(57)【要約】ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株より独特な複製タンパク質を含むプラスミドを単離した。複製タンパク質は、様々なクローニングおよび発現ベクター、特にロドコッカス種における異種遺伝子の発現のためのシャトルベクターにおいて使用することができる。
2004517623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；
（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃下で（ａ）にハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される単離された核酸；または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸、
から成る群より選択される、複製タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１に記載の請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２に記載の請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３７９アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離された核酸分子。
【請求項６】
（ａ）請求項１または５に記載の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングすること；
（ｂ）請求項１または５に記載の核酸分子にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含むゲノムフラグメントの配列を決定すること、
を含んで成り、配列決定されたゲノムフラグメントが複製タンパク質をコードする、複製タンパク質をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号２に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；および
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅すること；
を含んで成り、増幅された挿入物は複製タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、複製タンパク質をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法の産物。
【請求項９】
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；
（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃下で（ａ）にハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される単離された核酸；または
（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸、
から成る群より選択される、プラスミド安定性タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号３に記載されている請求項９に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項９に記載の単離された核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号４に記載されている請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも２９６アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離された核酸分子。
【請求項１４】
（ａ）請求項９または１３に記載の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングすること；
（ｂ）請求項９または１３に記載の核酸分子にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含むゲノムフラグメントの配列を決定すること、
を含んで成り、配列決定されたゲノムフラグメントがプラスミド安定性タンパク質をコードする、プラスミド安定性タンパク質をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１５】
（ａ）配列番号３に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；および
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅すること；
を含んで成り、増幅された挿入物はプラスミド安定性タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、プラスミド安定性タンパク質をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法の産物。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸を含むプラスミド。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸および請求項１３に記載の核酸を含むプラスミド。
【請求項１９】
配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有するプラスミド。
【請求項２０】
選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項１７または１８に記載のプラスミド。
【請求項２１】
選択マーカーはグラム陰性およびグラム陽性細菌の両方において選択可能である、請求項１９に記載のプラスミド。
【請求項２２】
グラム陽性細菌において機能的である複製開始点をさらに含む、請求項１７または１８に記載のプラスミド。
【請求項２３】
グラム陽性細菌は放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリーのメンバーである、請求項２２に記載のプラスミド。
【請求項２４】
グラム陽性細菌は、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）から成る群より選択される、請求項２３に記載のプラスミド。
【請求項２５】
ロドコッカスにおける遺伝子の発現に適切な少なくとも１つのプロモーターをさらに含む、請求項１７または１８に記載のプラスミド。
【請求項２６】
配列番号６に記載のヌクレオチド配列を有するプラスミド。
【請求項２７】
配列番号７に記載のヌクレオチド配列を有するプラスミド。
【請求項２８】
ａ）（ｉ）請求項１に記載の核酸および請求項１３に記載の核酸；
（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；ならびに
（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター；
を含むプラスミドを提供すること、
ｂ）（ａ）のプラスミドで放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を形質転換すること；ならびに
ｃ）（ｂ）の形質転換された放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を、核酸フラグメントが発現される期間および条件下で培養すること、
を含んで成る、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌において核酸を発現させる方法。
【請求項２９】
プラスミドはグラム陽性細菌において機能的である複製開始点をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
選択マーカー遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびチオストレプトン耐性遺伝子から成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
発現すべき核酸フラグメントは、イソプレノイド分子の産生に関与する酵素、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）シンターゼ、カロテノイド生合成酵素、亜硝酸ヒドラターゼ、エチレン形成酵素、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、テルペンシンターゼ、およびコレステロールオキシダーゼをコードする遺伝子から成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌は、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）から成る群より選択される、請求項２８に記載のプラスミド。
【請求項３３】
放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌は、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス・ロドキュラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス・コレエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、およびロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）から成る群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１７または１８に記載のプラスミドを含んで成る形質転換された細菌。
【請求項３５】
細菌は放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリーのメンバーである、請求項３４に記載の形質転換された細菌。
【請求項３６】
細菌は、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）から成る群より選択される請求項３５に記載の形質転換された細菌。
【請求項３７】
ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス・ロドキュラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス・コレエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、およびロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）から成る群より選択される、請求項３６に記載の形質転換された細菌。
【請求項３８】
異なる不和合性グループに属する第２のプラスミドを含んで成る、請求項３４に記載の形質転換された細菌。
【請求項３９】
ａ）（ｉ）請求項１に記載の核酸；
（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；および
（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター；
を含む第１のプラスミドを提供すること、
ｂ）第１のプラスミドと異なる不和合性グループにある少なくとも１つの他のプラスミドを提供することであって、ここで、少なくとも１つの他のプラスミドは、
（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；および
（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター；
を含む、
ｃ）（ａ）および（ｂ）のプラスミドで放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を形質転換すること；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換された放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を、核酸フラグメントが発現される期間および条件下で培養すること、
を含んで成る、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌において核酸を発現させる方法。
【請求項４０】
放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌は、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）から成る群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの他のプラスミドはＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ４７０７２を有するｐＤＡ７である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／２５４，８６８号の恩典を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、微生物学の分野に属する。より具体的には、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種などの生物体における遺伝子のクローニングおよび発現のためのベクターが提供される。
【０００３】
発明の背景
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するグラム陽性細菌（そのいくつかは、以前は、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、もしくはジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）種か、または「ロドキュラス（ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）」複合体のメンバーとして分類された）は、環境中に広範に分布する。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバーは、抗生物質およびアミノ酸の産生、バイオサーファクタントの産生、ならびに極めて多様な有機および生体異物化合物の生物分解および生物変換を含む広範な代謝活動を示す（Ｖｏｇｔ  ＳｉｎｇｅｒおよびＦｉｎｎｅｒｔｙ，  １９８８，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７０：６３８−６４５；ＱｕａｎおよびＤａｂｂｓ，  １９９３，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ２９：  ７４−７９；ＷａｒｈｕｒｓｔおよびＦｅｗｓｏｎ，  １９９４，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：２９−７３を参照のこと）。不運なことに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などの生物体におけるこれらの代謝活動について調査し、利用するのに適切な遺伝子ツールはほとんど存在しない（Ｆｉｎｎｅｒｔｙ，  １９９２，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４６：１９３  ２１８を参照のこと）。
【０００４】
最近、いくつかのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）プラスミドおよびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）シャトルベクターについて記載されている。これらのプラスミドおよびベクターは異なる５つの派生グループに分けることができる：ａ）ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）由来のプラスミド（Ｄｅｓｏｍｅｒら、１９８８，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７０：２４０１  ２４０５；およびＤｅｓｏｍｅｒら、１９９０，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５６：２８１８−２８１５）；ｂ）ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）由来のプラスミド（ＪＰ  １０２４８５７８、ＥＰ  ７５７１０１、ＪＰ  ０９０２８３７９、米国特許第５，７０５，３８６号、Ｄａｂｂｓら、１９９０，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ２３：２４２−２４７、ＱｕａｎおよびＤａｂｂｓ，  １９９３，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ２９：７４−７９、Ｄａｂｂｓら、１９９５，  Ｂｉｏｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ，  ７−８：１２９−１３５、Ｄｅ  Ｍｏｔ，ら、１９９７，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １４３：３１３７−３１４７）；ｃ）ロドコッカス・ロドキュラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来のプラスミド（ＥＰ  ４８２４２６；米国特許第５，２４６，８５７号；ＪＰ  １９９０−２７０３７７；ＪＰ  ０７２５５４８４；ＪＰ  ０８０３８１８４；米国特許第５，７７６，７７１号；ＥＰ  ７０４５３０；ＪＰ  ０８０５６６６９；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９９２，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３８：１００３−１０１０；Ｂｉｇｅｙら、１９９５，  Ｇｅｎｅ，  １５４：７７−７９；Ｋｕｌａｋｏｖら、１９９７，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ３８：６１−６９）；ｄ）ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）由来のプラスミド（米国特許第４，９２０，０５４号；Ｚｈｅｎｇら、１９９７，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ３８：１８０−１８７）ならびにｅ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種由来のプラスミド（ＷＯ  ８９／０７１５１；米国特許第４，９５２，５００号；Ｖｏｇｔ  Ｓｉｎｇｅｒら、１９８８，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７０：６３８−６４５；Ｓｈａｏら、１９９５，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２１：２６１−２６６；Ｄｕｒａｎ，  １９９８，  Ｊ．  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３８：１０１−１０６；Ｄｅｎｉｓ−Ｌａｒｏｓｅら、１９９８，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６４：４３６３−４３６７）。
