(57)【要約】本発明は、プロモーター、上記プロモーターを含むＤＮＡ断片、および特にＧタンパク質結合型受容体上の活性効果または抑制効果を示す物質を同定するための方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造遺伝子に機能的に連結される場合にその転写を調節するサッカロミセスセレビシエ ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子プロモーターを含む組換えＤＮＡ断片。
【請求項２】
以下のＤＮＡ配列：
2004513656.tif 000003
を有するプロモーターを含む組換えＤＮＡ断片。
【請求項３】
構造遺伝子に機能的に連結し、そしてその発現を調節するプロモーターおよび構造遺伝子を含む請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ断片。
【請求項４】
構造遺伝子がリポーター遺伝子をコードする請求項３に記載の組換えＤＮＡ断片。
【請求項５】
リポーター遺伝子がｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＧＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ＨＩＳ ３、ＵＲＡ ３、ＴＲＰ１およびＬＥＵ２から選択される請求項４に記載の組換えＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ断片を含むＤＮＡベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ断片を含む組み換えＳ． セレビシエ細胞。
【請求項８】
ｃ）ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターの制御下にある１つまたはそれ以上のリポーター遺伝子を含みかつ異種Ｇタンパク質結合型受容体を発現する組換えＳ． セレビシエ細胞を生産し、
ｄ）上記細胞を、研究される物質と共に培養し、そして
ｅ）リポーター遺伝子転写の変化を測定する、
Ｇタンパク質結合型受容体のアクチベーターを同定する方法。
【請求項９】
ａ）ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターの制御下にある１つまたはそれ以上のリポーター遺伝子を含みかつ異種Ｇタンパク質結合型受容体を発現する組換えＳ． セレビシエ細胞を生産し、
ｂ）上記細胞を、研究される物質と共に培養し、そして
ｃ）リポーター遺伝子転写の変化を測定する、
Ｇタンパク質結合型受容体のインヒビターを同定する方法。
【請求項１０】
異種タンパク質の構造遺伝子が、ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターに機能的に連結され、そしてその制御下で発現される、Ｓ．セレビシエにおいて異種タンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
ａ）ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーター制御下で１つまたはそれ以上のリポーター遺伝子を含む組換えＳ． セレビシエ細胞を生産し、
ｂ）そして上記細胞は、変異性の異種Ｇタンパク質結合型受容体を発現し、この変異が構成的に活性なＧタンパク質結合型受容体を生じ、
ｃ）上記細胞を、活性化物質または抑制化物質と共に培養し、そして
ｄ）リポーター遺伝子転写の変化を測定する、
Ｇタンパク質結合型受容体の構成的に活性な変異体を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プロモーター、上記プロモーターを含むＤＮＡ断片、および特にＧタンパク質結合型受容体に対して活性化作用または抑制化作用を示す物質を同定するための方法におけるその使用に関する。
【０００２】
