(57)【要約】【課題】癌疾患及び炎症性腸疾患の潜在的危険性を予測する方法及びその方法による試験【解決手段】癌疾患及び炎症性腸疾患の潜在的危険性を予測する方法及び／又はそれを診断する方法において、ＤＮＡ試料を多型ＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子の存在に関して試験する。突然変異が陽性であることは、癌疾患に対する感受性が陽性であることの指標と見なされる。同様に炎症性腸疾患に対する感受性の予測も行うことができる。この方法の場合に、ＤＮＡ試料によりエキソン１をＰＣＲ増幅し、続いて配列を分析し、決定した配列を野生型の配列及び多型対立遺伝子の配列と比較する。突然変異の存在又は不在は自動化蛍光色素配列決定法を用いた該当するｃＤＮＡの配列決定により検査される。組み換えＵＧＴ１Ａ７酵素は治療の目的でも使用される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査すべき人物のＤＮＡ試料を、コドン１１、１２９、１３１及び／又は２０８に突然変異を有する多型のＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子の存在に関して試験することを特徴とする、１種及び／又は複数種の癌疾患又は炎症性腸疾患を遺伝的素因によって診断し、それらの潜在的危険性を予測する方法。
【請求項２】
コドン１１及び２０８の突然変異が陽性であることを、癌疾患、特に、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、及び食道癌の感受性が陽性である指標として評価することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
陽性と評価された突然変異が、Ｗ２０８Ｒの置換、及びコドン１１のＣＣＣからＣＣＡへのサイレント突然変異であることを検査することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
コドン１１、１２９、１３１及び２０８の突然変異が陽性であることを、炎症性腸疾患及び癌疾患の感受性が陽性である指標として評価することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
陽性と評価された突然変異がＮ１２９Ｋ、Ｒ１３１Ｋ及び２０８Ｒ、並びにコドン１１のＣＣＣからＣＣＡへのサイレント突然変異であることを検査することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ゲノムＤＮＡ、好ましくはリンパ球のゲノムＤＮＡを試料として使用することを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
血液試料からゲノムデオキシリボ核酸を、カラムクロマトグラフィー法及び化学的分離法を用いて単離することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ試料を用いてＵＧＴ１Ａ７（約８５５塩基対）のエキソン１をＰＣＲによって増幅し、続いて配列分析を行い、決定された配列をＵＧＴ１Ａ７の野生型対立遺伝子及び多型対立遺伝子と比較することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ試料に対して、コドン１１、１２９／１３１又は２０８の周囲の該突然変異したＤＮＡ領域の上流の１部及び下流の１部と結合する特異的なプライマーペアを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応で、野生型対立遺伝子又は多型対立遺伝子の相当するフラグメントと同等のｃＤＮＡフラグメントを作成し、コドン１１、１２９、１３１及び／又は２０８における突然変異の存在を、配列決定技術及び／又はハイブリダイゼーション技術によって検出することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーペアは、コドン１１、コドン１２９／１３１並びにコドン２０８の上流及び下流のそれぞれ約５０個の塩基対と結合し、それにより約１００〜１５０個の塩基対のサイズのｃＤＮＡフラグメントが形成されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
野生型対立遺伝子にそれぞれ相応するｃＤＮＡフラグメントを用いた一本鎖コンフォメーション多型性分析（ＳＳＣＰ）により、該コドンの突然変異の存在を検出し、その際、野生型対立遺伝子と多型対立遺伝子とを、好ましくはゲル電気泳動により、さらに好ましくは温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）により識別することを特徴とする、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
自動化蛍光色素配列決定法を用い、突然変異の存在又は不在を、該ｃＤＮＡの配列を決定することによって検査することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
多型の塩基置換の３′末端と結合するプライマー配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって多型の存在を検出することを特徴とする、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
