(57)【要約】【課題】細胞中に存在するヌクレオチド量の変化を安価で単一容器で且つ高処理量で測定する方法を提供する【解決手段】試験化合物の試験媒体への添加に対応して試験媒体中で生成するヌクレオチド量の変化を測定する。また試験媒体によって生成するヌクレオチド量を増加させる化合物を試験化合物と試験媒体単独或いはヌクレオチドを増加させる化合物で化学的処理を行った試験媒体とを比較することによって同定する方【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験容器中で試験化合物を試験媒体と接触させ；（ｂ）試験容器中で試験媒体と接触している試験化合物を試験媒体中でヌクレオチドが生成するのに十分な時間保持し；（ｃ）試験媒体中で生成したヌクレオチドを試験容器中に開放し；（ｄ）放射能識別化ヌクレオチド配位子及びヌクレオチド結合性蛋白質の固定量を加え、そこでは放射能識別化ヌクレオチド配位子はヌクレオチド結合性蛋白質と結合するために試験媒体中で生成したヌクレオチドと競合し；（ｅ）試験媒体中で生成したヌクレオチドと放射能識別化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質に結合させヌクレオチド結合性蛋白質錯体を生成させるのに十分な時間試験容器を保持し；（ｆ）錯体化されていない放射能識別化ヌクレオチドからヌクレオチド結合性蛋白質錯体を分離し；そして（ｇ）ヌクレオチド結合性蛋白質錯体の放射能レベル、ここで放射能レベルは該試験媒体中で生じたヌクレオチドの量に反比例する、を測定することからなる化学的処理を伴う試験媒体中で生成したヌクレオチドレベルの測定方法。
【請求項２】
試験媒体が細胞又は細胞膜である請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験媒体中で生成したヌクレオチドが環状ホスフェートである請求項１記載の方法。
【請求項４】
環状ホスフェートが環状モノホスフェートである請求項３記載の方法。
【請求項５】
試験媒体中でヌクレオチドを生成させるのに十分な時間が
約１５℃から４０℃において約５から１８０分である請求項１記載の方法。
【請求項６】
試験媒体中で生成したヌクレオチドを試験容器中に開放することが試験媒体を溶解させそして約５から６０分間約１５℃から４０℃に保持することからなる請求項１記載の方法。
【請求項７】
放射能識別化ヌクレオチド配位子が放射能識別化環状ホスフェートである請求項１記載の方法。
【請求項８】
試験媒体中で生成したヌクレオチド及び放射能識別化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質と結合させヌクレオチド結合性蛋白質錯体を生成させるために試験容器を約１５℃から４０℃において約１５から１２０分間保持する請求項１記載の方法。
【請求項９】
ｉ）（ａ）試験容器中で試験化合物を試験媒体と接触させ；（ｂ）試験容器中で試験媒体と接触している試験化合物を試験媒体中でヌクレオチドが生成するのに十分な時間保持し；（ｃ）試験媒体中で生成したヌクレオチドを試験容器中に開放し；（ｄ）放射能識別化ヌクレオチド配位子及びヌクレオチド結合性蛋白質の固定量を加え、そこでは放射能識別化ヌクレオチド配位子はヌクレオチド結合性蛋白質に結合するために試験媒体中で生成したヌクレオチドと競合し；（ｅ）試験媒体中で生成したヌクレオチドと放射能識別化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質に結合させヌクレオチド結合性蛋白質錯体を生成させるのに十分な時間試験容器を保持し；（ｆ）錯体化されていない放射能識別化ヌクレオチドからヌクレオチド結合性蛋白質錯体を分離し；そして（ｇ）ヌクレオチド結合性蛋白質錯体の放射能レベル、ここで放射能レベルは該試験媒体中で生じたヌクレオチドの量に反比例する、を測定する諸工程からなる試験を実施し；そしてｉｉ）その試験から得られた結果を（ａ）化合物を試験媒体と接触させない負の対照；（ｂ）細胞中で生成するヌクレオチド量を増加させる化合物である正の対照化合物を試験化合物として使用する正の対照；又は（ｃ）正の対照及び負の対照の両方、ここでは試験媒体中で生成するヌクレオチドの量は負の対照での試験媒体中に現れるヌクレオチドより多くそして試験媒体中で生成したヌクレオチドの量は正の対照での試験媒体中で生成するヌクレオチドより多いか等しく、試験媒体中で生成したヌクレオチド量を増加させることのできる試験化合物の指標となる、のいずれかから得られた結果と比較することからなる試験媒体によって生成したヌクレオチドの量を増加させる化合物の同定方法。
【請求項１０】
該方法が生体活性を示す化合物を同定するために使用される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試験媒体が細胞又は細胞膜である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
試験媒体中で生成したヌクレオチドが環状ホスフェートである請求項９記載の方法。
【請求項１３】
試験媒体中でヌクレオチドを生成させるのに十分な時間が約１５℃から４０℃において約５から１８０分である請求項９記載の方法。
【請求項１４】
試験媒体中で生成したヌクレオチドを試験容器中に開放することが試験媒体を溶解させそして約５から６０分間約１５℃から４０℃に保持することからなる請求項９記載の方法。
【請求項１５】
放射能識別化ヌクレオチド配位子が放射能識別化環状ホスフェートである請求項９記載の方法。
【請求項１６】
