(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質受容体としてのα（２）マクログロブリン（「α２Ｍ」）受容体の使用、ＨＳＰに結合されたα２Ｍ受容体を発現する細胞、ならびに、α２Ｍ受容体−ＨＳＰ複合体と結合する抗体および他の分子に関する。さらに、本発明は、α２Ｍ受容体と相互作用しかつα２Ｍ受容体とそのリガンド（ＨＳＰなど）との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびに、免疫疾患、増殖性疾患および感染症を診断し治療するためのα２Ｍ受容体配列を含む組成物の使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 試験化合物を熱ショックタンパク質およびα（２）マクログロブリン受容体と接触させること、
（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体の活性または発現のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該試験化合物の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体の活性のレベルと異なると、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項２】
同定される化合物が熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるアンタゴニストであり、さらに下記ステップ：
（ｃ） 前記レベルが熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるか否かを判定すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物がα（２）マクログロブリン受容体に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
試験化合物がα（２）マクログロブリンに特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試験化合物が熱ショックタンパク質に特異的な抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物が小さい分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドがα（２）マクログロブリン受容体（配列番号７）の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドがα（２）マクログロブリン（配列番号４）の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが熱ショックタンパク質配列の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を増強するアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスが、自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染症、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、あるいは骨粗鬆症に影響を及ぼす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 試験化合物を、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞とに接触させること、
（ｂ） 該細胞におけるα（２）マクログロブリン受容体の活性または発現のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該試験化合物の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体の活性のレベルと異なると、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項１４】
測定されるα（２）マクログロブリン受容体の活性が熱ショックタンパク質と相互作用する能力である、請求項１または１３に記載の方法。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体の活性が該抗原ペプチドを提示する能力である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
熱ショックタンパク質が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体の活性が該抗原ペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
熱ショックタンパク質とα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 熱ショックタンパク質を、α（２）マクログロブリン受容体またはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体と、試験化合物の存在下で接触させること、
（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体またはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体に結合された熱ショックタンパク質の量を測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定された熱ショックタンパク質の結合量が、該試験化合物の非存在下での熱ショックタンパク質の結合量と異なると、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項１８】
固相表面がマイクロタイターディッシュである、請求項６５に記載の方法。
【請求項１９】
熱ショックタンパク質の結合量が前記細胞を熱ショックタンパク質特異的抗体と接触させることにより測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
熱ショックタンパク質が標識されており、熱ショックタンパク質の結合量が該標識を検出することで測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
熱ショックタンパク質が蛍光標識で標識されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 試験化合物を、α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞と、本質的に抗原分子と非共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複合体との混合物に、α（２）マクログロブリン受容体介在エンドサイトーシスを起こさせる条件下で添加すること、
（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたレベルが該試験化合物の非存在下での前記刺激のレベルと異なると、α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項２３】
哺乳動物における熱ショックタンパク質−α（２）マクログロブリン受容体関連障害を検出する方法であって、患者サンプル中のＨＳＰ−α（２）マクログロブリン受容体介在プロセスからの活性のレベルを測定することを含み、その結果として、測定されたレベルが臨床的に正常な個体に見出せる該レベルと異なると、熱ショックタンパク質−α（２）マクログロブリン受容体関連障害が検出される、上記方法。
【請求項２４】
患者由来のサンプルを、α（２）マクログロブリン受容体に特異的な抗体と、該抗体による免疫特異的結合が起こる条件下で接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者由来のサンプルを、熱ショックタンパク質に特異的な抗体と、該抗体による免疫特異的結合が起こる条件下で接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
患者由来のサンプルを、ＨＳＰ−α２Ｍ複合体に特異的な抗体と、該抗体による免疫特異的結合が起こる条件下で接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物に、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用をモジュレートする精製化合物を投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項２８】
前記化合物が熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を増強するアゴニストである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
自己免疫疾患の治療が必要な哺乳動物に、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げる精製化合物を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項３０】
前記化合物が熱ショックタンパク質とα２Ｍ受容体との相互作用を妨げるアンタゴニストである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンタゴニストがα（２）マクログロブリン受容体に特異的な抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アンタゴニストが熱ショックタンパク質に特異的な抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが小さい分子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記アンタゴニストがペプチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドがα（２）マクログロブリン受容体（配列番号１）の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドがα（２）マクログロブリン（配列番号３）の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドが熱ショックタンパク質配列の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患の治療が必要な哺乳動物に、機能性α（２）マクログロブリン受容体による熱ショックタンパク質の取り込みを低下させるα（２）マクログロブリン受容体を発現する組換え細胞を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項３９】
癌細胞または感染細胞を、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換することを含む、癌細胞または感染細胞の免疫能を高める方法。
【請求項４０】
癌細胞または感染細胞の免疫能を高める方法であって、下記ステップ：
（ａ） 該細胞を、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換すること、
（ｂ） 該細胞を治療が必要な個体に投与すること、
を含み、その結果として免疫応答が高められることを特徴とする、上記方法。
【請求項４１】
（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組換え癌細胞。
【請求項４２】
（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組換え感染細胞。
【請求項４３】
ヒト細胞である、請求項４１または４２に記載の組換え細胞。
【請求項４４】
１つ以上の容器に、（ａ）抗α２Ｍ受容体抗体またはα２Ｍ受容体核酸とハイブリダイズすることができる核酸プローブ、（ｂ）精製された熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞、および（ｃ）熱ショックタンパク質−α（２）マクログロブリン受容体関連障害を検出するための使用説明書、を含有するキット。
【請求項４５】
抗体または核酸プローブが検出可能なマーカーで標識されている、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
標識されたマクログロブリン受容体ポリペプチドをさらに含有する、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
１つ以上の容器に、（ａ）精製された熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞、および（ｂ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチド、α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードする核酸、またはα（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドを発現する細胞、を含有するキット。
【請求項４８】
α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチド、α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードする核酸、またはα（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドを発現する細胞が精製されたものである、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
自己免疫疾患、感染症、または増殖性疾患を治療するための使用説明書をさらに含有する、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
熱ショックタンパク質と結合することができるα２Ｍ受容体断片を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 熱ショックタンパク質またはそのペプチド結合性断片を、１つ以上のα（２）マクログロブリン受容体断片と接触させること、
（ｂ） 熱ショックタンパク質またはそのペプチド結合性断片と特異的に結合するα２Ｍ受容体断片を同定すること、
を含む、上記方法。
【請求項５１】
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスを誘導することができるα２Ｍ受容体断片を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 熱ショックタンパク質を、α２Ｍ受容体断片を発現する細胞と接触させること、
（ｂ） 該細胞におけるα（２）マクログロブリン受容体活性のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスまたは活性のレベルが、α２Ｍ受容体断片の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体活性のレベルより高いと、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスを誘導することができるα２Ｍ受容体断片が同定される、上記方法。
【請求項５２】
測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が熱ショックタンパク質と相互作用する能力である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
熱ショックタンパク質が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が該抗原ペプチドを提示する能力である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
熱ショックタンパク質が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が該抗原ペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
α２Ｍ受容体と結合することができる熱ショックタンパク質断片を同定する方法であって、下記ステップ
（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の熱ショックタンパク質断片と接触させること、
（ｂ） α２Ｍ受容体と特異的に結合する熱ショックタンパク質断片を同定すること、
を含む、上記方法。
【請求項５６】
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスを誘導することができる熱ショックタンパク質断片を同定する方法であって、下記ステップ
（ａ） α２Ｍ受容体断片を、熱ショックタンパク質を発現する細胞と接触させること、
（ｂ） 該細胞におけるα（２）マクログロブリン受容体活性のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスまたは活性のレベルが、前記熱ショックタンパク質断片の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体活性のレベルより高いと、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスを誘導することができる熱ショックタンパク質断片が同定される、上記方法。
【請求項５７】
測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が熱ショックタンパク質断片と相互作用する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
熱ショックタンパク質断片が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が該抗原ペプチドを提示する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
熱ショックタンパク質断片が抗原ペプチドと非共有結合で結合されており、かつ、測定されるα（２）マクログロブリン受容体活性が該抗原ペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する能力である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
α２Ｍ受容体と特異的に結合する分子を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の試験分子と、結合を起こさせる条件下で接触させること、
（ｂ） α２Ｍ受容体と特異的に結合する１つ以上の試験分子を同定すること、
を含む、上記方法。
【請求項６１】
前記試験分子が可能性のある免疫治療薬である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
α２Ｍ受容体と特異的に結合する分子をスクリーニングする方法であって、下記ステップ：
（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の試験分子と、結合を起こさせる条件下で接触させること、
（ｂ） 該試験分子のどれがα２Ｍ受容体と特異的に結合するかを判定すること、
を含む、上記方法。
【請求項６３】
α２Ｍ受容体リガンドとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） α２Ｍ受容体を、α２Ｍ受容体リガンドまたはα２Ｍ受容体結合性のその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体と、１つ以上の試験化合物の存在下で接触させること、
（ｂ） α２Ｍ受容体に結合されたα２Ｍ受容体リガンドまたはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体の量を測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたα２Ｍ受容体リガンドの結合量が、該試験化合物の非存在下でのα２Ｍ受容体リガンドの結合量と異なると、α２Ｍ受容体リガンドとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項６４】
ステップ（ａ）で接触させるα（２）マクログロブリン受容体が細胞表面上にある、請求項１７または６３に記載の方法。
【請求項６５】
α（２）マクログロブリン受容体が固相表面に固定されている、請求項１７または６３に記載の方法。
【請求項６６】
熱ショックタンパク質がｇｐ９６である、請求項１、６４または２２に記載の方法。
【請求項６７】
熱ショックタンパク質がｈｓｐ９０である、請求項１、６４または２２に記載の方法。
【請求項６８】
熱ショックタンパク質がｈｓｐ７０である、請求項１、６４または２２に記載の方法。
【請求項６９】
熱ショックタンパク質がカルレティキュリンである、請求項１、６４または２２に記載の方法。
【請求項７０】
α２Ｍ受容体とα２Ｍ受容体リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の試験化合物と接触させること、
（ｂ） α２Ｍ受容体の活性または発現のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該１つ以上の試験化合物の非存在下でのα２Ｍ受容体の活性のレベルと異なると、α２Ｍ受容体とα２Ｍ受容体リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項７１】
α２Ｍ受容体リガンドがα２マクログロブリンである、請求項６３または７０に記載の方法。
【請求項７２】
α２Ｍ受容体発現細胞による抗原提示をモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記ステップ：
（ａ） １つ以上の試験化合物を、α２Ｍ受容体発現細胞と、α２Ｍ受容体リガンドおよび抗原分子を含む複合体との混合物に、α２Ｍ受容体介在エンドサイトーシスを起こさせる条件下で添加すること、
（ｂ） α２Ｍ受容体発現細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定すること、
を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたレベルが該１つ以上の試験化合物の非存在下での前記刺激のレベルと異なると、α２Ｍ受容体発現細胞による抗原提示をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項７３】
ステップ（ｂ）でα２Ｍ受容体発現細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激を測定することが、
（ｉ） ステップ（ａ）で形成されたα（２）マクログロブリン受容体発現細胞をＴ細胞に、該Ｔ細胞の活性化を促す条件下で添加すること、
（ｉｉ） 前記細胞傷害性Ｔ細胞の活性化のレベルを、該試験化合物の非存在下で形成されたα（２）マクログロブリン受容体発現細胞によるＴ細胞の活性化のレベルと比較すること、
を含み、ここにおいて、Ｔ細胞活性化のレベルの増加または低下は、α（２）マクログロブリン受容体発現細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物が同定されたことを示す、請求項２２または７２に記載の方法。
【請求項７４】
哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における免疫応答をモジュレートするのに有効な量で投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法。
【請求項７５】
哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における疾患または障害を治療または予防するのに有効な量で投与することを含む、該疾患または障害の治療または予防方法。
【請求項７６】
前記疾患または障害が癌または感染症である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項７８】
患者に、該患者から採血してα２Ｍ受容体リガンドを除去するように処理した血液を投与することを含む、患者の免疫応答を刺激する方法。
【請求項７９】
前記患者に、熱ショックタンパク質または熱ショックタンパク質−抗原ペプチド複合体を投与することをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
患者の免疫応答を刺激する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 患者より採取した血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去すること、
（ｂ） 該患者に、α２Ｍ受容体リガンドを枯渇させた血液の少なくとも一部を戻すこと、
を含む上記方法。
【請求項８１】
患者の免疫応答を刺激する方法であって、下記ステップ：
（ａ） 患者より血液を採取すること、
（ｂ） 該血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去すること、
（ｃ） 該患者に、α２Ｍ受容体リガンドを枯渇させた血液の少なくとも一部を戻すこと、
を含む上記方法。
【請求項８２】
ステップ（ａ）の後でステップ（ｃ）の前に、前記血液に熱ショックタンパク質または熱ショックタンパク質−抗原ペプチド複合体を添加するステップをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去することが、該血液と、α２Ｍ受容体リガンド結合性分子を結合させた固相とを、α２Ｍ受容体リガンドをα２Ｍ受容体リガンド結合性分子固相に結合させるのに十分な条件下で、接触させるステップを含む、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８４】
α２Ｍ受容体リガンド結合性分子がα２Ｍ受容体またはその断片である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
α２Ｍ受容体リガンド結合性分子が熱ショックタンパク質と結合しない、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
α２Ｍ受容体リガンド結合性分子がα２Ｍ受容体リガンド特異的抗体またはそのフラグメントである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記除去ステップにおいてアフェレーシスシステムを使用する、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記採血ステップにおいて血液を手動で抜き取る、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記除去ステップが、前記血液から血漿を分離し、該血漿をα２Ｍ受容体リガンドを除去するように処理することを含む、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記血液を注射器で患者に投与する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９１】
前記血液を点滴静注で患者に投与する、請求項７８に記載の方法。
【請求項９２】
前記血液を注射器で患者に戻す、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項９３】
前記血液を点滴静注で患者に戻す、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項９４】
１つ以上の容器に精製したα２Ｍ受容体リガンド結合性分子を結合させた固相クロマトグラフィーカラムを含むキットであって、採取した血液を該カラムに通すことにより、該血液からα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させることができる、上記キット。
【請求項９５】
α２Ｍ受容体リガンド結合性分子が熱ショックタンパク質と結合しない、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
α２Ｍ受容体リガンドがα２Ｍ、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、または外毒素である、請求項７８、８０または８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．序
本発明は、熱ショックタンパク質受容体としてのα（２）マクログロブリン（「α２Ｍ」）受容体の使用、ＨＳＰに結合されたα２Ｍ受容体を発現する細胞、ならびに、α２Ｍ受容体−ＨＳＰ複合体と結合する抗体および他の分子に関するものである。さらに、本発明は、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびに、免疫疾患、増殖性疾患および感染症を診断し治療するためのα２Ｍ受容体配列を含む組成物の使用方法に関するものである。
【０００２】
２．発明の背景
２．１．　熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、ストレスタンパク質とも呼ばれており、初めは、細胞が熱ショックに応答して合成するタンパク質として同定されたものである。ＨＳＰは分子量に基づいて５つのファミリーに分類されており、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０およびｓｍＨｓｐがある。その後、これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出された（Ｗｅｌｃｈ， Ｍａｙ １９９３， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６−６４； Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０； Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９０２−１９０３； Ｇｅｔｈｉｎｇら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３−４５； およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔら， １９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７を参照のこと）。
【０００３】
熱ショックタンパク質は現存するタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のＨｓｐ７０であるＤｎａＫは、擦過傷（ｅｘｃｏｒｉａｔｅｓ）からのＨｓｐ７０タンパク質に対して約５０％のアミノ酸配列同一性を有する（Ｂａｒｄｗｅｌｌら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８４８−８５２）。Ｈｓｐ６０およびＨｓｐ９０ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存を示す（Ｈｉｃｋｅｙら， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２６１５−２６２６； Ｊｉｎｄａｌ， １９８９， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２２７９−２２８３）。さらに、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ファミリーは、配列の点では３５％を超えるアミノ酸同一性を有して、ストレスタンパク質に関係しているが、その発現レベルがストレスによって変化しないタンパク質を含むことが発見されている。
【０００４】
熱ショックや他の生理的ストレスに対する細胞性応答の研究から、ＨＳＰはこうした不利な状態から細胞を保護することに関わっているだけでなく、ストレスを受けていない細胞においても必須の生化学的および免疫学的プロセスに関係していることが明らかにされた。例えば、Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーは、細胞質、核、ミトコンドリア、または小胞体に存在し（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ ら， １９８８， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１−６７７）、免疫系の細胞への抗原提示に関与しており、さらに、正常細胞においてはタンパク質の転移、折りたたみおよび組み立てにも関係している。ＨＳＰはタンパク質またはペプチドと結合し、その結合したタンパク質またはペプチドをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）または低ｐＨの存在下で放出することができる。
【０００５】
２．２． ＨＳＰ−ペプチド複合体の免疫原性
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａらは、メチルコラントレンで誘発させた近交マウスの肉腫に対する免疫応答を実証した（１９８８， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：７８−８３）。これらの研究において、これらの腫瘍の個々に異なる免疫原性に応答可能な分子は９６ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ９６）と８４〜８６ｋＤａの細胞内タンパク質であることが判った（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３４０７−３４１１； Ｕｌｌｒｉｃｈら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３１２１−３１２５）。特定の腫瘍から単離されたｇｐ９６またはｐ８４／８６でマウスを免疫すると、マウスはその特定の腫瘍に対して免疫になるが、抗原的に区別される腫瘍に対しては免疫にならない。ｇｐ９６およびｐ８４／８６をコードする遺伝子を単離して特性決定を行なったところ、それらの間には有意な相同性が見られ、しかもｇｐ９６とｐ８４／８６は同一の熱ショックタンパク質のそれぞれ小胞体と細胞質にある同等物であることが示された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８８， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２８：２０５−２０７； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９１， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７：１０９−１２３）。さらに、Ｈｓｐ７０はそれが単離された腫瘍に対する免疫を誘導するが、抗原的に異なった腫瘍に対しては免疫を誘導しないことが示された。しかしながら、ペプチドを枯渇させたＨｓｐ７０はその免疫原活性を失うことが見出された（ＵｄｏｎｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：１３９１−１３９６）。これらの観察から、熱ショックタンパク質はそれ自体に免疫原性があるのではなく、抗原ペプチドと非共有結合の複合体を形成して、その複合体が抗原ペプチドに特異的な免疫を引き出すことができると示唆された（ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６２：１５３−１７７； Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３９８−５４０３； Ｓｕｔｏら， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６９：１５８５−１５８８）。
【０００６】
ＨＳＰとペプチドとの非共有結合複合体（癌細胞から精製されたもの）は、癌の治療および予防に使用することができ、１９９６年４月１１日付けのＰＣＴ国際公開ＷＯ ９６／１０４１１および１９９７年３月２０日付けのＷＯ ９７／１０００１（それぞれ、１９９８年４月１２日発行の米国特許第５，７５０，１１９号および１９９８年１１月１７日発行の米国特許第５，８３７，２５１号；これらの特許の各々を参考として本明細書に含めるものとする）に記載されている。ストレスタンパク質−ペプチド複合体の（例えば、病原体に感染した細胞からの）単離および精製も記載されており、これらはウイルスのような病原体や細菌、原生動物、真菌、寄生虫などの他の細胞内病原体が引き起こす感染症の治療・予防に使用することができる（例えば、１９９５年９月２１日付けのＰＣＴ国際公開ＷＯ ９５／２４９２３を参照のこと）。また、免疫原性のあるストレスタンパク質−ペプチド複合体は、ストレスタンパク質と抗原ペプチドとのｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体化によっても調製することができ、そのような複合体を癌や感染症の治療・予防に使用することは、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開ＷＯ ９７／１００００（２０００年２月２９日発行の米国特許第６，０３０，６１８号）に記載されている。養子免疫療法で使用するために抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感作するためのストレスタンパク質−ペプチド複合体の使用は、１９９７年３月２０日付けのＰＣＴ国際公開ＷＯ ９７／１０００２に記載されている（１９９９年１１月１６日発行の米国特許第５，９８５，２７０号も参照のこと）。
【０００７】
２．３． α（２）マクログロブリン受容体
α（２）マクログロブリン受容体（本明細書では相互に交換可能に「α２ＭＲ」または「α２Ｍ受容体」という）は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体関連タンパク質（「ＬＲＰ」）またはＣＤ９１としても知られており、主に肝臓、脳および胎盤で発現される。α２Ｍ受容体は低密度リポタンパク質受容体ファミリーのメンバーである。ヒト受容体の細胞外ドメインは、６個の５０アミノ酸ＥＧＦリピートと３１個の約４０〜４２アミノ酸の補体リピートを含む。補体リピートは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、２、８、１０および１１個のリピートのクラスターに組織化されており、クラスターＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶと呼ばれている（Ｈｅｒｚら， １９８８， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：４１１９−４１２７）。ある研究は、この受容体の主要なリガンド結合部分としての補体リピート３−１０（ＣＲ３−１０）を含むクラスターＩＩ（Ｃｌ−ＩＩ）に向けられている（Ｈｏｒｎら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３６０８−１３６１３）。α２Ｍ受容体は多岐にわたるリガンドのエンドサイトーシスにおいてある役割を担っている。α２Ｍに加えて、他のα２Ｍ受容体リガンドには、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、および外毒素が含まれる。こうして、α２Ｍ受容体はエンドサイトーシス、抗原提示、コレステロール調節、ＡｐｏＥ含有リポタンパク質のクリアランス、およびカイロミクロン残存物の除去を含めて、様々な細胞プロセスにおいて役割を担っている。
【０００８】
ヒトα２Ｍは１４７４アミノ酸からなる前駆体として合成され、その最初の２３アミノ酸はシグナル配列として機能するもので、開裂されて１４５１アミノ酸からなる成熟タンパク質をもたらす（Ｋａｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２：２２８２−２２８６）。組換えタンパク質を用いた実験において、α２Ｍのカルボキシ末端の１３８アミノ酸（成熟タンパク質のアミノ酸１３１４−１４５１に相当）が該受容体と結合することが分かった。このドメインはＲＢＤ（受容体結合ドメイン）と呼ばれている（Ｓａｌｖｅｓｅｎｔら， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３１３：１９８−２０２； Ｈｏｌｔｅｔら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：２４２−２４６）。追加の１５アミノ末端残基を含むα２Ｍのタンパク質加水分解断片（成熟タンパク質のアミノ酸１３１４−１４５１に相当）であるＲＢＤ変異体（ＲＢＤｖ）は、α２Ｍプロテイナーゼとほぼ同じ親和性でもって該受容体と結合する（Ｈｏｌｔｅｔら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：２４２−２４６）。
【０００９】
α２ＭＲリガンドのアライメントから、αマクログロブリンのＲＢＤに存在する保存ドメインが同定された。この保存配列はヒトα２Ｍのアミノ酸１３６６−１３９２にわたっている。このドメイン内の保存残基はＰｈｅ１３６６、Ｌｅｕ１３６９、Ｌｙｓ１３７０、Ｖａｌ１３７３、Ｌｙｓ１３７４、Ｇｌｕ１３７７、Ｖａｌ１３８２、Ａｒｇ１３８４である（Ｎｉｅｌｓｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１２９０９−１２９１２）。これらのうち、Ｌｙｓ１３７０とＬｙｓ１３７４は受容体結合にとって極めて重要であることが見出された（Ｎｉｅｌｓｅｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１２９０９−１２９１２）。
【００１０】
リガンドとα２ＭＲとの結合（α２Ｍとα２ＭＲとの結合を含む）はα２ＭＲ関連タンパク質（ＲＡＰ）によって阻害される。ＲＡＰは小胞体の中にあってα２ＭＲの正しいプロセッシングに必要とされる３９ｋＤａのフォールディング（高次構造形成）シャペロンである。ＲＡＰは試験したすべてのα２ＭＲのα２ＭＲリガンドへの結合を競合的に阻害する能力を有する。ある研究は、α２ＭＲのクラスターＩＩ（Ｃｌ−ＩＩ）中の補体リピートＣ５−Ｃ７ と結合するＲＡＰを示している（Ｈｏｒｎら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１３６０８−１３６１３）。また、別の研究は、Ｃ９−Ｃ１０モジュールを除くＣｌ−ＩＩ中のすべての２補体リピートモジュールと結合するＲＡＰを示している（Ａｎｄｅｒｓｅｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｍａｒ． ２４， ２０００， ＰＭＩＤ： １０７４７９２１；印刷の前に電子発表）。ＲＡＰには３つの構造ドメインが確認されており、それぞれアミノ酸残基１８−１１２、１１３−２１８および２１９−３２３からなる。組換えＲＡＰドメインのリガンド競合タイトレーションは、試験リガンドの阻害のための決定基がドメイン１および３のＣ末端領域にあることを示す（Ｅｌｌｇａａｒｄら， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４４：５４４−５１）。
【００１１】
２．４． 抗原提示
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子は抗原提示細胞の細胞表面に抗原を提示する。次に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＭＨＣ分子およびその結合ペプチドを認識して標的細胞を殺す。抗原はその由来が細胞内であるか細胞外であるかに応じて２つの異なった抗原プロセッシング経路によりプロセッシングされる。細胞内つまり内因性のタンパク質抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成された抗原）は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）分子によってＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球に提示される。一方、細胞外つまり外因的に合成された抗原決定基は、「特殊化」または「専門化」されたＡＰＣ（例えば、マクロファージ）の細胞表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される（一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ（編）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８４を参照のこと）。この抗原プロセッシング経路の区画分離は、さもなくば近隣細胞のＭＨＣＩ抗原の放出の結果として免疫応答中に起こりうる組織破壊を防止するのに重要である。
【００１２】
熱ショックタンパク質ｇｐ９６は、ｇｐ９６が単離される起源に応じて、広範なアレイのペプチドに対してシャペロンの機能をもつ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６５７−６６５を参照のこと）。腫瘍由来のｇｐ９６は腫瘍抗原ペプチドを担い（Ｉｓｈｉｉら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６２：１３０３−１３０９）、ウイルス感染細胞からのｇｐ９６調製物はウイルスのエピトープを担い（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８； Ｎｉｅｌａｎｄら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１８００−１８０５）、そしてオボアルブミンまたはβ−ガラクトシダーゼのようなモデル抗原で形質転換された細胞からのｇｐ９６調製物は対応するエピトープを伴っている（Ａｒｎｏｌｄら， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：８８５−８８９； Ｂｒｅｌｏｅｒら， １９９８， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：１０１６−１０２１）。ｇｐ９６とペプチドとの会合はｉｎ ｖｉｖｏで起こる（ＭｅｎｏｒｅｔおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ． ２６２：８１３−８１８）。ｇｐ９６−ペプチド複合体は、細胞から単離たれようと（Ｔａｍｕｒａら， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成されようと（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１１８３−１４０６）、優れた免疫原であり、ｇｐ９６シャペロン化抗原ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すために広く使用されている。
【００１３】
