(57)【要約】少なくともその一部がポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体により生成されるポリケチドである化合物の生合成は、特定の変更がＰＫＳのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン内で行われた後、行われる。そこにおける変更が基質特異性に影響を及ぼすような、基質結合ポケットにおけるか又はその近くの特定のモチーフが開示される。
2004506423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の合成方法であって、この化合物の少なくともその一部が、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインを含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体の生成物であるか、又はそのような生成物から誘導されるものであり、（ｉ）前記ＡＴドメインがわずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために変更されている前記ＰＫＳ酵素複合体を提供し、ここで前記変更された残基は、ＡＴドメインの活性部位ポケットに存在し、そしてＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼす１又は複数のモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼし；そして（ｉｉ）前記ＡＴドメインが変更されていないＰＫＳ酵素により生成され得たものとは異なる１つの化合物又は複数の化合物の混合物を生成するために、前記ＰＫＳ酵素複合体による合成を行う、段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記モチーフが、ＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインのＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物の合成方法であって、この化合物の少なくともその一部が、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインを含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体の生成物であるか、又はそのような生成物から誘導されるものであり、（ｉ）前記ＡＴドメインがわずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために変更されている前記ＰＫＳ酵素複合体を提供し、ここで前記変更された残基は、ＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼし、そしてＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインのＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列を含んで成るモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼし；そして（ｉｉ）前記ＡＴドメインが変更されていないＰＫＳ酵素により生成され得たものとは異なる１つの化合物又は複数の化合物の混合物を生成するために、前記ＰＫＳ酵素複合体による合成を行う、段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記モチーフが、ａ）ＡＴドメインの配列を決定することにより、そしてｂ）他のＡＴドメインの多くの配列との配列一列整列を行うことによって位置決定される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＫＳ酵素複合体が、モジュラーＩ型ＰＫＳ酵素複合体の少なくとも一部である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＴドメインの変更が、前記残基の５％以下に影響を及ぼす請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記変更が、ＸＡＦＨ， ＸＡＳＨ及びＸＡＧＨから選択されたモチーフを変更し、そして／又はそのようなモチーフを創造する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記モチーフがＸＡＧＨであり、そしてＸがＦ， Ｔ， Ｖ及びＨから選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記モチーフがＸＡＦＨであり、そしてＸがＨである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記モチーフがＸＡＳＨであり、そしてＸが、Ｙ， Ｈ， Ｗ及びＶから選択される請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記変更が、プロリン含有モチーフを生成するか又は変更する請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記モチーフの１又は複数の残基に対する変更の他に、前記基質結合ポケットにおけるか又はそれに隣接する１又は複数の追加の残基が変更されている請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記追加の変更された残基が、ａ）前記モチーフのすぐ下流の残基、ｂ）前記ＧＱＣモチーフから３個の残基の下流の残基、ｃ）前記ＧＨＳモチーフのすぐ下流に残基、及びｄ）前記保存されたアルギニン残基から４個の残基の下流の残基の１又は複数の残基を含んで成る請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記変更がマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そして前記モチーフに続いて、すでに存在しない場合、変更により生成されたＳが存在する請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記変更がメチルマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そして前記モチーフに続いて、すでに存在しない場合、変更により生成されたＳ、Ｇ、Ｃ又はＴが存在する請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記変更がメチルマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そして前記活性部位におけるＧＨＳモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＱである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記変更がマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そして前記活性部位におけるＧＨＳモチーフに続く残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＶ、Ｉ又はＬである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記変更がメチルマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そしてＧＱＧモチーフから３個の残基の下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＷである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記変更がマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そしてＧＱＧモチーフから３個の残基の下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＲ、Ｈ又はＴである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記変更がマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そしてＤＥＢＳの第１モジュールにおいて残基２５２として見出されるような保存されたＲから４個の残基の下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＭである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記変更がメチルマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そしてＤＥＢＳの第１モジュールにおいて残基２５２として見出されるような保存されたＲから４個の残基の下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＩ又はＬである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記変更がエチルマロニル−ＣｏＡに対して特異的なモチーフを生成し、そしてＤＥＢＳの第１モジュールにおいて残基２５２として見出されるような保存されたＲから４個の残基の下流の残基が、すでに存在しない場合、変更により生成されたＷである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＴドメインがＧＨＳモチーフと共に活性部位を有し、そして前記変更されたモチーフが前記ＧＨＳモチーフから８０〜１１０個下流の残基で開始する請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＫＳ酵素複合体を供給する前記段階（ｉ）が、前記複合体をコードする核酸配列を供給し、そしてその発現をもたらすことを含んで成る請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
発現が、ポリケチドを生成できる生物においてもたらされる請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸配列が、前記変更されたＡＴドメインをコードするよう、特定部位の突然変異誘発にゆだねられている請求項２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
変更の前の前記ＡＴドメインが第１生物において天然において発現され、そして前記変更されたＡＴが、前記変更が高められた特異性を有する基質を、前記第１生物よりも良好に供給することができ、そして／又は前記変更が低められた特異性を有する基質を、前記第１生物よりも十分に低く供給することができる第２生物において発現される請求項２４〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＫＳが、前記ＡＴドメイン、及び前記ＡＴにより第２ドメインにトランスファーされる基質を受けるよう、その変更の前、前記ＡＴドメインに対して天然においてカップリングされる第２ドメインを含み；そして前記変更が、前記第２ドメインに異なった基質をトランスファーするよう前記ＡＴによる作用を引き起こす請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＫＳが、前記ＡＴドメイン、及び前記ＡＴによりその天然の同起源のＡＣＰドメインにトランスファーされる基質を受けるよう、その変更の前、適合される前記ＡＣＰドメインを含み；そして前記変更が、前記同起源のＡＣＰドメインに異なった基質をトランスファーするよう前記ＡＴによる作用を引き起こす請求項１〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
前記変更されたＡＴドメインを含むＰＫＳが、ハイブリッドＰＫＳに対してスプライシングされる請求項１〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項記載の方法により得ることができる、ポリケチド化合物又はその誘導体、又はその一部がポリケチドである化合物又はその誘導体であって、前記ＡＴドメインの変更を伴わないで、前記ＰＫＳ酵素複合体によりもたらされる合成に起因する化合物とは異なる化合物。
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか１項記載の変更されたＡＴドメインを含むＰＫＳ酵素複合体をコードする核酸。
【請求項３３】
請求項３２記載の核酸を含むベクター。
【請求項３４】
請求項３２記載の核酸を含み、そしてＰＫＳ酵素複合体を発現することができる宿主生物。
【請求項３５】
少なくともその一部が、前記ＰＫＳ酵素複合体の作用に起因するポリケチドである化合物を合成するよう適合される請求項３４記載の宿主生物。
【請求項３６】
