(57)【要約】(i)夫々、IL-4及びSDF-1α、又はIL-2及びSDF-1α、並びにこれらのモジュレーター、(ii)夫々、IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、又はIL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、(iii)チロシンキナーゼSyk又はZAP-70のモジュレーター、又は(iv)活性化Ｔ細胞NFAT1もしくはNFAT2の核因子のモジュレーターからなる活性物質を含むことを特徴とするTh1/Th2比を変調することによりヒト又は動物のTh1細胞関連疾患又はTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Th1/Th2比を低下することによりヒト又は動物のTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、
g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
h)物質a)-g)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
Th1関連疾患が感染症である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Th1関連疾患が自己免疫疾患である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
Th1関連疾患が遅延型過敏症である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
Th1関連疾患が癌である、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
治療すべきTh1関連疾患を誘発する病原物質を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
病原物質が感染症を誘発する感染性物質である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
病原物質が抗原である、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
抗原が自己免疫疾患を誘発する自己抗原である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
抗原がハプテン又は遅延型過敏症を誘発するアレルゲンである、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
物質b)がIL-4又はSDF-1αとそれらの夫々の受容体の間の結合の刺激物質、又はIL-4もしくはSDF-1α受容体の発現の刺激物質である、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
物質c)がIL-2もしくはSDF-1α又はそれらの受容体の一種の抗体、IL-2もしくはSDF-1α又はそれらの受容体の一種に対して結合アフィニティーを有するペプチド、低分子量化合物、遊離IL-2又はSDF-1α受容体、Ｔ細胞にエフェクター機能を与える低下された能力を有するIL-2又はSDF-1α、或いはIL-2又はSDF-1α受容体の発現のインヒビターである、請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
物質d)がi)アンチセンス核酸分子、ii)細胞内抗体、iii)Syk又はNFAT1由来ペプチド化合物又はiv)Syk又はNFAT1を特異的に抑制する化学化合物である、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
アンチセンスストランドがDNA、RNA、PNA、LNA又はホスホロチオエートである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
物質e)が活性ZAP-70又はNFAT2タンパク質、ZAP-70又はNFAT2をコードする発現ベクター及びZAP-70又はNFAT2活性を特異的に刺激する化学薬剤である、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
物質e)がビスペルオキソバナジウム(bpV)である、請求項１から１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
物質f)がリン酸カルシウム又はAlヒドロゲルである、請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
医薬組成物であって、
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、
g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
h)物質a)-g)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１９】
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、
g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、又は
h)物質a)-g)のいずれかの組み合わせ
の、Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項２０】
Th1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法であって、
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、
g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
h)物質a)-g)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質の有効用量を被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
Th1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法であって、
Ｔヘルパー細胞を被験者から除去する工程、及び
該細胞を、
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、
g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
h)物質a)-g)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質の有効用量とex vivoで接触させる工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
治療すべき被験者又はレシピエントを免疫系の操作を伴う第二治療にかける工程を含む、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
免疫系の操作を伴う第二治療がワクチン投与、抗原特異性免疫療法、アレルゲン特異性免疫療法、非特異性免疫療法及び器官移植からなる群から選ばれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
Th1/Th2比を増大することによりヒト又は動物のTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、
o)IL-2及びSDF-1α、
p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
s)Syk又はNFAT1の刺激物質、
t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、
u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
v)物質o)-u)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２５】
Th2細胞関連疾患がアレルギー性疾患である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
アレルギー性疾患が枯草熱、鼻結膜炎、鼻炎及び喘息からなる群から選ばれる、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
Th2細胞関連疾患が癌である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２８】
治療すべきTh2関連疾患を誘発する病原物質を更に含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２９】
病原物質が寄生生物又はその部分である、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
病原物質が抗原である、請求項２８記載の組成物。
【請求項３１】
抗原がアレルギー性疾患を誘発するアレルゲンである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
物質p)がIL-2又はSDF-1αとそれらの夫々の受容体の間の結合の刺激物質、又はIL-2もしくはSDF-1α受容体の発現の刺激物質である、請求項２４から３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
物質q)がIL-4もしくはSDF-1α又はそれらの受容体の一種の抗体、IL-4もしくはSDF-1α又はそれらの受容体の一種に対して結合アフィニティーを有するペプチド、低分子量化合物、遊離IL-4又はSDF-1α受容体、Ｔ細胞にエフェクター機能を与える低下された能力を有するIL-4又はSDF-1α、或いはIL-4又はSDF-1α受容体の発現のインヒビターである、請求項２４から３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
物質r)がi)アンチセンス核酸分子、ii)細胞内抗体もしくはiii)ZAP-70又はNFAT2由来ペプチド化合物又はiv)ZAP-70又はNFAT2を特異的に抑制する化学化合物である、請求項２４から３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
物質r)がL-グルタミン、L-アラニン、L-ホモ-フェニルアラニン又はL-セリンから誘導された1,2,4-オキサジアゾール類似体、２座ζ-ITAMペプチドの擬態、１座化合物、ペプトイド、イソチアゾロン化合物、ノコダゾール、メチル-3-(N-イソチアゾロン)-2-チオフェンカルボキシレート、ZAP-70の触媒不活性突然変異体をコードするDNAである、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
アンチセンス核酸分子がDNA、RNA、PNA、LNA又はホスホロチオエートである、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
物質s)が活性Syk又はNFAT1タンパク質、Syk又はNFAT1をコードする発現ベクター及びSyk又はNFAT1活性を特異的に刺激する化学薬剤である、請求項２４から３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
物質t)がCpG分子又はMPL（モノホスホリル脂質Ａ）である、請求項２４から３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
医薬組成物であって、
o)IL-2及びSDF-1α、
p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
s)Syk又はNFAT1の刺激物質、
t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、
u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
v)物質o)-u)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４０】
o)IL-2及びSDF-1α、
p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
s)Syk又はNFAT1の刺激物質、
t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、
u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、又は
v)物質o)-u)のいずれかの組み合わせ
の、Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項４１】
Th1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法であって、
o)IL-2及びSDF-1α、
p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
s)Syk又はNFAT1の刺激物質、
t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、
u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
v)物質o)-u)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質の有効用量を被験者に投与する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
Th1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法であって、
被験者からＴヘルパー細胞を除去する工程、
該細胞を、
o)IL-2及びSDF-1α、
p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
s)Syk又はNFAT1の刺激物質、
t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、
u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
v)物質o)-u)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質の有効用量とex vivoで接触させる工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
治療すべき被験者又はレシピエントを免疫系の操作を伴う第二治療にかけることを含む、請求項４１又は４２記載の方法。
【請求項４４】
免疫系の操作を伴う第二治療がワクチン投与、抗原特異性免疫療法、アレルゲン特異性免疫療法、非特異性免疫療法及び器官移植からなる群から選ばれる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
チロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
【請求項４６】
5-25、好ましくは10-20、更に好ましくは13-18塩基を含む、請求項４５記載のPNA。
【請求項４７】
配列番号１の配列を有する請求項４５又は４６記載のPNA。
【請求項４８】
Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するためのチロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
【請求項４９】
Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための薬剤の製造のためのチロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の使用。
【請求項５０】
チロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の有効用量を被験者に投与する工程を含むことを特徴とする、Th1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法。
【請求項５１】
チロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
【請求項５２】
5-25、好ましくは10-20、更に好ましくは13-18塩基を含む、請求項５１記載のPNA。
【請求項５３】
配列番号２の配列を有する請求項５１又は５２記載のPNA。
【請求項５４】
Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するためのチロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
【請求項５５】
Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための薬剤の製造のためのチロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の使用。
【請求項５６】
チロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の有効用量を被験者に投与する工程を含むことを特徴とする、Th1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法。
【請求項５７】
被験者のＴヘルパー細胞プロフィールを評価するin vitro診断方法であって、
被験者からＴヘルパー細胞を含むサンプルを得る工程、
サンプル中のリン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2のレベルを測定する工程、及び
得られた測定結果を使用してTh1/Th2レベルを評価する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５８】
Th1/Th2比に関する製品又は方法の効果を試験するin vitro方法であって、
既知のTh1/Th2比を有するＴヘルパー細胞を含む培養物を得る工程、
Ｔヘルパー細胞を製品又は方法に暴露する工程、
サンプル中のリン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2のレベルを測定する工程、及び
得られた測定結果を使用してTh1/Th2レベルの変化を評価する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５９】
リン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2への結合に特異性の一種以上のプローブ、及び必要により検出系を含むことを特徴とする診断試験キット。
【請求項６０】
Th1細胞に富む培養物の生産方法であって、
Ｔヘルパー細胞を含むサンプルを得る工程、及び
該サンプルを
a)IL-2及びSDF-1α、
b)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、
e)Syk又はNFAT1の刺激物質、
f)物質a)-e)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
g)物質a)-f)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質に暴露してTh1/Th2比を増大させる工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
Th2細胞に富む培養物の生産方法であって、
Ｔヘルパー細胞を含むサンプルを得る工程、
該サンプルを
a)IL-4及びSDF-1α、
b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、
c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、
d)Syk又はNFAT1のインヒビター、
e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、
f)物質a)-e)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分、及び
g)物質a)-f)のいずれかの組み合わせ
からなる群から選ばれた活性物質に暴露してTh1/Th2比を低下させる工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項６０又は６１記載の方法により生産された培養物のin vitro又はin vivoの研究及び実験における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はTh1/Th2比を低下することによりヒト又は動物のTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
同様に、本発明はTh1/Th2比を増大することによりヒト又は動物のTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
【０００２】
背景技術
CD4+ Tヘルパー細胞は抗原刺激及びサイトカイン環境に応じてTh1又はTh2細胞に分化する。今までのところ、指令的かつ／又は選択的分化はin vivoでTh細胞形成に寄与し得るか否かは極めて明らかではない。IL-12の存在下で抗原により最初に活性化されたＴヘルパー細胞は主としてTh1細胞に発達し、一方、IL-4の存在下で活性化されたものは主としてTh2細胞に発達する（Coffmanら, 1999）。前駆Th細胞はTh1又はTh2経路を指示するサイトカインを合成するためにコンピテントになる前に個々の細胞分裂を必要とすると考えられる（Birdら, 1998）。Sykを含むSykファミリー及びZAP-70チロシンキナーゼがリンパ球発達及び活性化に必須である。SykとZAP-70の間の明らかな構造類似性にもかかわらず、これらの２種のキナーゼが発現及び活性の両方に関して差別的に調節されるという証拠が増しつつある（Chuら, 1998）。Th1及びTh2細胞表現型は早期活性化シグナル伝達経路、特にTCR関連タンパク質チロシンキナーゼの役割において互いに異なる（Tamuraら, 1995）。TCR及びその下流のタンパク質チロシンキナーゼ、例えば、Fyn、p56(lck)、及びZAP-70はTh1及びTh2細胞の発達及び分化に関係する（Swithら, 1998; Faithら, 1997; al-Ramadiら, 1996; Deckertら, 1998）。Cblは細胞表面で受容体から開始する多くのシグナリング経路のネガチブレギュレーター、例えば、Sykファミリーとして機能するアダプタータンパク質である（Mengら, 1999; Otaら, 1997）。Cblの同族体であるCbl-bは上流のキナーゼZAP-70との直接の相互作用によりＴ細胞シグナリングに積極的な役割を有する（Zhangら, 1999）。SDF-1αについて唯一知られている受容体であるCXCR4は、TCRと交差トークしてZAP-70を含むTCRシグナリングの重要な下流の基質の抗CD3刺激リン酸化に影響し得る（Peacockら, 1999）。重大な進歩にもかかわらず、Th1及びTh2細胞の発達及び力学に関係するシグナリング経路は明らかではないままである。
【０００３】
Jourdanら, 1998はIL-4がTh2細胞そしてまたTh1細胞中でCXCR4の細胞表面発現を特異的に増進するという知見を開示している。CXCR4リガンドSDF-1αはp42MAPキナーゼERK-2を活性化する。このような活性化はＴ細胞をHIV感染症に感受性にし、細胞のSDF-1α誘発移動を促進する。研究において、IL-4誘発CXCR4が機能性であるか否かを調べるために、p42MAPキナーゼの活性が測定された。加えて、ZAP-70チロシンキナーゼの活性がシグナリングタンパク質の包括的なレベルの目安として測定された。
Th2応答はNFAT1ノックアウトマウスで増進され（Hodgeら, 1996; Violaら, 1998）、Th2応答はNFAT2ノックアウトマウスで損なわれる（Rangerら, 1998; Yoshidaら, 1998）。
WO 00/24245は組み合わせてのNFATp(NFAT1)及びNFAT4がTh2細胞の選択的リプレッサーとして作用するという技術的教示を開示している。その書類はa)増大されたTh2細胞活性の特徴的な表現型を示すNFATp及びNFAT4の両方の欠乏のマウス、b)NFATp及びNFAT4の両方の欠乏の細胞、NFATp及びNFAT4の両方の欠乏のマウス、又はNFATp及びNFAT4の両方を含むインジケーター組成物を使用して、Th2細胞活性のモジュレーターを同定する方法、c)NFATp及びNFAT4の活性を変調する薬剤を使用してTh2細胞活性を調節する方法、及びd)NFATp及び／又はNFAT4発現の変化を評価することにより異常なTh2細胞活性と関連する疾患を診断する方法を記載している。
米国特許第5958671号はc-Mafの活性を変調することによりTh2関連サイトカイン、特にインターロイキン-4(IL-4)の生成を変調する方法及び転写因子活性を変調する薬剤を使用して被験者のTh1及びTh2サブセットの発生を変調する方法を開示している。特に、その書類はNFATファミリーのいずれかの員、好ましくはNFATpの発現又は活性を刺激する第二薬剤と組み合わせてc-Mafの発現又は活性を刺激する第一薬剤を使用することによりIL-4生成を刺激する方法を記載している。また、その書類はNFATファミリーのいずれかの員の発現又は活性を抑制する第二薬剤と組み合わせてmafファミリータンパク質の発現又は活性を抑制する第一薬剤を使用することによりIL-4生成を抑制する方法を記載している。
【０００４】
発明の開示
発明が解決しようとする課題
本発明の目的はTh1及びTh2細胞関連疾患を治療するための治療物質を提供することである。
【０００５】
課題を解決するための手段
本発明の目的は本発明の第一局面で得られ、これはa)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はh)物質a)-g)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とするTh1/Th2比を低下することによりヒト又は動物のTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
更に、本発明の目的は本発明の第二局面で得られ、これはo)IL-2及びSDF-1α、p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、s)Syk又はNFAT1の刺激物質、t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はv)物質o)-u)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とするTh1/Th2比を増大することによりヒト又は動物のTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
本発明はメカニズム中の数工程の発見に基づいており、これらは細胞外レベル及び細胞内レベルの両方でTh1及びTh2細胞への前駆Ｔ細胞の分化を測定する。第一に、本発明はSDF-1αと連係してのIL-2又はIL-2刺激アジュバントによる前駆Ｔ細胞の刺激がCD4+ T細胞をTh1細胞に発達させるという発見に基づく。第二に、SDF-1αと連係してのIL-4又はIL-4刺激アジュバントによる前駆Ｔ細胞の刺激がCD4+ T細胞をTh2細胞に発達させることがわかった。IL-2、IL-4、アジュバント及びSDF-1αは前駆Ｔ細胞の表面でそれらの夫々の受容体に結合し、Th1又はTh2細胞への前記分化をもたらす特異的な細胞内調節経路を誘発すると考えられる。
第三に、本発明はTh1細胞へのＴ細胞の分化をもたらす経路がチロシンキナーゼSykだけでなく、転写因子NFAT1の活性化を伴い、一方、その他のNFAT転写因子が活性化されないという発見に基づく。第四に、Th2細胞へのＴ細胞の分化をもたらす経路はチロシンキナーゼZAP-70だけでなく、転写因子NFAT2の活性化を伴い、一方、その他のNFAT因子が活性化されないことがわかった。
Th1及びTh2細胞へのCD4+ T細胞分化のメカニズムについての上記知見に鑑みて、本発明は更に前記Ｔ細胞分化に関係することがわかった物質のいずれかの機能に干渉し得るあらゆる物質がTh1又はTh2細胞により媒介される疾患を予防又は治療するための活性物質として使用し得るという認識に基づく。特に、Th1細胞へのＴ細胞の分化を抑制することにより、又は中和的Th2細胞へのＴ細胞の分化を刺激することにより、Th1細胞関連疾患、即ち、Th1細胞が疾患プロセスを支持する疾患を治療することが可能である。対応して、Th2細胞へのＴ細胞の分化を抑制することにより、又は中和的Th1細胞へのＴ細胞の分化を刺激することにより、Th2細胞関連疾患、即ち、Th2細胞が疾患プロセスを支持する疾患を治療することが可能である。
更に、本発明は下記のものに関する。
【０００６】
a)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はh)物質a)-g)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
a)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はh)物質a)-g)のいずれかの組み合わせの、Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物の製造のための使用。
有効用量のa)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はh)物質a)-g)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を被験者に投与することを特徴とするTh1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法。
Ｔヘルパー細胞を被験者から除去し、その細胞を有効用量のa)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)IL-4刺激アジュバント及びSDF-1α、g)物質a)-f)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はh)物質a)-g)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質とex vivoで接触させることを特徴とするTh1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法。
【０００７】
治療すべき被験者又はレシピエントを免疫系の操作を伴う第二治療にかけることを含む二つの前の節の一つに記載の方法。免疫系の操作を伴う前記第二治療はワクチン投与、抗原特異性免疫療法、アレルゲン特異性免疫療法、非特異性免疫療法及び器官移植からなる群から選ばれてもよい。
o)IL-2及びSDF-1α、p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、s)Syk又はNFAT1の刺激物質、t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はv)物質o)-u)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を含むことを特徴とする医薬組成物。
o)IL-2及びSDF-1α、p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、s)Syk又はNFAT1の刺激物質、t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はv)物質o)-u)のいずれかの組み合わせの、Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物の製造のための使用。
被験者に有効用量のo)IL-2及びSDF-1α、p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、s)Syk又はNFAT1の刺激物質、t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はv)物質o)-u)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質を投与することを特徴とするTh1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法。
被験者からＴヘルパー細胞を除去し、その細胞を有効用量のo)IL-2及びSDF-1α、p)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、q)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、r)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、s)Syk又はNFAT1の刺激物質、t)IL-2刺激アジュバント及びSDF-1α、u)物質o)-t)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はv)物質o)-u)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質とex vivoで接触させることを特徴とするTh1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法。
【０００８】
治療すべき被験者又はレシピエントを免疫系の操作を伴う第二治療にかけることを特徴とする二つの前の節の一つに記載の方法。免疫系の操作を伴う前記第二治療はワクチン投与、抗原特異性免疫療法、アレルゲン特異性免疫療法、非特異性免疫療法及び器官移植からなる群から選ばれてもよい。
チロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。Syk PNAは5-25、更に好ましくは10-20、最も好ましくは13-18塩基を含むことが好ましい。Syk PNAは配列番号１の配列を有することが好ましい。
Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するためのチロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
Th1/Th2比を低下することによりTh1細胞関連疾患を予防又は治療するための薬剤の製造のためのチロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の使用。
被験者に有効用量のチロシンキナーゼSyk又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)を投与することを特徴とするTh1/Th2比を低下することによるTh1細胞関連疾患の予防又は治療方法。
チロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。ZAP-70 PNAは好ましくは5-25、更に好ましくは10-20、最も好ましくは13-18塩基を含む。ZAP-70 PNAは配列番号２の配列を有することが好ましい。
Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するためのチロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)。
Th1/Th2比を増大することによりTh2細胞関連疾患を予防又は治療するための薬剤の製造のためのチロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)の使用。
【０００９】
被験者に有効用量のチロシンキナーゼZAP-70又はその部分をコードするDNA分子に相補性であるアンチセンスペプチド核酸(PNA)を投与することを特徴とするTh1/Th2比を増大することによるTh2細胞関連疾患の予防又は治療方法。
被験者からＴヘルパー細胞を含むサンプルを得、サンプル中のリン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2のレベルを測定し、得られた測定結果を使用してTh1/Th2レベルを評価することを特徴とする被験者のＴヘルパー細胞プロフィールを評価するin vitro診断方法。
既知のTh1/Th2比を有するＴヘルパー細胞を含む培養物を得、Ｔヘルパー細胞を製品又は方法に暴露し、サンプル中のリン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2のレベルを測定し、得られた測定結果を使用してTh1/Th2レベルの変化を評価することを特徴とする、Th1/Th2比に関する製品又は方法の効果を試験するin vitro方法。
リン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1及び／又は核内NFAT2への結合に特異性の一種以上のプローブ、及び必要により検出系を含むことを特徴とする診断試験キット。
Ｔヘルパー細胞を含むサンプルを得、そのサンプルをa)IL-2及びSDF-1α、b)IL-2の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-4のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)ZAP-70又はNFAT2のインヒビター、e)Syk又はNFAT1の刺激物質、f)物質a)-e)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はg)物質a)-f)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質に暴露してTh1/Th2比を増大することを特徴とするTh1細胞に富む培養物の生産方法。
Ｔヘルパー細胞を含むサンプルを得、そのサンプルをa)IL-4及びSDF-1α、b)IL-4の刺激物質及びSDF-1αの刺激物質、c)IL-2のアンタゴニスト及びSDF-1αのアンタゴニスト、d)Syk又はNFAT1のインヒビター、e)ZAP-70又はNFAT2の刺激物質、f)物質a)-e)のいずれかの機能性誘導体、類似体もしくは部分又はg)物質a)-f)のいずれかの組み合わせからなる群から選ばれた活性物質に暴露してTh1/Th2比を低下することを特徴とするTh2細胞に富む培養物の生産方法。
in vitro又はin vivoの研究及び実験における請求項６０又は６１記載の方法により生産された培養物の使用。
【００１０】
発明を実施するための最良の形態
本発明において、SDF-1αと組み合わせてのIL-2又はIL-4は夫々非抗原特異的様式で臍帯血(CB) CD4+ T細胞をTh1型及びTh2型の細胞にスイッチすることがわかった。この知見はタンパク質レベル及びmRNAレベルの両方で実証された。平行に、SDF-1αと組み合わせてのIL-2又はIL-4は夫々CB CD4+ T細胞中で８日以内にSyk及びZAP-70の強力かつ持続性の活性化を誘発する。Cblキナーゼの活性の減衰パターン又は増大パターンがIL-2とSDF-1α又はIL-4とSDF-1αで刺激された細胞中で８日以内に見られた。対照的に、Cbl-bキナーゼの強力かつ持続性の活性化がIL-4とSDF-1α又はIL-2とSDF-1αで刺激されたCB CD4+ T細胞中で８日以内に見られた。Syk又はZAP-70 PNAアンチセンスは夫々SDF-1αと組み合わせてのIL-2又はIL-4で刺激されたCB CD4+ T細胞中で８日以内にSyk又はZAP-70のキナーゼ活性及びタンパク質発現を完全に無効にする。同様に、Syk又はZAP-70 PNAアンチセンスはSDF-1αと組み合わせてのIL-2又はIL-4により誘発されたCB CD4+ T細胞中のIFN-γ又はIL-4 mRNA発現を選択的に抑制し、Syk及びZAP-70キナーゼ活性化がSDF-1αと組み合わせてのIL-2又はIL-4によるTh1又はTh2細胞オンスイッチに必須であることを示す。更に、選択的かつ持続性のNFAT1又はNFAT2活性化が（IL-2＋SDF-1α）又は(IL-4＋SDF-1α)で刺激されたCB T細胞中で検出され、NFAT1又はNFAT2がまたTh1又はTh2細胞オンスイッチに重要かつ選択的な役割を果たすことを示す。結論すると、本発明はIL-2又はIL-4がSDF-1αと一緒にSyk又はZAP-70キナーゼの選択的かつ持続性のリン酸化を誘発し、Th1又はTh2細胞への非抗原特異的CD4+ T細胞のオンスイッチをもたらす第二シグナリング経路を報告する。本発明の知見の略図が図４に示される。
上記のように、本発明の実験上の知見は臍帯血CD4+ T細胞の使用に基づき、これらはナイーブ細胞であると考えられた。ナイーブＴ細胞に関する知見はまた進行している免疫応答に有効であり、即ち、進行している応答に重ねられる、付加的な免疫応答を開始することが可能であると考えられる。
【００１１】
治療される疾患
Th1関連疾患
Th1関連疾患は下記の疾患のグループを含む：感染症、自己免疫疾患、遅延型過敏症及び癌。
感染症のグループは寄生虫及びウイルス、例えば、HIVにより生じる疾患を含む。
自己免疫疾患のグループは脳脊髄障害、脱髄疾患及びその他の自己免疫疾患を含む。
脳脊髄障害の例として、多発性硬化症(MS)；播種性硬化症；巣状硬化症；島性硬化症；後索硬化症；急性及び慢性の実験的アレルギー性（又は自己免疫）脳脊髄炎(EAE)（これはMSの動物モデルである）；ギラン-バレー症候群；実験的アレルギー性神経炎（ギラン-バレー症候群の動物モデル）；急性播種性脳脊髄炎；筋痛性脳脊髄炎（良性及び流行性）；ウイルス性脳脊髄炎；肉芽腫性脳脊髄炎等が挙げられるが、これらに限定されない。また、動物疾患、例えば、イヌジステンパー、ネコジステンパー、ウマ脳脊髄炎（東部、ベネズエラ、及び西部）；ニワトリ脳脊髄炎；ブタ脳脊髄炎；ウシ脳脊髄炎；マウス脳脊髄炎等が挙げられるが、これらに限定されない。
脱髄疾患の例として、多発性硬化症(MS)、播種性硬化症(DS)、急性播種性脳脊髄炎、進行性多巣状白質脳症(PML)、及び亜急性硬化性汎脳炎(SSPE)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
その他の自己免疫疾患の例として、多発性硬化症(MS)、結節性多発性関節炎、喘息、過敏性肺炎、間質性肺病、サルコイドーシス、突発性肺繊維症、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎又はホウィップル病と関連する間質性肺病、ウェジナー肉芽腫又は過敏性脈管炎と関連する間質性肺病、
脈管炎症候群、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、ウェジナー肉芽腫、
腎臓病、例えば、急性糸球体腎炎のような抗体媒介糸球体症、全身性エリテマトーデス(SLE)と関連する腎炎、その他の全身性疾患、例えば、ウェジナー肉芽腫及びグッドパスチャー症候群と関連する腎炎並びに混合結合組織疾患、慢性間質性腎炎、慢性腎炎、
胃腸疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症、ホウィップル病、こう原大腸炎、好酸球性大腸炎、リンパ性大腸炎、
肝胆汁性疾患、例えば、自己免疫肝炎、アルコール誘発肝炎、門脈周囲の繊維症、原発性胆汁肝硬変、硬化コランギチス（sclerosing colangitis）、
皮膚病、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、アレルギー性皮膚病、進行性全身性硬化症、剥脱性皮膚炎、尋常性天疱瘡、
関節疾患、例えば、慢性関節リウマチ(RA)、強直性脊椎炎、乾癬又は炎症性膀胱疾患と関連する関節炎、
筋骨格疾患、例えば、重症筋無力症(MG)、多発性筋炎、
内分泌腺疾患、例えば、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、自己免疫甲状腺炎、甲状腺中毒、甲状腺機能亢進症、
造血系の疾患、例えば、自己免疫貧血、自己免疫血小板減少、
心血管疾患、例えば、心筋症、脈管炎、全身性疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、結節性多発性関節炎、慢性関節リウマチ、強皮症、サルコイドーシスと関連する心血管疾患が挙げられる。
【００１３】
自己免疫疾患の認められる特徴はそれらの家族性クラスタリング及び特別な遺伝子、特にクラスＩ及びクラスII主要組織適合性複合体(MHC)の遺伝子の発現との関連である。例えば、MS患者の大比率がHLA-DR2ハプロタイプを有する（Beall SS, Concannon P, Charmley P.ら, J. Neuroimmumol., 21巻, 59-66頁, 1989）。感受性遺伝子型を有する全ての患者が自己免疫疾患を発生するとは限らないので、環境因子がまた重要な役割を果たすことが明らかである。例えば、MSは温和な気候の地域に住む被験者に一層共通であることが明らかである（Kurtzke JF著“多発性硬化症”, Hallpike JF, Adams CWM, Tourtelotte WW, 編集者, Williams及びWilkins, Baltimore, MD, 1983, 49-95頁）。自己免疫疾患の環境因子はウイルスの如き感染性物質であり得ると長きにわたって考えられていた。幾つかのヒト及び動物の疾患の病因はウイルス感染症に起因し得る。例えば、テイラーマウス脳脊髄炎はEAEと同様の臨床兆候及び病理的兆候を有する脱髄疾患である。抗体が自己免疫疾患の或るエフェクター応答に関係しているが、殆どの場合の誘発イベントはＢ細胞成熟及びクローン拡大に必要とされるCD4 T細胞の活性化で開始する。
遅延型過敏症のグループは低分子量物質に対する接触過敏症を含む。
Th2関連疾患
Th2関連疾患は下記の疾患のグループを含む：アレルギー性疾患及び癌。
遺伝的に疾病素質のある個体は個体が暴露される種々の環境源に由来する抗原に感作されるようになる（アレルギー性になる）ことが公知である。アレルギー反応は既に感作された個体が同じ又は相同のアレルゲンに再度暴露される場合に生じる。アレルギー反応は枯草熱、リノコンダクチビチス(rhinoconductivitis)、鼻炎及び喘息から全身性アナフィラキシー及び、例えば、ハチもしくはスズメバチの刺し又は昆虫の噛みに応答する死亡に至る範囲である。その反応は即時であり、種々のアトピー性アレルゲン、例えば、草、樹木、雑草、昆虫、（ハウスダクト）ダニ、食物、薬物、化学品及び香料に由来する化合物により生じられる。
アレルギー性疾患のグループは枯草熱、鼻結膜炎、鼻炎及び喘息を含む。
【００１４】
アレルギー反応が生じる最も普通のアレルゲンとして、例えば、樹木、草、ハーブ、菌類、ハウスダストダニ、貯蔵ダニ、ゴキブリ及び動物の毛髪、羽毛、及びふけに由来する吸入アレルゲンが挙げられる。樹木、草及びハーブからの重要な花粉アレルゲンは、例えば、カバ、ハンノキ、ハシバミ、シデ及びオリーブを含むブナ、オレアレス(Oleales)及びマツの分類学上の目；例えば、属ロリウム(Lolium)、フレウム(Phleum)、ポア(Poa)、シノドン(Cynodon)、ダクチリス(Dactylis)及びセカレ(Secale)の草を含むイネの目；例えば、属アンボロシア(Ambrosia)及びアルテミシア(Artemisia)のハーブを含むキク及びイラクサの目に由来するようなものである。菌類からの重要な吸入アレルゲンは、例えば、属アルテルナリア及びクラドスポリウムに由来するようなものである。その他の重要な吸入アレルゲンは属デルマトファゴイデス(Dermatophagoides)のハウスダストダニ、属レピドグリフィス・デストラクトル(Lepidoglyphys destructor)からの貯蔵ダニからのもの；ゴキブリからのもの；及び哺乳類、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、及びトリからのものである。また、刺したり、又は噛んだりする昆虫、例えば、ミツバチ、ハチ、及び蟻を含む膜し目の分類学上の目に由来するものに対するアレルギー反応が普通に観察される。特別なアレルゲン成分が当業者に知られており、例えば、最も普通のものを挙げると、Bet v 1（カバ）、Aln g 1（ハンノキ）、Cor a 1（ムラサキハシバミ）、及びブナ目のCar b 1（シデ）が挙げられる。その他のものはCry j 1（マツ目）、Amb a 1及び2、Art v 1（キク目）、Par j 1（イラクサ目）、Ole e 1（オレアレス(Oleales)）、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1及び5、Pas n 1、Phl p 1及び5、Poa p 1、2及び5、Sec c 1及び5、及びSor h 1（種々の草の花粉）、Alt a 1及びCla h 1（菌類）、Der f 1及び2、Der p 1及び2（ハウスダストダニ、夫々D.ファリナエ(farinae)及びD.プテロニシナス(pteronyssinus)）、Led d 1、Bla g 1及び2、Per a 1（ゴキブリ、夫々ブラテラ・ゲルマニカ（Blatella germanica）及びペリプラネタ・アメリカーナ(Periplaneta americana)）、Fel d 1（ネコ）、Can f 1（イヌ）、Equ c 1、2及び3（ウマ）、Apis m 1及び2（ミツバチ）、Ves g 1、2及び5、Pol a 1、2及び5（全てハチ）並びにSol i 1、2、3及び4（雑食性アリ）が挙げられる。
【００１５】
Th1及びTh2関連癌
一般に、癌細胞は癌細胞により特異的に発現される抗原に対する免疫応答を生じ得る。Th1及びTh2免疫応答の両方は組織の細胞傷害根絶をもたらす強い炎症応答を誘導し得るので、Th1又はTh2免疫応答の変調が癌の治療に使用し得る。
本発明の組成物で治療し得る癌は癌腫及び腺癌を含む悪性上皮腫瘍、並びに脂肪肉腫、繊維肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、グリオーム、神経芽細胞腫、髄芽腫、悪性メラノーマ、悪性髄膜腫、種々の白血病、種々の骨髄増殖性疾患、種々のリンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、血管肉腫、カポージ肉腫、リンパ管肉腫、悪性奇形腫、ジスゲルミノーマ、セミノーム、及び絨毛膜癌を含む悪性非上皮腫瘍として組織形成上分類し得る。
癌腫及び腺癌は最も多いものであり（癌による死亡の約90％に相当する）、それ故、本発明に従って治療／予防するのに重要な標的疾患である。最も重要な癌腫及び腺癌は気道（特に気管支起源）、胸部、結腸直腸及び胃の癌腫及び腺癌である。しかしながら、前立腺、卵巣、リンパ組織及び骨髄、子宮、膵臓、食道、膀胱、及び腎臓の癌腫及び腺癌がまたかなりの数の死亡を生じ、それ故、重要である。
癌疾患のグループは更にセーザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、肝臓癌及び肺癌を含む。
【００１６】
病原物質との活性物質の同時投与
