(57)【要約】Ｃｌａｄｏｒｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍの新規転写因子タンパク質であって植物にて過敏感反応を引き起こすもの、および植物に病原体抵抗性を付与するためにこのタンパク質を使用する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に病原体抵抗性を誘導する方法であって、発現されると植物において過敏感反応を引き起こす、配列番号２に示すアミノ酸配列またはそのミューテインを含む、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）転写因子タンパク質の発現を調節する、病原体誘導的プロモーターを含むポリヌクレオチド配列で、植物を形質転換することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍから得られ得る、かつ植物にＨＲ反応をエリシットすることのできるタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列またはそのミューテインを含むことを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
請求項２のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号１の塩基対２−７８５由来のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項３のヌクレオチド配列。
【請求項５】
病原体誘導的プロモーターの作動可能な制御下にある、請求項３または４のヌクレオチド配列を含むキメラヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５のキメラヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターを含む宿主。
【請求項８】
アグロバクテリウムであることを特徴とする、請求項７の宿主。
【請求項９】
請求項８の宿主を使用して、植物を形質転換する方法。
【請求項１０】
植物病原体に対して抵抗性の植物を作成するための、請求項１または９の方法。
【請求項１１】
請求項１、９または１０の方法にしたがって、植物病原体に対して抵抗性となった植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
病原体に抵抗性である植物は、しばしば、感染植物細胞の急速な死をもたらす過敏感反応（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ＨＲ）を最終的にもたらす機構を経由して、それらの抵抗性を引き起こすことが見出されている。この急速な細胞死またはネクロシスは、病原体のさらなる成長を阻害し、こうして感染を停止させる。この機構は、すでに長く知られ（Ｋｌｅｍｅｎｔ， Ｚ．， Ｉｎ： Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｖｏｌ． ２．：ｅｄｓ．： Ｍｏｕｎｔ， Ｍ． Ｓ． ａｎｄ Ｌａｃｙ， Ｇ．Ｈ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８２， ｐｐ． １４９−１７７）。ＨＲはしばしば、他の病斑様現象とで混乱しているが、典型的なＨＲは、局所的細胞死を生じ、そして二次的反応、例えば、カルス付着（ｃｕｌｌｕｓ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、活性酸素種の生成、ファイトアレキシンの誘導、膜を横断するイオン流束の変化および獲得抵抗性の誘導（ＡＲ）を生じる（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ， Ｋ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１０， １３８１−１３９４， １９９６）。
【０００２】
病原体抵抗性は、エリシター化合物への反応によってエリシットされ（ｅｌｉｃｉｔ）、これらはタンパク質状性質のものであるとして頻繁に見出される（Ａｒｌａｔ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３， ５４３−５３， １９９４； Ｂａｋｅｒ， Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２， １３４１−１３４４， １９９３； Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ， Ｂ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１， ６０２４−６０２８， １９８４； Ｖｉｖｉａｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． ３５， ３３５−３４４， １９８９； Ｋｅｅｎ， Ｎ．Ｔ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎ． ２４， ４４７−４６３， １９９０； Ｒｏｎａｌｄ， Ｐ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４， １６０４−１６１１， １９９２； Ｗｈｉｔｈａｍ ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７８， １−２０， １９９４； Ｋｏｂｅ， Ｂ． ａｎｄ Ｄｅｉｓｅｎｈａｏｆｅｒ， Ｊ．， Ｔｒｅｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９， ４１５， １９９４； ａｎｄ Ｈｏｎｅｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９， ９０９−９２０， １９９５）。これらのエリシタータンパク質（非病原性（ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）遺伝子によってコードされる）は、病原体によって生産され、そして植物中で利用可能な抵抗性タンパク質と相互作用し、それによってＨＲ反応という結果となる事象のカスケードを開始すると考えられる。該エリシタータンパク質は、これらが（レース）特異的であり、そして対応する（また特異的な）抵抗性タンパク質での反応をエリシットすることができるのみであることによって、特徴付けられる。
【０００３】
非病原性遺伝子に基づく抵抗性の概念はまた、遺伝子対遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ）反応の名称で既知である。非病原性遺伝子は、細菌性病原体（例えば、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からおよび真菌病原体（例えば、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ、Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｅｃａｌｉｓおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）からクローン化された。また、対応する抵抗性遺伝子のいくつかをコードする植物遺伝子がクローン化された（例えば、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍからの非病原性遺伝子ａｖｒ９に対応する、トマト遺伝子Ｃｆ９、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからの非病原性遺伝子ａｖｒＰｔｏに対応する、トマトＰｔｏ−遺伝子）。
【０００４】
近年、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｌｕｖｕｍ（トマト葉かび病菌）の多くの細胞外エリシタータンパク質が同定された（Ｋｎｏｇｇｅ， １９９６， Ｌａｕｇｅ ａｎｄ Ｄｅ Ｗｉｔ， １９９８）。Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍは、天然でトマト植物に感染することのできる真菌である。対応する広範なトマトの変種との、該真菌の広範な病原型の間の特異的相互作用に基づいて、該真菌からのエリシター分子と対応して、見出された多くの抵抗性タンパク質が存在する。
【０００５】
植物に病原体抵抗性を付与する抵抗性遺伝子を使用する方法は、しばしば、該抵抗性が２、３の特異的病原型に対してのみに限定されるという事実によって、阻害される。さらに、しばしば、エリシター分子でトリガーした後には、該過敏感反応はむしろゆっくりであることができ、そして急速に進行する病原体での感染を防止することはできないようである。
【０００６】
こうして、感染が開始すると、植物に速くかつ全般的な病原体抵抗性をもたらすことのでき、そして病原体が感染していないときには、病原体抵抗性をスイッチオンしない系の必要性がなお存在する。
【０００７】
発明の要約
本発明はここで、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはそのミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）であって、構成的に発現されるとき、植物に過敏感反応を生じるものを含む、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ転写因子タンパク質の発現を、調節する病原体誘導的プロモーターを含むポリヌクレオチド配列で、植物を形質転換することを特徴とする、植物の病原体抵抗性を誘導する方法を提供する。本発明の特定の実施態様は、該Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ転写因子が配列番号２に示される２５９アミノ酸のペプチドであるそのような方法である。
【０００８】
植物を病原体に対して抵抗性にする方法の次に、そのタンパク質それ自体、そのミューテインおよび該タンパク質またはそのミューテインをコードするヌクレオチド配列もまた本発明の一部を形成する。
また本発明の一部は、記載した方法のいずれかによって、植物病原体に対して抵抗性となった植物である。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、ｐＳｆｉｎｘ：：４３−７Ｇ（Ａ−Ｊ，Ｌ）またはｐＳｆｉｎｉｘ：：Ａｖｒ４を含むアグロバクテリウムを、ツースピックで接種した葉の病徴である（Ｋ）。
