(57)【要約】本発明は、血管新生およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を阻害するメリッサ葉抽出物を含む組成物に関する。本発明のメリッサ葉抽出物は、血管新生およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を阻害するため、血管新生およびマトリックスメタロプロテイナーゼに関する疾患の治療または予防に適用できる。本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、１以上のその他の抗血管新生、抗癌、抗炎症および抗老化成分を含んでいてもよい。メリッサ葉抽出物を含むこの特定の組成物は、医薬、食事療法および／または化粧品に用いることが出来る。
2004520294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メリッサ葉抽出物を含む血管新生阻害用組成物。
【請求項２】
組成物がさらに、イチョウ抽出物、チクロピジン、グルコサミンおよびセイヨウトチノキ抽出物およびグリシリザ・グラブラ、 シナモナム・カッシア、ソフォラ・ジャポニカ、アトラクチロード・ジャポニカ、アトラクチロード・ランセア、アルテミシア・キャピラリス、モルス・アルバ、ホットゥニア・コルダータ、ロニセラ・ジャポニカ、イヌラ・ジャポニカ、イヌラ・ブリタニカ、ペオニア・アルビフローラ、ペオニア・ジャポニカ、ペオニア・オボヴァータ、カークマ・ドメスティカ、カークマ・ロンガ、サウララス・チャイネンシス、ワクシニウム・ミルティラス、ラブス種、メリロツス・オフィシナリス、アジェリカ・ジャイジャンティス、サルビア・オフィシナリス、サルビア・ミルトリザ、リリオペ・プラティフィラ、ジンジバー・オフィシナリス、ウルムス・カヴィジアナ、ウルムス・マクロカルパ、カメリア・ジャポニカおよび ヴィティス・ヴィニフェラからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が血管新生阻害用の医薬組成物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が血管新生阻害用の食品組成物である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が、癌転移、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症、早産児網膜症、新生血管緑内障、血管新生によって誘導される角膜疾患、退行性網膜黄斑、黄斑変性症、翼状片、網膜変性症、水晶体後線維増殖症、顆粒状結膜炎、乾癬、末梢血管拡張、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、ざ瘡または関節炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の予防用および／または治療用に用いられる請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害用のメリッサ葉抽出物を含む組成物。
【請求項７】
組成物がさらにイチョウ抽出物、チクロピジン、グルコサミンおよびセイヨウトチノキ抽出物、グリシリザ・グラブラ、 シナモナム・カッシア、ソフォラ・ジャポニカ、アトラクチロード・ジャポニカ、アトラクチロード・ランセア、アルテミシア・キャピラリス、モルス・アルバ、ホットゥニア・コルダータ、ロニセラ・ジャポニカ、イヌラ・ジャポニカ、イヌラ・ブリタニカ、ペオニア・アルビフローラ、ペオニア・ジャポニカ、ペオニア・オボヴァータ、カークマ・ドメスティカ、カークマ・ロンガ、サウララス・チャイネンシス、ワクシニウム・ミルティラス、ラブス種、メリロツス・オフィシナリス、アジェリカ・ジャイジャンティス、サルビア・オフィシナリス、サルビア・ミルトリザ、リリオペ・プラティフィラ、ジンジバー・オフィシナリス、ウルムス・カヴィジアナ、ウルムス・マクロカルパ、カメリア・ジャポニカおよび ヴィティス・ヴィニフェラからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害用の医薬組成物である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害用の食品組成物である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害用の化粧品組成物である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が、癌転移、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＭＭＰ−依存性骨障害、中枢神経系の炎症、アルツハイマー病、皮膚老化、角膜潰瘍、癒着、骨疾患、タンパク尿症、腹部大動脈瘤、退行性軟骨減少、有髄神経減少、肝線維症、腎糸球体疾患、胚膜破裂、炎症性腸疾患、歯肉炎／歯周病、老人性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、増殖硝子体網膜症、未熟児網膜症、眼炎症、円錐角膜、シェーグレン症候群、近視、眼腫瘍、角膜移植拒絶、関節リウマチ、関節炎または敗血性関節炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療用である、請求項６または７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
