(57)【要約】本発明は、一般にＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードする核酸分子、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現しているウイルスベクター、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質及び／又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードする核酸分子を含有している薬学的組成物（例えばワクチン）に関する。本発明は更に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に関連した悪性疾患の治療において使用することを含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に対する免疫応答を誘発又は増強することによる癌の治療又は予防の方法に関する。
2004521609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインに融合されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含む、恒温動物において免疫応答を産生できる単離されたタンパク質。
【請求項２】
配列番号：６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するか、または、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含む配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列に直接融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含む配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列に融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号：４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号：２７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインが、化学リンカーを介してＨｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインに融合されている、請求項１記載のタンパク質。
【請求項８】
化学リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号：３１の配列を有するペプチドを更に含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１０】
ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインのＣ末端に融合されている、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号：２９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＮＳ１抗原またはその免疫原性断片を更に含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＮＳ１抗原またはその免疫原性断片がタンパク質のＮ末端に融合されている、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１５】
請求項１記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項１６】
アデノウイルスである、請求項１５記載のウイルスベクター。
【請求項１７】
αウイルスである、請求項１５記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１記載のタンパク質、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項１９】
ワクチンである、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
免疫賦活物質を更に含む、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
タンパク質が、水中油型乳剤中に存在する、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
免疫賦活物質が、ＳＢＡＳ−２、ＳＢＡＳ−４、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、または、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組合せである、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１４記載の核酸分子、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項２４】
ワクチンである、請求項２３記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
免疫賦活物質を更に含む、請求項２３記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項２３記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項１記載のタンパク質を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項２８】
タンパク質が、ワクチンの形状で投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項１４記載の核酸分子を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項３０】
核酸分子がワクチンの形状である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞を核酸分子でトランスフェクションし、次にトランスフェクションされた細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項１５記載のウイルスベクターを恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項３３】
ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスベクターがαウイルスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞をウイルスベクターに感染させ、次に感染細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメイン断片に融合されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含む、恒温動物において免疫応答を産生できる単離されたタンパク質。
【請求項３７】
配列番号：７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有するか、または、配列番号：５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項３８】
配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項３９】
配列番号：５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項４０】
配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項４１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインが、化学リンカーを介してＨｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメイン断片に融合されている、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項４２】
化学リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項４１記載のタンパク質。
【請求項４３】
配列番号：３１の配列を有するペプチドを更に含む、請求項３６記載のタンパク質。
【請求項４４】
ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメイン断片のＣ末端に融合されている、請求項４３記載のタンパク質。
【請求項４５】
請求項３６記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項４６】
請求項３６記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項４７】
アデノウイルスである、請求項４６記載のウイルスベクター。
【請求項４８】
αウイルスである、請求項４６記載のウイルスベクター。
【請求項４９】
請求項３６記載のタンパク質、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項５０】
ワクチンである、請求項４９記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
免疫賦活物質を更に含む、請求項４９記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
タンパク質が、水中油型乳剤中に存在する、請求項５１記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
免疫賦活物質が、ＳＢＡＳ−２、ＳＢＡＳ−４、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、または、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組合せである、請求項５１記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
請求項４５記載の核酸分子、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項５５】
ワクチンである、請求項５４記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
免疫賦活物質を更に含む、請求項５４記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項５４記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項３６記載のタンパク質を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項５９】
タンパク質がワクチンの形状で投与される、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項４５記載の核酸分子を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項６１】
核酸分子がワクチンの形状である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞を核酸分子でトランスフェクションし、次にトランスフェクションされた細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項４６記載のウイルスベクターを恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項６４】
ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ウイルスベクターがαウイルスである、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞をウイルスベクターに感染させ、次に感染細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインに融合されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含む、恒温動物における免疫応答を産生できる単離されたタンパク質。
【請求項６８】
配列番号：１のＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：１のＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に少なくとも１個の化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項６９】
配列番号：２のＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に少なくとも１個の化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された配列番号：３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項７０】
配列番号：１のＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：１のＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に少なくとも１個の化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項７１】
配列番号：２のＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に直接融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または、配列番号：２のＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列に少なくとも１個の化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された配列番号：８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項７２】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインが、化学リンカーを介してＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインに融合されている、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項７３】
化学リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項７２記載のタンパク質。
【請求項７４】
配列番号：３１の配列を有するペプチドを更に含む、請求項６７記載のタンパク質。
【請求項７５】
ペプチドが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインのＣ末端に融合されている、請求項７４記載のタンパク質。
【請求項７６】
請求項６７記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項７７】
請求項６７記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項７８】
アデノウイルスである、請求項７７記載のウイルスベクター。
【請求項７９】
αウイルスである、請求項７７記載のウイルスベクター。
【請求項８０】
請求項６７記載のタンパク質、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項８１】
ワクチンである、請求項８０記載の薬学的組成物。
【請求項８２】
免疫賦活物質を更に含む、請求項８０記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
タンパク質が水中油型乳剤中に存在する、請求項８２記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
免疫賦活物質が、ＳＢＡＳ−２、ＳＢＡＳ−４、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、または、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組合せである、請求項８２記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
請求項７６記載の核酸分子、および薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項８６】
ワクチンである、請求項８５記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
免疫賦活物質を更に含む、請求項８５記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項８５記載の薬学的組成物。
【請求項８９】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項６７記載のタンパク質を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項９０】
タンパク質がワクチンの形状で投与される、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項７６記載の核酸分子を恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項９２】
核酸分子がワクチンの形状である、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞を核酸分子でトランスフェクションし、その後トランスフェクションされた細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
免疫応答を誘発または増強するのに有効な量の請求項７７記載のウイルスベクターを恒温動物に投与する段階を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発または増強する方法。
【請求項９５】
ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
ウイルスベクターがαウイルスである、請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
投与段階が、エクスビボにおいて恒温動物の細胞をウイルスベクターに感染させ、次に感染細胞を該恒温動物に送達する段階を含む、請求項９４記載の方法。
【請求項９８】
請求項１、３６または６７記載の融合ポリペプチドの有効量を患者に投与し、それにより患者における癌の発生を阻害する段階を含む、患者における癌の発生を阻害する方法。
【請求項９９】
請求項１４、４５または７６記載のポリヌクレオチドの有効量を患者に投与し、それにより患者における癌の発生を阻害する段階を含む、患者における癌の発生を阻害する方法。
【請求項１００】
請求項１、３６または６７記載の融合ポリペプチドを発現する抗原提示細胞の有効量を患者に投与し、それにより患者における癌の発生を阻害する段階を含む、患者における癌の発生を阻害する方法。
【請求項１０１】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
癌が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌または前立腺癌である、請求項９８から１０１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
生体試料から腫瘍細胞を除去する方法であり、以下の段階を含む方法：
融合タンパク質が、
（ｉ）請求項１４、４５、または７６記載のポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）前述のポリヌクレオチドの相補体
からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列を含み、かつ
接触段階が、抗原を発現している細胞の試料からの除去を可能にするのに十分な条件下および期間で実施される、
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と特異的に反応するＴ細胞と生体試料を接触させる段階。
【請求項１０４】
生体試料が血液またはその画分である、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１０３記載の方法に従い処理された生体試料を患者に投与する段階を含む、患者における癌の発生を阻害する方法。
【請求項１０６】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大する（ｅｘｐａｎｄ）方法であり、以下の段階を含む方法：
Ｔ細胞を、
（ｉ）請求項１、３６、もしくは６７記載の融合タンパク質、
（ｉｉ）このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または
（ｉｉｉ）このような融合タンパク質を発現する抗原提示細胞
のうち一つ又は複数と、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および期間で接触させる段階。
【請求項１０７】
請求項１０６記載の方法で調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１０８】
請求項１０７記載のＴ細胞集団の有効量を患者に投与する段階を含む、患者における癌の発生を阻害する方法。
【請求項１０９】
患者における癌の発生を阻害する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、
（ｉ）請求項１、３６、または６７記載の融合タンパク質、
（ｉｉ）このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）このような融合タンパク質を発現する抗原提示細胞
からなる群より選択される少なくとも１種の成分と共にインキュベーションして、Ｔ細胞を増殖させる段階；ならびに
（ｂ）増殖したＴ細胞の有効量を患者に投与し、それにより患者における癌の発生を阻害する段階。
【請求項１１０】
患者における癌の発生を阻害する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、
（ｉ）請求項１、３６、または６７記載の融合タンパク質
（ｉｉ）このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）このような融合タンパク質を発現する抗原提示細胞
からなる群より選択される少なくとも１種の成分と共にインキュベーションして、Ｔ細胞を増殖させる段階；
（ｂ）少なくとも１種の増殖された細胞をクローニングする段階；ならびに
（ｃ）クローニングされたＴ細胞の有効量を患者に投与し、それにより患者における癌の発生を阻害する段階。
【請求項１１１】
請求項１、３６、または６７記載の融合タンパク質の作製法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）細胞に請求項１４、４５、または７６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する段階；
（ｂ）トランスフェクションされた細胞を培養する段階；および
（ｃ）発現されたタンパク質を精製する段階。
【請求項１１２】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１３】
細胞がＢＨＫ細胞である、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１４】
細胞が、血清非含有条件下、懸濁液中で培養される、請求項１１１記載の方法。
【請求項１１５】
発現されたタンパク質が、以下を含む２段階法により精製される、請求項１１１記載の方法：
（ａ）Ｑセファロース高速カラム上での陰イオン交換クロマトグラフィー；および
（ｂ）低交換フェニルセファロース６ファストフロー（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）上での疎水性クロマトグラフィー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が本明細書に参照として組入れられている、２０００年８月３日に出願された米国特許出願第０９／６３２，５０７号の恩典を主張するものである。
【０００２】
本出願はまた、２０００年１月２８日に出願された米国特許出願第０９／４９３，４８０号；および１９９９年１月２９日に出願された米国特許仮出願第６０／１１７，９７６号にも関連しており、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０００３】
政府支援の研究開発の下で行われた発明の権利に関する陳述
適用なし。
【０００４】
発明の背景
多大な経済的及び人的資源の投資にもかかわらず、癌は、依然主要死因のひとつである。例えば、癌は、年齢３５〜７４歳の女性において第一の死因である。乳癌が、女性における最も一般的な悪性疾患であり、かつ乳癌発症率は上昇している。女性９名中１名が本疾患と診断されると推定される。乳癌治療の標準的方法は、手術、放射線療法、及び化学療法の併用に集中している。これらの方法は、特定の悪性疾患においては一部劇的な成功を収めている。しかし、乳癌は、ある病期を過ぎて診断されると、多くの場合治癒できない。早期診断及び治療のための代替法が必要とされている。
【０００５】
悪性疾患の一般的な特徴は、制御できない細胞増殖である。癌細胞は、正常な表現型から自律的増殖可能な悪性の表現型への形質転換の過程を受けるように見える。体細胞遺伝子の増幅及び過剰発現は、正常細胞から悪性細胞への形質転換を生じる共通の第一の事象であるとみなされる。腫瘍原性遺伝子によりコードされた悪性表現型の特徴は、細胞分裂時に形質転換された細胞の子孫へと継代される。
【０００６】
悪性細胞において機能しかつ形質転換に寄与又は関連する少なくとも４０種の癌遺伝子が、同定されている。これらの癌遺伝子は、癌遺伝子により発現されたタンパク質などの、それらの遺伝子産物の推定機能又は局在位置を基に様々な群に分類されている。
【０００７】
癌遺伝子は、正常細胞の生理の特定の局面に必須であると考えられている。これに関して、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子は、受容体様糖タンパク質のチロシンキナーゼファミリーの一員であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と高度の同一性を共有しているように見える。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは恐らく、細胞増殖及び／又は分化において役割を果たしていると考えられる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、本質的に正常な遺伝子産物の増大した又は規制解除された発現によって生じた量的機構を通じて悪性疾患を誘導するように見える。
【０００８】
ｐ１８５糖タンパク質は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物である。乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、及び前立腺癌を含む様々な癌において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子は増幅され、かつｐ１８５が過剰発現される。ｐ１８５は、悪性の形質転換に関連しており、かつ浸潤性乳管癌腫（ｄｕｃｔａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）の５０％〜６０％において、侵襲性乳癌の２０％〜４０％において、並びに卵巣、前立腺、結腸、及び肺に生じる腺癌の実質的画分において認められる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの発現は、悪性表現型にのみ密に関連するのではなく、悪性疾患の攻撃性にも関連している。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現は、乳癌及び卵巣癌の予後不良に関連している。
【０００９】
ｐ１８５は、長さ約１２５５個のアミノ酸の推定相対分子量１８５ｋＤの膜貫通タンパク質である。ｐ１８５は、ＥＧＥＲと少なくとも４０％の同一性があり、高度に疎水性の膜貫通ドメインである、約６４５個のアミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と、ＥＧＦＲと少なくとも８０％の同一性を有する、約５８０個のアミノ酸のカルボキシル末端細胞内ドメイン（ＩＣＤ）とを有する。
【００１０】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に関連した悪性疾患を標的とすることができる抗癌ワクチン、並びにＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子に対する免疫応答を誘発及び増強することができるような組成物及び方法が必要とされている。
【００１１】
発明の概要
本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が関連した悪性疾患に対する恒温動物の免疫感作を含む用途のための、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ｐ１８５融合タンパク質、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードする核酸分子、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。一つの態様において、本発明の融合タンパク質は、更にＴｃＰ０モチーフを含む。別の態様において、本発明の融合タンパク質は、好ましくは融合タンパク質のＮ末端に結合した、ＮＳ１抗原またはその免疫原性断片を更に含む。本発明の融合タンパク質又は核酸分子は、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含有する組成物、例えば水中油型乳液の中に存在することができ、かつ任意に１種またはそれ以上の追加の有効成分、例えばＳＢＡＳ−２、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２ｌ、又は３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せなどの免疫賦活物質を含有する。本発明の組成物は、ワクチンとして有用であり、かつワクチンの形態であることができる。前述の融合タンパク質、核酸分子、ウイルスベクター、薬学的組成物及び／又はワクチンは、１回ベース（ｏｎｅ−ｔｉｍｅ ｂａｓｉｓ）（例えば、悪性疾患を獲得又は再獲得するリスクが上昇しているか、または悪性疾患が疑われる個体について）、または定期的なベース（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｂａｓｉｓ）（例えば、悪性疾患を獲得又は再獲得するリスクが上昇しているか、または悪性疾患が疑われる個体について）で投与することができる。本発明の化合物又は組成物は、ヒトを含む恒温動物における、１種またはそれ以上の存在する腫瘍の治療、又は腫瘍発生もしくは再発の予防において有用である。
【００１２】
本発明は更に、前述の薬学的組成物又はワクチンを患者に投与することを含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を誘発又は増強することによる、患者における癌の発生を阻害又は予防する方法を提供する。この場合の患者は、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、又は前立腺癌に罹患しており、これらの症例において本方法は、疾患の治療を提供するか、又はこのような疾患のリスクがあるとみなされた患者が予防的に治療することができる。ある態様において、この薬学的組成物又はワクチンの投与は、本発明の核酸分子を用いてエクスビボにおける恒温動物の細胞にトランスフェクションするか、又は本発明の核酸分子を含むウイルスベクターを用いてエクスビボにおける恒温動物の細胞に感染させて、その後トランスフェクション又は感染した細胞を恒温動物に送達する段階を含む。
【００１３】
本発明は更に、その他の局面内で、生体試料を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と特異的に反応するＴ細胞と接触する段階を含む、生体試料から腫瘍細胞を除去する方法を提供し、ここで試料と接触する段階は、試料からタンパク質を発現している細胞の除去をもたらす条件下でそれに十分な時間をかけて行われる。関連した局面において、患者に前述のように処理した生体試料を投与する段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法が提供される。
【００１４】
別の態様において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激及び／又は拡張する方法は、Ｔ細胞と下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１種またはそれ以上との、Ｔ細胞の刺激及び／又は拡張をもたらす条件下でそれに十分な時間をかけて接触する段階を含む：（ｉ）前述の融合タンパク質；（ｉｉ）このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び／又は（ｉｉｉ）このような融合タンパク質を発現している抗原提示細胞。前述のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団もまた、提供される。更なる局面において、本発明は、前述の有効量のＴ細胞群を患者に投与する段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法を提供する。
【００１５】
更に別の態様において、本発明は更に、以下の段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法を提供する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞を、下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１種またはそれ以上と共にインキュベーションする段階：（ｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質；（ｉｉ）このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉｉ）このような融合タンパク質を発現している抗原提示細胞；並びに、（ｂ）有効量の増殖されたＴ細胞を患者に投与することによって、患者における癌の発生を阻害する段階。増殖された細胞は、患者への投与前にクローン化することができるが、必ずしも必要ではない。
【００１６】
最後に、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の作製法を提供し、本方法は、（ａ）細胞にＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する段階、（ｂ）トランスフェクションされた細胞を培養する段階；及び（ｃ）発現されたタンパク質を精製する段階を含む。好ましい態様において、この細胞はＣＨＯ細胞またはＢＨＫ細胞である。別の好ましい態様において、細胞は、無血清条件下で、懸濁液中で培養される。更に別の態様において、発現されたタンパク質は、２段階法により精製され、これはＱセファロース高速カラム上での陰イオン交換クロマトグラフィー、及びフェニルセファロース６ファストフロー低置換上での疎水性クロマトグラフィーを含む。
【００１７】
本発明のこれら及びその他の局面は、下記の詳細な説明及び添付図面を参考にすることにより明らかになると考えられる。
【００１８】
特定の態様の説明
Ｉ． 緒言
本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子発現のタンパク質産物に対する免疫を調節、好ましくは誘発又は増強することが可能な化合物及び組成物に関し、これは悪性疾患で増幅されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子が、遺伝子のタンパク質発現産物が腫瘍に存在することを必要としないような、恒温動物の悪性疾患に関するものを含んでいる。例えば、この遺伝子の過剰発現は、腫瘍形成の開始及び早期病期に関連し得るが、タンパク質発現は、その後低減されるか又は存在しない。本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍をＨｅｒ−２／ｎｅｕ陰性に転換するために有効な免疫応答を誘発又は増強するため、加えてＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍の確立を防止し、かつ存在するＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍の退縮を惹起するために使用することができる。
【００１９】
下記の略号が、本明細書を通じて使用される。「ＥＣＤ」とは細胞外ドメインを意味し、「ＩＣＤ」とは細胞内ドメインを意味し、「ＰＤ」とは細胞内ドメイン内のリン酸化ドメイン（すなわちリン酸化されたドメイン）を意味し、「ΔＰＤ」とはリン酸化ドメイン内のリン酸化ドメイン断片を意味し、かつ「ＫＤ」とは細胞内ドメイン内のキナーゼドメインを意味する。「ΔＨｅｒ−２／ｎｅｕ」とは、キナーゼ活性を排除する、ＰＤにおけるアミノ酸変化を含むＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を意味する。例えば、マウスΔＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質（ΔｍＮｅｕ）をコードするヌクレオチド配列は、マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするｃＤＮＡの２２６１位におけるＡからＴへのヌクレオチド変化を含むが、これはリジンからメチオニンへのアミノ酸変化をもたらす。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の発現産物は、本明細書においては「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質」と称され、これは「ｐ１８５」又は「ｃ−ｅｒｂＢ２」としても公知であり、かつそのように称されることもある。
【００２０】
ＩＩ． 定義
