎｇ）は除去される。しかしながら、それらの小さなピークのエリアが適合パラメータと関連する多大なエラーにより評価されるだけであることを注意するべきである。温度、ＴＦＡ濃度及び反応時間を増加させることによって、脱保護条件を最適化することは、同様の結果を産出した。
【００７５】
接触角度の測定
接触角度は、脱保護の様々な段階の表面において測定された。
【００７６】
【表１】
2004508030.tif 000003
ｔ−ＢＯＣ保護化アミンは、疎水性である。１時間の２５％のトリフルオロ酢酸への露出に際して、接触角は、プロトン化アミン塩に関連した親水性の表面で期待される行動と一致していて、より小さくなった。１０％の水酸化アンモニウムにおいて表面をさらに洗浄することは塩を削除し、接触角測定の増加によって証拠づけられた第一アミン表面を生成した。
【００７７】
特定のハイブリダイゼーション
実施例に記載のように、アミンで修飾された表面は、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験での性能に関して特徴付けられる、小型ＤＮＡアレイ調製のための基板として採用される。図３ａ乃至３ｃを参照。２つの異なるタイプのオリゴは、ここに記載の方法を使用して、酸化されてない、ヨウ素で停止されたシリコン（００１）表面（約１ｃｍｘ１ｃｍ）に約２ｍｍの直径のスポットで固定された。固定されたオリゴヌクレオチドの一つに対して相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの溶液は、表面に置かれてハイブリダイズを可能にする。図３ａは、ハイブリダイゼーションと洗浄後に獲得された画像を示す。単一スポットが現れ、選択されたオリゴヌクレオチドに対する成功したハイブリダイゼーションを示す。代わりの蛍光性のオリゴヌクレオチドにおける、次の変性及びハイブリダイゼーションの画像は、第２の個別のスポットを示す（図３ｂ）。画像化に続き、最後の変性と、次ぎの蛍光で標識された相補鎖でのハイブリダイゼーションは、予想通りに両スポットを表した（図３ｃ）。
【００７８】
付加部位の表面密度の制御
表面付加部位の密度制御は、オリゴヌクレオチドなどの結合した生体分子の密度制御を可能にするため、本発明の主要な利点である。例えば、数多のアプリケーションが濃厚にパックされたＤＮＡ鎖を必要とする一方で、他のものは結合したオリゴヌクレオチド間の多大な間隔を必要とする。基板表面における付加位置の表面密度の制御は、２つの異なる手法で実証され、一つ目は付加段階における保護化されたアミノ修飾されたアルケンとドデセンの混合物の使用によって実証され、２つ目はＴＦＡに対するｔ−ＢＯＣ保護化アミン表面の露出時間の制御によって実証され、それによってアミン修飾された表面の脱保護化の範囲を限定する。
【００７９】
表面における反応性アミン部位の数の制御は、ｔ−ＢＯＣ保護化１０−アミンデカ−１−エンとドデセンの混合物の使用によって実証された。ドデセンはω反応性部位が欠損しているため、シリコン表面に一旦付加すると、反応性でなない。ｔ−ＢＯＣ保護化１０−アミンデカ−１−エンの増加する分画を含んでいる混合は、ヨウ素修飾されたシリコン基板に適用され、５１４ｎｍの可視光線での反応を可能にする。次いで、表面は、ＴＦＡ（脱保護化のため）、ＳＳＭＣＣ（クロスリンカー）、及びＤＮＡでここに記載のように処理される。蛍光性の相補鎖とのハイブリダイゼーション及び、続く蛍光画像での定量は、表面において成された。図４に示されるグラフは、測定された蛍光強度と１０−アミノデカ−１−エンの分画間の直線関係を示す。この発見は、表面のアミン基の密度を容易に制御することができることを明白に実証して、次いで、結合したオリゴヌクレオチド又はハイブリダ−ゼーション若しくはさらなる研究に利用可能な他の生体分子の最終的な表面密度の制御を可能にする。
【００８０】
表面付加部位の密度を制御する代替となる方法は、脱保護状態に対して初期に保護化された、ω修飾された表面の露出時間の制御を含む。このアプローチを実証するために、４つのヨウ素で停止されたシリコン表面は、ｔ−ＢＯＣ保護化１０−アミノデカ−１−エンで本発明にしたがって反応される。次いで、表面は２５％ＴＦＡで０、２、１５、及び６０分間露出される。次ぎに、表面はＳＳＭＣＣ及び５´チオール化ＤＮＡで修飾されて、蛍光性の相補鎖でハイブリダイズされる。図５は、それらの各表面の蛍光シグナルのグラフである。蛍光の量は、脱保護剤の露出時間に依存して測定された。脱保護は、露出時間の約１５分までに迅速に発生し、その時点において、ほとんどのｔ−ＢＯＣ基は除去される。６０分間脱保護を連続することは、反応で利用できるさらなる遊離アミンをわずかに生じる。
【００８１】
安定性
