(57)【要約】我々は以前、双極性（ＢＰ）障害に関する候補領域として１８ｑ２１．３３−ｑ２３を同定し、そして酵母人工染色体（ＹＡＣ）コンティングマップを構築した。次の段階で我々は、この領域に由来するすべてのＣＡＧ／ＣＴＧ反復を単離そして分析し、そしてそれらをＢＰ障害への関与から除外した。ここでこの領域に由来するすべてのＣＣＧ／ＣＧＧ反復を同定する過程において、我々は３つの有力なＣｐＧアイランドを単離し、その１つは予測される３６３９ｂｐのエキソンの１．５ｋｂ上流に位置する。さらなる分析で、これは我々がＮＣＡＧ１（新規ＣｐＧ関連遺伝子１）と呼ぶ新規ＣｐＧ−関連、脳−発現遺伝子の一部であることが示された。この位置的および機能的候補の突然変異分析で、２つの単一ヌクレオチド多型を同定し、そのいずれもＢＰ表現型との関連を示さなかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項４】
配列番号３のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項５】
配列番号３のヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド配列またはそれらの連続する断片からなる単離された核酸であって、該単離された核酸が双極性障害タンパク質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する核酸に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された核酸であって、該単離された核酸が生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸。
【請求項８】
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該単離された核酸が配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる、上記の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号３のヌクレオチド配列またはそれらの連続する断片からなる単離された核酸であって、該単離された核酸が生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸。
【請求項１０】
配列番号３のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する核酸に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された核酸であって、該単離された核酸が生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸。
【請求項１１】
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該単離された核酸が配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列からなる、上記の単離された核酸。
【請求項１２】
請求項６に記載の核酸によりコードされる、単離され、そして実質的に精製されたタンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載の核酸によりコードされる、単離され、そして実質的に精製されたウイルス阻害タンパク質１および２。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離され、そして実質的に精製されたウイルス阻害タンパク質。
【請求項１５】
配列番号２の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、単離され、そして実質的に精製されたタンパク質。
【請求項１６】
配列番号４の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、単離され、そして実質的に精製されたタンパク質。
【請求項１７】
配列番号４の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、単離され、そして実質的に精製されたタンパク質。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１９】
請求項４に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２０】
発現制御配列に操作可能に連結された請求項６に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２１】
請求項６に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２３】
ａ）請求項６に記載の核酸を宿主細胞に導入し：
ｂ）該宿主細胞を、該核酸がタンパク質に発現される条件下に維持し；
ｃ）該タンパク質を回収する、
ことを含んでなるタンパク質１および２の作成法。
【請求項２４】
ａ）請求項９に記載の核酸を宿主細胞に導入し：
ｂ）該宿主細胞を、該核酸が発現してタンパク質が生産される条件下に維持し；
ｃ）該タンパク質を回収する、
ことを含んでなるタンパク質の作成法。
【請求項２５】
ａ）請求項１６に記載の核酸を宿主細胞に導入し：
ｂ）該宿主細胞を、該核酸が発現してウイルス阻害タンパク質が生産される条件下に維持し；
ｃ）該タンパク質を回収する、
ことを含んでなるタンパク質の作成法。
【請求項２６】
精製されたタンパク質および担体を含んでなる組成物。
【請求項２７】
さらにウイルス阻害タンパク質２を含んでなる請求項２６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は広くは精神的健康に関連する遺伝因子の決定に関する。より詳細には本発明は罹患している個人および彼らの家系を対象とした気分障害または関連障害に関係するヒト遺伝子を対象とする。具体的には本発明は脳組織で発現し、そして双極性障害の診断マーカーとして使用することができる第１８染色体上に位置する遺伝子を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
薬理遺伝学的背景：
各個体は彼らの遺伝子と環境との相互作用の産物である。薬理遺伝学は薬剤に対する患者の応答の変異性に遺伝的差異がどのように影響するかという研究である。薬理遺伝学の使用を通して特定の薬剤に対する応答を予測するために、我々は個体のＤＮＡ間の変異をプロファイルすることができる。ヒトを対象とした臨床的兆候について、十分に耐性の、そして効果的薬剤を予測する標的確認は広く認知された問題である；しかし真の課題は標的の選択である。受容体および酵素を含む限られた数の分子標的ファミリーが同定され、それらのためのハイスループットスクリーニングが現在可能である。良い標的は活性分子（ヒット）を同定するためにそれに対する多くの化合物を迅速にスクリーニングできるものである。このようなヒットは至適化された分子（リード）に開発することができ、この分子は十分に許容され、そして効果的な薬剤の特性を有する。疾患または臨床的症状について確認することができる標的の選択は、製薬産業が直面する主要な問題である。最高と確認される標的は、すでに生産されている、ヒトを対象として十分に許容されおよび効果的な薬剤である（先行標的）。多くの標的は科学的仮説に基づき選択され、そして初期の仮説が後にしばしば反証を挙げられることから効果的な薬剤を導かない。
【０００３】
２つの広い方法を使用して遺伝子を同定し、そしてハイスループットの標的として使用するためのそれらのタンパク質産物を発現させる。これらのゲノム的および遺伝的取り組みは技術を共有するが、異なる化学的方策および投資（ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔｓ）を表す。探査ゲノミックス（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）は、疾患に遺伝的に関連しているとは知られていない、追跡可能なまたは順次動く標的について、遺伝子および遺伝子のファミリーを同定するために、益々増える数のＤＮＡ配列情報のデータベースを使用する。
【０００４】
患者に由来する罹病性遺伝子に関する情報の利点は、定義によればこれらの遺伝子が疾患に対する患者の遺伝的寄与に関連していると言う点である。しかし最も疑われる遺伝子は追跡可能な標的ではなく、または活性化合物を同定するための高処理スクリーニング法で分析できない。関連遺伝子変異体に関する代謝の差異は、疾患の発症または進行のメカニズムを見いだすために、機能的ゲノミックおよびプロテオミック（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）テクノロジーに焦点をあてて研究することができる。
【０００５】
