(57)【要約】本発明は、apoEドメイン相互作用を低下させる物質を提供する。本発明の物質は、apoEに関連した疾患を治療するために有用である。本発明はさらに、これらの物質を含有する薬学的組成物を提供する。本発明は更に、apoE4に関連した疾患を治療する方法を提供する。2004533996.tif 000011
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を少なくとも約10％特異的に低下させる物質を含有する組成物。
【請求項２】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記物質が、apoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
アポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を少なくとも約10％低下させる物質を含有する組成物であって、該物質が約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子であり、かつ該物質がapoE4のArg-61とGlu-255の間の塩橋の形成を阻害する、組成物。
【請求項５】
ApoE4を合成する細胞を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させることを含む、細胞におけるアポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を低下させる方法。
【請求項６】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記物質が、apoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、請求項5記載の方法。
【請求項８】
アポリポタンパク質E4(apoE4)を生成するまたはapoE4をその環境から取込む神経細胞を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させ、これにより神経細胞成長が促進されることを含む、神経細胞成長を促進する方法。
【請求項９】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記物質が、apoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
アポリポタンパク質E4(apoE4)を産生するまたはapoE4をその環境から取込む神経細胞を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させることを含む神経細胞成長を促進する方法であって、該物質が約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子であり、かつ該物質がapoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、方法。
【請求項１２】
個体における神経原線維塊の形成を低下させる方法であって、該個体へapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
個体における神経原線維塊の形成を低下させる方法であって、該個体へapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量投与することを含み、該物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、方法。
【請求項１５】
個体がアルツハイマー病(AD)を発症するリスクを低下させる方法であって、AD発症のリスクのある個体へapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量投与することを含み、該物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、方法。
【請求項１６】
アルツハイマー病(AD)に関連した症状の重症度を低下させる方法であって、ADに関連した症状を呈する個体へapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量投与することを含み、該物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、方法。
【請求項１７】
ADに関連した症状が、認知力低下および記憶喪失からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
アポリポタンパク質E4(apoE4)を合成するまたはapoE4をその環境から取込む神経細胞を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させることを含む、神経突起生長のアポリポタンパク質E4(apoE4)媒介型阻害を低下させる方法であって、該物質が約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、方法。
【請求項１９】
アポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を特異的に少なくとも約10％低下させる物質、および薬学的に許容される賦形剤を含有する、薬学的製剤。
【請求項２０】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項19記載の製剤。
【請求項２１】
前記物質が、apoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、請求項19記載の製剤。
【請求項２２】
アポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を少なくとも約10％低下させる物質であって、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子であり、かつapoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する物質と、薬学的に許容される賦形剤とを含有する薬学的製剤。
【請求項２３】
体液中のapoE4を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させることを含む、体液中のアポリポタンパク質E4(apoE4)ドメイン相互作用を低下させる方法。
【請求項２４】
体液が血清である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
体液が間質液である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
前記物質が、約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
前記物質が、apoE4のArg-61とGlu-255との間の塩橋の形成を阻害する、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
個体における神経突起生長のアポリポタンパク質E4(apoE4)媒介型阻害を低下させる方法であって、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を、それが必要な個体へ投与することを含み、該物質が約50ダルトン〜約2500ダルトンの範囲の分子量を有する有機分子である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、神経細胞リモデリングに作用する化合物、ならびにあるとすれば、神経細胞リモデリングおよび神経突起生長に対するそれらの作用について化合物をスクリーニングためのアッセイ法に関する。より詳細に述べると、本発明は、細胞がapoE3および／またはapoE4の発現に影響を及ぼすように遺伝子操作されている細胞培養アッセイシステム、ならびにこのようなアッセイ法由来の化合物および治療に関する。本発明は更に、apoE4ドメイン相互作用を減少する化合物、およびapoE4に関連した疾患の治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子量34,000のタンパク質であるapoEは、19番染色体上の単一遺伝子の産物であり、apoE2、apoE3およびapoE4と称される3種の主なアイソフォームで存在し、総説については、Mahleyの「Molecular and Genetic Bases of Neurological Disease」第2版(印刷中)；および、Mabley、Science、240:622-630(1988)を参照のこと。異なるアイソフォームは、アミノ酸残基の位置112および158でのアミノ酸置換により生じる。頻出するアイソフォームapoE3は、112位にシステイン残基および158位にアルギニン残基を有する。ApoE4アイソフォームは、apoE3と112位のみが異なり、これはアルギニン残基である。apoE2アイソフォームは、III型高リポタンパク質血症に関連し(MaHley(1988))、apoE3と158位のみが異なり、これはシステイン残基である。ApoE3およびapoE4は、通常低密度リポタンパク質(LDL)受容体に結合するが、apoE2は結合しない。
【０００３】
ApoEは、2個の構造ドメイン：アミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端ドメインを含む。Weisgraber、Adv. Protein Chem.、45:249-302(1994)。各ドメインは、特異的機能に関連している。このアミノ末端ドメインは、リポタンパク質受容体結合領域を含み、かつカルボキシ末端ドメインは、主要脂質結合エレメントを含む。これらふたつのドメインは、アイソフォーム-特異的方法で互いに相互作用し、一方のドメイン内のアミノ酸置換は、他方のドメインの機能に影響するように見え、この現象はドメイン相互作用と称される。ドメイン相互作用は、高密度リポタンパク質(HDL)についてのapoE3の優先性とは対照的に、超低密度リポタンパク質(VLDL)についてのapoE4の優先性に寄与する。この相互作用に関連しているapoE4中の特異的アミノ酸残基は、下記のように同定されている：アミノ末端ドメイン中のアルギニン-61およびカルボキシ末端ドメイン中のグルタミン酸-255。Dongら、J. Biol. Chem.、269:22358-22365(1994)；および、DongおよびWeisgraber、J. Biol. Chem.、271:19053-19057(1996)。
【０００４】
様々な器官の細胞間の脂質再分布により、apoEは、脂質代謝において重要な役割を果たしている。ApoEは、キロミクロンおよびVLDL代謝においてこの全体的輸送機序を発揮するが、これは組織内の細胞間の脂質の局所輸送においても機能する。過剰なコレステロールおよび他の脂質を有する細胞は、apoE-脂質複合体またはapoE含有HDLへこれらの物質を放出することができ、これらは脂質を、増殖または修復のためにそれらが必要な細胞へ輸送することができる。これらのリポタンパク質粒子上のapoEは、LDL受容体またはLRPを介して、それらの相互作用および取り込みを媒介する。
【０００５】
ApoEは、神経生物学的役割を果たしている。ApoE mRNAは、脳内に豊富であり、そこでは主に星状膠細胞により合成されかつ分泌される。Elshourbagyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:203-207(1985)；Boylesら、J. Clin. Invest.、76:1501-1513(1985)；および、Pitasら、Biochem. Biophys. Acta、917:148-161(1987)。脳は、apoE mRNA発現レベルが、肝臓に次いで第二位である。ApoE-含有リポタンパク質は、脳脊髄液中に認められ、かつ中枢神経系(CNS)における脂質輸送において大きな役割を果たしているように見える。Pitasら、J. Biol. Chem.、262:14352-14360(1987)。実際、主要な脳脊髄液リポタンパク質は、apoE-含有HDLである。ApoEに加え脂質給源は、培養物において背根神経節細胞中の顕著な神経突起伸展を促進する。Handelmannら、J. Lipid Res.、33:1677-1688(1992)。末梢神経損傷後に、apoEレベルは劇的に増加する(約250倍)。Mullerら、Science、228:499-501(1985)；および、Ignatiusら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83:1125-1129(1986)。ApoEは、軸索変性後に生成された脂質の捕捉、ならびに軸索再生のための新芽形成している神経突起へのおよびその後の新規軸索の髄鞘再形成のためのシュワン細胞へのこれらの脂質の再分配の両方に関与しているように見える。Boylesら、J. Clin. Invest.、83:1015-1031(1989)；および、Ignatiusら、Science、236:959-962(1987)。
【０００６】
最近になって、apoEは、アルツハイマー病および認知行動に関連づけられた。Saundersら、Neurol.、43:1467-1472(1993)；Corderら、Science、261:921-923(1993)；および、Reedら、Arch. Neurol.、51:1189-1192(1994)。ApoE4は、アルツハイマー病の下記の2種の特徴的神経病理学的病巣に関連している；アミロイドβ(Aβ)ペプチドの沈着を意味する、細胞外神経突起斑、および微小管関連タンパク質である高リン酸化されたタウの線維を意味する、細胞内神経原線維塊。総説については、McKhannら、Neurol.、34:939-944(1984)；Selkoe、Neurone、6:487-498(1991)；Crowther、Curr. Opin. Struct. Biol.、3:202-206(1993)；Roses、Curr. Neurol.、14:111-141(1994)；Weisgraberら、 Curr. Opin. Lipidol.、5:110-116(1994)；および、Weisgraberら、Curr. Opin. Struct. Biol.、4:507-515(1994)参照のこと。
【０００７】
アルツハイマー病は、一般に下記の3種類に分けられる：早期発症型家族性疾患(年齢が60歳以前、21および14番染色体上の遺伝子に関連)；晩期発症型家族性疾患；および、弧発性晩期発症型疾患。最近、両方の晩期発症型は、19番染色体にapoE遺伝子座で関連づけられている。別の結果は、apoE4は、晩期発症型家族性の本疾患の重症度に直接関連していることを示唆している。Roses(1994)。最近、コレステロール降下薬であるスタチン類が、apoE4レベルを低下させることによるアルツハイマー病の治療における使用について示唆されている。国際公開公報第95/06470号。
【０００８】
神経原線維塊は、高リン酸化されたタウの対をなすヘリックス線維であり、神経細胞の細胞質に蓄積する。タウは、微小管関連リンタンパク質であり、これは通常微小管の集成および安定化に参画するが、しかし高リン酸化は、微小管と相互作用するその能力を損なう。タウのapoEによる結合の増大は、アルツハイマー病の治療として示唆されている。国際公開公報第95/06456号。
【０００９】
インビトロにおいて、タウは、apoE3と相互作用するが、apoE4とは相互作用しない。Strittmatterら、Exp. Neurol.、125:163-171(1994)。ApoE3のタウとの相互作用は、その高リン酸化を妨害し、その結果微小管構造および機能を安定化するように通常機能させることができる。ApoE4が存在する場合、タウは、高リン酸化され、その結果失活され、これは神経原線維塊の形成を促進する。
【００１０】
ApoE4は最近、学習能力の減退および記憶障害に関連づけられた。Helkalaら、Neurosci. Letts.、191:141-144(1995)。ApoE4は、記憶障害を有することが示された患者の転帰の強力な予測因子であることはわかっている。ApoE4は、診断よりも、むしろリスク因子として説明されていることに注意。Petersonら、JAMA、273:1274-1278(1995)；および、Feskensら、BMJ、309:1202-1206(1994)。
【００１１】
ApoEは、LDL受容体およびLRPの両方、および疑いなく他の神経細胞上のapoE結合受容体と相互作用する。LRPは、脳損傷またはグリア細胞の新形成物への転換後に増大することはわかっている。Lopesら、FEBS Lett.、338:301-305(1994)。LRPは、先にマクログロブリン受容体として同定された。Stricklandら、J. Biol. Chem.、266:13364-13369(1991)；および、Borth、FASEB J.、6:3345-3353(1992)。ApoEは、LRPとは直接結合しないが、細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)と最初に結合しなければならない。Mahleyら、Curr. Opin. Lipidol.、2:170-176(1991)；および、Jiら、J. Biol. Chem.、269:2764-2772(1994)。LRPは、t-PA、I2-マクログロブリン-プロテアーゼ複合体、トロンボスポンジン-1、Pseudomonas外毒素A、受容体関連タンパク質(RAP)およびラクトフェリンを含む、多くの他のリガンドにも結合する。LRPリガンド結合部位は、少なくとも部分的に説明されている。Orthら、J. Biol. Chem.、269:21117-21122(1994)；Godynaら、J. Cell Biol.、129:1403-1410(1995)；Kounnasら、J. Biol. Chem.、267:12420-12423(1992)；Willnowら、J. Cell Sci.、107:719-726(1994)；Meilingerら、FEBS Lett.、360:70-74(1995)；Warshawskyら、J. Biol. Chem.、268:22046-22054(1993)；および、Willnowら、J. Biol. Chem.、269:15827-15832(1994)。
【００１２】
先に、β-VLDLと一緒の培養物中における背根神経節神経細胞のインキュベーションは、これらの細胞の神経突起成長を、培地単独において増殖された細胞のものと比べて、変更することが示されている。Handelmannら、(1992)。脂質給源(β-VLDLまたは遊離コレステロール)の存在下において、神経突起生長は、特に広範囲の枝分かれ(増大した神経突起伸展はほとんどまたは全くない)により、大きく増強される。β-VLDLが外来性ウサギapoE(112位のシステイン残基の出現に関してヒトapoE3と同等である)により濃厚化された場合、増強された神経突起伸展が認められた。脂質給源は、膜の生合成を増強するように見えるのに対し、脂質給源を伴う過剰なウサギapoEの添加は、長い神経伸展および枝の調整のための切り取り(trimming back)を生じる。さらに神経突起生長に対するapoE4の阻害作用は、微小管重合に関連しているのに対し、apoE3は微小管形成を支持することも認められる。Nathanら、J. Biol.  Chem.、270:19791-19799(1995)。
【００１３】
神経可塑性、新規シナプス結合の存在の維持または形成は、記憶を含む、正常な脳機能について重要である。この過程は、年齢、アルツハイマー病および酸素遮断における、斑沈着および神経原線維塊を含むが、これらに限定されるものではない様々な圧力により、損なわれる。神経細胞リモデリングとの干渉は、痴呆およびアルツハイマー病が極端な例であるような、損なわれた脳機能または神経変性につながる。米国において、アルツハイマー病だけで、およそ400万人が罹患している。この集団の加齢と共に、この数は今後20年間に3倍になると見積もられている。アルツハイマー病の現在の医療保険コストは、米国だけでも年間900億ドルと見積もられている。この疾患の平均発症が例え10年遅れるだけでも、社会の経済的負担、ならびに患者の家族の経済的および心理的負担は、劇的に低下すると思われる。
【００１４】
一旦不可逆的変性性カスケードが始まると、中枢および末梢神経系の機能不全に抵抗する(およびより重要なことには逆行する)有効な療法はない。同様に、誘導されたストレスが痴呆に比べ破滅性が少ないかまたは部分的に可逆的作用を有する場合、正常な中枢および末梢神経系の機能を回復する療法は現時点ではない。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、神経細胞リモデリングに影響を及ぼす物質を同定する方法、およびこれらの方法により同定された物質を提供する。本発明は更に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を提供する。本発明の物質は、apoE4に関連した障害を治療するのに有用である。本発明は更に、この物質を含有する薬学的組成物を提供する。本発明は更に、apoE4に関連した障害を治療する方法を提供する。
【００１６】
組成物が試験化合物の神経細胞リモデリングに影響を及ぼす能力を決定するアッセイ法により同定される、神経学的障害を治療するための組成物および療法が明らかにされている。詳細には、このアッセイ法は、神経細胞リモデリング、および神経突起生長に対し作用をもたらす方法で、apoE3および／またはapoE4のようなアポリポタンパク質の異なるアイソフォームの発現に影響を及ぼすように操作される、細胞培養に関連している。アポリポタンパク質E3-豊富なリポタンパク質は、生長および微小管安定性を刺激するのに対して、apoE4-豊富なリポタンパク質は、生長を阻害しかつ微小管を破壊する。神経細胞リモデリングおよび神経突起生長の阻害は、ある種の中枢神経系疾患に密に関連しているので、このアッセイ法は、このような疾患の治療における可能性のある効能についての化合物のスクリーニングに有用である。神経生長および微小管安定性を刺激する化合物は、このような化合物で中枢神経系を治療する方法として明らかにされている。ApoE3およびapoE4の示差的蓄積は、主に細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)により媒介される。ApoE3およびapoE4両方の保持(retention)は低下され、かつapoE3およびapoE4の示差的蓄積は、(1)プロテオグリカンを発現していない細胞およびHSPGを特異的に発現していない細胞において、ならびに(2)ヘパリナーゼ処理したHSPG-発現している細胞においては失われる。
【００１７】
本明細書において提供された結果は、アポリポタンパク質ならびにこれらのタンパク質の異なるアイソフォームの示差的取り込みおよび／または発現は、神経細胞成長に影響を及ぼし、かつそれ自体神経疾患において重要な役割を果たすことを明確に示している。更に、本明細書に示された結果は、一般的プロテオグリカンおよび詳細にはヘパリン硫酸プロテオグリカンが、apoE3およびapoE4の示差的蓄積に影響を及ぼすことを明らかにしている。従ってこれらの結果は、妨害されたまたは増強されたかのいずれかの神経細胞成長を模倣するように遺伝子操作された細胞株を含むアッセイ法の作成を可能にし、これにより、化合物の治療薬としての効能またはそれらの神経細胞成長に及ぼす可能性のある有害作用について、化合物をアッセイすることを可能にする。
【００１８】
本発明のアッセイシステムおよびトランスフェクションされた細胞株は、神経障害を治療する可能性のある治療的化合物をスクリーニングするためのみに使用するのではなく、どの化合物が神経細胞に対して有害作用を有するかを予想しかつそのようなものを避けることを決定するためにも使用することができる。
【００１９】
本発明は更に、apoE4に結合しおよびapoE3に影響することなくドメイン相互作用を低下させる化合物を提供する。このような化合物は、apoE4をより「apoE3-様」なものとし、その結果、神経障害、神経変性障害、および高脂血症により引き起こされた障害、例えば心臓血管障害を含むapoE4関連障害の治療に有用である。
【００２０】
本発明は更に、apoE4に関連した障害の治療法を提供する。一部の態様において、これらの方法は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる化合物の投与を含む。ApoE4に関連した障害は、神経障害および心臓血管障害を含む。
【００２１】
本発明の目的は、神経疾患の治療などにおいて使用する化合物、組成物および方法を提供することである。
【００２２】
別の本発明の目的は、化合物を神経突起生長に作用するそれらの能力について試験するためのアッセイ法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、apoE3およびapoE4の示差的細胞蓄積に影響を及ぼす化合物および組成物に加え、化合物のアッセイ法を提供することである。
【００２４】