（ａ）発明の分野
本発明は、血管新生およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対して阻害活性を有するメリッサ(Melissa)葉抽出物を含む組成物に関する。
【０００２】
詳細には、本発明は、活性成分としてメリッサ葉抽出物を含む組成物に関し、これは、医薬、食品または化粧品として、血管新生−および／またはＭＭＰ−依存性疾患の治療または予防に用いることが出来る。
【０００３】
（ｂ）関連技術の記載
シソ科植物であるメリッサ(メリッサ・オフィシナリス（Melissa officinalis）)は、一般的かつ民間的な名称として、レモンバーム、バーム、またはドロップシー(dropsy)植物とも呼ばれている。
【０００４】
メリッサ・オフィシナリスの重要な構成成分は精油（ゲラニアール、ネラール、シトロネラル、リナロール、ゲラニオール、ゲラニルアセテート、メチルシトロネラート、トランス−ベータ−オシメン(ocimene)、ゲルマクレン(germacren)、ユージノール）、コーヒー酸誘導体、フラボノイド、トリテルペン、カテキンおよびタンニンである。コーヒー酸誘導体である、ローズマリー酸(rosmarinic acid)は、メリッサ葉抽出物のもっとも豊富な構成成分であり(約４．７％）、抗炎症活性を有することが知られている。
【０００５】
メリッサは食用および薬用である。新鮮な葉はサラダに加えてもよいし、魚、鶏および豚用のソースを作るのに用いてもよい。乾燥させたまたは新鮮な植物体は、冷たい清涼飲料または温かいリラックス用の茶を作るのに用いられており、これは熱、風邪および頭痛によい。代替医療として、メリッサは、神経の鎮静、月経痛の緩和、不眠症、抑欝、甲状腺亢進症、胃の不調、および赤ん坊の疝痛に用いられている。それは、抗菌性、鎮痙性、抗ウイルス性、駆風性、発汗性、消化促進性、通経性、解熱性、鎮静性および強壮性を有する。最近では、メリッサ葉抽出物は血液循環活性剤に含まれており、これは末梢血管の拡張を助ける。新鮮な圧搾した葉は創傷および虫の刺傷に用いられる。油の形態のメリッサは、皮膚用調製物および香水にしばしば添加されている。精油はアロマテラピーにおいても用いられている(Cohen RA, Kucera LS, Herrmann EC Jr., Proc Soc Exp Biol Med 117, 431-434,1964; Kucera LS, Cohen RA and Herrmann EC Jr, Ann. NY Acad Sci 130, 474-82, 1965）。
【０００６】
血管新生は新しい毛細血管を生成する工程である。これは既存の内皮細胞の増殖の活性化によって起こる。新血管新生は、厳密に制御されており、活性化は胚発生、組織修復、創傷治癒および黄体発達周期においてのみ起こる（Folkman および Cotran, Relation of vascular proliferation to tumor growth, Int Rev Exp Pathol 16 207-248, 1976）。
【０００７】
内皮細胞は、体内のその他のタイプの細胞と比べて非常にゆっくりと増殖する。しかし、血管新生の制御不全によってこれらの細胞の増殖が誘発されると、なんらかの病的状態が発生する（Timar, J Pathol Oncol Res 6, 85-94, 2001）。病的血管新生は多くの疾患に関係している。例えば、血管腫、血管線維腫、血管奇形、アテローム性動脈硬化症、癒着および浮腫(edemic)硬化症等の循環器疾患：角膜移植後の新血管新生、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、血管形成角膜疾患、黄斑変性症、翼状片、網膜変性症、水晶体後線維増殖症および顆粒状結膜等の眼疾患は、血管新生に関係している。関節炎などの慢性炎症性疾患：乾癬、末梢血管拡張、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎およびざ瘡などの皮膚疾患も血管新生−依存性である。
【０００８】
特に、血管新生は癌の転移および増殖に必須である（D'Amato RJ および Adamis AP, Ophthalmol 102, 1261-1262, 1995; Arbiser JL, J Am Acad Derm 34, 486-497, 1996; O'Brien K.D. ら. Circulation 93, 672-682, 1996; Hanahan D および Folkman J, Cell 86, 353-364, 1996）。新しい血管は、急速に増殖する癌細胞に栄養素と酸素を供給するだけでなく、癌細胞が血流に入る道をも与え、その結果転移が起こる（Polverini P.J., Critical Reviews in Oral Biology, 6, 230-247, 1995）。現在、多種多様の化学療法および免疫療法が癌の治療に適用されているが、それら療法は抗転移効果に欠けるため、治療効果は限られたものに過ぎず、癌患者の寿命の延長に成功したものはない。
