(57)【要約】本発明は、細菌細胞内の細胞骨格の構造を抑制するためおよび抗菌剤を製造するための、細菌の翻訳ファクターＥＦ−Ｔｕに結合する物質の使用に関する。更に、本発明は、特に４〜２０個のアミノ酸の長さを有する、細菌のＥＦ−Ｔｕ蛋白質のドメイン２および／または３のアミノ酸配列の部分区間を含有する抗菌剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞内の細胞骨格の構成を抑制するための、ＥＦ−Ｔｕに結合する物質の使用。
【請求項２】
物質がドメイン２の範囲内（アミノ酸２０５〜２９８）および／またはドメイン３の範囲内（アミノ酸２９９〜３９４）でＥＦ−Ｔｕに結合する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
物質がドメイン２のアミノ酸２１８〜２２４の範囲内でＥＦ−Ｔｕに結合する、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
物質がドメイン３のアミノ酸３１７〜３２８の範囲内および／またはドメイン３のアミノ酸３４３〜３５４の範囲内でＥＦ−Ｔｕに結合する、請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
物質が４〜２０個のアミノ酸の長さを有するドメイン２および／またはドメイン３からなるアミノ酸配列の部分区間を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
部分区間が５〜１５個のアミノ酸、殊に６〜１２個のアミノ酸の長さを有する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
物質が線状または環状のペプチド化合物またはペプチド擬似薬から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ペプチド化合物またはペプチド擬似薬が結合された疎水性基、大きな空間充填部を有する基または分解に抗して保護機能を有する基を含む、請求項７記載の使用。
【請求項９】
抗菌剤を製造するための請求項１から８までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
抗菌剤を場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に製薬学的組成物として調製する、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
グラム陽性菌またはグラム陰性菌に抗する薬剤を製造するための請求項９または１０記載の使用。
【請求項１２】
マイコプラズマに抗する薬剤を製造するための請求項９または１０記載の使用。
【請求項１３】
４〜２０個のアミノ酸の長さを有する細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕのドメイン２および／または３のアミノ酸配列の部分区間を含有する抗菌剤。
【請求項１４】
５〜１５個のアミノ酸の長さを有する部分区間を含有する請求項１３記載の抗菌剤。
【請求項１５】
６〜１２個のアミノ酸の長さを有する部分区間を含有する、請求項１３または１４記載の抗菌剤。
【請求項１６】
部分区間に結合された疎水性基、大きな空間充填部を有する基および／または分解に抗して保護機能を有する基を含有する、請求項１３から１５までのいずれか１項に記載の抗菌剤。
【請求項１７】
製薬学組成物として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に調製された、請求項１３から１６までのいずれか１項に記載の抗菌剤。
【請求項１８】
新規の抗菌剤を同定する方法において、
（ａ）試験すべき物質と細菌のＥＦ−Ｔｕまたは重合する能力を有する、前記ＥＦ−Ｔｕの断片との接触、ならびに
（ｂ）物質がＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制することができるか否かの測定
を含むことを特徴とする、新規の抗菌剤を同定する方法。
【請求項１９】
インビトロボ試験として実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
