(57)【要約】本発明は、ゲノムＤＮＡのトランスジェニック変異および標的特定変異のスクリーニングを実施するための方法および装置を提供する。本発明はまた、指定遺伝配列についてＤＮＡをスクリーニングするためのシステムを提供する。本システムは、プロセッサー、メモリーおよびウェブブラウザーを有するコンピューター、および前記指定配列についてゲノムＤＮＡのサンプルを分析する自動スクリーニング装置を含み、前記コンピューターは、指定遺伝配列および他のスクリーニングパラメーター選択を遠隔地ユーザーから電子通信網を介して受信する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むゲノムＤＮＡサンプルで指定された遺伝配列を検出する方法：
（ａ）基材にゲノムＤＮＡを沈積させ；
（ｂ）前記指定された遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｃ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを検出して、前記ゲノムＤＮＡサンプルで前記指定遺伝配列を検出する。
【請求項２】
前記指定ゲノム配列が外来遺伝子挿入物である請求項１の方法。
【請求項３】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項１の方法。
【請求項４】
前記選択性マーカーが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項３の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのプローブが標的遺伝配列および増幅分子に特異的な請求項１の方法。
【請求項６】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項５の方法。
【請求項７】
前記増幅分子がチラミドである請求項５の方法。
【請求項８】
さらに、参考遺伝配列に特異的な少なくとも１つの標識プローブを前記基材に添加する工程を含む請求項１の方法。
【請求項９】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項１０】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項１の方法。
【請求項１１】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記基材がガラスである請求項１の方法。
【請求項１３】
前記基材がプラスチックである請求項１の方法。
【請求項１４】
前記基材が膜である請求項１の方法。
【請求項１５】
前記基材が、前記ゲノムＤＮＡと結合する化学的成分で官能基化される請求項１の方法。
【請求項１６】
前記ゲノムＤＮＡが紫外線架橋によって前記基材に固定される請求項１の方法。
【請求項１７】
前記ゲノムＤＮＡが熱によって前記基材に固定される請求項１の方法。
【請求項１８】
前記基材が、前記ゲノムＤＮＡを固定するために十分な数のアルデヒド基をもつ光学的に平坦なガラスである請求項１の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、ゲノムＤＮＡサンプルを指定されたゲノムＤＮＡコントロールサンプルと比較することによってゲノムＤＮＡサンプルで指定された遺伝配列を検出する方法：
（ａ）基材の第一の場所に前記サンプルの前記ゲノムＤＮＡを沈積させ；
（ｂ）前記基材の第二の場所に前記指定コントロールサンプルの前記ゲノムＤＮＡを沈積させ；
（ｃ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｄ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；さらに
（ｅ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記ゲノムＤＮＡで指定された遺伝配列を検出する。
【請求項２０】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記選択性マーカーが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのプローブが標的遺伝配列および増幅分子に特異的な請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記増幅分子がチラミドである請求項２３の方法。
【請求項２６】
さらに、参考遺伝配列に特異的な標識プローブを前記基材の前記第一および第二の場所の前記サンプルに添加する工程を含む請求項１９の方法。
【請求項２７】
参考遺伝配列に特異的な前記少なくとも１つのプローブが少なくとも２つの結合領域を含み、１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は前記増幅分子に特異的である請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項２６の方法。
【請求項２９】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項１９の方法。
【請求項３０】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記基材がガラスである請求項１９の方法。
【請求項３２】
前記基材がプラスチックである請求項１９の方法。
【請求項３３】
前記基材が膜である請求項１９の方法。
【請求項３４】
前記基材が、前記ゲノムＤＮＡと結合する化学的成分で官能基化される請求項１９の方法。
【請求項３５】
前記ゲノムＤＮＡが紫外線架橋によって前記基材に固定される請求項１９の方法。
【請求項３６】
前記ゲノムＤＮＡが熱によって前記基材に固定される請求項１９の方法。
【請求項３７】
前記基材が、前記ゲノムＤＮＡ上に固定されるために十分な数のアルデヒド基をもつ光学的に平坦なガラスである請求項１９の方法。
【請求項３８】
以下の工程を含む、組織サンプルを指定されたコントロール組織サンプルと比較することによって前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する方法：
（ａ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理し、ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得て；
（ｂ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片からゲノムＤＮＡを分離し；
（ｃ）前記サンプルのゲノムＤＮＡを基材の第一の場所に沈積させ；
（ｄ）前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第二の場所に沈積させ；
（ｅ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｆ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；さらに
（ｇ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する。
【請求項３９】
前記ゲノムＤＮＡが磁性粒子を用いて細胞破片から分離される請求項３８の方法。
【請求項４０】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約１００塩基対から１０００塩基対のゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子を用いて細胞破片から分離する請求項３８の方法。
【請求項４１】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約５００塩基対の平均サイズをもつゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子を用いて細胞破片から分離する請求項３８の方法。
【請求項４２】
前記溶解緩衝液が、遠隔地のユーザーからスクリーニング検査室に一晩輸送される間に前記サンプルを溶解する成分から構成される請求項３８の方法。
【請求項４３】
前記溶解緩衝液が、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ並びに４１５ｍｇのプロテイナーゼＫおよびＲＮＡ分解酵素を含む請求項３８の方法。
【請求項４４】
ウェルプレートのウェル中の前記サンプルおよび前記指定コントロールサンプルを覆うために十分な量の前記溶解緩衝液が、前記遠隔地のユーザーによって前記サンプルおよび前記指定コントロールサンプルに添加される請求項３８の方法。
【請求項４５】
前記指定遺伝配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項３８の方法。
【請求項４６】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項３８の方法。
【請求項４７】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項３８の方法
【請求項４８】
前記指定遺伝配列がノックインである請求項３８の方法
【請求項４９】
前記指定遺伝配列がノックアウトである請求項３８の方法。
【請求項５０】
前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項３８の方法。
前記増幅分子がデンドリマーである請求項２３の方法。
【請求項５１】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記増幅分子がチラミドである請求項５０の方法。
【請求項５３】
さらに、参考遺伝配列に特異的な標識プローブを前記基材の前記第一および第二の場所の前記サンプルに添加する工程を含む請求項３８の方法。
【請求項５４】
参考遺伝配列に特異的な前記少なくとも１つのプローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項５３の方法。
【請求項５６】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項３８の方法。
【請求項５７】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項５６の方法。
【請求項５８】
以下の工程を含む、組織サンプルを指定されたコントロール組織サンプルと比較することによって前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する方法：
（ａ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理し、ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得て；
（ｂ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；
（ｃ）前記サンプルのゲノムＤＮＡを基材の第一の場所に沈積させ；
（ｄ）前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第二の場所に沈積させ；
（ｅ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｆ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；さらに
（ｇ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する。
【請求項５９】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約１００塩基対から１０００塩基対のゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項５８の方法。
【請求項６０】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約５００塩基対の平均サイズをもつゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記溶解緩衝液が、遠隔地のユーザーからスクリーニング検査室に一晩輸送される間に前記サンプルを溶解する成分から構成される請求項５８の方法。
【請求項６２】
前記溶解緩衝液が、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ並びに４１５ｍｇのプロテイナーゼＫおよびＲＮＡ分解酵素を含む請求項５８の方法。
【請求項６３】
ウェルプレートのウェル中の前記サンプルおよび前記指定コントロールサンプルを覆うために十分な量の前記溶解緩衝液が、前記遠隔地のユーザーによって前記サンプルおよび前記指定コントロールサンプルに添加される請求項５８の方法。
【請求項６４】
前記指定遺伝配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項５８の方法。
【請求項６５】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項５８の方法。
【請求項６６】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項５８の方法
【請求項６７】
前記指定遺伝配列がノックインである請求項５８の方法
【請求項６８】
前記指定遺伝配列がノックアウトである請求項５８の方法。
【請求項６９】
前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項５８の方法。
【請求項７０】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項６９の方法。
【請求項７１】
前記増幅分子がチラミドである請求項６９の方法。
【請求項７２】
さらに、参考遺伝配列に特異的な標識プローブを基材の前記第一の場所および基材の第二の場所の前記サンプルに添加する工程を含む請求項５８の方法。
【請求項７３】
参考遺伝配列に特異的な前記少なくとも１つのプローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項７２の方法。
【請求項７４】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項７２の方法。
【請求項７５】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項５８の方法。
【請求項７６】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項７５の方法。
【請求項７７】
以下の工程を含む、組織サンプルを指定されたコントロール組織サンプルと比較することによって前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する方法：
（ａ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理し、ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得て；
（ｂ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；
（ｃ）ゲノムＤＮＡ濃度を調整して前記指定遺伝配列の検出を容易にし；
（ｄ）前記サンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第一の場所に沈積させ；
（ｅ）前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第二の場所に沈積させ；
（ｆ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｇ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；さらに
（ｈ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記組織サンプルで指定された遺伝配列を検出する。
【請求項７８】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約１００塩基対から１０００塩基対のゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項７７の方法。
【請求項７９】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約５００塩基対の平均サイズをもつゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項７７の方法。
【請求項８０】
前記溶解緩衝液が、遠隔地のユーザーからスクリーニング検査室に一晩輸送される間に前記サンプルを溶解する成分から構成される請求項７７の方法。
【請求項８１】
前記溶解緩衝液が、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ並びに４１５ｍｇのプロテイナーゼＫおよびＲＮＡ分解酵素を含む請求項７７の方法。
【請求項８２】
前記溶解緩衝液が、前記遠隔地のユーザーによって前記サンプルに添加される請求項７７の方法。
【請求項８３】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項７７の方法。
【請求項８４】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項７７の方法
【請求項８５】
前記指定遺伝配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項７７の方法。
【請求項８６】
前記指定配列の一部分に特異的な前記プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列の一部分に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項７７の方法。
【請求項８７】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項８６の方法。
【請求項８８】
前記増幅分子がチラミドである請求項８６の方法。
【請求項８９】
さらに、参考遺伝配列に特異的な標識プローブを基材の前記第一の場所および基材の第二の場所の前記サンプルに添加する工程を含む請求項７７の方法。
【請求項９０】
参考遺伝配列に特異的な前記少なくとも１つのプローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項８９の方法。
【請求項９１】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項８９の方法。
【請求項９２】
前記磁性粒子が１ミクロンの鉄芯をもつカルボキシル化粒子である請求項７７の方法。
【請求項９３】
前記基材に沈積させる前の前記ＤＮＡ濃度が液１μｌ当たり１７から２５０ｎｇである請求項７７の方法。
【請求項９４】
前記基材に沈積させる前の前記ＤＮＡ濃度が液１μｌ当たり１２．５から５００ｎｇである請求項７７の方法。
【請求項９５】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項７７の方法。
【請求項９６】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項９５の方法。
【請求項９７】
少なくとも１つの標識された標的結合プローブおよび少なくとも１つの標識された参考結合プローブを用い、組織サンプルを指定されたコントロール組織サンプルと比較することによって指定遺伝配列について前記組織サンプルをスクリーニングする、以下の工程を含む方法：
（ａ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理し、ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得て；
（ｂ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；