試験媒体中で生成したヌクレオチド及び放射能識別化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質と結合させヌクレオチド結合性蛋白質錯体を生成させるために試験容器を約１５℃から４０℃において約１５から１２０分間保持する請求項９記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）（ａ）マイクロタイタープレート中で試験化合物を細胞と接触させ；（ｂ）マイクロタイタープレート中で細胞と接触している試験化合物を細胞中でシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートが生成するのに十分な時間保持し；（ｃ）細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートをマイクロタイタープレート中に開放し；（ｄ）放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート及び牛の副腎腺から誘導された蛋白質の固定量をマイクロタイタープレート中に加え、そこでは放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートは細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートと牛の副腎腺から誘導された蛋白質に結合するために競合し；（ｅ）試験媒体中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートと放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを牛の副腎腺から誘導された蛋白質に結合させシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を生成させるのに十分な時間試験容器を保持し；（ｆ）錯体化されていない放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートからシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を分離し；そして（ｇ）シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体の放射能レベル、ここで放射能レベルは該細胞中で生じたシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量に反比例する、を測定する諸工程からなる試験を実施し；そしてｉｉ）その試験から得られた結果を（ａ）化合物を細胞と接触させない負の対照；（ｂ）細胞中で生成するシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート量を増加させる化合物である正の対照化合物を試験化合物として使用する正の対照；又は（ｃ）正の対照及び負の対照の両方、ここでは試験媒体中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量は負の対照下での細胞中に現れるシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートより多くそして細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量は正の対照下での細胞中で生成するシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートより多いか等しく、細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート量を増加させることのできる試験化合物の指標となる、のいずれかから得られた結果と比較することからなる生体活性化合物の同定方法。
【請求項１８】
細胞中でシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを生成させるのに十分な時間が約１５℃から４０℃において約５から１８０分である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートをマイクロタイタープレート中に開放することが試験媒体を溶解させそして約５から６０分間約１５℃から４０℃に保持することからなる請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート及び放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを牛の副腎腺から誘導された蛋白質に結合させシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を生成させるためにマイクロタイタープレートを約１５℃から４０℃において約１５から１２０分間保持する請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的にはヌクレオチドの分野に関する。特に、本発明は以下のような化学的処理によって細胞中のヌクレオチドレベルを測定することによる化合物の生体活性能力の測定法に関しそしてより詳しくは化合物の生体活性能力の測定のための化学的処理による細胞中に存在するシクロホスフェートヌクレオチドのレベルの測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの生体活性化合物に対する生理応答は“二次メッセンジャー”を介して行われる。ヌクレオチド、例えば、シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート
又はシクロＡＭＰ（ｃＡＭＰ）はホルモン又は他の細胞表面受容体に結合する生体活性化合物の信号形質導入過程において二次メッセンジャーとしての重要な役割を演ずる。受容体活性から生ずるヌクレオチドのレベルが増加すると、特定のヌクレオチド依存性の蛋白質キナーゼの活性化を引き起こし、それは順番に種々の目的蛋白質のホスフェート化を引き起こす。このように、存在するヌクレオチドのレベルが高いと化合物はより高い生体活性をもつことになる。
【０００３】
