(57)【要約】本発明は患者の同種免疫化の予防、または患者の同種免疫化や自己免疫性溶血性疾患によって引き起こされる応答の免疫抑制のための薬学的組成物に関する。この組成物はＲｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の同種免疫化を予防するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項２】
患者の同種免疫化によって引き起こされる応答または自己免疫性溶血性疾患を免疫抑制するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項３】
前記自己免疫性疾患は、「常温型」抗体によって媒介される突発性または続発性自己免疫性溶血性貧血である請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記Ｒｈタンパク質は、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかである請求項１乃至３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項５】
明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープを含む請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記エピトープは同種免疫化が起こった場合にはエピトープ１２Ａであり、自己免疫性溶血性貧血ではエピトープ２９である請求項４または５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記エピトープまたは免疫反応性誘導体は合成される請求項１乃至６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
患者の同種免疫化を誘導するための薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤中に置かれた免疫学的に有効なＲｈタンパク質のエピトープ、免疫学的活性を有するその類似体または誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項９】
前記Ｒｈタンパク質は、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかである請求項８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープを含む請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記エピトープは同種免疫化が起こった場合にはエピトープ１２Ａであり、自己免疫性溶血性貧血ではエピトープ２９である請求項９または１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記賦形剤は、前記組成物が、注射、経口、直腸、局所、または噴霧取り込み形態となるように選択される請求項８乃至１１のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
薬学的に有効な賦形剤中に置かれた寛容化ペプチドフラグメントであって、前記賦形剤は、患者に注射、経口、直腸、局所、または噴霧投与されるように構成される寛容化ペプチドフラグメントにおいて、該ペプチドのフラグメントはＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のエピトープである寛容化ペプチドフラグメント。
【請求項１４】
明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択される請求項１３に記載の寛容化ペプチドフラグメント。
【請求項１５】
前記フラグメントは同種免疫化が起こった場合にはエピトープ１２Ａであり、自己免疫性溶血性貧血ではエピトープ２９である請求項１３または１４に記載の寛容化ペプチドフラグメント。
【請求項１６】
前記薬学的に許容される賦形剤は、経皮投与または経粘膜投与用に構成されるか、あるいは該賦形剤は経口投与のための腸溶性コーティングを有する製剤である請求項１３乃至１５のいずれかに記載の寛容化ペプチドフラグメント。
【請求項１７】
前記患者に請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の寛容化ペプチドフラグメントを投与することを含む患者を寛容化する方法。
【請求項１８】
明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質からのエピトープ。
【請求項１９】
ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化される可能性を有する患者の寛容化のための薬剤の製造における使用。
【請求項２０】
ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化された患者または常温型自己免疫性溶血性貧血の患者の免疫抑制のための薬剤の製造における使用。
【請求項２１】
前記賦形剤は経皮的または経粘膜的投与用に構成される請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトリンパ球に対するＲｈタンパク質からの１以上のエピトープの効果を決定するための方法であって、
ａ）Ｒｈタンパク質の１以上のエピトープ／ペプチドにて前記リンパ球を刺激することと、
ｂ）４〜７日後に培養を再懸濁してその等分量を次の方法で作製したプレートに移すこと；
ｃ）プレートの各ウェルをモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体にてコーティングし、
ｄ）そのプレートをハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）にて少なくとも１回洗い、
ｅ）適当な溶液を用いてすべての非特異的結合を阻害し、
ｆ）そのプレートをリンパ球培養とともに、約５％ＣＯ２と約９５％空気の雰囲気中において３０〜４０℃にて１２〜３６時間培養し、
ｇ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｈ）各ウェルに適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体を導入して室温にて３０〜６０分間培養し、
ｉ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｊ）Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体を導入して１５〜４５分間培養し、
ｋ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｌ）ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えたものを１つのウェルについて５０〜１５０μｌとなるよう各ウェルに加えてそのプレートを呈色させ、
ｍ）４０５ｎｍでの吸光度を読み取る；
とを含む方法。
【請求項２３】
ＲｈＤ陰性の患者が、ＲｈＤ陽性の血液に暴露された後に抗Ｄ抗体を産生する傾向を決定するための方法であって、患者の組織型を特定し、患者がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５について陽性であるかを判定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＲｈ（ＲｈＤ及びＲｈＣｃ／Ｅｅ）タンパク質上の同種反応性Ｔ細胞エピトープのマッピングに関し、これらの抗原に対する免疫応答を調節するうえでのこうしたエピトープの使用に関する。
【０００２】
ヒトの血液は遺伝学的に複雑なｒｈｅｓｕｓ（Ｒｈ）血液型群系を含んでいる。例えば、ヒトはＲｈＤ陽性またはＲｈＤ陰性のいずれかであり、このことは、ＲｈＤ陰性の個人がＲｈＤ陽性の血液に暴露されて免疫化されることにより抗Ｄを産生する場合のように、輸血や妊娠の際の問題を生ずる。
【０００３】
ＲｈＤ血液型群系における最も重要な対立遺伝子はＤ抗原である。ＲｈＤ抗原は、４１７個のアミノ酸から構成されて、膜透過性ドメインと推定される１２の部分と、６つの細胞外ループを有する膜透過性タンパク質であるＲｈＤタンパク質の一部である。本発明では、Ｒｈタンパク質に基いて一連のペプチドが構築されるが、各ペプチドはアミノ酸（ＡＡ）１５個分の長さを有し、正常な個人、抗Ｄを産生するように同種免疫化されたドナー、及び常温型自己免疫性溶血性貧血を罹患した患者から得られたＴリンパ球に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで検定を行った。
【０００４】
ＲｈＣＥポリペプチドの全アミノ酸配列、ならびに、ｃ、ｅ、及びＤポリペプチドの配列における相違を図１に示した（参照：Ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，ｐ９４，Ｅｄｉｔｏｒｓ；Ｍ　Ｅ　Ｒｅｉｄ　＆　Ｃ　Ｌｏｍａｓ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０００５】
こうした血液系の複雑さは、ＲｈＤ陰性の女性がＲｈＤ陽性の胎児を妊娠した場合、その女性が自身の子のＲｈＤ陽性血液細胞によって免疫化されるリスクがあるため問題である。この免疫化は、例えば、羊水穿刺、分娩前の出血の際に母親と子の血液が混じるような場合に起きるが、主には分娩時に起きる。
【０００６】
母親の血液がＲｈＤ陽性の血液細胞に触れると抗Ｄ抗体が産生される。抗Ｄ抗体は胎盤を通過して後のＲｈ陽性の子の妊娠時にＲｈ溶血性疾患を起こす。こうした溶血性疾患は新生児にとって命に関わるものである。
【０００７】
例として羊水穿刺、分娩前出血、そして主として分娩時に母親が胎児のＲｈＤ陽性の赤血球に暴露される場合、現在では精製した抗Ｄ免疫グロブリンが注射される。白人女性の約１７％がＲｈＤ陰性であるため、多くの先進国では、すべてのＲｈＤ陰性の女性に出産時、または上述した他の高リスクの場合において抗免疫グロブリンによる予防措置が行われるＲｈＤ予防プログラムが整備されている。更に、多くの国においてＲｈ溶血性疾患の発生率を低減するための一般的な分娩前の予防策が実施されている。
【０００８】
この方法には多くの問題がある。まず、疾患の発生が見落とされたり、明らかでなかったり、また、胎児の出血が抗Ｄによって中和可能な程度よりも甚だしい場合があるため、効果が完全とはいえない点がある。第２に、現在使用されている抗Ｄ免疫グロブリンは故意に免疫化されたドナーからのものであるが、しばしば男性である（有、無償の）ボランティア被験者にも少ないながらリスクがともなう。更に、ドナーが利用可能となるまでに少なくとも１２ヶ月を要し、この間その血液を使用することはできない。これらの理由により、抗Ｄ免疫グロブリンは世界的に不足状態にある。最後に、例えば、充分な検査法が確立されていない変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）などの病原体に誤って感染するなど、輸血により感染する感染症の危険があり、レシピエントの安全性に関して懸念が存在する。
【０００９】
同種免疫化によるリスクを有する他の群としては、例えば血液学的な悪性疾患、鎌状赤血球貧血やサラセミアを罹患した患者などの、定期的に血液製剤の投与を受ける患者がある。
【００１０】
