(57)【要約】神経病理学的疾患の診断および処置における重要な問題の一つは臨床医が疾患の発症を決定できないことである。本発明は神経病理学的疾患の発症をニューロステロイドとくにＤＨＥＡおよびその代謝前駆体の脳および血清における正常レベルからの変化によって検知する方法およびキットを記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の形成を検出する方法であり、
（ａ）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化代謝物を産生する物質によって処理し、
（ｂ）対照液体または組織を上記物質によって処理し、ついで
（ｃ）試験サンプルおよび対照サンプルにおけるＤＨＥＡ量が上記処理に応答して上昇するか否かを決定することからなり、
この場合、対照サンプルに比較して試験サンプルにおける応答の欠如は体液の上記試験サンプル中で以前に酸化ストレス誘発ＤＨＥＡ形成が起こったことを指示する方法。
【請求項２】
上記体液または組織は脳脊髄液、血清、海馬組織、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトからなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
上記物質はβ―アミロイドタンパク質である「請求項１」記載の方法。
【請求項４】
上記物質はＦｅＳＯ４，他のフェントン反応物質、および酸化―還元物質からなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項５】
上記ＤＨＥＡの量は
（ｉ）サンプルを有機溶媒で抽出し、
（ｉｉ）抽出された物質をＨＰＬＣクロマトグラフィーに付し、
（ｉｉｉ）ラジオイムノアッセイを用いてＤＨＥＡを検出する
ことによって測定する「請求項１」記載の方法。
【請求項６】
上記ＤＨＥＡの量は質量スペクトルにカップリングさせたガスクロマトグラフィーにより測定する「請求項１」記載の方法。
【請求項７】
上記ラジオイムノアッセイは他のニューロステロイドを認識しない特異的抗体を用いて実施される「請求項５」記載の方法。
【請求項８】
上記サンプルは上記物質で処理したのちのラジカル酸素種の上昇についても試験される「請求項１」記載の方法。
【請求項９】
上記ラジカル酸素種は２，７ＤＣＦ蛍光または遊離ラジカルを測定する他の方法を用いて測定する「請求項８」記載の方法。
【請求項１０】
処理と効果の間の相関は、効果がビタミンＥまたは他の抗酸化剤によってブロックされるかどうかによって確証される「請求項１」記載の方法。
【請求項１１】
上記サンプルはＳＵ１０６０３によって前処理される「請求項１」記載の方法。
【請求項１２】
患者における神経病理学的障害の存在を診断する方法であり、上記患者のＣＮＳ中におけるニューロステロイドの量を測定することからなる方法。
【請求項１３】
対照に比較してニューロステロイド量の上昇は神経病理学的障害の発症を指示する「請求項１２」記載の方法。
【請求項１４】
上記ニューロステロイドはＤＨＥＡである「請求項１３」記載の方法。
【請求項１５】
対照に比較してニューロステロイド前駆体量の低下は神経病理学的障害の発症を指示する「請求項１２」記載の方法。
【請求項１６】
上記ニューロステロイドはＤＨＥＡの代謝性前駆体である「請求項１５」記載の方法。
【請求項１７】
脳脊髄液がＣＮＳの診断用ツールとして使用される「請求項１２」記載の方法。
【請求項１８】
上記ＤＨＥＡの量は
（ｉ）サンプルを有機溶媒で抽出し、
（ｉｉ）抽出された物質をＨＰＬＣクロマトグラフィーに付し、
（ｉｉｉ）ラジオイムノアッセイを用いてＤＨＥＡを検出する
ことからなる方法によって測定される「請求項１４」記載の方法。
【請求項１９】
上記前駆体の量を測定する方法において、
（ａ）上記患者から血液、体液または組織の試験サンプルを得て、
（ｂ）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化代謝物を産生する物質によって処理し、
（ｃ）対照液体または組織を上記物質によって処理し、
（ｄ）サンプル中においてどの程度のＤＨＥＡが産生されるかによって前駆体の量を測定することからなる「請求項１６」記載の方法であって、対照サンプルに比較して試験サンプル中のより少ない前駆体は神経病理学的障害の存在を指示するものである上記方法。
【請求項２０】
上記物質はＦｅＳＯ４である「請求項１９」記載の方法。
【請求項２１】
上記神経病理学的障害はアルツハイマー病である「請求項１２」記載の方法。
【請求項２２】
「請求項１」記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２３】
「請求項１２」記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２４】
血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の形成を検出するキットにおいて、上記血液、体液または組織と接触させた場合に酸化代謝物を産生する試薬からなるキット。
【請求項２５】
さらにＤＨＥＡ―特異的抗体を含む「請求項２４」記載のキット。
【請求項２６】
ＤＨＥＡ―特異的抗体からなる神経病理学的障害を検出するためのキット。
【請求項２７】
細胞をβ―アミロイドペプチドに暴露することを含む、細胞におけるＤＨＥＡ合成の上昇またはその誘発方法であって、そのような暴露の結果ＤＨＥＡが合成される上記方法。
【請求項２８】
上記細胞は脳細胞である「請求項２７」記載の方法。
【請求項２９】
上記脳細胞はアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される「請求項２８」記載の方法。
【請求項３０】
上記合成はビタミンＥによって阻害される「請求項２７」記載の方法。
【請求項３１】
オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトによるＤＨＥＡの合成を修飾する化合物を投与することを含むＤＨＥＡの合成が関与する神経病理学的疾患の防止または処置方法。
【請求項３２】
上記神経病理学的疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アミロイドーシス、毛細管拡張性運動失調、ビンスヴァンガー病、脳腫瘍、ハレルホルデン―シュパッツ病、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、リー病、ミトコンドリア障害、多発脳梗塞性痴呆、ペリツエーウス―メルツバヒャー病、ピック病、卒中、外傷性脳傷害、脊髄損傷および他の末梢神経系傷害からなる群より選択される「請求項３１」記載の方法。
【請求項３３】
神経病理学的疾患の処置に有用な可能性がある薬物候補を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、
（ａ）オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含む組成物を神経病理学的疾患のスクリーニングに使用できる可能性をスクリーニングする試験化合物に暴露し、
（ｂ）上記化合物のＤＨＥＡ合成に対する効果を、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含有するが上記化合物を含まない他の点では同一の対照組成物と比較して評価し、
（ｃ）有用な可能性がある化合物をそれらのＤＨＥＡ合成に対する修飾作用に基づいて同定することからなるアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、同一の発明者らの名前で２０００年１月２８日に出願された米国特許仮出願一連番号６０／１７８，６９８からの優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、中枢神経系におけるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のレベルの上昇を試験することによる神経病理学的疾患、とくにアルツハーマー病を検出する診断方法に関する。とくに本発明者らは神経病理学的疾患を有する患者の脳においてＤＨＥＡが末梢性ＤＨＥＡの合成に用いられるのとは別の代謝経路によって形成され、同時にこの別経路に関与するステロイド前駆体の低下が神経病理学的疾患のインディケーターとして働くことを発見した。神経活性ステロイドがヒト脳内で合成される機構ならびに正常および病的な脳機能におけるニューロステロイドの役割を理解することはまた、神経病理学的障害のための薬物処置をより良好に標的化する設計を可能にするものと思われる。
【０００３】
（発明の背景）
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）はヒトにおける主要な副腎ステロイドである（１）。末梢レベルのピークは、成人期の初期にあり、以後加齢とともに徐々に低下する（１，２）。その末梢における役割は、十分には確立されていないが、主としてアンドロゲンの前駆体として働くものと考えられている（３）。脳におけるＤＨＥＡレベルは末梢にみられるレベルより高いが、これらのレベルは、末梢のステロイド作動性臓器を除去したのちにも維持される（４，５）。ＤＨＥＡおよびその硫酸塩型はそれらがＧＡＢＡＡ受容体複合体、およびシグマ受容体を介するＮＭＤＡ―仲介グルタミン酸伝達に作用を有する点でニューロアクティブと考えられている（６，７）。さらに、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ硫酸塩（ＤＨＥＡ―Ｓ）は学習および記憶の修飾に関与すると考えられている（８，９）。
【０００４】
ＤＨＥＡのニューロステロイドとしての役割は十分に確立されている（１０）。しかしながら、ＤＨＥＡが脳で産生される機構は議論の原因となってきた。活性なシトクロームＰ４５０１７α―ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０ｃ１７）の存在の証拠はプレグネノロンをＤＨＥＡに変換する末梢性ステロイド生成酵素と矛盾している。発生の初期におけるＰ４５０ｃ１７に対するｍＲＮＡの発現にはある種の証拠がある（１１）が、この所見を報告した同じグループは成熟齧歯類ではｍＲＮＡを検出できなかったと報告している（１２）。一つの報告は成熟齧歯類での発現を指示している（１３）が、タンパク質または酵素活性の証拠は現れていない（１４，５）。
【０００５】
ニューロステロイドは、多くの様々な臨床状態たとえば記憶（９，２６，８５）、うつ状態（８４）および月経前緊張症（６７）との関連が指摘されてきた。それらはまた、ＧＡＢＡの阻害を増強する（６５）それらの能力により、不安（３６，３７，４０，４６）およびてんかん（３５，４１，４７）の処置用薬物としての可能性が提案されている。幾つかの研究はヒト脳におけるニューロステロイドの限局的な分布に注目している（３０，３１，３８）が、これらのステロイドがどこで合成されたのかに関しては、何の証拠もない。さらに、ニューロステロイドが存在すると考えられる齧歯類またはヒト脳のいずれかにおけるニューロステロイド生合成の調節機構を調べた研究もこれまで報告されていない。
【０００６】
脳におけるニューロステロイドの役割および脳細胞由来のニューロステロイド合成の機構に関する情報はないにもかかわらず、ＤＨＥＡの役割、または加齢過程におけるそのレベルの低下に関しては多くの考察がある（１，２）。ヒトでは末梢のＤＨＥＡは年齢とともに低下するので、脳でも加齢とともにＤＨＥＡは低下すると推定されてきた。しかしながらこの仮説を支持するために利用できる有効な研究はない。多数の研究が、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ―Ｓの末梢におけるレベルを、認識機能（２３―２５）または痴呆もしくはアルツハイマー病の将来の発症（２６）と関連づけることを試みてきた。実際、ＤＨＡＥの補充が最近、宣伝されているインターネットウエブサイトには、初期または後期のアルツハイマー病患者で正常対照に比較してＤＨＥＡ―Ｓレベルの有意な低下が報告されている。記憶および認識機能を改良するために有利な可能性に関して、ＤＨＥＡの補充には様々な意見はあるが、科学的研究も、末梢ＤＨＥＡレベルと認識能力の関係、または将来の神経病理学的疾患の予言者としての末梢ＤＨＥＡレベルの使用を結論的に証明するには至っていない。
