(57)【要約】Ｎ−アリールアクリダン誘導体である、エステル、チオエステル、アミド及びスルホンイミドの製造方法及びその中間体を提供する。【解決手段】アクリダン環の窒素原子と、他の芳香族又はヘテロ芳香族環化合物の炭素原子との間の結合生成によるＮ−アリール置換中間体の調製である。アリール化反応は、パラジウム触媒によって接触される。Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体は、光発成方法に有用であり、かつ、ペルオキシダーゼ酵素と酵素阻害剤とのアッセイ及び酵素標識化特異結合対を用いるアッセイに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（１）、
2004517924.tif 000017
（式中、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｚは、Ｏ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１が−ＮＲ１０Ｒ１１基であり、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係にアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルフォニル及びアリールスルフォニル基から選択され、かつ、Ｒ１０及びＲ１１はＮと結合して脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができ、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法であって、
ａ）化学式、
2004517924.tif 000018
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるアクリドン化合物（２）を、化学式、
2004517924.tif 000019
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるアクリダン化合物（３）に還元する工程と、
ｂ）アクリダン化合物（３）を、不活性溶媒中で塩基及びパラジウム触媒の存在下、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのハロゲン化物並びにアリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのスルフォネートエステルから選択されるアリール化化合物と反応させることによって、該アクリダン化合物（３）を、化学式、
2004517924.tif 000020
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りであり、Ａｒは、アリール、置換されたアリール又はヘテロアリール環基である）で表わされるＮ−アリールアクリダン化合物（４）に転化する工程と、
ｃ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を、カルボニル含有基がアクリダン環の９位に結合するカルボキシル化反応によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に転化する工程と、
を含むことを特徴とするＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
上記パラジウム触媒が２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製されるもので、ここでＬはいずれも不安定配位子であり、Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル及びアリール基から選択される請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
第３級ホスフィンが、Ｐ（ｔ−Ｂｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰから選択される請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
配位子Ｌがカルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
アクリドン化合物（２）を、Ｎａ／Ｈｇアマルガム、Ａｌ／Ｈｇアマルガム、銅クロマイト、ＮＨ２ＮＨ２及び水素化物還元剤から選択される還元剤を用いる反応によって還元する請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
基  −ＮＲ１０Ｒ１１が、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、ベンヅオキサゾール、チアゾール及びベンゾチアゾール基から選択される環基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
基  −ＮＲ１０Ｒ１１において、Ｒ１０及びＲ１１の一つがアルキルスルフォニル又はアリールスルフォニル基であり、かつ、他のＲ１０又はＲ１１がアルキル、フェニル又は置換されたフェニル基である請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
ＺがＯ又はＳであり、Ｒ１が少なくとも１個の電子吸引基で置換された置換アルキル及び置換アリール基から選択される請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
電子吸引基がハロゲン原子である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
Ｒ１がトリフルオロフェニル基である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
Ｒ２〜Ｒ９のいずれもが水素原子である請求項１に記載の製造方法。
【請求項１３】
工程ｃが、
（ｉ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を塩基と反応させ、Ｎ−アリールアクリダンのアニオンを生成し、
（ｉｉ）該アニオンをＣＯ２で捕捉し、化学式、
2004517924.tif 000021
で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸（５）を生成し、かつ、
（ｉｉｉ）Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を化合物  ＨＺ−Ｒ１と反応させて、化合物（１）を生成すること包含する請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を酸誘導体に転化する反応にカップリング剤を使用し、該カップリング剤がチオニルクロリド、ＰＣｌ３、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、強酸及び強塩基から選択されるものである請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
工程ｃが、
（ｉ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を塩基と反応させ、Ｎ−アリールアクリダンのアニオンを生成し、
（ｉｉ）該アニオンを、化学式  Ｘ−ＣＯ−ＺＲ１（式中、Ｘは脱離基である）で表わされる試薬と反応させることを包含する請求項１に記載の製造方法。
【請求項１６】
化学式（１）、
2004517924.tif 000022
（式中、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｚは、Ｏ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１が−ＮＲ１０Ｒ１１基であり、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係にアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルフォニル及びアリールスルフォニル基から選択され、かつ、Ｒ１０及びＲ１１はＮと結合して脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができ、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法であって、
上記に定義した通りの基Ｚ及びＲ１〜Ｒ９を有するアクリダンカルボン酸誘導体（６）、
2004517924.tif 000023
を、不活性溶媒中で塩基及びパラジウム触媒の存在下、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのハロゲン化物並びにアリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのスルフォネートエステルから選択されるアリール化化合物と反応させることによって、該アクリダンカルボン酸誘導体（６）をＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体（１）に転化することを含むことを特徴とするＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項１７】
上記パラジウム触媒が２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製されるもので、ここでＬはいずれも不安定配位子であり、Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル及びアリール基から選択される請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
第３級ホスフィンが、Ｐ（ｔ−Ｂｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰから選択される請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
配位子Ｌがカルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される請求項１７に記載の製造方法。
【請求項２０】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項１６に記載の製造方法。
【請求項２１】
化学式（１）、
2004517924.tif 000024
（式中、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｚは、Ｏ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１が−ＮＲ１０Ｒ１１基であり、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係にアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルフォニル及びアリールスルフォニル基から選択され、かつ、Ｒ１０及びＲ１１はＮと結合して脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができ、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法であって、
ａ）アクリダンカルボン酸（７）、
2004517924.tif 000025
を、不活性溶媒中で塩基及びパラジウム触媒の存在下、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのハロゲン化物並びにアリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのスルフォネートエステルから選択されるアリール化化合物と反応させることによって、該アクリダンカルボン酸（７）をＮ−アリールアクリダンカルボン酸（５）に転化する工程と、
ｂ）Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸（５）を化合物ＨＺ−Ｒ１（但し、Ｚ及びＲ１は上記に定義した通りである）と反応させ、化合物（１）を生成する工程と、
を含むことを特徴とするＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項２２】
Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を酸誘導体に転化する反応にカップリング剤を使用し、該カップリング剤がチオニルクロリド、ＰＣｌ３、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、強酸及び強塩基から選択されるものである請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
上記パラジウム触媒が２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製されるもので、ここでＬはいずれも不安定配位子であり、Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル及びアリール基から選択される請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２４】
第３級ホスフィンが、Ｐ（ｔ−Ｂｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰから選択される請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
配位子Ｌがカルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２６】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２７】
化学式（１）、
2004517924.tif 000026
（式中、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｚは、Ｏ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１が−ＮＲ１０Ｒ１１基であり、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係にアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルフォニル及びアリールスルフォニル基から選択され、かつ、Ｒ１０及びＲ１１はＮと結合して脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができ、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法であって、
ａ）化学式、
2004517924.tif 000027
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるアクリドン化合物（２）を、不活性溶媒中で塩基及びパラジウム触媒の存在下、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのハロゲン化物並びにアリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのスルフォネートエステルから選択されるアリール化化合物（但し、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）によって、化学式、
2004517924.tif 000028
（式中、ＡｒとＲ２〜Ｒ９とは上記に定義した通りである）で表わされるＮ−アリールアクリドン化合物（８）に転化する工程と、
ｂ）Ｎ−アリールアクリドン化合物（８）を、化学式、
2004517924.tif 000029
（式中、ＡｒとＲ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるＮ−アリールアクリダン化合物（４）に還元する工程と、
ｃ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を、カルボニル含有基がアクリダン環の９位に結合するカルボキシル化反応によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に転化する工程と、
を含むことを特徴とするＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法。
【請求項２８】
上記パラジウム触媒が２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製されるもので、ここでＬはいずれも不安定配位子であり、Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル及びアリール基から選択される請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
第３級ホスフィンが、Ｐ（ｔ−Ｂｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰから選択される請求項２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
配位子Ｌがカルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される請求項２８に記載の製造方法。
【請求項３１】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３２】
化学式、
2004517924.tif 000030
（式中、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされる化合物又はその塩。
【請求項３３】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ａｒが、フェニル、置換されたフェニル、ナフチル、置換されたナフチル基から選択される基である請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ２〜Ｒ９のいずれもが水素原子である請求項３２に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ２〜Ｒ９のいずれもが水素原子である請求項３４に記載の化合物。
