(57)【要約】ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のペプチドはビルレンス決定因子として同定され、感染の治療のためのワクチンの製造に有用であり得る。本ペプチドは、抗原として、または生経口ワクチンとして用いるための弱毒化微生物の製造において用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的または診断的使用のための、Ｓｉｔ１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｓｉｔ２Ｂ、ＣまたはＤ、Ｓｉｔ３Ａ、Ｂ、ＤまたはＤ、ＯＲＦ１〜１４およびＭＳ１〜１１として本明細書中で識別される遺伝子配列またはそれらの機能的断片のいずれかによりコードされるペプチド。
【請求項２】
ＰＰＩ１として本明細書中で識別される肺炎球菌病原性島１内でコードされるペプチド。
【請求項３】
治療的または診断的使用のための、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
治療的または診断的使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも４０個のヌクレオチドを有する、請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも８０個のヌクレオチドを有する、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
Ｓｉｔ１Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ、Ｓｉｔ２Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ、Ｓｉｔ３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ、ＯＲＦ１〜１４およびＭＳ１〜１１として本明細書中で識別される遺伝子配列のいずれかの発現を欠損させた突然変異を含む弱毒化微生物。
【請求項８】
前記遺伝子が、Ｓｉｔ１、Ｓｉｔ２またはＳｉｔ３遺伝子のいずれかである、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
前記突然変異が、欠失突然変異である、請求項７または請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
第二の遺伝子中にさらなる弱毒化突然変異を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の微生物。
【請求項１１】
前記のさらなる突然変異が、栄養要求性突然変異である、請求項１０記載の微生物。
【請求項１２】
異種抗原を発現するために遺伝的に改変された、請求項７〜１１のいずれかに記載の微生物。
【請求項１３】
請求項１記載の遺伝子に本来結合するプロモーター、および異種遺伝子を含む構築物。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれかに記載の微生物を含むワクチン。
【請求項１５】
請求項１記載のペプチドまたは請求項４記載のポリヌクレオチドを含むワクチン。
【請求項１６】
請求項１記載の少なくとも２つのペプチドを含むワクチン。
【請求項１７】
Ｓｉｔ１ＤによりコードされるペプチドおよびＳｉｔ２Ａによりコードされるペプチド、または免疫応答を誘発することができるその機能的断片を含むワクチン。
【請求項１８】
抗微生物薬の判別のためのスクリーニングアッセイにおける、請求項１〜１２のいずれかに記載の産物の使用。
【請求項１９】
ストレプトコッカス微生物の検出のための診断アッセイにおける、請求項１〜１２のいずれかに記載の産物の使用。
【請求項２０】
抗微生物薬の判別のためのスクリーニングアッセイにおける、Ｓｉｔ２Ａ遺伝子またはＳｉｔ１Ｄ遺伝子によりコードされるペプチドの使用。
【請求項２１】
ストレプトコッカス微生物の検出のための診断アッセイにおけるＳｉｔ２Ａ遺伝子またはＳｉｔ１Ｄ遺伝子によりコードされるペプチドの使用。
【請求項２２】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはその他のグラム陽性菌による感染に関連した症状の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の産物の使用。
【請求項２３】
前記治療が、家畜の治療である請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜６の産物のいずれかに対して産生される抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、遺伝子およびそれらがコードするタンパク質、タンパク質またはタンパク質の機能的断片を含有するワクチン、および遺伝子のいずれかまたは一部分を欠く生弱毒化細菌ワクチンに関する。特に、本発明は、それらの予防的および治療的使用、ならびに診断におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
高親和性鉄取込みメカニズムは、いくつかのグラム陰性病原体、例えば病原性ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃ， １９９９）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｊａｎａｋｉｒａｍａｎ ａｎｄ Ｓｌａｕｃｈ， ２０００）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔａｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）およびイエルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（Ｂｅａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ， １９９９）のビルレンスに不可欠である。グラム陰性病原体が宿主から鉄を得るメカニズムは、十分に説明されている。それらは、宿主鉄結合タンパク質、例えばトランスフェリンから鉄を掃去する、シデロフォアと呼ばれる低分子量鉄キレート化剤の分泌、ならびにヘモグロビンおよびヘミンから鉄を獲得する分泌ヘモフォアを包含する（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， １９９３； Ｗａｎｄｅｒｓｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃ， ２０００）。あるいは、鉄またはヘムを含有するタンパク質は、細菌外膜上の特定の受容体と結合し得る（Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， １９９３；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ａｎｄ Ｓｐａｒｌｉｎｇ， １９９４）。捕捉鉄の供給源とは関係なく、細菌細胞質中への輸送は、通常は細胞質膜ＡＢＣトランスポーターに依存している（Ｆｅｔｈｅｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００３】
グラム陰性病原体による鉄取込みに関するデータの豊富さにもかかわらず、グラム陽性病原体による鉄獲得についての感染中のメカニズムおよび重要性に関してはほとんど分かっていない。グラム陽性病原体のうち、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、全世界の死亡原因としてヒトマイコバクテリウム・ツベクローシス（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に次いで第２位である。ストレプトコッカス・ニューモニアエはしばしば、鼻咽頭にコロニー形成し、侵襲性感染が種々の身体各部、例えば中耳、肺間質、血液および脳脊髄液中で発達し得る。生物体はこれらの環境の各々で鉄供給源を利用しなければならないが、今日、ストレプトコッカス・ニューモニアエがいかにして、どの基質（単数または複数）から鉄を獲得するかはあまり理解されていない。気道中の考え得る鉄供給源としては、ラクトフェリン、トランスフェリン、フェリチン（粘膜上皮から脱落した死細胞から放出される）、ならびにおそらくは少量のヘモグロビンおよびその分解産物が挙げられる（ＬａＦｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃ， １９９９）。さらに、他の鼻咽腔共生により産生されるシデロフォアは、代替的鉄供給源を提供する。鉄欠乏培地中のストレプトコッカス・ニューモニアエの成長は、ヘミン、ヘモグロビンおよび硫酸第二鉄により補足され得るが、粘膜表面の他の病原体（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃ， １９９９； Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ａｎｄ Ｓｐａｒｌｉｎｇ， １９９４）と対照的に、トランスフェリンおよびラクトフェリンによっては補足されない（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。ストレプトコッカス・ニューモニアエはシデロフォアを産生しない（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）が、ヘミン結合ポリペプチドは単離され、鉄供給源としてヘミンを利用することができない非限定突然変異体はビルレンスを弱められた（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３および１９９７）、ということを化学的および生物学的アッセイは示唆している。しかしながら、ストレプトコッカス・ニューモニアエによる鉄取込みのための分子的基礎はまだ特性化されておらず、鉄トランスポーターは、グラム陽性病原体に関する動物モデルにおけるビルレンス決定因子であることは立証されていない。
