(57)【要約】本発明は、回折光学要素の使用下に、共焦測定容量中の光学的励起による発光分子の測定法に関する。この方法は、特に、例えば、蛍光−相関分光法による又は動力学的光散乱による単一分子測定に好適である。更に、本発明による方法の実施のために好適な装置が明らかにされる。
2004530137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を包含する共焦測定容量物中の光学的励起による発光分子の測定法：
（a）発光分子を包含するプローブの調製、
（b）光源、多重焦点への透過光の分離のための回折光学要素、及び多重共焦容量要素への透過多重光線の焦点化のための焦点光学器を包含する光学的励起装置でのプローブの照射及び
（c）多重共焦容量要素からの放射線の捕集。
【請求項２】
発光分子を、プローブ中に存在する分析物に結合する発光標識化検出試薬から選択する、請求項１に記載に方法。
【請求項３】
測定は、分析物及び１種以上の検出試薬から成る少なくとも2個の異なる発光標識化物を含有する複合体から由来する交差相関信号の測定を包含する、請求項１又は2に記載の方法。
【請求項４】
測定は、発光標識化検出試薬から由来する信号の測定を包含し、この際、分析物に結合する場合の検出試薬の発光強度又は／及び消光時間は、非結合状態の場合とは異なっている、請求項１又は2に記載の方法。
【請求項５】
発光強度又は／及び−消光時間の相違は、消滅−又はエネルギー転移過程により引き起こされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
測定は、核酸−ハイブリダイゼーションを包含し、この際、１本以上の発光標識化ゾンデが目的核酸に結合する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
測定は、酵素反応を包含する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
測定は、核酸−増幅、殊に、サーモサイクリング−法を包含する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
測定は、核酸の場合には、突然変異分析を包含する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
測定は、核酸の場合には、遺伝子発現分析を包含する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
測定は、核酸−ハイブリダイゼーションの場合には、温度依存性溶融曲線の測定を包含する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
測定は、粒子−選択を包含する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
測定は、核酸−配列化を包含する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
光源として、レーザーを使用する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
回折光学要素として、三次元の、場合により視覚的に透明な担体上に載せられた光学格子を使用し、透過光を回折させ、多重光学焦点を包含する先決の回折マスターを作成する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
多重光学焦点は、１次干渉によって形成される、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
光線は、２〜３２、殊に４〜１６個の光学的焦点に分離される、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
共焦容量要素は、１０−１８〜１０−９ｌ、有利に１０−１８〜１０−１２ｌの大きさを有する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
多重共焦容量要素からの放射線の捕集のために、各々１個の別個の検出器又は部位解像検出器マトリックスを使用する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
光源の焦点光学器と共焦容量要素との間の距離は、≧１ｍｍ、有利に、１．５〜１０ｍｍ、特に有利に、２〜５ｍｍである、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
