(57)【要約】本発明は、未分化ヒト胚性幹細胞と、分化細胞を培養、増殖および生産する方法とに関する。詳細には、本発明は、インビトロにおいて分化体細胞を生成することができるヒトＥＳ細胞並びに神経細胞および／またはグリア細胞を含む成熟した体細胞を生じることができる神経前駆細胞などの委任前駆細胞を生成することと、その使用とに関する。本発明の一態様において、インビトロにおいて増殖して、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる未分化ヒト胚性幹細胞の濃縮調製物が提供される。本発明は、ＥＳ細胞が神経系統に分化制御されるインビトロおよびインビボモデルを作製する方法を提供する。ヒトの神経発生の細胞生物学および分子生物学を研究するため、神経分化および再生に何らかの役割を果たす遺伝子、増殖因子および分化因子を発見するため、医薬品を発見するため並びに催奇形性、毒性および神経保護作用のスクリーニングアッセイを開発するために、本発明のモデルおよび神経分化経路で作製される細胞を使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいて増殖でき、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる、ヒト未分化胚性幹細胞の濃縮調製物。
【請求項２】
分化シグナルの非存在下において、線維芽細胞フィーダー層上で培養する場合に、未分化状態を維持する、請求項１に記載のヒト未分化胚性幹細胞の濃縮調製物。
【請求項３】
神経前駆細胞に分化することができる、請求項１または２に記載のヒト未分化胚性幹細胞の濃縮調製物。
【請求項４】
インビトロにおいて増殖し、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができ、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原およびＴＲＡ１−６０を含むヒト多分化能幹細胞のマーカーと免疫反応性である未分化ヒト胚性幹細胞。
【請求項５】
Ｏｃｔ−４を発現する、請求項４に記載の未分化ヒト胚性幹細胞。
【請求項６】
インビボにおいて長期培養中に二倍体核型を維持する、請求項４または５に記載の未分化ヒト胚性幹細胞。
【請求項７】
免疫寛容ＳＣＩＤマウスの精巣に注射すると腫瘍を形成する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の未分化ヒト胚性幹細胞。
【請求項８】
分化して、成熟ニューロンおよび／またはグリア細胞に増殖することができ、未分化ヒト胚性幹細胞由来である分化型委任ヒト前駆細胞系統。
【請求項９】
レシピエントの脳に移植片を確立することができる、請求項８に記載の分化型委任ヒト前駆細胞系統。
【請求項１０】
ニューロンおよび星状細胞ならびに稀突起膠細胞などのグリア細胞を含む他の細胞系統にインビボにおいて分化することができる、請求項９に記載の分化型委任ヒト前駆細胞系統。
【請求項１１】
未分化ヒト胚性幹細胞からインビトロにおいて分化された神経前駆細胞。
【請求項１２】
増殖することができる、請求項１１に記載の神経前駆細胞。
【請求項１３】
成熟ニューロン細胞またはグリア細胞に分化することができる、請求項１１に記載の神経前駆細胞。
【請求項１４】
他の細胞系統に分化転換して、幹細胞および非神経表現型の分化細胞を作製することができる、請求項１１に記載の神経前駆細胞。
【請求項１５】
神経外胚葉性系統のマーカー、神経前駆細胞のマーカー、神経フィラメントタンパク質、ＭＡＰ２ａｂを含むモノクローナル抗体、グルタメート、シナプトフィジン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、β−チューブリン、β−チューブリンＩＩＩ、ＧＡＢＡ　Ａα２受容体、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ガラクトセレブロシド（ｇａｌ　Ｃ）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ｐｌｐ、ＤＭ−２０およびＯ４を含むマーカーの発現によって特徴づけられる、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の分化型神経前駆細胞。
【請求項１６】
ＮＣＡＭ，ネスチン、ビメンチンおよび転写因子Ｐａｘ−６を含む群から選択される神経外胚葉および神経前駆細胞のマーカーを発現し、Ｏｃｔ−４を発現しない、請求項１５に記載の神経前駆細胞。
【請求項１７】
レシピエントの脳において移植片を確立することができる、請求項１６に記載の神経前駆細胞。
【請求項１８】
レシピエントの脳に広範に組み込むことができる、請求項１７に記載の神経前駆細胞。
【請求項１９】
宿主の脳経路に沿って移動することができる、請求項１７または１８に記載の神経前駆細胞。
【請求項２０】
宿主の環境シグナルに応答する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の神経前駆細胞。
【請求項２１】
局所的な宿主環境シグナルに応答して分化する、請求項２０に記載の神経前駆細胞。
【請求項２２】
レシピエントの脳の他の細胞系統に分化することができる、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の神経前駆細胞。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の細胞の濃縮された集団を含む神経前駆細胞の濃縮調製物。
【請求項２４】
未分化状態で長期に増殖することができる、請求項２３に記載の神経前駆細胞の濃縮調製物。
【請求項２５】
ニューロン、成熟ニューロンおよびグリア細胞に分化することができる、請求項２３に記載の神経前駆細胞の濃縮調製物。
【請求項２６】
腫瘍が存在しないレシピエント脳に移植片を確立することができる、請求項２５に記載の神経前駆細胞の濃縮調製物。
【請求項２７】
凍結保存から回収することができる、請求項２５または２６に記載の神経前駆細胞の濃縮調製物。
【請求項２８】
神経前駆細胞に分化する未分化ヒト胚性幹細胞を作製する方法であって、
インビトロにおいて受精させたヒト胚を入手し、胚を発生の胚盤胞期まで増殖させるステップと、
胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を取り出すステップと、
胚体外分化および細胞死を誘発せず、未分化幹細胞の増殖を促進する条件下においてＩＣＭ細胞を培養するステップと、
幹細胞を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２９】
フィーダー層から幹細胞を回収する前に、胚性幹細胞の増殖を促進するために、線維芽細胞フィーダー層上でＩＣＭ細胞を培養するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記線維芽細胞が、ヒトもしくはマウス線維芽細胞またはヒトおよびマウス線維芽細胞の組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
線維芽細胞フィーダー層が、胚性線維芽細胞を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記線維芽細胞が、近交系１２９／ＳｖもしくはＣＢＡマウスまたは１２９／ＳｖとＣ５７／Ｂ１６株の交配由来のマウスである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記線維芽細胞フィーダー層が、約２５，０００ヒト細胞および７０，０００マウス細胞／ｃｍ２の密度、または７５，０００〜１００，０００マウス細胞／ｃｍ２の密度である、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
線維芽細胞フィーダー層が、ＥＳまたはＩＣＭ細胞を添加する６〜４８時間前に確立される、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
線維芽細胞フィーダー細胞は、増殖が停止されている、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
線維芽細胞フィーダー細胞が照射によって停止されるか、またはマイトマイシンＣで処理される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
幹細胞を線維芽細胞フィーダー層から別の線維芽細胞フィーダー層に移すステップと、
形態的に未分化の幹細胞の増殖を促進するのに十分な時間、幹細胞を培養するステップと
をさらに含む、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２８〜３７のいずれか１項に記載の方法によって作製される未分化ヒト胚性幹細胞。
【請求項３９】
インビトロにおける幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化胚性幹細胞を入手するステップと、
幹細胞の再生を許容しない、細胞を死滅させない、および／または胚体外系統への一方向性分化を誘発する条件下において分化シグナルを提供するステップとを含む方法。
【請求項４０】
前記未分化胚性幹細胞が請求項４〜７または３８のいずれか１項による請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
幹細胞の体細胞分化を誘発する条件が、
分化を誘発する線維芽細胞フィーダー層で長時間、高密度に未分化幹細胞を培養するステップと、
無血清培地で未分化幹細胞を培養するステップと、
胚体外分化および細胞死を誘発しない、分化誘発性線維芽細胞フィーダー層で未分化幹細胞を培養するステップと、
ヒト発生の着床後期によく似た構造を作製するように、単層状態で、または半透膜上で高密度になるまで培養するステップと、
骨形態形成タンパク質−２またはそのアンタゴニストを含む群から選択される化学的分化因子の存在下において培養するステップと
を含む上記のいずれか１つから選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって作製される分化前駆細胞
【請求項４３】
神経前駆細胞または、血管芽細胞または造血幹細胞を含む中胚葉前駆細胞を含む群から選択される、請求項４２に記載の分化前駆細胞。
【請求項４４】
ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる神経前駆細胞である請求項４３に記載の分化前駆細胞。
【請求項４５】
胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞から体細胞を誘導する方法であって、
胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞源を入手するステップと、
接着性基材上で前駆細胞を培養するステップと、
体細胞分化を生じる条件下において、体細胞に分化するように細胞を誘導するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
前記胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞が無血清培地および増殖因子の存在下において増殖され、増殖因子の除去によって分化するように誘発される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
胚性幹細胞由来の前駆細胞が、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の細胞である請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前駆細胞が、ポリ−Ｄ−リジンとラミニン、またはポリ−Ｄ−リジンとフィブロネクチンから選択される接着性基材上で培養される、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前駆細胞がポリ−Ｄ−リジンとラミニン上で培養される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
細胞が、レチノイン酸の存在下においてさらに培養される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
誘導される前記体細胞が、成熟ニューロンを含むニューロンである、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前駆細胞がポリ−Ｄ−リジンとフィブロネクチン上で培養される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＤＧＦ−ＡＡおよびｂＦＧＦの存在下において無血清培地でポリ−Ｄ−リジンとフィブロネクチン上でプレーティングする前および後に前駆細胞を培養する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＰＤＧＦ−ＡＡ、塩基性ＦＧＦおよびＦＧＦの存在下においてプレーティングした後に前駆細胞を培養する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｔ３の存在下においてプレーティングした後に体細胞前駆細胞を培養するステップをさらに含む、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
誘導される前記体細胞が、星状細胞および稀突起膠細胞を含むグリア細胞である、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
請求項３８に記載の未分化ヒト胚性幹細胞を入手するステップと、
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって、胚性幹細胞の神経前駆細胞への体細胞分化を誘導するステップと、
ポリシアリル化Ｎ−ＣＡＭなどの初期の神経外胚葉および神経幹細胞マーカー、ネスチンおよびビメンチンなどの中間径フィラメントタンパク質、ならびに転写因子Ｐａｘ−６の発現によって神経前駆細胞を同定するステップと、
増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および成長（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を促進するように、神経前駆細胞を培養するステップと
を含むヒトＥＳ由来神経前駆細胞の濃縮調製物を作製する方法。
【請求項５８】
増殖因子を補完したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む無血清培地において、神経前駆細胞を球形または単層として培養する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
増殖因子がＢ２７、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
非神経細胞を排除するために培養するステップをさらに含み、前記培養するステップが、増殖因子を補完したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む無血清培地において選択培養するステップをさらに含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
さらに培養するステップが、Ｂ２７、ｂＦＧＦおよびＦＧＦを補完したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む無血清培地に未分化ＥＳ細胞塊を移すステップと、得られた神経前駆細胞を球形または単層として培養するステップとを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＥＳ由来の神経前駆細胞の球形物を移植する方法であって、
球形物を分離させるステップと、
生きた宿主に分離させた球形物を注射するステップと
を含む方法。
【請求項６３】
ＥＳ由来の神経前駆細胞の球形物が、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のＥＳ由来の神経前駆細胞を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
分離が機械的粉砕を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
分離が、パパインによる球形物の消化に機械的粉砕を組み合わせたものを含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６６】
分離させた球形物を宿主の神経系に注射する、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
球形物を側脳室に注射する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞からインビボにおいて体細胞を誘導する方法であって、
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法によって作製される胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞源を入手するステップと、
体細胞前駆細胞を宿主に移植して、体細胞への分化を誘発するステップと
を含む方法。
【請求項６９】
体細胞前駆細胞を移植する方法が請求項６２〜６７のいずれか１項による、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
分化が局所的な宿主環境シグナルによって誘導される、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
６８〜７０のいずれか１項に記載の方法によって作製される体細胞。
【請求項７２】
神経細胞の安定な移植片を形成し、生存している宿主の組織形成に寄与する方法であって、
請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の方法により、ＥＳ由来の神経前駆細胞球形物を生きた宿主に移植するステップ
を含む方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法により、神経細胞の安定な移植片を形成するステップを含む、宿主の神経系を改変する方法。
【請求項７４】
神経系を改変する前記ステップが、神経系の欠損している神経またはグリア細胞集団を補充するステップ、欠損している機能を回復させるステップまたは再生および治癒過程を活性化するステップのいずれか１つを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
神経前駆細胞の球形物が遺伝的に改変された神経前駆細胞を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
遺伝的に改変された神経前駆細胞が、標的器官において特定の望ましい遺伝子を発現する、請求項７３および７４に記載の方法。
【請求項７７】
請求項７３〜７６のいずれか１項により、患者の神経系を改良するステップを含む、神経系の異常な状態を治療する方法。
【請求項７８】
異常な状態が、神経変性性疾患、血管状態、自己免疫性疾患、先天性疾患および外傷を含む群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、未分化ヒト胚性幹細胞と、培養、増殖して分化細胞を作製する方法とに関する。詳細には、本発明は、インビトロにおいて分化体細胞を作製することができるヒトＥＳ細胞並びに神経細胞および／またはグリア細胞を含む成熟体細胞を生じることができる神経前駆細胞などの委任前駆細胞を作製することとそれらの使用とに関する。
【０００２】
［序文］
未分化状態で維持することができる、またはインビトロにおいて胚体外または体細胞系統に分化するように誘導することができるヒト胚性幹細胞を作製することにより、早期ヒト発生に関する細胞生物学および分子生物学の研究、機能ゲノム工学、移植または薬物スクリーニングおよびインビトロにおける医薬品発見に使用する幹細胞からの分化細胞の作製が可能になる。
【０００３】
一般に、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じることができる未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、異なる種類の最終的に分化した血液細胞のいずれかを生ずることができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は胚由来であり、多分化能をもつので、発生して、任意の器官、細胞種もしくは組織種またはおそらく完全な胚を形成する能力を有する。
【０００４】
１９８１年のマウスＥＳ細胞の開発（Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１；Ｍａｒｔｉｎ，１９８１）は、ヒトＥＳ細胞を開発するためのパラダイムおよび技術の多くを提供した。ＥＳ細胞の開発は、多量の体組織が乱れて並列しているマウス奇形癌腫（少数の近交系株の生殖腺に生ずる腫瘍）に関する研究から発展した。奇形癌腫に関する典型的な研究は、マウスの生殖細胞由来の起源を確立し、腫瘍に見られる多種類の組織を生ずることができる幹細胞（胚性癌腫、すなわちＥＣ細胞）の概念を提供した（Ｋｌｅｉｎｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｐｉｅｒｃｅ，１９６４；総説、Ｓｔｅｖｅｎｓ，１９８３）。ＥＣ細胞の胚盤胞注射によってキメラマウスが作製されたことにより、ＥＣ幹細胞の顕著な発生能力が明らかになると、奇形癌腫研究分野（総説、Ｍａｒｔｉｎ，１９８０）は７０年代にはかなり拡大し、研究者は、哺乳類発生のモデルとして腫瘍由来の培養細胞系統の潜在的な有用性を実現し始めた。しかし、ＥＣ細胞には限界があった。ＥＣ細胞には染色体の異常があることが多く、多種類の組織に分化する能力が制限されることが多かった。
【０００５】
奇形癌腫は、胚盤胞を異所的な部位に移植することによっても誘発することができたので、Ｇａｉｌ　ＭａｒｔｉｎおよびＭａｒｔｉｎ　Ｅｖａｎｓによって１９８１年に独立に実施されたように、腫瘍ではなく胚盤胞から直接多分化能細胞系統を誘導することが可能であること考えられた。得られたものは、生殖細胞を含む成体生体の全ての組織を形成することができる安定な二倍体細胞系統であった。奇形癌腫はまた、いくつかのマウス株において始原生殖細胞から自然に、または始原生殖細胞を異所的部位に移植することによっても発生し、１９９２年に、Ｂｒｉｇｉｄ　Ｈｏｇａｎらはマウス始原生殖細胞からのＥＧ細胞の誘導を報告した（Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。これらのＥＧ細胞は、ＥＳ細胞と非常によく似た発生能力を有する。
【０００６】