「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」とは本明細書において、「ＥＣＤ−ＩＣＤ」又は「ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」とも称されるが、これはＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（又はその断片）及び細胞内ドメイン（又はその断片）を含む融合タンパク質（又はその断片）を意味する。本明細書において使用されるように、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を含まず、好ましくはＨｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインを全く含まない。
【００２１】
「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」とは、「ＥＣＤ−ＰＤ」又は「ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」、又は「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」と称され、更に「ＥＣＤ−ΔＰＤ」もしくは「ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」とも称されるが、これはＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（又はその断片）及びリン酸化ドメイン（又はその一つもしくは複数の断片、例えばΔＰＤもしくはΔＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のＰＤ）の融合タンパク質（又はその断片）を意味する。ＥＣＤ−ＰＤ及びＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインの実質的部分を含まず、好ましくはＨｅｒ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインを全く含まない。
【００２２】
また「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」及び「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」という用語及びそれらの関連用語は、それらの断片、それらの相同体、及び１個以上のアミノ酸が挿入、欠失、又は他のアミノ酸又は非アミノ酸で置換されたもの（例えば、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞による反応を刺激する変異体、または抗体産生を刺激する変異体）などの、それらの機能的同等物（集合的に「変異体」と称される）を意味することが理解され、これらは本発明の好ましい態様においては、（ｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質と比べて免疫応答の誘発又は増強を増大する、もしくは（ｉｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質と比べて免疫応答の誘発又は増強に実質的に影響しない、のいずれかである、。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の代表的断片、相同体及び機能的同等物を含む変異体の具体的で限定的でない例は、本明細書により詳細に説明されている。変異体は、天然のポリペプチド成分を含む融合タンパク質と「実質的に同等」又は「実質的に類似」であることができ、かつ免疫応答を刺激する能力を保持している。
【００２３】
「融合タンパク質」とは、一方のポリペプチドがあるタンパク質配列又はドメインに由来し、かつ他方のポリペプチドが別のタンパク質配列又はドメインに由来するものが共有結合で連結された少なくとも２個のポリペプチドを有するタンパク質を意味する。これらのポリペプチドは、直接的に、又は共有結合リンカー（例えばポリグリシンリンカーなどのアミノ酸リンカー、又は別の種類の化学リンカー、例えば糖リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばＰＥＧなど）を介してのいずれかにより連結される（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ参照）。この融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端がＮ末端へ連結するが、これらは同じくＣ末端がＣ末端へ、Ｎ末端がＮ末端へ、又はＮ末端がＣ末端へ連結することもできる。この融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であってもよい。「融合タンパク質」という用語は、更に融合タンパク質を形成するポリペプチドの保存的に修飾された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、サブ配列、及び種間相同体も意味する。融合タンパク質は、例えば融合タンパク質を連続してコードする組換えポリヌクレオチドの調製によるものなどの、あるタンパク質配列に由来するアミノ酸鎖の別のタンパク質配列に由来するアミノ酸鎖への共有結合的連結により作製され得る。融合タンパク質は、同種又は異種の、２、３、４又はそれ以上の異なるアミノ酸鎖を含むことができる。融合タンパク質中の様々なアミノ酸鎖は、互いに直接スプライシングされるか、又は化学連結基もしくはアミノ酸連結基を介して間接的にスプライシングされ得る。この融合タンパク質は、本明細書により詳細に説明されるように、任意に他の構成要素を含むことができる。
【００２４】
本明細書において、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」及び「ペプチド」と互換的に使用される。
【００２５】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び１本鎖又は２本鎖のいずれかの形状のそれらのポリマーを意味する。この用語は、合成型、天然型、及び非天然型などの、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝されるような、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は結合を含む核酸を包含している。このような類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
特に指定しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列、ならびに明示された配列をも包含することを暗示している。具体的には、縮重コドン置換は、１個以上の選択された（又は全ての）コドンの第三の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されているような配列の形成により達成される（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１〜９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００２７】
本発明の融合タンパク質を含むポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質の個別の各ポリペプチドをコードする各ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。従って融合ポリペプチドの個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、保存的に修飾された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、サブ配列、および種間相同体を含む。
【００２８】
「配列同一性％」とは、２種の最適に整列化された配列を比較ウインドウ全体で比較することにより決定され、ここで比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２種の配列の最適なアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比べて付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列において生じる位置の数を決定し、合致した位置の数を得、合致した位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で除算し、かつその結果を１００倍し、配列同一性％を得ることにより、算出される。
【００２９】
ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。あるいは、同一性％は、２５％〜１００％の整数のいずれかであることができる。より好ましい態様は、好ましくは以下に説明する標準のパラメータを使用するＢＬＡＳＴであるような、本明細書に記したプログラムを用い、参照配列と比較して、少なくとも：２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％又はそれ以上を含む。当業者は、コドン縮重度、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮し、２種のヌクレオチド配列でコードされたタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調節することができることを認めると考えられる。これらの目的に関してアミノ酸配列が「実質的に同一」とは、通常少なくとも４０％の配列同一性を意味する。好ましいポリペプチドの同一性％は、４０％〜１００％の整数のいずれかであることができる。より好ましい態様は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を含む。「実質的に類似の」ポリペプチドは、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸変化により異なること以外は前述のような配列を共有している。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；並びに、イオウを含有する側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下のものである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸、及びアスパラギン−グルタミン。
【００３０】
比較のための配列の最適な整列化は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ．、２：４８２（１９８１）の局所的同一性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０）の同一性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）、８５： ２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータを使った実行により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は推測により実施することができる。
【００３１】
配列同一性％及び配列類似性％を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは各々、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）に説明されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０を、本明細書に記したパラメータと共に用い、本発明の核酸及びタンパク質について配列同一性％を決定した。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に公開されている。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータＭ（合致した残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）及びＮ（合致しない残基についてのペナルティスコア（ｐｅｎａｌｔｙ ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコア化のマトリクスを用いて、累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔ）の拡大は、下記の場合に中止される：累積アラインメントスコアが、その最高到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１個以上の負のスコア化残基のアラインメントの累積により、ゼロ以下になった場合；または、いずれかの配列の最後に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、Ｔ及びＸは、このアラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：１０９１５（１９８９））アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３２】
ヌクレオチド配列が実質的に同じであることの別の指標は、２種の分子が、中等度、及び好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、互いに、又は第三の核酸に、ハイブリダイズするかどうかである。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、かつ様々な環境において異なると考えられる。比較的長い配列は、比較的高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「ハイブリダイゼーションの原理の検証及び核酸アッセイ法の戦略（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ）」（１９９３）において見出されうる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０倍低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致したプローブにハイブリダイズするような温度である（所定のイオン強度及びｐＨで）。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン濃度約０．０１〜１．０Ｍ（又は他の塩）であり、並びに温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）について低くとも約３０℃及び長いプローブ（例えば、５０個よりも多いヌクレオチド）について低くとも約６０℃であるようなものであると考えられる。ストリンジェントな条件は、同じく、ホルムアミドなどの脱安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添加により達成されると考えられる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【００３３】
例証的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは以下のようなものであることができる：ホルムアミド５０％、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、もしくは、５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、並びに０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、温度６５℃での洗浄。
【００３４】
本発明の目的に適した「中等度のストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の溶液中での前洗浄、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション、それに続く各々２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣ （０．１％ ＳＤＳ含有）による６５℃２０分間の２回の洗浄である。このようなハイブリダイゼーションを行うＤＮＡ配列も、本発明の範囲内である。
【００３５】
本明細書において説明される「Ｔ細胞の増殖」とは、Ｔ細胞の増加に加えて、増加につながるＴ細胞の刺激、すなわち、有糸分裂につながる事象及び有糸分裂それ自身の開始を含む。
【００３６】
ＩＩＩ． 本発明の融合タンパク質
Ａ． Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞内ドメイン及び細胞外ドメイン
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質は、前述のようなＨｅｒ−２／ｎｅｕの知見を基に、抗癌ワクチンの標的として選択された。この方法の大きな障害のひとつは、十分量のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の単離が困難であることであった。この問題に対処するひとつの試みは、哺乳動物細胞において、ＥＣＤ及びＩＣＤを個別に発現することであった。ＥＣＤは、分泌タンパク質として高レベルで発現され、すなわちＥＣＤタンパク質約２０ｍｇが、１Ｌのマウス細胞培養物から精製された。しかし、ＩＣＤの発現レベルは低く、すなわち、わずかに約０．２ｍｇのＩＣＤタンパク質が１ＬのＨＥＫ−２９３細胞から単離された。加えて、得られるＩＣＤタンパク質は、細胞溶解液において非常に不安定であり、有用な量の精製に関して多数の予想外の問題点を生じている。
【００３７】
前述のように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、腫瘍原性の自己タンパク質であり、かつ自己タンパク質に対する免疫寛容は、免疫応答を減弱させる。いずれか特定のタンパク質の様々な部分に対する免疫寛容のレベルは、タンパク質の発現された部分が細胞膜内または細胞外のいずれかに存在するかによって決まる。ＥＣＤは、細胞表面に存在しかつ溢れている（ｓｈｅｄ）。対照的に、ＩＣＤ及びその一部は、細胞内に存在し、かつ溢れていない。ＥＣＤは、生体の免疫系と容易に接触することができるのに対して、ＩＣＤ及びその一部は、生体の免疫系から比較的隔離されている。結果的に、ＥＣＤに対する免疫寛容のレベルは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のＩＣＤ部分のものよりも大きい。従って、本発明のワクチンは、ＩＣＤタンパク質及びＩＣＤペプチド、並びにその変異体であって、ＰＤタンパク質及びＰＤペプチドを含むものが、ＥＣＤタンパク質及びＥＣＤペプチドよりもより大きいレベルの免疫応答を誘発する。
【００３８】
ＩＣＤ及びその変異体は、ＥＣＤ及びその変異体よりもより免疫原性であるが、ＥＣＤ及びその変異体に対する抗体は、有益でありかつ望ましい可能性がある。ＥＣＤは細胞表面に存在するが、ＩＣＤ及びその一部は、分泌されずかつ細胞の内部に隔離されている。従ってＥＣＤに対する抗体反応は、非常に治療的恩典を有し、従って本発明にとって好ましい。ＥＣＤそれ自身は余り免疫原性ではない。ＩＣＤ（ＰＤ及びΔＰＤを含む）は、ＥＣＤよりもより免疫原性であるので、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及び／又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ＥＣＤ単独よりもより免疫原性である。ＥＣＤに対する抗体誘起に関して、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及び／又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ＥＣＤ単独よりもより効果的であると予想され、本発明の好ましい態様である。
【００３９】
本発明において、ＥＣＤ又はその変異体は、ＩＣＤ又はその変異体、好ましくはＰＤ又はその変異体と、結合、連結、又は融合（直接又は間接のいずれか）される。ＥＣＤは、細胞表面でＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質と反応する抗体の誘導に関する構造的コンホメーションを提供する一方で、ＩＣＤ又はＰＤは、ＥＣＤの免疫原性を増大する。この組合せは、ＥＣＤに対する免疫応答の誘導に関してＥＣＤ単独よりも驚くほど効果的である。
【００４０】
ＥＣＤ又はその一部は、ＩＣＤもしくはＩＣＤの一部を含むその変異体、又はＰＤもしくはＰＤの一部を含むその変異体（例えばΔＰＤ又はΔＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のＰＤ）と結合することができる。本発明のＥＣＤは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのＥＣＤである。ヒトＥＣＤは、図９に配列番号：３として記されている。ラットＥＣＤは、図１４に配列番号：８として記されている。
【００４１】
本発明のＩＣＤは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのＩＣＤである。ヒトＩＣＤは、図７にＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５の領域を含んで広がる配列番号：１として記されている。ラットＩＣＤは、図８にＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６の領域を含んで広がる配列番号：２として記されている。
【００４２】
本発明のＰＤは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのＰＤである。ヒトＰＤは、図１０に配列番号：４として記されている。ヒトＰＤは、ヒトΔＰＤであることができ、これは図１１に配列番号：５として記されている。ラットＰＤは、図８にＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６の領域を含むように広がる配列番号：２として記されている。ラットＰＤは、ラットΔＰＤであることができ、これは図８にＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９の領域を含んで広がる配列番号：２として記されている。
【００４３】
ある態様において、ヒトＥＣＤは、（ｉ）ヒトＩＣＤもしくはラットＩＣＤ、又は（ｉｉ）ヒトＰＤもしくはΔＰＤ、又はラットＰＤもしくはΔＰＤのいずれかに融合することができる。別の態様において、ラットＥＣＤは、（ｉ）ヒトＩＣＤもしくはラットＩＣＤ、又は（ｉｉ）ヒトＰＤもしくはΔＰＤ、又はラットＰＤもしくはΔＰＤのいずれかに融合することができる。更に別の態様において、マウスＥＣＤはマウスＰＤに融合することができる。
【００４４】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤは、長さが２６８個のアミノ酸であり、細胞内にあり、かつタンパク質チロシンキナーゼによりリン酸化することができる。この領域は、他のチロシンキナーゼ受容体の対応する部分と同一性を共有していない。従って、このドメインの特異性及び独自性は、腫瘍ワクチンとしての用途にとって特に好ましい。しかし、細菌及び哺乳動物細胞におけるこのドメイン単独の発現は、問題が多い。例えば、得られるＰＤタンパク質は、非常に不安定であり、かつ大量生産に適していない。ある態様において、本発明は、このような問題点を、細胞内ドメイン又はリン酸化ドメインの全て又は一部を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインの全部又は一部と融合することにより解決している。本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、可溶性であり、分泌され、かつ培養培地において安定している。この系は、大量の細胞内ドメイン又はリン酸化ドメインタンパク質を、癌ワクチンの開発、好ましくは乳癌ワクチンの開発のために提供することができるが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現により特徴付けられるあらゆる癌に対するワクチンについて有用であると考えられる。ＥＣＤ−ＩＣＤ及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、細胞内ドメイン又はリン酸化ドメイン、もしくはそれらの変異体の、細胞外ドメイン又はその変異体との融合タンパク質としての発現を増加することに加え、改善されたワクチン製剤を提供する。
【００４５】
ＰＤは、ＰＤのＮ末端に先行し分泌シグナル配列を導入することにより分泌され、可溶性の、分泌された組換えタンパク質を生じる。この分泌法は、組換えタンパク質が培養培地中に蓄積するので好ましい。このタンパク質は細胞内タンパク質に会合していないので、タンパク質分解は制限される。従って、タンパク質は、より簡便かつ経済的に精製されうる。
【００４６】
実施例３に示されたように、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−ｌ発現プラスミド（Ｋｏｄａｋ社）を用いて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインのどの領域が分泌され得るかを決定した。このタンパク質は、そのＮ末端にプレプロトリプシン分泌シグナル及びＦＬＡＧタグを伴う融合タンパク質として発現された。ＨＥＫ−２９３細胞を、このような構築物によりトランスフェクションし、かつ細胞及び培養培地は、ＦＬＡＧタグ融合タンパク質について、プローブとしてＦＬＡＧタグＭ２抗体を使用するウェスタンブロットによりアッセイされた。図４の結果は、完全長ＩＣＤもＫＤも分泌されないが、ＰＤが可溶性でありかつ培養培地に分泌されかつ検出されることを示している。これらの結果は、ＩＣＤ又はＫＤタンパク質の完全長構造は分泌を生じないこと、つまり細胞膜を通るタンパク質の経路にあることを示している。
【００４７】
実施例４に示されたように、ＥＣＤは分泌シグナル配列を有し、かつ分泌されたタンパク質として良好に発現されるので、ＥＣＤがＰＤの融合のパートナーとして使用された。ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ＨＥＫ−２９３細胞において発現された。可溶性ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の分泌は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイ法、その後のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤ特異的抗体を用いるウェスタンブロットにより決定した。図６に示されたように、可溶性ＥＣＤ−ＰＤはＨＥＫ−２９３において発現され、かつ培養培地へと分泌された。
【００４８】
Ｂ． 本発明の融合タンパク質の免疫原性
好ましい態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子のタンパク質発現産物の特定の部分を基にした融合タンパク質（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質）に関し、これは抗体反応を誘発することが可能であり、かつ胸腺依存性リンパ球（「Ｔ細胞」）により認識され得る。従って、自己発生の免疫Ｔ細胞応答を、予防のために用いるか、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現されるかもしくはされた悪性疾患を治療するために用いることができる。別の局面において、本発明は免疫感作のための、このようなＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現を指示する核酸分子、又はそれらの変異体の、単独又はウイルスベクター内での使用に関する。
【００４９】
概説すると、ＣＤ４＋ Ｔ細胞群は、特異的抗原で刺激された場合のリンホカインの放出を通じてのヘルパー又はインデューサーとして機能すると考えられる；しかし、ＣＤ４＋細胞のサブセットは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）として作用することができる。同様に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、直接抗原性標的を溶解することによって機能すると考えられる；しかし、様々な環境下で、これらはリンホカインを分泌し、ヘルパー又はＤＴＨ機能を提供することができる。機能の重複の可能性があるにも関らず、表現型ＣＤ４及びＣＤ８マーカーは、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ抗原に結合したペプチドの認識部位に連結している。ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの状況における抗原認識は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞が、異なる環境下で提示された異なる抗原又は同一抗原に対し応答することを指示している。免疫原性ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合は、抗原提示細胞によって示された（ｉｎｇｅｓｔ）抗原について最も一般的に生じる。
【００５０】
本発明において示されるように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質発現産物のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、Ｔ細胞によって認識される。循環血中Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ペプチド断片に分解される。ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質に由来するペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の抗原に結合する。細胞表面上のＭＨＣ抗原に結合したペプチドの提示及びペプチド＋自己ＭＨＣ抗原の組合せの宿主Ｔ細胞による認識により、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質（悪性細胞上で発現されたものを含む）は、Ｔ細胞に対して免疫原性である。Ｔ細胞受容体の強烈な特異性は、個々のＴ細胞が、１個のアミノ酸残基が異なるタンパク質断片間の識別を可能にする。
【００５１】
ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質由来のペプチド断片に対する免疫応答時に、ペプチド−ＭＨＣ複合体の高い結合親和性を伴うＴ細胞受容体を発現しているＴ細胞は、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合することによって、活性化されかつ増殖が誘発される。ペプチドとの最初の遭遇において、少数の免疫Ｔ細胞がリンホカインを分泌し、増殖し、かつエフェクター細胞及び記憶Ｔ細胞に分化する。一次免疫応答は、インビボにおいて生じるが、インビトロにおいて検出することは困難である。記憶Ｔ細胞による同じ抗原との次回の遭遇は、より迅速かつより強度な免疫応答に繋がる。二次応答は、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて生じる。このインビトロ応答は、増殖の程度、サイトカイン産生の程度、又は抗原に再曝露されたＴ細胞集団の細胞溶解活性の発生を測定することにより、容易に評価される。特定の抗原に反応したＴ細胞群の実質的増殖は、抗原に曝露されるか、又は抗原により感作されるかする前の指標とみなされる。
【００５２】
Ｃ． 本発明の融合タンパク質
ある態様において、本発明の化合物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質もしくは変異体、又はこのようなＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、この核酸分子はＤＮＡ分子である。本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質において、ＥＣＤ及びＩＣＤポリペプチド構成要素は、直接融合されるか、またはリンカー、例えばアミノ酸リンカー又は他の種類の化学リンカーを介して融合される。好ましい態様において、本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＩＣＤの全部又は一部に直接融合されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ全部又は一部を含む。
【００５３】
更なる態様において、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質中のＥＣＤサイズは、ＥＣＤのカルボキシル末端から１〜約１００個のアミノ酸のどこか、好ましくは約１００個のアミノ酸を順次取り除くことにより、変更することができる。同様に、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質中のＩＣＤサイズは、ＩＣＤのＮ末端及び／又はＣ末端から１〜約１００個のアミノ酸のどこかを順次取り除くことにより、変更することができる。得られる変異体の形状は、本発明に係る用途のために、文献及び本明細書において説明されたような適当なスクリーニング法を用いて、それらの抗原性及び／又は免疫原性を基に選択することができる。
【００５４】
別の態様において、本発明の化合物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質、もしくは変異体、又はこのようなＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。ある態様において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ΔＰＤに融合される。好ましくは、この核酸分子はＤＮＡ分子である。本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質において、ＥＣＤ及びＰＤ又はΔＰＤポリペプチド構成要素は、直接融合されるか又はリンカー、例えばペプチドリンカーを介して融合されることができる。好ましい態様において、本発明のＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤ又はＨｅｒ−２／ｎｅｕΔＰＤに直接融合されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤを含む。ここで及び本明細書を通じて、本発明の融合タンパク質の好ましい態様は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤ融合タンパク質である。
【００５５】
別の態様において、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質におけるＥＣＤのサイズは、ＥＣＤのカルボキシル末端からの１〜約１００個のアミノ酸のどこか、好ましくは約１００個のアミノ酸を順次取り除くことにより変更することができる。同様に、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質中のＰＤサイズは、ＰＤのＮ末端からアミノ酸を順次取り除くことにより、変更することができる。同じく、好ましい態様はＰＤである。別の変異体の形状は、本発明における用途のために、文献及び本明細書において説明されたような適当なスクリーニング法を用いて、それらの抗原性及び／又は免疫原性を基に選択することができる。
【００５６】
以下の表１は、ＥＣＤのカルボキシル末端から１００個のアミノ酸を除去することが、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現レベル及び安定性に影響を及ぼさないことを示している。
【００５７】
【表１】ＥＣＤ切断型−ＰＤ概要
2004521609.tif 000003
【００５８】
ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の変異体は、同じく、各々、天然のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の様々な構造形態を含む。イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基の存在のために、例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、酸性又は塩基性塩の形状であることができるか、または中性の形状であってもよい。個々のアミノ酸残基も、酸化又は還元により修飾することができる。
【００５９】
本発明の範囲のその他の変異体は、各々天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質又は天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質の一次アミノ酸構造が、各々、他のペプチド又はポリペプチド、又はグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基などの化学部分と、共有結合又は凝集的抱合体の形成により修飾されるようなＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質である。共有結合誘導体は、例えばアミノ酸側鎖への又はＮ末端もしくはＣ末端での特定の官能基の連結により、調製することができる。いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質はＴｃＰ０ペプチドモチーフ（配列番号：３１）を更に含む。
【００６０】
本発明は更に、グリコシル化を伴う又は伴わない、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質も含む。酵母又は哺乳動物発現系において発現されたＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、分子量及びグリコシルパターンが、発現系によって、天然の分子と類似であるか、又はわずかに異なることができる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現は、典型的には非グリコシル化分子を提供する。真核生物タンパク質のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸三つ組Ａｓｎ−Ａ１−Ｚ（ここでＡ１はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、かつＺはＳｅｒ又はＴｈｒである）により特徴付けられる。失活されたＮ−グリコシル化部位を有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の変異体は、オリゴヌクレオチドの合成及び連結又は定方向突然変異技術などの当業者に公知の技術により作製することができ、これも本発明の範囲内である。代わりに、Ｎ連結したグリコシル化部位は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質に添加することができる。
