(57)【要約】本発明の課題は、抗アテローム動脈硬化性を有する物質のスクリーニングに対するＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、または代りに機能的同一物の使用である。本発明はまた、ＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメントを使用して、抗アテローム動脈硬化性を有する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、ＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、並びにアポＣ−ＩＩＩへのそれらの効果を使用して抗アテローム動脈硬化性を有する物質の作用機構を特徴付けたり、正当化したり、特許請求するために本発明に記載のスクリーニング方法を使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アテローム性動脈硬化症活性を有する物質のスクリーニングのためのＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、または代りにそれらの機能的同等物の使用。
【請求項２】
ＲＯＲ受容体およびＲＯＲ受容体の応答エレメントが、ＲＯＲα受容体またはＲＯＲα受容体の応答エレメントであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
試験物質がＲＯＲファミリーの受容体、および／またはＲＯＲ受容体の応答エレメント、および／またはＲＯＲをＲＮＡポリメラーゼ複合体に機能的に共役することのできる核因子、またはそれらの機能的同等物と接触させられ、次いでいずれかの適当な方法：
−  該物質の、ＲＯＲ受容体、および／またはその機能的同等物への結合、または該物質とＲＯＲ受容体で形成される複合体のその応答エレメントおよび／またはＲＯＲをＲＮＡポリメラーゼ複合体に機能的に共役することのできる核因子への結合、および／または
−  該応答エレメントを含むプロモーターのコントロール下に置かれた遺伝子の転写活性の調節、
によって測定することを特徴とする、脂質代謝機能障害の治療に有用な物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
以下の工程、即ち
ａ）  細胞ホストを、ＲＯＲ受容体をコードするＤＮＡフラグメントまたはその機能的同等物のひとつでトランスフェクトし、
ｂ）  工程（ａ）のホストを、該ＲＯＲ受容体の応答エレメントおよび少なくとも１つのリポーター遺伝子を含む構築物でコトランスフェクトし、
ｃ）  試験物質の存在下でのリポーター遺伝子の発現を何らかの適当な方法で測定する、
ことを含むことを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の工程、即ち
ａ）  リポーター遺伝子の発現をコントロールするように置かれた強い異種プロモーターの上流にクローン化したＲＯＲによって認識される、応答エレメントの複数のコピーを含むプラスミドを作成し、
ｂ）  工程（ａ）の構築物をＲＯＲを発現する細胞に自然に、または人工的にトランスフェクトし、
ｃ）  工程（ ｂ）のホストを試験物質の存在下で培養し、
ｄ）  リポーター遺伝子の活性を適当な方法によって測定する、
ことを含むことを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
以下の工程、即ち
ａ）  選択的な遺伝子の発現をコントロールするプロモーターの上流でクローン化したＲＯＲによって認識される応答エレメントの複数のコピーを含むプラスミドを作成し、
ｂ）  工程（ａ）の構築物を細胞ホストにトランスフェクトし、
ｃ）  工程（ｂ）のホストをＲＯＲを発現するベクターによりコトランスフェクトし、
ｄ）  工程（ｃ）のホストを試験物質の存在下で培養し、
ｅ）  毒性プロドラッグの存在下での、細胞の生存をなんらかの適当な方法によって測定する、
ことを含むことを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の工程、即ち
ａ）  リポーター遺伝子の活性をコントロールする強いプロモーターの上流でクローン化した酵母核因子Ｇａ１４によって認識される、応答エレメントの複数のコピーを含むプラスミドを作成し、
ｂ）  プラスミドを、Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインおよび、リガンドが結合するＲＯＲドメインであるＲＯＲのＤＥＦドメインを含むキメラから作成し、
ｃ）  工程（ａ）および（ｂ）で得られるプラスミドを細胞ホストにコトランスフェクトし、
ｄ）  工程（ｃ）のホストを試験物質の存在下で培養し、
ｅ）  リポーター遺伝子の活性をなんらかの適当な方法によって測定する、
ことを含むことを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
以下の工程、即ち
ａ）  上に定義された細胞ホストを、ＲＯＲ受容体およびその機能的同等物、および／またはＲＯＲ受容体の応答エレメントをコードする遺伝子を担う構築物で形質転換し、次いで
ｂ）  非放射能リガンドと標識されたリガンドの間での競合的な置換に基づく“結合”試験に該細胞ホストまたはそれらの抽出物を使用する、
ことを含むことを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＲＯＲ受容体またはＲＯＲ受容体の応答エレメントをコードする遺伝子を担う構築物がまた、リポーター遺伝子を含むことを特徴とする、請求項４および８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
リポーター遺伝子が、クロルアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子、ホタルまたはレニラからのルシフェラーゼの遺伝子、分泌アルカリホスファターゼの遺伝子、ベータ−ガラクトシダーゼ またはアポＣ−ＩＩＩの遺伝子から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
細胞ホストが、哺乳類、細菌または酵母の細胞、または代って昆虫細胞から選ばれることを特徴とする、請求項４から１０のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
さらに、アポＣ−ＩＩＩの発現への該物質の効果が、適当な方法によって決定されることを特徴とする、請求項３から１１のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＲＯＲ受容体およびＲＯＲ受容体の応答エレメントが、ＲＯＲα受容体またはＲＯＲα受容体の応答エレメントであることを特徴とする、請求項３から１２のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ヒトまたは動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防に有用な医薬組成物の製造のための、請求項３から１３のいずれか１つに記載のスクリーニング方法によって選択される物質の使用。
【請求項１５】
ヒトまたは動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防に有用な組成物、特に医薬組成物の製造のための、アポＣ−ＩＩＩの発現を調節することのできる物質の使用。
【請求項１６】
ヒトまたは動物におけるアテローム性動脈硬化症の治療および／または予防に有用な医薬組成物の製造のための、ＲＯＲ受容体またはその応答エレメントへ結合できる物質の使用。
【請求項１７】
ＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、並びにアポＣ−ＩＩＩへのそれらの効果を使用して抗アテローム動脈硬化性を有する物質の作用機構の特徴付け、正当化および特許請求のための、請求項３から１３のいずれか１つに記載のスクリーニング方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療に有用な物質をスクリーニングするためのＲＯＲ受容体の使用に関する。本発明はより詳細には、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防に有用な物質を同定することを可能にする異なるスクリーニング方法に関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防を意図される治療組成物の製造に対して、この様に同定される物質の使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、アテローム動脈硬化症の治療および／または予防を目的とした治療組成物の製造のための物質の作用機構を特徴付け、証明し、クレームするための、スクリーニングテストの使用に関する。
【０００３】
オーファン（ｏｒｐｈａｎ）受容体ＲＯＲ（オーファン受容体に関連したレチノン酸受容体）は、またはＲＺＲ（１７−１９）と呼ばれ、リガンドが同定されていない核受容体のサブファミリーを構成する。
【０００４】
ＲＯＲ受容体は、三つの形、ＲＯＲα、β、γ（１７、１９、２０）で存在する。 ＲＯＲ受容体はモノマーまたはダイマーの形で各々、ＰｕＧＧＴＣＡタイプの配列に先行するＡ／Ｔに富む配列からなる特異的応答エレメントに結合し（１７、２１、２２） 、そしてそれらの目標遺伝子の転写を調節する。
別のスプライシングによって、ＲＯＲα遺伝子は、Ｎ末端領域の異なる４つのイソ型α１、α２、α３およびＲＺＲα（１７−１９）になり、ＤＮＡ認識および明確なトランス作用性を示す（１７）。
【０００５】
ＲＯＲ受容体は、以後ＲＯＲ並びにＲＺＲおよびＲＯＲγ、並びに別に述べなければ、ＲＯＲαの異なるイソ型α１、α２、α３およびＲＺＲαを意味するものと理解されよう。本発明は、哺乳類ＲＯＲ受容体に関するが、ヒトＲＯＲ受容体がより詳細に考察される。
【０００６】
一般的にはオーファン受容体、具体的にはＲＯＲ受容体のファミリーに対するリガンドの発見およびＲＯＲの転写性におけるそれらの役割の定義が、遺伝子、特にある種の病態に含まれる遺伝子（ＤＮ＆Ｐ ９（３）， Ａｐｒｉｌ １９９６）の制御の現象の理解に対して基本的に重要な研究テーマを構成する。
【０００７】
メラトニンは、オーファン核受容体ＲＯＲ／ＲＺＲのファミリーの受容体に対するリガンドとして提案されている（５１）。同様、Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅらによる論文に基づくＷＯ ９５／２７２０２で公開されたＰＣＴ国際特許出願は、メラトニンタイプ、抗関節炎タイプ、抗腫瘍タイプまたは抗自己免疫タイプの活性を有する物質をスクリーニングするためのＲＺＲ／ ＲＯＲα受容体の使用を記載している。
【０００８】
しかし、最近の研究（５２）は、核受容体ＲＺＲ／ ＲＯＲαのファミリーリガンドとして作用するメラトニンの効果的な能力を求めている。
従って現在、ＲＺＲ／ ＲＯＲαファミリーの受容体に対するリガンドとして作用する能力が明確に確立されている物質はない。
発現が核受容体によって制御されているいくつかの遺伝子は、従来技術において知られている。それらの内、ＲＯＲα受容体がマウスおよびラットのアポＡ−１遺伝子の発現の制御に関与することを示す最近の仕事が挙げられる（５３）。
【０００９】
最近、実際の低アルファリポタンパク血症が、ＲＯＲα遺伝子が裁断され、非機能的タンパク質の合成（ｓｇ／ｓｇマウス）へと向かうマウスにおいて観察された。
さらに、これらのマウスは、アテローム性動脈硬化症を起す食事を与えられると、野性型ＳＧ／ＳＧマウスよりもより顕著なアテローム性動脈硬化症に罹る。この悪化する応答は、ｓｇ／ｓｇマウスにおける炎症応答の増大およびアポＡ−１遺伝子の発現の大きな減少に帰せられる（５４）。
【００１０】
しかし、マウスで得られた結果はそのままヒトへは移せない。なぜなら、アポＡ−１のヒト遺伝子が、ＲＯＲに対して非感受性であるという事実からであり、これは本出願者によって得られた結果によって説明され、且つ付属文書に表わされている（図１３）。実際、ネズミ科とヒトのアポＡ−１に対する遺伝子のプロモーターの配列がＲＯＲによって認識される部位のレベルで分かれる。
【００１１】
発明者はここに、驚くべきことに、ＲＯＲα受容体がマウスおよびヒトの両方のアポＣ−ＩＩＩ遺伝子の発現の調節に関与することを見い出した。
アポリポタンパクＣ−ＩＩＩは、肝臓そしてより少ない程度で腸において合成される７９個のアミノ酸の糖タンパクである。しかし、アポリポタンパクＣ−ＩＩＩは、以後アポＣ−ＩＩＩと呼び、トリグリセリドの血漿代謝の中心的生成物である。アポＣ−ＩＩＩの血漿濃度は、正常者および高トリグリセリド血症患者の両方において、トリグリセリドの血漿レベルに相関する（１−４）。
【００１２】
