(57)【要約】本発明はペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をポリマー、特にグリコミメチックポリマーで修飾し、それらの生物学的活性または薬物動態特性を改善するための方法及び組成物に関するものである。本発明はその他にこのようなポリマー修飾ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の方法および使用も提供する。本発明は、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質（図１Ｄ）の合成及びこのようなタンパク質を含む医薬組成物の製造に特に適切に使用できる。
2004508338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質−Ｕｎ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊の式を有する分離された合成生物活性タンパク質であって、上記式中、タンパク質はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含んでなり、前記ポリペプチド鎖は一つ以上の化学的ライゲーション部位によって共有結合した一つ以上の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ペプチドセグメントを含み、Ｕは一つ以上の前記重なり合わないペプチドセグメントの一つ以上のアミノ酸の側鎖ｎの相互に反応性の特異的官能基に共有結合する特異的官能基の残基であり、ここでｎは１ないし６から選択される整数であり、Ｂは同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい、３個以上のアームを有する分岐コアであり、ポリマーは実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Ｊ＊は負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有するペンダント基である合成生物活性タンパク質。
【請求項２】
前記合成生物活性タンパク質が２５，０００ダルトンより大きい分子量のモノマーを含んでなる請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３】
前記合成生物活性タンパク質は前記リボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有する請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４】
前記リボソーム特異的タンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５】
前記哺乳動物タンパク質がサイトカインである請求項４に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項６】
前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子及びシグナル　ペプチド　ホルモンからなる群から選択される請求項４に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項７】
前記哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質である請求項４に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項８】
前記リボソーム特異的タンパク質がリボソーム特異的グリコシル化部位を含む請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項９】
Ｕが、リボソーム特異的グリコシル化部位に対応する前記ポリペプチド鎖の一部位で前記側鎖ｎに共有結合する請求項８に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１０】
Ｕが、前記リボソーム特異的グリコシル化部位に対応する一部位だけで前記側鎖ｎに共有結合する請求項９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１１】
前記リボソーム特異的タンパク質が組換えによって産生されたタンパク質である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１２】
前記組換えによって産生されたタンパク質が非天然タンパク質である請求項１１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１３】
前記非天然タンパク質が一つ以上の非天然リボソーム特異的グリコシル化部位を有する請求項１２に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１４】
前記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１５】
前記イレギュラーアミノ酸が２０個の遺伝子的にコードされるアミノ酸の一つより多い側鎖を有する請求項１４に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１６】
前記イレギュラーアミノ酸が擬似アミノ酸及び疎水性アミノ酸誘導体からなる群から選択される請求項１５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１７】
前記化学的ライゲーション部位がアミド、オキシム、ヒドラゾン、チオエステル、チアゾリジン、オキサゾリジン及びチオエステルからなる群から選択される結合を含む請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１８】
前記側鎖ｎが非天然側鎖である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項１９】
Ｕが、化学的ライゲーションによって形成された結合によって前記側鎖ｎに共有結合する請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２０】
化学的ライゲーションによって形成された前記結合がアミド、オキシム、ヒドラゾン、チオエステル、チアゾリジン及びオキサゾリジンからなる群から選択される請求項１９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２１】
Ｕ、Ｂ、ポリマー及びＪ＊の一つ以上がスペーサーまたはリンカーによって分離され、式Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−ポリマー−ｓ３−Ｊ＊を有し、その際ｓ１、ｓ２、ｓ３が、同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２２】
Ｕがオキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、ヒドラジド、オキサゾリジン及びチアゾリジンから選択される結合の残基である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２３】
Ｂの一つのアームがＵに結合し、Ｂの第二のアームがポリマーに結合する請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２４】
Ｂが４本以上のアームを含んでなる請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２５】
前記アームの少なくとも１本がオキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、チオエステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、及びチアゾリジンからなる群から選択される結合の残基を含む請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２６】
Ｂがアミノ、カルボン酸塩及び混合アミノ−カルボン酸塩から選択される分岐コアを含む請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２７】
前記アミノ分岐コアがリジンを含み、前記カルボン酸塩分岐コアがグルタミン−またはアスパラギン酸を含み、前記混合アミノ−カルボン酸塩分岐コアがガンマ−グルタミン酸を含む請求項２６に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２８】
“ポリマー”がポリアルキレンオキシド、ポリアミド　アルキレン　オキシド及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項２９】
前記側鎖ｎが前記ポリペプチド鎖の化学的ライゲーション部位にある請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３０】
Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊が１，５００ないし８０，０００ダルトンの分子量を有する請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３１】
側鎖ｎが２以上であり、Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊の一つ以上が異なる請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３２】
Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊が負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有する請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３３】
Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊が単分散（ｍｏｎｏ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３４】
前記合成生物活性タンパク質が単分散である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３５】
“ポリマー”が式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−のポリアミドであり、上記式中、Ｘ及びＹは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、ｎは２ないし１００の整数であり、Ｘ及びＹのいずれかまたは両方が直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３６】
前記Ｘが式−ＮＨ−Ｘ’−または−Ｘ’−ＮＨ−であらわされる二価ラジカルであり、上記式中Ｘ’は直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項３５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３７】
前記Ｙが式−ＣＯ−Ｙ’−または−Ｙ’−ＣＯ−であらわされる二価ラジカルであり、上記式中Ｙ’は二価ラジカルである請求項３５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３８】
ｎが２から５０までの整数である請求項３５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項３９】
前記水溶性反復単位が式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−のエチレンオキシド反復単位を含んでなる請求項３５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４０】
前記エチレンオキシド反復単位が式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−または−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−を有し、上記式中ｎは２ないし５０の不連続整数である請求項３９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４１】
Ｊが、負−及び正電荷からなる群から選択される正味電荷を生理的条件下で有するイオン化可能基である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４２】
前記イオン化可能基がカルボキシル、アミン及びヒドロキシルから選択される請求項４１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４３】
Ｊが、生理的条件下で正味の中性電荷を有するイオン化可能基である請求項１に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４４】
前記水溶性ポリマーのない対応する合成生物活性タンパク質に比較して、哺乳動物において、より大きい循環半減期を有する請求項３５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４５】
リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を含んでなる合成生物活性タンパク質であって、前記ポリペプチド鎖は一つ以上の水溶性ポリマーを結合して含み、２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有する合成生物活性タンパク質。
【請求項４６】
前記合成生物活性タンパク質が、前記リボソーム特異的糖タンパク質に関連した生物活性を模する生物活性を有する請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４７】
前記リボソーム特異的糖タンパク質がサイトカインである請求項４６に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４８】
前記サイトカインが赤血球産生刺激タンパク質、ランテス（Ｒａｎｔｅｓ）、及び顆粒球コロニー刺激因子からなる群から選択される請求項４７に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項４９】
前記リボソーム特異的糖タンパク質が一つ以上のグリコシル化部位を含む請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５０】
前記水溶性ポリマーが前記ポリペプチド鎖の、前記一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位に結合する請求項４９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５１】
前記水溶性ポリペプチドが前記ポリペプチド鎖の、前記一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位にだけ結合する請求項５０に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５２】
前記リボソーム特異的糖タンパク質が組換えによって産生された糖タンパク質である請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５３】
前記組換えによって産生された糖タンパク質が非天然糖タンパク質である請求項５２に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５４】
前記非天然糖タンパク質が一つ以上のグリコシル化部位を有する請求項５３に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５５】
前記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５６】
前記水溶性ポリマーが１，５００ないし８０，０００ダルトンの分子量を有する請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５７】
前記水溶性ポリマーが負−、中性−及び正電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で含む請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５８】
“ポリマー”がポリアルキレンオキシド、ポリアミド　アルキレンオキシド及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項５９】
“ポリマー”が式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−のポリアミドであり、上記式中、Ｘ及びＹは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、ｎは２ないし１００の整数であり、Ｘ及びＹのいずれかまたは両方が直鎖または枝分かれした水溶性反復単位からなる請求項４５に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項６０】
ｎが２から５０までの整数である請求項５９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項６１】
前記水溶性反復単位が式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−のエチレンオキシド反復単位を含んでなる請求項５９に記載の合成生物活性タンパク質。
【請求項６２】
請求項１から請求項６１までのいずれか１項に記載の合成生物活性タンパク質、または薬物学的に容認されるそれらの塩類を含む医薬組成物。
【請求項６３】
緩衝剤、担体タンパク質、アミノ酸、界面活性剤、脂質、水溶性ポリマー及び保存料からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含む請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記合成生物活性タンパク質以外にその他の生物活性物質を一種類以上含む請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
ヒトの疾患または症状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする人に、約２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有し、天然ヒトタンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、またはサイトカインと関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の分子的に均質な医薬組成物を一種類以上含む医薬組成物を有効量投与することを含んでなる治療法。
【請求項６６】
前記合成生物活性タンパク質がサイトカインの生物活性を有する請求項６５に記載の治療法。
【請求項６７】
前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子及びシグナルペプチド　ホルモンからなる群から選択される請求項６６に記載の治療法。
【請求項６８】
天然ヒトタンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、またはサイトカインの生物活性またはその欠乏と関連するヒト疾患または症状を治療するために使用される請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記ポリマー修飾合成生物活性タンパク質がサイトカインの生物活性を有する請求項６８の医薬組成物。
【請求項７０】
前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、及びシグナルペプチド　ホルモンからなる群から選択される請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖を生成する方法であって、前記方法は前記合成生物活性ポリマー−修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結することを含み、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上がそれに結合した水溶性ポリマーを有し、それによって前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチド鎖がリボソーム特異的タンパク質のアミノ酸配列を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記リボソーム特異的タンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記哺乳動物タンパク質がサイトカインである請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記サイトカインがインターロイキン、赤血球産生刺激タンパク質、インターフェロン、リンホカイン、ケモカイン、増殖因子、コロニー刺激因子、及びシグナルペプチド　ホルモンからなる群から選択される請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
合成生物活性ポリマー修飾タンパク質を生成するために前記ポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたむことをさらに含む請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記ペプチドセグメントの一つ以上が部分的に保護されている請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
前記ペプチドセグメントの一つ以上が保護されていない請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
前記ペプチドセグメントの一つ以上が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
前記化学的ライゲーションが、天然型化学的ライゲーション、拡張天然型化学的ライゲーション及び擬似天然型化学的ライゲーションから選択される化学選択的ライゲーション化学作用を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
前記水溶性ポリマーが１，５００ないし８０，０００ダルトンの分子量を含む請求項７１に記載の方法。
【請求項８２】
合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖を生成する方法であって、前記方法は：
ａ．前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結し、前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のアミノ酸配列に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上は第一の特異的化学選択基を含み；
ｂ．水溶性ポリマーを前記完全長ポリペプチド鎖に化学的に連結し、前記水溶性ポリマーは、前記第一の特異的化学選択基と相互にかつ特異的に反応する第二の化学選択基を含み、それによって前記合成生物活性ポリマー−修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する
諸段階からなる方法。
【請求項８３】
合成生物活性ポリマー修飾タンパク質を産生するために前記ポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたむことをさらに含む請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の生成法であって、前記方法は、
ａ．前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に連結し、前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のアミノ酸配列に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際前記ペプチドセグメントの一つ以上が、遺伝子的にコードされたアミノ酸の側鎖官能基とは反応しない第一の特異的化学選択基を含む非天然側鎖を含み；
ｂ．前記完全長ポリペプチド鎖を折りたたんで、折りたたまれたポリペプチド鎖を形成し；
ｃ．水溶性ポリマーを前記折りたたまれたポリペプチド鎖に化学的に連結し、前記水溶性ポリマーは、前記第一の特異的化学選択基と相互にかつ特異的に反応する第二の化学選択基を含み、それによって前記合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリマー修飾ポリペプチド鎖が生成する
諸段階を含んでなる方法。
【請求項８５】
下記の式であらわされる分子的に均質な水溶性ポリマーにおいて：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊
上記式中Ｕは特異的官能基の残基であり、Ｂは同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい、３本以上のアームを有する分岐コアであり、“ポリマー”は式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−を有し、約５，０００Ｄａより大きい分子量を有するポリアミドであり、ここでＸ及びＹは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価ラジカルであり、ｎは２から５０までの整数であり、Ｘ及びＹのいずれかまたは両方が直鎖かまたは枝分かれしている実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、Ｊ＊は負−、正−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、ｓ１、ｓ２、及びｓ３は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である水溶性ポリマー。
【請求項８６】
Ｕがアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル　ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル　カルボネート、オルトピリジル　ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル　グルタレート、スクシミジル　スクシネート、琥珀酸、トレシレート及び活性化可能な官能基からなる群から選択される官能基の残基である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項８７】
Ｕが、カルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、及びオキサゾリジンからなる群から選択される結合を形成し得る官能基の残基である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項８８】
Ｕが保護されている請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項８９】
ｓ１、ｓ２及びｓ３の一つ以上が存在し、選択され、炭素原子１ないし１８個を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９０】
ｓ１、ｓ２及びｓ３の一つ以上が存在し、選択され、“ポリマー”を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９１】
ｓ１が“ポリマー”を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９２】
Ｂが４本以上のアームを含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９３】
前記分子量が約１０，０００Ｄａより大きい請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９４】
前記分子量が約１５，０００Ｄａより大きい請求項９３に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９５】
Ｂが一つ以上のアミド結合によってｓ２またはポリマーに結合した分岐コアを含んでなる請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９６】
Ｂがアミド結合によってポリマーに結合した分岐コアを含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９７】
前記反復単位が式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９８】
Ｘ、Ｙ、またはＸ及びＹが、−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選択され、上記式中、ｎ１は１ないし６の整数であり、ｎ２は２ないし５０の整数である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項９９】
ＸまたはＹの一つがフェニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１００】
Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−である請求項９６に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０１】
Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは６ないし３６である請求項１００に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０２】
Ｊ＊が保護されている請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０３】
Ｊ＊が生理的条件下で正味の中性電荷を有する非イオン化性基を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０４】
Ｊ＊が生理的条件下で正味の正電荷を含むイオン化性基を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０５】
Ｊ＊が生理的条件下で正味の負電荷を含むイオン化性基を含む請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０６】
Ｘが−Ｘ’−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｘ’−である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０７】
Ｙが−Ｙ’−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｙ’−である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０８】
Ｘ’及びＹ’の少なくとも一つが式（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎまたは（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎのポリエチレンオキシドを含み、上記式中ｎが２ないし５０である請求項１０７に記載の水溶性ポリマー。
【請求項１０９】
前記水溶性ポリマーが単分散である請求項８５に記載の水溶性ポリマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は生物学的活性を有する合成ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質を、ポリマー類、特にグリコミメチックポリマー類で修飾し、それらの生物学的活性または薬物動態特性を改良する方法及び組成物に関する。本発明はさらに、このようなポリマー修飾ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質類の製法及び使用も提供する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は米国特許出願第６０／２３１３３０号（２０００年９月８日出願）及び第６０／２３６３７７号（２０００年９月２９日出願）の一部継続出願である。これらは両方とも参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（背景技術）
過去３０年にわたり、タンパク質を疾患治療のための治療薬として使用する可能性について医学的関心がますます高まってきた（例えば“治療タンパク質１９９９”、Ｄａｔａｍｏｎｉｔｏｒ　ｐｌｃ、ロンドン、１９９９、を参照されたい）。大部分のタンパク質治療は天然発生性動物−またはヒト型のタンパク質に基づいており（インスリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターロイキン−２、等）、組換えＤＮＡで処理された細菌または真核細胞で産生される。残念なことに、大腸菌（Ｅ，ｃｏｌｉ）等の細菌細胞で作られた組換えタンパク質には、タンパク質の天然産生型には普通に見られる翻訳後修飾が欠けることが多い。この修飾欠如は患者に導入する際の薬物学的特性に重大なマイナスの影響を与え得る。
【０００４】
グリコシル化は、複雑な糖鎖とタンパク質との酵素的結合を含む真核生物における一般的翻訳後修飾の一例である。細菌の発現系において作られた組換えタンパク質にはタンパク質をグリコシル化する能力がないため、グリコシル化型または“糖タンパク質”が必要な場合はこれらに代わって植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞等の真核生物発現系が使われてきた。組換え糖タンパク質の産生における重要な問題は、生成した産物が一般には、異なる種々の“グリコ型”の複雑な混合物からなり、それは非常に多様な生理学的または薬物学的特性を有することである。
【０００５】
それにもかかわらず、組換えＤＮＡ法は、多くのポリペプチド類及びタンパク質の主要な商業的生産法となった；それは、それらが細菌やその他のホスト細胞内で多量に生産できるからである。組換えタンパク質の産生法は、ホスト細胞を所望外来タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトまたはトランスフォームし、それら細胞を組換えタンパク質の発現に好ましい条件下で増殖させる諸段階を含む。大腸菌及び酵母はホストとして好ましい、なぜならばそれらは組換えタンパク質を高濃度に産生するように作製できるからである（米国特許第５，７５６，６７２号）。
【０００６】
組換えＤＮＡでコードされるタンパク質の一般的細菌性発現に関して多数の米国特許が発行された（例えば米国特許第４，５６５，７８５号；第４，６７３，６４１号；第４，７３８，９２１号；第４，７９５，７０６号；第４，７１０，４７３号等を参照されたい）。残念なことに、組換えＤＮＡ法の使用はもれなく成功したわけではない。若干の条件のもとでは、細菌ホストから大量に発現する二、三の異種タンパク質が細胞内に緻密な凝集物となって沈殿した；それは位相差顕微鏡下で見える細胞膜内の明るいスポットとして確認された。これらの沈殿タンパク質の凝集物は“屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ）”と呼ばれ、全細胞タンパク質のかなりの部分を構成することがある（ブレムス（Ｂｒｅｍｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）２４巻：７６６２ページ）。
【０００７】
これら屈折体からのタンパク質の回収は多くの問題をあらわした；例えば細胞内に含まれる上記タンパク質を、これを担っている細胞物質やタンパク質からいかにして分離するか、及びこの封入タンパク質を生物学的活性型のままいかにして回収するか等の問題である。屈折体に関する一般的調査研究論文については下記を参照されたい。マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）、同上；ミツラキ（Ｍｉｔｒａｋｉ）及びキング（Ｋｉｎｇ）、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７巻、６９０ページ（１９８９）；マーストン及びハートレー（Ｈａｒｔｌｅｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２巻：２６４−２７６ページ（１９９０）；ウェツェル（Ｗｅｔｚｅｌ）著“生体内におけるタンパク質凝集：細菌封入体及び哺乳動物アミロイド（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ａｍｙｌｏｉｄ）”、タンパク質医薬品の安定性：Ｉｎ　ｖｉｖｏ分解経路及びタンパク質安定化戦略、アハーン（Ａｈｅｒｎ）及びマンニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）（編集）（プレナム・プレス、１９９１）；及びウェツエル“Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおける凝集抑制によるタンパク質の折りたたみ及び安定性の向上”、タンパク質工学−−実際的アプローチ、リース（Ｒｅｅｓ，Ａ．Ｒ．）ら（編集）（ＩＲＬプレス、オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９１）。
【０００８】
タンパク質類は研究試薬として化学的全合成によっても生成される（ウィルキン（Ｗｉｌｋｉｎ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）９巻：４１２−４２６ページ）。このプロセスには、個々のアミノ酸の段階的カップリングによるタンパク質の化学的合成、またはペプチドまたはポリペプチドセグメントを個別に合成し、その後このようなセグメントの化学的結合等により前記セグメントを連結し、完全長生成物を作成するという収束的戦略がある（例えばドーソン（Ｄａｗｓｏｎ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）６９巻、９２３−９６０ページを参照）。若干の場合には化学的合成を利用して、単純な低分子糖で修飾した小さい糖タンパク質が作られている。（シン（Ｓｈｉｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻、１１６８４−１１６８９ページ）。また或る場合には、検出可能の標識等を含むタンパク質が化学的に作られた（ボリン（Ｂｏｌｉｎ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）４５１巻、１２５−１３１ページ）。残念なことに、このような標識タンパク質には、組換えによって作られるそれらの対応物にまさる治療的利点がほとんどまたは全くない。だが、標的タンパク質のファーマコホア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）領域に小分子タイプの変化を適用して有効性（ｐｏｔｅｎｃｙ）を改善することに焦点を合わせた化学的合成によって、治療的ポテンシャルを示す幾つかのタンパク質が合成された（米国特許第６，１６８，７８４号）。有効性は治療薬の製造上重要な観点であるが、その他の要因はタンパク質治療薬ではいまだに問題である。
【０００９】
治療的に有用なタンパク質薬剤を開発する努力は、推定的薬剤候補をｉｎ　ｖｉｖｏ投与した際の不都合な生物活性、生体適合性及び生体内動態（クリアリング時間等）によって長い間妨げられてきた。タンパク質、特にポリペプチドの治療薬としての使用を大きく制限した主要な要因は、これらの化合物が循環系にしばしば免疫原性反応を引き起こすという事実であった（米国特許第４，１７９，３３７号（デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）ら）参照）。この作用は次の二つの二次的結果の一つまたは両方を有する。第一は誘発された抗体によるポリペプチドの破壊であり、第二は（より深刻なことに）アレルギー反応の誘発である。例えばインスリンの抗体仲介性破壊は、インスリンがヒト循環系にかなり短時間しか滞在しない原因であると考えられている。酵素の場合、ポリペプチドの破壊及びそれに続くその生理学的活性の消滅という問題があるだけでなく、最も好ましくないアレルギー反応の誘発もおこる。逆に、凝固因子、成長因子および因子サイトカイン等のタンパク質は、それらのｉｎ　ｖｉｖｏ投与の際に不都合に長い生物学的半減期を示す可能性がある。
【００１０】
治療薬として使用するタンパク質を改良する一つのアプローチは、上記タンパク質を水溶性ポリマーで誘導体化すること等である。このような組合わせは、投与したタンパク質類のｉｎ　ｖｉｖｏ循環寿命、水溶性または抗原性を改善する手段として提案されている（米国特許第４，１７９，３３７号（デイヴィスら）参照）。多くの異なる水溶性ポリマー及び結合の化学成分がこのゴールを目指して使用されている：例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー類、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸　コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）等。ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）は、治療的有用なタンパク質を得る試みにおいて用いられるこのような化学的成分の一つである（ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）、６巻：１５０−１６５ページ；メヴァー（Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．（２０００）３巻（１号）：１２５−１３６ページ）。その主鎖（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎはフレキシブルで、両親媒性であり、プロテアーゼの作用を受けず、非免疫原性である。ＰＥＧの結合は、タンパク質類をタンパク質分解から守ることも判明した（ブロムホフ（Ｂｌｏｍｈｏｆｆ、Ｈ．Ｋ．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ（１９８３）７５７巻：２０２−２０８ページ）。それはタンパク質類のその他の物理化学的特性も改善し得る。
【００１１】
例えば重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）の治療のためにｐｅｇａｄｅｍａｓｅ　ｂｏｖｉｎ（アダゲン（登録商標））（ＰＥＧポリマーが付加したアデノシン　デアミナーゼの組成物）が開発された；ＰＥＧ部分が付加したスーパーオキシドジスムターゼが頭部損傷治療のための臨床試験に用いられた；肝炎治療のために、付加ＰＥＧ部分を有するアルファ−インターフェロンの試験が行われた。Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ（ＰＥＧ化）ＩＬ−６が報告されている（ＥＰ　０　４４２　７２４、及び米国特許第５，２６４，２０９号を参照されたい）。ＥＰ　０　１５４　３１６は、リンホカインとポリエチレングリコール−アルデヒドとの反応を報告している。欧州特許出願ＥＰ　０　４０１　３８４は、ポリエチレングリコール分子を付加した顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）を作るための材料及び方法を記載している。修飾Ｇ−ＣＳＦ及びその同族体はＥＰ　０　４７３　２６８にも報告されており、ポリエチレングリコール等の水溶性粒子ポリマーに共有結合した種々のＧ−ＣＳＦ及び誘導体の使用について述べている。米国特許第５，８８０，２５５号はＰＥＧで修飾した多くのタンパク質を要約して書いている。
【００１２】
ＰＥＧのようなポリマー部分及び関連ポリマーをタンパク質上の反応性基に付加するための種々の方法が使用された（米国特許第４，１７９，３３７号（デイビスら）、及び米国特許第４，００２，５３１号（ロイヤー（Ｒｏｙｅｒ））。アブチョウスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）ら、“薬としての酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇｓ）”（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編集、３６７−３８３ページ、１９８１）及びザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６巻：１５０−１６５ページを参照されたい。タンパク質を修飾するためのＰＥＧの使用は、ヘング（Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．−Ｌ．）ら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．１９９９）１０巻：５２０−５２８ページ；ベルチェバ（Ｂｅｌｃｈｅｖａ，Ｎ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０巻：９３２−９３７ページ；ベッチンガーら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．（１９９８）９巻：８４２−８４６ページ；フアング（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．−Ｙ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．（１９９８）９巻：６１２−６１７ページ；Ｘｕ，Ｂ．ら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９７）１３巻：２４４７−２４５６ページ；シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｊ．Ｂ．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：２６６２−２６７３ページ；ロイター（Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．（１９９９）１０巻：２７１−２７８ページ；チャン（Ｃｈａｎ，Ｔ．−Ｈ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）６２巻：３５００−３５０４ページでも論議されている。タンパク質の典型的付着部位は、リジン残基上またはＮ−末端にあるような第一アミノ基、システイン側鎖にあるようなチオール基、及びグルタメート−またはアスパルテート残基上またはＣ−末端にあるようなカルボキシル基である。最も一般的な付着部位の幾つかを挙げると、糖タンパク質の糖残基、システインまたは標的タンパク質のＮ−末端及びリジンである。
【００１３】
ポリマーをタンパク質に結合するための多くの異なるアプローチが報告されているとはいえ、結合プロセスには複雑な要因がないわけではない。結合反応によって起きる生物学的活性の損失を少なくするするように注意しなければならない。例えば付着部位数を最小にするために折りたたみまたは再折りたたみタンパク質が一般に用いられる。もしも多すぎる活性化ポリマーが標的タンパク質またはポリペプチドに付着するならば、生物学的活性は著しく減少するかまたは消失する。同様に、タンパク質にポリマーを結合するために好ましくないリンカーを使用したり、または不十分な量のポリマーが標的に付着するならば、生成した結合物の治療効果は制限され、その生物活性の喪失を代償するためには循環寿命の十分な増加を示さないかも知れない。修飾するポリマーによるタンパク質活性部位のブロックによる問題も起きるかも知れない。この問題は避け難い、なぜならばポリマーとタンパク質とは溶液ベースの反応で結合するのが一般的だからである。活性部位を燐酸ピリドキサール等の材料であらかじめ遮蔽することが示唆されるが、その結果は一貫しない（米国特許第４，１７９，３３７号（デイヴィスら）参照）。これらの問題は、生物活性と関係ない付着部位をほとんどもたない低分子タンパク質及びペプチドでは特に深刻である。
【００１４】
例えば、一般的方法は水溶性ポリマーを標的タンパク質の第一アミン（Ｎ−末端アミノ基、及びリジンのイプシロンアミノ基等）に付着することである。チオール反応性−ポリマー結合物もシステインのチオール側鎖にポリマーを付着させるために用いられる。これらのアプローチは両方とも重大な問題をもたらす。なぜならば大部分のタンパク質は、タンパク質の活性、折りたたみ、再折りたたみ及び安定性の決定に重要な役割を演ずるこのような反応性基の多数のコピーをポリペプチド主鎖の種々の領域全体に含むからである。こうして広く使用されるとはいえ、このようなアプローチは多かれ少なかれ不完全なまたは望ましくないタンパク質活性低下、及び分離及び特徴づけが難しい複雑な混合物の生成という欠点を有する（デルガダ（Ｄｅｌｇａｄａ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９７）３巻：５９−６６ページ）。
【００１５】
ランダム付着を減らす試みにおいて、天然リジンを除去し、それと同時に所望のポリマー付着部位にリジンを付加したタンパク質が作製された（米国特許第４，９０４，５８４号）。例えばＧ−ＣＳＦ及びＩＬ−２はこのやり方で改質された。ランダム付着を回避するその他の試みは、天然システインを除去すると同時に所望のポリマー付着部位にシステインを付加したタンパク質か、または（もしあれば）天然システインを除去せずにシステインを付加したタンパク質を作製することであった（ＥＰ　０　６６８　３５３）。例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３及びＥＰＯはこのやり方で作られた。このようなシステインまたはリジンのバリアントは理論的に部位特異的ポリマー付着を可能にするが、それでもまだ、全ての選択部位がコントロールされたやり方で改質されるという保証はない。
【００１６】
同一または類似の反応性官能基を担う側鎖を有する多数のアミノ酸を含むタンパク質を、部位特異的に改質できない場合、最近の研究ではタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端の改質に焦点が置かれた。アミノまたはカルボキシ末端の改変は、若干の化学的結合法がこれらの部位を特異的に改変し得ることに依存する（ＷＯ９０／０２１３６及びＷＯ９０／０２１３５）。例えば、この方法を使用してＰＥＧ鎖をＧ−ＣＳＦ及びケモカインＩＬ−８のＮ−末端残基に結合した（ガートナー（Ｇａｅｒｔｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）７巻（１号）：３８−４４ページ；ＷＯ９６／４１８１３）。しかし、Ｎ−末端またはＣ−末端の改変は一般的にタンパク質の活性を低下させる（例えば米国特許第５，９８５，２６５号はＧ−ＣＳＦのＮ−末端及びリジン側鎖へのＰＥＧの結合を論じている）。水溶性ポリマーによるタンパク質修飾の欠点にもかかわらず、ＰＥＧ化及びその他の水溶性ポリマーのタンパク質への結合は追求され続けている。例えばα−ＩＦのヒスチジンへのＰＥＧの結合が米国特許第５，９５１，９７４号及び第６，０４２，８２２号に記載されている。アルファ−インターフェロンのリジンへのＰＥＧの結合が米国特許第５，５９５，７３２号に記載されている。エリスロポエチン（ＥＰＯ）の糖鎖及びリジンのような内部アミノ酸（欧州特許０　６０５　９６３及びＷＯ００／３２７７２）、及びＮ−末端（米国特許第６，０７７，９３９号及びＷＯ００／３２７７２）へのＰＥＧ結合も記載されている。
【００１７】
もう一つの問題は、上に述べたポリマーの全てが非常に不均質であり、それがポリマー修飾タンパク質の混合物の分析による特徴づけ及び精製を難しくすることである（デルガダら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９７）３巻：５９−６６ページ）。例えばＰＥＧまたはＰＥＧを基礎とする鎖の合成に使用する技術は、それが３４００のようなかなり低い相対的分子量のものでも、コントロールが不十分な重合段階を含み、それは平均値の周囲にひろがる長さの鎖を有する製品に導く；すなわちそれらは（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎのポリマー製品を含む、ここでｎは離散した数値ではなく平均値の周りの或る範囲の数値を有する。誘導体化タンパク質のこの不均質性は容易には確認できない、まして分離することはできない或る範囲の諸特性と関係していることが多い。ポリペプチド付加物の使用は原理的には解決の可能性を提供すると考えられるとはいえ、ポリペプチドはタンパク質分解的切断を受けやすく、誘導体化タンパク質を免疫原性にするため、ポリペプチドの使用は好ましくない。
【００１８】
だが残念なことに、現在治療的使用に用いられる全てのタンパク質は組換えＤＮＡ法によって誘導されるという事実によって、適切なポリマーを同定し、使用するという問題はさらに悪化する。組換えＤＮＡ技術の使用では、性能を高める部分と組換え産生されたタンパク質との間に形成し得る結合のタイプ及び特異性に厳しい制限がある。これは、先ず第一に、結合に適した官能基の数が非常に限定されており、第二に、修飾されるタンパク質には一般的に反応性官能基の数種のコピーがあり、これによって修飾の特異性が阻害されるからである。例えば、スーパーオキシドジスムターゼとＰＥＧとの非選択的結合の場合、修飾された酵素の幾つかのフラクションが完全に不活性であることが判明した（マックゴフ（Ｐ．ＭａｃＧｏｆｆ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６巻：３０７９−３０９１ページ）。また、そのような部分の、異なる数がランダムに結合する場合、治療的タンパク質の薬物動態は正確には予想できず、投与量に関して大きな問題が生ずる。結合がコントロールされなければ、（ａ）有効性の減少、（ｂ）誘導体の広範囲の混合物を分離するための、時間のかかる精製スキームの必要性、そして（ｃ）修飾部分の結合が不安定である可能性が、生まれる。当業者には公知のトレシルクロリド−ベースの結合等、数種の結合は免疫原性であることも知られている。
【００１９】
こうして、生物学的に産生されたタンパク質の循環寿命を改善し、タンパク質分解および免疫原性を減らし、その他の特性を改善するために、ＰＥＧのような水溶性ポリマーを結合することはできるが、コントロールされたやり方で、ユーザーが決めた正確さでそれらを結合することは難しく、不均質な結果が得られる。また、ポリマーをユーザーが決めた正確な部位に結合させる成功度は限定的であるため、タンパク質に一般的に使用できる好ましい結合部位についてはほとんど知られていない。その上、結合は統計学的性質のものであり、ＰＥＧ及びそのような目的に現在使われるその他の水溶性ポリマーはヘテロ分散性であるため、ＰＥＧ−タンパク質結合物の精製および分析による特徴づけは難しい。このため、再現性のある結合のコントロールの欠如とポリマーの不均質性とがからみあった問題が、ポリマー修飾タンパク質の治療薬としての日常的承認を著しく阻害してきた（１９７０年代初期に紹介されたにもかかわらず今日までに治療的使用が承認されたのはほんの数種に過ぎない）。
【００２０】
よって、組換えＤＮＡ法とは別個のもので、ポリマー修飾が可能なポリマーを形成するために利用できる、生物活性タンパク質の生成法が必要である。種々の長さの鎖の混合物でなく、決まった構造のポリマー付加物を有する誘導体化タンパク質を形成するために利用できる好ましいポリマーも必要である。天然タンパク質の好ましい諸特性を模するように仕立てることができる構造のポリマー付加物を有する誘導体化タンパク質の形成に使用できるポリマーも必要である。さらに、多くのタンパク質に一般的に適用できるタンパク質誘導体化法も必要である。本発明はこれらの、及びその他の必要性を満足する。
【００２１】
（発明の開示）
本発明は、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質、それらを含む医薬組成物およびそれらの製法及び使用法に関するものである。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は全体または一部分が、化学的合成によって形成され、したがって生物学的に産生されたタンパク質とは著しく異なる。
【００２２】
詳細には、本発明は約２５キロダルトン（“ｋＤａ”）より大きいモノマー分子量を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。本発明はさらに、一つ以上のイレギュラーアミノ酸残基を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。本発明は特に、天然哺乳動物タンパク質（例えばヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、またはウマ、トリ、またはサカナのタンパク質）のようなリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。より詳細に述べれば、本発明は、タンパク質受容体、そのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、及びサイトカインからなる群から選択されるリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質を提供する。
【００２３】
好ましい実施の態様において、本発明は下記の式を有する分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる：
“タンパク質”−Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊
【００２４】
上記式中、“タンパク質”はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含み、上記ポリペプチド鎖は、一つ以上の化学的結合部位によって共有結合した重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ペプチドセグメントを一つ以上含み、Ｕは、一つ以上の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ペプチドセグメントの一つ以上のアミノ酸の側鎖ｎの相互に反応する特異的官能基に共有結合した特異的官能基の残基であり、ｎは１ないし６の整数であり、Ｂは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい３本以上のアームを有する分岐コアであり、“ポリマー”は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、それはＢが存在する場合同じでも異なっていてもよい、そしてＪ＊は、陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される、生理的条件下において正味の電荷を有するペンダント群の残基であり、ｓ１、ｓ２及びｓ３は、同じでも異なっていてもよく、そして個々にあってもなくともよいスペーサーまたはリンカーである。本発明の好ましい分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有する単分散系のものである。
【００２５】
もう一つの実施態様において、本発明はリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる、その際上記ポリペプチド鎖はそれに結合した一つ以上の水溶性ポリマーを有する。より好ましい実施態様において、水溶性ポリマーの一つ以上がリボソーム特異的糖タンパク質のグリコシル化部位に対応する上記ポリペプチド鎖の一つ以上の部位に共有結合する。好ましい水溶性ポリマーは、グリコミメティック水溶性ポリマーであるポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド及びそれらの誘導体である。最も好ましいのは、サイトカイン糖タンパク質のポリペプチド鎖を含んでなるポリマー修飾合成タンパク質である。
【００２６】
本発明はさらに、このような本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を含んでなる医薬組成物に関係する。本発明はさらに、ヒトの病気または疾患を治療する方法であって、このような本発明の医薬組成物を１種類以上含む医薬組成物の有効量を、このような治療を必要とする人に投与することを含んでなる治療法を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法にも向けられる。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましい製法は、上記ポリマー修飾合成タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合することを含み、その際結合に使用される上記ペプチドセグメントの一つ以上が水溶性ポリマーを有し、その水溶性ポリマーは、ペプチドセグメント中の、ユーザーによって決まり、且つあらかじめ選択された部位に結合する。上記ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質が生成する。
【００２８】
本発明の合成生物活性タンパク質のもう一つの好ましい製法は、本発明の合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、その（ペプチドセグメントの）一つ以上の化学的結合部位のアミノ酸の側鎖に一つ以上の水溶性ポリマーを結合すること含む。上記ポリマー修飾ポリペプチド鎖をその後折りたたみ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を生成する。
【００２９】
本発明は、（１）合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）アミノ酸配列を含むペプチドセグメントを化学的に結合し、上記合成生物活性タンパク質に対応する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際少なくとも一つのペプチドセグメントが第一の化学選択的官能基を有するイレギュラーアミノ酸を含み、（２）上記ポリペプチド鎖を折りたたみ、（３）第一の化学選択的基と特異的に、かつ相互に反応する第二の化学選択的基を含む水溶性ポリマーをそこに結合させる諸段階を含んでなる、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法にも向けられる。