ＤＮＡで修飾されたシリコン表面の重要なパラメータは、核酸のハイブリダイゼーション及び酵素的操作などの生化学工程において採用される状態に対する安定性である。２つの実験が、ＤＮＡ修飾された表面の安定性を評価するために実行された。表面に対して共有的に結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドの安定性は、オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）に共有的に付加された蛍光性タグの手段によって評価され、表面はハイブリダイゼーションバッファーでオーバーナイト培養され、表面の蛍光は繰り返して測定された（図６を参照）。蛍光強度の著しい減少は観察されず、ＤＮＡと表面のリンクが試験状態下で安定であることを示している。
【００８２】
第二実験において、表面はあるエリアで蛍光標識されたＤＮＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）で修飾され、別のエリアの非標識ＤＮＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１の蛍光性の相補鎖で繰り返してハイブリダイズされる。ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３の測定された蛍光強度は、蛍光性の相補鎖にハイブリダイズされた、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１における、一般的には３分の２である。標準化されたデータは、本質的に同一の率で減衰する、両方のシグナルを示す（図７）。約１５サイクル後の蛍光強度は、初期の値に対して約８５％まで減衰する。これは、１サイクルにつき約１％の欠損に対応する。非共有結合表面の付加化学的性質４４を使用して、以前に記載した結果よりもこの安定は優れている。それらの２つの発見は、本発明により修飾された酸化されていないシリコン表面が、採用された保存とハイブリダイゼーション状態下で優れた安定性を表すことを実証する。
【００８３】
実施例
下記の実施例は、ここに開示されて請求された、本発明のさらなる完全な理解を提供するために、単独で含まれる。実施例は、請求項の範囲又は一般性を限定しない。
【００８４】
実施例１：ヨウ素で停止してシリコンに対するペルフルオロオクタデセンの付加
この実施例において、シリコン基板は、Ｓｉ−Ｂｒ結合で停止される表面のシリコン基板を生成するために、上の好ましい実施態様に記載のように、ＨＦとヨウ素のベンジル溶液で処理された。ペルフルオロオクタデカ−１−エンは、基板の表面に対する液体ドロップとして適用された。次いで、コーティングされた表面は、焦点を外された約２０ミリワット／ｃｍ２の強度のアルゴンレーザーからの５１４ｎｍの可視光線に露出された。これは、レーザーポインターによって生成されるおおよそのエネルギー量である。反応は、開始スペクトルからのＳｉ−Ｉピークの消滅と表面の構成分析でのフッ素ピークの現れをモニターすることによってＸ線光電子分光法を介して続いた。予期したように、露出（３時間）にわたって、Ｓｉ−Ｉピークはゆっくりと消滅し、シリコン基板の表面に付加されたペルフルオロオクタデセンとしてのフッ素ピークの付随した出現がある。暗所でのコントロール実験の実施は、基板表面に対するペルフルオロ化合物の著しい付加は示されなかった。
【００８５】
実施例２：ウンデシレン酸メチル・エステルを使用するフォトパターン化
この実施例において、ヨウ素で停止したシリコン基板は、実施例１と同一手法で調製された。ωウンデシレン酸メチル・エステルの薄膜は、基板表面にコーティングされた。コーティングされた基板の小さな領域は、実施例１のような同一手法で５１４ｎｍのレーザー光に露出され（２時間）、一方でサンプルの残りはマスクされて暗所で保存された。光処理の後、サンプルは穏やかに洗浄された。実験のこの時点において、基板の照らされた部分と照らされていない部分は、視覚化によって容易に区別できる（図３ｄ参照）。次いで、サンプルはドデセン（疎水性分子）に浸され、酸の形態を生成するようにサンプル全体はエステルを加水分解するカリウムｔ−ブトキシド（塩基性）に短い時間浸された。結果となるサンプルは、基板の照らされた部分の湿潤と、照らされていない部分における疎水性の行動を示した。これは、ウンデシレン酸メチル・エステルが基板の表面に事実上接合し、また、基板の表面から分子を分離せずに、接合した分子のメチル・エステル部分を削除することができるかもしれないことを実証する。
【００８６】
実施例３：オリゴヌクレオチド合成