ＧＰＣＲｓ（Ｇタンパク質結合型受容体）は、構造的および機能的に連結された膜貫通型タンパク質の遺伝子ファミリーを形成する。ＧＰＣＲｓは、医学研究および薬理学的活性物質の開発のために大きな重要性をもつ標的分子であり、病理学の多くで重要な地位を占める（Ｓｔａｄｅｌら、１９９７）。喘息の薬理学的治療におけるＧＰＣＲｓの中心的な位置付けの古典的な例は、β２ＡＲ（β２−アドレナリン作動性受容体）またはカポジ肉腫（ＫＳ）関連ヘルペスウィルスＧＰＣＲのＫＳ病因との関係である（Ｇｅｒａｓ−Ｒａａｋａら、１９９８）。受容体のこのクラスは、広範囲のリガンド、例えばタンパク質ホルモン、ケモカイン、ペプチドまたは二価カチオンを結合する。従って、Ｇタンパク質結合型受容体のアクチベーターおよびインヒビターの同定は、疾患のより良い理解および治療への最も有望な方法の１つである（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。
【０００３】
ＧＰＣＲシグナル伝達経路の多くの構成要素は、パン酵母のサッカロミセスセレビシエのＧＰＣＲシグナル伝達経路においてオルソログな（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）構成要素を有する。接合因子（フェロモンαまたはフェロモンａ）による刺激作用は、例えばフェロモン依存分裂促進物質活性化タンパク質キナーゼカスケード（以下ＭＡＰＫカスケードと示される）を活性化する（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ， １９９９）。酵母のこの特性は、関連するＧＰＣＲのアクチベーターもしくはインヒビターまたは対応するシグナル伝達経路を調査するために、酵母モデルにおいて哺乳動物ＧＰＣＲ、特にヒトＧＰＣＲを検定するために利用できる。なぜなら特に、外来種のＧＰＣＲｓが酵母において機能的に発現され、この導入されたＧＰＣＲが特定のリガンドによって活性化され、そしてこのシグナルが酵母ＭＡＰＫカスケードに伝達されると、酵母ＭＡＰＫカスケードを介して測定可能な細胞反応を生じることができるからである。これまでなんの機能もあるとは考えられていなかったＧＰＣＲ、「孤立（ｏｒｐｈａｎ）ＧＰＣＲｓ」のアクチベーターまたはインヒビターの研究に、特に関心がもたれる。
【０００４】
フェロモンαおよびａは、Ｓ． セレビシエにおいて、内因性Ｇタンパク質結合型受容体を介してＳｔｅｐ２及びＳｔｅｐ３に作用する（Ｇｕｓｔｉｎら、１９９８）。この関連において、フェロモンαは、フェロモン依存ＭＡＰＫカスケードに直接作用して、このことにより特定のＳ． セレビシエ遺伝子の発現を調節する。ある物質が、Ｓ． セレビシエで異種的に（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）発現されるＧＰＣＲに対して活性化方向に作用するかまたは抑制化方向に作用するかは、ＭＡＰＫカスケードにより調節されるＳ． セレビシエ遺伝子（マーカー遺伝子）を発現することにより検出し得る。この種のマーカー遺伝子のプロモーターは、ＧＰＣＲアクチベーターまたはインヒビターを同定するために、例えば適切なリポーター系と共に用いられる。
【０００５】
フェロモン−調節遺伝子は、トランスポゾン突然変異（Ｒｏｓｓ−Ｍａｃｄｏｎａｌｄら、１９９９）を用いることによるか、またはＤＮＡマイクロチップを用いることによるいずれかで同定することができ、そしてそれは特定の時間における細胞の全てのｍＲＮＡの発現分析を可能にする（Ｗｏｄｉｃｋａら、１９９７）。
【０００６】
これまで、ＧＰＣＲｓのインヒビターおよびアクチベーターを同定するための機能的なアッセイは、主に哺乳動物細胞において実施されてきた（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９８）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １２５、１３８７−１３９２、Ｇｅｒａｓ−Ｒａａｋａら（１９９８）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８ Ｎｏ．２， ４０５−４０８）。Ｓ． セレビシエの機能的な検定のためにＦＵＳ１およびＦＵＳ２遺伝子のプロモーターの使用が記載されている（Ｃｉｓｎｏｗｓｋｉら（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ １７， ８７８−８８３、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ， ８５２−８５３）。ＦＵＳ１は、フェロモンαによる活性化の後、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅの野生型細胞において発現を増大させる遺伝子である。ＵＳ ５，０６３，１５３では、ＦＵＳ１およびＦＵＳ２プロモーターが、興味のあるタンパク質をコードする構造遺伝子を多量に発現させるために使用される。