ある種のＲｈＤペプチドが同種免疫化された患者のヘルパーＴ細胞を特異的に刺激することが見出された。逆に、ある種のＲｈＤペプチドによってヘルパーＴ細胞による免疫抑制性サイトカインの産生が刺激されることも見出された。更に、同種及び自己免疫化されたドナーのＨＬＡ−ＤＲ型とヘルパーＴ細胞の応答を刺激するペプチドとの間には何らかの相関がある。
【００１１】
本発明の目的は、赤血球細胞に対して同種免疫化されているか、あるいは自己免疫疾患を有する患者の効果的な治療法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、同種免疫化を予防するための効果的な予防法を提供することにある。
【００１２】
本発明の第１の実施形態においては、患者の同種免疫化を予防するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００１３】
発明者等は、ＲｈＤタンパク質上のヘルパーＴ細胞エピトープをマッピングした。多くの同種免疫化されたドナーにおいて標的となるヘルパーエピトープを特徴付け、ＨＬＡ−ＤＲ型と特定の主要エピトープとの相関を特定することにより、ＲｈＤに対する免疫応答を調節し、Ｒｈ溶血性疾患及び抗Ｄに関連した輸血における問題を防止するための新規な方法としてのペプチド免疫療法を評価するための道が拓かれるものである。
【００１４】
現在、妊娠における主要な段階において妊娠中の女性に与えられる抗Ｄは、一時的に免疫現象を阻害する効果を有するために受動的な免疫療法と考えられている。
【００１５】
ＲｈＤ陰性の女性における受動的ペプチド療法を能動的ペプチド療法に置き換えることは、安全な合成寛容原を開発して妊娠前に投与することにより胎児の暴露を防止することが可能であることにより、魅力的な選択である。妊娠期間の全体を通じた抑制とは、１回のみの注射を必要とするということであり、ＲｈＤ陰性の女性の管理が大幅に簡略化されるばかりでなく、ＲｈＤに対する免疫応答を「スイッチオフ」するうえで、既に抗Ｄを産生している個人に免疫原性ペプチドを投与することによって、同種免疫化を防止するのではなく、これを逆行させることが初めて可能となる可能性がある。
【００１６】
本発明によって決定される、他のＲｈ抗原に対する免疫原性ペプチドは、自己免疫性溶血性疾患におけるＲｈＣ、Ｒｈｃ、ＲｈＥ及びＲｈｅならびにＲｈ５０（ペプチドは図４に示される）を含む（ただしこれに限定されない）各抗原による同種抗体の産生の防止または改変において同等の価値を有するものである。
【００１７】
したがって、事前の免疫化が考慮される個人のカテゴリーとしては次のようなものがある。
（１）出産可能な年齢のすべての女性。
（２）血液製剤の投与を定期的に受けている患者。例えば、血液学的悪性疾患、鎌状赤血球症、及びサラセミアなどにおいて輸血血液に暴露される可能性のある患者。
【００１８】
このような薬学的組成物をＲｈＤ陰性の血液とＲｈＤ陽性の子を有する妊婦に与えることが可能であり、この組成物によって、胚の血液が母親自身の免疫系と接触するようないかなる場合においても母親は免疫応答を生じることがなくなる。さらに、ＲｈＤ陽性であるすべての後の子において溶血性疾患を生ずる確率が低くなる。本発明に基く合成ペプチドの使用により、受動的免疫療法において使用される抗Ｄ免疫グロブリンによって、またはボランティア被験者であるレシピエントに与えられる赤血球細胞によって伝染するウイルス感染症についての不安がなくなる。信頼できるドナー及び提供を確認するうえで必要とされる、時間のかかる高価な方法も重要な考慮すべき点である。
【００１９】
更に、これらの組成物の使用により、しばしばＲｈＤ陰性の男性であるボランティア被験者が抗Ｄ免疫グロブリンの産生のために故意に免疫化される際に通常行われる赤血球の注射を避けることが可能である。
【００２０】
本発明の第２の実施形態においては、患者の同種免疫化によって誘導される応答または自己免疫性溶血性疾患を免疫抑制するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００２１】
ＲｈＤ陰性の母親の免疫系がＲｈＤ陽性の子からの血液に既に接触している場合、後にＲｈＤ陽性の子を妊娠した際にこの組成物を用いてその子がＲｈＤ溶血性疾患を患う確率を小さくすることが可能である。
【００２２】
更に、患者がＲｈＤ陰性であるのに誤ってＲｈＤ陽性の輸血が行われた場合にこの組成物を与えることが可能である。こうした組成物が利用可能であることにより、予防のための抗Ｄ免疫グロブリンの極めて大量の投与の必要性ならびに後に同種免疫化される確率が低減される。
【００２３】
好ましくは自己免疫性疾患は、「常温型」の自己抗体によって媒介される突発性または続発性の自己免疫性溶血性貧血である。この自己免疫性疾患の引き金となる原因は解明されておらず、したがってこの疾患はいつでも発症して、自身の赤血球細胞を攻撃する広いＲｈ血液型群特異性を有する自己抗体が体内で産生されうる。
【００２４】
Ｒｈタンパク質は、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかであれば都合がよい。
これらのＲｈタンパク質によって赤血球細胞の表面に見られる主要なＲｈ特異性の抗原が決定される。
【００２５】
好ましい一実施形態では、明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つからエピトープが選択される。
【００２６】
上記に述べたものは、同種免疫化された患者及び自己免疫性溶血性貧血の患者のＴ細胞によって認識される最も一般的なエピトープである。自己免疫性溶血性貧血では、好ましいエピトープは２，５，１４，２９，３１及び３８である。したがって、こうしたエピトープに対する誘導された寛容により、エピトープが患者の血中に出現した場合に免疫応答が起こることが防止される。
【００２７】
エピトープ１２Ａは、同種反応性Ｔ細胞によって認識される最も一般的なエピトープであり、エピトープ２９は自己免疫性溶血性貧血において最も一般的に認識されるエピトープであるので、エピトープとしては、エピトープ１２Ａか２９が好ましい。
【００２８】
上記のエピトープまたは免疫反応性誘導体のすべてのものは合成することが可能であれば都合がよい。
エピトープ配列が人工的に合成可能であれば、微生物による汚染は無視してよい。
【００２９】
本発明の第３の実施形態においては、患者の同種免疫化を誘導するための薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤中に置かれた免疫学的に有効なＲｈタンパク質のエピトープ、免疫学的活性を有するその類似体または誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００３０】
好ましくは、Ｒｈタンパク質はＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかであり、明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープであれば都合がよい。
【００３１】
好ましくは賦形剤は、前記の組成物が、注射、経口、直腸、局所、または噴霧取り込み形態となるように選択される。
哺乳類は、例えば鼻腔粘膜や腸から特定のペプチドフラグメントを取り込むことにより特定の刺激に対して寛容化されることが知られている。発明者等は、妊娠前、妊娠中、または妊娠後にレシピエントである雌においてＲｈＤに対する免疫応答をなくす優れた方法の一つは、Ｒｈペプチドを、鼻腔、頬、または肛門粘膜などの粘膜を介するか、または経皮的に投与することであることを提案するものである。本発明に基いたペプチドフラグメントは、粘膜組織を介して体内に入り、本発明のペプチド断片が初めて循環血液系に達する場合に起きうるような最大の免疫応答を引き起こすことなく患者を効果的に免疫化することが可能である。
【００３２】
これらのエピトープを注射可能な形態とし、例えば免疫抑制効果を有するＩＬ−１０やＴＧＦ−βを産生することが可能なエピトープにて患者を意図的に免疫化するために使用することが可能である。
【００３３】
この方法の結果として、Ｒｈタンパク質に対する免疫応答を抑制するＲｈエピトープを用いた「ワクチン」が開発される。
本発明の第４の実施形態においては、薬学的に有効な賦形剤中に置かれた寛容化ペプチドフラグメントであって、賦形剤は、患者に注射、経口投与、座薬による直腸投与、局所投与、または噴霧投与されるように構成される寛容化ペプチドフラグメントにおいて、該寛容化ペプチドフラグメントはＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のエピトープから選択されるものである寛容化ペプチドフラグメントが提供される。好ましくはエピトープは、明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択される。
【００３４】
薬学的に許容可能な賦形剤は、経皮または経粘膜投与用に構成することが可能であり、あるいは、この賦形剤は経口投与用の腸溶性コーティングを有する製剤とすることが可能である。
【００３５】
本発明の第５の実施態様においては、患者に寛容化ペプチドフラグメントを投与することを含む、患者を寛容化するための方法が提供される。
本発明の第６の実施態様においては、明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質からのエピトープが提供される。
【００３６】
本発明の第７の実施形態においては、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化される可能性を有する患者の寛容化のための薬剤の製造における使用が提供される。
【００３７】
本発明の第８の実施形態においては、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化された患者または常温型自己免疫性溶血性貧血の患者の免疫抑制のための薬剤の製造における使用が提供される。
【００３８】
本発明の第９の実施形態においては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトリンパ球に対するＲｈタンパク質からの１以上のエピトープの効果を決定するための方法であって、
ａ）Ｒｈタンパク質の１以上のエピトープ／ペプチドにて前記リンパ球を刺激することと、
ｂ）４〜７日後に培養を再懸濁してその等分量を次の方法で作製したプレートに移すこと；
ｃ）プレートの各ウェルをモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体にてコーティングし、
ｄ）そのプレートをハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）にて少なくとも１回洗い、
ｅ）適当な溶液を用いてすべての非特異的結合を阻害し、
ｆ）そのプレートをリンパ球培養とともに、約５％ＣＯ２と約９５％空気の雰囲気中において３０〜４０℃にて１２〜３６時間培養し、
ｇ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｈ）各ウェルに適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体を導入して室温にて３０〜６０分間培養し、
ｉ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｊ）Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体を導入して１５〜４５分間培養し、
ｋ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｌ）ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えたものを１つのウェルについて５０〜１５０μｌとなるよう各ウェルに加えてそのプレートを呈色させ、
