(57)【要約】本発明は、既知の副作用が低減し、そして簡単な方法で使用可能であるアミノ糖を含有する抗生物質、アンホテリシンＢ、ダウノルビシンおよびドクソルビシン用の新規な剤形に関する。この抗真菌剤Ｂは、腎毒性である。細胞増殖抑制剤ダウノルビシンおよびドクソルビシンは、極めて心毒性である。この新規な剤形は、この抗生物質がペプチド結合によりポリサッカライドとその還元性末端で結合した抗生物質−デンプン抱合体である。本発明によれば、この結合は、デンプン誘導体をアルカリ性水溶液中でその還元性末端でＩ2酸化し、そうして酸化されたデンプン誘導体を有機溶液中で、抗生物質にカップリングすることにより行われる。得られる抱合体は低毒性である。このポリサッカライド部分は血清−α−アミラーゼにより分解可能であり、そしてこのペプチド結合は酵素攻撃をうけやすい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2004534086.tif 000018
のポリサッカライド抱合体の形でアミノ糖を含む水溶性抗生物質誘導体であり、ここで、
Ｂは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、可溶性アミロース、ヒドロキシエチル化および／またはヒドロキシプロピル化形の可溶性アミロース、可溶性アミロペクチン、およびヒドロキシエチル化および／またはヒドロキシプロピル化形の可溶性アミロペクチンからなる群から選択される１，４結合で結合されたポリマーであり、
Ｒ2は、
【化２】
2004534086.tif 000019
であり、
Ｒ3、Ｒ4は、互に独立に
【化３】
2004534086.tif 000020
であり、ここで、条件としては、
ＢはＲ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈならば、アミロースまたはアミロペクチンであり、
ＢはＲ2、Ｒ3、Ｒ4＝（ＣＨ2）2−ＯＨならば、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチル化アミロペクチンまたはヒドロキシエチル化アミロースであり、
Ｂは、
【化４】
2004534086.tif 000021
ならば、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシプロピル化アミロペクチンまたはヒドロキシプロピル化アミロースであり、
Ａは、Ｒ1＝ＨまたはＯＨで
【化５】
2004534086.tif 000022
であるか、または
【化６】
2004534086.tif 000023
であり、そして
Ｚは、
【化７】
2004534086.tif 000024
であり、
ここで、条件として、
Ｚが、
【化８】
2004534086.tif 000025
であるならば、
Ａは、
【化９】
2004534086.tif 000026
であり、そして
Ｚが、
【化１０】
2004534086.tif 000027
ならば、
Ａは、Ｒ1＝ＨまたはＯＨで、
【化１１】
2004534086.tif 000028
であり、前記抱合体のポリサッカライド部分は、前記抗生物質のアミノ糖のＣ3でアミノ基と結合してペプチド結合を形成するものである。
【請求項２】
抗生物質とポリサッカライド部分のモル比が、１：１であることを特徴とする請求項１に記載の抗生物質誘導体。
【請求項３】
ポリサッカライド部分が、ヒドロキシエチルデンプンからなることを特徴とする請求項１および２に記載の抗生物質誘導体。
【請求項４】
ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量が２０００と２・１０6ダルトンの範囲内にあることを特徴とする請求項１ないし３に記載の抗生物質誘導体。
【請求項５】
ヒドロキシエチルデンプンが少なくとも１５の平均重合度を示すことを特徴とする請求項３ないし４に記載の抗生物質誘導体。
【請求項６】
ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量が＞７００００ダルトンであることを特徴とする請求項３ないし５に記載の抗生物質誘導体。
【請求項７】
前記ヒドロキシエチルデンプンが規格１３０／と０．１ないし０．８の範囲の置換度ＭＳを示すことを特徴とする請求項３ないし６に記載の抗生物質誘導体。
【請求項８】
ヒドロキシエチルデンプンが０．３ないし０．５の範囲の置換度ＭＳを示すことを特徴とする請求項７に記載の抗生物質誘導体。
【請求項９】
ヒドロキシエチルデンプンが２ないし１２の範囲のＣ2／Ｃ6置換比を示すことを特徴とする請求項３ないし８のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１０】
ヒドロキシエチルデンプンが５ないし１１の範囲のＣ2／Ｃ6置換比を示すことを特徴とする請求項９に記載の抗生物質誘導体。
【請求項１１】
