(57)【要約】Ｔｈ１誘導性アジュバントとヒトマラリア原虫の防御肝ステージ抗原又はその免疫学的フラグメントとを組み合わせて含むワクチン組成物であって、該免疫学的フラグメントがＬＳＡ−３の免疫学的フラグメントである場合には、Ｔｈ１誘導性アジュバントがモンタニドではない、ワクチン組成物。１つの好ましい態様において、Ｔｈ１誘導性アジュバントは、ＱＳ２１、デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及び水中油型エマルジョン（水中油型エマルジョンは、代謝可能な油（例えばスクアレン）、αトコフェロール及びＴｗｅｅｎ８０の組成を有する）を含む。さらに好ましい態様において、防御肝ステージ抗原は肝ステージ抗原３（ＬＳＡ−３）又はその免疫学的フラグメントである。本発明の組成物と、さらにマラリア原虫の少なくとも１つの他の防御抗原又はその免疫学的フラグメントを含む多価ワクチン組成物もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１誘導性アジュバントとヒトマラリア原虫の防御肝ステージ抗原又はその免疫学的フラグメントとを組み合わせて含むワクチン組成物であって、該免疫学的フラグメントがＬＳＡ−３の免疫学的フラグメントである場合には、Ｔｈ１誘導性アジュバントがモンタニドではない、ワクチン組成物。
【請求項２】
ヒトマラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
Ｔｈ１誘導性アジュバントが以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）ＱＳ２１、デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及び水中油型エマルジョンであって、水中油型エマルジョンが、代謝可能な油（例えばスクアレン）、αトコフェロール及びＴｗｅｅｎ８０の組成を有する；又は
（ｂ）コレステロール、サポニン及び任意によりＬＰＳ誘導体を含む小胞アジュバント製剤、
を含む、請求項１又は２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
防御肝ステージ抗原が肝ステージ抗原３（ＬＳＡ−３）又はその免疫学的フラグメントである、請求項１、２又は３記載のワクチン組成物。
【請求項５】
さらに、マラリア原虫の少なくとも１つの他の防御抗原又はその免疫学的フラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
他のマラリア抗原が、以下の群：
ａ）ＣＳタンパク質の実質的に全てのＣ末端部分、免疫優性領域の４以上のタンデムリピート、及びＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（特にＲＴＳ，Ｓ）又はそのフラグメントを含む免疫原性誘導体、を含むハイブリッドタンパク質；
ｂ）熱帯熱マラリア原虫のＴ９／９６単離体のＴＲＡＰタンパク質、及びこれに対し少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質、並びにそのフラグメントを含む免疫原性誘導体；
ｃ）熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−１、及びこれに対し少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質、並びにそのフラグメントを含む免疫原性誘導体；及び
ｄ）熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−３、及びそのＣ末端領域に対し少なくとも７０％の相同性を有するタンパク質、並びにそのフラグメントを含む免疫原性誘導体、
より選択される、請求項４記載のワクチン組成物。
【請求項７】
哺乳動物において抗原又は抗原性組成物に対するＴ細胞応答に関与しうる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
インターフェロンγの産生を刺激しうる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬとの比が１：１０〜１０：１である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬとの比が１：１〜１：２．５である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項２に規定されるＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及び水中油型エマルジョンと、ヒトマラリア原虫の防御肝ステージ抗原とを混合するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン組成物の製造方法。
【請求項１２】
肝ステージ抗原が熱帯熱マラリア原虫のＬＳＡ−３又はその免疫学的フラグメントである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
マラリア感染症の予防又は治療のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規なワクチン製剤（ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）、その製造方法及びそれらの医学における用途に関する。より詳細には、本発明は、水中油型エマルジョンなどのＴｈ１誘導型アジュバント、又はコレステロール、サポニン及び任意にリポ多糖類誘導体を含む小胞アジュバント製剤（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と合わせた、肝ステージ抗原３（Ｌｉｖｅｒ Ｓｔａｇｅ Ａｎｔｉｇｅｎ ３）として知られるマラリア抗原、又はその免疫学的フラグメントに関する。これら及び他の本発明の態様を下記に説明する。
【０００２】
腸内細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）のアジュバントとしての使用は、その毒性作用のために縮小されてきているが、腸内細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）が免疫系の強力な刺激因子であることは古くから知られている。コアの炭化水素基及びリン酸を、還元末端のグルコサミンから除去することによって製造される、毒性のないＬＰＳの誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が、Ｒｉｂｉｔら（１９８６， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ（細菌内毒素の免疫学及び免疫薬理学）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ． Ｃｏｒｐ．， ＮＹ， ｐ４０７−４１９）によって報告されている。
【０００３】
二糖類骨格の３位からアシル鎖を除去することによって、ＭＰＬがさらに解毒されたものが得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれている。３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡは、ＧＢ ２ ２２０ ２１１（Ｒｉｂｉ）から公知である。化学的には、上記のものは、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５又は６のアシル化鎖との混合物であり、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｍｏｎｔａｎａによって製造されている。ＧＢ ２ １２２ ２０４Ｂにはまた、ジホスホリルリピドＡの製造、及びその３−Ｏ−脱アシル化修飾体（ｖａｒｉａｎｔｓ）が開示されている。他の精製された合成リポ多糖類が報告されている（米国特許第６，００５，０９９号及びＥＰ ０ ７２９ ４７３ Ｂ１；Ｈｉｌｇｅｒｓら， １９８６， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７９（４）：３９２−６；Ｈｉｌｇｅｒｓら， １９８７， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６０（１）：１４１−６；及びＥＰ ０ ５４９ ０７４ Ｂ１）。
【０００４】
３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の好ましい形態は、国際特許出願ＷＯ９２／１１６５５６号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｓ．ａ．）に開示されている、直径０．２μｍ未満の小さな粒径を有するエマルジョンであることが好ましい。ＷＯ９４／２１２９２号も参照されたい。
【０００５】
モノホスホリルリピドＡ及び界面活性剤を含む水性製剤は、国際特許公開ＷＯ９８／４３６７０Ａ２号に記載されている。
【０００６】
サポニン類は、Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ， Ｍ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ Ｈ．（１９９６， Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ（サポニン類の生物学的及び薬理学的活性についての総説）， Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ ２ ｐｐ ３６３−３８６）に教示されている。サポニン類は、植物及び海洋生物界に広く分布しているステロイド又はトリテルペングリコシド類である。サポニン類は、振とうすると泡立つコロイド水溶液を形成すること、及びコレステロールを沈殿させることで有名である。サポニン類が細胞膜に接近すると、細胞膜に孔状の構造を形成して膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の１つの例であり、これはサポニン全部ではないが、ある種のサポニンの特性である。
【０００７】
サポニン類は、全身投与用ワクチンのアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバント及び溶血活性は、当業界で広く研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ及びＷａｇｎｅｒ、前掲）。例えば、ＱｕｉｌＡ（南アメリカの木、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来する）、及びその画分は、米国特許第５，０５７，５４０号及び”Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ（ワクチンアジュバントとしてのサポニン類）”， Ｋｅｎｓｉｌ， Ｃ． Ｒ．， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ， １９９６， １２（１−２）：１−５５；及びＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１号に記載されている。ＱｕｉｌＡの画分を含む、免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ；ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる、粒状構造体は、溶血性があり、ワクチン製造に用いられている（Ｍｏｒｅｉｎ， Ｂ．， ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１号；ＷＯ９６／１１７１１号；ＷＯ９６／３３７３９号）。溶血性サポニン類ＱＳ２１及びＱＳ１７（ＱｕｉｌＡのＨＰＬＣ精製画分）は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１号に開示されている。全身性ワクチン接種の研究に用いられている他のサポニン類としては、カスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）及びサポナリア（Ｓａｐｏｎａｒｉａ）などの他の植物種に由来するものが挙げられる（Ｂｏｍｆｏｒｄら， Ｖａｃｃｉｎｅ， １０（９）：５７２−５７７， １９９２）。