ｍ）４０５ｎｍでの吸光度を読み取る；
とを含む方法が提供される。
【００３９】
従来、研究者は細胞が産生するサイトカインの量を求めるうえで数ある手法の中でもＥＬＩＳＰＯＴと呼ばれる捕捉アッセイを用いてきた。このアッセイではサイトカイン産生細胞のそれぞれに対して色スポットが形成される。色スポットの数に基いた大まかな計算を行ってサイトカインの産生量が推定される。本発明のアッセイにおけるｐ−ニトロフェニルリン酸の使用により、ウェル内の抗体によって捕捉されるサイトカインの量を生じる色の変化に基いて算定することが可能である。色の変化はより精度の高い分光測定法によって測定することが可能である。
【００４０】
したがって、この方法は非常に感度が高く、特定のＲｈＤタンパク質が、ヒトＴ細胞を、増殖するようにではなく免疫抑制性を有する可能性のあるサイトカインを産生するように刺激することを確認することが可能である。このことは、エピトープの送達方法を決定するうえで重要である。Ｔ細胞を増殖させるエピトープは寛容原として鼻腔または粘膜経路より投与されるのに対し、免疫抑制性サイトカイン産生につながるエピトープは注射される。
【００４１】
本発明の第１０の実施形態においては、ＲｈＤ陰性の患者が、ＲｈＤ陽性の血液に暴露された後に抗Ｄ抗体を産生する傾向を決定するための方法であって、患者の組織型を特定し、組織型がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５であるかを判定することを含む方法が提供される。
【００４２】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５の組織型を有する場合、患者は抗Ｄ抗体を産生しやすいので、ＲｈＤ陽性の赤血球細胞に暴露されるリスクに曝される前に処置が講じられなければならない。
【００４３】
実施例１
ＲｈＤまたはＲｈＣｃ／Ｅｅ血液型群抗原の発現にそれぞれ関与した３０ｋＤのＲｈタンパク質の配列に対応する、５または１０個のアミノ酸重複を有する６８種の１５量体ペプチドの完全なパネルを２個合成した（マルチプルペプチドサービス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｒｖｉｃｅ），ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ（Ｃｈａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），チェシア（Ｃｈｅｓｈｉｒ）、ユーケー・アンド・デパートメント・オブ・バイオケミストリー（ＵＫ　ａｎｄ　Ｄｅｐｔ．　Ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ユニバーシティ・オブ・ブリストル（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｒｉｓｔｏｌ）、ＵＫ）。これらのタンパク質のそれぞれのアミノ酸配列は２ヶ所の研究機関によるｃＤＮＡ法から独立に推定された。２つのポリペプチド配列は９２％の相同性を示し、パネル同士の間で合成ペプチドの内の１６個のものが共通であった（アミノ末端から数えて、ペプチド１〜５、８，９，１４，２１，２８，２９，３７〜３９，４１及び４２）。純度を保証するため、各パネルは従来のｐｉｎ技術ではなく、塩基置換活性架橋剤を用いた樹脂上でフルオレニルメトキシカルボニル法によって合成し、ランダムに選択したペプチドをＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により純度についてスクリーニングした。これらのペプチドを２０μｇ／ｍｌにて培養を刺激するために使用したが、培養の応答はその程度及び動態において５〜２０μｇ／ｍｌのペプチド濃度での応答と同様であることが事前に示されている。
【００４４】
コントロール抗原としてのヒト結核菌の精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（スタテンス　シーラムインシュタット（Ｓｔａｔｅｎｓ　Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｕｔ）、デンマーク）、及びＫｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔのヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルバイオケム−ベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ラホーヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア、米国）をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して大量に透析し、フィルタ滅菌した後、５０μｇ／ｍｌにて培養に加えた。多くのイギリス国民はＢＣＧによって免疫化されているため、ＰＰＤはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて速やかに２次Ｔ細胞応答を引き起こしたがこれはＫＬＨでは見られなかった。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をシグマ（Ｓｉｇｍａ）社（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）より入手し、１０μｇ／ｍｌにて培養を刺激するために使用した。
【００４５】
抗体
ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４５またはＣＤ１４に対するＦＩＴＣ−またはフィコエリトリン−結合モノクローナル抗体をダコ・ユーケー（Ｄａｋｏ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）社より入手した。ベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）より入手される、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、または−ＤＲに特異的な遮断モノクローナル抗体をＰＢＳに対して入念に透析した後、予め決定された最適濃度である２．５μｇ／ｍｌにて培養に加えた。
【００４６】
末梢血単核細胞及びＴ細胞の単離
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用して新鮮な血液試料からドナーまたは患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。これらのドナー及び患者は、妊娠、輸血、または関連血液による免疫化によって、ＲｈＤ陽性血液に対して事前に同種免疫化されたものである。
【００４７】
ＰＢＭＣの生存率は、トリパンブルー色素排除法によって判定されたように、すべての実験において９０％を上回った。ヒトＩｇＧ／ヒツジ抗ヒトＩｇＧ免疫複合体にてコーティングしたガラスビーズアフィニティーカラムに通過させることによりＰＢＭＣからＴ細胞を分離した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎ）により、典型的な調製物に含まれるＴ細胞は９５％を上回ることが示された。
【００４８】
細胞増殖アッセイ
マイクロタイタープレートに入れた、５％自家血清、４ｍＭのＬ−グルタミン酸（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）、１００Ｕ／ｍｌのベンジルペニシリンナトリウムＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（シグマ）、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（シグマ）、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（シグマ）を補ったイーグル培地のアルファ改良型培地（アイ・シー・エヌ　フロー（ＩＣＮ　Ｆｌｏｗ）、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）１００μｌ中で１．２５×１０６細胞／ｍｌの濃度にてＰＢＭＣを培養した。プレートはすべて、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃にて培養した。培養の細胞増殖率を、上述した抗原による刺激後５日目に３重ウェル内での３Ｈ−チミジンの取り込み量から推定した。増殖の結果は、３重の試料の平均ＣＰＭ＋／−ＳＤとしてか、または、刺激されないコントロール培養に対する刺激した培養の平均ＣＰＭの比を表す刺激指数（ＳＩ）として表した。ＣＰＭ＞１０００でＳＩ＞３の場合、陽性の応答を表すものと解釈される。
【００４９】
活性化アッセイ
上記の実験は、ＲｈＤタンパク質を認識するが、免疫化によって活性化されない静態すなわち未実験のＴ細胞による応答を低減するように構成されたものである。実験を評価するため、上記の実験において増殖したＴ細胞を、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９４）２４：１５７８−１５８２）に掲載された方法を改良した方法を用いて検定し、Ｔ細胞がｉｎ　ｖｉｖｏにて活性化されたか否かを特定した。ここで、Ｔ細胞をスクリーニングして、これらのＴ細胞が静態すなわち未実験のＴ細胞の標識であるＣＤ４５ＲＡを有するサブセットからのものではなく、以前の活性化すなわち「記憶」の標識であるＣＤ４５ＲＯを有するサブセットからのものであることを確認した。
【００５０】
図２に示されるように、特定のペプチド配列に基いて異なるペプチド断片が選択された。これらを下に掲げる表１，２及び３に示した。また上記の例によって得られた結果を図２に示した。
【００５１】
すなわち、ＲｈＤに対して意図的に免疫化されたすべてのドナーからのヘルパーＴ細胞はＲｈＤペプチドによりｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激されることが示された。
【００５２】
更に、各Ｒｈペプチドに対するＴ細胞の応答は、同種免疫化ドナー間において差異が見られる。こうした差異はあるものの、ＲｈＤペプチドＮｏ２，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１５Ａ，１８Ａ，２８及び３９は最もよく標的化されており、また、ペプチド１２Ａによってドナーの７０％において増殖応答が引き起こされた。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を共有するドナーでは有意に関連したプロファイルが見られる。ＲｈＤタンパク質上の同種反応性Ｔ細胞エピトープはＲｈＤ陰性の個人にとって異物となる配列をなし、したがって、こうした個人の赤血球上で発現される関連したＲｈＣｃ／Ｅｅタンパク質上にないことが予測される。ペプチド２８を除く特定されたフラグメントのすべてのものはこの予測に当てはまる配列である。したがって、こうしたペプチドまたはこれから誘導される配列を使用し、調製物の投与経路及び／または投与量及び調合に応じて、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＴ細胞の応答または寛容を望みどおりに刺激することが考えられる。
【００５３】
実際、増殖させられた細胞は事前に活性化されたものから導出されたものである。このことは、ＲｈＤにより免疫化されたＲｈＤ陰性のドナーにおける抗Ｄ抗体の産生を司っているのはこれらの細胞であるため重要である。
【００５４】