ヒドロキシエチルデンプンがα−１，４−グリコシド結合で非分岐であることを特徴とする請求項３ないし１０のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１２】
ヒドロキシエチルデンプンがα−１，４−グリコシド結合とα−１，６−グリコシド結合により分岐していることを特徴とする請求項３ないし１０のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１３】
抗生物質がアンホテリシンＢであることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１４】
抗生物質がダウノルビシンであることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１５】
抗生物質がドクソルビシンであることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれかに記載の抗生物質誘導体。
【請求項１６】
ポリサッカライドをアルカリ性水溶液中で還元性末端で酸化してラクトン環を形成し、得られる生成物をアミノ糖を含む抗生物質と有機溶媒中で反応させて、抗生物質−ポリサッカライド抱合体を形成することを特徴とする請求項１ないし１５のいずれかに記載の抗生物質−ポリサッカライド抱合体の製造方法。
【請求項１７】
ポリサッカライドの酸化がＩ2により還元性末端で起こることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗生物質への酸化されたポリサッカライドのカップリングが有機溶媒中で起こることを特徴とする請求項１６および１７に記載の方法。
【請求項１９】
ジメチルスルホキシドを有機溶媒として使用することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
デンプンまたはデンプン誘導体をポリサッカライドとして使用することを特徴とする請求項１６ないし１９の一つに記載の方法。
【請求項２１】
ヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２０００と２・１０6ダルトンの間の範囲の平均分子量のヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１５の平均重合度のヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１および２２に記載の方法。
【請求項２４】
＞７００００ダルトンの平均分子量のヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし２３に記載の方法。
【請求項２５】
規格１３０／と０．１ないし０．８の範囲の置換度ＭＳのヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし２４に記載の方法。
【請求項２６】
０．３ないし０．５の範囲の置換度ＭＳのヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
２ないし１２の範囲のＣ2／Ｃ6置換比のヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
５ないし１１の範囲のＣ2／Ｃ6置換比のヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
α−１，４−グリコシド結合の非分岐ヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
α−１，４−グリコシド結合とα−１，６−グリコシド結合とを有する分岐ヒドロキシエチルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ヒドロキシエチルデンプンの代わりにヒドロキシプロピルデンプンを使用することを特徴とする請求項２１ないし３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
アンホテリシンＢを抗生物質として使用することを特徴とする請求項１６ないし３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
アンホテリシンＢを抗生物質として使用することを特徴とする請求項１６ないし３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ダウノルビシンを抗生物質として使用することを特徴とする請求項１６ないし３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ドクソルビシンを抗生物質として使用することを特徴とする請求項１６ないし３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
真菌感染の全身的治療用のアンホテリシンＢ抱合体の製造へのデンプン誘導体の使用。
