(57)【要約】【課題】抗菌剤または抗腫瘍剤として有用なＦＲ９０１２２８物質の発酵法は、Ｌ−システイン等の特定のアミノ酸又はその塩を添加した培地でＦＲ９０１２２８物質生産菌を培養し、それにより生産能を良好にすることにより行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
2004508049.tif 000004
で示されるＦＲ９０１２２８物質生産菌をＬ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シスチン及びＬ−システインからなる群から選択されるアミノ酸又はその塩を１種以上添加した培地で培養することからなるＦＲ９０１２２８物質の製造法。
【請求項２】
アミノ酸がＬ−システインである請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
アミノ酸が、体積１リットルの培地に対して２〜３０ｍＭの濃度で添加される請求項１又は２に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗菌剤及び抗腫瘍剤として有用なＦＲ９０１２２８物質の製造法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シスチン及びＬ−システインからなる群から選択されるアミノ酸又はその塩を１種以上添加した培地でＦＲ９０１２２８物質生産菌を培養することからなるＦＲ９０１２２８物質の製造法に関するものである。
【０００２】
背景技術
ＦＲ９０１２２８物質は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ） ＷＢ９６８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９６８）等のクロモバクテリウム属に属する菌株を栄養培地中で培養することによって生産される化合物であり、次式：
【化２】
2004508049.tif 000002
で表される（特公平７−６４８７２号公報）。
【０００３】
ＦＲ９０１２２８物質は、上記の発酵法のほか、当該分野で公知の技術を用いる半合成法もしくは全合成法によっても製造できることが知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １１８， ７２３７−７２３８ （１９９６））。
ＦＲ９０１２２８物質は、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有することが知られており（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２４１， １２６−１３３ （１９９８））、抗菌剤及び抗癌剤などとしての利用拡大が提案されている。
しかしながら、発酵法によるＦＲ９０１２２８物質の生産力価は満足できるものでない。したがって、ＦＲ９０１２２８物質産生能が高い菌株の探索又はＦＲ９０１２２８物質生産量を増大することができるような製造法の開発が望まれている。
【０００４】
発明の開示
本発明者らは、発酵法における培養条件に着目した。培地へのアミノ酸の添加を検討したところ、ＦＲ９０１２２８物質の構成材料となりうると考えられたバリンあるいはスレオニン、ならびにＳ含有化合物の生成に有効と考えられたメチオニンなどにＦＲ９０１２２８物質の生産性の増大が認められず、Ｌ−システインを代表とする特定のアミノ酸の添加で、意外にも生産性の増大が認められることが見出された。この結果、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、ＦＲ９０１２２８物質の新規な発酵製造法、詳しくはＬ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シスチン及びＬ−システインからなる群から選択されるアミノ酸又はその塩を１種以上添加した培地でＦＲ９０１２２８物質生産菌を培養することからなるＦＲ９０１２２８物質の製造法が提供される。
【０００５】
図面の簡単な説明
図１は、種々のシステイン関連化合物の添加によるＦＲ９０１２２８物質産生を比較したグラフである；
図２は、培地中でのＬ−システインの最適添加濃度を比較検討した結果を示すグラフである；
図３は、Ａ形結晶（エタノール／水から得られる結晶）の粉末Ｘ線回折分析の結果を示すグラフである；
図４は、Ａ形結晶（アセトン／水から得られる結晶）の粉末Ｘ線回折分析の結果を示すグラフである；及び
図５は、Ｂ形結晶の粉末Ｘ線回折分析の結果を示すグラフである。
【０００６】
発明を実施するための最良形式
ＦＲ９０１２２８物質生産菌としては、上記のクロモバクテリウム属に属する菌株、具体的にはクロモバクテリウム・ビオラセウム ＷＢ９６８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９６８：ブダペスト条約の下、１９８８年７月２０日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託）が使用される。また、ＦＲ９０１２２８物質を生産できるものであれば、上記以外の生産菌を使用してもよい。それらは、自然突然変異株、又はＸ線照射、ＵＶ照射またはＮ−メチル−Ｎ’‐ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどのような種々の化学物質による処理によって得られる人為的な突然変異株であってもよい。
