(57)【要約】この発明は、α−ホスホグルコムターゼをコードする遺伝子の変異により、細胞外多糖類を過剰生産する乳酸菌に関する。この突然変異は、発酵製品の製造又は細胞外多糖類の生産に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ホスホグルコムターゼのｐｇｍ遺伝子が、全体に又は部分的に不活化されている、細胞外多糖類を過剰生産する乳酸菌の突然変異体。
【請求項２】
ｇａｌＵ遺伝子が、過剰発現される請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
乳酸菌が、ストレプトコッカス・テルモフィラスであることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１つに記載の変異体。
【請求項４】
ガラクトースを使用できるストレプトコッカス・テルモフィラス株から得られることを特徴とする、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
発酵製品を製造するための、請求項１〜４のいずれか１つに記載の乳酸菌の突然変異体の使用。
【請求項６】
細胞外多糖類を製造するための請求項１〜４のいずれか１つに記載の乳酸菌の突然変異体の使用。
【請求項７】
アミノ酸配列が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２で示されるα−ホスホグルコムターゼと少なくとも７０％の同一性又は少なくとも８５％の類似性を示す、α−ホスホグルコムターゼをエンコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、乳酸菌による外細胞性ヘテロ多糖の生産の制御に関する。
【０００２】
一般に、多糖類は、食品のみならず、化粧品及び医薬品の添加剤、例えば増粘剤及び／又はゲル化剤、テキスチャー安定化剤、代用油脂などとして多量に使用されている。こうして使用される多糖類のうち、特に微生物、具体的には細菌によって生産される多糖類、例えばデキストラン、キサンタン、ジェラン、プルランなどが挙げられる。
【０００３】
多くの乳酸菌種、特にラクトコッカス、例えばラクトコッカス・ラクティス、ロイコノストック、例えばロイコノストック・メゼンテロイデス、ストレプトコッカス、例えばストレプトコッカス・テルモフィラス及びラクトバシラス、例えばラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・サケ、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・デルブリュッキィ亜種ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びラクトバシラス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）などが、多糖類を生産する。
これらの多糖類は２つのカテゴリー： 単糖の重合により得られるホモ多糖類、例えばデキストラン、及び２以上の異なる糖（一般にＤ−ガラクトース、Ｄ−グルコース及びＬ−ラムノース）からなる基本単位が組み合わさった複雑な構造を有するヘテロ多糖類に分類することができる。
【０００４】
乳酸菌のヘテロ多糖類は、一般的な用語ＥＰＳ（細胞外多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ））として従来称されており、これを以降でも用いる。それらは、発酵乳製品のテキスチャー、口ざわり（ｍｏｕｔｈｆｅｅｌ）及びレオロジーの発生に主要な役割を果たしている。さらに、それらの幾つかは、健康に有用な種々の作用を発揮し得る生物活性を有することが認められている［レビュウには、ＤＥ ＶＵＹＳＴ 及びＤＥＧＥＥＳＴ， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２３， １５３−１７７， （１９９９）参照］。
【０００５】
しかし、乳酸菌によって生産されるヘテロ多糖類の量は一般に少ない（発酵製品Ｌ当たり１０〜２００ ｍｇのオーダー）。テキスチャーを改善するために、発酵製品の製造者は、他のテキスチャー剤、例えば安定化剤（改質澱粉、カラギーナン、グアー、ペクチン、ゼラチンなど）を加える。しかし、これらの添加は、（例えば天然のヨーグルトで）常に承認されているとは限らず、一般に製品の味と香りに影響を及ぼす。したがって、製品において外細胞性へテロ多糖類（ＥＰＳ）の生産を最適化することが、好ましい。
【０００６】