さらに、アポリポタンパク、より詳しくは、アポＣ−ＩＩＩは、心循環器疾患の出現に大きな役割を演じる。実際、アポＢ（アポＣ−ＩＩＩ−ＬｐＢ）を含むリポタンパク粒子におけるアポＣ−ＩＩＩ濃度の上昇が、虚血性心疾患のリスクの上昇と相関する（５）。
アポＣ−ＩＩＩ不足が、ＶＬＤＬ粒子の異化の上昇をおこすことも報告されているが、アポＣ−ＩＩＩの合成の増加が高トリグリセリド血症患者で観察された（６、７）。アポＣ−ＩＩＩは従って、血漿トリグリセリドの異化に直接結びついている。
【００１３】
さらに、遺伝子研究は、アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のいくつかの多型と、アポＣ−ＩＩＩおよびトリグリセリドの高い血漿濃度との相関を示した（８、９）。同様にして、トランスジェニック動物におけるヒトアポＣ−ＩＩＩの過発現が、結果として、高トリグリセリド血症の発生をさせるが、マウスの相同的組み合わせによる内因性アポＣ−ＩＩＩ遺伝子の除去がアポＣ−ＩＩＩの血漿濃度の減少になり、食後の高トリグリセリド血症に対して動物を守る（１０、１１）。さらに、ヒトアポＣ−ＩＩＩ導入遺伝子をもつマウスの、ＬＤＬ受容体の欠損したヘテロ接合体のマウスとの交雑が、組み合わされた家族性高脂血症のいくつかの特徴の獲得となり且つアテローム動脈硬化症の増大する感受性をつくる：アポＣ−ＩＩＩ遺伝子がアテローム性動脈硬化症の発生を誘導することができる（５５）。
【００１４】
さらに、インビトロおよびインビボでの研究結果は、アポＣ−ＩＩＩが主として、内皮表面への付着の阻止を介してトリグリセリドに富む粒子の異化およびリポタンパクに特異的なリパーゼによる脂肪分解を遅らせること、並びにアポＥ受容体による血漿中の残存粒子のクリアランスをそこなうことによって作用することを示している（１２ー１６）。
【００１５】
最近、コレステロールの血漿レベルとその粒子分布に加えて、トリグリセリドの血漿レベルは、冠動脈疾患の発生の独立したリスク因子であることが明らかとなった（５６）。実際、いくつかの研究が、トリグリセリドの血漿レベルと、血管造影によって診断される冠動脈疾患の広がりおよび重症度との相関を示した（５８）。最後に、疫学的研究および臨床試験の最近の結果は、高レベルの循環トリグリセリドが冠動脈疾患とは独立したリスク因子を構成することを強く示唆している（５７）。
従って、アポＣ−ＩＩＩの発現の低減は、抗アテローム性動脈硬化性を有する物質を特定するための、関連する標的の代表的なものである。
【００１６】
本発明は、マウスおよびヒト両方のアポＣ−ＩＩＩ遺伝子の転写の正の調節をするものとしてのＲＯＲ受容体の新規な性質を示すことに基づく。これらの結果は特に、アポＣ−ＩＩＩ遺伝子の発現がＲＯＲα遺伝子の欠失をしていることが知られているスタガラー（ｓｔａｇｇｅｒｅｒ）マウスにおいて顕著に抑制され、非機能タンパク質の合成をおこすという本発明者によってなされた観察に基づく（２７）。
【００１７】
これらの結果は、ＲＯＲ受容体がトリグリセリドの異化、従ってアテローム性動脈硬化症に関わる遺伝子の発現を調節する新規な因子を構成することを確立することを可能にした。
従って、本発明の目的は、アポＣ−ＩＩＩ遺伝子の転写を調整でき、従って予防および治療の両方に関してアテローム性動脈硬化症に影響することのできるＲＯＲα受容体の新規なリガンドを同定することを可能にする方法を提供することである。
【００１８】
本発明は従って、抗アテローム性動脈硬化性を有する物質のスクリーニングのための、 ＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、または代りにそれらの機能的同等物の使用に関する。
本発明はまた、抗アテローム性動脈硬化性を有する物質の作用機構の特徴付け、正当化、特許請求のための、ＲＯＲ受容体および／またはそれらの応答エレメント、または別にその機能的同一物の使用に関する。
本発明の目的には、ＲＯＲ受容体はＲＯＲファミリーの全てのα、β、γイソ型を意味する。
【００１９】
ＲＯＲの機能的同等物は、両方即ち、
−  与えられたリガンドに対するＲＯＲαのそれと同等の選択性を有する結合部位、
および
−  ＲＯＲαと同じ応答エレメントまたは関連核酸配列を有する応答エレメントと同じ応答エレメントを認識するＤＮＡ結合部位
を有するいかなるタンパク質をも意味するものと理解される。
ＲＯＲの機能的同等物はまた、
−  与えられたリガンドに対するＲＯＲαのそれと同等の選択性を有するリガンド結合部位、
および
−  異種プロモーターの上流にクローン化したリポーター遺伝子の応答エレメントを認識するＤＮＡ結合部位、またはキメラの容易な精製をさせるタンパク質ドメイン、および例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の既知の鋳型へのその特異的な結合、
を有するキメラタンパク質を意味するものと理解される。後者のタイプのキメラはしばしば使用されてきた（４２）。アフィニティカラムによる１段階のタンパク質の精製か、または当業者に周知の簡単な操作（磁気ビーズまたはグルタチオンで被覆された樹脂にカップリングし、マルトースまたはグルタチオン等で溶出）によってそれを特異的に分離するという利点をもつ。
【００２０】
ＲＯＲ受容体の応答エレメントの機能的同等物は、ＲＯＲα受容体が結合できるいかなる核酸配列そしてより詳しくは、ＲＯＲα受容体の応答エレメントから得られる配列を意味するものと理解される。
ＲＯＲα受容体およびＲＯＲα受容体の応答エレメントがより詳しくは、本発明の使用に好ましい。
ｈ ＲＯＲα受容体、ｈ ＲＯＲαに対するメセンジャーＲＮＡおよびｈ ＲＯＲα受容体の応答エレメントがより詳しくは、本発明の使用に好ましい。
【００２１】
本発明の課題は従って、ＲＯＲファミリーの受容体、および／またはＲＯＲ受容体の応答エレメント、および／またはＲＯＲをＲＮＡポリメラーゼ複合体に機能的に共役することのできる核因子、またはそれらの機能的同等物と試験物質を接触させ、次いでなんらかの適当な方法：
−  該物質の、ＲＯＲ受容体および／またはその機能的同等物への結合、または該物質とＲＯＲ受容体で形成される複合体のその応答エレメントおよび／またはＲＯＲをＲＮＡポリメラーゼ複合体に機能的に共役することのできる核因子への結合、および／または
−  該応答エレメントを含むプロモーターのコントロール下に置かれた遺伝子の転写活性の調節、
によって測定することからなる脂質代謝機能障害の治療に有用な物質をスクリーニングする第１のタイプの方法である。
【００２２】
物質の、ＲＯＲ受容体、および／またはその機能的同等物への結合、または該物質とＲＯＲ受容体で形成される複合体のその応答エレメントへの結合の測定は、リポーター遺伝子、結合試験等を用いるもののような当業者に知られている直接法または間接法によって行なってもよい。
同様にして、ＲＯＲ応答エレメントを含むプロモーターのコントロール下に置かれた遺伝子の転写活性の調節の測定は、当業者に知られている直接法または間接法によって行なってもよい。
【００２３】
脂質代謝機能障害の治療において試験される物質の使用を明確にするために、本発明の方法は、アポＣ−ＩＩＩの発現に関する該物質の効果を何らかの方法で決定することを目的とする付加的な工程を含む。アポＣ−ＩＩＩの発現について試験される物質の効果の決定は、トランスフェクション、インビトロにおけるｍＲＮＡの分析、インビトロまたはインビボのモデル等の当業者に知られている直接法または間接法によって行なってもよい。
【００２４】
本発明に記載の方法の第１の例は、以下の工程、即ち
ａ）細胞ホストを、ＲＯＲ受容体をコードするＤＮＡフラグメントまたはその機能的同等物のもののトランスフェクトし、
ｂ）工程（ａ）のホストを、該ＲＯＲ受容体の応答エレメントおよび少なくとも１つのリポーター遺伝子を含む構築物でコトランスフェクト（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ）し、
ｃ）試験物質の存在下でのリポーター遺伝子の発現を何らかの適当な方法で測定する、
ことを含む。
【００２５】
応答エレメントを含む配列について核受容体の活性を測定することを可能にするいかなるリポーター遺伝子も本発明に記載のスクリーニングの方法において使用してもよい。これらの中で、専用ということではなしに、例えばクロムアンフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の遺伝子、ホタル（Ｌｕｃ）またはレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）（Ｒｅｎ）からのルシフェラーゼの遺伝子、分泌アルカリホスファターゼ（Ｐａｓ） の遺伝子またはベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）のそれが挙げられる。これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の活性は、通常の方法で容易に測定でき、核受容体の効果、または生成されるタンパク質の量および／またはそれらの酵素活性を測定することによって遺伝子の発現を知ることを可能にする。
【００２６】
選択のための自殺遺伝子（例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（４４）のような）または正の選択の遺伝子（例えば、抗生物質または栄養欠乏に耐性な遺伝子のような）はまた、選択性培地における細胞の生き残りがこれらの遺伝子の活性の反映であるという事実の故にリポーター遺伝子と考えることができる。
【００２７】
ＲＯＲ受容体およびより詳しくは、ｈ ＲＯＲα１受容体の、本発明者によって報告されるアポＣ−ＩＩＩの遺伝子への作用は勿論、本発明の構築物、およびそれらを使用するスクリーニングの方法において、リポーター遺伝子としてのアポＣ−ＩＩＩの遺伝子を使用することを可能にする。
【００２８】
本発明のスクリーニングの方法において、細胞ホストは、特に、哺乳類、細菌または酵母の細胞、または代って昆虫細胞のような、上記遺伝子の発現に適当ないかなる細胞タイプも意味すると理解される。使用されるベクターは勿論、トランスフェクトされる細胞タイプに適し；プラスミド、ウイルスまたは人工染色体を挙げることができる。
【００２９】
本発明に記載のスクリーニングの第１のタイプの方法の他の例は、以下の工程、即ち
ａ）例えばＭ． Ｌａｚｅｒ （４３）によって記載されたコンセンサス部位のようなＲＯＲによって認識される応答エレメントの数コピー、アポＣ−ＩＩＩプロモーター中に同定された応答エレメントを含むプラスミドをつくる。応答エレメントのこれらのコピーは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターのような強い異種プロモーター、またはアポＣ−ＩＩＩプロモーターのような強い異種プロモーターの上流でクローン化される。このプロモーターはそれ自体、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等のリポーター遺伝子の発現をコントロールするように置かれる、
ｂ）工程（ａ）の構築物がＲＯＲを自然にか、または人工的に、即ち発現ベクターの一過性コトランスフェクションまたはＲＯＲを発現する安定なラインをつくった後発現する細胞にトランスフェクトされる、
ｃ）工程（ｂ）のホストが試験物質の存在下培養される、
ｄ）リポーター遺伝子の活性が適当な方法によって測定される、
を含む。
【００３０】
この第１のタイプの方法のさらなる例は、以下の工程、即ち
ａ）例えば、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ等の毒性プロドラッグの活性化物のような選択のための自殺遺伝子の発現をコントロールするプロモーターの、ＲＯＲをクローン化した上流によって認識される応答エレメントの複数のコピーを含むプラスミドを作成し（４４）、
ｂ）工程（ａ）の構築物を細胞ホストにトランスフェクトし、
ｃ）工程（ｂ）のホストを、ＲＯＲを発現することによってコトランスフェクトし、
ｄ）工程（ｃ）のホストを試験物質の存在下で培養し、
ｅ）毒性プロドラッグの存在下の細胞の生存をなんらかの適当な方法によって測定する、
ことを含む。
毒性プロドラッグは例えばガンシクロビルである。
【００３１】
この第１のタイプの方法のまだ別の例は、以下の工程、即ち
ａ）ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、成長ホルモン、毒性プロドラッグ活性化物（例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ）等のリポーター遺伝子の活性をコントロールする、例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターのような強いプロモーターの上流にクローン化した酵母核因子Ｇａ１４によって認識される応答エレメントの数コピーを含むプラスミドがつくられる、
