(57)【要約】本発明は、炎症細胞のアポトーシスを誘発させることにより炎症を治療または予防するための、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬、とくに一般式（Ｉ）の化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の治療または予防のための医薬の製造におけるミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬の使用。
【請求項２】
炎症の治療または予防が、炎症細胞のアポトーシスを誘発させることにより達成される請求項１記載の使用。
【請求項３】
治療または予防される炎症が、気管支喘息に関連した気道の炎症である請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
治療または予防される炎症が、鼻炎、心筋炎、炎症性腸疾患、関節炎、リウマチ性関節炎または筋組織における炎症である請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
炎症の治療または予防のための医薬の製造における式（Ｉ）
【化１】
2004520278.tif 000004
（式中、ＸはＣＨ２またはＳである）
で示される化合物またはその薬学的に許容し得る塩の使用。
【請求項６】
治療または予防される炎症が、気管支喘息に関連した気道の炎症である請求項５記載の使用。
【請求項７】
治療または予防される炎症が、鼻炎、心筋炎、炎症性腸疾患、関節炎、リウマチ性関節炎または筋組織における炎症である請求項５記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物が実質的に純粋な（＋）エナンチオマーである請求項５、６または７記載の使用。
【請求項９】
［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルの実質的に純粋な（＋）エナンチオマー。
【請求項１０】
［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルの実質的に純粋な（＋）エナンチオマーを有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、炎症の治療または予防のための、一般式（Ｉ）の化合物などのミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬の使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
炎症は、好中球、Ｔ−リンパ球および好酸球のような炎症細胞が組織へ浸潤し、そこで活性化されることにより引き起こされる。炎症細胞は、様々な細胞により産生される成長因子および炎症メディエーターのために、炎症部位でより長く生存すると思われる。たとえば、気管支喘息では、大量の好酸球が存在する。好酸球はその細胞質内に細胞毒性の顆粒を含有し、好酸球活性化／脱顆粒（溶解）が上皮細胞傷害および気道過応答性を引き起こすと思われる。好酸球の生存は、好酸球アポトーシスを阻害するＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦのような成長因子により延長される。アポトーシスは、病理的ネクローシスとは区別されるプログラムされた細胞死の生理的過程である。アポトーシスでは、ネクローシスの特徴である有害な影響（すなわち、炎症および組織傷害）を伴うことなく、好酸球の顆粒内容物が除去される。
【０００３】
アポトーシスは、細胞収縮などの特定の生化学的および形態学的変化により特徴付けられ、その変化にはＫ＋流出、表面膿胞（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、クロマチン凝縮、およびエンドヌクレアーゼにより触媒されるＤＮＡ断片化がかかわっていると思われる。ミトコンドリアは、アポトーシスの機構を制御するのに重要な役割を果たしていると思われる。その証拠は、ミトコンドリアがアポトーシス過程を活性化し得る様々なタンパク質、たとえばカスパーゼ、チトクロームＣ、アポトーシス誘発因子（ＡＩＦ）を含有しているという事実に基づいている。現在のところ、細胞収縮を伴うミトコンドリア膜電位の低下および反応性酸素種の発生は、アポトーシス細胞で検出される核交代（ｎｕｃｌｅａｒ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ）に先行すると信じられている。
【０００４】
ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル（ミトコンドリアＡＴＰ依存性カリウムチャネル）を開口することができる薬剤は、ミトコンドリアの膜電位を低下させることにより、ミトコンドリア膨張を誘発することが示されている（スゼウクジク  エー（Ｓｚｅｗｃｚｙｋ， Ａ．）およびマルバン イー（Ｍａｒｂａｎ， Ｅ．）、 Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ、１９９９年、２０巻、１５７〜１６１頁）。膜電位の低下は、体積制御不能（ｖｏｌｕｍｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらすミトコンドリア透過性転移小孔の開口を導き、最終的にミトコンドリア膜の破裂を引き起こし得る。