細胞の化学的処理に伴う細胞内のヌクレオチドレベルの測定は文献、例えば武田らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０５巻３２７−３２９ページ（１９８９）、ベルクらのＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５巻，１号，５６−５９ページ（１９９３）、ブラウンらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２１．５６１−５６２ページ（１９７１）、及びＡ．Ｇ．ギルマンのＰＮＡＳ，６７巻，１号，３０５−３１２ページ（１９７０）に報告されてきた。しかしながら、これらの方法は多段反応器を必要としそして与えられた時間内で実施できる測定の数を時間強度で限定する傾向がある。このように、これらの方法は単一容器、即ち、ヌクレオチドの変化を測定する“ワンポット”高処理量方法を排除する。さらに、文献、例えばアメルシャムライフサイエンス社製商標名バイオトラック製品及びカリブらのＪ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４巻，１号，２７−３２ページ（１９９９）に報告されている“ワンポット”法は、高価となる傾向がある。結果として、細胞中に存在するヌクレオチド量の変化を測定するための安価で単一容器、高処理量法が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は細胞中に存在するヌクレオチド量変化を安価で単一容器で且つ高処理量で測定する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の一態様は試験媒体中で生成するヌクレオチドのレベルを測定する単一容器、高処理量の方法について記載する。本発明は試験化合物の試験媒体への添加に対応して試験媒体中で生成するヌクレオチド量の変化を測定する。本発明は特に細胞、特に昆虫細胞中のシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）のようなヌクレオチドの変化を測定するのに効果的である。
【０００６】
本発明の別の態様においては、試験媒体によって生成するヌクレオチド量を増加させる化合物を試験化合物と試験媒体単独或いはヌクレオチドを増加させる化合物で化学的処理を行った試験媒体とを比較することによって同定する単一容器、高処理量の方法を開示する。この方法は生体活性を示すと思われる化合物の同定において有用である。
【０００７】
本発明の更に別の態様においては、細胞中でのｃＡＭＰの生成過程での生体活性化合物を同定する単一容器、高処理量の方法について開示する。
【０００８】
本発明は複雑性が少なく、よりコスト効果があり、そして文献に開示されている感度と同等である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
修飾語“約”はここでは反応物、物質量のモル比、及び温度範囲のように固定的に決定できない或る好ましい操作範囲を示すために使用される。その意味は分子生物学の熟練した当業者にとってはしばしば明白なものとなるであろう。例えば、実験で参照される約１２０℃から約１３５℃の温度範囲を引用するとき、実験を遂行するのに有益と期待される同様な他の温度、例えば１０５℃又は１５０℃を包含することを意味する。一般的に、より特定の範囲が開示されない限り、“約”は最終点の絶対値の１０％又は引用範囲の１０％以下のどちらか少ない方を示す。
【００１０】
用語“室温”はここで使用されるときは実験室又は他の仕事場で適用できる温度で、そして一般的に１５℃以下ではなく又３０℃以上でもないことを意味する。
【００１１】
用語“生体活性”はここで使用されるときは、化学品、限定はしないが薬（例えば医薬品）及び農薬を含む物質が細胞、ウイルス、器官又は生体として振舞う能力及び細胞、ウイルス、器官又は生体の機能変化を作り出す能力を意味する。
【００１２】
用語“試験容器”はここで使用されるときは、検定、反応、方法、実験、又は他の手段を実行するために使用されるペトリ皿、マイクロタイタープレート、試験管、又はビーカーのような機器を意味する。
【００１３】
用語“試験媒体”はここで使用されるときは、ヌクレオチドを生成させるのに適した細胞又は細胞膜のような環境を意味する。
【００１４】
用語“ヌクレオチド結合性蛋白質”はここで使用されるときは、ヌクレオチドに選択的に結合するか付加する蛋白質、例えば、牛の副腎腺から誘導された蛋白質、牛の筋肉、又は抗体から誘導された蛋白質を意味する。
【００１５】
ここで使用されるときは、用語“溶解剤”は細胞溶解を起こすことのできる界面活性剤のような物質を意味する。
【００１６】
本発明の一態様は、試験媒体、例えば、細胞又は細胞膜中で化学的処理を行うことで生成するヌクレオチドのレベルを測定する方法を包含する。その方法は（ａ）試験容器中で試験化合物を試験媒体と接触させ；（ｂ）試験容器中で試験媒体と接触している試験化合物を試験媒体中でヌクレオチドが生成するのに十分な時間保持し；（ｃ）試験媒体中で生成したヌクレオチドを試験容器中に開放し；（ｄ）放射能識別化ヌクレオチド配位子及びヌクレオチド結合性蛋白質の固定量を加え、そこでは放射能識別化ヌクレオチド配位子はヌクレオチド結合性蛋白質と結合するために試験媒体中で生成したヌクレオチドと競合し；（ｅ）試験媒体中で生成したヌクレオチドと放射能識別化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質に結合させヌクレオチド結合性蛋白質錯体を生成させるのに十分な時間試験容器を保持し；（ｆ）錯体化されていない放射能識別化ヌクレオチドからヌクレオチド結合性蛋白質錯体を分離し；そして（ｇ）ヌクレオチド結合性蛋白質錯体の放射能レベル、ここで放射能レベルは該試験媒体中で生じたヌクレオチドの量に反比例する、を測定することからなる。
【００１７】