すべてのオリゴヌクレオチドは、ウィスコンシン大学のバイオテクノロジーセンター（ウィスコンシン州、マジソン）で合成された。２種類のオリゴヌクレオチドは、下記の実施例において採用され、それらの実施例は、表面に付加されるオリゴヌクレオチドと表面に対するハイブリダイゼーションのために採用されるオリゴヌクレオチドである。表面に付加されるオリゴヌクレオチドは、５´末端へのチオール修飾剤Ｃ６（ＨＳＣ６、グレンリサーチ、２８１６４、バージニア、スターリング、２２８２５デービスドライブ、ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ）を使用する５´末端へのチオール修飾、又は３´末端へのチオール修飾剤Ｃ３　Ｓ−Ｓ　ＣＰＧ（Ｃ３ＳＨ、グレンリサーチ）を使用する３´末端へのチオール修飾の何れかでチオール修飾され、それらの各オリゴヌクレオチドは３１塩基の長さであり、５´末端における１５ｍｅｒのｄＴスペーサーと、３´末端における特異的な１６ｍｅｒの配列から構成される。使用される３つの３１ｍｅｒ配列は、
５´−ＨＳＣ６−Ｔ１５ＡＡＣＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡ３´（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）、
５´−ＨＳＣ６−Ｔ１５ＡＡＣＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡ３´（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２）、及び
５´−ＦＡＭ−Ｔ１５ＡＡＣＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡ−Ｃ３ＳＨ３´（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）
である。
【００８７】
ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３において、“ＦＡＭ”は、６−ＦＡＭホスホルアミダイト試薬（パーキンエルマーバイオシステム、カリフォルニア州、フォスター）を用いる合成段階のオリゴヌクレオチドに組み込まれる蛍光色素を意味する。表面に結合した相補鎖に対するハイブリダイゼーションのために採用されるオリゴヌクレオチドは、１６塩基の長さであり、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１又はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２の何れかの３´末端の１６塩基に相補性である。それらのオリゴヌクレオチドはさらに５´末端をＦＡＭで修飾される。チオール修飾されたオリゴヌクレオチドは、グレンリサーチ４５，４６のガイドラインにしたがって脱保護され、２倍の勾配溶液で逆層ＨＰＬＣによって精製される。１６塩基の相補鎖は、同一の手法で精製される。下記の他の試薬は、ウィスコンシン州、ミルウォーキーのアルドリッチケミカルカンパニーか、或いは別のところから入手される。それらは、１−ドデセン、塩化１０−ウンデシノイル、アジ化ナトリウム、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル二炭酸塩（Ａｃｒｏｓ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ，　Ｊａｎｓｓｅｎｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌａｎ　３Ａ，　２４４０　Ｇｅｅｌ，　Ｂｅｌｇｉｕｍ，　ｗｗｗ．ａｃｒｏｓ．ｃｏｍ）、スルホ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＳＭＣＣ）（ピアスケミカル、イリノイ州ロックフォード、）、シリコン（００１）ウェハー（バージニアセミコンダクタ、バージニア州、フレドリックスバーグ、ｗｗｗ．ｖｉｒｇｉｎｉａｓｅｍｉ．ｃｏｍ）。ウェハーを洗浄するために使用される超純粋は、ミリポアシステム（マサチューセッツ州、マールボロ）から入手された。
【００８８】
実施例４：１０−アミノデカ−１−エンの合成
シリコン表面を修飾するために使用される１０−アミノデカ−１−エンは、クルチウス反応４７の変形を用いて調製された。４０．５ｇの塩化１０−ウンデシノイルとテトラブチルアンモニウムブロミド（２００ｍｇ）の溶液は、３００ｍＬのジクロロメタンで調製され、冷槽で冷却された。アジ化ナトリウム（１５．６ｇ）は、５０ｍＬの水で溶解されて、混合物に加えられた。この混合物は冷槽で２時間連続して攪拌された。有機層を除去して、５０ｍｌの水で２回洗浄し、３６時間無水の硫酸マグネシウムで乾燥されて、濾過された。トリフルオロ酢酸（２０．３ｍＬ）が徐々に攪拌しながら加えられて、混合物は６時間還流された。トリフルオロアセトアミドを含有する結果的な混合物は冷却され、５０ｍｌも飽和の水性炭酸水素ナトリウムで２回洗浄され、次いで、無水の硫酸マグネシウムで乾燥されて、濾過された。溶媒はオイルを産出するように回転式気化によって除去され、かかるオイルは、純粋なトリフルオロアセトアミドを生成するために真空蒸留される。核磁気共鳴は、トリフルオロアセトアミドを確認した。１０ｍＬ部分のトリフルオロアセトアミドの切断は、５００ｍＬの７％炭酸カリウム水：メタノール（２：５）溶液４８で３時間の還流によって達成された。遊離アミンは１００ｍｌのエーテルで２回抽出され、再度硫酸マグネシウムで乾燥されて、濾過された。回転式気化による溶媒の除去と真空蒸留は、所望の合成物を生成した。核磁気共鳴は、純粋なアミンとしてその本体を確認した。
