(57)【要約】大型の粒子または小型の多細胞生物体の分析のためのフローサイトメーターは、フローチャンバの大きな直径のため、非安定なフローを経験し得る。水の粘度よりも高い粘度を与えるため粘度増加剤の添加を伴うシース流体またはシースおよびサンプルの使用は、プレ分析部分におけるフローが完全に層流に発達され、そして分析部分におけるフローが層流であることを確実にする。このことは、速度の増加速度で大型の粒子の正確な分析および選別、または小さい粒子の分析および選別を可能にする。水溶性ポリマーが好まれる。これは、浸透圧効果がほとんどなく流体粘度を増加するためである。１，３００，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドンの０．９％重量溶液は欲に有効である。流体の表面張力において最小の増加しか引き起こさない粘度増加剤の使用もまた、好ましい。
2004500562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する方法であって、以下：
フローチャンバを有するフローサイトメーターにおいて使用されるための流体を提供する工程；
流速を選択する工程であって、該流体が該選択された流速で該フローチャンバを通って流される場合、安定な層流が該フローチャンバ内で生じない、工程；
粘度増加剤を選択する工程；および、
該流体に十分な量の該粘度増加剤を添加し、それで、該粘度増加剤が添加された後に、該流体が該選択された流速で該フローチャンバを通って流される場合、安定な層流が該フローチャンバ内で生じる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記粘度増加剤が１０，０００と１０，０００，０００との間の平均分子量を有する水溶性有機ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘度増加剤が少なくとも１，０００，０００の平均分子量を有する水溶性有機ポリマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記水溶性有機ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム、セルロースエーテル、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、オリゴ糖類および多糖類からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記フローチャンバが、線虫、ゼブラフィッシュの胚およびショウジョウバエの胚からなる群より選択される小型の細長い多細胞生物体を受け入れるために必要な大きさにされたフローチャンネルを備える分析チャンバの中へ送り込む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記粘度増加剤が添加される前に、前記流体が前記フローチャンバを通って流される場合、前記選択された流速が、中実出口ストリームを達成するために必要とされる最小の流速よりも大きいかまたは等しい、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記粘度増加剤が添加された後に、前記流体が前記フローチャンバを通って流される場合、前記選択された流速が、中実出口ストリームを達成するために必要とされる最小の流速よりも大きいかまたは等しい、方法。
【請求項８】
前記粘度増加剤がシース流体またはシース流体およびサンプル流体の両方に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル流体が水または生物学的生理食塩水に懸濁された大型の粒子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプル流体が水または生物学的生理食塩水に懸濁された小型の細長い多細胞生物体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記小型の細長い多細胞生物体が、線虫、ゼブラフィッシュの胚およびショウジョウバエの胚からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記粘度増加剤が実質的に前記流体の表面張力を増加しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記粘度増加剤が前記流体の表面張力を約１２５％より大きくは増加しない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記粘度増加剤が実質的に前記流体の浸透力を増加しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ショウジョウバエ胚が約８時間の期間の間、前記粘度増加剤に曝露されていた場合、該粘度増加剤はショウジョウバエ胚の生育能を約１５％より大きくは減少しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
フローサイトメーターのためのフローセルであって、以下：
シース流体のための入り口チューブ；
サンプル流体のためのインジェクターチューブ；
該入り口チューブおよびインジェクターチューブと流体で連絡するプレ分析チャンバ；ならびに、
該プレ分析チャンバと流体連絡するフローチャンネルを有する分析チャンバであって、ここで該フローチャンネルが、小型の細長い多細胞生物体の懸濁液を含む流体を受け入れるのに十分に幅広く；そして該プレ分析チャンバは、該シース流体が中実出口ストリームを産生するのに十分な流速で該プレ分析チャンバを通って流される場合、十分な量の粘度増加剤が該シース流体に添加されない限り、安定な層流が該プレ分析チャンバの中で達成されない様な長さを有する、分析チャンバ、