【００３０】
本発明のもう一つの実施態様は、式Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊であらわされる分子的に均質なグリコミメティック水溶性ポリマーに向けられる。上記式中、Ｕは特異的官能基の残基であり、Ｂは３本以上のアーム（同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい）を有する分岐コアであり、“ポリマー”は、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−であらわされる約５，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドであり、上記式中Ｘ及びＹは同じでも異なっていてもよく、分岐鎖でも直鎖でもよい二価のラジカルであり、ｎは２から５０までの整数であり、Ｘ及びＹのどちらかまたは両方が、直鎖または分岐鎖である実質的に非抗原性、水溶性の反復単位を含み、Ｊ＊は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、ｓ１、ｓ２及びｓ３は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である。
【００３１】
本発明はさらに次の式であらわされる分子的に均質な水溶性ポリマーに関係する：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊
上記式中、Ｕは特異的官能基の残基であり、Ｂは３本以上のアーム（同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい）を有する分岐コアであり、“ポリマー”は、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−であらわされる約５，０００ダルトンより大きい分子量を有するポリアミドであり、上記式中、Ｘ及びＹは、同じでも異なっていてもよく、分岐鎖でも直鎖でもよい二価のラジカルであり、ｎは２から５０までの整数であり、Ｘ及びＹのどちらかまたは両方が、直鎖または分岐鎖である実質的に非抗原性、水溶性の反復単位を含み、Ｊ＊は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、ｓ１、ｓ２及びｓ３は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である；存在するならば、それらが１ないし１８個の炭素を含むのが好ましい。
【００３２】
本発明は特に、Ｕがアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル　ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル　カルボネート、オルトピリジル　ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル　グルタレート、スクシミジル　スクシネート、琥珀酸、トレシレート及び活性化可能な官能基からなる群から選択される官能基の残基であるような、分子的に均質な水溶性ポリアミドに関係する。
【００３３】
本発明はさらに、Ｕがカルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、及びオキサゾリジンからなる群から選択される結合を形成できる官能基の残基であるような分子的に均質な水溶性ポリマー、特にＵが保護されているこのようなポリマーに関係する。
【００３４】
本発明はさらに、ポリマーが約１０，０００Ｄａより大きい、より好ましくは約１５，０００Ｄａより大きい分子量を有するこのような分子的に均質な水溶性ポリマーにも関係する。
【００３５】
本発明はさらに、Ｂが４本以上のアームを含んでなり、および／またはＢが一つ以上のアミド結合によってｓ２または“ポリマー”に結合している分岐コアを含み、および／またはＢがアミド結合によってポリマーに結合している分岐コアを含んでなるこのような分子的に均質な水溶性ポリマーに関する。
【００３６】
本発明はさらに、反復単位が式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−のエチレンオキシドを含み；および／またはＸ、Ｙ、またはＸとＹが：−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選択され、式中、ｎ１は１ないし６の整数であり、ｎ２は２ないし５０の整数であり；および／またはＸまたはＹの１つがフェニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、及びこれらの組合わせからなる群から選択される、上記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関係する。
【００３７】
本発明は特に、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−、または−Ｘ’−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｘ’−である上記分子的に均質な水溶性ポリマーに関係する。
【００３８】
本発明は特に、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは６ないし３６；または−Ｙ’−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｙ’−であり、特に、Ｘ’及びＹ’の少なくとも一つが式（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎまたは（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎであり、ここでｎは２ないし５０である上記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【００３９】
本発明は特に、Ｊ＊が保護されており、または（ｉ）生理的条件のもとで正味の中性電荷を有する非イオン化基、または（ｉｉ）生理的条件のもとで正味の陽電荷を含むイオン化基、または（ｉｉｉ）生理的条件のもとで正味の陰電荷を含むイオン化基、を含んでなる、前記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【００４０】
本発明は水溶性ポリマーが単分散系である前記分子的に均質な水溶性ポリマー類に関する。
【００４１】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明はポリマー修飾合成生物活性タンパク質、その製法及び使用に関するものである。本発明はグリコミメティック水溶性ポリアミドポリマーにも関係する。
【００４２】
Ｉ．本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質
ポリマー修飾タンパク質はこれまでに記述されているとはいえ、本発明において可能なポリマー修飾の性質及び方法はこれまでの試みとは明らかに異なる。例えば、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質はまるごと化学的に合成される。その上、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は一つ以上の特定の、ユーザーにより選択され、且つユーザーが決める部位が水溶性ポリマーで修飾される。
【００４３】
さらに、本発明のタンパク質の合成的製造により、このような修飾が、標本中のあらゆる分子の各ユーザー選択−及びユーザー決定部位に存在することを確認することができる。合成のこのような均一性及びコントロールによって、本発明は、先行技術の方法の使用では許される無秩序な修飾とははっきり区別される。重要なことに、本発明は、いかなる重要でない（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）残基も誘導体化されてポリマー付加物を含むことができるという合成タンパク質を設計することができる。その上、このようなユーザー選択−及びユーザー決定部位の各々に関して、このような付加物をポリペプチド−またはタンパク質主鎖に結合する正確な結合（アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシム等）をユーザーが決定できる。加えて、特定部位に存在することが望ましい特定のポリマー付加物を変えたり、コントロールして、存在するあらゆるタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導体化部位に、正確に同じ誘導体化付加物を含む最終試料が得られるようにすることができる。こうして、本発明はポリマー修飾ポリペプチド及びタンパク質の均質生成物の形成を可能にする。
【００４４】
水溶性ポリマーを結合できる結合部位の位置及び数を変えるための手段を提供できる上に、本発明は結合したポリマーの性質を変えることもできる。特定のユーザー選択及びユーザー決定部位に挿入できるポリマー付加物は決められたいかなる長さでもよい。同様に、本発明の方法により、異なる部位に異なる長さのポリマーを使うことも可能である。例えば、一実施形態において、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は水溶性ポリマー付加物による単修飾または多修飾のいずれでもよい。一種類以上のポリマー付加物が特定のポリペプチドまたはタンパク質に挿入される場合、使われるポリマーは、“単一種（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”、“多種（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”、“均一種（ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ　ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”、または“広範囲種（ｄｉｖｅｒｓｅｌｙ　ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”でよい。ここに使用する用語“単一種（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”は、一種類のポリマーによって修飾されるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。対照的に、用語“多種（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”は一種類より多い種類のポリマーによって修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を言う。このような多種（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）ポリペプチドまたはタンパク質は、もしもポリペプチドまたはタンパク質の全修飾部位において同じ一種類のポリマーが存在するならば、“均一種（ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ　ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”であると言われる。対照的に、多種（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）ポリペプチドまたはタンパク質は、もしも上記ポリペプチドまたはタンパク質の改変部位が種々の種類のポリマーで修飾されているならば“多様種（ｄｉｖｅｒｓｅｌｙ−ｓｐｅｃｉａｔｅｄ）”であると言われる。
【００４５】
その上、ユーザーが選択し、ユーザーが決定した各部位のポリマー付加物の直鎖性または枝分かれの程度を変えることができる。このためポリマー付加物は直鎖でも、枝分かれしていても、または均一に枝分かれしていてもよい。用語“均一に枝分かれ”とは、特定部位のポリマーの全ての枝が同じ構造及び長さを有することを意味する。我々が認めるように、本発明では、個々の枝の長さも、そのような分岐点に存在するポリマーの構造も両方とも独立的に変えることができる。
【００４６】
要するに、本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質主鎖の、ポリマーで修飾された、ユーザー選択、ユーザー決定部位の（１）位置及び（２）頻度を決定し、並びにそのような各部位に存在する枝分かれの（３）長さ、（４）種類、及び（５）程度をコントロールすることができる。さらに、ポリマーによる多数の修飾を有するポリペプチド及びタンパク質に関して、本発明は各部位の、上に述べた５変数の各々を独立的に決めることができる。その上、枝分かれポリマーで修飾したポリペプチド及びタンパク質に関しては、本発明は各分岐点に対して上記５変数の各々を独立的に決めることができる。これにより、存在する２０種類の遺伝子的にコードされるアミノ酸側鎖のいずれかまたは全ての多数のコピーを、望ましくないポリマー結合によって妨害されずに含む精密なポリマー修飾合成生物活性タンパク質の均一組成物の合成が可能である。
【００４７】
こうして本発明は、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質、特にサイトカイン、成長因子等のための受容体を標的とするそれらの設計、合成及び使用にかなりの柔軟性を与える。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列は、基礎となる遺伝子的にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（本発明の合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列はこれに基づいている）に比較して一つ以上の欠失、挿入または置換を含むことができる。アミノ酸配列は一つ以上のイレギュラーアミノ酸、例えば擬似アミノ酸および／または不自然な側鎖を担うその他のアミノ酸等、例えば水溶性ポリマー付加物を結合するための特異な化学選択的官能基を担うように改変されたアミノ酸等で置換することができる。こうして、水溶性ポリマーはイレギュラーアミノ酸または遺伝子的にコードされたアミノ酸を介して結合できる。上記水溶性ポリマーは直鎖でも枝分かれしていてもよい、そしてカルボン酸、脂肪族、アミドまたはアミンのような化学的成分を含む末端基を有することができる。その上、上記水溶性ポリマーは単分散系でよい、すなわちそれは精密に決められた構造及び組成の単一の分子種を含むように作ることができる。例えば、上記水溶性ポリマーは、こうして修飾される標的タンパク質の半減期、免疫原性、有効性、保存安定性、投与量、デリバリー性等を細かく調節する特徴を含むように設計できる。
【００４８】
好ましい実施の形態において、本発明は分子的に均質なポリマー修飾合成生物活性タンパク質に向けられる。これらのタンパク質は次の式であらわされる：
“タンパク質”−Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊
【００４９】
この式において、“タンパク質”はリボソーム特異的タンパク質のポリペプチド鎖を含む。上記ポリペプチド鎖は一つ以上の化学的結合部位によって共有結合した重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ペプチド　セグメントを一つ以上含む。
【００５０】
“リボソーム特異的タンパク質”とは細胞内でリボソームによって産生するタンパク質を意味する。好ましい実施形態において、ポリマー修飾ポリペプチド鎖は、天然哺乳動物タンパク質（例えばヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、またはウマ、トリ、またはサカナのタンパク質）のようなリボソーム特異的タンパク質と関連した生物活性を模する生物活性を有する。タンパク質受容体またはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドまたはそのフラグメント、及びサイトカインからなる群から選択されるリボソーム特異的タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性がより好ましい。リボソーム特異的タンパク質の生物活性ポリペプチド鎖には新規のものも、種々の遺伝子またはタンパク質のデータベースから得られるものも含まれる。このようなデータベースの例には、非制限的にジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）（ベンソン（Ｂｅｎｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６巻（１号）：１−７ページ；ＵＳＡ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）、ＴＩＧＲデータベース（Ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）、タンパク質データバンク（ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、ＵＳＡ）、及びＥｘＰＡＳｙ及びスイスタンパク質データベース（Ｓｗｉｓｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ジュネーブ、スイス）がある。最も好ましいリボソーム特異的タンパク質はサイトカインである：そのポリペプチド鎖及びそれらの特異的アミノ酸配列はよく知られている（例えば“サイトカイン・ハンドブック（Ｔｈｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）”、第３版、トーマス（Ａ．Ｔｈｏｍａｓ）編集、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、１９９８；“サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）”、Ａ．Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ＆Ｒ．Ｔｈｅｒｐｅ編集、アカデミックプレス、１９９８；及び“サイトカイン・リファレンス（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）”１巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム（Ｊ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）及びフェルドマン（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ）編集、アカデミックプレス、２００１、を参照されたい）。
【００５１】
“化学的ライゲーション部位”とは、化学的ライゲーション（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって両者の間に非可逆的共有結合を形成するまたは形成できる第一のペプチドまたはポリペプチドのＮ−末端アミノ酸及び第二のペプチドまたはポリペプチドのＣ−末端アミノ酸を意味する。ここに使用する“化学的ライゲーション”とは、２つの化学的成分の共有結合を含む化学選択的反応を言い、上記２つの化学的成分の各々は他者と特異的に非可逆的共有結合を形成できる相互に反応する官能基を担う。化学的ライゲーション（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）には（１）特異的に反応するＣ−末端基を担う第一ペプチドまたはポリペプチドと（２）特異的に反応するＮ−末端基を担う第二のペプチドまたはポリペプチドとの共有結合がある；ここでＣ−末端及びＮ−末端の反応性基はそれらの間に非可逆的共有結合を形成する。特に、化学的ライゲーションは、保護されていないペプチドセグメントのライゲーションに適用できるいかなる化学選択反応化学をも含む。
【００５２】
Ｕは一つ以上の重なり合わない（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ペプチドセグメントの、一つ以上のアミノ酸の側鎖ｎの、相互に反応性の特異的官能基に共有結合した特異的官能基の残基である。ここでｎは１ないし６の整数である。より好ましくは、側鎖ｎは１ないし４の整数である。ここに使用する用語“アミノ酸”は２０の遺伝子的にコードされるアミノ酸、天然に見いだされる稀なまたは異常なアミノ酸、及び天然以外で発生するアミノ酸、例えばイレギュラーアミノ酸等を含むものとする；ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の範囲内でアミノ酸残基を指す場合もある。Ｕ及び側鎖ｎの好ましい実施形態は、特異的相互反応性基から形成される共有結合である；その際このような結合はオキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、チアゾリジン、チオエーテル、エーテル及びエステルから選択される。最も好ましいＵ及びｎ結合は、Ｕが、アミド、オキシム、チオエステル、ヒドラゾン、チアゾリジン、オキサゾリジンからなる群から選択される化学的ライゲーションによって形成される結合を介して側鎖ｎに共有結合しているものである。
【００５３】
Ｂは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい３本以上のアームを有する分岐コアである。Ｂが存在し、３本以上のアームを含むことが最も好ましい。特に、Ｂのアームの１本がＵに結合し（任意にスペーサーまたはリンカーｓ１を介して）、Ｂの第二のアームが“ポリマー”に結合する（任意にスペーサーまたはリンカーｓ２を介して）ことが好ましい。好ましいポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、部分Ｂの枝分かれしたアームの少なくとも１本が、オキシム、アミド、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジン、及びチアゾリジンからなる群から選択される結合の残基を含むものである。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましい枝分かれ基Ｂは、アミノ、カルボン酸塩及び混合アミノーカルボン酸塩からなる群から選択される分岐コアを含んでなる。好ましいアミノ分岐コアはリジンを含み、好ましいカルボン酸塩分岐コアはグルタミンまたはアスパラギン酸を含み、好ましい混合アミノ−カルボン酸塩分岐コアはガンマーグルタミン酸、またはその誘導体を含む。
【００５４】
“ポリマー”成分は実質的に非抗原性の水溶性ポリマーで、Ｂが存在する場合は同一であるかまたは異なっていてもよい。“水溶性ポリマー”とは、水に溶解し、約１，０００ダルトンより大きい原子分子量を有する実質的に非抗原性のポリマーである。上記“ポリマー”は好ましくは１０，０００Ｄａより大きく、より好ましくは約２０，０００ないし５００，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００ないし３００，０００Ｄａの有効的流体力学的分子量を有する。“有効的流体力学的分子量”とは、水ベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定されたポリマー鎖の有効的水溶媒和サイズを意味する。水溶性ポリマーがエチレンオキシド反復単位等のポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含む場合、各鎖は約２００ないし約８０，０００Ｄａの原子分子量、好ましくは約１，５００ないし約４２，０００Ｄａの原子分子量を有するのが好ましく、２，０００ないし約２０，０００Ｄａが最も好ましい。特に説明しない限り、分子量は原子分子量を指すものとする。
【００５５】
“ポリマー”成分は広範囲の分子量、及びポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットには生物学的ポリマー、合成ポリマー、またはそれらの組み合わせがある。このような水溶性ポリマーの例には：デキストラン及びデキストラン誘導体、例えばデキストラン硫酸等、Ｐ−アミノ架橋デキストリン、及びカルボキシメチルデキストリン、セルロース及びセルロース誘導体、例えばメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース等、澱粉及びデキストリン類、及びデキストリン、澱粉の誘導体及び加水分解物、ポリアルキレングリコール及びこれらの誘導体類、例えばポリエチレングリコール、メチルオキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール　ホモポリマー、ポリプロピレングリコール　ホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー等（ここで前記ホモポリマー及びコポリマーは置換されていないか、または一端がアルキル基、ヘパリン及びヘパリン断片で置換されている）、ポリビニルアルコール及びポリビニルエチルエーテル類、ポリビニルピロリドン、アスパルタミド、及びデキストラン及びデキストラン誘導体、デキストリン及びデキストリン誘導体で置換されたポリオキシエチル化ポリオール類がある。上に詳細に記載された水溶性ポリマーの種々の誘導体も考慮されるのは当然である。
【００５６】
上に記載したような水溶性ポリマーはよく知られており、特にポリアルキレンオキシド−ベース−ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は公知である（下記を参照されたい：“ポリ（エチレングリコール）の化学：生物工学的及び生医学的用途”ハリス（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ）編集、プレナムプレス、ニューヨーク、ＮＹ（１９９２）；及び“ポリ（エチレングリコール）の化学及び生物学的用途”ハリス及びザリプスキー編集、ＡＣＳ（１９９７）；及び国際特許出願：ＷＯ９０／１３５４０、ＷＯ９２／００７４８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８９３７、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９６／２３７９４、ＷＯ９８／０７７１３、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３０７２７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３３４８３、ＷＯ９９／５３９５１、ＷＯ０１／２６６９２、ＷＯ９５／１３３１２、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９９／４５９６４、及び米国特許第４，１７９，３３７号、第５，０７５，０４６号；第５，０８９，２６１号；第５，１００，９９２号；第５，１３４，１９２号；第５，１６６，３０９号；第５，１７１，２６４号；第５，２１３，８９１号；第５，２１９，５６４号；第５，２７５，８３８号；第５，２８１，６９８号；第５，２９８，６４３号；第５，３１２，８０８号；第５，３２１，０９５号、第５，３２４，８４４号；第５，３４９，００１号；第５，３５２，７５６号；第５，４０５，８７７号；第５，４５５，０２７号；第５，４４６，０９０号；第５，４７０，８２９号；第５，４７８，８０５号；第５，５６７，４２２号；第５，６０５，９７６号；第５，６１２，４６０号；第５，６１４，５４９号；第５，６１８，５２８号；第５，６７２，６６２号；第５，６３７，７４９号；第５，６４３，５７５号；第５，６５０，３８８号；第５，６８１，５６７号；第５，６８６，１１０号；第５，７３０，９９０号；第５，７３９，２０８号；第５，７５６，５９３号；第５，８０８，０９６号；第５，８２４，７７８号；第５，８２４，７８４号；第５，８４０，９００号；第５，８７４，５００号；第５，８８０，１３１号；第５，９００，４６１号；第５，９０２，５８８号；第５，９１９，４４２号；第５，９１９，４５５号；第５，９３２，４６２号；第５，９６５，１１９号；第５，９６５，５６６号；第５，９８５，２６３号；第５，９９０，２３７号；第６，０１１，０４２号；第６，０１３，２８３号；第６，０７７，９３９号；第６，１１３，９０６号；第６，１２７，３５５号；第６，１７７，０８７号；第６，１８０，０９５号；第６，１９４，５８０号；第６，２１４，９６６号）。
【００５７】
より好ましい“ポリマー”成分は、ポリアルキレンオキシド、ポリアミドアルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。さらにより好ましい“ポリマー”成分は、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−であらわされる約１，０００Ｄａより大きい分子量を有するポリアミドである。上記式中、Ｘ及びＹは同じでも異なっていてもよく、枝分かれしていても直鎖でもよい二価のラジカルであり、ｎは２ないし１００、より好ましくは２ないし５０の整数であり、Ｘ及びＹの片方または両方が直鎖かまたは枝分かれした、生体適合性、実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含む。最も好ましい水溶性反復単位は式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−であらわされるエチレンオキシドを含む。このような水溶性反復単位のより好ましい数は２ないし５００、２ないし４００、２ないし３００、２ないし２００、２ないし１００であり、最も好ましいのは２ないし５０である。より好ましい実施形態の例では、Ｘ及びＹの片方または両方が−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）から選択され、式中ｎ１は１ないし６、１ないし５、１ないし４であり、最も好ましくは１ないし３であり、ｎ２は２ないし５０、２ないし２５、２ないし１５、２ないし１０、２ないし８であり、最も好ましくは２ないし５である。非常に好ましい実施形態の例は、Ｘが（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−であるものである。
【００５８】
“ポリマー”成分または一つ以上のスペーサーまたはリンカー（存在すれば）は、生体内安定性または生分解性であるポリマー鎖またはポリマー単位を含むことができる。例えば反復結合を有する“ポリマー”は、生理的条件下で結合の不安定さに応じて種々の安定度を有する。このような結合を有するポリマーは、低分子量同族体の公知の加水分解速度に基づき、生理的条件下におけるそれらそれぞれの加水分解速度によって、例えば安定性の小さいポリカルボネートからより安定なポリカルボネート類にまで分類できる：（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリエステル類（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリウレタン類（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリオルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞ポリアミド類（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に付加させる結合系は生体内安定でも生分解性でもよく、例えばより不安定なカルボネートからより安定なカルボネートまでのいずれでもよい：（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞オルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）。これらの結合は例として提供されるもので、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または結合系に使用できる結合のタイプを制限するものではない。
【００５９】
成分Ｊ＊は陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を生理的条件下で有するペンダント基の残基である。これはアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アシル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アミド、アミン、カルボニル基等を含む；これらは置換されていても置換されていなくともよい、そしてそれらの塩でもよい。中性の基はアルキルまたはアルコキシ基が好ましく、非制限的に、１ないし１８個の炭素を含む部分を含むことができ、直鎖でも枝分かれしていてもよい。帯電基として与えられる場合、Ｊ＊はイオン化官能基を含む。官能基の例には、非制限的に、カルボン酸、エステル、アミド、ニトリル、チオール、及びヒドロキシルがある。このようなＪ＊基はアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物の一成分、及びそれらの誘導体でもよく、キチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、燐脂質、シアル酸等のような部分でもよい。Ｊ＊はカルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジニウム、イミダゾール及びそれらの塩から選択されるイオン化可能部分を含むのが好ましい。最も好ましいのは、Ｊ＊がイオン化可能カルボン酸塩部分を含み、生理的条件下で正味の陰電荷を有する場合である。
【００６０】
成分ｓ１、ｓ２及びｓ３は、同じでも異なっていてもよく、個々に存在してもしなくともよいスペーサーまたはリンカー部分である。好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマーに用いられる一つ以上の反復単位、ジアミノおよび／またはジアシド単位、天然または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、並びに、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等を含み、好ましくは１８個までの炭素原子または追加的ポリマー鎖も含む脂肪族部分を含む直鎖または枝分かれ部分等である。スペーサーまたはリンカーがポリマー鎖を含むのが最も好ましい。
【００６１】
或いは、上記の式“タンパク質”−Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊は“タンパク質−Ｕｎ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊”と表すことができる；上記式中、基ｓ１、ｓ２及びｓ３は存在してもしなくてもよい。より好ましい“ポリマー”成分は、水溶性ポリマーＵ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊が全体として段階的合成によって生成される場合である。これは、これらのポリマーが精密な分子量及び決められた構造をもつことを意味する。これに対して、普通のポリマー重合（すなわち重合プロセス）は鎖の長さが異なる混合物を生成し、そのため分子量及びサイズの、分離不可能でないにしても分離困難な分布があらわれる。分子の純度をコントロールできれば、水溶性ポリマーを結合して含み、単分散系である合成タンパク質を形成するのに好都合である。これは、不均一化合物から生成する変動し得る特性を排除でき、最も好ましい特徴を有する化合物だけが合成され、比較的容易に分離されるという点で非常に有益である。
【００６２】
或いは、上の式“タンパク質”−Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊は、基ｓ１、ｓ２及びｓ３が存在してもしなくともよい場合は“タンパク質−Ｕｎ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊”とあらわすことができる。
【００６３】
式“タンパク質”−Ｕｎ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊のより好ましい化合物は、リボソーム特異的タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖を有する、そして上記ポリペプチド鎖が一つ以上のイレギュラーアミノ酸を有するのがより好ましい。ここに使用する用語“イレギュラーアミノ酸”とは、非遺伝子的にコードされる側鎖、非遺伝子的にコードされる主鎖、非遺伝子的にコードされる置換ＮαまたはαＣ（Ｏ）部分、またはこれらの組み合わせを有するアミノ酸を言う、すなわちリボソームで産生される２０の遺伝子的にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を言う。好ましいイレギュラーアミノ酸の例には、遺伝子的にコードされる官能基以外の特異な官能基を担う側鎖を有するアミノ酸並びに擬似アミノ酸及び種々のアミノ酸誘導体がある。これに関して、本発明は合成生物活性タンパク質の設計および／または構成において広い選択性及びフレキシビリティを可能にする。本発明に使用できるリボソーム非依存性アミノ酸の例には、非制限的に：Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタメート、γ−アミノブチレート、オルニチン、ホモシステイン、Ｎ−置換アミノ酸（シモン（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９巻：９３６７−７１ページ；ＷＯ９１／１９７３５（バートレットら）、米国特許第５，６４６，２８５号（Ｂａｉｎｄｕｒ））、α−アミノメチレンオキシ酢酸（アミノ酸−Ｇｌｙジペプチド　イソステア）、及びα−アミノオキシ酸及び、非遺伝子的、非コード化側鎖官能基等を有するその他のアミノ酸誘導体等がある。チオアミド、ビニロギーな（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド類、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミド及び置換、還元アミド　イソステア類及びβ−スルホンアミド（類）を含むペプチド同族体が使用できる。“擬似アミノ酸”は、遺伝子的にコードされたアミノ酸と同じ主鎖構造及び側鎖基を有するが、側鎖原子類の原子組成が異なるアミノ酸を意味する。
【００６４】
好ましい実施の形態において、ポリペプチド鎖のイレギュラーアミノ酸に付加した水溶性ポリマーを有する合成生物活性タンパク質が提供される。水溶性ポリマーをそこに結合させるために最も好ましいイレギュラーアミノ酸は、遺伝子的にコードされた官能基の存在のもとで、それらと反応することなく利用できる化学選択的結合作用を行うものである。
【００６５】
もう一つの実施形態において、本発明はリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質に向けられる；この際上記ポリペプチド鎖はそこに付加した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、それは２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有するのが好ましい。これはリボソーム特異的糖タンパク質と関連する生物活性とそっくりな生物活性を有する合成生物活性タンパク質を含む。ここに使用する“糖タンパク質”は、糖残基を介して上記タンパク質のアミノ酸側鎖に共有結合した炭水化物鎖を含むタンパク質を言う。これはグリコシル化タンパク質と呼ばれることもある。糖タンパク質の炭水化物は単糖、二糖（類）、オリゴ糖（類）、多糖（類）またはそれらの誘導体（例えばスルホ−またはホスホ置換）の形でもよい。タンパク質に付加した炭水化物を一つより多く有する糖タンパク質もあり、Ｎ−結合及びＯ−結合グリコシル化を含む糖タンパク質が典型例である。天然または非天然糖タンパク質のグリコシル化生物活性ドメインもある。グリコシル化部位の一つ以上を除去するように突然変異した糖タンパク質、または上記タンパク質をグリコシル化しない細胞（例えば大腸菌）において発現される糖タンパク質がこの定義に包含されることは当然である、なぜならばポリマー修飾のための残基の部位が位置的に同じだからである。
【００６６】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の好ましいポリペプチド鎖はリボソーム特異的哺乳動物糖タンパク質、例えばヒト糖タンパク質のアミノ酸配列を含む。より好ましいポリペプチド鎖は、サイトカインであるリボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含む：その多くのポリペプチド鎖及びそれらの特異的アミノ酸配列及び関連生物学的特性はよく知られている（例えば“サイトカインハンドブック”第３版、トーマス編集、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、１９９８；“サイトカイン”、Ａ．Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ＆Ｒ．Ｔｈｏｒｐｅ編集、アカデミックプレス、１９９８；及び“サイトカイン・リファレンス”１巻、リガンド、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム（Ｊ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）及びフェルドマン（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ）編集、アカデミックプレス、２００１、を参照されたい）。好ましい一実施形態において、リボソーム特異的糖タンパク質は一つ以上のグリコシル化部位を含み、水溶性ポリマーは、合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖に、リボソーム特異的糖タンパク質の一つ以上のグリコシル化部位に対応する一つ以上の部位に結合する。より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーはポリペプチド鎖に、専らこのようなグリコシル化部位の一つ以上に対応する一つ以上の部位に結合する。本発明のこの面には、リボソーム特異的糖タンパク質が組換え的に産生された糖タンパク質であるという合成生物活性タンパク質も含まれる。上記組換え的に産生される糖タンパク質は天然糖タンパク質でも非天然糖タンパク質でもよく、後者はさらに一つ以上の非天然グリコシル化部位を含むことができる。“グリコシル化部位”とは、オリゴ糖（炭水化物）鎖と、上記タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基の側鎖との酵素的結合をコードするタンパク質のアミノ酸配列を意味する；典型例はＮ−結合及びＯ−結合グリコシル化部位である。このようなグリコシル化部位の一つ以上が除去されるように突然変異した糖タンパク質が“グリコシル化部位”の定義に含まれることは当然である、なぜならばポリマー修飾のための残基の部位が位置的に同じだからである。“天然に発生するグリコシル化部位”とは、天然に見いだされる糖タンパク質のグリコシル化部位を意味する。“非天然的に発生するグリコシル化部位”とはタンパク質に工学的に設計されたグリコシル化部位を意味する。例えば、組換えヒトＥＰＯ及びＧＣＳＦはこのやり方で設計された（米国特許第５，８５６，２９８号及び第５，２１８，０９２号を参照されたい）。
【００６７】
本発明のこの好ましい実施形態は、一部分は次の知見に基づく：糖タンパク質のポリペプチド鎖を有する合成タンパク質においてその一つ以上のグリコシル化部位が本明細書に記載されるポリマー類等の水溶性ポリマーで修飾される際には、上記水溶性ポリマーを使用して、対応する天然発生性糖タンパク質、付加的グリコシル化部位を含むように工学的に設計された糖タンパク質、またはグリコシル化されるように工学的に設計された非−糖タンパク質のその位置に通常見いだされる炭水化物鎖に起因する生物学的作用の一つ以上を利用することができる。そのような生物学的作用には、耐プロテアーゼ性、免疫原性、受容体特異性、特異的活性、効力及び薬物動態の調節がある。しかし、炭水化物鎖の存在を排除し、その代わりに本発明の好ましい水溶性ポリマーを導入することによって、酵素的分解及びクリアランス（糖鎖のペンダントシアル酸が除去された時等）、不安定性、制限された循環半減期や分布、不十分な取扱い特性等が回避されるという重要な利益が得られる。重要なことに、本発明のこのようなポリマー修飾合成生物活性タンパク質が、修飾されない対応タンパク質に比較して生物学的活性の喪失を実質的には起こさずに生物活性の増強を含めるこのような有益な生物学的特性を保持することが判明した；上記合成タンパク質のモノマー分子量が２５ｋＤａより大きい場合でさえ、生物活性は増加した。
【００６８】
このため、もう一つの好ましい実施形態において本発明は、リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質において、上記ポリペプチド鎖がそれに結合した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有し、上記合成生物活性タンパク質が、前記水溶性ポリマーを含まないポリペプチド鎖を有する対応する合成生物活性タンパク質に同等かまたはより良い生物活性を含む、上記合成生物活性タンパク質に向けられる。上記生物活性はｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはその両方である。好ましい実施形態において、上記生物活性はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてである。もう一つの好ましい実施形態において、本発明は、リボソーム特異的糖タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖を含む合成生物活性タンパク質に向けられ、その際上記ポリペプチド鎖はこれに付加した一つ以上の水溶性ポリマーを有し、２５ｋＤａより大きいモノマー分子量を有する、そして上記合成生物活性タンパク質はリボソーム特異的糖タンパク質に同等かまたはより良い生物活性を含んでなる。ここでも、上記生物活性はｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはその両方でよい。好ましい実施形態においては上記生物活性はｉｎ　ｖｉｖｏである。最も好ましくは、このようなポリマー修飾合成生物活性タンパク質はこれに付加した整数の水溶性ポリマーを含む。
【００６９】
タンパク質の非天然発生性グリコシル化部位を標的とする利点は、天然に見いだされるタンパク質が、天然糖タンパク質であろうとなかろうと組換えＤＮＡ法（部位特異的突然変異または直接進化）によって、一つ以上の部位または領域−−例えば免疫原性またはプロテアーゼ感受性の原因となり得る保護されていない異常領域または表面露出領域等−−にグリコシル化部位を含むように改変できることである。例えば、非天然発生グリコシル化部位は標的ポリペプチド配列の潜在的免疫原性またはプロテアーゼ感受性部位に設計され、産生のための組換え系（例えばＣＨＯ細胞及び酵母細胞発現系等）でスクリーニングされ、該当する所望生物活性のアッセイが行われる。それからグリコシル化しやすいことが判明した新しい部位を利用して、一つ以上の位置に排他的に結合した水溶性ポリマーを有する本発明の合成生物活性タンパク質を設計、合成する。
【００７０】
もう一つの実施形態において、本発明は、タンパク質のライゲーション部位に擬似アミノ酸を含み、任意に上記水溶性ポリマーを結合して含む合成生物活性タンパク質に向けられる。これらの化合物は、システイン等の化学選択的反応性官能基を含むＮ−末端アミノ酸を有する第一のペプチドまたはポリペプチドをα−カルボキシチオエステル等の化学的ライゲーションに適するＣ−末端官能基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドに結合することによって、ライゲーション部位に未保護側鎖官能基を有するライゲーション産物を形成し、上記ライゲーション部位の未保護側鎖官能基を擬似アミノ酸に化学的に変換する（例えばシステイン　チオール側鎖のカルボキシメチル化を行い、擬似グルタメートアミノ酸を形成する等）という方法で作られる。天然型化学的ライゲーション部位におけるシステインの変換によって形成される擬似アミノ酸はここでは“擬似天然型化学的ライゲーション”と呼ばれる。これは以後詳細に説明される。
【００７１】
また、上記タンパク質のライゲーション部位のアミノ酸の側鎖に付加した水溶性ポリマーを含む合成生物活性タンパク質も提供される。これらの化合物は、システインのように化学選択的反応性官能基を含むＮ−末端アミノ酸を有する第一のペプチドまたはポリペプチドをα−カルボキシチオエステルのようなライゲーションに適するＣ−末端官能基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドに結合することによって未保護側鎖官能基を有するライゲーション生成物を形成し、ライゲーション部位の上記未保護側鎖官能基に水溶性ポリマーを付加するという方法で合成される。
【００７２】
本発明の擬似アミノ酸化学的ライゲーション及び化学的ライゲーション部位ポリマー修飾法を使用すると、先行技術に比べて幾つかの利点が得られる；例えばこの方法以外では適切なライゲーション部位を持もてないような合成生物活性タンパク質の確実な合成、部位特異的ポリマー修飾が日常的及び費用効果的に実施できる上記部位（及び結合化学）の拡大、並びに実質的分子量を有する合成生物活性タンパク質の合成等。これらは、高処理量を連続的に扱い、水溶性ポリマー結合のための個々のまたは複数の部位の走査等、所望の生特性を微調整するのに特に適する。
【００７３】
上記のように、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の生物学的特性は、ポリマー付加の部位及び結合化学を正確に調節すると共に上記水溶性ポリマーの分子量、ポリマー組成、構造（例えば直鎖　対　枝分かれ、またはそれらの混合物）、及びペンダント基（例えば帯電　対　非帯電、またはそれらの混合物）を正確に調節することによって、改良できる。特に、タンパク質の分子量を高めて半減期や枝分かれ等を改善するのに加えて、そこに付加する水溶性ポリマーは、その合成タンパク質に、上記合成生物活性タンパク質のアミノ酸配列の基礎となる対応する生物学的に産生されたタンパク質の電荷にほぼ等しい正確な電荷（等電点測定による）を提供することができる。これは、対応するリボソーム特異的タンパク質の天然電荷とそっくり似せるという利点を有する。こうして本発明の好ましい実施形態は、上記の特徴、並びにそのために使用される水溶性ポリマー、特に、あらかじめ選択した位置に付加することができる構造的に確立されたポリマー付加物を組合わせて有する合成生物活性タンパク質に向けられる。
【００７４】
やはり上記のように、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は約２５ｋＤａより大きい実質的総分子量を有することができる。本発明の目的では、分子量のこのような測定は変性ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によって行われる。用語“モノマー分子量”とは、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーをもつ合成タンパク質とは区別されるモノマー合成タンパク質の分子量を指すものとする。用語“モノマー　ポリペプチド分子量”はモノマーポリペプチドの分子量を指し、付加したポリマーおよび／またはタンパク質またはポリペプチドの複数のコピーをもつ合成タンパク質とは区別される。
【００７５】
ここに使用するように、（タンパク質の）アミノ酸残基の若干、最も好ましくは全てを重合するために非組換え技術を使用した場合、タンパク質は“合成物”であると言われる。用語“非組換え技術”とは、有機化学及びその他の合成重合アプローチを含む技術と、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む技術とを区別するためのものである。合成タンパク質は完全合成タンパク質及び半合成タンパク質を含む。完全合成タンパク質は、全てのライゲーション成分が人の手で化学合成によって産生される、すなわちリボソームなしの合成によって産生される。半合成タンパク質は、ライゲーション成分の少なくとも一部分が生物学的合成、すなわち細胞中でリボソームにより、または無細胞−翻訳系で作られ、その他の部分が化学的合成で作られる。
【００７６】
ここに使用される、合成タンパク質が“生物活性である”と言われるのは、上記タンパク質が認識可能の生物活性を有し、その生物活性が上記合成タンパク質の構造またはアミノ酸配列に依存して変化し、そのような構造または配列の変化が上記タンパク質の生物活性を高め、変化させ、または低下させる場合である。このような“生物活性”は、非制限的に、上記タンパク質が触媒的、シグナル化または誘導反応を仲介する能力を含む。ここに使用されるタンパク質は、それ自体は消費されず、永久的には改質されることなく、基質を産物に変換することによって“触媒反応を仲介する”と言われる。もしも或るタンパク質の存在が、生体またはその組織または細胞の遺伝子発現、細胞分化、または細胞増殖を開始、継続、増加、変更または減弱させるならば、そのタンパク質は“シグナル化または誘導性反応を仲介する”と言われる。このようなシグナル化または誘導性反応の例としては、サイトカイン発現の誘導またはサイトカイン発現に対する応答、赤血球産生の誘導、炎症および／または炎症プロセスの誘導または鎮静、血管形成または血管化の開始、アポトーシスの誘導、細胞サイクルへの影響等がある。
【００７７】
よって、本明細書において使用する“ポリマー修飾合成生物活性タンパク質”は、一つ以上の水溶性ポリマーを付加して有する合成生物活性タンパク質を言う。本発明の合成生物活性タンパク質の生物活性は、そのタンパク質が受容体、リガンドまたは抗体に特異的に結合する能力も含む。ここに使用する用語“特異的”結合は、構造に基づく結合相互作用、例えばホルモンとその受容体、または抗体と抗原エピトープ等であって、電荷、溶解度、疎水性等に基づく“非特異的”結合とは区別されるものとする。
【００７８】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、哺乳動物（ヒト、サル、ウシ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウマ等）、鳥類、または魚類タンパク質と関連する生物活性を模する生物活性をもつように設計される。ここに使用されるように、もしも第一タンパク質が、第二タンパク質の生物活性に対して改変された、または増加または減少した生物活性を有するならば、第一タンパク質は第二タンパク質を模すると言われる。もしも生物活性の存在がタンパク質のアミノ酸配列に直接または間接に依存するならば、生物活性はそのタンパク質と“関係がある（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）”と言われる。また別の実施形態において、本発明の生物活性タンパク質は、対応する天然生物活性対応物に比較することなく、全体または部分的に設計（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）してもよい。
【００７９】
本発明の好ましい合成生物活性タンパク質には、受容体以外のポリマー修飾タンパク質、及びポリマー修飾−可溶性受容体ドメインがある。例えば、ポリマー修飾−可溶性受容体ドメインを含む合成生物活性タンパク質が特に好ましい。ポリマー修飾のために好ましい可溶性受容体ドメインの例はＰＣＴ／ＵＳ００／０６２９７に記載されており、副腎皮質刺激ホルモン受容体及びその生物活性フラグメント、アンギオテンシン受容体、心房性ナトリウム利尿受容体、ブラジキニン受容体、成長ホルモン受容体、走化性受容体、ダイノルフィン受容体、エンドルフィン受容体、β−リポトロピンのための受容体及びその生物活性フラグメント、エンケファリン受容体、酵素阻害剤受容体、フィブロネクチンの受容体及びその生物活性フラグメント、胃腸−及び成長ホルモン放出ペプチド受容体、黄体ホルモン放出ペプチド受容体、メラノサイト刺激ホルモン、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オキシトシン受容体、バソプレッシン受容体、バソトシン受容体、副甲状腺ホルモン受容体及びそのフラグメント、タンパク質キナーゼ受容体、ソマトスタチン受容体、サブスタンスＰ受容体の可溶性ドメインがある。
【００８０】
ポリマー修飾合成サイトカイン類は本発明の特に好ましい実施形態である。特に、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質には、合成ケモカイン等の合成サイトカイン類がある。これらは細胞−細胞相互の作用や連絡に対する、そして生物学的設定におけるその他の細胞の挙動に対する特異的効果を仲介する。ここに使用される用語“サイトカイン”はインターロイキン（“ＩＬ”）（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４等）、リンホカイン類及び、赤血球産生刺激タンパク質（例：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、等、トランスフォーミング増殖因子、神経増殖因子、脳由来増殖因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、肝細胞増殖因子、Ｔ−細胞増殖因子（ＴＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、等）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）、上皮成長因子（ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＫＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、等）、線維芽細胞成長因子（αＦＧＦ、βＦＧＦ等）、等の増殖因子、およびホルモン類、特に成長ホルモン等のシグナルペプチドホルモン類、及びケモカイン類を含むものとする。ここに使用する用語“ケモカイン”は、６Ｃｋｉｎｅ、９Ｅ３、ＡＴＡＣ、ＡＢＣＤ−１、ＡＣＴ−２、ＡＬＰ、ＡＭＡＣ−１、ＡＭＣＦ−１、ＡＭＣＦ−２、ＡＩＦ、ＡＮＡＰ、Ａｎｇｉｅ、ベータ−Ｒ１、ベータ−トロンボグロブリン、ＢＣＡ−１、ＢＬＣ、ｂｌｒ−１リガンド、ＢＲＡＫ、Ｃ１０、ＣＣＦ１８、Ｃｋ−ベータ−６、Ｃｋ−ベータ−８、Ｃｋ−ベータ−８−１、Ｃｋ−ベータ−１０、Ｃｋ−ベータ−１１、ｃＣＡＦ、ＣＥＦ−４、ＣＩＮＣ、Ｃ７、ＣＫＡ−３、ＣＲＧ−２、ＣＲＧ−１０、ＣＴＡＰ−３、ＤＣ−ＣＫ１、ＥＬＣ、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｅｘｏｄｕｓ−１、Ｅｘｏｄｕｓ−２、ＥＣＩＰ−１、ＥＮＡ−７８、ＥＤＮＡＰ、ＥＮＡＰ、ＦＩＣ、ＦＤＮＣＦ、ＦＩＮＡＰ、フラクタルキン（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）、Ｇ２６、ＧＤＣＦ、ＧＯＳ−１９−１、ＧＯＳ−１９−２、ＧＯＳ−１９−３、ＧＣＦ、ＧＣＰ−２、ＧＣＰ−２−ｌｉｋｅ、ＧＲＯ１、ＧＲＯ２、ＧＲＯ３、ＧＲＯ−アルファ、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ガンマ、Ｈ４００、ＨＣ−１１、ＨＣ−１４、ＨＣ−２１、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＨＣＣ−４、Ｈ１７４、ヘパリン中和タンパク質、Ｈｕｍｉｇ、Ｉ−３０９、ＩＬＩＮＣＫ、Ｉ−ＴＡＣ、Ｉｆｉ１０、ＩＬ８、ＩＰ−９、ＩＰ−１０、ＩＲＨ、ＪＥ、ＫＣ、リンホタクチン、Ｌ２Ｇ２５Ｂ、ＬＡＧ−１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ−１、ＬＤ７８−アルファ、ＬＤ７８−ベータ、ＬＤ７８−ガンマ、ＬＤＣＦ、ＬＥＣ、Ｌｋｎ−１、ＬＭＣ、ＬＡＩ、ＬＣＦ、ＬＡ−ＰＦ４、ＬＤＧＦ、ＬＤＮＡＰ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＬＵＣＴ、ラングカイン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ＬＹＮＡＰ、マンチェスターインヒビタ、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＩＰ−１−ベータ、ＭＩＰ−１−デルタ、ＭＩ��−１−ガンマ、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−３−アルファ、ＭＩＰ−３−ベータ、ＭＩＰ−４、ＭＩＰ−５、モノタクチン−１、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＩＦ−２、ＭＲＰ−１、ＭＲＰ−２、Ｍ１１９、ＭＤＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、巨核球刺激因子、ＭＧＳＡ、Ｍｉｇ、ＭＩＰ−２、ｍｏｂ−１、ＭＯＣ、ＭＯＮＡＰ、ＮＣ２８、ＮＣＣ−１、ＮＣＣ−２、ＮＣＣ−３、ＮＣＣ−４　Ｎ５１、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１、ＮＡＰ−２、ＮＡＰ−３、ＮＡＰ−４、ＮＡＰ　Ｓ、ＮＣＦ、ＮＣＰ、ニューロタクチン、オンコスタチンＡ、Ｐ１６、Ｐ５００、ＰＡＲＣ、ｐＡＴ４６４、ｐＡＴ７４４、ＰＢＰ、ＰＢＰ−ｌｉｋｅ、ＰＢＳＦ、ＰＦ４、ＰＦ４−ｌｉｋｅ、ＰＦ４−ＡＬＴ、ＰＦ４Ｖ１、ＰＬＦ、ＰＰＢＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ−１−アルファ、ＳＣＩ、ＳＣＹ　Ａ２６、ＳＬＣ、ＳＭＣ−ＣＦ、ＳＴ３８、ＳＴＣＰ−１、ＳＤＦ−１−アルファ、ＳＤＦ−１−ベータ、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、ＴＣＡ−４、ＴＤＣＦ、ＴＥＣＫ、ＴＳＧ−８、ＴＹ−５、ＴＣＦ、ＴＬＳＦ−アルファ、ＴＬＳＦ−ベータ、ＴＰＡＲ−１、及びＴＳＧ−１等の走化性サイトカイン類を指すものとする。
【００８１】