（ｃ）前記サンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第一の場所に沈積させ；
（ｄ）前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第二の場所に沈積させ；
（ｅ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｆ）前記基材の前記第一および第二の場所に、少なくとも１つの標識された参考結合プローブを添加し；
（ｇ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；
（ｈ）少なくとも１つの標識された参考結合プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；
（ｉ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記指定遺伝配列についてサンプルをスクリーニングする。
【請求項９８】
前記少なくとも１つの標識された標的結合プローブが、指定遺伝配列の一部分に特異的である請求項９７の方法。
【請求項９９】
前記少なくとも１つの標識された標的結合プローブが、外来遺伝子挿入物の一部分に特異的である請求項９７の方法。
【請求項１００】
前記少なくとも１つの標識された標的結合プローブが、リコンビナント修飾物またはその一部分に特異的である請求項９７の方法。
【請求項１０１】
前記少なくとも１つの標識された参考結合プローブが、参考遺伝配列に特異的である請求項９７の方法。
【請求項１０２】
前記参考遺伝配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６から成る群から選ばれる請求項９７の方法。
【請求項１０３】
前記参考遺伝配列が配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８および配列番号：２９から成る群から選ばれる請求項９７の方法。
【請求項１０４】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項９７の方法。
【請求項１０５】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項９７の方法。
【請求項１０６】
前記標識が直接的である請求項９７の方法。
【請求項１０７】
前記標識が間接的である請求項９７の方法。
【請求項１０８】
前記少なくとも１つの標識された標的結合プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記標的遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項９７の方法。
【請求項１０９】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項１０６の方法。
【請求項１１０】
前記増幅分子がチラミドである請求項１０６の方法。
【請求項１１１】
前記少なくとも１つの標識された参考結合プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項９７の方法。
【請求項１１２】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項１０９の方法。
【請求項１１３】
前記増幅分子がチラミドである請求項１０９の方法。
【請求項１１４】
以下の工程を含む、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって前記組織サンプルを指定遺伝配列についてスクリーニングする方法であって、前記ゲノムＤＮＡを含む前記組織サンプルが遠隔地のユーザーによりスクリーニング検査室に送られる前記スクリーニング方法：
（ａ）溶解緩衝液を遠隔地のユーザーに提供することによって組織サンプルよりゲノムＤＮＡの抽出を容易にし；
（ｂ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理してゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得て；
（ｃ）前記溶解緩衝液中の前記組織サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に輸送し；
（ｄ）溶解された組織サンプルを遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室で受け取り；
（ｅ）前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルのゲノムＤＮＡを細胞破片から磁性粒子を用いて分離し；
（ｆ）前記サンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第一の場所に沈積させ；
（ｇ）前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを前記基材の第二の場所に沈積させ；
（ｈ）前記基材の前記第一および第二の場所に、前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；
（ｉ）前記指定遺伝配列の一部分に特異的な前記少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを前記基材の前記第一および第二の場所で検出し；さらに
（ｊ）前記基材の前記第一および第二の場所のシグナルを比較して、前記指定遺伝配列について前記組織サンプルをスクリーニングする。
【請求項１１５】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約１００塩基対から１０００塩基対のゲノムＤＮＡフラグメントを得る工程を含む請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約５００塩基対の平均サイズをもつゲノムＤＮＡフラグメントを得る工程を含む請求項１１４の方法。
【請求項１１７】
前記溶解緩衝液が、遠隔地のユーザーからスクリーニング検査室に一晩輸送される間に前記サンプルを溶解する成分から構成される請求項１１４の方法。
【請求項１１８】
前記緩衝液が、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ並びに４１５ｍｇのプロテイナーゼＫおよびＲＮＡ分解酵素を含む請求項１１４の方法。
【請求項１１９】
前記指定遺伝配列が選択性マーカーである請求項１１４の方法。
【請求項１２０】
前記指定遺伝配列が外来遺伝子挿入物である請求項１１４の方法。
【請求項１２１】
前記指定遺伝配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項１１４の方法。
【請求項１２２】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約１００塩基対から１０００塩基対のゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項１１４の方法。
【請求項１２３】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを常磁性粒子により分離した後で前記ゲノムＤＮＡを超音波処理して約５００塩基対の平均サイズをもつゲノムＤＮＡフラグメントを得ることを含む請求項１１４の方法。
【請求項１２４】
前記基材が光学的に平坦なガラススライドである請求項１１４の方法。
【請求項１２５】
前記指定配列の一部分に特異的な前記プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項１１４の方法。
【請求項１２６】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項１２５の方法。
【請求項１２７】
前記増幅分子がチラミドである請求項１２５の方法。
【請求項１２８】
前記参考遺伝配列の一部分に特異的な前記プローブが少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記参考遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項１１４の方法。
【請求項１２９】
前記増幅分子がデンドリマーである請求項１２８の方法。
【請求項１３０】
前記増幅分子がチラミドである請求項１２８の方法。
【請求項１３１】
前記基材に１から１３００００のゲノムＤＮＡスポットが沈積される請求項１１４の方法。
【請求項１３２】
前記磁性粒子が１ミクロンの鉄芯をもつカルボキシル化粒子である請求項１１４の方法。
【請求項１３３】
さらに、前記ゲノムＤＮＡを前記基材に沈積させる前に前記ゲノムＤＮＡに関する形態学的コントロールを添加する工程を含む請求項１１４の方法。
【請求項１３４】
前記形態学的コントロールがラムダＤＮＡである請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
以下の工程を含む、遠隔地のユーザーによりスクリーニング検査室に送られる少なくとも１つのサンプル中のゲノムＤＮＡを指定ゲノムＤＮＡ配列についてスクリーニングする方法であって、前記遠隔地のユーザーが電子通信網を介して前記スクリーニング検査室およびサプライヤーにスクリーニングパラメーターを提供する前記スクリーニング方法：
（ａ）アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；
（ｂ）アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答が前記スクリーニングパラメーターを含み；
（ｃ）前記遠隔地のユーザーがスクリーニングパラメーターを選択し；
（ｄ）遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に前記選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；
（ｅ）前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーの選択スクリーニングパラメーターを前記通信網を介して受信し；
（ｆ）選択スクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記遠隔地ユーザーの要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；
（ｇ）前記検査室は前記プローブを受け取り；
（ｈ）前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送し；
（ｉ）前記選択スクリーニングパラメーターにしたがって前記サンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに
（ｊ）前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【請求項１３６】
前記電子通信網がインターネットである請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項１３５の方法。
【請求項１３８】
前記プローブが前記指定遺伝配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はチラミドに特異的である請求項１３５の方法。
【請求項１３９】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はデンドリマーに特異的である請求項１３５の方法。
【請求項１４０】
１日当たり少なくとも２０００サンプルが前記スクリーニング検査室によりスクリーニングされる請求項１３５の方法。
【請求項１４１】
前記供給されるものに溶解緩衝液が含まれ、前記溶解緩衝液は、前記遠隔地ユーザーと前記スクリーニング検査室間を前記サンプルが輸送されている間に前記サンプルを溶解することができるように構成される請求項１３５の方法。
【請求項１４２】
前記データーが、前記選択スクリーニングパラメーターを前記スクリーニング検査室に送信してから４８時間以内に遠隔地の依頼者に報告される請求項１３５の方法。
【請求項１４３】
以下の工程を含む、遠隔地のユーザーによりスクリーニング検査室に送られる少なくとも１つのサンプル中のゲノムＤＮＡを指定されたＤＮＡ遺伝配列についてスクリーニングする方法であって、前記遠隔地のユーザーが電子通信網を介して前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーターを提供する前記スクリーニング方法：
（ａ）アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；
（ｂ）アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答が前記スクリーニングパラメーターを含み；
（ｃ）前記遠隔地のユーザーはスクリーニングパラメーターを選択し；
（ｄ）前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に前記選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；
（ｅ）前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーの選択スクリーニングパラメーターを前記通信網を介して受信し；
（ｆ）選択スクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記スクリーニング検査室から要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；
（ｇ）前記スクリーニング検査室は前記プローブを受け取り；
（ｈ）前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送し；
（ｉ）前記選択スクリーニングパラメーターにしたがって前記サンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに
（ｊ）前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【請求項１４４】
前記電子通信網がインターネットである請求項１４３の方法。
【請求項１４５】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項１４３の方法。
【請求項１４６】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はチラミドに特異的である請求項１４３の方法。
【請求項１４７】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はデンドリマーに特異的である請求項１４３の方法。
【請求項１４８】
１日当たり少なくとも２０００サンプルが前記スクリーニング検査室によりスクリーニングされる請求項１４３の方法。
【請求項１４９】
前記供給されるものに溶解緩衝液が含まれ、前記溶解緩衝液は、前記遠隔地ユーザーと前記スクリーニング検査室間を前記サンプルが輸送されている間に前記サンプルを溶解することができるように構成される請求項１４３の方法。
【請求項１５０】
前記データーが、前記選択スクリーニングパラメーターを前記スクリーニング検査室に送信してから４８時間以内に遠隔地の依頼者に報告される請求項１４３の方法。
【請求項１５１】
前記スクリーニングパラメーター選択が選択性マーカーを含む請求項１４３の方法。
【請求項１５２】
前記スクリーニングパラメーター選択が被験系統数の特定を含む請求項１４３の方法。
【請求項１５３】
前記スクリーニングパラメーター選択がプローブの配列を含む請求項１４３の方法。
【請求項１５４】
前記スクリーニングパラメーター選択が指定コントロールを含む請求項１４３の方法。
【請求項１５５】
前記スクリーニングパラメーター選択が指定遺伝配列を含む請求項１４３の方法。
【請求項１５６】
前記スクリーニングパラメーター選択が標的遺伝配列を含む請求項１４３の方法。
【請求項１５７】
以下の工程を含む、遠隔地のユーザーによりスクリーニング検査室に送られる少なくとも１つのサンプル中のゲノムＤＮＡを指定されたゲノムＤＮＡ配列についてスクリーニングする方法であって、前記遠隔地のユーザーが電子通信網を介して前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーターを提供する前記スクリーニング方法：
（ａ）アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；
（ｂ）アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答が前記スクリーニングパラメーターを含み；
（ｃ）前記遠隔地のユーザーはスクリーニングパラメーターを選択し；
（ｄ）前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に前記選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；
（ｅ）前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーの選択スクリーニングパラメーターを前記通信網を介して受信し；
（ｆ）選択スクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記スクリーニング検査室から要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；
（ｇ）前記スクリーニング検査室は前記プローブを受け取り；
（ｈ）前記遠隔地ユーザーから溶解緩衝液中の組織サンプルを前記スクリーニング検査室へ輸送し、前記溶解緩衝液は、前記遠隔地ユーザーと前記スクリーニング検査室との間の輸送時間中に前記サンプル中の前記組織を溶解することができるように構成され；
（ｉ）前記選択スクリーニングパラメーターにしたがって前記サンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに
（ｊ）前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【請求項１５８】
前記電子通信網がインターネットである請求項１５７の方法。
【請求項１５９】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域は増幅分子に特異的である請求項１５７の方法。
【請求項１６０】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はチラミドに特異的である請求項１５７の方法。
【請求項１６１】
前記プローブが前記指定配列の一部分に特異的で、前記プローブは少なくとも２つの結合領域を含み、その１つは前記指定遺伝配列に特異的で、第二の領域はデンドリマーに特異的である請求項１５７の方法。
【請求項１６２】
１日当たり少なくとも２０００サンプルが前記スクリーニング検査室によりスクリーニングされる請求項１５７の方法。
【請求項１６３】
前記電子通信網がインターネットである請求項１５７の方法。
【請求項１６４】
前記緩衝液が、４Ｍ尿素、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ並びに４１５ｍｇのプロテイナーゼＫおよびＲＮＡ分解酵素を含む請求項１５７の方法。
【請求項１６５】
前記スクリーニングパラメーター選択が選択性マーカーを含む請求項１５７の方法。
【請求項１６６】
前記スクリーニングパラメーター選択が被験系統数の特定を含む請求項１５７の方法。
【請求項１６７】
前記スクリーニングパラメーター選択がプローブの配列を含む請求項１５７の方法。
【請求項１６８】
前記スクリーニングパラメーター選択が指定コントロールを含む請求項１５７の方法。
【請求項１６９】
前記スクリーニングパラメーター選択が指定遺伝配列を含む請求項１５７の方法。
【請求項１７０】
前記スクリーニングパラメーター選択が標的遺伝配列を含む請求項１４３の方法。
【請求項１７１】