【０００４】
グラム陰性菌のビルレンス決定因子、例えば鉄およびマグネシウムトランスポーターはしばしば、水平伝播により獲得されると考えられ、かつ病原性島（ＰＩ）と呼ばれる染色体ＤＮＡの限定領域でコードされる（Ｃａｒｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｂｌａｎｃ−Ｐｏｔａｒｄ ａｎｄ Ｇｒｏｉｓｍａｎ， １９９７； Ｊａｎａｋｉｒａｍａｎ ａｎｄ Ｓｌａｕｃｈ， ２０００）。特徴として、ＰＩは宿主染色体ＤＮＡにとは異なるＧＣ含量を有し、しばしばそれらの境界にｔＲＮＡまたは挿入配列を有し、可動性遺伝要素をコードする遺伝子を含有し、低病原性ではあるが関連の細菌株中に存在しない（Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＰＩはしばしば、宿主細菌に特異的なビルレンス機能をコードする遺伝子を含有する。例えば、サルモネラ・チフィムリウムのＳＰＩ−２は、細菌をマクロファージ内で倍加させるが、密接に関連する腸内病原体には存在しないＩＩＩ型分泌装置をコードする（Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。その結果、ＰＩの獲得は、おそらくは、別個のグラム陰性病原体の進化における大きな影響である（Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。対照的に、２〜３のＰＩだけがグラム陽性病原体に関して記載されており、それらはグラム陰性ＰＩの古典的遺伝子特性をめったに有さない（Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。グラム陰性ＰＩと同様の遺伝子特性を有するグラム陽性病原体のこれらのＰＩは毒素をコードし、病原体のｉｎ  ｖｉｖｏ成長のために必要でない（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｌｉｎｄｓａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ストレプトコッカス・ニューモニアエは天然で形質転換可能であり、他のストレプトコッカスからの相同ＤＮＡを部分的にその染色体中に容易に組み込む（Ｃｌａｖｅｒｙｓ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。しかしながら、ＤＮＡの水平転移のこのメカニズムはＰＩの獲得とは異なり、ストレプトコッカス・ニューモニアエＰＩは記載されていない。
【０００５】
グラム陽性菌感染およびストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の予防および治療のための手段を提供することが望ましい。
【０００６】
［発明の概要］
ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｔａｇｇｅｄ突然変異誘発およびゲノム探索を用いて、Ｓｉｔ１、Ｓｉｔ２およびＳｉｔ３と呼ばれる３つの別個のストレプトコッカス・ニューモニアエ鉄取込みＡＢＣトランスポーターを同定した。Ｓｉｔ１、Ｓｉｔ２およびＳｉｔ３ＡＢＣＤ遺伝子の配列は、添付の配列表に示されている。Ｓｉｔ２オペロンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要とされる病原性島に位置する。推定ビルレンス決定因子をコードする他の遺伝子も同定され、本明細書中ではＭＳ１〜１１およびＯＲＦ１〜１４と呼ばれる。
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、ペプチドは、治療的または診断的使用のための、Ｓｉｔ１Ａ、Ｂ、またはＣ、Ｓｉｔ２Ｂ、Ｃ、またはＤ、Ｓｉｔ３Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ、ＯＲＦ１〜１４およびＭＳ１〜１１として本明細書中で識別される遺伝子配列あるいはその機能的断片のいずれかによりコードされる。
【０００８】
第二の態様によれば、弱毒化微生物は、上でＳｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａとして識別された遺伝子配列のいずれかの発現を欠損させた突然変異を包含する。
【０００９】
本発明の第三の態様によれば、ワクチン組成物は、上で同定された遺伝子配列のいずれかを、任意の薬学的に許容可能な希釈剤、担体またはアジュバントとともに含む。
【００１０】
特定の実施形態では、ワクチン組成物は、Ｓｉｔ１ＤによりコードされるペプチドおよびＳｉｔ２Ａによりコードされるペプチド、または免疫応答を誘発することができるそれらの機能的断片を含む。この組合せワクチンは、他の既知のペプチドワクチンと比較して、非常に良好な免疫応答を誘発する。
【００１１】
本発明の第四の態様によれば、本発明のペプチドは、抗微生物薬の同定のためのスクリーニングアッセイに、または連鎖球菌属微生物の検出のための診断アッセイに用いられる。
【００１２】
本発明を、添付の図面を参照して説明する。
【００１３】
［発明の説明］
本発明のペプチド（タンパク質）および遺伝子は、ｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｔａｇｇｅｄ突然変異誘発を用いて推定ビルレンス決定因子として同定された（Ｈｅｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【００１４】
本発明のタンパク質および遺伝子は、グラム陽性菌病原体およびストレプトコッカス・ニューモニアエに対する治療に有効なワクチンの製造に適した候補であり得る。「治療的に有効な」という用語は、ワクチンの予防効果を含むよう意図される。例えば組換えタンパク質は、個体への直接投与のための抗原として用いられ得る。タンパク質は、グラム陽性菌病原体から、もしくはストレプトコッカス・ニューモニアエから直接単離され得るか、または任意の適切な発現系、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ）中で発現され得る。タンパク質は、好ましくはアジュバント、例えば明礬とともに投与される。
【００１５】
好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、本発明のペプチド、例えばＳｉｔ１ＤによりコードされるペプチドおよびＳｉｔ２Ａによりコードされるペプチドまたは免疫応答を誘発することができるそれらの機能的断片の組合せを含む。この二重タンパク質ワクチンは、既知の防御的抗原である無毒性のニューモリシン（Ｐｄｂ）と比較して、改良された防御を提供することが示されている。
【００１６】
当該タンパク質は、効果的な免疫応答が生じるならば、野生型タンパク質と比較して突然変異体タンパク質か、タンパク質の断片、または異なる断片もしくはタンパク質を含むキメラタンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質断片は少なくとも２０個のアミノ酸のサイズであり、さらに好ましくは少なくとも３０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸のサイズである。
【００１７】
代替的アプローチは、生弱毒化グラム陽性菌または生弱毒化ストレプトコッカス・ニューモニアエワクチンを用いることである。これは、本発明の遺伝子の発現を欠失させるかまたは欠損させることにより生成され得る。好ましくはストレプトコッカス・ニューモニアエ株は、付加的ビルレンス遺伝子突然変異を含む。
【００１８】
本発明の突然変異微生物は、既知の技法により、例えば本発明の遺伝子の欠失突然変異誘発または挿入不活性化により調製され得る。産物の発現が、何らかの方法で欠損されていれば、遺伝子は必ずしも突然変異されなければならないわけではない。例えば突然変異は、遺伝子の上流に、または遺伝子調節系に対して作られ得る。欠失突然変異を有する突然変異体微生物の調製は、国際特許公報第ＷＯ−Ａ−９６／１７９５１号に示されている。適切な一技法では、突然変異遺伝子および選択マーカーを含む自殺プラスミドが、接合により微生物中に導入される。野生型遺伝子は、相同的組換えにより突然変異遺伝子に置き換えられ、選択マーカーを用いて突然変異微生物が判別される。
【００１９】
弱毒化微生物は、異種抗原、または治療的タンパク質／ポリヌクレオチドの担体としてとして用いられ得る。例えば、抗原を発現するベクターは、患者への送達のために弱毒化株中に挿入され得る。慣用的技法は、この実施形態を実行するために用いられ得る。
【００２０】
適切な異種抗原が当業者には明らかであり、任意の細菌、ウイルスまたは真菌抗原およびアレルゲン、例えば腫瘍関連抗原が挙げられる。例えば、適切なウイルス抗原としては、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎抗原、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、呼吸器シンシチウムウイルスＲＳＶ（ヒトおよびウシ）、ロタウイルス、ノーウォーク、ＨＩＶおよび水痘−帯状疱疹ウイルス（帯状疱疹および水痘）が挙げられる。適切な細菌抗原としては、ＥＴＥＣ、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）毒素、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコバクテリウム・ツベクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、マラリア（Ｍａｌａｒｉａ）およびシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）からのものが挙げられる。