少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）を含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体の合成方法であって、わずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために前記ＡＴドメインを変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基が、前記ＡＴドメインの活性部位ポケットに存在し、そして前記ＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼす１又は複数のモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を与えることを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記モチーフが、ＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインのＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列を含んで成る請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）を含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体の合成方法であって、わずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために前記ＡＴドメインを変更することを含んで成り、ここで前記変更された残基が、前記ＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼし、そしてＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインのＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列を含んで成るモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を与えることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６， ３７又は３８のいずれか１記載の方法により生成されるようなＰＫＳ酵素複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は、ポリケチド（ｐｌｏｙｋｅｔｉｄｅ）の合成のためのアシルチオエステル単位の選択に影響を及ぼすために使用され得る方法及び材料（例えば、酵素系、核酸、ベクター及び培養物）、及び新規であるその得られるポリケチドに関する。それは特に、マクロライド、ポリエーテル又はポリエン、及び組換え合成を利用してのそれらの調製に関する。
【０００２】
好ましいタイプの態様においては、異なったポリケチド生合成遺伝子クラスターに由来する、ポリケチド生合成遺伝子又はそれらの一部は、特定のポリケチド、例えば予測される構造の１２−、１４−及び１６−員のマクロイドの生成を可能にするために操作される。本発明は、例えば（ａ）マロネート連鎖延長剤単位；又は（ｂ）メチルマロネート連鎖延長剤単位；又は（ｃ）エチルマロネート連鎖延長剤単位；又は（ｄ）追加のタイプの連鎖延長剤単位；又は（ｅ）アセテート及び／又はマロネート開始剤単位；又は（ｆ）プロピオネート及び／又はメチルマロネート開始剤単位；又は（ｇ）ブチレート及び／又はエチルマロネート開始剤単位；又は（ｈ）追加のタイプの開始剤単位を組み込む予定されたケチド単位を有するポリケチドを調製するために、一般的にアシルＣｏＡ；ＡＣＰトランスフェラーゼ（ＡＴ）機能をコードする遺伝子材料を修飾することによるそのＡＴ機能の修飾に特に関する。もちろん、本発明は、ポリケチド中の１つよりも多くのケチド単位に影響を及ぼすために使用され得る。この方法は、ポリケチドシンターゼによるタンパク質構造の変更を最小にすることができる。
【０００３】
ポリケチドは、抗生物質又は他の薬理学的性質を有する多くの化合物、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン、ラパマイシン、アベルメクチン、モネンシン、エポチロン及びＦＫ５０６を包含する、多くの及び構造的に異なった種類の天然の生成物である。特に、ポリケチドは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）及び関連する放線菌により多量生成される。それらは、脂肪酸生合成の態様に類似する態様でアシルチオエステルの反復された段階的縮合により合成される。
【０００４】
天然のポリケチド間に見出される構造的多様性は、“開始剤”又は“連鎖延長剤”単位（種々の他のタイプの単位の１つが時折り、選択され得るか）としての（通常）アセテート（マロニールＣｏＡ）又はプロピオネート（メチルマロニル−ＣｏＡ）の選択から一部、及び個々の縮合の後に形成されるβ−ケト基の異なった程度のプロセッシングから発生する。プロセッシング段階の例は、β−ヒドロキシアシル−への還元、還元に続く２−エノイル−への脱水、及び飽和アシルチオエステルへの完全な還元を包含する。それからのプロセッシング段階の立体化学結果がまた、連鎖延長の個々のサイクルのために特定される。α−炭素又はβ−ヒドロキシでのメチル化がまた、時々観察される。
【０００５】
ポリケチドの生合成は、ポリケチドシンターゼとして知られている鎖−形成酵素グループにより行われる。２種の広い種類のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）が、放線菌において記載されている。マクロライドエリスロマイシン、オレアンドマイシン、アベルメクチン及びラパマイシンのためのＰＫＳにより及びポリエーテルモネンシンのためのＰＫＳにより表される、１つの種類、すなわちＩ型ＰＫＳは、ポリケチド鎖延長の個々のサイクルのための酵素の異なった組み又は“モジュール”から成る。例については、図１（Ｓｏｒｔｅｓ， Ｊ． など． Ｎａｔｕｒｅ （１９９０） ３４８： １７６−１７８； Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｓ． などＳｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５２３： ６７５−６７９； Ｓｗａｎ， Ｄ． Ｇ． など． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９４） ２４２： ３５８−３６２； ＭａｃＮｅｉｌ． Ｄ． Ｊ． など． Ｇｅｎｅ （１９９２） １１５： １１９−１２５； Ｓｃｈｗｅｃｋｅ， Ｔ． など． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９５） ９２： ７８３９−７８４３； また、特許出願ＷＯ９３／０１５４６号）を参照のこと。
【０００６】
多くのＩ型ＰＫＳをコードする遺伝子は、配列決定されており、そしてそれらの配列は、公的に入手できるＤＮＡ及びタンパク質配列データベース、例えばＧｅｎｂａｎｋ， Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ａｎｄ ＥＭＢＬに開示されている。例えば、中でもエリスロマイシン（Ｃｏｒｔｅｓ， Ｊ． など． Ｎａｔｕｒｅ （１９９０） ３４８： １７６−１７８； 受託番号Ｘ６２５６９号， Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｓ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５２： ６７５−６７９；受託番号Ｍ６３６７７号）；ラパマイシン（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ， Ｔ． など． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９５）： ７８３９−７８４３；受託番号Ｘ８６７８０号）；リファマイシン（Ａｎｇｕｓｔ， Ｐ． など． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （１９９８） ５： ６９−７９； 受託番号ＡＦ０４０５７０号）及びチロシン（Ｅｌｉｌｉｌｌｙ、受託番号Ｕ７８２８９号）の合成を支配するＰＫＳについての配列は入手できる。
【０００７】
用語“ポリケチドシンターゼ”（ＰＫＳ）とは、本明細書において使用される場合、ポリケチドの生合成を担当する酵素活性の複合体を言及する。それらの酵素活性は、β−ケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）、β−ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）及びチオエステラーゼ（ＴＥ）を包含するが、但しそれらの活性には限定されない。それらの活性の個々は、この活性を担当する別々のタンパク質又はポリペプチドフラグメント上に存在する。
【０００８】
そのようなフラグメントは、“ドメイン”と称する。本明細書において使用される用語“モチーフ”又は“標識配列”とは、触媒機能、例えば基質の選択の１つの観点を担当する（少なくとも部分的に）ドメイン内の小さな範囲のアミノ酸（通常、１０個以下のアミノ酸）を言及する。用語“延長モジュール”とは、本明細書において使用される場合、ポリケチド鎖延長の１つのサイクルを達成する、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（“ＫＳ”）ドメインから次のアシルキャリヤータンパク質（“ＡＣＰ”）ドメインまでの連続ドメインの組みを言及し；これはポリケチド鎖の還元プロセッシングを担当するドメインを含んでも又は含まなくても良い。用語“負荷モジュール”とは、ＰＫＳ上に開始剤単位の負荷を達成し、そして従って、特定の延長モジュールのＫＳドメインに対してそれを入手可能にするいずれかのグループの連続ドメインを言及するために使用される。
【０００９】
背景技術：
遺伝子工学によりＰＫＳのポリケチド生成物の性質を変更するいくつかのアプローチはこれまで提案されている：特に、ＷＯ９３／１３６６３号及びＷＯ９８／０１５７１号を参照のこと。形成されるポリケチドの長さは、エリスロマイシン生合成の場合、鎖−開放チオエステラーゼ／シクラーゼ活性を含むエリスロマイシン生成ＰＫＳの酵素ドメインの遺伝子工学を用いての特定の再配置により変更されて来た（Ｃｏｒｔｅｓ， Ｊ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５） ２６８： １４８７−１４８９； Ｋａｏ， Ｃ．Ｍ． など． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９５） １１７： ９１０５−９１０６）。
【００１０】
エリスロマイシン生成ＰＫＳ（また、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ、ＤＥＢＳとしても知られている）のモジュール５におけるケトレダクターゼドメインの部分をコードするＤＮＡのイン−フレーム欠失が、エリスロマイシン類似体５，６−ジデオキシ−３−α−マイカロシル−５−オキソエリスロノリドＢ、 ５，６−ジデオキシ−５−オキソエリスロノリドＢ及び５，６−ジデオキシ、６β−エポキシ−５−オキソエリスロノリドＢの形を誘導することが示されている（Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｓ． など． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５２： ６７５−６７９）。
【００１１】
同様に、その対応するＰＫＳ−コードのＤＮＡの遺伝子工学による、ＤＥＢＳにおけるモジュール４のエノイルレダクターゼドメインにおける活性部位残基の変更、及びサッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）中へのその導入は、６，７−アンヒドロエリスロマイシンＣの生成を導入した（Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｓ． など． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９３） ９０： ７１１９−７１２３）。
【００１２】
特許出願ＷＯ００／０１８２７号は、β−炭素の酸化状態を変えるためにＰＫＳを操作するさらなる方法を記載する。ラパマイシンＰＫＳモジュール１０及び１３に由来するドメインによる、エリスロマイシン生成ＰＫＳのモジュール２の還元性ドメインの置換は、それぞれ、Ｃ１０−Ｃ１１のオレフィン−エリスロマイシンＡ及びＣ１０−Ｃ１１のジヒドロエリスロマイシンＡの形成を誘導した。
【００１３】
第２種類のＰＫＳ、すなわちＩＩ型ＰＫＳは、芳香族化合物のためのジシンターゼにより表される。ＩＩ型ＰＫＳは、鎖延長のための１組の酵素活性のみを含み、そしてそれらは連続的サイクルにおいて適切な場合、再使用される（Ｂｉｂｂ， Ｍ． Ｊ． など． ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８９） ８： ２７２７−２７３６； Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｄ． Ｈ． など． ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８９） ８： ２７１７−２７２５； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ， Ｍ．Ａ． など． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９２） ２６７： １９２７８−１９２９０）。ＩＩ型ＰＫＳのための“連鎖延長剤”単位は通常、アセテート（マロニル−ＣｏＡ）単位であり、そして特定のシクラーゼの存在は、芳香族生成物中への完結された鎖の環化のための好ましい経路を指図する（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ， Ｃ．Ｒ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｉ， Ｉ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９９５） ４９： ２０１−２３８）。