【００８９】
実施例５：ｔ−ＢＯＣ保護化アミンの合成
ｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンは、標準的な方法４９で調製された。純粋なアミンの部分（５．１１ｇ）は、５０ｍｌ水に溶解した３ｇのＮａＨＣＯ３溶液に加えた６０ｍｌクロロホルムに溶解された。塩化ナトリウム（６．４５ｇ）は、数ミリリットルのクロロホルムに溶解した７．１８ｇのジ−ｔｅｒｔ−二炭酸塩と共に添加した。この混合物は９０分間還流されて、５０ｍｌのエーテルで２回抽出された。収集された有機性の抽出物は、硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過されて、さらに回転式気化によってエーテルが除去された。ｔ−ＢＯＣ保護化合成物は、真空蒸留によって精製されて、ＮＭＲによって存在が確認された。室温において、塩化メチレンに溶解した２５％ＴＦＡの１ｍｌで、かかる合成物の１０ｍｌアリコートを１時間処理することは、薄層クロマトグラフィによって実証されるような遊離アミンを回復した。
【００９０】
実施例６：ＤＮＡ修飾表面の調製
シリコンウェハーは、既に記載のようにして修飾するために調製された１９，４１，４４。ウェハーは表面原子を水素で停止するために２％のフッ化水素酸溶液で短時間露出された。次いで、ウェハーは直ちに反応チャンバーに浸され、１０乃至３０ｍｌのｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンで覆われ、ＵＶランプからの紫外線に２時間露出された。使用されたｔ−ＢＯＣ−保護化１０−アミノデカ−１−エンの容量は、表面を十分にカバーして、ウェハーのサイズによって変化した。ウェハーをカバーする層の厚さは、直接的には測定されないし、制御されないが、一般的には１ｍｍ未満である。次いで、修飾された表面は、ｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、一次アミンで停止した表面を形成するために塩化メチレンの２５％ＴＦＡで処理し、続いて１０％ＮＨ４ＯＨで３分間洗浄された。それらの表面は、異質二官能性クロスリンカーＳＳＭＣＣ（１．５ｍＭの１００ｍＭトリエタノールアミンバッファー、ｐＨ７）を含有する５０ｍｌの小滴に２０分間浸された。ＳＳＭＣＣは、チオール反応性マレイミド部分と同様に、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。マレイミド活性の表面は、ＤＮＡアレイを形成するために約１ｍＭのチオール修飾されたＤＮＡの０．４乃至０．８ｍｌの小滴でオーバーナイト反応された。次いで、ＤＮＡが修飾された表面は、非特異的な結合鎖を除去するために、蒸留水で洗浄されて、２´ＳＳＰＥ／０．２％ＳＤＳバッファー（“ＨＢ”としてここに指定された、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ，及び７ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で３７℃で１時間保存された。
【００９１】
実施例７：反応チャンバー
ＵＶを媒介とした反応に使用されるチャンバーは、直径が１１．５ｃｍで高さが５ｃｍの円筒状のアルミニウム基部から構成される。基部の内部は、直径が９ｃｍで深さが４ｃｍのチャンバーを生成するために研磨機で処理された。薄いテフロン（登録商標）ディスクは、かかるチャンバーの底に置かれた。入口と出口部分は、窒素ガスの連続する径路を可能にするために加えられた。中央部から取り除かれた８ｃｍ直径部分を備える、直径が１１．５ｃｍで高さが３．５ｃｍのテフロン（登録商標）リッドは、アルミニウム基部にわたって適合するように製造された。クオーツウィンドウを固定するために８ｃｍ径のホールは研磨機で処理された。組み立てられて使用する場合に、リッドは固定されて、ＵＶランプがチャンバー上に配置される。ＵＶランプはＵＶプロダクツ社（製品番号ＣＰＱ−７４４６）から購入され、アルミニウムリフレクタに設置された低圧水銀の蒸気でオゾンを生成するクオーツ・グリッド・ランプから構成される。
【００９２】
実施例８：ハイブリダイゼーション及び変性