【００２１】
異種抗原は、突然変異体により送達される真核生物ＤＮＡ発現カセットを利用して、宿主細胞中で発現され得る。あるいは、異種抗原は、原核生物発現カセットを利用して突然変異体細菌により発現され得る。
【００２２】
あるいは、微生物は、治療用異種ペプチドまたはポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するために用いられ得る。例えばサイトカインは、肝炎に感染した患者の治療のために微生物により送達され得る適切な治療用ペプチド（タンパク質）である。ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡのようなアンチセンスヌクレオチド、またはリボザイムのような触媒ＲＮＡの送達は、遺伝子療法に望ましい。
【００２３】
異種抗原等を用いた微生物の調製方法は当業者には明らかであり、Ｐａｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９９； ９２（１）：７６−８９（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【００２４】
異種産物をコードする遺伝子は、遺伝子の発現に必要な調節装置、例えばプロモーター、エンハンサー等を含有する組換えポリヌクレオチド上に提供され得る。例えば、原核生物または真核生物発現カセットは、ベクター、例えば多コピープラスミド中に組み込まれ得る。あるいは、異種遺伝子は、異種遺伝子が微生物のゲノム中に組み込まれるようになり、そしてその発現のために内因性またはクローン化調節装置を使用するよう、微生物に対して内因性である遺伝子、例えば突然変異される遺伝子に標的化され得る。
【００２５】
本発明のタンパク質（またはその断片）は、受動免疫化に用いるために、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の産生にも用いられ得る。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態では、タンパク質または対応するポリヌクレオチドは、潜在的に有用な薬剤、特に抗微生物薬をスクリーニングするための標的として用いられ得る。適切な薬剤は、それらの作用を発揮するためにタンパク質またはＤＮＡと結合するそれらの能力に関して選択され得る。適切な薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要とされるグラム陽性病原性島遺伝子、例えばＳｉｔ遺伝子の発現に影響を及ぼし、それによりｉｎ  ｖｉｖｏまたは特定の環境において生存する細菌の能力を低減または変更するそれらの能力に関して選択され得る。適切な薬剤に関してスクリーニングするための、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを使用するアッセイは、当業者には明らかである。
【００２７】
タンパク質、ポリヌクレオチド、弱毒化突然変異体、ならびにタンパク質および弱毒化突然変異体に対して産生される抗体は、個体の診断または治療に用いるために記載されているが、獣医学的使用も本発明の範囲内であるとみなされる。
【００２８】
さらなる実施形態では、本明細書中で同定された遺伝子に関連したプロモーター配列を用いて、異種遺伝子の発現を調節し得る。これは、ベクター系、例えば慣用的遺伝子発現ベクター中にプロモーターを組み込むことにより達成され得る。あるいは、異種遺伝子は、プロモーターが発現を調節するよう、細菌染色体中に挿入され得る。
【００２９】
概して、本発明を実行するために必要な技法は、当該技術分野で従来既知であるものである。特定の指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９５）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．に示されている。
【００３０】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでグラム陽性病原体の成長に必要な遺伝子を含有する病原性島に関する。実施例は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ０１００９９３株に関して説明されているが、すべての病原性ストレプトコッカス・ニューモニアエ株が同一遺伝子を有するはずである。サザン解析およびＰＣＲを利用して、Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２相同体が、試験したすべてのストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜型中に存在することが実証されている。Ｓｉｔ１プローブは、その他のストレプトコッカス、例えばＳ．ミチス（Ｓ． ｍｉｔｉｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ． ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．サングイス（Ｓ． ｓａｎｇｕｉｓ）、Ｓ．ミレリ（Ｓ． ｍｉｌｌｅｒｉ）のゲノム断片とハイブリダイズする。これらの各々に対するワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニアエに関して記載されたのと同様の方法で開発され得る。
【００３１】
ワクチン組成物を配合するために、突然変異体微生物は、任意の適切な賦形剤と一緒に組成物中に存在し得る。例えば組成物は、任意の適切なアジュバントを含み得る。あるいは、微生物は、アジュバントを内因的に発現するよう産生され得る。適切な配合物は、当業者には明らかである。配合物は、任意の適切な投与手段のために開発され得る。好ましい投与は、口、粘膜（例えば鼻腔）または全身経路による。
【００３２】
好ましくは、ワクチンの製造に有用であり得るペプチドは、本明細書中で同定されるペプチドとの４０％より高い類似性を有する。さらに好ましくは、ペプチドは６０％より高い配列類似性を有する。最も好ましくは、ペプチドは８０％より高い配列類似性を、例えば９５％の類似性を有する。好ましくは、ワクチンの製造に有用であり得るヌクレオチド配列は、本明細書中で同定されるヌクレオチド配列との４０％より高い同一性を有する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は６０％より高い配列同一性を有する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は８０％より高い配列同一性を、例えば９５％の同一性を有する。
【００３３】
「類似性」および「同一性」は、当該技術分野で既知である。当該技術分野では、同一性とは、配列を比較することにより確定されるようなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の関連性、特に、比較されている配列中の相対的に同一の位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸間の同一対等物を指す。類似性とは、ポリペプチド配列の関連性を指し、対応する位置の同一アミノ酸だけでなく、対応する位置の機能的に類似のアミノ酸も考慮に入れる。したがってポリペプチド配列間の類似性は、見かけの同一性がほとんどない場合でさえ、機能的類似性を示す。
【００３４】
遺伝子間の同一性のレベル、ならびにタンパク質間の同一性および類似性のレベルは、既知の方法を用いて算定され得る。本発明に関して、ポリペプチド配列間の同一性および類似性、ならびにポリヌクレオチド配列間の同一性を決定するための公的に利用可能なコンピューターベースの方法としては、ＧＣＧパッケージ（ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， （１９９１）， Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ７， Ａｐｒｉｌ １９９１， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよびその他の供給元から利用可能である。Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するために用いられ得る。ポリペプチド配列比較のためのパラメーターとしては、以下のものが挙げられる：
アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３（１９７０））
比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＳＵＭ６２（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ， ＰＮＡＳ ８９： １０９１５−１０９１９ （１９９２））
Ｇａｐペナルティー：１２
Ｇａｐ長ペナルティー：４
これらのパラメーターは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩからの「Ｇａｐ」プログラムのデフォルトパラメーターである。
ポリヌクレオチド配列比較のためのパラメーターとしては、以下のものが挙げられる：
アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３（１９７０））
比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
Ｇａｐペナルティー：５０
Ｇａｐ長ペナルティー：３
これらのパラメーターは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩからの「Ｇａｐ」プログラムとして利用可能である。