別の目的は、細胞-表面HSPGに影響を及ぼす化合物および組成物に加え、化合物のアッセイ法を提供することである。
【００２５】
別の目的は、細胞におけるapoEの内在化および蓄積に影響を及ぼす化合物および組成物に加え、化合物のアッセイ法を提供することである。
【００２６】
具体的目的は、これらの細胞がそれらのapoEタンパク質の発現およびスクリーニングアッセイ法における細胞培養物の使用に関して遺伝子操作された細胞培養物を提供する。
【００２７】
本発明の利点は、細胞培養物は、化合物の神経突起生長に対する作用の明確な指標を提供することである。
【００２８】
本発明の別の利点は、どの化合物が、それらの神経突起生長の阻害のために有害である可能性があるか、ならびにどの化合物がそれらの神経突起生長の増強のために治療的可能性があるかを決定するために使用することができる。
【００２９】
本発明の特徴は、apoEタンパク質の異なるアイソフォームを発現している遺伝子が、個別に影響され得ることである。
【００３０】
本発明は、apoE4ドメイン相互作用を妨害する点で有効である化合物を同定する方法も含む。これらの方法は、極微量の125I-標識したapoEを血漿に添加する工程、様々な血漿リポタンパク質画分をゲルろ過により分離する工程、およびリポタンパク質の種類間の125I-標識の分布を決定する工程を含む、血漿分布アッセイ法により例証される。例えば、Dongら、J. Biol. Chem.、269:22358-22365(1994)参照。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的、利点および特徴は、添付された図面と共に本説明を読むことで、当業者には明らかであると思われる。
【００３２】
定義および略号
本発明のアッセイ法および方法を明らかにしかつ説明する前に、本発明は、特定の細胞株、試薬などに限定されず、アッセイ法または方法はそれ自体当然変動することができることは理解されるべきである。本発明の範囲は添付された「特許請求の範囲」によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の態様を説明する目的についてのみであり、限定を意図しないことも理解されるべきである。
【００３３】
特に定義しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の通常の業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において説明されたものと同類または同等の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書において言及された全ての刊行物は、引用された刊行物に関連した方法および／または材料の開示および説明に関して、本明細書に参照として組入れられている。
【００３４】
本明細書において記載した刊行物は、本明細書の出願日以前の開示のみが提供される。本発明は、先行する発明により、このような刊行物に先行して権利を与えないことを承認するものとして本明細書において構成されるものではない。更に提供された刊行物の日付は、刊行物の実際の日付が本明細書に提供されたものと異なる場合は、変更することができる。
【００３５】
下記の略号を使用した：
apoE3、アポリポタンパク質3；
apoE4、アポリポタンパク質4；
CHO、チャイニーズハムスター卵巣；
DiI、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン；
DMEM、ダルベッコの改変イーグル培地；
FBS、ウシ胎仔血清；
FGF、線維芽細胞増殖因子；
GPI、グリセロホスファチジルイノシトール；
HSPG、ヘパリン硫酸プロテオグリカン；
LDL、低密度リポタンパク質；
LRP、LDL受容体-関連タンパク質；
PBS、リン酸緩衝生理食塩水；
SDS-PAGE、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；
TCA、トリクロロ酢酸；
VLDL、超低密度リポタンパク質。
【００３６】
本明細書において使用される「apoE4-関連障害」は、細胞、血清、間質液、脳脊髄液、またはいずれか他の個体の体液中のapoE4の存在により引き起こされる障害；apoE4ドメイン相互作用により影響を受ける生理的プロセスまたは代謝事象；apoE4の存在により特徴付けられる障害；細胞または体液中のapoE4の存在により引き起こされた障害の症状；apoE4の細胞または体液中の存在により引き起こされる障害に関連した現象；および、apoE4の存在により引き起こされた障害の後遺症である。ApoE4-関連障害は、apoE4-関連神経障害および高い血清脂質レベルに関連した障害を含む。ApoE4-関連した神経障害は、弧発性アルツハイマー病；家族性アルツハイマー病；卒中後の転帰不良；外傷性頭部損傷後の転帰不良；および、脳虚血を含むが、これらに限定されるものではない。ApoE4-関連神経障害に関連した現象は、神経原線維塊；アミロイド沈着；記憶喪失；および、認知機能の低下を含むが、これらに限定されるものではない。高い血清脂質レベルに関連したapoE4-関連障害は、アテローム性動脈硬化症、および冠動脈疾患を含むが、これらに限定されるものではない。このようなapoE4-関連障害に関連した現象は、高い血清コレステロールレベルを含む。
【００３７】
本明細書において使用される「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬学的および／または生理学的作用を得ることを意味する。この作用は、それらの疾患または症状の完全なまたは部分的ま防止において予防的であることができ、ならびに／または疾患および／もしくは該疾患に寄与し得る有害事象の部分的または完全な治癒に関して治療的であることができる。本明細書において使用される「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を範囲としており、かつ以下を含む：(a)疾患の素因を有するが、まだ疾患を有するとは診断されていない対象において疾患の発生を予防すること；(b)疾患を阻害、すなわちその発症を阻止すること；および、(c)疾患を緩和、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。
【００３８】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、マウス、サル、ヒト、哺乳類家畜、哺乳類競技用動物、および哺乳類ペットを含む哺乳類に関して、本明細書において互換的に使用される。
【００３９】
好ましい態様の詳細な説明
ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質
本発明は、apoE4ドメイン相互作用に作用する物質、およびこのような物質を含有する組成物を提供する。ApoE4ドメイン相互作用を低下させることにより、apoE4は、より「apoE3-様」となり、かつapoE4の望ましくない作用が減少する。ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4-関連神経障害の治療に有用である。ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は同じく、例えば心臓血管障害のような、高い血清脂質レベルに関連したapoE4-関連障害の治療にも有用である。
【００４０】
ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、arg-61とglu-255の間の塩橋の形成を阻害する物質である。関心のある物質は、この物質が存在しない場合のapoE4ドメイン相互作用と比べ、apoE4ドメイン相互作用を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％またはそれ以上、最大100％まで低下させるものである。
【００４１】
目的の物質は、apoE3構造に実質的に影響を及ぼすことなく、apoE4ドメイン相互作用に影響するものであり、すなわち、このapoE4ドメイン相互作用に対する作用は、apoE4に特異的である。多くの態様において、関心のある物質は、細胞傷害性でないものである。物質が細胞傷害性であるかどうかは、トリパンブルー色素排除試験を含むが、これらに限定されるものではない公知の方法のいずれかを用いて決定することができる。多くの態様において、関心のある物質は、apoE4タンパク質を変性しない。物質がapoE4タンパク質を変性するかどうかは、円偏光二色法を含むが、これらに限定されるものではない公知の方法のいずれかを用いて決定することができる。物質が特異的にapoE4ドメイン相互作用を低下させるかどうかは、実施例7に説明したような乳剤結合アッセイ法のようなアッセイ法を用いて決定することができる。
【００４２】
一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4分子をより「apoE3-様」とし、例えばapoE4分子はapoE3活性を有する。従って、一部の態様において、本発明は、apoE4分子を、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触させることを含む、apoE4活性をapoE3活性へ転換する方法を提供する。「apoE4活性」および「apoE3活性」の特徴は、特定のリポタンパク質クラスについてのこのアポリポタンパク質の結合優先性；インビトロおよび／またはインビボにおけるタウタンパク質への結合；および、Aβタンパク質への結合を含むが、これらに限定されるものではない。一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4活性をapoE3活性へ転換し、その結果apoE4がapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質と接触した場合に、これはapoE4の特徴を、この物質が存在しない場合のapoE4の特徴と比べて、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれ以上低下させる。
【００４３】
ApoE4は、VLDLに対する結合優先性を有するが、apoE3は、HDLに対する結合優先性を有する。典型的には、血漿リポタンパク質が、標識されたapoE4およびapoE3に結合させられる場合には、結合したタンパク質は分画され、かつ各画分中のapoE4およびapoE3の量が測定され、VLDL、IDL/LDL、およびHDL画分中のapoE4の量は、各々、約35％、約23％、約42％であるが、これらの各画分中のapoE3の量は、各々、約20％、約20％、約60％である。従って一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4をHDLに対する結合優先性を有するようにする。ApoE4がapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質に接触した場合に、VLDLに勝るHDLへの結合優先性を有するかどうかは、公知のアッセイ法を用いて決定することができる。ひとつの限定的でない例として、Dongら(J. Biol. Chem.、269:22358-22365(1994))の説明したアッセイ法がある。例えば、検出できるように標識されたapoE4およびapoE3(例えば、125Iで標識)を含む試料は、血漿と約37℃で約2時間混合され、その後これらの試料は、様々なリポタンパク質クラスに分画され(例えばクロマトグラフィーにより)、かつ各画分中の標識の量が決定される。
【００４４】
ApoE3はインビトロにおいてタウと相互作用するが、apoE4は作用しない。一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4のインビトロおよび／またはインビボにおけるタウとの結合を引き起こす。タンパク質がインビトロにおいて、例えばapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の存在下において、タウと結合するかどうかは、タンパク質-タンパク質相互作用を測定または検出するための標準アッセイ法を用いて決定することができる。アッセイ法の非限定的例は、Strittmatterら、Exp. Neurol.、125:163-171(1994)に提供されている。
【００４５】
多くの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、小有機分子であり、一般にはサイズ範囲が約50ダルトン〜約2500ダルトン、約100ダルトン〜約2000ダルトン、約200ダルトン〜約1500ダルトン、約300ダルトン〜約1250ダルトン、または約500ダルトン〜約1000ダルトンである。
【００４６】
「物質(agent)」、「物(substance)」および「化合物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。候補物質は、多くの化学的クラス、典型的には合成、半合成、または天然の無機もしくは有機分子を包含している。候補物質は、分子量が約50ダルトンより大きいおよび約2,500ダルトン未満である小有機化合物であることができる。候補物質は、例えばファンデルワール相互作用、水素結合などの、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含むことができ、かつアミン、スルホアルキル、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含むことができ、かつ前述の官能化学基を少なくとも2個含むことができる。候補物質は、1個または複数の前記官能基で置換された環式炭素またはヘテロ環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことができる。候補物質は、生体分子間で認めることもでき、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはそれらの組合せを含む。
【００４７】
候補物質は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な給源から得られる。例えば、多くの手段が、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび方向付けられた合成について利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然の化合物のライブラリーは、入手可能であるかまたは容易に作成される。加えて、天然または合成的に作成されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段を通じ、容易に修飾され、かつコンビナトリアルライブラリーを作成するために使用することができる。
【００４８】
薬理学的物質は、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、方向付けたまたはランダムおよび／または方向付けた化学修飾を施し、構造アナログを生成することができる。このような構造アナログは、バイオアベイラビリティを増大するものおよび／または細胞傷害性を低下させるものを含む。当業者は、多種多様な構造アナログを容易に構想しかつ生成し、ならびにこれらを増大したバイオアベイラビリティおよび／または低下した細胞傷害性のような所望の特性および／または血管脳関門を通過する能力について試験することができる。
【００４９】
一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる化合物は、構造的に関連した化合物ファミリーのメンバーであり、ブロックされたアミノ酸；ジスルホン酸塩；色素；モノ硫酸塩；および、モノスルホアルキル化合物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
特定の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる化合物は、Z-D-Tyr(BZL)-OH、アゾカルミンG、グリシンクレゾールレッド、エリスロシンB、5-クロロ-2-(4-クロロ-2-(3,4-ジクロロ)フェニルウレイド、RCL S19,214-7、3-ブチル-1-エチル-5-2-(3-スルホブチル-ベンゾ(1,3)オキシアゾ、または前述のいずれかの構造アナログからなる群から選択される。
【００５１】
多くの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経突起生長のapoE4媒介型阻害を低下させる。化合物が、神経突起生長のapoE4媒介型阻害を低下させるかどうかは、本明細書に説明されたような神経突起生長アッセイ法を使用し決定することができる。一般に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経突起生長のapoE4媒介型阻害を、apoE4存在下および該物質非存在下での神経突起生長と比べ、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、またはそれ以上低下させる。
【００５２】
ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を同定するために、多くの方法が利用可能である。ひとつの限定的でない例として、apoE4のN-末端ドメインに結合する化合物を同定するためにコンピュータモデリングを使用することができる。コンピュータモデリングプログラムは、当該技術分野において公知であり、実施例7に説明されたようなDOCKプログラムを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
コンピュータモデリングを基にしたapoE4のN-末端ドメインに結合する化合物は、更に、例えば機能アッセイ法により評価することができる。機能アッセイ法は、乳剤結合アッセイ法(実施例7に説明されたような)、LDL受容体への結合を測定するアッセイ法、LRPへの結合を測定するアッセイ法、HSPGへの結合を測定するアッセイ法、および神経突起生長アッセイ法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
同じく個体において神経原線維塊の形成も減少するapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質も目的である。これらの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下しかつ神経原線維塊の形成を減少する物質は、該物質非存在下での神経原線維塊の形成と比べ、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％、神経原線維塊の形成を低下させる。神経原線維塊の形成が減少されるかどうかは、例えば、アルツハイマー病の実験動物モデルを用いて決定することができ、ここでこの動物は、ヒトapoE4を合成し、その結果として神経原線維塊を形成する。米国特許第6,046,381号を参照のこと。
【００５５】
ApoE4は、神経細胞によるAβ生成を増強する。多くの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる対象物質は、apoE4の神経細胞におけるAβ生成を増強する能力を低下させる。これらの態様において、対象物質は、apoE4タンパク質と接触した場合、apoE4の神経細胞においてAβ生成を増強する能力を、該物質と接触しないapoE4と比べ、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれ以上低下させる。物質がapoE4の神経細胞におけるAβ生成を増強する能力を低下させるかどうかは、本明細書に説明されたアッセイ法を用いて決定することができる。
【００５６】
所望の程度apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、標準アッセイ法を用いて、細胞のアベイラビリティ、細胞傷害性、生体適合性、血管脳関門を通過する能力などについても評価することができる。
【００５７】
本発明は更に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を含有する組成物を提供する。これらの組成物は、緩衝剤を含有することができ、これはこの物質の望ましい用途に応じて選択され、かつ更に意図された用途に適当な他の物質を含有することができる。当業者は、多種多様なものが当該技術分野において公知であり、意図された用途に適しているような適当な緩衝剤を容易に選択することができる。場合によっては、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含有することができ、多種多様なそれが、当該技術分野において公知でありかつ本明細書において詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、様々な刊行物において十分に考察されており、これは例えば、A. Gennaroの「レミントン薬科学(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)」第19版(1995)、Lippincott, Williams, & Wilkinsがある。
【００５８】
製剤、用量、および投与経路
本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を含有する薬学的製剤を含む、製剤を提供する。一般に、製剤は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量含有する。「有効量」は、望ましい結果、例えばapoE4ドメイン相互作用の低下、神経突起生長の増大、血清脂質レベルの低下、心疾患リスクの低下などを生じるのに十分な用量を意味する。一般に望ましい結果は、少なくとも対照と比較した場合のapoE4ドメイン相互作用の低下である。ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、下記により詳細に説明されるように、血管脳関門を避けるような方法で送達することができる。ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、下記により詳細に説明されるように、物質が血管脳関門を通過することができるように処方および／または修飾することができる。
【００５９】
処方
本方法において、活性物質は、望ましいapoE4ドメイン相互作用の低下を生じることが可能である都合の良い手段を用い、宿主へ投与することができる。従って、この物質は、治療的投与のために、様々な製剤へ混入することができる。より詳細に述べると、本発明の物質は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより、薬学的組成物へ処方することができ、かつ錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルのような、固形、半固形、液体または気体の形状の調製物に処方することができる。
【００６０】
薬学的剤形において、これらの物質は、それらの薬学的に許容される塩の形状で投与することができ、もしくはこれらは単独でまたは他の薬学的活性のある化合物との適当な結合、更には組合せにおいて使用することができる。下記の方法および賦形剤は、単なる例であり、限定するものではない。
【００６１】
経口調製物について、これらの物質は、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するために、単独でまたは適当な添加剤と組み合わせて、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンのような、通常の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような、結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような、崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような、滑沢剤；ならびに望ましいならば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および矯味矯臭剤と共に、使用することができる。
【００６２】
これらの物質は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールのような、水性または非水性溶媒中にそれらを溶解、懸濁または乳化し；および望ましいならば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤などの通常の添加剤と共に、注射用調製物に処方することができる。
【００６３】
これらの物質は、吸入により投与されるエアロゾル製剤において使用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、加圧された許容される噴射剤に処方することができる。
【００６４】