【０００９】
周知の炎症性疾患である関節炎は、自己免疫疾患として発症する。しかし、滑液腔における血管内皮細胞の増殖が炎症性サイトカインによって活性化され、最終的には関節における軟骨が破壊される（Kocb AE, Polverini PJ および Lcibovich SJ, Arth Rheum 29, 471-479,1986; Stupack DG, Storgard CM および Cheresh DA, BrazJ Med Biol Rcs 32, 578-581, 1999; Koch AE, Arthritis Rheum 41, 951-962, 1998）。
【００１０】
世界中の多くの人々が様々な眼疾患のために視力を失っている。多くの患者が毛細血管細胞のガラス質への浸潤によって失明している（Jeffrey MI および Takayuki A, J Clin Invest 103, 1231-1236, 1999）。
【００１１】
乾癬は皮膚細胞の非常に活発な増殖によって起こる。急速に増殖する細胞は充分な血液供給を必要とし、乾癬においては血管新生が異常に誘導される（Folkman J., J Invest Dermatol 59, 40-48, 1972）。
【００１２】
上記の様に、血管新生は多くの疾患の発症および進行に密接に関連している。したがって、血管新生の阻害剤はそのような疾患の治療のためのよい候補であり得る。そのような疾患の予防および／または治療のために、血管新生阻害剤の開発に向けて多大な努力が払われてきた。
【００１３】
たった１つの腫瘍血管を構成する個体の細胞もかなり異なっているため、癌治療の有効性は、様々なタイプの抗血管新生療法によって改善され得る。抗血管新生療法を最適にするために、いくつかの血管新生阻害剤の混合物を調製するのが望ましい。
【００１４】
血管新生誘導についての主要な現象の１つは、毛細血管形成の前の細胞外マトリックスの崩壊である。マトリックス崩壊のための最も重要な酵素は、２０を超える酵素のファミリーである、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。ＭＭＰは、コラーゲン、プロテオグリカン、およびゼラチンなどの細胞外マトリックス成分を分解、すなわちタンパク分解するエンドペプチダーゼであり、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、および膜型ＭＭＰの４つのグループに分類される。ＭＭＰファミリーの多くの酵素は基質特異性を有する。ＭＭＰの発現は、細胞外マトリックスの再構築が要求される際の様々な生理的環境下で誘導される（Curry TE Jr, Osteen KG, Biol Repord 64, 1285-1296, 2001; Damjanovske S, Amano T, Li Q, Ueda S, Shi YB, Ishizuya-Oka A, Ann NY Acad Sci 926, 180-191, 2000; Ravanti L, Kahari VM, Int J Mol Med 6, 391-407 2000）。
【００１５】
ＭＭＰの発現上昇または活性化は多くの病的状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、皮膚老化、しわ、関節炎、角膜潰瘍、タンパク尿症、腹部大動脈瘤、退行性軟骨減少、有髄神経減少、肝線維症、腎糸球体疾患(nephrogromerula disease)、胚膜破裂、炎症性腸疾患、歯肉炎／歯周病、老人性黄斑変性症、網膜症、シェーグレン症候群、近視、角膜移植拒絶、血管新生および癌転移などにおいて観察される（Woessner Jr., Annals NY Acad Sci, 732, 11-21, 1994; Warner ら., Am J Pathol, 158, 2139-44, 2001; Stetler-Stevenson, Surg Oncol Clin N Am, 10, 383-92, 2001）。
【００１６】
例えば、ストロメライシンは軟骨の破壊の主要な酵素であることが知られている（Murphy, G. ら., Biochem J, 248, 265-268, 1987）。コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロメライシンは多くの網膜症における細胞外マトリックスの崩壊の原因である（Bruns, F.R. ら., Invest Opthalmol and Visual Sci, 32, 1569-1575, 1989）。コラゲナーゼおよびストロメライシンは炎症中の歯肉からの線維芽細胞において同定され、該酵素の活性は炎症の程度に依存する（Beeley, N.R.A. ら., 前掲; Overall, C.M. ら., J Periodontal Res, 22, 81-88, 1987）。
【００１７】