これらのパラメーターは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００３５】
第１表は、本発明の遺伝子および適切な配列番号を列挙する。
【００３６】
【表１】
2004521613.tif 000002
【００３７】
添付の図面を参照しながら、以下の実施例により、本発明をここでさらに説明する。
【００３８】
細菌株、培地および培養条件
肺炎患者から単離されたタイプ３ストレプトコッカス・ニューモニアエ株０１００９９３を、すべての実験に用いた。０．５％酵母抽出物を補足したトッド−ヒューイットブロス（ＴＨＹ）中の５％ウマ血液を補足したコロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）寒天上で、またはＲＰＭＩ培地の変法を用いて、３７℃で５％ＣＯ２で、ストレプトコッカス・ニューモニアエ株を培養した。組織培養培地ＲＰＭＩ（タイプ１６４０、Ｇｉｂｃｏ）に、０．４％ウシ血清アルブミンＶ因子（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、１％ビタミン溶液および２ｍＭのグルタミンを添加することにより、ＲＰＭＩｍを作った。２％（ＴＨＹ）または６％（ＲＰＭＩｍ）Ｃｈｅｌｅｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を連続攪拌下でブロス培地に８（ＴＨＹ）または２４（ＲＰＭＩ）時間添加することにより、培地を陽イオン枯渇させた。ＴＨＹをオートクレーブ処理し、使用前にフィルター滅菌によりＣｈｅｌｅｘを除去して、Ｃｈｅｌｅｘ化ＲＰＭＩをフィルター滅菌した後、直ちに使用した。使用前に、Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹおよびＣｈｅｌｅｘ−ＲＰＭＩｍに１００μＭのＣａＣｌ２および２ｍＭのＭｇＳＯ４を補足した。必要な場合には、以下の補足物を培地に添加した：クロラムフェニコール（ｃｍ）４μｇｍｌ−１、エリスロマイシン（ｅｒｙ）０．４μｇｍｌ−１、１０〜５０μＭのＦｅＣｌ３、１０〜５０μＭのＦｅＳＯ４、１〜５μｇｍｌ−１のラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ）、１〜５μｇｍｌ−１のフェリチン（Ｓｉｇｍａ）、５〜１０μＭのヒトヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ）、１〜１０μＭのヘミン（Ｓｉｇｍａ）および４００μＭの２，２’−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭのＭｎＳＯ４；２５μＭのＺｎＳＯ４。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｐｌｕｓ  Ｍｋｌｌプレート読取り機（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）、および９６ウエルマイクロタイター皿中の２００μｌの培養アリコート、またはＵＶ−１２０１分光光度計および滅菌キュベット中の１ｍｌの培養物を用いて、５８０ｎｍで吸光度を測定することにより、ブロス培養の成長をモニタリングした。ＴＨＹブロス中で０．３５〜０．６のＯＤ５８０に成長した株のアリコートを、−７０℃で１０％グリセロール中に貯蔵した。Ｆｅコンタミネーションを最小にするために、ＭｉｌｌｉＱ処理水を用いてストック溶液を作り、使い捨てプラスチック容器中に貯蔵し、培養物を使い捨てプラスチック容器中でインキュベートした。適切に選択したルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地上で３７℃で成長させた大腸菌株ＤＨ５α中でプラスミドを操作した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【００３９】
ＤＮＡ単離および操作
メーカーのプロトコールを用いて、Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを単離した。クローニング、形質転換、制限消化およびプラスミドＤＮＡの連結のためには、標準プロトコールを用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。サザンハイブリダイゼーションのためのナイロン膜を調製し、前に記載された（Ｈｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９）ようにＲｅｄｉＰｒｉｍｅランダムプライマー標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ， Ｂｕｃｋｓ， ＵＫ）を用いて作製された３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを用いてプローブした。ウィザードゲノムＤＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ストレプトコッカス・ニューモニアエ染色体ＤＮＡを単離した。
【００４０】
核酸配列のコンピューター解析
Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）からあらかじめストレプトコッカス・ニューモニアエ配列データを得て、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて解析し、操作した。利用可能なヌクレオチドおよびタンパク質データベースの、および不完全微生物ゲノムのＢＬＡＳＴ２探索を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を用いて実施した。Ｍｕｌｔａｌｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｈｔｍｌ）およびＴｒｅｅＶｉｅｗＰＰＣを用いて、系統樹を構築した。Ａｒｔｅｍｉｓ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ）およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）のウインドウアプリケーションを用いて作製されたＧＣ含量のグラフを用いて、配列ＧＣ含量を解析した。
【００４１】
突然変異体株の構築
この作業のために構築され、用いられたプラスミド、プライマーおよびストレプトコッカス・ニューモニアエ株を、第２表に示す。
【００４２】
【表２】
2004521613.tif 000003
【表３】
2004521613.tif 000004
【００４３】
挿入重複突然変異誘発により、ストレプトコッカス・ニューモニアエ突然変異体株を構築した。利用可能なゲノム配列から設計され、ｐＩＤ７０１に連結されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより標的遺伝子の内部部分を増幅した（ｃｍ耐性、ｐＥＶＰ３由来、またはｐＡＣＨ７４エリスロマイシン耐性）。Ｓｉｔ１Ａ−欠損ベクターｐＰＣ５を作製するために、ｂｐ３２０から７１１までのＳｉｔ１Ａの内部部分をプライマーＳｍｔ６．１およびＳｍｔ６．２を用いて増幅し、ＸｂａＩで消化して、ｐＩＤ７０１のＸｂａＩ部位に連結した。Ｓｉｔ２Ａ−欠損ベクターｐＰＣ１２を作製するために、ｂｐ８４から４２８までのＳｉｔ２Ａの内部部分をプライマーＩＲＰ１．１およびＩＲＰ１．２を用いて増幅し、ＸｂａＩで消化して、ｐＩＤ７０１のＸｂａＩ部位に連結した。二重突然変異体の構築のためのＳｉｔ１Ａ−欠損ベクターｐＰＣ２５を作製するために、ｂｐ３２０から７１１までのＳｉｔ１Ａの内部部分をプライマーＳｍｔ６．３およびＳｍｔ６．４を用いて増幅し、ＫｐｎＩで消化して、ｐＡＣＨ７４のＫｐｎＩ部位に連結した。それぞれプライマー対Ｓｍｔ３．３／Ｓｍｔ３．４およびＩＲＰ１．７／ＩＲＰ１．８により生成されたＰＣＲ産物をｐＩＤ７０１のＸｂａＩ部位に挿入することにより、Ｓｉｔ１Ｄの停止コドンの２６５ｂｐ下流（プラスミドｐＰＣ４）およびＳｉｔ２Ｄの２３４ｂｐ下流（プラスミドｐＰＣ２９）にプラスミドＤＮＡ２６５を挿入するよう設計されたベクターを構築した。欠損ベクターの挿入物をシーケンシングして、それらがそれらのそれぞれのＰＣＲプライマーのための予測ゲノム配列を含有することを確証した。
【００４４】
コンピテンス刺激ペプチド１（ＣＳＰ１）（Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を用いた形質転換コンピテンスの誘導を要求する修正プロトコールを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニアエ株を形質転換した。ＴＨＹブロス、ｐＨ６．８中で０．０１２〜０．０２０のＯＤ５８０に成長させたストレプトコッカス・ニューモニアエの８ｍｌ培養物を、４℃で２００００ｇでの遠心分離により収集し、１ｍＭのＣａＣｌ２および０．２％ＢＳＡを補足した１ｍｌのＴＨＹブロス、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。４００ｎｇのＣＳＰ１を添加し、その後、１０μｇの環状形質転換プラスミドを添加することにより、コンピテンスを誘導した。形質転換反応物を３７℃で３時間インキュベートし、次に選択培地上に置いて、５％ＣＯ２中で３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。野生型ストレプトコッカス・ニューモニアエ株を適切なプラスミドを用いて形質転換することにより個々の突然変異体を作製し、ｐＰＣ２５を用いたＳｉｔ２Ａ−株の形質転換により、二重Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株を構築した。突然変異体株により保有される突然変異の同一性を、ＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーションにより確証した。ｐＰＣ２９以外のすべての突然変異は、抗生物質を含有しないＴＨＹブロス中での２回の８時間成長サイクル後に安定であった（Ｓｉｔ１Ａ−、Ｓｉｔ２Ａ−およびｐＰＣ４は、１００コロニーのうちの１００％がクロラムフェニコールに対して耐性であり、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−は１００コロニーのうちの１００％がクロラムフェニコールに耐性であり、エリスロマイシンに対して１００％耐性であり、ｐＰＣ２９は、１００コロニーのうち６５％がクロラムフェニコールに対して耐性であった）。