発明者等が特定したヘルパーＴ細胞エピトープを特徴付けることは、抗免疫グロブリンドナーのための安全な免疫原の開発にとって重要なステップであり、特に新生児における溶血性疾患の予防の新規なアプローチとしてのペプチド免疫療法を評価するための道を拓くものである。
【００５５】
これらの実験は、ＲｈＣ、Ｒｈｃ、ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質などの他のＲｈタンパク質を用いて行うことが可能である。
自己免疫性溶血性貧血に罹患した被験者からの血液を使用して上記の実験を反復することが可能である。したがって被験者のＴ細胞は、ペプチド２，５，１４，２９，３１及び３８に対して増殖応答を示し（図３を参照）、患者の６５％はペプチド２９に対して応答を示すことが示された。この結果はさらに、自己免疫性溶血性貧血に罹患し、ＨＬＡ−ＤＲ１５の組織型を有する患者間の相関を示すものである。ペプチド３１を除くすべてのペプチドはＲｈＤ及びＲｈＣｅ／Ｅｅタンパク質に共通である。
【００５６】
実施例２
実施例１において検定されたドナーのＨＬＡクラスＩＩ組織型を標準的なＳＳＰ−ＰＣＲ法によって確認した。これは、組織型を決定する分子は、表示のための抗原性ペプチドフラグメントを選択してＴ細胞に結合させるため、この調査において重要であるという理由により行ったものである。
【００５７】
バーカー（Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｂｌｏｏｄ　９０：２７０１−２７１５）等により述べられる方法を用いて、Ｔ細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激するＲｈＤペプチドフラグメントを提供することにおいて、ＨＬＡ−Ｄの遺伝子座がＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱよりも重要であるということが示された。
【００５８】
ＲｈＤに対する応答性について選択されたＲｈＤ陰性ドナーのかなりの割合がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５遺伝子を有する（コントロール集団の約２９％に対して５６％）。すなわちこの組織型を有するということはＲｈＤ陽性の赤血球に暴露された後に抗Ｄ抗体を産生する可能性が高くなるということであり、ＨＬＡ−ＤＲ組織型における、応答を示した患者間の差異は一般の集団におけるよりも小さい。さらに、Ｔ細胞の増殖を誘引したＲｈＤペプチドのパターンは同じＨＬＡ−ＤＲタイプを共有するＲｈＤ陰性ドナーにおいて互いに大きく関連していることが示された（図３Ａ及び３Ｂを参照）。
【００５９】
常温型自己免疫性溶血性貧血でもやはりＨＬＡＤＲ１５との関連が見られ、患者の６５％がこのＨＬＡタイプを保有している。
しかしながら、全データの統計的分析は認識されたペプチドへのＨＬＡ−ＤＲタイプの影響は比較的弱いものであることを示している。言い換えれば、これらのＲｈＤペプチドの多くのものは組織型とは無関係にＴ細胞を刺激するということである。
【００６０】
これらの分析は、免疫化／寛容化レジメのためのＲｈＤペプチドフラグメントの選択は、この方法の臨床的応用のための重要な実際的考慮である、事前のレシピエントの組織型決定には依存しない可能性を示すものである。
【００６１】
実施例３
培養したＴ細胞を表１〜３に示されたエピトープにより刺激し、応答を示した細胞を５日後に、０．０５Ｍのアルカリ性炭酸コーティングバッファ（ｐＨ９．６）に希釈したモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体を１ウェルにつき５０μｌ用いてコーティングした平底マイクロタイタープレート（９６穴　Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に移した。結合しなかった捕捉抗体はＨＢＳＳによる２回の洗浄と、１つのウェルにつき２００μｌのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）にて培養することにより非特異的結合ポテンシャルを阻害することによって除去した。
【００６２】
刺激の５日後にリンパ球培養を混合して再懸濁し、１００μｌの等分量を、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−βに特異的なそれぞれの捕捉抗体にてコーティングしたウェルに移した。捕捉分子にてコーティングされ、リンパ球の層が形成されたこれらのプレートを、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃にて更に２４時間培養した。この培養の後、このＰＢＭＣを０．２％トウィーン／ＰＢＳによる４回の洗浄にて除去した。次いで０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳに加えた適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体の１００μｌ等分量をウェルに加え、室温にて４５分間培養した。０．５％トウィーン／ＰＢＳによる６回の洗浄の後、１００μｌの１：１００，０００Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（シグマ）をウェルのそれぞれに加え、室温にて３０分間培養した。Ｅｘｔｒアビジン複合体を０．２％トウィーン／ＰＢＳによる８回の洗浄により除去し、０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えて１．０ｍｇ／ｍｌとしたｐ−ニトロフェニルリン酸を１つのウェルについて１００μｌ使用してプレートを呈色させた。４０５ｎｍでの吸光度をマルチスキャンプレートリーダー（ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）社、Ｂａｓｉｎｇｓｔｒｏｋｅ，ＵＫ）を使用して測定した。
【００６３】
倍加する希釈度にて組換えヒトＩＦＮγまたはＩＬ−１０またはＴＧＦ−β（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を加えた複製ウェルを培養することにより得られた基準曲線から補間することによってサイトカイン分泌率を測定した。基準曲線は、吸光度の値に適用した平滑化三次式近似関数、及び準対数的変換の後のサイトカイン濃度によってモデル化した。
【００６４】
【数１】
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この方法は非常に感度が高いため、特定のＲｈＤペプチドが、ヒトＴ細胞を増殖するようにではなく、免疫抑制性のサイトカインを産生するように刺激することを確認することが可能である。
【００６５】
図５Ａ及び５Ｂから、エピトープ１０，１６，２２，２４及び３４は、ヒトＴ細胞によるＩＬ−１０及び／またはＴＧＦ−βの産生を誘導することが分かる。ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの分子は免疫抑制性を有することが知られている。予備実験において、ＩＬ−１０を誘導するペプチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて全ＲｈＤタンパク質に応じてＴ細胞の増殖を阻害することが示されている。したがって、Ｔ細胞によるＩＬ−１０またはＴＧＦ−βの産生を誘導するＲｈＤペプチドを事前に投与することによりＲｈＤ陰性の個人のＲｈＤへの応答を防止することが可能である。確立された応答を阻害することも可能である。免疫系を操作するこの新規な方法は、Ｒｈタンパク質が重要な標的である常温型自己免疫性溶血性貧血の治療などの他の応用を有するものである。他の抗原から誘導される同様の性質を有するペプチドを特定することによっても、抗原／タンパク質が特定されている広範な自己免疫疾患の治療法が与えられる。
【００６６】
いずれの培養においてもＩＬ−４の産生は検出されなかった。図５Ｃでは、エピトープ５，２１及び２７がＩＦＮ−γの分泌を刺激することが分かる。図５ＤはＲｈＤペプチドによる刺激後のＴ細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込み量を示したものである。
【００６７】
図６から、Ｔ細胞の培養にこれらのペプチドを加えることによってＲｈＤタンパク質に対する増殖応答は特異的に阻害されるが、コントロール抗原であるＰＰＤに対する応答は阻害されないことが分かる。このことは、患者に与えられた場合に、これらのペプチドもｉｎ　ｖｉｖｏでの有害な応答を阻害する一方で免疫系の残りの部分は抑制しないという可能性が高くなるために非常に重要である。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＲｈＣＥポリペプチドの全アミノ酸配列、及び、Ｒｈｃ、Ｒｈｅ，及びＲｈＤポリペプチドの配列における相違を示す図（参照：Ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ　Ｐ９４， 　Ｅｄｉｔｏｒ；　Ｍ　Ｅ　Ｒｅｉｄ　＆　Ｃ　Ｌｏｍａｓ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎ）。
【図２】表１， ２及び３に示されるペプチド１〜４２及び６Ａ〜４０ＡのＲｈＤ抗原によって同種免疫化されたドナーにおける刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−培養に添加されたＲｈＤペプチド；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図３Ａ】自己免疫性溶血性貧血の患者における刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図３Ｂ】正常なコントロールにおける刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図４】特定の組織型を共有するドナーにおいて認識されたＲｈエピトープ間の相関を示す図。Ｘ及びＹ軸はそれぞれドナー１，２の刺激指数を表す。各四角形は特定のペプチドの応答を表す。相関係数（Ｒ）＝０．７７４、ｐ値　９．５７Ｅ−０１５。
【図５Ａ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＴＧＦ−β産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＴＧＦ−β１分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｂ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＩＬ−１０産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＩＬ−１０分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｃ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＩＦＮ−γ産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＩＦＮ−γ分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｄ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞への３Ｈ−チミジンの取り込み量を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−３Ｈ−チミジン取り込み量（平均値　ＣＰＭ×１０−３±ＳＤ）　ＳＩ＝３、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図６】免疫抑制性サイトカイン応答を生ずるペプチドによる、ＲｈＤタンパク質に応答するＴ細胞の阻害を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−３Ｈ−チミジン取り込み量（平均値　ＣＰＭ×１０−３±ＳＤ）。Ａ−ｎｏｎｅ；Ｂ−コントロール（−）；Ｃ−ＲｈＤ；Ｄ−ＲｈＤと１６；Ｅ−ＲｈＤと２２；Ｆ−ＲｈＤと２４；Ｇ−ｎｏｎｅ；Ｈ−ＰＰＤ；Ｉ−ＰＰＤと１６；Ｊ−ＰＰＤと２２；Ｋ−ＰＰＤと２４。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004508273.tif 000194