更にこれらの物質は、乳化基剤または水溶性基剤のような様々な基剤と混合することにより、坐剤を製造することができる。本発明の化合物は、坐剤により直腸に投与することができる。これらの坐剤は、体温で融解するが室温では凝固されている、ココアバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビヒクルを含むことができる。
【００６５】
シロップ剤、エリキシル剤および懸濁化剤のような、経口または直腸投与のための単位剤形は、各単位用量、例えば小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤または坐剤1錠が、1種または複数のインヒビターを含有する組成物の予め定められた量を含有するように提供することができる。同様に、注射または静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水または他の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中にインヒビター(複数)を含有することができる。
【００６６】
本明細書において使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象への単一の用量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、望ましい作用を生じるのに十分量の算出された本発明の化合物の予め決められた量を、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと共に含有する。本発明の新規単位剤形の規格は、使用される特定の化合物および達成されるべき作用、ならびに宿主における各化合物に関連した薬物動態学によって決まる。
【００６７】
他の投与形態も、本発明での使用が認められると思われる。例えば、本発明の物質は、坐剤において、場合によってはエアロゾルおよび点鼻組成物において処方することができる。坐剤については、ビヒクル組成物は、従来の結合剤および担体、例えばポリアルキレングリコール、またはトリグリセリドを含む。このような坐剤は、約0.5％〜約10％(w/w)、好ましくは約1％〜約2％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。
【００６８】
点鼻製剤は、通常鼻粘膜への刺激を引き起さず、繊毛機能を著しく破壊しないようなビヒクルを含むと考えられる。水、水性生理食塩水または他の公知の物質のような希釈剤は、本発明において使用することができる。点鼻製剤は、更にクロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムであるが、これらに限定されるものではない保存剤も含有することができる。界面活性剤は、鼻粘膜による本タンパク質の吸収を増強するために存在することができる。
【００６９】
本発明の物質は、注射可能なものとして投与することができる。典型的には、注射可能な組成物は、液体または懸濁液として調製され；注射前に、液体ビヒクル中の液体または懸濁液とするのに適した固形型として調製することもできる。この調製物は、乳化することもでき、かつ活性成分はリポソームビヒクル中に封入される。
【００７０】
適当な賦形剤ビヒクルは、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、望ましいならば、このビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤のような、少量の補助物質を含有することができる。このような剤形を調製する実際の方法は当業者には公知であるか、または明らかであると思われる。例えば、「レミントンの薬科学」、Mack Publishing Company、イーストン、ペンシルバニア、第17版、1985を参照のこと。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療される対象において所望の状態に達成するのに適した物質の量を含有すると考えられる。
【００７１】
薬学的に許容される賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は、公に容易に利用可能である。更に、薬学的に許容される補助的物質、例えばpH調節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定剤、湿潤剤などは、公に容易に利用可能である。
【００７２】
用量
使用される用量は、達成されるべき臨床目的に応じて変動するが、適当な用量範囲は、約1μg〜約1,000μgまたは約10,000μの、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を提供するものであり、単回で投与することができる。あるいは、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の目標用量は、該物質の投与後最初の24〜48時間内に採取した宿主血液検体中に、ほぼ約0.1〜1000μM、約0.5〜500μM、約1〜100μM、または約5〜50μMの範囲であると考えられる。
【００７３】
当業者は、投与量レベルは、特定の化合物、症状の重症度および対象の副作用の易罹患性の関数として変動することができることを容易に理解すると思われる。所定の化合物の好ましい用量は、様々な手段により当該技術分野において容易に決定することができる。
【００７４】
投与経路
ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、インビボおよびエクスビボ法に加え、全身および局所的投与経路を含む、薬物送達に適当な利用可能な方法および経路を用いて個体に投与することができる。
【００７５】
従来型で薬学的に許容される投与経路は、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所塗布、静脈内、直腸内、経鼻的、経口的および他の非経口的投与経路を含む。投与経路は、組み合わせることができ、望ましいならば、物質および／または所望の作用に応じて調節することができる。これらの組成物は、単回投与または反復投与により投与することができる。
【００７６】
この物質は、いずれか利用可能性のある通常の方法、ならびに全身経路および局所的経路を含む通常の薬物の送達に適した経路を使用することにより、宿主に投与することができる。一般に、本発明により企図された投与経路は、経腸、非経口、または吸入経路を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００７７】
吸入投与以外の投与の非経口経路は、局所的、経皮的、皮下、筋肉内、眼内、被膜内、髄腔内、胸骨内および静脈内の経路、すなわち、消化管以外のいずれかの投与経路を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。非経口投与は、物質の全身または局所的送達に作用するように実施することができる。全身送達が望ましい場合、投与は典型的には、薬学的調製物の侵襲的または全身的に吸収された局所的または経粘膜投与に関連している。
【００７８】
この物質は、経腸投与により対象へ送達することもできる。投与の経腸経路は、経口および経直腸的(例えば、坐剤の使用)送達を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
皮膚または粘膜を通したこの物質の投与法は、適当な薬学的調製物の局所的塗布、経皮的浸透、注射および表皮投与を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。経皮的浸透に関して、吸収促進剤またはイオントホレシスは、適した方法である。イオントホレシス浸透は、数日またはそれ以上の期間にわたり破壊されていない皮膚を通して電気パルスにより連続的にそれらの製品を送達する市販の「貼布剤」を用いて実現することができる。
【００８０】
治療とは、少なくとも宿主を苦しめる病態に関連した症状の改善を意味し、ここで改善は、apoE4-関連神経障害およびそれに関連した疼痛のような、治療されるべき病態に関連したパラメータ、例えば症状の大きさを少なくとも縮小することを意味するように広い意味で使用される。そのように、治療は更に、病態、または少なくともそれに関連した症状が、完全に阻害される、例えば発生が妨害されるか、または停止される、例えば終結され、その結果宿主は最早その病態に、または少なくともその病態を特徴づける症状に罹患していないような状況を含む。
【００８１】
様々な宿主(本明細書において「宿主」は、「対象」および「患者」」という用語と互換的に使用される。)は、本方法に従い治療可能である。一般にこのような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここでこれらの用語は、肉食動物(例えば、イヌおよびネコ)、齧歯類(例えば、マウス、モルモット、およびラット)、および霊長類(例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル)を含む、哺乳動物綱内の生物を説明するために広く使用される。多くの態様において、宿主はヒトでありうる。
【００８２】
例えば経口または注射可能な用量である、活性物質の単位用量を伴うキットが提供される。このようなキット内には、単位用量を含む容器に加え、関心のある病態の治療における該薬物の用法および付随する恩恵を説明している情報に富む添付文書が含まれる。
【００８３】
アッセイ法
本発明は更に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を同定するための方法を提供する。この方法は一般に、apoE4を試験物質と接触させること、存在するならばapoE4ドメイン相互作用への物質の作用を決定することに関する。
【００８４】
「候補物質」、「試験物質」、「物」および「化合物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。候補物質は、多くの化学的クラス、典型的には合成、半合成または天然の無機または有機の分子を包含している。候補物質は、50ダルトンより大きくかつ約2,500ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物であることができる。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むことができ、かつ少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含むことができ、かつこれらの官能化学基の少なくとも2個含むことができる。これらの候補物質は、1個または複数の前記官能基により置換された環式炭素またはヘテロ環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことができる。候補物質は、更にペプチド、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはそれらの組合せを含む生体分子中に見出すことができる。
【００８５】
候補物質は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む、多種多様な給源から得られる。例えば、多くの手段は、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび方向付けられた合成のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、もしくは容易に作成される。加えて、天然または合成的に作成されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段により、容易に修飾され、かつコンビナトリアルライブラリーを作成するために使用することができる。公知の薬学的物質は、構造アナログを作成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような、方向付けられたまたはランダムな化学修飾を施すことができる。
【００８６】
候補物質は、更に本明細書に説明されたように、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を同定するためにコンピュータモデリングプログラムを用いて選択される。
【００８７】
一部の態様において、これらの方法は、細胞を試験物質およびapoE4と接触し、この細胞は、apoE4と接触された場合にAβタンパク質を分泌すること；および、試験物質が存在するならば、試験物質の細胞により分泌されたAβレベルに対する作用を、適当な対照と比べ、決定することに関連している。これらの態様において、これらの方法は、apoE4と接触した場合に、Aβタンパク質を、apoE4とインキュベーションしないか、またはapoE3とインキュベーションする場合に同じ細胞により分泌されたAβのレベルよりも高いレベルで分泌する神経細胞などの、細胞の使用に関連しており、例えば、これらの細胞は、apoE4と共にインキュベーションされた場合にAβを過剰生成する。神経細胞は、apoE4と接触した場合に、Aβタンパク質を、apoE4とインキュベーションしないか、またはapoE3とインキュベーションする場合に同じ細胞により分泌されたAβのレベルよりも、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％またはそれ以上のレベルで分泌する。
【００８８】
細胞のapoE4とのインキュベーション時にAβを分泌する神経細胞を使用することができる。典型的にはこの細胞は、apoE4とインキュベーションされない細胞により産生されたAβよりもより高いレベルで、および／またはapoE3とインキュベーションされた細胞により産生されたAβよりもより高いレベルで、apoE4とのインキュベーションに反応してAβを分泌するものである。一部の態様において、神経細胞株のような細胞株が使用され、この細胞株は、APPをコードしているヌクレオチド配列を含む構築体により一過性にまたは安定してトランスフェクションされる。適当な神経細胞株は、B103、PC12、NG108などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
APPをコードしているヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知であり、かつ十分に説明されている。例えば、APPをコードしているヒトcDNAは、GenBankアクセッション番号NM_000484；および、D87675において認められる。一般に、APP-コード領域(例えばcDNA配列)は、発現ベクターに挿入され、ここでこのコード領域は、適当なプロモーターおよび追加の制御エレメントに機能的に連結され、これは当該技術分野において周知である。発現ベクターは、当業者に周知の多くの刊行物において十分に説明されており、これは例えば、「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)、F. Ausubelら編集、Wiley & Sons社を含む。発現ベクターは、選択(例えばヒグロマイシン耐性)を提供するエレメントを含んでもよい。
【００９０】
神経細胞株は、APP-コードしている構築体により、周知の方法を用いて、安定してまたは一過性にトランスフェクションされる。例えば構築体は、電気穿孔、トランスフェクション、リポフェクション、またはいずれか他の公知の方法を用い、神経細胞株に導入することができる。
【００９１】
ApoE4は、該物質と最初に接触し、次に、約15秒〜約30秒、約30秒〜約1分、約1分〜約15分、約15分〜約60分またはそれ以上の期間の後に、該物質と接触されたapoE4は、神経細胞と接触される。あるいは、apoE4、物質および神経細胞は、実質的に同時に接触することができる。神経によるAPP産生のレベルは、公知の方法を用いて決定することができ、これはAβに対する特異的抗体を使用するELISAアッセイ法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
関心のある物質は、適当な対照と比較し、神経細胞中のapoE4により刺激されたAβ生成の増加を低下させるものである。適当な対照は、試験物質の非存在下でapoE4と接触された神経細胞により産生されたAβレベルを含む。関心のある試験物質は、更にapoE4に関連した障害を治療する際のその適合性について評価される。関心のある試験物質は、apoE4により刺激されたAβ生成を、試験物質の非存在下でapoE4と接触した神経細胞により産生されたAβのレベルと比較して、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上、低下させるものである。一部の態様において、関心のある物質は、apoE4により刺激されたAβ生成を、apoE3と接触された同じ神経細胞により産生されたAβのレベルに低下させる。
【００９３】
ApoE4関連性の神経障害を治療する方法
本発明は更に、apoE4神経障害を治療する方法を提供する。一部の態様において、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質をそれが必要な個体に有効量投与することを含む、apoE4を合成する宿主細胞において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、例えば血清、脳脊髄液または間質液など、細胞外にあるapoE4においてapoE4ドメイン相互作用を低下させる方法を提供する。一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経突起生長を増大するのに有効なものである。別の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、卒中後に改善された転帰を生じるものである。一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経突起生長の増大に有効なものである。別の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、外傷性頭部損傷後に改善された転帰を生じるものである。他の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、アルツハイマー病の発症のリスクを低下させるものである。別の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、アルツハイマー病に関連した症状または現象を低下させるものである。これらの態様のいくつかにおいて、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経原線維塊の形成を低下させるものである。別の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、個体に投与された場合に、個体の脳内のアミロイド沈着の減少を生じるものである。
【００９４】
一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、神経原線維塊の形成またはAβ沈着のような、ADに関連した症状を、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上低下させる。別の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、記憶または認識機能のような、ADの個体において下降するパラメータを、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれ以上改善し、これらのパラメータのひとつの下降は、少なくとも減速される。
【００９５】
神経細胞は、apoE4それ自身を産生することができる。あるいは、またはそれに加え、神経細胞は、それらの環境からapoE4を、例えば星状膠細胞およびグリア細胞のような支持細胞(supporting cell)により産生されかつ間質液へと分泌されたapoE4を取り込む。
【００９６】
一部の態様において、本発明の方法は、apoE4を産生する神経細胞および／またはその環境からapoE4を取り込む神経細胞、すなわちapoE4の検出可能量が認められる神経細胞において、apoE4ドメイン相互作用を低下させることにおいて有効である。本発明の方法を使用する治療に順応しやすい神経細胞は、48時間内に、総細胞タンパク質1mg当たり約1ng〜約1000ng(またはそれ以上)、約5ng〜約500ng、約10ng〜約100ngのapoE4を産生または取り込むものである。
【００９７】
別の態様において、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量個体に投与することを含む、個体において神経原線維塊の形成を阻害する方法を提供する。神経原線維塊の形成が阻害されたかどうかは、例えばアルツハイマー病(AD)の実験動物モデルにおいて決定することができる。ADの実験動物モデルは、当該技術分野において説明されており；いずれか公知のADの動物モデルを用い、本発明の物質が神経原線維塊の形成を阻害するかどうかを決定することができる。例えば、米国特許第6,046,381号参照のこと。このような動物モデルは更に、アミロイド沈着、および認知能力のような他の現象が、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質により影響され得るかどうかを決定するために使用することもできる。apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質が、神経原線維塊の形成および／またはAβ沈着を低下させるかどうかも、ヒトにおいて、脳生検標本の免疫組織化学染色を含むが、これらに限定されるものではない、公知の方法を用い決定することができる。
【００９８】
別の態様において、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量個体に投与することを含む、ADを治療する方法を提供する。AD発症のリスクがあることがわかっている個体は、本発明の方法を使用する治療に反応しやすい。従ってapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、apoE4についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるが、アルツハイマー病または他の神経変性障害の明白な症状を示していない患者における予防的使用に適している。これらの方法は、既にADの症状を示している個体の治療においても有用であり、ここでこの方法は、本疾患の利点を低下させることによりADを治療し、またはADに関連した症状の重症度を低下させる。ADの進行を低下させるかまたはAD-関連した症状の重症度を低下させるかどうかは、認知機能および記憶を含むが、これらに限定されるものではない、ADに関連した症状またはパラメータをアッセイすることにより決定することができる。このような決定は、当該技術分野において公知の標準の方法を使用し、十分に当業者の能力内である。
【００９９】
一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、卒中患者または外傷性頭部損傷を受けた個体のようなそれが必要な個体に投与した場合に、個体に関する臨床の転帰を改善するものである。ApoE4ドメイン相互作用を低下させる物質が、卒中または外傷性頭部損傷に罹患した個体に投与された場合に、この物質が卒中または外傷性頭部損傷の後に改善された転帰を生じるかどうかは、利用可能な卒中または外傷性頭部損傷の動物モデルを用い決定することができる。例えば脳虚血により引き起こされた神経損傷のような、神経損傷の齧歯類モデルは、外傷性事象により引き起こされた神経損傷の程度に対するapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の(on)作用に加え、神経細胞リモデリング、修復およびそのような発作からの回復におけるそれらの役割を決定するために試験することができる。全虚血および限局性虚血の両方の脳虚血の齧歯類モデルは、脳虚血の出現を制御する機序および虚血性事象により引き起こされた損傷の治療に関する可能性のある治療的戦略の研究に有用である。通常一過性である全虚血の動物モデルは、広範に罹患した脳領域を有するが、典型的には選択的に脆弱な脳領域において神経の変質を有する。このようなモデルの例は、前脳虚血の2種の血管閉塞モデル、前脳虚血の4種の血管閉塞モデル、および上昇した脳脊髄液圧に関連した虚血モデルを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、GinsbergおよびBusto、Stroke、20:1627-1642(1989)参照。
【０１００】
高脂血症に関連したapoE4関連性障害を治療する方法
本発明は更に、上昇した血清脂質レベルに関連したapoE4-関連障害を治療する方法を提供する。これらの方法は一般に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の有効量を個体に投与することを含む。
【０１０１】