このようなサイトカイン類、及びそれらのケモカインサブファミリー及びそれらそれぞれのポリペプチド鎖、それらの変種及び関連生物活性はよく知られており、多数のソースから一般に提供される（“サイトカイン・ハンドブック（Ｔｈｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）”、第３版、トーマス（Ａ．Ｔｈｏｍａｓ）編集、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、１９９８；“サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）”、Ａ．Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ＆Ｒ．Ｔｈｅｒｐｅ編集、アカデミックプレス、１９９８；及び“サイトカイン・リファレンス（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）”１巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム（Ｊ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）及びフェルドマン（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ）編集、アカデミックプレス、２００１、等を参照されたい）。
【００８２】
ＩＩ．本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法は、次の段階を含むと考察される：設計、ペプチド合成、ペプチドライゲーション、完全長ライゲーション産物を折りたたんでタンパク質を生成、上記タンパク質の生物活性の評価。我々は、ポリマー修飾が一つ以上のペプチド合成、ライゲーション、または、折りたたまれた生成物に関する諸段階で行われ得ることを見いだした。しかし、折りたたみの前にポリマーをペプチドに、またはライゲーション生成物に結合することが好ましい。このやり方で産生され、所望の生物活性を示すタンパク質が選択され、本発明の合成生物活性タンパク質を代表する。
【００８３】
特に好ましい実施形態において、本発明の標的合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含む化学的に結合しているペプチドセグメントを含む本発明の合成生物活性タンパク質の製法が提供される；その際ライゲーションのために使われるペプチドセグメントの一つ以上がユーザーが決定したあらかじめ選択した部位に結合する水溶性ポリマーを有する。ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を生成する。
【００８４】
本発明の合成生物活性タンパク質のもう一つの好ましい製法は、本発明の合成生物活性ポリマー修飾タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含んでなるペプチドセグメントを化学的に結合し、一つ以上の水溶性ポリマーを、アミノ酸の側鎖の一つ以上の化学的ライゲーション部位に結合させることを含んでなる。ポリマー修飾ポリペプチド鎖はその後折りたたまれ、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質が生成する。
【００８５】
本発明はポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法に関係し、その製法は（１）合成生物活性タンパク質のポリペプチド鎖の重なり合わないアミノ酸配列を含むペプチド鎖を化学的に結合し、上記合成生物活性タンパク質に相当する完全長ポリペプチド鎖を形成し、その際少なくとも１本のペプチドセグメントは第一の化学選択性官能基を有するイレギュラーアミノ酸を含み、（２）上記ポリペプチド鎖を折りたたみ、（３）上記第一の化学選択性基と特異的に且つ相互に反応する第二の化学選択性基を含む水溶性ポリマーをそこに結合する諸段階を含む。
【００８６】
特に、本発明において実施され、実施例で例示されるこれらの種々のプロセスは図によって説明できる。例えば図１Ａ−１Ｅは、ライゲーションの前か後、またはこれらの組み合わせで、水溶性ポリマー（本明細書で定義されるように、Ｕ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊）を部分的にまたは全く保護されていないペプチドセグメント
【化１】
2004508338.tif 000003
に付加することを含むライゲーションの図式を示す。図１Ａ−１Ｄにおいて、Ｙａａは第一のペプチドセグメント上のＣ−末端アミノ酸をあらわす。上記第一のペプチドセグメントは、Ｙａａと化学選択的に化学結合できる特異的かつ相互に反応性のＮ−末端アミノ酸Ｘａａ（例えばアミノ末端システイン）を担う第二のペプチドセグメントに化学的ライゲーションするための特異的化学選択性部分（例えばアルファ−カルボキシル　チオエステルを担うアミノ酸）を担う。ＹａａとＸａａとの間の化学選択性反応によりそれらの間に共有結合が形成される（例えばアミド結合）。こうしてＹａａとＸａａとは化学選択的ライゲーション対合を形成する。Ｕｎ−は図に示すように、アミノ酸の側鎖上のユーザーが決めた正確な位置に挿入された第二の特異的化学選択的部分を示し、水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊の基Ｕ−と相互に反応性である。例えば、Ｕｎがケトン基を担うように改変された側鎖である場合、水溶性ポリマーＵ−ポリマー−Ｊ＊のＵ−は、上記ケトンと反応するための化学選択的基、例えばそれらの間にオキシム結合を形成できるアミノオキシ基である。Ｕｎ−の下付き文字“ｎ”はアミノ酸と化学選択的基Ｕを担うように設計されたそれらの側鎖との数をあらわす、例えば、２カ所の特異的及びユーザー決定部位がポリマー修飾される場合はｎ＝２であり、それはＵ２またはＵｎ＝２とあらわすことができる。全ての場合に、ｎは設計によって正確にコントロールされる正の整数である。こうしてＵｎ及びＵは、Ｘａａ及びＹａａの化学選択的基と適合し、且つ反応しない第二の化学選択性ライゲーション対合をあらわす。図１Ａ及び１Ｂは起こり得る２種類の反応を示す。最初に描かれた反応において、Ｕｎ官能価を担うポリペプチド鎖は、第二のポリペプチドに連結し、それからＵ−Ｂ−“ポリマー”Ｊ＊部分と反応し、ポリマー修飾ポリペプチドを得る。次に描かれた反応では、Ｕｎ官能価を担うポリペプチド鎖はＵ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊部分と反応し、ポリマー修飾ポリペプチドを生成し、その後第二のポリペプチドに結合してより大きいポリマー修飾ポリペプチドを得る。これらの図の違いは、図１ＡではＸａａ残基を担うポリペプチドがポリマー修飾を受けることになり、図１ＢではＹａａ残基を担うポリペプチドがポリマー修飾を受けることになることである。図１Ｃは本発明が、複数のポリペプチド鎖を、それらのライゲーション前か後かどちらかに修飾し、より大きいポリペプチドを形成できることを説明している。図１Ｄにおいて、ＰＧ及びＰＧ’は保護基をあらわす、その際ＰＧ’は直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基である、すなわちＰＧ及びＰＧ’は異なる条件のもとで除去可能であり、異なる水溶性ポリマーが同じ化学作用によってＵｎ基に付加している場合、またはＵｎ基がポリマーによる修飾を所望されない側鎖官能基である場合（例えば、水溶性ポリマーのＵ基が専ら第一アミンまたは側鎖チオールと反応するように設計されている場合に反応性−ＮＨ２または−ＳＨを担う側鎖）に有用である。図１Ｄは、保護基を用いることによって、本発明の方法によって結合するポリペプチドの所望側鎖を保護できることを示す。
【００８７】
図１Ｅは、図１Ａ−１Ｄによるライゲーション及びポリマー修飾において用いられるペプチド鎖に多様の基が存在する（または存在しない）ことを示す。
【００８８】
図２Ａ−２Ｃは本発明の合成生物活性タンパク質の製法の追加的方法を描く。特に、図２Ａ−２Ｂはアミノ末端基Ｘａａのライゲーション部位の側鎖（例えばシステインの側鎖チオール）に水溶性ポリマーＵ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊を付加することを含むライゲーションの図式である。図２Ｃは図２Ａ−２Ｂによるライゲーション及びポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントに存在する（存在しないかも知れない）基の多様性を説明する。
【００８９】
図３Ａ−３Ｂは３本以上の重なり合わないペプチドセグメントの化学的ライゲーションを含む多セグメント結合を実施するためのプロセスの追加的図式である。すなわち少なくとも１本のセグメントが最終的完全長ライゲーション生成物に相当する中心セグメントである。このやり方で製造されたペプチドを用いて例えば図１Ａ−１Ｅ、図２Ａ−２Ｃ、及び図４Ａ−４Ｃに示されるような別のライゲーション反応に関係するペプチドセグメントを合成できる。概して多セグメントライゲーションでは、中心セグメント（類）が保護されたＸａａ基または保護されたＹａａ基を有し、使用するライゲーション化学作用による環化または鎖状化を回避するようになっている。逐次または連続ライゲーションでは、中心セグメントのＸａａ基は保護され（例えばＣｙｓ（Ａｃｍ））、一方Ｙａａ基は保護されない（例えばＹａａ−ＣＯＳＲ、ここでＣＯＳＲはアルファ−カルボキシル　チオエステル）。ここでＹａａは保護されていないＸａａ基を担う第二のペプチドと自由に反応し、その際上記第二のペプチドには遊離Ｙａａ基はない。ライゲーション後、上記保護基を除去してＸａａ基が再生され、次のライゲーション反応に使われる。このプロセスを必要に応じて続け、それによって長いポリペプチド鎖が生成する。４本以上のセグメントからなる最終的ライゲーション産物を生成するための集中的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）化学的結合には、Ｙａａ基の保護が特に有用である。例えば、４本のセグメント結合から生成される（すなわちライゲーション反応は３回行われる）タンパク質を標的とするためには、そのタンパク質の一端に相当する２本のセグメントと、そのタンパク質の他端に相当する２本のセグメントとを次々に対置して平行して結合し、最終的結合反応で前記２端を結合する。このような集中的化学的結合スキームは直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ライゲーション化学を利用することができる。ここで再び、このようなペプチドセグメントに存在し、または存在しないかも知れない基の多様性が図１Ｅ、２Ｃおよび４Ｃに示される。
【００９０】
図４Ａ−４Ｃは、生成した側鎖チオールの天然型（ｎａｔｉｖｅ）化学的ライゲーション及び化学的改変が本発明の原理によっていかに達成されるかを説明する。特に、図４Ａ−４Ｂは、ライゲーション部位（１または複数）に生成したシステイン側鎖チオールの天然型化学的ライゲーション及び化学的改変を利用して、チオアルキル化や、チオエーテル結合を含む化学的に改変された側鎖（ψによって示される）の形成によって“疑似アミノ酸”（ψＸａａと示される）を形成することを説明する。図示されていないもう一つの実施形態において、側鎖チオールは脱硫反応でアラニンに変換できる（リアング（Ｌｉａｎｇ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３巻（４号）、５２６−５３３ページ）。両反応で重要な面は、変換または改変が所望でない他の側鎖チオール類が全て、適切な保護基（ＰＧ）で保護され、または多セグメントライゲーションの際には直交保護基（ＰＧ’）で保護される、その際カルボキシ末端Ｙａａ基を担うセグメントは保護されたアミノ末端Ｘａａ基、すなわちＰＧ−Ｘａａ−ペプチドを含む；これは図４Ｂに例として提供されている。図４Ｃは、図１Ａ−１Ｅ、図２Ａ−２Ｃ、及び図３Ａ−３Ｂと同様に図４Ａ−４Ｂによるライゲーション及びポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントに存在する、または存在しないかも知れない基の多様性を示す。
【００９１】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を設計する際に、標的タンパク質の最初のポリペプチド主鎖のアミノ酸配列は一般的には遺伝子および／またはタンパク質データベースなどのデータベースを含む種々のソースから得るか、または例えば関心とする新規のタンパク質標的のプロテオミック同定によって新たに得る。上に記載したように、このようなデータベースの例には非制限的に、ジーンバンク（ベンソンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６巻（１号）：１−７ページ；米国生物工学情報センター、国内医学ライブラリー、国家保健機構、ベセスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）ＴＩＧＲデータベース（ゲノム研究機関、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）、タンパク質データバンク（ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、ＵＳＡ）、及びＥｘＰＡＳｙ及びスイス−プロテイン　データベース（スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス）がある。公開された特許データベースもこの目的に使用できる。設計のために使用されるポリペプチド主鎖は標的配列の一部（例えばドメイン）または全部（例えばポリペプチド鎖の完成形）をあらわすことができる。
【００９２】
最初のポリペプチド主鎖配列で、与えられた標的合成タンパク質またはその一連の類似体の所望完全長ポリマー修飾ポリペプチド構造が設計される。これは、ポリペプチド主鎖の設計、水溶性ポリマー（類）の構造、及び関心とする与えられた合成タンパク質構成物のためのライゲーション及び水溶性ポリマー付加の戦略を含む。特に、設計の基礎となるポリペプチドアミノ酸配列について、一つ以上のグリコシル化部位の存在、一つ以上の免疫原性部位、または一つ以上のプロテアーゼ感受性部位（すなわちヘリックス構造またはベータ−シート二次構造が実質的にない領域；一般的にはループ及びターン領域）の存在を調べる。その他の部位、例えば凝集部位及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合部位なども調べることができる。この後者は全てのケモカインに共通である。さらに、多くのタンパク質の三次元構造が知られており、設計を助けるために使用することができる。
【００９３】
グリコシル化部位にはＮ−結合及びＯ−結合グリコシル化部位があり、これは一般的にはループ及びターンに見いだされる不規則領域にあらわれるのが普通である。免疫原性部位はタンパク質の表面上にあるターンの親水性部位を含む。関心とするプロテアーゼ感受性部位は、プロテアーゼによって認識され、タンパク質の表面、一般的には不規則領域、にあるアミノ酸配列を含む。多くのタンパク質の凝集及びＧＡＧ部位、及びそれらを確認するための方法は、特にケモカインではよく知られている（“サイトカイン・ハンドブック（Ｔｈｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）”、第３版、トーマス編集、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、１９９８；“サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）”、Ａ．Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ＆Ｒ．Ｔｈｅｒｐｅ編集、アカデミックプレス、１９９８；及び“サイトカイン・リファレンス（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）”１巻、リガンド類、サイトカイン及びその他のホスト防御メディエータ概論、オッペンハイム及びフェルドマン編集、アカデミックプレス、２００１、等を参照されたい）
【００９４】
例として、或るタンパク質標的の免疫原性またはプロテアーゼ安定性を次のようにして減らしたり除去することができる：すなわち一つ以上のポリマーを免疫原性エピトープまたはプロテアーゼ認識配列に部位特異的に結合し、本発明のプロテアーゼ抵抗性または非免疫原性の水溶性ポリマー修飾生物活性タンパク質を生成する。ポリマー結合に適するその他の部位としては、与えられたタンパク質標的のためのアミノおよび／またはカルボキシ末端がある。
【００９５】
グリコシル化部位（天然の部位も、それらを含むように改変された部位も含めて）は、水溶性ポリマーが結合するのに特に適した部位である。これは、本発明の次のような知見に基づく；すなわち合成生物活性タンパク質において、このような部位（グリコシル化部位）の一つ以上を専ら水溶性ポリマーで修飾し、その位置の天然発生性糖タンパク質の１つ以上の炭水化物鎖の有益な生物学的効果にとって代わり、且つ上記効果とそっくりな効果を有する合成生物活性タンパク質を生成することができる。
【００９６】
このような水溶性ポリマーの付加部位はモデリングおよび／または生物学的または化学的分析アプローチによって決定することができる。モデリングは、生物情報的アプローチ、例えば相同性モデリング　ソフトウェア　アルゴリズムまたは、標的タンパク質の所与の核酸またはアミノ酸配列の全体までを比較するプログラム、関心とするポリペプチドの二次元構造情報、及び関心とするタンパク質の三次元構造情報、またはこれらの組み合わせを含む。かなり多数のソフトウェアプログラム及びデータベースが知られており、この目的に使用できる。（ジーンバンク（ベンソンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６巻（１号）：１−７ページ；米国生物工学情報センター、国内医学ライブラリー、国家保健機構、ベセスダ、ＭＤ、ＵＳＡ）ＴＩＧＲデータベース（ゲノム研究機関、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）タンパク質データバンク（ブルックヘヴン・ナショナル・ラボラトリー、ＵＳＡ）、及びＥｘＰＡＳｙ及びスイス−プロテイン　データベース（スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス）等を参照されたい）。これらの方法を統合するソフトウェアプログラムの例は“ＭＡＸＶＥＣＴＯＲ”（オックスフォード・モレキュラー・グループ）であり、これは二次構造（チョウ−ファスマン及びロブソンーガルニエル法）；親水性（ホップ−ウッズ、カイト−ドゥーリトル、ゴルドマン−エンゲルマン−ステイツ（ＧＥＳ）、及びホン−ヘイジュン法）；疎水性（ハウチャー（Ｆａｕｃｈｅｒｅ）−プリスカ、ジャニン、マナヴァラン、スィートアイゼンバーグ法）；抗原性（ホップ−ウッズ、パーカー、プロトゥルージョン−インデックス（ソーントン）、ウェリング法）；表面確率（カルプラス＆シュルツ法）；フレキシビリティ（ジャニン及びエミニ法）；両親媒性（アイゼンバーグ法）；ＰＲＯＳＩＴＥ基礎−サブシーケンス　データベース及びユーザー決定サブシーケンス；及びプロテアーゼ部位及びタンパク質分解性消化予測を含む。
【００９７】
例えば、或るタンパク質標的の一カ所以上のグリコシル化部位の存在を走査する際に、固有のアミノ酸配列の一部または全てについてＮ−結合グリコシル化部位（普通はループまたはターンのＡｓｎ−Ｘａａ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ配列に起こる）及びＯ−結合部位（普通はループまたはターンのＳｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＰｒｏまたはＴｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｒｏ配列に起こる）を調査研究するのが一般的である。種々のアルゴリズム及びモデリングプログラムがこの目的に適する（例えばＥｘＰＡＳｙ及びスイス−プロテイン　データベース（スイス生物情報機関、ジュネーブ、スイス）；グプタ（Ｇｕｐｔａ）ら、糖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９）９巻（１０号）：１００９−１０２２ページ；“ＤＩＣＴＹＯＧＬＹＣ”、ハンセンら、生化学ジャーナル（１９９５）３０８巻：８０１−８１３ページ；“Ｏ−ＧＬＹＣＢＡＳＥ”ハンセンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７）２５巻：２７８−２８２ページ；“ＮＥＴＯＧＬＹＸ”ハンセンら、糖結合物雑誌（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．）（１９９８）１５巻：１１５−１３０ページを参照されたい）。
【００９８】
タンパク質の免疫原性部位を予測するために下記のアプローチを使用できる。二次構造予測を上記タンパク質配列で行う。チョウ−ファスマン　パラメータがこの目的のために特に有用である（チョウら、最新酵素学（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（１９７８）４７巻：４５−１４８ページ；マクリン（Ｍａｃｌｉｎ）ら、“知識基礎神経網目構造に関する精細アルゴリズム：タンパク質折りたたみに関するチョウ−ファスマン−アルゴリズムの改良”、論文９１−２ページ、ウィスコンシン大学コンピューター科学部、マジソン、１９９１；及びキアン（Ｑｉａｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２０２巻：８６５−８８４ページ；“ＰＥＰＥＰＬＯＴ”プログラム、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ社）。不規則領域及び特にターンが確認される。上記タンパク質配列の疎水性も、一般的には標準法（例えばファウチャー−プリスクまたはホップ−ウッズ疎水性推定法またはＢｕｌｌ−Ｂｒｅｅｓｅ）にしたがって６残基のランニング平均値を用いて走査された。より親水性の領域は、特にターンにあるものを注意して確認する。これと関連して、Ｎ−結合部位及びＯ−結合部位を含むグリコシル化部位が確認される。上記タンパク質の最も親水性の部位は、もしそれがターンにあり、予想ではグリコシル化されていないならば、免疫原性の可能性が高く、したがってポリマー修飾部位として役立つ。同じ基礎的ルールがより親水性の小さい領域に上首尾に適用でき、ポリマー修飾の二次的部位であることが確認される。
【００９９】
本発明の合成生物活性タンパク質の作製においてポリマーを結合する特異的部位を確認するために生物学的及び化学的分析を使ってもよい。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質の設計及び合成の基礎として使用される分離された糖タンパク質を酵素消化にかけ、例えばＨＰＬＣペプチドマッピング及び質量分析等によって分析し、Ｏ−及びＮ−結合グリコシル化部位を実験的に確認することができる。免疫原性部位、またはプロテアーゼ感受性部位を確認するために、そのような領域を含むタンパク質分子の表面上のより高度に不規則な“ループ”領域を、多数の生物学または化学的方法で確認できる。例えば、本発明の合成生物活性タンパク質のデザイン及び合成の基礎として用いられる分離されたタンパク質を、種々のプロテアーゼによる制限されたタンパク質分解性消化にかけ、その後生成したペプチドフラグメントの質量分析を行い、標準的プロトコルにしたがってプロテアーゼの作用を最も受けやすい部位の地図を作成することができる（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ　ＪＥ）、ドュン（Ｄｕｎｎ　ＢＭ）、プロー（Ｐｌｏｅｇｈ　ＨＬ）、スパイヘル（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ　ＤＷ）、ウィングフィールド（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ　ＰＴ）編集、タンパク質構造の近代的実験計画（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）ＩＩ巻、ニューヨーク：ジョンウィリー＆ソンズ、１９９７；チャイト（Ｃｈａｉｔ，ＢＴ）、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（１９９４）２巻：４６５−４６７ページ；クリワキら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ（１９９７）７７７巻：２３−３０ページ；ヒレンカンプ（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ）ら、Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ．（１９９１）６３巻：Ａ１１９３−１２０１ページ；フェン（Ｆｅｎｎ）ら、Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒ　Ｒｅｖ（１９９０）９巻：３７−７０ページ；及びシウザク（Ｓｉｕｚｄａｋ　Ｇ．）生体工学のための質量分析、サンジエゴ、アカデミック・プレス、１９９６、等を参照されたい）。このような目的のために多くのプロテアーゼが一般的に使用されている（Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ　ＷＨ、Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９５）２６２巻：３３１−３４６ページ；キャリー（Ｃａｒｒｅｙ，ＥＡ）：クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）編集。“タンパク質構造、実際的アプローチ”ニューヨーク：ＩＲＬプレス（１９８９）１１７−１４４ページ；及びコリガン、ドュン、プロー、スパイヘル、ウィングフィールド編集、タンパク質構造の近代的実験計画、ＩＩ巻、ニューヨーク：ジョンウィリー＆ソンズ、１９９７）。折りたたまれたタンパク質のポリペプチド鎖の表面ループ領域は通常、タンパク質分解性消化の受けやすさの増加と関連している。限定的“ランダム”化学的改変後、消化し、質量分析によりペプチドマッピングを行うという類似のアプローチを用いて未知三次元構造のタンパク質の露出表面領域を確認することもできる。
【０１００】
免疫原性部位、プロテアーゼ感受性部位またはその他のポリマー修飾に適した部位を確認するために、アラニン走査を行って、水溶性ポリマー結合部位として適するポリペプチド主鎖の特異的残基を確認することもできる。これは生物学的活性のために必要な不変残基を確認するために特に有用であり、水溶性ポリマーの結合部位が標的分子の免疫原性またはプロテアーゼ感受性部位に位置する際に特に役立つ。アラニン走査は、上記のようなその他のタンパク質分析ツールと組み合わせて用いたときに特に有用である。その他のアプローチは、各分子のポリペプチド鎖における異なる部位に、修飾する水溶性ポリマー部分を有する関心とする合成タンパク質のライブラリーを系統的に作成することである。ライブラリーのポリマー修飾ポリペプチド鎖を折りたたんだ後、官能基の選択／アッセイを行い、例えば折りたたまれた分子を折りたたまれない分子から、または受容体結合分子を非結合分子から分離することができる。その後、ポリマー修飾部位の位置を上記官能性分子で決定できる。このようなアプローチは、ポリマー修飾の非妨害部位の確認を容易にする“タンパク質シグナチャー分析”法の原理を利用することができる。（Ｍｕｉｒら、化学＆生物学（１９９６）３巻：８１７−８２５ページ）。
【０１０１】
設計と関連して、ポリペプチド主鎖を合成するために使用するペプチドまたはポリペプチドセグメントを構成する。これは種々のポリペプチド主鎖セグメントを組立てるために選択されるライゲーションの化学、与えられた標的タンパク質のために選択されるポリマー結合化学、及び特定のポリマー結合部位に基づいて選択される適切なライゲーション部位の選択を含む。天然型化学的ライゲーションを行う際には、システインライゲーション部位は、標的ポリペプチド主鎖アミノ酸配列を走査して適切な天然発生システイン残基を探すというやり方で決定できる。この明細書に記載される“拡張天然型化学的ライゲーション”を用いる際には、標的ポリペプチド主鎖アミノ酸配列を走査して、Ｘａａ−Ｇｌｙのような強力な結合を可能とする適切な天然発生性ライゲーション部位連結を探し出すことによって、ライゲーション部位を選択できる。拡張天然型化学的ライゲーションはシステイン残基におけるライゲーションには限らないから、かなり多数の残基がライゲーション部位連結部として役立つ。若干の例では、天然型及び拡張天然型化学的結合の組合わせが設計の一部分となり得る。
【０１０２】
好ましい実施形態において、天然型化学的結合を用いて完全長ポリペプチド鎖の一部または全てを形成する。合成生物活性タンパク質の基礎となる天然発生性タンパク質に存在するシステインは化学的結合部位として使用できる。しかし、好ましいライゲーション連結部に適切なシステインがない場合は、その場所の非システイン−アミノ酸をシステインで置換し、その部位で天然型化学的結合が行われるようにすることができる。所望ならば、新たに導入したシステインを、ここに記載するようにその部位のオリジナルアミノ酸に対応する擬似アミノ酸に変換できる。或いは、上記システインがポリマー修飾のための部位に挿入されたとき、修飾が望まれない標的ポリペプチド中の他の全てのシステインが保護されている限り、上記システインの側鎖チオールは、チオール反応性水溶性ポリマー構成物の結合のために利用できる。
【０１０３】
また別の好ましい実施形態において、ここに記載される拡張天然型化学的結合を利用して、完全長ポリペプチドの一部または全てを生成することができる。この方法では、Ｎ−末端Ｎα−置換された２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸を使用できる。このような残基（ライゲーションのために使用したペプチドまたはポリペプチドのＮ−末端に存在する）を好都合に使用して、ここに記載の拡張天然型化学的ライゲーション法により、そのポリペプチドをＣ−末端α−カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドに結合することができる。
【０１０４】
一般的にはペプチドは、標準自動ペプチド合成器を用いる段階的標準的Ｂｏｃおよび／またはＦｍｏｃ固相ペプチド合成法で、または標準的プロトコルにしたがって手作業で合成され、または商業的売り手に注文し、そこから購入することができる。（“合成ペプチド、ユーザーのためのガイド”グラント（Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ）編　Ｗ．Ｈ．フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ＮＹ，１９９２；“ペプチド合成の原理、第２版”、Ｍ．ボダンスキー＆Ａ．ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９３；及び“保護基”、コシエンスキー（Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｚｋｙ）編集、ジョージ・シーム出版、シュトゥットガルト、ドイツ、１９９４；“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、実際的アプローチ”チャン（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ）及びホワイト（Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ）、オックスフォード大学出版、２０００）。チオエステル依存性ライゲーション、例えば天然型化学的ライゲーション等、に利用されるペプチドに関して言えば、それらは標準的プロトコルによって作ることもできる。（ドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；カン（Ｃａｎｎｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６巻：１２１７−１２２０ページ；ケントら、ＷＯ９６／３４８７８；ケントら、ＷＯ９８／２８４３４；インゲニト（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ）ら、ＪＡＣＳ（１９９９）４９巻：１１３６９−１１３７４ページ；ハッケングら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６巻：１００６８−１００７３ページ；アミアト（Ａｍｉａｔｏ）ら、同上、等を参照されたい）。
【０１０５】
水溶性ポリマー類のライゲーション及び部位特異的結合のためには、化学的直交戦略がペプチド合成に利用され（図１−４及び実施例参照）、不都合な結合を起こす副反応を回避する。例えば、ライゲーションデザイン及びポリマー結合法によって、種々の直交合成法が実施できる。特に、結合すべき水溶性ポリマーの性質、そして特に、それをポリペプチドに連結する官能基が、例えば本発明の好ましいグリコミメティックポリマーに関して以下に述べるように考慮される。
【０１０６】
詳細に述べれば、上記水溶性ポリマーは、ライゲーションのために使われる標的ペプチド、完全長物質、または折りたたまれたポリペプチドにある特異的官能基と選択的に反応する特異的官能基Ｕを含むように作られる。化学合成を用いる際には上記ペプチドはユーザーが決めた正確な部位に相互に反応する化学選択的基を含むように作られる。本発明のこの観点は、ペプチド合成（保護基戦略）及び化学的ライゲーション（部分的保護基または非保護基戦略）の原理を具体化する。保護基戦略では、水溶性ポリマー上の所望官能基を除く全ての潜在的反応性官能基、及び標的分子上に存在する相互に反応する官能基を適切な保護基でブロックする。多くの保護基が知られており、この目的に適する（例えば“有機合成における保護基”第３版、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ）及びウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）編集、ジョンウイリー＆ソンズ社、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ　カタログ２０００；“合成ペプチド、ユーザーガイド”グラント編集、フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ＮＹ、１９９２；“組合わせ＆固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”ベネット、クリステンセン、ハマカー、ピーターソン、ローズ及びサネイ編集、最新化学工学（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）１９９８；“ペプチド合成の原理、第２版”ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９３；“ペプチド合成の実際、第２版”ボダンスキー及びボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９４；及び“保護基”コシエンスキー編集、ジョージ・シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、１９９４を参照されたい）。
【０１０７】
こうして水溶性ポリマーは上記のもののような広範囲の官能基を担うように作ることができる。部分保護または非保護基戦略では、ポリマー上の官能基及び標的ペプチドまたはポリペプチド上に存在する相互に反応する官能基は化学選択的反応対合を利用する；その際その他の官能基がこの反応系に存在するが、反応はしない。これにはアミン捕獲戦略（例えばヘミアミン形成、イミン形成、及びマイケル付加によるライゲーション）、チオール捕獲戦略（例えばメルカプチド形成、ジスルフィド交換によるライゲーション）、天然型化学的ライゲーション戦略（例えば、システインまたはチオールを巻き込むチオエステル交換によるライゲーションには側鎖アミノ酸誘導体が含まれる）、及び直交ライゲーションカップリング戦略（例えばチアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換、及びアミド形成によるライゲーション）にしたがう基が含まれる（例えばコルタート（Ｃｏｌｔａｒｔ，Ｄ．Ｍ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６巻：３４４９−３４９１ページ）。
【０１０８】
この実施形態のために好ましい化学選択的Ｕ基は、次のような水相容性ライゲーション化学に用いられる特異的官能基の残基を含む：天然型化学的ライゲーション（ドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；ケント、ら、ＷＯ９８／３４８７８）、拡張一般的化学的ライゲーション（ケントら、ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成化学的ライゲーション（ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０−３３ページ）、チオエステル形成ライゲーション（シュネルツァら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６巻：２２１−２２５ページ）、チオエーテル形成ライゲーション（エングルブレセン（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ）ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６巻（４８号）：８８７１−８８７４ページ）、ヒドラゾン形成ライゲーション（ガートナー（Ｇａｅｒｔｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５巻（４号）：３３３−３３８ページ）及びチアゾリジン形成ライゲーション及びオキサゾリジン形成ライゲーション（ツァング（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５巻（１６号）：９１８４−９１８９ページ；タム（Ｔａｍ）ら、ＷＯ９５／００８４６）、またはその他の方法（ヤン（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．）及びドーソン（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．）“脱硫を伴う天然型化学的ライゲーションによる、システイン残基を含まぬペプチド及びタンパク質の合成”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３巻、５２６−５３３ページ（参考として本明細書に組みこまれる）；ギーゼルナン（Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ）ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３巻（９号）：１３３１−１３３４ページ；サキソン（Ｓａｘｏｎ，Ｅ．）ら、アミノ結合の化学選択的合成のための“トレースレス”シュタウディンガーライゲーション、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２巻、２１４１−２１４３ページ）。
【０１０９】
上記の種々の結合化学において、水溶性ポリマーと、標的ペプチドまたはポリペプチドとの間に形成される結合は、カルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等から選択される結合の残基を含むことができる。
【０１１０】
例えば図１−４に示したようなペプチドライゲーション段階は固相または液相ライゲーション戦略を用いることができる。図８は、水溶性ポリマーをライゲーションに使用できるペプチドセグメントに正確に結合して、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を産生するもう一つの経路である。第一段階は固相ペプチド合成（“ＳＰＰＳ”）（例えばＦｍｏｃまたはＢｏｃＳＰＰＳ）を用い、その際ポリマー結合の標的となるアミノ酸側鎖は直交保護基で保護される（例えばＦｍｏｃＳＰＰＳを使用する場合はポリマー結合部位を保護するためにＢｏｃ基を用い、或いはＢｏｃＳＰＰＳを使用する場合は、直交保護基としてＦｍｏｃを使用することができる）。ペプチド合成後、直交保護基は選択的に除去され、残りのペプチドは保護されたままになる。この結果、次の段階である固相ポリマー合成のための単一の結合部位が与えられる。ひとたび直交保護基が除去されると、そのポリマー鎖は中間体として結合する。より好ましくは、上記ポリマー鎖は図６Ａ−６Ｄに示されるプロセスを使ってポリマー合成の連続ラウンドによって形成される。単一のポリマー結合部位が示されているが、一つより多い結合部位が与えられることもある。
【０１１１】
上記のように、化学的ライゲーションは第一化学的成分と第二化学的成分との間の選択的共有結合の形成を含む。第一及び第二成分に存在する唯一の相互反応性の官能基を利用してライゲーション反応を化学選択的にすることができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの化学的ライゲーションは相溶性があり、唯一の相互反応性のＣ−末端及びＮ−末端アミノ酸残基を担うペプチドまたはポリペプチドセグメントの化学選択的反応を含む。この目的のために数種の異なる化学が用いられている：その例としては天然型化学的ライゲーション（ドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；ケントらＷＯ９６／３４８７８；ケントら、ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成化学的ライゲーション（ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６巻：３０−３４ページ）、チオエステル形成ライゲーション（シュネルツァーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６巻：２２１−２２５ページ）、チオエーテル形成ライゲーション（エングルブレセンら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６巻（４８号）：８８７１−８８７４ページ）、ヒドラゾン形成ライゲーション（ガートナーら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５巻（４号）：３３３−３３８ページ）及びチアゾリジン形成ライゲーション及びオキサゾリジン形成ライゲーション（ツァングら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５巻（１６号）：９１８４−９１８９ページ；タム（Ｔａｍ）ら、ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５，５８９，３５６号）；ギーゼルマンら、セレノシステイン依存性天然型化学的ライゲーション（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００１）３巻（９号）：１３３１−１３３４ページ）；及びシュタウジンガー　アミド形成化学的ライゲーション（サキソン（Ｓａｘｏｎ）ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２０００）２巻：２１４１−２１４３ページ）がある。こうして、このような目的に沿う非保護ペプチドセグメントのライゲーションにはあらゆる化学選択的反応化学が適用できることが理解される。
【０１１２】
与えられたライゲーション化学のための反応条件は、ライゲーションのために使用されるペプチドまたはポリペプチドセグメント類の所望の相互作用を維持するように選択される。例えばｐＨ及び温度、ライゲーション標識の水溶性、第一セグメント　対　第二セグメントの比、水分含有量、及び反応混合物の組成を変化させてライゲーションを最適にすることができる。ライゲーションセグメントを種々の程度に可溶性にするための試薬類を添加または排除して、所望ライゲーション反応の特異性及び速度をコントロールすることができる、すなわちペプチドまたはポリペプチドセグメントの溶解性を操作することによって反応基の露出または提示をコントロールすることができる。反応条件は、所望化学選択的反応産物を一つ以上の内部および／または外部対照と比較して分析試験することによって容易に決定できる。
【０１１３】
ライゲーションがＮ−末端システイン残基を有するポリペプチドの連結を含む場合、天然型化学的ライゲーションの方法を使用するのが好ましい（ドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；ケントら、ＷＯ９６／３４８７８；ケントら、ＷＯ９８／２８４３４）。この方法はライゲーション部位に天然型アミド結合を形成する確実な方法であることが証明された。天然型化学的ライゲーションは、Ｃ−末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第一ペプチドまたはポリペプチドセグメントと、Ｎ−末端システイン残基を有する第二のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応を含む。チオール交換反応は最初のチオエステル結合中間体を与える。これは自発的に再配列して、そのライゲーション部位に天然型アミド結合を与え、一方システイン側鎖チオールを再生する。多くの場合、天然タンパク質の配列は、Ｎ−末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成され、天然型化学的ライゲーション反応に用いられるように、適切に配置されたシステイン残基を含んでなる。その他の場合にはペプチド合成は、この目的のためにシステイン残基をポリペプチドに導入するように行われる。こうしてその標準形において、天然型化学的ライゲーションは標的ポリペプチド配列中のシステイン残基におけるチオエステル仲介性化学選択的反応を含む；ペプチド結合がライゲーション部位に形成され、Ｃｙｓの側鎖は天然型に再生される。
【０１１４】
別法として、本発明のタンパク質は“擬似天然型化学的ライゲーション”または“拡張天然型化学的ライゲーション”の使用によって合成できる。擬似天然型化学的ライゲーションはタンパク質合成に用いられるペプチド中のあらかじめ選択した位置に非天然発生性擬似アミノ酸残基を使用することを含む（例えば図４を参照）。このような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造と、合成しようとするタンパク質のこのようにあらかじめ選択された位置に天然に見いだされるアミノ酸の構造の両方を模するものである。このため、擬似天然型化学的ライゲーションは、天然型化学的ライゲーションのライゲーション部位に生成するシステイン側鎖のチオアルキル化に向けられる。好ましい観点は、システインライゲーション部位のチオアルキル化であり、その際少なくとも一つのペプチドが、適切な保護基で保護されたチオール側鎖を有する天然のシステインを含む。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態において、システイン基のチオール部分は所望の側鎖に改変される、例えばリボソーム特異的アミノ酸、そのようなアミノ酸の類似体、または非リボソーム特異的アミノ酸の側鎖に改変される。ここに使用する用語、リボソーム特異的アミノ酸（ｒｉｂｏｓｏｎａｌｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）は、タンパク質の翻訳プロセスにおいてリボソームによって認識され、リボソームで産生されるタンパク質に組み込まれ得るアミノ酸である。システイン側鎖チオール部分の化学的改変について記述した文献はかなり多く発表されている（“タンパク質科学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）”Ｊｏｈｎ　Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、ジョンウィリー＆ソンズ、ＮＹ（２０００）、等を参照されたい）。カイザー（Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．）は、システイン残基の側鎖を、天然発生性アミノ酸側鎖の化学特性を模するように変換することを記述している（カイザーら“酵素活性部位の化学的突然変異”Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４年１１月２日；２２６巻（４６７４）：５０５−１１ページ）。さらに、システイン側鎖を利用して標識をペプチドまたはタンパク質に導入することが記載されている。システイン側鎖の改変は、“タンパク質の結合及び架橋の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）”、ウォング（Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ）（１９９１、ＣＲＣプレス）；タンパク質の化学的改変（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｇａｒｙ　Ｅ．Ｍｅａｎｓら（１９７１、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）；タンパク質の化学的改変：すぐれた方法及び分析操作（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、グレイザー（Ｇｌａｚｅｒ，Ａ．Ｎ．）ら（１９７５、エルスヴィール）；タンパク質改変のための化学的試薬（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＬ　Ｌｕｎｄｂｌａｄ（１９９１、ＣＲＣプレス）で研究されている。タム（Ｔａｍ）ら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９８）、４６巻：３１９−３２７ページ）はｎｏｎ−ｃｙｓ　天然型化学的ライゲーションのためにホモシステイン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ）を使用し、その後メチルｐ−ニトロベンゼンスルホネート（メチル化剤）を使ってチオアルキル化することによってホモシステイン側鎖を天然メチオニン側鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３）に変換することを開示している。本発明も、ホモシステイン類を擬似アミノ酸に、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に、変換するために使用できる。しかし、ここに記載されるシステインの変換と同様に、本発明によると、変換したくないシステインを少なくとも一つは含むペプチドでは、ジスルフィド対に含まれる天然システインの破壊を避けるために保護基を使う必要がある。適切な保護基を以下に記載する。
【０１１６】
擬似天然型化学的ライゲーションの方法は或る種のリボソーム特異的アミノ酸の側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン及びプロリンの側鎖等）を模倣しやすくはしないが、アラニンの側鎖は脱硫反応によって形成することができる（リアング及びドーソン、“脱硫を伴う天然型化学的ライゲーションによる、システイン残基を含まぬペプチド及びタンパク質の合成”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３巻、５２６−５３３ページ；これは参考としてここに組み込まれる）、この方法を使って多くのリボソーム特異的アミノ酸またはコードされていないアミノ酸を模する側鎖を形成することができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション法により産生されるアミノ酸はチオエーテル結合を含み、ベーター分岐をもたない（すなわちそれら全てはベータ位置にメチル基を含む、すなわちａａ−ＣＨ２−Ｓ−）。このため、ベータ幾何学制約及びそれに付随する制約を受けずに、ペンダント側鎖構造を有するベータ−分岐アミノ酸、イソロイシン及びトレオニン、の擬似アミノ酸変形物（ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を作ることができる。
【０１１７】
本発明の方法を用いて、リボソーム特異的アミノ酸と同じ長さ、またはそのような長さより長いかより短い長さのアミノ酸側鎖を形成できることは重要である。側鎖長さをこのように変化させて、三次元コンホメーションを安定化（または不安定化）させ、タンパク質安定性を高めることができる（または上記タンパク質がコンホメーションを変え、それによって天然発生タンパク質が受け取るものとは異なる範囲の物質、インヒビター、受容体、リガンド等を受け取る能力を高めることができる）。例えば、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＯＯＨはＣｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨを与える（このような“擬似グルタミン酸”は１個の付加的側鎖原子、すなわち−Ｓ−基を有する；或いは、もしアスパラギン酸の代わりに使用するならば、それは２個の付加的側鎖原子、すなわち−ＣＨ２−Ｓ−基を有する）。その他の側鎖は同数の原子を側鎖に有するが、チオエーテル結合（−Ｓ−）を含むことが異なる。例えばＣｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｂｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＰＧの後にＰＧを除去するとＣｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２が得られる。生成した構造は側鎖に付加的原子をもたないが、１個の−ＣＨ２−基が−Ｓ−で置換されている。メチオニンはここではもう一つの例である、Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｉ−ＣＨ２−ＣＨ３はＣｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３を与える（Ｍｅｔ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３の天然メチオニシン構造に対し）；こうしてチオエーテルが再配置される。アルギニンでも：Ｃｙｓ−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｂｒ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））はＣｙｓ−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））を与える。特に擬似リシンを構成する際には、反応性アミノ基を保護して不都合な副反応を避けるのが好ましい。チオアルキル化反応を行った後に、上記保護基を除去することができる。
【０１１８】
概して、天然に発生するタンパク質をできるだけそっくり模することが所望である場合、上記タンパク質のそのような位置に通常存在するリボソーム特異的アミノ酸の側鎖の長さと同じ長さの側鎖を有する擬似アミノ酸分子を使うことが最も好ましい；上記リボソーム特異的アミノ酸の側鎖の長さより１原子長い側鎖長さの擬似アミノ酸酸分子を使うことはあまり好ましくなく、上記リボソーム特異的アミノ酸の側鎖より２原子長い側鎖長さをもつ擬似アミノ酸分子を使うことはさらに好ましくない。その上、遺伝子的変化が機能を破壊しそうもない位置または関連タンパク質類にその位置のアミノ酸類が保存されている、というような位置にあるシステイン　ライゲーション部位を選択するのが好ましい。このような部位はアラニン走査、相同体モデリング、及びその他の方法によって確認できる。
【０１１９】
擬似天然型化学的ライゲーションにおいて、天然型化学的ライゲーションと同様に、アミノ末端システイン残基を含むペプチドをカルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合する。その後システインのチオール側鎖を式Ｒａａ−Ｘであらわされる化合物と反応させる；式中、Ｘは有効な離脱基であり、Ｒａａはリボソーム特異的アミノ酸または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模する構造をもった基である。
【０１２０】
重要なのは、擬似天然型化学的ライゲーションの諸反応がシステイン側鎖の天然Ｌ−立体配置か、またはＤ−立体配置かどちらかで行われることである。Ｄ−立体配置の使用はそのライゲーション部位にプロテアーゼ抵抗性を与える、そのためタンパク質分解に対する安定性の増加が望まれる場合は好ましい。しかしＤ−システインを使用するとその部位の主鎖構造は変化する。プロテアーゼ抵抗性に加えて、このような変化は生物活性を変えるために好ましい。しかし、生物活性に与える影響を最小にするためには、Ｄ−システインを高フレキシビリティ部位、例えば生成した折りたたまれた分子の表面の、上記分子の無秩序末端に位置する不規則なループのような無秩序領域等に配置することが好ましい。擬似天然型化学的ライゲーションの諸反応を用いて大きい帯電した側鎖（例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＧｌｕの側鎖）を合成分子の表面に配置することが好ましい。
【０１２１】
適切な有効な離脱基、Ｘ、の例としてはハロゲン、特にヨウ素および臭素がある。Ｒａａ基の例としてはＰＯ４、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ２、グアニジニウム、アミン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、イミダゾール、アルキル化イミダゾール、インドール、またはアルキル化インドール基がある。
【０１２２】
使用すべきＲａａの選択は、特定の位置に存在することが望まれるアミノ酸側鎖に依存する。例えば、下記のアミノ酸配列を有する所望ポリペプチドまたはタンパク質：
ａａＮＨ２−Ｑ−ａａｘ−ａａｙ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
（上記式中、Ｑ及びＷは任意の存在または不在の各々付加的アミノ酸残基を示し、ａａｘ及びａａｙは内部隣接残基（それぞれ側鎖ｘ及びｙを有する）を示し、ａａＮＨ２及びａａＣＯＯＨはポリペプチドまたはタンパク質のアミノ（Ｎ−）末端残基及びカルボキシ（Ｃ−）末端残基をそれぞれ示す）
は次の２つのペプチドフラグメントを調製することによって合成できる：
ａａＮＨ２−Ｑ−ＣＯＳＲ及びＣｙｓ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
上記式中、Ｃｙｓはａａｙをシステインで置換したことをあらわし、Ｒはチオエステル基と適合するあらゆる基、非制限的にアリール、ベンジル、及びアルキル基等である。Ｒの例には、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル　チオエステル類、ベンジルエステル類、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンエステル等がある（ドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；カン（Ｃａｎｎｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６巻：１２１７−１２２０ページ；ケントら、ＷＯ９６／３４８７８；ケントら、ＷＯ９８／２８４３４；インゲニト（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ）ら、ＪＡＣＳ（１９９９）１２１巻（４９号）：１１３６９−１１３７４ページ；ハッケング（Ｈａｃｋｅｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６巻：１００６８−１００７３ページ）。その他の例には、ジチオトレイトール、またはアルキルまたはアリールチオエステル類がある；これらはよく知られているインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）−仲介性生物学的方法によって合成できる（チョング（Ｃｈｏｎｇ）ら、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２巻：２７７−２８１ページ）；チョングら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６巻：５１０９−５１１５ページ；エバンス（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７巻：２２５６−２２６４ページ；及びコットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６巻（９号）：２４７−２５６ページを参照されたい）；その後それらのフラグメントを一緒に連結して、
ａａＮＨ２−Ｑ−ａａｘ−Ｃｙｓ−Ｗ−ａａＣＯＯＨ
を形成する。
【０１２３】
連結したフラグメントをその後Ｒｙ−Ｘと反応させる、この式中、Ｒｙはｙ側鎖の構造を模する側鎖基である。上記反応は、システインのチオール基を“擬似−ｙ”側鎖に変換するのに十分な条件下で行われる。例えば、もしもＲａａがＣＨ２−ＣＯＯＨまたは（ＣＨ２）２−ＣＯＯＨであるように選択されるならば、上記反応はアスパラギン酸（“擬似−Ａｓｐ”）またはグルタミン酸（“擬似−Ｇｌｕ”）の構造及び機能を模するアミノ酸残基の形成に導く。上記の説明に照らして、２つより多いペプチドフラグメントを使用してより複雑な合成を行えることは理解される。
【０１２４】
このアプローチの重要な特徴は、反応するセグメントにおいて改変が望まれないシステイン残基は例えばＣｙｓ（Ａｃｍ）のように保護された側鎖となり、ライゲーション部位（１カ所または複数）のもの以外のＣｙｓ残基の化学的改変が回避されること、または反応するセグメントにおけるその他の全てのＣｙｓは、ライゲーション後の化学的改変によって同一の“擬似アミノ酸”を同時に形成するようになることである。
【０１２５】
ここに使用する記号ψはベンジル基をあらわす；ＩＭはイミダゾール基をあらわし、ＩＮはインドール基を示し；ＰＧは保護基を示す。本発明による擬似アミノ酸残基を含むペプチドの合成に使用できるＲａａ側鎖基をまとめる（この場合Ｘはハロゲン（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ；Ｉ及びＢｒが最も好ましく、ψ付加のためにはＦが好ましい））：
【０１２６】
塩基性アミノ酸：
Ｌｙｓ（余分の原子は含まない）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＰＧ、その後保護基の除去により、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２
を得る。
Ａｒｇ（余分の原子は含まない）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））は、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ２）（＝ＮＨ２＋））を与える。
Ｈｉｓ（余分の原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＩＭは
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＩＭを与える。
酸性アミノ酸：
Ａｓｐ（余分の原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＯＨは、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨを与える。
Ｇｌｕ（余分の原子１個）
−ＣＨ２ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＯＨは、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＯＨを与える。
【０１２７】
非帯電−極性アミノ酸：
Ｔｙｒ（余分の原子０または１個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｆ−ψ−ｐＯＨは−ＣＨ２−Ｓ−ψ−ｐＯＨ（余分原子０、同じ幾何学的構造）を与える
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ２−ψ−ｐＯＨはＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ψ−ｐＯＨ（余分原子１個）を与える。
Ｇｌｕ（余分原子１個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）は、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）を与える。
Ａｓｎ（余分原子２個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）は、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ２）を与える。
Ｓｅｒ（余分原子２または３個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２ＯＨは、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＯＨ（余分原子２個）を与える。
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨは、
−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２ＯＨ（余分原子３個）を与える。
Ｔｈｒ（余分原子２または３個、ベータ−分岐はない）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ３）（Ｏ−ＰＧ））、その後ＰＧを除去すると、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＯＨ））（余分原子２個）が生成する。
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（Ｏ−ＰＧ））、その後ＰＧを除去すると、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＯＨ））（余分原子３個）が生成する。
【０１２８】
無極性アミノ酸
Ｌｅｕ（余分原子１または２個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））は、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））（余分原子１個）を与え、
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））は、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（（ＣＨ３）（ＣＨ３））（余分原子１個）を与える。
Ｉｌｅ（余分原子２または３個、ベータ−分岐はない）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３は、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３（余分原子２個）を与える。
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｘ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３は、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ３（余分原子３個）を与える。
Ｐｈｅ（余分原子１または２個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｆ−ψは、−ＣＨ２−Ｓ−ψ（余分原子１個）を与える。
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ２−ψは、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ψ（余分原子２個）を与える。
Ｍｅｔ（余分原子０）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｉ−ＣＨ２−ＣＨ３は、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３を与える。
Ｔｒｐ（余分原子１個）
−ＣＨ２−ＳＨ　＋　Ｆ−ＩＮは、−ＣＨ２−Ｓ−ＩＮを与える。
【０１２９】
しかし、ライゲーションのために使用するポリペプチドの与えられたＮ−末端にシステインまたはホモシステイン残基が導入するようにタンパク質配列を改変することが不都合であるか、または好ましくない場合、またはライゲーション部位に擬似アミノ酸を使用する場合には、Ｎ−末端がＮ−置換−、より好ましくはＮα置換−２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含むように改変されたポリペプチドを使用して天然型化学的ライゲーションの方法を広げ、それによって天然型化学的ライゲーションの原理をシステイン残基のないポリペプチドに適用することができる（米国特許出願第６０／２３１，３３９号を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】
“拡張天然型化学的ライゲーション”の方法は、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第一成分を酸安定性Ｎ−置換、及び好ましくはＮα−置換、２または３炭素鎖アミノアルキルまたはαアリール　チオールを含む第二成分と結合することを含む。第一成分のカルボキシチオエステルと第二成分のＮ−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールとの間の化学選択的反応がチオエステル結合中間体を経て進み、最初のライゲーション産物になる。より詳細に述べれば、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間に起こるチオール交換は、チオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成し、それは自発的再配列後に、アミノアルキルチオール成分が式Ｉを有するかまたは式ＩＩを有するかによって、それぞれ５員環または６員環を経てアミド結合第一ライゲーション産物を生成する：
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−Ｊ２　　　　　Ｉ
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ−Ｊ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＩ
上記式中、Ｊ１は任意に保護されたアミノ酸側鎖を一つ以上有するペプチドまたはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化した表面、リンカーまたは検出可能マーカー、またはその他の、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する化学的成分である。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は独立的にＨまたはＣ１に結合する電子供与基である；この際、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一つが、Ｃ１に結合する電子供与基を含むことが条件である。Ｊ２は任意に保護されたアミノ酸側鎖を一つ以上有するペプチドまたはポリペプチド、またはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に官能化された表面、リンカーまたは検出可能のマーカー；またはその他の、化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合する化学的成分である。
【０１３１】
ライゲーション部位のＮ−置換−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−（Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］はペプチド適合性条件下で、生成物にダメージを与えることなく容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式ＩＩＩの最終的ライゲーション産物を生成する：
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２　　　　　ＩＩＩ
上記式中、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は上に定義せるものである。
【０１３２】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３基は、ペプチド適合性切断条件下でＮ−Ｃ１結合の切断を容易にするように選択される。例えば、特にＣ１に結合していれば、電子供与基を使用してＣ１に共鳴安定化カチオンを形成することができる。それは切断を容易にする。上記化学的ライゲーション反応は好ましくは賦形剤としてチオール触媒を含み、水性または混合有機−水性条件下、ほぼ中性のｐＨ条件で行われる。第一および第二成分の化学的ライゲーションは５または６員環を経て進み、その環は自発的再配列を受けてＮ−置換アミド結合ライゲーション産物を与える。第一および第二成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ−置換アミド結合ライゲーション産物は式ＩＶまたはＶを有する：
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＨＳ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＶ
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＨＳ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２　　　　　Ｖ
上記式中、Ｊ１、Ｊ２及びＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＺ２は上に定義せるものである。
【０１３３】
Ｎ−置換アミド結合ライゲーション産物の結合せる電子供与基Ｒ１、Ｒ２またはＲ３は、Ｎ−Ｃ１結合の切断を容易にし、Ｎ−置換アミド結合ライゲーション産物からの２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を容易にする。Ｎのアルキルまたはアリールチオ鎖をペプチド適合性切断条件下で除去すると、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。第一および第二成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション産物は次の式を有する：
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＮαＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２　　　　　Ｘ
【０１３４】
式Ｉの典型的Ｒ１置換基を表Ｉに示す。
表Ｉ
【表１】
2004508338.tif 000004
【０１３５】
式ＩＩの典型的Ｒ１、Ｒ２及びＲ３置換基を表ＩＩに示す。
表ＩＩ
【表２】
2004508338.tif 000005
【０１３６】
Ｎ−置換２炭素鎖化合物の場合のように、ライゲーション後にＮα−Ｃ１結合を確実に切断するためのＣ１炭素との電子結合を維持するためには、ベンジル及びピコリル電子供与置換基Ｒ１’、Ｒ３’及びＲ５’をオルトまたはパラ位に置くことが必要である。しかし、Ｒ２及びＲ３がＣ２及びＣ３と共にベンジル基を形成する場合、Ｒ１’及びＲ３’の少なくとも一つが強力な電子供与基を含み、その際Ｒ１’またはＲ３’は、メトキシ（−ＯＣＨ３）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びチオメチル（−ＳＣＨ３）から選択される。Ｒ２及びＲ３が水素であるＮ−置換３炭素鎖チオールでは、Ｒ１はベンジルまたはピコリル基を含み、そこではＲ１’、Ｒ３’及びＲ５’は強力または中程度の電子供与基、またはその組合わせのいずれかを含む。Ｎ−置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、強力な電子供与基が３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感度を高めて、ライゲーション後に切り離される。このようにして特定の電子供与基またはその組合わせを選択できる。
【０１３７】
Ｎ−置換２炭素鎖化合物と同様に、本発明のＮ−置換３炭素鎖化合物は、関心とする構成物における置換のために使用される際、Ｒ１’及びＲ５’の位置におけるＲ１の置換基としてチオールを含む。ここでも、電子供与チオール基はＣ１に結合し、これらの位置におけるその導入によって上記化合物は６員環形成ライゲーションのための２つのルートをもつことができる。それはα−カルボキシチオエステルと反応するために使用できるチオール類の局所的濃度を高め、ライゲーションを改善し得る構造的制約に関する別の立体配座（コンホメーション）を提供する。
【０１３８】
本発明のＮ−末端Ｎ−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、本明細書の例えばスキームＩ及びスキームＩＩに記載されるように、当業者に公知の標準的有機化学技術によって行うことができる。例えば“最新有機化学、反応、作用機序及び構造（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）”第４版、マーチ（Ｊ．Ｍａｒｃｈ）（編集）、ジョンウィリー＆ソンズ、ニューヨーク、ＮＹ、１９９２；“包括的有機変換、官能基生成の指針（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｒｏｕｐ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）”、ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）（編集）、ＶＣＨ出版、ニューヨーク、ＮＹ、１９８９、を参照されたい。それらは溶液中で、またはポリマー支持合成によって、またはこれらの組合わせによって合成される。好ましいアプローチはＮα保護−Ｎアルキル化Ｓ−保護アミノアルキル−またはアリール−チオールアミノ酸前駆体を使用する。合成のために使用される試薬類はかなり多くの商業的ソースから得ることができる。出発原料成分及び種々の中間体、例えば個々のアミノ酸誘導体等、がその後の使用のために保存されたり、キットで提供されることもよく理解されている。
【０１３９】
本発明のＮ−末端Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオアミノ酸を形成する際には保護基を使用する方法が使われる。種々の合成法に一般的に用いられる好ましい保護基（ＰＧ）は固相ペプチド合成（“ＳＰＰＳ”）に適合するものである。若干の例では異なる条件で除去できる直交保護基を利用することも必要である。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適する（例えば“有機合成における保護基”、第３版、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ）及びウッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）編集、ジョンウィリー＆ソンズ社、１９９９；ノバビオケム（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）カタログ２０００；“合成ペプチド、ユーザーの指針（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ）”、グラント編集、フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ＮＹ、１９９２；“組合わせ＆固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”ベネット（Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ）、クリステンセン（Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、ハマカ（Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ）、ピーターソン（Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、ローズ（Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ）、サニー（Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ）編集、最新化学工学（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）１９９８；“ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”第２版、Ｍ．ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９３；“ペプチド合成の実際”第２版、ボダンスキー＆ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９４；“保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓ）”、コシェンスキー（Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ）編集、ジョージ・シーム出版、シュッッツガルト、ドイツ、１９９４）。例としてはベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｓ、Ｔｒｔ、Ｎｐｓ、ＦｍｏｃＣｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ；ＮＳＣ；ＭＳＣ；Ｄｄｅ等がある。硫黄部分では、適切な保護基の例として、非制限的にベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル、ＡＣＭ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル、及びフェナンシルがある。
【０１４０】
より詳細に述べれば、Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類はスキームＩ（Ｎα−置換前駆体の固相製法）、スキームＩＩ（Ｎα−置換前駆体の液相製法）にしたがって合成できる。スキームＩでは、Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類は固相で、ポリマー置換有機合成標準法を使って直接組立てることができ、一方、スキームＩＩのＮα−保護、Ｎ−アルキル化、Ｓ−保護、アミノアルキルまたはアリールチオアミノ酸前駆体は標準カップリングプロトコルを用いて樹脂に結合させる。ラセミまたはジアステレオマー製品が生成する場合、拡張天然型化学的ライゲーションに使用するためにはこれらを標準法によって分離しなければならない。
【０１４１】
スキームＩ
ＥＣＬ補助誘導体化分子の固相合成
【化２】
2004508338.tif 000006
【０１４２】
スキームＩＩ
【化３】
2004508338.tif 000007
【０１４３】
α−カルボキシチオエステルは、実施例を含む本明細書に記載のものなど、当業者に公知の標準法にしたがって、化学的または生物学的方法によって合成できる。化学的合成では、α−カルボキシチオエステル　ペプチド類は溶液中で、またはチオエステル生成樹脂から合成できる；これらの方法はよく知られている（例えばドーソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６巻：７７６−７７９ページ；カンら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６巻：１２１７−１２２０；ケントら、ＷＯ９６／３４８７８；ケントら、ＷＯ９８／２８４３４；インゲニトら、ＪＡＣＳ（１９９９）４９巻：１１３６９−１１３７４ページ；ハッケングら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６巻：１００６８−１００７３ページ；アミアトら、同上、等を参照されたい）。例えば化学的に合成されたチオエステル　ペプチドを、対応するペプチドα−チオ酸から作ることができ、上記ペプチドα−チオ酸はこれはこれでチオエステル樹脂上で、または溶液中で合成できる。ただし樹脂法がより好ましい。ペプチド−α−チオ酸は対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニル　チオエステル、対応するベンジルエステル、または種々のアルキルチオエステルのいずれかに変換できる。これらのチオエステルの全てはライゲーション反応のための満足すべき離脱基となり、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル　チオエステルは対応するベンジルチオエステルより若干速い反応速度を示し、ベンジルチオエステルはこれはこれでアルキルチオエステルより反応性である。もう一つの例として、トリチル結合メルカプトプロピオン酸ロイシン　チオエステル生成樹脂を利用してＣ−末端チオエステルを構成することができる（ハッケングら、同上）。Ｃ−末端チオエステルは、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉（ｓａｆｅｔｙ−ｃａｔｃｈ）リンカーを使用し、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルで活性化後、適切なチオールで置換することによっても合成できる（インゲニトら、同上；ベルトッジら）。
【０１４４】
Ｃ−末端α−カルボキシチオエステル　ペプチドはインテイン依存性生物学的方法等の生物学的プロセスを用いて合成することもできる（チョング（Ｃｈｏｎｇ）ら、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２巻：２７７−２８１ページ；チョングら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６巻：５１０９−５１１５ページ；エバンスら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７巻：２２５６−２２６４ページ；コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６巻（９号）：２４７−２５６ページを参照されたい）。例えば、インテイン発現系（アフィニティ−タグのような標識のあるもの、またはないもの）を利用して、“インテイン”タンパク質スプライシング要素の誘導性自己分解活性を活用し、Ｃ−末端ジチオスレイトール（ＤＴＴ）エステルペプチドまたはポリペプチドを生成する。特に、インテインはＤＴＴ、ｂ−メルカプトエタノールまたはシステイン等のチオールの存在下で特異的自己分解を受け、その結果Ｃ−末端チオエステルを担うペプチドセグメントが生成する。チョングら（１９９７）同上；チョングら（１９９８）同上；エバンスら、同上；及びコットンら、同上、等を参照されたい。しかし、組換え的に生成されたセグメントを使用する際には、最終的構成物の化学的に合成される部分はポリマー修飾を含むのが普通である。
【０１４５】
本発明のＮ−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分と第一のカルボキシチオエステル成分とのライゲーションは、ライゲーション部位にＮ−置換アミド結合を有するライゲーション産物を生成する。上記反応のライゲーション条件は、上記チオエステルと、Ｎ−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオ部分との選択的反応性を保持するように選択される。好ましい実施形態において、ライゲーション反応はｐＨ６−８を有する緩衝液中で行われる。ｐＨ範囲６．５−７．５がより好ましい。緩衝溶液は水性、有機性またはそれらの混合物でよい。ライゲーション反応は１種類以上の触媒および／または１種類以上の還元剤、脂質、界面活性剤、その他の変性剤または可溶化試薬等も含むことができる。好ましい触媒の例はチオール及びホスフィン含有部分、例えばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰ及びアルキルホスフィン等である。変性剤および／または可溶化剤の例にはグアニジニウム、水または有機溶媒（ＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰ等）中の尿素、水と、またはグアニジニウムおよび尿素水溶液と混合したアセトニトリル等がある。ライゲーション反応速度を調節するために温度を利用することもできる。それは普通は５℃ないし５５℃であり、より好ましい温度は１５℃ないし４０℃である。一例として、ライゲーション反応は６Ｍのグアニジニウム中２％チオフェノールを含むｐＨ６．８ないし７．８の反応系でうまく進む。
【０１４６】
Ｎ−置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール類では、ライゲーションは、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間に起きるチオール交換から始まる。この交換はチオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成する、それは５員環中間体を経て再配列した後、ライゲーション部位に除去可能のＮ−置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２の第一ライゲーション産物を生成する；ここで置換基は上に定義せるものである。ライゲーション部位のＮ−置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］はペプチド適合条件下で容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終的ライゲーション産物が生成する。
【０１４７】
Ｎ−置換３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールでは、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換はチオエステル結合中間体ライゲーション産物を生成し、それは６員環中間体を経て自発的に再配列した後、ライゲーション部位に除去可能のＮ−置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２の第一ライゲーション産物を生成する。ライゲーション部位のＮ−置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］はペプチド適合性条件下で容易に除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終的ライゲーション産物を生成する。
【０１４８】
Ｎ−置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、Ｎ−Ｃ１結合の切断を容易にするために好ましくは酸性条件において行われ、ライゲーション部位に安定化された未置換のアミド結合を与える。“ペプチド−適合切断条件”とは、ペプチドと適合すし、アルキルまたはアリールチオール部分のライゲーション産物からの切断に適した物理的−化学的条件を意味する。ペプチド適合切断条件は概して、使用するα−置換化合物によって決まり、日常的及び公知のアプローチによって容易に推定される（例えば“有機合成における保護基”第３版、グリーン及びウッツ編集、ジョンウィリー＆ソンズ社、１９９９；ノバビオケム・カタログ２０００；“合成ペプチド、ユーザーの指針”、グラント編集、フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ＮＹ、１９９２；“組合わせ＆固相有機化学の最新化学工学ハンドブック”、ベネット、クリステンセン、ハマカ、ピーターソン、ローズ、サニー編集、“最新化学工学”１９９８；“ペプチド合成の原理”第２版、ボダンスキー（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）編集、スプリンガー出版、１９９３；“ペプチド合成の実際（Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”第２版、ボダンスキー＆ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９４；“保護基”、コシェンスキー編集、ジョージ　シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、１９９４、を参照されたい）。
【０１４９】
例えば、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３置換基がメトキシ、ヒドロキシル、チオール、またはチオメチル、メチル等を含む場合、除去のためのより普遍的方法には、ペプチド合成化学に典型的な酸性切断条件がある。これには、還元試薬および／または掃去剤系を含む、または含まない強酸性条件または水性酸性条件下におけるＮ−Ｃ１結合の切断がある（例えば、無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸（ＴＭＳＦＡ）等の酸類）。より特異的酸性切断系を選択してＮα−Ｃ１結合を最適に切断して或る与えられた構成物のためにアリールまたはアルキルチオール部分を切り離すことができる。このような条件は公知であり、ペプチドの一体性の維持と矛盾しない。特にトリプトファンがペプチドまたはポリペプチド配列に存在する際には、チオール掃去剤が含まれ、上記トリプトファンの側鎖と、遊離したアリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避する。チオール掃去剤の例には、エタンジオール、システイン、ベータ−メルカプトエタノール及びチオクレゾールが含まれる。
【０１５０】
その他の特殊な切断条件としては、ピコリル基が置換基である場合の、光−または還元性切断条件がある。一例として、Ｒ１、またはＲ２及びＲ３置換基がピコリル部分を含む場合、標準プロトコルにしたがって光分解（例えば紫外線）、亜鉛／酢酸または電気分解還元を使用して切断することができる。Ｎ−置換２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にチオメタンを含む場合、水銀またはＨＦ切断を利用することができる。第一または第二ライゲーション成分がその他の保護基を含む場合、上記切断系は固体支持体からの同時切断に、および／または脱保護試薬として利用される。
【０１５１】
本発明の一実施形態においては、Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールをペプチド合成段階に使用して（特に自動ペプチド合成及び直交−及びコンバージェント−ライゲーション戦略において）、合成生物活性タンパク質を生成するための拡張化学的ライゲーションの基質として使用できるＮ−末端で誘導体化されたポリペプチドを適切に得ることができる。このような化合物は、完全に保護され、一部分保護され、または全く保護されていない、酸安定性の、式（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２または（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２であらわされるＮα−置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む。これらは以下の表ＩＩＩ及び表ＩＶに示される。特に、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の一つ以上がＣ１に結合した電子供与基を構成し、それは、Ｎα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールがＮα−置換アミドアルキルまたはアリールチオールに変換した後、ペプチド適合性切断条件のもとでＮα−Ｃ１結合を切断しやすくする共鳴安定化カチオンをＣ１に形成することができる。ＰＧ１及びＰＧ２は個々に、または組合わせで存在するか、または存在しない保護基であり、同じでも異なっていてもよい；ここでＺ２は化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合するいかなる化学的成分でもよく、Ｊ２は化学的ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションと適合するいかなる化学的成分でもよい。ＰＧ１（またはＸ１）はアミンを保護する基である。ＰＧ２（またはＸ２）はチオールを保護する基である。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適する（例えば“有機合成における保護基”第３版、グリーン及びウッツ編集、ジョンウィリー＆ソンズ社、１９９９；ノバビオケム・カタログ２０００；“合成ペプチド、ユーザーの指針”、グラント編集、フリーマン＆カンパニー、ニューヨーク、ＮＹ、１９９２；“組合わせ＆固相有機化学の最新化学工学ハンドブック（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｔｅｃｈ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”ベネット、クリステンセン、ハマカ、ピーターソン、ローズ、サニー編集、“最新化学工学”１９９８；“ペプチド合成の原理”第２版、ボダンスキー（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ）編集、スプリンガー出版、１９９３；“ペプチド合成の実際”第２版、ボダンスキー＆ボダンスキー編集、スプリンガー出版、１９９４；“保護基”、コシェンスキー編集、ジョージ　シーム出版、シュトゥッツガルト、ドイツ、１９９４、を参照されたい）。
【０１５２】
表ＩＩＩ
【表３】
2004508338.tif 000008
【０１５３】
ＰＧ１及びＸ１の好ましい保護基の例としては、非制限的に、［Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣ１−Ｚ（Ｂｒ−またはＣ１−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロオキシ−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニルエチルオキシ−カルボニル）］が含まれる。好ましい保護基ＰＧ１及びＸ１は“有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、グリーン及びウッツ、第三版、ウィリー−インターサイエンス（１９９９）から選択されるものであり、最も好ましいのはＦｍｏｃ及びＮｓｃである。ＰＧ２の好ましい保護基の例には、非制限的に［Ａｃｍ（アセタミドメチル）、ＭｅｏＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、Ｍｅｂ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４ピリジル）、Ｆｍ（９−フルオレニルメチル）、ｔｂｕｔ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセタミドメチル）］がある。好ましい保護基ＰＧ２及びＸ２は“有機合成における保護基”、グリーン及びウッツ、第三版、ウィリー−インターサイエンス（１９９９）から選択されるものであり、最も好ましいのはＡｃｍ、Ｍｏｂ、Ｍｅｂ、ピコリルである。
【０１５４】
表ＩＶ
【表４】
2004508338.tif 000009
【０１５５】
本発明のＮα−置換２または３鎖アルキルまたはアリールチオール類の保護形は上記スキームＩ及びＩＩのように作られる。
【０１５６】
本発明の化合物はハロゲン仲介性アミノアルキル化、還元アミノ化などの種々の手段のいずれかによって、また、固相アミノ酸合成法に適合するＮα−保護、Ｎ−アルキル化、Ｓ−保護、アミノアルキル−またはアリール−チオール　アミノ酸前駆体の形成によって合成される。所望の場合、生成したラセミ体またはジアステレオマーの分離を標準法で行い、満足できるキラル純度を有する化合物を与えることができる。
【０１５７】
ＩＩＩ．本発明の好ましい水溶性ポリマー及びその製法
ここに使用する用語“分子的不均質性（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）”はタンパク質製造における各タンパク質に付加するポリマー分子の数に変動があることを意味する。用語“分子的多様性”は（ａ）ポリマーによって修飾されるタンパク質の部位（１カ所または複数箇所）のバリエーション、（ｂ）タンパク質調製物における同じタンパク質の異なる位置またはタンパク質調製物の異なるタンパク質の同じ位置のポリマー付加物の長さのバリエーション、または（ｃ）タンパク質調製物における同じタンパク質の異なる部位または異なるタンパク質の同じ部位のポリマー付加物の枝分かれの程度および／または性質のバリエーションを示すものとする。ここに使用する用語“分子的に均質”とは、タンパク質分子の全てが同一位置に（同じ）アミノ酸配列及び同じポリマー修飾を含むタンパク質の調製物を言う。２個以上の“分子的均質”なタンパク質調製物の混合物は本明細書では“分子的に定義された（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ）”調製物と言う。
【０１５８】
本発明のこの面によると、上で確認されたポリマー不均質性や多様性や不適切性の問題の解決は、ポリペプチド（正確な長さ、便利な合成）及び“ｐＰＥＧ”の両方の利点を組合わせた有する新しい生体適合性ポリマー群、すなわちフレキシブル、両親媒性、非免疫原性で、プロテアーゼの作用を受けにくいポリマーの製造を含む（ローズ（Ｒｏｓｅ，Ｋ．）ら、米国特許出願第０９／３７９，２９７号、参考としてここに組込まれる）。この生体適合性ポリマーの新しい群は下記の式を有する：
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−
ｎは整数、好ましくは１−１００、より好ましくは２−１００であり、式中、Ｘ及びＹはアミド結合によって結合した正確な構造の生体適合性反復要素である。好ましくは、Ｘ及びＹは、反応性官能基のない二価有機ラジカルであるか、または存在せず、同じであっても異なっていてもよく、各反復単位（ｎ）で独立的に変化し得る。ｎ＝２であるとき、ＸまたはＹの少なくとも一つが置換、未置換、枝分かれ及び直鎖脂肪族及び芳香族基からなる群から選択される。より好ましくは、ＸまたはＹの一つがフェニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、及びこれらの組合わせからなる群から選択される。
【０１５９】
特に好ましいｐＰＥＧ部分は下記の式を有する：
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２ＮＨ｝ｎ−
上記式中、ｎは好ましくは１−１００の間に、より好ましくは２−１００の間で変動する；または
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−｝ｎ−
上記式中、ｎは好ましくは１−５０の間に、より好ましくは２−５０の間に変動する。
【０１６０】
このようなｐＰＥＧ部分は種々の方法のいずれによっても合成できる。しかしこのような部分は重合法よりも諸単位の固相段階的鎖組立法を用いて製造するのが好ましい。このような組立法を利用すれば、或る調製物の上記部分に、それらの長さ、それらのＸ及びＹ置換基の性質、以上の分岐点の位置（もしあれば）、及び枝分かれ鎖の長さ、Ｘ及びＹ置換基、及び以上の位置に関して一定の均質構造をもたせることができる。
【０１６１】
このような部分は次のように段階的に合成するのが好ましい：
（ａ）式Ｚ−Ｑ−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基を、式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨを有する二酸の誘導体のモル過剰でアシル化する。上記式中、ＺはＨ２Ｎ−またはＨＯ−である；Ｑはリンカーまたは標的分子である；支持体は固相、基質または表面である；
（ｂ）段階（ａ）の生成物の遊離カルボキシル基を活性化する；
（ｃ）段階（ｂ）の生成物を、式ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を有するジアミンのモル過剰でアミノリシスにかける；
（ｄ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨ及びＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を用いて任意に段階（ａ）−（ｃ）を繰り返す；上記式中、Ｘ及びＹは二価の有機ラジカルまたは存在せず、同じでも異なっていてもよく、上記任意に反復する単位の各々で独立的に変化することができ、それまでのアシル化及びアミノリシス段階のいずれかに使用されたＸ及びＹ置換基と同じでも異なっていてもよい。
【０１６２】
好ましい実施形態において、上記反復単位の６量体（６−ｍｅｒ）、１２量体、１８量体及び３２量体が使用される。所望の際には上記反復単位を、例えばリジンのアミノ基と組み合わせて、分岐ｐＰＥＧ構造を形成することができる。ｐＰＥＧを本発明の合成タンパク質に、チオエーテル、オキシム、及びアミド結合形成等、種々の化学的方法によって結合することができる。
一実施形態において、単位の固相段階的鎖組立は次の諸段階を含んでなる：
段階１：保護−または未保護の二酸を樹脂上のアミノに結合し、結合部位にアミド結合を生成する（ここでＰＧは使用する二酸によって存在するかまたは存在しない保護基である）：
ＰＧ−ＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨ　＋　ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−樹脂
段階２：樹脂上の保護基（ＰＧ）（もしあれば）を除去する
ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
段階３：保護または未保護ジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングし、結合部位にアミド結合を生成する（この際ＰＧは使用したジアミノに依って、存在するかまたは存在しない）
ＰＧ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ　＋　ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
段階４：樹脂上の保護基（ＰＧ）（もしあれば）を除去する
−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
段階５：段階１−４を“ｎ”回繰り返して“ｎ”単位を付加し、その後樹脂から切断する
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−
【０１６３】
前に述べたように、直鎖及び枝分かれｐＰＥＧ構成物は本発明の合成生物活性分子に結合する好ましい水溶性ポリマーである。使用するｐＰＥＧは生理的条件下で帯電した、または中性のペンダント基を担い、使用するｐＰＥＧ構造によって、結合化学、長さ、枝分かれ及び溶解度に変化が起こり得る。上に述べたように、本発明の好ましいｐＰＥＧは反復単位−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−を有する水溶性ポリアミドを含み、この式中、Ｘ及びＹの一つまたは両方が水溶性反復単位を含み、最も好ましくは“ＰＥＧ”ベースの反復単位を含む。オリゴマー類は、アミノ樹脂、ＮＨ２−樹脂、及び対称性ジアミン、ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２、の場合について下に示すように、簡単な二段階固相法を用いて原理的には操作できる：
カルボニルジイミダゾールで活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２でアミノリシス→ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
（ここではこれらの二段階をｎ回繰り返し、反復単位−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−のオリゴマーを与える）；しかしこのアプローチはあまり好ましくない。それは、上記２段階の収量が、大過剰の試薬で長時間反応させた場合でさえ、室温では定量的にはいかないからである。よって、以下にアミノ樹脂、ＮＨ２樹脂、の場合について示すように、三段階固相法を使用してポリアミドを生成することが好ましい。試薬ＨＯ２Ｃ−Ｘ−ＣＯ２Ｈ及びＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２は、異性体生成物を避けるために左右対称でなければならない。
二酸ＨＯ２Ｃ−Ｘ−ＣＯ２Ｈ→ＨＯ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
カルボニルジイミダゾールで活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＯＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２でアミノリシス→ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
これらの三段階法を逐次ｎ回繰り返し、反復単位−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−を有するポリアミドを生成する。上記ポリマーは正確な数のモノマー単位を含み、Ｘ及びＹは各段階で独立的に変化し得る、そして末端基は随意に選択できる。例えばアシル化段階に無水琥珀酸（“Ｓｕｃｃ”）を使用し、アミノリシス段階に４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（“ＥＤＡ”または“ＴＴＤ”とも言われる）を使用することによって、Ｘが−ＣＨ２ＣＨ２−で、Ｙが−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−、反復単位が−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−である“ＰＥＧ”ベースのポリアミドが生成する。上記の方法が保護基をもたない二価の試薬を含むという事実にもかかわらず、標準的市販のペプチド合成樹脂を使用する際に、以下に記載される枝分かれ構成物を形成するための枝分かれＬｙｓコアの場合を除いて、架橋は問題とならない（ローズら（米国特許出願第０９／３７９，２９７号）；及びローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）。
【０１６４】
例えば、枝分かれｐＰＥＧ構成物は、ローズら（米国特許出願第０９／３７９，２９７号）及びローズ及びヴィザヴォナ（Ｖｉｚｚａｖｏｎａ，Ｊ）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）に記載されたのと同様なやり方で形成できる。こうして枝分かれｐＰＥＧ構成物はリジン枝分かれコアのような枝分かれコアをもつように作ることができる。このコアはオキシム　リンカーによって、−（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ）ｎ−のような好ましい水溶性ポリアミドに結合する。例えば、オキシム結合は上記ポリアミドの他端のＬｙｓ側鎖上のアミノオキシアセチル基と、リジン・コア、例えばテトラマー・コア（Ｏ＝ＣＨＣＯ）４Ｌｙｓ２Ｌｙｓ−上のグリオキシリル基との間に容易に形成できる。こうして各リジン枝分かれ点から離れたオキシム　リンカーが構造−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ２ＯＮ＝ＣＨＣＯ−）アミド−として形成される。また別の構成法は、好ましくはモノ保護ジアミンの使用及びポリアミドのカップリング後の脱保護によって、オキシム結合を上記ポリアミドとそのポリアミドの遊離ペンダント基との間に置き、下記によって示される四価の枝分かれ構成物を生成することができる：
［Ｏ＝ＣＨＣＯ−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−［ＯＣＨ２ＣＨ２］３−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）ｎ］４Ｌｙｓ２Ｌｙｓ−
【０１６５】
オキシムの化学は二量体および四量体の枝分かれ構成物の合成に利用できるだけでなく、八量体枝分かれ構成物を組立てるためにも適する（ローズ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６巻：３０ページ；ローズら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）７巻：５５２ページ）。このようなｐＰＥＧポリアミドを使用する際にその他の化学作用をこのような目的に使用することはもちろん可能である（図１５等を参照されたい）。さらに、ポリアミド生成を、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学作用を含むペプチド合成のための合成スキームに組み込んでもよい。しかしこのようなスキームを研究する際には、上記アミノリシス段階でＦｍｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ化学を利用する場合はインドールのホルミル保護を除去することを心に留めておかなければならない。
【０１６６】
よって、このようなｐＰＥＧは、適した結合（例えばアミド、チオエーテル、オキシム等）によって直鎖水溶性ポリアミド（−（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）ｎ等）に結合する種々の枝分かれコア（例えばリジン枝分かれコア等）をもつように作ることができる；この場合各直鎖水溶性ポリアミドの遊離端を各々所望のペンダント基（例えばカルボン酸塩、アミノ、アミド等）で冠して所望電荷を与える。さらに、本発明の直鎖及び枝分かれｐＰＥＧｓは、相互に反応する特異的官能基を一つ以上担持する合成タンパク質に結合するための特異的官能基を含むように作ることができ、上記ｐＰＥＧｓのペンダント基は非抗原性であることが好ましい（図１５等を参照されたい）。
【０１６７】
特に好ましい実施の形態において、本発明は下記の式であらわされる分子的に均質なグリコミメティック水溶性ポリマーに向けられる：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊
上記式中、Ｕは特異的官能基の残基であり、Ｂは、同じでも異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよい３本以上のアームを有する枝分かれコアである。“ポリマー”は式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎであらわされ、約５，０００Ｄａより大きい分子量を有するポリアミドであり、ここでＸ及びＹは同じでも異なっていてもよく枝分かれでも直鎖でもよい二価ラジカルであり、ｎは２ないし５０の整数であり、ここでＸ及びＹのどちらかまたは両方が、直鎖でも枝分かれでもよい実質的に非抗原性の水溶性反復単位を含み、Ｊ＊は、陰−、陽−及び中性電荷からなる群から選択される生理的条件のもとで正味の電荷を有する実質的に非抗原性のペンダント基の残基であり、ｓ１、ｓ２及びｓ３は同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー基である。このようなポリマー類には、米国特許出願第６０／２３６，３７７号に記載されるもの等がある。上記特許出願は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。式Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−“ポリマー”−ｓ３−Ｊ＊は、式Ｕ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊によってあらわすこともできる。ここではスペーサーまたはリンカー基ｓ１、ｓ２、ｓ３はあってもなくともよい。
【０１６８】
本発明の好ましいグリコミメティックポリマーの形成法は図５−７に説明される。図５Ａ−５Ｂは、本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊の枝分かれコア（Ｂ）及び特異的化学選択的官能基（Ｕ）を生成するための固相法を描いているものである。上記プロセスは示されるような固相法が好ましいとはいえ、溶液中で行ってもよい。特に、図５Ａは反応基
【化４】
2004508338.tif 000010
をもった直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体部分を示し、このような構成物の基礎的幾何学構造は結合
【化５】
2004508338.tif 000011
で連結した点によって描かれる；この基礎的幾何学構造は使用した化学的結合または基のタイプを制限するものではなく、本発明のＵ−Ｂ部分を形成するのに適した構造及び化学的合成点を形成するための幾何学の相対的点を単に説明するためのものである。直交的に保護されているＵ−Ｂ前駆体は、Ｕ−Ｂ前駆体に共有結合できる活性化後の適切な切断可能リンカー及び同時反応基
【化６】
2004508338.tif 000012
を含むポリマー支持体／樹脂に結合される：
【化７】
2004508338.tif 000013
【０１６９】
この系はポリマー支持有機化学の原理を応用する。カップリング後、上記枝分かれコアを図のように合成し（第一の枝分かれ点だけが示され、その他の枝分かれ点は存在してもしなくともよい）、実質的に非抗原性、水溶性、直鎖ポリマー等、所望の“ポリマー”成分がその後に付加するために適切な枝分かれコアを形成する。合成の始めに直交保護Ｕ−Ｂ前駆体の一部分として作るか、または枝分かれコアＢの合成中または合成後に作ることができるＵ基も示される。“ポリマー”成分の付加は樹脂上で、すなわち分離する前に、実施できるが、Ｕ−Ｂ部分をポリマー支持体／樹脂から分離し、精製できるＵ−Ｂコアを作製し、その後“ポリマー”成分を付加するのが好ましい経路である。
【０１７０】
図示されるように、コア基Ｂのペンダント枝分かれ点は官能基（Ｆｕｎｃ）を含むように組み立てられる。上記官能基は同じでも異なっていてもよく、可逆的に保護されていても（ＰＧ、ＰＧ’またはＰＧ’’）保護されていなくてもよい。各場合に、上記“ポリマー”成分の付加の最終的段階はペンダント枝分かれ点における官能基（Ｆｕｎｃ）の生成、及び基Ｕの生成を含む（図７参照）。図５Ｂは、保護されたＵ−Ｂ前駆体を、リンカーを担持するポリマー支持体と組合わせて使う別法を示す。リンカーが分裂すると所望の保護されたまたは未保護のＵ基が生成する。図５Ｂは、あらかじめ組み立てた枝分かれコアＢをポリマー支持体に結合させ、Ｕ基−生成樹脂を使用してＵ−Ｂ部分を作り、その後“ポリマー”成分を付加することも描いている。
【０１７１】
図６Ａ−６Ｄは、本発明の好ましい、実質的に非抗原性の水溶性ポリアミド、“ポリマー”−Ｊ＊成分、を形成し、その後Ｕ−Ｂコアに結合させる固相法を描いている。好ましい方法である固相法が説明されているけれども、液相法を応用して同じ最終結果を得ることができる。図６Ａ及び６Ｂでは、固相有機化学の原理を用いて二酸及びジアミノ単位をカップリングさせる。式−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｘ−ＣＯ］−のポリアミド構造を有する最終的分離生成物中の基Ｘ及びＹの追加的多様性のために、任意に、保護されたアミノ−Ｘ’−酸及び／またはアミノ−Ｙ’−酸　単位を挿入することができる。図６ＡはＮ−からＣ−末端方向への合成を描き、図６ＢはＣ−からＮ−末端方向への合成を描く。図６Ｃ及び６Ｄにおいて、保護されたアミノ−Ｘ’−酸及び／またはアミノ−Ｙ’−酸　単位を固相有機化学の原理を用いてカップリングする。図６ＣはＮ−からＣ−末端方向への合成を描き、一方図６ＤはＣ−からＮ−末端方向への合成を描く。図６Ａ−６Ｄからわかるように、最終的ポリアミド生成物の性質は正確にコントロールされ、それは合成のために行うサイクル数に依存する。その上、ペンダント基Ｊ＊は、実質的にユーザーが決めた仕様によって作ることができる。単分散系反復単位Ｘ、Ｙ、Ｘ’及びＹ’を使用する場合、最終的ポリアミド生成物の正確な分子構造を正確にコントロールすることができる。
【０１７２】
Ｕ−Ｂ成分を“ポリマー”−Ｊ＊成分にカップリングし、式Ｕ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊を有する本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成する好ましいプロセスが図７に描かれる。図示されるように、種々の保護基が提供され、所与の構成物の最終的使用目的によって自由に選択できる。固相アプローチ及び液相アプローチを含む所望Ｕ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊構成物を製造する異なる経路も図示される。
【０１７３】
上記のように、好ましい水溶性反復単位はポリアルキレン　オキシド、ポリアミド　アルキレンオキシド、またはそれらの誘導体を含む。最も好ましい水溶性反復単位は式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−を有するエチレンオキシドを含む。このような水溶性反復単位の数は著しく変動し得るが、このような単位の好ましい数は２ないし５００、２ないし４００、２ないし３００、２ないし２００、２ないし１００、２ないし５０であり、より好ましい数は２ないし３２、最も好ましいのは３ないし８である。より好ましい実施形態の例は、Ｘ及びＹの一つまたは両方が：−（（ＣＨ２）ｎ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−または−（ＣＨ２）ｎ１−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ２−（ＣＨ２）ｎ１−）−から選択され、上記式中、ｎ１は１ないし６、１ないし５、１ないし４、最も好ましくは１ないし３であり、ｎ２は２ないし５０、２ないし２５、２ないし１５、２ないし１０、２ないし８であり、最も好ましくは２ないし５である。非常に好ましい実施形態の例は、Ｘが−（ＣＨ２−ＣＨ２）−で、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）−であるものである。さらにより好ましいのは、各ｎが整数である単分散系組成物である。非常に好ましい実施形態において、Ｘは−（ＣＨ２−ＣＨ２）−であり、Ｙが−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−、または−（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２）ｎ−であり、ｎが１２ないし３６である。
【０１７４】
特に“ポリマー”は、水溶性ポリマーがエチレンオキシド反復単位のようなポリアルキレンオキシド反復単位を有するポリマー鎖を含む際には、各鎖が約１５００ないし約４２，０００Ｄａの分子量を有するのが好ましく、約２，０００ないし約２０，０００Ｄａの分子量を有するのが最も好ましい。
【０１７５】
好ましいＵ基は化学的ライゲーションのできる部分を含む。好ましいポリマー類は枝分かれしており、基Ｂが３本以上のアームを含む。好ましい成分Ｊ＊は、生理的条件下でイオン化可能である基を含み、最も好ましいのは、負に帯電しているものである。Ｕ及びＪのどちらかまたは両方が、構成物の一体性を破壊することなく除去できる保護基を含むことができる。
【０１７６】
好ましいスペーサーまたはリンカーは、水溶性ポリマーに使われる１個以上の反復単位を含む直鎖または枝分かれ部分、ジアミノおよび／または二酸単位、天然または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、並びにアルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシ等の脂肪族部分を含む。これらは１８個までの炭素原子、またはさらに他のポリマー鎖を含むのが好ましい。
【０１７７】
上記のように、成分Ｕは標的分子、例えばペプチドまたはポリペプチド、または関心とするその他の表面に結合し得る、または結合する官能基の残基である。Ｕが標的分子に結合するための官能基の残基である場合、Ｕは求核性基または求電子基を含み、上記標的分子は相互に反応する求電子基または求核性基をそれぞれ含む。
【０１７８】