【００１４】
ハイブリッドポリケチドは、異なったＩＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスターを含むもう１つの株中へのクローン化されたＩＩ型ＰＫＳ遺伝子含有ＤＮＡの導入により、例えばストレプトミセス・ガリレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇａｌｉｌｅｕｓ）のアントラキノンポリケチド−生成株中への、アクチノロジン、すなわちストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からの青色ポリケチドのための遺伝子クラスター由来のＤＮＡの導入により得られて来た（Ｂａｒｔｅｌ， Ｐ．Ｌ． など． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９９０） １７２： ４８１６−４８２６）。時折り、異常な開始剤単位が、特にオキシテトラサイクリン、フレノリシン及びダウノルビシンの生合成においてＩＩ型ＰＫＳにより導入され、そしてそれらの場合、別々のＡＴが開始剤単位をＰＫＳにトランスファーするために使用され得る。
【００１５】
菌類ＰＫＳ、例えば６−メチルサリチル酸又はロバスタチンＰＫＳは典型的には、それらの分子のポリケチド部分の合成のために必要とされるほとんどの活性を包含する単一の多−ドメインポリペプチドから成る（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃ． Ｒ． ａｎｄ Ｆｕｊｉｉ Ｉ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９９５） ４９： ２０１−２３８）。ＩＩ型菌類ＰＫＳもまた知られている。
ポリケチドシンターゼ及び非リボソームペプチドシンターゼ分子を含んで成る多くの混合されたシステム、例えばエポチロン及びブレオマイシン生合成クラスターが同定されている。
【００１６】
多数の治療的に重要なポリケチドが同定されているが、増強された性質を有するか、又は完全に新規の生活性を有する新規ポリケチドを獲得する必要がある。Ｉ型ＰＫＳにより生成される複合体ポリケチドは、それらが駆虫剤、殺昆虫剤、抗癌剤、免疫抑制剤、抗菌剤又は殺菌剤としての既知の利用性を有する化合物を包含することにおいて、特に価値がある。それらの構造的複雑性のために、そのような新規ポリケチドは、全体的な化学合成により、又は既知のポリケチドの化学的修飾により容易に得ることができない。
【００１７】
所望される特定の変化は、組み込まれる開始剤及び／又は連鎖延長剤単位の性質を変えることによる炭素骨格の変化、鎖延長の後に生じる一連の還元段階を変更することによるβ−ケト炭素の酸化レベル及び従って、酵素置換のパターンの変化、及び一般的に、ポリケチド分子のヒドロオキシル化、メチル化又はグリコシル化を包含する後ＰＫＳ“調整（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）”段階の変化である。
【００１８】
構成されるハイブリットＰＫＳ遺伝子のすべて、又は大部分が実施可能であり、且つ所望するポリケチド生成物を生成するよう、個々のモジュールを実際的に開発する信頼できる且つ特定の手段を開発する必要性がある。種々の方法が、特に組換えＤＮＡ技法新規生合成を用いて、それらのハイブリッドＰＫＳを生成することが記載されている。ＰＫＳタンパク質構造への変更を最小にする態様でそれらのＰＫＳを操作する方法を開発する特定の必要性がある。それらの操作を達成するための存在する方法は時々、修飾されていないＰＫＳが生成物を製造する割合のわずか１％又はそれ以下で、所望する生成物を付与するハイブリッドＰＫＳ多酵素を生成する。
【００１９】
ＷＯ９３／１３６６３号及びＷＯ９８／０１５７１号は、ＰＫＳを構築する新規方法を記載する。ポリケチド分子におけるいずれかの位置で使用される連鎖延長剤単位、特にマロニル−、メチルマロニル−、又はエチルマロニル−ＣｏＡの性質を変更する十分に確立された方法は、ドメイン置換によるものである。例えば、ＷＯ９８／０１５４６号及びアメリカ特許第６，０６３，５６１号は、修飾されたエリスロマイシンを形成するためにこの修飾を達成する方法を開示する。新規ポリケチド分子、この場合、特に新規エリスロマイシンは、サッカロミセス・エリトラエア染色体上の完全なＡＴドメイン−コードのＤＮＡフラグメントの、もう１つのＰＫＳクラスターからの同等の異種ＡＴドメイン−コードのフラグメントによる置換により生成される。異種ドメインを挿入するために正確なＤＮＡ／タンパク質スプライス部位の選択が、その対応するＤＮＡ及びタンパク質配列の詳細な分析を必要とすることは、当業者に良く知られている。
【００２０】
異なった研究者は、タンパク質の保存された、半保存された又は保存されていない領域で、又はＡＴドメインの境界内の又はその境界での部位でのスプライシング部位の使用を選択する。この技術の追加の欠点は、特定の異種ドメインがいずれかの所定の情況下で作動するかどうかを予測することが困難であることである。１つのモジュールにおいて都合良く作動するドメインは、隣接するモジュールにおいてまったく作動しないか、又は莫大に低められた収率でポリケチドを生成することができる。Ｏｌｉｙｎｙｋ， Ｍ． など． （Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （１９９６） ３： ８３３−８３９） 及びＲｕａｎなど． （Ｊ． Ｂａｃｔ． （１９９７） １７９： ６４１６−６４２５） は、エリスロマイシンＰＫＳのモジュールにおけるマロニル−ＣＡ特異的ＡＴドメインによりリメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインを交換する研究を公開している。
【００２１】
生成物は、モジュール１及び２における変化についてのみ観察され、そしてモジュール２においては、莫大に低められた収率で生成物が観察された。Ｓｔａｓｓｉなど． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９８） ９５： ７３０５−９） は、エチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにより、エリスロマイシンＰＫＳのモジュール４のメチルマロニルーＣｏＡ特異的ＡＴを交換し、そして再び、生成物の収率は、必要とされるエチルマロニル−ＣｏＡ前駆体の供給を高めると思われるクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の付加の後でさえ、低かった。制限する収率についての可能性ある理由は、効率的なポリケチド鎖合成のために適切に相互作用すべきである隣接するＫＳ及びＡＣＰドメインとの異種ＡＴドメインの構造的又は機械的非適合性である。
【００２２】
結果的に、適切な効率を表示する新規ポリケチド−生成株を得るために多ドメイン交換を試みることがしばしば必要である。なぜならば、それらの変化が二段階二重組み込み方法を通して染色体上での遺伝子置換により行われる場合、特に困難にされるからである。ＤＮＡレベルでのスプライシング部位の導入は、時間の浪費であり、そして技術的に困難であり、ＰＫＳタンパク質コードの読み取り枠が破壊されないことを確かめるための注意した分析を要する。制限酵素部位の導入はしばしば、さらなるＰＫＳタンパク質構造の破壊及び従って、触媒効率の損失を導く、アミノ酸レベルでの変化を必要とする。
【００２３】
タンパク質の三次構造に対する最少の破壊性を伴って、ＡＴ基質特異性に影響を及ぼすよう、特定部位の突然変異誘発のために利用できる多くの技法を使用する方法は、現在の技法に付加価値を与える。
【００２４】
活性部位に対する変化は、他のシステムにおける基質特異性を変更することが示されている。例えば、初期研究においては、Ｓｃｒｕｔｔｏｎなど． （Ｎａｔｕｒｏ （１９９０） ３４３： ３８−４３） は、グルタチオンレダクターゼの補酵素基質特異性を交換するために特定部位の突然変異誘発を使用した。ＮＡＤＰ＋結合ドメインにおける“フィンガープリント”構造モチーフを同定し、そして変更する場合、それらは酵素を、ＮＡＤ＋に対する著しい選択を示す酵素に転換することができた。指図された進化の技法が、酵素触媒機能を改良し／変更するために使用されて来た。文献中の多くの例の中で、Ｚｈａｎｇなど． （ＰＮＡＳ （１９９７） ９４： ４５０４−４５０９） は、それらの技法によるガラクトシダーゼのフコシダーゼへの転換を例示する。その得られるタンパク質は、６個の突然変異を担持し、それらのうち３個は、活性部位に又はその近くに存在する。
【００２５】
ＰＫＳドメインに対する、マイナーであるが、しかし指図された変更は、その触媒機能への有意な変化を行うことができる。特許出願ＷＯ００／００５００号は、連鎖延長剤ケトシンターゼドメインが、活性部位での特定部位の突然変異誘発により、脱カルボキシル化（及び従って、負荷）ケトシンターゼドメインに転換することを教授する。アメリカ特許第６，００４，７８７号及び第６，０６６，７２１号、及びＪａｃｏｂｓｅｎなど． Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９７） ２７７： ３６７−３６９は、修飾されたＰＫＳへの合成前駆体の育成により新規ポリケチドの生成を可能にするためにこの活性を不活性化するＫＳ１活性部位における残基の欠失を記載する。
【００２６】
いくつかの研究は、適切な基質、及び特に、基質側鎖（すなわち、アシル−ＣｏＡチオエステルのマロニル部分）の性質の認識と、直接的に包含されるアミノ酸を決定するためにＡＴの一次アミノ酸配列とを相互関係づけることを試みた。Ｈａｙｄｏｃｋなど． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３７４： ２４６−２４８） による研究は、既知の活性部位の上流のモチーフ１１のアミノ酸と、マロニル−又はメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴの基質特異性とを関連づけた。このモチーフと、Ｅ． コリ脂肪酸シンターゼからの既知のアシルトランスファラーゼのタンパク質構造との間の比較は、活性部位へのモチーフ残基の接近性（及び従って、基質を選択するその能力）の著者による評価を可能にした。
【００２７】
その著者は、このようにして同定されたこの規準からはずれた領域が、基質と直接的に接触するほど十分に接近していないが、アシルトランスフェラーゼ活性部位近くに存在することを認識した。他の研究（Ｋａｔｚ， Ｌ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． （１９９７） ９７： ２５５７−２５７５， Ｔａｎｇ， Ｌ． など．， Ｇｅｎｅ （１９９８） ２１６： ２５５−２６５） は、ポリケチド遺伝子クラスター配列決定計画に由来するタンパク質配列からＡＴ基質特異性を予測するための手段としてそれらの残基を用いて、特定の連鎖延長剤単位と追加の残基とを相互関連づけた。残基が機械論的重要性を有するかどうかはまだ、不明確であった。
【００２８】
わずか１つの場合、ＰＫＳ ＡＴドメイン内の領域が、ＡＴ特異性を交換する試みにおいて交換されており；特許出願ＷＯ００／０１８３８号及びＬａｕなど． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９９） ３８： １６４−５１） は、連鎖延長剤単位の選択においてＡＴドメインのＣ−末端での“超可変部”を包含した。それらの研究者は、この２５〜３０個の長さのアミノ酸を交換し、そしてこの変化がＡＴの基質特異的を変更するのに十分であったことを示し、すべてのＡＴドメインに存在する短い（２３〜３５個のアミノ酸）Ｃ−末端セグメントがそれらの基質特異性の主要決定因子であることを結論づけた。興味あることには、その長さの及びアミノ酸配列は、既知のＡＴドメイン間で相当に変化する。
【００２９】
従って、本発明者は、ＰＫＳモジュールによる連鎖延長剤単位の選択は、弱められた又は変更された基質特異性を有する新規ＡＴドメインを生成するために結合突然変異誘発を通して操作され得る“超可変域”により影響されることを示唆する。驚くべきことには、本発明者の構造分子モデリング研究は、この領域が活性部位から離れて表面接近領域で存在し、そして従って、マロニル部分又は使用される基質と直接的に相互作用する（そして従って、直接的に選択する）ことを示す。従って、基質特異性に対する効果はたぶん、三次構造の破壊により、不正確であり、且つより間接的な効果である。
【００３０】
発明の開示：
本発明の第１の観点によれば、少なくともその一部が、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインを包含するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素複合体の生成物であるか、又はそのような生成物から誘導されている化合物の合成方法が提供される。前記方法は、前記ＡＴドメインがわずかな割合のアミノ酸残基を選択的に変えるために変更されている前記ＰＫＳ酵素複合体を供給する段階を包含する。
