(57)【要約】本発明はＩＧＳ５８　Ｇタンパク質共役受容体ファミリーおよび、前記ＩＧＳ５８タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペチドの作用を阻害もしくは活性化すること、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、ＩＧＳ５８遺伝子が過剰発現、誤発現、過少発現、もしくは抑制（ノックアウト）される、そのようなベクターを含む宿主細胞およびヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明はさらに、前記Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＩＧＳ５８のアゴニストもしくはアンタゴニストの働きをする能力を持つ化合物をスクリーニングする方法、そして、広範な疾患の処置およびそのような状態の診断試験におけるＩＧＳ５８ポリペチドおよびポリヌクレオチドならびにＩＧＳ５８受容体ファミリーに対するアゴニストもしくはアンタゴニストの使用に関する。本発明は特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（例えば胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床）に関係する機能不全、障害もしくは疾患の処置、ならびにそのような状態の診断試験における、前記Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＩＧＳ５８のアゴニストもしくはアンタゴニストの働きをする能力を持つ化合物をスクリーニングするための方法、そして、ＩＧＳ５８ポリペチドおよびポリヌクレオチドならびにＩＧＳ５８受容体ファミリーに対するアゴニストもしくはアンタゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に従うＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）　ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列、特にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）　全長にわたってヌクレオチド配列（ａ）もしくは（ｂ）に少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％）の配列同一性を持つヌクレオチド配列；
ｄ）　（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に従うＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）　ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列、特にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）　全長にわたってヌクレオチド配列（ａ）もしくは（ｂ）に少なくとも９０％（好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を持つヌクレオチド配列；
ｄ）　（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ａ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に従うＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）　ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列、特にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）　全長にわたってヌクレオチド配列（ａ）もしくは（ｂ）に少なくとも９５％（好ましくは少なくとも９８％）の配列同一性を持つヌクレオチド配列；
ｄ）　（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ａ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に従うＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）　ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列、特にＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に対応するヌクレオチド配列；
ｃ）　全長にわたってヌクレオチド配列（ａ）もしくは（ｂ）に少なくとも９８％（好ましくは少なくとも９９％）の配列同一性を持つヌクレオチド配列；
ｄ）　（ａ）もしくは（ｂ）もしくは（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列；
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドをコードするＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中に含まれるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートの配列と全長にわたって少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートの配列と全長にわたって少なくとも９０％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートの配列と全長にわたって少なくとも９５％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートの配列と全長にわたって少なくとも９８％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートの配列と全長にわたって少なくとも９９％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートのポリヌクレオチドである、請求項５〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んで成るハイブリダイゼーション・プローブ。
【請求項１４】
発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチドを生成することができる前記発現系を構成するＤＮＡもしくはＲＮＡ分子。
【請求項１５】
発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチドを生成することができる前記発現系を構成するＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１６】
発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチドを生成することができる前記発現系を構成するＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１７】
