(57)【要約】トウモロコシのミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＭＩＰシンターゼ）遺伝子およびＭＩＰシンターゼ遺伝子に由来する新規な胚特異的調節配列は、植物の遺伝子工学に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＩＰシンターゼプロモーターを含んで成る単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号２の塩基対７〜２０６４、または植物細胞中でプロモーターとして機能する能力を保持するそのような配列のフラグメント、遺伝的変異体または欠失を含んで成る請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号２の塩基対７〜２０６４により定められる配列の２００個の連続する塩基対と同一の少なくとも２００個の連続する塩基対を含んで成る、請求項３に記載の分子のフラグメント、遺伝的変異体または欠失。
【請求項４】
配列番号２の塩基対７〜２０６４に説明される配列の２０個の連続する塩基対部分に配列が同一な２０個の塩基対のヌクレオチド部分を有する単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】
ヘテロロガスな核酸配列に操作可能に連結された、配列番号２と選択的にハイブリダイズするプロモーターを含んで成る、ＤＮＡ構築物。
【請求項６】
プロモーターが配列番号２の塩基対７〜２０６４を含んで成る、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
ａ）ヘテロロガスな核酸配列に操作可能に連結されたＭＩＰシンターゼプロモーターを含んで成るベクターを植物細胞に導入し；そして
ｂ）該細胞から植物を再生させる、
ことを含んで成る、植物中のヘテロロガスな核酸配列の発現法。
【請求項８】
ａ）ヘテロロガスな核酸配列に操作可能に連結されたＭＩＰシンターゼプロモーターを含んで成るベクターを植物細胞に導入し；
ｂ）該細胞から植物を再生させ；そして
ｃ）該ヘテロロガスな核酸配列に操作可能に連結された該ＭＩＰシンターゼプロモーターを子孫に有性生殖により伝達させる、
ことを含んで成る種子の生産法。
【請求項９】
上記子孫により生産された種子を集める追加の工程を含む、請求項８に記載の種子の生産法。
【請求項１０】
請求項５に記載のＤＮＡ構築物を含む少なくとも１つの植物細胞を含んで成る形質転換した植物。
【請求項１１】
請求項５に記載のＤＮＡ構築物を含む種子または穀物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、植物の遺伝子工学に有用なＤＮＡ配列および構築物を提供する。より詳細には本発明は、トウモロコシのミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＭＩＰシンターゼ）をコードする単離されたＤＮＡ配列、およびトランスジェニック植物の胚組織中で種々の核酸配列の発現を駆動するために使用することができるＭＩＰシンターゼ遺伝子に由来する新規調節配列を提供する。
発明の背景
植物の遺伝子工学プロジェクトには、導入遺伝子の発現を調節するために使用する種々の遺伝子要素に対する取り組みが必要である。第１の例は、転写の開始を調節するプロモーターである。
【０００２】
植物の遺伝子工学に使用するためには、種々のプロモーターが存在する必要がある。特に、胚組織で特異的に発現を駆動するプロモーターの存在が必要である。
配列の簡単な説明
配列番号１は、トウモロコシのＭＩＰシンターゼのＤＮＡ配列である。
【０００３】
配列番号２は、トウモロコシのＭＩＰシンターゼのアミノ酸配列である。
【０００４】
配列番号３は、胚に特異的なトウモロコシのＭＩＰシンターゼプロモーターに関するＤＮＡ配列である。
発明の要約
本発明は、トウモロコシのＭＩＰシンターゼをコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。
【０００５】
本発明の別の観点では、本発明は配列番号３に対応するかまたは由来する胚に特異的なトウモロコシのＭＩＰシンターゼプロモーターを提供する。
【０００６】
本発明の別の観点では、本発明は５’から３’方向へ操作可能に連結された、
ａ）トウモロコシのＭＩＰシンターゼプロモーター；
ｂ）目的のＤＮＡ配列；および
ｃ）３’ＵＴＲ、
を含んで成るＤＮＡ構築物を提供する。
【０００７】
本発明の別の観点では、本発明はトウモロコシのＭＩＰシンターゼプロモーター、好ましくは配列番号３のｂｐ７〜２０６４を含んで成るプラスミドを提供する。
【０００８】
本発明の別の観点では、本発明は本発明のＤＮＡ構築物を含む少なくとも１つの植物細胞を含んで成る形質転換された植物を提供する。この植物は単子葉植物または双子葉植物でよい。好適な植物はトウモロコシ、イネ、ワタおよびタバコである。
【０００９】
本発明の別の観点では、本発明は本発明のＤＮＡ構築物を含む種子および穀物を提供する。
発明の詳細な説明
本発明の構築物中に使用する目的ＤＮＡ配列は、植物中での発現または下方調節（ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ）を望む任意の遺伝子でよい。好ましくは有用な遺伝子は、除草剤、昆虫またはウイルスに対する耐性を付与する遺伝子、および改善された栄養価または植物の加工特性を提供する遺伝子である。
【００１０】
適当な作物学的に有用な遺伝子の例には、昆虫耐性を付与するためのバチルス サーリンギエンシンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来する殺昆虫遺伝子、および５’−エノールピルビル−３’−ホスホシキメートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子、およびグリホセート除草剤に対する耐性を付与するそれらの任意の変異体を含む。当業者には容易に理解されるように、所望の特質を付与する、または重要なタンパク質を生産する作物学的に重要な遺伝子を使用することができる。
【００１１】