最近の報告はまた、ＭＭＰ−１活性がアルツハイマー病において高度に誘導されており、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３は該疾患の病態生理に関係していることを示した（Leake A, Morris CM, & Whateley, J Neurosci Lett 291, 201-3, 2000; Yoshiyama Y, Asahina M, & Hattori T, Acta Neuropathol (berl), 99, 91-5, 2000）。
【００１８】
ＭＭＰは太陽ＵＶ照射−誘導性皮膚障害の原因でもあり、これは皮膚の色調および弾性に影響を及ぼし、早老を導く。これの兆候には、がさがさした質感、しわ、斑状色素沈着、たるみおよび血色の悪さが含まれる。したがって、ＭＭＰ阻害剤は抗−光老化または抗−しわ剤として化粧品に含ませることもできる（Hase T, Shinata K, Murase T, Tokimitsu I, Hattori M, Takimoto R, Tsuboi R および Ogawa H, Br J Dermatol 142, 267-273, 2000; Fisher GJ, Talwar HS, Lin J, Voorhees JJ, Photochem Photobiol 69, 154-157, 1999）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ＭＭＰおよび血管新生の阻害剤は多くの疾患の治療に適用することが出来るので、新規薬剤としての血管新生阻害剤の開発が期待される。阻害剤は、長期間投与する必要があるため、毒性または有害効果を有さず、患者の承諾が良好であるものが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の概要）
本発明者らは、メリッサ葉抽出物が以下の作用を示すことを見出した：血管新生の阻害、マトリックスメタロプロテイナーゼのタンパク分解活性の阻害。
【００２１】
したがって、本発明は、活性成分としてメリッサ葉抽出物を含み、その他の活性成分を含んでいても含んでいなくてもよい抗血管新生組成物を提供する。
【００２２】
より具体的には、本発明は医用または食用の抗血管新生組成物を提供する。
【００２３】
したがって、本発明の組成物は血管新生により起こる疾患の治療または予防に用いることが出来る。
【００２４】
さらに、本発明は、活性成分としてメリッサ葉抽出物を含み、その他の活性成分を含んでいても含んでいなくてもよい、ＭＭＰ−阻害組成物を提供する。
【００２５】
より具体的には、本発明は、医用、食用または化粧品用のＭＭＰ−阻害組成物を提供する。
【００２６】
したがって、本発明の組成物は、ＭＭＰにより起こる疾患の治療または予防用に用いることが出来る。
【００２７】
（発明の詳細な記載）
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、本発明のメリッサ葉抽出物が、管形成アッセイだけでなく、ＣＡＭアッセイおよびマウスマトリゲルモデルにおいても血管新生を阻害するということを見出した。メリッサ葉抽出物は経口投与した場合も血管新生を阻害する。
【００２８】
管形成アッセイはインビボの有効性に密接に関連したインビトロ実験法であり、このアッセイは、微小血管網を形成するヒト内皮細胞の遊走および分化に対する効果を調べるものである。ＣＡＭアッセイは受精卵を用いるインビボアッセイであるが、血管新生はマウスマトリゲルモデルにおいて定量的に測定することが出来る。
【００２９】
さらに、本発明者らは、メリッサ葉抽出物が、血管新生および癌転移の必須酵素のファミリーであるＭＭＰを阻害するということを見出した。ＭＭＰに対するメリッサ葉抽出物の効果を、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９について調べると、それは３つの酵素すべての活性を大幅に阻害する。しかし、ＭＭＰに対するメリッサ葉抽出物の阻害効果はこれら３つの酵素に限られるものではない。
【００３０】
それゆえ本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、血管新生依存疾患の治療または予防用の抗血管新生剤として、医用または食用に用いることが出来ることが明らかである。
【００３１】
それゆえ本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、ＭＭＰ−関連疾患の治療または予防用のＭＭＰ−阻害剤として、医用、食用または化粧品用に用いることが出来ることも明らかである。
【００３２】
本発明において用いられるメリッサ葉抽出物は購入してもよいし従来法により調製してもよい。市販のメリッサ葉抽出物も使用できる。従来からの抽出方法の例は以下の通りである。
【００３３】
簡単に説明すると、１０から２０Ｌの水性アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ブタノールなど）またはアセトンを、１ｋｇの乾燥メリッサ葉に添加する。混合物を放置して６０から８０℃の範囲の温度で３０分から２時間抽出する。抽出工程は他の溶媒（クロロホルム、酢酸エチル、ケトンなど）を用いて２、３回繰り返してもよい。その結果得られた抽出物を濃縮するとメリッサ葉抽出物が得られる。