本発明の方法に用いられるアミノ酸は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シスチン及びＬ−システインからなる群から選択され、これらの１種又は２種以上の組み合わせであってもよい。さらに、アミノ酸は、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、酒石酸、フマル酸及びマレイン酸のような酸との酸付加塩の形態であってもよい。
【０００７】
アミノ酸の培地への添加量は、アミノ酸の種類によって若干変動し得る。しかし、アミノ酸は、一般に体積１リットルの培地に対して２ｍＭ以上、好ましくは２〜３０ｍＭの濃度になるように添加され得る。そのような添加量で、ＦＲ９０１２２８物質が増大した収率で生産される。
２以上のアミノ酸を混合する場合、それらのアミノ酸は、その組み合わせや混合割合を特に限定することなく、任意に混合することができる。しかし、本発明者らの実験によれば、Ｌ−システインの添加が、個々に添加される他のアミノ酸と比べてＦＲ９０１２２８物質の生産量を著しく増すことが確認されている。したがって、アミノ酸混合物を使用する場合には、高い混合割合でＬ−システインを混合物の一成分として混合することによって、生産量をさらに増すことができるものと考えられる。
【０００８】
ＦＲ９０１２２８物質は、上記のようなアミノ酸ならびにＦＲ９０１２２８物質生産菌が利用できる炭素源及び窒素源を少なくとも含有する栄養培地中で、好気的条件下で該生産菌を培養することによって効率よく生産される。
炭素源の例には、グルコース、ガラクトース、デンプン、フルクトース、デキストリン、グリセリン、マルトース、アラビノース、マンノースなどが含まれる。また、窒素源の例には、ブイヨン、酵母エキス、ペプトン、グルテン・ミール、綿実粉、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、乾燥酵母、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム）または尿素のような無機又は有機窒素化合物が含まれる。
【０００９】
炭素源及び窒素源は、純度の高い単品を組み合わせることが好ましいが、微量の生育因子及び相当量の無機栄養素を含有している、純度が低いものも使用することができる。これらの源は、必要に応じて使い分けてもよい。
上記の培地は、所望により、炭酸アルカリ金属塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなど）、リン酸アルカリ金属塩；マグネシウム塩（例えば、硫酸マグネシウム塩）；銅塩（例えば、硝酸銅）及びコバルト塩（例えば、酢酸コバルト）のような無機塩；及び流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油、ならびにシリコンのような消泡剤を含んでいてもよい。
【００１０】
好ましくは、培養は、大量培養時には深部好気培養で行われ、少量培養時には振盪培養もしくは表面培養で行われる。菌株を大型タンクで培養する際は、菌株の前培養物を種培養物として用いて培養することが好ましい。例えば、前培養物は、比較的少量の培地に菌の胞子又は菌糸を接種し、その接種培地を培養して調製することができる。このような場合、前培養物の調製に用いられる培地は、あとに行われるＦＲ９０１２２８物質の生産に用いられる培地と実質的に同じであってもよく、また異なっていてもよい。
培養中、攪拌と通気は、当該分野で公知の種々の方法によって行うことができる。例えば、攪拌は、培養器に備えられたプロペラ又はポンプのような種々の攪拌装置を用いるか、または培養器自体を回転もしくは振盪させて行うことができる。あるいは、通気と攪拌は、培養物中に滅菌空気を通気させることによって同時に行うこともできる。
【００１１】
培養は、通常約１０〜４０℃の温度範囲、好ましくは約２５〜３５℃で、約１５〜５０時間行うことができる。その条件は、培養規模などの種々の要件に従って適宜変更することができる。
上記の培養によって得られるＦＲ９０１２２８物質は、従来の方法、例えば、溶媒抽出、減圧濃縮、ろ過、ｐＨ調整、無機吸着材、吸着樹脂等を用いる吸着処理、結晶化など、またはその組み合わせによって分離し、精製することができる。
【００１２】
例えば、ＦＲ９０１２２８物質は菌体内で生産される物質で、菌体からの分離すべきである。したがって、ＦＲ９０１２２８物質を容易に分離するため、硫酸、塩酸、リン酸、硝酸などの無機酸；またはクエン酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸を培養液に適宜添加することによって、ｐＨがｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ１．５〜２の範囲に調整される。
吸着処理に用いられる無機吸着材の例には、シリカゲル、多孔質セラミックなどが含まれる。吸着樹脂としては、ダイアイオン ＨＰ１０、ダイアイオン ＨＰ２０、ダイアイオン ＨＰ２１、ダイアイオン ＨＰ４０、及びダイアイオン ＨＰ５０など（商標、三菱化学（株）製）を用いることができる。
【００１３】
実施例
以下、実施例を挙げて本発明の製造法を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
培養：
グルコース（１％）及びブイヨン（２％）を含有する培地（２０ｍｌ）を１００ｍｌの三角フラスコに注入し、１２１℃で２０分間滅菌した。