Ａ：Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｂ：Ｎ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｃ：Ｎ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｄ：Ｎ． ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ，Ｅ：Ｎ． ｒｕｓｔｉｃａ、Ｆ：Ｎ． ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ、Ｇ：Ｎ． ｔｏｂａｃｕｍ（ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ）、Ｉ：Ｎ． ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｊ：Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ＫおよびＬ：Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ。
【００１０】
図２は、５’欠失構築物を含むプラスミドで形質転換したアグロバクテリウムをツースピックで接種した植物の病徴である。
トマトの左側（Ａ、Ｂ）およびタバコ（Ｃ、Ｄ）葉に、完全長ＤＮＡを含むプラスミドで形質転換したアグロバクテリウムを接種した。一方、右側に、欠失Δ７９（Ａ、Ｃ）または欠失Δ２５６ｃＤＮＡ（Ｂ、Ｄ）を接種した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ（Ｅ−Ｈ）の完全葉に、完全長ＤＮＡ（Ｅ）、欠失Δ７９（Ｆ）またはΔ２５６（Ｇ）を有するプラスミドを含むアグロバクテリウムを接種した。Ｈは、５’欠失構築物を含むプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウムを接種されたＮ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ植物の未接種葉のモザイク病徴を示す。
【００１１】
詳細な記載
驚くべきことに今回、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍによって生産されたタンパク質が、ＨＲ反応の誘導を与えることができることが見出された。該実験は実験の部において、該タンパク質が、Ｃｆ４を含有するトマト植物およびＣｆ９を含有するトマト植物において、および多数のタバコ種において反応をエリシットすることができることが示され、該タンパク質が、明瞭な病原体−宿主特異性を引き起こすＡｖｒタンパク質（Ａｖｒ４およびＡｖｒ９のような）と同じタイプではないことを指摘している。さらに、本出願に開示した分子データから、本発明のタンパク質が第２の点でＡｖｒタンパク質と非類似であることを導くことができる：それは、推定的転写因子（ｂＺＩＰモチーフ配列を含む）である。作用の推定される様式は、植物細胞中で発現されるとき、このタンパク質が、この防御反応の実行に関係する遺伝子の異所的発現を介して過敏感反応をトリガーする。「エリシター」という用語が伝統的に使用される意味では、それは真の「エリシター」ではないかもしれないが、用語クラドスポリウムエリシターを言及する容易性のために、本明細書中で使用する。
【００１２】
過敏感防御反応は、能動的な反応であることが当業者に周知である。これは、タンパク質エリシターに仲介される、過敏感反応の誘導を、アルファ−アマニチンという真核細胞ＲＮＡポリメラーゼの強力な阻害剤によって阻害することができる（Ｈｅ， Ｓ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７３（７）１２５５−１２６６（１９９３））。これらの阻害剤による阻害は、過敏感反応の「実行（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ）」のために、それぞれｄｅ ｎｏｖｏ転写およびタンパク質合成の必要性を非常に良く示している。過敏感反応と連関する、ほとんどの測定可能な細胞性反応は、転写阻害すると有効に抑制され、これは細胞死誘導を含む。
【００１３】
病原体非病原性タンパク質の植物による認識が、変化した転写パターンへと変換されることによる機構は、あまり詳細には理解されていないが、転写因子がこの効果を仲介しているようである。該過敏感反応は、ほとんどすべての植物種に見出される現象であるから、少なくとも、ｄｅ ｎｏｖｏ転写およびタンパク質合成に関係する段階は、これらの植物間に共通であり、そして緊密に調節された転写因子によってもたらされると信じられている。本発明の転写因子は、調節されることなく、内生植物転写因子を置換することができることが、信じられる。このように、本発明の転写因子の存在または不存在は、ＨＲの発生のためのオン／オフシグナルとして作用する。
【００１４】
転写因子は、これらがプロモーターに及ぼす影響を働かせることによって遺伝発現を調節する。ほとんどの人が「プロモーター」が基本的に２種の異なるエレメントからなるという。最小プロモーターは基本的転写機構である領域であり、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連するタンパク質が結合し、該ＤＮＡをほどき、そして転写を開始する。
【００１５】
その最小プロモーターの近傍に、しかし植物では通常最小プロモーターの上流に（転写領域から測定して）、転写因子のための、多くの種々の結合部位が見出される。この領域は通常、「エンハンサー」と呼ばれ、しかしまた他の表現、例えば、「サイレンサー」を使用することができる（しばしば転写因子の影響の性質に基づく）。
この領域は、転写因子に結合し得、これは、結合し、ほどき、そして最小プロモーターからの転写を開始させるための基本的転写機構の能力に及ぼす影響を有する。したがって、これらは直接的に、転写速度に影響する。
【００１６】
転写速度の、転写因子による活性化または不活性化は、最小プロモーターのある距離から発生し得、しかし通常植物では、ほとんどの影響のある転写因子は最小プロモーターから１．５ｋｂ上流以内で働く。
【００１７】
転写因子、および特に転写を活性化するものは、モジュラー構造を有するようである。これらは、塩基性アミノ酸の高存在率によって頻繁に特徴付けられるＤＮＡ結合ドメインを含む。加えて、いくつかは、二量体化ドメインを含み、これは、他の転写因子でのホモまたはヘテロ二量体化を可能とする。ＤＮＡ結合ドメインの例（ときどき二量体化ドメインに連結されている）は、ｂＨＬＨ、ｂＺＩＰ、ｂＨＬＨ−ＺＩＰ、ヘリックス−ターン−ヘリックス、ＰＯＵおよび亜鉛フィンガーである。
【００１８】
ほとんどの転写因子はまた、通常はＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインから分離可能である転写活性化ドメインを有する。転写活性化ドメインは頻繁に、グルタミンに富むストレッチ、プロリンを含む領域、酸性ドメインまたはイソロイシンを含む領域によって特徴付けられる。いくつかの転写活性化ドメインはしかし、前記のいずれによっても特徴付けられない。
【００１９】
すべてではないが、多くの転写因子は、それらの活性調節のいくつかのレベルを有するようである。あるものは、タンパク質を阻害することによって核外に隔離されている。これらの複合体は、シグナル誘導後に崩壊されることができ、核への転写因子の移動、ＤＮＡの結合および近接プロモーターからの転写の活性化につながる。他のものは、小分子、例えばホルモンと複合体化し、ＤＮＡ結合を可能とする形態へ折り畳み、そして転写活性化する必要がある。なおその他のものは、ＤＮＡに結合することができるが、完全に機能を働かせるように翻訳後に修飾される必要のある転写活性化ドメインを有する。疑いなく、幾つかのより多い活性化機構が働いている。
【００２０】
転写活性化ドメインを、転写因子それ自体の研究により、しかしまた、ヘテロロガスＤＮＡ結合ドメインへの連結（他の転写因子から）されるとき、転写を活性化する能力によって同定することができる。
この組み立てでは、通常はレポーター遺伝子を使用し、ここで最小プロモーターの上流にＤＮＡ結合部位が導入され、これは前記のＤＮＡ結合ドメインによって結合されることができる。
【００２１】
ほとんどのＤＮＡ結合ドメインはそれ自体では、ＤＮＡ結合部位へ結合されるときでもなお、近接する最小プロモーターからの転写を刺激することができない。これらのＤＮＡ結合ドメインを、研究された転写因子の一部と連結することによって、レポーター遺伝子発現率を分析することによって、転写活性化をモジュレートする領域を容易に同定することができる。
植物の転写因子の総説は、Ｍｅｓｈｉ， Ｔ．およびＩｗａｂｕｃｈｉ， Ｍ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３６（８）， １４０５−１４２０に見出すことができる。
【００２２】
本発明は、トマトおよびタバコ植物について詳細に例示するが、該過敏感反応の実行に関係する遺伝子の転写を本発明のタンパク質によって調節できる任意の植物種を、発現されるとＨＲ反応を誘導することのできる、１または２以上の植物発現可能遺伝子構築物で提供し得ることが理解されるべきである。本発明は、現在は形質転換に感受性（ａｍｅｎａｂｌｅ）ではない植物種でも実施でき、そのような種の感受性は、まさに時間の問題であるからであり、そしてなぜなら形質転換それ自体は、本発明に通じる原理に関係がないからである。ゆえに、この記載の目的のための植物は、それらが飼料、食品または産業的加工目的のためであれ、被子植物ならびに裸子植物、単子葉植物ならびに双子葉植物を含むものとし；林業および花き栽培、ならびに家庭園芸または室内園芸または他の装飾目的を含む、任意の農業的または園芸的目的のために使用される植物が含まれる。
【００２３】