ｂ）プラスミドが、Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインおよび、リガンドが結合するＲＯＲドメインであるＲＯＲのＤＥＦドメインを含むキメラからつくられる、
ｃ）工程（ａ）および（ｂ）で得られるプラスミドが細胞ホストにコトランスフェクトされる、
ｄ）工程（ｃ）のホストが試験物質の存在下培養される、
を含む。
【００３２】
リポーター遺伝子の活性はなんらかの適当な方法によって測定される。
核受容体のＤＥＦドメインは、このファミリーの異なるメンバーの間で異なる。それらは、転写のトランス作用およびリガンドとコファクターの結合に含まれる配列を含む。ＲＯＲのＤＥＦドメインは、Ｇａ１４応答エレメントに結合し、転写活性がＲＯＲのリガンドおよび／またはコファクターに依存するキメラＧａ１４− ＲＯＲをつくるためにＧａ１４のはじめの１４７個のアミノ酸を含有するＧａ１４フラグメントと結合する（４３）。
【００３３】
キメラの基礎の活性がＶＰ１６タンパクの全てまたは一部をコードするＤＮＡフラグメントの挿入によって増すことができる。
この第１のタイプのスクリーニング法のさらなる例は、コファクターと相互作用するＲＯＲフラグメントおよび、ＲＯＲを転写機構および特にＲＮＡポリメラーゼコンプレックスに共役させるコファクター（例えば、Ｎ−ＣＯＲ、ＳＭＲＴ （４３））の対応フラグメントを含む酵母または他の細胞における“二重ハイブリィド”タイプのシステムで試験された化合物の効果の定量的な評価からなる。
【００３４】
本発明に記載の第１のタイプのスクリーニング法の別の例は、全長のＲＯＲタンパクまたはそのいくつかのフラグメントとコファクターまたはそれらのフラグメントとの間のインビトロにおける相互作用の能力について試験される化合物の影響を技術水準で知られているどのような手法（例えば、ＰＰＡＲリガンドのスクリーニングのために開発されたＣＡＲＬＡアプローチ（４２）、共鳴蛍光エネルギー転移測定法による）によっても定量的に評価することからなる。
【００３５】
本発明に記載の第１のタイプのスクリーニング法の最後の例は、上に定義したホスト細胞をＲＯＲ受容体およびその機能的同一物、および／またはＲＯＲ受容体の応答エレメントをコードする遺伝子を担う構築物で形質転換すること、次いで非放射能リガンドと標識されたリガンドの間での競合的な置換に基づく結合試験に該細胞ホストまたはそれらの抽出物を使用することからなる。
【００３６】
本発明の課題はまた、本発明に記載のスクリーニング法によって選択される物質、並びに組成物、特に、アポＣ−ＩＩＩの発現を抑え、従ってヒトや動物の脂質代謝機能障害の治療を意図した医薬組成物の製造のためのこれらの物質の使用である。確かに、そのような性質を有する化合物は、アポＣ−ＩＩＩの発現を抑える能力に基づいて選択され、ＲＯＲリガンドまたはＲＯＲ類似体であってもよく、それらの性質は、直接アポＣ−ＩＩＩの発現のレベルからか、またはリポーター遺伝子の発現を介するか、または別にＲＯＲ受容体との複合体を形成する能力によって示される。
【００３７】
本発明はより一般的には、組成物、特に、ヒトや動物のアポＣ−ＩＩＩに結び付いた脂質代謝機能障害の治療および／または予防に有用な医薬組成物の製造のためのアポＣ−ＩＩＩの発現を調節することにできる物質の使用に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトや動物の脂質代謝機能障害の治療および／または予防に有用な医薬組成物の製造のために、ＲＯＲ受容体またはその応答エレメントへ結合できる物質の使用に関する。
【００３８】
本発明の課題はまた、 ＲＯＲへ結合したりおよびＲＯＲの活性を調節することによって、ヒトや動物のアポＣ−ＩＩＩに結び付いた脂質代謝機能障害の治療および／または予防に有用な医薬組成物の製造のためのアポＣ−ＩＩＩの発現を調節することにできる物質の作用機構を特徴付けたり、正当化したり、特許請求するために本発明に記載のスクリーニング法の使用である。
本発明の他の利点および特徴は、ヒトＲＯＲα受容体によるアポＣ−ＩＩＩプロモーターの活性化を記載する以下の例から明らかであろう。
【００３９】
Ｉ．方法
１．　細胞培養
ＨｅｐＧ２ （ヒト肝腫瘍）ラインはＥ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ｃ． （Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， ＵＫ）から得られるが、ＲＫ１３（家兎腎臓）細胞はＣ． Ｌａｇｒｏｓ （Ｓｔｅｆｅｌｉｎ教授の研究室）から与えられた。これらのラインを、１０％牛胎児血清を添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の湿った雰囲気で培養する標準の培養条件（ダルベッコ修飾イーグル最少必須培地）下に維持した。培養培地は２日毎に交換される。
【００４０】
２．組換えプラスミドの構築
アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの活性をリポーター遺伝子を使用して通常の方法によって研究した。野性型またはＣＡＴリポーター遺伝子の上流でクローンされたＣ３Ｐの５´位に存在するハーフサイト（ｈａｒｆ−ｓｉｔｅ）ＴＧＧＧＣＡのレベルで突然変異したアポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターのフラグメントを含む構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴ、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´ＫＯ−ＣＡＴ 、−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴおよび−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´ＫＯ−ＣＡＴが以前に記載されている（６１）。 ｈＲＯＲαコンセンサス応答エレメントのコピーを含む構築物ＲＯＲＥＴｋＣＡＴが以前に記載されている（５３）。
【００４１】
アプＡ−Ｉのヒト遺伝子のフラグメント−２０５１／＋２６を、γ＿Ｃｈａｒｏｎ ４ＡのゲノムＤＮＡライブラリーから単離されたクローンから酵素ＫｐｎＩを用いて切断し、ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にし、そして構築物−２０５１／＋２６ｈＡＩＷＴ−ＣＡＴをつくるためにＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にされたＸｂａＩ部位のレベルで、ベクターｐＢＬＣＡＴ５へＣＡＴリポーター遺伝子の前でクローン化する。単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの前でクローン化されるアプＡ−Ｉのヒト遺伝子のＴａＴａボックスの部位のコピーを含む構築物ｈＡＩＴａＴａｋＣＡＴを、オリゴヌクレオチドｈＡＩＦＩおよびｈＡＩＲＩを使用して構築物ＲＯＲＥＴｋＣＡＴに対して記載されたプロトコールに従って得た（表１）。
【００４２】
ＣＡＴリポーター遺伝子の上流でリポーター遺伝子Ｌｕｃ＋でクローン化されたアポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターのフラグメントを含む構築物のＣＡＴリポーター遺伝子を交換するために、リポーターベクターｐＧＬ３ （Ｐｒｏｍｅｇａ）のルシフェラーゼリポーター遺伝子Ｌｕｃ＋を、酵素ＳａｃＩおよびＢａｍｂＨＩで切断し、ベクターｐＢＫＣＭＶ− Ｌｕｃ＋を生成するためにベクター ｐＢＫＣＭＶ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の対応部位へサブクローン化した。構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴおよび−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５’ＫＯ− ＣＡＴのリポーター遺伝子を酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍｂＨＩで切断した。次いで、それを、プラスミド−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ− Ｌｕｃ＋および−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´ＫＯ−Ｌｕｃ＋をつくるためにプラスミドｐＢＫＣＭＶ−Ｌｕｃ＋を酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで消化することによって得られた Ｌｕｃ＋リポーター遺伝子で置換した。
【００４３】
アポＣ−ＩＩＩプロモーターの点変異体−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ３´ＫＯ−Ｌｕｃ＋、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´＋３‘ＫＯ−Ｌｕｃ＋、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａＫＯ−Ｌｕｃ＋、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ５´ＫＯ−Ｌｕｃ＋、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ３´ＫＯ−Ｌｕｃ＋が生産者のすすめに従って“Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｔｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”キット（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、それぞれオリゴヌクレオチドｈＣ３Ｆ２９／ｈＣ３Ｒ２０、 ｈＣ３Ｆ２０／ｈＣ３Ｒ３０およびｈＣ３Ｆ３０／ｈＣ３Ｒ２９（表１）使用して得られた。プラスミドＴｋ− Ｌｕｃ＋は、ＣＡＴリポーター遺伝子の代りにＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで切断されたベクター ｐＢＬＣＡＴ４ （２９）へプラスミドｐＢＫＣＭＶ− Ｌｕｃ＋を酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩで消化することによって得られた Ｌｕｃ＋リポーター遺伝子を挿入することによって構築される。構築物（ＲｅｖＤＲ２）３ｘＴｋ Ｌｕｃ＋および（ＲｅｖＤＲ２Ｍ３´）３ｘＴｋ Ｌｕｃ＋は、対応する構築物のＣＡＴリポーター遺伝子を Ｌｕｃ＋リポーター遺伝子で交換する（ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲ１）ことによって得られた。
【００４４】
対応するＣＡＴ構築物は、オリゴヌクレオチド１１２９／１１４２および１１２６／１１３２を使用して前に記述した（５９）仕方によって得られた。プラスミド−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋は、アポＣ−ＩＩＩプロモーターを切り取るためにＨｉｎｄＩＩＩで消化された。得られたＤＮＡフラグメントを次いで、構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３および−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＳＬ３０１をつくるためにプラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐＳＬ３０１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位へ挿入された。挿入の配向は次いで決められた。構築物−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３は、構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩｐＧＬ３をＰｓｔＩでの消化および再結合によって得られた。構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＳＬ３０１は次いで、酵素Ｅｃｏ０１０９Ｉで部分的に消化され、構築物−１０８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＳＬ３０１をつくるために自己再結合された。
【００４５】