本発明の構築物に使用する３’ＵＴＲ、すなわち３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの効率的なプロセッシングを与えるものであり、メッセージの安定性を維持し、そして転写されたｍＲＮＡ配列の３’末端へのアデノシン リボヌクレオチドの付加を支配する。３’ＵＴＲはプロモーター領域に自然なもの、構造遺伝子に自然なもの、または別の起源に由来するものでもよい。植物宿主中で発現することができる遺伝子から得られる広範な終結領域、例えば細菌性、オパイン、ウイルス性および植物遺伝子が利用可能である。適当な３’ＵＴＲには限定するわけではないが：例えばｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ（国際公開第９８／５６９２１号明細書）、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ、ｔｍＬ ３’、またはａｃｐ ３’を含む。
【００１２】
本発明は一般に、単子葉植物および双子葉植物の両方の構造遺伝子の発現に応用することができる。本発明は特に限定するわけではないがトウモロコシ、イネ、オオムギ、エンバク、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤマイモ、タマネギ、バナナ、ヤシおよびチツメヤシを含む単子葉植物（単子葉）ファミリーの員に適当である。本発明の好適な応用は、トランスジェニックトウモロコシ植物の生産である。本発明はイネ科（Ｇｒａｍｉｎａｃｅａｅ）のファミリー、特にトウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギおよびモロコシに応用することができる。双子葉植物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズおよびカノーラ（ナタネ）を含む。
【００１３】
また本発明は、ＤＮＡ配列が発現に開示した効果を及ぼすことができるように、具体的に開示した調節配列と実質的な配列相同性を有するＤＮＡ配列も含む。
【００１４】
本出願で使用するように、用語「実質的な配列相同性」とは、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡの場合）あるいはアミノ酸配列（タンパク質またはポリペプチドの場合）が、別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的な、機能的なまたは構造的な均等を表すことを示すために使用する。実質的な配列相同性を有する配列間の任意の機能的または構造的差異は最少になるだろう：すなわちそれらは本出願で示すように機能するための配列の能力に影響を及ぼさない。本明細書に開示する配列と実質的な配列相同性を有する配列は通常、突然変異のような開示した配列の変異体であるが、合成配列でもよい。
【００１５】
ほとんどの場合で、本明細書に具体的に開示する配列と９５％の相同性を有する配列は均等物として機能し、そして多くの場合でかなり低い相同性、例えば７５％または８０％も許容されるだろう。重要ではないこれらの配列の部分の配置には時間を要するが、当該技術では日常的であり、そして十分である。
【００１６】
上記配列に対応する配列は野生型に由来する配列中に１以上の修飾を含むことができるが、それでも各々の要素を本発明の教示に匹敵できるようにすることを意図する。例えば上記のように、フラグメントを使用してよい。種々のヌクレオチドの限られた数の付加、欠失または非保存的置換、あるいは多くのヌクレオチドの保存的置換を含む修飾を単離した配列に包含することができる。さらにそのようなＤＮＡ分子の構造には、それらの調節制御下に置かれたヘテロロガスな遺伝子の発現の強化を付与することを示した供給源を使用することができる。オリゴヌクレオチド配列を修飾するための例示的な技法には、ポリヌクレオチドが媒介する、部位特異的な突然変異誘発法を使用することを含む。Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４），ＤＮＡ，３：４７９−４８８；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：７３５１−７３６７；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７：５１−５９，Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７：６１；およびＰＣＲ法：ＤＮＡ増幅の原理と応用（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｅｒｌｉｃｈ（編集）（１９８９）を含む。
【００１７】
生物材料を宿主細胞に導入するための通例の技法には、電気穿孔（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５６−８６０；およびＰｏｗｅｌｌ，ｅｔ ａｌ（１９８８），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４：６５５−６６９を参照にされたい）；直接的なＤＮＡ取り込みメカニズム（Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ｈｉｇａ（１９７２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３：１５９−１６２；Ｄｉｔｙａｔｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９７２），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２８１：３１９−３２３；Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９７９），Ｃｅｌｌ，１６：７７；およびＵｃｈｉｍｉｙａ，ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ｐｒｏｃ．５ｔｈ Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ，Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅで，Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａ（編集），Ｊａｐ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｐｌａｎｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，ｐｐ．