迅速および簡単な試験を提供するために、もしＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍエリシターが提示されると、新規植物種が実際に過敏感反応をもたらすことができるならば、当業者はＡＴＴＡ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）の名称で既知の、急速な一過性発現試験を実施できる。この（その詳細はＶａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， （Ｃｅｌｌ ８７， １３０７−１３１６， １９９６）に見出すことができる）アッセイでは、Ｃｋａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍエリシターをコードするヌクレオチド配列を、植物構成的プロモーターの制御下に置き、そして安定的形質転換のためのプロトコルでまた使用されるアグロバクテリウム菌株に導入する。該バクテリアをアセトシリンゴンまたはアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ移入を高めると知られる任意の他のフェノール性化合物とインキュベーション後、１ｍｌのアグロバクテリウム培養物を、インジェクションによってインサイチュ植物に浸潤させ（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）、その後該植物をグリーンハウスに置く。２−５日後、該葉をＨＲ病徴の発生についてスコアー化することができる。
【００２４】
代替的に、そのような単純な試験のために、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍに由来するエリシターを、植物構成的プロモーターの制御下に置き、そして植物または植物細胞に、直接ＤＮＡ送達技術、例えば、「ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ」またはＰＥＧ仲介形質転換を使用して導入させることができる。さらに、機能性を試験する急速なやり方は、実験の部に記載の通り、ＰＶＸに由来する発現系を使用することである。
【００２５】
タンパク質の過剰発現
またＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍエリシターと称される、本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むすべてのタンパク質、およびそのミューテインを含む。
【００２６】
用語、タンパク質は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸の配列を意味する。ポリペプチドまたはペプチドはまた、タンパク質であるものと認める。本発明のタンパク質のミューテイン（ｍｕｔｅｉｎｓ）は、配列表に示されるタンパク質から、それらのＨＲ反応を誘導する活性をなお維持しつつ、１または２以上のアミノ酸を置換、付加および／または欠失することによって取得する。そのようなミューテインを、インビボでタンパク質を改変することによって、例えば、該タンパク質をコードすることのできるオープンリーディングフレームを、該アミノ配列がそれによって影響を受けないように変化させることによって容易に作成することができる。アミノ酸配列の変化がタンパク質の活性を完全には廃止しない限り、そのようなミューテインは本発明に含まれる。さらに、ミューテインは、生物学的活性を保持しつつ、配列表中に示されるタンパク質からの誘導可能であるべきであり、すなわち、該ミューテインおよび配列表に示されるタンパク質の間の中間体のすべてまたは大部分がＨＲを誘導する活性を有するものとする。大部分とは、該中間体の３０％またはより多い、好ましくは４０％またはより多い、より好ましくは５０％またはより多い、より好ましくは６０％またはより多い、より好ましくは７０％またはより多い、より好ましくは８０％またはより多い、より好ましくは９０％またはより多い、より好ましくは９５％またはより多い、より好ましくは９９％またはより多いことを意味する。
【００２７】
好ましいミューテインは、配列番号２に示される最初の９０アミノ酸が欠失している（およびここで該発現されたタンパク質は配列番号２のアミノ酸位置９１のＭｅｔ残基で開始する）ミューテインである。他の好ましい変異体は、ＤＮＡ結合またはロイシンジッパードメイン中に突然変異を有するミューテイン（複数もある）であり、例えば、アミノ酸位置２０７のＡｓｎ残基がＡｌａ残基で置換された変異体、またはアミノ酸位置２２５、２３９または２５３のＬｅｕ残基がＡｌａ残基で置換されたミューテインである。また、前記欠失または突然変異の組み合わせを有するミューテインが好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質は、明瞭なＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２０２−２２１）およびロイシンジッパードメイン（アミノ酸２２２−２５９）を含む。以下の実験の部に示されるように、ある変異が許容されるが、これらの領域の保存は該タンパク質の機能に必須であると信じられる。しかし、該タンパク質の他の部分は、該機能のためにはあまり重要ではなく、そして変化により感受性ではなくてよい。こうして、また本発明の一部は、ＤＮＡ結合ドメインおよびロイシンドメインが、配列番号２のドメインと８０％またはより多くが同一である、および配列番号２の配列と６０％またはより多くが同一である、タンパク質である。
【００２９】
パーセンテージ同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２）を、デフォルトパラメーターを使用して、あるいは、ＧＡＰアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３）を、デフォルトパラメーターを使用して、これら両方はＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ．に含まれる。ＢＬＡＳＴサーチは、タンパク質をランダム配列としてモデル化することができると考える。しかし、多くの現実のタンパク質は、ホモ重合性系、短期間反復、または１または２以上のアミノ酸で富化された領域であり得る非ランダム配列の領域を含む。そのような低複合性領域は、たとえ該タンパク質の他の領域が完全に非類似であるとしても、関連のないタンパク質間でアラインメントし得る。多くの低複合性フィルタープログラムを使用し、そのような低複合性のアラインメントを減少させることができる。例えば、ＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ， １９９３ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． １７：１４９−１６３）およびＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ， １９９３ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． １７： １９１−２０１）低複合性フィルターを、単独または組み合せて使用できる。
【００３０】
ここで使用するように、「配列同一性」または「同一性」は、２タンパク質配列（またはヌクレオチド配列）の文脈では、特定された比較ウインドウに渡る最大の対応についてアラインメントするときに、同じである２配列中の残基への言及を含む。配列同一性のパーセンテージを、タンパク質に言及して使用するとき、同一ではない残基位置が、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、ここでアミノ酸が、類似の化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、そしてしたがって、該分子の機能的特性を変化させないと認識される。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性を、上方に調節し、該置換の保存的性質を修正し得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するという。
【００３１】
これらの調節をなすための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、完全ミスマッチよりむしろ一部としての保存的置換のスコアー化に関係し、それによって、パーセンテージ配列同一性を増加させることができる。こうして、例えば、同一アミノ酸に１のスコアを与え、そして非保存置換にゼロのスコアを与える場合、保存的置換が０と１の間のスコアを与える。保存的置換のスコアー化を、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムにしたがって算出する。
【００３２】
ここで使用するように、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに渡って、２つの至適にアラインメントされる配列を比較することによって決定される値を意味し、ここで、比較ウインドウ中の該アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の一部が、２配列の至適アラインメントのための引用配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。該パーセンテージを、同一アミノ酸または核酸塩基残基が両方の配列に存在する位置の数を決定することによって算出し、マッチの位置の数を得て、マッチの位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数によって割って、そして結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得る。
【００３３】
配列番号２の約９０残基のアミノ末端ドメインは、グルタミンに非常に富む。このドメインまたはこのドメインの一部は、ＴＦＩＩＤ複合体に結合することによる転写の活性化に関係し得る。９０アミノ酸残基のこのステッチは、１５このグルタミンンを含むが（１７％）、残基３２ないし７３中のグルタミンのパーセンテージは、１５グルタミンからなる（３６％）。グルタミンに富むドメインはしばしば、転写に関係するタンパク質の構成要素であり、そして実際にすべての真核細胞で見出される（Ｅｓｃｈｅｒ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０（８）：２７７４−２７８２； Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒ Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３６（２）： １９５−２０４）。そのようなグルタミンに富む転写因子の例は、ヒト転写因子Ｓｐ１（１１２残基のストレッチ中２０％グルタミン）、Ｂ細胞由来の転写因子ＯＣＴ−２Ａ（６３残基中２６％）、およびＴＡＴボックス結合タンパク質（７８残基中４４％）である（Ｇｅｒｂｅｒ Ｈ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０８−８１１）。ポリグルタミンストレッチはまた、ヒトのＧＬＡ４のＤＮＡ結合ドメインに融合されるとき、転写を活性化することができる（Ｇｅｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。Ｇｕｇｎｅｊａ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６（１０）：５７０８−５７１６）は、１７６残基の１７グルタミンのストレッチを含むグルタミンでさえ（含量＜１０％）転写を活性化できることを示した。
