(57)【要約】本発明は、クルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１エンドペプチダーゼの容易に精製可能な可溶性変異体のサッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現および分泌、ならびに工業的応用で使用できる組換えタンパク質のインビトロプロセシングのためのその精製および使用に関する。ここで記述される可溶性のＫｅｘ１エンドプロテアーゼは、天然の酵素の膜貫通ドメインを含まず；膜貫通ドメインの欠失は、Ｃ末端から最低５７アミノ酸残基を除去することにより達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルイベロミセス　ラクティスのＫＥＸ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対応しかつ膜貫通ドメインを含まないアミノ酸配列を有する可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼ。
【請求項２】
最低５７アミノ酸残基がＣ末端から除去されている、請求項１に記載の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼ。
【請求項３】
最低５７かつ１００を越えないアミノ酸残基がＣ末端から除去されている、請求項１に記載の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼ。
【請求項４】
配列番号２の配列を有すること、もしくは配列番号２に関して９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性をもつ配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼ。
【請求項５】
請求項１に記載の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
最低５７アミノ酸残基がＣ末端から除去されている可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードする、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
最低５１かつ１００を越えないアミノ酸残基がＣ末端から除去されている可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードする、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
（ａ）配列番号１の配列を有すること、（ｂ）配列番号１にハイブリダイズする配列を有すること、（ｃ）遺伝暗号の結果として、配列番号１の配列を有するＤＮＡに縮重した配列を有すること、および／もしくは（ｄ）配列番号１に関して９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性をもつ配列を有することを特徴とする、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５ないし８のいずれか１つに記載のＤＮＡを含んで成るプラスミド発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
酵母細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
サッカロミセス　セレビシエ酵母細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
（ａ）目的のペプチドもしくはタンパク質の配列を含んで成りかつ目的のペプチドもしくはタンパク質のＮＨ２末端に請求項１ないし３に記載のエンドプロテアーゼにより加水分解可能なジペプチド部位を含有するアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドもしくはタンパク質の製造；（ｂ）請求項１ないし３に記載のエンドプロテアーゼの存在下での上記の段階（ａ）で挙げられた融合ポリペプチドもしくはタンパク質のインビトロインキュベーション；（ｃ）目的のペプチドもしくはタンパク質の分離および精製を含んで成る、ペプチドもしくはタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
加水分解可能なジペプチド部位が、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＡｒｇもしくはＰｒｏ−Ａｒｇであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドもしくはタンパク質が、例えばペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、成長因子、フィブリン溶解酵素のような治療的使用のための組換えタンパク質、および例えばリパーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、酸化酵素、ホスファターゼのような生物触媒として使用できる工業的目的の組換え酵素から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１ないし３に記載のエンドプロテアーゼが不溶性の有機もしくは無機支持体上に固定されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、工業的応用で使用できる組換えタンパク質のインビトロプロセシングで使用されるべき高い切断特異性を有する新規エンドペプチダーゼ、および、より具体的には、クルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１タンパク質の可溶性の分泌型誘導体、ならびに、融合タンパク質からの目的のタンパク質の遊離のための、可溶性の形態または不溶性の有機もしくは無機支持体上に固定された形態のそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の分野）
適する発現系での異種組換えタンパク質の製造は、組換えＤＮＡ技術の工業的目的の主応用の１つである。宿主細胞中でのペプチド／タンパク質の不安定性により、保護的（もしくは安定化する）タンパク質を含んで成る融合タンパク質の形態で目的のペプチド／タンパク質を製造することがしばしば有利であり、それはその後、所望のタンパク質もしくはペプチドを遊離させるために特異的な予め決められた部位でプロセシングされることができる。
【０００３】
その過程はまた、所望のタンパク質もしくはペプチドが、細菌の系で発現されるタンパク質の第一のアミノ酸残基を構成するＮ末端メチオニン残基の伸長を伴わずに得られることも可能にする。融合タンパク質はまた、発現レベルを増大させること、または、そのアミノもしくはカルボキシ末端に目的のタンパク質が結合される適するポリペプチド配列の選択により精製過程を助長することという目的をもっても製造される。
【０００４】