【０００５】
これらの先の研究は、いくつかのプラスミドおよびシャトルベクターについて記載しているが、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などの生物体を遺伝子操作するためにある市販のツールの相対数は制限されている。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に適切な発現ベクターを開発する上での難点の１つは、レプリカーゼまたはこの宿主でプラスミドの複製を可能にする複製タンパク質（ｒｅｐ）をコードする配列の数が制限されていることである。有用な発現またはシャトルベクターを設計するためには、そのような配列に関する知識が必要である。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において機能する他のシャトルベクターに関する複製配列は既知である（Ｄｅｎｉｓ−Ｌａｒｏｓｅら、１９９８，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６４：４３６３−４３６７）；Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  （１２），  ３２３３−３２３６  （１９９８）；Ｄａｓｅｎ，Ｇ．Ｈ．  ＧＩ：３２１２１２８；およびＭｅｎｄｅｓら、ＧＩ：６５２３４８０）が、それらは稀である。
【０００６】
同様に、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における発現およびシャトルベクターの設計におけるもう１つの関心はプラスミドの安定性である。任意のプラスミドの安定性はしばしば変動し、特定の宿主においてプラスミドの安定性を維持するには、通常抗生物質的選択が必要であるが、これは、産業規模の生産において経済的でなく、また安全な実施でもない。抗生物質的選択を伴わないプラスミドの安定性を増加するかもしくは維持するために機能する遺伝子またはタンパク質については、ほとんど知られていない。
【０００７】
従って、解決すべき問題は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などの生物体の遺伝子操作において、使用するためのさらなる有用なプラスミドおよびシャトルベクターを提供することである。そのようなベクターは強健な複製タンパク質を有する必要があり、宿主において安定に維持されることが可能でなければならない。
【０００８】
本出願人らは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）から新規のクリプティックプラスミド、ｐＡＮ１２を単離し、特徴付けし、ｐＡＮ１２を使用して新規の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターを構築することによって、上記の問題を解決した。本出願人らの発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種（ｓｐ．）などの生物体の遺伝子操作において使用するための重要なツールを提供する。本発明のベクターは、プラスミドの複製に必要な複製配列を含有し、プラスミドの複製に適切な他の複製配列を単離するか、または設計するために使用することができる。さらに本発明のプラスミドは、プラスミドの安定性に必要な細胞分裂タンパク質に相同性を有する配列を含有する。本出願人らのシャトルベクターは、同一のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主細胞において他のシャトルベクターと共存することができるため、それらは特に所望される。従って、本出願人らのベクターは、単一の宿主細胞において、同時発現のための他の和合性プラスミドと組み合わせて使用することもできる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種において外来遺伝子のクローニングおよび発現のための新規の核酸、およびこれらの核酸を含むベクターを提供する。特に、本発明は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）の専用株ＡＮ１２から単離された新規のプラスミド、ならびに本プラスミドから調製される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバーの両方において複製することができる新規のシャトルベクターを提供する。これらの新規のベクターを使用してクローニングし、宿主細菌細胞を遺伝子操作して、目的のタンパク質のポリペプチドを発現させることができる。さらに、本出願人らは、プラスミドの複製および安定性に一般的な有用性を有する、プラスミド上に存在するいくつかの独特なコーディング領域を同定し、単離した。これらのうちの第１は、新規のプラスミド内で独特な複製タンパク質、ｒｅｐをコードする核酸である。第２の配列は、細胞分裂タンパク質に顕著な相同性を有するタンパク質をコードし、プラスミドの安定性を維持する役割を有することが決定されている。複製タンパク質および安定性タンパク質のヌクレオチド配列の両方は、様々なクローニングおよび発現ベクター、特に、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種などの生物体における同種および異種遺伝子の発現のためのシャトルベクターにおいて使用することができる。
【００１０】
従って、本発明は、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃下で（ａ）にハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される単離された核酸；または（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸から成る群より選択される、複製タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【００１１】
同様に、本発明は、（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸；（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃下で（ａ）にハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される単離された核酸；または（ａ）もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸から成る群より選択される、プラスミド安定性タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドおよび該配列を含有する形質転換された宿主を提供する。
【００１３】
本発明の遺伝子の相同物を単離する方法も提供される。１つの実施態様において、本発明は、（ａ）本発明の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングすること；（ｂ）本発明の核酸分子にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；および（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含むゲノムフラグメントの配列を決定すること、を含んで成り、配列決定されたゲノムフラグメントが複製タンパク質または安定性タンパク質をコードする、複製タンパク質または安定性タンパク質をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１４】
もう１つの実施態様において、本発明は、（ａ）本発明の配列の一部に対応する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；および（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅すること；を含んで成り、増幅された挿入物は複製タンパク質または安定性タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、複製タンパク質または安定性タンパク質をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１５】
好適な実施態様において、本発明は、本発明の複製および安定性タンパク質をコードする遺伝子、および必要に応じて選択マーカーを含んで成るプラスミドを提供する。遺伝子発現のためのプラスミド複製に好適な宿主は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリーおよび特にロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属である。
【００１６】
もう１つの好適な実施態様において、本発明は、ａ）（ｉ）ｒｅｐおよび安定性タンパク質をコードする本発明の核酸；（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；ならびに（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター；を含むプラスミドを提供すること、ｂ）（ａ）のプラスミドで放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を形質転換すること；ならびにｃ）（ｂ）の形質転換された放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を、核酸フラグメントが発現される期間および条件下で培養することを含んで成る、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌において核酸を発現させる方法を提供する。
【００１７】
代替的実施態様において、本発明は、ａ）（ｉ）ｒｅｐタンパク質をコードする核酸；（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；および（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター；を含む第１のプラスミドを提供すること、ｂ）第１のプラスミドと異なる不和合性グループにある少なくとも１つの他のプラスミドを提供することであって、ここで、少なくとも１つの他のプラスミドは、（ｉｉ）選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸；および（ｉｉｉ）発現すべき核酸フラグメントに操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、ｃ）（ａ）および（ｂ）のプラスミドで放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を形質転換すること；ならびにｄ）（ｃ）の形質転換された放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌を、核酸フラグメントが発現される期間および条件下で培養することを含んで成る、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌において核酸を発現させる方法を提供する。
【００１８】
配列の説明
本発明は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００１９】
本出願人（ら）は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する３０配列を提供している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２０】
【表１】
2004517623.tif 000003
【００２１】
発明の詳細な説明
本出願人らは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株から新規のクリプティックプラスミド、ｐＡＮ１２を単離し、特徴付けし、ｐＡＮ１２を使用して新規の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターを構築した。本出願人らの発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種などの生物体の遺伝子操作において使用するための重要なツールを提供する。さらに、本出願人らは、新規のプラスミドから独特な複製タンパク質、ｒｅｐをコードする核酸を同定し、単離した。核酸をコードする複製タンパク質は、様々なクローニングおよび発現ベクター、特に、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種（ｓｐ．）などの生物体における同種および異種遺伝子の発現のためのシャトルベクターにおいて、使用することができる。同様に、本出願人らは、プラスミドの安定性を維持するのに有用なタンパク質をコードするプラスミド上の配列を同定し、特徴付けた。本出願人らのシャトルベクターは、同一のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主細胞において他のシャトルベクターと共存することができるため、それらは特に所望される。従って、本出願らのベクターは、単一の宿主細胞において、同時発現のための他の和合性プラスミドと組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
もう１つの実施態様において、本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の両方において複製する能力を有するが、大きなＤＮＡを輸送するのに十分小さい、コンパクトなシャトルベクターを提供する。
【００２３】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供され、本発明の範囲および実施を理解するのに役立つべきである。
【００２４】
特定の実施態様において、用語「約」または「およそ」は、所定の値または範囲の２０％内、好ましくは１０％内、より好ましくは５％内を意味する。
【００２５】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合したサブユニットから成る高分子化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（両方とも一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい）を含む。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれる。
【００２６】
「単離された核酸分子」または「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖型か、あるいは二本鎖ヘリックスのいずれかのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）リン酸エステルの高分子型か、あるいはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのその任意のホスホエステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語の核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の１次および２次構造のみを指すが、任意の特定の３次構造を限定するものではない。従って、この用語は、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子で見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）、プラスミドおよび染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する場合、配列は、本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣行に従って説明することができる。
【００２７】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集成体を指し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」はまた、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでいる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源に由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００２８】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどのもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）、特に、第１１章および該第１１章に掲載の表１１．１（以後「Ｍａｎｉａｔｉｓ」全体が参考として本明細書に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件はより高い温度を使用し、ここで洗浄は、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させることを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。もう１つの組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄によって規定される。
【００２９】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間にミスマッチの可能性が存在する。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当業者に周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリダイズに対するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリダイズについては、Ｔｍを算出するための式が誘導されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲、９．５０  ９．５１を参照のこと）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、および最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、必要であれば、プローブの長さなどの因子に従って、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識するであろう。
【００３０】