【請求項３７】
塩がアルカリ金属塩から選択される請求項３２に記載の化合物。
【請求項３８】
化学式（１）、
2004517924.tif 000031
（式中、Ｒ１は、アルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｚは、Ｏ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１が−ＮＲ１０Ｒ１１基であり、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係にアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルフォニル及びアリールスルフォニル基から選択され、かつ、Ｒ１０及びＲ１１はＮと結合して脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができ、Ｒ２〜Ｒ９はいずれも相互に無関係でＣ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択される基である）で表わされる化合物であって、
ａ）化学式、
2004517924.tif 000032
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるアクリドン化合物（２）を、化学式、
2004517924.tif 000033
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りである）で表わされるアクリダン化合物（３）に還元する工程と、
ｂ）アクリダン化合物（３）を、不活性溶媒中で塩基及びパラジウム触媒の存在下、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのハロゲン化物並びにアリール、置換されたアリール及びヘテロアリールのスルフォネートエステルから選択されるアリール化化合物と反応させることによって、該アクリダン化合物（３）を、化学式、
2004517924.tif 000034
（式中、Ｒ２〜Ｒ９は上記に定義した通りであり、Ａｒは、アリール、置換されたアリール又はヘテロアリール環基である）で表わされるＮ−アリールアクリダン化合物（４）に転化する工程と、
ｃ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を、カルボニル含有基がアクリダン環の９位に結合するカルボキシル化反応によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に転化する工程と、
を含む製造方法によって製造されたことを特徴とする化合物。
【請求項３９】
基Ａｒが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリヂル、キノリル、アクリヂニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基から選択され、そのいずれの任意の基も、ハロゲン、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、−ＣＨＯ、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アリキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルフォネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基から選択される１種以上の置換基を含有できるものである請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
基  −ＮＲ１０Ｒ１１が、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、ベンヅオキサゾール、チアゾール及びベンゾチアゾール基から選択される環基である請求項３８に記載の化合物。
【請求項４１】
基  −ＮＲ１０Ｒ１１において、Ｒ１０及びＲ１１の一つがアルキルスルフォニル又はアリールスルフォニル基であり、かつ、他のＲ１０又はＲ１１がアルキル、フェニル又は置換されたフェニル基である請求項３８に記載の化合物。
【請求項４２】
ＺがＯ又はＳであり、Ｒ１が少なくとも１個の電子吸引基で置換された置換アルキル及び置換アリール基から選択される請求項３８に記載の化合物。
【請求項４３】
電子吸引基がハロゲン原子である請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｒ１がトリフルオロフェニル基である請求項４２に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｒ２〜Ｒ９のいずれもが水素原子である請求項３８に記載の化合物。
【請求項４６】
カルボキシル化反応工程（ｃ）が、
（ｉ）Ｎ−アリールアクリダン（４）を塩基と反応させ、Ｎ−アリールアクリダンのアニオンを生成し、
（ｉｉ）該アニオンをＣＯ２で捕捉し、化学式、
2004517924.tif 000035
で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸（５）を生成し、かつ、
（ｉｉｉ）Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を化合物  ＨＺ−Ｒ１と反応させて、化合物（１）を生成することを包含する請求項３８に記載の化合物。
【請求項４７】
製造工程（ｂ）のパラジウム触媒が２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製されるもので、ここでＬはいずれも不安定配位子であり、Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル及びアリール基から選択される請求項３８に記載の化合物。
【請求項４８】
製造工程（ｂ）の第３級ホスフィンが、Ｐ（ｔ−Ｂｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰから選択される請求項３８に記載の化合物。
【請求項４９】
配位子Ｌがカルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される請求項４７に記載の化合物。
【請求項５０】
アクリドン化合物（２）を、Ｎａ／Ｈｇアマルガム、Ａｌ／Ｈｇアマルガム、銅クロマイト、ＮＨ２ＮＨ２及び水素化物還元剤から選択される還元剤を用いる反応により製造工程（ａ）において還元する請求項３８に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造に有用な合成法及び中間体に関する。Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体は、例えば、過酸化物とペルオキシダーゼとの反応によって、化学ルミネセンスを発生する方法に有用である。化学ルミネセンス反応はペルオキシダーゼ酵素又は過酸化水素検出用分析方法に有用である。それはまた、ペルオキシダーゼを標識として用い、かつ、過酸化水素を生成するオキシダーゼ酵素を検出する方法に用いる、各種の生体分子を検出し、定量する方法に有用である。
【０００２】
背景技術
生体分子を感度よく検出および定量する方法としては、これまで特定分子を放射性同位元素で標識する方法が使われてきた。最近になって、放射性物質の持つ危険性やその取り扱いの難しさを解消するため、放射性物質を使わない方法が数多く開発されてきている。試料物質を酵素と結合させ、その触媒作用による基質の反応を測定する方法を使えば、増幅した形で反応が観測されるため、最も高感度で検出を行うことができる。そのため、着色光、蛍光、化学ルミネセンスを発生する基質が作られるようになり、特に化学ルミネセンスによる高感度の検出が可能となってきている。
【０００３】
測定の感度がさらに向上すれば、微量物質の検出が可能となり、また測定に必要な時間や試薬の量が削減できるため、化学ルミネセンスの用途は一層広がる。このような酵素を用いた化学ルミネセンスアッセイの検出速度および感度を向上させるためには、例えば、基質としてより発光効率が高い物質、または長時間発光可能な物質を選ぶ必要がある。
【０００４】
イムノアッセイ、オリゴヌクレオチドの検出、およびハイブリッド核酸の作成などの酵素結合検出法に使われる酵素としては、これまでホースラディッシュペルオキシダーゼが最も一般的であった。従来知られている化学ルミネセンス試薬では、分析時の感度の限界などにより、この酵素の特性を最大限に活かすことができなかった。ペルオキシダーゼ抱合体（ｃｏｎｊｇａｔｅ）を用いて超高感度の検出を行うには、より微量な酵素の検出ができる試薬が要求される。具体的には、バックグラウンドの発光レベルや分析に不要な領域の発光レベルを上げることなく、特定領域において高い発光レベルを持つような試薬が必要である。この化学ルミネセンスの増強は、従来既知の化合物よりも最大光度を上げるか、または発光持続時間を長くすることで達成できる。
【０００５】
ａ．Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体の酵素酸化
本出願人による米国特許第５，４９１，０７２号公報、第５，５２３，２１２号公報、第５，５９３，８４５号公報、第５，６７０，６４４号公報、第５，７２３，２９５号公報及び第５，７５０，６９８号公報には置換及び無置換のＮ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体を酸化して化学ルミネセンスを発生するペルオキシダーゼ酵素の使用が開示されている。ペルオキシダーゼ酵素と過酸化物の存在下で、Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体が効果的に酸化されて、Ｎ−アルキルアクリドンと青色の化学ルミネセンスを生成する。Ｎ−アリール置換アクリダンカルボン酸誘導体は開示されていない。
【０００６】
米国特許第６，０３０，８０３号公報では、ペルオキシダーゼ酵素用化学ルミネセンス基質として、置換アルコキシ又はアルキルチオ脱離基を有するアクリダンカルボン酸の群が開示されているが、アリールオキシ又はアリールチオ脱離基を有するものは開示されていない。Ｎ−アリールアクリダン化合物は請求の範囲に記載されてはいるが、Ｎ−アリール化合物の実施例は提供されてはいない。化合物の全例は、アクリダン環の窒素原子への置換基としてメチル基を含有していた。
【０００７】
米国特許第６，１６２，６１０号公報には、ペルオキシダーゼ酵素用化学ルミネセンス基質として置換アルコキシ、アルキルチオ又はアミド脱離基を有する一群のアクリダンカルボン酸誘導体が開示されている。請求の範囲記載の化合物は、トリガー基であるとされる−ＯＸという記号の基を有する。しかし、Ｎ−アリール化合物の例が提示もされず、トリガー効果を示す根拠もない。
【０００８】
窒素原子に結合するヘテロ芳香族基を有するＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体は、上記刊行物又は引用したいずれの刊行物にも、或いは、本発明以前の如何なる他の刊行物にも、教示も示唆もされていない。
【０００９】
目的
そこで、本発明の目的は、化学ルミネセンス発生に用いるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の合成方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造方法に有用な合成中間体を提供することにある。本発明の更に他の目的は、化学ルミネセンス発生に用いるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体を提供することにある。また、本発明の目的は、分析及び検出方法に用いるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体を提供することにもある。更に、生体物質及び化合物の検出のための化学ルミネセンス方法を提供することも目的の一つである。また、本発明の目的は、ペルオキシダーゼ酵素と酵素抱合体との検出に用いる化学ルミネセンス法を提供することでもある。更にまた、本発明の目的は、核酸アッセイ、結合たんぱくアッセイ、ウェスタンブロット、サザンブロット及び他のＤＮＡとＲＮＡのハイブリッド形成アッセイにおける溶液又は表面上における用途のための、また、酵素イムノアッセイにおけるハプテン、たんぱく質及び抗体の検出のための、優れた方法を提供することにある。
【００１０】
好適実施形態の説明
定義
鎖又は環基のような有機部分を表わすときに使用する「置換された」の語は、鎖又は環における１個以上の水素原子を、他の原子又は基で置き換えることをいう。基の例としては、ハロゲン原子、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、ホルミル（−ＣＨＯ）、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基などがある。
【００１１】
ここで用いる「脱離基能」という語は、アクリダンカルボン酸誘導体のカルボニル基に結合している基が、過酸化物又は過酸化水素若しくはそのアニオンを含む本発明の求核反応において置き換えられる性質をいう。
【００１２】
本発明は、化学式、
2004517924.tif 000002
（式中、Ｒ１はアルキル、置換されたアルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリール、置換されたアリール及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２〜Ｒ９は相互に無関係に、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含む置換基から選択され、Ａｒはアリール、置換されたアリール又はヘテロアリール基であり、ＺはＯ及びＳ原子から選択されるか、又は基ＺＲ１は−ＮＲ１０Ｒ１１基で、ここで、Ｒ１０及びＲ１１は相互に無関係に、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、アルキルスルホニル及びアリールスルホニル基から選択され、かつ、Ｒ１０とＲ１１はＮと結合して、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、チアゾール及びベンゾチアゾール基を包む、脱離基能を持ったヘテロ環を形成することができる）で表されるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に関する。
【００１３】
Ｒ１０又はＲ１１がアルキルスルフォニル、又はアリールスルフォニル基である場合、一方は、好ましくはメタンスルフォニル、トリフルオロメタンスルフォニル、ベンゼンスルフォニル又は置換されたベンゼンスルフォニル基であり、他のＲ１０又はＲ１１は、好ましくはアルキル、フェニル又は置換されたフェニル基である。Ｒ１が置換されたアルキル、又は置換されたアリール基の場合には、当該基は１個以上の電子吸引基、好ましくはハロゲン原子で、最も好ましくはフッ素原子で置換されている。
【００１４】
Ｎ−アリール基を含有する化学式Ｉで表される化合物は、化学ルミネセンス発光法に有用である。かかる化合物は、全て環の窒素原子に置換されているのがアルキル基、通常メチル基である従来の既知化合物とは異なるものである。対照的に、本発明の化合物は、環の窒素原子に芳香族又はヘテロ芳香族環基を有する。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリジル、キノリル、アクリジニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基がある。アリール、又はヘテロアリール基は、上記の如く１個以上の置換基で置換することができ、このことは、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体のオキシダントとの反応から発光を生ぜしめ、即ち発光を阻止も妨害もするものではない。アリール基に存在し得る代表的な置換基は、制限されるものではないが、ハロゲン原子、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、ホルミル（−ＣＨＯ）、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基がある。
【００１５】
好適な化合物の数例は、
2004517924.tif 000003
であって、式中、Ｘは電子吸引基、Ｙは非水素原子置換基であり、ｍとｎとはそれぞれ０〜５の整数であり、Ｒ１０とＲ１１とは、上記に定義した通りであるものである。好ましくは、Ｒ１０はアルキルスルフォニル又はアリールスルフォニルであり、かつ、Ｒ１１はアルキル又はアリール基である。好適な電子吸引基はハロゲン原子であり、より好ましくは塩素又はフッ素原子である。かかる電子吸引基の数ｍは、好ましくは少なくとも１であり、より好ましくは少なくとも２である。
【００１６】
好適な化合物の他の群は、
2004517924.tif 000004
であって、式中、Ｘ，ｍ，Ｒ１０及びＲ１１は上記に定義したとおりであり、Ｎｐはナフチル基であるものである。
【００１７】
更に、別の好適な化合物は化学式、
2004517924.tif 000005
で表されるもので、式中、ａｌｋｙｌ−Ｘｍは置換されたアルキル基であり、Ｘ，Ｙ及びｍとｎとは上記に定義したとおりであり、かつ、ＺはＯ又はＳであるものである。
【００１８】
更に、本発明は、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の製造に用いる新規な方法及び合成中間体に関する。本出願人は、化学式、
2004517924.tif 000006
で表されるアクリドン又は環置換アクリドンを出発物質とし、化学式、
2004517924.tif 000007