【００６１】
本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、これはヒト及び非ヒトのポリペプチド間のあらゆる可能な組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどを含む。ある態様において、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）図９のヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図７に示されたＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：１）であるヒトＩＣＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ヒトＥＣＤ−ヒトＩＣＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；
（ｉｉ）図１４のラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図８に示されたＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットＩＣＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ラットＩＣＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；
（ｉｉｉ）図９のヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図８に示されたＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットＩＣＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ヒトＥＣＤ−ラットＩＣＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；並びに
（ｉｖ）図１４のラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図７に示されたＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：１）であるヒトＩＣＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ヒトＩＣＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体。
【００６２】
本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド１からヌクレオチド１９５９まで含むように広がることが示されている。ＩＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド２０２６からヌクレオチド３７６５を含むように広がることが示されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質の免疫応答産生能に関する任意の配列の修飾の効果は、例えば、変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質のＴ細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記載された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【００６３】
本発明のＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、これはヒト及び非ヒトのポリペプチドの間のあらゆる可能な組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどを含む。ある態様において、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）図９のヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図１０に示されたヒトＰＤ（配列番号：４）との、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製された融合タンパク質及びそれらの変異体を含むような、図１２に示されたようなヒトＥＣＤ−ヒトＰＤ融合タンパク質（配列番号：６）及びそれらの変異体；
（ｉｉ）図１４のラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図８に示されたＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットＰＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ラットＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；
（ｉｉｉ）図９に示されたヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図８に示されたＧｌｎ ９９１からＶａｌ １２５６を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットＰＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ヒトＥＣＤ−ラットＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；
（ｉｖ）図１４に示されたラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図１０に示されたヒトＰＤ（配列番号：４）との、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ヒトＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；並びに
（ｖ）図２２に示されたもの（配列番号：２７）などの、マウスＥＣＤ−マウスＰＤ融合タンパク質。
【００６４】
本発明のＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド１からヌクレオチド１９５９まで含むように広がることが示されている。ＰＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド２９６８からヌクレオチド３７６５を含むように広がることが示されている。マウスＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質をコードするマウスＤＮＡ配列が、図２３に示されている（配列番号：２８）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質の免疫応答産生能に関する任意の配列の修飾の効果は、例えば、変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質のＴ細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記載された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【００６５】
別の態様において、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、本発明のＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質であり、これは変異体を含むと理解され、ヒトと非ヒトポリペプチドの間のあらゆる可能性のある組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどを含む。ある態様において、ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）図９のヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図１１に示されたヒトΔＰＤ（配列番号：５）との、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製された融合タンパク質及びそれらの変異体を含むような、図１３に示されたようなヒトＥＣＤ−ヒトΔＰＤ融合タンパク質（配列番号：７）及びそれらの変異体；
（ｉｉ）図１４のラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図８に示されたＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットΔＰＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ラットΔＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；
（ｉｉｉ）図９のヒトＥＣＤ（配列番号：３）と、図８に示されたＧｌｎ ９９１からＡｒｇ １０４９を含むように広がるアミノ酸配列（配列番号：２）であるラットΔＰＤとの、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ヒトＥＣＤ−ラットΔＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体；並びに
（ｉｖ）図１４のラットＥＣＤ（配列番号：８）と、図１１に示されたヒトΔＰＤ（配列番号：５）との、化学及び／又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたものなどの、ラットＥＣＤ−ヒトΔＰＤ融合タンパク質、及びそれらの変異体。
【００６６】
本発明のＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド１からヌクレオチド１９５９まで含むように広がることが示されている。ΔＰＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば、図１５（配列番号：９）にヌクレオチド２９６８からヌクレオチド３１４４を含むように広がることが示されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質の免疫応答産生能に関する任意の配列の修飾の効果は、例えば、変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質のＴ細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記載された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【００６７】
好ましい態様において、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質である。
【００６８】
ある具体的な態様において、本発明の融合タンパク質は、例えば免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサーなどの融合パートナーを含むことができる。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくはヒトにより認識されたＴヘルパーエピトープの提供を補助することができるか、もしくは、組換え融合タンパク質よりもより高い収率で、融合タンパク質（発現エンハンサー）の発現を補助することができる。ある好ましい融合パートナーは、免疫学的及び発現増強の両方の融合パートナーである。その他の融合パートナーは、融合タンパク質の溶解度を増大するため、又は融合タンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするために選択することができる。更に別の融合パートナーは、関心対象の融合タンパク質の精製を促進する親和性タグを含む。
【００６９】
更に無関係の免疫原性タンパク質と一緒に、本明細書に記載された融合ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供される。好ましくは、この免疫原性タンパク質は、リコール反応を誘発することが可能である。このようなタンパク質の例は、破傷風、結核及び肝炎のタンパク質を含む（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３３６：８６〜９１（１９９７））。
【００７０】
その他の態様において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂの表面タンパク質であるプロテインＤに由来する（国際公開公報第９１／１８９２６号）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、タンパク質のほぼ１／３を含み（例えば、最初のＮ末端の１００〜１１０個のアミノ酸）、かつプロテインＤ誘導体は、リピド化され得る。ある好ましい態様において、リポプロテインＤの融合パートナーの最初の１０９個の残基は、そのＮ末端に含まれ、別の外因性Ｔ細胞エピトープとの融合タンパク質を提供し、かつ大腸菌における発現レベルを増大する（従って発現エンハンサーとして機能する）。リピド尾は、融合タンパク質の抗原提示細胞への最適な提示を確実にする。その他の融合パートナーは、インフルエンザウイルスに由来する非構造タンパク質であるＮＳ１（赤血球凝集素）、又はその免疫原性部分を含む（国際公開広報第９９／４０１８８号および国際公開広報第９３／０４１７５号を参照されたい）。典型的には、Ｎ末端の８１個のアミノ酸を使用するが、Ｔヘルパーエピトープを含む様々な断片を使用することができる。ある態様において、本発明の融合タンパク質は、好ましくは融合タンパク質のＮ末端領域に結合した、ＮＳ１融合パートナーまたはその免疫原性断片を更に含む。ＮＳ１パートナーを含む融合タンパク質は、好ましくは下記のようにＢＨＫ細胞内で組換え型で発現される。
【００７１】
別の態様において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、又はその一部（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するが、アミダーゼＬＹＴＡとして公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ、４３：２６５〜２９２（１９８６））。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン主鎖において特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリン又はＤＥＡＥなどのいくつかのコリン類似体に対する親和性に寄与することができる。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発において利用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含むハイブリッドタンパク質の精製は明らかにされている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７９５〜７９８（１９９２）を参照）。好ましい態様において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組込まれ得る。反復部分は、残基１７８から始まるＣ末端領域に認めることができる。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組入れている。
【００７２】
好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質の免疫源性を増強するＴｃＰ０ペプチドモチーフを更に含む。ＴｃＰ０は、エピトープ拡大（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を誘導することが示されている、リボソームＰタンパク質に由来した６個のアミノ酸ペプチドである。ＴｃＰ０モチーフは、異なる位置において融合タンパク質に結合することができるが、好ましくは融合タンパク質のＣ末端に融合される。ＴｃＰ０のアミノ酸配列は図２６（配列番号：３１）に示され、ＴｃＰ０をコードする核酸配列は図２７（配列番号：３２）に示されている。ＴｃＰ０モチーフを含む融合タンパク質をコードする組換え核酸を、標準の技術または以下で説明する技術を用いて得ることができる。好ましくはＴｃＰ０ポリヌクレオチド配列が関心対象の融合タンパク質の３’側に位置するように、組換え核酸が構築される。
【００７３】
別の好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、更に融合パートナーを含む。好ましい融合パートナーは、例えばＲａ１２又はＬｅＩＦを含むが、これらに限定されるものではない。特に本発明は、組換え融合ポリペプチドの発現の安定かつ高い収量を促進するか又は寛容を破壊するための融合パートナーとして、Ｒａ１２又はＬｅＩＦ配列を用いる材料及び方法を提供する。
【００７４】
Ｒａ１２は、ヒト型結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＭＴＢ３２Ａコード配列の１４ｋＤ Ｃ末端断片であり、これはそれ自身で高レベルで発現され、かつ精製過程を通じて可溶性であり続ける。ＬｅＩＦは、真核生物のリボソームタンパク質ｅＩＦと相同であり、かつＴｈ１及び／又はＣＴＬ免疫応答を刺激することが可能であるような、リーシュマニア抗原である（例えば米国特許第５，８７６，９６６号、第５，８７６，７３５号及び第５，８７９，６８７号を参照）。本発明は、Ｒａ１２及びＬｅＩＦポリペプチドのこれらの特性を利用し、かつＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドに加え、Ｒａ１２及びＬｅＩＦポリペプチドを含む融合ポリペプチドの安定かつ高収率の発現のための組換え核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び方法を提供する。Ｒａ１２又はＬｅＩＦポリペプチド及び問題の融合タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸は、従来の遺伝子工学技術により容易に構築することができる。組換え核酸は、好ましくは融合パートナーポリヌクレオチド配列が、選択された融合タンパク質配列の５’側に位置するように、構築される。融合パートナーポリヌクレオチド配列が、対象となる融合タンパク質のポリヌクレオチド配列の３’側に位置するか、又は、融合タンパク質のポリヌクレオチド配列が、融合パートナーポリヌクレオチド配列内の位置に挿入されることも適している。加えて、本明細書に記載されたような融合パートナー又はそれらの一部もしくは他の変異体をコードするいずれか適当なポリヌクレオチドを、本発明の組換え融合核酸の構築に使用することができる。
【００７５】
本発明の融合パートナーポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知のいずれか適当な方法で調製することができる。例証的方法は、適当な配列のクローニング及び制限、又はＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０〜９９（１９７９）；Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９〜１５１（１９７９）；Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエステルホスホロアミダイト法、Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９〜１８６２（１９８１）；及び米国特許第４，４５８，０６６号に開示された固体支持体法などの方法による直接の化学合成を含む。
【００７６】
融合パートナーポリペプチド及び選択された融合タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードする組換え核酸は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて調製することができる。前述のように、組換え核酸は、好ましくは、融合パートナーポリヌクレオチド配列が、対象となる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’側に位置するように構築される。この融合パートナー及び融合タンパク質のポリヌクレオチド配列は、それらの融合及びその後の発現を促進するように修飾することもできる。
【００７７】
組換え核酸は更に、タンパク質精製プロトコールを促進するアフィニティタグをコードする配列などの、他のヌクレオチド配列を含むこともできる。
【００７８】
Ｄ． 本発明の融合タンパク質の変異体
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、一般に腫瘍細胞の外側にある抗原を認識する。対照的に、正常な環境においては、ペプチドのＭＨＣクラスＩへの結合は、細胞質ゾルに存在しかつ標的それ自身により合成されるタンパク質についてのみ生じ、外部環境のタンパク質は除かれる。このことの例外は、外因性ペプチドの高濃度で細胞外に存在する正確なクラスＩ結合モチーフとの結合である。従って、ＣＤ４＋ Ｔ細胞びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、広く異なる機能を有し、かつその抗原が正常に存在する場所を反映して異なる抗原を認識する傾向がある。
【００７９】
本発明の変異体を作製するためのアミノ酸置換を作製する別の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ分子（例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞応答）又はＭＨＣクラスＩ分子（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞応答）と結合する可能性のあるＴ細胞モチーフ内のアミノ酸の同定及び置換である。理論的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する可能性のあるモチーフを伴うペプチドセグメント（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の）は、コンピュータ解析により確定することができる。例えば、Ｔ細胞認識の可能性のある位置を識別するように設計されたいくつかのコンピュータアルゴリズムを組込んだタンパク質配列解析パッケージ「Ｔ Ｓｉｔｅｓ」を利用することができる（Ｆｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７２０〜７２１（１９９１））。２種の検索アルゴリズムが使用される：（１）Ｍａｒｇａｌｉｔにより説明されるＡＭＰＨＩアルゴリズム（Ｆｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７２０〜７２１（１９９１）；Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：２２１３〜２２２９ （１９８７））は、α−ヘリックスの周期性及び両親媒性に従いエピトープモチーフを同定する；（２）Ｒｏｔｈｂａｒｄ及びＴａｙｌｏｒアルゴリズムは、電荷及び極性パターンに従いエピトープモチーフを同定する（Ｒｏｔｈｂａｒｄら、ＥＭＢＯ Ｊ、７：９３〜１００ （１９８８））。両モチーフを伴うセグメントは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に最も適している。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合したペプチドを認識する。Ｐａｒｋｅｒら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３（１９９４））は、特定のＭＨＣ分子に結合するペプチドが識別可能な配列モチーフを共有していることを明らかにした。ＨＬＡ−Ａ２．１のグローブにおける結合のためのペプチドモチーフは、培養細胞株のＨＬＡ−Ａ２．ｌ分子からストリップされたペプチドのエドマン分解法により定義されている（表２、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０〜２９６（１９９１））。この方法は、長さが９個のアミノ酸で、２位（Ｌ）及び９位（Ｖ）に生じるドミナントアンカー残基を伴う、典型的又は平均的ＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドを同定している。通常生じる強力な結合残基は、２位（Ｍ）、４位（Ｅ，Ｋ）、６位（Ｖ）、及び８位（Ｋ）で同定されている。この同定されたモチーフは、多くの結合ペプチドの平均を示している。
【００８０】
【表２】ＨＬＡ−Ａ２．１制限モチーフ
2004521609.tif 000004
【００８１】
ここで定義されたように誘導されたペプチドモチーフは、特にストリンジェントではない。一部のＨＬＡ−Ａ２．１結合ペプチドは、両ドミナントアンカー残基を有さず、かつこのドミナントアンカー残基に隣接するアミノ酸は、結合を許す又は許さないかにおいて大きな役割を果たしている。ここで説明された結合モチーフを伴うペプチドの全てが結合するわけではなく、モチーフを伴わないいくつかのペプチドが結合することがある。しかし、本モチーフは、結合が可能ないくつかのペプチドの同定をもたらすのに十分に妥当である。注意点としては、全てのＭＨＣ分子及び各モチーフが、残基２位及び９位のドミナントアンカーアミノ酸の間に６個のアミノ酸が配置されていることである。
【００８２】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質内のペプチドモチーフの同定の後、アミノ酸置換を、保存的又は非保存的に行うことができる。後者の種類の置換は、より強力及び／又はより広範な交差反応性を有する改善されたＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質又はポリペプチドを作製することが意図されている。より強力なタンパク質又はペプチドの例は、天然のタンパク質又はポリペプチドに特異的なＴ細胞による認識に影響を及ぼすことなく、天然のタンパク質又はポリペプチドと同じＭＨＣ分子により高い親和性で結合するものである。広い交差反応性を伴うポリペプチドの例は、天然のポリペプチドよりも、より広範な交差反応性免疫応答を誘発する（すなわち、より広い範囲のＭＨＣ分子に結合する）ものである。同様に、ペプチドモチーフ間に存在しかつスペーサー機能を有する（例えば、ＭＨＣ分子又はＴ細胞受容体と相互作用しない）ような１種以上のアミノ酸を、保存的又は非保存的に置換することができる。当業者には、１種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドは、Ｔ細胞認識を刺激する能力に関して本明細書に記載されたものを含む、様々なアッセイ法により、有益又は有害な免疫学的相互作用に関して試験することができることは明らかである。
【００８３】
本発明の範囲内の変異体は更に、もしくは代わりに、前述のような、ポリペプチドの所望の免疫学的特性の及ぼす影響が最小であるようなアミノ酸の欠失又は付加を含む他の修飾を含むことができる。当業者には、所望の免疫学的特性が、完全長、天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の特性と少なくともおおまかに同等であるならば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ 又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の切断型又は非天然の伸長型を用いることができることは理解されると考えられる。システイン残基は、変性時の不正確な分子間ジスルフィド橋の形成を防止するために、欠失するか、又は他のアミノ酸と置換することができる。ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増強するための他の突然変異法は、隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾に関する。
【００８４】
ＩＶ． 本発明の融合タンパク質の調製
Ａ． 融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
一つの態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードする単離又は精製されたポリヌクレオチドに関する。本発明において、関心対象の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列は、融合タンパク質の発現を指示する組換え分子の作製に使用することができる。
【００８５】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリヌクレオチドの作製のための完全長コード配列又は相同変異体をクローニングするために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕヌクレオチド配列又はそれらの相補体の任意の部分から設計された標識されたＤＮＡプローブを用いて、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、融合タンパク質の個別の成分の各々のコード配列を確定することができる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕヌクレオチド配列は、適当な哺乳動物、例えばヒト、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどに由来することができる。
【００８６】
ある態様において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ配列は、ヒト、ラット又はマウスに由来する。マウスのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子のヌクレオチド配列は、図１９（配列番号：１１）に示されている。マウスのＨｅｒ−２／ｎｅｕは、下記のプライマーを用いて、マウス脳ＲＮＡから増幅することもできる：５’−プライマー：ＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＴＧ （配列番号：１２）及び３’−プライマー：ＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧＣ （配列番号：１３）。マウスのＨｅｒ−２／ｎｅｕアミノ酸配列は、図２０（配列番号：１４）に示した。マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕの変異体アミノ酸配列は、Ｎａｇａｔａら（１９９７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９：１３３６〜１３４３に記載されている。
【００８７】
このようなクローンは、完全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を発現しているクローンの適当な発現ライブラリーのスクリーニングにより単離することができる。このライブラリーの調製及びスクリーニングは、一般に、当業者に公知の方法を用いて行われ、このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）に記載されている。簡単に述べると、バクテリオファージ発現ライブラリーを、フィルターに配置しかつ写し取る。その後このフィルターを、検出試薬と共にインキュベーションする。本発明の状況において、「検出試薬」とは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に結合することが可能な任意の化合物であり、これはその後当業者に公知の様々な手段のいずれかにより検出することができる。典型的検出試薬は、レポーター基に結合された、プロテインＡ、プロテインＧ、ＩｇＧ又はレクチンなどの「結合物質」を含む。好ましいレポーター基は、酵素、基質、補因子、阻害剤、色素、放射性核種、ルミネセンス基、蛍光基及びビオチンを含む。より好ましいレポーター基は、テトラメチルベンジジン又は２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸などの基質とのインキュベーションにより検出されるホースラディッシュペルオキシダーゼである。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を発現するゲノム又はｃＤＮＡ配列を含むプラークは、当業者に公知の技術により単離及び精製される。適当な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されている。
【００８８】
コード配列の単離は、本明細書に記載されたコード配列を基に設計された２種の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。所望の核酸も、他の周知の増幅技術を用いてクローン化され得る。ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼ技術を含むインビトロ増幅法を通じて、当業者に示すのに十分なプロトコールの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、及びＡｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４）、ならびに米国特許第４，６８３，２０２号；「ＰＣＲプロトコール、方法および適用の指針（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（Ｉｎｎｉｓら編集、１９９０）；Ａｒｎｈｅｉｍ及びＬｅｖｉｎｓｏｎ Ｃ＆ＥＮ、ｐ．ｐ．３６〜４７（１９９０年１０月１日）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３：８１〜９４ （１９９１）；Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：１１７３（１９８９）；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７：１８７４（１９９０）；Ｌｏｍｅｌｌら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７〜１０８０（１９８８）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２９１〜２９４（１９９０）；Ｗｕら、Ｇｅｎｅ、４：５６０（１９８９）；及びＢａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０）に記載されている。改善されたインビトロ増幅された核酸のクローニング法は、米国特許第５，４２６，０３９号に開示されている。本発明の核酸の増幅における使用に適したプライマーは、本明細書に提供された配列を基に設計することができる。
【００８９】
本発明において、融合タンパク質、その断片、又はその機能性同等物をコードする本発明のポリヌクレオチドを用い、適当な宿主細胞において融合タンパク質、その断片、又はその機能性同等物の発現を指示する組換え核酸分子を作製することができる。このようなポリヌクレオチドによってコードされた融合ポリペプチドは、コード配列の分子操作により変更することができる。
【００９０】
遺伝暗号の固有の縮重度のために、実質的に同じ又は機能的に同等のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を、融合ポリペプチドの発現のための、本発明の実践において使用することができる。このようなＤＮＡ配列は、本明細書において説明されるコード配列又はそれらの相補体に、本明細書において説明されたような、低、中又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なものを含む。
【００９１】
本発明において使用することができる変更されたヌクレオチド配列は、同じ又は機能的に同等の遺伝子産物をコードする配列を生じるような様々なヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物それ自身は、アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含むことができ、このことがサイレント変化を生じ、その結果機能的に同等の抗原性エピトープを産生する。このような保存的アミノ酸置換は、関連した残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性を基に作製することができる。例えば負荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み；正荷電したアミノ酸は、リシン、ヒスチジン及びアルギニンを含み；類似した親水値を有する荷電していない極性ヘッド基を有するアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシンであり；並びに、非極性ヘッド基を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、及びトリプトファンである。
【００９２】
本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を修飾するような変更を含むが、これに限定されるものではない様々な目的のために、融合タンパク質コード配列を変更するために操作することができる。例えば、突然変異は、当技術分野において周知の技術を用いて導入することができ、例えば、制限酵素部位の挿入又は欠失、グリコシル化パターンの変更、リン酸化、翻訳、開始及び／もしくは終結配列の作製及び／もしくは破壊、又はコード領域における変異の作製、更にインビトロ修飾の促進などである。当業者は、所定の核酸構築物において変更を作製する多くの方法を認めると考えられる。このような周知の方法は、例えば定方向突然変異、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、核酸を有する細胞の化学変異原性物質又は放射線照射への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、巨大核酸を作製するためのライゲーション及び／又はクローニングによる結合）又は他の周知の技術（例えば、Ｇｉｌｉｍａｎら、Ｇｅｎｅ ８：８１〜９７（１９７９）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５３：６５５１（１９７８）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１〜７３４（１９８７）を参照のこと）を含む。これらの操作は、融合ポリペプチドの免疫原性を破壊しないことが好ましい。