【００３４】
また本発明には、配列番号２のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸２０２−２２１）またはそのミューテイン、所望により二量体化に必須であるドメイン、例えば、配列番号２のロイシンジッパードメイン（アミノ酸２２２−２５９）、および転写活性化ドメインを有するキメラ転写因子が含まれる。前に例示のように、そのような転写活性化ドメインは、グルタミンに富むストレッチ、プロリンを含む領域、酸性ドメインまたはロイシンを含む領域によって特徴付けられ得る。該転写活性化ドメインを、好ましくは、植物プロモーターの活性を刺激するように発現的適合化する。
【００３５】
また本発明の一部は、本発明のタンパク質および前記ミューテインをコードするヌクレオチド配列である。好ましいヌクレオチド配列は、ヌクレオチド２（ａｔｇ開始）ないしヌクレオチド７８２（ｔａｇ停止）の配列番号１に示すような配列またはその保存的修飾または多型性変異体である。当業者は、遺伝的コードの縮重が、同一のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチド配列を可能とすることを認識する。そのような「サイレント変異」を使用し、例えば、本発明のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を選択的にハイブリダイズおよび検出することができる。他の変異を、コドン最適性を可能とするように改変し、それによってコドンを、同じアミノ酸をコードする他のコドンで置換し、宿主生物のコドン利用性に適合させ得る。
【００３６】
本発明は、過敏感反応をエリシットすることのできるＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍエリシターの発現を調節する病原体誘導的プロモーターを含むキメラＤＮＡ配列を提供する。該発現キメラＤＮＡ配列は、天然にはどこにも見出されないＤＮＡ配列を含む任意のＤＮＡ配列を含むことを意味するものとする。該オープンリーディングフレームは、植物ゲノムであってここで、それが天然には見出されないもの中に、またはレプリコンまたはベクターであってそれが天然には見出されないもの、例えば、バクテリアプラスミドまたはウイルスベクターに取りこませ得る。キメラＤＮＡは、宿主中で複製可能であるＤＮＡ分子に限定しないものとするが、またレプリコンに、例えば、本発明のヌクレオチド配列に物理的に連結された特異的アダプター配列によって、ライゲートできるＤＮＡを含むことを意味するものとする。
【００３７】
Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｌｕｖｕｍエリシターをコードするオープンリーディングフレームは、ゲノムライブラリーに由来し得る。この後者において、該タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成するエキソンを分離する１または２以上のイントロンを含む得る。該オープンリーディングフレームはまた、１の介入のないエキソンによって、またはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍエリシターをコードするｃＤＮＡないしｍＲＮＡによってコードされ得る。本発明に従うオープンリーディングフレームはまた、１または２以上のイントロンが人工的に除去されまたは付加されているものを含む。これらの変異体のそれぞれは本発明に含まれる。
【００３８】
病原体誘導的プロモーターは、当業界で既知であり、そして多くの病原体に、およびこれらの病原体によって生産される非特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）エリシターに反応する。そのような病原体誘導的プロモーターの例は：ｐｒｐ１プロモーター（Ｍａｒｔｉｎｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３６． １７９−１８６， １９９３）、Ｆｉｓ１プロモーター（ＷＯ９６／３４９４９）、Ｂｅｔｖ１プロモーター（Ｓｗｏｂａｄａ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ， Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｅｎｖ． １８， ８６５−８７４， １９９５）、Ｖｓｔ１プロモーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｒ．， Ｄｉｓｓｅｔａｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ， １９９４； Ｓｃｈｕｂｅｒｔ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４， ４１７−４２６， １９９７）、セスキテルペンシクラーゼプロモーター（Ｙｉｎ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１５， ４３７−４５１， １９９７）、ＭＳ５９プロモーター（ＷＯ９９／５０４２８）、ＩＣＳプロモーター（ＷＯ９９／５０４２３）およびｇｓｔＡ１プロモーター（Ｍａｕｃｈ， Ｆ． ａｎｄ Ｄｕｄｌｅｒ， Ｒ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２， １１９３−１２０１， １９９３）である。いくつかの他のプロモーターは、当業界で既知であり、そして本発明のヌクレオチド配列の発現を駆動することができる。
【００３９】
真核細胞では、発現カセットは通常さらに、オープンリーディングフレームの下流に位置する転写終結領域を含み、転写を終結させ一次転写物のポリアデニル化が起こるのを可能にする。加えて、該コドン利用性は、選択の宿主のコドン利用性に受けいられるように適合化し得る。選択された宿主細胞におけるキメラＤＮＡ構築物の発現を支配する原理は、一般に当業者に理解され、そして発現可能キメラＤＮＡ構築物の構築はまた、原核生物または真核生物であれ、宿主細胞の任意の種類についてルーチンである。
【００４０】
オープンリーディングフレームについては、宿主細胞で維持されるために、それは、選択された宿主細胞によって認識されおよび複製されるＤＮＡに連結された本発明に従う当該オープンリーディングフレームを含むレプリコンの形態で通常は提供される。代替的に、該レプリコンの選択を、選択の縮細胞によって大部分決定される。特定の選択された宿主について好適なレプリコンを支配するようなそのような原理は、当業者の範囲内である。
【００４１】
レプリコンの特別のタイプは、それ自体またはその一部を、別の宿主細胞、例えば、植物細胞に移入できるものであり、それによって本発明に従うオープンリーディングフレームを当該植物細胞に、共移入させる。そのような能力を有するレプリコンは、ベクターとしてここに言及する。そのようなベクターの例は、Ｔｉプラスミドベクターであって、好適な宿主、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中に存在するとき、それ自体の一部、いわゆるＴ−領域を植物細胞に移入させることのできるものである。Ｔｉプラスミドベクターの種々のタイプ（ＥＰ０１１６７１８Ｂ１参照）は現在、キメラＤＮＡ配列を植物細胞、またはプロトプラストであって、それよりゲノム中に当該キメラＤＮＡが安定的に取りこまれた新しい植物を発生し得るものに、移入させるためにルーチンに使用される。Ｔｉプラスミドベクターの特に好ましい形態は、（ＥＰ０１２０５１６Ｂ１およびＵＳ４９４０８３８）に請求されるいわゆるバイナリーベクターである。本発明のＤＮＡを植物宿主に導入し得る他の好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば、非インテグラティブ植物ウイルスベクター、例えば、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルス等に由来し得るようなウイルスベクターから選択し得る。そのようなベクターの使用は、特に、植物宿主を安定的に形質転換することが困難であるとき、有利であり得る。樹木種、特に樹木およびつる（ブドウ樹）については、それがあてはまる。
【００４２】
「本発明のキメラＤＮＡ配列をゲノム中に取り込んでいる宿主細胞」という表現は、当該キメラＤＮＡをそのゲノム中安定的に取りこんでおり、それによって該キメラＤＮＡを維持し、そして好ましくはそのようなキメラＤＮＡを、それが有糸分裂または無糸分裂を経由するものであれ、後代細胞に伝達する細胞、並びにそのような細胞を含む多細胞生物を含むことを意味するものとする。本発明の好ましい実施態様にしたがって、本質的に、１またはより多いコピーの当該キメラＤＮＡをそのゲノム中に取りこんでいる、そしてそれらの後代に１またはより多いコピーを、好ましくはメンデル様式で伝達することのできる細胞からなる植物を提供する。本発明に従うキメラＤＮＡの転写および翻訳によって、該植物細胞のいくつかまたは全部である、病原体に感染するとＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍエリシターを生産することのできるこれらの細胞が、真菌感染ヘの高い抵抗性を示す。
【００４３】