インビボ試験として実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を測定するために標識化された抗体および／または標識化されたＥＦ−Ｔｕ蛋白質またはその重合可能な部分断片を使用する、請求項１８から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制する物質またはそれから誘導される物質を製薬学的組成物として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に調製する、請求項１８から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞内の細胞骨格の構造を抑制するためおよび抗生物質を製造するための、細菌の翻訳ファクターＥＦ−Ｔｕに結合する物質の使用に関する。更に、本発明は、特に４〜２０個のアミノ酸の長さを有する、細菌のＥＦ−Ｔｕ蛋白質のドメイン２および／または３のアミノ酸配列の部分区間を含有する抗菌剤に関する。
【０００２】
抗菌剤としては、これまでなかんずくペニシリンが使用されたかまたは成長する細菌細胞に対して特異的な抑制効果を発揮する別の抗生物質が使用された。この抑制効果は、前記抗生物質が細胞成長の際に必要とされる、ペプチドグリカン骨格の拡張を阻止することに基づく。成長する細胞は、ムレインの前記脱安定化によって決定的に弱化される。固定相中での細菌類は、抑制されない。それというのも、この相中でムレイン骨格の拡張は行なわれないからである。
【０００３】
細菌の蛋白質ＥＦ−Ｔｕは、ドメイン１、２および３を含有する（Song, H., Parsons, M.R., Rowell, S., Leonard, G., Phillips, E.V., J. Mol. Biol. 285, 1245-1256, 1999。蛋白質ＥＦ−Ｔｕおよびそれをコードする遺伝子の配列は、Escherichia coliおよび一連の別の真性細菌に関連して刊行物に記載されており、データバンクで入手可能である。また、この場合には、ＥＦ−Ｔｕのドメイン１が蛋白質合成の際に１つの役を演じることをも記載されている。
【０００４】
原核生物の持続的な細胞骨格の存在が予想されることは、Naturwissensch. 85,1998, 278-282 (Mayer et al.)中で論議された。しかし、このような細胞骨格の形成への細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕの関与は、公知ではなかった。
【０００５】
これまで、刊行物（例えば、Schilstra, M.J., Slot., J.W. van der Meide, P.H., Posthuma, G., Cremers, A.F., Bosch, L.: Immunocytochemical Iocalization of the elongation factor Tu in Escherichia coli cells., Biochem Biophys. Acta 1291, (1996), 122-130参照）において、細菌細胞内のＥＦ−Ｔｕの配置に関連して、ＥＦ−Ｔｕが、実際に均質に細胞原形質中に分布していることから出発していた。
【０００６】
意外なことに、原核生物の細胞内には、抗−ＥＦ−Ｔｕ抗体で着色されうる細胞骨格が存在することが見い出された。この細胞骨格は、細胞原形質の方向に向けられた、細胞原形質膜の表面に隣接して細胞原形質を通って延在する蛋白質原繊維の網状組織を含む。細胞原形質膜および前記網状組織の周辺部は、２本の同心の中空管と見なされることができ、この場合細胞原形質膜は、２本の管の中の外側管であり、網状組織（細胞骨格）の周辺部は、内側管である。延在する原繊維は、細胞原形質によって補充され、系を安定化し、リボソームのための堆積位置である。また、リボソームは、細胞原形質の方向に向けられた細胞骨格の周辺部で検出されてもよい。
【０００７】
従って、原核生物の細胞骨格は、次の多数の変種を有する：
−  より高級な細胞の作用に類似しかつ棒状細菌類の場合に細胞の長さおよび直径を定義する蛋白質からなる、特異的な機能を仲介する変種、
−  より高級な細胞のチュービュリンに類似しかつ制御された細胞分布の達成に努力する変種ならびに
−  形状安定性の構造要素として細胞に使用されかつリボソームおよび別の複合体の分子凝集体のための付着構造体として機能する、蛋白質ＥＦ−Ｔｕ（elongation factor Tu）のプロトフィラメントの網状組織からなる、全ての原核生物の場合に一般に存在する変種（”塩基性細胞骨格”）。この中で、最後の変種は、細胞骨格網状組織とも呼称される。
【０００８】
