(57)【要約】本発明は、ホスホジエステラーゼ・タイプ３（ＰＤＥ３）に関連する方法および組成物に関する。特定の実施形態は、様々なＰＤＥ３Ａアイソフォームおよび／またはＰＤＥ３Ａアイソフォームの部位特異的な変異体に相当する単離ペプチド、ならびにこのようなアイソフォームや変異体をコードしている発現ベクターに関する。具体的な実施形態では、アイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤を同定する方法、ならびに拡張型心筋症、肺高血圧症および／または様々な細胞内区画中のｃＡＭＰレベルに対するＰＤＥ３の効果に関連する他の病状の処置における、このような阻害剤または活性化剤の使用方法が提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２または配列番号３と、少なくとも９５％相同なアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の配列と同一である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２の配列と同一である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３の配列と同一である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１の配列を有し、セリン残基２９２、２９３、３１２または４３８位のうち少なくとも１つに置換変異を有する請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記置換変異によってセリン残基がアラニンまたはアスパラギン酸残基で置換されている、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２の配列を有し、セリン残基３１２または４３８位のうち少なくとも１つに置換変異を有する請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記置換変異によってセリン残基がアラニンまたはアスパラギン酸残基で置換されている、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
ホスホジエステラーゼ・タイプ３のアイソフォームをコードしている核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
前記アイソフォームが請求項１に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記アイソフォームが請求項２に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記アイソフォームが請求項３に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記アイソフォームが請求項４に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記アイソフォームが請求項５に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記アイソフォームが請求項７に記載の単離ポリペプチドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
アイソフォーム選択的なホスホジエステラーゼ・タイプ３（ＰＤＥ３）の阻害剤または活性化剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを得ること、
（ｂ）前記単離ポリペプチドに結合する少なくとも１つの試験化合物を同定すること、および
（ｃ）ＰＤＥ３の触媒活性の阻害または活性化について前記少なくとも１つの試験化合物をアッセイすること
からなる方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの試験化合物がファージ・ディスプレイ・ライブラリの一部である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの試験化合物の同定にバイオパニングすることが含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ファージ・ディスプレイ・ライブラリが無作為なペプチド配列からなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記無作為なペプチド配列の長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アイソフォーム選択的なＰＤＥ３調節剤を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを得ること、
（ｂ）前記単離ポリペプチドに結合する少なくとも１つの試験化合物を同定すること、および
（ｃ）もう１つのポリペプチドがＰＤＥ３に結合することを妨げる能力について前記少なくとも１つの試験化合物をアッセイすること
からなる方法。
【請求項２２】
前記もう１つのポリペプチドがプロテイン・キナーゼ、ホスファターゼまたはホスホリラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤、活性化剤または調節剤を薬理学的に有効な量で個体に投与することからなる、心収縮性を変調する方法。
【請求項２４】
拡張型心筋症および／または高血圧症を患っている個体を処置する方法であって、アイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤、活性化剤または調節剤を薬理学的に有効な量で該個体に投与することからなる方法。
【請求項２５】
前記阻害剤がアンチセンス阻害剤である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アンチセンス阻害剤がベクターから転写される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載する発明は、退役軍人局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ）からのメリット・レビュー賞（Ｍｅｒｉｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｗａｒｄｓ）およびキャリア開発強化賞（Ｃａｒｅｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ａｗａｒｄｓ）の下、政府の支援によって行われた。連邦政府は本発明の権利の一部を所有する。本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下、（特許文献１）の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、心血管および他の疾病の分野に関する。より詳細には、本発明は、ホスホジエステラーゼ・タイプ３（ＰＤＥ３）のアイソフォーム選択的な活性化剤または阻害剤の組成物、同定方法および使用に関する。本発明の他の実施形態は、ＰＤＥ３アイソフォームを対象とした新規薬剤のハイスループット・スクリーニングに関する。特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物および方法は、心筋症、肺高血圧症および関連する病態の処置に有用である。
【背景技術】
【０００３】
ＰＤＥ３環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼはｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを加水分解し、これによりｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達が変調される（非特許文献１）。これらの酵素は、心筋細胞および血管筋細胞の収縮および弛緩の調節に重要な役割を果たしている。細胞内のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ含有量を増加させるＰＤＥ３阻害剤は、心筋細胞中ではｃＡＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ（ＰＫ−Ａ）の活性化に起因する変力効果を有し、血管筋細胞中ではｃＧＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ（ＰＫ−Ｇ）の活性化に起因する血管拡張効果を有する（非特許文献１）。拡張型心筋症の処置に使用する場合、ミルリノン、エノキシモンおよびアムリノンなどのＰＤＥ３阻害剤は最初は良好な血行動態応答を誘発するが、長期投与により死亡率を４０％にまで増加させる（非特許文献２）。ＰＤＥ３阻害の短期的な利益と拡張型心筋症における長期的な生存率への有害効果とのこの関連は、心血管治療法における最も複雑な問題の１つである。しかし、これら２相性の効果は、現在の阻害剤が示す区画非選択的な心筋細胞中の細胞内ｃＡＭＰ含有量の増加を反映していると考えられている。
【０００４】
ＰＤＥ３阻害剤と同様に心筋細胞中の細胞内ｃＡＭＰ含有量を増加させるβ−アドレナリン受容体作用剤（アゴニスト）の使用における臨床治験では、処置した患者の死亡率が増加したために完了する前に終了されたが、細胞内ｃＡＭＰ含有量を低下させるβ−アドレナリン受容体拮抗剤（アンタゴニスト）では、最初の有害な血行動態効果にもかかわらず、長期的な生存率が改善されることが示された。これらの発見により、ＰＤＥ３阻害の短期的な利益および長期的な有害効果のどちらもが心筋細胞中の細胞内ｃＡＭＰ含有量の増加に起因することが示唆される（非特許文献３）。
【０００５】
非特異的なＰＤＥ３拮抗剤の矛盾する効果は、心臓細胞および血管細胞中のｃＡＭＰにより調節される多様な細胞内プロセスに関連しているかもしれない。ｃＡＭＰによって活性化されると、ＰＫ−Ａは、収縮と弛緩、グリコーゲン代謝、遺伝子転写、細胞内Ｃａ２＋サイクリングおよびシグナル自己調節に関与している別の細胞内区画内にある数十個のタンパク質をリン酸化する。たとえば、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化により、ｃＡＭＰ応答配列を含有している遺伝子の転写が活性化される（非特許文献４）。心筋細胞で優性なリン酸化可能でないＣＲＥＢを発現しているトランスジェニック・マウスは、ヒトの疾病に非常に良く似た拡張型心筋症を発病し（非特許文献５）、これにより、拡張型心筋症にはＣＲＥＢのリン酸化が望ましいことが示唆される。
【０００６】
ｃＡＭＰ効果の別の例は、筋小胞体のＣａ２＋輸送ＡＴＰアーゼであるＳＥＲＣＡ２に対するホスホランバンの阻害を軽減させる、ホスホランバンのリン酸化である（非特許文献６）。拡張型心筋症を有する筋ＬＩＭタンパク質（ＭＬＰ）−／−マウス中のホスホランバンのアブレーションにより、正常な心室の大きさおよび収縮性が修復され（非特許文献７）、これにより、ホスホランバンのリン酸化もまた心筋症に有益であることが示唆される。
【０００７】
ＰＫ−Ａによってリン酸化される他の基質が、長期的な生存率に対する有害効果に寄与するかもしれない。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルのリン酸化により、チャネルが開いている確率が上昇して不整脈が発生するかもしれず（非特許文献８）、またマイトジェン活性化プロテイン・キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）カスケード中のタンパク質のリン酸化により、心筋遺伝子の転写が改変されて疾病の進行が速められるかもしれない（非特許文献９、１０）。
【０００８】
β１−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体もしくはプロスタグランジン受容体の活性化、またはイソブチルメチルキサンチンによる非選択的なホスホジエステラーゼの阻害などの機構による、心筋細胞中のｃＡＭＰ含有量の増加は、心筋のサイトゾル分画およびミクロソーム分画に代表される細胞内区画中のｃＡＭＰ含有量に示差的に影響を与え、その結果、異なるタンパク質リン酸化パターンおよび異なる生理応答が生じる（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５）。これらの考察は、受容体に媒介されるおよび受容体に依存しないｃＡＭＰ生成の減少が重要な特徴である、拡張型心筋症の病態生理学に特に関連している（非特許文献３、１６）。心不全の心臓と心不全でない心臓との間でサイトゾル分画およびミクロソーム分画中のサイトゾルｃＡＭＰ含有量を比較することにより、心不全の心筋のミクロソーム分画中でｃＡＭＰ含有量がサイトゾル分画より減少していることが示された（非特許文献１７）。
【０００９】
ＰＫ−Ａの個々の基質のリン酸化は、細胞外シグナルに応答して示差的に調節され得る。示差的な調節の証拠は、アデニル酸シクラーゼ活性の刺激による効果およびβ１−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体またはＰＧＥ１受容体によるｃＡＭＰの形成を観察した実験によってもたらされる。β−アドレナリン受容体により心筋細胞のサイトゾル分画およびミクロソーム分画のどちらものｃＡＭＰ含有量が増加して収縮性の応答が誘発されるが、ＰＧＥ１受容体の活性化ではサイトゾルのｃＡＭＰ含有量は増加するがミクロソームのｃＡＭＰ含有量は増加せず、収縮性の応答は誘起されない（非特許文献１１、１８）。β１−アドレナリン受容体の活性化に応答した細胞内の一過性Ｃａ２＋量幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）の増大は、ミクロソームのｃＡＭＰ含有量の変化と相関し、ホスホランバンのリン酸化の増加を伴う。逆に、β２−アドレナリン受容体の活性化は、ミクロソームのｃＡＭＰ含有量の変化と相関せずホスホランバンのリン酸化の増加なしに起こる、細胞内の一過性Ｃａ２＋量幅の増大をもたらす（非特許文献１９、２０、１３）。したがって、ｃＡＭＰ代謝に関連する様々な受容体の活性により、心臓組織の様々な応答が誘発され得る。
【００１０】
β−アドレナリン受容体の刺激および非選択的なホスホジエステラーゼ阻害は、拡張型心筋症の病態生理学に関連する、心筋細胞におけるｃＡＭＰ活性化タンパク質リン酸化に対して異なる効果を有する（非特許文献１４、１５）。この状態では、β１−アドレナリン受容体の下方調節およびβ−アドレナリン受容体の占有とアデニル酸シクラーゼの刺激との脱共役（β−アドレナリン受容体キナーゼ、Ｇαｉおよびヌクレオシド・ジホスフェート・キナーゼの増加に起因する）は、ｃＡＭＰの生成の障害に寄与する（非特許文献３、１６）。心不全の心臓および心不全でない心臓のサイトゾル分画およびミクロソーム分画のｃＡＭＰ含有量の研究では、心不全の心筋のミクロソーム分画中でｃＡＭＰ含有量がサイトゾル分画よりはるかに減少していることが実証された（非特許文献１７）。これらの結果があいまって、様々な細胞内区画中のｃＡＭＰ含有量を選択的に調節するとＰＫ−Ａの様々な基質のリン酸化を反映する様々な応答が誘起され得ることが示される。さらに、拡張型心筋症ではこの調節が異常をきたしている。
【００１１】
ＰＤＥ３の様々なアイソフォームが心筋細胞および血管筋細胞中で発現されており、これらは異なる細胞内区画に局在している。この様々なＰＤＥ３アイソフォームでは、ＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂ（プロテイン・キナーゼＢ、Ａｋｔとしても知られる）によるその調節が異なるかもしれない。インスリン様成長因子の下流エフェクターであるＰＫ−Ｂは、心筋細胞中の抗アポトーシス・メディエーターである（非特許文献２１、２２、２３）。また、ＰＫ−Ｂは、血管筋細胞における増殖応答にも関与しているかもしれない（非特許文献２４、２５、２６）。これらの発見は、異なるＰＤＥ３アイソフォームが、拡張型心筋症および／または肺高血圧症の病態生理学に関係づけられた様々なシグナルに対する、細胞および区画に選択的な応答に関与しているかもしれないことを示唆している。心筋細胞および血管筋細胞中の異なるＰＤＥ３アイソフォームは、ＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｇの様々な基質のリン酸化に関与している、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの機能的に明確に異なるプールを調節可能であり、また、これらのアイソフォームは様々な細胞外シグナルに応答して調節され得る。
【特許文献１】
２００１年８月１日出願の米国特許仮出願第６０／３０９，２７１号
【特許文献２】
チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，０７１，３９４
【特許文献３】
ザンズッチら（Ｚａｎｚｕｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，８５８，８０４
【特許文献４】
リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，９４８，６２７
【特許文献５】
米国特許第５，４０５，７６６号
【特許文献６】
米国特許第５，９８６，０７６号
【特許文献７】
米国特許第４，１９６，２６５号
【特許文献８】
米国特許第３，８１７，８３７号
【特許文献９】
米国特許第３，８５０，７５２号
【特許文献１０】
米国特許第３，９３９，３５０号
【特許文献１１】
米国特許第３，９９６，３４５号
【特許文献１２】
米国特許第４，２７７，４３７号
【特許文献１３】
米国特許第４，２７５，１４９号
【特許文献１４】
米国特許第４，３６６，２４１号
【特許文献１５】
米国特許第５，６０３，８７２号
【特許文献１６】
米国特許第５，４０１，５１１号
【特許文献１７】
米国特許第６，２１０，８９２号
【特許文献１８】
米国特許第６，２４８，７２４号
【特許文献１９】
米国特許第６，２７７，９８１号
【特許文献２０】
米国特許第６，３００，４９２号
【特許文献２１】
米国特許第６，３０３，３７４号
【特許文献２２】
米国特許第６，３１０，０４７号
【特許文献２３】
米国特許第６，３６５，３４５号
【特許文献２４】
米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２５】
米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献２６】
米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献２７】
１９９０年１２月２１日出願の国際公開公報第９０／０７６４１号
【特許文献２８】
欧州特許出願第３２０  ３０８号
【特許文献２９】
米国特許第４，８８３，７５０号
【特許文献３０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号
【特許文献３１】
英国特許出願ＧＢ  ２  ２０２  ３２８号
【特許文献３２】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号
【特許文献３３】
ジンゲラスら（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、国際特許出願国際公開第８８／１０３１５号
【特許文献３４】
デイビーら（Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、欧州特許出願第３２９  ８２２号
【特許文献３５】
ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、国際特許出願国際公開第８９／０６７００号
【特許文献３６】
米国特許第５，２７９，７２１号
【特許文献３７】
米国特許第５，３５４，８５５号
【特許文献３８】
米国特許第５，１６８，０５３号
【特許文献３９】
米国特許第５，６２４，８２４号
【特許文献４０】
米国特許第５，６２５，０４７号
【特許文献４１】
米国特許第４，２１５，０５１号
【特許文献４２】
米国特許第４，５５４，１０１号
【特許文献４３】
米国特許第４，２１５，０５１号（スミス（Ｓｍｉｔｈ）
【特許文献４４】
米国特許第５，５６５，３３２号
【特許文献４５】
米国特許第５，５９６，０７９号
【特許文献４６】
米国特許第６，０３１，０７１号
【特許文献４７】
米国特許第６，０６８，８２９号
【特許文献４８】
米国特許第６，０６８，８２９号
【特許文献４９】
国際公開公報第８４／０３５６４号
【特許文献５０】
米国特許第５，６１４，３９６号
【特許文献５１】
米国特許第５，６２４，８３０号
【非特許文献１】
シャクールら（Ｓｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年ａ
【非特許文献２】
ノニーら（Ｎｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献３】
モブセシアン（Ｍｏｖｓｅｓｉａｎ）、１９９９年
【非特許文献４】
シェイウィッツ（Ｓｈａｙｗｉｔｚ）およびグリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、１９９９年
【非特許文献５】
フェンツケら（Ｆｅｎｔｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献６】
シマーマン（Ｓｉｍｍｅｒｍａｎ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、１９９８年
【非特許文献７】
ミナミサワら（Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献８】
フィッシュマイスター（Ｆｉｓｃｈｍｅｉｓｔｅｒ）およびハーツェル（Ｈａｒｔｚｅｌｌ）、１９９０年
【非特許文献９】
クック（Ｃｏｏｋ）およびマコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）１９９３年
【非特許文献１０】
ラゾウら（Ｌａｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献１１】
ヘイズら（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年
【非特許文献１２】
シャオ（Ｘｉａｏ）およびラカッタ（Ｌａｋａｔｔａ）、１９９３年
【非特許文献１３】
シャオら（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献１４】
ラプンダロら（Ｒａｐｕｎｄａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年
【非特許文献１５】
ジュレビシウス（Ｊｕｒｅｖｉｃｉｕｓ）およびフィッシュマイスター（Ｆｉｓｃｈｍｅｉｓｔｅｒ）、１９９６年
【非特許文献１６】
ルッツら（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年
【非特許文献１７】
ボーム（Ｂｏｈｍ）、１９９４年
【非特許文献１８】
バックストン（Ｂｕｘｔｏｎ）およびブラントン（Ｂｒｕｎｔｏｎ）、１９８３年
【非特許文献１９】
ホール（Ｈｏｈｌ）およびリ（Ｌｉ）、１９９１年
【非特許文献２０】
シャオら（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献２１】
フジオら（Ｆｕｊｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献２２】
マツイら（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献２３】
ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献２４】
ロシック（Ｒｏｃｉｃ）およびルッチェシ（Ｌｕｃｃｈｅｓｉ）、２００１年
【非特許文献２５】
デュアンら（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献２６】
サンジラセガランら（Ｓａｎｄｉｒａｓｅｇａｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献２７】
ローゼンモンドら（Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献２８】
ツァオら（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献２９】
アンデルセンら（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献３０】
ラインハートら（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年
【非特許文献３１】
タイラら（Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献３２】
ミーチら（Ｍｅａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年
【非特許文献３３】
カスヤら（Ｋａｓｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献３４】
チョイら（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年
【非特許文献３５】
カスヤら（Ｋａｓｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年
【非特許文献３６】
チャンら（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年
【非特許文献３７】
ヒーら（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献３８】
シュら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献３９】
アティエンザら（Ａｔｉｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献４０】
チャン（Ｚｈａｎｇ）およびコールマン（Ｃｏｌｍａｎ）、２０００年
【非特許文献４１】
タンら（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年
【非特許文献４２】
ケナンら（Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献４３】
シャクールら（Ｓｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年ｂ
【非特許文献４４】
スミスら（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年
【非特許文献４５】
アーマドら（Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献４６】
グラントら（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年
【非特許文献４７】
ロペス−アパリチオら（Ｌｏｐｅｚ−Ａｐａｒｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献４８】
ラーンら（Ｒａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年
【非特許文献４９】
ロンディノンら（Ｒｏｎｄｉｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献５０】
レシェーら（Ｒｅｓｊｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献５１】
キタムラら（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献５２】
ラスコーンら（Ｒａｓｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献５３】
ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献５４】
ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献５５】
ソネンバーグら（Ｓｏｎｎｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年
【非特許文献５６】
グラノフシキーら（Ｇｒａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献５７】
フロリオら（Ｆｌｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年
【非特許文献５８】
ヤーウッドら（Ｙａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献５９】
ドッジら（Ｄｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年
【非特許文献６０】
ミクフィーら（ＭｃＰｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献６１】
パーマーら（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献６２】
フーら（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年
【非特許文献６３】
カパルディら（Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７７年）
【非特許文献６４】
スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９８４年
【非特許文献６５】
タムら（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８３年
【非特許文献６６】
メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９８６年
【非特許文献６７】
バラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９７９年
【非特許文献６８】
ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、１９７４年
【非特許文献６９】
ビーモン（Ｂｅｅｍｏｎ）およびハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、１９７８年
【非特許文献７０】
ルオら（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年
【非特許文献７１】
ハーロウおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ）、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年
【非特許文献７２】
ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、ページ６５〜６６、１９８６年
【非特許文献７３】
ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、１９７５年
【非特許文献７４】
ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、１９７６年
【非特許文献７５】
ゲフターら（Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７７年
【非特許文献７６】
ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、ページ７１〜７４、１９８６年
【非特許文献７７】
ナカムラら（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９８７年）
【非特許文献７８】
“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、第２版、ロバート・ビー・コルビン（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂ．Ｃｏｌｖｉｎ）、アトゥル・ケー・バーン（Ａｔｕｌ  Ｋ．Ｂｈａｎ）およびロバート・ティー・ミクラスキー（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｔ．ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年
【非特許文献７９】
サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年
【非特許文献８０】
“Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、ベルス（Ｂｅｌｌｕｓ）、１９９４年
【非特許文献８１】
イニスら（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年
【非特許文献８２】
ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６（１９９２年）
【非特許文献８３】
クォウら（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９年）
【非特許文献８４】
フローマン、エム  エー（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）
【非特許文献８５】
オハラら（Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５６７３−５６７７（１９８９年）
【非特許文献８６】
ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０（１９８９年）
【非特許文献８７】
フレイフェルダー（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ）、１９８２年
【非特許文献８８】
ワーグナーら（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献８９】
キム（Ｋｉｍ）およびチェフ（Ｃｅｃｈ）、１９８７年
【非特許文献９０】
チェフら（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１年
【非特許文献９１】
ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）、１９８９年
【非特許文献９２】
スキャンロンら（Ｓｃａｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年
【非特許文献９３】
サーバーら（Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年
【非特許文献９４】
シュード（Ｓｉｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年
【非特許文献９５】
シモンズ（Ｓｙｍｏｎｓ）、１９９２年
【非特許文献９６】
プロディーら（Ｐｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８６年
【非特許文献９７】
パルカイティスら（Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７９年
【非特許文献９８】
シモンズ（Ｓｙｍｏｎｓ）、１９８１年
【非特許文献９９】
フォアスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）およびシモンズ（Ｓｙｍｏｎｓ）、１９８７年
【非特許文献１００】
ユアンら（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年
【非特許文献１０１】
ユアン（Ｙｕａｎ）およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）、１９９４年
【非特許文献１０２】
ベルザール−ヘランツら（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年
【非特許文献１０３】
チョウリラら（Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献１０４】
ハセロフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）およびゲルラッホ（Ｇｅｒｌａｃｈ）、１９８８年
【非特許文献１０５】
チョウリラら（Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年
【非特許文献１０６】
ペリマンら（Ｐｅｒｒｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年