植物種の形質転換は、双子葉植物並びに単子葉植物の両方を含む多くの（ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ）数の植物種について現在ルーチンである。原理的には、いずれの形質転換方法も、細胞が全植物体に再生できるかぎり、本発明に従うキメラＤＮＡを好適な祖先細胞に導入するために使用し得る。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ， Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６， ７２−７４； Ｎｅｇｒｕｔｉｕ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｕｎｅ １９８７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，３６３−３７３）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ Ｒ． Ｄ．ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３， １０９９−１１０２）、植物材料ヘのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０２， １７９−１８５）、種々の植物材料の（ＤＮＡまたはＲＡＮコート）パーティクルボンバードメント（Ｋｌｅｉｎ Ｔ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２７， ７０）、（非インテグラティブ）ウイルスでの感染等から好適に選択され得る。本発明に従う好ましい方法は、アグロバクテリウムに仲介されるＤＮＡ移入を含む。ＥＰＡ１２０５１６およびＵＳ特許４９４０８３８に開示されるようないわゆるバイナリーベクター技術が特に好ましい。
【００４４】
トマト形質転換は、Ｖａｎ Ｒｏｅｋｅｌ ｅｔ ａｌ．によって本質的に記載されるように好ましくは実施する（Ｖａｎ Ｒｏｅｋｅｌ， Ｊ．Ｓ．Ｃ．， Ｄａｍｍ， Ｂ．， Ｍｅｌｃｈｅｒｓ， Ｌ．Ｓ．， Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．（１９９３）．Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １２， ６４４−６４７）。ジャガイモ形質転換は好ましくはＨｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．によって本質的に記載のように好ましくは実施する（Ｈｏｅｋｅｍａ， Ａ．，Ｈｕｉｓｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ， Ｌ．， ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ， Ｐ．Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ， Ｂ．Ｊ．Ｃ．（１９８９）． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｏｔａｔｏ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７， ２７３−２７８）。一般に、形質転換後に、植物細胞または細胞グルーピングを本発明にしたがう核酸配列と共導入される植物発現可能遺伝子によってコードされる１または２以上のマーカーの存在について選択し、その後該形質転換された材料を、全植物体に再生する。
【００４５】
遺伝的形質転換に対していくらかより手ごわいと考えられるが、単子葉植物は、形質転換に対して感受性（ａｍｅｎａｂｌｅ）であり、そして稔性のあるトランスジェニック植物を形質転換細胞または胚、または他の植物材料から再生することができる。現在、単子葉植物の形質転換のために好ましい方法は、胚、外植体または懸濁細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント、および直接的ＤＮＡ取りこみまたはエレクトロポレーションである（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， ｅｔ ａ；， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３８， ２７４−２７６）。トランスジェニックトウモロコシ植物を、ホスヒノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤ホスヒノスリシンを不活性化する酵素）をコードする、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｂａｒ遺伝子を、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって、トウモロコシ懸濁培養物の胚発生性細胞に導入することによって取得した（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ， １９９０， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２， ６０３−６１８）。遺伝的材料の、他の単子葉作物、例えば、コムギおよびオオムギのアリューロンプロトプラストへの導入が報告された（Ｌｅｅ， １９８９， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３， ２１−３０）。コムギ植物を、胚発生性懸濁培養物の確立のために、加齢した、緻密な（ｃｏｍｐａｃｔ）および節のある（ｎｏｄｕｌａｒ）胚発生性カルス組織のみを選択することによって、胚発生性懸濁培養物から再生した（Ｖａｓｉｌ， １９９０ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ４２９−４３４）。これらの作物のため形質転換系の組み合わせも、本発明の、単子葉植物への適用を可能とする。
【００４６】
商業的に重要な作物、例えばイネおよびトウモロコシを含む単子葉植物はまた、アグロバクテリウム菌株によるＤＮＡ移入に対して感受性である（ＷＯ９４／００９７７；ＥＰ０１５９４１８Ｂ１；Ｇｏｕｌｄ Ｊ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｏ， Ｕｌｉａｎ ＥＣ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｇ， Ｓｍｉｔｈ ＲＨ， （１９９１）Ｐｌａｎｔ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９５， ４２６−４３４； Ｙ． Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６． ２７１−２８２参照）。
【００４７】
ＤＮＡ移入および再生に続いて、推定的な形質転換植物を、例えば、サザン分析を使用して、本発明のキメラＤＮＡの存在、コピー数および／またはゲノム構成について評価し得る。当初の分析の後、所望により、新しく導入された本発明のキメラＤＮＡの望まれるコピー数および発現レベルを示す形質転換植物を、病原体に対する抵抗性のレベルについて試験し得る。
【００４８】
他の評価は、圃場条件での病原体抵抗性、稔性の確認、収量、および他の特性についての試験を含み得る。そのような試験は現在、通常の技術を有する者によってルーチンに実施される。
そのような評価に続いて、該形質転換植物を、直接的に成長させ得るが、通常はそれらを、新しい変種の育種における、またはハイブリッドの作出などにおける親系統として使用し得る。
植物変種を含む、病原体に対する改善された抵抗性のあるこれらの植物を、圃場で、グリーンハウス、または家庭またはその他で成長させ得る。植物またはその可食部を、動物飼料または人間の消費のために使用し得、または食品、飼料または農業または工業の任意の形態の他の目的のために加工し得る。農業は、園芸、樹芸、花き栽培等を含むことを意図するものとする。本発明の植物材料から利益となり得る産業は、製薬産業、紙およびパルプ製造産業、製糖産業、飼料および食品産業、酵素製造などを含み得るがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の植物またはその一部の有利性は、農薬処理のための減少された必要性、それによる材料のコスト、労働力および環境汚染の低減化、または産物（例えば、果実、種子など）のシェルフライフの延長である。本発明の目的のための植物は、光合成の可能な、および病原体に誘導される病気のある種の形態の対象となる多細胞生物を意味するものとする。これらは少なくとも、被子植物並びに裸子植物、単子葉植物並びに双子葉植物を含むものとする。
【００５０】
実験の部
ＤＮＡの単離、操作および増幅のための標準方法、並びに組換えＤＮＡの複製のための好適なベクター、好適なバクテリア菌株、選択マーカー、培地などは、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ． ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ａｎｄ ｉｎ Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｅ．−Ｌ．−Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ ｅｄ． １９８７）に例えば記載される。
【００５１】
実施例１
バイナリーＰＶＸベクターにおけるＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｂｕｍのｃＤＮＡライブラリーの構築および該ライブラリーの貯蔵
Ｃ． ｆｕｌｖｕｍの種々の菌株を、培地を交換することなく、Ｂ５培地で２２℃で１０ないし１６日間培養することによって栄養枯渇させた（Ｄｅ Ｗｉｔ ａｎｄ Ｆｌａｃｈ， １９７９）。そのような条件下では、該真菌は、トマト葉でコロニー化すると、卓越して誘導される遺伝子を発現し（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、植物ＲＮＡで汚染することなく、該真菌からＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、熱フェノール手法によって菌糸体から抽出し（Ｅｃｔｒａｃｔ−Ａ−Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）、そしてＡｖｒおよびＥｃｐ遺伝子の発現を、１％アガロース／グリオキサルゲル上で分離される、種々の菌株からの総ＲＮＡの３．５μｇのノーザンブロッティングによって試験した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。該ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋ｍｅｍｂｅｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）に移し、３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＫ）と６５℃でハイブリダイズさせ（Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ， １９８４）、高ストリンジェンシーで洗浄し（０．１ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ，６５℃）、そして次にＸ線フィルムを、ブロットに曝露した。Ａｖｒ４、Ａｖｒ９、Ｅｃｐ１、Ｅｃｐ２、Ｅｃｐ４およびＥｃｐ５のためのプローブを、クローニングベクター中に存在するｃＤＮＡインサートのＰＣＲ増幅によって作成した（Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｌａｕｇｅ， １９９９； Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。