精巣の奇形癌腫はヒトにおいて自然に発生し、多分化能細胞系統もこれらから発生した（総説、Ａｎｄｒｅｗｓ，１９８８）。２つの研究グループが、インビトロにおいてニューロンおよび他の細胞種に分化することができるクローン細胞系統のヒト奇形癌腫からの誘導を報告した（Ａｎｄｒｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４）。その後、胚の３つの胚葉全てを代表する組織に分化することができる細胞系統が開発された（Ｐｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。ヒトＥＣ細胞の特徴分析が進むと、それらは常に異数体であり、通常（常ではないが）体組織に自然に分化する能力に限界があり、マウスＥＳまたはＥＣ細胞とは表現型が異なることが明らかになった。
【０００７】
Ｐｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）が開発した多分化能細胞系統の特徴は以下のようである：
ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ　１−６０、ＧＣＴＭ−２、アルカリ性ホスファターゼ、Ｏｃｔ−４を発現する。
明確な細胞の境界を有する平坦なコロニーとして増殖する。
胚の３つの胚葉全ての派生物に分化する。
フィーダー層依存性である（増殖に対するフィーダー細胞の影響は、フィーダー細胞によるならし培地（コンディションド培地）またはフィーダー細胞の細胞外基質によって再構成されない）。
単一細胞に非常に分離しやすく、フィーダー層上でさえもクローニング効率が低い。
白血病抑制因子に応答しない。
【０００８】
ヒトＥＣ細胞に関するこれらの研究は、霊長類の多分化能幹細胞の表現型を本質的に規定している。
【０００９】
アカゲザル胚盤胞からの霊長類ＥＳ細胞の誘導、後にはマーモセットの胚盤胞からの誘導（Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，１９９６）が記載されている。これらの霊長類細胞系統は二倍体であるが、ほかの点では、最も近い種であるヒトＥＣ細胞に酷似している。サルの研究とヒトＥＣ細胞に関する研究の関係は、マウスＥＳ細胞とは表現型が異なる多分化能幹細胞がヒト胚盤胞から誘導することができるということであった。
【００１０】
Ｂｏｎｇｓｏら（１９９４）は、インビトロにおいて受精したヒト胚由来の細胞の短期培養および維持を報告した。Ｂｏｎｇｓｏらが単離した細胞は多分化能幹細胞に期待される形態を有したが、これらの早期の研究はフィーダー細胞による支持を使用しておらず、培養を長期維持することは不可能であった。
【００１１】
Ｊａｍｅｓ　Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）は、不妊治療を受けた夫婦から提供された過剰の胚盤胞からＥＳ細胞を誘導した。使用された方法は、マウスＥＳ幹細胞を誘導するために１７年前に使用された方法とあまり違わなかった。ＥＳ細胞樹立に抑制的であると考えられている栄養外胚葉を免疫手術によって取り出し、内部細胞塊をマウス胚線維芽細胞フィーダー層上で培養し、短期の接着および増殖後、得られた増殖を分離し、別のフィーダー層で再度培養した。培地または培養系の他の面においてマウスＥＳプロトコールから大きな逸脱はなく、比較的高い成功率が得られた。細胞の表現型は、Ｐｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．のヒトＥＣ研究において上記したものと類似していた。
【００１２】
サルおよびヒトＥＳ細胞に関するＴｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．の研究では、細胞がインビトロにおいて体細胞分化することができることを示す証拠はなかった。インビトロにおける分化の証拠は、栄養膜および内胚葉形成に特徴的なマーカーの発現（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよびα−フェトプロテインの産生）に限定されていた。α−フェトプロテインを産生することが見出されている細胞が、胚体外（卵黄嚢）内胚葉または最終的（胚体内）内胚葉を発現するかどうかをいうことはできないが、前者が可能性が高い。従って、実用的である任意のヒトＥＳ細胞系統の必須の特徴、すなわち、ヒトＥＣ細胞の以前の研究からわかるようにインビトロにおける分化体細胞の産生はサルまたはヒトＥＳ細胞研究では証明されなかった。
【００１３】
最近、生物学および医学における幹細胞の可能な用途に多大な関心が寄せられており、多分化能性および不死性の特徴はＥＳ細胞に独自であり、それによって、研究者達は、ヒト生物学および医学の多くの問題に始めて着手できる。ＥＳ細胞は、特に、別の培養系が必要な委任幹細胞の増殖を支持できない場合には、おそらく移植手法に使用するドナー組織の欠点に対処することができる。しかし、ヒトの医学に基づいた発生学的研究、機能ゲノム工学、増殖因子および医薬品発見、毒性学並びに細胞移植におけるＥＳ細胞技術の広範な適用の可能性のほとんど全ては、ＥＳ細胞を大規模に増殖すること、遺伝的改変を導入することおよび分化させることができるという仮定に基づいている。現在のシステムはこれらの目標に達していないが、進歩の兆しがある。多分化能幹細胞増殖を駆動する新規因子の同定または分化細胞の抑制作用を排除する幹細胞選択プロトコールが共にヒトＥＳ細胞を増殖およびクローニングする方法を提供している。
【００１４】
哺乳類の神経系は、着床後胚の外胚葉の誘導物である。軸形成過程中、胚のいくつかの領域（前内臓内胚葉および初期原腸胚形成体）によって発生される誘導シグナルが、前神経運命となる胚盤葉上層の多分化能細胞を誘導すると考えられている（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９９９）。神経形成を誘導する、これらの組織によって発生される因子の分子的アイデンティティーは不明であるが、ＷｎｔおよびＢＭＰファミリーのシグナリング分子のアンタゴニストが関与する可能性があるという強力な証拠が下等脊椎動物から得られている。
【００１５】
胚性幹細胞は、着床前胚の胚盤葉上層に相当すると考えられている多分化能細胞である。マウスＥＳ細胞は、自然にまたは胚葉体形成中にインビトロにおいて神経組織を生じることもできる。神経組織は、このような状況では、種々の細胞種の混合物から生じることが多い。培養条件の変更またはこの混合物からの神経細胞のその後の分離を使用して、ＥＳ細胞の分化培養から比較的純粋な神経細胞集団を作製することができる（例えば、Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。これらの神経細胞を実験モデルに使用して、動物モデルシステムの種々の欠点を克服している（総説、Ｓｖｅｎｄｓｅｎ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　１９９９）。同じことはヒトＥＳ細胞由来のニューロンでは実施されていないが、神経細胞は、レチノイン酸を使用して分化するように誘発したヒト胎児性癌細胞から誘導された。これらのＥＣ細胞は、その後、ＣＮＳ疾患の実験モデルの欠点を克服することが示された。
【００１６】
ヒトＥＳ由来ニューロンの好適な供給源あれば、それらを利用することにより、ＣＮＳの発生および疾患の基礎研究および応用研究の利点となるので、望ましいと思われる。神経細胞系統へのヒトＥＳ細胞の分化を制御することにより、神経系の早期発生中の事象を実験的に精査することができ、再生過程の誘発などの治療の可能性を有する新規遺伝子およびポリペプチド因子を同定することができる。追加の製薬学的用途は、神経保護化合物のハイスループットスクリーニングなどの毒性および医薬品発見の新規アッセイの作製を含んでもよい。インビトロにおけるＥＳ細胞からの神経前駆細胞の作製は、組織再建並びに神経系への遺伝子送達および発現のための無限の細胞源となりうる。
【００１７】
本発明の目的は、従来技術の問題点をいくつか克服または少なくとも軽減することである。
【００１８】
［発明の開示］
本発明の一態様において、インビトロにおいて増殖し、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる、未分化ヒト胚性幹細胞の濃縮調製物が提供される。
【００１９】
好ましくは、未分化ＥＳ細胞は、分化条件におかれたとき、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化する能力を有する。
【００２０】
さらに好ましくは、未分化ＥＳ細胞は、線維芽細胞フィーダー層上で培養すると、未分化状態を維持することができる。
【００２１】
本発明の別の態様において、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原およびＴＲＡ１−６０を含むヒト多分化能幹細胞のマーカーと免疫反応性であり、分化条件下において神経細胞に分化する可能性がある未分化ヒト胚性幹細胞が提供される。好ましくは、細胞は、ＲＴ−ＰＣＲにより示されるように転写因子Ｏｃｔ−４を発現する。さらに好ましくは、細胞は、インビトロにおける長期培養中、二倍体核型を維持する。
【００２２】
別の態様において、神経前駆細胞、ニューロン細胞およびグリア細胞に分化することができ、好ましくは本発明の方法によって作製される未分化細胞系統が提供される。
【００２３】
別の態様において、長期培養することができ、大量の前駆細胞を生じることができる分化した委任前駆細胞が提供される。
【００２４】
別の態様において、成熟ニューロンおよび／またはグリア細胞に分化することができる分化した委任前駆細胞が提供される。
【００２５】
別の態様において、インビトロにおいて未分化胚性幹細胞から分化される神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞が提供される。また、成熟ニューロン細胞およびグリア細胞を生じることができる委任神経前駆細胞が提供される。
【００２６】
別の態様において、レシピエントの脳に移植片を樹立することができ、神経系の組織形成に関与する分化委任前駆細胞系統が提供される。
【００２７】
好ましくは、未分化細胞系統は、凍結保存などの保存方法によって保存される。好ましくは、凍結保存方法は、ガラス化などの、胚を使用するのに効率の高い方法である。最も好ましくは、保存方法はＯｐｅｎ　Ｐｕｌｌｅｄ　Ｓｔｒａｗ（ＯＰＳ）ガラス化方法を含む。
【００２８】
別の態様において、神経前駆細胞系統は、凍結保存などの保存方法によって保存される。
【００２９】
別の態様において、星状細胞および稀突起膠細胞を含む、グリア細胞に分化することができる神経前駆細胞が提供される。
【００３０】
別の態様において、造血幹細胞などの非神経表現型の幹細胞および分化細胞を作製するために、他の細胞系統に分化転換することができる神経前駆細胞が提供される。
【００３１】
本発明のさらに別の態様において、神経前駆細胞に分化する未分化ヒト胚性幹細胞を作製する方法であって、
インビトロにおいて受精させたヒト胚を入手し、胚を発生の胚盤胞期まで成長させるステップと、
胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を取り出すステップと、
胚体外分化および細胞死を誘発せず、未分化幹細胞の増殖を促進する条件下においてＩＣＭ細胞を培養するステップと、
幹細胞を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００３２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様において、神経前駆細胞に分化する未分化ヒト胚性幹細胞を作製する方法であって、
インビトロにおいて受精させたヒト胚を入手するステップと、
胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を取り出すステップと、
胚性幹細胞の増殖を促進する線維芽細胞フィーダー層上でＩＣＭ細胞を培養するステップと、
フィーダー層から幹細胞を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明は、さらに、
幹細胞を線維芽細胞フィーダー層から別の線維芽細胞フィーダー層に移すステップと、
形態的に未分化の幹細胞の増殖を促進するのに十分な時間、幹細胞を培養するステップと
を含む。
【００３４】
本発明の別の態様において、本発明の方法は、未分化幹細胞を増殖するステップをさらに含む。
【００３５】
本発明の別の態様において、インビトロにおいて幹細胞が前駆細胞に体細胞的な分化することを誘発する方法であって、
未分化幹細胞を入手するステップと、
幹細胞の再生を許容しない、細胞を死滅させない、および／または胚体外系統への一方向性分化を誘発する条件下において分化シグナルを提供するステップとを含む方法が提供される。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様において、インビトロにおける幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化幹細胞を入手するステップと、
分化を誘発する線維芽細胞フィーダー層上で長期間、高密度に前記細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様において、インビトロにおける幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化幹細胞を入手するステップと、
分化を誘発する無血清培地に前記細胞を移すステップと
を含む方法が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様において、体細胞系統に分化させるように幹細胞を誘導する方法を使用することができる。さらに、本発明は、望ましい系統からの前駆細胞の純粋な調製物を樹立することができ、純粋な体細胞前駆細胞系統の樹立を促進する。
【００３９】
本発明の別の好ましい実施態様において、ＥＳ由来の神経前駆細胞が、分化した成熟神経細胞、並びに稀突起膠細胞および星状細胞を含むグリアに分化することを誘発する方法が提供される。
【００４０】
本発明は、ＥＳ細胞の神経系統の分化をインビトロおよびインビボにおいて制御するモデルを作製する方法を提供する。このモデルおよび神経分化経路によって作製される細胞を使用して、ヒトの神経発生の細胞生物学および分子生物学を研究するため、遺伝子、増殖因子並びに神経分化および再生に何らかの役割を果たす分化因子の発見のため、医薬品発見のため、並びに催奇形性、毒性および神経保護作用のスクリーニングアッセイを開発するために使用することができる。
【００４１】
本発明のさらに別の態様において、細胞治療および遺伝子治療に使用することができる神経前駆細胞、神経細胞およびグリア細胞が提供される。
【００４２】
［発明の説明］
本発明の一態様において、インビトロにおいて増殖し、神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる、ヒト未分化胚性幹細胞の濃縮調製物が提供される。
【００４３】
本明細書の説明および請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および「含んでいる」および「含有する」などのこの用語の変化形は、他の添加物、成分、完全物（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）またはステップを除外することを意図していない。
【００４４】
ヒト胚盤胞から樹立された多分化能ＥＳ細胞系統は本出願人らのＰＣＴ／ＡＵ９９／００９９０号に示されている。これまでに発表されているデータとは異なり、本願において本出願人らが誘導したヒトＥＳ細胞系統は、インビトロにおいて体細胞系統に分化して、ニューロンおよび筋細胞を生ずることが示されている。さらに、本出願人らは、インビトロにおいて神経前駆細胞がヒトＥＳ細胞から派生することを証明している。これらのＥＳ由来ヒト神経前駆細胞は、インビトロにおいて成熟ニューロンを生ずることができる。ＰＣＴ／ＡＵ９９／００９９０号の内容は本明細書に組み入れられている。
【００４５】
インビトロにおける増殖は、長期の細胞培養を含んでもよい。細胞は、実質的に、未分化状態で維持される。好ましくは、細胞は、細胞死または胚体外分化を誘発しない条件下において維持される。
【００４６】
好ましくは、それらは、好ましくは未分化条件下において線維芽細胞フィーダー層上で培養するとき、未分化状態を維持することができる。好ましくは、線維芽細胞フィーダー層は胚体外分化を誘発しない。
【００４７】
さらに好ましくは、細胞は、分化条件におかれたとき、インビトロにおいて分化する能力を有する。さらに好ましくは、細胞は、インビトロにおいて、多種多様な体細胞に分化する能力を有する。
【００４８】
一方ではインビトロにおいて未分化状態に維持することができ、もう一方ではインビトロにおいて胚体外および体細胞系統に分化することができる幹細胞を提唱することにより、早期ヒト発生の細胞生物学および分子生物学、機能的ゲノム工学、移植または薬物スクリーニングおよび薬物発見に使用する分化細胞を幹細胞から形成することをインビトロにおいて研究することができる。
【００４９】
細胞が未分化状態で維持されたら、それらは成熟機能細胞に分化することができる。胚性幹細胞は胚由来であり、多分化能であり、任意の器官または組織種に発生する能力を有する。好ましくは、組織種は、内分泌細胞、血液細胞、神経細胞または筋細胞を含む群から選択される。最も好ましくは、それらは神経細胞である。
【００５０】
本発明の別の態様において、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原およびＴＲＡ１−６０を含むヒト多分化能幹細胞のマーカーに免疫反応性であり、分化条件下において神経細胞に分化することができる未分化ヒト胚性幹細胞が提供される。好ましくは、細胞は、ＲＴ−ＰＣＲまたは分化遺伝子発現を分析する方法、マイクロアレイ分析または関連する技法によって示されるように、Ｏｃｔ−４などの特異的な転写因子を発現する。さらに好ましくは、細胞は、インビトロにおける長期培養中、２倍体核型を維持する。好ましくは、幹細胞は未分化幹細胞系統の濃縮調製物を構成する。さらに好ましくは、幹細胞系統は永久細胞系統であり、上記の特徴によって識別される。それらは、好ましくは、上記の特徴と共に正常な核型を有する。規定されている特性のこのような組み合わせは、それらの単離に使用する方法によらず、本発明の細胞系統を同定する。
【００５１】
これらの特徴を同定する方法は、当業者に周知の任意の方法によってもよい。従来の固定プロトコールによって固定し、次いで幹細胞特異的抗体を使用して染色し、不溶性着色生成物を生成することができる蛍光染料または酵素に結合した二次抗体を使用して可視化したＥＳ細胞コロニーに、間接的免疫蛍光法または免疫細胞化学的染色などの方法（これらに限定されない）を実施することができる。または、ＲＮＡを幹細胞から単離し、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を実施して、Ｏｃｔ−４などの幹細胞特異的遺伝子の発現を測定することができる。
【００５２】
好ましい実施態様において、未分化細胞は、免疫寛容ＳＣＩＤマウスの精巣に注射すると腫瘍を形成する。これらの腫瘍は３つの胚葉全てを代表する分化細胞を含む。胚葉は、好ましくは、内胚葉、中胚葉および外胚葉である。好ましくは、腫瘍が樹立されたら、それらを分離し、特定の分化細胞種を当業者が利用可能な任意の方法によって同定または選択することができる。例えば、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）もしくは他の選別方法を使用して、または関心のある組織の直接微小切開法によって、系統特異的なマーカーを使用することができる。これらの分化細胞は任意の方法で使用することができる。それらは、インビトロにおいて培養されて、例えば、移植に使用してもまたは薬物スクリーニングに使用してもよい大多数の分化細胞を形成することができる。
【００５３】
別の態様において、成熟ニューロンおよび／またはグリア細胞に分化して増殖することができる分化した委任前駆細胞系統が提供される。未分化細胞は、インビトロにおいて、分化して神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞を形成することができる。
【００５４】
別の態様において、未分化胚性幹細胞からインビトロにおいて分化した神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞が提供される。また、成熟ニューロン細胞を生ずることができる委任神経前駆細胞が提供される。
【００５５】
別の態様において、星状細胞および稀突起膠細胞を含む、グリア細胞に分化することができる神経前駆細胞が提供される。グリア細胞はミクログリア細胞および放射グリア細胞を含む。
【００５６】
別の態様において、他の細胞系統に分化転換して、造血幹細胞または内皮幹細胞などの非神経表現型の幹細胞および分化細胞を形成することができる神経前駆細胞が提供される。
【００５７】
これらの細胞はヒトＥＳ細胞の体細胞分化によって得られ、神経マーカーによって同定することができる。これらの細胞は、インビトロにおいて分化中のＥＳ細胞から純粋な形態で単離し、インビトロにおいて増殖することができる。それらは、成熟ニューロン細胞および／またはグリア細胞への分化を受けるように誘導することができる。
【００５８】
細胞は、インビトロにおいて分化を受けて、神経前駆細胞、ニューロンまたはグリア細胞並びに胚体外細胞を形成することができ、このような分化は、免疫化学的分析またはＲＮＡ分析によって証明するとき、特定の系統に特徴的な新規遺伝子発現によって特徴づけられる。特徴は、多分化能細胞または特定の系統に特徴的な遺伝子の発現を使用することによって得ることができる。好ましくは、Ｏｃｔ−４の分化発現を使用して、分化細胞から幹細胞を識別することができる。または、多分化能幹細胞または他の系統に特徴的な他の遺伝子の発現の有無はＧｅｎｅｓｉｓ、ＧＤＦ−３またはＣｒｉｐｔｏを含んでもよい。これらの遺伝子発現の分析は、ＥＳ細胞、委任前駆細胞または任意の種類の成熟分化細胞の分子的表現型を規定する遺伝子発現プロフィールを作製することができる。ＥＳ培養物の規定の細胞集団において特定の遺伝子発現をこのように分析することがサイトミクス（動的細胞構造科学）と呼ばれる。遺伝子発現プロフィールを分析する方法には、ＲＴ−ＰＣＲ、分化遺伝子発現方法、マイクロアレイ分析または関連の技法が挙げられる。
【００５９】
分化中の幹細胞培養物は、培養上清に酵素結合免疫吸着アッセイを実施して測定したとき、培養培地にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を分泌する。このように、これは分化細胞を同定する手段として働くこともできる。
【００６０】
神経前駆細胞、ニューロン細胞および／またはグリア細胞を形成する分化細胞はまた、分化中の細胞に特徴的な発現マーカーによっても特徴づけることができる。インビトロにおいて分化した細胞培養物は、神経外胚葉系統マーカー、神経前駆細胞マーカー、神経フィラメントタンパク質、ＭＡＰ２ａｂなどのモノクローナル抗体、グルタメート、シナプトフィジン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、β−チューブリン、β−チューブリンＩＩＩ、ＧＡＢＡ、Ａα２受容体、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ガラクトセレブロシド（ｇａｌ　Ｃ）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ｐｌｐ、ＤＭ−２０およびＯ４などの分子を検出することによって同定することができる。