【００４５】
ストレプトニグリン感受性アッセイ
細菌生存ストレプトニグリンアッセイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ ａｓｓａｙｓ）のために、Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス中で成長させ、−７０℃で貯蔵したストレプトコッカス・ニューモニアエ株のストックを氷上で解凍し、４℃で２００００ｇでの遠心分離によりペレット化して、ＴＨＹ中に再懸濁させ、次にこれに、２．５μｇｍｌ−１のストレプトニグリン（Ｓｉｇｍａ）を添加した。反応物を３７℃でインキュベートし、ストレプトニグリン添加後４０および６０分で採取した反応培養物のアリコートを希釈し、平板培養した。各時点でのｃｆｕをストレプトニグリン添加前のｃｆｕのパーセンテージとして表し、結果を野生型株の結果の比率として提示した。ストレプトニグリンディスクに対する感受性を評価するために、Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス中で培養したストレプトコッカス・ニューモニアエストックを、数千コロニー／プレートの密度で、５０μＭのＦｅＣｌ３および４００μＭのＤＩＰ補足物を含有するかまたは含有しないＲＰＭＩｍプレート上で平板培養した。５μｇストレプトニグリンを含浸させた抗体ディスクをプレート上に置いた。５％ＣＯ２中で３７℃で２０時間インキュベーション後、各ディスク周囲の成長阻害帯の幅を測定し、３つの別個の結果に関する信頼区間を算定した。
【００４６】
５５Ｆｅ輸送アッセイ
以前に記載されたプロトコール（Ｂｅａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ， １９９９）から、５５Ｆｅ輸送アッセイを修正した。ＴＨＹブロス中で培養し、−７０℃で貯蔵したストレプトコッカス・ニューモニアエ株のストックを氷上で解凍し、５×１０７細胞を３ｍｌのＲＰＭＩｍに添加した。５％ＣＯ２中で３７℃で１時間インキュベーション後、５５ＦｅＣｌ３（ＮＥＮ）を添加して、最終濃度を０．２μＣｉｍｌ−１とした。反応物を３７℃でさらに１５または３０分間インキュベートし、次に０．４５μＭのニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、１０ｍｌのＲＰＭＩで洗浄し、乾燥させた。バックグラウンド放射能を低減するために、ニトロセルロースフィルターを、０．２μＭ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過した４０μＭのＦｅＣｌ３および５５ＦｅＣｌ３培地を用いて使用前に予備濾過した。反応フィルターを１０ｍｌのＯｐｔｉｓａｆｅシンチレーション液（Ｗａｌｌａｃ）中に入れて、ベックマンＬＳ１８０１シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ）の３Ｈ設定を用いて計数した。
【００４７】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ感染のマウスモデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験
体重１８〜２２ｇの異系交配雄白マウス（ＣＤ１系統、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ）を、Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａ免疫化実験以外のすべての動物実験に用いた。接種物は、ＴＨＹブロス中で培養し、−７０℃で貯蔵したストレプトコッカス・ニューモニアエ株の適切に希釈した解凍ストックで構成された。競合感染により比較される株を、接種物中の細胞の５０％を各株が占めるよう算定された割合で混合した。肺炎モデルに関しては、ハロタン（Ｚｅｎｅｃａ）の吸入によりマウスを麻酔し、５×１０５〜５×１０６個の細菌を含有する０．９％生理食塩水４０μｌを鼻腔内（ＩＮ）接種した。全身モデルのためには、５×１０１（生存曲線用）または１×１０３個（競合感染用）の細菌を含有する０．９％生理食塩水１００μｌを腹腔内注射によりマウスに接種した。３〜５匹のマウスを競合感染実験当たりで接種し、２４時間後（ＩＰ接種）または４８時間後（ＩＮ接種）に屠殺した。標的器官を回収し、０．９％生理食塩水０．５ｍｌ中で均質化し、希釈物を平板培養して、非選択性および選択性培地上で、５％ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。競合感染に関する結果は、マウスから回収された突然変異体対野生型株の比を、接種物中の突然変異体対野生型の比で割った値と定義された競合指数（ＣＩ）として表された（Ｂｅｕｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。マウスが疾患の以下の臨床的徴候を示した場合に、生存曲線用の各株の純接種物を接種されたマウスを屠殺した：重症立毛、体を丸めた姿勢、貧可動性、体重損失、ならびに（ＩＮ接種のみに関して）咳および頻呼吸。スチューデントｔ検定を用いてＣｌを１．０（試験した２つの株間のビルレンスの差異が認められない場合の予測ＣＩ）と比較し、ログランク法を用いて生存曲線を比較した。
【００４８】
Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座の同定および配列解析
肺炎のマウスモデルにおけるストレプトコッカス・ニューモニアエ株のｓｉｇｎａｔｕｒｅ−ｔａｇｇｅｄ突然変異誘発スクリーニングは、その予測アミノ酸産物がカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）の鉄取込みＡＢＣトランスポーターの一構成成分であるＣｅｕＣと３１％の同一性および５３％の類似性を有する遺伝子（ｓｍｔＡ）中に突然変異を含有するビルレンスを弱毒化された株を同定した（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｋ， １９９５）。周囲ゲノム配列の解析（未完成微生物ゲノムに関するＴＩＧＲウェブサイトで利用可能、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）は、ｓｍｔＡが鉄取込みＡＢＣトランスポーターと高度の同一性を有する有望なＡＢＣトランスポーターをコードする４つの遺伝子座の第二の遺伝子であることを示した（図１）。この４つの遺伝子座は、Ｓｉｔ１ＡＢＣおよびＤ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｉｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ １）と改名された。ＩＲＰ１（鉄調節ジフテリア菌リポタンパク質（ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｒａｔｅｄ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ ｌｉｐｏｔｒｏｔｅｉｎ））を用いたストレプトコッカス・ニューモニアエゲノムの研究は、ＩＲＰ１と４３％の同一性および６２％の類似性を有する予測アミノ酸配列である遺伝子Ｓｉｔ２Ａを同定した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ゲノム配列の解析は、Ｓｉｔ２Ａが鉄取込みＡＢＣトランスポーターと高度の同一性を有する第二の４遺伝子座Ｓｉｔ２ＡＢＣおよびＤのうちの最初の遺伝子であることを示した（図１）。Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座はともに、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子座の報告された組織化に従い、推定ＡＴＰアーゼをコードする１つの遺伝子、推定リポタンパク質鉄受容体をコードする１つの遺伝子、ならびに推定膜貫通パーミアーゼタンパク質をコードする２つの遺伝子を含有する（図１）。両遺伝子座において、４つの遺伝子は同一方向で転写され、どちらも短い遺伝子間配列（Ｓｉｔ１ＢおよびＳｉｔ１Ｃ間最大１３５ｂｐ）または重複するＯＲＦを有し、このことは、それらが単一転写単位であることを示唆する。Ｓｉｔ１Ｄの７２ｂｐ下流に推定１９ｂｐのヘアピンループターミネーター配列が存在する。ヘアピンループターミネーター配列は、Ｓｉｔ２Ｄの下流では同定されなかった。
【００４９】