表面と結合したオリゴヌクレオチドに対して蛍光性の相補鎖をハイブリダイズするために利用される工程は、２８，４４で詳細に記載される。要約すると、ＤＮＡ修飾されたシリコン表面はハイブリダイゼーションバッファーから取り出されて、蒸留水で洗浄され、次いで５乃至１０ｍｌの２ｍＭの５´末端にフルオレセイン標識された相補鎖にハイブリダイゼーションバッファーで露出され、湿潤チャンバーにおいて室温で２０分間ハイブリダイスされた。次いで、ハイブリダイズされた表面は、ハイブリダイズしなかった相補鎖を除去するためにハイブリダイゼーションバッファーで５分間に２回洗浄された。次ぎに、ハイブリダイズされたＤＮＡ修飾された表面は、モレキューラーダイナミクス社のＦｌｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ５７５トレイでハイブリダイゼーションバッファーの小滴に対して下向きで置かれ、スキャンされた。これは、シリコン表面の蛍光部分の可視化と定量化を可能にした。変性は、水での洗浄に続く、室温で５分間の８．３Ｍの尿素溶液に表面を置くことによって達成された。次いで、表面は、完全に変性が成されていることを確認するためにＦｌｌｕｏｒＩｍａｇｅｒで再度スキャンされた。所望であれば、続くハイブリダイゼーションは同じ手順で反復されうる。代替として、何回かの密度実験において、変性は、ハイブリダイズされた表面を少量の水に９０℃で１５分間置くことによって達成された。これは二重鎖を変性し、蛍光性の相補鎖を定量化のために収集されることを可能にした。（２８、４４）
実施例９：ＤＮＡ修飾されたアミン表面の制御
一連の実施例は、結合されたオリゴヌクレオチドの挙動を特徴づけて、かつ遊離アミンの密度を制御するために導かれた。ハイブリダイゼーションの特異性は、蛍光性の相補鎖の何れかに対する選択的な白血球イブリダイゼーションに続き、表面への２つの異なる種類のオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２）を固定することによって試験された。表面の遊離アミンの密度は、ｔ−ＢＯＣ保護化アミンとドデセンの混合物で水素停止されたシリコン表面の反応によって制御できる。代替として、ｔ−ＢＯＣ保護化アミン表面は、様々な時間において２５％トリフルオロ酢酸に露出することで部分的に保護される。
【００９３】
実施例１０：表面密度の測定
表面にハイブリダイズされた多くの分子は、既に記載の手法（２８、４４）を用いて決定された。オリゴヌクレオチドは表面に固定され、さらにそれらの蛍光性の相補鎖は以前のようにハイブリダイズを可能にする。表面は画像化され、蛍光のエリアは測定された。次いで、表面は、二重鎖を完全に変性するために１５分間にわたって、マイクロフュージ管で８００μｌの９０℃の温水に位置される。次いで、表面は、本来の８００ｍｌへ定量的に溶出される、２００ｍＬの水で２回洗浄される。完全な変性が起こったことを確定するために、表面は再度スキャンされた。相補鎖を含んでいる水の容量は、真空遠心によって焼く１０ｍｌまで減少されてポリアクリルアミドゲルの１レーンにロードされ、一方で、蛍光オリゴヌクレオチドの標準量は他のレーンにロードされた。電気泳動後、ゲルは画像化されて、表面から溶出された蛍光性オリゴヌクレオチドの量は、既知のサンプルから得られた標準曲線を参照することによって計算された。この方法を使用して、ハイブリダイズした分子の密度は、１平方センチメートル当たり、ほぼ２．３ｘ１０１２分子であることが分かった。
【００９４】
実施例１１：
安定した測定
かかる表面化学の安定性は、固定された蛍光性オリゴヌクレオチドの直接モニタリング及び反復したハイブリダイゼーションの両者によって実証された。直接モニタリングにおいて、５´末端にフルオレセインを標識して、３´末端にチオール基を標識したオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３）は、活性された表面に対して共有的に付加された。共有的な付加がなされた後、表面は２７℃でハイブリダイゼーションバッファーにオーバーナイト保存された。次いで、表面の蛍光強度は、表面がバッファーに戻されて２７℃で１時間後にＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒでスキャンすることによって測定された。次ぎに、表面は再スキャンされて、さらに蛍光が計測された。続くスキャンは総体で１０時間の間、毎時間実行され、その間、表面は２７℃でバッファーに保存された。光に対する露出は、この実験にわたって最小限を維持した。
【００９５】
