(57)【要約】本発明は、インフルエンザワクチンの皮内送達、具体的なインフルエンザ製剤ならびにそれらの調製法および使用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザワクチンの皮内送達のための皮内送達装置であって、
ｉ  インフルエンザワクチンを含み、出口ポートを有する容器、
ｉｉ  出口ポートと流体連通している針であって、皮膚に侵入するように適合された前端を有する針、および
ｉｉｉ  針を取り囲み、かつ、皮内注射を受ける皮膚で受け止められるように適合された皮膚接触面を有するリミッターであって、針が皮膚を通じて侵入することのできる量をリミッター部分が制限するように、針の前端が皮膚接触面を選択された距離だけ越えて延びているリミッター
を含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
薬物の容器は、概ね中空で円筒形の本体部分および貯留部内に受け入れられるプランジャーを含む注射器であり、プランジャーは、注射中に出口ポートから物質を強制的に排出するために、貯留部内で選択的に移動できることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
針を支えるハブ部分を含み、ハブ部分は出口ポートの近くで薬物の容器に選択的に固定されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
薬物の容器は、ワクチンを収容するように適合された貯留部を有する注射器であり、注射器は貯留部を少なくとも部分的に取り囲む概ね平坦な本体部分を含み、その本体部分および貯留部は、注射中に貯留部から物質を放出するために貯留部の側壁が相互に向けて選択的に撓まされるように、２枚の熱可塑性材料のシートから作製されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
針を支え、出口ポート近くで注射器に選択的に固定されるハブ、および出口ポートに隣接する概ね円形の受容体を含み、ハブが受容体内に完全に受け入れられ、かつリミッターが出口ポートに隣接して本体部分により恒久的に支持されるように、リミッターは受容体と一体に形成されていることを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項６】
皮膚接触面は針を取り囲み、内径と外径の間で規定される厚みを有し、かつ内径は、針の外径の少なくとも５倍以上であることを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
皮膚接触面は概ね円形であることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
針の前端はハブから離れて第１の方向に延び、針の後端はハブから離れて第２の方向に延び、また出口ポートを閉鎖するシーリング膜を含み、かつハブが受容体によって受け入れられるとき、針の後端がシーリング膜を刺し貫くことを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項９】
針を支え、出口ポート近くで注射器に選択的に固定されるハブ、および出口ポートに隣接し、概ね円形の受容体を含み、ハブが受容体内に完全に受け入れられ、かつリミッターが受容体と別々に形成され、受容部により少なくとも部分的に受け入れられることを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項１０】
リミッターおよびハブは単一部品構造に一体に形成されていることを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
針はある長さを有し、選択された距離は針の長さよりはるかに短いことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
選択された距離は固定であり、約０．５ｍｍから約３ｍｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
皮膚接触面は概ね平坦であり、針の軸に概ね垂直な面を通って延びていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
皮膚接触面は針の外径よりわずかに大きな中央開口を含み、皮膚接触面は連続的であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
皮膚接触面は、皮膚に対して所望の姿勢に組立品を安定化するのに十分な大きさの接触表面領域を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
所望の姿勢は皮膚と概ね垂直であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
薬物の容器はある物質で予め充填されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
インフルエンザワクチンの皮内送達に使用するキットであって、
ｉ  インフルエンザワクチンを含むワクチン容器、および
ｉｉ  皮下注射針組立品であって、
薬物の容器に取り付けられることができるハブ部分、
ハブ部分により支持される針であって、ハブ部分から離れて延びる前端を備えた中空本体を有する針、および
針を取り囲み、ハブ部分から針の前端部分に向けて延びるリミッター部分であって、皮内注射を受ける動物の皮膚に受け止められるようになされた皮膚接触面を有し、針が動物の皮膚に侵入できる量をリミッター部分が制限するように、針前端が皮膚接触面を選択された距離だけ越えて延びているリミッター部分を含む針組立品を含むことを特徴とするキット。
【請求項１９】
ハブ部分およびリミッター部分が、プラスチック材料から作られた単一部品として一体に形成されることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ハブ部分およびリミッター部分が別々の部品として形成されることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
リミッター部分はハブ部分の少なくとも一部を受け入れる内腔を含み、内腔は、ハブ部分上の対応する構造に接触することにより、皮膚接触面を越えて針の前端が延びる量を制限する迫台面を含むことを特徴とする請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
リミッター部分は注射器の一部として一体に形成され、ハブ部分はリミッター部分内に受け入れられることを特徴とする請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
皮膚接触面は針を取り囲み、内径と外径との間に規定された厚みを有し、内径は、針の外径の少なくとも５倍以上であることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
皮膚接触面は概ね円形であることを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
皮膚接触面は針の外径よりわずかに大きな中央の開口を含み、皮膚接触面は連続的であることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２６】
皮膚接触面は概ね平坦であり、針の軸と概ね垂直な面を通って延びていることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２７】
針の前端が皮膚接触面を越えて延びる選択された距離は固定されていることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２８】
選択された距離は約０．５ｍｍから約３ｍｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２９】
皮膚接触面は、皮膚に対して所望の姿勢で組立品を安定化するのに十分な大きさの接触表面領域を含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項３０】
所望の姿勢は皮膚と概ね垂直であることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
薬物の容器が注射器であり、動物がヒトであることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項３２】
インフルエンザワクチンが以下のプロセスにより入手でき、
（ｉ）培養液からのウイルス含有材料の収集；
（ｉｉ）非ウイルス材料を除去するための収集材料の清澄化；
（ｉｉｉ）収集ウイルスの濃縮；
（ｉｖ）非ウイルス材料から全ウイルスを分離するための追加ステップ；
（ｖ）密度勾配遠心分離ステップにおいて好適なスプリッティング剤を用いる全ウイルスのスプリッティング；
（ｖｉ）好ましくない材料を除去するための濾過；
これらのステップはこの順序で実施されるが、必ずしも連続して実施する必要はないことを特徴とする請求項のいずれかに記載の装置、または請求項１から３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
皮内インフルエンザワクチンは３価の非生ワクチンであることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３４】
ウイルスは発育鶏卵上で培養され、収集材料は尿膜腔液であることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３５】
清澄化ステップは中程度の速度の遠心分離により行われることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３６】
濃縮ステップはＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を用いることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３７】
別の分離ステップ（ｉｖ）はショ糖勾配を用いるゾーン遠心分離であることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３８】
スプリッティングステップはさらなるショ糖勾配中で行われ、ショ糖勾配はスプリッティング剤を含有することを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項３９】
スプリッティング剤はデオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項３８に記載の装置またはキット。
【請求項４０】
濾過ステップ（ｖｉ）はスプリットウイルス材料を濃縮する限外濾過ステップであることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４１】
場合によりプロセスの最後に少なくとも１回の滅菌濾過ステップが存在することを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４２】
不活性化ステップが最終濾過ステップの前に行われることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４３】
方法が、ワクチン組成物中の１種または複数種の界面活性剤の濃度を調整するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４４】
ワクチンが、約０．１から約０．２ｍｌの投与量で提供されることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４５】