野生型配列又は多型配列と相補的なオリゴヌクレオチド、及び対応する対応プライマー（アンチセンスプライマー）を用いてＰＣＲ技術によって突然変異の存在を検出することを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
定量的Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲを使用することを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
蛍光色素又は酵素マーカーを有するＰＣＲ接合体を検出することを特徴とする、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
固定キャリア上に、結果を読み取るために準備された配置又は順序で並んだ請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法に必要な遺伝子検出試薬、即ち、必要なプライマー又はｃＤＮＡ、を有する試験装置において、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法により準備され且つ付加的に標識化された、検査すべき個体の１つ又は複数のＤＮＡ試料を試験装置と接触させて検出試薬の１つと結合させ、この位置についてマーカーを用いて検出する試験装置。
【請求項１８】
蛍光色素又は放射性同位体によって標識化することを特徴とする、請求項１７記載の試験装置。
【請求項１９】
複数のＵＧＴ１Ａ７多型のコンビネーション分析用の検出試薬が一緒に試験装置に固定されていることを特徴とする、請求項１７又は１８記載の試験装置。
【請求項２０】
結果を読み取るための固定キャリア上に、検出試薬の分類のための表示又は印字が設けられていることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の試験装置。
【請求項２１】
コードされた多型ＵＧＴイソ型の製造のための、多型ＵＧＴ１Ａ７＊２遺伝子、ＵＧＴ１Ａ７＊３遺伝子、及びＵＧＴ１Ａ７＊４遺伝子の使用。
【請求項２２】
腫瘍治療薬の代謝の特性決定のため並びに潜在的ＵＧＴ１Ａ７基質の毒性及び／又は発癌性の検査のための請求項２１記載のＵＧＴイソ型の使用。
【請求項２３】
ＵＧＴ１Ａ多型、特にＵＧＴ１Ａ７＊２又はＵＧＴ１Ａ７＊４のタイプの多型の場合に、治療用遺伝子治療薬の製造のためのＵＧＴ１Ａ野生型遺伝子又はその遺伝子フラグメントの使用。
【請求項２４】
治療目的のための組み換えＵＧＴ１Ａ７酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌疾患及び炎症性腸疾患の潜在的危険性を予測する方法及びその疾患を診断する方法に関する。第一に、本発明は結腸直腸癌の潜在的危険性を評価するための方法に関する。さらに、本発明は検査すべき個体のＤＮＡ試料を診断するための試験、並びに、薬剤、特に腫瘍治療剤の代謝特性を決定するためのＵＧＴ１Ａ７遺伝子の新規の多型の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、癌に対する危険性は遺伝的素因及び発癌性物質にさらされることを含む環境の影響により決定されると考えられている。
【０００３】
従って、発癌性物質代謝酵素の遺伝的多型性と発癌との間に関係があることがすでに予想されていた。しかしながら、代謝は解毒作用とは同一視されないために、統計的に確認された具体的な関係を見出すことは困難である。従って、癌の危険性を予測するためには、一般に、遺伝的変異を確認することでは不十分であり、この変異が代謝に明らかに不利な結果を引き起こすことを確認する必要がある。
【０００４】
このような関係を探し出す際の他の問題は、ヒトの代謝が極めて複雑であり、莫大な量の物質、中でも代謝産物、タンパク質及びさらには酵素が癌の危険性に対するマーカーとして挙げられることにある。これは、主要国で最も頻発する癌腫である結腸又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）にも当てはまる。ヒトの腸は大きな器官であり、これは多様な身体プロセスによって、また栄養によって影響を受ける。従って、一般に遺伝的素因による明瞭な危険性評価が可能であるかどうかは明確ではない。
【０００５】
腸内での代謝には多種の酵素が関与しており、この中には外来物質を代謝する酵素がある。
ヒトのウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−５′−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）は、多様な物質のグルクロニド化を行う大きな酵素クラスである。このスーパーファミリーの中で、特別な課題を有する３つのファミリーのＵＧＴ１、ＵＧＴ２及びＵＧＴ８が同定されている。ＵＧＴ１ファミリーの酵素の中だけでも、多様なイソ型が識別されている。肝臓中では、最近の１０年間に５種のファミリー、１ＡＵＧＴイソ型（ＵＧＴ１Ａ１、１Ａ３、１Ａ４、１Ａ６及び１Ａ９）が発見されてクローニングされ、その中のビリルビン−ＵＧＴイソ型がＵＧＴ１Ａ１である。胆管（ＵＧＴ１Ａ１０）、胃（ＵＧＴ１Ａ７）及び結腸（ＵＧＴ１Ａ８）から、３種の肝臓外ＵＧＴ１Ａ遺伝子産物を単離することができた。