ｇｐ９６−ペプチド複合体が免疫応答を引き出す能力は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子への該ペプチドの移行に依存している（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲）。小胞体［ＥＲ］中のｇｐ９６によりシャペロン化された内因的に合成された抗原は抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（またはＭＨＣＩ−制限ＣＴＬ）をｉｎ ｖｉｖｏで感作することができ、このＣＤ８＋Ｔ細胞の感作はマクロファージを必要とする。しかし、外因的に導入されたｇｐ９６−ペプチド複合体が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出すプロセスは完全には理解されていない。なぜならば、細胞外抗原をクラスＩ提示機構へ移行させるための確立された経路が存在しないからである。だが、ＨＳＰと会合された細胞外起源の抗原ペプチドはなんとかマクロファージにより救出され、内因経路に向けられ、そしてＣＤ８＋リンパ球により認識されるＭＨＣＩ分子により提示されたＣＤ８＋リンパ球により認識される（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， 前掲；Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１３１５−２２）。
【００１４】
抗原提示のために細胞外ペプチドを送達することを説明するために、いくつかのモデルが提案されてきた。一つの提案は、「直接移行」モデルとして知られており、ＨＳＰシャペロン化ペプチドがＣＤ８＋Ｔリンパ球への提示のためにマクロファージの細胞表面上でＭＨＣＩ分子に移行されるという提案である。別の提案は、可溶性の細胞外タンパク質が骨髄由来のマクロファージおよび樹状細胞における構成的マクロピノサイトーシスにより細胞質ゾルに輸送されるというものである（Ｎｏｒｂｕｒｙら， １９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８０−２８８）。さらに別の提案された機構は、ＨＳＰがマクロファージのＭＨＣクラスＩ分子により取り込まれ、このことが適切なＴ細胞を刺激するというものである（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。その他の研究者らは、細胞外媒体から小胞体の内腔へのペプチドの移動には新規な細胞内輸送経路が関係している可能性があると提唱している（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６４−８０６９； Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらなる提案として、（ａ） タンパク質をファゴソームから細胞質ゾルへ移行させる無規定の経路を保有する食細胞の関与；（ｂ） 摂取した物質をリソソーム中で消化し、ペプチドを表面上にのせるためにクラスＩ分子へ逆流させる食細胞の関与がある（Ｂｅｖａｎ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：６３９−４１）。
【００１５】
このほかにも、細胞外ペプチドを抗原提示のためにＡＰＣの細胞表面に送達する受容体介在経路が提案されている。免疫感作に必要とされるｇｐ９６シャペロン化抗原ペプチドの量が極めて少量であること（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， 前掲）、およびｇｐ９６−ペプチド複合体の免疫原性が機能的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に厳格に依存すること（Ｕｄｏｎｏら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：３０７７−３０８１）を考慮して、ＡＰＣはｇｐ９６の受容体をもつと提案されたことがあった（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９４， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：９３−９８）。最近になって、そのような受容体と合致する予備微視的証拠が得られている（Ｂｉｎｄｅｒら， １９９８， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ３ （Ｓｕｐｐ．１）：２．； Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：３７５７−３７６０； およびＷａｓｓｅｎｂｅｒｇら， １９９９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １：１２）。一つの仮説は、ｇｐ９６の取り込みのためにマンノース受容体が使用されるというものであるが、Ｈｓｐ７０のような非グリコシル化ＨＳＰのための機構は提案されていない（Ｃｉｕｐｉｔｕら， １９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７：６８５−６９１）。
【００１６】
ＨＳＰが介在するペプチドの抗原提示に関与する特定の分子を同定し特徴づけることは、ＨＳＰおよびＨＳＰ−ペプチド複合体による特異的免疫を誘起させるための、また、新規な診断および治療方法を開発するための、有用な試薬および手法を提供するだろう。
【００１７】
文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
【００１８】
３．発明の概要
本発明は、熱ショックタンパク質受容体としてのα（２）マクログロブリン（「α２Ｍ」）受容体を使用する組成物および方法に関する。本発明は、一部には、α２Ｍ受容体が熱ショックタンパク質の細胞表面受容体であるという本発明者らの発見に基づくものである。特に、本発明者らは、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンが直接α２Ｍ受容体と結合し、α２Ｍがｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンによりシャペロン化された（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄ）抗原ペプチドのマクロファージによる提示を阻害することを見出した。ＨＳＰのような豊富な細胞内タンパク質を認識する受容体の先例は皆無であるので、ＨＳＰ細胞表面受容体の発見は非常に予期せざることであった。
【００１９】
本発明は、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との複合体を含む組成物、ならびにＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体と結合する抗体および他の分子を提供する。本発明はまた、熱ショックタンパク質受容体としてのα２Ｍ受容体の使用方法、例えば、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする化合物のスクリーニング方法、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスならびにＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患および状態（自己免疫疾患、増殖性疾患、感染症など）の治療および検出方法を包含する。
【００２０】
本発明は、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） 試験化合物を熱ショックタンパク質およびα（２）マクログロブリン受容体と接触させること、（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体の活性または発現のレベルを測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該試験化合物の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体の活性のレベルと異なると、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される。この方法の一つの実施形態において、同定される化合物は熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるアンタゴニストであり、さらに、（ｃ） 前記レベルが熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるか否かを判定すること、をさらに含む。別の実施形態では、試験化合物がα（２）マクログロブリン受容体に特異的な抗体である。別の実施形態では、試験化合物がα（２）マクログロブリンに特異的な抗体である。別の実施形態では、試験化合物が熱ショックタンパク質に特異的な抗体である。別の実施形態では、試験化合物が小さい分子である。別の実施形態では、試験化合物がペプチドである。別の実施形態では、前記ペプチドがα（２）マクログロブリン受容体の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、前記ペプチドがα（２）マクログロブリンの少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、前記ペプチドが熱ショックタンパク質配列の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、前記化合物が熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を増強するアゴニストである。別の実施形態では、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスが、自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染症、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、あるいは骨粗鬆症に影響を及ぼす。
【００２１】
本発明はまた、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） 試験化合物を、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞とに接触させること、（ｂ） 該細胞におけるα（２）マクログロブリン受容体の活性または発現のレベルを測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該試験化合物の非存在下でのα（２）マクログロブリン受容体の活性のレベルと異なると、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される。別の実施形態では、測定されるα（２）マクログロブリン受容体の活性が熱ショックタンパク質と相互作用する能力である。
【００２２】
本発明はまた、熱ショックタンパク質とα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） 熱ショックタンパク質を、α（２）マクログロブリン受容体またはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体と、試験化合物の存在下で接触させること、（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体またはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体に結合された熱ショックタンパク質の量を測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定された熱ショックタンパク質の結合量が、該試験化合物の非存在下での熱ショックタンパク質の結合量と異なると、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物が同定される。別の実施形態では、ステップ（ａ）で接触させるα（２）マクログロブリン受容体が細胞表面上にある。別の実施形態では、α（２）マクログロブリン受容体が固相表面に固定される。別の実施形態では、固相表面がマイクロタイターディッシュである。別の実施形態では、熱ショックタンパク質の結合量が前記細胞を熱ショックタンパク質特異的抗体と接触させることにより測定される。さらに別の実施形態では、熱ショックタンパク質が標識されており、熱ショックタンパク質の結合量が該標識を検出することで測定される。別の実施形態では、熱ショックタンパク質が蛍光標識で標識される。
【００２３】
本発明はさらに、α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） 試験化合物を、α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞と、本質的に抗原分子と非共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複合体との混合物に、α（２）マクログロブリン受容体介在エンドサイトーシスを起こさせる条件下で添加すること、（ｂ） α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたレベルが該試験化合物の非存在下での前記刺激のレベルと異なると、α（２）マクログロブリン受容体を発現する細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物が同定される。この方法の一つの実施形態において、ステップ（ｂ）の細胞表面に提示された抗原分子のレベルを測定するステツプが、（ｉ） ステップ（ａ）で形成されたα（２）マクログロブリン受容体発現細胞をＴ細胞に、該Ｔ細胞の活性化を促す条件下で添加すること、（ｉｉ） 前記細胞傷害性Ｔ細胞の活性化のレベルを、該試験化合物の非存在下で形成されたα（２）マクログロブリン受容体発現細胞によるＴ細胞の活性化のレベルと比較すること、を含み、ここにおいて、Ｔ細胞活性化のレベルの増加または低下は、α（２）マクログロブリン受容体発現細胞による熱ショックタンパク質介在抗原提示をモジュレートする化合物が同定されたことを示す。
【００２４】
各種の実施形態において、本発明の方法で用いる熱ショックタンパク質はｇｐ９６である。あるいはまた、熱ショックタンパク質ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、またはカルレティキュリンを本発明の様々な実施形態で使用してもよい。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における熱ショックタンパク質−α（２）マクログロブリン受容体関連障害の検出方法を提供し、この方法は、患者サンプルにおけるＨＳＰ−α（２）マクログロブリン受容体介在プロセスのレベルを測定することを含み、その結果として、測定されたレベルが臨床的に正常な個体に見出せる該レベルと異なると、熱ショックタンパク質−α（２）マクログロブリン受容体関連障害が検出される。
【００２６】
本発明はまた、本発明の組成物を含むキットを包含する。一つの実施形態では、１つ以上の容器にパッケージされた、（ａ）精製された熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質をコードする核酸、または熱ショックタンパク質を発現する細胞、（ｂ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチド、α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードする核酸、またはα（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドを発現する細胞、を含むキットが提供される。一つの実施形態では、α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチド、α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードする核酸、またはα（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドを発現する細胞が精製されたものである。別の実施形態では、前記キットはさらに、自己免疫疾患、感染症、または増殖性疾患の治療に使用するための説明書を含む。
【００２７】
本発明はまた、哺乳動物に、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用をモジュレートする精製化合物を投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法を提供する。一つの実施形態において、前記化合物は熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を増強するアゴニストである。この方法の別の実施形態では、前記化合物は熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるアンタゴニストである。
【００２８】
本発明はさらに、哺乳動物に、熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げる精製化合物を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法を提供する。この方法の一つの実施形態において、前記化合物は熱ショックタンパク質とα（２）マクログロブリン受容体との相互作用を妨げるアンタゴニストである。一つの実施形態では、前記アンタゴニストがα（２）マクログロブリン受容体に特異的な抗体である。別の実施形態では、前記アンタゴニストが熱ショックタンパク質に特異的な抗体である。別の実施形態では、前記アンタゴニストが小さい分子である。別の実施形態では、前記アンタゴニストがペプチドである。別の実施形態では、前記ペプチドがα（２）マクログロブリン受容体の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、前記ペプチドがα（２）マクログロブリンの少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。別の実施形態では、前記ペプチドが熱ショックタンパク質配列の少なくとも５個連続したアミノ酸を含む。
【００２９】
本発明はさらに、癌細胞または感染細胞を、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換することを含む、癌細胞または感染細胞の免疫能を高める方法を提供する。
【００３０】
さらにまた、本発明は、癌細胞または感染細胞の免疫能を高める方法であって、（ａ） 該細胞を、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換すること、（ｂ） 該細胞を治療が必要な個体に投与すること、を含み、その結果として免疫応答が高められる上記方法を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組換え癌細胞を提供する。一つの実施形態では、前記組換え細胞がヒト細胞である。
【００３２】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ｉ）プロモーターに機能的に連結されており、かつ（ｉｉ）α（２）マクログロブリン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された組換え感染細胞を提供する。一つの実施形態では、前記組換え細胞がヒト細胞である。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、α２Ｍ受容体と特異的に結合する分子のスクリーニング方法を提供し、この方法は、（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の試験分子と、結合を起こさせる条件下で接触させること、（ｂ） 該試験分子のどれがα２Ｍ受容体と特異的に結合するかを判定すること、を含む。一つの実施形態では、試験分子は可能性のある免疫治療薬である。
【００３４】
本発明はまた、α２Ｍ受容体リガンドとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物の同定方法を提供し、この方法は、（ａ） α２Ｍ受容体を、α２Ｍ受容体リガンドまたはα２Ｍ受容体結合性のその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体と、１つ以上の試験化合物の存在下で接触させること、（ｂ） α２Ｍ受容体に結合されたα２Ｍ受容体リガンドまたはその断片、類似体、誘導体もしくは擬似体の量を測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたα２Ｍ受容体リガンドの結合量が、該試験化合物の非存在下でのα２Ｍ受容体リガンドの結合量と異なると、α２Ｍ受容体リガンドとα２Ｍ受容体との結合をモジュレートする化合物が同定される。
別の実施形態においては、α２Ｍ受容体リガンドとα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする化合物の同定方法が提供され、この方法は、（ａ） α２Ｍ受容体を１つ以上の試験化合物と接触させること、（ｂ） α２Ｍ受容体の活性または発現のレベルを測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定された活性または発現のレベルが、該１つ以上の試験化合物の非存在下でのα２Ｍ受容体の活性のレベルと異なると、α２Ｍ受容体とα２Ｍ受容体リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物が同定される。一つの実施形態では、α２Ｍ受容体リガンドはα２Ｍである。
【００３５】
別の実施形態においては、α２Ｍ受容体発現細胞による抗原提示をモジュレートする化合物の同定方法が提供され、この方法は、（ａ） １つ以上の試験化合物を、α２Ｍ受容体発現細胞と、α２Ｍ受容体リガンドおよび抗原分子を含む複合体との混合物に、α２Ｍ受容体介在エンドサイトーシスを起こさせる条件下で添加すること、（ｂ） α２Ｍ受容体発現細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定すること、を含み、その結果として、（ｂ）で測定されたレベルが該１つ以上の試験化合物の非存在下での前記刺激のレベルと異なると、α２Ｍ受容体発現細胞による抗原提示をモジュレートする化合物が同定される。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における免疫応答をモジュレートするのに有効な量で投与することを含む、免疫応答をモジュレートする方法を提供する。
【００３７】
さらに別の実施形態では、哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における疾患または障害を治療または予防するのに有効な量で投与することを含む、該疾患または障害の治療または予防方法が提供される。一つの実施形態では、該疾患または障害が癌または感染症である。
【００３８】
さらなる実施形態においては、哺乳動物に、α２Ｍ受容体と結合する精製化合物を、該哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様では、患者に、該患者から採血してα２Ｍ受容体リガンドを除去するように処理した血液を投与することを含む、患者の免疫応答を刺激する方法が提供される。特定の実施形態において、この方法はさらに、前記患者に、熱ショックタンパク質または熱ショックタンパク質−抗原ペプチド複合体を投与することを含む。特定の実施形態では、前記患者に血液を注射器で投与する。別の実施形態では、前記患者に血液を点滴静注で投与する。
【００４０】
他の実施形態においては、患者の免疫応答を刺激する方法が提供され、この方法は、（ａ） 患者より採取した血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去すること、（ｂ） 該患者に、α２Ｍ受容体リガンドを枯渇させた血液の少なくとも一部を戻すこと、を含む。
【００４１】
別の実施形態では、患者の免疫応答を刺激する方法が提供され、この方法は、（ａ） 患者より血液を採取すること、（ｂ） 該血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去すること、（ｃ） 該患者に、α２Ｍ受容体リガンドを枯渇させた血液の少なくとも一部を戻すこと、を含む。特定の実施形態では、この方法はさらに、ステップ（ａ）の後でステップ（ｃ）の前に、前記血液に熱ショックタンパク質または熱ショックタンパク質−抗原ペプチド複合体を添加するステップを含む。特定の実施形態では、前記患者に前記血液を注射器で戻す。別の実施形態では、前記患者に前記血液を点滴静注で戻す。別の特定の実施形態では、前記血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去することが、該血液と、α２Ｍ受容体リガンド結合性分子を結合させた固相とを、α２Ｍ受容体リガンドをα２Ｍ受容体リガンド結合性分子固相に結合させるのに十分な条件下で、接触させるステップを含む。別の特定の実施形態では、α２Ｍ受容体リガンド結合性分子がα２Ｍ受容体またはその断片である。別の実施形態では、α２Ｍ受容体リガンド結合性分子が熱ショックタンパク質と結合しない。別の実施形態では、α２Ｍ受容体リガンド結合性分子がα２Ｍ受容体リガンド特異的抗体またはそのフラグメントである。
【００４２】
各種の実施形態において、前記除去ステップではアフェレーシスシステムが使用される。他の実施形態では、前記採血ステップにおいて血液が手動で採取される。各種の実施形態において、前記除去ステップは、前記血液から血漿を分離し、該血漿をα２Ｍ受容体リガンドを除去するように処理することを含む。
【００４３】
本発明はさらに、１つ以上の容器に、精製したα２Ｍ受容体リガンド結合性分子を結合させた固相クロマトグラフィーカラムを含むキットであって、採取した血液を該カラムに通すことにより、該血液からα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させることができる、上記キットを提供する。一つの実施形態において、前記キットのα２Ｍ受容体リガンド結合性分子は熱ショックタンパク質と結合しない。
【００４４】
各種の実施形態において、α２Ｍ受容体リガンドはα２Ｍ、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、または外毒素である。
【００４５】
本明細書中で用いる「ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセス」とは、ＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用に、直接または間接的に、依存するまたは応答するプロセスを指す。そのようなプロセスとして、各種のα２Ｍリガンド（ＨＳＰ、α２Ｍ、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）または外毒素を含むが、これらに限らない）の結合に関係するエンドサイトーシス活性などの、α２Ｍ受容体の異常な発現、合成および／または活性のレベルから生じるプロセスが挙げられる。かかるプロセスには、限定するものではないが、エンドサイトーシス、抗原提示、コレステロールの調節、アポＥ含有リポタンパク質のクリアランス、およびカイロミクロン残存物の除去が含まれる。
【００４６】
本明細書中で用いる「ＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患」および「ＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連状態」とは、それぞれ、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体相互作用に関係する疾患および状態を指す。そのような疾患および状態は、例えば、ＨＳＰと相互作用するα２Ｍ受容体の異常な能力からもたらされ、それはおそらく、正常な非罹患非損傷個体に見られるレベル、臨床的に正常な個体に見られるレベル、および／またはそのレベルがベースラインの平均ＨＳＰおよび／またはα２Ｍ受容体レベルを表す集団に見られるレベルと比べて、ＨＳＰおよび／またはα２Ｍ受容体の異常な発現、合成および／または活性のレベルに起因する。かかる疾患には、限定するものではないが、自己免疫疾患、抗原提示および／またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患および障害、サイトカインのクリアランスおよび／または炎症に関係する疾患および障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患および他の感染症、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、および骨粗鬆症が含まれる。
【００４７】
本明細書中で用いる「α２ＭＲリガンド」とは、α２Ｍ受容体に結合することができる分子を指す。そのようなα２ＭＲリガンドには、限定するものではないが、α２Ｍおよびα２Ｍ複合体、熱ショックタンパク質および熱ショックタンパク質複合体、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）および外毒素などの公知のリガンドが含まれる。加えて、α２ＭＲリガンドにはさらに、当技術分野で公知の標準的な結合アッセイを用いてα２ＭＲリガンドとして容易に同定しうる分子も含まれる。そのようなα２ＭＲリガンドは典型的には、α２Ｍ受容体に結合すると、細胞によるエンドサイトーシスを受ける。
【００４８】
４．図面の説明
（図面の説明については下記参照）
５．発明の開示
本発明は、α２−マクログロブリン受容体（本明細書では相互に交換可能に「α２ＭＲ」または「α２Ｍ受容体」という）を熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）受容体として用いるための組成物と方法に関する。特に、本発明は、例えばα２ＭＲ−ＨＳＰ複合体などの単離されたα２ＭＲ−リガンド複合体を含んでなる組成物を提供し、それには、単離されたおよび／または組換えられた細胞、ならびに、α２ＭＲとα２ＭＲリガンド（例えばＨＳＰなど）との相互作用をモジュレートする抗体、分子、および化合物が含まれる。本発明にはさらにα２ＭＲを熱ショックタンパク質受容体として使用するための方法が包含され、その方法にはα２ＭＲとＨＳＰもしくはその他のα２ＭＲリガンドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法が含まれ、また、それらの分子および複合体の免疫疾患、増殖性疾患、および感染症の診断および治療での使用方法が包含される。
【００４９】
本明細書で用いている「α２ＭＲリガンド」という用語は、α２ＭＲ受容体に結合することのできる分子を意味する。そのようなα２ＭＲリガンドとしては既知のリガンド、例えば限定はされないが、α２Ｍおよびα２Ｍ複合体、熱ショックタンパク質および熱ショックタンパク質複合体、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ならびに外毒素なども含まれる。さらに、α２ＭＲリガンドには、当業界では既知の標準的な結合アッセイ法を用いて容易にα２ＭＲリガンドと同定しうる分子をも含む。そのようなα２ＭＲリガンドは、典型的には、α２ＭＲと結合すると細胞によってエンドサイトーシスによって取り込まれるものである。
【００５０】
本発明の実施において有用なＨＳＰは次の判断基準を満足するような細胞性タンパク質であればいかなるものであってもその中から選択することができる：細胞がストレス刺激に暴露されると、ＨＳＰの細胞内濃度が増加する；ＨＳＰが他のタンパク質もしくはペプチドと結合し、その結合したタンパク質もしくはペプチドをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在もしくは低いｐＨの条件下で放出することができる；または、ＨＳＰが上記の性質のいずれかを有する細胞性タンパク質と少なくとも３５％の相同性を有する。好ましくは、本発明の組成物および方法で用いられるＨＳＰには、限定はされないが、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ＢｉＰ、Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、Ｈｓｃ７０、ＰｈｏＥ、カルレティキュリン、ＰＤＩ、もしくはｓＨｓｐ、それら単独もしくは組み合わせたものが含まれる。
【００５１】
好ましい実施形態においては、ＨＳＰは哺乳類のもので（例えば、マウス、ラット、霊長類、飼い慣らされた動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ）、最も好ましくはヒトのものである。
【００５２】
本発明の実施に有用なＨｓｐとしては、限定はされないが、ＨＳＰ６０ファミリー、ＨＳＰ７０ファミリー、ＨＳＰ９０ファミリー、ＨＳＰ１００ファミリー、ｓＨＳＰファミリー、カルレティキュリン、ＰＤＩ、および、チオレドキシン様ドメイン（例えば、限定はされないが、ＥＲｐ７２およびＥＲｐ６１など）を含有している小胞体中のその他のタンパク質が含まれる。
【００５３】
ＨＳＰ類似体、突然変異タンパク質、誘導体、および断片も本発明でＨＳＰの代わりに用いることができる。本発明で使用するためのＨＳＰペプチド結合性「断片」とは、あるペプチドと非共有結合で会合して免疫応答を引き出しうる複合体を形成することのできるＨＳＰペプチド結合性ドメインを含んでなるポリペプチドを意味する。ある実施形態においては、ＨＳＰペプチド結合性断片は、約１００個から２００個のアミノ酸からなるＨＳＰペプチド結合性ドメインを含んでなるポリペプチドである。
【００５４】
データベースを用いて検索してクエリー配列と様々な程度の類似性を有する配列を同定することができ、それにはＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴなどのプログラムが用いられ、それらのプログラムはアライメントスコアおよび統計解析によって類似配列をランク付けする。本発明の方法で用いられるＨＳＰの調製のために用いることのできるそのようなＨＳＰのヌクレオチド配列は、限定はされないが、次のものが挙げられる：ヒトＨｓｐ７０， Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ ００５３４５， Ｓａｒｇｅｎｔら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：１９６８−１９７２； ヒトＨｓｐ９０， Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ１５１８３， Ｙａｍａｚａｋｉら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７１０８； ヒトｇｐ９６， Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ Ｘ１５１８７， Ｍａｋｉら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７：５６５８−５５６２； ヒトＢｉＰ， Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１９６４５， Ｔｉｎｇら， １９８８， ＤＮＡ ７：２７５−２８６； ヒトＨｓｐ２７， Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２４７４３， Ｈｉｃｋｅｙら， １９８６， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４１２７−４５； マウスＨｓｐ７０： Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３５０２１， Ｈｕｎｔら， １９９０， Ｇｅｎｅ． ８７：１９９−２０４； マウスｇｐ９６： Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１６３７０， Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８７． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：３８０７−３８１１； およびマウスＢｉＰ： Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６２７７， Ｈａａｓら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２２５０−２２５４。本明細書で用いている「ＨＳＰ配列」という用語は、遺伝暗号の縮重のため天然のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のみならずＨＳＰをコードする他の縮重配列全てをも含む。
【００５５】
前述のＨＳＰファミリーには配列がＨＳＰと関連性のあるタンパク質をも含んでおり、例えば、３５％を超えるアミノ酸同一性を有するが、その発現レベルがストレスによって変わることのないものが含まれる。従って本明細書で用いている熱ショックタンパク質、もしくはストレスタンパク質の定義には、これらのファミリーメンバーと少なくとも３５％〜５５％、好ましくは５５％〜７５％、最も好ましくは７５％〜８５％のアミノ酸同一性を有し、それらの細胞内での発現レベルがストレス刺激に応答して増強される他のタンパク質、それらの突然変異体、類似体、および変異体が含まれる。２つの配列間の同一性パーセントは数学的アルゴリズムを用いて決定することもできる。２つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの、好ましいが限定はされない例としては、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：２２６４−２２６８、さらにその改変としてＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３−５８７７に報告されているものが挙げられる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０に示されているＮＢＬＡＳＴやＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み入れられる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝１００、ワード長さ＝１２で行った。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長さ＝３で行った。比較を行う目的でギャップを入れたアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいはまた、分子間の遠い関連性を検出する反復検索を行うためにＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができる（Ａｌｔｓｈｕｌら， １９９７， 上述の文献）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的でない別の例としては、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７がある。そのようなアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒ． ２．０）中に組み込まれるが、そのプログラムはＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの一部である。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる際には、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティー１２、ギャップペナルティー４を用いることができる。
【００５６】
本発明の免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体には、ＨＳＰと、哺乳類で免疫応答を誘導することのできるペプチドとを含むあらゆる複合体が含まれる。そのペプチドは好ましくはＨＳＰと共有結合で結合している。好ましい複合体としては、限定はされないが、ｇｐ９６−ペプチド複合体、ＨＳＰ９０−ペプチド複合体、ＨＳＰ７０−ペプチド複合体、ＨＳＰ６０−ペプチド複合体、ＨＳＰ１００−ペプチド複合体、カルレティキュリン−ペプチド複合体、およびｓＨＳＰ−ペプチド複合体が含まれる。例えば、真核細胞の小胞体に存在し細胞質のＨＳＰ９０と関連のあるＨＳＰ ｇｐ９６は、ｇｐ９６−ペプチド複合体を含有する有効なワクチンの作製のために用いることができる。
【００５７】
本発明で用いるためのＨＳＰ、α２ＭＲ、および／または抗原性分子は天然源から精製したもの、化学合成によるもの、組換えにより産生されたものでありうる。患者にとってＨＳＰは同種のものではあってもよいが、好ましい実施形態おいては、ＨＳＰは投与されることとなる患者自身のものである。
【００５８】
５．１　本発明の組成物
本発明はα２ＭＲとα２ＭＲリガンド、例えばＨＳＰなどとの相互作用をモジュレートする組成物を提供する。そのような組成物は免疫応答を引き出す、もしくはモジュレートするための方法において用いることができる。そのような組成物としては、ＨＳＰ−α２ＭＲ複合体を特異的に認識する抗体、ＨＳＰ−α２ＭＲ複合体を発現する単離された細胞、ならびに組換えα２ＭＲおよびＨＳＰ配列を含んでいる単離されたおよび組換えられた細胞も含まれる。さらに、本発明の種々の方法において、α２ＭＲ、ＨＳＰ、およびα２Ｍをコードする配列が免疫療法に用いられる。そのような組成物は、例えば、増殖性疾患、感染症、およびその他のＨＳＰ−α２ＭＲ関連疾患に対する免疫療法で用いることができる。そのような組成物の合成および産生のための方法を本明細書に述べる。
【００５９】
５．１．１　組換えによる発現
本発明の種々の実施形態においては、α２ＭＲ、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドをコードする配列が、組換え細胞内での増殖と発現のための発現ベクター中に挿入される。ある実施形態においては、α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドのコード領域は、組換え細胞内での発現のための非天然のプロモーターと連結される。
【００６０】
ＨＳＰを認識し結合するα２ＭＲ部分のアミノ酸配列は図１２Ｂ（配列番号２）に示してある。本発明者らの知見に基づけば、このα２ＭＲの部分はＨＳＰおよびＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体を認識し結合する役割を担っている。ＨＳＰを結合した後、α２ＭＲはＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体の細胞中への輸送を容易にし、そこでペプチド抗原はＭＨＣクラスＩ分子と会合し、次いでその細胞の細胞表面上に提示され、免疫応答の刺激に用いることができるようになる。本発明に基づけば、α２ＭＲとＨＳＰとの相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを含んでなる組成物は免疫応答をモジュレートするために用いることができる。こうして、組換えα２ＭＲポリペプチド、α２ＭＲとＨＳＰの複合体、もしくはＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体、ならびにα２ＭＲもしくはα２ＭＲと抗原性ペプチドからなる複合体を発現している組換え細胞を、本明細書に記載の免疫療法および診断方法に用いることができる。
【００６１】
本発明の種々の実施形態においては、α２ＭＲ、および／または熱ショックタンパク質もしくはα２Ｍ、またはそれらの断片をコードする配列は、組換え細胞内での増殖と発現のために発現ベクター中に挿入される。本明細書中で用いている発現構築物とは、例えばα２ＭＲ、ＨＳＰ、もしくはα２Ｍなどの特定の遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列であって、適切な宿主細胞中でのコードされた遺伝子産物の発現を可能とする１つ以上の調節領域と機能的に結合されたものを意味する。「機能的に結合された」とは、調節領域と発現される遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が、転写および究極的には翻訳を行えるように連結され位置づけられている結合を意味する。
【００６２】
該ＤＮＡは、配列データベースから当業界で公知の標準的な方法を用いてＤＮＡ増幅を行うことによって得ることができ、またはある組織、細胞培養物、もしくはクローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる。ｈｓｐ遺伝子のコード領域を得るためにはその核酸の起源としていかなる真核細胞も用いることができる。ＨＳＰをコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳類、ならびにヒトを含む霊長類起源から単離することができる。ゲノムＤＮＡ由来のクローンはコード領域の他に調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含んでいる可能性がある；ｃＤＮＡ由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、ｈｓｐ遺伝子は増殖のためには適切なベクター中にクローン化されなければならない。
【００６３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づいたベクタは最も一般的であり、外来性タンパク質の高レベルでの発現に多目的に使用できる系である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．， ６０：５１２−５３８）。大腸菌中での発現に用いることのできる調節領域の非限定的な例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、λＰＬ、ならびにファージＴ３およびＴ７プロモーターが含まれる（Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．， ６０：５１２−５３８）。原核生物由来の発現ベクターの非限定的な例としてはλｇｔ１１などのλｇｔベクター系列（Ｈｕｙｎｈら， １９８４， 「ＤＮＡクローニング技法」”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ｖｏｌ．Ｉ：「実際的なアプローチ」”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）， ｐｐ．４９−７８， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）およびｐＥＴベクター系列（Ｓｔｕｄｉｅｒら， １９９０， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：６０−８９）が挙げられる。しかし原核生物の宿主−ベクター系の欠点は、哺乳類で行われるような翻訳後プロセッシングの多くを行うことができないことである。従って、真核生物の宿主−ベクター系が好ましく、哺乳類の宿主−ベクター系がより好ましく、ヒト宿主−ベクター系が最も好ましい。
【００６４】
α２ＭＲ配列の転写に必要な調節領域は、例えば、その発現ベクターで提供することができる。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）も、開始コドンを欠いたα２Ｍ受容体をコードするヌクレオチド配列を発現させるために提供することができる。適合しうる宿主−構築物系においては、転写に必要な細胞性タンパク質、例えばＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子などは、宿主生物体中でα２ＭＲ配列の転写が行えるように、発現構築物上の調節領域に結合される。遺伝子の発現に必要とされる調節領域の細かな性質は宿主細胞の種類毎に異なる。一般的には、ＲＮＡポリメラーゼと結合することのできるプロモーターはそれと機能的に連結された核酸配列の転写を開始するために必要とされる。そのような調節領域としては、転写および翻訳の開始と関係した５’非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ部位、ＣＡＡＴボックス、および類似のものなどが含まれる。コード配列の３’側の非コード配列には転写終結調節配列、例えばターミネーターおよびポリアデニル化部位が含まれる。
