(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、マングローブ関連植物から得られる生物活性分子を抽出、分画、及び精製する方法、粗抽出物、その画分、及び精製化合物の薬理活性をスクリーニングする方法、並びに前記粗抽出物の水画分の子宮収縮抑制剤としての使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮収縮抑制剤として有用な薬学的組成物であって、必要に応じて慣用の添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られる抽出物を含む薬学的組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、β−アミリン、ベツリン、ウルソール酸、パルミチン酸メチル、及びルペオールから選択される化合物を含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、Salvadora persicaの粗抽出物から得られる水画分である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記添加物が、治療的に許容される添加物から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中の抽出物の量が、１０μｇｍである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抽出物の薬用量が、３μｇ／ｍＬ乃至１０μｇ／ｍＬである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
子宮筋の痛みを緩和する方法であって、必要に応じて慣用の添加物とともに、前記植物Salvadora persicaから得られる治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項８】
前記植物Salvadora persicaから得られる前記抽出物が、水画分である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
３μｇ／ｍＬ乃至１０μｇ／ｍＬの量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物Salvadora persicaから得られる前記粗抽出物の水画分であって、哺乳動物中で子宮収縮抑制活性を示す水画分。
【請求項１２】
マングローブ関連植物から生物学的に有用な分子を抽出及び精製する方法であって、
１）Salvadora persicaの植物部分を収集及び加工する工程と、
２）Salvadora persicaの前記植物部分から粗抽出物を調製する工程と、
３）薬理学の方法を使用して前記粗抽出物を検査する工程と、
４）前記粗抽出物を分画する工程と、
５）薬理学の方法を使用して前記画分を検査する工程と、
６）カラムクロマトグラフィーによって純粋な化合物を単離する工程と、
７）薬理学の方法を使用することによって前記純粋な化合物を検査する工程と、
８）分光法によって前記化合物を同定する工程と、
を備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Salvadora persica  Linneaus  1753という植物から得られる生物学的に活性な抽出物に関する。本発明は、粗抽出物を得る方法も提供する。さらに、本発明は、生物活性、特に子宮収縮抑制活性を示す薬学的組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
マングローブ関連植物Salvadora persica  Linneaus  1753は、Salvadoracea目に属し、インド西海岸全域の朽ちたマングローブの湿地や塩分を含む浅瀬に多く見られる白い花の潅木又は低木である。これまで、数多くの海生植物の生物活性物質が調査されてきた。Ｎａｚａｒｉｎｅ、Ｆ；Ａｎｉｔａ  Ｆ；Ｒａｔａｂｏｌｉ、Ｐ．Ｖ．；Ｄｉｎｉｚ  Ｄ’Ｓｏｕｚａ、Ｒ．Ｓ、及びＤｈｕｍｅ、Ｖ．Ｇ．、１９９８は、「Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７：４９９−５０１」の中で、インドの海域で得た海洋生物中に有望な薬理活性を報告している。
【０００３】
様々な用途の天然化合物や方法に関連する特許が世界中で幾つか取得されている。Ｋｗａｋ、Ｗｉｅ−ｊｏｎｇ、Ｈａｎ、Ｃｈａｎｇ−ｋｙｕｎ、Ｋｕｍ、Ｈｗａｎ−ｓｕ、Ａｎ、Ｊａｅ−ｓｕｋ、Ｋｕｍ、Ｔａｅｋ−ｓｏｏは、薬用植物の混合物やそれらの抽出組成物から生物学的に有効な成分を抽出及び精製する方法に関して特許を付与された（米国特許第５，９１０，３０７号、１９９９年６月８日公開）。Ｄ’Ａｍｅｌｉｏ、Ｆｒａｎｋ  Ｓ、Ｍｉｒｈｏｍ、Ｙｏｕｓｓｅｆ  Ｗ．は、１９９８年９月８日に公開された、米国特許第５，８０４，２０６号の中で、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ  ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉという植物から得られる抽出物を用いて皮膚を治療する治療用組成物及び方法を開示した。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．、Ａｌｂｅｒ、Ｒａｎｄａｌｌ  Ｓ．、Ｔｏｄｄ、Ｊａｍｅｓ  Ｓ．、Ｃｒｅｗｓ、Ｐｈｉｌｉｐは、Ｚｏｓｔｒｅａ  ｍａｒｉｎａというアマモのメタノール抽出物から、水中での顕著な付着防止特性を有する化合物を単離した（米国特許第５，６０７，７４１号、１９９７年３月４日公開）。