【００５２】
レース５菌株を選択し、これは栄養枯渇中に、種々のＡｖｒおよびＥｃｐ遺伝子の比較的高発現を示した。この菌株から、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を使用して総ＲＮＡから精製した。Ｓｍａｒｔ ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）を使用し、プライマー伸長法、続いてサイズ分離ステップを使用して、非対称ＳｆｉＩ部位を有するｃＤＮＡを構築した。２５０塩基対よりも大きい完全長ｃＤＮＡを、ＳｆｉＩで消化し、そしてＳｆｉＩ消化され、脱ホスホリル化されたバイナリーｐＳｆｉｎｘベクターに、直接的にクローン化した。該ｐＳｆｉｎｘバイナリーベクターは、そのＴ−ＤＮＡ上に、ウイルスゲノムの植物発現を駆動する３５ＳＣａＭＶプロモーターの制御下の、修飾完全長ＰＶＸゲノム配列を含む。それは、過剰発現のためのＤＮＡ配列の挿入を可能とする二重コートタンパク質プロモーターを含む。簡単には、ｐＳｆｉｎｘを、二重ＰＶＸコートタンパク質プロモーターの下流のポリリンカーに存在するＣｌａＩとＡｓｃＩ部位の間に、４つの追加的制限部位（５’−ＳｆｉＩ／ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ／ＳｆｉＩ−３’）を挿入することによって、ｐＧｒ１０６（Ｄｒ． Ｄ． Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， ＵＫによって好意的に提供された）から誘導した。
【００５３】
該ライゲーション混合物を次に、電気適性（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ菌株Ｍｏｇ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， １９９３）であって、ヘルパープラスミドｐＩＣ−ＳＡｒｅｐ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２）を含むものに、Ｍｅｒｓｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９０によって記載された手法の変法を使用して形質転換した。簡単には、Ｍｏｇ１０１の電気適性細胞を、ＴＢ（１２ｇ／ｌのトリプトン、２４ｇ／ｌのコウボエキス、０．４％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．０１７ＭのＫＨ２ＰＯ４および０．０７２ＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ）中でそれらを、１の６６０ｎｍの光学的密度へ成長させ、次いで蒸留水で４回洗浄し、そして最終的に水中の１０％（ｖ／ｖ）グリセロールの０．００５体積中に再懸濁することによって取得した。ｐＳｆｉｎｘ中にライゲートしたｃＤＮＡを、適性Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞（一般的にプレートあたり約３００コロニーを生じる濃度の）の４０μｌに添加し、次いで、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ， ＵＳＡ）で電気形質転換した。１ｍｌのＬＢ−マンニトール（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのコウボエキス、２．５ｇ／ｌのＮａＣｌおよび１０ｇ／ｌのマンニトール）中で２８℃で３時間の回復の後、細胞を、ｍｌあたり１００μｇのカナマイシンおよび２０μｇのリファムピシンで補足した、ＬＢ−マンニトールアガー上に置き、そして２８℃で２日間インキュベートした。コロニーを、Ｆｌｅｘｙｓ ｒｏｂｏｔｉｃ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， ＵＫ）を使用して、ウェルあたり１００μｌのＴＢを含む９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。細胞を２日間２８℃で成長させ、そして−８０℃でプレートを貯蔵する前に３０％の最終濃度にグリセロールを添加した。
【００５４】
実施例２
ライブラリーの機能スクリーニング
植物上での該ライブラリーの機能スクリーニングのために、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養物を、抗生物質で補足したＬＢ−マンニトールアガープレートに、９６ウェルマイクロプレートから移し、２８℃で２日間インキュベートした。ツースピックで個々のコロニーを、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍに対する抵抗性遺伝子Ｃｆ−４（ＭＭ−Ｃｆ４）またはＣｆ−９（ＭＭ−Ｃｆ９）のいずれかを有する５週齢トマト植物上に、つる中部の両側の葉を突き刺すことによって接種した。この方法では、９６のコロニーを、１本のトマト植物において、１２小葉のそれぞれの上に、８コロニーを２反復で接種した。推定陽性クローンを、同じトマト遺伝子型上でおよびタバコ種Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ上で再スクリーニングした。タバコ（Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒ．Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）上での該ライブラリーの機能スクリーニングのために、植物あたり５までの展開した葉に、葉あたり９６コロニーを接種した。コロニーを、９６ニードルコロニー移動デバイスを使用して同時に移動した。葉を、接種１１ないし２０日後に、最初の接種部位に隣接するネクロシス性および／またはクロロシス性の範囲として視認できる局所的ＨＲの存在について、および全身性ＨＲについてスコアー化した。
【００５５】
Ｃ． ｆｕｌｖｕｍのｃＤＮＡライブラリーの機能スクリーニングのためにこのアプローチが可能であるかどうか試験するために、ｐＳｆｉｎｘを含むか、またはＰＶＸ構成要素（ｐＡｖｒ）を欠くバイナリーベクターを使用して、野生型Ａｖｒ４およびＡｖｙ９ｃＤＮＡのインプランタ発現を比較した。ｐＳｆｉｎｘでは、ｃＤＮＡを二重ＰＶＸコートタンパク質プロモーターの下流に挿入し、一方、ｐＡｖｒでは、Ａｖｒ−ｃＤＮＡは構成的３５ＳプロモーターＶａｎ ｄｅｒ Ｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）の下流に存在する。得られたプラスミドを、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ， Ｍｏｇ１０１に形質転換し、そして４つの組換え菌株を、ＭＭ−Ｃｆ４およびＭＭ−Ｃｆ９植物に、ツースピック接種した。ｐＳｆｉｎｘ構築物を含むＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓコロニーのみが、適合する抵抗性遺伝子を有する植物に接種したときに、視認できるＨＲを誘導する。ｐＡｖｒを含むＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、裸眼によって視認できるＨＲを誘導せず、このことは、ＰＶＸ構成要素が、植物で十分量のエリシターの発現を確保し、そして病斑の拡大に必須であることを示している。
【００５６】
Ａｖｒ４およびＡｖｒ９のインプランタ発現の以前の報告では、ＡＶＲの細胞外ターゲティングのためのシグナルペプチドをコードする真菌配列が、タバコのＰＲ−１ａシグナル配列の配列によって置換された（Ｈａｍｍｏｎｄ Ｋｏｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈａｍｍｏｎｄ Ｋｏｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｈｏｎｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ここで、我々は、天然のシグナルペプチドをコードする配列を含む、Ａｖｒ４およびＡｖｒ９ｃＤＮＡを発現させた。明瞭な遺伝子型特異的ネクロシスが観察されたように、コードされたタンパク質の正確なターゲティングがトマトで起こり、このことは、該天然の真菌シグナル配列はまた、インプランタで機能することを示している。
【００５７】
このバイナリーベクターＰＶＸ発現系がまた、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＰＶＸについて他の宿主において機能するかどうか決定するために、ｐＳｆｉｎｘベクターにＡｖｒ遺伝子を有するバクテリアを、Ｃｆ−４またはＣｆ−９のいずれかを発現するトランスジェニックＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖａｒ． ＳＰＩに接種した（Ｐｏｍｅｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｔａｋｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。適合するＡｖｒ−Ｃｆ遺伝子対が存在したときに、明確なネクロシスが発達した。タバコでは、ネクロシスは傷部位の周辺の組織に限定されたままであった一方、トマトでは該障害は最終的に全身に拡大し、植物の死という結果であった（結果は示さず）。