【００３１】
前記変更された残基は、ＡＴドメインの活性部位ポケットに存在し、そしてＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼす１又は複数のモチーフを含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼし；及び／又はＡＴドメインの基質特異性に影響を及ぼし、そしてＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインのＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列を含んで成るモチーフの１又は複数の残基を含んで成り、前記変更が前記基質特異性に影響を及ぼす。次に、合成は、前記ＡＴドメインが変更されていないＰＫＳ酵素により生成され得たものとは異なる１つの化合物又は複数の化合物の混合物を生成するために、前記ＰＫＳ酵素複合体によりもたらされる。
【００３２】
ＰＫＳ酵素複合体は、モジュラーＩ型ＰＫＳ酵素複合体の少なくとも一部であり得るか、それは、ＩＩ型ＰＫＳシステム、菌類ＰＫＳシステム、又はＰＫＳ及び非リボソームペプチドシンターゼモジュールを含んで成るハイブリッドシステムから誘導され得る。
【００３３】
本発明は、ＡＴドメインにおける少数のアミノ酸残基、及び特に、ＡＴドメイン内の短い標識“モチーフ”の１又は複数の残基を含んで成るＡＴ活性部位に隣接する残基を変更することによって、そのＡＴドメインにより選択されるアシルチオエステルに影響を及ぼすことが可能であることを教授する。新規ポリケチドは、１又は複数のモジュール上の標識モチーフが変更され、例えばマロニル基質のための異なった特異性に関連するモチーフにより置換されている修飾されたＰＫＳにより製造され得る。さらに、本発明は、不正確な連鎖延長剤単位の非特異的組み込みのために、天然のシステムにおいて時折見出される混合されたポリケチド生成物の割合を低める方法を提供する。逆に言えば、本発明は、ＰＫＳにより生成されるポリケチドの多様性を高める、混合された集団のポリケチド生成物を供給する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、通常の連鎖延長剤アシルチオエステルの１つの組み込みを特定するＡＴにおける存在するアミノ酸残基モチーフの、他のアシチルチオエステルを特定するもう１つのＡＴに見出されるもう１つのモチーフによる置換による修飾されたＰＫＳの調製を可能にする。これは、ポリケチドシンターゼの基質特異性がポリケチド−生成生物において発現される場合、その基質特異性を変更する。
【００３５】
多くのＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスターについてのＤＮＡ配列は開示されている。マクロライド、特にエリスロマイシン、ラパマイシン、アベルメクチン、リファマイシン、ＦＫ５０６、エポチロン、チロシン、ニダマイシン、イオノホレ、ポリエーテル、特にモネンシン及びポリエン、特にナイスタチンの形成を担当するＩ型ＰＫＳモジュール由来のＡＴドメインの包括的な配列分析は、ＡＴドメインの特徴であるアミノ酸の同定を可能にした。
【００３６】
図２は、それらのＡＴドメインの配列比較を示す。この配列比較は、関連する配列のグループからの複数の配列一列整列を創造する方法を用いてのコンピューターを使用して、一般的に便利な手段で生成されて来た。本発明者は、Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２５： ３５１−３６０ （１９８７）） の漸進性一列方法の単純化を用いて、複数配列の一列整列を創造する。Ｐｉｌｅ Ｕｐ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ） と呼ばれるプログラムを使用した。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ （ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３ （１９８９））により記載される方法に類似する。そのプログラムは、すべての配列の最終一列を形成するために、多数の配列の一緒の比較を可能にする一連の漸進性、対様一列整列を実行する。
【００３７】
ギャップが、強い類似性の領域の一列整列を可能にするために個々の配列中に挿入され得る。これはしばしば、強く保存される領域がしばしば、アミノ酸の数及びアミノ酸のタイプの両者に関して、より種々の領域により分離される場合、必要とされる。異なったプログラムは、それらの比較を行うために異なった数学的アルゴリズムを使用し、マイナーな手段で異なる一列整列をもたらす。しかしながら、強い相同性の領域は、たとえ一列整列プログラムが利用されても、まだ整列できことが予測されている。議論される特定のモチーフは、印が付けられている。
【００３８】
それらのモチーフは、ドメインの開始に隣接する保存されたＧＱＧモチーフ、ＡＣＰへのトランスファーの前、アシル鎖を共有結合する活性部位セリンを含むＧＨＳモチーフ、及びドメインの末端に隣接するＬＰＴＹモチーフを包含する。アルギニンを包含する、すべてのＡＴに共通する他の残基は、アシルチオエステルのカルボキシレート基を安定化すると思われる。さらなる詳細に配列分析は、マロニル−、メチルマロニル−及びエチルマロニル−ＣｏＡの組み込みを担当するＡＴ間で異なるアミノ酸残基の同定を可能にした。それらのアミノ酸又はモチーフのいくつかは、前に論じられたようなクラスターの配列分析の間、これまでに同定されている。
【００３９】
それらのモチーフは、マロニル−／メチルマロニル−ＣｏＡが使用され得るかどうかを予測することができるが、それらは一般的に、メチルマロニル−対エチルニル−ＣｏＡ又は通常使用される他の連鎖延長剤単位間の差異を示すことができない。本発明者は、基質認識に包含される最も重要且つ基本的な残基、及び従って、変更のための最も適切な残基の同定のための重要な必要条件としてこれを見た。精密な分析は、２個の残基がすべてのＡＴ中で実質的に不変であり、そして２個の残基が連鎖延長剤単位に依存して一貫して異なる、４個の残基（位置は図２において明確に同定される）の鎖を同定した。
【００４０】
特に、マロニル−ＣｏＡの認識を担当する大部分のＡＴにおいては、残基ＨＡＦＨの配列が同定された。メチルマロニル−ＣｏＡの認識を担当する大部分のＡＴにおいては、同等の残基が残基ＹＡＳＨにより置換された。エチルメロニル−ＣｏＡ又は他の類似するサイズのＣｏＡ単位組み込みを担当するＡＴＳにおいては、全体のモチーフは、異なっており、ほとんど保存されないが、しかし一般的に配列ＸＡＧＨ（ここでＸは最も頻繁には、Ｆ， Ｔ， Ｖ又はＨであるが、但しそれらだけには限定されない）を示した。
【００４１】
本発明者は典型的には、マロニル−ＣｏＡ、メチルマロニル−ＣｏＡ及びエチルマロニル／さらなるＣｏＡ特異性に関するそれらのモチーフを説明するために用語ＨＡＦＨ， ＹＡＳＨ及びＴＡＧＨを使用したが、しかしモチーフにおける、特に記載されるような残基１での置換を可能にするために本明細書におけるそれらの用語を使用する。モチーフの実質的な置換及び正確な位置は、図２の調査又は類似する配列分析により当業者に明確であろう。
【００４２】
図２に存在しないＡＴ配列内のモチーフの位置を決定するための下記３種の可能な方法が存在する。それはたぶん、使用されるであろう方法の組合せである。
Ｉ）モチーフＨＡＦＨ、ＹＡＳＨ又はＴＡＧＨを同定するために配列の可視的調査及び比較による。残基の置換以来、ヒスチジン（Ｈ）から１つのアミノ酸（通常Ｆ， Ｓ又はＧ）により分離されるアラニン（Ａ）を調べるための有用の方法に遭遇する。
【００４３】
ＩＩ）活性部位セリンからのアミノ酸の計数による。モチーフの開始は典型的には（但し、制限されるべきではない）、ＧＨＳ活性部位モチーフの下流の９０〜１００個のアミノ酸である。
（ＩＩＩ）図２に注釈される配列及びモチーフ、又は他のＡＴに対して新規配列の直接的な比較を可能にするコンピューター生成される複数の一列整列による。
【００４４】
これが、モチーフ内に置換が存在する場合、モチーフの明白な同定を可能にするので、第３の方法を使用することが好まし。これは、残基の１つがプロリン（Ｐ）により置換され得る、いくつかのより異常なタイプのＡＴにおいて特に必要である。前記第３の方法はまた、モチーフとＡＴ活性部位セリンとの間の残基の数が標準から有意に異なる場合、モチーフを同定するであろう。その第３の方法はまた、アミノ酸の同じか又は類似する開始がドメインにおける他の部分に存在する場合、モチーフをより良好に同定するであろう。
【００４５】
それらのモチーフ残基の特定の特徴は、選択される基質に比較して、第３の残基サイズの関係である。従って、マロニル−ＣｏＡが必要とされる場合、第３の残基は大きく（フェニルアラニン）、メチルマロニル−ＣｏＡが必要とされる場合、この残基は中間であり（セリン）、そしてエチルマロニル−ＣｏＡが必要とされる場合、この残基は小さい（グリシン）。基質側鎖サイズとこの第３の残基との間の逆の関係は、特に注目すべきである。興味アルことには、この関係はまた、例えばＰＫ５０６（ＨＡＧＨ）の生成の間、鎖延長のいくつかのサイズのために必要とされる。
【００４６】
より異常な連鎖延長剤単位、例えばメトキシマロニル−ＣｏＡの組み込みを考慮する場合、適用される。現在、５炭素−ＣｏＡ単位の組み込みを担当するＡＴの単一の例のみが開示されている。この場合、ＡＴはこの点で異なったモチーフ、すなわちヒスチジンのみが保存されているＣＰＴＨを表示する。このモチーフにおけるプロリン残基の組み込みは、大きな基質を特定するＡＴの表示であり得る。プロリンはまた、アベルメクチン及びソラフェンの場合に見られるように、大きな異常な開始剤酸を組み込むＡＴにおけるモチーフにも見出される。この領域における及びその周囲での、但しＡＴドメインの活性部位に存在する残基は、選択される基質に対するドメインの特異性を定義する。
【００４７】
マロニル−及びメチルマロニル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−及びエチルマロニル−ＣｏＡのためのモチーフのハイブリッドを表すもモチーフが同定されている。特に、エポチロンモジュール３−予測のＨＡＦＨ又はＹＡＳＨ（マロイル−ＣｏＡ又はメチルマロニル−ＣｏＡ特異的）がＨＡＳＨを見出し、又はモネンシンモジュール５−予測のＴＡＧＨ（エチルマロニル−ＣｏＡ特異的）がＶＡＧＨを見出した。有意には、それらの両者の場合、ＰＫＳの生成物は、２種の異なった連鎖延長剤単位の組み込みのために、メネンシンＡ及びＢ、及びエポチロンＡ及びＢの形成を引き起こすハイブリッドモチーフを含むモジュールによる混合物である。しかしながら、基質供給が形成されるメネンシンＡ及びＢの割合の有意な決定因子であることは知られている（Ｌｉｕ， Ｈ． ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｋ． Ａ （１９９９） Ｊ． Ｂａｃｔ． １８１： ６８０６−６８１３）。
【００４８】
前に提案された“予測的な”モチーフの多くは、それらが活性部位ポケットに位置しないので、基質特異性の主要決定因子でありそうもない。基質間を区別するよう作用することができるいずれかのモチーフの特定の必要条件は、それが活性部位近くに、及び好ましくは、基質結合ポケット内に存在することである。この分析においては、本発明者は補酵素Ａ部分よりもむしろアシルチオエステルのマロニル部分を結合し／認識するポケットの一部であるとその基質結合ポケットを考慮する。すべての確立においては、配列分析によりこれまで同定された類似性のいくつかは、機会的必要条件よりもむしろ進化的な保存性のためである。
【００４９】
対照的に、本発明者が同定した残基は、基質結合ポケットに又はそれに接近して存在する。空間でのモチーフの正確な位置を評価するために、本発明者は、Ｉ型ＰＫＳに由来するＡＴのタンパク質配列と、Ｅ．コリ脂肪酸マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼのその配列と比較し、このためには、高分解能Ｘ−線結晶構造が存在する（Ｓｅｒｒｅ， Ｌ． など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９５） ２７０： １２９６１−１２９６４）。それらのタンパク質間の配列類似性の全体レベルは低いが、基本的残基（及び特に、機械的重要な残基）は保存され、そしてアミノ酸の全体的な空間配置は保存されることが予測される。
【００５０】
多くのグループがモデルＡＴとしてこの構造を使用し、そして構造の保存が配列保存のレベルよりも高いことは当業者において良く知られている。構造分析は、同定されたモチーフが、基質カルボキシレートの結合に関与し、そして結合された基質側鎖と相互作用するのにアシルトランスフェラーゼ部位に十分に接近して存在するが、活性部位セリン及びアルギニンの反対側の活性部位ポケット内に存在することを示した。モチーフに見出される不変のヒスチジンは、セリンヒドロラーゼに典型的に見出されるように、活性部位セリンとの触媒的三元体の一部であると思われる（Ｓｅｒｒｅなど， 前記）。図３は、モデルＡＴ構造におけるモチーフループ及び重要な活性部位の位置を示す。
【００５１】
広範囲には、本発明は、その基質的特異性が変更されるよう基質の選択を担当する４−残基配列又はモチーフを変えることによってＡＴドメインを修飾することに関する。本発明者はまた、活性部位に接近する少数の他の残基を変更することができる。一般的に、変更された残基の合計数は、ＡＴの残基の５％以下である。　モチーフは、図２に示されるような番号付けの、ＤＥＢＳの第１モジュールのＡＴドメインの残基３３４−３３７近くで見出されるＹＡＳＨモチーフに対応する４−残基配列である。それは典型的には、ＧＨＳ活性部位モチーフの８０〜１００個のアミノ酸、より特定には、９０〜１００個のアミノ酸の下流で開始する。