【０００５】
一般式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
2004520278.tif 000002
【０００７】
（式中、ＸはＣＨ２またはＳである）の化合物は、本出願人の欧州特許第３８３４４９号明細書に記載されている。本化合物は、心筋細胞におけるトロポニン−Ｃをカルシウムに対して感作し、うっ血性心不全の治療に有用である。
【０００８】
式（Ｉ）において、ＸがＣＨ２である化合物は、シメンダン（Ｓｉｍｅｎｄａｎ）すなわち、［［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルである。その光学活性エナンチオマーは本出願人の欧州特許第５６５５４６号明細書に記載されている。強心効果は、大部分、化合物（Ｉ）の（−）エナンチオマー、すなわちレボシメンダン（ｌｅｖｏｓｉｍｅｎｄａｎ）によるものであることが示された。
【０００９】
梗塞の大きさおよび不整脈を減少させるシメンダンの効果は、国際公開第９３／２１９２１号パンフレットに開示されている。シメンダンの両エナンチオマーは不整脈を減少させ、かつその（＋）エナンチオマーは生存を増大させることも示された。肺性高血圧の治療のためのレボシメンダンの使用が、国際公開第９６／６６９１２号パンフレットに開示されている。
【００１０】
［発明の要約］
式（Ｉ）
【００１１】
【化３】
2004520278.tif 000003
【００１２】
（式中、ＸはＣＨ２またはＳである）の化合物、およびその光学活性エナンチオマーが、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルを開口し、炎症細胞のアポトーシスを引き起こす能力を有していることが見出された。それゆえ、本化合物は様々な炎症性疾患の治療または予防において有用である。
【００１３】
したがって、本発明は、炎症の治療または予防に使用するための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容し得る塩の新規な医薬的使用を提供する。
【００１４】
本発明はまた、炎症の治療または予防に使用するための医薬の製造における、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬の使用を提供する。
【００１５】
本発明はまた、患者の炎症を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容し得る塩を投与することからなる方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、患者の炎症を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者に、治療的有効量のミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬を投与することからなる方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、式（Ｉ）においてＸがＳである化合物の光学的に実質的に純粋な（＋）エナンチオマー、およびその医薬組成物を提供する。該化合物および組成物は炎症の治療または予防に有用である。
【００１８】
本発明にしたがって治療または予防される炎症は、とくに、気管支喘息に関連する気道の炎症である（該治療は気管支拡張とは関係ない）。
【００１９】
本発明にしたがって治療または予防されるのに適した他の炎症としては、たとえば、鼻炎、心筋炎、炎症性腸疾患、関節炎、リウマチ性関節炎および筋組織における炎症があげられる。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物は、本発明によれば、炎症の治療または予防のために好ましい薬剤である。式（Ｉ）の化合物の光学活性（＋）エナンチオマー（右旋性型）がとくに好ましい。
【００２１】
式（Ｉ）の化合物の例は、
［［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（シメンダン）、および［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（ＸがＳである化合物（Ｉ））
である。
【００２２】
［詳細な説明］
「ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬」なる用語は、本明細書では、ヒトを含む哺乳動物におけるミトコンドリアのＡＴＰ依存性カリウムチャネルを開口する能力のある薬学的に許容し得る化合物を意味する。化合物のミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口活性は、単離したミトコンドリアの膜電位の低下を測定することにより証明することができる。この方法は、実施例２に詳細に説明されている。本試験での陽性結果は、本発明の方法における化合物の潜在的な有用性を示している。