改変した代謝に関連する受容体の重要な酵素を標的として使用することができる。適切な細胞代謝に及ぼす特別な感受性遺伝子変異体の役割に焦点をあてた遺伝子−対−機能−対−標的法が重要となる。ヒトゲノムプジェクトおよび類似のプログラムからの配列のデータを有力なバイオインフォマティックツールを用いて調べることは、類似の配列を有するドメインの位置を突きとめることにより遺伝子ファミリーを同定することを可能にする。これらのゲノム法により同定される遺伝子は、一般に疾患プロセスとある種の機能的確認または関連を必要とする。差次的遺伝子発現、トランスジェニック動物モデル、プロテオミックス、インシトゥーハイブリダイゼーションおよび免疫組織学のような技術が、遺伝子と疾患との間の関係を意味すために使用される。
【０００６】
ゲノム的取り組みと遺伝的取り組みとの間の主な差異は標的の選択であり、標的は遺伝的に定められた遺伝子であり、そして変異体−特異的標的が疾患プロセスに関与することはすでに知られている。疾患との関係を求めて、各遺伝子を用いた非特異的で大規模な遺伝子同定のための探査ゲノミックスの今の流行は、医薬品開発のための大きな好機である。
【０００７】
薬剤の開発のための中心的課題は、標的の選択が良くないという点を認識することも重要である。疾患との関連の確認を意味するために、立証されていない技術をスクリーニングに使用すること、および選択された各遺伝子をヒトにおける概念の証明に進めるために必要な莫大な調査は、「確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）」という不明瞭で尊大な使用に基づく。各々の失敗は時間および経費の損失の点で大変不経済である。例えば差次的遺伝子発現（ＤＧＥ）およびプロテオミックスは、標的確認のために広く使用されているスクリーニング技術である。それらは組織中の遺伝子およびタンパク質発現の異なるレベルおよび／またはパターンを検出し、これはその組織に影響を及ぼす疾患に対する関係を意味するために使用することができる。
気分障害の背景：
気分障害または関連障害には、限定するわけではないが精神障害の診断用および統計用マニュアル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）カッコ中は分類ＤＳＭ−ＩＶコード）で定義されるような以下の障害を含む：気分障害（２９６．ＸＸ，３００．４，３１１，３０１．１３，２９５．７０）、統合失調症および関連障害（２９５．ＸＸ，２９７．１，２９８．８，２９７．３，２９８．９）、不安障害（３００．ＸＸ，３０９．８１，３０８．３）、適応障害（３０９．ＸＸ）および人格障害（コード３０１．ＸＸ）。
【０００８】
本発明は特に双極性（ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＢＰ）スペトクラム（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）障害として知られている気分障害の家系に関連する遺伝因子を対象とする。双極性障害（ＢＰ）は、極度な爽快状態（躁）から重度の不快状態（鬱）までの範囲で気分の振れを特徴とする重篤な精神的状態である。２つの型の双極性の病気が記載された：Ｉ型ＢＰ病（ＢＰＩ）は主要な鬱の発現の次に躁期がくることを特徴とし、そしてＩＩ型ＢＰ病（ＢＰＩＩ）は主要な鬱の発現の次に軽躁病がくることを特徴とする。ＢＰ発端者の親戚は、ＢＰ、一極性障害（鬱の発現のみを体験する患者：ＵＰ）、循環気質（わずかな鬱および軽躁病の発現：ｃｙ）ならびに躁（ＳＡｍ）および鬱（ＳＡｄ）型の分裂感情性障害の危険性が上昇する。これらの所見に基づき、ＢＰ、ｃＹ、ＵＰおよびＳＡはＢＰスペクトラム障害と分類される。
【０００９】
ＢＰスペクトラム障害の病因論において遺伝的因子の関与が家族、双生児および養子実験により示唆された（非特許文献１）。しかし正確な伝達のパターンは未知である。幾つかの研究では、複雑な分離分析がＢＰについて１つの主要な位置の存在を支持している（非特許文献２）。他の調査では傾向−閾値−モデルが提案され、ここで障害を発症する傾向は多くの遺伝的および環境的影響の付加的な組み合わせから生じる（非特許文献３）。
【００１０】
遺伝の複雑な様式ゆえに、パラメトリック（ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）および非−パラメトリック連関解析法（ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）が、メンデルの法則で伝達すると思われるＢＰ障害の家系に適用される。染色体１１ｐ１５（非特許文献４）およびＸｑ２７−ｑ２８（非特許文献５；６）上での初期の連関の知見は論争の的となり、そして最初のうちは繰り返すことができなかった（非特許文献７；８）。高度に多型のマーカーで満たされたヒトの遺伝子地図の開発およびデータ分析技術の連続的な開発で、多数の新たな連関の調査が始まった。幾つかの研究では、染色体４、１２、１８、２１およびＸ上の特定の領域への連関に関する証明または示唆的証明が見いだされた（非特許文献９；１０；１１；１２および１３）。報告された連関の結果の確実性を試験するために、これらの知見は他の独立した実験で繰り返された。
【００１１】
最近、双極性疾患の染色体１８上の動原体周辺（ｐｅｒｉｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）領域への連関が報告された（非特許文献１１）。また１８ｐｔｅｒ−ｐ１１および１８ｑ２３−ｑｔｅｒにブレイク−ポイントおよび欠失領域を持つ環状染色体１８が、ＢＰ病または関連する症候群を有する３名の無関係な患者で報告された（非特許文献１０）。染色体１８ｐの連関はｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献１４）により繰り返され、彼は同じ実験で１８ｑ２１．２−ｑ２１．３２上の座に関する示唆的証拠も報告した。
【００１２】
興味深いことにはＳｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．は影響の起源となる親（ｐａｒｅｎｔ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ  ｅｆｆｅｃｔ）を観察し、連関の証拠は父親の家系で最強であり、ここで発端者の父親または発端者の父親の親類の１名が影響を受けている。トリヌクレオチドリピート伸長（ＴＲＥｓ）の関与を示唆するＢＰ障害を伝達する家系に予期を記載した幾つかの研究（非特許文献１５；１６）は、ＣＡＧ／ＣＴＧ、ＣＣＧ／ＣＧＧまたはＧＡＡ／ＴＴＣ反復の伸長により引き起こされる多数の疾患を考慮して予期を示す（Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献１７）を参照にされたい）。潜在的に伸長する反復を見いだすためのこれまでの努力は、主にＣＡＧ／ＣＴＧ反復に集中していたが、ＣＣＧ／ＣＧＧ反復に関する調査も増えている（非特許文献１８；１９；２０；２１）。これまで我々は３つ組反復：３つ組反復ＹＡＣ断片化の単離に特異的な領域について新規方法を報告した（非特許文献２２）。これはＣＡＧ／ＣＴＧ反復の単離に正確な方法であることが証明され、そしてこの方法を使用して我々は双極性疾患に１８ｑ２１．３３−ｑ２３内に由来するＣＡＧ／ＣＴＧ反復の関与を除外した（非特許文献２３）。本発明はＣＣＧ／ＣＧＧ反復の単離に特異的な領域のための方法に適合させ、そしてそれを染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３  ＢＰ候補領域に適用した。
【非特許文献１】
Ｔｓｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｆａｒａｏｎｅ  （１９９０），ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｏｏｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】
Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ａｍ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．）ＱＱ  ｐｐ３７０−３７６
【非特許文献３】
ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ；Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇａｓｋｅｌｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ  ｐｐ  １１０−１２７
【非特許文献４】
Ｅｇｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ−ｐｐ  ７８３−７８７
【非特許文献５】
Ｍｅｎｄｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７，ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  １ｐｐ  １２３０−１２３２
【非特許文献６】
Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  １２  ＆  ｐｐ  ２８９−２９２
【非特許文献７】
Ｋｅｌｓｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ〜ｐｐ  ２３８−２４３
【非特許文献８】
Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ〜ｐｐ  ４９−５５
【非特許文献９】
Ｂｌａｃｋ  ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ〜ｐｐ  ４２７−４３０
【非特許文献１０】
Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｂｒｉｔ  Ｊ．  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ〜ｐｐ  ３５５−３５８
【非特許文献１１】
Ｂｅｒｒｅｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ〜ｐｐ  ５９１８−５９２１
【非特許文献１２】
Ｓｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ〜ｐｐ  ２９１−２９６
【非特許文献１３】
Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２  ｐｐ  １０５−１１５
【非特許文献１４】
ｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２２ｐｐ  １３８４−１３９４
【非特許文献１５】
ＭｃＩｎｎｉｓ  ＭＧ，ＭｃＭａｈｏｎ  ＦＪ，Ｃｈａｓｅ  ＧＡ，  Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＳＧ，Ｒｏｓｓ  ＣＡ，Ｄｅｐａｕｌｏ  ＪＲＪ．１９９３．  Ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５３：３８５−９０
【非特許文献１６】
Ｎｙｌａｎｄｅｒ  ＰＯ，Ｅｎｇｓｔｒｏｍ  Ｃ，Ｃｈｏｔａｉ  Ｊ，Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ  Ｊ．Ａｄｏｌｆｓｓｏｎ  Ｒ．１９９４．Ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｐｏｌａｒ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｊ．Ｍｅｄ，Ｇｅｎｅｔ．３１：６８６−９
【非特許文献１７】
Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＬ，  ＭｃＩｎｎｉｓ  ＭＧ，Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ  Ａ，Ｒｏｓｓ  ＣＡ．１９９９．Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５６（１１）：１０１９−３１
【非特許文献１８】
Ｋｌｅｉｄｅｒｌｅｉｎ  ＪＪ．Ｎｉｓｓｏｎ  ＰＥ，Ｊｅｓｓｅｅ  Ｊ，ＬｉＷＢ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＫＧ，Ｄｅｒｂｙ  ＭＬ，Ｒｏｓｓ  ＣＡ，Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＬ．１９９８．ＣＣＧ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｃＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３（６）：６６６−７３
【非特許文献１９】
Ｍａｎｇｅｌ  Ｌ，Ｔｅｒｎｅｓ  Ｔ，Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｂ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  Ｗ．１９９８．Ｎｅｗ  ５’−（ＣＧＧ）ｎ−３’ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４６）：３０４６６−７１
【非特許文献２０】
Ｅｉｃｈｈａｍｍｅｒ  Ｐ，Ｗａｌｚ  Ａ，Ｍｅｎｇｌｉｎｇ  Ｔ，Ｓｃｈｏｌｅｒ  Ａ，Ｐｕｔｚｈａｍｍｅｒ  Ａ，Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ  Ｔ，Ａｉｇｎｅｒ  ＪＭ，Ｋｌｅｉｎ  ＨＥ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ｊ．１９９８．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｔｒｉｐｌｅｔ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｂｉｐｏｌａｒ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１（６）：９８９−９３
【非特許文献２１】
Ｋａｕｓｈｉｋ  Ｎ，Ｍａｌａｓｐｉｎａ  Ａ，ｄｅ  Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ  Ｊ．２０００．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｎｄ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９（５）：２６５−７３
【非特許文献２２】
Ｄｅｌ  Ｆａｖｅｒｏ  Ｊ，Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  Ｄ，Ｄｅ  Ｊｏｎｇｈｅ  Ｐ，Ｂｅｎｓｏｎ  Ｋ，Ｍｉｃｈａｌｉｋ  Ａ，Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＢＤ，Ｈｏｒｗｉｔｚ  Ｍ，Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ  Ｃ．１９９９．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡＧ／ＣＴＧ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２ｐ２１−ｐ２４  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒａｐｌｅｇｉａ  （ＳＰＧ４）  ｂｙ  ＹＡＣ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０５（３）：２１７−２５
【非特許文献２３】
Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  Ｄ，Ｖｉｌｌａｆｕｅｒｔｅ  Ｓ，Ｔｉｓｓｉｒ  Ｆ，Ｖａｎ  Ｇｅｓｔｅｌ  Ｓ，Ｃｌａｅｓ  Ｓ，Ｓｏｕｅｒｙ  Ｄ，Ｍａｓｓａｔ  Ｉ，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｄ，  Ｖａｎ  Ｚａｎｄ  Ｋ，Ｍｅｎｄｌｅｗｉｃｚ  Ｊ，Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ  Ｃ，Ｄｅｌ−Ｆａｖｅｒｏ  Ｊ．２０００．Ｎｏ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＡＧ／ＣＴＧ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｉｎ  １８ｑ２１．３３−ｑ２３  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８（５）：３８５−８
【発明の開示】
【００１３】
発明の要約：
本発明は新規遺伝子およびその遺伝子によりコードされるタンパク質を対象とする。新規遺伝子は、１８ｑ２１．３３−ｑ２３でＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に位置する８．９ｃＭ染色体領域に位置している。物理的地図は酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）を使用して構築した。
【００１４】
以前に記載した方法をＣＣＧ／ＣＧＧ反復の単離に特異的な領域について適合させ、そして染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３  ＢＰ候補領域に適用した。３つの有力なＣｐＧアイランドが単離され、その１つは予測される３６３９ｂｐエキソンの１．５ｋｂ上流に位置する。さらなる分析ではこれが本明細書でＮＣＡＧ１と呼ぶ新規なＣｐＧ−に関係する脳で発現する遺伝子（新規ＣｐＧ関連遺伝子１）の一部であることが示された。この位置的および機能的候補の突然変異分析により、２つの単一ヌクレオチド多型が同定され、これはＢＰ表現型の診断用マーカーとして有用となり得る。
発明の詳細な説明：