本発明の好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は活性物質に加えて治療すべき疾患を誘発する病原物質を含む。このような医薬組成物は免疫応答の偏向が病原物質により特異的に特定される抗原に制限されるという利点を有する。
それ故、本発明の医薬組成物は更に治療すべきTh1関連疾患を誘発する病原物質、特に感染症を誘発する感染性物質又は抗原を含んでもよい。前記抗原は自己免疫疾患を誘発する自己抗原、ハプテン又は遅延型過敏症を誘発するアレルゲンであってもよい。
同様に、本発明の医薬組成物は更に治療すべきTh2関連疾患を誘発する病原物質、特に寄生虫生物もしくはその部分又は抗原を含んでもよい。抗原はアレルギー性疾患を誘発するアレルゲンであってもよい。
活性物質
本発明の活性物質、即ち、請求項１の物質a)-g)及び請求項24のo)-u)は作用の細胞外部位を有する物質、例えば、IL-4及びSDF-1α、並びに作用の細胞内部位を有する物質、例えば、Syk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2のモジュレーターの両方を含む。
作用の細胞外部位を有する物質は典型的には受容体-リガンド系中で細胞膜の細胞外側の受容体に結合する。一般に、このような系は受容体とリガンドの間の結合が損なわれ、又は妨げられる様式で受容体又はリガンドに結合するあらゆる物質により抑制し得る。このようなインヒビターの例は抗体、低分子有機物質及び遊離受容体である。受容体-リガンド系は受容体とリガンドの間の結合を促進するような様式で受容体及びリガンドに結合するあらゆる物質により刺激し得る。また、受容体-リガンド系はリガンド分子の数をその添加により増大することにより、又は受容体の細胞内発現を刺激する物質を添加することにより受容体分子の数を増大することにより刺激し得る。
作用の細胞内部位を有する物質は物質の活性又は発現を変調し得るあらゆる物質であってもよい。
以下に、本発明の種々の活性物質が更に詳しく記載される。
【００１７】
a)及びo)IL-4/IL-2及びSDF-1α
IL-2、IL-4及びSDF-1αは生物学的物質からの物質の精製により、又は通常の組換え技術を使用して物質を生成することにより得られてもよい。
b)及びp)IL-4/IL-2及びSDF-1αの刺激物質
IL-2、IL-4又はSDF-1αの刺激物質の例はIL-2、IL-4又はSDF-1α受容体の細胞内活性化及び細胞外発現を刺激する物質である。IL-2、IL-4又はSDF-1α受容体の発現を刺激し得る物質の詳細な説明について、見出し“e)及びs)Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の刺激物質”による以下の節が参考にされ、その内容がこの節に同等に適用される。
c)及びq)IL-2/IL-4及びSDF-1αのアンタゴニスト
IL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストとして、IL-2、IL-4又はSDF-1αのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が挙げられ、その両方の抗体はIL-2、IL-4又はSDF-1αの細胞受容体結合部位に結合し、これらの抗体はその受容体へのその分子の結合が減少され、又は妨げられる様式でIL-2、IL-4又はSDF-1α分子の別の部分に結合する。また、リガンドIL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストとして、IL-2、IL-4又はSDF-1α（CXCR4）の受容体のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が挙げられる。受容体の抗体は受容体及び抗体のリガンド結合部位に結合する抗体及び受容体の別の部分に結合し、それにより受容体へのリガンドの結合を減少し、又は妨げる抗体の両方であってもよい。
IL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストとして、更にリガンドIL-2、IL-4もしくはSDF-1α又はそれらの受容体に対する結合アフィニティーを有するペプチド、例えば、前記分子又はその部分の一つの結合部位を含むペプチドが挙げられる。
更に、IL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストは低分子化合物、例えば、有機化合物であってもよい。
また、IL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストは遊離受容体、即ち、Ｔ細胞、及び遊離リガンドに結合されない受容体として添加されてもよく、これらはその受容体に結合し得るが、Ｔ細胞にそのエフェクター機能を与えるのに使用し得ず、又は低下されたエフェクター機能を与えることができるのにすぎない。
IL-2、IL-4又はSDF-1αのアンタゴニストのその他の例はIL-2、IL-4又はSDF-1α受容体の細胞内発現を抑制する物質である。IL-2、IL-4又はSDF-1α受容体の発現を抑制し得る物質の詳細な説明について、見出し“d)及びr)Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2のインヒビター”による以下の節が参考にされ、その内容がこの節に同等に適用される。
【００１８】
d)及びr)Syk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2のインヒビター
以下、WO 00/24245が参考にされ、これがこの参考として本明細書に含まれる。
本発明の抑制化合物は、例えば、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の発現又は活性を特異的に抑制するように作用する細胞内結合分子であってもよい。本明細書に使用される“細胞内結合分子”という用語はタンパク質又はタンパク質をコードする核酸分子（例えば、mRNA分子）に結合することによりタンパク質の発現又は活性を抑制するように細胞内で作用する分子を含むことが意図されている。以下に更に詳しく記載される、細胞内結合分子の例として、アンチセンス核酸、細胞内抗体、標的分子（例えば、カルシニューリン）とのSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の相互作用を抑制するペプチド化合物及びSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2活性を特異的に抑制する化学薬剤が挙げられる。
抑制化合物の更なる例として、ホスファターゼ及びその他の酵素並びに脱リン酸化し得る化合物が挙げられる。
i.アンチセンス核酸分子
一実施態様において、本発明の抑制化合物はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードする遺伝子、もしくは前記遺伝子の部分に相補性であるアンチセンス核酸分子、又は前記アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。アンチセンス核酸分子はDNA、RNA、PNA、LNA又はホスホロチオエートであってもよい。細胞中で特別なタンパク質の発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の使用は当業界で公知である。アンチセンス核酸分子は別の核酸分子のコーディングストランドに相補性であるヌクレオチド配列（例えば、mRNA配列）を含み、それ故、別の核酸分子のコーディングストランドに水素結合し得る。mRNAの配列に相補性のアンチセンス配列はmRNAのコーディング領域、mRNAの5'もしくは3'未翻訳領域又はコーディング領域と未翻訳領域をブリッジする領域（例えば、5'未翻訳領域とコーディング領域の連結部で）に見られる配列に相補性であってもよい。更に、mRNAをコードする遺伝子の調節領域、例えば、転写開始配列又は調節要素に配列中で相補性であってもよい。アンチセンス核酸はコーディングストランド上又はmRNAの3'未翻訳領域中の開始コドンに先行し、又はスパンする領域に相補性であるように設計される。
【００１９】
Syk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2遺伝子のコーディングストランドについての既知のヌクレオチド配列（ひいてはSyk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2mRNAの既知の配列）が与えられたとすると、本発明のアンチセンス核酸はWatson及びCrickの塩基対合の規則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2mRNAの全コーディング領域に相補性であり得るが、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2mRNAのコーディング領域又は非コーディング領域のほんの一部にアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることが更に好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2mRNAの翻訳開始部位を包囲する領域に相補性であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、10、15、20、25、30、35、40、45又は50ヌクレオチドの長さであってもよい。本発明のアンチセンス核酸は当業界で知られている操作を使用する化学合成及び酵素連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は天然産ヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を増大し、又はアンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成される二重らせんの物理的安定性を増大するように設計された種々の修飾ヌクレオチドを使用して化学合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用し得る。アンチセンス核酸を生成するのに使用し得る修飾ヌクレオチドの例として、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチル-グアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチル-グアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンが挙げられる。培養中の細胞中のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2発現を抑制するために、一種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが培地中の細胞に添加し得る。
【００２０】
また、アンチセンス核酸はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNAの全部又は一部がアンチセンス配向でサブクローン化された発現ベクターを使用して生物学的に生成し得る（即ち、挿入された核酸から転写された核酸は関係する標的核酸にアンチセンス配向であろう）。アンチセンス配向でクローン化された核酸に機能し得る形で連結された調節配列が選択でき、これらは関係する細胞中でアンチセンスRNA分子の発現を誘導し、例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー又はその他の調節配列が選択でき、これらはアンチセンスRNAの構成的、組織特異的又は誘導的発現を誘導する。アンチセンス発現ベクターは、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNA（又はその部分）がアンチセンス配向でベクターにクローン化される以外は、組換え発現ベクターを構築するための通常の組換えDNA方法に従って調製される。アンチセンス発現ベクターは、例えば、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形態であってもよい。アンチセンス発現ベクターは通常のトランスフェクション技術を使用して細胞に導入される。
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的にはそれらがSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質をコードする細胞mRNA及び／又はゲノムDNAとハイブリダイズし、又は結合し、それにより、例えば、転写及び／又は翻訳を抑制することにより、タンパク質の発現を抑制するように被験者に投与され、又はin situで生成される。ハイブリダイゼーションは安定な二重らせんを形成するのに相補性の通常のヌクレオチドによるものであってもよく、又は、例えば、DNA二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主要な溝中の特異的相互作用によるものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与の経路の例として、組織部位における直接の注射が挙げられる。また、アンチセンス核酸分子は選択された細胞を標的とするように修飾され、次いで全身投与し得る。例えば、全身投与について、アンチセンス分子はそれが、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に結合することにより、選択された細胞表面で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように修飾し得る。また、アンチセンス核酸分子は本明細書に記載されたベクターを使用して細胞に送出し得る。アンチセンス分子の充分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が強力なpol II又はpol IIIプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００２１】
更に別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は、通常のＰ単位とは逆に、ストランドが互いに平行に走る相補RNAと特定の二本鎖ハイブリッドを形成する。アンチセンス核酸分子はまた2'-o-メチルリボヌクレオチド又はキメラRNA-DNA類似体を含み得る。
更に別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムはそれらが相補領域を有する一本鎖核酸、例えば、mRNAを開裂することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。こうして、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム）がSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2mRNA転写産物を触媒開裂し、それによりSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2mRNAの翻訳を抑制するのに使用し得る。Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムはSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計し得る。例えば、テトラヒメナL-19 IVS RNAの誘導体が構築でき、この場合、その活性部位のヌクレオチド配列はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードするmRNA中で開裂されるヌクレオチド配列に相補性である。
また、Syk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2遺伝子発現はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2遺伝子の調節領域（例えば、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2プロモーター及び／又はエンハンサー）に相補性のヌクレオチド配列を標的として、標的細胞中のNFAT1遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより抑制し得る。
最後に、Syk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2はSyk、ZAP-70、NFAT1及びNFAT2の触媒不活性突然変異体をコードする核酸により抑制し得る。
【００２２】
ii.細胞内抗体
細胞中のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質の発現及び／又は活性を抑制するのに使用し得る別の型の抑制化合物は本明細書に説明されたSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2に特異性の細胞内抗体である。細胞中のタンパク質機能を抑制するための細胞内抗体の使用は当業界で知られている。