発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチドを生成することができる前記発現系を構成するＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１８】
発現系が適合する宿主細胞中に存在する場合に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチドを生成することができる前記発現系を構成するＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかに記載の発現系を含んで成る宿主細胞。
【請求項２０】
酵母細胞である請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
動物細胞である請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれかに記載の細胞に由来するＩＧＳ５８受容体膜調製品。
【請求項２３】
ポリペチドの生産および培養からの前記ポリペチドの回収に十分な条件の下で請求項１９〜２１の宿主を培養することを含んで成る、ＩＧＳ５８ポリペチドを製造するための方法。
【請求項２４】
細胞が適当な培養条件の下でＩＧＳ５８ポリペチドを生産することができるように、請求項１４〜１８のいずれかの発現系により細胞を形質転換もしくはトランスフェクトすることを含んで成る、ＩＧＳ５８ポリペチドを生産する細胞を製造するための方法。
【請求項２５】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと全長にわたって少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチド。
【請求項２６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと全長にわたって少なくとも９０％が同一であるアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチド。
【請求項２７】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと全長にわたって少なくとも９５％が同一であるアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチド。
【請求項２８】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと全長にわたって少なくとも９８％が同一であるアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチド。
【請求項２９】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドと全長にわたって少なくとも９９％が同一であるアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８ポリペチド。
【請求項３０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を含んで成る、請求項２５〜２９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチドに免疫特異的な抗体。
【請求項３２】
（ａ）　治療的に有効な量の前記受容体に対するアゴニストを患者に投与すること；および／もしくは
（ｂ）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列に対して、全長にわたって少なくとも８０％の同一性を持つヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて前記受容体活性の生成をもたらすことができる形で患者に提供すること；
を含んで成る、請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチド受容体の増強された活性もしくは発現を必要とする患者の処置のための方法。
【請求項３３】
（ａ）　治療的に有効な量の前記受容体に対するアンタゴニストを患者に投与すること；および／もしくは
（ｂ）　前記受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチドを患者に投与すること；および／もしくは
（ｃ）　前記受容体とそのリガンドについて競合するポリペチドの治療的に有効な量を患者に投与すること；
を含んで成る、請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチド受容体の活性もしくは発現を阻害する必要のある患者の処置のための方法。
【請求項３４】
（ａ）　患者に由来するサンプルにおいて、前記患者のゲノム中の前記ＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列中における変異の有無を決定すること；および／もしくは
（ｂ）　患者に由来するサンプルにおいて、ＩＧＳ５８ポリペチド発現の存在もしくは量について分析すること；
を含んで成る、請求項２５〜３０のいずれかのＩＧＳ５８ポリペチドの患者中における発現もしくは活性に関係する疾患もしくは疾患への感受性を患者において診断するための方法。
【請求項３５】
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリペチドを生産する細胞に試験化合物を接触させること；および
（ｂ）　試験化合物がＩＧＳ５８ポリペチドの活性化によって発生するシグナルをもたらすか否かを決定すること；
を含んで成る、請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチドに対するアゴニストを同定するための方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって同定されるアゴニスト。
【請求項３７】
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリペチドを生産する細胞にアゴニストを接触させること；および
（ｂ）　前記アゴニストによって発生するシグナルが候補化合物の存在下で減少するか否かを決定すること；
を含んで成る、請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチドに対するアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法によって同定されるアンタゴニスト。
【請求項３９】
請求項２４に記載の方法によって製造された、ＩＧＳ５８ポリペチドを発現している組換え宿主細胞もしくはその膜。
【請求項４０】
遺伝子的に操作した非ヒト動物を生産する方法であって、
ａ）　アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を本質的に含むポリヌクレオチドのコード部分を、高レベルな遺伝子発現もしくは、その遺伝子が前記動物において通常は発現されない細胞型における発現を駆動することのできる制御配列に連結する段階；あるいは