プローブは、光源から及び殊に焦点光学器から、熱的に隔離されている、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
プローブは、数個の、有利に少なくとも１０２個の別個の容器を有する担体中で調製される、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
光学的測定装置は、開口数０．５〜１．２を有する、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
担体は、プローブの収容のための、数個の、有利に少なくとも１０個の別個の容器を含有する、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
プローブは、微細溝構造中で調製される、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
プローブ中に存在する分析物は、微細溝構造中で固定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
プローブ中に存在する分析物を分離反応させ、この際、分析物から分離したフラグメントを測定する、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
微細溝構造は、直径１〜１００ｍｍの１本以上の溝を有する、請求項２５から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
プローブ中に存在する分析物を担体粒子にカップリングさせる、請求項１から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
プラスチック、ガラス、石英、金属、半金属又は複合材料から成る担体粒子を使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
担体粒子は、直径０．５〜１０μｍを有する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
発光分子の測定のための、殊に、請求項１から３１までのいずれか１項に記載の方法の実施のための、次のものを包含する装置：
（a）測定すべき発光分子を含有するプローブの収容のための担体、
（b）光源、多重焦点への透過光の分離のための回折光学要素、及び多重共焦容量要素における発光の励起のための多重共焦容量要素への透過光の焦点化のための焦点光学器を包含する光学的励起装置及び
（c）多重共焦容量要素からの発光の検出のための光学検出装置。
【請求項３３】
担体は、プローブの収容のための、少なくとも１０個の別個の容器を有する微細構造を包含する、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
多重共焦容量要素中の分子相互作用の並行測定のための多重光学的焦点の生成のための回折光学要素の使用。
【請求項３５】
蛍光相関分光法のための、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
動力学的レーザー光散乱のための、請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、回折光学要素の使用下に、共焦の測定容量物中の光学的励起による発光分子の測定法に関する。この方法は、例えば、蛍光相関分光法又は動力学的光散乱による、殊に、単一分子測定に好適である。更に、本発明による方法の実施に好適な装置が明らかにされる。
【０００２】
分析物の検出のための蛍光−相関分光法（FCS）の使用は公知である。EP−B−０６７９２５１は、蛍光分光法による分析物の検出のための方法及び装置を公開しており、この際、検査すべきプローブの一部である共焦測定容量物中で測定が実施される。しかし、多数の測定容量物における平行測定は、条件付で、大きな技術的経費下でしか可能ではない。
【０００３】
本出願の基礎にある課題は、簡単な方法で、多重共焦容量要素における平行測定を可能にする、殊に、蛍光−相関分光法による発光分子の測定のための方法及び装置を作成することにある。
【０００４】
従って、本発明の目的は、次の段階を包含する共焦測定容量物における光学的励起による発光分子の測定法である：
（a）発光分子を含有するプローブの調製、
（b）光源、多重焦点への通過光の分離のための回折光学要素、及び多重共焦容量要素への透過多重光線の焦点化のための焦点光学器を包含する光学的励起装置でのプローブの照射、及び