一部の態様において、本発明は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を投与することを含む、血清コレステロールレベルを低下させる方法を提供する。これらの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、個体に投与された場合に、個体において血清コレステロールレベルを、該物質を投与しない個体の血清コレステロールに比べ、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、または少なくとも約50％低下させる。一般に、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の有効量は、少なくとも正常範囲内であるような血清コレステロールレベルを低下させることにおいて有効である。血清コレステロールの正常範囲は、個体の性別および年齢に加え、他の要因に応じて変動する。成人ヒトに関して、血清コレステロールの正常範囲は、約200〜約240mg/dLである。「上昇した血清コレステロールレベル」は、同様に個体の年齢および性別に応じて決まる。従って例えば、血清コレステロールレベルが240mg/dLを超える成人は、上昇した血清コレステロールレベルを有するとみなされる。一部の態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質の有効量は、血清コレステロールレベルを240mg/dL以下に低下させる効果があるものである。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、個体にapoE4ドメイン相互作用を低下させる物質を有効量投与することを含む、個体が冠動脈疾患(CAD)またはアテローム動脈硬化症を発症するリスクを低下させる方法を提供する。これらの態様において、apoE4ドメイン相互作用を低下させる物質は、CADまたはアテローム動脈硬化症を発症するリスクを、該物質で処置されていない個体のリスクと比べ、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、または少なくとも約50％またはそれ以上低下させる。
【０１０３】
本発明の方法による治療に反応しやすい個体は、個体はapoE4を発現しているのでCAD発症のリスクがあることがわかっている個体；apoE4を発現しかつ上昇した血清コレステロールレベルを有する個体；および、apoE4を発現しかつ1種または複数の心臓事象を有する個体である。
【０１０４】
神経細胞成長に影響を及ぼす化合物を検出するアッセイ法
アポリポタンパク質Eの異なるアイソフォームの示差的発現は、神経細胞成長に影響を及ぼす。一部の態様において、本発明のアッセイ法は、神経細胞成長に影響を及ぼす化合物を決定するために、アポリポタンパク質Eの異なるアイソフォームの示差的発現を利用する。別の態様において、本明細書に説明されたアッセイ法は、apoE4ドメイン相互作用を低下させる化合物を同定する。本発明のアッセイ法により同定された化合物は、神経学的疾患−特にアポリポタンパク質のアイソフォームの異常な示差的発現が存在するような疾患−の治療に有用な組成物に処方される。本発明の背後にある理論に加え本発明の具体例に関する詳細を、以下に提供する。しかし本発明は、このような理論または例に限定されるものではない。
【０１０５】
神経細胞において、細胞骨格は、神経突起の伸展および退縮において機能する。従って、本明細書および他のもの(Handelmann(1992)；および、Nathanら、Science、264:850-852(1994))に説明された研究は、apoE3およびapoE4の神経突起伸展および分枝のアイソフォーム-特異的作用に焦点を当てている。様々なapoEアイソフォームは、細胞内の細胞骨格装置を調節しかつ神経突起の伸展および分枝を変更する。様々なapoEアイソフォームがいかにして細胞骨格を変更するかの理解は、(1)神経原線維塊の形成のプロセス、および(2)晩年のシナプス連結のapoE-誘導したリモデリングの制御に関する情報を提供する。インビボにおける神経突起の伸展を刺激する化合物は、中枢神経系および末梢神経系の両方における神経細胞リモデリングの期間の神経再生またはシナプス連結の形成を促進する可能性が高い。
【０１０６】
本発明者らは、化合物を神経成長に対するそれらの作用に関しスクリーニングするための特異的アッセイ法を開発した。更にこのアッセイ法は、細胞-表面HSPGに影響を及ぼす化合物をスクリーニングし、かつこれによりapoE3およびapoE4の示差的細胞蓄積に対し作用することを可能にした。ヒトapoE3、対、ヒトapoE4の作用の比較は、神経突起生長に対する顕著な示差的アイソフォーム-特異的作用を示した。対照と比べて、ヒトapoE3＋β-VLDLは、神経突起伸展の増大を生じたが、apoE4＋β-VLDLは、神経突起の分枝および伸展の両方における著しい減少を生じた。Nathanらにより示された結果(1995)は、apoE4＋β-VLDLと共にインキュベーションされた背根神経節神経細胞は、非常に短い発育阻害された神経突起を提示したことを示した。新鮮なapoE4-欠損培地とapoE4-含有培地を交換すると、神経細胞の神経突起伸展を生じる能力を回復したので、これはapoE4の毒性作用ではなかった。更に、apoE3-およびapoE4-特異的作用は、(1)apoEの受容体結合ドメインに対する抗体、または(2)重要なリシン残基の還元的メチル化によりブロックされ、このことはapoEのこの作用が、受容体媒介型、またはHSPG媒介型であることを示している。
【０１０７】
中枢神経系由来のNeuro-2a細胞を用い、apoEの末梢神経系の皮質ニューロンに対する作用と先に説明された末梢神経系ニューロンに対する作用を比較した。両型の細胞は、apoEに同様に反応する。脂質給源を一緒にする場合、apoE3は神経突起伸展を刺激したのに対し、apoE4は神経突起伸展を阻害した。Nathanら、Soc. Neurosci.、20(パート2):1033(要約)(1994)；および、Nathanら、(1995)参照。β-VLDLを伴わない遊離apoE3またはapoE4の添加は、神経突起生長に影響を及ぼさない。これらの結果は、apoEの神経細胞に対する作用は、apoEまたはapoEと脂質の組合せのリポタンパク質受容体媒介型取り込みを必要とすることを示している。脂質がないと、apoEは、LDL受容体またはLRPのいずれにも結合しない。対照的に、別の試験において、Holtzmanらは、異なる神経細胞株を用い、β-VLDLを伴うapoE3は、神経成長因子が誘導した神経突起生長を刺激したのに対し、apoE4は作用を有さなかったことを明らかにした。Holtzmanら、Soc. Neurosci.、21(要約):1009, 400.10(1995)。
【０１０８】
低レベルの内因性に生成されたapoEがNeuro-2a細胞からの神経突起生長への作用を有するかどうかを決定するために、以下に提供した実施例において、これらの神経細胞を、apoE3またはapoE4をコードしているヒトapoE cDNA構築体でトランスフェクションした。等量のapoE3またはapoE4(〜50-60ngのapoE/1mgの細胞タンパク質/48時間)を分泌するトランスフェクションした細胞のクローンを、比較のために選択した。血清-非含有対照培地において増殖したapoE3-およびapoE4-分泌細胞は、同程度の限定された神経突起伸展を示した。しかし、脂質給源(β-VLDL)がこの培地に添加された場合、これらの細胞は、顕著に異なる成長パターンを示した。ApoE3-分泌細胞は、apoE4-分泌細胞よりもより大きい神経突起伸展を示した。従って、非常に低レベルの内因性に産生されたapoEであっても、脂質給源を伴うことで、apoE3対apoE4の示差的作用を明らかにした。様々な組成物の脂質乳剤に加え、脳脊髄液リポタンパク質を、β-VLDLと置換えることができ、かつ細胞のための脂質給源としてまたはapoEの特異的細胞内経路への輸送のためのビヒクルとして役立つように思われる。本明細書に示された例は、神経突起生長に対するapoE作用は、LRP、または類似のapoE結合受容体を介して媒介されること、およびこの相互作用のブロックまたは効果的妨害は、apoE4が誘導した神経突起生長の阻害を阻害することを示している。
【０１０９】
従って本発明は、apoE4とapoE結合受容体、例えばLRPの相互作用の阻害による、神経細胞リモデリングのapoE4-誘導した阻害を低下させる化合物の能力について、それらをアッセイすることに関連している。このアッセイ法を介して発見された化合物は、ドメイン相互作用を変更することにより、apoE4の機能を変更し、神経細胞リモデリングにおけるapoE4の阻害を妨げることができる。ApoE4においてアルギニン-61のグルタミン酸-255との相互作用をブロックする物質は、このアッセイ法においてスクリーニングされ得る。ApoE4におけるドメイン相互作用のブロックは、apoE4をAapoE3-様@分子に転換し、これにより望ましくないapoE4の神経突起伸展に対する作用を鈍くする。これは更にapoE4の結合優先性をVLDLからHDLへ切り換える作用も有することがある。
【０１１０】
アッセイ法は、神経突起成長に対する作用を伴う化合物についてスクリーニングすることができるが、これらの化合物は、少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約50％、および最も好ましくは少なくとも約90％、神経突起生長のapoE4阻害の優先的低下についてスクリーニングされる。神経突起生長に対する作用は、例えば本明細書に説明された方法により測定することができる。
【０１１１】
本発明のアッセイ法は、apoE4が神経細胞LRPまたは他のapoE結合受容体と効果的に相互作用しないようにする化合物をスクリーニングするために使用することができる。この妨害は、HSPGおよび／またはLRP相互作用で、もしくはよりapoE3-様にその機能を修飾することによるかのいずれかで示され、かつ直接的または間接的に結合をブロックするかまたはさもなければapoE4結合により誘導されたシグナル伝達を妨害することができる。従ってアッセイ法は、これらの経路のいずれかにより神経突起生長の阻害を妨害する化合物をスクリーニングする。その結果、本発明は、apoE4およびHSPGもしくはLRP、または他のapoE結合受容体の効果的相互作用を妨害する、全タンパク質、それらの機能的部分のいずれか、アナログまたはホモログを含む。スクリーニングされる化合物は、例えば、RAPまたはラクトフェリンおよび他の公知のLRPリガンドのアミノ酸配列の変化、またはapoE4とLRPの相互作用を効果的にブロックするそれらの能力に実質的に影響することはない他のapoE結合受容体である。
【０１１２】
同じく本発明は、apoE4とLRPおよび他のLDL受容体ファミリーのメンバーの相互作用を低下させる治療的物質を検出する方法を包含している。これらの方法は、インビトロにおけるリガンドブロッティング技術を含む。これは、例えばドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の非縮小(nonreduce)による細胞膜タンパク質(これはLRPを含む)または膜タンパク質から部分的に精製されたLRPの分離、およびニトロセルロース膜への移動後に行うことができる。LRPの部分的精製の方法は、例えば、Schneiderら、Methods Enzymol.、109:405-417(1985)に説明されている。この膜はその後、apoEおよび例えばビオチン化により標識されたリポタンパク質(例えば、β-VLDL)と共にインキュベーションされる。ApoE-β-VLDL複合体の膜への結合は、その後この標識物を検出する試薬を用いて可視化される。相互作用をブロックするそれらの能力について試験される物質は、ニトロセルロースに、apoEおよびβ-VLDLと共に添加され、この相互作用がブロックされたかどうかを決定する。
【０１１３】
神経疾患
本明細書に説明されたアッセイ法により認められた化合物は、広範な障害に罹患した患者に治療薬を提供するために処方される。例えば、神経変性または低酸素症に罹患した患者を治療することができる。神経変性は、多くの原因から生じ得、これはアルツハイマー病、外傷、ウイルス感染症、遺伝的酵素欠損症、年齢に関連した認知力低下、およびプリオン疾患を含むが、これらに限定されるものではない。神経変性を引き起こし得るウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびエプスタインバーウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。神経変性を引き起こし得る遺伝的酵素欠損症は、テイ-サックス病を引き起こすβ-N-アセチルヘキソサミニナーゼの欠損を含むが、これらに限定されるものではない。年齢が関連した認知力低下は、例えば、「Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders」、Fourth編集、ワシントンD.C.、米国精神医学会(APA)(1994)に説明されている。プリオン疾患は、クールー病およびクロイツフェルトヤコブ病を含むが、これらに限定されるものではない。低酸素症は一般に、卒中の結果であるか、または一過性であり、かつ溺水、気道閉塞または一酸化炭素中毒の事例に関連している。
【０１１４】
神経細胞リモデリングは、それ以外は健康な患者においても重要である。従ってこのアッセイ法により同定された化合物は、apoE4についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるがアルツハイマー病または他の神経変性障害の明らかな症状を呈していない患者における予防的使用に適している。
【０１１５】
本発明の神経突起生長アッセイ法は、全て神経突起生長のapoE4-誘導した阻害を低下または排除する糖タンパク質である、RAP、ヘパリナーゼ、およびラクトフェリンなどを含む治療薬を同定するために使用することができる。本発明のアッセイ法は、apoE4に特異的に結合しかつそのドメイン相互作用を妨害する化合物、例えば小分子および抗体を同定することができる。ドメイン相互作用を破壊する物質は、多種多様な分子から選択することができ、これはapoE4のアルギニン-61またはグルタミン酸-255に結合するようにデザインされた、小分子、糖タンパク質、ペプチドおよび抗体を含むが、これらに限定されるものではない。このドメイン相互作用を破壊する物質のスクリーニングのための特異的アッセイ法は、下記実施例3および実施例7に説明している。本発明のアッセイ法は、apoE4はapoE3活性を示すかどうかを決定するものを含む。
【０１１６】
ヘパリナーゼまたは他のHSPG修飾剤は、apoE4の神経細胞リモデリングに対する作用を改善する点でインビトロにおいて有効である。しかし、それらの多面発現作用は、これらをヒト治療に不適当なものにしている。本発明のアッセイ法を使用し、HSPGアナログなどの、apoE4に結合し、その神経細胞への結合を妨害するが実質的多面発現作用は発揮しないような、可能性のある有効な治療的物質を同定することができる。
【０１１７】
このRAPは、ヒトにおける見かけの分子量39kDを有する糖タンパク質である。RAPは、両方ともLDL受容体遺伝子ファミリーの一員であるgp330およびLRPに特異的に結合する。様々なRAPおよびそれらのホモログが説明されており、かつそれらの機能性ドメインがマッピングされている。総論に関しては、Orlandoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:3161-3165(1994)；および、Warshawskyetal、Biochem.、34:3404-3415(1995)を参照のこと。RAP、およびその一部は、LRPのそのリガンドt-PAおよびI2-マクログロブリン-プロテアーゼ複合体への結合をブロックすることがわかっている。Warshawskyら、Ann. N.Y. Acad. Sci.、514-517(1994)。
【０１１８】
ラクトフェリン
ラクトフェリンは、LRP、gp330、およびHSPGに結合することが示されている。Willnowら、J. Biol. Chem.、267:26172-26180(1994)；Mahleyら、Ann. N.Y. Acad. Sci. USA、737:39-52(1994)；および、Jiら、Arterioscler. Thromb.、14:2025-2032(1994a)。ラクトフェリンは、LRPとの結合により血流からクリアランスされるように見える。Meilingerら、(1995)。ラクトフェリンは、リガンドのLRPおよびHSPGの両方への結合をブロックし、かつHSPG-LRP経路をブロックする。これは明らかに、ラクトフェリン上の集中された正電荷領域の、HSPG上の負帯電した基およびLRPのリガンド結合ドメイン内の負帯電したアミノ酸との相互作用を介して生じる。
【０１１９】
抗体
ApoEに特異的な抗体は、apoE4が誘導した神経細胞リモデリングの阻害をブロックする。本発明のアッセイ法を使用し、apoE4またはLRPのいずれかに対する抗体をスクリーニングし、可能性のある治療的利用性を決定することができる。このアッセイ法は、LRPへの結合を阻害することによるか、もしくはよりapoE3-様になるようapoE4の機能を変更することにより、apoE4の神経細胞リモデリング阻害作用を阻害するものを発見するために、抗体をスクリーニングすることができる。好ましい抗体は、モノクローナル性であり、かつapoE4アイソフォームには特異的であるがapoE3もしくはapoE2には特異的でないものである。用語「抗体」は、それらの機能的部分または同等物も含む。例えば、抗体は、抗体全体が特異的に結合するエピトープへの結合に作用するのに十分な軽鎖可変領域の部分により構成された単一特異性化合物を含む。これらの断片は、少なくとも1本の重鎖または軽鎖免疫グロブリンペプチドの可変領域を含むことができ、かつこれはFabフラグメント、Fab2フラグメント、およびFvフラグメントを含むが、これらに限定されるものではない。加えて、抗体の単一特異性ドメインは、組換え操作により作出され得る。このような組換え分子は、細菌により作成された断片、およびマウス定常領域の大部分がヒト抗体定常領域と交換されたマウス抗体を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
治療的物質の送達
本発明のアッセイ法が、化合物が可能性のある治療性としてある種の特徴を有することを示した後、この化合物がインビボにおいて治療的利用性を有するかどうかを決定することは当業者の技術の範囲内である。この治療的物質を送達に適した剤形に処方することも、当業者の技術の範囲内である。送達部位が脳の場合、この治療的物質は脳へ送達することが可能でなければならない。
【０１２１】
血管脳関門は、多くの治療的物質の体循環から脳および脊髄への取り込みを制限する。血管脳関門を通過する分子は、ふたつの主要な機序を使用する：自由拡散；および促進輸送。血管脳関門の存在のために、CNSにおける所定の治療的物質の有益な濃度への到達には、薬物送達戦略の使用を必要とすることがある。治療的物質のCNSへの送達は、いくつかの方法により達成することができる。
【０１２２】
ひとつの方法は、神経外科技術に頼っている。事故の犠牲者のような危篤状態の患者または様々な型の痴呆に罹患した患者の場合は、外科的介入が、それに付随するリスクがあるにもかかわらず当然とされている。例えば、治療的物質は、薬物の脳室内またはクモ膜下注入のような、CNSへの直接の物理的導入により送達され得る。脳室内注入は、例えばOmmaya貯留器のような貯留器に連結された脳室内用カテーテルにより促進することができる。導入法は、再充填可能なまたは生分解可能な装置によりもたらすこともできる。別の方法は、血管脳関門の透過性を増大する物質による、血管脳関門の破壊である。例は、マンニトールのような拡散不良な物質、エトポシドのような脳血管の透過性を増大する医薬品、またはロイコトリエンのような血管作用性物質の動脈内注入を含む。NeuweltおよびRappoport、Fed. Proc.、43:214-219(1984)；Babaら、J. Cereb. Blood Flow Metab.、11:638-643(1991)；および、Gennusoら、Cancer Invest.、11:638-643(1993)。
【０１２３】
更に、治療が必要な領域へ局所的に薬学的物質を投与することも好ましく；これは、例えば、手術時の局所注入、注射、カテーテルにより、またはインプラントにより達成することができ、このインプラントは、多孔質、非孔質、またはゼラチン状物質であり、シラスティック膜のような膜、もしくは繊維を含む。
【０１２４】
治療的化合物は、化学的修飾または血管脳関門を通過するアナログのスクリーニングを含む薬学的技術を用いて送達することができる。この化合物は、分子の疎水性を増大し、分子の正味電荷または分子量を低下させるように修飾するか、または通常血管脳関門を超えて輸送されるものに似るようにこの分子を修飾することができる。Levin、J. Med. Chem.、23:682-684(1980)；Pardridge :Peptide Drug Delivery to the Brain、(1991)；および、Kostisら、J. Clin. Pharmacol.、34:989-996(1994)。
【０１２５】
リポソームのような疎水性環境中へのこの薬物の封入も、薬物のCNSへの送達において効果的である。例えば、国際公開公報第91/04014号は、薬物が、通常血管脳関門を通って輸送される分子が添加されたリポソーム内に封入されているリポソームデリバリーシステムを開示している。
【０１２６】
別の血管脳関門を通って薬物を処方する方法は、薬物をシクロデキストリン内に封入する。いずれか適当な血管脳関門を通過するシクロデキストリンを使用することができ、これはJ-シクロデキストリン、K-シクロデキストリンおよびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。全般的には、米国特許第5,017,566号、第5,002,935号および第4,983,586号を参照のこと。このような組成物は更に、米国特許第5,153,179号に開示されたようなグリセロール誘導体も含む。
【０１２７】
送達は、新規のキメラ性の輸送可能な治療的物質を得るための、治療的物質の輸送可能な物質への複合により得ることもできる。例えば、血管作用性小腸ペプチドアナログ(VIPa)は、その血管作用性作用を、モノクローナル抗体(Mab)の特異的担体分子トランスフェリン受容体への複合後にのみ発揮し、これはVIPa-Mab複合体の血管脳関門を通っての取り込みを促進した。Pardridge、(1991)；および、Bickelら、Proc. Natl. Acad Sci. USA、90:2618-2622(1993)。いくつかの他の特異的輸送システムが同定されており、これらは、インスリン、インスリン様成長因子IおよびIIの輸送のためのものを含むが、これらに限定されるものではない。他の適当な非特異的担体は、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびブドウ糖誘導体を含むが、これらに限定されるものではない。ある種のプロドラッグは、中枢神経系への侵入時に、薬物が担体から切断され、活性薬物を放出するｋとにより説明される。米国特許第5,017,566号参照。
【０１２８】
実施例
下記実施例は、いかにして本発明を実行するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示されているが、本発明者が自身の発明とみなす範囲を制限することは意図せず、下記実施例は実行された実験の全てまたは一部を表わすまたは暗示していることも意図しない。使用した数字(例えば、量、温度など)に関して精度を保証するように努力したが、若干の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。特に記さない限りは、部は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、かつ温度は摂氏である。
【０１２９】
実施例1
ApoEとLRPの相互作用および神経突起生長への作用
下記の材料および方法を用い、下記に考察した結果を得た。
【０１３０】
材料
ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、DME/F12(ダルベッコの栄養素改変イーグル培地およびハム混合液F12の1:1混合液)、培地補充物(プロゲステロン、プトレスシン、セレナイトおよびトランスフェリン)、塩素酸ナトリウム、ヘパリナーゼ、ラクトフェリン、トリオレイン、および卵黄ホスファチジルコリン(XI-E型)は、Sigma Chemical社(セントルイス、MO)から購入し、ウシ胎仔血清(FBS)およびインスリンはGibco社(グランドアイランド、NY)から、スラミンはMiles社(FBA Pharmaceuticals、ウェストヘブン、CT)から、ならびにDiIはMolecular Probes社(ユージーン、OR)から購入した。Neuro-2aは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、MD)から購入した。ウシCSFは、Pel-Freez社(ファイアットビル、AR)から入手した。