【０００７】
フェロモンαによって活性化され得、かつ調節される遺伝子の強い発現を達成するために使用できる異なるＳ． セレビシエプロモーターを同定することが本発明の目的である。
【０００８】
本発明は、Ｓ． セレビシエ ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターに関する。
本発明は、配列番号４の配列を有するプロモーターに関する。
【０００９】
本発明はまた、機能的に構造遺伝子に連結される場合にその転写を調節するサッカロミセスセレビシエ ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子プロモーターを含む組換えＤＮＡ断片および配列番号４のＤＮＡ配列を有するプロモーターを含む組換えＤＮＡ断片に関する。本発明は、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターおよび構造遺伝子を含み、そしてそのプロモーターが機能的に構造遺伝子に連結された組換えＤＮＡ断片に関する。構造遺伝子は、例えば受容体遺伝子またはＳ． セレビシエにおいて多量に生産されることが意図されるタンパク質をコードする。
【００１０】
本発明は、このような組換えＤＮＡ断片を含むＤＮＡベクターおよび組換えＳ．セレビシエ細胞に関する。このような組換えＳ． セレビシエ細胞は、好ましくは、機能的に活性な内因性受容体Ｓｔｅｐ２およびＳｔｅｐ３を発現しないかまたはごく少量だけ発現する。
【００１１】
本発明はまた、ＧＰＣＲの機能的な特徴付けならびにＧＰＣＲインヒビターおよび／またはアクチベーターのスクリーニングに関する方法、ならびにＳ． セレビシエのタンパク質を製造する方法に関する。
【００１２】
例えば、Ｇタンパク質結合型受容体のアクチベーターおよび／またはインヒビターを同定する方法であって、ここで
ａ）ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子を含みかつ異種Ｇタンパク質結合型受容体を発現する組換えＳ． セレビシエ細胞を生産し、
ｂ）その細胞を、研究される物質と共に培養し、そして
ｃ）リポーター遺伝子の転写の変化を測定する。
【００１３】
Ｇタンパク質結合型受容体の構成的に活性な変異体を同定する方法であって、ここで
ａ）ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターの制御下にある１つまたはそれ以上のリポーター遺伝子を含む組換えＳ． セレビシエ細胞を生産し、
ｂ）そしてこの細胞は、変異性の異種Ｇタンパク質結合型受容体を発現し、この変異は構成的に活性なＧタンパク質結合型受容体を生じ、
ｃ）この細胞を、活性化物質または抑制化物質と共に培養し、そして
ｄ）リポーター遺伝子転写の変化を測定する。
【００１４】
組換えＳ． セレビシエ細胞において、適切な内因性ＧＰＣＲｓ（Ｓｔｅｐ２および／またはＳｔｅｐ３）は、好ましくは、例えばこれらの遺伝子は欠失されていることから、発現されない。この欠失は、例えばＢｒｏａｃｈ Ｔｈｏｒｎｅｒ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ， ３８４， １４−１６に記載されているように実施し得る。
【００１５】
別の実施形態は、Ｓ．セレビシエにおける異種タンパク質を製造する方法に関し、ここで発現されるべき異種タンパク質の構造遺伝子は、ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターに機能的に連結され、そしてその制御下で発現される。
【００１６】
【発明の詳述】
フェロモン−誘導性および−抑制性ＯＲＦｓ（オープンリーディングフレーム）を、既知遺伝子および特にまだ特徴付けられていない遺伝子がフェロモンαにより誘導されるのかまたは抑制されるのかを決定するため、フェロモンαの有無でパン酵母サッカロミセスセレビシエの培養物を処理することにより同定した。ＤＮＡマイクロチップが用いられ、これは、６０００より多くの同定された酵母遺伝子の発現パターンを同時に示すことができる。例えばフェロモンの有無による異なった方法で処理された２つの細胞または細胞の培養物の遺伝子発現パターンの比較は、対応するｍＲＮＡの適当な調製後、ＤＮＡマイクロアレイを用いてどの遺伝子が特に活性化されたかまたは抑制されたかを決定することを可能とする。