【請求項３７】
デンプン誘導体がヒドロキシエチルデンプンであることを特徴とする請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
デンプン誘導体がヒドロキシプロピルデンプンであることを特徴とする請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
がん治療で使用するためのダウノルビシン抱合体の製造へのデンプン誘導体の使用。
【請求項４０】
デンプン誘導体がヒドロキシエチルデンプンであることを特徴とする請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
デンプン誘導体がヒドロキシプロピルデンプンであることを特徴とする請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
がん治療で使用するためのドクソルビシン抱合体の製造へのデンプン誘導体の使用。
【請求項４３】
デンプン誘導体がヒドロキシエチルデンプンであることを特徴とする請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
デンプン誘導体がヒドロキシプロピルデンプンであることを特徴とする請求項４５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプンまたはデンプン誘導体、特にヒドロキシエチルデンプンとヒドロキシプロピルデンプンをベースとするポリサッカライドとの抱合体の形でアミノ糖を含む抗生物質の経口あるいは非経口で投与できる水溶性製剤、及びこれらを高収率で、高い費用効果で製造する方法に関する。ヒドロキシエチルデンプンがポリサッカライドとして特に好ましい。アミノ酸部分のＣ3位置にアミノ基を含む、アンホテリシンＢ、ダウノルビシンおよびドクソルビシンが、アミノ糖を含む抗生物質として特に考えられる。
【背景技術】
【０００２】
アミノ糖を含有する抗生物質は、アンホテリシンＢ、ダウノルビシンおよびドクソルビシンが治療に広く使用され、時には選り抜きの薬剤の代表例となるものであるが、ある場合には深刻な副作用を示す。アンホテリシンＢは、主に非経口で投与され、そしてダウノルビシンとドクソルビシンは必ず静脈から投与されなければならない。
【０００３】
アンホテリシンＢは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓから単離されるポリエン抗生物質である。化学的には、これは、アミノ糖Ｄ−マイコサミンがＯ−グリコシド結合により結合している３８員のラクトン環内に全トランス立体配置の７個の共役二重結合を持つマクロ環状ラクトン（マクロライド）である。アンホテリシンＢは両性であり、真菌の細胞質膜中に存在するステロールと錯体を形成することができる親油性および親水性の領域を分子内に有し、それにより細胞透過性が阻害される。バクテリアの膜は、ステロールを含有していないので、アンホテリシンＢの抗生物質作用は真菌に選択的に向けられる。
【０００４】
【化１】
2004534086.tif 000002
【０００５】
ヒトに対して病原性である実質的にすべての真菌を包含するアンホテリシンＢの作用の広範な範囲（スペクトル）によって、これはヒトの真菌感染の系統的治療のための選り抜きの薬剤となる。特に、ＨＩＶまたはがんの患者などの免疫系に損傷を受けた患者では、関連する侵襲性真菌感染の治療が近年急激に増加している。
【０００６】
他方、アンホテリシンＢの使用は、時々かなり強い副作用と関連する。全身性真菌症と器官真菌症では、アンホテリシンＢは、通常、０．５ないし０．７ｍｇ／ｋｇ体重の日用量で静脈から投与される。しかしながら、アンホテリシンＢの耐容性は患者ごとに変わるので、この用量は個別に調整あるいは適合させなければならない。加えて、免疫系に損傷を受けた患者は、概ね、通常よりも高い用量、例えば一日１ｍｇ／ｋｇ体重を必要とするが、むずかしい経過の場合、耐えられるなら、これを１．５ｍｇ／ｋｇまで増加させることができる。これに関して、非経口投与の期間は数週間から数ヶ月まで延長してもよい。
【０００７】
非経口治療の過程では、例えば、発熱、嘔吐および震えの発作などの点滴注入に典型的な反応が普通起こるが、これは、通常対症療法を行えば点滴注入治療の中断は必要ない。しかしながら、しばしば起こる肝炎および特に腎臓の機能不全は、更に深刻である。このように、例えば、治療の始めには、糸球体濾過率は常にほぼ４０％低下する。治療を受けた者の大数は、糸球体濾過率は治療期間の間低下したままである。従って、血清中のクレアチニンと血液中の尿素は上昇する。時には、治療期間以降でも不可逆的な障害が観察される。２ないし３週間の治療の後、しばしば貧血も起こり、ヘマトクリットレベルが、２５ないし３０％になる可能性がある。しかしながら、この治療の終った後では、血球算定の変化は、概ね充分に再び元に戻る。
【０００８】