【０１３１】
リポタンパク質およびリポソームの調製
ウサギβ-VLDL(d＜1.006g/ml)は、Kowalにより説明された方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:5810-5814(1989))に従い、高脂肪、高コレステロール飼料で4日間飼育したニュージーランドホワイトウサギの血漿から単離した。ウサギVLDL(d＜1.006g/ml)を、通常のウサギ飼料(chow)で飼育したウサギから得た絶食血漿から超遠心により単離した。このVLDLは、超遠心により一回洗浄し、d＝1.006g/mlであった。ウシCSFリポタンパク質(d＜1.21g/ml)を、Pitasらの説明した方法(J. Biol. Chem.、262:14352-14360(1987))に従い、超遠心により単離した。これらは、d＝1.21g/mlの溶液により再度遠心することで、洗浄した。イヌのapoE HDLC(d＝1.006〜1.02g/ml)は、Mahleyらの説明した方法(Am. J. Pathol.、87:205-226(1977))に従い、水素化したココナッツ油およびコレステロールを含有する半合成飼料で飼育したフォックスハウンドから、超遠心および電気泳動により単離した。β-VLDLは、Bilheimerらの説明した方法(Biochim. Biophys. Acta、260:212-221(1972))に従い単離し、かつ遊離のヨウ素を、PD10カラムクロマトグラフィーにより除去した。
【０１３２】
DMPCベシクルは、本質的にInnerarityらの説明した方法(J. Biol. Chem.、254:4186-4190(1979))に従い調製した。DMPCの単独(90mg)またはコレステロール添加(10mg)したものを、ベンゼンに溶解し、かつ凍結乾燥により乾燥した。凍結乾燥した材料をその後、0.15M NaCl、10mM Tris-Cl、および1mM EDTA(pH7.6)の3ml中に再懸濁し、かつマイクロチップを装着した振動型(sonifier)細胞破壊装置(Branson 450、ダンベリー、CT)を用い、フル設定7(50ワット)で、37ECで30分間音波処理した。Innerarity(1979)。この材料は、2,000rpm(37EC)で10分間遠心し、かつ上清を細胞への添加に用いた。脂質乳剤Aを、Pittmanらの説明した方法(J. Biol. Chem.、262:2435-2442(1987))；および、Spoonerらの説明した方法(J.  Biol.  Chem.、263:1444-1453(1988))に従い調製した。簡単に述べると、これらの脂質は、トリオレイン100mgおよび卵黄ホスファチジルコリン25mgの比で混合し、その後窒素流れ下で乾燥した。次にこのペレットを、10mM Tris-Cl、0.1M KCl、および1mM EDTA(pH8.0)緩衝液5ml中で再懸濁し、Spoonerらの説明した方法(1988)に従い音波処理した。その後この材料を、2,000rpmで10分間遠心した。最終乳剤の組成は、トリオレイン：ホスファチジルコリンについて2.7:1(wt:wt)であった。この乳剤粒子のサイズおよび形態は、ネガティブ染色電子顕微鏡により決定した。
【０１３３】
発現ベクターの調製
発現ベクターは、pBSSKプラスミド(Stratagene社、ラホヤ、CA)において集成した。これらの構築体は、ラットの神経細胞-特異エノラーゼ(NSE)プロモーター(Dr. J. G. Sutcliffeのご厚意により入手、Scripps Clinic and Research Foundation、ラホヤ、CA)を含み、これは、トランスジェニックマウスにおける、ヒトアミロイド前駆体タンパク質およびβ-ガラクトシダーゼの、神経細胞-特異的発現を指示するためにこれまで使用されている。Quonら、Nature、352:239-241(1991)；および、Forss-Petter、Neuron、5:187-197 (1990)。加えて、この構築体は、ヒトapoE遺伝子の第一のエキソン(非コード)、第一のイントロン、第二のエキソンの最初の6個の塩基(開始メチオニンの前)、それに続くapoE cDNAを含んだ。
【０１３４】
ApoE4構築体は、第三のイントロンも含むこと以外は、同じであった(図1)。第四のエキソンの非コード領域は、cDNAの下流であり、それにポリアデニル化シグナルを含むヒトapoE遺伝子の3'-フランキング配列112bpが続いた。これらの発現ベクター内の挿入のためのapoE構築体は、J. David Gladstone InstitutesのDr. S. LauerおよびDr. J. Taylorのご厚意により入手した。これらのcDNAの方向は、Applied Biosystems社の自動シークエンサーを用い配列決定することにより確認した。最終構築物は、NSE-E3(apoE3 cDNAについて)およびNSE-E4(apoE4 cDNAについて)と称した(図1)。プラスミドDNAは、Sambrookらの説明した方法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1989)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、N.Y)に従い、塩化セシウム勾配超遠心を2回行うことにより精製した。これらの構築体を試験するために、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびヒト胎児腎293細胞を、一過性にトランスフェクションし(リポフェクチン媒介型)、かつ培地内のapoE濃度を、以下に説明するように測定した。apoE3およびapoE4の同様のレベルの発現が達成された。
【０１３５】
安定的にトランスフェクトされたNeuro-2a細胞株の作成
集密度20〜30％の細胞を、pSV2neoおよびNSE-E3またはNSE-E4のいずれかにより、Chenらにより本質的に説明されたリン酸カルシウム沈降プロトコール(BioTechniques、6:632-638(1988))を用い、同時トランスフェクションした。対照細胞は、同じプロトコールに従い、pSV2neoのみでトランスフェクションした。安定してトランスフェクションした細胞は、10％FBSおよびG418(Geneticin、Gibco社)400μLg/mlを含有するDME/F12培地における増殖により選択した。個々のG418-耐性コロニーを選択し、増殖した。トランスフェクションした細胞によるヒトapoE3またはapoE4の分泌は、馴化培地のウェスタンブロットにより証明した。
【０１３６】
ApoE定量
細胞において、細胞内、細胞-表面に結合しかつ分泌されたapoEを、N2培地、血清-および脂質-非含有培地(Bottensteinらに説明された(Exp. Cell Res.、129:361-366(1980))、成長補充物を含有するDME/F12)において96時間維持した細胞において、添加されたβ-VLDL(40μgコレステロール/ml)を伴うまたは伴わずに定量した。この培地は48時間で1回交換した。報告された分泌されたapoEは、2回目の48時間インキュベーション後の培地中に存在している。この培地を収集し、かつプロテアーゼインヒビターの添加後遠心し、懸濁された細胞を除去した。細胞単層をPBSで洗浄し、かつ25mM Hepesおよび細胞表面に結合したapoEを放出することができるポリアニオンである10mMスラミンを含有するDMEM/F12の2mlと共に、4℃で1時間インキュベーションした。Jiら(1994)。このapoEは、培地から沈殿し、かつスラミンは、ヒュームドシリカ(Sigma社、セントルイス、MO)50μg/mlの添加により抽出し、かつ13,000xgで10分間遠心した。
【０１３７】
各ペレットを、滅菌水で3回洗浄し、ゲル負荷用緩衝液中に溶解した。表面結合したapoEのスラミン除去後、細胞apoEを、STEN緩衝液(50mM Tris-Cl、pH7.6、150mM NaCl、2mM EDTA、1％NP-40、20mM PMSF、および5μg/mlロイペプチン含有)を用い、これらの細胞から抽出した。試料は、Jiらの説明した方法(J. Biol. Chem.、269:13429-13436(1994))に従い、ドデシル硫酸ナトリウムを含有する5〜20％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気泳動した。これらのタンパク質を、ブロッティングによりニトロセルロースペーパー上に移し、かつウサギにおいて生じた抗-ヒトapoEポリクローナル抗血清(1:1,000希釈)で処理した(Dr. K. H. Weisgraber、Gladstone Institutesから豊富に提供された)。その後ニトロセルロース免疫ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(1:5,000希釈)(Amersham社、アーリントンハイツ、IL)に複合したロバの抗-ウサギ二次抗体と共にインキュベーションした。未結合の抗体を除去するために洗浄した後、この免疫複合体を、製造業者の指示に従いECLキット(Amersham社)を用いて検出した。細胞により結合され、内在化され、および分泌されたapoEレベルの定量は、デンシトメーターによるスキャニング(Ambis Scanner社、サンディエゴ、CA)により、精製したヒト血漿apoE3およびapoE4の標準曲線を基に行った。
【０１３８】
神経突起生長
細胞は、10％FBSおよびG418(400μg/ml)を含有するDME/F12において増殖した。実験開始日に、これらの細胞は、10％FBSを含むDME/F12中の35mmプレートに継代培養した。これらの細胞は、37℃で2時間プラスチックプレートに接着することができ、その後この培養培地を、漸増濃度のリポタンパク質を伴うまたは伴わないN2培地と交換した。37℃で48時間後、この培地を、同じ培地(リポタンパク質を伴うまたは伴わない)と交換し、かつインキュベーションを更に48時間継続した。(CSFリポタンパク質は、細胞への添加前にN2培地に対して透析した。)。これらの細胞を次に、0.2％BSAを含有するDME/F12で洗浄し、Nathanらの説明した方法(Science、264:850-852(1994))に従い、DMSO中に添加したDiIにより37℃で1時間非特異的に染色し、PBS中の2.5％グルタルアルデヒド(v/v)で固定した。神経細胞は、共焦点レーザー走査システム(MRC-600、BioRad社、ハーキュレス、CA)で蛍光モードで像形成し、かつこれらの画像をImage-1/AT画像解析システム(Universal Images社、ウェストチェスター、PA)によりデジタル化した。神経細胞画像を、特徴決定の前にコード化し、下記の変量を測定した：1)各神経細胞上の神経突起(細胞直径の少なくとも半分の細胞表面突起と定義)の数；2)神経突起の枝分かれ(各神経突起の枝点の数)；および、3)神経突起伸展(細胞本体から測定した、最長の神経突起の長さ)。典型的には、各実験において、1個のプレートにつき20〜40個の神経細胞に神経突起が測定され、この結果は、平均±S.E.M.として保存した。
【０１３９】
LRPに結合したリポタンパク質のインヒビターの作用に関する試験において、細胞は、指定された濃度のラクトフェリン、塩素酸、もしくはヘパリナーゼを含有するN2培地において、または受容体結合タンパク質(RAP)と共に培地で、37℃で1時間インキュベーションした。その後β-VLDLを添加し、インキュベーションを合計96時間継続した。これらの試薬は、β-VLDLを除いて、24時間毎に再添加した。48時間後に、この培地およびβ-VLDLを交換した。
【０１４０】
125I-β-VLDLの細胞結合および分解
これらの細胞は、N2培地単独中で35mm皿において24時間増殖した。その後125I-β-VLDL(3μのタンパク質/1mlの培地)を添加し、インキュベーションを37ECで16時間継続した。この培地を、Goldsteinらにより説明された方法(Met. Enzymol.、98:241-260(1983))に従い、TCA-可溶性リポタンパク質分解産物について分析した。これらの細胞を、氷上に置き、0.2％BSAを含有するPBSで洗浄し、かつ0.1N NaOHに溶解した。細胞の放射能をガンマカウンター(Beckman Gamma 8000、Beckman Instruments社、フレルトン、CA)を用い、かつGoldsteinら(1983)の説明した方法に従い、測定することにより、リポタンパク質細胞結合を決定した。
【０１４１】
DiI-標識したβ-VLDLの細胞結合
細胞は、N2培地中で35mm皿において24時間増殖した。その後DiI-標識したβ-VLDL(4μgのタンパク質/1mlの培地)を、Pitasら、Arteriosclerosis、3:2-12(1983)；および、Pitasら、Arteriosclerosis、1:177-185(1981)の説明した方法に従い調製し、添加し、かつインキュベーションを37℃で5時間継続した。その後細胞をPBSで洗浄し、かつPBS中の4％(v/v)パラホルムアルデヒドで固定した。DiI-標識したβ-VLDLの取り込みは、蛍光顕微鏡により可視化した。インキュベーションの最後に細胞中のDiI-標識したリポタンパク質の量を定量するために、これらの細胞を、ふたつのPBSの0.5mlアリコートを用い、すくい取り、かつ凍結乾燥した。このDiIは、乾燥した細胞ペレットからメタノールで抽出し、かつ蛍光分光光度計(励起波長520nm、放出波長570nm)を用いて分析した。Pitasら(1983)。メタノール中のDiI標準を定量に用いた。
【０１４２】
ApoEの脂質粒子との結合
ApoE3およびapoE4は、Innerarityらの説明した方法(J. Biol. Chem.、258:12341-12347(1983))に従い、Bolton-Hunter試薬(DuPont NEN社、ボストン、MA)を用いてヨウ化し、次に脂質粒子と共に37℃で1時間インキュベーションした。次にこれらの試料を、Superose 6カラム(10/50HR、Pharmacia Fine Chemicals社、ウプスラ、スウェーデン)上において、クロマトグラフィーにより分画し、定常流0.5ml/分でPBS中の1mM EDTAで溶出した。0.5ml画分を収集し、かつコレステロールおよびトリグリセリドについて分析し、かつ125I-apoE含量を、Beckman 8000カウンター(Beckman Instruments社)において、Dongらの説明した方法(J. Biol. Chem.、269:22358-22365(1994))に従い測定した。
【０１４３】
統計解析
データは、対のあるt-検定を用いて解析した。
【０１４４】
結果
安定してトランスフェクションされたヒトapoE3またはapoE4を発現しているNeuro-2a細胞により、培地へ分泌されたapoE、細胞表面に結合したapoE、および細胞内蓄積されたapoEレベルは、ウェスタンブロット分析により評価し、かつデンシトメトリーにより定量化した。得られた結果を表1に示した。
【０１４５】
（表１）  apoE3またはapoE4 cDNAにより安定的にトランスフェクトされた細胞内に分泌された、スラミンにより放出可能な、またはそこに存在する、apoE3またはapoE4
2004533996.tif 000002
【０１４６】
表1に示した結果を得るために、トランスフェクションした細胞を、β-VLDL(40μgコレステロール/ml)を伴うまたは伴わない培地において、96時間インキュベーションした。この培地は48時間で交換した。最後の48時間に分泌されたapoE、細胞内apoE、スラミン-放出可能な(表面結合した)apoEを、Nathanら(1995)が説明したように、96時間インキュベーションした後に定量した。データは、2個の個別の測定値の平均である。これらのふたつ組は、12％を超えて異なることはなかった。
【０１４７】
表1に示した結果は、これらの細胞が、48時間で、細胞タンパク質1mgにつきapoE3を44〜54ngおよびapoE4を60〜89ngを分泌することを示している。このapoE3-およびapoE4-分泌細胞は、類似量の細胞表面に結合したapoEを有し(スラミン処理により放出可能な)、細胞タンパク質1mgにつきapoEが4.9〜8.0ngの範囲であった。2種のapoE3-発現細胞株におけるapoEの細胞内含量は、細胞タンパク質1mgにつきapoEが140および259ngであった。類似量の細胞内apoE(111〜215ng/mg)が、apoE4-発現細胞株において認められた。これらの細胞へのβ-VLDLの添加は、分泌されたapoE、表面結合されたapoE、またはapoE3-またはapoE4-分泌細胞内に存在するapoEの量に有意な作用を有さなかった(表1)。
【０１４８】
最初の実験において、apoE3(クローン1、54ng/1mgの細胞タンパク質)およびapoE4(クローン4、60ng/1mgの細胞タンパク質)の類似量を分泌したふたつのNeuro-2a細胞株を用い(表1)、神経突起成長を試験した。これらの細胞をβ-VLDLを欠いたN2培地において増殖した場合、apoE3-およびapoE4-分泌細胞の間に神経突起生長の明らかな差異はなかった。しかし、β-VLDLを含有するN2培地における細胞のインキュベーションは、これらの細胞からの神経突起生長の顕著に異なるパターンを生じた。β-VLDLと共にインキュベーションされたapoE3-分泌細胞は、長い神経突起を発生したのに対し、apoE4-分泌細胞において、神経突起成長は抑制された。
【０１４９】
増大する濃度のβ-VLDLの存在および非存在下での神経突起生長の差異は、1個の細胞当りの神経突起の数、神経突起の分枝、および神経突起伸展を測定することにより、定量した(各々、図2A、B、およびC)。β-VLDLの非存在下N2培地で96時間インキュベーションしたapoEでトランスフェクションしていない対照細胞の値を、100％と設定した。トランスフェクションされたNeuro-2a細胞によるapoE3またはapoE4のいずれかの発現は、リポタンパク質非添加のN2培地において増殖した場合、神経突起の数、分枝、または伸展には影響しなかった(図2A、BおよびC)。図2に示された結果を得るために、細胞(apoE3-発現についてクローン#1およびapoE4-発現についてクローン#4)を、N2培地単独または漸増濃度のβ-VLDLを含有する培地において96時間インキュベーションした。この培地は、48時間で交換した。これらの細胞を、DiIで染色・固定し、かつ示されたパラメータを測定した。各々のデータの点は、4回の個別の実験における20〜50個の神経突起を発現している細胞の測定により得た。このデータは、N2培地単独による対照細胞で得た値の百分率として表わしている。このデータは、平均±S.E.M.である。図2に示したように、N2培地単独でインキュベーションした対照細胞で得られた平均値は、下記のようであった：A：神経突起/細胞＝3；B：分枝点/神経突起＝2；C：平均神経突起長＝155μm。
【０１５０】
添加したβ-VLDLの作用の有意性のレベルの計算のために、β-VLDL存在下の結果を、β-VLDL非存在下の同じ細胞(すなわち、N2培地単独で増殖)で得たデータと比較する。*p＜0.025；**p＜0.010；***p＜0.005。
【０１５１】
しかし図2Aに示したように、β-VLDLの添加は、対照細胞およびapoE3を分泌している細胞における、神経細胞数の増加を生じた(N2培地中のapoE3-分泌細胞と比較して、40μgのβ-VLDLコレステロール/mlで有意に増加した)。他方高濃度のβ-VLDLが存在する場合、apoE4を分泌しているNeuro-2a細胞は、N2培地中のapoE4-分泌細胞と比較して、1個の細胞当りの神経突起数の有意な低下を示した。
【０１５２】
DRG細胞に関して先に説明したように(Handelmannら、J. Lipids Res.、33:1677-1688(1992)；および、Nathanら(1994))、β-VLDL単独の添加は、神経突起の分枝の増加を生じた。図2Bに示されたように、β-VLDLの非-apoE-トランスフェクション細胞への添加は、神経突起分枝の有意な増加を生じた。加えて、最高濃度のβ-VLDLコレステロールで、apoE3-分泌細胞は、N2培地単独で増殖されたapoE3-分泌細胞と比べ、増強された分枝を示した。対照的に、β-VLDLと共にインキュベーションした場合に、apoE4-分泌細胞は、分枝の減少を示す傾向があったが；しかし、この減少は、統計学的有意性には達しなかった。
【０１５３】
神経突起伸展は、最高濃度のβ-VLDLと共にインキュベーションした場合に、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞において増大した。対照的に、apoE4-分泌細胞において、神経突起伸展は、使用したβ-VLDLの最低濃度であっても非常に顕著に抑制された(図2C)。
【０１５４】
図2に示した結果は、神経突起の生長を有する細胞の比較を基にしているが、神経突起の伸長を伴わないNeuro-2a細胞は考慮しなかった。N2培地におけるNeuro-2a細胞のおよそ25〜30％が、神経突起伸展(少なくとも細胞直径の半分の細胞-表面突出と定義される)を有した。しかし、図3に示されるように、β-VLDLの存在下、神経突起を発生しているapoE3-分泌細胞の数は、合計の60〜70％まで顕著に増大した。他方で、神経突起伸展を発生しているapoE4-分泌細胞の数は、対照細胞またはapoE3-分泌細胞と比較し、有意に低下した。従って、β-VLDLと共にインキュベーションしたapoE3-分泌細胞は、より長い神経突起伸展を有するのみではなく、神経突起を伴う細胞数の増加も示した。β-VLDL存在下で増殖されたapoE4-分泌細胞は、より少ない神経突起を示し、かつ作成されたものは、はるかに短かった。
【０１５５】
ApoE3およびapoE4を分泌している細胞におけるβ-VLDLの神経突起生長に対する示差的作用が、クローン性の変種または様々な細胞株中のapoEの分泌もしくは細胞内含量の差異に起因しないことを確認するために、apoE3またはapoE4を分泌している別の安定してトランスフェクションされた細胞株により、追加実験を行った。これらの細胞のβ-VLDLとのインキュベーションは、神経突起生長に対するapoE3およびapoE4の示差的作用も生じた。得られた結果は、表2に示した。
【０１５６】
（表２）  apoE3またはapoE4で安定的にトランスフェクトされた細胞からの1細胞当りの神経突起の数、神経突起分枝、および神経突起伸展に対するβ-VLDL(40μgコレステロール/ml培地)の作用
2004533996.tif 000003
【０１５７】
表2において、クローン#1、#3、#4、#5、および#6による、apoEの分泌レベルは表1のように示した。クローン#2は、36ngのapoE3/1mgの細胞タンパク質/48時間を分泌した。表面結合しかつ内在化されたapoEは、クローン#2について定量しなかった。β-VLDLと一緒のインキュベーション条件は、図2に示した。各々のデータ点は、25〜40個の細胞の測定により得た。このデータは、平均±S.E.M.で示した。
【０１５８】
表2に要約したように、β-VLDLの存在下、リポタンパク質給源を欠いたN2培地で増殖した細胞と比べ、全てのapoE4-分泌している細胞は、発現された神経突起の数、分枝、および神経突起伸展において有意な低下を示したのに対し、apoE3-分泌している細胞は、増加した数の神経突起、増大した分枝、および増加した伸展を示した。
【０１５９】
ApoE4がβ-VLDLの存在下で神経突起伸展をブロックするかどうかもしくはこれが神経突起退縮を誘導するかどうかを決定するために、これらの細胞を、N2培地単独で48時間インキュベーションし、神経突起生長を刺激した。この培地を交換し、かつこれらの細胞を更に48または96時間、β-VLDL(40μgのコレステロール/ml)を伴う培地においてインキュベーションした。追加のβ-VLDLは、N2培地単独中でインキュベーションした細胞と比べ、apoE4-発現細胞の神経突起の伸展を減少しなかった。従って、β-VLDL存在下のapoE4は、神経突起伸展を直接阻害し、かつ既に伸展された神経突起の退縮を引き起さなかった。
【０１６０】
他のリポタンパク質を用い、apoEを保持する脂質ビヒクルが、β-VLDLと置換わるかどうかを決定した。apoE3-またはapoE4-発現細胞とトリグリセリド中に豊富なリポタンパク質であるウサギVLDLと一緒のインキュベーションは、神経突起伸展に、β-VLDLで得られたものと同様の作用を生じた。これらの結果を表3に示した。
【０１６１】
（表３）  apoE3またはapoE4 cDNAにより安定的にトランスフェクトされた細胞からの神経突起伸展に対するβ-VLDL、VLDL、または脂質乳剤の作用
2004533996.tif 000004
【０１６２】