【非特許文献１０７】
バス（Ｂａｓｓ）、２００１年
【非特許文献１０８】
エルバシールら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年
【非特許文献１０９】
カイト（Ｋｙｔｅ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、１９８２年
【非特許文献１１０】
スティンチコムら（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７９年
【非特許文献１１１】
キングスマンら（Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７９年
【非特許文献１１２】
チェンパーら（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年
【非特許文献１１３】
ヒッツェマンら（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年
【非特許文献１１４】
ヘスら（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９６８年
【非特許文献１１５】
ホーランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７８年
【非特許文献１１６】
ビットナーら（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年
【非特許文献１１７】
ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７７年
【非特許文献１１８】
シバルスカら（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９６２年
【非特許文献１１９】
ローウィーら（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年
【非特許文献１２０】
ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年
【非特許文献１２１】
オヘアら（Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１年）
【非特許文献１２２】
マリガンら（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１年）
【非特許文献１２３】
コルベール−ガラピンら（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８１）年
【非特許文献１２４】
サンテールら（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８４年
【非特許文献１２５】
スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９９０年
【非特許文献１２６】
スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９９３年
【非特許文献１２７】
「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、ページ１０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０
【非特許文献１２８】
スミスら（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年
【非特許文献１２９】
ルーおよびモーリス（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｉｃｅ）、１９９８年
【非特許文献１３０】
モブセシアンら（Ｍｏｖｓｅｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８４年
【非特許文献１３１】
キタムラら（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献１３２】
クレイコムら（Ｃｌａｙｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年
【非特許文献１３３】
シラースら（Ｓｃｈｉｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１年
【非特許文献１３４】
フランセンら（Ｆｒａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【非特許文献１３５】
ゾズルヤら（Ｚｏｚｕｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明以前は、心筋症および／または肺高血圧症の処置で使用する、アイソフォーム選択的なＰＤＥ３阻害剤または活性化剤の開発は不可能であった。アイソフォーム選択的なＰＤＥ３阻害剤は、非特異的なＰＤＥ３阻害剤に関連する長期的な死亡率の上昇を伴わずに心拍出量に有益な効果をもたらし得る。アイソフォーム選択的なＰＤＥ３活性化剤は、心収縮性の低下に耐えられないほどは血行動態の状態が損われていない拡張型心筋症および／または肺高血圧症の患者において、サイトゾルのｃＡＭＰ含有量の増加に起因する随発性の催不整脈性効果を伴わずに有益な抗アポトーシス効果を与えるかもしれない。後者の実例は、拡張型心筋症の処置におけるβ−アドレナリン受容体拮抗剤の使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
個々のＰＤＥ３アイソフォームを選択的に活性化または阻害する、あるいはその細胞内局在化を混乱させる能力を有する薬剤は、より小さなサブセットであるＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｇの基質のリン酸化に、治療上有利になるよう選択的に影響を与え得る。どの特定の一実施形態にも限定されることを望まないが、筋小胞体に関連するＰＤＥ３Ａ−１３６を選択的に阻害する薬剤は、サイトゾルのｃＡＭＰ含有量の増加に起因する催不整脈性効果を軽減させうるβ−アドレナリン受容体作用剤を服用中の、拡張型心筋症を患っている患者において、細胞内のＣａ２＋サイクリングおよび収縮性を維持するのに役立つかもしれない。あるいは、ＰＫ−ＢによるＰＤＥ３Ａ−１３６の活性化が心筋細胞中で抗アポトーシス性である場合、その阻害はプロ・アポトーシス性の可能性があり（拡張型心筋症におけるＰＤＥ３阻害で見られる長期的な死亡率の上昇の説明である可能性がある）、このアイソフォームの選択的な活性化が望ましいかもしれない。さらに、加水分解酵素のＫｍがｃＧＭＰに比べてｃＡＭＰに対してより高いために、現在利用可能な競合的ＰＤＥ３阻害剤は、ｃＧＭＰの加水分解活性より強くｃＡＭＰ活性を阻害する。本明細書中に記載する方法によって同定した、他の機構によってＰＤＥ３活性を阻害する薬剤は、２つの基質の加水分解に示差的に影響を与え、治療上有利な異なった細胞作用を生じ得る。
【００１４】
本明細書中に開示されるように、ＰＤＥ３の様々なアイソフォーム間でＮ末端の違いが存在する。どの特定の一実施形態にも限定されることを望まないが、これらのＮ末端の違いは、ＰＤＥ３の個々のアイソフォームを標的にする機会を提供し得る。触媒活性を刺激するリン酸化部位に関する違いから、これらの部位を含むドメインに結合してリン酸化を遮断するかまたはその効果を模倣するかいずれかの作用を有する薬剤がアイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤として有用であることが示唆される。例として、Ｐ１リン酸化部位に結合する薬剤は、ＰＤＥ３Ａ−１３６またはＰＤＥ３Ｂ−１３７を選択的に阻害または活性化し得る。Ｎ末端のタンパク質相互作用ドメインに結合してこれらの相互作用の効果を遮断または模倣する薬剤にも類似の原理が当てはまるが、実例としてはＰＫ−Ａ／ＡＫＡＰ相互作用を遮断することによってｃＡＭＰに媒介されるシグナル伝達を変調するペプチドがある（非特許文献２７）。どの特定の一実施形態にも限定されることを望まないが、リン酸化部位およびタンパク質相互作用ドメインは通常近接していることから、これらは好都合な薬剤標的となる。Ｎ末端領域におけるＰＤＥ３ＡとＰＤＥ３Ｂの違いは、ＰＤＥ３Ａ−１３６とＰＤＥ３Ｂ−１３７を選択的に標的にすることを可能にするのに十分であり、それにより心筋細胞および血管筋細胞中におけるＰＤＥ３活性の選択的な変調を可能にし得る。
【００１５】
本明細書中で示すように、様々なｍＲＮＡから様々なＰＤＥ３のアイソフォームが翻訳される。ある場合は、これらｍＲＮＡは異なる遺伝子（ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂ）から生成される。ＰＤＥ３Ａの場合は、同一遺伝子から転写された異なるｍＲＮＡ（たとえば、ＰＤＥ３Ａ１およびＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ）から、異なるアイソフォームが生成される。ＰＤＥ３Ａ１の読み枠（ＯＲＦ）を配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ）１４に示す。第１のＡＴＧコドンから始まるＰＤＥ３Ａ１の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を配列番号１８に示す。ＰＤＥ３Ａ２のおおよそのＯＲＦを配列番号１５に示す。ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡに特有のヌクレオチド配列が同定され、ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡと反応するがＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡとは反応しないｃＤＮＡプローブが設計された。どの特定の一実施形態にも限定されることを望まないが、これらの違いにより、ＰＤＥ３のｍＲＮＡは、アンチセンス構築物、リボザイムまたは小さな干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）によりその翻訳を阻害することによって個々のタンパク質アイソフォームの活性を低下させるための好都合な標的となる。
【００１６】
本発明は、アイソフォームに選択的なＰＤＥ３活性の阻害剤または活性化剤を開発するために使用し得るＰＤＥ３アイソフォーム間の違いを同定することによって、当分野で未解決の要求を満たす。このような阻害剤または活性化剤は、様々な細胞内区画、細胞種および組織中のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルの示差的な調節を可能にするべく提供される。特定の実施形態では、本発明はアイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤を同定する方法に関する。特定の実施形態は、このような方法によって同定された、心筋症および／または肺高血圧症の治療的処置に有用な化合物に関する。好ましい実施形態では、このような化合物は、心拍出量の改善をもたらし長期的な毒性はわずかであるかまたはまったく示さない。他の実施形態では、ＰＤＥ３のアイソフォーム選択的な阻害剤または活性化剤は、真性糖尿病、末梢血管疾患および冠動脈狭窄（限定はされないが、特に冠動脈形成術後に引き起こされる狭窄）などｃＡＭＰ濃度の調節における欠陥に関連する多くの疾病状態の治療的処置に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
添付の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含める。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書中で提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良く理解することができるであろう。
【００１８】
本明細書中では、以下の略記を使用する。以下に記載しない他の略記は、その明白かつ通常の意味である。
ＡＫＡＰ：ＰＫ−Ａ（「Ａキナーゼ」）アンカー・タンパク質
Ａｋｔ：プロテイン・キナーゼＢ
抗ＣＴ：ＰＤＥ３ＡのＣ末端に対して作製されたポリクローナル抗体
抗ＭＩＤ：ＰＤＥ３Ａ中のタンパク質アミノ酸配列の中間部に対して作製されたポリクローナル抗体
抗ＮＴ：ＰＤＥ３ＡのＮ末端に対して作製されたポリクローナル抗体
ＣａＭ：カルモジュリン
ＣＣＲ：保存された触媒領域
ＣＫ２：カゼイン・キナーゼ２
ＣＲＥＢ：ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質
Ｇ：Ｇタンパク質（Ｇα、Ｇβ、Ｇγ）
Ｇｌｙ  Ｓｙｎ：グリコーゲン合成酵素
ＩＢ：免疫ブロット
ＩＰ：免疫沈降
ＩＧＦ：インスリン様成長因子
ＩＮＳ：ＣＣＲ中の４４アミノ酸の挿入物
ＭＡＰキナーゼ：マイトジェン活性化プロテイン・キナーゼ
ＭＬＰ：筋ＬＩＭタンパク質
ＮＨＲ：Ｎ末端疎水性領域
ｐ３４ｃｄｃ２：サイクリン依存性プロテイン・キナーゼ
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３：ＰＤＥ３中のリン酸化部位
ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ
ＰＤＥ３：ホスホジエステラーゼ・タイプ３
ＰＤＥ３−ＢＰ：ＰＤＥ３結合タンパク質
ＰＧＥ１：プロスタグランジンＥ１
Ｐｈ  Ｋ：ホスホリラーゼ・キナーゼ
ＰＩ３−Ｋ：ホスファチジルイノシトール３・キナーゼ
ＰＫ−Ａ：ｃＡＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ
ＰＫ−Ｂ：プロテイン・キナーゼＢ、Ａｋｔとしても知られる
ＰＫ−Ｃ：プロテイン・キナーゼＣ
ＰＫ−Ｇ：ｃＧＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ
ＰＫＩ：ＰＫ−Ａに特異的なプロテイン・キナーゼ阻害剤
ＰＬ：ホスホランバン
ＲＡＣＫ：活性化ＰＫ−Ｃの受容体
ｒｔＸ：組換え型タンパク質「Ｘ」
Ｒｙ：リアノジン
ＳＥＲＣＡ：筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ
Ｔｎ：トロポニン
ＴＭ：トロポミオシン
Ｖ８：エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ
本明細書中で使用する「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）とは、１つまたはそれ以上の品目を意味しうる。
【００１９】
本出願は、少なくとも一部においては、ホスホジエステラーゼ・タイプ３（ＰＤＥ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９２１）にコードされている単離タンパク質および核酸、ならびにアイソフォーム選択的な阻害剤または活性化剤を同定する方法や、このようなタンパク質を標的とした、心筋症および／または肺高血圧症を治療的に処置する方法に関する。本発明の開示においては、さらなる但し書きや限定なしに「ＰＤＥ３」または「ホスホジエステラーゼ・タイプ３」について言及する場合は、本明細書中で特定したものであれ本明細書中に開示する方法によって発見または特徴づけられるものであれ、ＰＤＥ３のアイソフォームのうち任意のものまたはすべてを意味する。開示したＰＤＥ３Ａアイソフォーム・タンパク質の配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３）がＧｅｎＢａｎｋの配列と異なる場合は、本明細書中に開示する配列がより正確であり好ましいと考えられる。
【００２０】
「ＰＤＥ３アイソフォーム」とは、１次構造（すなわちアミノ酸配列）がＰＤＥ３の他のアイソフォームと異なるホスホジエステラーゼ・タイプ３の変異体である。この用語には、それだけには限定されないが、ある程度のアミノ酸配列の相違が生じている限り、切断、アミノ酸置換（変異）または代替的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）ｍＲＮＡスプライシングによって生成されたアイソフォームを包含する。本発明の目的では、他のタイプの共有結合修飾は単一のアイソフォームの範囲内にあると見なされる。たとえば、ＰＤＥ３Ａ−１３６のリン酸化型および非リン酸化型のいずれも、同じアイソフォームを表すと見なされる。ＰＤＥ３Ａの３つのアイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３に開示されている。
【００２１】
本明細書中で使用するＰＤＥ３の「阻害剤」とは、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの崩壊を触媒することに関して、直接的であれ間接的であれ、ＰＤＥ３の活性を低下させるように作用する、任意の化合物または化合物の組合せを意味する。阻害剤は、それだけには限定されないが、分子、原子、または分子や原子の組合せであり得る。ＰＤＥ３の「拮抗剤（アンタゴニスト）」という用語は、ＰＤＥ３の「阻害剤」とおおむね同義である。阻害剤は、たとえば活性に必要なＰＤＥ３の触媒部位または他の機能的ドメインに結合して遮断することによって、ＰＤＥ３に直接作用し得る。阻害剤はまた、たとえばＰＤＥ３のリン酸化（もしくは活性に対するその効果）を遮断するかまたは脱リン酸化を促進することによって、あるいはＰＤＥ３と別のタンパク質またはペプチドとの結合を促進もしくは阻害することによって、間接的に作用し得る。当分野の技術者は、阻害剤および／または活性化剤が、ＰＤＥ３アイソフォームタンパク質の活性に影響を与え得ること、かつ／あるいはＰＤＥ３アイソフォームタンパク質をコードしている１つまたは複数のｍＲＮＡ種（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９２１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８参照）の転写、プロセシング、転写後修飾、安定性および／または翻訳に影響を与え得ることを理解するであろう。
【００２２】
本明細書中で使用するＰＤＥ３の「活性化剤」とは、直接的であれ間接的であれ、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの崩壊を触媒することに関してＰＤＥ３の活性を高めるよう作用する任意の化合物または化合物の組合せを意味する。活性化剤は、それだけには限定されないが、分子、原子、または分子や原子の組合せであり得る。ＰＤＥ３の「作用剤（アゴニスト）」という用語は、ＰＤＥ３の「活性化剤」とおおむね同義である。活性化剤は、たとえば活性に必要なＰＤＥ３中のある機能的ドメインに結合することによって、あるいは活性が高められるようにＰＤＥ３の２次、３次または４次構造を改変させることによって、ＰＤＥ３に直接作用し得る。活性化剤はまた、たとえばリン酸化を促進するまたはその効果を模倣することによって、ＰＤＥ３の脱リン酸化を遮断することによって、あるいはＰＤＥ３と別のタンパク質またはペプチドとの結合を促進もしくは阻害することによって、間接的に作用し得る。上述のように、活性化剤は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルでＰＤＥ３アイソフォームに影響を与え得る。
【００２３】
ＰＤＥ３の「アイソフォーム選択的な」阻害剤または活性化剤とは、ＰＤＥ３の１つのアイソフォームに対して他のＰＤＥ３アイソフォームよりも強い効果を有する阻害剤または活性化剤である。好ましい実施形態では、「アイソフォーム選択的な」阻害剤または活性化剤は、ＰＤＥ３の１つのアイソフォームに対して、他のＰＤＥ３アイソフォームよりも少なくとも２倍高い、より好ましくは３倍高い、より好ましくは４倍高い、より好ましくは５倍高い、より好ましくは１０倍以上高い効果を与える。本発明の目的では、所望する治療効果が得られさえすれば、他のアイソフォームと比較したＰＤＥ３の１つのアイソフォームに対する阻害剤または活性化剤の選択性の正確な度合は重要ではない。たとえば、所望する治療効果は、アイソフォーム選択的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤の投与によりもたらされる、非特異的なＰＤＥ３阻害剤に比べて長期的な死亡率が低下した心拍出量の改善であるかもしれない。「アイソフォーム選択的な」ＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤とは、それだけには限定されないが、アイソフォームに特異的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤を包含する。アイソフォームに特異的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤とは、ＰＤＥ３のある単一のアイソフォームに対する阻害剤または活性化剤の効果が他のすべてのＰＤＥ３アイソフォームに比べて少なくとも１桁大きい、より好ましくは２桁大きい、より好ましくは３桁以上大きい効果であるような、ＰＤＥ３の単一のアイソフォームにほぼ排他的に作用する阻害剤または活性化剤である。
【００２４】
（ホスホジエステラーゼ・タイプ３）
環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに媒介される細胞内シグナル伝達の調節において遍在的な役割を果たしている。これらの酵素のファミリーが１１種同定されている。ＰＤＥ３ファミリーに属するものは、高い親和性でｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのいずれにも結合し、相互に競合する様式でこれらを加水分解する、二重特異的ホスホジエステラーゼである（図１）。細胞内のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの含有量を増加させるＰＤＥ３阻害剤は、心筋細胞中ではｃＡＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ（ＰＫ−Ａ）活性化に起因する変力効果を有しており、血管筋細胞中ではｃＧＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ（ＰＫ−Ｇ）活性化に起因する血管拡張効果を有している。
【００２５】
心筋細胞および血管筋細胞中における収縮および弛緩の調節に加えて、ＰＤＥ３環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼは、血小板凝集、脂肪細胞におけるインスリンに対する抗脂肪分解応答、膵臓β細胞によるインスリンの分泌および卵母細胞の成熟に関与している（非特許文献１、２８、２９）。図２は、ＰＫ−Ａ活性の数多くの標的および細胞内区分を例示している。
【００２６】
ＰＤＥ３の２つのサブファミリーである、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂと命名された遺伝子の産物が同定されている。ＰＤＥ３Ａは主に心筋細胞および血管筋細胞ならびに血小板中で発現され、ＰＤＥ３Ｂは主に脂肪細胞、肝細胞および膵臓細胞中で発現される（血管筋細胞中でも発現される）（非特許文献３０）。これまでに、１つのＰＤＥ３Ｂ（非特許文献３１）および３つのＰＤＥ３ＡのｃＤＮＡがクローニングされている。このうち後者は、ＰＤＥ３Ａの代替開始部位からの転写によって生成される。ヒト心筋からクローニングしたＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４、配列番号１８）には、ＰＤＥ３Ａの１６個のエキソンすべてが組み込まれている（非特許文献３２、３３）。大動脈筋細胞からクローニングしたＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）は、エキソン１中の開始部位から転写される（非特許文献３４）。胎盤からクローニングしたＰＤＥ３Ａ３は、エキソン３と４の間の開始部位から転写される（非特許文献３５）。３つのＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡの転写に使用される代替開始部位を図３に例示する。コードされているＰＤＥ３Ａアイソフォームのアミノ酸配列を、本明細書中では配列番号１（ＰＤＥ３Ａ−１３６）、配列番号２（ＰＤＥ３Ａ−１１８）および配列番号３（ＰＤＥ３Ａ−９４）として開示する。当分野の技術者は、ＰＤＥ３のタンパク質アイソフォームがＰＤＥ３Ａ遺伝子から転写したｍＲＮＡ種に正確に対応していないことに気付くであろう。たとえば、ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４のいずれもＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）から翻訳される。
【００２７】
ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂの最も長い読み枠（ＯＲＦ）に相当するタンパク質の機能
トポグラフィーは類似している（図４）。このＣ末端には、環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼのファミリー間で高度に保存されており、触媒活性が存在する「ＣＣＲ」と命名された約２８０アミノ酸の配列が含まれている（図４）。ＣＣＲ内には、環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼのＰＤＥ３ファミリーに特有の「ＩＮＳ」と命名された４４アミノ酸の挿入物がある。Ｎ末端は、「ＮＨＲ１」（約２００アミノ酸）および「ＮＨＲ２」（約５０アミノ酸）と命名された２つの疎水性配列を含んでいる。ＮＨＲ１およびＮＨＲ２は細胞内標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）に関与すると思われる。ＮＨＲ１およびＮＨＲ２の間には、ＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂによってリン酸化される複数の部位があり、これらは、ＣＣＲからの距離にもかかわらず触媒活性を変調する。機能が不明確なもう１つのＰＫ−Ａ部位は、ＮＨＲ２およびＣＣＲの間に位置する。
【００２８】
ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂの間には、構造的に類似しているにもかかわらず、そのアミノ酸配列に関して相当な相違が存在する。ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂは、ＣＣＲ領域内ではＩＮＳを除いて８４〜８６％同一である。しかし、ＩＮＳおよびＣ末端は３５〜３９％しか同一でなく、残りの上流領域の同一性は３０％未満である。したがって、アイソフォームの触媒配列は類似しているが、アイソフォームの調節部分は非常に異なっているように思われ、本発明の様々な阻害剤および活性化剤によって示差的に影響される可能性がある。
【００２９】
（構造／機能の関係）
（触媒活性）  ＰＤＥ３酵素の触媒活性には、すべてのＰＤＥファミリー間で大部分が保存されているＣＣＲドメインを含めたアミノ酸６５０位付近より下流のＣ末端配列のほぼ全体、ならびにＰＤＥ３ファミリーに特有のＩＮＳおよびＣＣＲフランキング領域が必要である（図４）（非特許文献３６、３７）。関連酵素ＰＤＥ４Ｂ２Ｂの結晶構造が最近決定されたことにより、その触媒部位が同定された（非特許文献３８）。触媒ドメインは、１７個のαヘリックスを含む３つのサブドメインからなる。
【００３０】
すべてのＰＤＥファミリーで保存されている活性部位は、これら３つのサブドメインの接合点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）にあり、不連続的なアミノ酸の付加によって形成されている。アイソフォーム・ファミリー間の基質親和性および選択性の違いは、環状ヌクレオチドのプリン環の１位および６位を「読み取って」ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに対する親和性（したがって選択性）を決定する、ＰＤＥ３ＡのＧｌｕ１００１に、アロステリック効果を与えるアミノ酸配列の違いによって、大いに影響され得る。ＰＤＥ３／ＰＤＥ４キメラを使用する実験では、この部位に隣接する領域がホスホジエステラーゼ阻害剤に対する感度の決定因子を含むことが示された（非特許文献３９）。活性部位が基質親和性をアロステリックに決定する不連続ドメインによって形成されているこのモデルにより、触媒活性に何故これほど多くの配列が必要であるかが説明されるかもしれない。また、何故一部のアミノ酸の変異がｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのいずれか一方の結合に優先的に影響を与え、他の変異がどちらのヌクレオチドにも影響を与えるかが説明されるかもしれない（非特許文献４０）。触媒活性にＮ末端は必要ではないが、Ｎ末端の欠失によりＶｍａｘｃＧＭＰ／ＶｍａｘｃＡＭＰの比が増加し、これによりＮ末端領域が触媒活性の調節に関与していることが示唆される（非特許文献４１）。
【００３１】
上述の構造モデルは、選択的なＰＤＥ３阻害または活性化の可能性において重要な意味合いを持っている。触媒活性に必要な領域、すなわちＩＮＳおよびＣＣＲに隣接する領域の配列は、アイソフォームに選択的な阻害剤または活性化剤の合理的な標的となるべくＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂ間で十分異なっている。以下の実施例に記載するように、ＰＤＥ３ＡまたはＰＤＥ３ＢのどちらかのＣ末端に選択的な抗ペプチド抗体の開発が、選択的な阻害または活性化が生じ得ることのさらなる証拠となる。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの加水分解に示差的に影響を与えるアロステリック部位の存在により、これら部位に選択的に結合してｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのどちらかの加水分解に影響を与える小分子の同定が可能となる。
【００３２】
（細胞内局在化）  ＰＤＥ３の細胞内標的化は、ＮＨＲ１およびＮＨＲ２のＮ末端ドメインによって主に決定されているように思える。ＮＨＲ１は６個の膜貫通ヘリックスからなり、このうち最後の２個は、これらのドメインを含む組換えタンパク質を細胞内膜に限定して局在させるのに十分である（非特許文献４２、４３）。このような組換えタンパク質は、高濃度の塩と界面活性剤との組合せでのみ溶解可能であり、これにより、これらが内在性膜タンパク質であることが示唆される。ＮＨＲ１を欠いているがＮＨＲ２を保持している組換えタンパク質は、トランスフェクションした細胞のミクロソーム分画およびサイトゾル分画いずれにおいても見出される。これらのタンパク質を溶解させるには高濃度の塩で十分であり、これにより、その細胞内局在化には他のタンパク質との相互作用が関与していることが示唆される。ＮＨＲ１およびＮＨＲ２のどちらも欠いている組換え体は主にサイトゾル分画にある。
【００３３】
（タンパク質のリン酸化による調節）  ＰＤＥ３のリン酸化は、その機能の調節において重要な役割を果たす。脂肪細胞では、ＰＫ−ＡおよびおそらくはＰＩ３−ＫによるＰＤＥ３のリン酸化は、インスリンに対する抗脂肪分解応答に関与している（非特許文献４４）。卵母細胞では、ＰＫ−Ｂによるリン酸化により、減数分裂が再開される（非特許文献２８）。前骨髄細胞では、ＰＫ−Ｂによるリン酸化により、ＤＮＡ合成を変調するｃＡＭＰプールが調節される（非特許文献４５）。血小板では、ＰＫ−Ａおよびインスリン活性化プロテイン・キナーゼによるＰＤＥ３Ａのリン酸化は、凝集の阻害に関連している（非特許文献４６、４７）。
【００３４】
以下の実施例中でより詳細に記載されているように、ＰＤＥ３アイソフォームで３つのリン酸化部位が同定されている（図４）。ＰＤＥ３Ｂはｉｎ  ｖｉｖｏで、ＰＫ−ＡおよびおそらくはＰＩ３−Ｋによって、Ｓｅｒ３１８（Ｐ２部位）がリン酸化される（非特許文献４８、４９）。このＰ２部位は、ＰＰ２Ａセリン／スレオニン・ホスファターゼによって脱リン酸化される（非特許文献５０）。ＰＤＥ３Ｂもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＫ−ＢによってＳｅｒ２９６（Ｐ１部位）がリン酸化される（非特許文献５１）。どちらの部位でのリン酸化も触媒活性を増大させる。Ｐ１およびＰ２がＮＨＲ１とＮＨＲ２との間に存在することにより、これらの部位でのリン酸化は細胞内標的化にも影響を与える可能性が生じる。
【００３５】
第３の部位、すなわちＰＤＥ３Ｂ中のＳｅｒ４２１（Ｐ３部位）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＫ−Ａによってリン酸化される（非特許文献５２）。脂肪細胞では、ＰＤＥ３Ｂが、ｉｎ  ｖｉｖｏでイソプロテレノールまたはインスリンに応答してＰ３でリン酸化されているのかは不明確である。他の細胞種のＰＤＥ３Ｂ中でもこの部位がリン酸化されているのかどうか、また、もしそうであれば、この部位のリン酸化がどのように活性に影響を与えるのかは不明である。また、これらの部位のうちいずれかのリン酸化が阻害剤感受性に影響するかどうかも不明であるが、関連する実例としては、別のホスホジエステラーゼであるＰＤＥ４Ｄ３の阻害剤ロリプラムに対する感受性の低下であり、これはＰＫ−ＡによるＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化によりもたらされる（非特許文献５３）。本発明以前には、ＰＤＥ３Ａアイソフォーム上のリン酸化部位は知られていなかった。ＰＤＥ３Ａのアミノ酸配列中には数多くのリン酸化コンセンサス部位が存在しており、これら部位のうちどれがｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されるかは不明であった。
【００３６】
ＰＤＥ３アイソフォームをリン酸化してその機能を変化させるプロテイン・キナーゼの同定により、拡張型心筋症におけるＰＤＥ３アイソフォームの役割が解明されるかもしれない。たとえば、ＰＫ−ＢによるＰＤＥ３のリン酸化および活性化は、拡張型心筋症におけるＰＤＥ３阻害の有害な長期的効果に関連する抗アポトーシス機構であるかもしれない。ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂの配列は、ＣＫ２、ＰＫ−Ｃおよび他のプロテイン・キナーゼのコンセンサス部位を複数含む。心筋症および／または肺高血圧症の病態生理学において、これらキナーゼによる交叉調節（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を考慮することが特に重要であるかもしれない。類推すれば、ＥＲＫ２によるＰＤＥ４Ｄ３のリン酸化によりその活性が大きく低下し、この低下は、ＰＫ−Ａによるリン酸化によって逆転される（非特許文献５４）。
【００３７】
（タンパク質−タンパク質相互作用）
ＰＤＥの他のファミリーの活性および細胞内局在化の調節には、他のタンパク質との相互作用が関与している。Ｃａ２＋／ＣａＭの結合は、複数のＣａＭ結合ドメインを介してＰＤＥ１の触媒活性を刺激する（非特許文献５５）。ＰＤＥ６αβおよびα’α’ダイマーの活性は、ＰＤＥγとのそれらの相互作用によって阻害される。ロドプシンに共役したＧタンパク質トランスデューシンとの相互作用によってこの阻害が軽減された場合に、光伝達が起こる（非特許文献５６）。ＰＤＥ６は、ＰＤＥδと結合すると細胞内膜から解離する（非特許文献５７）。ＰＤＥ４アイソフォームが多酵素複合体となる場合の細胞内標的化には、ＲＡＣＫ１およびＡＫＡＰとの相互作用が関与している（非特許文献５８、５９）。ＰＤＥ４とＳＲＣファミリーのチロシン・キナーゼのＳＨ３ドメインとの相互作用は、細胞内局在化および阻害剤感受性に影響を与える（非特許文献６０）。
【００３８】
本発明以前には、ＰＤＥ３が触媒的に調節されているのか他のタンパク質との相互作用によって細胞内で標的化されているのかは不明であった。抗インスリン受容体抗体を用いて、ＰＤＥ３Ｂ、インスリン受容体、ＰＩ３−Ｋのｐ８５およびｐ１１０サブユニットならびに未同定の９７ｋＤａタンパク質をヒト脂肪細胞から免疫共沈降させた（非特許文献４９）。ＰＤＥ３Ｂと１４−３−３タンパク質との相互作用の予備的データが報告されている（非特許文献６１）。１４−３−３タンパク質はコンセンサス・モチーフ中のリン酸化セリン残基に結合して、多様な様式でタンパク質の細胞内局在化に影響を与える（非特許文献６２）。以下の実施例で論じるように、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂ中のＰ１部位がこのコンセンサス・モチーフに隣接しており、これにより、１４−３−３タンパク質との相互作用によってリン酸化が細胞内局在化に影響を与える可能性が生じる。実施例はさらに、ＰＤＥ３ＢとＰＫ−ＢおよびＡＫＡＰ２２０との安定な複合体の存在を示している。これらの観察があいまって、他のタンパク質とＮ末端との相互作用がＰＤＥ３機能に関与しており、また、ＰＤＥ３のリン酸化がこれらの相互作用に影響を与え得ることが示されている。