を備える、フローセル。
【請求項１７】
前記小型の細長い多細胞生物体が、線虫、ゼブラフィッシュの胚およびショウジョウバエの胚からなる群より選択される、請求項１６に記載のフローセル。
【請求項１８】
シース流体のために少なくとも１つの他の入り口チューブをさらに備える、請求項１６に記載のフローセルであって、ここでシース流体のための２つ以上の入り口チューブがサンプル流体のための単一の中心インジェクターチューブの周りに配置される、フローセル。
【請求項１９】
前記分析チャンバが石英キャピラリーを備える、請求項１６に記載のフローセル。
【請求項２０】
請求項１６に記載のフローセルであって、前記粘度増加剤が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム、セルロースエーテル、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、オリゴ糖類および多糖類からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
中実出口ストリームを産生するに十分な前記流速が約２．５ｍｌ／分より大きいか、または等しい、請求項１６に記載のフローセル。
【請求項２２】
中実出口ストリームを産生するに十分な前記流速が約２０ｍｌ／分より大きいか、または等しい、請求項１６に記載のフローセル。
【請求項２３】
中実出口ストリームを産生するに十分な前記流速が約５０ｍｌ／分より大きいか、または等しい、請求項１６に記載のフローセル。
【請求項２４】
請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のフローセルを備える、フローサイトメーター。
【請求項２５】
請求項１６に記載のフローセル、粘度増加剤を含むシース流体、および小型の細長い多細胞生物体の懸濁液を含むサンプル流体の組み合わせ。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組み合わせであって、ここで前記粘度増加剤が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム、セルロースエーテル、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、オリゴ糖類および多糖類からなる群より選択される水溶性ポリマーである、組み合わせ。
【請求項２７】
前記小型の細長い多細胞生物体が、線虫、ゼブラフィッシュの胚およびショウジョウバエの胚からなる群より選択される、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項２８】
請求項２５に記載の組み合わせであって、ここで前記サンプル流体が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム、セルロースエーテル、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、オリゴ糖類および多糖類からなる群より選択される粘度増加剤をさらに含む、組み合わせ。
【請求項２９】
フローサイトメーターのための流体であって、該流体が、水または生物学的生理食塩水、粘度増加剤、および線虫、ゼブラフィッシュの胚およびショウジョウバエの胚からなる群より選択される小型の細長い多細胞生物体の懸濁液を含む、流体。
【請求項３０】
前記粘度増加剤が、実質的に前記水または生物学的生理食塩水の表面張力を実質的に増加しない、請求項２９に記載の流体。
【請求項３１】
前記粘度増加剤が、前記水または生物学的生理食塩水の表面張力を約１２５％より大きくは増加しない、請求項３０に記載の流体。
【請求項３２】
前記粘度増加剤が、実質的に前記水または生物学的生理食塩水の浸透力を実質的に増加しない、請求項２９に記載の流体。
【請求項３３】
ショウジョウバエ胚が約８時間の期間の間、前記粘度増加剤に曝露されていた場合、該粘度増加剤はショウジョウバエ胚の生育能を約１５％より大きくは減少しない、請求項３２に記載の流体。
【請求項３４】
前記粘度増加剤が１０，０００と１０，０００，０００との間の平均分子量を有する水溶性有機ポリマーである、請求項２９に記載の流体。
【請求項３５】
前記粘度増加剤が少なくとも１，０００，０００の平均分子量を有する水溶性有機ポリマーである、請求項３４に記載の流体。
【請求項３６】
請求項３４に記載の流体であって、前記水溶性有機ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム、セルロースエーテル、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、オリゴ糖類および多糖類からなる群より選択される、方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の流体であって、前記粘度増加剤がポリビニルピロリドンであり、そして該流体が約４０，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドンの５重量％までの溶液を含む、流体。
【請求項３８】