表3に示した結果を得るために、細胞(apoE3-発現についてクローン#1またはapoE4-発現についてクローン#4)を、N2培地単独または所定濃度の下記粒子を含有する培地において96時間インキュベーションした：β-VLDL、40μgコレステロール/ml培地(これは5μgトリグリセリド/ml培地に相当)；VLDL、5μgトリグリセリド/ml培地；乳剤A、5μgトリグリセリド/ml培地。CHOL＝コレステロール；Tg＝トリグリセリド；PL＝リン脂質。各々のデータ点は、3回の個別の実験における、30、40個の神経突起を発現している細胞の測定により得た。データは、平均±S.E.M.で示した。ap＜0.010、対、対照***。
【０１６３】
表3に示したように、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞がVLDLと共にインキュベーションされる場合、これらは、神経突起伸展の増加を示したのに対し、VLDLの存在下でapoE4-分泌している細胞は、神経突起伸展の阻害を示した。他の実験において、ヒトLDLおよびイヌapoE HDLc、コレステロール摂食により誘導したapoE-が豊富な血漿高密度リポタンパク質(HDL)およびCSFにおけるapoE-含有リポタンパク質に類似したもの(Pitasら、(1987))も使用した。ApoE3-およびapoE4-分泌しているNeuro-2a細胞は、LDL(40μgコレステロール/ml)に反応しなかった(すなわち、N2培地単独で増殖した対照細胞と比べ、神経突起伸展に差異はなかった)。他方で、apoE HDLc(40μgコレステロール/ml)のapoE4-分泌細胞またはapoE3-分泌細胞とのインキュベーションは、各々、神経突起伸展の小さい低下または増加のみを生じた(N2培地中の対照細胞、100％；apoE4-分泌細胞＋HDLc、N2培地で得た値の85、90％；apoE3-分泌細胞＋HDLc、N2培地で得た値の110％)。
【０１６４】
リポソームおよび脂質乳剤も、apoEの送達に必要な脂質ビヒクルの型を定義する試みにおいて使用した。このDMPC乳剤単独またはコレステロール複合したDMPCは、apoE3-およびapoE4-分泌している細胞と共に、最大45μgリン脂質までの漸増するリン脂質濃度および5μgコレステロール/ml培地(これ以上高い濃度は細胞にとって有毒である)で、96時間インキュベーションした。
【０１６５】
これらの試験において、apoE-トランスフェクションしたNeuro-2a細胞のいずれかによる神経突起生長に対する作用はなかった。先にapoEは、DMPCと複合し、かつLDL受容体との高親和性結合を媒介することが示されている。Pitasら、J. Biol. Chem.、255:5454-5460(1980)。他方で、トリグリセリド-およびリン脂質-含有球形粒子(およそ35.8nm)である脂質乳剤粒子(表3の乳剤A)は、apoE3-分泌細胞における神経突起伸展の有意な増強を引き起し、かつapoE4-分泌細胞における生長の阻害と関連していた。従って、脂質および／または独自の粒子サイズの特定の組合せは、apoEアイソフォームの誘発、神経突起生長への特異的作用に必要であると考えられる。細胞へのコレステロール送達には、示差的作用が必要とは見えないことに注目することは興味深い。
【０１６６】
ウシCSFからのリポタンパク質を使用する追加試験は、CNS中の天然のリポタンパク質は、apoE3およびapoE4のアイソフォーム-特異的作用を媒介し得ることを示唆している。図4に示されるように、CSFから単離されたリポタンパク質(d＜1.21g/ml)のこれらの細胞への添加は、apoE4-発現細胞からの神経突起生長の阻害およびapoE3-発現細胞からの生長の増加を引き起した。CSFリポタンパク質が、濃度40μgリポタンパク質コレステロール/mlで使用される場合、その作用は、β-VLDLを同じ濃度で使用して得られる作用と類似していた。
【０１６７】
CSFリポタンパク質(d＜1.21g/ml)は、タンパク質およびコレステロール含量ならびにアポリポタンパク質組成について分析した。コレステロール対タンパク質の比は、およそ1:1であり、イヌCSFについて報告されたデータに類似してた。Pitasら(1987)。ウシCSFリポタンパク質(d＜1.21g/ml)は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、かつクマーシーブリリアントブルー染色で可視化した場合に、apoEおよびapoA-Iのみを含有していた。これらの結果は、先にヒトおよびイヌCSFリポタンパク質について報告されたものに類似していた。Pitasら(1987)；および、Roheimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76:4646-4649(1979)。
【０１６８】
β-VLDLに結合、内在化、および分解する神経芽細胞腫の細胞の能力を試験し、apoE3-およびapoE4-発現細胞における神経突起生長の差異は、分泌されたapoE3およびapoE4のapoEおよび／またはリポタンパク質脂質の細胞への送達を刺激する能力の差異に起因しているかどうかを決定した。これらの試験において、125I-β-VLDLを用い、Neuro-2a細胞におけるリポタンパク質の結合、取り込みおよび分解を定量した。これらの結果は表4に表わしている。
【０１６９】
（表４）安定的にトランスフェクトされた細胞および対照細胞による125I-β-VLDLの細胞結合および分解
2004533996.tif 000005
【０１７０】
表4に示した結果を得るために、細胞を、N2培地単独中で24時間インキュベーションした。その後125I-β-VLDL(3μgタンパク質/ml培地)を添加し、37℃で16時間経過後、Neuro-2a細胞によるリポタンパク質細胞結合(結合したおよび内在化された)および分解を測定した。報告されたデータは、ふたつ組で行われた2回の個別の実験の平均である(±S.D.)。対照＝pSV2neo単独でトランスフェクションされた細胞。表4において、aは＜0.05対対照を表わし、bは＜0.01対対照を表わしている。
【０１７１】
これらの表4の結果は、細胞結合された(結合および内在化された)125I-β-VLDLの総量は、apoE3-およびapoE4-分泌している細胞(両方ともapoE-トランスフェクションされない対照細胞において認められたものよりもわずかに低い)において同様に変動することを示した。125I-β-VLDLのapoE3-およびapoE4-分泌細胞による分解は、同様であった。apoE4-分泌細胞による125I-β-VLDLの分解には、apoE-トランスフェクションしていない対照Neuro-2a細胞と比較した場合に、わずかな(しかし統計学的には有意な)減少があった。
【０１７２】
平行実験において、これらの細胞は、DiI-標識したβ-VLDLと共にインキュベーションし、蛍光顕微鏡によりapoE3-およびapoE4-分泌している細胞におけるリポタンパク質の内在化を可視化した。内在化した後、DiIは、リポソームにより捕獲され、従ってこれらの細胞の蛍光強度は、内在化されかつ分解されたリポタンパク質の総量に比例している。Pitasら(1983)。これらの試験において、apoE3-およびapoE4-分泌している細胞におけるDiI-標識したβ-VLDLの取り込みに差異は認められなかった。DiI-標識したβ-VLDL(40μgのコレステロール/ml)と共に37℃で16時間インキュベーションした細胞からのDiIの抽出および定量は、DiI-標識したβ-VLDLの取り込みは、apoE3-およびapoE4-分泌している細胞におけるものと類似していることを目視による印象で確認した。対照細胞は、8.9±0.4ngのDiI/1mgの細胞タンパク質を取込んだのに対し、apoE3-およびapoE4-発現細胞は、各々、10.2±1.0および10.8±0.3ngのDiI/1mgの細胞タンパク質を取込んだ。
【０１７３】
ApoEが、これらの細胞により分泌された濃度で存在する場合にこれが脂質粒子に結合することを明らかにするために、放射標識したapoE3またはapoE4を、β-VLDL、VLDL、または乳剤Aと共に37℃で1時間インキュベーションし(100ngのapoEを40μgのβ-VLDLコレステロールと共に、または100ngのapoEを5μgのVLDLもしくは乳剤Aトリグリセリドのいずれかと共に)、かつFPLCにより分離した。ApoEのおよそ70％が、β-VLDLと結合し、かつ50％がVLDLおよび乳剤Aと結合した。脂質粒子に結合されたapoE3またはapoE4の量に差異ははかった。
【０１７４】
実施例2
ApoE結合受容体へのapoE結合の特異的阻害
どの受容体がapoE3およびapoE4の神経突起生長に対する示差的作用の媒介に関与しているかを決定するために、HSPG-LRP経路によるが、LDL受容体経路によらない、apoE-豊富なリポタンパク質の結合および内在化をブロックするインヒビターを用いた。次に神経突起生長に対する作用を決定した。β-VLDLの添加前に、これらの細胞を、ヘパリナーゼ(20ユニット/ml)および塩素酸(20mM)と共に、RAP(5μg/ml)と共に、またはラクトフェリン(10μg/ml)のいずれかと共に、1時間プレインキュベーションした。apoE-豊富なリポタンパク質のLRPへの結合は、それらの最初の細胞-表面HSPGへの結合を必要とする。ヘパリナーゼおよび塩素酸は、各々、細胞-表面HSPGの硫酸化を切断および還元する。Jiら、J. Biol. Chem.、268:10160-10167(1993)；および、Humphriesら、Met. Enzymol.、179:428-434(1989)。ラクトフェリンは、リポタンパク質のHSPGおよびLRPの両方への結合をブロックするのに対し、RAPは主にapoE-豊富なリポタンパク質のLRPへの結合をブロックする。これらの試薬は全て、先にLRPによるapoE-豊富なβ-VLDLの取り込みを阻害することが示されている。Mahleyら、Ann. N.Y. Acad. Sci.、737:39-52(1994)；Jiら(1993)；Jiら(1994a)；および、Wilinowら、J. Biol. Chem.、267:26172-26180(1992)。先に図2に示したように、β-VLDL単独は、神経突起の生長を刺激した。β-VLDLによる神経突起生長の刺激は、更に、apoE3-発現細胞において増強され、かつapoE4-分泌細胞において顕著に阻害された(表5)。
【０１７５】
（表５）  β-VLDLの存在下での塩素酸、ヘパリナーゼ、RAP、およびラクトフェリンの、apoE3またはapoE4 cDNAにより安定的にトランスフェクトされた細胞からの神経突起伸展に対する作用
2004533996.tif 000006
【０１７６】
表5に示した結果を得るために、細胞を、N2 培地単独、または指定された濃度の塩素酸、ヘパリナーゼ、RAP、またはラクトフェリンを含有する培地において、1時間インキュベーションした。その後β-VLDLを添加し、インキュベーションを合計96時間継続した。β-VLDL以外の試薬は、24時間毎に再添加した。培地およびβ-VLDLは、48時間で交換した。各々のデータ点は、2回の個別の実験において、30、40個の神経細胞が発現している神経突起を測定することにより得た。データは、平均±S.E.M.である。ap＜0.05、bp＜0.01、対、対照細胞(β-VLDLとインキュベーションした非-apoE-発現細胞)で得られた値。cp＜0.05、対、β-VLDL単独によるapoE3-発現細胞。d平行実験のセットにおいて、5μg/mlのRAPは、DiI-標識したLDLのNeuro-2a細胞への結合をブロックしなかった。
【０１７７】
表5に示した結果は、塩素酸およびヘパリナーゼまたはRAPの添加は、対照細胞(apoEを発現していないNeuro-2a細胞)において神経突起生長に対するβ-VLDLの刺激作用をブロックしなかったことを示しており、このことは、β-VLDL単独の作用は、LDL受容体により媒介されることを示唆している；しかし、これらの試薬は、apoEを分泌している細胞においてアイソフォーム-特異的作用をブロックした(表5)。細胞の塩素酸およびヘパリナーゼ処理ならびにRAPの添加は、β-VLDLと共にインキュベーションしたapoE3-発現細胞における神経突起伸展の刺激を妨害した(すなわち、β-VLDLを有意に減少し、apoE3を分泌しているNeuro-2a細胞における神経突起伸展を誘導した)。更に、塩素酸およびヘパリナーゼまたはRAPは、apoE4-発現細胞において認められた神経突起伸展の阻害をブロックした(すなわち、β-VLDL存在下でapoE4-発現細胞は、神経突起伸展の阻害を明らかにしなかったが、実際に、増加した伸展を示した)(表5)。ヘパリナーゼおよび塩素酸またはRAPの存在下において、apoE-分泌している細胞における、神経突起生長は、apoE非存在下でβ-VLDLが対照細胞へ添加された場合に認められたものに類似していた(表5)。従って、これらの試薬、LDL受容体の存在下において、β-VLDLの媒介作用はブロックされなかった。更にラクトフェリンは、apoE3およびapoE4の神経突起成長に対する作用をブロックした；しかし、これは同じく、対照細胞におけるβ-VLDLの神経突起伸展に対する作用をわずかに抑制した。これらのデータは、β-VLDLとHSPG-LRP経路の間の相互作用の阻害は、apoE3およびapoE4の神経突起生長に対する示差的作用を妨害することを示している(表5)。
【０１７８】
背根神経節または神経芽細胞腫の細胞において、apoE3に加え脂質給源が、神経突起伸展を支援しかつ促進している。ApoE3は、細胞本体および神経突起に広範に蓄積し、細胞骨格を安定化しかつ神経突起の伸長を支援し、ならびに直接または間接的に微小管の集成を変更するように見える。他方apoE4は、神経細胞内に蓄積も、神経突起伸展を支援するようにも見えず、微小管の外観を不安定化さえすることがある。ApoE4の作用は、LRP経路により媒介されるように見える。ApoE4を伴う個体は、明らかに、生涯の初期には正常な神経発生を有する。しかしapoE4は、シナプス結合のリモデリングを可能にも支援もしないことにより、それ以後の晩年においてその有害な作用を発揮することがある。この影響は、アルツハイマー病の病理発生において重要であると考えられ、その理由は、apoE4は、濃密な複雑な毒性の可能性があるAβペプチド斑の形成を補助することによりアルツハイマー病に寄与すると考えられるからである。
【０１７９】
実施例3
ApoE4ドメイン相互作用を妨害する試薬の検出法
ApoE4は、Innerarityらにより先に説明されたように(J. Biol. Chem.、254:4186-4190(1979))、Bolton-Hunter試薬(New England Nuclear社、ボストン、MA)を、比活性範囲200〜1100dpm/ngで用いて得た。ヨウ化したapoE4(50〜10mlの0.1M NH4HCO3中0.5〜2mg)を、被験試薬または化合物と共にインキュベーションし、かつこの混合物を、健常対象から得た血漿250mlに添加し、37℃で2時間維持した。その後血漿を、様々なリポタンパク質のクラスに、Superose6カラム(10/50HR、Pharmacia Fine Chemicals社、ウプスラ、スウェーデン)上、0.15M NaClを含有する20mMリン酸ナトリウム(pH7.4)で溶離するクロマトグラフィーにより、分画した。カラムの流量は0.5ml/分であり、0.5mlの画分を収集し、かつ125I含量を、Beckman 8000ガンマカウンター(Beckman Instruments社、フレルトン、CA)において決定した。apoE4ドメイン相互作用を妨害する試薬は、「修飾された」apoE4の優先性をVLDLからHDLへとシフトし、これはapoE3(対照として平行して試行)のものに類似した分配を生じうる。
【０１８０】
ApoE代謝
培養された神経細胞(Neuro-2a細胞)によるapoE-豊富なβ-VLDLの代謝を、3種の方法で試験した：
(1)apoE-豊富な125I-VLDLの細胞結合(結合および内在化)の測定による；
(2)apoE-豊富なDiI-標識したβ-VLDLの代謝の試験による(DiIは、リポタンパク質粒子の脂質部分の蛍光マーカーとして利用)；および
(3)apoE-豊富なβ-VLDLの細胞コレステロール含量を増大する能力の定量による。
【０１８１】
実施例4〜6の材料および方法
ヘパリナーゼIおよび特異的ホスホリパーゼCは、Sigma Chemical社(セントルイス、MO)から購入した。スラミンは、Research Biochemicals International社(ナティック、MA)から得た。精製したヒト血漿apoEおよびヒツジ抗-ヒトapoE抗体は、Dr. Karl Weisgraber(Gladstone Institute of Cardiovascular Disease、サンフランシスコ、CA)から提供された。ロバ抗-ヒツジIgGは、Jackson ImmunoResearch Laboratories社(ウェストグローブ、PA)から購入した。
【０１８２】
リポタンパク質の調製
ウサギβ-VLDL(d＜1.006g/ml)を、高脂肪、高コレステロール飼料を4日間摂食させたニュージーランドホワイトウサギ血漿から単離した。このβ-VLDL中のコレステロールのタンパク質に対する比は、〜15から20:1の範囲であった。ヒトapoE-豊富なβ-VLDLは、apoEのβ-VLDLとの37℃で1時間のインキュベーションにより調製した。一部の実験において、apoE-豊富なβ-VLDLは、下記のように、高速液体クロマトグラフィーにより再単離した。125I-β-VLDLおよび標識していないapoEまたは125I-apoEおよび非標識のβ-VLDLのいずれかを、β-VLDLタンパク質のapoEに対する比1:1.5で混合し、かつ37℃で1時間インキュベーションした。次にこの混合物(250μl)を、Superose 6カラム(Pharmacia Fine Chemicals社、ウプスラ、スウェーデン、10/50HR)上でクロマトグラフィーにより分画した。流量は0.5mL/分であり、0.5ml画分を収集した。溶離プロフィールは、125Iおよびコレステロールの定量によりモニタリングした。
【０１８３】
リポタンパク質およびApoEの標識
β-VLDLは、Bilheimerらの方法(Biochim. Biophys. Acta、260:212-221(1972))により、ヨウ化した。アポリポタンパク質E3およびE4は、Bolton-Hunter法(Boltonら、Biochem. J.、133:529-539(1973))によりヨウ化した。遊離のヨウ素を、P10カラムクロマトグラフィーにより除去した。β-VLDLは、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン(DiI)により、先に説明されたように(Pitasら、Arteriosclerosis、1:177-185(1981))標識した。
【０１８４】
細胞抽出物中の完全なApoEの検出
マウスの神経芽細胞腫(Neuro-2a)の細胞を、10％ウシ胎仔血清(FBS)を含有するダルベッコの変更イーグル培地(DMEM)/F12(1:1)において〜100％の集密度になるよう増殖し、N2培地で洗浄し、かつN2培地において、β-VLDL(40μgコレステロール/ml)単独、または30μg/mlのヨウ化されたapoE3もしくはヨウ化されたapoE4と共にインキュベーションした。指定された時点で、表面結合したapoEを、10mMスラミンと一緒の4℃で30分間のインキュベーションにより除去した。その後これらの細胞を、リン酸-緩衝した生理食塩水(PBS)で4℃で3回洗浄し、かつラバーポリスマン(rubber policeman)により穏やかに小片とした。これらの細胞は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-試料緩衝液中に溶解し、かつこれらの細胞タンパク質を、3〜20％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、かつニトロセルロース膜に転写し；オートラジオグラフィーによりapoEを検出した。
【０１８５】
細胞培養
Neuro-2a細胞は、10％FBSを含有するDMEM/F12(1:1)において維持し；この培地は、血清-非含有培地と使用前16時間以内に交換した。ヒト皮膚線維芽細胞を、10％FBSを含有するDMEMにおいて増殖した。LDL受容体-陰性線維芽細胞は、10％FBSを補充した最小必須培地において増殖した。ヒト肝細胞癌(HepG2)細胞を、既報のように(Jiら、J. Biol. Chem.、269:2764-2772(1994))、10％FBS、1％ヒト非必須アミノ酸、および1％ピルビン酸ナトリウムを含有する最小必須培地において増殖した。突然変異体チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞pgsA-745(キシローストランスフェラーゼ-欠損)は、グリコサミノグリカンを産生せず、およびpgsD-677(N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ-欠損およびグルクロン酸トランスフェラーゼ-欠損)は、ヘパリン硫酸を産生せず(Esko、Curr. Opin. Cell Biol.、3:805-816(1991))、これらは、Dr. J.D. Esko(University of Alabama、バーミンガム)のご厚意により提供された。CHO細胞は、7.5％FBSを含有するF12培地において維持した。Dr. J. Herz(University of Texas Southwestern Medical School、ダラス、TX)から提供された、マウスのLRP-陰性(LRP-/-)およびLRPヘテロ接合性線維芽細胞(LRP+/-)は、10％FBSを含有するDMEMにおいて維持した。β-VLDLまたは培養した細胞中のコレステロール含量をアッセイした。
【０１８６】
免疫細胞化学
組織培養皿中で増殖したNeuro-2a細胞または線維芽細胞は、血清-非含有培地において洗浄し、かつ37℃で、apoE3(30μg/ml)またはapoE4(30μg/ml)に加えたβ-VLDL(40μgコレステロール/ml)と共に指定した時間インキュベーションした。インキュベーション直後、細胞を氷上に配置し、リン酸緩衝液で洗浄した。その後免疫蛍光細胞化学のために、細胞を、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中の3％パラホルムアルデヒドで固定した。ApoEからの免疫蛍光を検出した。ApoE免疫蛍光の強度は、共焦点顕微鏡により定量した。
【０１８７】
ApoE＋β-VLDLの細胞の結合、内在化、および分解
培養した細胞を、〜100％の集密度まで増殖し、新鮮な血清-非含有培地で2回洗浄し、かつ37℃で、apoE-豊富なβ-VLDLと共にインキュベーションした。これらの細胞への添加前に、β-VLDLおよびapoEは一緒に(特に記さない限りは、各々、5および7.5μgのタンパク質)、37℃で1時間インキュベーションした。一部の細胞は、50μMクロロキン、およびリポソームプロテアーゼインヒビターと共に、37℃で2時間インキュベーションし、その後apoE-豊富なβ-VLDLを添加した。指定された時点で、これらの細胞を氷上に配置し、かつこの培地を、タンパク質分解産物についてアッセイした。細胞結合試験については、Neuro-2a細胞を、0.2％ウシ血清アルブミンを含有する0.1M PBSで5回氷上で洗浄し、かつ0.1M PBSで1回洗浄した。細胞結合したリガンドは、結合したおよび内在化した両物質を表わしている。線維芽細胞は、氷上で、DMEM-Hepesにより3回洗浄し、および10mMスラミンと共に4℃で30分間インキュベーションし、表面結合したリガンドを除去した。細胞内に残留している放射能は、どれが「内在化された」かを表わしている。洗浄後、これらの細胞を、放射能およびタンパク質濃度を測定するために、0.1N NaOHに溶解した。
【０１８８】
線維芽細胞およびNeuro-2a細胞による125I-apoE-豊富なβ-VLDLの内在化も、18℃で試験した。これらの細胞は、18℃のインキュベーター中に20分間放置し、その後リポタンパク質を添加し、次に更に3時間18℃でインキュベーションした。インキュベーション後、これらの細胞を氷上に配置し、DMEM-Hepesで3回洗浄し、かつ10mMスラミンと共に4℃で30分間インキュベーションし、細胞表面に結合した125I-apoEを除去した。培地中の125I-β-VLDLまたは125I-apoEの分解産物をアッセイした。
【０１８９】
培養した細胞によるDiI-標識したβ-VLDLの取り込み
Neuro-2a細胞は、DiI-標識したβ-VLDL単独で、またはapoE3もしくはapoE4のいずれかと共に、37℃で2時間インキュベーションした。その後これらの細胞は洗浄し、かつ0.1N NaOHで溶解し、代謝された(結合、内在化、および分解された)リポタンパク質総量に比例するこの細胞結合したDiIを、アッセイした。
【０１９０】
細胞のヘパリナーゼおよび特異的ホスホリパーゼC処理
前述の細胞を、37℃で、ヘパリナーゼI(10ユニット/ml)により1時間、もしくは特異的ホスホリパーゼC(5ユニット/ml)により30分間前処理した。その後細胞を、これらの酵素の存在下で、apoE3またはapoE4のいずれかと一緒にしたβ-VLDLと共に、インキュベーションした。β-VLDL(5μgタンパク質/ml)およびapoE(7.5μg/ml)は混合し、かつ細胞への添加前に一緒に37℃で1時間インキュベーションした。