【００６５】
α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドの発現には、構成的および誘導的の双方の調節領域を用いることができる。組換え細胞の増殖に最適な条件と遺伝子産物の高レベルでの発現のための条件が異なる場合には誘導的プロモーターが望ましいであろう。有用な調節領域の例は次項に示す。
【００６６】
哺乳類細胞中でのα２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンド遺伝子産物の発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターが挙げられる。哺乳類細胞で有用と考えられる誘導的プロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルス、グルココルチコイド応答性ＬＴＲ（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、β−インターフェロン遺伝子、およびＨｓｐ７０遺伝子と結合しているものが含まれる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９８９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９：２７３５−４２； Ｔａｙｌｏｒら， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０：１６５−７５）。組換え宿主細胞中でのα２ＭＲの発現を駆動するためには、熱ショックプロモーターもしくはストレスプロモーターを用いることが有利であろう。
【００６７】
下記の動物の制御領域、それらは組織特異性を示しトランスジェニック動物で用いられてきたものであるが、そのような領域も特定の組織タイプの腫瘍細胞中で用いることができる：膵臓の腺房細胞で活動性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６； Ｏｒｎｉｔｚら， １９８６． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９； ＭａｃＤｏｎａｌｄ， １９８７， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）； 膵臓のβ細胞で活動性のインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）；リンパ細胞で活動性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， １９８４， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８； Ａｄａｍｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８； Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞中で活動性のマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓中で活動性のアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６）；肝臓中で活動性のα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， １９８５． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８； Ｈａｍｍｅｒら， １９８７， Ｓｃｉｅｎｃｃ ２３５：５３−５８）；肝臓中で活動性のα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら， １９８７， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）；骨髄細胞中で活動性のβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０； Ｋｏｌｌｉａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の希突起神経膠細胞中で活動性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， １９８７， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋中で活動性のミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；および視床下部で活動性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００６８】
宿主細胞内でのα２Ｍ受容体の発現効率は、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β−アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅａｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４； Ｇｏｒｍａｎ， １９９０， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １：３６−４７）。
【００６９】
発現ベクターはまた、２つ以上のタイプの宿主でのベクターの維持と複製を行うことのできる、もしくはそのベクターを宿主の染色体中に組み入れることのできる配列をも含むことができる。そのような配列としては、限定はされないが、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、およびテロメアＤＮＡが含まれる。また、少なくとも２つのタイプの宿主細胞中で複製し維持されうるシャトルベクターを用いることも有利である。
【００７０】
さらに、発現ベクターは、α２Ｍ受容体をコードするＤＮＡを含んでいる宿主細胞を最初に単離もしくは同定するための選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。α２Ｍ受容体の長期にわたる高収率の産生のためには、哺乳類細胞における安定した発現が好ましい。哺乳類細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋｉとＳｚｙｂａｌｓｋｉ， １９６２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：８１７）の遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、もしくはａｐｒｔ−細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も次のものの選択に用いることができる：ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）、この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら， １９８０， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸への耐性を付与する（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， １９８１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， １９８４， Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。他の選択マーカー、例えば、限定はされないが、ヒスチジノールおよびＺｅｏｃｉｎＴＭも用いることができる。
【００７１】
α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドをコードするＤＮＡ配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、調節機能を有するＤＮＡ配列、例えばプロモーターなどを、α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドをそれぞれコードするＤＮＡ配列に結合しなければならない。これを行うためには、当業界でよく知られた技法を用いて、適切な制限酵素切断部位を提供するリンカーもしくはアダプターを、α２Ｍ受容体をコードするｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡの末端に連結することができる（Ｗｕら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３４３−３４９）。制限酵素を用いた切断を行った後、連結前に、一本鎖のＤＮＡ末端を消化するかフィルインすることによって平滑末端が作られるように改変することができる。あるいはまた、所望の制限酵素切断部位は、所望の制限酵素切断部位を含んでいるプライマーを用いたＰＣＲによってそのＤＮＡを増幅させて、ＤＮＡの断片中に導入することができる。
【００７２】
ある実施形態においては、調節領域と機能的に連結されたα２Ｍ受容体配列を含んでなる発現構築物を、それ以上クローニングすることなく、α２ＭＲの発現および産生のための適切な宿主細胞中に直接的に導入することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。発現構築物にはまた、α２Ｍ受容体配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするＤＮＡ配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのα２Ｍ受容体の増殖と発現のために、適切な宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【００７３】
α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドをコードするクローン化されたヌクレオチド配列を含んでいる発現構築物を、当業界では公知の種々の技法によって宿主細胞内に導入することができ、そのような技法としては、限定されないが、原核細胞には細菌の形質転換（Ｈａｎａｈａｎ， １９８５， 「ＤＮＡ クローニング、実際的なアプローチ」”ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， １：１０９−１３６）、および真核細胞にはリン酸カルシウム介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら， １９７７， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）、リポソーム介在トランスフェクション（Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら， １９８２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６−１６８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｌｆｆら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３３４４）、およびマイクロインジェクション（Ｃａｐｐｅｃｈｉ， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：４７９−４８８）が含まれる。
【００７４】
適切にプロセッシングされたα２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドの長期にわたる高収率の産生には、哺乳類細胞中での安定な発現が好ましい。α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンド、またはα２ＭＲ−ペプチド複合体を安定に発現する細胞系は選択マーカーを含有するベクターを用いて操作することができる。限定としてではなく例示としては、発現構築物の導入後、操作された細胞を１〜２日間、栄養分に富む培地中で増殖させ、次いで選択培地に換える。発現構築物中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、最適な形としては細胞が安定にその発現構築物を染色体中に組み込み、培養下で増殖して細胞系へと増えることを可能にする。そのような細胞は長期間培養することができ、一方目的の遺伝子産物は連続的に発現され続ける。
【００７５】
その組換え細胞は、標準的な温度、インキュベーション時間、吸光度、および培地組成の条件下で培養することができる。あるいはまた、組換え抗原性細胞は、癌細胞もしくは感染細胞の必要とする栄養素要求性および生理学的要求性に匹敵する条件下で培養することができる。しかし、組換え細胞の増殖条件はα２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンド、または抗原ペプチドの発現のための条件とは異なる可能性がある。
【００７６】
５．１．２　ペプチド合成
α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドの配列を含むペプチドおよびポリペプチドを調製するための、組換え技法とは異なる方法にはペプチド合成がある。例えば、受容体結合ドメインを含んでなるＨＳＰもしくはα２Ｍペプチドの一部分に対応するペプチド、これは本明細書で述べる治療方法においてアンタゴニストとして用いることができるものだが、このペプチドはペプチド合成機を用いて合成することができる。本明細書で述べた治療方法に有用なα２Ｍ受容体配列に対応する合成ペプチドも合成によって調製することができる。従来のペプチド合成法もしくはその他の当業界ではよく知られた合成プロトコールを用いることができる。
【００７７】
例えば、α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンド、またはそれらの類似体、突然変異タンパク質、断片、もしくは誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に述べられている方法と類似の方法を用いて固相ペプチド合成で合成することができる。合成の際に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、Ｃ末端で不溶性のポリマー支持体（例えばポリスチレンビーズ）に連結された、成長しつつあるポリペプチド鎖に段階的に添加することができる。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸をジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させて活性化させたそのα−カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化されたカルボキシル基へ遊離アミノ基が結合することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基としては、酸に対して不安定なＢｏｃ、および塩基に対して不安定なＦｍｏｃが含まれる。適切な化学反応法、樹脂、保護基、保護アミノ酸、および試薬については当業界ではよく知られており、本明細書中では詳述しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９， 「固相ペプチド合成：実際的なアプローチ」”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， 「ペプチド化学、実際的教科書」”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ”， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。
【００７８】
この結果得られたα２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドペプチドの精製は、従来法、例えばゲル透過を用いた調製的ＨＰＬＣ、分配および／もしくはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて行われる。適切なマトリックスおよびバッファーの選択は当業界ではよく知られており、本明細書では詳述しない。
【００７９】
さらに、α２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドタンパク質の類似体および誘導体は化学的に合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体をα２Ｍ受容体、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンドの配列中に置換もしくは付加するものとして導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般にアミノ酸類似体とされるものが含まれる。
【００８０】
５．１．３　α２Ｍ受容体−ＨＳＰ複合体に特異的な抗体
α２Ｍ受容体のエピトープ、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体のエピトープ、または該受容体もしくは該受容体複合体の保存された変異体もしくはペプチド断片のエピトープを特異的に認識することのできる抗体を産生する方法をここに記載する。そのような抗体は本発明の治療方法および診断方法に有用である。
【００８１】
そのような抗体としては、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上述の抗体のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。そのような抗体は、例えば、生物学的サンプル中のα２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体の検出に用いることができる。そのような抗体はまた、例えば、第５．２節で後述する、試験化合物がＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用に及ぼす影響を評価するために、化合物スクリーニング計画と共に用いることができる。
【００８２】
抗α２Ｍ受容体複合体抗体は、さらに、異常な受容体産物活性を阻害する方法として使用することができる。こうして、そのような抗体はＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患（例えば、自己免疫疾患）の治療方法の一環として利用することができる。
【００８３】
α２Ｍ受容体もしくは受容体複合体に対する抗体の産生には、種々の宿主動物にα２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体またはその一部分を注射することによって、該動物を免疫する。α２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体の抗原性を示す部分は当業界で既知のアルゴリズムによって容易に予測することができる。
【００８４】
宿主動物としては、限定はされないが、ウサギ、マウス、およびラットを多数のうちのわずかであるが挙げることができる。宿主の動物種の如何によって、種々のアジュバントを、免疫応答を増強させるために用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有効である可能性のあるヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが含まれる。
【００８５】
ポリクローナル抗体とは、ある抗原、例えばα２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体などで免疫した動物の血清由来の抗体分子の一様でない集団、もしくはそれの抗原性機能を有する誘導体である。ポリクローナル抗体の産生には、上述のような宿主動物にα２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体またはそれらの一部分を、これも上述のアジュバントを補充して注射することによって、該動物を免疫する。
【００８６】
モノクローナル抗体はある特定の抗原に対する抗体の一様な集団であり、それは培養下の連続細胞系によって抗体分子の産生を行ういかなる技法によっても得ることができる。そのような技法としては、限定はされないが、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； および米国特許第４，３７６，１１０号）のハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２； Ｃｏｌｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら， １９８５， 「モノクローナル抗体と癌治療」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ．７７−９６）が含まれる。そのような抗体は免疫グロブリンのどのクラスであってもよく、そのクラスとしてはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのいかなるサブクラスも含まれる。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの高力価のｍＡｂの産生を行うことが産生方法として好ましい。
【００８７】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を用いることができ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４）、それは、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とスプライスすることによるものである。キメラ抗体とは、この分子の異なる部分が異なる動物種に由来するものであり、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などである（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら， 米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら， 米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと；これらはその全体を参照により本明細書中に組み入れる）。
【００８８】
本発明のまた別の実施形態においては、モノクローナル抗体は無菌動物で産生させることができる（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８９／１２６９０， １９８９年１２月１２日公開を参照）。本発明では、ヒト抗体を用いることができ、これはヒトハイブリドーマを用いて得ることができ（Ｃｏｔｅら， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０：２０２６−２０３０）、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＢＶウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって得ることができる（Ｃｏｌｅら， １９８５， 「モノクローナル抗体と癌治療」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． ｐｐ．７７−９６）。「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を用いることができ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４：４５２−４５４）、それは、α２Ｍ受容体−ＨＳＰ複合体に特異的なマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とスプライスすることによるものであるが、このような抗体は本発明の範囲内にある。
【００８９】
ヒト化抗体も提供される（Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号を参照）。免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３カ所の超可変領域が介在する「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの長さは正確に定められている（「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列」”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｋａｂａｔ， Ｅ．ら， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９８３）を参照のこと）。簡潔に記せば、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物種由来の１個以上のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、ヒト以外の動物種由来の抗体分子である。このようなＣＤＲをグラフトした抗体を種々の抗原に対して構築することが成功を収めており、例えばＱｕｅｅｎら（１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９）が報告しているＩＬ−２受容体に対する抗体；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３）が報告している細胞表面受容体ＣＡＭＰＡＴＨに対する抗体；Ｃｏら（１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：２８６９）が報告しているＢ型肝炎に対する抗体；ならびにＴｅｍｐｅｓｔら（１９９１， Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６７）が報告しているＲＳウイルスのウイルス抗原に対する抗体が挙げられる。ヒト化抗体はヒトでの治療用途には最も好ましい。
【００９０】
あるいはまた、一本鎖抗体産生のための技法として報告されているものを（米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６； Ｈｕｓｔｏｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３； およびＷａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）、α２Ｍ受容体もしくはＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体またはそれらの部分に対する一本鎖抗体を産生させるために適応させることができる。一本鎖抗体はＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントをアミノ酸の架橋を介して連結させることによって形成され、その結果一本鎖のポリペプチドが得られる。
【００９１】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは既知の方法によって作成することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定はされないが：抗体分子のペプシン消化によって作成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元して作成することのできるＦａｂフラグメントが含まれる。あるいはまた、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を行いうるようにＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１３８１）。
【００９２】
α２Ｍ受容体に対する抗体は、今度はα２Ｍ受容体を「模倣した」抗イディオタイプ抗体を、当業者にはよく知られた技法を用いて作成するために用いることができる（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎとＢｏｎａ， １９９３， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）：４３７−４４４； およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ， １９９１， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（８）：２４２９−２４３８）。例えば、α２Ｍ受容体ＥＣＤと結合して、ＨＳＰのα２Ｍ受容体への結合を競合的に阻害する抗体は、ＥＣＤを「模倣し」、それゆえにＨＳＰと結合してそれを中和する抗イディオタイプを作成するために用いることができる。そのような、中和能のある抗イディオタイプ抗体もしくはその抗イディオタイプ抗体Ｆａｂフラグメントは、天然のリガンドを中和し、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患、例えば免疫疾患、増殖性疾患、および感染症などの治療を行う治療レジメで用いることができる。
【００９３】
あるいはまた、α２Ｍ受容体活性のアゴニストとして作用しうるα２Ｍ受容体に対する抗体を作成することができる。そのような抗体はα２Ｍ受容体に結合し、該受容体のシグナル伝達活性を活性化することとなる。さらに、α２Ｍ受容体活性のアンタゴニストとして作用する抗体、すなわちα２Ｍ受容体の活性化を阻害する抗体は、自己免疫疾患、癌などの増殖性疾患、および感染症の治療に特に有用なものとなろう。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストをアッセイするための方法は下記の第５．２節に詳細に述べる。
【００９４】
５．２　α２Ｍ受容体と相互作用する化合物を同定するためのアッセイ法
本発明は、α２Ｍ受容体がＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体を認識し、そのような抗原性分子を免疫系の細胞に提示し免疫応答を引き起こす目的で、その細胞内に複合体を輸送する、という発見に基づいたものである。従って、受容体と相互作用する、または受容体の機能を増強もしくは阻止する化合物を同定する方法は本発明に包含される。本発明は下記の小節に述べるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系を提供し、それらの系は、α２Ｍ受容体と相互作用する、またはα２Ｍ受容体の活性およびα２Ｍ受容体のＨＳＰもしくはＨＳＰ−ペプチド複合体との相互作用をモジュレートする化合物もしくは組成物を同定するために用いることができる。
【００９５】
本発明はα２Ｍ受容体と相互作用する、もしくはＨＳＰのα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする小分子、タンパク質、およびその他の化合物の同定に有用なスクリーニング方法を提供する。そのような化合物はα２Ｍ受容体遺伝子もしくは遺伝子産物と種々の親和性で結合することができ、ｉｎ ｖｉｖｏでの受容体活性の調節物質として働き、これは免疫応答をモジュレートするという有用な治療用途を有する。例えば、受容体機能を阻害するある種の化合物は、ＨＳＰの細胞からの放出によって引き起こされる破壊的な免疫応答をダウンレギュレートするために用いることができる。
【００９６】
候補薬剤を、α２Ｍ受容体と相互作用する能力、もしくはα２Ｍ受容体の発現および活性をモジュレートする能力についてスクリーニングする方法は、本発明者らの発見である、上記受容体およびＨＳＰもしくはＨＳＰ−ペプチド複合体の結合および認識におけるその役割に基づいてデザインすることができる。α２Ｍ受容体タンパク質、核酸、および誘導体は、ＨＳＰタンパク質、誘導体、もしくは核酸と特異的に結合し、それゆえに、免疫応答をモジュレートするためのα２Ｍ受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとして使用しうる分子を検出するスクリーニングアッセイ方法で用いることができる。好ましい実施形態においては、そのようなアッセイ法は、抗自己免疫疾患薬、抗癌剤、および抗感染薬（抗ウイルス薬および抗生物質）、または薬物開発におけるリード化合物としての有用性をもちうる分子をスクリーニングするために行われる。例えば、α２Ｍ受容体核酸を発現する組換え細胞は、これらのアッセイ法でＨＳＰのα２Ｍ受容体への結合を妨げる分子のスクリーニングのために、α２Ｍ受容体を組換えで産生させるために用いることができる。同様の方法をα２Ｍ受容体誘導体もしくは核酸に結合する分子をスクリーニングするために用いることができる。上述のことを行うために用いることのできる方法は当業界では一般的に知られている。
【００９７】
α２Ｍ受容体と特異的に結合することのできる化合物は免疫療法に有用なものとなりうる。一つの実施形態においては、α２Ｍ受容体と特異的に結合する化合物を同定するためのアッセイ法が開示され、その方法は：（ａ）α２Ｍ受容体を１種以上の試験化合物と、結合を起こさせる条件下で接触させ；（ｂ）α２Ｍ受容体と特異的に結合する能力のある化合物が免疫療法に有用な化合物として同定されることとなるように、α２Ｍ受容体と特異的に結合する１種以上の試験化合物を同定すること、を含んでなる。
【００９８】
免疫療法に有用な化合物を同定するための、本発明に包含される別の方法では、α２Ｍ受容体リガンドのα２Ｍ受容体への結合をモジュレートする化合物を同定することに関するものである。本明細書で用いている「α２Ｍ受容体リガンド」という用語はα２Ｍ受容体と結合することのできる分子を意味する。そのようなα２Ｍ受容体リガンドには、限定はされないが、α２Ｍおよびα２Ｍ複合体、熱ショックタンパク質および熱ショックタンパク質複合体、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ならびに外毒素が含まれる。そのようなリガンドは典型的にはα２Ｍ受容体と結合すると細胞によるエンドサイトージスによって細胞内に取り込まれる。その方法は：（ａ）１種以上の試験化合物の存在下で、α２Ｍ受容体をα２Ｍ受容体リガンド、もしくはその断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と接触させ；（ｂ）α２Ｍ受容体と結合したα２Ｍ受容体リガンド、もしくはその断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体の量を測定し、この（ｂ）で測定したα２Ｍ受容体リガンドの結合量が、試験化合物不在の条件下で測定したα２Ｍ受容体の結合量とは異なっている場合には、α２Ｍ受容体に対するα２Ｍ受容体リガンドの結合をモジュレートする免疫療法に有用な化合物が同定されることとなる、各ステップを含んでなる。
【００９９】
別の実施形態においては、α２Ｍ受容体とα２Ｍ受容体リガンドとの間の相互作用をモジュレートする、免疫療法に有用な化合物を同定するための方法が本発明によって提供される。その方法は：（ａ）α２Ｍ受容体を１種以上の試験化合物と接触させ；（ｂ）α２Ｍ受容体の活性もしくは発現のレベルを測定し、この（ｂ）で測定した活性もしくは発現のレベルが１種以上の試験化合物不在の条件下でのα２Ｍ受容体活性のレベルとは異なる場合には、α２Ｍ受容体とα２Ｍ受容体リガンドとの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定されることとなる、各ステップを含んでなる。
【０１００】
別の実施形態においては、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物を同定するためのアッセイ法が開示される。そのアッセイ法は：試験化合物をＨＳＰおよびα２Ｍ受容体と接触させ；（ｂ）α２Ｍ受容体の活性もしくは発現のレベルを測定し、この（ｂ）で測定した活性もしくは発現のレベルが試験化合物不在の条件下でのα２Ｍ受容体活性のレベルとは異なる場合には、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定されることとなること、を含んでなる。同定された化合物がＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用を妨害するアンタゴニストであるような別の実施形態においては、該方法は、前記レベルがＨＳＰとα２Ｍ受容体との相互作用を妨害するかどうかを調べるステップをさらに含んでなる。
【０１０１】
別の実施形態においては、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物を同定するための細胞に基づく方法が開示される。この方法は：（ａ）試験化合物を熱ショックタンパク質およびα２Ｍ受容体発現細胞と接触させ：（ｂ）その細胞内でのα２Ｍ受容体活性もしくは発現のレベルを測定し、この（ｂ）で測定した活性もしくは発現レベルが試験化合物不在の条件下でのα２Ｍ受容体活性のレベルとは異なる場合には、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体介在プロセスをモジュレートする化合物が同定されることとなる、各ステップを含んでなる。
【０１０２】
別の実施形態においては、α２ＭＲと相互作用する化合物、もしくはＨＳＰのα２ＭＲへの結合をモジュレートする化合物を同定するための受容体−リガンド結合アッセイが提供される。そのような方法の１つでは：（ａ）ＨＳＰをα２Ｍ受容体、もしくはその断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と試験化合物の存在下で接触させ；（ｂ）α２ＭＲもしくはその断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と結合している熱ショックタンパク質の量を測定し、この（ｂ）で測定した熱ショックタンパク質の結合量が試験化合物不在の条件下での熱ショックタンパク質の結合量とは異なる場合には、ＨＳＰのα２ＭＲへの結合をモジュレートする化合物が同定されることとなること、を含んでなる。
【０１０３】
別の実施形態においては、α２ＭＲ発現細胞による抗原提示をモジュレートする化合物を同定するための方法が本発明によって提供される。一つの実施形態においては、そのような方法は：（ａ）１種以上の試験化合物を、α２ＭＲ発現細胞と、α２ＭＲリガンドおよび抗原分子を含む複合体との混合物に、α２ＭＲ介在エンドサイトージスが起こる条件下で添加し、（ｂ）α２ＭＲ発現細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定し、この（ｂ）で測定したレベルが、１種以上の試験化合物不在の条件下での該刺激のレベルと異なる場合には、α２ＭＲ発現細胞による抗原提示をモジュレートする分子が同定されることとなること、を含んでなる。別の実施形態においては、試験化合物を、α２ＭＲ発現細胞と、抗原分子に非共有結合で会合しているＨＳＰからなる複合体との混合物に、α２ＭＲ介在エンドサイトージスを起こさせる条件下で添加し、α２ＭＲ発現細胞による抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の刺激のレベルを測定し、その測定したレベルが試験化合物不在の条件下での該刺激のレベルと異なる場合には、ＨＳＰが介在するα２ＭＲ発現細胞による抗原提示をモジュレートする分子が同定されることとなる。
【０１０４】
本発明のアッセイ法はまず小スケール（すなわち、試験管内）で最適化し、その後スケールアップしてハイスループットのアッセイ法とすることができる。種々の実施形態において、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ法は精製した構成成分もしくは細胞溶解物を用いて行うことができる。他の実施形態においては、該スクリーニングアッセイ法を培養下のまたはモデル動物中のインタクト細胞で行うことができる。本発明では、本明細書に記載したｉｎ ｖｉｔｒｏでα２Ｍ受容体の活性をモジュレートすることが示された試験化合物は、さらにｉｎ ｖｉｖｏでアッセイされることとなり、そのようなアッセイには、その試験化合物がｉｎ ｖｉｖｏでも同様の効果を与えるか調べるための、また、試験化合物が抗原提示、サイトカイン放出、細胞内Ｃａ＋＋の放出、Ｔ細胞の細胞傷害性、腫瘍の進行、正もしくは負の調節物質の蓄積または分解、細胞増殖などに及ぼす影響を調べるための、培養細胞および動物モデルが含まれる。
【０１０５】
５．２．１　α２Ｍ受容体リガンド結合アッセイ
本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法は、α２ＭＲと相互作用する、もしくはＨＳＰとα２ＭＲとの相互作用をモジュレートする、ペプチドおよび有機の非タンパク質分子をはじめとする化合物および組成物を同定するために用いることができる。組換え化合物、合成化合物、もしくはその他の外来性化合物が結合能を有している可能性があり、それ故、医薬品の候補となりうる。あるいはまた、該タンパク質および化合物には、同定された遺伝子およびタンパク質とｉｎ ｖｉｖｏで相互作用するような内因性細胞性成分が含まれる。そのような内因性成分は医薬品および治療法による介入に対しての新たな標的を提供する可能性がある。
【０１０６】
好ましい実施形態においては、天然のおよび／または合成の化合物（例えば、小分子もしくはペプチドのライブラリー）は双方とも、α２Ｍ受容体との相互作用について、および／またはα２Ｍ受容体活性のモジュレーションについてスクリーニングすることができる。別の一連の実施形態においては、細胞溶解物もしくは組織ホモジネートを、正常もしくは突然変異型のα２Ｍ受容体遺伝子およびα２Ｍ受容体ポリペプチドのうちの１種と結合するタンパク質もしくはその他の化合物が存在するか否かスクリーニングすることができる。
【０１０７】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法は、α２Ｍ受容体と相互作用する、および／またはα２Ｍ受容体とＨＳＰとの相互作用をモジュレートする小分子、ペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体、および断片を同定するために用いることができる。そのような化合物は、α２Ｍ受容体リガンド（例えば、ＨＳＰおよびＨＳＰ複合体など）の細胞表面受容体による取り込みに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして用いることができる。例えば、α２Ｍ受容体−リガンド相互作用をモジュレートするような化合物としては、限定はされないが、α２Ｍ受容体に結合し、そのことによってリガンド、例えばＨＳＰおよびＨＳＰ複合体などのその受容体への結合を阻害する（アンタゴニスト）もしくは増強する（アゴニスト）化合物、ならびに、リガンド、例えばＨＳＰなどに結合し、そのことによってリガンドの受容体への結合を妨げるかもしくは増強する化合物が含まれる。α２Ｍ受容体遺伝子の発現に影響を及ぼすことにより、α２Ｍ受容体遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（そのような分子としては、例えば、転写に影響を与えるかもしくはスプライシングを妨害して、完全長のもしくはトランケートされた形のα２Ｍ受容体の発現がモジュレートされることとなるような、タンパク質もしくは小さな有機分子などが含まれる）も本発明のスクリーニングで同定することができる。さらに、ここに記載のアッセイ法はまた、α２Ｍ受容体リガンド（例えば、ＨＳＰ）のα２Ｍ受容体による取り込みをモジュレートする化合物（例えば、α２Ｍ受容体シグナル伝達系路の下流のシグナル伝達に影響を及ぼす化合物）を同定することもできることは注目すべきである。α２Ｍ受容体の下流のシグナル伝達イベントに影響を及ぼし、それゆえ免疫応答に際しての該受容体の作用をモジュレートするような化合物の同定と使用は本発明の範囲内にある。
【０１０８】
α２Ｍ受容体遺伝子の発現に影響を及ぼすことにより、α２Ｍ受容体遺伝子活性に影響を及ぼす化合物（そのような分子としては、例えば、転写に影響を与えるか、もしくはスプライシングを妨害して、完全長のもしくはトランケートされた形のα２Ｍ受容体の発現がモジュレートされることとなるような、タンパク質もしくは小さな有機分子などが含まれる）も本発明のスクリーニングで同定することができる。しかし、ここに記載のアッセイ法はまた、α２Ｍ受容体シグナル伝達をモジュレートする化合物（例えば、下流のシグナル伝達に影響を及ぼす化合物、例えばリガンドのα２Ｍ受容体への結合によって活性化されるエンドサイトーシス活性のインヒビターもしくはエンハンサーなど）を同定することもできることは注目すべきである。α２Ｍ受容体の下流のシグナル伝達イベントに影響を及ぼし、それゆえアレルゲン性応答に及ぼすα２Ｍ受容体の作用をモジュレートするような化合物の同定と使用は本発明の範囲内にある。
【０１０９】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法は、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体相互作用を含めて、リガンド−受容体相互作用をモジュレートする、すなわち妨害もしくは増強する化合物を検出するためにデザインされている。下記に詳述するとおり、そのようなアッセイ法は、ハイスループットスクリーニング法に適応させることのできる、結合アッセイなどの機能的アッセイ法である。
【０１１０】
結合アッセイ法は、リガンド（例えばＨＳＰ）とα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする化合物を同定するために用いることができる。本発明の１態様においては、該スクリーニング法はα２Ｍ受容体とリガンド（例えば、ＨＳＰもしくはＨＳＰ由来のペプチド、α２Ｍ、もしくは別のα２Ｍ受容体リガンドなど）との相互作用を破壊する化合物を同定するためにデザインすることができる。そのような化合物は、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患および状態、例えば免疫疾患、増殖性疾患、および感染症などのアンタゴニストを作るためのリード化合物として有用なものとなろう。
【０１１１】
結合アッセイは直接的結合アッセイもしくは競合的結合アッセイのいずれかで行うことができる。直接的結合アッセイにおいては、試験化合物はα２Ｍ受容体との結合、またはα２Ｍ受容体リガンド（例えばＨＳＰなど）との結合について試験される。その後、第２のステップでその試験化合物はリガンド−α２Ｍ受容体相互作用をモジュレートする能力があるか試験される。他方、競合的結合アッセイでは、α２Ｍ受容体との結合について、リガンド（すなわちＨＳＰ）と競合する試験化合物の能力を評価する。
【０１１２】
直接的結合アッセイにおいては、リガンドおよび／またはα２Ｍ受容体のいずれかを、試験化合物とリガンドもしくは受容体との結合を可能にする条件下で、試験化合物と接触させる。その結合は溶液中もしくは固相表面上で起こすことができる。その試験化合物があらかじめ検出用の標識をもつものであることが好ましい。標識には検出可能な化合物であればどのようなものでも用いることができ、例えば、限定はされないが、発光物質、蛍光物質、または放射性同位体もしくはそれを含有する基、または酵素や色素などの非同位体標識が挙げられる。結合が起こるのに十分な時間インキュベートした後、その反応液を、過剰のもしくは非特異的に結合した試験化合物を除去する条件および操作に付す。典型的には、そのような操作としては適切なバッファーでの洗浄が含まれる。最後に、リガンド−試験化合物（例えば、ＨＳＰ−試験化合物）もしくはα２Ｍ受容体−試験化合物複合体の存在を検出する。
【０１１３】