本発明は染色体１８の１８ｑ染色体候補領域に位置する新規遺伝子を対象とする。より具体的にはこの遺伝子は１８ｑ２１．３３−ｑ２３でＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に位置する８．９ｃＭ領域に位置している。
【００１５】
この遺伝子は双極性スペクトラム障害のような気分障害に関連する染色体領域に位置し、したがって双極性スペクトラム障害の診断用マーカーとして有用となり得る。問題の領域はヒトゲノムの全体性（ｔｏｔａｌｉｔｙ）から取り出された時、精神的健康および気分に影響を及ぼす他の遺伝子を配置し、単離し、そして配列決定するためにも使用することができる。
新規遺伝子の同定の単離および確認；
当業者に周知な標準的手順はＹＡＣクローンを同定するために応用し、適用できる場合は、関連遺伝子を同定し、そして特性決定するプロセスにおいて本明細書で定義するような気分障害に罹患している個体に由来するＤＮＡに適用する。例えば本発明者は、ヒト染色体１８上の目的領域内の候補遺伝子を同定するために、ヒトゲノム内のトリヌクレオチドリピート伸長（ＴＲＥ）と気分障害における予期現象との間ですでに確認された明白な関係（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ２．ｐｐ  ５５−６２およびＯ’Ｄｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １Ｑ  ｐｐ３８０−３８１）を利用して、選択したＹＡＣクローン中のＴＲＥをスクリーニングすることができる。様々な他の既知の手順を該ＹＡＣクローンに適用して以下に検討する候補遺伝子を同定することもできる。
【００１６】
したがって本発明の第１の観点は、上記定義のような気分障害または関連障害に関係する、少なくとも１つのヒト遺伝子（それらの突然変異および多型変異体を含む）を同定するために、多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配列したヒト染色体１８ｑの８．９ｃＭ領域の使用を含んでなる。以下に検討するように本発明者はそのような遺伝子について、Ｄ１８Ｓ５１とＤ１８Ｓ６１の間に以前配置した１２ＳＴＲ多型マーカーを含む家系ＭＡＤ３１を対象とした双極性疾患の共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の分析、その後のＬａＤスコア分析により、この染色体１８ｑの候補領域を同定した。本発明に従い使用することができる候補領域を覆う特定のＹＡＣは、候補領域にわたり最小のタイリングパス（ｔｉｌｉｎｇ  ｐａｔｈ）を有することから以下の９６１．ｈ−９、９４２−ｃ．３、７６６−ｆ−１２、７３１−ｃ−７、９０７．ｅ．１、７５２−ｇ−８および７１７−ｄ−３であり、好ましいのは９６１．ｈ−９、７６６−ｆ−１２および９０７．ｅ．１である。使用に適するＹＡＣクローンは、Ｄ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間で精密にされた（ｒｅｆｉｎｅｄ）候補領域に広がる人工染色体を有するものである。
【００１７】
ＹＡＣに存在してもしなくても、気分障害または関連障害に関係する候補遺伝子（１つまたは複数）を同定するために、上記定義の染色体１８ｑの候補領域に応用することができる多数の方法がある。例えばすでに前述したようにヒトゲノム中のトリヌクレオチドリピートの伸長（ＴＲＥ）の程度と気分障害の存在との間には明白な関連がある。
【００１８】
したがって本発明の第３の観点は、本明細書に定義するような気分障害または関連障害に関係する、少なくとも１つのヒト遺伝子（それらの突然変異および多型変異体を含む）の同定法を含んでなり、この方法は多型マーカーＤ１８Ｓ６８とＤ１８Ｓ９７９との間に配列したヒト染色体１８ｑの領域中にヌクレオチドの３つ組反復を検出することを含んでなる。
【００１９】
該遺伝子（１つまたは複数）の別の同定法は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間に配列したヒト染色体１８ｑの部分を含んでなるＹＡＣクローン（例えば前述の７つのＹＡＣクローンの１以上）を断片化し、そして該断片中に任意のヌクレオチドの３つ組反復、特にＣＡＧまたはＣＴＧの反復を検出することを含んでなる。少なくとも５個、そして好ましくは少なくとも１０個のＣＴＧおよび／またはＣＡＧの３つ組反復を含んでなる核酸プローブは、適当に標識された時には検出の適当な手段となる。トリヌクレオチド反復は既知のＲＥＤ（反復伸長検出）系（Ｓｈａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ〜ｐｐ１３５−１３９）を使用しても決定することができる。
【００２０】
本発明の第４の態様は、気分障害または関連障害に関係し、そして多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域に広がるＹＡＣクローン中に存在する、少なくとも１つの遺伝子（それらの突然変異および多型変異体を含む）を同定する方法を含んでなり、この方法は少なくとも８、しかし好ましくは少なくとも１２個の連続するグルタミン残基の一続きを含んでなるアミノ酸配列を持つタンパク質を認識することができる抗体の使用により、ヌクレオチドの３つ組反復を包含する遺伝子の発現産物を検出する工程を含んでなる。そのような方法は例えば７個の前述のＹＡＣクローンからヒトＤＮＡ発現ライブラリーまで、ＹＡＣのＤＮＡをサブクローニングすることにより実施することができる。関連する発現産物を検出する好適な手段は、モノクローナル抗体、特にｍＡＢ１Ｃ２の使用により、その抗体の調製および特性は、国際公開第９７／１７４４５号パンフレットに記載されている。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、上記定義のＹＡＣ  ＤＮＡの、ＢＡＣ（細菌の人工染色体）またはＰＡＣ（Ｐ１またはファージ人工染色体）のようなベクターまたはエキソン−トラップコスミドベクターのようなコスミドベクターへのサブクローニングに関与する関連遺伝子（１つまたは複数）を同定する方法に関する。そのような方法の出発点は、多型マーカーＤ１８Ｓ６０とＤ１８Ｓ６１との間のヒト染色体１８ｑの領域のコンティングマップの構築である。このために本発明者は７つの上記ＹＡＣクローンのそれぞれの中でヒトのＤＮＡ断片の末端領域を配列決定し、そしてこれらの配列を本明細書に開示する。上記のように他のベクターへのＹＡＣ  ＤＮＡのサブ−クローニング後、これらの末端配列またはそれらの部分、特に配列本明細書の図１〜１１に示す配列を含んでなるプローブを、本明細書に示すＹＡＣクローンコンティング中に記載されているようなこの領域中で既知の配列決定された標識部位（ＳＴＳ）と一緒に使用してサブクローン間の重複を検出し、そしてコンティングマップを構築することができる。また現在のＹＡＣコンティング中で知られている配列を、コンティングマップサブ−クローンの作成に使用することもできる。
【００２２】
気分障害または関連障害に関係する遺伝子（１つまたは複数）を同定することができる１つの道は、既知の技術であるエキソン−トラッピングの使用による。これは人工的なＲＮＡスプライシングアッセイであり、特殊化したエキソン−トラップコスミドベクターの現在のプロトコールで最もよく使用されている。ベクターは、複製起点および強力なプロモーター配列、多クローニング部位およびＳＶ４０ポリアデニレーション部位を含むイントロンにより分けられた２つのスプライシング−コンピテントエキソンを含むＳＶ４０ゲノムノセグメントからなる人工的なミニ−遺伝子を含む。
【００２３】
ＹＡＣ  ＤＮＡはエキソン−トラップベクター中でサブ−クローン化され、そして組換えＤＮＡをある種の哺乳動物細胞にトランスフェクトする。ＳＶ４０プロモーターからの転写がＲＮＡ転写物をもたらし、これは通常、ミニ遺伝子の２つのエキソンを含むようにスプライシングされる。クローン化ＤＮＡ自身が機能的エキソンを含む場合、これはエキソンがベクターのミニ遺伝子に存在するようにスプライシングされ得る。逆転写酵素を使用してｃＤＮＡコピーを作成することができ、そして特異的ＰＣＲプライマーを使用して挿入ＤＮＡのエキソンが関与するスプライシング反応（ｅｖｅｎｔ）を同定することができる。そのような手順でＹＡＣ  ＤＮＡ中のコーディング領域を同定することができ、これを気分障害または関連障害に罹患している個人に由来するＤＮＡの同等な領域と比較して関連する遺伝子を同定することができる。
【００２４】
したがって本発明の第５の観点は、気分障害または関連障害に関係する少なくとも１つのヒト遺伝子（それらの変異体または多型を含む）を同定する方法を含んでなり、この方法は：
（１）上記のように調製し、そしてマップされたエキソントラップコスミドベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクトし：
（２）該哺乳動物細胞を適当な培地中で培養し；
（３）ＳＶ４０プロモーターから発現したＲＮＡ転写物を単離し；
（４）該ＲＮＡ転写物からｃＤＮＡを調製し；
（５）該エキソントラップコスミドベクター中にサブ−クローン化したＤＮＡのエキソンを含むスプライシング反応を同定して、該サブ−クローン化ＤＮＡ中のコーディング領域の位置を解明し；
（６）該コーディング領域と、該気分障害または関連障害に罹患している個人のＤＮＡ中の同等な領域との間に差異を検出し；そして