ハイブリダイゼーション条件に関する表面の安定性はまた、試験された。非蛍光性のＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１と同様のフルオレセイン標識のＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３は、表面の２つの異なるエリアに共有的に付加された。ＤＮＡ修飾された表面は、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１の蛍光でタグ付けされた相補鎖に対して２０分間露出されて、さらにハイブリダイゼーションが成された。次いで、ハイブリダイズされた表面はＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒでスキャンされて、ＤＮＡが修飾されたエリア両者の蛍光シグナルは定量的に測定された。ハイブリダイズされた表面は二重鎖を変性するために８．３Ｍ尿素に置かれ、次いで、蛍光性の相補鎖が除去されたことを確定するために再度スキャンされた。表面は、１５サイクルのハイブリダイゼーション、スキャン、変性、再スキャン、及び再度のハイブリダイゼーションのサイクルを受ける（結果を参照）。
【００９６】
図書目録
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2004508030.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
アミンで修飾されたシリコン（００１）ウェハー上にＤＮＡを固定する反応スキームを示す図である。
【図１Ｂ】
アミンで修飾されたシリコン（００１）ウェハー上にＤＮＡを固定する反応スキームを示す図である。
【図２ａ】
シリコン基板に固定されたｔ−ＢＯＣで保護化された１０−アミノデカ−１−エンのＸ線の光電子スペクトルのグラフである。
【図２ｂ】
２５％ＴＦＡで１時間処理した後の、シリコン基板に固定されたｔ−ＢＯＣ−で保護化された１０−アミノデカ−１−エンのＸ線の光電子スペクトルを示すグラフである。
【図２ｃ】
２５％ＴＦＡで処理されて、続いて１０％ＮＨ４ＯＨで５分間洗浄処理された後のスペクトルを示すグラフである。
【図２ｄ】
ｔ−ＢＯＣで保護化されたアミンの炭素のスペクトルを示すグラフである。
【図２ｅ】
ＴＦＡでの脱保護化後のカルボニルピークを示すグラフである。
【図２ｆ】
ＮＨ４ＯＨでの脱保護化後のカルボニルピークを示すグラフである。
【図３ａ】
上スポットにおける蛍光性の相補鎖とのハイブリダイゼーションを示す画像である。
【図３ｂ】
下のスポットにおける変性とハイブリダイゼーションを示す画像である。
【図３ｃ】
両者の相補鎖との変性及びハイブリダイゼーションが、スポットの両方で視覚化できる画像を示す。
【図３ｄ】
ヨウ素で末端化されたシリコン基板にω−ウンデシレン酸メチル・エステルのグループを付加するフォトイニシエーション後における、実施例の基板の写真である。
【図４】
１０−アミノデカ−１−エンとドデセンの二成分混合物を使用してオリゴヌクレオチド密度の制御を示すグラフである。
【図５】
脱保護化条件に対して異なる処理時間で本発明により調製された表面を露出することによって実証されたオリゴヌクレオチド密度の制御を示すグラフである。
【図６】
蛍光的にタグ付けされたオリゴヌクレオチドで共有結合的に修飾されたシリコン表面の安定性を示すグラフである。
【図７】
１５回のハイブリダイゼーションと変性サイクルにおける、本発明により調製された表面の安定性を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２ａ】
2004508030.tif 000010
【図２ｂ】
2004508030.tif 000011
【図２ｃ】
2004508030.tif 000012
【図２ｄ】
2004508030.tif 000013
【図２ｅ】
2004508030.tif 000014
【図２ｆ】
2004508030.tif 000015
【図４】
2004508030.tif 000016
【図５】
2004508030.tif 000017
【図６】
2004508030.tif 000018
【図７】
2004508030.tif 000019
【国際公開パンフレット】
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2004508030.tif 000021
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508030.tif 000067
2004508030.tif 000068
【手続補正書】
【提出日】平成15年1月16日(2003.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面の生成方法であって、
（ａ）酸化されない、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を形成するために、酸化されない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を臭素、ヨウ素を含有する反応物質と接触する段階と、次いで