【００３４】
上記の様に、本発明のメリッサ葉抽出物は、血管新生およびＭＭＰ活性に対して阻害効果を有する。ＭＭＰは血管新生の原因である酵素であるが、メリッサ葉抽出物の抗血管新生活性は、ＭＭＰ阻害活性に限られない。即ち、ＭＭＰは血管新生を誘導する因子の１つであるが、メリッサ葉抽出物はその他の血管新生因子を阻害することが出来る。さらにメリッサ葉抽出物のＭＭＰに対する活性の阻害は、血管新生の阻害に限られるわけではない。
【００３５】
本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、血管新生−およびＭＭＰ−依存疾患の予防および／または治療のために、チクロピジン、グルコサミン（２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース）、セイヨウトチノキ抽出物およびイチョウ (Ginkgo biloba)抽出物などのその他の１以上の血管新生阻害剤の成分を含んでいてもよい。本発明者らは以前に血管新生は、セイヨウトチノキ抽出物(KR10-2001-66246)、グルコサミンおよびその塩 (KR-10-2001-18675)、イチョウ抽出物(KR10-2000-45265)およびチクロピジン(KR10-2000-43589)などの市販の医薬組成物によって阻害されることを報告している。
【００３６】
これらの市販の薬剤と本発明のメリッサ葉抽出物とを同時に用いて該組成物の効果を増強することが出来る。
【００３７】
具体的には、メリッサ葉抽出物と、イチョウ抽出物またはチクロピジンとの併合処理を転移阻害剤として用いることが出来る。
【００３８】
本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、グリシリザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）、 シナモナム・カッシア（Cinnamonum cassia）、ソフォラ・ジャポニカ（Sophora japonica）、アトラクチロード・ジャポニカ（Atractylodes japonica）、アトラクチロード・ランセア（Atracylodes lancea）、アルテミシア・キャピラリス（Artemisia capillaris）、モルス・アルバ（Morus alba）、ホットゥニア・コルダータ（Houttuynia cordata）、ロニセラ・ジャポニカ（Lonicera japonica）、イヌラ・ジャポニカ（Inula japonica）、イヌラ・ブリタニカ（Inula britannica）、ペオニア・アルビフローラ（Paeonia albiflora）、ペオニア・ジャポニカ（Paeonia japonica）、ペオニア・オボヴァータ（Paeonia obovata）、カークマ・ドメスティカ（Curcuma domestica）、カークマ・ロンガ（Curcuma longa）、サウララス・チャイネンシス（Saururus chinensis）、ワクシニウム・ミルティラス（Vaccinium myrtillus）、ラブス種（Rubus spp.）、メリロツス・オフィシナリス（Melilotus officinalis）、アジェリカ・ジャイジャンティス（Agelica gigantis）、サルビア・オフィシナリス（Salvia officinalis）、サルビア・ミルトリザ（Salvia miltorrhiza）、リリオペ・プラティフィラ（Liriope platyphylla）、ジンジバー・オフィシナリス（Zingiber officinalis）、ウルムス・カヴィジアナ（Ulmus cavidiana）、ウルムス・マクロカルパ（Ulmus macrocarpa）、カメリア・ジャポニカ（Camellia japonica） および ヴィティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）などのその他の抗癌、抗炎症および抗老化剤の１以上の成分を含んでいてもよい。上記組成物は、薬剤、医薬部外品、食品または飲料に添加して抗血管新生の目的で用いてもよい。
【００３９】
上記成分の抗血管新生活性も、先に記載したＨＵＶＥＣの管形成によって確認される。各組成物５０μｇ／ｍｌによる管形成の阻害は、非処理対照ＨＵＶＥＣと比べて３０−１００％であった。例えば、パーセント阻害は、Cinnamonum cassiaについては１００％、Atractylodes japonicaについては５１．７％、Artemisia capillarisについては５３％、Morus albaについては５３％、Vaccimium myrtillusについては４０％、Houttuynia cordataについては３０％、そしてPaeonia japonicaについては３８％であった。
【００４０】