その戦略の成功は、下流のプロセシングの費用を低下させるように、理想的にはいかなる二次産物も放出することなく、所望のレベルの特異性をもつ融合タンパク質のプロセシングを遂げることができる化学的もしくは酵素試薬の利用可能性を必要とする。提案された化学的方法のうち、ＣＮＢｒを用いるメチオニン残基での切断、Ａｓｎ−Ｐｒｏジペプチドでの酸加水分解、もしくはＡｓｎ−Ｇｌｙジペプチドでのヒドロキシルアミンを用いる切断を挙げることができる（Ｆｏｎｔａｎａら；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａ　ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｐ．５５６９−５７５、１９８６）。酵素法は、例えば、リシンのカルボキシル端からペプチド結合を特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ（アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ）、およびグルタミン酸のカルボキシル端からペプチド結合を特異的に切断するブドウ球菌からのプロテアーゼＶ８（日本国特許広告広報第６−８７７８８号明細書）を利用する。しかしながら、それらの化学的方法およびエンドプロテアーゼは単一アミノ酸残基を認識するため、キメラタンパク質からの所望のペプチドの効率的な摘出を可能にするために、アミノ酸残基が所望のペプチド中に存在しないことが必要であり；従って、製造されることができるペプチドが制限される。従って、多様な研究が、工業的目的の組換えタンパク質のインビトロの特異的なタンパク質分解的切断におけるそれらの使用に適する基質特異性を有するプロテアーゼの探索および／もしくは工作に向けられた。より制限される、すなわちアミノ酸の配列（そして単一の残基でなく）を包含する切断配列を有する他のエンドプロテアーゼが使用されており、そして、例えばトロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼを包含する（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、５６９−５７５、１９９２）。
【０００５】
より最近、かなりの興味が、ズブチラーゼもしくはセリンプロテアーゼのファミリーのいくつかのメンバーに集中されており、そのより公知のメンバーは：（１）細菌のズブチリシン、（２）Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫｅｘ２プロテアーゼ、（３）フリンおよびフリン類似物タンパク質である。とりわけ、適して工作された変異体でを除き、細菌のズブチリシンは融合タンパク質のインビトロプロセシングに対する十分な切断特異性を表さない（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５、１３５７９−１３５８５、１９９６；米国特許第５，８３７，５１６号明細書）一方、Ｋｅｘ２タンパク質およびフリンの双方は目的上十分な切断特異性を表す。高い切断特異性を有するズブチラーゼ（下でケキシノ（ｋｅｘｉｎｏ）類似物プロテアーゼという用語により称されることができる）は「プロホルモン転化酵素（ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）」の分子／生理学的役割を演じ；すなわち、それらは、塩基残基の対、Ｌｙｓ−ＡｒｇもしくはＡｒｇ−ＡｒｇのＣ末端でのタンパク質分解的切断によりインビボでそれらの前駆体からペプチドホルモンを生じさせる酵素である。図１は、ケキシノ類似物プロテアーゼの構造を図解で示す。およそ３３０アミノ酸の間伸長するズブチリシン類似物触媒ドメインは、真核生物のプロタンパク質転化酵素の間で高度に保存されている。とりわけ、触媒三つ組残基（Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ）を構成する活性部位の残基、および遷移状態でオキシアニオン空洞（ｏｘｙａｎｉｏｎｉｃ　ｃａｖｉｔｙ）を安定化させるＡｓｎの残基が、ＰＣ２（Ａｓｎ残基がＡｓｐ残基により置換されている）を除いた全メンバー中で対応する位置に存在する（Ｂｒｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８３：３７４３−３７４５１９８６）。
【０００６】
それらの残基に隣接する配列もまた良好に保存されている。加えて、「ホモＢ」、「Ｐ」もしくは「中間（ｍｉｄｄｌｅ）」ドメインとして知られる触媒ドメインの後に続く１４０アミノ酸の領域もまた、酵母のプロテアーゼＫｅｘ２を包含する真核生物の転化酵素の間で良好に保存されているが、しかし、細菌のズブチリシンに存在しない。ホモＢドメインは触媒活性に不可欠である（Ｚｈｏｎｇら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、３９６：３１−３６．１９９６）。そのドメインは、インテグリンの認識配列に似ている保存されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含有する。ＰＣ１／ＰＣ３中のそれら３残基の１つの突然変異は、触媒活性の喪失、および構成する分泌経路へのその神経内分泌転化酵素の正しくない指図を引き起こす（Ｌｕｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３２６：７３７−７４４　１９９７）。別の保存された領域はプロペプチドであり、これはＡｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ部位を転化酵素の成熟の間にプロセシングすることにより自己触媒的に除去される。Ｃ末端に向かって、フリン、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６ＡおよびＢはＣｙｓの豊富なドメインを有し、これは良好に保存され、また、その役割はこれまで未知である。フリン、Ｋｅｘ２、ＰＣ５／ＰＣ６ＢおよびＬＰＣ／ＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７は、Ｃ末端近くに膜貫通ドメインもまた有する。
【０００７】
酵母サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫｅｘ２エンドプロテアーゼは立証された最初の酵素であり、それに対する遺伝子的および生化学的証明が、経ゴルジネットワーク（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ　ｎｅｔｗｏｒｋ）中で二塩基部位（ｄｉ−ｂａｓｅ　ｓｉｔｅ）でプロタンパク質をプロセシングという機能を帰することを可能にした。
【０００８】