【００５２】
本発明の好ましい態様においては、所望する構造のポリケチドは、ＰＫＳ上の存在するＡＴモチーフの、他の連鎖延長剤又は開始剤単位の選択を担当するか、又は変更された程度の選択性（ほとんどの場合、高められた選択性）を担当する他のモチーフによる置換により生成される。これは、ＰＫＳクラスターをコードする１又は複数のモジュールにおいて行われ得る。１つのタイプの態様は、“天然においては”隣接するか、又は他方では、結合されたドメインである、２種の隣接するドメインを包含するＰＫＳであり、ここでそれらのドメインの第１ドメインは、４−残基モチーフがその特異性を変えるために変更されているＡＴドメイン（第２ドメインに基質をトランスファーするよう作用する）である。
【００５３】
１つの種類の態様においては、本発明は、ＰＫＳ多酵素又はその一部、又はそれをコードする核酸（一般的にＤＮＡ）を提供し、前記多酵素又はその一部は、好ましくはマクロライド、ポリエーテル又はポリエンから選択されたポリケチドの生成のための、負荷モジュール及び多くの延長モジュールを含んで成り、ここで前記負荷又は延長モジュール、又は少なくともその１つは、任意に置換されたマロニル−ＣｏＡ残基を負荷し、そしてそれをＡＣＰ（好ましくは）にトランスファーするよう適合された、修飾されたＡＴドメインを含む。
【００５４】
ＡＴドメインは好ましくは、その基質特異性を変更するために修飾される。このＡＴドメインは、活性部位に存在する少数のアミノ酸の修飾によってのみ、モジュールにおけるこの位置で天然において見出されるドメインとは異なることができる。この修飾は、ＹＡＳＨ又はＴＡＧＨによる、モチーフ、特にＨＡＦＨ（これだけには限定されない）のすべて又は一部の交換を含んで成り、又は逆もまた同じである。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、ＡＴ活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。
【００５５】
第２種類の態様は、１又は複数の修飾されたＡＴドメイン、及び特にモチーフＨＡＦＨ又はＹＡＳＨ又はＴＡＧＨ（ここでそれらのモチーフは存在する天然のモチーフを置換する）を有するＡＴドメイン（但し、それだけには限定されない）を組み込むＰＫＳ多面酵素を供給することによって、ポリケチド分子の周囲のいずれかの点で所望する延長単位を有するポリケチドの合成方法を提供する。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、ＡＴ活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。
【００５６】
第３種類の態様は、負荷モジュールにおける修飾されたＡＴドメイン、及び特に（但し、それだけには限定されない）、モチーフＨＡＦＨ又はＹＡＳＨ又はＴＡＧＨ、又はプロリン残基を組み込むモチーフ（それらのモチーフは存在する天然のモチーフを置換する）を有するＡＴドメインを組み込むＰＫＳ多酵素を供給することによって、所望する開始剤単位を有するポリケチドの合成方法を提供する。任意には、この配列の外部に存在するが、しかし好ましくは、ＡＴ活性部位に隣接して存在するアミノ酸の変更が行われる。優先的には、このＡＴの後に、ＫＳＱドメインが存在するだろうが、しかし他の負荷システムは当業界において知られている（例えば、ＡＴ−ＡＣＰ）。特許出願ＷＯ００／００５００号は、既知の負荷システムのいくつかを記載する。負荷モジュールの修飾は、他の延長単位における類似する修飾と組み合され得る。
【００５７】
さらなる種類の態様は、配列ＨＡＦＨ、ＹＡＳＨ又はＴＡＧＨにより、存在するハイブリッド又は他のタンパク質モチーフを置換することによって、天然の副生成物類似体を有さず、そして所望する連鎖延長剤又は負荷単位を有するポリケチドを合成する方法を提供する。エポチロン又はモネンシンＰＫＳ遺伝子クラスターにおいてこの変更を行うことが特に有用である。
【００５８】
さらなる観点においては、本発明は、変更された又はハイブリッドのモチーフ、特にＨＡＳＨ又はＶＡＧＨ（但し、それらだけには限定されない）を有するＡＴを組み込むＰＫＳ多酵素を供給することによって、混合された集団のポリケチドを合成するための方法を提供する。この方法の１つの特定の有用性は、化合物の結合ライブラリーの生成である。
【００５９】
さらなる観点においては、修飾されたＡＴドメインを含むＰＫＳは、ＷＯ９８／０１５４６号及びＷＯ９８／０１５７１号、又はＷＯ００／０１８２７号又はＷＯ００／００５００号におけるように、生成されるハイブリッドＰＫＳにスプライシングされ得る。天然のポリケチド、例えば１４−員のマクロライドの新規誘導体を生成する遺伝子アセンブリーにそのような修飾されたＰＫＳを連結することは特に有用である。
【００６０】
それらの観点及び種類の態様の１つは、ポリケチドシンターゼ多酵素をコードする核酸を供給し、そしてそれを、それが発現され得る生物中に導入することを包含する。適切なプラスミド及び宿主細胞は下記に記載される。そのようなにして生成されるポリケチドシンターゼ又はその一部は、その方法は通常、そのようにすることは好ましくはないが、通常の方法により宿主細胞から単離され得る。宿主細胞はまた、例えばエチルマロニルＣｏＡを生成することによって、必要とされるアシルチオエステルを生成することができる。
【００６１】
所望しないアシルチオエステルの特に強い供給により株からＰＫＳを除去するか、又は特定のアシルチオエステルの強い供給を有するよう特別に選択された株においてその変更されたＰＫＳを発現するか、又は他方では、所望する生成物の発現を増強する培地又は増殖条件を開発することが好都合である。逆に言えば、そのような技法は、所望する場合、生成物の混合物の形成を促進するために使用され得る。培地における所望するアシルチオエステルに化学的前駆体を供給し、例えばジエチルエチルマロネート又はシクロブタンカルボン酸、等を供給することはまた有益であり得る。
【００６２】
宿主細胞はまた、例えばエリスロマイシン（図４に示されるような）及び他のポリケチドの生成において通常の生合成修飾のすべて又はいくらかを実施することによって、初期ＰＫＳ生成物を修飾することができる。通常の経路のいくらか又はすべてが、例えば１又は複数の“天然の”ヒドロキシ基又はメチル基、又は糖基を有さない生成物を生成するために阻止されるよう、変異体生物を使用することができる。
【００６３】
本発明は、記載される正確なモチーフに制限されるべきではない。本発明者は、図２の調査又は類似する配列データの調査により決定され得るように、モチーフ内の、特に残基１での既知のいくらかの変動を記載している。しかしながら、他の修飾が認識され得；例えば、類似するサイズのチロシンによるマロニル−ＣｏＡモチーフにおけるフェニルアラニンの置換は同じ選択性をまだ示すことができる。同様に、エチルマロニル−ＣｏＡ／他の連鎖延長剤組み込みを担当するモチーフに見出される小さな残基のグリシンの、例えばアラニン（但し、それのみには限定されないが）による置換が行われ得る。それらの及び他の類似する保存性置換が時折、同じ選択性を維持することは、当業者に良く知られている。同様に、メチルマロニル−ＣｏＡの組み込みのためのモチーフに見出されるセリン残基は、サイズ的に中間の及び／又は類似する荷電分布を示す残基により置換される。
【００６４】
本発明は、このモチーフにおいてのみ変化することに制限されるべきではない。ＡＴドメインの周囲の他の残基の変更がまた、特異性又は触媒効率のレベルを高め、すなわち所望する生成物の割合又は量を高めるために必要とされ得る。それらの残基は、基質結合ポケットに選択的に接近する。それらの追加の変更のための必要条件は、所望する特定の内容物又は変化に依存するであろう。変更する特定の残基は、図２の調査又は他の類似する配列分析データにより、又は他方では、構造モデルの分析により容易に同定され得る。
【００６５】
モチーフの他に、変更され得る残基は、２種の種類に分割され得る。それらの残基のいくつかは、モチーフの特異性を予測するために使用されるモチーフにおいて、これまで同定されている（Ｈａｙｄｏｃｋなど． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （１９９５） ３７５： ２４６−２４８）。それらの残基は、基質−結合ポケットに優先的に接近している。それらの残基は、記載される特定の例に制限されるべきではない。
【００６６】
Ｉ）変化する第１種類の可能性ある残基は、ポリペプチド鎖上のモチーフに接近する残基を包含する。特定の例は、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は一般的に、セリン（Ｓ）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列は一般的にＨＡＦＨＳであり、そしてメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基はＳであるが、しかしまた、例えばＴ， Ｇ又はＣでもあり得る。従って、メチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴに、標識モチーフを変えることによって変えるためには、モチーフのすぐ後の残基がＳであることを確保することが有益である。この残基はポリペプチド鎖上のモチーフに接近するので、それは基質結合ポケットに接近して存在する。
【００６７】
ＩＩ）第２種類の残基は、空間的にモチーフ又は活性部位に接近して存在する残基を包含する。それらの残基は、これまでに記載されたモデルＡＴ構造、又は続いて誘導され得るもう１つのＡＴ構造により最良に同定される。構造分子モデリング又は関連する技法を用いて、関連するタンパク質配列を、存在する構造中に導入することが可能であることは、当業者に知られている。他方では、アシルチオエステルは、活性部位中に形成され得る。それらは好ましい方法であるが、しかし参照点としての高く保存されたモチーフを用いての存在する構造の単純な調査が、適切な近似を付与する。
【００６８】
変更され得るモチーフに対して、空間的に接近する残基の特定の例は、ＧＨＳ活性部位モチーフのすぐ後の残基である。メチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は一般的に、グルタミン（Ｑ）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はＧＨＳＱであり、そしてマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は例えば、しばしばＶ， Ｉ又はＬである。従って、標識モチーフを変えることによって、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴをメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴに変更するためには、ＧＨＳモチーフのすぐ後の残基がＱであることを確保することが有益である。この残基は、活性部位セリンに接近して存在するので、それは基質−結合ポケット内に存在する。
【００６９】
変更され得る空間的に接近する残基のさらなる例は、ＧＱＧモチーフの３個の残基の下流に存在する残基である。メチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は一般的に、トリプトファン（Ｗ）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はＧＱＧＸＸＷであり、そしてマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は例えば、しばしばＲ， Ｈ又はＴである。従って、標識モチーフを変えることによって、マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴをメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴに変更するためには、ＧＨＳモチーフのすぐ後の残基がＷであることを確保することが有益である。モデルＡＴ構造の分析は、ＧＱＧモチーフが活性部位ポケットに接近して存在し、そして従って、このトリプトファンであることを示す。
【００７０】
変更され得る空間的に接近する残基のさらなる例は、アシルチオエステル基質のカルボキシレート基を安定化すると思われる、上記保存されたアルギニンから４個の残基の下流の残基である。マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、Ｒの下流のこの残基は一般的に、メチオニン（Ｍ）であり、すなわちこの点でのタンパク質配列はＲＸＸＸＭＱであり、そしてメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、この残基は一般的に、Ｉ又はＬであり、そしてエチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴにおいては、それはしばしば、Ｗである。従って、標識モチーフを変えることによって、メチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴをマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴに変更するためには、ＧＨＳモチーフのすぐ後の残基がメチオニンであることを確保することが有益である。モデルＡＴ構造の分析は、この残基がが活性部位ポケットに接近して存在することを示す。