で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）を製造する新規方法を見出した。ここで、アクリドンは、市販されてはいないが、「Ａｃｒｉｄｉｎｅｓ， Ｒ． Ｍ． Ａｃｈｅｓｏｎ著、出版者Ｗｉｌｅｙ，（１９７３年）第ＩＩＩ章、第１４３〜１９６頁」に記載されている如く、１）２−アミノ−２’−ハロベンゾフェノン誘導体の環化、２）ジフェニルアミン−２−カルボン酸の環化、３）９−クロロアクリジン及び９−メトキシアクリジンの加水分解、及び４）３−フェニルアントラニルの転位、などの既知技法によって調製することができる。アクリドン化合物は、ケトン部分の還元によって、対応するアクリダンに還元される。還元は、前記「Ａｃｒｉｄｉｎｅｓ」の第２０１〜２頁に記載されている如きケトン還元用既知薬剤で実施でき、それにはＮａ／Ｈｇアマルガム、Ａｌ／Ｈｇアマルガム、銅クロマイト、ＮＨ２ＮＨ２、塩基及びエチレングリコールなどがある。他の方法としては、アクリドンを９−クロロアクリジン化合物に転化し、次いでラネーニッケルで還元する。更に、ケトンをＬｉＡｌＨ４の如き水素化還元剤で還元することができる。
【００１９】
このように生成した置換又は無置換のアクリダン化合物を、Ｎ−アリール化反応と、カルボン酸誘導体の一部である−Ｃ（＝Ｏ）ＺＲ１を結合させる反応方法とを伴う方法によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に転化させる。アリール化工程とカルボキシレート結合工程とは、下記に詳述する如く合成スキームにおいて種々の時点で実施することができる。
【００２０】
合成方法の第一の実施形態においては、アクリダン化合物を、塩基とパラジウム触媒との存在下、不活性溶媒中でアリールハロゲン化物とスルフォネートエステルとから選択されるアリール化化合物と反応させてＮ−アリールアクリダン化合物を生成する。
2004517924.tif 000008
【００２１】
この点について、アリール基には、芳香族及びヘテロ芳香族の環型化合物が含まれる。ハロゲン化合物はヨウ化物、臭化物及び塩化物である。スルフォネートエステルには、トリフルオロメタンスルホネート（トリフレート）や、脱離基として活性を有する他のエステルがある。好ましいパラジウム触媒は、２価のパラジウム化合物ＰｄＬ２と第３級ホスフィンＰＲ３とから調製され、ここで各Ｒはいずれも相互に無関係にアルキル基及びアリール基から選択される。好適な２価の化合物ＰｄＬ２は、カルボキシレートエステル、ハロゲン及びケトンから選択される不安定な配位基を持つ任意の２価のパラジウム化合物を含み、酢酸パラジウム、塩化パラジウム、パラジウムビス（ジベンジリデンアセトン）Ｐｄ（ｄｂａ）２及びＰｄ２（ｄｂａ）３がある。好適な第３級ホスフィンには、トリアルキルホスフィン、例えばＰ（ｔ−Ｂｕ）３、トリアリールホスフィン、例えばＢＩＮＡＰ及び混合アルキルアリールホスフィン、例えばＤＰＰＥ、ＤＰＰＦ、ＤＰＰＢ及びＤＰＰＰがある。塩基には、ＫＨＰＯ４、ＣｓＣＯ３及びアルコキサイド塩、例えばナトリウムｔ−ブトキサイドがある。この工程に有用な不活性溶媒にはトルエン、ベンゼン、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジグリムなどがある。溶媒は反応物の加熱を可能にするため、約５０℃以上の沸点を有するのが好ましい。しかし、反応は室温又は高温で実施できる。
【００２２】
次いで、Ｎ−アリールアクリダン化合物を、カルボニル含有基がアクリダン環の９位に結合するカルボキシル化反応によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸に転化する。カルボニル含有基は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はその塩、カルボキシルエステル基（−ＣＯＯＲ１）、チオエステル基（−ＣＯＳＲ１）又はアミド基（−ＣＯＮＲ１０Ｒ１１）であり得る。Ｎ−アリールアクリダンのカルボン酸誘導体への転化は、強塩基での処理による９位でのアクリダンアニオンの生成と、次いで、カルボニル含有基に結合する薬剤との反応を伴う。
【００２３】
この転化は、９位にアニオンを発生するＮ−アリールアクリダンと塩基との反応と、ＣＯ２によるアニオンの捕捉によるＮ−アリールアクリダンカルボン酸又はその塩の製造との２工程で達成し得る。引き続いて、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸の、化合物ＨＺ−Ｒ１（式中、ＺとＲ１とは上記に定義したとおりである）との反応によって、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸をＺ−Ｒ１基を有する各種酸誘導体（Ｉ）のいずれかに転化する。酸の酸誘導体への転化を促進するのに、カップリング剤を用いるのが好ましい。一実施形態では、先ず、一般に当業界既知の方法により、例えば、チオニルクロリド（ＳＯＣｌ２）又はＰＣｌ３の使用により、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を酸クロリドに転化する。酸クロリドを、塩基の存在下、式ＨＺ−Ｒ１で表される化合物と反応させるか、又は、化合物ＨＺ−Ｒ１の塩と反応させる。他の実施形態では、ジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミドカップリング剤の補助により、又は、カルボニルジイミダゾール、ＣＤＩにより、酸を化合物ＨＺ−Ｒ１に縮合させる。別の実施形態では、酸誘導体生成の触媒作用をするカップリング剤として、強酸又は強塩基を使用する。
【００２４】
Ｎ−アリルアクリダンのＮ−アリルアクリダンカルボン酸誘導体への転化は、上記の９位のアニオンと、エステル（−ＣＯＯＲ１）、チオエステル（−ＣＯＳＲ１）又はアミド（−ＣＯＮＲ１０Ｒ１１）の基の１種を直接結合させている式Ｘ−ＣＯ−ＺＲ１で表される薬剤との反応によって、一工程で完結させることができる。好適な薬剤はカルボキシル化剤のカルボニル基に結合しているハロゲンのような脱離基Ｘを有する。従って、好適な薬剤には、クロロホルメートエステル（Ｃｌ−ＣＯＯＲ１）、クロロチオホルメートエステル（Ｃｌ−ＣＯＳＲ１）、及びカルバモイルクロリド（Ｃｌ−ＣＯＮＲ１０Ｒ１１）がある。
【００２５】
本発明は更に、第２の実施形態として、アクリダンカルボン酸又は酸誘導体の生成の後に、Ｎ−アリール化工程を実施するＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）製造についての合成法に関する。例示方法（ａ）においては、アクリダン−９−カルボン酸誘導体又はアクリダン−９−カルボン酸を、上記のようなアリール化試薬及びパラジウム触媒と反応させて、Ｎ−アリール化を実施する。Ｎ−アリール化反応をカルボン酸について実施する場合には、その後、生成物Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸を、Ｚ及びＲ１が上記に定義したとおりの化合物ＨＺ−Ｒ１と反応させることによって、酸誘導体（Ｉ）に転化させる。酸の酸誘導体への転化を促進するために、上記のカップリング剤を用いることが好ましい。
2004517924.tif 000009
【００２６】
アクリダン−９−カルボン酸は市販されているが、また、科学文献を参考にすることによって、有機化学の当業者に既知の方法を用いて調製することができる。環に置換されたアクリダン−９−カルボン酸も同様に類似の方法によって調製することができる。
【００２７】
本発明は更に、第３の実施態様として、アクリドン又は環に置換したアクリドンを上記Ｎ−アリール化反応方法に従ってＮ−アリール化を進める、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）の製造についての合成法に関する。Ｎ−アリールアクリドン中間体を、次に、上記方法の一つに従いケトン部分の還元によって、対応するＮ−アリールアクリダンに還元する。次いで、上記の１工程か、又は２工程のいずれの方法を経て、カルボニル含有の基をアクリダン環の９位に結合させるカルボキシル化反応により、Ｎ−アリールアクリダン化合物をＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体に転化する。
2004517924.tif 000010
【００２８】
本発明の他の面は、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の調製に使用される合成中間体に関する。特に、次式、
2004517924.tif 000011
で表わされるＮ−アリールアクリダンカルボン酸化合物（ＩＩ）及びそのカルボン酸塩（式中、Ｒ２〜Ｒ９が相互に無関係に、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ及びハロゲン原子から選択される１〜５０個の原子を含有する置換基から選択され、Ａｒは、アリール、置換されたアリール又はヘテロアリール基である）に関する。
【００２９】
代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、ピレニル、ピリジル、キノリル、アクリジニル、フリル、キサンテニル、チエニル、チオキサンチル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イミダゾリル及びピロリル基がある。アリール又はヘテロアリール基は上述のとおり定義された１個以上の置換基で置換でき、これは過酸化物とペルオキシダーゼと反応する際、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体からの発光を生ぜしめ、即ち発光を阻止も阻害もするものではない。Ａｒはフェニル、置換したフェニル及びナフチル基から選択されるのが好ましい。アリール基に存在できる代表的な置換基は限定されるものではないが、ハロゲン原子、トリハロメチル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アンモニウム、ヒドラジニル、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボアルコキシ、ホルミル（−ＣＨＯ）、ケト、アミノ、置換されたアミノ、イミノ、イミド、アリール、アルキル、パーフルオロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、ホスホニウム、ホスフェート及びホスホネート基が挙げられる。式（ＩＩ）で表される好ましい化合物としては、Ｒ２〜Ｒ９のいずれもが水素原子であるか又は、Ｒ２〜Ｒ９の一つがアルコキシ基であり、他はいずれも水素原子である。化合物（ＩＩ）が塩の形態で存在する場合には、対イオンは、カルボキシル化反応に使用される強塩基の対イオンと同じとなる。好適な対イオンはアルカリ金属イオンである。
【００３０】
本発明の他の面は、本発明のＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）とオキシダントとの、可視的化学ルミネセンスを発生する反応に関する。一実施形態では、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体と、アクリダン環の９位の陽子、即ち、陽子αを非プロトン性溶媒中の分子状酸素の存在下で、カルボニルへ移すことができる塩基との反応により、化学ルミネセンスを生ずる。好適な塩基には、ヒドロキサイド塩、アルコキサイド塩、例えばナトリウムメトキサイド及びカリウムｔ−ブトキサイド、及びテトラアルキルアンモニウムフッ化物がある。有用な非プロトン性溶媒には、ジメチルスルフオキサイド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランがある。
【００３１】
他の方法では、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体と過酸化物及びペルオキシダーゼ酵素を含むオキシダント系との反応により化学ルミネセンスを生じる。この反応系は、アッセイへの応用に極めて有用である。化学ルミネセンスは、下記の一般化反応に示されるように、Ｎ−アリールアクリドン又は置換されたＮ−アリールアクリドン生成物の励起状態から生ずると思われる。
2004517924.tif 000012
【００３２】
本発明の化合物は、一般に放射線の１００〜２００ｎｍの広域帯に亘って発光し、電磁スペクトルの可視領域への近紫外の波長で最大強度を示す。最大強度λｍａｘの典型的な波長は３５０〜５００ｎｍの範囲内である。共有結合した蛍光保持体を有する式Ｉの化合物は、蛍光保持体の励起状態から、より長い波長での放射線を生じる分子内エネルギー転移を行うことができるものと予想される。
【００３３】
化学ルミネセンス反応を行うことができるペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えば、バナジウム・ブロモペルオキシダーゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、カビペルオキシダーゼ、例えば、リグニンペルオキシダーゼ並びにアルトロマイセス・ラモサスからのペルオキシダーゼ及び白腐れ病菌に生じるＭｎ依存ペルオキシダーゼ及び大豆ペルオキシダーゼがある。鉄錯体やＭｎ−ＴＰＰＳ４を含む、酵素ではないがペルオキシダーゼ様活性を有する、他のペルオキシダーゼ模擬化合物は、ここで用いられるペルオキシダーゼの意味合の範囲内にあることは、明白である（Ｙ．−Ｘ．Ｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ，Ｊ．５２、２５７〜６２（１９９５））。ペルオキシダーゼと生体分子との抱合体又は錯体もまた、ペルオキシダーゼ活性を示す場合に限り、化学ルミネセンス生成方法に使用することができる。ペルオキシダーゼの１個又はそれ以上の分子に抱合され得る生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、たんぱく質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンがある。ペルオキシダーゼを包含し、又は合体させる錯体、例えば、リポソーム、ミセル、小胞及び生体分子へ結合する機能を有するポリマーもまた、本発明の方法に用いることができる。
【００３４】
本発明の化合物は、ペルオキシダーゼの存在下で発光する試薬組成物に有用である。この組成物は、水溶液中、好ましくは緩衝溶液中にアクリダンと過酸化化合物を含有し、この場合、過酸化物はアクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与する。所望に応じて、組成物は、下記の追加成分、
化学ルミネセンス反応からの発光を強化する化合物、
組成物へのペルオキシダーゼの添加に先立って、過酸化化合物が反応することを防止するキレート剤、及び／又は、
モノマー性又はポリマー性の化合物を含む非イオン、陰イオン及び陽イオン性の化合物を含む界面活性剤、のいずれか、又は全部を含有することができる。
【００３５】
過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応可能な任意の過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドである。
【００３６】
好適な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物及び過硼酸塩がある。
【００３７】
好適な緩衝剤には、ｐＨを約６〜約１０の範囲内に維持できる任意の通常用いられる緩衝剤で、例えば、ホスフェート、ボレート、カルボネート、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、グリシン、トリシン、２−アミノ−２メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミンなどがある。
【００３８】
有用な化学ルミネセンス強化化合物は、酵素の反応性を促進する業界既知の化合物である。これらの強化剤の内に含まれるものとしては、他のペルオキシダーゼ反応を強化することが知られているフェノール性化合物及び芳香族アミンであって、Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｌ．Ｋｒｉｃｋａ，ｉｎ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，１９９−２０８頁（１９８７年），Ｍ．Ｉｉ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｈ．Ｍａｓｕｙａ，Ｔ．Ｈａｄａ，Ｍ．Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．Ｈａｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｉｃｈｉｍｏｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３巻（２），５４０−５頁（１９９３年），及び米国特許第５，１７１，６６８号公報及び第５，２０６，１４９号公報に記載されており、これらは参考のために本明細書に取り入れられているものである。米国特許第５，５１２，４５１号公報及び第５，６２９，１６８号公報に開示され、参考のために本明細書に取り入れられている置換又は無置換のアリールボロン酸化合物及びそのエステル並びに無水物誘導体もまた、本発明に有用な強化剤の範囲内にあると考えられる。さらに、他の強化剤化合物は、米国特許第５，１７１，６６８号公報及び第５，２０６，１４９号公報に開示されている。また、ＰＣＴ特許第ＷＯ９７／３９１４２号公報に開示されているように、フェノチアジン及びフェノキサジン化合物も含まれる。好適な強化剤を挙げると、これらに限定されるものではないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールがある。上掲の類別のものから、２種以上の強化剤の混合物もまた、使用することができる。これらの強化剤化合物は、ペルオキシダーゼへの副基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として働き、可逆的酸化を行うと考えられる。
【００３９】
キレート剤には、カチオン錯化剤があり、ここで該薬剤はキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）及びこれらの塩から成る群から選択し得るものである。
【００４０】