上記の、農製品（ａｇｒｏｆｏｏｄｓ）産業におけるＥＰＳの重要性から、多くの研究は、温度、ｐＨ及び培地の組成に対する作用によりバイオ技術処理を最適化することによる、その生産の増加法に関連している。しかし、これらの方法は、ある種の農製品処理、例えば培地と発酵条件が各製品タイプに特異的な発酵乳製品の生産に関して適用し難い場合がある。したがって、これらの生産は、ＥＰＳの生産を改善するために、処理を最適化する従来法の用途を余儀なく制限している。これらの方法の代替法は、これらの処理に適した株、つまり大量に、及び／又はＥＰＳの生産を発酵製品の製造条件下で制御し得る、ＥＰＳの生産が可能な株を用いることであろう。
【０００７】
乳酸菌によるＥＰＳ生産の主たる制限のひとつは、これらのＥＰＳの生合成と、利用可能な糖を用いるための他の代謝経路との競合に起因している可能性がある。実際、ホモ多糖類は培地中に存在する基質から特異的な細胞外酵素によって主に生産されるが、ヘテロ多糖類の合成は、細胞内の少なくとも一部で生じる。特に、トリホスフェートヌクレオチドとの反応で活性化される糖からなる、ヘテロ多糖類前駆体（ヌクレオチド糖）の形成は、他の代謝経路、特に解糖の一因となる細胞質内酵素を含むであろう。ここで、解糖反応は、乳酸菌の発酵代謝のために、ＥＰＳ合成に関連する反応よりかなり活性である。
発明者らは、ＥＰＳを生ずるために、培地で利用可能な糖、特にガラクトースを使用するための能力を制御し、特に増大し得る乳酸菌を得ることを目的とした。
【０００８】
この目的のため、ヌクレオチド糖の合成に関わる遺伝子、ＥＰＳの前駆体及び／又は解糖経路とＥＰＳ生合成との接点に関わる遺伝子を研究した。後者のうち、ガラクトースの代謝誘導体の解糖中間体への変換に関与するホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）の遺伝子、及びＥＰＳの前駆体であって、ヌクレオチド糖の形成を触媒するグルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼの遺伝子に、特に興味が置かれた。
ＤＥ ＶＵＹＳＴ及びＤＥＧＥＥＳＴ （上記文献）は、ホスホグルコムターゼは、解糖とＥＰＳ生合成とのあいだで重要な関連づけの役割を果たしている可能性があり、また、この酵素に炭素の流れ（ｃａｒｂｏｎ ｆｌｏｗ）の一部を流用すると、ＥＰＳ生産を増すことができるとの仮説を提唱している。しかし、彼らは、このことを有効に行えるかどうかが依然として確認されるべきであることも強調している。
【０００９】
ホスホグルコムターゼをエンコードする遺伝子［ＧＥＮＢＡＮＫ ＡＦ１６５２１８］をストレプトコッカス・ニューモニエで不活化させると、ＥＰＳを形成する細菌の莢膜の生産が劇的に低下し、この細菌は別のｐｇｍ遺伝子を有しているが、細胞の生存力もまた高度に損なわれることが、最近報告されている［ＨＡＲＤＹら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８５４−１８６３， （２０００）］。
α−ＰＧＭ及びβ−ＰＧＭの存在は、エル・ラクティスで報告されている；しかし、β−ＰＧＭに相当する遺伝子のみが単離されている［ＱＩＡＮら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４３， ８５５−８６５， （１９９７）］。乳酸菌のα−ＰＧＭをエンコードし得る遺伝子は、今日まで遺伝学的には特徴付けられていない。
【００１０】
ここで、発明者らは、ストレプトコッカス・テルモフィラスのα−ＰＧＭをエンコードするｐｇｍ遺伝子のクローニング及び特徴づけに成功した。
この遺伝子は、番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で添付の配列リストに示しており、相当するポリペプチドは番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２で示している。
【００１１】
この発明の対象は、アミノ酸配列が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２で示されるα−ＰＧＭと少なくとも７０％の同一性又は少なくとも８５％の類似性、好ましくは８０％の同一性又は少なくとも９０％の類似性、有利には少なくとも９０％の同一性又は少なくとも９５％の類似性、もっとも好ましくは少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９９％の類似性を示す、α−ＰＧＭをエンコードする核酸配列、及び該配列の２０ｂｐより多いいずれかのフラグメントである。
基準配列との配列の同一性％は、残基位置が最大限に一致するように２つの配列をアラインした際に、基準配列の残基と同一の、この配列の残基の％として定義される。アミノ酸配列が基準配列と少なくともＸ％の同一性を示すポリペプチドは、したがって、基準配列の１００アミノ酸当たり１００−Ｘ個までの修飾を含むことができる。これらの修飾には、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入が含まれ、それは連続的でも非連続的であってもよい。
【００１２】