【００６１】
本発明の別の好ましい態様において、神経外胚葉系統のマーカー並びにポリシアリル化ＮＣＡＭ、ネスチン、ビメンチンおよび転写因子Ｐａｘ−６を含む群から選択される神経マーカーを発現するが、Ｏｃｔ−４を発現しない神経前駆細胞が提供される。
【００６２】
好ましくは、細胞は転写因子Ｏｃｔ−４を発現しない。これは、ＲＴ−ＰＣＲまたは分化遺伝子発現分析方法、マイクロアレイ分析または関連する技法によって証明することができる。さらに好ましくは、細胞は濃縮調製物を構成する。それらは、未分化神経前駆細胞状態でインビトロにおいて長期増殖して、大多数の細胞を形成することができる。神経前駆細胞は、分化条件下において成熟ニューロンおよびグリア細胞に分化することができる。
【００６３】
さらに別の態様において、本発明は、レシピエントの脳に移植片を確立することができる神経前駆細胞を提供する。好ましくは、神経前駆細胞は上記のようである。
【００６４】
発生中の脳に移植すると、それらは宿主脳内に広範に組み込み、領域特異的な分化を受け、生存している宿主の発生および組織形成に関与する。規定している特性のこの組み合わせは、単離に使用する方法によらず、本発明の神経前駆細胞系統を同定する。
【００６５】
本発明のよりさらに別の態様において、神経前駆細胞から分化するグリア細胞が提供される。好ましくは、グリア細胞は星状細胞または稀突起膠細胞である。
【００６６】
本発明のさらに別の態様において、神経前駆細胞に分化する未分化ヒト胚性幹細胞を作製する方法であって、
インビトロにおいて受精させたヒト胚を入手し、胚を発生の胚盤胞期まで増殖させるステップと、
胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を取り出すステップと、
胚体外分化および細胞死を誘発せず、未分化幹細胞の増殖を促進する条件下においてＩＣＭ細胞を培養するステップと、
幹細胞を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００６７】
幹細胞は未分化細胞であり、分化シグナルが適用されると分化するように誘導することができる。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様において、神経前駆細胞に分化する未分化ヒト胚性幹細胞を作製する方法であって、
インビトロにおいて受精させたヒト胚を入手するステップと、
胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を取り出すステップと、
胚性幹細胞の増殖を促進する線維芽細胞フィーダー層上でＩＣＭ細胞を培養するステップと、
フィーダー層から幹細胞を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００６９】
胚性幹細胞（ＥＳ）は胚から誘導される。これらの細胞は未分化であり、種々の細胞種に分化する能力を有する。「胚」は、受精後８週までの受精後の任意の段階と規定される。それは細胞の繰り返した分裂によって発生し、外側の栄養外胚葉と内部細胞塊（ＩＣＭ）を含む胚盤胞期の発生段階を含む。
【００７０】
本発明の方法に必要な胚は、インビトロにおいて受精させた胚であっても、ヒトまたはヒト以外の起源の除核卵母細胞に体細胞または細胞核を導入し、次いで活性化し、胚盤胞期に発生させることによって得られる胚であってもよい。
【００７１】
胚は利用可能な任意のインビトロ方法によって受精することができる。例えば、従来の受精方法または卵細胞質内精子注入法を使用して胚を受精することができる。
【００７２】
凍結保存から回収した胚も好適である。任意の発生段階で凍結保存されている胚が好適である。好ましくは、接合体または卵割期で凍結保存された胚を使用する。任意の胚凍結保存方法を使用することができる。高品質（良好な形態グレード）の胚を作製する方法を使用することが好ましい。
【００７３】
任意の胚培養方法を使用することが好ましいが、高品質（良好な形態グレード）の胚盤胞を作製する方法を使用することが好ましい。胚の高品質性は形態学的基準によって評価することができる。最も好ましくは、内部細胞塊が発達している。これらの基準は当業者によって評価されうる。
【００７４】
受精後、胚を胚盤胞期まで培養することができる。この段階の胚の品質を評価して、ＩＣＭ細胞を誘導するのに好適な胚を判定することができる。胚は、生存性を維持し、胚盤胞発生を増強する任意の培地で培養することができる。
【００７５】
好ましくは、胚は、ＩＶＦ−５０またはＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ１（Ｓ１）またはＧ１．２培地（ＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＩＶＦ）中で事前に平衡にした滅菌鉱物油を重層して液滴状態で培養する。好ましくは、インキュベーションは２日間である。ＩＶＦ−５０またはＳ１を使用する場合は、３日目にＩＶＦ−５０とＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ−２培地（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　ＩＶＦ）の１：１混合物などの適当な培地を使用してもよい。少なくとも４日目からは、Ｇ２．２またはＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ−２（Ｓ２）培地などの好適な培地を単独で使用して、胚を胚盤胞期（胚盤胞）に成長させることができる。好ましくは、４日目以降はＧ２．２だけを使用する。
【００７６】
好ましい実施態様において、胚盤胞に酵素消化を実施して、透明帯またはその一部を除去する。好ましくは、約６日目であってもよい増殖した胚盤胞期において胚盤胞に消化を実施する。一般に、これは受精後約６日である。
【００７７】
胚盤胞から透明帯またはその一部を消化するために任意のタンパク質酵素を使用することができる。例としてプロナーゼ、酸性Ｔｙｒｏｄｅｓｙ溶液およびレーザー切開などの機械的方法が挙げられる。
【００７８】
好ましくは、Ｐｒｏｎａｓｅが使用される。プロナーゼはＰＢＳおよびＧ２またはＳ２培地に溶解することができる。好ましくは、ＰＢＳおよびＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ−２培地は１：１希釈する。胚盤胞から透明帯を消化するためには、約１０単位／ｍｌのＰｒｏｎａｓｅを、透明帯を除去するのに十分な時間使用することができる。好ましくは、約１〜２分、さらに好ましくは１〜１．５分を使用する。
【００７９】
胚（増殖した胚盤胞）はＧ２．２またはＳ２培地で洗浄し、透明帯を溶解するためにさらにインキュベーションすることができる。好ましくは、さらに消化するステップを使用して、透明帯を完全に溶解することができる。さらに好ましくは、プロナーゼ溶液中で１５秒間胚をさらにインキュベーションする。透明帯が除去されると栄養外胚葉が露出される。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の方法は、内部細胞塊細胞を入手するために、
胚を処理して、栄養外胚葉またはその一部を除去するステップと、
胚をＧ２．２またはＳ２培地で洗浄して、栄養外胚葉またはその一部を除去するステップと、
胚の内部細胞塊を入手するステップと
を含む。
【００８１】
透明帯を除去すると、ＩＣＭおよび栄養外胚葉に接近しやすくなる。好ましくは、栄養外胚葉をＩＣＭから分離する。任意の方法を使用してＩＣＭから栄養外胚葉を分離することができる。好ましくは、胚（すなわち、透明帯が除去されている胚盤胞）に免疫手術を実施する。好ましくは、栄養外胚葉表面のエピトープに反応性の抗体または抗血清で処理する。さらに好ましくは、この胚（好ましくは、透明帯が除去されている胚盤胞期の胚）の処理を補体による処理と組み合わせる。抗体および／または抗血清および補体処理は別個で使用しても、一緒に使用してもよい。抗体および／または抗血清および補体の好ましい組み合わせは、抗胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗体および仔ウサギ補体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）または抗ヒト血清抗体（Ｓｉｇｍａ）にモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）を組み合わせたものを含む。
【００８２】
好ましくは、抗体および補体はＧ２．２またはＳ２培地で希釈する。抗体および補体は、抗胎盤アルカリ性ホスファターゼ抗体（抗ＡＰ）を除き１：５に希釈し、抗ＡＰ抗体はＳ−２培地で１：２０に希釈する。
【００８３】
好ましくは、胚または胚盤胞（好ましくは、透明帯が除去されている）は、補体に暴露する前に抗体に暴露する。好ましくは、胚または胚盤胞は、約３０分間抗体中で培養する。
【００８４】
抗体暴露後、胚を洗浄することが好ましい。好ましくは、胚はＧ２．２またはＳ２培地中で洗浄する。胚または胚盤胞は、好ましくは、少なくとも約３０分間補体に暴露する。
【００８５】
好ましくは、Ｇ２．２またはＳ２（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ−２）培地を使用して胚または胚盤胞を洗浄して、栄養外胚葉またはその一部を除去する。除去は機械的手段によってもよい。好ましくは、除去は、小口径ピペットで胚盤胞を吸引することによる。
【００８６】
次いで、ＩＣＭ細胞を露出し、除去および培養の準備ができる。ＩＣＭ細胞の培養は線維芽細胞フィーダー層上で実施することができる。線維芽細胞フィーダー層がないと細胞は分化する。白血病細胞増殖抑制因子（ＬＩＦ）は、フィーダー層の代わりになり、細胞を未分化状態に維持する場合もあることが示されている。しかし、これはマウス細胞にのみ当てはまるようである。ヒト細胞では、高濃度のＬＩＦは、線維芽細胞フィーダー層が存在しない場合には細胞を未分化状態に維持できなかった。
【００８７】
胚体外分化および細胞死を誘発しない条件は、胚体外分化および細胞死を誘発しない線維芽細胞フィーダー層上で胚性幹細胞を培養することを含んでもよい。
【００８８】
好ましくは、マウスまたはヒト線維芽細胞を使用する。それらは別個に使用しても、組み合わせて使用してもよい。ヒト線維芽細胞は幹細胞の支持体となるが、凹凸があり、不安定なフィーダー層を形成することがある。しかし、ヒト線維芽細胞はマウス線維芽細胞と効果的に組み合わせて、最適な幹細胞増殖および分化阻止を生ずることができる。
【００８９】
線維芽細胞層の細胞密度はその安定性および性能に影響する。約２５，０００ヒトおよび７０，０００マウス細胞／ｃｍ２の密度が最も好ましい。フィーダー層は、好ましくは、ＥＳ細胞またはＩＣＭ細胞を添加する６〜４８時間前に確立される。
【００９０】
好ましくは、マウスまたはヒト線維芽細胞は継代数の少ないヒト細胞である。線維芽細胞の品質は、幹細胞を支持する能力に影響する。胚性線維芽細胞が好ましい。マウス細胞では、それらは１３５日齢の胎児から得ることができる。ヒト線維芽細胞は、妊娠中絶の胚または胎児組織由来であってもよく、標準的な細胞培養プロトコールを使用して培養することができる。
【００９１】
マウス胚線維芽細胞を取り扱うガイドラインは、トリプシン消化の使用を最小にすることおよび培養中過密を避けることを含むことができる。このように取り扱われていない胚線維芽細胞は未分化ＥＳ細胞の増殖を支持できない。新たに誘導されるマウス胚線維芽細胞のバッチは各々幹細胞の支持および維持の好適性について試験される。
【００９２】
幹細胞再生および／または体細胞分化の誘発を支持する際には、凍結−融解線維芽細胞と比較して、新鮮な一次胚線維芽細胞が好ましい。にもかかわらず、凍結および融解を繰り返した後でも支持能力を維持しているバッチもある。従って、ＥＳ細胞再生および／または体細胞分化の誘発を支持する際に有効であると証明されている新鮮なバッチを各々、凍結および融解後に再試験する。最も好ましくは、凍結および融解後に能力を保持するバッチを使用する。バッチは、幹細胞再生の支持、体細胞分化の誘発または胚体外分化の誘発の好適性を判定するために試験される。
【００９３】
いくつかのマウス株は、幹細胞維持および体細胞分化の誘発に対して他の株より好適である胚性線維芽細胞を形成する。例えば、近交系１２９／ＳｖもしくはＣＢＡマウスまたは１２９／ＳｖとＣ５７／Ｂ１６株の交配由来のマウスから誘導される線維芽細胞は、幹細胞維持にかなり好適であることが証明されている。
【００９４】
単離したＩＣＭ細胞塊は、ヒト幹細胞に好適な培養条件で培養し、増殖することができる。
【００９５】
フィーダーは増殖を停止するように処理されていることが好ましい。いくつかの方法を利用できる。それらは照射または増殖を停止するマイトマイシンＣなどの化合物で処理されることが好ましい。最も好ましくは、線維芽細胞フィーダーはマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理される。
【００９６】
線維芽細胞フィーダー層は、一般に、ゼラチン処理した培養皿上で培養されてもよい。好ましくは、組織培養皿は０．１％ゼラチンで処理される。
【００９７】
線維芽細胞フィーダー層はまた改変された線維芽細胞を含有してもよい。例えば、幹細胞再生に必須となる組換え膜結合因子を発現する線維芽細胞を使用することができる。このような因子は、例えば、ヒト多分化能幹細胞因子を含んでもよい。
【００９８】
内部細胞塊は線維芽細胞フィーダー層上で培養して、ＥＳ培地で維持することができる。好適な培地は、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ）、（ベータメルカプトエタノール−０．１ｍＭ）（ＧＩＢＣＯ）、非必須アミノ酸−ＮＥＡＡ１％（ＧＩＢＣＯ）、グルタミン  ２ｎＭ（ＧＩＢＣＯ）およびペニシリン５０μ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を補給したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ピルビン酸ナトリウムを含有せず、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを含有する）である。ＥＳ細胞培養の早期段階では、培地に、好ましくは２０００μ／ｍｌのヒト組換え白血病細胞増殖抑制因子ｈＬＩＦを補給してもよい。しかし、ＬＩＦは一般には必要ではない。ＥＳ細胞を支持することができる任意の培地を使用することができる。
【００９９】
ＥＳ細胞には、幹細胞増殖または生存を促進するか、または幹細胞分化を阻害する可溶性増殖因子をさらに補給してもよい。このような因子の例には、ヒト多分化能幹細胞因子または胚性幹細胞再生因子が含まれる。
【０１００】
単離したＩＣＭは少なくとも６日間培養することができる。この段階において、細胞のコロニーが発生する。このコロニーは、主に、未分化幹細胞を含む。それらは、分化した細胞の上面に存在することができる。未分化細胞の単離は化学的もしくは機械的手段またはその両方によって実施することができる。好ましくは、機械的単離およびマイクロピペットによる除去を使用する。細胞の分離を助けるために、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ培地またはディスパーゼなどの化学的または酵素的処理を機械的単離に組み合わせることができる。
【０１０１】
本発明のさらに別の好ましい実施態様において、本発明の方法は、
幹細胞を線維芽細胞フィーダー層から別の線維芽細胞フィーダー層に移すステップと、
形態的に未分化の幹細胞を増殖させるのに十分な時間幹細胞を培養するステップと
をさらに含む。
【０１０２】
未分化幹細胞をさらに培養するステップを実施する。第１の線維芽細胞フィーダー層の細胞群を単離して、上記と同じ培地で新鮮なヒト／マウス線維芽細胞フィーダー層上で再度培養することができる。
【０１０３】
好ましくは、細胞を７〜１４日間培養する。この期間の後、未分化幹細胞のコロニーを観察することができる。幹細胞は、好ましくは高い核／細胞質比、顕著な核小体およびコンパクトなコロニー形成によって形態的に同定することができる。細胞の境界は明瞭であることが多く、コロニーはマウスＥＳ細胞より平坦であることが多い。コロニーは、ＧＣＴ２７Ｘ−１などの多分化能ヒト胎児性癌細胞系統によって形成されるものに類似している。
【０１０４】
本発明の別の実施態様において、本発明の方法は、未分化幹細胞を増殖させるステップをさらに含む。増殖させる方法は、最初に、未分化幹細胞集団を細胞コロニーから取り出すステップに関係してもよい。分散は、好ましくは、化学的もしくは機械的手段またはその両方による。さらに好ましくは、細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ培地で洗浄しても、またはそれらをコロニーから機械的またはこれらの方法の組み合わせまたは当業者に利用可能な任意の周知の方法によって分離する。これらの方法において、細胞は約７日ごとに約１００細胞群として増殖させることができる。
【０１０５】
第１の方法において、細胞−細胞接着を低下するためにＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ培地を使用することができる。約１５〜２０分後、細胞は徐々に単層から、また互いに分離し始め、望ましいサイズの集団を単離することができる。細胞の分離が部分的である場合には、ピペットの鋭い先端を使用した機械的な分離が、細胞群の切断および単離を助けることができる。
【０１０６】
別の化学的方法は酵素の使用を含んでもよい。酵素は単独で使用しても、機械的方法と併用してもよい。好ましくは、酵素はディスパーゼである。
【０１０７】
別の方法は、コロニーを機械的に切断し、次にディスパーゼによってサブコロニーを単離する組み合わせた使用を含む。コロニーの切断は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含有するＰＢＳ中で実施することができる。マイクロピペットの鋭い先端を使用して、約１００細胞の集団のコロニーを切断することができる。ピペットを使用して、コロニー領域を削り取ることができる。好ましくは、ＰＢＳを、ディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）１００ｍｇ／ｍｌを含有する通常の平衡化したヒト幹細胞培地に変えて、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中で３７℃において約５分間インキュベーションしてもよい。細胞群が分離したら、広口マイクロピペットで取り、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含有するＰＢＳ中で洗浄して、新鮮な線維芽細胞フィーダー層に移してもよい。
【０１０８】
線維芽細胞フィーダー層は上記のようであってもよい。
【０１０９】
未分化胚性幹細胞は上記のような特徴的な形態を有する。幹細胞を同定する他の手段は、細胞マーカーによっても、または多分化能細胞に特徴的な遺伝子の発現を測定することによってもよい。
【０１１０】
多分化能細胞または特定の系統に特徴的な遺伝子の例には、それぞれ、幹細胞マーカーおよび神経前駆細胞マーカーとして、Ｏｃｔ−４およびＰａｘ−６、ポリシアリル化ＮＣＡＭ、ネスチン、ビメンチンが挙げられる（がこれらに限定されない）。幹細胞に特徴的な他の遺伝子には、Ｇｅｎｅｓｉｓ、ＧＤＦ−３およびＣｒｉｐｔｏが含まれてもよい。ＣＤ−３４は造血幹細胞に特徴的であり、ｆｌｋ−１は血管芽細胞によって発現される。このような遺伝子発現プロフィールは、ＲＴ−ＰＣＲ、分化遺伝子発現方法、マイクロアレイ分析法または関連する技法を含む任意の方法によって獲得することができる。
【０１１１】
好ましくは、幹細胞は、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原、ＴＲＡ１−６０を含むヒト多分化能幹細胞マーカーに免疫反応性であることによって同定することができる。好ましくは、細胞は転写因子Ｏｃｔ−４を発現する。細胞はまた２倍体核型を維持する。
【０１１２】
好ましくは、神経前駆細胞は、ポリシアリル化ＮＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンなどの中間径フィラメントタンパク質および転写因子Ｐａｘ−６などの初期神経外胚葉および神経幹細胞の発現マーカーによって同定される。ニューロンは、β−チューブリン、β−チューブリンＩＩＩ、６８ｋＤａおよび２００ｋＤａ神経フィラメントタンパク質などの構造マーカーによって同定することができる。成熟ニューロンはまた、１６０ｋＤａの神経フィラメントタンパク質、Ｍａｐ−２ａｂおよびシナプトフィジン、グルタメート、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ作動性（ｍｉｎｅｒｇｉｃ）ニューロン（ＧＡＢＡ  Ａα２）に特徴的なＧＡＢＡ生合成および受容体サブユニットによって同定することができる。星状細胞はグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現によって同定することができ、稀突起膠細胞はガラクトセレブロシド（ｇａｌ  Ｃ）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ｐｌｐ、ＤＭ−２０およびＯ４によって同定することができる。
【０１１３】
幹細胞は、任意の単離段階においてさらに改変することができる。それらは、Ｏｃｔ−４などの幹細胞特異的プロモーターの制御下において選択マーカーを発現するベクターを導入することによって遺伝的に改変することができる。胚性幹細胞の分化した子孫には、幹細胞再生または生存に抑制的な生成物を産生するものもある。従って、このような分化細胞に対する選択は、上記のものなどの構築物を導入することによって促進されるが、幹細胞増殖を促進し、分化を防止することができる。
【０１１４】
幹細胞は、マーカーが任意の培養段階まで保有されるように、任意の段階においてマーカーで遺伝子的に改変することができる。マーカーは、任意の培養段階において、分化または未分化幹細胞集団を精製するために使用することができる。
【０１１５】
遺伝子構築物は、任意の培養段階において未分化または分化細胞に挿入することができる。遺伝的に改変した細胞は、遺伝子治療経過において、移植後に、標的器官において遺伝子を保有し、発現するために使用することができる。
【０１１６】
幹細胞の進行および分化または未分化段階での維持は、ＥＬＩＳＡまたは関連する技法を使用して、培養培地または細胞の固定調製物中の幹細胞特異的分泌産物を測定することによって定量的にモニターすることができる。このような幹細胞特異的産物は、可溶型のＣＤ３０抗原またはＧＣＴＭ−２抗原を含んでもよく、またはそれらは、細胞マーカーまたは遺伝子発現を使用して上記のようにモニターしてもよい。
【０１１７】
本発明の別の態様において、インビトロにおける幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化胚性幹細胞を入手するステップと、