（ｂ）アルキル部分で置換された、介在する酸素原子の不在において、前記基板に対して直接結合された修飾された前記基板を生成するために、前記酸化されない、臭素若しくはヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板と置換体を有する直鎖、枝分かれ、又は環式アルケンの反応と、
によって特徴とされる、方法。
【請求項２】
前記段階（ｂ）において、前記反応はフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記段階（ｂ）において、前記反応は紫外線を使用してフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記段階（ｂ）において、前記反応は紫外線に対する前記基板の選択的な露出によってパターン化されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（ｂ）において、前記基板は、アミノアルケン、カルボキシアルケン、及びチオアルケンから構成されるグループから選択される置換されたアルケンと反応することを特徴とする、前述までの請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記段階（ｂ）において、前記アルケンの前記置換体は保護されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記段階（ｂ）において、前記基板は保護化されたアミノアルケンと反応することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記段階（ｂ）において、前記基板はｔ−ＢＯＣで保護化された１０−アミノデカ−１−エンと反応することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記段階（ｂ）において、前記アルケンはαオレフィンであり、前記置換体は前記アルケンのω炭素に位置することを特徴とする、請求項１乃至４までの何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｃ）前記基板に結合した前記置換したアルキル部分に対して分子を付加し、それによって前記基板に固定された前記分子を有する修飾された表面を生成する段階を前記段階（ｂ）の後にさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至４までの何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記段階（ｃ）において、ＤＮＡ及びＲＮＡから構成されるグループから選択される分子が、前記置換されたアルキル部分に付加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記段階（ｃ）において、前記分子は二官能性のクロスリンカーを使用して前記置換されたアルキル部分に付加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記段階（ｃ）において、ＳＳＭＣＣはクロスリンカーとして使用されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記段階（ｂ）の前に、前記基板は臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１乃至４までに記載の方法。
【請求項１５】
前記段階（ｂ）の前に、前記基板は、ベンゼンに溶解した臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１乃至４までに記載の方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）の前に、前記反応は、５１４ｎｍの波長を有する可視光線でフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１乃至４までに記載の方法。
【請求項１７】
前記段階（ｂ）において、前記基板を可視光線に対して選択的に当てることによって前記基板の所定位置で前記反応がフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
酸化されない炭素、シリコン、及びゲルマニウム表面上に修飾された表面を生成する方法であって、該方法は、
（ａ）酸化されない、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を形成するために、酸化されない炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板を臭素、ヨウ素を含有する反応物質と接触する段階と、次いで