（７）該気分障害または関連障害に関係する該遺伝子またはそれらの突然変異または多型変異体を同定する、
工程を含んでなる。
【００２５】
エキソントラッピングに対する代替として、ＹＡＣ  ＤＮＡはＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドまたは他のベクターにサブ−クローン化され、そしてコンティングマップを上記のように構築することができる。既知の様々な利用可能な方法があり、それらによりサブ−クローン化されたＤＮＡ上の関連遺伝子の位置が以下のように確立される：
（ａ）ｃＤＮＡ選択または捕捉（直接選択およびｃＤＮＡ選択とも呼ばれる）：この方法にはクローン化ＤＮＡ（例えばＹＡＣ  ＤＮＡの挿入物）を、特別な（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーに由来する全ＤＮＡクローンの挿入物のようなｃＤＮＡの複雑な混合物へハイブリダイズさせることにより、ゲノムＤＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二重鎖を形成すること含む。関連配列がハイブリダイズし、そしてビオチン−ストレプトアビジン捕捉およびＰＣＲ（または関連技術）を使用する後工程で濃縮することができる；
（ｂ）ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション：ゲノムクローン（例えば特別なコスミドの挿入物）を、培養細胞系のパネルに由来するｍＲＮＡのノーザンブロットに、または適当な（例えば脳）ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることができる。陽性シグナルはクローン化された断片内に遺伝子の存在を示すことができる；
（ｃ）ＣｐＧアイランドの同定；ＣｐＧまたはＨＴＦアイランドは短い（約１ｋｂ）低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ＧＣ−リッチ（＞６０％）配列であり、これは遺伝子の５’末端に見いだされることが多い。ＣｐＧアイランドはしばしば、幾つかのレア−カッター（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｅｒ）制限酵素の制限部位を有する。レア−カッター制限部位の集まり（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）は、ＣｐＧアイランドの指標であるので、ある可能な遺伝子の指標でもある。ＣｐＧアイランドはＤＮＡクローンの、レア−カッター酵素で消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットへのハイブリダイゼーションにより、またはアイランド−レスキュー（ｉｓｌａｎｄ−ｒｅｓｃｕｅ）ＰＣＲ（アイランドと近傍Ａｌｕ−反復との間の配列を増幅することによるＹＡＣに由来するＣｐＧアイランドの単離）により検出することができる；
（ｄ）ズー（ｚｏｏ）−ブロッティング：ＤＮＡクローン（例えば特別なコスミドの挿入物）を、種々の動物種に由来するゲノムＤＮＡサンプルのサザンブロッティングに対して、低ストリンジェンシーでハイブリダイズさせること。ハイブリダイゼーションシグナルの検出は保存配列を示唆し、可能な遺伝子を示すことができる。したがって本発明の第６の観点は、該気分障害または関連障害に関係する少なくとも１つのヒト遺伝子（それらの突然変異および多型変異体を含む）を同定する方法を含んでなり、この方法は：
（１）上記のようなＹＡＣ  ＤＮＡをコスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣまたは他のベクターにサブ−クローニングし；
（２）サブ−クローン間の重複を検出し、そしてそれらのマップを構築するために、図１〜１１の任意の１つ、または本明細書に記載するＹＡＣクローン  コンティング中のようなこの領域中の他の任意の配列を標識した部位（ＳＴＳ）に示されるヌクレオチド配列、あるいはそれらの１４個以上の連続する塩基または相補体からなるそれらの部分を使用し；
（３）ＣｐＧアイランド同定、ズーブロッティング、サブ−クローン化したＤＮＡの培養細胞系のパネルに由来するｃＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡのノーザンブロットへのハイブリダイゼーションの１以上により、サブ−クローン化したＤＮＡ内の遺伝子の位置を同定し；
（４）該遺伝子と気分障害または関連障害に罹患している個体のＤＮＡの同等領域との間に差異を検出し；そして
（５）気分障害または関連障害に関係する該遺伝子を同定する、
工程を含んでなる。
【００２６】
クローン化ＹＡＣ  ＤＮＡが配列決定されれば、コンピューター分析を使用して関連遺伝子の存在を確立することができる。相同性検索およびエキソン予測のような技術を応用してもよい。
【００２７】
本発明の方法に従いいったん候補遺伝子が単離されれば、より詳細な比較を正常個体および双極性スペクトラム障害のような気分障害に罹患した個体に由来する遺伝子間で行うことができる。例えばＤＮＡ配列中の突然変異または多型を同定することができる「突然変異試験（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔａｓｔｉｎｇ）」と記載される２つの方法がある。第１の方法ではＤＮＡサンプルを１つの特別な突然変異の存在または不存在について試験することができるが、しかしこれにはどれが突然変異であるかの知識が必要である。第２の方法ではＤＮＡのサンプルを標準（正常）ＤＮＡからの偏りについてスクリーニングする。後者の方法は突然変異が前以て同定されていない候補遺伝子を同定するために有用である。さらに以下の技術を上記方法により同定された遺伝子に適用して、正常または健康な個体に由来する遺伝子と気分障害または関連障害に罹患している個体に由来する遺伝子との間の差異を同定することができる：
（ａ）サザンブロッティング技術：クローンを、種々の制限酵素で消化した患者および健康個体のゲノムＤＮＡを含むナイロン膜にハイブリダイズさせる。患者と健康個体との間の大きな差異は放射能標識プロトコールを使用して視覚化することができる；
（ｂ）ポリアクリルアミドゲル中でのヘテロ二重鎖の移動度：この技術は非−変性ポリアクリルアミドゲル中でのヘテロ二本鎖の移動度がホモ二本鎖の移動度よりも低いという事実に基づく。２００ｂｐ未満の断片に最も効果的である；
（ｃ）一本鎖立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）の多型分析（ＳＳＣＰまたはＳＳＣＡ）：一本鎖ＤＮＡは折り畳まれて弱い分子内結合により安定化される複雑な構造を形成する。
【００２８】
非−変性ポリアクリルアミドゲル中でのこれらの構造の電気泳動的移動度は、それらの鎖長およびそれらの立体構造に依存する；
（ｄ）ミスマッチの化学的開裂（ＣＣＭ）：放射能標識プローブを試験ＤＮＡにハイブリダイズさせ、そしてミスマッチはミスマッチの部位でＤＮＡの１つの鎖を開裂する一連の化学反応により検出される。これは大変感度のある方法であり、そしてキロ塩基長のサンプルに応用することができる；
（ｅ）ミスマッチの酵素的開裂：このアッセイはＣＣＭに類似するが、開裂が特定のバクテリオファージ酵素により行われる；
（ｆ）変性勾配ゲル電気泳動：この技術では、ＤＮＡ二本鎖を変性剤（化学物質または温度）の量が増加する勾配が存在する電気泳動用ゲルに通して移動させる。移動はＤＮＡ二本鎖が、鎖が融解し、そして分離するゲル上の位置まで続き、その後、変性したＤＮＡはそれ以上移動しない。正常と突然変異ＤＮＡ二本鎖との間の１塩基対の差異が、それらをゲル中で異なる位置まで移動させるために十分である；
（ｇ）直接ＤＮＡシークエンシング。
【００２９】
本明細書に記載する方法に関して、ＹＡＣおよび気分障害または関連障害に罹患した個体のＤＮＡに由来するコーディング領域間に差異を検出する工程において、該個体は疾患を有する任意の個体でよく、家系ＭＡＤ３１の員である必要はない。
【００３０】
本発明のさらなる観点に従い、気分障害または関連障害に関係し、そして上記方法により得ることができる単離されたヒト遺伝子およびそれらの変異体、該遺伝子によりコードされる単離されたヒトのタンパク質および該タンパク質をコードするｃＤＮＡを提供する。
【００３１】
いったん遺伝子が同定されれば、多数の方法を利用してコードされたタンパク質の機能を決定することができる。これらの方法はＥｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．１５，Ｊｕｎｅ  ２０００）により記載され、そして引用により本明細書に編入する。１つの方法にはゲノム配列に由来する機能的関連を明らかにするコンピューター法を含み、そして遺伝子隣接法（ｇｅｎｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｍｅｔｈｏ）と呼ぶ。幾つかのゲノムで２つのタンパク質をコードする遺伝子が染色体上で隣接する場合、タンパク質は機能的に関連する傾向がある。この方法はオペロンが共通である原核生物における機能的関連を解明するのに有力となり得るが、真核生物のタンパク質相互作用を分析するにも有望である。