本発明の有用性を更に高めるためには、ペルオキシダーゼ酵素の不存在下で、過酸化水素とＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体との反応からの化学ルミネセンス発生を抑制する添加剤が使用される。ナトリウム・ドデシルサルフェート（ＳＤＳ）のようなアニオン性界面活性剤やカチオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステルなど、ある種の界面活性剤により、より大きい化学ルミネセンス信号及びバックグラウンド比に対してより良好な信号が得られることによって、本発明のアッセイにおけるペルオキシダーゼ酵素検出感度が改善されることが見出された。この改善は、おそらくアクリダン誘導体の自動酸化分解を遅らせることにより、添加ペルオキシダーゼの不存在下でのバックグラウンド化学ルミネセンスが最小化することによってなされるものである。本発明組成物の各種成分の好適量を下記に説明する。
【００４１】
表１  ペルオキシダーゼ酵素での化学ルミネセンス発生用試薬組成物
アクリダン      ０．０１〜１０ｍＭ
強化剤          ０．００１〜１０ｍＭ
界面活性剤      ０．００５〜５％
過酸化物        ０．０１〜１０ｍＭ
キレート剤      ０．０１〜５ｍＭ
【００４２】
この溶液を、溶液中にあるか、又は、固形支持体に付着させることのできるペルオキシダーゼ酵素と接触させる。試薬の最適濃度は、各組成物に対して別個に決定しなければならない。アクリダン化合物と強化剤の濃度は特に、光放射の最大強度を生じさせるために、各場合で注意深く最適化すべきである。検出反応は、少なくとも２０〜４０℃の範囲を含む温度範囲に亘って実施することができる。検出は簡便、かつ、有利に環境温度で実施できる。
【００４３】
本発明方法による放射光は、任意の好適な既知の方法、例えば、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーション計数管、化学光量計又は視覚的な方法によって検出することができる。各検出法は異なるスペクトル感度を有する。人間の眼は緑色の光に最適の感度を有し、ＣＣＤカメラは赤色光に最大感度を示し、Ｘ線フィルムは、紫外から青色光又は緑色光への感応が最大であることを利用可能である。検出装置の選択は、適用分野及びコスト、便利さ及び長期記録の作成が必要かどうかの考慮によって支配される。
【００４４】
本発明の他の面は、化学ルミネセンス反応によるアッセイ手順においてペルオキシダーゼ酵素又はペルオキシダーゼ酵素に結合しているかあるいは結合の可能性のある分析試料（ａｎａｌｙｔｅ）を検出するための方法にある。この方法は、化学式Ｉのアクリダンと過酸化物及びペルオキシダーゼ酵素とを反応させて化学ルミネセンスを発生させること、化学ルミネセンス量を検出すること、及び化学ルミネセンスの量を分析試料又は酵素の量と関連付けることを包含するものである。
【００４５】
本発明はまた、化学ルミネセンス反応によるアッセイ手順における過酸化水素検出方法に関する。この方法は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ酵素を化学式Ｉのアクリダンと反応させて化学ルミネセンスを発生させ、かつ、化学ルミネセンスの量を過酸化物の量と関連付けることを包含するものである。
【００４６】
更に本発明は、化学結合により、又は物理的相互作用により、この酵素と結合する各種の生体分子を検出し、定量する方法の用途に関する。更にまた、本発明は、例えば、ビオチン標識した分析試料及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ抱合体を用いることによる、ペルオキシダーゼと結合した、あるいは結合の可能性のある各種生体分子を検出し、定量する方法の用途に関する。当業界で既知の他の高親和性結合対、例えば、フルオレセインと抗フルオレセイン、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン又は相補的核酸配列もまた、本発明を実施する目的で、ペルオキシダーゼ酵素を分析試料に結合させる手段として容易に使用することができる。得られた化学ルミネセンスの強度は、標識された有機の若しくは生体分子の量の直接的な尺度を示すことになる。例えば、本方法は、イムノアッセイの技術によるハプテン、抗原及び抗体、ウェスタンブロッティングによるたんぱく質、並びにサザン及びノーザンブロッティングによるＤＮＡとＲＮＡとを夫々検出するのに使用できる。該方法はまた、ＤＮＡ配列決定分野でのＤＮＡ検出にも使用できる。
【００４７】
本方法は更に、酵素、例えば、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ガラクトース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びアミノ酸オキシダーゼによって生成した過酸化水素を検出するのに使用できる。従って、本方法は、過酸化水素を生成する上述の酵素の検出方法としても使用できる。
【００４８】
更に別の実施形態としては、本発明方法は酵素阻害剤の検出と測定に使用することができる。阻害剤は、酵素に不可逆的に結合して該酵素を変性させることにより、又は、酵素に可逆的に結合し、かつ、基質と競合することによって、可逆的若しくは不可逆的に作用することができる。例えば、ペルオキシダーゼ阻害剤には、シアン化物、硫化物及び高濃度過酸化水素がある。更に、若干の物質はある濃度でのみ抑制性であり、また、部分的にのみ抑制性であり得ることが分かっている。本発明に従って酵素阻害剤を検出する方法においては、化学式（１）の化合物を阻害剤の存在下と不存在下で、ペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させ、その結果を比較して阻害剤の存在及び量を測定する。阻害剤の作用は、光強度を低減し得、光強度の上昇速度を遅らせるか、又は、光放射開始前期間を遅延させることができ、若しくはこれらの作用の任意の組合せを得ることができる。
【００４９】
実施例
アクリダン誘導体の合成  アクリダンカルボン酸誘導体１ａ〜ｑを本発明の方法に従って合成した。
2004517924.tif 000013
【００５０】
表２  調製したＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体
2004517924.tif 000014
【００５１】
実施例１、化合物１ａ
１Ｌの丸底フラスコに、１６．８０ｇの水素化アルミニウムリチウム（０．４４２７モル）と３００ｍＬのジエチルエーテルを仕込んだ。水素放出終了後、２５．００ｇの９（１０Ｈ）アクリドン（０．１２８１モル）を３００ｍＬに分割したトルエンとともにフラスコに添加した。次に、灰色のスラリーをアルゴンでパージし、反応物を加熱して還流した。混合物を３時間撹拌し、得られた、黄色固体を含有する混合物を０℃に冷却し、添加漏斗経由で１６．８ｍＬの水を滴下処理した。水素放出が生じ、１００ｍＬの追加ジエチルエーテルを混合物に添加した。発泡が生じたら、１５（重量）％ＮａＯＨ溶液１６．８ｍＬを混合物に滴下し、更に５０．４ｍＬの水を加えた。得られた粒状の沈澱を吸引濾過によって単離し、２ＬのＣＨ２Ｃｌ２で完全に洗浄した。固形分を廃棄し、有機濾液を濃縮乾燥した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルでクロマトグラフ処理し、２１．０９ｇのアクリダンを白色固体として得た（９０．８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．０５（ｓ，２Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｄ，２Ｈ），６．８５（ｔ，２Ｈ），７．０５−７．１１（ｍ，４Ｈ）．
【００５２】
１８．１２ｇのアクリダン（０．１０モル）、１７．３０ｇのブロモベンゼン（０．１１モル）、１４．４０ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（０．１５モル）、１．１２ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（５ミリモル）及び０．８１ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（４ミリモル）を１００ｍＬの乾燥トルエンに投入し、この反応混合物を不活性雰囲気下で撹拌した。発熱反応物を還流まで加熱し、次に、室温まで冷却し、１時間撹拌を続けた。薄層クロマトグラフ解析が反応の完結を示したので、反応混合物をシリカゲルの小型プラグ（ｐｌｕｇ）を通過させ、続いて１ＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。濾液を濃縮、乾燥し、カラムクロマトグラフィによって精製し、２５．２１ｇのＮ−フェニルアクリダンを得た（９８．０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２３（ｓ，２Ｈ），６．１８−６．２０（ｄ，２Ｈ），６．８２−６．９６（ｍ，４Ｈ），７．１３−７．１５（ｄ，２Ｈ），７．３２−７．３４（ｄ，２Ｈ），７．４７−７．５２（ｔ，１Ｈ），７．５９−７．６４（ｔ，２Ｈ）．
【００５３】
Ｎ−フェニルアクリダン（１４．１５ｇ、５５ミリモル）を不活性雰囲気下に乾燥ＴＨＦ２００ｍＬに溶解した溶液を−７８％に冷却し、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ブチルリチウム３３．０ｍＬ（８２．５ミリモル）を２０分に亘って滴下、添加した。溶液を−７８℃で３０分間撹拌し、次に３５分に亘って室温まで加温した。反応混合物を再び−７８℃に冷却し、３５０ｇの粉砕ドライアイスを添加して沈澱を生ぜしめた。反応物を徐々に室温まで加温し、反応物を均一化した。室温で、アルゴン雰囲気下に撹拌を続行した。得た沈澱を吸引濾過によって収集し、固形物を１００ｍＬの水に溶解し、２ＮのＨＣｌを用いて酸性化して、ｐＨ３とし、２００ｍＬの酢酸エチル４回を用いて抽出した。収集した有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮、乾燥して粗製物８．７２ｇを得た。反応混合物濾液もまた、濃縮、乾燥して固形物を得、これを３００ｍＬの水に投入した。水溶液を酸性化し、３×２００ｍＬの塩化メチレンを用いて抽出し、合体した有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して二次生成物３．４４ｇのＮ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸を得た（７３．４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．１２（ｓ，１Ｈ），６．３０−６．３３（ｄ，２Ｈ），６．８８−６．９３（ｔ，２Ｈ），７．０２−７．０７（ｔ，２Ｈ），７．２５−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．５２（ｔ，１Ｈ），７．５８−７．６３（ｔ，２Ｈ）．
【００５４】
１００ｍＬの乾燥アセトニトリル（ＭｇＳＯ４）中、３．００ｇの酸（９．９６ミリモル）の溶液に、不活性雰囲気下、２．１０ｇのカルボニルジイミダゾール（１２．９ミリモル）を添加した。１０分間撹拌後、１．４１ｇのフェノール（１４．９ミリモル）を反応物に加え、これを１８時間撹拌した。追加の１．０５ｇのカルボニルジイミダゾール（６．４８ミリモル）と０．７１ｇのフェノール（７．５５ミリモル）を反応物に添加し、これを７２時間撹拌し続けた。反応混合物を真空内にて濃縮し、得られた褐色の油状物質を、ヘキサン中５％の酢酸エチルを用い、シリカゲルのクロマトグラフ処理を行い、褐色油状物質として２．２８ｇのエステル（１ａ）を得た（６０．６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３７（ｓ，１Ｈ），６．３４−６．３７（ｄ，２Ｈ），６．９２−６．９６（ｍ，４Ｈ），７．０４−７．１０（ｍ，２Ｈ）．７．１４−７．１９（ｔ，１Ｈ），７．２６−７．５２（ｍ，６Ｈ），７．５８−７．６３（ｔ，２Ｈ）．
【００５５】
クロロギ酸フェニルを用いた反応による１ａ合成の別法  ３０ｍＬの無水ＴＨＦ中、１．００ｇのＮ−フェニルアクリダン（３．９ミリモル）を不活性雰囲気下、０℃に冷却し、１０ｍＬのヘキサン中への２．３ｍＬ（３．８ミリモル）の２．５モル・ｎ−ブチルリチウム溶液を１５分間に滴下処理した。得られた暗褐色の溶液を１５分間に亘って室温まで加温した後、１．４６ｍＬのクロロギ酸フェニル（０．０１１７モル）を迅速に添加した。３０分後、薄層クロマトグラフ解析で数種類の生成物の生成が見られた。反応混合物を更に撹拌しても、薄層クロマトグラフによる変化は見られなかったので、反応混合物を褐色の油状物になるまで、真空中で濃縮し、シリカゲルカラムにより、ヘキサン中５〜１０％の酢酸エチルで溶出、分離した。
【００５６】
実施例２、化合物１ｂ
実施例１記載の如く調製したＮ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸６．０９ｇ（２０．２ミリモル）を１００ｍＬ乾燥アセトニトリル（ＭｇＳＯ４）に溶解した溶液に、不活性雰囲気下、４．２６ｇのカルボニルジイミダゾール、ＣＤＩ（２６．３ミリモル）を添加した。１０分間撹拌後、４．３８ｇの４−クロロチオフェノール（３０．３ミリモル）を反応物に添加し、１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色の固形分を、ヘキサン中５％〜２０％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによりクロマトグラフ処理し、黄色固体を得、酢酸エチルとヘキサンとで再結晶し、４．４０ｇのチオエステルを白色固体として得た（５５．３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３０（ｓ，１Ｈ），６．３５−６．３８（ｄ，２Ｈ），６．９３−６．９８（ｔ，２Ｈ），７．０８−７．１３（ｔ，２Ｈ），７．１９−７．２２（ｄ，２Ｈ），７．２９−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．３８−７．４１（ｄ，２Ｈ），７．５０−７．５５（ｔ，１Ｈ），７．６１−７．６６（ｔ，２Ｈ）．
【００５７】
実施例３、化合物１ｃ
Ｎ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸（０．３６ｇ、１．２ミリモル）と２５２ｍｇのＣＤＩ（１．５５ミリモル）との溶液を、不活性雰囲気下、３０ｍＬの乾燥アセトニトリルで調製した。１５分間撹拌後、２６５．４ｍｇの２，３，６−トリフルオロフェノール（１．８ミリモル）を添加し、１時間撹拌を継続した。反応混合物を真空中で濃縮し、粗製物をヘキサン中５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルのカラムによりクロマトグラフ処理し、油状残渣として１７１．３ｍｇのエステル生成物を得た（３９．７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．５１（ｓ，１Ｈ），６．３４−６．３７（ｄ，２Ｈ），６．８１−６．８９（ｍ，１Ｈ），６．９３−７．００（ｍ，３Ｈ），７．０６−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．４１（ｍ，４Ｈ），７．４８−７．５３（ｔ，１Ｈ），７．５９−７．６４（ｔ，２Ｈ）．
【００５８】
実施例４、化合物１ｄ
３．００ｇのＮ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸（１０ミリモル）と２．１０ｇのＣＤＩ（１２．９ミリモル）との溶液を、不活性雰囲気下、１００ｍＬの乾燥アセトニトリルにて調製した。１０分間撹拌後、２．３９ｇの２−ナフタレンチオール（１４．９ミリモル）を反応物に添加し、溶液を更に１時間撹拌した。薄層クロマトグラフ解析で生成物の生成が示されたので、反応混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮してゴム状褐色の固形物を得た。固形物をジエチルエーテル中で再懸濁し、濾過して、ヘキサン中２５〜１００％のＣＨ２Ｃｌ２を用いて溶離するカラムクロマトグラフィーにより精製して、純粋なチオエステル生成物２．１６ｇを白色固体として得た（４８．９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３４（ｓ，１Ｈ），６．３７−６．３９（ｄ，２Ｈ），６．９４−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．０９−７．１４（ｔ，２Ｈ），７．２９１−７．３３（ｄ，１Ｈ），７．３６−７．５５（ｍ，７Ｈ），７．６１−７．６６（ｔ，２Ｈ），７．７４−７．８３（ｍ，４Ｈ）．
【００５９】
実施例５、化合物１ｅ
７０ｍＬの乾燥トルエン中に、５．０ｇのアクリダン（０．０２７モル）、１８６ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（８．２×１０−４モル）、１８６ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（８．２×１０−４モル）、３．９７ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（０．０４１モル）及び６．１２ｇの１−ブロモ−２，６−ジメチルベンゼン（０．０３３モル）を含有する混合物を、アルゴン気流下に１６時間、室温で撹拌した。薄層クロマトグラフ解析では、まだ、出発物質の存在が示されたので、反応混合物を８５℃で３時間加熱した。反応混合物を冷却し、濾過し、沈澱をジエチルエーテルで洗浄した。濾液を２インチのセライトのプラグを通過させ、濃縮して褐色の固形物とした。粗製物をヘキサン中５％〜２０％のＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、５．１ｇ（６６．２％）のＮ−（２，６−ジメチルフェニル）アクリダンを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂２．０６（ｓ，６Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），６．０１−６．０３（ｄ，２Ｈ），６．８１−７．２９（ｍ，１０Ｈ）．
【００６０】