その毒性と副作用によって、アンホテリシンＢは、それゆえ、生命を脅かす環境においてのみ投与されるべきである。他方、これは、免疫系の擾乱から起こる真菌症における−例えば、ＡＩＤＳにおける、あるいは臓器移植後における−唯一の有効な薬剤の代表例である。
【０００９】
この分子内の親水性ドメインにも拘わらず、アンホテリシンは、全体としては著しい疎水性を呈し、そのため、生理学的なｐＨ範囲で水に実質的に不溶性である。有機溶媒中でも、アンホテリシンは、僅かに可溶性であるに過ぎない。結果として、現行の市販の製剤は、比較的複雑な構造の剤形の代表例であり、これは更なる難点となっている。デオキシコール酸Ｎａなどの好適な溶解剤により、水中の溶解性を増加することができる。このように、例えば、点滴注入用に意図された（ドイツで「アンホテリシンＢ」の商品名で入手できる）ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢにより製造されている原薬製剤は乾燥物質として存在するが、これは、水中で再構成されなければならず、そしてアンホテリシンＢとデオキシコール酸Ｎａの水中のミセル分散液の形をとる。即時投与できる点滴注入溶液を得るためには、このようにして得られた倍液を、例えば５％グルコ−ス溶液などの電解質のないキャリヤー溶液によってのみ所望の最終濃度まで希釈して得ることができる。
【００１０】
この製剤も極めて限定された治療係数を示す。すなわち、有効量と毒性を示す用量の間の窓は極めて狭い。加えて、アンホテリシンＢの作用の比較的広い範囲（スペクトル）にも拘わらず、この活性物質が真菌感染の部位に到達せず、あるいは不充分な濃度でのみでしか到達せず、アンホテリシンＢはそこでその特性的な抗真菌性作用を示すことができないか、あるいは不充分にしか作用を示すことができない。そのために、この製剤はある治療パターンにおいては、あまり有効でない。
【００１１】
原薬製剤のこれらの難点を克服するために、脂質製剤、例えばアンホテリシンＢを含む脂質錯体、アンホテリシンＢを含む硫酸コレステリルのコロイド分散液およびリポソームで包装されたアンホテリシンＢを代表とする一連のアンホテリシンＢ製剤が開発された。これらの剤形は、すべて大きな治療係数と高い許容性、特に慣用のアンホテリシンＢデオキシコール酸塩製剤に比較して低腎毒性−そのため高用量での投与が可能となる−を示すが、高用量で上記の副作用を完全に回避することはできない。
【００１２】
しかしながら、アンホテリシンＢのこのような脂質製剤の深刻な難点は、極めて高い製造コストとそれに伴う市価に在る。加えて、これらの複雑な剤形を手の込んだ方法で再構成して、即時投与できる形にしなければならない。特に、これらの難点により、アンホテリシンＢの脂質製剤で治療域が改善されたのにも拘わらず、市場での幅広い受け入れが実現できなかった。
【００１３】
注射の目的にアンホテリシンＢを水溶性の形に変換する更なる方法として、アンホテリシンＢ−アラビノガラクタン抱合体の形成が文献（非特許文献１）に記述されている。アラビノガラクタンは唐松から得られる水溶性ポリサッカライドであり、１：６の割合のアラビノースおよびガラクトース単位からなる。アラビノガラクタンに対するアンホテリシンＢの結合は４段階で起こる。まず第１に、アラビノガラクタンを過ヨウ素塩の酸化にかけて環開裂して、糖単位の隣接ヒドロキシル基をジアルデヒドに変換する。アニオン交換体カラムにより反応生成物を精製した後、イミン（シッフ塩基）を形成しながらアンホテリシンＢのマイコサミンのアミノ基をアルデヒド基に結合し、そして最後に、Ｎａ−ボロハイドライドでの還元により、イミン基をアミン基に、そして未反応のアルデヒド基をヒドロキシル基に変換する。
【００１４】
このカップリング反応をｐＨ１１で行う。このｐＨ値は、一方では形成される抱合体の収率と、他方ではこの抱合体の毒性の間の折衷を表わす。ｐＨ１０未満では、アンホテリシンＢは水に不溶性であり、そして収率が低い。ｐＨ１２以上では、アンホテリシンＢは比較的水溶性であり、これにより高収率が可能になるが、得られる生成物は毒性である。このＮａ−ボロハイドライド還元の最終段階を省略した場合も、毒性が観察された。
【００１５】
抗生物質ダウノルビシンおよびデオキシルビシンは、アントラサイクリンの群に属し、ヒドロキシル基のところのみ異なる。これらは、水に可溶性である。ドクソルビシンは、菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓの培養から、ダウノマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓまたはｃｏｅｒｕｌｅｏｒｕｂｉｄｕｓから得られる。
【００１６】
【化２】
2004534086.tif 000003
【００１７】