多くのそのような相互反応性官能基は公知であり、ペプチド及びポリペプチド、または誘導側鎖官能基に共通の側鎖官能基と結合できる（ザリプスキーら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９５）、６巻：１５０−１６５ページ；“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの展望”メアーズ（Ｃ．Ｆ．Ｍｅａｒｅｓ）編集、ＡＣＳ、１９９３；“タンパク質結合及び架橋の化学”、ウォング編集、ＣＲＣ出版社（１９９３））。官能基の例には、アミノ基と反応できる基、例えば（ａ）ｐ−ニトロフェニルまたはスクシンイミジルのようなカルボネート；（ｂ）カルボニルイミダゾール；（ｃ）アズラクトン；（ｄ）環状イミドチオン類；及び（ｅ）イソシアネート類またはイソチオシアネート類等がある。カルボン酸基及び反応性カルボニル基と反応できる官能基の例には（ａ）第一アミン；または（ｂ）ヒドラジン及びヒドラジド官能基、例えばアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼート、アミノオキシ等がある。メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応できる官能基には、フェニルグリオキサール類、マレイミド類及びハロゲンがある。（カルボキシル）酸のような、ヒドロキシル基と反応できる官能基の例、または求電子中心と反応できるその他の求核基の例には、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレン等がある。
【０１７９】
例えば、上記ポリマーは標的分子に結合するための官能基として成分Ｕを担うように製造できる、その際上記官能基はアクリレート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセテート、ジパルミトイル　ホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイル　ホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアネート、マレイミド、メタクリレート、ニトロフェニル　カルボネート、オルトピリジル　ジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジル　グルタレート、スクシンイミジル　スクシネート、琥珀酸、トレシレート等である。Ｕは活性化型でも提供される、例えばアミンのような求核基と反応できる活性エステル型に変換され得るカルボン酸等である。
【０１８０】
好ましい実施形態において、Ｕは標的分子上の特異的官能基と選択的に反応し得る特異的官能基の残基である。本発明のこの面は、上のＩＩ章で論じたようにペプチド合成（保護基戦略）及び化学的ライゲーション（部分保護基または無保護基戦略）の原理を具体化する。例えばＵは上に記載されたような広範囲の官能基の残基をあらわす。好ましいＵ基はアミン捕捉戦略（例えばヘミアミナル形成（ｈｅｍｉａｍｉｎａｌ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）による、イミン形成による、そしてマイケル付加によるライゲーション）、チオール捕捉戦略（例えばメルカプチド形成による、スルフィド交換によるライゲーション）、天然型化学的ライゲーション戦略（例えば、システインまたはチオールに関係するチオエステル交換によるライゲーションは側鎖アミノ酸誘導体を含む）、及び直交ライゲーション　カップリング戦略（例えばチアゾリジン形成、チオエステル交換、チオエステル形成、ジスルフィド交換及びアミド形成によるライゲーション）を受けやすい（コルタート（Ｃｏｌｔａｒｔ，ＤＭ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６巻：３４４９−３４９１ページ、等を参照されたい）。特に好ましいＵは、上のＩＩ章に記載したような水性適合性化学的ライゲーション化学に使用される特異的官能基の残基を含む。よって、Ｕはカルボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、尿素、チオ尿素、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジン等からなる群から選択される結合を形成できる官能基である。好ましい結合はオキシム及びアミド結合である。
【０１８１】
上記のように、Ｂは３本以上のアームを有する枝分かれコア部分であり、存在しても存在しなくてもよい。Ｂが存在する場合、１本のアームはＵに連結し、またはＵに結合したスペーサーまたはリンカーに連結する。そして他の各アームは“ポリマー”、または“ポリマー”に結合したスペーサーまたはリンカーに連結する。枝分かれコアＢの例には、非制限的に、アミノ、アミド、カルボキシル及びこれらの組み合わせがある。これらに、リジン等のオリゴアミド類、またはアルカンジアミンとアクリル酸から作られるオリゴマー類（“ポリアミドアミン類”）があり、後者は枝分かれコアに正味の正電荷をもたらす（例えばゼング（Ｚｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．（１９９６）２巻：６６−７２ページ；ローズら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．（１９９６）７巻（５号）：５５２−５５６ページ；ノボビオケム　カタログ及びペプチド合成ハンドブック、ファウフェルフィンゲン、２００１；ウェルズら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９８）４７巻：３８１−３９６ページ；マハジャン（Ｍａｈａｊａｎ）ら、（１９９９）４０巻：４９０９−４９１２ページ；ジュドソン（Ｊｕｄｓｏｎ）ら、（１９９８）３９巻：１２９９−１３０２ページ；スワリ（Ｓｗａｌｉ）ら（１９９７）６２巻：４９０２−４９０３ページ；米国特許第５，９３２，４６２号、第５，９１９，４５５号、第５，６４３，５７５号；第５，６８１，５６７号を参照されたい）。次に記すような多くのその他の異なる枝分かれコアが使用でき、それらはこの目的に適する；置換ジアミン、置換二酸、グリセリン等のアルキル酸、及び３個以上の官能基または活性化可能基を有するその他の部分、例えば多価アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよびアルコキシ部分等、及びオリゴ糖（例えばニーレンガルテン（Ｎｉｅｒｅｎｇａｒｔｅｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９９）４０巻：５６８１−５６８４ページ；マシュース（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．（１９９８）１−５６；サナー（Ｓｕｎｅｒ）ら、巨大分子（２０００）３３巻：２５３ページ；フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（１９９９）３８巻：８８４ページ；サンダー（Ｓｕｎｄｅｒ）ら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０００）１２巻：２３５ページ；マルダース（Ｍｕｌｄｅｒｓ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９７）３８巻：６３１−６３４ページ；マルダースら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．（１９９７）３８巻：３０−３０８８ページ；及びターンブル（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ）ら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２０００）１巻（１号）：７０−７４ページ）。“ポリマー”成分に結合する最も好ましい枝分かれコアは、アミド結合によって連結する。
【０１８２】
好ましい枝分かれコアはアミノ、カルボキシルまたは混合アミノおよびカルボキシル官能基から発出する。好ましい枝分かれコアの例は、それぞれリジンアミノコア、アスパラギン−またはグルタミン酸枝分かれコア、ガンマ−グルタミン酸枝分かれコアである。さらに、好ましい枝分かれポリマー構成物は、枝分かれがオリゴアミドまたはポリアミドアミンコアのような単一枝分かれコアから発するものである。しかし枝分かれ構成物のその他の群も使用できる；例えば枝分かれが、ポリマー主鎖に沿って分布する複数の枝分かれコアの列から発出している虫状（ｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ）構造等である（シュリュッタ（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０００）３９巻：８６４ページ）。ポリマー主鎖及び反復単位の化学組成および／または嵩高性によって、生成するｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ構造は水溶性になるように、または液晶構造を誘起しやすいように設計できる（クアリ（Ｑｕａｌｉ）ら、Ｍａｃｌｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０００）３３巻：６１８５ページ）；これはデリバリー投与、安定性及び作用持続時間のために好都合である。本発明のその他の枝分かれポリマー構成物では、上記ｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ構成物がＵを含むペンダント官能基を含むように作られる。
【０１８３】
“ポリマー”成分、または一つ以上のスペーサーまたはリンカーは、例えば前にＩ章で述べたように、生体安定性または生体内分解性であるポリマー鎖、または間を満たすリンカーまたは結合等を含む。やはりＩ章に記載したように、成分Ｊ＊は生理的条件のもとで、負−、正−及び中性電荷からなる群から選択される正味の電荷を有するペンダント基の残基である。最も好ましいのは、Ｊ＊がイオン化可能カルボン酸塩部分を含み、生理的条件下で正味の負電荷を有する場合である。成分ｓ１、ｓ２、及びｓ３は、Ｉ章で述べたもののように、同じでも異なっていてもよく、個々に存在しても存在しなくてもよいスペーサーまたはリンカー部分である。最も好ましいのは、上記スペーサーまたはリンカーがポリマー鎖を含み、その際上記スペーサーまたはリンカーが式−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−の反復単位を一つ以上含んでなる場合である。
【０１８４】
ＩＶ．本発明の好ましいポリマー修飾合成生物活性タンパク質
上記のように、ポリマー修飾合成サイトカイン及び走化性サイトカインは本発明の特に好ましい例である。より好ましいサイトカインは糖タンパク質である。多くのこの種のサイトカインは糖タンパク質であり、例えば多くのインターロイキン、インターフェロン、成長ホルモン、ケモカイン等がある。例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦα−ＩＩ、ＩＦ−γ、ＬＩＬ、ＩＦ−ベータ、神経成長因子、及びＲＡＮＴＥＳ及び多くのその他のケモカインは糖タンパク質であり、これら及びその他の、この種のタンパク質のグリコシル化部位は知られている。
【０１８５】
ＥＰＯは、赤血球産生刺激活性を有するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の設計に役立つように用いられるアミノ酸配列を含むタンパク質の特に好ましい例である。コロニー刺激因子及びＲＡＮＴＥＳも、本発明の範囲内の合成生物活性タンパク質の設計に役立つように使用できるアミノ酸配列を含むタンパク質の特に好ましい例である。
【０１８６】
ＥＰＯは、定常状態の条件下における赤血球産生の調節及び出血後の赤血球量の回復の促進に役割を果たす主要因子である（ジェルクマン（Ｊｅｌｋｍａｎｎ，Ｗ．）（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ　７２巻：４４９ページ；クランツ（Ｋｒａｎｔｚ，Ｓ．Ｂ．）（１９９１）Ｂｌｏｏｄ　７７巻：４１９ページ；ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．）及びゴールドバーク（Ｍ．Ａ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）（１９９３）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１巻：３９９ページ；ニッセンソン（Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）（１９９４）Ｂｌｏｏｄ　Ｐｕｒｉｆ．１２巻：６ページ）。ヒトＥＰＯの循環型は約３０，０００の分子量を有する１６５アミノ酸（ａａ）の糖タンパク質である（ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ，Ｓ．Ｔ．）ら（１９９４）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎｉｃｓ　ＮＡ　８巻：８９５ページ；ヤコブス（Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．Ｊ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３巻：８０６ページ；リン（Ｌｉｎ，Ｆ−Ｋ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２巻：７５８０ページ）。ＥＰＯのｃＤＮＡは１６６アミノ酸残基を有する分子を予測するとはいえ、カルボキシ末端アルギニンは翻訳後改変において除去される。Ｎ−結合−グリコシル化の可能性のある部位が３カ所あり、全部が満たされている。一つのＯ−結合−炭化水素部分も存在する。グリコシル化作用は複雑である。非グリコシル化大腸菌−由来ＥＰＯはｉｎ　ｖｉｔｒｏで十分な生物学的活性を示すとはいえ、十分なｉｎ　ｖｉｖｏ活性のためにはグリコシル化が明らかに必要である。例えば、大腸菌で産生され、脱グリコシル化された天然由来のＥＰＯは動物研究では非常に低い活性を示す（クランツ（Ｋｒａｎｔｚ，Ｓ．Ｂ．）（１９９１）Ｂｌｏｏｄ　７７巻：４１９ページ；ササキ，Ｈ．ら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：１２０５９ページ；ロウィー（Ｌｏｗｙ，Ｐ．Ｈ．）ら（１９６０）Ｎａｔｕｒｅ　１８５巻：１０２ページ；ウォジュコウスキー（Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ｍ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９１０巻：２２４ページ；ドーダル（Ｄｏｄａｌ，Ｍ．Ｓ．）ら（１９８５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１６巻：２２９３ページ）。
【０１８７】
上記により、種々のグリコシル化パターンは種々の効果を示す。例えば脱シアル化（ｄｅｓｉａｌｙａｔｅｄ）ＥＰＯはｉｎ　ｖｉｔｒｏでは高まった活性と、ｉｎ　ｖｉｖｏでは低下した活性との両方示す。この効果は、ガラクトースが露出し、肝細胞によって認識され、結合し、除去される結果である（スピバク（Ｓｐｉｖａｋ，Ｊ．Ｌ．）及びホーガンス（Ｂ．Ｂ．Ｈｏｇａｎｓ）（１９８９）Ｂｌｏｏｄ　７３ｖ：９０；ゴールドワッサー（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ．）ら、（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９巻：４２０２ページ）。完全にシアル化された（ｓｉａｌａｔｅｄ）ＥＰＯの枝分かれパターンも生物学的活性に差を生ずる。主として四本触覚型の枝分かれＥＰＯは“標準的”ＥＰＯに匹敵する活性を示し、一方、主として二本触覚型の枝分かれＥＰＯはｉｎ　ｖｉｔｒｏでは正常活性の３倍以上、ｉｎ　ｖｉｖｏでは正常活性のたった１５％の活性を示す（タケウチ，Ｍ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６巻、７８１９ページ）。研究の結果、Ｎ−結合糖のみがＥＰＯ機能化において重要であり、Ｏ−結合糖は重要でないことが判明した（ヒグチ，Ｍ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：７７０３１９ページ）。
【０１８８】
特に好ましい実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質にはポリマー修飾合成赤血球産生刺激タンパク質を含む。ここに使用する用語、赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球の産生を仲介するタンパク質である。或るタンパク質の赤血球産生刺激性生物活性は種々の方法のいずれか、例えばｉｎ　ｖｉｖｏ投与後の赤血球産生によって、上記タンパク質のＥＰＯ依存性細胞系増殖を仲介する能力の分析試験等によって測定できる。
【０１８９】
好ましい赤血球産生刺激タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのＥＰＯ、及びその類似体である。（例えば米国特許第５，８５６，２９８号、第５，９５５，４２２号；第８，８８８，７７２号；第５，８５８，３４７号；第５，６１４，１８４号；第５，４５７，０８９号；及び第６，０７７，９３９号；及びＷＯ　００／３２７７２号を参照されたい）。エリスロポエチンは主として腎臓の尿細管及び傍尿細管内皮および間質細胞によって合成、分泌される。慢性腎臓病は腎臓のＥＰＯ産生細胞を破壊させる。その結果としてのＥＰＯ不足は、貧血を起こすことが多い。そこでＥＰＯの主な臨床的用途は、通常輸血も受けている重症腎不全の患者（ヘマトクリット値０．３未満）の治療、並びに化学療法後の貧血患者の治療である。一般的に、ＥＰＯはハムスター卵細胞において組換え合成され臨床的に使用される。ＥＰＯはその成熟型では１６５アミノ酸残基の、相対的に耐熱性及びｐＨ安定性の酸性（ｐＩ＝４．５）タンパク質である。ＥＰＯの分子量の約４０パーセントはそのグリコシル化によるものである。グリコシル化はＥＰＯのｉｎ　ｖｉｖｏ薬物動態挙動を決定する重要な因子である。非グリコシル化ＥＰＯは極めて短い生物学的半減期を有する。それでもそれはその受容体に結合し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでも比較的高い特異な活性を有する。しかし最近の研究は、ＥＰＯのＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ（ＰＥＧ化）はその寿命を著しく高める一方で、細胞ベースのアッセイ系ではＥＰＯ活性を有意に低下させることを示した。
【０１９０】
本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質（“ＳＥＰ”）はヒト尿ＥＰＯのポリマー修飾合成類似体であるのが好ましい。好ましい実施形態において、それらはチオエーテル、オキシム、アミドまたはその他の結合によって、一つ以上のペプチド残基に結合した一つ以上のポリマー部分（最も好ましくはｐＰＥＧ部分）を含む。非常に好ましい実施形態において、このような結合はヒト尿ＥＰＯの、天然にグリコシル化された一つ以上の位置に存在する（すなわち位置２４、３８、８３及び１２６）。最も好ましくは、ＳＥＰ分子はこのような２つ以上の位置にｐＰＥＧ部分を有する。別の実施形態において、その他のタンパク質残基はポリマー部分によって修飾される。本発明の合成生物活性タンパク質の修飾位置としては、上記タンパク質の不規則ループ、領域またはドメインにある残基、または潜在的プロテア−ゼ開裂部位にあるまたはその近くにある残基が含まれる。例えば、ポリマー修飾はＥＰＯの９、６９および／または１２５の一つ以上の位置で行われる。本発明のＳＥＰ分子の総分子量は約２５から約１５０ｋＤａまでに変化し得る、より好ましくは約３０ないし約８０ｋＤａの間に変化し得る。上記分子量は所与の類似体の修飾のために用いられるポリマー（例えばｐＰＥＧ等）の数及び構造を増やしたり減らしたりすることによってコントロールできる。より大きい構成物のｐＰＥＧ依存性流体力学的ＭＷは約１００ｋＤａより大きい。ヒトＥＰＯ受容体を発現する細胞におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイは、本発明のＳＥＰが組換え的に産生されるグリコシル化ヒトＥＰＯのＥＤ５０に匹敵するＥＤ５０を有することを示す。
【０１９１】
オキシム結合ｐＰＥＧ類似体は好ましくはアミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能化ｐＰＥＧを、ＳＥＰタンパク質の、側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能基を担う非天然的にコードされるアミノ酸に結合することによって構成される。例えば、ＳＥＰ−０及び１の位置８９及び１１７は擬似グルタメートを含む（式ＣＨα−ＣＨ２−Ｓ−ＣＯＯＨの側鎖を担う非天然的にコードされるアミノ酸（グルタミン側鎖−ＣＨα−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨに比較））。チオエーテル結合を利用するＳＥＰ類似体は、チオールを担う側鎖を有するシステインまたは非天然アミノ酸によって提供されるチオール官能価を含むように構成するのが好ましい。図１０は好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の一つの型の基礎構造を描く。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明のＳＥＰ分子は、ＥＰＯの天然アミノ酸カルボキシ末端が配置し直された“循環的置換（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ　ｐｅｒｍｕｔｅｄ）”ＥＰＯ類似体を含むことができる。このような再配置がアミノおよびカルボキシ末端を構造的制約が低い位置、例えば不規則（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）ループ等に動かすことが最も好ましい。位置１２５及び１２６の周囲の不規則ループは（天然ＥＰＯ残基のナンバリング系に対して）このような再配置の一例である。このようなＳＥＰがジスルフィド−フリー（無ジスルフィド）であり、あらかじめ選択された残基がポリマー部分を含むように化学的に改変されるのが最も好ましい。
【０１９３】
或いは、ＳＥＰ分子はアミノ及びカルボキシ末端を天然に発生するグリコシル化部位に移動させ、またはグリコシル化されやすいその他の部位、例えば位置１２６及び１２５に移動させることができる。かかるＳＥＰ分子は（カルボキシアミド化等の）変化を排除または改変するためのアミノ及びカルボキシ末端の改変も含むことができる。このような循環的置換分子の好ましい一例において、新しいＮ−及びＣ−末端は位置１２６および１２５にそれぞれ作られる。位置７、２９、３３及び１６１の天然ジスルフィド形成システイン類は、非天然的にコードされるアミノ酸、Ｌ−α−Ｎ−酪酸（Ａｂａ）（これはジスルフィド−ブリッジを形成できない）によって置換されるのが好ましい。残基Ｒ１６６、Ｅ３７およびＶ８２をアラニンで置換し、生産を改善するのが好ましい。また、天然ＥＰＯナンバー・スキーム（これは以下で“０”のナンバーがつけられる）に対して追加的システインを位置１と１６６との間に挿入するのが好ましい。生成した分子は４個のシステインを含む（位置１２６、０、３８及び８３に（Ｎ−からＣ−末端方向に読んで））、これらは（１）結合部位及び（２）チオエーテル形成ｐＰＥＧ結合部位として利用される。任意に、システインをＡ１２５の代わりに入れて、付加的ｐＰＥＧ結合部位を与えてもよい。
【０１９４】
本発明のこのようなＳＥＰ分子の総分子量は約２５から約１５０ｋＤａまでに、より好ましくは約３０から約８０ｋＤａまでに変化し得る。上記分子量は所与の類似体の修飾のために用いられるポリマー（例えばｐＰＥＧ等）の数及び構造を増やしたり減らしたりすることによってコントロールできる。より大きい構成物のｐＰＥＧ依存性流体力学的ＭＷは１００ｋＤａより大きい。任意のｐＰＥＧ結合部位は位置１２５、９及び２４に置かれる（Ｎ−からＣ−末端方向に読んで）。その他のＳＥＰ類似体のデザインは不規則ループ領域に代ってＮ−及びＣ−末端をもち、および／または新しいＮ−および／またはＣ−末端から残基を切り捨てる。好ましい循環的置換分子の基礎構造は図１１に示される。
【０１９５】
例として、下記のやり方で、ヒトＥＰＯの天然配列を循環的に置換することによって或る配列を設計した：天然Ｎ−末端Ａｌａ１及びＣ−末端Ａｒｇ１６６とを追加的Ｃｙｓ残基によって結合し、１６７アミノ酸のポリペプチドを与える；天然配列の残基１２５−１２６のところで鎖を分断することによって新しいＮ−及びＣ−末端を作り出す；全ての天然Ｃｙｓ残基をＬ−□アミノ−ｎ−酪酸残基で置換した；そして下記の置換を行った：Ｇｌｕ３７Ａｌａ；Ａｓｎ３８Ｃｙｓ；Ｖａｌ８２Ａｌａ；Ａｓｎ８３Ｃｙｓ；Ｓｅｒ１２６Ｃｙｓ；Ａｒｇ１６６Ａｌａ（全残基のナンバーはヒトＥＰＯの天然配列に基づく）。同時に、これらの設計要素は示されるＳＥＰ−５のアミノ酸配列を形成する。ＳＥＰ−５−Ｌ２８タンパク質はＣｙｓ残基１２６、０、２４、３８及び８３（ヒトＥＰＯ配列に基づくナンバリング）がマイケル付加反応によって、マレイミド改変、直鎖性（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）６カルボン酸塩ポリマー構成物でポリマー修飾される。これらの変化は、ＳＥＰ−５−Ｌ２８タンパク質の合成及び取扱いを改善するために設計された。設計された配列は４ペプチドセグメントから作られ、各セグメントは末端Ｃｙｓ残基を有する。化学的ライゲーション部位はＣｙｓ０、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ８３であった。Ｃ−末端ペプチドが□−カルボン酸塩であるペプチドを合成した；その他の３ペプチドは□−チオエステルであり、このためＮ−末端Ｃｙｓ残基はＡｃｍで保護された側鎖であった。Ｃｙｓ２４は保護されない側鎖であった。上記セグメントはＣ−末端の２セグメントから始まり、逐次天然型化学的ライゲーションによって連結された。ライゲーション後、ライゲーション部位の遊離Ｃｙｓ側鎖をマイケル付加反応によってマレイミド改変、直鎖の（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）６カルボン酸塩　ポリマー構成物と反応させ、その後Ｃｙｓ側鎖のＡｃｍ保護基を除去し、次のセグメントのライゲーション及びポリマー修飾が同様に行われた。Ａｃｍ基の除去後、次の（第四の）セグメントのライゲーションが行われ、最後のＡｃｍ基が除去され、ポリマー修飾が同様に行われ、上に記載したような図３８に示される循環的に置換されたＳＥＰ構成物が生成した。
【０１９６】
また別の実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのＧ−ＣＳＦである。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の速やかな増殖及び血流への放出を誘起し、それによって感染症の克服に治療効果をもたらす。ヒトＧ−ＣＳＦタンパク質は長さが１７４アミノ酸である（特許：ＥＰ０４５９６３０（キャンブル（Ｃａｍｂｌｅ　Ｒ．）ら）。そしてその配列の変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）が分離されている（例えば米国特許第６，００４，５４８号；第４，８１０，６４３号；第５，２１８，０９２号；第５，２１４，１３２号；第５，４１６，１９５号；及び第５，５８０，７５５号を参照されたい）。上記タンパク質は４個のシステイン残基を有し、スレオニン位置１３３にＯ−グリコシル化部位を有する。
【０１９７】
このような合成ＧＣＳＦ分子の一実施形態において、上記分子のアミノ酸配列を天然ＧＣＳＦの配列に対して変化させ、位置１、２または３の一つ以上に天然、またはより好ましくは非天然にコードされた疎水性残基を含むようにすることができる。任意に、そのような分子をさらに改変し、ＧＣＳＦの位置５および／または位置１７３および／または１７４に追加的天然またはより好ましくは非天然にコードされた疎水性残基を含むようにする。
【０１９８】
その他の好ましい実施形態において、合成ＧＣＳＦ分子は位置６３、６４および／または１３３の一つ以上および／または位置１及び１７４の一つ以上がポリマー（好ましくはｐＰＥＧ）で修飾されている。ｐＰＥＧポリマーは直鎖、枝分かれ、帯電、非帯電、または混合のいずれでもよい；そして修飾のために使用するｐＰＥＧの数及び構造に応じて、約５ないし約８０ｋＤａの分子量、より好ましくは約４０ないし約７０ｋＤａのｐＰＥＧ総分子量を有する。流体力学的半径（ｒａｄｉｕｓ）はｉｎ　ｖｉｖｏではより大きいＭＷ効果を示す（例えば１０ｋＤａの枝分かれｐＰＥＧは約５５ｋＤａの有効ＭＷを示す）。推定ｐＰＥＧ依存性流体力学的ＭＷは１００ｋＤａより大きい。
【０１９９】
オキシム結合を使用する類似体では、ｐＰＥＧは側鎖アミノオキシ、ケトンまたはアルデヒド官能基を担う、非天然的にコードされる残基に付加するのが好ましい。チオエーテル結合を使用する類似体では、ｐＰＥＧはシステインまたはチオールを担う側鎖を有する非天然アミノ酸に付加するのが好ましい。アミド結合を使用する類似体では、ｐＰＥＧは反応性側鎖アミンを担う天然または非天然アミノ酸に付加する。
【０２００】
合成生物活性Ｇ−ＣＳＦタンパク質の基礎構造が図１２に示される。図において、“Ｊ”は疎水性側鎖を有する非天然的にコードされる残基を示す。
【０２０１】
このようなポリマー修飾合成生物活性ＧＣＳＦタンパク質類の生物活性は一般的手段、例えば因子依存性ヒトまたはマウス細胞株（ＮＦＳ６０細胞株等）の増殖を仲介するそれらの能力を分析測定（アッセイ）することによって、または２０日以上の半減期／放出をターゲティングするデリバリーシステムを利用した場合または利用しない場合のｉｎ　ｖｉｖｏ好中球刺激、半減期、及び免疫原性を測定することによって分析試験できる。
【０２０２】
また別の実施形態では、本発明の合成生物活性タンパク質は哺乳動物、最も好ましくはヒトのケモカイン、ＲＡＮＴＥＳ、である。ＲＡＮＴＥＳはＭ−ｔｒｏｐｉｃＨＩＶ種が主要受容体ＣＣＲ５を介して流入するのを遮断し、喘息、移植拒絶及び創傷治癒に関係する炎症経路を抑制する（カリンコヴィッチ（Ｋａｌｉｎｌｏｖｉｃｈ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ．（１９９９）６８巻：２８１−２８７ページ）。本発明の合成ＲＡＮＴＥＳ分子は、好ましくは、（１）ＲＡＮＴＥＳ１−６８の位置１に見いだされるＮ−末端セリンがｎ−ノナノイル（“ＮＮＹ”）基で置換され；（２）位置３のチロシンが疎水性側鎖を有する非天然にコードされるアミノ酸で置換される、というように化学的に改変されている点で、ＲＡＮＴＥＳケモカインとは異なる。このような化合物は極めて強力で、組換え“Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ１−６８”のｍＭ範囲のＥＤ５０に対して、ｐＭ範囲のＥＤ５０を有する。
【０２０３】
強力なＲＡＮＴＥＳ類似体は上記のものに次のような一つ以上の追加的変化をもたせるように作られた：位置２のプロリンを疎水性側鎖を有する非天然コード−アミノ酸で置換し、脂肪酸を上記分子のＣ−末端に結合する。ＲＡＮＴＥＳ残基１２−２０に相当するＮ−ループ領域を改変することによって受容体特異性が効力と共に改善された。その他の好ましい実施形態において、本発明の合成ＲＡＮＴＥＳ分子はポリマー部分（ｐＰＥＧ等）、またはノナノイル（“ＮＮＹ”）またはＹ３ＸをそれらのＮ−またはＣ−末端に組み込んで、特にｉｎ　ｖｉｖｏ半減期を改善する。上記ｐＰＥＧ部分はオキシム結合によって、位置６６、６７、６８に、または位置６８のリンカーに導入された非天然的にコードされたアミノ酸に結合するのが好ましい。この際、凝集領域の原因となる領域である位置６７がより好ましい。上記脂肪酸はオキシム結合によって（好ましくはリンカーによって）残基６８に結合するのが好ましい；例えばアミノ−オキシ改変アミノ酸ジ−またはトリ−ペプチド　リンカー等。その他の結合化学を代わりに使用してもよい。このような合成ＲＡＮＴＥＳ類似体の比較的大きい構成物の分子量は、ｐＰＥＧ結合の数及び構造に応じて約２５ｋＤａないし約４５ｋＤａの範囲であり、上記の比較的大きい構成物は６０ｋＤａを超えるｐＰＥＧ依存性流体力学的ＭＷを有する。好ましい合成ＲＡＮＴＥＳ類似体の構造は図１３に示される。
【０２０４】
Ｖ．医薬品
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は病気及び疾患を治療する薬剤として使用することができる。治療を必要とする患者または人に投与する際、このような合成生物活性ポリペプチドおよび／またはタンパク質をドラッグ・デリバリー・システムを利用して投与するのが最も好ましい。このようなシステムの使用により、患者が満足でき、そして所望生物活性の有効性を高めるようなやり方で薬を患者に与えることができる。本発明の目的において好ましいドラッグ・デリバリー・システムは、ポリペプチドまたはタンパク質を経口、経鼻、または吸入経路で、または筋肉内、皮下、経皮、静脈内、腸壁内（ｉｎｔｒａｕｒａｌｌｙ）、または眼球内に投与することができるシステムを含む。
【０２０５】
このようなドラッグ・デリバリー・システムには部位特異的に放出できる組成物または腸粘膜の保護を高める組成物がある。適切な組成物としては：乾燥粉末組成物、ウィルス粒子封入による運搬、リポソーム封入、経皮パッチ、電気的手段を用いる運搬（エレクトロポレーション治療）及びポリマー／ｎｉａｚｏｎｅ　複合体がある。
【０２０６】
好ましい実施形態において、このようなドラッグ・デリバリー・デバイスは生物学的環境の変化に反応し、これらの変化に基づいて薬を運搬し、または運搬を中止する。薬及びその他の活性物質の放出をコントロールする一連の物質が使われている：ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（メチルメタクリレート）、親水性及び強度のためのポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）等。その他の好ましい実施形態において、ドラッグ・デリバリーを容易にするために生体内分解性ポリマーが使用される。そのようなポリマーとしては、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、ポリ無水物、ポリオルトエステル等がある。ドラッグ・デリバリー・デバイス、及びそれらの使用法は米国特許第６，０７２，０４１号；第６，０４１，２５３号；第６，０１８，６７８号；第６，０１７，３１８号；第６，００２，９６１号；第５，８７９，７１２号；第５，８４９，３３１号；第５，７９２，４５１号；第５，７８３，２１２号；第５，７６６，６３３号；第５，７５９，５６６号；第５，６９０，９５４号；第５，６８１，８１１号；第５，６５４，０００号；第５，６４１，５１１号；第５，４３８，０４０号；第４，８１０，４９９号；及び第４，６５９，５５８号に記載されている。
【０２０７】
よって、本発明のもう一つの面は、治療を必要とする哺乳動物に、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を含む化合物類または薬物学的に容認されるそれらの塩の治療的有効量を投与することによって治療する医薬組成物及び方法に関係する。“薬物学的に容認される塩”とは、本発明のポリペプチドの生物学的有効性及び特性を保持し、生物学的にまたはそれ以外の面でも不都合でない塩を意味する。塩類は酸または塩基から誘導できる。酸付加塩は塩酸、臭化水素酸、硫酸（硫酸塩及び重硫酸塩を与える）、硝酸、燐酸等の無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸から誘導される。塩基付加塩は無機塩基から誘導され、ナトリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩等を含む。有機塩基から誘導される塩には、第一、第二及び第三アミン、天然に発生する置換アミンや環状アミン等を含む置換アミン、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルコサミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン等から形成されるものが含まれる。好ましい有機塩基はイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミン及びコリンである。
【０２０８】
ここに使用する用語“治療”は本明細書では哺乳動物、特にヒトの病気の全ての治療を含み、（ｉ）病気にかかる素因はあるが、まだその病気とは診断されていない人においてその病気の発生を阻止する；（ｉｉ）上記病気の阻止、すなわちその進行を止める；または（ｉｉｉ）上記病気の緩和、すなわち上記病気を後退させることを含む。
【０２０９】
本明細書に使用する“タンパク質拮抗物質または作用薬（アゴニスト）で予防されるかまたは軽快する哺乳動物の疾病状態”には、概してタンパク質インヒビターで有効に治療できることが当業者に一般的に認められている全ての疾病状態、及び本発明の特殊な化合物で治療することによって有効に阻止されまたは軽快することが判明した疾病状態を含むものとする。説明のためにこれらを非制限的に挙げれば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウィルス疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎及び臓器移植拒絶等である。
【０２１０】
ここに使用する用語“治療的有効量”とは、治療を必要とする哺乳動物に投与した際に、例えば抗炎症剤、抗喘息薬、免疫抑制剤または抗自己免疫病薬として十分な治療（上に定義した）効果をあらわし、哺乳動物におけるウィルス感染を阻止するポリマー修飾合成生物活性タンパク質の量を言う。“治療的有効量”を構成する量はタンパク質誘導体、疾患または病気およびその重症度、及び治療すべき哺乳動物、その体重、年齢等によって変動するが、その時代における知識及びこの開示によって、熟練せる当業者は日常的に決定できる。ここに使用する用語“ｑ．ｓ．”は、定められた機能を得るために十分な量、例えば或る溶液を所望容量（例えば１００ｍＬ）にするのに十分な量を加えることを意味する。
【０２１１】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質およびそれらの薬物学的に容認される塩類、すなわち活性成分が、治療的有効量、すなわち上記のように治療を必要とする哺乳動物に投与した際に治療効果をあらわすのに十分な量が投与される。ここに記載される合成生物活性タンパク質の投与は、同様な用途に役立つ薬剤類を投与する容認される方法のいずれによっても投与できる。ここに使用する用語“ポリマー修飾合成生物活性タンパク質”、“本発明のポリペプチドの薬物学的に容認される塩”及び“活性成分”は交換可能に用いられる。
【０２１２】
組成物中のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の濃度は、熟練せる当業者によって使用される全範囲内に変動し得る。例えば総組成物を基にしてタンパク質拮抗物質または作用薬が約０．０１質量パーセント（％ｗ）ないし約９９．９９％ｗの濃度であり、約０．０１％ｗないし９９．９９％ｗの賦形薬である。より一般的には、ポリマー修飾合成生物活性タンパク質は約０．５％ｗないし約８０％ｗの濃度で存在する。
【０２１３】
上記ポリマー修飾合成生物活性タンパク質のヒト投与量レベルはなお最適化すべきだが、一般的に、投与する化合物量は阻止または緩和の標的となる人及び疾病状態、疾患の性質または重症度、投与法及びスケジュール、及び処方医の判断によって決まるのは当然である。このような使用の最適化は熟練せる当業者による最適化の範囲内でよい。
【０２１４】
投与はあらゆる容認される全身または局所的経路、例えば非経口、経口（特に乳児用組成物）、静脈内、鼻孔内、気管支吸入（すなわちエアロゾル組成物）、経皮的または局所的経路を介して、固体、半固体、または液体またはエアロゾル投与型、例えば錠剤、丸薬、カプセル、粉末、液体、溶液、乳濁液、注射用、懸濁液、坐剤、エアロゾル等の形で投与できる。本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は除放性またはコントロール放出薬剤型、例えば蓄積型（ｄｅｐｏｔ）注射、浸透ポンプ、丸薬、経皮（エレクトロトランスポートも含む）パッチ等の形で上記ポリペプチドを所定の速度で持続的に投与し、好ましくは正確な容量を単回投与するための単位投与型で投与することもできる。上記組成物は一般的医薬用担体または賦形薬、及び本発明のタンパク質拮抗物質または作用薬を含み、加えてその他の医薬製剤、薬剤、担体、アジュバント等を含むことができる。担体は種々の油、例えば石油、動物油、植物油、または合成油、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、等から選択できる。水、生理食塩水、デキストロース水溶液、そしてグリコールは好ましい液体担体であり、特に注射用液には好ましい。適切な薬剤用担体には澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白墨、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール　モノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、等がある。その他の適切な薬剤用担体及びそれらの組成物はマーチン（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）の“レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）”に記載されている。
【０２１５】
所望ならば、投与すべき薬剤組成物は湿潤剤、または乳濁剤、ｐＨ緩衝剤等の無毒性補助物質も少量含むことができる；例えば酢酸ナトリウム、ソルビタン　モノラウレート、トリエタノールアミン　オレエート等である。
【０２１６】
活性成分がより多く必要な場合は、経口投与により従来の毎日投与方式を用いて本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質をデリバリーすることができ、それは所望の予防程度または苦痛の緩和程度によって調節できる。このような経口投与のためには、薬物学的に容認される無毒性組成物は、通常使用される賦形薬、例えば薬剤品位のマンニット、ラクトース、澱粉、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン　ナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメローズ　ナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等のいずれかを組み込むことによって形成される。このような組成物は溶液、懸濁液、分散性錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性組成物等の形をとる。経口組成物は特に胃腸疾患の治療に適する。全身的目的のための経口バイオアベイラビリティは、例えばアセチル化アミノ酸を含む組成物等のように、全身循環への取り込みを改善する賦形薬を使用することによって調節できる。米国特許第５，９３５，６０１号及び米国特許第５，６２９，０２０号等を参照されたい。
【０２１７】
上記組成物類はカプセル、丸薬または錠剤の形をとることができ、したがって上記組成物は活性成分と共に、ラクトース、スクロース、燐酸二カルシウム等の希釈剤；クロスカルメローズ　ナトリウム、澱粉またはそれらの誘導体等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑剤；及び澱粉、ポリビニルピロリドン、アカシアゴム、ゼラチン、セルロース及びその誘導体等の結合剤を含む。
【０２１８】
薬剤として投与できる液体組成物は例えば本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質（約０．５ないし約２０％）及び任意の補助薬剤を水、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール類、エタノール、保存剤等の担体に溶解、または分散し（またはその他の方法で）、溶液または懸濁液を生成するというやり方で調製できる。所望ならば、投与すべき薬剤組成物は湿潤剤、懸濁剤、または乳化剤、溶解剤、ｐＨ緩衝剤等の無毒性補助物質を少量含むことができる；例えば酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレン、ソルビタン　モノラウレートまたはステアレート等である。このような薬剤型の実際的製法は熟練せる当業者には公知であるか、明らかである；例えばレミントンの薬剤科学、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、を参照されたい。投与すべき組成物または処方は、活性成分を、少なくとも治療すべき人の症状を阻止または緩和するのに有効な量含む。乳児に経口投与するためには液体組成物（例えばシロップまたは懸濁液）が好ましい。
【０２１９】
液体を含む固型与型では、例えばプロピレンカーボネーと、植物油またはトリグリセリド−溶液または懸濁液をゼラチンカプセルに封入するのが好ましい。液体投与型では、溶液、例えばポリオキシエチレングリコール溶液を水等の薬物学的に容認される液体担体の十分量で希釈し、投与のために計量しやすいようにする。
【０２２０】
或いは、液体または半固体経口組成物は活性成分を植物油、グリコール類、トリグリセリド類、プロピレングリコールエステル類（例えばプロピレンカーボネート）等に溶解または分散し、これらの溶液または懸濁液を硬−または軟ゼラチンカプセル皮膜に封入することによって製造できる。
【０２２１】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を上記の病気の治療のために使用する際に、上記の活性成分の投与は非経口投与であることが好ましい。非経口投与は一般的に皮下、筋肉内または静脈内注射を特徴とし、皮内−または腹腔内注射、並びに胸骨内注射または注入法も含まれる。注射可能物質は一般的形の液体溶液または懸濁液として、または注射前に液体溶液または懸濁液とするのに適した固体形として、乳濁液としてまたは生体適合性ポリマー（例えばリポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ（Ｄ，Ｃ）ラクチド等）ベースのミクロスフェアとして調製できる。適切な賦形薬は例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。それに加えて、もし所望ならば、投与すべき薬剤組成物は少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、溶解促進剤、タンパク質担体等も含むことができる；例えば酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン、ソルビタン　モノラウレート、トリエタノールアミン　オレエート、シクロデキストリン、血清アルブミン等である。
【０２２２】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質は、例えばこの化合物を適切な溶媒（水または生理食塩水）に溶解し、またはリポソーム組成物に挿入し、その他の容認される注入液に分散させることによって、非経口的に投与できる。本発明のポリペプチドの典型的１日量は１回の注入によって、または定期的間隔をおいた一連の注入によって投与できる。非経口投与では、特に適切な水溶性形の活性成分の水溶液がある；例えば水溶性塩の形、または、カルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストラン等の粘度増加物質や、所望ならば安定剤も含む水性注射用懸濁液がある。上記活性成分は、任意に賦形剤と一緒に、凍結乾燥物の形でもよく、これを非経口投与前に適切な溶媒の添加によって溶液にすることができる。
【０２２３】
非経口投与のためのより最近工夫されたアプローチは一定の投与量レベルが維持されるように、徐放性または持続的放出系を埋め込む方法である。例えば米国特許第３，７１０，７９５号、米国特許第５，７１４，１６６号及び米国特許第５，０４１，２９２号を参照されたい。これらは参考として本明細書に組み込まれる。
【０２２４】
このような非経口組成物に含まれる活性成分のパーセンテージは、その特異的性質、並びにポリペプチドの活性及び対象の要求に大きく依存する。しかし溶液中０．０１％ないし１０％の活性成分パーセントが用いられ、その組成物が固体である場合はパーセンテージはより高く、その後上記のパーセントに希釈される。上記組成物は、溶液中に活性成分を０．０２−８％含むのが好ましい。
【０２２５】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の別の投与法は静脈内ボーラス注射（大量注射）と連続注入の両方を使用するものである。
【０２２６】
エアロゾル投与は、本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を直接呼吸気道に運搬する有効な手段である。この方法の利点の幾つかを挙げると；１）それは酵素的分解作用、消化管からの貧弱な吸収、または肝臓の初回通過効果（ｆｉｒｓｔ−ｐａｓｓ　ｅｆｆｅｃｔ）による治療薬の喪失を回避し；２）それらの分子サイズ、電荷または肺外部位への親和性により、それ以外の方法では呼吸気道のそれらの標的部位に達することができない活性成分を投与できる；３）それは肺胞を介して体内への速やかな吸収を可能にする；４）それはその他の器官系を活性成分に曝すことを避ける；これは上記被曝が好ましくない副作用をおこすかもしれない場合には重要なことである。これらの理由から、エアロゾル投与は喘息、肺の局所的感染症及び肺及び呼吸気道のその他の疾患または疾患状態の治療に特に有益である。
【０２２７】
３種類の薬剤吸入装置、ネブライザー吸入器、定量吸入器及び乾燥粉末吸入器がある。ネブライザー装置はタンパク質誘導体（液体形に処方されている）を霧として噴霧させる高速気流を生成する。定量吸入器は一般的には圧縮ガスと共に包蔵された組成物を含み、実施時には、測定量のポリペプチドを圧縮ガスによって放出し、したがって規定された量の薬剤を確実に投与する方法である。乾燥粉末吸入器は、この装置によって呼吸する際に患者の呼吸流に分散し得る流動性粉末の形のポリペプチドを投与する。流動性粉末を得るためには、上記タンパク質誘導体をラクトース等の賦形薬と一緒に処方する。測定量のタンパク質誘導体はカプセル形に保存され、各実施時に患者に分配される。上記の方法は全て、本発明の投与に用いられる。
【０２２８】
リポソームをベースにした薬剤組成物も本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質を使用するために適する。例えば米国特許第５，６３１，０１８号、第５，７２３，１４７号；第５，７６６，６２７号を参照されたい。リポソームの利点は、薬剤のリポソーム捕捉に起因する、組織分布及び薬物動態パラメーターの好都合な変化と関係があると考えられ、熟練せる当業者はこの利点を本発明のポリペプチドに応用できる。注射または経口投与のためのコントロールド放出性リポソーム液体薬剤組成物も使用できる。
【０２２９】
坐薬による全身投与の場合、伝統的結合剤及び担体には例えばポリエチレングリコールまたはトリグリセリド、例えばＰＥＧ１０００（９６％）およびＰＥＧ４０００（４％）がある。このような坐薬は活性成分を約０．５ｗ／ｗ％ないし約１０ｗ／ｗ％の範囲；より好ましくは約１ｗ／ｗ％ないし約２ｗ／ｗ％の範囲を含む混合物から形成される。
【０２３０】
本明細書において言及した全ての出版物及び特許公報は、それらを参照により本明細書に組み込む旨が具体的かつ個別に明記されていなくても、参照によって本明細書に組み込まれるものである。本発明の背景についての検討は、本発明の範囲を説明する目的で記載するものであって、言及した事物のいずれについても、本請求項に係わるいずれかの優先日現在、世界のいずれかの場所において、公表されていること、公知であること、或いは先行技術や一般的な通常の知見の一部であることを出願人が自認するものではない。ここに本発明を概ね説明したが、これは下記の実施例を参照してより容易に理解される；これらの実施例は説明のためのものであり、特に記載がない限り本発明を制限するものでない。
【０２３１】
（実施例）
（略語）
Ａｃｍ＝アセトアミドメチル　チオール保護基（すなわち−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３）
ＡｏＡ＝アミノオキシアセチル
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）＝Ｌ−アルギニン（側鎖ＮＧトルエンスルホニル保護）
ＡＲＴ＝網状赤血球の絶対数
Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）＝Ｌ−アスパラギン酸（側鎖シクロヘキシルエステル保護）
ＡＵＣ＝曲線下面積
Ｂｏｃ＝第三ブトキシカルボニル
ＣＤ＝円二色性
ＣＤＩ＝カルボニルジイミダゾール
ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬ＝クリアランス（ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ）
Ｃｍａｘ＝最大濃度
Ｃｙｓ（４ＭｅＢｚｌ）＝Ｌ−システイン（側鎖（４−メチル）ベンジル保護）
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）＝Ｌ−システイン（側鎖アカトアミドメチル［すなわち−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ３］−保護）
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＣ＝ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＤＰＣ＝ドデシルホスホコリン
Ｄｐｒ＝Ｌ−１，２−ジアミノプロピオン酸
ＥＤ５０＝５０％最大効果に達するために必要な有効量
ＥＤＡ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン
ＥＬＩＳＡ＝酵素免疫測定法
ＥＰＯ＝エリスロポエチン
ＥＳ−ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化質量分析法
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
Ｇｌｕ（ｃＨｅｘ）＝Ｌ−グルタミン酸（側鎖シクロヘキシルエステル保護）
ＧＭ−ＣＳＦ＝顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子
ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアンモニウム　ヘキサフルオロホスフェート
ＨＣＴ＝ヘマトクリット
ＨＧＢ＝ヘモグロビン
Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）＝Ｌ−ヒスチジン（側鎖ＮＩｍジニトロフェニル保護）
ＨＯＢＴ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー
ＩＭＤＭ＝イスコブの改良ダルベッコ培地
ＩＰＡ＝イソプロパノール
Ｌｅｖ＝レブリン酸
Ｌｙｓ（ＣＩＺ）＝Ｌ−リジン（側鎖２−クロロベンジルオキシカルボニル）保護
ＭＢＨＡ＝４−メチルベンズヒドリルアミン
ＭＲＴ＝平均滞在時間
ＭＴＴ＝４−メチルトリチル
ＭＴＴ＝チアゾリルブルー
ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂＝−Ｏ−ＣＨ２−Ｂｚ−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２（コポリスチレン−ジビニルベンゼン）−樹脂
Ｐｂｏ＝４−（ＣＨ３Ｓ（Ｏ））ベンジル
ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩液
ＰＣＶ＝赤血球沈層
ＲＢＣ＝赤血球
ＲＥＴ＝網状赤血球
ｒｈＥＰＯ＝組換えヒトＥＰＯ
ＲＳＡ＝ラット血清アルブミン
ＳＤＳ＝ドシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ＳＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動法
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）＝Ｌ−セリン（側鎖ベンジル保護）
アミノ酸の一字コード：Ａ＝アラニン；Ｃ＝システイン；Ｄ＝アスパラギン酸；Ｅ＝グルタミン酸：Ｆ＝フェニルアラニン；Ｇ＝グリシン；Ｈ−ヒスチジン；Ｉ＝イソロイシン；Ｋ＝リジン；Ｌ＝ロイシン；Ｍ＝メチオニン；Ｎ＝アスパラギン；Ｐ＝プロリン；Ｑ＝グルタミン；Ｒ＝アルギニン；Ｓ＝セリン；Ｔ＝スレオニン；Ｖ＝バリン；Ｗ＝トリプトファン；Ｙ＝チロシン
ＳＰＰＳ＝段階的固相ペプチド合成
Ｓｕｃｃ＝スクシニル［すなわち−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−］
ＴＣＥＰ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸
ＴＦＥ＝２，２，２，−トリフルオロエタノール
Ｔｈｒ（Ｂｚｙｌ）＝Ｌ−スレオニン（側鎖ベンジル保護）
アミノ酸の三文字コード：Ａｌａ＝アラニン；Ａｒｇ＝アルギニン；Ａｓｎ＝アスパラギン；Ａｓｐ＝アスパラギン酸；Ｃｈｇ＝シクロヘキシルグリシン；Ｃｙｓ＝システイン；Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｇｌｙ＝グリシン；Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝リジン；Ｍｅｔ＝メチオニン；Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝プロリン；Ｓｅｒ＝セリン；Ｔｈｒ＝スレオニン；Ｔｈｚ＝４−チオプロリン；Ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝チロシン；Ｖａｌ＝バリン
Ｔｒｐ（フォルミル）＝Ｌ＝トリプトファン（側鎖ＮＩｎホルミル保護）
ＴＴＤ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミン
Ｔｙｒ（ＢｒＺ）＝Ｌ−チロシン（側鎖２−ブロモベンジルオキシカルボニル−保護）
Ｖｃ＝中心コンパートメントの分布容量
【０２３２】
（実施例１）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−０の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ）を合成した。完全長合成タンパク質（“ＳＥＰ−０（１−１６６）”と呼ばれる）の配列は：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：１）
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されたシステインからなる非天然アミノ酸残基を指す。ＳＥＰ−０タンパク質は溶液中で４個のポリペプチドセグメントから合成される：
セグメントＳＥＰ−０：１（ＧＲＦＮ１７１１；配列番号：１の残基１−３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ　ＥＨ−チオエステル
セグメントＳＥＰ−０：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：１の残基３３−８８からなる）
ＣＳＬＮＥＫＩＴＶＰ　ＤＴＫＶＮＦＹＡＷＫ　ＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥ
ＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥ　ＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶ　ＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここでＣｙｓ３３がＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：１の残基８９−１１６からなる）：
ＣＰＬＱＬＨＶＤＫＡ　ＶＳＧＬＲＳＬＴＴＬ　ＬＲＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここでＣｙｓ８９がＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：４（ＧＲＦＮ１７１４、配列番号：１の残基１１７−１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＳ　ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ　ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ
ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ　ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＣ−末端システイン（Ｃｙｓ１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を担う）
【０２３３】
ペプチドＳＥＰ−０：１及びＳＥＰ−０：２及びＳＥＰ−０：３は、チオエステル生成樹脂上で、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）化学的処理のためのｉｎ　ｓｉｔｕ（現場）中和プロトコル、及び確立されたＳＰＰＳ、側鎖保護及びチオエステル樹脂戦略を使用する段階的固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって（ハッケン（Ｈａｃｋｅｎｇ）ら、ＰＮＡＳ（１９９９）９６巻：１００６８−１００７３ページ；及びシュノルツァ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９２）４０巻：１８０−１９３ページ）、ＡＢＩ４３３Ａ自動ペプチド合成器で、または手動鎖組立てによって合成するか、または商業的販売会社に注文し、そこから入手した。例えばＢｏｃ　ＳＰＰＳ保護基の標準セット、すなわち：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）；Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）；Ｃｙｓ（４ＭｅＢｚｌ）＆Ｃｙｓ（Ａｃｍ）；Ｇｌｕ（ｃＨｅｘ）；Ｈｉｓ（ＤＮＰ）；Ｌｙｓ（ＣＩＺ）；Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）；Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）；Ｔｒｐ（ホルミル）；Ｔｙｒ（ＢｒＺ）を使用した；Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎは側鎖が保護されていなかった。セグメントＳＥＰ−０：４は−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で同様に合成した。これらのペプチドを脱保護し、同時に、標準的Ｂｏｃ化学的処理法によりＨＦ／ｐ−クレゾールを用いて樹脂支持体から分離した；しかしＨＦ／ｐ−クレゾール中に取り出されない保護基を含むペプチド類では、保護基は保持された。上記ペプチド類を分取Ｃ４逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをＥＳ−ＭＳ（エレクトロスプレー　イオン化質量分析法）を使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【０２３４】