５０７−５０８を参照にされたい）；融合メカニズム（Ｕｃｈｉｄａｚ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）、生きている哺乳動物細胞への高分子の導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｉｎｔｏ Ｖｉａｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ）で、Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．（編集） Ｗｉｓｔａｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，１：１６９−１８５を参照にされたい）；感染剤（Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８６），ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，４；１−４６）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６：４０１−４０９を参照にされたい）；マイクロインジェクションメカニズム（Ｃｒｏｓｓｗａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０２：１７９−１８５を参照にされたい）；および高速発射メカニズム（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ，ＳｋｏｋｕｔおよびＧｏｕｌｄ（ダウケミカルカンパニー）への欧州特許第０ ４０５ ６９６号明細書を参照にされたい）。
【００１８】
選択した宿主細胞を形質転換するための適切な手順は、使用する宿主細胞に従い選択することができる。今日までの経験に基づき、いったん細胞に挿入されれば遺伝子の発現にそれほど差異はなく、形質転換の方法自体に起因し得ると思われる。いったん植物組織に導入されれば、構造遺伝子の発現は一過性の発現系でアッセイすることができ、あるいは植物ゲノム内への安定な組込みについて選択した後に測定することができる。
【００１９】
技法は植物組織のインビトロ培養、および多くの場合で全植物への再生について知られている。成熟トランスジェニック植物を作出する適当な手順は、使用する植物種に従い選択することができる。再生は植物の種毎に変動する。効率的な再生は、培地、遺伝子型および培養の経過に依存するだろう。いったん全植物が得られれば、それらは少なくとも１つの配列のコピーは子孫の細胞に存在する様式で、有性生殖によりまたはクローンにより複製することができる。再生した植物に由来する種子は将来の使用に備えて集め、そしてこの種子から植物を生育することができる。元の形質転換した植物から市販されている有用な栽培種へ導入された遺伝子を転移させるための手法は、当業者には周知である。
【００２０】
本発明の１つの観点では、本発明は機能的な植物プロモーターを提供するＭＩＰシンターゼプロモーターの任意の欠失変更体を包含するものとみなす。そのようなプロモーターは、用語「ＭＩＰシンターゼプロモーター」に包含される。実施例４のように試験した時、配列がバックグラウンドより高いレベルの一過性のＧＵＳ発現を与えるならば、配列は本出願の目的のための「機能的プロモーター」を提供するとみなす。当業者は２０５８ｂｐ配列（配列番号３のｂｐ７〜２０６４）に由来する種々の欠失は、プロモーターとしての配列の機能性を破壊することなく作成できると理解するだろう。欠失実験は当該技術分野の技術範囲である。好ましくは本発明のプロモーターは、配列番号３のｂｐ７〜２０６４により定められる配列の２００個の連続する塩基対と同一の２００個の連続する塩基対を含んで成る。より好ましくは、配列番号３のｂｐ７〜２０６４により定められる配列の５００個の連続する塩基対に同一の５００個の連続する塩基対を含んで成るプロモーターである。
【００２１】
以下の実施例では、ＤＮＡ精製、制限酵素消化、アガロースゲル分析、ＤＮＡフラグメントの単離、ライゲーションおよび形質転換の標準法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）；モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｄ）、第２版、（コールドスプリングハーバー；コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編集、（１９８７）；および分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ニューヨーク：ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）に記載されているように使用した。
【００２２】
【実施例】
実施例１
ＭＩＰシンターゼをコードするトウモロコシｃＤＮＡのクローニング
Ａ．縮重プライマーを使用したトウモロコシＭＩＰシンターゼプローブの単離
プローブは、酵母ＭＩＰシンターゼのアミノ酸配列から設計した縮重プライマーを使用して、トウモロコシの胚のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した。酵母ＭＩＰシンターゼ配列のみが知られていた時点で（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｅｎｒｙ，Ｓ．（１９８９）。酵母におけるイノシトールの生合成：ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＥＣ ５．５．１．４）の１次構造およびその構造遺伝子、ＩＮＯ１座の機能的分析 （Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｉｎ Ｙｅａｓｔ：Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｙｏ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−１−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＥＣ ５．５．１．４）ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｇｅｎｅ，ｔｈｅ ＩＮＯ１ Ｌｏｃｕｓ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２７４−１２８３）、ＭＩＰシンターゼタンパク質配列の「保存」領域を同定することは不可能であった。代わりに１または２のコドンによりコードされるそのようなアミノ酸が、酵母タンパク質配列中で同定された。これらの低い重複アミノ酸の５以上の延長物をプライマー設計のための領域として選択した。