【００３９】
（タンパク質）
ＰＤＥ３の機能すなわち「野生型」の活性に言及する場合は、当該分子がｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの分解を触媒する能力を有することを意味する。この活性を有する分子を、当分野の技術者が精通しているアッセイを使用して同定してもよい。たとえば、ＰＤＥ３活性を含むホモジネートのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはその変形により、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰを分解する能力によってＰＤＥ３活性を有する分子が同定されよう。当分野の技術者は、様々なホスホジエステラーゼが様々な細胞系および組織に固有であることを認識し、このようなアッセイを実施するために内在性ホスホジエステラーゼを欠いた適切なシステムを選択するであろう。
【００４０】
用語「ＰＤＥ３遺伝子」とは、上に定義したＰＤＥ３タンパク質をコードしているＤＮＡ配列と実質的に同一なすべてのＤＮＡ配列を言う。遺伝暗号の縮重を許容すると、少なくとも約５０％、一般的には少なくとも約６０％、より一般的には約７０％、最も一般的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは９８％以上がＰＤＥ３のｃＤＮＡ配列と同一であるヌクレオチドを有する配列が、これらの配列に「示されているもの」である。ＰＤＥ３のｃＤＮＡ配列と実質的に同一または「本質的に同じ」である配列も、比較的厳密性の高い条件下でＰＤＥ３のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む核酸セグメントにハイブリダイズ可能な配列として、機能的に定義し得る。このような条件は通常、約５０℃〜約７０℃の温度の約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによってもたらされる条件など、比較的低い塩濃度および／または高い温度の条件である。このような選択的な条件では、相補鎖と鋳型または標的鎖との間のミスマッチが許容されたとしてもわずかしか許容されない。このような遺伝子配列の全てが関連のある制御配列を含み得る。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明はＰＤＥ３ポリペプチド断片（ＰＤＥ３のホスホジエステラーゼ活性を保持していても保持していなくてもよい）に関するが、好ましい実施形態では、この断片はホスホジエステラーゼ活性を示す。この分子のＮ末端を含む断片は、コード領域内の翻訳停止部位を遺伝子操作することによって作製することができる（後述）。あるいは、タンパク質分子をタンパク質分解酵素で処理することによって、様々なＮ末端、Ｃ末端および内部の断片を生成し得る。断片の例には、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００アミノ酸またはそれ以上の長さのＰＤＥ３アミノ酸配列の連続した残基が含まれ得る。沈殿（たとえば、硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー（免疫アフィニティー・クロマトグラフィーを含む）、または様々なサイズ分離法（たとえば、沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）など周知の方法でこれらの断片を精製してもよい。
【００４２】
実施的に同一な類似体タンパク質は、天然型のタンパク質の対応する配列と約８０％を超える同一性を有し、より好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一、より好ましくは９８％同一、より好ましくは９９％同一、より好ましくは９９．５％同一、より好ましくは９９．９％同一であろう。より低い類似度を有するが匹敵する生物活性を有する配列は、等価物と見なされる。核酸配列を決定する際には、実質的に類似のアミノ酸配列をコードすることができる対象の核酸配列すべてが、そのコドン配列の違いにかかわらず、基準の核酸配列に実質的に類似していると見なされる。
【００４３】
（タンパク質の精製）
特定の実施形態には、個々のＰＤＥ３アイソフォームまたはその変異体を１つまたは複数精製することが含まれ得る。タンパク質精製技法は、当分野の技術者には周知である。１レベルでは、これらの技法は、ある段階で、細胞環境（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｌｉｅｕ）をポリペプチド分画とポリペプチドでない分画とに大まかに分画化することを含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のポリペプチドを、部分的または完全に精製する（または均一物になるまで精製する）べくクロマトグラフィーおよび電気泳動技法を使用してさらに精製することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティー・クロマトグラフィー、免疫アフィニティー・クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、さらにはＨＰＬＣである。
【００４４】
本発明の特定の態様は、コードされているタンパク質またはペプチドの精製に関し、具体的な実施形態では、その実質的な精製に関する。タンパク質またはペプチドに適用する用語「単離された」または「精製された」とは、前記タンパク質またはペプチドがその自然に得られる状態と比較してある程度精製されている、他の成分から単離可能な組成物を言うことを意図する。したがって、精製されたタンパク質またはペプチドとは、それが自然に存在する環境から離れた状態のタンパク質またはペプチドのことも言う。
【００４５】
一般的に、「精製された」とは、分画化して他の様々な成分を除去し、それが発現する生物活性が実質的に保持されているタンパク質またはペプチド組成物を意味する。用語「実質的に精製された」を使用する場合は、この表記は、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％以上を構成しているなど、該タンパク質またはペプチドが組成物の主要な成分を形成しているような組成物を言う。
【００４６】
タンパク質またはペプチドの精製度合を定量する様々な方法は、当分野の技術者には周知であろう。これらには、たとえば、活性分画の特異的活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画中のポリペプチド量を評価することが含まれる。分画の精製度を評価する好ましい方法は、分画の特異的活性を計算し、これを最初の抽出物の特異的活性と比較し、このようにして「〜倍精製数」によって評価される分画中の精製度合を計算することである。もちろん、活性量を表すのに使用する実際の単位は、精製に次いで選択された具体的なアッセイ技法、およびタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存するであろう。
【００４７】
タンパク質精製での使用に適した様々な技法は、当分野の技術者には周知であろう。これらには、たとえば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いて、または熱変性によって沈殿させること、ならびにその後、遠心分離；イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；およびこれらの組合せや他の技術を行うことが含まれる。当分野で一般的に知られているように、様々な精製工程を実施する順序を入れ替えても、または特定の工程を省略しても、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製する適切な方法がもたらされると考えられる。
【００４８】
タンパク質またはペプチドが常に、最も精製された状態で提供されなければならないという一般的な要件はない。実際、より低い程度に実質的に精製された生成物が特定の実施形態で有用性があることを企図する。より少ない精製工程を組み合わせて使用することによって、または同一の一般精製スキームを様々な形態で利用することによって、部分的な精製を行うことができる。たとえば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施した陽イオン交換カラム・クロマトグラフィーによって、一般的に、低圧クロマトグラフィー・システムを利用した同じ技法に比べて、より高い「〜倍」精製がもたらされることが理解されよう。相対的な精製の度合がより低い方法は、タンパク質産物の全体的な回収率、または発現されたタンパク質の活性保持において有利な場合もある。
【００４９】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥの様々な条件に伴って、ポリペプチドの移動度が、時には顕著に変動し得ることが知られている（非特許文献６３）。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製された発現産物の見かけの分子量が変動し得ることが理解されよう。
【００５０】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ピークの分解能が高い、非常に迅速な分離を特徴とする。さらに、粒子が小さく密に詰まっている故に空隙容量が総容積のごくわずかな一部分でしかないので、非常に少量の試料しか必要としない。また、バンドが狭い故に試料がごくわずかしか希釈されないので、試料の濃度をあまり高くする必要がない。
【００５１】
ゲル・クロマトグラフィー、すなわち分子篩クロマトグラフィーとは、分子の大きさに基づく分画クロマトグラフィーの一種である。粒子を構成している材料が分子を吸着しない限りは、移動速度を決定するただ１つの要素は孔径である。したがって、形状が比較的一定である限りは、分子は大きい順にカラムから溶出される。ゲル・クロマトグラフィーでは、分離はｐＨ、イオン強度、温度などすべての他の要素とは無関係である。
【００５２】
アフィニティー・クロマトグラフィーは、単離しようとする物質とそれが特異的に結合可能な分子との間の特異的な親和性に依存している。カラム材料は、抗体や抗体結合タンパク質などの結合パートナーの一方を不溶性のマトリクスに共有結合させることによって合成される。その後、カラム材料は溶液から標的物質を特異的に吸着させることができる。溶出は、条件を結合が起こらない条件に変えることによって（たとえば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変化）起こる。最も一般的なアフィニティー・クロマトグラフィーの形は免疫アフィニティー・クロマトグラフィーである。本発明による使用に適した抗体の産生を以下に記載する。
【００５３】
（合成ペプチド）
一部の実施形態では、本発明は抗体産生やＰＤＥ３の様々なエピトープに結合可能な潜在的な阻害剤または活性化剤についてのスクリーニングなど、多様な用途のための小ペプチドに関する。従来技術に従って、溶液中または固体の支持体上で約１００アミノ酸未満の小ペプチドを合成し得る。様々な自動ペプチド合成機が市販されており、周知のプロトコルに従って使用可能である。たとえば、それぞれを本願明細書に援用する非特許文献６４、６５、６６および６７を参照のこと。通常約６個から約３５〜５０個のアミノ酸の、ＰＤＥ３タンパク質の選択された領域に相当する短いペプチド配列または重複ペプチドのライブラリを容易に合成し、その後、反応性のあるペプチドまたは他の小分子を同定するように設計されたスクリーニング・アッセイでスクリーニングし得る。あるいは、組換えＤＮＡ技術を用いて本発明のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞内へ形質転換またはトランスフェクションし、発現に適した条件下で培養してもよい。約５０アミノ酸長より長いＰＤＥ３ペプチドが所望される実施形態では、クローニングしたＰＤＥ３配列の発現が好ましい。当分野の技術者は、複数の短いペプチド断片を合成し、これらをたとえばカルボジイミドを架橋基として使用して共有結合させることも可能であることを理解するであろう。この方法で、短い断片を合成し、それらを適切な順序で連結することによって、任意の所望の長さのペプチドが合成可能である。
【００５４】
（２次元マッピング）
プロテオーム解析としても知られる２次元マッピングは、細胞性タンパク質の発現の特性解析に有用なツールである。特に企図する方法は、それぞれその全体を本願明細書に援用する非特許文献６８、６９、７０に記載されている方法である。２次元マッピングは、２次元のタンパク質マップ中の特定の座標を使用して各タンパク質が同定可能であり、該マップから各タンパク質を抽出してさらに同定する（たとえば、マイクロ・シークエンシングや質量分析によって）ことが可能である、細胞溶解液またはホモジネート中のタンパク質の２次元電気泳動による分離に基づいている。
【００５５】
マッピングでは、目的タンパク質に特異的な抗体または一連の抗体を使用して細胞ホモジネートまたは溶解物中のタンパク質を免疫沈降し、分離用電気泳動タンパク質ゲルに流す。その後、このゲルからのタンパク質を固定化マトリクスへ移す。様々な固定化マトリクスを入手可能であり、使用し得る。本発明の目的に好ましいマトリクスは、ニトロセルロースや、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）［米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）所在］）などナイロンのマトリクスである。その後、得られたタンパク質−マトリクスのハイブリッド（ブロットと呼ばれる）を水で洗浄するが、これは、後続の工程で支障をきたし得る非結合の細胞片をすべて最初のホモジネートまたは溶解物から取り除くためである。その後、このブロットを、細胞ホモジネートまたは溶解物中の目的タンパク質または複数のタンパク質に特異的な抗体あるいは一連の抗体と接触させる。当分野の技術者には、これらの抗体がモノクローナル、ポリクローナル、または両方であり得ること、およびこれらのうちいずれを使用してもこの手法の結果は実質的に変わらないことを理解されよう。細胞ホモジネートまたは溶解物からの目的のタンパク質が抗体によって、すなわち抗体がタンパク質に結合して抗体−タンパク質複合体を形成することによって同定されたら、これらを残りのブロットマトリクスから物理的に切り出す。当分野の技術者には、任意の一般的な抗体検出方法を使用して前述の抗体−タンパク質複合体を同定し得ることを理解されよう。これらには、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、アルカリ・ホスファターゼとコンジュゲートさせた２次抗体、酵素とコンジュゲートさせた抗体、放射標識された抗体、または任意の他の一般的な検出方法が含まれる。本発明の目的には、放射標識された抗体が好ましい検出方法である。
【００５６】
まだ固定化マトリクスから得たバンドの形態のタンパク質または複数のタンパク質を、いくつかの一般的なペプチダーゼ酵素のうち１つで消化する。これらは、特異的な位置でのみタンパク質を切断する酵素であり、それだけには限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ＣＮＢｒおよびＶ８が含まれる。完了するまで、すなわち選択されたペプチダーゼが認識し得る試料中の可能なすべての部位が切断されるまで、消化を行わせてもよく、あるいは、より短い時間の間だけ行わせ、完了させない部分消化であってもよい。所望する消化レベルか完了した後、通常は遠心分離して上清を新しい容器または管に移すことによって、選択されたペプチダーゼを試料から取り除く。
【００５７】
その後、これら消化した試料を、マッピング工程の第１「次元」であるｐＨで駆動する泳動のためにセルロースの薄層プレート上に載せた。消化したタンパク質はこの薄層プレート上で、消化されたタンパク質断片が電気泳動緩衝液のｐＨに従って電荷によって分離されることを除いて、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合とほとんど同じように挙動する。ほんの一例として、選択された電気泳動緩衝液が１．９〜４．７２の範囲のｐＨを有する場合は、試料中の消化したペプチド断片のほとんどが正に帯電する。したがって、消化したペプチド断片の最適分離のために、薄層プレートには適切な負荷をかけるべきである。この例では、正極により近く、陰極からより離れた距離でプレートに負荷をかけるべきである。当分野の技術者には、個々の任意の電気泳動で使用するｐＨが、ペプチドの最適分布を与えるｐＨであるべきことを理解されよう。好ましいｐＨ値には、８．９、より好ましくは４．７２、さらに好ましくは１．９が含まれる。電気泳動が完了した後、通常は薄層プレートをオーブンで乾燥させる。この工程により、消化したペプチド断片と薄層プレート上のセルロースとが不可逆的に結合されると考えられている。
【００５８】
次に、マッピングの第２「次元」であるクロマトグラフィーを実施する。クロマトグラフィー液を入れたチャンバ内に薄層プレートを配置するが、薄層プレートの片側だけをこの液体に浸す。薄層プレートは、使用した液体が毛管現象によって薄層プレートを上っていく際に、プレート上で行った電気泳動の方向から９０度の角度で上るように配置する。この方法でクロマトグラフィーを行う場合は、消化したペプチド断片は、総電荷とは別のある種の様式で分離される。したがって、クロマトグラフィーが完了すると、消化したペプチドはまず総電荷によって、その後クロマトグラフィー液によって駆動された特性によって分離され、それ故「２次元」分離なのである。
【００５９】
当分野の技術者は、クロマトグラフィー緩衝液が分離に所望される特性に基づいて変化することを理解し、問題のペプチドの最適分離を与える緩衝液を使用するであろう。単なる一例として、クロマトグラフィー緩衝液は、疎水度、アルカリ度、水への溶解度、または総電荷以外の任意の他の一般的な分離手段に応じて分離するものを選択し得る。
【００６０】
クロマトグラフィーが完了した後は、薄層プレートを乾燥させ、一般的な手段（放射標識した抗体など）を使用して、上述のように分離した消化ペプチド断片を検出する。
（タンパク質チップ）
タンパク質チップ技術により、試料化合物を、固体の基材に固定化したＰＤＥ３アイソフォーム・タンパク質、ペプチドまたはサブユニットにハイブリダイズする能力について迅速にスクリーニングする手段が提供される。それぞれその全体を本願明細書に援用する（特許文献２、３、および４）に開示されているものなど、タンパク質アレイに基づいた技術を特に企図する。これらの技法には、多数の試料を迅速かつ正確に分析する方法が含まれる。この技術では、タンパク質またはペプチドの結合特性を利用して試料をスクリーニングする。
【００６１】
タンパク質チップまたはアレイは、タンパク質またはペプチドのアレイを付着させた固体の基材からなる。スクリーニングでは、チップまたはアレイを、ＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤として機能する可能性のある１つまたは複数の試験化合物を含む試料と接触させる。試験化合物がペプチドに結合する厳密性の度合は、たとえば、塩濃度、温度、ｐＨおよび媒体の界面活性剤含有量を変えることによって、所望に応じて操作し得る。その後、チップまたはアレイを走査し、どのタンパク質またはペプチドが試験化合物に結合したかを決定することができる。
【００６２】
タンパク質チップまたはアレイの構造は、（１）励起光源、（２）プローブ・アレイ、（３）サンプリング素子、（４）検出器、および（５）シグナル増幅／処理システムからなる。また、チップにプローブを固定化するための支持体を含めてもよい。
【００６３】
特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドを検出可能なシグナルを発する物質でタグ付けまたは標識してもよい。タグ付けまたは標識された分子種は、蛍光性、リン光性、もしくは発光性であるか、またはラマン・エネルギーを発するもしくはエネルギーを吸収してもよい。タンパク質またはペプチドが試験化合物に結合すると、シグナルが発生し、これがチップによって検出される。その後、シグナルはその性質に応じていくつかの方法で処理され得る。代替実施形態では、試験化合物を標識してもよい。
【００６４】
タンパク質またはペプチドを、光トランスデューサーおよびそれに関連する検出回路網も担持している集積マイクロチップ上に固定化してもよい。あるいは、ＰＤＥ３タンパク質またはペプチドを、その後マイクロチップまたは検出器の表面自体に付着させる膜またはフィルター上に固定化してもよい。最適な接触および最大の検出を確実にするために、タンパク質またはペプチドをトランスデューサーの検出表面上に直接的または間接的に固定化させてもよい。永続的または除去可能のいずれかの状態でタンパク質を基材に付着させるために、様々な方法が利用されてきた。基材上に固定化した場合は、タンパク質は安定化され、繰り返して使用し得る。
【００６５】
基材の例には、ニトロセルロース、ナイロン膜またはガラスが含まれる。強化ニトロセルロース膜、活性石英、活性ガラス、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ポリスチレン系基材、ポリアクリルアミド系基材、ならびに、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサンおよびフォト・ポリマー（ニトレン、カルベン、ケチルラジカルなど標的分子と共有結合を形成する能力を有する光反応性の分子種を含む）など他のポリマーを含めた、数多くの他のマトリクス素材を使用してもよい（それぞれ本願明細書に援用する特許文献５および６を参照のこと）。
【００６６】
いくつかの手段のうち任意のものによって、タンパク質またはペプチドを選択された支持体に結合させ得る。たとえば、まずガラス表面をシラン処理した後カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドで活性化させることによって、タンパク質をガラスに結合させ得る。代替手法では、アミノ基によって連結された３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）またはアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）などの試薬を使用し得る。ニトロセルロース膜では、タンパク質プローブを膜上にスポットしてもよい。
【００６７】
特異的なタンパク質またはペプチドを、まず膜上に固定化し、その後、トランスデューサーの検出表面と接触している膜に付着させてもよい。この方法ではタンパク質がトランスデューサー上に結合することが回避されるが、これは、大規模生産において望ましいかもしれない。この用途に特に適している膜には、ニトロセルロース膜（たとえば、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］製）、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）、ナイロン膜（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））、またはポリスチレン系の基材（ＤＮＡ．ＢＩＮＤ（登録商標）、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在］）が含まれる。
【００６８】
（抗体）
（抗体の産生）
本発明の特定の実施形態は、１つまたは複数のＰＤＥ３アイソフォームに対する抗体の産生を含む。抗体を調製し特性解析する手段は、当分野で周知である（たとえば、本願明細書に援用する非特許文献７１を参照のこと）。
【００６９】
ポリクローナル抗体を産生させる方法は当分野で周知である。手短に述べると、ポリクローナル抗体は、動物を免疫原性組成物で免疫化し、その免疫化した動物から抗血清を回収することによって調製する。抗血清の生産には広範の動物種を使用し得る。通常、抗動物抗血清の生産に使用する動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギでは血液量が比較的多いので、ポリクローナル抗体の産生にはウサギが好ましい選択である。
【００７０】
当分野で周知のように、与えられた組成物の免疫原性は様々であるかもしれない。したがって、多くの場合は、ペプチドまたはポリペプチド免疫原をキャリアに結合することによって成され得るように、宿主の免疫系を高めることが必要である。例示的な好ましいキャリアは、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、ウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも、キャリアとして使用し得る。ポリペプチドをキャリア・タンパク質にコンジュゲートさせる手段は当分野で周知であり、これにはグルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、カルボジイミドおよびビス−ジアゾ化ベンジジンが含まれる。
【００７１】
当分野で周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性を、アジュバントとして知られている、免疫応答の非特異的な刺激剤を使用することによって高めることができる。例示的な好ましいアジュバントには、完全フロイント・アジュバント（死滅させた結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有している非特異的な免疫応答の刺激剤）、不完全フロイント・アジュバントおよび水酸化アルミニウム・アジュバントが含まれる。
【００７２】
ポリクローナル抗体の産生で使用する免疫原組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫に使用する動物に応じて変化する。様々な経路が免疫原を投与するのに使用される（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。免疫後の様々な時点で免疫した動物の血液をサンプリングすることによって、ポリクローナル抗体の産生をモニターしてもよい。後に追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）を注射してもよい。適切な力価になるまで、追加免疫して力価を測定するこの工程を繰り返す。所望する免疫原性のレベルが得られたら、免疫した動物を出血させて血清を単離および保管する、かつ／またはこの動物を使用してＭＡｂを産生してもよい。ウサギ・ポリクローナル抗体の産生には、耳静脈または替わりに心臓穿刺によって出血させてもよい。取り除いた血液を凝固させ、その後遠心分離して血清成分を全細胞および血餅から分離した。血清をそのままで様々な用途に使用してもよく、あるいは、固体マトリクスに結合された別の抗体もしくはペプチドを使用したアフィニティー・クロマトグラフィーなど周知の方法によって所望の抗体分画を精製してもよい。
【００７３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、本願明細書に援用する（特許文献７）に例示される技法など周知の技法を使用して容易に調製し得る。通常、この技法は、適切な動物を選択された免疫原組成物（たとえば精製または部分的に精製した発現タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド）で免疫することを含む。免疫用組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な方法で投与する。
【００７４】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生させる方法は、ポリクローナル抗体を調製する方法とおおむね同じ方針で開始される。マウスやラットなどのげっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジまたはカエル細胞の使用も可能である。免疫した後、ＭＡｂ産生プロトコルで使用するために、抗体を産生する能力を有する体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を選択する。これらの細胞は、生検用に採取した脾臓、扁桃腺またはリンパ節から、あるいは末梢血試料から得ることができる。多くの場合、動物集団を免疫しておいて、最も抗体価の高い動物の脾臓を取り出してこの脾臓をシリンジでホモジナイズすることによって脾臓リンパ球を得る。
【００７５】
その後、免疫した動物由来の抗体産生Ｂリンパ球を、一般的には免疫した動物と同じ種由来の不死化骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを生成する融合手法での使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは抗体を産生せず、高い融合効率を有しており、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中では増殖できない酵素欠損を有する。いくつかの骨髄腫細胞のうち任意のものを使用可能であり、これは当分野の技術者には周知である（たとえば、非特許文献７２）。たとえば、免疫した動物がマウスである場合は、Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用可能であり、ラットには、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を使用可能であり、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６はすべて、ヒトの細胞融合に関して有用である。
【００７６】
抗体を産生する脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを作製する方法は通常、体細胞と骨髄腫細胞とを２：１の比率で混合することからなるが、この比率は、細胞膜の融合を促進する（化学的または電気的）作用因子の存在下でそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変化し得る。センダイ・ウイルスを使用した融合方法が（非特許文献７３、７４）に記載されており、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）たとえば３７％（ｖ／ｖ）のＰＥＧを使用した方法は（非特許文献７５）に記載されている。電気的に誘発させる融合法の使用も適している（非特許文献７６）。
【００７７】
選択培地中で培養することによって、融合された生きているハイブリッドを元の融合されていない細胞から区別する。一般的に、選択的培地は、組織培養培地中でヌクレオチドの新規合成を遮断する薬剤を含む。例示的な好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンまたはメトトレキセートを使用する場合は、ヌクレオチド源として培地にヒポキサンチンおよびチミジンを加える（ＨＡＴ培地）。アザセリンを使用する場合は、培地にヒポキサンチンを加える。好ましい選択培地はＨＡＴである。選択培地中で生存可能な細胞は、骨髄腫とＢ細胞とから形成されたハイブリッドの細胞のみである。
【００７８】
この培養によってハイブリドーマ集団がもたらされ、そこから特異的なハイブリドーマが選択される。通常、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイター・プレートにおいて単一クローンに希釈することによって細胞を培養し、次いで個々のクローンの上清を所望の反応性について試験することによって行う。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラーク・アッセイ、ドット免疫結合アッセイなど、感度が良く、簡便で迅速であるべきである。その後、選択されたハイブリドーマを連続希釈して個々の抗体産生細胞株としてクローニングし、次いでこのクローンを、無限に増殖させてＭＡｂを提供する。
【００７９】
本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体の断片は、上述のように産生させたモノクローナル抗体から、ペプシンやパパインなどの酵素による消化および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断を含めた方法によって得ることができる。あるいは、自動ペプチド合成機を使用して本発明に包含されるモノクローナル抗体断片を合成してもよい。
【００８０】
（免疫アッセイ法）
（免疫複合体の形成）  さらなる実施形態では、本発明は、目的ペプチドを結合、精製、除去、定量、またはそうでなければ一般に検出する免疫検出の方法に関する。本発明のＰＤＥ３タンパク質またはペプチドを用いて、それらとの反応性を有している抗体を検出してもよく、あるいは、本発明に従って調製した抗体を使用してＰＤＥ３タンパク質またはペプチドを検出または精製してもよい。様々な有用な免疫検出方法の工程は、（非特許文献７７）などの科学文献に記載されている。
【００８１】
一般的に、免疫結合の方法は、タンパク質、ペプチドまたは抗体を含有していると思われる試料を得ることと、前記試料を、場合によっては免疫複合体を形成させるのに有効な条件下で本発明の抗体またはタンパク質もしくはペプチドと接触させることとを含む。
【００８２】
免疫複合体の形成の検出は当分野で周知であり、数多くの手法を適用することによって行い得る。一般的にこれらの方法は、当分野で標準的に使用されている任意の放射活性、蛍光、生物学的もしくは酵素的なタグもしくは標識などの、標識またはマーカーの検出に基づいている。このような標識の使用に関する米国特許には、それぞれを本願明細書に援用する（特許文献８、９、１０、１１、１２、１３および１４）が含まれる。当分野で知られているように、２次抗体やビオチン／アビジンのリガンド結合処理など２次結合リガンドを使用することによってさらなる利点が見つかるであろう。
【００８３】
さらなる方法は、２段階の手法による１次免疫複合体の検出を含む。抗体など、標的タンパク質、ペプチドまたは対応する抗体に対する結合親和性を有する第２結合リガンドを使用して、上述のように２次免疫複合体を形成する。洗浄後、ここでも免疫複合体（３次免疫複合体）を形成させるのに有効な条件下かつ十分な時間で、２次免疫複合体を第２抗体に対する結合親和性を有する第３の結合リガンドまたは抗体と接触させる。第３のリガンドまたは抗体は検出可能な標識に連結されており、形成された３次免疫複合体の検出が可能となる。所望であれば、本システムはシグナル増幅を提供し得る。
【００８４】
本発明の免疫検出方法は、様々な疾病状態の診断に有用でありうる。標的タンパク質もしくはペプチド、または対応する抗体のいずれかを含有していると思われている生体試料または臨床試料を使用する。特定の実施形態では、心筋症および／または肺高血圧症を患っている患者由来の試料を免疫アッセイして、１つまたは複数の組織中に存在する様々なＰＤＥ３アイソフォームの種類および存在量を決定してもよい。ＰＤＥ３を対象とした標的療法では、患者の患部組織中で検出される１つまたは複数のＰＤＥ３アイソフォームに選択的または特異的であることが知られている阻害剤および／または活性化剤を使用し得る。
【００８５】
（免疫組織化学）  本発明の抗体を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって調製した、新鮮凍結またはホルマリン固定した、パラフィン包埋した組織塊と併せて使用し得る。本願明細書に援用する（非特許文献７８）に記載の方法など、当分野で周知の任意のＩＨＣ方法を使用し得る。
【００８６】
（ＥＬＩＳＡ）  ある種の免疫アッセイは、当分野で周知の様々なタイプのエライザ法（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を使用した免疫組織化学的な検出も特に有用である。しかし、当然のことであるが、検出はこれらの技法に限定はされず、ウエスタン・ブロット、ドット・ブロット、ＦＡＣＳ解析なども使用し得る。
【００８７】
ＥＬＩＳＡの１例では、本発明のＰＤＥ３タンパク質に結合する抗体を、ポリスチレン製のマイクロタイター・プレートのウェルなどタンパク質親和性を示す選択された表面上に固定化する。その後、臨床試料などＰＤＥ３アイソフォームを含有していると考えられる試験組成物をウェルに加える。結合させ、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄した後、結合した抗原を検出することができる。検出は一般的に、検出可能な標識に連結された、標的タンパク質に特異的な２次抗体を加えることによって実施する。このタイプのＥＬＩＳＡは単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。また、第２抗体を加え、次いで、検出可能な標識に連結された、２次抗体に対する結合親和性を有する第３抗体を加えることによっても、検出が可能である。当分野の技術者には、様々なＥＬＩＳＡや他の免疫アッセイ技法が当分野で周知であり、これらのうち任意のものを本発明の範囲内で実施し得ることが理解されよう。
【００８８】
（固定化の方法）