【００９３】
本発明のある態様において、融合タンパク質のコード配列は、当技術分野において周知の化学的方法を用いて、全体又は一部を合成してもよい（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．、７：２１５〜２３３（１９８０）；Ｃｒｅａら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９（１ ０）：２３３１（１９８０）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ、２１：７１９（１９８０）；及び、Ｃｈｏｗら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、９（１２）：２８０７〜２８１７（１９８１）を参照のこと）。
【００９４】
Ｂ． ポリペプチド合成
あるいは、前記融合ポリペプチドそれ自身を、アミノ酸配列の全部又は一部を合成する化学的方法を用いて作製することができる。例えば、ペプチドは固相法で合成することができ、例としてアミノ酸を連続的に付加しアミノ酸鎖を伸長させる、メリフィールド固相合成法がある（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１４６ （１９６３））。ポリペプチドの自動合成装置は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（フォスターシティ、ＣＡ）などの供給業者から市販されており、かつ一般に製造業者の指示に従い操作することができる。その後合成されたペプチドは、樹脂から切断され、かつ例えば分取高速液体クロマトグラフィーなどで精製することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、タンパク質構造および分子の原理（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）」、ｐｐ．５０〜６０ （１９８３）参照）。この合成融合ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確定することができる（例えば、エドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「タンパク質、構造と分子の原理（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）」、ｐｐ． ３４〜４９ （１９８３）参照）。
【００９５】
加えて、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、配列に置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸は、概して、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体を含むが、これらに限定されるものではない。更に、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）であることができる。
【００９６】
Ｃ． 連結基
別の態様において、融合タンパク質のポリペプチド、例えばＥＣＤ及びＩＣＤ又はＥＣＤ及びＰＤは、連結基を介して連結される。この連結基は、例えばスクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）などを含む化学架橋剤であることができる。この連結基は、例えばポリグリシン連結基を含む付加アミノ酸配列であることもできる。
【００９７】
具体的な態様において、融合タンパク質内の各ポリペプチドのコード配列は、それらのアミノ末端又はカルボキシル末端に、任意の順で結合されたペプチドを介して、直接結合している。
【００９８】
あるいは、アミノ酸リンカー配列を用い、第一及び第二のポリペプチド構成要素を、各ポリペプチドの二次及び三次構造への折畳みを確実にするのに十分な距離で隔てることができる。このようなアミノ酸リンカー配列は、当技術分野において周知の常法を用いて融合タンパク質に組込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、下記の要因を基に選択することができる：（１）それらが、柔軟性のある延長されたコンホメーションを採用する能力があること；（２）それらが第一及び第二のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用することができる二次構造を採用することができないこと；並びに、（３）ポリペプチドの機能性エピトープと反応することがあるような疎水性又は荷電した残基が存在しないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒ及びＡｌａも、リンカー配列において使用することができる。リンカーとして有用に利用できるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０：３９〜４６（１９８５）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３：８２５８〜８２６２（１９８６）；ならびに米国特許第４，９３５，２３３号及び第４，７５１，１８０号に記載されている。このリンカー配列は、一般に長さが１個〜約５０個のアミノ酸である。リンカー配列は、第一及び第二のポリペプチドが、機能性ドメインを分離しかつ立体障害を防ぐような非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合は不要である。
【００９９】
他の化学リンカーは、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ＰＥＧなどのポリエーテルリンカーなどがある（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ参照）。
【０１００】
Ｄ． 追加のポリペプチド
前述のように、融合タンパク質は、１個以上の追加のポリペプチドに連結することができる。例えば、この融合ポリペプチドは、融合タンパク質の２種のポリペプチドの一方のコピーの１個以上に連結することができる。あるいは、前述のように、この融合タンパク質を、例えばＲａ１２もしくはＬｅＩＦなどの追加の異種ポリペプチド、または例えばＴｃＰ０などのペプチドモチーフに連結させることができる。この融合ポリペプチドは、発現時の精製を容易にするために、アフィニティタグにも融合することができる。例えば、タグでコードされた複数のヒスチジン残基は、融合ポリペプチドの精製のために金属キレートアフィニティクロマトグラフィー法を使用することを可能にする。別のアフィニティタグ分子の例は、例えばＳｔｒｅｐタグ、ＰｉｎＰｏｉｎｔ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどがある（例えば、Ｇｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ、「組換えＤＮＡの分子生物学の原理及び用途（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」（第２版、１９９９）を参照）。
【０１０１】
ある態様において、融合ポリペプチドは、任意にミコール酸、リポアリブドマニン（「ＬＡＭ」）、又はトレハロース誘導体などの脂質部分に連結される。
【０１０２】
前述のように、ある態様において、このような融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸の組換え発現により作製される。このような融合産物は、適切なコード枠において、当技術分野において公知の方法により互いに所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列をライゲーションし、かつこの産物を当技術分野において公知の方法で発現することにより作製することができる。あるいは、このような産物は、例えばペプチド合成装置を使用するタンパク質合成法により作製することもできる。サイトカイン又はアジュバントなどの他の分子のコード配列を更に、融合ポリヌクレオチドに追加することができる。
【０１０３】
Ｅ． 配列修飾
免疫応答刺激能を保持している本発明の融合タンパク質の変異体は、一般に、前述の１種以上の局面で配列を修飾し、かつ得られた融合タンパク質を例えばＴ細胞応答又は抗体応答などの免疫応答刺激能についてアッセイすることにより同定することができる。例えば、このようなアッセイ法は一般に、Ｔ細胞を修飾された融合タンパク質と接触し、かつ応答をアッセイすることにより行うことができる。融合タンパク質の個々のポリペプチド成分の自然に生じる変異体は、同じく例えば個別のポリペプチド又はそれらの変異体の各々をコードするＤＮＡ配列による適当なｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングにより、単離することができる。
【０１０４】
前述の配列修飾は、標準組換え技術又は修飾された融合タンパク質の自動合成を用いて、導入することができる。例えば、突然変異を、突然変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の座位に導入することができ、天然の配列の断片にライゲーションすることができる制限酵素部位に隣接することができる。ライゲーション後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。
【０１０５】
あるいは、オリゴヌクレオチドが指定した位置特異的突然変異法を用いて、特定のコドンが必要な置換、欠失、又は挿入に従い変更された遺伝子を提供することができる。前述の別のセットを作製する方法の例は、Ｗａｌｄｅｒら、Ｇｅｎｅ、４２：１３３（１９８６）；Ｂａｕｅｒら、Ｇｅｎｅ、３７：７３（１９８５）；Ｃｒａｉｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１月：１２〜１９ （１９８５）；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）、「遺伝子工学：原理及び方法（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；及び米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号に記載されている。
【０１０６】
このようなＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の発現のために構築されたヌクレオチド配列における突然変異は、当然コード配列の読み枠を保存しなければならず、かつ、ハイブリダイズし、ｍＲＮＡの翻訳に有害に作用するループ又はヘアピンなどのｍＲＮＡ二次構造を形成することがあるような相補的領域を形成しないことが好ましい。突然変異部位は予め定められるが、突然変異の性質それ自身を予め定める必要ない。例えば、所定の部位での突然変異体の最適な特性を選択するために、ランダム突然変異を、標的コドンで行い、かつ発現されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質突然変異体を所望の活性についてスクリーニングすることができる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全ての突然変異がが、最終産物において発現されるわけではない。例えば、ヌクレオチド置換は、発現を増強すること、主として転写されたｍＲＮＡにおいてループ二次構造を避けること（例えば欧州特許出願第７５，４４４Ａ号参照）、又は例えば大腸菌発現のための周知の大腸菌優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）コドンなどの選択された宿主においてより容易に翻訳されるコドンを提供することが行われる。
【０１０７】
Ｆ． 発現ベクター
本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質、及びそれらの変異体は、好ましくは組換えＤＮＡ法により作製される。このような方法は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の組換え発現ベクターへの挿入、並びに融合タンパク質の発現及び好ましくは分泌を促進する条件下での、組換え微生物、哺乳動物、真菌又は昆虫細胞発現系におけるＤＮＡ配列の発現を含む。本発明により提供されるＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、もしくは一連のオリゴヌクレオチドから構成され、組換え発現ベクターに挿入されかつ組換え転写ユニットにおいて発現されることが可能である合成遺伝子を提供することができる。
【０１０８】
組換え発現ベクターは、哺乳動物、真菌、微生物、ウイルス、又は昆虫遺伝子に由来した適当な転写又は翻訳調節エレメントに機能的に連結されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。このような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。複製起点及び形質転換体の認識を促進する選択マーカーを更に組込むことができる。
【０１０９】
ＤＮＡ領域は、これらが互いに機能するように関連付けられる場合に、「機能的に連結される」。例えば、シグナルペプチドのためのＤＮＡ（分泌リーダー）は、それがポリペプチドの分泌に参加する前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結され；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合は、コード配列に「機能的に連結され」；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置される場合には、コード配列に機能的に連結される。一般に、「機能的に連結された」とは、連続した、且つ分泌リーダーの場合は読み枠内にあることを意味する。微生物において発現されるＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好ましくはｍＲＮＡへのＤＮＡの転写を早期に終結することがあるイントロンを含まない。
【０１１０】
細菌的使用のための発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１ ７）の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカー及び細菌の複製起点を含むことができる。このような市販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、ウプスラ、スウェーデン）、ｐＧＥＭＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社、マジソン、ＷＩ）、ｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）及びｐＰＤＭ（修飾されたｐＥＴ２８ｂ、Ｃｏｒｉｘａ社）を含む。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」セクションは、適当なプロモーター及び発現される構造配列に組みあわせられれいる。大腸菌は、典型的には大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２誘導体を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２：９５（１９７７））。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、その結果、形質転換された細胞を同定するための簡単な手段を提供する。通常組換え微生物発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５（１９７８）；及びＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）；及び欧州特許出願第３６，７７６号）、並びにｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐ．４１２ （１９８２））を含む。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰＬプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定リプレッサーを使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手でき、λＰＬプロモーターの誘導体を組入れるプラスミドベクターは、大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）のレジデントであるプラスミドｐＨＵＢ２、及び大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ ５３０８２）のレジデントであるｐＰＬｃ２８を含む。
【０１１１】
酵母ベクター内の適切なプロモーター配列は、アルコールオキシダーゼ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５：２０７３（１９８０））、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．、７：１４９（１９６８）；及びＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７：４９００（１９７８））のプロモーターを含む。酵母発現において使用するのに適当なベクター及びプロモーターは、例えば欧州特許出願第７３，６５７号などに、更に開示されている。
【０１１２】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択及び複製のためのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子及び複製起点）並びにグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーター及びα因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を用いて構成することができる。ＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５８：２６７４（１９８２）及びＢｅｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３００：７２４（１９８２）に説明されている。異種タンパク質の分泌を指示する酵母α因子リーダーは、プロモーターと発現されるべき構造遺伝子の間に挿入することができる（例えば、Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ、３０：９３３（１９８２）；及び、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：５３３０（１９８４）を参照）。リーダー配列は、その３’末端の近傍に、リーダー配列の外因性遺伝子への融合を促進するために、１個以上の有用な制限酵素部位を含むように修飾することができる。
【０１１３】
脊椎動物細胞の形質転換において使用するための発現ベクターにおける転写及び翻訳の制御配列は、ウイルス給源により提供される。例えば、通常使用されるプロモーター及びエンハンサーは、例えばポリオーマ、アデノウイルス２、シアミンウイルス（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝的エレメントを提供することができる。初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含む断片としてウイルスから容易に得られるので、両者とも特に有用である（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））。ウイルス複製起点に位置されたＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩＩ部位に向かって伸びているおよそ２５０ｂｐの配列が含まれるならば、比較的小さい又は大きいＳＶ４０断片も使用することができる。更に、このような制御配列が選択された宿主細胞と共存可能であるならば、ウイルスゲノムプロモーター配列、制御配列、及び／又はシグナル配列を使用することができる。構築することができるベクターの例は、Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３：２８０（１９８３）に記載されている。
【０１１４】
マウスの乳腺上皮細胞Ｃ１２７における哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定した高レベル発現のための有用な系は、Ｃｏｓｍａｎら、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：９３５（１９８６）により説明されたように、実質的に構築することができる。本発明の融合タンパク質の発現に適した真核細胞ベクターは、ｐＤＣ４０６である（ＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：２８２１（１９９１）、これは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に由来する調節配列を含む。他のベクターはｐＤＣ４０６に由来する、ｐＤＣ４０９及びｐＤＣ４１０を含む。ｐＤＣ４１０は、ＥＢＶ複製起点のＳＶ４０ラージＴ抗原コード配列による置換により、ｐＤＣ４０６に由来する。ｐＤＣ４０９は、多クローニング部位の外側のＢｇｌＩＩ制限酵素部位が欠失され、多クローニング部位内に独自のＢｇｌＩＩ部位を形成している点で、ｐＤＣ４０６と異なる。更なる適切な哺乳動物発現ベクターには、例えばｐＢＩＢベクター及びＣＲ１０１２ベクターが含まれる。ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウスの乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は哺乳動物細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターも適している。
【０１１５】
一部の発現系は、転写及び翻訳の制御配列に加え、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【０１１６】
ＥＢＶ複製起点を含むｐＤＣ４０６及びｐＤＣ４０９などの発現ベクターのエピソーム複製を可能にする有用な細胞株は、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）である。ＣＶ−ｌ／ＥＢＮＡ細胞株は、ＣＶ−ｌ細胞株のエプスタイン−バーウイルス核抗原−Ｉ（ＥＢＮＡ−ｌ）をコードする遺伝子によるトランスフェクションにより誘導され、かつヒトＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーターで起動されるＥＢＮＡ−ｌを構成的に発現する。
【０１１７】
哺乳動物培養細胞における発現に好ましいベクターは、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１（Ｋｏｄａｋ社）、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＥ１４−ＧＳ （ＣｅｌｌＴｅｃｈ社）、ｐＢＩＢ及びＶＲ１０１２（Ｈａｒｔｉｋｋａら（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７（１０）：１２０５〜１２１７）を含む。
【０１１８】
Ｇ． 宿主細胞
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された発現ベクターで形質転換又はトランスフェクションされ、かつ本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質コードする配列を含む細胞である。形質転換された宿主細胞は、所望のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現することができるが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡのクローニング又は増幅目的で形質転換された宿主細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現する必要はない。好ましくは発現されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、選択されたＤＮＡに応じて、培養培地又は上清に分泌される。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質が培養上清に分泌された場合は、これらが培養上清中に溶解することを、当業者は理解すると考えられる。
【０１１９】
外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への導入のための周知の手段のいずれかを用いて、発現ベクターを導入することができる。これらは、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）などの試薬、リポソーム法、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、微量注入法、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃アクセレーション（遺伝子銃）、又はクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は外因性遺伝物質を宿主細胞に導入するいずれか他の周知の方法の使用を含む（例えば前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの論文を参照のこと）。
【０１２０】
組換えタンパク質発現に適した宿主細胞は、適当なプロモーターの制御下での、原核細胞、酵母、又はより高等な真核細胞を含む。原核細胞は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。より高等な真核細胞は、以下に説明するような、昆虫又は哺乳動物給源の確立された細胞株を含む。細胞非含有翻訳系も、ＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いるＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の作製に使用することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主における使用に適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、「クローニングベクター：実験マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ（１９８５）に説明されている。
【０１２１】
原核細胞発現宿主を、徹底的なタンパク質分解及びジスルフィドプロセシングを必要としない、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の発現に使用することができる。原核細胞発現ベクターは一般に、１種以上の表現型の選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要件を提供するタンパク質をコードする遺伝子、宿主における増幅を確実にするために宿主により認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核細胞宿主は、大腸菌（例えばＢＬ２１（ＤＥ３） ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の様々な種を含むが、他の宿主も使用することができる。
【０１２２】
組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母宿主において発現することもできる。他の属の酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）も使用することができる。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現は、細菌シャトルベクター（例えば、ｐＰＩＣＺシリーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）への発現されるべき遺伝子のライゲーション、このベクターによる酵母の形質転換、及びこの酵母ゲノムのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）座への染色体組込みにより行われる。その後組換え酵母の選択は、例えばＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行われ、かつタンパク質発現は、増殖培地へのメタノールの添加により誘導される（Ｈｉｇｇｉｎら、「ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）プロトコール」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ． １０３、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９９８））。タンパク質発現に適したピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株は、例えばＳＭＤｌ１６８ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）株を含む。ＥＳＰ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの他の方法を基にした発現系も使用することができる。
【０１２３】
適切な酵母の形質転換プロトコールは、当業者に公知である。Ｈｉｎｄら（１９７８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７５：１９２９により記載された例示的な技術は、０．６７％酵母窒素ベース、０．５％カザアミノ酸、２％グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニン、及び２０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地においてＴｒｐ＋形質転換体を選択する段階を伴う。ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株は、８０ｍｇ／ｍｌアデニン及び８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる濃縮培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ）において、発現のために増殖することができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコースが使い果たされた時点で生じる。粗酵母上清を、濾過により収集し、かつ更なる精製まで４℃で保存する。
【０１２４】
様々な哺乳動物又は昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｒａ）細胞培養系も、同じく組換えポリペプチドの発現に使用することができる。昆虫細胞における異種ポリペプチドの産生のためのバキュロウイルス系は、例えばＬｕｃｋｏｗら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７（１９８８）において検証されている。適当な哺乳動物宿主細胞株の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３：１７５（１９８１）に記載されたサル腎細胞のＣＯＳ−７株、及び例えばＣＶ−１／ＥＢＮＡ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、ＮＳ−１、ＨｅＬａ、ヒト胚腎繊維芽細胞株（ＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ細胞株およびＨＥＫ２９３細胞株などを含む、適当なベクターの発現が可能であるような他の細胞株を含む。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント（例えば、複製起点、発現されるべき遺伝子に連結された適当なプロモーター及び／又はエンハンサー、及び５’又は３’近接非転写配列）並びに５’又は３’非翻訳配列（例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに転写終結配列）を含むことができる。好ましい哺乳動物発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、およびＢＨＫ細胞株である。
【０１２５】
Ｈ． 本発明の融合タンパク質の精製
精製されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、本発明のＤＮＡの組換え翻訳産物の発現に適当な宿主／ベクター系の培養、その後の培養培地又は細胞抽出物からの精製により調製することができる。例えば、組換えポリペプチドを培養培地に分泌する系の上清は、最初に例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットなどの市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮することができる。濃縮段階の後、この濃縮物を適当な精製マトリクスに適用することができる。例えば、適当なアフィニティマトリクスは、適当な支持体に結合されたカウンター構造（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）タンパク質（すなわち、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質が構造を基に特異的相互作用で結合しているようなタンパク質）又はレシチンもしくは抗体分子を含むことができる。
【０１２６】
あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、マトリクス又はペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する基質を使用することができる。これらのマトリクスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリスチレン、セファロース又は他の種類のタンパク質精製において通常使用されるものであることができる。あるいは、陽イオン交換手順を使用することができる。適当な陽イオン交換体は、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基、好ましくはスルホプロピル基を含む様々な不溶性マトリクスを含む。ゲル濾過クロマトグラフィーも、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の精製の手段を提供する。本発明の融合タンパク質は、好ましくは例えばｍｏｎｏＱカラム又はＱセファロース高速クロマトグラフィーを用いる、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。
【０１２７】
アフィニティクロマトグラフィーは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を精製する別の好ましい方法である。例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に対するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法を使用することによる、アフィニティクロマトグラフィー精製において有用である。
【０１２８】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地（例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１種以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）手順を用いて、更にＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質組成物を精製することができる。前述の精製手順の一部又は全部は、様々な組合せにおいて、均質な組換えタンパク質又はポリペプチドを提供するために使用することもできる。
【０１２９】
細菌培養において産生される組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、細胞ペレットからの最初の抽出により抽出されうり、その後、濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーの手順の１種以上が行われる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製手順のために使用することができる。組換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結解凍サイクル、音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、いずれか常法により破壊することができる。
【０１３０】
分泌タンパク質としてＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現する酵母細胞の発酵は、精製を非常に簡素化する。大規模発酵において得られる分泌された組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．、２９６：１７１（１９８４）に記載されたものに類似の方法で精製することができる。この参考文献は、分取ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの精製のための、２段階の逐次逆相ＨＰＬＣ手順を説明している。
【０１３１】
組換え培養において合成されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の調製は、培養物からＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を回収するために行われた精製手順によって量及び特徴が左右されるタンパク質を含む、非Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞成分を含むことができる。これらの成分は、通常酵母、原核生物又は非ヒト真核生物給源であることができる。このような調製物は、典型的にはその給源種において天然に認められるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に通常会合し得る他のタンパク質を含まない。
【０１３２】