【００２３】
酵母ＭＩＰシンターゼと同一性を有するタンパク質に翻訳され得るクローン（ＭＰ１８）を同定した。ＭＩＰ１８の挿入物をゲル精製し、３２Ｐで標識し、そしてラムダトウモロコシ胚ｃＤＮＡライブラリーを釣り上げるために使用した。
Ｂ．トウモロコシのＭＩＰ陽性ｃＤＮＡの単離
ファージ平板法、プラーク精製およびインビボ切り出しのプロトコールは、製造元（ストラタジーン：Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ、ラジョラ、カリフォルニア州）に薦められた通りであった。幾つかの変更を加え、そしてそれらを以下に記する。
【００２４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＸＬ−１ ｂｌｕｅは、５２０ｎｍで１．０の光学密度で０．２％マルトースを含有するＮＺＹ培地で増殖させた。細胞を低速遠心により集め、そして１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に同じ密度で再懸濁した。細胞は４℃で数日間保存し、プラーク形成効率にはほとんど損失がなかった。ファージはＦａｌｃｏｎ２０５９管中で室温にて１５分間、続いて３７℃で１５分間、２００μＬの細胞に前吸着させた。細胞は４８℃でＮＺＹプレート上の３ｍＬのＮＹＺアガロース中にまいた。プレートは３７℃で一晩インキューベーションした。
【００２５】
プレートを冷却し、０．２２ミクロンのナイロンフィルターをプレートにやさしくかけ、そしてファージを２分間、吸着させた。次いでフィルターは、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌで飽和したブロッティングペーパーに５分間移した。フィルターを５分間乾燥させ、次いで０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１．５Ｍ ＮａＣｌの中和溶液で飽和したブロッティングペーパーに１５分間移した。次いでフィルターは、ストラタジーンＵＶ架橋−リンカーを使用して「自動」設定で架橋結合した。次いでフィルターは２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを２回変えて洗浄した。プレハイブリダイゼーションは、４２℃で６×ＳＳＣ、１０×デンハーツ溶液、０．１％ ＳＤＳ、２００ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡ中、最低６時間であった。
【００２６】
ＤＮＡフラグメントは、キアジェン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）（チャッツワース、カリフォルニア州）のＱｉａｅｘ 精製法を使用して単離した。ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）Ｒａｎｄａｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡラベリングキット（インディアナポリス、インディアナ州）を製造元の使用説明に従い使用した。取り込まれなかったヌクレオチドは、製造元の推薦に従いストラタジーンＰＵＳＨカラムに通すゲル濾過により除去した。
【００２７】
低緊縮ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、１０×デンハーツ溶液、０．１％ ＳＤＳ、２００ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡ、４２℃、６時間であった。低緊縮洗浄は、４０℃、６×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、全部で２リットルを４回交換した。
【００２８】
高緊縮のためのハイブリダイゼーション溶液は、５０％脱イオン化ホルムアミドに調整したことを除き、上記の通りであった。洗浄条件は、０．１％ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６０℃、全部で２リットルを４回交換した。
【００２９】
１次スクリーニングでは、２重フィルター上に出現した多くの陽性プラークを生じた。陽性プラークの頻度は１％に達し、遺伝子が胚で高度に発現していることが示された。幾つかのプラークを取り出し、そして第２および第３回のスクリーニングを行った。８つの個別のプラークを純粋なストックから取り出し、そしてｃＤＮＡ挿入物の分析のためにプラスミドを取り出した（ｒｅｓｃｕｅｄ）。
【００３０】
８つのＭＩＰシンターゼ陽性クローンを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ−１で消化し、ベクターから挿入物を離した。酵母の配列に基づき、約２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を予想し、これは５００アミノ酸のコード容量および非翻訳配列の数百塩基対を含む。２つのクローンが２ｋｂマーカーと同時に移動した挿入物を含んだ。他の６つのクローンは、サイズが有意に小さい挿入物を含み、そしてさらに特性を決定しなかった。約２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を持つ１つのクローンを、ＤＮＡ配列分析のために選択し、このクローンをクローンｐＭＩＰ−７と命名した。
Ｃ．トウモロコシのＭＩＰシンターゼｃＤＮＡのＤＮＡ配列分析
トウモロコシのＭＩＰシンターゼに関するＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を、配列番号１に示す。ｃＤＮＡは１９５９ヌクレオチド長である。最も５’のＡＴＧは、１３７位に位置し、１３６ヌクレオチドの推定上の５’非コード領域を与える。大きなオープンリーディングフレイムが１３７位のＡＴＧから１６６７位の終結コドンに延びている。リーディングフレイムは、５１０アミノ酸のポリペプチドをコードする。ストップコドンは１６６７位に位置し、これには３’非翻訳領域の２４８ヌクレオチドが続く。短いポリ（Ａ）域が１９１８位に位置している。
【００３１】
実施例２
種子における組織特異的および発育的パターンの分析