１００ｍＬのＴＨＦ中、４．２８ｇのＮ−（２，６−ジメチルフェニル）アクリダン（１５ミリモル）の溶液を、アルゴン気流下、−７８℃に冷却した。１０分後、７．６ｍＬのｎ−ＢｕＬｉ（１８．７ミリモル）を加えた。黒色溶液を３０分撹拌し、次いで温度を４０分間で０℃まで上昇させた。反応物を再び、−７８℃に冷却し、２７０ｇの粉砕ドライアイスを反応混合物に添加して、白色沈澱を伴う黄色溶液を生成し、反応物を室温まで加温したら白色沈澱は溶解した。反応物を室温で１６時間撹拌し、次いで、濃縮して、水とジエチルエーテルとの混合物に投入した。水性部分をＨＣｌで酸性化して、白色沈澱を得、それを濾過、乾燥して４．８ｇのＮ−（２，６−ジメチルフェニル）−アクリダン−９−カルボン酸を白色固体として得た（９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）∂１．８３（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），５．１２（ｓ，１Ｈ），５．９８−６．０１（ｄ，２Ｈ），６．８７−７．３７（ｍ，１０Ｈ），１２．４７（ｂｓ，１Ｈ）．
【００６１】
上記の酸（６．１ミリモル）と１．０３ｇのＣＤＩ（６．４ミリモル）とを、３０ｍＬのＴＨＦへ溶解した溶液を、不活性雰囲気下で１０分間撹拌したとき、１．１ｇのｐ−クロロチオフェノール（７．６ミリモル）を反応混合物に添加した。２０分後、反応混合物をヘキサン中５％〜４０％のＣＨ２Ｃｌ２にてシリカゲルによるクロマトグラフ処理を行って、２．１ｇの白色固体を得た（７５．５％）。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、白色固体が所望のチオエステルであると確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．９２（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），５．３７（ｓ，１Ｈ），６．１６−６．１９（ｄ，２Ｈ），６．９２−７．３７（ｍ，１３Ｈ）．
【００６２】
実施例６、化合物１ｆ
実施例５に記載の通りに調製したＮ−（２，６−ジメチルフェニル）−アクリダン−９−カルボン酸２．０ｇ（６．１ミリモル）と、ＣＤＩ１．０３ｇ（６．４ミリモル）とを、３０ｍＬのＴＨＦへ溶解した溶液を不活性雰囲気下、１０分間撹拌してから、２−ナフタレンチオール１．２１ｇ（７．６ミリモル）を反応混合物に添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、次いで、反応混合物をヘキサン中３０％のＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルによりクロマトグラフ処理をして、１．４ｇの所望のチオエステルを得た（４９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．９４（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｓ，（３Ｈ），５．４２（ｓ，１Ｈ），６．１７−６．２０（ｄ，２Ｈ），６．９４−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．０９−７．１５（ｔ，２Ｈ），７．２６−７．４９（ｍ，８Ｈ），７．７４−７．８２（ｍ，４Ｈ）．
【００６３】
実施例７、化合物１ｇ
５５ｍＬの乾燥トルエン中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、０．２６０ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１６ミリモル）、０．２２３ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（１．１モル）、８．７５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（９１ミリモル）及び６．９０ｍＬのブロモアニソール（６０．７ミリモル）の混合物を、アルゴンでパージし、黒色溶液を室温で撹拌した。１０分後、２０ｍＬの追加トルエンを濃厚な溶液に添加し、反応物を１時間撹拌し続けた。反応混合物を濾過し、収集した沈澱を５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で、次に５０ｍＬのＴＨＦで、洗浄した。次いで、沈澱を水中で１時間細粉化し、吸引濾過によって収集し、空気乾燥させた。ＮＭＲ解析により、１１．５ｇのＮ−（４−メトキシフェニル）アクリダンを純粋な状態で分離したことが示された（７２．５％）。１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．９０（ｓ，３Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），６．２３（ｄ，２Ｈ），６．８４（ｔ，２Ｈ），６．９５（ｔ，２Ｈ），７．１２（ｍ，４Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ）．
【００６４】
２２０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、Ｎ−（４−メトキシフェニル）アクリダン（９．２３ｇ、３２．１ミリモル）を不活性雰囲気下、−７８℃に冷却し、２０ｍＬの２．５モルｎ−ブチルリチウム（４８．２ミリモル）溶液を滴下して処理した。反応混合物を室温まで加温し、暗褐色溶液を得、これを２０分間撹拌した。反応物を再び−７８℃に冷却し、３５０ｇのドライアイスを溶液に加えた。反応物を室温まで加温し、１２時間撹拌した。得られたスラリーを吸引濾過によって分離し、固形物を３０ｍＬのＴＨＦで洗浄し、３００ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。水溶液をｐＨ２まで酸性化し、乳白色溶液から暗色の油状物を分離した。溶液をデカンテーションし、３×１００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、集めた有機相を硫酸ナトリウムによって乾燥し、濃縮、乾燥して所望の生成物１．８ｇを得た。暗色の油状物を酢酸エチルに抽出し、有機相を硫酸ナトリウムによって乾燥し、濃縮、乾燥して、カルボン酸生成物：不純物を１：１で含有する固形物５．９５ｇを得た。総収量７．７５ｇであった。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．９０（ｓ，３Ｈ），５．１１（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｄ，２Ｈ），６．９１（ｔ，２Ｈ），７．０５（ｔ，２Ｈ），７．１０（ｄ，２Ｈ），７．２４（ｄ，４Ｈ）．
【００６５】
２０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中に０．９２ｇの酸（２．７８ミリモル）を溶解した溶液に、不活性雰囲気下、０．５９ｇのＣＤＩ（３．６２ミリモル）を添加した。１０分間撹拌後、０．６０ｇの４−クロロチオフェノール（４．１８モル）を反応物に添加し、これを３時間撹拌し続けた。反応混合物を、ヘキサン中、５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をして、３１０ｍｇのチオエステルを得た（２４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．８９（ｓ，３Ｈ），５．２８（ｓ，１Ｈ），６．４０（ｄ，２Ｈ），６．９３（ｔ，２Ｈ），７．０７−７．１３（ｍ，４Ｈ），７．１８（ｄ，２Ｈ），７．２６−７．３２（ｍ，６Ｈ）．
【００６６】
実施例８、化合物１ｈ
１０．０２ｇのアクリダン（５５．３ミリモル）、１２．６７ｇの２−ブロモナフタレン（６１．２ミリモル）、８．０２ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８３．５ミリモル）、０．２５ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１１ミリモル）及び０．１９ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．９４ミリモル）を１００ｍＬの乾燥トルエンに投入し、反応混合物を不活性雰囲気下に１８時間撹拌し続けた。薄層クロマトグラフとＮＭＲとの解析で出発物質の存在が示されたので、０．１９ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．９４モル）とＰｄ（ＯＡｃ）２とを反応混合物に添加したが、発熱反応のため反応混合物は室温以上に加温された。更に２時間撹拌を追加した後、薄層クロマトグラフ解析で反応完結が示された。反応混合物を濃縮して黒色油状物とし、ヘキサン中４％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をして、白色固体１４．０２ｇを得た。ＮＭＲ解析により、所望のＮ−（２−ナフチル）アクリダンを８２．６％収率で単離したことを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２７（ｓ，２Ｈ），６．２２（ｄ，２Ｈ），６．８２−６．９４（ｍ，４Ｈ），７．１７（ｄ，２Ｈ），７．３９（ｄｄ，１Ｈ），７．５２−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．８７−７．９０（ｍ，２Ｈ），７．９７（ｄ，１Ｈ），８．１０（ｄ，１Ｈ）．
【００６７】
２００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、Ｎ−（２−ナフチル）アクリダン（９．００ｇ、２９．３ミリモル）を、不活性雰囲気下で−７８℃に冷却し、ヘキサン（４５ミリモル）中、２．５モルｎ−ＢｕＬｉの１８ｍＬを加えた。溶液を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで、室温まで加温した。反応混合物を、固体ＣＯ２を含有する別個の、栓のあるフラスコにシリンジを用いて添加し、室温まで徐々に加温した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、黄色固形物を得、アセトンで洗浄して不純物を除去した。残った白色固体を水に溶解し、ｐＨ２〜３に酸性化し、酢酸エチルで抽出した。合体した有機相を硫酸マグネシウムによって乾燥し、濃縮して褐色の粘着性固形物（８．２１ｇ）とした。ＮＭＲ解析により、固形物は所望の酸と若干の不純物との両方を含むことが判明した。この生成物を、更に精製することなく直接エステル化反応に移した。
【００６８】
８０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中、粗製Ｎ−（２−ナフチル）アクリダン−９−カルボン酸（８．２１ｇ、約２３．４ミリモル）の溶液に、不活性雰囲気下、５．３１ｇのＣＤＩ（３２．７ミリモル）を添加した。１５分間撹拌した後、５．４１ｇの４−クロロチオフェノール（３７．４ミリモル）を反応物に添加し、更に１８時間撹拌を続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、ヘキサン中３％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、不純な、白っぽい固形物（６．５７ｇ）を得た。この固形物を（シリカゲル、ヘキサン中２％の酢酸エチル使用の）カラムクロマトグラフィにより、再び精製してＮＭＲ解析で２０〜２５％の所望生成物を含有する固体４．１２ｇとＮＭＲ解析で７５〜８０％の所望生成物を含有する固体０．９６ｇとを得た。これらの固体を夫々ヘキサン中５％の酢酸エチルで再クロマトグラフ処理して、合体量１．０４ｇの所望エステルを白色固体として得た（２工程に亘って２４．４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３４（ｓ，１Ｈ），６．３９（ｄ，２Ｈ），６．９２−７．００（ｍ，２Ｈ），７．０３−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．２３−７．２６（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．４０（ｍ，４Ｈ），７．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．５４−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．８８−７．９３（ｍ，２Ｈ），７．９９（ｄ，１Ｈ），８．１２（ｄ，１Ｈ）．
【００６９】
実施例９、化合物１ｉ
不活性雰囲気下に５０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中、実施例８記載の通りに調製したＮ−（２−ナフチル）アクリダン−９−カルボン酸（８．０４ｇ、約２２．９ミリモル）に４．８９ｇのＣＤＩ（３０．１ミリモル）を添加した。５分間撹拌後、５．６９ｇの２−ナフタレンチオール（３５．５ミリモル）を反応物に加え、更に１８時間撹拌を続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に投入、水で抽出した。抽出ＣＨ２Ｃｌ２から得た物質を、ヘキサン中１０％酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、粗製固体を得た（５．８５ｇ）。この固体を（シリカゲル、ヘキサン中５％の酢酸エチルで）カラムクロマトグラフィにより再び精製し、合体して合計４．４０ｇのやや不純な生成物を得た（〜６５％）。物質１．０７ｇを含む留分の一種は、ＮＭＲ解析により〜９０％純度であった。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３８（ｓ，１Ｈ），６．４０−６．４２（ｄ，２Ｈ），６．９６−７．００（ｔ，２Ｈ），７．０６−７．１２（ｔ，２Ｈ），７．３３−７．６１（ｍ，８Ｈ），７．７６−７．８０（ｍ，７Ｈ），８．０７−８．１３（ｍ，１Ｈ）．
【００７０】
実施例１０、化合物１ｊ
１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、１４．１５ｇの４−ブロモビフェニル（６０．７ミリモル）、７．９５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．７ミリモル）、０．２５ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１０ミリモル）及び０．１８ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）を５０ｍＬの乾燥トルエンに投入し、この反応混合物を不活性雰囲気下、１時間撹拌し続けた。薄層クロマトグラフ解析により反応完結を確認したので、３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとを反応混合物に加えた。混合物を撹拌し、濾過し、固形物を１．５ＬのＣＨ２Ｃｌ２を添加して洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、沈澱を含む濃厚液を得た。沈澱を濾過して集め、ヘキサンによって洗浄し、乾燥して１Ｈ−ＮＭＲ解析によって確認した所望の生成物１３．０９ｇを得た。母液を濃縮して黄色固体とし、ヘキサン中で粉砕した。固体を濾過によって集め、生成物の第二次収穫品を得た。濾液を再び濃縮し、ヘキサンを用いて粉砕し、濾過して、１Ｈ−ＮＭＲ解析で確認した〜１０％の不純物を含む生成物の第三次収穫品を得た。３ロットの生成物を合体して、１８．６０ｇのＮ−ビフェニルアクリダンを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２５（ｓ，２Ｈ），６．２８−６．３１（ｄ，２Ｈ），６．８４−６．８９（ｔ，２Ｈ），６．９５−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．１５−７．１７（ｄ，２Ｈ），７．３８−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．４８−７．５３（ｔ，２Ｈ），７．６８−７．７１（ｄ，２Ｈ），７．８２−７．８５（ｄ，２Ｈ）．
【００７１】
Ｎ−ビフェニルアクリダン（１３．０９ｇ、３９ミリモル）を、不活性雰囲気下、２００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。溶液を−７８℃に冷却し、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉ２３．６ｍＬ（５９ミリモル）を、１５分間に亘って滴下、添加した。溶液を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで３０分間で室温に加温した。反応混合物を再び−７８℃に冷却し、４００ｇの粉砕ドライアイスを添加し、沈澱生成を生じた。反応物を室温まで徐々に加温したところ、反応物が均一になった。アルゴン気流下、室温で撹拌を継続し、反応混合物は再び沈澱を生じた。１８時間撹拌後、沈澱を吸引濾過によって収集し、３００ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。固形物を５００ｍＬの水中で撹拌し、次いで、１５％ＮａＯＨ（水溶液）５０ｍＬで処理したが、均一な溶液は得られなかった。混合物を２Ｎの塩酸を用いて酸性化してｐＨ３とし、３×８００ｍＬの酢酸エチルを用いて抽出した。合体した有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮、乾燥して淡黄色の固体を得た。この固体をヘキサン中で粉砕し、濾過乾燥して５．７９ｇのカルボン酸を得た。ヘキサン洗浄からの濾液をも濃縮、乾燥して、生成物の二次製品を得た。合計収量は１０．９７ｇであった（７４．０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．０６（ｓ，１Ｈ），６．３７−６．３９（ｄ，２Ｈ），６．８８−６．９０（ｍ，２Ｈ），７．０１−７．０３（ｍ，２Ｈ），７．２８−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．４６−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．６７−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．８０−７．８３（ｍ，２Ｈ）．