競合的結合アッセイでは、試験化合物を、リガンド（例えばＨＳＰ）とα２Ｍ受容体との結合を破壊もしくは増強するその能力についてアッセイする。標識したリガンド（例えばＨＳＰ）をα２Ｍ受容体またはその断片もしくは誘導体と混合し、試験化合物を添加してあるいは添加しないで、それらの間の相互作用が通常は起こると考えられる条件下に置く。α２Ｍ受容体と結合する標識リガンド（例えばＨＳＰ）の量を、試験化合物の存在下もしくは不在下での結合の量と比較する。
【０１１４】
好ましい実施形態においては、複合体の形成および検出を容易にするために、結合アッセイは固相表面上に固定化された１種以上の成分を用いて行われる。種々の実施形態においては、固相支持体は、限定はされないが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミド、およびアガロースとすることができる。支持体の形態としてはビーズ、膜、微粒子、またはマイクロタイタープレート、試験管、もしくはその他の反応容器のような反応容器の内表面が含まれる。α２Ｍ受容体もしくはその他の成分の固定化は、共有結合または非共有結合を介して行うことができる。一実施形態においては、その結合は間接的なもの、すなわち、結合した抗体を介するものとすることができる。別の実施形態においては、α２Ｍ受容体および陰性対照を、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのエピトープでタグ付けして、固相表面への結合が、抗ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような市販の抗体によって媒介されうるようにする。
【０１１５】
例えば、そのようなアフィニティー結合アッセイは固相支持体上に固定化したα２Ｍ受容体を用いて行うことができる。典型的には、結合反応の非固定化成分、この場合はリガンド（例えばＨＳＰ）もしくは試験化合物のいずれか、は検出が行えるように標識される。種々の標識法が利用可能であり、例えば、発光物質、発色団、蛍光物質、または放射性同位体もしくはそれを含有する基、ならびに酵素や色素などの非同位体による標識を用いることができる。好ましい実施形態においては、試験化合物を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）から入手できる）などの蛍光団で標識する。
【０１１６】
その後、標識された試験化合物、もしくはリガンド（例えばＨＳＰ）＋試験化合物は、固相支持体と、特異的な結合が起こるような条件下で接触させる。結合反応が起こった後、未結合のおよび非特異的に結合した試験化合物を、表面を洗浄することによって分離する。結合パートナーの固相への結合は、当業者には既知の種々の方法で行うことができ、そのような方法としては、限定はされないが、化学的架橋、プラスチック表面への非特異的接着、固相表面に結合させた抗体との相互作用、結合パートナー（例えばビオチン）に結合させたリガンドと固相に結合させたリガンド結合タンパク質（例えばアビジンもしくはストレプトアビジン）との間の相互作用、などが含まれる。
【０１１７】
最後に、固相表面上に残存する標識は、当業界では既知の何らかの検出方法によって検出することができる。例えば、試験化合物が蛍光団で標識されていれば、複合体の検出にはフルオリメーターを用いることができる。
【０１１８】
好ましくは、α２Ｍ受容体は、結合アッセイに添加する際には、α２Ｍ受容体を発現しているインタクトな細胞の形、もしくはα２Ｍ受容体を含有している単離された膜の形態で添加される。従ってα２Ｍ受容体に対する直接的結合もしくは試験化合物のリガンド−α２Ｍ受容体複合体（例えば、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体複合体）をモジュレートする能力は、培養下のインタクトな細胞もしくは動物モデルにおいて試験化合物の存在下もしくは不在下でアッセイすることができる。標識リガンド（例えば、ＨＳＰ）を、α２Ｍ受容体を発現している細胞と混合するか、もしくはそのような細胞から得られた粗抽出物中で混合し、試験化合物を添加することができる。単離した膜を使用してα２Ｍ受容体と相互作用する化合物を同定することもできる。例えば、単離膜を用いた典型的な実験では、α２Ｍ受容体を発現するように細胞を遺伝子操作することができる。膜を標準的な技法によって採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイで用いることができる。標識リガンド（例えば、１２５Ｉ−標識ＨＳＰ）を膜と結合させ、その比活性を測定する；特異的結合は過剰の非標識（コールド）リガンドの存在下で行った結合アッセイの結果と比較して測定する。あるいはまた、可溶性α２Ｍ受容体を組換えで発現させて、α２Ｍ受容体と結合する化合物を同定する無細胞系のアッセイにおいて用いる。組換えで発現させたα２Ｍ受容体ポリペプチド、またはα２Ｍ受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）もしくはそれらの１つ以上のサブドメインを含む融合タンパク質は、無細胞系のスクリーニングアッセイ法で用いることができる。あるいはまた、α２Ｍ受容体の１つ以上のＣＤに対応するペプチド、またはα２Ｍ受容体の１つ以上のＣＤを含む融合タンパク質は、α２Ｍ受容体の細胞質部分と結合する化合物を同定する無細胞系のアッセイに用いることができる；そのような化合物はα２Ｍ受容体のシグナル伝達系路をモジュレートするためにおそらく有用であろう。無細胞系のアッセイ法においては、組換えで発現させたα２Ｍ受容体を、固相支持体、例えば試験管、マイクロタイタープレートのウエル、もしくはカラムに、当業界ではよく知られた方法を用いて結合させる（Ａｕｓｕｂｅｌら， 上述の文献、を参照せよ）。次いで試験化合物をそのα２Ｍ受容体への結合能についてアッセイする。
【０１１９】
あるいはまた、結合反応は溶液中で行うことができる。このアッセイ法では、標識成分をその結合パートナーと溶液中で相互作用させる。標識成分とその結合パートナーとの間のサイズの差異によって分離することが可能であるならば、そのような分離は、結合反応の産物を、結合しなかった標識成分は通過するが結合パートナーもしくはそのパートナーと結合している標識成分は通過し得ないような孔径を有する限外ろ過膜を通過させることによって、行うことができる。分離はまた、標識成分の結合パートナーを溶液から捕捉することのできる何らかの試薬、例えばその結合パートナーに対する抗体、リガンド結合タンパク質（結合パートナーにあらかじめ付着したリガンドと相互作用しうるもの）などを用いても行うことができる。
【０１２０】
一つの実施形態においては、例えば、連続的ファージディスプレイライブラリーから得たファージを、プラスチックビーズなどの固相に連結された精製α２Ｍ受容体またはその誘導体、類似体、断片もしくはドメインを含有するカラムを通過させることによって、ファージライブラリーをスクリーニングすることができる。洗浄バッファーのストリンジェンシーを変えることによって、α２Ｍ受容体に高い親和性を有するペプチドを発現するファージを濃縮することができる。カラムから単離されたファージをクローン化し、短いペプチドの親和性を直接的に測定することができる。２個以上のオリゴヌクレオチドの配列を組み合わせて、α２Ｍ受容体に対する結合親和性がより高いものを調べることができる。どのアミノ酸配列がα２Ｍ受容体に対する最も強い結合を与えるかが分かれば、コンピューターモデルを使用してα２Ｍ受容体と試験化合物との間の分子的接触を同定することができる。これによって、そのような接触を模倣することのできる非タンパク質性化合物のデザインが行えるようになろう。そのような化合物は、おそらく該ペプチドと同じ活性を示して治療に用いることができ、製造効率がよく費用もあまりかからないという利点を有するだろう。
【０１２１】
本発明のこの態様の別の特別な実施形態においては、固相支持体はマイクロタイターディッシュに結合させたα２Ｍ受容体を含有する膜である。試験化合物、例えばライブラリーのメンバーを発現している細胞を、マイクロタイターディッシュ中で、ライブラリーのメンバーの発現を可能にする条件下で培養する。該タンパク質（または核酸もしくは誘導体）と結合するライブラリーのメンバーを採取する。そのような方法は、例えばＰａｒｍｌｅｙとＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８； Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７； ＰＣＴ公開 Ｎｏ．ＷＯ９４／１８３１８； およびそこで引用されている文献に報告されている。
【０１２２】
本発明の別の実施形態においては、α２Ｍ受容体もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）と試験化合物との相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。既知のもしくは未知の分子を、α２Ｍ受容体核酸、タンパク質、もしくは誘導体への特異的結合について、結合を起こさせる条件下でアッセイし、次いでα２Ｍ受容体と特異的に結合する分子を同定する。２種の成分の測定は種々の方法で行うことができる。１つのアプローチとしては、それらの成分うちの１種に容易に検出可能な標識を付し、それを試験化合物と共に結合を起こさせる条件下に置き、結合した標識成分を未結合の標識成分から分離させる分離ステップを行う。一実施形態においては、α２Ｍ受容体を標識し、結合を起こさせる条件下で試験薬剤に添加することができる。試験薬剤の結合はポリアクリルアミドゲルによる分析を用いて、試験薬剤の存在下および不在下で形成される複合体を比較することによって測定することができる。
【０１２３】
また別の実施形態においては、リガンド（例えば、ＨＳＰ）のα２Ｍ受容体への結合は動物モデルの体内のインタクトな細胞でアッセイすることができる。標識リガンド（例えば、ＨＳＰ）は、試験化合物と共にまたは試験化合物なしで直接的に動物に投与することができる。リガンド（例えば、ＨＳＰ）の取り込みを試験化合物の存在下または不在下で測定する。これらのアッセイのために、試験化合物が添加される宿主細胞は、α２Ｍ受容体および／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）を発現するように遺伝子操作することができ、その発現は一過性のもの、誘導されるもの、もしくは構成的なもの、または安定なものとすることができる。本発明のスクリーニング方法には、広範な宿主細胞を用いることができ、そのようなものとして、限定はされないが、組織培養細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、および細菌が含まれる。α２Ｍ受容体を発現するマクロファージもしくはその他の細胞などの哺乳類細胞、すなわち単球系の細胞、肝実質細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経細胞、および胎盤の合胞体栄養細胞層は、本発明のアッセイを行うための好適な細胞タイプとなろう。細菌と酵母は比較的培養が容易であるが、哺乳類細胞とは異なる様式でタンパク質をプロセシングする。
【０１２４】
５．２．２　α２Ｍ受容体活性アッセイ
α２ＭＲと相互作用する、もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）とα２ＭＲとの相互作用をモジュレートする試験化合物を同定した後、その試験化合物について、α２ＭＲ活性およびリガンド−α２ＭＲのエンドサイトーシスシグナル伝達経路に及ぼす影響を測定してさらに特徴を調べることができる。例えば、試験化合物をそのリガンド（例えば、ＨＳＰ）／α２ＭＲ細胞活性に及ぼす影響をｉｎ ｖｉｖｏで試験することにより特徴を調べることができる。そのようなアッセイには、下流シグナル伝達アッセイ、抗原提示アッセイ、細胞傷害性Ｔ細胞の抗原特異的活性化についてのアッセイ、および類似のものが含まれる。
【０１２５】
種々の実施形態において、一次アッセイで同定された候補化合物を生来のα２ＭＲシグナル伝達活性に及ぼす影響を試験することができる。例えば、アッセイすることができるα２Ｍ受容体活性化の下流シグナル伝達に及ぼす影響には、限定はされないが、マクロファージの移動と走化性の増大（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５０：２５１−２５９）、プロテイナーゼ合成のダウンレギュレーション、ならびに細胞内カルシウム、イノシトールリン酸、およびサイクリックＡＭＰの上昇（Ｍｉｓｔｒａら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２９０：８８５−８９１）が含まれる。試験することができるその他の生来の免疫応答としては、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＧＭＣＳＦ、およびＴＮＦα）の放出がある。従って、二次アッセイとして、同定された候補化合物のいずれかを、それの存在と不在での上述の活性の変化について試験することができる。
【０１２６】
例えば、１実施形態においては、一次スクリーニングアッセイで同定された候補化合物の特徴をさらに調べるために走化性アッセイを用いることができる。プロテアーゼとの相互作用によって改変されたα２Ｍが、細胞のリガンドへの方向性を持った移動を誘導することができることが知られている。ｉｎ ｖｉｔｒｏで走化性の移動を試験するためには多数の技法を用いることができる（例えば、Ｌｅｏｎａｒｄら， １９９５， 「αおよびβケモカインの測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ α ａｎｄ β Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）」， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６．１２．１−６．１２．２８， Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９５を参照せよ）。例えば、１実施形態においては、候補化合物について、多ウエルのボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）走化性チャンバー内でケモカイン勾配を用いて、受容体を発現している細胞の移動を誘導するα２ＭＲの能力をモジュレートするその化合物の能力を試験することができる。この方法の特定の例においては、リガンド（例えば、ＨＳＰ）／一次スクリーニングで同定されたα２ＭＲアンタゴニストもしくはアゴニスト試験化合物の連続希釈物をボイデン走化性チャンバーの底部のウエルに置く。またその希釈物の一連に一定量のリガンドも添加する。対照として、少なくとも１つのアリコートがリガンド（例えば、ＨＳＰ）のみを含有する。アンタゴニストもしくはアゴニスト化合物のα２ＭＲの走化性活性への寄与は、リガンド（例えば、ＨＳＰ）のみを含有しているアリコートのメンブランフィルターの下方の表面上に移動した細胞数を、試験化合物とリガンド（例えば、ＨＳＰ）を含有しているアリコート中での細胞数と比較することによって測定される。リガンド（例えば、ＨＳＰ）溶液中への試験化合物の添加によってメンブランで検出される細胞数がリガンド（例えば、ＨＳＰ）のみを含有する溶液を用いて検出される細胞数と比較して減少する場合には、α２ＭＲ発現細胞の走化性活性のリガンド（例えば、ＨＳＰ）誘導のアンタゴニストが同定される。
【０１２７】
細胞内のイオン化されたカルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の上昇もα２ＭＲ活性化の指標である（Ｍｉｓｒａら， １９９３， 上述の文献）。従って、別の１実施形態においては、カルシウムフラックスアッセイを、リガンド−α２ＭＲ相互作用のモジュレーターの特徴をさらに調べるための二次スクリーニングとして用いることができる。細胞内カルシウムイオン濃度の測定は、リガンドの存在下で、試験化合物の存在および不在の条件下で、α２Ｍ受容体を発現している細胞において行うことができる。例えば、カルシウムの動員は、細胞内で捕捉される蛍光色素で標識することによって、フローサイトメトリーで検出および測定することができる。Ｉｎｄｏ−１などの蛍光色素はカルシウムと結合すると発光スペクトルの変化を示し、カルシウムが結合した色素によって産生される蛍光と未結合色素によって産生される蛍光との比を細胞内カルシウム濃度の評価に用いることができる。特定の１実施形態においては、細胞をキュベット中で、Ｉｎｄｏ−１を含んでいる培地中で３７℃でインキュベートし、励起させ、蛍光を蛍光計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて測定する。試験化合物の存在および不在の条件で特定の時点でリガンドを添加し、全てのカルシウムを放出させてキレート化するためにＥＧＴＡをキュベットに添加し、その反応を測定する。リガンドの結合によってα２ＭＲを発現している細胞における細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇がもたらされる。アゴニストでは相対的な細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇がもたらされ、一方アンタゴニストでは相対的な細胞内Ｃａ２＋濃度の低下がもたらされる。
【０１２８】
別の実施形態においては、抗原特異的応答アッセイを、α２ＭＲリガンド、例えばＨＳＰもしくはＨＳＰ複合体による抗原性分子の提示に及ぼす候補化合物の影響を検出するために用いることができる。例えば、抗原提示アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏでα２Ｍ受容体と相互作用する能力のある複合体、例えばＨＳＰ−抗原性分子複合体の、α２Ｍ受容体を発現している細胞による取り込みに及ぼす試験化合物の影響を測定するために行うことができる。そのような提示アッセイは当業界では公知であり、既に記載されている（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８）。例えば、１実施形態においては、抗原提示細胞、例えばマクロファージ細胞系（例えばＲＡＷ２６４．７）などを抗原特異的Ｔ細胞と、各々のタイプの細胞を約１０，０００個、約１：１の比率で用いて培地中で混合する。ＨＳＰの複合体（１０μｇ／ｍＬ）およびペプチド抗原、ならびに試験化合物をその細胞に添加し、その培養物を約２０時間インキュベートする。次いで試験化合物の存在および不在の条件でのＴ細胞の刺激を測定することができる。
【０１２９】
別の１実施形態においては、抗原特異的Ｔ細胞の刺激をアッセイすることができる。１実施形態においては、ＩＦＮ−γ放出アッセイを用いることができる。洗浄後、細胞を固定し、透過性とし、ヒトＩＦＮ−γに反応性の、色素標識抗体（ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ）と反応させる。サンプルを、標準的な技法を用いてフローサイトメトリーで分析する。あるいはまた、フィルターイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着定量法）、もしくは酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を、活性化Ｔ細胞によって産生される特定のサイトカインの検出に用いることができる。１実施形態においては、例えば、ニトロセルロースで裏打ちしたマイクロタイタープレートを精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち、抗ＩＦＮ−γでコーティングし、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを避けるためにそのプレートをブロッキングする。抗原で刺激されたＡＰＣ細胞のサンプルをマイクロタイタープレートのウエル上に希釈して入れる。例えばビオチン標識などで標識した二次抗サイトカイン抗体を添加する。次いで、抗体−サイトカイン複合体を、酵素コンジュゲートストレプトアビジンによって検出することができる。サイトカイン分泌細胞は肉眼的、顕微鏡的、もしくは電子的検出法で「スポット」として出現するだろう。別の１実施形態においては、「四量体染色」アッセイ（Ａｌｔｍａｎら， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６）を抗原特異的Ｔ細胞の同定に用いることができる。例えば、特定のペプチド抗原、例えば腫瘍特異的抗原などを含有しているＭＨＣ分子は多量体化されて可溶性のペプチド四量体となり、例えばストレプトアビジンと複合体化することによって標識される。次いでＭＨＣ−ペプチド抗原複合体を刺激されたＴ細胞の集団と混合する。次いで、ＭＨＣ−抗原複合体を認識しそれと結合しているＴ細胞を染色するためにビオチンを用いる。
【０１３０】
５．２．３　本発明でスクリーニングすることのできる化合物
本明細書に記載のスクリーニングアッセイは、α２Ｍ受容体と相互作用する、もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）とα２Ｍ受容体との相互作用をモジュレートする小分子、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体、および断片を同定するために用いることができる。本発明でスクリーニングすることのできる化合物としては、限定はされないが、α２Ｍ受容体のＥＣＤと結合し天然のリガンドによって誘発される活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）か、もしくは天然のリガンドによって誘発される活性を模倣する（すなわちアゴニスト）小分子、ペプチド、抗体およびそのフラグメントおよびその他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ））、ならびに小分子、ペプチド、抗体またはそのフラグメントおよびその他の有機化合物が挙げられる。１実施形態においては、そのような化合物としては、天然のリガンド、例えばＨＳＰ、α２Ｍ、ＬＤＬなどと結合し「中和」することのできる、α２Ｍ受容体のＥＣＤなどのα２Ｍ受容体の配列が挙げられる。別の１実施形態においては、そのような化合物には、α２Ｍ受容体の活性部位と結合しその活性をブロックすることのできる、ＨＳＰ配列および／もしくはα２Ｍ配列などのリガンド配列が含まれる。
【０１３１】
スクリーニングに用いうる化合物としては、限定はされないが、例えば限定はされないがランダムペプチドライブラリーのメンバー；（例えば、Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照せよ）、ならびにＤおよび／またはＬ配置のアミノ酸からなるコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含めた可溶性ペプチドなどのペプチド、リンペプチド（限定はされないが、ランダムなもしくは部分的に縮重のある、指向性リンペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えばＳｏｎｇｙａｎｇら， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照せよ）、抗体（限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、または一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメントを含む）、ならびに小さな有機もしくは無機分子が挙げられる。
【０１３２】
本発明の１実施形態においては、ペプチドライブラリーは、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体などのα２ＭＲ相互作用のモジュレーターのスクリーニングに用いることのできる試験化合物の供給源として用いうる。ランダムもしくはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様性ライブラリーをα２Ｍ受容体と特異的に結合する分子を探すためにスクリーニングすることができる。当業界で公知の多数のライブラリーを用いることができ、そのようなものとしては例えば、化学的に合成したライブラリー、組換え（例えばファージディスプレイライブラリー）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳に基づくライブラリーが挙げられる。
【０１３３】
化学的に合成したライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：８４−８６； Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４； Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０； Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１； Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６； Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２； Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８； Ｓａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２； ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ ９３／２０２４２； ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３に述べられている。
【０１３４】
ファージディスプレイの例は、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１−７１８； Ｌｅｎｓｔｒａ， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５２：１４９−１５７； Ｋａｙら， １９９３，Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５； およびＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日付）に述べられている。
【０１３５】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照せよ）を適応させて用いることができる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）も用いることができる。化学的に変化させたコンビナトリアルライブラリーを生成するためにペプチド中のアミド官能性が過メチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）されているような、用いることができるライブラリーの別の１例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載されている。
【０１３６】
ライブラリーのスクリーニングは一般的に知られている種々の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記のペプチドライブラリーのスクリーニングについて開示している文献を参照せよ：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１ ：２１５−２１８； ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２； ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７； Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７； Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５； Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０； Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６； Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２； Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２； 米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（これらの特許は全てＬａｄｎｅｒらに与えられたもの）； ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３； ならびにＰＣＴ公開Ｎｏ． ＷＯ ９４／１８３１８。
【０１３７】
本発明の別の１実施形態においては、スクリーニングは標識したリガンド（例えば、ＨＳＰ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）系などに添加し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏプライミング反応を進めることによって行うことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳に基づくライブラリーには、限定はされないが、ＰＣＴ公開Ｎｏ． ＷＯ ９１／０５０５８（１９９１年４月１８日付）； およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６に述べられているものが含まれる。
【０１３８】
本明細書に記載の方法で試験し同定することのできる化合物には、限定はされないが、商業的供給者から得られる化合物が含まれ、そのような商業的供給者としては、Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ ５３２３３）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、 Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、 Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． （Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ， ＮＹ）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ， ＴＮ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、 Ｔａｋａｓａｇｏ（Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ， ＮＪ）、ＳＳＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｌｉｆｔｏｎ， ＮＪ）、Ｆｅｒｒｏ （Ｚａｃｈａｒｙ， ＬＡ ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ （Ｓｅｅｌｚｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ １５２７２）が挙げられる。さらに天然の産物のいかなる種類のものも本発明の方法を用いてスクリーニングすることができ、そのような天然の産物としては、微生物、真菌、植物、もしくは動物の抽出物が挙げられる。
【０１３９】
さらに、小分子の試験化合物を含む試験化合物の多様性ライブラリーを用いることができる。例えば、ライブラリーは、Ｓｐｅｃｓ ａｎｄ ＢｉｏＳｐｅｃｓ Ｂ．Ｖ． （Ｒｉｊｓｗｉｊｋ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｎｙ， Ｍｏｓｃｏｗ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｒｕｓｓｉａ）、 Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ Ｉｎｃ． （Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＰＬ３４ ＯＨＷ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、およびＡｓｉｎｅｘ （Ｍｏｓｃｏｗ， Ｒｕｓｓｉａ）から市販されているものを入手できる。
【０１４０】
さらにまた、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリーを用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ）固相もしくは液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィーでの選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、もしくは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５）。小分子の試験化合物を含む試験化合物のコンビナトリアルライブラリーを用いることができ、例えば、ＥｉｃｈｌｅｒおよびＨｏｕｇｈｔｅｎ， １９９５， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ １：１７４−１８０； Ｄｏｌｌｅ， １９９７， Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ２：２２３−２３６； およびＬａｍ， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２：１４５−１６７に開示されているように生成することができる。
【０１４１】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は当業界で見出すことができ、例えば：ＤｅＷｉｔｔら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９； Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０５９； Ｃａｒｅｌｌら， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６ｌ； およびＧａｌｌｏｐら， １９９４． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３中に記載されている。
【０１４２】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号； 第５，４０３，４８４号； および第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）、もしくはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｌｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２； およびＦｅｌｉｃｉ， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）上に提示することができる。
【０１４３】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られている種々の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記のペプチドライブラリーのスクリーニングについて開示している文献を参照せよ：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１ ：２１５−２１８； ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２； ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７； Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７； Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５； Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０； Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６； Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２； Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２； 米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（これらの特許は全てＬａｄｎｅｒらに与えられたもの）； ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３； ならびにＰＣＴ公開Ｎｏ． ＷＯ ９４／１８３１８。
【０１４４】
５．３　免疫療法に有用な、α２Ｍ受容体および／またはα２Ｍ受容体リガンド、例えばＨＳＰなどの断片の同定
本発明はまた、リガンド結合性のα２ＭＲ断片（例えば「ＨＳＰ結合ドメイン」など）、およびその類似体、ムテイン、もしくは誘導体を同定する方法をも包含し、それらは、ＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体などのα２ＭＲリガンド−抗原性ペプチドとの結合およびその取り込みを行うことができる。次いでそのようなリガンド結合性α２ＭＲ断片、例えばＨＳＰ結合ドメインは、上述の第５．２．１節で述べたα２Ｍ受容体／リガンド結合アッセイを用いてｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性について試験することができる。１実施形態においては、熱ショックタンパク質と結合することのできるα２ＭＲ断片を同定するためのそのような方法は：（ａ）熱ショックタンパク質を１種以上のα２ＭＲ断片と接触させ；そして（ｂ）熱ショックタンパク質と特異的に結合するα２ＭＲポリペプチド断片を同定する、ステップを含んでなるものである。
【０１４５】
α２ＭＲのリガンド結合ドメイン、例えばＨＳＰ結合ドメインはリガンド−抗原性ペプチド複合体、例えばＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体などと結合する能力があり、それらはさらに、上述の第５．２．２節で述べたものなどの、ｉｎ ｖｉｖｏでの結合アッセイ、提示アッセイ、またはＣＴＬアッセイを用いて活性について試験することができる。例えば、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスを誘導することのできるα２ＭＲ断片を同定するそのような方法の１つは：（ａ）熱ショックタンパク質をα２ＭＲ断片を発現している細胞と接触させ；そして（ｂ）その細胞内のα２ＭＲ活性のレベルを測定して、この（ｂ）で測定したＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスもしくは活性のレベルがα２ＭＲ断片の不在下でのα２ＭＲ活性のレベルよりも高ければ、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスを誘導することのできるα２ＭＲ断片が同定されたこととなる、ステップを含んでなる。そのようなアッセイでのそれらの挙動の如何によって、そのような分子を投与するかもしくはｉｎ ｖｉｖｏで発現させた場合に、受容体の機能を増強または、あるいはブロックするためのいずれかに用いることができる。例えば、これらのアッセイは、ＨＳＰ−抗原複合体と結合することができ、かつその複合体の抗原提示細胞による取り込みをネガティブに妨害することのできるα２ＭＲのＨＳＰ結合ドメインを同定するために用いることができる。これらのアンタゴニストはＨＳＰの細胞放出によって引き起こされる免疫応答をダウンレギュレートするために用いうる。あるいは、ある特定のα２ＭＲのＨＳＰ結合ドメインをＨＳＰ−抗原複合体の取り込みおよびシグナル伝達を増強するために用いることができる。そのようなアゴニストは被験者に投与するか、または被験者において発現させて、目的の抗原に対する免疫応答を引き出すことができる。
【０１４６】
別の１実施形態においては、本発明は、α２Ｍ受容体（「α２Ｍ受容体結合ドメイン」）、ならびにその類似体、ムテイン、もしくは誘導体と結合し、それに取り込まれることができるようなリガンド断片、例えばＨＳＰ断片などを同定するための方法を包含する。上述のα２Ｍ受容体関連ポリペプチドのアッセイについて述べたように、次いでそのようなα２Ｍ受容体結合ドメインは、上述の第５．２．１節に記載の結合アッセイを用いてｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性について試験することができる。例えば、α２Ｍ受容体と結合することのできる熱ショックタンパク質断片を同定するためのそのような方法の１つは：（ａ）α２Ｍ受容体を１種以上の熱ショックタンパク質断片と接触させ；そして（ｂ）α２Ｍ受容体と特異的に結合する熱ショックタンパク質断片を同定する、ことを含んでなる。
【０１４７】
目的のリガンド断片、例えばＨＳＰ断片をさらに、上述の第５．２．２節に記載したものなどの、ｉｎ ｖｉｖｏでの結合アッセイ、提示アッセイ、もしくはＣＴＬアッセイを用いて細胞において試験することができる。例えば、１実施形態においては、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスを誘導することのできる熱ショックタンパク質断片を同定するためのそのような方法は：（ａ）α２Ｍ受容体断片を熱ショックタンパク質を発現している細胞と接触させ；そして（ｂ）細胞内のα２ＭＲ活性のレベルを測定し、この（ｂ）で測定したＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスもしくは活性のレベルが該熱ショックタンパク質断片の不在下でのα２ＭＲ活性のレベルより高ければ、そのような熱ショックタンパク質断片が同定されたこととなる、ことを含んでなる。あるいは、ＨＳＰの取り込みを低減させるα２Ｍ受容体結合ドメインをα２Ｍ受容体によるＨＳＰの取り込みをブロックするために用いることができる。１実施形態においては、α２Ｍ受容体結合ドメイン配列を含んでなるそのようなＨＳＰ断片を、熱ショックタンパク質α２Ｍ受容体結合ドメインおよび抗原性ペプチド配列から成る組換え融合タンパク質を構築するために用いることができる。そのような組換え融合タンパク質は免疫応答を引き出し、そして免疫疾患および障害を治療もしくは予防するために用いることができる（Ｓｕｚｕｅら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１３１４６−５１）。
【０１４８】
本発明のα２Ｍ受容体断片、類似体、ムテイン、および誘導体、ならびに／またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）断片、類似体、ムテイン、および誘導体は組換えＤＮＡ技法、合成法、または天然のα２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の酵素的もしくは化学的切断によって産生することができる。
【０１４９】
α２Ｍ受容体遺伝子もしくはα２Ｍ受容体リガンド（例えば、ＨＳＰ）遺伝子のコード領域を得るための核酸供給源としては真核細胞のいかなるものでも用いることができる。リガンド（例えば、ＨＳＰ）および／もしくはα２Ｍ受容体をコードする核酸配列は脊椎動物、哺乳類、ならびにヒトを含む霊長類供給源から単離することができる。天然のリガンド（例えば、ＨＳＰ）およびα２Ｍ受容体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は配列データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋなどから通常は入手することができる。
【０１５０】
ＤＮＡは組織、細胞培養物、もしくはクローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から直接的にＤＮＡ増幅もしくは分子クローニングによる当業界では公知の標準的な手順によって得ることができる。ゲノムＤＮＡ由来のクローンにはコード領域に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域が含まれている可能性がある；ｃＤＮＡ由来のクローンにはエキソン配列のみが含まれていることとなろう。好ましい１実施形態においては、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡからα２Ｍ受容体リガンド、例えば、ＨＳＰ、α２Ｍ、またはその他のα２ＭＲリガンドの公知の配列から設計されたプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は目的の遺伝子もしくは遺伝子断片を得るために一般的に用いられている。例えば、任意の所望の長さの断片をコードするヌクレオチド配列は、ペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列に隣接しているＰＣＲプライマーを用いて生成することができる。あるいは、α２ＭＲリガンド、例えば、ＨＳＰ、α２Ｍ、もしくはその他のα２ＭＲリガンド受容体の遺伝子配列は適切な部位で制限エンドヌクレアーゼで（そのような部位が利用できる場合）切断することができ、ペプチド結合ドメインをコードするＤＮＡ断片を放出する。都合の良い制限部位が利用できない場合には、当業界で公知の部位特異的突然変異誘発および／もしくはＤＮＡ増幅法によって、そのような部位を適切な位置に作製することができる（例えば、Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａら， １９９２， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ． １：２７７−２７８を参照せよ）。次いで、リガンド（例えば、ＨＳＰ）遺伝子もしくはα２Ｍ受容体遺伝子の断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、適切な発現ベクター中に連結するが、それらの操作は適切な翻訳リーディングフレームが維持されていることの確認に注意を払う。ゲノムＤＮＡの単離の別法としては、限定はされないが、公知の配列から遺伝子配列それ自体を化学的に合成すること、またはリガンド（例えば、ＨＳＰ）および／もしくはα２Ｍ受容体をコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製することが挙げられる。
【０１５１】
当業界で公知の突然変異誘発技法のいずれかを、発現されたペプチド配列中にアミノ酸置換を作製する目的で、またはさらに操作を容易にするために制限部位を作製／欠失させる目的で、ＤＮＡ配列中の個々のヌクレオチドの改変に用いることができる。そのような技法としては、限定はされないが、化学的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｃ．ら， １９７８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：６５５１）、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ， １９８５， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３−４６３； Ｈｉｌｌら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：５５８−５６８）、ＰＣＲに基づくオーバーラップ伸長（Ｈｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９）、ＰＣＲに基づくメガプライマー突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒら， １９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ８：４０４−４０７）、その他が挙げられる。２本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定分析によって改変を確認することができる。