【０１９１】
野生型およびHSPG-欠損CHO細胞による125I-apoE＋β-VLDLのパルス追跡
培養した細胞を、〜100％の集密度まで増殖し、氷上に配置し、かつ冷DMEM-Hepesで2回洗浄した。その後これらの細胞を、125I-apoE＋β-VLDLと共に、4℃で1時間インキュベーションし、細胞-表面結合(ゼロ時に結合したリガンド)を可能にした。細胞を冷F12培地で3回すすぎ、未結合のリガンドを除去した。予め温めたF12培地を添加し、かつこれらの細胞を37℃で指定した時間インキュベーションした。各時点で、これらの細胞を再度氷上に配置し、かつ培養培地を収集した。培地0.5mlに、0.2％ウシ血清アルブミン(Sigma社)0.4mlおよび50％トリクロロ酢酸(TCA)0.4mlを添加した。その後この培地を、4℃で30分間インキュベーションし、かつ3,000rpmで10分間遠心した。上清を125I-apoE分解アッセイ法のために収集し、かつペレットをTCA-沈殿した完全な125I-apoEとしてカウントした。これらの細胞を、冷DMEM-Hepesで1回洗浄し、コールドルームにおいて10mMスラミンと共に氷上で30分間インキュベーションし、その後0.1N NaOHに溶解した。細胞の放射能(内在化されたapoE)を、ガンマカウンターで測定し、かつタンパク質濃度を Lowry法で決定した。
【０１９２】
実施例4
ApoE-豊富なβ-VLDL粒子の結合および内在化
Neuro-2a細胞による125I-β-VLDLまたはヒトapoE3またはapoE4が豊富な125I-β-VLDLの細胞結合を、37℃で試験した(図5)。これらの試験において、β-VLDL単独の最大の細胞結合は、〜225ng/1mgの細胞タンパク質であった。β-VLDLの細胞結合は、apoE3またはapoE4により〜1.7倍に増強された。従って、apoE3またはapoE4の125I-β-VLDLの結合および内在化を促進する能力において、大きいアイソフォーム-特異的差異は存在せず、このことは類似量のβ-VLDLが内在化されたことを示唆している。加えてDiI-標識したβ-VLDLを用い、Neuro-2a細胞によるβ-VLDL粒子の取り込みを試験した(図6)。リポタンパク質により内在化されたDiIは、細胞により保持され、かつ代謝された(結合、内在化および分解された)リポタンパク質総量の定量に使用することができる。これらの試験において、2時間で、apoE3およびapoE4の両方が、apoEの非存在下で内在化されたDiI-標識したβ-VLDLの量と比較し、DiI-標識したβ-VLDLの取り込みを刺激した(〜1.8-2倍)[apoE4はβ-VLDL取り込みを、apoE3よりもわずかに大きい程度に刺激した(p＜0.002)]。
【０１９３】
更にapoE3およびapoE4が同様のβ-VLDL粒子の取り込みを刺激したことを確定するために、これらの細胞を、培地単独、β-VLDLを含有する培地、またはβ-VLDLおよびapoE3またはapoE4のいずれかを含有する培地においてインキュベーションし、かつこれらの細胞のコレステロール含量を決定した(図7)。β-VLDL単独は、細胞のコレステロール含量を、リポタンパク質非存在下で維持された対照細胞と比べ、〜4.7倍増大した。apoE3またはapoE4が豊富なβ-VLDLは、β-VLDL単独でインキュベーションした細胞と比べ、細胞のコレステロール含量を増大した[各々、〜1.5倍および〜1.7倍；apoE4によるコレステロール含量は、有意に大きかった(p＜0.005)]。脂質を伴わずに添加した遊離のapoE3またはapoE4は、本質的に細胞のコレステロールレベルに影響を及ぼさなかった。まとめると、apoE3およびapoE4の125I-β-VLDLまたはDiI-標識したβ-VLDLの取り込みに対する作用ならびに細胞のβ-VLDL-由来のコレステロールを蓄積する能力を試験するこれらの結果は、apoE3およびapoE4は、Neuro-2a細胞において同程度にβ-VLDL内在化を刺激し、apoE4が若干より活性があることを明らかにしている。従ってリポタンパク質粒子取り込みの差異は、apoE-が豊富なβ-VLDLと一緒にインキュベーションしたNeuro-2a細胞におけるapoE3対apoE4の蓄積の差異(apoE3はapoE4よりも大きい)を説明していない。
【０１９４】
実施例5
ApoEアイソフォームの細胞内蓄積
ApoE3およびapoE4の示差的蓄積の時間経過を、Neuro-2a細胞において分析した(図8)。これらの細胞は、apoE-豊富なβ-VLDLと共に2から48時間インキュベーションし、透過性とし、かつ免疫細胞化学のために精製されたヒトapoE3およびE4をウェスタンブロットで同等に良く検出するポリクローナル抗体で処理した。免疫反応性apoEを共焦点顕微鏡により検出および定量し、相対蛍光強度を測定した。最も早い時点(2時間目)で、これらの細胞は、apoE4よりもおよそ1.8倍多いapoE3を含んでいた。この免疫反応性apoEレベルの差異は、最大48時間(apoE4よりも〜1.6倍多いapoE3)まで維持された(図8)。
【０１９５】
蓄積された細胞内apoEは、主として完全なタンパク質であった。細胞は、apoE-豊富なβ-VLDLと共に指定した時間インキュベーションし；これらの細胞タンパク質を抽出し、SDS-PAGEにより分解し、ニトロセルロース膜に転写し、かつapoEをオートラジオグラフィーにより検出した。オートラジオグラフィーは、apoE4よりもより多くのapoE3の細胞蓄積および分解産物の明確でない蓄積を明らかにした。ウェスタンブロット分析は、同様の結果をもたらし、完全なapoEの示差的細胞内蓄積を明らかにしている。
【０１９６】
細胞によるapoE3およびapoE4の蓄積または保持の差異が、細胞結合(結合および内在化)の差異に起因するか、または内在化されたapoE3またはapoE4の分解の差異に起因するかを決定するために、125I-apoE3または125I-apoE4が豊富なβ-VLDLを用いて試験を行った。これらの試験において、Neuro-2a細胞(図9)およびヒト皮膚線維芽細胞(図11)の両方におけるヨウ化されたapoE3およびapoE4の示差的細胞結合または内在化も、最も早い時点(2時間目)で始まりかつ実験の最後(24時間目)まで継続することが明らかであった。これらの細胞中のapoE3およびapoE4含量の差異は、インキュベーションの4〜8時間後に最大であった。Neuro-2a細胞において、これらの細胞に結合されたapoE3の量は、細胞に結合されたapoE4量の2倍であった(図9)のに対し、線維芽細胞においては、apoE3は、それらの細胞中のapoE4よりも3倍豊富であった(図11)。同様に、125I-apoE2も、apoE4よりも大きい程度細胞内に蓄積した(2時間目にapoE4よりも〜1.5倍大きい)。Neuro-2a細胞および線維芽細胞における、各々、125I-apoE3および125I-apoE4の示差的細胞蓄積または内在化とは対照的に、これらの細胞によるヨウ化したapoE3またはapoE4の分解には有意差はなかった(図10および12)。
【０１９７】
ApoEが豊富なβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的細胞蓄積は、肝細胞癌においても認められた。表6に示したように、125I-apoE3＋β-VLDLと共にインキュベーションしたHepG2細胞は、125I-apoE4＋β-VLDLと共にインキュベーションした細胞と比べ、約2.5倍大きいapoEの細胞蓄積を示した。免疫学的試験およびオートラジオグラフィー的試験からのデータに加え、結合および分解実験は、apoE3-またはapoE4-豊富なβ-VLDLと共にインキュベーションしたNeuro-2a細胞、線維芽細胞および肝細胞癌における、apoE3およびapoE4の示差的蓄積を示した。
【０１９８】
（表６）  HepG2細胞による125I-apoE3または125I-apoE4に富むβ-VLDLの細胞結合
2004533996.tif 000007
平均±S.D.は、二連で行った二つの独立した実験から得た。
【０１９９】
これまでに説明した実験において、apoE3およびapoE4は、β-VLDLと共に37℃で1時間インキュベーションし、その後この混合物をこれらの細胞に添加した。高速液体クロマトグラフィーによる混合物の分離は、〜50％のapoEが、β-VLDL粒子に結合されたことを明らかにした。この示差的蓄積のひとつの可能性のある理由は、apoE4よりもapoE3のほうがβ-VLDLと結合すること、およびその結果apoE3の方が細胞により送達されることである。この可能性は、高速液体クロマトグラフィーによるapoE-豊富なβ-VLDLの単離後にβ-VLDLに結合した125I-apoE3または125I-apoE4量の試験により、あり得ないとされた。実際、リポタンパク質粒子に結合したのはapoE3よりもapoE4がわずかに多い(7.0対6.1μg/mgのβ-VLDLコレステロール)。更に、高速液体クロマトグラフィーで精製した125I-apoE-豊富なβ-VLDLを用い、本発明者らは、示差的apoE蓄積が、β-VLDL粒子上のapoEにより生じるが、脂質非含有または脂質がわずかなapoEでは生じないことを示した。この細胞結合は、精製した125I-apoE3豊富なβ-VLDLと共にインキュベーションしたNeuro-2a細胞の方が、精製した125I-apoE4豊富なβ-VLDLと共にインキュベーションしたものよりも大きかった(58対39ng/1mgの細胞タンパク質、2時間目；101対65ng/1mgの細胞タンパク質、4時間目)。
【０２００】
実施例6
AooEアイソフォームの示差的蓄積に寄与する機序
いかにしてapoE3対apoE4の示差的プロセシングが、示差的蓄積を説明し得るかをより詳細に調べるために、本発明者らは、ヨウ化したapoE-豊富なβ-VLDLの内在化を、線維芽細胞およびNeuro-2a細胞において、18℃で試験したが、この温度は、リポタンパク質の内在化は生じるが分解は生じない温度である(図13および14)。125I-apoEの分解産物の培養培地の分析は、分解は、使用した条件下では生じなかったことを確認した。これらの試験において、線維芽細胞(図13)および神経細胞(図14)の両方において、apoE3は、apoE4よりもより多い程度蓄積し、このことは、示差的蓄積は、内在化されたapoEの少なくとも一部の示差的取扱い(handling)に起因するが、リポソーム分解の差異には起因しないことを明らかにしている。この結論は、分解がクロロキンによりブロックされる線維芽細胞における試験により裏付けられた。リソソーム分解が存在しなくとも、細胞をapoE3-またはapoE4-豊富なβ-VLDLと共にインキュベーションした場合の、apoE3およびapoE4の示差的蓄積は明らかであった。
【０２０１】
ApoE3およびapoE4の示差的細胞蓄積の機序を確定するために、本発明者らは、LDL受容体、LRP、または特異的細胞-表面プロテオグリカンの発現を欠いた線維芽細胞を使用するようにした。apoE-豊富なβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的細胞蓄積は、LDL受容体-発現している線維芽細胞およびLDL受容体-陰性線維芽細胞の両方で生じ、これは、LDL受容体はこの示差的蓄積に関与しないことを明らかにしている(図15)。他方で、示差的蓄積は、正常なまたはFH線維芽細胞のヘパリナーゼ処理前に全般的にブロックされ、かつこの全体の細胞結合は、両アイソフォームについて有意に低下し、これは示差的作用は、HSPG/LRP複合体またはHSPG単独のいずれかにより媒介され得ることを示唆している(図15)。図16に示されたように、LRP発現についてヘテロ接合性(LRP+/-)またはLRP発現を欠いている(LRP-/-)いずれかの胚性マウス線維芽細胞は、apoE3およびapoE4の示差的蓄積を示した。従って、LRP発現は、apoE3対apoE4の示差的蓄積には必要ではない。しかし、これらの細胞のヘパリナーゼ処理は、この作用をブロックし、再度細胞-表面HSPGの役割を示している(図16)。示されたように、ヘパリナーゼは、apoE3-およびapoE4-が豊富な両β-VLDLの全体的内在化を著しく低下し、更にapoE-豊富なリポタンパク質の増強された代謝の媒介におけるHSPG単独の重要性を示唆している。
【０２０２】
ApoE3およびapoE4の示差的蓄積におけるHSPGの役割を、更に対照CHO細胞、HSPG発現を特異的に欠いている突然変異体CHO細胞、および全てのプロテオグリカンの発現を欠いているCHO細胞において試験した(図17)。125I-apoE3対125I-apoE4の示差的細胞蓄積または保持は、野生型CHO細胞において明らかであった；しかし、この示差的蓄積または保持は、HSPG-欠損およびプロテオグリカン-欠損の両方のCHO細胞において完全に廃止され、結論としてこのプロセスにおける細胞-表面HSPGの重要性を示している。同様に、CHO突然変異細胞により内在化されたapoE3およびapoE4のレベルは、非常に有意に低下した。
【０２０３】
プロテオグリカンは、グリセロホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーによるかまたはそれらのコアタンパク質の膜貫通のいずれかにより、細胞膜に結合されている。これらのプロテオグリカンの種類は、異なる割合で細胞プロセシングを受ける。GPI-アンカーされたプロテオグリカンは、迅速なエンドソームのリソソームへの輸送を示し、かつリソソーム分解を受け、細胞内半減期は〜30分であるのに対し、コアタンパク質にアンカーされたプロテオグリカンは、緩徐なエンドソームのリソソームへの輸送を示し(半減期〜4時間)、かつ遅延型プロセシングを受ける。これらの細胞によるapoE保持は、エンドソームのリソソームへの輸送の緩徐な経路の使用で一貫しており、かつこれらの細胞におけるapoE3およびapoE4の示差的蓄積は、GPI-アンカーされたプロテオグリカンによるapoEの内在化に起因しないことを示唆している。これは、GPI-アンカーされたHSPGを取除く特異的ホスホリパーゼCの、線維芽細胞とのヨウ化したapoE-豊富なβ-VLDLの細胞結合に対する作用の試験により明らかにされた(図18)。使用した条件下で、このホスホリパーゼは、[35S]O4で24時間標識された細胞から〜15％の35Sを取除く。細胞の特異的ホスホリパーゼC処理は、細胞中のapoE3およびapoE4の示差的蓄積またはapoE3-もしくはapoE4-いずれかが豊富なβ-VLDLの結合および内在化には影響を及ぼさず、これはGPIでアンカーされたHSPGは関与しないことを明らかにしている(図18)。
【０２０４】
ApoE4アイソフォームが、特異的な細胞内区画レトロエンドサイトーシスへのapoE3のシャント(shunting)および／またはapoE4の内在化を示差的に生じる可能性を考察した。これらの可能性を評価するために、本発明者らは、CHO細胞を125I-apoE-豊富なβ-VLDLと共に4℃で1時間インキュベーションし、未結合のリポタンパク質を洗浄除去し、次に内在化、分解および保持するために、37℃で数回温めた(「材料および方法」の項参照)ような、変更された「パルス追跡」試験を行った。特定の時点で、分解産物(分解したapoE)およびTCA-沈殿可能なタンパク質(放出された完全なapoE)の両方の分析のために、培地を取り、かつこれらの細胞を、スラミン(スラミン-放出可能なapoE)で洗浄し、その後計数した(内在化されたapoE)。
【０２０５】
表7は、4℃(ゼロ時)で結合したapoE3およびapoE4の量が類似していることを示す；しかし、37℃で30、60、および120分後の、細胞内(内在化された＝蓄積されたまたは保持された)のapoE3の量は、apoE4の量のほぼ2倍であった。各時点で、本発明者らは、少量の125I-apoE(すなわち、細胞表面に存在するapoE)がスラミン-放出可能であることを認めた。30〜120分の間に、分解された125I-apoE3およびapoE4の量は増大し、かつ両方のアイソフォームについてほぼ等しかった。従って、内在化されたapoE3およびapoE4の類似した画分が分解された。関心があることは、より多くの量のapoE4が、インキュベーション期間中、特に30分および60分の時点で、培地に出現したことである。このTCA-沈殿可能な完全なapoEは、レトロエンドサイトーシスされたapoE、または細胞表面上もしくは近傍にありかつ加温により迅速に放出されるapoEを表わしている。従って、経時的に、apoE4は、apoE3よりもより大きく放出されるかまたはより少なく内在化されるか、あるいは、より多くのapoE3が、区画に隔離されかつ放出されないと利用できなくなる。従ってより多くのapoE3が蓄積しかつ細胞により保持される。典型的には、4℃ゼロ時に細胞に結合した全apoEの80〜90％が、加温期間後の培地および細胞の様々な画分において回収された(表7)。
【０２０６】
（表７）  野生型CHO細胞による125I-apoE3-および125I-apoE4に富むβ-VLDLの代謝
2004533996.tif 000008
【０２０７】
125I-apoE3-および125I-apoE4の類似量(各々、399ng/mgおよび378ng/mg細胞タンパク質)が、4℃(すなわちゼロ時)に細胞に結合していた。37℃へ加温後に分析した画分中の125I-apoE(合計)の回収も、この表に報告している。データは、4つ組で行った1回の実験結果を表わしている。この実験は3回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２０８】
このパルス追跡試験のデータは、図19に図示した。3回の個別の実験をこのデザインで行い、かつ同等の結果を得た。野生型CHO細胞において、全ての時点で、apoE3が、apoE4よりもより多く蓄積され、かつ保持され、同量のapoE3およびapoE4が分解され、ならびに30および60分で、培地中により多くのapoE4が再出現した。対照的に、HSPG-欠損CHO細胞は、野生型CHO細胞(399および378ng/mg細胞タンパク質)よりもはるかに少ない125I-apoE3＋β-VLDLおよび125I-apoE4＋β-VLDLが結合し(77および75ng/mg細胞タンパク質)；HSPG-欠損細胞は、全ての時点において、apoE3およびapoE4の類似量が内在化されかつ分解された。本発明者らは、スラミン-放出可能なおよびTCA-沈殿可能な125I-apoE3-および125I-apoE4が類似量であることを発見した(図10B)。従ってHSPG-欠損細胞は、apoEの取り込みを顕著に低下させるのみではなく、アイソフォーム-特異的示差的蓄積、分解または保持を示すこともない。
【０２０９】
ApoEに富むβ-VLDLの代謝を試験し、apoE3およびapoE4がβ-VLDL粒子の取り込みを同レベル刺激するかどうかを決定した。更に、この細胞取り込み(保持もしくは蓄積)またはapoE-豊富なβ-VLDLからのapoEは、免疫細胞化学により直接およびそれに続くヨウ化したapoEの代謝により試験される。
【０２１０】
Neuro-2a細胞のapoE3-またはapoE4-豊富なβ-VLDLのいずれかとのインキュベーションは、同様のβ-VLDLの細胞結合、および細胞コレステロールの同様の増加を示した。これは、神経細胞において、線維芽細胞におけるように、apoE3およびapoE4は、類似数のリポタンパク質粒子の取り込みを刺激することを示している。他方で、特異的apoE3およびapoE4の細胞蓄積が、免疫蛍光または抽出された細胞タンパク質の分析のいずれかにより、Neuro-2a細胞において試験される場合、apoE3およびapoE4の示差的蓄積が認められた。これらの知見は、Neuro-2a細胞において確認され、かつ125I-apoE3または125I-apoE4-豊富なβ-VLDLの内在化の細胞結合を試験することにより線維芽細胞および肝癌細胞へと拡大された。3種全ての細胞型において、細胞内apoE3は、apoE4よりも多く蓄積された(〜2倍)。同様にapoE2も、Neuro-2a細胞においてapoE4よりも多く蓄積された(〜1.5倍)。apoE3およびapoE4の示差的蓄積は、LDL受容体-陰性ヒト線維芽細胞およびLRP-陰性マウス胚性線維芽細胞の両方において生じ、このことはこれらの受容体が有意には関係しないことを明らかにしている。しかし、この示差的蓄積または保持は、細胞のヘパリナーゼ処理により廃止された。
【０２１１】
このプロセスにおけるHSPGの役割は、HSPG合成を欠損している突然変異CHO細胞の使用により確認した。これらの細胞において、apoE3およびapoE4の両方の蓄積は低下し、かつapoE3およびapoE4の示差的蓄積は廃止された。これらの細胞のリン脂質-アンカーされたHSPGを放出する特異的ホスホリパーゼCによる処理は、apoE-豊富なβ-VLDLからのapoE3およびapoE4の示差的蓄積に対する作用を有さなかった。ApoE4の増強された分解は、これらの細胞によるapoE3およびapoE4の細胞蓄積の差異の理由ではなく、その理由は、この示差的蓄積は18℃で生じ、この温度ではエンドソーム-リソソーム融合は生じず、更にリソソーム分解を阻害するクロロキノンの存在下で生じない。
【０２１２】
前述のパルス追跡試験(表7、図19および20)は、apoEの示差的蓄積または保持の可能性のある機序を示唆している。125I-apoE3および125I-apoE4-豊富なβ-VLDLの類似量が4℃でCHO細胞に結合した後、細胞の37℃への加温は、apoE4よりも多くのapoE3の内在化を生じた。他方で、より多くのapoE4が早い時点(30および60分)で培地中に認められ、これは示差的apoE蓄積および保持が、細胞からのapoE4の優先的放出の結果であることを示唆している。これらの同じ試験において、HSPG-欠損CHO細胞は、はるかに少ないapoEに結合し、内在化し、かつ分解し、これはapoE3およびapoE4の間に相違はなかった。
【０２１３】
細胞表面HSPGは、多くの生物学的に重要な分子に結合する。加えて、HSPGは、特異的リガンドの結合および内在化に直接関連した受容体として機能することができる。これは、ある種のウイルス、トロンボスポンジン、リポタンパク質および肝性リパーゼ、トロンビン、および線維芽細胞増殖因子(FGF)について明らかにされている。加えてHSPGは、リガンドの他の受容体との相互作用を促進し、もしくは共-受容体のように機能する橋として利用する。例えば、HSPGは、FGFのFGF受容体との相互作用、apoE-および肝性リパーゼ含有リポタンパク質の結合および内在化におけるHSPGおよびLRPの共-受容体機能を促進することができる。本試験において明らかにされたように、apoE-含有リポタンパク質は、HSPG-依存型のプロセスで、LDL受容体またはLRPの関与を伴うことなく、結合されかつapoE内在化することができる。ヘパリナーゼ処理単独は、apoEの示差的蓄積を廃止する。培養細胞のヘパリナーゼ処理は、LDL受容体媒介したLDL結合またはα2-マクログロブリンのLRP媒介した結合を妨害しない。
【０２１４】
HSPG単独でまたは共受容体との複合体でのリガンドの内在化において機能する能力は、これらの分子の細胞内プロセシングの方法が異なることを示唆している。FGFの細胞内の運命は、使用される経路によって決定される。FGFがHSPG単独により内在化される場合、これは分解される；しかし、FGFがHSPG/FGF受容体経路により内在化される場合は、FGFの一部が細胞質に、かつ最終的には核に侵入する。明確に、apoE-豊富なリポタンパク質は、下記の3種の細胞の機序により内在化され得る：LDL受容体、HSPG/LRP経路、およびHSPG-依存型/LRP-非依存型経路。従ってapoEの細胞内の運命は、これらの各経路により細胞へ侵入するタンパク質の割合によって左右されることがある。より詳細に述べると、HSPG-依存型/LRP-非依存型経路は、apoE3のapoE4よりも大きい蓄積が原因であるapoE3対apoE4の示差的取扱い(handling)を説明する。ひとつは、HSPG経路を介したapoE3-豊富なリポタンパク質の取り込みは、apoE3を個別の(細胞内に隔離された)プールに向け、それが細胞内に蓄積することを可能にすると推測することができる。他方で、HSPG経路を介したapoE4-豊富なリポタンパク質の取り込みは、典型的なエンドソーム/リポソームカスケードを回避することに失敗し、その結果apoE4は蓄積しない。あるいは、HSPGに複合されたapoE4は、リサイクルされかつ細胞表面に放出される(レトロエンドサイトーシス)。
【０２１５】
ここに提供された結果は、神経細胞、線維芽細胞、および肝癌細胞の、apoE3またはapoE4のいずれかを伴うβ-VLDLと一緒のインキュベーションが、これらの細胞による完全なapoEの保持、ならびにapoE4よりも大きいapoE3の細胞蓄積を生じることを示している。細胞-表面HSPGは、保持およびapoEならびにapoE3対apoE4の示差的蓄積の両方において主要な役割を果たしているように見える。LRPおよびLDL受容体は、主に関与していない。ApoEの細胞内運命は、決定されたように維持される；しかし、これらの細胞によるapoEの保持は、恐らくHSPGの緩徐なエンドソームからのリソソームへの輸送との関連によると考えられる。この経路においてapoEがリポソーム分解を回避し細胞質区画に侵入し、そこでこれは微小管-関連されたタンパク質またはapoE3およびapoE4の神経突起生長および細胞骨格に対する示差的作用を説明する他の細胞成分と相互作用するかどうかは、まだ決定されていない。