【００５８】
こうして、ＰＶＸに挿入された、所望のｃＤＮＡを含むバイナリーベクターのＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに仲介される送達は、トマトおよびタバコの両方において、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍのＡｖｒ４およびＡｖｒ９をコードするｃＤＮＡを発現するための効果的な手段である。これらの肯定的な結果は、トマトおよびタバコの特定の遺伝子型において、ＨＲを特異的に誘導する「エリシター」をコードするｃＤＮＡを同定するための、インビトロで成長したＣ． ＦｕｌｖｕｍのｃＤＮＡライブラリーの、ハイスループットの、機能スクリーニングのために、この系を使用することを我々に促進させる。
【００５９】
トマトでのｃＤＮＡライブラリーの機能スクリーニングおよびＨＲを誘導するクローンの回収
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍの菌株５ａから単離し、ｃＤＮＡを合成し、ｐＳｆｉｎｘにライゲートし、そして次にＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに形質転換した。個々のコロニーをピックし、そしてそれぞれｃＤＮＡインサートを有するｐＳｆｉｎｘベクターを含む、９６００個のＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓコロニーからなるライブラリーを貯蔵した。５０個のランダムに選択したクローンの分析は、ほとんどすべてが２５０ないし３５００以上の塩基対（ｂｐ）のサイズで異なるインサートを、妥当な方向で含んだことを明かにした（結果は示さず）。該ライブラリーを、それぞれ個々のＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓコロニーの、ＭＭ−Ｃｆ４およびＭＭ−Ｃｆ９植物の葉への、ツースピック接種によってスクリーニングした。接種後１１と２０日の間に、葉を接種部位周辺のネクロシスおよびクロロシスの発達について試験した。推定陽性コロニーを、トマトおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉの両方に再接種し、ＨＲを誘導する活性の特異性を決定した。
【００６０】
最終的に、このスクリーニングは、トマトにＨＲを繰り返し与える４つの異なるＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓコロニーの同定という結果であった（表１）。これらのコロニーの３つは、また、Ｎ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉでＨＲを誘導した。コロニー７２−１１Ｆのみが、ＭＭ−Ｃｆ４植物でＨＲを誘導し、一方、コロニー８４−５Ｃは、ＭＭ−Ｃｆ４およびＭＭ−Ｃｆ９植物の両方でＨＲを与えた。恐らく、コロニー８９−１０Ａおよび４３−７Ｇは、それぞれＭＭ−Ｃｆ９およびＭＭ−Ｃｆ４での、最初の品種特異的スクリーニングで見逃された。というのは、これらは品種非特異的ＨＲを誘導するからである。トマトおよびタバコの両方で陽性であると見出されたこれら３つのコロニー（４３−７Ｇ、８４−５Ｃおよび８９−１０Ａ）は、品種特異的ＨＲを与えるコロニーよりも１ないし２日より早期にネクロシスを誘導する。
【００６１】
機能発現がＨＲを誘導するｃＤＮＡの性質を同定するために、陽性Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓコロニー中に存在するクローンを単離および配列決定した。ＭＭ−Ｃｆ４特異的クローン（７２−１１Ｆ）は、４０８ｂｐのオープンリーヒングフレーム（ＯＲＦ）、５５ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および１６６ｂｐの３’ＵＴＲを含む。該配列は、ＡＶＲ４エリシターをコードするＡｖｒ４　ｍＲＮＡについて公開された配列と同一である（Ｊｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００６２】
機能発現が、トマトおよびタバコの両方で病斑を誘導する３つのｃＤＮＡは、すべて約８３０ｂｐの長さである。配列決定は、これらのｃＤＮＡがすべて同じ遺伝子に起源することを明らかにした。しかしこれらは、明かに独立であり、というのはこれらの５’ＵＴＲおよびポリアデニル化部位が、すべての３ケースで異なるからである。該ｃＤＮＡは、恐らくＣ． ｆｕｌｖｕｍの転写因子をコードする５１０ｂｐの介入のないＯＲＦを含み、Ｂｌａｓｔサーチ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）が、コードされたタンパク質が、Ｂ−Ｚｉｐ塩基性転写因子のファミリーのそれに高い相同性を有するＤＮＡ結合ドメインを含むことを明かにしたとおりである。それは、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＦＯＳ関連性抗原（ＤＦＲＡ）転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ． １９９０）に４２％相同であり、一方それはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの一般的な制御タンパク質（ＣＧＮ）−４のＤＮＡ結合ドメインという、アミノ酸生合成の調節に関係する転写因子（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ， １９８４）と５０％相同性を有し、一方それはトリ肉腫ウイルス１７のＪＵＮと最高の相同性を有した。これらの遺伝子のすべては、ｂＺＩＰ転写因子をコードし、最高の相同性が、塩基性ＤＮＡ結合ドメインおよびロイシンジッパードメインに見出された。プローブとしての３クローン（４３−７Ｇ）の一つのサザン分析は、相同な配列が、単一コピーの遺伝子として、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍレース０、４および５に存在することを明かにした。
【００６３】
同種の遺伝子が植物中に存在するか同定するために、トマト、タバコおよびアラビドプシスのｇＤＮＡのサザンブロットを、標識した４３−７Ｇ　ｃＤＮＡで探索した。特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、低ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件（５５℃、３ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）を使用しては見出されなかった。このことは、ＤＮＡレベルでは同種の遺伝子がこれらの植物種に存在しないことを示している。ところが、植物は実際、ｂＺＩＰタンパク質を有する（例えば、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２．．ＥＭＢＯ Ｊ． １１：１２６１−７３）。
【００６４】
実施例３
機能発現がＨＲを引き起こすｃＤＮＡクローンの単離および配列決定
再スクリーニング後、局所および／または全身性ＨＲを引き起こしたＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのコロニーを、抗生物質で補足したＴＢ中で成長させた。次に、プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解によって単離し、そして標準手法にしたがって（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）電気適合性Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換させた。インサートを、該ｃＤＮＡインサートに隣接するプライマーＯＸ１０（５’−ＣＡＡＴＣＡＣＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＴＧＣ−３’）（配列番号３）およびＮ３１（５’− ＧＡＣＣＣＴＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号４）を使用するＰＣＲによって、またはＣｌａＩおよびＮｏｔＩでの消化のいずれかによって単離した。該ｃＤＮＡインサートを、ＯＸ１０またはＮ３１プライマーを使用して、Ｂｉｇ Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｍｅｔｈｏｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， ＵＳＡ）で配列決定した。
【００６５】
ｃＤＮＡライブラリーのコロニーハイブリダイゼーション
コロニーハイブリダイゼーションのために、Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのカルチャーを、９６ウェルマイクロタイタープレートから、カナマイシンおよびリファマイシンで補足したＬＢ−マンニトールアガープレートに移した。コロニーを２８℃で２日間成長させ、そしてＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋ ｍｅｍｂａｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）に移した。このバクテリアを次に溶解し、そして解放されたＤＮＡを、溶解工程が１５分に延長された修飾を有する標準手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を使用して膜に固定化した。変性および中和の後、該フィルターを、ノーザンブロットの探索と類似する種々のプローブとハイブリダイズさせた。
【００６６】
実施例４
４３−７Ｇの発現は多くの植物種でネクロシスを誘導する