段階１：ライゲーション＃１　セグメントＳＥＰ−０：４及びセグメントＳＥＰ−０：３をＴＦＥに１５ｍＭ濃度で溶解した。６Ｍ塩化グアニジン及び１％チオフェノールを含む飽和燐酸緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、ペプチドセグメント類の澄明溶液を生成した。ライゲーション後、ライゲーション混合物を、２５％β−メルカプトエタノールを含む、２ｍｌＴＦＥ（トリフルオロエタノール）、６ｍｌ６Ｍ塩化グアニジン、１００ｍＭ燐酸塩の溶液に加え、２０分間インキュベートした。この溶液を、氷酢酸中１５ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ）溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム（直径１インチ）上に注入した。ペプチド類をその後分取勾配逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望の結合産物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
【０２３５】
段階２：Ａｃｍ−除去＃１　Ａｃｍを除去するために、集めたフラクションＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むアセトニトリル水溶液を１×ＨＰＬＣ級水で希釈し、固体尿素を最終濃度２モルになるまで加えた。３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ　Ｈｇ（ａｃｅｔａｔｅ）２溶液を３倍モル過剰（総推定システイン濃度に対して）加え、その溶液を１時間撹拌する。上記溶液をβ−メルカプトエタノール中２０％にし、半−分取逆相ＨＰＬＣカラム上に注入し、段階的勾配で精製した。所望生成物ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２３６】
段階３：ライゲーション＃２　等量のＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４及びＳＥＰ−０：２を生のＴＦＥに１５ｍＭ濃度で一緒に溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウム及び１％チオフェノールを含む２５０ｍＭ燐酸緩衝液を加え、上記ペプチドセグメントの澄明溶液を生成した。１日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物を１０ｍｌＴＦＥ、１０ｍｌβ−メルカプトエタノール、１０ｍｌピペリジン及び２０ｍｌ　６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ４、の溶液に加え、２０分間インキュベートして残っている全ての保護基を除去した。上記溶液を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＥＰの溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラム上に置き、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２３７】
段階４：カルボキシメチル化　ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４をＴＦＥ中に１５ｍＭ濃度になるように溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウムを含む２００ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．９）の２倍過剰（ｖ／ｖ）を加えると、ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。最小量のメタノールに溶解した２５倍過剰のブロモ酢酸を加え、その溶液を２時間反応させた。上記溶液を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＥＰの溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラムに置き、段階的勾配で精製した。所望のカルボキシメチル化生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋ＥｔをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
【０２３８】
段階５：ピコリル除去　亜鉛ダストを２Ｍ　ＨＣｌ中で３０分間活性化した。ペプチドＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔを生のＴＦＥに約１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解した。その溶液を３５ｍｇ／ｍｌＬ−メチオニン及び３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシン（すなわちＮ−ドデカノイルサルコシン　ナトリウム）を含む（調製時に加える）４×（ｖ／ｖ、ＴＦＥに対して）６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭアセテート、ｐＨ４、で希釈した。溶液を活性化Ｚｎ粉末に加えた。反応を〜１時間間隔でモニターし、５時間後に完了した。完了後、上澄液を分離し、残るＺｎ粉末を、３５ｍｇ／ｍｌＬ−メチオニン及び３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシンを含み、２０％ＴＦＥを含む６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ４、１００ｍＭアセテートで５分間、２度洗い、２０％β−メルカプトエタノールを含む同じ溶液で１度洗った。合一した生成物を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰの溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラム上に置き、段階的勾配で精製した。所望の修飾生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−ＰｉｃｏをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
【０２３９】
段階６：Ａｃｍ−除去＃２　プールしたＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏの溶液を３×ＨＰＬＣ級水で希釈し、固体尿素を最終濃度２モルになるまで加えた。３％酢酸水溶液に３倍モル過剰（総推定システイン濃度に対して）の３０ｍｇ／ｍｌ　Ｈｇ（アセテート）２溶液を溶解した溶液を加え、その溶液を１時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプトエタノール２０％にし、半−分取逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、段階的勾配で精製した。所望生成物ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ＋Ｐｉｃｏを含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、２×（ｗ／ｗ、ペプチド重量に対して）ＤＰＣ（ドデシルホスホコリン）を含む水２倍量（ｖ／ｖ）で希釈し、一晩凍結乾燥した。
【０２４０】
段階７：ライゲーション＃３　等量のＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ＋Ｐｉｃｏ及びＳＥＰ−０：１を生のＴＣＥＰに１５ｍＭ濃度で一緒に溶解し、６Ｍ塩化グアニジニウムを含む２５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加える。その溶液に１％チオフェノールを加えた。１日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物を、１０ｍｌＴＦＥ、１０ｍｌβ−メルカプトエタノール、１０ｍｌピペリジン及び２０ｍｌ６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ４、の溶液に加え、２０分間インキュベートし、残っている保護基を除去した。溶液を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰの溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラム上に置き、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−０（１−１６６）：（配列番号１）を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析法によって同定し、２×（ｗ／ｗ、ペプチド重量に対して）ドデシルサルコシンを含む２倍量（ｖ／ｖ）の水で希釈し、凍結乾燥した。
【０２４１】
段階８　折りたたみ：完全長結合ペプチドＳＥＰ−０（１−１６６）を、６Ｍ塩化グアニジニウム及び２０％ＴＦＥ及び１０倍モル過剰（タンパク質中のＣｙｓ残基に対して）のシステインを含む２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した。この溶液を、３Ｍ塩化グアニジニウムを含む２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）の溶液に対して室温で一晩透析した。上記溶液をその後１Ｍ塩化グアニジニウムを含む２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）溶液に対して４℃で４時間再び透析し、最後に１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で４時間透析すると最終的折りたたみ生成物が得られた。折りたたみはエレクトロスプレーＥＳ−ＭＳ及びＣＤ（円二色性）分光法によって証明された。
【０２４２】
段階９　精製：折りたたまれたポリペプチドをセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）コンセントレータバイアル中で５倍に濃縮し、１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７．０で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ　Ｓ　カチオン交換カラム上に注いだ。折りたたまれたタンパク質を、５００ｍＭ　ＮａＣｌまでの直線塩勾配で１０分間溶出した。所望の折りたたまれた生成物ＳＥＰ−０（１−１６６）を含むフラクションをＳＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって同定し、凍結し、−８０℃で保存した。折りたたまれたタンパク質生成物の分析的逆相ＨＰＬＣクロマトグラム及びＥＳ−ＭＳスペクトル並びにＣＤスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【０２４３】
（実施例２）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
第二の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ３０と呼ばれる）は、ＳＥＰ−０の２４及び１２６の位置にオキシム形成基を含むように合成された。これらの基を用いてＳＥＰ−１−Ｌ３０を形成した；このタンパク質ではＳＥＰ−１−Ｌ３０では直鎖（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ−）１８カルボン酸塩（ＥＤＡ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン、ＴＴＤとも呼ばれる；Ｓｕｃｃ＝−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−）ポリマーがタンパク質の主鎖に結合している。完全長ＳＥＰ−１−（１−１６６）の配列を次に示す：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
上記配列中、ψはスルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し；ＫＯＸは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合を介して結合したオキシムリンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを指す。ＳＥＰ−１−Ｌ３０の構造も図１７に示される。
【０２４４】
以下に述べるＳＥＰ−１−Ｌ３０の化学的合成を説明するスキームが図１６に示される。つまり、図１６Ａ及び１６Ｂにおいて、水溶性ポリマーＧＲＦＮ３２（ＧＰ３２）がオキシム結合形成化学的ライゲーション反応によってペプチドＳＥＰ−１：１及びＳＥＰ−１：４に結合する。示されているように、ペプチドＳＥＰ−１：１は位置３２に、その後の天然型化学的ライゲーションのためのヒスチジン　アルファ−カルボキシル　チオエステルからなるＣ−末端Ｙａａ基を担い、位置２４には非天然リジン残基（その側鎖は化学的に改変され、アミノオキシアシル部分を含んでなるＵｎ＝１基を有する）を担う。最終的完全長生成物の位置１に相当するＮ−末端アラニンが参照のため示される。ペプチドＳＥＰ−１：４は位置１１７にシステインを含む非保護Ｎ−末端Ｘａａ基を有し、Ｕｎ＝１基は位置１２６（天然ヒトＥＰＯのグリコシル化部位）にアミノオキシアシルで改変されたリジンを、位置１６１にピコリル基で保護された側鎖チオールを有するシステイン（ジスルフィド形成システイン）を含んでなる。Ｃｙｓ１６１は保護され、天然型化学的ライゲーション部位のために行われるその後のシステイン変換時のチオアルキル化は阻止される（図１６Ｄ参照）；また、ピコリル保護基を使用するのは、その除去が、最初の天然型化学的ライゲーション反応におけるＡｃｍ（アセタミドメチル）保護システインを除去するために必要な条件に直交的であるからである（図１６Ｃ参照）。位置２４及び位置１２６におけるＧＰ３２ポリマー構成物の部位特異的及び排他的付加は、オキシム形成化学的ライゲーションによって行われ、精密なポリマー修飾ペプチドＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２及びＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２を生成する。図１６ＣはＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の、ミドルペプチドセグメントＳＥＰ−１：３への天然型化学的ライゲーションと、ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の生成を示す。その結合部位はＬｙｓ１１６及びＣｙｓ１１７である。示されるように、ペプチドＳＥＰ−１：３は位置８９に、Ａｃｍ保護システインを含むＮ−末端Ｘａａ基を含み、位置１１６にはリジン　アルファ−カルボキシル　チオエステルを含むＣ−末端Ｙａａ基を含む。天然型化学的ライゲーション後、Ａｃｍ保護基は除去され、このライゲーション生成物は次のライゲーション反応のために使われる。図１６ＤはＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の、ミドルペプチドセグメントＳＥＰ−１：２への天然型化学的ライゲーション、及びＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の生成を示す。その結合部位はＴｒｐ８８及びＣｙｓ８９である。示されるように、ペプチドＳＥＰ−１：２は位置３３にＡｃｍシステインを含むＮ−末端Ｘａａ基、及び位置８９にトリプトファン　アルファ−カルボキシル　チオエステルを含むＣ−末端Ｙａａ基を有する。天然型化学的ライゲーション後、ライゲーション生成物をブロモ酢酸にさらし、ライゲーション部位システイン８９及び１１７の側鎖チオールをカルボキシメチル化し、それらを擬似グルタミン酸に変換する。カルボキシメチル化後、Ａｃｍ及びピコリル保護基を除去し、この非保護、ポリマー修飾ライゲーション産物を次のライゲーション反応に使う。図１６ＥはＳＥＰ−１−：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２の、ペプチドセグメントＳＥＰ−１１＋ＧＰ３２（完全長生成物のＮ−末端セグメントに相当する）への天然型化学的ライゲーション、及び完全長ＳＥＰ−１−Ｌ３０生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ＋１：４＋ＧＰ３２の生成を示す；その最後のライゲーション部位はＨｉｓ３２とＣｙｓ３３である。示されるように、完全長ＳＥＰ−１−Ｌ３０生成物はユーザーが決めた部位、すなわち天然ヒトＥＰＯの位置２４及び位置１２６に相当するグリコシル化部位だけに結合する２個の水溶性ポリマー（Ｇ３２）を含む。上記合成の詳細を次に記載する。
【０２４５】
Ａ．ＧＲＦＮ１７７６及びＧＲＦＮ１７１１とＧＲＦＮＰ３２とのオキシム化　オキシム形成を行い、アミノオキシアセチル基を担う水溶性ポリマーをケトンカルボニル基を担持するペプチドに結合した。これを実現するために下記のペプチドセグメントを合成した。：
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６；配列番号２の残基１１７−１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ　ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ　ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ
ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ　ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＬｙｓ１２６はε−アミノ基のレブリン酸残基で改変され、Ｃｙｓ１１７はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号２の残基１−３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４はレブリン酸残基で改変される）
【０２４６】
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）は実施例１におけるようにチオエステル生成樹脂上で合成し、ＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）は−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４及び１２６では最初はε−アミノ基がＦｍｏｃ基で保護されていた。鎖の組立ての完了後、Ｆｍｏｃ担持アミノ基は標準的Ｆｍｏｃ脱保護操作にしたがって脱保護され、各ペプチド樹脂それぞれへのレブリン酸の結合によって改変された。実施例１に記載したように上記ペプチドを脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した。これらペプチドを分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをＥＳ−ＭＳを使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。ＧＲＦＮＰ３２［−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボン酸塩］を標準的プロトコルにしたがってサスリン（Ｓａｓｒｉｎ）カルボキシル生成樹脂上で組立てた（ローズ（Ｒｏｓｅ，Ｋ．）ら、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）。アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分を、活性化Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸の５倍過剰をカップリングすることによって、上記ポリマーのＮ−末端アミノ基に付加した。古典的Ｆｍｏｃ−化学操作を使用してポリマー鎖を樹脂支持体から切り離した。上記ポリマー鎖を分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋ポリマーを含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【０２４７】
セグメントＳＥＰ−１：４及びＧＲＦＮＰ３２を一緒に等モル比で、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２４８】
セグメントＳＥＰ−１：１及びＧＲＦＮＰ３２を一緒に等モル比で、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２４９】
Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ３０を溶液中で４ポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１−３２に相当する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４ではε−アミノ基が、ＫＯＸとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合によってＧＲＦＮＰ３２にカップリングしたレブリン　オキシム　リンカー基で改変されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に相当する）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここでＣｙｓ３３はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に相当する）：
ＣＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここではＣｙｓ８９がＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１１７−１６６に相当する）：
ＣＡＩＳ　ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ　ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＬｙｓ１２６ではε−アミノ基が、ＫＯＸと示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム基によってＧＲＦＮＰ３２にカップリングするレブリン　オキシム　リンカー基で改変されており、Ｃ−末端システインはピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を担持する）
【０２５０】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製を実施例１の記載のように行って、完全長の、折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｌ３０を得た。上記折りたたまれたタンパク質生成物の分析的逆相ＨＰＬＣクロマトグラム及びＥＳ−ＭＳスペクトル並びにＣＤスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【０２５１】
（実施例３）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
第三の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ２６と呼ばれる）を、ＳＥＰ−０の位置２４及び１２６にオキシム形成基を含むように合成した。これらの基を使ってＳＥＰ−１−Ｌ２６を形成した；その際直鎖ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボン酸塩及び（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）６−アミドがタンパク質主鎖の位置２４及び１２６にそれぞれオキシム結合によって連結した。完全長ＳＥＰ−１（１−１６６）の配列を次に示す：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基をあらわし、ＫＯＸは、ε−アミノ基が、“オキシム結合によって指定の水溶性ポリマーにカップリングしたオキシムリンカー基”で化学的に改変されている非天然リジンをあらわす。
ＳＥＰ−１−Ｌ３０とは異なり、ＳＥＰ−１−Ｌ２６構成物は位置１２６に結合した比較的小さい、電荷をもたない水溶性ポリマーを担うように設計された。位置２４に付加するポリマーはＳＥＰ−１−Ｌ３０と同じであった。完全長生成物の組立ては実施例２の記載と同様であった。ＳＥＰ−１−Ｌ２６の構造は図１８に示される。
【０２５２】
Ａ．ＧＲＦＮＰ６によるＧＲＦＮ１７７６のオキシム化、及びＧＲＦＮＰ３２によるＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
オキシム形成を行い、アミノオキシアセチル基を担う水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を担うペプチドに結合した。これを実現するために下記のペプチドセグメントを合成した：
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６；配列番号：２の残基１１７−１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ　ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ　ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ
ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ　ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＬｙｓ１２６は、ε−アミノ基がレブリン酸残基で改変され、Ｃｙｓ１１７はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１−３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４はレブリン酸残基で改変されている）
【０２５３】
実施例１と同様にセグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）は、チオエステル生成樹脂上で、セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）は−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂上で合成された。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４及び１２６は先ず最初にε−アミノ基をＦｍｏｃで保護された。鎖組立ての完了後、Ｆｍｏｃを担うアミノ基を、標準的Ｆｍｏｃ保護基除去法によって脱保護し、標準的カップリング　プロトコルによって、各ペプチド樹脂にそれぞれレブリン酸を付加することによって改変した。それから上記ペプチドを脱保護し、同時に実施例１と同様のＢｏｃ化学操作によって樹脂支持体から切り離した。これらペプチドを別々に分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。各ペプチドについて、純粋ペプチドを含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【０２５４】
水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８カルボン酸塩（ＧＲＦＮＰ３２）をサスリン　カルボキシ生成樹脂上で標準的プロトコルにしたがって組み立てた（ローズら、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）。水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）６−アミド（ＧＲＦＮＰ６）を下記の標準プロトコルにしたがってシーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）アミド−生成樹脂上で組み立てた（ローズら、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）。活性化Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸の５倍過剰をカップリングすることによって、アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分を各樹脂結合ポリマーのＮ−末端アミノ基に付加した。古典的Ｆｍｏｃ化学操作を使って、２つのポリマー鎖を別々にそれぞれの樹脂支持体から切り離した。各ポリマー鎖を分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。各ポリマーで、純粋ポリマーを含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【０２５５】
セグメントＳＥＰ−１：４及びＧＲＦＮＰ６を等モル比で一緒に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液をその後凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ６を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
セグメントＳＥＰ−１：１及びＧＲＦＮＰ３２を等モル比で一緒に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶液をその後凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、ポリマー修飾ペプチドを分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２５６】
Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ２６を溶液中で４ポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１−３２に相当する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４はε−アミノ基のところで、ＫＯＸとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合によってＧＲＦＮＰ３２にカップリングしているレブリンオキシム　リンカーで改変されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に相当する）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここではＣｙｓ３３はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に相当する）：
ＣＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここではＣｙｓ８９はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ６（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ６、配列番号：２の残基１１７−１６６に相当する）：
ＣＡＩＳ　ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ　ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＬｙｓ１２６は、ε−アミノ基が、ＫＯＸとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合によってＧＲＦＮＰ６にカップリングしているレブリン　オキシム　リンカー基で改変され、Ｃ−末端システイン［すなわちＣｙｓ１６１］はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を担う）
【０２５７】
その他のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製が実施例１及び２に記載のように実施され、完全長の折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｌ２６を与える。折りたたまれたタンパク質生成物の分析的Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラム及びＥＳ−ＭＳスペクトル並びにＣＤスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【０２５８】
（実施例４）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
第四の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５０と呼ばれる）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５０のアミノ酸配列はＳＥＰ−１−Ｌ３０のそれと同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し；ＫＯＸは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム　リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
【０２５９】
しかし、上記タンパク質をＳＥＰ−１−Ｌ３０の直鎖（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）１８ポリマーでなく、４個の直鎖（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）１２を有する枝分かれポリマー構成物で誘導体化した。誘導体化はオキシム結合によって行われた。
【０２６０】
図１９は以下に詳細に説明するように、オキシム形成ライゲーションによってＳＥＰ−１−Ｂ５０に連結した枝分かれ水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ２９（ＧＰ２９）の化学的合成を図示するスキームである。図１９に示すように、直交的に保護されたリジンＵ−Ｂ前駆体を使用してＵ基としてアミノオキシアセチルを担持し、４個のペンダント　チオール基を担う３×リジン枝分かれコアＢを有するＵ−Ｂ成分ＧＲＦＮ１７（ＧＰ１７）を生成した。上記４個のペンダントチオール基はその後チオエーテル結合によってＧＰ２９と呼ばれる直鎖水溶性ポリアミドエチレンオキシド構成物（これは琥珀酸残基によって与えられるペンダントカルボン酸塩を担う）にカップリングする。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の構造は図２０に示される。
【０２６１】
Ａ．複数のチオール基を担うテンプレートＧＲＦＮＰ１７の合成
テンプレートＧＲＦＮＰ１７をアミド生成（４−メチル）ベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）−樹脂上で０．４ｍｍｏｌ規模で手で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを標準的カップリングプロトコルを使用してカップリングした（シュネルツァー（Ｓｃｈｎ　ｌｚｅｒ）Ｉｎｔ．Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．（１９９２）４０巻、１８０−９３ページ）。０．５Ｍ　ＨＢＴＵ３．８ｍｌ中２．１ｍｍｏｌアミノ酸、１０％ＤＩＥＡを使用した；すなわち５倍過剰のアミノ酸を使用した。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをカップリングした（０．５Ｍ　ＨＢＴＵ３．８ｍｌ中２．１ｍｍｏｌアミノ酸、１０％ＤＩＥＡ；すなわち５倍過剰のアミノ酸）。第二のＦｍｏｃ除去段階後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを標準的アミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした（０．５Ｍ　ＨＢＴＵ７．６ｍｌ中４．２ｍｍｏｌアミノ酸、１０％ＤＩＥＡ；すなわち遊離アミンに対して５倍過剰のアミノ酸）。最後のＦｍｏｃ脱保護段階後、ＤＭＦ中の５倍過剰の（遊離アミンに対して）Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ｏＰｆｐ）を３０分間カップリングした。生のＴＦＡで１分間づつ２回バッチ洗浄することによって、Ｃ−末端リシル残基の側鎖のＢｏｃ保護基を除去し、その後ＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡで洗うことによって上記樹脂を中和した。２ｍｍｏｌＢｏｃ−アミノオキシ酢酸と２ｍｍｏｌＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を３ｍｌのＤＭＦに溶解した。２ｍｍｏｌＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）の添加後、上記酸を３０−６０分間活性化した。その溶液を、中和した上記樹脂に加え、１時間カップリングした。最後にＳ−結合アセチル基をＤＭＦ中２０％ピペリジンで３０分間除去した。遊離アルデヒドの掃去剤としてのシステインの存在下で、標準的Ｂｏｃ−化学的操作によりＨＦ／ｐ−クレゾールを使用してテンプレートを脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した（シュネルツァー、Ｉｎｔ．Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．（１９９２）４０巻：１８０−９３ページ）。５０％Ｂ［すなわち０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液］（アルデヒドを含まず）中の回収ポリアミドを凍結乾燥した。精製のために、テンプレート粗生成物を２ｍｌ５０％Ｂに溶解し、１００％Ａ［すなわち０．１％ＴＦＡ水溶液］１００ｍｌを加えてサンプルを希釈した（アルデヒドの添加が保証されているから、グアニジニウム塩化物またはグアニジニウム　アセテートの添加は避ける）。３％Ｂ、Ｔ＝４０℃で平衡化したＣ４分取逆相ＨＰＬＣカラム上にテンプレートを載せた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレート、ＧＲＦＮＰ１７を直線勾配で精製した。所望生成物を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２６２】
Ｂ．枝分かれ水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ２９の合成
ＧＲＦＮＰ２９、１５ｋＤａ分子量を有する枝分かれ（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２ポリマー、を精製チオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７および直鎖ポリマーＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２カルボン酸塩のチオエーテル生成結合によって合成した；その際ＧＲＦＮＰ３１はサスリン　カルボキシ生成樹脂上で標準的プロトコルにしたがって合成された（ローズら、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；ローズら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１巻：７０３４ページ）。
【０２６３】
１．３モル過剰（総チオールを上回る）の精製ＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２、及び精製チオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７を一緒に、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ／６Ｍグアニジニウム塩化物（ｐＨ８．７）に　〜１０ｍＭ濃度で溶解した。溶解後、溶液を０．１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．７緩衝液で３倍（ｖ／ｖ）に希釈した。上記ライゲーション混合物を室温で撹拌し、反応を逆相ＨＰＬＣ及びＥＳ−ＭＳによってモニターした。追加的ＧＲＦＮＰ３１反応体を必要なバイアスで加え、所望の反応生成物が主要生成物になるようにした。仕上げのために３×（ｖ／ｖ、ライゲーション混合物に対して）０．１Ｍアセテート／６Ｍグアニジニウム塩化物（ｐＨ４）を加え、その溶液を分取逆相ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、直線勾配で精製した。純粋ＧＲＦＮＰ２９構成物を含むフラクションをＥＳ−ＭＳを使って同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２６４】
Ｃ．ＧＲＦＮ１７７６及びＧＲＦＮ１７１１のＧＲＦＮＰ２９によるオキシム化
セグメントＳＥＰ−１：４及びセグメントＳＥＰ−１：１を実施例２に記載のように合成した。セグメントＳＥＰ−１：４及びＧＲＦＮＰ２９を等モル比で一緒に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。その溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末を分取逆相ＨＰＬＣカラム（１インチ直径）に載せた。ポリマー修飾ペプチドを分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ２９を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
セグメントＳＥＰ−１：１及びＧＲＦＮＰ２９を一緒に等モル比で、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。乾燥した粉末を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、分取ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）カラム（１インチ直径）上に載せた。ポリマー修飾ペプチドをアイソクラチック溶出によって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ２９を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
【０２６５】
Ｄ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
ＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）を溶液中で４ポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号：２の残基１−３２に相当する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４はε−アミノ基が、ＫＯＸとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合によってＧＲＦＮＰ２９に結合したレブリン　オキシム　リンカー基で改変されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３−８８に相当する）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここではＣｙｓ３３はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に相当する）：
ＣＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここではＣｙｓ８９はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号：２の残基１１７−１６６に相当する）；
ＣＡＩＳ　ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ　ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＬｙｓ１２６は、ε−アミノ基が、ＫＯＸとして示されるレブリン−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合によってＧＲＦＮＰ２９に結合したレブリン　オキシム　リンカー基で改変されており、Ｃ−末端システインはピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を担う）
【０２６６】
その他のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ、及び精製は、精製がリソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）Ｑカラム上で行われたこと以外は、実施例１及び実施例２に記載のように行われ、完全長、折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）を得た。折りたたまれたタンパク質生成物ＳＥＰ−１−Ｂ５０の分析的Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラム及びＥＳ−ＭＳ並びにＣＤスペクトルは折りたたまれたタンパク質の存在を証明した。
【０２６７】
（実施例５）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−３−Ｌ４２の合成
第五の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−３−Ｌ４２と呼ぶ）を合成した。完全長ＳＥＰ−３のアミノ酸配列は次の通りである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＣＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＡＣＳＳＱＰＷＥＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＣＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：３）
位置：２４、３８、８３及び１２６のシステイン残基をマレイミド官能化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８（ＧＲＦＮＰ３２）ポリマー単位で修飾し（マイケル付加反応による）、ＳＥＰ−３−Ｌ４２を生成した。ＳＥＰ−３−Ｌ４２の構造は図２２に示される。
【０２６８】
下に記載するＳＥＰ−３−Ｌ４２の化学的合成を説明するスキームは図２１に示す。つまり、図２１Ａおよび２１ＢはＳＥＰ−３：１からＳＥＰ−３：４までの４個のＳＥＰ−３−Ｌ４２ペプチドセグメントの天然型化学的ライゲーションを示す。そのライゲーションは、ヒトＥＰＯの４個全ての天然グリコシレーション部位に相当するライゲーション部位にシステインを生成する。特に、図２１Ｂは全て保護されたジスルフィド形成システインを有する完全長ポリペプチドを示し、４個の帯電直鎖水溶性ポリマー（ＧＲＦＮ３２−マレイミド（ＧＰ３２−マレイミド）と呼ばれる）がマイケル付加反応によってシステインライゲーション部位に部位特異的に結合できる。図２１Ｂはジスルフィド形成システインの最終的脱保護段階と完全長、ポリマー修飾生成物の生成も示す。
【０２６９】
詳細に述べれば、ＳＥＰ−３を溶液中で４ポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−３：１（ＧＲＦＮ１７４７、配列番号の残基１−３７に対応する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥ−チオエステル（ここでＣｙｓ７、Ｃｙｓ２９、及びＣｙｓ３３はＡｃｍで保護されている）
セグメントＳＥＰ−３：２（ＧＲＦＮ１７７４、配列番号３の残基３８−８２に対応する）：
ＣＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ　ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＡ−チオエステル（ここでＣｙｓ３８はＡｃｍ基で保護された側鎖である）
セグメントＳＥＰ−３：３（ＧＲＦＮ１７４９、配列番号：３の残基８３−１２５に相当する）：
ＣＳＳＱＰＷＥＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ
ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ　ＰＰＤＡＡ−チオエステル（ここではＣｙｓ８３がＡｃｍ基で保護された側鎖である）
セグメント−３：４（ＧＲＦＮ１７５０、配列番号：３の残基１２６−１６６に相当する）：
ＣＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここではＣｙｓ１６１はＰｂｏ［すなわち４−（ＣＨ３Ｓ（Ｏ）−）ベンジル−］で保護されている）
【０２７０】
ペプチド合成：ペプチドＳＥＰ−３：１及びＳＥＰ−３：２及びＳＥＰ−３：３を、チオエステル生成樹脂上で、Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳのためのｉｎ　ｓｉｔｕ中和プロトコルによって、実施例１に記載したような確立された側鎖保護戦略を用いて（上記の特定のペプチドについて記したように保護基戦略に変化を加えて）、合成した。セグメントＳＥＰ−３：４は−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂上で同様に合成した。上記ペプチド類は実施例１に記載したように、脱保護し、同時に樹脂支持体から切り離した。上記の生成したペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。純粋ペプチドを含むフラクションをＥＳ−ＭＳを使用して同定し、集め、その後のライゲーションのために凍結乾燥した。
【０２７１】
段階１：ライゲーション＃１。セグメントＳＥＰ−３：４及びセグメントＳＥＰ−３：３をＴＦＥに１５ｍＭ濃度で溶解した。６Ｍグアニジニウム塩化物及び１％チオフェノールを含む飽和燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えるとペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。ライゲーション後、ライゲーション混合物（１容量とする）を２容量の｛２ｍｌＴＦＥ、６ｍｌ６Ｍグアニジニウム塩化物、１００ｍＭ燐酸塩、２５％β−メルカプロエタノールを含む｝溶液に加え、２０分間インキュベートした。溶液を氷酢酸中１５ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、直線勾配で精製した所望の結合産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集めた。
【０２７２】
段階２：Ａｃｍ−除去＃１　Ａｃｍを除去するために、プールしたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を１×ＨＰＬＣ級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度２モルになるまで加えた。３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌＨｇ（アセテート）２溶液を３倍モル過剰（期待される総システイン濃度に対して）に加え、その溶液を１時間撹拌した。その後上記溶液をβ−メルカプトエタノール２０％にし、半−分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、段階的勾配で精製した。所望結合産物ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７３】
段階３：ライゲーション＃２　等量のＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４及びＳＥＰ−３：２を一緒に、１５ｍＭ濃度で生のトリフルオロエタノールに溶解し、１％チオフェノールを加えると、上記ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。１日ライゲーションを行った後、ライゲーション混合物（１容量とする）を１０ｍｌＴＦＥ、１０ｍｌβ−メルカプロエタノール、１０ｍｌピペリジン及び２０ｍｌ＆Ｍグアニジニウム、ｐＨ４、の溶液２容量に加え、２０分間インキュベートし、残っている保護基を全て除去した。上記溶液を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、直線勾配で精製した。所望の結合産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７４】
段階４：Ａｃｍ除去。Ａｃｍを除去するために、ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むアセトニトリル水溶液を１×ＨＰＬＣ級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度２モルになるまで加えた。３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌＨｇ（アセテート）２溶液を３倍モル過剰（期待される総システイン濃度に対して）に加え、その溶液を１時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプロエタノール２０％にし、Ｃ４半分取逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、段階的勾配で精製した。所望の結合産物ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７５】
段階５：ライゲーション＃３　等量のＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４及びＳＥＰ−３：１を一緒に１５ｍＭ濃度で生のＴＦＥに溶解した。６Ｍグアニジニウム及び１％チオフェノールを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えると上記ペプチドセグメントの澄明溶液が生成した。１日ライゲーションを行った後、ライゲーションミックス（１容量とする）を１０ｍｌＴＦＥ、１０ｍｌβ−メルカプロエタノール、１０ｍｌピペリジンおよび２０ｍｌ６Ｍグアニジニウム、ｐＨ４、の溶液２容量に加え、２０分間インキュベートして残っている保護基を除去した。上記溶液を２０％酢酸水溶液中１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰの溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、直線勾配で精製した。所望結合産物ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７６】
段階６：ポリマーＧＲＦＮＰ３２の付加。ＧＲＦＮＰ３２−マレイミドと呼ばれるマレイミド官能化直鎖（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８ポリマーを次のように合成した：ＧＲＦＮＰ３２を、メーカーのプロトコルにしたがってＢＭＰＳ（３−マレイミド　プロピオン酸ＮＨＳエステル、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＵＳＡ）で官能化し、マレイミド官能化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８ポリマー［すなわちマレイミド−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１８］を形成した。ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を必要最小量のＴＦＥに溶解した。３倍過剰のＧＲＦＮＰ３２−マレイミドを６Ｍグアニジニウム塩化物、１００ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７．５、に溶解し、ＴＦＥ溶液に加えた。マイケル付加反応の進行を分析的逆相ＨＰＬＣによって辿った。反応が完了した後、この溶液を分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、直線勾配で精製した。所望のポリマー修飾産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ｐＰＥＧ［すなわちＣｙｓ２４、Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ８３及びＣｙｓ１２６の側鎖チオールに結合したＧＲＦＮＰ３２の４コピーを有する結合完全長１６６残基ポリペプチド鎖であり、このためＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２とも呼ばれる］を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７７】
段階７：Ｐｂｏの除去　Ｐｂｏを還元するために、ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２を、５％エタンジチオールを含む生のＴＦＡに溶解した。Ｐｂｏ基を、１０％チオアニソール及び１５％ブロモトリメチルシランの添加によって３０分間切り離した。上記溶液を回転蒸発器で乾燥し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル水溶液に取った。生成した溶液を半−分取逆相ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、段階的勾配で精製した。所望Ｃｙｓ１６１−脱保護産物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏを含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７８】
段階８：Ａｃｍ除去。Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ２９、及びＣｙｓ３３の側鎖からの最終的Ａｃｍ除去のために、プールしたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏフラクションを含むアセトニトリル水溶液を１×ＨＰＬＣ級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度２モルになるまで加えた。３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌＨｇ（アセテート）２溶液を３倍モル過剰（期待される総システイン濃度に対して）に加え、その溶液を１時間撹拌した。上記溶液をβ−メルカプトエタノール２０％にし、半−分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに載せ、段階的勾配で精製した。所望の結合ポリマー修飾産物ＳＥＰ−３（１−１６６）をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。
【０２７９】
段階９：折りたたみ：完全長結合、ポリマー修飾ペプチドＳＥＰ−３（１−１６６）を、６Ｍグアニジニウム塩化物及び２０％ＴＦＥ及び１０倍モル過剰（ＳＥＰ−３のＣｙｓ残基に対して）のシステインを含む２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した。この溶液を３Ｍグアニジニウム塩化物を含む２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）の溶液に対して室温で一晩透析し、最後に１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で４時間透析し、最終的折りたたみ生成物を得た。折りたたみはエレクトロスプレーＥＳ−ＭＳ及びＣＤスペクトロメトリーによって確認された。
【０２８０】
段階１０　精製：折りたたまれたポリペプチドはセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）コンセントレータ　バイアル中で５倍に濃縮され、１０ｍＭ燐酸塩（ｐＨ７．０）で平衡化したリソースＳ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｓ）カチオン交換カラムに置かれる。折りたたまれたタンパク質は５００ｍＭＮａＣｌまでの直線塩勾配で１０分間溶出された。所望の折りたたまれた産物ＳＥＰ−３−Ｌ４２を含むフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、凍結して−８０℃で保存した。
【０２８１】
（実施例６）
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性のアッセイ