マイコジェン（Ｍｙｃｏｇｅｎ）所有のトウモロコシ遺伝子型ＣＳ６０８、ＨＯ１、ＣＱ８０６、ＯＱ４１４およびＨｉＩＩ、ならびに市販されている同系Ｂ７３は、標準的な温室条件下で生育させた。ＭＩＰシンターゼプロモーターの組織特異的な遺伝子発現を分析するために、組織を目的の発育時期に収穫し、そしてＲＮＡ抽出まで−７０℃で保存した。種子の胚中でＭＩＰの一過性発現パターンを測定するために、穀粒は受粉後の異なる日（ＤＡＰ）にＣＱ８０６およびＨＯ１の穂から切り出した。収穫後、穀粒を直ちに切開し、胚を集め、そしてドライアイス上の５０ｍｌのコニカル管中で凍結した。ＲＮＡを抽出し、そして標準的な技法を使用してノーザン分析用に調製した。ＭＩＰシンターゼハイブリダイゼーションプローブは、プラスミドｐＭＩＰ７（説明については実施例１を参照にされたい）から、ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１を用いた消化、続いて約１９５０ｂｐの挿入物のゲル精製により調製した。２５ナノグラムのゲル精製したフラグメントは、５０μＣｉ［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ リサーチ プロダクツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を用いて、ＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ標識ビーズ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を製造元に従い使用して標識し、そしてＮＵＣＴＲＡＰプッシュカラム（ストラタジーン）で精製した。標識したプローブは５分間煮沸して変性させ、氷上で５分間冷却し、そしてプレハイブリダイゼーションブロットに直接加えた。ハイブリダイゼーションはＳＥＡＬ−Ａ−ＭＥＡＬ バッグ（ＤＡＺＥＹ 社、インダストリアルエアポート、ＫＡ）中、４２℃で１６時間行った。ブロットは６０℃で予め暖めた大過剰（５００ｍＬ）の洗浄溶液［２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ］で３０分間、６回洗浄した。ハイブリダイゼーションの結果は、試験したトウモロコシの各遺伝子型に由来する胚組織中でＭＩＰシンターゼが発現したことを示した。胚中の最大の発現は、１８〜２７ＤＡＰで観察された。葉および根では有意な発現は観察されなかった。これらのデータは、ＭＩＰシンターゼの発現が胚組織で優先的に調節されたことを示唆した。
【００３２】
実施例３
トウモロコシのＭＩＰシンターゼ遺伝子に由来する５’非翻訳領域のクローニング　トウモロコシのＭＩＰシンターゼ５’フランキング配列を、トウモロコシのゲノムＤＮＡ、ｖａｒ．ＯＱ４１（アグリシキェネティックス社（Ａｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）の所有する系、ｄ／ｂ／ａ マイコジェン種子（Ｍｙｃｏｇｅｎ Ｓｅｅｄｓ））から単離した。ＤＮＡシークエンシングは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ シークエンシングキットを使用してＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ポリメラーゼＦＳを製造元（パーキン エルマー／アプライド バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）部門、フォスター市、カリフォルニア州）による説明のように用いて行った。シークエンシング反応は、アプライドバイオシステムズ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（パーキン エルマー／アプライド バイオシステムズ部門）で行った。ＭＩＰシンターゼプロモーターに関するＤＮＡ配列を配列番号３に与える。
【００３３】
ベクターの説明
ＭＩＰシンターゼプロモーターをｐＵＣ１９骨格上のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）から上流に包含する４つの発現ベクターを構築した。
【００３４】
ｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１は、一過性のアッセイでＧＵＳ発現を試験するために設計した。これら２つのベクター間の差異は、異なる３’非翻訳配列を転写ターミネーターとして使用したことであった。ｐＭｉｐＧＰ３３９−１はｐｅｒ５ ３’ＵＴＲを使用し；ｐＭｉｐＧＮ３４５−１はｎｏｓ３’ＵＴＲを使用した。
【００３５】
ｐＭｉｐＧＰ３４１およびｐＭｉｐＧＮ３５０−１は、二重強化３５Ｓプロモーターにより駆動される選択可能なマーカー遺伝子（ストレプトミセス ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のホスフィノトリシン アセチル トランスフェラーゼ（ＢＡＲ）遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２））を加えたｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１の誘導体である。ｐＭｉｐＧＰ３４１およびｐＭｉｐＧＮ３５０−１は、安定に形質転換されたトウモロコシの胚中でＭＩＰシンターゼプロモーター／ＧＵＳ融合体を試験するために使用した。
【００３６】
プラスミドＵＧＰ２３２−４は、一過性の発現実験で陽性対照として使用した。ＵＧＰ２３２−４はｐＭｉｐＧＰ３３９と同様であるが、ＧＵＳ遺伝子がＭＩＰシンターゼプロモーターに代わりトウモロコシに由来するユビキチン１（ｕｂｉ）プロモーターおよびイントロンにより駆動される点が異なる。
【００３７】
プラスミドｐＤＡＢ３０５は、多数の実験にわたりＧＵＳ発現を標準化するために、一過性の発現実験における対照として使用した。ｐＤＡＢ３０５はｐＭｉｐＧＮ３４５−１と同様であるが、ＧＵＳ遺伝子の発現を駆動するためにｐＭｉｐＧＮ３５０−１で使用する二重強化３５Ｓプロモーターを使用する点が異なる。
【００３８】