【０１５２】
組換え技法によるα２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）断片の産生に替わる方法はペプチド合成である。例えば、基質結合ドメインを含んでなる、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドと結合する、α２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の一部分に対応するペプチドは、ペプチド合成機を用いて合成することができる。従来のペプチド合成または当業界で周知の他の合成プロトコールを用いることができる。
【０１５３】
さらに、α２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）の類似体および誘導体を化学的に合成することができる。さらにまた、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を、α２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）配列中に置換もしくは付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。
【０１５４】
α２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）ペプチド、またはその突然変異体もしくは誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９に述べられている手順と類似の手順を用いて固相ペプチド合成によって合成することができる。合成の際に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を伸長しつつあるポリペプチド鎖に段階的に添加してそのＣ末端に連結させ、および不溶性のポリマー支持体、例えばポリスチレンビーズに段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸（このアミノ酸はジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることによって活性化させている）のα−カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化されたカルボキシルに遊離のアミノ基が付着することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基としては、酸に対して不安定なＢｏｃ、および塩基に対して不安定なＦｍｏｃが挙げられる。適切な化学反応、樹脂、保護基、保護アミノ酸、および試薬についての詳細は当業界で周知であり、本明細書中では詳述しない（Ａｔｈｅｒｔｏｎら， １９８９， 「固相ペプチド合成：実際的なアプローチ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ， １９９３， 「ペプチド化学、実用的教科書（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ）」， 第２版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照せよ）。
【０１５５】
得られた断片の精製は、従来の手順、例えばゲル浸透、分配および／もしくはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いた分取ＨＰＬＣを用いて達成される。適切なマトリックスおよびバッファーの選択については当業界で周知であり、本明細書では詳述しない。
【０１５６】
別の１実施形態においては、α２Ｍ受容体断片および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）断片は、天然の、もしくは組換えα２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）分子を化学的にもしくは酵素的に切断させて得ることができる。特定の化学的切断は臭化シアン、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成、その他を用いて行うことができる。また特定の部位で切断するエンドプロテアーゼも用いることができる。そのようなプロテアーゼは当業界で公知であり、そのようなものとしては、限定はされないが、トリプシン、α−キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、パパイン、およびプロテイナーゼＫが挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら， （編） 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １７．４．６−１７．４．８を参照せよ）。目的のα２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）のアミノ酸配列を、これらのプロテアーゼの認識部位について調べることができる。ペプチド結合ドメイン、もしくはペプチド結合断片を放出させることのできる酵素を選択する。次いで、α２Ｍ受容体および／もしくはリガンド（例えば、ＨＳＰ）分子をそのプロテアーゼと、そのプロテアーゼによる消化と特に指定されたペプチド結合断片の放出が可能となる条件下で、インキュベートする。あるいは、そのようなプロテアーゼ消化は盲目的に、すなわち、どの消化産物がペプチド結合ドメインを含んでいるのかが判らない状態で、プロテイナーゼＫもしくはプロナーゼなどの特定のもしくは一般的な特異性を有するプロテアーゼを用いて行うことができる。
【０１５７】
断片が調製されれば、消化産物を上述のとおりに精製し、次いでペプチド結合能、または免疫原性について試験することができる。α２Ｍ受容体−リガンド（例えば、ＨＳＰ）複合体の免疫原性を細胞傷害性試験によって測定する方法は、第５．２．２節に述べている。
【０１５８】
５．４　薬物設計
α２ＭＲと相互作用する、またはα２Ｍ受容体リガンド、例えば、ＨＳＰなどとα２Ｍ受容体との間の相互作用をモジュレートする化合物が同定されれば、そのような化合物をさらに、免疫応答を改変させる能力について調べることができる。特に、例えば、本発明の方法を介して同定された化合物は、ＨＳＰ−α２ＭＲが介在するプロセスおよびＨＳＰ−α２ＭＲ関連疾患、例えば免疫疾患、増殖性疾患、および感染症などの認められている動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで、さらに試験することができる。
【０１５９】
コンピューターモデリングおよび検索技法によって、α２Ｍ受容体とそのリガンド、例えばＨＳＰとの相互作用をモジュレートすることのできる化合物の同定、または既に同定した化合物の改良が可能となる。そのような化合物もしくは組成物を同定した後、活性部位もしくは領域が同定される。そのような活性部位は典型的にはリガンド結合部位でありうる。活性部位は当業界で公知の方法を用いて、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または関連化合物もしくは組成物とその天然のリガンドとの複合体に関する研究から、同定することができる。後者の場合には、化学的もしくはＸ線結晶学的方法を、複合体化されたリガンドが見出される因子上の位置を見つけ出すことによって活性部位を見出すために用いることができる。
【０１６０】
次いで、活性部位の３次元的幾何学的構造が決定される。これは公知の方法で行うことができ、その方法としてはＸ線結晶学的方法が含まれ、この方法で完全な分子構造を決定することができる。他方、固相もしくは液相ＮＭＲを、ある特定の分子内距離を決定するために用いることができる。構造決定のための他の実験方法のいずれのものも部分的もしくは完全な幾何学的構造を得るために用いることができる。幾何学的構造は複合体化したリガンド、それは天然のものもしくは人工のものであるが、それを用いて測定することができ、決定された活性部位の構造の正確性を高めることができる。
【０１６１】
正確性が不完全なもしくは不十分な構造しか決定されない場合には、コンピューターに基づく数値モデリングを、構造を完全なものとするため、もしくはその構造の正確性を改良するために用いることができる。知られているモデリング法のいずれも用いることができ、そのような方法としては、特定の生体高分子、例えばタンパク質もしくは核酸などに特異的なパラメーター化モデル、分子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱集合（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）に基づく統計力学モデル、または結合モデルが挙げられる。モデルのタイプの大多数では、構成原子および基の間の力を示す標準的な分子力場が必要であり、物理化学で公知の力場から選択することができる。不完全なもしくは正確性の低い実験的構造は、これらのモデリング法によって計算される完全でより正確な構造に対する制約として用いることができる。
【０１６２】
最後に、活性部位の構造を実験的に、モデリングによって、またはその組み合わせによって決定した後、候補モジュレーティング化合物を、化合物が含まれているデータベースをそれらの分子構造に関する情報と共に検索することにより同定することができる。そのような検索では、決定した活性部位の構造にマッチし、その活性部位を定義づけている基と相互作用する構造を有する化合物が探し出される。そのような検索は手動で行うこともできるが、好ましくはコンピューターによって行う。この検索によって見出されたこれらの化合物は、α２Ｍ受容体モジュレーティング化合物である可能性があるものである。
【０１６３】
あるいは、これらの方法は、既に知られているモジュレーティング化合物もしくはリガンドから改良されたモジュレーティング化合物を同定するために用いることができる。既知の化合物の組成を改変することができ、その改変の構造に及ぼす影響は、上述の実験的方法およびコンピューターモデリング法を新たな組成に適用するように用いることによって決定することができる。次いでその改変された構造を該化合物の活性部位構造と比較して適合性もしくは相互作用の改善がもたらされたか否かを決定する。この方法では組成中の系統的な変化、例えば側鎖を変化させることによるものなどの変化を迅速に評価して、改変されたモジュレーティング化合物もしくはリガンドで特異性もしくは活性が改良されたものを得ることができる。
【０１６４】
α２Ｍ受容体、またはＨＳＰ、およびその他のα２Ｍ受容体リガンドおよびそれらの類似体のいずれかの活性部位の同定に基づく、モジュレーティング化合物の同定に有用な、さらなる実験的方法およびコンピューターモデリング法は当業者には明らかであろう。
【０１６５】
分子モデリングシステムの例としては、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）が挙げられる。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子動力学機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子同士の挙動の相互作用構築、改変、可視化、および分析を可能にする。
【０１６６】
多数の論文が特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングを総説しており、そのような論文としては、例えばＲｏｔｉｖｉｎｅｎら， （１９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７：１５９−１６６）； Ｒｉｐｋａ（１９８８， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７）； ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ （１９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｉｏｌ． ２９：１１１−１２２）； ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ， ＯＳＡＲ：「薬物設計における定量的構造−活性関係（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」， ｐｐ．１８９−１９３ Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８９； ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ（１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６：１２５−１４０ および １４１−１６２）が挙げられ；そして、核酸成分に対するモデル受容体に関してはＡｓｋｅｗら，（１９８９， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：１０８２−１０９０）が挙げられる。化学物質をスクリーニングし視覚的に示す、その他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ， Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手することができる。これらのプログラムは主として特定のタンパク質に対して特異的な薬物に適用するために設計されてはいるが、ＤＮＡもしくはＲＮＡの領域に対して特異的な薬物の設計にも、その領域が同定さえされていれば、適応させることができる。
【０１６７】
５．５　診断的使用
α２Ｍ受容体は、多数の組織および細胞型上に存在する細胞表面タンパク質であり（Ｈｅｒｚら， １９８８， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：４１１９−２７； Ｍｏｅｓｔｒｕｐら， １９９２， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ２６９：３７５−８２）、α２Ｍ受容体リガンド、例えばＨＳＰおよびＨＳＰ−ペプチド複合体などの特異的取り込みと提示に関与しているものと考えられる。α２Ｍ受容体は当初はそれがｇｐ９６（これはつねに細胞内にあり、壊死性細胞死（アポトーシス性でなく）の結果として放出されるものである）と相互作用するため、熱ショックタンパク質受容体として同定された。従ってα２Ｍ受容体によるｇｐ９６の取り込みは壊死性細胞死のセンサーとして作用しうる。それ自体で、α２Ｍ受容体−リガンド複合体は、癌などの増殖性疾患、自己免疫疾患、および感染症の検出および診断に用いることができる。従って、α２Ｍ受容体タンパク質、その類似体、誘導体、および部分配列、α２Ｍ受容体核酸（およびそれに対して相補的な配列）、ならびに抗α２Ｍ受容体抗体はそのような疾患を検出し診断することにおいて使用される。
【０１６８】
α２Ｍ受容体およびα２Ｍ受容体核酸は、腫瘍形成、癌腫、腺腫などをもたらしうる免疫系疾患、ならびにウイルス性疾患の検出、予後判定、または診断のためのアッセイで用いることができる。
【０１６９】
本発明の分子はイムノアッセイなどのアッセイで、α２Ｍ受容体発現に影響を及ぼす種々の状態、疾患、および障害を検出、予後判定、診断、もしくはモニターするために、またはそれらに対する治療をモニターするために用いることができる。特に、そのようなイムノアッセイは、患者由来のサンプルをＨＳＰ−α２Ｍ受容体特異的抗体と、免疫特異的結合が起こりうる条件下で接触させ、その抗体による免疫特異的結合の量を検出もしくは測定することを含んでなる方法によって実施される。特定の１態様においては、組織切片において、そのような抗体の結合は、異常なα２Ｍ受容体の局在、またはα２Ｍ受容体の異常な（例えば、低値もしくは不在）レベルを検出するために用いることができる。特定の１実施形態においては、α２Ｍ受容体の異常なレベルが疾病の状態を示すものである場合、α２Ｍ受容体に対する抗体は、患者の組織もしくは血清サンプルをα２Ｍ受容体の存在についてアッセイするために用いることができる。「異常なレベル」とは、その疾患を有していない被験者の体の一部分またはその疾患を有していない被験者からの類似のサンプル中に存在しているレベル、または標準的なレベルと比較して、増大しているもしくは低減しているレベルを意味する。
【０１７０】
用いることのできるイムノアッセイとしては、限定はされないが、いくつかを挙げれば、ウエスタンブロット、免疫組織化学的ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。
【０１７１】
またα２Ｍ受容体遺伝子ならびに関連の核酸配列および部分配列（相補的配列を含む）は、ハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。α２Ｍ受容体核酸配列、または少なくとも約８個のヌクレオチドを含んでなるその部分配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、上述のα２Ｍ受容体発現および／もしくは活性の異常な変化を伴う状態、障害、もしくは疾病状態を検出、予後判定、診断、もしくはモニターするために用いることができる。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含んでいるサンプルをα２Ｍ受容体ＤＮＡもしくはＲＮＡとハイブリダイズすることのできる核酸プローブとハイブリダイゼーションが起こりうる条件下で接触させ、その結果起こるハイブリダイゼーションを検出もしくは測定することを含む方法によって実施される。
【０１７２】
特定の実施形態においては、感染もしくは悪性の疾患の際に免疫応答性の低下が関与する疾患および障害を、α２Ｍ受容体タンパク質、α２Ｍ受容体ＲＮＡ、またはα２Ｍ受容体の機能的活性（例えば、ＨＳＰとの結合、抗体結合活性など）のレベルの低下を検出することによって、またはα２Ｍ受容体の発現もしくは活性の低下を引き起こすようなα２Ｍ受容体ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはα２Ｍ受容体タンパク質の突然変異（例えば、α２Ｍ受容体核酸内での転座、α２Ｍ受容体遺伝子内もしくはタンパク質内でのトランケーション、野生型α２Ｍ受容体に対してヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の変化）を検出することによって、診断することができ、またはそのような疾患および障害があることが疑われるときにはスクリーニングすることができ、またはそのような障害が発症する素因を検出することができる。そのような疾患および障害としては、限定はされないが、第５．７節、第５．８節、および第５．９節に述べたものが挙げられる。例として、α２Ｍ受容体タンパク質のレベルはイムノアッセイで検出することができ、α２Ｍ受容体ＲＮＡのレベルはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）で検出することができ、α２Ｍ受容体活性はｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで結合活性を測定することによりアッセイすることができる。α２Ｍ受容体核酸における転座、欠失、および点突然変異は、サザンブロッティング、ＦＩＳＨ、ＲＦＬＰ分析、ＳＳＣＰ、プライマー、好ましくは少なくともα２Ｍ受容体遺伝子の大部分にわたる断片を生成するようなプライマーを用いたＰＣＲ、患者から得たα２Ｍ受容体ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列決定分析などによって検出することができる。
【０１７３】
好ましい１実施形態においては、患者のサンプル中のα２Ｍ受容体ｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルは、悪性疾患もしくは過剰増殖性（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）疾患を有していない被験者から得た類似のサンプル中に存在するレベルと比較して検出もしくは測定する。レベルの低下は、被験者がウイルス感染、悪性疾患もしくは過剰増殖性疾患を発症しうる、または発症する素因を有しうることを示す。
【０１７４】
別の特定の１実施形態においては、細胞の増殖をもたらす免疫応答性の欠如が関与する疾患および障害、または細胞増殖が治療のためには望ましいような疾患および障害は、α２Ｍ受容体タンパク質、α２Ｍ受容体ＲＮＡ、もしくはα２Ｍ受容体の機能的活性（例えば、ＨＳＰとの結合、もしくはα２Ｍ受容体抗体など）のレベルの増加を検出することによって、またはα２Ｍ受容体の発現もしくは活性の増加を引き起こすようなα２Ｍ受容体ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはタンパク質における突然変異（例えば、α２Ｍ受容体核酸における転座、遺伝子もしくはタンパク質におけるトランケーション、野生型α２Ｍ受容体に対するヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の変化）を検出することによって、診断することができ、またはそのような疾患および障害があることが疑われるときにはスクリーニングすることができ、またはそのような障害が発症する素因を検出することができる。そのような疾患および障害としては、限定はされないが、第５．７節、第５．８節、および第５．９節に述べたものが挙げられる。例として、α２Ｍ受容体タンパク質のレベル、α２Ｍ受容体ＲＮＡのレベル、α２Ｍ受容体結合活性、および転座、もしくは点突然変異の存在は、上述のとおり測定することができる。
【０１７５】
特定の１実施形態においては、患者のサンプル中のα２Ｍ受容体ｍＲＮＡもしくはタンパク質のレベルは、障害を有していない被験者から得た類似のサンプル中に存在するレベルと比較して検出もしくは測定することができるが、その障害では、そのレベルの上昇が被験者が自己免疫疾患を有しているか、またはその素因を有していることを示している。
【０１７６】
診断用途のキットもまた提供されており、それは１個以上の容器中に、抗α２Ｍ受容体抗体、および場合によってはその抗体に対する標識結合パートナーを含んでなる。あるいは、その抗α２Ｍ受容体抗体を標識（検出マーカー、例えば、化学発光性、酵素性、蛍光性、もしくは放射性部分を用いて）することができる。また、１個以上の容器中に、α２Ｍ受容体ＲＮＡとハイブリダイズすることのできる核酸プローブを含んでなるキットも提供される。特定の１実施形態においては、キットは１個以上の容器中に、少なくともα２Ｍ受容体核酸の一部分の適切な反応条件下で増幅をプライミングできる一組のプライマー（例えば、その各々が６〜３０ヌクレオチドの範囲の大きさ）［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Ｉｎｎｉｓら， １９９０， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡを参照せよ）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ ３２０，３０８を参照せよ）、ＱＢレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、またはその他の当業界では公知の方法によって］を含んでなる。キットは、場合によってさらに例えば標準、もしくは対照として用いるためにあらかじめ定められた量の精製α２Ｍ受容体タンパク質もしくは核酸を容器中に含んでなるものとすることができる。
【０１７７】
５．６　治療的使用
本発明はさらに、免疫応答をモジュレートする方法を包含する。α２Ｍ受容体は抗原性ペプチド複合体（例えば、ＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体）をその抗原性分子を免疫系の細胞に提示し免疫応答を引き出す目的で認識し、輸送する。従って、本発明の組成物と方法は、自己免疫疾患、癌、および感染性疾患などのＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患および状態の治療的処置に用いることができる。特に、下記に詳述するとおり、α２Ｍ受容体と相互作用するか、またはα２Ｍ受容体とそのリガンド、例えばＨＳＰとの間の相互作用をモジュレートする、ＨＳＰ−抗原性ペプチド複合体などのα２Ｍ受容体複合体、抗体、および他の化合物、ならびにＨＳＰ−α２Ｍ受容体が介在するプロセスをモジュレートする他の化合物を含んでなる組換え細胞を、免疫応答を引き出して、またはブロックして上述のようなＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患および状態を治療するために用いることができる。
【０１７８】
５．６．１　同定されたアゴニストおよびアンタゴニストの治療的使用
α２Ｍ受容体（本明細書中では「α２ＭＲ」とする）と相互作用するか、またはα２Ｍ受容体とそのリガンド、例えばＨＳＰとの間の相互作用をモジュレートする、本明細書で提供されたスクリーニング方法によって同定されたものなどの化合物は、治療薬として有用なものとなりうる。そのような化合物としては、限定はされないが、アゴニスト、アンタゴニスト、例えば抗体、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイムが挙げられる。リガンド（例えば、ＨＳＰ）−α２Ｍ受容体相互作用を妨害する化合物を免疫応答をブロックするために用いることができ、自己免疫応答および状態の治療に用いることができる。他の抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムは、リガンド（例えば、ＨＳＰ）−α２ＭＲ相互作用、活性、もしくは発現をアップレギュレートすることができ、抗原複合体（例えばＨＳＰ−抗原複合体）の取り込みを増大させるであろうと考えられ、従ってワクチンの投与に先立って、もしくはそれと同時に宿主の免疫系を刺激することにおいて有用なものとなるであろう。下記には、免疫疾患、増殖性疾患、および感染症などのＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患の治療における上述のような化合物の使用のための方法と組成物が記載されている。
【０１７９】
１実施形態においては、α２Ｍ受容体−リガンド（例えば、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体）相互作用のアンタゴニストが免疫応答をブロックするために用いられる。そのようなアンタゴニストとしては、リガンド（例えば、ＨＳＰ）の受容体への結合を、α２Ｍ受容体、そのリガンド、またはそのリガンド−α２Ｍ受容体複合体への結合の競合によって妨害する化合物が挙げられる。
【０１８０】
１実施形態においては、アンタゴニストはα２Ｍ受容体に特異的な抗体、またはＨＳＰリガンド結合部位を含んでいるそのフラグメントである。別の１実施形態においては、アンタゴニストはＨＳＰに特異的な抗体で、それはＨＳＰの受容体への結合を妨害する。
【０１８１】
別の１実施形態においては、アンタゴニストはＨＳＰ配列の少なくとも連続した１０個のアミノ酸を含んでなるペプチドである。そのようなペプチドは、α２Ｍ受容体のリガンド結合部位と結合してＨＳＰもしくはＨＳＰ複合体の相互作用をブロックすることができる。別の１実施形態においては、アンタゴニストは、α２Ｍ配列の少なくとも連続した１０個のアミノ酸を含んでなるペプチドで、それはＨＳＰと同様に、α２Ｍ受容体と結合して、ＨＳＰ−抗原複合体の結合および取り込みを妨害することができる。また別の１実施形態においては、アンタゴニストはα２Ｍ受容体配列、特にα２Ｍ受容体のＥＣＤ（もしくはその一部分）の少なくとも連続した１０個のアミノ酸を含んでなるペプチドで、それは天然のリガンド、例えばＨＳＰ、α２Ｍ、ＬＳＬなどと結合し「中和」することができる。
【０１８２】
そのようなペプチドは合成で、または標準的な分子生物学の技法を用いて産生することができる。天然のα２Ｍ受容体リガンド、例えばα２ＭおよびＨＳＰなどのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、通常、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースにおいて入手可能である。そのデータベースを閲覧し、登録番号によって目的のアミノ酸配列および遺伝的配列データを検索するために、Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いることができる。そのようなペプチドの組換えおよび合成による産生の方法については第５．１．１節および第５．１．２節で述べている。
【０１８３】
さらに、上述の第５．２節に記載した技法などによって同定されたものなどの、α２Ｍ受容体遺伝子産物の活性をモジュレートすることのできる化合物を、当業者には周知の標準的な技法を用いて投与することができる。
【０１８４】
５．６．１．１　α２ＭＲ−リガンド相互作用の競合的アンタゴニスト
１実施形態においては、α２ＭＲ−リガンド（例えば、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体）相互作用のアンタゴニストは、例えば、自己免疫疾患の治療のために、抗原複合体に対する免疫応答をブロックするために用いられる。そのようなアンタゴニストとしては、α２Ｍ受容体と結合することによってリガンド（例えば、ＨＳＰ）の受容体への結合を妨害する分子が挙げられる。このタイプの競合的インヒビターの１例はα２Ｍ受容体に対する抗体、またはＨＳＰリガンド結合部位を含有しているα２ＭＲの断片である。競合的アンタゴニストの別の１例は、α２Ｍ、またはその受容体結合断片で、それ自体がα２ＭＲと結合することで、細胞によるＨＳＰ−抗原複合体の結合および取り込みをブロックする。
【０１８５】
α２ＭＲ−リガンド（例えば、ＨＳＰ）の競合的インヒビターは、どのようなタイプの分子でもよく、そのようなものとしては、限定はされないが、タンパク質、核酸、または薬物が挙げられる。好ましい１実施形態においては、ＨＳＰ−α２Ｍ競合的インヒビターは、α２ＭＲ結合ペプチドまたはＨＳＰ結合ペプチドである。そのようなペプチドの例は下記に示す。
【０１８６】
５．６．１．１．１　α２Ｍ受容体結合ペプチド
αマクログロブリンペプチド
本発明の１実施形態においては、ＨＳＰ−α２ＭＲ競合的アンタゴニストは、αマクログロブリンで、好ましくはα２Ｍ、またはそのα２ＭＲ結合部分である。
【０１８７】
α２Ｍまたはそのα２ＭＲ結合部分の機能的発現（ＦＸ融合タンパク質としての組換えによる発現、プロセシング、精製、およびリフォールディングを含む）は、好ましくはＨｏｌｔｅｔら， １９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４４：２４２−２４６に記載されたとおりに実施される。
【０１８８】
この実施形態の特定の１様式においては、α２Ｍのα２ＭＲ結合部分は、少なくとも１０個の（連続した）アミノ酸からなるα２Ｍ ＲＢＤの断片からなるか、またはその断片を含んでなる。この実施形態の他の様式においては、その断片は、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、もしくは１００個のＲＢＤのアミノ酸からなる。この実施形態の特定の様式においては、そのような断片は２７、１３８、もしくは１５３個のアミノ酸より大きくない。最も好ましいペプチドは、Ｌｙｓ１３７０およびＬｙｓ１３７４のアミノ酸のうちの１つもしくは双方を含んでなるものである。そのようなペプチドは、成熟α２Ｍタンパク質のアミノ酸１２９９−１４５１（図１３ＢのｖＲＢＤ）（配列番号８）、１３１４−１４５１（配列番号９）（図１３ＢのＲＢＤ）、または１３６６−１３９２ （配列番号１０）からなるものを含んでいる。その他の好ましいペプチドとしては、限定はされないが、成熟ヒトα２Ｍタンパク質のアミノ酸１３００−１４２５ （配列番号１１）、１３００−１４００（配列番号１２）、１３００−１３８０（配列番号１３）、１３２５−１４２５（配列番号１４）、１３２５−１４００（配列番号１５）、１３２５−１３８０（配列番号１６）、１３５０−１４２５（配列番号１７）、１３５０−１４００（配列番号１８）、または１３５０−１３８０（配列番号１９）からなるものが挙げられる。
【０１８９】
またα２Ｍまたはα２Ｍのα２ＭＲ結合部分の誘導体もしくは類似体は、ＨＳＰ−α２ＭＲ複合体の競合的アンタゴニストとして考えられる。そのような誘導体もしくは類似体には、限定はされないが、α２Ｍ、α２Ｍ ＲＢＤもしくはその断片と実質的に相同な領域（例えば、種々の実施形態において、同一のサイズを有するアミノ酸配列にわたって、または、当業界では公知のコンピューターホモロジープログラムでアラインメントが行われるアラインメントさせた配列と比較するとき、少なくとも６０％もしくは７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の同一性を有する）、またはその領域をコードしている核酸がα２Ｍ ＲＢＤコード配列に、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または非ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできるような領域を含んでなる分子が含まれる。ある特定の実施形態においては、α２Ｍ誘導体は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端でペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列と連結されたα２ＭＲタンパク質もしくはそのα２ＭＲ結合部分（好ましくはＬｙｓ１３７０およびＬｙｓ１３７４を含んでなるα２Ｍ ＲＢＤの少なくとも１０個のアミノ酸からなるもの）を含んでなる、キメラタンパク質または融合タンパク質である。
【０１９０】
特に、α２Ｍ誘導体は、α２Ｍコード配列を、機能的には同等の分子を提供するような置換、付加、もしくは欠失によって改変することにより作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重により、α２Ｍ遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の実施に用いることができる。これらのものとしては、限定はされないが、結果としてサイレント変化がもたらされるような、配列の内部の機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変されたα２Ｍ遺伝子の全体もしくはそのα２ＭＲ結合部分を含んでなるヌクレオチド配列が挙げられる。同様に、本発明のα２Ｍ誘導体には、限定はされないが、一次アミノ酸配列として、α２Ｍタンパク質のアミノ酸配列の全てもしくはα２ＭＲ結合部分を含有しているものが含まれ、それには結果としてサイレント変化がもたらされるような配列の内部の残基が、機能的に同等なアミノ酸残基の置換によって改変された配列が含まれる。例えば、配列内の１個以上のアミノ酸残基を、類似の極性を持ち、結果としてサイレント変化がもたらされるような、機能的に同等なものとして作用する別のアミノ酸で置換することができる。その配列内の１個のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１９１】
本発明のα２Ｍ誘導体および類似体は当業界で公知の種々の方法で産生させることができる。それらの産生をもたらす操作は遺伝子レベルもしくはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたα２Ｍ遺伝子配列は当業界で公知の多数のストラテジーのいずれかによって改変することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， １９９０， 「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。その配列は制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で切断することができ、その後所望により、さらなる酵素的改変、単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの連結を行うことができる。α２Ｍの誘導体もしくは類似体をコードする遺伝子の産生においては、改変した遺伝子が依然としてα２Ｍと同一の翻訳リーディングフレーム中にあり、翻訳停止シグナルによって中断されず、所望のα２Ｍ活性がコードされている遺伝子領域中にあることの確認に注意を払うべきである。
【０１９２】
またα２Ｍ配列の操作は、タンパク質レベルで行うことができる。本発明の範囲内に包含されるものには、α２Ｍタンパク質の断片、またはその他の誘導体もしくは類似体であって、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解酵素による切断、抗体分子もしくはその他の細胞性リガンドへの連結などによって翻訳中もしくは翻訳後に区別して改変されるものがある。公知の技法によって多数の化学的修飾のいかなるものも行うことができ、そのようなものとしては、限定はされないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などが挙げられる。
【０１９３】
さらに、α２Ｍの類似体および誘導体は化学的に合成することができる。例えば、α２Ｍのα２ＭＲ結合部分はペプチド合成機を用いて合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体をα２Ｍ配列中に置換もしくは付加するものとして導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）もしくはＬ（左旋性）とすることができる。
【０１９４】
この実施形態の他の特定の様式においては、ＨＳＰ−α２ＭＲ競合的アンタゴニストは別のαマクログロブリンもしくはそのα２ＭＲ結合部分であり、それは例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら， 上記， 図３， グループＡから選択したαマクログロブリンＲＢＤドメインである。
【０１９５】
ＲＡＰ
本発明の１実施形態においては、ＨＳＰ−α２ＭＲ競合的アンタゴニストは、α２ＭＲ結合タンパク質（α２ＭＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＡＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号Ａ３９８７５）もしくはそのα２ＭＲ結合部分である。この実施形態の特定の１様式においては、ＲＡＰのα２ＭＲ結合部分は、少なくとも１０個の（連続的な）アミノ酸からなるＲＡＰ ＲＢＤの断片からなるか、またはその断片を含んでなる。この実施形態の他の様式においては、その断片は、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、もしくは１００個のＲＢＤのアミノ酸からなる。この実施形態の特定の様式においては、そのような断片は２８、５０、もしくは１００個のアミノ酸より大きくない。この実施形態の他の特定の様式においては、ＲＡＰのα２ＭＲ結合部分は、例えばＮｉｅｌｓｅｎら， 上記， 図３， グループＤもしくはＥに示されているような、ドメイン１もしくは３のα２ＭＲ結合部分を含んでなる。組換えＲＡＰ、もしくはそのα２ＭＲ結合部分、例えばドメイン１もしくは３の発現は、好ましくはＡｎｄｅｒｓｅｎら， 上記に記載されているように達成される。
【０１９６】
５．６．１．１．２　ＨＳＰ結合ペプチド
α２ＭＲペプチド
本発明の１実施形態においては、ＨＳＰ−α２ＭＲ競合的アンタゴニストは、ＨＳＰと結合することができ、従ってＨＳＰの天然の受容体への結合を競合的に阻害することのできるα２ＭＲペプチド、好ましくは可溶性ペプチドである。
【０１９７】
α２ＭＲのＨＳＰ結合部分の機能的発現は、好ましくはＣＲ８ドメインについてＨｕａｎｇら， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１４１３０−１４１３６に記載されているとおりに行われる。簡潔に言えば、適切なフォールディングを維持するために、タンパク質をＧＳＴ融合物として発現させ、組換えで発現させて、そのＧＳＴ部分を切断し、切断されていないタンパク質をＧＳＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで除去し、切断されたタンパク質をリフォールディングさせる。補完的反復は、カルシウムと結合するので、適切なフォールディングをリフォールディングされたタンパク質のカルシウムへの結合を測定することによってアッセイする。
【０１９８】
この実施形態の特定の１様式においては、α２ＭＲのＨＳＰ結合部分は、少なくとも１つの、最も好ましくはＣＲ３〜ＣＲ１０から選択される補完的反復からなるか、またはそれを含んでなる。この実施形態の別の特定の１様式においては、α２ＭＲのＨＳＰ結合部分は補完的反復のクラスター、最も好ましくはＣｌ−ＩＩを含んでなる。この実施形態の他の様式においては、ＨＳＰ結合部分は、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、さらにより好ましくは少なくとも３０個、なおいっそう好ましくは少なくとも４０個、および最も好ましくは少なくとも８０個の（連続した）アミノ酸からなる。この実施形態の他の特定の様式においては、そのような断片はアミノ酸４０〜４５個より大きくはない。この実施形態の他の特定の様式においては、そのような断片はアミノ酸８０〜９０個よりも大きくはない。代表的な好ましいペプチドとしては、限定はされないが、ヒトα２ＭＲのアミノ酸２５−６８（配列番号２０）、２５−１１０（配列番号２１）、６８−１１Ｏ（配列番号２２）、８５３−８９４（配列番号２３）、８５３−９３４（配列番号２４）、８５３−９７４（配列番号２５）、８５３−１０１３（配列番号２６）、８５３−１０６０（配列番号２７）、８５３−１１０２（配列番号２８）、８５３−１１８３（配列番号２９）、８９５−９３４（配列番号３０）、８９５−９７４（配列番号３１）、８９５−１０１３（配列番号３２）、８９５−１０６０（配列番号３３）、８９５−１１０２（配列番号３４）、８９５−１１８３（配列番号３５）、９３５−９７４（配列番号３６）、９３５−１０１３（配列番号３７）、９３５−１０６０（配列番号３８）、９３５−１１０２（配列番号３９）、９３５−１１８３（配列番号４０）、９７５−１０１３（配列番号４１）、９７５−１０６０（配列番号４２）、９７５−１１４３（配列番号４３）、９７５−１１８３（配列番号４４）、１０１４−１０６０（配列番号４５）、１０１４−１１０２（配列番号４６）、１０１４−１１８３（配列番号４７）、１０６１−１１０２（配列番号４８）、１０６１−１１４３（配列番号４９）、１０６１−１１８３（配列番号５０）、１１０３−１１４３（配列番号５１）、１１０３−１１８３（配列番号５２）、または１１４４−１１８３（配列番号５３）からなるものが挙げられる。
【０１９９】
またα２ＭＲのＨＳＰ結合部分の誘導体もしくは類似体もＨＳＰ−α２ＭＲ複合体の競合的アンタゴニストとして考えられる。そのような誘導体もしくは類似体としては、限定はされないが、α２ＭＲの細胞外ドメインもしくはその断片と実質的に相同な領域（例えば、種々の実施形態において、同一のサイズを有するアミノ酸配列にわたって、または、当業界で公知のコンピューターホモロジープログラムでアラインメントが行われるアラインメントさせた配列と比較するとき、少なくとも６０％もしくは７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の同一性を有する）、またはその領域をコードしている核酸がα２ＭＲ−ＨＳＰ結合配列をコードする配列と、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、もしくは非ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできるような領域を含んでなる分子が挙げられる。ある特定の実施形態においては、α２ＭＲ誘導体は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端でペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列と連結されたα２ＭＲのＨＳＰ結合部分（好ましくは、少なくとも１個のＣｌ−ＩＩの補完的反復からなるもの）を含んでなる、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質である。そのようなキメラタンパク質は切断再精製ステップを省略して、上述のように組換えで産生することができる。
【０２００】
他のＨＳＰ結合α２ＭＲ誘導体は、α２ＭＲコード配列を、機能的には同等の分子を提供するような置換、付加、もしくは欠失によって改変することにより作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重により、ＨＳＰ結合α２ＭＲ遺伝子もしくは遺伝子断片と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を本発明の実施に用いることができる。ＨＳＰ結合α２ＭＲ誘導体の適切な改変の選択および産生は、上述のα２Ｍ誘導体について述べたものと同じ原則を適用し、第５．１．１節および第５．１．２節に述べた一般的な方法を用いて行うことができる。
【０２０１】
ＨＳＰペプチド
実施形態の別の１様式においては、アンタゴニストはＨＳＰ配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含んでなるペプチドである。そのようなペプチドは、α２Ｍ受容体のリガンド結合部位と結合して、ＨＳＰもしくはＨＳＰ複合体の相互作用をブロックすることができる。
【０２０２】
そのようなペプチドは合成で、または標準的な分子生物学の技法を用いて産生することができる。天然のＨＳＰのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、通常、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースにおいて入手可能である。そのデータベースを閲覧し、登録番号によって目的のアミノ酸配列および遺伝的配列データを検索するために、Ｅｎｔｒｅｚなどのコンピュータープログラムを用いることができる。そのようなペプチドの組換えおよび合成による産生の方法については第５．１．１節および第５．１．２節で述べている。
【０２０３】
さらに、上述の第５．２節に記載した技法などによって同定されたものなどの、α２Ｍ受容体遺伝子産物の活性をモジュレートすることのできる化合物を、当業者には周知の標準的な技法を用いて投与することができる。
【０２０４】
５．６．２　癌および感染症に対するα２Ｍ受容体の治療的使用
他の実施形態において、自己免疫疾患、あるいは腫瘍形成もしくは癌を引き起こす増殖性または分化性疾患等の、ある種のα２Ｍ受容体遺伝子疾患の症状は、α２Ｍ受容体遺伝子の発現レベルおよび／またはα２Ｍ受容体遺伝子産物の活性レベルを調節することにより和らげることができる。１つの実施形態において、例えば、α２Ｍ受容体遺伝子発現の減少は、α２Ｍ受容体活性を低下させ、および自己免疫疾患の症状を和らげるのに役立ち得る。この場合、α２Ｍ受容体遺伝子の発現レベルは、周知のアンチセンス法、遺伝子「ノックアウト」法、リボザイム法および／または三重らせん法（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｍｅｔｈｏｄ）と組み合せてα２Ｍ受容体遺伝子配列を用いることにより、低下させることができる。他の実施形態において、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体媒介経路における突然変異体または欠陥遺伝子を補うため、およびＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患の症状を和らげるためには、α２Ｍ受容体遺伝子発現の増加が望ましい。
【０２０５】