幹細胞の再生を許容しない、細胞を死滅させない、および／または胚体外系統への一方向性分化を誘発する条件下において分化シグナルを提供するステップとを含む方法が提供される。
【０１１８】
本発明の未分化細胞系統は、分化シグナルが与えられるまで、無限に培養することができる。
【０１１９】
分化シグナルが存在する場合には、正しい条件下における未分化ＥＳ細胞は、ニューロン組織および／または胚体外組織などの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の誘導体に分化する。この分化過程は制御することができる。
【０１２０】
本発明の方法は、幹細胞を体細胞系統に分化させるのに有用である。さらに、本発明の方法は、望ましい系統からの純粋な前駆細胞調製物の樹立および他の系統からの望ましくない分化細胞の排除を可能にする。本発明の方法は、純粋な体細胞前駆細胞系統の樹立を促進する。
【０１２１】
本発明の方法は、中胚葉前駆細胞（血管芽細胞または造血幹細胞）および神経前駆細胞などであるが、これらに限定されない種々の体細胞前駆細胞の濃縮調製物を誘導するために使用することができる。好ましくは、本発明の方法は神経前駆細胞を誘導するために使用される。
【０１２２】
胚性幹細胞から体細胞の分化培養物を入手する条件は、幹細胞再生に非許容的であるが、幹細胞を死滅させないか、または主に幹細胞に胚体外系統に分化させるものである。幹細胞増殖に最適な条件を徐々に減らすと体細胞分化が促進される。幹細胞は、最初、未分化状態であり、分化するように誘導することができる。
【０１２３】
本発明の好ましい実施態様において、インビトロにおいて幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化幹細胞を入手するステップと、
分化を誘発するために、線維芽細胞フィーダー層上で長時間、高密度で前記細胞を培養するステップと
を含む方法が提供される。
【０１２４】
本発明の別の実施態様において、インビトロにおいて幹細胞の前駆細胞への体細胞分化を誘発する方法であって、
未分化幹細胞を入手するステップと、
分化を誘発するために無血清培地に前記細胞を移すステップと
を含む方法が提供される。
【０１２５】
幹細胞は未分化幹細胞であってもよく、生存可能な未分化幹細胞を提供する任意の供給源または方法から誘導されてもよい。胚から幹細胞を回収する上記の方法が最も好ましい。
【０１２６】
これらの好ましい態様において、線維芽細胞フィーダー層上で高密度に細胞を培養する条件または無血清培地に移す条件は、幹細胞再生に非許容的であるか、または胚体外系統への一方向分化を生ずることが意図されている。
【０１２７】
一般に、線維芽細胞フィーダー層の存在はこれらの細胞を未分化状態に維持する。これは、マウスおよびヒトＥＳ細胞の培養にあてはまることが見出されている。しかし、理論に結びつけるのではないが、線維芽細胞フィーダー層の種類および取り扱いが細胞を未分化状態に維持する、または幹細胞の分化を誘発するために重要であることがここで明らかになった。
【０１２８】
好適な線維芽細胞フィーダー層は上記のようである。
【０１２９】
ＥＳ細胞系統のインビトロにおける体細胞分化は、継代培養後の培養期間、培養物の密度および線維芽細胞フィーダー層の関数である。体細胞分化は、フィーダー層に直接接触する部分から離れた領域（継代培養後早期経過時に、コロニー辺縁部などの、迅速な幹細胞増殖が生じているフィーダー層に隣接する領域とは対照的である）または集密に到達した培養物において、継代培養後最初の週にはもう検出することができ、形態的に明らかであり、上記の継代培養後約１４日目に、免疫化学によって証明可能であることが見出されている。マウス胚線維芽細胞を調製し、取り扱う方法、線維芽細胞が誘導されるマウス株および特定のバッチの品質に応じて、幹細胞再生、胚体外分化または体細胞分化を促進することができる。
【０１３０】
好適な線維芽細胞系統が選択されたら、１つの体細胞系統または多数の体細胞系統に分化するように未分化幹細胞を誘導するための分化誘導性線維芽細胞フィーダー層として使用することができる。これらは、上記のマーカーまたは遺伝子発現を使用して同定することができる。好ましくは、線維芽細胞フィーダー層は胚体外分化および細胞死を誘発しない。
【０１３１】
線維芽細胞フィーダー層の適当な使用および培養条件の操作によって幹細胞増殖を調節することは、体細胞分化が、広範な細胞死または胚体外分化を誘発することなく、幹細胞再生の限界に伴ってインビトロにおいて誘発できる一例となる。
【０１３２】
種々の組成の無血清培地中での培養などの培養条件の他の操作は、幹細胞死または一方向性の胚体外分化を生ずることなく幹細胞再生を停止するために使用することができる。
【０１３３】
分化は、ヒト発生の着床後期を模倣する構造を作製するように、単層状態で、または半透過性膜上で高密度まで培養することによってまたはこの方法の任意の改良法によっても誘導することができる。脊椎動物の胚（例えば、内胚葉細胞または正常な胚もしくは悪性腫瘍組織由来の細胞）または成体組織（例えば、骨髄間質調製物）において増殖および分化を調節することが知られているものを代表する細胞種の存在下における培養も、特定の細胞系統の樹立を促進するように、特定の細胞系統内の細胞の分化を誘発し、分化を調節し、または成熟化を誘発することができる。
【０１３４】
化学的な分化を使用して分化を誘発することもできる。骨形態形成タンパク質−２またはこのような因子のアンタゴニストなどの脊椎動物の胚細胞の分化を調節することが知られている可溶性因子または膜結合因子の存在下における分化を使用することができる。
【０１３５】
出願人らは、Ｏｃｔ−４は幹細胞内で発現され、分化中ダウンレギュレーションされていることを見出し、これはＯｃｔ−４プロモーターによって駆動される薬物耐性遺伝子を使用した幹細胞選択が、ヒトＥＳ細胞を操作する有用な方法であることを強力に示している。増殖因子を使用した指向的分化または増殖因子増強を組み合わせた系統選択の補助的方法により、上記のように作製した自発的に分化中の細胞から純粋な委任前駆細胞集団を選択することができる。
【０１３６】
幹細胞の遺伝的改変または上記の遺伝的に改変した幹細胞のさらなる改変を使用して、分化の誘発を制御することができる。特定の細胞系統においてのみ発現されるプロモーターの制御下において選択マーカーを含有する構築物を導入するように幹細胞を遺伝的に改変し、次に細胞を上記のように処理し、その後プロモーターが活性である細胞を選択することを使用することができる。
【０１３７】
細胞が分化するように誘導されたら、上記の手段によって同定される種々の細胞種を分離し、選択的に培養することができる。好ましくは、神経前駆細胞を選択する。これらの前駆細胞はニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化することができる。さらに好ましくは、それらは、胚体外分化系統由来のものなどの他の分化細胞が存在しない場合には、ニューロン細胞および／またはグリア細胞に分化する。
【０１３８】
選択的な培養は、好ましくは幹細胞増殖およびその後のこれらの特定の系統の増殖に望ましくない条件下において出現する混合集団から特定の系統の前駆細胞または成熟分化細胞を単離することを意味する。選択的な培養は、成熟細胞集団または系統特異的な委任前駆細胞集団を単離するためにも使用することができる。単離は、以下を単独または併用して使用することを含む、細胞生物学における種々の技法によって実施することができる。微小切開、特定の系統の分化細胞によって発現されるエピトープに対する抗体で標識することによって免疫学的に選択し、その後蛍光顕微鏡下で単離する方法、パニング、免疫磁気的選択またはフローサイトメトリーによる選択；特定の増殖因子もしくは細胞外基質因子への暴露などの特定の細胞系統の増殖もしくは接着または選択的細胞−細胞接着を促進する選択的条件；密度などの細胞の生物物理学的特性に基づいた分離；細胞の混合集団の分離、次に、細胞の小集団または単一細胞の別個の培養容器への単離および培養並びに形態、マーカータンパク質の分泌、抗原発現、増殖特性または遺伝子発現に基づいた選択；選択マーカーまたは他のリポーターを駆動する系統特異的なプロモーター構築物を使用した系統選択。
【０１３９】
ＥＳ細胞からの神経前駆細胞の誘導、さらに純粋な神経前駆細胞の樹立は上記原則の証明として以下に記載されている。以下の記載は、幹細胞から分化した体細胞として神経前駆細胞を例示しており、本発明の一般性を制限するものと考えられるべきではでない。本発明の方法は、血管芽細胞または造血幹細胞または神経前駆細胞などの中胚葉前駆細胞などであるが、これらに限定されない種々の体細胞前駆細胞の濃縮調製物を誘導するために使用することができることが注目されるべきである。
【０１４０】
胚性幹細胞からの神経前駆細胞の樹立、さらに好ましくは、神経前駆細胞の純粋な調製物の樹立、よりさらに好ましくは神経前駆細胞系統の樹立は、以下の方法のいずれか１つまたは組み合わせによって実施することができる。
【０１４１】
好ましい一方法において、ＥＳ細胞の体細胞分化は、胚体外細胞系統への一方向分化を防止し、体細胞分化を促進する適当な線維芽細胞フィーダー層上で高密度までのＥＳ細胞の長期培養によって誘発される。細胞が体細胞系統へ分化するように誘導されたら、主に神経前駆細胞集団を生じることが運命付けられている領域は、上記の特徴的な形態的特徴に基づいて同定することができる。これらの領域のサイズおよびサイズは、増殖培地を、ＥＧＦとｂＦＧＦを補給した無血清培地と交換することによって増大させることができる。領域は機械的に分離され、無血清培地で再度培養されると、球形の構造物を形成する。
【０１４２】
任意の無血清培地を使用することができる。好ましくは、ＮＳ−Ａ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。さらに好ましくは、Ｎ２またはＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＮＳ−ＡまたはＤＭＥＭ／Ｆ−１２を使用する。最も好ましくは、Ｂ２７を補給したＤＭＥＭ／Ｆ−１２を使用する。
【０１４３】
ＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦなどであるが、これらに限定されない増殖因子が無血清培地に適当に補給された状態で、神経前駆細胞を培養し、細胞系統を樹立するように増殖することができる。増殖因子は前駆細胞のさらなる分化を阻止し、増殖を促進する。
【０１４４】
無血清培地および好ましくは増殖因子中での培養は選択的であるので、培養物中に共存することがある胚体外細胞系統または十分に発達した内胚葉の子孫などの他の種類の分化細胞の長期増殖を制限する。従って、これらの選択的な条件における培養を使用して、神経前駆細胞の濃縮細胞系統を樹立することができる。
【 ０１４５】
前駆細胞は球形として、または単層状態で培養することができる。継代培養は機械的に実施することができる。削り取りは単層培養物を増殖するのに好ましい。しかし、粉砕または切断などの任意の機械的方法を使用して、球形物を継代培養するために使用することができる。最も好ましくは、球形物をより小さい集団にスライスする。前駆細胞は増殖して大多数の細胞を形成することができる。
【０１４６】
別の好ましい方法において、本発明の方法は、一方では、この場合では神経細胞系統である望ましい体細胞系統に分化させ、他方では選択的であるので、望ましくない系統（胚体外細胞系統または内胚葉など）への分化およびこれらの系統由来の分化細胞の生存を制限する培養条件に未分化幹細胞を移すステップに関係する。このような培養条件は、ｂＦＧＦおよびＥＧＦを含むが、これらに限定されない増殖因子を補給してもよい（上記の）無血清培地に移すことを含む。無血清培地は神経外胚葉系統（および、おそらく、中胚葉などの他の非神経系統）への分化を促進する。無血清培地は、胚体外細胞または内胚葉系統由来のものなどの望ましくない細胞の増殖および生存を制限することができる。
【０１４７】
本発明のさらに別の好ましい実施態様において、本発明は、望ましい系統からの純粋な前駆細胞系統の樹立を可能にする。
【０１４８】
培地に添加される増殖因子は、神経前駆細胞などの望ましい体細胞前駆細胞の増殖および培養を促進することができる。選択的な培養条件は、培養中に、胚体外細胞系統などの他の系統由来の望ましくない分化細胞をさらに排除する。本発明の方法を使用して、血液芽細胞または造血幹細胞などの神経前駆細胞および中胚葉前駆細胞を含むが、これらに限定されない種々の体細胞前駆細胞の純粋な調製物および／または純粋な細胞系統を誘導することができる。
【０１４９】
好ましくは、神経前駆細胞の濃縮細胞系統を誘導する際に、未分化幹細胞群を、無血清培地を含有するプラスチック製の組織培養皿に移すことができる。無血清培地は、最初にＥＳ細胞の外胚葉への分化を誘発し、次いで神経外胚葉系統への分化を誘発する。
【０１５０】
任意の無血清培地を使用することができる。好ましくは、ＮＳ−Ａ培地（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２を使用する。さらに好ましくは、無血清培地にＮ２またはＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）を補給する。さらに好ましくは、培地は、Ｂ２７を補給したＤＭＥＭ／Ｆ−１２である。未分化幹細胞群は、移した後約２４時間以内に球形になる（図９）。
【０１５１】
神経前駆細胞の未分化状態での増殖を促進するために、無血清培地にさらに塩基性ＦＧＦおよびＥＧＦを補給することができる。前駆細胞はこのような条件下において長期培養することができる。無血清培地および増殖因子によって誘発される選択的な条件により、培養中に他の分化細胞種が徐々に精製され、排除される。
【０１５２】
前駆細胞は球形または単層として培養することができる。継代培養は機械的に実施することができる。削り取りは、単層培養物を増殖するのに好ましい。粉砕または切断などの当業者に周知の任意の機械的方法を使用して球形物を継代培養することができる。最も好ましくは、球形物をより小さい集団にスライスする。前駆細胞を増殖して大多数の細胞を作製することができる。
【０１５３】
未分化幹細胞から直接作製される前駆細胞は、分化中の幹細胞コロニーから作製される神経前駆細胞に類似した特性を有する。それらは、ポリシアリル化ＮＣＡＭ、中間径フィラメントタンパク質ネスチン、ビメンチンおよび転写因子Ｐａｘ−６などの、原始的な神経外胚葉および神経前駆細胞の同じマーカーを発現する。それらは転写因子ｏｃｔ−４を発現しない。それらは同様の増殖能力を有する。それらは、適当な基材上で培養し、増殖因子を除去すると、同様の形態とマーカー発現を有する分化神経細胞を作製する。
【０１５４】
本発明の別の態様において、胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞から体細胞を誘導する方法であって、
胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞を入手するステップと、
接着性基材上で前駆細胞を培養するステップと、
体細胞分化を促進する条件下において体細胞に分化するように細胞を誘導するステップと
を含む方法が提供される。
【０１５５】
胚性幹細胞由来の前駆細胞源は任意の供給源由来であってもよい。しかし、それらは、好ましくは、上記の方法によって樹立される。好ましくは、細胞は無血清培地および増殖因子が存在する条件下において増殖される。
【０１５６】
体細胞は、好ましくは、ニューロンまたは星状細胞もしくは稀突起膠細胞前駆細胞を含むグリア前駆細胞であってもよい。好ましくは、体細胞前駆細胞は神経前駆細胞である。
【０１５７】
任意の接着性基材を使用することができる。さらに好ましくは、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンまたはポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチンを使用する。
【０１５８】
体細胞の誘導は、好ましくは、培地から増殖因子を除去することによって実施される。しかし、許容されうる他の誘導方法を使用することができる。これらは、
分化を誘発するために、未分化細胞を長時間、高密度で培養するステップと、
無血清培地において細胞を培養するステップと、
胚体外分化および細胞死を誘発しない、分化誘導性線維芽細胞フィーダー層上で細胞を培養するステップと、
ヒト発生の着床後期に類似した構造を形成するように、単層状態または半透過性膜上で高密度に培養するステップと、
骨形成タンパク質−２またはそのアンタゴニストを含む群から選択される化学的分化因子の存在下において培養するステップと
を含んでもよい。
【０１５９】
ニューロンを誘導するためには、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンをさらに使用することが好ましい。
【０１６０】
ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンなどの適当な基材上で神経前駆細胞を培養し、無血清培地から増殖因子を除去すると、分化細胞は球形から単層として増殖し、成熟ニューロンの形態と、１６０ｋｄの神経フィラメントタンパク質、Ｍａｐ−２ＡＢ、シナプトフィジン、グルタメート、チロシンヒドロキシラーゼ、成熟ニューロンに特徴的であるＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＢＡ  Ａα２）に特徴的な受容体サブユニットなどのマーカー発現を獲得する。
【０１６１】
好ましい実施態様において、ニューロンを誘導する方法は、体細胞前駆細胞、好ましくは未分化神経前駆細胞または分化中の神経前駆細胞をレチノイン酸の存在下において培養するステップさらに含む。
【０１６２】
レチノイン酸は、成熟ニューロンへの分化をさらに誘発することが見出されている。
【０１６３】
稀突起膠細胞および星状細胞の樹立は、神経前駆細胞がグリア細胞系統に分化することができることを示す。
【０１６４】
星状細胞および稀突起膠細胞前駆細胞を含むグリア細胞を誘導するためには、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチンを使用することが好ましい。フィブロネクチンは、グリア細胞系統への分化を誘導するのにラミニンより有意に強力である。
【０１６５】
好ましい実施態様において、グリア細胞を誘導する方法は、体細胞前駆細胞、好ましくは未分化神経前駆細胞をＰＤＧＦ−ＡＡおよび塩基性ＦＧＦの存在下において培養するステップをさらに含む。
【０１６６】
さらに別の好ましい実施態様において、グリア細胞を誘導する方法は、体細胞前駆細胞、好ましくは未分化神経前駆細胞をＴ３の存在下において培養するステップをさらに含む。次いで、増殖因子が存在しない条件下において細胞を増殖することができる。
【０１６７】
グリア細胞は星状細胞または稀突起膠細胞から選択されてもよい。
【０１６８】
ｂ−ＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡを補給した無血清培地での培養は、神経前駆細胞をグリア前駆細胞に移行させ、グリア前駆細胞の増殖を誘発することができる。この次に、前駆細胞をポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で培養し、さらに増殖因子およびＴ３の存在下において培養し、次に増殖因子を補給しないＴ３の存在下において培養する。理論に結びつけるわけではないが、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡなどの増殖因子はグリア前駆細胞の増殖および拡大を促進し、フィブロネクチンはグリア細胞系統への分化をさらに誘発し、Ｔ３は稀突起膠細胞系統への分化を誘発することが仮定されている。
【０１６９】
別の態様において、星状細胞および稀突起膠細胞を含むグリア細胞への分化は、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で神経前駆細胞を培養し、ＥＧＦ、ｂ−ＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡを補給した無血清培地でそれらを培養することによって誘発される。次いで、増殖因子を除去し、Ｔ３の存在下において細胞をさらに培養する。
【０１７０】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製される神経細胞、神経前駆細胞、神経および／またはグリア細胞を含む分化体細胞を提供する。グリア細胞は星状細胞または稀突起膠細胞を含む。
【０１７１】
上記の方法によって誘導される前駆細胞を使用して、他の系統から分化細胞を作製することができる。球形の前駆細胞は、神経前駆細胞以外に、さらに、原始的な外胚葉細胞または血液芽細胞もしくは造血幹細胞などの他の系統の前駆細胞などの原始的な細胞を含んでもよい。培養条件を操作することによって、これらの原始的な細胞は全ての体細胞種を形成することができる。
【０１７２】
ｆｌｋ−１およびＣＤ−３４などの中胚葉マーカーの発現が、ヒトＥＳ由来の前駆細胞調製物中で証明されている。これは、血液芽細胞または造血幹細胞などの中胚葉の原始的な細胞の存在を示している。または、球形物内の原始的な神経前駆細胞がこれらの中胚葉マーカーを発現する場合もある。マーカーの発現は、神経前駆細胞が中胚葉細胞に分化転換する高い柔軟性を持っている可能性のあることを示している。
【０１７３】
本発明は、インビトロおよびインビボにおける神経系統へのＥＳ細胞の制御された分化モデルを作製する方法を提供している。このモデルおよび神経分化経路によって作製される細胞は、ヒト神経発生の細胞生物学および分子生物学を研究するため、神経の分化および再生に役割を果たす遺伝子、増殖因子および分化因子を発見するために使用することができる。このモデルおよび神経分化経路によって作製される細胞は、薬物発見並びに催奇形性、毒性および神経保護作用についてのスクリーニングアッセイの開発に使用することができる。
【０１７４】
本発明のさらに別の態様において、大量の分化細胞および未分化細胞を作製する方法が提供される。これらの細胞は細胞培養物中において増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ）、拡大および増殖（ｇｒｏｗｎ）することができることが意図されている。
【０１７５】
さらに別の態様において、本発明は、
本明細書に記載する未分化ヒト胚性幹細胞を入手するステップと、
本明細書に記載する方法によって、神経前駆細胞への胚性幹細胞の体細胞分化を誘発するステップと、
ポリシアリル化Ｎ−ＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンなどの中間径フィラメントタンパク質ならびに転写因子Ｐａｘ−６などの原始的な神経外胚葉および神経幹細胞の発現マーカーによって神経前駆細胞を同定するステップと、
増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を促進するように、神経前駆細胞を培養するステップと
を含むヒトＥＳ由来神経前駆細胞の濃縮調製物を作製する方法を提供する。
【０１７６】
神経前駆細胞は、好ましくは無血清培地において球形または単層として増殖する。好適な培地は、Ｂ２７、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む群から選択される増殖因子を補給したＤＭＥＭ／Ｆ−１２である。