【０００８】
ＱＳ２１は、南アメリカの木キラハ・サポナリア・モリナ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮由来のサポニンのＨＰＬＣ精製された毒性の無い画分であり、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に（ＱＡ２１として）開示されている。
【０００９】
フロイント完全及び不完全鉱油エマルジョンアジュバント類を含む油エマルジョンアジュバントは古くから知られている。それ以来、これらの効力が高いが反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）のアジュバント製剤に対して、安定で十分に許容性のある代替品を設計するための多くの研究が行われている。
【００１０】
多くの単一又は多層エマルジョン系が報告されている。水中油型エマルジョンアジュバントそれ自身は、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰ ０ ３９９ ８４３ Ｂ号）、また、水中油型エマルジョンと他の活性試薬との組み合わせも、ワクチン用アジュバントとして報告されている（ＷＯ９５／１７２１０）。油中水型エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ ０ ４８０ ９８２ Ｂ２号）及び水中油中水型エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ ０ ４８０ ９８１ Ｂ号）などの、他の油エマルジョンアジュバントも報告されている。
【００１１】
任意の水中油型組成物をヒトへの投与に好適なものとするためには、エマルジョン系の油相は、代謝可能な（ｍｅｔａｂｏｌｉｓａｂｌｅ）油を含むことが好ましい。代謝可能な油という用語の意味は当業界で周知である。代謝可能とは、「代謝によって変換されうること」と定義することができる（Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ， Ｗ． Ｂ． Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， 第２５版 （１９７４））。この油は、受容者に対して毒性が無く、代謝によって変換されうる任意の植物油、魚油、動物油又は合成油でありうる。木の実（落花生油など）、種、及び穀物は、一般的な植物油源である。合成油もまた、本発明の一部であり、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）その他の市販の油を挙げることができる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメ肝油中に多量に見出され、オリーブ油、小麦胚芽油、米糠油、及び酵母中に少量見出される不飽和油であり、本発明において用いるのに特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成中間体であるという事実から代謝可能な油である（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， 第１０版、出典番号８６１９）。
【００１２】
本発明の一部を構成する水中油型エマルジョンは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１と共に処方した場合に、ＩｇＧ２ａ産生及びＴＨ１細胞応答の選択的刺激因子となる。細胞仲介応答にはＴＨ１応答が関係していることが知られているので、これは利点である。確かにマウスにおいては、ＩｇＧ２ａの誘導が、そのような免疫応答と相互に関係している。
【００１３】
強い細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導できるという観察結果は、疾病に対する防御の誘導が示されているある種の動物モデルにおいて、これらの応答として重要である。
【００１４】
本発明者らは、アジュバントＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬと抗原を有する水中油型エマルジョンとの組み合わせが、脾臓中で強力なＣＴＬ特異的ＣＳタンパク質の誘導をもたらすことを示した。ＱＳ２１はまた、３Ｄ−ＭＰＬの誘導は促進しないが、それ自身についてＣＴＬの誘導を促進する。
【００１５】
ＣＴＬの誘導は、抗原のタンパク質分解作用による分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）によって産生されるペプチドが適切なプロセシング経路に入り、細胞膜上のクラスＩ分子と共同した提示に導くことができるので、標的抗原が細胞内で合成されるとき（例えば、ウイルスによる感染、細胞内細菌による感染、又は腫瘍において）に容易に観察される。しかしながら、一般に、形成前の溶解性抗原は、このプロセシング及び提示経路に到達せず、クラスＩ制限ＣＴＬを顕在化させない。従って、従来の非生ワクチンは、抗体及びＴヘルパー応答を呈示するが、通常ＣＴＬ仲介免疫は誘導しない。２種のアジュバントＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬと水中油型エマルジョンとの組み合わせは、ワクチン系又は組換えタンパク質のこの厳しい制限を解消でき、より広いスペクトルの免疫応答を誘導することができる。
【００１６】
ＣＳタンパク質に特異的なＣＴＬが、マウスモデル系でマラリアから防御することが示されている（Ｒｏｍｅｒｏら， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：３２３ （１９８９））。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の照射を受けたスポロゾイト（分裂体）を用いてボランティアを免疫し、続いてマラリアによるチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対し防御されていることが示されたヒトでの試験では、ＣＳエピトープに特異的なＣＴＬの誘導が証明された（Ｍａｌｉｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３３００ （１９９１））。
【００１７】
照射されたスポロゾイトの使用は、製造及び免疫応答の性質の理由から現実的ではないので、組換え分子として投与された抗原に対して特異的なＣＴＬを誘導する能力は、マラリアワクチン開発に適切である。
【００１８】
ある系では、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１と水中油型エマルジョンとの組み合わせは、インターフェロンγ産生を相乗的に促進することができた。
【００１９】
ＩＦＮ−γ分泌は、寄生虫、細菌及びウイルスを含む、細胞内病原菌に対する防御応答と関連している。ＩＦＮ−γによるマクロファージの活性化は、細菌の細胞内殺傷を促進し、Ｆｃレセプターの発現を増加させる。特にリンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）との相乗効果で、直接の細胞傷害性も生じることがある（ＴＨ１細胞の別の生成物）。ＩＦＮ−γはまた、ＮＫ細胞の誘導因子及び生成物の両者でもあり、そしてそれらは防御の主な自然免疫の作用因子である。ＩＦＮ−γを介するか又は他の機構を介するＴＨ１型応答は、ＩｇＧ２ａ免疫グロブリンアイソタイプを優先的に補助する。
【００２０】
本明細書中に記載され、本発明で用いることができる特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１（ＥＰ ０ ６７１ ９４８ Ｂ１号）、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含む水中油型エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０号、ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５７１４号）、他の賦形剤と共に製剤化された３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ ０６８９ ４５４ Ｂ１号）又は免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５号）の組み合わせである。
【００２１】
ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２タンパク質の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面（Ｓ）抗原に結合された熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全てのＣ末端タンパク質を含むハイブリッドタンパク質である。ＲＴＳ及びそれから誘導された分子の構造は、国際特許出願公開第ＷＯ９３／１０１５２号に開示されている。
【００２２】
酵母中で発現された場合、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と共に発現された場合は、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。
【００２３】
肝ステージ抗原は、Ｍａｌａｒｉａ， Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（マラリア、寄生虫微生物学、病原論及び防御）（Ｉｒｗｉｎ Ｗ． Ｓｈｅｒｍａｎ編集， １９９８ ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）、特に第３４節（Ｐ． Ｄｒｕｉｌｈｅら）に記載されている。
【００２４】
熱帯熱マラリア原虫の肝ステージ抗原３（ＬＳＡ−３）に基づく２６アミノ酸合成ペプチドは、Ｅｕｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， ２７， １２４２−１２５３（Ｌ． ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら）に記載されている。
【００２５】
ヒトマラリア原虫（ｈｕｍａｎ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ）の前赤血球ステージで発現される４種の新規なマラリア原虫分子に由来する１２種の合成ペプチドの免疫原性は、Ｖａｃｃｉｎｅ １８ （２０００）， ２８４３−２８５５頁（Ｌ ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら）に報告された。これらの研究では、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ−５１アジュバント（ＳＥＰＰＩＣ， Ｑｕａｉ Ｄ’Ｏｒｓａｙ， Ｆｒａｎｃｅ）が用いられた。しかしながら、他のアジュバントと組み合わされたそれらのペプチドについての報告はない。本発明は、アジュバント、特に、好ましくはトコフェロールそのものとして又はＱＳ２１及び／若しくは３Ｄ−ＭＰＬ（又は関連分子）との組み合わせでトコフェロールを含む水中油型エマルジョンを誘導するＴｈ１が、明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ）マラリア抗原に対する免疫応答を増強させるという驚くべき発見に基づいている。利用可能なそのような増強は、従来よりも良好な免疫学的応答を生じる。
【００２６】
