(57)【要約】３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ／コリスミン酸ムターゼ、及びメチロフィラス・メチロトロファス由来のこれらの酵素をコードする遺伝子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２記載のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は同配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質。
【請求項６】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質。
【請求項７】
下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項６記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は同配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性及びコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項７記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、及びこれらをコードする遺伝子に関する。これらの遺伝子は、芳香族アミノ酸の生産能の改善に有用である。
【０００２】
背景技術
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】
上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりアミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特公昭４５−２５２７３号公報）、プロタミノバクター属（特開昭４９−１２５５９０号公報）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特開昭５０−２５７９０号公報）、ミクロサイクラス属（特開昭５２−１８８８６号公報）、メチロバチルス属（特開平４−９１７９３号公報）、バチルス属（特開平３−５０５２８４号公報）などに属する微生物を用いる方法が知られている。
【０００５】
ところで、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族化合物の生合成経路では、中心的な役割を果たすいくつかの酵素がある。キーとなる酵素は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（３−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｈｅｐｔｕｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（以下、「ＤＳ」と略すことがある）である。Ｌ−フェニルアラニンの生合成においては、プレフェン酸デヒドラターゼ（ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）（以下「ＰＤ」と略すことがある）もキーとなる酵素である。
【０００６】
しかし、これまでメチロフィラス属細菌のＤＳ及びＰＤをコードする遺伝子はいずれも知られていない。
【０００７】
発明の開示
本発明は、メチロフィラス属細菌のＤＳをコードする遺伝子、及びＰＤをコードする遺伝子を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア・コリのコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（ｐｈｅＡ）欠損株を用いて、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）のＤＳ遺伝子及びＰＤ遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列又は同配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（３）のＤＮＡ。
（５）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質。
（６）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列又は同配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性又はコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１０】
本発明において、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ活性とは、ホスホエノールピルビン酸とＤ−エリスロース　４−リン酸から３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。また、プレフェン酸デヒドラターゼ活性とは、プレフェン酸からフェニルピルビン酸を生成する反応を触媒する活性を、コリスミン酸ムターゼ活性とは、コリスミン酸からプレフェン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。本発明のＰＤは、エシェリヒア・コリ等の他の微生物のＰＤと同様に、プレフェン酸デヒドラターゼ活性とともにコリスミン酸ムターゼ活性も備えていることが示唆された。本発明において「プレフェン酸デヒドラターゼ活性及びコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方」とは、このようなＰＤの持つ性質の一方又は両方を指す。以下、本明細書においては、「プレフェン酸デヒドラターゼ活性及びコリスミン酸ムターゼ活性の少なくとも一方」を、「ＰＤ活性」ということがある。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
【００１２】
メチロフィラス・メチロトロファス、例えばメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１株の染色体ＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡは、例えばＳａｉｔｏらの方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ７２， ６１９−６２９ （１９６３）に記載）あるいはＫ． Ｓ． Ｋｉｒｂｙの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，６４，４０５，（１９５６））等の方法により、細胞沈殿物から取得することができる。
【００１３】
次に、得られた染色体ＤＮＡからＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩ又はＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００１４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより生じた末端と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００１５】
