(57)【要約】複数の変異及び減少したＩｇＥ結合親和性を有する新規組換えアレルゲンを開示する。前記アレルゲンは、天然に存在するアレルゲンの天然に存在しない変異体である。その全体のα炭素骨格三次構造は、本質的に保存される。さらに、この組換えアレルゲンの調製方法及びその使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在するアレルゲンの変異体であって各々が前記天然に存在するアレルゲンのＩｇＥ結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的なＩｇＥ結合能力を減少する少なくとも四つの第一変異を有し、前記第一変異の各々が別の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、前記第一変異の各々が各他の第一変異から少なくとも１５Åが隔てられ少なくとも一つの面積８００Å２である円形表面領域が変異を含まないように配置されることを特徴とする組換えアレルゲン。
【請求項２】
第一変異が互いに２０Å、好ましくは２５Å、最も好ましくは３０Å隔てられている、請求項１記載の組換えアレルゲン。
【請求項３】
幾つかの第二変異を含み、前記第二変異の各々が前記天然に存在するアレルゲンと比べて変異アレルゲンの特異的ＩｇＥ結合能力を減少させ、前記第二変異の各々は他の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、前記第二変異が前記円形領域の外側に位置する、請求項１又は２に記載の組換えアレルゲン。
【請求項４】
天然に存在するアレルゲンの置換される表面露出アミノ酸の少なくとも一つが約２０％、好ましくは約３０％、より好ましくは約４０％、最も好ましくは約５０％の溶媒接触性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項５】
天然に存在するアレルゲンの置換される表面露出アミノ酸の少なくとも一つが、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において７０％より高く、好ましくは８０％より高く、最も好ましくは９０％より高い同一性で保存されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項６】
前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項７】
変異体アレルゲンへ組み込まれる各アミノ酸残基が前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、好ましくは亜科、さらに好ましくは科、より好ましくは上科、より好ましくは亜綱、より好ましくは亜目、最も好ましくは目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項８】
変異アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ結合性が少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％減少されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項９】
変異体及び天然に存在するアレルゲン分子のα炭素骨格三次構造を比較した場合、原子座標の平均標準偏差が２Åより小さいことを特徴とする、請求項６記載の組換えアレルゲン。
【請求項１０】
前記円形表面領域が１５〜２５アミノ酸残基の原子を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか記載の組換えアレルゲン。
【請求項１１】
表面露出アミノ酸残基が溶媒接触性に関して順位付けられること、及び、より溶媒接触可能であるアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１２】
表面露出アミノ酸残基が、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して順位付けられること、及び、より保存されるアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１３】
変異体アレルゲンが天然に存在しないアレルゲンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１４】
５〜２０、好ましくは６〜１５、さらに好ましくは７〜１２、最も好ましくは８〜１０の第一変異を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１５】
変異体アレルゲンが第一変異あたり１〜４つの第二変異を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１６】
一つ以上の置換が部位特異的変異誘発によって行われることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１７】
一つ以上の置換がＤＮＡシャッフリングによって行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１８】
吸入アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項１９】
花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１８記載の組換えアレルゲン。
【請求項２０】
分類学上ファガレス目、オレアレス目又はピナレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１９記載の組換えアレルゲン。
【請求項２１】
Ｂｅｔ ｖ １の変異体であることを特徴とする、請求項２０記載の組換えアレルゲン。
【請求項２２】
一つ以上の置換がＶ２， Ｄ７２， Ｅ８７， Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７及びＥ−７３からなる群より選択される、請求項２１記載の組換えアレルゲン。
【請求項２３】
分類学上ポアレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１９記載の組換えアレルゲン。
【請求項２４】
分類学上アステラレス目又はウルチカレス目由来の花粉アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１９記載の組換えアレルゲン。
【請求項２５】
イエダニアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１８記載の組換えアレルゲン。
【請求項２６】
デルマトファゴイデス由来のダニアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項２５記載の組換えアレルゲン。
【請求項２７】
ゴキブリアレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１８記載の組換えアレルゲン。
【請求項２８】
動物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１８記載の組換えアレルゲン。
【請求項２９】
ネコ、イヌ又はウマ由来の動物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項２８記載の組換えアレルゲン。
【請求項３０】
毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項３１】
分類学上ヒメノプテラ目由来の毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項３０記載の組換えアレルゲン。
【請求項３２】
分類学上ベスピダエ目、アピダエ目又はフォルミコイダエ目由来の毒物アレルゲンの変異体であることを特徴とする、請求項３１記載の組換えアレルゲン。
【請求項３３】
Ｖｅｓ ｖ ５の変異体であることを特徴とする、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項３４】
一つ以上の置換がＫ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９， Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， −−Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５及びＩ−１８２からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３３記載の組換えアレルゲン。
【請求項３５】
医薬品として使用するための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン。
【請求項３６】
アレルギーを予防及び／又は治療するための医薬品を調製するための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲンの使用。
【請求項３７】
各変異体が他の変異体の少なくとも一つに存在しない第一変異の少なくとも一つを有し、前記各変異体について第二変異が前記第一変異の各々から半径１５Åの範囲内に存在しない、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の２つ以上の組換え変異体アレルゲンを含む組成物。
【請求項３８】
２〜１２、好ましくは３〜１０、さらに好ましくは４〜８、最も好ましくは５〜７の変異体を含む請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
医薬品として使用するための、請求項３７又は３８記載の組成物。
【請求項４０】
アレルギーを予防及び／又は治療するための医薬品を調製するための、請求項３７又は３８に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項３７若しくは３８に記載の組成物を含み、これに組合せて任意で医薬として許容される担体及び／又は賦形剤、及びアジュバントを含んでもよいことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４２】
アレルギーを患う患者の天然に存在するアレルゲンによって誘発されるアレルギー反応に対するワクチンの形態であることを特徴とする、請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、請求項３７若しくは３８記載の組成物、又は、請求項４１若しくは４２記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者に免疫応答を発生させる方法。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、請求項３７若しくは３８記載の組成物、又は、請求項４１若しくは４１記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のワクチン接種又は治療。
【請求項４５】
医薬として許容される物質及び／又は賦形剤と共に、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項３７若しくは３８記載の組成物を混合することを含む、請求項４１若しくは４２記載の医薬組成物を調製する製法。
【請求項４６】
請求項４５記載の製法によって得られる医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、請求項３７若しくは３８記載の組成物、又は、請求項４１−４２若しくは４６のいずれか１項に記載の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のアレルギー反応の治療、予防又は軽減のための方法。
【請求項４８】
ａ）天然に存在するアレルゲンにおいて少なくとも２０％の溶媒接触性を有するアミノ酸残基の番号を同定すること；
ｂ）前記同定されたアミノ酸残基から少なくとも四つのアミノ酸残基を選択することであって、各選択されたアミノ酸が各他の選択されたアミノ酸から少なくとも１５Å隔てられており、少なくとも一つの面積８００Å２の円形表面領域が前記選択されたアミノ酸を含まないように配置されるように前記選択を行うこと；及び
ｃ）前記各選択されたアミノ酸に対して、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的ＩｇＥ結合能力を減少させる第一変異を起こすことであって、前記第一変異の各々は別のアミノ酸による前記選択されたアミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在しないことを特徴とする、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲンを調製する方法。
【請求項４９】
前記同定されたアミノ酸残基を溶媒接触性に関して順位付けること、及び、より溶媒接触可能なアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することを特徴とする、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において、７０％より高い同一性を保存する同定されたアミノ酸残基を選択することを特徴とする、請求項４８又は４９記載の方法。
【請求項５１】
前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して前記同定されたアミノ酸残基を順位付けすること、及び、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することを特徴とする、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する変異体アレルゲンを形成するために、前記同定されたアミノ酸を選択することを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
アミノ酸残基の置換が部位特異的変異誘発によって行われることを特徴とする、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
対応する天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡのＤＮＡシャッフリング（分子育種）によって得られるＤＮＡ配列からアレルゲンが作製されることを特徴とする、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲンを調製する方法。
【請求項５５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲンをコードするＤＮＡ配列、その誘導体、その部分配列、その縮重配列又はストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダイズする配列であって、少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有するペプチドをコードする前記誘導体、前記部分配列、前記縮重配列又は前記ハイブリダイズする配列。
【請求項５６】
天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡ配列の誘導体である、請求項５５記載のＤＮＡ配列。
【請求項５７】
天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって誘導体が得られる、請求項５６記載のＤＮＡ配列。
【請求項５８】
図３に示す配列の誘導体であって、Ｖ２， Ｄ７２， Ｅ８７， Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７及びＥ−７３からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するＤＮＡ配列である、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項５９】
図１３に示す配列の誘導体であって、Ｋ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９， Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５及びＩ−１８２からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するＤＮＡ配列である、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６０】
図１６に示す配列の誘導体であって、Ｒ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９及びＲ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９及びＫ−１５からなる群より選択される変異を少なくとも四つ有するアレルゲンをコードするように変異するＤＮＡ配列である、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
【請求項６１】
請求項５５〜６０のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項６２】
請求項６１記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６３】
請求項６２記載の宿主細胞を培養する工程を含む、組換え変異体アレルゲンを作製する方法。
【請求項６４】
天然に存在するアレルゲンに対して特異的なＴ細胞クローン又はＴ細胞株を刺激する能力を有するＴ細胞エピトープを少なくとも一つ含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換えアレルゲン、又は、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされる組換えアレルゲン。
【請求項６５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組換え変異体アレルゲン、又は、請求項３７若しくは３８記載の組成物を用い、対象者のＩｇＥを含むサンプルと前記変異体又は前記組成物を混合して前記サンプル中のＩｇＥと前記変異体間の反応性レベルを評価する、対象者の治療の妥当性、安全性又は成果を評価するための診断的アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、天然に存在するアレルゲンの変異体である新規組換えアレルゲンに関する。また本発明は、新規組換え変異体アレルゲンの混合物を含む組成物にも関する。さらに本発明は、前記組換え変異体アレルゲンの調製方法、及び、組換え変異体アレルゲンを含むワクチンを含む医薬組成物の調製方法に関する。さらなる態様において本発明は、対象者に免疫応答を発生させる方法、対象者のワクチン接種又は治療、及び、本発明の前記組成物を調製するための方法に関する。
（背景技術）
遺伝的素因がある個体は、種々の環境原因に由来する抗原に対し、曝露されるアレルゲンに対して感作される（アレルギー性）。以前に感作された個体が同じ又は相同なアレルゲンに再び曝露された時に、アレルギー反応が起こる。アレルギー応答は花粉症、鼻結膜炎、鼻炎及び喘息から、例えばミツバチ又はスズメバチの針又は虫刺されに応答しての全身アナフィラキシー及び死亡までにわたる。この反応は即時型であり、草本、樹木、雑草、虫、食物、薬物、化学薬品及び香水に由来する化合物のような種々のアトピー性アレルゲンによって引き起こされ得る。
しかしながら、個体が初めてアレルゲンに暴露された時には、応答は起こらない。最初の適応応答は時間がかかり、通常は何の症状も引き起こさない。しかしアレルゲンと反応する能力がある抗体及びＴ細胞が産生されると、続いて起こるいかなる暴露も症状を誘発し得る。このようにアレルギー応答は、命にかかわり得る深刻な病理状態を免疫応答自身が引き起こし得ることを実証する。
【０００２】
アトピー性アレルギーに関与する抗体は、本来ＩｇＥクラスの免疫グロブリンに属する。ＩｇＥは、肥満細胞及び好塩基球の表面の特異的レセプターに結合する。肥満細胞に結合したＩｇＥと特異的アレルゲンの複合体形成に続く細胞表面上のレセプターの架橋結合が、標的細胞のレセプターを通じたシグナル伝達及び生理反応を生じさせる。脱顆粒が特にヒスタミン、へパリン、好酸性白血球に対する化学走化因子、気管平滑筋細胞の長期的な収縮を引き起こすロイコトリエンＣ４、Ｄ４及びＥ４の放出を生じさせる。その結果生じる影響は、事実上全身又は局所的であり得る。
抗体媒介性の過敏反応は四種類、すなわちＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型に分類することができる。Ｉ型アレルギー反応は、抗原の曝露に続いて数秒又は数分以内に起こる古典的即時型過敏反応である。これらの症状はアレルゲン特異的ＩｇＥによって媒介されている。
一般的にアレルギー反応は、例えば花粉、イエダニ、動物の毛及びフケ、毒物及び食品に存在するタンパク質アレルゲンに対する応答として観察される。
アレルギー反応を減少させる又は排除するために、慎重に制御され繰り返されるアレルギーワクチン投与が通常用いられる。アレルギーワクチン接種は、かなり長期間にわたって投与量を増加しながら非経口、鼻腔内又は舌下投与によって伝統的に行われており、患者の脱感作を導く。その正確な免疫学的メカニズムは知られていないが、誘導されるアレルゲン特異的Ｔ細胞の表現型の違いが特に重要であると考えられる。
【０００３】
アレルギーワクチン接種
ワクチン接種の概念は２つの基本的な免疫系の特徴、すなわち特異性及び記憶に基づく。ワクチン接種はレシピエントの免疫系を初回抗原刺激し得て、同様なタンパク質に対する曝露が繰り返された時に、例えば微生物感染症の攻撃に対して免疫系はさらに厳しく応答する状態になり得る。ワクチンは、レシピエントにそのような防御免疫応答を発生させることを目的としてワクチン接種に用いられることを意図するタンパク質の混合物である。この防御は、ワクチン及び相同抗原に存在する構成成分のみを含み得る。
他の種類のワクチン接種と比較して、アレルギーワクチン接種はアレルギー患者において進行中の免疫応答の存在によって複雑にされている。この免疫応答は、アレルゲンに対する曝露においてアレルギー症状の放出を媒介するアレルゲン特異的ＩｇＥの存在によって特徴付けられる。このように、自然源由来のアレルゲンを用いるアレルギーワクチン接種は、患者に対し命にかかわる極端な結果となる副作用の本来的な危険性を有する。
この問題を回避するアプローチは、三つのカテゴリーに分類され得る。実際には多くの場合、２つ以上のカテゴリーに由来する処置が併用される。処置の第一カテゴリーは、充分な累積投与量を達成するための長期間にわたる少用量の複数回投与を含む。処置の第二カテゴリーは、アルミニウムヒドロキシドのようなゲル状物質中へのアレルゲンの混合によるアレルゲンの物理改変を含む。アルミニウムヒドロキシド製剤はアジュバント効果、及び、活性アレルゲン成分の組織濃度を減少させる緩慢なアレルゲン放出という徐放製剤効果を有する。処置の第三カテゴリーは、アレルギー性すなわちＩｇＥ結合性を減少するためのアレルゲンの化学改変を含む。
成功したアレルギーワクチン接種の背後にある詳細なメカニズムには、議論の余地が残されている。しかしながら、免疫応答の全体的な調節においてＴ細胞が重要な役割を果たすことは同意されている。現在の総意によると、Ｔ細胞表現型の両極端であるＴｈ１及びＴｈ２間の関係が個体のアレルギー状態を決定する。アレルゲンで刺激されると、Ｔｈ１細胞はインターフェロンγによって支配されるインターロイキンを分泌して防御免疫をもたらし、個体は健康である。反対にＴｈ２細胞はインターロイキン４及び５を優勢に分泌してＩｇＥ合成及び好酸球増加をもたらし、個体はアレルギー状態にある。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究は、関連するＴ細胞エピトープを含むアレルゲン由来のペプチドでの攻撃によってアレルゲン特異的Ｔ細胞応答を変化させる可能性を示している。従って、新しいアレルギーワクチンに対する現在のアプローチは主にＴ細胞に対処することに基づき、Ｔ細胞を静めること（アネルギー誘導）又は応答をＴｈ２表現型からＴｈ１表現型にシフトすることを目的とする。
【０００４】
抗体結合エピトープ（Ｂ細胞エピトープ）
Ｆａｂ−抗原複合体のＸ線結晶解析は、抗体結合エピトープの理解を高めている。この種類の解析によると、抗体結合エピトープは１５〜２５アミノ酸残基に由来する原子を含む抗原表面の一部分として定義することができ、前記アミノ酸残基は抗体原子と直接相互作用できる距離範囲内にある。抗原抗体相互作用の親和性は、ファンデルワールス相互作用、水素結合又はイオン結合が寄与するエンタルピーのみからは予測することができない。界面からの水分子のほぼ完全な排除に付随するエントロピーは、同様な規模のエネルギー貢献を示す。これは、相互作用する分子の輪郭間の完全な適合が、抗原抗体高親和性相互作用の根底にある主要な要因であることを意味する。
ＷＯ ９７／３０１５０（参考文献１）においてタンパク質分子の集団がクレームされており、このタンパク質分子は親タンパク質に比べてアミノ酸配列における特異的変異の分布を有する。この記述からこの発明は、親タンパク質と比べて改変されるが、処理され消化された、Ｔ細胞に対して親タンパク質（天然に存在するアレルゲン）と同じ様式で提示されるアナログを作製することに関すると考えられる。これにより、改変されたＴ細胞応答が得られる。改変タンパク質ライブラリーはＰＭ（節約（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ）変異誘発）を表す技術を用いて調製される。
ＷＯ ９２／０２６２１（参考文献２）において組換えＤＮＡ分子が記述されており、この分子はＡｌｎ ｇ １、Ｃｏｒ ａ １及びＢｅｔ ｖ １より選択されるファガレス目樹木アレルゲンの少なくとも一つのエピトープを有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。この明細書に記述される組換え分子は全て、天然に存在するアレルゲンの配列に対応するアミノ酸配列又はその一部を有する。
ＷＯ ９０／１１２９３（参考文献３）は特に、ブタクサ花粉の単離アレルギー性ペプチド及び改変ブタクサ花粉ペプチドに関する。ここで開示されたペプチドは、天然に存在するアレルゲンの配列又はその天然に存在するイソフォームの配列のいずれかに対応するアミノ酸配列を有する。
【０００５】
アレルゲンの化学改変