ｂ）　アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を本質的に含むポリヌクレオチドのコード部分を改変し、そして、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つタンパク質または生物学的に活性なフラグメントをコードする内在性の対立遺伝子が完全に、もしくは部分的に不活化されるような方法で前記配列を前記動物のゲノム中に再導入する段階；
を含んで成る方法。
【請求項４１】
請求項３５もしくは３７に記載の方法を含んで成り、それから、製薬学的に許容されうる担体とみなされる化合物を混合することを含んで成る、製薬組成物の製造のための方法。
【請求項４２】
（ａ）　治療的に有効な量の請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８受容体ポリペチドに対するアゴニスト；および／もしくは
（ｂ）　請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチドの活性もしくは発現の増加が必要な、ＩＧＳ５８受容体ポリペチドの発現もしくは活性に関係する疾患を患う患者の処置のための薬物の生産のための、前記受容体活性の生成をｉｎ　ｖｉｖｏでもたらすことができるような形の、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペプチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるポリペチドをコードするヌクレオチド配列に対し、全長にわたって少なくとも８０％の同一性を持つヌクレオチド配列を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；または、前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
の使用。
【請求項４３】
（ａ）　治療的に有効な量の請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８受容体ポリペチドに対するアンタゴニスト；および／もしくは
（ｂ）　請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８受容体ポリペチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害する核酸分子；および／もしくは
（ｃ）　請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８ポリペチドの活性もしくは発現を阻害する必要を有する、ＩＧＳ５８受容体ポリペチドの発現もしくは活性に関係する疾患を患う患者の処置のための薬物の調製のための、治療的に有効な量の請求項２５〜３０のいずれかに記載のＩＧＳ５８受容体ポリペチドとそのリガンドについて競合するポリペチド；
の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、それらによってコードされるポリペチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペチドの使用、ならびにそれらの製造に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペチドは、以下ＩＧＳ５８と記載するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に関する。本発明はまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペチドの作用を阻害もしくは活性化すること、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、ＩＧＳ５８遺伝子が過剰発現、誤発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、過少発現、および／もしくは抑制（ノックアウト）される、そのようなベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック動物にも関する。本発明はさらに、前記Ｇタンパク質共役受容体ＩＧＳ５８のアゴニストもしくはアンタゴニストの働きをする能力を持つ化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
多くの医学的に重要な生物学的プロセスがＧタンパク質および／または二次情報伝達物質（例えばｃＡＭＰ）を含むシグナル伝達経路に参加するタンパク質によって媒介されることは、十分に確立されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５１：３５３−３５４）。本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路に参加するタンパク質として記載される。これらのタンパク質のいくつかの例には、アドレナリン作動性物質およびドーパミンに対するもののようなＧＰＣ受容体（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９８７，８４：４６−５０；　Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８：６５０−６５６；　Ｂｕｎｚｏｗ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３６：７８３−７８７）、Ｇタンパク質自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼおよびホスホジエステラーゼ）、アクチュエータータンパク質（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）（Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５２：８０２−８）を含む。
【０００３】
例えば、シグナル伝達の一つの形態では、ＧＰＣＲへのホルモンの結合に伴って、その受容体はヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用し、グアニンヌクレオチド結合部位からのＧＤＰの解離を誘導する。グアニンヌクレオチドの正常な細胞内濃度では、ＧＴＰが即座に部位を満たす。Ｇタンパク質のαサブユニットへのＧＴＰの結合は、受容体からのＧタンパク質の解離と、Ｇタンパク質のαとβγサブユニットへの解離を引き起こす。ＧＴＰを保有している形態は、それから、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自体によって触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解（αサブユニットは内因性のＧＴＰアーゼ活性を有する）が、Ｇタンパク質を基底の不活性な形へと戻す。αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性は、本質において、オン／オフ・スイッチを制御する内部時計である。αサブユニットのＧＤＰ結合型はβγに対する高いアフィニティーを有し、その後のαＧＤＰとβγの再結合が系を基底状態へと戻す。このように、Ｇタンパク質は受容体からエフェクター（この例ではアデニル酸シクラーゼ）へのシグナルを中継する中間体として、および、シグナルの持続期間を制御する時計としての二重の役割を担う。