【０００４】
ベツリンという化合物から調製されるベツリン酸は、多くの薬学的な効能を有している。Ｐｅｚｚｕｔｏ  Ｊｏｈｎ  Ｍ、Ｋｉｍ、Ｄａｒｒｉｃｋ  Ｓ．Ｈ．Ｌ．は、ベツリンからベツリン酸を作製する方法を開示した（１９９８年９月８日に公開された米国特許第５，８０４，５７５号）。ベツリン酸は、様々な病気の治療剤の候補として熱心に研究されている。Ｐｅｚｚｕｔｏ、Ｊｏｈｎ  Ｍ、Ｄａｓ  Ｇｕｐｔａ、Ｔａｐａｓ  Ｋ、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍａｒｙ  Ｌｏｕ、Ｋｕｚｍａｎｏｆｆ、Ｋｏｎｒａｄ  Ｍａｒｃ、Ｌｉｎｇ  Ｉｎｄｅｃｋ、Ｌｙｄｉａ、及びＫｉｍ、Ｄａｒｒｉｃｋ、Ｓ．Ｈ．Ｌ．（１９９９年１０月５日付け米国特許第５，９６２，５２７号）。Ｐｉｓｈａ  Ｅ，Ｃｈａｉ  Ｈ、Ｌｅｅ  ＩＳ、Ｃｈａｇｗｅｄｅｒａ  ＴＥ、Ｆｒａｍｓｗｏｒｔｈ  ＮＲ、Ｃｏｒｄｅｌｌ  ＧＡ、Ｂｅｅｃｈｅｒ  ＣＷ、Ｆｏｎｇ  ＨＨ、Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ＡＤ、Ｂｒｏｗｎ  ＤＭは、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、１０４６−１０５１頁（１９９５）」の中で、ヒトの黒色腫（例えば、ＭＥＬ−１、ＭＥＬ−２、及びＭＥＬ−４）に対して、ベツリン酸が予期せぬ選択的な抗腫瘍活性を有することを開示している。さらに、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｔ、Ｋａｓｈｉｗａｄａ  Ｙ、Ｋｉｌｋｕｓｋｉｅ  ＲＥ、Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ  ＬＭ、Ｂａｌｌａｓ  ＬＭ、Ｊｉａｎｇ  ＪＢ，Ｊａｎｚｅｎ  ＷＰ、Ｃｈｅｎ  ＩＳ、Ｌｅｅ  ＫＨ、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５７（２）２４３−２４７頁（１９９４）は、Ｈ９リンパ球細胞中でベツリン酸が抗ＨＩＶ活性を有することを開示している。これらの発明者らは、入手可能なベツリン酸の量が極めて限られており、しかも極めて高価なので、ｔ  ベツリン酸を治療剤として開発した研究者達にとって困難となったことを述べている。Ｒａｍａｄｏｓｓ、Ｓｕｎｄｅｒ、Ｊａｇｇｉ、Ｍａｎｕ、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ、Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｊａｍｓｈｅｄ  Ａｈｍｅｄは、２０００年４月１１日に公開された米国特許第６，０４８，８４７号の中で、ベツリン酸とその誘導体を癌の増殖を阻害するために使用すること、及びこれをモニタリングする方法について記載している。Ｋａｎｇ、Ｒａｐｈａｅｌ  Ｋ．Ｌ．、Ｚｙｚａｋ、Ｌｉ  Ｌｉ、ｎａｋａｔｓｕ、Ｔｅｔｓｕｏは、１９９９年９月７日付けの米国特許第５，９４８，４６０号の中で、製品中の後味を弱め、製品（ダイエット飲料など）の甘みを増強するために風味付製品に加えられた三つの化合物群の一つがウルソル酸である風味付製品の添加物を公開した。これは、皮膚の腫瘍発生を阻害するための調製物の成分としても使用された。
【０００５】
Ｈｅｒｍａｎ，Ｓ（米国特許第５，１９０，９７９号、１９９３年３月２日に公開）は、医学的な価値を有する薬理学的に活性なテルペンオゾニド類を作製することができる化合物として、ルペオールも開示した。
【発明の開示】
【発明の目的】
【０００６】
本発明の主たる目的は、マングローブの生える沼地で一般的に入手可能な低木であるSalvadora persicaの茎部、葉、及び花の粗抽出液を得る方法と、並びにその生物活性研究をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、植物Salvadora persicaから得られる天然の化合物を単離し、その分子量、分子式、融点、及び構造式を同定することであり、これらは前記化合物の化学合成において有益であろう。
【０００８】