本発明で生成しそして測定される好ましいヌクレオチドは、限定はしないが、シクロホスフェートを包含する。本発明で生成しそして測定される好ましいヌクレオチドはシクロモノホスフェート、例えば、シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）、ジブチルシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート（ｄｂｃＡＭＰ）、シクログアノシン３’，５’−モノホスフェート（ｃＧＭＰ）、シクロイノシン３’，５’−モノホスフェート（ｃＩＭＰ）、及びシクロユリジン３’，５’−モノホスフェート（ｃＵＭＰ）である。本発明で生成しそして測定される特に好ましくそして有効なヌクレオチドはｃＡＭＰ及びｃＧＭＰである。
【００１８】
本発明において試験媒体として使用される好ましい細胞としては、限定はしないが、付着性或いは非付着性の自然の又はクローン化された無脊椎或いは脊椎細胞、例えばＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、ＫＣ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞が包含される。
【００１９】
試験化合物はそのまま又は溶媒中の溶液として接触させる。ここで使用するとき、用語“そのまま”は混ぜ合わせのない又は如何なる不純物も混在しない直接の技術的な物質を意味する。本発明で使用される溶媒の例は塩類溶液、例えばカリウム、ナトリウム、又はマグネシウム塩溶液、組織培養媒体、緩衝剤、例えば酸、塩基、又は中性緩衝剤、水、酸、ケトン、アルコール、スルフォキサイド、又はそれらの混合物である。好ましい試験化合物は組織培養媒体、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルフォキサイド、メタノール、アセトン、又はそれらの混合物中に溶液として加えられる。試験媒体はまたそのまま又は溶媒中の溶液として加えることができる。上記の溶媒は又試験媒体と組み合わせて使用してもよい。
【００２０】
試験媒体中でヌクレオチドを生成させるのに十分な時間は、約１５℃から約４０℃、より好ましくは約２０℃から約４０℃において約５から１８０、より好ましくは約５から約６０分である。
【００２１】
試験媒体中で生成したヌクレオチドは熟練した当業者に公知の方法で試験容器に開放される。好ましくは、ヌクレオチドは試験媒体を溶解させることによって、例えば、そのまま或いは上記で開示した溶媒中の溶液として溶解剤を添加することによって；機械的に細胞壁を例えば、超音波、融氷、加熱、又は酸及びアルカリ処理を使用して破壊させることによって；それから試験媒体を約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約５から６０、好ましくは約５から約３０分で試験容器に開放させることができる。好ましくは、試験媒体は
ノニオン性界面活性剤、エンザイム、又は界面活性剤のような溶解剤の添加によって溶解させることができる。
【００２２】
好ましくは、放射能識別化ヌクレオチド配位子は放射能識別化シクロホスフェート、より好ましくは、放射能識別化シクロモノホスフェートである。使用される放射能識別化ヌクレオチド配位子の例としては、限定はしないが、放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート、放射能識別化シクログアノシン３’，５’−モノホスフェート、放射能識別化シクロイノシン３’，５’−モノホスフェート、又は放射能識別化シクロユリジン３’，５’−モノホスフェートが包含される。本発明で使用される好ましい放射能識別化ヌクレオチド配位子は放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート及び放射能識別化シクログアノシン３’，５’−モノホスフェートであり、より好ましくは放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートである。
【００２３】
上述のように、本発明において有用なヌクレオチド結合性蛋白質の例は牛の副腎腺から誘導された蛋白質、牛の筋肉及び抗体から誘導された蛋白質である。本発明で使用できる好ましいヌクレオチド結合性蛋白質は牛の副腎腺から誘導された蛋白質である。試験媒体中で生成するヌクレオチド及び放射能標識化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質と結合させてヌクレオチド結合性蛋白質錯体を形成させるために必要な時間は本発明にとって臨界的ではない。一般的には、約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約１５から１２０、好ましくは約９０から約１２０分間、試験容器を維持することで試験媒体中で生成するヌクレオチド及び放射能標識化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質と結合させてヌクレオチド結合性蛋白質錯体を形成させるのに十分である。
【００２４】
ヌクレオチド結合性蛋白質錯体はろ過、遠心分離、溶媒抽出又はそれらの組み合わせのような熟練した当業者に公知の方法によって錯体化していない放射能標識化ヌクレオチド配位子から分離することができる。同様に、ヌクレオチド結合性蛋白質錯体の放射能レベル（生成したヌクレオチド量に反比例する）はシンチレーションカウンター又は分光光度計（例えば、Ａ．Ｇ．ギルマンのＰＮＡＳ，６７巻，１号，３０５−３１２ページ（１９７０）を参照、ここでは放射能と細胞内で生成したヌクレオチド量との間で反比例関係にある錯体の放射能測定について議論している）のような熟練した当業者に公知の方法で測定することができる。
【００２５】
本発明の別の態様においては、試験媒体によって生成したヌクレオチドの量を増加させる化合物の同定方法を開示する。この方法は上記に開示した方法を利用する試験を実施しそしてそれから試験から得られた結果を（ａ）試験媒体と接触する化合物が存在しない負の対照；（ｂ）細胞中で生成するヌクレオチド量を増加させる化合物である正の対照化合物を試験化合物として使用する正の対照；又は（ｃ）正の対照及び負の対照の両方、ここでは試験媒体中で生成したヌクレオチドの量は負の対照下での試験媒体中に現れるヌクレオチドより多くそして試験媒体中で生成したヌクレオチドの量は正の対照下での試験媒体中で生成するヌクレオチドより多いか等しく、試験媒体中で生成したヌクレオチド量を増加させる試験化合物の指標となる、のいずれかから得られる結果と比較することから構成される。