アレルゲンの化学改変に対して複数のアプローチが行われている。７０年代初めのアプローチは、アレルゲンのポリマーとの化学共役、及び、ホルムアルデヒドを用いたアレルゲンの化学架橋結合などを含み、いわゆる「アレルゴイド」を作製することを含む。これらのアプローチの理論的根拠は、化学リガンドの付加によるＩｇＥ結合エピトープのランダム破壊が、この複合体分子量を増加することによって免疫原性を保持する一方でＩｇＥ結合性を減少することである。「アレルゴイド」作製に固有な不利益は、化学架橋結合工程の制御における困難、及び、得られる高分子量複合体の解析及び標準化における困難に結び付けられる。「アレルゴイド」は現在臨床使用されており、ＩｇＥ結合エピトープのランダム破壊のために従来ワクチンに比べて多い用量を投与することができる。しかし、その安全性及び有効性評価基準は、従来ワクチンの使用を超えて改善されていない。
より最近のアレルゲンの化学改変に対するアプローチは、アレルゲンの三次構造を全体的に破壊してＩｇＥ結合を排除することを目的とし、治療上の本質的な標的がＴ細胞特異的なアレルゲンであると仮定している。このようなワクチンは最小Ｔ細胞エピトープを表す合成ペプチド由来のアレルゲン配列、結合Ｔ細胞エピトープを表すさらに長いペプチド、免疫優性Ｔ細胞エピトープ領域を表す合成ペプチド由来のより長いアレルゲン配列、又は、組換え技術により二つ半分に切断されたアレルゲン分子を含む。この理論的根拠に基づく別のアプローチは、“低ＩｇＥ結合”組換えイソフォームの使用を提案している。天然アレルゲンは不均一であって、およそ２５％に至るアミノ酸置換を有するイソアレルゲン及び変異体を含むことが、近年明らかになっている。幾つかの組換えイソアレルゲンは、おそらく不可逆的な変性によって三次構造が全体的に破壊されるため、ＩｇＥ結合における効果が弱まることが見出されている。
【０００６】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発及びアレルギーワクチン接種
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの部位特異的変異誘発によりアレルゲン性を減少する試みが、Ｄｅｒ ｆ ２（Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ、参考文献４）、Ｄｅｒ ｐ ２（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ、参考文献５）、３９ ｋＤａのデルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）アレルゲン（Ａｋｉ ｅｔ ａｌ、参考文献６）、ハチ毒物ホスホリパーゼＡ２（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ、参考文献７）、Ａｒａ ｈ １（Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ、 参考文献８）、Ａｒａ ｈ ２（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ、参考文献９）、Ｂｅｔ ｖ １（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ、参考文献１０及び１１）、カバノキ・プロフィリン（Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、参考文献１２）及びＯｒｙ ｓ １（Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ、参考文献１３）を含む種々のアレルゲンを用いて行われている。
これらのアプローチの理論的根拠は、この場合もやはりアレルゲン特異的Ｔ細胞に向けられているが、一方同時に組換え変異体アレルゲンの三次構造の破壊によるＩｇＥ結合性の減少又は排除によってＩｇＥが媒介する副作用の危険性を減少することである。これらのアプローチの理論的根拠は、優性ＩｇＥ結合エピトープの概念を含まず、Ｂ細胞及び抗体産生をも伴う新しい防御免疫応答を開始させるという概念を含まない。
Ｆｅｒｒｅｉｒａ等の論文（参考文献１１）は、ＩｇＥ結合性を減少する目的で部位特異的変異誘発の使用を記述している。この論文の中でＢｅｔ ｖ １の三次元構造が述べられているが、著者等は変異のためのアミノ酸残基（その半分は低い程度の溶媒露出を有する）の予測のためにこの構造を使用していない。彼等はむしろ、ここに記述する保存表面領域の同定に基づく構造という概念と異なり、タンパク質における機能的残基の予測のために開発された方法を用いている。この著者等はα炭素骨格三次構造の保存を議論しているが、その概念は治療的ストラテジーの一部ではなく単にｉｎ ｖｉｔｒｏのＩｇＥ結合性を評価するために含まれるだけである。さらに、一般的な問題であるがＣＤスペクトルの標準化がサンプルの空間的な大きさの変性の評価を妨げるために、示された証拠は不充分である。記載された治療的ストラテジーはアレルゲン特異的Ｔ細胞におけるトレランスの誘導を目的としており、新しい免疫応答の開始は述べられていない。
Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ等による論文（参考文献１２）は、モノクローナル抗体エピトープを特徴付ける目的のため、部位特異的変異誘発及びペプチド合成の使用を記述している。この著者等は抗原の三次構造について知識があり、この知識を使用し変異誘発のためアミノ酸を露出する表面を選択している。相同配列と異なるアミノ酸が選択されているため、用いられたアルゴリズムは本発明者により記述されるものと反対であると言える。この研究は、表面露出アミノ酸の置換はモノクローナル抗体の結合特性を改変する能力を有することを実証しているが、これは通常の知識を考慮すれば驚くべきことではない。記述された実験はアレルギー患者の血清ＩｇＥのようなポリクローナル抗体の結合性における変化を評価することを設計していない。この実験の一つは定量的評価には適していないが血清ＩｇＥを適用することを含み、行われた変異誘発によってＩｇＥ結合性は影響されないようである。
Ｓｍｉｔｈ等による論文（参考文献５）は、モノクローナル抗体のエピトープマッピング及びＩｇＥ結合性の減少を目的とする部位特異的変異誘発の使用を記述している。この著者等は三次構造の知識がなく、α炭素骨格三次構造の保存を評価する試みを行っていない。用いられたアルゴリズムは、変異誘発のために選択されたアミノ酸が実際に分子表面に露出されることを保証していない。記述された変異体の一つのみが、ＩｇＥ結合性の実質的な減少をもたらす。この変異体は試験した抗体全部の結合性を欠いており、三次構造が破壊されていることを示している。この著者等は治療的ストラテジーを定めておらず、新しい免疫応答の開始は言及されていない。
Ｃｏｌｏｍｂｏ等による論文（参考文献１４）は、部位特異的変異誘発及びペプチド合成の使用によるＩｇＥ結合エピトープの研究を記述している。この著者等は、相同タンパク質の結晶構造に基づく三次元コンピューターモデル構造を使用し、分子表面上のエピトープの存在を例示している。エピトープを表す合成ペプチドを用いて、一次構造相同性を示す異なるアレルゲン上のエピトープのさらなる存在が取り扱われている。この治療的ストラテジーは、一価ＩｇＥ結合エピトープを表すこの合成ペプチドを用いた治療に基づく。相同アレルゲン間の保存表面領域及び新しい防御免疫応答を開始するという治療的概念は、言及されていない。
Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ等による論文（参考文献１５）は、主要なカバノキアレルゲンの三次元構造及び保存された表面露出パッチを記述している。この論文は主要なＩｇＥ結合エピトープも部位特異的変異誘発も言及しておらず、治療的応用も扱われていない。
上記研究のいずれにおいても、表面露出アミノ酸の置換によってＩｇＥ結合性が減少する一方でα炭素骨格三次構造を保存することを記述していない。上記言及されたアプローチの理論的根拠は、優性ＩｇＥ結合エピトープの概念を含まず、新しい防御免疫応答を開始するという治療的概念を含まない。
ＷＯ ９９／４７６８０は、アレルゲンのα炭素骨格三次構造を保持したままでの規定した重要な位置への人為的アミノ酸置換の導入を開示している。特にＷＯ ９９／４７６８０は天然に存在するアレルゲンに由来する天然に存在しない変異体である組換えアレルゲンを開示し、この組換えアレルゲンにおいてはＢ細胞エピトープの少なくとも一つの保存された表面露出アミノ酸残基が他の残基によって置換され、これは前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置には起こらない。前記変異体アレルゲンは前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有し、前記天然に存在するアレルゲンに比べ変異アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ結合性が減少している。
ＷＯ ９９／４７６８０において開示される組換えアレルゲンは、ａ）前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある全既知相同タンパク質において、７０％より高い同一性で保存される天然に存在するアレルゲンのアミノ酸残基を同定すること、ｂ）少なくとも一つのＢ細胞エピトープを含み、少なくとも２０％の溶媒接触性を有することにより定義され、アレルゲン分子の三次元表面の少なくとも４００Å２にわたって密着して連結される保存アミノ酸残基の少なくとも一つのパッチを決定すること、及びｃ）前記少なくとも一つのパッチにおいて、少なくとも一つのアミノ酸残基がアレルゲン分子の全体的なα炭素骨格三次構造を本質的に保存しながら特定の位置で他の非保存的アミノ酸残基により置換されることによって、得ることができる。
【０００７】
（発明の目的）
本発明の理論的根拠
本発明はユニークな原理に基づいている。この原理によると、成功したアレルギーワクチン接種のメカニズムは進行中のＴｈ２型免疫応答の変更ではなく、むしろＢ細胞及び抗体形成物による三次エピトープ認識に関する新しい免疫応答の並行的開始である。この新しい免疫応答は部分的にＴｈ１型免疫応答であると信じられている。このモデルは、成功したワクチン接種治療により特異的ＩｇＥレベルが影響されないこと、及び、成功した治療は多くの場合アレルゲン特異的ＩｇＧ４の実質的な増加を伴うことの観察によって支持される。加えて、アレルゲン攻撃前後の鼻のバイオプシー研究はＴｈ２様表現型を有するＴ細胞の減少を示さないが、むしろＴｈ１様Ｔ細胞の増加が観察される。ワクチン（又は医薬組成物）が気道以外の経路を経て投与される場合、進行中のＴｈ２応答とは物理的に離れた位置において新しい免疫応答が発達し、二つの応答が並行して存在することを可能にしていることが仮定される。
免疫系の別の重要な側面は、いわゆる優性ＩｇＥ結合エピトープの存在の表明である。これら優性ＩｇＥ結合エピトープは、抗体結合を収容するのに充分な大きさの密着した表面領域に依存する三次構造によって構成されており、近縁種由来のイソアレルゲン、変異体及び／又は相同アレルゲンのうちで保存されることが提唱される。相同アレルゲン上の同様なエピトープに結合する能力がある交差反応性のＩｇＥの存在は、例えばハンノキ、カバノキ及びハシバミといった種々の近縁種、多様な草本種又はデルマトファゴイデ種の様々なイエダニに対してアレルギー患者が頻繁に反応するという臨床観察によって支持される。これはさらに、近縁種由来の相同アレルゲン間のＩｇＥ交差反応性、及び、相同アレルゲンに対するＩｇＥ結合を阻害する一つのアレルゲンの能力を実証する研究室での実験（Ｉｐｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９２，参考文献１６）によって支持される。曝露及び免疫応答は、用量依存的な様式に関連することがよく知られている。これらの観察の組合せに基づき、保存表面領域は非保存表面領域よりも高用量で免疫系に対して曝露されて高親和性を伴うＩｇＥ抗体産生を生じることが仮定され、従って「優性ＩｇＥ結合エピトープ」という用語で呼ぶ。
この原理によると、アレルゲンは天然アレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有し、ＩｇＥ結合性の減少を目的とする変異誘発のための標的を表す保存パッチを取り囲む領域の表面トポロジーの保存を確実にすることが必要不可欠である。これらの基準を満たすことにより、アレルゲンは安全性を妥協することなく防御免疫応答を発生させることにおいてその効果が改善し、相対的に高い用量で投与される可能性を有する。さらに本発明は、アレルギー症状はエフェクター細胞、すなわち肥満細胞及び好塩基球の表面に高親和性ＩｇＥレセプターＦｃｅＲＩを介して結合した二つの特異的ＩｇＥとアレルゲンの架橋結合により引き起こされるという発見に基づく。説明のために、我々はＩｇＥ結合エピトープを伴うアレルゲンの理論的モデルを示す図１５に言及する。肥満細胞からのメディエーター放出の誘導及びそれによるアレルギー症状は、肥満細胞表面に結合したＩｇＥのアレルゲン媒介架橋結合によって影響を受ける（図１５Ａを参照）。図１５Ｂに示す状態において、エピトープの二つがＩｇＥ結合能力を減少するように変異させられて、それによりアレルゲン媒介架橋結合が妨害される。これに関連して、アレルゲンは通常三つより多いＢ細胞エピトープを含むことを述べるべきである。しかしながら、図１５に描かれた理論上の状態から、より多くのエピトープがＩｇＥ結合能力を除去又は減少されるように変異させられるにつれて、アレルゲン媒介架橋結合及び結果として生ずるアレルギー症状の危険性がより低下することが想定され得る。
しかしながら、変異アレルゲンがＩｇＧ応答を含む新しい免疫応答を生じることが可能になるためには、アレルゲンは少なくとも一つの原型のエピトープを含まなければならない。好ましくは、この原型のエピトープが優性エピトープである。なぜならそのような変異アレルゲンがワクチン接種に用いられる場合、改善された防御を提供するであろうからである。
結論として、本発明の発明概念は、複数のＢ細胞エピトープにおいてＩｇＥ結合性を減少する変異及び少なくとも一つの原型のエピトープを有する変異アレルゲンが、一方ではアレルゲン媒介架橋結合を減少し他方ではＩｇＥに競合する結合能力を有するＩｇＧ応答の発生を可能にし得るという認識に基づく。このように、前記変異アレルゲンはアナフィラキシー反応の危険性を強く減少させ得る点で非常に有利なアレルゲンを構成するであろう。
また、本発明は、理想的にはその多数又は全エピトープが原型のまま提示されるような変異アレルゲンの異なる混合物を含むワクチンは、アレルギー症状に対して防御を誘導する能力において、この変異アレルゲンの起源である天然に存在するアレルゲンと同等な効果が有り得るという認識に基づく。
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、各変異エピトープの特異的ＩｇＥ結合能力の減少を目的として、複数の特定の重要な位置、すなわちＩｇＥ結合エピトープへの人為的なアミノ酸置換の導入に関する。
本発明は、以下の点で特徴付けられる組換えアレルゲンを提供する。この組換えアレルゲンは天然に存在するアレルゲンの変異体であって、各々が前記天然に存在するアレルゲンのＩｇＥ結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的ＩｇＥ結合能力を減少する少なくとも四つの第一変異を有し、各第一変異は他の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列の同じ位置に存在せず、各第一変異は各他の第一変異から少なくとも１５Å隔てられており、かつ面積８００Å２の円形表面領域の少なくとも一つが変異を含まないように配置される。
理論に縛られることなく、Ｂ細胞エピトープはアレルゲンの全表面の大部分にわたって分布し得ることが信じられている。さらに、少なくとも複数のエピトープが重複エピトープの多数を含むエピトープのクラスターの一部を構成することの実験証拠が存在する。従って本発明に対する理論的根拠は、どの表面露出アミノ酸も変異の潜在的部位を構成し、結果として変異は特異的ＩｇＥを結合する能力を減少し得ることである。
従って、第一変異は相互に関してその位置によって規定され、すなわち離して隔てられ、それらがエピトープの分離クラスターに存在する変異であることを確実にする。
本発明は、請求項１に記載する二つ以上の異なる組換え変異体アレルゲンを含む組成物も提供する。各前記変異体は少なくとも一つの主要な変異を有することによって規定され、その変異は別の変異体の少なくとも一つには存在しない。各変異体に対して各前記主要な第一変異から半径１５Åの範囲内に第二変異は存在しない。この組成物は、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは３〜１０、さらに好ましくは４〜８、最も好ましくは５〜７の変異体を含む。
本発明は、ａ）〜ｃ）の点で特徴付けられる請求項１記載の組換えアレルゲンの調製方法も提供する。
ａ） 天然に存在するアレルゲンにおいて少なくとも２０％の溶媒接触性を有するアミノ酸の番号を同定すること；
ｂ）同定されたアミノ酸残基から少なくとも四つを選択することであって、各選択されたアミノ酸は他の選択されたアミノ酸の各々から少なくとも１５Å隔てられており、面積８００Å２の円形表面領域内の少なくとも一つに存在しないように配置されていること；及び
ｃ）選択されたアミノ酸の各々に対して、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力と比べて変異アレルゲンの特異的ＩｇＥ結合能力を減少する第一変異を行うことであって、各第一変異は選択されたアミノ酸残基の別のアミノ酸による置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在しないこと。
別の側面において本発明は、対応する天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡのＤＮＡシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（分子育種）によって得られたＤＮＡ配列からアレルゲンが作製されることによって特徴付けられる、本発明の組換えアレルゲンの調製方法に関する。
さらに、本発明は医薬品として使用するための請求項１の組換えアレルゲンに関する。
また、本発明はアレルギーを予防及び／又は治療するための医薬品を調製するための請求項１の組換えアレルゲンの使用に関する。
さらに、本発明は医薬品として使用するための請求項３７の組成物に関する。
また、本発明はアレルギーを予防及び／又は治療するための医薬品を調製するための請求項３７の組成物の使用に関する。
さらに、本発明は請求項１の組換えアレルゲン又は請求項３７の組成物を含み、これに組合せて医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含んでもよく、アジュバントを含んでもよいことを特徴とする医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、アレルギーを患う患者において天然に存在するアレルゲンによって誘発されるアレルギー反応に対するワクチンの形態をとり得る。
また、本発明は請求項１の組換えアレルゲン、請求項３７の組成物、又は、請求項４１−４２若しくは４６の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者に免疫応答を発生させる方法に関する。
さらに、本発明は請求項１の組換えアレルゲン、請求項３７の組成物、又は、請求項４１−４２若しくは４６の医薬組成物を対象者に投与することを含む、対象者のワクチン接種又は治療に関する。
また、本発明は請求項１の組換えアレルゲン又は請求項３７の組成物を医薬的に許容される物質及び／又は賦形剤とともに混合することを含む、請求項４１又は４２の医薬組成物を調製する方法に関する。
さらに本発明は請求項４５の方法によって得ることができる医薬組成物に関する。
また、本発明は請求項１の組換えアレルゲン、請求項３７の組成物、又は、請求項４１−４２若しくは４６の医薬組成物を対象者に投与することを含む、患者のアレルギー反応の治療、予防又は軽減のための方法に関する。
さらに本発明は、本発明のアレルゲンをコードするＤＮＡ配列、その誘導体、その部分配列、その縮重配列、又は、ストリンジェントな条件下でそれらとハイブリダイズする配列であって、少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有するペプチドをコードする前記誘導体、前記部分的配列、前記縮重配列又は前記ハイブリダイズする配列に関する。
また、本発明は本発明のＤＮＡを含む発現ベクターに関する。
さらに、本発明は本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
加えて、本発明は本発明の宿主細胞を培養する工程を含む組換え変異体アレルゲンを作製する方法に関する。
最後に、本発明は、天然に存在するアレルゲンに特異的なＴ細胞クローン又はＴ細胞株を刺激する能力がある少なくとも一つのＴ細胞エピトープを含む、本発明の組換えアレルゲン又は本発明のＤＮＡ配列によってコードされる組換えアレルゲンに関する。本発明の変異体は、Ｔ細胞刺激指標の測定による同様な様式／程度でアレルゲン特異的Ｔ細胞株を刺激し得るのが好ましい。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい態様では、第一変異同士が２０Å、好ましくは２５Å、最も好ましくは３０Å隔てられている。
アレルゲンは特異的ＩｇＥに対して幾つかの潜在的結合領域を含み、その各領域はおよそ８００Å２の大きさを有し、その各表面領域は重複エピトープの多数を含むことが信じられている。このように、アレルゲンは８００Å２で分割された表面領域の潜在的第一変異の幾つかを有する。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンが５〜２０、好ましくは６〜１５、さらに好ましくは７〜１２、最も好ましくは８〜１０の第一変異を含む。
本発明の好ましい態様では、変異を含まない表面領域が７００Å２、好ましくは６００Å２、さらに好ましくは５００Å２、最も好ましくは４００Å２の面積を有する。
本発明の好ましい態様では、組換えアレルゲンが、前記天然に存在するアレルゲンの結合能力に比べて各々が変異アレルゲンの特異的ＩｇＥ結合能力を減少する第二変異を幾つか含み、この各第二変異は別の残基による一つの表面露出アミノ酸残基の置換であって前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在せず、前記円形領域の外側に位置する。
第二変異は第一変異の近くに位置付けることができ、すなわち第二変異は第一変異によって変異された同じエピトープに対する付加的な変異であるだろう。
本発明の好ましい態様では、天然に存在するアレルゲンにおいて置換される少なくとも一つの表面露出アミノ酸が約２０％、好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、最も好ましくは約５０％の溶媒接触性を有する。
本発明の別の好ましい態様では、天然に存在するアレルゲンにおいて置換される少なくとも一つの表面露出アミノ酸が、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において７０％より高く、好ましくは８０％より高く、最も好ましくは９０％より高い同一性で保存される。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンが本質的に前記天然に存在するアレルゲンと同じα炭素骨格三次構造を有する。
変異体及び天然に存在するアレルゲン分子のα炭素骨格三次構造を比較した場合、原子座標の平均標準偏差が２Åより小さいのが好ましい。
本発明の組換えアレルゲンの好ましい態様では、変異体アレルゲンに組み込まれる各アミノ酸残基は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、好ましくは亜科、さらに好ましくは科、さらに好ましくは上科、さらに好ましくは亜綱、さらに好ましくは亜目、最も好ましくは目の範囲内にある既知相同タンパク質のアミノ酸配列において同じ位置に存在しない。
本発明の好ましい態様では、本発明の組換え変異体アレルゲンは天然に存在しないアレルゲンである。
変異アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ結合性が、起源特異的ＩｇＥ反応性アレルギー患者由来の血清又はそのプールを用いた免疫アッセイにおいて、天然に存在するイソアレルゲン又は同様な組換えタンパク質と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％減少されるのが好ましい。
変異体の減少したＩｇＥ結合性及び減少した架橋結合媒介能力を評価する別の手段は、変異体のヒスタミン放出（ＨＲ）を開始する能力である。ヒスタミンの放出は種々のヒスタミン放出アッセイで測定することができる。変異体の減少したヒスタミン放出は、細胞表面の特異的ＩｇＥ結合に対する減少した親和性、及び、架橋結合促進の減少した能力に由来する。天然に存在するアレルゲンと比較して本発明の変異体に対し、ＨＲが好ましくは５〜１００％、さらに好ましくは２５〜１００％、さらに好ましくは５０〜１００％、最も好ましくは７５〜１００％減少される。
一般的に、変異を含まない面積８００Å２の円形表面領域は、１５〜２５のアミノ酸残基の原子を含む。
本発明の好ましい組換えアレルゲンは、表面露出アミノ酸残基が溶媒接触性に関して順位付けられ、より溶媒接触可能なアミノ酸残基のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることに特徴付けられる。
本発明のさらに好ましい組換えアレルゲンは、表面露出アミノ酸残基が前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して順位付けられ、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸が置換されることに特徴付けられる。
好ましくは、本発明の組換えアレルゲンは第一変異あたり一つ〜四つの第二変異を含む。
本発明の好ましい態様は、一つ以上の置換が部位特異的変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明の別の好ましい態様は、一つ以上の置換がランダム変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明のさらに好ましい態様は、一つ以上の置換がＤＮＡシャッフリングによって行われることに特徴付けられる。