これらのテトラサイクリン基によって、ダウノルビシンとドクソルビシンは、かなり長期間変わらない極めて安定なＤＮＡインターカレーション錯体を形成して、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成を阻害する能力がある。加えて、これらは、チトクロームＰ−４５０レダクターゼとＮＡＤＰＨによる細胞内代謝と関連して、更なるラジカル反応（スーパーオキシドアニオンとヒドロキシラジカル）を惹き起こすセミキノンラジカルを形成する。これにより、これらの抗生物質は著しい細胞増殖抑制作用を獲得し、結果としてがん治療で細胞増殖抑制剤として使用される。
【００１８】
これらの抗生物質は、経口投与されると、不適切に吸収されるだけであるので、１０ないし１５分間の短い点滴注入で静脈から（厳密に）投与されなければならない。これらの体内分配は迅速に進み、最も高い濃度が心臓、肺、脾臓および腎臓で見出される。
【００１９】
代謝による反応性ラジカルの形成に関連するこれらの迅速な体内分配が、結果として、特に心臓に有害な影響を及ぼす著しい毒性の副作用の原因の一つであるように思われる。
【００２０】
ドクソルビシンとダウノルビシンは、両方とも著しく心毒性である。特に、用量依存性の累積的な器官毒性の代表例である遅発型の心毒性は、通例、不可逆的であり、時には生命を脅かす。成人で５５０ｍｇ／ｍ3体表面積である最大の累積全用量を超えると、アントラサイクリン誘起の心筋症の出現率が、急速に増加する。それゆえ、全用量が５５０ｍｇ／ｍ3体表面積以上では、重度の心臓機能不全症の発症に対してほぼ５％のリスクが存在する。この累積全用量に達したならば、治療を中断しなければならない。
【非特許文献１】
アンティ  ミクロバイアル  アンド  ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、４３巻  Ｎｏ．８、１９９９年、１９７５〜１９８１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、特定の毒性副作用が低減し、より均一で、制御された体内分配を保証し、そのため高用量が可能となるが、それにも拘わらず使用が容易であるアミノ糖含有抗生物質剤形を提供することである。本発明の更なる目的は、この剤形を高収率で製造するための費用効果の高い方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
驚くべきことには、デンプンまたはデンプン誘導体のこのような抗生物質との抱合体により、これらの目的を達成することができることが見出された。本発明による剤形は、
一般式（Ｉ）
【００２３】
【化３】
2004534086.tif 000004
のポリサッカライド抱合体の形でアミノ糖を含む水溶性抗生物質誘導体であり、
【００２４】
ここで、Ｂは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、可溶性アミロース、ヒドロキシエチル化および／またはヒドロキシプロピル化形の可溶性アミロース、可溶性アミロペクチン、およびヒドロキシエチル化および／またはヒドロキシプロピル化形の可溶性アミロペクチンからなる群から選択される１，４結合で結合されたポリマーであり、
【００２５】
Ｒ2は、
【化４】
2004534086.tif 000005
であり、
【００２６】
Ｒ3、Ｒ4は、互に独立に
【化５】
2004534086.tif 000006
であり、
【００２７】
ここで、条件としては、
Ｂが、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈならば、アミロースまたはアミロペクチンであり、
Ｂが、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4＝（ＣＨ2）2−ＯＨならば、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシエチル化アミロペクチンまたはヒドロキシエチル化アミロースであり、
【００２８】
Ｂが、
【化６】
2004534086.tif 000007
ならば、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシプロピル化アミロペクチンまたはヒドロキシプロピル化アミロースであり、
【００２９】
Ａは、Ｒ1＝ＨまたはＯＨで
【化７】
2004534086.tif 000008
であるか、または
【００３０】
【化８】
2004534086.tif 000009
であり、そして
【００３１】
Ｚは、
【化９】
2004534086.tif 000010
であり、
【００３２】
ここで、条件として、
Ｚが、
【化１０】
2004534086.tif 000011
であるならば、
【００３３】
Ａは、
【化１１】
2004534086.tif 000012
であり、そして
【００３４】
Ｚが、
【化１２】
2004534086.tif 000013
であるならば、
【００３５】
Ａは、Ｒ1＝ＨまたはＯＨで、
【化１３】
2004534086.tif 000014