α２Ｍ受容体遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力（ＨＳＰ−α２Ｍ受容体関連疾患の症状を和らげる能力を含む）を示すことができる化合物としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子が挙げられる。このような分子は、欠陥のない（または適当である場合は突然変異型の）標的遺伝子の活性を低下させるまたは阻害するように設計することができる。このような分子を作製および使用するための技法は、当業者に周知である。
【０２０６】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的とするｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質の翻訳を妨げることによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻害する働きをする。アンチセンスによるアプローチは、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を阻害する。完全に相補的であることが好ましいが、そうである必要はない。
【０２０７】
本明細書中で記載される、ＲＮＡの一部に「相補的な」配列とは、ＲＮＡにハイブリダイズして安定な二重らせん（ｄｕｐｌｅｘ）を形成することができる程度に十分な相補性を有する配列を意味する。従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合は、二本鎖ＤＮＡのうちの一方の鎖をテストしてもよいし、または三重らせん（ｔｒｉｐｌｅｘ）の形成を分析してもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の長さおよび相補性の程度の両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ、その核酸は、ＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含んでもなお安定な二重らせん（または場合により三重らせん）を形成し得る。当業者であれば、標準的な手法を用いることによりミスマッチの許容度（ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｄｅｇｒｅｅ）を確認して、ハイブリダイズした複合体の融点を決定することができる。
【０２０８】
１つの実施形態において、α２Ｍ受容体遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスによるアプローチで用いて、内因性α２Ｍ受容体ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができた。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきで、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、このオリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２０９】
本発明の実施形態において、ＨＳＰ受容体リガンド結合ドメインをコードする核酸に相補的なオリゴヌクレオチドが用いられる。
【０２１０】
標的配列の選択にかかわらず、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ研究をまず行うことが好ましい。これらの研究では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生物学的効果とを区別する対照を用いることが好ましい。また、これらの研究では、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することも好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得た結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得た結果と比較することが想定される。対照オリゴヌクレオチドはテストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、およびオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを阻害するのに必要な程度しかアンチセンス配列と異ならないことが好ましい。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物、誘導体もしくは改変体（一本鎖または二本鎖）であってもよい。例えばその分子の安定性またはハイブリダイゼーション等を改善するために、オリゴヌクレオチドの塩基部分、糖鎖部分、またはリン酸骨格（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を改変することができる。オリゴヌクレオチドは、（例えばｉｎ ｖｉｖｏでの宿主細胞受容体のターゲッティングのための）ペプチド等の他の付属基、細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６， ６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅら， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４， ６４８−６５２； １９８８年１２月１５日に公開された国際特許出願公開ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）もしくは血液脳関門（例えば１９８８年４月２５日に公開された国際特許出願公開ＷＯ８９／１０１３４号を参照されたい）を経由する輸送を容易にする物質、ハイブリダイゼーションにより起動する切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｇｅｎｔ）（例えばＫｒｏｌら， １９８８， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６， ９５８−９７６を参照されたい）、またはインターカレート剤（例えばＺｏｎ １９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５， ５３９−５４９を参照されたい）を含み得る。そのためには、オリゴヌクレオチドを他の分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーションにより起動する架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーションにより起動する切断剤等）に結合させてもよい。
【０２１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、ならびに２，６−ジアミノプリンを含む（ただしこれらに限定されない）群より選択される少なくとも１種の改変された塩基部分を含み得る。
【０２１３】
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む（ただしこれらに限定されない）群より選択される少なくとも１種の改変された糖鎖部分も含み得る。
【０２１４】
更に他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｓ−ＯＤＮ）、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはその類似体からなる群より選択される少なくとも１種の改変されたリン酸骨格を含む。
【０２１５】
更に他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドでは、通常のβユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に延びている（Ｇａｕｔｉｅｒら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら， １９８７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５， ３２７−３３０）である。
【０２１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知である標準的な方法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（ＢｉｏｓｅａｒｃｈやＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されているもの等）を用いて、合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８８， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６， ３２０９）によって合成することができる。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔ガラスポリマー支持体（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ）（Ｓａｒｉｎら， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５， ７４４８−７４５１）等を用いて調製することができる。
【０２１７】
標的遺伝子コード領域の配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いることができるが、転写された未翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０２１８】
本発明の１つの実施形態において、特定の標的ｍＲＮＡは、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）とハイブリダイズした後にＲＮアーゼＨにより消化されるので、遺伝子発現のダウンレギュレーションが行われる。どのアンチセンスＳ−ＯＤＮがより成功率が高いかを予測するためのルールはないので、最も良い戦略は、完全に経験的な方法であり、幾つかのアンチセンスＳ−ＯＤＮを試して行われる。アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）は、目的のｍＲＮＡの特定の領域を標的とするように設計される。ヌクレオチドの含有量を同じにし、核酸含有量が原因となって生じ得る差を最少にするために、アンチセンスＳ−ＯＤＮのスクランブル配列からなる対照Ｓ−ＯＤＮも設計される。全てのＳ−ＯＤＮは、Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ． （Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ， ＯＲ）により合成することができる。アンチセンス分子を培養細胞に適用したときの効果をテストするために（例えば研究目的のアッセイやｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子療法プロトコールなど）、細胞を１００ｍｍの組織培養プレートで６０〜８０％コンフルエント状態になるまで培養し、ＰＢＳで濯ぎ、８ｍｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ， ５２．８μｌ リポフェクチンからなるリポフェクションミックスを重層し、最終濃度を２００ｎＭ Ｓ−ＯＤＮとした。リポフェクションは、リポフェクチン試薬およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて行った。細胞を、リポフェクションミックスの存在下で５時間インキュベートする。インキュベーションの後、培地を完全ＤＭＥＭと取りかえる。リポフェクションの後の様々な経過時点で細胞を回収し、ウェスタンブロットにより、タンパク質レベルを分析する。
【０２１９】
標的遺伝子を発現する細胞にアンチセンス分子をターゲッティングしなければならない（被験者にｉｎ ｖｉｖｏで直接、または例えばｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法プロトコール等のように培養細胞で、行われる）。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するための多数の方法が開発された。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射したり、または（所望の細胞を標的とするように設計された）改変されたアンチセンス分子（例えば標的細胞の表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合させたアンチセンス等）を全身投与することができる。
【０２２０】
しかし、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することはしばしば困難である。したがって、好適な方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に置いた組換えＤＮＡ構築物を利用する。このような構築物を用いて患者の体内の標的細胞をトランスフェクトすることにより、十分な量の一本鎖ＲＮＡが転写され、これらは内因性標的遺伝子転写産物と相補的な塩基対を形成することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。例えば、ベクターが細胞に取り込まれるようベクターを導入して、アンチセンスＲＮＡの転写を指令させることができる。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができるものであれば、エピソームのままであってもよいし、または染色体に組み込まれても良い。このようなベクターは、当技術分野で標準的である組換えＤＮＡ技法によって構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞中で複製および発現されるプラスミド、ウイルス型、または当技術分野で公知である他のベクターであってもよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、当技術分野において哺乳動物（好ましくはヒト細胞）中で機能することが知られている任意のプロモーターによって行うことができる。このようなプロモーターは、誘導的なものであっても構成的なものであってもよい。このようなプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０， ３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復配列の中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２， ７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８， １４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６， ３９−４２）等が挙げられるがこれらに限定されない。プラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルス型ベクターのうち任意のタイプを用いて、組換えＤＮＡ構築物を調製し、これを組織部位に直接導入することができる。あるいは、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いることができる。この場合、投与は他の経路（例えば全身経路など）によって行っても良い。
【０２２１】
また、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写産物の切断を触媒するよう設計されたリボザイム分子を用いて、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、これにより標的遺伝子産物の発現を妨げることができる（例えば１９９０年１０月４日に公開された国際特許出願公開ＷＯ９０／１１３６４号およびＳａｒｖｅｒら， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， １２２２−１２２５を参照されたい）。本発明の実施形態において、ＨＳＰ受容体遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、ＨＳＰ受容体のリガンド結合ドメインをコードする核酸に相補的になるように設計される。
【０２２２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。（概説についてはＲｏｓｓｉ， １９９４， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４， ４６９−４７１を参照されたい）。リボザイムの作用のメカニズムは、そのリボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイズの後、核酸分子内部のヌクレオチド結合を分解する切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｖｅｎｔ）を伴う。リボザイム分子の組成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な１以上の配列を含むものでなければならず、ｍＲＮＡ切断に関わる周知の触媒的配列を含むものでなければならない。この配列については、例えば米国特許第５，０９３，２４６号（参照により本明細書にその全てを組み入れる）を参照されたい。
【０２２３】
標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊するためにｍＲＮＡの部位特異的認識配列を切断するリボザイムを使用することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一必要なことは、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列（５’−ＵＧ−３’）を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および作製は、当技術分野において周知であり、Ｍｙｅｒｓ， １９９５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （特に第８３３頁図４を参照されたい）およびＨａｓｅｌｏｆｆ ＆ Ｇｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４， ５８５−５９１（参照により本明細書にその全てを組み入れる）に更に詳しく記載されている。
【０２２４】
好ましくは、標的遺伝子ｍＲＮＡの５’側末端付近に切断認識部位が位置するように、すなわち効率を上げて非機能的ｍＲＮＡ転写産物の細胞内への蓄積を最低限に抑えるように、リボザイムは設計される。
【０２２５】
また本発明のリボザイムは、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「チェック型（Ｃｅｃｈ−ｔｙｐｅ）リボザイム」と呼ぶ）、例えばテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）で天然に存在するもの（ＩＶＳまたはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとしても知られる）等も含み、これは、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよびその共同研究者らにより非常に詳しく記載されている（Ｚａｕｇら， １９８４， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４， ５７４−５７８； ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ， １９８６， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３１， ４７０−４７５； Ｚａｕｇら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２４， ４２９−４３３； Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｉｎｃ．による国際特許出願公開ＷＯ８８／０４３００号； Ｂｅｅｎ ＆ Ｃｅｃｈ， １９８６， Ｃｅｌｌ， ４７， ２０７−２１６）。チェック型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対活性部位を有し、その後ろで標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、標的遺伝子の中に存在する８塩基対活性部位を標的とするこれらのチェック型リボザイムを包含する。
【０２２６】
アンチセンス法の場合と同様に、リボザイムは、（例えば安定性およびターゲッティングなどの改善のために）改変されたオリゴヌクレオチドで構成することができ、標的遺伝子を発現する細胞にはｉｎ ｖｉｖｏで送達しなければならない。好適な送達法は、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いるものであって、トランスフェクトされた細胞が、内因性標的遺伝子メッセージを破壊して翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを産生するものである。リボザイムはアンチセンス分子と違って触媒的なものであるため、効率を良くするためには細胞内濃度が低いことが必要である。
【０２２７】
また、内因性標的遺伝子発現は、ターゲッティングによる相同的組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活化する即ち「ノックアウト」することによって減少させることもできる（例えばＳｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ２３０−２３４； Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１， ５０３−５１２； Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ， ５， ３１３−３２１を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書にその全てを組み入れる）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域）に相同なＤＮＡによりフランキングされた突然変異型非機能性標的遺伝子（または全く関係のないＤＮＡ配列）を、単独で、または選択マーカーおよび／もしくは負の選択マーカーと一緒に用いて、標的遺伝子を発現する細胞をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトすることができる。ターゲッティングによる相同的組換えによりＤＮＡ構築物を挿入することにより、標的遺伝子が不活化される。このような方法は、特に、ＥＳ（胚幹）細胞の改変に特に適しており、不活化された標的遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用することができる（例えばＴｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ， １９８９（前掲）を参照されたい）。しかしこのアプローチは、組換えＤＮＡ構築物が、適当なウイルスベクターを用いてｉｎ ｖｉｖｏで必要な部位に直接投与またはターゲッティングされるのであれば、ヒトに適用することもできる。
【０２２８】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域（すなわち標的遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングして三重らせん構造を形成し、体内の標的細胞内での標的遺伝子の転写を阻害することにより、減少させることができる（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）， ５６９−５８４； Ｈｅｌｅｎｅら， １９９２， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０， ２７−３６； およびＭａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）， ８０７−８１５を参照されたい）。
【０２２９】
転写を阻害するための三重らせんの形成に用いられる核酸分子は、一本鎖であり且つ、デオキシリボヌクレオチドで構成されるものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティン型塩基対の法則による三重らせんの形成を促進するように設計されなければならず、これには一般に、プリンまたはピリミジンのかなり大きなストレッチが二重らせんのうち一方の鎖上に存在することが必要である。ヌクレオチド配列はピリミジンベースのものであってもよく、この場合、得られる三重らせんの３つの会合鎖間でＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットが形成される。ピリミジンが豊富な分子は、二重らせんのうちの一方の鎖のプリン・リッチ領域に、その鎖に平行な向きの塩基相補性を提供する。さらに、プリンが豊富な核酸分子（例えば、Ｇ残基のストレッチを含む核酸分子など）を選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対を豊富に含むＤＮＡ二重らせんと一緒に三重らせんを形成し、この中で、プリン残基の大部分は、標的とする二重らせんのうちの一方の鎖上にあり、その三重らせんの中の３つの鎖間でＧＧＣトリプレットが形成される。
【０２３０】
あるいは、三重らせん形成のために標的とすることができる候補配列は、いわゆる「スイッチバック（ｓｗｉｔｃｈｂａｃｋ）」核酸分子を作製することにより、増やすことができる。スイッチバック分子は、二重らせんの中の一方の鎖とまず塩基対を形成した後に他方の鎖と塩基対を形成するように、５’−３’、３’−５’を交互に繰り返して合成され、これにより二重らせんの中の一方の鎖上にプリンまたはピリミジンのかなり大きなストレッチが存在する必要性がなくなる。
【０２３１】
本明細書中に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび／または三重らせん分子を用いて突然変異型遺伝子の発現を阻害する場合、この技法は、正常な標的遺伝子の対立遺伝子により生じるｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を非常に効率的に低減または阻害するので、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要な濃度よりも低くなる可能性がある。したがってこのような場合、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性を維持するために、アンチセンス、リボザイムまたは三重らせんによる治療のいずれかを利用した際に影響を受け易い配列を含まない、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子を、遺伝子療法学的方法（例えば以下の第５．６．３節に記載される方法等）により細胞内に導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、必要レベルの標的遺伝子活性を維持するために、正常標的遺伝子タンパク質を同時に投与することが好ましい場合もある。
【０２３２】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ならびに三重らせん分子は、上記に記載したような、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を合成するための当技術分野で公知である任意の方法によって調製することができる。これらの方法としては、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成法等の、当技術分野で周知であるオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技法が挙げられる。あるいはＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写によって作製してもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ様々なベクターの中に組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的（使用するプロモーターによって異なる）に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系の中に安定に導入することができる。
【０２３３】
５．６．３　遺伝子置換療法
正常なα２Ｍ受容体遺伝子の発現レベルおよび／またはα２Ｍ受容体遺伝子産物の活性レベルの増加に関して、α２Ｍ受容体遺伝子の核酸配列を、例えば癌などの増殖性疾患をもたらす免疫疾患の治療に用いることができる。このような治療は、例えば遺伝子置換療法の形で行うことができる。特に、正常なα２Ｍ受容体遺伝子、または正常なα２Ｍ受容体遺伝子機能を示すα２Ｍ受容体遺伝子産物の産生を指令するα２Ｍ受容体遺伝子の部分の１つ以上のコピーを、ベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない）および細胞内にＤＮＡを導入する他の粒子（リポソーム等）を用いて患者の体内の適当な細胞の中に挿入することができる。
【０２３４】
遺伝子置換療法の技法は、患者の体内のＨＳＰ受容体を発現する細胞型にα２Ｍ受容体遺伝子配列を送達することができるものでなければならない。したがって、１つの実施形態において、当業者に周知である技法（例えば１９８８年４月２５日に公開された国際特許出願公開ＷＯ８９／１０１３４号を参照されたい）を用いて、α２Ｍ受容体遺伝子配列が、発生している骨髄系統の細胞（例えば骨髄）に送達されるようにすることができる。他の特定の実施形態において、遺伝子置換は、マクロファージを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで行い、養子免疫療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）の技法を用いて患者に送達することができる。
【０２３５】
他の実施形態において、送達のための技法は、このようなα２Ｍ受容体遺伝子配列を、α２Ｍ受容体遺伝子配列を発現させようとする細胞の部位に直接（例えば腫瘍の部位に直接）投与するものである。
【０２３６】
α２Ｍ受容体遺伝子の発現レベルおよび／またはα２Ｍ受容体遺伝子産物の活性レベルを全体的に増加させるために用いることができる他の方法としては、患者のある部位にα２Ｍ受容体障害の症状を和らげるのに十分な数の適当なα２Ｍ受容体発現細胞（好ましくは自己由来細胞）を導入する方法がある。このような細胞は、組換え細胞であっても非組換え細胞であってもよい。
【０２３７】
患者の体内においてα２Ｍ受容体遺伝子の全体的な発現レベルを増加させるために投与することができる細胞としては、α２Ｍ受容体遺伝子を正常に発現する細胞が挙げられる。
【０２３８】
あるいは、細胞（好ましくは自己由来細胞）を、α２Ｍ受容体遺伝子配列を発現するように遺伝子操作した後、患者のα２Ｍ受容体障害または増殖性もしくはウイルス性疾患（例えば癌および腫瘍形成）の症状を和らげるのに適した場所に導入することができる。あるいは、損傷していないα２Ｍ受容体遺伝子を発現する細胞であってＭＨＣが適合する個体に由来する細胞を用いることができ、このような細胞としては、例えば脳細胞が挙げられる。α２Ｍ受容体遺伝子配列の発現は、必要な細胞型の中でのこのような発現を可能とする適当な遺伝子調節配列によって制御される。このような遺伝子調節配列は、当業者に周知である。このような細胞ベースの遺伝子療法の技法は、当業者に周知である（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第５，３９９，３４９号を参照されたい）。
【０２３９】
投与しようとする細胞が非自己由来細胞である場合、これらの細胞は、導入された細胞に対する宿主免疫反応が発生するのを防ぐ周知の技法を用いて投与することができる。例えば、これらの細胞は、成分が細胞のすぐ外側の環境と交換できるようにし且つ導入された細胞が宿主免疫系によって認識されないようにするカプセル化形態で導入することができる。
【０２４０】
５．６．４　可溶性α２Ｍ受容体ポリペプチドの送達
可溶性α２Ｍ受容体ＥＣＤまたは融合タンパク質（例えば融合Ｉｇ分子等）を発現する遺伝子操作された細胞は、これらが可溶性分子の供給を行う「バイオリアクター」として機能することができる場合、ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。このような可溶性α２Ｍ受容体ポリペプチドおよび融合タンパク質は、適度な濃度で発現された時、ＨＳＰまたはα２Ｍ受容体の他の天然リガンドを中和するまたは「一掃する（ｍｏｐ ｕｐ）」ことによりα２Ｍ受容体活性のインヒビターとして機能するものでなければならず、従って、ＨＳＰ−α２Ｍ受容体に関係する障害および疾患（例えば自己免疫疾患、増殖性疾患および感染症等）を治療するために使用することができる。
【０２４１】
５．６．５　優性ネガティブ突然変異体の送達
本発明の他の実施形態において、例えば自己免疫疾患を治療するために、優性ネガティブ突然変異体（「優性ネガティブ体」）を治療に用いて、ＨＳＰ−抗原複合体に対する免疫反応を阻害することができる。一般に、このような優性ネガティブ体は、発現された時にリガンド（すなわちＨＳＰ−抗原性分子複合体）と相互作用するが、正常なα２ＭＲのエンドサイトーシス機能および／またはシグナル伝達機能のうち１つ以上の機能に欠陥のある突然変異体である。このような突然変異体は、例えば野生型受容体からのＨＳＰ−ペプチド複合体のタイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により、同じ細胞内または違う細胞内の正常なα２ＭＲの機能を妨げる。このような突然変異は、例えば、α（２）マクログロブリン受容体の５１５ｋＤａサブユニットの細胞外ドメインの中、または８５ｋＤａサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインもしくは細胞内ドメインの中の１つ以上の点突然変異、欠失、挿入または他の突然変異であってもよい（α２ＭＲサブユニットの立体配置についてはＫｒｉｅｇｅｒおよびＨｅｒｚ， １９９４， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ６３：６０１−６３７を参照されたい）。しかし、いずれのサブユニットにおいても優性ネガティブ突然変異を構築する際には、５１５ｋＤａサブユニットがプロセシングされて細胞表面上に提示されるように、（α２ＭＲの前駆体のａａｓ３５２５と３５２６との間での切断をシグナル伝達する）切断ドメインが無傷のままとなるように注意を払わなければならない。さらに、２つのサブユニットをつなぐドメインも機能可能なままとなるように注意しなければならない。例えば、特定の実施形態において、８５ｋＤａサブユニットのＣ末端細胞内ドメインはトランケートされる。他の実施形態において、Ｎ末端５１５ｋＤａサブユニット上の点突然変異はエンドサイトーシスを阻害するが、リガンドの結合は阻害しない。他の実施形態において、Ｎ末端５１５ｋＤａサブユニットは融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質のＣ末端は、他のＩ型の単一膜貫通受容体の膜貫通ドメインおよび場合によっては細胞内ドメインである。
【０２４２】
細胞内でのこのような優性ネガティブ突然変異の発現は、利用可能なリガンドの量をタイトレートし尽くす（ｔｉｔｒａｔｅ ｏｕｔ）ことにより、同じ細胞または近隣の細胞の中の正常に機能する受容体によるリガンドの取り込みを阻害することができる。したがって、このような優性ネガティブを発現する組換え抗原提示細胞を用いて、自己免疫疾患の治療が必要な患者に投与した時に、ＨＳＰ−抗原性分子複合体をタイトレートし尽くすことができる。
【０２４３】
５．６．６　免疫反応を調節するための体外法
また本発明は、体外法を用いて血流中のα２Ｍ受容体リガンドのレベルを変更することにより、患者における免疫反応を調節するための方法にも関する。α２Ｍ受容体は、α２Ｍ受容体発現細胞（例えばマクロファージや樹状細胞等）において熱ショックタンパク質の受容体として機能する。ＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体がこのようなα２Ｍ受容体発現細胞に結合すると、ＨＳＰが細胞内に取り込まれ、ＨＳＰによりシャペロン化されたペプチドが再び提示される。しかし、α２Ｍ受容体は異なる細胞型において多様な役割を有し、数多くの非ＨＳＰリガンドに結合するので、α２Ｍ受容体リガンド同士の競合により、ＨＳＰおよびＨＳＰ複合体がα２Ｍ受容体にアクセスする能力が低下する。
【０２４４】
本発明者は、血液から非−ＨＳＰ−α２Ｍ受容体リガンドを枯渇させ、このようなα２Ｍ受容体−リガンド枯渇血液を患者の血流中に輸血することにより、おそらくα２Ｍ受容体へのＨＳＰ複合体のアクセスを増やすことによって、免疫反応を刺激することができることを見い出した。あるいは、血液からα２Ｍ受容体リガンド（ＨＳＰを含む）を枯渇させた後、ＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を加えることにより、特定の免疫反応を刺激することができる。α２Ｍ受容体リガンドのレベルを低下させることにより、患者（例えば癌患者や感染症患者等）において所望の免疫反応を強化することができる。このような血流中へのα２Ｍ受容体リガンドの枯渇方法について、以下に詳細に記載する。
【０２４５】
様々な実施形態において、体外手法（例えば輸血やアフェレーシス等）を用いて、患者の循環中のα２Ｍ受容体リガンドのレベルを調節することによって、あるいは、α２Ｍ受容体リガンド（ＨＳＰを含む）を血液から枯渇させた後、特定のＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を血液に選択的に加えることによって、免疫反応を刺激することができる。例えば、１つの実施形態において、アフェレーシス技法をアフィニティーカラム技術と組み合せて用い、α２Ｍ受容体リガンドを患者の血液から除去した後、リガンド枯渇血液を循環中に戻す。
【０２４６】
他の実施形態において、アフェレーシス技法をアフィニティークロマトグラフィー技法を組み合せて用い、患者の血液からα２Ｍ受容体リガンドを除去した後、ＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を患者の血液に選択的に加え、処理した血液を患者の循環中に戻す。
【０２４７】
血液の抽出は、手作業で、または一般的な自動化された電子制御型「アフェレーシス」システム（例えばＡｕｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ−Ｃ． ＲＴＭ．システム， Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， １４２５ Ｌａｋｅ Ｃｏｏｋ Ｒｏａｄ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ， Ｉｌｌ． ６００１５等）のうちのいずれかによって、行うことができる。好適な実施形態において、血液分離装置は、血液抽出チューブによって患者の血管に流体接続されている。蠕動ポンプ等の血液ポンプを血液抽出チューブに設置し、患者から血液分離装置へと血液を汲み上げる。アフェレーシスシステムに流体接続された別のチャンバからヘパリン等の抗凝固剤を血液に加えることができる。
【０２４８】
場合により、アフェレーシスシステムから血液を取り出して、実験室で処理してα２Ｍ受容体リガンドを除去した後、アフェレーシスシステムに戻して患者の体内に再び導入することができる。他の実施形態において、血液をさらに細胞成分毎に分けて、特定の細胞のサブセット（すなわち白血球）のみを処理してα２Ｍ受容体リガンドを取り除き、患者に再び戻すか、あるいは血漿のみを処理してα２Ｍ受容体リガンドを取り除き、患者に戻すことができるようにすることができる。他の実施形態において、血液を処理してα２Ｍ受容体リガンドを取り除いた後、ＨＳＰを血液に戻す。
【０２４９】
様々な実施形態において、患者から血液を手作業で採血し、標準的な実験室用の血液細胞回収装置によって細胞を分離することができる。細胞の回収後または回収中に、血液を処理してα２Ｍ受容体リガンドを取り除くことができる。次に、静脈内点滴または注射器による注入によって細胞を患者の体内に戻すことができる。
【０２５０】
１つの実施形態において、輸血／アフェレーシス法を用いて免疫反応を強化することができる。α２Ｍ受容体リガンドを、免疫疾患の治療が必要な患者の輸血血液から取り除く。他の実施形態において、血液から取り出したα２Ｍ受容体リガンドは熱ショックタンパク質ではない。
【０２５１】
このような方法の１つの例は、以下の工程を含む：（１）患者から血液を採取する工程；（２）α２Ｍ受容体リガンドに特異的な抗体等のα２Ｍ受容体リガンド結合性化合物を含むアフィニティーカラムに、該アフィニティーカラムにα２Ｍ受容体リガンドを結合させるのに十分な条件下で十分な時間、患者の血液を通過させる工程；（３）患者にα２Ｍ受容体リガンド枯渇血液を戻す工程。
【０２５２】
他の実施形態において、アフェレーシス法を用いて、α２Ｍ受容体リガンド（ＨＳＰを含む）を枯渇させた後、患者の血液に選択的なＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を加えることにより、免疫反応を強化することができる。
【０２５３】
このような方法の１つの例は、以下の工程を含む：（１）患者から血液を採取する工程；（２）α２Ｍ受容体リガンド結合性化合物を含むアフィニティーカラムに、該アフィニティーカラムにα２Ｍ受容体リガンドを結合させるのに十分な条件下で十分な時間、患者の血液を通過させる工程；（３）リガンド枯渇血液にＨＳＰまたはＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を加える工程；（４）患者に血液を戻す工程。
【０２５４】
血液からリガンドを取り除くために使用することができる方法には、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。アフィニティー精製は、アフィニティーカラム上の化合物とその結合相手との間の相互作用に基づいて行われる。アフィニティークロマトグラフィーの原理は、当技術分野において周知である。１つの実施形態において、組換えにより発現および精製された（もしくは部分的に精製された）タンパク質（α２Ｍ受容体など）を、例えばクロマトグラフィーカラムなどの固相支持体に共有結合または非共有結合により結合させる。患者から抽出された血液をこのようなカラム上で泳動させることができる。支持体に結合させたタンパク質はα２Ｍ受容体リガンドと結合し、血液からα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させる。次に枯渇血液を患者に戻すことができる。他の実施形態において、リガンドに特異的な抗体をクロマトグラフィーカラムに結合させることができ、α２Ｍ受容体リガンドに抗体が免疫特異的に結合する習性を用いて、血液からα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させることができる。あるいは、当技術分野で一般的に使用される多くの陽イオンまたは陰イオン交換樹脂のうちの１つを用いて、血液からα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させることができる。
【０２５５】
他の実施形態において、本発明は、精製α２Ｍ受容体リガンド結合性分子が結合した固相クロマトグラフィーカラムを含むキットも含む。このようなキットは、このような治療を必要とする患者の血液からα２Ｍ受容体リガンドを体外で取り除くのに必要なコンポーネントを含むことができる。
【０２５６】
また、輸血／アフェレーシス法は、免疫療法の他の方法と組み合せて用いることもできる。１つの実施形態において、例えば上記のように非ＨＳＰα２Ｍ受容体リガンドを枯渇させた後、輸血／アフェレーシス法や他の方法を用いてＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を癌患者または感染症患者に送達することができる。輸血／アフェレーシス法を用いて、ＨＳＰ抗原性ペプチド複合体を送達するのと同時に、送達しているＨＳＰ抗原性ペプチド複合体に対する免疫反応を刺激するために、α２Ｍ受容体リガンド（ＨＳＰ以外）を患者の血液から取り除くことができる。このように輸血／アフェレーシス法により、ＨＳＰ抗原性ペプチド複合体の送達および競合するα２Ｍ受容体リガンドの除去を１つの手順で両方とも行うことが可能となる。
【０２５７】
５．７　標的自己免疫疾患
本発明の方法によって治療することができる自己免疫疾患には、インシュリン依存型真性糖尿病（すなわちＩＤＤＭまたは自己免疫性糖尿病）、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、硬皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴズ病、重症筋無力症、自己免液性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状狼瘡、潰瘍性大腸炎、および密沈積症（ｄｅｎｓｅ ｄｅｐｏｓｉｔ ｄｉｓｅａｓｅ）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書中で記載されるとおり、上記疾患には、このような疾患の動物モデル（例えばＩＤＤＭの非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウス、および多発性硬化症の実験用自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスなど）により示されるものが含まれる。
【０２５８】
本発明の方法を用いて、患者自身の（自己の）組織への免疫反応を低下させるまたは取り除くことにより、あるいは自己免疫反応によりダメージを受けた自己の組織もしくは器官の代わりに移植された組織もしくは器官に対する既存の自己免疫反応を低下させるまたは取り除くことにより、このような自己免疫疾患を治療することができる。
【０２５９】
５．８　標的感染症
本発明の方法および組成物を用いて治療または予防することができる感染症には、ウイルス、細菌、原生動物および細胞内寄生虫などの細胞内病原体によって引き起こされるものが挙げられる。ウイルスには、ウイルス疾患が含まれ、例えばＢ型肝炎ウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルスやサイトメガロウイルスなど）、パポバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、およびＳＶ４０）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）およびエプスタイン−バーウイルスなど）、ポックスウイルス（天然痘（痘瘡）およびワクシニアウイルスなど）、ＲＮＡウイルス（ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴリンパ球好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）およびヒトＴリンパ球好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）を含むがこれらに限定されない）、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルスなど）、レオウイルス、トガウイルス（風疹ウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスなど）、アルボウイルス、ならびにＡ型肝炎ウイルス等により引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６０】