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリＢ−７０７８株（ｐｈｅＡ：：Ｔｎ１０（ＫｍＲ））を形質転換し、フェニルアラニンを含まない寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収すれば、ＰＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００１６】
上記のようにして得られるＤＮＡ断片がＰＤ遺伝子を含むことの確認は、同ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列番号３に示す塩基配列を有することを確認することによって行うことができる。
【００１７】
尚、後記実施例で取得したＰＤ遺伝子を含むクローン化断片は、ＤＳ欠損のエシェリヒア・コリＡＢ３２５７株（ａｒｏＧ３６５−，ａｒｏＨ３６７−，ａｒｏＦ３６３−，ｔｈｉ−１， ｉｌｖＣ７， ａｒｇＥ３， ｈｉｓ−４， ｐｒｏＡ２， ｘｙｌ−５ ｇａｌＫ２， ｌａｃＹ１， ｍｔｌ−１， ｓｔｒＡ７１２， ｔｆｒ３， ｔｓｘ−３５８， ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄＲ２， ｚｊｊ−２０２：：Ｔｎ１０）の芳香族化合物要求性を相補したこと、及び前記断片の塩基配列決定により、ＤＳ遺伝子も含んでいることが判明した。
【００１８】
メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１株の染色体ＤＮＡの切断にＢａｍＨＩを用いた場合には、ＰＤ遺伝子及びＤＳ遺伝子は約１０ｋｂのＢａｍＨＩ断片中にクローン化される。
【００１９】
上記と同様にして、他のメチロフィラス属細菌からＰＤ遺伝子及びＤＳ遺伝子を単離することができる。また、本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、同塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）、又は同塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、メチロフィラス属細菌の染色体又は染色体ＤＮＡライブラリーから単離することができる。
【００２０】
染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，　（１９８９）等に記載されている。
【００２１】
上記のようにして得られるＤＳ遺伝子の塩基配列を配列表配列番号１に示す。また、この塩基配列によってコードされ得るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
上記のようにして得られるＰＤ遺伝子の塩基配列を配列表配列番号３に示す。また、この塩基配列によってコードされ得るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２３】
本発明のＤＮＡは、コードされるＤＳ又はＰＤの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＳ又はＰＤをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従って、ＤＳ又はＰＤを構成するアミノ酸配列全体に対し、３０から５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上の相同性を有し、かつＤＳ活性またはＰＤ活性を有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」は、２〜３０個、好ましくは、２〜２０個、より好ましくは２〜１０個である。
【００２４】
上記のようなＤＳ又はＰＤと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＤＳ又はＰＤをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＤＳ又はＰＤをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００２５】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、ＤＳ又はＰＤを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００２６】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のＤＳ又はＰＤ活性を調べることにより、ＤＳ又はＰＤと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＤＳ又はＰＤをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤＳ又はＰＤ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＤＳ又はＰＤと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２７】
このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ上記方法に従ってＤＳ又はＰＤ活性を測定することによって容易に取り除くことができる。
【００２８】
上記の本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることにより、ＤＳ又はＰＤを製造することができる。
【００２９】
ＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を発現させるための宿主としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、メチロフィラス・メチロトロファス等のメチロフィラス属細菌、その他の種々の原核細胞が好ましく、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をはじめとする種々の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細胞、特にエシェリヒア・コリ、コリネ型細菌及びメチロフィラス・メチロトロファスが好ましい。
【００３０】
エシェリヒア・コリにＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を導入するためのベクターとしては、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。また、コリネ型細菌にＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を導入するためのベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６９９号公報参照）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（以上、特開昭５８−１９２９００号公報参照）、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報参照）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報参照）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（以上、特開昭５７−１８３７９９号公報参照）、ｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報参照）等が挙げられる。