自動合成は、本発明のタンパク質及びポリペプチド調製の別法を提供する。例えば、市販の固相技術、例えばアミノ酸が成長しているアミノ酸鎖に逐次追加されるメリフィールド固相合成法などのいずれかを用いることができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１４６（１９６３）参照）。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（フォスターシティ、ＣＡ）などの供給業者から市販されており、かつ一般に製造業者の指示に従い操作することができる。
【０１３３】
一般に、本明細書に記載されたようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）及びポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、その当初の環境から取り出されたものである。例えば、天然のタンパク質は、天然の系において共存する物質の一部又は全部から分離される場合に、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％の純度、より好ましくは少なくとも約９５％の純度、及び最も好ましくは少なくとも約９９％の純度である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないようなベクターにクローニングされる場合に、単離されているとみなされる。
【０１３４】
Ｖ． 結合物質
本発明は更に、本発明のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的に結合する、抗体及びそれらの抗原結合断片などの物質を提供する。本明細書で使用される抗体、又はそれらの抗原結合断片は、これが検出可能なレベル、すなわちバックグラウンドシグナル（例えばＥＬＩＳＡ内で）の少なくとも２倍以上で、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と反応し、かつ類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能なように反応しない場合に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に「特異的に結合」すると称される。本明細書で使用される「結合」とは、複合体が形成されるような、２個の個別の分子間の非共有結合的会合を意味する。結合能は、例えば複合体形成のための結合定数を決定することにより評価することができる。この結合定数は、複合体の濃度を、成分濃度の積で除算し、得られる。一般に、本発明の状況では、複合体形成の結合定数が約１０３ Ｌ／ｍｏｌを越える場合に、２種の化合物が「結合」すると称される。この結合定数は当技術分野において周知の方法を用いて決定される。
【０１３５】
結合物質は、更に本明細書に記載された代表的アッセイ法を用いて、患者を、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌などの癌の有無で識別することが可能である。別の表現をすると、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に結合する抗体又は他の結合物質は、疾患を有する患者の少なくとも約２０％において癌の存在を示すシグナルを発生し、かつ癌を有さない個体の少なくとも約９０％において疾患の非存在を示す陰性シグナルを発生すると考えられる。結合物質がこの要件を満足するかどうかを決定するために、癌を有する又は有さない患者（標準の臨床検査により決定された）由来の生体試料（例えば血液、血清、血漿、尿及び／又は腫瘍生検標本）は、結合物質に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されたようにアッセイすることができる。疾患を伴う又は伴わない試料の十分に有意な数をアッセイしなければならないことは明らかである。各結合物質は、前述の基準を満たさなければならないが；しかし、当業者は、結合物質を感度を向上するために組合せて使用することができることを認めると考えられる。
【０１３６】
前記要件を満たす任意の物質は、結合物質であることができる。例えば結合物質は、ペプチド成分を伴う又は伴わないリボソーム、ＲＮＡ分子又はポリペプチドであることができる。好ましい態様において、結合物質は、抗体又はその抗原結合断片である。抗体は、当業者に公知の様々な技法のいずれかにより調製することができる（例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照のこと）。一般に、抗体は、本明細書に記したモノクローナル抗体の作製、又は組換え抗体の作製をもたらすための、抗体遺伝子の適当な細菌又は哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションによる方法を含む、細胞培養技術により作製することができる。ある技法おいて、例えば融合ポリペプチド又は対象となる融合タンパク質の個々のポリペプチドの間の接合点に相当する配列（「接合領域」と称される）を含む免疫原が、最初に、広範な種類の哺乳動物のいずれか（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）に注射される。この手順において、対象となる融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質の接合領域は、修飾を伴わない免疫原として利用することができる。あるいは、特に比較的短い配列について、配列がウシ血清アルブミン又はキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質に連結されている場合に、優れた免疫応答が誘発される。この免疫原は、動物宿主に、好ましくは１回以上の追加免疫を含む予め定められた投与スケジュールに従い注射され、かつ動物は、定期的に採血される。次に融合ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、このような抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合した融合ポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、精製される。
【０１３７】
本発明の融合タンパク質に対して生じるポリクローナル抗体は、対象となる融合タンパク質とは特異的に免疫反応性であるが、融合タンパク質の個々のポリペプチド成分とは反応性でないようなポリクローナル抗体のみを得るように選択することができる。この選択は、対象となる融合タンパク質の個々のポリペプチド成分と交差反応する抗体の消去（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｎｇ）により行うことができる。
【０１３８】
あるいは、融合タンパク質の個々のポリペプチド成分の各々又は全てを認識する抗体は、本発明において有用である。
【０１３９】
対象となる免疫原性融合ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１〜５１９（１９７６））の技術、及びその改良法を用いて調製することができる。簡単に述べると、これらの方法は、所望の特性を有する抗体を産生することが可能である（すなわち、対象となる融合ポリペプチドと反応性がある）不死化された細胞株の調製に関する。このような細胞株は、例えば前述のように免疫処置した動物から得られた脾細胞から作製することができる。その後脾細胞は、例えば骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは免疫処置した動物と同系のものとの融合により、不死化される。様々な融合技法を用いることができる。例えば脾細胞及び骨髄腫細胞を、非イオン性界面活性剤と数分間一緒にし、かつその後ハイブリッド細胞の増殖を維持するが骨髄腫細胞はそうではないような選択培地に低密度で播種する。好ましい選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間経過後、通常約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが認められる。単独のコロニーを選択し、かつそれらの培養上清を、融合ポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性及び特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０１４０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーを増殖する上清から単離することができる。加えて、ハイブリドーマ細胞株の、マウスなどの適当な脊椎動物の腹腔への注射などの様々な技術を、収量を増大させるために使用することができる。その後モノクローナル抗体を、腹水又は血液から収集する。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿及び抽出などの常法により抗体から除去することができる。本発明の融合ポリペプチドは、例えばアフィニティクロマトグラフィー手順などの精製法において使用することができる。
【０１４１】
ある態様において、抗体の抗原結合断片の使用が好ましいことがある。このような断片は、通常の技術により調製することができるようなＦａｂ断片を含む。簡単に述べると、免疫グロブリンは、ウサギ血清からプロテインＡビーズカラム上のアフィニティクロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、上記）により精製し、かつパパイン消化し、Ｆａｂ及びＦｃ断片を得ることができる。Ｆａｂ及びＦｃ断片は、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティクロマトグラフィーにより分離することができる。
【０１４２】
本発明のモノクローナル抗体は、１種以上の治療的物質と併用することができる。これに関して適当な物質は、放射性核種、分化誘発剤、医薬品、毒物及びそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ及び２１２Ｂｉである。好ましい医薬品は、メトトレキセート、並びにピリミジン及びプリン類似体を含む。好ましい分化誘発剤は、フォルボールエステル及び酪酸を含む。好ましい毒物は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナスエンドトキシン、赤痢菌毒素、及びアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【０１４３】
治療的物質は、適当なモノクローナル抗体に直接又は間接（例えば連結基を介して）のいずれかで組み合わせ（例えば共有結合）することができる。物質と抗体の間の直接反応は、各々が他方と反応することが可能であるような置換基を有する場合に可能である。例えば、一方のアミノ基又はスルフヒドリル基などの求核基は、他方の、無水物又は酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、もしくは良好な脱離基（例えばハロゲン化物）を有するアルキル基と反応することができる。
【０１４４】
あるいは、連結基を介して治療的物質及び抗体と結合することが望ましい。連結基は、結合能による相互作用を避けるために、物質から抗体を隔てるためのスペーサーとして機能することができる。連結基は、物質又は抗体上の置換基の化学反応性を増大し、その結果結合効率を増大するためにも利用することができる。化学反応性の増加も、さもなければ可能でないような、物質、又は物質上の官能基の利用を促進する。
【０１４５】
当業者には、ホモ官能性及びヘテロ官能性の両方である様々な二官能性又は多官能性試薬（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ロックフォード、ＩＬ）のカタログに記載されたもの）を連結基として利用できることは明らかである。結合は、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は酸化された炭水化物残基を介して作用することができる。例えば米国特許第４，６７１，９５８号を含む、このような方法を記した多くの参照文献がある。
【０１４６】
治療的物質は本発明の免疫複合体の抗体部分を含まないとより強力であるので、細胞への内在化の途中又はその時点で切断されるような連結基を使用することがより望ましい。多くの様々な切断可能な連結基が説明されている。これらの連結基からの物質の細胞内放出の機序は、ジスルフィド結合の還元による（例えば米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定性の結合への照射（例えば米国特許第４，６２５，０１４号）による、誘導されたアミノ酸側鎖の加水分解による（例えば米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体が媒介した加水分解による（例えば米国特許第４，６７１，９５８号）、及び酸で触媒された加水分解による（例えば米国特許第４，５６９，７８９号）ような切断を含む。
【０１４７】
１種以上の物質が抗体に結合することが望ましい可能性がある。ある態様において、物質の複数の分子が、１抗体分子に結合される。別の態様において、１よりも多い種類の物質が、１抗体に結合される。この特定の態様に関らず、１よりも多い物質との免疫複合体は、様々な方法で調製することができる。例えば、１種よりも多い物質を、抗体分子に直接結合するか、又は複数の結合部位を提供するリンカーを使用することができる。あるいは担体を使用することができる。
【０１４８】
担体は、直接又は連結基を介した共有結合を含む、様々な方法で物質を運搬することができる。適当な担体は、タンパク質、例えばアルブミン（例えば米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド及び多糖、例えばアミノデキストラン（例えば米国特許第４，６９９，７８４号）などを含む。担体は、非共有結合又はリポソーム小胞（例えば米国特許第４，４２９，００８号及び第４，８７３，０８８号）内などへの封入によっても物質を運搬することができる。放射性核種に特異的な担体は、放射性ハロゲン化された小分子及びキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的放射性ハロゲン化された小分子及びそれらの合成を開示している。放射性核種キレート剤は、窒素及びイオウ原子を金属に結合するためのドナー原子として有するものを含む化合物、又は金属酸化物、放射性核種のキレートにより形成することができる。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的キレート化合物及びその合成を開示している。
【０１４９】
抗体及び免疫複合体の投与のためには、様々な経路を使用することができる。典型的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下又は切開された腫瘍の床（ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｄ ｏｆ ａ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ）である。抗体／免疫複合体の正確な用量は、使用した抗体、腫瘍上の抗原密度、及び抗体のクリアランス速度によって決まることは明らかであると考えられる。
【０１５０】
利用できる本発明の融合タンパク質に適当な抗体の例は、８０２９Ｋウサギポリクローナル抗体、マウスモノクローナルｃ−ｎｅｕ−３抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、及びマウスモノクローナルハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体（米国特許第５，６７７，１７１号）を含むが、これらに限定されるものではない。モノクローナルｃ−ｎｅｕ−３抗体は、ＥＣＤ−ΔＰＤ構築物において欠失された（１２４２〜１２５５ ａａ）ＰＤドメインの逐次エピトープを認識する。ハーセプチン抗体は、ＥＣＤドメインのコンホメーション性エピトープに結合する。
【０１５１】
ＶＩ． Ｔ細胞
同じく、又はあるいは、免疫療法用組成物は本発明の融合タンパク質に特異的なＴ細胞を含む。このような細胞は、インビトロ又はエクスビボにおいて調製することができる。例えば、Ｔ細胞は、患者の骨髄、末梢血、又は骨髄もしくは末梢血の画分から、市販の細胞分離系を用いて単離される（同じく米国特許第５，２４０，８５６号及び第５，２１５，９２６号；国際公開公報第８９／０６２８０号；第９１／１６１１６号及び第９２／０７２４３号を参照のこと）。あるいは、Ｔ細胞は、関連のある又はないヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株又は培養物に由来することができる。
【０１５２】
Ｔ細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／又はこのような融合ポリペプチドを発現している抗原提示細胞（ＡＰＣ）により刺激されることがある。このような刺激は、融合ポリペプチドに特異的なＴ細胞を生じる条件下及びそれに十分な時間で行われる。好ましくは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、特異的Ｔ細胞の形成を促進するためにミクロスフェアなどの送達ビヒクル内に存在する。
【０１５３】
Ｔ細胞が融合ポリペプチドで被覆されるか又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現している標的細胞を殺傷する場合に、Ｔ細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドに特異的であると考えられる。Ｔ細胞特異性は、様々な常法のいずれかで評価することができる。例えば、クロム放出アッセイ法又は増殖アッセイ法における、陰性対照と比較して溶解及び／又は増殖における刺激指数の２倍以上の増加は、Ｔ細胞の特異性を示している。このようなアッセイ法は、例えばＣｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４：１０６５〜１０７０（１９９４）に記載されている。あるいは、Ｔ細胞増殖の検出は、様々な公知の技法により達成される。例えばＴ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の増大した速度を測定することにより検出することができる（例えば、Ｔ細胞のトリチウム化されたチミジンとのパルス標識培養、及びＤＮＡに組入れられたトリチウム化されたチミジン量の測定）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との、３〜７日間の接触は、結果的にＴ細胞の増殖を少なくとも２倍増大する。前述のような２〜３時間の接触は、サイトカイン（例えばＴＮＶＦ又はＩＦＮ−γ）放出レベルの２倍の増加がＴ細胞活性化の指標となるような標準のサイトカインアッセイ法を用いて測定される、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、「現在の免疫学プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第１巻、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｅｊｅｎｃｅ、Ｇｒｅｅｎｅ （１９９８）参照）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は融合ポリペプチド発現ＡＰＣに反応して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的なＴ細胞は、常法を用いて拡張することができる。好ましい態様において、Ｔ細胞は、患者に由来するか、又は関連のある又はないドナーに由来し、かつ刺激及び発現後患者に投与される。
【０１５４】
治療目的で、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はＡＰＣに反応して増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで数を増やすことができる。このようなＴ細胞のインビトロにおける増殖は、様々な方法で行うことができる。例えば、Ｔ細胞は、インターロイキン−２のようなＴ細胞増殖因子及び／又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドを合成する刺激細胞の添加を伴う又は伴わずに、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドに再度晒すことができる。あるいは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の存在下で増殖するような１種以上のＴ細胞は、クローニングにより数を増大することができる。細胞クローニングの方法は当技術分野において周知であり、かつ限定希釈を含む。拡張後、これらの細胞は、例えばＣｈａｎｇら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．、２２：２１３（１９９６）に記載されているように、患者に戻される。
【０１５５】
ＶＩＩ． 本発明の融合タンパク質を含有する薬学的組成物及びワクチン組成物
別の好ましい態様において、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質、又はその変異体、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＩＣＤタンパク質、又はその変異体を含有する組成物に関する。この融合タンパク質は、好ましくは本明細書に詳述されたような、本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質、又はそれらの変異体である。ＩＣＤタンパク質は、好ましくは図７に示したＬｙｓ ６７６からＶａｌ １２５５を含む領域に広がる（配列番号：１）ヒトＩＣＤタンパク質であるか、又は図８に示されたＬｙｓ ６７７からＶａｌ １２５６を含むように広がるアミノ酸配列である（配列番号：２）ラットＩＣＤタンパク質である。あるいは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＩＣＤタンパク質は、免疫原性であるか又は増強された免疫原性を組成物に提供するような、ＩＣＤタンパク質の変異体又は一部である。例えば、ＩＣＤタンパク質の一部は、本明細書に記載されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤタンパク質、本明細書に記載されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ΔＰＤタンパク質、本明細書に記載されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＫＤタンパク質、又はＩＣＤタンパク質のＮ末端又はＣ末端から１〜１００個のアミノ酸のいずれかが順次除去されるようなＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＩＣＤタンパク質であることができる。加えて、本発明の変異体の他の態様を提供するためのアミノ酸置換は一般に、様々な方法で行うことができる。一つの態様において、保存的アミノ酸置換が前述のように行われる。
【０１５６】
ある局面において、本明細書に記載されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、Ｔ細胞及び／又は結合物質は、薬学的組成物又は免疫原性組成物（すなわちワクチン）中に混入され得る。薬学的組成物は、１種以上のこのような化合物及び生理的に許容できる担体を含む。ワクチンは、１種以上のこのような化合物及び非特異的免疫応答エンハンサーを含む。非特異的免疫応答エンハンサーは、外因性抗原に対する免疫応答を増強する任意の物質であることができる。非特異的免疫応答エンハンサーの例は、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えばポリラクティックガラクチド）及びリポソーム（その中に化合物が組入れられる、例えば米国特許第４，２３５，８７７号を参照）を含む。ワクチン調製物は、一般に例えばＰｏｗｅｌｌ及びＮｅｗｍａｎ編集の「ワクチン設計（Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｄｅｓｉｇｎ）」（サブユニット及びアジュバント法）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９５）に記載されている。ワクチンは、ＣＴＬ又はＣＤ４＋ Ｔ細胞から生じるような抗体免疫及び／又は細胞免疫を生じるように設計される。
【０１５７】
本発明の範囲内の薬学的組成物及びワクチンは、更に他の化合物も含み、これは生物学的に活性又は不活性であることができる。例えば、他の腫瘍抗原の１種以上の免疫原性部分が、組成物又はワクチン内に、融合ポリペプチドに組込まれるか又は個別の化合物のいずれかで存在することができる。ポリペプチドは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号及び第４，４７４，７５７号に開示されているように、他の巨大分子に複合化することができるが、必ずしも必要ではない。薬学的組成物及びワクチンは、一般に予防及び治療目的で使用される。
【０１５８】
薬学的組成物又はワクチンは、１種以上のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば前述のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ及び／又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤを含み、その結果、融合タンパク質がインサイチューで生成される。このようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された核酸又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。前述のようにポリヌクレオチドは、核酸発現系、細菌及びウイルス発現系を含む、当業者に公知の様々な送達系の任意の中に存在してもよい。多くの遺伝子送達技術が当技術分野において周知であり、例えばこれは本明細書に引用されている参考文献Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、１５：１４３〜１９８（１９９８）に記載されている。適当な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列を含む（例えば、適当なプロモーター及び終結シグナル）。細菌送達系は、その細胞表面上に融合タンパク質の免疫原性部分を発現するか又はこのようなエピトープを分泌するような細菌（例えばカルメット‐ゲラン杆菌）の投与に関連している。
【０１５９】
好ましい態様において、ＤＮＡは、ウイルス発現系（例えばワクシニア、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または、ＳＦＶなどのαウイルス）を用いて導入され、これにはウイルスの一部、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルス、またはウイルス全体の使用が伴う。
【０１６０】
一つの例示的態様において、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利かつ効率的なプラットフォームを提供する。本発明の融合タンパク質をコードする選択されたヌクレオチド配列をベクターに挿入することができ、当技術分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子内にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離して被験者に送達できる。多くの例示的レトロウイルスが説明されている（米国特許第５，２１９，７４０号、Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｓｍａｎ（１９８９）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ３：１０２−１０９参照）。
【０１６１】
加えて、多くの例示的アデノウイルスベースの系（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）も説明されている。宿主ゲノムに組込まれるレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体外に存在し続け、それにより挿入突然変異誘発関連性のリスクを最小にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４６１−４７６）。
【０１６２】
様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系も、ポリヌクレオチド送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当技術分野において周知の技術を用いて、容易に構築されうる（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公開公報第９２／０１０７０号および国際公開公報第９３／０３７６９号；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ、９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：１６５−１６９；ならびに、Ｚｈｏｕら（１９９４）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７９：１８６７−１８７５参照）。
【０１６３】
遺伝子導入による本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子の送達に有用な追加のウイルスベクターは、例えばワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスなどのポックスウイルス科に由来するものを含む。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルス組換え体を、下記のように構築することができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡを、最初に、ワクシニアプロモーター配列および、例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列などの近接するワクシニアＤＮＡ配列に隣接するように、適当なベクターへ挿入する。次にこのベクターを用いて細胞をトランスフェクションし、この細胞を同時にワクシニアに感染させる。相同的組換えを利用し、ワクシニアプロモーターおよび、関心対象の融合タンパク質をコードする遺伝子をウイルスゲノムへ挿入する。得られるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体は、５−ブロモデオキシウリジン存在下での細胞の培養、およびそれに耐性のウイルスプラークの採取により選択することができる。
【０１６４】
ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系は通常、本明細書に記載された一つ又は複数の融合タンパク質の、生物の宿主細胞における誘導可能な一過的発現または同時発現を提供するために、便利に使用されうる。この特定の系において、細胞は最初にインビトロにおいて、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体により感染される。このポリメラーゼは、これがＴ７プロモーターを持つ鋳型しか転写しないという点で、巧妙な（ｅｘｑｕｉｓｉｔｅ）特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターにより駆動された、関心対象の一つ又は複数のポリヌクレオチドでトランスフェクションする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質内で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクションされたＤＮＡをＲＮＡへ転写し、次にこれは宿主の翻訳機構によりポリペプチドへ翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の高レベルの一過的の細胞質内の産生を提供する（例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８３：８１２２−８１２６参照）。
【０１６５】
あるいは、家禽ポックスおよびカナリヤポックスのようなトリポックスウイルスを用いて、関心対象のコード配列を送達することもできる。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えトリポックスウイルスが非トリ種に投与された場合に、防御免疫をもたらすことがわかっている。トリポックス属の一員は、易感染性であるトリ種においてのみ生産的に複製でき、従って哺乳動物細胞においては非感染性であるため、トリポックスベクターの使用は、特にヒトおよび他の哺乳動物種において望ましい。組換えトリポックスウイルスの作製法は、当技術分野において公知であり、ワクシニアウイルスの作製に関して以前説明された遺伝子組換えを使用する（例えば、国際公開公報第９１／１２８８２号；国際公開公報第８９／０３４２９号；および国際公開公報第９２／０３５４５号参照）。
【０１６６】
多くのαウイルスベクターのいずれか（例えば、セムリキ森林ウイルス）を用いて、本発明のポリヌクレオチド組成物を送達することもでき、このようなベクターは、米国特許第５，８４３，７２３号；第６，０１５，６８６号；第６，００８，０３５号および第６，０１５，６９４号に開示されている。ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）に基づくある種のベクターも使用されうり、この例示的な実施例は米国特許第５，５０５，９４７号および第５，６４３，５７６号に見出されうる。
【０１６７】
更に分子接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ベクター、例えばミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）ら（１９９３）Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８：６８６６−６８６９およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：６０９９−６１０３に記載されたアデノウイルスキメラベクターもまた、本発明における遺伝子送達に使用されうる。
【０１６８】
これら及びその他のウイルスベースの送達系に関する、更なる例示的な情報は、例えばＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：３１７〜３２１（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、５６９：８６〜１０３（１９８９）；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８：１７〜２１（１９９０）；米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、及び第５，０１７，４８７号；国際公開公報第８９／０１９７３号；第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；欧州特許第０，３４５，２４２号；国際公開公報第９１／０２８０５号；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６〜６２７（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：２１５〜２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０：１１４９８〜１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８８：２８３８〜２８４８（１９９３）；及びＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ． Ｒｅｓ．、７３：１２０２〜１２０７（１９９３）において見出されうる。
【０１６９】
このような発現系にＤＮＡを組込む技術は、当業者に周知である。ＤＮＡは、例えばＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５〜１７４９（１９９３）に記載され、かつＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１６９１〜１６９２（１９９３）において検証されたように、「剥き出し」であってもよい。剥き出しのＤＮＡの取り込みは、細胞に効率的に輸送される、生分解性ビーズ上のＤＮＡのコーティングにより増大され得る。ワクチンは、ポリヌクレオチド及びポリペプチド成分の両方を含むことができることは明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供することができる。
【０１７０】
ワクチンが、本明細書に提供されたポリヌクレオチド及び融合ポリペプチドの薬学的に許容される塩を含むことは明らかである。このような塩は、有機塩基（例えば、一級、二級及び三級アミン及び塩基性アミノ酸の塩）及び無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩）を含む、薬学的に許容される無毒の塩基から調製することができる。
【０１７１】
当業者に公知の任意の適当な担体を、本発明の薬学的組成物において使用することができ、担体の種類は、投与の形態に応じて決まる。本発明の組成物は、例えば局所、経口、鼻腔内、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与を含む、投与に適当な方法で製剤することができる。皮下注射などの非経口投与については、、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又は緩衝液を含む。経口投与のためには、前述の担体又は固形担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムなどのいずれかを使用することができる。生分解性ミクロスフェア（例えばポリラクテートポリグリコレート）も、本発明の薬学的組成物のための担体として使用することができる。適当な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号；第５，０７５，１０９号；第５，９２８，６４７号；第５，８１１，１２８号；第５，８２０，８８３号に開示されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（５，８−２／ｎｅｕ）融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア内に封入されるか又はミクロスフェアの表面に会合されることができる。ある態様において、本明細書に記載されたＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア内に封入されている。代わりにもしくは加えて、本明細書に記載されたＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア中に封入されている。ミクロスフェアは、例えば、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質及びＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の両方を含むことができる。好ましくは、ミクロスフェアは、約２５μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約１０μｍである。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号に開示されている。