【０００７】
脳疾患および加齢過程のよりよい理解を発展させる目的で、ならびにこの知識が新しい薬物および診断方法の設計を創造すると思われることから、脳におけるニューロステロイドの合成および調節の更なる理解は有益であると考えられる。
【０００８】
（発明の概要）
文献の報告とは異なり、本発明者らは驚くべきことにアルツハイマー病に罹患している患者では中枢神経系（ＣＮＳ）のＤＨＥＡが上昇していることを発見した。この発見は、アルツハイマー病患者のＤＨＥＡレベルは脳を含めて異常に低いと主張するこれまでの報告と矛盾し、多くの会社が最近、アルツハイマー病の発症を防止する手段としてＤＨＥＡの補充を提唱している事実と重大な関連を有するものである。しかも本発明者らは、以前の研究の焦点とは異なり、ＤＨＥＡは脳において、末梢で用いられるのとは別の代謝経路により合成されることも発見した。これらの所見が、神経病理学的疾患とくにアルツハイマー病の診断または検出を目的とする本発明の方法およびキットの基盤となっている。
【０００９】
本発明の方法には、患者の中枢神経系および血清中のニューロステロイド量の測定を包含する。とくに、本発明の方法は、神経病理学的疾患の発症初期のインディケーターとしてＤＨＥＡレベルの上昇または新たに同定されたＤＨＥＡ前駆体レベルの低下のスクリーニングを包含する。細胞をβ―アミロイドタンパク質に暴露することによりＤＨＥＡの合成を起こさせる方法または上昇させる方法も、β―アミロイドタンパク質および酸化的ストレスを誘発する他の物質または条件がＤＨＥＡ合成の別経路に調節的な役割を有するとの本明細書に記載の所見から、本発明に包含される。脳におけるニューロステロイドの生合成およびその調節の機構を理解すること、ならびに脳ＤＨＥＡの別代謝経路の性質および神経病理学的疾患におけるＤＨＥＡ産生増加の役割を悟ることは、開示されたスクリーニング方法により同定された患者における疾患の進行の防止または処置を目指すプロアクティブな処置の設計を可能にすると思われる。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１：アルツハイマー病（ＡＤ）および対照脳におけるニューロステロイドレベル
ヒト脳における内因性ニューロステロイドレベルはＨＰＬＣ精製後に特異的なラジオイムノアッセイにより測定した。ＡＤおよび対照患者の間のプレグネノロンレベルには有意差はない。しかしながら、調べた３つの領域のすべてにおいてＡＤ患者のＤＨＥＡは有意に高いレベルを示す。提示したデータは３〜１０サンプルからの二重の測定についての平均±ＳＥＭである。ＮＳ：有意差なし。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００１１】
図２：ＡＤおよび対照脳におけるＰ４５０ｃ１７のｍＲＮＡ発現
ＲＴ―ＰＣＲ増幅Ｐ４５０ｃ１７をＤＮＡブロットによって追跡すると、Ｐ４５０ｃ１７は対照およびＡＤ患者のいずれの皮質でも発現することを示すが、発現は手許にあったＡＤ患者の一つにのみ見られる。海馬ではＰ４５０ｃ１７の検知可能な発現は認められず、この領域のＤＨＥＡは末梢酵素仲介経路によっては作成されないことが指示される。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号で標識する。
【００１２】
図３：ＡＤおよび対照脳におけるＡβ免疫反応性
脳ホモジネートをＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離し、β―アミロイド（Ａβ）ペプチドのアミノ酸１７〜２４に対するモノクローナル抗体、４Ｇ８でブロットした。Ａ）ＡＤ患者の視床下部におけるＡβ―免疫反応性の大部分は対照患者の場合よりも低分子量種のものである。対照サンプル中にも同様に検出可能なＡβがある。Ｂ）Ａβ―免疫反応性は対照患者の海馬では検出されないが、ＡＤ患者の海馬には存在する。Ｃ）Ａβ―免疫反応性はすべてのＡＤ患者の前頭皮質に類似の分子量種パターンで存在する。ＡＤ前頭皮質Ａβ―免疫反応性の大部分は約３０ｋＤａである。対照患者とくにＣ５患者ではある程度のＡβ―免疫反応性は存在するが、この免疫反応性はＡＤ患者の場合より高い分子量、約５０ｋＤａを示す。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号を付す。
【００１３】
図４：ＡＤおよび対照患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）中ＤＨＥＡおよびＡβレベル
Ａ）ＤＨＥＡはＣＳＦ抽出物からＨＰＬＣにより精製し、特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。ＤＨＥＡレベルは対照の場合よりＡＤ対象ではるかに高い。
Ｂ）対照患者は９８ｋＤａ種のみを有するが、ＡＤ患者は４６〜９８ｋＤａの広い分子量範囲で存在するＡＰ―免疫反応性を有する。
【００１４】
図５：ＡＤおよび対照患者におけるＦｅＳＯ４に対する血清応答
ＡＤ患者（Ａ）からの血清を１０ｍＭＦｅＳＯ４で処理した場合、ＤＨＥＡレベルの上昇はない。しかしながら、対照患者（Ｂ）からの血清を１０ｍＭＦｅＳＯ４で処理した場合、ＤＨＥＡレベルにおける大きな誘導がみられ、酸化剤により作用されることが可能なＤＨＥＡ前駆体の存在が指示される。ＡＤ患者はこの前駆体をもたず、それは多分、末梢に到達する前に脳で既に変換されたものと考えられる。
【００１５】
図６：ヒト脳細胞はＤ合成に対する別経路を有する
細胞を、５ｍＭＳＵ１０６０３の存在下または不存在下にＦｅＳＯ４濃度を上昇させて処理した。２時間後、細胞およびメジウムをエーテル：酢酸エチルで抽出処理したのち、サンプルを逆相Ｃ１８ＴＬＣプレート上に流し、分画をジエチルエーテルで抽出してＤの量をＲＩＡで測定した。Ｄレベル（ｐｇ／ｍｇタンパク質）を片側ＡＮＯＶＡで分析した。（Ａ）ＫＧ―１―Ｃ；Ｆ＝１．９４８，ｐ＝０．０９７９（Ｂ）ＭＧＭ―１；Ｆ＝５．００４，ｐ＜０．００１（Ｃ）ＭＧＭ―３；Ｆ＝０．５９０２，ｐ＝０．７３６６（Ｄ）ＮＨＡ；Ｆ＝４．１３１，ｐ＜０．０１および（Ｅ）ｈＮＴ―ＰＦ；Ｆ＝０．６５５２，ｐ＝０．６８８６．データは平均ＳＥＭ（ｎ＝４〜１５）で示す。すべての実験は、ＦｅＳＯ４に加えて５ｍＭＰとインキュベートしたｈＮＴ―ＰＦ細胞の場合を除いて、内因性Ｐの不存在下に実施した。Ｘ軸上の標識はＦｅＳＯ４のｍＭ用量を指示し、ＳＵ，ＳＵ／３およびＳＵ／１０は相当するｍＭ用量のＦｅＳＯ４とともに添加した５ｍＭＳＵ１０６０３を指示する。
【００１６】
図７：ＦｅＳＯ４はＭＧＭ―１およびＮＨＡ細胞内のＲＯＳレベルを上昇させる
ＦｅＳＯ４処理は試験したすべての用量でＭＧＭ―１およびＮＨＡ細胞性ＲＯＳのレベルの有意な上昇を引き起こす（＊，ＭＧＭ―１：Ｆ＝５９．８８３，ｐ＜０．０００１；■，ＮＨＡ：Ｆ＝２５．４１９，ｐ＜０．０００１）。ＮＨＡ細胞はＲＯＳ産生の意味でヒトグリオーマ細胞よりもＦｅ＋感受性である。
【００１７】
図８：β―アミロイドは細胞性ＲＯＳおよびＤ合成を上昇させる
ＭＧＭ―１細胞をβ―アミロイド（Ａβ）単独またはＡβおよびビタミンＥと、少なくとも２４時間処理した。細胞性ＲＯＳおよびＤレベルを測定した。Ａβは対照のレベル以上にＲＯＳを有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）上昇させ、これはビタミンＥの共処理で部分的にブロックされた（ｐ＝０．０５４ｖｓＡｂ）が、なお対照のレベルより有意であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。同様に、ＡｂはＤレベルを対照以上に有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）上昇させ、この作用はビタミンＥでブロックされた（＊Ｐ＜０．０５ｖｓＡｂ）。データは対照以上の平均上昇ＳＥＭ（ｎ＝１２）として示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、脳内ＤＨＥＡレベルの上昇に基づいて、酸化的ストレス関連神経病理学的疾患の初期段階で患者を同定できること、およびこれらの患者におけるＤＨＥＡは脳内で別の代謝経路によって合成されることを発見した（１６）。この経路は細胞内遊離ラジカルおよび反応性酸素種により新規な前駆体を介して調節され、この前駆体の不存在または低下は、これらの患者のＣＮＳ中におけるＤＨＥＡの観察される低下と平行する。前駆体の正確な同一性はまだ不明であるが、その存在はＦｅＳＯ４、および前駆体が存在すると古典的フェントン反応およびＤＨＥＡの形成を生じると思われる他の還元剤の添加により（１５）測定することができる。
【００１９】
細胞にＦｅ２＋を添加して酸素の遊離ラジカルを発生させることは以前に記載されている（８８，８９）。酸素遊離ラジカルの発生は神経変性に関係し（４４）、酸化的ストレスの証拠はアルツハイマー病の脳において示され（２０，２１，２９）、この場合酸化的ストレスはアミロイドプラークおよび神経細線維のもつれの形成に寄与する（４５，８３）。β―アミロイドプラークはアルツハイマー病プラークの成分であり（１８）、幾つかの機構を介して（５５，５８，５９）反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加を引き起こす場合がある。
【００２０】
ＦｅＳＯ４のＤＨＥＡ形成に対する作用およびＦｅ２＋およびβ―アミロイドのＲＯＳに対する作用を考慮し、ＤＨＥＡレベルがアルツハイマー病患者の脳において上昇するという本明細書に報告された発見を考え合わせて、本発明者らは、ＤＨＥＡ合成の別代謝経路はβ―アミロイドによって刺激されると推測した。その結果、オリゴデンドロサイトがβ―アミロイドに暴露された場合、これらの細胞はＤＨＥＡ合成の増加を生じた。一方、β―アミロイドの作用は、強力な抗酸化剤であることが知られている（５２）ビタミンＥによってブロックされた。アルツハイマー病患者の脳におけるＤＨＥＡレベルの上昇の観察、ならびにオリゴデンドロサイトによるＤＨＥＡ合成に対する観察されたβ―アミロイドの役割の両者は、上昇したＤＨＥＡレベルが神経病理学的疾患過程の初期のインディケーターとして使用される可能性を示唆する。
【００２１】
したがって、本発明は、酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の形成、すなわち血液、体液または組織の試験サンプル中における別代謝経路によるＤＨＥＡの形成を、前駆体の正常レベルの不存在下または低下時にスクリーニングすることによる検出方法を提供する。前駆体の同一性は未知であるが、その存在は、ＲＯＳの形成を生じることができる物質で細胞を処理し、ついでＤＨＥＡの形成をスクリーニングすることによって定量することができる。この現象は本発明の以前に報告されていたが、この前駆体が特定の組織で欠落または低下していて、比較スクリーニングアッセイを正当化するという事実は本発明によるまで明らかにされなかった。
【００２２】
したがって本発明には、一つの診断方法として、血液、体液または組織の試験サンプル中における酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡ形成を検出する方法において、
（ａ）上記試験液体または組織を、対照液体または組織中で酸化的代謝物を産生する物質で処理し、
（ｂ）対照液体または組織中を上記物質で処理し、ついで
（ｃ）試験サンプル中において上記処理に応答して試験サンプルおよび対照サンプル中のＤＨＥＡ量が上昇するか否かを測定することからなる方法を包含する。この場合、対照サンプルに比較して試験サンプルにおける応答の欠如は、酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡの形成が、体液の上記試験サンプル中で以前に起こったことを指示する。