細胞内抗体を使用してタンパク質活性を抑制するために、組換え発現ベクターが調製され、これは、細胞へのベクターの導入後に、抗体鎖が細胞の細胞内区画中で機能性抗体として発現されるような形態で抗体鎖をコードする。本発明の抑制方法による転写因子活性の抑制のために、転写因子を特異的に結合する細胞内抗体が細胞の核内で発現されることが好ましい。細胞内抗体の核発現は抗体Ｌ鎖及びＨ鎖遺伝子からＮ末端疎水性リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を除去し、Ｌ鎖及びＨ鎖遺伝子のＮ又はＣ末端に核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列を加えることにより行ない得る。細胞内抗体鎖の核ターゲッティングに使用されるのに好ましい核局在化シグナルはSV40ラージＴ抗原の核局在化シグナルである。
【００２３】
細胞内抗体発現ベクターを調製するために、関係する標的タンパク質、例えば、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質に特異性の抗体鎖をコードする抗体Ｌ鎖及びＨ鎖cDNAが、典型的にはSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質に特異性のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離される。Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質の抗血清の調製は当業界で記載されていた。抗Syk、抗ZAP-70、抗NFAT1又は抗NFAT2抗体は好適な被験者（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳類）を夫々Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2免疫原で免疫することにより調製し得る。適当な免疫原製剤は、例えば、組換え発現されたSyk、ZAP-70、NFAT1もしくはNFAT2タンパク質又は化学合成されたSyk、ZAP-70、NFAT1もしくはNFAT2ペプチドを含み得る。その製剤は更にアジュバント、例えば、フロイント完全又は不完全アジュバント、又は同様の免疫刺激性化合物を含み得る。抗体産生細胞は被験者から得られ、通常の技術、例えば、ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を調製するのに使用し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成するための技術は公知である。簡単に言えば、不死細胞系（典型的にはミエローマ）が上記Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質免疫原で免疫された哺乳類からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合され、得られるハイブリドーマ細胞の培養上澄みがスクリーニングされてSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。リンパ球及び不死化細胞系を融合するのに使用される多くの公知のプロトコルのいずれもが抗Syk、抗ZAP-70、抗NFAT1又は抗NFAT2タンパク質モノクローナル抗体を生成する目的に適用し得る。更に、当業者はまた有益であるこのような方法の多くの変化があることを認めるであろう。典型的には、不死細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）はリンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは本発明の免疫原製剤で免疫されたマウスからのリンパ球を不死化マウス細胞系と融合することによりつくられる。好ましい不死細胞系はヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地（“HAT培地”）に感受性であるマウスミエローマ細胞系である。幾つかのミエローマ細胞系のいずれか、例えば、P3-NSI/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653又はSp2/0-Agl4ミエローマ系が通常の技術に従って融合パートナーとして使用し得る。これらのミエローマ系はATCC（ロックビル、Md）から入手し得る。典型的には、HAT感受性マウスミエローマ細胞がポリエチレングリコール（“PEG”）を使用してマウス脾細胞に融合される。次いで融合から得られるハイブリドーマ細胞がHAT培地を使用して選択され、この培地は未融合ミエローマ細胞及び非生産的に融合されたミエローマ細胞を死滅する（未融合脾細胞は数日後に死滅する。何とならば、それらが形質転換されないからである）。mafタンパク質を特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、通常のELISAアッセイを使用してこのような抗体についてハイブリドーマ培養上澄みをスクリーニングすることにより同定される。
【００２４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2に結合するモノクローナル抗体が組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をタンパク質、又はそのペプチドでスクリーニングし、それによりタンパク質に特異的に結合する免疫グロブリンライブラリー員を単離することにより同定され、単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、ファーマシア・リコンビナント・ファージ・抗体系、カタログ番号27-9400-01、及びストラタゲンSurfZ4pTMファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号240612）。更に、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに特に使いやすい方法及び化合物の例が文献に見られる。
Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2に特異性の関係するモノクローナル抗体が一旦同定されると（例えば、ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体又は当業界で既に知られているSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2のモノクローナル抗体を含む、コンビナトリアルライブラリーからの組換え抗体）、モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードするDNAが通常の分子生物学技術により単離される。ハイブリドーマ由来抗体について、Ｌ鎖及びＨ鎖cDNAは、例えば、PCR増幅又はcDNAライブラリースクリーニングにより得られる。ファージディスプレイライブラリーからのような組換え抗体について、Ｌ鎖及びＨ鎖をコードするcDNAはライブラリースクリーニング方法中に単離されたディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）から回収し得る。PCRプライマー又はcDNAライブラリープローブが調製される抗体Ｌ鎖及びＨ鎖遺伝子のヌクレオチド配列が当業界で知られている。例えば、多くのこのような配列がKabat, E.A.ら(1991)“免疫学上重要なタンパク質の配列”, 第５編, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242及び“Vbase”ヒト生殖系列配列データベースに開示されている。
【００２５】
一旦得られると、抗体Ｌ鎖及びＨ鎖配列は通常の方法を使用して組換え発現ベクターにクローン化される。先に説明したように、Ｌ鎖及びＨ鎖の疎水性リーダーをコードする配列が除去され、核局在化シグナルをコードする配列（例えば、SV40ラージＴ抗原からのもの）がＬ鎖及びＨ鎖の両方のアミノ末端又はカルボキシ末端をコードする配列にインフレーム(in-frame)で結合される。その発現ベクターは幾つかの異なる形態の一つの細胞内抗体をコードし得る。例えば、一実施態様において、ベクターは完全長抗体が細胞内で発現されるように完全長抗体Ｌ鎖及びＨ鎖をコードする。別の実施態様において、ベクターはFabフラグメントが細胞内で発現されるようにＨ鎖のVH/CHI領域のみ以外は完全長Ｌ鎖をコードする。最も好ましい実施態様において、ベクターは一本鎖抗体(scFv)をコードし、この場合、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域が可撓性ペプチドリンカー（例えば、(Gly4Ser)3）により結合され、一本鎖分子として発現される。細胞中で転写因子活性を抑制するために、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2特異性細胞内抗体をコードする発現ベクターが前記通常のトランスフェクション方法により細胞に導入される。
【００２６】
iii.Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2由来ペプチド化合物
別の実施態様において、本発明の抑制化合物はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2アミノ酸配列から誘導されたペプチド化合物である。特に、一種以上の抑制化合物は標的分子とのSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の夫々の相互作用を媒介するSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の一部（又はその擬態）を含み、その結果、このペプチド化合物とのSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の接触が標的分子とのSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の夫々の相互作用を競合的に抑制する。好ましい実施態様において、ペプチド化合物はカルシニューリンとのNFAT1の相互作用を媒介するNFAT1の領域に基づいて設計される。Avramburuら(1998) Mol. Cell. 1:627-637（参考として本明細書に明らかに含まれる）に記載されたように、NFATタンパク質のアミノ末端における保存領域はカルシニューリンとのNFATタンパク質の相互作用を媒介し、その領域をスパンするペプチドがその他の基質に対するカルシニューリンのホスファターゼ活性に影響しないでNFATタンパク質に結合し、それをリン酸化するカルシニューリンの能力を抑制する。更に、細胞内で発現された場合、この領域をスパンするペプチドはNFAT脱リン酸化、核トランスロケーション及び刺激に応答するNFAT媒介遺伝子発現を抑制し、それによりNFAT依存性機能を抑制する。カルシニューリンとの相互作用を媒介するNFAT1の領域は保存アミノ酸モチーフSer-Pro-Arg-Ile-Glu-Ile-Thr（モチーフ１）を含む。
好ましい実施態様において、NFAT抑制化合物はペプチド化合物であり、これはNFAT1のカルシニューリン相互作用領域に基づいて調製される。ペプチドは上記アミノ酸モチーフ１を含むアミノ酸配列を有するNFAT1のカルシニューリン相互作用領域から誘導し得る。また、ヒトNFAT1の一層長い領域がこのようなペプチドとして使用でき、これは上記アミノ酸モチーフ１をスパンする。
本発明のペプチド化合物は一種以上のペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入することにより細胞（例えば、リンパ系細胞）中で細胞内でつくられる。このような発現ベクターは通常の技術により、例えば、先に説明されたアミノ酸モチーフの一つをコードするオリゴヌクレオチドを使用してつくられる。一種以上のペプチドが別のタンパク質又はペプチドとの融合（例えば、GST融合）として細胞内で発現し得る。細胞中のペプチドの組換え合成の代わりに、ペプチドは通常のペプチド合成技術を使用する化学合成によりつくられる。次いで合成されたペプチドがペプチドを細胞に導入するために当業界で知られている種々の手段（例えば、リポソーム等）により細胞に導入し得る。NFAT抑制ペプチドをつくる組換え方法、及びそれらを使用して細胞中でNFAT活性を抑制する方法が、Avramburuら(1998) Mol. Cell. 1:627-637に更に記載されている。
また、カルシニューリンと相互作用するNFAT1の領域がNFAT1の核輸送並びに有効な認識及び脱リン酸化に必要であり、その結果、この領域の突然変異がNFAT1活性を抑制することが実証されていた（Avramburuら(1998) Mol. Cell. 1:627-637を参照のこと）。こうして、別の実施態様において、NFAT1活性は上記モチーフ１を含む、アミノ末端におけるカルシニューリン結合領域を突然変異させることにより抑制し得る。野生型NFAT1アミノ酸が突然変異配列に修飾されて低下された活性を有するNFAT1の突然変異形態を生じ得る。
【００２７】
iv.化学化合物
Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質の活性を特異的に抑制するのに使用し得る別の抑制薬剤はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2活性を直接抑制し、又はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2と標的分子の間の相互作用を抑制する化学化合物である。このような化合物がこのような化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定し得る。
ZAP-70抑制化学化合物の例はL-グルタミン、L-アラニン、L-ホモ-フェニルアラニン又はL-セリンから誘導された1,2,4-オキサジアゾール誘導体（Vu, 2000）；２座ζ-ITAMペプチドの擬態（Vu, 2000）；１座化合物（Vu, 2000）；ペプトイド（Vu, 2000）；イソチアゾロン化合物（Trevillyanら, 1999）；ノコダゾール（Hubyら, 1998）；メチル-3-(N-イソチアゾロン)-2-チオフェンカルボキシレート（Trevillyanら, 1999）である。
【００２８】
e)及びs)Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の刺激物質
刺激化合物の例として、活性Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードする発現ベクター及びSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2活性を特異的に刺激する化学薬剤が挙げられる。
好ましい刺激化合物はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードする少なくとも一種のアミノ酸分子であり、この場合、一種以上の核酸分子が被験者の細胞中のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2タンパク質の発現に適した形態で被験者に導入される。例えば、Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNA（完全長又は部分Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNA配列）が組換え発現ベクターにクローン化され、ベクターが通常の分子生物学技術を使用して細胞にトランスフェクトされる。Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNAは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する増幅又は適当なcDNAライブラリーのスクリーニングにより得られる。Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNAのヌクレオチド配列は当業界で知られており、通常のPCR方法によるcDNAの増幅を可能にするPCRプライマーの設計又は通常のハイブリダイゼーション方法を使用してcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用し得るハイブリダイゼーションプローブの設計に使用し得る。Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2 cDNAの単離又は増幅後に、そのDNAフラグメントが上記のように一種以上の好適な発現ベクターに導入される。SykとNFAT1又はZAP-70とNFAT2コーディング配列を両方有する単一発現ベクターが使用でき、又は２種の別々のベクターが使用し得る。宿主細胞中のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の発現に適した形態のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2をコードする核酸分子は、当業界で知られているヌクレオチド配列を使用して上記のように調製し得る。ヌクレオチド配列は通常のPCR方法によるcDNAの増幅を可能にするPCRプライマーの設計又は通常のハイブリダイゼーション方法を使用してcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用し得るハイブリダイゼーションプローブの設計に使用し得る。