【００２３】
本発明の方法における使用に適したミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬としては、式（Ｉ）の化合物があげられるが、それに限定されるものではない。一般に、当技術分野でよく知られたものを含めて、薬学的に許容し得るミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬であればいずれも、本発明の方法に使用することができる。好ましくは、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口薬は、他のＫチャネルよりもミトコンドリアＫＡＴＰチャネルに対して選択的である。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物は、欧州特許第３８３４４９号明細書に記載されているように、対応するアミノ中間体を亜硝酸ナトリウムおよびマロン酸ニトリルで処理することにより製造できる。化合物（Ｉ）の光学活性エナンチオマーは、欧州特許第５６５５４６号明細書に記載されているような光学活性中間体を用いて同様に製造できる。化合物（Ｉ）の光学的に実質的に純粋な（＋）エナンチオマー（右旋性型）は、著しい血行力学的作用を有していないので、とくに好ましい。「光学的に実質的に純粋な」という用語は、本明細書では、約９０％を超える、好ましくは９５％を超える、さらに好ましくは９９％を超える光学純度を意味する。本発明の化合物の塩は、既知方法により製造できる。薬学的に許容し得る塩は活性な医薬として有用であるが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩が好ましい。
【００２５】
本発明の化合物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉末、座剤、注射剤、パッチ、懸濁剤およびシロップ剤のような通常の製剤形態を用いて、経口、非経口、経皮または吸入などを含む様々な方法で投与され得る。「有効量」という用語は、炎症を阻害しまたは予防する、本発明の化合物の量を意味する。本発明の化合物は、患者のニーズに応じて、定期的に、または毎日、または一日数回投与され得る。投与は、全身的であっても、局所的であってもよい。一日当たりの投与量は、投与される化合物、患者の年齢および体重、治療されるべき症状、ならびに投与方法に応じて変動し得る。たとえば、式（Ｉ）の化合物はヒトに一日当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲内の投与量で、経口投与できる。本発明の化合物は、単独でまたは他の活性化合物と共に投与してもよい。
【００２６】
活性成分のための組成物は、当技術分野で普通に採用されている方法で製造できる。活性化合物に加えて、本組成物は、担体、結合剤、賦形剤、滑沢剤、懸濁剤および希釈剤のような、当技術分野で普通に用いられている薬学的に許容し得る添加剤を含有してもよい。本発明の組成物中の活性化合物量は、所望の治療効果を生じさせるに充分な量であり、たとえば、式（Ｉ）の化合物に関しては、経口投与、肺投与または非経口投与のための単位投与量（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ）で、約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜約５０ｍｇである。
【００２７】
実施例１  好酸球のアポトーシス
明らかに健康なボランティアの末梢血液から単離した好酸球において、アポトーシスを測定した。白血球細胞を全血液から３％ヒドロキシエチルスターチを用いる遠心沈降により取得し、フィコール上に積層し、遠心分離した。混在する赤血球細胞を低張処理により溶解（ｌｙｓｅ）した。好酸球を、免疫磁気的な抗ＣＤ１６抗体複合ビーズを用いて、好中球から分離精製した。得られた好酸球を、抗生物質添加１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で２２〜４０時間培養した。
【００２８】
好酸球アポトーシスを、ＤＮＡ断片化のヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーにより測定し、形態学的分析により確認した。アポトーシス指数は、（アポトーシス細胞数／全細胞数）として表示した。
【００２９】
化合物ＡおよびＢの効果を検討した。
Ａ  （＋）−［［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル（デキストロシメンダン）、および
Ｂ  （＋）−［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル
【００３０】
結果を図１ａおよび１ｂに示す。両化合物は、用量依存的に構成的（培地）およびＦａｓ誘発ヒト好酸球アポトーシスを促進し、培養４０時間でＩＬ−５で与えられる好酸球生存を逆転させたことがわかる。