本発明の組換えアレルゲンは、特に樹木、草本、ハーブ、菌類、イエダニ、ゴキブリ及び動物の毛若しくはフケに由来する吸入アレルゲンの変異体であるのが適切であろう。樹木、草本又はハーブ由来の重要な花粉アレルゲンは、特にカバノキ（ベツラ（Ｂｅｔｕｌａ））、ハンノキ（アルナス（Ａｌｎｕｓ））、ハシバミ（コリルス（Ｃｏｒｙｌｕｓ））、シデ（カルピナス（Ｃａｒｐｉｎｕｓ））及びオリーブ（オレア（Ｏｌｅａ））を含む分類学上ファガレス（Ｆａｇａｌｅｓ）目、オレアレス（Ｏｌｅａｌｅｓ）目及びピナレス（Ｐｉｎａｌｅｓ）目、特にロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）属、フェレウム（Ｐｈｌｅｕｍ）属、ポア（Ｐｏａ）属、シノドン（Ｃｙｎｏｄｏｎ）属、ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）属及びセカレ（Ｓｅｃａｌｅ）属の草本を含むポアレス（Ｐｏａｌｅｓ）目、特にアンブロシア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）属及びアルテミシア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）属のハーブを含むアステラレス（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）目及びウルチカレス（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）目に由来する。菌類由来の重要な吸入アレルゲンは、特にオルターナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属及びクラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属に由来する。他の重要な吸入アレルゲンは、デルマトファゴイデス属のイエダニ由来、ゴキブリ由来及びネコ、イヌ及びウマのような哺乳動物由来である。さらに、本発明の組換えアレルゲンはミツバチ（アピダエ（Ａｐｉｄａｅ）上科）、ワスプ（ベスピデア（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）上科）及びアリ（フォルミコイダエ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）上科）を含む分類学上ヒメノプテラ（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）目に由来するような虫が刺すこと又は噛むことに由来するアレルゲンを含む毒物アレルゲンの変異体であり得る。
特異的アレルゲン成分は、例えばファガレス目のＢｅｔ ｖ １（Ｂ．ベルルコサ（ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、カバノキ）、Ａｌｎ ｇ １（アルナス・グルチノサ（ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ハンノキ）、Ｃｏｒ ａ １（コリルス・アベラナ（ａｖｅｌａｎａ）、ハシバミ）及びＣａｒ ｂ １（カルピナス・ベツルス（ｂｅｔｕｌｕｓ）、シデ）を含む。他のものは、Ｃｒｙ ｊ １（ピナレス）、Ａｍｂ ａ １及び２、Ａｒｔ ｖ １（アステラレス）、Ｐａｒ ｊ １（ウルチカレス）、Ｏｌｅ ｅ １（オレアレス）、Ａｖｅ ｅ １、Ｃｙｎ ｄ １、Ｄａｃ ｇ １、Ｆｅｓ ｐ １、Ｈｏｌ ｌ １、Ｌｏｌ ｐ １及び５、Ｐａｓ ｎ １、Ｐｈｌ ｐ １及び５、Ｐｏａ ｐ １、２及び５、Ｓｅｃ ｃ １及び５、及びＳｏｒ ｈ １（種々の草本の花粉）、Ａｌｔ ａ １及びＣｌａ ｈ １（菌類）、Ｄｅｒ ｆ １及び２、Ｄｅｒ ｐ １及び２（イエダニ、それぞれＤ．ファリナエ及びＤ．プテロニスシナス（ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、Ｌｅｐ ｄ １及び２（レピドグリフュス・デストルクター（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）；倉庫（ｓｔｏｒａｇｅ）ダニ）、Ｂｌａ ｇ １及び２、Ｐｅｒ ａ １（ゴキブリ、それぞれブラテルラ・ジャーマニカ（Ｂｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）及びペリプラネタ・アメリカーナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、Ｆｅｌ ｄ １（ネコ）、Ｃａｎ ｆ １（イヌ）、Ｅｑｕ ｃ １、２及び３（ウマ）、Ａｐｉｓ ｍ １及び２（ミツバチ）、Ｖｅｓ ｖ １、２及び５、Ｐｏｌ ａ １、２及び５（全スズメバチ）及びＳｏｌ ｉ １、２、３及び４（ハリアリ）である。
一つの態様では、組換えアレルゲンはＢｅｔ ｖ １の変異体である。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸Ｖ２， Ｄ７２， Ｅ８７， Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７及びＥ−７３を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、Ｖ２Ｆ， Ｖ２Ｌ， Ｖ２Ｉ， Ｖ２Ｍ， Ｙ５Ｖ， Ｔ１０Ｐ， Ｔ１０Ａ， Ｋ２０Ｎ， Ｄ２５Ｅ， Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｑ３６Ａ， Ｑ３６Ｋ， Ｅ４２Ｓ， Ｅ４５Ｓ， Ｎ４７Ｓ， Ｋ５５Ｎ， Ｋ６５Ｎ， Ｄ７２Ｈ， Ｄ７２Ｑ， Ｄ７２Ｎ， Ｔ７７Ａ， Ｎ７８Ｋ， Ｅ８７Ｇ， Ｅ９６Ｌ， Ｋ９７Ｓ， Ｋ１０３Ｖ， Ｐ１０８Ｇ， Ｄ１０９Ｎ， Ｋ１２３Ｉ， Ｄ１２５Ｙ， Ｋ１２９Ｎ， Ｋ１３４Ｅ， Ｒ１４５Ｅ， Ｓ１４９Ｒ， Ｓ１４９Ｔ， Ｄ１５６Ｈ及び＋１６０Ｎからなる群より選択され得る（＋は付加的なアミノ酸が含まれることを意味する）。
本発明によるＢｅｔ ｖ １変異体の例は以下である（用いられている括弧は第一及び第二変異を示す）：
変異体Ａ：
（Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， （Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ）， Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ， （Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ， ＋１６０Ａｓｎ）
変異体Ｂ：
Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｇｌｕ４２Ｓｅｒ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ， Ｌｙｓ１２３Ｉｌｅ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ， Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ
変異体２５９５（実施例２）：
Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｅ４５Ｓ， Ｐ１０８Ｇ
変異体２６２８（実施例４）：
Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ
変異体２６３７（実施例４）：
Ａｌａ１６Ｐｒｏ， （Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｌｙｓ１０３Ｔｈｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， （Ｌｅｕ１５２Ｌｙｓ， Ａｌａ１５３Ｇｌｙ， Ｓｅｒ１５５Ｐｒｏ）
変異体２７２４：
Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｎ７８Ｋ， Ｋ１０３Ｖ， Ｐ１０８Ｇ， Ｒ１４５Ｅ， Ｄ１５６Ｈ， ＋１６０Ｎ
変異体２７３３（実施例４）：
（Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ）， （Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， （Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ）， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ， （Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ， ＋１６０Ａｓｎ）
変異体２７４４：
（Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ）， （Ｇｌｕ４２Ｓｅｒ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ）， （Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ）， Ｌｙｓ１２３Ｉｌｅ， （Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ， ＋１６０Ａｓｎ）
変異体２７５３（実施例４）：
（Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， （Ｇｌｕ９６Ｌｅｕ， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ）， （Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， Ａｓｐ１０９Ａｓｎ）， （Ａｓｐ１２５Ｔｙｒ， Ｇｌｕ１２７Ｓｅｒ）， Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ
変異体２７４４＋２５９５：
Ｙ５Ｖ， Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｅ４２Ｓ， Ｅ４５Ｓ， Ｎ７８Ｋ， Ｋ１０３Ｖ， Ｐ１０８Ｇ， Ｋ１２３Ｉ， Ｋ１３４Ｅ， Ｄ１５６Ｈ， ＋１６０Ｎ
変異体２７４４＋２６２８：
Ｙ５Ｖ， Ｅ４２Ｓ， Ｅ４５Ｓ， Ｋ６５Ｎ， Ｎ７８Ｋ， Ｋ９７Ｓ， Ｋ１０３Ｖ， Ｋ１２３Ｉ， Ｋ１３４Ｅ， Ｄ１５６Ｈ， ＋１６０Ｎ
変異体２７４４＋２５９５＋２６２８：
Ｙ５Ｖ， Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｅ４２Ｓ， Ｅ４５Ｓ， Ｋ６５Ｎ， Ｎ７８Ｋ， Ｋ９７Ｓ， Ｋ１０３Ｖ， Ｐ１０８Ｇ， Ｋ１２３Ｉ， Ｋ１３４Ｅ， Ｄ１５６Ｈ， ＋１６０Ｎ
さらに、上記変異体の全ては以下の置換を一つ以上含む：Ｖ２Ｆ， Ｖ２Ｌ， Ｖ２Ｉ， Ｖ２Ｍ， Ｔ１０Ａ， Ｋ２０Ｎ， Ｑ３６Ａ又はＱ３６Ｋ， Ｄ７２Ｈ， Ｄ７２Ｑ， Ｄ７２Ｎ， Ｅ８７Ｇ， Ｋ１２９Ｎ及びＳ１４９Ｒ又はＳ１４９Ｔ。
別の態様では、組換えアレルゲンは分類学上ベスピダエ目、アピダエ目及びフォルミコイダエ目由来の毒物アレルゲンに由来する。
さらなる態様では、組換えアレルゲンはＶｅｓ ｖ ５に由来する。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸Ｋ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９， Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５及びＩ−１８２を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、Ｋ２９Ａ， Ｔ６７Ａ， Ｋ７８Ａ， Ｖ８４Ｓ， Ｙ１０２Ａ， Ｋ１１２Ｓ， Ｋ１４４Ａ， Ｋ２０２Ｍ及びＮ２０３Ｇからなる群より選択され得る。
さらなる態様では、組換えアレルゲンはＤｅｒ ｐ ２に由来する。置換に対して潜在的に適切なアミノ酸は、アミノ酸Ｒ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９及びＲ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９， Ｋ−１５を含む。一つ以上の第一置換及び第二置換は、Ｋ６Ａ， Ｎ１０Ｓ， Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｎ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ及びＲ１２８Ｑからなる群より選択され得る。
本発明によるＢｅｔ ｖ １変異体の例は、以下である。
変異体Ａ：
Ｋ６Ａ， Ｋ１５Ｅ， Ｈ３０Ｎ， Ｅ６２Ｓ
変異体Ｂ：
Ｋ６Ａ， Ｋ１５Ｅ， Ｈ３０Ｎ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ
変異体Ｃ：
Ｋ６Ａ， Ｎ１０Ｓ， Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｎ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ及びＲ１２８Ｑ
【００１０】
ワクチン
ワクチンの調製は、この技術分野において一般的によく知られている。ワクチンは通常、溶液又は懸濁液いずれかのように注射可能物質として調製される。前記ワクチンは、経鼻投与及び、口内及び舌下を含む経口投与を可能にするため、乳化又は調合されることもある。問題とする免疫成分（本明細書に定義する組換えアレルゲン）は、適切には医薬的に許容される賦形剤と混合され得、さらに活性成分と互換性がある。適切な賦形剤の例は、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等及びこれらの組合せである。ワクチンは付加的に、湿潤剤、乳化剤、緩衝化剤又はワクチンの効果を増強するアジュバントのような他の物質を含み得る。
ワクチンは皮下又は筋肉内注射によって、最も頻繁に投与される。他の経路による投与に対して適切な製剤は、経口製剤及び坐剤を含む。経口投与のためのワクチンは、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常前記製剤に使用される賦形剤と適切に調合され得る。組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、エアロゾル、粉末又は顆粒として調合されることが可能である。
ワクチンは、治療上効果的かつ免疫原性のある量を適合する投薬製剤形態の方法で投与される。ワクチンに含まれる活性成分の量は、治療される対象者、特に治療に対して対象者の免疫系が応答する能力、投与経路、及び、対象者の年齢若しくは体重に依存する。適切な処方量の範囲は、約０．０００１ μｇ〜１０００μｇの範囲内で変えることができる。
既に述べたように、製剤にアジュバントを加えることにより増加した効果が得られ得る。このようなアジュバントの具体例は、リン酸緩衝生理食塩水の水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（アルム）又はリン酸カルシウムの０．０５〜０．１％溶液、糖又はポリラクチドグリコリド（ＰＬＧ）の合成ポリマーの０．２５％溶液である。Ｃ．パルブム（ｐａｒｖｕｍ）のような細菌細胞、グラム陰性菌のエンドトキシン又はリポ多糖成分の混合物、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）モノアセテート（アラセルＡ）のような生理的に許容されるオイルビヒクルのエマルジョン、又は、遮断物質として用いられるペルフルオロカーボン（例えばＦｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液のエマルジョンも使用され得る。ＭＦ−５９のようなオイルエマルジョンも用いられ得る。完全及び不完全フロイントアジュバントのような他のアジュバント、ＱｕｉｌＡ、Ｑｓ−２１及びＩＳＣＯＭのようなサポニン、及びＲＩＢＩも用いられ得る。
ほとんどの場合、効果を確実にするためワクチンの複数回投与が必要である。多くの場合、ワクチンは最初の投与とそれに続く接種又は他の投与によって投与される。ワクチン接種の回数は１〜５０の範囲内が典型であり、通常は３５回のワクチン接種を超えない。ワクチン接種は普通、３ヶ月〜５年の期間に週２回〜隔月で行われる。これは所望する予防的又は治療的効果レベルを与えるために企図される。
組換えアレルゲンは医薬製剤として用いられてもよく、症状が起こる（予防）期間中にアレルギー応答に対してある種の防御を提供することに適する。通常、防御効果を維持するためこの処置を毎年繰り返さなければならないであろう。経鼻、経口及び舌下の適用に対して調合された製剤は、この目的に特に適する。
【００１１】
本研究の組換えアレルゲンを調製する方法
既に述べたように、本発明は本発明の組換え変異体アレルゲンを調製する方法にも関する（請求項４８を参照）。
本発明によると置換に適する表面露出アミノ酸は、表面露出の程度を表す溶媒（水）接触性の情報に基づいて同定され得る。本発明の方法の好ましい態様は、前記同定されたアミノ酸残基を溶媒接触性に関して順位付けすること、及び、より溶媒に接触可能なアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することによって特徴付けられる。
本発明において置換に適する表面露出アミノ酸の同定に貢献し得る第二パラメーターは、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質においてアミノ酸が保存される程度である。あるいは、前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の属、亜科、科、上科、亜綱、亜目又は目の範囲内にある全既知相同タンパク質における程度が、前記第二パラメーターとして用いられる。
従って、本発明の方法の好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質において７０％より高く、好ましくは８０％より高く、最も好ましくは９０％より高い同一性が保存される同定されたアミノ酸残基を選択することに特徴付けられる。
さらに、本発明の方法の特に好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンが由来する種の範囲内にある全既知相同タンパク質における保存の程度に関して前記同定されたアミノ酸残基を順位付けすること、及び、より保存されたアミノ酸のうち一つ以上のアミノ酸を置換することに特徴付けられる。
本発明の方法のさらなる好ましい態様は、前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する変異体アレルゲンを形成するように、同定されたアミノ酸を選択することを含む。
本発明の方法のもう一つの好ましい態様は、アミノ酸残基の置換が部位特異的変異誘発によって行われることに特徴付けられる。
本発明の方法の別の好ましい態様は、アミノ酸残基の置換がＤＮＡシャッフリングによって行われることに特徴付けられる。
【００１２】
置換に対する基準
三次構造が決定されている（例えば、Ｘ線結晶解析又はＮＭＲ電子顕微鏡によって）分子に対して、置換されたアミノ酸を持つ変異体は、好ましくは次の基準を満たすべきである：
１．分子の全体的なα炭素骨格三次構造が保存されているのが好ましい。保存とは、構造を比較して原子座標の平均標準偏差が２Åより少ないこととして定義される。これは二つの理由のため重要である：ａ）天然アレルゲンの全体表面は潜在的抗体結合エピトープの重複連続体を構成することが予測される。分子表面の大部分はこの置換によって影響されずその抗体結合誘導特性を維持し、このことは天然のアレルゲン上にも存在するエピトープに向けられる新しい防御抗体特異性の発生に重要である。ｂ）保存期間及び体液へ注入する際の両方に関係する安定性。
２．置換されるアミノ酸は表面に位置し、それにより抗体結合に対して接触可能であるのが好ましい。三次元構造において表面に位置するアミノ酸は通常少なくとも２０％、適切には２０〜８０％、さらに適切には３０〜８０％の溶媒（水）接触性を有する。溶媒接触性は、溶媒分子に匹敵する半径（水、ｒ＝１．４Å）の球に対して接触可能な分子の面積として定義される。
３．置換されたアミノ酸の各々は、好ましくは４００Å２より大きい面積を有する保存されたパッチに位置する。保存されたパッチは、表面露出保存アミノ酸残基及び骨格の密着して連結した面積として定義される。保存アミノ酸残基は、分類学上の同じ種、属、亜科、科、上科、亜綱、亜目又は目の範囲内にある相同タンパク質の全既知（導き出された）アミノ酸配列の配列アラインメントによって定義される。配列の７０％より高く同一なアミノ酸残基を有するアミノ酸配置を、保存されたとみなす。保存されたパッチは、患者の大部分のＩｇＥが対象とするエピトープを含むと予想される。
α炭素骨格三次構造の保存は、変異誘発前及び変異誘発後のＸ線結晶解析又はＮＭＲにより同一構造が得られることによって決定されるのが最もよい。変異体を表す構造的データが無い場合、構造的に決定された分子の解析によって得られるデータと比較してみて、区別できないＣＤスペクトル又は例えば抗体反応性といった免疫学的データがα炭素骨格三次構造の保存を与え得る。
４．保存されたパッチ中にある変異誘発のためのアミノ酸は、好ましくは保存されたパッチの中心近くに位置する最も溶媒（水）接触可能なアミノ酸の中から優先的に選択されるべきである。
５．極性アミノ酸残基が他の極性残基によって優先的に置換され、非極性アミノ酸残基は他の非極性アミノ酸残基によって置換される。
アレルゲンの三次元構造を本質的に維持する目的で組み込まれるアミノ酸は、アレルゲンと構造的相同体であって例えばアレルゲンと分類学上同じ目に属しアレルゲンとどんな交差反応性も持たないタンパク質、との比較に基づいて選択され得る。
【００１３】
本発明のＤＮＡ
好ましい態様では、本発明のＤＮＡ配列が天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡ配列の誘導体である。
好ましくは、ＤＮＡ誘導体が天然に存在するアレルゲンをコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発によって得られる。
特に好ましい第一態様では、ＤＮＡ配列が図３に示す配列の誘導体である。図３に示すＤＮＡ配列は、Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７， Ｅ−７３からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
特に好ましい第二態様では、ＤＮＡ配列が図１３に示す配列の誘導体である。この図１３に示すＤＮＡ配列は、Ｋ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９， Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５及びＩ−１８２からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
特に好ましい第三態様では、ＤＮＡ配列が図１６に示す配列の誘導体である。この図１６に示すＤＮＡ配列は、Ｒ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９及びＲ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９， Ｋ−１５からなる群より選択される少なくとも四つの変異を有するアレルゲンをコードするように変異する。
【００１４】
ＤＮＡシャッフリング
本発明の組換え変異体アレルゲンは、対応する天然ＤＮＡのＤＮＡシャッフリング（分子育種）によって得られたＤＮＡ配列を用いて作製され得る。ＤＮＡシャッフリングはＰｕｎｎｏｎｅｎ等による論文（参考文献２５）で開示される手順及び前記論文中で言及された論文で開示される手順に従って行われ得る。これら前記論文は全て、この参照により本明細書中に含まれるものとする。
診断的アッセイ
さらに、本発明の組換え変異体アレルゲンは診断的な可能性及び利点を有する。先行技術のアレルギーワクチンは天然に存在するアレルゲン原料の抽出物に基づいており、そのため多種多様なイソフォームを表す。アレルギー性の個体は最初に感作されて、一つ又は複数の存在するイソフォームに対するＩｇＥを持つ。イソフォームの幾つかは、相同性及び続いて起こるアレルギー性の個体に対するイソフォームとの交差反応のため、アレルギー性の個体のアレルギー反応について関係し得る。一方他のイソフォームは、アレルギー性の個体が有する特異的ＩｇＥに対するいかなるＩｇＥ結合エピトープも保持しないため、無関係であり得る。このＩｇＥ集団の特異性の不均一性によって、幾つかのイソフォームは結果的に投与が安全であり得、すなわちこれらはＩｇＥを介してアレルギー応答を起こす結果とならず、一方他のイソフォームは望ましくない副作用を引き起こし有害であり得る。
このように、治療的に投与されることを意図する本発明の変異体及び組成物は、前記変異体又は組成物を用いる治療の妥当性、安全性又は成果をモニターするｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断的アッセイにも用いられ得る。適用される診断サンプルは、血清のような身体サンプルを含む。
このように本発明は、本発明による組換え変異体アレルゲン又は組成物を用いる対象者の治療の妥当性、安全性又は成果を評価する診断的アッセイにも関する。対象者のＩｇＥを含むサンプルが前記変異体又は前記組成物と混合され、サンプル中ＩｇＥの前記変異体間の反応性レベルを評価される。サンプル中のＩｇＥと前記変異体間の反応性レベルの評価は、既知の免疫アッセイを用いて行われ得る。
【００１５】
定義
本発明に関して「前記天然に存在するアレルゲンのＩｇＥ結合能力と比較して特異的ＩｇＥ結合能力を減少する」という表現は、天然に存在するアレルゲンに対してアレルギー性の対象者に由来する血清を用いる少なくとも一つの免疫アッセイにおいて、減少が統計的に有意な様式で（Ｐ＜０．０５）測定可能であることを意味する。好ましくはＩｇＥ結合能力が少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも１０％減少される。
「表面露出アミノ酸」という表現は、アレルゲンが溶液中に存在する場合にアミノ酸残基の少なくとも一原子の少なくとも一部分が周囲の溶媒と接触可能であるように、アミノ酸残基が三次元構造の表面に位置することを意味する。好ましくは、三次元構造中のアミノ酸酸基が少なくとも２０％、適切には少なくとも３０％、さらに適切には少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の溶媒（水）接触性を有する。
「溶媒接触性」という表現は、溶媒分子に匹敵する半径（水、ｒ＝１．４Å）を有する球に接触し得る分子の面積として定義される。
「表面露出」及び「溶媒露出」という表現は互換的に用いられる。
「前記天然に存在するアレルゲンが由来する分類学上の種」という表現は、分類学上の系統における種を意味する。