ワクチンが、存在するインフルエンザ１株当たり１〜５μｇの赤血球凝集素の抗原投与量で提供されることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４６】
ワクチンが少なくとも２株についてＥＵ基準を満たすことを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４７】
ワクチンが、さらに胆汁酸もしくはコール酸、またはデオキシコール酸ナトリウムなどのそれらの誘導体を含むことを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４８】
ワクチンが少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項４９】
少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤が、オクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、市販のトリトン（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイーン（商標）シリーズ）および一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルもしくはエステル：
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである）；ならびにこれらのうち２種類以上の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項３２に記載の装置またはキット。
【請求項５０】
ワクチンがポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８０）およびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）の組合せを含むことを特徴とする請求項４９に記載の装置またはキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチンの皮内送達、具体的なインフルエンザ製剤ならびにそれらの調製法および使用法に関する。
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も広範に分布するウイルスの１つであり、ヒトと家畜の双方に影響を及ぼす。インフルエンザウイルスは、粒径が直径約１２５ｎｍのＲＮＡ被膜ウイルスである。インフルエンザウイルスは、基本的に内部ヌクレオカプシドすなわち核タンパク質と結合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアからなり、脂質二層構造を有するウイルスエンベロープおよび外部糖タンパク質によって囲まれている。ウイルスエンベロープの内層は、主にマトリックスタンパク質から構成され、外層は、大部分が宿主由来の脂質材料から構成されている。表面糖タンパク質のノイラミニダーゼ（ＮＡ）および赤血球凝集素（ＨＡ）は、粒子表面上における長さ１０から１２ｎｍのスパイクのように見える。インフルエンザサブタイプの抗原特異性を決定するのはこれらの表面タンパク質、特に赤血球凝集素である。
【０００３】
典型的なインフルエンザの流行は、入院または死亡の増加率によって示されるように肺炎および下気道疾患の発生率を増加させる。高齢者または基礎的慢性疾患を有する患者は、このような合併症を経験する可能性が高いが、乳児も重症疾患を被ることがある。したがって、これらのグループは特に守られる必要がある。
【０００４】
現在入手可能なインフルエンザワクチンは、不活化ワクチンまたは弱毒生ワクチンのどちらかである。不活化インフルエンザワクチンは、不活化全ウイルス、精製ウイルス粒子を界面活性剤もしくは他の試薬で破壊し、脂質エンベロープを可溶化させたサブビリオン（いわゆる「スプリット」ワクチン）または精製ＨＡおよびＮＡ（サブユニットワクチン）という３タイプの抗原調製物のうち１つを含有する。これらの不活化ワクチンは、一般に筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与される。
【０００５】
インフルエンザワクチンは、通常３価ワクチンである。３価ワクチンは、一般に２種類のＡ型インフルエンザウイルス株および１種類のＢ型インフルエンザ株に由来する抗原を含む。ほとんどの場合、標準的な注射用投与量０．５ｍｌは、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）により測定されるように、各株に由来する赤血球凝集素抗原成分１５□ｇを含有する（Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ他：インフルエンザ赤血球凝集素抗原をアッセイするための改良型一元放射免疫拡散法（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）：不活化全ウイルスワクチンおよびサブユニットワクチンの効力決定に対する適応（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｃｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ）。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．５（１９７７）２３７〜２４７；Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄ他、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素抗原をアッセイするための一元放射拡散法および免疫電気泳動法の国際的共同研究（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９（１９８１）３１７〜３３０）。各季節にインフルエンザワクチン中に組み入れられるインフルエンザウイルス株は、各国の保健機関およびワクチン製造者と連携して世界保健機構によって決定される。
【０００６】
従来の筋肉内スプリットまたはサブユニットインフルエンザワクチンは、一般的には有機溶媒または界面活性剤によってウイルスを破壊し、ウイルスタンパク質を様々な程度まで分離または精製することによって調製される。スプリットワクチンは、感染性または不活化のどちらかの全インフルエンザウイルスを可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤によって断片化し、続いて可溶化剤および一部または大部分のウイルス脂質材料を除去することにより調製される。スプリットワクチンは、一般的にマトリックスタンパク質および核タンパク質、時には脂質、ならびに膜エンベロープタンパク質を含有する。スプリットワクチンは、通常ウイルス構造タンパク質の大部分またはすべてを含有するが、必ずしも全ウイルスで存在するのと同一の比率である必要はない。一方、サブユニットワクチンは、本質的に高度に精製されたウイルス表面タンパク質、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼからなり、それらはワクチン接種により所望のウイルス中和抗体を誘導することを担う表面タンパク質である。マトリックスおよび核タンパク質は、サブユニットワクチンでは検出できないか、わずかに検出できるかのどちらかである。
【０００７】
インフルエンザワクチンの有効性を測定するための基準が国際的に適用される。インフルエンザに対して有効なワクチンに関する欧州連合の公式基準を下表に示す。理論上は、インフルエンザワクチンが欧州連合の要件を満たし、ＥＵにおいて発売が承認されるためには、ワクチンに含まれるインフルエンザのすべての株について表中の基準のうち１つを満たさなければならない。しかしながら、実際には、特に新たなワクチンを市販するためには、すべての株について基準のうち少なくとも２つまたはおそらく３つすべてを満たす必要がある。ある状況下では２つの基準で十分なことがある。例えば、すべての株について３基準のうち２つが満たされ、第３の基準はすべてでなく一部の株（例えば、３株のうち２株）によって満たされる場合も許容可能と思われる。これらの要件は、成人集団（１８〜６０歳）および高齢者集団（＞６０歳）によって異なる。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
＊血清変換率は、各ワクチン株についてワクチン接種後の血清中赤血球凝集素阻害（ＨＩ）力価が少なくとも４倍に増加したワクチン被接種者の割合と定義される。
【００１０】
＊＊変換係数は、各ワクチン株についてワクチン接種後の血清中ＨＩの幾何平均力価における増加倍率と定義される。
【００１１】
＊＊＊防御率は、（各ワクチン株について）ワクチン接種後に１：４０以上の血清中ＨＩ力価を有するワクチン被接種者の割合として定義され、通常は防御を示したと認められる。
【００１２】
例年のインフルエンザの流行に伴う罹患率および死亡率を抑えるための現在の努力は、筋肉内投与される不活化スプリットワクチンまたはサブユニットインフルエンザワクチンの使用をベースとしている。呼吸器疾患およびインフルエンザ合併症の予防におけるこのようなワクチンの有効性は、健康成人における７５％から高齢者における５０％未満の範囲である。
【００１３】
インフルエンザワクチンを投与する代替方法、特に痛みがないか筋肉内注射より痛みが少なく、注射部位感染という同様の危険性がなく、さらに「注射針恐怖症（ｎｅｅｄｌｅ  ｆｅａｒ）」による患者のコンプライアンスに対するマイナス効果を伴わない方法を提供することが望ましいであろう。さらに、針刺し傷害の高い危険性などの保健医療従事者に対するマイナス効果を持たない投与経路によって投与することが望ましいであろう。
【００１４】
不活化インフルエンザワクチンをヒトに皮内曝露する実験は１９４０年代にさかのぼることができる。皮内ワクチン接種の利点は認識されていたが、これらのワクチン接種の成功率は変動が多く、今までのところインフルエンザに対する通常のワクチン接種が皮内経路を介して有効かつ実施可能であるという合意はない。通常、この変動性は、真皮中へ再現可能なワクチン投与を行うことが困難なためである。通常、ワクチンの投与が皮膚中に深く入りすぎて、皮下または筋肉内投与の原因となるか、浅すぎて注射部位からのワクチン漏出を引き起こして防御がほとんどまたはまったく得られない結果となる。
【００１５】
従来の皮内注射の技法であるマントー法は複雑であり、訓練されかつ熟練した技術者が行う必要がある。この方法は、皮膚を消毒するステップと、次いで一方の手で伸ばすステップと、狭いゲージの針（２６〜３１ゲージ）のベベルを上に向け、針を１０〜１５°の角度で挿入するステップとを含む。針のベベルを挿入したら、針のバレルを下げ、わずかに圧力を加えながら先に進め、皮膚の下で針を持ち上げる。次いで、液体を極めてゆっくりと注射することによって皮膚表面上に小疱または瘤を作り、続いて針をゆっくりと引き抜く。
【００１６】
皮内注射を提供するためにいくつかの装置が提案されており、それらには従来の針サイズに比べて短くした針が含まれる。より小さな針は、患者の真皮層を越えて突き抜けないようにしている。このような装置は、１９９６年６月１８に発行された米国特許番号５，５２７，２８８；１９８９年１２月１２日に発行された４，８８６，４９９；および１９９４年７月１２日に発行された５，３２８，４８３に示されている。しかしながら、提案された装置には欠点および弱点がないわけではない。
【００１７】
例えば、米国特許番号５，５２７，２８８および４，８８６，４９９に示される装置は、高度に特殊化した注射器である。これらの注射器の設計には、量産スケールで経済的に製造することができない比較的複雑な構成部品の配置が含まれる。したがって、このような装置の応用性および用途は限られている。
【００１８】