【００１７】
フェロモンαの添加後、ＯＲＦ ＹＮＬ２７９ｗは、その発現において顕著な時間に依存した増加を示した（図２および３）。遺伝子の転写および発現は、通常、転写開始点から５′側の調節配列を介して調節されることから、このような調節配列を有する「プロモーター」は特別の関心をもたれる。
【００１８】
薬理学的および医学的に興味をもたれるＧＰＣＲｓのアクチベーターまたはインヒビターを同定するため、遺伝子または構造遺伝子の前方で同様に上記誘導性または抑制性プロモーターをクローニングすることが可能であり、これは、添加後にリポーター系において活性化作用または抑制化作用を示す物質を同定するために適切なリポーター系を表す。適切なリポーター系の例は、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、エクオリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＥＵ２の遺伝子であるが、また特定の抗生物質、例えばカナマイシンに対する耐性遺伝子もその例である。
【００１９】
例えば、これらの「リポーター遺伝子」は、ｌａｃＺのような遺伝子であってもよく、ＭＡＰＫカスケードにおける特定の物質の作用を、細胞コロニーの色変化を介して検出できる。リポーター遺伝子はまた、例えば、細胞が特定の選択条件下で増殖することを可能にする遺伝子、例えば栄養要求性遺伝子ような遺伝子であってもよい。
【００２０】
ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーターおよび上記プロモーターの後ろでクローニングされるリポーター遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ構築物）の例が、表１に列挙される。上記ＤＮＡ構築物は、例えば機能的なアッセイのＧＰＣＲアクチベーター（アゴニスト）およびインヒビター（アンタゴニスト）を同定するために用いることができる。
【００２１】
【表１】
2004513656.tif 000002
【００２２】
このような受容体遺伝子をコードするＤＮＡは、酵母サッカロミセスセレビシエのＯＲＦ ＹＮＬ２７９ｗのフェロモン−誘導性プロモーターの３′側に融合され、例えば、高複製（ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ）ベクターまたは低複製（ｌｏｗ−ｃｏｐｙ）ベクターにクローニングされる。次いでこれらのベクターは、酵母細胞を形質転換するために使用できる。同様に、プロモーターに融合されたＤＮＡを安定に酵母ゲノムに組み込むことができる。
【００２３】
栄養要求性遺伝子（例えばＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２およびＬＹＳ１）の群に属しているリポーター遺伝子によって遺伝的に操作される酵母株は、対応する遺伝子に関して変異し、すなわち機能的に不活性化されなければならない。フェロモンによる酵母細胞の刺激作用は、酵母プロモーターＹＮＬ２７９ｗの活性化、およびそのプロモーターにより調節されるリポーター遺伝子の発現の増大を導く。ＧＰＣＲアゴニストをサーチする場合、遺伝子ＹＮＬ２７９ｗのプロモーターは、リポーター遺伝子（例えばＨＩＳ、ＡＤＥ、ＴＲＰまたはＬＥＵ）の前で好ましくはクローニングされる。なぜならこの組み合わせは、適当に欠乏させた培地中での細胞増殖を介した読出し（ｒｅａｄ ｏｕｔ）を可能とするからである。研究される物質による選択されたＧＰＣＲの活性化は、ＭＡＰＫカスケードの基礎であるプロモーターＹＮＬ２７９ｗの活性化を生じ、従ってＹＮＬ２７９ｗプロモーターにより調節されるリポーター遺伝子の発現を生じる。ＨＩＳ、ＡＤＥ、ＴＲＰまたはＬＥＵの場合、これは対応する選択培地中での増殖に至る。アゴニストは、選択培地中で増殖する対応するＳ． セレビシエ細胞により同定され得る。
【００２４】
ＬａｃＺ、ＧＦＰまたはＥＧＦＰに関する遺伝子を使用する場合、読出しは、比色計または照度計による計測を介して実施できる。異種ＧＰＣＲがアゴニストによって活性化された細胞のみ化学発光を示す。
【００２５】