細胞中のSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の発現を刺激するための刺激化合物の別の形態は細胞中の内因性Syk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の発現又は活性を特異的に刺激する化学化合物である。ビスペルオキソバナジウム(bpV)がZap-70の刺激物質の例である。
刺激化学化合物はSyk、ZAP-70、NFAT1又はNFAT2の発現又は活性を刺激する化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定し得る。
【００２９】
f)及びt)IL-4及びIL-2刺激アジュバント
本発明のIL-4刺激アジュバントは
リン酸アルミニウム
水酸化アルミニウム
Alヒドロゲル
リン酸カルシウム
コレラハロトキシン
コレラトキシンＢサブユニット
リヒドロゲルHPA/LV
ポリホスファゼン
からなるグループＡから選ばれてもよい。
グループＡアジュバントはAlヒドロゲル又はリン酸カルシウムであることが好ましい。前記グループＡはまたTh2細胞刺激アジュバントと称される。
本発明のIL-2刺激アジュバントは
アブリジン
ブロックコポリマーP1205そしておそらくその他のブロックコポリマー
スレオニル-MDP
スペコール（マルコール52、スパン85、トウィーン85）
QS-21
CpG分子
ノニオン表面活性剤小胞
ムラパルミチン
ムラメチド
MPL（モノホスホリル脂質Ａ）
E coli不安定エンテロトキシン
γイヌリン
フロイント完全アジュバント
フロイント不完全アジュバント
からなるグループＢから選ばれてもよい。
グループＢアジュバントはCpG分子又はMPL（モノホスホリル脂質Ａ）であることが好ましい。前記グループＢアジュバントはまたTh1細胞刺激アジュバントと称される。
一般に、本発明のIL-4刺激アジュバントは上記グループＢアジュバントのいずれかのサイトカイン応答よりもTh2細胞傾斜しているサイトカイン応答を生じる、あらゆるアジュバントであってもよい。
同様に、本発明のIL-2刺激アジュバントは上記グループＡアジュバントのいずれかのサイトカイン応答よりもTh1細胞傾斜しているサイトカイン応答を生じる、あらゆるアジュバントであってもよい。
【００３０】
g)及びu)物質a)-f)及びo)-t)の誘導体、類似体又は部分
物質a)-f)及びo)-t)の誘導体、類似体又は部分は従来技術で知られているあらゆる誘導体、類似体又は部分であってもよい。例えば、活性物質がタンパク質である場合、少なくとも部分的に保存された機能性を有するタンパク質の部分が使用されてもよい。特に、活性物質が抗体である場合、その特異性の少なくとも一部を含む抗体分子の部分が使用されてもよい。
医薬組成物
先に説明したように、本発明に使用される活性物質は、例えば、有機物質、ペプチド、タンパク質及び核酸であってもよい。使用される活性物質の型に応じて、活性物質は注射用及び経口、非経口、肺及び鼻投与用の医薬組成物を含む、従来技術で知られているあらゆる医薬組成物中に製剤化し得る。
経口組成物として、錠剤、カプセル、ピル、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤又はペレットが挙げられる。
医薬組成物は、例えば、レミントンのPharmaceutical Science, 第18編（1990, マック・パブリッシング社、イーストン、PA 18042）に記載されているように、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、着色剤、矯味矯臭薬、崩壊剤、バインダー、耐摩擦剤、滑剤、表面活性剤、アジュバント及び／又は担体を含む、従来技術で知られているあらゆる医薬上許される賦形剤を含んでもよい。
【００３１】
治療の方法
本発明の医薬組成物は非経口注射又は粘膜投与により投与されることが好ましい。局所投与がSDF-1αの望ましくない副作用を避けるために全身投与よりも好ましい。これに関して、“局所投与”という表現は局所投与又は局所注射を意味する。“局所注射”は活性物質の全身の内転移が50％未満、好ましくは40％未満、更に好ましくは30％未満、更に好ましくは20％未満、最も好ましくは10％未満である注射を意味する。
本発明の治療の方法はin vitro又はin vivoで実施し得る（後者が下記の細区分に更に説明される）。その方法をin vitroで実施するために、細胞が被験者から通常の方法により得られ、本発明の医薬組成物とともにin vitroでインキュベートされる（即ち、培養される）。
【００３２】
例えば、リンパ系細胞が被験者から単離され、本発明の変調薬を使用してin vitroで治療され、次いで同被験者、又は細胞のドナーと適合性の別の被験者組織に再投与される。それ故、別の実施態様において、本発明の変調方法は細胞を活性物質（モジュレーター）とともにin vitroで培養することを含み、更に細胞を被験者に投与し、それにより被験者中のTh1/Th2細胞比を変調することを含む。被験者への細胞の投与のために、培養物中の残留化合物を細胞から最初に除去し、その後にそれらを被験者に投与することが好ましいかもしれない。これは、例えば、細胞の勾配遠心分離又は細胞の洗浄により行ない得る。細胞のex vivo遺伝子修飾、続いて被験者への再投与の更なる説明について、またW.F. Andersonらの米国特許第5,399,346号を参照のこと。
別の実施態様において、活性物質がin vivoで被験者に投与される。核酸（例えば、活性物質をコードする組換え発現ベクター）を含む刺激性又は抑制性薬剤について、これらの化合物は核酸（例えば、DNA）をin vivoで細胞に導入するための当業界で知られている方法を使用して被験者の細胞に導入し得る。このような方法の例として、下記の方法が挙げられる。
直接注射：裸のDNAがDNAを細胞に直接注射することによりin vivoで細胞に導入し得る（例えば、Acsadiら(1991) Nature 332:815-818; Wolffら(1990) Science 247:1465-1468を参照のこと）。例えば、DNAをin vivoで細胞に注射するための送出装置（例えば、“遺伝子銃”）が使用し得る。このような装置が市販されている（例えば、バイオラドから）。
【００３３】
受容体媒介DNA摂取：裸のDNAがまたDNAを陽イオン、例えば、ポリリシン（これは細胞表面受容体のリガンドに結合される）に錯生成することによりin vivoで細胞に導入し得る。受容体へのDNA-リガンド錯体の結合は受容体媒介エンドサイトーシスによりDNAの摂取を促進する。アデノウイルスキャプシド（これらはエンドソームを自然に分断し、それにより物質を細胞質に放出する）に結合されたDNA-リガンド錯体は細胞内リソソームによる錯体の分解を避けるのに使用し得る。
レトロウイルス：欠損レトロウイルスは遺伝子治療目的のための遺伝子導入における使用について良く特性決定されている（概説について、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照のこと）。レトロウイルスゲノムにとり込まれた関係するヌクレオチド配列を有する組換えレトロウイルスが構築し得る。更に、レトロウイルスゲノムの部分が除去されてレトロウイルス複製を欠損にし得る。次いで複製欠損レトロウイルスがビリオンにパッケージされ、これが通常の技術によりヘルパーウイルスの使用により標的細胞を感染するのに使用し得る。組換えレトロウイルスを生成し、また細胞をこのようなウイルスでin vitro又はin vivoで感染するためのプロトコルがCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.ら編集, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14及びその他の通常の実験マニュアルに見られる。好適なレトロウイルスの例として、pLJ、pZIP、pWE及びpEMが挙げられ、これらは当業者に公知である。好適なパッケージングウイルス系の例として、Y Crip、yCre、y2及びyAmが挙げられる。レトロウイルスは種々の遺伝子を上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝臓細胞、骨髄細胞を含む、多くの異なる細胞型にin vitroかつ／又はin vivoで導入するのに使用されていた。レトロウイルスベクターはレトロウイルスゲノム（及びそれに挿入された外来核酸）が宿主ゲノムに組み込まれて核酸を細胞に安定に導入するために標的細胞分裂を必要とする。こうして、標的細胞の複製を刺激することが必要であるかもしれない。
【００３４】
アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムはそれが関係する遺伝子産物をコードし、発現するが、通常の溶解ウイルス寿命サイクルで複製するその能力に関して不活化されているように操作し得る。アデノウイルス株Ad型5d1324又はアデノウイルスのその他の株（例えば、Ad2、Ad3、Ad7等）に由来する好適なアデノウイルスベクターが当業者に公知である。組換えアデノウイルスはそれらが分裂細胞を必要としないで有効な遺伝子送出ビヒクルである点で有利であり、気道上皮、内皮細胞、肝臓細胞及び筋肉細胞を含む、多種の細胞型を感染するのに使用し得る。更に、導入されたアデノウイルスDNA（及びその中に含まれる外来DNA）は宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それにより導入されたDNAが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスDNA）に組み込まれるようになる状況で挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。更に、外来DNAのためのアデノウイルスゲノムの保有能力はその他の遺伝子送出ベクターに対して大きい（８キロベースまで）。現在使用されている殆どの複製欠損アデノウイルスベクターはウイルスE1及びE3遺伝子の全部又は一部について欠失されるが、アデノウイルス遺伝物質の80％程度に多くを保持する。
【００３５】
アデノ関連ウイルス：アデノ関連ウイルス(AAV)は有効な複製及び増殖性寿命サイクルのためのヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを必要とする天然産欠損ウイルスである。それはまたそのDNAを非分裂細胞に組込み得る二三のウイルスのうちの一つであり、安定な組み込みの高頻度を示す。AAVの300塩基対程度に少ないものを含むベクターがパッケージでき、組込み得る。外因性DNAのためのスペースは約4.5kbに制限される。Tratschinら(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に記載されたようなAAVベクターがDNAを細胞に導入するのに使用し得る。種々の核酸がAAVベクターを使用して異なる細胞型に導入されていた。
特別な発現ベクター系及び核酸を細胞に導入する方法の効力は当業界でルーチンで使用される通常のアプローチにより評価し得る。例えば、細胞に導入されたDNAがフィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）により検出でき、また導入されたDNAの転写により生成されたRNAが、例えば、ノーザンブロッティング、RNase保護又は逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により検出し得る。遺伝子産物が適当なアッセイ、例えば、特異性抗体によるような生産タンパク質の免疫学的検出、又は遺伝子産物の機能性活性を検出するための機能性アッセイ、例えば、酵素アッセイにより検出し得る。
【００３６】
診断試験キット
診断試験キットは測定すべき夫々の化合物のための一つ以上のプローブを含む。プローブとして、測定すべき化合物、即ち、リン酸化Syk、リン酸化ZAP-70、核内NFAT1又は核内NFAT2に結合するのに適したあらゆる既知のプローブ、例えば、抗体、核酸、そのフラグメント等が使用し得る。プローブは、例えば、標識で標識されてもよい。
また、キットは検出系を含んでもよい。検出系として、あらゆる既知の検出系が使用し得る。検出系は検出試薬を含むことが好ましく、これはプローブに結合することができ、また標識化合物を含む。このような検出系の例はプローブの標識抗体である。
定義
本発明に関して、“Ｘの刺激物質”という用語は関係するメカニズムにかからわずＸの発現及び／又は活性を直接又は間接に刺激するあらゆる薬剤を含む。
本発明に関して、“Ｘのインヒビター”という用語は関係するメカニズムにかからわずＸの発現及び／又は活性を直接又は間接に抑制するあらゆる薬剤を含む。
“Th1細胞”という用語はIL-2及びIFNγを分泌することができるあらゆるCD4+Tヘルパー１細胞を意味する。
“Th2細胞”という用語はIL-4及びIL-5を分泌することができるあらゆるCD4+Tヘルパー２細胞を意味する。
“Th1細胞関連疾患”という表現は、Th1細胞が疾患プロセスを支持し、生じ、もしくは媒介し、又はTh1細胞が疾患の症候を治癒もしくは軽減するのに関係するあらゆる疾患を意味する。
“Th2細胞関連疾患”という表現は、Th2細胞が疾患プロセスを支持し、生じ、もしくは媒介し、又はTh2細胞が疾患の症候を治癒もしくは軽減するのに関係するあらゆる疾患を意味する。
【００３７】
“病原物質”という用語は、被験者に疾患を誘発するあらゆる物質を意味する。
“抗原”という用語は、被験者に免疫学的疾患を誘発するあらゆる物質を意味する。
“免疫学的疾患”という表現は、免疫学的応答系により支持されるあらゆる疾患を意味する。
“核内NFAT1”及び“核内NFAT2”という表現は、夫々Ｔリンパ球の核中に存在するNFAT1及びNFAT2を意味する。
“アジュバント”という用語は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増進するあらゆる物質を意味する。
“アンチセンス核酸分子”という表現はアンチセンス核酸の相補性核酸によりコードされた特別なタンパク質の発現をダウンレギュレートすることができるDNA、RNA、PNA、LNAもしくはホスホロチオエート又はこれらの誘導体、類似体もしくはフラグメントの形態のあらゆる核酸分子を意味する。
“Th1/Th2比を低下する”という表現はTh1細胞のレベルが低下されること及び／又はTh2細胞のレベルが増大されることを意味する。従って、“Th1/Th2比を増大する”という表現はTh1細胞のレベルが増大されること及び／又はTh2細胞のレベルが低下されることを意味する。
略号
IL-2：インターロイキン２
IL-4：インターロイキン４
SDF-1α：ストロマ細胞由来因子-1α
Syk：Sykチロシンキナーゼ
ZAP-70：ZAP-70チロシンキナーゼ（ζ鎖関連タンパク質70kD）
Cb1：カシタス(casitas)Ｂ系列リンパ腫
Cb1-b：カシタスＢ系列リンパ腫-ブレジオン(bregion)
NFAT：活性化Ｔ細胞の核因子
TCR：Ｔ細胞受容体
CXCR4：CXC受容体４
DNA：デオキシリボ核酸
RNA：リボ核酸
PNA：ペプチド核酸
LNA：ロックされた核酸
【００３８】
実施例
実施例１
物質及び方法
細胞
複雑ではない誕生の臍帯血からのCD4+ T細胞をいずれかに（Jinquanら, 1997）記載されたように精製した。簡単に言えば、フィコール-ハイペーク（ナイコムド、オスロ、ノルウェー）を使用して、単核細胞をヘパリン処理した臍帯血から分離した。ダイナビーズ（ダイナールA/S、ノルウェー）の陽性選択を使用して製造業者の指示に従ってCD4+ T細胞を精製した。CD4+ T細胞の純度はフローサイトメトリーにより測定して96％以上であった。全ての血清IgMは検出可能なレベルの下であった。
サイトカインの細胞内免疫蛍光染色
いずれかに（Chalmersら, 1998）記載されたように、細胞をPBS中で２回洗浄し、次いで固定し、イントラプレプ（登録商標）（コウルター-イムノ・テク、マイアミ、フロリダ、USA）を使用して製造業者の指示に従って透過性にした。細胞内IL-4染色のために、細胞をその後に室温で15分間にわたって一次マウス抗ヒトIL-4mAb（10μg/ml、Ｒ＆Ｄシステムズ、オキソン、UK）とともにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、室温で15分間にわたってFITC結合ヤギ抗マウス抗体で染色した。第二サイトカインの染色のために、染色細胞を室温で30分間にわたってマウスIgG（300μg/ml）とともにインキュベートしてヤギ抗マウス抗体の遊離結合部位をブロックした。第二の細胞内サイトカインINF-γ染色のために、細胞をその後に室温で15分間にわたって一次マウス抗ヒトINF-γmAb（10μg/ml、Ｒ＆Ｄシステムズ）とともにインキュベートした。細胞を２回洗浄し、室温で15分間にわたってPE結合ヤギ抗マウス抗体で染色した。細胞を洗浄し、FACS分析のために0.5％のホルムアルデヒドを含むPBS中で再懸濁させた。