異なるプロモーター変更体により制御される遺伝子からのＧＵＳタンパク質の生産は、発光飛翔昆虫ルシフェラーゼを生産する内部対照遺伝子に対して比較されることが多い（Ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７（２），７２５−３７）。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）コード領域を含むプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−１ ＬＵＣ）を、クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣ）（パロ アルト、カリフォルニア州）から購入し、そしてコード領域をその５’および３’末端で標準法により修飾して、ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩによる消化後に１７０２ｂｐフラグメント上の完全なルシフェラーゼコード領域の単離を可能とした。このフラグメントはプラスミドｐＤＡＢ３０５のＧＵＳ遺伝子を置き換えてルシフェラーゼコード領域が、強化された３５Ｓプロモーターから発現するように使用し、プラスミドｐＤｅＬｕｘを得た。
【００３９】
実施例４
Ｍｉｐシンターゼ−Ｇｕｓ構築物の一過性試験
Ａ．胚での一過性の組織化学的ＧＵＳ発現
３つの単一（ｓｉｎｇｌｅ）遺伝子プラスミドは、トウモロコシの胚におけるＭＩＰシンターゼプロモーターにより駆動されるＧＵＳの一過性発現を試験するために使用した。ｐＵＧＰ２３２−４（ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲでＧＵＳに融合されたトウモロコシのユビキチンプロモーターをコードする）を、陽性対照として役立てた。ｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１は、それぞれｐｅｒ５およびＮｏｓ ３’末端とのＭＩＰシンターゼプロモーター−ＧＵＳ融合物を含んだ。“Ｈｉ−ＩＩ”遺伝子型に由来する未熟接合胚（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｎｅｗｓ Ｌｅｔｔ．６５：９２−９３）を、受粉から１２、１８および２０日後（ＤＡＰ）に収穫した。胚は、Ｎ６塩およびビタミン類（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８） Ｎ６培地およびその穀類作物の葯培養への応用（Ｔｈｅ Ｎ６ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ．）、Ｐｒｏ．Ｓｙｍｐ．植物組織培養（Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、ペキン（Ｐｅｋｉｎｇ）出版、第４３〜５６頁）、１．０ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２５ｍＭ Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物、１０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２．５ｇ／Ｌ ＧＥＬＲＩＴＥ（シュバイツァーホール、サウスプレインフィールド、ニュージャージー州）および２０ｇ／Ｌグルコース、オートクレーブ前のｐＨ５．８から成る１５Ａｇ１０カルス開始培地で１〜２日間培養した。
【００４０】
形質転換前に、胚を１５Ａｇ１０＋ＳＭ培地（０．２Ｍ ソルビトールおよび０．２Ｍ マンニトールを含む１５Ａｇ１０）に４時間の浸透前処理のために移した。ヘリウムブラスティング（ｂｌａｓｔｉｎｇ）については、１２個の胚を約１ｃｍ２のブラスティング培地の標的面積に並べ、そして２３０μｍメッシュのステンレス鋼製のスクリーンで覆った。ブラスティング培地は、硝酸銀を含まず、そしてわずか６ｍＭ Ｌ−プロリンを含有し、そして２０ｇ／ＬのＴＣ寒天（フィトテクノロジー ラボラトリーズ（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＬＬＣ、シュワニー ミッション、カンザス州）で固化した点で１５Ａｇ１０＋ＳＭ培地とは異なった。
【００４１】
ＤＮＡは等モル量のＧＵＳプラスミドを使用してブラスティングのために調製した。全部で７０μｇのＤＮＡ、必要な時には試験ＤＮＡにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＤＮＡ（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）を加えたものを、滅菌水で１５０μＬの容量に希釈した。ＤＮＡおよび水を３０ｍｇの表面を滅菌した１．０μｍの球状の金粒子（バイオ−ラッド ラボラトリーズ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヘリキュラス、カリフォルニア州）に加えた。混合物をボルテックスで簡単に混合（約１５秒間）した後、３７μＬの２．５Ｍ 塩化カルシウムおよび１５μＬの０．１Ｍ スペルミジン（遊離塩基）を加えた。３０秒間ボルテックス混合した後、ＤＮＡおよび金を溶液から沈殿させた。上清を除去し、そして１ｍＬのエタノールを加えた。ＤＮＡ／金混合物を形質転換に使用する前に１：４に希釈した。
【００４２】
ヘリウムブラスティングは、懸濁したＤＮＡ−被覆金粒子を調製した組織標的に向け、そしてその中に加速した。使用したデバイスは、引用により本明細書に編入する米国特許第５，１４１，１３１号明細書に記載されたより初期のプロトタイプであった。組織は２５インチＨｇの部分的真空下でデバイスのチャンバー内に置いた。１５００ｐｓｉのヘリウム圧をいったん使用すると、ＤＮＡ−被覆金粒子は各胚標的に加速され、各ブラスティングで２０μＬのＤＮＡ／金懸濁液を送達した。ブラスティングの後、胚を１５Ａｇ１０＋ＳＭ培地に戻し、そして暗中２７℃で１８〜２４時間インキューベーションした後に、ＧＵＳ組織化学的アッセイにかけた。
【００４３】
胚は、ウェルあたり２５０〜５００μＬのアッセイバッファー［０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．５ｍＭ フェロシアン化カリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム、０．９５ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−グルクロニドおよび０．６（容量／容量）％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００］を含有する２４−ウェルのマイクロタイタープレートにまいた。部分的に２〜１５分間、真空に吸引した後、暗中３７℃で２４〜４８時間インキューベーションした。