【０１７７】
さらに、調製物の濃縮は、細胞群を新たな培地に移すステップを含む、新たな培地中でさらに培養することによって実施することができる。
【０１７８】
本発明のさらに別の態様において、球形物を単一の細胞懸濁液に分離する方法が提供される。トリプシンまたはディスパーゼによる消化を使用する分離は無効である場合がある。分離は、パパインを機械的粉砕と併用して消化することによって実施することができる。
【０１７９】
本発明の別の態様において、ＥＳ由来の神経前駆細胞の球形物を移植する方法であって、
球形物を分離させるステップと、
生存している宿主に分離させた球形物を注射するステップと
を含む方法が提供される。
【０１８０】
球形物の分離は、細胞を小さい群または単一の細胞に分離するいかなる方法で実施されてもよい。理想的には、チロシンまたはディスパーゼを使用しない。注射前に、機械的な分離または粉砕を使用して細胞を分離することができる。または、パパインを好ましくは機械的粉砕と組み合わせて消化することによって球形物を分離することができる。
【０１８１】
注射は、宿主の神経系に細胞を導入するようにいかなる方法で実施されてもよい。好ましくは、細胞は、神経系の特定の部位に導入される。任意の方法を使用して特定の位置に細胞を導入することができる。好ましくは、マイクロインジェクター（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，  Ｊａｐａｎ）にマイクロガラスピペット（外径３００ミクロン）を接続したものを使用して細胞を注射する。ガラスピペットは、宿主の神経系への穿通深さを制限するプラスチックスリーブで覆ってもよい。細胞は、定位装置を使用して、ハミルトンシリンジによって所定の深さに注射してもよい。いかなる定位注射方法でも好適である場合がある。
【０１８２】
注射する容量および移植溶液中の細胞濃度は、移植の適応症、神経系の位置および宿主の種に依存する。好ましくは、１マイクロリッターあたり２５，０００〜５０，０００細胞のもの２マイクロリッターを、出産直後のラットまたはマウスの側脳室に注射する。
【０１８３】
本発明の別の態様において、宿主の神経系に移植して、安定な移植片を樹立し、生存している宿主の組織形成に貢献することができる神経前駆細胞が提供される。
【０１８４】
本発明の別の態様において、胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞からインビボにおいて体細胞を誘導する方法であって、
好ましくは、本明細書に記載する方法によって作製される胚性幹細胞由来の体細胞前駆細胞源を入手するステップと、
体細胞前駆細胞を宿主に移植して、体細胞への分化を誘発するステップと
を含む方法が提供される。
【０１８５】
移植は、本明細書に記載する方法のいずれによって実施されてもよい。
【０１８６】
発生中の神経系に移植する場合には、前駆細胞は正常な発生過程に関与し、宿主の発生刺激に応答する。移植された前駆細胞は樹立されている移動経路によって移動し、神経系の散在した領域に広く広がり、宿主の発生プログラムに応じて神経系統およびグリア細胞系統の子孫に時間的および領域的に適当な方法で分化する。移植された神経前駆細胞は、宿主の神経前駆細胞および分化細胞を破壊することなく混ざり合うことができる。移植された細胞は、欠損している特定の神経またはグリア細胞集団と代わり、欠損している機能を回復することができ、広範な領域において異種遺伝子を発現することができる。
【０１８７】
本発明のさらに別の態様において、ＥＳ由来の神経前駆細胞または分化した子孫を発生後の神経系に移植することができる。それらは安定な移植片を形成し、宿主神経系内に移動し、宿主の神経前駆細胞および分化した細胞と混ざり合い、相互作用することができる。それらは、欠損している特定の神経またはグリア細胞集団と代わり、欠損している機能を回復し、宿主神経系の再生および治癒過程を活性化することができる。本発明のよりさらに別の態様において、移植された細胞は、宿主の神経系において異種遺伝子を発現することができる。
【０１８８】
好ましくは、安定な移植片は、中枢神経系または抹消神経系において樹立された移植片である。
【０１８９】
本発明のさらに別の態様において、前駆細胞は、分化転換して、安定な機能的移植片を形成する造血系などで、これらに限定されない他の器官に移植される。
【０１９０】
さらに好ましくは、球形物は、生存している宿主に移植されるＥＳ細胞由来のヒト神経前駆細胞球形物である。
【０１９１】
本発明のさらに別の態様において、神経変性生理食塩液疾患、血管状態、自己免疫性疾患、先天性疾患、外傷等を含むが、これらに限定されない種々の異常な状態に細胞治療を使用することができる神経前駆細胞、神経細胞および／またはグリア細胞が提供される。
【０１９２】
本発明のさらに別の態様において、遺伝子治療に使用することができる神経前駆細胞、神経細胞および／またはグリア細胞が提供される。遺伝的に操作された神経前駆細胞または神経細胞またはグリア細胞は、ベクターとして移植後、標的器官に望ましい遺伝子を搬送し、発現するために使用することができる。
【０１９３】
本発明の別の態様において、委任前駆細胞系統が提供される。前駆細胞系統は、多量の前駆細胞、神経前駆細胞、神経細胞、成熟神経細胞およびグリア細胞を作製するために増殖させることができる。
【０１９４】
本発明の別の態様において、１つまたは少数の体細胞系統に自己再生または分化することができる委任神経前駆細胞および本発明の方法によって作製される成熟分化細胞が提供される。
【０１９５】
委任前駆細胞の増殖は、ＥＳ細胞から誘導することができる前駆細胞の数が少数のとき、有用となりうる。このような場合、前駆細胞の増殖は、移植治療のための十分な細胞を作製する、遺伝子発見研究のための十分なＲＮＡを作製する等などの種々の用途のために有用となりうる。例えば、上記の技法を使用することによって、１０継代につき１０個の球形物からの前駆細胞の増殖は５０×１０６細胞を作製することができ、いかなる用途にも十分であると思われる。
【０１９６】
神経系統の細胞を観察すると、記載の技法を使用することによって、委任前駆細胞が胚性幹細胞培養物から単離され、増殖され、拡大され、濃縮され、十分に分化した細胞を作製するようにさらに誘導される原則が樹立される。
【０１９７】
本発明のさらに別の態様において、多量の分化細胞および未分化細胞を作製する方法が提供される。
【０１９８】
別の態様において、長期培養して、多量の前駆細胞および十分に分化した細胞を生じることができる分化した委任前駆細胞系統が提供される。
【０１９９】
上記の方法によって誘導される神経前駆細胞または他の委任前駆細胞を使用して、分化転換によって他の系統から分化した細胞を作製することができる。
【０２００】
別の態様において、成熟ニューロンおよび／またはグリア細胞に分化することができる分化した委任前駆細胞系統が提供される。好ましくは、前駆細胞は神経前駆細胞である。
【０２０１】
別の態様において、本発明の方法によって作製される神経前駆細胞に分化することができる未分化細胞系統が提供される。
【０２０２】
特定の細胞系統ＨＥＳ−１およびＨＥＳ−２を上記の手法によって単離したところ、上記の特性を有している。
【０２０３】
本発明の別の態様において、好ましくは本発明の方法によって作製される神経前駆細胞に分化することができるヒト分化細胞または未分化細胞と担体を含む細胞組成物が提供される。
【０２０４】
担体は、細胞を維持する製薬学的に許容されうる任意の担体であってもよい。担体はＰＢＳまたはＥＳ培地であってもよい。
【０２０５】
分化細胞または未分化細胞は、生物材料の保存に好適な任意の方法によって保存または管理されてもよい。生物材料のガラス化は、従来の低速冷凍法より好ましい方法である。
【０２０６】
ＥＳ細胞の効果的な保存は、先々何度も使用するために細胞の長期保存を可能にするので、かなり重要である。従来の低速凍結方法は、通常細胞系統の凍結保存に使用されているが、未分化細胞または分化細胞を凍結保存するために使用することができるが、生存しているヒト未分化ＥＳ細胞のこのような方法による回収効率は極めて低い。ＥＳ細胞系統は、多分化能細胞が胚盤胞から誘導され、培養中胚の特性を保持するので、他の細胞系統とは異なる。従って、胚に効率的である方法を使用した凍結保存が最も適当である。胚の凍結保存に効率的ないかなる方法を使用することができる。好ましくは、ガラス化方法を使用する。さらに好ましくは、Ｖａｊｔａ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，５１，  ５３−５８によって以前に記載されたＯｐｅｎ  Ｐｕｌｌｅｄ  Ｓｔｒａｗ（ＯＰＳ）ガラス化方法が、未分化細胞を凍結保存するために使用される。さらに好ましくは、Ｖａｊｔａ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９，３８９−３９２によって記載されている方法を使用する。一般に、この方法は、胚を凍結保存するためだけに使用されている。
【０２０７】
委任前駆細胞系統は、従来の低速冷却方法を使用して凍結保存から効率的に回収されている。
【０２０８】
増殖因子、分化因子または組織再生を制御する因子を含むが、これらに限定されない新規遺伝産物を単離および同定する起源として分化細胞または未分化細胞を使用しても、または新規エピトープに対する抗体を形成するために使用してもよい。細胞系統はまた、先天性疾患を診断、予防または治療する手段を開発するために使用することもできる。
【０２０９】
最近、生物学および医学における幹細胞の可能な用途に多大な関心が寄せられている。多分化能性および不死性の特徴はＥＳ細胞に独自であり、それによって、研究者達は、ヒト生物学および医学の多くの問題に始めて着手できる。ＥＳ細胞は、特に、別の培養系が、必要な委任幹細胞の増殖を支持できない場合には、おそらく移植手法に使用するドナー組織の欠点に対処することができる。ＥＳ細胞には、ヒト医学、発生学的研究、機能的ゲノム工学、新規増殖因子の同定および薬物発見および毒性学などの分野において多数の他の達成されていない用途がある。
【０２１０】
成体または胚ＣＮＳから誘導される神経幹細胞の可能な用途は多数あるが、ＥＳ細胞培養物から誘導される神経前駆細胞に実際の利点がある場合がある。
【０２１１】
体細胞核移植により患者自身の組織から誘導されるＥＳ細胞系統は、レシピエント自身の組織に正確に適合し、従って移植により好適である神経前駆体を作製すると思われる。
【０２１２】
さらに、ＣＮＳのある種の疾患の特定の遺伝的素因を有する個人からＥＳ細胞を生じるために使用される核移植は、疾患の病因モデルをインビトロにおいて作製する強力なツールとなる。
【０２１３】
ＥＳ細胞培養物から作製される神経前駆体は、胎児または成体ＣＮＳ由来の委任前駆細胞より増殖または発生力が大きいことが証明されている。
【０２１４】
成体ＣＮＳ内には広大な数の細胞種があり、ＥＳ細胞はマウスにおいてこれらのいずれかを生ずることができることが明らかであるが、神経幹細胞がそうできるかどうかはあきらかではない。
【０２１５】
ＥＳ由来の神経前駆細胞は、神経発生過程の早期段階の研究を可能にし、それによって組織再生を増強する新規因子を発見する重要な手がかりまたは損傷組織と代わりやすいと思われる新規幹細胞中間体を提供する。
【０２１６】
ＥＳ細胞における相同組換えの頻度は神経幹細胞よりはるかに高く、従ってインビトロにおいて疾患モデルを作製するためまたは種々の遺伝子治療のために、ヒト神経組織に標的遺伝子改変を導入する唯一の実用的な経路は、遺伝的に改変された胚性幹細胞からの神経前駆細胞の再現可能な再生および単離にあるだろう。
【０２１７】
本発明は、本明細書において、以下の実施例を参照にしてより詳細に記載される。しかし、以下の記載は例示的にすぎず、上記の発明の一般的に制限を加えるものといかなる形でも考えられるべきではないことが理解されるべきである。
【０２１８】
［文献］
【表１−１】
2004500103.tif 000002
【表１−２】
2004500103.tif 000003
【表１−３】
2004500103.tif 000004
【０２１９】
［実験プロトコール］
１．　ＥＳ細胞の誘導と増殖
受精卵母細胞は、標準的な非共培養系（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｒｅｅ）プロトコールにより、連続培地（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉａ）において胚盤胞期（受精後６日）まで培養した（Ｆｏｎｇ．Ｃ．Ｙ．，ａｎｄ　Ｂｏｍｇｓｏ　Ａ．　共培養系および非共培養系の直接培地におけるヒト胞胚形成率と総細胞数の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｌａｓｔｕｌａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｃｅｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉａ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ．）　Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１４，７７４−７８１（１９９９））。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）による透明帯消化後（Ｆｏｎｇ　Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．　無透明帯胚盤胞導入後の妊娠の進行：ヒトへの胚導入の適応例（Ｏｎｇｏｉｎｇ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ　ｚｏｎａ−ｆｒｅｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｅｍｂｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ．）　Ｈｕｍ．　Ｒｅｐｒｏｄ．１２，５５７−５６０（１９９７））、抗ヒト血清抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用し、次にモルモット補体（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）に暴露して、免疫手術によってＩＣＭを単離した（Ｓｏｌｔｅｒ　Ｄ．，　ａｎｄ　Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｂ．マウス胚盤胞の免疫手術（Ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ．）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，５０９９−５１０２（１９７５））。次いで、ゼラチンをコートした組織培養皿においてマイトマイシンＣ有糸分裂阻害マウス胚線維芽細胞フィーダー層（７５，０００　細胞／ｃｍ２）上でＩＣＭを培養した。培地は、２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸、２ｍＭ　グルタミン、５０ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０（ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補完したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ピルビン酸ナトリウムを含有せず、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを含有する）であった。単離およびＥＳ細胞培養の早期段階において、２０００ｕ／ｍｌのヒト組換え白血病細胞増殖抑制因子ｈＬＩＦ（Ａｍｒａｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を補給した。最初の培養から６〜８日後に、分化した細胞増殖物からマイクロピペットで機械的にＩＣＭ様の集団を取り出し、新鮮なフィーダー層上で再度培養した。得られたコロニーを、約７日ごとに、マウスフィーダー層上で約１００個の幹細胞様細胞集団ずつさらに増殖させた。細胞集団は機械的に分離するか、または機械的にスライスし、次にディスパーゼ（１００ｍｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に暴露する組み合わせ方法で分離した。
【０２２０】
（ａ）胚培養
受精後、胚は、ＩＶＦ−５０培地（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２培地）で事前に平衡させた滅菌鉱物油を重層して液滴状態で培養した。
【０２２１】
３日目にＩＶＦ−５０とＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２培地（Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２培地）の１：１混合物を使用した。
【０２２２】
培養４日目以降は、分割期胚を胚盤胞に増殖させるために、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２培地だけを使用した。
【０２２３】
（ｂ）透明帯消化
透明帯消化は、６日目の胚盤胞拡張期に実施した。
【０２２４】
消化溶液は、Ｐｒｏｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，ＴＳ　ｔｅｓｔｅｄ）１０ｕをＰＢＳおよびＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２の培地（１：１）に加えた。
【０２２５】
胚はプロナーゼ溶液中で１〜１．５分間インキュベーションし、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ２培地で洗浄し、３０分間インキュベーションした。透明帯が完全に溶解していない場合には、胚をプロナーゼ溶液中で１５秒間さらにインキュベーションした。
【０２２６】
（ｃ）ヒト幹細胞培養
ヒト幹細胞はＭＭＣ処理済みの線維芽細胞フィーダー層上で増殖させた。線維芽細胞はゼラチン処理した培養皿で培養した。ヒトおよびマウス由来の線維芽細胞の組み合わせは、それぞれ、約２５，０００および７０，０００細胞／ｃｍ２の密度で使用した。線維芽細胞は、幹細胞を培養する４８時間前までに培養した。マウス線維芽細胞だけでも幹細胞の増殖を支持することができた。しかし、ヒト線維芽細胞も幹細胞を支持できるが、それらは凹凸があり、安定でないフィーダー層を形成した。従って、ヒト線維芽細胞をマウス線維芽細胞と組み合わせて、増殖のより良い支持および分化の防止を増強し、達成した。
【０２２７】
ヒト幹細胞の増殖に使用した培地は、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ）、（−メルカプトエタノール−０．１ｍＭ）（ＧＩＢＣＯ）、非必須アミノ酸−ＮＥＡＡ　１％（ＧＩＢＣＯ）、グルタミン　２ｎＭ（ＧＩＢＣＯ）およびペニシリン５０μ／ｍｌおよびストレプトマイシン５０（ｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を補給したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ピルビン酸ナトリウムを含有せず、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを含有する）である。幹細胞の最初の単離時に、培地にｈＬＩＦ２０００ｕ／ｍｌを補給した。後に、ＬＩＦは必要ないことが示された。
【０２２８】
（ｄ）ヒト幹細胞増殖
培養後、単離したＩＣＭを接着させ、６日間培養した。この時点において、分化した細胞の上面に幹細胞群を含むコロニーが発生した。Ｃａ／Ｍｇ不含ＰＢＳ培地を使用してマイクロピペットで機械的にＩＣＭ群を単離し、取り出して、細胞−細胞接着を低下させた。
【０２２９】
単離した群を新鮮なヒト／マウス線維芽細胞フィーダー層上で再度培養した。２週間の培養後、原始的な多分化能幹細胞の特徴的な形態を有するコロニーが発生した。幹細胞を２つの方法のうち一方でさらに増殖した。両方の方法において、未分化であると思われる細胞を５〜７日ごとに約１００細胞群ずつ増殖させた。
【０２３０】
第一の方法において、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ培地を使用して、細胞−細胞接着を低下させた。約１５〜２０分後、細胞は徐々に分離し始め、望ましいサイズの群を単離することができる。細胞の分離が部分的である場合には、ピペットの鋭い先端を使用した機械的分離で細胞群の切断と分離を助けた。
【０２３１】
別の方法は、コロニーを機械的に切断し、次にディスパーゼによってサブコロニーを単離する組み合わせ使用によって実施した。コロニーの切断は、ＣａおよびＭｇを含有するＰＢＳ中で実施した。マイクロピペットの鋭い先端を使用して、コロニーを約１００細胞の群に切断した。また、ピペットを使用して、コロニーの分離した領域を削り取り、取り出した。次いで、ＰＢＳを、ディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する事前に平衡させた通常のヒト幹細胞培地に変え、５〜１０分間インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。群が分離したら、広口マイクロピペットで取り、ＣａおよびＭｇを含有するＰＢＳで洗浄し、新鮮なフィーダー層に移した。
【０２３２】
（ｅ）ヒト幹細胞の凍結保存
ｏｐｅｎ  ｐｕｌｌｅｄ  ｓｔｒａｗ（ＯＰＳ）ガラス化方法（Ｖａｊｔａ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）に少し改良を加えたものを使用して、早期継代細胞を約１００細胞群ずつ凍結保存した。フレンチミニストロー（２５０μｌ、ＩＭＶ，Ｌ’Ａｉｇｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をホットプレート上で加熱軟化し、内径が元の直径の約半分になるまで手で引っ張った。藁を室温に冷却させ、次いでカミソリで最も細いところで切断した。麦をγ線照射（１５〜２５ｋ  Ｇｙ）によって滅菌した。２つのガラス化溶液（ＶＳ）を使用した。共に、２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を補給したＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、ピルビン酸ナトリウムを含有せず、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを含有する）を含有するＤＭＥＭを含む維持培地にもとづいていた。第１のＶＳ（ＶＳ１）は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ）および１０％エチレングリコール（ＥＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有した。第２のガラス化溶液（ＶＳ２）は２０％ＤＭＳＯ、２０％ＥＧおよび０．５Ｍスクロースを含有した。手法は全て３７℃に加熱しているステージ上で実施した。４〜６群のＥＳ細胞をまずＶＳ１で１分間インキュベーションし、次にＶＳ２で２５秒間インキュベーションした。次いで、それらを２０μｌ液滴のＶＳ２０で洗浄し、１〜２μｌ液滴のＶＳ２内においた。毛細管現象で群を液滴からストローの狭い方の端部からつめた。狭い方の端部を液体窒素に速やかに浸した。ストローを液体窒素中に保存した。先に記載したものにわずかに改良を加えて、融解も３７℃の加熱中のステージ上で実施した（Ｖａｊｔａ  ｅｔ  ａｌ  １９９８）。液体窒素から取り出してから３秒後、ストローの狭い方の端部を、０．２Ｍスクロースを補給したＨＭに漬けた。１分のインキュベーション後、群を、０．１Ｍスクロースを加えたＨＭ中でさらに５分間インキュベーションし、ＨＭ中でもう５分インキュベーションした。