（c）多重共焦容量要素からの放射線の捕集。
【０００５】
プローブ中に放射された励起光の回折光学要素による分離は、検出に充分な光強度を保持しながら、多重共焦容量要素の作成を可能にすることが意外にも判明した。この原則は、好適な励起−又は検出法により、共焦容量要素中の単一分子又は少数、例えば、１００個までの分子の検出のための多重共焦的点焦点の作成に適用することができる。
【０００６】
新規の微細構造−製作技術によって、光源のための先決の回折格子である前以て算出された三次元構造を有する光学要素を製作することができる。この際、光回折によって生成された所望の点マスターを、フーリエ（Fourier）−変換によって、三次元の回折構造に換算し、引続き、これを好適な材料から、例えば、写真石版エッチングにより作成する。
【０００７】
回折光学要素として、例えば、三次元の、場合により視覚的に透明な支持体上に載せられた光格子を使用することができ、これは、通過光を回折し、対象平面に構築的及び破壊的干渉によって、多重光学焦点の先決の回折マスター、即ち、所望の配列を生じさせる。そのような回折光学要素を使用する場合の実際の利点は、光格子の形態によって、任意の焦点配列を選択することができることにある。この際、多重光学焦点は、有利に、１次干渉によって形成され、この際、ほんの僅少な光損失が、０次干渉又はより高い次数の干渉によって生じる。
【０００８】
好適な回折光学要素の製造は、例えば、F.Nikolaef am Chalmers Institute of Technologies (1999) の論文、M.Johansson am Chalmers Institute of Technologies (2001) の論文、及びPublikation Johansson und Haerd (Applied Optics 38(1999),1302-1310) に記載されている。光学要素製造のための材料として、写真石版エッチングによって加工され得るプラスチック、ガラス及び複合物質又は所定の波長のための視覚的透明性を有する他の材料が好適である。
【０００９】
本発明による方法の有利な１実施態様は、蛍光−相関分光法による共焦測定容量物中の発光分子の検出に関する。この方法は、原則的には、EP−B−O６７９２５１に記載された方法により実施することができる。この際、有利に、測定容量中の１個以上の分析分子の測定が行われ、この際、測定すべき分析分子の濃度は、有利に≦１０−６モル／ｌであり、測定容量は、有利に≦１０−１４である。分析分子での発光測定によって調査される物質特異性パラメーターが測定される。このパラメーターとは、発光分子の並進散乱−係数、回転散乱−係数又は／及び励起波長、放射波長又は／及び励起状態の寿命又はこれらの１種以上の測定値の組合せである。装置的細目の詳細については、EP０６７９２５１の開示が参照される。
【００１０】
本発明による方法の１つの有利な特徴は、プローブ液中の測定容量と光源の焦点光学器との間の距離が、≧１ｍｍ、有利に１．５〜１０ｍｍ及び特に有利に２〜５ｍｍであることにある。更に、プローブ液を含有する担体と光学的焦点装置との間で、空気、保護ガスを含有する又は真空であってよい気相範囲が配置されていることが有利である。焦点光学器と共焦測定容量との間に大きな距離を有するFCSの実施のための方法及び装置は、DE１０１１１４２０．６に記載されている。
【００１１】
本発明による方法は、原則的に、任意の測定法の実施に好適である。有利な１実施態様は、例えば、目的物質と相互作用する作用物質の同定のための診断的使用又はスクリーニングのためのプローブ中の分析物の測定に関する。そのために、１種以上の分析物−結合物質を、発光測定によって検出可能な標識化基、殊に、発光−標識化基を有するプローブに添加する。この場合には、本発明による方法は、有利に、検出すべき分析物への標識化物質の結合の測定を包含する。この検出は、例えば、分析物への結合をベースとする標識化基の可動性変化によって、又は分析物への結合をベースとする標識化基の発光変化（強度又は／及び消光時間）によって、又は数種の標識化基を使用する場合には、いわゆる交差相関によって行うことができる。交差相関測定の場合には、その相関信号が測定容量内で測定される少なくとも２つの異なる標識化物、殊に蛍光標識化物が使用される。この交差相関測定は、例えば、Schwille et al. (Biophys.J.72（1997),1878-1886）及びRigler et al.（J.Biotechnol.63（1998），97-109）に記載されている。