【００３９】
免疫沈殿
いずれかに（Tamuraら, 1995）記載されたように、細胞(5x106)を50mMトリス-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、20mM EDTAを含む１％(v/v)ノニデットP-40、10μg/mlのアプロチニン、0.4mMナトリウムバナデート、及び10mMピロリン酸ナトリウムからなる冷TNE緩衝液１ml中で可溶化した。細胞溶解産物を10,000xgで５分間にわたって遠心分離し、上澄みをプロテインG-セファロースで前透明化した。次いで溶解産物を４℃で１時間にわたってウサギ抗Syk(c-20)、ウサギ抗ZAP-70(LR)、ヤギ抗Cbl(C-15)、又はヤギ抗Cbl-b(C-20)（全てサンタ・クルーズ・バイオテク社、サンタ・クルーズ、CA、USAから）５μgとともにインキュベートし、免疫複合体をプロテインG-セファロースで沈殿させた。ブロッティングのために、免疫複合体をTNE緩衝液で５回洗浄した。
免疫複合体キナーゼアッセイ
いずれかに（Tamuraら, 1995）記載されたように、プロテインG-セファロースで沈殿させた免疫複合体をTNE緩衝液で４回及びキナーゼ緩衝液（50mM HEPES-NaOH、pH 7.4、及び10mM MnCl2）で４回洗浄した。免疫沈殿を10μCiの〔γ-32P〕ATPを含むキナーゼ緩衝液20μl中で懸濁させ、30℃で30分間インキュベートした。反応を3Xサンプル緩衝液（195mMトリス-HCl、pH 6.8、９％SDS、15％2-ME、及び30％グリセロール）15μlの添加により停止した。次いでその混合物を５分間沸騰させ、還元条件下で８％SDS-PAGEにかけ、続いてオートラジオグラフィーにかけた。
【００４０】
イムノブロッティング
いずれかに（Tamuraら, 1995）記載されたように、免疫沈殿中のタンパク質を還元条件下でSDS-PAGEにより分離し、次いでポリビニリデンジフルオリド微孔質膜（シュライヘル＆シュエル・ライフ・サイエンス、ダッセル、ドイツ）に移した。膜を５％BSA-TBS（20mMトリス-HCl、pH 7.5、及び150mM NaCl）中でブロックし、次いで抗Syk、抗ZAP-70、抗Cbl、又は抗Cbl-bとともにインキュベートした。イムノブロットを〔γ-125I〕プロテインＡ（NEN（登録商標）ライフ・サイエンス・プロダクツ社、ボストン、MA、USA）とともにインキュベートした。インキュベーション後に、膜をTBSで洗浄し、続いてオートラジオグラフィーにかけた。
ペプチド核酸(PNA)アンチセンスアッセイ
改良を伴って既に記載されたように（Nortonら, 1996）、精製CBT細胞を比較的低濃度の洗剤を含む緩衝液（20mMトリス-HCl、pH 8.3、1.5mM MgCl2、68mM KCl、0.05％トウィーン20、1mMエチレンビス（オキシエチレン-ニトリロ）テトラ酢酸、5.0％グリセロール、及び0.1mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド）で透過性にした。次いで細胞を示された時間の期間で刺激とともに、又は刺激なしに２μMのアンチセンスPNA（PEアプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティ、USA）の存在下で10％FCSを含むRPMI1640中で培養した。使用したPNA配列は以下のとおりであった：
アンチセンスSyk   (933) 5'-ATTTTTTGACATGGGA-3' (918) （配列番号１）
アンチセンスZAP-70  (738) 5'-GTTTGCGCTCGGCCTC-3' (723) （配列番号２）
更なるアッセイのために、細胞を操作の前に徹底的に洗浄した。
【００４１】
実時間定量的逆転写(RT)-PCRアッセイ
全ての実時間定量的RT-PCRをいずれかに（Heidら, 1996; Kruseら, 1997）記載されたように行なった。簡単に言えば、CB T細胞（2x106）からの全RNAをクイック・プレプ（登録商標）全RNA抽出キット（ファーマシア・バイオテク、USA）を使用することにより調製し、潜在的な汚染染色体DNAを製造業者の指示に従ってDNAse Iで消化した。逆転写のために、オリゴ(dT)12-18及びスーパースクリプトII逆転写酵素（ライフ・テクノロジーズ、グランド・アイランド、USA）を使用することにより、製造業者の指示に従って、RNAを逆転写した。逆転写を37℃で60分間行ない、潜在的な汚染タンパク質を95℃で10分間のインキュベーションにより変性した。
定量的PCRをABIプリズム（登録商標）7700配列検出器システムズ（PEアプライド・バイオシステムズ）について96ウェル・ミクロタイタ・プレート（PEアプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティ、USA）フォーマットで特別な光学管中で製造業者の指示に従って行なった。SYBR（登録商標）グリーンPCRコアー試薬キット（パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ、P/N 4304886）を使用することにより、蛍光シグナルをアンプリタク・ゴールド（Kruseら, 1997）の5'-3'エンドヌクレアーゼ活性により夫々のPCRサイクル中に生じて実時間定量的PCR情報を得た。γIFN及びIL-4に特異的なプライマー（DNAテクノロジーズ、アーラス、デンマーク）の下記の配列を使用した：
γIFNセンス：         5'-TGTAAGCCCCCAGAAACAGAAAG-3'
γIFNアンチセンス：   5'-TTGCCCATCAAGAAACAGCAG-3'
IL-4センス：           5'-TCACTCTTCACTCTTTTCTTCCCC-3'
IL-4アンチセンス：     5'-TCTTCCCACTTTGCTGTTCCTC-3'
【００４２】
ソフトウェアプライマー・エクスプレスTM1.0（PEアプライド・バイオシステムズ）を使用することにより、これらのオリゴヌクレオチド配列を設計した。それらはゲノムDNAの増幅から防止するためにエキソン結合をスパンする。受動基準1(ROX)を含むタクマン（登録商標）普遍PCRマスターミックス（PEアプライド・バイオシステムズ）を使用して蛍光シグナル中の非PCR関連変動について基準化した。既知の量の分子（ウェル当り1.0x103、2.0x103、4.0x103、1.0x104、2.0x104、1.0x105）を含む通常のDNA鋳型及び“無鋳型”対照を使用して標準曲線をつくった。全ての未知のcDNAを希釈して等しい量のβ-アクチンcDNAを含んだ。標準物質、“無鋳型”対照及び未知のサンプルを反応当り50μlの全容積で添加した。PCR保持条件は夫々の増幅について50℃で２分間、95℃で10分間、95℃で15秒、60℃で60秒による40サイクルであった。潜在的なPCR産物汚染をウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)により消化した。何とならば、dTTPがdUTPにより置換されるからである（Kruseら, 1997）。全てのPCR実験を熱開始により行なった。反応系中で、UNG及びアンプリタク・ゴールド（PEアプライド・バイオシステムズ）を製造業者の指示に従って適用した（Heidら, 1996; Kruseら, 1997）。PCR産物のデータを分析するために、２種の用語を使用して結果を表した：ΔRnは基準化リポーターシグナル−最初の二三のサイクルPCRで確立された基準線シグナルを表し、CT（閾値サイクル）は基準線の上のリポーター蛍光シグナルの増大が最初に検出し得るPCRサイクルを表す。
【００４３】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
核抽出物をMcCaffrey（McCaffreyら, 1992; Aramburuら, 1995）により記載されたように調製した。簡単に言えば、氷冷ディグナム緩衝液Ａ400μl次いで10％NP-40 25μlを細胞（5x106）に添加した。細胞を撹拌し、遠心分離した（9000rpm、30秒、４℃）。ペレットにした核をディグナム緩衝液Ｃ50μl中で溶解し、遠心分離し（1,2000rpm、10分間、４℃）、得られる上澄みをディグナム緩衝液Ｄで希釈した(1:1)。二本鎖合成オリゴヌクレオチドDNAプローブを〔γ-32P〕ATP（5,000Ci/ミリモル）及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（アメーシャム・ファーマシア・バイオテク社、UK）で末端標識した。使用したオリゴヌクレオチドプローブの配列（5'から3'へ、一本鎖）は（Jainら, 1993; McCaffreyら, 1993）：ヒトIL-2遠位NFAT部位（NFAT huIL-2）GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGG（結合配列が下線を施された）であった。EMSA反応を室温で25μlの最終容積で行なった。核抽出物（反応容積当りタンパク質３μg）を結合緩衝液（Aramburuら, 1995）中で15分間インキュベートし、続いて32P標識プローブ0.5ngを添加して15分間反応させ、サンプルを0.25TBE緩衝液中で非変性５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。幾つかの実験において、スーパーシフトに使用したmAb又はpAb（全て10μg/mlで）を氷の上で30分間にわたって核抽出物とともにインキュベートした。
結果
結果を表１、２及び３並びに図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄに示す。
CB CD4+ T細胞はTh1 T細胞及びTH2 T細胞にスイッチされる。
【００４４】
【表１】
2004536800.tif 000002
【００４５】
表１：フローサイトメトリーによる細胞内Th1及びTh2サイトカイン検出  a:CB T細胞を物質及び方法に記載された細胞内サイトカインアッセイの前に示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中から異なる組み合わせで刺激した。b:表中にリストされた数は物質及び方法に記載された細胞内サイトカインアッセイで検出された％である。Th1及びTh2サイトカインはIFN-γ、IL-4又はIFN-γとIL-4である。c:５μg/mlのCXCR4マウスmAb。d:５μg/mlのCXCR4マウスmAbとマッチされたイソタイプIg。e:N.D.測定せず。リストされたデータは行なわれた５回のうちの単一の代表的な実験からのものである。
表１に示されたデータから明らかなように、正常なCBからのCD4+ T細胞はナイーブThパターンを示す“分化されず、かつ感作されない”と思われる。新たに単離されたCB CD4+ T細胞では、IFN-γ及びIL-4二重陽性が9.7％であるが、一方、IFN-γ又はIL-4単一陽性が夫々8.5％又は12.1％である。IL-2及びSDF-1αによる刺激の８日後に、細胞はIFN-γの発現に関してTh1パターンにスイッチされ（84％）、一方、IL-4及びSDF-1αによる刺激はCB T細胞がTh2パターンを発現することをもたらす（90.3％）。IL-2、IL-4及びSDF-1α単独又はIL-2とIL-4の組み合わせのいずれもがこのような機能を示さなかった（データは示されていない）。有意差がDNAへの〔3H〕チミジンとり込みアッセイにより検出して８日以内のSDF-1αと一緒にIL-2又はIL-4で刺激されたCB CD4+ T細胞と刺激しないで培養されたCB CD4+ T細胞の間で細胞増殖に関して見られなかった（本発明者らの未公表の結果）。刺激しないで培養された細胞は８日間で細胞内サイトカインの発現に関して有意な変化が見られなかった（データは示されていない）。重要なことには、CXCR4 mAbはこのようなオンスイッチを有意にブロックし得るが、一方、イソタイプIgはそれをなし得ない。更に、CD3 mAbがCB T細胞（本発明者らがこのようなパターンオンスイッチを誘発し得なかった）を刺激するためにSDF-1αを置換するのに使用された（データは示されていない）。
【００４６】
【表２】
2004536800.tif 000003
【００４７】
表２：CB T細胞中のIFN-γ及びIL-4のcDNAの実時間検出及び増幅。IL-2及びIL-4を10ng/mlで使用し、またSDF-1αを100ng/mlで使用した。示された値は行なわれた４回の同様の実験の代表値である。
また、実時間定量的RT-PCRによるCB T細胞中のIFN-γ又はIL-4のmRNA発現を調べた。表２に示されるように、夫々、新たに単離されたCB T細胞中でIFN-γについて約7.3x102のコピー、IL-2及びSDF-1αで８日間刺激された細胞中でIFN-γについて1.0x104のコピー、またIL-4及びSDF-1αで８日間刺激された細胞中でIFN-γについて7.8x101のコピーがある。また表２に示されるように、夫々、新たに単離されたCB T細胞中でIL-4について約2.1x103のコピー、IL-2及びSDF-1αで８日間刺激された細胞中でIL-4について3.6x102のコピー、またIL-4及びSDF-1αで８日間刺激された細胞中でIL-4について1.3x104のコピーがある。CTと標準DNA鋳型又は標的cDNA（IFN-γ及びIL-4）の開始量のlogの間の線形関係が検出された（データは示されていない）。相関関係係数は0.99以上である。
【００４８】
Syk又はZAP-70の持続性活性化が必須である。
図１はCB T細胞中のSyk(A)、ZAP-70(B)、Cbl(C)、及びCbl-b(D)キナーゼの活性化を示す。細胞を新たに単離し、又は示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の間の異なる組み合わせで刺激した。KAは免疫複合体キナーゼアッセイを表し、またIBはイムノブロッティングを表す。細胞を示された異なる時間間隔にわたって刺激し、溶解し、物質及び方法に記載されたようにウサギ抗Syk pAb、ウサギ抗ZAP-70 pAb、ヤギ抗Cbl pAb又はヤギ抗Cbl-b pAbで免疫沈殿した。免疫沈殿をキナーゼ反応にかけ、又は物質及び方法に記載されたように示された夫々の抗体でイムノブロッティングした。最も左のレーンは抗体が単独で使用された場合であった。
図１に示されるように、IL-2及びSDF-1αは一緒に30分以内にSykキナーゼの活性化を誘発した。Sykキナーゼの強力かつ持続性のリン酸化がIL-2及びSDF-1αによる4d及び8d刺激で見られ、一方、IL-2とIL-4の組み合わせ又はIL-4とSDF-1αの組み合わせのいずれもが新たに単離されたCB T細胞中のレベルと較べてSykキナーゼ活性化を誘発しなかった（図1A）。対照的に、IL-4及びSDF-1は一緒に30分以内にZAP-70キナーゼのリン酸化を誘発した。ZAP-70の強力かつ持続性の活性化がIL-4及びSDF-1αによる4d及び8d刺激で見られ、一方、IL-2とIL-4の組み合わせ又はIL-2とSDF-1αの組み合わせのいずれもが新たに単離されたCB T細胞中のレベルと較べてZAP-70活性化を誘発しなかった（図1B）。バンドは正常なウサギ血清が免疫沈殿アッセイに使用されたレーンで観察されなかった（データは示されていない）。
【００４９】
更に、CB T細胞中のアダプタータンパク質Cbl及びCbl-bの活性化を調べた。図1C及び1Dに示されるように、新たに単離されたCB T細胞中でCbl及びCbl-bキナーゼのキナーゼ活性は検出できない。IL-2及びSDF-1αは一緒に30分以内にCblの強力な活性化を誘発した。Cblキナーゼの活性の減衰パターンがIL-2及びSDF-1αによる4d及び8d刺激で見られ、一方、Cblキナーゼの活性の増大パターンがIL-4及びSDF-1αによる4d及び8d刺激で見られた（図1C）。対照的に、IL-2及びSDF-1αは一緒に30分以内にCbl-bキナーゼの弱い活性化を誘発した。Cbl-bキナーゼの強力かつ持続性の活性化がIL-2とSDF-1α又はIL-4とSDF-1αによる4d及び8d刺激で見られた（図1D）。それらはZAP-70キナーゼに対して逆の効果を有することが報告されたので、Cbl及びCbl-bの調節効果の最終成果は２種のキナーゼの活性の間のバランスに依存する。バンドはヤギ血清が免疫沈殿アッセイで使用されたレーンで観察されなかった（データは示されていない）。
【００５０】
図２はSykキナーゼ及びZAP-70キナーゼの活性化に関するPNA Syk及びPNA ZAP-70のブロッキング効果を示す。Ａ及びＢでは、細胞は精製CB T細胞であり、これらは更なるアッセイの前に透過性にされ、物質及び方法に記載されたように示されたPNAアンチセンスの存在下又は不在下で、かつ８日間にわたって示されたその他の刺激物質とともに培養された。図１に関して記載されたように、細胞をその後に溶解し、免疫沈殿し、キナーゼ反応(KA)にかけ、又はイムノブロッティング(IB)した。最も左のレーンは抗体が単独で使用された場合であった。
