(57)【要約】【課題】エストラジオール当量の係数を用いて有効成分を定量した藻類のパディナパボニカの粉末または抽出物の製造方法。【解決手段】カルシウムイオンを多く含む培地で骨芽細胞を培養し、カルシウム固定拮抗剤の存在下または非存在下で、細胞間マトリクスの細胞によって固定されたカルシウムを分析し、得られた結果を基準目盛に対して任意の単位または国際単位で表すか、所定量のエストラジオールまたはカルシウム固定を促進する他の任意の試薬の公知活性を基準にして表すことを特徴とする方法を用いてパディナパボニカ抽出物または粉末を定量する。本発明は生物学で使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム固定を促進する試薬の所定量での公知活性量を基準にして藻類抽出物または藻類粉末の骨細胞によるカルシウム固定で有効な成分を定量する方法において、
ウェルプレート上の完全培地中でヒトまたは動物の骨細胞株を培養し、藻類パディナパボニカ（algae Padina pavonica）の抽出物または粉末の存在下で上記培地を完全に増殖させ、カルシウム固定に拮抗する拮抗剤の存在下または非存在下で、上記外部細胞マトリクス中で上記細胞によって固定されたカルシウムを定量し、藻類パディナパボニカの抽出物または粉末中に含まれる結果を任意単位またはエストラジオールの量で表すことを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒトまたは動物の細胞株の懸濁液を培養して、比濁分析または基準値に対する計算によって求めた細胞密度を修正する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各ウェルに完全培地（CCM）、次に、カルシウムの固定を抑制する試薬の分散液を添加し、さらに、テストする藻類の抽出物の一定容量の溶液を培地に添加し、この培地を二酸化窒素の雰囲気下で37℃で1〜3日間培養する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
倍地から上澄み画分を分離し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない倍地で細胞を洗浄し、さらに、上記細胞によって作られる細胞間マトリクスを破壊することができる所定容量の試薬、特に無機酸で容量を調節し、上記細胞によって固定されたカルシウムを定量する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
基準有効成分としてカルシウム代謝調節ホルモン、例えばエストラジオールを用いる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カルシウム固定抑制剤が炎症誘発剤、例えばインターロイキンIL-1である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
カルシウム固定抑制剤がカルシウムチャネルを阻害する試薬、例えばベラパミルまたはシンコニンである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法で量が求められた藻類パディナパボニカの定量済みの抽出物または粉末。
【請求項９】
有効成分の量が約240μgで、エストラジオール等のカルシウム代謝調節剤の調製物のカルシウム固定活性とほぼ同じカルシウム固定活性を有する請求項８に記載の藻類パディナパボニカの抽出物または粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学、特に植物化学の分野に関するものである。
本発明の対象は、骨細胞によるカルシウム固定に有効な有効成分の量が定量された藻類をベースにした調製物（titrated preparation）の新規な製造方法にある。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムの量（dosage）は測定が容易な活性の指標になる。骨芽細胞または細胞株由来の細胞のカルシウム固定はカルシウム固定を活性化させるカルシウム代謝調節剤（エストラジオール、ビタミンD3、カルシトニン）またはカルシウム固定に有害な物質、例えばカルシウムチャネル阻害剤（ベラパミル、シンコニンまたはジルチアゼム）、炎症誘発剤サイトカイン、プロスタグランジン、インターロイキン、PAFに対して依存性がある。
【０００３】