本発明によれば、ヒトマラリア原虫の防御肝ステージ抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｌｉｖｅｒ Ｓｔａｇｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）又はその免疫学的フラグメントとの組み合わせでＴｈ１誘導性アジュバントを含むワクチン組成物であって、但し免疫学的フラグメントがＬＳＡ−３の免疫学的フラグメントである場合には、Ｔｈ１誘導性アジュバントがモンタニドではない、ワクチン組成物が提供される。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、Ｔｈ１誘導性アジュバントは、ＱＳ２１、デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）及び水中油型エマルジョンを含み、水中油型エマルジョンは、以下の組成を有する：すなわち、スクアレンなどの代謝可能な油、α−トコフェロール及びＴｗｅｅｎ８０。
【００２８】
通常は、本発明のいずれかの態様によるワクチン組成物は、哺乳動物における抗原又は抗原性組成物に対するＴ細胞応答を引き起こし、インターフェロンγ産生を刺激できることが好ましい。本発明で用いる水中油型エマルジョンは、それ自体で又は他のアジュバント若しくは免疫刺激因子と共に利用してもよく、従って、本発明の重要な実施態様は、スクアレン又は他の代謝可能な油、α−トコフェロール、及びＴｗｅｅｎ８０を含む水中油型製剤である。水中油型エマルジョンはまた、スパン８５（ｓｐａｎ ８５）及び／又はレシチン（Ｌｅｃｉｔｈｉｎ）を含有していてもよい。
【００２９】
２種のアジュバントＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬと水中油型エマルジョンとの組み合わせが特に好ましい。これは公知であり、本明細書中でＳＢＡＳ２、又はその代わりに単にＡＳ２若しくはＡＳ０２と呼ぶ。
【００３０】
ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの割合は、一般には、１：１０〜１０：１のオーダーであり、好ましくは１：５〜５：１そして実質的には１：１であることが多い。最適な相乗効果のための好ましい範囲は、３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１が２．５：１〜１：１である。ヒトへの投与については、通常、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬは、１回用量当たり１μｇ〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲でワクチン中に配合する。通常は、水中油型エマルジョンは２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のα−トコフェロール及び０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を含むものとしうる。スクアレン：α−トコフェロールの割合は、より安定なエマルジョンを提供することから、同量又は１未満であることが好ましい。スパン８５はまた、１％の濃度で存在させることができる。場合によっては、本発明のワクチンはさらに安定化剤を含有することが有利である。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、本発明のワクチンは、コレステロール、サポニン、及び任意にＬＰＳ誘導体を含む小胞のアジュバント製剤を含むことが有利である。この点について、好ましいアジュバント製剤は、コレステロールを含み、好ましくはジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有する単層状（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）小胞を含み、サポニン及び任意にＬＰＳ誘導体が、脂質二重層と結合されて又はその中に埋め込まれている。小胞アジュバントは、サポニン及びＬＰＳ誘導体の両方を含んでいることが好ましい。より好ましくは、これらのアジュバント製剤は、サポニンとしてＱＳ２１、及びＬＰＳ誘導体として３Ｄ−ＭＰＬを含み、ＱＳ２１：コレステロールの割合が１：１〜１：１００質量／質量、最も好ましくは１：５質量／質量である。そのようなアジュバント製剤は、ＷＯ９６／３３７３９号及びＥＰ ０ ８２２ ８３１ Ｂ号に記載されており、それらの開示は参照によって本明細書中に組み入れられる。例えば、好適な製剤は０．２５ｍｇのコレステロール、１ｍｇのジオレオイルホスファチジルコリン、５μｇの３Ｄ−ＭＰＬ、及び５０μｇのＱＳ２１を含むことができ、サポニン（ＱＳ２１）及びＬＰＳ誘導体（３Ｄ−ＭＰＬ）が小胞の構成要素である、小さな層状の小胞からなることができる。
【００３２】
上記のように、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの修飾体（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び誘導体もまた、本発明の精神から逸脱することなく用いることができることは理解できるであろう。
【００３３】
本発明のアジュバント組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）で製剤される細菌性リポ多糖誘導アジュバントは、細菌源から精製及び処理されてもよく、あるいは、合成されてもよい。従って、本発明で用いることができるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳ誘導体又はＭＰＬ若しくは３Ｄ−ＭＰＬと構造が類似している免疫刺激因子である。本発明の別の態様では、ＬＰＳ誘導体は、アシル化単糖であってもよく、そしてそれはＭＰＬの副部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）である。好ましい態様では、３Ｄ−ＭＰＬはＷＯ９２／１１６５５６号に記載されているような小粒子３Ｄ−ＭＰＬである。
【００３４】
本発明で用いる油エマルジョンアジュバントは、天然のもの又は合成のものであってよく、鉱物性又は有機性であってよい。鉱油及び有機油の具体例については、当業者であれば本明細書中の記載から、容易に理解できるであろう。
【００３５】
特に好ましい油エマルジョンは、水中油型エマルジョンであり、より詳細には、水中スクアレン型エマルジョンである。
【００３６】
さらに、最も好ましい本発明の油エマルジョンアジュバントは、抗酸化剤を含み、そしてそれは油であるα−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ ０ ３８２ ２７１ Ｂ１号）であることが好ましい。
【００３７】
ＷＯ９５／１７２１０号は、免疫刺激因子ＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＰＬと任意に製剤化される、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴｗｅｅｎ８０に基づくエマルジョンアジュバントを開示している。
【００３８】
安定な水中油型エマルジョン内に見出される油滴（ｏｉｌ ｄｒｏｐｌｅｔｓ）のサイズは１ミクロン未満であることが好ましく、光子相関分光学によって測定した直径が実質的に３０〜６００ｎｍの範囲でり、好ましくは実質的に直径およそ３０〜５００ｎｍであり、最も好ましくは実質的に直径１５０〜５００ｎｍであり、特に直径約１５０ｎｍでありうる。これに関して、油滴数の８０％は、好ましい範囲内に入るべきであり、より好ましくは９０％超、最も好ましくは油滴数の９５％超が規定サイズ範囲内になっている。本発明の油エマルジョン中に存在する構成成分の量は、慣例的にはスクアレンなどの油２〜１０％の範囲であり、存在する場合には、α−トコフェロール２〜１０％、及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤０．３〜３％である。油：α−トコフェロールの割合は、より安定なエマルジョンを提供するために、同量又は１未満であることが好ましい。また、スパン８５は、約１％の濃度で存在させることができる。場合によっては、本発明のワクチンはさらに安定化剤を含むことが有利であり得る。油エマルジョンは、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０；商標名（ＴＭ））を含有することが好ましいが、他の界面活性剤（その好ましい例は、スパン（ＳＰＡＮ）シリーズ（特に、スパン８５））及びレシチンである）を使用できることは、当業者には明らかであろう。
【００３９】
水中油型エマルジョンの製造方法は、当業者に周知である。一般に、製造方法は、油相とＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ８０（商標名）溶液などの界面活性剤との混合、次いで、ホモジナイザーを用いる均質化を含むものであり、また当業者には、混合物を注射針に２回通過させることを含む方法が、容量の少ない液体を均質化するのに好適であることは、明らかであろう。同様に、当業者であれば、より少量又は多量のエマルジョンを製造するために、ミクロ液状化装置（ｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）（Ｍ１１０Ｓ ミクロ流体工学装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｍａｃｈｉｎｅ）、最大圧力入力６バール（出力圧力約８５０バール）、２分間で最大５０回通過）における乳化方法を適用することができるであろう。この適用は、製造物が要求される直径の油滴を達成できるまで、得られたエマルジョンを測定することを含むルーチンな実験によって達成できるであろう。
【００４０】
本発明の好ましい態様では、ヒトマラリア原虫は熱帯熱マラリア原虫である。
【００４１】
本発明の特定の態様では、防御肝ステージ抗原は肝ステージ抗原３（ＬＳＡ−３）又はその免疫学的フラグメントである。
【００４２】
しかしながら、他の肝ステージ抗原、例えば、Ｍａｌａｒｉａ， Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（マラリア、寄生虫生物学、病原論及び防御）（Ｉｒｗｉｎ Ｗ． Ｓｈｅｒｍａｎ編集、１９９８ ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）、特に第３４節（Ｐ． Ｄｒｕｉｌｈｅら）に記載されているＬＳＡ−１及びＬＳＡ−２を用いることもできる。
【００４３】
本明細書中で免疫学的フラグメントとは、相同性％の点からその対照抗原と関連するか又は類似の配列を有し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて類似の、細胞性又は体液性免疫応答を誘導できる分子を意味する。
【００４４】
ＬＳＡ−３抗原及びＬＳＡ−３を表す（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）アミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含有するポリペプチド分子が、ＷＯ９６／４１８７７号に記載されている。本発明で用いるためのＬＳＡ−３は本明細書中の実施例部分で記載するように好適に製造できる。また、Ｃ Ｍａｒｃｈａｎｄ及びＰ Ｄｒｕｉｌｈｅ， Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ， Ｖｏｌｕｍｅ ６８ （Ｓｕｐｐｌ．） １５８−１６４ （１９９０）、並びに米国特許第６，１００，０６７号明細書も参照することができる。
【００４５】
さらに別の態様では、さらに少なくとも１つのマラリア原虫の他の防御抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ）又はその免疫学的フラグメント、特にＬＳＡ−３、を含む本発明のワクチン組成物を提供する。
【００４６】
より詳細には、他のマラリア抗原は、下記の群から選択することができる：