【０２３３】
２．  幹細胞の特徴づけ
幹細胞表面マーカーＧＣＴＭ−２、ＴＲＡ１−６０およびＳＳＥＡ−１免疫蛍光により証明するためにコロニーを１００％エタノールで培養皿に固定し、ＳＳＥＡ−４には９０％アセトン固定を使用した。マーカーを検出するために使用したモノクローナル抗体の起源は以下のようであった：ＧＣＴＭ−２、本発明者らの実験室；ＴＲＡ１−６０、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄからの提供による；ＳＳＥＡ−１（ＭＣ−４８０）およびＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎ，Ｉｏｗａ，ＩＡ。抗体の局在化は、フルオレセインイソチオシアネート（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）に結合したウサギ抗マウス免疫グロブリンを使用して実施した。
【０２３４】
アルカリ性ホスファターゼ活性は、以前に記載されているように証明した（Ｂｕｅｈｒ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｃｌａｒｅｎ  Ａ．始原生殖細胞の単離および培養（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．）  Ｍｅｈｔｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５，５８−７６，（１９９３））。標準的なＧ−バンド技法を核型分析に使用した。
【０２３５】
３．  ｏｃｔ−４発現検討
ｏｃｔ−４の発現をモニターするために、主に幹細胞からなるコロニーまたは以下のように自発的な分化を受けたコロニーにＲＴ−ＰＣＲを実施した。製造業者の指示により細胞融解後、ｍＲＮＡを磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ａｓ，Ｏｓｌｏ）に単離し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、固相第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。ＰＣＲ反応は、鋳型として固相ｃＤＮＡおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）を使用して、ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）により実施した。ｏｃｔ−４転写物は、以下のプライマー：５’−ＣＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＣ（順方向）および３’−ＡＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＴＣ（逆方向）。ｍＲＮＡ品質の対照として、β−アクチン転写物を、同じＲＴ−ＰＣＲと、以下のプライマー：５’−ＣＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣＡＴ−３’（順方向）、５’−ＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣ−３’（逆方向）を使用してアッセイした。産物は１．５％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウム染色で可視化した。
【０２３６】
４．  インビトロにおける分化
コロニーは、有糸分裂阻害マウス胚線維芽細胞上で集密化まで（約３週間）培養し、さらに継代７週間までさらに培養した。培地は毎日交換した。アルファフェトプロテインおよびベータヒト繊毛性性腺刺激ホルモンレベルは、それぞれ、継代１７および６の時点においてＨＥＳ−１およびＨＥＳ−２によるコンディションド（ならし）培地中で測定した。４〜５週間の培養後、最後の培地交換の３６時間後に条件培地を回収し、それぞれ、特異的な免疫酵素定量アッセイ（Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｌｏ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）および蛍光定量酵素イムノアッセイ（Ｄａｄｅ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）によって測定した。これらの化合物は、フィーダー層だけによるコンディションド対照培地では検出されなかった。
【０２３７】
分化培養物は、系統特異的なマーカーを免疫蛍光検出するために、継代培養後６〜７週めに固定した（２６−ＨＥＳ−１および９−ＨＥＳ−２）。１００％エタノールでの固定後、特異的なモノクローナル抗体を使用して６８ｋＤａの神経フィラメントタンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｕ．Ｋ．）および神経細胞接着分子（Ｄａｋｏ）を検出した。筋特異的アクチンおよびデスミンも、メタノール／アセトン（１：１）による固定後、モノクローナル抗体（Ｄａｋｏ）によって検出した。抗体の局在化は上記のように実施した。
【０２３８】
５．  重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）における奇形癌腫形成
通常の継代培養時に、未分化形態を有する約２００細胞の群を上記のように回収し、４〜８週齢のＳＣＩＤマウス（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ製のＣＢ１７株，１０〜１５群／精巣）の精巣に注射した。６〜７週後、得られた腫瘍を中性の緩衝ホルマリン１０％に固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色後組織学的に調査した。
【０２３９】
６．  神経前駆細胞の誘導および培養
ヒトＥＳ細胞から神経前駆細胞を誘導するために、２つの方法を開発した。
（ａ）分化中のＥＳ細胞からの神経前駆細胞の誘導
未分化のＥＳ細胞のコロニーをマウス胚線維芽細胞上で２〜３週間継続して培養した。培地は毎日交換した。培養の第２週からみられ、さらに通常は第３週目に、堅く小さい分化ＥＳ細胞の領域が、位相差顕微鏡および立体顕微鏡によってコロニー中に同定できた。これらの領域は培養３週目には分画性がより明瞭になる傾向であった（図２６）。１週目の培養以降、血清含有培地を、上皮増殖因子２０ｎｇ／ｍｌ（ＥＧＦ，Ｇｉｂｃｏ）および塩基性線維芽細胞増殖因子２０ｎｇ／ｍｌ（ｂＦＧＦ，Ｇｉｂｃｏ）を補給し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｂ２７補給物（１：５０，Ｇｉｂｃｏ）、グルタミン  ２ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン  ５０ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン  ５０μｇ／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）からなる無血清培地と交換すると、これらの領域のサイズおよび分画性を増大させることができた。小型で堅くパックされた細胞の群をマイクロピペットによって機械的にこれらの領域から分離し、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および塩基性ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補給した無血清培地（上記）を含有するプラスチック製培養皿に移した。実験の一部では、培地にヘパリン５μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補給した。細胞集団は、移動から２４時間以内に小型の堅い細胞を含む丸い球形に変わった。球形物は約７〜２１日ごとに継代培養した。継代培養の時期は、球形物のサイズによって判定した。継代培養時の球形物の直径は、通常、０．５ｍｍ以上であった。各球形物は、２つの手術用カミソリ（サイズ２０）でサイズに応じて４つに切開し、最大径０．３〜０．５ｍｍの群を作製した。約３日ごとに培地の５０％を交換した。
【０２４０】
（ｂ）未分化ＥＳ細胞からの神経前駆体の誘導
未分化ＥＳ細胞のコロニーは、上記のようにマウス胚線維芽細胞上で増殖した。未分化ＥＳ細胞は７日ごとに約１５０〜２００細胞の群ずつ継代培養した。通常の継代培養時、約２００のＥＳ細胞群を、項目１で上記したものと同じ無血清培地を含有するプラスチック製の組織培養皿に移した。細胞集団は、移動から２４時間以内に丸い球形に変わった。上記のように、球形物を約７〜２１日ごとに継代培養した。約３日ごとに培地の５０％を交換した。
【０２４１】
（ｃ）増殖の特徴づけおよび球形物中の細胞数
前駆細胞の増殖は、各継代培養時に球形物の数の増加によって大まかに評価した。増殖は、２４個の球形物の容積の連続測定によってもモニターした。個々の球形物は２４ウェル培養皿で培養し（１ウェルあたり１個の球形物）、それらの径を７日ごとに評価した。容積は、球体の容積の式を使用して算出した。継代培養後７日目に測定したとき、６個の母球形物の各々の継代培養前の容積と１週間後の４つの娘球形物の容積の合計を比較することによって増殖を評価した。
【０２４２】
球形物あたりの細胞数と球形物の径との相関は、種々のサイズの球形物試料で評価した。各球形物は機械的に１つの細胞に分離するか、または酵素（パパイン、Ｗｏｒｔｉｎｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，  ＮＪ）消化と続く粉砕によって分離した。次いで（ｔｈａｎ）細胞を無血清培地に撹拌しながら再度懸濁し、計数した。細胞は、生存細胞率を測定するために、トリパンブルーでも染色した。
【０２４３】
（ｄ）球形物の凍結保存
前駆体の球形物を、事前に冷却した（４℃）０．５〜１ｍｌの凍結培地（９０％無血清培地（上記）および１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ））を入れた１．２ｍｌ凍結管（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｃ  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に移した。バイアルは凍結容器（Ｎａｌｇｅｇｅ，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｃ  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中で−８０℃まで徐々に冷却した（〜１℃／分）、液体窒素中で保存した。バイアルは、３７℃の水浴中で急速に融解した。凍結培地は１０ｍｌの無血清培地で徐々に希釈し、球形物を新鮮な無血清培地に移した。
【０２４４】
７．  球形物中の前駆細胞の特徴づけ
（ａ）免疫組織化学的検討
球形物は、ポリ−Ｄ−リジン（３０〜７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（Ｓｉｇｍａ）をコーティングしたスライドガラス上で培養し、４時間後に固定し、間接的免疫蛍光分析によって、Ｎ−ＣＡＭ（アセトン固定、Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ製のマウスモノクローナル抗体ＵＪ１３ａ）、ネスチン（４％パラホルムアルデヒド固定、ウサギ抗血清、Ｄｒ．Ｒｏｎ  ＭｃＫａｙの親切な提供による）およびビメンチン（メタノール固定、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，  ＮＳＷ）製のマウスモノクローナル抗体Ｖｉｍ３Ｂ４の発現について調査した。
【０２４５】
ポリシアリル化ＮＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンを発現した細胞集団を評価するために、少なくとも６週間培養した球形物を、カルシウムおよびマグネシウムを加えないＰＢＳ中で機械的粉砕または酵素的（パパイン、Ｗｏｒｔｉｎｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，  ＮＪ）消化と続く粉砕によって１細胞に分離した。次いで（ｔｈａｎ）細胞を、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンコーティングしたスライドガラス上で培養し、２４時間後に固定し、間接的免疫蛍光分析によって、Ｎ−ＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンの発現について調査した。１５０〜２００細胞を各マーカーについてスコア化し、スコア化を各マーカーについて２〜３回反復した。分化中のコロニーから誘導される３つの前駆細胞系統および未分化細胞から直接誘導される２つの系統を評価した。
【０２４６】
内胚葉マーカーの発現を調査するために、球形物を、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、５ｍｃｇ／ｍｋ）をコーティングしたスライドガラスで培養し、増殖因子を添加しないで４週間培養し、間接的免疫蛍光分析によって、低分子量（ＬＭＷ）サイトケラチン（４％パラホルムアルデヒド固定、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ製のマウスモノクローナル抗体）およびラミニン（４％パラホルムアルデヒド固定、マウスモノクローナル抗体、１：５００希釈、Ｓｉｇｍａ製）の発現について調査した。
【０２４７】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、球形物中のネスチンを使用して、転写因子Ｐａｘ−６、ｏｃｔ−４、ＣＤ−３４、ＦＬＫ−１、ＨＮＦ−３およびアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現を検討した。
【０２４８】
内胚葉マーカーＨＮＦ−３、ＡＦＰおよびトランスフェリンの発現は、ポリ−Ｄ−リジン（３０〜７０ｋＤａ）およびフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、５ｍｃｇ／ｍｋ）またはラミニン（Ｓｉｇｍａ）上で培養し、増殖因子を補給した同じ無血清培地で２週間培養し、次いで増殖因子補給を行わないで２週間培養した分化した球形物においても検討した。
【０２４９】
製造業者の指示により、細胞を溶解後、ｍＲＮＡを磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ａｓ，Ｏｓｌｏ）に単離し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して固相第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。
【０２５０】
または、商標ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０キット（Ｔｅｌ−Ｔｅｓ  Ｉｎｃ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔｘ）を使用して総ＲＮＡを単離し、製造業者の指示により、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。
【０２５１】
ＰＣＲ反応は、鋳型として固相ｃＤＮＡおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）を使用して、ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）により実施した。ｍＲＮＡ品質の対照として、β−アクチン転写物を、同じＲＴ−ＰＣＲを使用してアッセイした。ＰＣＲプライマーはＢｅｓａｔｅｃまたはＰａｃｉｆｉｃ  Ｐｌｉｇｏｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成した。以下のプライマーを使用した。
【０２５２】
【表２】
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【０２５３】
産物を１．５％または２％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウム染色で可視化した。
【０２５４】
（ｃ）神経分化検討
一般に、球形物を、適当な基材（ポリ−Ｄ−リジン、３０〜７０ｋＤａおよびラミニン、Ｓｉｇｍａ）上で増殖因子を添加しないで培養することによって分化を誘発した。
【０２５５】
最も普通には２つのプロトコールを使用した。第１のプロトコールでは、上記と同じ無血清培地において、増殖因子を添加しないで、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンをコーティングしたスライドガラス上で球形物を培養することによって、分化を誘発した。球形物中の細胞は２〜３週間増殖、分化させ、３〜５日ごとに培地を交換した。実験の一部では、培養６日目以降からは、培地に全てトランス型のレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、１０〜６Ｍ）を補給した。
【０２５６】
第２のプロトコールでは、球形物は、増殖因子を補給した無血清培地中でポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンをコーティングしたスライドガラス上で培養した。５〜６日後、増殖因子を除去し、全てトランス型のレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、１０〜６Ｍ）を培地に添加した。細胞をさらに１〜２週間培養した。培地は５日ごとに交換した。
【０２５７】
（ｄ）分化した神経細胞の特徴づけ
球形物から増殖している分化細胞は、間接的免疫蛍光分析によって、以下のマーカーの発現について培養後２〜３週間に分析した：２００ｋＤａ神経フィラメントタンパク質（４％パラホルムアルデヒド固定、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ製のマウスモノクローナル抗体ＲＴ９７）、１６０ｋＤａ神経フィラメントタンパク質（メタノール固定、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，　ＣＡ製のマウスモノクローナルＮＮ１８）６８ｋＤａ神経フィラメントタンパク質（１００％エタノール、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｕ．Ｋ．）、ＭＡＰ２ａ，ｂ（４％パラホルムアルデヒド固定、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｕｎｉｏｎ　Ｃｉｔｙ　ＣＡ製のマウスモノクローナル抗体　ＡＰ２０）、グルタメート（１％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタールアルデヒド、Ｓｉｇｍａ製のウサギ抗血清）、シナプトフィジン（４％パラホルムアルデヒド、Ｄａｋｏ製のマウスモノクローナル　ＳＹ３８）、チロシンヒドロキシラーゼ（４％パラホルムアルデヒド、マウスモノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ）グルタミン酸デカルボキシラーゼ（１％パラホルムアルデヒド、１％グルタールアルデヒド、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，　ＣＡ製のウサギ抗血清）、β−チューブリン（４％パラホルムアルデヒド、Ｓｉｇｍａ製のマウスモノクローナルＴＵＢ２．１）およびβ−チューブリンＩＩＩ（４％パラホルムアルデヒド　Ｓｉｇｍａ製のマウスモノクローナルＳＤＬ．３Ｄ１０）。
【０２５８】
分化細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲによって、β−アクチン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（プライマー、Ｖｅｓｃｏｖｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）およびＧＡＢＡＡ受容体サブユニットα２（プライマー、Ｎｅｅｌａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）の発現について、培養後２〜３週間めに分析した。ｍＲＮＡ作製およびＲＴ−ＰＣＲ反応は上記のように実施した。
【０２５９】
（ｅ）グリア分化検討
通常の継代培養時に、血小板由来増殖因子（組換えヒトＰＤＧＦ−ＡＡ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ  ２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ、２０ｎｇ／ｍｌ）を補給した無血清培地（上記）において球形物を継代培養した。培地の５０％を３日後ごとに新鮮な培地と交換した。６日の培養後、球形物を、増殖因子を添加しない無血清培地においてポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンをコーティングしたスライドガラス上で培養した。球形物中の細胞は１０〜１２日間拡張、分化させ、培地は３〜５日ごとに交換した。別のプロトコールを実験の一部に使用した。これらの実験では、球形物は、ＰＤＧＦ−ＡＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補給した無血清培地（上記）において３週間培養した。次いで、球形物を、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、５ｍｃｇ／ｍｋ）をコーティングしたスライドガラス上で培養した。それらは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＴ３（３０ｎＭ）を補給した無血清培地中で１週間培養した。次いで、増殖因子を培地から除去し、Ｔ３だけが存在する条件下において細胞をさらに１〜２週間培養した。培地の５０％を３日ごとに新鮮な培地に交換した。別の方法において、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下において増殖した球形物を、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、５ｍｃｇ／ｍｋ）をコーティングしたスライドガラス上で培養した。ＥＧＦを培地から除去し、球形物をＴ３（３０ｎＭ）およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において１週間培養した。次いで、Ｔ３およびＰＤＧＦ−ＡＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において細胞をさらに３〜４週間培養した。