折りたたまれた合成赤血球産生刺激タンパク質、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、及びＳＥＰ−３−Ｌ４２の生物活性をＵＴ／７及び３２Ｄ　１０３１９７細胞系を使用し、対照標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いる因子依存性（ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞系増殖アッセイによって測定した。ＵＴ−７は、インターロイキン−３、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）の一つに絶対的に依存して増殖および生存するヒト巨核芽球性白血病細胞系である（ミウラ　Ｙ、ら、Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ（１９９８）９９巻：１８０−１８４ページ）；コマツ　Ｎ、ら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（１９９１）５１巻：３４１−８ページ）。３２Ｄ　１０３１９７はネズミ赤血球産生細胞系である（メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ）Ｉｎｔ．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９９２）１０巻：１１６−２５ページ）。
【０２８２】
ＳＥＰ構成物の保存溶液をイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、グルタミン及びペンストレプ（Ｐｅｎｓｔｒｅｐ）で作り、これらの保存溶液の２×希釈液をマルチウェル−プレートに加え、それに濃度５０００細胞／５０μｌのヒトＵＴ／７ＥＰＯ細胞を加えた。プレートを５％ＣＯ２の存在のもとで３７℃でインキュベートし、増殖を毎日モニターした。４日後、ＰＢＳ（燐酸緩衝食塩液）中２．５ｍｇ／ｍｌ　ＭＴＴ（メチルチアゾール　テトラゾリウム）２０μｌを加え、プレートを４時間インキュベートした。１５０μｌ　ＩＰＡを加え、各ウェルの吸光度を５６２ｎｍで読んだ。上記ＳＥＰ化合物類のＥＤ５０（最大効果の５０％に達する有効量）値を測定し、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）−細胞で産生されたｒｈＥＰＯ（組換えヒトエリスロポエチン）のそれと比較した。これらの実験の結果は、合成赤血球産生刺激タンパク質の全てが生物活性をあらわすことを証明した。ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０のＥＤ５０結果を表ＶＩに示す。
【０２８３】
表ＶＩ
【表５】
2004508338.tif 000014
【０２８４】
ポリマー修飾ＳＥＰ−１−Ｌ３０において吸光度によってタンパク質濃度を計算するために吸光係数を使用してペプチド含有量を標準化した際、これらの実験から得られるその他の結果をＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、ＳＥＰ−３−Ｌ４２及びＳＥＰ−１−Ｂ５１（ＳＥＰ−１−Ｂ５１化合物の合成は実施例７に説明される）について表ＶＩＩおよび図２８に示した。まとめて言うと、これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイは、ポリマー構造及び結合部位が変わるとｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活性に異なる効果があらわれることを示している。その際これらの化合物は（１）ヒトＥＰＯ受容体活性について試験した際には以下の相対的順序の効力を有し（最大効力から最小効力へ）：ＳＥＰ−１−Ｌ２６≒ＳＥＰ−１−Ｌ３０＞ＳＥＰ−１−Ｂ５０≒ＳＥＰ−１−Ｂ５１＞ＳＥＰ−３−Ｌ４２＞ＳＥＰ−０；そして（２）マウスＥＰＯ受容体活性について試験した際には以下の相対的順序の効力を有する（最大効力から最小効力へ）：ＳＥＰ−１−Ｌ２６＞ＳＥＰ−１−Ｌ３０＞ＳＥＰ−０＞ＳＥＰ−３−Ｌ４２＞ＳＥＰ−１−Ｂ５０≒ＳＥＰ−１−Ｂ５１。
【０２８５】
表ＶＩＩ
【表６】
2004508338.tif 000015
【０２８６】
表ＶＩＩおよび図２８の結果も、非ポリマー修飾構成物ＳＥＰ−０に比較してポリマー修飾ＳＥＰ構成物に対する受容体選択性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に非ポリマー修飾構成物ＳＥＰ−０に比較して有意差があることを示す。特に、ＳＥＰ−１−Ｌ２６は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位、位置２４（この部位に結合したペンダント負電荷を有する５．５ｋＤａ直鎖ポリマー）及び位置１２６（この部位に結合したペンダント中性電荷を有する１．８ｋＤａ直鎖ポリマー）に結合した異なる直鎖ポリマーで修飾されている；この構成物はヒト及びマウス受容体両方に同様の活性を有する。ＳＥＰ−１−Ｌ３０は対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位である位置２４及び１２６にペンダント負電荷を有する５．５ｋＤａ直鎖ポリマーで修飾されている；この構成物はマウス受容体と比較してヒト受容体に対して、約５倍より高い活性をもっていた。ＳＥＰ−３−Ｌ４２は対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位の位置２４、３８、８３及び１２６にペンダント負電荷を有する５．５ｋＤａ直鎖ポリマーで修飾され、この構成物はマウス受容体に比べてヒト受容体に対しては約１０倍の活性を有した。最大の差はＳＥＰ−１−Ｂ５０およびＳＥＰ−１−Ｂ５１に認められた。これらは対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位の位置２４及び１２６に結合した、枝分かれし、負電荷を有する１５ｋＤａポリマーで修飾され、約５のｐＩ（ヒトｐＩと同様）を有した；これら２構成物はマウス受容体に比べてヒト受容体に対して〜６０倍の活性を有した。
【０２８７】
マウスＥＰＯにはヒトＥＰＯ位置１２６に対応する位置にグリコシル化部位がないため（マウスＥＰＯは、ヒトＥＰＯに見られるＯ−グリコシル化セリンの代わりに非グリコシル化プロリンを有する）、異なる受容体活性は一部分はこの差によるものであり、こうしてマウス受容体が、対応する位置１２６にＯ−結合グリコシル化がないＥＰＯを優先的に選択するためである。これはＳＥＰ−１−Ｌ２６及びＳＥＰ−１−Ｌ３０と、ＳＥＰ−１−Ｂ５０及びＳＥＰ−１−Ｂ５２との比較と一致する。例えば、ＳＥＰ−１−Ｌ２６は位置１２６に１．８ｋＤａの帯電していないポリマーを有し、一方ＳＥＰ−１−Ｌ３０は位置１２６に５．５ｋＤａの負に帯電したポリマーを有する。ヒトＥＰＯ受容体に対しては等しい活性が認められたとはいえ、マウスＥＰＯ受容体に対しては４倍の差が見いだされた。最大の差は、対応するヒトＥＰＯグリコシル化部位の位置１２６に結合した負に帯電した１５ｋＤａポリマーを有するＳＥＰ−１−Ｂ５０及びＳＥＰ−１−Ｂ５１構成物で認められた。ＳＥＰ−３−Ｌ４２構成物の場合のようにヒトＥＰＯの４つの天然グリコシル化位置、すなわち２４、３８、８３および１２６全てに対応する部位に５．５ｋＤａの負に帯電したポリマーを付加すると、マウスに対する優先性はさらに減少したが、ＳＥＰ−１−Ｂ５０及びＳＥＰ−１−Ｂ５１構成物ほどではなかった。これらの結果は、受容体特異性が生物学的に産生するグリコシル化タンパク質のグリコシル化部位に相当する部位の精密な修飾によって、そして上記ポリマーの大きさ、枝分かれの性質および電荷を調整することによって調節できることを証明するものである。
【０２８８】
（実施例７）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５１の合成
Ａ．ＳＥＰ−１−１−Ｂ５１の組成。第六の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５１と呼ばれる）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−５１のアミノ酸配列はＳＥＰ−１−Ｂ５０のそれと同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し；ＫＯＸは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム　リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
しかしＳＥＰ−１−Ｂ５０とは異なり、このタンパク質は、アミド結合によってリジン枝分かれコアに結合した４本の直鎖（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−アラニノ−ＯＨ［すなわち（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａ−ＯＨ、または（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−Ａｌａ］ポリマーを有する枝分かれポリマー構成物で誘導体化された。上記直鎖ポリマーのアミド結合を介する枝分かれコアへのカップリングは安定性を改善するために設計された。４本の直鎖ポリマーもアラニン部分及びペンダント負電荷を担うように設計された；上記負電荷はシアリン酸を模し、アラニンは炭水化物鎖のペンダント糖部分に類似の疎水性を模する。枝分かれポリマー類は、上記枝分かれコアとタンパク質主鎖結合部位との間に水溶性スペーサを有し、枝分かれコア・テンプレートの合成及び取扱い特性を改善し、天然炭水化物鎖においてタンパク質主鎖への糖結合部位と上記炭水化物の第一の枝分かれ点との間に見いだされるスペーシングを模するように設計された。
図２３は、以下に説明するように、オキシム形成ライゲーションによってＳＥＰ−１−Ｂ５１に結合した枝分かれ水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ４１（ＧＰ４１）の化学的合成を説明するスキームである。完全長生成物の組立ては実施例２に記載した通りであった。ＳＥＰ−１−Ｂ５１の構造は図２４に示される。
【０２８９】
Ｂ．枝分かれテンプレート（ＧＲＦＮＰ４０）にカップリングする（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）の合成
直鎖ポリマー（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）を０．５ｍｍｏｌｅスケールで、サスリン酸不安定カルボン酸生成樹脂上で合成した。０．５ｍｍｏｌｅ（〜０．５グラム）サスリン酸不安定、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂（ヒドロキシ置換１．０２ｍｍｏｌｅ／ｇ）をＤＭＦ中で１５分間膨潤させ、それから水気をきった。このヒドロキシル官能化樹脂に、５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を含む８ｍｌのＤＭＦに溶解した４５０ｍｇ（４．５ｍｍｏｌｅ）琥珀酸無水物及び４８８ｍｇ（４ｍｍｏｌｅ）４−（ジメチルアミノ）ピリジンを加え、渦状に撹拌しながら３０分間反応させ、水気をきった。カップリングを繰り返し、過剰の反応体及び可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）で１分間渦流洗浄することによって除去し、それから水気をきった。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ中新鮮１．０Ｍ（８ｍｍｏｌｅ）ＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）溶液８ｍｌの添加によって活性化し、４０分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）で１分間渦流洗浄することによって除去し、水気をきった。ＤＭＦ中０．５Ｍ（２ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴ溶液４ｍｌに溶解した（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミン（ＴＴＤ）４ｍｌ（４グラム、１８．２ｍｍｏｌｅ）を加え、渦状に撹拌しながら３０分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体および可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍ）で１分間渦流洗浄することによって除去し、その後水気をきった。５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡを含む０．５Ｍ（４ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液８ｍｌに溶解した琥珀酸無水物（４５０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌｅ）を上記樹脂に加え、渦状撹拌しながら１５分間反応させ、それから水気をきった。上記３段階（ＣＤＩ活性化；ＴＴＤカップリング；琥珀酸無水物反応）を１１回繰り返した［すなわち全部で１２回］。過剰の反応体および可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ中新鮮１．０Ｍ（８ｍｍｏｌｅ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化し、４０分間反応させ、水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。２．５ｍｍｏｌｅ　Ｈ−ＡｌａＯｔＢｕ．ＨＣｌを、１５０マイクロリットル（１１１ｍｇ、０．８２５ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡを含むＤＭＦ中０．５Ｍ（２．３７５ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴに溶解し、渦状に撹拌しながらＣＤＩ活性化ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）と１時間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。上記生成物ｔｅｒｔＢｕＯＯＣ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＨＮ−ＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂をＤＣＭ（ジクロロメタン）でよく洗い、水気をきり、それから上記樹脂を一定重量になるまで真空下で乾燥した。生成樹脂の典型的重量は約２グラムであった。
【０２９０】
直鎖（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕポリマーを樹脂支持体から、ＤＣＭ中４％ＴＦＡを使用する標準的Ｆｍｏｃ−化学操作によって切り離した。沈殿した粗生成物を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したポリマーを０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈して有機物濃度を１％未満に減らした。粗生成物をＴ＝４０℃、３％Ｂで平衡化したＣ４分取逆相カラム上に置いた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを２０−３５％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の直線勾配で６０分間にわたって精製した。所望の（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ物質（ＧＲＦＮＰ３９）を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、凍結乾燥した。
【０２９１】
Ｃ．枝分かれのための複数のアミン基と、（後に）タンパク質（ＧＲＦＮＰ４０）に付加するための保護されたアミノオキシ基とを担持するテンプレートの合成
テンプレートＧＲＦＮＰ４０を、手で、シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）アミド生成樹脂上で０．４ｍｍｏｌ規模で合成した。各カップリング、脱保護及び活性化段階の間にＤＭＦによる１分間流れ洗浄段階が設けられた。２ｍｍｏｌＮα−Ｆｍｏｃ−Ｎβ（Ｂｏｃ−アミノオキシアセチル）−Ｌ−ジアミノプロピオン酸を上記樹脂に１時間結合させた；その際ＤＣＭ／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中２ｍｍｏｌＤＩＣ及び２ｍｍｏｌＮＨＳによる３０分間のＮＨＳ−エステル予備活性化を行った。Ｆｍｏｃ保護基除去（２×３分間、ＤＭＦ中２０％ｖ／ｖピペリジン）及び洗浄後、２．２ｍｍｏｌＤＩＥＡを含む０．５Ｍ　ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液８ｍｌに溶解した４ｍｍｏｌ琥珀酸無水物を上記樹脂に１０分間結合させた。この段階後、カルボキシル基をＤＭＦ中新鮮０．５Ｍ（４ｍｍｏｌｅ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化した。４ｍｌ（１８．２ｍｍｏｌｅ）ＴＴＤをＤＭＦ中０．５Ｍ　ＨＯＢＴ溶液４ｍｌに加え、３０分間結合させた。
【０２９２】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（２ｍｍｏｌ）を、生成したアミノ−ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ−Ｄｐｒ（ＢｏｃＡｏＡ）−樹脂（ここでＤｐｒ＝ジアミノプロピロン酸）に、ＤＭＦ中２ｍｍｏｌＤＩＣ及び２ｍｍｏｌＮＨＳによる３０分間予備活性化及び１時間のカップリングを用いて結合した。このカップリングをもう一度繰り返した。Ｆｍｏｃ除去段階（２×３分間、ＤＭＦ中２０％ｖ／ｖピペリジン）後に、４ｍｍｏｌ　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｓ）−ＯＨを上記のようにカップリングした（再カップリングも含む）。最後のＦｍｏｓ保護段階（２×３分間、ＤＭＦ中２０％ｖ／ｖピペリジン）後、テンプレートを樹脂支持体から、ＤＣＭ中４％ＴＦＡを使用する標準的Ｆｍｏｓ化学操作によって切り離した。沈殿した生成物を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥した粗生成物を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、有機物濃度が１％未満に減るまで希釈した。上記テンプレートをＴ＝４０℃で３％緩衝液Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）で平衡化したＣ４分取逆相ＨＰＬＣカラム上に載せた。塩類およびその他の非アミド物質をアイソクラチックに溶出し、所望のテンプレートを５−１２％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の直線勾配で６０分間精製した。所望のＬｙｓ−Ｌｙｓ（Ｌｙｓ）−ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ−Ｄｐｒ（ＢｏｃＡｏＡ）アミド物質（ＧＲＦＮＰ４０）を含むフラクションがＥＳ−ＭＳによって同定され、これを凍結乾燥した。
【０２９３】
Ｄ．アミド結合枝分かれポリマー（ＧＲＦＮＰ４１）の組立て及び脱保護
ＧＲＦＮＰ４１、１６ｋＤａ分子量の枝分かれ（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）４９−ポリマー、をＧＲＦＮＰ３９［（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ］と精製テンプレートＧＲＦＮＰ４０とのカップリングによって合成した。２０ｍｇ／ｍｌ濃度になるように６０℃でＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶解した精製（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）（１．０ｍｍｏｌｅ）を、２０倍（モル）過剰のＤＩＥＡの存在下で、ＤＭＳＯ中０．９５ｍｏｌｅＨＡＴＵ｛Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート｝で活性化した。ＤＭＳＯ中に３．９ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した精製テンプレートＧＲＦＮＰ４０（０．２４ｍｏｌｅ）を直ちに加えた。反応の進行をＣ４分析的逆相ＨＰＬＣ及びＥＳ−ＭＳでモニターした。一般的には上記カップリングは数分以内に完了した。仕上げのために４容量（ライゲーション　ミックスに対して）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム／６Ｍグアニジニウム塩化物、ｐＨ４、を加え、溶液を分取（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラム上に置いた。塩類およびその他の非アミド含有物質をアイソクラチック溶出し、所望の枝分かれポリマー生成物を２０−３５％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の直線勾配で８０分間精製した。所望物質を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【０２９４】
生成した精製ポリマーを生のＴＦＡに濃度１ｍｇ／ｍｌで１時間溶解し、アミノオキシアセチル部分からＢｏｃ基を除去し、−Ａｌａ−ＯｔＢｕ部分からｔｅｒｔ−ブチルエステル基を除去した。上記溶液を回転蒸発機で回転して乾燥させ、乾燥したポリマーを５０％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）に溶解した。アミノオキシ酢酸（ａ．ｋ．ａ．“カルボキシメトキシルアミン”）を最終濃度０．５Ｍまで加え、付加物形成不純物を掃去した。２０分後、溶液を３．３容量の緩衝液Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）で希釈し、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに置き、全てのアミノオキシ酢酸が除去されるまでポンプを使って１０％緩衝液Ｂで吸い出した。それから上記ポリマーを１５％ないし４５％緩衝液Ｂ対０．１％ＴＦＡ水溶液の段階的勾配で８０分間精製した。所望の枝分かれポリマー物質（ＧＲＦＮＰ４１）を含む集めたフラクションを凍結し、凍結乾燥した。
【０２９５】
Ｅ．ペプチドセグメントＧＲＦＮ１７７６及びＧＲＦＮ１７１１と、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４１とのオキシム形成ライゲーション（オキシム化）
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６、配列番号：２の残基１１７−１６６からなる）及びセグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１−３２からなる）を前記の実施例１に記載のように標準ｉｎ　ｓｉｔｕ中和Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳを使って合成した。ペプチドＧＲＦＮ１７７６はやはり前記のように標準的プロトコルにしたがって−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。ペプチドＧＲＦＮ１７１１は前記のように標準的プロトコルにしたがってチオエステル生成樹脂上で合成した。Ｌｙｓ１２６上にレブリンアシル部分を含むセグメントＧＲＦＮ１７７６とＡｏＡ含有ＧＲＦＮＰ４１とを等モル比で、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に一緒に溶解した。その溶液を凍結乾燥した。乾燥した粉末粗生成物を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に再溶解し、分取逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラム上に置いた。ポリマー修飾ペプチドを分取勾配逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望オキシム結合（オキシム化）生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１をＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２９６】
Ｌｙｓ２４上にレブリンアシル部分を含むセグメントＧＲＦＮ１７１１とＡｏＡ含有ＧＲＦＮＰ４１とを等モル比で０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に一緒に溶解した。その溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥粉末を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、Ｃ４分取逆相ＨＰＬＣカラム上に注いだ。このポリマー修飾ペプチドを分取勾配溶出Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム結合（オキシム化）生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４１を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０２９７】
Ｆ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５１の合成
（配列番号：２）を有するＳＥＰ−１−Ｂ５１を溶液中で４ポリペプチドセグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４１（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ４１；配列番号：２の残基１−３２に相当する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４はＫＯＸによって示される、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４１にオキシム結合したレブリンアシル　ペンダント部分を有する；Ｈｉｓ３２はＤｎｐで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２；配列番号：２の残基３３−８８に相当する）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここでＣｙｓ３３はＡｃｍで保護され；３個のＴｒｐ残基がホルミルで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に相当する）：
ＣＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここでＣｙｓ８９はＡｃｍで保護され；Ｈｉｓ９４はＤｎｐで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ４１、配列番号：２の残基１１７−１６６に相当する）
ＣＡＩＳ　ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ　ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＣ−末端システイン（すなわちＣｙｓ１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有し、Ｌｙｓ１２６はＫＯＸによって示される、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４１にオキシム結合したレブリンアシル　ペンダント部分を有する）
【０２９８】
完全長、折りたたまれたＳＥＰ−１−Ｂ５１（配列番号：２）を得るためのその他のペプチド類の合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製は下記の改良を伴う実施例１−４に記載の方法で行われた：
【０２９９】
段階１：ライゲーション＃１　セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１をＴＦＥ（１容量）中に３ｍＭ濃度で溶解した。セグメントＳＥＰ−１：３を６Ｍグアニジウム塩化物を含む２容量の３００ｍＭ　Ｎａ燐酸緩衝液（ｐＨ７．９）に、２．２５ｍＭ濃度で溶解した。上記２溶液を混合し、１ｍＭ　ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１及び１．５ｍＭ　ＳＥＰ−１：３の最終セグメント濃度とし、１％チオフェノールを加え、ｐＨ６．８−７．２のペプチドセグメント溶液（“３容量”）を生成した。反応を室温で一晩進行させた。ライゲーション後、β−メルカプトエタノール（３容量）を上記ライゲーションミックスに加え、それから６Ｍグアニジウム塩化物を含む３００ｍＭ　Ｎａ燐酸ｐＨ７．９緩衝液、３容量を加え、ＴＣＥＰを加え（重量で、ペプチドセグメントの総重量の０．２５）、この溶液を２０分間撹拌した。溶液を０．６容量の氷酢酸でｐＨ４．０±０．１まで酸性にすると澄明溶液が得られる。これに３０容量のｐＨ４．０、１００ｍＭ　Ｎａアセテート希釈緩衝液、６Ｍグアニジウム塩化物を加えた。生成した溶液をポンプで分取逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラムに注いだ。緩衝液を非ペプチド物質が全てカラムから溶出するまで５％Ｂで［したがって残りは９５％緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）である］ポンプで吸引した。それからライゲーション生成物を２５−４５％緩衝液Ｂの勾配によって８０分間にわたって精製した。所望の結合産物（Ｃｙｓ８９（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析によって同定し、集めた。
【０３００】
段階２：Ａｃｍ−除去＃１　Ａｃｍ除去のために、プールした（Ｃｙｓ８９（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝のフラクションを含むアセトニトリル水溶液を１×ＨＰＬＣ級−水で希釈し、固体尿素を最終濃度２Ｍまで加えた。３倍モル過剰（総システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌＨｇ（アセテート）２溶液を加え、溶液を１時間撹拌した。上記溶液をその後β−メルカプトエタノール２０％にし、半−分取逆相ＨＰＬＣカラム上に載せ、全ての非ペプチド物質が溶出するまで２５％緩衝液Ｂでポンプで吸引し、生成物を５０％緩衝液Ｂの段階的勾配で精製した。所望の結合産物｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをエレクトロスプレー質量分析によって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０３０１】
段階３：ライゲーション＃２　段階２から得られる｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝生成物［すなわち１７１３−１７７６−ＧＰ４１］をＴＦＥ（１容量）に３ｍＭ濃度で溶解した。セグメントＳＥＰ−１：２（セグメントＧＲＦＮ１７１２）を６Ｍグアニジウム塩化物を含む３００ｍＭ　Ｎａ燐酸緩衝液（ｐＨ７．９）２容量に、濃度２．２５ｍＭになるように溶解した。２液を混合すると最終的に１ｍＭ｛ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝及び１．５ｍＭ　ＳＥＰ−１：２のセグメント濃度が得られる。１％チオフェノールを加えると、ｐＨ６．８−７．２のペプチドセグメント溶液（“３容量”）が生成した。反応を室温で一晩進行させた。その後ライゲーションミックスを３容量（すなわち使用したＴＦＥの容量に対して）の希釈緩衝液：６Ｍグアニジウム塩化物を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で希釈し、それから３容量のＴＦＥ、３容量のβ−メルカプトエタノール、３容量のピペリジン及び６容量の６Ｍグアニジウム塩化物、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０からなる４℃に冷やした溶液に加え、室温で２０分間撹拌して残る保護基を全て除去した。上記溶液を凍結氷酢酸１．８容量で酸性にすると澄明溶液が得られた。これにＴＣＥＰ（重量でペプチドセグメントの総重量の０．２５）を加え、溶液を２０分間インキュベートした。それから３０容量のｐＨ４．０、１００ｍＭ酢酸ナトリウム希釈緩衝液、６Ｍグアニジウム塩化物を加え、溶液を混合した。生成した溶液をポンプで分取逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラムに注入した。緩衝液を３０％Ｃ（緩衝液Ｃ：６０％イソプロパノール／３０％アセトニトリル／１０％水中、０．１％ＴＦＡ）で、非ペプチド物質が全てカラムから溶出するまでポンプで吸引し、それからライゲーション産物を３７−５７％緩衝液Ｃの勾配によって８０分間精製した。所望の結合産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０３０２】
段階４：残基Ｃｙｓ８９及びＣｙｓ１１７のカルボキシメチル化
（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝［すなわち（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ））−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４２］をＴＦＥに１ｍＭ濃度で溶解した。６Ｍグアニジウム塩化物を含む３００ｍＭ　Ｎａ燐酸緩衝液（ｐＨ７．９）１０容量を加えた。メタノールに７５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解したブロモ酢酸の２５倍過剰（スルフヒドリル基に関して）を加えた。溶液を室温で撹拌しながら２時間反応させた。反応混合物を１１容量の１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、６Ｍグアニジウム塩化物で希釈し、分取逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣカラム上に注ぎ、全ての非ペプチド化合物が溶出するまで２０％緩衝液Ｃで吸引し、それからライゲーション産物を５５％緩衝液Ｃまでの段階的勾配で精製した。所望の修飾産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝をＥＳ−ＭＳによって同定し、集め、凍結乾燥した。
【０３０３】
段階５：ピコリル除去　亜鉛くず（ペプチド１ミリグラムあたり７１ミリグラム）を２Ｍ　ＨＣｌ中で５分間活性化し、その活性化をもう一度繰り返し、上記亜鉛を、（新たに加える）３５ｍｇ／ｍｌ　Ｌ−メチオニン及び３５ｍｇ／ｍｌドデカノイルサルコシン　ナトリウムを含む６Ｍグアニジウム塩化物、５０ｍＭグリシンｐＨ２．２、及び１０％ｖ／ｖＴＦＥで１０分間洗い、過剰の酸を除去した。洗浄をもう一度繰り返した。Ｃｙｓ１６１（ピコ）−含有ペプチド（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝を生のＴＦＥに約３０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した。その溶液を、（新たに加える）３５ｍｇ／ｍｌ　Ｌ−メチオニン及び３５ｍｇ／ｍｌドデカノイルサルコシン　ナトリウムを含む６Ｍグアニジウム塩化物、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．２、の４容量（ＴＦＥに対して）及び１０％ｖ／ｖＴＦＥで希釈した。上記溶液を活性化亜鉛粉末に加え、室温で５０分間撹拌した。反応を部分（等容量のβ−メルカプトエタノール及び数滴のＴＣＥＰで処理し、２容量の６Ｍグアニジウム塩化物、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０で希釈して分析する）の分析的Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって〜１時間間隔でモニターした。上記反応は２ないし５時間で完了した。分析ＨＰＬＣピーク（すなわち９１Ｄａ質量の喪失）のＥＳ−ＭＳ分析によって示されるように、ピコリル基の除去が完了した後、上澄液を濾過して除去し、残るＺｎ粉末を３５ｍｇ／ｍｌ　Ｌ−メチオニン及び３５ｍｇ／ｍｌドデカノイルサルコシン及び２０％ＴＦＥを含む６Ｍグアニジウム塩化物、ｐＨ４、１００ｍＭアセテートで３回洗った。ビオラドＳＭ−２（ＢｉｏＲａｄ　ＳＭ−２）ビーズ（上記溶液の容量の約３分の１）を合一した上澄液に加え、洗い、室温で３０分間撹拌し、それから濾過した。β−メルカプトエタノールを１０％ｖ／ｖまで加え、それから０．２５×（ペプチドの合一量）のＴＣＥＰを加え、その溶液を室温で５分間撹拌した。溶液を等容量の１００ｍＭ酢酸ＮａｐＨ４．０、６Ｍグアニジウム塩化物で１：１に希釈し、分取（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラム上に置き、所望産物を５５％緩衝液Ｃまでの段階的勾配で精製した。所望のＣｙｓ１６１−脱保護産物（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝をエレクトロスプレー質量分析によって同定し、プールした。
【０３０４】
段階６：Ａｃｍ除去＃２　（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝［すなわち（Ｃｙｓ３３（Ａｃｍ）；ψ８９，１１７）−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］のプールした溶液をＨＰＬＣ級−水で３×希釈し、固体尿素を最終濃度２Ｍになるように加えた。３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌＨｇ（アセテート）２溶液の３倍モル比（総システイン濃度に対して）を加え、溶液を室温で１時間撹拌した。上記溶液をそれからβ−メルカプトエタノール中２０％にし、半−分取（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラム上に置いた。緩衝液Ｃ（２０％）を全ての非ペプチド材料が溶出するまでポンプで吸引し、所望産物を５５％緩衝液Ｃの段階的勾配で精製した。所望産物（Ｃｙｓ３３；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、２×（ｗ／ｗ、ペプチド質量に対して）ＤＰＣ（ドデシルホスホコリン）を含む水で２倍（ｖ／ｖ）に希釈し、一晩凍結乾燥した。
【０３０５】
段階７：ライゲーション＃３　（Ｃｙｓ３３；ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１−Ｐｉｃｏ｝［すなわち（Ｃｙｓ３３；ψ８９，１１７）−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を生のＴＦＥ（１容量）に３ｍＭ濃度で溶解した。ＳＥＰ−１：１［すなわち１７１１−ＧＰ４１］を６Ｍグアニジウム塩化物を含む３００ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）２容量に溶解した。上記の溶液を合一し、１％ｖ／ｖチオフェノールを加えた。ライゲーションミックスを室温で一晩撹拌した。上記溶液に３容量（上のＴＦＥ容量に対して）のβ−メルカプトエタノール、９容量のライゲーション緩衝液（６Ｍグアニジウム塩化物を含む３００ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７．９）を加えた。上記溶液に０．２５×（合一ペプチド重量）ＴＣＥＰを加え、上記溶液を室温で２０分間撹拌した。氷酢酸（０．６容量）を加えて上記溶液をｐＨ４．０まで酸性にし、その後溶液を６Ｍグアニジウム塩化物を含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０の３０容量で希釈し、分取（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラム上に置いた。緩衝液Ｃ（２５％）を、全ての非ペプチド物質が溶出するまでポンプで引いた。
それからライゲーション生成物を３５−５５％の緩衝液Ｃの直線勾配で８０分間にわたって精製した。所望の結合産物ＳＥＰ−１（１−１６６）（ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：１（＋ＧＰ４１）＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝（配列番号：２）をエレクトロスプレー質量分析によって同定し、プールした。
【０３０６】
段階８　折りたたみ：　完全長結合ペプチド　ＳＥＰ−１（１−１６６）（ψ８９，１１７）｛ＳＥＰ−１：１（＋ＧＰ４１）＋ＳＥＰ−１：２＋ＳＥＰ−１：３＋ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４１｝［すなわち１７１１（ＧＰ４１）−１７１２−１７１３−１７７６−ＧＰ４１］を含む合一フラクションに、固体グアニジウム塩化物、１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．７）及び蒸留水を加え、１ｍｌあたり０．１ミリグラムの結合ペプチドＳＥＰ−１（１−１６６）、６Ｍグアニジウム塩化物、１００ｍＭトリスの最終的溶液を調製した。この結合ペプチド（“タンパク質”）溶液を１５ｍｌ透析カセットに入れ、４℃で、３Ｍグアニジウム塩化物、５マイクロモル　システイン及び２マイクロモル　システインを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に対して一晩透析した。上記タンパク質溶液をその後、１Ｍグアニジウム塩化物を含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に対して４℃で８時間透析し、最後に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で１４時間透析すると、最終的折りたたみ生成物が得られる。透析カセットからの折りたたまれたタンパク質を含む溶液を合一した。折りたたみはＥＳ−ＭＳ、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＣＤスペクトロメトリーによって確認された。
【０３０７】
段階９　精製：折りたたまれたタンパク質を含む溶液を１０ｍＭトリス、ｐＨ７．０、で平衡化したＱ−セファロース　イオン交換カラムに注入した。上記折りたたまれたタンパク質を１２５ｍＭ　ＮａＣｌまでの直線塩勾配を用いて溶出した。所望折りたたみ生成物ＳＥＰ−１−Ｂ５１を含むフラクションを非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、集めた。合一したフラクションを限外濾過によって濃縮し、約２ミリグラム／ミリリットルの濃度にし、そのタンパク質溶液を２．６×１００ｃｍＳ−３００ゲル濾過カラム上に注いだ。生成ＳＥＰ−１−Ｂ５１を１０ｍＭトリスｐＨ７．０、１３７ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。高純度のＳＥＰ−１−Ｂ５１を含むフラクションを非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、集め、凍結し、−８０℃で保存した。最終的精製折りたたみタンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５１を分析的（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳによって、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、及びＣＤスペクトロメトリーによって特徴づけた。図２７は、上記折りたたまれた精製ＳＥＰ−１−Ｂ５１の相対的分子量を示す代表的等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦ）及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。同じゲル上の分子量標準移動が比較のために示される。示されているように、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定されたＳＥＰ−１−Ｂ５１の相対的分子量は約７３ｋＤａである。相対的ｐＩは約５．０である。折りたたまれ、精製されたＳＥＰ−１−Ｂ５１生成物の代表的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムも示される。これは、本発明の精密なポリマー修飾タンパク質の純粋性及び高い相対分子量を示す。
【０３０８】
（実施例８）
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５２の合成
Ａ．ＳＥＰ−１−Ｂ５２の組成。第七の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５２と呼ぶ）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５２のアミノ酸配列はＳＥＰ−１−Ｂ５１のそれと同じである：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷψＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫψＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ　ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ（配列番号：２）
上記配列中、ψは、スルフヒドリル基がカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し；ＫＯＸは、ε−アミノ基が、指定された水溶性ポリマーにオキシム結合によってカップリングしているオキシム　リンカー基で化学的に改変されている非天然リジンを示す。
【０３０９】
ＳＥＰ−１−Ｂ５２タンパク質は、残基２４及び１２６がＳＥＰ−１−Ｂ５１と同様に枝分かれ（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａポリマー構成物で誘導体化された；だがこの類似体では上記ポリマーはピルビン酸とアミノオキシ酢酸との間のオキシム結合によって結合した。その上、リジン残基２４及び１２６のε−アミノ基はレブリンアシル部分の代わりにアミノオキシアセチル官能基を担うように改変され、枝分かれ（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−Ａｌａポリマー構成物はペンダント−ピルビンアシル部分を担うように作られた。これらの変化は合成及び取扱いを改良するために、そして上記オキシム結合の安定性をさらに高めるために設計された。
図２５は、以下に述べるようにオキシム形成ライゲーションによってＳＥＰ−１−Ｂ５２に結合した、枝分かれ水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ４３（ＧＰ４３）の化学合成を説明するスキームである。完全長生成物の組立ては実施例２に記載された。ＳＥＰ−１−Ｂ５２の構造を図２６に示す。
【０３１０】
Ｂ．枝分かれテンプレート（ＧＲＦＮＰ４２）にカップリングするための（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）の合成
（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）を０．５ｍｍｏｌスケールで合成した。０．５ｍｍｏｌｅ（〜０．５グラム）サスリン酸不安定、カルボン酸生成ポリスチレン樹脂（ヒドロキシル置換１．０２ｍｍｏｌｅ／ｇ）をＤＭＦ中で１５分間膨潤させ、それから水気をきった。このヒドロキシル官能化樹脂に、５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を含む８ｍｌのＤＭＦに溶解した４５０ｍｇ（４．５ｍｍｏｌｅ）琥珀酸無水物及び４８８ｍｇ（４ｍｍｏｌｅ）４−（ジメチルアミノ）ピリジンを加え、渦状に撹拌しながら３０分間反応させ、水気をきった。カップリングを繰り返し、過剰の反応体及び可溶性副生成物を１分間ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）で渦流洗浄することによっ除去し、それから水気をきった。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ中新鮮１．０Ｍ（８ｍｍｏｌｅ）ＣＤＩ溶液８ｍｌの添加によって活性化し、４０分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物を、ＤＭＦ（〜５０ｍｌ）で１分間渦流洗浄することによって除去し、水気をきった。０．５Ｍ（２ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴ−ＤＭＦ溶液４ｍｌに溶解した４ｍｌ（４グラム、１８．２ｍｍｏｌｅ）のＴＴＤを加え、渦状に撹拌しながら３０分間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体および可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍ）で１分間渦流洗浄することによって除去し、その後水気をきった。５００マイクロリットル（３．９ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡを含む０．５Ｍ（４ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液８ｍｌに溶解した琥珀酸無水物（４５０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌｅ）を上記樹脂に加え、渦状撹拌しながら１５分間反応させ、それから水気をきった。上記３段階（ＣＤＩ活性化；ＴＴＤカップリング；無水琥珀酸反応）を１１回繰り返した［すなわち全部で１２回］。過剰の反応体および可溶性副生成物はＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）をＤＭＦ中新鮮１．０Ｍ（８ｍｍｏｌｅ）ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化し、４０分間反応させ、水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物をＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。２．５ｍｍｏｌｅ　Ｈ−ＡｌａＯｔＢｕ．ＨＣｌを、１５０マイクロリットル（１１１ｍｇ、０．８２５ｍｍｏｌｅ）ＤＩＥＡを含むＤＭＦ中０．５Ｍ（２．３７５ｍｍｏｌｅ）ＨＯＢＴの４．７５ｍｌに溶解し、渦状に撹拌しながらＣＤＩ活性化ＨＯＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂（０．５ｍｍｏｌｅ）と１時間反応させ、それから水気をきった。過剰の反応体及び可溶性副生成物はＤＭＦ（〜５０ｍｌ）による１分間渦流洗浄によって除去し、水気をきった。上記生成物ｔｅｒｔＢｕＯＯＣ−ＣＨ（ＣＨ３）−ＨＮ−ＯＣ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ（ＴＴＤ−スクシニル）１２−Ｏ−樹脂を、ＤＣＭでよく洗い、水気をきり、それから上記樹脂を一定重量になるまで真空下で乾燥した。生成樹脂の典型的重量は約２グラムであった。
【０３１１】
直鎖ＧＲＦＮＰ３９を樹脂支持体から、ＤＣＭ中４％ＴＦＡを使用する標準的Ｆｍｏｃ−化学操作によって切り離した。沈殿した粗生成物を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したポリマーを０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈し、有機物の濃度を１％未満に減らした。粗生成物をＴ＝４０℃、３％Ｂで平衡化したＣ４分取逆相カラム上に置いた。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを２０−３５％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の直線勾配で６０分間にわたって精製した。所望の（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ物質（ＧＲＦＮＰ３９）を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【０３１２】
Ｃ．枝分かれのための複数のアミン基、及び（その後）タンパク質（ＧＲＦＮＰ４２）に結合するためのペンダント　ピルビン　アシル部分を担うテンプレートの合成。
テンプレートを手で、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂上で、０．４ｍｍｏｌスケールで合成した。各カップリング、脱保護および活性化段階の間にＤＭＦによる１分間流れ洗浄段階を設けた。Ｂｏｃ基は生の（すなわち１００％）ＴＦＡによる処理によって除去した。ＤＭＦ洗浄後、２ｍｍｏｌ　Ｆｍｏｃ−（Ｒｉｎｋ−リンカー）−ＯＨを、１ｍｌ　ＤＩＥＡを含む３．８ｍｌＤＭＦ中１．８ｍｍｏｌ　ＨＢＴＵで活性化した後、上記樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ−保護基を除去した後（２×３分、ＤＭＦ中２０％ピペリジン）、２ｍｍｏｌ　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＴＴ）−ＯＨ［ＭＴＴ＝４−メチルトリル］を、ＤＭＦ中２ｍｍｏｌ　ＤＩＣ及び２ｍｍｏｌＮＨＳを用いて上記樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ−保護基を除去した後（２×１分、ＤＭＦ中０．５％ＤＢＵ）、２．２ｍｍｏｌＤＩＥＡを含む０．５Ｍ　ＨＯＢＴ溶液８ｍｌ中に溶解した４ｍｍｏｌ無水琥珀酸を上記樹脂に１０分間カップリングした。この段階後、樹脂に結合したカルボキシル基をＤＭＦ中０．５Ｍ　ＣＤＩ溶液８ｍｌで活性化した。４ｍｌ　ＴＴＤを４ｍｌの０．５Ｍ　ＨＯＢＴ溶液に加え、３０分間カップリングした。
【０３１３】
２ｍｍｏｌ　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、ＤＭＦ中２ｍｍｏｌ　ＤＩＣ及び２ｍｍｏｌ　ＮＨＳで活性化したＮＨＳ−エステルを用いて上記樹脂にカップリングした。Ｆｍｏｃ除去段階後（２×１分、ＤＭＦ中０．５％ＤＢＵ）、４ｍｍｏｌ　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨＳを３ｍｌＤＭＦ中でカップリングした。
【０３１４】
ＭＴＴ保護基をＤＣＭ中２％ＴＦＡによる複数回の洗浄によって除去した。上澄液がその黄色を失ったとき、脱保護は完了した。上記樹脂をＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡで１分間中和した。２ｍｍｏｌ　ピルビン酸を、ＤＭＦ中２ｍｍｏｌ　ＤＩＣ及び２ｍｍｏｌ　ＮＨＳによるＮＨＳ−エステル活性化を使用して４５分間樹脂にカップリングした。上記テンプレートを脱保護し、５％水を含む生のＴＦＡを使用して上記樹脂支持体から切り離した。上記切断溶液を回転蒸発器中で蒸発乾固した。残渣を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したテンプレートを０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液の少量に溶解し、希釈して有機物の濃度を１％未満に減らした。上記ピルベート含有テンプレートをＴ＝４０℃で０％緩衝液Ｂ［すなわち１００％緩衝液Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ］で平衡化したＣ４分取カラム上に注入した。塩類をアイソクラチック溶出し、所望のテンプレートを５−１２％緩衝液Ｂ対０．１％ＴＦＡ水溶液で６０分間精製した。所望物質（ＧＲＦＮＰ４２）を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【０３１５】
Ｄ．アミド結合枝分かれポリマー（ＧＲＦＮＰ４３）の組立て及び脱保護
ＧＲＦＮＰ４３（１６ｋＤａ分子量を有する枝分かれ（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）４９−ポリマー）を、ＧＲＦＮＰ３９と精製テンプレートＧＲＦＮＰ４２とのカップリングによって合成した。ＤＭＳＯに６０℃で２０ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解した精製（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）１２−Ｓｕｃｃ−ＡｌａＯｔＢｕ（ＧＲＦＮＰ３９）（１．０ｍｍｏｌｅ）を、２０倍（モル）過剰のＤＩＥＡの存在下で、１０ｍｇ／ｍｌ濃度のＤＭＳＯ中ＨＡＴＵ（０．９５モル）で活性化した。ＤＭＳＯに濃度３．９ｍｇ／ｍｌになるように溶解した精製テンプレート（０．２４モル）ＧＲＦＮＰ４２を直ちに加えた。反応の進行を分析的Ｃ４逆相ＨＰＬＣ及びＥＳ−ＭＳによってモニターした。一般的にはこのカップリングは数分以内に完了した。仕上げのために４容量（ライゲーション混合物に対して）の０．１Ｍアセテート／６Ｍグアニジニウム塩化物、ｐＨ４、を加え、上記溶液を分取（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣカラム上に注入した。塩類及びその他の非アミド含有物質をアイソクラチック溶出し、所望産物である枝分かれポリマーを２０−３５％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）対０．１％ＴＦＡ水溶液の直線勾配で８０分間にわたって精製した。所望物質を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、凍結し、凍結乾燥した。
【０３１６】
生成した精製枝分かれポリマー構成物ＧＲＦＮＰ４３を生のＴＦＡに濃度１ｍｇ／ｍｌに１時間溶解し、Ａｌａ−ＯｔＢｕ　ｔｅｒｔブチル　エステル保護を取り除いた。上記溶液を回転蒸器中で蒸発乾固し、乾燥したポリマーを５０％緩衝液Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）に溶解した。このポリマーを分取逆相ＨＰＬＣ上で１５％ないし４５％緩衝液Ｂ対０．１％ＴＦＡ水溶液の段階的勾配で８０分間脱塩した。所望物質（ＧＲＦＮＰ４３）を含むプールしたフラクションを凍結し、凍結乾燥し、上記乾燥粉末をオキシム化形成ライゲーション段階に使用した。
【０３１７】
Ｅ．ＧＲＦＮ１７７６及びＧＲＦＮ１７１１の、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４３によるオキシム形成ライゲーション（オキシム化）
セグメントＳＥＰ−１：４、及びセグメントＳＥＰ−１：１を実施例２、３、４、及び７に記載のように合成した、ただしレブリン酸の代わりに、アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分をそれぞれのペプチドセグメントのＬｙｓ２４及びＬｙｓ１２６に、標準的カップリングプロトコルにしたがって付加した。こうして、ペプチド樹脂の組立て後、側鎖Ｆｍｏｃ基を各ペプチド樹脂から除去し、２ｍｍｏｌ　ＢＯｃ−アミノオキシ酢酸を、ＤＭＦ中２ｍｍｏｌ　ＤＩＣ及び２ｍｍｏｌ　ＮＨＳによるＮＨＳ−エステル活性化を行って上記樹脂に加えた。上記２ペプチドを脱保護し、ＨＦで樹脂から切り離し、Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。カルボニル化合物にさらされないように適切な注意をした。セグメントＳＥＰ−１：４及びＧＲＦＮＰ４３を一緒に、等モル比で、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結乾燥した。乾燥粉末を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に再溶解し、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。上記ポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分取勾配逆相ＨＰＬＣによって分離した。所望オキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４３を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。
【０３１８】
セグメントＳＥＰ−１：１及びＧＲＦＮＰ４３を等モル比で一緒に、０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解した。上記溶液を凍結し、凍結乾燥した。乾燥した粉末を０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。上記ポリマー修飾ペプチドを未修飾ペプチド及び未反応ポリマーから分取逆相勾配溶出によって分離した。所望オキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４３を含むフラクションをＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。
【０３１９】
Ｆ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５２の合成
ＳＥＰ−１−Ｂ５２（配列番号：２）を溶液中で４ポリペプチド　セグメントから合成した：