ａ）ＣＳタンパク質の実質的に全てのＣ末端部分、免疫優性領域の４個又はそれ以上のタンデムリピート、及びＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、特にＲＴＳ，Ｓ、又はそのフラグメントを含む免疫原性誘導体を含むハイブリッドタンパク質；
ｂ）熱帯熱マラリア原虫のＴ９／９６単離体のＴＲＡＰタンパク質及びそれと少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質及びそのフラグメントを含む免疫原性誘導体（欧州特許出願第９１９０３２４９．０号明細書を参照されたい）；
ｃ）熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）のＭＳＰ−１及びそれと少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質及びそのフラグメントを含む免疫原性誘導体；及び
ｄ）熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−３及びそのＣ末端領域と少なくとも７０％の相同性を有するタンパク質、及びそのフラグメントを含む免疫原性誘導体。
【００４７】
熱帯熱マラリア原虫又は三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−１は、米国特許第４，８３７，０１６号に記載されている。免疫原性誘導体は、Ｃ末端の４２ＫＤａの抗原（ｐ４２）などのＭＳＰ−１のフラグメントを含む。
【００４８】
ＭＳＰ−３抗原は、米国特許第６，０１７，５３８号に記載されている。
【００４９】
配列分析の相同性は、Ｂｌａｓｔ ２．０及びＦａｓｔａをこれらのプログラムにより使用されるアルゴリズムのデフォルト設定によって使用して確認することができる。種々の単離体又はストック株におけるＬＳＡ−３配列の比較は、計算マニュアルを用いて行いうる。
【００５０】
ＭＳＰ−３のＣ末端領域とは、１９３〜３８１位の１８５個のアミノ酸領域を意味する。この領域は、その末端（Ｃ末端部分）にロイシンジッパーを含み、酸性アミノ酸に富んでいる。三次元構造は二重コイル（ｃｏｉｌ−ｃｏｉｌｅｄ）である。クローンＤＧ２１０（アミノ酸１９３−２５７）は、非常に複雑な球形の領域に対応しており、二重コイル領域に続いている。
【００５１】
本発明のさらに別の態様では、医学用途のための本明細書中に記載のワクチンを提供する。
【００５２】
さらにまた別の態様では、本発明は、標準技術を用いて必要な構成成分を混合することによる、本発明のいずれかの態様によるワクチン組成物を製造する方法を提供する。ワクチン製造は、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ワクチンの新しい傾向及び開発）、Ｖｏｌｌｅｒら編集， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９７８に一般的に記載されている。
【００５３】
ある態様では、この方法は、ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及び水中油型エマルジョンと、本明細書中上記で規定したヒトマラリア原虫の防御肝ステージ抗原と、任意にさらにマラリア抗原とを混合することを含む。
【００５４】
各ワクチン中のタンパク質の量は、一般的なワクチンにおける有意な副作用を伴わない免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、特定の免疫原が選択され、それがどのように存在するかによって変動するであろう。一般的には、１回の投与は、１〜１００μｇ、好ましくは２〜１００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇのタンパク質を含むであろうと予想される。特定のワクチンについての最適量は、被験者の適切な免疫応答の観察に関する標準的な研究によって確かめることができる。初回のワクチン接種に続き、被験者は、適切な間隔をおいて１回又は数回の追加免疫を受けることができる。
【００５５】
本発明の製剤は、予防目的及び治療目的の両方に用いることができる。
【００５６】
従って、ある態様では、本発明は、本発明のワクチンの有効量を患者に投与することを含む治療方法を提供する。
【００５７】
下記実施例によって本発明を具体的に説明する。
【００５８】
実施例
実施例１
それぞれ下記の水中油型エマルジョン構成成分を含む２種のアジュバント製剤を製造した。
【００５９】
ＳＢ２６：スクアレン５％、トコフェロール５％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．４％；粒径５００ｎｍ
ＳＢ６２：スクアレン５％、トコフェロール５％、Ｔｗｅｅｎ８０ ２．０％；粒径１８０ｎｍ
１（ａ）エマルジョンＳＢ６２（２倍濃縮物）の製造
Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、ＰＢＳ中２％溶液を得る。１００ｍＬの２倍濃縮エマルジョンを得るために、ＤＬ−α−トコフェロール５ｇ及びスクアレン５ｍＬを撹拌して十分に混合する。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液９０ｍＬを加え、十分に混合する。次いで、得られたエマルジョンを注射筒に通し、最後にＭ１１０Ｓミクロ流体工学装置を用いてミクロ流動化させる（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｄ）。得られた油滴はおよそ１８０ｎｍのサイズを有している。
【００６０】
１（ｂ）エマルジョンＳＢ２６の製造
このエマルジョンは、０．４％のＴｗｅｅｎ８０を用いて同様にして製造した。
【００６１】
１ａ）又はｂ）のエマルジョンに、適量のＬＳＡ−３（例えば、２μｇ〜１００μｇ）を加え、混合することができる。これを、例えば、５０μｇ／ｍＬの３Ｄ−ＭＰＬ及び２０μｇ／ｍＬのＱＳ２１（又は関連分子）と組み合わせて、最終製剤を得ることができる。
【００６２】
実施例２
保存された前赤血球抗原（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＬＳＡ−３を用いた免疫によるチンパンジーでの熱帯熱マラリア原虫に対する防御
照射弱毒化前赤血球マラリア原虫を用いたワクチン接種によってヒトで誘導される強力な免疫学的防御の原理は、あまり理解されていない。しかしながら、現在、防御を誘導するには、発生において停止した肝細胞間の肝栄養型（トロフォゾイト）ではなく、照射を受けたスポロゾイトの生体（ｌｉｖｅ）への形質転換が必要であると推測されている９。これは、高い照射量（２３〜３０キロラド）ではなく、低い照射量（１５〜２０キロラド）で生じる９，１０。そのような照射を受けたスポロゾイトで免疫された宿主の選択的（示差的）応答は、防御に適切な分子のスクリーニングを提供できると理由付けた。本発明者らは、前赤血球ステージの寄生虫発生の間に発現され６，７、およそ２０種の別個の遺伝子から誘導される６，７，１１，１２、熱帯熱マラリア原虫のポリペプチドを発現することが予め同定されている１２０種のファージλクローンのスクリーニングを進めた。これらの推定上の遺伝子のそれぞれに対応するクローンを、低照射量又は高照射量で照射されたスポロゾイトで免疫されたヒトボランティア（４／６が防御されている）及びチンパンジー（１／２が防御されている）由来の８種の血清を用いてスクリーニングした。１つのクローン（ＤＧ７２９）が、防御されているヒト及びチンパンジー由来の血清とのみ反応した。この示差的な反応性は、このフラグメントから誘導されたペプチド（表１）によってもさらに確認された。この結果から、このクローンをさらに研究することを選択した。
【００６３】
熱帯熱マラリア原虫（Ｋ１）ゲノムライブラリーをプロービングするためにＤＧ７２９を用いた。１つのクローンがＤＧ７２９に対応する全長遺伝子を含有していることが見出され、そしてそれを肝ステージ抗原−３（ＬＳＡ−３）と名付けた。ｌｓａ−３遺伝子の配列、発現、位置及び保存の全ての記載は、補足情報（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （Ｓ．Ｉ．））に示し、下記及び図１〜３に概要を記載する。簡単に言えば、本発明者らは、小エキソン（ｍｉｎｉ−ｅｘｏｎ）１、小イントロン（ｍｉｎｉ−ｉｎｔｒｏｎ）、及び大エキソン（ｌａｒｇｅ ｅｘｏｎ）２（図１ａ）を含み、熱帯熱マラリア原虫の他の表面抗原の構造に類似した構造を有する１３、単一コピー遺伝子を同定した。ｌｓａ−３は、その遺伝子が「ＲＥＳ−Ｈ３」遺伝子（受託番号：ＡＥ００１４２４）として注記されている、２番染色体１４上に位置していることが最近確認された。分子量が２００ｋＤａ（Ｋ１中）であると予測される、ＬＳＡ−３は、３個のグルタミン酸に富むリピート領域と隣り合う大きな非リピートで構成されており、全赤血球構成成分を含むように既知の熱帯熱マラリア原虫のグルタミン酸リッチ（Ｇｌｕ−ｒｉｃｈ）な抗原ネットワーク１５まで延びているという特徴を有する。元のフラグメント（ＤＧ７２９）の位置並びにリピート領域Ｒ２に対応するペプチド及び非リピート領域ＮＲ−Ａ及びＮＲ−Ｂに対応するペプチドの位置を図１ｂに示す。自然に又は人工的に誘導された非リピートペプチドに対する抗体及び組換えタンパク質ＧＳＴ−ＰＣは、リピートグルタミン酸リッチ領域との交差反応性が無く、さらなる研究に用いた。
【００６４】
ＬＳＡ−３の前赤血球発現（図２〜３及びＳ．Ｉ．を参照されたい）を、ａ）いずれの場合もスポロゾイトから単離された、全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（プライマーｉｌ及びｉ２）及びタンパク質抽出物のウエスタンブロッティングによって、並びに、ｂ）そのタンパク質の交差反応性のない部分に対する抗体を用いる、感染した肝切片及び乾燥又は湿潤スポロゾイト調製物についての免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）によって確認した。５及び６日令の肝繁殖体では、ＬＳＡ−３は、寄生菌含有空砲（ｐａｒａｓｉｔｏｐｈｏｒｏｕｓ ｖａｃｕｏｌｅ）中及び成熟肝細胞メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ；分裂小体）の周辺に存在していた。この位置は、２つの疎水性領域を含む、このタンパク質の分子構造と一致している（図１ａ）。本発明者らには、ｌｓａ−３由来のｍＲＮＡを、赤血球ステージ由来のノーザンブロットされたＲＮＡ中で検出できないであろう。感染した赤血球のウエスタンブロッティング及びＩＦＡＴも、非交差反応性抗体によって一貫して陰性であった。しかしながら、グルタミン酸リッチリピート領域に対する抗体を用いたときには反応性が得られた。このことは、グルタミン酸リッチエピトープ１６と広く交差反応する抗体を用いただけで同定された、赤血球内寄生虫で前に記載した推定上相同な抗原（Ｄ２６０）の検出を部分的に説明できるかもしれない。
【００６５】
多くのマラリアワクチン候補分子の多形性はある程度認識されており、それ故、本発明者らはＬＳＡ−３において自然に生じる配列変異を調査した（Ｓ．Ｉ．を参照されたい）。この遺伝子は、１１１種全ての熱帯熱マラリア原虫単離体、株又は種々の地理的起源のクローンにおいて、ＮＲ−Ａ領域のＰＣＲ増幅（プライマーＳ１及びＳ２）によって一貫して検出された。ＩＦＡＴアッセイにおけるＬＳＡ−３特異的抗体を用いて、２つの異なる株の肝繁殖体及びタイ生殖母体（ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで常食とする蚊で発生した３０種の野生の単離体由来のスポロゾイトの全てにおいてＬＳＡ−３の発現も検出された。リピート領域Ｒ１及びＲ３は高度に保存されているが、Ｒ２のリピート単位の数及び順序が異なる寄生虫系列の間で生じることが見出された。しかしながら、これは、Ｒ２を認識する抗体が、試験した全ての寄生虫によるＩＦＡＴによって確かに陽性に反応したので、予測された保存された構成、主なＢ細胞エピトープを規定するのに重要であると考えられる第２の構造に影響を及ぼさなかった。多数のＴｈ及びＣＴＬエピトープが見出される、エキソン２の非リピート領域は、かなりな程度の異なる寄生虫の間でのアミノ酸（ａａ）配列の保存を示す（＞９５．５％の相同性）。ＮＲ２ペプチドの配列は、Ｋ１及びＴ９／９６寄生虫、免疫タンパク質の供給源、スポロゾイトチャレンジに用いられるＮＦ５４寄生虫及び種々の地理的起源の２７種の熱帯熱マラリア原虫サンプルの間で十分に保存されていた１７。ＬＳＡ−３のＮＲ−Ｂ領域で特定されたＨＬＡ−Ｂ５３制限エピトープ（ＧＳＴ−ＰＣ組換えタンパク質中に存在する）がクローン３Ｄ７及び１８種のガンビア（Ｇａｍｂｉａｎ）単離体において変異がないことも見出された１９。この免疫学的に重要なエピトープの保存は、現在の前赤血球ワクチン候補の実質的な多形性とは対照的である。