ＥＦ−Ｔｕは、３個のドメインを含む蛋白質であり、この場合ドメイン１は、翻訳の過程に関与している。これまでドメイン２および３については、特異的な機能は、記載されなかった。今や、ドメイン２および３の側方で露出されたエピトープは、１つの適合位置を形成し、この場合１つの表面は、凸面状であり、１つの表面は、凹面状である。この適合位置は、ＥＦ−Ｔｕポリマー、殊に線状で互いに接して並べられた原繊維の形成を、実際にインビトロならびにインビボで実現させうるものと仮定される。この原繊維は、細胞骨格として機能する網状組織の成分である。この事実から、ＥＦ−Ｔｕに結合する物質は、殊にドメイン２および／または３の範囲内で細菌細胞内での細胞骨格の形成の抑制、ひいては抗菌剤の製造に使用されうることが導き出されうる。
【０００９】
従って、細胞骨格の網状組織は、新しい種類の抗生物質のための攻撃点（ターゲット）として採用されうる。
【００１０】
殊に、ＥＦ−Ｔｕは、新規の抗菌剤のためのターゲット蛋白質として使用することができ、この場合この抗菌剤は、ドメイン２および／または３上に適合個所を有することができ、それによって細菌細胞の構造にとって本質的なことである、細胞内のＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を阻止する。
【００１１】
この機能形式は、原則的にＥＦ−Ｔｕに対して作用する別の抗生物質の機能形式とは区別される（例えば、Vogeley, L., Palm, G.J., Mesters, J.R., Hilgenfeld, R.: Conformational change of elongation factor Tu(EF-Tu) induced by antibiotic binding. J. Biol. Chem. 276 (2001), 17149-17155参照）。そこには、キロマイシン型のこれまでに公知の抗生物質は、ドメイン１に対して配座の変化の可逆性を阻止することによって作用することが示されており、その際、ＧＴＰが結合されている場合には、ドメイン１は、ドメイン２の方向に湾曲する。この機構は、原則的にドメイン２および３が含まれているような本明細書中に記載された、重合の抑制の作用機構とは異なる。
【００１２】
ＥＦ−Ｔｕは、３９４個のアミノ酸を含む。ドメイン１には、アミノ酸８〜２０４が属し、この場合アミノ酸１７２〜２０４は、ドメイン２に対して結合構造体を形成する。ドメイン２には、アミノ酸２０５〜２９８が属し、ドメイン３には、アミノ酸２９９〜３９４が属する。
【００１３】
ドメイン２および３内には、異なる二次構造体が発生する。この場合、３１７〜３２８および３４３〜３５４のアミノ酸配列が特に重要であり、これらのアミノ酸配列は、ドメイン３内に存在しかつループを形成し、このループは、空間内に自由に突入しかつアミノ酸配列との相互作用のための候補配列であり、この候補配列は、ドメイン２の抹消部で相応して位置した凹所内に存在し、この場合この配列は、アミノ酸２１８〜２２４で十分である。
【００１４】
本発明によれば、意外なことに、細菌の細胞骨格の場合には、一般にＥＦ−Ｔｕの重合を抑制することによって細胞の損傷を達成しうることが確認された。このような細胞の損傷は、殊に細胞壁を有する一般的な細菌細胞の場合にも達成される。本発明は、殊に真性細菌に対して使用可能である。
【００１５】
細胞骨格の構造の抑制に使用可能な物質は、この物質が２個の隣接したＥＦ−Ｔｕ分子のドメイン２とドメイン３との間の相互作用を抑制する状態にある限り、最も異なった性質であることができる。適当な物質は、例えば次の方法：
（ａ）試験すべき物質と細菌のＥＦ−Ｔｕまたは重合する能力を有する、前記ＥＦ−Ｔｕの断片、例えばドメイン２および３を含む断片との接触、ならびに
（ｂ）物質がＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制することができるか否かの測定
を含む方法によって同定されることができる。
【００１６】
この方法は、インビトロならびにインビボで実施されることができる。インビトロ方法の場合には、有利に精製されたＥＦ−Ｔｕ分子またはその適当な部分断片が原繊維の形成を生じうる条件下で恒温保持される。原繊維の形成に対する試験物質の作用は、簡単な方法で、例えば標識化された抗ＥＦ−Ｔｕ抗体による免疫学的着色によるかまたは標識化基、例えば蛍光標識化基を有するＥＦ−Ｔｕ分子の使用によって測定することができる。勿論、この方法は、インビボで実施されてもよく、この場合細胞内での原繊維の網状組織上への試験物質の添加の作用は、免疫学的方法、例えば免疫組織化学的に標識化された抗ＥＦ−Ｔｕ抗体および鏡検評価により測定されることができる。
【００１７】
ＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制しかつ上記方法により得ることができる物質ならび例えば経験に基づく誘導体化および／またはコンピューターモデリングによって前記物質から導かれる物質は、場合によっては製薬学的に常用されている担持剤、助剤および／または希釈剤と一緒の製薬学的組成物として配合されることができる。
【００１８】
製薬学的組成物は、例えば液体調製物、固体調製物、乳濁液または分散液として存在することができる。投与は、調製物に応じて注射、経口、直腸、経鼻、局所的等により行なうことができる。投与量は、作用物質、投与形ならびに疾病の種類および重さに依存して、細菌による感染の撲滅を可能にする程度に選択される。
【００１９】
抗菌剤の作用は、異なる性質を有することができる。一面で、直接にＥＦ−Ｔｕのドメインの２および／または３の適合位置に結合することができる物質が使用される。他面、ＥＦ−Ｔｕ分子の別の位置に結合するが、しかし、適合に対して抑制の影響を及ぼし、ひいては原繊維の形成を阻止する物質が使用されてもよい。
【００２０】
本発明の１つの好ましい実施態様において、ペプチド系抗菌剤が使用される。ペプチド系の薬剤は、特にドメイン２および／またはドメイン３の適合位置の範囲内でＥＦ−Ｔｕに結合しているオリゴペプチドに基づいている。オリゴペプチドは、有利に４〜２０個のアミノ酸、特に有利に５〜１５個のアミノ酸の長さ、殊に有利に６〜１２個のアミノ酸の長さを有するドメイン２および／またはドメイン３のアミノ酸配列の部分区間を含むことができる。この部分区間は、それぞれ別のドメインの相補的配列に結合する状態にあり、即ちドメイン２からの配列は、ドメイン３に結合する状態にあり、ドメイン３からの配列は、ドメイン２に結合する状態にある。
【００２１】
更に、好ましい実施態様において、ＥＦ−Ｔｕに結合する物質は、少なくとも４個、殊に少なくとも５個のアミノ酸の長さを有するドメイン２からのアミノ酸配列の部分区間、殊にアミノ酸２１８〜２２４のドメイン２の範囲内の部分区間を含み、同時にＥＦ−Ｔｕのドメイン３のアミノ酸３１７〜３２８の範囲および／またはアミノ酸３４３〜３５４の範囲に相当する区間を含まない。また、少なくとも４個のアミノ酸、殊に少なくとも５個のアミノ酸、特に有利に少なくとも６個のアミノ酸の長さを有するドメイン３からのアミノ酸配列の部分区間を含み、ドメイン２のアミノ酸２１８〜２２４に相当する部分区間を含まない物質は、好ましい。このような区間は、例えば”短縮された”ＥＦ−Ｔｕであることができ、このＥＦ−Ｔｕは、専らドメイン１および２なしにドメイン３からなるかまたは専らドメイン３なしにドメイン１および２からなる。このようなＥＦ−Ｔｕ破片は、細胞内で細胞から合成された固有の天然のＥＦ−Ｔｕ蛋白質分子と競争反応し、連鎖破断のために重合性プロトフィラメント中への導入の際に役立つ。それというのも、それぞれ連鎖延長に必要とされる第２のドメインが欠けているからである。それによって、無傷の網状組織は、もはや形成されない。これは、細菌細胞の生存能力の損失と同じことを意味する。細菌細胞内での網状組織の顕在化が損なわれることは、例えば試験によって確認することができたように細菌細胞の形および挙動に不利な影響を及ぼす。細胞の形および挙動に対する不利な影響には、本発明による抗生物質の使用の際に起こる予想すべき細胞死が指摘される。
【００２２】
また、記載された”切り捨てられた”ＥＦ−Ｔｕ断片の代わりに、ＥＦ−Ｔｕ蛋白質分子の重合の阻止、即ち別の薬剤による連鎖破断が、例えば他のＥＦ−Ｔｕ蛋白質分子の結合を阻止する区間の存在によって達成されるような抗生物質が使用されてもよい。
【００２３】
本発明による抗生物質の特別な利点は、前記の新しい種類の抗生物質に抗する細菌の耐性を生じさせるために、存在する危険が僅かであるにすぎないことである。１つの耐性とは、細菌が細胞内に潜り込んだペプチドを分解するであろうことを意味する。このことがもしも起きた場合には、細胞は、まさに細胞に固有のＥＦ−Ｔｕ蛋白質の成分でありかつ翻訳にとって最も重要である、構造的に等しい固有のペプチドを一緒に分解してしまうことを回避することができないであろう。
【００２４】
抗菌剤は、線状または環状のペプチド化合物またはペプチド擬似薬を含むことができる。ペプチド化合物は、天然のＬ−α−アミノ酸から形成されていてもよいが、しかし、他面、別のアミノ酸、例えばＤ−α−アミノ酸、アザアミニド酸、β−アミノ酸、遺伝学的にコードされていないＬ−α−アミノ酸および／またはＤ−α−アミノ酸等またはこれらの組合せ物から形成されていてもよい。ペプチド擬似薬の製造は、例えばRIPKA, A.S., RICH, D.H. (1998) Peptidomimetic design, Curr.Op. Chem. Biol. 2, 441-452 に記載されている。