【０００４】
Ｇタンパク質共役受容体の膜結合型スーパーファミリーは、推定される７回膜貫通領域を有するとして特徴づけられている。このドメインは細胞外もしくは細胞質内のループにつながれている膜貫通αヘリックスをあらわしていると考えられている。Ｇタンパク質共役受容体はホルモン、ウイルス、増殖因子および神経性受容体といった、広範囲にわたる生物学的に活性な受容体を含む。
【０００５】
Ｇタンパク質共役受容体ファミリーは、ＣＮＳ疾患の処理に使用される神経遮断薬に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーのメンバーの他の例は、カルシトニン、アドレナリン、ニューロペプチドＹ、ソマトスタチン（ｓｏｍａｓｔｏｔａｔｉｎ）、ニューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＣＲＦ、ＣＣＫ、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、カイニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１、ロドプシン、臭気物質（ｏｄｏｒａｎｔ）、およびサイトメガロウィルスの受容体を含むが、それらに限定されない。
【０００６】
大部分のＧタンパク質共役受容体は、最初の２つの細胞外ループの各々に単一の保存されたシステイン残基を有しており、これらは機能的なタンパク質構造を安定化すると考えられるジスルフィド結合を形成する。７回膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と名付けられている。ＴＭ５とＴＭ６とをつなぐ細胞質内ループはＧタンパク質結合ドメインの主要な成分である。
【０００７】
大部分のＧタンパク質共役受容体は、第３の細胞質内ループ内および／もしくはカルボキシ末端に潜在的なリン酸化部位を含む。βアドレナリン受容体のような、いくつかのＧタンパク質共役受容体では、プロテインキナーゼＡおよび／もしくは特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感作を媒介する。
【０００８】
最近、カルシトニン受容体様受容体のようないくつかのＧＰＣＲは、受容体活性変更タンパク質（ＲＡＭＰ）と呼ばれる小さな１回貫通膜タンパク質と相互作用しうることが発見された。このＧＰＣＲと特定のＲＡＭＰとの相互作用は、どの天然リガンドがそのＧＰＣＲとＲＡＭＰの組み合わせに適切なアフィニティーを有し、複合体の機能的シグナル活性を調節するかを決定している（ＭｃＬａｔｈｉｅ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９３：３３３−３３９）。
【０００９】
一部の受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役受容体膜貫通領域によって形成される親水性ソケットを含んで成り、前記ソケットはＧタンパク質共役受容体の疎水性残基によって囲まれていると考えられている。各Ｇタンパク質共役受容体膜貫通ヘリックスの親水性側は、内側を向いており、極性のリガンド結合部位を形成すると仮定される。ＴＭ３はいくつかのＧタンパク質共役受容体において、ＴＭ３のアスパラギン酸残基のようなリガンド結合部位を有するとされている。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、ならびにＴＭ６もしくはＴＭ７のフェニルアランもしくはチロシンもまた、リガンド結合に関係付けられている。
【００１０】
Ｇタンパク質共役受容体は細胞内で、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって、さまざまな細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体にカップリングされうる（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ．，１９８９，１０：３１７−３３１を見よ）。異なるＧタンパク質αサブユニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞中のさまざまな生物学的機能を調整する。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質内残基のリン酸化は、一部のＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質カップリングの調節に重要な機構として同定された。Ｇタンパク質共役受容体は哺乳類宿主内の多数の部位に見出される。
【００１１】
受容体（主にＧＰＣＲクラス）は現在既知の薬剤の半分以上を導いた（Ｄｒｅｗｓ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１４：１５１６）。これは、これらの受容体が治療の標的としての確立され、証明された歴史を持つことを示す。本発明において記述される新たなＩＧＳ５８　ＧＰＣＲは、機能不全、障害もしくは疾患（以降では一般に「疾患」と記載する）の診断、予防、改善もしくは矯正に役割を演じうるさらなる受容体の同定および特徴付けに対して、当該技術分野に存在する必要性を明らかに満足させる。疾患には、統合失調症、強迫性障害（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニックのような挿間性発作性不安（ＥＰＡ）障害、大鬱病性障害、双局性障害、パーキンソン病、一般的不安障害、自閉症、譫妄、多発性硬化症、アルツハイマー病／痴呆および他の神経変性疾患、重度の精神遅滞、ジスキネジア、ハンチントン病、トゥレット症候群、チック、震え、筋緊張異常、攣縮、食欲不振症、過食症、発作、中毒／依存症／渇望、睡眠障害、癲癇、片頭痛、注目欠陥／活動亢進障害（ＡＤＨＤ）を含むＣＮＳ障害；心不全、狭心症、不整性、心筋梗塞、心肥大、低血圧、高血圧（本態性高血圧症、腎性高血圧症もしくは肺高血圧症など）、血栓症、動脈硬化、脳血管攣縮、クモ膜下出血、脳虚血、脳梗塞、末梢血管疾患、レイノー病、腎臓病（腎不全など）を含む循環器病；肥満症；嘔吐；過敏性腸管症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、術後性もしくは糖尿病性の胃不全麻痺のような運動性障害および胃排出遅延状態、ならびに糖尿病、潰瘍（胃潰瘍など）を含む胃腸疾患；下痢；骨粗鬆症を含む他の疾患；炎症；細菌性、真菌性、原生動物性およびウイルス性の感染（特にＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に起因する感染）のような感染症；疼痛；癌；化学療法誘導性傷害；腫瘍浸潤；免疫疾患；尿閉；喘息；アレルギー；関節炎；前立腺肥大症；内毒素ショック；敗血症；真正糖尿病の合併症；ならびに婦人科の疾患を含む。
【００１２】