同様に、米国特許番号５，３２８，４８３に示される装置は、特別に設計された注射器を必要とするため、様々なタイプの注射器と一緒に使用するように適合させることは容易ではない。さらに、この特許の組立品は、経済的な量産にはつながらない。
【００１９】
マントー法またはジェットガン注射器による皮内インフルエンザワクチン接種の例には、Ｃｒｏｗｅ（１９６５）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１、３８７〜３９６；ＭｃＥｌｒｏｙ（１９６９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ中、１１月６日、１０７６ページ；Ｔａｕｒａｓｏ他（１９６９）Ｂｕｌｌ  Ｗｌｄ  Ｈｌｔｈ  Ｏｒｇ４１、５０７〜５１６；Ｆｏｙ（１９７０）ＪＡＭＡへのレター中、６／７／７０、２１３巻１３０ページ；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌへのレター、２９／１０／７７  １１５２ページ；Ｂｒｏｏｋｓ他（１９７７）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３９、１１０〜１１２；Ｂｒｏｗｎ他（１９７７）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １３６、４６６〜４７１；Ｈａｌｐｅｒｉｎ他（１９７９）ＡＪＰＨ  ８９、１２４７〜１２５２；ＨｅｒｂｅｒｔおよびＬａｒｋｅ（１９７９）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １４０、２３４〜２３８；Ｂａｄｅｒ（１９８０）ＡＪＰＨへのレター中、７０巻、５号；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ他（１９８１）Ａｒｃｈ  Ｒｏｕｍ  Ｐａｔｈ  Ｅｘｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ中、４０、６７〜７０が含まれる。
【００２０】
すなわち、６０年代半ば（または前半）から１９８０年代前半までは、文献は皮内ワクチン接種に興味を示している。しかしながら、２回のワクチン投与が必要であるとするのが一般的な考えであったように見える。また、所望の部位に少量のワクチンをうまく位置づける投与の困難さおよび確実性の欠如のため、皮内送達経路の使用は従来の集団ワクチン接種の目的としては考慮されないという広く支持された考えもあった。
【００２１】
したがって、市販のインフルエンザワクチンは、依然として筋肉内投与されるスプリットまたはサブユニット注射用ワクチンのままである。
【００２２】
不活化ウイルスをベースとする皮内インフルエンザワクチンがこの数年研究されてきたが、皮内インフルエンザワクチンが現在のところ市場に出ていないという事実は、この経路による有効なワクチン接種を行う困難さを反映している。
【００２３】
今回、特有な送達装置により患者の真皮中へ確実に投与された場合に、特定のインフルエンザワクチンが特に良好な皮内ワクチンとなることを発見した。特に、このようなインフルエンザウイルスワクチン調製物の皮内投与は、低用量の抗原により防御レベルで全身性免疫を刺激する。さらに、有効なインフルエンザワクチンに関する国際基準を満たす。より具体的には、低用量抗原ワクチンの皮内投与は、同ワクチンの皮下投与によって得られるものに匹敵する全身性血清変換（抗ＨＡ力価で４倍の増加）を生み出すことができる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「皮内送達」は、皮膚の真皮の領域へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンがまったく真皮だけに局在することは必ずしも必要ではない。真皮は、ヒト皮膚において表面より約０．５から約３ｍｍに位置する皮膚中の層であるが、個人間および身体の様々な部分である程度の変動がある。一般的に、皮膚の表面下１．５ｍｍに至ることにより真皮に到達すると思われる。真皮は、角質層および表面の表皮とその下の皮下層との間に位置する。
【００２５】
送達の方法により、ワクチンはもっぱらもしくは主に真皮内に最終的に局在するか、または表皮および真皮内に最終的に分布してもよい。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、インフルエンザワクチンの皮内送達のために皮内送達装置であって、
ｉ  インフルエンザワクチンを含む貯留部を有し、インフルエンザワクチンが注射中に貯留部から出ることを可能にする出口ポートを有する容器、
ｉｉ  出口ポートと流体連通している針であって、動物の皮膚を貫通するようになされた前端を有する針、および
ｉｉｉ  針を取り囲み、動物の皮膚に向かって位置し、皮内注射を受け止めるようになされた皮膚接触面を有するリミッターであって、針の前端が皮膚を貫通する量をリミッターが制限するように、針の前端が皮膚接触面を越えて選択された距離まで延びているリミッターを含む装置を提供する。
【００２７】
このような皮内送達装置を用いるインフルエンザワクチンの送達は、極めて有効で再現性があり、他の方法では筋肉内送達を介する必要があると考えられるわずかなワクチンを用いて有効な防御応答を確実に誘発する。
【００２８】
インフルエンザの好ましい特徴
インフルエンザワクチンは、生きていないインフルエンザ抗原調製物を含むことが好ましい。生きていない抗原調製物は、生きているウイルスから調製されたスプリットインフルエンザ調製物またはサブユニット抗原調製物であることが好ましい。抗原は、スプリットインフルエンザ抗原調製物であることが最も好ましい。スプリットインフルエンザ抗原調製物は、本明細書に記載の方法に従って製造することができる。
【００２９】
ワクチンは、皮内送達用の１回投与のインフルエンザワクチンであることが好ましい。インフルエンザ抗原調製物は、特に本明細書に記載の方法を含む様々な知られている方法に従って製造することができる。
【００３０】
ワクチンは、３価ワクチンであることが好ましい。
【００３１】
本発明によるワクチンは、前述のインフルエンザワクチンに関するＥＵ基準の一部またはすべてを満たし、ワクチンは欧州において承認可能である。ワクチンに表示されるインフルエンザの株またはすべての株について（ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｒ  ａｌｌ  ｓｔｒａｉｎｓ）、３つのＥＵ基準のうち少なくとも２つは満たされることが好ましい。すべての株について少なくとも２つの基準が満たされ、第３の基準は、すべての株によって、または少なくとも１つを除くすべての株によって満たされることがより好ましい。存在するすべての株が３つの基準すべてを満たすことが最も好ましい。
【００３２】
本発明によるワクチンは、従来のワクチンより少量の赤血球凝集素を有することができ、より少ない容積で投与される。インフルエンザ１株当たりの赤血球凝集素の量は、約１〜７．５μｇ、より好ましくは約３μｇまたは約５μｇであることが好ましく、これらの量は、筋肉内投与のための従来のワクチンで使用される赤血球凝集素の投与量のそれぞれ５分の１または３分の１である。本発明によるワクチンの投与容積は０．０２５ｍｌから２．５ｍｌであることが好ましく、約０．１ｍｌまたは約０．２ｍｌであることがより好ましい。５０μｌの投与容積を考慮してもよい。０．１ｍｌの投与は、従来の筋肉内インフルエンザワクチン投与容積の約５分の１である。皮内投与できる液体の容積は、部分的には注射の部位によって異なる。例えば、三角筋部位に注射する場合には、０．１ｍｌが最も好ましい容積であるが、腰部の場合には、大量、例えば約０．２ｍｌを投与することができる。
【００３３】
スプリットインフルエンザワクチンは、以下のプロセスにより入手できることが好ましく、
（ｉ）培養液からのウイルス含有物質の収集；
（ｉｉ）非ウイルス物質を除去するための収集物質の清澄化；
（ｉｉｉ）収集ウイルスの濃縮；
（ｉｖ）非ウイルス物質から全ウイルスを分離するための追加ステップ；
（ｖ）密度勾配遠心分離ステップにおいて好適なスプリッティング剤を用いる全ウイルスのスプリッティング；
（ｖｉ）好ましくない物質を除去するための濾過；
これらのステップはこの順序で実施されるが、必ずしも連続して実施する必要はない。
【００３４】
ウイルスは卵、より具体的には発育鶏卵上で培養することが好ましく、この場合に収集材料は尿膜腔液である。
【００３５】
清澄化ステップは、中程度の速度における遠心分離法によって行われることが好ましい。あるいは、例えば０．２μｍの膜による濾過ステップを用いてもよい。清澄化ステップは、培養液由来の、例えば卵由来の材料の大部分を取り除く。
【００３６】
濃縮ステップは、吸着法を用いることが好ましく、ＣａＨＰＯ４を用いることが最も好ましい。あるいは、濾過、例えば限外濾過を用いてもよい。
【００３７】
追加分離ステップ（ｉｖ）は、ゾーン遠心分離法、特にショ糖勾配を用いる分離法であることが好ましい。場合により、勾配は微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。
【００３８】
スプリッティングステップは、追加ショ糖勾配で行うことが好ましく、ショ糖勾配はスプリッティング剤を含有する。
【００３９】
濾過ステップ（ｖｉ）は、スプリットウイルス材料を濃縮する限外濾過ステップであることが好ましい。
【００４０】
少なくとも１回の滅菌濾過ステップが、場合によりプロセスの最後にあることが好ましい。
【００４１】
場合により、最終濾過ステップの前に不活化ステップがある。
【００４２】
本明細書に記載の皮内ワクチンは、少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。
【００４３】
本発明によるワクチンは、皮膚の表面下約１．０から２．０ｍｍの位置に投与されることが好ましい。ワクチンは、皮膚の表面下約１．５ｍｍの距離に送達されることがより好ましい。
【００４４】
本発明が関係するワクチンは、粒子を含むスプリットビリオンワクチンである。ワクチンは、動的光散乱法（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａ  Ｓｉｚｅｒ）を用いて測定した平均粒径が２００ｎｍ以下である粒子を含有することが好ましく、５０から１８０ｎｍであることがより好ましく、１００から１５０ｎｍであることが最も好ましい。粒径は、株により季節毎に変化することがある。
【００４５】
本発明で使用されるスプリットインフルエンザウイルス抗原調製物は、少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。非イオン性界面活性剤は、オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、市販のトリトン（商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイーン（商標）シリーズ）および一般式（Ｉ）であって、
（Ｉ）ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
ｎが１〜５０であり、Ａが結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲがＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルであるポリオキシエチレンエーテルまたはエステル；ならびにこれらのうち２種類以上の組合せからなる群から選択される少なくとも１種類の界面活性剤であることが好ましい。
【００４６】
２種類の非イオン性界面活性剤の組合せであって、各々がオクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル由来の界面活性剤であり、特にツイーン８０とトリトンＸ−１００の組合せが好ましい。界面活性剤の他の可能で好ましい組合せを以下で考察する。