Ｓｉｔ１遺伝子座は、その誘導アミノ酸配列がラクトコッカス・ラクティ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ）のＵＤＰガラクトースエピメラーゼと４３％の同一性を有するＯＲＦ（Ｓｉｔ１Ａの３９２ｂｐ上流で終結し、同一方向に転写される）およびその誘導アミノ酸配列が未知の機能を有するＯＲＦと高度の類似性を有する小ＯＲＦ（Ｓｉｔ１Ｄの２３０ｂｐ下流で開始し、反対方向に転写される）が隣接している（図１）。Ｓｉｔ２遺伝子座は、その誘導アミノ酸配列がバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ相同体と４２％の同一性を有するＯＲＦ（Ｓｉｔ２Ａの１３５３ｂｐ上流で終結し、同一方向に転写される）およびその誘導アミノ酸配列がスタフィロコッカス・アエレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）と２５％の同一性を有するＯＲＦ（Ｓｉｔ２Ｄの１９９７ｂｐ下流で開始し、同一方向に転写される）が隣接する（図１）。Ｓｉｔ１、Ｓｉｔ１Ｄ、およびＳｉｔ２、Ｓｉｔ２Ａの推定金属結合受容体の誘導アミノ酸配列間の同一性および類似性の程度は、２２％および５３％と低い。Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａは、鉄化合物結合リポタンパク質の別個の群に対して最高度の同一性を有する。Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａはともに、リポタンパク質シグナルペプチド切断部位に関するコンセンサス配列に適合するモチーフを含有する（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， １９９５）。推定ＡＴＰアーゼ、Ｓｉｔ１ＣおよびＳｉｔ２Ｄの誘導アミノ酸配列は、ＡＴＰ結合タンパク質に一般的に見出されるモチーフを含有する（Ｌｉｎｔｏｎ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， １９９８）。
【００５０】
鉄取込みおよびビルレンスにおけるＳｉｔ遺伝子座の役割を評価するために、ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ突然変異誘発により、Ｓｉｔ１ＡおよびＳｉｔ２Ａの突然変異を有する株を構築した。挿入物を各遺伝子座の第一の遺伝子に入れて、オペロン機能の完全不活性化を確実にした。Ｓｉｔ１ＡおよびＳｉｔ２Ａの両方に挿入物を含有する第三の突然変異体も構築した。突然変異体表現型がＳｉｔ遺伝子座の下流の遺伝子上の挿入物の極性効果によらないことを保証するため、それぞれＳｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ｄの停止コドンの７３および１００ｂｐ下流に挿入物を含有する２つのさらなる突然変異体、ＰＰＣ４およびＰＰＣ２９を構築した（図１）。
【００５１】
鉄欠損培地上でのＳｉｔ突然変異体の成長
Ｓｉｔ突然変異体株の成長を、非限定完全培地ＴＨＹ中、および陽イオンを除去するためにＣｈｅｌｅｘ−１００で処理されていたＴＨＹ中で、野生型株と比較した（図３）。ＴＨＹ中のすべての突然変異体株および野生型株間で成長に識別可能な差は認められなかった。ＴＨＹ中での成長と比較して、すべての株がＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹ中では成長減損を示し、この培地中では、二重突然変異体Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株が、野生型および単一Ｓｉｔ株と比較して、成長低減を示した（図３）。Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹ中での野生型および単一Ｓｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−株の成長欠陥は、４０μＭの塩化第二鉄または第一鉄の補足により逆転され、１０μＭのヘモグロビンの補足により部分的に逆転されたが、５μｇｍｌ−１のラクトフェリンまたは５μｇｍｌ−１のフェリチンによっては逆転されなかった。Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹ中での二重突然変異体Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株の成長は、塩化第二鉄または第一鉄の添加により野生型株の場合と類似したレベルに回復されたが、このことは、Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹ中での野生型株と比較した場合のこの株の成長欠陥は、鉄枯渇によるものであることを示唆している。しかしながら１０μＭのヘモグロビンのＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹへの補足はＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株の成長を回復せず、このことは、この株が鉄供給源としてヘモグロビンを使用できないことを示す。
【００５２】
鉄を添加していない限定培地ＲＰＭｌｍ中でのＳｉｔ株の成長を調べることにより、これらの知見を確証した。Ｃｈｅｌｅｘ−ＲＰＭｌｍ中での野生型株の成長は、Ｃｈｅｌｅｘ−ＴＨＹ中での成長と比較して遅延され、低減されたが、５μＭのヘモグロビンまたはヘミンの添加により顕著に改良され得た。Ｃｈｅｌｅｘ−ＲＰＭｌｍ中での野生型株の成長は、おそらくは遊離鉄による利用可能な金属イオントランスポーターの競合的阻害のために、塩化第一鉄、クエン酸第二鉄および塩化第二鉄により部分的に阻害されて、他の陽イオンの取込み低減を生じた。二重Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株は、１０μＭの塩化第二鉄または第一鉄を培地に補足しない場合には、Ｃｈｅｌｅｘ−ＲＰＭＩｍ中で成長できなかった。５μｍのヘモグロビンもしくはヘミン、または２５μＭのＭｎおよびＺｎの補足は、成長に最小作用を及ぼした。これらの結果は、鉄制限培地中で成長する場合、二重Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株が鉄の外因性供給源としてヘモグロビンを用いることができない、ということを確証する。それゆえ、Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座鉄トランスポーターの一基質はヘモグロビンである可能性が高く、Ｓｉｔ１またはＳｉｔ２の機能損失は他の鉄トランスポーターにより補償され得る。
【００５３】
Ｓｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−突然変異体はストレプトニグリンに対する感受性低減を示す
抗生物質ストレプトニグリンの殺菌作用は、細胞内鉄を必要とする（Ｙｅｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， １９８２）。それゆえ、ストレプトニグリンに対する低減した感受性は、鉄の低細胞内レベルの証拠であり、この特性は、鉄トランスポーター突然変異を同定するために利用されてきた（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３； Ｐｏｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ストレプトニグリンとともにインキュベートし、かつＲＰＭｌｍ培地上で平板培養した場合のストレプトニグリンディスク周囲の成長阻害帯を測定することにより、、突然変異体対野生型株の比例的生存率を比較することで、Ｓｉｔ−株のストレプトニグリン感受性を評価した（図４）。いずれの方法も、ストレプトニグリンに対してＳｉｔ株は野生型より感受性が低いことを示した。野生型細胞の約１０倍以上のＳｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−細胞ならびに１０００倍以上のＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−細胞がストレプトニグリンを用いた６０分間インキュベーションを生き残り（図４）、ストレプトニグリンディスク周囲の成長阻害帯は、野生型株よりＳｉｔ株の方が小さかった。金属キレート化剤２，２’−ジピリジル（ＤＩＰ）の補足は、Ｓｉｔ株と野生型株との間のストレプトニグリン感受性の差を強調した。４００μＭのＤＩＰの存在下では、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−二重突然変異体は５μｇのストレプトニグリンディスクに対して完全に耐性であったことは顕著であった。ＤＩＰを補足したプレートへの２５μＭのＦｅＣｌ３の添加はストレプトニグリン感受性を回復したが、２５μＭのＭｎＳＯ４は回復せず、このことは、ストレプトニグリンの効力が鉄依存性であることを確証する。これらの結果は、Ｓｉｔ−細胞が野生型細菌より少ない鉄を含有することを示し、Ｓｉｔ遺伝子座が鉄トランスポーターをコードするという間接的証拠を提供する。Ｓｉｔ２Ａ−株は、ストレプトニグリンに対する感受性がＳｉｔ１Ａ−株より低かったが、このことは、それが２つのうちの優勢鉄トランスポーターであり得ることを示唆する。両Ｓｉｔ遺伝子座の欠損は明らかな付加的作用を有し、ストレプトニグリンに対して高耐性の株を生じる。Ｓｉｔ遺伝子座のすぐ下流に挿入物を含有する突然変異体株、ｐＰＣ４およびｐＰＣ２９は、野生型株と同様のストレプトニグリン感受性を有したが、このことは、Ｓｉｔ−株のストレプトニグリン感受性の損失がＳｉｔ遺伝子座における突然変異によるものであることを確証する。ｐＰＣ２９は安定突然変異を含有しないが、ストレプトニグリン感受性実験において試験した培養物の５０％より多くが、依然としてクロラムフェニコール耐性であった。それゆえ、ｐＰＣ２９がストレプトニグリンに対して低感受性である場合には、部分的表現型が判別され得る。
【００５４】
Ｓｉｔ突然変異体株による５５ＦｅＣｌ３取込み