様々な実施形態では、本発明のＰＤＥ３タンパク質またはペプチドあるいは抗ＰＤＥ３抗体を固体表面に付着（「固定化」）してもよい。好ましい実施形態では、固定化は、磁気、ガラスもしくはプラスチックのビーズ、プラスチック製マイクロタイター・プレートまたはガラス・スライドなどの固体表面への付着によって起こり得る。
【００８９】
タンパク質またはペプチドの固定化は、固定化されたタンパク質またはペプチドとアンカーとの間の非共有相互作用または共有相互作用のいずれかを要する様々な方法によって実施可能である。例示的な実施形態では、固体表面をアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、アルコール基または他の基など架橋結合可能な基でコーティングし、架橋結合試薬を使用してタンパク質またはペプチドを付着させることによって実施可能である。
【００９０】
同一の官能基を２つ有するホモ二官能性試薬は、架橋結合を誘導する効率が高い。ヘテロ二官能性試薬は２つの異なる官能基を有する。２つの異なる官能基の示差的な反応性を利用することにより、架橋結合を選択的にも経時的にも制御し得る。二官能性架橋結合試薬は、その官能基、たとえばアミノ基、スルフヒドリル基、グアニジノ基、またはカルボキシルなどの特定基の特異性に応じて分類可能である。これらのうち、遊離アミノ基を対象とした試薬が、市販されていること、合成が容易なこと、およびそれを適用可能な反応条件が穏やかであることにより、特に人気が高い。分子を架橋結合させる方法は、（特許文献１５および１６）に開示されている。アミノシランを使用することによってアミン残基を表面上に導入してもよい。架橋結合試薬には、ビスイミデート類、ジニトロベンゼン、スベリン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、酒石酸ジスクシンイミジル、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、４−（ブロモアミノエチル）−２−ニトロフェニルアジド、４−アジドギロキサル、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。本発明は、使用し得る架橋結合試薬について限定しない。
【００９１】
（核酸）
別の実施形態では、本発明は、ＰＤＥ３をコードしている遺伝子も提供する。以下に述べるように、「ＰＤＥ３遺伝子」は、様々な異なる塩基を含有していても、それでも機能上、一部の場合では構造上、本明細書中に開示する遺伝子と見分けのつかない対応するポリペプチドを生産しうる。本発明の他の実施形態は、ＰＤＥ３Ａアイソフォーム・タンパク質をコードしている１つまたは複数のＲＮＡ種に結合してその転写および／または翻訳を阻害し得る核酸（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム）に関していてもよい。アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡをコードしているｃＤＮＡの設計および生産は当分野で周知であり、このような周知の方法の任意のものを使用して本発明を実施し得る（たとえば、特許文献１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）。特定の実施形態では、たとえば一方のＰＤＥ３ＡアイソフォームｍＲＮＡ中に存在するが他方には存在しない標的配列を選択することによって、アンチセンスＲＮＡを特定のＰＤＥ３Ａアイソフォームを標的とし得る。用語「核酸」とは、任意のタイプの１本鎖、２本鎖、３本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよび／またはＲＮＡの類似体や化学修飾型が包含される。
【００９２】
核酸に言及する場合はすべて、その核酸を含む宿主細胞、および一部の場合ではその核酸の産物を発現する能力を有する宿主細胞を包含していると解釈すべきである。本発明の核酸を発現している細胞により、ＰＤＥ３アイソフォームの触媒活性、調節特性あるいは細胞内局在化を誘導、抑制、阻害、増強、妨害、遮断、抑止、刺激、または亢進する薬剤をスクリーニングするために有用であることが証明されるかもしれない。
【００９３】
（ＰＤＥ３をコードしている核酸）
核酸は、触媒活性を示すＰＤＥ３アイソフォームの遺伝子全体、ｃＤＮＡ、もしくは１つのドメイン、または本明細書中で述べる配列の任意の他の断片を含有していてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ由来、すなわち特定の生物のゲノムから直接クローニングされていてもよい。しかし、好ましい実施形態では、核酸は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むであろう。
【００９４】
本発明のＤＮＡセグメントには、生物学上機能的な等価のＰＤＥ３タンパク質およびペプチドをコードしているものが含まれる。このような配列は、核酸配列内およびそこにコードされるタンパク質内に自然に存在することが知られているコドンの冗長性ならびにアミノ酸の機能的等価性の結果として生じうる。あるいは、機能的に等価であるタンパク質またはペプチドは、交換しようとするアミノ酸の特性の検討に基づいて、タンパク質構造を改変操作可能な組換えＤＮＡ技術の応用によって作製してもよい。人為的に設計された変化を、部位特異的変異誘発技法を適用することによって導入しても、または後述のように無作為に導入して後に所望の機能をスクリーニングしてもよい。
【００９５】
（ＰＤＥ３ＡアイソフォームのｍＲＮＡレベルのアッセイ）
本発明の一部の実施形態は、様々な細胞、組織、器官または他の試料中の３つのＰＤＥ３ＡアイソフォームをコードしているｍＲＮＡ種のレベルを決定する方法に関する。ｍＲＮＡレベル用の様々なアッセイが当分野で周知であり、このような周知のアッセイのうち任意のものを使用してよい。３つのＰＤＥ３ＡアイソフォームのｍＲＮＡは、配列ではなく長さが異なっている。したがって、ｍＲＮＡレベル用のアッセイはすべて、ｍＲＮＡをサイズに応じて分離するか、または減算方法によって実施されるかのいずれかでなければならない。当分野の技術者は、ＲＮＡ分子種が内在性および／または外来性のＲＮＡ分解酵素による分解に特に感受性が高く、ＲＮＡレベルが決定可能な前にＲＮＡ分解酵素を阻害または不活性化するべく細心の注意を払わなければならないことを認識しているであろう。典型的な手順には、溶液をジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理すること、オートクレーブすること、ならびに市販のＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることが含まれる。
【００９６】
ノーザン・ブロットは、サイズが異なるｍＲＮＡ種をアッセイするための周知の方法である。周知の技法により、試料から全細胞ＲＮＡまたはポリアデニル化されたｍＲＮＡのいずれかを精製し得る（たとえば、非特許文献７９）。ゲル電気泳動を用いて、精製したＲＮＡをサイズに応じて分離する。ナイロン、ニトロセルロースまたは他の膜に移した後、１つまたは複数の標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドを用いて、サイズに応じて分離されたＲＮＡを探索する。オリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズするＲＮＡ種の存在は、オートラジオグラフィー、フルオログラフィーまたは周知の他の技法によって検出される。ＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡを検出するためにノーザン・ブロットを使用するさらなる例は、以下の実施例のセクションに開示されている。ほとんどの細胞種内で、特定のＰＤＥ３ＡアイソフォームのｍＲＮＡは存在するか存在しないかのどちらかであるように思われる。したがって、これは一般的に、ＰＤＥ３ＡアイソフォームのｍＲＮＡが存在することまたは存在しないことを検出するのに十分であろう。しかし、試料中に存在する各アイソフォームのｍＲＮＡの量は、オートラジオグラフィーまたはフルオログラフィーを使用してフィルム（たとえば、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ（登録商標）、イーストマン・コダック［米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在］）に暴露させ、現像したフィルム上のバンド強度を走査するなど、標準の技法によっても決定し得る。
【００９７】
ｍＲＮＡ種を検出および／または定量する他の周知の方法を使用してもよい。たとえば、以下に開示するように目的の標的核酸を増幅してもよい。増幅産物を、膜、９６ウェル・プレート、核酸チップまたは他の基材に付着させて検出し得る。ＰＤＥ３Ａアイソフォームの配列が同じであるので、各ｍＲＮＡ種の量の決定には３つの個別のプローブが必要となる。１つのプローブは、ＰＤＥ３Ａ３のｍＲＮＡ配列に相補的であるように設計され、ＰＤＥ３Ａ１、ＰＤＥ３Ａ２およびＰＤＥ３Ａ３を検出する。第２のプローブは、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ配列（配列番号１５参照）の５’部分、たとえばエキソン１の３’末端またはエキソン２もしくはエキソン３に相補的であるように設計される。このプローブは、ＰＤＥ３Ａ１およびＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。第３のプローブは、エキソン１の５’末端に相補的であるように設計される。このプローブは、ＰＤＥ３Ａ１をコードしているｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）のみとハイブリダイズする。３つの異なるプローブを使用してＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡのレベルをアッセイすることにより、減算によって各アイソフォームのｍＲＮＡ種の量を決定することが可能となる。
【００９８】
実施例のセクションでさらに詳細に記述するように、ＰＤＥ３Ａアイソフォームは少なくとも２つ、おそらく３つの異なるｍＲＮＡによってコードされている。ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡは１３６ｋＤａのタンパク質アイソフォームに翻訳されるが、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡは翻訳されると９４ｋＤＡおよび１１８ｋＤＡのタンパク質アイソフォームのどちらをも生じ得る。あるいは、様々なサイズのタンパク質アイソフォームのそれぞれが個別のｍＲＮＡ種によってコードされているかもしれない。
【００９９】
Ｎａｎｏｃｈｉｐ（登録商標）Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ナノゲン社（Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（商標）（アフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州サンタ・クララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）所在］）など、ｍＲＮＡ発現レベルのアッセイ用の装置およびキットが市販されている。
【０１００】
（ハイスループット・スクリーニング）
本発明の特定の実施形態では、ｍＲＮＡを対象としたハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）法を使用して特定のＰＤＥ３アイソフォームの発現に影響を与える阻害剤および／または活性化剤をアッセイして探し得る。このような方法は当分野で周知であり、一部の実施形態では、市販品の製造供給元から得たキットおよび／または装置（たとえば、Ｘｐｒｅｓｓ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）  ｍＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）［米国カリフォルニア州フォスター・シティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）所在］）を使用して実施し得る。ハイスループット・スクリーニングの目的は、たとえば小分子ライブラリ、ファージ・ディスプレイ・ライブラリ、天然の植物または動物抽出物、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリなどの形態の数千個もの化合物を、標的タンパク質、細胞、組織、器官または生物に対する医薬として有意な効果について調査することである。有効な化合物を、有効性、安全性、効果の持続性などをもたらすために、化学的置換および／または化学修飾によってさらに改変してもよい。
【０１０１】
ＨＴＳアッセイは、周知の技術を使用して、ＰＤＥ３Ａ−１３６、ＰＤＥ３Ａ−１１８、ＰＤＥ３Ａ−９４またはＰＤＥ３Ｂ−１３７など、１つまたは複数の目的タンパク質またはペプチドを対象にしていてもよい。好ましくは、潜在的な阻害剤および／または活性化剤のライブラリをＰＤＥ３タンパク質および／またはペプチドに暴露させ、酵素触媒活性および／または調節特性をアッセイする。このようなアッセイを、たとえば酵素活性について周知の比色アッセイ、発光アッセイおよび／または放射活性アッセイなどを使用して９６ウェル・マイクロタイター・プレートで実施してもよい。他の代替実施形態では、試験ペプチドおよび／またはタンパク質を、タンパク質チップ、マイクロタイター・ウェル、膜または当分野で周知の他の表面などの表面上に付着させ、化合物のライブラリを様々なＰＤＥ３アイソフォームに結合する能力についてスクリーニングしてもよい。
【０１０２】
タンパク質に基づいたＨＴＳアッセイは、困難で時間がかかる可能性がある。ＨＴＳ分析を実施する代替方法は、ｍＲＮＡレベルに対する試験化合物の効果について細胞、組織、器官または生物などの標的をスクリーニングする方法である。ＰＤＥ３アイソフォームに関しては、このようなアッセイはＰＤＥ３Ａ１またはＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡレベルに直接的または間接的に影響を与える化合物を同定することを対象とする可能性を有している。目的の細胞または組織、たとえば拡張型心筋症の個体由来の組織試料やＰＤＥ３Ａをコードしている遺伝子をトランスフェクションしたＳｆｏ細胞を、９６または３８４ウェルのマイクロプレート中で一連の試験化合物に暴露してもよい。インキュベーションおよび細胞溶解の後、目的ｍＲＮＡに特異的なビオチン化したプローブを使用して全細胞ＲＮＡまたは精製したポリアデニル化ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。このＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、ビオチン化プローブに結合するストレプトアビジンでコーティングしたプレートに移してもよい。ＲＮＡ−ＤＮＡに特異的に結合する、アルカリ・ホスファターゼとコンジュゲートした抗体など標識した抗体を該プレートでインキュベートし、洗浄によって結合していない抗体を除去し、たとえば化学発光基質（Ｘｐｒｅｓｓ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して標識した抗体を現像することによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの存在を検出する。この方法により、ＰＤＥ３アイソフォームの発現に対する効果について数百個もの試験化合物を同時にスクリーニングし得る。
【０１０３】
代替実施形態では、ＰＤＥ３Ａアイソフォーム・タンパク質の２次的効果を探すことによって試験化合物をスクリーニングしてもよい。ＰＤＥ３活性および／または発現の阻害または活性化を間接的に決定し得る。ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの細胞中のレベルに影響を与えることにより、ＰＤＥ３アイソフォームは環状ヌクレオチドに調節される既知遺伝子の発現に影響を与えるかもしれない。試験化合物に暴露させた細胞または組織を、上述のように、環状ヌクレオチドのレベルに依存することが知られている遺伝子にコードされているｍＲＮＡについてスクリーニングしてもよい。ＰＤＥ３アイソフォームの阻害剤および／または活性化剤の効果は、正常状態の細胞、疾病状態の細胞および／または形質転換させた細胞をｃＡＭＰまたはｃＧＭＰに調節される遺伝子の発現レベルの変化についてスクリーニングすることによってモニターし得る。
【０１０４】
（核酸の増幅）
増幅の鋳型として有用な核酸を、標準的な方法に従って、生体試料中に含まれる細胞から単離し得る（非特許文献７９）。この核酸は、ゲノムＤＮＡであっても、分画化したＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡを使用する場合は、ＲＮＡを相補的なｃＤＮＡに変換することが望ましいかもしれない。１実施形態では、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、増幅の鋳型として直接使用される。他の実施形態では、ＲＮＡはポリアデニル化されたｍＲＮＡであってもよい。たとえばオリゴｄＴカラムへのアフィニティー・クロマトグラフィーによるｍＲＮＡの精製は、当分野で周知である。
【０１０５】
選択的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、特異的なマーカーに相当する核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー対を単離した核酸と接触させる。ハイブリダイズした後は、核酸：プライマー複合体を、鋳型依存性の核酸合成を促進する１つまたは複数の酵素と接触させる。十分な量の増幅産物が生成されるまで、「サイクル」とも呼ばれる複数回の増幅を行う。
【０１０６】
次に、増幅産物を検出する。特定の応用例では、視覚的な手段によって検出を実施してもよい。あるいは、検出は、化学発光、取り込まれた放射標識や蛍光標識の放射性シンチグラフィー、またはさらには電気もしくは熱のインパルス・シグナルを使用したシステムによる生成物の間接的な同定を含み得る（非特許文献８０）。
【０１０７】
検出に次いで、ある患者で見られた結果を、統計的に有意な健常な患者の参照群および疾病状態にある患者と比較してもよい。この方法によって、様々な臨床状態で検出されるマーカーの量の相互関係を示すことが可能である。
【０１０８】
（プライマー）
本明細書中で定義するプライマーという用語は、鋳型依存性のプロセスにおいて新生核酸の合成を開始させる能力を有する任意の核酸を包含することを意味する。典型的にはプライマーは１０〜２０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用してもよい。プライマーは２本鎖または１本鎖の形で提供し得るが、１本鎖の形が好ましい。
【０１０９】
（鋳型依存性の増幅方法）
ある鋳型試料中に存在するマーカー配列を増幅するためには、いくつかの鋳型依存性の方法が利用可能である。最もよく知られている増幅方法の１つは、それぞれその全体を本願明細書に援用する（特許文献２４、２５、２６、非特許文献８１）に詳述されている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）である。
【０１１０】
増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために、逆転写酵素ＰＣＲ増幅の手法を行ってもよい。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、（非特許文献７９）に記載されている。逆転写の代替方法では耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、（特許文献２７）に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応の方法は当分野で周知である。
【０１１１】
増幅の別の方法は、その全体を本願明細書に援用する（特許文献２８）に開示されている、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、２対の相補的なプローブを用意するが、各対は標的配列の存在下で隣接するように標的の相対する相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、２対のプローブは連結されて単一のユニットを形成する。ＰＣＲの場合のような温度サイクリングによって、結合し連結されたユニットが標的から解離し、次に過剰量のプローブ対のライゲーションの「標的配列」として役割を果たす。（特許文献２９）は、プローブ対を標的配列に結合する、ＬＣＲに類似の方法を記載している。
【０１１２】
（特許文献３０）に記載のＱｂｅｔａレプリカーゼも、本発明におけるさらに別の増幅方法として使用し得る。この方法では、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、標的と相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列を試料に加える。ポリメラーゼが複製配列を複写し、その後それを検出してもよい。
【０１１３】
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖にヌクレオチド５’−［α−チオ］−三リン酸を含む標的分子の増幅を行う等温増幅方法も、本発明の核酸の増幅に有用であるかもしれない。全体を本願明細書に援用する非特許文献８２を参照のこと。
【０１１４】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数回の鎖置換および合成、すなわちニック・トランスレーションを要する、核酸の等温増幅を実施する別の方法である。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる類似の方法は、増幅の標的とされた領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングさせ、次いで４種の塩基のうち２種しか存在させないで修復反応を行わせることを含む。容易に検出するために、他の２種の塩基をビオチン化誘導体として加えてもよい。同様の手法がＳＤＡで用いられる。標的に特異的な配列を、サイクル式プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出してもよい。ＣＰＲでは、非特異的なＤＮＡの３’および５’配列ならびに特異的なＲＮＡの中間配列を有するプローブを、試料中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、反応物をＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、プローブ産物を消化後に放出された独特の生成物として同定する。最初の鋳型を別のサイクリング・プローブにアニーリングさせ、反応を繰り返す。
【０１１５】
それぞれその全体を本願明細書に援用する（特許文献３１および３２）に記載のさらに他の増幅方法も、本発明に従って使用可能である。前者の適用では、「修飾された」プライマーをＰＣＲ様の鋳型および酵素依存性の合成に使用する。該プライマーは、捕捉部分（ｍｏｉｅｔｙ）（たとえばビオチン）および／または検出部分（たとえば酵素）で標識することによって修飾する。後者の適用では、過剰の標識したプローブを試料に加える。標的配列の存在下で、プローブは結合して触媒的に切断される。切断後、標的配列は損なわれずに放出されて過剰のプローブと結合する。標識したプローブの切断により、標的配列の存在が示される。
【０１１６】
他の核酸増幅手法には、核酸配列に基づいた増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）や３ＳＲを含めた転写に基づいた増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＴＡＳ）が含まれる。それぞれその全体を本願明細書に援用する非特許文献８３、特許文献３３を参照のこと。ＮＡＳＢＡでは、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液での処理ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを単離するためのミニスピン・カラムまたはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出によって、核酸を増幅用に調製してもよい。これらの増幅技法は、標的特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせることを含む。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、２本鎖ＤＮＡ分子を再度熱変性させる。どちらの場合も、第２の標的特異的プライマーを加え、その後重合させることによって、１本鎖ＤＮＡが再び完全に２本鎖となる。その後、Ｔ７やＳＰ６などのポリメラーゼによって、２本鎖ＤＮＡ分子を転写して増やした。等温サイクル式反応では、ＲＮＡが２本鎖ＤＮＡに逆転写され、Ｔ７やＳＰ６などのポリメラーゼによって再び転写される。生じた生成物は、切断されていようが完全であろうが、標的特異的な配列を示す。
【０１１７】
全体を本願明細書に援用する（特許文献３４）は、本発明に従って使用し得る、１本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル式で合成することを含む核酸増幅方法を開示している。ｓｓＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される第１プライマーのオリゴヌクレオチドの第１鋳型である。その後、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ２重鎖から、リボヌクレアーゼＨ（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかと２重鎖を形成しているＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅであるＲＮａｓｅ  Ｈ）の作用によってＲＮＡを除去する。生じたｓｓＤＮＡは第２プライマーの第２鋳型であり、このプライマーも、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の配列を、鋳型と相同な位置の５’側に含む。その後、このプライマーをＤＮＡポリメラーゼ（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」断片）によって伸長させると、プライマー間に最初のＲＮＡと同一の配列を有し、さらに一方の末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子が生じる。このプロモーター配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡのＲＮＡコピーを多数作成するのに使用され得る。その後、これらのコピーをサイクルに再導入してもよく、これにより非常に迅速な増幅がもたらされる。適切な酵素を選択することにより、各サイクルで酵素を加えることなく、等温でこの増幅を行い得る。このプロセスは周期的な性質を有するので、開始配列はＤＮＡまたはＲＮＡのどちらの形態であるように選択されてもよい。
【０１１８】
（その全体を本願明細書に援用する特許文献３５）は、プロモーター／プライマー配列の標的１本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションと、続く該配列の多数のＲＮＡコピーの転写とに基づいた核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームはサイクル式ではない、すなわち、新しい鋳型は生じたＲＮＡ転写物から生成されない。他の増幅方法には「ｒａｃｅ」および「片側ＰＣＲ（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲ）」が含まれる。それぞれ全体を本願明細書に援用する非特許文献８４および８５を参照のこと。
【０１１９】
２つ（以上）のオリゴヌクレオチドを、生じる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下でライゲーションさせ、これによりジオリゴヌクレオチドを増幅することに基づいた方法も、本発明の増幅工程で使用可能である。その全体を本願明細書に援用する非特許文献８６を参照のこと。
【０１２０】
（分離方法）
増幅の後、特異的な増幅が起こったかどうかを決定するために、増幅産物を鋳型および過剰のプライマーから分離することが望ましいかもしれない。１実施形態では、増幅産物をアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドのゲル電気泳動によって、標準的な方法を使用して分離する。（非特許文献７９参照。）
あるいは、分離を行うためにクロマトグラフィー技法を使用してもよい。本発明で使用し得る多種類のクロマトグラフィーが存在する。これらは、吸着、分配、イオン交換および分子篩クロマトグラフィーであり、これらを使用するための、カラム、ペーパー、薄層およびガス・クロマトグラフィーを含めた、専門技法が多数ある（非特許文献８７）。
【０１２１】
（同定方法）
マーカー配列の増幅を確認するためには、増幅産物を可視化しなければならない。１つの典型的な可視化方法は、ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光の下で可視化することを含む。あるいは、増幅産物が放射標識したまたは蛍光測定用に標識したヌクレオチドで一体的に標識されている場合は、分離の後に増幅産物をＸ線フィルムに暴露するまたは適切な刺激波長の下で可視化してもよい。
【０１２２】
１実施形態では、可視化を間接的に行う。増幅産物を分離した後、標識した核酸プローブを増幅したマーカー配列と接触させる。プローブは、好ましくは発色団にコンジュゲートされているが、放射標識されていてもよい。別の実施形態では、プローブは抗体やビオチンなどの結合パートナーにコンジュゲートされており、この場合、結合対のうちプローブでないメンバーが検出可能な部分を有する。
【０１２３】
１実施形態では、サザン・ブロットおよび標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出する。サザン・ブロットで必要な技法は当分野の技術者には周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的書籍に記載がある。（非特許文献７９参照。）手短に述べると、ゲル電気泳動によって増幅産物を分離する。その後、ゲルをニトロセルロースなどの膜と接触させ、核酸を移行させて非共有結合を行わせる。次いで、標的増幅産物とハイブリダイズする能力を有する、発色団とコンジュゲートさせたプローブと共に膜をインキュベートする。膜をＸ線フィルムまたはイオン放射検出装置に暴露させることによって検出する。
【０１２４】
前述の１例は、核酸の電気泳動を行ってそれを移す自動化された装置および方法を開示している、本願明細書に援用する（特許文献３６）に記載されている。この装置により、ゲルを外部から操作せずに電気泳動およびブロットを行うことが可能になり、本発明の方法を実施するのに理想的に適している。
【０１２５】
（アンチセンス構築体、リボザイムおよび小さな干渉ＲＮＡ）
（アンチセンス）
用語「アンチセンス」とは、標的とした遺伝子またはｍＲＮＡ種の一部分に相補的なポリヌクレオチド分子を言う。相補的なポリヌクレオチドとは、標準的なワトソン−クリックの相補性法則に従った塩基対合が可能なポリヌクレオチドである。つまり、プリンがピリミジンと塩基対合して、シトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）、およびＤＮＡの場合はチミンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）またはＲＮＡの場合はウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）の組合せを形成する。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンその他のより稀な塩基がハイブリダイズする配列中に含まれても、対合は妨げられない。
【０１２６】
アンチセンス・ポリヌクレオチドは、標的細胞内に導入されると、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合して転写、ＲＮＡプロセッシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨げる。アンチセンスＲＮＡ構築体、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードしているＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはヒトを含めた宿主動物内などｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで、宿主細胞内で遺伝子転写もしくは翻訳またはそのいずれも阻害するために使用してもよい。
【０１２７】
１価陽イオンの細胞内濃度は約１６０ｍＭである（１０ｍＭのＮａ＋；１５０ｍＭのＫ＋）。２価陽イオンの細胞内濃度は約２０ｍＭである（１８ｍＭのＭｇ＋；２ｍＭのＣａ＋＋）。ハイブリダイゼーションの容積を減少させ、したがって核酸分子種の有効濃度を上昇させるのに寄与する細胞内タンパク質濃度は１５０ｍｇ／ｍｌである。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ条件を模倣する条件下で、構築体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的ハイブリダイゼーションについて試験してもよい。
【０１２８】
アンチセンス構築体を、遺伝子のプロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロン、またはエキソン−イントロン境界にさえも結合するように設計してもよい。特定の実施形態では、有効なアンチセンス構築体がｍＲＮＡ開始部位に相補的な領域を含みうることが企図される。好ましい実施形態では、１つのＰＤＥ３Ａアイソフォーム中に存在するが別のアイソフォーム中には存在しないｈｎＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡの配列をアンチセンス構築体の標的にする。たとえば、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）には存在しない、ＰＤＥ３Ａ１をコードしているｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）の５’末端を標的にしてもよい。当分野の技術者は、標的タンパク質のレベルに影響が与えられたかどうかを決定するためにこのような構築体を容易に試験することが可能である。
【０１２９】
本明細書中で使用する用語「相補体」または「アンチセンス」とは、その全長にわたって標的配列と実施的に相補的であり、塩基のミスマッチがほとんどないポリヌクレオチドを意味する。たとえば、１５塩基長の配列は、１５個のうち１３または１４個の相補ヌクレオチドを有する場合に相補的であると言われる。当然、「完全に相補的」である配列とは、その全長にわたって完全に相補的であり塩基ミスマッチをまったく有さない配列である。
【０１３０】
より低度の相同性を有する配列も企図される。たとえば、相同性の高いある程度の領域を有するが、非相同領域も含むアンチセンス構築体（たとえばリボザイム）を設計可能である。これらの分子は、５０％未満の相同性しか有さないが、適切な条件下で標的配列と結合する。
【０１３１】
アンチセンス配列は完全長のｃＤＮＡコピーまたはその大きな断片であり得るが、これらはより短い断片、すなわち本明細書中では５０塩基未満のポリヌクレオチドと定義される「オリゴヌクレオチド」でもあり得る。短いオリゴマー（８〜２０）ほど作製しやすくｉｎ  ｖｉｖｏでの接近性が増大するが、塩基対合の特異性の決定には数多くの他の要素が関与している。たとえば、あるオリゴヌクレオチドの、その相補的な標的に対する結合親和性および配列特異性のどちらもが、長さが増すにつれて増大する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または１００塩基対のオリゴヌクレオチドを使用することが考えられる。遺伝子配列のすべてまたは一部をアンチセンス構築体との関連で使用してもよいが、統計的に、任意の１４塩基長の配列はヒトゲノム中で１度しか現れないはずであり、したがって、固有の標的配列を特定するのに十分であろう。
【０１３２】