【００４７】
式（Ｉ）に含まれる好ましい界面活性剤は、ｎが４〜２４、より好ましくは６〜１２、最も好ましくは９であり、Ｒ部分がＣ１〜５０、好ましくはＣ４〜２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルである分子である。
【００４８】
オクチルフェノキシポリオキシエタノールおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルは、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ」ＡｔｔｗｏｏｄおよびＦｌｏｒｅｎｃｅ編（１９８３、ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ）に記載されている。ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００（商標））を含むオクチルフェノキシポリオキシエタノール（オクトキシノール）もＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  Ｅｎｔｒｙ  ６８５８（１１６２ページ、第１２版、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ；ＩＳＢＮ  ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８０（商標））を含むポリオキシエチレンソルビタンエステルはＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  Ｅｎｔｒｙ  ７７４２（１３０８ページ、第１２版、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ；ＩＳＢＮ  ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。どちらも、本明細書に記載の方法を用いて製造するか、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．などのコマーシャルソースから購入することができる。
【００４９】
特に好ましい非イオン性界面活性剤には、トリトンＸ−４５、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、トリトンＸ−１０２、トリトンＸ−１１４、トリトンＸ−１６５、トリトンＸ−２０５、トリトンＸ−３０５、トリトンＮ−５７、トリトンＮ−１０１、トリトンＮ−１２８、Ｂｒｅｉｊ３５、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）およびポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ステアレス９）が含まれる。トリトンＸ−１００およびラウレス９が特に好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８０（商標））も特に好ましい。
【００５０】
一般式（Ｉ）のさらに好適なポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される。ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００５１】
ポリオキシエチレンラウリルエーテルに関する代替用語または代替名は、ＣＡＳ登録に開示されている。ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルのＣＡＳ登録番号は９００２−９２−０である。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ（第１２版：エントリ７７１７、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ；ＩＳＢＮ  ０９１１９１０−１２−３）に記載されている。ラウレス９は、エチレンオキシドをドデシルアルコールと反応させることによって生成され、平均して９個のエチレンオキシド単位を有する。
【００５２】
界面活性剤におけるポリオキシエチレン区分の長さとアルキル鎖の長さの比（すなわち、ｎ：アルキル鎖長）は、水性媒体におけるこの種類の界面活性剤の溶解性に影響を及ぼす。すなわち、本発明の界面活性剤は、溶液中にあるか、またはミセルまたは小胞などの粒子状構造を形成することができる。溶液として、本発明の界面活性剤は安全で、容易に滅菌可能で投与も簡単であり、均一な粒子状構造の形成に関係するＧＭＰおよびＱＣ問題も伴わずに簡単な方法で製造することができる。ラウレス９などの一部のポリオキシエチレンエーテルは、非小胞の溶液を形成することができる。しかしながら、ポリオキシエチレン−８−パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）エーテル（Ｃ１８Ｅ８）は、小胞を形成することができる。したがって、ポリオキシエチレン−８−パルミトイルエーテルの小胞を少なくとも１種類の別の非イオン性界面活性剤と組み合わせ、本発明の製剤に用いることができる。
【００５３】
本発明の製剤で使用されるポリオキシエチレンエーテルは、溶血活性を有することが好ましい。ポリオキシエチレンエーテルの溶血活性は、以下のアッセイを参照してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて測定することができ、赤血球の溶解を引き起こさない界面活性剤の最高濃度として表される。
【００５４】
１．モルモットの新鮮血を卓上型遠心分離機中でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により３回洗浄する。元の容積まで再懸濁した後、血液をＰＢＳでさらに１０倍希釈する。
【００５５】
２．この血液懸濁液５０μｌを、界面活性剤の２倍希釈液を含有するＰＢＳ８００μｌに加える。
【００５６】
３．８時間後、視覚的または上清の光学密度を測定することにより溶血を評価する。５７０ｎｍで光を吸収する赤色の上清の存在は、溶血の存在を示している。
【００５７】
４．結果は、もはや溶血が起きない第１の界面活性剤溶液の濃度として表される。
【００５８】
このような生物学的アッセイに特有の実験的変動内で、本発明のポリオキシエチレンエーテル、または一般式（Ｉ）の界面活性剤は、約０．５〜０．０００１％の溶血活性を有することが好ましく、０．０５〜０．０００１％であることがより好ましく、さらに０．００５〜０．０００１％であることがより好ましく、０．００３〜０．０００４％であることが最も好ましい。理想としては、前記ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルは、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテルのどちらかの溶血活性に類似した（すなわち、１０倍の差以内）溶血活性を有していなければならない。
【００５９】
本明細書に記載のワクチン製剤中には、記載した異なる界面活性剤の群からの２種類以上の非イオン性界面活性剤が存在することができる。特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８０（商標））などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００（商標））を含むオクトキシノールの組合せが好ましい。非イオン性界面活性剤の他の特に好ましい組合せは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルもしくはオクトキシノールまたは両者を含む。
【００６０】
この非イオン性界面活性剤または各々の非イオン性界面活性剤は、最終ワクチン製剤中に０．００１から２０％の濃度で存在することが好ましく、０．０１から１０％であることがより好ましく、約２％までであることが最も好ましい（ｗ／ｖ）。１種または複数の界面活性剤が存在する場合には、一般的に各々が約２％までの濃度、通常は各々約０．６％までの濃度で最終製剤中に存在する。１種または複数の別の界面活性剤が存在してもよく、一般的には各々約１％まで、通常は各々約０．２％または０．１％までの痕跡量である。本発明によるワクチン製剤中には、界面活性剤のいかなる混合物も存在することができる。
【００６１】
前述のような非イオン性界面活性剤は、最終ワクチン組成物中で次の通りの好ましい濃度を有する。ツイーン８０（商標）などのポリオキシエチレンソルビタンエステル：０．０１から１％、最も好ましくは約０．１％（ｗ／ｖ）；トリトンＸ−１００（商標）などのオクチルもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノールまたはトリトンシリーズの他の界面活性剤：０．００１から０．１％、最も好ましくは０．００５から０．０２％（ｗ／ｖ）；ラウレス９などの一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテル：０．１から２０％、好ましくは０．１から１０％および最も好ましくは０．１から１％または約０．５％（ｗ／ｖ）。
【００６２】
製剤中には他の試薬も存在することができる。本発明の製剤は、胆汁酸またはその誘導体を、特に塩の形態で含むことができる。それらには、コール酸の誘導体およびその塩、特にコール酸またはコール酸誘導体のナトリウム塩が含まれる。胆汁酸およびその誘導体の例には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および上記胆汁酸のグリコ、タウロ、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコール酸アミドが含まれる。特に好ましい例は、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）であり、最終ワクチン投与に存在してもよい。
【００６３】
本発明によるワクチン製剤は、１種または複数の非イオン性界面活性剤と組み合わせたスプリットインフルエンザウイルス調製物を含むことが好ましい。１種または複数の非イオン性界面活性剤は、スプリットインフルエンザ抗原調製物を製造するプロセスからの残留物であってもよく、かつ／またはその後に抗原調製物に添加してもよい。その非イオン性界面活性剤または各々の非イオン性界面活性剤の濃度は、スプリッティング／精製プロセスの終了時に所望のレベルに調整することができる。スプリットインフルエンザ抗原材料は非イオン性界面活性剤の存在下で安定化されると考えられているが、当然のことながら、本発明は必ずしもこのような例ではない。
【００６４】
本発明によるワクチンは、すべてのソースに由来する無毒化リピドＡおよびリピドＡの非毒性誘導体、サポニンならびにＴＨ１型応答を刺激することができる他の試薬などであってそれらに限定されないアジュバントまたは免疫刺激薬をさらに含むことができる。
【００６５】
腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）が免疫系の強力な刺激剤であることは長く知られていたが、その毒作用のためにアジュバントとしての使用法は限られていた。ＬＰＳの非毒性誘導体であるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）は、核となる炭水化物グループおよび還元末端グルコサミンからのリン酸の除去により製造され、Ｒｉｂｉ他（１９８６、細菌内毒素の免疫学および免疫薬理学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７〜４１９ページ）により報告され以下の構造を有する。
【００６６】
【化１】
2004520144.tif 000003
【００６７】