【００２３】
「酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡの形成」は、プレグノノロンのＤＨＥＡへの変換をシトクロームＰ４５０１７α―ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０ｃ１７）に依存するといわれる末梢において使用される古典的合成経路とは異なる別の代謝経路によって合成されるＤＨＥＡをとくに意味する。本発明者らは何らかの特異的な理論に固執することを望むものではないが、別の経路には過酸化水素中間体、とくにＣ―１７またはＣ―２０酸素化ステロイドが関与する（２８）。酸化的ストレスとは独立した疾患である精神分裂病の患者からのＣＳＦを使用した予備的データは、対照患者に類似したＤＨＥＡレベルを示し、別経路が反応性酸素種（ＲＯＳ）の形成を包含する神経病理学的疾患にとくに関係するとの仮説の有効性をさらに支持するものである。酸化的ストレスが関与する神経病理学的疾患にみられるＤＨＥＡレベルの上昇がＲＯＳ調節前駆体の低下と平行する事実は、本発明の以前には脳のニューロステロイドの合成および調節について利用できる情報がなかったことを考えれば、きわめて重要な示唆である。
【００２４】
様々なタイプ脳細胞が別経路を介してＤＨＥＡを合成する能力を調べたのちに、本発明者らは、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトがこの経路を介してＤＨＥＡを合成することができるが、神経細胞では合成できないことを見出した。すなわち、脳障害の開始段階にある患者は、上述の方法によりオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトのサンプル中における前駆体レベルの低下を示すことによって検出できる可能性がある。
【００２５】
オリゴデンドロサイト細胞およびアストロサイトはその細胞型に特異的なマーカーの存在により同定することができる。たとえば、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）および２´，３´―サイクリックヌクレオチド―３´―ホスホジエステラーゼの両者はオリゴデンドロサイト特異的なマーカーであり、一方、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）はアストロサイト特異的マーカーである。これらの細胞タイプに特異的な他のマーカーは本技術分野において周知であり、本技術分野の熟練者によれば本アッセイに使用される細胞の同一性を確証するために、たとえばＲＴ―ＰＣＲまたは他のスクリーニング技術を用いて容易に使用することができる。
【００２６】
別代謝経路を介してＤＨＥＡを合成するそれらの能力により、様々な細胞系がここに特徴づけられたが、これらの細胞系は、アッセイの対照細胞の便利なソースとして使用できる可能性がある。たとえば、ＦｅＳＯ４はＮＨＡ細胞、アストロサイト細胞系によるＤＨＥＡの形成に重要な作用を有する。すなわちこの細胞系はここに記載の方法による陽性対照として使用できた。グリオーマ多形腫瘍に由来するＭＧＭ―１（７０）もＦｅＳＯ４処理ならびにβ―アミロイド処理に、ＲＯＳ形成およびＤＨＥＡ合成の増加によって応答する。これに反して、ＭＧＭ―３細胞（７０）もＫＧ―１―Ｃ細胞（６９）もＦｅＳＯ４処置に応答せず、陰性対照として使用できる可能性がある。
【００２７】
本発明者らはさらに、ＦｅＳＯ４処理が対照患者の海馬および皮質においてＤＨＥＡを有意に増加させ、これらの患者における別の前駆体の存在が指示される。これに反し、アルツハイマー病の患者では、ＦｅＳＯ４処理に応答する有意なＤＨＥＡレベルの上昇は前頭皮質においてのみ認められ、海馬または視床下部ではみられないことを示した。ＦｅＳＯ４処理前のアルツハイマー病患者の脳におけるＤＨＥＡの高レベルでの存在およびＦｅＳＯ４処理後のアルツハイマー病患者および対照患者の海馬におけるＤＨＥＡの増加の差を考慮すれば、これはアルツハイマー病患者の海馬における前駆体は既にＤＨＥＡに変換されてしまっていることを示唆する。すなわち、脳障害の開始段階にある患者は、上述の方法により海馬組織サンプル中における前駆体レベルの低下を示すことにより診断できる可能性がある。
【００２８】
上に開示された診断方法は、しかしながら、脳脊髄液（ＣＳＦ）または血清により最も簡単に実施できる。アルツハイマー病患者および対照患者から採取した場合、これらの体液はいずれもＦｅＳＯ４処理に応答してＤＨＥＡ形成の低下を示す。ＣＳＦ液体が本発明のアッセイにおいて診断ツールとして使用できる事実は多分、アルツハイマー病の脳における酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡ形成に関する本発明者らの他の所見を考えれば論理的であろう。しかしながら、上述の方法で脳における酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡ形成を診断するツールとして血清を使用できるという所見は、この関連ではかなり驚くべきことであった。たとえばアルツハイマー病患者の血清におけるＤＨＥＡレベルは対照患者における血清レベルに比べて有意に高くはない。したがって、アルツハイマー病患者の血清中の前駆体レベルは、それにもかかわらず低い事実は、正常時には血清中に見出される前駆体がこれらの患者の脳では既に代謝してしまったことを示唆している。すなわち、上に導入した最初の診断方法は様々な体液およびサンプル、たとえば、脳脊髄液、血清、海馬組織、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトからなる群より選択されるサンプルで実施することができる。
【００２９】
上述のように、本発明者らはまた、β―アミロイドペプチドおよびＲＯＳの形成を誘発できる他の試薬が体液または組織サンプル中における前駆体の存在の試験に使用できることを発見した。すなわち本方法には、ＦｅＳＯ４のみならず他の還元剤および／または酸化剤が同様に使用可能であり、とくに他の古典的フェントン反応剤もＦｅＣｌ３およびＨ２Ｏ２によって例示される。
【００３０】
本発明の方法によって形成されるＤＨＥＡの量を正確に測定するために考えられる方法は幾つかあるが、ＤＨＥＡの量は好ましくは（ｉ）サンプルを有機溶媒で抽出し、（ｉｉ）抽出された物質をＨＰＬＣクロマトグラフィーに付し、ついで（ｉｉｉ）ラジオイムノアッセイを用いてＤＨＥＡを検出することによって測定される。好ましい有機溶媒はエーテル：酢酸エチル（ｖ／ｖ）であるが、任意の溶媒が使用可能であり、多くは本技術分野で周知である。ＤＨＥＡおよびその硫酸化誘導体、ＤＨＥＡ―Ｓは市販品を入手可能である（たとえばＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，４４５ＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｒｅＢｌｖｄ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｔｅｘａｓ７７５９８）。ＤＨＥＡに特異的な抗体もＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）から入手できる。別法として、ＤＨＥＡの量は質量スペクトルにカップリングさせたガスクロマトグラフィーによっても測定することができる。他の試験では、最初の抽出物をさらに精製工程を設けないで、光学的にステロイドレベルを測定した。しかしながら、本発明者らはＤＨＥＡおよび他のニューロステロイドを前もって精製操作を行わないで測定する試みは正確な測定値を与えないことを見出している。
【００３１】
ＤＨＥＡの別代謝経路における既知の特徴を考えると、本発明の方法は、結果の有効性を確証するために更なるアッセイを補充することもできる。たとえば、サンプルは、調節剤で処理したのち、たとえば２，７ＤＣＦの蛍光を用いてラジカル酸素種の増加についても試験する。処理と結果の相関はまた、結果がビタミンＥによりブロックされるか否かを測定することにより確証することができる。サンプルはまた、ＤＨＥＡの代謝前駆体の存在について、それが同定されたのちに、直接試験してもよい。
【００３２】
上述の診断方法はまた、別経路を用いるＤＨＥＡの合成を至適化する化合物で、細胞を処理する工程を包含する。たとえば、ＳＵ１０６０３はＰ４５０ｃ１７の既知の阻害剤である（６４）。Ｐ４５０ｃ１７はプレグネノロンのＤＨＥＡへの古典的変換（非酸化的ストレス誘発経路）に関与する酵素である。すなわち、本発明の方法に使用される細胞の試験サンプルが両経路を介するＤＨＥＡ合成能を有する場合、ＳＵ１０６０３による処理は古典的経路を介する合成を阻害することによって結果を明瞭にし、別経路の可能性のみが測定される。
【００３３】
トリロスタン（ＳｔｅｇｒａｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、３β―ＨＳＤの特異的阻害剤もプロゲステロンへのプレグネノロンの変換を阻害することにより、プレグネノロンの代謝を阻害する。細胞サンプルをトリロスタンおよびＳＵ１０６０３の両者で処理することにより、プレグニノロンの産生を最大にすることができる。メバスタチン、３―ヒドロキシ―３―メチルグルタリルＣｏＡリダクターゼ阻害剤、すなわちコレステロール合成の阻害剤で処理することにより、未知の基質のレベルを修飾することもできる。
【００３４】
上述のように、本発明者らは驚くべきことに、ＤＨＥＡレベルがアルツハイマー病患者の脳において対照患者の脳の場合よりも有意に高く、この上昇と同時に、ＤＨＥＡの酸化的ストレス誘発代謝経路の前駆体は減少していることを発見した。酸化的ストレスは様々な神経病理学的障害に寄与しＤＨＥＡレベルの上昇はこのような様々な神経病理学的疾患、たとえば一般的痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、アミロイドーシス、毛細管拡張性運動失調、ビンスヴァンガー病、脳腫瘍（一部の例では、反応性酸素種の増加を招くことがある）、ハレルホルデン―シュパッツ病、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、リー病、ミトコンドリア障害、多発脳梗塞性痴呆、ペリツエーウス―メルツバヒャー病、ピック病、卒中、および外傷性脳傷害のインディケーターとして使用することができると思われる。実際、外傷性脳傷害の診断は傷害による劇的な急性の酸化的ストレスの上昇によって、開示された診断アッセイがとくに有利である。脊髄損傷および他の末梢神経系傷害はまた、脊髄スワン細胞のニューロステロイドを作成し、傷害による酸化的ストレスを増大させる能力を考慮すれば、診断の標的である。
【００３５】
したがって本発明は、患者における神経病理学的障害の存在を診断する方法であり、上記患者のＣＮＳにおけるニューロステロイドの量を測定することからなる方法を包含する。ＤＨＥＡレベルまたはその前駆体のレベルを測定するかによって、対照に比べてニューロステロイドの量の増加または減少のいずれかが神経病理学的障害の発症を指示することになる。
【００３６】
本発明はまた、開示された診断方法を実施するためのキットを包含する。血液、体液または組織の試験サンプル中の酸化的ストレス誘発デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の形成を検出するためのこのようなキットは、上記血液、体液または組織と接触させた場合に酸化的代謝物を産生する試薬からなる。たとえば本発明のキットは、ＦｅＳＯ４のような試薬を含有し、血清およびＣＳＦの混合物の収集に便利なようなバイアルとして設計することができる。
【００３７】