アポＣ−ＩＩＩプロモーターのフラグメント−１０８／＋２４を次いで、構築物−１０８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３をつくるためにベクター ｐＧＬ３のＸｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローン化された。構築物−６２／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３をつくるために、構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＳＬ３０１が酵素Ｅｃｏ０１０９Ｉで徹底的に消化され、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にされ、そして自己再結合された。アポＣ−ＩＩＩプロモーターのフラグメント−６２／＋２４を次いで、ベクター ｐＧＬ３のＸｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローンされた。プラスミドｐＴｋｐＧＬ３を、プライマー５１４および５１０（表１）を用いてプラスミドｐＢＬＣＡＴ４に存在する単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターをＰＣＲによって増幅し、酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで得られたＰＣＲフラグメントを消化し、そしてそれをベクター ｐＧＬ３の対応する部位へ挿入することによって構築した。
【００４６】
構築物（−２７／−５８）３ｘｈＣＩＩＩＴｋｐＧＬ３、（−５８／−２７）８ｘｈＣＩＩＩＴｋｐＧＬ３および（−４７／−７９） ｈＣＩＩＩＴｋｐＧＬ３は、それぞれオリゴヌクレオチドｈＣ３Ｆ１５／ｈＣ３Ｒ１５およびｈＣ３Ｆ１７／ｈＣ３Ｒ１７を用いて上記の仕方（Ｖｕ Ｄａｃ ｅｔ ａｌ．， ＪＣＩ， ９６， ７４１−７５０， １９９５） に従って得られた。ベクターｐｉｃ２０Ｈの中間構成物を酵素ＳａｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。得られる挿入体は次いで、ベクターＴｋｐＧＬ３のＸｈｏＩ部位へクローンされ、それらの配向は配列によって決められた。オリゴヌクレオチドｈＣ３Ｆ１８およびｈＣ３Ｒ１８は、Ｐｆｕポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の助けによるＰＣＲによって、アポＣ−ＩＩＩプロモーターのフラグメント−３０／−１５の数コピーを含むＤＮＡフラグメントをつくるためにプライマーとして使用された。
【００４７】
このフラグメントを酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化し、構築物（−３０／−１５）ｎＴｋｐＧＬ３をつくるために酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで予め切断されたベクター ＴｋｐＧＬ３へ挿入した。オリゴヌクレオチドｈＣ３Ｆ２２およびｈＣ３Ｒ２２は、アポＣ−ＩＩＩプロモーターの−１０３／−７３フラグメントの数コピーを含むＤＮＡフラグメントをＰｆｕポリメラーゼ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の助けによるＰＣＲによってつくるためにプライマーとして使用された。このフラグメントは、酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩで消化され、そして構築物（−７６／−１００）２ｘＴｋｐＧＬ３をつくるために酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで予め切断されたベクター ＴｋｐＧＬ３へ挿入された。プラスミドｐＧ５ＴｋｐＧＬ３を、Ｔｋプロモーターの上流で酵母転写因子Ｇａ１４（部位１７ｍ）の応答エレメントの５コピーをプラスミドＴｋｐＧＬ３へ挿入することによって得た。
【００４８】
対応する核受容体の外因性発現をさせるプラスミドｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１、ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα２、ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα３が得られ、以前に記述されている（４７）。プラスミドｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１は、プラスミドｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１を酵素ＫｐｎＩを用いて、部分的にＸｂａＩで制限切断し、挿入物をベクター ｐＣＤＮＡ３の対応する部位へクローニングすることによって構築された。
【００４９】
プラスミドｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１を生成するために、プラスミドｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１を酵素ＫｐｎＩで消化し、 ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にし、そしてＢａｍＨＩで消化した。得られる挿入物をＥｃｏＲ１で消化されたベクター ｐＳＧ５へクローン化し、ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にし、そしてＢａｍＨＩで消化した。プラスミドｐＧａ１４−φは、ベクター ｐＣＤＮＡ３のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位へプラスミドｐＢＤ−Ｇａ１４（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に存在する酵母転写因子Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインをサブクローニングすることによって構築された。
【００５０】
プラスミドｐＢＤＧａ１４−ｈＲＯＲαＤＥＦを生成するために、プラスミドｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１を酵素ＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理することによって平滑にし、そしてＸｍａＩで消化した。この挿入物は次いで、ＥｃｏＲＩで予め切断され、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑にされ、そしてＸｍａＩで消化されたベクターｐＢＤＧａ１４へクローン化された。プラスミドｐＢＤＧａ１４−ｈＲＯＲαＤＥＦを次いで、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。得られる挿入物は、プラスミドｐＧａ１４−ｈＲＯＲαＤＥＦをつくるためにベクター ｐＣＤＮＡ３の対応する部位へクローンされた。
すべての構築物は、配列によってチェクされた。
【００５１】
３．一過性トランスフェクションとヒトアポＣ−ＩＩＩのプロモーター活性の測定
核受容体の活性を通常のリポーター遺伝子／コトランスフェクション手法によって測定した。ＤＮＡを実験室にある普通の技術（リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、リポフェクション等）を使用して研究される細胞へ挿入した。ベクター ｐＳＧ５、ｐＣＤＮＡ３およびｐＣＭＸを負のコントロールとして使用した。
【００５２】
リン酸カルシウム沈殿法を用いて行なわれた実験において、６０−ｍｍ培養プレート上で平板培養された細胞は、リポータープラスミドＣＡＴ、Ｌｕｃ＋またはｐＧＬ３（０．５ μｇ／６０−ｍｍプレート）および発現ベクター ｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１、 ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１、ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα２およびｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα３（０．１−１ μｇ／６０−ｍｍプレート）に加えて、トランスフェクション効率のコントロールとして使用されるプラスミドｐＣＭＸ−βｇａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含むプラスミド混合物で５０−６０％集蜜度でトランスフェクトされた（３０）。５から６時間後、細胞を洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２）を用いて２回洗浄し、そして１０％牛胎児血清を含有する新鮮培養培地で３６時間培養した。
【００５３】
トランスフェクション後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。リポフェクションによって行なわれた実験では、細胞が１ウェルあたり１０，０００細胞の量で２４穴プレートに置かれ、トランスフェクションの前に３７℃で１６時間培養した。細胞を次いで、カチオン性脂質を用いて血清を含有しない培養培地において３７℃で２時間トランスフェクトした。
【００５４】
プラスミド（リポーターベクター：５０ ｎｇ／ウェル）；発現ベクター：１００ ｎｇ／ウェル、トランスフェクション効率のコントロールのためのベクター：ｐＳＶ−βｇａｌ （Ｐｒｏｍｅｇａ） （５０ ｎｇ／ウェル）およびキャリアーＤＮＡ （トランスフェクトされたＤＮＡの量を調べるために加えられたｐＢｕｌｅｓｃｒｉｐｔ （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を、ＮａＣｌ （１５０ ｍＭ）、重炭酸ナトリウム （５０ ｍＭ）およびカチオン性脂質 （６ ｎｍｏｌ／μｇ ＤＮＡ）で添加された血清を含有しないＤＭＥＭに溶かし、ボルテックスし、室温で３０分培養し、そして細胞に加えた。２時間培養後、細胞を上記の洗浄緩衝液を用いて洗い、そして１０％牛胎児血清を含有する新鮮培養培地で３６時間培養した。実験の終わりに、細胞を洗浄緩衝液を用いて洗い、そしてルシフェラーゼ活性を生産者の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｚｅＴＭリポーターアッセイ系”キットによって測定した。得られた抽出物のタンパク質含量を“Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ”キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ手法によってアッセイした。
【００５５】
４．ゲル・リターデション
ｈＲｏＲα１タンパク質を、インビトロでプラスミドｐＣＭＸ− ｈＲｏＲα１で出発して、Ｐｒｏｍｅｇａの“ＴｎＴ Ｔ７迅速共役転写／翻訳システム”キットによって網状赤血球ライセート（ｌｙｓａｔｅ）手法によって合成した。ゲル・リターデション実験を、前記プロトコール（４８および４９）に従って、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼを使用して端でホスホリル化された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて行なった。オリゴヌクレオチド８２および５１２の５００ ピコモルを、ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識し、生産者のプロトコールに従ってシリカマトリックス （Ｑｕｉａｇａｎ）で精製し、そして鋳型としてプラスミド−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋を使用してアポＣ−ＩＩＩプロモーターの−１９８／＋２４フラグメントを増幅するためにプライマーとして使用した。得られたＰＣＲフラグメントは次いで、生産者の指示に従ってシリカマトリックス （Ｑｕｉａｇａｎ）で精製され、そしてプローブとして使用された。
【００５６】
プローブとして使用された二本鎖ＤＮＡを合成するために使用されたオリゴヌクレオチドの性質は表２に記載される。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、 ５０ ｍＭ ＫＣｌ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ ｍＭ ＤＴＴ）中に希釈された２．５μｇまたは５μｇのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを１００℃で１０分、次いで６５℃で１０分培養し、そして混合物を室温までゆっくり冷却することによって得られた。それらは、前記のように（４８および４９） 、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼを使用して５‘ 末端でホスホリル化された。