当該分野において公知である用語「同一性％」は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することによって決定される。当該分野において、場合により「同一性」は、ペプチドまたはポリペプチド配列間の配列関係の程度をも意味し、そのような配列のストリング間の一致によって決定される。「同一性」および「類似性」は、以下に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に算出することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：    Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ  （１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９１）。同一性を決定するための好適な方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化される。配列のアラインメントおよび同一性％の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施した。配列の複数のアラインメントは、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用い、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ  （１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ  ５：  １５１−１５３）を使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用する対にしたアラインメントのためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズ  セイブド＝５であった。
【００３１】
適切な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は本明細書において報告したアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告されているアミノ酸配列に約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告されているアミノ酸配列に約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告されているアミノ酸配列に約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけでなく、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドを典型的にコードする。
【００３２】
用語「プローブ」は、相補的な一本鎖標的核酸と塩基対を形成し、二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を指す。
【００３３】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびにそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的である単離された核酸フラグメントを含む。
【００３４】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な一般に約１８ヌクレオチドの核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチドまたはビオチンなどの標識が共有結合しているヌクレオチドで標識することができる。オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、本発明のヌクレオチドの存在を検出することができる。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドの全長またはフラグメントをクローニングするためかまたは本発明の核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（そのうち一方または両方を標識することができる）をＰＣＲプライマーとして使用することができる。さらなる実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子によって三重らせん構造を形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは合成的により、好ましくは核酸合成機で調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などの天然には存在しないリン酸エステル類似体結合により調製することができる。
【００３５】
ＤＮＡ「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビトロまたはインビボで細胞においてポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含んでもよい。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終了コドンによって決定される。コーディング配列としては、原核生物配列、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。コーディング配列が真核細胞における発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、通常、コーディング配列の３’側に位置する。
【００３６】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略称され、ＡＴＧまたはＡＵＧなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドンおよび終了コドンを含み、潜在的にポリペプチドに翻訳され得るＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのある長さの核酸配列を意味する。
【００３７】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般にコーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見いだされる異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントから成るか、または合成ＤＮＡセグメントをも含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞タイプ、または異なる発生段階において、あるいは異なる環境または生理的条件に応答して遺伝子の発現を指令することができることが理解される。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成プロモーター」と呼ぶ。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００３８】
「プロモーター配列」は細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を可能にし得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的のため、プロモーター配列は、３’末端で転写開始部位と結合し、バックグランドを超える検出可能なレベルで、転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むために、上流側（５’方向）に伸張する。プロモーター配列内に、（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって簡便に規定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００３９】
ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで該ｍＲＮＡがトランス−ＲＮＡスプライシングを受け（コーディング配列がイントロンを含有する場合）、そしてコーディング配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コーディング配列は細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００４０】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００４１】
用語「操作可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能の影響を受けるような単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響することが可能である（即ち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。コーディング配列は、センスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００４２】
本明細書で使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また、発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００４３】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列内で結合および切断する酵素を指す。
【００４４】
「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、特定の核酸（同種領域）の発現を天然で担う配列を含み得るかまたは異なるタンパク質もしくは合成タンパク質（異種領域）の発現を担う異なる起源の配列を含み得る。特に、配列は、原核生物、真核生物、もしくはウイルス遺伝子の配列あるいは特定または非特定の様式および誘導性または非誘導性の様式で、遺伝子の転写を刺激もしくは抑制する誘導された配列であり得る。調節領域は、複製開始点、ＲＮＡスプライシング部位、プロモーター、エンハンサー、転写終了配列、およびポリペプチドを、標的細胞の分泌経路に指令するシグナル配列を含む。
【００４５】
「異種起源」由来の調節領域は、発現された核酸とは天然には関連しない調節領域である。異種調節領域の間では異なる種由来の調節領域、異なる遺伝子由来の調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在しないが、当業者により設計される調節配列が誘導される。
【００４６】
「異種」ＤＮＡは、細胞、または細胞の染色体部位において天然には位置しないＤＮＡを指す。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞に対して外来性の遺伝子を含む。
【００４７】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によりポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でありかつこれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを包含し、そして、従って細胞によりポリペプチドに翻訳される可能性があるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号；ＷＯ  ９９２８５０８）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、またはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分に対してであり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されていないがしかし細胞の過程に対する影響をなお有する他のＲＮＡを指す。
【００４８】
「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基から成る高分子化合物である。アミノ酸は以下の一般構造を有する。：
【００４９】
【化１】
2004517623.tif 000004
【００５０】
アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つのグループに分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）イオウ原子を含有する側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側鎖、（６）芳香環を含有する側鎖、および（７）プロリン、側鎖がアミノ基に融合したイミノ酸。本発明のポリペプチドは、好ましくは少なくとも約１４アミノ酸を含む。
【００５１】
「タンパク質」は、生細胞において構造的または機能的役割を果たすポリペプチドである。
【００５２】
「異種タンパク質」は、細胞において天然には産生されないタンパク質を指す。
【００５３】
「成熟タンパク質」は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド；すなわち、それから一次翻訳産物中に存在するいかなるプレペプチド、またはプロペプチドも除去されているものを指す。「前駆」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物；すなわちなお存在するプレペプチドおよびプロペプチドを伴うものを指す。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであってよいがしかしそれに制限されない。
【００５４】
用語「シグナルペプチド」は、分泌される成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは、成熟タンパク質から切断され、従って成熟タンパク質内には存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜を横切って分泌されるタンパク質を指令し、輸送する機能を有する。シグナルペプチドはまた、シグナルタンパク質とも称される。
【００５５】
「シグナル配列」は、細胞の表面上で発現されるタンパク質のコーディング配列のはじめの部分に含まれる。この配列は、シグナルペプチド（成熟ポリペプチドに対してＮ末端）をコードし、宿主細胞にポリペプチドを輸送することを指令する。用語「輸送シグナル配列」は、この種のシグナル配列を指すものとして本明細書において使用する。輸送シグナル配列は、真核生物および原核生物に生来の様々なタンパク質に関連することが見出され得、しばしば、両方の種類の生物体において機能的である。
【００５６】
本明細書において使用される用語「相同的」は、そのすべての文法的形態および綴りにおいて、スーパーファミリー由来のタンパク質および異なる種由来の相同的タンパク質を含む「共通進化起源」を有するタンパク質間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、１９８７，  Ｃｅｌｌ  ５０：６６７）。そのようなタンパク質（およびそれらをコードする遺伝子）は、それらの高い程度の配列類似性によって反映される配列相同性を有する。
【００５７】
用語「に対応する」は、類似性または相同性が測定される分子と正確な位置で同一であるかまたは異なるかどうかに係わらず、類似または相同的配列を指すものとして本明細書において使用される。核酸またはアミノ酸配列アラインメントは空白部分を含み得る。従って、用語「に対応する」は、配列の類似性を指し、アミノ酸残基または核酸塩基の番号付けを指すものではない。
【００５８】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「本質的な部分」は、当業者により人的評価によるかまたはＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）のようなアルゴリズムを使用するコンピュータにより自動化された配列の比較、および同定を使用することによるかのいずれかで、ポリペプチドもしくは遺伝子を推定的に同定するのに十分であるポリペプチドのアミノ酸配列、または遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る。一般に、あるポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に対して、相同として推定で同定するためには、１０もしくはそれ以上の連続するアミノ酸または３０もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーもしくはバクテリオファージのプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列に依存する方法では、２０〜３０の連続するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。加えて、プライマーを含んで成る特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増幅プライマーとして、使用することができる。従って、ヌクレオチド配列の「本質的な部分」は、該配列を含んで成る核酸フラグメントの特異的に同定し、および／または単離するのに十分な配列を含んで成る。本明細書は、１種またはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的、もしくは完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告されるような配列の恩恵を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の全部もしくは本質的な部分を使用してよい。従って本発明は、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上で規定されたようなそれらの配列の本質的部分を含んで成る。
【００５９】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の解析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されていてもよく、また独立して開発してもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとして、ＧＣＧプログラムソフトウェアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］  （１９９４），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，  １１１−２０．    Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：    Ｓｕｈａｉ，  Ｓａｎｄｏｒ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：    Ｐｌｅｎｕｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）が挙げられるが、これらに限定されない。本出願に従い、配列解析ソフトウェアが解析のために使用される場合、解析結果は、他に特定しない限り参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書において使用される「デフォルト値」は、最初に初期化した場合に本来ソフトウェアにロードされる任意の組の値、またはパラメータを意味する。
【００６０】