【０００６】
ヒトＵＧＴ１Ａ７遺伝子によりコードされるタンパク質は、グルクロニド化により人体の多数の内因性及び外因性化合物（生体異物、即ち、工業的起源の難分解性化合物）の解毒に用いられる。これは、ヒトのいわゆるフェーズ２−代謝、たとえばアセチル化、硫酸化及びグルクロニド化におけるタンパク質である。１９９６年に初めて、転写物として記載されたＵＧＴ１Ａ７が、発癌物質と見なされている多環式炭化水素及び複素環式アミンを解毒することが証明された。
【０００７】
ＷＯ  ００／０６７７６では、ＵＧＴ２Ｂ活性を変更するヒトのＵＧＴＢ４遺伝子、ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子及びＵＧＴ２Ｂ１５遺伝子の遺伝的多型の同定を開示している。ＵＧＴ２酵素は、特にステロイド代謝に関与している。多型ＵＧＴ２配列を含む核酸を用いて、患者のＵＧＴ２Ｂ基質に対する代謝、考えられる作用物質と作用物質の相互作用、及び不利な作用物質／副作用の変化、並びに環境的被毒又は職業的被毒に起因する疾患が試験された。この核酸を用いて、作用物質代謝に関する動物モデル、細胞モデル及びインビトロモデルが確立された。
【０００８】
ＷＯ  ９９／５７３２２では、ヒトのＵＧＴ１遺伝子における遺伝的多型が同定された。この多型は、ＵＧＴ１依存性の作用物質代謝を変化させる。この場合も、多型配列はＵＧ１Ｂ基質に対する代謝、考えられる作用物質と作用物質の相互作用、及び不利な作用物質／副作用の変化、並びに環境的被毒又は職業的被毒に起因する疾患が試験された。この核酸を用いて、同様に作用物質代謝に関する動物モデル、細胞モデル及びインビトロモデルが確立された。
【０００９】
さらに、ヒトのＵＧＴ１Ａ７遺伝子の遺伝的変異と機能的変異の因果関係は、Ｃ．  Ｇｕｉｌｌｅｍｅｔｔｅ，  Ｊ．  Ｋ．  Ｒｉｔｔｅｒ，  Ｄ．  Ｊ．  Ａｕｙｅｕｎｇ，  Ｆ．  Ｋ．  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｈｏｕｓｍａｎ著、“Ｓｔｒｕｋｔｕｒａｌ  ｈｅｔｒｅｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １  ｌｏｃｕｓ  ：  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＵＧＴ１Ａ７  ｇｅｎｅ”，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２０００，  １０  ：  ６２９−６４４に既に記載されている。この場合に、肺における発癌性生成物の解毒及び排泄の際にＵＧＴ１Ａ７の考えられ得る役割も議論されている。ＵＧＴ１Ａ７は肺において試験されているが、ヒトの大腸においては試験されていない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の課題は、発癌の危険性、特に結腸癌（結腸直腸癌、ＣＲＣ）の危険性と遺伝的素因との間の具体的な関係を見出し、且つこの素因の検出のための試験を提供することである。
【００１１】
これは、ＵＧＴ１Ａ７＊２、ＵＧＴ１Ａ７＊３、及びＵＧＴ１Ａ７＊４と表され、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の発生、さらには特定の炎症性腸疾患（ＩＢＤ、ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；  クローン病）の発生と統計的に驚くべき関連性を有し、また、膵臓癌、肝臓癌、胃癌及び食道癌と関連している可能性がある、新規の多型ＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子を見出すことにより達成される。この結果は、ＵＧＴ１Ａ７が大腸中で、つまり疾患領域内では発現されない点で意外である。遺伝的素因が該当器官内での発現に依存するのではなく、空間的に離れても可能であることは、今までの試験では発見されていないことであり、驚くべきことであった。このことから、遺伝的変異が広範囲な効果を有し、器官に特異的な効果だけを有するのではないことが判明した。これは本願明細書において初めて指摘されるものである。
【００１２】
遺伝的多型とは、生殖系列における突然変異であり、腫瘍の体細胞における突然変異ではない。基本的な分析は、腫瘍（ＣＲＣ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者とこれらの疾患のない対照者のリンパ球からゲノムＤＮＡを採取して行う。全部で１１１人の個体の分析により、個々のコドンに関する多型が相互に独立して生じるのではなく、組合わさって遺伝的に伝達されるという結果が得られた。
【００１３】