他の実施形態において、以下に挙げる病原性細菌（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる疾患等（ただしこれらに限定されない）の細菌感染を治療または予防することができる：化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルチ菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、鼻硬腫菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、牛カンピロバクター症菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ （Ｖｉｂｒｉｏ） ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ、アエロモナス・ヒドロフィラ、バシラス・セレウス、エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エルシニア・エンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、ネズミチフス菌、腸チフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、ピンタ・トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｒｕｍ）、ヴァンサンボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、黄疸出血症レプトスピラ、ヒト型結核菌、トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ニューモシスティス・カリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラスマ属に属する種、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、クラミジア属に属する種、およびヘリコバクター・ピロリ。
【０２６１】
他の好適な実施形態において、これらの方法は、以下に挙げる病原性原生動物（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる感染症を治療または予防するために使用することができる：赤痢アメーバ（Ｅｎｔｏｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、口腔トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｔｅｎａｓ）、腸トリコモナス、腟トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、肺炎ニューモシスティス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫。
【０２６２】
５．９　標的増殖性細胞障害
ＨＳＰ−α２Ｍ受容体活性に関係する特定の増殖性および腫瘍性疾患に関して、本発明の方法によって治療または予防することができる疾患には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ヒト肉腫および癌腫（例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌腫、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など）；急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病などの白血病（例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病。
【０２６３】
細胞増殖に欠陥のある、または治療もしくは予防のために細胞増殖が望まれる疾患および障害であって、例えば創傷の治癒を促進するため、または変性した、損傷した、もしくは負傷した組織等の再生を促進するために、α２Ｍ受容体の機能を阻害することにより治療もしくは予防することができる疾患および障害には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：変性疾患、成長不良、低増殖性障害（ｈｙｐｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、物理的外傷、損傷、および創傷。
【０２６４】
５．１０　医薬調製物および投与方法
α２Ｍ受容体遺伝子の発現または遺伝子産物の活性に影響を及ぼすことが分かっている化合物を、細胞増殖性障害を治療または緩和するために治療的有効量で患者に投与することができる。治療的有効量とは、このような障害の症状を和らげるのに十分な化合物の量を指す。
【０２６５】
５．１０．１　有効量
このような化合物の毒性および治療的効力を、標準的な薬学的手法によって、細胞培養または実験動物で決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療的有効量）を決定するための手法などがある。毒性と治療的効果との用量比（ｄｏｓｅ ｒａｔｉｏ）は治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用がある化合物を用いてもよいが、感染していない細胞にダメージを与える可能性を最低限に抑えることにより副作用を軽減させるために、このような化合物を患部組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するように注意を払わなければならない。
【０２６６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを、ヒトで使用する投薬量の範囲の公式化において用いることができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性を殆どもしくは全く持たないＥＤ５０を含む循環中の濃度の範囲内である。投薬量は、この範囲内で、使用される剤形および利用される投与経路に応じて異なる。本発明の方法で使用される全ての化合物について、治療的有効量は、まず細胞培養アッセイから判断することができる。動物モデルで用量を公式化して、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成するテスト化合物濃度）を含む循環中の血漿濃度範囲を達成することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２６７】
５．１０．２　製剤化および使用
本発明に従って使用する医薬組成物を、１種以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて従来の方法で製剤化することができる。
【０２６８】
このように、これらの化合物ならびにそれらの生理学的に許容可能な塩および溶媒化物は、吸入法または通気法（口もしくは鼻から）による投与用に、あるいは経口、バッカル、非経口、または直腸内投与用に、製剤化することができる。
【０２６９】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の製薬上許容可能な賦形剤と一緒に従来法により調製される錠剤やカプセル剤の形状のものであってもよい。錠剤は、当分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、たとえば溶液、シロップまたは懸濁液の形態であってもよいし、使用する前に水または他の適当なビヒクルで構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）、乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは精製植物油）、および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）等の製薬上許容可能な添加物と一緒に従来法により調製されてもよい。また調製物は、緩衝塩、香料、着色料および甘味料などを適宜含んでいてもよい。
【０２７０】
経口投与用調製物は、活性化合物の放出を制御するよう適切に製剤化される。
【０２７１】
バッカル投与の場合、組成物は、従来法により製剤化される錠剤またはトローチ剤の形状であってもよい。
【０２７２】
吸入法により投入する場合、本発明に従って使用される化合物は、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体）を用いて、圧力パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーとして都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、服用量単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入器または吹入器で用いる例えばゼラチン製等のカプセルおよび薬包は、ラクトースやデンプンなどの好適な粉末基剤と本発明の化合物との混合粉末を含んで製剤化することができる。
【０２７３】
本発明の化合物は、注射による（例えばボーラス注射または連続注入などによる）非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、服用量単位の剤形として、例えばアンプルまたは複数用量容器の中に保存剤を加えた形で提供されてもよい。本発明の組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳剤などの形態であっても良く、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤等の製剤化剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用する前に好適なビヒクル（例えば発熱物質を含まない無菌水）で構成するための粉末状のものであってもよい。
【０２７４】
また本発明の化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤または貯留浣腸等の直腸用組成物として製剤化してもよい。
【０２７５】
先に記載した製剤のほかに、本発明の化合物は、デポ製剤として製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、体内移植（例えば皮下または筋肉内）により、または筋肉内注射により、投与することができる。したがって、例えば本発明の化合物は好適なポリマー材料もしくは疎水性材料と一緒に（例えば許容可能な油中の乳剤として）、またはイオン交換樹脂と一緒に、あるいは例えば難溶性塩等の難溶性誘導体として、製剤化することができる。
【０２７６】
望ましい場合、本発明の組成物は、有効成分を含む単位剤形を１つ以上含むパックまたはディスペンサーに入れて提供してもよい。パックは例えば金属箔またはプラスチック箔製のもの（ブリスターパック等）であってもよい。パックまたはディスペンサーに、投与方法説明書を添付してもよい。
【０２７７】
６．実施例：ＨＳＰ受容体としてのα２Ｍ受容体の同定
６．１　序論
本明細書中に提供される実施例は、マクロファージおよび樹状細胞中に存在するα２Ｍ受容体とｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンとの相互作用を首尾良く同定したことについて記載する。ここで提供される実験は、α２Ｍ受容体ポリペプチドの単離、ならびに本発明のスクリーニング方法、診断方法および治療方法の基礎を成すものである。
【０２７８】
本発明者は、ある観察結果が、ＨＳＰシャペロン化ペプチド抗原（ＨＳＰ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅｄｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の提示の「直接輸送」モデルと一致しないことに気付いた。まず、ＨＳＰ調製物の免疫原性は、Ｂ細胞や他の非プロフェッショナル抗原提示細胞ではなく機能的な食細胞の存在に依存するが（ＵｄｏｎｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９３（前掲）； ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））、遊離ペプチドは全ての細胞型を感作することができる。第２に、極端に少量のＨＳＰ−ペプチド複合体は、特異的な免疫を誘発するのに効果的であった。すなわち、ＣＴＬ認識のためにマクロファージを感作する上で、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドは、遊離ペプチドに比べて数百倍効果がある。このことは、特異的な取込みメカニズムが存在する可能性を示唆している。第３に、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドは、ＭＨＣ Ｉ反応を誘発し、この反応はペプチドの大きさによって制限されなかった。最後に、マクロファージ中でのｇｐ９６−ペプチド複合体のプロセッシングは、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）（ゴルジ体を経由する輸送を遮断する）に対して感受性であることが分かった。このことは、細胞内のメカニズムを介してプロセッシングが起こったことを示す。これらの観察結果により、ＨＳＰシャペロン化ペプチドは、内部でプロセッシングされ、マクロファージの細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される、という仮説が導き出された（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））。また、マンノース受容体がｇｐ９６の取込みに使用されるという仮説もあるが、ＨＳＰ７０などの非グリコシル化ＨＳＰについてのメカニズムは提唱されていない（Ｃｉｕｐｉｔｕら， １９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８７： ６８５−６９１）。他の観察結果は、新規な細胞内の輸送経路が、細胞外の媒質からＥＲのルーメンへのペプチドの輸送に関係していることを示した（Ｄａｙら， １９９７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：８０６５−８０６９； Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９）。さらに、（ａ） 食胞から細胞質ゾルにタンパク質を短絡させて通常のクラスＩ経路に入れる未だ不明確な経路を有する食細胞および（ｂ）リソソーム中に摂取された物質を消化してペプチドを表面のクラスＩ分子に負荷させるように戻す食細胞、の関与が示唆されている（Ｂｅｖａｎ， １９９５， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９２：６３９−４１）。本明細書中に開示された熱ショックタンパク質に対する受容体の発見は、ＨＳＰと複合体を形成した細胞外抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子により抗原提示細胞上にどのように提示され得るのかというパラドックスを解明する手掛りとなる。
【０２７９】
６．２　材料および方法
マウス、細胞および試薬　ジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からＣ５７Ｂ１／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＴＡＰ（−／−）マウスを入手した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄由来ＤＣを作製した。骨髄をフラッシュアウトし、白血球を得て、１０％熱不活化ＦＣＳおよび２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦ（Ｅｎｄｏｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を加えた完全ＲＰＭＩ１６４０中で、Ｌｕｔｚら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：７７−９２に記載されたように６日間培養した。この６日間培養物については、ＧＭＣＳＦを添加した新しい培地を３日目にプレートに加えた。プリスタン処理したマウスのＰＥＭから、ＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）の陽性選択により、マクロファージを得た。ＲＡＷ２６４．７は、クリストファー・ニキータ博士（Ｄｒ． Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ）から供与された。Ａ２０．２５は、ローレンス・クワク博士（Ｄｒ． Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｋｗａｋ）から供与された。他の全ての細胞系は、ＡＴＣＣから入手した。プロテアソームインヒビターであるラクタシスチンは、カミヤ社（Ｋａｍｉｙａ Ｉｎｃ．， Ｊａｐａｎ）から購入した。抗−ＣＤ９１抗体（クローン５Ａ６）は、ＰＲＡＧＥＮ社（ハイデルベルグ）から購入した。抗−ｈｓｐ７０（クローンＮ２７Ｆ３）および抗−ＰＤＩ（クローン１Ｄ３）抗体は、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社（カナダ国ビクトリア州）から購入した。
【０２８０】
ＨＳＰの精製　ＨＳＰを、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｐ．Ｋ．， １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２：１６５−１７１； ＢａｓｕおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９（５）：７９７−８０２に記載されているように精製した。精製に使用される全ての緩衝液は、内毒素を含まない水（Ｎａｎｏｐｕｒｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＶ／ＵＦ， Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ， Ｄｕｂｕｑｕｅ， ＩＡ）を用いて調製し、および精製に使用した全てのガラス器具類は内毒素を含まない水で洗浄し、４０００Ｆのオーブン（Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ， Ｗｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ， ＰＡ）で焼いた。イムノブロットによってＨＳＰ含有画分を同定した。
【０２８１】
ＦＩＴＣへのタンパク質の結合および細胞の染色　ＦｌｕｏｒｏＴａｇ ＦＩＴＣコンジュゲーションキット（ＳＩＧＭＡ）を用いて製造業者のプロトコールに従い、精製したタンパク質をＦＩＴＣに結合させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用いたイムノブロットによって分子量の２ｋＤＡ増加により結合を確認した。指示された量のＦＩＴＣタグ付加タンパク質と細胞を、１％脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標））含有ＰＢＳの存在下で４℃にて２０分間インキュベートした。繰返し洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により細胞を分析した。またＦＡＣＳｃａｎ分析の直前に、細胞を、ヨウ化プロピジウムでも標識した。ヨウ化プロピジウムについて陽性に染色された細胞を事象から除外した。プリスタン処理したマウスとプリスタン処理していないマウスとでは、Ｍａｃ−１＋細胞へのＨＳＰの結合において差は見られなかった。固定された細胞または固定されていない細胞をＦＩＴＣタグ付加ＨＳＰで上記のように標識した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ共焦点顕微鏡を用いて、標識された細胞を可視化した。
【０２８２】
アフィニティークロマトグラフィー　容量２ｍｌのタンパク質（１ｍｇ）を、還元剤（ＮａＣＮＢＨ３）を加えた平衡化したＡｍｉｎｏＬｉｎｋビーズ含有ＰＢＳ（２ｍｌ）と一緒に、１時間インキュベートした。カラムを徹底的に洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、未反応基をクエンチングさせた。固定化の収率は、一般には、タンパク質の最初の量の９２％を超えていた。カラムは使用するまで４℃で保存した。このようなカラムを、ｇｐ９６（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ８３：３４０７−３４１１に記載されたように精製した）およびアルブミンを用いて作成した。膜を精製するために、ダウンスホモジェナイズによりＰＭＳＦを含む低張緩衝液中に細胞を溶解した。１０００ｇにて５分間遠心分離することにより、溶解しなかった細胞および核を取り除いた。核を取り除いた上清を１００，０００ｇにて９０分間遠心分離した。ペレットは全ての膜を含んでおり、デキストラン／ポリエチレングリコールの二重相で、水性二相分画により分画した。簡単にまとめると、膜をＰＥＧ（０．２２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、３３重量％；ｐＨ６．５）中に再懸濁し、デキストラン（０．２２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中、２０重量％；ｐＨ６．５）の上に穏やかに重層した。これら２つの相をゆっくりかき混ぜ、２０００ｇにて１５分間遠心分離した。これらの境界相にある白い物質は原形質膜を豊富に含んでおり、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８、０．０８％オクチルグルコシドを含む）中で４℃にて２時間インキュベートすることにより、これらのタンパク質を抽出した。
【０２８３】
推定上の受容体へのｇｐ９６の光架橋　架橋剤ＳＡＳＤ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＩ１２５で標識した。放射性標識したＳＡＳＤを、室温にて１時間インキュベートすることによって、共有結合によりｇｐ９６に結合させた。遊離ＳＡＳＤおよびＩ１２５をサイズ排除カラム（ＫｗｉｋＳｅｐカラム， Ｐｉｅｒｃｅ）により除去した。架橋研究のために、Ｉ１２５−ＳＡＳＤ−ｇｐ９６（５０μｇ ｇｐ９６）を精製ＣＤ１１ｂ＋細胞と一緒にインキュベートした。結合していないタンパク質を洗浄して除去した。この点について、全ての手順は、非常に微かな光の中で行った。紫外線でタンパク質を架橋させた。溶解バッファー（０．５％ＮＰ４Ｏ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ， １ｍＭＥＤＴＡ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ）で細胞を溶解し、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールで処理して架橋を切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより、細胞溶解液を分析した。
【０２８４】
提示アッセイ　ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８に記載されたように、提示アッセイを行った。抗原提示細胞（ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞系）を、完全ＲＰＭＩ中でＡＨＩ−特異的Ｔ細胞と一緒に１：１の比率でプレーティングした。各タイプにつき約１０，０００個の細胞を用いた。ＡＨ１−２０量体ペプチド（ＲＶＴＹＨＳＰＳＹＶＹＨＱＦＥＲＲＡＫ）をシャペロン化するｇｐ９６（１０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、全培養物を２０時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）により上清中に放出されたＩＦＮ−γの量を定量することにより、Ｔ細胞の刺激を測定した。さらに、ＣＤ１１ｂ＋腹腔滲出細胞（１×１０４）を、肝臓から精製したＨＳＰまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されたＨＳＰ−ペプチド複合体でパルスし、関連ＣＤ８＋Ｔ細胞（指定した、ＶＳＶ８特異的ＣＴＬ系またはＡＨ１特異的ＣＴＬクローン）を培養物に加えた。５％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を入れた９６ウェルプレート中で容量２５０ｍｌで３７℃にて２０時間アッセイを行った。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）によりＩＦＮ−γ放出の存在についてテストした。
【０２８５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＳＰとペプチドとの複合体形成　０．７Ｍ ＮａＣｌのＮａ−リン酸緩衝液中にＨＳＰをＶＳＶ１９またはＡＨ１−１９と５０：１（タンパク質に対するペプチドのモル比）で混合して、５０℃にて１０分間加熱した後、室温にて３０分間インキュベートした。ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０（Ａｍｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて過剰な遊離ペプチドをＰＢＳで除去した。
【０２８６】
ＣＤ１１ｂ＋細胞の精製　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ． （Ａｕｂｕｒｎ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により提供されるＭＡＣＳカラムおよびプロトコールを用いて、ＣＤ１１ｂ＋細胞を選択した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．からＣＤ１１ｂ抗体（ＣＤ１１ｂ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとして供給）を購入し、それをこの実験においてテストしたマーカーに関してＣＤ１１ｂ＋細胞を活性化しないことが分かった。
【０２８７】
細胞傷害性Ｔ細胞の誘導　ＶＳＶ１９ペプチドと複合体形成させたｇｐ９６（５０ｍｇ）を腹膜内に投与してＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。１０日後、受容者の脾臓を取り出し、脾細胞をＶＳＶ８合成ペプチド（１ｍＭ濃度）で刺激した。５日後、ＭＬＴＣの細胞傷害性について、標的としてＥＬ４細胞のみ、およびＶＳＶ８ペプチドでパルスしたＥＬ４細胞を用いて、クロム放出アッセイでテストした。
【０２８８】
タンパク質のマイクロ配列決定法　アフィニティークロマトグラフィーにより同定されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、さらにクーマシーブルーで染色するか、またはＰＶＤＦ膜に移してクーマシーブルーで染色した（全てケラチンを含まない条件下で行った）。かみそりでゲルまたは膜からタンパク質バンドを切り出した。８０ｋＤａのかすかなクーマシーバンドからトリプシンペプチドを、５０％アセトニトリル、５％蟻酸で抽出し、乾燥し、７５ｍ １０ｃｍの逆相Ｃ１８マイクロキャピラリーカラム（体積３μｌ）上に載せ、オンラインマイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析法によりトリプシンペプチドを分離した後、先に記載されたように、ＳＥＱＵＥＳＴプログラムを用いてデータベース検索を行った（Ｇａｔｌｉｎら， ２０００， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７２：７５７−６３； Ｌｉｎｋら， １９９９， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：６７６−８２）。Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ質量分析計を用いて、データ依存型自動ＭＳ／ＭＳ様式で、分析を行った。
【０２８９】
６．３　結果
潜在的ｇｐ９６受容体としての８０ｋＤａタンパク質の同定　ｇｐ９６の均質な調製物をＦＩＴＣに結合させ、ｇｐ９６−ＦＩＴＣを用いてＲＡＷ２６４．７細胞を染色したところ、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示することができる機能があることが分かった。ｇｐ９６−ＦＩＴＣはＲＡＷ２６４．７細胞の細胞表面を染色したが、対照アルブミンＦＩＴＣ調製物は染色しなかった（図１Ａ）。細胞表面ビオチン化ＲＡＷ２６４．７細胞の原形質膜調製物を、０．０８％オクチル−グルコシド中に可溶化し、可溶性抽出物をｇｐ９６−セファロースカラムに加えた。結合したタンパク質を３Ｍの塩化ナトリウムで溶出した。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、およそ７５〜８０ｋＤａのサイズの２つの大きなバンドが得られた（図１Ｂ、左上）。このゲルをアビジン−ペルオキシダーゼを用いてブロットしたところ、いずれのバンドもビオチン化されていることが分かった。これは、これらが表面に局在していることを示す（図１Ｂ、左下）。対照血清アルブミンアフィニティーカラム上でのＲＡＷ２６４．７細胞の膜抽出物のアフィニティー精製では、いずれのタンパク質も単離されず、このようなゲルのイムノブロットをアビジンペルオキシダーゼでプローブしても、アルブミン結合性表面タンパク質は検出されなかった（図１Ｂ、一番上および一番下の中央のライン）。ｇｐ９６アフィニティーカラム上で、追加的な対照として、ｇｐ９６−ＦＩＴＣに結合せず、かつｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示しないＰ８１５細胞の膜抽出物のクロマトグラフィーを行ったが、ｇｐ９６−結合タンパク質は溶出されなかった（図１Ｂ、一番上および一番下の右側のライン）。
【０２９０】
並行実験で、ｇｐ９６分子を、光架橋可能基を含む放射性ヨウ素化リンカーであるスルホスクシンイミジル（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（ＳＡＳＤ）に結合させた。ｇｐ９６−ＳＡＳＤ−Ｉ１２５を、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示することが先に証明されている腹腔マクロファージ（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８）上にパルスした。細胞の洗浄を何度も行って過剰なｇｐ９６−ＳＡＳＤを除去し、紫外線を細胞に１０分間照射することにより、光活性化を行った。推定上のｇｐ９６リガンドにＩ１２５基を転移させるために、細胞溶解液を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にオートラジオグラフィーを行って分析した。ｇｐ９６分子は、提示不能Ｐ８１５細胞中ではなく提示可能（ｒｅ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マクロファージ中に特異的に存在するおよそ８０ｋＤａのバンドに架橋することが観察された（図１Ｃ）。このバンドは、ｇｐ９６アフィニティーカラムの溶出物中に見られる２つのバンドのうち大きな方にサイズが対応するようである（図１Ｂ）。その調製物の下方のバンドに対応するバンドは、光架橋調製物中には見られない。ｇｐ９６が、提示不能細胞系の中ではなく２つの異なる提示可能細胞型の中の８０ｋＤａタンパク質に特異的に結合するという観察結果、ならびに２つの独立したアッセイによる観察結果は、この８０ｋＤａ分子がｇｐ９６受容体の候補であることを支持していた。
【０２９１】
８０ｋＤａタンパク質に対する抗血清は、ｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドの提示を阻害する。７５〜８０ｋＤタンパク質を含む溶出物を用いて、ニュージーランド白ウサギを免疫し、免疫前および免疫後の血清を用いて、提示可能ＲＡＷ２６４．７、一次腹腔マクロファージおよび提示不能Ｐ８１５細胞の原形質膜抽出物のブロットをプローブした。免疫後の血清は、Ｐ８１５細胞ではなく一次マクロファージおよびＲＡＷ２６４．７膜の原形質膜抽出物中の８０ｋＤａバンド（およびこれより低いかすかな７５ｋＤａバンド）を検出したが、免疫前の血清は検出しなかった（図２Ａ）。免疫前および免疫後の血清を、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドの提示を妨げる能力についての機能アッセイにおいてテストした。ネズミ大腸癌ＣＴ２６のｇｐ７０抗原に由来するＬｄ−制限エピトープＡＨ１（Ｈｕａｎｇら， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３： ９７３０−９７３５）をモデル系として用いた。ＡＨ１前駆体（直接的な提示を阻害するために使用される）とｇｐ９６との複合体を、ＲＡＷ２６４．７細胞上にパルスし、これらを用いてＬｄ／ＡＨ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを刺激した。クローンによるインターフェロン−γの放出を、それらの活性化をマーカーとして測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、このアッセイにおいてｇｐ９６によりシャペロン化されたＡＨ１前駆体を効率良く提示することができた。最も高い濃度で、免疫後血清は、提示を完全に阻害したことが観察された（図２Ｂ）。免疫前の血清は、免疫後血清に比べて提示の阻害における効力が低かったが、高い濃度では提示をかなり阻害した。この観察結果の重大性は、後に本発明者らがｇｐ９６受容体の正体を決定したときに明らかとなった。アフィニティー精製したｇｐ９６結合タンパク質で繰返し免疫しても、それに応じて抗体力価が上昇することはなかった。
【０２９２】
α２Ｍ受容体の重鎖のアミノ末端フラグメントとしての８０ｋＤａタンパク質の同定
ｇｐ９６アフィニティーカラムから溶出した８０ｋＤａタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色することにより可視化した。タンパク質のバンドをゲル中でトリプシン消化し、第６．２節の「方法」に記載されたように質量分析法をベースとするタンパク質のマイクロ配列決定にかけた。α２−マクログロブリン（α２Ｍ）受容体のＮ末端領域に対応する独立した４つのトリプシンペプチド（免疫学者によりＣＤ９１と呼ばれる）が同定された（図３Ｃ）。
【０２９３】
α２Ｍはｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドのＲＡＷ２６４．７による提示を阻害する。α２Ｍ受容体は、α２Ｍ受容体の公知の天然リガンドのうちの１つである。ｇｐ９６によりシャペロン化された抗原性ペプチドＡＨ１の提示を阻害するその能力を、図２に記載したアッセイでテストした。α２Ｍは提示を完全に且つ滴定可能に（ｔｉｔｒａｔａｂｌｙ）阻害するが、対照タンパク質であるセレクチン（ＣＤ６２）や血清アルブミンはこれを阻害しないことが観察された（図４）。この観察結果は、免疫前の血清はＲＡＷ２６４．７細胞の原形質膜中の８０ｋＤａバンドを検出しなかったが、高い濃度では提示をある程度阻害した、という図２の結果とも一致していた。このように、構造的基準および機能的基準により、α２Ｍ受容体は、ｇｐ９６の受容体としての必須基準を満たすと判断された。
【０２９４】
一次細胞および培養細胞のパネルへの蛍光標識ＨＳＰおよびα２−マクログロブリンの結合　ＦＩＴＣで標識したＨＳＰ、ｇｐ９６、ｈｓｐ９０もしくはｈｓｐ７０、または対照非ＨＳＰ血清アルブミン（ＳＡ）を、一次細胞（例えばプリスタンにより誘導された腹腔マクロファージ等）、分化した骨髄由来樹状細胞、または不死化細胞系（例えばマクロファージ起源のＲＡＷ２６４．７、ＲＡＷ３０９Ｃｒ．１、Ｐ８１５肥満細胞腫、ＹＡＣ−１リンパ腫、ＥＬ４胸腺腫、Ｍｅｔｈ ＡおよびＰＳ−Ｃ３Ｈ線維肉腫、Ｂ１６黒色腫、ＣＴ２６結腸癌、ならびにＵＶ６１３９扁平上皮癌）と一緒に、「方法」に記載したように、インキュベートした。結合しなかったタンパク質を十分に洗浄することにより除去した後、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。図５に示すように、腹腔マクロファージおよび骨髄由来樹状細胞は、アルブミンではなく３つのＨＳＰの各々にしっかり結合することが分かった。しかし、２つのマクロファージ細胞系のうち一方（ＲＡＷ２６４．７）しか、３つのＨＳＰに結合しなかった。ＲＡＷ３０９Ｃｒ．１は、ＨＳＰのどれにも結合しなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。ＦＩＴＣで標識したｇｐ９６、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ７０を用いてテストした８つの他の細胞系のうち、ＲＡＷ２６４．７を用いて観察された結合に匹敵する程度にＨＳＰに結合したものは観察されなかった。ＹＡＣ１はｈｓｐ７０への結合が観察されたが、程度は非常に低かった。その結合はＡＰＣで観察された結合の何分の１かしかなかった。
【０２９５】
先に記載したように、α２マクログロブリン受容体は、ｇｐ９６の受容体として同定された。図５の細胞型全てを、ＦＩＴＣ−α２マクログロブリンで染色することによりＣＤ９１の存在についてもテストした。ＣＤ９１は、３つのＨＳＰの各々と、同じ分布パターンを正確に示した（図５）。
【０２９６】
ＨＳＰおよびα２Ｍへの細胞の結合能は、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示する能力と相関関係がある。本発明者らは、図５に示す特定の細胞型がＨＳＰまたはα２マクログロブリンに結合する能力が、ｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドを提示するその能力と相関するか否かをテストした。提示研究は一般に、ＡＰＣおよびＨＳＰ（既知のペプチドをシャペロン化する）を、シャペロン化ペプチドの中に存在するエピトープに特異的なＴ細胞と一緒にインキュベートすることにより、行われる（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））。ペプチドが、ＭＨＣ Ｉ上に直接負荷されることができずに、細胞内でプロセッシングされた後にＴ細胞に提示され必要があるように、実験系をセットアップする。ＶＳＶ８およびＡＨ１抗原系をこれらの研究に用いた。ＶＳＶ８エピトープ（ＲＧＹＶＹＱＧＬ）はＫｂ分子により提示されるが、ＶＳＶ１９（ＳＬＳＤＬ ＲＧＹＶＹＱＧＬＫＳＧＮＶＳ）はそれが伸長してできた変異体であり、これは、Ｋｂに直接負荷できない。ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）は、マウス白血病ウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ７０のＬｄ制限エピトープであり（Ｈｕａｎｇら， １９９６）、ＡＨ１−１９（ＲＶＴＹＨＳＰＳＹＶＹＨＱＦＥＲＲＡＫ）は、それが伸長したものである。腹腔マクロファージおよびＢＭ−ＤＣを、ＶＳＶ８系における提示について並行してテストしたところ、これらの細胞型はいずれもｈｐ９６によりシャペロン化されたＶＳＶ１９をＶＳＶ８特異的Ｔ細胞に提示することができた（図７Ａ）。ＥＬ４およびＢ１６細胞（ｂハロタイプの両方）もテストし、同じアッセイで提示することができないことが分かった（データは示されていない）。マクロファージに比べてＢＭ−ＤＣはｇｐ９６によりシャペロン化されたＶＳＶ１９をずっとよく提示することが観察された。しかしこのデータからは、この差が一般にＤＣのＴ細胞刺激特性が良いことによるものであるのか、またはＤＣがマクロファージに比べてｇｐ９６シャペロン化ペプチドを特により効率良く提示するのか否かは、決定することができない。２つのマクロファージ細胞系ＲＡＷ３０９Ｃｒ．１およびＲＡＷ２６４．７の、ＡＨ１系における提示能についてテストした。ＨＳＰおよびα２Ｍ染色データ（図５）と並行して、ＲＡＷ２６４．７細胞はｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドを提示することができるが、ＲＡＷ３０９Ｃｒ．１はできないことが観察された（図７Ｂ）。
【０２９７】
ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびＣＲＴによりシャペロン化されたペプチドは、ＡＰＣのＭＨＣＩ分子によって提示される。ｇｐ９６は、提示現象が実験的に証明された最初のＨＳＰであった（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ １９９５（前掲））。最近になって、ｈｓｐ７０シャペロン化ペプチドは、ＡＰＣによって提示されることが分かった（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏら， ２０００， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９１（１１）：１９５７−１９６４）。他のＨＳＰ、ｈｓｐ９０およびＣＲＴが、シャペロン化ペプチドを内因性提示経路の中に導入する能力を、ＡＰＣとしてＲＡＷ２６４．７細胞を用いてＡＨ１系でテストした。ＲＡＷ２６４．７細胞をｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、カルレティキュリン、または陽性対照としてｇｐ９６を用いて、これらのみで、またはこれらにてシャペロン化ＡＨＰ１−１９ペプチドで、パルスした。ＨＳＰによるペプチドのシャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）は、以前に記載されたように（Ｂｌａｃｈｅｒｅら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１３１５−１３２２； ＢａｓｕおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ １９９９， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９：７９７−８０２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで行った。ＲＡＷ２６４．７細胞をｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、ＣＲＴまたはｇｐ９６とＡＨ１−１９との複合体でパルスしたところ、Ｌｄ／ＡＨ−１に特異的なＴ細胞はＩＦＮ−γを分泌したが、ＨＳＰを該ペプチドと複合体形成させなかったときは、分泌しなかった（図８）。ＲＡＷ２６４．７細胞をＡＨ１−１９のみでパルスしても、Ｌｄ分子の表面負荷およびそれによるＴ細胞の刺激には至らなかった。さらに、ＲＡＷ２６４．７細胞をＡＨ１−１９と血清アルブミンとの複合体でパルスしても、Ｌｄ／ＡＨ１−特異的Ｔ細胞を刺激しなかった。このことは、内因性提示経路へのシャペロン化ペプチドの導入にＨＳＰが特に必要であることを示している（図８）。
【０２９８】
ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびＣＲＴは、共通の受容体に結合する。各ＨＳＰはユニークな受容体を有するのか、それともこれらは共通の受容体を共有するのか？　この論点は、以下に挙げる３つの独立した判断基準によって検討される：過剰量および滴定量の遊離（すなわちＡＨ１−１９と複合体形成していない）ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０または血清アルブミンの存在下でｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１−１９の提示を測定する（図７および８）；α２マクログロブリン（ｇｐ９６の受容体であるＣＤ９１の既知のリガンド）が、ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、またはＣＲＴによりシャペロン化されたペプチドの提示を阻害することができるか否かをテストする；および最終的に、抗ＣＤ９１抗体が一部または全てのＨＳＰによりシャペロン化されたペプチドの提示を阻害することができるか否かをテストする。
【０２９９】
ｇｐ９６−ＡＨ１−１９複合体をＲＡＷ２６４．７培養物に一定の最終濃度４０μｇ／ｍｌで加える一方、競合するＨＳＰまたは血清アルブミンを２００〜８００μｇ／ｍｌの濃度で加えた。効率は異なるが、全ての３つの競合ＨＳＰがｇｐ９６によりシャペロン化されたＡＨ１−１９の提示を阻害することができたことが観察された（図９Ａ）。ｇｐ９６は自身と競合することができたが、ｈｓｐ９０はｇｐ９６よりもさらに良い競合因子であった。ｈｓｐ７０は、ｇｐ９６に比べて効率の低い競合因子であったが、重要な競合因子であった。アルブミンの競合効率は低かった。定量的な点では、ｇｐ９６の濃度が４０μｇ／ｍｌであるとき、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示を５０％阻害するためには、約２倍モル過剰のｈｓｐ９０、６倍モル過剰のｇｐ９６および１３倍モル過剰のｈｓｐ７０が必要であった。３つのＨＳＰ全ては、テストした最高濃度で、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示を完全に阻害することができた。この観察結果は、ｇｐ９６、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ７０が、特異性は異なるが、単一の受容体を利用することを示唆している。
【０３００】
更なる実験において、ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０またはＣＲＴによりシャペロン化されたＡＨ１−１９がＲＡＷ２６４．７細胞によってＬｄ／ＡＨ−１特異的Ｔ細胞に提示される提示アッセイに、α２マクログロブリンを増加した量で加えた。α２マクログロブリンが、滴定可能な様式で、４つのＨＳＰの各々によりシャペロン化されたペプチドの提示を阻害するのが観察された（図９Ｂ）。ｇｐ９６、ｈｓｐ７０およびＣＲＴによりシャペロン化されたペプチドの提示は等しく阻害されたが、ｈｓｐ９０によりシャペロン化されたペプチドの提示が最も効率良く阻害され、α２マクログロブリンがテストした中で最も高い濃度であるときには、ほぼ完全に阻害された。血清アルブミンは、最も高い濃度でテストしたとき、提示をそれほど阻害しなかった。図９Ａのデータは、特異的ペプチド欠損ＨＳＰがテストした最も高い濃度であるときｇｐ９６−ＡＨ１−１９複合体の提示を完全に阻害したが、α２マクログロブリンは量的観点から見ると４つのＨＳＰのうち３つによりシャペロン化されるペプチドの提示の阻害についての効果は非常に低いようであることを示すことに留意されたい（図９Ｂ）。しかし、α２マクログロブリン分子がモル質量で平均ＨＳＰ分子よりもおよそ１０倍大きいことに注目すれば、この量の格差はなくなる。
【０３０１】