実施例：
実施例１
Ａ：３つ組反復の単離
ＣＣＧ／ＣＧＧ  ＹＡＣ断片化ベクターは、平滑化（ＣＣＧ）１０／（ＣＧＧ）１０アダプターを、すでに記載されたｐＤＶ１基本ベクター（Ｄｅｌ−Ｆａｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）の平滑化ＳｐｈＩ部位にクローニングすることにより構築した。シークエンシングでは断片化ベクターｐＤＶＣＣＧおよびｐＤＶＣＧＧがそれぞれ５’−（ＣＣＧ）１０−３’および５’−（ＣＧＧ）１０−３’方向でアダプター配列を有することが決定された。
【００３２】
これらのベクターを使用して、ＣＣＧ／ＣＧＧ反復およびフランキング配列を記載されたように（Ｄｅｌ−Ｆａｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）ＹＡＣ断片化により単離した。
Ｂ．ＮＣＡＧ１遺伝子の特性決定および構造
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．共同体［ＬＬＮＬ］ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）
【００３３】
【表１】
2004534540.tif 000002
【００３４】
を、ＲＺＰＤドイツ  ゲノム研究用資源センター有限会社（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｎｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｅｒ  Ｇｅｎｏｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ）（ドイツ、ベルリン−シャーロッテンブルグ  １４０５９、ホーベネルベルグ）に注文した。単一コロニーから出発した培養を成長させ、そしてプラスミドはＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ精製システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）により調製した。ＤＮＡシークエンシングは、ＤＮＡシークエンシングキット（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、フォスター、カリフォルニア州）を使用してジデオキシヌグオチドシークエンシング法で行い、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキン−エルマー、フォスター、カリフォルニア州）またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００ＤＮＡアナライザー（パーキン−エルマー、フォスター、カリフォルニア州）により分析した。
【００３５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応について、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞に由来するｍＲＮＡはμＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ単離キット（ミルテニー  バイオテック（Ｍｉｌｅｔｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ベルギッシェ  グラドバッハ、ドイツ）を使用して調製した。ＤＮＡｓｅＩ（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）処理後、ＲＴ反応をオリゴ（ｄＴ）プライマーでプライムし、そして第１鎖ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、Ｎ．Ｖ．ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メレルベーク、ベルギー）を用いて行った。Ｆｓ−ｃＤＮＡは、ＴａＫａＲａＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造株式会社、大津、滋賀県、日本）を用いた長−範囲ＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲ産物はネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いて増幅し、そして上記のように配列決定した。
Ｃ：ＮＣＡＧ１遺伝子の特性決定および発現パターン
脳、胎児脳、胎盤、肝臓、精巣および肺に由来するＧｅｎｅｐｏｏｌ  ｃＤＮＡ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）をｃＤＮＡマッピングパネルとして使用した。ヒト脳多組織ノーザン（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ：ＭＴＮ）ブロットＩＶ（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア州）は、製造元の使用説明に従い添付されたＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中での放射性ハイブリダイゼーションに使用した。ズーブロット（ｚｏｏｂｌｏｔ）は１０μｇのゲノムＤＮＡをHindＩＩで完全に消化し、それをＴＡＥ  １％アガロースゲルで泳動し、そしてサザンブロットを行うことにより調製した。ＮＣＡＧ１遺伝子のＯＲＦを含むＰＣＲ産物を放射能標識し、そして６５℃でハイブリダイズさせた。
Ｄ：ＮＣＡＧ１遺伝子の突然変異分析
約６００ｂｐの重複ＰＣＲ産物を作成し、そして上記のように配列決定した。両方の同定された多型は、ＰＣＲ産物をＨｉｎｆＩで消化し、そして断片をＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動システム（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）、ウプサラ、スウェーデン）でプレキャストＥｘｃｅｌＧｅｌゲルにて泳動することにより検出した。
Ｅ：ＣＣＧ／ＣＧＧ  ＹＡＣ断片化
ＣＣＧ／ＣＧＧ  ＹＡＣ断片化をＹＡＣ  ９６１ｈ９、７６６ｆ１２および９０７ｅ１（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）に適用した。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）およびサザンブロットハイブリダイゼーションによるサイズ決定で、３３組の等しいサイズに断片化されたＹＡＣクローンが生じた。１１２個の断片化されたＹＡＣ末端の配列決定で、特異的な相同的組換えにより生じる同一の末端配列を持つ７組（３３のうちの）の断片化ＹＡＣが同定された。第１組（ＣＣＧ７）はＣＡＰ２遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号Ｌ４０３７７７）の５’ＵＴＲ中の（ＣＧＧ）６反復中の断片化の結果であった。第２組（ＣＣＧ６）は（ＣＣＧ）２反復を含み、そして第３（ＣＣＧ４）は不完全なＣＣＣＣＧ反復を含んだ。ＣＡＰ２遺伝子の５’ＵＴＲ中の３つ組反復は、ＢＰ疾患に関係しないことがすでに示された（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＣＣＧ４のサイズを１２名のＢＰおよび１２名のＵＰ患者で分析したが、唯一の対立遺伝子が検出された。ＣＣＧ６中のサイズは、これが多型となるには小さすぎることから分析しなかった。
【００３６】
深い分析で７つの配列のうちの３つ（ＣＣＧ３、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号．．．．．；ＣＣＧ４、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号．．．．．；およびＣＣＧ６、ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号．．．．．）が高いＣＧ含量（７０〜８０％）および高いＣｐＧ含量（２００ｂｐ中に１５〜２０ＣｐＧ）を有したが、さらなるＣＣＧ／ＣＧＧ反復は見いだされなかった。これらの有力なＣｐＧアイランドに対するプライマー対を使用して、ＹＡＣコンティング上でのそれらの位置を決定した（図１）。ＢＬＡＳＴＮ分析（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）は、両ＣＣＧ４およびＣＣＧ６についてＲＰＣＩ−１１  ＢＡＣｓの配列でヒットした。ＣＣＧ４はＲＰＣＩ−１１  ＢＡＣ  ２９０１３（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＡＣ０２２６６２、ＧＩ：７２４９１１７）のワーキングドラフト配列の２７１５０ｂｐのコンティングにヒットを与えた。ＣＣＧ６はＲＰＣＩ−１１  ＢＡＣ  ７９３Ｊ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＡＣ００９８０２）の完全配列の一部であった。