【００２５】
更に、ペプチド化合物またはペプチド擬似薬は、細胞質膜を通しての移行を簡易化する結合された疎水性基を含有するかまたは他のＥＦ−Ｔｕ分子の貯蔵ならびに重合産生物形成を阻止する大きな空間充填部を有する基を含有する。更に、抗菌剤は、分解に抗する保護機能を有する基を有することができる。
【００２６】
抗菌剤は、任意の原核有機体および始原細菌、殊に病原有機体に抗して使用されることができる。グラム陽性菌、グラム陰性菌ならびにマイコプラズマは、ＥＦ−Ｔｕをベースとする細胞骨格を有し、したがって本発明による薬剤によって抑制させることができる。例えば、抗菌剤は、バンコマイシン耐性病原菌、例えばスタフィロコッカスに抗して使用されることができる。
【００２７】
従って、新しい種類の抗生物質については、幅広の使用スペクトルがもたらされる。プロトフィラメントの形成のためにモノマーの結合に当てはまるような範囲は、試験された全ての細菌類の場合にアミノ酸配列に関連して極めて類似していることが確認された。ＥＦ−Ｔｕは、この範囲内で高度に貯蔵されている。また、所定のＥＦ−Ｔｕ分子内のこの範囲の互いの距離、即ちアミノ酸の数で表わされる、ドメイン２と３の強調された範囲の距離は、同一であり、この場合には、常に１２６個のアミノ酸が貯蔵された範囲の間に存在する。
【００２８】
本発明による抗生物質は、高度な特異性および殊に極めて僅かな副作用を示す。大きなＥＦ−Ｔｕ配列は、マイトコンドリアル（Mytochondrien）以外にヒトの細胞内では発生しない。マイトコンドリアルのＥＦ−Ｔｕ類似の配列は、抗生物質に抗するマイトコンドリアルの二重膜によって十分に保護されている。
【００２９】
更に、本発明は、次の図および実施例によって詳説される。
【００３０】
図１は、細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕの巨大分子のアーキテクチャーを示す略図であり、この場合には、ドメイン１、２および３が詳細に示されている。この細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕは、周期的に形成される原繊維への重合の際に一緒に貯蔵される。
【００３１】
図２は、図１と同様に、細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕの巨大分子のアーキテクチャーを示す略図であり、この場合には、ドメイン１、２および３が詳細に示されている。この細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕは、周期的に形成される原繊維への重合の際に一緒に貯蔵される。
【００３２】
図３は、＋または−で示される、ドメイン２および３の反応性の結合範囲での重合を示す略図である。
【００３３】
図４は、インビボで重合され単離された、ＥＦ−Ｔｕ蛋白質分子の原繊維の電子顕微鏡撮影による拡大された図である（倍率：約１．５百万倍）。この場合、点線の上には、ドメイン１が存在し、点線の下には、互いに接して堆積されたドメイン２および３が存在する。ＥＦ−Ｔｕ蛋白質の重合が図３において＋および−で示された結合範囲でドメイン２または３のアミノ酸配列の部分区間を含有する過剰量の粒子の添加によって抑制される場合には、当該細菌細胞の生存は、不可能になる。それというのも、細胞の構造は、共に破壊されるからである。
【００３４】
実施例：
グラム陽性菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum EM1（以下、ＥＭ１と省略した）および無壁の細菌Mycoplasma pneumoniae（以下、Ｍｐと省略した）を用いて、前記細菌がＥＦ−Ｔｕをベースとする永続的な細胞骨格を有することを証明する試験を実施した。
【００３５】
この試験は、細菌蛋白質との多少とも強い交叉反応に基づく抗アクチン抗体（高級細胞のアクチンに抗して製造された）の使用によって、細菌の場合に周知のように高級細胞のアクチンとの目立つ配列同族性を有するアクチン超ファミリーに属する蛋白質が存在するような細菌の細胞骨格に対して候補の蛋白質の同定および細胞局在化を含む。原核生物は、前記されたアクチン遺伝子を有していない。
【００３６】