ＵＧＴ１Ａ７＊２は、ポジション３でＣがＡに置換されている（ＣＣＣがＣＣＡになっている）コドン１１のサイレント突然変異を特徴とする。この突然変異は小胞体のシグナルペプチドドメイン内に含まれる。これと関連しているのは、コドン２０８の第２の突然変異、即ち、Ｗ２０８ＲのＴからＣへの置換であり、この突然変異は、芳香族トリプトファンの正に帯電したアルギニン基への非保存的置換を引き起こす。コドン２０８のこの多型は、ＵＧＴ１Ａ７−１０の第１のエキソン中だけでなく、ＵＧＴ１Ａ７ファミリーのすべてのメンバーにおいて保存されている配列範囲に含まれる。アミノ酸２０６と２０９との間にＲＶ−Ｎ−配列モチーフが存在することは、全てのＵＧＴ１Ａ−タンパク質と共通である。ＵＧＴ１Ａ７におけるこのＷ２０８Ｒの置換は、ＵＧＴ１Ａ８及びＵＧＴ１Ａ９の野生型配列を表す。本出願人の調査は、コドン１１及びコドン２０８での多型が個別に生じるのではないことを示した（１１１人の個体に関する試験において）。ヘテロ接合した個体の２つのポジションでの特性決定から、及び、コドン１１又はコドン２０８が個々にホモ接合した形が見られないという事実から、ＵＧＴ１Ａ７＊２における２つの交換が存在することが容易に推測できる。
【００１４】
ＵＧＴ１Ａ７＊３は２つの突然変異を含む。第１の突然変異はコドン１２９におけるＴからＧへの置換であり、これはアスパラギンからリシンへの保存的なコドン置換である（Ｎ１２９Ｋ）。第２の突然変異は、コドン１３１におけるポジション１のＣからＡへの置換、及びポジション２のＧからＡへの置換の２箇所であり、これはアルギニンからリシンへの置換が生じる（Ｒ１３１Ｋ）。この多型は、同様にＵＧＴタンパク質の著しく保存性の高い配列に影響を及ぼす。全てのＵＧＴ１Ａ７タンパク質中に存在するロイシン−１２７に後続して、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４及びＵＧＴ１Ａ５中のＬＨＮ−Ｌ−モチーフ（アミノ酸１２８〜１３３）が保存されている。アミノ酸ポジション１２８〜１３４で、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９及びＵＧＴ１Ａ１０中のＦ−Ｄ−ＫＬＶ−アミノ酸モチーフが保存されている。Ｎ１２９Ｋ多型及びＲ１３１Ｋ多型の分析は、これらの置換が相互に無関係に起こってはいないことを示した。ホモ接合したＵＧＴ１Ａ７＊３−対立遺伝子を同定することができ、これはＮ１２９Ｋ／Ｒ１３１Ｋ−突然変異が個々の対立遺伝子上で同定することができ、ＵＧＴ１Ａ７＊２とは無関係に生じることが示された。ＵＧＴ１Ａ７のＮ１２９／Ｒ１３１Ｋ−多型は、ＵＧＴ１Ａ９のこのコドンの野生型配列に一致し、このことからさらに、３塩基対−突然変異がハプロタイプとして遺伝的に伝えられていることが容易に推測される。
【００１５】
第３の対立遺伝子のＵＧＴ１Ａ７＊４は、ＵＧＴ１Ａ７＊２及びＵＧＴ１Ａ７＊３において観察された全ての変異型と結びつく。コドン１１、１２９、１３１及び２０８のホモ接合した突然変異を有する個体が確認され、これは全ての４種の多型が唯一の対立遺伝子上に存在することを示している。コドン１１、１２９、１３１又は２０８での多型は個別にヘテロ接合又はホモ接合を生じることは注目すべきである。この観察は、上記したように、コドン１１及び２０８の多型及びコドン１２９の多型がコドン１３１と共にハプロタイプとして遺伝的に伝えられるという想定を支持している。
【００１６】
この結果に基づいて、前記の課題は本発明において、検査すべき人物のＤＮＡ試料を、コドン１１、１２９、１３１及び／又は２０８に突然変異を有する多型のＵＧＴ１Ａ／−対立遺伝子が存在するかどうかによって試験する、癌疾患又は炎症性腸疾患の潜在的危険性を予測する方法及び／又は癌疾患又は炎症性腸疾患を診断する方法により解決される。
【００１７】
この場合に、特にコドン１１及びコドン２０８の突然変異が陽性であることを、癌疾患、特に結腸直腸癌又は結腸癌（ＣＲＣ）に対する感受性が陽性である指標として評価する。このための試験方法を次に記載する。本発明の実施態様の場合には、さらに、陽性と評価された突然変異が、Ｗ２０８Ｒの置換、及びコドン１１のＣＣＣからＣＣＡへのサイレント突然変異であることを検査する。
【００１８】
さらに、本発明において、４つのコドン１１、１２９／１３１及び２０８の全ての突然変異が陽性であることを、炎症性腸疾患、つまり特に“ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｌ  ｄｉｓｅａｓｅ”（ＩＢＤ）及び潰瘍性大腸炎の概念に含まれる疾患、及び癌疾患、特にＣＲＣに対する感受性の指標として評価する。これに基づく試験で、陽性として評価された突然変異がＮ１２９Ｋ、Ｒ１３１Ｋ及びＷ２０８Ｒ並びにコドン１１のＣＣＣからＣＣＡへのサイレント突然変異であることを検査することもできる。
【００１９】
ＵＧＴ１Ａ７多型と、結腸直腸癌および結腸発癌物質の危険因子を形成する炎症性腸疾患との関連性が確認されたことから、腫瘍疾患に対する潜在的危険性を同定するために前記マーカーを使用することが可能である。この場合に、多型を検出することができる解毒酵素はヒトの器官内で広範囲な機能を担っているため、ここに示された結腸直腸癌の他に、胃腸管、呼吸器官系、造血及び生殖器及び生殖腺の癌疾患にもおそらく関連がある。
【００２０】
本発明の利点は、患者を早期に、相応するハイリスクグループに分類して予防治療を実施することができ、これが早期発見の改善につながる点にある。
【００２１】
本発明の他の利点はこの方法が診断のためにも適用できることである。診断を改善することによって、患者の状態に関してより迅速且つ明確な診断を得ることができ、目標を定めて治療することができる。早期発見及び早期治療は、癌疾患の場合に特に重要となる。ＣＲＣは早期に発見された場合には、たいていが回避可能であるか、治癒可能である。
【００２２】