【００４４】
表３は、トウモロコシのユビキチン対照と比べて、ＭＩＰ−シンターゼプロモーターの一過性ＧＵＳ発現を試験したこれらの実験の結果をまとめる。各実験で、構築物あたり３〜５個の標的（１２個の胚／標的）をブラスティングした。対照ほど強くはないが、ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲを含むＭＩＰシンターゼ構築物は１２、１８および２０ＤＡＰで収穫した胚中にＧＵＳ発現をもたらした。Ｎｏｓ ３’末端を持つＭＩＰシンターゼプラスミドも、２０ＤＡＰの胚にＧＵＳ活性が示された。結論すると、トウモロコシの未熟な接合胚中のＭＩＰシンターゼプロモーターにより穏やかなレべルの一過性発現が観察された。
【００４５】
【表１】
2004508803.tif 000002
【００４６】
Ｂ．トウモロコシの再生可能なカルスにおける一過性の定量的ＧＵＳ発現。
【００４７】
プラスミドｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１は、ＭＩＰシンターゼプロモーターが構成的発現を駆動するレベルに対する指標について、再生可能なトウモロコシカルス中で試験した。トウモロコシで高度に発現する修飾した３５Ｓプロモーター／ＧＵＳ構築物（ｐＤＡＢ３０５）を対照として使用した。ｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１のいずれかにより駆動されるＧＵＳの発現は、ｐＤＡＢ３０５により駆動されるＧＵＳのパーセントとして測定した。
【００４８】
ｐＭｉｐＧＰ３３９−１およびｐＭｉｐＧＮ３４５−１は両方ともｐＤＡＢ３０５の３％の発現をもたらし、これは対照とは統計的に異なった。上記の胚のデータと関連して、有意ではない構成的な発現は、胚に特異的なプロモーターとしてのＭＩＰシンターゼを強く示している。
【００４９】
実施例５
安定に形質転換されたトウモロコシのカルスの生産
ＩＩ型カルスの培養は、遺伝子型“Ｈｉ−ＩＩ”の未熟な接合胚から開始した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｏｏｐ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．，６５：９２−９３）。胚はＨｉ−ＩＩ親ＡおよびＨｉ−ＩＩ親Ｂの交配またはＨｉ−ＩＩ植物の自家−または兄妹受粉に由来するＦ２胚から温室で育てた穂から単離した。未熟胚（１．５〜３．５ｍｍ）は、本明細書に記載する１５Ａｇ１０カルス開始培地で培養した。４〜６週間後、カルスをカルス維持培地（ＡｇＮＯ３が除かれ、そしてＬ−プロリンが６ｍＭに減らされた開始培地）にサブクローン化した。ＩＩ型カルスの選択は、約１２〜１６週間行った。
【００５０】
プラスミドｐＭｉｐＧＮ３５０−１およびｐＭｉｐＧＰ３４１は、胚発生カルス組織に個別に形質転換した。ヘリウムブラスティングのための調製には、１４０μｇのプラスミドＤＮＡは、７４μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２、Ｈ２Ｏおよび３０μＬの０．１Ｍスヘルミジン（遊離塩基）を３００μＬのプラスミドＤＮＡおよびＨ２Ｏに加えることにより、６０ｍｇのアルコールですすいだ球状の金粒子（直径１．５〜３．０μｍ、アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）上に沈殿させた。溶液は直ちにボルテックス混合し、そしてＤＮＡを被覆した金粒子を沈殿させた。生成した透明な上清を除去し、そして金粒子を１ｍｌの無水エタノールに再懸濁した。この懸濁液を無水エタノールで希釈して、１５ｍｇのＤＮＡで被覆された金／ｍＬを得た。
【００５１】
約６００ｍｇの胚発生カルス組織を本明細書に記載するＩＩ型カルス浸透培地の表面に広げた。４時間の前処理後、組織は本明細書に記載するブラスティング培地を含む培養皿に移した。標的は本明細書に記載するヘリウムブラスティングデバイスを使用して、個々にＤＮＡ／金混合物でブラスティングした。組織はステンレス鋼製のスクリーン（１０４μｍの開口）で覆い、そしてデバイスチャンバー中２５インチＨｇの部分的真空下に置いた。ＤＮＡで被覆した金粒子はブラスティング前にさらに無水エタノールを用いて１：１に希釈し、そして１５００ｐｓｉのヘリウム圧を使用してカルス標的に向けて４回加速し、１回のブラストあたり２０μＬのＤＮＡ／金懸濁液を送達した。標的を各ブラスト後に１８０゜回転させた。ブラストしていないカルスを露出するために、手順の中間点で組織も混合した。ブラスティングの直後、組織は１６〜２４時間の回復期間、ＩＩ型浸透培地に戻した。その後、組織を小片に分割し、そして選択培地（カゼイン加水分解物およびＬ−プロリンを欠くが、３０ｍｇ／ＬのＢＡＳＴＡ（商標）（アグルエボ（ＡｇｒＥｖｏ）、ベルリン、独国）を含む維持培地に移した。４週間毎に３カ月間、組織片は新鮮な選択培地に非選択的に移した。選択では９週間後、そして２１週まで成長が抑制された組織のバックグラウンドに対して増殖していると認められるカルス領域を取り出し、そして単離した。生じたＢＡＳＴＡ（商標）−耐性組織は、新しい選択培地中上で隔週毎に継代培養した。
【００５２】
実施例６
成熟体細胞胚の発生およびトランスジェニック植物の再生
これらの安定に形質転換されたカルチャーから種子胚として発生させるために、胚発生カルスを６０ｇ／Ｌのシュクロースを含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基本培地（今後ＭＳ培地と言う（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９６２）１５：４７３−４９７）で成長させることにより、体細胞胚を誘導した。カルスは数日間成長させ、そして次いで体細胞胚は、６０ｇ／Ｌのシュクロースおよび１０μＭのアブシジン酸（今後ＡＢＡと言う）を含有するＭＳ培地に個別に移し、さらに７日間成長させた。成熟の１４日後、異なるトランスジェニック系に由来する体細胞胚は、真空に吸引することなく本明細書に記載した約４００μＬのＧＵＳ溶液中に置くことにより、ＧＵＳ遺伝子の組織化学的発現についてアッセイした。ＧＵＳを発現している系およびＧＵＳを発現していない系を同定し、そして再生培地に移した。再生は胚発生カルス組織をサイトカイニンに基づく誘導培地、３０ｇ／Ｌのシュクロース、１００ｍｇ／Ｌのｍｙｏ−イノシトール、３０ｇ／Ｌのマンニトール、５ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン（今後ＢＡＰと言う）、０．