前記供給物にプローブが含まれ、前記プローブは遺伝標的および増幅分子に特異的な配列を含む請求項１５７の方法。
【請求項１７２】
以下を含む、スクリーニング検査室に遠隔地ユーザーより送られる組織サンプルの高容量スクリーニングおよび標的特定変異のスクリーニングのための自動化装置：
（ａ）アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信する手段；
（ｂ）アクセスを可能にする応答をスクリーニングパラメーターとともに前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する手段；
（ｃ）前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーター選択を送信する手段；
（ｄ）前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送する手段；
（ｅ）ゲノムＤＮＡを前記サンプルから単離する手段；
（ｆ）前記ゲノムＤＮＡを基材に沈積させる手段；
（ｇ）ゲノムＤＮＡをスクリーニングする手段；
（ｈ）前記データを前記遠隔地ユーザーに送信する手段。
【請求項１７３】
前記サンプルを輸送する前記手段がオーバーナイトパッケージシステムである請求項１７２の装置。
【請求項１７４】
前記ゲノムＤＮＡを単離する前記手段が磁気分離器である請求項１７２の装置。
【請求項１７５】
データーを送信する手段がインターネットである請求項１７２の装置。
【請求項１７６】
前記装置が１日当たり少なくとも２０００サンプルをスクリーニングする能力をもつ請求項１７２の装置。
【請求項１７７】
前記ゲノムＤＮＡを沈積させる前記手段が自動配列器（アレーヤー）である請求項１７２の装置。
【請求項１７８】
以下を含む、遠隔地ユーザーによって作製されたスクリーニングパラメーター選択にしたがって組織サンプルを修飾または変異ゲノムＤＮＡについてスクリーニングするための高容量装置：
（ａ）液体を第一のウェルプレートから第二のウェルプレートに移すための自動アクセッショニングステーション；
（ｂ）前記第二のウェルプレートのゲノムＤＮＡを単離するための単離ステーション；
（ｃ）前記第二のウェルプレート中のＤＮＡ濃度を調整するための光学的標準化ステーション；
（ｄ）前記第二の検査プレートから基材に前記ゲノムＤＮＡを沈積させるための配列（アレイイング）ステーション；
（ｅ）ゲノムＤＮＡの部分と結合する標識プローブをハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーションステーション；
（ｆ）結合した標識プローブを検出するための検出ステーション；
（ｇ）遠隔地ユーザーがスクリーニングパラメーターを作製し、前記遠隔地ユーザーが電子通信網を介して前記装置と通信する手段；
（ｈ）スクリーニングの結果を前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して通信する手段。
【請求項１７９】
前記検出ステーションがマイクロアレー画像化装置を含む請求項１７８の装置。
【請求項１８０】
前記スクリーニングパラメーターが選択性マーカーを含む請求項１７８の装置。
【請求項１８１】
前記スクリーニングパラメーターが被験系統数を特定することを含む請求項１７８の装置。
【請求項１８２】
前記スクリーニングパラメーターがプローブの配列を含む請求項１７８の装置。
【請求項１８３】
前記スクリーニングパラメーターが標的遺伝配列を含む請求項１７８の装置。
【請求項１８４】
前記スクリーニングパラメーターが指定コントロールを含む請求項１７８の装置。
【請求項１８５】
前記スクリーニングパラメーターが指定遺伝配列を含む請求項１７８の装置。
【請求項１８６】
前記スクリーニングパラメーターが標的遺伝配列を含む請求項１７８の装置。
【請求項１８７】
前記第二のウェルプレート中のＤＮＡの濃度が液体１μｌ当たり１７から２５０ｎｇである請求項１７８の装置。
【請求項１８８】
前記第二のウェルプレート中の前記ＤＮＡの濃度が液体１μｌ当たり１２．５から５００ｎｇである請求項１７８の装置。
【請求項１８９】
前記装置が１日当たり少なくとも２０００サンプルをスクリーニングする能力を有する請求項１７８の装置。
【請求項１９０】
以下を含む、サンプル中のゲノムＤＮＡを指定されたゲノムＤＮＡ配列についてスクリーニングするシステム：
（ａ）遠隔地ユーザーからの前記スクリーニングパラメーター選択を受信できるように適合させた、プロセッサー、メモリーおよびウェブブラウザーを有するコンピューター；および
（ｂ）ゲノムＤＮＡサンプルを前記スクリーニングパラメーター選択について分析する、マイクロアレー画像化装置を含むワークステーション。
【請求項１９１】
前記スクリーニングパラメーター選択が、指定遺伝配列；選択性マーカー；標的遺伝配列；指定コントロールの遺伝配列；被験系統数；およびプローブの配列から成る群から選ばれる請求項１９０のシステム。
【請求項１９２】
前記スクリーニングパラメーター選択が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５から成る群から選ばれる請求項１９０のシステム。
【請求項１９３】
前記スクリーニングパラメーターがインターネットを介して受信される請求項１９０のシステム。
【請求項１９４】
前記ゲノムＤＮＡが原核細胞性である請求項１９０のシステム。
【請求項１９５】
前記ゲノムＤＮＡが真核細胞性である請求項１９０のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願Ｎｏ．６０／２３０，３７１（２０００年９月６日出願）に基づきＵＳＣ§１１９（ｅ）により優先権を主張する。前記出願は参照により本明細書に含まれる。
発明の背景
発明の分野：本発明は、トランスジェニック変異および標的特定変異をスクリーニングするためのシステムに関する。さらに、本発明は組織サンプルに由来する指定された遺伝配列もしくはその部分を検出またはスクリーニングする種々の方法に関する。より具体的には、本発明は、トランスジェニック変異および標的特定変異をスクリーニングするための高容量装置に関する。
【０００２】
関連技術の記載：生物のＤＮＡの変異によって生じるゲノムの修飾は、そのような変異が前記生物の配偶子に存在する場合（生殖細胞系列変異と称される）に子孫に伝達される。これらの変異は、ＤＮＡ組換え技術を用いるＤＮＡの遺伝的操作から生じるか、または化学的もしくは物理的手段によりＤＮＡを攻撃することによって導入することができる。ＤＮＡ組換え技術により導入されるＤＮＡは多くの供給源から得ることができる（ウイルス、マイコプラズマ、細菌、真菌、酵母、哺乳類（例えばヒト）を含む脊索動物門に由来するＤＮＡを含むがただしこれらに限定されない）。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術によって生物のＤＮＡの導入、欠失または置換が可能になった。細胞内へのＤＮＡの任意導入は、例えばトランスフェクション（エレクトロポレーション、リポフェクションを含む）、注入（前核注入、核移植）または形質導入（ウイルス感染）のような技術によって達成できる。ランダム変異（点変異、欠失、増幅）は、細胞を突然変異誘発化学物質で処理するか、または細胞を物理的傷害（例えばエックス線照射または線エネルギー付与照射（ＬＥＴ））に付すことによって発生させることができる。生物におけるＤＮＡの標的特定付加、欠失または置換（誘発性または非誘発性）は相同組換えによって実施される。誘発可能な系では、配列特異的遺伝子組換え酵素（リコンビナーゼ）、例えばＣｒｅ−ＬｏｘＰ（米国特許５，６５４，１８２号および５，６７７，１７７号）およびＦＬＰ／ＦＲＴ（米国特許５，５２７，６９５号）（参照により本明細書に含まれる）が用いられる。
【０００４】
トランスジェニック生物とは、別の種に由来するＤＮＡ配列（そのままの遺伝子または遺伝子セグメント）をそのゲノム内に安定に組み込まれた状態で含む生物である。トランスジェニック哺乳動物は、一般的にはＤＮＡを受精卵の前核にマイクロインジェクトすることによって作出される。前記技術では、ＤＮＡコピー数またはホストゲノムへのＤＮＡの組み込み部位を制御することはできない。トランスジェニック系統とはその子孫に外来ＤＮＡ配列が伝達された生物を指す。
【０００５】
標的特定変異、位置特異的変異または遺伝子ターゲッティングは、ＤＮＡの相同組換えを利用しホストゲノム内の特定のＤＮＡ配列を変化させる方法として報告されている。これは、遺伝子の不活化（ノックアウト変異）または遺伝子の遺伝的改変（ノックイン変異）をもたらす。哺乳類では、これは、クローン化変異遺伝子セグメント（標的誘導構築物）を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）にトランスフェクトし、相同組換えによってＥＳ細胞の内因性遺伝子セグメントを置換することによって達成される。これらＥＳ細胞に由来する動物は標的特定変異をそのゲノム内に所有するであろう。さらに改良されたこの技術は、誘発性遺伝子改変を伴う。この方法では、内因性遺伝子は、位置特異的リコンビナーゼ（Ｃｒｅ，ＦＬＰ）のための認識配列（ＬｏｘＰまたはＦＲＴ配列）を含むＤＮＡセグメントにより標的として捕らえられた。標的ＥＳ細胞またはＥＳ細胞由来動物でのリコンビナーゼの発現は、認識部位に接するＤＮＡセグメントの枯渇をもたらす。標的誘導構築物の構造に応じて、これは標的遺伝子の不活化、活性化または改変をもたらすことができる。動物の誘発可能な系の利点は、遺伝子改変が、リコンビナーゼを特異的に活性化させるその能力に応じて任意の時点で、または任意の組織で誘発可能であるということである。これは、誘発性プロモーター（化学誘発性またはホルモン誘発性プロモーター）の制御下にリコンビナーゼを配置することによって達成される。
【０００６】
トランスジェニック変異および標的特定変異のスクリーニングは、ゲノムが特定の遺伝配列（内因的に存在するか、または修飾、変異もしくは遺伝子操作された配列）をもつか否かを決定するために用いられる。ゲノムＤＮＡはこのような修飾または変異についてスクリーニングされる。ゲノムＤＮＡはそのサイズのために基材に堅固に固定するのが困難である。ゲノムＤＮＡにはコード領域および非コード領域の両方が含まれる。したがって、ゲノムＤＮＡはエクソンおよびイントロン、プロモーターおよび遺伝子調節領域、テロメア、複製開始点、複製機能および非機能性遺伝子間ＤＮＡを含む。ゲノムＤＮＡはメチル化された二本鎖ＤＮＡである。ｃＤＮＡおよびＰＣＲアンプリコンを固定することはこれら分子か極めて小さいという点で異なることである。さらに、生化学的修飾現象（例えばメチル化）はこれら小さな分子では発生しない（Ｍ． Ｓｈｅｎａ， ＤＮＡ
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ（この文献は参照により本明細書に含まれる））。
トランスジェニックスクリーニングは現在のところ手動で実施されている。この手動系は時間を要し、各実験室で結果が様々で、さらには実施者の技量によっても異なる結果をもたらす。現在のところサザンブロット法を用いる研究者の場合は、トランスジーン（外来遺伝子）または標的特定変異について組織サンプルをスクリーニングするには１週間以上を必要とするかもしれない。また別の方法では、３０ものＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）をエッペンドルフマイクロチューブ（登録商標Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）（Ｂｅｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｅｒｙ， ＮＹ）で実施し、これをゲル上で分離する。この方法の場合には、ほとんどの実験室で３から７日が必要である。より正確で迅速なさらに高容量のトランスジェニック変異および標的特定変異のスクリーニングのためのシステムおよび方法が工業的に必要とされている。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、トランスジェニック変異および標的特定変異の自動化された検査のための方法およびシステムを提供することによって上記の問題に対する唯一無比の解決方法を提供する。
本発明の目的は、トランスジェニックサンプルおよび標的特定変異誘発サンプルを指定された遺伝配列について、従来の方法よりも高容量でのスクリーニングを提供することである。本発明の別の目的は、従来のトランスジェニックサンプルおよび標的特定変異サンプルのスクリーニング方法よりも迅速にスクリーニングの結果を研究者に提供することである。これらの目的は本発明のいくつかの特徴によって達成される。これらの特徴は、原核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡを基材上に沈積させ、さらにマイクロアレー画像化装置を用いてゲノムＤＮＡを検出して高容量スクリーニングを容易にすることを含む。
【０００８】
さらにまた、サンプルスクリーニングを実施するための遠隔地ユーザーの選択パラメーターおよび付随する試薬を統合的な態様で提供するオーダー（注文）プロセスは、指定遺伝配列についてトランスジェニックサンプルおよび標的特定変異誘発サンプルの高容量スクリーニングを容易にする。この特徴の他に、磁性粒子を用いて細胞溶解物から得られるゲノムＤＮＡのスクリーニングおよび、遠隔地のユーザーからスクリーニング検査室にサンプルが輸送されている間に機能するように構成されている溶解緩衝液による組織サンプルの溶解は、高容量スクリーニングを容易にすることが判明した。指定された遺伝配列についてゲノムＤＮＡの高容量スクリーニングを可能にする本明細書で開示する技術は、当業者によりゲノムＤＮＡサンプル中の遺伝配列を検出する多様な方法に広範囲に応用できることは特記されるべきである。
【０００９】
本発明の別の特徴では、ゲノムＤＮＡサンプル中の指定された遺伝的配列を検出する方法が提供される。この方法は以下を含む：ゲノムＤＮＡを基材上に沈積させ；前記指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブを添加し；前記指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを検出して、指定された遺伝配列を前記ゲノムＤＮＡサンプルで検出する。
【００１０】
本発明のまた別の特徴では、ゲノムＤＮＡサンプルを指定されたゲノムＤＮＡコントロールサンプルと比較することによって、前記ゲノムＤＮＡサンプル中の指定遺伝配列を検出する方法が提供される。この方法は以下の工程を伴う：基材の第一の場所にサンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ、指定されたコントロールサンプルに由来するゲノムＤＮＡを基材の第二の場所に沈積させ、指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し、前記指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し、基材の第一および第二の場所のシグナルを比較してゲノムＤＮＡサンプル中の指定遺伝配列を検出する。
【００１１】
本発明のまた別の特徴では、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって、前記組織サンプル中の指定遺伝配列を検出する方法が提供される。この方法は以下の工程を伴う：組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルを十分な量の溶解緩衝液で処理してゲノムＤＮＡを含む細胞破片を入手し；組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルのゲノムＤＮＡを細胞破片から分離し；サンプルに由来するゲノムＤＮＡを基材の第一の場所に沈積させ；指定コントロールサンプルに由来するゲノムＤＮＡを基材の第二の場所に沈積させ；指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分と特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して組織サンプル中の指定遺伝配列を検出する。
【００１２】
本発明の別の特徴にしたがえば、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって、前記組織サンプル中の指定遺伝配列を検出する方法が提供される。本方法は以下の工程を含む：ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得るために十分な量の溶解緩衝液で組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルを処理し；前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；基材の第一の場所に前記サンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；基材の第二の場所に前記指定コントロールサンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して組織サンプル中の前記指定遺伝配列を検出する。
【００１３】
本発明の別の特徴にしたがえば、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって、前記組織サンプル中の指定遺伝配列を検出する方法が提供される。本方法は以下の工程を含む：ゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得るために十分な量の溶解緩衝液で組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルを処理し；前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；ゲノムＤＮＡ濃度を調整して前記指定遺伝配列の検出を容易にし；基材の第一の場所に前記サンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；基材の第二の場所に前記指定コントロールサンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して組織サンプル中の前記指定遺伝配列を検出する。
【００１４】
本発明の別の特徴では、少なくとも１つの標識された標的結合プローブおよび少なくとも１つの標識された参考結合プローブを用い、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって組織サンプルを指定遺伝配列についてスクリーニングする方法が提供される。本方法は以下の工程を含む：前記組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルをゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得るために十分な量の溶解緩衝液で処理し；前記組織サンプルおよび前記指定コントロール組織サンプルの細胞破片から磁性粒子を用いてゲノムＤＮＡを分離し；基材の第一の場所に前記サンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；基材の第二の場所に前記指定コントロールサンプルに由来するゲノムＤＮＡを沈積させ；前記指定ゲノム配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；少なくとも１つの標識された参考結合プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し、少なくとも１つの標識された参考結合プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して前記指定遺伝配列についてサンプルをスクリーニングする。
【００１５】