検査には、リンパ球のゲノムＤＮＡを使用するのが好ましい。このゲノムＤＮＡは発端者の血液試料からカラムクロマトグラフィー法及び化学的処理により単離することができる。検査すべき人物の遺伝的素因を表現するこのゲノムＤＮＡは、他の全ての遺伝子試験ストラテジーの基礎をなしている。
【００２３】
一般的には、得られた患者のＤＮＡを最初にポリメラーゼ連鎖反応で増幅する。
本発明の第１の実施態様の場合には、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子（約８５５塩基対）の全体のエキソン１をＰＣＲによって増幅することができ、これに続いて配列分析を行う。決定された配列を適切な方法で評価する。即ち、野生型配列及びこの方法にとって適切なＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子のＵＧＴ１Ａ７＊２、ＵＧＴ１Ａ７＊３及びＵＧＴ１Ａ７＊４の配列と比較することができる。
【００２４】
他の実施態様の場合には、検査する突然変異に関する情報を提供するｃＤＮＡフラグメントだけを増幅する。従って、ＤＮＡ試料を、コドン１１、１２９／１３１又は２０８の周囲の該当する突然変異したＤＮＡ領域の上流の１つ及び下流の１つとそれぞれ結合する特異的なプライマーペアで処理し、ポリメラーゼ連鎖反応で、野生型対立遺伝子又は多型対立遺伝子の相当するフラグメントと同等のｃＤＮＡフラグメントを作成し、コドン１１、１２９、１３１及び／又は２０８の突然変異の存在を配列決定技術及び／又はハイブリダイゼーション技術で検出するのが好適である。
【００２５】
コドン１１、コドン１２９／１３１並びにコドン２０８の上流及び下流のそれぞれ約５０塩基対と結合するプライマーペアを使用するのが好ましく、それにより、約１００〜１５０塩基対のサイズのｃＤＮＡ断片が得られる。
【００２６】
多型の検出は、配列決定法及び／又はハイブリダイゼーション法を用いて多様な方法で行うことができる。この場合に、当業者が公知の方法の中から適切に選択することは基本的に自由である。
【００２７】
特に、検査する多型は、先行するＰＣＲで得られた患者のｃＤＮＡフラグメントと野生型対立遺伝子の、それぞれ相応するｃＤＮＡフラグメントとから二本鎖を得る完全な再結合を検出することによる一本鎖コンフォメーション多型分析（ＳＳＣＰ）により検査することができる。この基本原理は、変異したＤＮＡ配列は野生型配列と完全に一致する二本鎖を形成することができないという事実に基づいている。これは、スクリーニング検査においてゲル電気泳動によって判明し、突然変異の存在を示す。この方法を改良し、多型のｃＤＮＡフラグメントの検出を温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）によって行うことができる。
【００２８】
また、突然変異の存在又は不在は、自動化蛍光色素配列決定法によって該当するｃＤＮＡの配列を決定することにより検査することが好ましい。
【００２９】
他の検出方法は、純粋なＰＣＲをベースとするストラテジー（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、増幅耐性突然変異システム）において、多型の塩基置換の３′末端で結合する特異的なプライマー配列によって多型の存在を検出する方法である。同時に、この方法はヘテロ接合及びホモ接合したキャリアを区別するように変更することができる。自動化可能な試験キットシステムとしてのこの方法の実施例は、後に実施例として記載する。プライマーとして、一方は野生型配列、他方は多型配列と結合するオリゴヌクレオチド、並びに対応する対応プライマー（アンチセンスプライマー）を使用する。これにより、プライマーにコードされた野生型又は多型の対立遺伝子が存在する場合にのみ、ＰＣＲ産物が生じる。対照として、所定の多型を有する所定のｃＤＮＡを使用する。この方法は、たとえば定量的Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲの使用下で自動化することが可能である。
【００３０】
このＰＣＲ接合体は通常のように蛍光色素又は酵素マーカーで検出することができる。当業者は適当な方法を選択することができ、これについては特に記載する必要はない。
【００３１】
本発明はさらに、本発明による方法を実施するための試験キットもしくは試験装置も提供するものである。
【００３２】
本発明の試験装置は、基本的に、少なくともこの方法に必要な遺伝子検出試薬、即ち、必要なプライマー又はｃＤＮＡを、固定キャリア上で、この結果を読みとるために準備された配置又は順序で並んで有しており、この場合に、検査すべき個体の、準備され且つ付加的に標識されたＤＮＡ試料をテスト装置と接触させて検出試薬の１つと結合させ、この位置についてマーカーを検出するようになされている。この場合に、発端者ＤＮＡの標識は蛍光色素又は放射性同位体で行うことができる。
【００３３】
数種のＵＧＴ１Ａ７多型を組み合わせて分析（この分析はいずれにせよ有利である）するために、このために必要な検出試薬、即ち、たとえば異なるコドン１１、１２９／１３１及び２０８に対するプライマー又は野生型対立遺伝子及びＵＧＴ１Ａ７＊２／３／４−対立遺伝子のＤＮＡフラグメントを、選択されたストラテジーに応じて、試験装置上に、たとえば遺伝子チップ上に一緒に固定することができる。
【００３４】