ＭＰＬをさらに無毒化したバージョンは、二糖主鎖の３位からのアシル鎖の除去によって得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と呼ばれる。ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示されている方法により精製しかつ調製することができ、この参考文献はジホスホリルリピドＡおよびその３−Ｏ−脱アシル化変形例も開示している。
【００６８】
好ましい形態の３Ｄ−ＭＰＬは、直径０．２μｍ未満の小さな粒径を有するエマルジョンの形態であり、その製造方法はＷＯ９４／２１２９２に開示されている。モノホスホリルリピドＡおよび界面活性剤を含む水性製剤は、ＷＯ９８４３６７０Ａ２に記載されている。
【００６９】
本発明の組成物中に製剤化される細菌性リポ多糖由来のアジュバントは、細菌ソースから精製しかつ加工するか、あるいは合成品であってもよい。例えば、精製モノホスホリルリピドＡはＲｉｂｉ他１９８６（同上）に記載され、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）に由来する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドＡはＧＢ２２２０２１１およびＵＳ４９１２０９４に記載されている。その他の精製および合成リポ多糖が報告されている（Ｈｉｌｇｅｒｓ他、１９８６、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９（４）：３９２〜６；Ｈｉｌｇｅｒｓ他、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６０（１）：１４１〜６；およびＥＰ０５４９０７４Ｂ１）。特に好ましい細菌性リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００７０】
したがって、本発明で使用することができるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと構造が類似した免疫刺激薬である。本発明の別の態様では、ＬＰＳ誘導体は、ＭＰＬの上記構造に対するサブ部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）であるアシル化単糖であってもよい。
【００７１】
サポニンはＬａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ、ＭおよびＷａｇｎｅｒ  Ｈ．（１９９６。サポニン類の生物活性および薬理活性の総説（Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ）。Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２巻  ３６３〜３８６ページ）に教示されている。サポニンは、植物界および海生動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンはかき混ぜて泡立てると水の中でコロイド溶液を形成すること、およびコレステロールを沈殿させることで有名である。サポニンが細胞膜の近くにある場合には、膜に孔の様な構造を作り、膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の１例であり、これは、すべてではないが特定のサポニンの特性である。
【００７２】
サポニンは、全身投与のためのワクチンではアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血活性は、当技術分野で広く研究されている（Ｌａｃａｉｌｌｅ−ＤｕｂｏｉｓおよびＷａｇｎｅｒ、同上）。例えば、ＱｕｉｌＡ（南アメリカの樹木であるバラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来）、およびその分画は、ＵＳ５，０５７，５４０および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン類（Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」、Ｋｅｎｓｉｌ、Ｃ．Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、１９９６、１２（１〜２）：１〜５５；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載されている。ＱｕｉｌＡの分画を含み、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）と呼ばれる粒子状構造は溶血性であり、ワクチンの製造に使用されてきた（Ｍｏｒｅｉｎ、Ｂ．、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１；ＷＯ９６／１１７１１；ＷＯ９６／３３７３９）。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（ＱｕｉｌＡのＨＰＬＣ精製分画）は強力な全身性アジュバントとして記載され、それらの製造方法は米国特許番号５，０５７，５４０およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に開示されている。全身性ワクチン接種試験に使用されてきたその他のサポニンには、ＧｙｐｓｏｐｈｉｌａおよびＳａｐｏｎａｒｉａなどの他の植物種に由来するサポニンが含まれる（Ｂｏｍｆｏｒｄ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０（９）：５７２〜５７７、１９９２）。
【００７３】
機能強化された系には、非毒性リピドＡ誘導体およびサポニン誘導体の組合せ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されているＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているようにコレステロールによりＱＳ２１がクエンチされている反応原生（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）が低い組成物が含まれる。
【００７４】
水中油エマルジョン中にＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬを含む特に強力なアジュバント製剤がＷＯ９５／１７２１０に記載されており、好ましい製剤である。
【００７５】
したがって、本発明の一実施形態では、無毒化したリピドＡまたはリピドＡの非毒性誘導体によりアジュバント化された、より好ましくはモノホスホリルリピドＡまたはその誘導体によりアジュバント化された本発明のインフルエンザ抗原調製物を含むワクチンを提供する。
【００７６】
ワクチンがさらにサポニンを含むことが好ましく、ＱＳ２１を含むことがより好ましい。
【００７７】
製剤がさらに水中油エマルジョンを含むことが好ましい。また、本発明は、ワクチン製剤の製造方法であって、本発明の抗原調製物を３Ｄ−ＭＰＬなどの薬剤として許容される賦形剤と一緒に混合することを含む方法を提供する。
【００７８】
本発明によるアジュバント化されたワクチン製剤中に存在することが好ましい追加の成分には、本明細書に記載のオクトキシノールおよびポリオキシエチレンエステル、特にｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン８０）；および本明細書に記載の胆汁酸塩およびコール酸誘導体、特にデオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウムなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。すなわち、特に好ましい製剤は３Ｄ−ＭＰＬ、トリトンＸ−１００、ツイーン８０およびデオキシコール酸ナトリウムを含み、これをインフルエンザウイルス抗原調製物と混合し、皮内投与に適したワクチンを得ることができる。
【００７９】
本発明の好ましい一実施形態では、皮内インフルエンザワクチンは、コレステロール、サポニンおよびＬＰＳ誘導体を含む小胞のアジュバント製剤を含む。この点で好ましいアジュバント製剤は、コレステロールを含む単層の小胞を含み、この小胞はジオレイルホスファチジルコリンを含むことが好ましい脂質二分子層を有し、サポニンおよびＬＰＳ誘導体は脂質二分子層と結合するか脂質二分子層内に包埋されている。これらのアジュバント製剤は、サポニンとしてＱＳ２１を、ＬＰＳ誘導体として３Ｄ−ＭＰＬを含み、ＱＳ２１：コレステロールの比は１：１から１：１００重量／重量であることがより好ましく、１：５重量／重量であることが最も好ましい。このようなアジュバント製剤は、ＥＰ０８２２８３１Ｂに記載されており、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【００８０】
また、本発明は、対象においてインフルエンザ感染または疾患を予防する方法であって、本発明によるスプリットインフルエンザワクチンを対象に皮内投与することを含む方法を提供する。
【００８１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の皮内投与装置およびワクチン製剤を含む薬剤キットを提供する。この装置は、すでにワクチンが充填されて提供されることが好ましい。ワクチンは、本明細書に記載の従来の筋肉内ワクチンよりも少ない液体容積、特に０．０５ｍｌから０．２ｍｌの容積であることが好ましい。
【００８２】
本発明によるインフルエンザワクチンは、２種類以上のインフルエンザの株を含む多価インフルエンザワクチンであることが好ましい。３株を含む３価ワクチンであることが最も好ましい。従来のインフルエンザワクチンは、２種類のＡ株および１種類のＢ株からなる３種類のインフルエンザの株を含んでいる。しかしながら、例えば汎発性の状況において有用と考えられる１価ワクチンを本発明から除外するものではない。１価の汎発性インフルエンザワクチンは、単一Ａ株に由来するインフルエンザ抗原を含有する可能性が最も高い。
【００８３】
インフルエンザウイルス調製物は、従来の発育鶏卵法に由来するか、組織培養を用いてウイルスを培養する次世代の方法のいずれに由来してもよい。ウイルスを培養するのに適している細胞基質には、例えばＭＤＣＫもしくはＭＤＣＫのクローンに由来する細胞、ＭＤＣＫ様細胞などのイヌ腎臓細胞、Ｖｅｒｏ細胞を含むＡＧＭＫなどのサル腎臓細胞、またはワクチンの目的でインフルエンザウイルスを製造するのに適しているその他の哺乳動物細胞タイプが含まれる。また、好適な細胞基質には、ヒト細胞、例えばＭＲＣ−５細胞も含まれる。好適な細胞基質は細胞系に限定されることはなく、例えばニワトリ胚線維芽細胞などの一次細胞も含まれる。
【００８４】
伝統的に、スプリットインフルエンザは、リン酸トリ−ｎ−ブチル、またはツイーン（商標）と組み合わせたジエチルエーテル（「ツイーン−エーテル」スプリッティングとして知られる）などの溶媒／界面活性剤処理を用いて製造され、このプロセスは一部の製造施設では依然として用いられている。現在用いられているその他のスプリッティング剤には、界面活性剤またはタンパク質分解酵素または胆汁酸塩、例えば、参照により本明細書に組み込む特許番号ＤＤ１５５８７５に記載のデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。スプリッティング剤として用いることができる界面活性剤には、陽イオン界面活性剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、他のイオン性界面活性剤、例えばラウリル硫酸、タウロデオキシコール酸、またはトリトンＸ−１００（例えばＬｉｎａ他、２０００、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２８、９５〜１０３に記載の方法における）およびトリトンＮ−１０１を含む前述のような非イオン性界面活性剤、または２種類以上の界面活性剤の組合せが含まれる。