【００３１】
実施例２  ミトコンドリアＡＴＰ依存性カリウムチャネル開口
呼吸するミトコンドリアにおいては、ＫＡＴＰチャネル開口によるΔΨの減少は、呼吸速度の増加により相殺される。ミトコンドリアが内在性基質に対してのみ呼吸し、かつリン酸化がオリゴマイシンにより阻害される場合、呼吸速度は高いΔΨを生み出すのに充分である。しかし、ＫＡＴＰチャネルの開口は、増加した呼吸速度では相殺され得ないようなΔΨの減少を導く。このようなモデルでは、ＫＡＴＰチャネルの開口はマスクされず、記録され得る。開口がデキストロシメンダンおよびレボシメンダンにより引き起こされ得る場合、このモデルを試験に適用した。
【００３２】
２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、１０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する培地（ｐＨ７．４）中、分画遠心分離により、ラット肝臓からミトコンドリアを単離した。ミトコンドリアのタンパク質濃度を改変ビューレット法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｉｕｒｅｔ ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。単離した肝臓ミトコンドリアの酸素消費を、ＫＣｌ培地（１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭヘペス，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、ＴＲＩＺＭＡベース添加）または塩化コリン培地（１００ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭヘペス，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、ＴＲＩＺＭＡベース添加）中で、クラーク型電極システムにより、２５℃で記録した。実験に用いられたミトコンドリアタンパク質の最終濃度は、１ｍｇタンパク質／ｍｌであった。呼吸しているミトコンドリアを検討するために、５μＭロテノンの存在下で５ｍＭコハク酸塩を基質として使用した。
【００３３】
日立Ｆ４０００蛍光光度計を用い、室温で５０３ｎｍでの励起と５２７ｎｍでの発光を用い、蛍光プローブとしてローダミン１２３を用いて、肝臓ミトコンドリアの膜電位（ΔΨ）を測定した。ＦＣＣＰ（０．４μＭ）を添加したミトコンドリアと無添加のミトコンドリアとのあいだの蛍光の差を１００％とし、試験化合物による膜電位の低下をＦＣＣＰ効果の％で表示した。
【００３４】
デキストロシメンダンおよびレボシメンダン（＜２．５８μＭ濃度）は、ＫＣｌ培地（４００μＭ  ＡＴＰおよび１ｍｇオリゴマイシン／ｍｇタンパク質を補充）中では、内在性基質に対してのみ呼吸しているラット肝臓ミトコンドリアのΔΨを低下させ、塩化コリン培地中ではΔΨを顕著に変化させなかった。
【００３５】
ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルの選択的遮断剤である５−ヒドロキシデカノエート（５−ＨＤ）は、デキストロシメンダンおよびレボシメンダンの効果を喪失させた（表示されていない）。これらの結果は、内在性基質に対してのみ呼吸しているミトコンドリアの、デキストロシメンダンおよびレボシメンダンによるΔΨの低下が、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネル開口に起因していることを示している。
【００３６】
実施例３  ラットにおけるカラギーナン誘発足浮腫に対する効果
１または２％ラムダカラギーナン溶液を雄性ウィスターラットの右後足の足底下組織（ｓｕｂｐｌａｎｔａｒ ｔｉｓｓｕｅ）に注射することにより、急性炎症を誘発させた（＝１または２ｍｇ／足）。カラギーナン注射の３時間後にラットを死亡させた。両後足を踝のすぐ上で切断し、重量を測定した。試験化合物（レボシメンダンおよびデキストロシメンダン）は、炎症誘発３０分前に、下記投与レベルで経口投与した。
【００３７】
レボシメンダン            ０．１、１および１０ｍｇ／ｋｇ
デキストロシメンダン      １０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ
【００３８】
対照ラットを各実験に組み込んだ。右後足と左後足との重量差を腫脹とみなした。各群には９〜１０匹の動物を含めた。
【００３９】
結果を図３ａ（レボシメンダン）および図３ｂ（デキストロシメンダン）に示す。レボシメンダンおよびデキストロシメンダンのいずれも、カラギーナン誘発ラット足浮腫を顕著に阻止したことがわかる。
【００４０】
実施例４  （＋）−［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリル
【００４１】
ａ）ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸を用いるラセミ型（±）５−（４−アミノフェニル）−６−メチル−３，６−ジヒドロ−［１，３，４］−チアジアジン−２−オンの分割