クロモバクテリウム・ビオラセウムＷＢ ９６８の斜面培養物１白金耳を培地に接種し、回転振盪機上、３０℃で２４時間培養した。
【００１４】
グルコース（１％ ｗ／ｖ）、ブイヨン（２％ ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム（１．１％ ｗ／ｖ）、リン酸２ナトリウム・１２水和物（０．７２％ ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム（０．１％ ｗ／ｖ）及び硫酸マグネシウム・７水和物（０．００６％ ｗ／ｖ）を含む別の培地（２０ｍｌ）を１００ｍｌ三角フラスコに注入し、１２０℃で２０分間滅菌する。この培地に、上記で得られた培養物の一部（４００μｌ）を接種した。さらに、１２０℃で２０分間滅菌したグルコース（４０％、１ｍｌ）及びろ過滅菌（孔径０．４５μｍ以下のメンブレンフィルター使用）した各種アミノ酸溶液（２００ｍｍｏｌ／ｌ）又はアミノ酸を含まない滅菌水（５００μｌ）を培地に添加した。次いで、回転振盪培養機中、２６．５℃で４８時間培養した。
【００１５】
実施例１
上記の培養法において培地に添加するアミノ酸として、下記の表１に記載のＬ−アミノ酸を５ｍＭ／Ｌずつ用い、ＦＲ９０１２２８物質産生に対するアミノ酸の影響を検討した。
培養液中のＦＲ９０１２２８物質量は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ （粒径３μｍ）（関東化学社製）、３．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．ｘ １５０ｍｍ、カラム温度：３５℃付近一定、検知波長：２１０ｎｍ、流量：０．３ｍｌ／分、注入量：２μｌ、移動相：ＴＨＦ／アセトニトリル／水／リン酸（５７０：３８０：５０：１））によって測定した。
培養液を遠心分離し、得られた菌株を乾燥させ、重量を測定した。こうして乾燥菌体量を得て、培養液に対するその量を算出した。
【００１６】
【表１】
2004508049.tif 000003
【００１７】
表１に示すように、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）またはシステイン（Ｃｙｓ）の添加により、ＦＲ９０１２２８物質の生産性が増大した。アルギニンやヒスチジンは、添加に伴い乾燥菌体量をも増加したが、システインは、対照と比較して、乾燥菌体量に変化を示さなかった。このため、乾燥菌体量当たりの生産能力は、システインを添加した場合に顕著に高かった。
ＦＲ９０１２２８物質の構成材料となりうるバリン（Ｖａｌ）、スレオニン（Ｔｈｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）、ならびに硫黄原子を有するアミノ酸であるメチオニン（Ｍｅｔ）は、予想に反してＦＲ９０１２２８物質の生産性増大を示さなかった。
【００１８】
実施例２
実施例１と同様にして、種々のシステイン関連化合物を用いて、ＦＲ９０１２２８物質産生に対するそれらの影響を検討した。Ｌ−シスチン（Ｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）は、１／２量で用いた。
この結果、図１に示すように、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、その塩酸塩（Ｃｙｓ・ＨＣｌ）とＬ−シスチンは、ＦＲ９０１２２８物質の生産性を増大した。
ＦＲ９０１２２８物質中のシステインはＤ体であるにもかかわらず、ＦＲ９０１２２８物質の生産性は、Ｄ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）添加によっては増大しなかった。さらに、ＳＨ基を含有する化合物であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）またはアセチル化システイン化合物、つまりＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ａｃ−Ｌ−Ｃｙｓ）をそれぞれ添加しても、生産性は増大しなかった。
【００１９】
実施例３
実施例１と同様にして、Ｌ−システインの培地中での最適添加濃度を検討し、図２に示す結果を得た。５００ｍｍｏｌ／Ｌのアミノ酸溶液を用いた。
この結果から、Ｌ−システインの培地中の濃度はＦＲ９０１２２８物質の産生能と直接的に関連していないことが明らかとなった。
【００２０】
実施例４
実施例１で調製した、アミノ酸を添加していない対照のサンプルから、以下の方法でＦＲ９０１２２８物質を単離し、精製した。
培養の項に記載されている量の１００倍スケールで培養液（２１９０ｍｌ）調製した。培養終了後、１Ｎ硫酸でｐＨ ２．０に調整し、培養液をろ過した。菌株を水で洗浄し、洗浄液を先の工程で得たろ液と合わせた。合わせた溶液（５０００ｍｌ）を、吸着樹脂ダイアイオンＨＰ２０（商標、三菱化学製、５４ｍｌ）を含むカラムに導入した。カラムを水（１００ｍｌ）及び２５％アセトン水（１００ｍｌ）で洗浄し、６５％アセトン水で溶出した。
溶出液を水分含量７０％以上となるように水で希釈した。希釈液（７２０ｍｌ）をダイアイオン ＨＰ２０ＳＳ （商標、三菱化学製、４０ｍｌ）を含むカラムに導入し、４０％アセトン水（１６０ｍｌ）で洗浄し、４７％アセトン水で溶出した。
【００２１】