【００８５】
スプリットインフルエンザウイルス調製物を製造するために用いることができるその他の好適なスプリッティング剤は以下の通りである。
【００８６】
１．胆汁酸およびその誘導体（コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および上記胆汁酸のグリコ、タウロ、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸、アミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体、またはＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコール酸アミドが含まれる）。具体的な例は、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＯＣ）であり、最終ワクチン投与に痕跡量で存在することができる。
【００８７】
２．アルキルグリコシドまたはアルキルチオグリコシド（アルキル鎖はＣ６〜Ｃ１８で通常はＣ８からＣ１４であり、糖部分はペントースもしくはヘキソースまたは１−＞６、１−＞５、１−＞４、１−＞３、１−２のような様々な結合を有するそれらの組合せである。アルキル鎖は、飽和不飽和かつ／または分枝であってもよい）。
【００８８】
３．上記の２の誘導体（１個または複数のヒドロキシル基、好ましくは６ヒドロキシル基が、エステル、エトキシレート、サルフェート、エーテル、カーボネート、スルホスクシネート、イセチオネート、エーテルカルボキシレート、４級アンモニウム化合物などで修飾されている）。
【００８９】
４．アシル糖（アシル鎖はＣ６〜Ｃ１８で通常はＣ８からＣ１２であり、糖部分はペントースもしくはヘキソースまたは１−＞６、１−＞５、１−＞４、１−＞３、１−２のような様々な結合を有するそれらの組合せである。アシル鎖は、飽和もしくは不飽和かつ／または分枝、環式もしくは非環式であってもよく、１個または複数のヘテロ原子、例えばＮ、Ｓ、ＰまたはＯを有することもあり、有しないこともある）。
【００９０】
５．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−３−アミノ−１−プロパンスルホネートのスルホベタイン（ＲはＣ６からＣ１８、通常はＣ８からＣ１６のアルキル鎖またはアリールアルキル鎖である。アルキル鎖Ｒは、飽和不飽和かつ／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１からＣ４、通常はＣ１のアルキル鎖であることが好ましく、またはＲ１、Ｒ２は窒素と一緒に複素環を形成することができる）。
【００９１】
６．構造Ｒ−Ｎ，Ｎ−（Ｒ１，Ｒ２）−グリシンのベタイン（ＲはＣ６からＣ１８、通常はＣ８からＣ１６のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和不飽和かつ／または分枝であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１からＣ４、通常はＣ１のアルキル鎖であることが好ましく、またはＲ１、Ｒ２は窒素と一緒に複素環を形成することができる）。
【００９２】
７．構造Ｒ−（Ｎ−Ｒ１）−グルカミドのＮ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（ＲはＣ６からＣ１８、通常はＣ８からＣ１２のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和不飽和かつ／または分枝もしくは環式であってもよい。Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１からＣ６、通常はＣ１のアルキル鎖である。糖部分は、ペントースまたはヘキソースで修飾されていてもよい）。
【００９３】
８．構造Ｒ，−Ｎ＋（−Ｒ１，−Ｒ２，−Ｒ３）の４級アンモニウム化合物（ＲはＣ６からＣ２０、通常はＣ２０のアルキル鎖である。アルキル鎖は、飽和不飽和かつ／または分枝であってもよい。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｃ１からＣ４、通常はＣ１のアルキル鎖であることが好ましく、またはＲ１、Ｒ２は窒素と一緒に複素環を形成することができる。具体的な例は臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である）。
【００９４】
スプリットワクチンの調製プロセスには、超遠心分離、限外濾過法、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィ（例えばイオン交換）ステップなどの多くの様々な濾過ステップおよび／または他の分離ステップが様々な組合せで含まれ、場合によりスプリッティング前後に行うことができる例えばホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンまたはＵＶによる不活化ステップが含まれる。このスプリッティングプロセスは、バッチプロセス、連続プロセスまたは半連続プロセスとして行うことができる。
【００９５】
本発明によるスプリットワクチン製剤中にはデオキシコール酸ナトリウムなどの胆汁酸塩が痕跡量で存在することが好ましく、０．０５％以下、または０．０１％以下の濃度が好ましく、約０．００４５％であることがより好ましい（ｗ／ｖ）。
【００９６】
本発明による好ましいスプリットインフルエンザワクチン抗原調製物は、製造プロセスから残った残留量のツイーン８０および／またはトリトンＸ−１００を含むが、スプリット抗原の調製後にそれらを加えるかそれらの濃度を調整することができる。ツイーン８０とトリトンＸ−１００は共に存在することが好ましい。ワクチン投与におけるこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度に関する好ましい範囲は、以下の通りである。
【００９７】
ツイーン８０：０．０１から１％、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）
トリトンＸ−１００：０．００１から０．１（％ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００５から０．０２％（ｗ／ｖ）。
【００９８】
これら２種類の界面活性剤の組合せが低濃度で存在すると、溶液における抗原の安定性を促進することがわかった。この増強された安定性は、以前の製剤よりも抗原を皮内でより免疫原性にすることが可能である。このような増強は、小さな抗原凝集体が多いことまたは抗原の自然のコンホメーションが強化されることに起因すると考えられる。本発明は、この理論的説明が正しいということには左右されないことは理解されよう。
【００９９】
特定の実施形態では、好ましいスプリットウイルス調製物は、好ましくは０．１から２０％、より好ましくは０．１から１０％、最も好ましくは０．１から１％の範囲でラウレス９を含有する（ｗ／ｖ）。
【０１００】
本発明によるワクチンは、一般的に２５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１５％未満、最も好ましくは約２％以下の界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を含有する。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、皮内投与のためのインフルエンザワクチンを製造する方法であって、
（ｉ）従来の注射用（例えば筋肉内）インフルエンザワクチンと基本的には同様に製造され、少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を含むスプリットインフルエンザウイルス調製物を提供すること、
（ｉｉ）調製物中の赤血球凝集素の濃度および／または非イオン性界面活性剤の濃度を場合により調整すること、
（ｉｉｉ）スプリットインフルエンザウイルス調製物からワクチン一回量を皮内送達装置に充填することを含み、前記一回量が皮内投与に適した容積、好ましくは液体ワクチン約０．０５ｍｌから０．２ｍｌである方法を提供する。
【０１０２】
皮内送達装置は、本明細書に記載の装置であることが好ましい。
【０１０３】
本発明のこの態様による方法における別の任意選択ステップには、ラウレス９などの吸収促進界面活性剤の添加、および／または非毒性リピドＡ誘導体、特に３Ｄ−ＭＰＬなどのアジュバントの添加が含まれる。
【０１０４】
従来の注射用不活化インフルエンザワクチンを製造するプロセスはよく知られており、文献に記載されている。このようなプロセスは、本発明で使用する、例えば１回投与皮内ワクチンを製造するために、他の成分、例えば非イオン性界面活性剤の濃度を調整して本発明による皮内ワクチンに好適な％（ｗ／ｖ）とするステップを、例えば含めることにより変更することができる。しかしながら、ワクチンの活性成分、すなわちインフルエンザ抗原は、従来の筋肉内ワクチンと本発明による１回投与皮内ワクチンと本質的に同一であってもよい。
【０１０５】
本発明によるワクチン製剤には、１回投与ワクチンとして投与した場合にすべての株についてＥＵ基準のうち少なくとも２つを満たさない製剤は含まれないことが好ましい。
【０１０６】
装置
皮内送達に好ましい本発明の装置は、インフルエンザワクチンを有する薬物の容器を含み、その容器は針と動作可能に組み合わされ、容器中のワクチンを必要に応じて針を介して送達することができる。この装置は、ワクチンが真皮に送達されるように針が皮膚を貫通できる限度を制限するようになされたリミッターをさらに含む。
【０１０７】
また、本発明は、コンポーネント形の装置の提供、例えば、リミッター装置を有する針組立品が別の充填済みワクチン容器と合わせて提供され、容器および針組立品が接続可能であり、好ましい皮内送達装置を形成する提供にまで及ぶ。好適な容器には、注射器本体が含まれ、本発明の針組立品は、様々なこのような容器と一緒に使用できる点で有利である。
【０１０８】
さらに、本発明は、空の容器に接続された針組立品を含む本発明の装置がインフルエンザワクチンと組み合わせて提供されるキットにまで及ぶ。
【０１０９】
したがって、本発明は、皮内インフルエンザワクチン送達のためのキットであって、
（ａ）インフルエンザワクチンを含むワクチン容器、および
（ｂ）皮下針組立品であって、
ｉ  薬物の容器に接続することができるハブ部分、
ｉｉ  ハブ部分により支えられる針であって、前端がハブ部分から離れて延びる中空本体を有する針、および
ｉｉｉ  針を取り囲み、ハブ部分から針の前端部分まで離間方向に延びるリミッター部分であって、皮内注射を受ける動物の皮膚に受け止められるようになされた皮膚接触面を有し、針が動物の皮膚に侵入できる量をリミッター部分が制限するように、針前端が皮膚接触面を選択された距離だけ越えて延びているリミッター部分を含む針組立品を含むキットを提供する。
【０１１０】
キットは、針組立品および注射器本体の形態の充填済みワクチン容器を含むことが好ましい。
【０１１１】
次に、以下の非限定的図および説明で本発明の送達装置をさらに説明する。
【０１１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
図１および２は、皮内注射を行うために用いるように設計された本発明の針組立品２０を図示し、図３は針組立品２０と一緒に用いるための注射器６０などの薬物の容器を示し、図４〜７は、皮内注射を行うための本発明の皮内送達装置８０を示す。皮内注射は、ヒトなどの動物の皮膚中にワクチンを投与するものである。
【０１１３】
針組立品２０には、針２４を支えるハブ２２が含まれる。リミッターは、図２を見ると最もよくわかるように、リミッター２６が針２４を全体に取り囲むように、ハブ２２の少なくとも一部を受け入れている。