【００２６】
好ましくは、試験から得られた結果を、正の対照及び負の対照の両方、ここでは試験媒体中で生成したヌクレオチドの量は試験媒体中に現れるヌクレオチドより多くそして試験媒体中で生成したヌクレオチドの量は正の対照下での試験媒体中で生成するヌクレオチドより多いか等しく、試験媒体中で生成したヌクレオチド量を増加させる試験化合物の指標となる、から得られた結果と比較することである。
【００２７】
本発明で使用される正の対照化合物の例はオクトパミン、シネフェリン、ジメチルクロロジメフォルム、又はアミトラッツ（ａｍｉｔｒａｚ）である。
【００２８】
この方法は特に生体活性を示す化合物の同定に有用である。限定はしないが、上記で開示した好ましい試験媒体、ヌクレオチド、試験容器、放射能標識化ヌクレオチド配位子、及びヌクレオチド結合性蛋白質を含む試験媒体、ヌクレオチド、試験容器、放射能標識化ヌクレオチド配位子、及びヌクレオチド結合性蛋白質もまたこの態様に使用することができる。
【００２９】
上述のように、試験媒体中でヌクレオチドを生成させるのに十分な時間は約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約５から１８０、好ましくは約５から約６０分である。
【００３０】
同様に、試験媒体中で生成したヌクレオチドは上記の方法（これはもし長々と述べられるときここで取り込まれている）によって試験容器中に開放することができる。
【００３１】
上述のように、約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約１５から１２０、好ましくは約９０から約１２０分間、試験容器を維持することで、試験媒体中で生成するヌクレオチド及び放射能標識化ヌクレオチド配位子をヌクレオチド結合性蛋白質と結合させてヌクレオチド結合性蛋白質錯体を形成させるのに十分である。上述のヌクレオチド結合性蛋白質錯体を錯体化していない放射能標識化ヌクレオチド配位子から分離しそしてヌクレオチド結合性蛋白質錯体の放射能レベルを測定する方法はこの態様においても又使用することができる。
【００３２】
本発明の別の態様においては、生体活性をもつ化合物を同定する方法を開示する。その方法はｉ）（ａ）マイクロタイタープレート中で試験化合物を細胞と接触させ；（ｂ）マイクロタイタープレート中で細胞と接触している試験化合物を細胞中でシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートが生成するのに十分な時間保持し；（ｃ）細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートをマイクロタイタープレート中に開放し；（ｄ）放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート及び牛の副腎腺から誘導された蛋白質の固定量をマイクロタイタープレート中に加え、そこでは放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートは細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートと牛の副腎腺から誘導された蛋白質に結合するために競合し；（ｅ）試験媒体中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートと放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを牛の副腎腺から誘導された蛋白質に結合させシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を生成させるのに十分な時間試験容器を保持し；（ｆ）錯体化されていない放射能識別化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートからシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を分離し；そして（ｇ）シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体の放射能レベル、ここで放射能レベルは該細胞中で生じたシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量に反比例する、を測定する諸工程からなる試験を実施し；そしてｉｉ）試験から得られる結果を（ａ）細胞と接触する化合物が存在しない負の対照；（ｂ）細胞中で生成するシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート量を増加させる化合物である正の対照化合物を試験化合物として使用する正の対照；又は（ｃ）正の対照及び負の対照の両方、ここでは試験媒体中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量は負の対照下での細胞中に現れるシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートより多くそして細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートの量は正の対照下での細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートより多いか等しく、細胞中で生成したシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート量を増加させる試験化合物の指標となる、のいずれかから得られる結果と比較することから構成される。