本発明の別の特徴にしたがえば、指定された遺伝配列についてゲノムＤＮＡをスクリーニングする方法が提供される。本方法では、ゲノムＤＮＡを含む組織サンプルは遠隔地のユーザーによってスクリーニング検査室に送られる。本方法は以下の工程を含む：遠隔地のユーザーに溶解緩衝液を提供することによって組織サンプルよりゲノムＤＮＡの抽出を容易にし；前記組織サンプルを前記遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室へ輸送し；前記遠隔地のユーザーから溶解された組織サンプルを前記スクリーニング検査室で受けとり；磁性粒子を用いて前記溶解組織サンプルからゲノムＤＮＡを分離し；前記サンプルのゲノムＤＮＡを基材の第一の場所に沈積させ；前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを基材の第二の場所に沈積させ；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；少なくとも１つの標識された参考結合プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し、少なくとも１つの標識された参考結合プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して、指定された遺伝配列についてサンプルをスクリーニングする。
【００１６】
本発明の別の特徴にしたがえば、組織サンプルを指定コントロール組織サンプルと比較することによって、指定遺伝配列について前記組織サンプルをスクリーニングする方法が提供される。本方法では、ゲノムＤＮＡを含む組織サンプルは遠隔地のユーザーによってスクリーニング検査室に送られる。本方法は以下の工程を含む：遠隔地のユーザーに溶解緩衝液を提供することによって組織サンプルよりゲノムＤＮＡの抽出を容易にし；前記組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルをゲノムＤＮＡを含む細胞破片を得るために十分な量の溶解緩衝液で処理し；溶解緩衝液中の前記組織サンプルを前記遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室へ輸送し；溶解された組織サンプルを前記遠隔地のユーザーから前記スクリーニング検査室で受けとり；磁性粒子を用いて前記組織サンプルおよび指定コントロール組織サンプルの細胞破片からゲノムＤＮＡを分離し；前記サンプルのゲノムＤＮＡを基材の第一の場所に沈積させ；前記指定コントロールサンプルのゲノムＤＮＡを基材の第二の場所に沈積させ；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブを基材の第一および第二の場所に添加し；前記指定遺伝配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識プローブに由来するシグナルを基材の第一および第二の場所で検出し；さらに基材の第一および第二の場所のシグナルを比較して、指定された遺伝配列について組織サンプルをスクリーニングする。
【００１７】
本発明の別の特徴にしたがえば、遠隔地のユーザーによって送られた少なくとも１つのサンプルで指定ゲノムＤＮＡ配列についてゲノムＤＮＡをスクリーニングする方法が提供される。本方法では遠隔地のユーザーは電子通信網を介して前記スクリーニング検査室およびサプライヤーにスクリーニングパラメーターを提供する。本方法は以下の工程を含む：アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答には前記スクリーニングパラメーターが含まれ；前記遠隔地のユーザーはスクリーニングパラメーターを選択し；遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に選択されたスクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーからスクリーニングパラメーター選択を電子通信網を介して受信し；選択スクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記遠隔地ユーザーの要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；前記検査室は前記プローブを受け取り；前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送し；前記選択スクリーニングパラメーターにしたがってサンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【００１８】
本発明の別の特徴にしたがえば、遠隔地のユーザーによって送られた少なくとも１つのサンプルで指定ゲノムＤＮＡ配列についてゲノムＤＮＡをスクリーニングする方法が提供される。本方法では遠隔地のユーザーは電子通信網を介して前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーターを提供する。本方法は以下の工程を含む：アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答には前記スクリーニングパラメーターが含まれ；前記遠隔地のユーザーはスクリーニングパラメーターを選択し；遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に前記選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーからスクリーニングパラメーター選択を前記通信網を介して受信し；選択されたスクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記スクリーニング検査室から要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；前記検査室は前記プローブを受け取り；前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送し；前記選択スクリーニングパラメーターにしたがってサンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【００１９】
本発明の別の特徴にしたがえば、遠隔地のユーザーによって送られた少なくとも１つのサンプルで指定ゲノムＤＮＡ配列について遺伝ＤＮＡをスクリーニングする方法が提供される。本方法では遠隔地のユーザーは電子通信網を介して前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーターを提供する。本方法は以下の工程を含む：アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信し；アクセスを可能にする応答を前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信し、前記アクセスを可能にする応答には前記スクリーニングパラメーターが含まれ；前記遠隔地のユーザーはスクリーニングパラメーターを選択し；前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室に前記選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して送信し；前記スクリーニング検査室は前記遠隔地ユーザーの選択スクリーニングパラメーターを電子通信網を介して受信し；選択されたスクリーニングパラメーターに一致するプローブを入手するために前記スクリーニング検査室から要望を電子通信網を介してサプライヤーに送信し；前記スクリーニング検査室は前記プローブを受け取り；溶解緩衝液中の組織サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送し、前記溶解緩衝液は遠隔地ユーザーとスクリーニング検査室との間を輸送されている間にサンプル中の組織を溶解するように構成され；前記選択されたスクリーニングパラメーターにしたがって前記サンプルのスクリーニングを実施してデータを入手し；さらに前記データを前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する。
【００２０】
本発明の別の特徴にしたがえば、遠隔地のユーザーによってスクリーニング検査室に送られた組織サンプルの高容量スクリーニングおよび標的特定変異のスクリーニングのための自動化装置が提供される。本装置は以下を含む：アクセスしたい旨を遠隔地ユーザーからスクリーニング検査室に電子通信網を介して送信する手段；アクセスを可能にする応答をスクリーニングパラメーターとともに前記スクリーニング検査室から前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して送信する手段；前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室にスクリーニングパラメーター選択を送信する手段；前記サンプルを前記遠隔地ユーザーから前記スクリーニング検査室へ輸送する手段；ゲノムＤＮＡを前記サンプルから単離する手段；前記ゲノムＤＮＡを基材に沈積させる手段；ゲノムＤＮＡをスクリーニングする手段；前記データを前記遠隔地ユーザーに送信する手段。
【００２１】
本発明の別の特徴にしたがえば、遠隔地のユーザーによって作製されたスクリーニングパラメーター選択にしたがって修飾または変異ゲノムＤＮＡについて組織サンプルをスクリーニングするための高容量装置が提供される。本装置は以下を含む：液体を第一のウェルプレートから第二のウェルプレートに移すための自動アクセッショニングステーション；前記第二のウェルプレートのゲノムＤＮＡを単離するための単離ステーション；前記第二のウェルプレート中のＤＮＡ濃度を調整するための光学的標準化ステーション；前記第二の検査ウェルプレートから基材に前記ゲノムＤＮＡを沈積させるための配列（アレイイング）ステーション；ゲノムＤＮＡの部分と結合する標識プローブをハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーションステーション；結合した標識プローブを検出するための検出ステーション；遠隔地ユーザーがスクリーニングパラメーターを作製し、前記遠隔地ユーザーが電子通信網を介して前記装置と通信する手段；スクリーニングの結果を前記遠隔地ユーザーに電子通信網を介して通信する手段。
【００２２】
本発明の別の特徴にしたがえば、指定されたゲノムＤＮＡ配列についてサンプル中のゲノムＤＮＡをスクリーニングするシステムが提供される。本システムは以下を含む：遠隔地ユーザーからのスクリーニングパラメーター選択を受信できるように適合させた、プロセッサー、メモリーおよびウェブブラウザーを含むコンピューター、およびゲノムＤＮＡサンプルをスクリーニングパラメーター選択について分析する、マイクロアレー画像化装置を含むワークステーション。
【００２３】
（１０）好ましい実施態様の記載
本発明は、高容量のトランスジェニックスクリーニングおよび標的特定変異誘発スクリーニングのための方法およびシステムを提供する。本発明は、そのゲノムが特定の遺伝配列を有する生物を迅速に特定する方法を提供する（前記特定の遺伝配列は内因的に存在するか、または修飾、変異または遺伝子操作を受けたものである）。本明細書中で考察または引用した全ての特許、特許出願および論文は参照によって本明細書に含まれる。
以下の用語および頭字語は本明細書の詳細な説明において以下のような定義で用いられる。
【００２４】
１．定義
相補的：水素結合の結果による窒素含有塩基間の化学的親和性。核酸鎖間の塩基対形成に必要（Ｗ．Ｓ． Ｋｌｕｇ ＆ Ｍ．Ｒ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， （１９９７） Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ， Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ， ＮＪ．（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
コピー数：ゲノムに任意に組み込まれたトランスジーン（外来遺伝子）の数。
欠失変異：遺伝子または染色体から１つまたは２つ以上のヌクレオチドが除去されることによって生じた変異。
指定された遺伝配列：この配列にはトランスジェニック（外来遺伝子）挿入物、選択性マーカー、組換え部位または任意の遺伝子もしくは遺伝子セグメントが含まれる。
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：遺伝情報をコードする分子。ＤＮＡは、ヌクレオチド塩基対の間で弱い結合によって保持された二本鎖分子である。ＤＮＡの４種のヌクレオチドは以下の塩基を含む：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）。本質的にＡとＴ間でのみ、ＧとＣ間でのみ対を形成し、したがってそれぞれの一本鎖の塩基配列はその相手方から推論できる。
【００２５】
エレクトロポレーション：細胞の形質膜を透過性にし、したがってトランスフェクションを可能にする高電圧電流の急速パルスに細胞を暴露すること。
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）：無限に増殖し、他の細胞に分化することができる初期胚の細胞。幹細胞は新しい細胞の連続的供給源として機能する。
ゲノム：個々の生物の染色体中の全遺伝物質。そのサイズは一般にその塩基対総数として与えられる。
ゲノムＤＮＡ：細胞内でコードされる全遺伝情報（Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｄ．Ｌ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｍ．Ｍ． Ｃｏｘ （１９９３） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
遺伝子型：個々の細胞または生物の遺伝子組成。
生殖細胞系列：配偶子を介して子孫に伝達される未修飾の遺伝情報。
遺伝子ターゲッティング：相同組換えまたは遺伝子置換によるゼロ遺伝子座または変異遺伝子座の作出。
【００２６】
加熱カセット：加熱時のガラス基材のための収納機構。
画像化カセット：画像化時のガラス基材の収納機構。
誘発性遺伝子ターゲッティング：実験的な操作（例えば薬剤の投与）によって、標的として捕らえられた遺伝子の誘発可能な不活化（活性化）を可能にする遺伝子ターゲッティングの方法の１つ。例：Ｃｒｅリコンビナーゼは位置特異的リコンビナーゼで、ｌｏｘ認識配列と接するＤＮＡの切り出しを触媒する。Ｃｒｅ発現のためのプロモーターはインターフェロンに感受性をもつので、標的特定欠失を誘発することができる。
インターネット：標準的プロトコル群によって共に連結され、地球規模の配信ネットワークを形成する相互に連結された（公共的および／または私的）ネットワーク集合体。ワールドワイドウェブ（以下ではウェブ）は、相互に連結された、ユーザーが閲覧可能なハイパーテキストドキュメント（一般にはウェブページと称される）の配信集合物（インターネットを介してアクセス可能）、および標準的インターネットプロトコルを用いてユーザーがアクセスすることを可能にするユーザーとサーバーのソフトウェアコンポーネントの両方を指す。
系統：系統とは１つの遺伝条件について交配されたコロニーである。
リポフェクチン：食作用によって形成されるリポソーム小胞を用いてトランスジーン（外来遺伝子）を細胞膜を貫通して導入すること。本方法は、組織特異的であるという点で有利である。
【００２７】
マイクロアレー技術：本技術は、多くの核酸種の同時定量を可能にするハイブリダイゼーションを用いる方法で、以下の文献（これら文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている（Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， Ｄ． Ｓｈａｌｏｎ， Ｒ．Ｗ． Ｄａｖｉｓ ＆ Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ， ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｉｔｈ Ａ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０（５２３５）， ４６７−７０， １９９５； Ｊ． ＤｅＲｉｓｉ， Ｌ． Ｐｅｎｌａｎｄ， Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ， Ｍ．Ｌ． Ｂｉｔｔｎｅｒ， Ｐ．Ｓ． Ｍｅｌｔｚｅｒ， Ｍ． Ｒａｙ， Ｙ． Ｃｈｅｎ， Ｙ．Ａ． Ｓｕ ＆ Ｊ．Ｍ． Ｔｒｅｎｔ， ”Ｕｓｅ ｏｆ Ａ ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ Ａｎａｌｙｚｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １４（４）， ４５７−６０（”ＤｅＲｉｓｉ”）， １９９６； Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， Ｄ． Ｓｈａｌｏｎ， Ｒ． Ｈｅｌｌｅｒ， Ａ． Ｃｈａｉ， Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｒ．Ｗ． Ｄａｖｉｓ， ”Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ １００ Ｇｅｎｅｓ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３（２０）， １０６１４−９， １９９６）。本技術は以下の操作を合体させる：少量の純粋な個々の核酸種のロボットによる滴下、複数の蛍光標識核酸を含む本配列（アレイ）とのハイブリダイゼーション、および生じた蛍光付加ハイブリッドの共焦点走査顕微鏡による検出および定量。この技術は遺伝子の発現を研究するために開発された。
【００２８】
マイクロインジェクション（微量注入）：ＤＮＡ溶液を胚盤胞または受精卵の前核に微細管ピペットを用いて導入する技術。
変異：突然変異誘発物質により生じたＤＮＡ配列における遺伝性変化。フレームシフト変異、ミスセンス変異およびナンセンス変異を含む種々のタイプの変異がある。
ゼロ変異：通常は物理的欠失による遺伝子機能の完全な除去。
リコンビネーション（組換え）：いずれかの親の遺伝子と異なる遺伝子の結合を子孫にもたらす過程。高等動物ではこれは交雑によって生じる。
リコンビナント（組換え）ＤＮＡ：リコンビナント（組換え）ＤＮＡ技術を用いて結合させた、異なる起源のＤＮＡ分子の結合。
レトロウイルス感染：リコンビナント（組換え）ＤＮＡを含むレトロウイルスベクターが、それが感染した細胞の染色体にそのゲノムを組み込ませること。
【００２９】
選択性マーカー：ターゲッティング効率を高めるよりはむしろランダムな組み込み体検出を減少させることによって標的としてとらえられた細胞の検出を容易にする方法。２つのタイプの選択性遺伝子、すなわち指定された遺伝子および負の遺伝子がある。指定選別遺伝子（例えばネオマイシン）は、通常は細胞にとって致死的である薬剤に対する耐性を付与する。ネオマイシンを相同組換えによってそのゲノムに組み込まれた細胞は薬剤のネオマイシンに対して耐性をもつ。逆に非相同性組換え現象は陰性選別遺伝子を保持する。陰性選別遺伝子（例えばＨＳＶｔｋ）はある種の薬剤に対して感受性を付与し、細胞死をもたらす（ＨＳＶｔｋを発現する細胞はガンシクロビルに対して感受性を示す）。選択性マーカーは遺伝配列である。
位置特異的リコンビナーゼ：特定のＤＮＡ配列間の組換えを促進する酵素。
二次ウェルプレート：プレートＤＮＡがそれからプリントされる。
供給源ウェルプレート：遠隔地のユーザーがサンプルおよび凍結乾燥試薬を加えるプレート。
【００３０】
標的特定欠失：ゲノムから遺伝子を欠失させることによってその遺伝子を不活化させる技術。相同組換えまたは誘発性遺伝子ターゲッテイングによって達成できる。
標的特定変異誘発：位置特異的変異による生殖細胞系列の変更。
トランスフェクション：真核細胞によるリコンビナント（組換え）ＤＮＡの取り込み、組み込みおよび発現。
トランスジーン：外来遺伝子またはＤＮＡ。
トランスジェニック：この用語は、リコンビナント（組換え）ＤＮＡ技術によって別の生物の遺伝子が自身のゲノムに導入された生物を指す。これらの生物は通常は、受精卵の前核にＤＮＡをマイクロインジェクション（微量注入）し、ランダムにこのＤＮＡを組み込ませることによって作製される。