この結果の読みとりを容易にするために、固定キャリア上に、検出試薬の分類のための表示又は印字が設けられているのが好ましい。
【００３５】
全てのＵＧＴ１Ａ７多型を組み合わせた分析は、遺伝子チップ技術を利用して行うことができる。この場合、例えば固定相中に多型および野生型のオリゴヌクレオチド配列を固定することができる。発端者ＤＮＡから対応するオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅し、蛍光色素、放射性同位体又は他の接合体により標識する。続いてハイブリダイゼーション反応により、遺伝子アレイ上で対応するオリゴヌクレオチドを同定し、多型の存在を決定する。アレイをベースとする試験ストラテジーは、多様な実施が可能であり、当業者はこの方法に適合させることができる。
【００３６】
本発明の他の態様の場合には、多型のＵＧＴ１Ａ７＊２遺伝子、ＵＧＴ１Ａ７＊３遺伝子及びＵＧＴ１Ａ７＊４遺伝子をそれらが属するＵＧＴイソ型の製造のために使用することができる。この同定された多型は組み換えタンパク質として発現し、たとえば腫瘍の治療の代謝による特性決定のために使用でき、この物質の代謝の予想を可能にする。同様に、ＵＧＴ１Ａ７の全ての多型は、潜在的な変異原物質又は発癌物質の毒性又は発癌性能力に関する予想を行う目的で、これらの物質の代謝を調査するために用いることができる。このために、異種発現系中で、バクテリア中で、真核細胞培地中で及び多型の対立遺伝子の発現及び引き続くその使用が、接触分析用の酵素調製物として用いられる。一連の異なる多型タンパク質を含んだ試験キットは、この場合に簡単なインビトロ分析を可能にする。
【００３７】
結腸癌及び炎症性腸疾患のための感受性マーカーの同定を、原則として遺伝子治療ストラテジーのために使用することも可能である。基本的な遺伝子治療による使用の可能性は、今日では当業者に既に公知であるため、多様な変法が開示されている。腫瘍治療においてＵＧＴ１Ａ７単独での使用又はこの酵素ファミリーの他の同種のメンバーと組み合わせた使用は、特定の遺伝子会合の使用である。
【００３８】
従って、本発明は、タイプＵＧＴ１Ａ７＊２、ＵＧＴ１Ａ７＊３及びＵＧＴ１Ａ７＊４のＵＧＴ１Ａ７多型の場合に治療を行うための遺伝子治療薬を製造するための、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子又はＵＧＴ１Ａ７遺伝子フラグメントの使用でもある。
【００３９】
従って、本発明の実施態様の場合には、腫瘍治療において又は潜在的危険性のある場合での腫瘍予防において、ＵＧＴ１Ａファミリーの遺伝子の組み換えタンパク質の経口又は腸管外使用が考えられる。ＵＧＴ１Ａ７  ｃＤＮＡ又は同族のＵＧＴ１Ａ７  ｃＤＮＡをヒト細胞及び腫瘍細胞に送達するために、ベクターを使用することができ、このベクターは当業者にとって基本的に公知であり、このベクターはその専門知識を用いて選択することができる。これは胚組織又は胎児組織を含めた目的組織内でタンパク質を発現させ、この組織で前駆細胞を変更するための遺伝子治療によるＵＧＴ１Ａ７医薬を使用することができる。
【００４０】
ＵＧＴ１Ａ−ｃＤＮＡの送達は、たとえば器官特異性のプロモータを備えた腸管外ベクターにより、ＵＧＴ１Ａ  ｃＤＮＡの筋肉内注射により、又はリポソームでパッケージングしたｃＤＮＡを消化管を介して行うことができる。当業者は、専門知識の範囲内で適当なデリバリーシステムを選択することができる。
【００４１】
次に、実施例及び図面を用いて本発明を詳細に説明する。
【００４２】
【実施例】
実施例１  試験例
一方が野生型配列、他方が多型配列と結合するオリゴヌクレオチド（プライマー）、並びに対応する対応プライマー（アンチセンスプライマー）を使用する。これにより、プライマーにコードされた野生型又は多型の対立遺伝子が存在する場合にのみ、ＰＣＲ産物が生じる。この原理を図１に示す。対照として、所定の多型を有する所定のｃＤＮＡを使用する。
【００４３】
使用したプライマーを表１に示す。
【００４４】
【表１】
2004533808.tif 000003
このプライマーを自動化された定量的ＰＣＲで使用する場合に、蛍光色素、酵素マーカー又はＤＮＡ用の他の標識システムとの接合体を製造し、この診断のために利用する。この標識手段は一般に公知であり、ここでは特に記載しない。
【００４５】
この試験システムを用いて、ホモ接合およびヘテロ接合の突然変異の存在を特異的に検出した結果が得られた。この結果を表２に示した。
【００４６】
【表２】
2004533808.tif 000004
ＵＧＴ１Ａ７＊２対立遺伝子（コドン１１及び２０８）並びにＵＧＴ１Ａ７＊４対立遺伝子（コドン１１、１２９、１３１、２０８）の存在は結腸直腸癌と関連しており、ＵＧＴ１Ａ７＊４対立遺伝子の存在は炎症性腸疾患と関連しているため、３つの全ての多型遺伝子の位置１１、１２９／１３１及び２０８について、この分析を使用することは、極めて重要である。従って、この遺伝子分析は、試験キットを用いて同定された位置に関する分析と組み合わせられることが好ましい。
【００４７】
１１１人の発端者に関する一連の試験：
１９９９年にハノーバー医科大学の胃腸学及び肝臓学の機関において１１１人の患者から試料を集めた。
【００４８】
調査したグループは次のとおりである。
【００４９】
ａ）対照グループ（ｎ＝５４、４４．３２±１５．６５才、男性３１人／女性２３人）を、腹部超音波及び内視鏡（上部又は下部）により除外して前記の癌疾患に関する所見を有していない患者として定義した。