【０１７２】
このような組成物は、更に緩衝液（例えば、中性に緩衝された生理食塩水又はリン酸緩衝された生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、レシピエント血液に対し製剤を等張、低張又はやや高張とする溶質、懸濁剤、増粘剤及び／又は保存剤も含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥品として製剤することができる。化合物は、周知の技術を用いてリポソームに封入することもできる。
【０１７３】
様々な免疫応答エンハンサー又は免疫賦活物質のいずれかを、本発明のワクチンにおいて使用することができる。例えば、アジュバントを含むことができる。ほとんどのアジュバントは、抗原を急激な代謝から保護するように設計された物質、例えば水酸化アルミニウム又は鉱油など、及び免疫応答の刺激剤、例えばリピドＡ、百日咳菌（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質などの物質を含む。適当なアジュバントは市販されており、例えばフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、デトロイト、ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ社、ラーウェイ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、フィラデルフィア、ＰＡ）及びその変種；アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（アルム）又はリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化されたチロシンの不溶性懸濁液；アシル化された糖；陽イオン性又は陰イオン性に誘導された多糖；ポリホスファザン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡ及びＱｕｉｌ Ａがある。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、−７、もしくは−１２などのサイトカイン類も、アジュバントとして使用することができる。
【０１７４】
本明細書に記載されたワクチンにおいて、アジュバント組成物を、例えば主にＴｈ１型の免疫応答を誘発するように設計してもよい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）は、投与された抗原に対して細胞媒介した免疫応答を好んで誘発する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−ＩＣ）は、体液性免疫応答を好んで誘発する傾向がある。本明細書に記載されたようなワクチンの適用後、患者は、Ｔｈ１型及びＴｈ２型応答を含む免疫応答を維持すると考えられる。応答が主にＴｈ１型であるような好ましい態様において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルよりもより大きい程度に増大すると考えられる。これらのサイトカイン類のレベルは、標準のアッセイ法を用いて、容易にアッセイできると考えられる。サイトカインファミリーの検証については、Ｍｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｎｉｕｎｏｌ．、７：１４５〜１７３（１９８９）を参照のこと。
【０１７５】
主にＴｈ１型応答の誘発における使用が好ましいアジュバントは、例えばモノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化されたモノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の、アルミニウム塩との組合せを含む。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ社（シアトル、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号及び第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手できる。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここではＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）も、主にＴｈ１型応答を誘発する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、かつ例えば国際公開公報第９６／０２５５５号、国際公開広報第９９／３３４８８号、米国特許第６，００８，２００号、及び米国特許第５，８５６，４６２号に開示されている。免疫賦活性ＤＮＡ配列も説明されており、例えばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：３５２（１９９６）に記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは恐らく単独で又は他のアジュバントと組合せて使用することができる。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡ及びサポニン誘導体の組合せ、例えば国際公開公報第９４／００１５３号に記載されたようなＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合わせに関連しており、国際公開公報第９６／３３７３９号に記載されたようにＱＳ２１がコレステロールで失活されるより反応性の少ない組成物である。他の好ましい製剤は、水中油型乳剤及びトコフェロールを含む。水中油型乳剤中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールに関連している特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第９５／１７２１０号に開示されている。
【０１７６】
他の好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳアジュバントシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２、ＳＢＡＳ−４、もしくはＳＢＡＳ−６、又はそれらの変異体、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍから入手、リキセンサルト、ベルギー）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、ハミルトン、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ社、ハミルトン、ＭＴ）及び、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号及び第０９／０７４，７２０号記載のものなど、その他のアミノアルキルグルコサミニド−４−リン酸（ＡＧＰ）がある。
【０１７７】
好ましい態様において、アジュバントはＳＢＡＳ−２又はＳＢＡＳ−４である（例えば欧州特許第７３５８９Ｂ１号を参照）。
【０１７８】
本明細書に提供されたワクチンはいずれも、抗原、免疫応答エンハンサー及び適当な担体又は賦形剤の組合せを生じる周知の方法を用いて調製することができる。本明細書に記載された組成物は、徐放性製剤の一部として投与することができる（すなわち、投与後に化合物の緩徐な放出をもたらすカプセル剤又はスポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）などの製剤）。このような製剤は、一般に周知の技術を用いて調製され（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４：１４２９〜１４３８（１９９６）参照）、かつ例えば、経口、経直腸、又は皮下移植、もしくは所望の標的部位への移植により投与される。徐放性製剤は、担体マトリクス中に分散された及び／又は速度制御膜で囲まれた貯蔵器内に含まれた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体を含むことができる。
【０１７９】
このような製剤において使用するための担体は、生体適合性であり、かつ生分解性でもあり；好ましくは、この製剤は、比較的一定のレベルの活性成分放出を提供する。このような担体は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の微粒子に加え、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、及びデキストランを含む。他の遅効型放出担体は、非液体親水性コア（例えば架橋した多糖又はオリゴ糖）を含み、任意にリン脂質などの両親媒性化合物を含有する外層を含むような、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）を含む（例えば米国特許第５，１５１，２５４号；ならびに国際公開公報第９４／２００７８号、国際公開広報第９４／２３７０１号、及び国際公開広報第９６／０６６３８号を参照のこと）。徐放性製剤に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度及び予定期間、並びに治療又は予防される病態の性質によって決まる。
【０１８０】
様々な送達ビヒクルのいずれかを、腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の形成を促進するために、薬学的組成物及びワクチンにおいて使用することができる。送達ビヒクルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球及びＡＰＣが有効であるように操作された他の細胞などがある。このような細胞は、抗原提示能を増大し、Ｔ細胞応答の活性化及び／又は維持を改善し、それ自身抗腫瘍作用を有し、及び／又は受取り手と免疫学的に共存性があるように（すなわち合致したＨＬＡハロタイプ）遺伝的に修飾することができるが、これは必須ではない。ＡＰＣは、一般に腫瘍及び腫瘍周辺（ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ）組織を含む様々な体液又は器官のいずれかから単離され、かつ自家、同種、同系又は異種の細胞であることができる。
【０１８１】
本発明のある好ましい態様は、樹状細胞又はその前駆体を抗原提示細胞として使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ、３９２：２４５〜２５１（１９９８））、かつ予防的又は治療的抗腫瘍免疫を誘起する生理的アジュバントとして有効であることが示されている（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ．、５０：５０７〜５２９（１９９９）参照）。一般に樹状細胞は、それらの典型的形状（インサイチューで星型、インビトロにおいて目視できる著しい細胞質の隆起（樹状突起））、それらの隆起を縮め（ｔａｋｅ ｕｐ）かつ高い効率で抗原を提示する能力並びにそれらの天然のＴ細胞応答を活性化する能力を基に同定することができる。樹状細胞は、当然、通常インビボ又はエクスビボの樹状細胞においては認められない特異的細胞表面受容体又はリガンドを発現するように操作することができ、かつこのような修飾された樹状細胞が、本発明により考察されている。樹状細胞の代わりに、分泌された小胞抗原を負荷した樹状細胞（エキソソームと称される）は、ワクチンにおいて使用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、４：５９４〜６００（１９９８）参照）。
【０１８２】
樹状細胞及び前駆体は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血又はいずれか他の適当な組織もしくは液体から得ることができる。例えば末梢血から収集された単球を培養液に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３及び／又はＴＮＦαなどのサイトカインの組合せを添加することにより、エクスビボにおいて樹状細胞に分化することができる。あるいは、末梢血、臍帯血又は骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド及び／又は樹状細胞の成熟及び増殖を誘導する他の化合物の組合せを培養培地に添加することにより、樹状細胞に分化することができる。
【０１８３】
樹状細胞は、通常「未成熟」細胞及び「成熟」細胞に分類され、これは２種の良く特徴付けられた表現型の間で簡単に識別することができる。しかし、この命名法は、全ての可能性のある分化の中間段階を排除するように構築されるものではない。未成熟の樹状細胞は、抗原取り込み及びプロセシングの高い能力を伴うＡＰＣとして特徴付けられ、これはＦｃγ受容体及びマンノース受容体の高い発現と相関している。成熟表現型は、典型的にはこれらのマーカーの低い発現、しかしＭＨＣのクラスＩ及びクラスＩＩ、接着分子（例えばＣＤ５４及びＣＤ１１）及び同時刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び４−１ＢＢ）などの、Ｔ細胞活性化に寄与し得る細胞表面分子の高い発現で特徴付けられる。
【０１８４】
ＡＰＣは一般に、本発明の融合タンパク質（又はその変異体）をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクションされ、その結果融合タンパク質、又はその変異体が細胞表面に発現される。このようなトランスフェクションは、エクスビボで行われ、かつこのようなトランスフェクションされた細胞を含む組成物又はワクチンは、その後本明細書に記したように治療目的で使用することができる。あるいは、樹状又は他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを、患者に投与し、インビボで生じるトランスフェクションを得ることができる。樹状細胞のインビボ及びエクスビボのトランスフェクションは、例えば、一般に国際公開公報第９７／２４４４７号に開示されたもの、又はＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７５：４５６〜４６０（１９９７）に説明された遺伝子銃法などの当技術分野において公知の方法のいずれかを用いて行うことができる。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞又は前駆細胞の、対象となる融合タンパク質、ＤＮＡ（剥き出し又はプラスミドベクター内）又はＲＮＡとの；または、融合タンパク質を発現している組換え細菌又はウイルス（例えば、ワクシニア、トリポックス、アデノウイルス又はレンチウイルスベクター）との、インキュベーションにより達成される。負荷する前に、対象となる融合タンパク質を、Ｔ細胞ヘルプ（ｈｅｌｐ）（例えば担体分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合により複合化することができる。あるいは、樹状細胞を、複合化していない免疫学的パートナーで、個別に又は融合タンパク質存在下でパルスすることができる。
【０１８５】
ワクチン及び薬学的組成物は、シールされたアンプル又はバイアルなどの、単回用量又は反復用量用の容器中で提供することができる。このような容器は、使用時まで製剤の無菌性を保つために、密閉式にシールされることが好ましい。一般に製剤は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤として貯蔵される。あるいは、ワクチン又は薬学的組成物は、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵することもできる。
【０１８６】
当業者には、ワクチンのためのＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質又は核酸は、合成により調製するか、又は天然に由来することができることは明らかであると考えられる。
【０１８７】
ＶＩＩＩ． 本発明の融合タンパク質に対する免疫応答
Ａ． 本発明の融合タンパク質に対する免疫応答の検出
本発明のひとつの局面において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質（又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に関連する悪性腫瘍内で発現しているものを含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答を形成するために使用される。このような悪性疾患の例は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌及び前立腺癌である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質により一旦形成された、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答は長期に渡って存在し（ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ）、かつタンパク質が試験の時点で体内に存在するか否かに拘らず、免疫処置後しばらくして検出することができる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に対する反応により形成されるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫応答は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の特異的活性化もしくは抗体の有無、又は増強を試験することにより検出することができる。例えば、通常の技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離）により免疫処置された個体から単離されたＴ細胞は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と共にインキュベーションする。例えば、Ｔ細胞は、インビトロにおいて２〜９日間（典型的には４日間）３７℃でＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と共に（典型的には全タンパク質５μｇ／ｍｌ又はＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を合成する細胞の等級化された数）インキュベーションされる。別のＴ細胞試料アリコートを対照として利用するために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の非存在下でインキュベーションすることが望ましい。
【０１８８】
ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の特異的活性化は、様々な方法で検出することができる。特異的Ｔ細胞活性化の検出法は、これらに限定されるわけではないが、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えばリンホカイン）の産生、又は細胞溶解活性の発生（すなわちＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の形成）の検出を含む。ＣＤ４＋ Ｔ細胞について、好ましい特異的Ｔ細胞活性化の検出法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞について、好ましい特異的Ｔ細胞活性化の検出法は、細胞溶解活性の発生の検出である。
【０１８９】
Ｔ細胞増殖の検出は、様々な公知の技術により行うことができる。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成速度を測定することにより検出することができる。増殖するように刺激されているＴ細胞は、ＤＮＡ合成の上昇した速度を示す。典型的ＤＮＡ合成速度の測定法は、例えば、Ｔ細胞のトリチウム化されたチミジン、新たに合成されたＤＮＡに組入れられるヌクレオシド前駆体とのパルス標識培養である。組込まれるトリチウム化されたチミジンの量は、液体シンチレーション分光光度計を用いて決定することができる。Ｔ細胞増殖を検出する別法は、インターロイキン−２（ＩＬ２）産生、Ｃａ２＋灌流、又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムなどの色素取り込みの増分の測定を含む。あるいは、リンホカイン（例えばインターフェロン−γ）の合成を測定することができ、もしくは無傷のｐ１８５Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に応答することができるＴ細胞の相対数を定量化してもよい。
【０１９０】
Ｂ． 本発明の融合タンパク質に応答した抗体産生の検出
本発明は更に、Ｔ細胞が免疫原性であることに加え、Ｂ細胞を刺激し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を認識することが可能な抗体を産生することを明らかにするＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質にも関する。このような抗体の検出は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が悪性腫瘍に結合されている悪性疾患を診断する別の方法を提供する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に対する抗体特異性（すなわち、約１０７ ｌ／ｍｏｌ以上の結合親和性を示す）は、血清及び腹水を含む様々な体液中において見出されうる。簡単に述べると、体液試料を、融合タンパク質に対する抗体特異性が存在するかどうかを決定することが望ましい、ヒトなどの恒温動物から単離することができる。体液は、免疫複合体がＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質及びこの融合タンパク質に特異的な抗体の間に形成される条件下でそれに十分な時間、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と共にインキュベーションされる。例えば、体液及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、４６℃で２４〜４８時間インキュベーションされる。インキュベーション後、反応混合液を、免疫複合体の存在について試験する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質とＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的な抗体の間に形成された１種以上の免疫複合体の検出は、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）などの様々な公知の技術により達成することができる。
【０１９１】
適当なイムノアッセイ法は、Ｄａｖｉｄら（米国特許第４，３７６，１１０号）の二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法；モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａｍ及びＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ． ａｎｄ Ｓ． Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））；Ｇｏｒｄｏｎらの「ウェスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５：４９８０〜４９８３ （１９８０））；例えばＲａｉｎｅｓらの論文、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５７：５１５４〜５１６０（１９８２）に記載されたような酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＺＡ）；フルオロクロムの使用を含む免疫細胞化学的技術（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３９：４７７（１９８０））；及び、活性の中和（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：２３９６〜２４００（１９８４））を含む。前述のイムノアッセイ法に加え、多くの他のイムノアッセイ法を利用でき、これは米国特許第３，８１７，８２７号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号；及び米国特許第４，０９８，８７６号に開示されている。
【０１９２】
検出目的のためのＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質（すなわち抗原）は、標識又は非標識かのいずれであってもよい。非標識の場合、融合タンパク質は、凝集反応アッセイ法において使用されることがわかっている。加えて、非標識の融合タンパク質は、免疫複合体と反応性である標識分子と組合せるか、又は免疫グロブリンに特異的な抗体などの、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に対する抗体と反応性である標識された抗体（二次抗体）と組合せて使用することができる。あるいは融合タンパク質は、直接標識することができる。標識された場合、例えば放射性同位元素、発蛍光団、酵素、発光物質、色素粒子などのレポーター基を含む。これら及び他の標識物は、当技術分野において周知であり、かつ例えば米国特許第３，７６６，１６２号；第３，７９１，９３２号；第３，８１７，８３７号；第３，９９６，３４５号；及び第４，２３３，４０２号に開示されている。
【０１９３】
ＥＬＩＳＡにおいて、典型的には、対象となる融合タンパク質が、マイクロタイターウェルの表面に吸着される。その後表面上の残余のタンパク質結合部位が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱失活した正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（保存剤、塩及び消泡剤を含む脂肪非含有乾燥ミルクの緩衝液）などの適当な物質でブロッキングされる。その後ウェルを、特異的抗体を含むことが疑わしい試料と共にインキュベーションする。試料は、希釈せずに適用するか、もしくはより頻繁には通常ＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯなどのタンパク質を少量（０．１〜５．０質量％）含有する緩衝液中に希釈することができる。特異的結合が生じるのに十分な時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、非結合のタンパク質を除去し、かつ次にレポーター基で標識した抗種（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）特異的免疫グロブリン抗体と共にインキュベーションする。このレポーター基は様々な酵素から選択することができ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼがある。特異的結合が生じるのに十分な時間経過後、次にウェルを再度洗浄し、非結合の複合体を除去し、かつ酵素の基質を添加する。色を発色させ、ウェルの内容物の光学密度を、肉眼で又は装置により決定する。
【０１９４】
本発明のこの局面の好ましい態様の一つにおいて、レポーター基は対象となるＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に結合される。免疫複合体の検出手順は、実質的にあらゆる非結合のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の除去、及びその後のレポーター基の存在又は非存在の検出に関連している。
【０１９５】
別の好ましい態様において、レポーター基は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的な抗体への結合が可能な二次抗体に結合される。免疫複合体の検出手順は、（ａ）実質的にあらゆる非結合の抗体の除去、（ｂ）二次抗体の添加、（ｃ）実質的にあらゆる非結合の二次抗体の除去、及びその後の（ｄ）レポーター基の存在又は非存在の検出が関連している。関心対象のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的な抗体は、ヒトに由来し、二次抗体は、抗ヒト抗体である。
【０１９６】
免疫複合体検出の第三の好ましい態様において、レポーター基は、免疫複合体への結合が可能な分子に結合される。検出手順は、（ａ）分子の添加、（ｂ）実質的にあらゆる非結合の分子の除去、及びその後の（ｃ）レポーター基の存在又は非存在の検出が関連している。免疫複合体への結合が可能な分子の例は、プロテインＡである。
【０１９７】
免疫複合体を検出する様々な方法を本発明において使用することができることは、当業者には明らかである。これらの方法のいずれかにおける使用に適したレポーター基は、放射性同位元素、発蛍光団、酵素、発光物質、色素粒子などを含む。
【０１９８】
本発明の関連する局面において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と体液中のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的な抗体の間で形成される免疫複合体の検出は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ癌遺伝子が関連した悪性腫瘍に関してＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に関与している癌療法の効果をモニタリングするために使用することができる。治療開始前及びそれ以降に個体から採取された体液試料は、前述の方法論により免疫複合体について分析することができる。簡単に述べると、両方の試料中に検出された免疫複合体の数を比較する。第一の試料（治療前）に対する第二の試料（治療開始時以降）中の免疫複合体数の実質的変化は、治療がうまくいったことを反映している。
【０１９９】
ＩＸ． 癌療法
本発明の更なる局面において、本明細書に記載された組成物は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌及び前立腺癌などの癌の免疫療法に使用することができる。このような方法において、典型的には薬学的組成物及びワクチンを患者に投与する。本明細書で使用される「患者」とは、恒温動物、好ましくはヒトを意味する。患者は、癌に罹患していてもしていなくともよい。従って、前述の薬学的組成物及びワクチンを用いて、癌の発生を防止するか、又は癌に罹患した患者を治療することができる。悪性腫瘍の存在を含む癌は、当技術分野において一般に採用される診断基準を用いて診断することができる。薬学的組成物及びワクチンは、原発性腫瘍の外科的摘出及び／又は放射線療法又は従来の化学療法薬の投与などの治療の前又はそれ以降のいずれかに投与することができる。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、経直腸、経膣、局所、舌下及び経口の経路を含む、いずれか適当な方法で行うことができる。
【０２００】
特定の態様において、免疫療法は能動免疫療法であり、これは治療が、免疫応答を修飾する物質（例えば本明細書に提供されたような融合ポリペプチド及びポリヌクレオチド）の投与により腫瘍に対して反応するように、内在性宿主免疫系をインビボ刺激することに頼っている。
【０２０１】
他の態様において、免疫療法は、受動免疫療法であり、これは治療が、抗腫瘍作用を直接又は間接に変調することができかつ無傷の宿主免疫系には不要であるような、確立された腫瘍免疫反応性を伴う物質（エフェクター細胞又は抗体）の送達に関連している。エフェクター細胞の例は、前述のＴ細胞、Ｔリンパ球（例えばＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球及びＣＤ４＋ Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（ナチュラルキラー細胞及びリンホカインで活性化されたキラー細胞）、Ｂ細胞及び本明細書に記載された融合タンパク質を発現している抗原提示細胞（樹状細胞及びマクロファージなど）を含む。本明細書において列挙された融合ポリペプチドに特異的なＴ細胞受容体及び抗体受容体は、クローン化され、発現され、及び養子免疫療法のために他のベクター又はエフェクター細胞に転移される。本明細書において提供された融合ポリペプチドは、受動免疫療法のための抗体又は抗イディオタイプ抗体（前述及び米国特許第４，９１８，１６４号）の産生のために使用することができる。
【０２０２】
エフェクター細胞は、一般に本明細書に記したようにインビトロにおける増殖による養子免疫療法のために十分量得ることができる。１個の抗原特異性エフェクター細胞数の数十億個へのインビボにおける抗原認識を保持しながら増殖するための培養条件は、当技術分野において周知である。このようなインビトロ培養条件は、典型的には、多くはサイトカイン（ＩＬ−２など）及び未分化の支持細胞の存在中、抗原による間欠刺激を使用する。前述のように、免疫療法に十分な数の細胞を生成するために、本明細書において提供された免疫反応性融合ポリペプチドを用いて、急速に抗原特異性Ｔ細胞培養物を拡張することができる。特に樹状細胞、マクロファージ又はＢ細胞などの抗原提示細胞は、当技術分野において周知の技術を用いて、免疫反応性融合ポリペプチドでパルスされるか、又は１種以上のポリヌクレオチドでトランスフェクションされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルス又は他の発現系における発現を増大するのに適したプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクションすることができる。治療において使用するために培養されたエフェクター細胞は、増殖しかつ広範に分布し、かつインビボにおいて長期生存することができなければならない。培養されたエフェクター細胞を、ＩＬ−２が補充された抗原による反復刺激により、インビボで増殖しかつかなりの数で長期生存するように誘導することができることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１５７：１７７（１９９７）参照）。
【０２０３】
あるいは、本明細書において列挙された融合ポリペプチドを発現しているベクターは、患者から採取された抗原提示細胞に導入され、かつ同じ患者への戻し移植のためにエクスビボにおいてクローン性に繁殖することができる。トランスフェクションされた細胞は、当技術分野において公知の任意の手段を用い、好ましくは滅菌型の静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍内への投与で、患者に再導入することができる。
【０２０４】
本明細書に記載された治療的組成物の投与の経路及び頻度、更に用量は、個体毎に変動し、かつ常法を用いて容易に確立することができる。一般に、薬学的組成物及びワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は皮下）、鼻腔内（例えば吸引により）又は経口により投与される。好ましくは、１〜１０回用量で、５２週間にわたり投与される。好ましくは、１ヶ月間隔で６回用量が投与され、且つその後は追加免疫が定期的に施される。別のプロトコールが、個々の患者に適していることがある。適当な用量は、前述のように投与した場合に、抗腫瘍免疫応答を促進することが可能であり、かつ基本（すなわち未治療）レベルよりも少なくとも１０〜５０％高いような化合物の量である。このような反応は、患者における抗腫瘍抗体の測定によるか、又はインビトロにおいて患者の腫瘍細胞を殺傷することが可能な細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存型の形成により、モニタリングすることができる。このようなワクチンは、ワクチン投与した患者においてワクチン投与しない患者と比べて改善された臨床の転帰（例えば、より頻繁な寛解、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存）に繋がるような免疫応答の惹起も可能であるはずである。一般に、１種以上の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物及びワクチンについて、各融合タンパク質の量は、宿主１ｋｇにつき、約１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜５ｍｇ、及び最も好ましくは５μｇ〜２５０μｇの範囲の用量で存在する。適当な投与サイズは、患者のサイズによって変動するが、典型的には約０．１ｍｌ〜約５ ｍｌである。
【０２０５】
好ましくは、初回又は一次免疫は、例えば少なくとも１種のＥＣＤ及び／又はＩＣＤ又はＰＤを有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質によって、並びに次回又は追加免疫は、例えば少なくとも１種のＥＣＤ及び／又はＩＣＤ又はＰＤを有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質によって行われると考えられる。免疫処置に好ましいＥＣＤ−ＩＣＤ及び／又はＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、本明細書に記載されたものを含む。当業者には、本発明が、無傷のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の使用に加え、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質の複数のペプチドへの分裂を意図していることは理解されると考えられる。更に、例えば本明細書に記載されたΔＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質（例えばマウスΔＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質）などの、完全なＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の変異体もまた、本発明における免疫処置に使用されうる。無傷のヒトｐ１８５Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質もＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤドメイン全体（又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤドメインの一部）のアミノ酸配列を有するペプチドも、単独では免疫処置に使用されない。