【００７２】
１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ（ＭｇＳＯ４）中に２．２０ｇの当該酸（５．８ミリモル）を溶解した溶液に、不活性雰囲気下に１．２３ｇのＣＤＩ（７．６ミリモル）を加えた。１５分間撹拌の後、１．２６ｇの４−クロロチオフェノール（８．７ミリモル）を反応物に添加し、更に１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色の油状物をヘキサン中５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルでのクロマトグラフ処理をし、白色固体として１．９０ｇ（６４．６％）のチオエステルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．３２（ｓ，１Ｈ），６．４５−６．４８（ｄ，２Ｈ），６．９５−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．１１−７．１６（ｔ，２Ｈ），７．２０−７．２３（ｄ，２Ｈ），７．２９−７．３６（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．５３（ｍ，５Ｈ），７．６８−７．７１（ｄ，２Ｈ），７．８３−７．８６（ｄ，２Ｈ）．
【００７３】
実施例１１、化合物１ｋ
実施例１０で調製した通りのＮ−ビフェニルアクリダン−９−カルボン酸（１．５０ｇ、４ミリモル）の、乾燥ＴＨＦ（ＭｇＳＯ４）１００ｍＬ中の溶液を不活性雰囲気下、０．８４ｇのＣＤＩ（５．２ミリモル）を用いて処理した。１５分間撹拌後、０．８９ｇの２，３，６−トリフルオロフェノール（６ミリモル）を反応物に添加し、更に９０時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色の残渣を、ヘキサン中５％〜１０％の酢酸エチルを用いてシリカゲルのクロマトグラフ処理をし、白色固体を得た。不純な生成物を、ヘキサン中５０％のＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルのクロマトグラフで再処理し、白色固体として１．３０ｇ（６４．７％）のエステルを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．５３（ｓ，１Ｈ），６．４５−６．４８（ｄ，２Ｈ），６．８１−６．８９（ｍ，１Ｈ），６．９４−７．０５（ｍ，３Ｈ），７．０９−７．１５（ｔ，２Ｈ），７．３８−７．５３（ｍ，７Ｈ），７．６８−７．７０（ｄ，２Ｈ），７．８２−７．８４（ｄ，２Ｈ）．
【００７４】
実施例１２、化合物１ｌ
３００ｍＬの乾燥ＣＨ３ＣＮ（ＭｇＳＯ４）中、８．００ｇのＮ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸（２６．６ミリモル）及び５．６０ｇのＣＤＩ（３４．５ミリモル）の溶液を不活性雰囲気下で１時間撹拌した。２，６−ジメチルチオフェノール（５．５０ｇ、３９．８ミリモル）を反応物に添加し、これを１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色の固形物を、ヘキサン中５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルのクロマトグラフ処理をし、２’，６’−ジメチルチオフェニル１０−フェニルアクリダン−９−カルボキシレート６．４９ｇを得た（５８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂２．０９（ｓ，６Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ），６．３３−６．３６（ｄ，２Ｈ），６．９０−６．９５（ｔ，２Ｈ），７．０４−７．１７（ｍ，５Ｈ），７．３２−７．３４（ｄ，２Ｈ），７．３９−７．４１（ｄ，２Ｈ），７．４９−７．５４（ｔ，１Ｈ），７．６０−７．６５（ｔ，２Ｈ）．
【００７５】
実施例１３、化合物１ｍ
２００ｍＬの乾燥トルエン中、１６．２ｇのアクリダン（８９．２ミリモル）、１．００ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（４．４６ミリモル）、０．７２ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（３．５６ミリモル）、１２．９ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（１３４ミリモル）及び１６．６ｇの２−クロロベンゾチアゾール（９８．１ミリモル）の混合物を不活性雰囲気下、室温で７２時間撹拌した。反応混合物を、３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとの混合物に注入した。混合物を濾過し、追加の１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて洗浄し、固形物を廃棄した。濾液を真空中で濃縮し、褐色の固体を得た。固体を２×２００ｍＬのヘキサン中で粉砕し、濾過し、１００ｍＬのヘキサンを追加して洗浄し、乾燥して、ＮＭＲ解析によって、所望生成物：出発物質を２：１で含有する淡褐色固体を得た。固体を５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に取り、７．８ｍＬの塩化オキサリル（８９．４ミリモル）を用いて処理し、分離を促進するために出発物質をより極性の強い誘導体に転化した。混合物を６時間撹拌し、得られた沈澱を濾過によって収集し、１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて洗浄し、ＮＭＲにより解析して、Ｎ−ベンゾチアゾリルアクリダンの純粋なＨＣｌ塩を得たことを確認した。この固体を５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中でトリエチルアミン７．５ｍＬを用いて処理した。１時間撹拌後、混合物を３×４００ｍＬの水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して黄色固体１１．４７ｇを得た。ＮＭＲ分析で該固体が純粋なＮ−ベンゾチアゾリルアクリダンであることを確認した（４１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．９１（ｓ，２Ｈ），７．１６−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．３０−７．３７（ｍ，５Ｈ），７．６０−７．６３（ｄ，１Ｈ），７．７０−７．７３（ｄ，１Ｈ），７．９５−７．９８（ｄ，２Ｈ）．
【００７６】
Ｎ−ベンゾチアゾリルアクリダン（１１．４７ｇ、３６．５ミリモル）を、不活性雰囲気下、５００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。溶液を−７８℃に冷却し、ヘキサン中２．５モルのｎ−ＢｕＬｉ２１．９ｍＬ（５４．７ミリモル）を１５分間に亘って滴下、添加した。溶液を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで３０分かけて室温まで加温した。反応混合物を再び−７８℃に冷却し、粉砕したドライアイス３００ｇを加えた。反応物を徐々に室温まで加温した。１８時間撹拌後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣を３００ｍＬの水に溶解し、濃厚ＨＣｌで酸性化してｐＨ６とした。１５分撹拌後、得られた沈澱を濾過によって収集し、１００ｍＬの水で洗浄し、乾燥して８．９３ｇの固形物を得た。濾液を濃厚ＨＣｌで酸性化してｐＨ３とし、室温で撹拌している間に沈澱を生じた。沈澱を濾過によって収集し、乾燥して２．６５ｇの固体を得た。両収穫物のＮＭＲ解析でＮ−ベンゾチアゾリルアクリダン−９−カルボン酸が単離されたことを確認した（１１．５８ｇ、８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．８２（ｓ，１Ｈ），７．１７−７．２６（ｍ，３Ｈ），７．３２−７．４３（ｍ，５Ｈ），７．６２−７．７０（ｍ，２Ｈ），７．９４−７．９６（ｄ，２Ｈ）．
【００７７】
乾燥ＴＨＦ１００ｍＬ中、２．００ｇの酸（５．５８ミリモル）及び１．１８ｇのＣＤＩ（７．２５ミリモル）の溶液を、不活性雰囲気下、１５分間撹拌した。１．２４ｇの２，３，６−トリフルオロフェノール（８．３７ミリモル）を反応物に加え、それを１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた黄色油状物を（シリカゲル使用、ヘキサン中５％の酢酸エチル及びヘキサン中５０％のＣＨ２Ｃｌ２で）２回クロマトグラフ処理し、白色固体０．６３ｇを得た（２３％）。１Ｈ−ＮＭＲ解析で２’，３’，６’−トリフルオロフェニル−１０−ベンゾチアゾリルアクリダン−９−カルボキシレートの単離を確認した。１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．２９（ｓ，１Ｈ），６．７１−６．８０（ｍ，１Ｈ），６．８６−６．９７（ｍ，１Ｈ），７．２４−７．２８（ｍ，３Ｈ），７．３８−７．４３（ｔ，３Ｈ），７．４８−７．５１（ｄ，２Ｈ），７．６４−７．６７（ｄ，１Ｈ），７．８４−７．９３（ｍ，３Ｈ）．
【００７８】
実施例１４、化合物１ｎ
２５０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、４．００ｇのＮ−ベンゾチアゾリルアクリダン−９−カルボン酸（１１．２ミリモル）及び２．３５ｇのＣＤＩ（１４．５ミリモル）との溶液を不活性雰囲気下で１５分間撹拌した。２．４２ｇのｐ−クロロチオフェノール（１６．７ミリモル）を反応物に添加し、これを１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた黄色油状物をヘキサン中５０％ＣＨ２Ｃｌ２を用いて、シリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、２．４５ｇの白色固体を得た（４５％）。１Ｈ−ＮＭＲ解析で４’−クロロチオフェニル１０−ベンゾチアゾリルアクリダン−９−カルボキシレートの単離が確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂５．０７（ｓ，１Ｈ），７．０２−７．０５（ｄ，２Ｈ），７．１８−７．２１（ｄ，２Ｈ），７．２３−７．３０（ｍ，３Ｈ），７．３９−７．４５（ｍ，５Ｈ），７．６７−７．７０（ｄ，１Ｈ），７．８５−７．９３（ｍ，３Ｈ）．
【００７９】
実施例１５、化合物１ｏ
１５ｍＬのトルエン中、１．００ｇのアクリダン−９−カルボン酸メチルエステル（４．１８ミリモル）、０．４４ｍＬのブロモベンゼン（４．１８ミリモル）、０．６０ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（６．２７ミリモル）、２３ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．１０５ミリモル）及び１７ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．０８４ミリモル）の溶液を、不活性雰囲気下、室温で撹拌した。２．５時間後、１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の５ｇのシリカゲルを反応混合物に添加した。スラリーを濾過し、過剰のＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、濾液を濃縮して濃厚な溶液とした。２０ｍＬのヘキサンをこの溶液に添加して、白色沈澱を生成した。沈澱を濾過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥して０．９６ｇのＮ−フェニルアクリダン−９−カルボン酸メチルエステルを得た（７２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．６６（ｓ，３Ｈ），５．１７（ｓ，１Ｈ），６．３０−６．３３（ｄ，２Ｈ），６．８９（ｔ，２Ｈ），７．０４（ｔ，２Ｈ），７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．３６（ｄ，２Ｈ），７．５０（ｔ，１Ｈ），７．５９−７．６２（ｔ，２Ｈ）．
【００８０】
実施例１６、化合物１ｐ
６００ｍＬのペンタノール中、６０．０ｇのｏ−クロロ安息香酸（０．３８モル）、６０．０ｇの炭酸カリウム（０．４３モル）、４９．８ｇのｍ−アニシヂン（０．４０モル）及び１．９８ｇの粉末銅（０．０３１モル）の溶液を、還流しながら２７時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、黒色固形物を得た。固形物を６００ｍＬの水に溶解し、３００ｍＬの濃厚ＨＣｌ含有の水３Ｌに注入した。得られた黒色の沈澱を濾過によって収集し、２Ｌの水で洗浄し、乾燥して９１．２５ｇの固体Ｎ−（２−カルボキシフェニル）アニシヂン９１．２５ｇを得た（９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤ３ＯＣＤ３）∂３．８０（ｓ，３Ｈ），６．６５−６．６８（ｄ，１Ｈ），６．７８−６．８６（ｍ，３Ｈ），７．２１−７．４４（ｍ，３Ｈ），８．０１−８．０４（ｄ，１Ｈ），９．６（ｓ，１Ｈ）．
【００８１】
２５０ｍＬのＰＯＣｌ３中、９０．２５ｇの当該酸（０．３７モル）の溶液（発熱性）を数分間撹拌し、次いで加熱して還流し、６時間撹拌し続けた。反応混合物を室温まで冷却し、真空中で濃縮した。褐色の残渣を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。５％ＮＨ４ＯＨの水溶液２Ｌを、急速撹拌しながら、徐々に添加した。混合物が発泡停止後、有機相を分離し、硫酸ナトリウムにより乾燥し、暗褐色固体まで濃縮した。固体を１Ｌのヘキサン中で粉砕し、濾過によって収集し、乾燥して９４．３４ｇの黄褐色固体３−メトキシ−９−クロロアクリジンを得た（１０４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．０２（ｓ，３Ｈ），７．２９−７．３３（ｄ，１Ｈ），７．４４−７．４５（ｓ，１Ｈ），７．５６−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．７７−７．８２（ｔ，１Ｈ），８．１４−８．１７（ｄ，１Ｈ），８．３０−８．３３（ｄ，１Ｈ），８．３８−８．４１（ｄ，１Ｈ）．
【００８２】
５ＮのＨＣｌ  ２Ｌ中、９３．３４ｇの３−メトキシ−９−クロロアクリジン（０．３８モル）の溶液を還流しながら４０時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、吸引濾過して沈澱を収集し、１Ｌの水で洗浄して乾燥した。固形物を１Ｌのメタノール中で撹拌して、不溶性の沈澱を濾過によって集め、所望の３−メトキシ−アクリジン１５．３ｇを得た。濾液を真空中で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２中の２０％メタノールで、シリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、暗褐色固体を得た。固体を２００ｍＬのメタノール中で粉砕し、不溶性の沈澱を濾過によって集め、生成物の第２次収穫品を得た。濾液を濃厚な溶液まで濃縮し、生成物の第３次収穫品を濾過によって収集した。生成物の第２次及び第３次収穫品を合体して３−メトキシアクリドン２．６ｇを得、合体物合計量は１７．９ｇであった（２１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．９３（ｓ，３Ｈ），６．８０−６．８７（ｍ，２Ｈ），７．１８−７．２３（ｔ，１Ｈ），７．４３−７．４６（ｄ，１Ｈ），７．５８−７．６４（ｔ，１Ｈ），８．２８−８．３１（ｄ，１Ｈ），８．３５−８．３８（ｄ，１Ｈ），１１．０（ｓ，１Ｈ）．
【００８３】
２００ｍＬのジエチルエーテル中、１５．２９ｇの３−メトキシアクリドン（６７．９ミリモル）の撹拌溶液に、７．７３ｇのＬｉＡｌＨ４を徐々に少量ずつ添加した。Ｈ２の発成が終わった後、不活性雰囲気下で２００ｍＬの乾燥トルエンを添加し、反応物を還流しながら、２時間撹拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、８．０ｍＬの水、８．０ｍＬの１５％の（水性）ＮａＯＨ及び２４．０ｍＬの水を順次、滴下しながら添加した。５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、得られた沈澱を濾過し、５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して廃棄した。濾液を真空中で濃縮し、ヘキサンに再懸濁し、再び濃縮して１４．０６ｇの３−メトキシアクリダンを得た（９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．７７（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），５．９４（ｂｓ，１Ｈ），６．２３（ｓ，１Ｈ），６．４１−６．４４（ｄ，１Ｈ），６．６３−６．６６（ｄ，１Ｈ），６．８２−６．８７（ｔ，１Ｈ），６．９８−７．１０（ｍ，３Ｈ）．
【００８４】