請求項２９に記載の流体であって、前記粘度増加剤がポリビニルピロリドンであり、そして該流体が約１，３００，０００の平均分子量を有するポリビニルピロリドンの０．９重量％までの溶液を含む、流体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、１９９９年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／１７３，５７２号の優先権および利益を請求する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般にフローサイトメトリーと呼ばれる、粒子の計数および分析のための技術に関する。詳細には、本発明は、フローサイトメトリーデバイスが、１）フローサイトメトリー装置で通常用いられる粒子よりもかなり大きい、大型の粒子（小型の細長い多細胞生物体を含む）を取り扱えるようにする、そして／または、２）有意に上昇したスピードで操作できるようにする、改善に取り組む。
【０００３】
（２．関連技術の説明）
フローサイトメトリー装置は、集束された光ビームを通過する粒子として流体ストリーム中の懸濁された粒子を光学的に分析する。この装置は、流体力学的集束を用いて、流体ストリーム中の粒子を中心におく。正確かつ安定なセンタリングを確実にするため、この流体フローは、完全に層流であり、振動や乱流があってはならない。言うまでもなく、流体力学的な集束の不完全性によって、この装置の能力が低下させられる。不完全な流体力学的集束は、フローの不安定性を生じ、そして光学測定は、光学ビームの中心を一定速度で通過する分析された粒子に基づく。不安定かつ不完全な集束を考えた場合、これらの仮定は満たされず、そして得られる光学データは誤ったものである。
【０００４】
代表的なフローサイトメトリーにおいて、シースストリームおよびサンプル流体ストリーム（分析されるべき懸濁された粒子を含む）は、フローセルのプレ分析チャンバ中のフローセルに導入される。このシースストリームは、フローセル中に注入され、そして完全に発達された層流プロフィールを形成するのに十分な距離で流れることが可能にされる。このサンプルストリームは、このフロープロフィールの中心に注入される。従って、このサンプル流体は、層流シースフロー（シースストリームとサンプルストリームとの間に速度差を含む）によって、フローセルのフローチャネルの中心に保たれる。この中心にされたサンプル粒子は、「インテロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）」ステーション（ここでは、レーザービームのようなビームが、フローセルを横切り、そして懸濁された粒子を１つずつ撃つ（ｓｔｒｉｋｅ））を通過するとき、分析される。この粒子によって放出されたまたは散乱された光は、１つ以上の光学的検出器によって受容される。この光学検出器は、入射光に応答して光学データを出力する。
【０００５】
いくつかの理由のために、シースフローが、層流中へ完全に展開されない場合、ランダムな振動が、この流体中で発生し得、そして一般に、一旦、このようないずれかの振動が開始されれば、それを衰えさせることはできない。これらの不安定性が、この装置の測定精度を破壊する。従前の発明者らは、フローサイトメーターにおけるフローの特徴を改善する目的を持っていた。Ｅｄｅｎｓら、米国特許第５，８０８，７３７号は、測定の精度を改善し、そしてサンプルラインの長さを減少するためにプレ分析チャンバの形態を改変するいくつかの方法を開示している。Ｎｏｒｔｈ，Ｊｒ．，米国特許第４，７９０，６５３号は、層流シースフローを維持することを補助する分流テーパーを有するプレ分析チャンバを開示している。これらは、フローチャンバの形態を調節するのに重点をおいており、そして層流を確実にするための構成要素に関連していた。
【０００６】
層流の欠陥に起因する問題は、特に速い流速で、および大型の粒子によって悪化される。速い流速は、乱流を増大する。大型の粒子に対応するためには、フローチャネルの直径が大きくされなければならない。ある程度まで、層流は、流れる流体とチャネルの壁との間の相互作用によって安定化される。チャネルが大きくされるにつれ、この壁と流体ストリームの部分との間の距離は増大し、それによって不安定性を支持する。
【０００７】
いくつかの先行技術発明はまた、大型の粒子を分析しかつ選別するように設計された。Ｈａｎｓｅｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９０３５（１９９９年８月２０日出願され、そして本明細書において参考として援用される）は、流体ジェットソーティング機構によって、フローサイトメトリー原理で大型の粒子および小型の多細胞生物体を選別する方法を記載している。このデバイスのフローセルおよび光学は、本質的に、代表的なフローサイトメーターのものと類似である。しかし、このフローチャネルの直径は、多細胞生物体（例えば、線虫ならびにゼブラフィッシュおよびショウジョウバエの胚）に対応するように増大されている。代表的な層流プロセスは、フローストリーム中のサンプルを中心に集中させるだけでなく、このプロセスはまた、細長い生物体をその長軸がフローの方向と平行になるように向かせる。生物体がレーザービームを通過し、そしてそれによって分析されたその生物体の光学的特徴を有した後、この流体ストリームはノズルを通過し、そして空気中で中実（ｓｏｌｉｄ）サンプルストリーム（すなわち、一連の小滴に反対向きの連続「中実」ストリ−ム）になる。
【０００８】
この流体ストリームは、マイクロタイタープレートまたは他の適切な容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）のウェルを目指している。流体ストリーム全体は、それが「流体切り替え」でない場合、このウェルに配置される。この流体切り替えは、このフローセルの直下の空気中でストリームを撃つ、集束された流体の別のストリームからなる。この別のストリームは、サンプルストリームを空気中で迂回し、その結果これは無駄に浪費されそしてマイクロタイタープレートに入らない。この交差部分は、フローセルの下で生じ、この交差部分によって生じるどのような衝撃波または不安定性も、それが分析を損なう分析領域中の上流へは伝達されない。