さらに、本発明の別の目的は、粗抽出物、その画分、及び精製化合物を薬理学的にスクリーニングして、前記祖抽出物及び画分によって示された前記活性が終始維持されることをチェックすることである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、植物Salvadora persicaからの抽出物を含有し、生物活性、特に子宮収縮抑制作用を示す薬学的組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、活性な粗抽出物を加工し、これを分画し、活性な化合物を単離及び精製するための極めて効率がよく且つ選択的な手段を提供することにより、従来技術に存する欠点を克服しようと努める。さらに、本発明は、植物Salvadora persicaから得た抽出物を含有する薬学的組成物であって、子宮筋の疼痛緩和に有益な薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、インド西海岸のマングローブが生息する沼地で一般的に入手可能な植物から得た、上述した商業的に重要な全ての化合物を単離し、精製し、及び薬理学的にスクリーニングする方法を初めて開示する。前記植物はSalvadora persicaであると同定されたマングローブ関連植物である。この植物は低木で、花弁のついた小枝を手で摘み取ることができる。さらに、この粗抽出物及び画分には治療的価値がある。重要な点は、抽出液の示す生物活性がパルミチン酸メチル及びベツリン等の精製化合物中で維持されることである。
【００１２】
本開示は、平滑筋弛緩薬及び気管支喘息、腎疝痛、未熟産予防等の疾患治療のために、前記抽出物及び画分を将来臨床に使用できる可能性があることを指し示している。また、本開示は、パルミチン酸メチル及びベツリンを乗り物酔い及び腹部痙攣に使用することにも関する。
【００１３】
本発明は、Salvadora persica  Linneaus  1753として同定されたマングローブ関連植物から生物活性を有する粗抽出物を調製する方法を提供する。Salvadora persica  Linneaus  (Salvadoraceae)は、西アジアのインド西海岸全域の削剥したマングローブの沼地及び塩水の河原に多く見られる、白い花を咲かせる低木又は小さな木である。本発明において開示された方法は、さらに、前記植物の活性成分代謝物の抽出、分画、及び精製に関する。本発明は、β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）、ベツリン、ウルソール酸（トリテルペン酸）、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）、及びルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）等の化合物のスペクトル同定にも関する。本発明は、前記化合物の分子式、分子量、融点、及び構造式も扱う。本発明は、Salvadora persicaから得た活性な粗抽出物を加工し、これを分画し、単離及び精製するための極めて効率が良く且つ選択的な方法を提供する。本明細書で使用されている分画(fractionation)という語は、粗抽出物の分離を意味する。単離及び分画という語は、その分画を純粋な化合物に分別することを意味する。
【００１４】
本発明はさらに、前記化合物の薬理学的な活性を哺乳類組織においてスクリーニングする方法に関する。本出願人は、植物Salvadora persicaから得た粗抽出物が２つの分画（すなわちクロロホルム画分と水画分）に分離できることを発見した。この水分画は子宮収縮抑制作用を示すことが発見されたので、本発明に詳細に記述する。
【００１５】
従って、本発明は、マングローブ関連植物から生物学的に有用な分子を抽出及び精製する方法であって、
１）Salvadora persicaの植物部分を収集及び加工する工程と、
２）Salvadora persicaの前記植物部分から粗抽出物を調製する工程と、
３）薬理学の方法を使用して前記粗抽出物を検査する工程と、
４）前記粗抽出物を分画する工程と、
５）薬理学の方法を使用して前記画分を検査する工程と、
６）カラムクロマトグラフィーによって純粋な化合物を単離する工程と、
７）薬理学の方法を使用することによって前記純粋な化合物を検査する工程と、
８）分光法によって前記化合物を同定する工程と、
を備えた方法を提供する。
【００１６】
前述したように、マングローブ植物Salvadora persicaから得た前記粗抽出物の水分画は子宮収縮抑制作用を示したが、残り２つの画分（ブタノール及び石油エーテル）は不活性であった。
【００１７】
本発明は、スペクトルデータからの分子の同定も提供する。このスペクトルデータからは、５つの化合物の分子式が提供される。本発明は、ＥＩＭＳから得られた前記分子の分子量を提供する。前記スペクトルデータからは、前記化合物の構造式も提供される。
【００１８】
このように、植物Salvadora persicaから粗抽出物が得られた。該粗抽出物の生物活性を検査し、その薬理学的活性の観点から有望であることが見出された場合には、石油エーテル、クロロホルム、ブタノールの及び水等の画分を得るために、極性が増加する溶剤を使用して分画した。これらの各々についても、その薬理学的活性を検査した。
【００１９】
前記植物の抽出物から精製した５つの化合物は、β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）、ベツリン、ウルソール酸（トリテルペン酸）、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）、及びルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）であった。