１００ｍＬの乾燥トルエン中、１３．０ｇの３−メトキシアクリダン（５７．７ミリモル）、２５９ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１５ミリモル）、１８７ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．９２ミリモル）、８．３２ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８６．６ミリモル）及び１０．９ｇのブロモベンゼン（６９．２ミリモル）の混合物を不活性雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとの混合物に注入した。混合物を濾過し、５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を追加して洗浄し、固形物を廃棄した。濾液を真空中で濃縮し、黄色固体を得た。固体を１００ｍＬのヘキサン中で粉砕し、濾過し、１００ｍＬのヘキサンを追加して洗浄し、乾燥してＮＭＲ解析で確認した１３．８ｇのＮ−フェニル−３−メトキシアクリダンを得た（８３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．６２（ｓ，３Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），５．７７（ｓ，１Ｈ），６．１６−６．１８（ｄ，１Ｈ），６．４０−６．４３（ｄ，１Ｈ），６．８２−６．８６（ｔ，１Ｈ），６．９０−６．９５（ｔ，１Ｈ），７．０３−７．０６（ｄ，１Ｈ），７．１２−７．１４（ｄ，１Ｈ），７．３０−７．３３（ｄ，２Ｈ），７．４５−７．５０（ｔ，１Ｈ），７．５７−７．６２（ｔ，２Ｈ）．
【００８５】
Ｎ−フェニル−３−メトキシアクリダン（１２．５ｇ、４３．５ミリモル）を不活性雰囲気下に５００ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した。溶液を−７８℃に冷却し、ヘキサン中２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉ２６．１ｍＬ（６５．３ミリモル）を、１５分間に亘って滴下、添加した。溶液を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで室温まで加温した。反応混合物を再び−７８℃に冷却し、３００ｇの粉砕ドライアイスを添加した。反応物を室温まで徐々に加温した。１８時間撹拌後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣を３００ｍＬの水に溶解し、濃厚ＨＣｌで酸性化してｐＨ６とし、１５分撹拌した。得られた沈澱を濾過して収集し、１００ｍＬの水で洗浄し、乾燥してＮＭＲ解析による生成物２．９１ｇを得た。濾液を濃厚ＨＣｌで酸性化してｐＨ４とし、室温で撹拌しながら沈澱を生成した。沈澱を濾過によって集め、１００ｍＬの水で洗浄し、乾燥して生成物の第２次収穫品を得た。同様の方法での酸性化と濾過とにより、第３次及び第４次の生成物収穫品を単離し、合計１０．９７ｇの生成物を得た。各収穫品のＮＭＲ解析で、粗製の酸を単離したことが確認された（１３．９ｇ、９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ）∂３．５４（ｓ，３Ｈ），４．９２（ｓ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），６．１３−６．１５（ｄ，１Ｈ），６．４６−６．４９（ｄ，１Ｈ），６．８２−６．８７（ｔ，１Ｈ），６．９７−７．０１（ｔ，１Ｈ），７．１５−７．１８（ｄ，１Ｈ），７．２２−７．２４（ｄ，１Ｈ），７．３０−７．３５（ｄ，２Ｈ），７．５４−７．５９（ｔ，１Ｈ），７．６６−７．７１（ｔ，２Ｈ）．
【００８６】
２００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、４．００ｇの３−メトキシ−１０−フェニルアクリダン−９−カルボン酸（１２．１ミリモル）及び２．５４ｇのＣＤＩ（１５．７ミリモル）の溶液を不活性雰囲気下で１５分間撹拌した。２．６２ｇの４−クロロチオフェノール（１８．１ミリモル）を反応物に添加し、これを１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色油状物をヘキサン中５０％ＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、４．０６ｇの粘着性白色固体を得た（７３％）。１Ｈ−ＮＭＲ解析で４’−クロロチオフェニル３−メトキシ−１０−フェニルアクリダン−９−カルボキシレートの単離が確認された。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．６６（ｓ，３Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），６．３２−６．３５（ｄ，１Ｈ），６．５１−６．５４（ｄ，１Ｈ），６．９１−６．９６（ｔ，１Ｈ），７．０６−７．１２（ｔ，１Ｈ），７．１９−７．３３（ｍ，６Ｈ），７．３７−７．４０（ｄ，２Ｈ），７．４９−７．５４（ｔ，１Ｈ），７．６０−７．６５（ｔ，２Ｈ）．
【００８７】
実施例１７、化合物１ｑ
１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、２．００ｇの３−メトキシ−１０−フェニルアクリダン−９−カルボン酸（６．０４ミリモル）と１．２７ｇのＣＤＩ（７．８５ミリモル）との溶液を不活性雰囲気下で１５分間撹拌した。１．３４ｇの２，３，６−トリフルオロフェノール（９．０５ミリモル）を反応物に添加し、これを１８時間撹拌し続けた。反応混合物を真空中で濃縮し、得られた褐色の油状物をヘキサン中５０％のＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、黄色液体を得た。液体をジエチルエーテル中で撹拌し、３度真空中で濃縮して、褐色固体を得た。該固体を２５ｍＬのジエチルエーテル中で粉砕し、濾過によって集め、乾燥して５７８ｍｇの２’，３’，６’−トリフルオロフェニル３−メトキシ−１０−フェニルアクリダン−９−カルボキシレートを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂３．６４（ｓ，３Ｈ），５．４６（ｓ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），６．３２−６．３５（ｄ，１Ｈ），６．５１−６．５４（ｄ，１Ｈ），６．８０−６．８８（ｍ，１Ｈ），６．９２−７．１０（ｍ，３Ｈ），７．３０−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．５２（ｔ，１Ｈ），７．５７−７．６２（ｔ，２Ｈ）．
【００８８】
アクリダンの合成  下記の、追補的Ｎ−アリール−アクリダン（３）を、本発明方法に従ってアクリダンと芳香族化合物とのＰｄ接触的結合によって合成した。これは本発明方法に従ってＮ−アリールアクリダンカルボン酸と、酸誘導体（１）とに転化することができる。
2004517924.tif 000015
【００８９】
表３  合成した追補的Ｎ−アリールアクリダン
Ａｒ
４−ＰｉｖＯ−Ｃ６Ｈ４
４−ＮＯ２−Ｃ６Ｈ４
３−ＰｉｖＯ−Ｃ６Ｈ４
３−ＨＯ−Ｃ６Ｈ４
４−Ｆ−Ｃ６Ｈ４
４−（ベンゾチアゾル−２−イル）−フェニル
アントリル
２−ピレニル
４−ＣＮ−Ｃ６Ｈ４
４−ＰｉｖＯ−Ｃ６Ｈ４−Ｃ６Ｈ４
２−Ｃ６Ｈ４Ｎ（ピリジル）
【００９０】
実施例１８  Ｎ−（４’−ピバロイルオキシフェニル）アクリダンの合成
乾燥ＴＨＦ１００ｍＬ中、２０．０２ｇの４−ブロモフェノール（０．１１６モル）の溶液を、１５．０ｍＬのピバロイルクロリド（０．１２６モル）で、次いで、３５．５ｍＬのトリエチルアミン（０．２５５モル）で処理した。大量の白色固体が沈澱したので、追加ＴＨＦ５０ｍＬを混合物に加え、流動性のスラリーを得た。反応混合物を濾過し、沈澱を２００ｍＬのＴＨＦで洗浄してから廃棄した。濾液を真空中で濃縮し、減圧下で乾燥して液を固化して、収量３０．５ｇ（１００％）の４−ブロモフェニルピパレートを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．３５（ｓ，９Ｈ），６．９５（ｄ，２Ｈ），７．８１（ｄ，２Ｈ）．
【００９１】
乾燥トルエン６０ｍＬ中、７．０５ｇのアクリダン（３８．９ミリモル）、０．２１８ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．９７ミリモル）、０．１５７ｇのトリ−ｔ−ブチル−ホスフィン（０．７８ミリモル）、５．６１ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（５８．３ミリモル）及び１０．０ｇの４−ブロモフェニルピバレート（３８．９ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、集められた沈澱をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して廃棄した。濾液を真空中で濃縮し、残渣をヘキサン中５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、純粋なＮ−（４’−ピバロイルオキシフェニル）アクリダン８．６ｇを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．４１（ｓ，９Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），６．２２（ｄ，２Ｈ），６．８５（ｔ，２Ｈ），６．９５（ｔ，２Ｈ），７．１４（ｄ，２Ｈ），７．３３（ｓ，４Ｈ）．
【００９２】
実施例１９  Ｎ−（４’−ニトロフェニル）アクリダンの合成
乾燥トルエン（ＭｇＳＯ４）１５０ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、０．２６ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．１１ミリモル）、０．２０ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）、７．９６ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．８ミリモル）及び１２．３９ｇの１−ブロモ−４−ニトロベンゼン（６１．３ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出し、シリカゲルを通して濾過した。濾液をヘキサン中２．５〜５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をして白色固体を得、これをヘキサン中で粉砕し、濾過、乾燥して収量４．００ｇの純粋なＮ−（４−ニトロフェニル）アクリダン（２４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．１５（ｓ，２Ｈ），６．３５−６．３８（ｄ，２Ｈ），６．９４−７．０６（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．２６（ｄ，２Ｈ），７．５０−７．５４（ｄ，２Ｈ），８．４０−８．４５（ｄ，２Ｈ）．
【００９３】
実施例２０  Ｎ−（３’−ピバロイル−オキシフェニル）アクリダンの合成
乾燥トルエン３０ｍＬ中、１．０ｇのアクリダン（５．５ミリモル）、７９５．４ｍｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８．３ミリモル）、６４．１ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．２９ミリモル）、１．５６ｇの３−ブロモフェニルピバレート（６．０７ミリモル）及び４７．２ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．２３ミリモル）の混合物を不活性雰囲気下、室温で２時間撹拌し続けた。反応混合物をシリカゲルのプラグを通して濾過し、これを５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、ヘキサン中２．５％の酢酸エチルでシリカゲルによるクロマトグラフ処理をして固体を得、これをヘキサン中で粉砕し、濾過乾燥して、８２９．９ｍｇのＮ−（３’−ピバロイルオキシフェニル）アクリダンを得た（４２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．３５（ｓ，９Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），６．２５−６．２７（ｄ，２Ｈ），６．８４−６．８８（ｔ，２Ｈ），６．９５−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．０７−７．０８（ｓ，１Ｈ），７．１３−７．１５（ｄ，２Ｈ），７．２０−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．５９−７．６５（ｔ，１Ｈ）．
【００９４】
実施例２１  Ｎ−（３’−ヒドロキシフェニル）アクリダンの合成
１ＭのＮａＯＨ２．６１ｇ（２．６ミリモル）を含有するメタノール２０ｍＬ中、Ｎ−（３’−ピバロイルオキシフェニル）−アクリダン６２１．９ｍｇの溶液を薄層クロマトグラフ解析で出発物質が消費されたことを確認するまで還流した。溶剤を濃縮し、残渣を水に溶解し、１Ｍ塩酸で酸性化した。得られた沈澱を吸引濾過によって収集し、塩化メチレンを用いて取り、硫酸ナトリウムにより乾燥し、濃縮して粗製油状物とした。油状物をヘキサン中５％の酢酸エチルでシリカゲルによるクロマトグラフ処理をした。精製生成物をヘキサンで処理し、得られた固体を濾過によって収集し、Ｎ−（３’−ヒドロキシフェニル）アクリダン３１５．８ｍｇを得た（６７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２２（ｓ，２Ｈ），６．２５−６．２８（ｄ，２Ｈ），６．８０−６．９８（ｍ，７Ｈ），７．１２−７．１５（ｄ，２Ｈ），７．４４−７．５０（ｔ，１Ｈ）．
【００９５】
実施例２２  Ｎ−（４’−フルオロフェニル）アクリダンの合成
乾燥トルエン９０ｍＬ中、９．０ｇのアクリダン（４９．６ミリモル）、４４６ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（２ミリモル）、３２１ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン、７．１６ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（７４ミリモル）及び９．６ｇの１−ブロモ−４−フルオロベンゼン（５４ミリモル）を、アルゴン気流のもと、室温で２時間撹拌した。薄層クロマトグラフで出発物質の不存在を確認した。反応混合物をブフナー漏斗を通して濾過し、固形物をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。次いで、濾液を真空中で濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に取って再濾過した。濾液を濃縮して乾燥し、ヘキサン中５％酢酸エチルでまた、ＣＨ２Ｃｌ２に変えてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をした。生成物を含有する留分を合体し、濃縮、乾燥して、Ｎ−（４’−フルオロフェニル）アクリダンを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２２（ｓ，２Ｈ），６．１６−６．１９（ｄ，２Ｈ），６．８４−６．８８（ｔ，２Ｈ），６．９３−６．９８（ｔ，２Ｈ），７．１３−７．１６，（ｄ，２Ｈ），７．２９−７．３１（ｄ，４Ｈ）．
【００９６】
実施例２３  Ｎ−［４−（ベンゾチアゾ−２−リル）フェニル］アクリダンの合成
乾燥トルエン２５０ｍＬ中、１５．０ｇの４−ブロモ安息香酸（７４ミリモル）と１３．９ｇの２−アミノチオフェノール（１１０ミリモル）との溶液を４５℃に加熱し、１０．１ｍＬの三塩化リン（１１０ミリモル）をスポイトを用いて反応混合物に徐々に添加した。混合物を４時間還流させた。反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、黄色固形物を得た。固形物を５００ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３に添加し、水溶液を２×２００ｍＬの酢酸エチルを用いて抽出した。合体した有機溶液を水で（３回）洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥し、濃縮、乾涸した。粗製物をカラムクロマトグラフィによって精製し、６．０ｇの２−（４−ブロモフェニル）ベンゾチアゾールを得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂７．３８−７．４３（ｔ，１Ｈ），７．４８−７．５４（ｔ，１Ｈ），７．６２−７．６５（ｄ，２Ｈ），７．９０−７．９３（ｄ，１Ｈ），７．９６−７．９８（ｄ，２Ｈ），８．０６−８．０９（ｄ，１Ｈ）．
【００９７】
トルエン６０ｍＬ中、３．７４ｇのアクリダン（２０ミリモル）、６９ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．３ミリモル）、４４ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．２２ミリモル）、２．８８ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（３０ミリモル）及び６．０ｇの２−（４−ブロモフェニル）ベンゾチアゾール（２０ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下、室温で１時間撹拌した後、５０℃で１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、減圧下に濃縮した。粗製物を、ヘキサン中１５％の酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィにより精製した。ＮＭＲ解析で３．１ｇのＮ−アリール化アクリダン生成物を単離したことを確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．２５（ｓ，２Ｈ），６．２７−６．３０（ｄ，２Ｈ），６．８６−６．９１（ｔ，２Ｈ），６．９５−７．００（ｔ，２Ｈ），７．１６−７．１８（ｄ，２Ｈ），７．４１−７．５７（ｍ，４Ｈ），７．９５−７．９７（ｄ，１Ｈ），８．１１−８．１４（ｄ，１Ｈ），８．３３−８．３６（ｄ，２Ｈ）．
【００９８】
実施例２４  Ｎ−アントラセニルアクリダンの合成