【０００９】
流体ストリーム（コントロールストリーム）を迂回するこの「流体切り替え」は、高速の流体バルブによって制御される。レーザービームを通過する粒子の電気的分析が、所望の生物体が存在することを示す場合、この生物体を含む空気中のストリームの部分がマイクロタイターウェル中に妨げられずに通過するように、この高速バルブを正しい瞬間に閉じる。次いで、高速バルブを再度開き、空気中のサンプルストリームを迂回し、そしてさらなる液体または生物体がこのマイクロタイターウェルに入ることを防ぐ。このマイクロタイタートレイを機械的に取り除き、別のウェルを空気中のストリームを受容する位置にさせ、そしてこのプロセス全体を繰り返してこのウェル中の単一の所望の生物体を堆積させる。この方法で、マイクロタイタートレイの各々のウェルは、単一の選択された生物体を受容する。
【００１０】
図１は、このような装置の単純化されたブロック図を示す。懸濁された多細胞のサンプル生物体の供給源２０は、破線で示されるフローセル２４に流入する。容器２２からのシース流体は、フローセル２４に入り、そして層流が、以下に考察するように発生する。検知ゾーン（分析領域）２６では、レーザービーム（示さず）が、フローセル２４を横切りそして生物体を照射する。放射された光および散乱された光は、光学検出器２８によって受容される。このシグナルをコンピューター３０によって分析する。このコンピューター出力は、流体バルブ３４を制御し、供給源３６から流体（すなわち圧縮気体）を切り替える。バルブ３４から生じるコントロールストリーム３８は、空気中のサンプルストリーム４０に向けられ、このサンプルストリームは、フローセル２６の下端から生じ、これは下向き偏向ストリーム４２を形成し、これは無駄に浪費される。実際の手技では、下向き偏向ストリームは、小滴のミストであり得る。サンプルストリーム４０が、下向きに偏向していない場合、その中のストリームおよび生物体は、マイクロタイタープレート４６のウェル４４中に存在する。
【００１１】
この設計の装置は、ＣＯＰＡＳ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＰｌａｔｆｏｒｍとしてＵｎｉｏｎ　Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，から市販されている。
【００１２】
さらに、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙは、ＦＡＣＳｔａｒ　ＰｌｕｓおよびＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒを含む装置を製造している。これらの装置は、利用可能であり、通常のフローチャネルよりも大きい特別なフローセルを備えている。これらの装置は、水、緩衝液または生理食塩水中で懸濁されたサンプルでの使用が意図されている。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明者らは、水または生理食塩水の粘度よりも有意に高い粘度を有するシース流体をフローサイトメトリー装置中で用いることが大きい利点を有することを見出した。粘性のシースが特に利点となる２つの主な状況が存在する：
１）層流の不安定性によって生じる能力の低下のない、大型の粒子（小型の細長い多細胞生物体を含む）の分析および／または選別において；
２）可能かさもなければ伝統的なフローサイトメーターで達成されるより高速で粒子を分析および／または選別するのにおいて；
本発明者らは、シース流体の粘度の増大が、フローを完全に安定化させるのに必要なフロー長を劇的に減少させることを見出した。
【００１４】
本発明は、中実ストリームとして、そして小滴としてではなく、ストリームが空気中に出て行くことを必要とするシステムにとって重要である。フロー速度が非常に遅い場合、このストリームは、小滴を形成し、そして出口ノズルから滴る。高粘度シースは、これらのシステムが十分高い流速（流体が一連の小滴としてではなく、中実ストリームとしてノズルを出る）で実施されることを可能にする。高粘度シース流体のさらなる利点は、大型の粒子は、それがフローセルに達する前に、しばしば分析されているサンプルから沈殿するということである。サンプル流体の粘性の増大は、この粒子が沈殿する速度を遅らせ、これは、サンプルの混合の作製を容易にし、そしてサンプルライン中の沈殿を妨げる。粒子を検出し、そして測定するために光散乱が用いられる場合、シースおよびサンプルの流体は、同じ屈折係数を有さなければならないか、または粒子が存在しない場合でさえ、このサンプル流体は光を散乱させることに気を留めておくべきである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態は、短いプレ分析チャンバからなる。このチャンバではシースがフローセルの軸（例えば、２つの反対のポートを通じて）、広い（１ｍｍ）のフローチャネルを有する分析チャンバ、およびノズル（これを通して、分析部分の下流末端でフローストリームが空気に放出される）と並んで送達される。好ましい実施形態では、流体の中実ストリームが、粒子を分配するためにオフに切り替えられる、切り替え可能な流体ストリーム（例えば、気体）によって迂回される。多数の異なる粘度増加剤が本発明において用いられ得るが、好ましい薬剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。この物質は、かなりの範囲の溶液濃度および分子量の組成物にわたって効果的に用いられ得る。例えば、４０，０００の平均分子量を有するポリマーの５重量％までの溶液が効果的である。ポリマーの分子量が増大すれば一般に粘度が増大し、その結果より低い濃度が用いられ得る。理想的な溶液は、１３０万の平均分子量を有するポリマーの０．９重量％までの溶液である。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