【００５７】
結合緩衝液は以下の組成を有した：１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０ ｍＭ ＫＣｌ、１％ グリセロール、２．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２５ ｍＭ ＤＴＴ、０．１μｇ／μｌ ｐｏｌｙｄＩｄＣ、５０ ｎｇ／μｌ ニシン精子ＤＮＡ、１μｇ／μｌ 牛血清アルブミン、１０％ 網状赤血球ライセート。
競合実験中、上昇する濃度の非標識二本鎖オリゴヌクレオチド（１０から１００倍モル過剰）を混合物へ加え、放射活性プローブの添加前に室温で１５分培養した。放射活性プローブの添加後、網状赤血球ライセートを混合物に加え、室温で０．２５Ｘトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液中ポリアクリルアミドゲル（４％）上電気泳動によるタンパク質／ＤＮＡの分離の前に室温で１５分培養した。
【００５８】
５．マウス
スタガラー同型接合体変異マウス（ｓｇ／ｓｇ）は、野性型タイプＣ５７ＢＬ／６ ＳＧ／＋ＳＧと比較すると、大脳失調および神経変性（２３、２４）並びに炎症性サイトカインの過産生等の免疫異常を発症する（２６、２５）。ｓｇ／ｓｇマウスは、ＲＯＲα遺伝子の欠失を担う。この欠失は、推定リガンド結合ドメインの翻訳を防ぎ、それによってこの転写因子の機能をこわす（２７）。スタガラー突然変異は、粥腫形成性領域へ付した後アテローム性動脈硬化病変の進展を解析させるＣ５７ＢＬ／６ゲノムに維持されると、血漿リポーターンパクおよびポタンパクのプロフィール、動脈の脂肪プラークの程度および冠動脈のアテローム性動脈硬化の発症が、ｓｇ／ｓｇマウスを脂肪に富む粥腫形成性食事に付し、且つそれらを＋／＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較して決定された。この結果は、ｓｇ／ｓｇマウスがきびしいアテローム性動脈硬化症になることを示し、それは心血管疾患におけるＲＯＲαの重要な役割を示唆する。
【００５９】
オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６マウス（６から８週齢）をＣＥＲＪ（フランス）から得、スタガラー突然変異マウス（ｓｇ／ｓｇ）は、知られている異種接合体（＋／ｓｇ）を交雑し、そしてそれらの失調によってホモ接合子孫を同定することによって得られた。ｓｇ突然変異は、 Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子背景の上に開発された。
【００６０】
６．ＲＮＡの解析
マウスをエーテルの過剰量で犠牲にさせた。ＲＮＡ抽出、“ノーザン”および“ドットブロット”ハイブリダイゼーション、アポＣ−ＩＩＩに対するメッセンジャー ＲＮＡのレベルの測定を前に記載されたように行なう（３２）。ヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ （３４）をコードする３６Ｂ４ ｃＤＮＡ クローン （３３）がコントロールとして使用される。ｃＤＮＡプローブは、プライマーとしてランダムヘキサマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して標識される。フィルターを、記載されたように１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの各プローブでハイブリダイズする。それらを、１度０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用いて室温で１０分、そして２度６５℃で３０分洗浄し、次いでＸ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲ、Ｋｏｄａｋ）に曝す。オートラジオグラムを定量的走査デンシトメトリー（Ｂｉｏｒａｄ ＧＳ６７０ デンシトメター）によって解析し、そして結果は３６Ｂ４メッセンジャー ＲＮＡレベルに対して標準化される（３５）。
【００６１】
ＩＩ．   図
図１：ＨｅｐＧ２細胞におけるヒト遺伝子アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性のｈＲＯＲα１での刺激。
図２：アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターのｈＲＯＲα１による活性化：３つの発現ベクターと２つのトランスフェクション法の比較。
図３：２つの異なるリポーターベクターへクローン化されたアポＣ−ＩＩＩ遺伝子活性の刺激の比較。
図４：ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１によるベクターｐＢＬＣＡＴ５へクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性の刺激。
【００６２】
図５： ＲＫ１３細胞へコトランスフェクトされた増加する量のプラスミドｐＣＤＮＡ３− ｈＲＯＲα１による構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋活性の刺激。
図６：ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１によるベクターｐＧＬ３へクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの減少するサイズのフラグメント活性の刺激。
図７：ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子の近位プロモーターへのｈＲＯＲα１の結合の評価。
図８：ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価。
図９：ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０および−６２／−１００フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価。
【００６３】
図１０：ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−９０／−６４フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価。
図１１：ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１による、ヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの点変異体活性の刺激。
図１２：ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１による、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの前でクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターのフラグメント活性の刺激。
図１３：ヒトアポＣ−ＩＩＩのプロモーターのｈＲＯＲα１による活性化の新規性。
図１４： ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲαのα１、α２およびα３イソ型による、ヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性の刺激。
【００６４】
図１５：ｓｇ／ｓｇ突然変異体またはＳＧ／ＳＧ野性型マウスにおけるアポＣ−ＩＩＩ遺伝子の肝発現。
図１６：ｈＲＯＲαの活性を調節することのできる物質のスクリーニングに適当なリポーターベクターの評価。
図１７：酵母転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインおよびｈＲＯＲαのリガンド結合ドメインＤＥＦを結合するキメラの使用に基づくｈＲＯＲαの活性を調節することのできる物質のスクリーニング試験の評価。
【００６５】
ＩＩＩ．結果
１．　ｈＲＯＲαはＨｅｐＧ２細胞のヒトアポＣ−ＩＩＩプロモーターを活性化
図１はＨｅｐＧ２細胞で誘導された核受容体の外因性発現に対するアポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの感受性を説明している。
この図で、 ＨｅｐＧ２細胞を６０−ｍｍプレート上で平板培養し、５００ｎｇのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋、示されたような１ μｇ／プレートの発現ベクターｐＣＭＸ（ネガティブコントロール）またはｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１、およびトランスフェクション効率のコントロールとして使用される１００ ｎｇ／プレートのプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌを用いてリン酸カルシウム手法によって５０−６０％集蜜度でトランスフェクトした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００６６】
これらの細胞を、ルシフェラーゼリポーター遺伝子（−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋）および発現ベクターｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１の上流でクローン化された位置−１４１５と＋２４の間のアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの部分を含有するリポータープラスミドでコトランスフェクトした。この観察は、ヒトアポＣ−ＩＩＩのプロモーターの−１４１５／＋２４部分にｈＲＯＲα１核受容体エレメントの存在を示唆する。
【００６７】
２．ｈＲＯＲαはＲＫ１３細胞のヒトアポＣ−ＩＩＩプロモーターを活性化
ｈＲＯＲα１によるヒトアポＣ−ＩＩＩプロモーターの活性化が細胞含有量によるのかどうかを決定するため、且つＨｅｐＧ２細胞よりも安定な実験モデルを確定するために、実験をＲＫ１３細胞で繰り返した。同様の結果が得られる（図２）。
【００６８】
実験１において、 ＲＫ１３細胞を６０−ｍｍプレート上で平板培養し、５００ｎｇのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋、示されたような１ μｇ／プレートの発現ベクターｐＣＭＸまたはｐＳＧ５（ネガティブコントロール）またはｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１またはｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１、およびトランスフェクション効率のコントロールとして使用される１００ ｎｇ／プレートのプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌを用いてリン酸カルシウム手法によって５０−６０％集蜜度でトランスフェクトした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００６９】
実験２において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そしてカチオン性脂質を用い、５０ｎｇ／ウェルのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクターｐＣＭＸまたはｐＣＤＮＡ３またはｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用い５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
表現型がＨｅｐＧ２細胞のそれよりも一定しているこのモデルは従って、以下ｈＲＯＲおよびそのイソ型の評価に使用されるであろう。
【００７０】
３．ｈＲＯＲα１の効果はトランスフェクションの様式、発現ベクターおよび使用されるリポーター遺伝子に無関係
ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１による構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋の活性化は、使用されるトランスフェクションプロトコール、リン酸カルシウムによるＤＮＡの沈殿またはリポフェクションに関係なく観察される（図２）。第２の方法によるトランスフェクション効率が高く、使用されるＤＮＡの量が実質的に減少でき、そしてトランスフェクションが過剰な不活性キャリアー ＤＮＡの存在下に行なうことができるから、後者の方法が好ましい。構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋のｈＲＯＲα１による活性化が、ベクター ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１、ｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１およびｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１で観察される（図２）。
【００７１】
ベクター ｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１によって誘起されるｈＲＯＲα１の外因性発現はより効果的であるし（データは示されていない）、エンプティベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ） ｐＣＤＮＡ３は構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋の基本的な活性をほとんど損なわないから、このベクターが好ましく使用される。アポＣ−ＩＩＩプロモーターの位置−１４１５と＋２４の間の部分の活性化が、それがＬｕｃ＋リポーター遺伝子の前でベクター Ｌｕｃ＋またはベクターｐＧＬ３ （Ｐｒｏｍｅｇａ）へ（図３）、並びにＣＡＴリポーター遺伝子の前でベクターｐＢＬＣＡＴ５へ（図４）クローン化されるとき観察される。
【００７２】
図３において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルにつき平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、示されたような５０ｎｇ／ウェルのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋（−１４１５／＋２４ＩＷＴＬｕｃ＋と記す）、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクターｐＣＤＮＡ３またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００７３】
図４において、ＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレート上で平板培養し、そして示されたよう５００ｎｇのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴ（−１４１５／＋２４ＷＴＣＡＴと記す）、ｐＢＬＣＡＴ５またはｐＢＬＣＡＴ４（３０）、示されたような１ μｇ／プレートの発現ベクターｐＳＧ５（ネガティブコントロール）またはｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１、およびトランスフェクション効率のコントロールとして使用される１００ ｎｇ／プレートのプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌを用いてリン酸カルシウム手法によって５０−６０％集蜜度でトランスフェクトした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
結論として、アポＣ−ＩＩＩプロモーターの位置−１４１５と＋２４の間の部分のｈＲＯＲα１での活性化が試験したすべての実験系で観察される：効果は強い。
【００７４】
４．ｈＲＯＲα１の効果はトランスフェクトされた発現ベクターの量による
図５は、トランスフェクトされた発現ベクターの量に関係する構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋の活性へのｈＲＯＲα１の効果の依存を示す。
図５において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルにつき平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルのリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋（−１４１５／＋２４ＩＷＴＬｕｃ＋と記す）、示されたような０から１００ｎｇ／ウェルの発現ベクターｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１（転写ユニットを一定に維持するためにプラスミドｐＣＤＮＡ ３で補う）、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００７５】
５．ｈＲＯＲα１の効果は特異的
図６において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルにつき平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルの示されたようなリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３（−１４１５／＋２４ＩＷＴｐＧＬ３と記す）、−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３（−１９８／＋２４ＩＷＴｐＧＬ３と記す）、−１０８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３（−１０８／＋２４ＩＷＴｐＧＬ３と記す）、−６２／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３（−６２／＋２４ＩＷＴｐＧＬ３と記す）、ｐＧＬ３およびＴｋｐＧＬ３（ネガティブコントロール）、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクター ｐＣＤＮＡ３またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００７６】
図４および６は、アポＣ−ＩＩＩプロモーターの位置−１４１５と＋２４の間のフラグメントがクローン化されるプロモーター無しのベクター（ｐＢＬＣＡＴ５、ｐＧＬ３）のリポーター遺伝子の活性がｈＲＯＲα１の外因性発現によって増加されないことを示す。さらに、異種プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターの活性はまた、 ｈＲＯＲα１の作用に反応を示さない。従って、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターへのこの核受容体の効果は特異的である。
【００７７】
６．ｈＲＯＲα１の作用の分子機構の同定
ａ．　プロモーターの欠失変異体の解析
図６は、リポーター遺伝子の上流でクローン化されたアポＣ−ＩＩＩプロモーターのフラグメントが位置−１０８（構築物−１０８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３）まで端を切り取られると、ｈＲＯＲα１活性の徐々なる減少を示す。ｈＲＯＲα１に対する反応は、欠失−６２／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３から出発して消える。これは、位置−６２と−１０８間にｈＲＯＲα１の活性に必須の配列エレメントの存在を示唆する。構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３と−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴｐＧＬ３の間で観察されるｈＲＯＲα１に対する感受性の差（図６）が位置−１４１５と−１９８の領域に、ｈＲＯＲα１応答エレメントまたはｈＲＯＲα１と相乗的に作用する核因子の付着の部位の存在を示唆する。例えば、核因子ＨＮＦ４によるアポＣ−ＩＩＩプロモーターの活性のコントロールにそのような部位の役割は技術水準において知られている（６０）。
【００７８】
ｂ．ゲル・リターデションによるプロモーターの解析
アポＣ−ＩＩＩプロモーターの−１９８／＋２４フラグメントへのｈＲＯＲα１のインビトロ結合をチェックするために、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで放射能活性標識されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。さらに、ｈＲＯＲα１タンパク質をインビトロで家兎網状赤血球ライセートを用いてプラスミドｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１から合成した。標識されたＤＮＡは、ｈＲＯＲα１タンパク質を被覆する網状赤血球ライセートまたはタンパク質を発現するようにプログラムされていないライセートの存在下培養された。このようにして得られたＤＮＡ／タンパク質複合体は次いでポリアクリルアミドゲル（“ゲル・リターデション”法）を用いて分けられた。−１９８／＋２４フラグメントへのｈＲＯＲα１に特異的な複合体が同定された、そして図７に矢印で記されている。
【００７９】
図７において、アポＣ−ＩＩＩに対するヒト遺伝子のプロモーターの−１９８／＋２４フラグメントが、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼにより５´末端で予めリン酸化されたプライマー８２および５１２を用いてＰＣＲによって増幅された（表１）。このプローブを、製造者によって定められたプロトコールに従ってｈＲＯＲα１受容体を発現するためにプログラムされた網状赤血球ライセート（ＴＮＴ−Ｔ７、Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下またはコントロールライセートの存在下に培養した。ＤＮＡ／タンパク質複合体を次いで、非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。乾燥後、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。ゲルの最初のレーンはプローブのみの移動に対応する。第２のレーンは、コントロールライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。他のレーンは、ｈＲＯＲα１を発現するためにプログラムされたライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。過剰モル（１０、５０、１００ ×）の示された非標識二本鎖オリゴヌクレオチドを、プローブの添加前１５分間プログラムされたライセートと予め培養した。
【００８０】
この複合体の形成を、配列がｈＲＯＲα１の共通応答エレメント（ＲＯＲＥＣｏｎｓ）およびヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のＴａＴａボックス（ｈＣＩＩＩＴａＴａＷＴ） （強い）の下流に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡに対応する過剰に添加された非標識二本鎖オリゴヌクレオチド（競合物）の添加によって減少する。一方、配列が変異されている（ＡＧＧＴＣＡ→ＡＧＧＣＡＧ） （ｈＣＩＩＩ−ＴａＴａＫＯ）対応する非標識二本鎖オリゴヌクレオチドは、この複合体の形成を減少しない。特異的ゲル・リターデションはまた、プローブとして使用される標識オリゴヌクレオチドがヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のＴａＴａボックスの部位のレベルで存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡに対応するとき観察される（図８）。
【００８１】
この図において、アポＣ−ＩＩＩに対するヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０フラグメント（ｈＣＩＩＩＴａＴａＷＴ）は、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼにより５´末端で予めリン酸化された。このプローブを，製造者によって定められたプロトコールに従ってｈＲＯＲα１受容体を発現するためにプログラムされた網状赤血球ライセート（ＴＮＴ−Ｔ７、Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下またはコントロールライセートの存在下に培養した。ＤＮＡ／タンパク質複合体を次いで、非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。乾燥後、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。ゲルの最初のレーンは、コントロールライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。その他のレーンは、ｈＲＯＲα１を発現するためにプログラムされたライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。過剰モル（１０、５０、１００ ×）の示された非標識二本鎖オリゴヌクレオチドを、プローブの添加前１５分間プログラムされたライセートと予め培養した。