キットにはＤＨＥＡの精製を容易にするため、少なくとも１個のミニカラムまたはミニカラムのセットを包含させる。たとえばＨＰＬＣカラムのミニチュアバージョンのようなシリカＣ１８逆相カラム（すなわち、Ｍｅｒｃｋ，Ｂｅｃｋｍａｎ等）を導入してもよい。本発明のキットにはさらにまたは別法として、キットがＤＨＥＡのレベルを直接測定するように設計されるか、または酸化的ストレス誘発代謝経路を介してＤＨＥＡを産生するサンプルの能力により前駆体のレベルを測定するように設計されるかによって、ＤＨＥＡ―特異的抗体から構成されてもよい。現時点では入手できるＤＨＥＡ抗体の特異性は低い。したがって、正確なラジオイムノアッセイ結果を得るためには精製が要求される。しかしながら、さらに特異性の高い抗体が入手できるようになれば、アッセイに要求される精製レベルは低下し、本発明のキットも然るべく改良されることになろう。
【００３８】
ＤＨＥＡは加齢過程、とくに海馬におけるＮＭＤＡ受容体に対するその作用による記憶形成の調節に重要であるとずっと推定されてきた。本発明者らは、現在の理論に反して、アルツハイマー病の脳においては対照の脳に比べてＤＨＥＡのレベルがはるかに高いことを証明した。しかしながら、ＤＨＥＡの合成が神経病理学的疾患において保護的な役割を演じているのか、またはその疾患過程の増強に作用しているのかの疑問は残っている。
【００３９】
たとえば、ＤＨＥＡおよびその硫酸化誘導体は、海馬において興奮性アミノ酸によって誘導される毒性に対し神経保護作用を有する（３２）。しかしながら、ＤＨＥＡのグリアに対する神経保護作用については、これまでほとんど研究されていない。酸化的ストレスに応答してグリアにより形成されるＤＨＥＡの観察された上昇は保護の役割を果たすのかもしれない。また、β―アミロイドペプチドが酸化的ストレス誘発ＤＨＥＡの合成を刺激する可能性を考慮すれば、アルツハイマー病の病態においてはアストロサイトがこのペプチドに反応するようになり、細胞外マトリックス分子およびプラーク形成の強化を助ける増殖因子を産生する可能性もある（３３）。このシナリオでは、ＤＨＥＡの増加は反応性アストロサイトの保護および神経細胞傷害の強化を補助する有害な現象である。ＤＨＥＡの増加が神経病理学的疾患に重要な役割を果たしているのか、またそれは単純に疾患過程の偶発症状であるのかは今後に残された問題である。
【００４０】
ＤＨＥＡがアルツハイマー病および他の神経病理学的疾患の病因に重要な役割を果たしているかどうかには無関係に、それは上述の診断方法により疾患の有用なマーカーとして働く。しかし、ＤＨＥＡが保護的な役割を提供することが見出されたならば、別代謝経路が細胞のβ―アミロイドペプチドへの暴露によって刺激されるという新たな観察は、別代謝経路が可能な細胞によりＤＨＥＡを合成する新規な手段を、医薬組成物に使用するために提供できる可能性がある。ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡ―Ｓをアルツハイマー病の処置のための医薬組成物に使用することについての考察は、米国特許４，８１２，４４７に提供されている。この特許は、引用により本明細書に導入される。
【００４１】
したがって本発明はまた、細胞によるＤＨＥＡ合成を増大または誘導させる方法において、上記細胞をβ―アミロイドペプチドに暴露させることからなり、このような暴露がＤＨＥＡの合成を起こさせる方法を包含する。脳細胞は、現時点でこの様式による合成を促進することが示されている唯一の細胞であるから、合成のために好ましい細胞は脳細胞とくにアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトである。しかしながら、他の細胞がこのような方法に使用できる可能性を同定することも可能である。さらに、別代謝経路に関与する前駆体または酵素が同定されたならば、この所見に基づきＤＨＥＡを合成するための、細胞を含まないシステムを創製することも可能になろう。
【００４２】
本発明はまた、ＤＨＥＡ合成の増大が関与する神経病理学的疾患を防止および処置する方法において、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトによるＤＨＥＡの合成を修飾する化合物を投与することからなる方法を包含する。「修飾」の語には、神経病理学的疾患におけるＤＨＥＡの役割は有害なことが分かった場合には、その合成阻害、ＤＨＥＡの役割が保護的であることが分かった場合には、その合成の増強の両者を包含する。ＤＨＥＡおよびその前駆体は、異なる神経病理学的疾患において異なる役割を果たす可能性がある。
【００４３】
本発明はまた、神経病理学的疾患の処置に有用な可能性がある薬物候補を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、（ａ）神経病理学的疾患のスクリーニングに使用できる可能性についてスクリーニングする試験化合物をオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトからなる組成物に暴露し、（ｂ）オリゴデンドロサイトまたはアストロサイトを含有するが、上記試験化合物は含まない。他の方法で同定された対照組成物に比べた、上記化合物のＤＨＥＡ合成に対する作用を評価し、ついで（ｃ）ＤＨＥＡ合成に対するそれらの修飾作用に基づいて有用な可能性のある化合物を同定することからなるアッセイを包含する。この場合も「修飾」の語は、ＤＨＥＡがその疾患過程に破壊的または保護的役割のいずれを示すかに依存して変動する。
【００４４】
以下の方法および作業実施例は本発明の基底にある概念を例示する目的で提供される。
【００４５】
実験操作
細胞系
ヒトグリオーマ細胞系ＫＧ―１―ＣはＲｉｋｅｎＣｅｌｌＢａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から入手した。ＭＧＭ―１およびＭＧＭ―３細胞系はＨｉｒｏａｋｉＫａｔａｏｋａおよびＭａｓｈｉＫｏｏｎｏ博士（ＭｉｙａｚａｋｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｊａｐａｎ）から恵与された。正常ヒトアストロサイト（ＮＨＡ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、一方、精製ヒト神経細胞（ｈＮＴ―ＰＦ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。Ｐ４５０ｃ１７抗体はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓのＤａｌｅＢ．Ｈａｌｅｓ博士から恵与された。特異的な３β―ＨＳＤ阻害剤のトリロスタンはＳｔｅｇｒａｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫから恵与された。Ｐ４５０ｃ１７の阻害剤ＳＵ１０６０３（６４）はＣｉｂａ―Ｇｅｉｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから恵与された。
【００４６】
組織サンプル
すべてのヒト組織サンプルおよびＣＳＦはＨａｒｖａｒｄＢｒａｉｎＴｉｓｓｕｅＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒｉｎＢｅｌｍｏｎｔ，ＭＡから入手した。ステロイド測定のためのサンプルは液体窒素中でスナップ凍結または受動的に凍結した。ＲＮＡ抽出のためのサンプルはスナップ凍結した。すべての患者の平均年齢は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者については７４．６歳、対照については７３．４歳であった。平均死後間隔はＡＤ患者で１０．２時間、対照で１４．７時間であった。血清サンプルはＪ．Ｒ．Ｒａｐｉｎ博士（ＣＥＢ，ＭｏｎｔＳａｉｎｔ―Ａｇｎｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。ヒト組織の使用についてのプロトコールはＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩｎｔｅｒｎａｌＲｅｖｉｅｗｓＢｏａｒｄ１によって承認された。
【００４７】
細胞培養
ＫＧ―１―Ｃは混合グリオーマに由来し、オリゴデンドロサイトの特性を有するとして記述されていた（６９）。ＭＧＭ―１およびＭＧＭ―３はグリア芽細胞腫多形腫瘍に由来する（７０）。３つの細胞系はすべて、１０％ウシ胎児血清（ＭｅｄｉａｔｅｃｈＣｅｌｌｇｒｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１２．５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃および６％ＣＯ２で増殖させた。ＮＨＡ細胞は、５％ウシ胎児血清、０．０２ｍｇ／ｍＬヒト上皮増殖因子、２５ｍｇ／ｍＬインスリン、０．０２５ｍｇ／ｍＬプロゲステロン、５０．０ｍｇ／ｍＬトランスフェリン、５０．０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび０．０５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢを含有するアストロサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中で増殖させた。ＨＮＴ―ＰＦはＮｔｅｒａ２／Ｄ１奇形腫細胞系（ＮＴ２）由来の、有糸分裂後分化細胞である。ＮＴ２前駆体細胞はインビトロでレチノイン酸（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）により６週間処理して分化を誘導することができる。ＨＮＴ―ＰＦ細胞は平板し、ｈＮＴ―ＰＦ神経細胞条件培地（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中３７℃，６％ＣＯ２に維持した。
【００４８】
逆転写―ポリメラーゼ連鎖反応およびＤＮＡブロッティング
総ＤＮＡは、ＲｎａｚｏｌＢ（Ｔｅｌ―ＴｅｓｔＩｎｃ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を用い、酸性グアニジウムチオシアナートフェノールクロロホルム抽出により各細胞化合物タイプから単離した。各細胞タイプからのＲＮＡは、オリゴ（Ｔ）およびＭｕＬＶ逆転写酵素を用い、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）により提供されたプロトコールに従い逆転写した。興味ある遺伝子に特異的なプライマーを用いて特異的なフラグメントを増幅した（表１）。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上に流し、ナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移した。プローブは総副腎ＲＮＡ（ＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃ，Ｐ４５０ｃ１７または３ｂ―ＨＳＤ）または総ヒト脳ＲＮＡ（ＭＢＰ）のいずれかからＲＴ―ＰＣＲにより合成した。特異性を確認するために、ＡＢＩＰｒｉｓｍプロトコールを用い、ＬｏｍｂａｒｄｉＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒＦａｃｉｌｉｔｙ，ＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒにおいて、プローブを配列決定した。プローブはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのキットを用いてランダムプライムラベルにより標識し、膜と４２℃で一夜インキュベートした。膜を洗浄し、２〜２４時間，−７０℃でＸＯＭＡＴ―ＡＲフィルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露出した。
2004507712.tif 000002
【００４９】
免疫細胞化学