【００１２】
本発明による方法は、殊に、生物分子、例えば、核酸、蛋白質又は他の、生きている有機体、殊に哺乳類、例えば、ヒト中に由来する分析分子の検出に好適である。更に、試験管中で生物学的プローブから生成されている分析物、例えば、ｍRNAから逆転写によって製造されているｃDNA−分子、又はｍRNA又はDNAから試験管内翻訳によって製造されている蛋白質を検出することができる。この方法は、更に、ライブラリー要素として存在し、先決の特性、例えば、検出試薬への結合を示すという分析物の検出に好適である。そのようなライブラリーの例は、ファージライブラリー又はリボソームライブラリーである。
【００１３】
特に有利な１実施態様では、測定は、核酸ハイブリダイゼーションを包含し、この際、１種以上の発光標識化ゾンデが分析物としての目的核酸に結合する。この種類のハイブリダイゼーション法は、例えば、遺伝子発現の分析に、例えば、遺伝子発現プロフィールの調査のために、突然変異、例えば、単一ヌクレオチド多型（SNP)の分析のために使用され得る。しかし、本発明による方法は、酵素反応の測定又は／及び殊にサーモサイクリングプロセスにおける核酸増幅の測定にも好適である。核酸多型の測定のための有利な方法は、DE１００５６２２６．４及びDE１００６５６３１．５に記載されている。この際、特に有利に、２色以上の交差相関測定が実施される。
【００１４】
もう１つの特に有利な実施態様で、測定は、蛋白質−蛋白質−又は蛋白質−リガンド−相互作用の検出を包含し、この際、蛋白質リガンドとして、例えば、低分子の作用物質、ペプチド、核酸等を使用することができる。この種類の測定には、有利に、２色以上の相関測定が実施される。
【００１５】
選択的に有利な１実施態様では、いわゆる”分子ビーコン”ゾンデ又はプライマーを使用することができ、これは、（それが遊離形で存在する場合には）発光強度又は／及び消光時間に関して、結合状態にある場合とは異なる測定信号を示す。
【００１６】
本発明のもう１つの有利な実施態様では、物質ライブラリー中の粒子の選択法を包含し、この際、先決の特性を有する粒子が、多数の異なる粒子を包含する集団から選択される。そのために、有利に、異なる粒子の集団を調製し、先決の特性を有する粒子を標識化し、微細溝中の粒子を多重共焦容量要素が包含される検出要素に導入通過させ、標識化粒子と非標識化粒子とを区別し、標識化粒子を分離する。誘導及び分離の段階は、有利に、少なくとも１回繰り返され、この際、後続サイクルでの粒子濃度は、先行サイクルに比べて、有利に、凡そ少なくともファクター１０４減少される。粒子は、例えば、細胞、細胞表面部分、細胞小器官、ウイルス、核酸、蛋白質及び低分子物質から選択することができる。方法は、遺伝的包含体、例えば、ファージ、細胞、胞子又はリボソームを含有し得る組合わせライブラリーからの粒子の選択にも好適である。粒子集団は、有利に、１０６個以上、特に有利に１０１０個以上の異なる粒子を含有する。これらの粒子は、有利に、発光−標識化基で標識化される。
【００１７】
更にもう１つの実施態様は、ポリマー、殊に、生体高分子の配列分析の実施を包含し、この際、プローブ中に存在する分析物の発光断片が測定される。この実施態様は、殊に、核酸−配列化の実施に好適である。このために、有利に、それに固定化された核酸分子を有する担体粒子を調製し、この際、実際に、少なくとも１本の核酸分子鎖中の少なくとも１種の塩基型ヌクレオチド構成要素の全てが、１個の蛍光標識化を有する。担体粒子は、微細溝を包含する配列化装置中に入れられ、そこで、例えば、IR−捕集レーザーで捉えられ、かつ、例えば、エキソヌクレアーゼでの処理によって逐次個々のヌクレオチド構成要素が固定化核酸分子から分離される。次いで、分離されたヌクレオチド構成要素は、微細溝を通って、有利に、流体力学的流れによって導かれ、そこで、共焦容量要素中で、一連の分離されたヌクレオチド構成要素に基づいて、核酸分子の塩基配列が決定される。
【００１８】
本発明による方法は、光源、例えば、レーザーから由来する光線を数個の光学的焦点に分解することができる。光線は、有利に２〜３２、殊に４〜１６の光学的焦点に分解される。好適な焦点光学器の使用によって、この光学的焦点からプローブ中の共焦容量要素が結像される。共焦容量要素は、好適に１０−１８〜１０−９ｌ、有利に１０−１８〜１０−１２ｌ、特に有利に１０−１６〜１０−１４ｌの大きさを有する。
【００１９】