さらに「前記天然に存在するアレルゲンと本質的に同じα炭素骨格三次構造を有する前記変異体アレルゲン」という表現は、構造を比較する場合に原子座標の平均標準偏差が２Åより小さいことを意味する。
本発明に関して「置換」という表現は、天然に存在するアレルゲンのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の欠失、置換又は付加を意味する。
本発明は以下の非限定的な実施例によって、さらに説明される。
【００１６】
（実施例）
実施例１
実施例１は、一つ及び三つの第一変異を有する組換え変異体アレルゲンの調製を記述する。本発明の組換え変異体アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含むアレルゲンは、同じ手順を用いて調製され得る。
ファガレス花粉アレルゲンに含まれる共通エピトープの同定
主要なカバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ ｖ １は、分類学上の近縁な樹木すなわちファガレス（例えばハシバミ及びシデ）の花粉に由来する主要なアレルゲンと約９０％のアミノ酸配列同一性を示し、カバノキ花粉アレルギー患者は多くの場合これらＢｅｔ ｖ １相同タンパク質に対してアレルギー交差反応性の臨床症状を示す。
Ｂｅｔ ｖ １は、ある種の果物（例えばリンゴ及びサクランボ）及び野菜（例えばセロリ及びニンジン）に存在するアレルギー性タンパク質とも約５０〜６０％の配列同一性を示し、Ｂｅｔ ｖ １及びこれら食物関連タンパク質間のアレルギー性交差反応性に対する臨床的証拠が存在する。
加えてＢｅｔ ｖ １は病原関連タンパク質（ＰＲ−１０）と呼ばれる植物タンパク質群と有意な配列同一性（２０〜４０％）を共有するが、しかしながら、これらＰＲ−１０タンパク質に対するアレルギー性交差反応性の報告は存在しない。
分子モデリングは、ファガレス及び食物アレルゲン及びＰＲ−１０タンパク質の構造がＢｅｔ ｖ １の構造とほぼ同一であることを示唆する。
アレルギー性Ｂｅｔ ｖ １交差反応性の構造的根拠は（Ｇａｊｈｅｄｅ ｅｔ ａｌ １９９６，参考文献１７）で報告されており、Ｂｅｔ ｖ １分子表面上の三つのパッチが既知の主要な樹木花粉アレルゲンに対して共通であることが確認できた。このように、Ｂｅｔ ｖ １上のこれらパッチを認識するどのＩｇＥも他のファガレス主要花粉アレルゲンに対し交差反応及び結合することが可能であり、アレルギー症状を生じさせ得る。主要な樹木花粉アレルゲンの全既知アミノ酸配列アラインメント後に、参考文献１７に報告されたα炭素骨格三次構造により明らかにされたＢｅｔ ｖ １分子表面の解析と組合せて、これらの共通パッチの同定を行った。加えてパッチは、結合している抗体によって覆われた面積に基づいて一定の最小サイズ（４００Å２より大きい）を有することが明らかにされた。
【００１７】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基は、その改変が臨床樹木花粉アレルギー性交差反応性を示している患者の大部分に由来する血清ＩｇＥの結合性に影響することが予想されるので、Ｂｅｔ ｖ １特異的領域及び共通パッチに存在する残基の中から選択した。
それぞれのパッチ内にある各アミノ酸残基の相対方向及び溶媒露出のパーセンテージを、それらの原子座標に基づいて計算した。低度の溶媒露出（２０％より少ない）を有する残基は、構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性があるために、変異に対して適切であるとみなさなかった。残りの残基を、溶媒露出の程度に従って順位付けした。
配列アラインメント
問い合わせ配列（Ｂｅｔ ｖ １ナンバー２８０１、ＷＨＯ ＩＵＩＳアレルゲン学名小委員会）に対する配列相同性は、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ．ａｌ．，参考文献１８）によってＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬ配列データベースから得た。ＢＬＡＳＴが０．１より少ない確率を報告した全配列を考慮し、相同配列の非重複性一覧表を含む一つの一覧表を構成した。これらをＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，参考文献１９）によって整列させ、完全な一覧表又は分類学上の近縁種のみを考慮した配列における各位置に対し同一性のパーセンテージを計算した。全部で１２２の配列がＢｅｔ ｖ １ナンバー２８０１に対して相同で、そのうちの５７配列が分類学上の近縁種に由来していた。
Ｂｅｔ ｖ １をコードする遺伝子のクローニング
フェノール抽出及びＬｉＣｌ沈殿によって、ベツラ・ベルルコサの花粉（Ａｌｌｅｒｇｏｎ、スウェーデン）からＲＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）−セルロースアフィニティークロマトグラフィーをエッペンドルフチューブ中でバッチ式に行い、商業的に入手可能なキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｂｅｔ ｖ １をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、クローニングを行った。簡単に言うと、鋳型としてのｃＤＮＡ、及びＢｅｔ ｖ １のアミノ末端及び３’非翻訳領域に対応する位置のｃＤＮＡ配列に適合するようにそれぞれ設計したプライマーを用いてＰＣＲを行った。前記プライマーはｐＫＫ２３３−２への方向性を有するクローニングのため制限酵素部位（ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を提供するように５’末端を延長した。
【００１８】
ｐＭＡＬ−ｃへのサブクローニング
続いてＢｅｔ ｖ １をコードする遺伝子を、マルトース結合タンパク質融合ベクターｐＭＡＬ−ｃ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にサブクローニングした。参考文献１５に記述されるように、この遺伝子をＰＣＲによって増幅しｍａｌＥとイン・フレームにサブクローニングしてＭＢＰ及びＢｅｔ ｖ １が切断時にＢｅｔ ｖ １真正アミノ末端配列を回復するように配置した因子Ｘａプロテアーゼ切断部位によって隔てられたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−Ｂｅｔ ｖ １タンパク質融合オペロンを生成した。簡単に言うと、鋳型としてＢｅｔ ｖ １を挿入したｐＫＫ２３３−３、及び、このタンパク質のアミノ及びカルボキシ末端にそれぞれ対応するプライマーを用いてＰＣＲを行った。プロモーターに近いプライマーは、イン・フレームのＸａ因子プロテアーゼ切断部位をコードする四つのコドンを提供するように５’末端を延長した。両プライマーは、クローニングのための制限酵素部位（ＫｐｎＩ）を提供するように５’末端をさらに延長した。Ｂｅｔ ｖ １をコードする遺伝子を、ＰＣＲアーチファクトの頻度を減少するため２０サイクルのＰＣＲを用いてサブクローニングした。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発
Ｂｅｔ ｖ １を挿入した組換えｐＭＡＬ−ｃを鋳型として用いたＰＣＲによって、Ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発を行った。各変異体Ｂｅｔ ｖ １遺伝子を、四つのプライマーを用いる三つのＰＣＲ反応によって生成させた。
二つの変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、各ＤＮＡ鎖に対し一つ、各変異を提供するように合成した（図１及び２を参照）。変異ヌクレオチドを起点として用い、両プライマーを５’末端で７ヌクレオチド、３’末端で１５ヌクレオチドを延長した。延長ヌクレオチドは実際領域のＢｅｔ ｖ １遺伝子と同一であった。
さらに二つの一般的に適用可能なプライマー（図２で「全センス」及び「全非センス」と表示）を合成し、全変異体に対して用いた。これらのプライマーは長さが１５ヌクレオチドであり、ｐＭＡＬ−ｃベクターのＢｅｔ ｖ １からおよそ１キロベース上流及び下流の領域に対応する配列であった。上流プライマーの配列はセンス鎖に由来し、下流プライマーの配列は非センス鎖に由来する（図２を参照）。
【００１９】
ＰＣＲアーチファクトの頻度を減らすために２０回しか温度サイクルを行わなかったことを除き、本質的には標準的手順（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ １９８８，参考文献２０）に従って二つの独立なＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応は、鋳型としてＢｅｔ ｖ １を挿入したｐＭＡＬ−ｃ、及び、一つの変異特異的プライマー及び一つの一般的に適用可能なプライマーの意味の有る組合せを用いた。
三重パッチ変異体における四つのアミノ酸置換（Ａｓｎ２８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ）の導入は、上述したように段階的処理で行った。鋳型としてＢｅｔ ｖ １ナンバー２８０１、Ｂｅｔ ｖ １（Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ）、Ｂｅｔ ｖ １（Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ）をそれぞれ挿入したｐＭＡＬ−ｃを用いて、最初にＧｌｕ４５Ｓｅｒ変異、次にＰｒｏ１０８Ｇｌｙ変異、最後にＡｓｎ２８Ｔｈｒ、Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ変異を導入した。
このＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出に続くエタノール沈殿によって精製した。第三ＰＣＲ反応は、鋳型として二つの第一ＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物の組合せ、及び、一般的に適用可能な両プライマーを用いて行った。再度、２０サイクルの標準的ＰＣＲを用いた。このＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出に続くエタノール沈殿によって精製し、制限酵素（ＢｓｉＷＩ／ＥｃｏＲＩ）で切断し、同じ制限酵素で切断したＢｅｔ ｖ １挿入ｐＭＡＬ−ｃへ方向性を持たせてライゲーションさせた。
図３は、以下の全９つのＢｅｔ ｖ １変異体の概観を示す。
Ｔｈｒ１０Ｐｒｏ， Ａｓｐ２５Ｇｌｙ， Ａｓｎ２８Ｔｈｒ ＋ Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ａｓｎ４７Ｓｅｒ， Ｌｙｓ５５Ａｓｎ， Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ （非パッチ）， Ｔｈｒ７７Ａｌａ及びＰｒｏ１０８Ｇｌｙ。四つの変異を有する付加変異体も作製した（Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ）。これらから、さらなる試験のために五つの変異体を選択した：Ａｓｎ２８Ｔｈｒ ＋ Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ及び三重パッチ変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ。
【００２０】
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前と後、及びｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発後にそれぞれ、Ｂｅｔ ｖ １をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン０．１ ｇ／ｌを補充したＬＢ培地中で一晩飽和状態まで増殖させた細菌培養液１０ ｍｌから、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ ２０カラムで精製し、シークエネース（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２．０ ＤＮＡシークエンシングキット（ＵＳＢ）を用い、供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換えＢｅｔ ｖ １及びその変異体の発現及び精製
参考文献１５に記述されるように、マルトース結合タンパク質と融合した組換えＢｅｔ ｖ １（Ｂｅｔ ｖ １ ナンバー２８０１及び変異体）を大腸菌ＤＨ５ａで過剰発現させ、精製した。簡単に言うと、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を４３６ ｎｍでの光学密度１．０まで３７℃で増殖させてから、ＩＰＴＧの添加によってＢｅｔ ｖ １融合タンパク質の発現を誘導した。細胞を３時間誘導した後、遠心分離によって収穫し、溶菌緩衝液に再懸濁し、超音波処理によって破砕した。超音波処理後さらなる遠心分離を行い、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによって組換え融合タンパク質を単離し、続けてＸａ因子とインキュベーションすることによって切断した（参考文献１５）。第Ｘａ因子切断後、組換えＢｅｔ ｖ １をゲル濾過によって単離した。必要があれば、微量のマルトース結合タンパク質を除去するために、さらにもう一回アミロースアフィニティークロマトグラフィーを行った。
精製組換えＢｅｔ ｖ １を限外濾過によって約５ ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。精製組換えＢｅｔ ｖ １調製品の最終的な収率は、Ｅ ｃｏｌｉ細胞培養液１リットルあたり２〜５ ｍｇであった。
精製組換えＢｅｔ ｖ １調製品は、銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の後に見かけ上の分子量１７．５ ｋＤａの単一なバンドとして現れた。Ｎ末端シークエンシングは、ｃＤＮＡヌクレオチド配列由来の期待される配列を示し、定量アミノ酸分析は予想されるアミノ酸構成成分を示した。
我々は既に、組換えＢｅｔ ｖ １ナンバー２８０１が天然に存在するＢｅｔ ｖ １と免疫化学的に区別がつかないことを示している（参考文献１５）。
【００２１】
ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫電気泳動
Ｂｅｔ ｖ １の七つの変異体を組換えＢｅｔ ｖ １タンパク質として作製し、上述のように精製し、カバノキ花粉から単離したＢｅｔ ｖ １に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体に対する反応性を試験した。未変性状態で免疫電気泳動（ロケットライン免疫電気泳動）によって分析した場合ウサギ抗体は全変異体を沈殿させることができ、このことは変異体が保存されたα炭素骨格三次構造を有することを示している。
ヒトポリクローナルＩｇＥ応答への効果を分析する目的で、変異体Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ、Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ及びＧｌｕ６０Ｓｅｒをさらなる分析のために選択した。
Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体
位置４５のグルタミン酸は高度の溶媒露出（４０％）を示し、ファガレスアレルゲンに共通な分子表面パッチ（パッチＩ）に位置する。Ｂｅｔ ｖ １相同ＰＲ−１０タンパク質の幾つかにおいて位置４５を占めるセリン残基が見出され、グルタミン酸がα炭素骨格三次構造の歪み無しにセリンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの既知ファガレスアレルゲン配列も位置４５にセリンを有していないことから、セリンによるグルタミン酸の置換が天然に存在しないＢｅｔ ｖ １分子を生ずる。
組換えＧｌｕ４５Ｓｅｒ Ｂｅｔ ｖ １変異体を用いたＴ細胞増殖アッセイ
この分析は、Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ等の１９９６ａに記述されたように行った。組換えＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体は、三つの異なるカバノキアレルギー患者由来のＴ細胞株において、組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数で増殖を誘導することが可能であったことが見出された。
【００２２】
組換えＧｌｕ４５Ｓｅｒ Ｂｅｔ ｖ １の結晶化及び構造決定
組換えＧｌｕ４５Ｓｅｒ Ｂｅｔ ｖ １の結晶を、本質的には（Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ １９９６ｂ、参考文献２１）に記述されたように、２５℃の蒸発拡散によって成長させた。濃度５ ｍｇ／ｍｌのＧｌｕ４５Ｓｅｒ Ｂｅｔ ｖ １を等体積の２．０ Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、１％ （ｖ／ｖ）ジオキサン、ｐＨ ６．０と混合し、１００倍の体積の２．０ Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、１％ （ｖ／ｖ）ジオキサン、ｐＨ ６．０に対して平衡化した。２４時間の平衡化の後、組換え野生型Ｂｅｔ ｖ １の結晶を種のもととして用い参考文献２１に記述される播種技術を応用することによって、結晶の成長を誘導した。
約２ヶ月後に結晶を収穫し、参考文献２１に記述されるようにＲｉｇａｋｕ回転アノードから発生させたＸ線を用いて解析し、分子置換を用いて構造を明らかにした。
Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体の構造
回転アノードから発生させたＸ線によって三次元のＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒタンパク質結晶回析を解像度３．０Åまで上げて解析し、変異誘発の構造的効果に取り組んだ。位置４５におけるセリンによるグルタミン酸の置換がＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ構造電子密度マップによって検証され、全体的なα炭素骨格三次構造が保存されていることも示された。
【００２３】
Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体のＩｇＥ結合特性
カバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＢｅｔ ｖ １と比較した。
組換えＢｅｔ ｖ １ナンバー２８０１を、１：５（Ｂｅｔ ｖ １ナンバー２８０１：ビオチン）のモル分率でビオチン化した。阻害アッセイは次のように行った：血清サンプル（２５ μｌ）を抗ＩｇＥ固体相とインキュベートし、洗滌し、ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １ナンバー２８０１（３．４ ｎＭ）及び得られた変異体（０〜２８．６ ｎＭ）の混合物に再懸濁してさらにインキュベートし、固体相に結合したビオチン化Ｂｅｔ ｖ １ナンバー２８０１の量をアクリジニウムエステル標識ストレプトアビジンとインキュベーションした後に測定したＲＬＵから推定した。緩衝液及び阻害剤として変異体を用いて得られたＲＬＵの間の比として、阻害の程度を計算した。
図４は、非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＢｅｔ ｖ １は約６．５ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体の対応する濃度は約１２ ｎｇである。このことは、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体に導入された点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／２に低下させることを示す。Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体によって達成された阻害の最大値は、組換えＢｅｔ ｖ １と比べて明らかに低くなる。このことは、Ｇｌｕ４５ｓｅｒ置換すると血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかはＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体を認識できないことを示し得る。
【００２４】
Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ
位置２８及び３２のアスパラギン及びリジンはそれぞれ、高度の溶媒露出（それぞれ、３５％及び５０％）を示し、ファガレスアレルゲンに共通の分子表面パッチ（パッチＩＩ）に位置する。構造上、アスバラギン２８及びリジン３２は分子表面上で互いに近接して位置し、水素結合を介して相互作用する可能性が高い。Ｂｅｔ ｖ １相同ＰＲ−１０タンパク質の幾つかにおいてスレオニン及びグルタミン残基がそれぞれ位置２８及び３２を占めるのが見出され、アスパラギン及びリジンがそれぞれα炭素骨格三次構造の歪み無しにスレオニン及びグルタミンで置き換えられることが可能なことを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置２８及び３２にそれぞれスレオニン及びグルタミンを有していないことから、この置換が天然に存在しないＢｅｔ ｖ １分子を生ずる。
Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２ＧｌｎのＩｇＥ結合特性
上述のように、カバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２ＧｌｎのＩｇＥ結合特性を組換えＢｅｔ ｖ １と比較した。
図５は、非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎによる、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＢｅｔ ｖ １は約６．５ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎの対応する濃度は約１２ ｎｇである。このことは、Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎに導入された点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／２に低下させたことを示す。
Ｂｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎにより達成された阻害の最大値は、組換えＢｅｔ ｖ １に比べて明らかに低くなる。このことは、Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｎ３２Ｇｌｎ置換すると血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかはＢｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎを認識できないことを示し得る。
【００２５】
Ｂｅｔ ｖ １変異体Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ
位置１０８のプロリンは高度の溶媒露出（６０％）を示し、ファガレスアレルゲンに共通する分子表面パッチ（パッチＩＩＩ）に位置する。Ｂｅｔ ｖ １相同ＰＲ−１０タンパク質の幾つかにおいてグリシン残基が位置１０８を占めるのが見出され、プロリンはα炭素骨格三次構造の歪み無しにグリシンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置１０８にグリシンを有さないことから、グリシンによるプロリンの置換が天然に存在しないＢｅｔ ｖ １分子を生ずる。
Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体のＩｇＥ結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＢｅｔ ｖ １と比較した。
図６は、非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＢｅｔ ｖ １は約６．５ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙの対応する濃度は１５ ｎｇである。このことは、Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙに導入された一つの点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／２に低下させることを示す。
Ｂｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体によって達成される阻害の最大値は、組換えＢｅｔ ｖ １と比べていくらか低くなる。このことは、Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ置換すると血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかはＢｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体を認識できないことを示し得る。
【００２６】
Ｂｅｔ ｖ １変異体Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ（非パッチ変異体）
位置６０のグルタミン酸は高度の溶媒露出（６０％）を示すが、ファガレスアレルゲンに共通の分子表面パッチに位置しない。Ｂｅｔ ｖ １相同ＰＲ−１０タンパク質の幾つかにおいてセリン残基が位置６０を占めるのが見出され、グルタミン酸がα炭素骨格三次構造の歪み無しにセリンで置き換えられることが可能であることを支持している。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置６０にセリンを有さないことから、セリンによるグルタミン酸の置換が天然に存在しないＢｅｔ ｖ １分子を生ずる。
Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ変異体のＩｇＥ結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＢｅｔ ｖ １と比較した。