メリッサ葉抽出物を含む組成物は、デキストロース、マルトデキストリン、食塩水、緩衝食塩水、水、グリセロールおよびエタノールを含む１種以上の希釈剤を含んでいてもよいが、希釈剤はこれらに限定されるわけではない。適当な希釈剤は、Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing co, Easton PA)において挙げられている。
【００４１】
メリッサ葉抽出物を含む製剤はいかなる形態に調製してもよい。製剤は、注射用調製物（真性溶液、懸濁液、または乳濁液）、および好ましくは経口用量形態（錠剤、カプセル、軟カプセル、水溶性医薬、丸薬、顆粒剤）および局所用調製物（軟膏、パッチ、スプレー、溶液など）として調製することができる。
【００４２】
本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、様々な経路で投与できる。投与経路には、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、動脈内、経皮、直腸、経鼻、眼球および局所投与が含まれる。
【００４３】
本発明のメリッサ葉抽出物を含む組成物は、疾患および投与経路によって様々に投与すればよい。活性成分の量は様々な因子によって決定しなければならないことを理解すべきである。これら因子には、患者の症状の重篤度、その他の同時投与薬剤（例えば、化学療法薬剤）、個々の患者の年齢、性別、体重、食餌、投薬時間、選択した投与経路、および組成物の比が含まれる。
【００４４】
メリッサ葉抽出物の１日投与用量は、好ましくは約５ｍｇから２ｇであり、最も好ましくは１０から１０００ｍｇである。一般に、０．１から２００ｍｇ／ｋｇのメリッサ葉抽出物を一日当たり単一用量として、あるいは一日当たり２−３回に分けた用量として投与すればよい。
【００４５】
本発明のメリッサ葉抽出物を含む化粧品組成物は、光老化またはしわの治療に用いることが出来る。
【００４６】
以下の実施例は本発明を更に説明する意図のものである。しかしこれら実施例は本発明をよりよく理解するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
（実施例１）
Emil Flachsmann AGから購入したメリッサ葉抽出物を以下の実施例において用いた。
【００４８】
（試験１）ＨＵＶＥＣの管形成に対するメリッサ葉抽出物の効果
血管新生に対するメリッサ葉抽出物の効果をヒト内皮細胞を用いてインビトロで調べた。
【００４９】
管形成アッセイを行うために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を帝王切開後に得た新鮮な臍帯から単離した。細胞を培養し、抗−因子VIII抗体による免疫細胞化学染色によって同定した。マトリゲル（Matrigel）(BD Bioscience, Bedford, MA, USA)でと一緒に増殖したＨＵＶＥＣを２５μｇ／ｍｌの上記実施例１のメリッサ葉抽出物 (Emil Flachsmann AG)で処理し、さらに３７℃で８−１６時間インキュベートした。対照として、同じ手順をメリッサ葉抽出物無しで繰り返した。
【００５０】
図１は、ＨＵＶＥＣをマトリゲル上で増殖させた場合、新血管新生の過程として管状網が形成されていることを示す。しかし、マトリゲル上のＨＵＶＥＣの微小血管網は図２に示すようにメリッサ葉抽出物によって連絡切断された。
【００５１】
図２は、２５μｇ／ｍｌのメリッサ葉抽出物で処理されたマトリゲル上で増殖するＨＵＶＥＣであり、微小血管網が連絡切断されていることを示す。
【００５２】
管面積を、画像分析プログラムImage-Pro Plus（登録商標）(Media Cybernetics, USA)によって測定し、表１に要約した。メリッサ葉抽出物の処理後の管形成は、未処理対照と比較して約６６％阻害されていた。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
（試験２）血管新生についての動物実験（マウスマトリゲルモデル）
メリッサ葉抽出物の抗血管新生活性をマウスマトリゲルモデルで定量的に調べた。
【００５５】
それぞれ５０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および５０ユニット／ｍｌのヘパリンと混合したマトリゲルの０．４ｍｌ部分を６から８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌性マウスに皮下注射によって移植した。３−５日後、マトリゲルをそれぞれのマウスの切除した皮膚から取り出し、マトリゲル中のヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを、血中総ヘモグロビン測定試薬であるDrabkin kit (Sigma Chemical Co., St. Louise, MI, USA, カタログ番号. 525)で測定した。
【００５６】
同じ実験を実施例１のメリッサ葉抽出物（０．５ｍｇ）を含むマトリゲルを用いて行い、処理群のヘモグロビン含量を対照群のヘモグロビン含量と比較した。図３および表２に示すように、処理群のヘモグロビン含量は対照群のヘモグロビン含量と比較して顕著に減少していた。それゆえ、血管新生は約９９％阻害された。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