【００７１】
さらなる観点においては、本発明は、ベクター、例えば上記観点において定義されるような核酸を包含するプラスミド又はファージ（好ましくは、プラスミド）、及びそのような核酸又は構造体により形質転換された宿主細胞、特にサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種を提供する。特に、核酸レベルで、ＡＴドメインに対して所望する変更を達成するための複数の分子生物学的方法、例えば特定部位の突然変異誘発又は指図された進化の技法が存在することは、当業者に容易に明らかであろう。
【００７２】
適切なプラスミドベクター、及び変更されたＡＴドメインを組み込むモジュールを有するＰＫＳ遺伝子の発現のために適切な遺伝子的に構築された細胞は、当業者により容易に企画されるか又は選択され得る。それらは、Ｉ型のハイブリッドＰＫＳ遺伝子の発現のために適切であるような、ＷＯ９８／０１５４６号に記載されるそれらを包含する。効果的な宿主の例は、次のものを包含する：
【００７３】
サッカロポリスポラ・エリトラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．アベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、Ｓ．グリセオフスカス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、Ｓ．シンナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．フラジアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、Ｓ．ロンギスポロフラバス（Ｓ．ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｏｆｌａｖｕｓ）、Ｓ．ヒグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ミクロモノスポラ・グリセオルビダ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ）、Ｓ．ラサリエンシス（Ｓ．ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ベネズエラ（Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、Ｓ．アンチビオチカス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．リモサス（Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、アミコラトピシス・ミジテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、及びＳ．ツクバエンシス（Ｓ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）。
【００７４】
それらは、ＳＣＰ２★−由来のプラスミドが自律的に複製することが知られている宿主、例えばＳ．コエリコロル、Ｓ．アベルミチリス、及びＳ．グリセオフスカス；及び他の宿主、例えばＳＣＰ２★−由来のプラスミドがプラスミド挿入体上の配列と染色体上の配列との間での相同組換えを通して染色体中に組み込まれるように成るサッカロポリスポラ・エリトラエア；及び自殺プラスミドベクターにより統合的に形質転換されるすべてのそのようなベクターを包含する。ｉｎｔ配列を有するプラスミドは、宿主の染色体上の特異的結合部位中に組み込むであろう。
【００７５】
Ｉ型ＰＫＳからの比較できるＡＴドメインをコードする核酸間の全体的な配列類似性は、十分に高く、そして異なったＩ型ＰＫＳのドメイン組織は異なったポリケチド−生成生物間で一致し、記載される新規ハイブリッドポリケチドを得るための方法は、すべての天然のモジュラーＩ型ＰＫＳ又はそれらの誘導体に適用できることは、当業者に明らかである。
本発明は、現在、例示されるが、しかしいくつかの例により制限されるものではない。
【００７６】
それらの標準の１文字コードにより十分に定義されて来たアミノ酸は次の通りである：Ａ−アラニン、Ｒ−アルギニン、Ｎ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｃ−システイン、Ｑ−グルタミン、Ｅ−グルタミン酸、Ｇ−グリシン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｋ−リシン、Ｍ−メチオニン、Ｆ−フェニルアラニン、Ｐ−プロリン、Ｓ−セリン、Ｔ−トレオニン、Ｗ−トリプトファン、Ｙ−チロシン及びＶ−バリン。
【００７７】
実施例
例１．プラスミドｐＨＰ４１の構成
プラスミドｐＨＰ４１は、負荷モジュール、すなわちＤＥＢＳ及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るＤＥＢＳ１ ＤＫＳ遺伝子を含むｐＣＪＲ２４−基材のプラスミドである。第１モジュールのＡＴドメインのモチーフＹＡＳＨは、ＨＡＦＨに変更されている。プラスミドｐＨＰ４１を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。プラスミドｐＤ１ＡＴ２ （Ｏｌｉｙｎｙｋ， Ｍ． など． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （１９９６） ３： ８３３−８３９） を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩにより消化した。約１１ｋｂｐのフラグメントを、ゲル電気泳動により単離し、そしてＤＮＡをそのゲルから精製した。
【００７８】
このフラグメントを、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩによる消化により線状化され、そしてアルカリホスファターゼにより処理されたｐＣＪＲ２４（Ｒｏｗｅ， Ｃ．Ｊ． など． Ｇｅｎｅ （１９９８） ２１６： ２１５−２２３） 中に連結した。連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＣＪＲ２６について調べた。プラスミドｐＣＪＲ２６を制限パターンにより同定した。ｐＣＪＲ２６により、Ｅ．コリ株ＥＴ１２５６７（ＭｃＮｅｉｌ， Ｄ．Ｊ． など． Ｇｅｎｅ （１９９２） １１１： ６１−６８）を形質転換し、そして個々のコロニーを一晩、増殖し、脱メチル化されたＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、ＭｓｃＩ及びＡｖｒＩＩを用いて線状化し、そして約１３ｋｂのフラグメント（フラグメントＡ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【００７９】
ヌクレオチド４２１０４からヌクレオチド４１５４２までに及ぶ、Ｓ．エリトラエアからのｅｒｙＡＩ遺伝子（開始ヌクレオチド４５３６８， 終結ヌクレオチド３４７３４）のＤＮＡセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＧＧＣＡ−３’；及び５’−ＴＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴ−３’。ｐＣＪＲ２４及びＤＥＢＳ１ ＴＥ由来のｐＣＪＲ６５と称するプラスミドからのＤＮＡを、鋳型として使用した。ヌクレオチド４２１０５でＭｓｃＩを導入されているプライマー、及び位置４１５４６でＢｓｔＸＩ部位を通して感作された第２プライマーの企画を行った。５７４ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてＳｍａＩによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドＰＵＣ１８に連結した。
【００８０】
連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＨＰ３９の存在について調べた。プラスミドｐＨＰ３９を、制限パターン及び配列分析により同定した。脱メチル化されたＤＮＡを、プラスミドＤＮＡによりＥ．コリ株ＥＴ１２５６７を形質転換することにより生成した。得られるＤＮＡを、ＭｓｃＩ及びＢｓｔＸＩによる消化により線状化し、そしてその得られる５５２ｂｐのフラグメント（フラグメントＢ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【００８１】
ヌクレオチド４１５５７からヌクレオチド４１１２０に及ぶＳ．エリトラエアからのｅｒｙＡＩ遺伝子のＤＮＡセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：５’−ＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣ−３’及び５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴ−３’。プラスミドｐＣＪＲ６５からのＤＮＡを、鋳型として使用した。ヌクレオチド４１１２５でＡｖｒＩＩ部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド４１５５７でＢｓｔＸＩ部位を通して感作された第２プライマーを企画し、そしてアミノ酸配列ＹＡＳＨ〜ＨＡＦＨ（ヌクレオチド４１５３７〜４１５２６によりコードされる）を突然変異誘発した。４４２ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてＳｍａＩによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。
【００８２】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＨＰ４０の存在について調べた。プラスミドｐＨＰ４０を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドｐＨＰ４０を、制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＢｓｔＸＩによる消化により線状化し、そして４２７ｂｐのフラグメント（フラグメントＣ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントＡ， Ｂ及びＣを、一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換した。個々のクローンを、ＤＥＢＳ由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、ｐＨＰ４１と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフＨＡＦＨを含むことを確かめた。
【００８３】
例２．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２／ｐＨＰ４１の構成及びトリケチドの生成
Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２は、ＴＥの他に、ｅｒｙＡＩ， ｅｒｙＡＩＩ及びｅｒｙＡＩＩＩの欠失を含む（Ｒｏｗｅ， Ｃ．Ｊ． など． Ｇｅｎｅ ２１６， ２１５−２２３）。プラスミドｐＨＰ４１を、相同性領域としてＴＥを用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＨＰ４１） を、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＳＭ３寒天（特許出願ＷＯ００／０１８２７号を参照のこと）上にプレートし、そして３０℃で１１日間、増殖した。約１ｃｍ２の寒天を均質化し、そして１．２ｍｌの酢酸エチル及び２０μｌの蟻酸の混合物により抽出した。
【００８４】
溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物を、メタノールに溶解し、そしてＧＣ／ＭＳにより分析した。主用生成物を、標準（Ｏｌｉｙｎｙｋ， Ｍ． など． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （１９９６） ３：８３３−８３９）との比較により、トリケチドラクトン（２Ｓ， ３Ｒ， ５Ｒ）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン（ＡＰＰ， すなわち、アセテート、アセテート、プロピオネート組み込み）、（２Ｓ， ３Ｒ， ５Ｒ）−２−メチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（ＰＡＰ）、（２Ｒ， ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｒ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン−（ＰＰＰ）及び（２Ｒ， ３Ｓ， ４Ｓ， ５Ｒ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン（ＡＰＰ）として同定した。
【００８５】