特に、本発明において記述される新たなＩＧＳ５８　ＧＰＣＲは、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患を診断、予防、改善もしくは矯正する際に重要な役割を演じうるさらなる受容体の同定および特徴付けに対して、当該技術分野に存在する必要性を満足させる。
【００１３】
〔発明の概要〕
一つの態様では、本発明はＩＧＳ５８のポリペチド、ポリヌクレオチド、および組換え物質、ならびにそれらの製造方法に関する。本発明の別の態様は、そのようなＩＧＳ５８ポリペチド、ポリヌクレオチドおよび組換え物質を使用する方法に関する。そのような使用には治療標的としての使用、および上述の疾患の一つの処置のための使用を含むが、それらに限定されない。特に、この使用には、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患の処置を含む。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いたアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための方法、ならびに、同定された化合物によるＩＧＳ５８の不均衡に付随した状態の処置に関する。本発明のさらに別の態様は、不適当なＩＧＳ５８活性もしくはレベルに関連した疾患を検出するための診断試験に関する。本発明のさらなる態様は、ＩＧＳ５８の異常な発現もしくは活性から生じる疾患のモデルとして働く動物に基づいた系に関する。
【００１５】
【表１】
2004514426.tif 000002
【００１６】
【表２】
2004514426.tif 000003
【００１７】
〔発明の記述〕
配列およびモチーフの文脈における構造的および化学的な類似が、本発明のＩＧＳ５８　ＧＰＣＲと他のヒトＧＰＣＲの間に存在する。さらに、ＩＧＳ５８は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）において発現される。したがって、ＩＧＳ５８はとりわけ上述の疾患において役割を演じることが暗示される。ＩＧＳ５８は特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患において役割を演じることが暗示される。
【００１８】
特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的のおよび科学的な用語は、本発明が属する当該技術分野の通常の熟練者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記述されるものと類似もしくは等価なあらゆる方法および材料が、本発明の実施もしくは試験のために使用されうるものの、好ましい方法、装置および材料がこれから記述される。本明細書中で引用される刊行物はすべて、あたかも個々の各刊行物が引用することによって完全に記載されたかのように本明細書中に取り込まれるべきものと明確に、かつ個別的に表示されたかのように、引用することによって本明細書中に取り込まれている。
【００１９】
〔定義〕
以下の定義は、本明細書中でしばしば使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００２０】
「ＩＧＳ５８」は特に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に規定されるアミノ酸配列を含んで成るポリペチドもしくはそのバリアントを指す。
【００２１】
「受容体活性」もしくは「受容体の生物活性」とは、同様な活性もしくは向上した活性もしくは減少した望ましくない副作用を伴うこれらの活性を含む前記ＩＧＳ５８の代謝もしくは生理学的機能を指す。また、前記ＩＧＳ５８の抗原性および免疫原性の活性も含まれる。
【００２２】
「ＩＧＳ５８遺伝子」とは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に規定されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドもしくはその各バリアント（例えば、その対立遺伝子バリアントおよび／もしくはそれらの相補物）を指す。
【００２３】
本明細書中で使用される「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、ヒト化抗体のほか、Ｆａｂもしくは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントを含む。
【００２４】
「単離された」とは、天然の状態から「人の手によって」変更され、および／もしくは天然の環境から分離されたことを意味する。よって、天然に生じる「単離された」組成物もしくは物質が「単離された」ならば、それはそのオリジナルの環境から変更され、もしくは除去され、もしくはその両方が行なわれている。たとえば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドもしくはポリペチドは「単離」されていないが、その天然状態で共に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドもしくはポリペチドは、この用語が本明細書中で使用されるように、「単離」されている。
【００２５】
「ポリヌクレオチド」は、あらゆるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に指し、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖または、より一般的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖の領域の混合でありうるＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成る混成分子を限定することなく含む。さらに、「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡとＤＮＡの両方を含んで成る三本鎖領域もまた含みうる。また、ポリヌクレオチドという用語には、安定性もしくは他の理由のために、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、および修飾された骨格を持つＤＮＡもしくはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基および、イノシンのような通常は見られない塩基を含む。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれている；よって、「ポリヌクレオチド」は天然に一般に見出されるような、化学的、酵素的、もしくは代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびに、ウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２６】