特定の実施形態では、他の要素、たとえばＣ−５プロピン・ピリミジンを含むアンチセンス構築体を使用することが望まれるかもしれない。ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン類似体を含有するオリゴヌクレオチドが高い親和性でＲＮＡと結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている（非特許文献８８）。
【０１３３】
あるいは、本発明によるアンチセンスのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドをＲＮＡとして提供してもよく、これは前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをコードしている核酸を保有している発現構築体からの転写によって提供される。この出願全体にわたって、用語「発現構築体」とは、ある産物をコードする核酸を含有し、その核酸配列の一部またはすべてが転写され得る任意のタイプの遺伝子構築体を含むことを意味する。典型的な発現ベクターには、ｐＵＣやＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド・シリーズの任意のものなど細菌プラスミドまたはファージ、あるいは、以下にさらに述べるように、真核細胞中での使用に順応させたウイルス・ベクターが含まれる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、核酸はプロモーターの転写制御下にアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをコードしている。「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼに認識されて遺伝子の特異的な転写を開始させるＤＮＡ配列を言う。「転写制御下」とは、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼの開始を制御するように核酸との関係が正しい位置および向きにあることを意味する。
【０１３５】
プロモーターという用語は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りに集まっている転写制御モジュールの群を言う。プロモーターは、それぞれが約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなる個別の機能的モジュールから構成されており、転写アクチベータまたはリプレッサー・タンパク質の認識部位を１つまたは複数含む。各プロモーター内の少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のために開始部位を位置づけるべく機能している。これの最も知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどＴＡＴＡボックスを欠いている一部のプロモーターでは、開始部位自体の上に重なっている個別の要素が開始の位置を固定するのに役立っている。
【０１３６】
さらなるプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、最近いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能的要素を含んでいることが示された。プロモーター要素間の間隔は、要素が相対的に反転または移動した場合にもプロモーター機能が保存されるように、多くの場合柔軟性がある。ｔｋプロモーターでは、活性が下がり始めるまでにプロモーター要素間の間隔を５０ｂｐまで増すことが可能である。プロモーター次第では、個々の要素が協調的または独立のどちらかの状態で機能して転写を活性化させ得る。
【０１３７】
阻害性のポリヌクレオチドをコードしている核酸の発現を制御するのに使用される具体的なプロモーターは、標的細胞内でペプチドを発現させる能力がありさえすれば重要だと考えられていない。したがって、ヒト細胞を標的にする場合は、阻害性のペプチドをコードしている核酸を、ヒト細胞中で活性のあるプロモーターに隣接する位置に置き、その制御下におくことが好ましい。一般的に言えば、このようなプロモーターにはヒトまたはウイルスのプロモーターのいずれかが含まれ得る。
【０１３８】
様々な実施形態で、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス末端反復配列を使用して高いレベルの転写を得ることが可能である。転写および／または翻訳のレベルが定められた目的に十分であることを条件として、当分野で周知の他のウイルスまたは哺乳動物の細胞性プロモーターまたは細菌性ファージ・プロモーターもまた企図されている。
【０１３９】
特定の生理シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、アンチセンス配列の誘発性発現を可能にし得る。たとえば、ヒトＰＡＩ−１プロモーターの制御下にある核酸は、腫瘍壊死因子誘発性の発現となる。さらに、本発明による核酸の発現を駆動するために任意のプロモーター／エンハンサーの組合せも使用可能である。表１および２に、機能し得るように共役させた遺伝子の転写および／または翻訳を調節するために使用可能な要素／プロモーターをリストとして記載する。このリストは単なる例示的なものであり、任意の周知のプロモーターおよび／または調節要素を使用し得る。
【０１４０】
【表１】
2004536614.tif 000002
【０１４１】
【表２】
2004536614.tif 000003
（リボザイム）
特定のＰＤＥ３Ａアイソフォームの発現を阻害する別の方法は、リボザイムによるものである。リボザイムとは、部位特異的な様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する（非特許文献８９）。たとえば、多数のリボザイムが高度に特異的にリン酸エステル転移反応を加速させ、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質内のいつくかのリン酸エステルのうち１つのみを切断する（非特許文献９０）。この特異性は、化学反応に先立って基質が特異的な塩基対の相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（「ＩＧＳ」）に結合するという要件に起因すると考えられている。
【０１４２】
リボザイム触媒は最初、核酸に関与する配列特異的な切断／ライゲーションの一部として観察されていた（非特許文献９１、９０）。たとえば、（特許文献３７）は、ある種のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼより高い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。したがって、配列特異的なリボザイムに媒介される遺伝子発現阻害は、治療用途に特に適しているかもしれない（非特許文献９２、９３、９４）。リボザイムが、それを適用した細胞株の一部で遺伝子変化を誘発させたことが報告された。変化した遺伝子には発癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶ遺伝子が含まれていた。
【０１４３】
いくつかの異なるリボザイム・モチーフがＲＮＡ切断活性について記載されている（非特許文献９５）。同等に機能すると予測される例には、タバコ輪点ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｒｉｎｇｓｐｏｔ  Ｖｉｒｕｓ）（非特許文献９６）、アボカド・サンブロッチ・ウイロイド（Ａｖｏｃａｄｏ  Ｓｕｎｂｌｏｔｃｈ  Ｖｉｒｏｉｄ）（非特許文献９７、９８）、およびルーサン・トランジエント・ストリーク・ウイルス（Ｌｕｃｅｒｎｅ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｓｔｒｅａｋ  Ｖｉｒｕｓ）（非特許文献９９）を含めたグループＩ自己スプライシング・イントロン由来の配列が含まれる。これらおよび関連するウイルス由来の配列は、ハンマーヘッド・リボザイムと呼ばれる。他の適切なリボザイムには、ＲＮａｓｅ  Ｐ（非特許文献１００、１０１、特許文献３８および３９）、ヘアピン・リボザイム構造（非特許文献１０２、１０３）およびデルタ肝炎ウイルスに基づいたリボザイム（特許文献４０）由来の配列が含まれる。リボザイム依存的なＲＮＡ切断活性の全般的な設計および最適化については詳述されている（非特許文献１０４、９５、１０５）。
【０１４４】
リボザイムの設計における他の変数は、所定の標的ＲＮＡ上の切断部位の選択である。相補的な塩基対の相互作用により部位にアニーリングすることによってリボザイムの標的を所定の配列とする。この標的化には２つの相同ストレッチが必要である。これら相同配列のストレッチは、上に定義した触媒的なリボザイム構造に隣接する。相同配列の各ストレッチは、長さが７〜１５個のヌクレオチドまで変動し得る。相同配列を定義する唯一の要件は、標的ＲＮＡ上で、切断部位である特異的配列によってこれらが分離されることである。ハンマーヘッド・リボザイムでは、この切断部位は標的ＲＮＡ上のジヌクレオチド配列、すなわちウラシル（Ｕ）の次にアデニン、シトシンまたはウラシル（Ａ、ＣまたはＵ）のいずれかが続いたものである（非特許文献１０６）。
【０１４５】
中程度の大きさの遺伝子内の多数の切断部位候補と、触媒的ＲＮＡ切断活性が実証された配列の増加とがあいまって、遺伝子発現を下方調節する潜在性を有する多数のリボザイムが利用可能であることが示される。さらに、様々な遺伝子間での配列の差異により、個々の遺伝子または遺伝子産物を特異的に切断するようにリボザイムを設計することが可能である。標的ＲＮＡを効率的に切断するためのリボザイムの設計および試験は、当分野の技術者に周知の方法である。リボザイムを設計および試験する科学的方法の例は、本願明細書に援用する（非特許文献１０５）に記載されている。
【０１４６】
（小さい干渉ｍＲＮＡ）
別の可能性は、ＲＮＡ干渉によって個々のＰＤＥ３のｍＲＮＡの翻訳を阻害することである。この転写後の遺伝子サイレンシングには、目的ｍＲＮＡ内の特有のヌクレオチド配列と相同である２１または２２ヌクレオチドの２本鎖合成ＲＮＡ分子が使用される。まだ定義されていない機構によって、このような小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は同族タンパク質の発現を低減させる能力を有している。いくつかの細胞骨格タンパク質の発現を低減させるためにこの手法が使用されてきた。上述のように、ＰＤＥ３Ａ−１３６の発現に対する特異的な干渉を可能にし得るＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）内の特有配列が同定された。
【０１４７】
小さい干渉ＲＮＡ種（「ｓｉＲＮＡ」）を使用して遺伝子発現に選択的に干渉する方法は、当分野で周知である（たとえば、非特許文献１０７、１０８）。サイレンシングする遺伝子（たとえば、ＰＤＥ３Ａ）と配列が相同である約３０ｂｐ以下の短い２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を標的細胞内に導入する（非特許文献１０８）。よく理解されていない内因性経路によって、ｄｓＲＮＡが約２１〜２２ｂｐのより小さい断片（ｓｉＲＮＡ）に砕かれる。これら断片が相同ｍＲＮＡ配列、たとえばＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）の分解の引き金となる（非特許文献１０８）。ｓｉＲＮＡの使用により、標的遺伝子の発現の低減、またはさらには完全な排除が可能になる（非特許文献１０７）。ｓｉＲＮＡの別の利点は、これらがアンチセンス構築体より低い濃度（約１〜２５ｎＭ）で有効であることである（非特許文献１０７、１０８）。
【０１４８】
陽イオン性リポソームを使用して２１ｂｐのｄｓＲＮＡ配列をＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＨｅｌａ  Ｓ３細胞内にトランスフェクションさせることにより、相同レポーター遺伝子の阻害がもたらされた（非特許文献１０８）。高度に発現されている遺伝子はｓｉＲＮＡ構築体による阻害がより低く、阻害の有効性は標的遺伝子の発現レベルと逆相関しているように見える（非特許文献１０８）。高度に発現される哺乳動物遺伝子に比べてＰＤＥ３遺伝子は比較的低いレベルで発現されるので、ｓｉＲＮＡ阻害剤の使用は標的ＰＤＥ３アイソフォームの発現を阻害または排除するのに有効であることが証明されるであろう。
【０１４９】
（発現ベクター）
ＰＤＥ３アイソフォーム・タンパク質またはペプチドをコードしている核酸を発現ベクター内に組み込んで、コードされているタンパク質またはペプチドを生成させてもよい。当分野で周知の発現系の非限定的な例には、大腸菌など細菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）など酵母、バキュロウイルス、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞など哺乳動物の発現系が含まれる。完全な遺伝子を発現することが可能であり、あるいは代替例としてポリペプチドの一部分をコードしている遺伝子断片を生成可能である。
【０１５０】
ポリペプチドをコードしている遺伝子または遺伝子断片を、標準的なサブクローニング技術によって発現ベクター中に挿入することができる。組換えポリペプチドを融合タンパク質として生成し、該タンパク質の迅速なアフィニティー精製を可能にする大腸菌発現ベクターを使用してもよい。このような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ系（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在］）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ）所在］）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ［米国コネチカット州ニューヘーブン（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）所在］）、および６×Ｈｉｓ系（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）［米国カリフォルニア州チャッツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ）所在］）である。
【０１５１】
これらの系の一部は、ごく少数の付加アミノ酸を有する組換えポリペプチドを生成するが、これらの付加アミノ酸は組換えポリペプチドの抗原性能力に影響を与える可能性が低い。たとえば、ＦＬＡＧ系および６×Ｈｉｓ系のいずれもごく短い配列を付加するが、いずれの配列も抗原性に乏しく、ポリペプチドがその自然のコンホメーションにフォールディングすることに悪影響を与えないことで知られている。他の融合系は、融合パートナーが所望のポリペプチドから容易に切り出される融合体を生成するように設計されている。１実施形態では、あるプロテアーゼに特異的な認識配列を含有するペプチド配列によって、融合パートナーが組換えポリペプチドに連結されている。適切な配列の例は、タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）プロテアーゼ（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）［米国メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在］）またはＸａ因子（ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）［米国マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ）所在］）に認識される配列である。
【０１５２】
使用する発現系は、バキュロウイルス多角体プロモーターによって駆動されるものであってもよい。バキュロウイルス・ベクター内へのクローニングを容易にするために、ポリペプチドをコードしている遺伝子を標準的な技法によって操作してもよい。バキュロウイルス・ベクターの１つはｐＢｌｕｅＢａｃベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州ソレント（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）所在］）である。ポリペプチドの遺伝子を保有しているベクターを、標準プロトコルによってＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞内にトランスフェクションし、細胞を培養および処理して組換え抗原を生成する。（本願明細書に援用する特許文献４１参照。）
ポリペプチドのアミノ酸配列変異体も調製し得る。これは、たとえば集団内の自然な変異から生じるポリペプチドの軽微な配列変異または他の種に見出される相同体でもよい。これらはまた、天然には存在しないが、ポリペプチドの天然型と同様に機能するおよび／または交叉反応する免疫応答を誘発させるほど十分に類似している配列であってもよい。本明細書中に記載する方法などの部位特異的変異導入の標準的な方法によって配列変異体を調製してもよい。
【０１５３】
置換変異体は通常、タンパク質内に１つまたは複数の部位で代替アミノ酸を含み、タンパク質分解性の切断に対する安定性などポリペプチドの特性の１つまたは複数を変調するように設計され得る。置換は保存的であることが好ましい。すなわち、あるアミノ酸が類似のサイズおよび電荷のアミノ酸に置換される。保存的置換は当分野で周知であり、たとえば、アルギニンからリジンへ、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ、アスパラギン酸からグルタミン酸へ、システインからセリンへ、グルタミンからアスパラギンへ、グルタミン酸からアスパラギン酸へ、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ、イソロイシンからロイシンまたはバリンへ、ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ、リジンからアルギニンまたはグルタミンへ、メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ、フェニルアラニンからチロシンへ、セリンからスレオニンへ、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ、およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更が含まれる。
【０１５４】
このような変更を行うに際して、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮してもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性は一般に当分野で理解されている（非特許文献１０９）。アミノ酸の相対的なハイドロパシーの特徴が、生じるタンパク質の２次構造に寄与し、それが今度はそのタンパク質と他の分子との相互作用を定義づけることが認められている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている（非特許文献１０９）。これらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【０１５５】
特定のアミノ酸を類似のハイドロパシー指標またはスコアを有している他のアミノ酸で置換しても同様の生物活性を有するタンパク質が生じる、すなわち生物学的機能が等価なタンパク質が得られることは、当分野で周知である。このような変化を行うに際しては、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸がさらに特に好ましい。
【０１５６】
類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に行うことが可能なことも、当分野で理解されている（本願明細書に援用する特許文献４２）。以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている。すなわち、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。アミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換しても生物学的に等価で免疫学的に等価なタンパク質を得ることが可能なことが理解されている。このような変更では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸がさらに特に好ましい。
【０１５７】
挿入変異体には、ポリペプチドの迅速な精製を可能にするために使用するものなど融合タンパク質が含まれ、また、該ポリペプチドの相同体である他のタンパク質やポリペプチドに由来する配列を含有するハイブリッド・タンパク質も含み得る。たとえば、挿入変異体は、ある１つの種由来のポリペプチドのアミノ酸配列の一部分を、別の種由来の相同ポリペプチドの一部分と共に含んでいてもよい。他の挿入変異体には、ポリペプチドのコード配列内に追加のアミノ酸が導入されている挿入変異体がある。通常、これらは上述の融合タンパク質より小さな挿入物であり、たとえばプロテアーゼ切断部位を破壊するために導入する。
【０１５８】
原核または真核系内で発現させるためのＤＮＡセグメントの遺伝子操作は組換え発現分野の技術者に一般に知られている技法によって実施し得る。特許請求の範囲に記載の核酸配列を発現させる場合、事実上どのような発現系も使用し得ると考えられる。
【０１５９】
本明細書中で使用する用語「遺伝子操作した」細胞および「組換え」細胞とは、人の手によってｃＤＮＡまたは遺伝子などの外来ＤＮＡセグメントまたは遺伝子を導入した細胞を言うことを意図する。したがって、遺伝子操作した細胞は、組換えによって導入された外来ＤＮＡセグメントや遺伝子を含有しない自然に存在する細胞から識別可能である。組換え細胞には、導入されたｃＤＮＡやゲノム遺伝子を有する細胞、また自然状態ではその特定の導入遺伝子とは関連のない異種プロモーターに隣接して配置された遺伝子を含む細胞も含まれる。
【０１６０】
変異体であれ野生型であれ、組換えによりコードされているタンパク質またはペプチドを発現させるためには、本発明に従って、１つまたは複数のプロモーターの制御下にある、または機能し得るように該プロモーターに連結された、特許請求の範囲に記載の単離核酸のうち１つからなる発現ベクターを調製する。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を一般には選択されたプロモーターの約１〜約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち、３’側）に配置する。「上流」のプロモーターがＤＮＡの転写を刺激し、コードされている組換えタンパク質の発現を促進する。これが、この文脈における「組換え発現」の意味である。
【０１６１】
様々な宿主発現系でタンパク質またはペプチドの発現を成すために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築する、多くの標準的な技法が利用可能である。発現に利用可能な細胞の種類には、それだけには限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換させた大腸菌や枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など細菌が含まれる。
【０１６２】
組換えＤＮＡの構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）のプロモーター系が含まれる。これらが最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが発見されて利用されており、またそのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されているので、当分野の技術者はこれらを機能し得るようにプラスミド・ベクターにライゲーションすることが可能である。
【０１６３】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現には、たとえばプラスミドＹＲｐ７が一般的に使用される（非特許文献１１０、１１１、１１２）。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異株、たとえばＡＴＣＣ寄託番号４４０７６号またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を既に含有している。その結果、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１障害が存在することにより、トリプトファンを非存在下で増殖させることによって形質転換を検出するための有効な環境をもたらす。
【０１６４】
酵母ベクター内の適切な促進配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（非特許文献１１３）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース・リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど他の糖分解酵素のプロモーター（非特許文献１１４、１１５）が含まれる。適切な発現プラスミドを構築するにあたって、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供するために、発現ベクター内の発現させたい配列の３’側に、上記遺伝子に関連する終結配列もライゲーションする。
【０１６５】
増殖条件によって転写が制御されるという付加的利点を有する他の適切なプロモーターには、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を司っている酵素のプロモーター領域が含まれる。
【０１６６】
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として使用し得る。原理的には、このような細胞培養物の任意のものが、脊椎動物由来の培養物であろうと無脊椎動物由来の培養物であろうと利用可能である。哺乳動物細胞に加えて、これらには組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ならびに組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、あるいは１つまたは複数のコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系が含まれる。有用な昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞内で増殖する。単離された核酸コード配列をウイルスの非必須（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）領域（たとえば多角体遺伝子）中にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえば多角体プロモーター）の制御下におく。コード配列の挿入に成功すると、多角体遺伝子が不活性化され非閉塞組換えウイルス（すなわち、多角体遺伝子によってコードされているタンパク質の外被を欠いているウイルス）が生成される。その後、これらの組換えウイルスを使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞を感染させ、挿入遺伝子をその細胞内で発現させる（たとえば、特許文献４３）。
【０１６７】
有用な哺乳動物の宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮならびにＭＤＣＫ細胞株である。さらに、挿入配列の発現を変調する、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾かつプロセッシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質生成物のこのような修飾（たとえば糖修飾）およびプロセッシング（たとえば切断）は、コードされているタンパク質の機能にとって重要である可能性がある。様々な宿主細胞がタンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために適切な細胞株または宿主系を選択し得る。哺乳動物細胞で使用するための発現ベクターは通常、複製起点（必要に応じて）、発現する遺伝子の前に位置するプロモーターおよび任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、ならびに転写終結配列を含む。複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（たとえばポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＶＳＶ、ＢＰＶ）などが供給源であり得る外来性の起点を含むように構築されたベクターによって提供されてもよいし、あるいは宿主細胞の染色体複製機構によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体内に組み込まれる場合は、多くの場合後者で十分である。
【０１６８】
プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来（たとえばメタロチオネイン・プロモーター）または哺乳動物ウイルス由来（たとえばアデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニア・ウイルスの７．５Ｋプロモーター）であってもよい。さらに、所望の遺伝子配列に通常関連しているプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、望ましいかもしれない。ただし、このような制御配列は宿主細胞系に適合性があることが条件である。
【０１６９】
いくつかのウイルスに基づいた発現系が利用可能であり、たとえば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマウイルス、アデノウイルス２由来であり、最も頻繁にはシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。ウイルス複製起点内にＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位の方向に伸びた約２５０ｂｐの配列が含まれていることを条件として、より小さなまたは大きなＳＶ４０断片も使用し得る。
【０１７０】
発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合は、コード配列をアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三者構成（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションしてもよい。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノム内に挿入することが可能である。ウイルス・ゲノム内の非必須領域（たとえばＥ１またはＥ３領域）への挿入により、生存可能で感染した宿主内でタンパク質を発現しうる組換えウイルスが生じる。
【０１７１】
特許請求の範囲に記載の単離した核酸コード配列を効率よく翻訳するには、特異的な開始シグナルも必要であるかもしれない。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含めた外来性の翻訳制御シグナルを追加で提供する必要もあるかもしれない。当分野の技術者であれば、容易にこれを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠に対してイン・フレーム（またはイン・フェーズ（ｉｎ−ｐｈａｓｅ））でなければならないことは周知である。これら外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれでも様々な由来であってよい。適切な転写エンハンサー要素または転写終結因子を含めることによって発現効率を高めてもよい（非特許文献１１６）。
【０１７２】
真核細胞での発現では通常、適切なポリアデニル化部位（たとえば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）がクローニングした元のセグメントに含まれない場合は、転写ユニットにこれを組み込むことが望ましいかもしれない。通常、転写終結の手前の位置に、タンパク質の終結部位の約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」にポリＡ付加部位を配置する。
【０１７３】
組換えタンパク質の長期的な、高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。たとえば、タンパク質をコードする構築体を安定に発現する細胞株を遺伝子操作により作製し得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）と選択可能なマーカーとによって制御されるベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよい。外来ＤＮＡの導入に次いで、遺伝子操作した細胞を１〜２日間、富栄養培地中で増殖させ、その後選択培地に切り替えてもよい。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーにより選択に対する耐性が与えられ、細胞がその染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することが可能となる。その後この増殖巣をクローニングして細胞株に拡大させてもよい。
【０１７４】
それだけには限定されないが、単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子（非特許文献１１７）、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（非特許文献１１８）およびアデニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（非特許文献１１９）など（それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−の細胞内で使用）の選択系を使用し得る。また、メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（非特許文献１２０、１２１）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）耐性を与えるｇｐｔ（非特許文献１２２）、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ（非特許文献１２３）、およびハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ（非特許文献１２４）についての選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を使用してもよい。
【０１７５】
（部位特異的突然変異誘発）
部位特異的突然変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特異的突然変異誘発によって個別のペプチドあるいは生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドを調製することに有用な技法である。この技法はさらに、前述の考察を１つまたは複数考慮に入れてＤＮＡに１つまたは複数のヌクレオチド配列変化を導入することにより、配列変異体を調製かつ試験する即時能力をもたらす。部位特異的突然変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードしている特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、変異を誘発しようとしている接点のない部位の両側に安定な２重鎖を形成するのに十分なサイズおよび十分な配列複雑性を有するプライマー配列を提供することによる、変異体の生成を可能にする。通常は、変更しようとする配列の接合点の両側に約５〜１０残基を有する、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【０１７６】