放射、殊に、多重共焦容量要素からの放射の捕集のために、有利に、１容量単位当たり、各々１個の別個の検出器又は位置分解検出器マトリックス、例えば、なだれ−フォトダイオードマトリックス（Avalanche-Fotodiodenmatrix）又は電子工学的検出器マトリックス、例えば、CCD−カメラが使用される。
【００２０】
数個の光学的焦点への光線の分離は、別個の共焦容量要素における平行測定を可能にする。有利な１実施態様では、この共焦容量要素は、有利に、微細構造の担体の各々別個の容器中に備えられている。
【００２１】
この容器の容量は、有利に≦１０−６ｌ、特に有利に≦１０−８ｌ〜１０−１２ｌである。即ち、担体は、プローブ液の収容のための数個の窪みを有する微細波形構造を包含し、これは、例えば、直径１０〜１０００μｍを有する。好適な微細構造は、例えば、DE１００２３４２１．６及びDE１００６５６３２．３に記載されている。この微細構造は、例えば、核酸−ハイブリダイゼーションの測定のために溶解して使用され得る。更に、担体は、担体又は／及びその中の個別のプローブ容器の温度調節を可能にする、有利に少なくとも１個の温度−調節要素、例えば、ペルティエ（Peltier）−要素を包含する。
【００２２】
本発明に使用される担体は、有利に、プローブの光学的検出を可能にするように形成されている。従って、有利に、少なくともプローブ容器の範囲に視覚的に透明な担体が使用される。この際、担体は、完全に視覚的に透明であるか、又はプローブ中に視覚的に透明な基礎及びプローブ容器中に空所を備える視覚的に不透明な被覆層を有することができる。単体の好適な材料は、例えば、金属（例えば、被覆層用の珪素）及びガラス（基礎用の）から成る複合物質担体である。この種類の担体は、例えば、ガラス上にプローブ容器のための前与の空所を備える金属層を被せることによって製作することができる。選択的に、例えば、ポリスチロール又はアクリレート−又はメタクリレートをベースとするポリマーから成るプラスチック担体を使用することができる。更に、測定中に周囲から実際に隔離した密閉系を準備するために、担体がプローブ容器用の蓋を有することが有利である。
【００２３】
特に有利な実施態様では、光路中に測定容量と光源又は光学的装置の検出器との間に配列されているレンズ要素を含有する担体を使用する。レンズ要素は、例えば、微細波形構造の底部に設置されていてよい。このようなレンズ要素は、例えば、金属、例えば、珪素から成るマスター−形の使用下に、例えば、フォトレジスト（Fotoresist）の加熱及び成形によって作成され、次いで、担体上に載せられ得る。選択的に、（例えば、完全プラスチック構造から成る担体の使用の場合では）レンズ要素は、例えば、製造中に射出成形により作成され、担体に統合され得る。レンズ要素、有利に、凸レンズ要素の使用によって、光学的測定装置の開口数を大きくすることができる。この開口数は、有利に、０．５〜１．２の範囲にある。
【００２４】
更に、担体は、より高い屈折率を生じさせるために、有利に、透明な抗反射被覆で被覆されている。抗反射被覆として、例えば、透明な酸化物又は窒化物を使用することができる。抗反射被覆物は、有利に、光学器上にも使用される。
【００２５】
更に、測定容量中で測定すべき分析物の濃縮を達成するために、担体中に電場を、殊に、プローブ容器の範囲に発生させることができる。そのような電場の発生に好適である電極の例は、例えば、DE１０１０３３０４．４に記載されている。
【００２６】
測定すべき分子は、（殊に、微細波形型中の測定で又は単一分子配列化の場合に）担体粒子に結合していてよい。担体粒子は、微細溝中の運動及び配列化装置内の所望の位置での固定を可能にする大きさを有する。粒度は、有利に、０．５〜１０μｍ、特に有利に１〜３μｍの範囲にある。担体粒子の好適な材料の例は、プラスチック、例えば、ポリスチロール、ガラス、石英、金属又は半金属、例えば、珪素、金属酸化物、例えば、二酸化珪素又は数種の前記成分を含有する複合材料である。例えば、プラスチック又はプラスチック核及び二酸化珪素外被を有する粒子から成る視覚的に透明な担体粒子を使用することが特に有利である。
【００２７】
核酸分子は、有利に、その５’−末端を介して、例えば、共有又は非共有相互作用によって担体粒子に固定される。担体へのポリヌクレオチドの結合は、特異的結合ペア、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン又はアビジン等のパートナー間の高親和性相互作用によって特に有利に行われる。選択的に、核酸分子は吸着的又は共有的に担体に結合され得る。
【００２８】