以下の説明は、当業者が本発明を実施および使用できるように提供しており、そしてこれらの発明を実行する本発明者らの意図する最適の様式を示している。しかし、種々の改変が当業者に容易に明白である。なぜなら、本発明の一般的定義は、装置のシース試薬の粘度を増大することにより、分析された粒子のサイズおよび流体力学的に集束されたフローサイトメーターにおける粒子分析の全体的速度を増大するための方法を特に提供するように、本明細書において規定されたからである。
【００１７】
フローサイトメーターにおいて、シースおよびサンプル流体は、プレ分析部分においてフローセル中に導入される。このシース流体は、短いフロー長（入り口長さ）内で完全に発達した層流プロフィールを形成し、そしてサンプル流体は、このフロープロフィールの中心に注入される。サンプル流体（分析されるべき粒子の単一縦列を含む）は、層流シースフローによってフローチャネルの中心に保持され、そしてそれは、１つ以上の光学検知器と組み合わせた、フローセルを横切るレーザービームのような、「インテロゲーション」ステーション（検知ゾーン）を通過するときに分析される。
【００１８】
このレーザービームは、サンプル粒子を、それがインテロゲーションステーションを一定速度で通過する場合、１つずつ撃つ。各粒子によって散乱された光そして放射された光は、一連の光学的検出器によって検出される。この検出器の出力は、分析された粒子の光学的特徴を記載するデータである。サンプル粒子は全て中心に集中されているので、各粒子は、レーザービームと類似の光学的相互作用を示す。細長い多細胞生物体の場合、中心に集中する（センタリングする）プロセスはまた、この生物体の長軸とフローの方向をそろえる。この粒子が横に移動する場合、それはレーザービームを通過するので、この検出器のデータは、このようなランダムな動きによって誘導された動揺（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）に起因して偽である。
【００１９】
いくつかの理由のため、サンプル粒子がレーザービームに達する前に、このシースフローが、層流中に完全に発達しない場合、ランダムな振動が、この流体中で発生し得、そして一般に、一旦このような任意の振動が始まれば、それが自然に収まることはない。これらの不安定性が、この装置の測定精度を壊す。以下に考察されるように、フローセルのプレ分析領域が増大され、安定なフローのためのより長い長さが発達することを可能にし得る。しかし、他の要因がこのアプローチを邪魔する。本発明者らは、シース流体の粘度の増大がフローを安定させるために必要な長さを劇的に減少することを見出した。
【００２０】
プレ分析チャンバまたは領域から、このフローは、このフローは分析チャンバまたはフローセルの領域（粒子が測定され、分析される）に通過する。粒子がフローセルを通過する速度は、流体フローの粘度に依存する。今度は、この粘度が流速に依存する。不幸にも、流速が常に増大されて、粒子分析の速度が増大され得るわけではない。なぜなら特定の粘度（分析チャンバ中のそのフローが不安定になる）以上では、層流が、失われ、そして正確な測定はもはやできないからである。本発明者らは、シース流体の粘度の増大が、不安定なフローへの遷移が生じる粘度を増大することを示した。
【００２１】
図２は、Ｓｈａｐｉｒｏ（Ｓｈａｐｉｒｏ　Ｈｏｗａｒｄ　Ｍ．「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　３ｒｄ　ｅｄ」，１９９５　Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ１２０）によって記載されたフローセルと類似のフローセルの図の表示を示す。シース流体は、シース入り口チューブ１を通じて入り、そしてオリフィス１１を通じてセルのプレ分析部分に入る。サンプル流体は、サンプルインジェクターチューブ２を通じて入り、そして第二のオリフィス（開口部）６を通じてシースフローの中心に注入される。このシース流体は、内側チャンバ壁およびサンプルインジェクターチューブ２の外側壁から伸長する境界層１２を発生する。この境界層は、ポイント５に集束する。サンプル注入後、このフローは集束し、そしてセルの分析部分８（ここでは石英キャピラリーとして示す）を通じて流れる。この流体はノズル先端９でこのセルを出て、そして以下に考察するように、流速に依存して、示されるように小滴１０を、または空気中で中実ストリーム（図示せず）を形成し得る。
【００２２】
図３は、境界層１７のクローズアップ図を示し、下に考察するように層流の発達を説明する。境界層は、中心で無粘性フロー１４の範囲を取り巻く空洞の壁から発達する粘性フローの範囲である。全体的な粘度プロフィールは、１３として任意の点で示される。Ｂｒｏｄｓｋｅｙ（Ｂｒｏｄｓｋｅｙ　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｓ．「Ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ　ｏｆ　Ｆｌｕｉｄ　Ｍｏｔｉｏｎｓ」、１９９５　Ｄｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｉｎｃ．Ｍｉｎｅｏｌａ　ＮＹ．，ｐ．１２０）は、式：