ＫＥＸ２遺伝子は、１００から１２０ｋＤａまでの分子量をもつ８１４アミノ酸残基の糖タンパク質をコードする。その糖タンパク質は経ゴルジネットワークの膜に固定され、そして、α因子およびキラートキシンをプロセシングするという生理学的役割を有する。Ｋｅｘ２タンパク質は、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＡｒｇおよびＰｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端でペプチド結合を特異的に切断するカルシウム依存性プロテアーゼセリンである（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４４：８０７−８１４　１９８７）。Ｋｅｘ２のアミノ酸配列は、ＮＨ２末端部分に、潜在的自己タンパク質分解部位（Ｌｙｓ７９−Ａｒｇ８０、Ｐｒｏ１０２−Ａｒｇ１０３およびＬｙｓ１０８−Ａｒｇ１０９）を有するプレプロドメイン、次いで細菌のズブチラーゼとの高程度の配列の相同性（３０％の同一性）を有する領域（１４４−４３８ａａ）を含有する（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５６：２４６−２５４　１９８８；Ｆｕｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１４３４−１４３８　１９８９）。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＡＴα細胞中で不活性の前駆体として発現され、そして成熟した形態のＮＨ２末端領域が、Ｌｙｓ１０８−Ａｒｇ１０９部位でのタンパク質分解性プロセシング、次いでジペプチジルアミノペプチダーゼ酵素Ｓｔｅ１３によるジペプチドＬｅｕ−ＰｒｏおよびＶａｌ−Ｐｒｏのタンパク質分解性切断により生じられる（ＢｒｅｎｎｅｒとＦｕｌｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９２２−９２６　１９９２）。
【０００９】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の触媒的に活性のＫｅｘ２プロテアーゼを、ＣＯＯＨ末端の膜貫通ドメインの前への終止コドンの挿入により生成される分泌型可溶性酵素（ｓｓ−Ｋｅｘ２）として酵母から精製した。この改変は該酵素の精製を助長した。精製されたｓｓＫｅｘ−２　Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）プロテアーゼの基質特異性に関する研究は、該プロテアーゼがＡｓｐおよびＰｒｏを除いてＰ３位置のいかなる残基も排除しないが、しかし、他方、Ｐ２およびＰ１位置のアミノ酸について選択的であることを立証した。とりわけ、Ｐ２位置のＫｅｘ２は、嵩高い鎖を有するアミノ酸を排除するとみられるが、しかし、しかしながら正に荷電した残基を有するものを認識するとみられる一方、Ｐ１位置においては、Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼは、アルギニンの電荷および構造の双方についてきわめて選択的である。欧州特許第ＥＰ−３２７３７７号明細書は、Ｃ末端の疎水性領域を含まないＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫｅｘ２プロテアーゼを記述し；それらのプロテアーゼは水中で可溶性でありかつ細胞の外側に分泌されることができ、天然のタンパク質の酵素活性を変えられないままとする。
【００１０】
（発明の詳細な記述）
クルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のいくつかの株は、多様な種の酵母の感受性細胞を殺すことが可能なトキシンを分泌するキラー表現型（ｋｉｌｌｅｒ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を表す。そのキラー特性は、協同してトキシンおよびその免疫を可能にする成分を産生する直鎖状ＤＮＡの２種のプラスミド、ｐＧＫＬ１およびｐＧＫＬ２の存在による。突然変異（ｋｅｘ１）を、ＫＥＸ１と呼ばれるＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）染色体の単一の遺伝子座で単離し、その突然変異は、前述のプラスミドが維持されることを可能にしつつ、キラー表現型の喪失に至る。
【００１１】
前述の突然変異の遺伝子補完によりクローン化され、遺伝子ＫＥＸ１はサッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＫＥＸ２に対して類似（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）であることが見出された。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＫＥＸ２およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＫＥＸ１によりコードされるタンパク質は、高程度の配列の相同性（＞５０％の同一性）を有し、また、それらのそれぞれは他方の欠乏を補償することが可能である。その情報は、クルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫＥＸ１遺伝子（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌら　Ｙｅａｓｔ　４：７１−８１　１９８８）が、二塩基残基に対する切断特異性を有しかつその前駆体をプロセシングすることにより生じられる成熟した形態のキラートキシンの産生に関与するプロテアーゼもまたコードすることを示唆する。しかしながら、ＫＥＸ１遺伝子の産物の発現に関するデータはこれまで入手可能でなく、また、そのタンパク質の生化学的および酵素的特徴づけに関するいかなるデータも入手可能でない。
【００１２】
膜貫通ドメインを含まず（かつｓｓ−Ｋｅｘ１という用語により称されることができる）、また、Ｐｒｏ−Ａｒｇ残基および二塩基残基を含有する基質に関しての、とりわけＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基に対するインビトロエンドペプチダーゼ触媒活性を明示する、本発明の主題を構成するＫ．ラクティス（Ｋ．Ｌａｃｔｉｓ）の組換えＫｅｘ１プロテアーゼが、今や見出された。そのタンパク質配列が、膜に固定するためのドメインを含んで成る欠失を除いて（おそらく膜に固定するためのドメインを含んで成る欠失を除いて）Ｋ．ラクティス（Ｋ．Ｌａｃｔｉｓ）のＫＥＸ１遺伝子によりコードされるものに対応する、それらの組換えＫｅｘ１プロテアーゼは、そのタンパク質配列がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子によりコードされるものに対応する同一ファミリーのタンパク質に比較して実質的により大きな熱安定性を立証することもまた、驚くべきことに見出され、その結果、それらはケキシンファミリーの他のタンパク質、とりわけＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＫｅｘ２が不活性化される条件下でのインビトロの標的を定められたタンパク質分解の過程で使用することができる。
【００１３】
本発明の可溶性Ｋｅｘ１プロテアーゼは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子によりコードされる対応する変異体に比較してより大きな安定性を特徴とし、可溶性のＫｅｘ１プロテアーゼは、Ｋｅｘ２タンパク質が完全に不活性化される条件下でそれらの活性の５０％以上を保存する。
【００１４】