一般に、部位特異的突然変異誘発の技法は当分野で周知である。この技法では通常、１本鎖および２本鎖のどちらの形態でも存在するバクテリオファージ・ベクターが使用されることは理解されよう。部位特異的突然変異誘発に有用なベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらファージ・ベクターは市販されており、その使用は当分野の技術者には一般的によく知られている。２本鎖プラスミドも部位特異的突然変異誘発に日常的に使用されており、これにより目的遺伝子をファージからプラスミドに移す工程が排除される。一般に、部位特異的突然変異誘発は、最初に１本鎖ベクターを得ること、または所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列をその配列内に含む２本鎖ベクターの２本の鎖を融解することによって行う。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチド・プライマーを合成により調製する。その後、このプライマーを１本鎖ＤＮＡ調製物とアニーリングさせ、変異を保有している鎖の合成を完了させるために大腸菌のポリメラーゼＩクレノウ断片などのＤＮＡ重合酵素処理を行う。このようにして、１本の鎖が元の変異していない配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を保有しているヘテロ２重鎖が形成される。その後、このヘテロ２重鎖を使用して大腸菌細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異した配列構成を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１７７】
（ファージ・ディスプレイ）
特定の実施形態では、潜在的なアイソフォームに選択的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤として使用するために、ファージ・ディスプレイ・ライブラリの形態の無作為なアミノ酸配列を使用することが望ましいかもしれない。このファージ・ディスプレイ法は、様々な目的のために使用されてきた（たとえば、それぞれを本願明細書に援用する非特許文献１２５、１２６、特許文献４４、４５、４６、４７参照）。
【０１７８】
一般に、ファージ・ディスプレイ・ライブラリはまず、数多くのアミノ酸の組合せをコードしている、部分的に無作為化されたｃＤＮＡ配列のライブラリを構築することによって作製される。ｃＤＮＡ配列を、たとえばｆｕｓｅ５ベクターなどファージのウイルス外被タンパク質内にイン・フレームで挿入する（特許文献４８）。ｃＤＮＡは無作為なアミノ酸配列として発現され、外被タンパク質に組み込まれる。したがって、無作為化されたペプチドがファージの外部表面に示され、タンパク質またはペプチドに結合し得る。ＰＤＥ３タンパク質またはペプチドに結合しているファージを、標準的な方法を使用して、たとえば膜やクロマトグラフィー・ビーズなどの固体の支持体に共有結合されているＰＤＥ３ペプチドに対するアフィニティー・クロマトグラフィーによって、結合していないファージから分離し得る。所望する場合は、結合したファージを回収し、適切な溶液に曝すことでＰＤＥ３ペプチドから脱離させ、結合および分離の工程をもう１順進めることも可能である。この反復工程により、ＰＤＥ３に対する特異性がより高いファージを選択することができる。
【０１７９】
適切な結合厳密性のファージを得た後は、ファージ・ゲノムのｃＤＮＡを含有している部分を、たとえばｃＤＮＡ挿入部位に隣接するＰＣＲプライマーを使用してシークエンシングすることによって、結合ペプチドのアミノ酸配列を決定することが可能である。結合が特異的であることを保証するために、ｃＤＮＡ挿入物を全く欠いているファージを対照として使用し得る。
【０１８０】
当分野の技術者には、所望のタンパク質またはペプチドに結合可能なペプチド（３〜１００アミノ酸残基長、より好ましくは５〜５０アミノ酸残基長、より好ましくは７〜２５アミノ酸残基長）を選択するためにファージ・ディスプレイを使用し得ることが分かるであろう。このようなペプチドは、たとえばＰＤＥ３触媒活性またはタンパク質−タンパク質結合の潜在的な阻害剤または活性化剤として有用であるかもしれない。
【０１８１】
（活性化合物をスクリーニングする方法）
本発明はまた、潜在的なＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤のスクリーニングにおける、ＰＤＥ３アイソフォーム・タンパク質、ペプチドおよび活性断片、ならびにＰＤＥ３をコードしている核酸の使用も企図している。上記のアッセイでは、様々な異なる形式を利用可能であり、スクリーニングを実施する「活性」の種類によって変わりうる。考えられる有効な「読出し」には、基質（たとえば、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）への結合、膜または別のタンパク質への結合の阻害、ＰＤＥ３のリン酸化または脱リン酸化、あるいはカルシウム・チャネルの活性化やプロテイン・キナーゼ活性など様々なｃＡＭＰ依存性プロセスの阻害または刺激が含まれる。
【０１８２】
（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）
１実施形態では、本発明は、ＰＤＥ３アイソフォームまたはその断片に結合する化合物のスクリーニングに適用されるものである。ポリペプチドまたは断片は、溶液中に遊離していても、支持体上に固定されても、または細胞内もしくは細胞表面上で発現されてもよい。ポリペプチドまたは化合物のどちらかを標識することによって結合の測定を可能にしてもよい。
【０１８３】
別の実施形態では、アッセイにより、天然もしくは人工の基質または結合パートナーへのＰＤＥ３の結合の阻害を測定してもよい。薬剤のうち１つが標識される競合的結合アッセイを行うことが可能である。通常は、標識される分子種はポリペプチドである。結合または結合の阻害を決定するために、結合した標識の量に対する遊離標識の量を測定してもよい。
【０１８４】
化合物のハイスループット・スクリーニングに関する別の技法は、その内容を本願明細書に援用する（特許文献４９）に記載されている。多数の小さなペプチド試験化合物を、プラスチック製のピンや何か別の表面など固体の基材上で合成する。ペプチド試験化合物をＰＤＥ３と反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドを様々な方法によって検出する。
【０１８５】
前述の薬物スクリーニング技法での使用のために、精製したＰＤＥ３をプレート上に直接コーティングすることが可能である。しかし、ポリペプチドを固相に固定化するために該ポリペプチドに対する非中和抗体を使用することが可能である。また、反応性領域（好ましくは末端領域）を含有する融合タンパク質を使用してＰＤＥ３の活性領域を固相に連結させてもよい。
【０１８６】
ＰＤＥ３の野生型または天然もしくは遺伝子操作による変異体を含んでいる様々な細胞株を使用して、これらタンパク質の様々な機能的特質を調べ、候補化合物がこれらの特質にどのように影響を与えるかを調査することが可能である。遺伝子操作によって変異させる方法は、本文書中の他の箇所に記載されている。このようなアッセイでは、化合物を適切な剤形としてその生化学的性質を付与し、標的細胞と接触させる。アッセイ次第では、培養が必要かもしれない。その後、いくつかの異なる生理学的アッセイによって細胞を検査し得る。あるいは、ＰＤＥ３の機能または関連する経路が探索され得る分子解析を行ってもよい。これは、様々な分子のリン酸化状態、ｃＡＭＰレベル、ＣＲＥＢ関連遺伝子のｍＲＮＡ発現、あるいはＰＤＥ３活性によって完全にまたは部分的に調節される任意の他のプロセスに関するアッセイなどのアッセイを含み得る。特定の実施形態では、挿入されたＰＤＥ３アイソフォームに対する様々な化合物の効果を特異的にアッセイするために、内在性ホスホジエステラーゼ活性を欠いている「ノック・アウト」細胞を作製することが好ましいかもしれない。
【０１８７】
（Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ）
本発明はまた、様々な動物モデルの使用も包含している。１つまたは複数のＰＤＥアイソフォームの示差的な発現を示す変異細胞株を開発または単離することによって、ヒトおよび他の哺乳動物における心筋症および／または肺高血圧症を予測する動物モデルを作製することが可能である。これらのモデルには、１つまたは複数のＰＤＥ３アイソフォームを示差的に発現するトランスジェニック動物を使用し得る。
【０１８８】
試験化合物を用いた動物の処置は、化合物を適切な形で動物に投与することを伴う。投与は、臨床または非臨床目的で利用できる任意の経路によるものであり、それだけには限定されないが、経口、経鼻、口腔内、直腸内、膣内または局所経路が含まれる。あるいは、投与は、気管内注入、気管支内注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または動脈内注射によるものでもよい。
【０１８９】
化合物の効力をｉｎ  ｖｉｖｏで決定するには、様々な異なる評価基準を要するかもしれない。このような評価基準には、それだけには限定されないが、生存、心拍出量の増大、心室駆出率の増加、肺動脈圧の低下、運動耐性の改善、クオリティ・オブ・ライフ指標の向上、心筋虚血または心筋梗塞の発生率の低下、心室異所性活性または不整脈の発生率の低下、血圧の低下または上昇、心筋質量の減少（異常発達の軽減）、血管過形成の軽減、血管抵抗の軽減、血小板凝集の軽減が含まれる。
【０１９０】
（合理的薬物設計）
合理的薬物設計の目的は、生物活性のあるポリペプチドまたは該ポリペプチドが相互作用する化合物（作用剤、拮抗剤、阻害剤、結合パートナーなど）の構造類似体を作製することである。このような類似体を作製することによって、変化に対して様々な感受性を有し、または様々な他の分子の機能に影響を与え得る天然分子に比べてより活性のあるまたは安定である薬物を創り出すことが可能となる。１手法では、ＰＤＥ３またはその断片の３次元構造を作製する。これは、Ｘ線結晶構造解析、他のホスホジエステラーゼの３Ｄ構造に基づいたコンピュータ・モデリングまたは両手法の組合せによって成し得る。さらに、ポリペプチド配列の知見により構造−機能相関についてのコンピュータを使用した予測が可能となる。代替手法では、「アラニン走査」は、タンパク質またはペプチド分子の全体にわたって残基をアラニンで無作為に置換し、次いでその結果生じるタンパク質機能への効果（または複数の効果）を決定することを含む。
【０１９１】
機能的アッセイによって選択したＰＤＥ３特異的抗体を単離し、その後その結晶構造を解析することも可能である。原理的には、この手法によって薬理作用中心（ｐｈｒａｍａｃｏｒｅ）が得られ、続く薬物設計をこれに基づかせることが可能である。機能的かつ薬理活性のある抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作製することによって、タンパク質結晶構造解析を完全に回避することも可能である。抗イディオタイプ抗体は鏡像の鏡像であるので、その結合部位は元の抗原の類似体であることが予測される。その後、抗イディオタイプ抗体を使用して、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクからペプチドを同定または単離し得る。その結果、選択されたペプチドは薬理作用中心として役割を果たすであろう。抗イディオタイプ抗体は、抗体を抗原として使用し、本明細書中に記載の抗体を産生する方法を使用して作製し得る。
【０１９２】
このようにして、ＰＤＥ３アイソフォーム選択的な活性が向上した薬物、あるいはＰＤＥ３の刺激剤、阻害剤、作用剤、または拮抗剤として作用する薬物を設計し得る。
（ノック・アウト）
相同組換えとして知られている技法により、特定の遺伝子の不活性化ならびに１つの遺伝子を別の遺伝子で置き換えることなど、存在する遺伝子の正確な改変が可能となる。相同組換えの方法は、本願明細書に援用する（特許文献５０）に記載されている。
【０１９３】
相同組換えは、核酸が相補配列と塩基対合するという性質に依存している。この場合、塩基対合は、鎖の切断および修復が起こり得るように２つの個別の核酸分子の相互作用を助長する役割を果たす。つまり、この方法の「相同的」な側面は、２つの相補配列を近接させるための配列の相同性にあり、また、「組換え」の側面により、特定の結合を切断して他の結合を形成することによって、一方の相補配列が他方で置き換えられる。
【０１９４】
まず、宿主内でＰＤＥ３ＡやＰＤＥ３Ｂ遺伝子などの組込み部位を選択する。組込み部位と相同な配列を、ゲノム中に組み込もうとする選択された遺伝子に隣接させて遺伝子構築体に含める。この文脈で隣接とは、単純に、標的相同配列が選択された遺伝子の上流（５’）および下流（３’）のどちらにも位置することを意味する。その後、構築体を細胞内に導入し、細胞内の配列と構築体との間の組換えを行わせる。
【０１９５】
構築体内に選択可能なマーカー遺伝子を含めることが一般的である。この遺伝子は、様々な生物抑止（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）薬物および生物殺傷（ｂｉｏｃｉｄａｌ）薬物に対する耐性を与えることによって、そのゲノムＤＮＡ内に構築体を組み込んだ細胞の選択を可能にする。さらに、この技法を使用して特定の遺伝子を「ノック・アウト」（削除）または該遺伝子に割り込んでもよい。したがって、遺伝子発現を阻害する別の手法は、相同組換え、すなわち「ノック・アウト技術」の使用を含む。これは、構築体内のフランキング領域の間に、変異したまたは幅広く欠失させた異種遺伝子を含めることによって成される。相同組換えが行われる構築体の配置は、以下のようでもよい。
【０１９６】
ベクター・５’−隣接配列・選択された遺伝子・選択可能なマーカー遺伝子・隣接配列−３’・ベクター
この種の構築体を使用して、単回の組換え現象で（ｉ）内在遺伝子を「ノック・アウト」すること、（ｉｉ）この現象を同定するための選択可能なマーカーを提供すること、または（ｉｉｉ）発現用の導入遺伝子を導入することが可能である。
【０１９７】
相同組換え手法の別の改良は、「陰性」の選択可能なマーカーの使用を含む。陰性の選択法におけるシトシン・デアミナーゼ遺伝子の使用の１例は（特許文献５１）に記載されている。陰性選択マーカーは、選択可能なマーカーとは異なり、マーカーを発現する細胞の死滅をもたらす。したがって、これは望ましくない組換え現象を同定するのに使用される。選択可能なマーカーを使用して相同組換え体を選択しようとする場合は、最初のスクリーニング工程で正しい相同組換え体を無作為な、配列特異的でない現象により作製された組換え体から確認するのは困難である。これらの組換え体も、選択可能なマーカー遺伝子を含む可能性があり、目的の異種タンパク質を発現するかもしれないが、たいていは望ましい表現型を有さない。構築体に、フランキング領域の外側に陰性の選択可能なマーカーを結合することによって、陰性の選択可能なマーカーを組み込む多くの無作為な組換え現象を排除する選択が可能になる。陰性の選択可能なマーカーはフランキング配列の外側にあるので、陰性の選択可能なマーカーが相同組換えによって導入されることはないであろう。
【０１９８】
（患者に投与するための配合および経路）
特定の実施形態では、ＰＤＥ３のアイソフォーム選択的な阻害剤または活性化剤を拡張型心筋症および／または肺高血圧症などの病状の治療的処置に使用し得る。臨床的な用途を企図する場合は、意図する用途に適した形態で薬剤組成物を調製する必要がある。これには一般的に、発熱物質、ならびにヒトや動物に有害な可能性のある他の不純物を実質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【０１９９】
本発明の水性組成物は、製薬上許容される担体または水性媒体中に溶解または分散させた、有効量のＰＤＥ３阻害剤または活性化剤を含む。このような組成物は、接種剤とも呼ばれる。表現「製薬上または薬理学上許容される」とは、動物またはヒトに投与した場合に副作用、アレルギー性反応、または他の有害反応を生じない分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）および組成物を言う。本明細書中で使用する「製薬上許容される担体」には、任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。薬剤活性を有する物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が本発明のＰＤＥ３の阻害剤または活性化剤と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も組成物に組み入れることが可能である。
【０２００】
本発明の活性組成物に、標準的な薬剤調製物を含めてもよい。本発明によるこれら組成物の投与は、任意の一般的な経路によるものであるが、その経路によって標的組織に到達可能でなければならない。これには、経口、経鼻、口腔内、直腸内、膣内または局所経路が含まれる。あるいは、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射であってもよい。このような組成物は通常、製薬上許容される組成物として投与される。
【０２０１】
また、活性化合物を非経口的にまたは腹腔内に投与してもよい。遊離塩基または薬理学上許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製し得る。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレン・グリコール、およびそれらの混合物、ならびに油で調製し得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を阻止するために保存料を含む。
【０２０２】
注射用の使用に適した薬剤形態には、無菌的な注射用溶液または分散剤を即時調製するための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。すべての場合において、この形態は無菌的でなければならず、また注射器で容易に使用可能な程度に流動性がなければならない。上記の形態は製造および保管条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用を避けて保存されていなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレン・グリコール、液体ポリエチレン・グリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒子経を保つことによって、および界面活性剤を使用することによって維持することが可能である。
【０２０３】
微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張剤、たとえば糖類や塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされる。
【０２０４】
所要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中に取り込み、その後、濾過滅菌することによって、無菌の注射用溶液を調製する。一般に、分散剤は、様々な滅菌した活性成分を、塩基性分散媒と上に列挙した成分のうち所要の他の成分とを含有する無菌ベヒクルに取り込むことによって調製する。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望する成分との溶液を予め無菌濾過したものから粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥の技法である。
【０２０５】
本発明の組成物は、中性または塩の形に配合し得る。製薬上許容される塩には、塩基性基と、たとえば、塩酸やリン酸など無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など有機酸との反応によって形成される酸付加塩が含まれる。遊離酸基を用いて形成される塩はまた、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄など無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど有機塩基に由来することも可能である。
【０２０６】
配合した後に、剤形に適合した様式で、治療上有効な量で溶液を投与する。配合物は、注射用溶液、薬物放出カプセルなど様々な剤形で容易に投与される。水溶液の状態での非経口投与には、たとえば、必要な場合は溶液を適切に緩衝するべきであり、まず十分な生理食塩水もしくはグルコースを用いて希釈液を等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。
【０２０７】
この点については、使用可能な無菌の水性媒体は、本開示を考慮すれば当分野の技術者に分かるであろう。たとえば、１用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、１０００ｍｌの皮下注入液に加えるか、または予定のインフュージョン部位に注射する（たとえば、非特許文献１２７参照）。処置する対象者の状態に応じて、いくらかの用量の変動が必然的に起こるものである。いずれにせよ、投与の責任者が個々の対象者にとって適切な用量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与では、ＦＤＡの生物製剤局（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の基準によって要求される無菌性、発熱原性、全般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【実施例】
【０２０８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。当分野の技術者には当然のことであるが、以下の実施例中で開示する技法は、本発明者らによって本発明の実施において十分に機能することが判明した技法を表し、したがって、その実施における好ましい形態を構成していると見なし得る。しかし、当分野の技術者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行っても本発明の思想および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果が得られることを理解されよう。
（実施例１：材料および方法）
（ｒｔＰＤＥ３Ａ１の調製）
８アミノ酸のＦｌａｇエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）をＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）の停止コドンのすぐ上流に挿入することによって、ヒト心筋ＰＤＥ３Ａ構築体を生成させた。５０ｎｇのＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９２１）を鋳型として使用し、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｍｅ）［米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在］を用いて、ＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦのヌクレオチド（ｎｔ）３００９〜３０２７に対応するセンス・プライマー
ＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧ（配列番号４）
ならびにヌクレオチド３４２３〜３４０３およびＦｌａｇエピトープに対応するアンチセンス・プライマー
ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧ（配列番号５）
をそれぞれ３ｐｍｏｌずつ使用して、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）［米国マサチューセッツ州ウェルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）所在］）でＰＣＲ増幅を行った。
【０２０９】
生じたＰＣＲ産物は、ただ１つのＰＤＥ３  ＤｒａＩＩＩ部位を５’末端に、停止コドンを３’末端に含んでいた。停止コドンは、その上流にはＦｌａｇエピトープをコードしている配列、下流にはＸｈｏＩ部位が隣接していた。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ（登録商標）ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）中にサブクローニングし、ＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片としてこのベクターから単離した。ただ１つのＤｒａＩＩＩ部位より上流にあるＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦ配列（配列番号１４）を含むＸｈｏＩ／ＤｒａＩＩＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）から制限酵素処理で切り出した。三者間のライゲーションで、ＤｒａＩＩＩ部位を介して上記５’ＸｈｏＩ／ＤｒａＩＩＩ断片を３’ＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩ  Ｆｌａｇエピトープ含有断片およびＸｈｏＩで切断したｐＺｅｒｏ（登録商標）ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結し、ＰＤＥ３Ａ１  Ｆｌａｇ−ｐＺｅｒｏを得た。その後、ＸｈｏＩを用いてｐＺｅｒｏからＰＤＥ３Ａ１−Ｆｌａｇを切り出し、ｐＡｃＳＧ２ベクター中に連結し、サブクローニングし、増幅した。
【０２１０】
ＰＤＥ３Ａ１−Ｆｌａｇ−ｐＡｃＳＧ２プラスミド（２μｇ）を、直線化したＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡと共にＳｆ２１細胞中にコトランスフェクションした（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）。５日後、ＴＮＭ−ＦＨ培地（ＢＤ−ファーミンゲン（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）中で増殖させた、７５ｃｍ２フラスコあたり（１０〜２０）×１０６個の新鮮なＳｆ２１細胞を、ＰＤＥ３Ａ１−Ｆｌａｇバキュロウイルスを含む培地で感染させた。増幅するために、７２〜９６時間後に１００〜５００μｌの培地を回収して新鮮な培養物に感染させるために使用し、その後、１２ウェルの終点希釈アッセイによってウイルス力価を決定した。７５ｃｍ２フラスコの細胞（通常１フラスコあたり（１０〜２０）×１０６個）を１０分間、１０００×ｇで沈降させ、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのショ糖、１０ｍＭのピロリン酸、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１％のＮＰ−４０ならびにそれぞれ１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンを含む溶液に再懸濁させた。Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ３５０（ブランソン・ソニック・パワー（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ）［米国コネチカット州ダンバリー（Ｄａｎｂｕｒｙ）所在］）を用いて氷上で超音波処理（２回の２０秒間パルス、出力２、４０％サイクル）することによって溶解物を調製した。溶解液を１０分間１２，０００×ｇで沈降させ、上清分画をウエスタン・ブロットに使用した。抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫沈降と続くＦｌａｇペプチドとの競合的放出によって、Ｃ末端にＦｌａｇタグが付加されたｒｔＰＤＥ３Ａ１を見た目が均一になるまで精製した。
【０２１１】
（ヒト心筋および培養大動脈筋細胞の細胞成分分画の調製）
拡張型心筋症を有する心臓移植患者の外植心臓の左心室心筋から、ホモジナイズ、示差的沈降（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および高濃度の塩による洗浄によって、サイトゾル分画およびＫＣｌで洗浄したミクロソーム分画を調製した。各調製物は、少なくとも３つの異なる心臓からプールした組織から作製した。左心室自由壁からの組織から心外膜および心内膜を切り取り、おおよそ０．５ｃｍ３の小片に切り、液体窒素中で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存しておいた。細胞成分分画を調製するために、０．３ｇの凍結組織を５倍体積の緩衝液（５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４および２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８、４℃）、１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのベンズアミジン、０．８ｍＭのＰＭＳＦ、ならびにそれぞれ１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、ロイペプチン、およびアンチパイン）に加えた。組織を１０秒間ずつ２回ホモジナイズした。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のモデル５４１５遠心分離機を使用して、１４，０００ｒｐｍで２０分間、ホモジネートを沈降させた。上清を取っておき、ペレットを１．５ｍｌの緩衝液に再懸濁した後、捕捉されたサイトゾル・タンパク質をすべて可溶化するために再びホモジナイズして沈降させた。サイトゾル・タンパク質を含んだ上清をプールし、４０％ｖ／ｖのグリセロールを含む緩衝液で１：１に希釈し、使用するまで−８０℃で保存しておいた。培養ヒト大動脈筋細胞（クロンチックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）［米国ニュージャージー州イーストラザフォード（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ）所在］；７継代目）の同様の分画を同じように調製した。
【０２１２】
（ウエスタン・ブロット）
ｒｔＰＤＥ３Ａ１を発現しているＳｆ２１細胞の溶解物ならびにヒト心筋および大動脈筋細胞の細胞成分分画をトリクロロ酢酸（終濃度５０％）で沈殿させ、ＳＤＳ緩衝液に溶かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％アクリルアミド）にかけ、電気泳動によってニトロセルロース膜（シュライチャー＆シュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）［米国ニューハンプシャー州ケンネ（Ｋｅｎｎｅ）所在］）に移しとった。移した後、膜をブロッキングし、洗浄し、室温で少なくとも２時間、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）の読み枠の選択された領域に相当する配列を有する合成ペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体と共にインキュベートした。これらのポリクローナル抗体は、ＰＤＥ３Ａ１のＮ末端アミノ酸２９〜４２（抗ＮＴ）、中間配列のアミノ酸４２４〜４６０（抗ＭＩＤ）、およびＣ末端アミノ酸１１２５〜１１４１（抗ＣＴ）に対応する（配列番号１参照）。製造者の指示に従って、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた二次抗体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）および増強化学発光発光試薬（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］）を用いて免疫反応性のバンドを検出した。
【０２１３】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳によるｒｔＰＤＥ３Ａ１アイソフォームの発現）
ＰＤＥ３Ａ１  ｃＤＮＡのコード領域全体（配列番号１４）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）に挿入した。さらに、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）［米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在］）を使用し、ＰＣＲによってヌクレオチド１４５０〜５（ＡＴＧ７／８）にＡＴＧＡＴＧからＣＴＧＣＴＧへの変異（Ｍｅｔ−Ｍｅｔ＞Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）を有するプラスミドを作製した。突然変異誘発には、センス・プライマー
ＧＧＡＡＴＡＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣ（配列番号６）
および相補的なアンチセンス・プライマー（ＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦ（配列番号１４）のヌクレオチド１４３５〜７６に相当）を使用した。大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）中で増幅させた後、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）［米国カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）所在］）を使用して変異したプラスミドを精製し、配列決定した。
【０２１４】
遺伝子特異的配列のすぐ上流にＴ７プロモーター部位を含有している５つのセンス・プライマーならびに停止コドンおよびポリＡテールを含有しているアンチセンス・プライマーを使用して、野生型および変異型のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＰＤＥ３Ａ１プラスミドから、様々な５’欠失を有するＰＣＲ産物を生成させた。これらの反応で増幅に使用したセンス・プライマーは以下のとおりである。
【０２１５】
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧ（配列番号７）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧ（配列番号８）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＣＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣ（配列番号９）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣ（配列番号１０）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＣ（配列番号１１）
上記プライマーはそれぞれ、５’非翻訳領域のヌクレオチド（−）２２〜（−）７、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９２１）の読み枠のヌクレオチド４０９〜４３８、ヌクレオチド５１１〜５３７、ヌクレオチド７０６〜７３２、およびヌクレオチド１４０１〜１４２７に対応している。それぞれの反応において、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）のヌクレオチド３４００〜３４２６に対応するアンチセンス・プライマーは、
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴ（配列番号１２）であった。
【０２１６】
網状赤血球の溶解物中で、ＴｎＴ（登録商標）Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ＤＮＡシステム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）を使用して鋳型ＰＣＲ断片からｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物を合成し、４μＣｉの［３５Ｓ］メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。人工タンパク質を作製するために、５’欠失およびＴ７プロモーター配列を含有しているＰＣＲ産物をＴｎＴ  Ｔ７  ＰＣＲ  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに加え、３０℃でおよそ６０〜９０分間インキュベートした。５’欠失を含有している各ＰＣＲ構築体について、この工程を繰り返した。このようにして作製されたタンパク質を単離し、次いでオートラジオグラフィーによって分析した。
【０２１７】
（５’ＲＡＣＥ）