【００３１】
上記のベクターにＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を連結して得られる組換えベクターで上記宿主を形質転換することによって、ＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を導入することができる。また、ＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を、トランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１，４１７（１９８３））、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９７２））を用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。
【００３２】
上記のようにしてＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を導入された細胞を培地で培養し、ＤＳ又はＰＤを培養物中に生成蓄積させ、該培養物よりＤＳ又はＰＤを採取することにより、ＤＳ又はＰＤを製造することができる。培養に用いる培地は、用いる宿主に応じて適宜選択すればよい。
【００３３】
上記のようにして製造されるＤＳ又はＰＤは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等の通常の酵素精製法を用いて精製することができる。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡを利用して、細胞中のＤＳ又はＰＤ活性が野生株よりも高い微生物を作製することができる。細胞中のＤＳ又はＰＤ活性が野生株よりも高い微生物は、ＤＳ遺伝子又はＰＤ遺伝子を発現可能な形態で含むベクターで微生物を形質転換することによって得ることができる。
【００３５】
本発明に用いるメチロフィラス属細菌としては、例えばメチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所 ＮＣＩＭＢ Ｌｔｓ．， Ｔｏｒｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ １３５， Ａｂｂｅｙ Ｒｏａｄ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９ ８ＤＧ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。
【００３６】
芳香族アミノ酸、特にＬ−フェニルアラニンの生産能を改善するためには、ＤＳおよびＰＤの酵素をコードする遺伝子を増幅することが有用である。
【００３７】
発明を実施するための最良の形態
メチロフィラス・メチロトロファスのプレフェン酸デヒドラターゼおよびＤＡＨＰシンターゼ遺伝子を含む１０ＫｂｐのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を、低コピーベクターであるｐＭＷ１１９ＡｐＲ上に相補性試験によるショットガン実験によって単離した（図１）。この実験では、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩにより消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＭＷ１１９（ＡｐＲ）プラスミドのＢａｍＨＩ消化産物にＴ４ ＤＮＡライゲースを用いてライゲーションした。ライゲーション産物をエシェリヒア・コリＢ−７０７８株（ｐｈｅＡ：：Ｔｎ１０（ＫｍＲ））の形質転換に使用した。アンピシリン耐性のクローンの中で、フェニルアラニン要求性が消えた株を選択し、プラスミドを回収した。得られたプラスミドの一つをｐＰＤ１と名付けた。単離された断片をｐＰＤ１と逆の向きに含むプラスミドをｐＰＤ２と名付けた。
【００３８】
プラスミドｐＰＤ１及びｐＰＤ２は、エシェリヒア・コリＢ−７０７８株のＰｈｅＡ−変異株だけでなく、ＤＳ欠損エシェリヒア・コリＡＢ３２５７株（ａｒｏＧ−，ａｒｏＨ−，ａｒｏＦ−）の原栄養性を相補した。従って、ｐＰＤ１およびｐＰＤ２の両プラスミドは、同じ単離ＤＮＡ断片にＰＤ酵素およびＤＳ酵素をコードする遺伝子を持つと想定された。
【００３９】
ｐＰＤ１及びｐＰＤ２の欠失誘導体を構築した。（図２）。欠失は、インビトロで、異なる制限酵素でプラスミドＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡ断片をライゲーションすることにより行った。ライゲーション混合物を、エシェリヒア・コリＢ−７０７８株のＰＤ欠損株（ｐｈｅＡ：：Ｔｎ１０（ｋａｎ））を形質転換してＰｈｅ＋の原栄養性にするために使用した。単離したプラスミドをマッピングし、ＤＳ欠損変異体エシェリヒア・コリＡＢ３２５７株（ａｒｏＧ−；ａｒｏＨ−；ａｒｏＦ−）を相補してＡｒｏ＋の原栄養性にする能力をテストした。構築した欠失誘導体は、様々な構造と相補性能力を有していた。ＰＤ酵素をコードする単一遺伝子のみを含む欠失誘導体を取得した。これらの欠失誘導体は、ＤＳ欠損株エシェリヒア・コリＡＢ３２５７株（ａｒｏＧ−；ａｒｏＨ−；ａｒｏＦ−）を原栄養性に相補する能力を失った。従って、ｐＰＤ１又はｐＰＤ２にクローン化されたメチロフィラス・メチロトロファスのＤＮＡ断片は、ＤＳおよびＰＤ酵素を別々にコードする２つの異なる遺伝子を持つものと想定された。
【００４０】
メチロフィラス・メチロトロファスのＤＳおよびＰＤ酵素をコードする２つの遺伝子の塩基配列を決定した。ＤＳ遺伝子の塩基配列とその塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号１に示した。ＰＤ遺伝子の塩基配列とその塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【００４１】
メチロフィラス・メチロトロファスのＤＳおよびＰＤ酵素をコードする遺伝子の塩基配列を解析した。コンピュータープログラムにより構造解析した。ＤＳおよびＰＤの遺伝子配列を翻訳すると、他の多くの微生物の同じ機能のタンパク質と有意に相同性のあるアミノ酸配列を示した（表１，２）。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
【表２】
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【００４４】
産業上の利用の可能性
本発明は３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、及びこれらをコードする遺伝子を提供する。これらの遺伝子は芳香族アミノ酸の生産能を向上させるために有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＳおよびＰＤ遺伝子を有するプラスミドｐＰＤ１およびｐＰＤ２の構築を示す図。
【図２】メチロフィラス・メチロトロファス由来のＤＳおよびＰＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片の欠失によって得られたプラスミドの相補性解析を示す図。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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