【手続補正書】
【提出日】平成13年1月30日(2001.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【書類名】明細書
【発明の名称】同種及び自己反応性Ｔ細胞エピトープ
【特許請求の範囲】
【請求項１】寛容化による患者の同種免疫化の予防、または患者の同種免疫化によって引き起こされる応答の免疫抑制のための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項２】前記Ｒｈタンパク質は、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかである請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】明細書中に記載される配列番号２，５，６，１１，１２，１４，２８，２９，３１，３８，３９，４４，４７，５０，５１，６６，７５，７７，７８，７９，８１及び８４の少なくとも１つから選択されるエピトープを含む請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】前記エピトープは同種免疫化が起きた場合には配列番号７９のものである請求項２または３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】前記エピトープまたは免疫応答性誘導体は合成される請求項１乃至４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載される配列番号２，５，６，１１，１２，１４，２８，２９，３１，３８，３９，４４，４７，５０，５１，６６，７５，７７，７８，７９，８１及び８４の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化される可能性を有する患者の寛容化のためまたは同種免疫化された患者の免疫抑制のための薬剤の製造における使用。
【請求項７】前記賦形剤は経皮的または経粘膜的投与用に構成される請求項６に記載の使用。
【請求項８】薬学的に有効な賦形剤中に置かれた寛容化ペプチドフラグメントを含む薬学的組成物であって、前記賦形剤は、患者に注射、経口、直腸、局所、または噴霧投与されるように構成される薬学的組成物において、該ペプチドのフラグメントはＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のエピトープである薬学的組成物。
【請求項９】前記ペプチドフラグメントは、明細書中に記載される配列番号２，５，６，１１，１２，１４，２８，２９，３１，３８，３９，４４，４７，５０，５１，６６，７５，７７，７８，７９，８１及び８４の内の少なくとも１つから選択される請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】前記フラグメントは同種免疫化が起きた場合には配列番号７９のものである請求項８または９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】前記薬学的に許容される賦形剤は、経皮投与または経粘膜投与用に構成されるか、あるいは該賦形剤は経口投与のための腸溶性コーティングを有する製剤である請求項８乃至１０のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１２】前記患者に請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の寛容化ペプチドフラグメントを投与することを含む患者を寛容化する方法。
【請求項１３】明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質からの寛容化エピトープ。
【請求項１４】ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトリンパ球に対するＲｈタンパク質からの１以上のエピトープの効果を決定するための方法であって、
ａ）Ｒｈタンパク質の１以上のエピトープ／ペプチドにて前記リンパ球を刺激することと、
ｂ）４〜７日後に培養を再懸濁してその等分量を次の方法で作製したプレートに移すこと；
ｃ）プレートの各ウェルをモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体にてコーティングし、
ｄ）そのプレートをハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）にて少なくとも１回洗い、
ｅ）適当な溶液を用いてすべての非特異的結合を阻害し、
ｆ）そのプレートをリンパ球培養とともに、約５％ＣＯ２と約９５％空気の雰囲気中において３０〜４０℃にて１２〜３６時間培養し、
ｇ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｈ）各ウェルに適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体を導入して室温にて３０〜６０分間培養し、
ｉ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｊ）Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体を導入して１５〜４５分間培養し、
ｋ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｌ）ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えたものを１つのウェルについて５０〜１５０μｌとなるよう各ウェルに加えてそのプレートを呈色させ、
ｍ）４０５ｎｍでの吸光度を読み取る；
とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＲｈ（ＲｈＤ及びＲｈＣｃ／Ｅｅ）タンパク質上の同種反応性Ｔ細胞エピトープのマッピングに関し、これらの抗原に対する免疫応答を調節するうえでのこうしたエピトープの使用に関する。
【０００２】
ヒトの血液は遺伝学的に複雑なｒｈｅｓｕｓ（Ｒｈ）血液型群系を含んでいる。例えば、ヒトはＲｈＤ陽性またはＲｈＤ陰性のいずれかであり、このことは、ＲｈＤ陰性の個人がＲｈＤ陽性の血液に暴露されて免疫化されることにより抗Ｄを産生する場合のように、輸血や妊娠の際の問題を生ずる。
【０００３】
ＲｈＤ血液型群系における最も重要な対立遺伝子はＤ抗原である。ＲｈＤ抗原は、４１７個のアミノ酸から構成されて、膜透過性ドメインと推定される１２の部分と、６つの細胞外ループを有する膜透過性タンパク質であるＲｈＤタンパク質の一部である。本発明では、Ｒｈタンパク質に基いて一連のペプチドが構築されるが、各ペプチドはアミノ酸（ＡＡ）１５個分の長さを有し、正常な個人、抗Ｄを産生するように同種免疫化されたドナー、及び常温型自己免疫性溶血性貧血を罹患した患者から得られたＴリンパ球に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで検定を行った。
【０００４】
ＲｈＣＥポリペプチドの全アミノ酸配列、ならびに、ｃ、ｅ、及びＤポリペプチドの配列における相違を図１に示した（参照：Ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，ｐ９４，Ｅｄｉｔｏｒｓ；Ｍ　Ｅ　Ｒｅｉｄ　＆　Ｃ　Ｌｏｍａｓ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０００５】
こうした血液系の複雑さは、ＲｈＤ陰性の女性がＲｈＤ陽性の胎児を妊娠した場合、その女性が自身の子のＲｈＤ陽性血液細胞によって免疫化されるリスクがあるため問題である。この免疫化は、例えば、羊水穿刺、分娩前の出血の際に母親と子の血液が混じるような場合に起きるが、主には分娩時に起きる。
【０００６】
母親の血液がＲｈＤ陽性の血液細胞に触れると抗Ｄ抗体が産生される。抗Ｄ抗体は胎盤を通過して後のＲｈ陽性の子の妊娠時にＲｈ溶血性疾患を起こす。こうした溶血性疾患は新生児にとって命に関わるものである。
【０００７】
例として羊水穿刺、分娩前出血、そして主として分娩時に母親が胎児のＲｈＤ陽性の赤血球に暴露される場合、現在では精製した抗Ｄ免疫グロブリンが注射される。白人女性の約１７％がＲｈＤ陰性であるため、多くの先進国では、すべてのＲｈＤ陰性の女性に出産時、または上述した他の高リスクの場合において抗免疫グロブリンによる予防措置が行われるＲｈＤ予防プログラムが整備されている。更に、多くの国においてＲｈ溶血性疾患の発生率を低減するための一般的な分娩前の予防策が実施されている。
【０００８】
この方法には多くの問題がある。まず、疾患の発生が見落とされたり、明らかでなかったり、また、胎児の出血が抗Ｄによって中和可能な程度よりも甚だしい場合があるため、効果が完全とはいえない点がある。第２に、現在使用されている抗Ｄ免疫グロブリンは故意に免疫化されたドナーからのものであるが、しばしば男性である（有、無償の）ボランティア被験者にも少ないながらリスクがともなう。更に、ドナーが利用可能となるまでに少なくとも１２ヶ月を要し、この間その血液を使用することはできない。これらの理由により、抗Ｄ免疫グロブリンは世界的に不足状態にある。最後に、例えば、充分な検査法が確立されていない変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）などの病原体に誤って感染するなど、輸血により感染する感染症の危険があり、レシピエントの安全性に関して懸念が存在する。
【０００９】
同種免疫化によるリスクを有する他の群としては、例えば血液学的な悪性疾患、鎌状赤血球貧血やサラセミアを罹患した患者などの、定期的に血液製剤の投与を受ける患者がある。
【００１０】
ある種のＲｈＤペプチドが同種免疫化された患者のヘルパーＴ細胞を特異的に刺激することが見出された。逆に、ある種のＲｈＤペプチドによってヘルパーＴ細胞による免疫抑制性サイトカインの産生が刺激されることも見出された。更に、同種及び自己免疫化されたドナーのＨＬＡ−ＤＲ型とヘルパーＴ細胞の応答を刺激するペプチドとの間には何らかの相関がある。
【００１１】
本発明の目的は、赤血球細胞に対して同種免疫化されているか、あるいは自己免疫疾患を有する患者の効果的な治療法を提供することにある。
本発明の更なる目的は、同種免疫化を予防するための効果的な予防法を提供することにある。
【００１２】
本発明の第１の実施形態においては、患者の同種免疫化を予防するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００１３】
発明者等は、ＲｈＤタンパク質上のヘルパーＴ細胞エピトープをマッピングした。多くの同種免疫化されたドナーにおいて標的となるヘルパーエピトープを特徴付け、ＨＬＡ−ＤＲ型と特定の主要エピトープとの相関を特定することにより、ＲｈＤに対する免疫応答を調節し、Ｒｈ溶血性疾患及び抗Ｄに関連した輸血における問題を防止するための新規な方法としてのペプチド免疫療法を評価するための道が拓かれるものである。