それらの生成物を、正確な質量１４４、１５８、１７２及び１５８に対応するそれらのアンモニウムアダクトとして同定した。４種の生成物を、この株において、及び実験の条件下で、負荷モジュールは、アセテート及びプロピオネートの両者を負荷し、そして修飾されたＡＴがマロニル−ＣｏＡ及びメチルマロニル−Ｃｏａを負荷するので、生成した。３種のトリケチドラクトンピークのみが標準条件下でＧＣ／ＭＳスペクトルとして観察され、これは同等の質量のＡＰＰ及びＰＡＰ化合物の同時溶出によるものであった。イソクラチックグラジエントを用いて、このピークが２種の成分から構成されたことを確かめた。さらなる組みの実験においては、Ｓ．エリトレエアＪＣ２（ｐＨＰ４１）を用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＴＳＢ５ｍｌを接種した。
【００８６】
３日間の増殖の後、この培養物１．５ｍｌを用いて、２５０ｍｌのフラスコ中、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＳＭ３培地２５ｍｌを接種した。フラスコを、３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりｐＨ３に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をＧＣ／ＭＳにより分析した。個々の実験において、本発明者は、４種の生成物ＡＡＰ， ＰＡＰ， ＰＰＰ及びＡＰＰを同定したが、しかしその絶対比及び量は、たぶん、個々のフラスコ内の正確培地及び増殖条件に依存して、変化する（図６）。
【００８７】
例３．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８（ｐＨＰ４１）の構成及び１２−デスメチルエリスロマイシンＢを生成するためへのその使用
プラスミドｐＨ４１を用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。いくつかのクローンを、ＤＩＧラベルされたベクターＤＮＡによるそれらのゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、染色体中に組み込まれるｐＨＰ４１の存在について試験した。正しく組み込まれたコピーのｐＨＰ４１を有するクローンを、この手段で同定した。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８（ｐＨＰ４１）を用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＴＳＢ５ｍｌを接種した。
【００８８】
３日間の増殖の後、この培養物１．５ｍｌを用いて、２５０ｍｌのフラスコ中、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む２５ｍｌのＥｒｙＰ培地（特許出願ＷＯ００／００５００号）を接種した。フラスコを、３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。この時点で、上清液をアンモニアによりｐＨ９．０に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。分子質量ｍ／ｚ （Ｍ＋Ｈ）＝７０４のピークが、エリスロマイシンＡ（Ｍ＋Ｈ）＝７３４に対応するピークの他に、Ｃ−１２デスメチルエリスロマイシンＢのために必要とされることが観察された。部分的に処理されたエリスロマイシン中間体に対応する他のピークを同定することができた。
【００８９】
例４．プラスミドｐＨＰ０４８の構成
プラスミドｐＨＰ０４８は、負荷モジュール、すなわちＤＥＢＳ１及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るＤＥＢＳ１ ＤＫＳ遺伝子を含むｐＣＪＲ２４−基材のプラスミドである。第１モジュールのＡＴドメインのモチーフＹＡＳＨは、ＨＡＳＨに変更されている。プラスミドｐＨＰ０４８を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。
【００９０】
ヌクレオチド４１５５７からヌクレオチド４１１２０に及ぶＳ．エリトラエアからのｅｒｙＡＩ遺伝子のＤＮＡセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：５’−ＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣ−３’及び５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＣＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴ−３’。プラスミドｐＣＪＲ６５からのＤＮＡを、鋳型として使用した。ヌクレオチド４１１２５でＡｖｒＩＩ部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド４１５５７でＢｓｔＸＩ部位まで延長された第２プライマーを企画し、アミノ酸配列ＹＡＳＨ（ヌクレオチド４１５３７〜４１５２６によりコードされる）〜ＨＡＳＨを突然変異誘発した。
【００９１】
４４２ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてＳｍａＩによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＨＰ０２２の存在について調べた。プラスミドｐＨＰ０２２を、制限パターン及び配列分析により同定した。
【００９２】
プラスミドｐＨＰ０２２を、制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＢｓｔＸＩによる消化により線状化し、そしてフラグメント（フラグメントＤ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントＤを、これまでに記載されるフラグメントＡ及びＢにより連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換した。個々のクローンを、ＤＥＢＳ１由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、ｐＨＰ０４８と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフＨＡＳＨを含むことを確かめた。
【００９３】
例５．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＨＰ０４８）の構造及びトリケチドを生成するためへのその使用
Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２は、ＴＥの他に、ｅｒｙＡＩ， ｅｒｙＡＩＩ及びｅｒｙＡＩＩＩの欠失を含む（Ｒｏｗｅ， Ｃ．Ｊ． など． Ｇｅｎｅ ２１６， ２１５−２２３）。プラスミドｐＨＰ０４８を、相同性領域としてＴＥを用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。Ｓ．エリトレエアＪＣ２（ｐＨＰ０４８）を用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＴＳＢ５ｍｌを接種した。３日間の増殖の後、この培養物１．５ｍｌを用いて、２５０ｍｌのフラスコ中、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＳＭ３培地２５ｍｌを接種した。
【００９４】
フラスコを、３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりｐＨ３に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をＧＣ／ＭＳにより分析した。生成物の混合物を、例２に記載のようにして、ＡＰＰ， ＰＡＰ， ＡＰＰ及びＰＰＰトリケチドラクトンに応答するそれらのアンモニウムアダクトとして同定した。この実験においては、記載される培地／増殖条件下で、ＨＡＳＨ変化を有するＰＫＳは、生成される合計量のトリケチドラクトンにより判断される場合、ＨＡＦＨ変化よりも触媒的により活性であるが（例２）、しかしながら、この場合、修飾されたＰＫＳは、ＡＡＰ：ＰＰＰトリケチドラクトンの比により判断される場合、アセテートに対して低い選択性を示すように思える。
【００９５】
例６．プラスミドｐＨＰ４７の構成
プラスミドｐＨＰ４７は、負荷モジュール、すなわちＤＥＢＳ１及び鎖終結チオエステラーゼの第１及び第２延長モジュールを含んで成るＤＥＢＳ１ ＰＫＳ遺伝子を含むｐＣＪＲ２４−基材のプラスミドである。第１モジュールのＡＴドメインのモチーフＹＡＳＨは、ＶＡＧＨに変更されている。プラスミドｐＨＰ４７を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。
【００９６】
ヌクレオチド４１５５７からヌクレオチド４１１２０に及ぶＳ．エリトラエアからのｅｒｙＡＩ遺伝子のＤＮＡセグメントを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：５’−ＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣ−３’及び５’−ＴＴＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＣＧＴＣＧＡＧＡＣＧＡＴ−３’。プラスミドｐＣＪＲ６５からのＤＮＡを、鋳型として使用した。ヌクレオチド４１１２５でＡｖｒＩＩ部位を導入されているプライマー及びヌクレオチド４１５５７でＢｓｔＸＩ部位まで延長された第２プライマーを企画し、アミノ酸配列ＹＡＳＨ（ヌクレオチド４１５３７〜４１５２６によりコードされる）〜ＶＡＧＨを突然変異誘発した。４４２ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてＳｍａＩによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。
【００９７】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＨＰ４６の存在について調べた。プラスミドｐＨＰ４６を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドｐＨＰ４６を、制限酵素ＡｖｒＩＩ及びＢｓｔＸＩによる消化により線状化し、そしてそのフラグメント（フラグメントＥ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントＥを、これまでに記載されるフラグメントＡ及びＢを、一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換した。個々のクローンを、ＤＥＢＳ由来の挿入体の存在について調べた。得られるプラスミドを、ｐＨＰ４７と命名した。配列分析を用いて、クローンが正しいモチーフＶＡＧＨを含むことを確かめた。
【００９８】
例７．プラスミドｐＬＳ００７の構成
プラスミドｐＬＳ００７は、細胞内のエチルマロニル−ＣｏＡのレベルに影響を及ぼすと思われるＳ．シンナモネンシスからのクロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）遺伝子を含む。プラスミドｐＳＧ１４２ （Ｇａｉｓｓｅｒなど． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （２０００） ３６： ３９１−４０１） は、ａｃｔＩプロモーターの制御下に遺伝子を配置し、そしてエリスロマイシン遺伝子クラスターの右側に、又は前もって形質転換された放線菌のａｃｔプロモーター領域に組み込むために使用され得る。次の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて、Ｓ．シンナモネンシスＣＣＲ遺伝子を増幅するために使用した：５’−ＧＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＧ−３’及び５’−ＴＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＣＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＧＴＧＣ−３’。
【００９９】
クローニングを促進するためにＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を組み込まれたプライマーを企画した。１．４ｋｂの生成物を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩにより前もって消化されたｐＳＧ１４２により連結した。その得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。プラスミドｐＬＳ００３を、誤りが増幅の間、導入されていないことを確かにするために、制限分析及び配列決定により同定した。この公開された配列との不一致を同定した。しかしながら、他の公開されたＣＣＲタンパク質配列との比較によるさらなる分析は、ｐＬＳ００３が正しかったことを示した。
【０１００】
プラスミドｐＬＳ００３を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩにより消化し、そして得られる４．５ｋｂのフラグメント（フラグメントＦ）を、ゲル電気泳動により同定し、そしてゲルから精製した。このフラグメントを、ＮｄｅＩ部位の後ろのａｃｔＩ／ａｃｔＩＩプロモーター領域を含むｐＫＣ１１３２の誘導体をｐＬＳＢ２に連結した。プラスミドｐＬＳＢ２を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩにより消化し、そしてその得られる約４ｋｂのフラグメント（フラグメントＧ）を、ゲル電気泳動により分離し、そしてそのゲルから精製した。フラグメントＦ及びＧを一緒に連結し、そしてその得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。プラスミドｐＬＳ００７を、制限分析により同定した。