Ｆ：ＮＣＡＧ１遺伝子の同定およびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ特性決定
有力なＣｐＧアイランドＣＣＧ４およびＣＣＧ６に関連する可能性がある遺伝子を見いだすために、それらの周辺ＢＡＣ配列をバイオインフォマティクスツールを使用して分析した。ＢＡＣ  ２９０１３の２７１５０ｂｐコンティングおよびＢＡＣ  ７９３Ｊ２の完全配列を分析のためにルマージハイスループット配列アノテーションサーバー（Ｒｕｍｍａｇｅ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒ）に送った（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎ１００．ｉｍｂ−ｊｅｎａ．ｄｅ／ｒｕｍｍａｇｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００３７】
最初にＬＣＰ（Ｈｕａｎｇ  １９９４）およびＣＰＧ（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｙ  ａｌ  １９９２）が、それぞれ１．２ｋｂおよび０．４ｋｂのＣＣＧ４およびＣＣＧ６を含むＣｐＧアイランドを認識し、それらのＣｐＧアイランドにおける役割の可能性が示唆された。
【００３８】
次の段階で、エキソン予想プログラムＧｒａｉｌ（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ  ＆  Ｍｕｒａｌ  １９９１）およびＧｅｎｓｃａｎ（Ｂｕｒｇｅ  ＆  Ｋａｒｌｉｎ  １９９７）の両方がＣＣＧ４を含む１．２ｋｂの大きなＣｐＧアイランドの１．５ｋｂ下流に３６３９ｂｐエキソンの存在を予測した。この予測されたエキソンは、ほとんど完全なコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を持つＡＴＧ出発コドンで始まり、そしてＴＡＡ停止コドンで終わるオープンリーディングフレイム（ＯＲＦ）を含む。他の予測された特徴は、ＯＲＦから２３５２ｂｐ上流の転写開始コドン（ＴＳＳ）（Ｐｒｏｓｃａｎ（Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ  １９９５）によるスコア７６．６）、およびＯＲＦから３０３２、３２４７、４３６４、５３３８および８２６６下流のポリアデニレーションシグナル（それぞれＰｏｌｙＡＨ（Ｓａｌａｍｏｖ  ＆  Ｓｏｌｏｖｙｅｖ  １９９７）により４．７９、３．８３、４．９４、４．９３および６．２７のスコア）（図２ａ）である。
【００３９】
ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９０）並列配置は、ｄｂＥＳＴの配列を調査し、２１のヒトＥＳＴｓに対して有意な相同性（＞９７％）を明らかとした（表１、図２ｂ）。ＴＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）はＧｅｎｅＢａｎｋの非−過多データベース（ｎｒ）を調査し、ＯＲＦがタンパク質レベルでＴ−細胞により認識される偏平上皮細胞癌腫抗原（Ｎａｋａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）であるＳＡＲＴ−２（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＮＰ ０３７４８４）と完全な相同性を示した。より弱い相同性が一連のスルホトランスフェラーゼで見いだされた。ＳＭＡＲＴ（単純なモジュラーアーキテクチャーリサーチツール（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、Ｖ３．１）（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）による翻訳されたＯＲＦの１２１２長のアミノ酸配列の分析は、１〜２０位での開裂可能なシグナルペプチドおよび７７１〜７９１および８００〜８２０位での２つの膜貫通ドメイン以外の既知のドメインを生じなかった。Ｉｎｔｅｒｐｒｏは有意なヒットを報告しなかったが、ＰｒｏｄｏｍデータベースのＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  １９９７）は、ＮＣＡＧ１遺伝子とコンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼドメイン（Ｐｒｏｄｏｍ寄託番号ＰＤ０４２４６０）との間に相同性を示した。
Ｇ：ＮＣＡＧ１遺伝子の構造的組織の特性決定
ＢＬＡＳＴＮ  ＥＳＴヒットに基づき、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ，共同体［ＬＬＮＬ］ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）を注文し、そして配列決定した。推定される５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、ＯＲＦおよび推定される３’ＵＴＲ中のゲノム配列と並列配置した配列は、これらの配列が正に転写されることを示す（図２ｃ）。ＩＭＡＧｐ９９８Ｂ１９４３４６Ｑ２の配列とゲノム配列との並列配置は、ｃＤＮＡに８６５ｂｐが無かったことを示した。フランキング配列の詳細な分析により、コンセンサスアクセプターおよびドナースプライス部位の存在が明らかとなり、この断片がイントロンらしいことを確認した。またクローンＩＭＡＧｐ９９８Ｄ１９３６２８Ｑ２は、ゲノム配列と比べた時に１．９ｋｂの断片が無かったが、コンセンサススプライス部位は不存在であった。２つのクローン、ＩＭＡＧｐ９９８Ｄ１９３６２８Ｑ２およびＩＭＡＧｐ９９８Ａ１３６８２６Ｑ２はＯＲＦから４．４ｋｂ下流の推定されるポリアデニレーションシグナルで正確に終結した。クローンＩＭＡＧｐ９９８Ａ１５４３０７Ｑ２、ＩＭＡＧｐ９９８Ｄ１２６８２６Ｑ２およびＩＭＡＧｐ９９８Ｆ１３１８６６Ｑ２の配列はゲノム配列と並列配置せず、そしてさらに分析しなかった。
【００４０】
ｃＤＮＡクローンのシークエンシングは転写物の連続配列を生じなかったので、プライマーを消化し、そしてＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。異なる重複ＲＴ−ＰＣＲ産物のシークエンシングにより、推定される５’および３’配列に連結した予測されるエキソンのＯＲＦを含む、少なくとも９ｋｂの転写物の存在が確認された（図２ｄ）。８６５ｂｐの５プライムイントロンを確認し、そして３’ＵＴＲをＯＲＦの４．４ｋｂ下流の予測されるポリアデニレーションシグナルまで延長した。
Ｈ：ＮＣＡＧ１遺伝子の発現パターンの特性決定
ＮＣＡＧ１遺伝子の発現プロフィールを調査するために、ＯＲＦに広がる長い範囲のＰＣＲをゲノムＤＮＡで至適化し、そしてｃＤＮＡマッピングパネルに適用した。これにより断片は脳、胎児脳、胎盤および肝臓に由来するｃＤＮＡに存在することが示されたが、精巣および肺に由来するｃＤＮＡ中には検出できなかった。脳での発現についてより詳細な情報は、調査したすべての組織（肺、胎盤、小腸、肝臓、腎臓、骨格筋、心臓、脳、子宮、気管、甲状腺、胃、脊髄、前立腺、乳腺、リンパ節、脳（全体：ｗｈｏｌｅ）、膀胱、副腎、扁桃、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床および全脳（ｔｏｔａｌ  ｂｒａｉｎ））中に＞９．５ｋｂの転写物の発現を示すノーザンブロットハイブリダイゼーションにより得た。
【００４１】
ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）のズーブロットハイブリダイゼーション実験は、イヌ、ブタ、マウス、ロバ、ウマおよびヒツジのような他の哺乳動物のゲノムＤＮＡに相同的配列の存在を示した。
Ｉ：ＮＣＡＧ１遺伝子の突然変異分析
この新規ＣｐＧ−関連遺伝子は脳で発現し、そして染色体１８ｑ２１．３−ｑ２３  ＢＰ候補領域に位置するので、ＯＲＦの突然変異分析を３名の患者および染色体１８関連家系ＭＡＤ３１の１名の逸脱者（ｅｓｃａｐｅｅ）について行った。このようにして２つの単一ヌクレオチド多型が同定された。第１はＯＲＦの２０１７位でＣからＴへのトランジッションであり、アミノ酸（ＡＡ）６７３をプロリンからセリンに変える。この多型は健康な対照にのみ見いだされた。第２の多型は３名のすべての患者に見いだされた。これも２８２４位に位置するＣからＴへのトランジッションであり、そして９４２ＡＡをプロリンからセリンに変えた。家系ＭＡＤ３１でのこの多型の分析で、Ｔ−対立遺伝子が疾患のハプロタイプに存在したことが示された。
【００４２】
両多型を９２名のＢＰ患者および９２名の年齢、性別および民族を合わせた対照での群衆実験でＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析により分析した。Ｐ６７３Ｓ多型は両方の対立遺伝子がほぼ等しく存在する頻度が高い多型であることが判明した。しかしＰ９４２Ｓ多型はわずか３名のＢＰ患者および２名の対照にのみ存在するＴ対立遺伝子を含む稀な多型であることが分かった。統計的分析では対照群が両多型についてハーディ−ワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）平衡にあることが示された。対立遺伝子、遺伝子型またはハプロタイプはＢＰ障害に関連しないことが分かった。