細胞は４チャンバースライド（ＶＷＲ，Ｗ．Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）中で増殖させ、７０％エタノール中４℃で１５〜３０分間固定させた。スライドを１０％ウシ血清中一次抗体と、以下の希釈：ＰＢＲ；１：２００（３４），Ｐ４５０ｓｃｃ；１：２００（４９），Ｐ４５０ｃ１７；１：２００，３ｂ―ＨＳＤ；１：１００（ＯｘｙｇｅｎｅＩｎｃ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）により室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ―連結抗―ウサギ二次抗体（ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）を希釈１２０００で１時間室温において適用し、ペルオキシダーゼ反応の検出にはＨＲＰ基質、３―アミノ―９―エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた。スライドはヘモキシリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で対比染色した。
【００５０】
ステロイド生合成実験
デノボでのステロイド合成：すべてのステロイド合成実験は６０８０％コンフルーエントの細胞で実施した。細胞がデノボにおいてステロイドを合成する能力を測定するために、細胞を３７℃，６％ＣＯ２において２時間、前述のように（５０）特異的なステロイド生合成酵素阻害剤とともにインキュベートした。略述すれば、細胞を、血清を含まないメジウム中２０ｍＭのメバスタチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と１時間インキュベートして内因性コレステロール合成をブロックした。ついで、１０ｍＭのトリロスタンおよび５ｍＭのＳＵ１０６０３を加えた。３０分後、３ｍＬの３Ｈ―メバロナクトン（３３Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ，ＤｕＰｏｎｔＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と１０ｍＭのコールドのメバロナクトン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。３０分後、メジウムおよび細胞を合わせ、氷上で２０秒間ホモジネートした。ホモジネートを４ｍＬのエーテル：酢酸エチル（１１，ｖ／ｖ，Ｆｌｕｋａ，ＮｅｗＹｏｒｋおよびＥＭＳｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で２回抽出し、蒸発させた。抽出液を１００％メテノール中に再構築し、ＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄＨＰＬＣシステム上１２６ＮＭ溶媒モジュール、１６６ＮＭ検出器およびＢｅｃｋｍａｎウルトラスフェアＸＬ３―ｍｍＳｐｈｅｒｉｃａｌ８０Ａ多孔性カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて分離し、メタノール勾配で溶出した。１分毎に分画を集め、液体シンチレーションスペクトロメトリー（ＥＧ＆ＧＷａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）によってカウントし、放射標識されたステロイドの産生を測定した。ステロイドは、放射標識標準と比較したそれぞれの保持時間によって同定した（保持時間Ｐ＝２８分，保持時間プロゲステロン＝２４分，保持時間Ｄ＝１８分）。以前の実験で、これらの分画中のステロイドは、ガスクロマトグラフィー・質量スペクトロメトリーによりそれぞれＰ，プロゲステロンおよびＤとして同定された（１５）。
【００５１】
別経路：別経路によって合成されたＤの量を決定するために、細胞を先に記載されたように処理した（１５）。略述すれば細胞を洗浄し、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを、血清を含まないメジウム中、ＦｅＳＯ４の濃度を上昇させながらインキュベートした。神経細胞は血清を含まず、５ｍＭＰおよびＦｅＳＯ４を含有するメジウム中、１０ｍＭＳＵ１０６０３の存在下または不存在下にインキュベートした。２時間後、細胞およびメジウムを上述のようにホモジナイズし、抽出した。抽出液を、移動相として９５％メタノール（ｖ／ｖ）を用い、Ｃ１８ＴＬＣプレート（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）上に流した。Ｐ，プロゲステロンおよびＤの放射標識標準もそれぞれのプレートに流し、各サンプルについて適当なステロイド分画を収集した。ＴＬＣ分画を２ｍＬのジエチルエーテル（Ｆｌｕｋａ，ＮｅｗＹｏｒｋ）で抽出し、蒸発させた。別の実験では、ステロイドをＴＬＣから溶出し、さらにＨＰＬＣ，ＲＩＡおよびガスクロマトグラフィー・質量スペクトロメトリーにより同定した（データは示していない）。
【００５２】
組織サンプル：アルツハイマー病患者および対照患者からの脳サンプルについて、サンプルを前に記載したように（１７）処理した。略述すれば、ホモジネートのアリコートを最終濃度３０ｍＭ（脳）または１０ｍＭ（血清およびＣＳＦ）ＦｅＳＯ４で、３７℃において２時間インキュベートした。２時間後、サンプルを、内因性レベルについて記載したようにして抽出、精製し、特異的なラジオイムノアッセイでアッセイした。
【００５３】
ＤＨＥＡの血清およびＣＳＦレベル：血清は１１例の患者、ＡＤ５例および年齢のマッチした対照６例から得た。血清サンプルは分割して１０ｍＭＦｅＳＯ４の存在下または不存在下に処理した。血清およびＣＳＦサンプルは脳組織サンプルについて述べたようにして抽出し、ＨＰＬＣで精製した。ＤＨＥＡレベルは特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。
【００５４】
別経路のβ―アミロイドによる調節：ＭＧＭ―１細胞は９６―ウエル（約５，０００細胞／ウエル，ＲＯＳ測定）または２４―ウエル（約１５，０００細胞／ウエル，Ｄの測定）プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）上で平板培養した。同時に、１ｍｇのＡｂ（Ａｂ１―４２，ＡｎａＳｐｅｃＩｎｃ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を０．５ｍＬの血清を含まないメジウムに溶解し、集合させるため４℃でインキュベートした。２４時間後、細胞は１０％ウシ胎児血清および５０ｍＭＡｂまたは５０ｍＭＡｂ＋ビタミンＥ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにＤＭＥＭ中でインキュベートした。対照サンプルは１０％ＦＢＳとともにＤＭＥＭ中でインキュベートした。細胞を３７℃，６％ＣＯ２において少なくとも１２時間インキュベートし、別の実験について上述したようにＲＯＳ発生またはＤ合成のために処理した。
【００５５】
ＲＯＳの測定
処理メジウムを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。蛍光プローブ２，７―ジクロロフルオレセインジアセテート（２，７―ＤＣＦ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて酸化的ストレスのレベルを測定した（４８）。細胞を５０ｍＭ２，７―ＤＣＦとインキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ２ＭｕｌｔｉｌａｂｅｌＣｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆ＧＷａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を用いて、４８５ｎｍ／５３５ｎｍで蛍光を測定し、細胞の蛍光値を得た。
【００５６】
ラジオイムノアッセイ
各ステロイドに特異的な抗体（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡＭｅｓａ）を使用するＲＩＡによりＰ，プロゲステロンおよびＤレベルを測定した。データはＪａｆｆｅａｎｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇ，ＭＤ）からのＩＢＭ―ＰＣＲＩＡＤａｔａＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（バージョン４．１）を使用して解析した。ＡＤおよび対照脳サンプル中のβ―アミロイド種は、β―アミロイドペプチドのアミノ酸１７〜２４を認識するモノクローナル抗体、４Ｇ８（ＳｅｎｅｔｅｘＰＬＣ，Ｎａｐａ，ＣＡ）を用いて解析した。０．２５Ｍスクロース緩衝液中のサンプルを４２０％の勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）上に流した。サンプルをニトロセルロース膜に移し、室温において、１時間一次抗体と希釈１：２０００でインキュベートした。膜を二次抗体（１：１０００）と室温で１〜１．５時間インキュベートし、ＥＣＬ試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｑｕａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて可視化した。ブロットはＸ―ＯＭＡＴフィルムに露出した。
【００５７】
タンパク質アッセイ
タンパク質のμｇ量をＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６，３９）の色素―結合アッセイにより、標準としてウシ血清アルブミン（ＩＣＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）を用いて測定した。
【００５８】
統計
細胞系を使用した別経路結果の統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＩＮＳＴＡＴ３．００パッケージを用いて、片側ＡＮＯＶＡにより実施した。ＲＯＳおよびβ―アミロイドのデータの解析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＪａｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎＲａｆａｅｌ，ＣＡ）により対のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ―検定を用いて実施した。組織サンプルからの統計データは３〜１５の測定値の平均±ＳＥＭとして示す。データは正規検定によるＷｅｌｃｈのｔ―検定を用いて解析した。有意差レベルはＰ＜０．０５に設定した。
【００５９】
結果：ニューロステロイド合成の特性および脳細胞系を用いる調節
細胞タイプの特性
グリオーマ細胞系の表現型を決定するため、本発明者らは、ＭＢＰ，オリゴデンドロサイトマーカー、およびＧＦＡＰ，アストロサイトマーカーについてＲＴ―ＰＣＲを実施した。本発明者らは、３種のグリオーマ細胞系のすべてで、総ヒト脳ＲＮＡと同様ＭＢＰについてのメッセージを発現すること（データは示していない）を発見した。グリオーマ細胞系は、どれもＧＦＡＰに対するメッセージは発現しない（データは示していない）。これらの細胞は集合的にオリゴデンドロサイトと呼ぶ。
【００６０】
ＣｌｏｎｅｔｉｃｓからのＮＨＡ細胞は、ＧＦＡＰに対して免疫陽性にし、ＲＴ―ＰＣＲによりＧＦＡＰの発現を確認した（データは示していない）。これらの細胞はまた、ＣＤ６８，マイクログリアのマーカー、および２´，３´―サイクリックヌクレオチド―３´―ホスホジエステル、オリゴデンドロサイトマーカー（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｏｆＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）に対して免疫陰性である。ＨＮＴ―ＰＦ細胞はＮｔｅｒａ２／Ｄ１奇形腫細胞系から、レチノイン酸で５〜６週間の分化により誘導する。これらの細胞は減数分裂後であり、他の研究者によって十分に特性が明らかにされている。いったん分化すると、それらは３つの神経フィラメントタンパク質を発現するが、ＧＦＡＰは発現しない（６１）。それらはまた、神経細胞に特異的な接着分子たとえばＮＣＡＭおよびＮ―カドヘリンも発現する。電気生理学的には、ｈＮＴ―ＰＦ細胞は、テトロドトキシン―感受性ナトリウム電流で神経細胞様に挙動する（７８）。レチノイン酸分化はまた、ＮＭＤＡおよび非―ＮＭＤＡサブタイプ両者の機能性グルタミン酸受容体の発現を誘導する（８６）。