以下から認識されるであろうとおり、本発明の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼにおいて、膜貫通ドメインの欠失は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＫＥＸ１遺伝子によりコードされる酵素のＣ末端から最低５７アミノ酸残基を除去することにより達成され；本発明の好ましい態様において、最低５７および１００を越えないアミノ酸残基がＣ末端から除去され；実験的に使用される遺伝子配列は、受託番号Ｘ０７０３８でＥＭＢＬデータバンクから入手可能なものである。
【００１５】
とりわけ、本発明の好ましい態様の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼは、配列、配列番号２を有すること、もしくは、いずれにせよ、配列番号２に関して９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性をもつ配列を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の第二の目的は、本発明の可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードする、および、とりわけ、最低５７アミノ酸残基がＣ末端から除去されている可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードする、ならびに、好ましくは、最低５１かつ１００を越えないアミノ酸残基がＣ末端から除去されている可溶性Ｋｅｘ１エンドプロテアーゼをコードするＤＮＡ分子により表される。
【００１７】
好ましい一態様によれば、前記ＤＮＡ分子は、（ａ）配列番号１の配列を有すること、（ｂ）配列番号１にハイブリダイズする配列を有すること、（ｃ）遺伝暗号の結果として、配列番号１の配列を有するＤＮＡに縮重した配列を有すること、および／もしくは（ｄ）配列番号１に関して９０％の相同性、好ましくは９５％の相同性をもつ配列を有することを特徴とする。
【００１８】
本発明のさらなる一目的は：
（ａ）型ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨ（ここで、ＮＨ２は該融合ポリペプチドもしくはタンパク質のＮＨ２末端であり、Ａはいずれかの所望のタンパク質もしくはポリペプチド（場合によっては翻訳の開始コドンによりコードされるメチオニンのみ）であり、Ｂは本発明のＫｅｘ１エンドプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列で終端する結合する「リンカー」フラグメントであり、Ｃは目的のポリペプチドもしくはタンパク質を表し、その結果、目的の成熟タンパク質の第一のアミノ酸が本発明のＫｅｘ１エンドプロテアーゼにより認識される配列のすぐカルボキシル端にあり、かつ、ＣＯＯＨは該融合ポリペプチドもしくはタンパク質のカルボキシ末端を表す）の構築物中に目的のペプチドもしくはタンパク質の配列を含んで成る融合ポリペプチドもしくはタンパク質の製造；
（ｂ）目的のタンパク質もしくはポリペプチドを融合パートナーから分離するための、かつ、目的のポリペプチドもしくはタンパク質のＮＨ２末端に対応する遊離ＨＮ２末端をもつ、本発明のＫｅｘ１エンドプロテアーゼの存在下での上の段階（ａ）で挙げられた融合ポリペプチドもしくはタンパク質のインビトロインキュベーション；
（ｃ）目的の生物学的に活性のペプチドもしくはタンパク質の分離および精製
を含んで成る、目的の生物学的有効成分（ペプチドもしくはタンパク質）の製造方法により構成される。
【００１９】
上に列挙された操作（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実施するための手順は当該技術分野で公知であり、そして従って詳細に説明される必要はなく；それらは、例えば、文書、欧州特許第ＥＰ−３２７３７７号、同第ＥＰ−７９４２５４号、同第ＥＰ−７９４２５５号および米国特許第ＵＳ−５，０７７，２０４号明細書（それらの内容は本記述の不可欠の一部分とみなされるべきである）に記述される。
【００２０】
本発明のエンドプロテアーゼは、工業的および／もしくは治療的目的のペプチドもしくはタンパク質を含有する融合タンパク質をプロセシングするために使用することができ；本発明の方法を使用して得ることができる可能なタンパク質は、例えば、例えばペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、成長因子、フィブリン溶解酵素のような治療的使用のための組換えタンパク質、および例えばリパーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、酸化酵素、ホスファターゼのような生物触媒として使用することができる工業的目的の組換え酵素である。
【００２１】
本発明の他の目的は、前述のプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列、対応する発現プラスミド、およびそれらを含有する宿主細胞により表される。
【００２２】
本発明のクルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１プロテアーゼは、サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母中で発現されるべき膜に固定するためのドメインを含まないＫｅｘ１プロテアーゼの変異体をもたらすことにより得た。ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼの成長培地中での分泌は、相同なプレプロ領域、もしくはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の相同なＫｅｘ２タンパク質のプレプロ領域のいずれかによって、ならびにサッカロミセス　セレビシエ　バリエタス　ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）のグルコアミラーゼの（プレ）シグナル配列のおかげで、達成された。それらの研究により、Ｋｅｘ１およびＫｅｘ２の触媒ドメインが、残基５８０で終端するＫｅｘ１タンパク質が残基５９３（Ｋｅｘ２タンパク質中の対応する残基である）で終端するＫｅｘ２タンパク質と異なり触媒的に不活性である（Ｇｌｕｓｃｈａｎｋｏｆら、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１３：２２８０−２２８８　１９９４）という観察結果により立証されるような機能の差異を有することが、驚くべきことに見出された。フラスコ中でのプロテアーゼの産生および分泌により適した成長条件もまた探究された。
【００２３】
可溶性のＫｅｘ１を成長培地から精製し、そして、モデル基質での切断効率、ならびに温度のような多様な物理化学的作用因の存在下での安定性および触媒活性を包含するそれらの生化学的特徴のいくつかを決定した。
【００２４】
そうして得られたｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼはそれ自体使用することができるか、または不溶性の有機もしくは無機マトリックス上に固定することができ；そうして固定されたプロテアーゼは、明白な利点を伴い、工業的目的の融合タンパク質のインビトロプロセシングで数回再使用することができる。