であり、抱合体のポリサッカライド部分は、抗生物質のアミノ糖のＣ3でアミノ基とペプチド結合を形成して結合するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
デンプンまたはデンプン誘導体として、アミロース（α−１，４−グリコシド結合を有するのみで非分岐）および／またはアミロペクチン（加えて、α−１，６−グリコシド結合を有し分岐）と、特にヒドロキシアルキル化デンプンが考えられる。アミロースまたはアミロペクチンを使用する場合には、市販の「可溶性」デンプンを使用する。後者はヒドロキシエチル化およびヒドロキシプロピル化の形でも存在している。
【００３７】
ヒドロキシアルキル化デンプンの本発明による好ましい使用において、ヒドロキシエチルデンプンとヒドロキシプロピルデンプンは、平均分子量（重量平均Ｍｗ）２０００と２・１０6ダルトンの間の範囲内にあってもよい。しかしながら、平均重合度は、少なくとも１５であり、そして好ましい態様においては、ほぼ３０００（ほぼ５・１０5の平均分子量に相当）まで拡大する。ヒドロキシエチルデンプンの使用が特に好ましい。
ヒドロキシエチルデンプンに関連して、特に好ましい態様として下記に述べる記述は、ヒドロキシプロピルデンプンにも類似であてはまる。
【００３８】
本発明による抗生物質−ＨＥＳ抱合体においては、このＨＥＳの分子量は、好ましくはＨＥＳに対する腎臓のしきい値以上、すなわち、７００００ダルトン以上でなければならない。規格１３０／１３００００ダルトン平均分子量のＨＥＳが特に好ましい。置換度ＭＳは好ましくは０．１〜０．８の範囲内にある。好ましい態様においては、置換度は０．３〜０．５の範囲内にある。好ましいＣ2／Ｃ6比は、２〜１２の範囲内、特に好ましい態様においては５〜１１の範囲内にある。この関連で、ＨＥＳは主としてα−１，４−グリコシド結合のみで非分岐の形で、およびα−１，４−グリコシド結合とα−１，６−グリコシド結合の両方による分岐の形の両方で存在してもよい。
【００３９】
本発明による抱合体においては、ポリサッカライドの結合は、この方法では、末端ポリサッカライド分子の遊離の還元性アルデヒド基により抗生物質のアミノ糖のアミノ基に対して行われ、好ましくは、Ｉ2によりアルドン酸基に酸化され、このアルドン酸基は末端糖単位の遊離ヒドロキシル基と、好ましくは末端糖単位のＣ4原子でラクトン環を形成し、さらに、このラクトン環は抗生物質のアミノ糖のアミノ基とペプチド結合を形成することができる。過ヨウ素塩の酸化から生じるアラビノガラクタンのアルデヒド基とアミノ糖のアノ基からのシッフ塩基の形成と異なり、ＨＥＳの還元性末端での酸化生成物の本発明によるカップリング反応を有機溶媒中、例えば抗生物質アンホテリシンＢが可溶性である、例えばＤＭＳＯ中でアミノ糖（例えば、アンホテリシンＢの場合マイコサミン）のアミノ基とのあいだで高収率で行うことができる。
【００４０】
【化１４】
2004534086.tif 000015
【００４１】
このカップリング反応は普通以上に選択的であることが判明し、そして抗生物質−デンプン抱合体を高収率で生成したが、これは、過ヨウ素塩の酸化の場合と異なり、抗生物質とポリサッカライドの間のモル比が１：１となった。
【００４２】
驚くべきことには、得られた抱合体は、経口によっても投与することができるほど非毒性であることが判明した。このポリサッカライドキャリア、特にＨＥＳの抗生物質へのカップリングは、本質的に水不溶性のアンホテリシンＢの場合においても、全体として適度な水溶性を有する抱合体を生じる。このことは、所望の投与可能な最終濃度への抱合体の溶解または希釈を電解質含有溶媒あるいは混合物（例えば、等張性食塩溶液およびグルコ−ス溶液の混合物）によっても行うことができることを意味する。さらに、得られる抱合体は、毒性ではないので、高用量、例えばアンホテリシンＢ抱合体の日用量をアンホテリシンＢ分１５ｍｇまで投与することができる。
【００４３】
ヒドロキシエチルデンプンを血漿増量剤として高用量で静脈から投与することができるので、ＨＥＳとアンホテリシンＢのカップリングに関連して、ＨＥＳの未反応フラクションは生理学的に安全であり、それゆえ、反応生成物から特異的に分離する必要がなく、これは、合成においてかなりの経済的なメリットとなる。アンホテリシンＢの場合、形成される抱合体を更に低毒性とするのに最終の水和を必要としない。さらに、驚くべきことには、非結合ヒドロキシエチルデンプンは、本来的にアンホテリシンＢに可溶化効果を及ぼし、その結果、過剰のＨＥＳにより抗真菌活性物質の更なる安定化を達成できることが判明した。
【００４４】
本発明による抗生物質−ＨＥＳ抱合体の更なる利点は、このポリサッカライド部分を血清α−アミラーゼにより分解することができるという事実に存する。この分解は、血漿増量剤として使用されるＨＥＳの薬物動力学についての関連文献において詳細に記述されている。加えて、インビボでのポリサッカライド部分と抗生物質の間のペプチド結合は、原理的に酵素攻撃を受けやすい。