【００１４】
現在、妊娠における主要な段階において妊娠中の女性に与えられる抗Ｄは、一時的に免疫現象を阻害する効果を有するために受動的な免疫療法と考えられている。
【００１５】
ＲｈＤ陰性の女性における受動的ペプチド療法を能動的ペプチド療法に置き換えることは、安全な合成寛容原を開発して妊娠前に投与することにより胎児の暴露を防止することが可能であることにより、魅力的な選択である。妊娠期間の全体を通じた抑制とは、１回のみの注射を必要とするということであり、ＲｈＤ陰性の女性の管理が大幅に簡略化されるばかりでなく、ＲｈＤに対する免疫応答を「スイッチオフ」するうえで、既に抗Ｄを産生している個人に免疫原性ペプチドを投与することによって、同種免疫化を防止するのではなく、これを逆行させることが初めて可能となる可能性がある。
【００１６】
本発明によって決定される、他のＲｈ抗原に対する免疫原性ペプチドは、自己免疫性溶血性疾患におけるＲｈＣ、Ｒｈｃ、ＲｈＥ及びＲｈｅならびにＲｈ５０（ペプチドは図４に示される）を含む（ただしこれに限定されない）各抗原による同種抗体の産生の防止または改変において同等の価値を有するものである。
【００１７】
したがって、事前の免疫化が考慮される個人のカテゴリーとしては次のようなものがある。
（１）出産可能な年齢のすべての女性。
（２）血液製剤の投与を定期的に受けている患者。例えば、血液学的悪性疾患、鎌状赤血球症、及びサラセミアなどにおいて輸血血液に暴露される可能性のある患者。
【００１８】
このような薬学的組成物をＲｈＤ陰性の血液とＲｈＤ陽性の子を有する妊婦に与えることが可能であり、この組成物によって、胚の血液が母親自身の免疫系と接触するようないかなる場合においても母親は免疫応答を生じることがなくなる。さらに、ＲｈＤ陽性であるすべての後の子において溶血性疾患を生ずる確率が低くなる。本発明に基く合成ペプチドの使用により、受動的免疫療法において使用される抗Ｄ免疫グロブリンによって、またはボランティア被験者であるレシピエントに与えられる赤血球細胞によって伝染するウイルス感染症についての不安がなくなる。信頼できるドナー及び提供を確認するうえで必要とされる、時間のかかる高価な方法も重要な考慮すべき点である。
【００１９】
更に、これらの組成物の使用により、しばしばＲｈＤ陰性の男性であるボランティア被験者が抗Ｄ免疫グロブリンの産生のために故意に免疫化される際に通常行われる赤血球の注射を避けることが可能である。
【００２０】
本発明の第２の実施形態においては、患者の同種免疫化によって誘導される応答または自己免疫性溶血性疾患を免疫抑制するための薬学的組成物であって、Ｒｈタンパク質の免疫学的に有効なエピトープ、または免疫学的活性を有するその類似体もしくは誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００２１】
ＲｈＤ陰性の母親の免疫系がＲｈＤ陽性の子からの血液に既に接触している場合、後にＲｈＤ陽性の子を妊娠した際にこの組成物を用いてその子がＲｈＤ溶血性疾患を患う確率を小さくすることが可能である。
【００２２】
更に、患者がＲｈＤ陰性であるのに誤ってＲｈＤ陽性の輸血が行われた場合にこの組成物を与えることが可能である。こうした組成物が利用可能であることにより、予防のための抗Ｄ免疫グロブリンの極めて大量の投与の必要性ならびに後に同種免疫化される確率が低減される。
【００２３】
好ましくは自己免疫性疾患は、「常温型」の自己抗体によって媒介される突発性または続発性の自己免疫性溶血性貧血である。この自己免疫性疾患の引き金となる原因は解明されておらず、したがってこの疾患はいつでも発症して、自身の赤血球細胞を攻撃する広いＲｈ血液型群特異性を有する自己抗体が体内で産生されうる。
【００２４】
Ｒｈタンパク質は、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかであれば都合がよい。
これらのＲｈタンパク質によって赤血球細胞の表面に見られる主要なＲｈ特異性の抗原が決定される。
【００２５】
好ましい一実施形態では、明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つからエピトープが選択される。
【００２６】
上記に述べたものは、同種免疫化された患者及び自己免疫性溶血性貧血の患者のＴ細胞によって認識される最も一般的なエピトープである。自己免疫性溶血性貧血では、好ましいエピトープは２，５，１４，２９，３１及び３８である。したがって、こうしたエピトープに対する誘導された寛容により、エピトープが患者の血中に出現した場合に免疫応答が起こることが防止される。
【００２７】
エピトープ１２Ａは、同種反応性Ｔ細胞によって認識される最も一般的なエピトープであり、エピトープ２９は自己免疫性溶血性貧血において最も一般的に認識されるエピトープであるので、エピトープとしては、エピトープ１２Ａか２９が好ましい。
【００２８】
上記のエピトープまたは免疫反応性誘導体のすべてのものは合成することが可能であれば都合がよい。
エピトープ配列が人工的に合成可能であれば、微生物による汚染は無視してよい。
【００２９】
本発明の第３の実施形態においては、患者の同種免疫化を誘導するための薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤中に置かれた免疫学的に有効なＲｈタンパク質のエピトープ、免疫学的活性を有するその類似体または誘導体を含む薬学的組成物が提供される。
【００３０】
好ましくは、Ｒｈタンパク質はＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のいずれかであり、明細書中に記載される番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープであれば都合がよい。
【００３１】
好ましくは賦形剤は、前記の組成物が、注射、経口、直腸、局所、または噴霧取り込み形態となるように選択される。
哺乳類は、例えば鼻腔粘膜や腸から特定のペプチドフラグメントを取り込むことにより特定の刺激に対して寛容化されることが知られている。発明者等は、妊娠前、妊娠中、または妊娠後にレシピエントである雌においてＲｈＤに対する免疫応答をなくす優れた方法の一つは、Ｒｈペプチドを、鼻腔、頬、または肛門粘膜などの粘膜を介するか、または経皮的に投与することであることを提案するものである。本発明に基いたペプチドフラグメントは、粘膜組織を介して体内に入り、本発明のペプチド断片が初めて循環血液系に達する場合に起きうるような最大の免疫応答を引き起こすことなく患者を効果的に免疫化することが可能である。
【００３２】
これらのエピトープを注射可能な形態とし、例えば免疫抑制効果を有するＩＬ−１０やＴＧＦ−βを産生することが可能なエピトープにて患者を意図的に免疫化するために使用することが可能である。
【００３３】
この方法の結果として、Ｒｈタンパク質に対する免疫応答を抑制するＲｈエピトープを用いた「ワクチン」が開発される。
本発明の第４の実施形態においては、薬学的に有効な賦形剤中に置かれた寛容化ペプチドフラグメントであって、賦形剤は、患者に注射、経口投与、座薬による直腸投与、局所投与、または噴霧投与されるように構成される寛容化ペプチドフラグメントにおいて、該寛容化ペプチドフラグメントはＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質のエピトープから選択されるものである寛容化ペプチドフラグメントが提供される。好ましくはエピトープは、明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択される。
【００３４】
薬学的に許容可能な賦形剤は、経皮または経粘膜投与用に構成することが可能であり、あるいは、この賦形剤は経口投与用の腸溶性コーティングを有する製剤とすることが可能である。
【００３５】
本発明の第５の実施態様においては、患者に寛容化ペプチドフラグメントを投与することを含む、患者を寛容化するための方法が提供される。
本発明の第６の実施態様においては、明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質からのエピトープが提供される。
【００３６】
本発明の第７の実施形態においては、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化される可能性を有する患者の寛容化のための薬剤の製造における使用が提供される。
【００３７】
本発明の第８の実施形態においては、ＲｈＤ，ＲｈＣ，Ｒｈｃ，ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質から選択されるか、または明細書中に記載されるエピトープ番号２，５，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１４，１５Ａ，１８Ａ，２８，２９，３１，３８及び３９の内の少なくとも１つから選択されるエピトープと、薬学的に許容される該エピトープ用の賦形剤とからなる、同種免疫化された患者または常温型自己免疫性溶血性貧血の患者の免疫抑制のための薬剤の製造における使用が提供される。
【００３８】
本発明の第９の実施形態においては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒトリンパ球に対するＲｈタンパク質からの１以上のエピトープの効果を決定するための方法であって、
ａ）Ｒｈタンパク質の１以上のエピトープ／ペプチドにて前記リンパ球を刺激することと、
ｂ）４〜７日後に培養を再懸濁してその等分量を次の方法で作製したプレートに移すこと；
ｃ）プレートの各ウェルをモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体にてコーティングし、
ｄ）そのプレートをハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）にて少なくとも１回洗い、
ｅ）適当な溶液を用いてすべての非特異的結合を阻害し、
ｆ）そのプレートをリンパ球培養とともに、約５％ＣＯ２と約９５％空気の雰囲気中において３０〜４０℃にて１２〜３６時間培養し、
ｇ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｈ）各ウェルに適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体を導入して室温にて３０〜６０分間培養し、
ｉ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｊ）Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体を導入して１５〜４５分間培養し、
ｋ）そのプレートをトウィーン／ＰＢＳにて少なくとも１回洗い、
ｌ）ｐ−ニトロフェニルホスファターゼを０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えたものを１つのウェルについて５０〜１５０μｌとなるよう各ウェルに加えてそのプレートを呈色させ、
ｍ）４０５ｎｍでの吸光度を読み取る；
とを含む方法が提供される。
【００３９】
従来、研究者は細胞が産生するサイトカインの量を求めるうえで数ある手法の中でもＥＬＩＳＰＯＴと呼ばれる捕捉アッセイを用いてきた。このアッセイではサイトカイン産生細胞のそれぞれに対して色スポットが形成される。色スポットの数に基いた大まかな計算を行ってサイトカインの産生量が推定される。本発明のアッセイにおけるｐ−ニトロフェニルリン酸の使用により、ウェル内の抗体によって捕捉されるサイトカインの量を生じる色の変化に基いて算定することが可能である。色の変化はより精度の高い分光測定法によって測定することが可能である。