乾燥トルエン１００ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、２４７．７ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１０ミリモル）、１７８．６ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）、７．９５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．７ミリモル）及び１５．６１ｇの９ブロモアントラセン（６０．７ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下で１時間撹拌した。追加のトルエン２００ｍＬを混合物に加え、室温で３０分間撹拌を継続した。反応混合物を６００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとの混合物に注入した。１５分撹拌後、混合物を濾過し、固形物を追加のＣＨ２Ｃｌ２６００ｍＬで洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、濃厚な液体を得、これを５００ｍＬのヘキサンで処理した。１５分撹拌後、沈澱を濾過して集め、５００ｍＬのヘキサンで洗浄し乾燥した。次に固形物を５００ｍＬのヘキサン中で１時間粉砕し、濾過、乾燥して１Ｈ−ＮＭＲ解析で確認したＮ−アントラセニルアクリダン１４．３９ｇを得た。母液を濃縮して黄色固体とし、これを３００ｍＬのヘキサン中で１５分間粉砕した。沈澱を濾過で集め、２００ｍＬのヘキサンで洗浄し、乾燥して５．４０ｇの固体を得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析で生成物の第２収穫品は第１のものよりわずか純度が劣ることを確認した。２ロットを合体して、Ｎ−アントラセニルアクリダン１９．７９ｇを得た（１００％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．５２（ｓ，２Ｈ），５．７０−５．７３（ｄ，２Ｈ），６．６９−６．７４（ｔ，２Ｈ），６．８０−６．８５（ｔ，２Ｈ），７．２２−７．２５（ｄ，２Ｈ），７．３５−７．４０（ｔ，２Ｈ），７．４７−７．５１（ｔ，２Ｈ），７．９１−７．９４（ｄ，２Ｈ），８．１２−８．１５（ｄ，２Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ）．
【００９９】
実施例２５  Ｎ−ピレニルアクリダンの合成
乾燥トルエン１００ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、２４７．７ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１０ミリモル）、１７８．６ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）、７．９５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．７ミリモル）及び１７．０６ｇの１−ブロモピレン（６０．７ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下で撹拌した。発熱反応による加熱で還流し、沈澱を生成させた。追加のトルエン２００ｍＬを混合物に加え、室温で１時間撹拌を継続した。反応混合物を６００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとの混合物に注入した。混合物を濾過し、固形物をＣＨ２Ｃｌ２６００ｍＬで洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、沈澱を含む濃厚な液体を得た。沈澱を濾過して集め、３００ｍＬのトルエンと５００ｍＬのヘキサンで洗浄し乾燥して、１Ｈ−ＮＭＲ解析で確認したＮ−ピレニルアクリダン１２．６９ｇを得た。母液を濃縮して黄色固体とし、これを３００ｍＬのヘキサン中で３０分間粉砕した。沈澱を濾過で集め、２００ｍＬのヘキサンで洗浄し、乾燥して７．４６ｇの固体を得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析で生成物の第２収穫品は第１のものよりわずか純度が劣ることを確認した。２ロットを合体して、Ｎ−ピレニルアクリダン２０．１５ｇを得た（９５．７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．４５（ｓ，２Ｈ），５．９３−５．９６（ｄ，２Ｈ），６．７６−６．８７（ｍ，４Ｈ），７．２２−７．２５（ｄ，２Ｈ），７．９８−８．０６（ｍ，４Ｈ），８．１７−８．２７（ｍ，４Ｈ），８．３７−８．４０（ｄ，１Ｈ）．
【０１００】
実施例２６  Ｎ−（４’−シアノフェニル）アクリダンの合成
乾燥トルエン１００ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、１０．４８ｇの４−ブロモベンゾニトリル（５７．６ミリモル）、７．８９ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．１ミリモル）、０．１８ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．８０ミリモル）及び０．１２４５ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．６２ミリモル）の溶液を、不活性雰囲気下、室温で１８時間と、還流しながら７時間撹拌した。０．１２ｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（０．５３ミリモル）と０．０９ｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．４４ミリモル）とを反応混合物に添加し、これを更に４時間還流した。反応混合物を濃縮して濃厚なスラリーとし、ヘキサン中５％の酢酸エチルを用いてシリカゲルによるクロマトグラフ処理をし、１１．６７ｇの不純な生成物を得た。合体した固形物のＣＨ２Ｃｌ２１００ｍＬ中の溶液を５ｍＬの塩化オキサリルで処理し、１時間撹拌を続けた。反応混合物を水性ＮａＨＣＯ３で抽出し、有機相を濃縮してオレンジ色の固体とした。固体をヘキサン中の２％酢酸エチルを用いシリカでのクロマトグラフィによって精製して、Ｎ−（４’−シアノフェニル）アクリダン４．８１ｇを得た（３０．９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．１９（ｓ，２Ｈ），６．１９−６．２２（ｄ，２Ｈ），６．９０−７．０１（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．２６（ｄ，２Ｈ），７．４６−７．４９（ｄ，２Ｈ），７．８９−７．９２（ｄ，２Ｈ）．
【０１０１】
実施例２７  Ｎ−（４’−（４”−ピバロイル）ビフェニル）−アクリダンの合成
乾燥ＴＨＦ２００ｍＬ中、２０．００ｇのＮ−（４’−（４”−ヒドロキシビフェニル））−アクリダン（８０．３ミリモル）の溶液を不活性雰囲気下で１０．４ｍＬのピバロイルクロリド（８４．３ミリモル）で処理した後、乾燥トリエチルアミン（ＫＯＨ）２４．０ｍＬ（１６９ミリモル）で処理した。溶液を室温で３０分撹拌し、沈澱を生成した。１．０ｍＬのピバロイルクロリドを反応物に添加して、１５分後に、沈澱を真空濾過によって収集し、１００ｍＬのＴＨＦで洗浄して廃棄した。濾液を真空中で濃縮、乾燥して白色固体２７．３３ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲ解析で４−（４’−ブロモフェニル）フェニルピバレートを単離したことが確認された（１０２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．３８（ｓ，９Ｈ），７．１１−７．１４（ｄ，２Ｈ），７．４１−７．４４（ｄ，２Ｈ），７．５３−７．５７（ｍ，４Ｈ）．
【０１０２】
乾燥トルエン６０ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、２４７．７ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１０ミリモル）、１７８．６ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）、７．９５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．７ミリモル）及び２０．２２ｇの４−（４’−ブロモフェニル）フェニルピバレート（６０．７ミリモル）の混合物を不活性雰囲気に置いた。発熱反応の混合物を１時間室温で撹拌したとき、薄層クロマトグラフ解析で出発物質が消費されたことが示された。６００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルを反応混合物に添加した。１５分撹拌後、混合物を濾過し、固形物を６００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を追加して洗浄した。濾液を真空中で濃縮し、濃厚な液体を得、これを５００ｍＬのヘキサンで処理した。１８時間撹拌後、濾過によって沈澱を集め、３００ｍＬのヘキサンで洗浄し、乾燥して、Ｎ−（４’−（４”−ピバロイル）ビフェニル）アクリダン２１．６３ｇを得た（９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂１．４０（ｓ，９Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），６．２７−６．３０（ｄ，２Ｈ），６．８４−６．８９（ｔ，２Ｈ），６．９４−６．９９（ｔ，２Ｈ），７．１４−７．２１（ｍ，４Ｈ），７．３７−７．４０（ｄ，２Ｈ），７．６７−７．７０（ｄ，２Ｈ），７．７９−７．８１（ｄ，２Ｈ）．
【０１０３】
実施例２８  Ｎ−ピリジルアクリダンの合成
乾燥トルエン１００ｍＬ中、１０．００ｇのアクリダン（５５．２ミリモル）、２４７．７ｍｇのＰｄ（ＯＡｃ）２（１．１０ミリモル）、１７８．６ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（０．８８ミリモル）、７．９５ｇのナトリウムｔ−ブトキサイド（８２．７ミリモル）及び６．３ｍＬの２−ブロモピリジン（６６．２ミリモル）の混合物を、不活性雰囲気下で１８時間撹拌した。反応混合物を３００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と１００ｇのシリカゲルとの混合物に撹拌しながら注入した。混合物を濾過し、固形物を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。濾液を真空中で濃縮して黄色油状物を得、これをヘキサン中に取った。半溶液を再び真空中で濃縮し、黄色固体を得た。固体を１００ｍＬのヘキサン中で数時間粉砕し、濾過し、乾燥してＮ−ピリジルアクリダン１２．５０ｇを得た（８８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）∂４．１２（ｓ，２Ｈ），６．５９−６．６２（ｄ，２Ｈ），６．９１−６．９６（ｔ，２Ｈ），７．００−７．０５（ｔ，２Ｈ），７．１７−７．２０（ｄ，２Ｈ），７．２８−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．８１−７．８７（ｍ，１Ｈ），８．６９−８．７０（ｄ，１Ｈ）．
【０１０４】
化学ルミネセンスの測定
下記実施例での実験は、光の減衰についてのニュートラル密度フィルター（ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ）を備えたターナー・デザインス（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）ＴＤ−２０ｅ（カナダ国、サニーバル）ルミノメーターか、又はラブシステムズ  ルミノスカン（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ）（フィンランド国、ヘルシンキ）ルミノメーターを用いて行なった。データの収集、解析及び表示はソフトウェアで抑制した。
【０１０５】
実施例２９  ペルオキシダーゼ検出用化学ルミネセンス処方
ペルオキシダーゼ酵素との反応において、本発明のＮ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体を用いて化学ルミネセンスを発生させる好適処方は、下記の成分を含む；
（１）０．０１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０
（２）０．０５ｍＭのアクリダン化合物１
（３）０．５ｍＭの過酸化尿素
（４）０．１ｍＭのｐ−フェニルフェノール
（５）０．０２５％のＴＷＥＥＮ  ２０
（６）１ｍＭのＥＤＴＡ
最終形態での試薬には、可溶化目的に用いたｐ−ジオキサン１．２５％とエタノール１．２５％とを含有させた。
【０１０６】
実施例３０  化合物１ｂ〜ｌ，ｐ，ｑによるＨＲＰの検出に関する光強度一時間一覧表での比較
個々の実験においては、化合物１ｂ〜ｌ，１ｐ及び１ｑの各溶液１００μＬ量を、ＨＲＰ１．４×１０−１６モルを含む水溶液１μＬと反応させた。処方は実施例２９に従って調製した。この条件下で得た最大光強度の値を表４に示した。
【０１０７】
表４  Ｎ−アリールアクリダンについての相対光強度及び他の試験結果
2004517924.tif 000016
【０１０８】
実施例３１．ウェスターンブロットによるたんぱく質の改良された化学ルミネセンス検出法
生体分子のペルオキシダーゼ抱合体を検出する方法において、Ｎ−アリールアクリダンカルボン酸誘導体の有用性を示すために、化学ルミネセンスのウェスタンブロットを実施した。化合物１ｂ〜１ｅをそれぞれ含有する検出試薬を使用した。β−ガラクトシダーゼ、マウス抗−βガラクトシダーゼＩｇＧ及びＦａｂフラグメントを抱合した羊抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼをロシェ・モレキュラー・プロダクツ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。ＩｇＧのサンプルは、２分間１０，０００×ｇで遠心分離し、上澄液を免疫学的反応に使用した。
【０１０９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥをラエムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２２７，６８０（１９７０））に記載された緩衝液システムを用いて実施した。スタッキングゲルは、４．３８％アクリルアミド：０．１２％ビスアクリルアミドとした。セパレーティングゲルは６．８１％アクリルアミド：０．１９％ビスアクリルアミドとした。次の電気泳動では、ゲルは、２０ｍＭのトリスと１５３ｍＭのグリシンと２０％（ｖ／ｖ）メタノールとを含有するトランスファー緩衝液と７〜８分間平衡状態にあった。このゲルをＰＶＤＦのトランスファー膜のシートとクロマトグラフィー紙３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ）のシートとの間に挟持したものをトランスファーユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ，カナダ国、リッチモンド）中に設置した。ゲル中のたんぱく質を、１００ボルトの一定電圧下、４℃で２５分間電気溶離した。次いで、膜を、ｐＨ７．４のトリス−ＨＣｌ緩衝液の生理的食塩水（ＴＢＳ）５０ｍＭ中に４℃で一晩中放置した。その後、膜を１５分間ＴＢＳで洗浄した。
【０１１０】
膜を、１％の無脂肪粉乳（ＮＦＭ）を含有する、ｐＨ７．４で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液の生理的食塩水中における０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０（Ｔ−ＴＢＳ）で、室温にて１時間処理した。このブロックした膜を、１％ＮＦＭを含有するＴ−ＴＢＳを用い、一次抗体（３．３μｇ／ｍＬのマウス抗β−ガラクトシダーゼＩｇＧフラクションの１５００分の１の希釈液）と、室温で７５分間インキュベートした。
【０１１１】
次いで、膜を濯ぎ、室温でＴ−ＴＢＳで１０分間ずつ２回の後、Ｔ−ＴＢＳ中の１％ＮＦＭで１０分間ずつ２回、洗浄した。洗浄した膜を室温で３０分間、二次抗体（Ｆａｂフラグメントを抱合した抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼの６００分の１の希釈液６７ｍＵ／ｍＬ）と、１％ＮＦＭを含有するＴ−ＴＢＳを用いて、インキュベートした。膜を濯ぎ、Ｔ−ＴＢＳで１５分間ずつ４回洗浄した。
【０１１２】
洗浄した膜を、検出試薬に３分間浸積し、脱水して、透明なフィルムのシートの間に置いた。エックス線フィルムを種々の時間、膜に暴露し、現像した。アクリダン化合物を含有する検出試薬溶液の組成は以下の通りである。
トリス緩衝液、ｐＨ８．０                  ０．０２５Ｍ
アクリダン１ｂ，ｃ，ｄ又はｅ              ０．０５ｍＭ
ｐ−ヨードフェノール                      ２ｍＭ
ＴＷＥＥＮ  ２０                          ０．１％（ｗ／ｗ）
過酸化尿素                                ２．５ｍＭ
ＥＤＴＡ                                  ０．５ｍＭ
ｐ−ジオキサン                            １．２５％
エタノール                                １．２５％
【０１１３】
用いたβ−ガラクトシダーゼの標準（５ｎｇ〜５ｐｇ）は、バックグランド上で５ｐｇ／ｓｌｏｔまで鮮明に見ることができた。膜が光りを放射し続けたので２４時間の間に数回膜の暴露をすることができた。
【０１１４】
上記記述は、本発明の説明のために記載したものであり、本発明はこれによって、特許請求の範囲が制限を受けるべきものではない。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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