「ベクター」は、核酸を宿主細胞へ伝達するための任意の手段を意味する。ベクターは、付着したセグメントの複製が生じるように、もう１つのＤＮＡセグメントが付着し得るレプリコンであってもよい。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自立単位として機能する、即ち、自体の制御下での複製が可能である任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルスおよび非ウイルス手段の両方を含む。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、痘、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン−バールおよびアデノウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））、ＤＮＡ−タンパク質複合体、および生体高分子が挙げられる。核酸に加えて、ベクターは、１つ以上の調節領域、ならびに／または核酸伝達結果（どの組織に伝達されたか、発現の期間など）の選択、測定、およびモニタリングに有用な選択マーカーをも含有することができる。
【００６１】
用語「プラスミド」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状、環状あるいはスーパーコイルであってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。
【００６２】
「クローニングベクター」は、順次複製し、付着したセグメントの複製が生じるように、もう１つのＤＮＡセグメントが付着し得るプラスミド、ファージまたはコスミドなどの複製開始点を含む単位長さのＤＮＡの「レプリコン」である。クローニングベクターは、１つの細胞タイプにおける複製、および別の細胞タイプにおける発現が可能であり得る（「シャトルベクター」）。
【００６３】
外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入されている場合、細胞はそのようなＤＮＡにより「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化を生じる場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込む（共有結合する）ことができる。
【００６４】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。
【００６５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略称され、特定の核酸配列を酵素的に増幅するためのインビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、各サイクルが３つの段階：標的分子のストランドを分離するためのテンプレート核酸の変性、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレート核酸にアニーリングさせること、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を含んで成る、温度サイクルの反復系列に関与する。
【００６６】
用語「ｒｅｐ」または「ｒｅｐＡ」はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）プラスミドが複製する能力を制御する複製タンパク質を指す。本明細書において使用されるタンパク質は、「複製タンパク質」または「レプリカーゼ」とも称される。用語「ｒｅｐ」は、ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を記述するために使用される。
【００６７】
用語「ｄｉｖ」は、プラスミドの安定性を維持するために必要なタンパク質を指す。ｄｉｖタンパク質は、細胞分裂タンパク質に対して顕著な相同性を有し、本明細書においては「プラスミド安定性タンパク質」とも称される。
【００６８】
用語「複製開始点」または「ＯＲＩ」は、ＤＮＡの複製が開始されるＤＮＡ分子内の特定の部位もしくは配列を指す。細菌およびファージ染色体は、単一の複製開始点を有する。
【００６９】
用語「ｐＡＮ１２」は、配列番号５に記載の核酸配列のすべてまたは本質的な部分を含むプラスミドを指し、ここで、プラスミドは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｒｅｐコード核酸、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むｄｉｖコード核酸、および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む複製開始点を含む。
【００７０】
用語「ｐＲＨＢＲ１７」は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは本質的な部分を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターを指し、ここで、シャトルベクターは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｒｅｐコード核酸、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むｄｉｖコード核酸、および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む複製開始点を含む。
【００７１】
用語「ｐＲＨＢＲ１７１」は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列のすべてまたは本質的な部分を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターを指し、ここで、シャトルベクターは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｒｅｐコード核酸、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むｄｉｖコード核酸、および配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む複製開始点を含む。
【００７２】
用語「遺伝子領域」は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域を指す。
【００７３】
用語「選択マーカー」は、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択され得る同定因子、通常、抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、該効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を遺伝している細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００７４】
プラスミドに適用される用語「不和合性」は、任意の２つのプラスミドが同じ細胞に共存できないことを指す。同じ不和合性グループ由来に由来する任意の２つのプラスミドは、同じ細胞内に維持することができない。異なる「不和合性グループ」由来のプラスミドは、同時に同じ細胞に存在することができる。不和合性グループは、グラム陰性細菌の接合性プラスミドで最も広範に分析されている。
【００７５】
用語「放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリー」は、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）を含むがこれらに限定されない属から成る細菌ファミリーを意味する。
【００７６】
本発明の核酸
本出願人らは、本発明の新規のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）プラスミド内の独特な複製タンパク質、ｒｅｐをコードする核酸を同定し、単離した。この複製タンパク質をコードする核酸は、様々なクローニングおよび発現ベクター、特に、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種などの生物体における同種、および異種遺伝子の発現のためのシャトルベクターにおいて使用することができる。本発明の複製タンパク質の核酸およびアミノ酸配列の比較は、スミス−ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］  （１９９４），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，  １１１  ２０．    Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：    Ｓｕｈａｉ，  Ｓａｎｄｏｒ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：    Ｐｌｅｎｕｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）によって整列されるように、この配列が独特であり、アルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の４５９アミノ酸Ｒｅｐタンパク質にわずか５１％同一性および３５％類似性しか有さないことを示した（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｓ．  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０，  ３２３３−３２３６，  １９９８）。
【００７７】
本出願人らは、本発明の新規のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）プラスミド内に、推定細胞分裂（ｄｉｖ）タンパク質に相同性を有する独特なプラスミド安定性タンパク質をコードする核酸を同定し、単離した。この安定性タンパク質は独特であり、公共データベース中の配列と比較した場合、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来の５２９アミノ酸推定細胞分裂タンパク質のＣ末端部分に対して２４％の同一性と４０％の類似性を有するのみである（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９  （５２２３），  ４９６  ５１２  （１９９５））。
【００７８】
従って、配列が複製機能をコードし、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドか、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列と比較して、アラインメントのスミス−ウォーターマン法（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ、上掲）に基づき少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３７９アミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、該配列は本発明の範囲内にある。
【００７９】
同様に、配列が安定性機能をコードし、配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドか、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列と比較して、アラインメントのスミス−ウォーターマン法（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ、上掲）に基づき少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも２９６アミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、該配列は本発明の範囲内にある。
【００８０】
従って、好適なアミノ酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に対し少なくとも約７０％〜８０％同一である。本明細書において報告されているアミノ酸フラグメントに対し、少なくとも約９０％〜９５％同一であるアミノ酸フラグメントが最も好適である。同様に、本発明のｒｅｐおよびｄｉｖ遺伝子に対応する好適なコード核酸配列は、有効タンパク質をコードするタンパク質であり、本明細書において報告されている核酸配列に少なくとも７０％同一である。より好適なｒｅｐおよびｄｉｖ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に対し少なくとも８０％同一である。本明細書において報告されている配列に対し少なくとも９０％〜９５％同一であるｒｅｐおよびｄｉｖ核酸フラグメントが、最も好適である。
【００８１】
本発明の核酸フラグメントを使用して、同じまたは他の微生物種由来の同種タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを使用する相同的遺伝子の単離は、当該分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術［例えばポリメラーゼ連鎖反応、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  １０７４−１０７８  （１９８５）］またはストランド置換増幅［ＳＤＡ，  Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８９，  ３９２，  （１９９２）］の多様な使用によって例示されるように、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドに類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明の核酸フラグメントのすべてまた一部を、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して任意の所望される細菌からライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。本発明の核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において既知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲、１９８９）により設計および合成することができる。さらに、配列全体は、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、もしくは末端標識技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成するのに直接使用することができる。加えて、本配列の一部または完全長を増幅するための特異的プライマーを設計かつ使用することができる。生じる増幅産物は増幅反応の間に直接標識することができるか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で、完全長のＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【００８３】
典型的に、ＰＣＲ型増幅技術において、プライマーは、異なる配列を有し、相互に相補的ではない。所望される試験条件に依存して、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ正確な複製を提供するために設計するべきである。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該分野において周知である。（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ，  “Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｋ．  Ｅ．  Ｄａｖｉｓ  Ｅｄ．，  （１９８６）  ｐｐ．  ３３−５０  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ；Ｒｙｃｈｌｉｋ，  Ｗ．  （１９９３）  Ｉｎ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｂ．  Ａ．  （ｅｄ．），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １５，  ｐａｇｅｓ  ３１−３９，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．    Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ）。
【００８４】
一般に、本発明の配列の２個の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルで使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同な遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリー上で実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列は本発明の核酸フラグメント由来であり、そして他方のプライマーの配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の存在を利用する。あるいは、第２のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列に基づいてよい。例えば、当業者は、ＰＣＲを使用して転写物と３’またはは５’末端との単一点の間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを生じさせるＲＡＣＥプロトコル［Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８  （１９８８）  ］に従うことが可能である。本発明の配列から３’および５’方向に配向されたプライマーを設計することが可能である。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特異的な３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる［Ｏｈａｒａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３  （１９８９）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７  （１９８９）］。
【００８５】
あるいは、本発明の配列は、相同物の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いることもできる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成成分には、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑われるサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション方法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは５塩基〜数万塩基に変動することができ、実施しようとする特定の試験に依存する。典型的に、約１５塩基〜約３０塩基のプローブの長さが適切である。プローブ分子のただ一部のみが検出しようとする核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全な相補的分子の間でも生じ、その結果、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は、適切な相補的塩基と対を形成しない。