使用するリポーター遺伝子がＣＡＮ１である場合、細胞はカナバニン含有培地中で増殖する。ＣＡＮ１遺伝子は、異種的に発現されたＧＰＣＲのアクチベーター（アゴニスト）の存在下で発現され、その結果この細胞はカナバニン含有培地中での増殖を止める。アンタゴニスト（インヒビター）が添加される場合、培養物は上記選択培地中で増殖する。
【００２６】
このスクリーニング方法は、プロモーター−リポーター遺伝子構築物（例えば表１からのＤＮＡ構築物）によって前もって形質転換された酵母細胞を播種したミクロタイタープレートにおいて実施され得る。さらに上記細胞は、アゴニストまたはアンタゴニストを見出すべき異種ＧＰＣＲにより形質転換される。例えば上記方法において、ヒトＧＰＣＲｓ、例えばアデノシン受容体、ソマトスタチン受容体、ドーパミン受容体、ブラジキニン受容体、リソリピド（ｌｙｓｏｌｉｐｉｄ）受容体、β−アドレナリン作動性受容体およびムスカリン性アセチルコリン受容体を使用することが可能である。
【００２７】
フェロモンα誘導性遺伝子として、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターはまた、フェロモン依存性ＭＡＰＫカスケードのアクチベーターおよびインヒビターを同定するために使用できる。ＹＮＬ２７９ｗプロモーターは、フェロモンα処理後、例えばＦＵＳ１プロモーターよりも刺激に対して感受性が高いことから、本明細書中で提案されるＹＮＬ２７９ｗプロモーターの使用は、例えばＦＵＳ１プロモーターを使用する他のスクリーニング法と比較して有利である。図４は、ＹＮＬ２７９ｗプロモーター／エクオリン構築物（Ｐ４１５ＹＮＬ２７９−ＡＥＱ）の刺激が、ＦＵＳ１遺伝子（ここで４ＰＲＥ−ＡＥＱを意味する）のプロモーター由来の領域に対応するプロモーターエレメントの場合より実質的によく反応することを示す。
【００２８】
【実施例】
実施例１：ＯＲＦ ＹＮ２７９ｗの同定
遺伝子型（ＭＡＴ：ａ ｓｓｔ１：：ＬＥＵ２、ａｄｅ２、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１，１５、ｌｅｕ２−３，１１２、ｔｒｐ１−１、ｕｒａ３−１）を有するサッカロミセスセレビシエ酵母株の細胞培養物を、１μＭフェロモンα（９０％メタノールに溶解された）によって刺激し、コントロール細胞は９０％メタノールだけで処理した。刺激後、２０分、９０分、および１８０分に、約１０ ＯＤ６００ｎｍに対応する量の細胞を取り出した。これらの細胞から全ＲＮＡを標準的な方法（例えばＳａｍｂｒｏｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９）に従って単離し、そして各場合、全ＲＮＡのうちの３０μｇを第１鎖合成のために使用した。第１鎖および第２鎖の合成のためのプロトコル、ならびに産生された２本鎖ｃＤＮＡの精製工程、ハイブリダイゼーションのためのｃＲＮＡのインビトロ転写および調製のためのプロトコルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのプロトコルに対応する。
【００２９】
ＹＮＬ２７９ｗ ＯＲＦは、フェロモンα誘導性および非誘導性酵母細胞の発現プロフィールの比較を介して、もっとも強く誘導されるＯＲＦの１つとして同定された。適切なリポーターを用いたスクリーニング系におけるプロモーターの活性および有用性は、ゲノムサッカロミセスセレビシエＤＮＡからのＹＮＬ２７９ｗプロモーター領域を増幅することで測定された。
【００３０】
実施例２：ＹＮＬ２７９ｗプロモーター（「プロモーター」）の単離
ＹＮＬ２７９ｗ遺伝子のプロモーター領域を、プライマーＹＮＬ２７９Ｆ１（配列番号１、５′−ＣＣＧＡＧＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＡＧＧ−３′）およびＹＮＬ２７９Ｒ（配列番号２、５′−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＣＡＡＡＴＴＣＧ−３′）を使用して増幅した。得られた増幅物の同定は、標準的な配列決定方法で測定された。ＹＮＬ２７９Ｆ１／ＹＮＬ２７９Ｒを介して増幅されたプロモーター領域の長さは、制限切断部位のない４７３ｂｐであり、プロモーター領域のこの断片は、以下「プロモーター」と表される。
【００３１】
実施例３：機能性の決定