【０２０６】
一般に、適当な用量及び治療様式は、治療及び／又は予防の利益を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような反応は、治療した患者において未治療の患者と比べて改善された臨床の転帰（例えば、より頻繁な寛解、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存）を確立することにより、モニタリングすることができる。予め存在するＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質に対する免疫応答の増加は、一般に改善された臨床の転帰に相関している。このような免疫応答は、一般に、治療の前後に患者から得られた試料を用いて行うことができる、通常の増殖アッセイ法、細胞傷害性アッセイ法、又はサイトカインアッセイ法を用いて評価することができる。
【０２０７】
Ｘ． 癌の検出
Ａ． 癌の検出法
一般に、癌は、患者から得た生体試料（血液、血清、血漿、尿及び／又は腫瘍生検標本など）中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質及び／又はこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を基に患者において検出することができる。別の言い方をすると、このようなタンパク質は、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌などの癌の有無を示すためのマーカーとして使用することができる。本明細書に提供された結合物質は、一般に生体試料中の物質に結合しているＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質レベルの検出をもたらす。ポリヌクレオチドのプライマー及びプローブを使用し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出することができ、このことは更に癌の有無の指標でもある。一般に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍配列は、腫瘍組織において正常組織よりも少なくとも３倍高いレベルで存在しなければならない。
【０２０８】
試料中のポリペプチドマーカーの検出のための結合物質の使用については、当業者に公知の様々なアッセイ形式がある（例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、前記を参照のこと）。一般に、患者における癌の有無は、（ａ）患者から得られた生体試料と結合物質との接触段階；（ｂ）試料中の結合物質と結合するポリペプチドレベルの検出段階；及び（ｃ）ポリペプチドの予め定められたカットオフ値との比較段階により決定されうる。
【０２０９】
好ましい態様において、本アッセイ法は、試料の残余からポリペプチドに結合しかつこれを除去するための固体支持体上に固定された結合物質の使用に関する。その後結合したポリペプチドは、レポーター基を含みかつ結合物質／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出することができる。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチド又は抗体に特異的に結合するような結合物質、もしくは結合物質に特異的に結合するような他の物質、例えば抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ又はレクチンなどを含むことができる。あるいは、競合アッセイ法を利用することができ、ここでポリペプチドは、レポーター基で標識され、かつ試料と結合物質のインキュベーション後に固定された結合物質に結合することが可能である。試料の成分が標識されたポリペプチドの結合物質への結合を阻害する程度は、試料の固定された結合物質との反応性の指標である。このようなアッセイ法における使用に適したポリペプチドは、前述のような、結合物質が結合するような完全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍タンパク質及びその一部、並びに結合物質が結合するようなＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質及びその一部である。
【０２１０】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着することができるような当技術分野において公知の任意の物質であることができる。固体支持体は、例えばマイクロタイタープレート中の試験ウェル又はニトロセルロースもしくは他の適当な膜である。あるいは、支持体は、例えばガラス、ガラスファイバー、ラテックス又はポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルなどのプラスチック材料のようなビーズ又はディスクである。支持体は更に、例えば米国特許第５，３５９，６８１号に開示されたものなどの、磁気ビーズ又は光ファイバーセンサーであることもできる。この結合物質は、当業者に公知の様々な技術を用いて、固体支持体上に固定することができ、これらは、特許及び科学文献に十分に説明されている。本発明の文脈において、「固定」という用語は、吸着などの非共有結合的会合、及び共有結合的付着（物質と支持体上の官能基の間の直接の連結、又は架橋剤による連結）の両方を意味する。マイクロタイタープレートのウェル又は膜への吸着による固定が好ましい。このような場合、吸着は、結合物質の適当な緩衝液中での固体支持体との適当な時間接触することにより達成される。この接触時間は温度により変動するが、典型的には約１時間〜約１日の間である。一般に、プラスチック（ポリスチレン又はポリ塩化ビニル）製マイクロタイタープレートのウェルの、結合物質約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲との接触が、適量の結合物質の固定に十分である。
【０２１１】
結合物質の固体支持体への共有結合的付着は、一般に支持体と結合物質上のヒドロキシル又はアミノ基などの官能基の両方と反応するであろう二官能性試薬と、支持体の第一の反応により達成される。例えばこの結合物質は、ベンゾキノンを用いるか、又は支持体上のアルデヒド基の、結合パートナーのアミン及び活性水素との縮合により、被覆された適当な高分子を有する支持体に共有結合的に付着することができる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３参照）。
【０２１２】
ある態様において、アッセイ法は、２抗体サンドイッチアッセイ法である。このアッセイ法は、一般にはマイクロタイタープレート上のウェルである固体支持体上に固定されている抗体と、試料の最初の接触により行うことができ、その結果試料中のポリペプチドは、固定された抗体に結合することができる。次に非結合の試料が、固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、かつレポーター基を含む検出試薬（好ましくはポリペプチドの異なる位置に結合することが可能な二次抗体）が添加される。その後固体支持体に結合された残留する検出試薬の量は、具体的なレポーター基に適した方法で決定される。
【０２１３】
より詳細には、前述のように一旦抗体が、支持体上に固定されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロッキングされる。例えばウシ血清アルブミン又はＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）などのブロッキング剤が当業者に公知である。その後固定された抗体は、試料とインキュベーションされ、かつポリペプチドは、抗体と結合することが可能になる。試料は、インキュベーション前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適当な希釈剤で希釈することができる。一般に適当な接触時間（すなわちインキュベーション時間）は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌を伴う個体から得られた試料中のポリペプチドの存在を検出するのに十分な期間である。好ましくは、接触時間は、結合及び非結合のポリペプチド間の平衡を達成するような少なくとも約９５％の結合レベルに達するのに十分なものである。当業者は、平衡に到達するのに必要な時間が、ある期間をかけて生じる結合レベルのアッセイ法により容易に決定されることを認めると考えられる。室温でのインキュベーション時間は、概して約３０分で十分である。
【０２１４】
その後、非結合試料を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳなどの適当な緩衝液により固体支持体を洗浄して除去する。その後レポーター基を含む二次抗体が固体支持体に添加される。好ましいレポーター基は、先に列記された基を含む。
【０２１５】
その後検出試薬を、固定化した抗体−ポリペプチド複合体と共に、結合したポリペプチド検出するのに十分な時間インキュベーションする。適当な時間は通常ある期間に生じる結合レベルのアッセイ法により決定される。その後、非結合の検出試薬は除去され、かつ結合した検出試薬が、レポーター基を用いて検出される。レポーター基の検出に用いられる方法は、レポーター基の性質によって決まる。放射性基については、シンチレーション計数又はオートラジオグラフ法が一般に適している。分光学的方法は、色素、発色基及び蛍光基を検出するために使用される。ビオチンは、様々なレポーター基（市販の放射性もしくは蛍光基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出される。酵素レポーター基は一般に、基質の添加（一般に特定の時間）、その後の反応生成物の分光学的又はその他の分析により検出される。
【０２１６】
乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌などの癌の有無を決定するために、固体支持体に結合し続けているレポーター基で検出されたシグナルは、一般に予め定められたカットオフ値に相当するシグナルと比較される。ある好ましい態様において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体が癌を有さない患者の試料と共にインキュベーションされた場合に得られたシグナル中位値の平均である。一般に、予め定められたカットオフ値よりも標準偏差の３倍高いシグナルを発生する試料は、癌について陽性とみなされる。別の好ましい態様において、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、「臨床疫学：臨床用医薬品の基本的科学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｎｏｌｏｇｙ ： Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、Ｌｉｔｔｌｅ Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．、１９８５、ｐ．１０６〜１０７に記載された方法に従いＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｕｒｖｅを用いて決定される。簡単に述べると、この態様において、カットオフ値は、診断試験結果の各々の可能性のあるカットオフ値に相当している真の陽性率（すなわち感度）及び偽陽性率（１００％特異性）のプロット対により決定される。左上隅（すなわち最大面を囲う値）に最も近いプロット上のカットオフ値は、最も正確なカットオフ値であり、かつこの方法で決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、陽性であるとみなし得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最小化するために、プロットに沿って左側にシフトされるか、又は偽陰性率を最小化するために、右側にシフトされる。一般に、この方法で決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、癌について陽性とみなされる。
【０２１７】
関連する態様において、アッセイ法は、フロースルー又はストリップ試験形式において行うことができ、ここで結合物質は、ニトロセルロースなどの膜上に固定される。フロースルー試験において、試料中のポリペプチドは、試料が膜を通過する際に、固定された結合物質に結合する。その後第二の標識された結合物質は、第二の結合物質を含有する溶液が膜を通って流れる際に、結合物質−ポリペプチド複合体に結合する。次に結合された第二の結合物質の検出が前述のように行われる。ストリップ試験形式においては、結合物質が結合した膜の一方の端が、試料を含有する溶液中に浸漬される。試料は膜に沿って、第二結合物質を含む領域を通りかつ固定された結合物質の領域へと移動する。固定された抗体の領域の第二結合物質の濃度は、癌の存在を示す。典型的には、その部位の第二結合物質の濃度は、線状などのパターンを形成し、これは容易に目視できる。このようなパターンが存在しない場合は、結果は陰性である。一般に、膜に固定された結合物質の量は、生体試料が前述の形式の２抗体サンドイッチアッセイ法において陽性シグナルを発生するのに十分なポリペプチドのレベルを含む場合に、肉眼により識別できるパターンを形成するように選択される。このようなアッセイ法で使用するのに好ましい結合物質は、抗体及びその抗原結合断片である。好ましくは、膜上に固定された抗体量は、約２５ ｎｇ〜約ｌμｇ、及びより好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、典型的には極少量の生体試料で行うことができる。
【０２１８】
当然、腫瘍タンパク質、又は本発明の結合物質の使用に適している多くの他のアッセイプロトコールが存在する。先の説明は、単に例証するためのものである。例えば、前記プロトコールは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポリペプチドを用い、生体試料中のこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出するように容易に修飾することができることは、当業者には明らかであると考えられる。このようなＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に特異的な抗体の検出は、癌の存在と相関している。
【０２１９】
癌は、同じく又はあるいは、生体試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在を基にしても検出される。ある方法において、患者から単離されたＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む生体試料は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド、このような融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又は少なくともこのような融合ポリペプチドを発現しているＡＰＣと共にインキュベーションされ、かつＴ細胞の特異的活性化の有無が検出される。適当な生体試料は、単離されたＴ細胞を含むが、これに限定されるものではない。例えばＴ細胞は、常法（例えば末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離による）により、患者から単離することができる。Ｔ細胞は、インビトロにおいて２〜９日間（典型的には４日間）、３７℃で、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド（例えば５〜２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベーションすることができる。対照として利用するために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドが存在しないＴ細胞試料の別のアリコートをインキュベーションすることが望ましい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞について、活性化は、Ｔ細胞の増殖を評価することで検出されることが好ましい。ＣＤ８＋ Ｔ細胞について、活性化は、細胞溶解活性の評価により検出されることが好ましい。罹患していない患者よりも少なくとも２倍大きい増殖レベル及び／又は少なくとも２０％大きい細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示している。
【０２２０】
前述のように、癌は、同じく又はあるいは、生体試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを基に検出してもよい。例えば、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドプライマーを、生体試料由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕ ｃＤＮＡの一部を増幅するアッセイ法を基にしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用することができ、ここで少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわちこれにハイブリダイズする）。その後増幅されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動などの当技術分野において周知の技術を用いて分離・検出される。同様に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、生体試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ法において使用することができる。
【０２２１】
アッセイ条件下のハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、長さが少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドであるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分との同一性か、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、及びより好ましくは少なくとも約９０％であるオリゴヌクレオチド配列を含まなければならない。オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは、前述のように中等度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されたＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが好ましい。診断法において有用に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは、好ましくは、長さが少なくとも１０〜４０個のヌクレオチドである。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：９、１０又は１１に記載された配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲベースのアッセイ法及びハイブリダイゼーションアッセイ法の両技術共、当技術分野において周知である（例えばＭｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ， Ｑｕｎａｎｔ． Ｂｉｏｌ．、５１：２６３（１９８７）；Ｅｒｌｉｃｈ編集、「ＰＣＲ技術（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）参照）。
【０２２２】
ある好ましいアッセイ法は、ＰＣＲが逆転写と組合せて適用されるＲＴ−ＰＣＲを使用する。典型的には、ＲＮＡが生検組織などの生体試料から抽出され、かつ逆転写され、ｃＤＮＡ分子を作製する。少なくとも１種の特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生じ、これは、例えばゲル電気泳動を用いて、分離・可視化される。増幅は、被験患者から及び癌に罹患していない個体から得られた生体試料上について行われる。増幅反応は、２桁にわたるｃＤＮＡの数種の希釈物で行うことができる。被験患者試料の数種の希釈物における発現の、非癌性試料の同じ希釈物と比較した場合の２倍又はそれ以上の増加は、典型的には陽性と認められる。
【０２２３】
別の態様において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質及びこのようなタンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、癌の進行のモニタリングのためのマーカーとして用いることができる。この態様において、癌の診断のための前述のアッセイ法は、経時的に行うことができ、かつ反応性ポリペプチドレベルの変化が評価される。例えば、このアッセイ法は、６ヶ月から１年の間２４〜７２時間毎に行われ、その後は必要に応じて行われる。一般に、結合物質により検出されるポリペプチドのレベルが経時的に増加する患者においては、癌が進行している。対照的に、反応性ポリペプチドのレベルが、一定であるか又は時間と共に減少する場合は、癌は進行していない。
【０２２４】
あるインビボ診断アッセイ法は、腫瘍について直接行うことができる。このようなアッセイ法のひとつは、腫瘍細胞を、結合物質と接触することを含む。その後結合された結合物質は、レポーター基により直接又は間接に検出することができる。このような結合物質は、同じく組織学的用途においても使用することができる。あるいは、ポリヌクレオチドプローブを、このような用途において用いることができる。
【０２２５】
前述のように、感度を向上するために、複数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質マーカーを、所定の試料内でアッセイすることができる。本明細書に提供された様々なタンパク質に特異的な複数の結合物質が、単独のアッセイ法で組合せることができることは明らかであると考えられる。更に、複数のプライマー又はプローブを同時に使用することができる。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、どの組合せが最適な感度を生じるかを決定するための通常の実験を基にすることができる。加えて、又はあるいは、本明細書に提供された腫瘍タンパク質のアッセイ法は、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイ法と組合わせることができる。
【０２２６】
Ｂ． 診断キット
更に本発明は、前述の診断方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。このようなキットは、典型的には、診断アッセイ法を行うのに必要な２種以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器及び／又は装置であることができる。例えばキット内のひとつの容器は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を含む。このような抗体又は断片は、前述のように、支持体材料に付着して提供することができる。１個以上の別の容器には、アッセイ法において使用される試薬又は緩衝液などの要素が収まっている。このようなキットは、更に又はあるいは、前述のような抗体結合の直接又は間接の検出に適したレポーター基を含む検出試薬も含むことができる。
【０２２７】
あるいは、キットは、生体試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するために設計することができる。このようなキットは、前述のような、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドを、例えばＰＣＲ又はハイブリダイゼーションアッセイ法において使用することができる。このようなキットに存在する追加成分は、第二のオリゴヌクレオチド及び／又は診断試薬又はＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を促進するための容器を含む。
【０２２８】
本明細書に引用された全ての出版物及び特許明細書は、個々の出版物及び特許明細書が具体的かつ個別に参照として組入れられることが指示されるのと同じように、本明細書に参照として組入れられている。
【０２２９】
前述の発明は、理解を明確化する目的で例証及び実施例によりある程度詳細に説明されているが、当業者には、本発明の内容は、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りは、それに変更及び修飾を行うことができることは明らかであると考えられる。
【０２３０】
ＸＩ． 実施例
実施例において、オリゴヌクレオチドプライマー、リポフェクトアミン、および制限エンドヌクレアーゼのように、一般的な分子生物学の試薬は、主にＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から入手した。制限エンドヌクレアーゼであるＡａｔＩＩおよびｐｆｌＭ−Ｉは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＬＩＳＡアッセイキットおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的モノクローナル抗体Ａｂ−３は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｈａｓｓｅｔ、ＮＹ）から購入した。ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現ベクターおよびＦＬＡＧタグＭ２抗体はＫｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）から購入した。ＰｆｕポリメラーゼはＳｔａｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手した。ｐｃＤＮＡ ３．１／ｈｙｇ発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【０２３１】
実施例１
ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現ベクターにおけるＨｅｒ−２／ｎｅｕのＩＣＤ、ＫＤおよびＰＤ断片のクローニング
細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、キナーゼドメイン（ＫＤ）、およびリン酸化ドメイン（ＰＤ）をコードするＨｅｒ−２／ｎｅｕのＤＮＡ断片が、ポリメラーゼ連鎖反応によって別々に得られた。制限切断部位であるＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩが、これらの５’末端および３’末端に導入された。この設計により、Ｎ末端にプレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）のリーダー配列およびＦＬＡＧタグ配列のあるフレームを持つｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現ベクター（Ｋｏｄａｋ）でＤＮＡ断片がクローニングされた。ＰＣＲ産物がゲルから精製され、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＳａｌＩ部位でクローニングされた。その結果、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＩＣＤ（図１）、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＫＤ（図２）、およびｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＰＤ（図３）が発現プラスミドとして設計された。
【０２３２】
実施例２
ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ発現ベクターにおけるＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質のクローニング
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤをコードするＤＮＡ断片が、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。ゲルから精製された後、ｐＴ７−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕプラスミドのＡａｔＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位でクローニングされた。この方法により、ＥＣＤおよびＰＤを一緒に結合させた新規のクローニングベクターであるｐＴ７／ＥＣＤ−ＰＤ（膜貫通ドメインのセリンを含む）が作製された。ｐＴ７／ＥＣＤ−ＰＤプラスミドは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで３７℃、１時間処理することにより切断された。ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質をコードする２．７ｋｂのＤＮＡ断片がゲルから精製され、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位でサブクローニングされた。得られた発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇＥＣＤ−ＰＤとして設計された（図５）。
【０２３３】
実施例３
ＨＥＫ−２９３細胞におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕのＩＣＤ、ＫＤ、およびＰＤ断片の発現
ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現プラスミド（Ｋｏｄａｋ）は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインのどの部分が培地中に分泌されるのかを特定するために使用された。このタンパク質は、実施例１で記載したように、Ｎ末端にプレプロトリプシンの分泌シグナルおよびＦＬＡＧタグを持つ融合タンパク質として発現された。
【０２３４】
ＩＣＤ、ＫＤおよびＰＤを発現している細胞系のトランスフェクションおよび培養は以下のように行われた。ヒト胎児腎臓線維芽細胞（ＨＥＫ−２９３細胞）が１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地で培養された。トランスフェクション前日に、６穴培養プレートの各ウェルに１．５×１０５個の細胞が播種された。トランスフェクションには１μｇのプラスミドＤＮＡを使い、無血清培地中でリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）によって行われた。培地および細胞は、７２時間後に回収された。安定な形質転換株を選別するために、トランスフェクトされた細胞は２００μｇ／ｍｌハイグロマイシン添加培地で培養された。
【０２３５】
以下のように、細胞および培地中のＦＬＡＧタグ融合タンパク質に対するアッセイをウェスタンブロット解析によって行った。トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の培地および細胞溶解液が、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離された。タンパク質は電気泳動によって、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写された。ＰＶＤＦ膜は、最初に５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でインキュベートし、一次抗体と共に１時間インキュベートした後、最後にペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体で、さらに１時間インキュベートした。免疫ブロットは、ＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を使用して行った。マウスのモノクローナル抗体であるｃ−ｎｅｕ ＡＢ−３（「Ａｂ−３」）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）がＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するために使用された。ＡＢ−３は、ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のカルボキシル末端を認識する。ＦＬＡＧタグ融合タンパク質を検出するために、解析にはＭ２モノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ）を一次抗体として使用した。
【０２３６】
図４に示された結果から、全長のＩＣＤおよびＫＤはいずれも分泌されないが、ＰＤは培地中に検出されたことが示された。この結果は、ＫＤの構造によってタンパク質が細胞膜を通過できないことを示す。
【０２３７】
実施例４
ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ発現ベクターを使ったＨＥＫ−２９３細胞およびＣＨＯ細胞におけるＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現
実施例２で示したように、Ｎ末端にプレプロトリプシン分泌シグナルおよびＦＬＡＧタグを持つＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質が構築された。
【０２３８】
ＥＣＤ−ＰＤを発現している細胞系のトランスフェクションおよび増殖は以下のように行われた。ＨＥＫ−２９３細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。トランスフェクション前日に、６穴培養プレートの各ウェルに１．５×１０５個の細胞を播種した。トランスフェクションは１μｇのプラスミドＤＮＡを使い、無血清培地中でリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で行った。培地および細胞は７２時間後に収穫された。安定な形質転換株を選別するために、トランスフェクトした細胞は、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン添加培地で培養した。
【０２３９】
可溶性ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の分泌を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤに特異的な抗体を用い、ＥＬＩＳＡアッセイ法によって以下のように測定した。試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を結合するために、マイクロプレートをＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なマウス抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）でプレコーティングした。試料の入ったマイクロプレートを室温で一晩インキュベートした後、検出用抗体と共に１時間インキュベートした。それから、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体を加えて、さらに１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼの基質であるｏ−フェニレンジアミンを添加すると、着色産物が形成された。この着色産物を分光光度計で定量した。４９０ｎｍにおける吸光度は試料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質量を反映している。
【０２４０】
その後、可溶性ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパクが、以下のようにＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＰＤ特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析で特定された、すなわち、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の培地および細胞溶解液が、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離された。タンパク質は電気泳動によって、ＰＶＤＦ膜に転写された。ＰＶＤＦ膜を５％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳＴでインキュベートし、次に一次抗体と共に１時間インキュベートしてから、最後にペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体で、さらに１時間インキュベートした。免疫ブロットは、ＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて行った。本実験では、マウスＡｂ−３モノクローナル抗体（「Ａｂ−３」）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）が、本実験においてＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を検出するために使用された。ＡＢ−３はヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のカルボキシル末端を認識する。ＦＬＡＧタグ融合タンパク質を検出するために、解析にはＭ２モノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ）を一次抗体として使用した。図６に結果を示す。
【０２４１】
実施例５
ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ発現ベクターにおけるヒトＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質のクローニング