０２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｍｇ／ＬのＢＡＳＴＡ（商標）、および２．５ｇ／ＬのＧＥＬＲＩＴＥ、ｐＨ５．７を含有するＭＳ培地に移すことにより開始した。カルチャーは１週間、低光（１２５ｆｔ−キャンドル）、続いて１週間、高光（３２５ｆｔ−キャンドル）に置いた。２週間の誘導期の後、組織はホルモンを含まない再生培地（これは２，４−ＤおよびＢＡＰを欠くことを除き誘導培地と同一）に非選択的に移し、そして高光に維持した。小さい苗木（３〜５ｃｍ）を取り出し、そしてＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ塩およびビタミン類（今後ＳＨ培地という）（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，（１９７２） Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．５０：１９９−２０４）、１０ｇ／Ｌのシュクロース、１００ｍｇ／Ｌのミオ−インシトールおよび２．５ｇ／ＬのＧＥＲＩＴＥ（商標）、ｐＨ５．８を含有する１５０×２５ｍｍの培養管に移した。各々の再生可能な系から少なくとも１つの個別の苗木を、組織化学的なＧＵＳアッセイのために利用した（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）。完全な苗木（３〜１０ｃｍ）は、１５ｍＬのコニカル遠心管に入れ、そして約５〜１０ｍｌのＧＵＳアッセイバッファーに浸水させ、そして本明細書に記載するようにインキューベーションした。アッセイしない苗木は、温室中の約０．２５ｋｇのＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０（ザ スコッツ社（Ｔｈｅ Ｓｃｏｔｔｓ Ｃｏ．）、メリーズビル、オハイオ州）を含む１２ｃｍの丸いポットに移すとすぐに成長し、そして十分な根系が発達した。それらは高圧ナトリウムおよびハロゲン化金属ランプの組み合わせにより追加した１６時間の光期間で成長させ、そして必要に応じてＰｅｔｅｒｓ Ｅｘｃｅｌ 肥料配合物（グレース−シエラ ホルチィカルチャルプロダクツ社（Ｇｒａｃｅ−Ｓｉｅｒｒａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミルピタッツ、カリフォルニア州）の３回の独立した組み合わせを散布した。６〜８葉の段階で、植物は約４ｋｇのＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０を含有する��ガロンのポットに移し、そして成熟するまで成長させた。
【００５３】
初代再生体はえり抜き（ｅｌｉｔｅ）の同系であるＯＱ４１４と異系交配させた。Ｒ１種子は受粉から約６週間後に集めた。
【００５４】
全部で３１２のＩＩ型カルス標的を、ｐＭｉｐＧＮ３５０−１およびｐＭｉｐＧＰ３４１でブラスティングした。３６のＢａｓｔａ（商標）−耐性カルス単離物を選択から回収したが、２９だけが誘導されて本明細書に記載するような成熟した体細胞胚を形成した。これら発生（ｅｖｅｎｔ）のうちの２４が本明細書に記載する組織化学的ＧＵＳアッセイ後に大変かすかな青色から深いインディゴ青の範囲まで幾つかの青色の染色レベルを生じた。これらの発現体の１３に加えて１つのトウモロコシユビキチン／ＧＵＳ／Ｎｏｓ 陽性対照および１つの（非−ＧＵＳ）トランスジェニック陰性対照を再生させた。約１６のＲ０植物をこれらの各系から再生させた。１３体のＭＩＰ再生体からの１０体がＲ１種子を生じた。
【００５５】
実施例７
トランスジェニック植物のＧＵＳ分析
Ａ．胚のＧＵＳ分析
ｐＭｉｐＧＰ３４１−０６．０６、ｐＭｉｐＧＮ３５０−０５．０１、ｐＭｉｐＧＮ３５０−１４．０１、１８１７−０２．１１（トランスジェニック陰性対照）、Ｗｈｉｓｋｅｒ−１２．１２およびＷｈｉｓｋｅｒ−１２．１４（トウモロコシユビキチン−ＧＵＳ陽性対照）に由来する胚を、受粉から１０から３０日後（ＤＡＰ）に５日の間隔で集めた。各回収で穂毎に最高１０個の穀粒を、Ｒ０植物の種子の組に依存して集めた。本明細書に記載するようにＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５の方法に従い、胚をＧＵＳ発現に関して組織化学的に調査した。
【００５６】
トランスジェニック陰性対照（１８１７−０２．１１）の胚ではＧＵＳ発現は観察されなかった。予期せずに、ユビキチン陽性対照（Ｗｈｉｓｋｅｒ−１２．１２およびＷｈｉｓｋｅｒ−１２．１４）の胚にはＧＵＳが検出されなかった。これら植物の成長は発育が阻害され、そして種子は乏しかった。しかし各３つのＭＩＰシンターゼ発生は、Ｒ１胚中にＧＵＳ発現を示した。ｐＭｉｐＧＰ３４１−０６．０６では、発現が早い１０ＤＡＰに観察された。ｐ３５０発生については、ＧＵＳは最初の１５ＤＡＰで検出された。すべての系で発現は、３０ＤＡＰでの成熟まで続いた。分離は一般にメンデルの遺伝パターンに従った。
【００５７】
Ｂ．根および葉のＧＵＳ分析
トランスジェニック発生あたり２つの植物、ならびに２つの非形質転換対照（ＯＱ４１４）、形質転換陰性対照（１８１７−０２植物）およびトウモロコシのユビキチン−駆動ＧＵＳ（Ｗｈｉｓｋｅｒ−１２発生体）を発現する陽性対照を、異なる発育段階で利用した。発生あたり１つの植物をＶ６（６葉）およびＶＴ（発生している雄穂）段階で収穫し、そして葉および根を分析のために別個にプールした。さらに、発生あたり数種の植物の第６葉をＶ６段階で集め、そしてＧＵＳ発現に関して別個に評価した。
【００５８】
非形質転換（ＯＱ４１４）または形質転換陰性（１８１７−０２）対照の葉および根ではＧＵＳ活性は検出されなかった。変動するが有意なＧＵＳ発現が、陽性対照（Ｗｈｉｓｋｅｒ−１２発生体、７植物）で観察され、葉では０．４５〜２．３４ｎｇのＧＵＳ当量／μｇタンパク質および根では０．２８〜０．４７の範囲であった。ＭＩＰシンターゼ−ＧＵＳトランスジェニック発生体は、葉および根での有意なＧＵＳ活性が示されず、ＭＩＰシンターゼプロモーターが胚に特異的であるという結論を導く。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508803.tif 000034
【国際調査報告】
2004508803.tif 000035
2004508803.tif 000036
2004508803.tif 000037