また、細菌による超薄手の切片での上記抗体を用いての免疫電子顕微鏡と共に、”全載電子顕微鏡観察”技術も使用された。前記技術の組合せによって、細胞原形質に向けられた、細胞原形質膜の表面に隣接して細胞原形質を通って延在する蛋白質原繊維の網状組織が存在し、この場合網状組織の成分は、抗アクチン抗体と交叉反応する。細胞原形質膜および前記網状組織の周辺部は、２本の同心の中空管を形式的に形成し、この場合細胞原形質膜は、２本の管の中の外側管であり、網状組織（細胞骨格）の周辺部は、内側管である。延在する原繊維は、細胞原形質によって補充され、系を安定化し、リボソームのための堆積位置である。また、リボソームは、細胞原形質の方向に向けられた細胞骨格の周辺部で検出されてもよい。
【００３７】
ＥＭ１の細胞を、フレンチ圧縮機（French-Presse）を用いて溶解し、取得された物質（可溶性画分、粒子状画分）を用いてＳＤＳゲル電気泳動法およびウェスタンブロッティングを実施した。ＳＤＳ−ゲル法において、多数の定義されたバンドを得ることができ、その中の１つのバンド（約４３ｋＤａ）は、抗アクチン抗体ならびにＭｐのＥＦ−Ｔｕに抗して取得された抗ＥＦ−Ｔｕ抗体で着色可能であった。このバンドは、ＳＤＳゲル電気泳動法のための物質として低速回転の遠心分離によって取得される細胞分解された粒子状画分が使用されたような場所で色濃く発生した。４３ｋＤａの場合には、通常、ＥＦ−Ｔｕを見出すことができ（細菌の蛋白質物質の９％までで十分である）、ＥＦ−Ｔｕがアクチン超ファミリーに属し、かつＥＦ−Ｔｕが大量に原核生物の細胞内に現れるので、抗ＥＦ−Ｔｕ抗体が使用された。
【００３８】
細菌の細胞骨格の構成成分としてのＥＦ−Ｔｕの役割は、新規である。細胞骨格として表わされるような複雑な網状組織のための構成成分としてのＥＦ−Ｔｕの前記性質から、このための細菌細胞が大きな蛋白質量を使用しなければならないことを導き出すことができる。前記の細菌の細胞骨格の構造と高級細胞の構造との比較により、細菌の細胞骨格が多数の蛋白質タイプから形成されていてよいことが明らかになる。ＥＦ−Ｔｕは、主成分である。高級細胞の場合、実際にＥＦ−Ｔｕは、細胞骨格の形成に関与しない（高級細胞は、ＥＦ−Ｔｕを有しない）が、しかし、その際、多数の異なる蛋白質が細胞骨格に貢献することは、公知である。
【００３９】
切片および全体で取り付けられて抗アクチン抗体と反応する、細胞骨格の上記に示された網状組織の成分は、抗ＥＦ−Ｔｕ抗体とも強力に反応することを示すことに成功した。
【００４０】
この反応は、Ｍｐの場合にトリトン処理（細胞原形質膜の除去）によって露出された、今や外界の方向に晒された、元来被覆されている全表面上で行なわれた。トリトンで処理されたのではなく、その代わりに同様に処理され、ひいては細胞原形質膜を失っていない細胞を使用しながら得られた対照は、標識化を全く示さなかった。即ち、前記の対照試験において、細胞原形質膜は、ＥＦ−Ｔｕのための潜在的な結合位置を隠蔽する。
【００４１】
細胞原形質膜の除去によって露出された表面は、細胞の細胞骨格の周辺部分である。この位置で内側の細胞成分、例えばリボソームは、露出されておらず、この場合この細胞成分は、翻訳の経過中に補助機能を実施するＥＦ−Ｔｕのための付着位置であることが示されている（この場合、ＥＦ−Ｔｕは、ドメイン１と一緒に行動する）。これから、翻訳の経過中にＥＦ−Ｔｕがリボソームに移行するのではなく、リボソームがＥＦ−Ｔｕに移行し、このＥＦ−Ｔｕは、まさに性質の点で細胞骨格の成分として細胞周辺部上および横方向に細胞原形質を通って延在する原繊維上に空間的に固定されるものと推論された。
【００４２】
更に、永続的な細菌の細胞骨格の存在は、真性細菌Escherichia coli, Bacillus sp., Ralstonia eutrophaおよびThemoanaerobacterium thermosulfurigenesならびに始原細菌Methanococcus jannaschiiおよびMethanococcus voltaeにおいて検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕの巨大分子のアーキテクチャーを示す略図。
【００４４】
【図２】図１と同様に、細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕの巨大分子のアーキテクチャーを示す略図。
【００４５】
【図３】＋または−で示される、ドメイン２および３の反応性の結合範囲での重合を示す略図。
【００４６】