【００４３】
３つ組反復の断片化は３つ組反復の単離に特異的な領域について正確な方法となることが示された（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）ので、我々はＣＣＧ／ＣＧＧ反復を単離するためにこれを染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３  ＢＰ候補領域に適用した。したがって我々は最初に新たな組の断片化ベクター、ｐＤＶＣＣＧおよびｐＤＶＣＧＧを構築しなければならなかった。これらのベクターを用いた断片化実験は、ＣＡＧ／ＣＴＧ断片化ベクターｐＤＶＣＡＧおよびｐＤＶＣＴＧを用いて得た範囲と同じ形質転換および断片化効率を生じた（データは示さず）。ＣＣＧ／ＣＧＧ断片化のＹＡＣ  ９６１ｈ９への適用は、ＣＡＰ２の５’ＵＴＲ中の（ＣＧＧ）６反復の単離をもたらした。この反復を以前に報告された（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０００）（ＣＡＧ）６反復へ調整する。ここでこの（ＣＧＧ）６（ＣＡＧ）６反復は多型であるが、ＢＰ症例で伸長せず、そしてＢＰ障害と関係もしないことがことが示された。合わせて考えるとＣＣＧ／ＣＧＧ  ＹＡＣ断片化データはＣＣＧ／ＣＧＧ反復を、染色体１８ｑ２１．３３−ｑ２３関連ＢＰ障害における疾患原因物質として支持しない。
【００４４】
一方、断片化実験は高いＣＧ（７０〜８０％）およびＣｐＧ含量を有するが、ＣＣＧ／ＣＧＧ反復を含まない３つの配列（ＣＣＧ３、ＣＣＧ４およびＣＣＧ６）を生じた。ＣｐＧアイランドは通常、５０％以上のＣＧ含量を有する２００塩基以上であり、観察対予想のＣｐＧ比が統計的に予測される比に近いＤＮＡの領域と定義される。したがってＣＣＧ３、ＣＣＧ４およびＣＣＧ６は有力なＣｐＧアイランドと考えることができる。ＬＣＰ（Ｈｕａｎｇ  １９９４）およびＣＰＧ（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９２）を用いたＣＣＧ４およびＣＣＧ６の近傍配列の分析により、両方の場合で生じた断片化は正にＣｐＧアイランドであることを確認した。ＣｐＧアイランドは遺伝子、より特異的なハウスキーピングおよび広く発現する遺伝子と強力に関連しているので、これら３つの配列はこの種の遺伝子近傍に位置するらしい。
【００４５】
単離されたＣｐＧアイランドと関連する可能性がある遺伝子に関する調査で、エキソン予測プログラムＧｒａｉｌ（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ  ＆  Ｍｕｒａｌ  １９９１）およびＧｅｎｓｃａｎ（Ｂｕｒｇｅ  ＆  ｋａｒｌｉｎ  １９９７）の両方が、単離された最長ＣｐＧアイランドの下流に３．６ｋｂのエキソンの存在を予測した。２つの事実により疑陽性の予測は強く反論された。第１は異なるモデルに基づくこの２つのプログラムが、全く同じエキソンを予測したことであった。第２は３．６ｋｂ続き、そしてコザックコンセンサスＡＴＧから始まるこのＯＲＦのゲノムＤＮＡ中での単なる存在であった。このエキソンが正に転写されたさらなる証拠は、一連のＥＳＴがＯＲＦ中および近傍の配列と大変高い相同性（９７〜１００％）を有したという事実が見いだされた点である。次の工程ではこの証拠をＥＳＴが由来するｃＤＮＡのシークエンシングにより拡大した。ＥＳＴ配列を延長し、そして補正して、相同性が９９〜１００％に上昇した。ｃＤＮＡクローンは異なるｃＤＮＡライブラリーに由来するという事実は（表１）、遺伝子が異なる組織中で発現したことを示した。ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット実験で、このＯＲＦが広く発現し、そしてＣｐＧ関連遺伝子の普通の特徴であるという最終的確認をもたらした。
【００４６】
ｃＤＮＡクローンのシークエンシングでは、ＮＣＡＧ１と並列配置した７つのヒトｃＤＮＡクローンの完全な配列をもたらした。２つの場合て、ゲノムＤＮＡの１片がｃＤＮＡ配列から欠けていた。クローンＩＭＡＧｐ９９８Ｂ１９４３４６Ｑ２は８６５ｂｐ断片が欠けていた（図２ｃ）。この断片はスプライスドナーおよびアクセプターコンセンサス配列に挟まれているので、そしてこの断片はＲＴ−ＰＣＲ産物中にも無いので、これをイントロンと呼ぶのに十分な証拠が集まった。クローンＩＭＡＧｐ９９８Ｄ１９３６２８Ｑ２もゲノム配列に比べて１．４ｋｂの断片が欠けていた。この場合、コンセンサススプライス部位は存在しなかった。さらにｃＤＮＡクローンＩＭＡＧｐ９９８Ｌ１５３９６７Ｑ２およびＩＭＡＧｐ９９８Ａ１３６８２６Ｑ２は、ＩＭＡＧｐ９９８Ｄ１９３６２８Ｑ２の欠失断片中に位置する配列を含む（図２ｃ）。このデータと、ＥＳＴ  ＡＡ４４２５４３が全部、欠失断片中に位置し（図２ｂ）、そしてこの断片がＲＴ−ＰＣＲ産物中に存在するという事実（図２ｄ）とを合わせると、この断片はイントロンというよりはむしろアーティファクトかもしれない。
【００４７】
ＥＳＴ−相同性およびｃＤＮＡクローンのシークエンシングにより、一連のｃＤＮＡクローンがＯＲＦの４．３ｋｂ下流の、または予測されるＴＳＳの１０，３ｋｂ下流の予想されるポリアデニレーションシグナルで終結したことを示した。８６５ｂｐのプライムイントロンを考慮するならば、転写物のサイズは９．５ｋｂとなり、これはノーザンブロット実験で認識される転写物のサイズである。
【００４８】
タンパク質レベルでは、開裂可能なシグナルペプチドおよび２つの膜貫通ドメインが予測される。これが正しいならば、Ｎ−末端およびＣ−末端側の両方が埋め込まれる膜の同じ側となるだろう。ＳＡＲＴ−２タンパク質との強い相同性は有意であるが、これが新規タンパク質の潜在的機能に関してさらなる手掛かりを加えるものではない。
【００４９】
染色体１８関連家系ＭＡＤ３１で疾患のハプロタイプ上に存在する２８２４Ｔ対立遺伝子は０．０３の頻度を持つ大変稀な対立遺伝子である。したがって関連するサンプルでの統計的分析はその強さを失い、この対立遺伝子がＢＰ疾患の危険性を上げる可能性が残る。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｄｂＥＳＴのＢＬＡＳＴＮ並列配置調査により見いだされたすべてのヒトＥＳＴのリストである。ＥＳＴはそれらのＧｅｎｅｂａｎｋ寄託番号Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅで名付ける。共同体［ＬＬＮＬ］ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）はそれらのＲＺＰＤクローンＩＤで名付ける。
【図２】１８ｑ２１．３３−ｑ２３  ＢＰ候補領域の最小ＹＡＣタイリングパス（Ｖｅｒｈｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。ＹＡＣは実線で表し、ＣＣＧ／ＣＧＧ断片化産物は点線で表す。カッコ内のＹＡＣサイズは、ＰＦＧＥ分析により予想する。黒丸は陽性ＳＴＳ／ＳＴＲヒットである。陰を付けたボックスはＣＣＧ／ＣＧＧ反復を強調し、そして３つのＣｐＧアイランドがＹＡＣ断片化により単離される。
【図３】ＮＣＡＧ１の特徴マップ。ａ）生物情報科学により予想される特徴。それらはＬＣＰ（Ｈｕａｎｇ  １９９４）およびＣＰＧ（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９２）により予測されるＣｐＧアイランド、Ｇｒａｉｌ（Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ  ＆  Ｍｕｒａｌ  １９９１）およびＧｅｎｓｃａｎ（Ｂｕｒｇｅ  ＆  Ｋａｒｌｉｎ  １９９７）により予測されるＯＲＦまたはエキソン、Ｐｒｏｓｃａｎ（Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ  １９９５）により予測される転写開始部位（ＴＳＳ）およびＰｏｌｙＡＨ（Ｓａｌａｍｏｖ  ＆  Ｓｏｌｏｖｙｅｖ  １９９７）により予測されるポリアデニレーションシグナルを包含する。特徴の下の数字はＰｒｏｓｃａｎおよびＰｏｌｙＡＨにより戻されたスコアを示す。ｂ）ＥＳＴヒットの並列配置。ＥＳＴはそれらのＧｅｎｅｂａｎｋ寄託番号で名付ける。ｃ）ｃＤＮＡクローンの並列配置。Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ共同体［ＬＬＮＬ］ｃＤＮＡクローン（Ｌｅｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）はそれらのＲＺＰＤクローンＩＤで名付ける。ｄ）ＲＴ−ＰＣＲ産物。灰色の棒はＲＴ−ＰＣＲ産物を表し、太い黒線はネスティッドＰＣＲで得た配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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