【００８６】
ハイブリダイゼーション方法は良好に規定されており、上記で説明している。典型的に、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下でプローブとサンプルとを接触させることを要する。プローブおよびサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸との間に可能な任意のハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間だけ接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短い。必要に応じて、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする。［Ｖａｎ  ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ  （１９９１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：５１４３−５１５１］。適切なカオトロピック剤としては、特に、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ハイブリダイゼーション混合物に典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを添加することができる。
【００８７】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアルデヒド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（約６〜９のｐＨ範囲）などの約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビリルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、フラグメント化した核酸ＤＮＡ、例えばウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡおよび必要に応じて約０．５〜２％ｗｔ．／ｖｏｌ．グリシンが含まれる。また、ポリエチレングリコールなどの様々な極性水溶性または膨潤剤、ポリアクリレートまたはポリメタクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性多糖性ポリマーを含む体積排除剤などの他の添加物も含まれ得る。
【００８８】
核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応可能である。最も適切な形式の１つはサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能である。サンドイッチ型アッセイの主な構成成分は固相支持体である。固相支持体は、標識されていない、配列の一方の部分に相補的である固定化された核酸プローブを吸着するかまたは共有結合している。
【００８９】
本発明のプラスミドおよびベクター
細菌における遺伝子発現に有用なプラスミドは自己複製（自律複製）プラスミドまたは染色体への組込みのいずれであってもよい。自己複製プラスミドは、複数コピーの目的の遺伝子を有する利点を有し、従って発現レベルは極めて高い。染色体組込みプラスミドは、組換えによってゲノムに組込まれる。それらの利点は安定であることであるが、発現レベルの低下が生じる可能性がある。好適な実施態様において、本発明のプラスミドまたはベクターは自己複製であり、本発明の方法に従って使用される。
【００９０】
適切な細胞宿主の形質転換に有用なベクターまたはプラスミドは、当該分野において周知である。典型的に、ベクターまたはプラスミドは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自律複製および染色体組み込みを可能にする配列を含有する。特定の実施態様において、プラスミドまたはベクターは本発明の核酸を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の５’領域および転写終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含む。両制御領域が形質転換される宿主細胞に相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定の種に生来の遺伝子から誘導される必要はない。本発明のベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主におけるベクターの複製を容易にする上記の独特な複製タンパク質（ｒｅｐ）をさらに含有する。さらに、本発明のベクターは、宿主におけるベクターの安定性を維持するのに有用である安定性コーディング配列を含み、推定細胞分裂タンパク質に顕著な程度の相同性を有する。本発明のベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主において発現させようとする目的の遺伝子の容易な挿入のための簡便な制限部位を含有する。
【００９１】
本発明は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）宿主から単離された２つの特定のプラスミド、ｐＡＮ１２ならびにそれから誘導および構築されたシャトルベクターに関する。ｐＡＮ１２ベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の独特なＯｒｉおよび複製および安定性配列を含有する一方、シャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の複製のための複製開始点（ＯＲＩ）ならびにロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）における選択のための抗生物質耐性マーカーをさらに含有する。
【００９２】
細菌プラスミドのサイズは、典型的に、約１ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲であり、該プラスミドは、一般に、細菌宿主において自律複製遺伝子単位である。所望の遺伝子を含有するプラスミドを含有し得る細菌宿主が同定されている場合、宿主細胞の培養を増殖させ、溶解し、細胞材料からプラスミドを精製する。プラスミドが高コピー数型である場合、さらなる増幅を伴うことなく該プラスミドを精製することが可能である。さらなるプラスミドＤＮＡが必要である場合、細菌細胞は、宿主細胞のタンパク質合成を阻害するクロラムフェニコールなどのタンパク質合成阻害剤の存在下で増殖し、作製しようとするプラスミドのさらなるコピー数を可能にすることができる。細胞溶解は、軽度の界面活性剤の存在下で酵素的（即ち、リゾチーム）、煮沸または強塩基による処置のいずれかで達成することができる。選択される方法は、宿主細菌の特徴および単離しようとするプラスミドのサイズを含む因子の数に依存する。
【００９３】
溶解後、プラスミドＤＮＡは、勾配遠心分離（例えば、ＣｓＣｌ−臭化エチジウム）またはフェノール：クロロホルム溶媒抽出によって精製することができる。さらに、サイズまたはイオン交換クロマトグラフィーならびにポリエチレングリコールによる分画分離を使用することができる。
【００９４】
一旦、プラスミドＤＮＡが精製されると、制限酵素解析によってプラスミドを解析し、プラスミド上に含有される遺伝子の配列およびプラスミドの制限地図を作成するための各制限部位の位置を決定するために配列決定することができる。ベクターを構築するかまたは単離する方法は一般的であり、当該分野において周知である（例えば、Ｍａｎｉｔａｓ、上掲、Ｃｈａｐｔｅｒ  １；  Ｒｏｈｄｅ，  Ｃ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９５），  １１（３），  ３６７−９）；Ｔｒｅｖｏｒｓ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８５），  ３（５−６），  ２５９−７１を参照のこと）。
【００９５】
これらの一般的方法を使用して、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２より６．３ｋｂのｐＡＮ１２を単離し、地図を作成し（図１を参照のこと）、制限部位の位置を決定した（以下の表１を参照のこと）。
【００９６】
【表２】
2004517623.tif 000005
【００９７】
一旦、地図が作成されたら、単離されたプラスミドを多くの方法で修飾することができる。現存の制限部位を使用して、宿主細胞での発現に所望される特定の遺伝子をプラスミド内に挿入することができる。さらに、当該分野において周知の技術を使用して、遺伝子の挿入を容易にするように、新たなまたは異なる制限部位をプラスミドに操作することができる。多くの生来の細菌プラスミドは、様々な抗生物質に対する耐性または感受性をコードする遺伝子を含有する。しかし、現存のマーカーを他のマーカーで置き換えるために、さらなる選択マーカーを挿入することは有用であり得る。本発明において有用な選択マーカーとしては、抗生物質耐性または感受性を付与する遺伝子、色（例えば、ｌｕｃ）または光（例えば、Ｌｕｃ；Ｌｕｘ）などの選択標識をコードする遺伝子または特定の表現型の代謝もしくは形態学的特質を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、グラム陰性およびグラム陽性宿主において選択可能であるマーカーが好ましい。アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびチオストレプトン耐性遺伝子を含むがこれらに限定されない抗生物質耐性または感受性をコードするマーカーが本発明において特に適切である。
【００９８】
本発明のプラスミドは、宿主において発現させようとする目的の遺伝子を含有する。発現させようとする遺伝子は、宿主に対し生来もしくは内因性であるか、または異種遺伝子のいずれであってもよい。様々な合成または分解経路に関与する酵素をコードする遺伝子が特に適切である。
【００９９】
出願人らのベクターおよび方法を使用するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における発現のための目的の内因性遺伝子としては、ａ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において発現され、本生物体においてイソプレノイド経路の高流量を利用することができるイソプレノイド分子の産生に関与する酵素をコードする遺伝子、例えば、１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子（ｄｘｓ）；ｂ）生物分解性プラスチックの産生のためにも発現され得るポリヒドロキシアルカノン酸（ＰＨＡ）シンターゼ（ｐｈａＣ）をコードする遺伝子；ｃ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における色素の産生を増加するために発現され得るカロテノイド経路遺伝子（例えば、ｃｒｔｌ）；ｄ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などにおいてアクリルアミド産生のためのニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子；およびｄ）廃物内細菌由来のモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における発現のための目的の異種遺伝子としては、ａ）エチレン産生のためのシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来のエチレン形成酵素、ｂ）アルコール産生のためのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、ｃ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるテルペン類の産生のための植物由来のテルペンシンターゼ、ｄ）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などにおける酵素の産生のためのマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のコレステロールオキシダーゼ（ｃｈｏＤ）、およびｅ）廃物内細菌由来のモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明のプラスミドまたはベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における遺伝子の発現を駆動するのに適切な少なくとも１つのプロモーターを含む。典型的に、開始制御領域を含むこれらのプロモーターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種由来である。終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の様々な遺伝子由来であり得る。必要に応じて、終了部位は必要ではないが、しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【０１０２】
必要に応じて、本発明の遺伝子産物を形質転換された宿主の分泌産物として産生することを所望してもよい。増殖培地への所望されるタンパク質の分泌は、単純化された低コストの精製手順を利点とする。当該分野においては、分泌シグナル配列は、しばしば、細胞膜を横切る発現可能なタンパク質の能動輸送を容易にすることが周知である。分泌が可能である形質転換された宿主の作製は、宿主産生宿主において機能的である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の組み入れによって、達成することができる。適切なシグナル配列を選択する方法は当該分野において周知である（例えば、ＥＰ  ５４６０４９；ＷＯ９３２４６３１を参照のこと）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進因子は、発現制御ＤＮＡと本発明の遺伝子または遺伝子フラグメントとの間であって、後者と同じリーディングフレーム内に位置することができる。
【０１０３】
本発明はまた、少なくとも２つの異なる生物体間で複製するかもしくは「往復する」ことが可能であるプラスミドまたはベクターに関する。シャトルベクターは、１つの生物体から別の生物体へ遺伝子材料を運搬するのに有用である。シャトルベクターは、１を超える宿主において複製する能力によって他のベクターとは区別される。これは、複製しなければならない各宿主に対応する複製開始点の存在によって容易にされる。本発明のベクターは、遺伝子発現の目的のためにロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において複製するように設計される。それ自体は、それぞれロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における複製のための独特な複製開始点を含有する。この配列は配列番号８に記載されている。このベクターのための遺伝子操作の多くは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）において容易に達成することができる。従って、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）および他のグラム陽性細菌において機能する複製開始点を含んで成るシャトルベクターを有することは特に有用である。グラム陽性細菌のための多くのＯＲＩ配列が決定され、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）におけるＯＲＩのための配列が決定されている（Ｈｉｒｏｔａら、Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８１），  ２６，  ３３−４８；Ｚｙｓｋｉｎｄ，  Ｊ．Ｗ．；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７７，  ２４６０−２４６４  （１９８０），  ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣ．  ＮＯ．  （ＧＢＮ）：  Ｊ０１８０８）。グラム陽性細菌、特に放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリーのメンバーから単離されたそれらのＯＲＩ配列が本発明での使用に好適である。放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）細菌ファミリーのメンバーとしては、例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ダイエットジア（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属が挙げられる。
【０１０４】
本明細書では、２つのシャトルベクター、ｐＲｈＢＲ１７およびｐＲｈＢＲ１７１について記載しており、それぞれ個別に構築され、単離されているが、しかし本質的に同じ特徴を有する。ｐＲｈＢＲ１７の完全配列は配列番号６に示され、ｐＲｈＢＲ１７１の完全配列は配列番号７に示されている。
【０１０５】
ｐＲｈＢＲ１７は、約１１．２ｋｂのサイズを有し、表２および図２に示される制限酵素による切断の特徴を有する。
【０１０６】
【表３】
2004517623.tif 000006
【０１０７】
ｐＲｈＢＲ１７１は、約９．７ｋｂのサイズを有し、表３および図３に示される制限酵素による切断の特徴を有する。
【０１０８】
【表４】
2004517623.tif 000007
【０１０９】
本発明のベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種などの細菌における遺伝子の発現に特に有用である。これらのベクターの使用に特に適切なロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の種としては、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス・ロドキュラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス・コレエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ）、およびロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
遺伝子発現の方法
本出願人らの発明は、宿主細胞、特に微生物宿主の細胞における遺伝子発現の方法を提供する。組換え微生物宿主における発現は、様々な経路中間体の発現；これまで宿主を使用することができなかった新たな産物の合成のための宿主にすでに存在する経路の変調に有用であり得る。さらに、遺伝子産物は、宿主のより高い増殖収量を付与するかまたは利用すべき代替的増殖態様を可能にするのに有用であり得る。
【０１１１】