トランスジェニック系統：トランスジーン（外来遺伝子）がその生殖細胞系列に安定に組み込まれ、したがってメンデルの法則にしたがって後続の世代に受け継がれるトランスジェニックマウスまたは生物。
ウェブサイト：標準的なワールドワイドウェブプロトコルを用いてネットワーク全体に情報内容を供給するコンピューターシステム。ウェブサイトは特定のインターネットドメイン名（例えばＴｒａｎｓｎｅｔＹＸ．ｃｏｍ．）に一致する。
【００３１】
（本システムの構成要素及び操作の概要）
本発明は、トランスジェニック及び標的突然変異誘発スクリーニングの方法及びシステムを提供する。ここで述べる特徴に従って操作するシステム及び方法を使用して（自動配列機のみを用いて）１日に約２０００試料を、又は全自動ならば１日に約１００，０００試料をスクリーニングすることできる。さらに、ここで述べる特徴に従って操作するシステム及び方法は、４８時間以内に複数試料のスクリーニングパラメータ選択を受けるというスクリーニング結果をスクリーニング研究室２０から遠隔ユーザー１に提供することができる。
図１〜３は、本発明の特定の特徴の概要を提示する。本発明は、コンピュータ５にアクセスする遠隔ユーザー１に、試料のトランスジェニック及び標的突然変異誘発スクリーニングを注文させ、それら試料がトランスジェニック又は標的突然変異誘発スクリーニングウェブサイト１９、その後スクリーニング研究室に提出される。インターネット又は他の通信リンク７を用いて、遠隔ユーザー１が遠隔ユーザーのコンピュータ５からインターネットのような電子通信リンク７経由でアクセス要求をスクリーニング研究室コンピュータ９に送る。スクリーニング研究室ウェブサイト１６は、インターネットのような電子通信リンク経由で遠隔ユーザー１に応答を可能にするアクセスを送信する。この応答は、３つの別個のセクションを含む。この３セクションは、アカウント登録２１、作業の調査２３及び試料特定及び指定２５である。
【００３２】
図２を参照すると、遠隔ユーザー１はスクリーニング研究室のウェブサイト１９に通信リンク７経由でアクセスできる。ウェブサイト１９は、Ｄｏｔｌｏｇｉｘ（登録商標）（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のようなオーダーマネジャー２２によって収容されうる。オーダーマネジャーは、管理システムを整えるソフトウェアである。好ましい実施形態では、このソフトウェアはＳｐａｃｅｗｏｒｋｓ（Ｍａｎｕｇｉｓｔｉｃｓ，ＩＮＣ．，（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））である。オーダーマネジャー２２は、オーダーの配置を管理する機能を果たし、かつウェブサイト１９を収容する。ウェブサイト１９に記録された通りの遠隔ユーザー１から受けたオーダーは、スクリーニング研究室コンピュータ９によって電子通信７内にあるオーダーマネジャー２２に記録される。スクリーニング研究室コンピュータ９は、プロセスコントローラ２６に通信的に連結されているＬＩＭＳ２４を含む。
【００３３】
ＬＩＭＳ２４は、研究室情報管理システムソフトウェアの一般名である。ＬＩＭＳ２４の機能は、データの貯蔵所であること、研究室の自動化を制御すること、試料を追跡すること、作業の流れを図表にすること、かつ電子データを捕獲することである。別の実施形態では、ＬＩＭＳ２４は電子通信リンク７経由で遠隔ユーザー１と直接通信することもできる。いずれの標準的な研究室情報システムソフトウェアを使用してもこれら機能を提供できる。好ましい実施形態では、Ｎａｕｔｉｌｉｓ（登録商標）プログラム（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｖｅｒｅｌｅｙ，Ｍａｓｓ．）が使用される。
【００３４】
プロセスコントローラ２６は、通信的にワークステーション１４に連結されている。プロセスコントローラは、ワークステーション１４のいずれの部分にも自動化を容易にするコマンドを与える。例えば、Ｌａｙｎｅら，米国特許第５，９６８，７３１号を参照せよ（ここに、引用によって取り込まれる）。例えば、プロセスコントローラ２６は、ハイブリダイゼーションステーション９６内の基材２２９にプローブの送達を指示する。ワークステーション１４は通信的にＬＩＭＳ２４に連結される２８。このようにして、ワークステーション１４は、インターネットのような電子通信リンク７経由でオーダーマネジャー２２又は遠隔ユーザー１に送る出力報告２４９の定式化用にＬＩＭＳ２４に日付を与えることができる。これとは別の実施形態では、遠隔ユーザー１をスクリーニング研究室２０に直接電話線、ケーブル又は衛星接続によって連結することができる。
【００３５】
図４を参照すると、ユーザーのアカウント登録セクション２１は、スクリーニング研究室のウェブサイトへのアクセスを受信すると、アカウント番号３１を入力することによって既存アカウントを遠隔ユーザー１がアクセスすることを要求する。そして、ユーザーはパスワードを入力する。ユーザーは、ユーザーが主要ユーザー３３か又は別の許可ユーザー３５かを尋ねられる。正当なパスワードを入力すれば、ユーザーは新規オーダー３９を提起することができる。代わりに、ユーザーは、オーダー番号４３を与えることによってオーダー状況をチェックし、かつ追跡４５に進むことができる。代わりに、施設名、主要研究者、住所、電話番号、ファックス番号、電子メールアドレス、請求書発送情報、他の許可ユーザー名４９を提供することによって新規アカウント４７を開くことができる。パスワードが選択され５１、確認され５３、かつ請求書発送情報５５がユーザーによって提供される。
【００３６】
作業の調査セクション２３は、ユーザーにスクリーニングパラメータを選択させるドロップダウンセクションを有する。図５を参照すると、これら選択は、試料がトランスジェニック６０又は標的突然変異７０かの指定を含む。トランスジェニック生体は、組換えＤＮＡ技法によってそのゲノム内に挿入された別の生体由来の遺伝子を持っている。これら動物は、一般的に、受精卵の前核中に、ランダムに該ＤＮＡが組み込まれているＤＮＡのマイクロ注射をして作られる。ゲノム内に組み込む導入遺伝子のコピー数は制御できない。トランスジェニック系統は、導入遺伝子が安定して生殖細胞系内に組み込まれ、それゆえに次世代までにメンデル様式で遺伝される生体系統を指す。導入遺伝子は、何らかの外来性ＤＮＡ配列又は遺伝子である。
【００３７】
好ましい実施形態では、マウス、すなわちＧｅｎｕｓ Ｍｕｓがトランスジェニック及び標的突然変異用にスクリーニングされる。作業の調査ステーション２３で指定されるプローブのいくつかはＭｕｓ由来である。さらに、種の全メンバーに存在する遺伝子配列は、スクリーニング研究室２０によってスクリーニング基準として使用される。例えば、Ｇｅｎｕｓ Ｍｕｓでは、主な尿タンパク質ＭＵＰが基準遺伝子配列でありうる。Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．及びＬａｃｙ，Ｅ（１９９４）Ｍａｎｕｐｉｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｈａｒａｂｏｒ，ＮＹ．（ここに、引用によって取り込まれる）。
この方法で、全種のＭｕｓをスクリーニングできる。さらに、他の種が本方法によってスクリーニングできることが期待される。異種のスクリーニングパラメータの選択を行うこと、及びスクリーニング研究室が異属の種の基準遺伝子配列を選択することは、関連技術の当業者の能力の十分範囲内である。
【００３８】
試料がトランスジェニック６０である場合、遠隔ユーザー１は遺伝子配列６１、すなわちトランスジェニック挿入、試験すべき系統の数、系統毎の試料数６２、及び系統毎に標的とすべき標的遺伝子配列６３を指定するように要求される。標的遺伝子配列は、指定された遺伝子配列の一部であり、それはプローブの配列に対応する。遠隔ユーザー１は、系統毎にスクリーニングに使用するのに必要な、指定遺伝子配列の一部に相補性であるプローブ配列（通常１７〜３０塩基対）を特定するように要求される。用語“スクリーニング”が使用される場合はいつでも、これらプロセスは“検出”をも意味することに留意すべきである。プローブ配列は、標的遺伝子配列に相補的である。遠隔ユーザー１は、ハイブリダイズする、すなわち標的遺伝子配列６３と結合するプローブ配列６４を、それが試料中に存在するかどうかを特定する。そして、このプローブ配列がサプライヤーに伝達され、そのプローブプロバイダによって作られた標的結合プローブがこの配列を含む。
【００３９】
そして、遠隔ユーザー１によって与えられた指定対照についての特徴づけを特定するように要求される。指定対照は、指定遺伝子配列を有することが分かっているゲノムＤＮＡ試料である。遠隔ユーザー１によって指定対照がスクリーニング研究室２０に提示される。さらに、遠隔ユーザー１は、指定対照の接合子体の構造、コピー数及びモザイク性質を含む指定対照について分かっている特有の特徴づけを提供する。未知試料のコピー数は推定することができ、指定対照試料に対する定量結果を伴うことができる。
【００４０】
標的突然変異誘発スクリーニング７０に関し、遠隔ユーザー１は、系統及び試料数７１を特定するように要求される。遠隔ユーザー１は、遺伝子修飾がノックアウトか又はノックイン７２であるか尋ねられる。遠隔ユーザー１が、選択可能なマーカーが存在すると指定した場合７３、マーカーの選択がユーザーに提示される７４。選択可能なマーカー配列は、指定された遺伝子配列である。通常の選択可能なマーカーとしては、限定するものではないが、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性及びピューロマイシン耐性が挙げられる。遠隔ユーザー１が選択可能なマーカーが存在するかどうかを特定すると、遺伝子配列がユーザー１に提示される。
【００４１】
ネオマイシン配列
2004508057.tif 000002
【００４２】
ハイグロマイシン配列
2004508057.tif 000003
【００４３】
ピューロマイシン配列
2004508057.tif 000004
【００４４】
遠隔ユーザー１は、塩基ごとに配列をレビューし、かつ提示された配列がそれらの試料中に実際に存在することを確認するように要求される７４。選択可能なマーカーの一部が、標的遺伝子配列６３として指定される。プローブ配列が指定される６４。プローブ配列６４は、標的遺伝子配列６３に結合する。
遠隔ユーザー１は、選択可能なマーカーが除去されたか又は試料が部位特異的組換え突然変異を受けたことを示すと７５、遠隔ユーザー１はどの組換え技法を利用して、それら試料に突然変異を起こしたかを示すように指示される。遠隔ユーザー１は、限定するものではないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘ７８及び酵母菌ＦＬＰ／ＦＲＴ７９を含む通常の組換え技法を提示される。技法の１つを選択後、以下のような、それぞれＬｏｘ−ｐ部位７８及びＦＲＴ部位７９に関連する配列
2004508057.tif 000005
及び
2004508057.tif 000006
が遠隔ユーザー１に提示される。遠隔ユーザー１は、塩基ごとに配列をレビューし、かつ提示された配列がそれら試料中に実際に存在することを確認するように要求される。組換え部位は、選択可能なマーカー除去のための指定遺伝子配列である。遠隔ユーザー１は、組換え配列７８又は７９の部分に対応する標的遺伝子配列を指定する。遠隔ユーザー１は、それが試料中に存在すればハイブリダイズ、すなわち該標的遺伝子配列６３に結合するであろうプローブ配列７７を特定する。そして、このプローブ配列７７がサプライヤーに伝達され、指示に従って製造される。
【００４５】
そして、遠隔ユーザー１は、遠隔ユーザー１によって提供された指定対照について特徴づけを特定するように要求される。指定対照は、その指定された遺伝子配列を有することが分かっているゲノムＤＮＡ試料である。指定対照は、遠隔ユーザー１によってスクリーニング研究室２０に提出される。さらに、遠隔ユーザー１は、指定対照の接合子体の構造、コピー数及びモザイク性質を含む指定対照について分かっている特有の特徴づけを提供する。未知試料のコピー数は推定することができ、指定対照試料に対する定量結果を伴うことができる。
【００４６】
好ましい実施形態では、遠隔ユーザー１は、名前、一意の前もって登録されたアカウント番号、パスワードを特定し、かつ会社にそれらのオーダーを提出するように要求される。トランスジェニック試料の挿入又は標的突然変異誘発スクリーニング用の選択可能マーカーの遺伝子配列は、集団的に指定遺伝子配列と呼ぶことができる。標的は該指定遺伝子配列のいずれのサブセットでもある。
【００４７】
図６を参照して、遠隔ユーザー１が作業の調査セクションを提示すると、遠隔ユーザー１は試料特定及び指定セクション２５が示される。試料特定及び指定セクション２５は、９６ウェルプレート位置を含む。遠隔ユーザー１は、どの試料が各ウェル内に置かれたかを指定する。遠隔ユーザー１が９６より多い試料、さらに９６より多いソースウェルプレートを有する場合に指定が役立つ。図６に関し、バーコード受入れ番号３を有する９６ウェルプレートが、Ｈ〜Ａと表示されたＸ軸及び１〜１２と表示されたＹ軸を有する縦方向に配置して示される８０。Ｘ及びＹ軸は、Ａ１８１のようにウェル位置を示す。
【００４８】
図６を参照して、遠隔ユーザー１は以下：プレート受入れ番号８２、系統数８３、遺伝子系統特定８４、試料数８５、標的配列８６、プローブ配列８７及びウェル位置８８；を提供するように要求される。そして、遠隔ユーザー１は、ウェルＡ１に沈着された物質が対照かどうか尋ねられる。その物質が対照である場合８９、遠隔ユーザーはその物質の接合子体の構造、モザイク性質及びコピー数を指定する９０。これらパラメータがすべて分からない場合は、遠隔ユーザーは分かる限りの多くの情報を入力する。すると、遠隔ユーザー１は、何らかの内部試料の特定番号を要求される９１。
【００４９】
図１及び２を参照すると、遠隔ユーザー１は、完成されたスクリーニングパラメータ選択を含む自分のオーダーをインターネット又は直接回線のような電子通信の形態を介してスクリーニング研究室２０に送信する。遠隔ユーザー１は選択されたスクリーニングパラメータ選択を電子通信リンク７経由でスクリーニング研究室に送信することができる。このリンク７は直接的又は間接的でありうる。間接ルートでは、スクリーニングパラメータはウェブサイト１９に送信され、ここでオーダーマネジャー２２がＬＩＭＳ２４にスクリーニングパラメータ選択を提供する。好ましい実施形態では、オーダーは２つの電子メッセージを生成し、異なる場所に送られる。第１メッセージはＬＩＭＳ２４内で在庫プローブのリストと相互参照され、ユーザーによって指定されたプローブの在庫がない場合、契約プローブプロバイダーのようなサプライヤー１６に、オーダーメッセージが送られる。この要求は、遠隔ユーザー１からスクリーニング研究室２０にいずれの形態の電子通信経由でも送ることができ、それから電子通信１０の形態を介してサプライヤーのコンピュータ８に送信され、又は代替的にこのオーダーメッセージはユーザー１からいずれの形態の電子通信１２を介してもサプライヤーのコンピュータ８に送信するこができる。
【００５０】
このサプライヤー１１は、遠隔ユーザー１が指定ゲノム配列用のゲノムＤＮＡをスクリーニングするためのオーダーで指定したプローブを製造する。オーダーに対して作られたプローブを標的結合プローブと呼ぶことができる。そして、このサプライヤー１１はバーコードを付して標的結合プローブをスクリーニング研究室２０に終夜輸送する１３。当該スクリーニング日用の各オーダーの標的結合プローブがスクリーニング研究室２０によって受け取られると、標的結合プローブ上のバーコードがＬＩＭＳ２４中にスキャンされる。ＬＩＭＳ２４は、プローブプロバイダーから提供された品質管理データと共に、標的結合プローブを受け取った日時を記録する。
【００５１】
好ましい実施形態では、標的結合プローブはワークステーション１４内に配置され、ハイブリダイゼーションステーション９６に関連してさらに詳述するように、ＬＩＭＳ２４がプローブのバーコードを記録し、ワークステーション１４のデッキ上におけるその特定位置を記録する。さらに、スクリーニング研究室２０及びＬＩＭＳ２４システムは、ハイブリダイゼーションセクション９６に関連してさらに詳述するように、どの標的結合プローブがどの試料について使用されるかを関係づける。
【００５２】
好ましい実施形態では、遠隔ユーザー１のオーダー配置から生成される第２メッセージは、ユーザーがそれら試料を包装かつ輸送するために適切な供給を有することを保証する。このメッセージはウェルプレートの数、輸送ラベル及びユーザーが必要とする試薬の量を定義する。この要求は、ＬＩＭＳ２４内に遠隔ユーザーの場所に位置づけされている在庫リストと相互参照される。この要求は、遠隔ユーザー１から研究室２０にいずれの形態の電子通信７経由でも送ることができ、サプライヤー１１又はサプライヤーのコンピュータ８への電子通信の形態を介して、又は代わりに、この要求は、遠隔ユーザー１からいずれの形態の電子通信１２経由でもサプライヤー１１に達することができる。適切な供給量がユーザーの施設内に位置している場合、必要な輸送物質を得ることができる場所を限定するメッセージがユーザーに送られる。しかし、分かっている在庫と相互参照してユーザーの場所で十分な数の供給が確証できない場合は、これらアイテムが包装され１８、かつユーザー１４に輸送される。遠隔ユーザー１は、到着予定時に物質が輸送されることを彼らに通知するメッセージを受ける。
【００５３】
遠隔ユーザー１がこれら供給を受け取ると、彼らはソースウェルプレート２内に適切な試料を置く。試料は、原核生物又は真核生物から得ることができる。試料はマウス由来の組織試料でよいが、他の動物及び植物由来でもよい。好ましい実施形態では、マウス尾部又は耳が切り取られて組織試料を提供する。ソースウェルプレート２は、組織試料と十分量の溶解緩衝液を受けて、スクリーニング研究室２０に輸送する間にその組織試料を覆う９６ウェルプレート等である。ソースウェルプレート２は、プレートの側面に貼付された受入れ番号３を有する。受入れ番号を用いてＬＩＭＳ２４がウェルプレート２のソースを追跡する。遠隔ユーザー１は、ソースウェルプレート２内の、図６で彼らのオーダーを出す際に前もって指定していたウェル位置中に適切な試料を置く。試料がソースウェルプレート２内の適切なウェル内にあると、遠隔ユーザー１は、ピペットを用いて各ウェル内に所定量の再構成凍結乾燥緩衝液４を分配して試料を覆う。緩衝液は、組織を溶解してゲノムＤＮＡを含有する細胞デブリを得るように配合される。さらに詳細には、緩衝液は、遠隔ユーザー１とスクリーニング研究室１４との間の輸送中にデブリを溶解するように配合される。輸送時間は、すべての試料がＦｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）のような速達便サービス経由で輸送されるので、約２４時間である。さらに詳細には、例えば、緩衝液は、（４Ｍ尿素，０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ−７．５），１ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，５ｍＭ ＤＤＴ及び４１５ｍｇのプロテイナーゼＫ及びＲＮアーゼ）から調製することができる。遠隔ユーザー１は、ソースウェルプレート２の各ウェル内に溶解緩衝液を添加する。緩衝液４が完全に試料を覆うべきである。試料と溶解緩衝液がソースウェルプレート内にあると、試料が漏れないようにソースウェルプレート２の頂部にシールが配置される。そのシールの上に輸送用のプラスチックの蓋が配置される。そして、遠隔ユーザー１は、ソースウェルプレート２を終夜配送サービスパッケージ１５内に置く。遠隔ユーザー１はそのパッケージを封止してスクリーニング研究室２０に輸送し１６、バーコード輸送ラベルを与える。
【００５４】