「ポリペチド」とは、ペプチド結合もしくは修飾ペプチド結合（すなわちペプチド・イソスター）によって互いに繋がれた２つ以上のアミノ酸を含んで成る、あらゆるペプチドもしくはタンパク質を指す。「ポリペチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドもしくはオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖、および／もしくはそれらの組み合わせを指す。ポリペチドは、遺伝子にコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含みうる。「ポリペチド」には、翻訳後プロセッシングのような天然の過程、もしくは、当該技術分野において公知の化学修飾技法のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究書のほか、豊富な研究論文中によく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および、アミノもしくはカルボキシル末端を含む、ポリペチド中のあらゆる所に生じうる。同じ型の修飾が、与えられたポリペチド中のいくつかの部位に同一もしくは変化する程度で存在しうることが理解されるであろう。また、与えられたポリペチドは多くの型の修飾を含みうる。ポリペチドはユビキチン結合の結果として分岐されることができ、また、それらは分枝を持つ環状もしくは分枝を持たない環状でありうる。環状、分枝状、分枝環状のポリペチドは、翻訳後の天然プロセスに起因して生じるか、もしくは合成的方法によって作製されうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合；架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質に対するアミノ酸のｔ−ＲＮＡ媒介付加、ならびにユビキチン結合を含む。例としては、ＰＲＯＴＥＩＮＳ　−　ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３　ａｎｄ　Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２　ｉｎ　ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯＶＡＬＥＮＴ　ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８３；　Ｓｅｉｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，″Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｆａｃｔｏｒｓ″，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ　ｅｔ　ａｌ．，″Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｙｎｔ���ｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ａｇｉｎｇ″，Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）６６３：４８−６２を見よ。
【００２７】
「バリアント」とは、本明細書中で用語が使用されるように、基準のポリヌクレオチドもしくはポリペチドからそれぞれ異なっているが、本質的な生物学的性質、構造的性質、制御もしくは生化学的性質といった本質的性質を保持しているポリヌクレオチドもしくはポリペチドである。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペチドのアミノ酸配列を変えてもよいし、変えなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に議論されるように、基準配列によってコードされるポリペチドにおいて、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらしうる。ポリペプチドの典型的なバリアントは、別の、基準のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般には、基準ポリペチドとバリアントの配列が全体的に極めて類似で、多くの領域では同一となるように、差異は限定される。バリアントおよび基準ポリペチドは、あらゆる組み合わせの１つ以上の置換、付加および欠失によってアミノ酸配列が異なりうる。置換されたか、もしくは挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであっても、もしくは、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドもしくはポリペチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントのような天然に生じるものでも、もしくは、それは天然に生じることが知られていないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペチドの天然には生じないバリアントは、突然変異生成技法によって、もしくは直接合成によって作製されうる。
【００２８】
「同一性」は、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高いオーダーの一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は、当該技術分野において認識された意味を有しており、公表された技法を用いて計算されうる。例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８；　ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ　ＡＮＤ　ＧＥＮＯＭＥ　ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．；　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３；　ＣＯＭＰＵＴＥＲ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ　Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１を見よ。２つのポリヌクレオチドもしくはポリペチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在しており、「同一性」という用語は当業者にとって公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３）。２つの配列間の同一性もしくは類似性を決定するために一般に使用される方法には、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，１９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．（１９８８）４８：１０７３に開示されているものを、それらに限定することなく含む。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムにコードされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８４）１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３）を含むが、それらに限定されない。「相同性」という語は「同一性」という語に置換されうる。