提案されたスクリーニング法の機能性を、ベクターｐ４１５（図５を参照、ベクターｐＲＳ４１５、ＡＴＣＣ ８７５２０の誘導体）中に、エクオリン−コード遺伝子の前にＹＮＬ２７９ｗ遺伝子の増幅されるプロモーター領域をクローニングすることにより決定した。この構築物により、酢酸リチウム法（Ｉｔｏら， １９８３）を用いてサッカロミセスセレビシエ株（Ｍａｔ ａ ｆａｒ１：：ｈｉｓＧ ｓｓｔ２：：ｕｒａ３ＦＯＡ ｆｕｓ１：：ＨＩＳ３）を形質転換した。以下のようにフェロモンαを用いてサッカロミセスセレビシエ株（Ｍａｔ ａ ｆａｒ１：：ｈｉｓＧ ｓｓｔ２：：ｕｒａ３ＦＯＡ ｆｕｓ１：：ＨＩＳ３）のＭＡＰＫカスケードを刺激した後、エクオリンを検出した：
【００３２】
１．２５μｌの細胞懸濁液（選択培地中２５μｌあたり１．５×１０６個細胞、ＳＣ／グルコースロイシン）を９６穴プレートのウェルに添加し、
２．段階希釈（１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ）の接合因子αおよび１μＭのセレンテラジン（最終濃度０．５μＭ）を含有する２５μｌの２倍濃縮刺激混合物を細胞に添加し、
３．９６穴プレートを慎重に攪拌し、
４．９６穴プレートを暗室で１．５時間、３０℃の湿った大気中で培養し、
５．検出のため、１５０μｌのカルシウム／細胞溶解緩衝液を添加し、エクオリンはこの混合物を加えると直ちに光子を発し、生じたシグナルは１５秒間で積分され、そのシグナルを照度計（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ、ＬＡＢＳＹＳＴＥＭ）により検出する。
【００３３】
接合因子α原液：９０％のメタノールにおいて１００μＭ
セレンテラジン原液：１００％メタノールにおいて１ｍＭ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ、参照Ｃ−２９４４）
ＣａＣｌ２原液１Ｍ：１Ｍ トリス−ＨＣｌ溶液において１Ｍ（使用前に細胞溶解緩衝液で１００倍希釈）
細胞溶解緩衝液：酵母タンパク抽出試薬、ＰＩＥＲＣＥ、参照７８９９０。
【００３４】
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
ＹＮＬ２７９ｗの配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｚ７１５５５、配列番号３）。ＡＴＧ開始コドンに下線を引く。ボールド体の配列領域は、フェロモン応答性エレメント（ＰＲＥ）を表す。
【図１ｂ】
図１ａのＹＮＬ２７９ｗの配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｚ７１５５５、配列番号３）の続き。
【図１ｃ】
ＹＮＬ２７９ｗのプロモーター領域（５′−ＵＴＲ）（配列番号４）。
【図１ｄ】
図１ｃのＹＮＬ２７９ｗのプロモーター領域（５′−ＵＴＲ）（配列番号４）の続き。
【図１ｅ】
ＹＮＬ２７９ｗのプロモーター領域におけるフェロモン応答性エレメント（ＰＲＥ）。
【図２】
フェロモンαによる誘導後のサッカロミセスセレビシエ ＯＲＦ ＹＮＬ２７９ｗの発現プロフィール。遺伝子発現において観察された変化は、ＤＮＡマイクロチップを用いた調査の結果に基づく。ＦＵＳ１遺伝子の遺伝子発現の変化を、比較のために示す。
【図３】
酵母変異体ｓｓｔ１においてフェロモンαにより酵母培養物を刺激した後のＹＮＬ２７９ｗ遺伝子の発現プロフィールのノザンブロット分析。
【図４】
（Ｂ）で示された濃度における、フェロモンαにより酵母細胞を刺激した後のエクオリン発現（相対的な光単位として）の誘導。図に示された値は、３つの独立して実施された実験の平均を表し、そして対応する個々の値が（Ａ）に表される。ｐＹＮＬ２７９−ＡＥＱの場合、エクオリンリポーター遺伝子は、ＹＮＬ２７９ｗプロモーターの制御下にある。４ＰＲＥ−ＡＥＱの場合、エクオリンは、ＦＵＳ１遺伝子の領域（開始の前−２７１〜−１）の制御下にある。各々の刺激実験が３回行われた。
【図５】
ベクターｐ４１５（ベクターｐＲＳ４１５の誘導体：ＡＴＣＣ ８７５２０）中にＹＮＬ２７９ｗプロモーター領域およびエクオリンリポーター遺伝子を含むプロモーター−リポーター遺伝子ベクターの構築物の線図。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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