【図４】インビボで重合され単離された、ＥＦ−Ｔｕ蛋白質分子の原繊維の電子顕微鏡撮影による拡大された図（倍率：約１．５百万倍）。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月4日(2003.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌細胞内の細胞骨格の構成を抑制する薬剤を製造するための、ＥＦ−Ｔｕに結合する物質の使用、この場合この物質は、ドメイン２の範囲内（アミノ酸２０５〜２９８）および／またはドメイン３の範囲内（アミノ酸２９９〜３９４）でＥＦ−Ｔｕに結合する。
【請求項２】
物質がドメイン２のアミノ酸２１８〜２２４の範囲内でＥＦ−Ｔｕに結合する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
物質がドメイン３のアミノ酸３１７〜３２８の範囲内および／またはドメイン３のアミノ酸３４３〜３５４の範囲内でＥＦ−Ｔｕに結合する、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
物質が４〜２０個のアミノ酸の長さを有するドメイン２および／またはドメイン３からなるアミノ酸配列の部分区間を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
部分区間が５〜１５個のアミノ酸、殊に６〜１２個のアミノ酸の長さを有する、請求項４記載の使用。
【請求項６】
物質が線状または環状のペプチド化合物またはペプチド擬似薬から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ペプチド化合物またはペプチド擬似薬が結合された疎水性基、大きな空間充填部を有する基または分解に抗して保護機能を有する基を含む、請求項６記載の使用。
【請求項８】
抗菌剤を製造するための請求項１から７までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
抗菌剤を場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に製薬学的組成物として調製する、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
グラム陽性菌またはグラム陰性菌に抗する薬剤を製造するための請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
マイコプラズマに抗する薬剤を製造するための請求項８または９記載の使用。
【請求項１２】
４〜２０個のアミノ酸の長さを有する細菌蛋白質ＥＦ−Ｔｕのドメイン２および／またはドメイン３のアミノ酸配列の部分区間を含有する抗菌剤。
【請求項１３】
５〜１５個のアミノ酸の長さを有する部分区間を含有する請求項１２記載の抗菌剤。
【請求項１４】
６〜１２個のアミノ酸の長さを有する部分区間を含有する、請求項１２または１３記載の抗菌剤。
【請求項１５】
部分区間に結合された疎水性基、大きな空間充填部を有する基および／または分解に抗して保護機能を有する基を含有する、請求項１２から１４までのいずれか１項に記載の抗菌剤。
【請求項１６】
製薬学組成物として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に調製された、請求項１２から１５までのいずれか１項に記載の抗菌剤。
【請求項１７】
新規の抗菌剤の作用物質を同定する方法において、
（ａ）試験すべき物質と細菌のＥＦ−Ｔｕまたは重合する能力を有する、前記ＥＦ−Ｔｕの断片との接触、ならびに
（ｂ）物質がＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制することができるか否かの測定
を含むことを特徴とする、新規の抗菌剤を同定する方法。
【請求項１８】
インビトロボ試験として実施する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
インビボ試験として実施する、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を測定するために標識化された抗体および／または標識化されたＥＦ−Ｔｕ蛋白質またはその重合可能な部分断片を使用する、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＥＦ−Ｔｕポリマーの形成を抑制する物質またはそれから誘導される物質を製薬学的組成物として、場合によっては製薬学的に常用の担持剤、希釈剤および／または助剤と一緒に調製する、請求項１７から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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