突然変異体および野生型株による放射性同位元素５５ＦｅＣｌ３の取込みを測定することにより、Ｓｉｔ遺伝子座の鉄取込みにおける役割に関する直接的証拠を得た（図５）。５５ＦｅＣｌ３とともに１５分間インキュベーション後、野生型と単一Ｓｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−株との間に差異は検出されなかった。しかしながら、５５ＦｅＣｌ３レベルは、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株に関しては有意に低かった。１５分でのＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株に関する５５ＦｅＣｌ３のより低いレベルが鉄取込み速度低減によるものであったことを示すために、野生型およびＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株に関する５５ＦｅＣｌ３のレベルを、５５ＦｅＣｌ３を用いて１５分間および３０分間インキュベーション後に比較した。１５〜３０分間に、野生型株の５５ＦｅＣｌ３含量は２８０％増大したが、一方、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株の５５ＦｅＣｌ３含量は１６０％増大し、このことは、Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座が鉄トランスポーターとして機能することを確証する。
【００５５】
肺炎および全身性感染のマウスモデルにおけるＳｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−株のビルレンス
Ｓｉｔ１Ａ−もしくはＳｉｔ２Ａ−または両方の遺伝子における突然変異のビルレンスに及ぼす影響を、肺（鼻腔内接種、ＩＮ）および全身感染（腹腔内接種、ＩＰ）のマウスモデルで調べた（図６）。突然変異体株対野生型株の競合感染を用いて、ビルレンスにおけるかすかな差異を評価し、致命的疾患を引き起こす株の能力を、生存曲線を用いて評価した。競合感染に関する結果は、標的器官から回収された突然変異体対野生型コロニーの比を接種物中の突然変異体対野生型株の比で割って表される（競合指数、ＣＩ）（Ｂｅｕｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００５６】
野生型株に対する競合感染において、Ｓｉｔ１Ａ−株は肺感染において軽度に弱毒化された（肺ＣＩ＝０．６７、ＳＤ  ０．０７；脾臓ＣＩ  ０．４、ＳＤ  ０．３４）が、全身感染モデルにおいては弱毒化されなかった（脾臓ＣＩ  １．１３）。Ｓｉｔ２Ａ−株は、肺感染モデル（肺ＣＩ  ０．１３、ＳＤ  ０．１４；脾臓ＣＩ  ０．１４、ＳＤ  ０．１５）および全身感染モデル（脾臓ＣＩ  ０．３２、ＳＤ  ０．１１）の両方において明らかに弱毒化された。それゆえ、Ｓｉｔ遺伝子座は感染中に異なる役割を有すると思われ、Ｓｉｔ２は、肺および全身感染の両方に関してより重要である。Ｓｉｔ１遺伝子座のすぐ下流に挿入物を含有する突然変異体株ｐＰＣ４はビルレンスを低減されず、このことは、Ｓｉｔ１Ａ−株のビルレンス低減が極性効果によるものでなかったことを確証する。その相対的不安定性のために、Ｓｉｔ２遺伝子座のすぐ下流に挿入物を含有する突然変異体株ｐＰＣ２９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは試験しなかった。二重Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株は、感染の肺および全身モデルの両方で、野生型株と比較してビルレンスがかなり低減された。Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−コロニーは野生型株を用いた混合接種物においてＩＰ接種の２４時間後に脾臓から回収され、ＩＮ接種後に野生型コロニーより約１０３少ないＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−コロニーが肺から回収された（それぞれ１．３×１０４対６．８×１０７、ｎ＝３）。これらの結果は、Ｓｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−の両方の突然変異がストレプトコッカス・ニューモニアエのビルレンスに相乗作用を及ぼすことを示唆する。この知見を確証するために、肺競合感染においてＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株をＳｉｔ２Ａ−株と比較した。Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座における突然変異が非連結ビルレンス機能に影響を及ぼした場合、Ｓｉｔ２Ａ−突然変異のＣＩに及ぼす結果は接種物中の両株に等しく影響を及ぼす。それゆえ、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株対Ｓｉｔ２Ａ−株に関するＣＩは、Ｓｉｔ１Ａ株対野生型のＣＩ（ＣＩ＝０．６７）と同様であった。しかしながら、ＣＩは０．００１より低く、これは、Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２の二重突然変異がストレプトコッカス・ニューモニアエビルレンスに相乗作用を及ぼすことを実証する。
【００５７】
肺（接種物５×１０６ｃｆｕ、５日後死亡率８０〜１００％）または全身感染（接種物５０ｃｆｕ、４８時間後死亡率１００％）における野生型または単一Ｓｉｔ１Ａ−およびＳｉｔ２Ａ−株を接種したマウスの死亡率に、差異は認められなかった（図６）。しかしながら、二重突然変異体Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株は、肺感染モデルにおいて高度に弱毒化された。接種後最初の３６時間中に軽度の立毛および可動性低減を伴う一過性疾病後、Ｓｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株を接種されたすべてのマウスが回復し、実験継続中生存した。対照的に、どちらかの単一の突然変異体（Ｓｉｔ１Ａ−またはＳｉｔ２Ａ−）株を用いた全身感染によるマウスの死亡率は、９０％であった。しかしながら、死亡時間は、野生型株と比較して、有意に遅延された（ｐ＝０．００２、対数ランク試験）。
【００５８】
ｓｉｔ２は病原性島上にコードされる
Ｓｉｔ２遺伝子座のすぐ下流のＯＲＦの最も近い相同体（ＯＲＦ１）は、黄色ブドウ球菌ｍｅｃ可動性遺伝要素により保有される推定リコンビナーゼである。ｍｅｃは、メチシリン耐性を付与する「抗生物質耐性島」であり、リコンビナーゼは黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ中でのｍｅｃの組換えを触媒し得る（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。さらに、ゲノム配列の解析は、Ｓｉｔ２遺伝子座が上流ＤＮＡ配列より低いＧＣ含量を有し、Ｓｉｔ２遺伝子座のすぐ上流のＯＲＦ（ＯＲＦ  Ｂ）のＣ末端内でＧＣ含量の顕著な低下が生じることを示した。これらの知見は、血清型４ストレプトコッカス・ニューモニアエ株からの利用可能なゲノム配列を用いて、Ｓｉｔ２がＰＩの一部であり得るというさらなる証拠に関する研究を刺激した。
【００５９】
Ｓｉｔ１を含有するコンティグ上の２５０，０００ｂｐのストレプトコッカス・ニューモニアエ染色体ＤＮＡのＧＣ含量は３８．９％で、これは化学的方法により算定された推定値と類似した（３８．５％、Ｈａｒｄｉｅ， １９８６）。Ｓｉｔ２遺伝子座を含む４１．６ｋｂのＤＮＡの連続８００ｂｐセグメントのＧＣ含量の解析は、平均ＧＣ含量３２．６％で、周囲配列よりほぼ７％低い約２７，０００ｂｐの領域を同定した（ｐ＜０．００１、図２）。この領域は、ＰＰＩ１（肺炎球菌病原性島１：Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｐａｔｈｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｓｌａｎｄ １）と命名された。ＰＰＩ１の境界は、ＧＣ含量の著しい低減により特徴付けられ（図２）、ＧＣ含量解析により、１０ｂｐ重複するＤＮＡの２００ｂｐ長のうちの５０ｂｐ内に限定された。左手境界は、有望なＲＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするＳｉｔ２遺伝子座に対して最初のＯＲＦ５‘のＣ末端内にある（図２）。ＰＰＩ１の右手境界は、データベース中に密接な相同染色体を有さないＯＲＦとおそらくはトランスポザーゼとの間にある（図２）。ＰＰＩ１境界周囲のＤＮＡ配列の視覚的解析は、逆または直接反復を同定しなかった。約４０００および３２００ｂｐ長のＰＰＩ１内の２つの領域は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ染色体に近いＧＣ含量を有する（図２）。ＰＰＩ１の３’末端のすぐ下流の推定トランスポザーゼは挿入配列ファミリーＩＳ６０５に属し、これはグラム陰性病原体のＩＳ２００トランスポゾンを含む（Ｍａｈｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ， １９９８）。ＩＳ６０５トランスポゾンはストレプトコッカス・ニューモニアエで報告されており（Ｏｇｇｉｏｎｉ ａｎｄ Ｃｌａｖｅｒｙｓ， １９９９）、低頻度の転位およびトランスポザーゼに対する５’のヘアピンループを特徴とするが、末端逆位反復（ＩＲ）を含有しない（Ｂｅｕｚｏｎ ａｎｄ Ｃａｓａｄｅｓｕｓ， １９９７； Ｍａｈｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ， １９９８）。これらのデータをふまえて、トランスポザーゼに対して５’のヘアピンループ１５９ｂｐをわれわれは同定した。トランスポザーゼが隣接するほかに、ＰＰＩ１は、可動性遺伝要素に関連した２つのＯＲＦ、上記のリコンビナーゼおよびレラキサーゼ（ＯＲＦ１１）を含有する。Ｓｉｔ２遺伝子座と対照的に、Ｓｉｔ１遺伝子座周囲の染色体ＤＮＡは４０．１％の平均ＧＣ含量を有し、そのＧＣ含量の領域は、ストレプトコッカス・ニューモニアエに関する平均から有意に変化しない。