単一核酸分子１個だけがそれに結合している担体粒子を使用することが有利である。そのような担体粒子は、測定のために所定の核酸分子を、有利に１：５〜１：２０、例えば１：１０のモル比で担体粒子と、担体への核酸分子の固定が行われる条件下に、接触させることによって生成される。
【００２９】
担体に結合した核酸分子、例えば、DNA−分子又はRNA−分子は、単鎖形又は二重鎖形で存在することができる。核酸分子は単鎖形で存在することが有利である。配列化に使用する場合には、実際に、少なくとも１種の塩基型の全ヌクレオチド構成要素の全部、例えば、少なくとも９０％、有利に少なくとも９５％が、１個の蛍光標識化基を有する。実際に、少なくとも2種の塩基型、例えば２、３又は４種の塩基型の全ヌクレオチド構成要素は、１個の蛍光標識化基を有することができ、この際、各々の塩基型は有利に１個の異なる蛍光標識化基を含有する。このように標識化された核酸は、好適なポリメラーゼ、例えば、熱安定性DNA−ポリメラーゼの使用下に、核酸マトリックスでの酵素的プライマー伸長によって生成され得る。この方法の正確な記載は、DE１００３１８４０．１及びDE１００６５６２６．９及びそこに挙げられた文献引用文にある。
【００３０】
更に、本発明のもう１つの目的は、発光分子の測定のための、殊に、前記のような方法の実施のための、次のものを有する装置である：
（a）測定すべき発光分子を含有するプローブの収容のための担体、
（b）光源、多重焦点への透過光の分離のための回折光学要素、及び多重共焦容量要素における発光の励起のための多重共焦容量要素への透過光の焦点化のための焦点光学器を包含する光学的励起装置及び
（c）多重共焦容量要素からの発光の検出のための光学的検出装置。
【００３１】
担体は、有利に、プローブ液の収容のための数個の、有利に少なくとも１０個、特に有利に少なくとも１０２個の容器を有する微細構造であり、この際、別個の容器中のプローブ液は１種以上の給源から由来してよい。担体容器中へのプローブ液の装入は、例えば、ピエゾ電気液体供給−装置により行うことができる。
【００３２】
担体容器は、それが検出試薬と分析物との結合を液状で可能にするように形成されている。容器は、有利に、担体表面上の窪みであり、この際、この窪みは、原則的に任意の形、例えば、円形、四角形、菱形等を有することができる。担体は、１０３個以上の別個の容器を包含することができる。
【００３３】
選択的に、担体は、１本以上の微細溝を有する微細溝構造を含有することもでき、これは、殊に、例えば、DE１００３１８４０．１及びDE１００６５６２６．９に記載されている単一分子配列化法、又は、例えば、DE１００３１０２８．１に記載されている粒子−選択法に好適である。
【００３４】
光学的励起装置は、相応する光学的装置によってプローブ液中の測定容量に焦点を合わせられる強力焦点化光源、有利にレーザー線を包含する。光源は、２種以上のレーザー線を含有することもでき、その場合には、これは、その都度、プローブ液中への進入の前に、異なる光学器を通って測定容量へ焦点される。２種以上のレーザー線を使用する場合には、各レーザー線のために、別個の回折光学要素を使用することができる。
【００３５】
検出装置は、例えば、繊維カップリング化のなだれ−フォトダイオード検出器又は電子工学的検出器を含有することができる。しかし、回折光学器又は量子−波−レーザーによって生成されるレーザー点の点マトリックス、及びなだれ−フォトダイオードマトリックス又は電子工学的検出器マトリックス、例えば、CCD−カメラによって生成される検出器マトリックスから成る励起−又は／及び検出マトリックスを使用することもできる。
【００３６】
担体は、既に既製形で設置されていてよく、この際、担体の数個の別個の容器中に、発光標識化検出試薬、有利に、蛍光標識化ハイブリダイゼーションゾンデ又は−プライマーが充填される。引続き、検出試薬を含有する担体は、有利に、乾燥される。
【００３７】
本発明の有利な１実施態様では、多数の、例えば、１００個の別個の容器を含有する既製担体が準備され、その中にその都度異なる検出試薬、例えば、プライマー又は／及びゾンデのような核酸ハイブリダイゼーションの検出のための試薬が充填されて存在する。次いで、この担体に、検査すべき生体、例えば、ヒトの患者から由来するプローブを充填することができ、従って、各容器中で、単一プローブからの異なる分析物が測定される。例えば、このような担体は、例えば、病気の診断のための遺伝子発現プロフィール作成のために、又は、核酸多形の測定のために、例えば、一定の遺伝的素質の検出に使用することができる。
【００３８】