藻類パディナパボニカ（algae Padina pavonica）の抽出物または粉末は生物活性（タンパク合成およびグリコアミノグリカン合成）を刺激する作用を有する他に、生理学的機能の回復作用、例えば骨形成原細胞によるカルシウム固定作用も有している。そのために、固定カルシウムの定量に所定の細胞株、例えば細胞株UMR106または細胞株G292が用いられている。この定量はカルシウム固定に有害な物質（カルシウムチャネル阻害剤および炎症誘発剤、例えばIL 1の存在下または非存在下で行なわれる。その結果は正常な骨芽細胞では良い結果であるが、その利用可能性には問題がある。
【０００４】
被分析調製物をカルシウム固定に有害物質の存在下または非存在下で同一細胞株に対して平行テストし、固定されたカルシウム量をカルシウム代謝調節剤を用いて得られた量およびカルシウム固定阻害剤の存在下で得られた量と比較した。その結果、藻類パディナパボニカの活性分子（ＭＡＰＰ）はカルシウムチャネル阻害剤またはIL 1のような炎症誘発剤の存在下でも骨細胞によるカルシウム固定を改善する特性を維持するということが確認された。このことはパディナパボニカ抽出物は一つまたは複数の有効成分を含み、その作用様式はカルシウム阻害剤の存在下でカルシウム固定を改善しない公知の物質の作用様式とは異なるということを示している。
【０００５】
状況を複雑にしているのは藻類の活性が季節、さらには植物の発達時期、成長段階、藻類の厚さ、照明等によって大きく異なり、また、技術者や最終消費者が一定活性の製品を望むことから来る。従って、この植物の有効成分の変動に影響されないような条件下で抽出物を製造する必要がある。
【０００６】
この植物を収穫し、処理し、抽出物を安定して製造するにためは、処理した物質の活性を定量する必要がある。
この植物の収穫は有効成分の含有量が最適レベルにあるときに行うべきである。従って、収穫時機を決定する必要がある。
また、この植物の保存、加工、原料抽出、抽出物の製造には物質の活性を定量化できる分析法を用いる必要がある。
【０００７】
一般に、抽出物を製造する場合には活性分子を化学的に定量する必要がある。活性が一つの分子ファミリーによってもたらされる場合には化学的定量法に頼るのは難しいか、不可能である。すなわち、異性体または互変異性体が存在する分子では活性分子と不活性分子が存在するという問題がある。
【０００８】
異性体が官能基に依存する場合には全体の官能基を定量し、それから有効成分の活性分を求めることができる。その例としてはセンナ、アルカロイド等の定量を挙げることができる。一方、強心ヘテロイドのジギタリスの場合には多くの有効成分の活性レベルが多重になっているため、化学分析と生物活性との関の関係が異常になることが多い。
【０００９】
異性体の特性が基本的に構造的な要素に依存する場合には分析はより複雑になり、分光光度分析によって構造要素の特徴を明らかにする必要があるか、特徴的反応、例えば対象分子ファミリーを代表する官能基の呈色反応等を行う必要がある。例えば、シス−トランス異性体の場合には、二重結合に反応性官能基を固定し官能化し、その官能基に共役反応によって発色団基（例えばフルオレッセインイソチオシアネート）を固定することができる。質量分析を用いることもできるが、この方法は破壊的であり、単離した画分の活性を再検証することができない。
【００１０】
大抵の物質の場合、その活性は一般に生物学的手段によって定量される。その例としてはペニシリン、多くのビタミン（例えばビタミンA、ビタミンE）、抗体、抗原、ある種ホルモン（例えばインシュリン）、FSH、GSH、サイトカイン（例えばインターフェロン）、TNF等が挙げられる。この生物学的手段は基本的に化学的手段が適用できない定量の場合に用いちれる。ビタミンAおよびEはそのよい例で、これらは多くの異性体の形で存在している。
【００１１】
検出容易な発色団基を持たず、しかも構造が不明な物質の場合には問題はさらに複雑になる。この場合、生物活性の定量だけが選択可能な唯一の方法であると思われる。
【００１２】
活性の各種定量法の中で、原核生物細胞または真核生物細胞の生物活性を変える物質に適用される方法がある。しかし、この生物活性の定量には正常細胞または細胞株の安定性に問題が生じる。さらに、分析信号は分析基準によって変動し、大抵の場合、この分析基準は正確に決めることができない。この定量法を用いる場合、操作者は細胞応答が変動するという問題に直面する。従って、細胞株の応答性を基準系に対して較正する必要がある。しかし、パディナ（Padine）では良い応答が得られない。すなわち、パディナはカルシウム阻害剤（Inh-Ca）の存在下およびIL-1等の炎症誘発剤の存在下でカルシウム固定に対する応答を誘発することができる唯一の公知植物であり、これまでにテストした他の物質は全てカルシウム阻害剤（Inh-Ca）の存在下でカルシウム固定能を示さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