図７は非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ及びＡｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｎ３２Ｇｌｎ変異体とは対照的に、グルタミン酸６０のセリンへの置換はＩｇＥ結合特性にどんな有意な効果も示さない。このことは、明らかにされたファガレス共通パッチの外側の置換は、特異的血清ＩｇＥの結合に重要でない効果を有するのみであることを示し、保存されたアレルゲン分子表面領域が優性ＩｇＥ結合エピトープを含むという概念を支持している。
Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体
三重パッチ変異体では、上述した三つの異なるファガレス共通パッチに導入された点変異（Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ、Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ及びＰｒｏ１０８Ｇｌｙ）を同時に導入して、四つのアミノ酸置換を有する人為的変異体を作成した。
Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体の構造解析
精製三重パッチ変異体の構造上の完全性を、円二色性（ＣＤ）分光法によって解析した。図８は、ほぼ等しい濃度で記録された組換え体及び三重パッチ変異体のＣＤスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のＣＤスペクトルにおけるピークの振幅及び位置における重複は二つの調製品が二次構造を等量含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆している。
【００２７】
Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体のＩｇＥ結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＢｅｔ ｖ １と比較した。
図９は、非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １、Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。上述した単変異体とは対照的に、三重パッチ変異体の阻害曲線は組換え体に対し、もはや並行関係でない。このことは、三重パッチ変異体に導入された置換が組換え体と比べてＩｇＥ結合特性及びエピトープの外形を変化させていることを示す。この並行性の欠如が、特異的血清ＩｇＥに対する三重パッチ変異体の親和性の減少を定量化することを困難にしている。
組換えＢｅｔ ｖ １は約６ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｂｅｔ ｖ １三重パッチ変異体の対応する濃度は３０ ｎｇ、すなわち１／５の親和性減少である。しかしながら、８０％阻害を達成するための対応する値はそれぞれ２０ ｎｇ及び４００ ｎｇ、すなわち１／２０の減少である。
組換えＢｅｔ ｖ １三重パッチ変異体を用いたＴ細胞増殖アッセイ
この分析は、参考文献１５に記述されたように行った。三つの異なるカバノキ花粉アレルギー患者由来のＴ細胞株において、組換えＢｅｔ ｖ １三重パッチ変異体が組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数で増殖を誘導できることが見出された。このことは、三重パッチ変異体が抗体産生に必要な細胞性免疫応答を開始可能であることを示唆する。
【００２８】
実施例２
実施例２は、一つの第一変異を有する組換え変異体アレルゲンの調製を記述する。本発明の組換え変異体アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含むアレルゲンは、同じ手順を用いて調製され得る。
ベスプラ・ブルガリス毒物主要アレルゲン抗原５に含まれる共通エピトープの同定
抗原５は、ヒトにおけるアレルゲンとして知られる三つのスズメバチ毒物タンパク質の一つである。前記スズメバチはホーネット、イエロージャケット及びワスプを含む。他二つのスズメバチ毒物の既知アレルゲンは、ホスホリパーゼＡ１及びヒアルロニダーゼである。ベスプラ・ブルガリス由来の抗原５（Ｖｅｓ ｖ ５）はクローニングされて、酵母系において組換えタンパク質として発現されている（Ｍｏｎｓａｌｖｅ ｅｔ ａｌ．１９９９、参考文献２２）。組換えＶｅｓ ｖ ５の三次元結晶構造は１．８Åの解像度で最近決定されている（近刊）。この構造の主な特徴は、「α−β−αサンドイッチ」を生じる三つの積み重ねられた層に配置された四つのβ鎖及び四つのαへリックスから構成される。異なるベスプラ種に由来する抗原５の相同アレルゲン間の配列同一性は約９０％であり、保存された分子表面領域及び保存されたＢ細胞エピトープの存在を示唆している。
既に樹木花粉アレルゲンに対して述べたように、ベスプラ抗原５アレルゲンの全既知アミノ酸配列のアラインメント後、Ｖｅｓ ｖ ５の三次元構造によって明らかにされた抗原５の分子表面の解析と組合せて、共通パッチの存在を明らかにし、その同定を行った。図１０は、個々に整列させた抗原５の残基の溶媒接触性、及び、ベスプラ抗原５配列アラインメント（左パネル）を示す。図１０右パネル上で、ベスプラ抗原５：ｓの中の保存された領域を着色して、抗原５の分子表面を示す。
【００２９】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
臨床ベスプラアレルギー性交差反応性を示す患者の大部分に由来する血清ＩｇＥの結合性にアミノ酸残基の改変が影響することが予測されるため、部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基をベスプラに共通するパッチに存在する残基の中から選択した。
各パッチ内の各アミノ酸残基の相対方向及び溶媒露出パーセンテージを、各アミノ酸残基の原子座標に基づいて計算した。低度の溶媒露出を有する残基は、構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性により、変異誘発に適切であるとみなさなかった。残りの残基を溶媒露出の程度に従って順位付けした。
Ｖｅｓ ｖ ５をコードする遺伝子のクローニング
全ＲＮＡを（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９８８、参考文献２３）に記述されるようにベスプラ・ブルガリス・スズメバチの毒物胃酸分泌線から単離した。
第一鎖ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅及びＶｅｓ ｖ ５遺伝子のクローニングを（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．１９９３、参考文献２４）に記述されるように行った。
ｐＰＩＣＺαＡへのサブクローニング
続いてＶｅｓ ｖ ５をコードする遺伝子を、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＶｅｓ ｖ ５の分泌発現のため、ｐＰＩＣＺαＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングした。この遺伝子をＰＣＲによって増幅し、酵母のα因子分泌シグナルのためのコード配列とともに、イン・フレームにサブクローニングした。この構築物において、α因子はタンパク質分泌の間にピチア・パストリスＫｅｘ２プロテアーゼ系によりｉｎ ｖｉｖｏで切断除去される。
簡単に言うと、鋳型としてＶｅｓ ｖ ５、及び、タンパク質のアミノ及びカルボキシル末端にそれぞれ対応するプライマーを用いてＰＣＲを行った。このプライマーはそれぞれ、クローニングのためのＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を提供するように５’末端を延長した。Ｋｅｘ２切断部位をコードするヌクレオチドを、この構築物においてタンパク質のアミノ末端に対し１８ヌクレオチド上流に配置し、アミノ末端に六つの付加アミノ酸Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅを有するＶｅｓ ｖ ５を発現させた。Ｐ．パストリスへのｐＰＩＣＺαＡ−Ｖｅｓ ｖ ５の挿入
Ｖｅｓ ｖ ５遺伝子が挿入されたｐＰＩＣＺαＡベクターをＳａｃＩ制限酵素切断によって線形にし、ピチア・パストリスのゲノム上のＡＯＸ１遺伝子座に挿入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの推奨に従ってＫＭ７１細胞のピチア・パストリス上の相同組換えによって、挿入を行った。
【００３０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発
鋳型としてＶｅｓ ｖ ５を挿入した組換えｐＰＩＣＺαＡを用いたＰＣＲによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発を行った。四つのプライマーを用いた三つのＰＣＲ反応によって各変異体Ｖｅｓ ｖ ５遺伝子を生成させた。
二つの変異誘発特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、各変異を提供するように、各ＤＮＡ鎖に対し一つずつ合成した（図１１及び１２を参照）。変異ヌクレオチドを起点として用い、両プライマーを５’末端側に６〜７ヌクレオチド、３’末端側に１２〜１３ヌクレオチド延長した。延長ヌクレオチドは、実際領域においてＶｅｓ ｖ ５遺伝子と配列が同一であった。
さらに、二つの一般的に適用可能なプライマー（図１２において「全センス」及び「全非センス」と表示）を合成して、全変異体に対して用いた。真正アミノ末端を有するＶｅｓ ｖ ５変異体の発現を保証するために、タンパク質のアミノ末端に対応する一つのプライマーはＸｈｏＩ認識部位を有するように５’末端で延長した。Ｖｅｓ ｖ ５変異体遺伝子のｐＰＩＣＺαＡベクターへの挿入時に、Ｋｅｘ２プロテアーゼ切断部位をＶｅｓ ｖ ５アミノ末端の上流に直接再生成させた。第二プライマーは、ｐＰＩＣＺαＡベクターのＶｅｓ ｖ ５遺伝子からおよそ３００ ｂｐ下流に位置する領域の配列に対応させた。Ｖｅｓ ｖ ５アミノ末端に対応するプライマー配列はセンス鎖由来であり、下流プライマー配列は非センス鎖由来である（図１１を参照）。
ＰＣＲアーチファクトの頻度を減少するために２０回しか温度サイクルを行わなかったことを除き、二つの独立したＰＣＲ反応を本質的には標準的手順（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ １９８８）に従って行った。各ＰＣＲ反応は、鋳型としてＶｅｓ ｖ ５を挿入されたｐＰＩＣＺαＡ、一つの変異特異的プライマー及び一つの一般的に適用可能なプライマーの意味のある組合せを用いた。
このＰＣＲ産物を”コンサート，ラピッドＰＣＲピュアリフィケーションシステム” （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製した。鋳型として二つの第一ＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物の組合せ、及び、一般的に適用可能な両プライマーを用いて、第三ＰＣＲ反応を行った。再び、２０サイクルの標準的ＰＣＲを用いた。このＰＣＲ産物を” コンサート，ラピッドＰＣＲピュアリフィケーションシステム” （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて精製し、制限酵素（ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ）で切断し、同じ酵素で制限酵素切断したｐＰＩＣＺαＡベクターに方向性を持たせてライゲーションさせた。図１３は、全Ｖｅｓ ｖ ５変異の概要を示す。
【００３１】
Ｐ．パストリスへのｐＰＩＣＺαＡ−Ｖｅｓ ｖ ５変異体の挿入
Ｖｅｓ ｖ ５変異体遺伝子を挿入されたｐＰＩＣＺαＡベクターをＳａｃＩ制限酵素切断によって線形にし、ピチア・パストリスのゲノム上のＡＯＸ１遺伝子座に挿入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの推奨に従ってＫＭ７１細胞のピチア・パストリス上の相同組換えによって、挿入を行った。
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前及び後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発後にそれぞれ、Ｖｅｓ ｖ ５をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン０．１ ｇ／ｌを補充したＬＢ培地中で一晩飽和に達するまで増殖させた細菌培養液１０ ｍｌから、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ ２０カラムで精製し、シークエネース・バージョン２．０ ＤＮＡシークエンシングキット（ＵＳＢ）を用いて供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換えＶｅｓ ｖ ５の発現及び精製
酵母窒素塩基、ビオチン、グリセロール及びヒスチジンを含むｐＨ ６．０のリン酸緩衝液１００ ｍｌを含む５００ ｍｌボトル中、３０℃、２２５ ｒｐｍで軌道振盪しながら、ピチア・パストリス株ＫＭ７１の組換え酵母細胞をＡ６００ ｎｍが４〜６になるまで増殖させた。細胞は遠心分離によって集め、グリセロールの代わりにメタノールを含む同様な緩衝化培地１０ ｍｌに再懸濁した。毎日メタノール０．０５ ｍｌを加えながら、３０℃で７日間インキュベーションを続けた。
細胞を遠心分離によって収穫し、集めた培養液を限外濾過によって濃縮した。ｐＨ ４．６の５０ ｍＭアンモニウムアセテート緩衝液に透析した後、このサンプルを同じ緩衝液で平衡化したＦＰＬＣ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） ＳＥ−５３カチオン交換カラムに装填した。このカラムを０〜１．０ Ｍ ＮａＣｌ、５０ ｍＭアンモニウムアセテートの直線グラジエントで溶離した。約０．４ Ｍ ＮａＣｌで溶離された組換えＶｅｓ ｖ ５のピークを集め、０．０２ Ｎ酢酸に透析した。約１０ ｍｇ／ｍｌまで濃縮した後、精製Ｖｅｓ ｖ ５を４℃で保存した。
【００３２】
組換えＶｅｓ ｖ ５の結晶化
Ｖｅｓ ｖ ５の結晶を、２５℃の蒸発拡散技術によって成長させた。結晶化のために、５ μｌの５ ｍｇ／ｍｌ Ｖｅｓ ｖ ５を５ μｌの１８％ ＰＥＧ ６０００、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ６．０と混合し、１ ｍｌの１８％ ＰＥＧ ６０００、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ６．０に対して平衡化した。
天然Ｖｅｓ ｖ ５結晶及び重原子取込み後の誘導体から１００ＫでＸ線回析データを集め、Ｖｅｓ ｖ ５三次元構造を解析することに用いた（図１０を参照）（原稿は準備中）。
ウサギポリクローナル抗体を用いた免疫電気泳動
二つのＶｅｓ ｖ ５変異体を組換えＶｅｓ ｖ ５タンパク質として作製し、組換えＶｅｓ ｖ ５に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体に対する反応性を試験した。未処理状態下でロケット免疫電気泳動によって分析した場合、ウサギ抗体は組換えＶｅｓ ｖ ５及び両前記変異体を沈殿させることが可能であった。このことは前記変異体が保存されたα炭素骨格三次構造を有することを示している。
特異的血清ＩｇＥの阻害
スズメバチ毒物アレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｖｅｓ ｖ ５変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＶｅｓ ｖ ５と比較した。
この阻害アッセイは、Ｂｅｔ ｖ １の代わりにビオチン化組換えＶｅｓ ｖ ５を用いて上述のように行った。
Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体
位置７２のリジンは高度の溶媒露出（７０％）を示し、ベスプラ抗原５に共通な分子表面パッチに位置する。この相対方向及び高度の溶媒露出は、リジン７２がα炭素骨格三次構造の歪み無しにアラニン残基によって置き換えられることが可能であることを支持した。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置７２にアラニンを有さないことから、アラニンによるリジンの置換が天然に存在しないＶｅｓ ｖ ５分子を生ずる。
【００３３】
Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体のＩｇＥ結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＶｅｓ ｖ ５と比較した。
図１４は、非ビオチン化Ｖｅｓ ｖ ５、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＶｅｓ ｖ ５の結合の阻害を示す。
血清中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＶｅｓ ｖ ５は約６ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａの対応する濃度は４０ ｎｇである。このことは、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２ Ａｌａ変異体に導入された一つの点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／６に低下させることを示す。Ｖｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体によって達成された阻害の最大値は、組換えＶｅｓ ｖ ５に比べて著しく低下する。このことは、Ｌｙｓ７２Ａｌａ置換すると血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかはＶｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体を認識できないことを示し得る。
【００３４】
Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体
位置９６のチロシンは高度な溶媒露出（６５％）を示し、ベスプラ抗原５に共通な分子表面パッチに位置する。この相対方向及び高度な溶媒露出は、チロシン９６が三次元構造の歪み無しにアラニン残基で置き換えられることが可能であることを支持した。加えて、どの天然に存在するイソアレルゲン配列も位置９６にアラニンを有さないことから、アラニンによるチロシンの置換が天然に存在しないＶｅｓ ｖ ５分子を生ずる。
Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体のＩｇＥ結合特性
上述のようにカバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体のＩｇＥ結合特性を組換えＶｅｓ ｖ ５と比較した。
図１４は、非ビオチン化Ｖｅｓ ｖ ５、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＶｅｓ ｖ ５の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要な各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＶｅｓ ｖ ５は約６ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体の対応する濃度は４０ ｎｇである。
このことは、Ｖｅｓ ｖ ９６ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体に導入された一つの点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／６に低下させることを示す。
Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体により達成された阻害の最大値は、組換えＶｅｓ ｖ ５に比べて著しく低下する。このことは、Ｔｙｒ９６Ａｌａ置換すると血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかは、Ｖｅｓ ｖ ５ Ｔｙｒ９６Ａｌａ変異体を認識できないことを示し得る。
【００３５】
実施例３
置換のためのアミノ酸の同定及び選択
溶媒接触性及び保存の程度のパラメータを用いて、アレルゲンＢｅｔ ｖ １、Ｄｅｒ ｐ ２及びＶｅｓ ｖ ５のための置換に適する表面露出アミノ酸の同定及び選択をした。溶媒接触性
ソフトウエアＩｎｓｉｇｈｔＩＩバージョン９７．０（ＭＳＩ）及び半径１．４Å（コナリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）表面）のプローブを用いて、溶媒接触性を計算した。
ソフトウエアＰＡＳＳ（球による推定活性部位）を用いプローブで満たすことによって解析から内部空洞を排除した。その後、表面上のプローブを手動で取り出した。
保存
Ｂｅｔ ｖ １：
３−Ｄ構造は、アクセッション番号Ｚ８０１０４（１ｂｖ１．ｐｄｂ）に基づく。
保存残基の解析に含まれた３８の他のＢｅｔ ｖ １配列は、アクセッション番号：Ｐ１５４９４＝Ｘ１５８７７＝Ｚ８０１０６， Ｚ８０１０１， ＡＪ００２１０７， Ｚ７２４２９， ＡＪ００２１０８， Ｚ８０１０５， Ｚ８０１００， Ｚ８０１０３， ＡＪ００１５５５， Ｚ８０１０２， ＡＪ００２１１０， Ｚ７２４３６， Ｐ４３１８３＝Ｘ７７２７１， Ｚ７２４３０， ＡＪ００２１０６， Ｐ４３１７８＝Ｘ７７２６７， Ｐ４３１７９＝Ｘ７７２６８， Ｐ４３１７７＝Ｘ７７２６６， Ｚ７２４３８， Ｐ４３１８０＝Ｘ７７２６９， ＡＪ００１５５１， Ｐ４３１８５＝Ｘ７７２７３， ＡＪ００１５５７， Ｚ７２４３４， ＡＪ００１５５６， Ｚ７２４３３＝Ｐ４３１８６， ＡＪ００１５５４， Ｘ８１９７２， Ｚ７２４３１， Ｐ４５４３１＝Ｘ７７２００， Ｐ４３１８４＝Ｘ７７２７２， Ｐ４３１７６＝Ｘ７７２６５， Ｓ４７２５０， Ｓ４７２５１， Ｚ７２４３５， Ｚ７２４３９， Ｚ７２４３７， Ｓ４７２４９を含む。
【００３６】
Ｄｅｒ ｐ ２：
３−Ｄ構造はアクセッション番号Ｐ４９２７８（１ａ９ｖ．ｐｄｂ）に基づく。
保存残基の解析に含まれた６つの他のＤｅｒ ｐ ２配列は、以下の置換を含む：
ＡＬＫ−Ｇ： Ｖ４０Ｌ， Ｔ４７Ｓ， Ｍ１１１Ｌ， Ｄ１１４Ｎ．
ＡＬＫ−１０１： Ｍ７６Ｖ
ＡＬＫ−１０２： Ｖ４０Ｌ， Ｔ４７Ｓ
ＡＬＫ−１０４： Ｔ４７Ｓ， Ｍ１１１Ｉ， Ｄ１１４Ｎ
ＡＬＫ−１１３： Ｔ４７Ｓ
ＡＬＫ−１２０： Ｖ４０Ｌ， Ｔ４７Ｓ， Ｄ１１４Ｎ。
Ｖｅｓ ｖ ５：
３−Ｄ構造はアクセッション番号Ｑ０５１１０（ｐｄｂ座標は公知でない）に基づく。
保存残基の解析における他のＶｅｓ ｖ ５配列は、一つのアミノ酸置換：Ｍ２０２Ｋを含む。
結果
Ｂｅｔ ｖ １
高度に溶媒露出された５９アミノ酸：
Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｔ−７７， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｌ−６２， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７， Ｅ−７３。
【００３７】
高度に溶媒露出され、７０％より高く保存された５７アミノ酸：
Ｋ−１２９， Ｅ−６０， Ｎ−４７， Ｋ−６５， Ｐ−１０８， Ｎ−１５９， Ｄ−９３， Ｋ−１２３， Ｋ−３２， Ｄ−１２５， Ｒ−１４５， Ｄ−１０９， Ｅ−１２７， Ｑ−３６， Ｅ−１３１， Ｌ−１５２， Ｅ−６， Ｅ−９６， Ｄ−１５６， Ｐ−６３， Ｈ−７６， Ｅ−８， Ｋ−１３４， Ｅ−４５， Ｔ−１０， Ｖ−１２， Ｋ−２０， Ｓ−１５５， Ｈ−１２６， Ｐ−５０， Ｎ−７８， Ｋ−１１９， Ｖ−２， Ｌ−２４， Ｅ−４２， Ｎ−４， Ａ−１５３， Ｉ−４４， Ｅ−１３８， Ｇ−６１， Ａ−１３０， Ｒ−７０， Ｎ−２８， Ｐ−３５， Ｓ−１４９， Ｋ−１０３， Ｙ−１５０， Ｈ−１５４， Ｎ−４３， Ａ−１０６， Ｋ−１１５， Ｐ−１４， Ｙ−５， Ｋ−１３７， Ｅ−１４１， Ｅ−８７， Ｅ−７３。
実施した２３変異：
Ｙ５Ｖ， Ｔ１０Ｐ， Ｄ２５Ｅ， Ｎ２８Ｔ， Ｋ３２Ｑ， Ｅ４２Ｓ， Ｅ４５Ｓ， Ｎ４７Ｓ， Ｋ５５Ｎ， Ｋ６５Ｎ， Ｔ７７Ａ， Ｎ７８Ｋ， Ｅ９６Ｌ， Ｋ９７Ｓ， Ｋ１０３Ｖ， Ｐ１０８Ｇ， Ｄ１０９Ｎ， Ｋ１２３Ｉ， Ｄ１２５Ｙ， Ｋ１３４Ｅ， Ｒ１４５Ｅ， Ｄ１５６Ｈ， ＋１６０Ｎ。
表１は、Ｂｅｔ ｖ １アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第１欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第２欄は１文字略語でアミノ酸を記載し、第３欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第４欄はこの位置において関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【００３８】
【表１】
2004521618.tif 000002
2004521618.tif 000003
2004521618.tif 000004
2004521618.tif 000005
【００３９】
Ｄｅｒ ｐ ２
高度に溶媒露出された５５アミノ酸：
Ｒ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｄ−１１４， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９， Ｋ−１５。
高度に溶媒露出され、７０％より高く保存された５４アミノ酸：
Ｒ−１２８， Ｄ−１２９， Ｈ−１１， Ｈ−３０， Ｓ−１， Ｋ−７７， Ｙ−７５， Ｒ−３１， Ｋ−８２， Ｋ−６， Ｋ−９６， Ｋ−４８， Ｋ−５５， Ｋ−８９， Ｑ−８５， Ｗ−９２， Ｉ−９７， Ｈ−２２， Ｖ−６５， Ｓ−２４， Ｈ−７４， Ｋ−１２６， Ｌ−６１， Ｐ−２６， Ｎ−９３， Ｄ−６４， Ｉ−２８， Ｋ−１４， Ｋ−１００， Ｅ−６２， Ｉ−１２７， Ｅ−１０２， Ｅ−２５， Ｐ−６６， Ｌ−１７， Ｇ−６０， Ｐ−９５， Ｅ−５３， Ｖ−８１， Ｋ−５１， Ｎ−１０３， Ｑ−２， Ｎ−４６， Ｅ−４２， Ｔ−９１， Ｄ−８７， Ｎ−１０， Ｍ−１１１， Ｃ−８， Ｈ−１２４， Ｉ−６８， Ｐ−７９， Ｋ−１０９， Ｋ−１５。