【００２３】
【数１】
2004500562.tif 000003
を有するように平坦なプレート上に発達する境界層について方程式を与える。
【００２４】
図２のフローセルにおいて、境界層は、環状空洞の内部半径および外部半径の両方で同時に形成するが、係数Ｋは、内部層および外部層で異なり、内部層がより速く発達しない。これは、そこでは壁表面がより小さいためである。ｘの任意の値での内部境界層の厚さは、１６として示され、そして外部層の厚さは１５として示される。下流のいくつかの点で、境界層は収束する。この点（ここでは１８）は、入り口長さをマークする。この点で、環における層流プロフィールが完全に発達する。この点でのいずれかの境界層の厚みは、２層（下付ｉおよびｏによって示される）に対するＫの値、ならびにギャップαによって単独で決定される。ｘ＝Ｌｅとして入り口長さを示す；
【００２５】
【数２】
2004500562.tif 000004
従って、いずれかの境界層厚みは、この点で固定される。自由ストリーム粘度Ｕ∞の代わりに中心線粘度ＵＣＬを使用して、方程式（１）は、以下：
【００２６】
【数３】
2004500562.tif 000005
になる。
【００２７】
中心線粘度は、流速および形態によって決定される；一般的に円筒チャンバについて；
【００２８】
【数４】
2004500562.tif 000006
方程式（３）への代入は、
【００２９】
【数５】
2004500562.tif 000007
を与える。
【００３０】
細胞のプレ分析部分における安定な、層流についての状態は、境界層が収束するポイント５、１８が、サンプルが注入されるポイント６の上流にあるべきであるということである。この状態から、方程式（５）は、フローセルの長さが、フローセルを通る流速に比例して増加するべきであることを示す。
【００３１】
図４は、ノズルの内側の粘度プロフィールに沿った出口ノズル２７で形成される小さな小滴を示す。図５は、出口ノズル２７の先を横切って切断した入り口平面と小滴からなるコントロール容積を示す。
【００３２】
出口ノズル２７の内側で、フローは、伝統的な放物層流プロフィール２６を示す；Ｂｒｏｄｓｋｅｙ（ｐ．９０）から、定常状態は；
【００３３】
【数６】
2004500562.tif 000008
であり、ここでＵＣＬは中心線粘度、そしてＲはチューブの半径である。流体が小滴の入り口平面を横切る場合、これは、プロフィール２９である。
【００３４】
力の合計は、ニュートンの第２法則に従う；＋ｘ方向の力をプラスとして取り扱い；
【００３５】
【数７】
2004500562.tif 000009
ここで、Ｗは小滴の重量であり、ＦＳＴは表面張力によって入り口平面を横切って働く力２８であり、そしてＪは入り口平面を横切る小滴への運動量フラックスである。
【００３６】
小滴が形成し始める瞬間を取り扱うことによって、重量は、無視して良い。運動量フラックス項は、キャピラリーを横切る示差運動量を積分することによって見出され得る：
【００３７】
【数８】
2004500562.tif 000010
円筒形座標において方程式を当てはめると、
【００３８】
【数９】
2004500562.tif 000011
そして方程式（６）からの粘度プロフィールを代入すると；
【００３９】
【数１０】
2004500562.tif 000012
を与える。
【００４０】
ノズルの全域を積分して、そして方程式（６）から容積流速Ｑを代入すると、
【００４１】
【数１１】
2004500562.tif 000013
を与える。
【００４２】
Ｊを方程式（７）に代入し、そして表面張力の定義をＦ＝ｐＹ（ここで、Ｆは働く力、ｐは切断表面の長さ、そしてＹは表面張力である）と取り扱うと：
【００４３】
【数１２】
2004500562.tif 000014
従って、空気中において流体の「中実」ストリームを維持するために必要とされる流速は、フローチャンネルの直径に直接関連する。このような中実ストリームが、流体切り替えソーティング配置について必要条件であることを思い出すこと。フローセルからの出口ノズルが、０．２５ｍｍの直径しかない場合、約２．５ｍＬ／分の流速が、中実ストリームを確保するために必要である。ノズルが４倍の１ｍｍに増加する場合、要求される流速は、８倍の約２０ｍｌ／分に上がる。ノズルが２ｍｍに増加する場合（８倍増加）、流速は、約５０ｍｌ／分（２０倍増加）まで増加する。
【００４４】
固定されたノズルサイズで、粘度の変化は最小流速に影響を及ぼさない。しかし、多くの粘度変化剤はまた、液体の表面張力を変える。最小流速は、ノズル直径の１．５乗として、および流体の表面張力の０．５乗として変化する。所定のノズルサイズで、フローセルの内部の安定フローについての最大流速は、粘度の増加と共に直線的に増加する。同時に、中実出口ストリームについての最小流速は、流体の表面張力の平方根で変化する。
【００４５】
従って、所定の薬剤が、粘度を倍増し、そして表面表力を倍増する場合、最大安定流速は、２倍であるが、最小中実流速は４１％まで増加する。例えば、５％（重量で）ＰＶＰ（４０，０００ＭＷ）は、粘度において１８０％の増加を与え、そして表面張力において１２５％の明らかな増加を与えた。これは、安定層流が可能な流速をほぼ３倍するが、最小中実流速を約５０％までしか増加しない。
【００４６】