ヒト心筋由来のＭａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［米国カリフォルニア州パロ・アルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在］）について、１ｐｍｏｌの遺伝子特異的なアンチセンス・プライマーおよび１ｐｍｏｌのセンス・プライマー（製造者の５’タグの５’末端に対応）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。２順目のＰＣＲは、１ｐｍｏｌの遺伝子特異的なネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーおよび１ｐｍｏｌのネスティド・センス・プライマー（製造者のタグ内の第２の配列に対応）を使用して、３５サイクル行った。ＲＡＣＥ産物をアガロース・ゲルで精製し、ＴＡクローニング・キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）所在］）を使用して、Ｔ４リガーゼを用いてｐＣＲ２．１ベクター内に連結させた（１４℃、終夜）。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｋｉｔ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在］）を用いてコンピテント細胞（ＩＮＶ  Ｆ’）を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ  ＬＢ−アンピシリン・プレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）に播いた。ＬＢ−アンピシリン培地中で、陽性コロニーを終夜増殖させた。Ｍｉｎｉ−またはＭｉｄｉｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ精製システム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してプラスミドを精製し、ＥｃｏＲＩで挿入物を切り出した。アガロース・ゲルの電気泳動によって挿入物のサイズを推定した。
【０２１８】
（サザン・ブロットおよびノーザン・ブロット）
領域特異的なプライマーを使用したＰＣＲによって、ＰＤＥ３Ａ１プラスミドからＤＮＡプローブを調製した。ＱＩＡＱｕｉｃｋ（登録商標）Ｋｉｔｓ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してＰＣＲ産物を精製した。ランダムプライマー標識キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、ＤＮＡを［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）で標識した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０（ｆｉｎｅ）カラム（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在］）を使用して取り込まれなかったヌクレオチドを除去した。サザン・ブロットには、ＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦ（配列番号１４、配列番号１８）のヌクレオチド（−）２６８〜ヌクレオチド２６１０に相当する直線状ＤＮＡを鋳型ＰＤＥ３Ａ１からＰＣＲによって調製し、上述のように精製した。Ａ２６０／Ａ２８０の比の測定によってＰＣＲ産物を定量し、その純度をアガロース・ゲル電気泳動によって確認した。ＰＣＲ産物の試料を０．７％アガロース・ゲルの電気泳動にかけ、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ニュー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｌｃｌｅａｒ）［米国マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）所在］に移しとり、架橋結合させ、ＱｕｉｋＨｙｂ（登録商標）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中で２〜３時間プレハイブリダイズさせた。１．２５×１０６ｃｐｍ／ｍｌのプローブおよび０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡとを使用して、標識ＤＮＡプローブをＤＮＡブロットと共に６５℃で３〜４時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することによって過剰の放射標識プローブを除去し、−８０℃でオートラジオグラフィーを実施した。ノーザン・ブロットには、ＴＲＩ試薬（モレキュラー・リサーチ・センター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）［米国オハイオ州シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）所在］）を使用して、拡張型心筋症を有する移植患者の切除した心臓由来のヒト左心室心筋から、ＲＮＡを抽出した。Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ  ｋｉｔ（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）を使用して、全ＲＮＡからポリＡ  ＲＮＡを調製した。上述のように、ＲＮＡを定量してその純度を確認した。ポリＡ  ＲＮＡ試料を１％アガロース・０．５Ｍホルムアルデヒド・ゲルの電気泳動にかけ、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓに移し、架橋結合させ、ＱｕｉｋＨｙｂ（登録商標）中で２〜３時間プレハイブリダイズさせた。標識ＤＮＡプローブをＲＮＡブロットとハイブリダイズさせ、過剰のラジオ標識プローブを除去した。
（実施例２：心筋細胞および血管筋細胞中のＰＤＥ３アイソフォーム）
抗ＰＤＥ３抗体を用いて、哺乳動物の心筋から３つの異なる見かけの分子量のタンパク質を免疫沈降し得ることが示された（非特許文献１２８）。ＰＤＥ３ＡのＯＲＦ由来のペプチドに対して産生させた抗体を使用したヒト心筋のサイトゾル分画およびミクロソーム分画のウエスタン・ブロットによって、これらのタンパク質が、本発明においてＰＤＥ３アイソフォームと同定される。
【０２１９】
ＰＤＥ３のＣ末端に対する抗体（「抗ＣＴ」）は、これら分画中の３つのタンパク質と反応した（図５）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけの分子量１３６，０００を有する最も大きいタンパク質（「ＰＤＥ３Ａ−１３６」）は、ミクロソーム分画中だけに存在した（図５）。見かけの分子量１１８，０００を有する別のＰＤＥ３アイソフォーム（「ＰＤＥ３Ａ−１１８」）は、ミクロソーム分画およびサイトゾル分画のいずれにも存在し、見かけの分子量９４，０００を有する第３のアイソフォーム（「ＰＤＥ３Ａ−９４」）も同様であった（図５）。
【０２２０】
ＮＨＲ２およびＣＣＲの間のアミノ酸配列に対する抗体（「抗ＭＩＤ」）は、ＰＤＥ３Ａ−１３６およびＰＤＥ３Ａ−１１８と反応したが、ＰＤＥ３Ａ−９４とは反応しなかった（図５）。アミノ酸２５〜４９に対する抗体（「抗ＮＴ」）は、ミクロソーム分画またはサイトゾル分画中のどのタンパク質とも反応せず、これにより、心臓および血管のＰＤＥ３アイソフォーム中にこの領域が存在しないことが示された（図５）。しかし、抗ＮＴは完全長ＯＲＦを含有するｒｔＰＤＥ３Ａ１とは反応した（図５）。
【０２２１】
これらの抗体を使用して、大動脈筋細胞の細胞成分分画中のＰＤＥ３アイソフォームを同定した（非特許文献３４）。抗ＣＴは、大動脈筋細胞のミクロソーム分画およびサイトゾル分画中の９４ｋＤＡタンパク質および１１８ｋＤａタンパク質と反応した（図示せず）。抗ＭＩＤは、１１８ｋＤａタンパク質とのみ反応した（図示せず）。抗ＮＴではタンパク質がまったく見られず、すべての事例で１３６ｋＤａタンパク質のバンドが存在しなかった（図示せず）。
【０２２２】
ＰＤＥ３Ｂが血管筋細胞中に存在することはウエスタン・ブロットを使用して示されたが、ＰＤＥ３Ｂは、ミクロソーム分画中の１３７ｋＤａのバンドとして現れる（ＰＤＥ３Ｂ−１３７）（非特許文献１２９）。ウエスタン・ブロット（図示せず）により、ＰＤＥ３Ｂ−１３７が心筋中に存在しないことが示されている（図示せず）。これらの結果を表３に要約する。
【０２２３】
【表３】
2004536614.tif 000004
３つのポリクローナル抗体（抗ＮＴ、抗ＭＩＤおよび抗ＣＴ）すべてを組換えＰＤＥ３Ａ１と反応させた。抗ＣＴは、ヒト心筋のサイトゾル分画およびミクロソーム分画中の、９４，０００Ｄａおよび１１８，０００Ｄａの見かけの分子量を有するタンパク質と反応した。抗ＣＴは、心筋のミクロソーム分画中でのみ見られた１３６，０００Ｄａの見かけの分子量を有するタンパク質とも反応した。抗ＭＩＤも１１８，０００タンパク質および１３６，０００タンパク質と反応したが、９４，０００Ｄａタンパク質とは反応しなかった。
（実施例３：心臓および血管のＰＤＥ３Ａアイソフォームが生成される機構）
［３５Ｓ］で標識したｒｔＰＤＥ３Ａ（完全長ＯＲＦ、配列番号１４）を、サイトゾル分画およびミクロソーム分画を調製する前にヒト心筋の試料に加えても、標識した完全長ｒｔＰＤＥ３Ａのタンパク質分解によってより小さなアイソフォームが生成されるという証拠は得られなかった（図示せず）。その他の考えられる機構も調査された。
【０２２４】
心臓および血管のＰＤＥ３Ａアイソフォームの移動を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳によって生成させた組換えタンパク質の移動と比較した。様々なイン・フレームＡＴＧから開始されるｒｔＰＤＥ３Ａを得るために設計した５’欠失を有するＰＤＥ３Ａ構築体を調製し、Ｔ７プロモーターおよびコザック配列の下流に挿入した（図３）。ＰＤＥ３Ａ−１３６、ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４は、それぞれＡＴＧ１５０７、１９６９および２５２１で開始されるｒｔＰＤＥ３Ａと同じ見かけの分子量で移動した（図６）。このことは、３つのＰＤＥ３Ａアイソフォームが代替開始部位からの転写によって生成されることと矛盾しない。ＰＤＥ３Ａ由来のすべての構築体の転写／翻訳から、見かけの分子量がＰＤＥ３Ａ−９４に対応するｒｔＰＤＥ３Ａが生成された。ＰＤＥ３Ａ−９４が下流のＡＵＧからの翻訳によって生成されるかどうかを決定するために、ヌクレオチド２５２１のＡＴＧをＣＴＧに（ＭをＬに）変異させた完全長ｒｔＰＤＥ３Ａ構築体を調製した。この変異により、ｒｔＰＤＥ３Ａ−９４は消失した（図示せず）。ＰＤＥ３Ａ−９４アイソフォームはヌクレオチド２５２１のＡＴＧ開始コドンからの転写によって生成されると考えられる。
【０２２５】
少なくとも２つの異なるメッセンジャーＲＮＡ種が異なる組織中で発現される。すなわち、心筋細胞中でＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）が、心筋細胞および血管筋細胞の両方においてＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）が発現される（非特許文献３４）。ＰＤＥ３Ａ中の代替開始部位からの転写により、心筋細胞中ではＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）の発現が、心筋細胞および血管筋細胞中ではＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）の発現がもたらされると考えられる。上記の結果から、ＰＤＥ３Ａ−１３６は心筋細胞中でＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４）中の２番目のＡＵＧからの翻訳によって生成され、ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４は心筋細胞および血管筋細胞中でＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）の二者択一の下流ＡＵＧからの翻訳によって生成されることが結論づけられた（図７）。
（実施例４：ＰＤＥ３Ａアイソフォームにおける構造−機能相関）
図１１は、ＰＤＥ３Ａの読み枠（ＯＲＦ）の完全なアミノ酸配列を示す。これまでに、３つのＰＤＥ３Ａアイソフォームが特性解析されている。これらは明らかにＰＤＥ３Ａ  ＯＲＦ（配列番号１４）のＮ末端切断によって生成されている。３つのアイソフォームの明らかなＮ末端メチオニン残基を図１１中に太字で示す。これらは、ＰＤＥ３Ａ−１３６については残基１４６位、ＰＤＥ３Ａ−１１８については３００位、ＰＤＥ３Ａ−９４については４８４位または４８５位のいずれかに位置している。ＰＤＥ３Ａアイソフォーム上のリン酸化部位の位置を図１１中に下線で示す。Ｐ１部位は残基２８８〜２９４位、Ｐ２部位は残基３０９〜３１２位、Ｐ３部位は残基４３５〜４３８位に位置している。ＰＤＥ３Ａアイソフォーム上のＰ２およびＰ３部位にはセリン残基が１つだけ含まれており、リン酸化されるアミノ酸は明確である。Ｐ１部位は複数のセリン残基を含んでおり、これらのうちどれがリン酸化によって共有結合修飾されるかは、現在ではまだ知られていない。
（実施例５：ＰＤＥ３Ａアイソフォームの機能的ドメイン）
心臓および血管のＰＤＥ３アイソフォーム内の機能的ドメインを表４に示す。ドメインは、天然のＰＤＥ３アイソフォームと、様々なイン・フレーム開始コドン（ＡＴＧコドン配列）から翻訳されるように設計した読み枠の５’欠失を有する構築体からｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写／翻訳によって生成された組換えＰＤＥ３Ａアイソフォームとの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動の移動度を比較することによって部分的に解明された。ｒｔＰＤＥ３Ａ欠失構築体およびＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦ（配列番号１４）中の様々なＡＴＧ開始コドンの位置を図１２に示す。すべての組換えアイソフォームが、そのアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３）から予測されるより約２０，０００大きい見かけの分子量を示して移動した。
【０２２６】
ＰＤＥ３Ａ−１３６の見かけの分子量はＰＤＥ３Ａ１読み枠（配列番号１４）のＡＴＧ−２から翻訳された組換えタンパク質の見かけの分子量１３１，０００よりわずかに大きく、このことは、ＰＤＥ３Ａ１−１３６に含まれるのがＮＨＲ１部位の一部（ミクロソーム分画のみで回収されることと矛盾しない知見）、ＮＨＲ２のすべて、ならびに、ＰＫ−ＢおよびＰＫ−Ａによるリン酸化および活性化のためのＰ１、Ｐ２およびＰ３部位であることを示している。したがって、ＰＤＥ３Ａ−１３６は、ＡＴＧ１からの翻訳後にＮ末端がタンパク質分解されることによって、または何らかの翻訳後修飾によりその電気泳動の移動度が低下して見かけの分子量が大きくなることによって、心筋細胞中でＰＤＥ３Ａ１から生成される。
【０２２７】
ＰＤＥ３Ａ−１１８の見かけの分子量はＡＴＧ４から翻訳された組換えＰＤＥ３Ａの見かけの分子量と識別不可能であり、このことは、ＰＤＥ３Ａ−１１８がＮＨＲ１およびＰＫ−Ｂ活性化部位を欠いているがＮＨＲ２およびＰＫ−Ａ部位を含んでいることを示している。ＰＤＥ３Ａ−１１８は、心筋細胞および血管筋細胞中でＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）から、クローニングしたｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９２１）から予測される読み枠の第３ＡＴＧであるＡＴＧ４からの翻訳によって、あるいはＡＴＧ２またはＡＴＧ３からの翻訳後にＮ末端がタンパク質分解されることによって生成される。
【０２２８】
【表４】
2004536614.tif 000005
ＰＤＥ３Ａ−９４の見かけの分子量はＡＴＧ７／８から翻訳された組換えＰＤＥ３Ａの見かけの分子量９４，０００とほぼ等価であり、このことは、ＰＤＥ３Ａ−９４が膜関連ドメインＮＨＲ１およびＮＨＲ２のどちらも含有せず、３つのリン酸化部位も全て含有しないことを示している。ＰＤＥ３Ａ−９４は、心筋細胞および血管筋細胞中でＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）から、ＡＵＧ７／８からの翻訳によって、またはさらに上流のＡＴＧからの翻訳後にさらに長いＮ末端配列がタンパク質分解により除去されることによって生成される。ＰＤＥ３Ａ１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４が単一のｍＲＮＡ（配列番号１５）から代替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）翻訳プロセッシングによってｉｎ  ｖｉｖｏで生成されることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＥ３Ａ−９４様のタンパク質がより長い構築体から下流のＡＴＧ配列からの翻訳によって生成されることと矛盾しない。
【０２２９】
ＰＤＥ３Ａ１の読み枠（配列番号１４）から予測されたＮ末端は、同定された最も長いＰＤＥアイソフォームである天然型ＰＤＥ３Ａ−１３６には存在していなかった。３つのアイソフォームすべてが、異なるＮ末端開始点の下流に同一のＣ末端アミノ酸配列を含有している。
【０２３０】
ＮＨＲ１の膜貫通ヘリックスを含むＰＤＥ３Ａ−１３６およびＰＤＥ３Ｂ−１３７は、心筋細胞および血管筋細胞中で専ら膜に結合していると予測される。ＮＨＲ２を含むがＮＨＲ１を含まないＰＤＥ３Ａ−１１８、およびＮＨＲ１およびＮＨＲ２のどちらも欠いているＰＤＥ３Ａ−９４は、細胞内の膜タンパク質と可逆的に会合しているかまたはサイトゾル区画とミクロソーム区画との間で分配されていると予測される。ミクロソーム分画およびサイトゾル分画のいずれにもこれらが存在することは、この推論と矛盾していない。さらに、ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４がミクロソーム分画で回収可能なことにより、その細胞内局在化にはアンカータンパク質または標的タンパク質との相互作用が関与していることが示唆される。
【０２３１】
Ｎ末端配列の差異が原因となって、様々なＰＤＥ３アイソフォームが、これを様々なシグナル伝達モジュールに局在させる様々なアンカータンパク質または標的タンパク質と相互作用するのかもしれない。その結果、各ＰＤＥ３アイソフォームがＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｇの様々な基質のリン酸化を調節するかもしれない。
【０２３２】
驚くべきことに、すべてのＰＤＥ３Ａ由来構築体からの転写／翻訳により、見かけの分子量がＰＤＥ３Ａ−９４に相当する組換えＰＤＥ３Ａアイソフォームが生成された。ＰＤＥ３Ａ−９４が完全長ＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）内の下流のＡＵＧからの翻訳によって生成されたかどうかの決定は、ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４）内のＡＴＧ１から始まる、ＡＴＧ７／８がＣＴＧＣＴＧに変異した（Ｍｅｔ−Ｍｅｔ→Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）変異型構築体の発現によって行った。変異型構築体の発現では分子量９４，０００の組換えＰＤＥ３Ａが消失したが、このことは、ＰＤＥ３Ａ−９４がＡＵＧ７／８からの翻訳により、完全長ＰＤＥ３のｍＲＮＡからの生成されることと矛盾しない結果である。
（実施例６：５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ）
研究により、その配列がＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡの読み枠（配列番号１４）のヌクレオチド３００辺りより下流ではＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡの配列と同一であるが、ＰＤＥ３Ａ１の上流配列（配列番号１４、配列番号１８）を欠いている、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）は、心筋細胞および血管筋細胞のいずれにも存在するが、一方ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４は配列番号１８）は心筋細胞中には存在するが血管筋細胞中には存在しないことが示されている（非特許文献３４）。ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）がヌクレオチド３００辺りより上流に代替配列を含んでいたかを決定するために、ヒト心筋ｃＤＮＡライブラリについて、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）とＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）との共通配列由来の３組のアンチセンス・プライマーを使用して、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。
【０２３３】
複数の５’ＲＡＣＥ生成物のサブクローニングおよびシークエンシングにより、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）はヌクレオチド３００辺りより上流に代替配列を含んでいないことが示された（図示せず）。ヒト大動脈ｃＤＮＡライブラリについて、相応のプライマーを用いて５’ＲＡＣＥを行った場合も、同様の結果が得られた（図示せず）。
（実施例７：サザン・ブロットおよびノーザン・ブロット）
ヒト左心室心筋由来の核酸について、ＰＤＥ３Ａ１の読み枠（配列番号１４参照）の様々な領域由来のプローブを使用して、ノーザン・ブロットおよびサザン・ブロットを行った。ヌクレオチド（−）２６８〜１８９由来の第１核酸プローブは、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）中に存在するがＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）中には存在しないと予測される領域に対応させた。使用した他の２つの核酸プローブはそれぞれ、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）およびＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）のいずれにも存在すると予測される領域である、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）のヌクレオチド５１７〜９５７および２２４８〜２６１０に対応させた。
【０２３４】
３つの核酸プローブすべてが８．２キロベースのバンドに結合した（図示せず）。２つの下流のプローブは、上流のプローブが結合しなかった６．９キロベースのバンドにも結合した（図示せず）。これらの結果は、８．２キロベースのバンドがＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４、配列番号１８）であり、６．９キロベースのバンドがＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）であることを示している。２つのハイブリダイズしたバンドで観察されたサイズの相違は、ＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）にはＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）の読み枠の最初の約３００ヌクレオチドが存在しないことが原因であり、これは、ＰＤＥ３Ａ１の読み枠（配列番号１４）の代替転写またはエキソン１内のスプライシングによるＰＤＥ３Ａ２の生成と矛盾しない。この結果は、ＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４）のヌクレオチド２０８〜５３７およびヌクレオチド２２４８〜２６１０に及ぶアンチセンス・プローブを用いた、ヒト心筋および培養ヒト大動脈筋細胞から調製したＲＮＡのＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）から予測された結果と矛盾しない（非特許文献３４）。重要なことに、ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）およびＰＤＥ３Ａ−１３６は心筋細胞中のみに存在すると決定づけられたが、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）、ＰＤＥ３Ａ−１１８、およびＰＤＥ３Ａ−９４は心筋細胞および血管筋細胞のいずれにも存在していた。この結果は、ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）からＰＤＥ３Ａ−１３６が生成され、ＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡ（配列番号１５）からＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４の両方を生成することを示している。
（実施例８：ＰＤＥ３活性の阻害剤および触媒活性に対する細胞内局在化の効果）
ヒト心筋のサイトゾル分画およびミクロソーム分画中のｃＡＭＰ加水分解活性に対する２つのＰＤＥ３阻害剤、すなわちシロスタゾール（図示せず）およびミルリノン（図８）の効果を検査した。これらの薬物は、ミクロソーム分画中で効果がより強力であった（図８）。
【０２３５】
ＰＤＥ３阻害剤であるミルリノンを使用して、組換えＰＤＥ３Ａアイソフォームを発現しているＳｆ９細胞の溶解物ならびにヒト心筋のサイトゾル分画および塩で洗浄したミクロソーム分画における、ＰＤＥ３のｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−加水分解活性を定量した（表５）。０．１μＭのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰで触媒活性を測定した。組織分画のミルリノン感受性活性は、組換えＰＤＥ３Ａ１によるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの加水分解におけるそのＩＣ５０値に等しい濃度のミルリノンによって阻害される環状ヌクレオチド加水分解を測定し、０．５で除することによって計算した。
【０２３６】
サイトゾル分画中におけるミルリノン感受性加水分解活性のｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比は完全長の組換えＰＤＥ３Ａで観察されたものより低かったが、ミクロソーム分画中における比は高かった。これらの違いがＮ末端欠失の結果であるかどうかを決定するために、Ｎ末端が削除された組換えＰＤＥ３Ａ（ｒｔＰＤＥ３ＡΔ５）を発現しているＳｆ９細胞の溶解物で同じ調査を行った。Ｎ末端切断は、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ活性比に影響を与えなかった。
【０２３７】
【表５】
2004536614.tif 000006
ミルリノン感受性加水分解活性のｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比が、組換えＰＤＥ３アイソフォームよりもミクロソーム分画において高いことにより、細胞内膜への局在化がｃＡＭＰに対するＰＤＥ３アイソフォームの選択性を高めることが示唆され、これはおそらく膜に結合したＰＤＥ３と他のタンパク質との相互作用に起因するものである。
【０２３８】
環状ヌクレオチドの加水分解を区画別に調節することに対するＰＤＥ３アイソフォームの貢献を、天然のヒト心筋および培養肺動脈筋細胞由来の細胞成分調製物で検査した。結果を表６に示す。
【０２３９】
ＰＤＥ３は、ｃＡＭＰ濃度が低い場合でも高い場合でも、ヒト心筋のミクロソーム分画中の全ｃＡＭＰ加水分解活性の大部分を構成する。ＰＤＥ３は、これらの細胞のサイトゾル分画中のｃＡＭＰ加水分解活性については、より少ないが有意な割合を占めるが、このことは、おそらくはサイトゾル中に他のｃＡＭＰホスホジエステラーゼがより多く存在することを反映している。培養肺動脈筋細胞では、この発見は逆転している。膜に結合したｃＡＭＰ加水分解活性へのＰＤＥ３の貢献はより少ないが、サイトゾルのｃＡＭＰ加水分解活性への貢献はより大きい。
【０２４０】
【表６】
2004536614.tif 000007
ＰＤＥ３は、ｃＧＭＰ濃度が低い場合はヒト心筋のミクロソーム分画中の全ｃＧＭＰ加水分解活性の大部分を占めるが、濃度が高い場合はそうではない。これはおそらく、これらの分画中に他のより低い親和性のｃＧＭＰホスホジエステラーゼが存在していることを反映している。
【０２４１】
ＰＤＥ３は、ヒト心筋のサイトゾル分画中のｃＧＭＰ加水分解活性には比較的わずかしか貢献しない。ＰＤＥ３は、基質の濃度が低い場合も高い場合も、肺動脈筋細胞のミクロソーム分画およびサイトゾル分画のいずれにおいても、全ｃＧＭＰ加水分解活性のうち驚くべきほどわずかしか構成しない。ＰＤＥ３がこれらの細胞の細胞成分分画中で全ｃＧＭＰ加水分解活性より全ｃＡＭＰ加水分解活性に貢献していることを、競合的ＰＤＥ３阻害剤がＰＤＥ３のｃＡＭＰ加水分解活性をｃＧＭＰ加水分解活性より強力に阻害する（表７参照）という状況から見ると、現在利用可能な競合的ＰＤＥ３阻害剤の臨床効果は、心筋細胞および血管筋細胞のいずれにおいても、ｃＧＭＰ含有量の増加よりもｃＡＭＰ含有量の増加によってより高度に媒介される可能性が高いことが示唆される。この推論を、本明細書中で提案する非競合的機構によってＰＤＥ３活性を阻害し得る薬剤について外挿することはできない。後者はＰＤＥ３阻害による細胞作用のプロファイルを変化させ、提案した手法で現在利用可能な療法を越えるさらなる可能な利益を示すかもしれない。
【０２４２】
【表７】
2004536614.tif 000008
（実施例９：ＰＤＥ３Ａアイソフォームのリン酸化部位およびリン酸化の効果）
アミノ酸残基２８８〜２９４（Ｐ１部位）、３０９〜３１２（Ｐ２部位）および４３５〜４３８（Ｐ３部位）への標識による調査によって、ＰＤＥ３Ａ−１３６上のリン酸化部位を特定した。ＰＤＥ３Ａ−１３６上のＰ２およびＰ３部位はそれぞれセリン残基を１つだけ含み、リン酸化される残基は明確である（図１１）。Ｐ１部位は複数のセリン残基を含み、どれがリン酸化されるかは、現在では確実ではない。
【０２４３】
様々なＰＤＥ３アイソフォーム内のＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂ部位に関する違いは、リン酸化による調節の違いを示している。ＰＤＥ３Ａ−１３６およびＰＤＥ３Ｂ−１３７はＰ１、Ｐ２およびＰ３部位を含有しており、したがって潜在的にＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂのいずれによっても調節を受ける対象となる（表４）。ＰＤＥ３Ａ−１１８はＰ２およびＰ３のみを含有しており、したがってＰＫ−Ａにのみ調節され得る（表４）。ＰＤＥ３Ａ−９４はこれらリン酸化部位をどれも含有しておらず、したがってその活性はＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂのいずれによっても調節され得ない。これらＮ末端配列の違いは、他の相互作用パートナーによる調節の相違をもたらすかもしれない。
【０２４４】
ＰＤＥ３ＡのＰ３部位、ならびにＰＤＥ３Ｂ−１３７上の明らかに等価の部位におけるリン酸化の、ホスホジエステラーゼ触媒活性に対する効果を表８に示す。２つのＰＫ−Ａ部位のうちの１つであるＰ３（図４）に変異を有する、Ｆｌａｇタグを付加したｒｔＰＤＥ３Ｂ−１３７アイソフォーム（完全ＯＲＦ）を調製した。これらには、Ｓｅｒ４２１がアラニンに変異している（「Ｓ４２１Ａ」）構成的にリン酸化されない形、およびＳｅｒ４２１がアスパラギン酸に変異している（「Ｓ４２１Ｄ」）構成的にリン酸化されているかのように作用する形が含まれる。アスパラギン酸側鎖の末端上の帯電した基は、ホスホジエステラーゼ活性に対するその効果がリン酸基に似ている。触媒活性および阻害剤感受性に対するＰ３部位リン酸化の効果を調べるために、これらの組換えアイソフォームを対応する野生型ｒｔＰＤＥ３Ｂと共に使用した。ＰＤＥ３触媒活性は、Ｆｌａｇタグを付加したｒｔＰＤＥ３アイソフォーム（完全長ＯＲＦ）を発現しているＳｆ２１細胞を界面活性剤に溶かした溶解物で測定した。Ｖｍａｘ値およびＫｍ値を非線形回帰によって計算した（１次反応速度論（ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ））。抗Ｆｌａｇ抗体を用いた定量的ウエスタン・ブロットによって決定してそれぞれ同じ濃度の免疫反応性ＰＤＥ３を含むように調製物を希釈した。ｒｔＰＤＥ３Ｂの３つのアイソフォームがｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに対して同程度の触媒活性を有することが観察された（表８）。３つのアイソフォームは、シロスタゾールによる阻害に対しても類似の感受性を示した（データ示さず）。これにより、Ｐ３のリン酸化は酵素活性に直接的な影響を与えるとしてもわずかであることが示唆される。
【０２４５】
【表８】
2004536614.tif 000009
ｒｔＰＤＥ３Ｂを使用して、ＰＫ−Ａによる他の部位のリン酸化の効果を調査した。ＰＫ−Ａを用いたこれらアイソフォームのリン酸化は、Ｓ４２１Ａや野生型のｒｔＰＤＥ３Ｂに比べてＳ４２１Ｄではるかに高い活性の刺激を引き起こした（図９）。これらの結果は、Ｐ３と上流のＰＫ−Ａ部位であるＰ２との間の相互作用を示している。Ｐ３のリン酸化は、Ｐ２のリン酸化を促進することによってＰＫ−Ａによる活性の刺激を高めるのかもしれない。野生型ｒｔＰＤＥ３Ｂの刺激がＰ３のＳｅｒ→Ａｓｐ変異より効果が小さいことは、後者の不完全なリン酸化を反映するものかもしれない。あるいは、Ｐ３のリン酸化は、酵素活性に対するＰ２リン酸化の効果を増強するのかもしれない。別の可能性は、Ｐ３のリン酸化が触媒活性に対する阻害効果を有しているが、その効果がＰ２のリン酸化によって覆されるということである。
（実施例１０：部位特異的突然変異およびリン酸化）
ＰＫ−ＡおよびＰＫ−ＢによるＰＤＥ３Ｂ−１３７、ＰＤＥ３Ａ−１３６およびＰＤＥ３Ａ−１１８のリン酸化は、Ｃ末端にトロンビン切断部位に続いてｈｉｓ６タグを有する組換え構築体を使用して検査した。バキュロウイルス・ベクターを用いた感染によって、構築体をＳｆ９細胞中で発現させた。Ｈｉｓ６タグが付き組換えタンパク質をＣｏ２＋アフィニティー・クロマトグラフィー（クロンテックの樹脂）によって精製し、トロンビン切断によってそのｈｉｓ６タグを除去した。ＰＫ−Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびＰＫ−Ｂ（アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））によってｒｔＰＤＥ３をリン酸化した。様々な濃度の精製ｒｔＰＤＥ３を、ナノモル濃度のキナーゼ、飽和濃度の［γ３２Ｐ］ＡＴＰおよびホスファターゼ阻害剤の存在下でインキュベートした。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、確立されたプロトコル（非特許文献１３０）に従って、切り出したＰＤＥ３のバンドにおける３２Ｐの取り込みを定量した。ＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂによるリン酸化のＫｍ値およびＶｍａｘ値を非線形回帰によって計算し、ペプチド基質を対照として（ＰＫ−Ａにはケンプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）、ＰＫ−Ｂにはクロスチド（Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ））標準化した。
【０２４６】
選択したリン酸化部位にＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有するｒｔＰＤＥ３の使用により、個々の部位の単離が可能となる（他の部位をリン酸化不可能にすることによる）。部位間の相互作用も調べることができる。たとえば、ＰＫ−ＢによるＰ１のリン酸化に対するＰＫ−ＡによるＰ２のリン酸化の効果を調べるために、Ｐ２およびＰ３にＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有するｒｔＰＤＥ３を調製する。Ｐ１のＰＫ−Ｂによるリン酸化のＫｍおよびＶｍａｘに対する効果を検査する。
【０２４７】