基準配列との配列の類似性％は、残基の位置が最大限に一致するよう２つの配列をアラインした際に、基準配列の残基と同一であるか、又はひとつの同類置換によってのみ基準配列と異なるこの配列の残基の％としてここに定義される。用語「同類置換」は、タンパク質の機能特性を変えない類似の物理化学特性（大きさ、電荷又は極性）を有する別の残基でアミノ酸残基を置換することを意味することを意図する。したがって、アミノ酸配列が基準配列と少なくともＸ％の類似性を示すポリペプチドは、基準配列の１００アミノ酸当たり、１００−Ｘ個までの非保存修飾を含むことができる。これらの修飾には、アミノ酸残基の欠失、非同類置換又は挿入が含まれ、それらは連続的でも非連続的であってもよい。
【００１３】
したがって、既定パラメータでＢＬＡＳＴｐ プログラム［ＡＬＴＳＣＨＵＬら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ３３８９−３４０２， （１９９７）］を用いる「ＧＥＮＢＡＮＫ ｎｒ」データベースでの検索によって同定される、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２と最大の同一性又は類似性を示すポリペプチドは、以下のとおりである：
−　バシラス・サチリスのｙｂｂＴタンパク質： ５７％同一及び６９％ 類似；
−　スタフィロコッカス・アウレウスのｆｅｍＤタンパク質： ５３％ 同一及び６９％ 類似；
−　ストレプトマイセス・ケルコロールの仮説上のホスホグルコムターゼ： ４２％ 同一及び５５％ 類似；
−　シュードモナス・シリンゲのｍｒｓＡ同族体： ４１％ 同一及び５４％ 類似；
−　マイコバクテリウム・レプレのｍｒｓＡ同族体： ４１％ 同一及び５４％ 類似。
【００１４】
ＱＩＡＮら（上記公報）に記載されるエル・ラクティスのｐｇｍ遺伝子との有意なホモロジーは、認められなかった。ＨＡＲＤＹら（上記公報）に記載されるエス・ニューモニエのｐｇｍ遺伝子との同一性％は、３１％未満である。
発明者らは、エス・テルモフィラスのｐｇｍ遺伝子について部位特異的突然変異を行い、驚くべきことに、この遺伝子の全体又は一部の不活化がＥＰＳ生産の増加をもたらすことを認めた。
【００１５】
また、この発明の対象は、α−ホスホグルコムターゼのｐｇｍ遺伝子が全体又は部分的に不活化されている、ＥＰＳ過剰生産性の乳酸菌の突然変異体である。
この乳酸菌は、ストレプトコッカス及びラクトバシラスから選択される、中温性又は高温性の細菌であることが好ましい。一例としては、それは、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・テルモフィラス、リューコノストク・メゼンテロイデ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・デルブリュッキィ、ラクトバシラス・サケなどであってもよい。
【００１６】
ｐｇｍ遺伝子の不活化は、α−ＰＧＭをエンコードする配列及び／又はその発現を制御する配列に１以上の突然変異を行って生じてもよい。
特に、当業者にそれ自体で公知であり、所望の位置で、遺伝子に所定の変異を導入できる部位特異的突然変異技術を利用してもよい。
したがって、例えばコード配列又は制御配列、外因性配列、例えばトランスポゾンに導入することによって、ｐｇｍ遺伝子を不活化させることができる。
有利には、相同組換えによって、変異配列でｐｇｍの野生型配列を置換することもできる。この場合、連続的又は非連続的であり得る１以上のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換による１以上の修飾を、変異を意図する遺伝子領域のそれと同一の配列に行う。
【００１７】
この発明の好ましい具体例によれば、変異配列は、ベクターにクローンした細菌のＤＮＡフラグメントと細菌ゲノムの同族体領域との組換え（単純な乗換え）によって組み込みを可能にするベクターに挿入される。次に、ベクター配列を切除することにより、二次組換え事象（二重乗換え）を生じ、修飾型による野生型染色体形態に置換を生じることができる。
乳酸菌の染色体に外因性配列を組み込むことができるベクターは、それ自体公知で、多くの乳酸菌種に利用可能である； ベクターは、例えば非複製ベクター、不安定な複製ベクター又は条件付で複製するベクター、挿入配列を有するベクターなどであってもよい。
【００１８】
ある場合には、挿入を意図した変異配列を有するＤＮＡで、直接細菌を形質転換することも可能である。
この発明によるｐｇｍ遺伝子の突然変異体は、ランダム突然変異誘発（例えば化学的突然変異誘発又放射線）によっても得ることができる； それらは、その表現型特性に基づいてスクリーンすることによって乳酸菌の培養物から選択される天然の突然変異体であってもよい。