１ｍｍのフローチャンネルフローセルに対する好ましい設計において（図１）、最大層流速度は、１４ｍＬ／分であるが、中実出口ストリームに対する最小速度は、２０ｍＬ／分である。ＰＶＰ（４０，０００ＭＮの５重量％または１，３００，０００ＭＷの０．９％）を添加することで、最大安定流速は４０ｍｌ／分を越えるまで増加するが、中実出口ストリームに対する最小速度は２９ｍＬ／分まで増加する。つまり、増加した粘度は、より高い層流速度を生じる。しかし、粘度変化薬剤は、しばしば流体の表面張力を増加し、中実フローストリームを維持するために必要な最小流速において増加を生じる。粘度の影響は、直線的に関連し、一方表面張力の栄養は平方根として関連するため、所定の粘度変化薬剤は、実際に所定のフローセル設計を使用可能にし得る。ここで、同じ設計は、水を用いては全く作動しない。
【００４７】
短すぎる入り口長さ（Ｌｅ）、または高すぎる流速を有するフローは、レーザービームに到達する場合、完全に安定ではない。フローが安定でない場合、サイトメーターは、十分に機能しない。これは、光学測定が不正確であるためである。空気系における中実ストリームの場合、ノズルが空気において中実フローストリームを噴出するためにＶを増加する場合、Ｌｅを比例的に増加して、レーザービームでのフローが層流であることを確実にしなければならない。このようなアプローチは、フローセルの入り口長さにおいて素早い増加を生じる。全ての実施目的のため、このことは、過度に長いフローセルを有する装置を生じる。このことが構築または対応を困難にし得る。
【００４８】
計算によって、フローセルの直径の増加が所望されない場合でさえシース粘度を増加する有用性が示される。おおざっぱな見積もりを使用して、２の因子によってνを増加させることを見出し、ＤおよびＬｅを同じにする（すなわち、変化しないフローセルの形態を残す）場合、Ｖを増加し得る（そのうえ、ほぼ２の因子による）。それで、同じサンプル希釈について（目詰まりおよび同時の粒子を防ぐように、セットされている）、層流を犠牲にせずに１秒あたり同数の粒子を２回行い得る。一方、粘度を増加またはフローセル形態を変化せずにＶを増加使用とする場合、フローは、安定しない。
【００４９】
増加した粘度は、水溶性の多数の添加剤（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、植物ゴム（例えば、アカシアゴムおよびトラガンスゴム）、セルロースエーテル（カルボキシメチルセルロース）、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、イヌリン、ショ糖および他の炭水化物（単糖類、オリゴ糖類および多糖類）を含む）を用いて達成され得る。非水性流体（グリセロール、プロピレングリコールなど）がまた、使用されて、水と混和できる限り粘度を増加し得る。一般的に、生物学的対象は、少なくとも部分的に水性である培地を必要とする。非生物学的対象の分析について、流体は、完全に非水性であり得る。
【００５０】
本発明は、現行のフローサイトメトリー方法を上回る改良である。これは、フローセルチャンネルがこの装置の他の機能を損なうことなく拡張可能であるためである。シースとして水または生物学的生理食塩水を用いて、より大きなチャンネルの使用は、層流を確保するために、サンプルがフローセルを通過する粘度における減少を必要とし、それによって速度を限定する。より大きなチャンネルはまた、分析チャンバまたは領域が延長され、シース流体に対する十分な距離が定常な層流を発達することを可能にすることを必要とする。本発明は、プレ分析チャンバの長さにおける増加または流体粘度における減少なしに大きなフローチャンネルの使用を可能にする。
【００５１】
さらに、高粘度シース試薬は、使用され、標準的なフローサイトメーターにおける分析速度を増加し得る。同じ粘度でより大きなフローチャンバを通って粒子が流れる代わりに、粒子は、より高い粘度で同じフローチャンネルを通って流れ得る。
【００５２】
本発明は、ストリームが中実ストリームとしておよび小滴としてではなく空気中へ出ていくことを必要とする系について特に有用である。流速が遅すぎる場合、ストリームは小滴を形成し、そして出口ノズルから滴る。しかし、流速が中実ストリームの形成を確実にするために増加される場合、フローセルにおける層流は、入り口長さが増加されない限り、失われ得る。上で説明したように、細長い多細胞生物体に対応するためにフローチャンネル直径が増加される場合、この問題の全体は、大いに悪化する。高粘度のシースの使用は、流体が、層流を損なうことなく小滴としてではなく中実ストリームとしてノズルを出るのに十分に高い流速でこれらの系が行われることを可能にする。
【００５３】
高粘度シース流体の１つのさらなる利点は、より大型の粒子がしばしば、フローセルに到達する前に、分析されるサンプル流体から沈殿することである。サンプル流体の増加された粘度は、粒子が沈降する速度を遅くし、サンプルの混合をより簡単にし、そしてサンプルラインに落ち着くことを防ぐ。しかし、光散乱が使用されて粒子を検出および測定する場合、シースおよびサンプル流体が同じ屈折率を有するかまたはサンプル流体が粒子が存在しない場合でさえ光を散乱することに留意するべきである。これは、シース粘度の改変は、屈折指数を一致するようにサンプル流体の同様の改変を通常必要とすることを意味する。
【００５４】
サンプル流体はしばしば、シース流体として同じかまたは同様の改変を必要とするため、粘度改変剤の浸透効果に対していくつかの注意が払われなければならない。ショ糖、グリセリンおよび他の低分子量の化合物は、粘度改変のため使用され得るが、このような物質は、粘度を有意に変えるのに十分な濃度でしばしば重要な浸透効果を有する。生物学的サンプルの場合、過多の浸透圧は、サンプルを歪め、そして生育能の損失さえ導き得る。従って、より高い分子量を有する薬剤（例えば、ＰＥＧポリマー、ＰＶＰポリマーまたは炭水化物ポリマー）を使用することが好ましい。このような薬剤を用いる粘度における重要な増加は、浸透力において無視できる増加のみで達成され得る。