一旦、適切なプラスミドが構築されれば、それらは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。プラスミドを宿主細胞に導入することは、例えば、カルシウム透過性細胞を使用する形質転換、エレクトロポレーション、形質導入、または組換えファージウイルスを使用するトランスフェクションなどによる既知の手順によって達成することができる。（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲）
【０１１２】
好適な実施態様において、本発明のベクターは、宿主細胞に対して異種のＤＮＡをも含有するさらなるベクターと共に同時形質転換することができる。本発明のベクターおよびさらなるベクターの両方は、同じ不和合性グループ内になければならないことが理解されよう。２つ以上のプラスミドが同じ宿主内に共存する能力は、それらが同じ不和合性グループに属するかどうかに依存する。一般に、同じ代謝エレメントに対して競合しないプラスミドは、同じ宿主において和合性である。プラスミドの共存に係わる問題の競合に関する検討については、Ｔｈｏｍａｓら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９８７），  ４１，  ７７−１０１を参照のこと。本発明のベクターは、配列番号１に記載のｒｅｐタンパク質コーディング配列および配列番号８に記載のＯＲＩ配列を含む。本発明のｒｅｐタンパク質コーディング配列およびＯＲＩを含有する任意のベクターは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において複製することが予想される。本発明のｒｅｐ発現プラスミドと共に共存する能力を有する任意のプラスミドは、本発明のプラスミドとは異なる和合性グループ内にあり、指定された宿主における異種遺伝子の同時発現に有用である。
【０１１３】
微生物産生プラットホームとしてのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）形質転換体
一旦、適切なロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主が本発明の適切なベクターで首尾よく形質転換されたら、該宿主は、所望される遺伝子産物の商業的製造を可能にするために様々な方法で培養することができる。例えば、バッチまたは連続培養方法論の両方によって、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大規模製造を行うことができる。
【０１１４】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体または複数の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、最終産物産生の大部分を担うかまたはいくつかの系において中間的である。定常または指数後期産生は他の系で得ることができる。
【０１１５】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加培養プロセスも本発明に適切であり、培養の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ形を構成する。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、培地中の基質量を制限することを所望するならば、流加培養系は有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるためｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ．，  ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３６，  ２２７，  （１９９２）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【０１１６】
本タンパク質の商業的製造は、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、有益な産物、副産物または不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料から成る広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１１７】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調整することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの限られた栄養物を一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子は連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は培養物中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスの栄養および増殖因子を調整するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【０１１８】
実施例
以下の実施例において本発明をさらに規定する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【０１１９】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  （１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）ならびにＴ．  Ｊ．  Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．  Ｗ．  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８４）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂ．  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）  により記載されている。
【０１２０】
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｒ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｒａｌｐｈ  Ｎ．  Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，  Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．  Ｗｏｏｄ，  Ｎｏｅｌ  Ｒ．  ＫｒｉｅｇおよびＧ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編），  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ．  （１９９４））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  （１９８９）に記載の通りに見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）より入手した。
【０１２１】
遺伝子配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．から入手可能なプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して成し遂げられた。ここで、ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を使用する場合、１２のギャップ作成デフォルト値、および４のギャプ伸長デフォルト値を使用した。ＧＣＧ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを使用する場合、５０のデフォルトギャプ作成ペナルティおよび３のデフォルトギャプ伸長ペナルティを使用した。スミス−ウォーターマンアルゴリズム（Ｗ．  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］  （１９９４），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，  １１１〜２０．    Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：    Ｓｕｈａｉ，  Ｓａｎｄｏｒ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：    Ｐｌｅｎｕｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）を組み入れたＦＡＳＴＡプログラムを使用して、複数のアルゴリズムを作成した。プログラムのパラメータが即時的でない場合、これらまたは他の任意のプログラムにおいて、デフォルト値を使用した。
【０１２２】
略語の意味は次のようである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットル（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数および複数）を意味し、「Ｌ」はリットル（単数および複数）を意味し、「μＭ」はマイクロモル（単数および複数）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（単数および複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（単数および複数）を意味し、「ｍｇ」はミリグラム（単数および複数）を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチあたりのポンドを意味し、「ｐｐｍ」は百万あたりの部を意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「×ｇ」は重力の倍数を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチド（単数および複数）を意味し、「ａａ」はアミノ酸（単数および複数）を意味し、「ｂｐ」は塩基対（単数および複数）を意味し、「ｋｂ」はキロベース（単数および複数）を意味する。
【０１２３】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２の単離
本発明のロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株は、実施例１において以下に記載の通りに汚泥から単離した。
【０１２４】
配列決定のためのゲノムＤＮＡの調製および配列の生成
標準的なプロトコルに従って、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株からゲノムＤＮＡを単離した。
【０１２５】
ゲノムＤＮＡおよびライブラリー構築は、公開されているプロトコル（Ｆｒａｓｅｒら、Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，  １９９５）に従って調製される。細胞ペレットを、１００ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する溶液に再懸濁した。
【０１２６】
ゲノムＤＮＡ調製
再懸濁後、１０％ＳＤＳ中で細胞を穏やかに溶解し、３０分間、５５℃でインキュベートした。室温でインキュベーション後、プロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を１００μｇ／ｍｌまで添加し、懸濁液が澄明になるまで３７℃でインキュベートした。ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ緩衝化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡを７０％エタノール中で沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）ｐＨ７．５を含有する溶液に再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＲＮＡａｓｅの混合物で処理し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝化フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出した。これに続いて、エタノール中での沈殿およびＴＥ中で再懸濁した。
【０１２７】
ライブラリーの構築
２００〜５００μｇの染色体ＤＮＡを、３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、および３０％グリセロールの溶液に再懸濁し、Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒチャンバ（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ）中、１２ｐｓｉで６０秒間、せん断した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）で処置した。サイズ分画後、画分（２．０ｋｂ、または５．０ｋｂ）を切り出し、洗浄し、２段階連結反応手順を使用して、９９％を超える単一挿入物を有する高力価ライブラリーを生成した。
【０１２８】
配列決定
ショットガン配列決定ストラテジーアプローチを、全微生物ゲノムの配列決定に適応した（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，  Ｒｏｂｅｒｔら、Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，  ２６９：１９９５）。
【０１２９】
配列は、色素ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号；ＥＰ２７２００７）を使用して、ＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃシークエンサー上で作成した。配列の編集は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ）またはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のいずれか、およびＣＯＮＳＥＤ（バージョン７．０）で実施した。すべての配列は、両方向で少なくとも２倍の範囲を表す。
【０１３０】
ｒｅｐＡコーディング領域の同定および特徴付け
（３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベース由来のすべての非縮重性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、配列を含む）ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベースに含有される配列に対する類似性について、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．ら、（１９９３）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）調査を行うことにより、ｒｅｐＡタンパク質をコードするＤＮＡを同定した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）より提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含有される公的に利用可能なすべてのＤＮＡ配列に対する類似性について、配列を解析した。ＤＮＡ配列をすべてのリーディングフレーム内で翻訳し、ＮＣＢＩより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ，  Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，  Ｄ．  Ｊ．  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベースに含有される公的に利用可能なすべてのタンパク質配列に対する類似性について、比較した。すべての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを使用して行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果を表４に示し、それらが最も類似性を有する配列についてまとめている。表４は、予想値において報告された値でＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを示す。予想値は、このサイズのデータベースの調査において全く偶然に予想される一致数を所定のスコアで特定し、一致の統計的有意性を推定する。
【０１３１】
実施例１
ＡＮ１２株の単離および特徴付け
本実施例は、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリン上で増殖し得ることに基づく、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）のＡＮ１２株の単離について説明する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の解析は、ＡＮ１２株が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌に関連することを示した。
【０１３２】
アニリン上で増殖した細菌を、集積培養から単離した。集積培養は、１２５ｍｌスクリューキャプ付きＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中、１０ｍｌのＳ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、および０．０００１％ＦｅＳＯ４）に１ｍｌの活性汚泥を接種することによって樹立した。活性汚泥は、廃物処理施設から入手した。集積培養に、１００ｐｐｍのアニリンを培養培地に直接添加して補充し、２５℃、往復振盪でインキュベートした。集積培養は、１００ｐｐｍのアニリンを２〜３日ごとに添加することによって、維持した。培養物を、１４日ごとに、９．９ｍｌの培養物を同容量のＳ１２培地で置き換えることによって希釈した。集積培養のサンプルをＳ１２寒天上に拡げることによって、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリンを利用する細菌を単離した。アニリンは、各ペトリ皿の蓋の内側に配置した。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、倒置して室温（２５℃）でインキュベートした。次いで、代表的な細菌コロニーを、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリンを使用する能力について試験した。最初の単離に使用した本来のＳ１２寒天プレートから新たなＳ１２寒天プレートにコロニーを移し、各ペトリ皿の蓋の内側にアニリンを供給した。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、倒置して室温（２５℃）でインキュベートした。
【０１３３】