実際、α−ＰＧＭが部分的又は全体的に不活性な突然変異体は、ラクトースで正常に成長し、グルコース又はガラクトースのみでは極めてゆっくりと成長する。したがって、このような突然変異体は、天然の変異体であろうが、突然変異誘発から得られる変異体であろうが、この特性に基づいて直接選択することができる。
【００１９】
ｐｇｍ遺伝子における突然変異の存在及びこれらの突然変異の性質は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １から得られる核酸プライマー又はプローブ又は株を用いて、従来の分子生物学技術で容易に確認することができる。
望ましい場合には、ｐｇｍ遺伝子を誘導性プロモーターの転写制御下に置くことによって、例えば培養条件の目的として、ＥＰＳ生産を意のままに増加又は減少させることもできる。
また、発明者らは、エス・テルモフィラスのグルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをエンコードするｇａｌＵ遺伝子をクローンし、特徴付けた。この遺伝子を、番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で添付の配列リストに示す。この遺伝子でエンコードされるＧａｌＵタンパク質は、番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示す。
【００２０】
また、この発明の対象は、アミノ酸配列が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるグルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼと、少なくとも９０％の同一性又は少なくとも９５％の類似性、有利には少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９９％の類似性を示すグルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをエンコードする核酸配列である。
【００２１】
つまり、ＢＬＡＳＴｐ プログラム［ＡＬＴＳＣＨＵＬら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ３３８９−３４０２， （１９９７）］を用いて「ＧＥＮＢＡＮＫ ｎｒ」データベースで検索して同定される、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４と最大の同一性又は類似性％を示すポリペプチドは、以下のとおりである：
−　ストレプトコッカス・ミュータンスのグルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ： ８７％ 同一及び ９３％ 類似；
−　ストレプトコッカス・ニューモニエのＧａｌＵタンパク質： ８７％ 同一及び９３％ 類似；
−　ストレプトコッカス・ピオゲネスのＵＤＰ−グルコースピロホスホリラ−ゼ： ８４％ 同一及び ９０％ 類似；
−　ストレプトコッカス・ニューモニエのＣａｐ３Ｃタンパク質： ７６％ 同一及び８８％ 類似；
−　バシラス・サチリスのＵＤＰ−グルコースピロホスホリラ−ゼ： ５５％ 同一及び７４％ 類似。
【００２２】
ｇａｌＵ遺伝子を過剰発現することによって、その前駆体量を増して、ＥＰＳ生合成を増すことができる。
したがって、この発明の対象は、ｇａｌＵ遺伝子が過剰発現される、ＥＰＳを過剰生産する乳酸菌の突然変異体でもある。
このような突然変異体は、乳酸菌にこの遺伝子の１以上のコピーを導入し、及び／又は強力なプロモーターでそのプロモーターを置換することによって得ることができる。好ましくは、変異体は、部分的に又は全体的に不活性なα−ＰＧＭをも有する乳酸菌から得られる。
【００２３】
この発明による突然変異体株は、特にエス・テルモフィラス、特にガラクトースでのその成長能について選択されたエス・テルモフィラスの株から得てもよい。実際、この細菌では、ＥＰＳの生合成を制限する別の要因は、多くの株が、成長のためであれ、ＥＰＳの生合成のためであれ、ガラクトースを有効に使用しないとの事実に起因している可能性がある。
発明者らは、ガラクトースでの成長能について選択したエス・テルモフィラスのｇａｌ＋ 株は、大量のＥＰＳを合成できることを認めた。その成長にガラクトースを使用できるこれらのクローンを用いると、大量になると考えられる、コロニーを生ずる株を二次的に選択することができ、これにより、ＥＰＳが大量に合成される。
【００２４】
したがって、この発明による突然変異体の生産用原料としてエス・テルモフィラスのこれらのｇａｌ＋ 株を使用することは、そのＥＰＳの生産能をさらに改善する。
この発明による乳酸菌株は、ＥＰＳ含量を制御、特に増加することが望まれる発酵製品、特に食品の製造、またＥＰＳの製造に有利に用いることができる。
この発明は、この発明による乳酸菌株の入手及び使用の実施例に言及する以下のさらなる記載によって、明確に理解されるであろう。
【００２５】