図７Ａ〜Ｄには、本発明の好ましい実施形態が示される。図７Ａでは、ソースウェルプレート２がスクリーニング研究室２０に到着する１０１。輸送ラベルの追跡番号がバーコードリーダー１０３によって読み取られる。輸送ラベルを読取れない場合は、追跡番号が手動で入力される１０７。追跡番号のスキャニングがＬＩＭＳ２４内で受け取られ１０４、追跡フィールドに示されるように受信メッセージがユーザーのアカウントに通知される。パッケージからソースウェルプレート２が取り出され、クリーンルーム１０９に持って行かれる。ソースウェルプレート２は生の生体物質と溶解緩衝液を含む。ソースウェルプレート２の個々のバーコードがバーコードリーダによってスキャンされ１１１、ＬＩＭＳ２４内に受入れ番号として記録される。ＬＩＭＳ２４は、プローブオーダーをサプライヤー１１にオーダーメッセージ２２を通じて送ることができる１０６。ソースウェルプレート２の個々のバーコードをスキャンできない場合１１３、受入れ番号が手動で入力される１１５。追跡番号、受入れ番号ユーザーオーダーとワークリストが適切に相関する場合、ＬＩＭＳ２４はプレートの活性記録番号を活性化する（図示せず）。
【００５５】
ソースウェルプレート２がクリーンルーム内の輸送装置中に装填される１１６。輸送装置は、ウェルプレートを保持しかつワークステーションとドッキングできる何らかの装置である。好ましい実施形態では、輸送装置は、いくつかの可動なハウジングユニットに垂直に積み重ねられた硬質トレイを含む。この輸送装置は、異なる自動ステーション間を動き、ドッキングすることができ、硬質トレイは自動様式で除去され、かつワークステーションのデッキ上に進むことができる。各硬質トレイは、ウェルプレート用の９箇所からなる。トレイ毎のこの９箇所のそれぞれが、輸送モジュール内におけるその特有の位置を指定する一意のバーコードを有する。
【００５６】
ソースウェルプレート２の受入れ番号３がバーコードリーダーでスキャンされ、輸送装置内のバーコード化されたウェルプレート位置がスキャンされる。ソースウェルプレート２のバーコードがＬＩＭＳ２４内で追跡目的用の輸送装置内の一意性バーコード位置と照合される１０６。ソースウェルプレート２は、物理的に輸送装置内に載置される１１７。ＬＩＭＳ２４は、この位置に対してウェルプレート２を記録かつ関連づける。輸送装置がソースウェルプレート２で装填されると、輸送装置はワークステーション１４内にドッキングされる１１９。
【００５７】
ＬＩＭＳ２４は、研究室職員用のワークシートを生成する（図示せず）。ワークシートは必要な分析プレートの数及び必要な種々のプローブの概要を示す。ＬＩＭＳ２４ワークリストは単一ファイルを生成する。ファイルフォーマットとしては、限定するものではないが、ＡＳＣＩＩ、ＸＭＬ又はＨＴＭＬが挙げられる。ファイルはネットワークドライブ上の所定ディレクトリ内に書き込まれる。ファイル名は一意かつ、試験番号に関連する。拡張はワークリストファイルについて一意性である。
【００５８】
図８は、ワークステーションの一実施形態を示すブロック図である。標準的な研究室ステーションは、研究室操作の理論的なグループ化をしている。しかし、これらグループ化は、必ずしも異なる物理的ステーションを意味しない。これらグループ化としては以下が挙げられる：自動受入れステーション９２、単離／精製ステーション９３、光学標準化ステーション９４、配列ステーション９６、ハイブリダイゼーションステーション９６及び検出ステーション９７。
以下の説明は好ましい実施形態を提供するが、本技術の当業者は、必要に応じて自動化の程度を変え、これら方法を行うことを選択できる。
【００５９】
自動受入れステーション９２
自動受入れステーション９２は、ソースウェルプレート２から第１マスターウェルプレートに液体を移すための装置を提供する。この第１マスターウェルプレートは、その中でＤＮＡが単離されるプレートである。Ｇｅｎｅｓｉｓ（登録商標）Ｔｅｃａｎ（Ｒａｌｅｉｇｈ−Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）又はＭｕｌｔｉｍｅｃｋ（登録商標）Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のようないずれの商業的に入手可能な自動受入れ装置もこの機能を果たすことができる。これら装置は、液体ハンドラーと呼ばれる。液体ハンドラーはソースプレートの硬質プラスチックカバーを外す１２１。好ましい実施形態では、バリア封止機構１２３に穴を開けることによって液体ハンドラーにより液体検出が行われる。液体ハンドラーは、液体検出を行って元の試料の存在を検証する。ソースウェルプレート２のバーコードが再スキャンされる１２７。この測定値はＬＩＭＳ２４のデータベース内に記録され１０８、かつ出力報告２４９に反映される。さらに、ＬＩＭＳ２４は、ウェルプレートが輸送装置から自動受入れステーション９２まで一貫していることを保証する。不十分量の生試験材料しか入手できない場合はエラーコードが生成される。液体ハンドラーはステンレススチール等の、各試料移動間で洗浄されるピペットチップを使用する。
【００６０】
ＤＮＡが、第１マスタープレートと呼ばれる清潔なウェルプレートに移される１２９。第１マスターウェルプレートのバーコードがスキャンされ１３１、ＬＩＭＳ２４が第１ウェルプレート用の新規バーコードを照合する。自動受入れプロセスは、その日に未決のままの試料がすべて第１マスターウェルプレート内に受け入れられるまで続く。
【００６１】
単離／精製ステーション９３
第１マスターウェルプレートのトレイが、輸送装置によって単離／精製ステーション９３に移される。このステーションでは、磁性又は常磁性粒子のような分離方法によってゲノムＤＮＡが単離かつ精製される。本明細書における用語“磁性”は、磁性及び常磁性の両方を意味する。磁性粒子は平均直径が０．１ミクロン〜１００ミクロンの範囲でよい。磁性粒子は、Ｈａｗｋｉｎｓによって米国特許第５，７０５，６２８号のカラム３で示されるように（以後‘６２８特許と呼び、ここに引用によって取り込まれる）機能することができる。好ましい実施形態では、磁性粒子は１ミクロンのカルボキシル化イオンコア粒子であるが、異なるサイズの異なる官能基を有する他の磁性粒子も使用できる。
【００６２】
例えば、単離／精製ステーション９３では、第１マスターウェルプレートの各ウェルは磁性粒子１３３で充填される。粒子はシリンジポンプを介してウェル中に分配される。第２シリンジポンプが、生の生体物質と活性粒子１３３を含有するウェル内に結合緩衝液を分配する。分配自体で試料が十分に混合される。チップのような第２混合機構が、液体を吸引かつ再分配することができる。２０％プロピレングリコール（ＰＥＧ）８０００、０．０２％ナトリウムアジド及び２．５Ｍ塩化ナトリウムのような結合緩衝液を用いてゲノムＤＮＡを非特異的に磁性粒子の表面化学に結合させる。ＰＥＧは、ＤＮＡの濃縮を引き起こす水の水素結合を斟酌する。さらに別の結合パラメータは、Ｈａｗｋｉｎｓの‘６２８特許に開示されている。緩衝液及び生の生体物質と結合する粒子が、室温で１０分間インキュベートされる。インキュベーション後、磁石が数分間、すなわち２〜６分間第１マスターウェルプレートの底に接触する１３７。ゲノムＤＮＡが結合された磁性粒子は、磁気的にマスターウェルプレートの底にくっつき、粒子のペレットを形成する。上清を除去する１３９。洗浄緩衝液、例えば７０％エタノール及び３０％脱イオン水を用いて粒子を再懸濁させる１４１。磁石を用いて上清から、ゲノムＤＮＡが結合された磁性粒子を分離する１４３。上清を吸引する１４５。粒子洗浄工程を２〜４回繰り返す。
【００６３】
ペレット化粒子を有する第１マスターウェルプレートを空気乾燥する１４７。代替法では、ペレット化粒子を圧縮窒素で乾燥するとができる。粒子が完全に乾燥されると、磁石が除去される１４９。ゲノムＤＮＡが結合された粒子を懸濁緩衝液中に再懸濁させる１５１。懸濁緩衝液は、結合されたＤＮＡを粒子から溶出するように配合される。このような懸濁緩衝液の一例は、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．４）、０．０２％ナトリウムアジド又はナトリウムサリーンシトレート（ＳＳＣ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ショ糖（２０％）又はホルムアミド（１００％）である。好ましい実施形態では、第１マスターウェルプレートは２分間８０℃に加熱され１５３、粒子からＤＮＡを引き離す。
【００６４】
加熱及び溶液中にＤＮＡを再懸濁させた後、磁石を用いて磁性粒子を精製ＤＮＡから分離させる１５５。粒子から上清を除去し１５７、第２ウェルプレート中にピペットで入れる。第２ウェルプレートのバーコードが読み取られる。ＬＩＭＳ２４は、第１及び第２ウェルプレートのバーコードを関連づける１１４。少量の（１〜１０μｌ）ＤＮＡ上清をピペットで清潔なバーコード付き光学１５３６ウェルプレート中に入れる１５９。
【００６５】
完全自動システムが望まれる場合、磁気分離器を自動化して、ワークステーションの底部から上昇させ、同時にすべての第１ウェルプレートの底部と接触させることができる。
一実施形態では、磁性粒子による分離の前又は後にゲノムＤＮＡを超音波処理することができる１６１。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡは細胞デブリからの分離後に超音波処理される。超音波処理は、固定ホーン器具のようないずれの通常の手段によっても行うことができる。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡは５分間超音波処理され、ＤＮＡ断片を生成する。約１００塩基対から１キロ塩基までの広範囲の断片があるが、断片の平均サイズは約５００塩基対程度である（約は５０塩基対を意味する）。
【００６６】
光学標準化及びウェルプレートステーション９４
光学標準化はＤＮＡ定量化を含む。吸収剤の読みが測定できる透明な底部を有する１５３６ウェルプレートのような光学プレートが提供される。好ましい実施形態では、１５３６ ＵＬＴＲＡＭＡＲＫ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）が使用される。光学プレートのバーコードがスキャンされる１６１。第２マスターウェルプレートからの小アリコートのＤＮＡ上清が、ＬＩＭＳ２４によって、ＤＮＡ濃縮光学ウェルプレート内の特異的なウェル位置まで追跡される。光学ウェルプレートは、ＤＮＡ濃度分析に供される１６３。この分析には、光学密度スキャン（２６０／２８０比）又は当業者には公知の蛍光定量法が含まれる。ＤＮＡ濃度値が定量され、ＬＩＭＳ２４に記録される１１２。
第２ウェル内のゲノムＤＮＡの濃度は、好ましくは第２マスターウェルプレート内に約１２．５〜５００ｎｇ／μｌの範囲の液体となるように、さらに好ましくは第２マスターウェルプレート内に約１７〜２５０ｎｇ／μｌの範囲の液体となるように調整される。
【００６７】
光学標準化ステーション９４は、第２マスターウェルプレート内の既知ＤＮＡ濃度を有する既知試料量に基づいて調整し、各試料の水和するための量又は乾燥させる時間を計算することを行う。第２ウェルプレート試料は、自動液体ハンドラーシステムによって脱イオン水と水和され、ＤＮＡ濃度が減少しうる１６５。反対に、試料は計算された時間枠の間に圧縮ガスで乾燥されてＤＮＡ試料を濃縮しうる１６７。ＤＮＡ濃度がゼロであるか又は定量値が最適化のためのパラメータより低い場合は、ＬＩＭＳ２４は出力報告に記述すべき不十分量の報告を生成する（図示せず）。最適化された試料１６９が、第２マスターウェルプレート内で、濃度検証のために再スキャンされる１７１。
【００６８】
配列ステーション９５
配列ステーション９５では、第２ウェルプレートからのゲノムＤＮＡの試料が基材２２９上に沈着される。基材は図９に示されている。基材２２９は光学的にフラットなので、それはレーザーによってスキャンでき、かつスクリーニングされるゲノムＤＮＡと結合するための十分な数の官能基を含む。基材２２９はガラス、プラスチック、膜又は該要素の組合せでよい。典型的に、基材２２９は付着されたいくつかの表面化学を有する。これら表面化学としては、限定するものではないが、アミン基、アルデヒド基又はポリリジンが挙げられる。反応基は、共役的又は非共役的に核酸を（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、単位複製配列等）基材２２９の表面に結合させる。好ましい実施形態では、アルデヒド官能基（５．０×１０１２）、ｃｍ２当たりの反応基が光学的にフラットなガラススライドに加えられる。スライド（ＳＭＡ−１０００）はＴｅｌｅＣｈｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入される。
【００６９】
配列ステーション９５では、自動配列機を用いて固体ピン用具でゲノムＤＮＡが基材２２９の表面上に沈着される１７５。配列機は、チタンチップ等をウェル中に浸漬し、かつ基材上にプリントする機械である。自動配列機は、基材上のその位置で特有の試料の位置を追跡するソフトウェアを含む。配列機は、ＬＩＭＳ２４に通信的に連結され、かつ各試料に関する情報がＬＩＭＳ２４に送信される１１４。典型的には、自動配列機は、限定するものではないが、固体ピン、スリットピン／羽、ピンセット、ＴｅｌｅＣｈｅｍのＭｉｃｒｏ Ｓｐｏｔｔｉｎ Ｐｉｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、ピンとリング、圧電技術及びシリンジ−ソレノイド技術を含む。製造業者の操作説明書に従って変更することなくこの方法で自動配列機を使用できる。
【００７０】
アルデヒド被覆スライドでは、基材にさらに付着させるためにゲノムＤＮＡスポットを処理する必要はない。しかし、他の官能基を使用すると、ゲノム試料は、紫外線による架橋で表面に付着するか及び／又は加熱して試料を結合させる。例えば、ゲノムＤＮＡは、３０秒間紫外線によって基材に１２００μ／ｊで付着される。同様に、８０℃で２．４時間加熱しても結合を果たすだろう。基材２２９上のスポットは１〜１００ミクロンの大きさである。約１〜１３０，０００のゲノムＤＮＡスポット間に、別個の追跡可能な試料に応じて個々の基材２２９上に位置づけられる。
【００７１】
図７Ｃを参照すると、例えば、基材バーコード２３１がスキャンされる１７３。ＬＩＭＳ２４がウェルプレートと基材バーコード２３１を照合する１１８。さらに、ＬＩＭＳ２４は、基材上の位置を有する特定試料と基材バーコード２３１を照合する１１４。試験すべき試料由来のゲノムＤＮＡと、遠隔ユーザー１によって提供された指定対照由来のゲノムＤＮＡが、例えば、ある組織試料の試験にのみ言及する場合、基材上の第１及び第２位置の割当てられた位置の基材上に沈着される。基材上にゲノムＤＮＡを沈着させる前に、ゲノムＤＮＡ試料は十分量の標定緩衝液と混合して基材２２９上への沈着を容易にする。
【００７２】
好ましい実施形態では、標定緩衝液は３ＸＳＳＣであるが、ＤＭＳＯ、ＩＸＳＳＣ又は市販の標定緩衝液を含む他の等価な緩衝液を使用できる。ゲノムＤＮＡは、基材２２９上に沈着される１７５。ゲノムＤＮＡの試料は、品質管理の目的で３回基材２２９上に沈着される。ＬＩＭＳ２４は、自動マイクロ配列装置から得られた情報から基材２２９上に沈着されたゲノムＤＮＡ試料の正確な位置を記録する１１４。これとは別の実施形態では、基準遺伝子配列に特異的な少なくとも１つのプローブも各スポットに添加される。このプローブは基準遺伝子配列に特異的である。
【００７３】
別の代替実施形態では、小量の形態学的配列の核酸が、第２ウェルプレートの各ウェルに添加される１１７。形態学的配列は、試験される生体物質のゲノム中には天然に存在しない原核生物又は真核生物のようないずれのソース由来のいずれの核酸配列でもよい。試料中に固定されたラムダＤＮＡは形態学的対照として使用できる。形態学的配列の例としては、限定するものではないが、外因性遺伝子、部分遺伝子、タンデムリピート、任意配列又は合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。形態学的配列は、第２ウェルプレートのゲノムＤＮＡ中にピペット処理され、ピペットを緩やかに上下して混合される。形態学的対照を用いて、試料が基材２２９にうまく移動されたかどうかを決定する。
【００７４】
図７Ｄを参照すると、好ましい実施形態では、基材上への沈着が完了された後、第２ウェルプレートが配列ステーション９５の装填から外される１９７。第２ウェルプレートが封止され１９９、第１マスタープレートが再び蓋をされ、これらプレートのバーコードが再スキャンされ、かつ貯蔵ユニット位置が割り当てられる２０３。ＬＩＭＳ２４は、マスタープレートを輸送装置位置２０４に結合させる。第２ウェルプレートをフリーザー２０５に移動する。ＤＮＡ試料及び任意に形態学的対照配列を含有する第２ウェルプレートがバリアシールで封止される。バリアシールは、試料の分解を防止し、かつ安全な貯蔵機構を提供する。処理後の第２ウェルプレートを収容する輸送貯蔵ユニットは、ユニット内に特有番号及び特有位置を有する。ユニット内の各位置は、関連づけられた一意のバーコード番号を有する。ワークステーション１４から除去された各第２ウェルプレートは、バーコードがスキャンされ、かつ輸送貯蔵ユニット内の特有位置のバーコードのスキャニングを有する。ＬＩＭＳ２４は、第２ウェルプレート番号及びその特有位置を記録する。第２ウェルプレートのその位置との照合は、試料が再アクセスを必要とする場合に２０４、有益である。輸送貯蔵ユニットは長期貯蔵用の冷却貯蔵室に移動される。
【００７５】
ハイブリダイゼーションステーション９６
基材２２９は、ハイブリダイゼーションのための加熱カセット１７７内に置かれる。図９には、例として加熱カセット２２０が示されている。この加熱カセット２２０は、斜面トップ２２５、複数のスペーサー２２６、金属フレーム２２７及び張力クランプ２３０で構成される。基材２２９は、金属フレーム２２７内に下ろされ、プラスチックスペーサー２２６が縁に沿って縦に走る基材２２９のトップに配置される。斜面トッププレート２２５は、複数のスペーサー２２６のみで分離された基材２２９の周囲に下ろされる。金属の張力クランプ２３０が加熱カセット２２０に加えられ、カセット２２０を一緒にしっかりと保持する。基材２３１のバーコードは、加熱カセット２２０を越えて伸長してスキャニングを容易にする。
【００７６】
図７Ｃを参照すると、好ましい実施形態では、加熱カセット２２０が組み立てられる１７８。加熱カセット２２０内の基材２２９が加熱ブロック（Ｇｅｎｅ Ｐａｉｎｔ（登録商標）−Ｔｅｃａｎ）（Ｒａｌｅｉｇｈ−Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に移される１７９。加熱ブロックの機能は、温度を増減させることである。好ましい実施形態では、二本鎖ＤＮＡを分離させてハイブリダイゼーション１８１をしやすくするために、加熱ブロックが９５〜９９℃に２分間加熱される。そして、基材２２９が１０〜２０容量のエタノールで洗浄される１１５。好ましい実施形態では、基材２２９は、如何なる残留エタノールをも追い出すために加熱カセットのトップ斜面中に圧縮Ｎ２を通すことによって乾燥される。十分量のカゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はいずれかの商業的に入手可能な遮断剤を加熱カセットの斜面に施して１８３、未結合表面化学、すなわちアルデヒドを遮断する。加熱カセット２３０は、加熱ブロック上でインキュベートされる１８４。遮断剤による表面化学の遮断に次いで、基材２２９は洗浄される１８５。好ましい実施形態では、基材２２９は脱イオン水で１分間３回洗浄される。
【００７７】
基材２２９上に固定化されたゲノムＤＮＡは、プローブとハイブリダイズされる１８７。ＬＩＭＳ２４は、作業の調査２３で遠隔ユーザー１によって選択された通りに、プローブのような試薬を分配するようにハイブリダイゼーションステーション９６を指揮する。好ましい実施形態では、種々のプローブが基材２２９上の各ＤＮＡスポットに添加される。スポットは試験すべき試料、又はスポットは対応する対照試料のＤＮＡでありうる。第１プローブは、標的遺伝子配列６３と呼ばれる、トランスジェニック及び標的突然変異誘発スクリーニングの両方のために指定された遺伝子配列の一部分に特異的である。標的遺伝子配列に特異的な標的プローブは、標的結合プローブと呼ばれる。
【００７８】
好ましい実施形態では、さらに、基準遺伝子配列の一部分に特異的な少なくとも１種の第２プローブがハイブリダイゼーション緩衝液に添加される。このプローブは、基準結合プローブと呼ぶことができる。基準結合プローブの機能は、指定された品質管理チェックポイントを提供する。基準結合プローブは、スクリーニングされる種内の遺伝子又は遺伝子セグメントに相補的な遺伝子配列、すなわち基準遺伝子配列を有する。