経口投与したメリッサ葉抽出物の血管新生に対する活性を試験するために以下の実験を行った。
【００５９】
５０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および５０ユニット／ｍｌのヘパリンを含有するマトリゲルの０．４ｍｌ部分を皮下注射によって移植し、マウス当たり０．６ｍｇのメリッサ葉抽出物を４日間一日２回経口投与した。５日目にマトリゲルを取りだし、マトリゲル中のヘモグロビン量を測定した。
【００６０】
図４および表３に示すように、メリッサ葉抽出物処理群はマトリゲルにおけるヘモグロビンレベルが、対照群のレベルより約７１％低かった。それゆえメリッサ葉抽出物は経口投与しても抗血管新生活性を示した。
【表３】
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【００６１】
（試験３）絨毛尿膜アッセイ（ＣＡＭアッセイ）での血管新生アッセイ
ニワトリ受精卵を加湿インキュベーターで３７℃に保った。３日間のインキュベーション後、２６−ゲージ針のシリンジで卵から２−３ｍｌのアルブミンを吸引し、卵を透明テープでシールした。卵の末端に小さい穴の窓をドリルで開けた。２日後、１５μｌの食塩水に溶解した５０μｇのアリコートのメリッサ葉抽出物を滅菌Thermanox ディスク (Miles Scientific) にアプライし、風乾させた。ディスクを窓を通して絨毛尿膜表面にアプライし、透明粘着テープでカバーした。胚をさらに加湿インキュベーターで３７℃で３日間インキュベートした。適当な容量の脂質乳濁液を２６−ゲージ針を用いて胚絨毛尿膜に注入し、絨毛尿膜の血管網が白い脂質バックグラウンドから目立つようにした。対照として１５μｌの生理的食塩水をメリッサ葉抽出物の代わりにディスクに与え、上記と同じ手順を行った。その結果得られた血管を観察し、処理卵と比較した。
【００６２】
対照群（ｎ＝２０）において、毛細血管形成は９０％の胚において影響を受けなかった（図５ａ）のに対し、メリッサ葉抽出物で処理したディスク（図の明るい部分）における管形成の阻害は有意であり、純毛尿膜の血管形成の阻害がすべての処理卵において観察された（ｎ＝１５、１００％、図５ｂ）。
【００６３】
（試験４）メリッサ葉抽出物とイチョウ抽出物の混合処理の血管新生阻害に対する効果
メリッサ葉抽出物とその他の組成物の同時処理の血管新生に対する効果をマウスマトリゲルモデルで調べた。
【００６４】
５０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および５０ユニット／ｍｌのヘパリンを含むマトリゲル０．４ｍｌ部分を皮下注射によって移植し、０．５ｍｇのイチョウ抽出物と混合したメリッサ葉抽出物１．０ｍｇを４日間、１日２回経口投与した。
【００６５】
他の群において、より低用量のメリッサ葉抽出物とイチョウ抽出物の混合組成物をマウスに与えた。これらには前記混合組成物の５分の１の量を与えた（メリッサ０．２ｍｇ、イチョウ０．１ｍｇ）。
【００６６】
マトリゲル中のヘモグロビン量を測定し、結果を非処理対照群と比較した。表４において要約するように、処理群からのマトリゲルにおける総ヘモグロビンレベルの平均は対照群の約１０−１８％であった。混合処理による血管新生のパーセント阻害は８２−９０％であり、メリッサ葉抽出物のみの場合よりも大きかった。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
（試験５）メリッサ葉抽出物とその他の組成物との混合処理による癌転移の阻害
Ｂ１６ＢＬ６細胞（５ｘ１０４）を６から７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスに尾静脈を介して注射した。その後、０．２ｍｌの水または薬剤混合物を３週間毎日マウスに経口投与によって与えた。注射の３週間後、マウスを殺し肺表面の腫瘍コロニーの数を顕微鏡下で数えた。処理群のマウスの肺におけるメラノーマコロニーの平均数は対照マウスのものより少なかった。転移のパーセント阻害は単剤処理群で３７−３８％であり、混合処理群では５０−５４％にまで減少した(表５）。
【００６９】
即ち、その他の血管新生阻害剤とメリッサ葉抽出物の混合処理は、メリッサ葉単独よりも強力である。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
（実施例２）
（１）ＭＭＰの調製
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を昆虫細胞（Ｓｆ２１昆虫細胞）からバキュロウイル系（Baculovirus system）を用いてクローニングおよび調製した。
【００７２】