実施例１： ＥＰＳ合成のためにより有効にガラクトースを用いるエス・テルモフィラス株の選択
Ａ）　ガラクトースを有効に使用できる株を、ＲＨＯＤＩＡ 及びＤＡＮＯＮＥのコレクション： ＲＤ４８８ （ＪＩＭ７４４６） （ＲＨＯＤＩＡ コレクション）及び ｅｘｔ １．５ （ＪＩＭ７４５９） （ＤＡＮＯＮＥ コレクション）からのエス・テルモフィラスの工業用酵母（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｌｅａｖｅｎｓ）の培養物を用いて選択した。
【００２６】
このため、ラクトース１％を含むＭ１７培地［ＴＥＲＺＡＧＨＩ 及びＳＡＮＤＩＮＥ， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２９， ８０７−８１３， （１９７５）］での１２時間培養物を、ガラクトース１％含有 Ｍ１７寒天プレートに沈積させ、４２℃で２日間インキュベートする。こうして得たコロニーをガラクトース１％含有Ｍ１７寒天プレートにストリークし、 一晩４２℃でインキュベートする。こうしてＭ１７ガラクトースで成長させたコロニーを回収し、ガラクトース１％含有液体Ｍ１７で４２℃で６時間成長させ、コレクションに入れる。他の培地、例えば糖の源を制御し得る、ＳＩＳＳＬＥＲら［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， Ｎｏ． １６， ８９８５−８９９０， （１９９９）］に記載の化学的に明らかな培地は、この選択のためにも用いることができる。
【００２７】
得られた株が、実際、より有効にガラクトースを使用できることを確認するために、これらの株及びその親株の成長を比較する。
以下のようにして、成長させる： １０ ｇ のウシ抽出物／ｌ （ＤＦＩＣＯ）を加え、ガラクトース１％を含むＢＥＬＬＩＫＥＲ培地（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０ｍｌ中の一晩前養物を１００倍に希釈し、糖（ショ糖、乳糖、グルコース又はガラクトース）２％含有Ｍ１７ 培地２ｍｌ中で４時間４２℃で成長させる。次いで、それらを、糖１％含有Ｍ１７培地２００μｌに２％で接種する。次いで、株の成長を、ＢＩＯＳＣＲＥＥＮシステム（ＬＡＢＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて追跡する。
図１は、工業上の株ＪＩＭ７４５９ （１Ａ）及びこの株から選択されたｇａｌ＋ 変異体（１Ｂ）の、種々の糖に対する成長を示す。
【００２８】
Ｂ）　成長にガラクトースをすでに使用できるクローンから、さらなる選択を行うことができる。体積が大きいと考えられるコロニー生産クローンを、次いでプレートで探索する。これらの株は、さらに有効にガラクトースを使用する。
図２は、工業上の株（ＪＩＭ７４４６， ＤＡＮＯＮＥ コレクション）の培養物から、上記Ａに記載のようにして選択したｇａｌ＋ 変異体（２Ａ）、及びコロニーの大きさに基づいて、このｇａｌ＋ 変異体の培養物から選択したｇａｌ＋＋ 変異体（２Ｂ）の種々の糖に対する成長を示す。
【００２９】
化学的に明らかな培地又はＭ１７培地でこれらの種々の株を成長させた後、 ｇａｌ＋ 変異体の細菌のペレットは野生型株のそれよりも繊維質（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）で、これが、得られた変異体とその親株とのＥＰＳ生産を異にしている可能性がある。これらの株のＥＰＳ生産は、化学的に明らかな培地８０ｍｌ中の培養物から測定した［ＳＩＳＳＬＥＲら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６， Ｎｏ． １６， ８９８５−８９９０， （１９９９）］。
成長後、培養物を１６０００ ｇ で１０ 分４℃で遠心分離する。細胞ペレットを除き、上清を２４時間４℃で沈澱させる（２容量の１００％エタノール／上清１容量）。沈澱後、１６０００ ｇで１５分４℃で遠心分離を行う。上清を除き、ペレットを水６０ ｍｌに再懸濁する。４日間、１日当たり水を３〜４回交換しながら、水に透析する。フェノール／硫酸法を用いて、ＥＰＳをアッセイする［ＤＵＢＯＩＳら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２８， ３５０−３５６， （１９５６）］。
【００３０】
７４４６ Ｇａｌ＋ 株及びより有効にガラクトースを使用できるこの株の変異体の場合に得た結果を、以下の表１に示す。
【００３１】
【表１】
2004500832.tif 000002
【００３２】
ガラクトース存在下での成長後、ガラクトースをより有効に用いる株は、ＥＰＳの量を増加する。
【００３３】
実施例２： ストレプトコッカス・テルモフィラスのＰＧＭ遺伝子のクローニング及び該遺伝子が不活性な変異体の構築
遺伝子のクローニング：