溶出液（１２０ｍｌ）を、水分含量が７０％以上となるように水で希釈した。こうして得た溶液（２００ｍｌ）をダイアイオンＨＰ２０のカラム（９ｍｌ）に導入し、２０％アセトン水（１８ｍｌ）で洗浄し、アセトン（５０ｍｌ）で溶出した。溶出液を減圧下で濃縮乾固し、得られた残渣を酢酸エチル（３ｍｌ）に溶解した。溶液を予めｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１ ｖ／ｖ）を用いて充填したシリカゲルカラム（シリカゲル６０、７０−２３０メッシュ）（６０ｍｌ）に導入した。カラムをｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１ ｖ／ｖ、１８０ｍｌ）及びｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：２ ｖ／ｖ）で展開した。ＦＲ９０１２２８物質を含む画分を合わせ、減圧下で濃縮した。残渣をアセトン（２０ｍｌ）に溶解し、メタノールを加え、減圧濃縮してＦＲ９０１２２８物質（２５０ｍｇ）を得た。
【００２２】
精製−１：
ＦＲ９０１２２８物質（１５０ｍｇ）を、８５％エタノール中で９４ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解した。この溶液に、溶液の０．８倍量の水を約１０分かけて添加し（５２ｍｇ／ｍｌ濃度）、次いで４．２倍量の水を約３時間かけて添加した（最終濃度約１５ｍｇ／ｍｌ）。総量の水を添加後、析出物をろ取してＦＲ９０１２２８物質のＡ形結晶（１００ｍｇ）を得た。
このエタノール／水から得た結晶を、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＭＰＤ １８８０ 粉末Ｘ線回折を用いて、以下の条件で測定した；電圧４０ｋｖ；電流３０ｍＡ；Ｇｏｎｉｏ ｍｅｔｅｒ ＰＷ１７７５；スキャン方法 連続；速度 ０．１０ｄｅｇ／ｓ；間隔 ０．０２ｄｅｇ；試料時間 ０．２０ｓ；ＤＳ　１°；ＲＳ ０．２ｍｍ；及びＳＳ １°。結果を図３に示す。
【００２３】
精製−２：
ＦＲ９０１２２８物質（１５０ｍｇ）を、８５％アセトン水に９４ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した。この溶液に、溶液の０．８倍量の水を約１０分かけて添加し（５２ｍｇ／ｍｌ濃度）、次いで４．２倍量の水を約３時間かけて添加した（最終濃度約１５ｍｇ／ｍｌ）。総量の水を添加後、析出物をろ取してＦＲ９０１２２８物質のＡ形結晶（１２０ｍｇ）を得た。
このアセトン／水から得た結晶を、精製−１と同様にして粉末Ｘ線回折に付した。その結果を図４に示す。
【００２４】
精製−３：
ＦＲ９０１２２８物質（５１０ｍｇ）を、アセトンに約１１ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解した。このＦＲ９０１２２８物質含有液を５℃に冷却した。冷却後、温度を１０℃以下に保ちながら、溶液と等量のｎ−ヘキサンを約２０分かけて添加し（約５．６ｍｇ／ｍｌ濃度）、次いで溶液の８倍量のｎ−ヘキサンを約７０分かけて添加した（最終濃度約１．２ｍｇ／ｍｌ）。総量のｎ−ヘキサンを添加後、析出物をろ取してＦＲ９０１２２８物質のＢ形結晶（４６５ｍｇ）を取得した。
このＢ形結晶の粉末Ｘ線回折測定結果（測定条件は精製−１に同じ）を、図５に示す。
【００２５】
本発明によれば、ＦＲ９０１２２８物質生産菌をＬ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シスチン及びＬ−システインからなる群から選択されるアミノ酸又はその塩を１種以上添加した培地で培養することからなるＦＲ９０１２２８物質の製造法が提供される。
この製造法よれば、アミノ酸を用いない従来の製造法よりもＦＲ９０１２２８物質を効率的に生産することができる。したがって、工業的に利用価値の高いＦＲ９０１２２８物質の利用を一層促進することができる。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】
種々のシステイン関連化合物の添加によるＦＲ９０１２２８物質産生を比較したものである。
【図２】
培地中でのＬ−システインの最適添加濃度を比較検討した結果である。
【図３】
Ａ形結晶（エタノール／水結晶）の粉末Ｘ線回折分析の結果である。
【図４】
Ａ形結晶（アセトン／水結晶）の粉末Ｘ線回折分析の結果である。
【図５】
Ｂ形結晶の粉末Ｘ線回折分析の結果である。
【図１】
2004508049.tif 000005
【図２】
2004508049.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004508049.tif 000007
2004508049.tif 000008
2004508049.tif 000009
2004508049.tif 000010
2004508049.tif 000011
2004508049.tif 000012
2004508049.tif 000013
2004508049.tif 000014
2004508049.tif 000015
2004508049.tif 000016
2004508049.tif 000017
2004508049.tif 000018
2004508049.tif 000019
2004508049.tif 000020
2004508049.tif 000021
2004508049.tif 000022
2004508049.tif 000023
【国際調査報告】
2004508049.tif 000024
2004508049.tif 000025