解決すべき課題は、抽出物の活性とはどのようなものでなければならないか、また、いかにして滴定量が常に一定である生成物を得るかにある。本発明の目的はこの技術的問題を解決することにある。本出願人は多くの技術的困難を乗り越えて、効率的かつ再現性のある定量方法を生み出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の特定の対象は、エストラジオール当量の係数を用いて有効成分を定量した藻類のパディナパボニカの粉末または抽出物の製造方法にある。本発明方法ではカルシウムイオンを多く含む培地で骨芽細胞を培養し、カルシウム固定拮抗剤の存在下または非存在下で、細胞間マトリクスの細胞によって固定されたカルシウムを分析し、得られた結果を基準目盛に対して任意の単位または国際単位で表すか、所定量のエストラジオールまたはカルシウム固定を促進する他の任意の試薬の公知活性を基準にして表すことを特徴とする方法を用いてパディナパボニカ抽出物または粉末を定量する。
【００１５】
本発明方法では、特に、所定の細胞密度を比濁分析または基準値に対する計算によって修正してヒトまたは動物の骨細胞株の懸濁液を調製し、二酸化窒素の存在下で完全培地（CCM）で37℃で1〜3日間培養し、カルシウム固定抑制剤またはカルシウム代謝調節ホルモンおよび定量すべき抽出物を各ウェルに添加し、培地から上澄み液を除去し、カルシウムまたはマグネシウムを含まない洗浄倍地（例えばP.B.S）でウェルを洗浄して培地から固定されていないカルシウムを除去し、上澄み画分を除去し、一定容量の無機酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸、過塩素酸または培養された細胞によって作られた細胞間マトリクスを破壊することができる他の任意の化合物を用いて分散体の容量を調節する。最後に、混合物を調節し、カルシウムを定量する。例えばAFNOR規格n。NT-690,005に従って定量する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では被テスト物質を細胞培地で定量する。すなわち、骨細胞によって固定されたカルシウムを分析する。そのために骨芽細胞株によって固定されたカルシウムを定量とする。例としてはInh-CaおよびIL-1等のカルシウム固定に有害な剤の存在下または非存在下で用いる骨芽細胞株UMR106およびG292を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。分析する調製物もInh-CaおよびIL-1等の試薬の存在下または非存在下で上記と同じ細胞に対してテストをする。
上記と同じ条件下で、エストラジオールの存在下で同じ細胞株で固定されたカルシウムを定量してエストラジオールの重量で表した較正スケールを作る。この較正スケールのスケールは10-3〜10-10エストラジオールモル、一般に10-7〜10-9エストラジオールモルである。この方法でパディナ抽出物の活性とエストラジオールの活性量との関係を確立することができる。この比較は細胞培地でのエストラジオールの直接の活性と、Inh-CaまたはIL-1等のカルシウム固定に有害な剤の存在下での活性パディナ抽出物との比較である点に注意する必要がある。従って、真の重量比較ではないので、活性度（UA）で表記するのが望ましい。活性度はウェル1ml当たり1ngのインターロイキン存在下で48時間培養された400,000細胞によって固定されたカルシウムの量を50％増加させることができる抽出物の量と定義される。IL-1の代わりに同じ活性量の別のカルシウム固定阻害剤を用いることもできる。
【００１７】
パディナ抽出物は下記文献に説明されている。
【特許文献１】
欧州特許第0,655,250号公報
【００１８】
この文献ではシクロヘキサンまたはアセトン等の炭化水素溶剤によって藻類を乾燥抽出してから、植物質を分離し、次いで、抽出生成物を濾過し、蒸発乾固させる。正確に秤量した一定量の乾燥抽出物をエタノールに溶解する。
【００１９】