ストレプトコッカス・テルモフィラスのｐｇｍ遺伝子は、エス・テルモフィラスの染色体ＤＮＡから、リバースＰＣＲ（ＯＣＨＭＡＮら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）， ８， Ｎｏ． ８， ７５９−７６０， （１９９０））によって得ることができる。エス・テルモフィラスの染色体ＤＮＡを、制限酵素（ＢａｍＨｉ、 ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓＩ、ＸｈＩ）で消化し、切断生成物を環化し、次いで逆鎖に相補的なプライマー： ＯＳＴ１５、ＯＳＴ１６、ＯＳＹ２３〜ＯＳＴ２６ （表２）を用いるＰＣＲで増幅する。
【００３４】
【表２】
2004500832.tif 000003
【００３５】
得られたバンドをゲルから抽出し、シークエンスする。ｐｇｍ遺伝子及びそのフランキング領域からなるクローンフラグメントの配列を、番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で添付の配列リストに示す。
ストレプトコッカス・テルモフィラスのｐｇｍ遺伝子のオープンリーディングフレームの長さは、１３５０ ｂｐである。
【００３６】
ｐｇｍ遺伝子の変異体の構築
ｐｇｍ遺伝子の活性を低下させるために、発明者らは、相同組換えで遺伝子にベクターを挿入することによる不活化ストラテジを採用した。不活化の一般的なストラテジを、図３に示す。最初に、ｐｇｍ遺伝子に内在的なフラグメントを含む温度感受性複製プラスミドを、温度感受性複製ベクター ｐＧ＋ｈｏｓｔ ［ＢＩＳＷＡＳ ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７５， １１， ３６２８−３６３５， （１９９３）；　ＰＣＴ 出願ＷＯ／１８１１６４］を用いて構築した。それぞれｐｇｍ遺伝子の６５０ 及び８３５ ｂｐを示すオリゴヌクレオチドＯＳＴ２９＋ＯＳＴ３１ 及び ＯＳＴ２８＋ＯＳＴ３１を用いて作成した２つのＰＣＲフラグメントを、ｐＧ＋ｈｏｓｔにクローンし、プラスミドｐＳＴ２８ 及びｐＳＴ２９を作成した。
【００３７】
【表３】
2004500832.tif 000004
【００３８】
ｐＳＴ２８によって保持される６５０ ｂｐのフラグメントは遺伝子の中枢であり、したがって、その挿入は遺伝子の全体的な不活化を生じるものと予想される。ｐＳＴ２９によって保持される８３５ ｂｐのフラグメントは、翻訳開始コドンを有するが、そのリボソーム結合部位のない、遺伝子の５’位置に局在する部分を含む。染色体へのｐＳＴ２９の挿入は、ｐｇｍの翻訳を極めて大きく低下させ、極めて低い基本的な発現のみを可能にすることが、予想される。
プラスミドｐＧ＋ｈｏｓｔ、ｐＳＴ２８ 及びｐＳＴ２９を、エス・テルモフィラスの株ＪＩＭ７４４６ 及びＪＩＭ７４５９に３０℃で形質転換により導入し、次いで、図３に図示するように、単純な乗換えによって組み込んだ。単純な乗換えによる組み込みは、以下を変更して、ＢＩＳＷＡＳら［上記公報、（１９９３）］により記載されるプロトコルにしたがって行った：
【００３９】
プラスミドｐＧ＋ｈｏｓｔ又はその誘導体を含むストレプトコッカス・テルモフィラスの株を、エリスロマイシンの存在下で３０℃で一晩成長させ、次いで同一培地中で５０倍に希釈する。次に、それらを４２℃に６時間移す。次に、試料を希釈し、最初にエリスロマイシンを含むＭ１７プレートに４２℃でプレートアウトし、組み込み事象を見出し、次に抗生物質のないＭ１７プレートに３０℃でプレートアウトし、生存能力のある細胞の全数を検出する。細胞当たりの組み込み頻度を、これらのカウントの比から算出する。これらのプラスミドの組み込み頻度は、ｐＧ＋ｈｏｓｔ、ｐＳＴ２８ 及びｐＳＴ２９に対してそれぞれ３．５×１０−３、３×１０−３ 及び１０−２である。これらの組み込みそれぞれから得たクローンを単離し、株ＳＴＪ３、ＳＴＪ１ 及びＳＴＪ２それぞれを得た。
【００４０】
ＳＴＪ１ （ｐＳＴ２８）、ＳＴＪ２ （ｐＳＴ２９） 及びＳＴＪ３ （ｐＧ＋ｈｏｓｔ）の株を、グルコース及びガラクトースを含む化学的に明らかな培地のプレート、又はグルコースのみもしくはガラクトースのみのいずれかを含む同一培地のプレートで成長させた。得られた結果を、表４に示す。
【００４１】
【表４】
2004500832.tif 000005
【００４２】
したがって、ＳＴＪ１ 及びＳＴＪ２のクローンはグルコース又はガラクトースのみでは成長しないが、通常ラクトースもしくはグルコースとガラクトースの混合物で成長する。これは、グルコースとガラクトースの代謝が、この株で実際に分離していること、及び活性に影響を受ける遺伝子が実際にｐｇｍであることを示している。
これらの結果は、不活化遺伝子が、ＥＰＳ経路と解糖を連絡する酵素を明らかにエンコードしていることを示している。したがって、おそらくそれは、配列が乳酸菌でいまだ実験的に特徴付けられていないα−ＰＧＭをエンコードしている。