【００２５】
新規可溶性分泌型ｓｓ−Ｋｅｘ１エンドペプチダーゼの熱安定性は、それらが５０℃で６分間のインキュベーション（その条件下で、対応するＫｅｘ２タンパク質はそれらの活性を完全に喪失する）後にそれらの元の活性のおよそ６０％もしくはそれ以上を維持するようである。
【００２６】
本発明の新規ｓｓ−Ｋｅｘ１エンドペプチダーゼの推定される分子量は、サンプルの加熱および還元後にＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で決定されるとおり、およそ６５から７０ｋＤａまで（株ＮＰ３１から産生される酵素）および７０から８０ｋＤａまで（株ＮＰ１６８から産生される酵素）である。
【００２７】
本発明は、特定の実施例により下に説明することができる。該実施例は本発明を解明するという単独の目的を有するが、とは言え本発明はいかなる方法でもそれにより制限されないことが認識されるべきである。
実施例
実施例１
サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのクルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）からのＫｅｘ１の発現のためのプラスミドの構築
別の方法で示されない限り、慣習的手順を組換えＤＮＡの全部の標準的操作に使用した。それらの手順の収集物は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇに与えられる。
【００２８】
多様なシグナル配列の制御下でＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１プロテアーゼのＣＯＯＨ末端領域の短縮された変異体のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためのプラスミドを構築するために、適する突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを実施し、標準的サブクローニング手順が後に続いた。本発明で使用された発現ベクターは、ｐＥＭＢＬｙｅｘ４（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ　Ｊ．、６：２２９−２３４　１９８７）、ｐＶＴＵ（Ｖｅｒｎｅｔら、Ｇｅｎｅ　５２：２２５−２３３　１９８７）およびＹＥＰＳＴＡ（Ｍａｒｔｅｇａｎｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：６０４−６０８　１９９２）であった。それらの誘導体からのケキシンを発現するプラスミドを表１に列挙する。その表中に示される情報に基づき、過度の実験なしに前述のプラスミドを構築することが当業者に可能であろう。本特許において、タンパク質および核酸の以下の配列に言及がなされる：（ＫＥＸ１遺伝子、ＥＭＢＬ受託番号Ｘ０７３８；Ｋｅｘ１タンパク質、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）受託番号０９２３１；ＫＥＸ２遺伝子ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２２８７０；Ｋｅｘ２タンパク質、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）受託番号Ｐ１３１３４）。以下の本文において、ヌクレオチドの１は、プロテアーゼをコードする各所定の遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に対応するアデニンヌクレオチド（Ａ）を指し；同様に、アミノ酸の１は、前記開始コドンによりコードされるメチオニンを指す。Ｋｅｘ２について上に示された記述に類似に、本発明に記述される可溶性かつ酵素的に活性の成熟した形態のＫｅｘ１は、最初に不活性のプレプロタンパク質の形態で発現され、それがその後Ｌｙｓ１０１−Ａｒｇ１０２部位（相同なプロタンパク質を使用する場合）もしくはＬｙｓ−１１３−Ａｒｇ−１１４部位（ｋｅｘ２プロタンパク質を使用する場合）でプロセシングされる。本発明の目的上、可溶性かつ酵素的に活性の成熟した形態のＫｅｘ１は、図２に示される配列のアミノ酸１０３とアミノ酸６４３との間のポリペプチド鎖を有することを特徴とし、また、ｓｓ−Ｋｅｘ１−Ｃｘの用語法（ここで、ｘは、可溶性の形態のＫｅｘ１のカルボキシ末端残基を構成する図２の配列のアミノ酸残基を表す）により示される。純粋に例として、Ｋｅｘ１−Ｃ６００プロテアーゼを発現するＰＬ２４プラスミドの構築を詳細に示す。ＤＮＡ配列が既知であるため、それらのプラスミドの構築は当業者の通常の能力内にあり、そして例示されるものと異なるがしかし期待される生成物（１種もしくは複数）を得ることに関して同等である戦略および技術によってもまた実施することができる。
【００２９】
アミノ酸６００（その残基はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子によりコードされるＫｅｘ２タンパク質中のアミノ酸６１３に対応する）で短縮されたＫｅｘ１−Ｃ６００の発現のためのプラスミドを構築するために、Ｋｅｘ１の残基１−６００をコードする配列を、下に示されるオリゴヌクレオチド（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を構成するヌクレオチドに下線をつける）：
５’ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＣＴＡ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　Ｃ３’
５’Ｃ　ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＴＴＣ　ＡＧＣ　ＡＴＣ　ＣＴＣ　ＴＴＴ　ＧＴＣ３’
を用いるＰＣＲによって増幅した。
【００３０】
ＰＣＲの終了時に、増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの制限にかけ、調製的電気泳動の後にアガロースゲルから精製し、そして前もってＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にされていた発現ベクターｐＥＭＢＬｙｅｘ４にサブクローニングし、かように、Ｋｅｘ１−Ｃ６００タンパク質が誘導可能なハイブリッドプロモーターＧＡＬ１−１０−ＣＹＣ１の制御下に酵母中で発現されることを可能にするプラスミドｐＬ２４が得られることを可能にする。
【００３１】
【表１】
2004513655.tif 000002
【００３２】
実施例２
サッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でのクルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１タンパク質の発現および分泌