（ｂ）介在する酸素原子の不在において、前記基板に共有的に結合した、保護化した、アミノ、カルボキシ、又はチオール修飾されたアルカン分子の表面を生成するために、前記段階（ａ）の前記酸化されない、臭素又はヨウ素で停止した炭素、シリコン、又はゲルマニウム基板とアミノ、カルボキシ、又はチオール修飾されて、さらに保護化されたアルケンとの反応段階と、次いで、
（ｃ）前記段階（ｂ）の前記修飾されたアルカン分子が脱保護化され、それによって前記基板に結合した未保護で修飾されたアルカン分子の表面を生成する段階と、次いで、
（ｄ）前記段階（ｃ）の前記脱保護化されて修飾されたアルカンは、クロスリンカーと反応して、それによって前記クロスリンカーは前記修飾されたアルカン分子に付加される段階と、及び
（ｅ）前記段階（ｄ）の前記クロスリンカーに分子を付加し、それによって前記基板に固定された分子表面を生成する段階と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記段階（ｂ）の前に、前記基板は臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記段階（ｂ）の前に、前記基板は、ベンゼンに溶解した臭素又はヨウ素溶液を含有する試薬と接触されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記段階（ｂ）において、前記反応は、５１４ｎｍの波長を有する可視光線でフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ｂ）において、前記基板を可視光線に対して選択的に当てることによって前記基板の所定位置で前記反応がフォトイニシエーションされることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ｂ）において、前記基板はωアミノ、ωカルボキシ、又はωチオールで修飾されて保護されたアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記段階（ｂ）において、前記基板はアミノ、カルボキシ、又はチオールで修飾されて保護されたαアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記段階（ｂ）において、前記基板はωアミノ、ωカルボキシ、又はωチオールで修飾されて保護されたαアルケンと反応されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記段階（ｄ）において、前記クロスリンカーはＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記段階（ｅ）において、核酸が付加されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、又は１８に記載の何れか一項により生成される修飾された炭素、シリコン、又はゲルマニウム表面。
【請求項２９】
酸化されておらず、水素で停止された炭素、シリコン、及びゲルマニウムから構成されるグループから選択される基板と、
介在する酸素分子の不在において、前記基板に直接的に結合されて、アミノを含む置換体、カルボキシルを含む置換体、及びチオールを含む置換体から構成されるグループから選択される置換体が前記基板に付加された、置換されたアルカン分子の層と、
前記置換されたアルカン分子の層に結合された架橋剤分子の層と、
を含むことを特徴とする、修飾された炭素、シリコン又はゲルマニウム基板。
【請求項３０】
前記架橋分子はＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項２９に記載の修飾された基板。
【請求項３１】
前記置換体は、前記アルカンのω炭素で前記置換されたアルカンに付加されることを特徴とする、請求項２９又は３０の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３２】
前記修飾されたアルカンの前記置換体に結合された分子の層をさらに含むことを特徴とする、請求項２９又は３０の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３３】
前記分子は核酸であることを特徴とする、請求項３２に記載の修飾された炭素基板。
【請求項３４】
前記置換されたアルカン分子の前記層に結合された架橋分子の層と、前記架橋分子に結合された分子の層をさらに含むことを特徴とする、請求項２９又は３０の何れか一項に記載の修飾された基板。
【請求項３５】
前記架橋分子に結合された前記分子の層は、核酸であることを特徴とする、請求項３４に記載の修飾された基板。
【請求項３６】
前記架橋分子はＳＳＭＣＣであることを特徴とする、請求項３４に記載の修飾された基板。
【国際調査報告】
2004508030.tif 000069
2004508030.tif 000070