４３−７Ｇのネクロシスを誘導する活性を、ほとんど同遺伝子型のトマト（ｖａｒ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）系統Ｃｆ−２、Ｃｆ−４、Ｃｆ−５、Ｃｆ−９、Ｃｆ−ｖｅｄａおよびＣｆ−１８、および１１種のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．の、ｐＳＦｉｎｘ：：４３−７Ｇを有するアグロバクテリウムのツースピック接種によって試験した。Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓを除いて、すべての植物が４３−７Ｇ特異的ネクロシスを示した（図１）。幾つかの植物のみが、接種部位にネクロシスを示し（Ｎ． ｒｕｓｔｉｃａ、Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ、Ｎ． ｐａｎｉｃｕｌａｔａおよびＮ． ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ）、一方その他は、接種およびより上位の未接種葉の両方に全身性ネクロシスを示した（すべてのトマト変種、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａおよびＮ． ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ）。ネクロシス系の重度はこれらの種で異なり、これは恐らくこの宿主中での、ウイルスのより高いまたはより低い効率の複製による４３−７Ｇの発現レベルの相違のためである。例えば、Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓは、ＰＶＸ系を使用してはＨＲ様病徴を示さなかったが、アグロバクテリウムで４３−７Ｇを発現するバイナリーベクターのＡＴＴＡ浸潤 （Ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００ ＭＰＭＩ １３：４３８−４４６）をすると、ネクロシスを示した。
【００６７】
実施例５
必須ドメインの同定
配列番号１の最大ＯＲＦは、ポリリンカー中のＡＴＧ（配列表の位置３、ＡＴＧ３）にて開始し、そして位置７８０の停止コドン（ＴＧＡ）まで続く。同じリーディングフレームでは、第２のＯＲＦが存在し（ＡＴＧ２７３−ＴＡＧ７８０）、これは、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍで実際に機能するタンパク質をコードし得る。これらの２つの開始コドンの間に、３つの追加的ＡＴＧが存在し（ＡＴＧ１０２、１５５、２６２）、これらは同じリーディングフレーム中にはない。どのＡＴＧがＨＲを誘導する活性にとって必須であるか同定するために、２つの欠失突然変異体を作成した：４３−７Ｇ＊７９（ポリリンカー中のＡＴＧを除去しただけ）および４３−７Ｇ＊２６５（同じリーディングフレーム中の第２のＯＲＦの一つを除いてすべてのＡＴＧを除去した）。これらを、ｓＰｆｉｎｘにクローン化し、そしてアグロバクテリウムに仲介される接種のために使用した。驚くべきことに、これらの構築物は種々の植物種においてネクロシスを誘導する活性の異なるスペクトルを示した。前のように、明瞭なネクロシスが、コントロールの非突然変異性４３−７Ｇ未接種植物のトマト、Ｎ． ｔａｂａｃｕｍおよびＮ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉで観察された。４３−７Ｇ＊７９を接種したときこれらの植物種にはネクロシスは観察されなかったが、４３−７Ｇ＊２６５を接種したときはＮ． ｔａｂａｃｕｍはネクロシスを示し、一方トマトおよびＮ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉは示さなかった（図２）。ネクロシスを誘導する後者の構築物の能力を、感染性ウイルス粒子を含む樹液を使用して他のタバコ種の接種によってさらに調査した。Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ． ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉは、重度のネクロシスを示し、一方いくつかのより温和な病徴がＮ． ｔａｂａｃｕｍ、Ｎ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａおよびＮ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａでみられた。接種Ｎ． ｐａｎｉｃｕｌａｔａおよびＮ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ葉にはネクロシス病徴が観察されなかった。
【００６８】
４３−７Ｇのさらに６突然変異体を作成し、ＤＮＡ結合およびロイシンジッパードメインの妨害の影響を研究した。該ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸２０２（Ａｒｇ）からアミノ酸２２１（Ａｒｇ）にわたり、一方該ロイシンジッパードメインはアミノ酸２２２（Ａｌａ）からアミノ酸２５９（Ｌｙｓ）にわたり、これは配列番号２に示されるとおりである。保存アミノ酸のコドン中の２つの点突然変異を、該ＤＮＡ結合ドメインに導入し、一つは位置２０７のアミノ酸Ａｓｎのコドンを、Ａｌａのコドンと置換し、その他は位置２１５および２１７のＡｒｇの２つのコドンを、Ａｌａをコードするコドンで置換した。さらに突然変異体を小さい欠失で作成し、アミノ酸２０２−２０７を喪失させた（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）。ロイシンジッパードメインのために、３つの突然変異体を、それぞれ位置２２５、２３９および２５３のＬｅｕをＡｌａに変更し点突然変異を作成した。すべての６つの構築物（およびコントロールとして完全長４３−７Ｇ構築物）を、３５Ｓプロモーターの制御下でバイナリーベクターに挿入し、そしてＮ．ＬａｎｇｓｄｏｒｆｉｉでＡＴＴＡによってＨＲを誘導する活性について試験した。該ＡＴＴＡは３回繰り返し、結果を表２に示す。結果はあきらかに、塩基性アミノ酸によって特徴付けられるＤＮＡ結合ドメインが、ＨＲの誘導に極度に重要であり、そしてまたロイシンジッパーモチーフ中の保存されたロイシン残基がそのＨＲ誘導活性を決定するにとって重要であることを示している。両方のエレメントは、ＤＮＡ結合にとって必須であることが既知であり、該塩基性領域がＤＮＡヘリックスと直接的に相互作用し、そして該ロイシンジッパーモチーフが、このクラスのタンパク質の二量化ドメインとして作用する。
【００６９】
表１．ＭＭ−Ｃｆ４およびＭＭ−Ｃｆ９トマトにおける、Ｃ． ｆｕｌｖｕｍの菌株５ａのｃＤＮＡライブラリーの、第１の機能スクリーニングの後のＨＲ誘導コロニーの数および、第２のスクリーニング後に残っている陽性コロニーの位置
【表１】
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ａ該ライブラリーを２ラウンドでスクリーニングした；９６００コロニーの第１のスクリーニングラウンドでＨＲ様病徴を与えたコロニーを、再スクリーニングした。
ｂ第２ラウンドで明瞭なＨＲを誘導するコロニーを、Ｎ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉおよび両方のトマト遺伝子型で、ＨＲ誘導活性の特異性についてまたスクリーニングした。「非特異的」は、該コロニーが、トマトのすべてのほとんど同遺伝子型系統でおよびＮ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉでＨＲを誘導することを示す。
【００７０】
表２．Ｎ． ｌａｎｆｓｄｏｒｆｉｉにおける、種々の構築物を含むバイナリーベクターのＡＴＴＡ浸潤。該構築物のＨＲ誘導活性を、総浸潤領域のネクロシス面積のパーセンテージとして示す。
【表２】
2004506415.tif 000003
【００７１】
引用文献
【表３】
2004506415.tif 000004
【表４】
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【表５】
2004506415.tif 000006
【表６】
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【表７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＳｆｉｎｘ：：４３−７Ｇ（Ａ−Ｊ，Ｌ）またはｐＳｆｉｎｉｘ：：Ａｖｒ４を含むアグロバクテリウムを、ツースピックで接種した葉の病徴である（Ｋ）。Ａ：Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｂ：Ｎ． ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｃ：Ｎ． ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｄ：Ｎ． ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ，Ｅ：Ｎ． ｒｕｓｔｉｃａ、Ｆ：Ｎ． ｌａｎｇｓｄｏｒｆｉｉ、Ｇ：Ｎ． ｔｏｂａｃｕｍ（ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ）、Ｉ：Ｎ． ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｊ：Ｎ． ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、ＫおよびＬ：Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ。
【図２】図２は、５’欠失構築物を含むプラスミドで形質転換したアグロバクテリウムをツースピックで接種した植物の病徴である。トマトの左側（Ａ、Ｂ）およびタバコ（Ｃ、Ｄ）葉に、完全長ＤＮＡを含むプラスミドで形質転換したアグロバクテリウムを接種した。一方、右側に、欠失Δ７９（Ａ、Ｃ）または欠失Δ２５６ｃＤＮＡ（Ｂ、Ｄ）を接種した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ（Ｅ−Ｈ）の完全葉に、完全長ＤＮＡ（Ｅ）、欠失Δ７９（Ｆ）またはΔ２５６（Ｇ）を有するプラスミドを含むアグロバクテリウムを接種した。Ｈは、５’欠失構築物を含むプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウムを接種されたＮ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ植物の未接種葉のモザイク病徴を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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