ＭＭＰ−２ｃＤＮＡ (GENEBANK No. XM_048244)をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５トランスファーベクター (Invitrogen, カタログ番号. V1995-20)にクローニングし、Bac-N-Blue Transfection Kit (Invitrogen, カタログ番号. K855-01)を用いてＳｆ２１細胞にトランスフェクトした。ＳＦ２１細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A)培地で２７℃でインキュベートし、収集して１０７細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁した。細胞懸濁液をクローニングした遺伝子を含むウイルスとともに１時間室温でインキュベートした。感染したＳｆ２１細胞を７２時間培養し、培地を回収した。回収した培地からＭＭＰ−２をゼラチン−セファロースアフィニティーカラムで精製した。
【００７３】
ＭＭＰ−１ (GENEBANK NO. XM_040735) およびＭＭＰ−９ (GENEBANK NO. XM_009491) を対応する遺伝子から先に記載したようにして調製した。ＭＭＰ−１はＳＰ−セファロースで精製し、ＭＭＰ−９はゼラチン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００７４】
（２）ＭＭＰ活性の阻害
メリッサ葉抽出物によるＭＭＰ阻害を調べるために、ＭＭＰ酵素活性を分光蛍光分析法 (Perkin-Elmer LS50B)によってアッセイした。
【００７５】
アッセイ前に１ｍＭ  ＡＰＭＡで活性化した後、精製ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を用いた。
【００７６】
ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−９の基質は、２，４−ジニトロフェニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ（配列番号１）であり、Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄａｐ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２ (配列番号２ :BACHEM, カタログ番号. M-1895) をＭＭＰ−２の基質として用いた。
【００７７】
対照として、１０ｎＭのＭＭＰ−１および１μＭの基質（配列番号１）を２ｍｌキュベット中の２ｍｌの反応緩衝液（５０ｍＭ  トリシン（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に混合した。蛍光強度を２分ごとに２０分間分光蛍光光度計で室温で測定した。励起波長は２８０ｎｍ、発光波長は３６０ｎｍであった。
【００７８】
水に溶解したメリッサ葉抽出物（２５μｇ／ｍｌ）と１０ｎＭのＭＭＰ−１を基質を含む反応緩衝液に添加し、蛍光強度を同様にして測定した。
【００７９】
ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９の活性もアッセイした。蛍光強度を前述のようにして測定した。
【００８０】
図６、７および８は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性の図である。図６に示すように、ＭＭＰ−１活性の５７％がメリッサ葉抽出物によって阻害された。メリッサ葉抽出物によるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の阻害はそれぞれ７１％(図７）および７３％(図８）であった。
【００８１】
上述のように、本発明のメリッサ葉抽出物は血管新生およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を阻害する。これに基づき、メリッサ葉抽出物を、血管新生−および／またはＭＭＰ−依存疾患の治療または予防のための新規な組成物として用いることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、マトリゲルで増殖したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成を示す図である。
【図２】図２は、２５μｇ／ｍｌのメリッサ葉抽出物で処理したＨＵＶＥＣを示す図である。
【図３】図３は、マウスマトリゲルモデルにおける血管新生に対するメリッサ葉抽出物の効果のグラフである。
【図４】図４は、マウスマトリゲルモデルにおけるメリッサ葉抽出物の経口投与による血管新生の阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、絨毛尿膜アッセイにおけるメリッサ葉抽出物の抗血管新生効果を示す図である（ａ：対照、ｂ：被処理）。
【図６】図６は、メリッサ葉抽出物によるＭＭＰ−１活性の阻害を示すグラフである。
【図７】図７は、メリッサ葉抽出物によるＭＭＰ−２活性の阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、メリッサ葉抽出物によるＭＭＰ−９活性の阻害を示すグラフである。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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