【０１１４】
ハブ２２の一端３０は、注射器の受容部３２に固定することができる。本発明に従って設計された針組立品と一緒に様々な種類の注射器を使用することができ、いくつかの例を以下に示す。ハブ２２の反対端には、リミッター２６内で迫台面（ａｂｕｔｍｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ）３６によって入れ子状態で受け止められるエクステンション３４が含まれることが好ましい。リミッター２６上に複数個のリブ３８を用意し、構造保全性を提供し針組立品２０の取扱いを容易にすることが好ましい。
【０１１５】
構成部品のサイズを適切に設計することにより、前端または針２４の尖端４０とリミッター２６上の皮膚接触面４７との間の距離ｄを厳重に制御することができる。距離ｄは、約０．５ミリメートルから約３ミリメートルの範囲内にあることが好ましい。針２４の前端４０が皮膚接触面４２を越えてその範囲内の距離だけ延びている場合に、針が動物の典型的な真皮層以上に侵入できないので、皮内注射が保証される。典型的な組織層には、５０から１００マイクロメートルの表皮、２から３ｍｍの真皮、次いで皮下組織に筋肉組織が続く。
【０１１６】
図２を見ると最もよくわかるように、リミッター２６は、針２４の前端４０がそれを通じて突き出すための開口４４を含む。開口４４と針４０の寸法関係は、具体的な状況の必要性に応じて制御することができる。例示した実施形態では、皮膚接触面４２は全体に平面でかつ連続的であり、動物の皮膚に対する針組立品２０の安定な配置を提供する。具体的には示さないが、針先端４０の近くで動物の皮膚を伸ばしたり集めるのを助長して注射を行うのを助長するため、皮膚接触面をわずかに凹面または凸面にすることも有利と考えられる。さらに、注射がされる場所の近くの皮膚を操作するのを助長するように、リブ３８が皮膚接触面４２を越えて伸長されていてもよい。
【０１１７】
皮膚接触面４２の形または輪郭とは関係なく、好ましい実施形態は、皮膚と接触して動物の皮膚に対する注射器の安定化を助長するのに十分な表面領域を含む。最も好ましい配置では、皮膚接触面４２は、皮膚表面に対して概ね垂直な姿勢に注射器を保つことを助長する。
【０１１８】
図１および２は、ハブ２２がリミッター２６とは別体にされる二個構成の組立品を示しているが、本発明は、このような配置に限定されるものではないことに注目することは重要である。プラスチック材料の単一部品からハブ２２およびリミッター２６を一体に形成することは、図１および２に示す例に対する代替法である。さらに、組み立てた時に針組立品２０が単一部品のユニットとなるように、図２に示した位置でハブ２２をリミッター２６に接着またはその他の方法で固定することも可能である。
【０１１９】
ハブ２２およびリミッター２６を有することは、皮内針の製造を実用的にするという利点を提供する。好ましい針サイズは、一般に３０ゲージまたは３１ゲージ針として知られている小さなゲージの皮下針である。このような小さな直径の針を有することは、針を動物の真皮層を越える過度の侵入を防ぐのに十分に短くするための挑戦を示している。リミッター２６およびハブ２２は、注射の間に患者の組織に侵入する針の有効長よりかなり大きな全長を有し、針２４の利用を助長する。皮内注射を達成する目的で短い針を有する利点を得ながら、製造および組立工程の間により長い針を取り扱うことができるため、本発明に従って設計された針組立品により製造が助長される。
【０１２０】
図３は、注射器６０などの薬物の容器に固定された針組立品２０を示す。概ね円筒形の注射器本体６２は、当技術分野で知られているようにプラスチックまたはガラスから製造することができる。注射器本体６２は、注射中に投与される物質を収容するための貯留部６４を提供する。プランジャー６６は、当技術分野で知られているように、一端に手動動作フランジ６８を、また反対端のストッパー７０を有する。貯留部６４を通じるプランジャー６６の手動運動は、望むように針の末端４０から貯留部６４の物質を押しやる。
【０１２１】
ハブ２２は、知られている様々な方法で注射器本体６２に固定されることができる。一例では、ハブ２２の内側と注射器本体６２の出口ポート部分７２の外側との間に締まりばめが提供される。別の例では、注射器６０の端にハブ２２を固定するための従来型ルアーフィット配置が提供される。図３から理解できるように、本発明に従って設計された針組立品は、多種多様な従来のスタイルの注射器に容易に適応できる。
【０１２２】
図４および５は、２枚の熱可塑性材料のシートで作られた注射器を含む皮内送達装置８０の代替実施形態を示す。注射器には、概ね平面であり貯留部８４を取り囲む本体部分８２が含まれる。出口ポート８６は、貯留部８４内の流動性物質を、注射を打つために貯留部の外に連通させる。注射器本体は、当技術分野で知られているように熱成形プロセスを用いて形成することが好ましい。
【０１２３】
受容体９０は、当技術分野で知られているように加熱プロセスまたは溶接プロセスを用いて出口ポート８６に固定されることが好ましい概ね円筒型のネック部分９２を含む。フランジ９４は、注射器の本体部分８２に支えられ、構造保全性を得ることが好ましい。エクステンション９６は、円筒形の部分９２の反対方向にフランジ９４から離れて延びている。針組立品２０は、図５に示すようにエクステンション９６内に受け止められていることが好ましい。
【０１２４】
受容体９０は、注射器に予め充填できるように出口ポート８６を閉鎖するシーリング膜１００を支持することが好ましい。針組立品２０は、ハブ２２がエクステンション９６内に受け入れられるときにシーリング膜１００を貫通する針の後端１０２を含むことが好ましい。
【０１２５】
貯留部８４の側壁は、側壁がお互いに向けて潰れ、貯留部８４内の物質が針２４の前端４０における開口から放出されるように親指と人差し指の間で締め付けられることが好ましい。図４および５の実施形態では、ハブ２２およびリミッター２６は、プラスチック材料の単一部品として一体に成形されることが好ましい。スナップ式（ｓｎａｐ  ｆｉｔ）配置が、ハブ２２を受容体９０のエクステンション９６内に固定する。図６および７に別の代替法を示す。この実施形態では、リミッター２６とは別々にハブ２２が成形され、それがエクステンション９６と一体化される。図４および５の実施形態と図６および７の実施形態との相違は、エクステンション９６の側壁がリミッター２６の皮膚接触面４２を提供するように、引き延ばされたエクステンション９６を含む。この実施形態では、リミッターは注射器本体によって支えられている。針２４の寸法およびエクステンション９６の長さを適切に選択することにより、皮膚接触面４２と針の尖端４０との間に所望の距離ｄを実現することができる。
【０１２６】
また、図７は、針シールド１１０を示し、これはハブ２２および針２４上に提供されることが好ましい。針シールド１１０は、皮内送達装置８０が使える状態になるように、エクステンション９６内にハブ２２が適切に受け止められるまで受容体９０内にハブ２２を挿入することを助長する。針シールド１１０は、ハブ２２が所定の位置についた後は廃棄することができる。あるいは、皮内送達装置８０を使用後に取り扱う間に針を突き刺す可能性を回避するために、注射が完了した後は針２４上を針シールド１１０で置き換えることができる。シールド１１０は図７に示すに過ぎないが、図４〜７の実施形態と共に利用することが好ましい。
【０１２７】
本発明は、様々なタイプの注射器と合わせて使用するように適合された皮内針注射器を提供する。したがって、本発明は、経済的に量産スケールで皮内針を製造しかつ組み立てることを助長するという著しい利点を提供する。
【０１２８】
操作および使用法
針組立品２０および薬物の容器６０を含む本発明の皮内送達装置８０の好ましい実施形態について説明したので、その操作および使用法を以下に説明する。
【０１２９】
皮内層中に物質ワクチンを投与するための送達装置の使用法は、従来の注射器および針によるよりも著しく容易である。従来の注射器および針を使用することは技術に左右され、許容される皮内丘疹を作るのには相当な技術が必要である。特に、針の先端面取り部の正しい方向を維持しながら、浅い角度で注意深く針を皮下に導かなければならない。対照的に、本発明の充填済み（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）皮内送達装置では、使用者は単に皮膚と垂直に装置を押しつけ物質を注射するだけである。針が侵入する深さは機械的に皮内空間に制限される。この方法では、注射中に針の先端面取り部を正しい位置におく必要がない。装置、特に針を皮膚に対して垂直に正しい位置に置くことならびに物質を注射する間の安定性は、装置の設計によって助長される。
【０１３０】
次に、図８を参照しながら、本発明に従って設計された装置の充填方法の例をフローチャートフォーマットに図示する。装置が図３に示すスタイルの注射器を含む場合には、所望の物質で注射器を予め充填するために以下の基本的手順が有用である。
【０１３１】
注射器バレルの供給２００には、上記に示しかつ記載したような所望の形態の注射器が含まれる。局所的管理環境２０２は知られている方法で維持されることが好ましい。局所的管理環境２０２は、供給２００と環境２０２の間にいかなる中間の清浄化ステップまたは滅菌ステップも必要とせずに注射器を直ちに受け入れる位置にあることが好ましい。
【０１３２】
一例では、注射器バレルを２０４において空気で洗浄し、注射器からすべての粒子状物質を除去する。次いで、注射器を潤滑シリコーンオイルなどの潤滑剤で２０６において内面上をコーティングすることが好ましい。潤滑剤は、装置を実際に使用する間に注射器を通ってストッパー７０およびプランジャー６６が動くのを容易にする。
【０１３３】
最終的に組立品２０を必要とする注射器の端は、環境２０２内で、先端キャップにより蓋をすることができる。一例では、先端キャップは２０８において供給される。先端キャップは２１０において空気洗浄される。清浄化された先端キャップおよび注射器バレルは組立装置２１２に運ばれ、そこで先端キャップは注射器に固定される。次いで、注射器バレル組立品が充填ステーション２１４に運ばれ、所望の物質が充填される。
【０１３４】
望むように充填したら、２２０において注射器の開放端にストッパー７０を挿入する。ストッパー７０を挿入する前に、それらは２２２においてプランジャーロッド６６に組み付けられ、２２４において知られている方法で従来の潤滑剤により潤滑されることが好ましい。組み立て、充填された注射器は、２２６において欠陥を点検され、局所的管理環境から送り出されることが好ましい。
【０１３５】
注射器は、通常２３０において殺菌され、個別的な状況の必要性に応じ、２３２において個装またはバルク包装に包装される。好適な滅菌技法は知られており、個別的な状況または所与の物質の特性を提供する必要性に応じて当業者によって選択される。本発明に従って設計された装置の滅菌は、包装前または包装後に完了することができる。
【０１３６】
充填ステップの変形形態は本発明の範囲内にある。例えば、ストッパーをまず挿入し、次いで注射器に充填し、続いて先端キャップをすることができる。さらに、装置が例えば図４および５に示すタイプの注射器本体を含む場合には、充填操作が上述のストッパーの挿入も前記の潤滑ステップも含まないことは明白である。代わりに、知られている適切な充填技法が利用される。
【０１３７】
注射器本体中へ所望の物質を実際に挿入することは、いくつかの知られている方法のいずれかで行うことができる。充填技法の例は、Ｈｅｆｆｅｒｍａｎ他による米国特許番号５，６２０，４２５；Ｓｍｉｔｈ他による５，５９７，５３０；ＤｅＨａｅｎによる５，５３７，０４２；Ｖａｃｃａによる５，５３１，２５５；Ｖｅｕｓｓｉｎｋ他による５，５１９，９８４；Ｖｅｕｓｓｉｎｋ他による５，３７３，６８４；Ｌｉｅｂｅｒｔ他による５，２６５，１５４；Ｌｉｅｂｅｒｔ他による５，２８７，９８３；およびＪｕｒｇｅｎｓ、Ｊｒ．他による４，７１８，４６３に開示されており、各々の特許を参照により本出願に組み込む。