基準遺伝子配列として用いられる内因性遺伝子は、導入遺伝子のものと同様の反復周波数を有するので、各プローブについて同量のハイブリダイゼーション及び線状曲線が得られる。導入遺伝子の１〜１０のコピーを保有する個体は、いずれの単一コピーマウス遺伝子も基準遺伝子配列として使用できる。種Ｍｕｓ内に存在する単一コピーマウス遺伝子の例は、表１に示される。
【００７９】
【表１】
2004508057.tif 000007
【００８０】
さらに、例えば、マウスの主要な尿タンパク質遺伝子ファミリーは、単相ゲノム毎に２０〜３０コピーを含む。主要タンパク質ファミリーに含まれる遺伝子配列としては以下が挙げられる。
2004508057.tif 000008
【００８１】
多数の導入遺伝子組込み現象を含む個体を評価するため、リボソームＲＮＡ遺伝子用のプローブがうまく機能する。リボソームＲＮＡ遺伝子は５０から数百コピーを十分に明らかにすることができる。Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．， Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ， Ｆ． ａｎｄ Ｌａｃｙ， Ｅ． （１９９４） Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ． （ここに、引用によって取り込まれる）。
標的結合プローブ、及び基準結合プローブに加え、形態学的結合プローブをハイブリダイゼーション緩衝液に加えることができる。形態学的結合プローブの機能は、品質管理チェックポイントを与え、確実にプリント処理が成功するようにすることである。この品質管理は、標的試料が基材に適用されるかどうかの決定を斟酌する。また、それは、試料と基材を越えて再現性を評価するため、評価すべき沈着された試料の形状を斟酌する。
【００８２】
標的結合プローブ、基準結合プローブ、及び任意に形態学的結合プローブがハイブリダイゼーション緩衝液内で懸濁されると、プローブ増幅分子又は二次シグナル生成試薬も混合物に添加される。樹状突起プローブのような増幅分子は、標的結合プローブ、形態学的結合プローブ又は基準結合プローブに相補的である核酸捕獲配列を有する。これとは別に、標的結合プローブ、形態学的結合プローブ及び基準結合プローブのエピトーム（ｅｐｉｔｏｍｅ）を４５℃〜５０℃でインキュベートして、二次シグナル生成試薬でプローブを予備ハイブリダイズすることができる。
種々の技法を使用してプローブを標識化することができる。直接標識化法と間接標識化の両方が許容できる結果を与える。間接的な方法論は米国特許第５，７３１，１５８号；第５，５８３，００１号；第５，１９６，３０６号及び第５，１８２，２０３号に記載されているようなものである（ここに、引用によって取り込まれる）。直接標識化法では、標識化プローブが標的遺伝子配列にハイブリダイズする。プローブは直接的に修飾され、プローブ毎に、シアニン、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又は他のいずれかの蛍光シグナル生成試薬のような少なくとも１種の蛍光性、放射性又は染色性分子を含有する。蛍光シグナル生成試薬としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＤＴＡＦ及びＦＡＭが挙げられる。ＦＡＭはカルボキシフルオレッセインスクシンイミジルエステル（例えば、５−ＦＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で生体接合されたフルオレッセインである。ＤＴＡＦはフルオレッセインジクロロトリアジン生体接合体である。
【００８３】
間接標識化法は、選択された遺伝子標的配列と結合するプローブで、かつ修飾されて特定エピトームを含んでいるか又は核酸結合配列を有する場合は二分プローブを形成するプローブを使用する。プローブは、遠隔ユーザー１のスクリーニングパラメータ選択に基づいて調製される。遠隔ユーザー１は、標的遺伝子配列６３に関連するプローブ配列６４を提示する。標的配列６３に加え、特定された標的配列６３を超える追加の結合配列が加えられる。これら２要素の組合せが二分プローブを生じさせる。
例えば、プローブの結合配列は、逆転写酵素の５’末端と同一配列を有する。従って、二分プローブは以下の結合配列を含む：５’ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＣ Ｇ プローブ配列３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）。そして、この結合配列は、Ｃｙ３樹状突起５’ ＧＧＣ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＧＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＣＣ ＣＧＣ Ｃ − ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の捕獲配列に相補的である。
【００８４】
標的遺伝子配列６３は、それぞれプローブ遺伝子配列６４に特異的である。二部プローブの結合配列は自由であり、かつ標的遺伝子配列６３に結合しない。同様に、基準遺伝子配列については、基準結合プローブ配列は基準遺伝子配列に特異的である。二分プローブの結合配列は自由であり、かつ関連遺伝子配列に結合しない。単一コピーマウス遺伝子に相補的な二分プローブの例を下表２に示す。
【００８５】
【表２】
2004508057.tif 000009
【００８６】
マウス主要尿タンパク質に相補的な二分プローブの例を下表３に示す。これら二分プローブは１つのＭＵＰ遺伝子配列と、増幅分子に相補的である第２遺伝子配列で構成される。
【表３】
2004508057.tif 000010
【００８７】
デンドリマー又はチラミドのような増幅分子が導入される。増幅分子は直接又は間接的に核酸結合配列又はエピトームに結合する。遊離二分プローブ及び過剰増幅分子は、数回の連続洗浄工程で除去される。結合された増幅分子は、結合分子の数と直線関係にあるシグナルを発する。
結合プローブの典型的な修飾としては、限定するものではないが、ビオチン化及びフルオレッセイン付着が挙げられる。そして、酵素のような二次シグナル生成試薬がエピトームに結合する。二次シグナル生成要素は、それに直接付着するシグナル分子を有するか、又はそれが他のシグナルユニットの付着を活性化若しくは促進しうる。複数シグナルユニットを用いて標的のシグナルを増幅することができる。
【００８８】
デンドリマー、チラミド等は、遺伝子発現分析でｃＤＮＡを増幅するために伝統的に使用されている増幅分子の例であり、本方法で使用することができる。
好ましい実施形態では、ＬＩＭＳ２４がハイブリダイゼーションステーション９６に、選択された結合プローブとハイブリダイゼーション緩衝液をピペット処理するように液体ディスペンサーを指揮するように指示する。水及び生理食塩水ナトリウムシトレート（ＳＳＣ）のような多くのハイブリダイゼーション緩衝液が許容される。代わりに、０．２５ ＮａＰＯ４、４．５％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ＸＳＳＣ又は４０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳのような緩衝溶液も使用できる。
【００８９】
ハイブリダイゼーション溶液が加熱カセット２２０の斜面トップ２２５に施される１８７。加熱カセット２２０内の基材２２９がインキュベートされる１８９。好ましい実施形態では、標的結合プローブ、基準結合プローブ及び任意の形態学的結合プローブがそれらのそれぞれの標的にハイブリダイズした後、加熱ブロック上で、ハイブリダイゼーション混合物が４〜１２時間４０℃〜６５℃の範囲の温度でインキュベートされる１８９。ハイブリダイゼーション溶液は増幅分子又は二次シグナル試薬を含むことができ、又はそれらを二次的に添加しうることに留意すべきである。
【００９０】
基材２２９をハイブリダイゼーション溶液と共にインキュベートすると１８９、基材の表面を数回洗浄し１９１、プローブ増幅分子又は二次シグナル試薬のようないずれの過剰な試薬をも除去する。好ましい実施形態では、まず基材２２９を洗浄し１９１、数容量の２Ｘ ＳＣＣ、０．２％ＳＤＳと共に５５℃で１０分間インキュベートする１８９。再び基材を室温で１０分間数容量の２Ｘ ＳＳＣで洗浄する。最後の洗浄は、室温で１０分間０．２Ｘ ＳＳＣで行う。
画像処理を容易にするために基材を乾燥する１９７。好ましい実施形態では、加熱カセットのトップ斜面内に圧縮窒素を通すことによって基材を乾燥する。圧縮窒素乾燥は、残留緩衝液のすべてが加熱カセットから追い出され、かつ基材が乾燥するまで続けられる。
【００９１】
検出ステーション９７
この検出ステーション９７は、前記基材上の第１及び第２位置において前記指定遺伝子配列の一部分に特異的な少なくとも１つの標識化プローブからシグナルを検出する工程、及び基材上の第１及び第２位置由来のシグナルを比較して、ゲノムＤＮＡの試料中の指定遺伝子配列を検出する工程を含む。
【００９２】
好ましい実施形態では、基材２２９を検出ステーション９７に移す。基材２２９をＧＳＩ Ｌｕｍｉｎｉｃｓ （Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）のような商業的に入手可能な画像処理カセット内に装填し、その画像処理カセットをマイクロ配列画像処理装置ＧＳＩ Ｌｕｍｉｎｉｃｓ ５０００（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）内に製造業者の説明書に従って装填する。基材２２９を興奮性エネルギー源にさらし、シグナル分子から定量可能なシグナルを生じさせる１９５。さらに詳細には、基材のバーコードをスキャンし、ＬＩＭＳ２４に報告する１２０。基材表面を少なくとも３つの異なるチャネルでスキャンし、その結果をＬＩＭＳ２４内に報告する１２０。個々の基材２２９はバーコードを有しており、スキャンされ、かつ貯蔵位置バーコードと照合される。基準結合プローブ、標的結合プローブ及び任意の形態学的プローブシグナルを記録かつ分析する。
【００９３】
図１０を参照すると、ＬＩＭＳ２４が出力報告２４９を準備している。出力報告２４９を書き込む前に、ＬＩＭＳ２４内でいくつかの計算が行われる。好ましい実施形態では、このような計算は、試料毎の３複製すべての評価を含む。標的結合プローブによって得られる曲線の勾配（定量されたハイブリダイゼーション強度／ｎｇＤＮＡ）を、各個体試料用の指定対照プローブの曲線勾配で除す。これは誘発比率を意味する。そして、この誘発比率を比較して対照に対する複製と他の複製誘発比率との密接さを決定する。誘発比率が計算されると、定性及び定量結果が出力報告２４９に書き込まれる。実験の定量シグナルと、指定対照の定量シグナルとの間の直線関係を計算すると、試料のコピー数、接合子体の構造又はモザイク性質が明らかになる。ホモ接合性個体の比率は、ヘテロ接合性個体の比率の２倍であるべきだ。さらに、単離プロセスから回収されるゲノムＤＮＡの量から細胞数が決定される。
【００９４】
図１０を参照すると、試料出力報告２４０は、アカウント登録２５０、ウェルプレート受入れ番号２５２、対照試料位置２５０及び指定対照の遺伝子特徴づけ２５２を含む。さらに、出力報告２４９は、ウェル位置２５４、試料特定２５６、液位検出２５８、ＤＮＡ濃度２６０、標的配列２６２、プローブ配列２６４、シグナル定量化２６６、定性結果２６８、接合子体の構造／コピー数２７０、補正前のウェル毎の光学密度読み２７４、補正後の光学密度読み２７６、分析した細胞の推定数２７８、コピー数評価、接合子体の構造又はモザイク性質を斟酌した、指定対照シグナル強度に対する比較による定量分析２７０を含むことができる。出力報告２４９は、画像ファイル（電子メール）又は結果の画像表示２７２を含むことができる。さらに、最適化によって遠隔ユーザー１の要求で集められた情報及び配列確認品質管理データやエラーメッセージが出力報告２４９に含まれる。遠隔ユーザー１は、このファイルを電子的に送信し、又は電子的に通知してもらうことを選択できる。さらに、遠隔ユーザー１は郵便業務経由でハードコピーを送ってもらう選択肢も有する。
【００９５】
ＬＩＭＳ２４が出力報告２４９用の全データをコンパイルすると、出力報告が遠隔ユーザー１に送られる７。好ましい実施形態では、ＬＩＭＳ２４は、報告を遠隔リンク７経由で各遠隔ユーザー１又はウェブサイト１６上に結果を書き込むか若しくは電子的リンク７経由で出力報告２４９を送ることができるオーダーマネジャー２２に送る。ＬＩＭＳ２４ ２２４は、結果を６カ月間入手可能な状態に維持し、かつ結果は長期間保存ディスクに記録され、保管される。
【００９６】
これとは別の実施形態では、高処理能力ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はＴａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ． Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）若しくはＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって販売されている分子標識のようなＰＣＲ反応の変形を利用して、自動トランスジェニック及び標的突然変異誘発スクリーニングを行うことができる。同一又は等価の因子を考慮して、ユーザーのアカウント登録、作業の調査及び試料特定及び指定を作ることができる。さらに、供給、輸送追跡、試料追跡、品質管理及び結果のソフトウェアアーキテクチャを、同様のマンネリズムで再生できる。ＰＣＲ反応を使用するための修正は、さらにオーダープロセス、具体的には作業の調査で描写された情報を必要とする。この等価な化学を使用すると、ユーザーに、反応緩衝液、マグネシウム濃度、プライマー配列、プライマー濃度、ｄＮＴＰ濃度、サイクル条件及び反応量のような判定基準を指定するように要求する。自動液体ハンドリングはこれらの変数を調整し、かつ適切な位置に反応緩衝液を分配できる。試料を自動化システムで追跡しながら、ゲノムＤＮＡを、真空マニホールド単離、微細粒子単離又は化学抽出によって自動化様式で単離することができる。単離された哺乳類ＤＮＡを、ＩＡＳ’ｓ Ｇｅｎｏｍａｔｒｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のような高処理能力の熱循環機内に装填することができる。代わりに、化学処理されたガラス、プラスチック、膜又はいずれかの組合せのような基材を反応基材として使用できる。これらが基材を、ＰＣＲの熱的パラメータに従って加熱及び冷却する加熱ブロック上に収容することができる。液体ハンドリング台が、ウェルの各試料に、又は基材の表面を通して適切な反応緩衝液を添加する。増幅の検出は、ゲル電気泳動法又はキャピラリー電気泳動法による染色でよい。検出は、ＰＣＲ反応時の蛍光若しくは放射標識化ｄＮＴＰの取込みによって、又は間接的な染色方法によって定性／定量化もできる。
【００９７】
これとは別のＰＣＲ検出法は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）プローブの使用を含む。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）プローブは、シグナル生成要素（リポーター染料）と、正常な条件下ではシグナル−生成要素の検出を考慮しないクエンチング要素（クエンチング染料）とで構成される。オリゴヌクレオチドＴａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）プローブ配列は、ＰＣＲ単位複製配内に存在する内部標的配列と相同性である。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）プローブの単位複製配への特有なハイブリダイゼーション反応は、クエンチング要素をシグナル−生成要素から分離するのを可能にする。遊離されるシグナル分子は定量可能である。シグナル強度は、結合しているＴａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）プライマーの数に比例する。
【００９８】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｗｅｌｌｓｌｅｙ， ＭＡ）に類似の方法は、分子標識法である。分子標識はシグナルベースの変形とは区別することができる。プローブは、蛍光分子のようなシグナル生成要素と、クエンチャー要素を備える。プローブがその相補的配列に正確に結合すると、クエンチャー要素が除去され、そして蛍光分子が検出可能になる。
以下の実施例は、例示のために提供されており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００９９】
実施例
実施例１−トランスジェニックスクリーニング
遠隔ユーザー１がスクリーニング研究室２０のウェブサイト１９にアクセスし、試験サービスをオーダーする。遠隔ユーザー１は、前もってスクリーニング研究室２０から特異的に割当てられているアカウント番号３１を入力する。遠隔ユーザー１がアカウント登録２１を完了した後、遠隔ユーザー１に作業の調査セクション２３が提示される。作業の調査セクション２３から遠隔ユーザー１に要求される第１の指定は、試料が事実上トランスジェニック又は標的突然変異誘発のものかを特定することである。
【０１００】
この例では、遠隔ユーザー１は、試験すべき試料がトランスジェニック６０性質のものであることを指定している。遠隔ユーザー１は、１つのトランスジェニック系統のみを試験すべきことを特定する６２。試験すべく指定された遺伝子配列６１は“ＨＵＰＰＣＡ”である。そして、遠隔ユーザー１は、この系統６２からスクリーニングすべきトランスジェニック試料要求を指定する４７。遠隔ユーザー１は、検出すべき標的遺伝子配列を特定する６３。遠隔ユーザー１は、プローブの塩基配列６４、ＧＣＡ ＡＧＧ ＡＣＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＧＡ Ｇ　（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を提供する。それは、標的遺伝子配列６３に相補的である。ユーザーが示すプローブ配列が、以下の結合配列に連結される：
2004508057.tif 000011
結果として以下の二分プローブになる：
2004508057.tif 000012
この結合配列は、シアニン（Ｃｙ３）デンドリマーの逆転写酵素配列の捕獲アームに特異的に結合する。
【０１０１】
遠隔ユーザー１は、図６に示されるような、試料特定及び指定画面が表示される。画面は、適切な方向のソースウェルプレート９６の画像を表示する。この画像表示は、ユーザーがその正確なソースウェルプレート９６内に各試料を具体的に指定するプロセスで役立つ。遠隔ユーザー１の試料のそれぞれが、図６に示されるように、ソースプレートの特定ウェルに関連づけられ、記録されかつ追跡される。
【０１０２】
遠隔ユーザー１は、図６に示されるように、ソースウェルプレート２を適切な試料で正確な位置に装填する。指定対照の性質についての情報が確認される。この情報には、分かっている場合は接合子体の構造とコピー数が含まれる９０。ユーザーは、凍結乾燥溶解試薬を脱イオン水と共に再構成する。ユーザーは、十分量の溶解緩衝液４をソースウェルプレート２の各ウェル内にピペットで入れて試料を覆う。ソースウェルプレート２をバリア機構で封止する。さらに構造的な完全性を加えるため、ソースウェルプレート２を硬質蓋で封止する。ソースウェルプレート２を、提供された包装及び輸送資材内に装填する。パッケージをスクリーニング研究室に発送する１６。
【０１０３】
スクリーニング研究室２０でパッケージが受け取られ、ソースウェルプレート２が取り出されてワークステーション１４内に装填される。全試料が個々に追跡される際、試料は抽出かつ最適化されたゲノムＤＮＡを有する。ＤＮＡの量が記録される。ゲノムＤＮＡ試料及び指定対照試料が、光学的にフラットなガラススライド上に沈着され、以下とハイブリダイズされる：
基準結合プローブ：
2004508057.tif 000013
二分プローブの５’−ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＧＣＧ要素は、シアニン５（Ｃｙ５）デンドリマーの一意性の捕獲アームに特異的に結合する；及び