【０２６０】
稀突起膠細胞は、間接的免疫蛍光分析によって、マーカーＯ４の発現について同定した。まず、細胞を、一次（抗稀突起膠細胞マーカーＯ４、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，  ＣＡ製のマウスモノクローナルＩｇＭ）および二次ＦＩＴＣまたはローダミン結合抗体と共にインキュベーションし、次いで４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０２６１】
星状細胞における分化を証明するために、ｂ−ＦＧＦおよびＥＧＦの存在下において増殖させた球形物を、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチンまたはラミニンをコーティングしたスライドガラス上で培養し、無血清培地中で増殖因子を添加しないでさらに６日間培養した。
または、球形物は、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびｂＦＧＦの存在下において６週間増殖し、次いで、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチンをコーティングしたスライドガラス上で培養した。それらは、上記の増殖因子の存在下において１週間単層に拡張させた。次いで、細胞を、Ｔ３またはＴ３とＰＤＧＦ−ＡＡの組み合わせの存在下においてもう１週間培養した。
【０２６２】
このプロトコールにより、星状細胞への分化は、間接的免疫蛍光分析によって、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（４％パラホルムアルデヒド固定、Ｄａｋｏ製のウサギ抗ウシ）の発現について証明した。
【０２６３】
星状細胞および稀突起膠細胞への分化もｍＲＮＡレベルで確認した。球形物をポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で培養し、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡを補給した無血清培地で２週間培養した。次いで、分化中の球形物を、増殖因子を添加しないで、Ｔ３の存在下において２週間培養した。ＲＴ−ＰＣＲを上記のように使用して、ＧＦＡＰおよびｐｌｐ遺伝子の発現を証明した。ＧＦＡＰ転写物は、以下のプライマーを使用してアッセイした：５’−ＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＴＴ−３’（順方向）および５’−ＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＴ−３’（逆方向）、バンドサイズ３８３ｂｐ。ｐｌｐ遺伝子発現の分析のプライマーは、５’−ＣＣＡＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＣＡＴＣ−３’（順方向）および５’−ＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＴＧＴ−３’（逆方向）。ｐｌｐ遺伝子は、脳ミエリンの主要タンパク質であるプロテオリピドタンパク質および別にスプライシングされた産物ＤＭ−２０をコードする。ｐｌｐの予測されるバンドサイズは３５４ｂｐで、ＤＭ−２０の予測されるバンドサイズは２４９ｂｐである（Ｋｕｋｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ｍＲＮＡ品質の対照として、β−アクチン転写物を、上記と同じプライマーを使用してアッセイした。産物を２％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウム染色で可視化した。
【０２６４】
（ｆ）翻訳の検討
球形物を機械的または酵素的（パパイン、Ｗｏｒｔｉｎｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，ＮＪ）な消化およびその次に実施する粉砕によって小さい群に分離した。約５０，０００細胞（２μｌ  ＰＢＳ中）を、マイクロインジェクター（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｊａｐａｎ）に接続したマイクロガラスピペット（外径３００ミクロン）を使用することによって、生まれたばかりの（誕生第１日め）マウスおよびラット（Ｓａｂｒａ）の側脳に注射した。ガラスピペットは、宿主の神経系への穿通深さを制限するプラスチックスリーブで覆った。一部の実験において、移植前に、神経前駆細胞をＢｒＤＵ（２０μＭ、４週）で標識した。４週齢時、レシピエントを麻酔し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を潅流した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色後、７マイクロメーターの連続Ｖｉｂｒａｔｏｍ切片を組織学的に調査した。移植細胞のヒトアイデンティティーは、製造業者のプロトコールにより、ジアミノゼンザジン（ＤＡＭ）ペルオキシダーゼ検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して、抗ＢｒＤＵ（マウス、モノクローナル、１：２０、Ｄａｋｏ）免疫組織化学染色によって確認した。移植細胞の細胞種アイデンティティーは、星状細胞のＢｒＤＵおよびＧＦＡＰ（ウサギポリクローナル、１：１００  Ｄａｋｏ）または稀突起膠細胞のＢｒＤＵおよびＣＮＰａｓｅ（マウスモノクローナル、１：５０  Ｓｉｇｍａ）に対する抗体で二重染色することによって確立した。抗ＧＦＡＰおよびＣＮＰａｓｅの免疫反応性は、フルオレセイン結合（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）二次抗体で明らかになった。
【０２６５】
［実施例］
＜実施例１−細胞系統ＨＥＳ−１およびＨＥＳ−２の誘導＞
外側の栄養外胚葉を免疫手術によって４つの胚盤胞から除去して内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離し、次いでこれをマウス胚線維芽細胞のフィーダー層上で培養した（図１Ａ）。小型で密に詰まった細胞群は、数日以内に、４つのＩＣＭの２つから増殖を始めた。小型の細胞を機械的に分化細胞の増殖物から分離し、再培養後、それらは、ヒトＥＣ細胞または霊長類ＥＳ細胞の形態的性状を有する細胞コロニーを生じた（図１Ｂ、Ｃ幹細胞コロニー）。これらのコロニーをさらに増殖して、機械的に群に分離し、これを新鮮なフィーダー層上で再度培養した。小さい細胞群（＜１０細胞）からの増殖はこれらの培養条件下では生じなかった。早期内胚葉の形態的性状を有する細胞を生じることが多い自発的な分化は、細胞の通常の継代培養中に観察されることが多かった（図１Ｄ）。ＬＩＦが存在する場合でも、細胞にフィーダー層が与えられない場合には、分化が速やかに生じた（図１Ｅ）。ＬＩＦは細胞系統樹立の早期段階に使用されたが、樹立された培養物の増殖または分化に全く影響を与えないことがその後見出された（図示せず）。通常の継代培養中のコロニーサイズの平均増加に基づいて、それぞれ最小約３６０および９０２４０集団倍加に対応して、細胞系統ＨＥＳ−１はインビトロにおいて６０継代増殖し、ＨＥＳ−２は４０継代増殖し、両細胞系統は、主に、依然としてＥＳ細胞の形態を有する細胞からなる。両細胞系統は冷凍保存からうまく回収された。
【０２６６】
＜実施例２−ヒトＥＳ細胞のマーカー発現および核型＞
マーカーおよび核型分析は、継代レベル５〜７、１４〜１８、２４〜２６および４４〜４６のＨＥＳ−１および継代レベル６〜８のＨＥＳ−２について実施した。ＥＳ細胞はアルカリ性ホスファターゼ活性を有した（図２Ａ）。ＥＳ細胞の免疫表現型分析は、ヒトＥＣ細胞に見出される細胞表面炭水化物および関連のタンパク質を検出する一連の抗体を使用して実施した。ＥＳ細胞は、間接的免疫蛍光分析において、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ１−６０炭水化物エピトープにポジティブに反応し、染色パターンはヒトＥＣ細胞に観察されるものと類似していた（図２Ｂ、Ｃ）。ＥＳ細胞はまた、ヒトＥＣ細胞に見出されるケラタン硫酸／コンドロイチン硫酸細胞周囲基質プロテオグリカンのタンパク質コアのエピトープを検出するモノクローナル抗体ＧＣＴＭ−２と反応した（図２Ｄ）。ヒトＥＣ細胞と同様に、ヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１を発現しなかった。両細胞系統は核型的には正常であり、共に雌胚盤胞から誘導された。
【０２６７】
Ｏｃｔ−４は、その発現がマウスの多分化能細胞に限定されるＰＯＵドメイン転写因子であり、最近の結果は、Ｏｃｔ−４の接合体発現は内部細胞塊の多分化能幹細胞集団の樹立に必須であることを直接示している。Ｏｃｔ−４はヒトＥＣ細胞においても発現され、その発現は、これらの細胞が分化するとダウンレギュレーションされる。主に幹細胞からなる単離されたコロニーにｍＲＮＡ分析を実施するＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、ヒトＥＳ細胞もＯｃｔ−４を発現することを示した（図３、レーン２〜４）。ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定し、ヒトＯｃｔ−４と同一であることを示した（図示せず）。
【０２６８】
＜実施例３−インビトロにおけるヒトＥＳ細胞の分化＞
両細胞系統は、標準的な培養条件下において自発的な分化を受けたが、自発的な分化過程は最適状態には及ばない培養条件によって加速することができた。フィーダー層を交換しないで、長時間の（４〜７週間）高密度までの培養は、ヒトＥＳ細胞の分化を促進した。高密度培養において、幹細胞マーカーＯｃｔ−４の発現は、ハウスキーピング遺伝子β−アクチンのレベルと比較して、検出不可能であるか、または強力にダウンレギュレーションされていた（図３、レーン５〜７）。アルファフェトプロテインおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンは、高密度まで増殖した培養物の上清においてイムノアッセイによって容易に検出された。アルファフェトプロテインは内胚葉細胞の特徴的な産物であり、胚体外分化または胚内胚葉分化を反映していることがあり、観察されるレベル（１２１０〜５８０６）は広範な内胚葉が存在することを示している。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンは栄養膜の分化に特徴的であり、観察されるレベル（６．４〜５４．６ＩＵ／リッター）はこの系統の中程度の量の分化に一致している。
【０２６９】
高密度の長期培養後、多細胞凝集物または小胞構造物が単層面の上方に形成し、これらの構造物のうちでは、細胞体から延在し、他の細胞に接触する網状構造を形成する細長い突起を有する細胞群または１つの細胞（図１Ｆ）が観察された。細胞および突起は、神経フィラメントタンパク質および神経細胞接着分子に対する抗体でポジティブに染色した（図２ＥおよびＦ）。収縮筋が培養物中にまれに見られた。収縮筋はまれな所見であるが、筋特異的形態のアクチンに対する抗体でポジティブに染色される細胞束およびまれにデスミン中間径フィラメントを含有する細胞（図２ＧおよびＨ）がしばしば観察された。これらの高密度培養物では、マウスＥＳ細胞凝集物に形成されるものまたはマーモセットＥＳ細胞培養物に散発的に生じるものと同様の胚様体の形成を示唆する一定パターンの構造組織化はなかった。
【０２７０】
＜実施例４−異種移植片におけるヒトＥＳ細胞の分化＞
早期継代レベル（６、ＨＥＳ−１および２）または後期継代レベル（ＨＥＳ−１、１４および２７）のＨＥＳ−１またはＨＥＳ−２コロニーをＳＣＩＤマウスの精巣嚢の下側に接種すると、精巣病変が発症し、接種後約５週間目以降触知できた。マウスは全て腫瘍を発症し、ほとんどの症例において両側の精巣が罹患していた。剖検時、嚢状塊からなる病変は淡い色の流体が充満し、固形組織領域が観察された。腹膜腔内の他の部位への転移性広がりの肉眼的徴候は認められなかった。組織学的な調査は、病変が正常な精巣と代わり、奇形癌腫の固形領域を含有することを明らかにした。胎児性癌はどの領域にも観察されなかった。奇形癌腫は３つの胚葉全てを代表する組織を含有した。見られる分化組織は軟骨、扁平上皮、原始的な神経外胚葉、神経節構造、筋、骨および線上皮を含んだ（図４）。胚葉体は異種移植片には観察されなかった。
【０２７１】
＜実施例５−ヒトＥＳ細胞由来の神経前駆細胞の発生、増殖および特徴づけ＞
ａ）ヒトＥＳ細胞からの神経前駆細胞の誘導
細胞系統ＨＥＳ−１およびＨＥＳ−２由来の未分化ＥＳ細胞コロニーを、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で２〜３週間継続的に培養した。継代１週間目に、自発的分化のいくつかが、通常、コロニーの中心部において細胞形態の変化によって同定された。分化の過程は、この段階では、ネスチンおよびＰａｘ−６などの早期神経マーカーの発現によって明らかである神経外胚葉系統を含んだ（図１９）。継代第２週目以降、小型で密に詰まった重層分化細胞領域が、位相差顕微鏡および倒立顕微鏡によって両細胞系統のコロニーに同定することができた。ＥＳ細胞培地を含有する血清を、継代の１週間目以降または好ましくは２週間目以降に、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補給した無血清培地と交換すると、これらの領域のサイズおよび分画性は増大した。これらの領域の細胞は、早期神経外胚葉マーカーポリシアリル化ＮＣＡＭに対する抗体による免疫組織化学的染色において反応しなかった。領域は、血清含有培地で培養したコロニーの５４％においてマイクロピペットによって細胞群を機械的に取れるほど十分に大きく、分画していた（６７／１２４，ＨＥＳ−１）。ＨＥＳ−１およびＨＥＳ−２の分化中のコロニーから細胞群を取り、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）を補給した無血清培地に移した。単離時に、細胞集団は、ゆるく接着した大きい細胞の上面に小型で密に詰まった細胞（約１００〜３００細胞／群）の層を主に含んだ。これらの大きい細胞を機械的または酵素消化によって取り出すことができた。１時間以内に、細胞群は形状を球形に変化し始め、２４時間後には、細胞群は全て丸い球形に変化した（図５ａ）。
【０２７２】
培養の７〜１０日以降、大多数の球形物のサイズが徐々に増加することが明らかであり、球形物はほとんどが浮遊しているか、または培養皿にゆるく接着しているが、少数は接着しており、拡張し始めた。
【０２７３】
別の方法では、球形の前駆細胞へのＥＳ細胞の体細胞分化は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）を補給した無血清培地に未分化ＥＳ細胞群を移すことによって誘導した。２４時間以内に、細胞群は球形物に変化した。これらの球形物は丸いものもあれば、不規則な形状のものもあった。無血清培地では７２時間後に、球形物の４２％（１０／２４）が丸い対称的な性状であり（図９）、１２日後には、６２．５％（１５／２４）であった。この早期培養期では大多数の球形物において有意な増殖が観察された。浮遊している丸い球形物の平均容積を測定し、算出することができ、平均容積は５日目〜１２日目で６４％（１５個の球形物の平均増殖）増加した。
【０２７４】
ｂ）前駆細胞の球形物のインビトロにおける増殖
培養７〜１０日以降、浮遊中またはゆるく接着した直径＞０．５ｍｍの球形物を継代培養し、機械的分離によって４片に分け、これを事前に平衡させた新鮮な培地で再度培養した。球形物はこのように５〜６ヶ月間培養した（１５継代）。球形物のいくつかは培養初期に不規則な形状であったが、増殖に伴い丸い対称的な球形物の割合が増加した。また、早期継代レベルでは、球形物内部細胞塊の性状（立体顕微鏡下）は不規則であったが、継代レベルが進行するにつれて、徐々に均一になった。継代レベル５（誘導から５〜６週目）までには、球形物は全て丸い対称的な形状と均一な性状を持った。
【０２７５】
細胞の増殖は、各継代に伴った球形物の数の増加を測定し、時間に伴った球形物の容積の増加を測定することによって評価した。一般に、未分ＥＳ細胞または分化中のＥＳ細胞から形成される球形物の増殖速度は、最初の５〜６継代中の過剰な増殖によって特徴づけられる同様のパターンを有した。最初の５継代の各継代において（７日ごとに実施）、球形物の数は１２６％＋５４％（平均＋ＳＤ、３細胞系統の結果の合計）増加した。次いで、各継代に伴った球形物数の増加は１週間あたり１０〜５０％に低下した。この増殖速度は長期間（４ヶ月）維持された（３細胞系統の平均データ）。分化中のＥＳ細胞または未分化細胞から直接形成される球形物の平均容積も同様の速度で増加した（図１６および１７）。
【０２７６】
トリプシン消化を使用することによる球形物の分離は、特に、球形物が長期培養された場合には無効であるが、パパインによる酵素消化の後に機械的に球形物を１細胞懸濁液に分離することができた。球形物の容積と球形物内の細胞数との間には線形相関が見られた。この相関の回帰直線を規定する係数は、分化中のＥＳ細胞または未分化ＥＳ細胞から誘導される球形物においてほぼ同じであった。ほとんどの細胞（＞９０％）は、分離手法後生存していた（図１０、図１８）。
【０２７７】
各継代の球形物の増殖速度および平均サイズの球形物（継代５の７日目の２４個の球形物の平均径±Ｓ．Ｄ．、０．５９±０．１４ｍｍに基づいた０．１ｍｍ３）あたりの細胞数（２０，０００、図１０、１８）を考慮すると、ＥＳ細胞の１０細胞群は１０継代以内に、５０×１０６細胞を含有する２５００個の球形物を形成することができると算出された。
【０２７８】
継代させないで長期（３週間）無血清増殖培地（増殖因子を補給した）で培養した球形物は、組織培養プラスチックに接着する傾向があり、単層の細胞として徐々に拡張した。単層中の細胞は、神経前駆細胞の均一な性状を有し、高い有糸分裂活動が明らかであった（図７）。
【０２７９】
凍結保存から球形物を回収することができた。
【０２８０】
ｃ）球形物内の前駆細胞の特徴づけ
分化中のＥＳ細胞コロニーから、または未分化ＥＳ細胞から直接形成される球形物中の細胞は、ポリシアリル化ＮＣＡＭ（図５ｂ、１１、１２）、中間径フィラメントタンパク質ネスチン（免疫染色、図５ｃおよび１３、ＲＴ−ＰＣＲ、図３ｂおよび図１９）およびビメンチン（図５ｄおよび１５）並びに転写因子Ｐａｘ−６（図３ｂおよび図１９）などの原始的な神経外胚葉および神経前駆細胞のマーカーを発現した。これらのマーカーの発現は長期培養中（１８週）維持された。転写因子ｏｃｔ−４は球形物中の細胞によって発現されず、これは、未分化のヒトＥＳ細胞が球形物内に存在しないことを示している（図１９）。
【０２８１】
ポリシアリル化ＮＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンを発現する球形物中の細胞の割合を評価するために、少なくとも６週間（１８週間以下）培養した球形物を分離して１細胞懸濁液にした。得られた１細胞を増殖培地中で基材上で培養した。培養後２４時間経過時に、分化中のＥＳ細胞（３つの前駆細胞系統）および未分化ＥＳ細胞（２つの前駆細胞系統）から形成された球形物の細胞の、それぞれ、平均９９％（９４．５％〜１００％、ｎ＝７実験）および９５．５％（９５．７％〜９６．７％、ｎ＝６）がポリシアリル化ＮＣＡＭに対する抗体で修飾された。ネスチンおよびビメンチンに対してポジティブに染色された細胞の平均割合は、分化中のコロニーから樹立された球形物の、ぞれぞれ、９６．６％（９４．３％〜１００％、ｎ＝６）および７３．１％（４２．１％〜９７．５％、ｎ＝４）であった。これらのマーカーは、未分化の細胞から形成される球形物から生じた細胞の６６．８％（４８．５％〜１００％、ｎ＝５）および５８％（４１．６％〜７６．５％、ｎ＝５）によって発現された。これらの割合は、長期培養中（１８週間）安定であった。
【０２８２】
ポリシアリル化ＮＣＡＭを発現する細胞の高い割合は、両起源由来の球形物が神経前駆細胞の濃縮率の高い調製物を含むことを示す。分化中のＥＳコロニーから誘導される球形物も極めて高い割合の細胞が神経前駆細胞マーカーネスチンを発現した。ネスチンを発現する細胞の割合は、未分化ＥＳ細胞から生じる球形物では大きくなかった。これらのマーカーを発現する細胞の高い割合は長期培養中安定であった。
【０２８３】
他の細胞系統由来の細胞が球形物内に存在するかどうかを判定するために、内胚葉および中胚葉系統のマーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学的分析によって調査した。
【０２８４】
どちらの方法によって誘導される球形物の細胞によっても、内胚葉系統のマーカーの発現の徴候はなかった（ＨＮＦ−３、ＡＦＰ、ＲＴ−ＰＣＲ、図２４）。さらに、内胚葉系統のマーカーの発現はまた、分化中のコロニーから誘導された球形物および適当な基材上で培養し、増殖因子が存在しない場合に４週間培養することによって分化を誘発した球形物でも検出されなかった（ＨＮＦ−３、ＡＦＰ、トランスフェリンはＲＴ−ＰＣＲによって評価し、ｌＭＷサイトケラチンおよびラミニンは免疫組織化学的分析によって評価した）。長期培養（３〜４週間）によって分化を誘発したＥＳ細胞コロニーは上記マーカーの全てを発現し、ポジティブコントロールとして働いた。
【０２８５】
しかし、中胚葉前駆体のマーカーの発現（ＦＬＫ−１およびＣＤ−３４）は、どちらの方法によって形成される球形物においても証明された（図２４）。
【０２８６】
球形物は濃縮率の高い神経前駆体集団を含み（＞９５％）、内胚葉系統由来の細胞をおそらく含まないと結論づけることができる。早期中胚葉マーカーの発現は、球形物内に小数の中胚葉前駆体集団が存在することを示す。または、球形物内の原始的な神経前駆体がこれらの中胚葉マーカーを発現することがある。ヒト胎児脳から誘導された神経幹細胞において最近証明されている造血マーカーＡＣ−１３３の発現（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）がこの可能性を裏付けている。また、神経前駆体による造血マーカーの発現は、造血系を含む種々の組織に分化転向する神経幹細胞の最近報告されている広い可能性に一致している可能性がある（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０２８７】
（ｄ）インビトロにおける神経分化
分化中のＥＳ細胞コロニーまたは未分化ＥＳ細胞から形成される球形物は、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニン上で培養すると、接着し、分化した細胞が自ら由来の単層上に増殖した。