【００６１】
オリゴデンドロサイトはデノボでＰを合成するが、アストロサイトおよび神経細胞は発現しない
ステロイド合成細胞は、内因性コレステロールをプレグネノロン（Ｐ）に変換できる細胞として定義される。体内ではこの能力を有する細胞はほとんどなく、それはステロイド合成組織たとえば副腎、生殖腺、胎盤および脳に限定されている。しかしながら、ほとんどすべての細胞はステロイドを最終ステロイド産物に代謝する能力はもっている。本発明者らは、３―ヒドロキシ―３―メチルグルタリル―ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、メバスタチンで内因性コレステロールの合成をブロックし、細胞を、放射標識コレステロール前駆体、３Ｈ―メバロナクトンとインキュベートした。本発明者らはトリロスタンおよびＳＵ１０６０３でＰの代謝をブロックすることにより、Ｐの産生を最大にすることを試みた。サンプルのＨＰＬＣ分離は、ＭＧＭ―３細胞系が、放射標識前駆体からデノボでＰを合成することを指示した。一部の実験では、ＫＧ―１―Ｃ細胞も放射標識されたＰを生じたが、多くの実験の結果を合わせると、この作用は有意ではなかった。さらに、ＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―３細胞も放射標識されたＤを生じ、ＳＵ１０６０３はこれらの２種の細胞系における内因性Ｄの産生のブロックに有効ではなかった。これは、ヒト脳内のステロイド生合成に関与する機構は副腎および生殖腺に存在する機構とは異なることを示唆している。ＭＧＭ―１，ＮＨＡおよびｈＮＴ―ＰＦ細胞はデノボでＰを産生しない（データは示していない）。
【００６２】
本発明者らは、ＲＯＳの高い内因性レベルがＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―３細胞におけるデノボＤ形成に関与していると仮定した。ヒトグリオーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中１０ｍＭのビタミンＥの存在下または不存在化に少なくとも１２時間処理した。本発明者らは、これらの細胞中のＲＯＳおよびＤレベルを実験操作の項に記載したようにして測定した。本発明者らは、これらの細胞のビタミンＥ処理が、非処理の細胞と比較してＲＯＳおよびＤ両者のレベルを低下させることを見出した（データは示していない）。すべての処理でＲＯＳおよびＤのレベルは相関し、ｒ＝０．７０３４であった。
【００６３】
ヒト脳細胞はｍＲＮＡおよび末梢ステロイド生合成機構の様々な成分についての免疫反応性を発現する
ヒト脳におけるステロイド生合成の可能な機構を決定するために、本発明者らは古典的な末梢ステロイド合成経路における４つの成分の発現に注目した。細胞を、ｍＲＮＡ，ＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃ，Ｐ４５０ｃ１７および３β―ＨＳＤの存在についてアッセイした。３つのグリオーマ細胞系はすべて、４つの成分のすべてに対するｍＲＮＡを発現する（データは示していない）。さらに、相当するタンパク質がこれらの細胞において、免疫細胞化学的に検出された（データは示していない）。ＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―１細胞は４つの成分のすべてに対する免疫反応性を発現する。興味あることに、ＭＧＭ―１細胞はＰＢＲ似たい至適化明瞭な核局在化を示す。これは、より攻撃的なヒト乳癌細胞系および生検ＰＢＲにおいて、非攻撃的細胞にみられるミトコンドリア局在化（５３）と異なり、核および核周辺領域における局在化を見出した本発明者らの実験室からの最近のデータと一致する。ＭＧＭ―３はＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃおよびＰ４５０ｃ１７に対する免疫反応性を発現するが、３β―ＨＳＤに対する免疫反応性は発現しない。しかしながら、ＭＧＭ―３は３β―ＨＳＤに対するメッセージは有する。これは、３β―ＨＳＤｍＲＮＡの破壊の増大またはタンパク質の変性の増大を指示している。全体的にこれらのデータは、ヒトオリゴデンドロサイトにおいて、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現はその細胞がデノボでニューロステロイドを合成する能力に相当することを指示している。
【００６４】
ヒトアストロサイトは４つの成分のすべてに対するｍＲＮＡを発現する（データは示していない）。それらは、ＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃおよびＰ４５０ｃ１７に対して免疫反応性であるが、タンパク質の発現はグリオーマ細胞にみられるよりもはるかに低い。ＭＧＭ―３細胞と同様に、ＮＨＡはｍＲＮＡを有するが、３β―ＨＳＤに対する免疫反応性は示さない。この場合も、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性の変化が指示される。ＮＨＡ細胞はＰおよびＤの合成能を示すが、プロゲステロンは合成できない。ヒト神経細胞はＰＢＲ，Ｐ４５０ｃ１７および３β―ＨＳＤに対するｍＲＮＡを発現するが、Ｐ４５０ｓｃｃのｍＲＮＡは発現しない。一方、ＮＴ２前駆体細胞は４つの成分すべてに対してメッセージを有する（データは示していない）。これは、ｈＮＴ―ＰＦがデノボでＰを合成できないことを指示し、上記データと一致するが、それらはＰを他の神経活性なステロイドに代謝することはできる。
【００６５】
オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトはＤ合成のための別経路を有する：神経細胞は別経路をもたない
本発明者らは最近、ラットグリオーマ細胞が、Ｐ４５０ｃ１７とは独立した経路により、ＤＨＥＡ（Ｄ）のようなニューロステロイドを合成できることを証明した（１５）。本発明者らはヒト脳細胞系における別経路の活性評価の場合と類似のプロトコールを使用した。本発明者らは、ＭＧＭ―１細胞系が、別経路を介してＤを産生する能力を有することを見出した（図６：片側ＡＮＯＶＡのＦおよびｐ値は、図面の簡単な説明の項参照）が、これらの細胞は、放射標識前駆体からデノボでＰを産生することはできない。ＦｅＳＯ４はＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―３のＤレベルには有意な影響を与えなかった（図６Ａ，６Ｃ）。ＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―３は、ＳＵ１０６０３によって阻害されない様式で放射標識されたＤをデノボで合成した細胞であることに注意すべきである。この場合も、内因性の遊離ラジカルがこれらの細胞におけるＤの形成に関与していることが示唆される。ＦｅＳＯ４処理はＮＨＡ細胞におけるＤの形成に有意な影響を有し（図６Ｄ）、この作用は腫瘍細胞系に限定されないことが指示される。この作用は、用いたＦｅＳＯ４の最高用量でのみ認められ、それらのＦｅＳＯ４またはＲＯＳレベルに対する感受性の意味で細胞タイプ間に差があることを指示するものである。
【００６６】
ｈＮＴ―ＰＦ細胞も、上述のように、ＳＵ１０６０３の存在化または不存在下に、ＦｅＳＯ４の濃度を上昇させてインキュベートした。さらにこれらの細胞は、Ｄの産生を増強させるために５ｍＭのＰとインキュベートした。最近の研究（１５）によりラットＣ６細胞で基質としてＰを与えるとＦｅＳＯ４の作用を増強できることが示された。ヒト神経細胞はＦｅＳＯ４処理によって影響されず（図６Ｅ）、この別経路はグリア細胞に特異的であることが示唆された。ＨＮＴ―ＰＦ細胞もＳＵ１０６０３処理によって影響されず、これらの細胞におけるＤはＰ４５０ｃ１７酵素の内因性の活性に由来しないことを示している。したがって、神経細胞のＤは完全に他のソースに由来するものと思われる。
【００６７】
調べたヒト脳細胞のすべてにおいてＳＵ１０６０３はＤの形成を阻害しなかった。ＳＵ１０６０３はきわめて複雑な薬理学的性質を有し、場合によってはＤレベルを上昇させるようにみえる（図６Ｄ）。しかしながら、これはＰ４５０ｃ１７活性の利用できる唯一の既知阻害剤である。本明細書に提示した結果に反して、この化合物は精巣のライディッヒ細胞においてＰ４５０ｃ１７の活性を阻害し（データは示していない）、この薬物はＰ４５０ｃ１７の活性を抑制できることが指示される。
【００６８】
ヒト脳からの細胞系のＦｅＳＯ４処理は内因性遊離ラジカルを増加させる
本発明者らはＦｅＳＯ４がＤの合成を調節する機構の可能性として、細胞性ＲＯＳ産生の調節を仮定した。本発明者らは、ＭＧＭ―１ヒトグリオーマ細胞およびＮＨＡ細胞をＦｅＳＯ４で処理し、これらの細胞中のＲＯＳレベルを、実験操作の項に記載の方法で測定した。本発明者らは、試験したすべてのＦｅＳＯ４濃度で、非処理細胞に比べてＲＯＳレベルの有意な上昇を見出した（図７：片側ＡＮＯＶＡのＦおよびｐ値は、図面の簡単な説明の項参照）。ＮＨＡ細胞は、ＭＧＭ―１細胞の場合よりさらに明瞭にＦｅＳＯ４に応答した。これは、ＦｅＳＯ４がこれらの細胞中のＲＯＳを上昇させることを指示し、この機構がＤ合成のレギュレーターである可能性を支持する。
【００６９】
β―アミロイドによる処理は、ＭＧＭ―１ヒトグリオーマ細胞中のＲＯＳおよびＤレベルを上昇させる
本発明者らは、内因性の細胞性ＲＯＳがＫＧ―１―ＣおよびＭＧＭ―３細胞にみられるデノボでのＤ形成に関与し、ＲＯＳ形成を誘導するＦｅ２＋の添加（図７）はＭＧＭ―１およびＮＨＡ細胞においてＤの形成を起こさせることを示した。他の処理によって生じるＲＯＳの増加がＤの形成を増加させるか否かを調べるために、本発明者らはＭＧＭ―１細胞を、１０ｍＭの抗酸化剤、ビタミンＥの存在下または不存在下に５０ｍＭのＡβで処理した。Ａβによる処理は、対照レベルに対して２，７―ＤＣＦの蛍光に有意な増加を生じる（ｐ＜０．０１，Ｓｔｕｄｅｎｔの対のないｔ―検定）ことが見出され、ＲＯＳの増加が指示された（図８Ａ）。この増加はビタミンＥによる同時処理で部分的にブロックされた（ｐ＝０．０５４）が、対照のレベルよりもまだ有意であった（ｐ＜０．０１）。Ａβによる処置はまた、対照に比較してＤのレベルも有意に上昇させた（ｐ＜０．０１，図８Ｂ）。この有意な上昇はビタミンＥによる処理でブロックされた（ｐ＜０．０５ｖｓ．Ａβ）。このデータＲＯＳがヒト脳でＤの合成を調節する役割を演じていることを示唆するものである。
【００７０】
考察
齧歯類で脳に見出されるステロイドは末梢および局所起源の両者であることを示すかなり多数の証拠はあるが、ヒト脳のニューロステロイド合成能については何も知られていない。すなわち、ここに報告されるのはヒト脳細胞におけるステロイド生合成機構の最初の証明である。本発明者らは、放射標識前駆体ｍＲＮＡからのデノボでのＰの生合成、ならびにＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃ，Ｐ４５０ｃ１７および３β―ＨＳＤのタンパク質発現、さらにＤ合成のための遊離ラジカル仲介、別経路の存在について検討した。
【００７１】