多様な株のＳ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、触媒的に活性かつ可溶性の分泌される形態のＫ．ラクティス（Ｋ．Ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１プロテアーゼの発現を得るために、上述された構築物を使用して形質転換した。ＧＲＦ１８＊（ＭＡＴαｈｉｓ　３−１１、１５　ｌｅｕ２−３、１１２　ｕｒａ３）；Ｘ４００４（ＭＡＴａ　ｌｙｓ５　ｍｅｔ２　ｕｒａ３　ｔｒｐ１）；ＭＶＹ４９３５（ＭＡＴα　ｓｔａ１０　ｌｅｕ２　ｕｒａ３　ａｒｇ４　ｈｉｓ３　ｌｙｓ２）；Ｗ３０３　１−ａ（ＭＡＴａ　ｌｅｕ２−３、１１２　ｕｒａ３−１　ｔｒｐ１−１　ｈｉｓ３−１１，１５　ａｄｅ２−１　ｃａｎ１−１００　ＧＡＬ　ＳＵＣ２）。使用された形質転換方法はＳｃｈｉｅｓｔｌとＧｉｅｔｚ（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３３９−２４６に記述されるものである。液体培地中で酵母を成長させるために使用されたフラスコを、継続的にダブノフ（Ｄｕｂｎｏｆｆ）サーモスタット浴中でインキュベートしかつ攪拌した。プレート上での成長は、適するインキュベーター中、湿気のある雰囲気中で実施した。酵母に関しての方法論について、方法を明確に記述しない場合はいつでも、Ｃ．ＧｕｔｈｒｉｅとＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９４が引用されるべきである。
【００３３】
形質転換された細胞を、炭素源としてブドウ糖を含む選択最小培地（ＹＮＢ）上でプレート培養し、そして３０℃でインキュベートした。それらの条件下で、工作された細胞は、目的のタンパク質を産生することなく成長する。ｐＥＭＢＬｙｅｘ４類似物ベクターに基づく発現系はガラクトースにより誘導することができる。目的のタンパク質は誘導可能なハイブリッドプロモーターＧＡＬ−ＣＹＣの制御下に置かれ、また、培地中のブドウ糖の存在が発現の抑制の状態をもたらすからである。その系は、活性化を可能にするための炭素源としてのラフィノースの使用、および誘導状態を確実にするためのガラクトースの使用を提供する。加えて、選択マーカーｌｅｕ２ｄを提供されたｐＥＭＢＬｙｅｘ４類似物ベクターに基づく発現系は、目的のプラスミドのコピー数をさらに増幅させるという可能性を提供し、形質転換された株の遺伝子型により可能にされる場合は、ロイシンを含まない最小培地中での選択に頼ることを有する。
【００３４】
形質転換された株は、以下の培地中で成長させた：
ＹＰ豊富培地：炭素源２０ｇ／ｌ；ペプトン２０ｇ／ｌ；酵母抽出物１０ｇ／ｌ。
ＹＮＢ−ａａ最小培地：炭素源２０ｇ／ｌ；アミノ酸を含まないＹＮＢ　６．７ｇ／ｌ。
標準１０４０培地：アミノ酸を含まずかつ硫酸アンモニウムを含まないＹＮＢ　１．７ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．３２ｇ／ｌ；ＮＨ４Ｃｌ　５．０ｇ／ｌ；ＢＩＳ−ＴＲＩＳ　８．３７ｇ／ｌ：炭素源２０ｇ／ｌ；Ｌ−トリプトファン０．１２ｇ／ｌ；アデニン−ＨＣｌ　０．２４ｇ／ｌ；カザミノ酸５．０ｇ／ｌ。必要とされる場合は培地を２％アガーで固化した。ヌクレオチド塩基およびアミノ酸を５０ｍｇ／ｌまで添加する。
【００３５】
それらの形質転換された株の培地を活性測定にかけて、触媒的に活性の分泌された形態の目的のプロテアーゼの存在を証明した。酵素活性は、基質Ｚ−Ｌ−チロシン−Ｌ−リシン−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｚ−Ｙ−Ｋ−Ｒ−ｐＮＡ）を加水分解する該酵素の能力を活用する比色試験により測定した。インキュベーション混合物は、３７℃で１．５ｍｌの総容量中の０．２Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０および１ｍＭ　ＣａＣｌ２中に０．１ｍＭのＺ−Ｙ−Ｋ−Ｒ−ｐＮＡを含んで成る。反応を４０５ｎｍ（１０．９ｍＭ−１ｃｍ−１に等しいモル吸光係数（Δε）の最大の減少が起こる波長）でモニターする。１酵素単位は、上述された条件下で１分あたり１μモルの基質の変換を触媒する酵素の量であると定義する。別の方法で明白に示されない限り、表２に提示されるデータは、攪拌（２２０ｒｐｍ）を伴い３０℃で１０４０培地−２％ガラクトース（培地に添加された炭素源が２％ブドウ糖であった株ＮＰ２５５およびＮＰ２６５を除く）中、フラスコ中で成長されたＷ３０３株の誘導体により成長培地中に分泌された活性を指す。多様なサンプルを、各株の成長曲線に沿って採取した。表２は、各形質転換された株について測定された最大活性を示す。見ることができるとおり、良好なレベルの分泌は、Ｋｅｘ１の発現がＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターにより導かれる場合、およびデヒドロゲナーゼアルコールのプロモーターを使用する場合の双方で観察される。本発明は、従って、本発明のエンドプロテアーゼの分泌のレベルが満足すべきである限りは、使用されるプロモーターの型により制限されない。
【００３６】
【表２】
2004513655.tif 000003
【００３７】
Ｋｅｘ２のものによるＫｅｘ１のプレプロ配列の置き換えが、それ自身のプレプロ配列を使用したＫｅｘ１タンパク質とちょうど同じくらい良好に成長培地中に分泌されたタンパク質をもたらしたことが見出された。逆に、サッカロミセス　セレビシエ　バリエタス　ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｖａｒ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）（株ＮＰ３３）のＳＴＡ２遺伝子によりコードされるグルコアミラーゼのシグナル配列、もしくはＫｅｘ２のシグナル配列（株ＮＰ１５７）によるプレ配列単独（シグナル配列）の置き換えは、Ｋｅｘ１タンパク質の低下された分泌をもたらした。従って、以下の実施例で記述される実験において、その分泌がＫｅｘ１もしくはＫｅｘ２のプレプロ配列により導かれたタンパク質を利用した（それぞれ株ＮＰ３１およびＮＰ２３１）。
【００３８】
アミノ酸５８０で終端するＫｅｘ１を発現する株ＮＰ１１５が検出可能な酵素活性を表さないことが、驚くべきことに見出された。この結果は、アミノ酸５９３、すなわちＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１のアミノ酸５８０に対応するＫｅｘ２のアミノ酸で終端するＫｅｘ２タンパク質の部分での酵素活性の維持とよい対照をなす（Ｇｌｕｓｃｈａｎｋｏｆら、上記、整列について図２もまた参照されたい）。この結果は、高レベルの相同性にもかかわらず、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のタンパク質Ｋｅｘ１およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫｅｘ２は、それらが本発明の態様に関する全部の局面で同等物とみなすことができないように相互とかなり異なることを意味する。この点に関して、それぞれ図３および４に示される、比較的な熱安定性データ、および温度の関数としての活性プロフィルにもまた注意を払うべきである。株ＮＰ３１に存在するタンパク質と比較して、株ＮＰ１８０、ＮＰ１８３、ＮＰ１６６およびＮＰ１６８は、膜貫通ドメインの直前で停止するセリン／トレオニンが豊富なドメイン全体にわたることが可能であるカルボキシ末端の伸長を有する。株ＮＰ３１と比較した有意の差異は、前述の株により成長培地中に分泌されるＫｅｘ１活性において観察されない。