【００２０】
β―アミリンは、下記の詳細を有する非ステロイド性多環式トリテルペンであることが明らかとなった。
【００２１】
分子式      :Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量      :４２６
融点        :１６０℃
発見された別の分子は、
分子式      :Ｃ３０Ｈ５０Ｏ２
分子量      :４４２
融点        :２５５℃
前記抽出物中には、ウルソール酸（トリテルペン酸）分子も見出された。ウルソール酸は、
分子式      :Ｃ３０Ｈ４８Ｏ３
分子量      :４５６
融点        :２９２℃
を有していた。
【００２２】
前記抽出物中に見出されたパルミチン酸メチル（脂肪族エステル）は、
分子式      :Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２
分子量      :２５６
融点        :３０℃
前記抽出物中に見出されたルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）は、
分子式      :Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量      :４２６
融点        :２１５℃
を有していた。
【００２３】
ベツリン酸の製造に使用され得る化合物ベツリンの一つは、１９９８年９月８日に公開された（米国特許第５，８０４，５７５号）。ベツリン酸は、様々な疾患に対する治療薬の候補として徹底的に研究されている。
【００２４】
風味製品の後味を減少させ、ダイエット飲料等の甘味を強化するために、ウルソール酸は風味製品に添加される。また、ウルソール酸は、皮膚腫瘍形成を抑制するための調製物の成分としても使用された。
【００２５】
植物の抽出物には、血管収縮及び鎮痛特性を示すものがあり、トリテルペノイドのβ―アミリンを含むものもある。好ましくない皮膚の色素沈着形成を阻止するために、これらの組成物は、化粧品における安定性、顕著な細胞毒性の欠如、及び相乗作用に加えて、高いチロシナーゼ遮断能を併有する（米国特許第５，７７３，０１４号及び５，６７９，３９３号）。医薬品のジメチルステロールの成分として、β―アミリン及びルペオールが使用されている（米国特許第４，８０８，５７４号）。
【００２６】
２０００年４月１日に公開された米国特許第６，０４９，０１３号に記述の通り、パルミチン酸メチルはアルコールの製造に使用される化合物である。ルペオールは、いくつかの治療薬、昆虫忌避剤、醸造所、抗腫瘍剤及び化学産業用の成分として使用することができる（米国特許第４，８０８，５７４号、第５，９６２，５２７号、第５，９０８，６２８号）。
【００２７】
このように、Salvadora persicaの抽出物には上記の化合物の幾つかが含まれていた。次いで、前記植物Salvadora persicaの抽出物の水画分の生物活性をモルモットで検査した。本出願人らは、驚くべきことに、前記水画分が優れた子宮収縮抑制作用を示すことを発見した。
【００２８】
従って、本発明は、子宮筋の疼痛を緩和するための組成物であって、Salvadora persicaから得た抽出物の水画分を含有し、必要に応じて、慣用の添加物を加えた組成物を提供する。前記組成物には、約１０μｇｍの前記抽出物を含有し得る。このように、植物Salvadora persicaから得た前記粗抽出物の水画分は、子宮収縮抑制薬の候補である。前記組成物は、必要に応じて、様々な物理的形状に調剤することができる。必要に応じて、前記抽出液は、そのまま使用してもよいし、あるいは慣用の添加物、生理学的に許容し得る担体、防腐剤、緩衝剤等と共に使用してもよい。
【００２９】
さらに、本発明は、子宮収縮抑制症状を治療する方法であって、Salvadora persicaから得た治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与することを備えた方法を提供する。前記抽出物は、健常な成体の場合、５０μｇ／ｍＬから２５０μｇ／ｍＬの範囲の用量で投与され得る。前記抽出物の正確な投与量は、治療を受ける患者により異なり、患者の要求及び治療を受ける症状の重症度、抽出液の活性等の因子に左右されるであろう。特定の患者に対する最適な投与量の決定は、当業者に周知である。
【００３０】
以下の実施例によって、本発明を詳述し、説明するが、本明細書に具体化された発明の思想を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００３１】
本実施例は、用いた化学薬品、試薬、装置、及びそれらの入手先を記載する。
【００３２】
＜試薬／化学薬品の名前＞              ＜会社＞
メタノール水溶液            Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
石油エーテル                Ranbaxy Fine Chemicals Ltd.