【００８２】
遅延される複合体の強度は、相同非標識二本鎖オリゴヌクレオチドとの競合、配列がラットアポＡＩ遺伝子（ｒＡＩＴａＴａＷＴ） （ｈＲＯＲα１が高い親和性で結合することの知られている部位（Ｖｕ−Ｄａｃ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ２２４０１−２２４０４ ） ）、またはｈＲＯＲα１共通応答エレメント（ＲＯＲＥＣｏｎｓ）のプロモーターへのｈＲＯＲα１の付着部位に対応する非標識二本鎖オリゴヌクレオチドによって減少される。配列がアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のＴａＴａボックスの下流に位置する変異ＡＧＧＴＣＡハーフサイトｈＣＩＩＩＴａＴａＫＯ （ＡＧＧＣＡＧ） （図８）に対応する非標識二本鎖オリゴヌクレオチドは不活性である。特異的であるが弱いゲル・リターデションがまた、一過性トランスフェクション実験（図９）においｈＲＯＲα１によるリポーター遺伝子の発現活性化観察するために必要な位置−６２と−１０９の間のＤＮＡフラグメントについて観察される。
【００８３】
この図において、アポＣ−ＩＩＩに対するヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０フラグメント（ｈＣＩＩＩ−ＴａＴａＷＴ）は、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼにより５´末端でリン酸化された。このプローブを，製造者によって定められたプロトコールに従ってｈＲＯＲα１受容体を発現するためにプログラムされた網状赤血球ライセート（ＴＮＴ−Ｔ７、Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下またはコントロールライセートの存在下に培養した。ＤＮＡ／タンパク質複合体を次いで、非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。乾燥後、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。
より詳しくは、この遅延は位置−８２と−７０（ｈＣＩＩＩ−Ｃ３ＰＤＲ１）の間の部位に帰せられるようだ（図１０）。
【００８４】
この図において、アポＣ−ＩＩＩに対するヒト遺伝子のプロモーターの−９０４／−６４フラグメントは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ の存在下ポリヌクレオチドキナーゼにより５´´末端でリン酸化された。このプローブを、製造者によって定められたプロトコールに従ってｈＲＯＲα１受容体を発現するためにプログラムされた網状赤血球ライセート（ＴＮＴ−Ｔ７、Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下またはコントロールライセートの存在下に培養した。ＤＮＡ／タンパク質複合体を次いで、非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。乾燥後、ゲルをオートラジオグラフィーに付した。ゲルの最初のレーンは、コントロールライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。その他のレーンは、ｈＲＯＲα１を発現するためにプログラムされたライセートの存在下に培養されたプローブの移動に対応する。過剰モル（１０、５０、１００ ×）の示された非標識二本鎖オリゴヌクレオチドを、プローブの添加前１５分間プログラムされたライセートと予め培養した。
【００８５】
この遅延は特異的である：配列がｈＲＯＲα１の共通応答エレメント（ＲＯＲＥＣｏｎｓ）およびヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子（ｈＣＩＩＩＴａＴａＷＴ）のＴａＴａボックスの部位のレベルで存在するハーフサイトに対応するオリゴヌクレオチドと競合がおこる（図１０）。相同非標識オリゴヌクレオチドとの競合もまた、観察される（図１０）。
結論として、ゲル・リターデション実験は、ｈＲＯＲα１のアポＣ−ＩＩＩプロモーター位置−１９８と＋２４の間の部分との相互作用を確認し、且つ２つの結合部位の存在を示唆する、即ちＴａＴａボックス（−２３／−１８）の下流に位置するハーフサイトＡＧＧＴＣＡおよびＣ３Ｐ部位（−７７／−８２）の５´末端に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡ。
【００８６】
ｃ．アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの点変異体の解析
欠失変異体およびゲル・リターデション法で得られた結果をチェックするために、構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴＬｕｃ＋をアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のＴａＴａボックス（−２３／−１８）の下流に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡのレベルおよび／またはＣ３Ｐ部位（−７７／−８２）の２つのハーフサイトＡＧＧＴＣＡのレベルでの部位特異的変異によって変異した。
【００８７】
図１１において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルの示されたようなリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋（ＷＴと記す）、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´ＫＯ−Ｌｕｃ＋（Ｃ３Ｐ５´ＫＯと記す）、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ３´ＫＯ−Ｌｕｃ＋（Ｃ３Ｐ３´ＫＯと記す）、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ５´ ‘＋３´ＫＯ−Ｌｕｃ＋（Ｃ３Ｐ５´＋３´ＫＯと記す）、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａＫＯ−Ｌｕｃ＋（ＴａＴａＫＯと記す）、−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ５´ＫＯ−Ｌｕｃ＋（ＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ５´ＫＯと記す）および−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ３´ＫＯ−Ｌｕｃ＋（ＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ３´ＫＯと記す）、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクター ｐＣＤＮＡ３またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００８８】
図１１は、Ｃ３Ｐ３部位（−７８／−８２） （構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＣ３Ｐ３‘ＫＯＬｕｃ＋）の位置３’に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡの変異がヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターのｈＲＯＲα１に対する感受性を減じることを示している。さらに、ＴａＴａボックス （構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａＫＯＬｕｃ＋）の下流に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡの単一変異はｈＲＯＲα１の作用に対するプロモーターの感受性に影響しないが、Ｃ３Ｐ部位（構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＴａＴａ＋Ｃ３Ｐ３´ＫＯＬｕｃ＋）の位置３´に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡの変異と同じ変異の組み合わせがｈＲＯＲα１に対するプロモーターの感受性の喪失を強調するようだ。
【００８９】
ｄ．ＴＫプロモーターの上流にクローン化しアポＣ−ＩＩＩプロモーターから単離される応答エレメントの解析
図１２において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルの示されたようなリポーターベクター（−３０／−１５）ｎＴｋｐＧＬ３、（−７６／−１００）２ｘＴｋｐＧＬ３、（−２７／−５９）５ｘＴｋｐＧＬ３、（−５９／−２７）８ｘＴｋｐＧＬ３、  （−４７／−７９）ＴｋｐＧＬ３およびＴｋｐＧＬ３（ネガティーブコントロール）、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクター ｐＣＤＮＡ３またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００９０】
図１２は、Ｔｋプロモーター （構築物（−３０／−１５） ｈＣＩＩＩＴｋｐＧＬ３））の上流でクローン化されたアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のＴａＴａボックスの下流に存在するハーフサイトＡＧＧＴＣＡがｈＲＯＲα１によって活性化できることを示す。Ｔｋプロモーターの前でクローン化されたフラグメント−７６／−１００の２つのコピー（含まれるＣ３Ｐ部位のハーフサイトＡＧＧＴＣＡ３´） （構築物（−７６／−１００）２ｘｈＣＩＩＩ３ＴｋｐＧＬ３）を含む構築物もまたｈＲＯＲα１によって活性化される。Ｔｋプロモーターの前でクローン化されるＴａＴａボックスとＣ３Ｐ部位の間のヒトアポＣ−ＩＩＩの近接プロモーターの他のフラグメントを含む構築物がｈＲＯＲα１に対して非感受性である。
【００９１】
ｅ．結論
ヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターへのｈＲＯＲα１の作用に対して必須である少なくとも１つの部位が明確に同定された、即ちＣ３Ｐ部位（−７７／−８２）の位置３´に位置するハーフサイトＡＧＧＴＣＡ。ＴａＴａボックスの下流に存在するハーフサイトの役割は、表わされた結果のもとで評価するには困難である。他のｈＲＯＲα１応答エレメントの、またはｈＲＯＲα１と相互作用することのできる他の核因子が結合する部位の存在が、フラグメント−１４１５／−１９８がアポＣ−ＩＩＩプロモーターから除かれるとき観察されるｈＲＯＲα１への感受性の喪失によって示唆される。
【００９２】
７．ｈＲＯＲα１の作用の新規性
図１３において、ＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そして５００ｎｇ／プレートの示されたようなリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴ（−１４１５／＋２４ＷＴＣＡＴ と記す）、−１９８／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−ＣＡＴ（−１４１５／＋２４ＷＴＣＡＴ と記す）、−２０５１／＋２６ｈＡＷＴ−ＣＡＴ（−２０５１／＋２６ｈＡＩＣＡＴ と記す）、（ヒトアポＡＩプロモーター）、ｈＡＩＴａＴａｋＣＡＴ （Ｔｋプロモーターの 前でクローン化されたヒトアポＡＩ遺伝子のＴａＴａボックス）、ＲＯＲＥＴｋＣＡＴ （Ｔｋプロモーターの上流でクローン化された共通ＲＯＲ応答エレメント（単量体））またはｐＢＬＣＡＴ４、示されたような１μｇ／プレートの発現ベクター ｐＳＧ５ （ネエガティブコントロール）またはｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１、およびトランスフェクション効率のコントロールとして使用される１００ ｎｇ／プレートのプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌを用いてリン酸カルシウム法により５０−６０％の集蜜度でトランスフェクトした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００９３】