（±）５−（４−アミノフェニル）−６−メチル−３，６−ジヒドロ−［１，３，４］−チアジアジン−２−オン（２０．４ｇ、０．００９モル）を、加熱下でアセトニトリル（８１６ｍｌ）に溶解した。この溶液にジベンゾイル−Ｌ−酒石酸（５２．０ｇ、０．１４モル）を徐々に添加した。混合物を、透明な溶液が得られるまで、加熱下に撹拌した。溶液をついで撹拌しながら室温までゆっくりと冷却した。室温で更に２時間撹拌したのち、結晶生成物をろ過した。沈殿物のエナンチオマー純度をＨＰＬＣで調べ、生成物のエナンチオマー純度が９９．０％より高くなるまで、再結晶を同じ条件で繰り返した。湿った塩をついで水（１５０ｍｌ）中に溶解し、炭酸カリウム溶液（水７５０ｍｌ中Ｋ２ＣＯ３１９０ｇ）を撹拌しながら添加した。遊離塩基を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、真空乾固して、（＋）５−（４−アミノフェニル）−６−メチル−３，６−ジヒドロ−［１，３，４］−チアジアジン−２−オンを結晶性固体（１．３４ｇ）として得た。本品は光学純度１００．０％、クロマトグラフ純度９９．５％、融点２１６〜２２０℃、［α］Ｄ２５＝＋１０００°であった。
【００４２】
ｂ）（＋）［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルの製造
（＋）５−（４−アミノフェニル）−６−メチル−３，６−ジヒドロ−［１，３，４］−チアジアジン−２−オン（１．３４ｇ、６ミリモル）を水（２３ｍｌ）および６Ｎ塩酸（４．５ｍｌ）に溶解した。溶液を撹拌し、冷却した。水（５ｍｌ）中亜硝酸ナトリウム（０．５ｇ）の冷溶液を添加した。ついで、ｔ−ブタノール（５４ｍｌ）中マロン酸ニトリル（０．９ｇ）の冷溶液を添加した。最後に、この溶液に、水（４０ｍｌ）中に希釈した酢酸ナトリウム（５．４ｇ）の冷溶液を添加した。反応混合物を冷却下（０℃）に３時間撹拌した。撹拌後、結晶生成物をろ過し、水で洗浄して、（＋）［［４−（３，６−ジヒドロ−６−メチル−２−オキソ−２Ｈ−１，３，４−チアジアジン−５−イル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルを結晶性固体（１．７ｇ）として得た。本品は光学純度１００％、クロマトグラフ純度９９．３％、融点１２５〜１２８℃、［α］Ｄ２５＝＋１００２°であった。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１ａは、構成的（培地）およびＦａｓ誘発ヒト好酸球アポトーシス、ならびに培養４０時間でＩＬ−５で与えられる好酸球生存の逆転に対する化合物Ａ（μＭ）の効果を示す。
【図１ｂ】
図１ｂは、構成的（培地）およびＦａｓ誘発ヒト好酸球アポトーシス、ならびに培養４０時間でＩＬ−５で与えられる好酸球生存の逆転に対する化合物Ｂ（μＭ）の効果を示す。
【図２】
図２は、ＫＣｌ培地中において内在性基質に対してのみ呼吸するラット肝臓ミトコンドリアの膜電位（ΔΨ）に対するレボシメンダンおよびデキストロシメンダンの効果を示す。
【図３ａ】
図３ａは、カラギーナン（１ｍｇ）誘発ラット足浮腫に対するレボシメンダンの効果を示す。垂直棒はＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、アノバ（ａｎｏｖａ）およびダネット検定、ｎ＝９〜１０。
【図３ｂ】
図３ｂは、カラギーナン（２ｍｇ）誘発ラット足浮腫に対するデキストロシメンダンの効果を示す。垂直棒はＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、スチューデント  ｔ−検定、ｎ＝９〜１０（１０ｍｇ／ｋｇおよび対照以外、ｎ＝２０）。
【図１ａ】
2004520278.tif 000005
【図１ｂ】
2004520278.tif 000006
【図２】
2004520278.tif 000007
【図３ａ】
2004520278.tif 000008
【図３ｂ】
2004520278.tif 000009
【国際公開パンフレット】
2004520278.tif 000010
2004520278.tif 000011
2004520278.tif 000012
2004520278.tif 000013
2004520278.tif 000014
2004520278.tif 000015
2004520278.tif 000016
2004520278.tif 000017
2004520278.tif 000018
2004520278.tif 000019
2004520278.tif 000020
2004520278.tif 000021
2004520278.tif 000022
【国際調査報告】
2004520278.tif 000023
2004520278.tif 000024
2004520278.tif 000025
2004520278.tif 000026
2004520278.tif 000027
2004520278.tif 000028
2004520278.tif 000029