【００６６】
本発明者らは下記の理由でＬＳＡ−３免疫の防御能力を研究するためにチンパンジーを選択した。チンパンジーは、ヒトで見られるそれに匹敵する速度の肝形態に対するスポロゾイト形質転換によって、完全な熱帯熱マラリア原虫の肝細胞内発生が十分に可能な唯一の非ヒト霊長類である。チンパンジーはまた、ヒトに最も近縁の動物であり（ＤＮＡレベルで９８．４％の相同性８）、免疫応答の詳細な研究を行うことができ、ヒトの免疫応答と正当に比較できる動物である１７，１８。寄生生物学上及び免疫学上のイベントは肝生検において直接に試験できるという事実、感染したヒトを考慮できる可能性は、明らかに重要である。このワクチン評価用モデルの適合性を確認するために、多数の予備ストリンジェント試験を対照動物で行った。費用及び論理的考慮から、多数の動物の使用は不可能なので、このモデル系における感染の高い再現性は重要である。予備実験（グループＩ、表ＩＩ）で、チンパンジーにおいては、照射されたスポロゾイトで免疫することによる防御が照射量に依存することを確認し、防御のアッセイとして感染した赤血球の検出を確認した。この結果から多数の重要なパラメーターが特定できた：ａ）ヒトにおけるのと同様に、チンパンジーは照射されたスポロゾイトによる免疫によって強力な防御応答を発達させ、ｂ）チンパンジーは、第１回目のチャレンジによって不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）になる下等な霊長類又は齧歯類とは対称的に、ヒトのように少なくとも５回の連続チャレンジに対して幅広く感受性を残しており、そしてｃ）高投与量でスポロゾイトが予防接種された結果として、赤血球寄生虫の検出は、肝細胞内繁殖体から放出されたメロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ；分裂小体）による赤血球への最初の侵入に対応していた。陽性の血液塗沫標本は、６日目又は７日目に非防御チンパンジーにおいて繰り返し得られた。チンパンジーでは、赤血球感染は、高用量チャレンジにもかかわらず実際に観察される無症状（ｓｕｂ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）及び自己制御（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）が通常残る。これらの結果は、さらに２匹のチンパンジーで最近確認された（製造において記載したＬａｎｇｅｒｍａｎｓ Ｊ．ら）。
【００６７】
チンパンジーの適当性が確立されたので、本発明者らは、生存能力のある熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイトでチャレンジすることによるＬＳＡ−３免疫の防御値をアッセイした。予備実験において、ＬＳＡ−３及びＬＳＡ−１組換えタンパク質の混合物で２匹の動物を免疫した。数ヶ月に渡る３回のチャレンジに対する完全な防御は、ＬＳＡ−３に応答した（ＬＳＡ−１の両方に応答した）動物でのみで見られた。第５日目に行われたこの動物の肝生検では、たった１つの不健康な外見で、白血球が侵入した肝繁殖体が、スクリーニングされた３００個の肝切片中で検出された（Ｄｉｒｋ、図３）。これに対し、健康な外見の２５００個及び７５０個の肝繁殖体が、２種の非防御対照で観察された。
【００６８】
これらの結果から、ＬＳＡ−３のみに関するさらなる免疫及びチャレンジ実験に焦点を当てた。チンパンジーの２つのグループを用いて、リポペプチド及び組換えタンパク質製剤を評価した（表ＩＩ、グループＩＩ〜ＩＩＩ）。グループＩＩでは、１匹の動物（Ｇｅｒｄａ）を最初にＬＳＡ−３のＮＲ２リポペプチドのみで免疫し、モンタニドＩＳＡ ５１中の組換えＬＳＡ−３分子によって促進した。Ｇｅｒｄａは、１０７個のスポロゾイトでチャレンジすると、十分に防御されたが、モンタニドＩＳＡ ５１を受けた対照では防御されなかった（図４ａ）。
【００６９】
Ｇｅｒｄａでは、組換えＬＳＡ−３製剤での促進が、最初のリポペプチド／ペプチド注射によってすでに呼び起こされていた強いＢ細胞、Ｔヘルパー細胞及びＣＴＬ応答の何らかの検出可能な増加の誘導は見出されなかった１７，１８。それ故、単純で十分に抵抗性を有するペプチド製剤のみで防御を誘導しうるか否かを理解することに興味を持った。２匹のチンパンジー、Ｍｏｐｉａ及びＭｇｂａｄｏをＬＳＡ−３リポペプチド／ペプチドのみで免疫した（表ＩＩ、グループＩＩＩ）。２×１０４個のスポロゾイトによる最初のチャレンジに対する防御は、両方で得られた。同じグループは、開存（ｐａｔｅｎｃｙ）に対する１日の遅れを生じさせる１匹の動物（Ｊｕｄｙ）における、アジュバント無しの組換えタンパク質のミクロビーズ提示の効果の研究（図４ｂ）を含むものである。続く高用量のスポロゾイトチャレンジ（５×１０６個のスポロゾイト）によって、ＭｏｐｉａとＭｇｂａｄｏの両者は、開存（ｐａｔｅｎｃｙ）への明らかな２日遅延及び低い一時的な寄生虫血症を示したが、Ｊｕｄｙについては何の防御も見られなかった（図４ｃ）。開存（ｐａｔｅｎｃｙ）の遅延は、免疫応答が肝細胞内繁殖体負荷の９０％を超える低減を引き起こしたことを示唆している２１（図４）。
【００７０】
グループＩＶ及びＶからのチンパンジーで、本発明者らは、より複雑でないリポペプチド混合物のみの、又はＳＢＡＳ２（その有効性がヒトで最近確立された新規なアジュバント）をアジュバントとして含む組換え体の有効性を調査した４，５。免疫原性の研究１７，１８及び以前のチンパンジーのデータの分析は、ペプチドＣＴ１は免疫原性に乏しく、それ故重要でないことを示していたが、チンパンジーのＰａｔｔｙは、４個のペプチドの代わりに３個のペプチドの混合によって免疫された。この動物は、チャレンジに対して防御を示した。ＳＢＡＳ２をアジュバントとしてＬＳＡ−３タンパク質を投与された４匹の動物のうち、２匹は、中用量でのチャレンジに対して完全で殺菌的な防御を示した。１匹は、部分的な防御を示すことができる開存（ｐａｔｅｎｃｙ）の遅延を示したが、４匹目もＳＢＡＳ２アジュバントのみを投与された対照も防御されなかった。完全に防御された２匹のチンパンジーのうちの１匹を、３ヵ月後に高用量でさらにチャレンジしたところ、依然として完全な防御を示した。
【００７１】
本明細書中において、チンパンジーにおけるヒトマラリアに対する防御ワクチンについて初めて報告する。このモデルは、熱帯熱マラリア原虫のＬＳＡ−３が、前赤血球ステージに対して有効なワクチン注射の価値ある候補であることの説得力のある証拠を提供した。全部で９匹の動物を、生理食塩水中のポリペプチド又はモンタニドアジュバント又はＳＢＡＳ２アジュバントのいずれか中のポリペプチドを用いて免疫した。最初のチャレンジの際に、これら９匹のチンパンジーのうちの６匹において完全殺菌的防御が誘導された。対照と比較して有意な遅延を考慮するならば、ＬＳＡ−３によって誘導された防御効果は、９匹の動物のうちの８匹で示された。行われた１４回のチャレンジのうち、完全な防御は７匹で得られ、部分的な防御はさらに４回のチャレンジで得られた。これらの研究で用いられた７匹全ての対照動物は、生育可能な寄生虫での１２回のチャレンジのそれぞれの後に、血液ステージ寄生虫血症の外観（ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）及び経過に一致するパターンを示した。対照動物、過剰照射されたスポロゾイトによって免疫された動物、及び他の実験（示していない）で行われたさらなる２６回のチャレンジにおけるこの再現性の実証は、本発明者らのデータの解釈の要点である。
【００７２】
その配列がＫ１及びＴ９／９６寄生虫から誘導されたＬＳＡ−３分子で免疫された異系交配された動物での異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）チャレンジ（ＮＦ５４）に対する防御が誘導されたことは自信を与えた。この研究の過程で、多様な免疫計画を調査した。データはＳＢＡＳ２アジュバントの価値を支持していた。Ｇｅｒｄａ、Ｍｏｐｉａ、Ｍｇｂｏｄｏ及びＰａｔｔｙによる結果は、ＧＭＰ条件下２２で比較的製造が容易な単純なペプチド及びリポペプチド製剤に基づいているので、それらもまた自信を与えた。本発明者らの動物では、リポペプチド注射、赤毛ザル（ｍａｃａｑｕｅｓ）２３のＳＩＶから誘導される類似の製剤による予備実験と一致する所見及びヒトにおけるＨｂＳ２４又はＨＩＶ２２に続いて、局所的又は全体的な反応は検出されなかった。このことは、将来の臨床試験を十分に予測するものである。
【００７３】
方法
クローンＤＧ７２９の選択
１／１００希釈されたヒト及びチンパンジー血清を用いて、前赤血球クローンによってコードされるβ−ガラクトシダーゼ融合組換えタンパク質のドットブロット分析を、前述のように、ニトロセルロース上で行った７。ＰＢＳ中、ＮＲ１、ＮＲ２及びＲＥペプチドそれぞれの０．３、３及び１０μｇ／ｍＬのコーティング溶液を用いて１／１００希釈された血清について、上述のように、２検体でＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定）を行った２５。
【００７４】
ＬＳＡ−３のクローニング及び特性決定
分子方法の詳細な説明、遺伝子クローニング、配列データ、タンパク質の特徴並びに組換えタンパク質の説明及びペプチドの説明はＳ．Ｉ．に示す。ＰＣＲに用いたプライマーは、Ｓ１（ヌクレオチド１６１−１８４）／Ｓ２（ヌクレオチド４５４−４３２）であり、ＲＴ−ＰＣＲ用に用いたプライマーは、ｉ１（ヌクレオチド６９５−７２２）／ｉ２（ヌクレオチド８２４−７９９）であり、番号付けはＫ１（受託番号：ＡＪ００７０１０）のｌｓａ−３配列を引用している。図２に示されるウエスタンブロット（１／１００希釈）に用いた全てのマウス血清は、ＳＢＡＳ２アジュバント４中で乳化された免疫原（１００μｇ）の３回の皮下注射後に得た。長鎖の合成ペプチドＧＰ５、ＧＰ６、ＧＰ８及びＧＰ１１を、参考文献２６に記載されているように合成した（位置については図１を参照されたい）。
【００７５】
チンパンジーに注射された免疫原
本明細書中で評価した種々の配列は、クローンＤＧ７２９、及びインサートＮＮ及びインサートＰＣ、並びにペプチド（ｐｅｐ．）ＮＲ１、ＮＲ２、ＲＥ及びＣＴ１とからなっており、これらの位置を図１に示し、Ｓ．Ｉ．により詳細に記載する。クローンＤＧ７２９、並びにインサートＮＮ及びインサートＰＣは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合組換え体として発現させ、製造会社の推奨法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， オランダ）に従って精製した。組換え体ＧＳＴ−ＤＧ７２９、ＧＳＴ−ＮＮ及びＧＳＴ−ＰＣは、ＬＳＡ−３抗原の９５％をカバーするように設計し、ＬＳＡ−３ ＧＳＴ−ｒｅｃと称する混合物として用いた。ペプチドＮＲ１、ＮＲ２及びＣＴ１もまた、文献番号１７に記載されている、パルミトイル結合リポペプチド（ｌｉｐｏｐｅｐ．）として合成した。合成化合物（（ｌｉｐｏ）ｐｅｐ．と称する）は、ＮＲ１、ＮＲ２及びＣＴ１リポペプチド及びＲＥペプチドの混合物からなっていた。全てのペプチドとリポペプチドは、逆相クロマトグラフィーによって＞９０％純度まで精製され、不純物は本質的により短い配列からなる関連ペプチドからなっていた１７。
【００７６】
チンパンジーの免疫及びチャレンジ