クロロホルム                Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
ブタノール                  Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
酢酸エチル                  Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
ヒスタミン酸ホスフェート    Blenkinsop & Co. Ltd
塩化アセチルコリン          Hopkin & Williams Ltd.
５−ヒドロキシトリプタミン−クレアチン硫酸塩          Sigma Chemicals
塩化バリウム                Apex Chemicals
硫酸ニコチン                BDH chemicals
オキシトシン                Parke Davis India Ltd.
プロストジン−ＰＧＦ２α    Astra IDL Ltd.
＜装置＞：
１.  フィジオグラフ（Ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈ）
会社：Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ、
インド国、アンバーラ
２.  フォース・トランスデューサー、
モデル番号Ｔ−３０５
会社:ＧＲＡＳＳ、米国
３.  刺激装置、
モデル  ＳＳ４４
会社：Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ、アンバーラ
４.  多用途記録計
モデル  ７
会社：ＧＲＡＳＳ、米国
５.  フォース・トランスデューサー
モデル番号  ＦＴ―０３
会社：ＧＲＡＳＳ、米国
６.  臓器槽
アンバーラ、
インド国
【実施例２】
【００３３】
Ｍａｎｄｏｖｉ川（インド国）の河口近くから上流へとＲｉｂａｎｄａｒに沿って、インド国ゴア州の沿岸からマングローブ植物Salvadora persica  Ｌを収集した。この種はゴア州の沿岸地域まで広範に分布しており、潮間の河原から手作業で収集した。
【実施例３】
【００３４】
収集したマングローブの加工は、最初に海水で洗い、次に水道水で洗った。塩分を除去するために、水道水で洗浄しながら不要な物質を取り除いた。マングローブ関連植物の葉、茎部、及び花を風乾した。乾燥後、前記植物材料を小片に切断して、抽出のために９０％メタノール水溶液中に１週間浸した。これらが確実に上手く溶剤中に浸漬されていることに注意を払い、腐敗に関する検査を行った。
【実施例４】
【００３５】
粗抽出物の抽出と調製は、室温での低温パーコレーション法と減圧下の水槽（５０℃）での溶剤蒸発によって行った。これは、その中に存在する全ての非耐熱性代謝物の保護に役立つ。前記抽出物が濃縮されるまで、真空下で再抽出を２度行い、粗抽出物を得た。
【実施例５】
【００３６】
＜粗抽出物の分画＞:
分液漏斗を使用して、前記粗抽出物を石油エーテル、クロロホルム、ｎ―ブタノール及び水画分に分けた。分液漏斗中の抽出物に石油エーテルを加えて析出させた。次に、その残渣にクロロホルムを加えて十分に混合し、下層を分離した。前記残渣にブタノールを加えたところ、最上層はブタノール分画、下層は水分画となった。各画分の抽出を３度行い、エマルジョンが生じる度に、そのエマルジョンを分解するために塩化ナトリウムを加えた。クロロホルム及びブタノール画分に硫酸ナトリウムを加えて、濃縮の前に微量の水を除去した。前記画分全てを粗抽出物と同一の方法で濃縮した。親粗抽出物と同一の薬理学的活性について、これらの画分を検査した。純粋な化合物を単離するためにカラムクロマトグラフィーを繰り返し、溶離剤の薄層クロマトグラフィーを行った。ＴＬＣによって、β−アミリン、ベツリン、ウルソール酸、及びルペオール等の化合物が明らかになった。
【実施例６】
【００３７】
化合物β−アミリン及びベツリンを得るために、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で薄層クロマトグラフィーによる分離を行う。溶離剤は、石油エーテルと酢酸エチルの９０：１０（ｖ／ｖ）の混合物であり、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧することによってスポットを展開し、１１０℃での加熱によって固定した。