本発明者らは、オリゴデンドロサイトにおけるＰのデノボでの合成を証明したが、アストロサイトおよび神経細胞では証明されなかった。これは、オリゴデンドロサイトが脳で合成されるＰのソースである可能性を示す（６２）ラットモデルで得られたデータを確認し、ニューロステロイドの生合成を研究するためのモデルとしてラットを使用することの正当性を認めるものであろう。しかしながら、本発明者らは、アストロサイトまたは神経細胞がＰをプロゲステロンおよびＤまたは他の神経活性化合物に代謝する能力を有する可能性も排除しなかった。オリゴデンドロサイトはステロイド合成細胞と命名し、アストロサイトおよび神経細胞をステロイド代謝細胞集団と命名することができる。これは、神経細胞の興奮性に役割を果たす神経活性ステロイドは多くの様々な、末梢を含めたソースから局所的に産生されることが可能であることを意味する。
【００７２】
本発明者らは、ステロイド生合成機構の４種の成分について、ｍＲＮＡの存在および免疫反応性を調べた。オリゴデンドロサイトはｍＲＮＡ、ならびにＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃ，Ｐ４５０ｃ１７および３β―ＨＳＤに対する免疫反応性を有する。これはオリゴデンドロサイトが前駆体からコレステロールを作成し、コレステロールをミトコンドリアに輸送し、それをＰに代謝する能力を確認する。Ｐ４５０ｃ１７の酵素活性は、これらの細胞におけるＤ形成をブロックする特異的阻害剤ＳＵ１０６０３の不安定性により検出されなかった（図６Ａ〜Ｃ）。アストロサイトもｍＲＮＡ、ならびにＰＢＲ，Ｐ４５０ｓｃｃおよびＰ４５０ｃ１７に対する免疫反応性を有するが、本発明者らはＰ４５０ｓｃｃに対する活性は見出すことはでなかった。Ｐ４５０ｓｃｃが機能するためには、アストロサイトにはない補因子が必要であり、この場合、酵素活性は防止される。これらの結果は、オリゴデンドロサイトに由来するＰからの神経活性ステロイドを作成できるステロイド代謝細胞としてのアストロサイトの可能性ある役割を指示する。アストロサイトは、Ｐ４５０ｃ１７によってＰをＤに変換できる可能性があるが、Ｐ４５０ｃ１７の阻害剤、ＳＵ１０６０３（６４）はこれらの細胞内のＤレベルには影響しない（図６Ｄ）。オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトの両者では、免疫反応性Ｐ４５０ｃ１７は検知できる何らの活性も示さなかった。アストロサイトにおけるＰ４５０ｓｃｃと」同様、これらのタイプの細胞にはない補因子がこの酵素の機能には要求されるのかもしれない。興味あることに、すべてのグリア細胞では、ＤＮＡブロットによって同定される２つのアイソフォームがＰ４５０ｃ１７には存在するように思われる。以前の研究において、ラットの皮質および小脳でＰ４５０ｃ１７の２つの転写体が見出されている（８１）。一方または他方のアイソフォームが優先的に翻訳され、これらのアイソフォームは異なる活性を有する。最後に、神経細胞は、ＰＢＲ，Ｐ４５０ｃ１７および３β―ＨＳＤのｍＲＮＡを発現するが、Ｐ４５０ｓｃｃのｍＲＮＡは発現しない。これは、これらの細胞が、本発明者らのデノボでの実験によって支持されるように、デノボではＰを作成できないことを指示する。神経細胞がＰを他のステロイドに代謝するかどうかは残された問題である。
【００７３】
脳でのＤ生合成の機構についての分野には論争がある。１９９４年、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎおよび共同研究者らは、末梢のステロイド生合成には無関係な化合物と反応し、ニューロステロイドを産生する別のニューロステロイドの前駆体がラット脳抽出物中に存在すると提唱した。彼らは、ラット脳の有機抽出物を様々な抗酸化化合物で処理し、Ｄの遊離が起こることを証明した（２８）。本発明者らは、Ｐ４５０ｃ１７ｍＲＮＡおよびタンパク質はないのに、ラットグリオーマ細胞を様々な酸化化合物で処理した場合、同じくＤが形成されることを証明した（１５）。この別経路は脳由来の細胞に特異的であり、細胞のない環境では再現できなかった（１５）。今回はこの別経路がヒト脳からの細胞系に存在することを報告する。
【００７４】
オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトは別経路でＤを産生することができる。Ｄ合成のＲＯＳ誘導にはある閾値が存在するように思われる。これは、オリゴデンドロサイトとアストロサイトでは異なっている。アストロサイトは、グリオーマ細胞よりもＦｅ２＋に応答して、より多くのＲＯＳを産生するようにみえる。これはＦｅＳＯ４に対する感受性が高いことを指示する。これは多分、正常のヒト脳細胞において、Ｄ合成のＲＯＳ誘導の閾値が高いことを指示するものと思われる。これらのデータは、様々な条件下での脳の酸化的環境が、グリアによるＤの形成に影響することを示唆している。神経細胞がＤ合成のための別経路をもらず、別経路はグリアに特異的であることが示唆される。Ｆｅ２＋に応答しないオリゴデンドロサイトは、Ｐ４５０ｃ１７に独立した様式で、デノボにおいてＤを合成できる。これは多分、高い内因性ＲＯＳによるものであろう。興味あるコトニ、グリオーマ細胞系のビタミンＥ処理は、ＭＧＭ―１細胞にみられるレベルに対し、ＭＧＭ―３ＲＯＳおよびＤレベルを低下させるが、ＫＧ―１―Ｃ細胞はこの抗酸化剤によってそれほど劇的には影響されない。これらのデータは、単離されたオリゴデンドロサイトおよびアストロサイトが一次培養システムにおいて、Ｆｅ２＋に応答してＤを産生することを見出した本発明者らに実験室での結果（４２）を確認するものである。
【００７５】
ステロイド合成モデルに理想的な前駆体を添加して酵素活性を研究すること、すなわちＰ４５０ｃ１７を介してＤの形成のためにＰを添加することは、慣用方法であることに注意すべきである。本発明者らは、Ｐを添加することにより方法が生理学的機構ではないＰ４５０ｃ１７仲介Ｄ形成の方向に偏る可能性を考慮したので、上に報告した研究を、前駆体を用いないで実施することを選択した。本発明者らはｈＮＴ―ＰＦ細胞でのみＰを使用した。この場合は細胞数が限られているので、至適条件を用いることを選択している。これらの条件下には、ＰはＰ４５０ｃ１７酵素によりＤに代謝されなかった。５μＭのＰをオリゴデンドロサイトまたはアストロサイトに添加してもＤの産生の増加は生じなかったこと（データは示していない）に留意すべきである。
【００７６】
内因性であり、偏りを生じないＰ４５０ｃ１７酵素活性を阻害する手段として、本発明者らはＳＵ１０６０３を使用した。この化合物はＰ４５０ｃ１７の特異的阻害剤として開発されたが、他のＰ４５０も、Ｐ４５０ｓｃｃを含めて阻害することが明らかにされている。本発明者らは、ＳＵ１０６０３単独の添加は、用いたいずれの細胞系においても、Ｐレベルには影響しないことを見出している（データは示していない）。これは薬物がＰ４５０ｓｃｃの活性を変化させないことを指示している。ＳＵ１０６０３が試験したヒト脳細胞系でＤの形成を阻害しなかったことを考慮し、本発明者らは、ヒト脳細胞系においては、Ｐ４５０ｃ１７はＤ形成の機構ではないと結論する。
【００７７】
上述のように、齧歯類の脳におけるＰ４５０ｃ１７活性の存在は論争の種となっていた。最近の研究で、本発明者らはラットオリゴデンドロサイトにおけるＰ４５０ｃ１７ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を見出したが、別経路がＤ形成に関与するアストロサイトでは見出すことができなかった（４２および未発表データ）。しかしながら、Ｚｗａｉｎ＆Ｙｅｎは最近、Ｄはラット脳で、さらに特定すればアストロサイトおよび神経細胞でＰ４５０ｃ１７経路を介して形成できたことを報告した（８７）。Ｄの単離および特徴解析に用いられた技術が、すなわちＨＰＬＣ，ＴＬＣおよびＧＣ―ＭＳついでＲＩＡ（１５，４２，および本報告）対直接ＲＩＡ（８７）と多様なため、ラットで得られたデータと本明細書に報告されたデータを現時点で比較することは困難である。
【００７８】
ＲＯＳの発生が生理学的な関連で別経路の調節に関与したか否かを決定するため、本発明者らはＭＧＭ―１細胞を、アルツハイマー病のプラークであるＡβで処理した。Ａβは神経細胞に毒性を示し、細胞性ＲＯＳの増加を引き起こす（５４）。この作用は抗酸化剤たとえばビタミンＥでブロックすることができる（５２）。本発明者らはＡβ処理がＭＧＭ―１ヒトグリオーマ細胞における細胞性ＲＯＳを上昇させ、Ｄレベルを上昇させる。ＲＯＳおよびＤにおける上昇は両者ともビタミンＥの同時処理によってブロックできた。これは、脳におけるＤ合成の調節機構に関する最初の証明であり、これはヒト脳とくに神経病理学におけるＤの役割に関する洞察を可能にする。
【００７９】
Ａβは神経細胞に毒性を示すが、アストロサイトの活性化（５６）および細胞骨格の再編成（８０）を誘導する。しかし、アストロサイトの生存能には影響しない（７６）。アストロサイトの活性化ついでコンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（３０）および増殖因子（９０）の沈着はプラークの形成に関与するものと思われる。グリア細胞がそのＤを産生する能力によってＡβの毒性作用に抵抗し、海馬における神経保護作用を発揮すること（３２）も考えられる。
【００８０】
ヒト脳腫瘍ではＰＢＲが上方調節されていることが知られている（４３，６８）。これはステロイド生合成経路の一般的な上方調節を指示するものかもしれない。さらに、ＡＤ脳の特異的な領域およびパーキンソン患者からの脳（６６）では、ＰＢＲ結合部位が有意に増加している。ステロイド生合成成分の上方調節は、別経路の活性と同様に、脳内のホメオスターシスの変化、神経細胞変性または外傷の徴候かもしれない。ニューロステロイドの生合成の上昇は変化または毒性のある細胞環境の特性かもしれない。別経路は、正常なホメオスターシスが破壊した環境下のみで、核ＰＢＲを有し、したがって古典的な酵素経路を介してはニューロステロイドを合成できないＭＧＭ―１細胞のように、脳ステロイド生合成における実行者になるのかもしれない。すなわち、傷害または疾患による細胞過程の変化が、正常時には別経路は使用しない細胞において、別経路の機能が可能になるのかもしれない。
【００８１】
実施例１
本発明者らは、ＡＤ患者および年齢がマッチした対照からの視床下部、海馬および皮質からのサンプルにおけるプレグノロン（Ｐ）およびＤＨＥＡ（Ｄ）のレベルを測定した。本発明者らは、海馬または前頭皮質においてはＰレベルに有意な差を見出さなかった（図１）。視床下部のＰレベルには変化がみられるが、このサンプル中に存在するＰの量はきわめて少なく、１回の測定を行うことしかできなかった。３つの領域のすべてでＤレベルには有意な上昇が認められた（ｐ＜０．０１ｖｓ．対照レベル、図１）。β―アミロイド（Ａβ）はまたヒトグリオーマ細胞で、多分、細胞内ＲＯＳレベルの上昇により、Ｄの形成を誘導できるので、ＡＤ患者Ｄのこの上昇は多分、ＡＤ脳における酸化的ストレスのレベルの上昇による。
【００８２】
本発明者らは、末梢におけるＤの形成に関与する酵素、Ｐ４５０ｃ１７の発現をヒト皮質および海馬で、特異的なＰ４５０ｃ１７放射標識プローブによるＲＴ―ＰＣＲついでサザンブロットを用いて調べた。本発明者らは、ＡＤ（２例の患者からの１例）および対照患者の両者の皮質にはＰ４５０ｃ１７の発現はあるが、海馬では発現がみられないこと（図２）を発見した。これは、海馬に見出されるＤが、内因性Ｐ４５０ｃ１７活性からではなく、別経路の活性に由来することを強く示唆する。
【００８３】
本発明者らは、ヒト脳サンプル中のＡβレベルをイムノブロット解析により調べた。モノクローナル抗体４Ｇ８を用い、ＡＤおよび対照患者の両者の視床下部にＡβ―免疫反応性の存在を発見した（図３Ａ）。しかしながら、対照患者に存在するＡβ―免疫反応性は、ＡＤ視床下部における約５０ｋＤａに対して約７０ｋＤａで、高い分子量を示す。最近の研究で、神経細胞に毒性を示すＡβ型は低分子量であることが証明された。高分子量複合体は毒性がない（２７）。
【００８４】
海馬では、ＡＤサンプルは分子量範囲４５８０ｋＤａの、はるかに高いＡβロードを有する（図３Ｂ）のに対し、対照サンプルは検出できるＡβ―免疫反応性をほとんどもたない。これは、海馬中のＤは、存在するＡβの高いレベルによって誘導される酸化的ストレスの結果として形成されるとする仮説を支持する。この関連で、ＡＤ患者は比較的一定したレベルのＡβ―免疫反応性、２０〜５０ｋＤａの範囲を有する。対照患者も検出可能なＡβ―免疫反応性を有するが、これらの患者は約３０〜５０ｋＤａの範囲の高い分子量種を有する傾向がある。