【０２８８】
培養時にｂＦＧＦおよびＥＧＦを除去すると、分化中の細胞は、徐々に放射状に広がった（図６ａ）。増殖因子を１〜２週目以降に入ってから除去すると、突起を有し、単層を形成した細胞のさらに広範な広がりが明らかであった（図８）。培養後２〜３週間目には、どちらの方法によって誘導された球形物から生じる分化細胞も、ニューロンに特徴的な形態並びにβ−チューブリン（図６ｈ）、β−チューブリンＩＩＩ（図２７ｃ、２００ｋＤａ神経フィラメント（図６ｂ）および６６ｋＤａ神経フィラメントタンパク質などの、構造マーカーの発現を示した。
【０２８９】
さらに、どちらの方法によって誘導された球形物から生じる分化細胞も、１６０ｋＤａ神経フィラメントタンパク質（図６ｃ、図２７ａ）、Ｍａｐ−２ａ，ｂ（図６ｄ、図２７ｂ）およびシナプトフィジン（図６Ｆ）などの成熟ニューロンのマーカーを発現した。さらに、培養物は、グルタメートを合成する細胞（図６ｅ）、ＧＡＢＡ生合成の律速酵素を発現する細胞（グルタミン酸デカルボキシラーゼ、図３ｃおよび６ｇ）、酵素チロシンヒドロキシラーゼを発現する細胞（図２８）およびＧＡＢＡ作動性ニューロンに特徴的な受容体サブユニットを発現する細胞（ＧＡＢＡα２、図３ｄ）を含有した。
【０２９０】
ｅ）インビトロにおけるグリア分化
星状細胞および稀突起膠細胞への分化が、分化中のＥＳ細胞または未分化ＥＳ細胞から形成される球形物に観察された。
【０２９１】
増殖因子を除去し、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニン上で培養すると、低スケールでグリア細胞への分化が観察されたが、この系統への分化を増強するために種々のプロトコールが開発された。これらのプロトコールは全て、グリア細胞への分化を有意に増強するポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で神経前駆細胞を培養することと、グリア前駆細胞増殖を促進するＰＤＧＦ−ＡＡおよび稀突起膠細胞前駆体の成熟を誘発するＴ３を培地に補給することとに基づいていた。
【０２９２】
星状細胞グリア細胞系統への分化は、ＧＦＡＰの間接的免疫蛍光染色によって証明された。増殖因子を除去し、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニン上で培養することにより分化が誘発されるとき、ごく少数の陽性細胞が時折証明された。しかし、ポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で球形物を分化させると、星状細胞への分化は有意に増強された。さらに星状細胞への分化は、以下のプロトコールの後では有意に多かった。先ず、球形物をＰＤＧＦ−ＡＡおよびｂＦＧＦの存在下において６週間増殖し、次いでポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で培養した。上記増殖因子の存在下において球形物を１週間単層に拡張させた。次いで、分化中の細胞を、Ｔ３およびＰＤＧＦ−ＡＡの存在下においてさらに１週間培養し、次にＴ３の存在下またはＴ３とＰＤＧＦ−ＡＡの組み合わせの存在下においてさらに１〜２週間培養した（図２０）。
【０２９３】
稀突起膠細胞への分化を促進するために、球形物を、最初に、ＰＤＧＦ−ＡＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補給した無血清培地において６日間培養し、次いで増殖因子を添加しない同じ培地においてポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンをコーティングしたスライドガラス上で培養した。球形物中の細胞を１０〜１２日間拡張させ、分化させた。この時点において抗体Ｏ４で修飾された小型の細胞を証明することができ、稀突起膠細胞前駆細胞への分化を示している。
【０２９４】
ＰＤＧＦおよび塩基性ＦＧＦの存在下において球形物を３週間培養し、次にポリリジンおよびフィブロネクチン上で培養することによって、また増殖因子およびＴ３の存在下において１週間培養し、次に増殖因子を添加しないでＴ３の存在下において１〜２週間培養することによって、稀突起膠細胞前駆細胞への分化を促進することもできた（図１４）。または、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの存在下において増殖した球形物をポリリジンおよびフィブロネクチン上で培養し、ｂＦＧＦおよびＴ３の存在下において１週間培養した。次いで、細胞をＰＤＧＦおよびＴ３の存在下において３〜４週間さらに培養した。
【０２９５】
星状細胞および稀突起膠細胞への分化をｍＲＮＡレベルにおいてさらに確認した。球形物をポリ−Ｄ−リジンおよびフィブロネクチン上で培養し、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＡを補給した無血清培地培地において２週間培養した。次いで、分化中の球形物を、Ｔ３の存在下において増殖因子を添加しないで２週間さらに培養した。ＧＦＡＰの発現はＲＴ−ＰＣＲによって証明し、星状細胞の存在を示し、確認している（図２５）。ｐｌｐ遺伝子の発現は、稀突起膠細胞への分化のマーカーとして使用した。ｐｌｐ遺伝子は、脳ミエリンの主要タンパク質である、プロテオリピドタンパク質および別にスプライシングされた産物ＤＭ−２０をコードする。
【０２９６】
分化した球形物のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｄｍ−２０およびｐｌｐ転写物を証明しており、稀突起膠細胞への分化が生じたことを示している（図２５）。
【０２９７】
ｆ）神経球形物の移植
ヒトＥＳ由来の神経前駆体のインビボにおける発生の可能性を調査するため、およびヒト前駆体が位置刺激に応答して、生存している宿主の発生および組織形成に関与するかどうかを明らかにするために、分離した球形物を出生直後のラットおよびマウスの側脳室に植え込んだ。一部の実験において、植え込む前に、神経前駆細胞をＢｒＤＵで標識した。連続脳切片の組織学的および免疫化学的評価を移植後４週目に実施した。移植したマウスにおいて、抗ＢｒＤＵ修飾核を有するヒト細胞（図２１）が大量に脳室から移動し、宿主脳内に組み込んだ。ヒト細胞は、グリア分化が顕著であり、従って移植細胞のグリア分化が期待される主に白質痕跡からなる質周囲領域の広範な分布を証明した（図２２）。実際、移植細胞は領域の分化シグナルに応答し、ＢｒＤＵおよびＧＦＡＰの二重免疫化学的染色は、両方の抗体によって修飾された質周囲の細胞を証明し、これは、移植した神経前駆細胞がインビボにおいて星状細胞への分化を受けたことを示している（図２９）。稀突起膠細胞に分化し、従って、抗ＢｒＤＵおよび抗ＣＮＰａｓｅに反応性である移植細胞も質周囲領域に証明された（図３０）。移植されたヒト細胞も、ニューロンが生涯を通じで継続的に形成されており、従って、移植細胞の神経的な運命が期待されるｒｏｓｔａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍにより遠くまで移動した（図２３）。これらのデータは、移植細胞が、宿主の刺激に応答することができ、移動して、領域シグナルにより分化することができたことを示している。
【０２９８】
レシピエント動物において腫瘍が形成される組織学的な証拠はない。
【０２９９】
＜実施例６：ヒトＥＳ細胞の凍結保存＞
従来の低速凍結プロトコールを使用することによってヒトＥＳ細胞を凍結保存する試みは、融解後の成果が非常に不良となった。ＥＳ細胞は胚盤胞から誘導され、培養中胚の特性を保持しているので、胚に効率的な方法を使用することによる凍結保存が有用となると本発明者らは仮定した。ウシ胚盤胞の凍結保存に高い効率を示すことが最近示されているｏｐｅｎ  ｐｕｌｌｅｄ  ｓｔｒａｗ（ＯＰＳ）ガラス化方法（Ｖａｔｊａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）を使用してヒトＥＳ細胞の早期継代細胞群を凍結した。両細胞系統はうまく融解され、さらに長時間増殖された。ガラス化手法の成果を細胞系統ＨＥＳ−１でさらに検討し、この手法による生存細胞の回収は効率が高いことが見出された。細胞群は全て（ｎ＝２５）はこの手法で生存しており、接着し、融解後増殖した。融解後２日目にガラス化した細胞群から生じるコロニーサイズが、非ガラス化対照細胞群のコロニーと比較したとき小さいことによって明らかであるように、ガラス化は若干の細胞死と関連があった。しかし、この細胞欠損を克服するのに２日の培養で十分である、培養９日目では、凍結−融解細胞群のコロニーサイズは７日目の対照コロニーを上回った。ガラス化は、融解後分化を誘発しなかった。融解した細胞は正常な核型および霊長類の幹細胞マーカーの発現を保持し、ＳＣＩＤマウスに奇形癌腫を形成した。
【０３００】
最後に、本明細書に概要される本発明の精神から逸脱することなく、種々の他の改良および／または変更を加えることができることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＥＳ細胞および分化したそれらの子孫の位相差顕微鏡写真を示す。Ａ、培養３日後の内部細胞塊。Ｂ、ＥＳ細胞のコロニー。Ｃ、高倍率のＥＳ細胞コロニー領域。Ｄ、通常の継代中に自発的な分化を受けるＥＳ細胞のコロニー領域。Ｅ、フィーダー層が存在しないが、２０００単位／ｍｌのヒトＬＩＦの存在下で培養後４日目の、辺縁部が分化を生じているコロニー。Ｆ、高密度培養中の神経細胞。スケールバー：ＡおよびＣ、２５ミクロン；ＢおよびＥ、１００ミクロン；ＤおよびＦ、５０ミクロン。
【図２】
ＥＳ細胞および分化体細胞におけるマーカー発現を示す。Ａ、アルカリ性ホスファターゼの組織化学的染色を示すＥＳコロニー。Ｂ、ＳＳＥＡ−４エピトープを認識する抗体ＭＣ−８１３−７０で染色したＥＳ細胞コロニー。Ｃ、抗体ＴＲＡ１−６０で染色したＥＳ細胞コロニー。Ｄ、抗体ＧＣＴＭ−２で染色したＥＳ細胞コロニー。Ｅ、高密度培養、抗神経フィラメント６８ｋＤａタンパク質で染色した細胞体と細胞突起。Ｆ、高密度培養、神経細胞接着分子に対する抗体で染色した細胞クラスターと細胞から生ずる突起網。Ｇ、高密度培養、筋アクチンに対する抗体で染色した細胞質フィラメントを示す細胞。Ｈ、デスミンに対する抗体で染色した細胞質を示す細胞。スケールバー：Ａ、１００ミクロン；Ｂ−ＤおよびＦ、２００ミクロン、Ｅ、ＧおよびＨ、５００ミクロン。
【図３】
ＥＳ細胞および分化した誘導物における遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。パネルは全て、臭化エチジウム染色した１．５％アガロースゲルを示す。Ａ、ＥＳ幹細胞および高密度培養物中のＯｃｔ−４およびｂ−アクチンの発現。レーン１、１００ｂｐＤＮＡラダー。レーン２、幹細胞培養、ｂ−アクチン。レーン３、幹細胞培養、Ｏｃｔ−４。レーン４、幹細胞培養、逆転写酵素を添加しない場合に実施したＯｃｔ−４のＰＣＲ。レーン５、高密度培養、ｂ−アクチン。レーン６、高密度培養、Ｏｃｔ−４。レーン７、高密度培養、逆転写酵素を添加しない場合に実施したＯｃｔ−４のＰＣＲ。ｂ−アクチンバンドは２００ｂｐであり、Ｏｃｔ−４バンドは３２０ｂｐである。Ｂ、分化中のＥＳコロニー由来の神経前駆細胞におけるネスチンおよびＰａｘ−６の発現。左レーン、１００ｂｐＤＮＡラダー、レーン１、ＨＸ　１４２神経芽細胞腫細胞系統におけるｂ−アクチン（ネスチンＰＣＲのポジティブコントロール）、レーン２、神経前駆細胞におけるｂ−アクチン、レーン３、ＨＸ　１４２神経芽細胞腫細胞系統におけるネスチン、レーン４、神経前駆細胞におけるネスチン、レーン５、レーン４と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないネスチンＰＣＲ、レーン６、Ｐａｘ−６、レーン７、レーン６と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないＰａｘ−６ＰＣＲ、ネスチンバンドは２０８ｂｐであり、Ｐａｘ−６は２７４ｂｐである。Ｃ、ニューロン培養物中のグルタミン酸デカルボキシラーゼの発現。左のレーン、１００ｂｐ　ＤＮＡラダー、レーン１、ｂ−アクチン、レーン２、レーン１と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないｂ−アクチンＰＣＲ、レーン３、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、レーン４、レーン３と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないグルタミン酸デカルボキシラーゼ。グルタミン酸デカルボキシラーゼバンドは２８４　ｂｐである。Ｄ、ＧＡＢＡ　Ａα２受容体の発現。左のレーン、１００ｂｐ　ＤＮＡラダー、レーン１、ｂ−アクチン、レーン２、ＧＡＢＡ　Ａα２受容体、レーン３、逆転写酵素を添加しないＰＣＲ。ＧＡＢＡ　Ａα２受容体サブユニットバンドは４７１ｂｐである。
【図４】
ＨＥＳ−１またＨＥＳ−２コロニーのインキュベーション後に、ＳＣＩＤマウスの精巣に形成される奇形癌腫に見られる分化要素の組織を示す。Ａ、軟骨および扁平上皮細胞、ＨＥＳ−２。Ｂ、神経ロゼット、ＨＥＳ−２。Ｃ、神経節、腺および横紋筋、ＨＥＳ−１、骨および軟骨、ＨＥＳ−１。Ｅ、腺上皮、ＨＥＳ−１。Ｆ、繊毛円柱上皮、ＨＥＳ−１。スケールバー：Ａ〜Ｅ、１００ミクロン、Ｆ、５０ミクロン。
【図５】
分化中のＥＳ培養物から単離した神経前駆細胞におけるマーカー発現位相差顕微鏡像の免疫化学的分析を示す。Ａ、無血清培地に形成される球形物の位相差像。Ｂ〜Ｄ、接着性基材上で４時間培養後の、Ｎ−ＣＡＭ、ネスチンおよびビメンチンの球形物の間接的免疫蛍光染色。ＣおよびＤ、フィラメントの染色を例示するために、球形物の底部の細胞を焦点面におく。共焦点による調査は、球形物全体の細胞が両方の抗体で修飾されていることを明らかにした。スケールバーは全てのパネルにおいて１００ミクロンである。
【図６】
図５に示す前駆細胞由来のニューロンの培養物における位相差像およびマーカー発現を示す。粘着表面上で培養した球形物から生じる分化細胞の位相差電子顕微鏡写真。Ｂ〜Ｈ、２００ｋＤａの神経フィラメントタンパク質（Ｂ）、１６０ｋＤＡの神経フィラメントタンパク質（Ｃ）、ＭＡＰ２ａ＋ｂ（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、シナプトフィジン（Ｆ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｇ）およびβ−チューブリン（Ｈ）に対する抗体で修飾した分化細胞の間接的免疫蛍光顕微鏡。スケールバー：Ａ、Ｂ，１００ミクロン、Ｃ，２００ミクロン、Ｄ、２０ミクロン、ＥおよびＦ、１０ミクロン、Ｇ、２０ミクロン、Ｈ，２５ミクロン。
【図７】
ＥＧＦおよびｂＦＧＦの存在下においてプラスチック製組織培養皿上で単層として増殖中の神経前駆細胞。増殖中の細胞のこれらの単層培養物は、増殖因子の存在下において球形物を長期（２〜３週間）培養後に得た。継代培養を行っていない。
【図８】
分化した神経細胞からなる培養物の位相差像を示す。
【図９】
未分化ＥＳ細胞群を無血清培地に移した７２時間後に形成される球形物の位相差像（スケールバー１００ミクロン）。
【図１０】
球形物の容積と球形物内の前駆細胞数との線形相関を示す。分化中のＥＳコロニーから形成され、１４〜１５週間培養した種々の直径の球形物を単一細胞懸濁液に分離し、球あたりの細胞数を計測した。
【図１１】
接着性基材上で４時間培養したＮ−ＣＡＭの球形物の間接的免疫蛍光染色を示す。球形物は、未分化のＥＳ細胞を無血清培地に直接移し、得られた球形物を５継代増殖することによって形成した。（スケールバー１００ミクロン）。
【図１２】
接着性基材上で４時間培養後の球形物の辺縁部の単一細胞のＮ−ＣＡＭの間接的免疫蛍光膜染色を示す。球形物は、未分化のＥＳ細胞を無血清培地に直接移し、得られた球形物を５継代増殖することによって形成した。（スケールバー２５ミクロン）。
【図１３】
接着性基材上で４時間培養後の中間径フィラメントネスチンの球形物の間接的免疫蛍光染色を示す。フィラメントの染色を例示するために、球形物の底部の細胞を焦点面におく。球形物は、未分化のＥＳ細胞を無血清培地に直接移し、得られた球形物を５継代増殖することによって形成した。（スケールバー２５ミクロン）。
【図１４】
稀突起膠細胞前駆細胞マーカーＯ４に対する抗体で修飾した分化細胞の間接的免疫蛍光顕微鏡像を示す（スケールバー１２．５ミクロン）。
【図１５】
接着性基材上で４時間培養後の中間径フィラメントビメンチンの球形物の間接的免疫蛍光染色を示す。フィラメントの染色を例示するために、球形物の底部の細胞を焦点面におく。球形物は、未分化のＥＳ細胞を無血清培地に直接移し、得られた球形物を７継代増殖することによって形成した。（スケールバー２５ミクロン）。
【図１６】
未分化のＥＳ細胞から直接形成された球形物の増殖パターンを示す。各バーは、誘導後第１週から１２週目までの２４個の球形物の１週間あたりの容積の平均（±ＳＤ）増加量を示す。過剰な増殖速度は最初の５週目において明らかである。
【図１７】
経時的な球形物の容積の持続的な増殖を示す。各バーは、誘導後９週目から２１週目までの２４個の球形物の１週間あたりの容積の平均（±ＳＤ）増加量を示す。球形物は分化中のＥＳコロニーから形成した。
【図１８】
球形物の容積と球形物内の前駆細胞数との線形相関を示す。未分化のＥＳコロニーから直接形成され、５〜７週間培養した種々の直径の球形物を単一細胞懸濁液に分離し、球あたりの細胞数を計測した。
【図１９】
ＥＳ細胞（継代後１週間）と、分化中のコロニー由来の神経細胞球形物および未分化のＥＳ細胞から直接形成した神経細胞球形物における遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。全てのパネルは臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルを示す。レーン１、２および３はＥＳ細胞培養物中のＯｃｔ−４、分化中のコロニー由来の神経球形物、未分化のＥＳ細胞由来の神経球形物。レーン４、幹細胞培養物、逆転写酵素を添加しないで実施したＯｃｔ−４のＰＣＲ。レーン５、６および７、ＥＳ細胞培養物中のネスチン、分化中のコロニー由来の神経球形物、未分化のＥＳ細胞由来の神経球形物。レーン８、幹細胞培養物、逆転写酵素を添加しないで実施したネスチンのＰＣＲ。レーン９、１０および１１、ＥＳ細胞培養物中のＰａｘ−６、分化中のコロニー由来の神経球形物、未分化のＥＳ細胞由来の神経球形物。レーン１２、幹細胞培養物、逆転写酵素を添加しないで実施したＰａｘ−６のＰＣＲ。レーン１３、１００　ｂｐＤＮＡラダー。Ｏｃｔ−４バンドは３２０ｂｐであり、ネスチンは２０８ｂｐであり、Ｐａｘ−６は２７４ｂｐである。
【図２０】
ＧＦＡＰに対する抗体で修飾した分化した星状細胞の間接的免疫蛍光顕微鏡像を示す（スケールバー２５ミクロン）。
【図２１】
ＢｒＤＵで事前標識したヒト神経前駆物質を移植後４週間の２匹のマウス（ＡおよびＢ）の脳切片の間接的免疫蛍光顕微鏡像を示す。抗ＢｒＤＵで修飾した核を有する細胞（茶色染色、黒矢印）は脳室表面付近に明らかである（白色の矢印はマウス未染色核を示す、バー＝２０ミクロン）。
【図２２】
ＢｒＤＵで事前標識したヒト神経前駆物質を移植後４週間のマウスの脳切片の間接的免疫蛍光顕微鏡像を示す。抗ＢｒＤＵで修飾した移植したヒト細胞の広範囲の分布が脳室周囲領域において明らかである。Ａの脳室周囲領域は、ＢおよびＣの高倍率像で証明されている。（バー＝Ａ、ＢおよびＣにおいて１５０、６０および３０ミクロン）。
【図２３】
ＢｒＤＵで事前標識したヒト神経前駆物質を移植後４週間のマウスの脳切片の間接的免疫蛍光顕微鏡像を示す。移植したヒト細胞は吻方向への移動流（ｒｏｓｔｒａｌ　ｍｉｇｒａｔｏｒｙ　ｓｔｒｅａｍ）に沿って移動している（バー＝１５０ミクロン）。
【図２４】
分化中（Ａ）および未分化の（Ｂ）のＥＳ細胞由来の神経球形物における遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。パネルは全て臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルを示す。レーン１および１０、１００ｂｐＤＮＡラダー、レーン２、ＣＤ−３４、レーン３、Ｆｌｋ、レーン４、ＮＨＦ−３、レーン５、αフェトプロテイン。レーン６〜９　レーン２〜５と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないＰＣＲ反応。ＣＤ−３４バンドは２００ｂｐであり、Ｆｌｋ−１は１９９であり、ＨＮＦ−３は３９０であり、ＡＦＰは３４０ｂｐである。
【図２５】
分化中のＥＳ細胞コロニー由来の神経球形物から分化した細胞におけるＧＦＡＰおよびｐｌｐ遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＧＦＡＰの発現は、星状細胞への分化を示すが、ｄｍ−２０およびｐｌｐ転写物両方の存在は、稀突起膠細胞への分化が生じたことを示す。レーン２、４、６およびレーン３、５、７は、ＥＳ細胞から独立に由来する分化した球形物由来の２つの別個のＲＮＡ試料由来である。レーン１およびレーン８、１００ｂｐＤＮＡラダー、レーン２および４、ＧＦＡＰ、レーン３および５、ｐｌｐおよびｄｍ−２０、レーン６およびレーン７、レーン３および５と同じ試料の、逆転写酵素を添加しないで実施したＰＣＲ反応。ＧＦＡＰバンドは３８３であり、ｐｌｐバンドは３５４ｂｐであり、ｄｍ−２０は２４９ｂｐである。
【図２６】
継代後３週間の分化中のＥＳ細胞中で神経前駆細胞を生ずることが運命づけられている領域（矢印）の暗視野立体顕微鏡写真を示す。
【図２７】
未分化ＥＳ細胞から直接誘導される前駆細胞由来のニューロン培養物中のマーカー遺伝子の間接的免疫化学的分析を示す。Ａ，１６０ｋＤＡ神経フィラメントタンパク質に対する抗体で修飾した神経炎の間接的免疫蛍光顕微鏡像。ＢおよびＣ、ＭＡＰ２ａ＋ｂおよびβ−チューブリンＩＩＩの分化した細胞の間接的免疫蛍光染色。スケールバー：Ａ　１００ミクロン、ＢおよびＣ　１０ミクロン。
【図２８】
チロシンヒドロキシラーゼの発現の間接的免疫化学的分析。神経炎（Ａ）および分化した細胞（Ｂ）は、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体で修飾されている。スケールバー：３０　ミクロン。
【図２９】
ＢｒＤＵで事前標識した移植後のヒト神経前駆細胞の星状細胞へのインビボにおける分化を示す。ドナー細胞は、ＢｒＤＵの間接的免疫化学的検出によって同定される（核は暗く見える、矢印）。二重染色は、抗ＧＦＡＰによって修飾されたドナー細胞を示している（オレンジ色）。移植後の細胞は脳実質に移動しており（白色の矢印）、脳室辺縁帯（濃い色の矢印）にも見られる、（Ａ）星状細胞に分化した細胞の高倍率像と宿主脳に移動した（Ｂ）細胞の高倍率像。
【図３０】
ＢｒＤＵで事前標識した移植後のヒト神経前駆細胞の稀突起膠細胞へのインビボにおける分化を示す。ドナー細胞は、ＢｒＤＵの間接的免疫化学的検出によって同定される（核は暗く見える、矢印）。二重染色は、抗ＣＮＰａｓｅによって修飾されたドナー細胞を示している（オレンジ）。
【図１０】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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