実施例３
適して形質転換されたサッカロミセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株により成長培地中に分泌されるクルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１タンパク質の精製。
【００３９】
Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１プロテアーゼの欠失変異体ｓｓ−Ｋｅｘ１−Ｃ６００の精製を、後期指数期までフラスコもしくは醗酵槽中で成長されたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換された株から出発して実施した。双方の場合において、培地を遠心分離により細胞から分離し、５μｍの孔を有するフィルターで濾過し、そしてその後およそ１０倍濃縮し、そして１０ｋＤａのカットオフをもつメンブレン上での限外濾過により、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００　０．１％−ＣａＣｌ２　４ｍＭの溶液に対し透析した。透析された溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．２で予め平衡化されたＳＰ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）樹脂のカラム上で精製し、そしてトリス−酢酸緩衝液中のｐＨの直線勾配によって溶出した。ｋｅｘ１の酵素活性を含有する画分を、ビストリス−酢酸緩衝液で予め平衡化されたＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）樹脂のカラム上に導入し、そしてＮａＣｌの直線勾配によって溶出した。ｋｅｘ１の酵素活性を含有する画分のプールをＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、５５℃の温度でヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）−Ｃ１８カラム、２．１×２５０ｍｍを使用しかつ２１５ｎｍの波長でのＵＶ検出を用いて実施し；溶出は、２１分で移動相Ｂ（アセトニトリル中０．０８％トリフルオロ酢酸）の３７％から８７％までの直線勾配を伴う移動相Ａ（水中０．１％トリフルオロ酢酸）およびＢから出発する０．２１ｍｌ／分の流量で実施した。分析は、９５％以上の純度（図５）およびおよそ１００Ｕ／ｍｇの比活性を伴う均一なピークの存在を立証した。
実施例４
クルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１タンパク質の特徴づけ
動力学的定数は、測定を基質の単一の初期濃度でかつ基質が使い果たされるまで実施することを必要とする単純化された手順により決定した。該方法は、多様な時点で、残余の濃度および速度の平均値が測定されることを提供し、そして、酵素が該操作条件下で完全に不可逆的な反応を触媒する場合に応用可能であり、また、生成物による阻害にさらされない（Ｓｅｇｅｌ、Ｉ．Ｈ．（１９７５）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク）。そうして得られた結果を、ミカエリス−メンテンプロフィルの内挿ならびに表３に提示されるＫｍおよびＶｍａｘの値の決定を可能にしたＧｒａｆｉｔプログラムを使用して処理した。その後、ｋｃａｔおよびｋｃａｔ／Ｋｍ比を、それらの値および酵素濃度から得た。結果は、２種のプロテアーゼ、ｓｓ−Ｋｅｘ１およびｓｓ−Ｋｅｘ２がそれらの動力学的特性において有意に異ならないことを示す。
【００４０】
【表３】
2004513655.tif 000004
【００４１】
生物触媒としての工業的応用に必要とされる酵素の主な特徴のうち、操作条件下での安定性は、決定的に、最も重要なものの１つである。従って、その観点からもまた２種のプロテアーゼを検討かつ特徴づけすることが必要であることが認識されるであろう。われわれは、最初に、いかなる安定剤の非存在下でも、多様な温度で２種の酵素の熱不活性化プロフィルを決定した。該プロフィルは、酵素を予め決められた温度でインキュベートすること、連続的時点でサンプルを採取すること、およびサンプル中の残余の酵素活性を測定することにより得た。時間の関数としての活性の低下（この活性は活性の酵素の濃度に比例すると想定される）をかように決定する。
【００４２】
２種のプロテアーゼの不活性化プロフィルを１０から５０℃までの温度で遂げた。データを図３に示し、そして、驚くべきことに、ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼがｓｓ−Ｋｅｘ２プロテアーゼのものより有意により高い熱安定性を有することを示す。すなわち、例として、後者は５０℃での６分のインキュベーション後にほぼ完全に不活性化された一方、同一条件下で、Ｋｅｘ１は５０％より少なくないその活性を維持した。６０℃および７０℃でのＫｅｘ１プロテアーゼの不活性化プロフィル、ならびに比較のための５０℃でのＫｅｘ２のものもまた、該２種の分子の間の熱安定性の実質的な差異を示す。すなわち、ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼは、７０℃で、５０℃のｓｓ−Ｋｅｘ２タンパク質とおよそ同じくらい安定であることが明らかである。ｓｓ−Ｋｅｘ１およびｓｓ−Ｋｅｘ２を、飽和濃度の基質を用いかつ反応の最初の５分での平均速度を測定することにより、標準的条件下で添加した場合、Ｋｅｘ１タンパク質はおよそ７０℃の至適機能温度を表した一方、同一条件下で、Ｋｅｘ２エンドペプチダーゼの見かけの至適作用温度はおよそ５０℃であった（図４）。
実施例５
融合タンパク質のプロセシングにおけるクルイベロミセス　ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）のＫｅｘ１タンパク質の使用。
【００４３】
融合タンパク質のプロセシングを、モデルタンパク質として、カルボキシ末端にＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドを担持する３５アミノ酸のペプチド配列とヒト成長ホルモン（ｈ−ＧＨ）の１９１アミノ酸残基の配列との間の融合物を使用して研究した。構造（ペプチド部分）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−（ｈ−ＧＨ）を有する融合タンパク質は、形質転換された株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、抽出し、そして７０％より高い純度の程度まで精製しておいた。融合タンパク質（１グラム／リットル）の加水分解を、３０℃の温度で４ｍＭのＣａ２＋を含有するｐＨ７の緩衝液中、かつ、０．２ｍｇ／リットルの精製されたｓｓ−Ｋｅｘ１６００ΔＣ調製物を使用して、１８時間の総期間の間実施した。反応の進行はＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりモニターし、それは９５％より高い反応収率を示し（図６）；加水分解の特異性は反応生成物のＮＨ２末端配列の分析によりチェックし、それはｈ−ＧＨの期待された配列を示した。類似の結果が、ｈ−ＧＨを異なる長さ（２０から３００アミノ酸残基まで）のポリペプチドに融合した場合に得られた。