【００３３】
上記で開示された正の対照化合物もまたこの態様に使用できる。好ましくは、正の対照化合物はオクトパミン又はアミトラッツである。
【００３４】
好ましくは、細胞中でシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを生成させるのに十分な時間は約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約５から１８０、好ましくは約５から約６０分である。
【００３５】
好ましくは、細胞中で生成するシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートは溶解させること、好ましくはノニオン性界面活性剤のような溶解助剤を添加することによって、そしてまた約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約５から６０、好ましくは約５から約３０分間維持することによってマイクロタイタープレートに開放させることができる。
【００３６】
一般的には、マイクロタイタープレートは細胞中で生成するシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート及び放射能標識化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートを牛の副腎腺から誘導される蛋白質と結合させてシクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体を形成させるために約１５℃から約４０℃、好ましくは約２０℃から約４０℃において約１５から１２０、好ましくは約９０から約１２０分間、維持することができる。一旦シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体が形成されると、錯体化していない放射能標識化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートから分離しそしてその放射能を上記に開示した方法によって測定することができる。好ましくは、シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート結合性蛋白質錯体は錯体化していない放射能標識化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェートからろ過によって分離されそしてその放射能はシンチレーションカウンターによって測定される。
【００３７】
本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明がそれによって限定されるものではない事を理解すべきである。
【００３８】
【実施例】
【００３９】
実施例１
この実施例は溶解剤としてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを使用するアミトラッツから生成したｃＡＭＰの定量を説明する。
【００４０】
下記の溶液は実験が同じ日に実施されるように調製された：
溶液Ａ：　脱イオン化した水約４５０ｍｌに撹拌しながらトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（塩基）、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社、フィリップスバーグ、ＮＪ製）６．０５ｇ、濃塩酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）３．４ｍｌ、塩化ナトリウム７．３ｇ、エチレンジアミン４酢酸ナトリウム塩（ＥＤＴＡ、シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ製）１．８６ｇ、ショ糖（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）４２．８ｇ及び２−メルカプトエタノール（シグマケミカル社製）０．５ｍｌを加えた。得られた溶液を撹拌し、濃塩酸でｐＨを７．４に調節した。ｐＨ７．４にした後に、十分な脱イオン水を加え全容積を５００ｍｌとした。
【００４１】
溶液Ｂ：　脱イオン化した水約９００ｍｌにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２．１ｇ、濃塩酸６．５ｍｌ、ＥＤＴＡ１．８６ｇ、テオフィリン（シグマケミカル社製）１．４４ｇ、及び２−メルカプトエタノール１ｍｌを加えた。得られた溶液を５分間撹拌しそして濃塩酸でｐＨを７．４に調節した。適切なｐＨにした後に、十分な脱イオン水を加え全容積を１リッターとした。
【００４２】
溶液Ｃ１：　リン酸ナトリウム２塩基７水和物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）２６．８ｇを１リッターの脱イオン水中に溶解させた。
溶液Ｃ２：　リン酸ナトリウム１塩基１水和物（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）１３．８ｇを１リッターの脱イオン水中に溶解させた。
【００４３】
溶液Ｄ：　脱イオン水約５００ｍｌに８１ｍｌの溶液Ｃ１と１９ｍｌの溶液Ｃ２を加えた。得られた溶液を５分間撹拌しそして十分な水を加え全容積を１リッターとした。添加終了後、もし必要ならｐＨを７．４に調節した。
【００４４】
溶液Ｅ：　８８０ｍｌの溶液Ｄに１２０ｍｌの５０％ポリエチレンイミン水溶液（シグマケミカル社製）を加えた。
【００４５】
溶液Ｆ１：　脱イオン水３．５リッターにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４８．４４ｇ及び濃塩酸２６ｍｌを加えた。得られた溶液を撹拌しそしてさらに塩酸をｐＨが７．４になるまで追加した。適切なｐＨにした後に、十分な脱イオン水を加え全容積を４リッターとした。