図１３（配列番号：７）に示したように、ヒトＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質は、以下のプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された。
ＰＤＭ−２５１ ５’−ｃｃｔｇａａｔｃｇｃｇａａｃｃｃａａｇｔｇｔｇｃａｃｃｇｇｃａｃ−３’ （配列番号：１５） Ｔｍ ６９℃
ＰＤＭ−２７９ ５’−ｃｔｇｇａｃｔｃｇａｇｔｃａｔｔａｇｃｇｇｔｇｃｃｔｇｔｇｇｔｇｇ−３’ （配列番号：１６） Ｔｍ ６９℃
【０２４２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の条件下で行った。１０μｌ １０×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌ １０μＭ各プライマー、８３μｌ 滅菌水、１．５μｌ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、および５０ｎｇ鋳型で、９６℃ ２分×１回；（９６℃ ２０秒、６９℃ １５秒、７２℃ ５分）×４０回；７２℃ ５分×１回。ＰＣＲ産物はＮｒｕ ＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＰＤＭ Ｈｉｓベクター（平滑制限酵素カッターＥｃｏ７２Ｉを持つインフレームのＨｉｓタグ改変ｐＥＴ２８ベクター）でクローニングを行い、Ｅｃｏ７２ＩおよびＸｈｏＩで切断した。配列を確認し、組換えプラスミドを大腸菌発現用のＢＬ２１ ｐＬｙｓ Ｓに形質転換した。プラスミド構築物は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断され、同じ制限酵素で切断されたｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇＥＣＤ−ＰＤにクローニングされた。
【０２４３】
実施例６
大腸菌におけるヒトＥＣＤ−ＰＤ−ＣＴ−ＨＩＳタグ融合タンパク質の発現
ヒトＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、実施例２で示されたようにｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇベクターでクローニングされ、Ｃ末端に６×ヒスチジンタグを持つフレームでｈＥＣＤ−ＰＤを構築するための鋳型として使用した。ｈＥＣＤ−ＰＤは以下のプライマーを使用し、ＰＣＲによって増幅した。
ＡＷ０２８ ＮｃｏＩ部位を持つ ｈＥＣＤ−ＰＤセンスプライマー：
５’−ＧＧＧｃｃａｔｇｇｇｇＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣ−３’ （配列番号：１７）
ＡＷ０２９ ＸｈｏＩ部位を持ち、終止（ｓｔｏｐ）のないｈＥＣＤ−ＰＤアンチセンスプライマー：
５’−ＧＧＧｃｔｃｇａｇＣＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’ （配列番号：１８）
【０２４４】
その後、ＰＣＲ産物はＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断、精製され、２つの同じ制限酵素で直鎖状にしたｐＥＴ２８ｂ発現ベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換し、いくつかのコロニーがスクリーニングのために選別された。これらのうち、ｈＥＣＤ−ＰＤ．ＣＴｈｉｓクローンがＤＮＡ配列によって確認され、その後タンパク質発現に使用された。
【０２４５】
タンパク質発現のために、ｈＥＣＤ−ＰＤ．ＣＴｈｉｓクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＵ大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使って行われた。最も良好な結果はＴＢ培地で３７℃、２時間培養したときに得られた。
【０２４６】
大腸菌が産生したｈＥＣＤ−ＰＤ．ＣＴｈｉｓは、その後、モノＱカラムで精製され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）緩衝液でリフォールディングされた。リフォールディングされたタンパク質が分析され、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ（図１７）によってハーセプチン結合陽性であることが示された。しかし、おそらくタンパク質が変性したために、ハーセプチン結合活性は後に消失した。
【０２４７】
実施例７
大腸菌におけるヒトＮＴ−ＨＩＳタグ−ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現
ヒトＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質が、５’側Ｎｄｅ Ｉおよび３’側ＸｈｏＩの制限酵素部位を持つｐＰＤＭ発現ベクターでクローニングされた。ＥＣＤ−ＰＤ挿入物はＮ末端に６×ヒスチジンタグを持つフレームに融合された。
【０２４８】
タンパク質発現のために、ＮＴｈｉｓ−ｈＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質を含むｐＰＤＭベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＵ大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使用して行われた。ＴＢ培地で３０℃、２時間細胞を増殖させた場合には、最も良好な結果が得られた。
【０２４９】
大腸菌に由来する未精製のＮＴｈｉｓ−ｈＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、マウスｂｃ−ｎｅｕ−３抗体およびウサギ抗ＥＣＤ抗体によって認識された。次に行う精製で、大腸菌由来のＮＴｈｉｓ−ｈＥＣＤ−ＰＤは、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイ法の両方（図１７）において、ハーセプチンで認識された。
【０２５０】
実施例８
大腸菌におけるマウスＥＣＤ−ＰＤ−ＣＴ−ＨＩＳタグ融合タンパク質の発現
以下のように、実施例２で示されたヒトＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質のクローニングと同様の方法で、マウスＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質が、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターでクローニングされた。この構築物はさらに、Ｃ末端の６×ヒスチジンタグに続いて終止コドンを持つフレームにｍＥＣＤ−ＰＤを構築するための鋳型として使用された。ｍＥＣＤ−ＰＤ／ｐｃＤＮＡ３．１構築物（１９３２塩基対のＯＲＦ）のＮｃｏＩ内部部位は、以下のプライマーを用いた部位指定突然変異誘発法により発現しないように突然変異を起こさせた。
ＡＷ０３８プライマー：
５’−ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧ−３’ （配列番号：１９）
ＡＷ０３９プライマー：
５’−ＣＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣ−３’ （配列番号：２０）
【０２５１】
配列が確認された後、ｍＥＣＤ−ＰＤ融合構築物は、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。
ＮｃｏＩ制限酵素部位を持つＡＷ０３６センスプライマー：
５’−ＧＧＧｃｃａｔｇｇＧＴＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧＧ−３’ （配列番号：２１）
ＸｈｏＩ制限酵素部位を持つＡＷ０３７アンチセンスプライマー：
５’−ＧＧＧｃｔｃｇａｇＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧ−３’ （配列番号：２２）
【０２５２】
その後、ＰＣＲ産物は、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断、精製され、同じ２つの制限酵素で直鎖状にしたｐＥＴ２８ｂ発現ベクターにライゲーションされた。
【０２５３】
ライゲーション産物をＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。配列解析によって、４つのコロニーが選別された。これらのうち、正しい配列を持つｍＥＣＤ−ＰＤ．ＣＴｈｉｓクローンを、ＢＬ２１（ＤＥ３） ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＵ大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使って行われた。２倍濃度のＹＴ培地で３０℃、３時間培養した場合に、最も良好な結果が得られた。
【０２５４】
実施例９
大腸菌におけるＲａ１２−ｍＥＣＤ−ＰＤ−ＣＴＨＩＳタグ融合タンパク質の発現
実施例８に述べられたように、マウスＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質がｐＥＴ２８ｂ発現ベクターにクローンニングされた。Ｒａ１２配列は、以下のように５’末端および３’末端にＮｃｏＩ部位を加えたＰＣＲ断片を使って増幅された。
Ｒａ１２．ＪＣ０５：  ５’−ＣＣＧｃｃａｔｇｇＧＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＣＧＡＴＡＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：２３）
Ｒａ１２．ＪＣ０６：  ５’−ＧＣＧｃｃａｔｇｇＣＧＧＣＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣ−３’（配列番号：２４）
【０２５５】
ｍＰＣＤ−ＥＤとＲａ１２のアジュバント融合（ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ）を得るために、Ｒａ１２ＰＣＲ産物がＮｃｏＩ制限酵素で切断され、ＮｃｏＩで切断されＣＩＡＰ処理されたｐＥＴ２８ｂ−ｍＥＣＤ−ＰＤベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。方向性の非特異的なライゲーション反応のために、２倍のコロニーがプラスミドミニプレップのために採取された。正方向の挿入物をスクリーニングするために、これらのコロニーは、ＡｆｉＩＩＩ制限酵素で切断でされた。正方向性を示す少数のクローンの配列が解析された。発現のために、正方向の１クローンをＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＵ大腸菌コンピテントセルに形質転換した。誘導産物を決定するために、形質転換されたクローンを使い、標準少量発現スクリーニングを行った。最も良好な結果は、細胞をＬＢ培地で３７℃、３時間培養した場合に得られた。
【０２５６】
実施例１０
大腸菌におけるＬｅＩｆ．ｍＥＣＤ−ＰＤ−ＣＴＨＩＳタグ融合タンパク質の発現
実施例８で述べられたように、マウスｍＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクターでクローニングされた。ＬｅＩＦ配列は５’末端および３’末端にＮｃｏＩ部位を付け加えた、以下のＰＣＲ断片を使って増幅された。
ＬｅＩｆ．ＪＣ０３：  ５’−ＣＧＣｃｃａｔｇｇＣＧＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＣＧＣＣＣ−３’（配列番号：２５）
ＬｅＩｆ．ＪＣ０４：  ５’−ＧＣＣｃｃａｔｇｇＣＧＴＣＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号：２６）
【０２５７】
ｍＰＣＤ−ＥＤとＬｅＩＦのアジュバント融合を得るために、ＬｅＩＦ ＰＣＲ産物がＮｃｏＩ制限酵素で切断され、ＮｃｏＩで切断されＣＩＡＰ処理されたｐＥＴ２８ｂ−ｍＥＣＤ−ＰＤベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。方向性の非特異的なライゲーション反応のために、２倍のコロニーがプラスミドミニプレップのために採取された。正方向の挿入物をスクリーニングするために、これらのコロニーは、Ｋｐｉ Ｉ制限酵素で切断でされた。正方向性を示す少数のクローンの配列が解析された。発現のために、正方向の１クローンをＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＵ大腸菌コンピテントセルに形質転換した。誘導産物を決定するために、形質転換されたクローンを使い、標準少量発現スクリーニングを行った。もっとも良好な結果は、細胞を２倍濃度のＹＴ培地で３０℃、３時間培養した場合に得られた。
【０２５８】
実施例１１
ピチアにおけるＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現
ピチアで発現するために使用されたＥＣＤ−ＰＤ組換えタンパク質は、２つの改良点を持つＣＨＯでの発現用と同様に設計された：（ｉ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の天然の分泌シグナル配列はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファプレ・プロシグナル配列によって置換され；且つ（ｉｉ）組換えタンパク質のＣ末部分は、１個のグリシンおよび６個のヒスチジンによって延長された。
【０２５９】
ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現カセットは、スフェロプラスト法によってピチアＳＭＤ１１６８株に組み込まれた。複数コピーが組み込まれた６株のクローンは、定量的ドットブロット解析により２５０株のクローンから選別された。選別されたクローンは、緩衝されたメタノール混合培地（ＢＭＭＹ−１％）中で７２時間のフラスコ振盪培養によって誘導された。６株の候補クローンは、細胞を含まない上清および全細胞抽出液中で、同様の発現特性を示した。
【０２６０】
細胞非含有上清中には、全長のＥＣＤ−ＰＤ組換えタンパク質の分泌は非常に少なく、ｃ−ｎｅｕ−３マウス抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いたウェスタンブロットでのみ検出された。±７０ｋＤａタンパク質の分泌および蓄積（７２時間後に最大）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色で可視化された。また、ハーセプチンマウス抗体を用いた非還元条件下でのウェスタンブロットによって検出された。このタンパク質は、マウスｃ−ｎｅｕ−３抗体またはマウス抗ヒスチジン抗体（ＱＩＡＧＥＮ）を用いても検出されなかった。
【０２６１】
全細胞抽出液では、銀染色試薬第一キットを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、特異的なバンドは検出されなかった。マウスｃ−ｎｅｕ−３抗体または抗ヒスチジン抗体を使ったウェスタンブロットによって、２本のバンドが検出された。１本は、以下に示すＣＨＯ細胞の発現産物である分泌型ＥＣＤ−ＰＤとして観察されたものと、同じ分子サイズを持つ。もう１本は１００〜１２０ｋＤａの大きさで、「スメア（ｓｍｅａｒ）」のように見える。これらの２本のシグナルは、Ｅ．Ｒ．に保持されているにＥＣＤ−ＰＤ組換えタンパク質で、様々な形態に糖化されたものに相当する可能性がある。
【０２６２】
実施例１２
ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質のＣＨＯＫ１細胞における発現
ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ／ＥＣＤ−ＰＤおよびｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ／ＥＣＤ−ΔＰＤプラスミドが、Ｘｂａ Ｉ制限酵素によって切断され、ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質を含むＤＮＡ断片が、各々２７８３塩基対および２１６６塩基対のＸｂａ Ｉ断片としてゲルから精製された。各断片は、Ｘｂａ Ｉ（ＣＭＶ極初期プロモーターの下流にあるクローニング部位）で直鎖状にしたｐＥＥ１４−ＧＳベクター（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ）に移された。ライゲーション後に、ＤＨ５αコンピテント大腸菌細胞に形質転換された。制限酵素の切断によって解析された１６個のコロニーのうち、ＥＣＤ−ＰＤに対しては２のコロニーが陽性で、そしてＥＣＤ−ΔＰＤに対しては１個のコロニーが陽性であることが示された。得られたプラスミドは大量培養され、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒの二重勾配遠心法によって精製された。プラスミドは、制限酵素切断による解析、および挿入物とプラスミド間の５’および３’連結部位の配列決定による解析で異常のないことが示された。
【０２６３】
マスターセルバンク（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ；ＭＣＢ）ＣＨＯ−Ｋ１ ０２８Ｗ １９９６／２ ＳＨＦ ｐ３１由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞が、無血清条件下で懸濁培養され、ｐＥＥ１４−ＥＣＤ−ＰＤおよびｐＥＥ１４−ＥＣＤ−ΔＰＤの両プラスミドに古典的なＤＮＡリン酸カルシウム共沈殿法でトランスフェクトされた。トランスフェクション後４８時間で細胞数が計測され、９６穴プレートに５０００個／ウェルの密度で培養された。トランスフェクトされた細胞は、Ｃｒｏｃｋｅｔｔら、（（１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈ．、８：６６２）によって述べられたグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現系に従って選別され、グルタミン無添加のＧＭＥＭ培地に、３０μＭメチオニンスルフォキサミン（ＭＳＸ）、添加物（グルタミン酸／アスパラギン／ヌクレオシド）、および５％の透析済みウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えて増殖させた。細胞は第１週目に３回洗浄され、トランスフェクションを行う第２週目には２回洗浄された。３回目の洗浄で２０％の馴化培地が添加された。５回目の洗浄で、選別のレベルを上げるためにＭＳＸの濃度が５０μＭまで増加された。
【０２６４】
ＭＳＸ形質転換コロニーは、トランスフェクション後３〜５週間で２４穴プレートに移され、培養上清が回収された。ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質の発現はハーセプチン抗体を使った非還元条件下で、ウェスタンブロット解析により検査され、一方、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現は、検査された５２株のクローンのうち１８株で検出された。ＥＣＤ−ΔＰＤでの発現では、検査された４７株のクローンのうち１３株が陽性だった。融合タンパク質を発現している選別されたクローンは、無血清培地条件下での懸濁液に再度馴化された。発現レベルに基づいて、ＥＣＤ−ＰＤ構築物を保持する５株のクローンおよびＥＣＤ−ΔＰＤ構築物を保持する３株のクローンの生育と生存可能性が評価され、特徴が示された。ＥＣＤ−ＰＤ構築物としては、クローンＦ５６０ Ｆ３の発現レベルが最も高かった。
【０２６５】
発現は、３３℃で酪酸ナトリウム（２ ｍＭ）およびＤＭＳＯ（２％）の有無によって評価された。いくつかのクローンはＮａＢまたはＤＭＳＯによって誘導された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤの発現は、ウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く、銀染色またはクーマシー染色のいずれかによって解析された。８０９２Ｋウサギポリクローナル抗体に加えて、ハーセプチンおよびｃ−ｎｕ−３マウスモノクローナル抗体がウェスタンブロット解析に使用された。ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤクローンの培養上清の解析では、クーマシー／銀染色されたゲルにおいて、それぞれ１５０ｋＤａおよび９８ｋＤａのバンドが検出された。同様のバンドは、ＥＣＤ−ＰＤだけに対するｃ−ｎｅｕ−３抗体（図１８）に加えて、ハーセプチンおよび８０２９Ｋポリクローナル抗血清によって示された。ＣＨＯで発現されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質は、ハーセプチン抗体によって認識される（図１８）。
【０２６６】
融合タンパク質の発現レベルは、次の細胞へ継代する間の安定性についても継続して検討された。５株のＥＣＤ−ＰＤクローンと２株のＥＣＤ−ΔＰＤクローンが継代期間中追跡調査され、発現の安定性が、ウェスタンブロット解析により評価された。解析された７株のクローンのうち４株は３２代以上の継代でも安定していた。しかし、そのうちの１株は死亡率が高く、その他のクローンでは細胞の大型化が見られた。
【０２６７】
ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤクローンの中で、最も良好なクローン２株を使って少規模産生が行われた。細胞は２ ｍＭ酪酸ナトリウムを添加した無血清培地で３３℃、１２０時間懸濁培養した。融合タンパク質の発現は両方とも、ハーセプチン抗体を使ったウェスタンブロットおよび銀染色試薬、第一キットを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。いずれの融合タンパク質も＋／− １００μｇ／ｍｌの発現がみられた。
【０２６８】
実施例１３
ＣＨＯ細胞で発現したＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質の精製
ＣＨＯ細胞での発現と分泌に続き、ＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質は、Ｑセファロース高性能カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。カラムに上清を添加する前に、１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．５に調整した。クロマトグラフィーのために、１ｍｌのＱセファロース高性能樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がＣ１０／１０カラムとして使用された（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０２６９】
カラムは、最初に４ ｍｌ／分でカラムの１０倍容積の水で平衡化され、次に４ ｍｌ／分で１倍容積の０．５Ｍ水酸化ナトリウム、それから４ ｍｌ／分で１０倍容積の緩衝液Ａ（２０ ｍＭＢｉｓ−ＴｒｉｓプロパンｐＨ６．５−５０ ｍＭ  塩化ナトリウム）で平衡化された。カラムに試料を添加し、１ ｍｌ／分の流速で送液した。その後、２８０ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．１に達するまで、カラムを１ ｍｌ／分の緩衝液Ａで洗浄し、２０倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。溶出の前に流動を逆転させて、３倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。
【０２７０】
溶出は最初に、流速１ ｍｌ／分の緩衝液Ｂ（２０ ｍＭ Ｂｉｓ−ＴｒｉｓプロパンｐＨ６．５−２５０ ｍＭ塩化ナトリウム）を用いて行われ、それから緩衝液Ｃ（２０ ｍＭ Ｂｉｓ−ＴｒｉｓプロパンｐＨ６．５−１ ｍＭ塩化ナトリウム）を用いた。対象となる融合タンパク質は緩衝液Ｂで溶出した。
【０２７１】
融合タンパク質はフェニルセファロース６ファーストフロー低置換（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｌｏｗ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の疎水性クロマトグラフィーによってさらに精製された。ＥＣＤ−ＰＤＤ融合タンパク質およびＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質を含む溶出液（緩衝液Ｂ  溶出液）は、固体の硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を添加することで１Ｍ濃度のＡＭＳ（１４０ｇ／ｌｉｔｅｒの溶液）になるように調整された。溶液のｐＨは７．０になるように調整した。
【０２７２】
クロマトグラフィーのために、０．５ ｍｌのフェニルセファロース６ファーストフロー低置換（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｌｏｗ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が、Ｃ１０／１０カラムとして使用された（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。カラムは最初に４ ｍｌ／分でカラムの１０倍容積の水で平衡化され、次に４ ｍｌ／分で１倍容積の０．５Ｍ水酸化ナトリウム、その後、４ｍｌ／分で１０倍容積の緩衝液Ｄ（１ｍＭ ＰＯ４ ｐＨ ７．０−１Ｍ ＡＭＳ）で平衡化された。平衡化に続いて試料を添加し、０．５ｍｌ／分の流速でカラムを通過させた。２８０ｎｍでのＯ．Ｄ．がベースラインに達するまで、カラムは０．５ ｍｌ／分の緩衝液Ｄで洗浄され、それから１ ｍｌ／分の１０倍容積で洗浄された。溶出前に流動を逆転させて、３倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。溶出は１ ｍｌ／分のＥ緩衝液（１ｍＭ ＰＯ４ ｐＨ ７．０）で行った。
【０２７３】
精製された融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、第一キットを使用した銀染色、および８０９２Ｋウサギポリクローナル抗体またはマウスハーセプチン抗体を使ったウェスタンブロットによって解析された。これらの解析から、２段階の精製ステップによる純度はデンシトメトリー（Ｂｉｏｒａｄ ＧＳ−７００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）によって＋／− ９０％と判定された。ウェスタンブロット解析から、モノマーは精製の間、主要バンドに保持され、酸化レベルがあがっていないこと、そしてハーセプチン抗体を使って示されたように、対象となるエピトープの検出は、精製条件によって変化しないことが示された。各々の融合タンパク質の総量は、タンパク質比色法（ＤＯＣ ＴＣＡ ＢＣＡ）を使って測定された。このアッセイ法では、７５ｍｌの培養物から純度＋／− ９０％のレベルで、それぞれ２ｍｇのＥＣＤ−ＰＤおよび４ ｍｇのＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質が精製されたことになる。
【０２７４】
実施例１４
マウスＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ＰＤＴｃＰ０融合タンパク質の哺乳動物細胞における発現
完全長マウスＮｅｕ、ΔマウスＮｅｕ、マウスＥＣＤ−ＰＤおよびマウスＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０組換えタンパク質を発現する、一過的トランスフェクションされた哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞を作製した。マウスＥＣＤＰＤおよびマウスＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０組換えタンパク質を発現する安定ＨＥＫクローンも作製した。
【０２７５】
哺乳動物細胞における組換え発現のために、様々な形状のマウスＮｅｕ（ｍＮｅｕ）ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターへとサブクローニングした。完全長ｍＮｅｕ（図１９）を、ｐＢＩＢおよびＶＲ１０１２ベクターにサブクローニングし、かつ、ｍＮｅｕ ｃＤＮＡの２２６１位における操作されたＡ−Ｔ塩基対の変更（およびそれに続くリシンからメチオニンへのアミノ酸の変更）を含むΔｍＮｅｕを、ｐＢＩＢベクターへサブクローニングした。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメイン（ＰＤ）をコードするｃＤＮＡ、ならびにＥＣＤ、ＰＤおよび６個のアミノ酸ＴｃＰ０ドメインをコードするｃＤＮＡを、完全長マウスＮｅｕ ｃＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ増幅により作製した。次にこれらのＥＣＤ−ＰＤおよびＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０産物を、ＤＨＦＲゲノム断片を含むように修飾された哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へとサブクローニングした。全ての構築物を、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）へ、Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。簡単に述べると、ＨＥＫ細胞を、細胞密度１００，０００個／ｍｌとなるよう、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中に播種し、一晩増殖させた。翌日、２μｌのＦｕｇｅｎｅ ６を、ＦＢＳを含有しないＤＭＥＭ １００μｌ中に添加し、室温で１５分間インキュベーションした。Ｆｕｇｅｎｅ ６／ＤＭＥＭ混合液を次に、１μｇのｍＮｅｕ／発現ベクターＤＮＡに添加し、かつ室温で１５分間インキュベーションした。その後Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合液をＨＥＫ２９３細胞へと添加し、かつ３７℃で４８時間〜７２時間、７％ＣＯ２下でインキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後遠心分離により収集しペレット化した。ウェスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液中で細胞を氷上で３０分間インキュベーションすることにより、全細胞溶解液を作製した。溶解液を次に、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離することにより透明化させた。試料を、β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥロード用緩衝液により希釈し、次に１０分間煮沸し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質をニトロセルロース膜に移行させ、マウスモノクローナル抗体−３（ｃ−ｎｅｕ ３；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社）を濃度１μｇ／ｍｌで用いてプロービングした。ブロットを、ＨＲＰに結合したヤギ抗マウスＩｇにより明らかにし、その後ＥＣＬ基質中でインキュベーションした（図２１）。
【０２７６】
本明細書において本発明の特定の態様は例示を目的として説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることが、先に記した内容から理解されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】サイズが６．７ｋｂである、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＩＣＤ発現プラスミドの地図を示す。
【図２】サイズが５．７ｋｂである、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＫＤ発現プラスミドの地図を示す。
【図３】サイズが５．７ｋｂである、ｐＦＬＡＧＣＭＶ−１／ＰＤ発現プラスミドの地図を示す。
【図４】実施例３に説明されたように、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインが、培養培地に分泌され、かつＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞内ドメイン及びＨｅｒ−２／ｎｅｕキナーゼドメインが培養培地に分泌されなかったことを示す。
【図５】サイズが８．３ｋｂである、ｐｃＤＮＡ３．ｌ／ｈｙｇｒｏ／ＥＣＤ−ＰＤ発現ベクターの地図を示す。
【図６】実施例４に説明されたように、ＨＥＫ−２９３及びＣＨＯ細胞におけるＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の発現の結果、並びに融合タンパク質が培養培地に分泌されたことを例示している。
【図７−１および図７−２】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図８−１および図８−２】ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。このキナーゼドメインは、アミノ酸７２１位からアミノ酸９９８位を含むように広がっている。
【図９】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図１０】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメイン（ＰＤ）のアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図１１】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメインの好ましい部分（ΔＰＤ）のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【図１２−１および図１２−２】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びリン酸化ドメイン（ＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びリン酸化ドメインの好ましい部分（ΔＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【図１４】ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図１５−１から図１５−８】ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号：９）及び、コードされるタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。この完全長ヌクレオチド配列は、国際公開公報第９６／３０５１４号に開示されている。
【図１６−１および図１６−２】ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。この完全長ヌクレオチド配列は、Ｂａｒｇｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３１９：２２６〜３０（１９８６）、及びＧＥＮＢＡＮＫ／Ｘ０３３６２に開示されている。
【図１７】哺乳動物細胞又は大腸菌のいずれかにおいて産生された様々なＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質へのハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）結合に関するＥＬＩＳＡアッセイ法の結果を示す。大腸菌において産生された融合タンパク質は、Ｃ末端又はＮ末端６×ヒスチジンタグ（各々、Ｃ−Ｈｉｓタグ及びＮ−Ｈｉｓタグと記す）を伴うフレーム内にある。
【図１８】無血清条件下、懸濁液中で増殖したＣＨＯ−Ｋ１における、及びピチア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞における、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質発現の比較を示している。
【図１９−１および図１９−２】マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。
【図２０−１から図２０−３】マウスＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【図２１】ＨＥＫ２９３溶解液における、マウスＮｅｕ（ｍＮｅｕ）、マウスΔＮｅｕ（ΔｍＮｅｕ）、マウスＥＣＤ−ＰＤ（ｍＥＣＤＰＤ）およびマウスＥＣＤ−ＰＤＴｃＰ０（ｍＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０）の組換えタンパク質発現のウェスタンブロット分析の結果を示す。タンパク質の検出には、ｃＮｅｕ３抗ＰＤ抗体を使用した。ΔマウスＮｅｕは変異キナーゼドメインを有するが、ｍＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０は、リボソームＰ−ペプチドエピトープをコードする６ｍｅｒペプチドを含む。
【図２２−１から図２２−３】マウスＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２７）を示す。
【図２３】マウスＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号：２８）を示す。
【図２４−１から図２４−３】マウスＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２９）を示す。
【図２５】マウスＥＣＤ−ＰＤ−ＴｃＰ０融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（配列番号：３０）を示す。
【図２６】ＴｃＰ０ペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３１）を示す。
【図２７】ＴｃＰ０ペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：３２）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521609.tif 000196
2004521609.tif 000197
【国際調査報告】
2004521609.tif 000198
2004521609.tif 000199
2004521609.tif 000200
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