【００３８】
ウルソール酸及びパルミチン酸メチルの化合物に関しては、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で薄層クロマトグラフィーによる分離を行った。溶離剤は、石油エーテルと酢酸エチルの８５：１５（ｖ／ｖ）の混合物であり、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧することによってスポットを展開し、１１０℃での加熱によって固定した。
【００３９】
ルペオールの化合物に関しては、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で薄層クロマトグラフィーによる分離を行う。溶離剤は、石油エーテルと酢酸エチルの７５：２５（ｖ／ｖ）の混合物であり、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧することによりスポットを展開し、１１０℃での加熱によって固定した。
【００４０】
本発明では、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって、マングローブ植物のＳ．ｐｅｒｓｉｃａの活性な水画分を分離して、活性成分を単離した。同一のＴＬＣ特性を有するカラムからの溶出物を混合し、薬理学的検査に供した。活性な純粋化合物が得られるまで、活性なサブフラクションをクロマトグラフィーによってさらに分離した。ヨウ素蒸気を用い、メタノール性硫酸を噴霧することにより、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上のスポットを可視化した。
【００４１】
使用前に、１時間１１０℃で活性化させたＴＬＣ品質等級のシリカゲル（Ｑｕａｌｉｇｅｎｓ）の０．２５ｍｍの層でコートしたガラスプレート(２０Ｘ２０ｃｍｓ)上でＴＬＣを行った。活性な水分画をＸＡＤ―カラムに通過させ、活性成分の代謝物を単離及び精製するために、上述のように、溶出物を処理した。
【００４２】
下記のスペクトルによって、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＲＳＩＣ）で取得したスペクトルデータに基づいて前記５つの化合物を同定した。
【００４３】
分子のプロトン環境を測定するための１ＨＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ―２００ＭＨＺ上で行った。
【００４４】
装置：Ｂｒｕｋｅｒの分光計
モデル：ＤＰＸ
Ｂｒｕｋｅｒ社
炭素原子用１３ＣＮＭＲはＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＶ  ３００  ＭＨＺ。
【００４５】
前記化合物のスペクトルデータを、文献に報告されている類似の化合物のスペクトルデータと比較して化合物を同定した。
【００４６】
その分裂パターンとともに分子量を決定するために、質量スペクトル（ＥＩＭＳ）電子衝撃質量分析法を質量分析装置（ＥＩ／ＣＩＭＳ）モデルＤ．３００  ＪＥＯＬで行った。
【００４７】
装置：質量分析装置（ＥＩＭＳ）
モデル：Ｄ―３００
日本国、日本電子株式会社（ＪＥＯＬ）
【実施例７】
【００４８】
＜純粋な化合物の薬理学的検査＞
使用した標準薬は下記の通り：
回腸に対してヒスタミン酸ホスフェート（Ｂｌｅｎｋｉｎｓｏｐ＆  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）。
【００４９】
回腸に対して塩化アセチルコリン（Ｈｏｐｋｉｎ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｌｔｄ．）。
【００５０】
胃腸管に対して５−ヒドロキシトリプタミン−クレアチニン硫酸塩（ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．）。
【００５１】
平滑筋収縮に対して塩化バリウム（Ａｐｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００５２】
神経節刺激薬として腸に対して硫酸ニコチン（ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００５３】
子宮に対してオキシトシン（Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ  Ｉｎｄｉａ  Ｌｔｄ）。