【０２１６】
実施例7
ドメイン相互作用を妨害する化合物の同定
本発明者らは、apoE4においてドメイン相互作用をブロックする小さい有機分子を同定しかつこのアイソフォームに関連した増強されたリスクを逆転させようとした。本発明者らの戦略は、生理的試験のための選択肢を狭めるために利用可能な構造情報を使用するものであった。最近決定されたヒトapoE4のN-末端ドメインの構造は、構造を基にしたドラッグデザインのための刺激的な機会を提供した。一般的方法は、N-末端ドメインの適当な領域に結合しかつC-末端ドメインとの相互作用をブロックする分子を見つけるという、「ネガティブイメージ」法であった。Available Chemicals Directory(ACD；Molecular Design社、サンレアンドロ、CA)を、ヒトapoE4のN-末端ドメインの構造を用い、コンピュータによりスクリーニングした。ACDは、化学物質供給業者から入手可能な200,000種を超える化合物のモデル-構築した座標を含む。
【０２１７】
検索法-ネガティブイメージ法
ネガティブイメージ法において、プログラムDOCKは、各候補分子の標的タンパク質への結合をモデル化している。Kuntz, I.D.、Science、257:1078-82(1992)；および、EwingおよびKuntz、J. Comput. Chem.、18:1175-1189(1997)。結合に利用可能な空間は、集合的にその部位を満たしている球体のセットとして説明されている。その後これらの球体の中心を、可能性のあるリガンド原子位置で処理し、かつ各分子が数百から数千の位置の中の部位にコンビナトリアル的(conbinatorially)に配置される。単純なスコア化関数、ひとつの反射形の相補性ならびにLennard-Jones van der Waals項(term)およびクローン静電項からなる別のものを用い、位置を評価する。予め計算したグリッドは迅速なスコア化を可能にする。Mengら、J. Comput. Chem.、13:505-524(1992)。各分子について、各スコア化関数に従う最良の位置が保存される。この過程の最後に、各関数に従い数百の最良のスコア化された分子が、グラフにより検証される。Kuntzとその同僚は、このDOCK戦略を、HIV1プロテアーゼおよびチミジン酸シンターゼを含むいくつかの標的に適用した。
【０２１８】
DOCK検索
DOCK ver4.0を用い、apoE3およびapoE4の両方のN-末端ドメイン構造に対し、ACDを検索した。Kuntz、J. Comput. Chem.、18:1175-1189(1997)。関心のある部位は、残基109、112、および61に加え、周囲領域を含んでいた。この構造中の全てのタンパク質原子を、コンピュータのスコアに使用した。検索者は、標本採取をふたつの異なるレベルで行った(おおまかに言うと、これはいかに多くの位置が各分子について試行されたかということに対応している)。
【０２１９】
2000種を超えるapoE4にドック化(docked)された場合に良くスコア化された分子を、DOCKから出力した。ほとんどの場合、apoE3の対応するリストにも出現する分子は、考察から省いた。更に化合物を、グラフ化プログラムMIDASを用い、標的部位との相補性および所望の薬物様特性の存在を評価することにより、可視的にスクリーニングした。Ferrinら、J. Mol. Graph.、6:13-27(1988)；および、Lipinskiら、Adv. Drug Delivety Rev.、23:3-25(1997)。例えば、非常に大きく、疎水性またはペプチド-様の分子は、考察から省いた。非常に多数の立体中心を伴う天然の産物は、誘導体の合成に適合しにくいので、これらも廃止した。この方法は、115種の化合物のリスト、65種の最初の推奨物(密接なアナログのセットにつき1個)につながった。
【０２２０】
ドメイン相互作用のアッセイ法
ApoE4は、ドメイン相互作用により媒介される大きいトリグリセリドがリッチなリポタンパク質粒子について優先性を示すので、候補化合物をそれらのドメイン相互作用を妨害する能力について試験するための、乳剤結合アッセイ法を開発した。
【０２２１】
乳剤粒子の調製    トリオレイン(160mg)およびL-α-ホスファチジルコリン(40mg)を一緒にし、かつ窒素下で乾燥した。緩衝液(10mM Tris、100mM KCl、1mM EDTA、pH8.0)8mlを添加後、この混合物を水浴中で音波処理し、乳剤粒子の非均一の混合物を得た。これらの粒子は、超遠心(TLA 100.2ローター、30,000rpmで30分間)により収集し、かつ引き続き脂質ケーキを、チューブの切断により取り出し、かつ20mMリン酸緩衝液(PB)100μl中に再懸濁した。トリオレインおよびリン脂質含量を測定し、かつ総乳剤粒子濃度を決定した。
【０２２２】
放射性標識    新たに変性しかつ再生したアポリポタンパク質E3およびE4を、Bolton-Hunter Reagent[125I](ICN)を用いて放射標識した。比活性は、Lowry法およびGamma 8000カウンターを用いて決定した。
【０２２３】
結合親和性アッセイ法    ApoE3およびapoE4の乳剤粒子に対する結合親和性を下記のように決定した。ガラス管において、タンパク質(ヨウ化したトレーサーを伴う)25μgを、1％β-メルカプトエタノールで還元した。乳剤粒子250μgおよび化合物(10mMストック)2.5μlを添加し、かつ最終混合物を、20mMリン酸緩衝液(PB)により250μlとした。次にこの反応混合液を、37℃の水浴において2時間インキュベーションし、その後1.5mlの超遠心管に移した。最後に、60％ショ糖50μlを試料と混合し、かつ20mM PB 400μlを慎重に最上層に積層した。TLA 100.2ローターを用い、このチューブを、30,000rpmで30分間遠心し、引き続き管の底の遊離タンパク質から浮遊している乳剤粒子層を分離するように切断した。その後これらの画分を実際の管の各々半分と一緒にし、かつGamma-8000を用いてカウントした。これらの結果から、総乳剤結合したタンパク質を、総遊離タンパク質と比較した。タンパク質のみのアッセイ法は、管の底の部分に蓄積されたタンパク質の94.5〜96.6％を得た。乳剤粒子のみのアッセイ法において、乳剤粒子の94％が、管の頂上部分に蓄積された。
【０２２４】
対照結合アッセイ法は、化合物の添加を伴わずに行い、回収率ならびにapoE3およびapoE4各々の乳剤粒子への親和性を決定した。
【０２２５】
（表８）
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【０２２６】
一旦ApoE3およびE4の結合親和性が決定されると、DOCK化合物を含むアッセイ法を行った。ApoE4対照は、最初のアッセイ法に含まれ、かつapoE3およびapoE4対照はフォローアップアッセイ法に含まれた。
【０２２７】
最初のスクリーニングにおいて、14種の化合物が、ドメイン相互作用を妨害し、かつ6種が部分的に妨害した。フォローアップアッセイ法において、14種の化合物中の8種が、ドメイン相互作用を妨害することが確認され、apoE3の乳剤への結合に対する作用はほとんどまたは全くなかった。表9は、ドメイン相互作用を妨害する8種の化合物の結果を示している。値は、apoE4("E4")またはapoE3("E3")のいずれかの、％結合／％遊離として示した。
【０２２８】
（表９）
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【０２２９】
実施例8
Aβ生成に対するapoE4の作用
Aβ生成アッセイ法
野生型hAPP cDNA構築体(B103-APP)でトランスフェクションした安定した神経芽細胞腫B103細胞株を、10％ウシ胎仔血清(FBS)および400μg/ml G418を含有するダルベッコの変更イーグル培地(DMEM)で増殖することにより選択した。マウス脳において、APPを同レベル発現している細胞株を、RNase防御アッセイ法(RPA)により同定し、かつ下記に説明した試験において使用した。Aβ生成を決定するために、B103-APP細胞を、apoEアイソフォームを伴うまたは伴わないN2補充物を含有する血清-非含有最小必須培地(MEM)において37℃で24時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地50μlを収集し、かつELISA法によりAβレベルについてアッセイした。これらの細胞を溶解し、かつ細胞タンパク質を、Lowry法により決定した。Aβ生成は、細胞タンパク質について正規化した。
【０２３０】
APPプロセシングおよびAβ生成に対する細胞コレステロールの作用
最近の研究は、コレステロール降下薬と称されるスタチン類が、動物モデルにおけるAβ生成を減少し、かつヒト集団におけるADのリスクを低下させることを示している。インビボおよびインビトロの両試験も、細胞へのコレステロール送達が、Aβ生成を増大することを示している。この知識を用い、本発明者らは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)により安定してトランスフェクションされたラットの神経芽細胞腫B103細胞(B103-APP)を、apoEアイソフォームのようないくつかの物質をAPPプロセシングおよびAβ生成に対する作用を研究するための細胞道具として使用することができるかどうかを検証した。B103-APP細胞におけるコレステロールレベルが、コレステロール-リッチなリポタンパク質β-VLDLと一緒のインキュベーションにより増大した場合、APPαの分泌は減少し、かつAβの生成は増大した。対照的に細胞コレステロールがHMG-CoAレダクターゼインヒビターであるロバスタチンにより低下した場合は、APPαの分泌は増大され、かつAβの産生は減少される。これらのデータは、細胞コレステロールレベルは、Aβ生成にとって重要であるという考え、およびより高い細胞コレステロールはαセクレターゼ活性を低下し、その結果Aβ生成を増大するという考えに一致した。従って、B103-APP細胞株は、APPプロセシングおよびAβ生成を試験するための有用な細胞株であることが証明された。
【０２３１】
apoEアイソフォームのAPPプロセシングおよびAβ生成に対する作用
多くの研究が、apoEは、Aβ沈着およびクリアランスに対しアイソフォーム-特異的作用を有することを示唆している。しかしapoEがAPPプロセシングおよびAβ生成にも影響を及ぼすかどうかということに焦点を当てた研究はほとんどない。ApoEの主要な役割は、コレステロールの細胞への輸送である。従ってapoEは、細胞コレステロール含量を変更することにより、Aβ生成を変更することができる。ApoE4またはapoE3を伴うまたは伴わないβ-VLDLのAβ生成に対する作用を試験した。これらの結果は、図21A〜Dに示した。培養物したB103-APP細胞のapoE3-またはapoE4-豊富なウサギβ-VLDLと一緒のインキュベーションは、リポタンパク質を伴わずまたはβ-VLDLのみを伴いインキュベーションした細胞と比較し、Aβ生成を刺激した。しかしapoE-豊富なβ-VLDLが、FPLCによりふたつの個別の画分に分画される場合(大きいβ-VLDL画分および比較的小さい脂質-少量apoE-含有画分)(図21A)、β-VLDLおよびapoE3またはapoE4のいずれかが豊富なβ-VLDLは、Aβ生成を同程度刺激したが(図21B)、それにもかかわらず試験した細胞のコレステロール含量の差異はなかった。これらの結果は、β-VLDLおよびapoE3またはapoE4を含有するβ-VLDLが、細胞コレステロール含量を増大し、これは次にAβ生成を増大することを示唆している；しかし、β-VLDLのapoE3またはapoE4による濃厚化は、Aβ生成には更には影響しない。
【０２３２】
他方で、脂質少量のapoE画分は、アイソフォーム-特異的方法でAβ生成を増大し、apoE4はapoE3よりもより活性があった(図21C)。このアイソフォーム-特異的作用は、細胞の脂質-非含有apoEによる処理により、更に確認された。脂質-非含有apoE3は、Aβ生成を30％増大し、かつ脂質-非含有apoE4は、Aβ生成をほぼ70％増大した(図21D)。細胞コレステロール含量は脂質-非含有apoEによって変更されないので、これらのデータは、Aβ生成に対するapoEのアイソフォーム-特異的作用は、コレステロールの細胞含量の変化により媒介されないことを示唆している。別の言い方をすると、apoEおよびコレステロールは、異なる機序でAβ生成を調節することができる。
【０２３３】
Aβ生成に対するapoEのアイソフォーム-特異的作用の原因となる可能性のある機序を調べるために、本発明者らは、apoEアイソフォームがAβと相互作用し、かつその分解を示差的に妨害し、これにより異なる量のAβを培地中に維持するかどうかを決定した。125I-標識したAβ(350pg/ml)を、neo-トランスフェクションしたB103細胞と共に、apoE3またはapoE4を伴うかまたは伴わずに、インキュベーションした。Aβの細胞結合および分解は、24-時間のインキュベーション後変化しなかった。更に、apoE3およびE4は、APPα分泌およびα-セクレターゼ活性に作用を有さなかった。同様に、apoE3およびapoE4は、全-細胞溶解液中のα-セクレターゼ活性に酵素的に影響を及ぼさなかった。
【０２３４】
ApoE3およびapoE4のAPPリサイクルに対する示差的作用
成熟APPが細胞表面に戻ってリサイクルされる場合、分泌されたAβの大部分は、エンドソーム的経路内で産生されるので、APPリサイクルに示差的に影響を及ぼすことにより、apoE3およびE4はAβ生成を刺激することが可能である。この仮説を裏付けるために、22℃での細胞増殖によるエンドサイトーシスを阻害したところ、Aβ生成に対するapoEのアイソフォーム-特異的作用が完全に止まった。更にapoEのAPPリサイクルに対する作用を確認するために、本発明者らは、内在化アッセイ法を行った。細胞-表面APPは、細胞表面に結合しかつその後30分間の酢酸とのインキュベーションにより放出された、APPアミノ-末端抗体(1G7)に関連した放射能の測定により検出した。細胞内APPは、細胞溶解液中の放射標識された1G7の測定により検出し、かつ細胞内対細胞-表面のAPPの比を算出した。ApoEは、アイソフォーム-特異的方法においてAPPの内在化を増大し、apoE4はE3よりもより効果的であった。APP内在化の増大した割合は、α-セクレターゼのためにより多くのAPPを提供し、その結果より多くのAβを産生し得る。
【０２３５】
LRPはAβ生成のapoE4増強を媒介し得る
ApoEは、多くの細胞-表面受容体のリガンドであり、これはLDL受容体、LDL受容体-関連タンパク質(LRP)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)、VLDL受容体、およびapoE受容体-2を含む。従って本発明者らは、apoE4のAβ生成への刺激作用を媒介することに寄与する受容体を決定することに着手した。受容体関連したタンパク質(RAP)は、LRPアンタゴニストである。B103-APP細胞は、RAPを伴わずまたはLRP経路をブロックするような低濃度(25nM)で伴い、もしくはLRPおよびLDL受容体経路の両方をブロックするような高濃度(1μM)を伴い、37℃で1時間インキュベーションし、その後更にapoE3またはapoE4(7.5μg/ml)を伴い、24時間インキュベーションした。少なくとも部分的にLRP経路をブロックする低濃度のRAP(25nM)は、Aβ生成のapoE4増強を止め、このことはLRP経路の可能性のある関与を示唆している。興味深いことに、LRPおよびLDL受容体経路を両方ブロックする高濃度のRAP(1μM)は、低濃度のRAPと同様の作用を有し、これはLDL受容体経路は、Aβ生成のapoE増強に関与しないことを示唆している。
【０２３６】
ApoE4ドメイン相互作用は、Aβ生成のapoE4増強に寄与し得る
カルボキシ末端ドメインとアミノ末端ドメインの間の相互作用は、apoE4特有の生物物理学的特性である。ApoEアイソフォームは、それらのリポタンパク質結合優先性が異なり：apoE2およびapoE3はHDLを好むのに対し、apoE4はVLDLを好む。これは、apoE4のVLDL 優先性を決めているドメイン相互作用である。ApoE4のArg-112は、恐らくそれがapoE2およびapoE3において占拠している位置からArg-61の側鎖に新たな方向を与え(reorient)、Glu-255と塩橋を形成することを可能にしている。ApoE2およびapoE3において、Arg-61は異なるコンホメーションを有し、ドメイン相互作用は生じない。ヒトapoEのみがArg-61を有し；apoE遺伝子が配列決定された他の17種は全て、Thr-61を有する。ApoE4におけるArg-61のトレオニンへのまたはGlu-255のアラニンへの突然変異は、ドメイン相互作用を妨害し、かつapoE4を、apoE3同様に優先的にHDLへ結合するような型に転換する。
【０２３７】
次に本発明者らは、ドメイン相互作用がapoE4がAβ生成を刺激するのに必要であるかどうかを決定した。B103-APP細胞は、細胞内ドメイン相互作用を欠いているapoE4(Arg-61-＞Thr)(7.5μg/ml)と共に、37℃で24時間インキュベーションした。Aβ生成を決定し、かつapoE3またはapoE4(7.5μg/ml)と共にインキュベーションしたB103-APP細胞で得られたものと比較した。この試験は、Arg-61のトレオニンとの交換は、増強されたAβ生成を止めることを明らかにし、このことはapoE4ドメイン相互作用はAβ生成の刺激に関連していることを示唆している。
【０２３８】
apoE4ドメイン相互作用を破壊する小分子の同定
実施例7において考察したように、本発明者らは、DOCKプログラムを使用し、インビトロリポタンパク質分布アッセイ法により決定したように、apoE4と相互作用しかつドメイン相互作用を破壊する小分子(分子量〜500-600)を同定した。理論的ドラッグデザインのために、カリフォルニア大学サンフランシスコ校で開発されたコンピュータ-モデリングプログラムであるDOCKは、200,000種を超える化合物のモデル-構築座標を含む。ApoE4ドメイン相互作用が生じることが自明である領域のapoE3およびapoE4の結晶構造(重要な残基61、109、および112および周辺残基)は、Available Chemical Directoryの200,000種の化合物と相補性について検索し、apoE4と特異的にドック化している小分子を同定した。ApoE4をドック化した場合に、およそ2000種の分子が良くスコア化された；この数は、分子フィットの肉眼による評価により、60種の分子に減少し、かつおよそ12種が更なる試験のために選択された。
【０２３９】
本発明者らは、これらの小分子の8種(表9に示した)のAβ生成のapoE4増強に対する作用を試験した。8種の化合物中の4種-アゾカルミンG、グリシンクレゾールレッド、5-クロロ-2-(4-クロロ-2-(3,4-ジクロロフェニルウレイド)、および3-ブチル-エチル-5-(2-(3-スルホブチル-ベンゾ(1,3)オキシアゾで、各々、GIND25、GIND29、GIND32およびGIND105とも称される-は、Aβ生成のapoE4増強を完全に廃止したが、apoE3に対しては作用がなかった(図22)。これら4種の活性小分子は、恐らく重要な塩基性残基と相互作用し、apoE4のヘリックス2および3の間の溝に合致し、従ってドメイン相互作用を破壊するようなスルホアルキル化合物である。
【０２４０】
まとめると、ドメイン相互作用の結果として、apoE4は、細胞-表面LRPとの相互作用により、APPリサイクルを増大し、これは増大したAβ生成につながる。ApoE4と相互作用しかつドメイン相互作用を破壊する小分子、またはそれらの誘導体は、apoE4-関連したAβ過剰産生を低下させるのに有用な薬物であると考えられる。
【０２４１】
前述の本発明は、理解を明確にするために例証および実施例によりかなり詳細に説明されているが、当業者には、ある種の変更および修飾を行うことができることは明らかであると思われる。従ってこれらの説明および実施例は、添付された「特許請求の範囲」によって線引きされる本発明の範囲を限定するものとして構築されたのではない。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】Neuro-2a細胞をトランスフェクションするために使用したヒトapoE cDNA構築体の概略図である。NSEプロモーター(N)、下部に「E」を有するapoEエクソン、下部に「P」を有するポリリンカー領域、および下部に「A」を有するapoE cDNA。
【図２】対照Neuro-2a細胞からおよびapoE3またはapoE4を発現するように安定してトランスフェクションされた細胞からの、1個の細胞当りの神経突起の数(A)、神経突起分枝(B)、および神経突起伸展(C)に対するβ-VLDLの作用を示す、一連の棒グラフである、2A、2Bおよび2Cを含む。各場合において、べた黒棒は対照を表し、斜線付き棒はapoE3発現細胞を表し、かつべた白棒はapoE4発現細胞を表す。全ての場合において、X-軸は、β-VLDL(μgコレステロール/ml)を表す。
【図３】β-VLDLの、神経突起を発現している細胞の割合に対する作用を示すグラフである。各皿において4種の異なる領域で、神経突起を示している細胞の割合(％)を測定した。データは、2つ組で行った3回の異なる実験の平均である(±S.E.M.)。β-VLDL非存在下で神経突起を発現している細胞の割合は：対照細胞、35±11(白四角)；apoE3-発現細胞、32±9(黒円)；apoE4-発現細胞、25±13(黒四角)であった。＊p＜0.025と対照との対比；＊＊p＜0.005と対照との対比。
【図４】apoE3またはapoE4を発現するように安定してトランスフェクションされたNeuro-2a細胞からの神経突起伸展に対する脳脊髄液(CSF)リポタンパク質の作用を示す棒グラフである。細胞は、β-VLDLまたはウシCSFリポタンパク質(d＜1.21g/ml)と共に、インキュベーションした。各データ点は、20〜40個の神経細胞の測定値を表す。このデータは、平均±S.E.M.として報告している。べた黒棒は、対照を表す。斜線付き棒は、apoE3発現している細胞を表わす。べた白棒は、apoE4発現している細胞を表す。＊p＜0.025；＊＊p＜0.01；p＜0.005。
【図５】本発明の特定細胞に結合した125I-β-VLDLの量を、時間単位で経時的に示したグラフである。
【図６】標識された細胞の異なる3種類に関する細胞に結合したDiI-β-VLDLの相対蛍光強度の棒グラフである。
【図７】標識物としての異なる4種類についてのμg/ml細胞タンパク質中のコレステロール量の棒グラフである。
【図８】経時的なApoE相対蛍光強度のグラフである。
【図９】2種の異なる細胞についての細胞結合した125I-ApoE量の経時的グラフである。
【図１０】2種の異なる細胞についての経時的に分解された125I-ApoE量のグラフである。
【図１１】時間で測定した2種の異なる細胞による内在化された125I-ApoE量の経時的グラフである。
【図１２】時間で測定した2種の異なる細胞についての分解された125I-ApoE量の経時的グラフである。
【図１３】細胞培養物に添加した125I-ApoE濃度に対する、2種の異なる細胞により内在化された125I-ApoE量のグラフである。
【図１４】試験した2種の異なる細胞により内在化された125I-ApoE総量のグラフである。
【図１５】LDL受容体を発現しているまたは欠いているヒト線維芽細胞により内在化された125I-ApoE量の棒グラフである。
【図１６】LRPを発現しているまたは欠いている2種類の細胞により内在化された125I-ApoE量の棒グラフである。
【図１７】標識された異なる種類の細胞により内在化された125I-ApoE量の棒グラフである。
【図１８】標識された異なる種類の細胞と結合された125I-ApoEの棒グラフである。
【図１９】標識されたCHO細胞の異なる種類について細胞タンパク質1mg当りの125I-ApoE量(ng/mg)の棒グラフである。
【図２０】標識されたHSPG-欠損CHO細胞の異なる種類について細胞タンパク質1mg当りの125I-ApoE量(ng/mg)の棒グラフである。
【図２１Ａ−Ｄ】B103/APP細胞によるAβの産生に対する、β-VLDL；apoE4またはapoE3と組み合わせたβ-VLDL；apoE3；および、apoE4の作用を示す。
【図２２】化合物のAβ生成のapoE4増強に対する作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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2004533996.tif 000125
2004533996.tif 000126
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533996.tif 000127
【国際調査報告】
2004533996.tif 000128