標的結合プローブ：
2004508057.tif 000014
及び増幅分子（Ｃｙ３及びＣｙ５デンドリマー）。
【０１０４】
光学的にフラットなガラススライドが刺激エネルギーレーザーに供され、定量可能なデータが記録される。出力報告２４９が生成され、インターネットによって遠隔ユーザー１に送信される。出力報告２４９は、アカウント登録情報２５０、ウェルプレート番号２５２、遺伝子特徴づけ２５４、ウェル位置、試料特定２５６、ＤＮＡ濃度２６０、標的配列２６２、プローブ配列２６４、シグナル定量化２６６、結果２６８、接合子体の構造／コピー数２７０、細胞の推定数２７８、画像表示２７２、グラフ表示２８０、エラーメッセージ２７４及び品質管理データ２７４を含む。
【０１０５】
実施例２：標的突然変異誘発
遠隔ユーザー１がスクリーニング研究室２０のウェブサイト１９にアクセスし、試験サービスをオーダーする。遠隔ユーザー１は、前もってスクリーニング研究室２０から特異的に割当てられているアカウント番号３１を入力する。遠隔ユーザー１がアカウント登録２１を完了した後、遠隔ユーザー１は作業の調査２３が提示される。作業の調査セクション２３から遠隔ユーザー１に要求される第１の指定は、試料が事実上トランスジェニック又は標的突然変異誘発のものかを特定することである。
【０１０６】
この例では、遠隔ユーザー１は、試験すべき試料が標的突然変異誘発性質７０のものであることを指定している。遠隔ユーザー１は、１つのノックアウト系統のみ７１、７２、ＮＳＥ−ＰＰＣＡ（ニューロン特異性エノラーゼ）を試験すべきことを特定する。試験すべく指定された遺伝子配列はノックアウト系統であり、選択可能なマーカーハイグロマイシン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）用である。そして、遠隔ユーザー１は、この系統からスクリーニングすべきＮＳＥ−ＰＰＣＡ試料の要求を指定する４７。遠隔ユーザー１は、検出すべきハイグロマイシンの選択可能なマーカー標的配列を特定する７４。遠隔ユーザー１は、この選択可能なマーカーが、Ｃｌｅ−ｌｏｘ又はＦＬＰ／ＦＲＴのような組換え技法で除去されなかったことを明確に示す。選択可能なマーカー遺伝子配列が提供される６３。ハイグロマイシンプローブのプローブ配列が、ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＴＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）であると特定される６４。遠隔ユーザー１が示すプローブ配列６４が、以下の結合配列に連結される：
2004508057.tif 000015
この結合配列は、シアニン（Ｃｙ３）デンドリマーの逆転写酵素配列の捕獲アームに特異的に結合する。
【０１０７】
遠隔ユーザー１は、試料特定及び指定画面が表示される。画面表示は、図６に示されるような適切な方向のソースウェルプレート２の画像である。この画像表示は、ユーザーがその正確なソースウェルプレート２の位置内に各試料を具体的に指定するプロセスで役立つ。遠隔ユーザー１の試料のそれぞれが、ソースプレートの特定ウェルに関連づけられ、記録されかつ追跡される。ユーザーは、ソースプレートのバーコードから受入れ番号３を特定する。
【０１０８】
遠隔ユーザー１は、図６に示されるように、試料特定セクション２５で、ソースウェルプレート２を適切な試料で正確な位置に装填する。指定対照の性質についての情報が確認される９０。遠隔ユーザー１は、提供された凍結乾燥溶解試薬を脱イオン水と共に再構成する。ユーザーは、十分量の溶解緩衝液４をソースウェルプレート２の各ウェル内にピペットで入れて試料を覆う。ソースウェルプレート２をバリア機構で封止する。さらに構造的な完全性を付加するため、ソースウェルプレート２を硬質蓋で封止する。提供された包装及び輸送資材内にソースウェルプレート２を装填する。遠隔ユーザー１は、輸送パッケージ１５をスクリーニング研究室２０に発送する１６。
【０１０９】
スクリーニング研究室２０でパッケージ１５が受け取られ、ソースウェルプレート２が取り出されてワークステーション１４内に装填される。全試料が個々に追跡されている際、試料は、自動化様式で抽出かつ最適化されたゲノムＤＮＡを有する。ＤＮＡの量が記録される。ＤＮＡが基材上にプリントされ、かつ以下の基準プローブとハイブリダイズされる：
５’−ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＧＣＧ
ＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣ　（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）。
二分プローブの５’−ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＧＣＧ要素は、シアニン５（Ｃｙ５）デンドリマーの一意性捕獲アームに特異的に結合する；及び
標的結合プローブ：
2004508057.tif 000016
【０１１０】
光学的にフラットなガラススライドが刺激エネルギーレーザーに供され、定量可能なデータが記録される。出力報告２４９が生成され、インターネットによって遠隔ユーザー１に送信される。出力報告２４９は、アカウント登録情報２５０、ウェルプレート番号２５２、遺伝子特徴づけ２５４、ウェル位置、試料特定２５６、ＤＮＡ濃度２６０、標的配列２６２、プローブ配列２６４、シグナル定量化２６６、結果２６８、接合子体の構造／コピー数２７０、細胞の推定数２７８、画像表示２７２、グラフ表示２８０、エラーメッセージ２７４及び品質管理データ２７４を含む。
【０１１１】
実施例３　真核生物のゲノムＤＮＡの磁性粒子単離
Ｓｔ． Ｊｕｄｅ子供病院からいくつかのマウス尾部についての試験結果を得た。試料を溶解して、染色体性ＤＮＡを含有する細胞含量を放出した。溶解緩衝液は、４Ｍ尿素，０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ〜７．５），１８０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，５ｍＭ ＤＤＴ，４１５ｍｇのプロテイナーゼＫ及びＲナーゼで構成されていた。試料は、輸送中室温で２４時間インキュベートされた。このライセートは、原核生物の働き由来のクローン化ＤＮＡ要素のないゲノムＤＮＡを含有する溶液を生じさせた。ゲノムＤＮＡを分離した。このライセートをカルボキシル−末端イオンオキシド粒子と混合した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００，０．０２％ナトリウムアジド，２．５Ｍ ＮａＣｌを添加し、穏やかに混ぜた。試料を室温で１０分間インキュベートした。試料を数分間上清が澄むまで磁場にさらした。上清を吸引して捨てた。微細粒子を洗浄し、７０％エタノールと３０％脱イオン水で再懸濁させ、いずれの塩をも除去した。試料を上清が澄むまで磁場にさらした。そして、上清を吸引して捨てた。エタノール洗浄を繰り返した。微細粒子を数分間空気乾燥して。微細粒子を０．０１Ｍ トリス（ｐＨ７．４）、０．０２％ナトリウムアジドに再懸濁させた。トリス−微細粒子溶液を８０℃で数分間インキュベートした。試料を上清が澄むまで再び磁場にさらした。上清を吸引し、清潔なチューブに入れた。ゲノムＤＮＡの回収率を決定するため、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ定量分析を行った。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡのみに結合する商業的に入手可能な着色剤である。試料をキュベット内に入れ、４８０ｎｍで励起させた。分光蛍光光度計を用いて５２０ｎｍで蛍光発光強度を測定し、ＤＮＡ濃度の関数としてプロットした。
【０１１２】
【表４】
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結果は、組織又は細胞内の哺乳類のゲノムＤＮＡが室温でうまく溶解され、かつゲノムＤＮＡが磁性粒子で回収されることを示している。
【０１１３】
実施例４　哺乳類のゲノムＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーション、検出
マウスゲノムＤＮＡが基材に結合し、プローブにハイブリダイズし、かつ検出される定量可能なシグナルを有するための相違を評価し、かつ最適条件を決定するため、いくつかの相互作用を導いた。超音波処理し、及び超音波処理しない研究中の２つの別タイプのマウスゲノムＤＮＡがあった。この両タイプのマウスゲノムＤＮＡを用いて４つの異なる緩衝液内で連続的希釈を行った。５３８ｎｇ／μＬ〜１７ｎｇ／μＬの範囲で両マウスゲノムＤＮＡの６つの連続的希釈を行った。指定対照として供するためにＰＣＲで増幅された全種のマウスに遍在する７つの内因性遺伝子配列があった。
【０１１４】
マウスゲノム中に天然に存在する７つのマウスマーカーをＰＣＲによって増幅した。これらマーカーは、未知系統ゲノムＤＮＡの対照として機能する。マーカーは下表のものだった。
【表５】
2004508057.tif 000018
【０１１５】
ＰＣＲ断片をアガロースゲル上で分離し、その単位複製配列を、Ｈａｗｋｉｎｓ‘６２８特許で述べられている手順で磁性粒子を用いて単離した。定量分析（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を利用して、ＰＣＲ単位複製配列ＤＮＡの特定濃度を決定した。連続的希釈の既知濃度のＰＣＲ単位複製配列対照と、連続的希釈の超音波処理及び非超音波処理の両系統の内因性マウスゲノムＤＮＡを基材上にプリントした。単位複製配列（増幅される遺伝子配列の部分の一般名）ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを、共有及び／又は非共有結合を介して基材に固定した。
【０１１６】
【表６】
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対照ゲノムＤＮＡシグナル連続的希釈の結果
【０１１７】
基材上にプリントされ、探査され、かつ検出されるＰＣＲ単位複製配列は文献でよく実証されている。ＰＣＲ単位複製配列は一般的に遺伝子発現の研究で用いられる。これらＰＣＲ単位複製配列対照を、マウスゲノムＤＮＡの濃度勾配（５３８ｎｇ／μＬ〜１７ｎｇ／μＬ）と等価な濃度勾配で、４つの異なる緩衝液中６つの連続的希釈にした。超音波処理及び非超音波処理マウスゲノムＤＮＡの連続的希釈及びＰＣＲ単位複製配列対照の連続的希釈を一緒に６つの異なるタイプの基材上にプリントした。これら基材を２つの異なるタイプのプローブで探査した。ＦＡＭプローブ（直接標識）及びデンドリマーで増幅された二分プローブである。
【０１１８】
連続的希釈を保持するウェル−プレートは以下のように作った：
超音波処理及び非超音波処理の両方の真核生物及び原核生物ＤＮＡを、４つの異なる緩衝液中に種々の濃度で懸濁させた。４つの緩衝液は、３ＸＳＳＣ、５０％ＤＭＳＯ、５．５Ｍ ＮａＳＣＮを含み、かつ４番目の緩衝液は、商業的に入手可能なＴｅｌ−Ｃｈｅｍ （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）プリンティング緩衝液である。マウスゲノムＤＮＡを半分に６回希釈した（５３８ｎｇ／μＬ、２６９ｎｇ／μＬ、１３５ｎｇ／μＬ、６８ｎｇ／μＬ、３４ｎｇ／μＬ及び１７ｎｇ／μＬ）。ＰＣＲ対照連続的希釈も作った。対照希釈は、前もって増幅された内因性マウス遺伝子のＰＣＲ−単位複製配列から調製した。ＰＣＲ対照は、以下のように生成した：第１の４つの対照連続的希釈は、３ＸＳＳＣ緩衝液、５．５Ｍ ＮａＳＣＮ、５０％ＤＭＳＯ及び商業的に入手可能な緩衝液Ｔｅｌ−Ｃｈｅｍ （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）。ＰＣＲ単位複製配列ＤＮＡの開始濃度は５３８ｎｇ／μＬだった。ＰＣＲ単位複製配列の６つの希釈（５３８ｎｇ／μＬ、２６９ｎｇ／μＬ、１３５ｎｇ／μＬ、６８ｎｇ／μＬ、３４ｎｇ／μＬ及び１７ｎｇ／μＬ）があった。第５及び第６対照も別個のウェル−プレート内で、開始量５３８ｎｇ／μＬで希釈した。再びそれらを３ＸＳＳＣ、５．５Ｍ ＮａＳＣＮ、５０％ＤＭＳＯ及び商業的に入手可能な緩衝液Ｔｅｌ−Ｃｈｅｍ （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）中に懸濁させた。
【０１１９】
【表７】
2004508057.tif 000020
【０１２０】
以下の二分プローブを使用した。
【表８】
2004508057.tif 000021
【０１２１】
ＦＡＭ修飾プローブ（直接標識）を使用した。
【表９】
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【０１２２】
マウスゲノムＤＮＡの超音波処理：
マウスゲノムＤＮＡは、ホーン超音波処理装置を用いて固定設定で５分間超音波処理した。
【０１２３】
配列設計：
配列設計は以下の通りだった：それぞれ配列マシーン用の１４個のスライドを保持する６個のパレットがあった。各パレットは、右上象限以外１フォーマットのスライドを保持した。各パレットが１フォーマットのスライドを保持した。左上象限パレットは１４個のスーパー−アルデヒドスライドを保持した。中央上象限パレットは１４個のＳｃｈｌｉｅｃｈｅｒ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ国）スライドを保持した。右上象限は５個のシグマスライド及び９個のスーパー−アミンスライドを保持した。左下象限は１４個のスーパー−アミンスライドを保持した。中央下象限はポリ−リジンスライドを保持し、かつ右下象限はアミノ−シリナイテッド（ｓｙｌｉｎａｔｅｄ）スライド（ＳＣＡスライド）を保持した。
【０１２４】
３８４ウェル−プレートを配列マシーン上に装填した。スリット−ピンチップを用いて配列マシーンを補正し、各基材上に正確な量の試料を精確に沈着させた。配列マシーンは、８４個のスライドを横断して３８４ウェルプレートの含量を塗布した。このプロセスに約４０分かけ、全プリントを完了した。プリント後、ニトロセルロース膜が損傷されるのでＳｃｈｌｉｅｃｈｅｒ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ国）からのＦａｓｔ Ｓｌｉｄｅｓ（登録商標）を除去した。
【０１２５】
ＤＮＡの架橋
これらスライドは、アルデヒドスライドを除き、１２００μＪでＵＶ架橋された。全スライドを５分間煮沸し、基材の一表面上で二本鎖ＤＮＡを分離した。基材の煮沸はスライドホルダーと水の中で起こった。基材を水中で５分間煮沸した後、１分間１００％エタンノール中に浸漬し、スライドの乾燥を容易にした。
ＦＡＭプローブを再懸濁させ、各プローブタイプの系統溶液を調製した。２７９ｍＭ／２７９μＬが１μＭに等しい。各系統は１μＭだった。
【０１２６】
直接標識化ＦＡＭプローブをすべて混合（多重化）して１つのハイブリダイゼーション緩衝液にした。このハイブリダイゼーション緩衝液を種々の基材に適用した。１μＭのプローブ又は３０μＬ中０．３ｐＭ。ハイブリダイゼーション緩衝液は以下のように調製した：約３０μＬの溶液が基材毎に必要だった。ハイブリダイゼーション緩衝液の全量は１８０μＬだった。このハイブリダイゼーション緩衝液は、１８μＬの２０ＸＳＳＣ、０．２μＬのプローブ−１、０．２μＬのプローブ−２、０．２μＬのプローブ−３、０．２μＬのプローブ−４、１．２μＬの１０％ＳＤＳ、６μＬのＢＳＡ、及び１５４μＬの水を含有し、トータルで１８０μＬの緩衝液に相当する。ＦＡＭは伝統的に高い自然放射能と低いシグナルを有することに留意すべきである。ＦＡＭハイブリダイゼーション緩衝液を２〜３の短い秒数の間ボルテックスして適切な混合を確実にした後、微量遠心管内で数秒間回転させた。スーパーアミンスライド０１２３２０、ポリリジンスライド０１２３７０、シグマスライド０１２８００、スーパーアルデヒド基材０１２８５０及びＣＳＡ基材０１２４４０にＦＡＭ反応混液を施した。３０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液をスライドに施した。そして、ハイブリダイゼーション緩衝液を有する基材をＳｃｈｌｉｅｃｈｅｒ Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ国）からのカバーガラスで覆い、不十分なハイブリダイゼーションをもたらしうる如何なる空気泡をもスライドカバー下から除去するように操作した。基材を湿ったタオレットを有するハイブリダイゼーションチャンバー内に置いて、スライドが乾かないようにした。チャンバーを４５．１℃のインキュベーター内に３０分間入れた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて基材表面上の化学基を適切に目隠しした。ハイブリダイゼーションプロセスが完了した後、スライドを２ＸＳＳＣ中１％ＳＤＳで約５分間洗浄した。２ＸＳＳＣ内でさらに５分間スライドを洗浄した。０．６ＳＳＣ内で５分間洗浄後、１００％エタノール内で洗浄した。探査後７日でＦＡＭスライドを画像処理し、検出可能なシグナルを定量できた。
【０１２７】
好ましい実施形態では、表７に示したような二分プローブをすべて混合（多重化）して１つのハイブリダイゼーション緩衝液にした。このハイブリダイゼーション緩衝液を種々の基材に施してインキュベートした。そして、シアニン３（Ｃｙ３）デンドリマーを使用してプローブに結合させた。図１１を参照すると、Ｙ軸２８２は標識化プローブの蛍光強度を示し、Ｘ軸２８４は試料識別スライドを示す。１スライドからのデータを用いて図１１として示される結果のグラフ表示を作成した。スライドをスキャンし、定量可能なデータを記録した。図１１は、ゲノムＤＮＡがマイクロ配列画像処理機を用いて検出できることを示している。
さらに詳細に、下表１０に結果を示す。
【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
結果は、超音波処理又は非超音波処理ゲノムＤＮＡが、光学的にフラットな基材に付加され、かつマイクロ配列画像処理機で解読されると、リポート可能なシグナルを生成できることを示している。
本発明を好ましい形態及びその好ましい使用に関して述べ、かつ図示したが、本発明の全範囲内で変形及び変更を構成することができるので、本発明はそのように限定されるものではない。
【０１３０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の遠隔操作自動検査方法の説明図である。
【図２】
図２は本システムの実施態様の１つの組み立て分解図である。
【図３】
図３は注文手順の組み立て分解図である。
【図４】
図４は顧客登録の組み立て分解図である。
【図５】
図５は作業検索の組み立て分解図である。
【図６】
図６はサンプル識別および指定のためのオリエンテーションの説明図である。
【図７】
図７Ａは検査室の作業システムの組み立て分解図である。
図７Ｂは検査室の作業システムの組み立て分解図である。
図７Ｃは検査室の作業システムの組み立て分解図である。
図７Ｄは検査室の作業システムの組み立て分解図である。
【図８】
図８は標準的な検査室ステーションの組み立て分解図である。
【図９】
図９は加熱カセットの説明図である。
【図１０】
図１０は、ある出力ファイルに関するトランスジェニックスクリーニング検査室のウェブサイト上のドキュメントを示す画面表示の説明図である。
【図１１】
図１１はグラフで表された結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2004508057.tif 000050
【図７Ｄ】
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【図８】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004508057.tif 000175
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508057.tif 000176
【国際調査報告】
2004508057.tif 000177
2004508057.tif 000178
2004508057.tif 000179
2004508057.tif 000180