この研究に含まれる全てのチンパンジーは、これ以前にマラリア感染症又は抗原に暴露されたことは無かった。組換え体及び合成化合物を各ペプチド及び／又はリポペプチド１００μｇ、及び／又は各タンパク質５０μｇの用量で、皮下注射した。特に断らない限り、リポペプチドは常にＰＢＳで注射し、ペプチド及び組換え体はモンタニド ＩＳＡ ５１で乳化した。グループＩの動物（Ｃａｒｌ及びＪａｐｉｅ）を、０日目及び８、２４４４及び６５週目で、５×１０６γで照射されたスポロゾイトの５回の静脈注射で免疫し、７１、９７及び１２３週目で３回チャレンジした（チャレンジ用量を表ＩＩに示す）。本明細書中で報告された３回のチャレンジの１年後に、これらのチンパンジーを１回再免疫し、１回の低用量のチャレンジ及び１回の高用量のチャレンジを行ったが、それは同じパターンの防御を示した（原稿準備中のため示していないＬａｎｇｅｒｍａｎｓ Ｊ．ら）。グループＩＩでは、Ｇｅｒｄａに、文献番号１７に記載されているように、０日目及び３、１３及び３１週目にＮＲ２リポペプチドを投与した。次いで、これを、４０、４５、４８及び５０週目にＬＳＡ−３ ＧＳＴ−ｒｅｃの混合物で追加免疫した。対照動物のＬｉａｎｎｅに、モンタニド ＩＳＡ ５１を投与した。６０週目にチャレンジを行った。グループＩＩＩの動物を、０日目並びに３及び６週目に免疫した。Ｍｏｐｉａ及びＭｇｂａｄｏに、ＬＳＡ−３（リポ）ペプチドを投与し、一方、Ｊｕｄｙには、ラテックスビーズに吸着させたＬＳＡ−３ ＧＳＴ−ｒｅｃを注射した。２１及び２９週目に、ＬＤ（低用量）及びＨＤ（高用量）チャレンジを行った。グループＩＶでは、Ｐａｔｔｙに、リポペプチドＣＴ１無しでＬＳＡ−３（リポ）ペプチドを投与し、一方、Ｗｅｎｄｙ及びＷｉｌｌｙにはＳＢＡＳ２アジュバント中のＬＳＡ−３ ＧＳＴ−ｒｅｃを注射した４，５。対照動物のＨｅｌｅｎには、ＳＢＡＳ２アジュバントのみを投与した。全ての動物を、０、４及び８週目に免疫し、１３週目に２０，０００個のスポロゾイトでチャレンジした。グループＶでは、Ｃｉｎｄｙ及びＭａｒｔｙの両者を、０、４、８及び２６週目に（グループＩＶと同じ）ＳＢＡＳ２アジュバント中ＬＳＡ−３ ＧＳＴ−ｒｅｃで免疫し、陰性対照動物のＦａｕｚｉには、Ｊａｐｉｅ（グループＩ）と同様に、過剰照射されたスポロゾイトを、５、８、１１及び２６週目に投与した。３３及び４６週目に、３匹全ての動物においてＬＤ及びＨＤチャレンジを行った。
【００７７】
ＮＦ５４スポロゾイトを、前述の感染したハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）の切開した唾液腺から得た２７。スポロゾイトをプールし、ＰＢＳ中に懸濁し、静脈注射した。各グループの全ての動物を、同じプールのスポロゾイトでチャレンジした。経費的理由から、最少有効用量についての広範な評価は行わなかったが、５×１０３個のスポロゾイトでのチャレンジ（現在までに用いた最低用量）は、４匹の他の動物での感染を証明した（Ｔｈｏｍａｓ， Ａ． Ｗ．、未発表データ）。
【００７８】
防御状態の測定
グループＩ、ＩＩ、ＩＶ及びＶについて、５及び９日目に動物の血液を採取し、濃淡フィルムギームザ染色プレパラートによって評価し、文献番号２１に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養（示していない）によって全てのケースで確認された。グループＩＩＩについては、５日目から１８日目までの毎日、次いで３０日目までの１日おきに採取したチンパンジーの血液を用いて、ギームザ染色され、二人の別の顕微鏡使用者によって調査される濃淡塗沫標本を調製した。１匹のチンパンジーは、ａ）直接顕微鏡観察及び長期培養によって、循環血中に寄生虫が検出できないときに完全に防御されている、又はｂ）開存（ｐａｔｅｎｃｙ）までの時間が、対照動物で観察されたよりも１日又はそれ以上遅れた場合に部分的に防御されていると判断した。マウスでは、これらの遅延は、スポロゾイトチャレンジに対して８０％（２４時間）又は９６％（４８時間）の防御に対応する。ヒトでは、１２時間の遅延は、スポロゾイトチャレンジ後の肝形態の９２％減少に対応するものと計算された２１。限られた数の動物で、高用量チャレンジの５日後に獣医によって麻酔下で肝生検を行った。試料（ｍａｔｅｒｉａｌ）を固定し、４μｍの切片を作製し、ギームザ−コロホニウム（ｃｏｌｌｏｐｈｏｎｉｕｍ）２８で染色してから、３００個の切片（平均面積：０．８ｃｍ２）の肝形態の完全な顕微鏡計数を行った。それぞれの防御状態に関係なく、観察期間後直ちに全ての動物をクロロキンで治療処置した。
【００７９】
実施例２の参照文献
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２１． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｊ．Ｒ．， Ｂａｑａｒ， Ｓ．， Ｄａｖｉｓ， Ｊ．Ｒ．， Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｄ．Ｆ．， Ｃｌｙｄｅ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ６．５−ｄａｙ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｏｆ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｔａｒｄｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２７， １４３４−１４３７ （１９８９）．
２２． Ｇａｈｅｒｙ−Ｓｅｇａｒｄ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｉｃ Ｂ− ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｂｙ ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４， １６９４−７０３ （２０００）．
２３． Ｂｏｕｒｇａｕｌｔ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ： ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｏｆ ＧＡＧ ｏｒ ＮＥＦ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２， ２５３０−２５３７ （１９９４）．
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２５． Ｌｏｎｄｏｎｏ， Ｊ．Ａ．， Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ， Ｈ．， Ｄｕｂｅａｕｘ， Ｃ．， Ｔａｒｔａｒ， Ａ． ａｎｄ Ｐ．， Ｄｒｕｉｌｈｅ． Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， １５５７−１５６３ （１９９０）．
２６． Ｒｏｇｇｅｒｏ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ １０４−ｍｅｒ ａｎｄ １０２−ｍｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｎ− ａｎｄ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＣＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２， １３０１−１３０９ （１９９５）．
２７． Ｐｏｎｎｕｄｕｒａｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｌｏａｄ ｏｆ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ｔｒａｎｓ． Ｒｏｙ Ｓｏｃ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ８３， ６７−７０ （１９８９）．
２８． Ｄｒｕｉｌｈｅ， Ｐ．， Ｐｕｅｂｌａ， Ｒ．Ｍ．， Ｍｉｌｔｇｅｎ， Ｆ．， Ｐｅｒｒｉｎ， Ｌ． ａｎｄ Ｍ．， Ｇｅｎｔｉｌｉｎｉ． Ｓｐｅｃｉｅｓ− ａｎｄ ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ． Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ３３， ３３６−３４１ （１９８４）．
２９． Ｍｅｉｓ， Ｊ．Ｆ．Ｇ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ： ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍａｔｕｒｅ ｅｘｏｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ， Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ． Ｅｘｐ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７０， １−１１ （１９９０）．
【００８０】
実施例３
下記実験は、短時間で、且つ、低コストで、長鎖合成ペプチド（Ｌｏｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を製造することによって、臨床レベルでの構想の証拠を確立させる、ローザンヌのＧｉａｎＰｉｅｔｒｏ Ｃｏｒｒａｄｉｎによって開発された長鎖ペプチド計画（ｌｏｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ； ＬＳＰ）を利用している。実際、臨床試験に利用しうる短鎖タンパク質が存在する。全長のＬＳＡ−３分子をカバーする一連の１７個のオーバーラップする長鎖合成ペプチドを合成した。
【００８１】
これらのペプチドを、セネガル領域で感染した個体中のＴ細胞及びＢ細胞レベルの抗原性研究に用い、感染集団における各ペプチドに対する抗体及びリンパ球増殖性応答をモニターした。これらのペプチドは、ＡＳ２アジュバントを用いてマウスを免疫するのにも用いた。
【００８２】
両方の研究で、それぞれが、少なくとも１つのＢ細胞及び１つのＴ細胞エピトープを規定している、殆どのペプチドの非常に強力な抗原性が証明され、マウスにおける免疫原性研究では、研究した殆どのペプチドが、研究用マウスに対して強力な免疫原性を有することが示された（Ｐｅｒｌａｚａら， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００１ Ｊｕｌ； ３１， ７， ２２００−９にまとめられている）。
【００８３】
交差反応性を有する齧歯類のプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）であるプラスモジウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）を用いたチャレンジ実験では、特に、ＧＰ１と呼ばれるペプチドが感染力の強いプラスモジウム・ヨエリのスポロゾイトチャレンジに対する防御を誘導できることが示された。ヒトにおけるさらなる研究については、分子の非リピートＮ末端領域及びリピート領域の最初の部分とオーバーラップするＤＧ７２９と称する組換え体によって得られた最初の結果を信頼して、免疫するペプチドを選択した。
【００８４】
２種類の製剤を調査した：
ａ）前に調査した短鎖ペプチドＮＲ１及びＮＲ２及びリピート領域の先頭を含む、非リピート領域の末端をカバーする、約１６０個のアミノ酸からなる非常に長鎖のＬＳＰ
ｂ）２個のペプチドの混合物であり、その一方のペプチドはＧＰ１と呼ばれ、非リピート領域のみをカバーしており、他方のペプチドはＧＰ１４と呼ばれ、リピート領域の先頭に位置している。
【００８５】
実際上の理由から、上記ａ）で述べた、非常に長鎖の種を十分に純粋な形態で製造することが困難であること、及びＧＭＰ製造のためには、ｂ）で述べた２つのペプチド、すなわち、ＧＰ１及びＧＰ１４の混合物を信頼することがより安全であることが見出された。
【００８６】