各単離体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、以下のように解析した。各単離体は、Ｒ２Ａ寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）上で増殖させた。培養プレート由来のいくつかのコロニーを１００μｌの水に懸濁した。混合物を凍結し、次いで融解した。市販のキットを使用して、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の指示に従い、ＰＣＲにより、プライマーＨＫ１２（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号９）およびＨＫ１３（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号１０）で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００で実施した。サンプルは、９４℃で５分間、インキュベートし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を３５回サイクルを行った。増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、市販のキットを使用し、製造者（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）の指示に従って精製し、自動化されたＡＢＩシークエンサー上で配列を決定した。配列決定反応は、プライマーＨＫ１２、ＨＫ１３、およびＨＫ１４（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＹＭＧＣＧＧＴ−３’）（配列番号１１、ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ）で開始した。類似配列について、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ調査［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２（１９９７）］に対する照会配列として、各単離体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を使用した。
【０１３４】
ＡＮ１２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し（配列番号１２）、ＧｅｎＢａｎｋの配列データベースで他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した。ＡＮ１２株由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対し少なくとも９８％相同であった。
【０１３５】
実施例２
ＡＮ１２株由来のプラスミドＤＮＡの単離および部分配列決定
本出願人らはＡＮ１２由来のゲノムＤＮＡ調製物に低分子量ＤＮＡが混入していることを観察したことにより、実施例１に記載の単離されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＮ１２株に小さなプラスミドＤＮＡが存在することが示唆された。Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコルを以下に概略するように改変して使用し、ＡＮ１２からプラスミドＤＮＡを実質的に単離した。ＡＮ１２を、２５ｍｌのＮＢＹＥ培地（０．８％栄養ブロス、０．５％酵母エキスおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）中、３０℃で２４時間、増殖させた。細胞を３８５０×ｇで３０分間、遠心分離した。細胞ペレットを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および５０ｍＭ重炭酸ナトリウムおよびＫＣｌ（ｐＨ１０）で洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡおよび２ｍｌ／ｍｌリゾチームを有する５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｐ１中に再懸濁し、３７℃で３０分間、インキュベートし、細胞溶解を確実にする。５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｐ２および７ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎ３溶液を添加して、染色体ＤＮＡおよびタンパク質を沈殿させた。１２ｍｌのイソプロパノールを添加することによって、プラスミドＤＮＡを回収した。ＤＮＡを洗浄し、８００μｌの水に再懸濁した。このＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピンカラムに充填し、５００μｌＰＢ緩衝液で２回、続いて、７５０μｌＰＥ緩衝液で１回洗浄し、ＤＮＡをさらに精製した。１００μｌの溶出緩衝液でＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡサンプルのアリコートを、０．８％アガロースゲル上で調べ、小さな分子量のＤＮＡのバンドを観察した。
【０１３６】
次いで、ＤＮＡを一連の制限酵素で消化し、ｐＡＮ１２の制限地図を図１に示す。ＨｉｎｄＩＩＩはｐＡＮ１２を３つの部位で切断し（表１を参照のこと）、さらなる解析のために２つの大きなバンドのみを回収した。ＨｉｎｄＩＩＩにより作製されたこれらの２つのバンド（１つは１．７ｋｂおよび１つは４．４ｋｂ）をアガロースゲルから切り出し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。Ｍ１３ユニバーサルプライマー（−２０；ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）（配列番号１３）およびＭ１３逆方向プライマー（−４８；ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）（配列番号１４）を使用して、両挿入物の末端部分を、ｐＵＣ構築物から配列決定した。各挿入物の２つのクローンの配列決定からコンセンサス配列を入手し、該配列は、配列番号１５〜１７に記載のヌクレオチド配列を含んだ。４．４ｋｂ挿入物の一方の末端から得た配列は、不良であったため示していない。ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を太字で強調し、配列番号１５〜１７に下線を付している。
【０１３７】
実施例３
ＡＮ１２株中クリプティックプラスミドの完全配列決定および確認
プラスミドＤＮＡの２つのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントから作製された配列を使用して、ＤｕＰｏｎｔ内部ＡＮ１２ゲノムデータベースを調査した。すべての３つの配列は、ＡＮ１２ゲノム配列の集成体４由来のコンティグ２１９７に対し１００％一致を有する。コンティグ２１９７の長さは、６３３４ｂｐであった。コンティグ２１９７の両末端を含む全長のデータベースには無作為に配列決定されたクローンが存在し、これはＤＮＡの環状片であることを示す。本出願人は、ＡＮ１２株由来の６３３４ｂｐの環状プラスミドをｐＡＮ１２と命名した。ｐＡＮ１２の完全ヌクレオチド配列は独特なＳｓｐＩ部位を位置１と命名しており、配列番号５に記載されている。１．７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ挿入物の１つの末端（配列番号１５）は、ｐＡＮ１２配列（配列番号５）の相補鎖の６３１３〜５５９２ｂｐ領域と一致した。１．７ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ挿入物のもう１つの末端（配列番号１６）は、ｐＡＮ１２配列（配列番号５）の４６１１〜５１３３ｂｐ領域と一致した。４．４ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ挿入物の１つの末端（配列番号１７）は、ｐＡＮ１２配列（配列番号５）の相補ストランドの４６１６〜４０１１ｂｐ領域と一致した。３つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、完全配列に基づいて、ｐＡＮ１２プラスミド上にあることが予測された。ＨｉｎｄＩＩＩ消化物から作製された３つの制限フラグメントのサイズは、４５５０ｂｐ、１６８７ｂｐおよび８７ｂｐであるべきである。本出願人らがゲル上で観察した４．４ｋｂおよび１．７ｋｂのバンドは、４５５０ｂｐおよび１６８７ｂｐと推定されるフラグメントに良好に一致した。８７ｂｐのフラグメントは、０．８％アガロースゲル上では容易に検出されない。染色体の配列を表す他のコンティグは平均で約８×範囲であるのに比べて、コンティグ２１９７は８０×範囲で配列決定されたという統計に基づき、ｐＡＮ１２プラスミドのコピー数は、細胞あたり約１０コピーと推定された。
【０１３８】
ＢＬＡＳＴＸ解析は、ｐＡＮ１２上でコードされる２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が（３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベース由来のすべての非縮重性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、配列を含む）「ｎｒ」データベース内のタンパク質といくつかの相同性を共有したことを示した。配列番号５に記載のヌクレオチド３０５２〜１９１２の相補鎖での１つのＯＲＦ（ｒｅｐと称される）がアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のプラスミドｐＡＰ１の複製タンパク質に最も大きな相同性を示した（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｓ．  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０，  ３２３３−３２３６，  １９９８）。配列番号５に記載のヌクレオチド５１７９〜４２８８の相補鎖での第２のＯＲＦ（ｄｉｖと称される）は、ゲノム配列決定によって同定されるヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来の推定細胞分裂タンパク質に最も大きな相同性を示した（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９  （５２２３），  ４９６−５１２  （１９９５））。ｐＡＰ１２上のｒｅｐ核酸（配列番号１）は、３７９アミノ酸長のＲｅｐタンパク質（配列番号２）をコードする。それは、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の４５９アミノ酸Ｒｅｐタンパク質に５１％同一性および３５％類似性を共有する（表４を参照のこと）。ｐＡＰ１２上のｄｉｖ核酸（配列番号３）は、長さが２９６アミノ酸のＤｉｖタンパク質（配列番号４）をコードする。それは、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５２９アミノ酸推定細胞分裂タンパク質の内部タンパク質に対してわずか２４％同一性および４０％類似性しか共有しない（表４を参照のこと）。
【０１３９】
【表５】
2004517623.tif 000008
【０１４０】
実施例４
クリプティックＰａｎ１２プラスミドによる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターの構築
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ならびにロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の両方において機能する複製機能および抗生物質耐性マーカーの組を必要とする。本出願人らは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に対する複製機能をコードするクリプティックプラスミドｐＡＮ１２プラスミドを同定した。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の抗生物質マーカーを同定するため。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）プラスミドｐＢＲ３２８（ＡＴＣＣ３７５１７）を試験して、該プラスミドがロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において機能するかどうかを調べた。プラスミドｐＢＲ３２８は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）で機能するアンピシリン、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン耐性マーカーを担持する。ｐＢＲ３２８をＰｖｕＩＩで線状化し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を破壊し、ＳｓｐＩで消化したｐＡＮ１２と連結した。得られたクローンをｐＲｈＢＲ１７（配列番号６）と命名した。
【０１４１】
ｐＲｈＢＲ１７は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性、クロラムフェニコール感受性およびテトラサイクリン耐性であることを確認した。ｐＲｈＢＲ１７のＤＮＡをＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から調製し、ｐＡＮ１２プラスミドを含有しないロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ４７０７２）にエレクトロポレートした。ＡＴＣＣ４７０７２のエレクトロコンピテント細胞を以下のように調製した。
【０１４２】
ＡＴＣＣ４７０７２を、ＮＢＹＥ（０．８％栄養ブロスおよび０．５％酵母エキス）＋Ｔｗｅｅｎ８０（０．０５％）培地中で３０℃で通気しながら約１．０のＯＤ６００に達するまで増殖させた。細胞を遠心分離によりペレット化する前に、３０分を超えて４℃で冷却した。ペレットを氷冷滅菌水で３回洗浄し、氷冷滅菌１０％グリセロールで２回洗浄し、急速冷凍のためにアリコートとして１０％グリセロールに再懸濁した。０．２〜２μｇのプラスミドと混合した５０μｌのコンピテント細胞でエレクトロポレーションを実施した。使用したエレクトロポレーションの設定は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のエレクトロポレーションに類似した：０．２ｃｍギャプキュベットに対し２００Ω、２５μＦおよび２．５ｋＶ。エレクトロポレーションパルス後、０．５〜１ｍＬのＮＢＹＥ培地を直ちに添加し、氷上で少なくとも５分間、細胞を回収した。形質転換した細胞を３０℃で４時間インキュベートし、抗生物質耐性マーカーを発現させ、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを有するＮＢＹＥ上にプレート化した。ＡＴＣＣ４７０７２をｐＲｈＢＲ１７で形質転換した場合に、テトラサイクリン耐性形質転換体を得た。滅菌水によるＡＴＣＣ４７０７２の模擬形質転換では、テトラサイクリン耐性コロニーは得られなかった。結果は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）上で機能するｐＢＲ３２８上のテトラサイクリン耐性マーカーおよびプラスミドｐＲｈＢＲ１７は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）とロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）との間を往復することが可能である。形質転換頻度は、ＡＴＣＣ４７０７２に対し、１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）／μｇＤＮＡであった。シャトルベクターはまた、約１０倍弱の頻度で、固有のｐＡＮ１２クリプティックプラスミドを含有するＡＮ１２株を形質転換することが可能である。
【０１４３】
実施例５
ｐＡＮ１２レプリコンはｐＤＡ７１のノカルディオファージＱ４レプリコンと和合性である
レプリコンは、自律単位として挙動する遺伝子エレメントである。ｐＡＮ１２レプリコンの機能を規定する複製タンパク質および複製開始点などの必須エレメントを同定および確認するために、他のプラスミドとの複数の配列アラインメントによって、ｐＡＮ１２配列をさらに調べた。ｐＡＮ１２のＲｅｐはアルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）プラスミドｐＡＰ１に対しわずか３５％の全体アミノ酸同一性しか有さないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列アラインメント（図４Ａ）によって、ｐＡＰ１を含むローリングサークル型複製のｐｌＪ１０１／ｐＪＶ１ファミリー（Ｉｌｙｉｎａ，  Ｔ．  Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０：３２７９〜３２８５；Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｓ．  Ｊ．ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０，  ３２３３〜３２３６，  １９９８）において保存されているｐＡＮ１２Ｒｅｐの５つのモチーフを同定した（図４Ａ）。このファミリーのプラスミドの他のメンバーのいくつかは、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来のｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０：４６３４〜４６５１，  １９８８）、ストレプトマイセス・フェオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のｐＪＶ１（Ｓｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄ．  ３０：１３１〜１４０，  １９９３；Ｓｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １４１：２４９９〜２５１０，  １９９５）およびストレプトマイセス・ニグリファシエンス（Ｋａｔａｏｋａ，  Ｍ．ら、Ｐｌａｓｍｉｄ．  ３２：５５〜６９，  １９９４）由来のｐＳＮ２２を含む。図４Ａ中の番号は、Ｒｅｐ内の各モチーフの開始アミノ酸を示す。複数配列アラインメントによりｐＡＮ１２の推定複製開始点（Ｋｈａｎ，  Ｓ．  Ａ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  ６１：４４２〜４５５，  １９９７）も同定した（図４Ｂ）。図４Ｂ中の番号は、複製開始点に対するプラスミド上の最初のヌクレオチドの位置を示す。ｐＩＪ１０１、ｐＪＶ１およびｐＳＮ２２の複製開始点は、以前に実験的に確認されている（Ｓｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｌ．  Ｐｌａｓｍｉｄ．  ３０：１３１〜１４０，  １９９３；Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｉ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １５０：２８３〜２８８，  １９９７）。複製が開始するニック部位の位置のＧＧジヌクレオチドもｐＡＮ１２に保存される。