最後に、本発明は、多重共焦容量要素における分子相互作用の並行測定のための多重光学的焦点の生成のための回折光学的要素の使用に関する。特に、前記のような発光−相関分光法のための使用が有利である。しかし、回折光学要素は、他の方法、例えば、動力学レーザー光散乱に使用されることもでき、その中で、共焦容量要素中の散乱光による強度変動が測定される。
【００３９】
更に、本発明を添付図面及び例によって説明する。
【００４０】
図１は、本発明による方法の実施態様の略図を示す。光線（２）、例えば、レーザー線は回折光学要素（４）中で数個の、例えば４本の部分光線（６）に分離し、光学焦点化装置（８ａ、８ｂ）中に導かれる。そこを出る部分光線（１０）は、光学焦点化装置に対して先決の距離に、先決の大きさを有する共焦容量要素を形成するように光束する。
【００４１】
図２は、回折光学要素によって生成され得る多重光学焦点の例としての配列を示す。焦点の配列は、原則的には、自由に選択可能である。焦点は、有利に、１次干渉から生成される。ゼロ次及びそれ以上の次数の干渉による損失は少なく、有利に、≦３０％である。
【００４２】
図３は、本発明による方法のもう１つの実施態様を示す。レーザー線（１２）は、回折光学要素（１４）によって数個の、例えば、４本の部分光線（１６）に分離し、これは光学焦点の先決マスターを生成させる。引続き、部分光線は、２色性の鏡（１８）によって方向を変え、焦点光学器（非記載）を経て担体（２０）上に向けられ、そこで数個の共焦容量要素を形成する。共焦容量要素から、例えば、蛍光による放射光（２２）は、検出器（２４）によって捕集され、検出される。
【００４３】
図４Ａ及び４Ｂは、好適な担体の有利な実施態様を示す。図４Ａによる担体は、例えば、少なくとも１０２個の別個のプローブ容器（２４）を有するチップ形の微細構造である。2つのプローブ容器の間の距離は、有利に５０〜１５０μｍ、例えば、１００〜１１０μｍである。容器の厚さは、有利に、１ｃｍ２当たり１００〜１００００個の窪みの範囲である。個々の容器中のプローブ容量は、有利に１０−６〜１０−１２ｌである。プローブ容量内で、共焦容量要素が、単一分子又は僅少数の分子の間の相互作用の測定のために形成される。図４Ａ中に示された担体は、殊に、高流量診断及び作用物質スクリーニング法に好適である。担体内の容器の数が、回折光学要素により生成される部分放射の数よりも大きい場合には、担体を数段階で走査することができる。そのために、光学器又は／及び担体は、各段階について好適な手段によってその都度新規に調整されることができる。
【００４４】
図４Ｂは、その中に配列された共焦容量要素（２８）を有する微細溝（２６）を示す。この微細溝構造は、殊に、単一分子-配列化又は単一分子-選択に使用することができる。
【００４５】
図５Ａは、回折光学要素により生成される多重光学焦点（明斑点）の２×２-マスターを示す。
【００４６】
図５Ｂは、多重焦点１個中の１０個の蛍光リポーター分子の自動相関曲線を示す。全４個の焦点中で、自動相関曲線が各々同一であることが判明した。
【００４７】
図５Ｃは、本発明による方法の実施に好適な、プローブの収容のための２５×２５個の窪みを有する直径３００μｍのバイオチップ-微細配列の図を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明による方法の実施態様の略図を示す。
【図２】回折光学要素によって生成され得る多重光学焦点の例としての配列を示す。
【図３】本発明による方法のもう１つの実施態様を示す。
【図４Ａ】好適な担体の有利な実施態様を示す。
【図４Ｂ】その中に配列された共焦容量要素（２８）を有する微細溝（２６）を示す。
【図５Ａ】回折光学要素により生成される多重光学焦点（明斑点）の２×２−マスターを示す。
【図５Ｂ】多重焦点の１個中の１０個の蛍光リポーター分子の自動相関曲線を示す。
【図５Ｃ】本発明による方法の実施に好適な、プローブの収容のための２５×２５個の窪みを有する直径３００μｍのバイオチップ−微細配列の図を示す。
【符号の説明】
【００４９】
２    光線
４    回折光学要素
６    部分光線
８ａ、８ｂ    光学焦点装置
１０  部分光線
１２  レーザー線
１４  回折光学要素
１６  部分光線
１８  鏡
２０  担体
２２  放射光
２４  検出器、プローブ容器
２６  微細溝
２８  共焦容量要素
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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