【０１０１】
例８．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＨＰ４７／ｐＬＳ００７） の構成及びトリケチドの生成へのその使用
Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２は、ＴＥの他に、ｅｒｙＡＩ， ｅｒｙＡＩＩ及びｅｒｙＡＩＩＩの欠失を含む（Ｒｏｗｅ， Ｃ．Ｊ． など． Ｇｅｎｅ ２１６， ２１５−２２３）。プラスミドｐＨＰ４７を、相同性領域としてＴＥを用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。
【０１０２】
ＰＬＳ００７を用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＨＰ４７） のプロトプラストを形質転換し、チオストレプトン及びアプラマイシン耐性クローンを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトン及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン並びに１０ｍＭの塩化マグネシウムを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択し、そして耐性マーカーを、同じ構成物質を含む水道水培地上にプレートすることによって確かめた。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＨＰ４７／ｐＬＳ００７） を用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトン及び５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含む５ｍｌのＴＳＢを接種した。
【０１０３】
３日間の増殖の後、この培養物１．５ｍｌを用いて、２５０ｍｌのフラスコ中、５μｇ／ｍｌのチオストレプトン及び５μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含むＳＭ３培地２５ｍｌを接種した。フラスコを、３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。この時点で、上清液を、蟻酸によりｐＨ３に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をＧＣ／ＭＳにより分析した。この実験においては、トリケチド生成物の量は低かったが、しかし生成物の混合物は、正確な質量１５８、１７２及び１８６に対応するそれらのアンモニウムアダクトとして同定され得た。
【０１０４】
例９．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８（ｐＨＰ４７）の構成及びエリスロマイシンを生成するためへの使用
プラスミドｐＨ４７を用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８プロトプラストを形質転換した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８（ｐＨＰ４７）を用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＴＳＢ５ｍｌを接種した。３日間の増殖の後、この培養物１．５ｍｌを用いて、２５０ｍｌのフラスコ中、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む２５ｍｌのＥｒｙＰ培地を接種した。フラスコを、３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。この時点で、上清液をアンモニアによりｐＨ９．０に調節し、そして等体積の酢酸エチルにより２度、抽出した。溶媒を蒸発により除去し、そして残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。エリスロマイシンＡに対応する（Ｍ＋Ｈ）＝７３４のピークが、観察された。
【０１０５】
例１０．プラスミドｐＳＧＫ０５１の構成
プラスミドｐＳＧＫ０５１は、ｐＰＦＬ４３−基材のプラスミドである（ＷＯ００／００５００号）。負荷ドメインのＡＴドメインのモチーフＨＡＦＨは、ＹＡＳＨに変更されていた。プラスミドｐＳＧＫ０５１を、次の通りにして、いくつかの中間体プラスミドにより構成した。
プラスミドｐＰＦＬ４３を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩによる消化により線状化し、そして８５８ｂｐのフラグメント（フラグメントＱ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。
【０１０６】
ヌクレオチド１６３６０−１７３６６からのモネンシン負荷ドメインのＤＮＡセグメント（図５及びＰＣＴ／ＧＢ００／０２０７２号を参照のこと）を、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した：５’−ＧＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＴ−３’及び５’−ＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＡ−３’。ヌクレオチド１６３６７でＮｏｔＩ部位を通して増幅され、そしてヌクレオチド１６３９８−１６４０９でのアミノ酸配列ＨＡＦＨ〜ＹＡＳＨを変更されたプライマー、及びｐＰＦＬ４３における部位と同等のＮｈｅＩ部位を導入された第２プライマーを企画した。プラスミドｐＰＦＬ４３を鋳型として使用した。１００６ｂｐのＰＣＲ生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理し、そしてＳｍａＩによる消化により線状化され、そして次に、アルカリホスファターゼにより処理されたプラスミドｐＵＣ１８に連結した。
【０１０７】
この連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０Ｂを形質転換し、そして個々のクローンを、所望するプラスミドｐＣＳＡＴ９の存在について調べた。プラスミドｐＣＳＡＴ９を、制限パターン及び配列分析により同定した。プラスミドｐＣＳＡＴ９を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＮｈｅＩによる消化により線状化し、そして９９５ｂｐのフラグメント（フラグメントＲ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてそのゲルから精製した。
【０１０８】
プラスミドｐＰＦＬ４３を、ＮｃｏＩ及びＮｈｅＩにより消化し、１．８ｋｂのフラグメントを除去し、そして大きな方のフラグメント（フラグメントＳ）を、ゲル電気泳動により単離し、そしてゲルから精製した。フラグメントＱ、Ｒ及びＳを一緒に連結し、そして得られる連結混合物を用いて、エレクトロコンピテントＥ．コリＤＨ１０８を形質転換した。個々のクローンを、所望するプラスミドｐＳＧＫ０５１について調べた。得られるプラスミドを、制限消化により分析し、そして配列決定し、正しいモチーフＹＡＳＨの存在を確かめた。
【０１０９】
例１１．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２／ｐＳＧＫ０５１の構成及びトリケチドの生成
プラスミドｐＳＧＫ０５１を、相同性領域としてのＴＥを用いて、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ Ｊ２プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ ＪＣ２ （ｐＳＧＫ０５１） を、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上にプレートし、そして３０℃で１１日間、増殖した。
【０１１０】
約１ｃｍ２の寒天を均質化し、そして１．２ｍｌの酢酸エチル及び２０μｌの蟻酸の混合物により抽出した。溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物をメタノールに溶解し、そしてＧＣ／ＭＳにより分析した。主要生成物を、標準との比較により、トリケチドラクトン（２Ｓ， ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｒ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン及び（２Ｓ， ３Ｒ， ４Ｓ， ５Ｒ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ヘキサン酸δ−ラクトンとして同定した。
【０１１１】
例１２．Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８（ｐＳＧＫ０５１）の構成及びエリスロマイシンの生成へのその使用
プラスミドｐＳＧＫ０５１を、Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ Ｊ２プロトプラストを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上で選択した。Ｓ．エリトラエアＮＲＲＬ２３３８ （ｐＳＧＫ０５１） を、４０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０寒天上にプレートし、そして３０℃で１０日間、増殖した。
【０１１２】
約２ｃｍ２の寒天を均質化し、そして１．２ｍｌの酢酸エチル及び２０μｌの蟻酸の混合物により抽出した。溶媒をデカントし、そして蒸発により除去し、そして残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。質量ｍ／ｚ （Ｍ＋Ｈ）＝７３４及び７２０のピークが、たぶん、不完全なプロセッシングの生成物と共に、観察され得る。標準との比較は、生成される化合物がエリスロマイシンＡ及び１３−メチルエリスロマイシンＡであったことを証明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ）、６−デオキシトロノリドＢを生成するモジュラーＰＫＳ， エリスロマイシンＡの前駆体の機能を示す図である。
【図２】図２は、代表的なＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスターのＡＴドメインのアミノ酸配列比較を与える。モチーフＧＱＧ， ＧＨＳ及びＬＰＴＹは、アルギニン及び特異性を定義するような本発明において定義されるモチーフと共に、図の低部に印を付けられている。使用されるＰＫＳを定義するために側部で使用される略語は次の通りである：ａｖｅ： アベルメクチン、ｄｅｂｓ： エリスロマイシン、ｅｐｏ： エポチロン、ｓｏｒ： ソラフェン、ｆｋｂ： ＦＫ５０６、ｒａｐ： ラパマイシン、ｔｙｌ： チロシン、ｍｏｎ： モネンシン、ｎｉｄ： ニダマイシン、ｎｙｓ： ナイスタチン、ｒｉｆ： リファマイシン。番号はモジュール番号を表す。表示の最後での文字ａはマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴを示し、文字ｐはメチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴを示し、そして文字ｂはエチルマロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴを示す。異常な又は不明確なＡＴ特異性を有するさらなる型のＡＴは、文字ｘにより示される。考慮される配列の数により、５０個のアミノ酸の個々のセクションは２ページに及ぶ。モネンシンＡＴの配列は公開されていない。それらはＰＣＴ／ＧＢ００／０２０７２号に詳しく記載されている。
【図３】図３は、Ｅ．コリアシルトランスファーゼの活性部位の立体的表示である。本明細書に記載されるモチーフの空間的配置は矢印により示され、そして原子は太字で示される。
【図４】図４は、サッカロポリスポラ・エリトラエアにおいて６−デオキシエリスロノリドＢをエリスロマイシンＡに転換する酵素的段階を示す。
【図５】図５は、例８に使用される負荷ＡＴをコードするモネンシンＰＫＳからのＤＮＡ配列を示す。
【図１】
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【図２ｌ】
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【図２ｍ】
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【図２ｎ】
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【図２ｖ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506423.tif 000101
2004506423.tif 000102
【国際調査報告】
2004506423.tif 000103
2004506423.tif 000104
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