本発明の目的は上記活性を決定することにある。具体的にいうと、本発明方法は、ヒト細胞株G292（ECAC no.901-110522）の培養懸濁液を調製する。培養懸濁液に10％のウシ血清を補充して完全培地（CCM）1ml当たり400,000細胞に細胞密度を調節する。この細胞懸濁液を24ウェルの各プレートに1mlずつ分配する。37℃でCO2雰囲気下で一晩培養する。上澄み液を分離し、新たにCCmを追加して希釈する。一定量のIL-1を調製し、5μlのインターロイキンIL-1、すなわち各ウェルにつき1ngを添加し、IL-1によって細胞が一度だけ阻害処置されるようにする。
【００２０】
各テストごとに定量する溶液に5μlのパディナ抽出物溶液を添加する。次に、テストを行うのに必要な時間、通常は24〜74時間、好ましくは48時間培養する。次に、上澄み液を除去し、予め37℃の温度に加熱したカルシウムとマグネシウムを含まないPBS緩衝液で細胞塊を3回洗浄し、培地で生じた溶液からカルシウムを全て除去する。通常の精製プロセスの後、溶液を酸と混合し、規格n。NT-690,005に従ってカルシウムを定量する。このカルシウム量は活性指標にすぎず、任意単位で表すことがきる。得られた値を未処置の細胞に由来する値または基準処置をした値（例えばIL-1、エストラジオール、カルシウム阻害剤で処理した値）と比較することでカルシウム量の絶対値を得ることができる。
【実施例】
【００２１】
実施例I
インターロイキン1の存在下または非存在下でのエストラジオール、ビタミンD3およびパディナ抽出物（EPP）で比較した骨芽細胞株G292によるカルシウム固定
【００２２】
【表１】
2004533854.tif 000002
【００２３】
上記条件下で得られた結果は〔図1〕に示してある。
インターロイキンIL-1単独で処置した細胞の不活性レベルは対照細胞の不活性レベルよりもはるかに低い。IL-1およびパディナ抽出物で処置した細胞の活性は対照細胞の活性に近い。
【００２４】
実施例II
IL-1存在下でのエストラジオールを用いたパディナ抽出物の較正値
【００２５】
【表２】
2004533854.tif 000003
【００２６】
得られた結果は〔図２〕に示してある。
240 ng EPP＝10-9Mエストラジオール＝272μg/L、すなわち272 ng/ml。240ngのパディナ抽出物はカルシウム固定で10-9Mエストラジオール活性に相当する（240ngのパディナ抽出物＝272μg/L、すなわち272 ng/mlのエストラジール）。240 ngの抽出物は1単位の滴定量を有するということもできる。
【００２７】
実施例III
ベラパミル等のカルシウム阻害剤の作用に対するカルシウム固定でのパディナ抽出物（EPP）とエストラジオールとの較正値
【００２８】
【表３】
2004533854.tif 000004
【００２９】
得られた結果は〔図３〕に示してある。
Verap.＝ベラパミル
Est.＝エストラジオール
【００３０】
実施例IV
エストラジオールおよびカルシウム阻害剤シンコニンに対するパディナ抽出物の較正値
【００３１】
【表４】
2004533854.tif 000005
【００３２】
実施例V
1年間の腰柱の骨密度の変動
【００３３】
【表５】
2004533854.tif 000006
【００３４】
得られた結果は〔図４〕に示してある。
活性に関するデータを２つの平均と２つの標準偏差を比較した統計的テスト（スチューデントテスト）を用いて比較した結果は全て統計学的に有意である。
実施例Ｉ〜Ｖから、本発明方法で得られた結果と、生物学的手段およびヒトの臨床試験で得られた結果とが一致することがわかる。わずかな差（272ng/mlエストラジオールに対して240ng）は主として生物学的プロセスの評価に必要な手段が確定していないことによる。
【００３５】
従って、パディナパボニカの生物学的抽出物はエストラジオールの活性と同等な活性を有し、その活性は、エストラジオール、ビタミンDおよびカルシトニン等の既に公知のカルシウム固定剤と違って、インターロイキンまたはベラパミルまたはジルチアゼム等のカルシウムチャネル阻害剤の存在でも損なわれないということができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例Ｉの結果を示す図。
【図２】実施例IIの結果を示す図。
【図３】実施例IIIの結果を示す図。
【図４】実施例IVの結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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