【００８５】
本発明者らは次に、３０ｍＭのＦｅＳＯ４で処理したのち別経路を介してＰおよびＤを作成するＡＤおよび対照脳の能力を調べた。本発明者らは、ＦｅＳＯ４が対照患者におけるいずれの領域におけるＰレベルにも有意に影響しないが、視床下部においては強い影響の示唆がある。処置はＡＤの視床下部および前頭皮質におけるＰレベルを有意に上昇させたが、ＡＤ海馬では上昇させなかった（表２）。ＤレベルはＦｅ２＋処理にもっと応答性である。３０ｍＭのＦｅＳＯ４は対照患者の海馬および皮質でＤの有意な上昇を生じるが、視床下部には何の影響もなかった。ＡＤ患者は皮質のＤに有意な上昇を示したが、海馬および視床下部では、有意な変化は示さなかった。
【００８６】
ＡＤ脳における上昇がＣＳＦにも反映されるかを調べるため、本発明者らは対照およびＡＤ患者のＣＳＦ中のＤレベルを測定した。本発明者らはＡＤＣＳＦと対照ＣＳＦでＤレベルの３５―倍の上昇を認めた（図４Ａ）。これは脳にみられた２〜４倍の上昇（表２）に比べて著しい増大である。
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【００８７】
さらに、免疫ブロットで検出されるＡβ―免疫反応性は、ＡＤと診断された患者からのＣＳＦ中で対照患者に比べて上昇している（図４Ｂ）。本発明者らは、Ｄの血清レベルおよび血清中のＤに対する１０ｍＭのＦｅＳＯ４の効果を調べた。ＡＤでは対照患者に比べて血清Ｄレベルに一般的な低下がみられるが、この低下は本研究では有意ではない。ＦｅＳＯ４は対照の血清におけるＤレベルに１．５〜３倍の上昇を生じるが、ＡＤ血清には作用はなかった（図５）。血清Ｄレベルには患者対患者で広範な変動があるが、対照患者におけるＦｅＳＯ４に応答したＤの上昇はすべてのサンプルで生じた。
【００８８】
考察
本発明者らは、アルツハイマー病（ＡＤ）および対照脳におけるＤＨＥＡ（Ｄ）およびプレグネノロン（Ｐ）のレベルを、ＡＤの発症によってニューロステロイドのプロフィルに何らかの有意な変化があるか否かを決定するために測定した。本発明者らは、調べた３つの領域のすべてでＡＤの脳ではＤは有意に上昇するが、Ｐレベルには有意な影響はみられない。これは、多分β―アミロイド（Ａβ）の作用によるＡＤ脳における酸化的ストレス上昇の他の反映である。他の研究では、ＡＤ脳からの神経細胞細胞質および神経細胞およびグリアの核にカルボニールの増加（２９）ならびにＡＤにおける脂質過酸化、タンパク質過酸化およびミトコンドリアエネルギー代謝の破壊（１７，１９―２１）が示され、ＡＤの発症における反応性酸素種の役割が指示されている。
【００８９】
本発明者らは、脳のＤの起源を解析するため、ヒトの脳におけるＰ４５０ｃ１７に注目した。本発明者らは、前頭皮質にはＰ４５０ｃ１７に対するメッセージはあるが、海馬にはＰ４５０ｃ１７の検出可能な発現はないことを見出した。これは海馬におけるＤは末梢のソースに由来し、海馬に蓄積し保存されたものか、または別経路の活性に由来するかのいずれかである。本発明者らはこれらの患者からの末梢血清Ｄレベルは測定しなかったが、刊行された報告には、末梢Ｄのレベルが０．３〜２μｇ／ｍＬ（２）、健康な高齢者（年齢６０〜９０）で１．８３ｎｍｏｌ／Ｌ（３０，年齢＝７６〜９３）、およびステロイドを服用していない年齢３〜８５歳の患者で約０．２６０ｎｍｏｌ／Ｌ（２６）であると指示されている。Ｄの本発明者らの測定レベルは、対照およびＡＤ患者の両者の血清で報告された値よりも高く、以前に報告されたレベル（３１）に匹敵するか（Ｐ）またはそれらのレベルより低い（Ｄ）。対照に比較して、ＡＤの視床下部、海馬および前頭皮質における高いＤレベルは、Ｄが酸化的ストレスの増大により誘導される別経路の活性に由来できることを指示する。さらにＡＤの脳ではＡβ―免疫活性種、とくに毒性を示した（２７）低分子種のレベルが上昇している。
【００９０】
本発明者らは、ＡＤおよび対照の脳における別経路の活性の可能性を調べた。本発明者らは、ＦｅＳＯ４による処置が対照の視床下部ならびにＡＤの視床下部および前頭皮質における有意なＰの上昇を引き起こすことを発見した。ＦｅＳＯ４は対照患者の海馬および皮質におけるＤの有意な増加をもたらし、これらの領域における別経路の前駆体の存在を指示する（２８）。視床下部には影響はない。ＡＤ患者では前頭皮質にのみＤの有意な増加がみられ、別経路の前駆体がそこには存在するが、視床下部または海馬にはないことを指示している。ＦｅＳＯ４処理前に存在するＤの高レベルは、ＡＤの脳では、別経路の前駆体は既に変換されてしまっていることを示唆するものである。これがＡＤの脳におけるより高いＤの内因性レベルおよびより小さいＦｅＳＯ４の効果を生じる。
【００９１】
ＡＤの脳におけるＤのレベル増加は加齢におけるＤの役割に関する現在の考え方に反するものである。加齢とともにＤレベルが低下することは、加例とともに起こる多くの問題における役割を果たしている可能性があるその過程の特性と考えられてきたのである。年齢に関連する認知の変化および痴呆の防止を試みるＤの置換が多くの臨床研究の焦点とされてきた（２３―２６）。本発明者らは今回、Ｄの現実のＣＮＳレベルがＡＤの病態においては増加していることを示す。これは正常な加齢とともに末梢でみられた事実の反対である。この観察がＡＤの発症初期を試験するための診断方法およびキットを編み出した本発明の基礎として用いられた。
【００９２】
ＡＤの診断および処置における一つの大きな問題は、臨床家にとってその疾患の発症を決定できないことである。現在では、これは脳の全体的な収縮を探すためのＭＲＩスキャンおよび痴呆の状態を決定するための認知試験の組み合わせによって行われている。典型的な症状は疾患過程のきわめて後期まで起こらない。ＣＳＦ中のＤの変化が実際に脳内の酸化状態によって調節されているならば、疾患の進行の早期にＣＳＦ中のＤに変化がみられる筈である。本発明者らはまた、別の前駆体が対照患者の血清中に検出できるが、ＡＤ患者では検出されないことを示した。表２に示したデータの更なる解析では、血清はＦｅＳＯ４処理に対して、試験した他の脳領域よりも大きな応答を示すことが指示される。したがって、別の前駆体がＦｅＳＯ４処理によって間接的に血液ＣＳＦ中に存在するか否かを決定することによって、脳内の酸化的ストレスの状態を予測することが可能な筈である。これは、別のＤ前駆体の利用性がＡＤの発症および進行を決定するツールとして使用できることを指示する。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
アルツハイマー病（ＡＤ）および対照脳におけるニューロステロイドレベル
ヒト脳における内因性ニューロステロイドレベルはＨＰＬＣ精製後に特異的なラジオイムノアッセイにより測定した。ＡＤおよび対照患者の間のプレグネノロンレベルには有意差はない。しかしながら、調べた３つの領域のすべてにおいてＡＤ患者のＤＨＥＡは有意に高いレベルを示す。提示したデータは３〜１０サンプルからの二重の測定についての平均±ＳＥＭである。ＮＳ：有意差なし。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２】
ＡＤおよび対照脳におけるＰ４５０ｃ１７のｍＲＮＡ発現
ＲＴ―ＰＣＲ増幅Ｐ４５０ｃ１７をＤＮＡブロットによって追跡すると、Ｐ４５０ｃ１７は対照およびＡＤ患者のいずれの皮質でも発現することを示すが、発現は手許にあったＡＤ患者の一つにのみ見られる。海馬ではＰ４５０ｃ１７の検知可能な発現は認められず、この領域のＤＨＥＡは末梢酵素仲介経路によっては作成されないことが指示される。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号で標識する。
【図３】
ＡＤおよび対照脳におけるＡβ免疫反応性
脳ホモジネートをＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離し、β―アミロイド（Ａβ）ペプチドのアミノ酸１７〜２４に対するモノクローナル抗体、４Ｇ８でブロットした。Ａ）ＡＤ患者の視床下部におけるＡβ―免疫反応性の大部分は対照患者の場合よりも低分子量種のものである。対照サンプル中にも同様に検出可能なＡβがある。Ｂ）Ａβ―免疫反応性は対照患者の海馬では検出されないが、ＡＤ患者の海馬には存在する。Ｃ）Ａβ―免疫反応性はすべてのＡＤ患者の前頭皮質に類似の分子量種パターンで存在する。ＡＤ前頭皮質Ａβ―免疫反応性の大部分は約３０ｋＤａである。対照患者とくにＣ５患者ではある程度のＡβ―免疫反応性は存在するが、この免疫反応性はＡＤ患者の場合より高い分子量、約５０ｋＤａを示す。レーンには患者内の比較が可能なように患者番号を付す。
【図４】
ＡＤおよび対照患者からの脳脊髄液（ＣＳＦ）中ＤＨＥＡおよびＡβレベル
Ａ）ＤＨＥＡはＣＳＦ抽出物からＨＰＬＣにより精製し、特異的ラジオイムノアッセイにより測定した。ＤＨＥＡレベルは対照の場合よりＡＤ対象ではるかに高い。
Ｂ）対照患者は９８ｋＤａ種のみを有するが、ＡＤ患者は４６〜９８ｋＤａの広い分子量範囲で存在するＡＰ―免疫反応性を有する。
【図５】
ＡＤおよび対照患者におけるＦｅＳＯ４に対する血清応答
ＡＤ患者（Ａ）からの血清を１０ｍＭＦｅＳＯ４で処理した場合、ＤＨＥＡレベルの上昇はない。しかしながら、対照患者（Ｂ）からの血清を１０ｍＭＦｅＳＯ４で処理した場合、ＤＨＥＡレベルにおける大きな誘導がみられ、酸化剤により作用されることが可能なＤＨＥＡ前駆体の存在が指示される。ＡＤ患者はこの前駆体をもたず、それは多分、末梢に到達する前に脳で既に変換されたものと考えられる。
【図６】
ヒト脳細胞はＤ合成に対する別経路を有する
細胞を、５ｍＭＳＵ１０６０３の存在下または不存在下にＦｅＳＯ４濃度を上昇させて処理した。２時間後、細胞およびメジウムをエーテル：酢酸エチルで抽出処理したのち、サンプルを逆相Ｃ１８ＴＬＣプレート上に流し、分画をジエチルエーテルで抽出してＤの量をＲＩＡで測定した。Ｄレベル（ｐｇ／ｍｇタンパク質）を片側ＡＮＯＶＡで分析した。（Ａ）ＫＧ―１―Ｃ；Ｆ＝１．９４８，ｐ＝０．０９７９（Ｂ）ＭＧＭ―１；Ｆ＝５．００４，ｐ＜０．００１（Ｃ）ＭＧＭ―３；Ｆ＝０．５９０２，ｐ＝０．７３６６（Ｄ）ＮＨＡ；Ｆ＝４．１３１，ｐ＜０．０１および（Ｅ）ｈＮＴ―ＰＦ；Ｆ＝０．６５５２，ｐ＝０．６８８６．データは平均ＳＥＭ（ｎ＝４〜１５）で示す。すべての実験は、ＦｅＳＯ４に加えて５ｍＭＰとインキュベートしたｈＮＴ―ＰＦ細胞の場合を除いて、内因性Ｐの不存在下に実施した。Ｘ軸上の標識はＦｅＳＯ４のｍＭ用量を指示し、ＳＵ，ＳＵ／３およびＳＵ／１０は相当するｍＭ用量のＦｅＳＯ４とともに添加した５ｍＭＳＵ１０６０３を指示する。
【図７】
ＦｅＳＯ４はＭＧＭ―１およびＮＨＡ細胞内のＲＯＳレベルを上昇させる
ＦｅＳＯ４処理は試験したすべての用量でＭＧＭ―１およびＮＨＡ細胞性ＲＯＳのレベルの有意な上昇を引き起こす（＊，ＭＧＭ―１：Ｆ＝５９．８８３，ｐ＜０．０００１；■，ＮＨＡ：Ｆ＝２５．４１９，ｐ＜０．０００１）。ＮＨＡ細胞はＲＯＳ産生の意味でヒトグリオーマ細胞よりもＦｅ＋感受性である。
【図８】
β―アミロイドは細胞性ＲＯＳおよびＤ合成を上昇させる
ＭＧＭ―１細胞をβ―アミロイド（Ａβ）単独またはＡβおよびビタミンＥと、少なくとも２４時間処理した。細胞性ＲＯＳおよびＤレベルを測定した。Ａβは対照のレベル以上にＲＯＳを有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）上昇させ、これはビタミンＥの共処理で部分的にブロックされた（ｐ＝０．０５４ｖｓＡｂ）が、なお対照のレベルより有意であった（＊＊Ｐ＜０．０１）。同様に、ＡｂはＤレベルを対照以上に有意に（＊＊Ｐ＜０．０１）上昇させ、この作用はビタミンＥでブロックされた（＊Ｐ＜０．０５ｖｓＡｂ）。データは対照以上の平均上昇ＳＥＭ（ｎ＝１２）として示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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