【００４３】
ｐｇｍ遺伝子に突然変異を有する ストレプトコッカス・テルモフィラス株ＳＴＪ２によって産生されるＥＰＳのアッセイ
上記実施例１に記載するように、ＥＰＳをアッセイする。
ｐｇｍ遺伝子の発現に関し影響を受けた株でのＥＰＳ生産は、２０ ｍｇ／ｌである。したがって、この生産は、親株７４４６ Ｇａｌ＋＋について得た８ ｍｇ／ｌに例えると、２．５倍の増加に相当する。
【００４４】
実施例３： 工業上の株から得たｐｇｍ 遺伝子変異体によるＥＰＳ生産
上記実施例２に記載のプラスミドｐＳＴ２９ を用い、工業上の株（ＤＡＮＯＮＥ コレクション） Ｅｘｔ １．１ （ＪＩＭ７４５５）及び Ｅｘｔ １．１０ （ＪＩＭ７４６４）を形質転換した。これらの株は、様々な組成（Ｅｘｔ １．１ について１−ｇｌｕ：２−ｇａｌ：１−ｇａｌＮａｃ 及びＥｘｔ １．１０について３−ｇａｌ：１−ｒｈａ）を有し、ＪＩＭ７４４６株によって生産されるもの（３−ｇｌｕ：４−ｇａｌ）と異なるＥＰＳを生じる。
【００４５】
エレクトロポレーションの後、細胞を１２時間３０℃でプレートアウトし、次にプレートを４２℃に置き、プラスミドに存在するｐｇｍ配列と染色体に存在する配列との相同組換えによってｐｇｍ遺伝子にプラスミドｐＳＴ２９を組み込ませる。エリスロマイシンの存在下、４２℃で成長しうる突然変異細菌のコロニーを得た。これらの細菌は、グルコース及びガラクトースの存在下、ＣＤＭ（化学的に明らかな培地）で成長することもできるが、グルコースのみ又はガラクトースのみの存在下では成長できない。
プラスミドｐＳＴ２９で形質転換した株について、エリスロマイシンの存在下（５ μｇ／ｍｌ）、２％ ラクトース、１．５％ カジトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）及び１０ ｍＭユレアを含むＣＤＭ １０ｍｌ中で形質転換又は非形質転換の株を培養した。種々の株によって生産したＥＰＳは、４２℃で６７．５時間培養した後、アッセイした。得られた結果を、以下の表５に示す。
【００４６】
【表５】
2004500832.tif 000006
【００４７】
本発明によってｐｇｍ遺伝子が不活化される株は、等しいバイオマスで、由来源の株の２〜２．５倍のＥＰＳを生じることが認められる。
【００４８】
実施例４： 二重乗換えによるｐｇｍ遺伝子の変異体の構築
内部変異によって不活化したｐｇｍ遺伝子を含むベクターｐＳＴＪ６を、マトリクスとしてプラスミドｐＳＴ２９、及び点突然変異を有するｐｇｍ遺伝子の配列から得られ、特にＮｓｉＩ部位の形成を誘導する以下のプライマーを用いて、リバースＰＣＲ増幅によって構築した。
【化１】
2004500832.tif 000007
【００４９】
プライマーに導入した変異に下線を付す： 形成したＮｓｉＩ部位を斜体で示す。
ＰＣＲ産物をＮｓｉＩで切断し、それ自体に再連結し、ベクター ｐＳＴＪ６を得る。
このベクターは、エス・テルモフィラスＪＩＭ７４４６への形質転換により導入する。
コロニーを３０℃で１２時間プレートアウトし、次いで２４時間４２℃で成長させ、プラスミドに存在するｐｇｍ配列と染色体に存在する配列との組換えによって、最初の乗換えを介して染色体にベクターを組み込ませる。こうして得た、エリスロマイシン耐性で、４２℃で成長しうるコロニーを、次いで３０℃で成長させ、ｐＧ＋ｈｏｓｔ配列のいずれかの側に存在するｐｇｍ配列間の組換えによる二次乗換えで、ｐＧ＋ｈｏｓｔプラスミド配列の切除を促進する。次に、エリスロマイシンでの選択がない４２℃での成長段階によって、細胞からｐＧ＋ｈｏｓｔを除く。こうして得た株は、もはやベクターｐＧ＋ｈｏｓｔの配列を全く含まず、特に抗生物質耐性の遺伝子を含まない。
【００５０】
それは、ｐｇｍ遺伝子の一部に変異が存在することによってのみ、エス・テルモフィラスの由来株ＪＩＭ７４４６と異なる。ｐｇｍ遺伝子のこの部分の最初の配列と変異配列を、以下に示す； 突然変異に下線を付す。
最初の配列：
【化２】
2004500832.tif 000008
突然変異の配列：
【化３】
2004500832.tif 000009
【００５１】
突然変異株は、上記実施例２及び３に記載した、ｐｇｍ変異に特徴的な表現型を有する。それは、グルコースとガラクトースの存在下ＣＤＭで成長できるが、グルコースのみ又はガラクトースのみの存在下では成長できない。この株によるＥＰＳ生産の親株に対する増加は、実施例２及び３に記載される、ｐＳＴ２９で形質転換した株の場合に認められるものに匹敵している。
【００５２】
実施例５： ＧＡＬＵを過剰生産する変異体の構築
グルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをエンコードするｇａｌＵ遺伝子のクローニング
全ｇａｌＵ遺伝子は、逆鎖に相補的なプライマー（ＯＳＴ１３、ＯＳＴ１４、ＯＳＴ２１ 及び ＯＳＴ２２） （表６）を用いて、エス・テルモフィラスの染色体ＤＮＡからリバースＰＣＲ ［ＯＣＨＭＡＮら、（１９９０）、上記公報］によって得ることができる。