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ４３（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ４３；配列番号：２の残基１−３２に相当する）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ　ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ　ＥＡＥＫＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（ここでＬｙｓ２４は、ＫＯＸによって示される、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４３にオキシム結合したＡｏＡペンダント部分を有する；Ｈｉｓ３２はＤｎｐで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２；配列番号：２の残基３３−８８に相当する）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ　ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ　ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ　ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ　ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（ここでＣｙｓ３３はＡｃｍで保護されている；３個のＴｒｐ残基はホルミル保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９−１１６に相当する）：
ＣＰ　ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ　ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ　ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（ここでＣｙｓ８９はＡｃｍで保護されており、Ｈｉｓ９４はＤｎｐで保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ４３（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ４３、配列番号：２の残基１１７−１６６に相当する）：
ＣＡＩＳ　ＰＰＤＡＡＫＯＸＡＡＰＬ　ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ　ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ　ＣＲＴＧＤＲ−カルボン酸塩（ここでＣ−末端システイン（すなわちＣｙｓ１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を担い、Ｌｙｓｑ１２６は、ＫＯＸによって示される、枝分かれポリマーＧＲＦＮＰ４３にオキシム結合したＡｏＡペンダント部分を有する）。
【０３２０】
付加的ペプチドの合成、ライゲーション反応体、カルボキシメチル化、保護基除去反応、折りたたみ及び精製は実施例１、２、３、４、及び７に記載のように行われ、完全長折りたたみＳＥＰ−１−Ｂ５２（配列番号：２）を与える。これは分析的（Ｃ４）逆相ＨＰＬＣ、ＥＳ−ＭＳ、及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴づけられた。バイオアッセイはその他のＳＥＰ構成物について記載したように行われる。
【０３２１】
（実施例９）
ＳＥＰ−３−Ｌ４２の有効性試験
ＳＥＰ−３−Ｌ４２をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）　＋　０．２５％ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）中で再組成化し、正常雄ラット（５ラット／群）に１週間に３回（ｔｉｗ）１、３、６日目に、０、１、５または１０μｇ／ｋｇの用量を静脈内投与した。血液サンプルを最後の注射後４日目（９日目）に採取し、血液学的パラメーターを分析した。これらの用量のＳＥＰ−３−Ｌ４２の最後の注射後４日目の赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、及び網状赤血球（ＲＥＴ）の数値には対照群のこれらと比較して統計的有意差はなかった。
【０３２２】
（実施例１０）
ＳＥＰ−３−Ｌ４２の薬物動態試験
ＳＥＰ−３−Ｌ４２をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として５μｇ／ｋｇ用量レベルで静脈内投与した。投与後０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間目に血液サンプルを採取した。血漿ＳＥＰ−３−Ｌ４２濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、抗−ＥＰＯ　ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトエリスロポエチン　クァンチカインＩＶＤ免疫アッセイキット＃ＤＥＰ００）を使用して測定した。結果を図２９に示す。
【０３２３】
図２９に示すように、ＳＥＰ−１−Ｂ５０はＳＥＰ−３−Ｌ４２に比較してわずかに遅いクリアランスを示した。その循環半減期にもかかわらず、ＳＥＰ−３−Ｌ４２は試験に使用した用量では赤血球産生の促進において統計的有意差を示すことができなかった。これに対して、ＳＥＰ−１−Ｂ５０は同量で赤血球産生を刺激した。これは、ポリマー構造を利用して、薬物動態的挙動及び効力を含むｉｎ　ｖｉｖｏ生物学的特性を微調整することができることを示すものである。
【０３２４】
（実施例１１）
ＳＥＰ−１−Ｌ３０の有効性試験
ＳＥＰ−１−Ｌ３０をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ＲＳＡ中で再組成化し、正常雄ラット（５ラット／群）に１週間に３回（ｔｉｗ）１、３、５日目に、０、１、５、２５または５０μｇ／ｋｇの量を静脈内投与した。最後の注射後４及び８日（９及び１３日目）に血液サンプルを採取し、血液学的パラメーターを分析した。
ＳＥＰ−１−Ｌ３０投与後いかなる間隔をおいても、ＲＢＣ、ＨＧＢ及びＨＣＴ数値には対照群のそれらと比較して統計的有意差はなかった。網状赤血球は最後の注射後４日（９日目）には２５及び５０μｇ／ｋｇを投与したラットではより高かった（対照群のそれらと比較して統計的有意差あり）。９日目または１３日目には、ＳＥＰ−１−Ｌ３０投与動物のいずれにも血液パラメーターのその他の差は認められなかった［データは示されず］。
【０３２５】
（実施例１２）
ＳＥＰ−１−Ｌ３０の薬物動態試験
ＳＥＰ−１−Ｌ３０をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として５または２５μｇ／ｋｇの量を静脈内投与した。投与後０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、及び１６８時間に血液サンプルを採取した。ＳＥＰ−１−Ｌ３０の血漿中濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトエリスロポエチン　クァンチカインＩＶＤ免疫測定キット＃ＤＥＰ００）を使用して測定した。与えた投与量ではいずれの時点にもＳＥＰ−１−Ｌ３０は検出されなかった。
【０３２６】
（実施例１３）
ＳＥＰ−１−Ｂ５０の有効性試験
ＳＥＰ−１Ｂ５０を滅菌ＰＢＳ（燐酸緩衝食塩液）＋０．２５％ＲＳＡ中で再組成化し、正常雄ラット（５匹／群）に、１週間に３回（ｔｉｗ）１、３、６日目に、０、１、５、２５または１２５μｇ／ｋｇの量を静脈内投与した。血液サンプルを最後の注射後４、９及び１４日（１０、１５及び２０日目）に採取し、血液学的パラメーターを分析した。そのデータを下の表ＶＩＩＩに示す。最後の注射後４日（１０日目）には、５、２５及び１２５μｇ／ｋｇのＳＥＰ−１−Ｂ５０を投与した動物たちのＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ及びＲＥＴが用量依存的に増加するのが認められた（対照群のそれらと比較して統計的有意差あり）。これらの動物のＲＢＣ、ＨＧＢ及びＨＣＴは１５日目には対照値より高いままで、１２５μｇ／ｋｇを投与した動物では２０日目（最後の注射後１４日）にも対照値より有意に高かった。ＲＥＴ産生は１０日目後には減少し、２５及び１２５μｇ／ｋｇ動物では、１５及び２０日目には有意に低下した。
【０３２７】
表ＶＩＩＩ
【表７】
2004508338.tif 000016
【０３２８】
（実施例１４）
ＳＥＰ−１−Ｂ５０の薬物動態試験
ＳＥＰ−１−Ｂ５０をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ＲＳＡ、ｐＨ６．９、中で再組成化し、正常雄ラットに単回量として５または２５μｇ／ｋｇ量を静脈内投与した。投与後０、１、２、４、６、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、及び１６８時間に血液サンプルを採取した。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の血漿中濃度をメーカーのインストラクションにしたがって、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトエリスロポエチン　クァンチカインＩＶＤ免疫測定キット＃ＤＥＰ００）を使用して測定した。排泄半減期は５及び２５μｇ／ｋｇ量ではそれぞれ９．７及び９．９時間と測定された。観察されたＭＲＴ（平均滞留時間）は５及び２５μｇ／ｋｇ量でそれぞれ１３．９及び１４．４時間であった。ＳＥＰ−１−Ｂ５０の典型的薬物動態プロフィールを図２９に示す。
【０３２９】
（実施例１５）
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の有効性試験
ＳＥＰ−１−Ｂ５１を２実験で正常雄ラットに静脈投与した。
実験１：ＳＥＰ−１−Ｂ５１をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ＲＳＡ中で再組成化し、雄ラット（５匹／群）に、１週間に３回（ｔｉｗ）、１、３、６日目に、０、１、５、または２５μｇ／ｋｇの量を静脈内投与した。最後の注射後１４日（１０、１５及び２０日目）に血液サンプルを採取し、血液学的パラメーターを分析した。そのデータを下の表ＩＸに示す。２５μｇ／ｋｇＳＥＰ−１−Ｂ５１投与動物ではＳＥＰ−１−Ｂ５１の３番目そして最後の投与後４日に（１０日目）、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、及び絶対的網状赤血球数（ＡＲＴ）の、２０日目の対照値と比較した統計的有意な増加が認められた。網状赤血球産生は１０日目の後には減少し、１５日目には５及び２５μｇ／ｋｇ投与動物で有意に低い数値が認められた。
【０３３０】
表ＩＸ
【表８】
2004508338.tif 000017
【０３３１】
実験２：ＳＥＰ−１−Ｂ５１をクエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム＋１００ｍＭ塩化ナトリウム）＋０．２５％ヒト血清アルブミン中で再組成化し、雄ラット（５匹／群）に１週３回、１、３及び５日目に、０、１、５、または２５μｇ／ｋｇ量を静脈内に投与した。血液サンプルを最後の注射後２、４、及び６日（７、９及び１１日目）に集め、血液学的パラメーターを分析した。その上、ヘマトクリット測定［血球容積として］のためだけの血液サンプルを残りの試験日（２、３、４、５、６、８、１０、１２及び１３日目）に毎日集めた。データを下表Ｘに示す。ＨＣＴ（ＰＣＶまたは計算）値は５及び２５μｇ／ｋｇ投与動物では最初の注射後２日（３日目）から始まって有意に増加し、その増加は第三の、最後の注射後６日（１１日目）まで続いた。ＲＢＣ及びＨＧＢも、５及び２５μｇ／ｋｇ投与動物では、それらを測定した日（最後の投与後２、４、及び６日；７、９及び１１日目）には有意に増加した。ＡＲＴは２５μｇ／ｋｇ群においてのみ、最後の投与後２及び４日（７及び９日目）に有意に増加した。
【０３３２】
表Ｘ
【表９】
2004508338.tif 000018
【０３３３】
追加的ラット群に単回静脈内投与で２５μｇ／ｋｇのＳＥＰ−１−Ｂ５１を投与し、血液サンプルを注射後４８時間目に集め、血液学的パラメーターを分析した。ヘマトクリットだけの測定（血球容積として）のための血液サンプルを注射後８、２４、及び７２時間及び７日（１、２、４及び８日目）に集めた。ＳＥＰ−１−Ｂ５１を静脈内投与したラットのＨＣＴ、ＨＧＢ及びＡＲＴ値は３日目に（注射後２日）対照動物のそれらより高かった（統計的に有意）。ＨＣＴはこれらの動物において４日目にも有意に増加した。
【０３３４】
（実施例１６）
赤血球増加症−及び低酸素症モデルにおけるＳＥＰ−１−Ｂ５１の有効性試験　各１０匹ずつの正常マウス群（ビヒクル対照、ＣＨＯ−細胞で産生された組換えグリコシル化ヒトエリスロポエチン（“ｒｈＥＰＯ”）の４用量レベル；及びＳＥＰ−１−Ｂ５１、４用量レベル：１００ｍＵ／ｎｇと仮定して、０．３２、１、５、２５μｇ／ｋｇ／投与）を、１日１８時間、模擬高所−室中で５０６．５ｍｂに維持した空気に２０日間さらした。クエン酸緩衝液プラス０．２５％ヒト血清アルブミン中に処方されたｒｈＥＰＯまたはＳＥＰ−１−Ｂ５１を２００μＬ容量にして、低酸素後の第４日目に静脈注射（ＩＶ）した。２日後各マウスに０．２μＣｉの５９Ｆｅを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３日後にＲＢＣ−放射性鉄の取り込みを、心臓穿刺によって採取した血液５００μＬに存在する放射能の量を測定することによって推定した。
【０３３５】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１及びｒｈＥＰＯの７２時間−ＲＢＣ−５９Ｆｅ取り込み（投与量の％）は明白な用量依存的応答を示し、投与量５μｇ／ｋｇまでは投与量の増加につれて５９Ｆｅ取り込みは増加し、５μｇ／ｋｇ以上では応答は平らになった（２５μｇ／ｋｇ）。そこで３種類の最低投与量レベルを使用して直線回帰を計算した。ＳＥＰ−１−Ｂ５１及びｒｈＥＰＯの直線回帰分析を図３０に示す。ＳＥＰ−１−Ｂ５１およびｒｈＥＰＯでは応答は実質的に同じであった。ｒｈＥＰＯに対するＳＥＰ−１−Ｂ５１の効力比は１．００３５（９５％信頼限界は０．６９４７ないし１．４４９８）で、このアッセイにおいて測定されたＳＥＰ−１−Ｂ５１の効力は１００ｍＵ／ｎｇであった（９５％信頼限界６９−１４５）。
【０３３６】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１はｒｈＥＰＯに近いｉｎ　ｖｉｖｏ活性を示し、このモデルのｒｈＥＰＯに典型的な負のフィードバックメカニズムの誘導による比較的高投与量における応答プラトー等も含めて用量依存的に作用する。これは、ＳＥＰ−１−Ｂ５１の正確なユーザー決定グリコシル化部位に結合したポリマー構造がｒｈＥＰＯの糖鎖が貢献するｉｎ　ｖｉｖｏ活性を模することを示している。
【０３３７】
（実施例１７）
ＳＥＰ−１−Ｂ５１の薬物動態試験
正常雄ラット群に、クエン酸緩衝液＋０．２５％ヒト血清アルブミン中で処方したＳＥＰ−１−Ｂ５１の単回量、５μｇ／ｋｇ、またはｒｈＥＰＯ（５００Ｕ／ｋｇに匹敵する）を静脈内に単回投与し、その投与後５、３０、６０分、２、４、８、及び２４時間、及び２、３、４、５、６及び７日に採血した。血漿サンプル中のＳＥＰ−１−Ｂ５１またはｒｈＥＰＯ濃度を、メーカーのインストラクションにしたがって、Ｒ＆Ｄシステムズ抗−ＥＰＯ　ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトエリスロポエチン　クァンチキンＩＶＤ免疫測定キット＃ＤＥＰ００）を用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０３３８】
濃度の対数の最小二乗分析を行い、下の表ＸＩに列挙する薬物動態的パラメーターを得た。５μｇ／ｋｇの単回静脈注射を受けた雄ラットにおいて時間の経過につれて起きるＳＥＰ−１−Ｂ５１の血漿濃度の変化は半減期１０．５±０．５時間の片側指数的薬物動態的消失関数によって説明できる。ＳＥＰ−１−Ｂ５１の中心コンパートメントの分布容積（Ｖｃ）は３２．５±２．０ｍＬ／ｋｇであった。クリアランス（ＣＬ）は２．１５ｍＬ／ｈｒ／ｋｇで、平均滞留時間（ＭＲＴ）は１５．１±０．７時間であった。比較によると、５μｇ／ｋｇの静脈内投与を受けた雄ラットの血漿中ｒｈＥＰＯ濃度の変化は両側指数的薬物動態的消失関数によって最もよく説明でき、α半減期は１．２４±０．２２時間、β半減期は５．５１±０．４０時間であった。ｒｈＥＰＯのＶｃは５７．０±３．２ｍＬ／ｋｇであった。ＣＬは１６．０±０．５ｍＬ／ｈｒ／ｋｇであり、ＳＥＰ−１−Ｂ５１のそれより約８倍大きかった。ｒｈＥＰＯの平均滞留時間（ＭＲＴ）は５．７３±０．１７時間であり、ＳＥＰ−１−Ｂ５１のそれの約３分の１であった。
【０３３９】
表ＸＩ
【表１０】
2004508338.tif 000019
【０３４０】
ＳＥＰ−１−Ｂ５１及びｒｈＥＰＯの血漿中クリアランスのグラフを図３１に示す。これらのデータはＳＥＰ−１−Ｂ５１の循環半減期がグリコシル化組換えヒトＥＰＯを上回って有意に増加することを示し、この増加が分子の正確なユーザー決定部位に結合したポリマー構造によることを示す。
【０３４１】
（実施例１８）
ポリマー修飾合成ＲＡＮＴＥＳタンパク質の合成
本発明のポリマー修飾タンパク質をさらによく説明するために、ＲＡＮＴＥＳ　２−６８の２種類のポリマー修飾誘導体（ＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１７５５−０１；図３２、及びＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１７５５；図３３）及びＲＡＮＴＥＳ４−６６の２種類のポリマー修飾誘導体（ＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１８０５；図３４、及びＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１８０６；図３５）を合成した。これらのポリマー修飾タンパク質の構造は図３２−３５に示される。
【０３４２】
ＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１７５５−０１の製法
図３２に示されるＲＡＮＴＥＳ類似体、Ｇ１７５５−０１、を次のように合成した。
【０３４３】
１．ＡＯＰ−［ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）］−チオエステルの製法
アミノオキシペンタン−グリオキサリル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ
ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ　ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫ−チオエステル
Ｎ−末端アミノオキシペンタン−グリオキサリル　オキシム部分（ＡＯＰ）を含む、Ｎ−末端ペプチドセグメントＡＯＰ−［ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）］−αチオエステル（チオエステルは−Ｃ（Ｏ）ＳＲとも記される）を、チオエステル生成樹脂上でＲＡＮＴＥＳ（２−３３）配列を組立てることによって合成し（ハッケング（Ｈａｃｋｅｎｇ）ら、ＰＮＡＳ（１９９９）９６巻：１００６８−１００７３ページ）、それから標準的プロトコルにしたがって、アミノオキシペンタン−グリオキサリルオキシム部分［すなわちＣＨ３（ＣＨ２）４−Ｏ−Ｎ＝ＣＨＣＯＯＨ］と樹脂との直接カップリングによって上記Ｎ末端を改変した（ウィルケン（Ｗｉｌｋｅｎ）ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６巻（１号）：４３−５１ページ）。ペプチド−樹脂はフッ化水素で切り離し、逆相ＨＰＬＣによって精製してα−カルボキシチオエステル　ペプチド　ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）−チオエステルを得た。分析質量＝４１７９．６Ｄａ；計算質量＝４１７８．６Ｄａ（平均同位体組成物）。
【０３４４】
２．［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０の製法
ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ　ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ　ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ
ＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ
上記配列において、ＧＰ６はＬｙｓ６９のＮεに結合する：
【化８】
2004508338.tif 000020
ａ．固相ペプチド合成及び｛ペプチド−樹脂｝水溶性ポリマーの合成
Ｃ−末端ペプチドセグメント［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｓ）−Ｌｅｕ７０を、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で、Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳのためのｉｎ　ｓｉｔｕ中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを用いる一般的ＳＰＰＳ（シュネルツァーら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．（１９９２）４０巻：１８０−１９３ページ）によって合成した。
鎖の組立て完了後、Ｌｙｓ６９のイプシロン窒素のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン処理によって、保護されたペプチド樹脂から除去した。その後無水琥珀酸をＤＩＥＡを含むＤＭＦ中ＨＯＢＴ溶液中でＬｙｓ６９のイプシロン窒素にカップリングした。洗浄後、樹脂結合琥珀酸の遊離カルボキシル基をＤＭＦ中ＣＤＩの添加によって活性化した。もう一回洗浄サイクルを行った後、ＤＭＦ中０．５Ｍ　ＨＯＢＴ中５０％ＴＴＤを加えた。洗浄後、樹脂結合ポリマーは次の無水琥珀酸カップリング／ＣＤＩ活性化／ＴＴＤカップリングというサイクルの準備ができた。６サイクル後、琥珀酸無水物を、ＨＯＢＴ／ＤＭＦプラスＤＩＥＡ溶液中の最後のＴＴＤアミンにカップリングした。
ペプチド／直鎖水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で樹脂から切り離し、生成物を逆相分取ＨＰＬＣによって精製すると、［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０が得られる。分析質量＝６２５３Ｄａ；計算質量＝６２５２Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３４５】
３．Ｇ１７５５−０１の製法
アミノオキシペンタン−グリオキサリル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ
ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ　ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ
ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ　ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ　ＩＮＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号：４）
上記のＮ−末端及びＣ−末端ペプチドセグメントを、ドーソン（Ｄａｗｓｏｎ）らが記載したように（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６６巻：７７６−７７９ページ（１９９４））天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型の完全長ポリペプチド生成物を逆相ＨＰＬＣを使用してアセトニトリル対０．１％トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量＝１０，０６０Ｄａ。
ＧＰ６が付加した完全長ポリペプチドを、システイン−システイン　レドックス対を含む緩衝水溶液中で２ジスルフィド結合を同時に形成しながら折りたたみ、標準的プロトコルにしたがい逆相ＨＰＬＣによって精製した（ウィルケンら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６巻（１号）４３−５１ページ）。折りたたまれた生成物はＨＰＬＣでは均質であった。分析質量＝１０，０５６Ｄａ；計算質量＝１０，０５８Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３４６】
（実施例１９）
ＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１７５５の製法
図３３に描かれるＧ１７５５を次のようにして合成した。
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）の製法
ｎ−ノナノイル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫ−チオエステル
ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）をチオエステル生成樹脂上で実施例１８に記載したように合成し、その後ｎ−ノナノン酸を樹脂に直接カップリングすることによってＮ−末端を改変した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、逆相ＨＰＬＣで精製すると、ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）が得られた。分析質量＝４１７７．０Ｄａ；計算質量＝４１７７．６Ｄａ（平均同位体組成）
【０３４７】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０の製法ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ　ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ　ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ
ＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ
ａ．固相ペプチド合成及び｛ペプチド−樹脂｝水溶性ポリマー合成
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｓ）−Ｌｅｕ７０を、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上の一般的固相ペプチド合成法によって、実施例１８に記載のようにＢｏｃ化学固相ペプチド合成のためのｉｎ−ｓｉｔｕ中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用して合成した。
鎖組立完了後、Ｌｙｓ６９のイプシロン窒素上のＦｍｏｃ基を保護されたペプチド樹脂から除去し、上記ペプチド樹脂上で実施例１８に記載のようにＧＰ６構成物を合成した。ペプチド／直鎖水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取ＨＰＬＣで精製すると、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０が得られた。分析質量＝６２５２．９Ｄａ；計算質量＝６２５２．２Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３４８】
３．Ｇ１７５５の製法
ノナノイル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ　ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ
ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ　ＩＮＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号：５）
ａ．天然型化学的ライゲーションによる完全長ポリペプチドの組立
Ｎ−末端及びＣ−末端ペプチドセグメントを上の実施例１８に記載のように天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型の完全長ポリペプチドを、逆相ＨＰＬＣを用い、アセトニトリル対０．１％トリフルオロ酢酸含有水の直鎖勾配で精製した。分析質量＝１００６０．７Ｄａ；計算質量＝１００５８．７Ｄａ（平均同位体組成）。
ｂ．水溶性ポリマーで修飾したポリペプチドの折りたたみ及び精製
ＧＰ６が付加した完全長ポリペプチドを、システイン−システイン　レドックス対を含む緩衝水溶液中で２ジスルフィドの同時形成のもとで折りたたみ、上の実施例１８に記載のように逆相ＨＰＬＣによって精製した。折りたたまれた生成物はＨＰＬＣでは均質であった。分析質量＝１００５７．４Ｄａ；計算質量＝１００５４．７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３４９】
（実施例２０）
ＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１８０５の製法
図３４に描かれるＧ１８０５化合物を次のように合成した。
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステルの製法
ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫ−チオエステル
上記配列中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）。
ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）を実施例１８に記載のようにチオエステル生成樹脂上で合成し、それからｎ−ノナノン酸を上記樹脂に直接カップリングすることによってＮ−末端を改変した。上記ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、逆相ＨＰＬＣによって精製するとｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）が得られた。分析質量＝４１５１２．０Ｄａ；計算質量＝４１５２．６Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３５０】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ）−Ｌｙｓ６９−Ｌｅｕ７０）の製法
ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ　ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ　ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ
ＳＬＥＫ（Ｌｅｖ）ＳＫＬ
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ７０をＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂上で一般的ＳＰＰＳによって、実施例１８に記載のようにＢｏｃ化学ＳＰＰＳのためのｉｎ　ｓｉｔｕ中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用して合成した。
鎖組立の完了後、Ｌｙｓ６７のイプシロン窒素上のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中２０％ピペリジン処理によって、保護ペプチド樹脂から除去した。レブリン酸は１，３−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで対称性無水物として活性化され、Ｌｙｓ６７のイプシロン窒素にカップリングした。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取ＨＰＬＣによって精製すると、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９−Ｌｅｕ７０が得られた。分析質量＝４４３３．２Ｄａ；計算質量＝４４３４．２Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３５１】
３．Ｇ１８０５の製法
ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ　ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ
ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ　ＩＮＳＬＥＫ（Ｌｅｖ−ＧＰ２９）ＳＫＬ（配列番号：６）
上記配列中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、ＧＰ２９は、図３４に描かれ、実施例４に記載のように合成された枝分かれオキシム結合水溶性ポリマー構成物である。
ａ．天然型化学ライゲーションによる完全長ポリペプチドの組立
Ｎ−末端及びＣ−末端ペプチドセグメントを実施例１８に記載のように天然型化学的ライゲーションによって一緒に結合した。還元型完全長ポリペプチドを逆相ＨＰＬＣを用い、アセトニトリル　対　０．１％トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量＝８２１３．６Ｄａ；計算質量＝８２１６．６Ｄａ（平均同位体組成）。
ｂ．ＧＰ２９の、結合完全長ポリペプチドへの付加
凍結乾燥した完全長ポリペプチドを、等モル量のアミノオキシアセチル（ＡｏＡ）含有、枝分かれ水溶性ポリマー構成物ＧＰ２９と共に溶解し、共に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相ＨＰＬＣによって精製すると、位置６７リジンの改変された側鎖上のケト官能基にオキシム結合によって共有結合したＧＰ２９を有する完全長ポリペプチドが得られた。分析質量＝２３．８３６Ｄａ；計算質量＝２３．８４５Ｄａ（平均同位体組成）。別法として上記ポリペプチドの折りたたみ後にＧＰ２９が共有結合された；しかしこの方法では低収率であることが判明した。
ｃ．オキシム結合ＧＰ２９を含むポリペプチドの折りたたみおよび精製
ＧＰ２９と結合した完全長ポリペプチドをシステイン−システイン　レドックス対を含む緩衝水溶液中で２ジスルフィド結合を同時に生成しながら折りたたみ、実施例１８に記載のように逆相ＨＰＬＣによって精製した。折りたたまれた生成物はＨＰＬＣでは均質であった。分析質量＝２３，８３２Ｄａ；計算質量＝２３，８４０Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３５２】
（実施例２１）
ＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１８０６の製法
図３５に描かれるＲＡＮＴＥＳ類似体、Ｇ１８０６、を次のように合成した。
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステルの製法
ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫ−チオエステル
上記配列中、Ｘ＝シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）
ペプチドセグメント　ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステル（チオエステルは−ＣＯＳＲとも記される、ここでＲはアルキル基である）を実施例１８に記載したようにチオエステル生成樹脂上で合成し、その後ｎ−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってＮ−末端を改変した。上記ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相ＨＰＬＣで精製するとｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）Ｔｙｒ３Ｃｈｇが得られた。分析質量＝４１５２．０Ｄａ；計算質量＝４１５２．６Ｄａ（平均同位体組成物）。
【０３５３】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９（Ｐａｌｍ）−Ｌｅｕ７０の製法
ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ　ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ　ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ
ＳＬＥＫ（Ｌｅｖ）ＳＫ（Ｐａｌｍ）Ｌ
上記配列中、Ｋ（ｌｅｖ）は、野生型ＲＡＮＴＥＳから変化したＭｅｔ６７ＬｙｓのＬｙｓ６７のレブリン酸修飾イプシロン窒素である；Ｋ（Ｐａｌｍ）はアミノ−オクタン部分を介して結合したパルミテート修飾−Ｌｙｓ６９−イプシロン窒素で、次の構造を有する：
［ε窒素Ｌｙｓ６９］−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ６９（Ｐａｌｍ）−Ｌｅｕ７０は、一般的ＳＰＰＳによって、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｌｍ樹脂上で実施例１８に記載のようにＢｏｃ化学固体相ペプチド合成のためのｉｎ　ｓｉｔｕ中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを用いて合成された。位置６９でＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｓ）−ＯＨをカップリングした後、上記Ｆｍｏｓ基をＤＭＦ中で２０％ピペリジンで除去した。Ｆｍｏｓ−８−アミノ−オクタン酸をＨＢＴＵ／ＤＩＥＡで活性化し、Ｌｙｓ６９のイプシロン窒素にカップリングした。Ｆｍｏｓ基の除去後、パルミチン酸を１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＡＴＵ）及び１，３−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで活性化し、樹脂に結合した。それから実施例１８に記載のように、標準Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳ法を使用して鎖組立を完了した。鎖組立の完了後、Ｌｙｓ６７のイプシロン窒素上のＦｍｏｓ基をＤＭＦ中２０％ピペリジン処理によって除去した。レブリン酸を１，３−ジ−イソプロピルカルボジ−イミドで対称性無水物として活性化し、Ｌｙｓ６７のイプシロン窒素に連結した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切り離し、生成物を逆相分取ＨＰＬＣで精製すると、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９（パルミテート）−Ｌｅｕ７０が得られた。分析質量＝４８１３．７Ｄａ；計算質量＝４８１３．８Ｄａ（平均同位体組成）。
【０３５４】
３．Ｇ１８０６の製法
ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ　ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ
ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ　ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ　ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ
ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ　ＩＮＳＬＥＫ（Ｌｅｖ−ＧＰ２９）ＳＫ（Ｐａｌｍ）Ｌ　（配列番号：７）
上記配列中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）であり、パルミテート（“Ｐａｌｍ”）脂肪酸結合はアミノ−オクタン部分を介して行われる：
［ε窒素Ｌｙｓ６９］−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３
ａ．脂肪酸修飾完全長ポリペプチドの天然型化学的ライゲーションによる組立
Ｎ−末端及びＣ−末端ペプチドセグメントを一緒に、実施例１８に記載のように天然型化学的ライゲーションによって結合した。還元型の完全長ポリペプチドを、逆相ＨＰＬＣを使用し、アセトニトリル　対　０．１％トリフルオロ酢酸含有水の直線勾配で精製した。分析質量＝８５９８．２Ｄａ；計算質量＝８５９６．３Ｄａ（平均同位体組成）
ｂ．水溶性ポリマーＧＰ２９と、連結した脂肪酸修飾完全長ポリペプチドとの結合
凍結乾燥した完全長ポリペプチドを溶解し、等モル量のＡｏＡ含有ポリマーＧＰ２９と共に凍結乾燥した。乾燥した粉末を溶解し、逆相ＨＰＬＣによって精製すると、位置６７のリジンの改変された側鎖上のケト官能基にＧＰ２９がオキシム結合した完全長ポリペプチドが得られた。分析質量＝２４，２１７Ｄａ；計算質量＝２４，２２４Ｄａ（平均同位体組成）。或いは、上記ポリペプチドの折りたたみ後にＧＰ２９を共有結合することができる、しかしこの方法は低収率であることが判明した。
ｃ．オキシム結合したＧＰ２９及び脂肪酸を含むポリペプチドの折りたたみ及び精製
ＧＰ２９が付加した完全長ポリペプチドをシステイン−システイン　レドックス対を含む緩衝水溶液中で２ジスルフィド結合を同時に生成しながら折りたたみ、実施例１８に記載のように逆相ＨＰＬＣによって精製した。折りたたまれた生成物はＨＰＬＣでは均質であった。分析質量＝２４，２１０Ｄａ；計算質量＝２４，２２０Ｄａ（平均同位体組成）。
図３６には最終的折りたたみ、精製、合成Ｒａｎｔｅｓ類似体をあらわす分析データが示される。より詳細に述べれば、還元（Ｒ）及び非還元（Ｎ）条件下で野生型（Ｗｔ）ＲＡＮＴＥＳの相対的分子量を合成ケモカイン類似体ＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１８０６に比較する典型的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３６に示される。相対的分子量は各ゲルの左手側に記され、それらは同じゲル上の分子量標準試験（示されず）に対応する。折りたたまれ、精製されたＧ１８０６生成物の代表的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムも示される。これらは精密なポリマー修飾構成物が野性型天然ＲＡＮＴＥＳに比較して純粋であり、相対的分子量が大きいことを説明する。
【０３５５】
（実施例２２）
Ｇ１７５５−０１、Ｇ１７５５、Ｇ１８０５及びＧ１８０６の細胞融合アッセイ　細胞融合アッセイを行い、種々のポリマー修飾ＲＡＮＴＥＳ類似体の抗−ＨＩＶ活性を調べた。与えられた化合物パネルのＣＣＲ５−依存性細胞融合能力を、ＣＤ４及びＣＣＲ５を担い、リポーター系を含む細胞と融合するウィルス−エンベロープタンパク質を含むように改質された細胞を使用して測定した。ＣＣＲ５−依存性ウィルス−エンベロープ仲介性細胞融合アッセイは、実質的にシモンズら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６巻：２７６−２７９ページ）が記載した方法で、細胞系ＨｅＬａ−Ｐ５Ｌ及びＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡを用いて（両方ともアリゾン（Ｍ．Ａｌｉｚｏｎ）（パリ）の研究室から提供された）行われた。つまり、ＨｅＬａ−Ｐ５Ｌ細胞を９６ウェル　プレートに培養した（１０４細胞／１００μｌ／各ウェル）。２４時間後、培地を除去し、１０４ＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡ細胞／ウェル＋ケモカインを含む培地を加えた（２００μｌ最終容量）。さらに２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗い、５０μｌ　ＰＢＳ／０．５％ＮＰ−４０中で室温で１５分間溶解（ｌｙｓｅｄ）した。溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）について、β−ガラクトシダーゼ活性を次のように分析試験した：５０μｌ　２×ＣＰＲＧ基質（１６ｍＭクロロフェノール　レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；１２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、８０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、及び１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール）を加え、それから暗所で室温で１−２時間インキュベートした。５７５ｎｍの吸光度をラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）マイクロプレート　リーダーで読み取った。これらの数値から、阻止パーセント［１００×（ＯＤ（試験））−ＯＤ（陰性対照）］／ＯＤ（陽性対照）−ＯＤ（陰性対照）］を各阻止濃度で計算した。融合阻止パーセントを阻止濃度に対してプロットすると、各化合物のＩＣ５０が計算できた。
代表的結果を下の表ＸＩＩに示す。
【０３５６】
表ＸＩＩ
【表１１】
2004508338.tif 000021
【０３５７】
これらの結果は、直鎖または枝分かれ水溶性ポリマー構成物で部位特異的修飾を行った後も、抗融合活性がかなり保有されることを示す。この結果は、脂肪酸のような疎水性部分がＣ−末端に付加した際に種々のＲＡＮＴＥＳ類似体に観察された活性増加を考えると、驚くべきである。これはＲＡＮＴＥＳ類似体の疎水性が概して抗融合活性を高めるという仮説を支持するものである。これに対して、修飾に用いた水溶性ポリマー、特に枝分かれ水溶性ポリマーは非常に親水性で負に帯電していたが、活性の減少はごくわずかで、それはｉｎ　ｖｉｖｏ活性に求められる目標効力範囲内に十分入っていることが認められた。さらにより予想外だったことは、大きい、負に帯電した枝分かれ水溶性ポリマー構成物で修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似体の活性が、より小さい直鎖水溶性ポリマー構成物に比較して、相対的に保留されていたこと、及び小さい直鎖ポリマーで修飾された類似体と大きい枝分かれポリマーで修飾された類似体とが活性に対してほぼ同じ効果を有したことである。この後者の考察は、一部分は、水溶性ポリマーによる修飾が野生型ＲＡＮＴＥＳのペンダントＣ−末端残基内部の凝集領域において設計通り行われる際の凝集特性、および／または水溶性ポリマーの局所的抗融合特性によると考えられる。
【０３５８】
追加的効力増強性変化が、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ及びＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳに対して、水溶性ポリマーの結合に起因するわずかの活性損失を代償する。これらの変化は、Ｎ−末端への１個以上の疎水性アミノ酸誘導体の挿入、及びＣ−末端への疎水性脂肪酸部分の付加等がある。これらの結果は、単分散ポリアミド　エチレンポリマー類（またはその他の水溶性ポリマー類）と関連した付加的変化がＮＮＹ−及びＡＯＰ−型改変ケモカイン分子（例えばＮ−末端にＰｒｏ２Ｔｈｚ及びＴｙｒ３Ｃｈｇ両方の変化を受けた、および／またはＣ−末端に脂質部分が付加された、ＡＯＰ−またはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ等）の全体的効力を改善し得ることを示唆する。
【０３５９】
（実施例２３）
Ｇ１７５５、Ｇ１８０５、及びＧ１８０６の薬物動態試験
ポリマー−修飾ＲＡＮＴＥＳ類似体の薬物動態試験を次のように雄ＳＤラットで行った。前記のように製造したＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１７５５、Ｇ１８０５、及びＧ１８０６（対照としてのＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳと共に）を注射直前に、凍結乾燥タンパク質ストックから燐酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）中組成物として静脈注射（ＩＶ）用に処方した。個々の試験動物に等モル量のＲＡＮＴＥＳ類似体が投与されるように処方した［４００μｇ／ｋｇ（ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ）；５１０μｇ／ｋｇ（Ｇ１７５５）；１２１０μｇ／ｋｇ（Ｇ１８０５）；及び１２２５μｇ／ｋｇ（Ｇ１８０６）（μｇ類似体／ｋｇ動物）］。必要ならば最終濃度を調節して各動物で１ｍｌ／ｋｇの総投与量にした（すなわち投与容量を一定に保った）。実験１日目に処方した各類似体をラットの尾から静脈内に投与し、各動物は単回量を受けた。
【０３６０】
実験期間を通じて、各サンプル採取時点に約０．２５ｍｌの血液を尾静脈／動脈から集め、標準的プロトコル及び国立衛生研究所（ＮＩＨ）動物ケア指針及び推奨される試験法にしたがって抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して血漿または血清サンプルを調製した。最初のデータ収集に基づいて、各動物で３週間以内に０．２５リットル　サンプルを１４回より多く採取することは避けるようにサンプル採取時を調節した（ＮＩＨ動物ケア指針によって決められている）。最初のサンプル後、検出可能の血中濃度が持続するまでの間、１週間間隔で追加的サンプルを集めた。各時点における各ＲＡＮＴＥＳ類似体の血漿濃度をメーカーのインストラクションによって、クァンチカイン（商標）ＥＬＩＳＡ、ヒトＲＡＮＴＥＳイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ　カタログ＃ＤＲＮ００）を使用して測定した。動物の体重、食習慣、素質、外観等を含む全身的健康状態を実験期間中モニターした。明らかな副作用は認められなかった。典型的結果を図３７に記す。
【０３６１】
これらの結果は、種々の前駆体ＲＡＮＴＥＳ類似体に水溶性ポリマーを付加することによって循環半減期が実質に増加することを示している；半減期の見かけ上の増加はＧ１８０５＞Ｇ１８０６＞Ｇ１７５５＞ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳである。ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳに比べて、Ｇ１８０５では約４０倍、Ｇ１８０６では２０倍、Ｇ１７５５では１０倍であった。まとめていうと、水溶性ポリマー修飾ＲＡＮＴＥＳ類似体において保持される高い効力と顕著に改善される循環半減期とのバランスから、ｉｎ　ｖｉｖｏ環境におけるこれら化合物の治療的硬化の改善、並びに治療に必要な投与回数および一量の減少が期待される。
【０３６２】
本発明を本発明の特殊な実施形態と関連づけて説明したが、その他の改変も可能であることは当然であり、本出願は、概ね本発明の原理にしたがう本発明のいかなるバリエーション、使用または適応を網羅し、そのなかには、本発明が係わる技術の範囲内の公知のまたは従来の実地に使われる、またはこれまでに示した本質的特徴のために利用できる本開示からの逸脱も含まれるものとする。
【０３６３】
【配列表】
2004508338.tif 000022
2004508338.tif 000023
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本発明のポリマー修飾合成生物活性タンパク質の製法の略図である。
【図１Ｂ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｃ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｄ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｅ】
図１Ａと同様な図である。
【図２Ａ】
本発明の合成生物活性タンパク質の製法の略図である。
【図２Ｂ】
図２Ａと同様な図である。
【図２Ｃ】
図２Ａと同様な図である。
【図３Ａ】
３本以上の重なり合わないペプチドセグメントの化学的ライゲーションを含む多セグメントライゲーションのプロセスの略図である；すなわち少なくとも１本のセグメントが最終的完全長ライゲーション生成物に対応する中間セグメントである。
【図３Ｂ】
図３Ａと同様な図である。
【図４Ａ】
生成した側鎖チオールの化学的ライゲーション及び化学的改変を示す図である。
【図４Ｂ】
図４Ａと同様な図である。
【図４Ｃ】
図４Ａと同様な図である。
【図５Ａ】
本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−“ポリマー”−Ｊ＊の分岐コア（Ｂ）及び特異的化学選択的官能基（Ｕ）を生成する固相プロセスを示す図である。
【図５Ｂ】
図５Ａと同様な図である。
【図６Ａ】
本発明の好ましい実質的に非抗原性、水溶性ポリアミド“ポリマー”−Ｊ＊コンポーネントを生成し、その後Ｕ−Ｂコアに結合させる固相プロセスを示す図である。
【図６Ｂ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｃ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｄ】
図６Ａと同様な図である。
【図７】
Ｕ−Ｂコンポーネントを“ポリマー”−Ｊ＊コンポーネントにカップリングし、式Ｕ−Ｂ−ポリマー−Ｊ＊であらわされる本発明の好ましい合成ポリマー構成物を生成するプロセスを示す図である。
【図８】
本発明の生物活性タンパク質のライゲーション及び産生のために使用できるペプチドセグメントに水溶性ポリマーを正確に結合するためのもう一つの経路を示す図である。
【図９】
本発明の合成生物活性タンパク質の全体的製法を示す図である。
【図１０】
合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましいタイプの一般的構造を示す図である。ｐＰＥＧ＝“ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ＰＥＧ”
【図１１】
再配置されたアミノ及びカルボキシ末端を有する、環状に入れ替えたＳＥＰ同族体の一般的構造を示す図である。
【図１２】
合成生物活性タンパク質の基礎構造を示す図である。図において、“Ｊ”は疎水性側鎖を有する非天然的にコードされた残基を意味する。
【図１３】
好ましい合成ＲＡＮＴＥＳ類似体の構造を示す。図において、ＮＮＹ＝ノナノイル、Ｘ＝疎水性側鎖を有する非天然的にコードされたアミノ酸。ＦＡ＝脂肪酸。
【図１４Ａ】
好ましい水溶性ポリマー、及びその種々の直鎖及び枝分かれ構成物を示す図である。
【図１４Ｂ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１４Ｃ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１４Ｄ】
図１４Ａと同様な図である。
【図１５】
枝分かれ鎖ｐＰＥＧポリマーの形成を図式的に描いた図である。
【図１６Ａ】
実施例２に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｌ３０と呼ばれる合成サイトカインの合成を示す図である。
【図１６Ｂ】
図１６Ａと同様な図である。
【図１６Ｃ】
図１６Ａと同様な図である。
【図１６Ｄ】
図１６Ａと同様な図である。
【図１６Ｅ】
図１６Ａと同様な図である。
【図１７】
実施例２に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｌ３０と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図１８】
実施例３に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｌ２６と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図１９Ａ】
実施例４に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｂ５０と呼ばれる合成サイトカインに結合する好ましい枝分かれ鎖水溶性ポリマーの形成を図式的に示す図である。
【図１９Ｂ】
図１９Ａと同様な図である。
【図２０】
実施例４に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体であるＳＥＰ１−Ｂ５０と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図２１Ａ】
実施例５に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体であるＳＥＰ３−Ｌ４２と呼ばれる合成サイトカインの合成を示す図である。
【図２１Ｂ】
図２１Ａと同様な図である。
【図２２】
実施例５に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体であるＳＥＰ３−Ｌ４２と呼ばれる合成サイトカイン
を示す図である。
【図２３Ａ】
実施例７に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｂ５１と呼ばれる合成サイトカインに結合させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す図である。
【図２３Ｂ】
図２３Ａと同様な図である。
【図２４】
実施例７に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｂ５１と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図２５Ａ】
実施例８に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｂ５２と呼ばれる合成サイトカインに結合させるための好ましい水溶性ポリマーの合成を示す図である。
【図２５Ｂ】
図２５Ａと同様な図である。
【図２６】
実施例８に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー修飾合成類似体である、ＳＥＰ１−Ｂ５２と呼ばれる合成サイトカインを示す図である。
【図２７】
実施例２−５及び７−８に記載したように作製されたヒトＥＰＯの精密なポリマー−修飾合成類似体の代表的分析データを示す図である。示されるように、代表的等電点電気泳動ゲル（ＩＥＦ）及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは折りたたまれた精製ＳＥＰ１−Ｂ５１の相対的モノマー分子量を示す。
【図２８】
ＳＥＰ化合物の因子依存性細胞系、ＳＥＰ０、ＳＥＰ１−Ｌ２６、ＳＥＰ１−Ｌ３０、ＳＥＰ１−Ｂ５０、ＳＥＰ１−Ｂ５１、及びＳＥＰ３−Ｌ４２のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
【図２９】
ＳＥＰ３−Ｌ４２及びＳＥＰ１−Ｂ５０の血漿中濃度、ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）対　時間（ｈｏｕｒ）を比較する薬物動態曲線を示す図である。
【図３０】
ＳＥＰ１−Ｂ５１と、低酸素症ラットモデルのＣＨＯ細胞で産生された組換えグリコシレート化ヒトエリスロポエチンとで、７２時間赤血球（ＲＢＣ）−５９Ｆｅ取り込み（投与量の％として）によって測定したｉｎ　ｖｉｖｏ活性の線型回帰分析を示す図である。
【図３１】
各化合物５μｇ／ｋｇの単回静脈内注射後の時間（ｈｏｕｒ）に対するＳＥＰ１−Ｂ５１及びｒｈＥＰＯの血漿中濃度（ｎｇ／ｋｇ）を比較する、ラットにおけるクリアランスの典型的薬物動態曲線を示す図である。
【図３２】
実施例１８に記載したように作製したＲＡＮＴＥＳの精密なポリマー−修飾合成類似体である、ＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１７５５−０１と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図３３】
実施例１９に記載したように作製されたＲＡＮＴＥＳの精密なポリマー−修飾合成類似体である、ＲＡＮＴＥＳ　Ｇ１７５５と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図３４】
実施例２０に記載したように作製された、ＲＡＮＴＥＳの精密なポリマー−修飾合成類似体であるＲＡＮＴＥＳＧ１８０５と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図３５】
実施例２１に記載したように作製された、ＲＡＮＴＥＳの精密なポリマー−修飾合成類似体である、ＲＡＮＴＥＳＧ１８０６と呼ばれる合成ケモカインを示す図である。
【図３６】
実施例１８−２１において作製された合成ケモカイン類似体に関する典型的分析データを示す図である。示されるように、典型的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは還元性状態（Ｒ）及び非還元性状態（Ｎ）における野生型（Ｗｔ）ＲＡＮＴＥＳと合成ケモカイン類似体ＲＡＮＴＥＳＧ１８０６との相対的分子量を比較する。
【図３７】
各動物に各化合物の等モル量／キログラム（ｋｇ）を単回静脈内投与した後の時間（分）に対する合成ＲＡＮＴＥＳ類似体Ｇ１７５５、Ｇ１８０６、及びＧ１８０５の血漿中濃度（ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ））を比較するラットのクリアランスの薬物動態曲線を示す図である。
【図３８】
環状に入れ替えたポリマー修飾化合物を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2004508338.tif 000031
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2004508338.tif 000038
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2004508338.tif 000044
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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