【００４０】
したがって、この方法は非常に感度が高く、特定のＲｈＤタンパク質が、ヒトＴ細胞を、増殖するようにではなく免疫抑制性を有する可能性のあるサイトカインを産生するように刺激することを確認することが可能である。このことは、エピトープの送達方法を決定するうえで重要である。Ｔ細胞を増殖させるエピトープは寛容原として鼻腔または粘膜経路より投与されるのに対し、免疫抑制性サイトカイン産生につながるエピトープは注射される。
【００４１】
本発明の第１０の実施形態においては、ＲｈＤ陰性の患者が、ＲｈＤ陽性の血液に暴露された後に抗Ｄ抗体を産生する傾向を決定するための方法であって、患者の組織型を特定し、組織型がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５であるかを判定することを含む方法が提供される。
【００４２】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５の組織型を有する場合、患者は抗Ｄ抗体を産生しやすいので、ＲｈＤ陽性の赤血球細胞に暴露されるリスクに曝される前に処置が講じられなければならない。
【００４３】
実施例１
ＲｈＤまたはＲｈＣｃ／Ｅｅ血液型群抗原の発現にそれぞれ関与した３０ｋＤのＲｈタンパク質の配列に対応する、５または１０個のアミノ酸重複を有する６８種の１５量体ペプチドの完全なパネルを２個合成した（マルチプルペプチドサービス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｒｖｉｃｅ），ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ（Ｃｈａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），チェシア（Ｃｈｅｓｈｉｒ）、ユーケー・アンド・デパートメント・オブ・バイオケミストリー（ＵＫ　ａｎｄ　Ｄｅｐｔ．　Ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ユニバーシティ・オブ・ブリストル（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｒｉｓｔｏｌ）、ＵＫ）。これらのタンパク質のそれぞれのアミノ酸配列は２ヶ所の研究機関によるｃＤＮＡ法から独立に推定された。２つのポリペプチド配列は９２％の相同性を示し、パネル同士の間で合成ペプチドの内の１６個のものが共通であった（アミノ末端から数えて、ペプチド１〜５、８，９，１４，２１，２８，２９，３７〜３９，４１及び４２）。純度を保証するため、各パネルは従来のｐｉｎ技術ではなく、塩基置換活性架橋剤を用いた樹脂上でフルオレニルメトキシカルボニル法によって合成し、ランダムに選択したペプチドをＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により純度についてスクリーニングした。これらのペプチドを２０μｇ／ｍｌにて培養を刺激するために使用したが、培養の応答はその程度及び動態において５〜２０μｇ／ｍｌのペプチド濃度での応答と同様であることが事前に示されている。
【００４４】
コントロール抗原としてのヒト結核菌の精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（スタテンス　シーラムインシュタット（Ｓｔａｔｅｎｓ　Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｕｔ）、デンマーク）、及びＫｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔのヘモシアニン（ＫＬＨ）（カルバイオケム−ベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ラホーヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア、米国）をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して大量に透析し、フィルタ滅菌した後、５０μｇ／ｍｌにて培養に加えた。多くのイギリス国民はＢＣＧによって免疫化されているため、ＰＰＤはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて速やかに２次Ｔ細胞応答を引き起こしたがこれはＫＬＨでは見られなかった。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をシグマ（Ｓｉｇｍａ）社（Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）より入手し、１０μｇ／ｍｌにて培養を刺激するために使用した。
【００４５】
抗体
ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４５またはＣＤ１４に対するＦＩＴＣ−またはフィコエリトリン−結合モノクローナル抗体をダコ・ユーケー（Ｄａｋｏ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）社より入手した。ベクトン・ディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）より入手される、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、または−ＤＲに特異的な遮断モノクローナル抗体をＰＢＳに対して入念に透析した後、予め決定された最適濃度である２．５μｇ／ｍｌにて培養に加えた。
【００４６】
末梢血単核細胞及びＴ細胞の単離
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用して新鮮な血液試料からドナーまたは患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。これらのドナー及び患者は、妊娠、輸血、または関連血液による免疫化によって、ＲｈＤ陽性血液に対して事前に同種免疫化されたものである。
【００４７】
ＰＢＭＣの生存率は、トリパンブルー色素排除法によって判定されたように、すべての実験において９０％を上回った。ヒトＩｇＧ／ヒツジ抗ヒトＩｇＧ免疫複合体にてコーティングしたガラスビーズアフィニティーカラムに通過させることによりＰＢＭＣからＴ細胞を分離した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎ）により、典型的な調製物に含まれるＴ細胞は９５％を上回ることが示された。
【００４８】
細胞増殖アッセイ
マイクロタイタープレートに入れた、５％自家血清、４ｍＭのＬ−グルタミン酸（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）、１００Ｕ／ｍｌのベンジルペニシリンナトリウムＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン（シグマ）、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール（シグマ）、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）（シグマ）を補ったイーグル培地のアルファ改良型培地（アイ・シー・エヌ　フロー（ＩＣＮ　Ｆｌｏｗ）、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）１００μｌ中で１．２５×１０６細胞／ｍｌの濃度にてＰＢＭＣを培養した。プレートはすべて、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃にて培養した。培養の細胞増殖率を、上述した抗原による刺激後５日目に３重ウェル内での３Ｈ−チミジンの取り込み量から推定した。増殖の結果は、３重の試料の平均ＣＰＭ＋／−ＳＤとしてか、または、刺激されないコントロール培養に対する刺激した培養の平均ＣＰＭの比を表す刺激指数（ＳＩ）として表した。ＣＰＭ＞１０００でＳＩ＞３の場合、陽性の応答を表すものと解釈される。
【００４９】
活性化アッセイ
上記の実験は、ＲｈＤタンパク質を認識するが、免疫化によって活性化されない静態すなわち未実験のＴ細胞による応答を低減するように構成されたものである。実験を評価するため、上記の実験において増殖したＴ細胞を、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９４）２４：１５７８−１５８２）に掲載された方法を改良した方法を用いて検定し、Ｔ細胞がｉｎ　ｖｉｖｏにて活性化されたか否かを特定した。ここで、Ｔ細胞をスクリーニングして、これらのＴ細胞が静態すなわち未実験のＴ細胞の標識であるＣＤ４５ＲＡを有するサブセットからのものではなく、以前の活性化すなわち「記憶」の標識であるＣＤ４５ＲＯを有するサブセットからのものであることを確認した。
【００５０】
図２に示されるように、特定のペプチド配列に基いて異なるペプチド断片が選択された。これらを下に掲げる表１，２及び３に示した。また上記の例によって得られた結果を図２に示した。
【００５１】
すなわち、ＲｈＤに対して意図的に免疫化されたすべてのドナーからのヘルパーＴ細胞はＲｈＤペプチドによりｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激されることが示された。
【００５２】
更に、各Ｒｈペプチドに対するＴ細胞の応答は、同種免疫化ドナー間において差異が見られる。こうした差異はあるものの、ＲｈＤペプチドＮｏ２，６，６Ａ，１０Ａ，１１，１１Ａ，１２，１２Ａ，１５Ａ，１８Ａ，２８及び３９は最もよく標的化されており、また、ペプチド１２Ａによってドナーの７０％において増殖応答が引き起こされた。ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を共有するドナーでは有意に関連したプロファイルが見られる。ＲｈＤタンパク質上の同種反応性Ｔ細胞エピトープはＲｈＤ陰性の個人にとって異物となる配列をなし、したがって、こうした個人の赤血球上で発現される関連したＲｈＣｃ／Ｅｅタンパク質上にないことが予測される。ペプチド２８を除く特定されたフラグメントのすべてのものはこの予測に当てはまる配列である。したがって、こうしたペプチドまたはこれから誘導される配列を使用し、調製物の投与経路及び／または投与量及び調合に応じて、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＴ細胞の応答または寛容を望みどおりに刺激することが考えられる。
【００５３】
実際、増殖させられた細胞は事前に活性化されたものから導出されたものである。このことは、ＲｈＤにより免疫化されたＲｈＤ陰性のドナーにおける抗Ｄ抗体の産生を司っているのはこれらの細胞であるため重要である。
【００５４】
発明者等が特定したヘルパーＴ細胞エピトープを特徴付けることは、抗免疫グロブリンドナーのための安全な免疫原の開発にとって重要なステップであり、特に新生児における溶血性疾患の予防の新規なアプローチとしてのペプチド免疫療法を評価するための道を拓くものである。
【００５５】
これらの実験は、ＲｈＣ、Ｒｈｃ、ＲｈＥまたはＲｈｅタンパク質などの他のＲｈタンパク質を用いて行うことが可能である。