【００５４】
子宮に対してプロストジン（Ｐｒｏｓｔｏｄｉｎ）-ＰＧＦ２（Ａｓｔｒａ  ＩＤＬ  Ｌｔｄ）。
【００５５】
使用したその他の試薬は全て分析グレードのものであった。
【００５６】
モルモットの回腸にはタイロード液を使用し、モルモットの子宮にはｄｅ  Ｊａｌｏｎ’ｓ溶液を使用した。
【００５７】
リンガー・ロックの生理溶液を表３のモルモットの心房に使用した。
【００５８】
使用したその他の試薬は全て分析グレードのものであった。
【００５９】
使用した生理溶液と様々なパラメータ：
全ての生理溶液は、実験の時に新たに調製した。
【００６０】
ｐＨ：様々な生理的塩溶液のｐＨは７．３と７．４の間を推移した。低いｐＨでは、組織標本のトーヌスは減少する傾向にあり、それ故に薬物の効果が変わりやすい。
【００６１】
温度：一定の効果を得るためには、槽溶液の温度を一定のレベルに維持することが重要であった。温度が３７℃以下に下がると腸のトーヌスは増加するため、収縮はさらに小さくなり収縮及び緩和時間は増加する。
【００６２】
空気：組織が正常に機能するためには、空気又は酸素が必要である。加えて、組織に酸素を供給し、気泡の流れで槽溶液を撹拌したため、槽に加えた薬物の拡散が促進された。
【００６３】
長期にわたって通気するとｐＨが変わる傾向にあるので、槽中の溶液を頻繁に交換した。
【００６４】
＜インビトロ実験＞：
体重が約３００−３５０ｇで、均一な管理条件（温度２５±１℃）下で飼育された、交尾経験のない雌のモルモットを使用した。実験前の２４時間は、前記モルモットに食事を与えず、水のみを自由に与えた。
【００６５】
単離したモルモットの子宮を、子宮収縮抑制作用の研究のために使用した。
【００６６】
単離したモルモットによる実験のために、双角子宮を切り出して脂肪組織を取り除いた。１つの子宮角を切除して生理溶液（前もって空気を通気したｄｅ  Ｊａｌｏｎ’ｓ液）を入れた浅い皿に保管した。組織が薄くて飽和が早かったので酸素より空気の方が好ましかった。Ｊａｌｏｎ’ｓ液には、
グルコース０．５ｇ
塩化ナトリウム９．０ｇ
炭酸水素ナトリウム０．５ｇ
塩化カリウム０．４２ｇ
塩化カルシウム０．０６ｇ
が含まれる。
【００６７】
全てを１０００ｍｌの水に溶解した。
【００６８】
２つの端を縫合した。子宮の細片の下端を組織保持器に縛り付けて１０ｍｌの容量の臓器槽中に懸濁し、より感受性が高い上端は、Ｇｒａｓｓの多用途記録計（モデル７）に接続したフォース・トランスデューサー（ＦＴ０３）のレバーに縛り付けた。安定させるために３０分間放置し、１０分毎に槽中の生理溶液を取り替えた。６０秒の接触期間でのオキシトシン及びＰＧＦ２α等の標準的な子宮刺激薬に対する様々な用量（５０及び２５０μｇ／ｍＬ）の抽出物に対する子宮の反応（多用途記録計上に記録した）。
子宮収縮抑制効果を下記の式で評価した。
【００６９】
抑制％  ＝（Ｘ−Ｙ）／Ｘ  ×１００
ここで、Ｘ＝標準収縮の高さ（ｍｍ）
Ｙ＝抽出物の存在下における標準収縮の高さ（ｍｍ）
モルモットの子宮に対する、Salvadora persica粗抽出物のインビトロでの相対的な子宮収縮抑制効果を下記の表に示す（５つの測定値の平均）。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１ａ】図１（ａ）は、マングローブ植物を示している。
【図１ｂ】図１（ｂ）は、用いたマングローブ関連植物の小枝を示している。
【図２】図２は、Salvadora persicaという植物の粗抽出物から得られた様々な画分を示している。
【図３】図３は、β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）の構造式を示している。
【図４】図４は、ベツリンの構造式を示している。
【図５】図５は、ウルソル酸（トリテルペン酸）の構造式を示している。
【図６】図６は、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）の構造式を示している。
【図７】図７は、ルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）の構造式を示している。
【図８】図８は、Salvadora persicaの抽出物の分画チャートを示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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