Ｓｅｒ→Ａｓｐ変異を使用して非生理的人工物を導入してもよい。たとえば、これらは目的細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏではリン酸化されない部位のリン酸化を模倣し得る。この問題を解決するために、タグ付きｒｔＰＤＥ３でトランスフェクションした大動脈筋細胞およびＨＬ−１細胞内における特定部位のリン酸化を調べる。Ｐ１のリン酸化を検査するためには、Ｐ１のＳｅｒ→Ａｌａ変異体でトランスフェクションしたＨＬ−１細胞を陰性対照として使用して、Ｐ２およびＰ３にＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有するＰＤＥ３構築体を用いてＨＬ−１細胞をトランスフェクションする。細胞を３２ＰＯ４３−でプレインキュベートし、β１−アドレナリン受容体およびβ２−アドレナリン受容体の作用剤、フォルスコリン、ＰＧＥ２およびＩＢＭＸ（ＰＫ−Ａを活性化させるため）ならびに／またはＩＧＦ−１±ウォルトマンニン（ＰＫ−Ｂをリン酸化し活性化させるＰＩ３−Ｋを活性化させるため）に曝した。生じた細胞分画からＰＤＥ３を抗ＴＡＧ抗体と共に免疫沈降し、Ｐ１でのリン酸化が起こったかどうか、また他の部位のリン酸化によって影響されるかどうかを決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにかける。その後、免疫反応性ＰＤＥ３への３２Ｐの取り込みを正規化するために定量的ウエスタン・ブロットを行った。この手法は、ある部位のリン酸化が別の部位のリン酸化にｉｎ  ｖｉｖｏ（培養細胞）で影響を与えるかどうかを決定するために使用し得る。この手法は、トランスフェクションされたタンパク質でリン酸化される部位が天然のタンパク質でリン酸化される部位と同じであることが決定づけられている脂肪細胞で確認されている（非特許文献１３１）。
【０２４８】
培養筋細胞中のリン酸化を確認するために２つの類似した手法を使用し得る。まず、リン酸化されたＰ１、Ｐ２およびＰ３ドメインに対応する合成ペプチドに対して抗体を産生させる。上記の調査を、トランスフェクションしていない細胞（放射標識なしで）で繰り返した。細胞ホモジネートでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、リン酸化特異的抗体を使用してウエスタン・ブロットによって個々の部位のリン酸化を確認または反証する。同じ調査を３２ＰＯ４３−とのプレインキュベーション後に行ってもよい。細胞ホモジネートから天然のＰＤＥ３を抗ＣＴ抗体と共に免疫沈降する。これら天然のタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＤＥのバンドを切り出す。タンパク質をゲル物質から抽出し、トリプシン、キモトリプシン、ＣＮＢｒおよび／またはＶ８を用いたタンパク質限定加水分解を行う。生じたペプチド断片を２次元マッピングによって解析するが、対照としてｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化した変異ｒｔＰＤＥ３の２次元ペプチド・マッピングを使用する。これらの比較により、どの部位がＨＬ−１細胞内でリン酸化されるかが明らかになる。
（実施例１１：細胞内局在化に対するリン酸化の効果）
細胞内標的化におけるＮ末端の役割は、培養細胞をｒｔＰＤＥ３構築体でトランスフェクションすることを伴う手法により解明された。この手法は、培養大動脈筋細胞（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ））を、本発明において同定した３つのリン酸化部位にＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有するｈｉｓ６タグまたはＦｌａｇタグ付きＰＤＥ３Ｂ−１３７およびＰＤＥ３Ａ−１１８由来の構築体で安定的にトランスフェクションすることによって拡張可能である。ＰＤＥ３Ａ−９４はどのリン酸化部位も含有していないと考えられるので、含まれていない。
【０２４９】
安定なトランスフェクションのプロトコルでは、ベクターｐＣＤＮＡ３．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用する。このベクターはＣＭＶプロモーターによって駆動され、選択用にネオマイシン耐性要素を含み、発現されたタンパク質にＣ末端ｍｙｃ−ｈｉｓ６タグを付加する。一過性ではなく安定なトランスフェクショを選択するのは、安定な形質転換体でより高レベルのタンパク質発現が観察されることに基づいている（図示せず）。ｒｔＰＤＥ３アイソフォームの細胞内局在化は、フルオロフォア・タグを付加した抗ｈｉｓ６または抗Ｆｌａｇ抗体を使用した間接免疫蛍光法によって決定し得る。同時局在化するかどうかは、様々な細胞内膜のマーカーに対する抗体を使用することに依存している。ＰＤＥ３Ｂ−１３７はＮＨＲ１の膜貫通ヘリックスを含有しており、したがって内在膜タンパク質である可能性が高いので、リン酸化によってＰＤＥ３Ｂ−１３７の移行は誘発されない。しかし、Ｓｅｒ→Ａｓｐ変異の一部の組合せにより、細胞内膜からサイトゾルへのＰＤＥ３Ａ−１１８の移行が誘発される。
【０２５０】
ＰＤＥ３アイソフォームが同一ではなく、細胞内の標的化機構が異なっているかもしれないので、これらの調査の結果は心筋細胞には適用できないかもしれない。このため、上に記載した調査を、心筋細胞または心筋細胞由来の細胞でＰＤＥ３Ｂ−１３７の代わりにＰＤＥ３Ａ−１３６を使用して繰り返してもよい。
（実施例１２：間接免疫蛍光法と細胞内局在化）
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３部位のリン酸化の膜標的ドメインＮＨＲ１およびＮＨＲ２ならびに細胞内局在化に対する効果を調査した。細胞内標的化におけるＰＤＥ３のＮ末端の役割は、培養細胞にｒｔＰＤＥ３構築体をトランスフェクションし、これらｒｔＰＤＥ３構築体の細胞内局在化を間接免疫蛍光法により可視化することによって解明した。ＣＯＳ−７細胞にＣ末端Ｆｌａｇタグと様々なＮ末端欠失とを有するＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂ構築体をトランスフェクションし、フルオレセインで標識した抗Ｆｌａｇ抗体を使用して局在化を可視化した。ＮＨＲ１を含有している構築体は膜に結合していることが判明した（図示せず）。ＮＨＲ１を欠いているがＮＨＲ２を含有している構築体は一部膜に結合しており、一部サイトゾルに存在し、ＮＨＲ１およびＮＨＲ２のどちらも欠いている構築体はもっぱらサイトゾルに存在していた（図示せず）。以上の分布は、ヒト心筋および大動脈筋細胞中の天然型ＰＤＥ３の分布と一致している。
【０２５１】
この手法を広げるために、培養大動脈筋細胞（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）［米国ニュージャージー州イーストラザフォード（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ）所在］）に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３のＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂリン酸化部位にＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有する、Ｆｌａｇタグを付加したＰＤＥ３Ｂ−１３７由来およびＰＤＥ３Ａ−１１８由来の構築体をトランスフェクションしてもよい。安定なトランスフェクションでは、転写ベクターｐＣＤＮＡ３．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）を利用する。ｐＣＤＮＡベクターはＣＭＶプロモーターによって駆動され、選択用にネオマイシン耐性配列を含み、発現されたタンパク質にＣ末端Ｆｌａｇタグを付加する。変異したリン酸化部位を有するｒｔＰＤＥ３アイソフォームの細胞内局在化は、フルオロフォア・タグを付加した抗Ｆｌａｇ抗体を使用した間接免疫蛍光法によって決定し得る。同時局在化するかどうかは、様々な細胞内膜のマーカーに対する市販の抗体を使用することに依存している。
【０２５２】
血管筋細胞における結果は心筋細胞に適用できないかもしれない。２つの細胞種中のＰＤＥ３アイソフォームは同一ではなく、細胞内の標的化機構が異なっているかもしれない。このため、上に記載した調査を、心房筋細胞由来の不死化細胞株であるＨＬ−１細胞で繰り返してもよい（非特許文献１３２）。ウエスタン・ブロットにより、これらの細胞から調製した細胞成分分画中のＰＤＥ３アイソフォームの発現がヒト左心室心筋由来の調製物で見られるものと類似していることが示され、これにより、これらの細胞が上記実験に特に適切なものとなる。細胞性発現の様々なパターンを反映させるために、ＨＬ−１細胞のトランスフェクションをＰＤＥ３Ａ−１３６由来ではなくＰＤＥ３Ｂ由来の構築体を用いて行う。このトランスフェクションは一過性であっても安定であってもよい。一過性トランスフェクションによるＰＤＥ３構築体を用いたトランスフェクション効率は高いので、ｒｔＰＤＥ３アイソフォームの安定なトランスフェクションの必要性はない。
（実施例１３：タンパク質−タンパク質相互作用）
ＰＫ−ＢとＰＤＥ３Ｂとの相互作用を検査した。３Ｔ３脂肪細胞（ＰＤＥ３Ｂを発現する）のミクロソーム分画をＮＰ−４０に溶かし、ゲル濾過によって分画した。ウエスタン・ブロットにより、ＰＤＥ３ＢおよびＰＫ−Ｂの分離したピークの存在が示されたが、ＰＫ−Ｂの一部がＰＤＥ３Ｂにピーク中に見つかった（図示せず）。ＰＫ−ＢとＰＤＥ３Ｂとの間の会合は、抗ＰＤＥ３Ｂ抗体がＰＤＥ３Ｂピーク中の２つのタンパク質と免疫共沈降しうることによって確認された（図示せず）。インスリンを用いた処理によりＰＫ−Ｂのリン酸化が増大し、ＰＤＥ３Ｂと同時精製されるＰＫ−Ｂの割合を増加させていると考えられた（図示せず）。これらの結果により、ＰＫ−ＢおよびＰＤＥ３Ｂが直接の相互作用または別のタンパク質との同時相互作用のどちらかによってｉｎ  ｖｉｖｏで安定な複合体を形成することが示唆される。
【０２５３】
ｒｔＰＫ−Ｂを発現しているＳｆ９細胞を界面活性剤に溶かした溶解物を、Ｆｌａｇタグを付加した形態の２つのＰＤＥ３Ｂのうち１つを発現しているＳｆ９細胞を界面活性剤に溶かした溶解物と混合した。ＰＤＥ３Ｂの第１アイソフォームは、その完全ＯＲＦを含んでいた。第２アイソフォームは、ＮＨＲ１、ＮＨＲ２および３つのリン酸化部位を含有するＮ末端の６０４アミノ酸を欠いていた。ＰＫ−Ｂは完全長ｒｔＰＤＥ３Ｂの存在下で抗Ｆｌａｇ抗体と免疫共沈降することが可能であったが、Ｎ末端が欠失したｒｔＰＤＥ３Ｂの存在下では免疫共沈降できず（図１０）、これにより、ＰＫ−Ｂとの会合におけるＰＤＥ３ＢのＮ末端の役割が確認された。
【０２５４】
Ｆｌａｇタグ付きｒｔＰＤＥ３Ｂを３Ｔ３溶解物に加えることにより、ＰＫ−ＡおよびＰＰ１（非特許文献１３３）を同時局在化させるＡＫＡＰ２２０の免疫共沈降が可能となった。これは、他のタンパク質と相互作用することが、ＰＤＥ３を特異的なシグナル伝達モジュールに局在させる役割を果たしていることを示しており、また、これらの相互作用を遮断することによりＰＤＥ３の機能が変化することを示唆している。
（実施例１４：ＰＤＥ３のキナーゼ、ホスファターゼおよび結合ペプチド／相互作用パートナーの同定）
精製されたｒｔＰＤＥ３を、心筋および血管平滑筋のファージ・ディスプレイｃＤＮＡライブラリからの相互作用クローニングによってＰＤＥ３結合タンパク質（「ＰＤＥ３−ＢＰ」）を同定するための親和性リガンドとして使用してもよい。この手法は、ファージ・ディスプレイｃＤＮＡライブラリを調製する工程、およびｒｔＰＤＥ３を用いてバイオパニングする工程の、２つの基本的な工程を含む。
【０２５５】
（ファージ・ディスプレイｃＤＮＡライブラリの調製）
ただ１つの制限部位を有するベクター（心臓にはλＴｒｉｐｌＥｘ、大動脈にはλｇｔ１０）由来のプライマーを使用して、市販のヒト心臓由来（ＸｂａＩ−（ｄＴ）１５プライマー法）および大動脈由来（オリゴ（ｄＴ）およびランダムプライマー法）のｃＤＮＡ挿入物のライブラリ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［米国カリフォルニア州パロ・アルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在］）をＰＣＲ増幅する。これらのライブラリは、比較的低い量で発現されるＰＤＥ３アイソフォームをクローニングするために使用されてきた。ＰＣＲ産物をアガロース・ゲルでサイズ分画する。５００ヌクレオチド長より大きい生成物をアガロース・ゲル電気泳動によって精製し、ただ１つの制限部位を使用してファージ外被タンパク質の遺伝子内にライゲーションする。ｃＤＮＡ挿入物によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片がファージの表面に提示される。
【０２５６】
増殖上の生態の異なる２つのファージを使用する。１つは、細菌ペリプラズム内での組立後に分泌される非溶菌性のファージ、Ｍ１３である。最大１０００アミノ酸長までのｃＤＮＡ挿入物を、Ｍ１３のｐＶＩ外被タンパク質のＣ末端融合物として発現可能である。使用したプロトコルは、（非特許文献１３４）に開示されている。ヒト心臓および大動脈のｃＤＮＡライブラリをｐＶＩ内に挿入するために同ベクターとプロトコルとを使用する。第２のファージはＴ７である（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）［米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在］）。このファージは溶菌性であり、Ｍ１３とはまったく異なったプロセッシングが行われるので、Ｍ１３の機能を妨げるｃＤＮＡ挿入物はＴ７に影響を与えない可能性が高い（逆もまた同様）。Ｔ７は最大１２００アミノ酸長までのｃＤＮＡ産物を提示する能力を有している。その使用方法は（非特許文献１３５）に開示されている。
【０２５７】
（ｒｔＰＤＥ３を用いたバイオパニング）
ｃＤＮＡ挿入物を有するファージを、直接ポリスチレン・ウェル上に固定化されるかまたはＣ末端ｈｉｓ６タグが抗ｈｉｓ６ｍＡｂに結合することによって間接的に固定化されたｒｔＰＤＥ３と共にインキュベートし、次いで免疫沈降する。ｃＤＮＡ挿入物に完全長または切断されたＰＤＥ３−ＢＰがコードされているファージをＰＤＥ３と共に固定化し、その後溶出させて大腸菌中で増幅させる。この手順を一巡するごとに、ＰＤＥ３結合タンパク質をコードしているｃＤＮＡが濃縮されたファージ・ライブラリがもたらされる。固定化したＰＤＥ３に結合するファージの力価がバックグラウンド（ＰＤＥ３を存在させない場合にウェルに結合するファージ）より１０倍高くなるまでバイオパニングを数回繰り返し、この時点で個々のファージ・コロニーをクローニングし、そのｃＤＮＡ挿入物をシークエンシングする。
【０２５８】
ファージをｒｔＰＤＥ３と共にバイオパニングする。ｒｔＰＤＥ３Ａ−１１８およびｒｔＰＤＥ３Ａ−９４は、心臓および大動脈のライブラリのいずれにも使用する。ＰＤＥ３Ｂ−１３７およびＰＤＥ３Ａ−１３６は、それぞれ大動脈および心臓ライブラリにのみ使用する。リン酸化されたＰＤＥ３に優先的に結合するタンパク質、たとえばホスファターゼを選択する平行実験における囮として使用するために、ＰＫ−Ａおよび／またはＰＫ−ＢならびにＡＴＰγＳを用いてチオリン酸化ｒｔＰＤＥ３を調製する。ホスホチオエステルは脱リン酸化に耐性があり、したがって、チオリン酸化されたタンパク質はタンパク質ホスファターゼに安定に結合する。
【０２５９】
バイオパニングによって同定し、クローニングしたｃＤＮＡ配列を使用して、タンパク質データベースを探索して完全長のＰＤＥ３結合タンパク質を同定してもよい。
当分野の技術者には、上述の方法を使用して新規のアイソフォーム選択的なＰＤＥ３阻害剤または活性化剤が同定可能であることが認識されよう。精製したアイソフォーム・タンパク質は、短いペプチドをコードしている無作為な核酸配列を含む一般的なファージ・ディスプレイ・ライブラリをバイオパニングするためのリガンドとして使用される。１つまたは複数のＰＤＥ３アイソフォームに比較的高い親和性で結合するファージを選択し、そのＤＮＡ挿入物をシークエンシングする。コードされているペプチドを化学合成し、同ペプチドがＰＤＥ３触媒活性を活性化または阻害する能力、あるいは触媒活性に対するＰ１、Ｐ２またはＰ３のリン酸化の効果を遮断または模倣する能力を、標準的な酵素分析を使用して検査する。同定された活性化剤または阻害剤の各ＰＤＥ３アイソフォームに対する効果を決定し、アイソフォーム選択的な化合物を同定する。構成的にリン酸化不可能であるように、またはＰ１、Ｐ２およびＰ３が構成的にリン酸化された残基を模倣するように設計された、部位特異的突然変異を導入したアイソフォームの使用により、各アイソフォームのリン酸化変異体または脱リン酸化変異体に選択的な活性化剤または阻害剤が同定される。
（実施例１５：結合相互作用およびＰＤＥ３機能に対する効果の特性解析）
（クローニングされたＰＤＥ３−ＢＰ候補のＰＤＥ３への結合の確認）
結合相互作用は免疫共沈降によって確認されるが、免疫共沈降は４つの方法のいずれでも起こり得る。第１に、抗ＰＤＥ抗体を使用して天然型のＰＤＥを心臓および大動脈筋細胞の溶解物から免疫沈降し、免疫共沈降をクローニングしたＰＤＥ−ＢＰに対して産生させた抗体を使用したウエスタン・ブロットによって確認する。第２の方法では、使用する抗体の順序を逆にする。したがって、クローニングしたＰＤＥ３−ＢＰに対する抗体を免疫沈降に使用し、免疫共沈降は抗ＰＤＥ３抗体を使用したウエスタン・ブロットによって確認する。第３に、大動脈筋細胞またはＨＬ−１細胞にＦｌａｇタグを付加したｒｔＰＤＥ３−ＢＰをトランスフェクションし、次いで免疫共沈降および抗Ｆｌａｇ抗体を用いたウエスタン・ブロットを行う。最後に、タグ付きｒｔＰＤＥ３およびｒｔＰＤＥ３−ＢＰを、網状赤血球の溶解物中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって、またはバキュロウイルス／Ｓｆ９系内で発現させる。組換えタンパク質を共にインキュベートし、ＡＫＡＰ−２２０の場合と同じように免疫共沈降を試験するが、この方法は本明細書中の他の箇所に記載してある。
【０２６０】
（結合相互作用およびＰＤＥ３機能に対する効果の特性解析）
ＰＤＥ３と様々な結合タンパク質またはペプチドとの間の相互作用の親和性（ＫＤ）は、固定化したｒｔＰＤＥ３およびｒｔＰＤＥ３−ＢＰ（大腸菌またはＳｆ９／Ｓｆ２１細胞中での発現によって得た）を使用したＥＬＩＳＡによって決定し得る。ｒｔＰＤＥ３の触媒活性および阻害剤感受性に対するｒｔＰＤＥ３−ＢＰの効果を、上に記載のように決定する。ＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｒｔＰＤＥ３のリン酸化に対するＰＤＥ３−ＢＰの効果を、上に記載のように決定する。Ｓｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ→Ａｓｐ変異を有するｒｔＰＤＥ３は、特異的部位のリン酸化がＰＤＥ３−ＢＰとの相互作用にどのように影響を与えるかを決定するために使用する。
【０２６１】
ＰＤＥ３および／またはＰＤＥ３−ＢＰの欠失突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発によってＰＤＥ３の相互作用ドメインおよびその結合パートナーを同定する。相互作用ドメイン由来のペプチドを、ＰＤＥ３／ＰＤＥ３−ＢＰ相互作用の阻害について検査する。ＰＤＥ３／ＰＤＥ３−ＢＰ相互作用の阻害は、ＥＬＩＳＡによって、または結合の機能相関の阻害を測定することによって検査される。たとえば、ＰＤＥ３−ＢＰへの結合によりｃＡＭＰに対するＰＤＥ３のＫｍが増加する場合、ペプチドがこの増加を阻止する能力が測定される。別例として、ＰＤＥ３−ＢＰの効果を模倣するペプチドはＰＤＥ３の活性化剤であり得る。どちらに分類されるペプチドも、潜在的な治療剤として重要であり、ペプチド擬態（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）薬物の鋳型またはハイスループット・スクリーニングのレポーターとして役立ち得る。
【０２６２】
上記から派生したファージ・ディスプレイ実験由来のペプチドについても、ＰＤＥ３のＰＤＥ３−ＢＰへの結合を遮断する能力、またはＰＤＥ３の触媒活性もしくは阻害剤感受性に対するＰＤＥ３−ＢＰの効果を模倣する能力のいずれかについて試験する。
【０２６３】
ＰＤＥ３−ＢＰに対するＰＤＥ３の親和性を定量するために、精製したｒｔＰＤＥ３およびｒｔＰＤＥ３−ＢＰ（大腸菌またはＳｆ９／Ｓｆ２１細胞中での発現によって得た）を使用した表面プラズモン共鳴（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在］）を行う。一般に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）では、異なる屈折率の２つの媒体間の境界面での導電膜から反射される光を使用する。この場合、媒体は生物試料およびセンサ・チップのガラスである。導電膜はセンサ・チップ表面上の薄い金の層である。生物試料中の分子がセンサ・チップの表面に結合すると、チップ表面での濃度（したがって屈折率）が変化し、ＳＰＲ応答が検出される。ここでは、ｈｉｓタグを付加したｒｔＰＤＥ３が、バイオセンサ・チップのフロー・セル表面上に固定化された抗ｈｉｓモノクローナル抗体によって捕捉される。一連の濃度のｒｔＰＤＥ３−ＢＰ（Ｓｆ９細胞中で発現され、上に記載のように精製したもの）をこれの上で灌流し、表面プラズモン共鳴を使用してＫＤ値を決定する。
【０２６４】
（ＰＤＥ３およびＰＤＥ３−ＢＰの間の相互作用に対するリン酸化の効果）
ＰＤＥ３およびＰＤＥ３−ＢＰの間の相互作用に対する特定部位のリン酸化の効果を決定するために、３つのリン酸化部位Ｐ１、Ｐ２およびＰ３でのＳｅｒ→ＡｌａおよびＳｅｒ−Ａｓｐ変異を有するｒｔＰＤＥ３を使用して、表面プラズモン共鳴実験を上記のように実施する。上に記載した反応のＫＤに対するこれら変異の効果を決定する。ＰＤＥ３−ＢＰが存在するまたは存在しない場合の、ＰＫ−ＡおよびＰＫ−ＢによるＰ１、Ｐ２およびＰ３のリン酸化の反応速度も決定する。
【０２６５】
任意の新しいＰＤＥ３キナーゼがＰ１、Ｐ２およびＰ３をリン酸化する能力を、上に記載のようにＰＫ−ＡおよびＰＫ−Ｂについて検査してもよい。
ＰＤＥ３ホスファターゼがＰ１、Ｐ２およびＰ３を脱リン酸化する能力も決定し得る。これには、１つを除きすべてのリン酸化部位にＳｅｒ→Ａｌａ変異を有するｒｔＰＤＥ３の使用を伴う。これらのｒｔＰＤＥ３を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび適切なキナーゼ（たとえばＰＫ−ＡまたはＰＫ−Ｂ）の存在下でリン酸化させる。ホスファターゼ存在下における３２Ｐの放出を、ＶｍａｘおよびＫｍに関して特性解析する。その後、Ｓｅｒ→Ａｓｐ変異を有するｒｔＰＤＥ３を使用して、ある部位のリン酸化が別の部位の脱リン酸化に与える効果を決定する。
【０２６６】
ＰＤＥ３−ＢＰが存在しない場合および存在する場合の環状ヌクレオチドの加水分解を測定することによって、触媒活性、基質優先度、および阻害剤感受性に対するＰＤＥ３−ＢＰの相互作用の効果を決定する。ＰＤＥ３／ＰＤＥ３−ＢＰの相互作用の機能上のＫ値を決定し、表面プラズモン共鳴によって決定されたＫＤ値と比較する。
【０２６７】
（ＰＤＥ３およびＰＤＥ３−ＢＰの相互作用ドメインの同定）
ＰＤＥ３およびＰＤＥ３−ＢＰの相互作用ドメインの同定は、ＰＤＥ３および／またはＰＤＥ３−ＢＰの欠失突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発によって行う。いくつかの方面の証拠により、心筋細胞中の細胞内ｃＡＭＰ含有量が区画非選択的に増加することにより、拡張型心筋症に有益な効果および有害な効果の両方をもたらすことが示唆される。異なる細胞内区画内に局在化した個々のＰＤＥ３アイソフォームを選択的に活性化または阻害する能力、あるいはｃＡＭＰまたはｃＧＭＰに対する活性に選択的に影響を与える能力を有する薬剤は、治療用途における主要な利点を提供し得る。ＰＤＥ３とＰＤＥ３−ＢＰとの相互作用を遮断または妨げるペプチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能的な因果関係を同定するために使用し得る。あるいは、ＰＤＥ３−ＢＰの効果を模倣するペプチドはＰＤＥ３の活性化剤であるかもしれない。どちらに分類されるペプチドも、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＤＥ３アイソフォームの機能を調査するための有用な手段であろうし、治療剤のプロトタイプとして重要であるかもしれない。これらは、ペプチド擬態薬物の鋳型として役に立ち得るし、またはハイスループット・スクリーニングのレポーターとして使用するためにタグを付加してもよい。
（実施例１６：ＰＤＥ３Ａ１のｓｉＲＮＡ阻害）
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）のＲＮＡホスホアミダイトおよびチミジン・ホスホアミダイト（プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）［ドイツ所在］）の化学反応を使用して２１−ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製する。ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、ヒト心筋ＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡ配列（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００９２１号）のヌクレオチド配列−２６８〜−２４１に対応する。この配列はＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１８）中の５’非翻訳領域内に位置しており、ＰＤＥ３Ａ２（配列番号１５）中には存在しない。したがって、これはＰＤＥ３Ａ−１３６タンパク質の発現の阻害に特異的であるはずである。
【０２６８】
ｒｔＰＤＥ３Ａ１を発現しているＳｆ２１細胞を、ＴＮＭ−ＦＨ培地（ビー・ディー・ファーミンゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）中で３７℃で増殖させる。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、１．０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションを、製造者の説明どおりに行う。トランスフェクション後、細胞を２０時間インキュベートし、ノーザン・ブロットによってｒｔＰＤＥ３Ａ１の発現をアッセイする。ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションでは、Ｓｆ２１細胞におけるｒｔＰＤＥ３Ａ１発現の完全な阻害がもたらされることが観察される。無作為な２１ｂｐのｓｉＲＮＡ配列をトランスフェクションした対照の細胞では、ｒｔＰＤＥ３Ａ１発現に対する効果はまったく示されない。
（実施例１７：アイソフォームに特異的なプローブおよびアンチセンス構築体）
本発明の特定の実施形態では、アイソフォームに特異的なプローブを構築し、たとえば様々な細胞や組織中のＰＤＥ３アイソフォームの発現レベル、または推定される様々な阻害剤や活性化剤に応答したＰＤＥ３アイソフォームの発現レベルを決定するために、ｍＲＮＡを対象としたハイスループット・スクリーニング・アッセイなどで使用し得る。ＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１５）の下流（３’）部分は同一らしいので、アイソフォームに特異的なプローブおよび／またはアンチセンス構築体が利用可能な領域はＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）の５’末端にしかない。ＰＤＥ３Ａ−１３６アイソフォーム・タンパク質をコードしているｍＲＮＡに特異的な例示的なプローブを以下に開示する。
【０２６９】
【化１】
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このプローブ配列はＰＤＥ３Ａ１（配列番号１４、配列番号１８）のヌクレオチド−２６８〜１８９に対応し、ヌクレオチド１がＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡ配列（配列番号１４）の最大の読み枠（ＯＲＦ）の第１ＡＴＧコドンから開始されている。このプローブ配列（配列番号１３）は、主にＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡのエキソン１内に位置しており、５’ＵＴＲから開始され、ＮＨＲ１配列の直前で終わっている。このプローブをＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡから作製する、または試料ＲＮＡから標的配列を増幅するために、以下に開示するプライマーを使用しうる。
【０２７０】
センス鎖：ＴＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＴＴＴＴＣ（配列番号１６）
アンチセンス：ＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧＡＧ（配列番号１７）
当分野の技術者には、上に開示したアイソフォーム特異的なプローブおよびプライマーの、数多くの潜在的な用途が存在することが分かるであろう。たとえば、正常な個体または心筋症および／もしくは肺高血圧症などの疾病状態にある個体のいずれかの、様々な細胞または組織における、ＰＤＥ３Ａ１の発現を測定することが可能である。無処置の細胞内でのＰＤＥ３Ａ１の発現に対する、様々な推定活性化剤または推定阻害剤の効果を、ハイスループット・スクリーニング・アッセイの一部として決定し得る。別例として、ＰＤＥ３Ａ１のｍＲＮＡ（配列番号１４、配列番号１８）のみに結合するように、アンチセンス構築体、リボザイムおよび／またはｓｉＲＮＡ阻害剤を設計することが可能である。このような阻害剤はＰＤＥ３Ａ−１３６の活性を低下させる一方で、ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４の活性は影響を受けないままである。配列番号１３がＰＤＥ３Ａ１のｃＤＮＡの部分配列を表しているので、当分野の技術者には、アンチセンス構築体が、配列番号１３の配列の一部またはすべてと相補的、好ましくは完全に相補的であるように設計されることを理解されよう。このような構築体をプロモーターに機能的にカップリングされている２本鎖ＤＮＡ配列として設計し、標的細胞中にトランスフェクション可能な発現ベクター内に挿入し得る。哺乳動物細胞で有用な発現ベクターは、上に要約したように、当分野で周知である。
【０２７１】
本明細書中で開示し、特許請求の範囲に記載しているすべての組成物、方法および装置は、本開示に照らして、過度の実験をすることなしに作製かつ実行し得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点から記載したが、当分野の技術者には、本発明の概念、思想および範囲から逸脱せずに本明細書中に記載した組成物、方法および装置、ならびに方法中の工程または工程の順序に変更を加えてもよいことが明らかであろう。より具体的には、化学的かつ生理的に関連する特定の薬剤で本明細書中に記載した薬剤を置き換えても、同じまたは類似の結果が得られることが明らかであろう。当分野の技術者に明らかであるこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０２７２】
（参照文献）
以下の参照文献は、これらが本明細書中に述べた例示的な手順上またはその他の詳細を補足するような例示的な手順上または他の詳細を提供する限りにおいて、引用により特に本願明細書に援用する。
【０２７３】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達におけるＰＤＥ３の役割を示す図。ＰＫ−Ａ：ｃＡＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ；ＰＫ−Ｇ：ｃＧＭＰ依存性プロテイン・キナーゼ。
【図２】心筋細胞中のＰＫ−Ａの基質を示す図。ＡＫＡＰ：ＰＫ−Ａ（「Ａキナーゼ」）アンカー・タンパク質；ＣＲＥＢ：ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質；Ｇｌｙ  Ｓｙｎ：グリコーゲン合成酵素；Ｐｈ  Ｋ：ホスホリラーゼ・キナーゼ；ＰＩ３−Ｋ：ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ；ＰＬ：ホスホランバン；Ｒｙ：リアノジン；ＳＥＲＣＡ：筋小胞体／小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ；Ｔｎ：トロポニン；ＴＭ：トロポミオシン。
【図３】選択的転写によるＰＤＥ３ＡのｍＲＮＡの生成を示す図。影付きの四角は、ＰＤＥ３Ａのエキソンを表す。
【図４】ＮＨＲ１およびＮＨＲ２、ＩＮＳを有するＣＣＲ、ならびにＰＫ−ＢおよびＰＫ−Ａ部位（「Ｂ」、「Ａｕｐ」ならびに「Ａｄｏｗｎ」）を示す、ＰＤＥ３ＡおよびＰＤＥ３Ｂの読み枠の機能トポグラフィーを示す図。点線の間の数値は、相同領域のアミノ酸配列の同一性（％）を表す。
【図５Ａ】ｒｔＰＤＥ３Ａ１（ＰＤＥ３Ａ１の完全なＯＲＦ産物を含む）ならびにヒト心筋のミクロソームおよびサイトゾル分画のウエスタン・ブロットを示す図。ｒｔＰＤＥ３Ａ１の完全長の読み枠ＯＲＦを発現しているＳｆ２１細胞の溶解物（１．０μｇ／レーン）ならびにヒト心筋のミクロソームおよびサイトゾル分画（それぞれ５０および２０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、電気泳動によってニトロセルロース膜に移しとり、抗ＮＴ、抗ＭＩＤおよび抗ＣＴ抗体を使用してウエスタン・ブロットを行った。
【図５Ｂ】ＰＤＥ３Ａ１の完全長ＯＲＦ上における抗ＮＴ、抗ＭＩＤおよび抗ＣＴ結合部位の位置を示す図。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラムを示す、［３５Ｓ］で標識したｒｔＰＤＥ３Ａタンパク質の分子量の比較、ならびに同一ゲルから調製した膜の記載の抗体を用いたウエスタン・ブロットにより同定された天然の心臓型および大動脈型ＰＤＥ３Ａアイソフォームを示す図。オートラジオグラムの下の数字は、ＰＤＥ３Ａ由来の構築体の開始コドンを示す。
【図７】心臓型および大動脈型ＰＤＥ３Ａアイソフォームの生成を示す図。ＰＤＥ３Ａ１およびＰＤＥ３Ａ２のｍＲＮＡは選択的転写によって生成した。ＰＤＥ３Ａ１は心筋細胞でのみ発現される。ＰＤＥ３Ａ２は心筋細胞および大動脈筋細胞のいずれにおいても発現される。ＰＤＥ３Ａ−１３６はＰＤＥ３Ａ１から翻訳される。ＰＤＥ３Ａ−１１８およびＰＤＥ３Ａ−９４はＰＤＥ３Ａ２内の選択的な部位から翻訳される。「ｍＲＮＡ」内の数字は開始コドンを示す。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３はリン酸化部位を示す。
【図８】ミルリノンによる、ｒｔＰＤＥ３Ａ１（Ｓｆ９の溶解物中）ならびにヒト心筋のサイトゾル分画およびミクロソーム分画のｃＡＭＰ加水分解活性の阻害を示す図。
【図９】ＰＫ−ＡによるｃＧＭＰ加水分解活性の刺激を示す図。ｒｔＰＤＥ３Ｂアイソフォーム（野生型、Ｓｅｒ→Ａｌａ変異、Ｓｅｒ→Ａｓｐ変異を含む完全長ＯＲＦ）を発現しているＳｆ２１細胞を界面活性剤で可溶化した溶解物を調製し、ＰＫ−ＡおよびＡＴＰの存在下または非存在下でインキュベートした後、０．０３μＭのｃＧＭＰでｃＧＭＰ加水分解活性を決定した。値は、平均値±標準偏差を表す（各組の値は、単一の調製物からのデータを表す）。
【図１０】ｒｔＰＫ−ＢおよびｒｔＰＤＥ３Ｂの免疫共沈降を示す図。ｒｔＰＤＥ３Ｂのアミノ酸配列を１番上に示した。ｒｔＰＤＥ３Ｂを感染させたＳｆ９細胞を界面活性剤で可溶化した溶解物を、ｒｔＰＫ−Ｂで感染させたＳｆ９細胞からの溶解物と混合した。抗ＰＤＥ３Ｂ抗体を用いてタンパク質を免疫沈降し、抗ＰＤＥ３Ｂおよび抗ＰＫ−Ｂ抗体を用いてウエスタン・ブロットに供した。ＰＫ−Ｂは完全長のｒｔＰＤＥ３Ｂと共沈降するが、不完全なｒｔＰＤＥ３Ｂとは共沈降しない。９２ｋＤａのバンドが何であるかは知られていない。
【図１１】ＰＤＥ３Ａの読み枠を示す図（配列番号１４参照）。３つのアイソフォームにおける見かけのＮ末端メチオニン残基を太字で示す。これらは、ＰＤＥ３Ａ−１３６（アミノ酸１４６）、ＰＤＥ３Ａ−１１８（アミノ酸３００）およびＰＤＥ３Ａ−９４（アミノ酸４８４または４８５）である。ＰＤＥ３Ａアイソフォーム上のリン酸化部位を下線で示す。これらは、Ｐ１（アミノ酸２８８〜２９４）、Ｐ２（アミノ酸３０９〜３１２）およびＰ３（アミノ酸４３５〜４３８）である。
【図１２】［３５Ｓ］ｒｔＰＤＥ３Ａタンパク質ならびに天然の心臓型および大動脈型ＰＤＥ３Ａアイソフォームの見かけの分子量の比較を示す図。ｒｔＰＤＥ３Ａアイソフォームは、ＰＤＥ３Ａ１のＯＲＦ内の異なるイン・フレームＡＵＧコドンから翻訳されるように設計された５’欠失を有する構築体から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって生成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004536614.tif 000179
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