【００４５】
ありうる真菌感染病原体のスペクトルから指標微生物として既知のＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについての研究から示されるように、本発明によるアンホテリシンＢの抱合体は、この脂質製剤に匹敵する活性を示した。ヒツジ赤血球についての溶血試験で、アンホテリシンＢ−ＨＥＳ抱合体のインビトロ毒性は、市販のアンホテリシンＢデオキシコール酸塩製剤におけるよりもかなり低いということを示すことができた。
【００４６】
使用されるＨＥＳの分子量、置換度、置換パターンおよび分岐度の適切な選択により、得られる抱合体の薬物動力学的性質を特定の患者のニーズに合わせて実質的に設計することができるという事実に本発明による抗生物質−ＨＥＳ抱合体の決定的な利点を見ることができる。
【００４７】
次の実施例で、好ましい抗生物質−ＨＥＳ抱合体の製造方法と溶血作用を更に詳細に明らかにする。
【実施例１】
【００４８】
ＨＥＳ１３０ｋＤの酸化：
１０ｇのＨＥＳ（１３０ｋＤ）を反応容器に入れ、そしてできるだけ少容量の水中に溶解させる。２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液とほぼ３ｍｌの０．１ＮＮａＯＨ溶液を攪拌（マグネチックスターラー）しながらこの溶液に添加する。Ｉ2を示す色が消えるまで、この混合物を攪拌する。合計１０ｍ１の０．１Ｎヨウ素溶液と２０ｍｌの０．１ＮＮａＯＨ溶液を添加するまで、ヨウ素溶液および／またはＮａＯＨ溶液の添加を数回繰り返す。次に、得られた溶液をＨ+イオン交換体カラム（アンバーライトＩＲ１２０）に添加し、引き続いて透析管中で４−６ｋＤの除去限界により蒸留水に対して２０時間透析する。この透析生成物を凍結乾燥し、そして酸化度をＳＯＭＯＧＹＩの方法により求める。
【００４９】
酸化度の定量：
形成された酸化ＨＥＳ（ｏｘ−ＨＥＳ）を求めるために、ＳＯＭＯＧＹＩの方法を採用した（Ｍｅｔｈ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｉ、３８４−３８６、１９６２年）。この方法は、Ｃｕ2+のＣｕ+への還元による遊離アルデヒド基の定量に基づいている。ヨウ化物とヨウ素酸塩から形成されるヨウ素により、Ｃｕ+を再度Ｃｕ2+に酸化する。次に、過剰のヨウ素をチオ硫酸塩の平均により滴定する。
【実施例２】
【００５０】
アンホテリシンＢ−ＨＥＳ抱合体の合成：
反応容器中で、６５０ｍｇ（１．５・１０-5モル）の乾燥したｏｘ−ＨＥＳ（１３０ｋＤ、酸化度ほぼ１００％）と２．８ｍｇ（３．０・１０-6モル）のアンホテリシンＢを攪拌（マグネチックスターラー）しながら、ほぼ４ｍｌの無水ＤＭＳＯにＮ2雰囲気中室温で溶解する。軽く除去しながら、この混合物を７０℃で２４時間反応させる。１０容量のＨ2Ｏの添加の後、この水を４回交換しながら４℃で４８時間、Ｈ2Ｏに対して透析することにより、この反応生成物の処理を軽く除去しながら行う。引き続いて凍結乾燥した生成物は僅かに黄色の粉末であった。
【００５１】
このカップリング方法を更に３バッチについて繰り返し、＞９０％の再現性のある収率をこのカップリング反応について得た。結果を表１に示す。（この表の最後の欄に示した収量は、カップリング生成物プラス未反応ＨＥＳ基準のものである）。
【００５２】
【表１】
2004534086.tif 000016
【００５３】
得られたアンホテリシンＢ−ＨＥＳ抱合体をＵＶスペクトル（０．５ｇ／５ｍｌ蒸留Ｈ2Ｏ）により特性化を行った。この抱合体は、アンホテリシンＢのポリマー形あるいはミセル形の相互作用に典型的な吸収帯を３００−４００ｎｍの範囲にわたって示した。水に実質的に不溶性である遊離アンホテリシンＢとは異なり、得られたアンホテリシン−ＨＥＳ抱合体は、＞０．１ｇ／５ｍｌＨ2Ｏの水溶解性を示した。
【００５４】
ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィと組み合わせた小角レーザー光散乱）によって、次のＧＰＣ特性を求めた。
重量平均分子量Ｍｗ：１０２，７００
分子量の数平均値：３６，０５０
ピークフラクション（１０％）：２４，０５０
ベースフラクション（９０％）：１３，８００
これらの特性は使用したＨＥＳの特性と本質的にマッチした。
【実施例３】
【００５５】
アンホテリシンＢ−ＨＥＳ抱合体の溶血比較試験：
活性物質が８μｇ／ｍｌの濃度以上で溶血性であるように意図された（Ｒ．Ｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年、１９７５−１９８１）市販のアンホテリシンＢ−デオキシコール酸塩製剤（「アンホテリシンＢ」Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ製、バッチ表示：Ａ０６８）と比較して、本発明によるアンホＨＥＳ製剤溶血作用を求めた。
【００５６】