実施した６変異：
Ｋ６Ａ， Ｋ１５Ｅ， Ｈ３０Ｎ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ。
表２は、Ｄｅｒ ｐ ２アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第１欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第２欄はアミノ酸を１文字略語で記載し、第３欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第４欄はこの位置における関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【００４０】
【表２】
2004521618.tif 000006
2004521618.tif 000007
2004521618.tif 000008
2004521618.tif 000009
【００４１】
Ｖｅｓ ｖ ５
高度に溶媒露出された８９アミノ酸：
Ｋ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９，Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｋ−２０２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５， Ｉ−１８２。
高度に溶媒露出され、７０％より高く保存された８８アミノ酸：
Ｋ−１６， Ｋ−１８５， Ｋ−１１， Ｋ−４４， Ｋ−２１０， Ｒ−６３， Ｋ−１３， Ｆ−６， Ｋ−１４９， Ｋ−１２８， Ｅ−１８４， Ｋ−１１２， Ｆ−１５７， Ｅ−３， Ｋ−２９， Ｎ−２０３， Ｎ−３４， Ｋ−７８， Ｋ−１５１， Ｌ−１５， Ｌ−１５８， Ｙ−１０２， Ｗ−１８６， Ｋ−１３４， Ｄ−８７， Ｋ−５２， Ｔ−６７， Ｔ−１２５， Ｋ−１５０， Ｙ−４０， Ｑ−４８， Ｌ−６５， Ｋ−８１， Ｑ−１０１， Ｑ−２０８， Ｋ−１４４， Ｎ−８， Ｎ−７０， Ｈ−１０４， Ｑ−４５， Ｋ−１３７， Ｋ−１５９， Ｅ−２０５， Ｎ−８２， Ａ−１１１， Ｄ−１３１， Ｋ−２４， Ｖ−３６， Ｎ−７， Ｍ−１３８， Ｔ−２０９， Ｖ−８４， Ｋ−１７２， Ｖ−１９， Ｄ−５６， Ｐ−７３， Ｇ−３３， Ｔ−１０６， Ｎ−１７０， Ｌ−２８， Ｔ−４３， Ｑ−１１４， Ｃ−１０， Ｋ−６０， Ｎ−３１， Ｋ−４７， Ｅ−５， Ｄ−１４５， Ｖ−３８， Ａ−１２７， Ｄ−１５６， Ｅ−２０４， Ｐ−７１， Ｇ−２６， Ｙ−１２９， Ｄ−１４１， Ｆ−２０１， Ｒ−６８， Ｎ−２００， Ｄ−４９， Ｓ−１５３， Ｋ−３５， Ｓ−３９， Ｙ−２５， Ｖ−３７， Ｇ−１８， Ｗ−８５， Ｉ−１８２。
実施した９変異：
Ｋ２９Ａ， Ｔ６７Ａ， Ｋ７８Ａ， Ｖ８４Ｓ， Ｙ１０２Ａ， Ｋ１１２Ｓ， Ｋ１４４Ａ， Ｋ２０２Ｍ， Ｎ２０３Ｇ。
表３は、Ｖｅｓ ｖ ５アミノ酸の溶媒露出を降順にした一覧表を示す。第１欄はアミノ末端から始まるアミノ酸番号を記載し、第２欄はアミノ酸を１文字略語で記載し、第３欄は標準化溶媒露出指数を記載し、第４欄はこの位置における関連アミノ酸を有する既知配列のパーセンテージを記載する。
【００４２】
【表３】
2004521618.tif 000010
2004521618.tif 000011
2004521618.tif 000012
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2004521618.tif 000014
【００４３】
実施例４
この実施例は、本発明の組換え変異体Ｂｅｔ ｖ １アレルゲン、すなわち少なくとも四つの第一変異を含みＩｇＥ結合親和性を減少させたアレルゲンの調製及び特徴付けを記述する。
Ｂｅｔ ｖ １の部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
Ｂｅｔ ｖ １アミノ酸残基の溶媒接触性を、実施例３の表１に示す。アミノ酸保存の割合は、ＥｘＰａＳｙ分子生物学サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）において、Ｂｅｔ ｖ １．２８０１野生型アミノ酸配列を入力配列として用いたＢＬＡＳＴ検索にＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて行われた配列アラインメントに基づく。このアラインメントは、ファガレス目の範囲内の種（Ｂｅｔ ｖ １：ベツラ・ベルルコサ；Ｃａｒ ｂ １：カルピナス・ベツルス；Ｃｏｒ ａ １：コリルス・アベルラナ（ａｖｅｌｌａｎａ）；Ａｌｎ ｇ １：アルナス・グルチノサ）に由来する６７アレルゲン配列（３９のＢｅｔ ｖ １配列、１１のＣａｒ ｂ １配列、６のＣｏｒ ａ １配列及び１３のＡｌｎ ｇ １配列）を含む。実施例中に示された変異組換えＢｅｔ ｖ １アレルゲンに関し、置換のための標的残基は９５％以上のアミノ酸同一性に基づいた。
実施例１に記述するように、高度な溶媒露出、及び、近縁種に由来する花粉アレルゲン間において高度な保存を有するアミノ酸残基を部位特異的変異誘発のために選択した。低度の溶媒露出（２０％より低い）を有する残基は、三次構造を破壊する可能性又は抗体相互作用を失う可能性のため、変異誘発に適切であるとみなさなかった。
導入された残基は、病原関連（ＰＲ−１０）タンパク質と呼ばれる植物タンパク質群のイソフォームにおいて対応する位置に全て存在した。分子モデリングは、ファガレスアレルゲン及びＰＲ−１０タンパク質の三次構造がほぼ同一であることを示唆する。Ｂｅｔ ｖ １は、有意な配列同一性（２０〜４０％）をＰＲ−１０タンパク質と共有する。しかしながら、これらＰＲ−１０タンパク質に対するアレルギー性交差反応性の報告は存在しない。このように、Ｂｅｔ ｖ １由来の高度に保存及び溶媒露出されたアミノ酸をＰＲ−１０タンパク質の対応する位置のアミノ酸と交換することにより、未改変のα炭素骨格三次構造を有するが減少したＩｇＥ結合親和性を有する変異Ｂｅｔ ｖ １タンパク質が生じる。
【００４４】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発
Ｂｅｔ ｖ １を挿入された組換えｐＭＡＬ−ｃを鋳型として用いたＰＣＲによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発を行った。５〜９の第一変異を含む組換え変異体アレルゲンの調製は二つのＰＣＲ工程；工程Ｉ及びＩＩを含む。最初に、図１７（Ｉ）で概略的に説明するように、各変異を提供するセンス及びアンチセンス変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーに加えて、変異に隣接する上流若しくは下流又はＢｅｔ ｖ １のＮ末端／Ｃ末端のいずれかを提供するセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ用いて、各一つの変異（又は、ＤＮＡ配列上で共に近接して位置する場合には複数の変異）をＢｅｔ ｖ １．２８０１又はＢｅｔ ｖ １．２８０１誘導体の一連のＤＮＡ配列に導入した。第二に、図１７（ＩＩ）で概略的に説明するように、ＰＣＲ反応ＩによるＰＣＲ産物を精製し、混合し、追加ＰＣＲ反応（ＩＩ）のための鋳型として、Ｂｅｔ ｖ １のＮ末端及びＣ末端を提供するオリゴヌクレオチドプライマーとともに用いた。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動及びＰＣＲゲル精製（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に続くエタノール沈殿によって精製し、制限酵素（ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ）又は（ＳａｃＩ／ＸｂａＩ）で切断し、同じ酵素で制限酵素切断したｐＭＡＬ−ｃに方向性を持たせてライゲーションを行った。
図１８は、合成したオリゴヌクレオチドプライマー、及び、５〜９の第一変異を有するＢｅｔ ｖ １変異体の構築の概略的な説明を示す。変異アミノ酸は、好ましくは実施例３で記述したように高度に溶媒露出及び保存されたことによって特徴付けられるアミノ酸からなる群より選択した。Ｂｅｔ ｖ １変異体は、括弧内に示された以下の第一及び第二変異である：
変異体Ｂｅｔ ｖ １ （２６２８）： Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ
変異体Ｂｅｔ ｖ １ （２６３７）： Ａｌａ１６Ｐｒｏ， （Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｌｙｓ１０３Ｔｈｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， （Ｌｅｕ１５２Ｌｙｓ， Ａｌａ１５３Ｇｌｙ， Ｓｅｒ１５５Ｐｒｏ）
変異体Ｂｅｔ ｖ １ （２７３３）： （Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ）， （Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， （Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ）， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ， Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ， （Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ， ＋１６０Ａｓｎ）
変異体Ｂｅｔ ｖ １ （２７４４）： （Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕ）， （Ｇｌｕ４２Ｓｅｒ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ）， （Ａｓｎ７８Ｌｙｓ， Ｌｙｓ１０３Ｖａｌ）， Ｌｙｓ１２３Ｉｌｅ， （Ａｓｐ１５６Ｈｉｓ， ＋１６０Ａｓｎ）
変異体Ｂｅｔ ｖ １ （２７５３）： （Ａｓｎ２８Ｔｈｒ， Ｌｙｓ３２Ｇｌｎ）， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， （Ｇｌｕ９６Ｌｅｕ， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ）， （Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ， Ａｓｐ１０９Ａｓｎ）， （Ａｓｐ１２５Ｔｙｒ， Ｇｌｕ１２７Ｓｅｒ）， Ａｒｇ１４５Ｇｌｕ。
【００４５】
ヌクレオチドのシークエンシング
サブクローニングの前及び後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発後のそれぞれで、Ｂｅｔ ｖ １をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。
アンピシリン０．１ ｇ／ｌを補充したＬＢ培地で一晩飽和に達するまで増殖させた細菌培養液１０ ｍｌから、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ ２０カラムで精製し、（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手したレディ（Ｒｅａｄｙ）・リアクション・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキット及び蛍光シークエンサーＡＢ ＰＲＩＳＭ ３７７を用い、供給元の推奨に従ってシークエンシングを行った。
組換えＢｅｔ ｖ １及び変異体の発現及び精製
参考文献１５に記述されるように、組換えＢｅｔ ｖ １（Ｂｅｔ ｖ １．２８０１及び変異体）をマルトース結合タンパク質に融合した状態で大腸菌ＤＨ５αにおいて過剰発現させ、精製した。簡単に言うと、組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を６００ ｎｍにおける光学密度０．８に達するまで３７℃で増殖させた後、ＩＰＴＧの添加によってＢｅｔ ｖ １融合タンパク質の発現を誘導した。細胞を３時間のインキュベーションの後、遠心分離によって収穫し、溶菌緩衝液中に再懸濁させ、超音波処理によって破砕した。超音波処理及びさらなる遠心分離の後、組換え融合タンパク質をアミロースアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、その後Ｘａ因子とともにインキュベーションすることにより切断した（参考文献１５）。第Ｘａ因子切断後、組換えＢｅｔ ｖ １をゲル濾過によって単離し、微量のマルトース結合タンパク質を除去するためにもう一回アミロースアフィニティークロマトグラフィーで処理した。
精製組換えＢｅｔ ｖ １を限外濾過によって約５ ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。精製組換えＢｅｔ ｖ １調製品の最終的な収率は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養液１リットルあたり２〜５ ｍｇであった。
精製組換えＢｅｔ ｖ １調製品は、銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後見かけ上の分子量１７．５ ｋＤａの単一バンドとして現れた。
我々は既に、組換えＢｅｔ ｖ １ナンバー２８０１が天然に存在するＢｅｔ ｖ １と免疫化学的に区別がつかないことを示している（参考文献１５）。
【００４６】
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体
図１９は、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の分子表面に導入された点変異を示す。変異体Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）では、五つの第一変異がＢｅｔ ｖ １の半分に導入され、残り半分は不変のままであった。変異体Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）では、五つの第一変異及び三つの第二変異が前記残り半分に導入され、もう半分は不変のままであった。このように、変異体Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及び変異体Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）における変異は、それぞれＢｅｔ ｖ １表面の異なる半分に影響する。
組換えＢｅｔ ｖ １（２６２８）変異体タンパク質の結晶化及び構造決定
本質的には（Ｓｐａｎｇｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ １９９６ｂ、参考文献２１）に記述されるように、組換えＢｅｔ ｖ １（２６２８）の結晶を２５℃の蒸発拡散によって成長させた。濃度５ ｍｇ／ｍｌのＢｅｔ ｖ １（２６２８）を、等体積の２．２ Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、１％ （ｖ／ｖ）ジオキサン、ｐＨ ６．３と混合し、１００倍の体積の２．２ Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ Ｍクエン酸ナトリウム、１％ （ｖ／ｖ）ジオキサン、ｐＨ ６．３に対して平衡化した。２４時間の平衡化の後、組換え野生型Ｂｅｔ ｖ １の結晶を種のもととして用い、参考文献２１に記述される播種技術を応用することによって、結晶の成長を誘導した。
約４ヶ月後に結晶を収穫し、参考文献２１に記述されるようにＲｉｇａｋｕ回転アノードから発生させたＸ線を用いて解析し、分子置換を用いて構造を明らかにした。
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）変異体の構造
回転アノードから発生させたＸ線によって、三次元のＢｅｔ ｖ １（２６２８）タンパク質結晶回析を２．０Åの解像度で解析することによって、変異誘発の構造的効果に取り組んだ。Ｔｙｒ５Ｖａｌ， Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ， Ｌｙｓ６５Ａｓｎ， Ｌｙｓ９７Ｓｅｒ， Ｌｙｓ１３４Ｇｌｕの置換はＢｅｔ ｖ １（２６２８）構造電子密度マップによって検証され、全体的なα炭素骨格三次構造が保存されていることも示された。
【００４７】
Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）変異体の構造解析
精製Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）変異体の構造上の完全性を、円二色性（ＣＤ）分光法により解析した。図２０は、ほぼ等しい濃度で記録された組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体のＣＤスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のＣＤスペクトルにおけるピークの振幅及び位置の重複は、この二つの調製品が等量の二次構造を含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆する。
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体のＩｇＥ結合特性
カバノキアレルギー患者由来の血清ＩｇＥのプールを用いた流動相ＩｇＥ阻害アッセイによって、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）のＩｇＥ結合特性、及び、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の１：１混合物のＩｇＥ結合特性を、組換え野生型Ｂｅｔ ｖ １．２８０１と比較した。
実施例１で記述したように、組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１を１：５（Ｂｅｔ ｖ １ナンバー２８０１：ビオチン）のモル比でビオチン化した。阻害アッセイは次のように行った：血清サンプル（２５ μｌ）を抗ＩｇＥ固体相とインキュベートし、洗滌し、ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １．２８０１及び得られた変異体の混合物、又は、二つの変異体の１：１混合物に再懸濁してさらにインキュベートし、固体相に結合したビオチン化Ｂｅｔ ｖ １．２８０１の量をアクリジニウムエステル標識ストレプトアビジンとインキュベーションした後に測定したＲＬＵから推定した。阻害の程度は、緩衝液及び阻害剤として変異体を用いて得られたＲＬＵの間の比として計算した。
図２１は、非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １．２８０１、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）、Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の１：１混合物による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１の結合の阻害を示す。
血清プール中に存在する血清ＩｇＥに対する結合の５０％阻害を達成するために必要である各組換えタンパク質の量には、明らかな差がある。組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１は約５ ｎｇで５０％阻害を達成する一方、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）変異体の対応する濃度は約１５〜２０ ｎｇである。このことは、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）変異体に導入された点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性を約１／３〜１／４に低下させることを示す。
【００４８】
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）変異体タンパク質によって達成された阻害の最大値は、組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１と比べて明らかに低下している。このことは、血清プール中に存在する特異的ＩｇＥの幾らかは導入された点変異のためにＢｅｔ ｖ １（２６２８）変異体タンパク質を認識できないことを示し得る。
Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）は約４００〜５００ ｎｇで５０％阻害を達成し、Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）変異体に導入された点変異が特異的血清ＩｇＥに対する親和性をＢｅｔ ｖ １．２８０１に比べて１／８０〜１／１００に低下させることを示す。ＩｇＥ結合性における大きな差異は、Ｂｅｔ ｖ １．２８０１の阻害曲線と比較してＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体タンパク質から得られた阻害曲線の傾きの明らかな相違によって、さらに支持される。この異なる傾きは、ＩｇＥ結合性の減少はＢｅｔ ｖ １．２８０１と比べて明確に異なる変異体のエピトープパターンによることの証拠を提供する。
単改変アレルゲンでの阻害アッセイに加えて、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）又はＢｅｔ ｖ １（２６３７）の各サンプルそれぞれがＢｅｔ ｖ １と同じモル濃度を有するＢｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の１：１混合物を試験すると、組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１に対してＩｇＥ結合を阻害する完全な（１００％）能力を示した。このＩｇＥ結合を完全に阻害する能力は、Ｂｅｔ ｖ １．２８０１上に存在する反応性エピトープ全部が前記１：１アレルゲン混合物中に存在したことを明確に示している。このことはＢｅｔ ｖ １．２８０１及び前記アレルゲン混合物による二つの阻害曲線の傾きの比較によって、さらに支持される。ＩｇＥ結合の５０％阻害を得るためにＢｅｔ ｖ １．２８０１と比べて四倍高濃度のアレルゲン混合物を必要とすることから、混合アレルゲンサンプルの減少したＩｇＥ反応性が実証される。
【００４９】
変異組換えＢｅｔ ｖ １アレルゲンを用いたＴ細胞増殖アッセイ
この分析は参考文献１５に記述されるように行った。Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体タンパク質は両方とも、組換え体及び天然に存在するアレルゲンと同様な刺激指数でカバノキ花粉アレルギー患者由来のＴ細胞株の増殖を誘導することができた。このことは、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の両変異体タンパク質それぞれが、抗体産生のために必要な細胞性免疫応答を開始可能であることを示唆する。
ヒト好塩基球を用いたヒスタミン放出アッセイ
好塩基性白血球からのヒスタミン放出を次のように行った。各カバノキ花粉患者から採取したヘパリン添加血液（２０ ｍｌ）を室温で保存し２４時間以内に用いた。ヘパリン添加全血２５ μｌをグラスファイバーコートしたミクロタイターウェルに加え（関連研究室、コペンハーゲン、デンマーク）、２５ μｌのアレルゲン又は抗ＩｇＥと３７℃で１時間インキュベートした後、前記プレートをリンスして妨害物質を除去した。最後にミクロファイバーに結合したヒスタミンを蛍光分光分析的に測定した。
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体タンパク質のヒスタミン放出特性
ヒスタミン放出データを図２２及び図２３に示す。Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体タンパク質が二つのカバノキ花粉アレルギー患者由来のヒト好塩基球におけるヒスタミン放出を誘導する作用強度を試験した。両方のケースにおいて、ヒスタミン放出を誘導する変異アレルゲンの放出曲線はＢｅｔ ｖ １．２８０１の放出曲線に比べ明らかに右にシフトしている。このシフトは、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の作用強度が１／３〜１／１０に減少されたことを示す。
【００５０】
変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）及び変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７５３）
Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）及びＢｅｔ ｖ １（２７５３）を混合アレルゲンワクチンとしての使用のため同様に構築した。これらの変異アレルゲンの点変異は全体表面において図２４及び図２５に示されるような配置様式で分布し、ここでも図２６に示されるように二分子それぞれにおいて異なる表面領域に影響するように設計した。しかしながら、これらの改変アレルゲンが個々に単一アレルゲンワクチンとしても用いることができるであろう。
Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）変異体タンパク質の構造解析
精製Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）変異体の構造上の完全性を円二色性（ＣＤ）分光法によって解析した。図２７は、ほぼ等しい濃度で記録された組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）及びＢｅｔ ｖ １（２７４４）変異体のＣＤスペクトルを示す。二つの組換えタンパク質由来のＣＤスペクトルにおけるピークの振幅及び位置の重複は、この二つの調製品が二次構造を等量含むことを示し、導入されたアミノ酸置換によってα炭素骨格三次構造が影響されないことを強く示唆している。
Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）のヒスタミン放出特性