【００６０】
ＰＰＩ１内のＳｉｔ２遺伝子座のほかに、その予測アミノ酸産物が１００残基より長い１４のＯＲＦが存在する（図２）。不完全ゲノム配列は、３つの非ストレプトコッカス・ニューモニアエストレプトコッカス種（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）およびストレプトコッカス・エクイー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｉ）に関して、ワールドワイドウェブ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）で利用可能であり、ストレプトコッカスの間のＰＰＩ１内に、またはそれに隣接して存在するＯＲＦの分布の調査を可能にする（図２）。ＰＰＩ１に隣接する５つのＯＲＦは、２つまたはそれ以上の非ストレプトコッカス・ニューモニアエストレプトコッカス種からのＯＲＦと少なくとも５９％の同一性を有するが、ＰＰＩ１内の１４のＯＲＦのうちの８つは、非ストレプトコッカス・ニューモニアエストレプトコッカス種からのＯＲＦと同一性を有さない。残りの６つのＯＲＦは、非ストレプトコッカス種およびストレプトコッカス種からのＯＲＦと同様のレベルの、２２％〜４２％の範囲の同一性を有する。さらにこれらのＯＲＦは、可動性要素の一部を含み（例えばＯＲＦ１はリコンビナーゼであり、ＯＲＦ１０はレラキサーゼである）、または所与のゲノム内の多数の代表物を有するタンパク質のファミリーに属する（ＯＲＦ１３は有望なＡＴＰアーゼであり、ＯＲＦ１１は考え得る転写因子である）。Ｓｉｔ２Ａは、非ストレプトコッカス種からのＯＲＦのみと高度の類似性を有するが、Ｓｉｔ１Ｄはストレプトコッカス突然変異体からのＯＲＦと高度の同一性を有する（３３２残基にわたって、３５％の同一性および５２％の類似性）。
【００６１】
ＢＬＡＳＴ探索の結果は、ＰＰＩ１と隣接するＯＲＦがわずかに関連したストレプトコッカス種中に存在し、一方、Ｓｉｔ２およびＰＰＩ１内のＯＲＦはそうではないことを示唆した。非ストリンジェント条件下での、Ｓｉｔ遺伝子およびＰＰＩ１  ＯＲＦの内部断片をプローブとして用いたサザン解析により、ストレプトコッカス・ニューモニアエに密接に関連したストレプトコッカス種内のＳｉｔ遺伝子座およびＯＲＦの分布をＰＰＩ１内および周囲で調べた。Ｓｉｔ１Ｄプローブは、Ｓ．ミチス（Ｓ． ｍｉｔｉｓ）、Ｓ．サングイス（Ｓ． ｓａｎｇｕｉｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ． ｏｒａｌｉｓ）およびＳ．ミレリ（Ｓ． ｍｉｌｌｅｒｉ）のゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズしたが、Ｓｉｔ２Ａプローブはストレプトコッカス・ニューモニアエＤＮＡとだけハイブリダイズした。それゆえ、Ｓｉｔ１はストレプトコッカス・ニューモニアエに密接に関連したストレプトコッカス種の間に広範に分布するが、一方、Ｓｉｔ２はストレプトコッカス・ニューモニアエに限定される。Ｓｉｔ１ＡおよびＳｉｔ２Ａの内部断片（Ｓｍｔ６．１／２およびＩＲＰ１．１／２）に特異的なプライマーによるＰＣＲを用いて、異なるストレプトコッカス・ニューモニアエ株中のＳｉｔ遺伝子座の存在を調べた。調べたすべてのストレプトコッカス・ニューモニアエ株中に、両遺伝子が存在した。ＰＰＩ１内の、およびそれに隣接するＯＲＦの内部断片を用いてプローブした種々のストレプトコッカス種のサザン解析の結果を、図２に示す。要約すると、それぞれＰＰＩ１の５’末端に隣接するＯＲＦＢおよびＤならびにＰＰＩ１の３’末端のトランスポザーゼに関してすべてのビリダンスストレプトコッカス（ｖｉｒｉｄａｎｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）から、ハイブリダイゼーションシグナルを得た。しかしながら、ＰＰＩ１内のＯＲＦは、通常はストレプトコッカス・ニューモニアエから以外、ハイブリダイゼーションシグナルを生じず、このことは、ＰＰＩ１がストレプトコッカス・ニューモニアエ中にのみ存在し、ストレプトコッカス・ニューモニアエと最も密接に関連するストレプトコッカス種中には存在しないことを確証する。
【００６２】
本明細書中に開示した実験は、４つの遺伝子配列（ＳｉｔＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）を含有する第三の鉄輸送系（Ｓｉｔ３）も明示した。遺伝子配列は、添付の配列表で識別される。
【００６３】
Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａ免疫化実験
この実験は、Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａタンパク質の組合せを含むワクチンの有効性を例証する。
【００６４】
ＢＡＬＢｃは、７〜１０日間隔をあけて３回、ＩＰにより１０μｇのタンパク質（大腸菌中のｐＱＥ３０発現ベクター中で発現させ、Ｈｉｓタグを用いて精製した）を投与され、次にＩＰ接種した１０，０００個のストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞による最終免疫化後２週間目に試験されたマウスであった。
【００６５】
明礬を陰性対照として用いて、Ｐｄｂと呼ばれる無毒性ニューモリシン変異体を陽性対照（防御的であることが既知である）として用いた。他のタンパク質は、Ｓｉｔ１Ｄ、Ｓｉｔ２Ａ、Ｓｉｔ２Ａと組合せたＳｉｔ１Ｄ、Ｐｄｂと組合せたＳｉｔ１Ｄ、およびＰｂｄと組合せたＳｉｔ２Ａであった。
【００６６】
本質的に、Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａはともに、Ｐｄｂと同様に防御的であり、Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａの組合せは非常に防御的である（明礬群の０％と比較して、８０％長期生存者）。ＰｄｂとＳｉｔ１ＤまたはＳｉｔ２Ａのいずれかの組合せは、個々のタンパク質を上回る付加的防御利点を有さなかった（図７）。
【００６７】
防御作用が抗体媒介性であることを示すために、免疫化マウスからの血清を別の群の実験未使用マウスにＩＰ投与し、次にこれらのマウスを３０００個の細菌を接種した。結果は、組合せＳｉｔ１Ｄ／Ｓｉｔ２Ａ抗血清を投与された群に関する明らかな効果を示した。Ｓｉｔ１Ｄ／Ｓｉｔ２Ａ抗血清による明らかな陽性結果は、Ｓｉｔ１ＤおよびＳｉｔ２Ａによる免疫化の防御効果が血清、すなわち抗体依存性現象であることを確証する（図８）。
【００６８】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｓｉｔ１およびＳｉｔ２遺伝子座の概略図であって、中白ボックスはＳｉｔ遺伝子座に隣接するＯＲＦを表し、黒色ボックスは推定鉄結合受容体を表し、灰色ボックスは推定ＡＴＰアーゼを表し、斜線陰影は推定パーミアーゼを表し、矢印は突然変異体株における挿入の部位を表す。
【図２】
ＰＰＩ１の概略図であって、（Ａ）および（Ｂ）はＰＰＩ１に関するＧＣ含量プロットを示し、破線は、ストレプトコッカス・ニューモニアエＤＮＡの平均ＧＣ含量を表し（３８．９％）、（Ｃ）はＰＰＩ１に隣接し、ＰＰＩ１内に含入されるＯＲＦを示す。ある種に存在するＯＲＦには＋印を、存在しないＯＲＦには−印を付す。
【図３】
光学濃度により測定したｓｉｔ突然変異体の成長を示すグラフであって、（Ａ）はＴＨＹブロス中での成長を示し、（Ｂ）はＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス中での、（Ｃ）はＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス＋１０μＭのＦｅＣｌ２中での、（Ｄ）はＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス＋１０μＭのＦｅＣｌ３中での、および（Ｅ）はＣｈｅｌｅｘ−ＴＨＹブロス＋１０μＭのヘモグロビン中での成長を示し、図中、◇は野生型株、□はＳｉｔ１Ａ−株、○はＳｉｔ２Ａ−株、▲はＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株を表し、（Ｆ）は、Ｃｈｅｌｅｘ−ＲＰＭｌｍ中でのＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ−株の成長を示す（Ｘは補足なしを表し、■は１０μＭのＦｅＣｌ３を表し、○は１０μＭのヘモグロビンを表し、△は２５μＭのＭｎＳＯ４および２５μＭのＺｎＳＯ４補足物を表す）。
【図４】
Ｓｉｔ株のストレプトニグリンに対する感受性を例示する。
【図５】
５５ＦｅＣｌ３取込みを示すグラフであって、図中、（Ａ）は１５分後の野生型、Ｓｉｔ１Ａ−、Ｓｉｔ２Ａ−およびＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ株を表し、（Ｂ）は１５分後および３０分後の野生型およびＳｉｔ１Ａ−／Ｓｉｔ２Ａ株を表す。
【図６】
Ｓｉｔ突然変異体株を接種されたマウス１０匹の群の生存率を表すグラフである。（Ａ）は鼻腔内（ＩＮ）接種を表し、（Ｂ）は腹腔内（ＩＰ）接種を表す。
【図７】
種々のタンパク質で処置され、ストレプトコッカス・ニューモニアエに感染させたマウスの生存率（％）を示すグラフである。
【図８】
本発明の種々のタンパク質で免疫化されたマウスからの血清を投与されたマウスの生存率を示すグラフである。シリーズ１は明礬のみを表わし、シリーズ２はＳｉｔ１Ｄ、シリーズ３はＳｉｔ２Ａ、シリーズ４はｐｄｂ、シリーズ５はｐｄｂ＋Ｓｉｔ１Ｄ、シリーズ６はｐｄｂ＋Ｓｉｔ２Ａ、シリーズ７はＳｉｔ１Ｄ＋Ｓｉｔ２Ａである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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