【００５３】
【表６】
2004500832.tif 000010
【００５４】
得られたバンドをゲルから抽出し、シークエンスする。
ｇａｌＵ 遺伝子からなるクローンフラグメントの配列を、番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で添付の配列リストに示す。
ｇａｌＵ遺伝子の大きさは、９１４ ｂｐである。
【００５５】
ＧａｌＵの過剰発現
ｇａｌＵ遺伝子（ターミネーター及びそのリボソーム結合部位を有する）を、オリゴヌクレオチドＯＳＴ４４ 及びＯＳＴ４５ （表７）で増幅し、ＡｐａＩ部位のエル・ラクティスのｐ４５ プロモーター［ＳＩＢＡＫＯＶら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５７， ３４１−３４８， （１９９１）］の下流にクローンした。
【００５６】
【表７】
2004500832.tif 000011
【００５７】
Ｐ４５、次いでｇａｌＵを有する得られたプラスミドのＳｍａＩフラグメントを精製し、エス・テルモフィラスで複製するベクターｐＧＫＶ２５９のＳｍａＩ部位に挿入した。 Ｐ４５プロモーターの制御下でｇａｌＵ遺伝子を発現するプラスミドｐＧＫＶ２５９ ［ＶＡＮ ＤＥＲ ＶＯＳＳＥＮら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５３， ２４５２−２４５７， （１９８７）］を、ｐＳＴＪ４と称する（図４）。このプラスミドを、エス・テルモフィラスの株 ＪＩＭ７４４６ もしくはＪＩＭ７４５９又はｐｇｍ遺伝子に突然変異を含む株（ＳＴＪ２）に形質転換により導入する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
工業上の株ＪＩＭ７４５９ （１Ａ）及びこの株から選択されたｇａｌ＋ 変異体（１Ｂ）の、種々の糖に対する成長を示す。
【図２】
工業上の株（ＪＩＭ７４４６， ＤＡＮＯＮＥ コレクション）の培養物から、上記Ａに記載のようにして選択したｇａｌ＋ 変異体（２Ａ）、及びコロニーの大きさに基づいて、このｇａｌ＋ 変異体の培養物から選択したｇａｌ＋＋ 変異体（２Ｂ）の種々の糖に対する成長を示す。
【図３】
不活化の一般的なストラテジを示す。
【図４】
Ｐ４５プロモーターの制御下でｇａｌＵ遺伝子を発現するプラスミドｐＧＫＶ２５９を、ｐＳＴＪ４と称する。
【図１】
2004500832.tif 000012
【図２】
2004500832.tif 000013
【図３】
2004500832.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004500832.tif 000015
2004500832.tif 000016
2004500832.tif 000017
2004500832.tif 000018
2004500832.tif 000019
2004500832.tif 000020
2004500832.tif 000021
2004500832.tif 000022
2004500832.tif 000023
2004500832.tif 000024
2004500832.tif 000025
2004500832.tif 000026
2004500832.tif 000027
2004500832.tif 000028
2004500832.tif 000029
2004500832.tif 000030
2004500832.tif 000031
2004500832.tif 000032
2004500832.tif 000033
2004500832.tif 000034
2004500832.tif 000035
2004500832.tif 000036
2004500832.tif 000037
2004500832.tif 000038
2004500832.tif 000039
2004500832.tif 000040
2004500832.tif 000041
2004500832.tif 000042
2004500832.tif 000043
2004500832.tif 000044
2004500832.tif 000045
2004500832.tif 000046
2004500832.tif 000047
2004500832.tif 000048
【国際調査報告】
2004500832.tif 000049
2004500832.tif 000050
2004500832.tif 000051
2004500832.tif 000052
2004500832.tif 000053
2004500832.tif 000054
2004500832.tif 000055
2004500832.tif 000056