実施例６
Ｋｅｘ１プロテアーゼの固定および融合タンパク質のプロセシングにおけるその使用
ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼを、無機固体支持体として、そのエポキシ基が酵素のアミノ、チオールもしくはヒドロキシル基との共有結合の形成のための反応基として作用するユーペルギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）Ｃ２５０Ｌ樹脂を使用して固定した。それは酵素の構造の可撓性を低下させ、そして従ってその安定化を促進するはずである。インキュベーション混合物は、攪拌なしで周囲温度で４日間、５５μｌの総容量中に、８ｍｇのユーペルギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）Ｃ２５０Ｌ樹脂の存在下、１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０中に７８９μｇの酵素を含んで成る。インキュベーション期間の終了時に、固定された酵素を、投与緩衝液（ｄｏｓａｇｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、Ｈｅｐｅｓ　０．２Ｍ　ｐＨ７．０＋ＣａＣｌ２　１ｍＭを用いる連続的洗浄操作にかけ、そして、０．２Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、１ｍＭ　ＣａＣｌ２／６０％グリセロールの溶液の存在下、４℃で保存する。
【００４４】
固定されたＫｅｘ１タンパク質を、融合タンパク質ＰＮＰ２０ａａ−ｈＧＨのプロセシングで使用し、後者を固定された酵素と１０：１の比で３７℃でインキュベートした。それらの条件下で、タンパク質のプロセシングを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１０分から１５時間までの期間の間継続した。６時間のインキュベーション後に、融合されたタンパク質のおよそ６０％に等しい消化を得、そしてほぼ完全な消化を１５時間後に得る（図７）。同一の操作条件下での固定されたＫｅｘ１プロテアーゼの同一調製物のその後の再使用は、前の結果に実質的に同一の結果をもたらし、かように、採用された条件下で固定されたＫｅｘ１プロテアーゼが３７℃での３０時間のインキュベーション後でさえ認めうるほどに活性を喪失せず、また、融合パートナーからの目的のタンパク質の遊離で再使用することができることを立証する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、Ｋｅｘ２タンパク質のドメイン中の構造の構成、典型的表示、およびケキシノ類似物をプロセシングするズブチラーゼのファミリーの最初に同定されたメンバーを示す。
【図２】
発明にかかる、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＫｅｘ２およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からのＫｅｘ１のタンパク質配列の整列を示す。
【図３】
発明にかかる、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのプロテアーゼｓｓ−Ｋｅｘ２およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からのｓｓ−Ｋｅｘ１の熱安定性を示す。
【図４】
発明にかかる、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのプロテアーゼｓｓ−Ｋｅｘ２およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からのｓｓ−Ｋｅｘ１の温度の関数としての活性プロフィルを示す。
【図５】
発明にかかる、本発明の可溶性ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼの精製された調製物のＲＰ−ＨＰＬＣでの溶出プロフィルを示す。
【図６】
発明にかかる、本発明の可溶性ｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼを用いて得られた融合タンパク質のインビトロ消化の動力学を示す。
【図７】
発明にかかる、本発明の固定されたｓｓ−Ｋｅｘ１プロテアーゼを用いて得られた融合タンパク質のインビトロ消化プロフィルを示す。
【図１】
2004513655.tif 000005
【図２】
2004513655.tif 000006
【図３】
2004513655.tif 000007
【図４】
2004513655.tif 000008
【図５】
2004513655.tif 000009
【図６】
2004513655.tif 000010
【図７】
2004513655.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004513655.tif 000012
2004513655.tif 000013
2004513655.tif 000014
2004513655.tif 000015
2004513655.tif 000016
2004513655.tif 000017
2004513655.tif 000018
2004513655.tif 000019
2004513655.tif 000020
2004513655.tif 000021
2004513655.tif 000022
2004513655.tif 000023
2004513655.tif 000024
2004513655.tif 000025
2004513655.tif 000026
2004513655.tif 000027
2004513655.tif 000028
2004513655.tif 000029
2004513655.tif 000030
2004513655.tif 000031
2004513655.tif 000032
2004513655.tif 000033
2004513655.tif 000034
2004513655.tif 000035
2004513655.tif 000036
2004513655.tif 000037
2004513655.tif 000038
2004513655.tif 000039
2004513655.tif 000040
2004513655.tif 000041
2004513655.tif 000042
2004513655.tif 000043
2004513655.tif 000044
2004513655.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513655.tif 000046
【国際調査報告】
2004513655.tif 000047
2004513655.tif 000048
2004513655.tif 000049
2004513655.tif 000050