【０１４４】
ｐＡＮ１２レプリコンは、ノカルジオファージ由来の少なくとも１つの他のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）レプリコンＱ４（Ｄａｂｂｓ，  １９９０，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ２３：２４２〜２４７）と和合性であることを見出した。ｐＤＡ７１は、ノカルジオファージＱ４レプリコンに基づいて構築される大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルプラスミドであり、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）において発現するクロラムフェニコール耐性マーカーを担持する（ＡＴＣＣ  ７７４７４，  Ｄａｂｂｓ，  １９９３，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ２９；７４〜７９）。ｐＤＡ７１のロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株への形質転換および形質転換からの以後のプラスミドＤＮＡ単離により、クロラムフェニコール耐性ｐＤＡ７１プラスミド（〜約９ｋｂ）ＡＮ１２株の６．３ｋｂ固有のｐＡＮ１２プラスミドと共存することが示された。さらに、宿主へのプラスミド導入の順序は逆であった。クロラムフェニコール耐性ｐＤＡ７１は、プラスミドを含まないロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４７０７２株に最初に導入した。ＡＴＣＣ４７０７２（ｐＤＡ７１）のクロラムフェニコール耐性形質転換体からコンピテント細胞を調製し、次いでｐＡＮ１２レプリコンに基づいて構築されたテトラサイクリン耐性ｐＲｈＢＲ１７シャトルベクタープラスミドで形質転換した（実施例４）。クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン耐性の両方の形質転換体が単離されたことから、ｐＤＡ７１およびｐＲｈＢＲ１７の両方は、ＡＴＣＣ４７０７２宿主に維持されたことが示唆される。ｐＡＮ１２レプリコンとノカルジオファージＱ４レプリコンとの和合性は、ｐＲｈＢＲ１７などのｐＡＮ１２レプリコン由来のシャトルプラスミドおよびｐＤＡ７１などのノカルジオファージＱ４レプリコン由来のシャトルプラスミドを使用して、単一のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）宿主において異なる遺伝子の共存に利用することが可能である。
【０１４５】
実施例６
ｐＡＮ１２上のＲｅｐはシャトルベクターの機能に必須である
先の実施例は、ｐＡＮ１２が構築されたシャトルプラスミドにロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）における複製機能を提供することを実証した。シャトルプラスミド機能に対するｐＡＮ１２の必須領域を特徴付けするために、本出願人らは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）由来のＧＰＳ−１ゲノムプライングシステムを使用して、シャトルベクタープラスミドｐＲｈＢＲ１７のインビトロトランスポゾン変異を実施した。インビトロ転移は、製造者の指示に従って実施した。得られたｐＲｈＢＲ１７のトランスポゾン挿入物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）に形質転換し、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上にプレート化することによって、カナマイシン耐性コロニーを選択した。アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性遺伝子へのトランスポゾン挿入は、それぞれアンピシリンおよびテトラサイクリンに対する感受性によってスクリーニングした。３４のアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性およびカナマイシン耐性コロニー由来のプラスミドＤＮＡを精製し、トランスポゾンの右側末端に相補的なプライマーＮ（ＡＣＴＴＴＡＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＴＴＡＧＡＴＣＴＡＴＴＴＴＧ；配列番号１８）を使用する配列決定によって、挿入部位の地図を作成した。本出願人らはまた、トランスポゾン挿入物を含むシャトルプラスミドがロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＴＣＣ４７０７２を形質転換する能力を試験した。表５は、挿入物の地図作成および形質転換能に関するデータについてまとめている。表５における挿入部位は、シャトルプラスミドの１位としてｐＢＲ３２８の位置１を使用するシャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７（配列番号６）上の塩基対（ｂｐ）番号付けを指す。トランスポゾン挿入物の正確な位置がプラスミド上で同定され得るように、ほとんどの挿入物について、高品質結合配列を得た。コロニー１７、３３および３７では、正確な挿入部位の地図を作成するためのトランスポゾン末端の配列を同定することはできなかった。
【０１４６】
【表６】
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【０１４７】
シャトルプラスミドのほとんどの部位で、トランスポゾンの挿入により、プラスミドがロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＴＣＣ４７０７２を形質転換する能力が破壊された。シャトルベクタープラスミドの機能を破壊した挿入は、ｒｅｐ領域でクラスター化された。クローン５、９、１１、１２、１６、および２８のすべてはｐＡＮ１２のｒｅｐ遺伝子内で地図作成されたトランスポゾンの挿入を含有した。これらの変異プラスミドには、もはやロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＴＣＣ４７０７２を形質転換する能力はなかった。クローン６は、Ｒｅｐ領域の開始コドン（６６４２ｂｐ）の１００ｂｐ上流である６７４３ｂｐで挿入物を含有した。この挿入物は、おそらくｒｅｐプロモーターの転写を中断するため、この挿入物もシャトルプラスミドの機能を破壊する。クローン７は、Ｒｅｐ領域のＣ末端（５５０２ｂｐ）の極めて近くにある５５４６ｂｐで挿入物を含有した。このプラスミドの形質転換頻度は少なくとも１００倍減少した。これは、おそらく、トランスポゾン挿入のためにＣ末端の１４アミノ酸を失った短縮型Ｒｅｐの残留活性によるものであろう。要約すると、データは、ｐＡＮ１２（配列番号５）のヌクレオチド３０５２〜１９１２の相補鎖のＲｅｐ領域は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるシャトルプラスミド機能に必須であった。
【０１４８】
実施例７
ｐＡＮ１２上のＤｉｖはプラスミドの安定性の維持に関与する
ｐＡＮ１２のｄｉｖ遺伝子内のトランスポゾン挿入物は、シャトルベクターがロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）を形質転換する能力に影響を与えなかった。ｄｉｖによってコードされる推定細胞分裂タンパク質が細胞分裂、特にプラスミドの分割において役割を果たすかどうかを決定するために、異なる挿入を伴うｐＲｈＢＲ１７プラスミドを含むロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＮ１２株またはＡＴＣＣ４７０７２のプラスミドの安定性を調べた。抗生物質選択（１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）を伴うおよび伴わないＮＢＹＥ＋Ｔｗｅｅｎ８０培地中で細胞を約３０世代増殖させた後、細胞の希釈物（１０−４、１０−５および１０−６）をＬＢプレート上でプレート化した。続いて、非選択ＬＢプレート上で増殖させたコロニーをＬＢおよびＬＢ＋テトラサイクリンプレートの組上に貼付した。テトラサイクリン感受性について、それぞれの２００コロニーが記録された。ＰＣＲおよびプラスミドの単離によるプラスミドの消失を確認するために、テトラサイクリン感受生細胞の代表についても試験した。ｐＡＮ１２のｒｅｐ遺伝子配列に基づいて、ＰＣＲのためのプライマーを設計した。ｐＡＮ１２に基づくシャトルベクターが細胞内に存在し、テンプレートとして役割を果たす場合、Ｒｅｐ１プライマー：５’−ＡＣＴＴＧＣＧＡＡＣＣＧＡＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１９）およびＲｅｐ１プライマー：５’−ＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＣＴ−３’（配列番号２０）により１．１ｋｂＰＣＲフラグメントを得ることができた。３０世代後も維持されたプラスミドの百分率を表６にまとめて示す。野生型ｐＲｈＢＲ１７プラスミドはＡＮ１２において極めて安定であったが、ＡＴＣＣ４７０７２での安定性は若干低下した。クローン番号１５は、ｐＲｈＢＲ１７上のｒｅｐの上流領域で挿入物を含有し（表５）、ＡＮ１２およびＡＴＣＣ４７０７２の両方における安定性については若干の低下を示し、野生型プラスミドの安定性に匹敵した。野生型ｐＲｈＢＲ１７プラスミドおよび挿入物番号１５を有するプラスミドは、両方のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株においてテトラサイクリン選択の存在下で１００％維持された。対照的に、クローン番号２３は、推定細胞分裂タンパク質ｄｉｖを破壊する挿入物を含有し、プラスミド安定性の低下を示した。テトラサイクリン選択の存在下でもプラスミドの消失が観察された。ＡＮ１２よりもＡＴＣＣ４７０７２において安定性が影響を受けた。これらの結果は、ｐＡＮ１２上の推定細胞分裂タンパク質が細胞分裂中のプラスミド分割を調節し、プラスミドの安定性の維持に重要であることを示唆している。
【０１４９】
【表７】
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【０１５０】
実施例８
より小さいサイズのｐＲｈＢＲ１７１シャトルベクターの構築
シャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７のトランスポゾン変異は、シャトルプラスミドの特定の領域がプラスミドの機能に必須ではないことを示唆した（表５）。領域の１つはｐＢＲ３２８およびｐＡＮ１２の結合部分であった。プラスミドのこの領域が不必要であるかどうか、およびシャトルベクタープラスミドのサイズを整えることができるかどうかについて調べることにした。ＰｓｔＩ（２部位／２５２０、３７００ｂｐ）およびｍｌｕＩ（１部位／４１０５ｂｐ）でシャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７を消化し、次のサイズの３つのフラグメントを得た：９６５６、１１８０および４０５ｂｐ。消化されたＤＮＡフラグメントを、ブンドウ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）により、製造者の指示に従って平滑化した。最も大きな９．７ｋｂフラグメントを、アガロースゲル上でサイズにより分別し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して精製した。ｐＲｈＢＲ１７の領域２５２０〜４１０５ｂｐに欠失をもつこの９．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを自己連結させ、ｐＲｈＢＲ１７１と名付けた環状プラスミドが形成された（図３）。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ形質転換体からのプラスミド単離および制限酵素による特徴付けにより、ｐＲｈＢＲ１７１の正確なサイズおよび消化パターンが示された。ＰｓｔＩおよびＭｌｕＩ消化により、親プラスミド上に存在するアンピシリン耐性遺伝子のコーディング領域の部分が取り出されるため、ｐＲｈＢＲ１７１プラスミドを有する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で増殖する能力を消失した。ｐＲｈＢＲ１７１上のテトラサイクリン遺伝子は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の両方に対する選択マーカーとして役割を果たした。ｐＲｈＢＲ１７１のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）への形質転換について試験した。それは、コンピテントなロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４７０７２およびＡＮ１２細胞を、エレクトロポレーションによって、親プラスミドｐＲｈＢＲ１７と比べて同様な頻度で形質転換した。これらの結果は、トランスポゾン変異によって示唆されるように、ｐＲｈＢＲ１７のこの領域（２５２０〜４１５０ｂｐ）は必須ではなかったことを実証する。またそれは、クローニングにより簡便なより小さなシャトルベクターを提供した。
【０１５１】
実施例９
ｐＲｈＢＲ１７１上でのｄｘｓのマルチコピー発現によるカロテノイド産生の上昇
ｄｘｓ遺伝子は、カロテノイド合成のためのイソプレノイド経路においてグリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸前駆体から１−デオキシキシルロース−５−リン酸の合成の第１段階を触媒する１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする。マルチコピーシャトルベクターｐＲｈＢＲ１７１上でＡＮ１２由来の推定ｄｘｓ遺伝子が発現され、カロテノイド発現に対するｄｘｓ発現の影響について評価した。
【０１５２】
生来のプロモーターを有するｄｘｓ遺伝子は、ＰＣＲによってロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＮ１２から増幅した。異なる長さを有するｄｘｓの生来のプロモーター領域を含むように、２つの上流プライマー、Ｎｅｗ  ｄｘｓ５’プライマー：５’−ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣ−３’（配列番号２８）およびＮｅｗ２  ｄｘｓ５’プライマー：５’−ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号２９）を設計した。下流プライマー、Ｎｅｗ  ｄｘｓ３’プライマー：５’−ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴ−３’（配列番号３０）は、ｄｘｓ遺伝子の下線を付した終止コドンを含んだ。Ｎｅｗ  ｄｘｓ５’＋Ｎｅｗ  ｄｘｓ３’を使用するＡＮ１２全ＤＮＡのＰＣＲ増幅により、全長ＡＮ１２ｄｘｓコーディング領域、および約５００ｂｐの即時上流領域（ｎｔ．番号５００〜番号３０１９）を含んだ２５１９ｂｐのサイズの１つの産物を生じた。Ｎｅｗ２  ｄｘｓ５’＋Ｎｅｗ  ｄｘｓ３’プライマー対を使用する場合、ＰＣＲ産物のサイズは２９８５ｂｐであり、完全なＡＮ１２ｄｘｓ遺伝子および約１ｋｂ上流領域（ｎｔ．番号３４〜番号３０１９）を含む。製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の指示に従い、両ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られるクローンをスクリーニングし、配列決定した。確認されたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、各プラスミド由来のｄｘｓ遺伝子および上流領域を含有する２．５ｋｂおよび３．０ｋｂフラグメントをＫｌｅｎｏｗ酵素で処置し、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７１の独特なＳｓｐＩ部位にクローニングした。得られる構築物ｐＤＣＱ２２（クローン番号４および番号７）およびｐＤＣＱ２３（クローン番号１０および番号１１）を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ選択でロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ４７０７２へエレクトロポレートした。
【０１５３】
ｐＤＣＱ２２およびｐＤＣＱ２３の−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）形質転換体の色素は、ベクターコントロールで形質転換したものに比べて暗い色を呈した。各ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）株のカロテノイド産生を定量するために、１ｍｌの新鮮培養細胞を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０および１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを有する２００ｍｌの新鮮ＬＢ培地に添加し、３０℃で３日間、定常期まで増殖させた。４０００ｇで１５分間、遠心分離により細胞をペレット化し、各細胞ペレットについて湿潤重量を測定した。細胞ペレットから、１０ｍｌのアセトンに１晩で振盪しながらカロテノイドを抽出し、吸収極大（４６５ｎｍ）で定量した。４６５ｎｍは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種ＡＴＣＣ４７０７２から単離されたカロテノイドの診断的吸収ピークである。吸収のデータを使用して、細胞ペースト重量ならびに細胞密度（ＯＤ６００）に基づいて、各株において産生、算出および正規化されたカロテノイドの量を算出した。いずれかの方法で算出されたカロテノイドの産生は、より短いプロモーター領域を有するｄｘｓ遺伝子を含有するｐＤＣＱ２２を有するＡＴ４７０７２では約１．６倍の増加を示した。
【０１５４】
より長いプロモーター領域でｄｘｓ遺伝子を発現させた場合、カロテノイドの産生はより多く増加（２．２倍）した。１ｋｂ上流のＤＮＡは、発現の増強のためのプロモーターおよびいくつかのエレメントを含有すると思われる。ＨＰＬＣ分析によっても、ｄｘｓ発現株において野生型株と同じカロテノイドが産生された。
【０１５５】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株由来のｐＡＮ１２、クリプティックプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【図２】ｐＲｈＢＲ１７、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【図３】ｐＲｈＢＲ１７１、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。
【図４Ａ】ローリングサークル複製プラスミドのｐｌＪ１０１／ｐＪＶ１ファミリーに関する、多様な複製タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図４Ｂ】ローリングサークル複製プラスミドの多様な複製開始点のヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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