従って、コロンビア、カリのＳｏｃｒａｔｅｓ Ｈｅｒｒｅｒａの共同研究所のＢｌａｎｃａ−Ｌｉｌｉａｎａ Ｐｅｒｌａｚａによって、南アメリカの霊長類であるフクロウザル（Ａｏｔｕｓ ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ ｇｒｉｓｅｉｍｅｍｂｒａ）での前臨床研究が行われた。
【００８７】
７匹の動物を下記のようにこの研究に登録した：
グループ１：１回の注射当たり総容量５００ｍＬで、ＡＳ２で補助された、１匹の動物当たり１回の注射で５０ｍｇの用量で、ＬＳＡ−３ ＧＰ１ ＬＳＰの注射を３回受ける２匹の動物
グループ２：１回の注射当たり総容量５００ｍＬで、ＡＳ２で補助された、１匹の動物当たり１回の注射で５０ｍｇの用量で、ペプチドＬＳＡ−３ ＧＰ１＋ＬＳＡ−３ ＧＰ１４からなる混合物の注射を３回受ける２匹の動物
グループ３：１回の注射当たり総容量５００ｍＬで、アジュバントＡＳ２と共にＰＢＳの注射を３回受ける２匹の動物、プラス１匹の非免疫対照動物。
【００８８】
最終の免疫（十分に抵抗性を示し、且つ、主な局所的又は全身的反応を何ら誘導しない）の１ヵ月後に、血液サンプルを採取し、免疫原性を分析した：結果を対応するグラフに示すが、結果は、強力な抗体製造、リンパ球増殖応答及びリンパ球の培養液上清中及びエリスポット技術の両者で、インターフェロンｇ製造を示した。最終免疫の３ヵ月後に、熱帯熱マラリア原虫のＳａｎｔａ Ｌｕｃｉａ株の１００，０００個のスポロゾイトの静脈注射によって、動物をチャレンジした。チャレンジ後６０日間に渡り採取した血液サンプルを、３種類の異なる方法、すなわち、培養した血液の顕微鏡検査、ポリメラーゼ連鎖反応及びＬＤＨアッセイで分析した。
【００８９】
ＬＤＨアッセイによって達成された防御程度の研究は完了した。この方法は、最近報告され（Ｄｒｕｉｌｈｅら， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ， ６４ （５，６） ２００１， ２３３−２４１）、顕微鏡法よりも少なくとも１０倍感度が高いことが示された、二重部位（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｉｔｅ）ＥＬＩＳＡ捕獲アッセイによる寄生虫の検出に基づいている。得られた結果を図１に示す。結果は基本的に、３匹の対照動物は血液ステージ陽性になり（すなわち、追跡調査の間、寄生虫特異的ＬＤＨ検出で陽性）、一方、２つの免疫したグループは、６０日間の追跡調査に渡りこの方法で一貫して陰性であったことを示している。
【００９０】
この結果は、ＡＳ２で補助されたＧＰ１ ＬＳＰ又はＧＰ１＋ＧＰ１４ ＬＳＰｓによる免疫で防御が誘導されたことを支持している。これらの結果は、抗原の同じ領域をカバーする組換え体ＤＧ７２９を単独で用いて得られた前記データ、並びに同じ領域をカバーするリポペプチドの混合物によって行われた免疫、並びにＡＳ２によって補助された３種の組換え体（７２９、ＮＮ、ＰＣ）の混合物によって得られた免疫と一致している（Ｄａｕｂｅｒｓｉｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎｏｖ． ２０００， ６， １１， １２５８−１２６３）。用いた２種のペプチドの配列を下記に示す。
【００９１】
ＧＰ１
2004513152.tif 000002
ＧＰ１４
2004513152.tif 000003
【表１】
2004513152.tif 000004
表Ｉ（上記）：ペプチドＮＲ２によって防御された若しくは防御されていないヒト又はチンパンジー由来の血清の差別的反応性
ＮＲ２に対するＩｇＧ特異的抗体を、低用量又は高用量で照射されたスポロゾイトで免疫されたヒトボランティア（コード）及びチンパンジー（イタリック体で示された名前）由来血清のＥＬＩＳＡによって測定した。コード、免疫計画、スポロゾイトＩＦＡＴ力価及びヒトボランティアＶ４〜Ｖ８及びＷＲ４についての防御状態は、文献番号１及び２にそれぞれ詳細に記載されている。チンパンジーＣａｒｌ及びＪａｐｉｅを本文及び方法の欄（グループＩ）に記載したように免疫し、チャレンジした。ＥＬＩＳＡ力価は、平均ＯＤ＋同じプレートで並行して研究した１０種の対照からの３つの標準偏差に対する試験血清由来の平均ＯＤの割合を示す任意の単位で表現する。結果は上記の１より高い割合のものを陽性とする（太字で示す）。ペプチドＮＲ１及びＲＥ（図１を参照されたい）を用いた同様の実験で、これらの血清による陰性の結果を得た（示していない）。
【００９２】
【表２】
2004513152.tif 000005
表ＩＩ（上記）：チンパンジーにおける免疫及びチャレンジ実験
２×１０４（低用量）又は１０７（高用量）個のＮＦ５４熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトのいずれかを用いてチャレンジを行った（「防御」の欄）。免疫計画（横棒の下の括弧中）及びチャレンジ計画（横棒の上の矢印によって示されている）は、最初の免疫からの週数で表す。完全な防御を（＋）で示し；対照動物及び非防御動物と比較した開存までの遅延（日数による）をｄ１又はｄ２で示す（防御状態の決定については方法の欄に詳細に記載する）。
【００９３】
図面の説明
図１：ＬＳＡ−３遺伝子、組換えタンパク質及びペプチドの略図
ａ）ＤＧ７２９とハイブリダイズするＫ１寄生虫ゲノムＤＮＡライブラリーから単離した６．２ｋｂのＥｃｏＲＩインサート。５．５３Ｋｂの遺伝子は、１９８ｂｐのエキソン１、１６８ｂｐのイントロン（ｉ）及び５．１６Ｋｂのエキソン２を含む。領域ＮＲ−Ａ、ＮＲ−Ｂ及びＮＲ−Ｃは、非リピート配列に対応するが、Ｒ１〜Ｒ３は、３つのリピートブロックを指定する。ＮＨ２末端シグナルペプチドに潜在的に対応する２つの疎水性領域及びアンカー領域を、それぞれＨＲ１及びＨＲ２で示す。ｂ）組換え融合タンパク質（１行目）中のＬＳＡ−３をコードする配列の位置及びこの研究で用いた合成ペプチド（ストローク（ｓｔｏｒｏｋｅｓ））（アミノ酸番号付けについての補足情報を参照されたい）。免疫のために、ＣＴ１及びＮＲ２を、パルミトイル結合リポペプチド（＊印で示す）として用いた１７。
【００９４】
図２：熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト中でのＬＳＡ−３の発現
Ｃ）対照ＧＳＴ、１）ＧＳＴ−ＰＣ、２）ペプチドＧＰ５、ＧＰ６、ＧＰ８又はＧＰ１１、３）ＧＳＴ−７２９に対するマウス抗血清を用いてＮＦ５４スポロゾイト及び対照の感染していない蚊の唾液腺からのタンパク質抽出物についてウエスタンブロット分析を行った（図１、方法の欄及びＳ．Ｉ．を参照されたい）。この寄生虫株のＬＳＡ−３の理論上の分子量と一致している、１７５ｋＤａのタンパク質（＊）として、ＬＳＡ−３は可視化される。
【００９５】
図３：抗ＬＳＡ−３抗体を用いる熱帯熱マラリア原虫前赤血球ステージの免疫染色
ａ）組換えβｇａｌ−ＤＧ７２９上でアフィニティー精製されたヒト抗体を用いたＩＦＡＴによって染色されたスポロゾイト。ｂ）チンパンジーＧｅｒｄａでのリポペプチドＮＲ２注射１７によって誘導された抗体を用いた、チンパンジー由来の肝ステージ２９チャレンジ６日後の肝ステージのＩＦＡＴによる染色（追加的な図についてのＳ．Ｉ．を参照されたい）。ｄ）の対照チンパンジーＰｅｅｒで観察された多数の健康な繁殖体の１つ（３００個の肝切片当たり総数約２５００個の繁殖体、ギームザコロホニウム染色２８）（本文を参照されたい）。と比較して、ｃ）単核リンパ球細胞によって浸潤されて現れた、チンパンジーＤｉｒｋで検出された単体で残った肝繁殖体（チャレンジ５日後）。横棒は、パネルａ）では５μｍであり、パネルｂ）〜ｄ）では２０μｍに対応している。
【００９６】
図４：グループＩＩ及びＩＩＩでの血液寄生虫血症の経過
ＮＦ５４スポロゾイトによる高用量（ＨＤ）又は低用量（ＬＤ）チャレンジ後の、ａ）グループＩＩからのチンパンジー及びｂ〜ｃ）グループＩＩＩの動物。完全に又は部分的に防御された動物の名前を太字で示す。斜線模様は、対照チンパンジーに対応している。異なる数のスポロゾイトでのチャレンジから予測されるように、寄生虫血症の目盛りはチャレンジ毎に異なっている。対照動物及び防御されていない動物での開存の日は、（上記及び本明細書中で示していない他のグループで）各グループ内の所定のチャレンジ接種材料に対して同じであった。
【００９７】
図５：ＧＰ１及びＧＰ１４による免疫後の抗体力価
図は、免疫ペプチドＧＰ１又は組換え体ＤＧ７２９に対するＬＳＡ−３ ＧＰ１＋アジュバントＡＳ２によって免疫したフクロウザル（Ａｏｔｕｓ）Ｍ７３及びＤ１１４のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。両方のケースで、結果がＥＬＩＳＡ比が１より高い値に対して有意なので、力価は高い。図の後半は、ペプチドＧＰ１及びＧＰ１４又は組換え体７２９又はリピート領域をカバーするＮＮ、又は対照組換え体（ＧＳＴ）に対する、ＡＳ２によって補助されたＧＰ１＋ＧＰ１４で免疫されたフクロウザルＭ８８及びＭ９１で得られた結果を示す。ここでもまた、応答は両方の免疫ペプチドに対して高い。
【００９８】
図６：ＧＰ１及びＧＰ１４に対する増殖性応答
図は、ＡＳ２アジュバントと一緒のＧＰ１＋ＧＰ１４の混合物によって免疫されたサルである、Ｍ８８及びＭ９１及びＭ２２３（実際、グループ２に含まれるが、チャレンジを行わない、３番目の動物）における増殖性応答を示す。免疫ペプチドＧＰ１及び、より少ない程度に、ＧＰ１４、又はＮＲ１、ＮＲ２、又はスポロゾイト自体（Ｐｆ）などのより長いペプチドに含有されているここに含まれるより短いペプチドに対して有意な増殖性応答が得られた。しかしながら、他の２匹に比べてサルＭ８８では、応答はより低く、ボーダーライン（陽性の閾値＝２）であった。ＰＨＡは、陽性刺激対照である。
【００９９】
ＡＳ２によって補助されたＧＰ１で免疫されたサルでは、主にサルＭ７３で陽性応答が記録され、サルＶ１１４における免疫ペプチドＧＰ１に対してのみボーダーライン陽性であった（一方、それらはサルＭ５１では基本的に陰性である）。
【０１００】
図７：ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）アッセイ
図は、ＧＰ１ペプチドの投与を受けたサルＭ７３及びＶ１１４、並びにＧＰ１＋ＧＰ１４の混合物の投与を受けたサルＭ８８及びＭ９１で記録された応答を示す。結果は、ＳＦＣ、すなわち、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてインターフェロン−ｇを分泌するコロニー数の平均で表す。結果は、幾つかのペプチド、例えば、組換え体７２９及びＭ７３での免疫ペプチドＧＰ１、並びに熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト、サルＶ１１４で用いた殆どのペプチド又はスポロゾイト、サルＭ８８及びＭ９１に対する組換え体７２９及びＮＮ並びに同じサルで免疫ペプチドＧＰ１及び、より少ない程度に、ＧＰ１４、並びに同じサルでの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト、に対して全てのサルで強い陽性である。
【０１０１】
図８：ＬＤＨ濃度
図は、対照動物（青い線）と比較した、上述の種々のサルで検出されたＬＤＨの種々の濃度を示す。横線は、対照＋３つの標準での平均ＯＤとして測定された陽性の閾値である。アッセイは、感染していないフクロウザルの対照血液＋３つの標準偏差で与えられた平均値として測定した（この閾値より低い結果は陰性であり、この閾値より高い結果は陽性である）。横軸は、スポロゾイト注射後の日数を示し、それはサンプルを採取し、ＤＥＬＩ−ＬＤＨアッセイで処理した日である。
【０１０２】
実施例４
配列データ及び補足情報
本発明を例示するさらなる情報を下記に記載する：
配列データ−遺伝子：全配列（Ｋ１寄生虫）
−タンパク質：全配列（Ｋ１寄生虫）
−クローンＤＧ７２９／ＤＧ６７９（Ｔ９／９６寄生虫）
−寄生虫３Ｄ７におけるＬＳＡ−３配列に関する備考
遺伝子及びタンパク質−構造、制限地図、疎水性
−使用したオリゴヌクレオチド
−組織
領域及びコメント−ＮＲ−Ａ、Ｒ１、Ｒ２、ＮＲ−Ｂ、Ｒ３、ＮＲ−Ｃ
保存−遺伝子について
−配列について
−リピート領域Ｒ２について
−免疫配列及びチャレンジ配列の比較