先の観察を確認するために、PNAアンチセンスアッセイを行なった。Syk PNAアンチセンス及びZAP-70 PNAアンチセンスはまた夫々８日以内に培養中の非刺激CB T細胞中でキナーゼ活性並びにSyk及びZAP-70のタンパク質発現を有意に抑制する（図２）。Syk PNAアンチセンスは１日以内にSykキナーゼ活性を有意に低下でき（データは示されていない）、また８日以内に（IL-2＋SDF-1α）刺激CB T細胞及び（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞中でSykキナーゼ活性を完全に無効にし得る（図2A）。Sykタンパク質の合計量がまたひどく減少される。同様に、ZAP-70 PNAアンチセンスは１日以内にZAP-70キナーゼ活性を有意に低下でき（データは示されていない）、また８日以内に（IL-2＋SDF-1α）刺激CB T細胞及び（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞中でZAP-70キナーゼ活性を完全に無効にし得る（図2B）。ZAP-70タンパク質がまた完全に排除される。バンドはウサギ血清が免疫沈殿アッセイに使用されたレーンで観察されなかった（データは示されていない）。
【００５１】
【表３】
2004536800.tif 000004
【００５２】
表３：CB T細胞中のIFN-γ及びIL-4のcDNAの実時間検出及び増幅。IL-2及びIL-4を10ng/mlで使用し、またSDF-1αを100ng/mlで使用した。示された値は行なわれた４回の同様の実験の代表値である。
平行して、Syk PNAアンチセンスはIL-2及びSDF-1αにより誘発されるIFN-γmRNA発現を著しく抑制し（4.5x102コピー）（表３）、一方、それはIL-4及びSDF-1αにより誘発されるIFN-γmRNA発現を有意に変化しなかった（1.2x103コピー）。対照的に、ZAP-70 PNAアンチセンスはIL-2及びSDF-1αにより誘発されるIFN-γmRNA発現を抑制するこのような能力をもたず（1.1x105コピー）、一方、それはIL-4及びSDF-1αのいずれにより誘発されるIFN-γmRNA発現を有意に変化しなかった（1.4x102コピー）。再度平行して、ZAP-70アンチセンスはIL-4及びSDF-1αにより誘発されるIL-4 mRNA発現を著しく抑制し（6.1x101コピー）（表３）、一方、それはIL-2及びSDF-1αにより誘発されるIL-4 mRNA発現を有意に変化しなかった（1.8x102コピー）。対照的に、Syk PNAアンチセンスはIL-4及びSDF-1αにより誘発されるIL-4 mRNA発現を抑制するこのような能力をもたず（1.9x104コピー）、一方、それはIL-2及びSDF-1αのいずれにより誘発されるIL-4 mRNA発現を有意に変化しなかった（8.5x102コピー）。Syk PNAアンチセンス及びZAP-70 PNAアンチセンスはまた夫々８日以内に培養中の非刺激CB T細胞中でIFN-γ及びIL-4のmRNA発現を有意に抑制する（データは示されていない）。実時間mRNA定量に関する実験における相関関係係数は0.97以上である。一緒にされると、これらの結果はSykキナーゼ活性化がIL-2及びSDF-1αにより誘発されるTh1細胞オンスイッチに必須であること、及びZAP-70キナーゼ活性化がIL-4及びSDF-1αにより誘発されるTh2細胞オンスイッチに必須であることを示す。
【００５３】
NFAT1又はNFAT2の持続性活性化がまた重要である。
図３はIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせによる刺激後のCB T細胞中のNFATの活性化及び同定を示す。試験した物質は核抽出物（Ａ、Ｃ及びＤ）又は全細胞抽出物（Ｂ）であった。細胞を新たに単離し、又は示された夫々の時間間隔にわたって異なる刺激物質で刺激した。NFAT活性化を物質及び方法に記載された32P標識NFAT huIL-2プローブを使用するEMSAにより評価した。Ａ及びＢでは、NFATの位置を示した。物質及び方法に記載されたスーパーシフトアッセイでNFAT1又は／及びNFAT2（Ｃ）或いはNFAT3又は／及びNFAT4（Ｄ）のAbを使用することにより、NFAT1、NFAT2、NFAT3、及びNFAT4の存在の同定を分析した。32P標識NFAT huIL-2プローブの添加の前に、サンプルの同じアリコートをイソタイプマウスIgGもしくはヤギ血清(i)、マウスNFAT1 mAb (1)、マウスNFAT2 mAb (2)、NFAT1 mAb＋NFAT2 mAb (1.2)、又はヤギNFAT3 pAb (3)、ヤギNFAT4 pAb (4)、NFAT3 pAb＋NFAT4 pAb (3.4)とともに、又はこれらを用いないで(-)インキュベートした。特異性Abの存在下で誘発された32P標識NFAT huIL-2へのNFAT結合及びスーパーシフトを夫々下部矢印及び上部矢印で示す。
【００５４】
Syk又はZAP-70活性化後の下流のイベントを更に明らかにするために、本発明者らは次に（IL-2＋SDF-1α）刺激CB T細胞又は（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞中のNFATの活性化を調べた。図3Aでは、新たに単離されたCB T細胞の核抽出物中にNFATを検出することができない。30分間にわたるIL-2＋SDF-1α、IL-4＋SDF-1α、又はIL-2＋IL-4による刺激後に、NFAT huIL-2がCB T細胞の核抽出物中で検出され、これはこれらの組み合わせによる刺激がCB T細胞中のNFATのトランスロケーションを確実にするNFAT活性化を誘発し得ることを示す。しかしながら、IL-2＋IL-4のみが細胞質から核へのNFATのトランスロケーションに関してNFATの弱い活性化を誘発する。（IL-2＋SDF-1α）刺激又は（IL-4＋SDF-1α）刺激が1d、4d及び8dでCB T細胞中の強力かつ持続性のNFAT活性化を誘発し、一方、この現象は（IL-2＋IL-4）で刺激されたCB T細胞中で見られなかった（図3A）。対照的に、殆ど等しいNFATタンパク質が新たに単離されたCB T細胞又は異なる組み合わせ（IL-2＋SDF-1α、IL-4＋SDF-1α、又はIL-2＋IL-4）による刺激後のCB T細胞の全細胞抽出物中に見られ（図3B）、異なる組み合わせによる刺激のみがNFATの活性化を誘発するが、NFATの新たな合成を誘発しないことを示す。図3Cでは、NFAT複合体が8dにわたるIL-2及びSDF-1αによる刺激後にCB T細胞の核抽出物中でNFAT huIL-2プローブで検出された。この複合体は抗NFAT1 mAbによりスーパーシフトされた。イソタイプマウス抗体又は抗NFAT2 mAbのいずれもが（IL-2＋SDF-1α）刺激CB T細胞の核抽出物中のNFAT複合体の相対的移動度に影響し得ない。対照的に、NFAT複合体はIL-4及びSDF-1αによる刺激後にCB T細胞の核抽出物中で抗NFAT2 mAbによりスーパーシフトされた。イソタイプマウス抗体又は抗NFAT1 mAbのいずれもが（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞の核抽出物中のNFAT複合体の相対的移動度に影響し得ない。これらの結果はNFAT2ではなく、NFAT1のみが（IL-2＋SDF-1α）刺激CB T細胞の核抽出物中に存在することを確かめる。これらの結果はまたNFAT1ではなく、NFAT2のみが（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞の核抽出物中に存在することを確かめる。図3Dでは、（IL-2＋SDF-1α）又は（IL-4＋SDF-1α）刺激CB T細胞の核抽出物中に検出された、NFAT複合体が抗NFAT3 pAb又は抗NFAT4 pAbのいずれによっても全くスーパーシフトされなかった。これらの結果はNFAT3又はNFAT4のいずれもが（IL-2＋SDF-1α）又は（IL-4＋SDF-1）刺激CB T細胞の核抽出物中に存在しないことを確かめる。
【００５５】
説明
Th1及びTh2サイトカインプロフィールの間のバランスが炎症の部位で免疫応答を改善し得る（Coffmanら, 1999）。例えば、アレルギー性炎症はTh2関連疾患である（Casolaroら, 1996）。Th2サイトカインはアレルギー性炎症プロセスの開始、発達、進行及び終結に必須の役割を果たす。Th1及びTh2サイトカインの発現及び力学の測定がTh1関連疾患及びTh2関連疾患の診断及び予後に重要であろう。Th1クローン及びTh2クローンが最初に高度免疫マウスから（O'Garraら, 1998）又はヒトの慢性疾患中に（Romagnaniら, 1994; Sherら, 1992）単離されたという一つの重要な局面が考慮されるべきである。今まで、ヒトTh1 T細胞及びTh2 T細胞が慢性感染症及びアレルギー中に末梢血、ドレーニング(draining)リンパ節及び冒された組織から単離された（Romangnaniら, 1994）。高レベルの調節サイトカインのそれらの産生により慢性疾患又は病的プロセスに影響するそれらの能力は疑いのないものであるが、Th1細胞及びTh2細胞がこのようなin vivo応答をどの数的程度まで支配するのかは未だに明らかではない（O'Garraら, 1998）。Th1及びTh2サブセットは同じＴ細胞前駆体から発生し、これは抗原特異性刺激後に主としてIL-2を産生する成熟したナイーブCD4+ T細胞である（O'Garraら, 1998）。この前駆体からのTh1及びTh2分化を決める因子はTCRの連結反応の段階における免疫応答の開始時に存在するサイトカインである（Abbasら, 1996）。
【００５６】
SDF-1αと組み合わせてIL-2又はIL-4が非抗原特異性CB CD4+ T細胞をTh1又はTh2細胞にスイッチし得ることを示す本データはSDF-1αがTh1及びTh2細胞形成の誘導に関してマイトジェン様機能を有するか否かという問いを確かに生じる。そうではない場合、その問いはTh1及びTh2細胞形成を特定する抗原の段階が絶対に必要であるか否かに拡大し得る。Th1及びTh2形成の誘発に平行に、SDF-1αはIL-2又はIL-4と一緒にSyk及びZAP-70キナーゼの持続性かつ選択的な活性化を誘発し、続いてCblファミリー及びNFATファミリーを含むシグナル伝達のその他の要素の下流の活性化を生じる。こうして、これらのデータは或る種のサイトカイン（SDF-1α）がTh誘導性サイトカインと一緒にオルタナチブTCR関連チロシンキナーゼリン酸化を選択的に開始でき、続いてレギュレーターを含む下流の要素を活性化し得るオルタナチブ経路を指摘すると考えられ、シグナル伝達における要素のこのような一連の活性化及びそれらの間のバランスがTh1又はTh2分極のオンスイッチをもたらす。このシステムについての略図を図４に示す。
TCR媒介シグナル伝達はＴ細胞発生に重要である。Sykキナーゼファミリーに属し、TCRと関連する、Syk及びZAP-70は、それらの明らかな構造類似性にかかわらず発現及び活性の両方に関して異なる（Chuら, 1998）。SykファミリーのキナーゼがTh1及びTh2細胞の活性化に選択的に関係することを示す或る種の証拠があるが（Tamuraら, 1995; Faithら, 1999）、Th1及びTh2細胞の分極をもたらすシグナリング経路は今まで非常に明らかではない。現在の研究はIL-2及びSDF-1αにより誘発される持続性Sykキナーゼ活性化がTh1細胞オンスイッチをもたらし、一方、IL-4及びSDF-1αにより誘発される持続性ZAP-70活性化がTh2細胞オンスイッチを誘発するという最初の直接の証拠を与える。こうして、それはSykとZAP-70の相違が発現及び活性に関してだけでなく、機能に関して存在するという証拠である。ケモカインは多様な白血球のトラフィッキング及びミエロイド前駆細胞の増殖を含む、幾つかの生物学的プロセスを調節する。Th1及びTh2細胞はケモカイン受容体の異なる組を発現する。CXCR4とTCRの間のクロストーク及び相互調節の示唆があるが（Peacockら, 1999）、本研究はIL-2又はIL-4と組み合わせてのSDF-1αが累積的かつ持続性のSyk又はZAP-70キナーゼ活性化、続いてオンスイッチTh1又はTh2細胞を選択的かつ特異的に誘発することを報告する最初のものである。
【００５７】
Th1及びTh2細胞の両方は、それらの発生の早期段階では、相互変換性であるが、反復刺激により、両方の集団は不可逆性になる。この可逆性又は安定性の生化学的基礎はサイトカイン遺伝子の調節された転写又はサイトカイン受容体の発現であり得る（Abbasら, 1996）。或る研究者らは前駆Th細胞が抗原刺激及びin vivoのサイトカイン環境後にTh1又はTh2細胞クローンに分化するという考えを保持している。或る種の臨床症候はこのような意見を支持しないと考えられる。例えば、Th2サイトカインが重要かつ支配的な役割を果たすアレルギー性喘息は数秒以内に発症し得るが、緩解期中では、Th1とTh2サイトカインのバランスが妥当に支持し得る。本結果に基づいて、静止Th細胞は抗原刺激及びin vivoのサイトカイン刺激後にTh1又はTh2細胞に完全かつ迅速にスイッチし得ると仮定されるかもしれず、それは早期では局所で、また後期では全身で生じる。新生児は低レベルの誘発性Th1及びTh2細胞を有する。これらの細胞はナイーブTh細胞の発生中に記憶Th1及びTh2細胞になる。記憶Th1及びTh2細胞（これらはサイトカインの合成及び分泌の数及び能力に関して正常条件ではバランスしている）は、抗原の暴露後にin vivoで存在し得る。記憶Th1及びTh2細胞、おそらく遺伝的“疾患”Th1及びTh2細胞は、マクロファージの如きその他の免疫細胞と一緒に、Th1又はTh2分極疾患が生じる、in situのオートクリンサイトカイン環境を与える。
【００５８】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１−Ａ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用する、新たに単離され、又は示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせで刺激されたCB T細胞中のSykの活性化を示す。
【図１−Ｂ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用する、新たに単離され、又は示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせで刺激されたCB T細胞中のZAP-70の活性化を示す。
【図１−Ｃ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用する、新たに単離され、又は示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせで刺激されたCB T細胞中のCblの活性化を示す。
【図１−Ｄ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用する、新たに単離され、又は示されたようにIL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせで刺激されたCB T細胞中のCbl-bの活性化を示す。
【図２−Ａ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用するSykキナーゼの活性化に関するPNA Sykアンチセンスのブロッキング効果を示す。
【図２−Ｂ】免疫複合体キナーゼアッセイ(KA)及びイムノブロッティング(IB)を使用するZAP-70キナーゼの活性化に関するPNA ZAP-70アンチセンスのブロッキング効果を示す。
【図３−Ａ】IL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせによる刺激後のCB T細胞中のNFATの活性化及び同定を示す。
【図３−Ｂ】IL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせによる刺激後のCB T細胞中のNFATの活性化及び同定を示す。
【図３−Ｃ】IL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせによる刺激後のCB T細胞中のNFATの活性化及び同定を示す。
【図３−Ｄ】IL-2（10ng/ml）、IL-4（10ng/ml）、及びSDF-1α（100ng/ml）の中からの異なる組み合わせによる刺激後のCB T細胞中のNFATの活性化及び同定を示す。
【図４】Th1及びTh2分化をもたらす調節経路の略図を示す。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
2004536800.tif 000006
【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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