本発明による製剤用の倍液：１１．６１ｇのアンホＨＥＳ（５０ｍｇのアンホテリシンＢの重量部に相当）を５０ｍｌの５％グルコ−ス溶液（バッチ表示：９２３３Ａ４，Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ製）に溶解した。このように作製した倍液の活性物質含量は１ｍｌ当たり１ｍｇアンホテリシンＢであった。この倍液から、３つの希釈液を表２に従って作製し、その溶血作用も調べた。
【００５７】
市販の参照製剤（アンホテリシンＢ−デオキシコール酸塩製剤）：５０ｍｇの瓶を１０ｍｌのＡ．ａ．ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉａ（バッチ表示：０５１４Ａ６３，Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ製）により溶解し、５％グルコ−ス溶液中で０．１２ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢまで希釈した。
【００５８】
赤血球懸濁液の作製：新しく採取したヒトの血液をほぼ５倍容積の無菌の０．９％ＮａＣｌ溶液（バッチ表示：９０５５Ａ６４，Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ製）により希釈し、２０００の相対遠心加速度で５分間遠心分離した。次に、この上澄み溶液を抜き出し、そして沈降赤血球を同じ方法で２回処理した。
【００５９】
このように洗浄した赤血球をＮｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバーで計数し、そして必要ならば、無菌の０．９％ＮａＣｌ溶液により１ｍｌ当たりほぼ５・１０8赤血球の最終濃度まで再度希釈した。この懸濁液は、ＤＩＮ標準に従えば室温で６時間まで使用可能である。
【００６０】
溶血比較試験：５ｍｌの試験対象溶液を１ｍｌの上記の赤血球懸濁液と混合し、清浄な遠心分離管に移し、そして水浴中３７±１℃で２０分間インキューベーションした。次に、遠心分離を２０００の相対遠心加速度で５分間行った。
【００６１】
この上澄み液の吸光度を測定した。各５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液と５％グルコ−ス溶液を１ｍｌのこの赤血球懸濁液と混合し、同様に３７±１℃で２０分間インキューベーションし、上記のように遠心分離し、ネガチブコントロールとして使用した。
【００６２】
溶血試験のために、１０ｍｍの厚さのキュベットを用いて、各上澄みの吸光度を光度計により、ネガチブコントロールに対して５７６の波長で測定した。赤血球懸濁液のない溶液の比較のために、溶液を異なる色に着色して、吸光度を測定した。
【００６３】
種々の試験バッチの結果を表２に要約する。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
表２に示すように、試験した市販アンホテリシンＢ−デオキシコール酸塩製剤は、上記の試験条件下で試験バッチ中の僅か０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で強い溶血作用を示す。上澄みは、５７６ｎｍで２．２７１の吸光度を有し、強い赤色であった。
【００６６】
比較として、本発明によるアンホＨＥＳ製剤については、１ｍｌ当たり０．２ｍｇアンホテリシンＢの濃度まで溶血作用は観察できなかった。ネガチブコントロールと比較して０．４ｍｇ／ｍｌの濃度ではじめて若干赤色の着色が、この試験バッチの上澄みで検出でき、これは吸光度値でも認識できた。従って、試験バッチでは、このアンホテリシンＢ濃度で若干の溶血活性が存在する。この試験製剤による強い溶血活性が０．８３ｍｇ／ｍｌの濃度で検出でき、ここで、上澄みは赤に強く着色していた。加えて、沈降期間時の高粘度により、ペレットで沈降することができない僅かな破壊されていない赤血球が上澄み中でなお顕微鏡的に検出可能であった。
【実施例４】
【００６７】
ダウノルビシン−ＨＥＳ抱合体の合成：
６５０ｍｇ（１．５・１０-5モル）の乾燥したｏｘ−ＨＥＳ（１３０ｋＤ、酸化度ほぼ１００％）と０．８ｍｇ（３．０・１０-6モル）のダウノルビシンを反応容器中で実施例２と同じ製造条件下で反応させ、実施例２と同じように更に処理した。ここでも、また、ほぼ７２％の再現性のある収率を得た。
【実施例５】
【００６８】
ドクソルビシン−ＨＥＳ抱合体の合成：
６５０ｍｇ（１．５・１０-5モル）の乾燥したｏｘ−ＨＥＳ（１３０ｋＤ、酸化度ほぼ１００％）と０．８ｍｇ（３．０・１０-6モル）のドクソルビシンを反応容器中で実施例２と同じ製造条件下で反応させ、実施例２と同じように更に処理した。得られた収率は、
ほぼ７０％であった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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