ステージ特異性及び細胞小器官位置（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）
相同性−種内
−種間
チンパンジー免疫に用いた合成ペプチド及び組換えタンパク質
−ペプチドＣＴ１、ＮＲ１、ＮＲ２、ＲＥ
方法
実施例４の参照文献
また、適当なフォーマットの全配列リストを本明細書中に示す。
【０１０３】
2004513152.tif 000006
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【０１０４】
方法
１．寄生虫
２．核酸単離及びハイブリダイゼーション
３．クローニング及び配列決定プロトコール
４．ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅
５．ペプチド合成及び組換えタンパク質産生
６．抗体及び抗血清
７．ウエスタンブロット分析
８．免疫蛍光抗体試験
【０１０５】
１．寄生虫
血液ステージの熱帯熱マラリア原虫Ｔ９／９６クローン（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇら、１９８４）、ＮＦ５４株（Ｐｏｎｎｕｄｕｒａｉら、１９８８１）及びＫ１株（Ｔｈａｉｔｈｏｎｇ ａｎｄ Ｂｅａｌｅ， １９８１）は、Ｔｒａｇｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ （１９７６）に記載のように培養した。熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイトは、ＮＦ５４株からＰｏｎｎｏｄｕｒａｉら（１９８９）に記載のように、またタイ患者単離体からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生させた生殖体を与えた蚊から（Ｇａｌｅｙら、１９９０）得た。熱帯熱マラリア原虫の肝臓分裂体（繁殖体）は、アフリカ由来の単離体７３０ＸＩ（Ｄｒｕｉｌｈｅ ら、１９８４）を感染させたカツラザル（Ｃｅｂｕｓ ａｐｅｌｌａ、スポロゾイトチャレンジ後５日目）、及びＮＦ５４株（Ｍｅｉｓら、１９９０）を感染させたチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、スポロゾイトチャレンジ後６日目）の肝臓生検において同定された。
【０１０６】
２．核酸単離及びハイブリダイゼーション
寄生虫ゲノムＤＮＡは、サポニン溶解した感染赤血球（Ｒｏｂｓｏｎら、１９９１）から精製した。スポロゾイト及び寄生虫の血液ステージ由来の総ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら（１９８７）に従って抽出した。ＤＮＡプローブを、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）の推奨に従ってランダムに［３２Ｐ］−放射性標識した。サザン及びノーザンブロッティング、プローブハイブリダイゼーション、並びに洗浄は、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、１９８９）により５〜１０μｇの材料を用いて行った。
【０１０７】
低ストリンジェンシー異種間ハイブリダイゼーションを、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＣバッファー、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ中で５４℃にて一晩かけて実施した。０．２×又は０．１×ＳＳＣバッファー中５４℃にて３０分間膜を洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。
【０１０８】
３．クローニング及び配列決定プロトコール
サイズ選択した（０．５〜１．５Ｋｂ）ゲノム発現ライブラリーを熱帯熱マラリア原虫Ｔ９／９６ ＤＮＡからファージλｇｔ１１において調製し、既に記載されているように（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍａｒｃｈａｎｄら、１９８７）種々のステージ限定血清を用いて示差的にスクリーニングした。λｇｔ１１−ＤＧ７２９及び−ＤＧ６７９ ＤＮＡは液体ファージ溶解物から調製した。ゲル精製ＥｃｏＲＩインサートをプラスミドｐＵＣ１８にクローニングし、配列決定した。ＤＧ７２９インサートをランダムに放射性標識し、これをプローブとして用いて、ファージλｇｔ１０（Ｇ． Ｌａｎｇｓｌｅｙ， Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより提供をうけた）におけるＫ１株から調製したＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。５つの陽性クローンを単離し、分析した。これらのうち１つのクローンｋ１．２が、最も大きなＥｃｏＲＩインサートを含んでいたためサブクローニング及び完全配列分析のために選択した。この６．７ＫｂのＥｃｏＲＩ断片及びこれ由来のサブクローン（インサート全体を包含する）をｐＵＣ１８にクローニングした。Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、クローンｋ１．２の１．８Ｋｂの反復（リポート）領域Ｒ１−Ｒ２由来の一連のエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化サブクローンを得た。上述した全てのクローン及びサブクローンを、インサートのフランキング又は内部オリゴヌクレオチドプライマーと共に、ダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）及びシークエナーゼ酵素系（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて、両方の鎖について配列決定した。
【０１０９】
４．ＰＣＲ及びＰＣＲ増幅
ＲＴ−ＰＣＲ実験は、３００〜５００ｎｇの総ＲＮＡ（血液ステージ寄生虫）又は１０６〜１０７のＮＦ５４スポロゾイトから得たＲＮＡペレットを用いて実施した。ＭＭＬＶ逆転写酵素を製造業者（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の推奨に従って最終容量２０μｌで用いて３０ｐｍｏｌのプライマーＳ２（−）からｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は１０μｌのｃＤＮＡ合成反応又は１μｇのゲノムＤＮＡを用いて製造業者の推奨（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）に従って行った。
【０１１０】
ヒト血液サンプルにおけるｌｓａ−３の増幅及びチャレンジしたチンパンジーにおける熱帯熱マラリア原虫の検出に関しては、本明細書において報告するプライマーＳ１及びＳ２に対応するクローンＤＧ１５７のためのプライマーが記載されているＢｏｔｔｉｕｓら（１９９６）に記載のようにＰＣＲを実施した。
【０１１１】
５．ペプチド合成及び組換えタンパク質産生
チンパンジーの免疫のために使用したペプチド及びリポペプチドは、Ｂｅｎ Ｍｏｈａｍｅｄら（１９９７）に記載のように合成した。全てのペプチド及びリポペプチドを逆相クロマトグラフィーにより９０％以上に精製し、不純物が本質的に短い配列のものからなるようにした。長鎖合成ペプチドＧＰ５（アミノ酸１２４１−１３４６）、ＧＰ６（アミノ酸１１４３−１２５５）、ＧＰ８（アミノ酸１０２６−１０９５）及びＧＰ１１（アミノ酸８４０−９０７）をＲｏｇｇｅｒｏら（１９９５）に記載のように合成したが、これらは全てＫ１株のＮＲ−Ｂ領域内、すなわちＰＣインサートの非リピート領域に位置するものである。
【０１１２】
組換えタンパク質β−７２９は、液体溶解物から、Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍａｒｃｈａｎｄら（１９８７）に記載のようにして調製した。対照ＧＳＴタンパク質及びＧＳＴ融合組換え蛋白質は、ＧＳＴ−ＰＣを低収率であるため２０Ｌの培養物から調製した以外は製造業者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って調製した。この大規模培養物を、ＯＤ６００が８．０になるまでインキュベートした後、細菌をペレット化し、フレンチプレスを用いて溶解させ、ろ過した後、標準的な精製を行った。
【０１１３】
６．抗体及び抗血清
ヒト抗体は、組換えタンパク質及びペプチドにおいてそれぞれＭａｒｃｈａｎｄ ＆ Ｄｒｕｉｌｈｅ （１９９０）及びＢｒａｈｉｍｉら（１９９３）に記載のように免疫精製を行った。Ｂｅｎ Ｍｏｈａｍｅｄら（１９９７）に記載のようにリポペプチドＮＲ２を注射することによりそれぞれマウス及びチンパンジーＧｅｒｄａにおいてマウス及びチンパンジーの抗ＮＲ２ペプチド抗体を誘導した。ＧＳＴ−ＰＣ組換えタンパク質及び長鎖ペプチドＧＰ５−６−８−１１に対するマウス抗血清（ウエスタンブロッティングに使用する）は、ＳＢＡＳ２アジュバント（Ｓｔｏｕｔｅら、１９９７）に乳化した免疫原（１００μｇ）を３回皮下注射することにより得た。
【０１１４】
７．ウエスタンブロット分析
赤血球内の寄生虫及びスポロゾイトからのタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有サンプルバッファー中に溶解し、還元条件下で５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングし、既に記載（Ｂｏｕｈａｒｏｕｎ−Ｔａｙｏｕｎ ＆ Ｄｒｕｉｌｈｅ， １９９２）されているようにマウス抗体（１００倍希釈）を用いて検出した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ及び化学発光（ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）により可視化を行った。
【０１１５】
８．免疫蛍光抗体試験
既に記載（Ｄｒｕｉｌｈｅら、１９８６）されているように、熱帯熱マラリア原虫のＮＦ５４株の非同時性赤血球培養物、懸濁液中で標識した新たに切片調製した生スポロゾイト、ポリＬリジン被覆スライド上に置かれた湿潤スポロゾイト、又はグルタルアルデヒド固定スポロゾイト、並びにカルノイ（Ｃａｒｎｏｙ）固定肝臓繁殖体においてＩＦＡＴを実施した。肝臓繁殖体における陽性ＩＦＡＴを、位相差顕微鏡により、続いて切片のギムザ染色（Ｄｒｕｉｌｈｅら、１９８４）により確認した。
【０１１６】
参照文献
2004513152.tif 000024
2004513152.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＬＳＡ−３遺伝子、組換えタンパク質及びペプチドの略図である。
【図２】
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト中でのＬＳＡ−３の発現を示す図である。
【図３】
抗ＬＳＡ−３抗体を用いる熱帯熱マラリア原虫前赤血球ステージの免疫染色を示す図である。
【図４】
グループＩＩ及びＩＩＩでの血液寄生虫血症の経過を示す図である。
【図５】
ＧＰ１及びＧＰ１４による免疫後の抗体力価を示す図である。
【図６】
ＧＰ１及びＧＰ１４に対する増殖性応答を示す図である。
【図７】
Ｅｌｉｓｐｏｔ（酵素結合免疫スポット）アッセイを示す図である。ＧＰ１ペプチドの投与を受けたサルＭ７３及びＶ１１４、並びにＧＰ１＋ＧＰ１４の混合物の投与を受けたサルＭ８８及びＭ９１で記録された応答を示す。
【図８】
対照動物（青い線）と比較した、上述の種々のサルで検出されたＬＤＨの種々の濃度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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2004513152.tif 000034
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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