溶液Ｆ２：　１００ｍｌの溶液Ｆ１に９００ｍｌの脱イオン水を加えた。
【００４６】
溶液Ｇ：　約８００ｍｌの脱イオン水に１００ｍｌの溶液Ｆ１引き続き５０ｍｌの溶液Ｅを加えた。添加終了後、十分な脱イオン水を加え全容積を１０００ｍｌとした。
【００４７】
溶液Ｈ：　ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（シグマケミカル社製商標名トリトンＸ−１００、シグマウルトラ）１ｇを溶液Ｂに溶解させ全容積を１００ｍｌとなるようにした。
【００４８】
溶液Ｊ：　３−イソブチル−メチルキサンチン（シグマケミカル社製ＩＢＭＸ）１１１ｍｇをメタノール１０ｍｌ中に溶解させた。
【００４９】
溶液Ｋ：　フォルスコリン（シグマケミカル社製）４．１ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルスルフォキサイド（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製ＤＭＳＯ）１０ｍｌ中に溶解させた。
【００５０】
溶液Ｍ：　ｃＡＭＰ（シグマケミカル社製）１．２ｍｇをＤＭＳＯ１０ｍｌ中に溶解させた。
【００５１】
溶液Ｏ：　血清フリーＳｆ９媒体（Ｓｆ９００ＩＩＳＦＭ−ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　ライフサイエンステクノロジー社、グランドアイランド、ＮＹ）１０ｍｌを撹拌し、これに０．０２ｍｌの溶液Ｊ及び０．０１ｍｌの溶液Ｋを添加した。添加終了後、得られた溶液を均一になるまでゆっくりと混合した。
【００５２】
溶液Ｐ（結合性蛋白質溶液）：　１０００ｍｌのビーカーに解凍した牛の副腎腺（ペルフリーズバイオロジカルズ、ロジャーズ、ＡＫ製）５０ｇを加え、引き続き５００ｍｌの溶液Ａを加えた。得られた溶液を０から４℃で２分間で３０秒間隔でホモジナイザーにかけた。この後、この溶液をろ過し、そして高速ＲＣ５Ｂ／Ｃ遠心分離機（ソーバルニュートン社、ＣＴ製）で遠心ろ過した。得られた上澄みをマイクロクロスでろ過しそして後で使用するためにアリコートに入れレブコ冷凍庫（Ｒｅｖｃｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ、ＮＣ製）中−８０℃で貯蔵した。
【００５３】
溶液Ｑ：　１０ｍｌの溶液Ｐに１０ｍｌの溶液Ｂを添加した。
【００５４】
溶液Ｒ：　１０ｍｌの溶液Ｂに０．０２ｍｌの放射能標識化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート株溶液（アメルシャムファーマシアバイオテック社、ピスキャタウェイ、ＮＪ製［３Ｈ］ｃＡＭＰ株、カタログＮｏ．：ＴＲＫ５５９）を添加した。
【００５５】
溶液Ｓ：　（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（シグマケミカル社製ＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０）１ｇを約１００ｍｌの溶液Ｂに溶解させた。
【００５６】
実験日において、第一段階で使用するために４日間経時Ｓｆ９細胞（細胞密度約５，０００，０００から約６，０００，０００細胞）をバイオフュージ１５遠心分離機（ヘネアウスインスツルメンツ、ドイツ製）にかけた。この後、上澄み液を廃棄しそして十分なＳｆ９血清フリー媒体（Ｓｆ９００ＩＩＳＦＭ）を得られた細胞ペレットに加え最終濃度を２，０００，０００細胞／ｍｌとした。この細胞に０．０２ｍｌの溶液Ｊを添加した。添加終了後、得られた溶液をゆっくり混合しそしてそれから以下で使用するために室温で４０分間、培養した。
【００５７】
第一段階を実施する際に、９６個のウェルミクロ板の各ウェル（穴）に１００μｌの溶液Ｏを添加した。添加終了後、５μｌのＤＭＳＯを対照ウェルとして指定されたウェルに添加した；ＤＭＳＯ中でアミトラッツ（ケムサーブ社、ウエストチェスター、ＰＡ製）約０．００１２３ｍＭから約０．０３ｍＭの濃度範囲となるように種々の希釈５μｌを結合のために指定されたウェルに添加した；そして５μｌの溶液Ｍを非−特定結合のために指定されたウェルに添加した。それから、上記で調製したＳｆ９細胞溶液５０μｌを全てのウェルに添加した。ミクロ板を室温で４５分間培養した。その後、Ｓｆ９細胞を５０μｌの溶液Ｈを加えて溶解させた。ミクロ板を室温で１５から２０分間２度目の培養を行った。この後、２５μｌの溶液Ｒ引き続き２５μｌの溶液Ｑをミクロ板に添加した。ミクロ板を室温で１２５ｒｐｍで振りながら９０分間３度目の培養を行った。得られた混合物をガラス繊維ろ布（使用前に５００ｍｌの溶液Ｇに３０分間浸漬した）を通して減圧下でろ過した。このろ布を１０秒間で氷冷溶液Ｆで洗浄しそれからスタビル−サーモ乾燥器（ブルーＭエレクトリック社、ブルーアイランド、ＩＬ製）中で６０℃で４５から６０分間乾燥した。この後、ろ布に付着した放射能標識化シクロアデノシン３’，５’−モノホスフェート／結合性蛋白質錯体の量を前述の定量法によって決定した。結果を表１に示す。
【００５８】
実施例２
この実施例は溶解剤としてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを使用するシネフェリンから生成したｃＡＭＰの定量を説明する。
この方法は、アミトラッツの代わりにシネフェリンを使用しシネフェリンの希釈濃度が０．００１２３ｍＭから０．３ｍＭの代わりに０．００３６９ｍＭから１．０ｍＭの範囲であることを除き実施例１に開示した方法で実施した。結果を表１に示す。
【００５９】
実施例３
この実施例は溶解剤としてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを使用するＤＬ−オクトパミンから生成したｃＡＭＰの定量を説明する。
この方法は、アミトラッツの代わりにＤＬ−オクトパミンを使用しＤＬ−オクトパミンの希釈濃度が約０．００１２３ｍＭから約０．３ｍＭの代わりに約０．０１２３ｍＭから約３．０ｍＭの範囲であることを除き実施例１に開示した方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６０】