マウスモノクローナル抗−ＣＤ９１ ＩｇＧ１抗体およびアイソタイプ対照抗体がｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびＣＲＴによりシャペロン化されたペプチドの提示を阻害する能力についてテストした。先に記載したように、ＲＡＷ２６４．７／ＡＨ１系を用い、指示された濃度で抗体を提示培養物に加えた（図９Ｃ）。抗ＣＤ９１抗体は、テストした４つのＨＳＰの各々によりシャペロン化されたＡＨ１の提示を滴定可能に且つ特異的に阻害することが観察された。アイソタイプ対照抗体は、いずれのケースにおいても提示を阻害しなかった。さらに、抗ＣＤ９１抗体により媒介される阻害は、ＨＳＰの各々について完全且つ一様であり、これは、ＣＤ９１が４つのＨＳＰのそれぞれに対する唯一の受容体であることを示唆している。
【０３０２】
ｇｐ９６シャペロン化ペプチドがＡＰＣにより提示されるためには機能的プロテアソーム複合体が必要である。特異的プロテアソームインヒビターであるラクタシスチンの存在下または不在下において、提示アッセイを行った。腹腔マクロファージをラクタシスチンで２時間処理したものと処理しなかったものとを用意し、これらをインヒビターの存在下または不在下にてｇｐ９６−ＶＳＶ１９複合体と一緒に更に２時間培養した。細胞を同時に１時間にわたりクロムで標識した後に洗浄し、４時間のクロム放出アッセイにおいてＶＳＶ８に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に対する標的として使用した。ラクタシスチンで処理しなかった、ｇｐ９６−ＶＳＶ１９でパルスしたＡＰＣは、ＶＳＶ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって溶解された（図１０Ａ）。ｇｐ９６（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ １９９５（前掲））およびｈｓｐ７０（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏら， ２０００ （前掲））について前に観察されたように、テストした中で一番高いＥ：Ｔ比であっても、パルスしたＡＰＣのほんの一部しかＡＰＣにより溶解されなかった（図１０Ａ）。（表面チャージによって）ＶＳＶ８でパルスしたＡＰＣは、滴定可能にかなりの程度で溶解され、このことは、ＡＰＣを完全に溶解することが可能であったことを示している。ＨＳＰシャペロン化ペプチドを提示するＡＰＣの選択的溶解性の原理はまだはっきりしていない。しかし、この観察結果にもかかわらず、ラクタシスチンで処理した、ｇｐ９６−ＶＳＶ１９でパルスしたＡＰＣは、ＶＳＶ８特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されず、これらにより溶解されなかった（図１０Ａ）。したがってプロテアソーム機能の阻害は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドのプロセッシングを阻害する（図１０Ａ）。また、テストした他のＨＳＰも同じ侵入門戸（ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｅｎｔｒｙ）を使用するので（図９）、プロテアソーム機能の阻害が、これらによりシャペロン化ペプチドのプロセッシングも同様に阻害すると思われる。Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏらにより最近報告されたｈｓｐ７０についてのデータは、この推論と一致する。
【０３０３】
ｇｐ９６シャペロン化ペプチドがＡＰＣのＭＨＣ Ｉにより提示されるには機能的ＴＡＰが必要である。ｇｐ９６シャペロン化ペプチドのＡＰＣによる提示におけるＴＡＰの必要性についてテストした。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの提示アッセイにおいて、肝臓から精製したｇｐ９６またはＶＳＶ１９と複合体を形成した同ｇｐ９６を、ＴＡＰ＋／＋もしくは−／−マウスに由来する腹腔マクロファージの初代培養物にパルスした。パルスしたＡＰＣを用いて、Ｋｂ／ＶＳＶ８に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞系を刺激した。２０時間インキュベートした後、培養上清を、Ｔ細胞刺激のマーカーとしてＩＦＮ−γの放出についてテストした（図１０Ｂ）。ＴＡＰ＋／＋マウスに由来するＡＰＣは、特にＶＳＶ１９と複合体を形成したｇｐ９６の存在下で培養したときにＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に刺激したが、ＴＡＰ１−／−マウスに由来するＡＰＣはそれができなかったことが観察された。この結果は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドがＭＨＣ Ｉ分子に負荷されるためには、ＴＡＰ分子を通って小胞体の中に入り込まなければならないことを示す。テストした他のＨＳＰも同じ侵入門戸を使用するので（図９）、他のＨＳＰによりシャペロン化されたＨＳＰも提示されるためにはＴＡＰを必要とすると考えられる。Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏらにより最近報告されたｈｓｐ７０についてのデータの一部は、この推論と一致する。
【０３０４】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究において、ＴＡＰ１（−／−）（Ｃ５７ＢＬ／６／ＳＶ１２９Ｊ）または野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスを、ｇｐ９６−ＶＳＶ１９複合体（５０μｇのＶＳＶ１９と複合体を形成させた５０μｇのｇｐ９６）、ＶＳＶ１９のみ、またはｇｐ９６のみで免疫した。免疫したマウスの脾臓細胞をＶＳＶ８と一緒に培養し、５１Ｃｒで標識したＥＬ４細胞またはＶＳＶ８ペプチドでパルスしたＥＬ４細胞を標的としてこれらに対する細胞傷害活性についてテストした。ｇｐ９６−ペプチド複合体で免疫した野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスの脾臓細胞は、ＶＳＶ８特異的ＣＴＬ活性を示したが、ｇｐ９６−ペプチド複合体で免疫したＴＡＰ１（−／−）マウスの脾臓細胞は細胞傷害活性を示さなかった（図１０Ｃ）。ＴＡＰ−／−マウスにおけるＣＴＬ活性の欠如は、提示における特異的遮断によるものというよりは、ＭＨＣ Ｉ分子の負荷および安定性が一般的に乏しい結果である、と主張することもありうるだろう。これはあり得ることであり、完全に異議を唱えるのは難しいが、本発明者らは、フロイントの不完全アジュバント中のＶＳＶ８ペプチドを用いた免疫により、ＴＡＰ＋／＋マウスと同様に、ＴＡＰ−／−マウスにおいてＶＳＶ８特異的ＣＴＬを簡単に作製することができる（データは示されていない）。Ｓａｎｄｂｅｒｇら（１９９６）は、同様のデータを報告している。いずれの場合においても、ＴＡＰ＋／＋および−／−マウスに由来するＡＰＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの提示アッセイから得たデータ（図１０Ｂ）は、提示にＴＡＰが必要であることを納得いくように示しており、このデータにはｉｎ ｖｉｖｏ実験により持ち込まれる複雑性はない。
【０３０５】
６．４　考察
α２Ｍ受容体（ＣＤ９１とも呼ばれる）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関係するタンパク質として最初に同定された（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら， １９９０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１７４０１−１７４０４； Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら， １９９０， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２７６：１５１−１５５）。このタンパク質は、およそ４２０ｋＤａのαサブユニット、８５ｋＤａのβサブユニットおよび３９ｋＤａがしっかり会合した分子（ＲＡＰ）からなる。αおよびβサブユニットは、サイズがおよそ１５Ｋｂである単一の転写産物によってコードされる（Ｖａｎ Ｌｅｕｖｅｎら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １１７３：７１−７４）。この受容体は、単球系列の細胞の中、ならびに肝細胞、線維芽細胞およびケラチノサイトの中に存在することが証明された。ＣＤ９１は活性化状態の血漿糖蛋白α２Ｍ（これは種々のエンドプロテイナーゼに結合して阻害する）に結合することが既に証明されている。またα２Ｍ受容体はトランスフォーミング増殖因子β（Ｏ Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１４０９０−１４０９９）、血小板由来増殖因子（Ｈｕａｎｇら， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：３４２−３４６）、および線維芽細胞増殖因子（Ｄｅｎｎｉｓら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：７２１０−７２１６）等の他のリガンドにも結合する。したがって、α２Ｍは、その様々なリガンドの活性を調節し、そして特異的に消失させると考えられる。これらの様々なリガンドと複合体を形成すると、α２Ｍは細胞表面上のα２Ｍ受容体に結合し、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。α２Ｍと複合体形成したリガンドの取込みは、α２Ｍ受容体の主な機能であるとこれまで考えられていたが、脂質代謝におけるα２Ｍ受容体の役割も考えられる。α２Ｍ以外のα２Ｍ受容体リガンド（例えば組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター＝インヒビター複合体（Ｏｒｔｈら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：７４２２−７４２６）およびウロキナーゼ−ＰＡＩ１複合体（Ｎｙｋｊａｅｒら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １４５４３−１４５４６））が同定された。これらのリガンドは、ある範囲の細胞外血漿産物の浄化におけるα２Ｍ受容体の役割も立証する。
【０３０６】
本明細書で報告された研究は、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンがα２Ｍ受容体の更なるリガンドであることを示している。ヒトｇｐ９６コード遺伝子は、既に本発明者らにより１２番染色体（ｑ２４．２→ｑ２４．３）にマッピングされている（Ｍａｋｉら， １９９３， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． １９：７３−８１）。この点において、α２Ｍ受容体遺伝子が同染色体のそう遠くない位置（ｑ１３→ｑ１４）にマッピングされていることは興味深いことである（Ｈｉｌｌｉｋｅｒら， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：４７２−４７４）。ｇｐ９６は、α２Ｍなどの他のリガンドを介さずにα２Ｍ受容体に直接結合する。溶液中のまたは固相基質に架橋されたｇｐ９６の均質な調製物は、α２Ｍ受容体に結合する。確かに、α２Ｍ受容体の主なリガンドであるα２Ｍは実際に、ｇｐ９６とα２Ｍ受容体との相互作用を促進するのではなく阻害する。これは、ｇｐ９６がα２Ｍ受容体の直接的なリガンドであるという証拠である。ｇｐ９６に結合することが証明された８０ｋＤａタンパク質が、α２Ｍ受容体のαサブユニットのアミノ末端分解産物であることは明らかである。このサイズ範囲のα２Ｍ受容体の分解産物は、過去の研究においても観察されており（Ｊｅｎｓｅｎら， １９８９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｒｃｈ． ５：１７１−１７６）、蛋白加水分解による切断に特に感受性のある独立した外部ドメインがα２Ｍ受容体の中に存在することを示している。
【０３０７】
本明細書で示した研究は、α２Ｍ受容体は、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンによっても結合されることを示している。この観察結果は、ｈｓｐ７０、カルレティキュリンおよびｈｓｐ９０／ｇｐ９６が互いに明確な構造的類似性を持たないという事実を照らし合わせると、驚くべきことである。別の背景において、ＨＳＰは、以前にも本発明者らにこのジレンマ、すなわち種々のＨＳＰの多くは、互いに明らかな相同性を持たないが、同じペプチドの多くに結合するようである（Ｉｓｈｉｉら， １９９９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２（３）：１３０３−１３０９； Ｂｒｅｌｏｅｒら， １９９８， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８（３）： １０１６−１０２１）ということをもたらしていた。拡張されたｈｓｐ７０ファミリーに属するｇｒｐ１７０と、他のＨＳＰのいずれとも相同性を持たないｈｓｐ１１０とが、ＣＤ９１受容体を共有するか否はまだ不明である。第４のパラダイムを共有するＨＳＰの多数の共通の特徴（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｐ．Ｋ．， １９９４， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０（１１−１２）： １０５４−１０６０）（すなわちペプチド結合性、共通の受容体を介したＡＰＣとの相互作用、ＡＴＰ結合性およびＡＴＰアーゼ活性）は、これらの分子がこれらの一次配列からは明らかでない構造的類似性を共有しているに違いない、ということを強く示している。ＨＳＰの結晶学的分析により、これらの構造が明らかにされつつあり（Ｚｈｕら， １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： １６０２−１６１４； Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕら， １９９７， Ｃｅｌｌ ９０：６５−７５； Ｓｔｅｂｂｉｎｓら， １９９７， Ｃｅｌｌ ８９：２３９−２５０）、この問題の解明に役立つであろう。
【０３０８】
α２マクログロブリンおよび抗ＣＤ９１抗体がこれら４つのＨＳＰの各々による提示を完全に阻害する、という観察結果は、ＣＤ９１がこれら４つのＨＳＰの唯一の受容体であることを示している。先天性（Ｂａｓｕら， ２０００， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２（１１）： １５３９−１５４６）および適応性の免疫反応においてＨＳＰが担う次第に明らかになっている役割を考えると、この観察結果は、幾分直感に反している。しかし、２つの独立した手段による完全阻害についてのデータ（図９）は極めて動かしがたい。本発明者らは、ｇｐ９６受容体への結合についての競合能がｈｓｐ７０とｈｓｐ９０／ｇｐ９６とでは大きく差があることに早くから気付いており、ここで報告する（Ｂｉｎｄｅｒら， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：２５８２：２５８７）。他のグループも、ｇｐ９６とｈｓｐ７０との間に同じような差を観察した（Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄら， １９９９， １６２：３７５７−３７６０）。これらの差は、４つのＨＳＰに対する単一の受容体を指摘する本発明者らの本報告とは一致しない。これらの差は、種々のＨＳＰが広く異なる親和性で単一の受容体と相互作用することを単純に示唆している。Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏらは近年、受容体により媒介される取込みを通じて、ｈｓｐ７０シャペロン化ペプチドがＡＰＣによって提示されることを示し、単一のＨＳＰに対する異なる親和性クラスの受容体が存在することを示唆した。この主張は生物学的に説得力があるが、本発明者らの現在のデータによっては裏付けられない。
【０３０９】
ＨＳＰペプチド複合体が受容体に結合すると、ＨＳＰシャペロン化ペプチドがＨＳＰと一緒にＡＰＣの中に入るに違いない。本明細書中に報告する研究は、全てのＨＳＰが同じ門戸を通過するならば、その下流で起こる出来事がこれらの各々によりシャペロン化されたペプチドの場合と同じかまたは似ているに違いない、という仮説のもとで、ｇｐ９６に専ら関する下流の出来事に焦点を当てている。本発明者らの観察結果は、ペプチドがエンドソームから細胞質ゾル、ＥＲを経由した後、分泌経路へと進み、表面上に再び提示されることを示唆している。細胞質ゾルを通る輸送は、提示におけるＴＡＰの必要性およびプロテアソームの必要性により立証される。小胞から可溶性コンパートメントへの分子の移行メカニズムは知られていないが、先例は確かに存在する（Ｃｈｉａｎｇら， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：３８２−３８５）。この経路の探究は、疑い無く、本発明者らが細胞内のタンパク質の輸送を理解する手掛りとなるであろう。Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏらは最近、ＡＰＣによるｈｓｐ−７０ペプチド複合体の受容体媒介型取込みの下流で起こる出来事について報告した（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏら， ２０００（前掲））。異なるＨＳＰ（ｇｐ９６）を用いた本発明者らの観察結果は、その出来事の有り様と完全に一致しており、同侵入門戸が提示のためにペプチドをシャペロン化する全てのＨＳＰにより使用される、という考えを支持する。
【０３１０】
本明細書中に記載されるように、熱ショックタンパク質とα２Ｍとの相互作用は、α２Ｍ受容体の新しいタイプの機能、つまりセンサーとしての機能（以前に知られているその血漿ベースのリガンドを含む細胞外環境のセンサーとしてだけでなく細胞内環境のセンサーとしての機能）を提供する。ｇｐ９６等のＨＳＰは必須の細胞内分子であり、（アポトーシス性ではなく）壊死性の細胞死の条件下においてのみ、細胞外環境の中に放出される。このように、α２Ｍ受容体は、スカベンジャー受容体ＣＤ３６と同じように、壊死性細胞死のセンサーとして機能し得る（図１１を参照されたい）。また、近年同定されたホスファチジルセリン結合タンパク質は、アポトーシス性細胞死のセンサーおよびアポトーシス細胞の受容体として機能する（Ｓａｖｉｌｌら， １９９２， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１５１３−１５２２； Ｆａｄｏｋら， ２０００， Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８５−９０）。アポトーシス細胞とマクロファージとの相互作用は、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインのダウンレギュレーションをもたらし（Ｆａｄｏｋら， ２０００（前掲））、ｇｐ９６−ＡＰＣ間の相互作用は、ＡＰＣのＭＨＣ Ｉ分子によるｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示をもたらし、その後、抗原特異的Ｔ細胞の刺激（ＳｕｔｏおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ， １９９５（前掲））およびさらにＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１２などの炎症前サイトカインの分泌をもたらす。興味深いことに、α２Ｍ（α２Ｍ受容体の独立したリガンド）は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドのマクロファージによる提示を阻害する。この観察結果は、ｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示が、血液中では生理学的に発生し得ず、局在化した壊死性細胞死の結果として組織内においてのみ発生し得ることを示す。これは、テストした全ての条件下で血液中にｇｐ９６または他のＨＳＰが全く存在しなかったことと一致する。まとめると、これらの観察結果は、組織のひどい損傷および細胞溶解の結果、血液中にＨＳＰが放出されても、全身性の致命的な炎症前サイトカインのカスケードには至らないようにするメカニズムの可能性を示唆している。
【０３１１】
したがって、α２Ｍ受容体が、ＡＰＣが（ｉ）α２Ｍおよび他の血漿リガンドを介して血液の細胞外環境を、ならびに（ｉｉ）ＨＳＰ（特にｇｐ９６ファミリーのＨＳＰ）を介して組織の細胞内環境を、サンプリングすることができるようにするという可能性がある。前者は、ＡＰＣがその原始的な食細胞機能を実行することができるようにし、後者はＡＰＣがその先天性および適応性の免疫学的機能を実行することができるようにする。他の観点から見て、ＣＤ３６またはホスファチジルセリンを介したＡＰＣによるアポトーシス細胞の認識は、抗炎症性シグナルをもたらすが、α２Ｍ受容体を介する壊死性細胞とＡＰＣとの相互作用は、炎症前の先天性および適応性の免疫反応をもたらす（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら， １９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６５７−６６５を参照されたい）。
【０３１２】
本発明は、本発明の個々の態様を１つずつ例示した記載された具体的な実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、機能的に同等な方法および構成要素は、本発明の範囲内に含まれる。実際に、本明細書中に示され記載されたもの以外にも、これまでの説明および添付した図面を見れば、当業者には本発明の様々な改変が自明となろう。このような改変は、本発明の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０３１３】
本明細書中に引用された全ての参考文献（特許出願、特許および他の出版物を含む）は、あらゆる目的のために、本明細書中に参照によりその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
推定上のｇｐ９６受容体としての８０ｋＤａ ポリペプチドの同定。Ａ：ｇｐ９６−ＦＩＴＣ（左のパネル）およびアルブミン−ＦＩＴＣ（右のパネル）で染色した提示能のあるＲＡＷ２６４．７細胞の共焦点顕微鏡検査。Ｂ：ｇｐ９６またはアルブミン−セファロース（ＳＡ）カラムから溶出し、銀染色（上）またはアビジン−ペルオキシダーゼ（下）で染色した表面ビオチン化ＲＡＷ２６４．７細胞（提示能あり）またはＰ８１５細胞（提示能なし）からの原形質膜の界面活性剤抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｃ：ｇｐ９６−ＳＡＳＤ−Ｉ１２５を生存している腹腔マクロファージ（ＭＯ）またはＰ８１５細胞に架橋結合させ、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーで試験した。示されるように、対照として各種の成分を省いた。
【図２】
抗ｐ８０抗血清は８０ｋＤａ分子を検出し、マクロファージによるｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示を阻害する。Ａ：免疫前および免疫後血清を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞、腹腔マクロファージ（両細胞タイプとも提示能あり）またはＰ８１５細胞の原形質膜抽出物のブロットをつり上げた。Ｂ：ｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示。示した最終希釈で血清を添加した。黒抜きの十字は、ＡＰＣを直接ＡＨ１ペプチドでパルスしたときのＴ細胞刺激のレベルを示す。白抜きの十字は、パルスしなかったＡＰＣについての対応する値を示す。
【図３】
８０ｋＤａ タンパク質のタンパク質マイクロ配列決定。Ａ：タンデム質量分析による単一のトリプシン（ＧＡＬＨＩＹＨＱＲ）ペプチドの分析。確認されたｂ−イオン系列（赤）およびｙ−イオン系列（青）と共に全ての可能なｂ−およびｙ−イオン系列を示す。Ｂ：このペプチドの衝突誘導解離（ＣＩＤ）スペクトルを示す。Ｃ：α２Ｍ受容体からの４つの同定されたペプチド、ペプチド質量、および配列を示す。
【図４】
α２−マクログロブリンはマクロファージによるｇｐ９６シャペロン化ＡＨ１ペプチドの提示を阻害する。黒抜きの十字は、ＡＰＣを直接ＡＨ１ペプチドでパルスしたときのＴ細胞刺激のレベルを示す。白抜きの十字は、パルスしなかったＡＰＣについての対応する値を示す。
【図５】
種々の組織由来の一次培養物および細胞系へのＨＳＰおよびα２−マクログロブリンの特異的結合を示す表。「＊＊」は、バックグラウンド染色のみに対するＦＩＴＣで染色される細胞のパーセントを示す。「＃」は、細胞を共焦点顕微鏡で検査したことを示す。全てのＣＤ１１ｃ＋細胞は３種のＨＳＰおよびα２Ｍとの結合に対して強い陽性を示した。
【図６】
ＦＩＴＣで標識された細胞の存在についてのフローサイトメトリーによる細胞の分析。マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（Ａ）またはＲＡＷ３０９Ｃｒ．１（Ｂ）を１００ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣで標識したｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０またはＳＡと共にインキュベートした。ＦＳＣに基づいて生存細胞のみをゲートした。
【図７】
ＨＳＰおよびα２−マクログロブリンと結合するＡＰＣによるｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示。ＣＴＬ刺激のマーカーとしてＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）の組成物をアッセイした。（Ａ）Ｃ５７Ｂ１／６マウス由来の腹腔マクロファージまたはＢＭ−ＤＣ（１Ｘ１０４）。（Ｂ）ＲＡＷ２６４．７またはＲＡＷ３０９Ｃｒ．１マクロファージ系をｇｐ９６（４０ｍｇ／ｍｌ）単独またはＡＨ１−１９ペプチドと複合体化したｇｐ９６と共に培養し、ＡＨ１特異的ＣＴＬ（１Ｘ１０４）を刺激するために使用した。
【図８】
ｈｓｐ９０、ＣＲＴ、ｈｓｐ７０およびｇｐ９６によりシャペロン化されたペプチドはＲＡＷ２６４．７細胞によって提示されるが、血清アルブミンによるものは提示されない。ＡＨ１−１９ペプチドと複合体化されたまたはされていないシャペロンを用いてＲＡＷ２６４．７細胞をパルスし、コグネイトＣＴＬを刺激する能力について試験した。
【図９】
ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびカルレティキュリンは提示のために共通の受容体を利用する。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞を、次第に増加する濃度の非複合体化ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０またはＳＡの存在下に、ｇｐ９６−ＡＨ１−１９複合体（４０ｍｇ／ｍｌのｇｐ９６）でパルスした。（Ｂ）ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０、ＣＲＴまたはアルブミンと複合体化されたＡＨ１−１９の提示を、次第に増加する濃度のα２−マクログロブリンの存在下で実施した。データは提示の阻害パーセントとしてプロットしてある。（Ｃ）次第に増加する濃度の抗ＣＤ９１抗体の存在下でのｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０またはカルレティキュリンと複合体化されたＡＨ１−１９の提示。データは提示の阻害パーセントとしてプロットしてある。
【図１０】
ｇｐ９６シャペロン化ペプチドの提示は古典的な内因性抗原提示経路に従う。（Ａ）プロテアソームの必要性。腹腔マクロファージ（１Ｘ１０６）をラクタシスチン（１００ｍＭ）で処理した、または処理しなかった。この細胞をクロムで標識して、ＶＳＶ８特異的ＣＴＬに対する標的として使用した。（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定したときのＴＡＰの必要性。ＴＡＰ＋／＋またはＴＡＰ−／−マウス由来の腹腔マクロファージをｇｐ９６またはｇｐ９６−ＶＳＶ１９複合体およびＶＳＶ８特異的ＣＴＬ系と共に培養した。培養上清をＣＴＬ刺激のマーカーとしてのＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）の存在について試験した。（Ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏで測定したときのＴＡＰの必要性。ｇｐ９６−ＶＳＶ１９複合体を腹腔内注射した。１０日後、脾臓を摘出し、細胞をＶＳＶ８と共にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養した。リンパ球培養物を、ＥＬ４細胞（点線）またはＶＳＶ８ペプチドでパルスしたＥＬ４細胞（実線）を溶解する能力について試験した。各線は１匹のマウスを表す。
【図１１】
α２Ｍ受容体は細胞外ｇｐ９６を検出するその能力ゆえに壊死性細胞死のセンサーとなる。反対に、ホスファチジルセリン（ｐｓ）の受容体（ｐｓＲ）はアポトーシス性細胞死を検出する。
【図１２】
Ａ：マウスα２Ｍ受容体ｃＤＮＡ（配列番号１）およびマウスα２Ｍ受容体タンパク質の推定上のオープンリーディングフレーム（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号ＣＡＡ４７８１７）。Ｂ：マウスα２Ｍタンパク質（配列番号２）、ここで、この受容体の８０ｋＤａのｇｐ９６相互作用性断片のマイクロ配列決定により同定された残基は太字で強調してある。
【図１３】
Ａ：ヒトα２Ｍ ｃＤＮＡ（配列番号３）およびα２Ｍタンパク質の推定上のオープンリーディングフレーム（配列番号４）（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号Ｍ１１３１３）。Ｂ：Ｎ−末端の２３アミノ酸からなるシグナルペプチドを開裂させた後の成熟ヒトα２Ｍタンパク質の配列（配列番号５）。強調した残基は１３８アミノ酸からなるα２Ｍ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を表す。下線を施した残基はα２Ｍのα２Ｍ受容体結合性のタンパク質加水分解断片（ＲＢＤｖ）中に存在するＲＢＤの延長部分を表す。太字で示した残基はα２Ｍ受容体結合にとって重要であることが示された。イタリック体で示した残基はα２Ｍ受容体のリガンド間で保存されているドメインを表す。
【図１４】
Ａ：ヒトα２Ｍ受容体ｃＤＮＡ（配列番号６）およびヒトα２Ｍ受容体タンパク質の推定上のオープンリーディングフレーム（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録番号ＮＰ ００２３２３）。Ｂ：ヒトα２Ｍ受容体の一次アミノ酸配列（配列番号７）。補体リピートクラスターＩおよびＩＩのおおよその位置は灰色で強調してある。ＣＩ−ＩＩの個々の補体リピートは次のように示される。すなわち、ＣＲ３， ５， ７および９のアミノ酸はイタリック体で、ＣＲ４， ６， ８および１０のアミノ酸は下線で示してある。太字で強調したアミノ酸はｇｐ９６と結合したマウスα２Ｍ受容体の８０ｋＤａペプチド断片中に存在していた。二重下線を施した残基は推定されるシグナルペプチドを表す。この受容体の他の特徴（例えば、ＥＧＦリピート）の位置については、Ｈｅｒｚら， １９８８， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：４１１９−４１２７の文献を参照されたい。
【図１】
2004514113.tif 000002
2004514113.tif 000003
2004514113.tif 000004
【図２】
2004514113.tif 000005
2004514113.tif 000006
【図３】
2004514113.tif 000007
2004514113.tif 000008
2004514113.tif 000009
【図４】
2004514113.tif 000010
【図５】
2004514113.tif 000011
【図６】
2004514113.tif 000012
【図７】
2004514113.tif 000013
【図８】
2004514113.tif 000014
【図９】
2004514113.tif 000015
2004514113.tif 000016
2004514113.tif 000017
【図１０】
2004514113.tif 000018
2004514113.tif 000019
2004514113.tif 000020
【図１１】
2004514113.tif 000021
【図１２】
2004514113.tif 000022
2004514113.tif 000023
2004514113.tif 000024
2004514113.tif 000025
2004514113.tif 000026
2004514113.tif 000027
2004514113.tif 000028
2004514113.tif 000029
2004514113.tif 000030
2004514113.tif 000031
2004514113.tif 000032
2004514113.tif 000033
2004514113.tif 000034
2004514113.tif 000035
2004514113.tif 000036
2004514113.tif 000037
2004514113.tif 000038
2004514113.tif 000039
2004514113.tif 000040
2004514113.tif 000041
2004514113.tif 000042
2004514113.tif 000043
2004514113.tif 000044
2004514113.tif 000045
2004514113.tif 000046
2004514113.tif 000047
2004514113.tif 000048
2004514113.tif 000049
2004514113.tif 000050
2004514113.tif 000051
【図１３】
2004514113.tif 000052
2004514113.tif 000053
2004514113.tif 000054
2004514113.tif 000055
2004514113.tif 000056
2004514113.tif 000057
2004514113.tif 000058
2004514113.tif 000059
2004514113.tif 000060
2004514113.tif 000061
2004514113.tif 000062
【図１４】
2004514113.tif 000063
2004514113.tif 000064
2004514113.tif 000065
2004514113.tif 000066
2004514113.tif 000067
2004514113.tif 000068
2004514113.tif 000069
2004514113.tif 000070
2004514113.tif 000071
2004514113.tif 000072
2004514113.tif 000073
2004514113.tif 000074
2004514113.tif 000075
2004514113.tif 000076
2004514113.tif 000077
2004514113.tif 000078
2004514113.tif 000079
2004514113.tif 000080
2004514113.tif 000081
2004514113.tif 000082
2004514113.tif 000083
2004514113.tif 000084
2004514113.tif 000085
2004514113.tif 000086
2004514113.tif 000087
2004514113.tif 000088
2004514113.tif 000089
2004514113.tif 000090
2004514113.tif 000091
2004514113.tif 000092
【国際公開パンフレット】
2004514113.tif 000093
2004514113.tif 000094
2004514113.tif 000095
2004514113.tif 000096
2004514113.tif 000097
2004514113.tif 000098
2004514113.tif 000099
2004514113.tif 000100
2004514113.tif 000101
2004514113.tif 000102
2004514113.tif 000103
2004514113.tif 000104
2004514113.tif 000105
2004514113.tif 000106
2004514113.tif 000107
2004514113.tif 000108
2004514113.tif 000109
2004514113.tif 000110
2004514113.tif 000111
2004514113.tif 000112
2004514113.tif 000113
2004514113.tif 000114
2004514113.tif 000115
2004514113.tif 000116
2004514113.tif 000117
2004514113.tif 000118
2004514113.tif 000119
2004514113.tif 000120
2004514113.tif 000121
2004514113.tif 000122
2004514113.tif 000123
2004514113.tif 000124
2004514113.tif 000125
2004514113.tif 000126
2004514113.tif 000127
2004514113.tif 000128
2004514113.tif 000129
2004514113.tif 000130
2004514113.tif 000131
2004514113.tif 000132
2004514113.tif 000133
2004514113.tif 000134
2004514113.tif 000135
2004514113.tif 000136
2004514113.tif 000137
2004514113.tif 000138
2004514113.tif 000139
2004514113.tif 000140
2004514113.tif 000141
2004514113.tif 000142
2004514113.tif 000143
2004514113.tif 000144
2004514113.tif 000145
2004514113.tif 000146
2004514113.tif 000147
2004514113.tif 000148
2004514113.tif 000149
2004514113.tif 000150
2004514113.tif 000151
2004514113.tif 000152
2004514113.tif 000153
2004514113.tif 000154
2004514113.tif 000155
2004514113.tif 000156
2004514113.tif 000157
2004514113.tif 000158
2004514113.tif 000159
2004514113.tif 000160
2004514113.tif 000161
2004514113.tif 000162
2004514113.tif 000163
2004514113.tif 000164
2004514113.tif 000165
2004514113.tif 000166
2004514113.tif 000167
2004514113.tif 000168
2004514113.tif 000169
2004514113.tif 000170
2004514113.tif 000171
2004514113.tif 000172
2004514113.tif 000173
2004514113.tif 000174
2004514113.tif 000175
2004514113.tif 000176
2004514113.tif 000177
2004514113.tif 000178
2004514113.tif 000179
2004514113.tif 000180
2004514113.tif 000181
2004514113.tif 000182
2004514113.tif 000183
2004514113.tif 000184
2004514113.tif 000185
2004514113.tif 000186
2004514113.tif 000187
2004514113.tif 000188
2004514113.tif 000189
2004514113.tif 000190
2004514113.tif 000191
2004514113.tif 000192
2004514113.tif 000193
2004514113.tif 000194
2004514113.tif 000195
2004514113.tif 000196
2004514113.tif 000197
2004514113.tif 000198
2004514113.tif 000199
2004514113.tif 000200
2004514113.tif 000201
2004514113.tif 000202
2004514113.tif 000203
2004514113.tif 000204
2004514113.tif 000205
2004514113.tif 000206
2004514113.tif 000207
2004514113.tif 000208
2004514113.tif 000209
2004514113.tif 000210
2004514113.tif 000211
2004514113.tif 000212
2004514113.tif 000213
2004514113.tif 000214
2004514113.tif 000215
2004514113.tif 000216
2004514113.tif 000217
2004514113.tif 000218
2004514113.tif 000219
2004514113.tif 000220
2004514113.tif 000221
2004514113.tif 000222
2004514113.tif 000223
2004514113.tif 000224
2004514113.tif 000225
2004514113.tif 000226
2004514113.tif 000227
2004514113.tif 000228
2004514113.tif 000229
2004514113.tif 000230
2004514113.tif 000231
2004514113.tif 000232
2004514113.tif 000233
2004514113.tif 000234
2004514113.tif 000235
2004514113.tif 000236
2004514113.tif 000237
2004514113.tif 000238
2004514113.tif 000239
2004514113.tif 000240
2004514113.tif 000241
2004514113.tif 000242
2004514113.tif 000243
2004514113.tif 000244
2004514113.tif 000245
2004514113.tif 000246
2004514113.tif 000247
2004514113.tif 000248
2004514113.tif 000249
2004514113.tif 000250
2004514113.tif 000251
2004514113.tif 000252
2004514113.tif 000253
2004514113.tif 000254
2004514113.tif 000255
2004514113.tif 000256
2004514113.tif 000257
2004514113.tif 000258
2004514113.tif 000259
2004514113.tif 000260
2004514113.tif 000261
2004514113.tif 000262
2004514113.tif 000263
2004514113.tif 000264
2004514113.tif 000265
2004514113.tif 000266
2004514113.tif 000267
2004514113.tif 000268
2004514113.tif 000269
2004514113.tif 000270
2004514113.tif 000271
2004514113.tif 000272
2004514113.tif 000273
2004514113.tif 000274
2004514113.tif 000275
2004514113.tif 000276
2004514113.tif 000277
2004514113.tif 000278
2004514113.tif 000279
2004514113.tif 000280
2004514113.tif 000281
2004514113.tif 000282
2004514113.tif 000283
2004514113.tif 000284
2004514113.tif 000285
2004514113.tif 000286
2004514113.tif 000287
2004514113.tif 000288
2004514113.tif 000289
2004514113.tif 000290
2004514113.tif 000291
2004514113.tif 000292
2004514113.tif 000293
2004514113.tif 000294
2004514113.tif 000295
2004514113.tif 000296
2004514113.tif 000297
2004514113.tif 000298
2004514113.tif 000299
2004514113.tif 000300
2004514113.tif 000301
2004514113.tif 000302
2004514113.tif 000303
2004514113.tif 000304
2004514113.tif 000305
2004514113.tif 000306
2004514113.tif 000307
2004514113.tif 000308
2004514113.tif 000309
2004514113.tif 000310
2004514113.tif 000311
2004514113.tif 000312
2004514113.tif 000313
2004514113.tif 000314
2004514113.tif 000315
2004514113.tif 000316
2004514113.tif 000317
2004514113.tif 000318
2004514113.tif 000319
2004514113.tif 000320
2004514113.tif 000321
2004514113.tif 000322
2004514113.tif 000323
2004514113.tif 000324
2004514113.tif 000325
2004514113.tif 000326
2004514113.tif 000327
【国際調査報告】
2004514113.tif 000328