【０１３８】
次に、本発明のインフルエンザワクチンについて、以下の非限定的実施例を参照しながらさらに説明する。
【０１３９】
（実施例）
実施例１−スプリットインフルエンザワクチンの調製
以下の手順に従い、スプリットワクチンのための各株を調製した。
【０１４０】
ウイルス接種材料の調製
発育鶏卵の接種日に、有効な播種用ロット（ｓｅｅｄ  ｌｏｔ）を、０．５ｍｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含有するリン酸緩衝食塩水と混ぜることにより新鮮な接種材料を調製する（ウイルス株依存性）。ウイルス接種材料は２〜８℃に保つ。
【０１４１】
発育鶏卵の接種
ウイルス複製には９から１１日齢の発育鶏卵を使用する。殻を除洗する。ウイルス接種材料０．２ｍｌを卵に接種する。接種された卵を適当な温度（ウイルス株依存的）で４８時間から９６時間インキュベートする。インキュベーション期間が終わったら、冷却して胚を致死させ、卵を２〜８℃で１２〜６０時間保存する。
【０１４２】
収集
冷却した発育鶏卵から尿膜腔液を収集する。通常、卵１個当たり粗製の尿膜腔液８から１０ｍｌを集める。場合により、粗製１価ウイルスバルクに０．１００ｍｇ／ｍｌチオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）を加える。
【０１４３】
尿膜腔液からの全ウイルスの濃縮および精製
１．清澄化
収集した尿膜腔液を中程度の速度（範囲：４０００〜１４０００ｇ）の遠心分離により清澄化する。
【０１４４】
２．吸着ステップ
清澄化したウイルスプール中にＣａＨＰＯ４ゲルを得るため、ウイルス株に応じて、０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４および０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２溶液を加えて１リットル当たりＣａＨＰＯ４１．５ｇから３．５ｇのＣａＨＰＯ４の最終濃度に到達させる。
【０１４５】
少なくとも８時間の沈降の後、上清を除去し、用いたＣａＨＰＯ４の量に応じて０．２６ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ−Ｎａ２溶液を添加することによって、インフルエンザウイルスを含む沈降物を再可溶化する。
【０１４６】
３．濾過
再懸濁した沈降物を６μｍのフィルター膜で濾過する。
【０１４７】
４．ショ糖勾配遠心分離
１００μｇ／ｍｌチオメルサールを含有する線形ショ糖勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））における等密度遠心法によりインフルエンザウイルスを濃縮する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１４８】
遠心分離の終わりに、４つの異なる分画（ショ糖は屈折計で測定する）によりローターの内容物を回収する。
【０１４９】
−分画１  ５５〜５２％ショ糖
−分画２  約５２〜３８％ショ糖
−分画３  ３８〜２０％ショ糖＊
−分画４  ２０〜０％ショ糖
＊ウイルス株依存：分画３は１５％ショ糖まで減少することがある。
【０１５０】
さらにワクチンを調製する場合には、分画２および３のみを使用する。
【０１５１】
ショ糖含有量を約６％以下に減少させるため、リン酸緩衝液によるダイアフィルトレーションにより分画３を洗浄する。この希釈分画に存在するインフルエンザウイルスをペレット化し、可溶性の混入物を除去する。
【０１５２】
ペレットを再懸濁し、十分に混ぜると均一な懸濁液が得られる。分画２および分画３の再懸濁したペレットをプールし、リン酸緩衝液を加えると約４０リットルの容積が得られる。この生成物は、１価全ウイルス濃縮物である。
【０１５３】
５．デオキシコール酸ナトリウムによるショ糖勾配遠心分離
１価全インフルエンザウイルス濃縮物をＥＮＩ−Ｍａｒｋ  ＩＩ超遠心分離機にかける。Ｋ３ローターには、デオキシコール酸ナトリウムの勾配がさらに重ねられている線形ショ糖勾配（０〜５５％（ｗ／ｖ））が含まれる。スプリッティング中にはツイーン８０が０．１％（ｗ／ｖ）まで存在する。最大デオキシコール酸ナトリウム濃度は０．７〜１．５％（ｗ／ｖ）であり、株に依存する。流速は８〜１５リットル／時間である。
【０１５４】
遠心分離の終わりに、３つの異なる分画（ショ糖は屈折計で測定する）によりローターの内容物を回収する。次の処理には分画２を用いる。分画限界（４７〜１８％）のショ糖含有量は株により異なり、評価後に固定する。
【０１５５】
６．滅菌濾過
０．２μｍの膜で終了するフィルター膜上でスプリットウイルス分画を濾過する。希釈には０．０２５％（ｗ／ｖ）ツイーン８０を含有するリン酸緩衝液を用いる。濾過した分画２の最終容積は元の分画容積の５倍である。
【０１５６】
７．不活性化
濾過した１価材料を最大８４時間（ウイルス株により異なる、このインキュベーションは短縮することができる）２２±２℃でインキュベートする。次いで、総タンパク質含量を最大２５０μｇ／ｍｌまで下げるため、０．０２５％ツイーン８０を含有するリン酸緩衝液を加える。ホルムアルデヒドを最終濃度５０μｇ／ｍｌまで加え、２０℃±２℃で少なくとも７２時間不活性化を行う。
【０１５７】
８．限外濾過
不活化スプリットウイルス材料は、２０ｋＤａ  ＭＷＣＯの酢酸セルロース膜を備えた限外濾過ユニット中で少なくとも２倍に濃縮する。次いで、０．０２５％（ｗ／ｖ）ツイーン８０を含有するリン酸緩衝液と続いて０．０１％（ｗ／ｖ）ツイーンを含有するリン酸緩衝食塩水で材料を洗浄する。
【０１５８】
９．最終滅菌濾過
０．２μｍの膜で終了するフィルター膜上で限外濾過後の材料を濾過する。ＳＲＤ（ＷＨＯが推奨する方法）による測定で赤血球凝集素の最終濃度が４５０μｇ／ｍｌを超えなければならない。
【０１５９】
１０．保存
１価最終バルクは、２〜８℃で最長１８カ月保存する。
【０１６０】
純度
純度は、クーマシー染色のポリアクリルアミドゲルのＯ．Ｄ．走査法により半定量的に測定した。ピークは手動で測定した。試料の結果を表１に示す。
【０１６１】
【表２】
2004520144.tif 000004
【０１６２】
本発明で使用するための特定の株の組合せには、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８が含まれる。
【０１６３】
実施例２−バルクワクチンからのワクチン１回量の調製
最終ワクチンは、必要に応じて界面活性剤濃度を調整し、１価バルクから３価ワクチンを製剤化することにより調製する。
【０１６４】
ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋／−０．２、ツイーン８０およびトリトンＸ−１００を混ぜて必要な最終濃度（ＰＢＳ１×濃縮、ツイーン８０  ０．１５％およびトリトンＸ−１００  ０．０２％）を得る。以下の３種類の不活化スプリットビリオンを１０分間の撹拌の間に加える。
【０１６５】
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）１５μｇ
Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０／９９（Ｈ３Ｎ２）１５μｇ
Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８  １５μｇ
１５分撹拌した後、ｐＨをｐＨ７．２＋／−０．２に調整する。
【０１６６】
投与容積は５００μｌである。１回量を滅菌アンプル中に充填する。ワクチンを投与する直前に、内皮投与のための装置を用いて０．１ｍｌをアンプルから取り出す。
【０１６７】
実施例３−抗体応答を測定するのに使用する方法
１．ＥＬＩＳＡによるヒト鼻汁中の特異的抗インフルエンザおよび全ＩｇＡの検出
ヒト鼻汁の採集方法
鼻汁を採集するため、適当な方法、例えば古典的鼻洗浄法または鼻ウイック（ｗｉｃｋ）法を用いる。
【０１６８】
ヒト鼻汁の採集および処理後、全および特異的抗インフルエンザＩｇＡの検出を例えば以下のＥＬＩＳＡｓで実施する。
【０１６９】
全ＩｇＡの検出のための捕捉ＥＬＩＳＡ
全ＩｇＡは、マイクロタイタープレート上に固定化した抗ヒトＩｇＡポリクローナル親和性精製Ｉｇで捕捉し、次いでペルオキシダーゼと結合した異なる抗ヒトＩｇＡ親和性精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１７０】
精製ヒトｓＩｇＡを標準品として用い、採集した鼻汁中でｓＩｇＡの定量を行う。
【０１７１】
このアッセイでは、３種類の精製ヒトｓＩｇＡを低基準、中基準および高基準として用いる。
【０１７２】
特異的抗インフルエンザＩｇＡの検出のための直接ＥＬＩＳＡ
ワクチン製剤中に存在する各インフルエンザ株の１つについて３種類の異なるＥＬＩＳＡを行う。
【０１７３】
特異的抗インフルエンザＩｇＡは、マイクロタイタープレート上にコーティングされたスプリット不活化インフルエンザ抗原で捕捉し、次いで、全ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡに用いたのと同一のペルオキシダーゼと結合した異なるポリクローナル抗ヒトＩｇＡ親和性精製Ｉｇを用いて検出する。
【０１７４】
結果−表示および計算
全ＩｇＡ表示
結果は、Ｓｏｆｔｍａｘｐｒｏプログラムを用い、鼻汁１ｍｌ中の全ＩｇＡのμｇとして表す。
【０１７５】
特異的抗インフルエンザＩｇＡ表示
結果はエンドポイント単位力価として表し、カットオフ以上のＯＤ４５０ｎｍが得られる最後の希釈液の逆数として算出する。
【０１７６】
試料の最終結果は、以下の通りに表す。
【０１７７】
特異的応答と全ＩｇＡ濃度の比を算出することによる特異的応答の正規化：エンドポイント単位／全ＩｇＡ（μｇ）（文献で最も広く使用される計算方法）。
【０１７８】
２．インフルエンザ特異的血清Ａｂの赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）活性
血清（５０μｌ）を３７℃で１６時間、ＲＤＥ（レセプター破壊酵素）２００μｌで処理する。２．５％クエン酸ナトリウム１５０μｌで反応を停止させ、５６℃で３０分間、血清を不活性化する。ＰＢＳ１００μｌを加えることにより１：１０希釈液を調製する。次いで、血清（１：１０）２５μｌをＰＢＳ２５μｌで希釈することにより、９６ウエルプレート（Ｖ底）上に２倍希釈シリーズを調製する。基準抗原２５μｌを各ウエルに、２５μｌ当たり４血球凝集単位の濃度で加える。マイクロタイタープレート振盪機を用いて抗原および抗血清希釈液を混ぜ、室温で６０分間インキュベートする。次いで、ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（０．５％）５０μｌを加え、室温で１時間赤血球を沈降させる。ＨＡＩ力価は、ウイルス誘発性赤血球凝集を完全に阻害する最後の血清希釈液の逆数に相当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による針組立品の分解斜視図である。
【図２】
図１の実施形態の部分的断面図である。
【図３】
注射装置を作製するために注射本体に接続された図２の実施形態を示す図である。
【図４】
本発明に従って設計された注射装置の別の実施形態の分解側面図である。
【図５】
図４における線Ａ−Ａに沿った断面図であるが、組み立てられた状態の構成部品を示す。
【図６】
図５に示した図と類似した分解断面図であり、別の実施形態を示す。
【図７】
組み立てられた状態の図６の実施形態を示す図である。
【図８】
本発明による装置に充填する方法を図示するフローチャート図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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