自己免疫性溶血性貧血に罹患した被験者からの血液を使用して上記の実験を反復することが可能である。したがって被験者のＴ細胞は、ペプチド２，５，１４，２９，３１及び３８に対して増殖応答を示し（図３を参照）、患者の６５％はペプチド２９に対して応答を示すことが示された。この結果はさらに、自己免疫性溶血性貧血に罹患し、ＨＬＡ−ＤＲ１５の組織型を有する患者間の相関を示すものである。ペプチド３１を除くすべてのペプチドはＲｈＤ及びＲｈＣｅ／Ｅｅタンパク質に共通である。
【００５６】
実施例２
実施例１において検定されたドナーのＨＬＡクラスＩＩ組織型を標準的なＳＳＰ−ＰＣＲ法によって確認した。これは、組織型を決定する分子は、表示のための抗原性ペプチドフラグメントを選択してＴ細胞に結合させるため、この調査において重要であるという理由により行ったものである。
【００５７】
バーカー（Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）Ｂｌｏｏｄ　９０：２７０１−２７１５）等により述べられる方法を用いて、Ｔ細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激するＲｈＤペプチドフラグメントを提供することにおいて、ＨＬＡ−Ｄの遺伝子座がＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱよりも重要であるということが示された。
【００５８】
ＲｈＤに対する応答性について選択されたＲｈＤ陰性ドナーのかなりの割合がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５遺伝子を有する（コントロール集団の約２９％に対して５６％）。すなわちこの組織型を有するということはＲｈＤ陽性の赤血球に暴露された後に抗Ｄ抗体を産生する可能性が高くなるということであり、ＨＬＡ−ＤＲ組織型における、応答を示した患者間の差異は一般の集団におけるよりも小さい。さらに、Ｔ細胞の増殖を誘引したＲｈＤペプチドのパターンは同じＨＬＡ−ＤＲタイプを共有するＲｈＤ陰性ドナーにおいて互いに大きく関連していることが示された（図３Ａ及び３Ｂを参照）。
【００５９】
常温型自己免疫性溶血性貧血でもやはりＨＬＡＤＲ１５との関連が見られ、患者の６５％がこのＨＬＡタイプを保有している。
しかしながら、全データの統計的分析は認識されたペプチドへのＨＬＡ−ＤＲタイプの影響は比較的弱いものであることを示している。言い換えれば、これらのＲｈＤペプチドの多くのものは組織型とは無関係にＴ細胞を刺激するということである。
【００６０】
これらの分析は、免疫化／寛容化レジメのためのＲｈＤペプチドフラグメントの選択は、この方法の臨床的応用のための重要な実際的考慮である、事前のレシピエントの組織型決定には依存しない可能性を示すものである。
【００６１】
実施例３
培養したＴ細胞を表１〜３に示されたエピトープにより刺激し、応答を示した細胞を５日後に、０．０５Ｍのアルカリ性炭酸コーティングバッファ（ｐＨ９．６）に希釈したモノクローナル抗サイトカイン捕捉抗体を１ウェルにつき５０μｌ用いてコーティングした平底マイクロタイタープレート（９６穴　Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に移した。結合しなかった捕捉抗体はＨＢＳＳによる２回の洗浄と、１つのウェルにつき２００μｌのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）にて培養することにより非特異的結合ポテンシャルを阻害することによって除去した。
【００６２】
刺激の５日後にリンパ球培養を混合して再懸濁し、１００μｌの等分量を、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、またはＴＧＦ−βに特異的なそれぞれの捕捉抗体にてコーティングしたウェルに移した。捕捉分子にてコーティングされ、リンパ球の層が形成されたこれらのプレートを、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃にて更に２４時間培養した。この培養の後、このＰＢＭＣを０．２％トウィーン／ＰＢＳによる４回の洗浄にて除去した。次いで０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳに加えた適当なビオチン化モノクローナル検出用抗体の１００μｌ等分量をウェルに加え、室温にて４５分間培養した。０．５％トウィーン／ＰＢＳによる６回の洗浄の後、１００μｌの１：１００，０００Ｅｘｔｒアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（シグマ）をウェルのそれぞれに加え、室温にて３０分間培養した。Ｅｘｔｒアビジン複合体を０．２％トウィーン／ＰＢＳによる８回の洗浄により除去し、０．０５Ｍの炭酸アルカリ緩衝溶液（ｐＨ９．６）に加えて１．０ｍｇ／ｍｌとしたｐ−ニトロフェニルリン酸を１つのウェルについて１００μｌ使用してプレートを呈色させた。４０５ｎｍでの吸光度をマルチスキャンプレートリーダー（ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）社、Ｂａｓｉｎｇｓｔｒｏｋｅ，ＵＫ）を使用して測定した。
【００６３】
倍加する希釈度にて組換えヒトＩＦＮγまたはＩＬ−１０またはＴＧＦ−β（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を加えた複製ウェルを培養することにより得られた基準曲線から補間することによってサイトカイン分泌率を測定した。基準曲線は、吸光度の値に適用した平滑化三次式近似関数、及び準対数的変換の後のサイトカイン濃度によってモデル化した。
【００６４】
【数１】
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この方法は非常に感度が高いため、特定のＲｈＤペプチドが、ヒトＴ細胞を増殖するようにではなく、免疫抑制性のサイトカインを産生するように刺激することを確認することが可能である。
【００６５】
図５Ａ及び５Ｂから、エピトープ１０，１６，２２，２４及び３４は、ヒトＴ細胞によるＩＬ−１０及び／またはＴＧＦ−βの産生を誘導することが分かる。ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの分子は免疫抑制性を有することが知られている。予備実験において、ＩＬ−１０を誘導するペプチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて全ＲｈＤタンパク質に応じてＴ細胞の増殖を阻害することが示されている。したがって、Ｔ細胞によるＩＬ−１０またはＴＧＦ−βの産生を誘導するＲｈＤペプチドを事前に投与することによりＲｈＤ陰性の個人のＲｈＤへの応答を防止することが可能である。確立された応答を阻害することも可能である。免疫系を操作するこの新規な方法は、Ｒｈタンパク質が重要な標的である常温型自己免疫性溶血性貧血の治療などの他の応用を有するものである。他の抗原から誘導される同様の性質を有するペプチドを特定することによっても、抗原／タンパク質が特定されている広範な自己免疫疾患の治療法が与えられる。
【００６６】
いずれの培養においてもＩＬ−４の産生は検出されなかった。図５Ｃでは、エピトープ５，２１及び２７がＩＦＮ−γの分泌を刺激することが分かる。図５ＤはＲｈＤペプチドによる刺激後のＴ細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込み量を示したものである。
【００６７】
図６から、Ｔ細胞の培養にこれらのペプチドを加えることによってＲｈＤタンパク質に対する増殖応答は特異的に阻害されるが、コントロール抗原であるＰＰＤに対する応答は阻害されないことが分かる。このことは、患者に与えられた場合に、これらのペプチドもｉｎ　ｖｉｖｏでの有害な応答を阻害する一方で免疫系の残りの部分は抑制しないという可能性が高くなるために非常に重要である。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【００７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＲｈＣＥポリペプチドの全アミノ酸配列、及び、Ｒｈｃ、Ｒｈｅ，及びＲｈＤポリペプチドの配列における相違を示す図（参照：Ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ　Ｐ９４， 　Ｅｄｉｔｏｒ；　Ｍ　Ｅ　Ｒｅｉｄ　＆　Ｃ　Ｌｏｍａｓ−Ｆｒａｎｃｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎ）。
【図２】表１，２及び３に示されるペプチド１〜４２及び６Ａ〜４０ＡのＲｈＤ抗原によって同種免疫化されたドナーにおける刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−培養に添加されたＲｈＤペプチド；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図３Ａ】自己免疫性溶血性貧血の患者における刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図３Ｂ】正常なコントロールにおける刺激ＲｈＤペプチドの分布を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−特定のＲｈＤペプチドに応答した患者の割合。
【図４】特定の組織型を共有するドナーにおいて認識されたＲｈエピトープ間の相関を示す図。Ｘ及びＹ軸はそれぞれドナー１，２の刺激指数を表す。各四角形は特定のペプチドの応答を表す。相関係数（Ｒ）＝０．７７４、ｐ値　９．５７Ｅ−０１５。
【図５Ａ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＴＧＦ−β産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＴＧＦ−β１分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｂ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＩＬ−１０産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＩＬ−１０分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｃ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞のＩＦＮ−γ産生の誘導に対する応答パターンを示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−ＩＦＮ−γ分泌量（ｎｇ／ｍｌ）、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図５Ｄ】Ｒｈペプチドを加えた培養後のＴ細胞への３Ｈ−チミジンの取り込み量を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−３Ｈ−チミジン取り込み量（平均値　ＣＰＭ×１０−３±ＳＤ）　ＳＩ＝３、値Ｄ＝ｎｏｎｅ。
【図６】免疫抑制性サイトカイン応答を生ずるペプチドによる、ＲｈＤタンパク質に応答するＴ細胞の阻害を示す図。ｘ−ＲｈＤペプチド刺激；ｙ−３Ｈ−チミジン取り込み量（平均値　ＣＰＭ×１０−３±ＳＤ）。Ａ−ｎｏｎｅ；Ｂ−コントロール（−）；Ｃ−ＲｈＤ；Ｄ−ＲｈＤと１６；Ｅ−ＲｈＤと２２；Ｆ−ＲｈＤと２４；Ｇ−ｎｏｎｅ；Ｈ−ＰＰＤ；Ｉ−ＰＰＤと１６；Ｊ−ＰＰＤと２２；Ｋ−ＰＰＤと２４。
【国際調査報告】
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