五つの異なるカバノキ花粉アレルギー患者由来の好塩基性白血球を用いた五つの実施例からのヒスタミン放出データを、図２８及び図２９Ａ−Ｄに示す。Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）変異体タンパク質がヒト好塩基球におけるヒスタミン放出を誘導する作用強度を試験した。変異アレルゲンの放出曲線はＢｅｔ ｖ １．２８０１の放出曲線と比べて明らかに右にシフトしており、Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）のヒスタミン放出する作用強度が１／３〜１／５に減少されたことを示している。
変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７３３）
九つの第一変異を有する変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７３３）を構築し、組換え的に発現させた。Ｂｅｔ ｖ １（２７３３）における点変異の分布は、構成要素となるそれぞれの表面領域を４００Å２より大きく変化させないままにする。図３０は、Ｂｅｔ ｖ １（２７３３）の分子表面に導入された点変異を示す。
【００５１】
実施例５
この実施例は、デルマトファゴイデス・プテロニスシナス由来のＤｅｒ ｐ ２をコードする遺伝子のクローニング、及び、ＩｇＥ結合親和性を減少した変異体の構築を記述する。
デルマトファゴイデス・プロテニスシナス全ＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡ合成からＰＣＲ増幅した産物を、Ｄｒ．Ｗｅｎｄｙ−Ａｎｎｅ Ｓｍｉｔｈ及びＤｒ．Ｗａｙｎｅ Ｔｈｏｍａｓ（ＴＶＷ 児童健康調査テレソン研究所、１００ Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒｄ、Ｓｕｂｉａｃｏ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ６００８）から入手した。第一鎖ｃＤＮＡライブラリーの増幅の際に、Ｄｅｒ ｐ ２特異的プライマーを用いてＤｅｒ ｐ ２を選択的に増幅した。続いてＰＣＲフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）のＢａｍＨＩ認識部位へクローニングした。Ｄｅｒ ｐ ２のＤＮＡサブクローニングを、ベクター特異的なセンス（５’−ＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧ−３’）プライマー及びアンチセンス（５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣ−３’）プライマーを用いて行った。
ＡＬＫ−１０１、ＡＬＫ−１０２、ＡＬＫ−１０３、ＡＬＫ−１０４、ＡＬＫ−１１３、ＡＬＫ−１１４及びＡＬＫ−１２０と命名した全部で七つのユニークなＤｅｒ ｐ ２イソフォームを同定した。データーベースのアクセッション番号１Ａ９Ｖを有するＤｅｒ ｐ ２のＮＭＲ構造と高い配列同一性を有することから、ＡＬＫ−１１４と題したクローンを低親和性ＩｇＥ変異体生成のための出発点として選択した。ＡＬＫ−１１４と比べると、他の６つの天然に存在するイソフォームは以下の置換を含む：
ＡＬＫ−１０１：  Ｍ７６Ｖ
ＡＬＫ−１０２：  Ｖ４０Ｌ， Ｔ４７Ｓ
ＡＬＫ−１０３：  Ｍ１１１Ｌ， Ｄ１１４Ｎ
ＡＬＫ−１０４：  Ｔ４７Ｓ， Ｍ１１１Ｉ， Ｄ１１４Ｎ
ＡＬＫ−１１３：  Ｔ４７Ｓ
ＡＬＫ−１２０：  Ｖ４０Ｌ， Ｔ４７Ｓ， Ｄ１１４Ｎ。
【００５２】
Ｄｅｒ ｐ ２のｐＧＡＰＺα−Ａへの挿入
酵母ピチア・パストリスにおけるＤｅｒ ｐ ２の分泌発現のため、続いてＤｅｒ ｐ ２（ＡＬＫ−１１４）をコードする遺伝子をｐＧＡＰＺα−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に挿入した。この遺伝子を、Ｄｅｒ ｐ ２ポリペプチドのアミノ末端及びカルボキシ末端にそれぞれ対応するセンスプライマーＯＢ２７（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＣ−３’）及びアンチセンスプライマーＯＢ２８（５’− ＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣＡＴＧＡＧＴＴＧＣ−３’）を用いて増幅した。これらプライマーは、制限酵素部位ＸｈｏＩ及びＸｂａＩをそれぞれ提供するように５’末端を延長した。ＸｈｏＩ制限酵素部位は、Ｄｅｒ ｐ ２の第一コドンをｐＧＡＰＺα−ＡのＫＥＸ２切断部位（ＬＹＳ−ＡＲＧ）をコードする核酸配列とイン・フレームに融合させる。ＰＣＲ増幅の１ラウンドを、体積１００ μｌ中：０．１ ｍｇの鋳型ＡＬＫ−１１４ ＤＮＡ、１ｘ伸長ポリメラーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手可能）、各四つのｄＮＴＰを０．２ ｍＭずつ、各０．３ μＭのセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、２．５ユニットの伸長ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより入手可能）で行った。前記ＤＮＡを９５℃ １５秒、４５℃ ３０秒、７２℃ １分の２５サイクルで増幅し、続いて７２℃ ７分の１サイクルを行った。得られた４７５ ｂｐのＡＬＫ−１１４ ＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡクイック・スピン・ピュアリフィケーション・プロシージャー（Ｑｉａｇｅｎより入手可能）を用いて精製した。この精製ＤＮＡフラグメントをＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、同様に消化したｐＧＡＰＺα−Ａへライゲーションさせた。このライゲーション反応物をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αにトランスフォームして、プラスミドｐＣＢｏ０６が得られた。
クローニングの前及び後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの変異誘発の後に、ＤＮＡシークエンシングによってＤｅｒ ｐ ２のヌクレオチド配列を確かめた（以下を参照）。
【００５３】
Ｄｅｒ ｐ ２配列
配列番号１は、Ｄｅｒ ｐ ２（ＡＬＫ−１１４）の核酸配列に対応する：
2004521618.tif 000015
配列番号２は、Ｄｅｒ ｐ ２（ＡＬＫ−１１４）の導き出されたアミノ酸配列に対応する：
2004521618.tif 000016
ｐＧＡＰＺα−Ａ−Ｄｅｒ ｐ ２のＰ．パストリスへの挿入
ＡｖｒＩＩ制限酵素を用いてベクターｐＣＢｏ０６を線形にし、コンピテントなＰ．パストリス株Ｘ−３３へＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアルに記述されるようにトランスフォームした。１００ μｇ／ｍｌのゼオシンに対して抵抗性を持つ組換え細胞を選択し、ゼオシン１００ μｇ／ｍｌを含む新しいＹＰＤプレート上でコロニー精製した。
組換えＤｅｒ ｐ ２の発現及び精製
ゼオシン１００ μｇ／ｍｌを含むＹＰＤ培地２５０ ｍｌ（１％イーストエクストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）に、Ｄｅｒ ｐ ２を発現する組換え酵母細胞の一夜培養液を植え付けた。この培養液を３０℃で７２時間、最適なＤｅｒ ｐ ２発現が得られるまで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、得られた培養上清を５０％硫酸アンモニウムで飽和させた。３０００ｘ ｇ、３０分間の遠心分離に続いて、この上清を８０％硫酸アンモニウムで飽和させた。遠心分離の後、ペレットを１５０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３に再懸濁し、同じ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過カラム上で分画した。Ｄｅｒ ｐ ２を、その予測された分子量に対応する主要なピークとして溶離した。Ｄｅｒ ｐ ２の溶離は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に続く銀染色、及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に続くＤｅｒ ｐ ２特異的ポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット分析の両方によってモニターした。
【００５４】
部位特異的変異誘発のためのアミノ酸残基の選択
変異誘発のためのアミノ酸残基の選択は、イエダニ（Ｄｅｒ ｐ ２／ｆ ２及びＥｕｒ ｍ ２）及び倉庫ダニ（Ｔｙｒ ｐ ２、Ｌｅｐ ｄ ２、Ｇｌｙ ｄ ２）由来のアレルゲンのうちで高く溶媒露出され高く保存された残基の同定に基づいた。高く溶媒露出されたアミノ酸残基は、Ｄｅｒ ｐ ２ ＮＭＲ構造（＃１．９、１Ａ９Ｖ．ｐｄｂ）の分子表面解析によって視覚的に同定した。１２のアミノ酸残基を、変異誘発のために選択した：Ｋ６Ａ， Ｎ１０Ｓ， Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｎ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ及びＲ１２８Ｑ。
部位特異的変異誘発
一つの第一変異及びそれら複数の組合せを有する組換え変異体アレルゲンの構築を、以下に記述する。
Ｄｅｒ ｐ ２変異体をコードする発現プラスミドを、鋳型ＤＮＡとしてｐＣＢｏ０６を用いて作製した。特定の変異を取り込んだセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。特定の変異を生成させるためにＰＣＲ反応に用いたプライマー対を、図３１に列挙する。この図では、変異をボールド体で表し、その後に続くクローニング工程に用いた制限酵素部位に下線を引いている。変異体Ｋ６Ａ、Ｋ１５Ｅ、Ｈ３０Ｎ、Ｈ７４Ｎ及びＫ８２Ｎの構築のため、本質的には「Ｄｅｒ ｐ ２のｐＧＡＰＺα−Ａへのクローニング」の節で記述するようにＰＣＲ反応を行った。精製ＰＣＲフラグメントを表示の制限酵素部位（図３１を参照）で消化し、ゲル精製し、同様に消化したｐＣＢｏ０６にライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへトランスフォームした。
実施例１においてＢｅｔ ｖ １変異体生成について記述した選択的ＰＣＲ変異誘発方法論を用い、変異Ｅ６２Ｓを生成させた。二つの変異特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、特定の変異を網羅するように合成した（ＯＢ４７及びＯＢ４８、図３１に記載した）。第二増幅工程に対して用いた二つの追加プライマーは、「Ｄｅｒ ｐ ２のｐＧＡＰＺα−Ａへの挿入」の節で記述するＯＢ２７及びＯＢ２８であった。
作製した変異体アレルゲンは実施例４で記述する方法、例えば円二色性（ＣＤ）分光法、結晶化、ＩｇＥ結合特性の測定、ヒスタミン放出、Ｔ細胞増殖刺激能力等と同じ方法を用いて特徴付ける。
【００５５】
実施例６
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換えダニアレルゲン（Ｄｅｒ ｐ ２）
この実施例において、イエダニアレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Ｄｅｒ ｐ ２によって例証する。他のイエダニアレルゲンの操作は、同等の手順によって行うことができる。
変異組換えＤｅｒ ｐ ２分子の設計
配列番号３は、野生型イソフォームであるＤｅｒ ｐ ２−ＡＬＫ−Ｇクローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
配列番号３：Ｄｅｒ ｐ ２−ＡＬＫ−Ｇのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
2004521618.tif 000017
【００５６】
図３２は、ＥｘＰａＳｙ分子生物学サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）において、配列番号３に示すＤｅｒ ｐ ２−ＡＬＫ−Ｇアミノ酸配列を入力配列として用いたＢＬＡＳＴ検索にＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて行った配列アラインメントを示す。このアラインメントは、イエダニ種すなわちＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｆ ２及びＥｕｒ ｍ ２由来の配列を含む。図３２において、Ｄｅｒ ｐ ２−ＡＬＫ−Ｇタンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基は、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は、白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
イエダニグループ２アレルゲンを表すアミノ酸配列は８５％より高い類似性を有し、分子表面の幾らかを保存する（灰色に着色したゾーン）（図３３を参照）。
図３３は、Ｄｅｒ ｐ ２−ＡＬＫ−Ｇタンパク質配列を公知のＰＤＢ：１Ａ９Ｖ ＮＭＲ構造（ＰＤＢファイルに含まれる１０のうちの構造番号１）に重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。
全体表面にわたり２５〜３０Åの距離範囲内に空間的に分布する保存され高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節では、次の情報を与える：変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト（Ａ）、設計された変異体のリスト（Ｂ）及び前記設計された変異体を表すＤＮＡ配列（Ｃ）。図３４は一例として、変異体番号１の表面輪郭を示す。灰色は保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【００５７】
Ａ．変異のために選択されたアミノ酸のリスト
Ｋ１５， Ｓ２４， Ｈ３０， Ｒ３１， Ｋ４８， Ｅ６２， Ｈ７４， Ｋ７７， Ｋ８２， Ｋ１００， Ｒ１２８
Ｂ．設計された変異体のリスト
変異体１：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ
変異体２：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体３：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体４：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体５：
Ｋ１５Ｅ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体６：
Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体７：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ
変異体８：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体９：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体１０：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体１１：
Ｋ１５Ｅ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
変異体１２：
Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
【００５８】
Ｃ．変異体のヌクレオチド配列
変異体１：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ
2004521618.tif 000018
【００５９】
変異体２：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000019
【００６０】
変異体３：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000020
【００６１】
変異体４：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000021
【００６２】
変異体５：
Ｋ１５Ｅ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000022
【００６３】
変異体６：
Ｓ２４Ｎ， Ｈ３０Ｇ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｋ７７Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000023
【００６４】
変異体７：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ
2004521618.tif 000024
【００６５】
変異体８：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000025
【００６６】
変異体９：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000026
【００６７】
変異体１０：
Ｋ１５Ｅ， Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000027
【００６８】
変異体１１：
Ｋ１５Ｅ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000028
【００６９】
変異体１２：
Ｓ２４Ｎ， Ｒ３１Ｓ， Ｋ４８Ａ， Ｅ６２Ｓ， Ｈ７４Ｎ， Ｋ８２Ｎ， Ｋ１００Ｎ， Ｒ１２８Ｑ
2004521618.tif 000029
【００７０】
実施例７
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換えダニアレルゲン（Ｄｅｒ ｐ １）
この実施例において、イエダニアレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Ｄｅｒ ｐ １によって例証する。他のイエダニアレルゲンの操作は、同等な手順によって行うことができる。
変異組換えＤｅｒ ｐ １分子の設計
配列番号４は、野生型イソフォームであるＤｅｒ ｐ １−ＡＬＫクローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
【００７１】
配列番号４：Ｄｅｒ ｐ １−ＡＬＫのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
2004521618.tif 000030
2004521618.tif 000031
【００７２】
図３５は、ＥｘＰａＳｙ分子生物学サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）において、配列番号４に示すＤｅｒ ｐ １−ＡＬＫアミノ酸配列を入力配列として用いたＢＬＡＳＴ検索にＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて行った配列アラインメントを示す。このアラインメントは、イエダニ種すなわちＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｆ １及びＥｕｒ ｍ １由来の配列を含む。図３５において、Ｄｅｒ ｐ １−ＡＬＫタンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基を、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
イエダニグループ１アレルゲンを表すアミノ酸配列はある程度類似しており、分子表面の幾らかは保存されている（灰色に着色したゾーン）（図３６を参照）。図３６は、Ｄｅｒ ｐ １−ＡＬＫタンパク質配列をＤｅｒ ｐ １分子構造モデルに重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。
全体表面にわたり２５〜３０Åの距離範囲内に空間的に分布する保存され高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節で、次の情報を与える：変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト（Ａ）、設計された変異体のリスト（Ｂ）及び前記設計された変異体を表すＤＮＡ配列（Ｃ）。図３７は、一例として変異体番号１１の表面輪郭を示す。灰色は、保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【００７３】
Ａ．変異のために選択されたアミノ酸のリスト
Ｅ１３， Ｐ２４， Ｒ２０， Ｙ５０， Ｓ６７， Ｒ７８， Ｒ９９， Ｑ１０９， Ｒ１２８， Ｒ１５６， Ｒ１６１， Ｐ１６７， Ｗ１９２
Ｂ．設計された変異体のリスト
変異体１：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
変異体２：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
変異体３：
Ｒ２０Ｅ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
変異体４：
Ｒ２０Ｑ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
変異体５：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
変異体６：
Ｒ２０Ｅ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
変異体７：
Ｒ２０Ｑ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
変異体８：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
変異体９：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
変異体１０：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ， Ｗ１９２Ｆ
変異体１１：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ， Ｗ１９２Ｆ
【００７４】
Ｃ．変異体のヌクレオチド配列
変異体１：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000032
【００７５】
変異体２：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000033
【００７６】
変異体３：
Ｒ２０Ｅ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000034
【００７７】
変異体４：
Ｒ２０Ｑ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000035
【００７８】
変異体５：
Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000036
【００７９】
変異体６：
Ｒ２０Ｅ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000037
【００８０】
変異体７：
Ｒ２０Ｑ， Ｙ５０Ｖ， Ｓ６７Ｎ， Ｒ９９Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000038
【００８１】
変異体８：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000039
【００８２】
変異体９：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ
2004521618.tif 000040
【００８３】
変異体１０：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｅ， Ｒ９９Ｑ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｅ， Ｒ１５６Ｑ， Ｒ１６１Ｅ， Ｐ１６７Ｔ， Ｗ１９２Ｆ
2004521618.tif 000041
【００８４】
変異体１１：
Ｅ１３Ｓ， Ｐ２４Ｔ， Ｙ５０Ｖ， Ｒ７８Ｑ， Ｒ９９Ｅ， Ｑ１０９Ｄ， Ｒ１２８Ｑ， Ｒ１５６Ｅ， Ｒ１６１Ｑ， Ｐ１６７Ｔ， Ｗ１９２Ｆ
2004521618.tif 000042
【００８５】
実施例８
特異的アレルギーワクチン接種のための改良された安全性を有する変異組換え草本アレルゲン（Ｐｈｌ ｐ ５）
この実施例において、草本花粉アレルゲンにおける本発明の概念の応用を一つのアレルゲン、Ｐｈｌ ｐ ５によって例証する。他の草本花粉アレルゲンの操作は、同等な手順によって行うことができる。
変異組換えＰｈｌ ｐ ５分子の設計
配列番号５は、野生型イソフォームであるＰｈｌ ｐ ５．０１０３クローンのヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列を示す。
配列番号５：Ｐｈｌ ｐ ５．０１０３のヌクレオチド配列及び導き出されたアミノ酸配列
2004521618.tif 000043
2004521618.tif 000044
【００８６】
図３８は、ＥｘＰａＳｙ分子生物学サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）において、配列番号５に示すＰｈｌ ｐ ５．０１０３のアミノ酸配列を入力配列として用いたＢＬＡＳＴ検索にＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いて行われた配列アラインメントを示す。このアラインメントは、草本種すなわちＰｈｌ ｐ ５、Ｐｏａ ｐ ５、Ｌｏｌ ｐ ５、Ｈｏｌ ｌ ５、Ｐｈａ ａ ５、Ｈｏｒ ｖ ９及びＨｏｒ ｖ ５由来のグループ５アレルゲン配列を含む。図３８において、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０３タンパク質配列における同じ位置のアミノ酸と同一であるアミノ酸残基を、灰色背景上に黒色の文字を用いて強調する。同一でないアミノ酸は、白色背景上に黒色で印刷する。