【００５５】
粘度増加剤に対する潜在的な欠点は、一般的に流体の表面張力を増加することである。これは、空気において中実ストリームの形成を確保するためにより高い流速を必要とする。しかし、表面張力効果は、表面張力増加の平方根に関連するが、達成される層流の速度変化は、粘度における増加に直線的に関連するため、ここでは多くの薬剤が表面張力における増加によって生じる問題を上回る粘度上昇に起因する改良を有する。それにもかかわらず、粘度増加剤を選択する場合、１モルベースで表面張力の増大が最小でありながら、１モルベースあたり１モルで粘度において最も大きな増加を引き起こす薬剤を選択するべきである。一般的に、高分子量のポリマーは、モルベースで粘度の最も大きな増加を引き起こす。これらの同じポリマーはまた、生物体に対して最も無毒性であるようである。これは、このような大きなポリマーは、細胞膜を通り得ないからである。等価の他の因子（表面張力での最も小さいモル効果を有する薬剤）が選択されるべきである。親水性ポリマー（例えば、ＰＶＰ）は、いくつかの表面活性剤活性を示すことが公知であり、そして表面張力においてより小さな増加を引き起こす。しかし、上で説明した数学的関係のため、特に好ましい粘度および毒性特性は、しばしば好ましくない表面張力特性より重要であり得る。
【００５６】
一般に、好ましいシースおよびサンプル流体は、約０．９重量％のＰＶＰ（約１，３００，０００の分子量を有する）を含む。多細胞動物を分析および／または選別するために使用される場合、強力な新たな薬物化合物の試験は、本発明の好ましい使用である。従って、分析された生物体の長期間の生育能が重要である。本発明者らは、５％ＰＶＰ（４０，０００ＭＷ）および０．９％ＰＶＰ（１，３００，０００ＭＷ）の両方ならびにこれらの形態の間での種々の濃度および分子量において、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ幼虫の生育能を試験し、そして毒性について、あったとしてもほとんど見いだせていない。これは、ほとんど驚きではない。それは、ＰＶＰ使用は、ビールからヘア製品、目薬までの範囲の多くの食品および医療用製品に許可されているからである。ＰＶＰは、ヒト血漿の代用品としてさえ用いられている。全体的な生育能は、抗発泡剤と共にＰＶＰ中で８時間、胚を空気にさらした後でさえ９５％を上回った。胚が漂白剤における処理により「脱塩素」される場合、ＰＶＰ中の生育能はなお８５％を上回った。
【００５７】
従って、添付の特許請求の範囲は、特に例示され、そして上に記載されたもの、概念上等価であるもの、および明らかに置き換えられ得るものを含むと理解されるべきである。当業者は、記載しただけの好ましい実施形態の種々の適応および改変が、本発明の範囲から逸脱せずに形成され得ることを認識する。例示された実施形態は、例示の目的のみに示されており、そして本発明を限定すると取られるべきではない。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書中に特に記載される以外を実施され得ると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明において記載される型のソーティングフローサイトメーターのブロック図を示す。
【図２】
図２は、層流の発生を記載するために示した境界層を有する単純なフローセルの断面図である。
【図３】
図３は、図２の細部「３」の拡大図であり、シース入り口の付近のフローセルのプレ分析部分を示す。
【図４】
図４は、図２の細部「４」の拡大図であり、フローセルが小滴形成を伴って出ることを示す。
【図５】
図５は、図４の細部であり、この小滴のコントロール容積を示す。
【図１】
2004500562.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004500562.tif 000016
2004500562.tif 000017
2004500562.tif 000018
2004500562.tif 000019
2004500562.tif 000020
2004500562.tif 000021
2004500562.tif 000022
2004500562.tif 000023
2004500562.tif 000024
2004500562.tif 000025
2004500562.tif 000026
2004500562.tif 000027
2004500562.tif 000028
2004500562.tif 000029
2004500562.tif 000030
2004500562.tif 000031
2004500562.tif 000032
2004500562.tif 000033
2004500562.tif 000034
2004500562.tif 000035
2004500562.tif 000036
2004500562.tif 000037
2004500562.tif 000038
2004500562.tif 000039
2004500562.tif 000040
2004500562.tif 000041
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500562.tif 000042
【国際調査報告】
2004500562.tif 000043
2004500562.tif 000044
2004500562.tif 000045