実施例４
この実施例は溶解剤としてｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを使用するジメチルクロロジメフォルム（ＤＣＤＭ）から生成したｃＡＭＰの定量を説明する。
この方法は、アミトラッツの代わりにＤＣＤＭを使用しＤＣＤＭの希釈濃度が約０．００１２３ｍＭから約０．３ｍＭの代わりに約０．０００１２３ｍＭから約０．０３ｍＭの範囲であることを除き実施例１に開示した方法で実施した。結果を表１に示す。
【００６１】
実施例５
この実施例は溶解剤として（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノールを使用するジメチルクロロジメフォルム（ＤＣＤＭ）から生成したｃＡＭＰの定量を説明する。
【００６２】
実験が行われた同じ日に、溶液Ａ−Ｓを再度上記の方法で調製した。
実験日において、第一段階で使用するための４日間経時Ｓｆ９細胞（細胞密度約５，０００，０００から約６，０００，０００細胞）をバイオフュージ１５遠心分離機に１３１０ｒｐｍ（５００Ｇ）で５分間かけた。この後、上澄み液を廃棄しそして十分なＳｆ９血清フリー媒体（Ｓｆ９００ＩＩＳＦＭ）を得られた細胞ペレットに加え最終濃度を２，０００，０００細胞／ｍｌとした。この細胞に０．０２ｍｌの溶液Ｊを添加した。添加終了後、得られた溶液をゆっくり混合しそしてそれから室温で４０分間、以下で使用するために培養した。
【００６３】
この実施例の第一段階を実施する際に、９６個のウェルミクロ板の各ウェル（穴）に１００μｌの溶液Ｏを添加した。添加終了後、５μｌのＤＭＳＯを対照ウェルとして指定されたウェルに添加した；メタノール中でＤＣＤＭ約０．０００１２３ｍＭから約０．０３ｍＭの濃度範囲となるように種々の希釈５μｌを結合のために指定されたウェルに添加した；そして５μｌの溶液Ｍを非−特定結合のために指定されたウェルに添加した。それから、上記で調製したＳｆ９細胞溶液５０μｌを全てのウェルに添加した。ミクロ板を室温で４５分間培養した。その後、Ｓｆ９細胞を５０μｌの溶液Ｈを加えて溶解させた。ミクロ板を室温で１５から２０分間２度目の培養を行った。この後、２５μｌの溶液Ｒ引き続き２５μｌの溶液Ｑをミクロ板に添加した。ミクロ板を室温で１２５ｒｐｍで振りながら９０分間３度目の培養を行った。得られた混合物をガラス繊維ろ布（使用前に５００ｍｌの溶液Ｇに３０分間浸漬した）を通して減圧下でろ過した。このろ布を１０秒間で氷冷溶液Ｆで洗浄しそれからスタビル−サーモ乾燥器中で６０℃で４５から６０分間乾燥した。
【００６４】
表１の結果が示すように、本発明は試験化合物の全てがたとえ濃度レベルが低くても（実施例を参照すれば、例えば、ＤＣＤＭは０．０００００４１ミリモル（ｍＭ）濃度レベルでも１１．７％の阻止率をもつ）放射能標識化ｃＡＭＰが利用可能な細胞受容体と結合するのを阻止するのに十分なｃＡＭＰを生成し、一方対照物はｃＡＭＰをまったく生成しないことを確定した。このように、本発明は上記のように存在するヌクレオチドレベルが高ければ化合物はより高い生体活性をもつがゆえに、期待される生体活性剤が生体活性を示すかどうかを予測するのに用いることができる。
【００６５】
本発明は好ましい態様について強調して説明してきたが、好ましい機器や方法における変更を行ってもよいことそして本発明はここで特徴的に記載した以外の方法で実施してもよいことは熟練した当業者にとっては明白なことである。従って、本発明は、特許請求の範囲に規定された本発明の精神と範囲内で取り込まれる全ての変更を包含する。
【００６６】
本発明は試験媒体中で生成するヌクレオチドの増加を測定する改良法並びに生体活性を決定する改良法について記載する。該方法は従来技術で開示された方法の改良法であり、安価でより経済効果がありそして従来技術で開示された方法の感度と同等である単一容器で、且つ高処理量の方法である。
【００６７】
【表１】
2004513630.tif 000002
【００６８】
【表２】
2004513630.tif 000003
【００６９】
注：
１ ＤＭＳＯ対照
２ 客観的な又は放射能標識化していないｃＡＭＰ
３ 特定カウント数＝化合物で決定された全カウント数（ｄｐｍ）−非特定で決定された全カウント数（ｄｐｍ）
例えば、ＤＬ−オクトパミン０．１ｍＭ溶液の特定カウント数は２２２４．７−９５６．８＝１２６７．９となる。
４ 阻止率％は放射能標識化ｃＡＭＰが利用可能な細胞受容体と結合するのを阻止するための生成した又は標識化していないｃＡＭＰの能力、即ち利用できる細胞受容体と結合した生成ｃＡＭＰの量の割合を意味し、以下のように計算される：
阻止率％＝［１−（化合物の特定カウント数（ｄｐｍ）÷対照の特定カウント数（ｄｐｍ））］ｘ１００
例えば、ＤＬ−オクトパミンの０．１ｍＭ溶液の阻止率％は［１−（１２６７．９／６３８３．４）］ｘ１００＝８０．１％となる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明の改良方法により、生成するヌクレオチド量の増加を単一容器で、高処理量で測定することができ、また生体活性をもつ化合物を複雑ではなく、より経済的に、また従来技術で開示されたものと同等の感度で同定することができる。
【国際公開パンフレット】
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2004513630.tif 000005
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2004513630.tif 000028
2004513630.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513630.tif 000030
【国際調査報告】
2004513630.tif 000031
2004513630.tif 000032