【００５０】
ｂ）結腸直腸癌患者（ｎ＝２６、６２．１５±１１．６５才、男性１５人／女性１１人）は、アムステルダムＩＩ−基準に従って除外することにより確認された結腸直腸癌を患っている。
【００５１】
ｃ）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（ｎ＝３１、３６．７４±１１．７９才、男性１４人／女性１６人）の例は、潰瘍性大腸炎（ｎ＝１４、３５．０７±１３．８６才、男性９人／女性５人）及びクローン病（ｎ＝１７、３８．１２±１０．００才、男性５人／女性１２人）を有する。潰瘍性大腸炎及びクローン病の診断は上部及び下部の内視鏡の診断に基づき、かつ腸管バイオプシーにより組織学的に確認した。
【００５２】
ゲノムＤＮＡ：
ゲノムＤＮＡは製造元の推奨法によりＱｕｉａＡｍｐ  （Ｒ）システムを用いて完全血試料から調製した（Ｑｕｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）。濃度データをスペクトル分析により２６０及び２８０ｎｍで測定し、この試料をＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＭ中、４℃で次の試験まで貯蔵した。
【００５３】
ＵＧＴ１Ａ７エキソン１配列の分析：
ＵＧＴ１Ａ７エキソン１の配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。フォワードプライマーは、ＵＧＴ１Ａ７（５′−ｇｃｇｇｃｔｃｇａｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｔａｔｔａｔａｇｇａｇｃｔ−３′）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ３９５７０）のＡＴＧ開始コドンの上流の塩基対６１〜３８を用いた。対応するプライマーは、ＵＧＴ１Ａ７エキソン１の配列（５′−ｇｃｇｇａｔａｔｃｃａｔａｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇａｔｇａｃａ−３′）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ８９５０７）の塩基対８５５から８２９を用いた。ＵＧＴ１Ａ７−１０エキソン１の配列は９３％の相同性を示していたため、増幅の特異性を達成するためにはオープンリーディングフレーム外に上流プライマーを局在させることが必要であった。９１６塩基対のサイズの産物を、ＫＣｌ  １０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）２０ｍＭ、硫酸アンモニウム  １０ｍＭ、硫酸マグネシウム  ２ｍＭ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、ゲノムＤＮＡ  ２０ｎｇ、プライマー  ２μＭ、及びＶＥＮＴ（ｅｘｏ）ＤＮＡ−ポリメラーゼ  ５ユニットを含む１００μｌの溶液中で増幅した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ２４００システムを用い、開始時に９４℃で３分間、次いで９４℃で３秒間、５７℃で３０秒間、そして７２℃で３０秒間を３０サイクルに渡って運転した。２％アガロースゲルを用いた電気泳動でこの産物を可視化し、ＱｕｉａＱｕｉｃｋ（Ｒ）カラムを用いて製造元（Ｑｕｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）の指示に従って精製した。ＰＣＲ産物の配列を自動化蛍光色素配列決定法により２つの鎖に関して決定した（（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ，  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）。この配列データを、ＰＣ−Ｇｅｎｅ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｐａｃｋａｇｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ＣＡ，  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．）で分析した。クラスカル−ワリス試験（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ−Ｔｅｓｔ）に従って統計学的分析を行った。
【００５４】
ＧｅｎＢａｎｋ（ジーンバンク）  受入番号：  ＵＧＴ１Ａ７＊１  ：  Ｕ８９５０７  ；  ＵＧＴ１Ａ７＊２  ：  ＡＦ２９６９２２６  ；  ＵＧＴ１Ａ７＊３  ：  ＡＦ２９２６２７，  ＵＧＴ１Ａ７＊４  ＡＦ２９２６２７
次に、図面を用いて本発明を詳細に説明する。それぞれの図は次のものを示す。
【００５５】
図１はＵＧＴ１Ａ７多型診断を表す。同定された多型の周囲の領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。この際、特異的なプライマーペアを使用した。このプライマーペアは、コドン１１、コドン１２９／１３１並びにコドン２０８の上流及び下流の約５０塩基対と結合する。このＰＣＲによって、１００〜１５０ｂｐのサイズの相補的デオキシリボ核酸フラグメント（ｃＤＮＡ）が作成され、これは野生型対立遺伝子に一致するか、又は同定された多型を有している。