図１３は、ｈＲＯＲα１の効果がアポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子に特異的であることを示す、即ちヒトアポＡＩプロモーターはラットで記載されているもの（５３）とは違って有意には影響されない。ＴａＴａボックスに隣接するヒトアポＡＩプロモーターの部分の配列がラットプロモーターの同一部分と比較して異なる。図１３は、アポＡＩのヒトプロモーターのこの部分がｈＲＯＲα１に対して感受性がないことを示す。従って、発現またはｈＲＯＲα１の活性の調節が、アポＣ−ＩＩＩまたはアポＡＩをそれぞれコードするヒト遺伝子の発現に異なる影響を与えることができる。 ｈＲＯＲα１の活性を調節できる物質は従って、血漿ＨＤＬコレステロールのレベルへの作用とは分離されているトリグリセリドのレベルでの作用をもつであろう。
【００９４】
８．ｈＲＯＲのイソ型の効果
図１４は、驚くべきことに、イソ型ｈＲＯＲα１、 ｈＲＯＲα２およびｈＲＯＲα３のすべてが構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴＬｕｃ＋を活性化することを示す。この観察はラットアポＡＩプロモーター上に ｈＲＯＲα２のないことと対照的である（５３）。
【００９５】
この図において、ＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そして５００ｎｇ／プレートの示されたようなリポーターベクター−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋ 、示されたような１μｇ／プレートの発現ベクター ｐＣＭＸ （ネエガティブコントロール）またはｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα１、 ｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα２またはｐＣＭＸ−ｈＲＯＲα３、およびトランスフェクション効率のコントロールとして使用される１００ ｎｇ／プレートのプラスミドｐＣＭＶ−βｇａｌを用いてリン酸カルシウム法により５０−６０％の集蜜度でトランスフェクトした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【００９６】
９．ｓｇ／ｓｇスタガラーマウスにおけるＲＯＲα遺伝子の破壊がこれら動物の肝臓におけるアポＣ−ＩＩＩの減少した発現を伴う
図１５において、ｓｇ／ｓｇ 変異マウス（端を切り取られ且つ機能のないＲＯＲα遺伝子を担う）のアポＣ−ＩＩＩ遺伝子の肝発現が、前記（３２）のプロトコールにしたがってノーザンブロティングによるＳＧ／ＳＧ野性型マウスにおける対応する発現と比較される。ネズミ科アポＣ−ＩＩＩをコードするメッセンジャーＲＮＡを、プライマーとしてランダム６量体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して標識されたラットアポＣ−ＩＩＩをコードするｃＤＮＡを用いて見れるようにされる。発現が一定であるヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（３４）をコードする３６Ｂ４ ｃＤＮＡクローンが定量のコントロールとして使用される。
【００９７】
図１５は、マウスアポＣ−ＩＩＩ 遺伝子の発現がＲＯＲα遺伝子の欠損するｓｇ／ｓｇ 変異マウスの肝臓において、ＳＧ／ＳＧマウスと比較してかなり減少している。ＳＢ３４コントロール遺伝子の発現は変異によって影響されない。この結果は、上記の観察の生理学的正当性を確かめ、且つＲＯＲα遺伝子がまたげっし類の肝臓のアポＣ−ＩＩＩ の発現に対して重要であることを示唆する。
【００９８】
１０．提案するスクリーニング法の妥当性
ｈＲＯＲα１の外因性発現が人工的に増加されるとき、アポＣ−ＩＩＩ のヒト遺伝子のプロモーターの下流にクローン化したリポーター遺伝子の発現の活性化（図１から６、１１、１３および１４）は、 ｈＲＯＲα１の活性を調節できる物質を同定するこの方法の使用の妥当性に基づく。
【００９９】
図１２は、ｈＲＯＲα１の活性を調節できる物質を同定するためにリポーター遺伝子の前のＴｋプロモーターの上流にクローン化した孤立部位を用いることの適切性を立証している。以下の部位、即ちＴｋプロモーターの前でクローン化された５‘−ＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧ−３’の３つのコピーを含む構築物が確認されている（図１６）。
【０１００】
この図において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルの示されたようなリポーターベクター（ＲｅｖＤＲ２）３ｘＴｋＬｕｃ＋、（ＲｅｖＤＲ２ｍ３‘）３ｘＴｋＬｕｃ＋（変異ＤＲ２のハーフサイト３´）またはＴｋｐ Ｌｕｃ＋（ネガティーブコントロール）、示されたような１００ｎｇ／ウェルの発現ベクター ｐＣＤＮＡ３またはｐＣＤＮＡ３−ｈＲＯＲα１、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【０１０１】
ｈＲＯＲα１に対するその感受性が増加する。このことは、未変性のｈＲＯＲα１核受容体の活性を調節することのできる物質をスクリーニングするためのその重要性を正当化する。
最後に、図１７は、酵母転写因子Ｇａ１４のＤＮＡ結合ドメインおよび、ｈＲＯＲα１とｈＲＯＲα１の活性を調節することのできる物質を同定するためにＧａ１４応答エレメントの５つのコピーを含むリポーターベクターとのリガンド結合ドメインを結合するキメラを使用することの適切性を立証する。
【０１０２】
図１７において、１０，０００個のＲＫ１３細胞を、２４穴培養プレートの１ウェルで平板培養し、そしてカチオン性脂質を用いて、５０ｎｇ／ウェルの示されたようなリポーターベクターｐＧ５ＴｋｐＧＬ３、示されたような０から１００ｎｇ／ウェルの発現ベクター ｐＧａ１４−φまたはｐＧａ１４−ｈＲＯＲαＤＥＦ（転写ユニットの数を一定に維持するためにプラスミドｐＣＤＮＡ３を補う）、および５０ ｎｇのベクターｐＳＶ−βｇａｌを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされたＤＮＡの全量を、担体として使用されるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを用いて５００ｎｇ／ウェルにした。３６時間培養後、細胞を洗浄し、溶解し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａの“Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＴＭリポーターアッセイ系”キットを用いてアッセイした。細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性を通常のプロトコールに従って測定した（３１）。
【０１０３】
【外１】
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【０１０４】
【外２】
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【０１０５】
【外３】
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【０１０６】
【外４】
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【０１０７】
【外５】
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【０１０８】
【外６】
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【０１０９】
【外７】
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【０１１０】
【外８】
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【０１１１】
【外９】
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【０１１２】
【外１０】
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【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
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【０１１５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞におけるヒト遺伝子アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性のｈＲＯＲα１での刺激を示す図である。
【図２】アポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターのｈＲＯＲα１による活性化：３つの発現ベクターと２つのトランスフェクション法の比較を示す図である。
【図３】２つの異なるリポーターベクターへクローン化されたアポＣ−ＩＩＩ遺伝子活性の刺激の比較を示す図である。
【図４】ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１によるベクターｐＢＬＣＡＴ５へクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性の刺激を示す図である。
【図５】ＲＫ１３細胞へコトランスフェクトされた増加する量のプラスミドｐＣＤＮＡ３− ｈＲＯＲα１による構築物−１４１５／＋２４ｈＣＩＩＩＷＴ−Ｌｕｃ＋活性の刺激を示す図である。
【図６】ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１によるベクターｐＧＬ３へクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの減少するサイズのフラグメント活性の刺激を示す図である。
【図７】ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子の近位プロモーターへのｈＲＯＲα１の結合の評価を示す図である。
【図８】ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価を示す図である。
【図９】ゲル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−３４／−１０および−６２／−１００フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価を示す図である。
【図１０】ル・リターデションによる、アポＣ−ＩＩＩのヒト遺伝子のプロモーターの−９０／−６４フラグメントへのｈＲＯＲα１の結合の評価を示す図である。
【図１１】ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１による、ヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターの点変異体活性の刺激を示す図である。
【図１２】ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲα１による、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの前でクローン化されたヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーターのフラグメント活性の刺激を示す図である。
【図１３】ヒトアポＣ−ＩＩＩのプロモーターのｈＲＯＲα１による活性化の新規性を示す図である。
【図１４】ＲＫ１３細胞中のｈＲＯＲαのα１、α２およびα３イソ型による、ヒトアポＣ−ＩＩＩ遺伝子のプロモーター活性の刺激を示す図である。
【図１５】ｓｇ／ｓｇ突然変異体またはＳＧ／ＳＧ野性型マウスにおけるアポＣ−ＩＩＩ遺伝子の肝発現を示す図である。
【図１６】ｈＲＯＲαの活性を調節することのできる物質のスクリーニングに適当なリポーターベクターの評価を示す図である。
【図１７】酵母転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインおよびｈＲＯＲαのリガンド結合ドメインＤＥＦを結合するキメラの使用に基づくｈＲＯＲαの活性を調節することのできる物質のスクリーニング試験の評価を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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