表面構造像
草本花粉グループ５アレルゲンを表すアミノ酸配列はある程度類似しており、分子表面の幾らかは保存されている（灰色に着色したゾーン）（図３９を参照）。図３９は、Ｐｈｌ ｐ ５．０１０３タンパク質配列をＰｈｌ ｐ ５分子構造モデルに重ね合わせた際の、四つの異なる角度から見た表面輪郭を示す。この構造モデルはニ分割した形で分子を含み、モデルＡ（アミノ酸３４〜１４２）を図３９Ａに示し、モデルＢ（アミノ酸１４９〜２５９）を図３９Ｂに示す。
全体表面にわたり２５〜３０Åの距離範囲内に空間的に分布する高く溶媒露出されたアミノ酸を、変異のために選択する。以下の節において、次の情報を与える：変異のために適切であると考えられるアミノ酸のリスト（Ａ）、設計された変異体のリスト（Ｂ）及び前記設計された変異体を表すＤＮＡ配列（Ｃ）。図４０Ａ及びＢはそれぞれ、一例として変異体番号１のモデルＡ及びモデルＢの表面輪郭を示す。灰色は、保存されたアミノ酸残基を示す。黒色は、変異のために選択されたアミノ酸残基を示す。
【００８７】
Ａ．変異のために選択されたアミノ酸のリスト
Ｉ４５， Ｒ６６， Ｅ１３３， Ｒ１３６， Ｉ１３７， Ｄ１８６， Ｆ１８８， Ｋ２１１， Ｐ２１４， Ｑ２２２， Ｐ２３２， Ｌ２４３， Ｑ２５４
Ｂ．設計された変異体のリスト
変異体１：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体２：
Ｒ６６Ｎ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体３：
Ｉ４５Ｋ， Ｒ１３６Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体４：
Ｉ４５Ｋ， Ｉ１３７Ｋ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体５：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体６：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｑ２２２Ｋ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体７：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｐ２１４Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体８：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｋ２１１Ｎ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体９：
Ｒ６６Ｎ， Ｒ１３６Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体１０：
Ｒ６６Ｎ， Ｉ１３７Ｋ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体１１：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｐ２１４Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体１２：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｋ２１１Ｎ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体１３：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｐ２１４Ｇ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
変異体１４：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｋ２１１Ｎ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
【００８８】
Ｃ．変異体のヌクレオチド配列
変異体１：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000045
【００８９】
変異体２：
Ｒ６６Ｎ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000046
【００９０】
変異体３：
Ｉ４５Ｋ， Ｒ１３６Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000047
【００９１】
変異体４：
Ｉ４５Ｋ， Ｉ１３７Ｋ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000048
【００９２】
変異体５：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000049
【００９３】
変異体６：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｑ２２２Ｋ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000050
【００９４】
変異体７：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｐ２１４Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000051
【００９５】
変異体８：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｋ２１１Ｎ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000052
【００９６】
変異体９：
Ｒ６６Ｎ， Ｒ１３６Ｓ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000053
【００９７】
変異体１０：
Ｒ６６Ｎ， Ｉ１３７Ｋ， Ｆ１８８Ｉ， Ｑ２２２Ｋ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000054
【００９８】
変異体１１：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｐ２１４Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000055
【００９９】
変異体１２：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｄ１８６Ｈ， Ｋ２１１Ｎ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000056
【０１００】
変異体１３：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｐ２１４Ｇ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000057
【０１０１】
変異体１４：
Ｉ４５Ｋ， Ｅ１３３Ｓ， Ｋ２１１Ｎ， Ｐ２３２Ｇ， Ｌ２４３Ｅ， Ｑ２５４Ｋ
2004521618.tif 000058
【０１０２】
実施例９
組換えＢｅｔ ｖ １及び変異体Ｂｅｔ ｖ １のＴ細胞反応性
目的：
変異アレルゲンに対するｉｎ ｖｉｔｒｏのＴ細胞応答を、増殖及びサイトカイン産生に関して調査すること。
方法：
アレルギー患者由来のＰＢＬ（末梢血リンパ球）を以下の調査に用いた。
既刊のプロトコール（２６）に記述されるように、Ｔ細胞に提示されるｂｅｔ ｖ １イソフォームの多様性を維持する目的で、ＰＢＬ及び天然な精製ｂｅｔ ｖ １から八つのｂｅｔ ｖ １特異的Ｔ細胞株を樹立した。
十のＰＢＬ及び八つのＴ細胞株を、カバノキ抽出物（Ｂｅｔ ｖ）、天然な精製ｂｅｔ ｖ １（ｎＢｅｔ ｖ １）、組換えＢｅｔ ｖ １（ｒＢｅｔ ｖ １又はｗｔ； ２７）及びｒＢｅｔ ｖ １の四つの異なる変異型（他の箇所に記述する）：２５９５、２６２８、２６３７、２７４４、２７７３で刺激した。２６３７変異体は部分的に折り畳まれないことが後に見出され、以後議論しないことにする。
簡単に言うと：丸底の９６ウェルプレートに、ＰＢＬを１ウェルあたり２ｘ１０５加えた。異なるカバノキサンプルを３つの異なる濃度で四つ組で加え、６日間増殖させた。６日目に、最も高濃度のカバノキを加えた各ウェルから、半分の体積（１００ μｌ）の細胞をサイトカイン産生のために収集した。放射性標識したチミジンを前記ウェルに加えた。翌日（７日目）、この細胞をフィルター上に収集した。シンチレーション液をフィルターに加え、シンチレーションカウンターで放射能を測定した。
同様に丸底の９６ウェルプレートにＴ細胞を１ウェルあたり３ｘ１０４加え、照射した自家ＰＢＬ（１ｘ１０５ 細胞数／ウェル）及び、異なるカバノキサンプルの３つの異なる濃度で刺激した。１日後、最も高濃度のカバノキを加えた各ウェルから、サイトカイン産生のために細胞を収集した。放射性標識したチミジンを前記ウェルに加えた。２日後、細胞をフィルター上に収集し、ＰＢＬに対して記述したようにカウントした。
四つ組のプレートから上清をプールし、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手したＣＢＡ（サイトカインビーズアレイ）キットを用いてサイトカインを測定した。
【０１０３】
結果：
十のＰＢＬ培養物は、カバノキに対し特異的な刺激を示した。一般的に、異なるカバノキサンプルに対するＰＢＬの増殖は類似していたが、多様性が見られた。３つのＰＢＬにおいて、ｎＢｅｔ ｖ １がｒＢｅｔ ｖ １及びこの変異体よりも増殖をより刺激した。前記変異体カバノキサンプルはｒＢｅｔ ｖ １とほぼ同じにＰＢＬを刺激した（図４１）。図４１は、上述のＢｅｔ ｖ １調製品に対する刺激指数を示す。刺激指数（ＳＩ）は、刺激されたサンプル（最も高濃度）の増殖（ｃｐｍ：１分あたりのカウント）をコントロールである培地の増殖（ｃｐｍ）で割って計算する。ＰＰＤは、ポジティブコントロールとして役立つミコバクテリウム結核菌由来の精製タンパク質を指し示す。
サイトカイン産生はＩＦＮ−γによって支配され、ＰＢＬ増殖に比例して増加した。Ｔｈ１／Ｔｈ２シフトの徴候は現れなかった（図４２〜４４）。図４２は、Ｔｈ０プロフィールを有する患者を示し、図４３はＴｈ１プロフィール、図４４はＴｈ２プロフィールを有する患者を示す。サイトカイン産生はｐｇ／ｍｌで測定してバーとして表示し、ＩＬ−５／ＩＦＮ−γ間の比は下方の点線である（右側のＹ軸）。増殖をｃｐｍで測定し、右側のＹ軸においてｃｐｍで測定した実線として示す。培地及びＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）をバックグラウンドコントロールとして含む。
ｎＢｅｔ ｖ １に対して八つのＴ細胞株が樹立され、一つを除き、その全てが全カバノキサンプルに対し等しく充分に増殖した。四つのＴ細胞株は、ＩＬ−５及びＩＦＮ−γ比に基づけば（Ｔｈ２ ＞ ５、５ ＞ Ｔｈ０ ＞０．２、０．２ ＞ Ｔｈ１）Ｔｈ０様サイトカインを分泌していた。三つのＴ細胞株はＴｈ１サイトカインを分泌しており、一つのＴ細胞株はＴｈ２サイトカインを分泌していた。ＩＬ−５／ＩＦＮ−γ比は、カバノキサンプルの違いによって影響されなかった。
結論：
ｎＢｅｔ ｖ １に対して特異的興奮を示した全ＰＢＬ培養物及び７／８のＴ細胞株は、ｒＢｅｔ ｖ １及びその変異体に対しても応答した。これらのデータは、Ｔ細胞刺激に関してＢｅｔ ｖ １の一つのイソフォーム又はその４つの変異体が、天然アレルゲン調製品に見出される個々のイソフォームの混合物を代用できることを示唆する。このように組換えアレルゲン又はその４つの変異体に基づくワクチンが、既存のＢｅｔ ｖ １特異的Ｔ細胞集団に対処するであろう。
【０１０４】
実施例１０
組換え体及び変異体Ｂｅｔ ｖ １タンパク質を用いた免疫に続くＢｅｔ ｖ １特異的ＩｇＧ抗体及び遮断抗体の誘導：
この節において「遮断抗体」という用語は、ヒトＩｇＥ抗体と異なり、抗原に結合可能であって抗原に対するヒトＩｇＥ抗体の結合を妨害することができる抗体を定義する。
組換えＢｅｔ ｖ １ ２２２７野生型タンパク質（ｒＢｅｔ ｖ １）及びＢｅｔ ｖ １ ２５９５、２６２８、２７４４及び２７７３変異体タンパク質がＢｅｔ ｖ １特異的ＩｇＧ抗体及び遮断抗体を誘導する能力を、マウスでの免疫実験において試験した。
ＢＡＬＢ／ｃＡマウス（各群８匹ずつ）を、腹腔注射によって組換えＢｅｔ ｖ １ ２２２７野生型タンパク質又は四つの変異体タンパク質で免疫した。このマウスを、１４日間の間隔で１用量を四回免疫した。前記異なるタンパク質を、１．２５ ｍｇ／ｍｌアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（水酸化アルミニウムゲル、１．３％ ｐＨ ８．０〜８．４、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）と複合化させた。前記マウスを、１ μｇタンパク質／１用量又は１０ μｇタンパク質／１用量のいずれかで免疫した。血液サンプルは、０、１４、３５、２１、４９及び６３日目に眼窩採血によって採取した。
特異的ＩｇＧ抗体レベルを、ｒＢｅｔ ｖ １でコートしたミクロタイタープレート及び検出抗体としてのビオチン化ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた直接的ＥＬＩＳＡによって分析した。組換えＢｅｔ ｖ １ ２２２７野生型タンパク質又はその四つの変異体タンパク質を用いた免疫は、強いｒＢｅｔ ｖ １特異的ＩｇＧ応答を誘導した。この知見は、前記四つの変異タンパク質がＢｅｔ ｖ １ ２２２７野生型タンパク質に対して高く交差反応性である抗体を誘導することが可能であることを実証する。
【０１０５】
遮断抗体の誘導を評価するため、カバノキ花粉アレルギー患者由来の血清サンプルをモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＥ抗体でコートした常磁性ビーズと共にインキュベートした。インキュベーション後、このビーズを洗滌し、緩衝液中、又は、免疫していないマウス（コントロール）若しくは上述のように免疫したマウス由来のマウス血清の希釈サンプル（１：１００）中に再懸濁させた。それから、このビーズ及びマウス血清抗体の混合物にビオチン化ｒＢｅｔ ｖ １を加えた。インキュベーション後、このビーズを洗滌し、アクリジニウム標識ストレプトアビジンを用いて結合したビオチン化ｒＢｅｔ ｖ １を検出した。免疫していないマウス由来の血清とビーズのインキュベーションは、ビーズに対するｒＢｅｔ ｖ １の結合性を変化させなかった。反対に、組換えＢｅｔ ｖ １ ２２２７野生型タンパク質又はその四つの変異体タンパク質で免疫したマウス由来の血清とビーズのインキュベーションは、ビーズに対するＢｅｔ ｖ １の結合性を著しく減少させ、血清サンプル中のＢｅｔ ｖ １特異的遮断抗体の存在を実証する。このように、６３日目には全高用量（１０ μｇ／１用量）免疫群由来の一つ以上の血清サンプルが、ビーズに対するｒＢｅｔ ｖ １の結合性を８０％より大きく減少させることができた。これらの知見は、前記四つの変異タンパク質がＢｅｔ ｖ １特異的遮断抗体として作用可能な抗体を誘導することが可能であることを実証する。
【０１０６】
（参考文献）
2004521618.tif 000059
2004521618.tif 000060
2004521618.tif 000061
2004521618.tif 000062
【図面の簡単な説明】
【図１】
変異体番号１のＢｅｔ ｖ １ に対して用いた変異体特異的オリゴヌクレオチドプライマーを示す。変異させたヌクレオチドは下線を引いてある。
【図２】
合成し、全ての変異体に対して用いた二つの一般的に適用可能なプライマー（「全センス」及び「全非センス」と表示）を示す。
【図３】
天然に存在するアレルゲンＢｅｔ ｖ １のＤＮＡおよびアミノ酸配列、及び、Ｂｅｔ ｖ １変異の番号を示す。
【図４】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １及びＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ４５Ｓｅｒ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
【図５】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １及びＢｅｔ ｖ １変異体Ａｓｎ２８Ｔｈｒ＋Ｌｙｓ３２Ｇｌｎによる、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
【図６】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １及びＢｅｔ ｖ １ Ｐｒｏ１０８Ｇｌｙ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
【図７】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １及びＢｅｔ ｖ １ Ｇｌｕ６０Ｓｅｒ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
【図８】
ほぼ等しい濃度で記録された、組換え変異体及び三つのパッチ変異体のＣＤスペクトルを示す。
【図９】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １及びＢｅｔ ｖ １三つのパッチ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １の結合の阻害を示す。
【図１０】
個々に整列させた抗原５の残基の溶媒接触性及びベスプラ抗原５配列アラインメントを示す（左パネル）。図１０の右パネルは、ベスプラ抗原５：ｓの中で保存された面積の抗原５の分子表面を示す。
【図１１】
センス鎖に由来するＶｅｓ ｖ ５のアミノ末端に対応するプライマー配列を示す。
下流プライマー配列は非センス鎖に由来する。
【図１２】
合成し、全変異体に対して用いた二つの一般的に適用可能なプライマー（「全センス」及び「全非センス」と表示）を表す。
【図１３】
天然に存在するアレルゲンＶｅｓ ｖ ５及び二つのＶｅｓ ｖ ５変異体のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１４】
非ビオチン化Ｖｅｓ ｖ ５及びＶｅｓ ｖ ５ Ｌｙｓ７２Ａｌａ変異体による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＶｅｓ ｖ ５の結合の阻害を示す。
【図１５】
ＩｇＥ架橋結合によるアレルゲン及び肥満細胞間の反応の理論的モデルを示す。
【図１６】
天然に存在するアレルゲンＤｅｒ ｐ ２のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図１７】
変異体を作製するために用いたプライマーを模式的に示す。（Ｉ）はセンス及びアンチセンスプライマーを示す。（ＩＩ）は、指示した位置に変異を含む最終的な組換えタンパク質を示す。
【図１８】
Ｂｅｔ ｖ １変異体の構築の説明図、及び、用いたプライマーの一覧表を示す。変異体は５〜９のアミノ酸を含む。
【図１９】
Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）の表面に導入された点変異を示す。Ｂｅｔ ｖ １（２６２８） 変異体では五つの第一変異がＢｅｔ ｖ １の半分に導入され、残り半分は変わらないままであった。Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）変異体では、五つの第一変異及び三つの第二変異が前記残り半分に導入され、前記半分は変わらないままであった。
【図２０】
ほぼ同一の濃度で記録された、組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）変異体の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
【図２１】
非ビオチン化Ｂｅｔ ｖ １．２８０１及びＢｅｔ ｖ １（２６２８）、Ｂｅｔ ｖ １（２６３７）、及び、１：１混合比のＢｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）による、アレルギー患者のプール由来の血清ＩｇＥに対するビオチン化組換えＢｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）の結合の阻害を示す。
【図２２】
Ｂｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図２３】
Ｂｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）、Ｂｅｔ ｖ １（２６２８）及びＢｅｔ ｖ １（２６３７）のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図２４】
Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）の表面での点変異を示す。
【図２５】
Ｂｅｔ ｖ １（２７５３）の表面での点変異を示す。
【図２６】
Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）及びＢｅｔ ｖ １（２７５３）の表面での点変異を示す。
【図２７】
ほぼ等しい濃度で記録されたＢｅｔ ｖ １（２７４４）（野生型）及びＢｅｔ ｖ １（２７４４）の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。
【図２８】
Ｂｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）及び変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図２９】
図２９Ａ〜Ｄは、Ｂｅｔ ｖ １．２８０１（野生型）及び変異体Ｂｅｔ ｖ １（２７４４）のヒト好塩基球細胞でのヒスタミン放出を示す。
【図３０】
Ｂｅｔ ｖ １（２７３３）の表面での点変異を示す。
【図３１】
Ｄｅｒ ｐ ２の部位特異的変異誘発のために用いたプライマーを示す。
【図３２】
他のグループ２のイエダニアレルゲンと共にＤｅｒ ｐ ２の配列一覧表を示す。
【図３３】
四つの異なる角度からのＤｅｒ ｐ ２の表面輪郭を示す。
【図３４】
四つの異なる角度からのＤｅｒ ｐ ２変異体の表面輪郭を示す。
【図３５】
図３５Ａ及びＢは、他のグループ１のイエダニアレルゲンと共にＤｅｒ ｐ １の配列一覧表を示す。
【図３６】
四つの異なる角度からのＤｅｒ ｐ １の表面輪郭を示す。
【図３７】
四つの異なる角度からのＤｅｒ ｐ １変異体の表面輪郭を示す。
【図３８】
図３８Ａ〜Ｄは、他のグループ５の草本アレルゲンと共にＰｈｌ ｐ ５の配列一覧表を示す。
【図３９】
図３９Ａ及びＢはそれぞれ、Ｐｈｌ ｐ ５モデルＡ及びモデルＢの四つの異なる角度からの表面輪郭を示す。
【図４０】
図４０Ａ及びＢはそれぞれ、Ｐｈｌ ｐ ５変異体モデルＡ及びモデルＢの四つの異なる角度からの表面輪郭を示す。
【図４１】
種々のＢｅｔ ｖ １調製品に対する刺激指標（ＳＩ）として表された末梢血リンパ球の増殖を示す。
【図４２】
種々のＢｅｔ ｖ調製品で刺激されたＴｈ０プロフィールを有する患者のＴ細胞のサイトカイン特性を示す。
【図４３】
種々のＢｅｔ ｖ調製品で刺激されたＴｈ１プロフィールを有する患者のＴ細胞のサイトカイン特性を示す。
【図４４】
種々のＢｅｔ ｖ調製品で刺激されたＴｈ２プロフィールを有する患者のＴ細胞のサイトカイン特性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
2004521618.tif 000100
【図３２−２】
2004521618.tif 000101
【図３２−３】
2004521618.tif 000102
【図３３】
2004521618.tif 000103
【図３４】
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【図３５Ａ−１】
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【図３５Ａ−２】
2004521618.tif 000106
【図３５Ａ−３】
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【図３５Ｂ−１】
2004521618.tif 000108
【図３５Ｂ−２】
2004521618.tif 000109
【図３５Ｂ−３】
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【図３６】
2004521618.tif 000111
【図３７】
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【図３８Ａ−１】
2004521618.tif 000113
【図３８Ａ−２】
2004521618.tif 000114
【図３８Ａ−３】
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【図３８Ｂ−１】
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【図３８Ｂ−２】
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【図３８Ｂ−３】
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【図３８Ｃ−１】
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【図３８Ｃ−２】
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【図３８Ｄ−１】
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【図３８Ｄ−２】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
2004521618.tif 000125
【図４０Ｂ】
2004521618.tif 000126
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521618.tif 000341
【国際調査報告】
2004521618.tif 000342
2004521618.tif 000343
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