【００５６】
図２は図３に定義されたような多型ＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子の罹患率の分析を示す。定義された多型ＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子をベースとするこの分析は、ＵＧＴ１Ａ７＊４及びＵＧＴ１Ａ７＊２と結腸直腸癌（ＣＲＣ）との明らかな関係を示し、対照グループ（ＮＣ）の場合ではこの対立遺伝子のわずかな存在を示す。これとは反対に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）はＵＧＴ１Ａ７＊４の存在だけが関連している。ＣＲＣでもＩＢＤでも、ＵＧＴ１Ａ７＊３対立遺伝子との明らかな関係は見られなかった。しかしながらＵＧＴ１Ａ７＊３／ＵＧＴ１Ａ７＊４ヘテロ接合個体と、ＣＲＣ及びＩＢＤとの関連は明らかであった。統計的に明らかな比較を＊で表した。ＵＧＴ１Ａ７＊２はコドン１１のＣＣＡとＷ２０８Ｒ突然変異との組み合わせとして定義される。これは、２つの突然変異が常に組み合わさっており、コドン１１又はコドン２０８のヘテロ接合又はホモ接合が個別に同定できないという観察に基づいている。ＵＧＴ１Ａ７＊２はホモ接合対立遺伝子として検出されなかった。ＵＧＴ１Ａ７＊３は、Ｎ１２９Ｋ及びＲ１３１Ｋの組み合わせによってだけ定義された。これらの患者はＮ１２９Ｋ並びにＲ１３１に対してもホモ接合又はヘテロ接合であった。ヘテロ接合ＵＧＴ１Ａ７＊４は、ヘテロ接合ＵＧＴ１Ａ７＊２／ＵＧＴ１Ａ７＊３の結合を表すこともできる。
【００５７】
図３に、ヒトＵＧＴ１Ａ７エキソン１配列中に同定された３つの多型サイトを図式的に示した。コドン１１の突然変異ＣＣＣ／Ａはサイレントである。コドン１２９、１３１及び２０８の突然変異はアミノ酸の置換を生じる。この配列分析は、ＵＧＴ１Ａ７＊２、ＵＧＴ１Ａ７＊３及びＵＧＴ１Ａ７＊４に帰属する３つの異なる多型の存在を示した。コドン１１及び２０８（ＵＧＴ１Ａ７＊２）の置換、並びにコドン１２０及び１３１（ＵＧＴ１Ａ７＊３）の多型は、独立して存在しない。
【００５８】
図４は、コドン１１の周辺領域と比較して、ポジション１２９／１３１及びポジション２０８の同定された多型が、保存性が高い配列領域内にあることを示す。Ｎ１２９Ｋ／Ｒ１３１Ｋ多型はこのポジションでのＵＧＴ１Ａ９の野生型配列を表す。Ｗ２０８ＲはこのポジションでのＵＧＴ１Ａ８及びＵＧＴ１Ａ９の野生型配列を表す。
【００５９】
図５は、Ｗ２０８Ｒ突然変異と結腸直腸癌疾患並びに炎症性腸疾患との関係が統計的に極めて明白であることを示す。コドン２０８の突然変異（Ｗ２０８Ｒ）は、標準対照が２２％しか出現していないのに対して、結腸直腸癌の患者では７３％、炎症性腸疾患の患者では６１％出現していた。ＵＧＴ１Ａ７＊２対立遺伝子については、結腸直腸癌（７％に対して１９％）との明らかな関係を示したが、炎症性腸疾患とは明らかな関係を示さなかった。ＵＧＴ１Ａ７＊４対立遺伝子は、結腸直腸癌に対しても、炎症性腸疾患に対しても明らかな関係を示したが、ＵＧＴ１Ａ７＊３に対しては明らかな関係を示さなかった（低い有意水準）。ＣＲＣ患者（７３％）の場合に、標準対照（２２％）と比較したＷ２０８Ｒ突然変異の存在の統計的有意性は極めて高かった（ｐ＜０．０００１）。この場合にヘテロ接合（１５％に対して５０％、ｐ＜０．００１）及びホモ接合（７％に対して２３％、ｐ＜０．０２）のＷ２０８Ｒ突然変異が考慮された。この関係は、６１％のＷ２０８Ｒ突然変異（ｐ＜０．０００１）を示したＩＢＤ患者に対しては同様に明らかであるが、３５％のヘテロ接合及び２６％のホモ接合の個体においては低い。標準対照の場合に２２％までのＷ２０８Ｒ突然変異の出現率の場合には、さらに血液試料採取時点での腫瘍のない状態が後のＣＲＣの発生を排除しないことに考慮すべきである。
【００６０】
＊の符号は、標準対照に対する有意水準を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ  Ｔｅｓｔ）。次に省略記号を説明する：ｎ．ｓ．は明らかでないことを示す。ＮＣは標準対照を示す。ＣＲＣは結腸直腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を示す。ＩＢＤは炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）を示す。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＵＧＴ１Ａ７多型診断を図式的に示す図。
【図２】
図２はＵＧＴ１Ａ７＊２及びＵＧＴ１Ａ７＊４とＮＣ、ＣＲＣ及びＩＢＤとの関連を示す。
【図３】
図３はヒトＵＧＴ１Ａ７エキソン１配列の多型位置（サイト）を示す。
【図４】
図４はコドン１１、１２９、１３１及び２０８の周辺領域の比較を示す。
【図５】
図５はＷ２０８Ｒ突然変異と結腸直腸癌及び炎症性腸疾患との関連を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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