【００２９】
例示として、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を持つヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の基準ヌクレオチド配列各１００ヌクレオチドにつき、最高５つまでのヌクレオチドの違いを含みうること以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％が同一なヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを得るためには、基準配列中のヌクレオチドの任意の５％までが削除され、もしくは別のヌクレオチドと置換されるか、または、基準配列の全ヌクレオチドの５％までの任意の数のヌクレオチドが基準配列中に挿入されるか、あるいは、基準配列の全ヌクレオチドの５％までの任意の数のヌクレオチドに、欠失、挿入および置換の組み合わせが起こりうる。これらの差異は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端、または、これら末端位の間のどこかにおいて、基準配列内のヌクレオチドの中に個別に分散して、もしくは基準配列中の１ヶ所以上の近接したグループ内に分散して生じうる。
【００３０】
同様に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の基準アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「同一性」を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２の基準アミノ酸配列各１００アミノ酸につき、最高５つまでのアミノ酸の違いを含みうること以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準アミノ酸配列に少なくとも９５％が同一なアミノ酸配列を持つポリペプチドを得るためには、基準配列中の５％までの任意のアミノ酸が削除されるか、もしくは別のアミノ酸と置換されるか、または、基準配列の全アミノ酸の５％までの任意の数のアミノ酸が基準配列中に挿入される。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または、これら末端位置の間のどこかにおいて、基準配列内の残基の中に個別に分散して、もしくは基準配列内の１ヶ所以上の近接したグループ内に分散して生じうる。
【００３１】
〔本発明のポリペプチド〕
一つの態様では、本発明はＩＧＳ５８ポリペチド（ＩＧＳ５８タンパク質を含む）に関する。ＩＧＳ５８ポリペチドには、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドおよび、２００１年８月３０日にユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託された受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチド、ならびにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を含んで成るポリペチドおよび、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｉｔｕｒｅｓの受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチド、ならびにＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２および／もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペチドに対して、全長にわたり、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、そして、さらにより好ましくは前記アミノ酸配列対して少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドを含む。さらに、少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を持つものは非常に好ましい。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のアミノ酸配列を持つポリペチドもしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７中に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペチドに対して、全長にわたり、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、そして、さらにより好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペチドもまた、ＩＧＳ５８ポリペチドの範囲内に含まれる。さらに、少なくとも９７％、特に少なくとも９９％の同一性を持つものは非常に好ましい。好ましくは、ＩＧＳ５８ポリペチドは少なくとも一つの受容体生物活性を示す。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様では、ＩＧＳ５８ポリペチドは融合タンパクのような、より大きなタンパク質の一部でありうる。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のような精製を助ける配列、抗原性ペプチドタグ（ヘマグルチニン（ＨＡ）タグなど）のような検出を助ける配列、または、組換え体生産中の安定性のための付加的な配列を含むさらなるアミノ酸配列を含めることは、しばしば有利である。
【００３３】
ＩＧＳ５８ポリペチドのフラグメントもまた、本発明に含まれる。フラグメントとは、前記のＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列の全部ではなく、一部と同一であるアミノ酸配列を有するポリペチドである。ＩＧＳ５８ポリペチドと同様に、フラグメントは「独立的（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」でありえ、つまり、最も好ましくは単一の連続した領域として、それらがその一部もしくは領域を形成する、より大きなポリペチドの中に含まれうる。発明のポリペチド・フラグメントの代表的な例は、例えば、アミノ酸番号がだいたい１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００および１０１からＩＧＳ５８ポリペチドの終わりまでのフラグメントを含む。この文脈において、「だいたい」には特に列挙された範囲からどちらかの端もしくは両方の端に、いくつか、５、４、３、２もしくは１アミノ酸だけより大きいもの、もしくはより小さいものを含む。
【００３４】
好ましいフラグメントには、例えば、アミノ末端を含む連続した一連の残基の欠失、もしくはカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、もしくは一つがアミノ末端を含み、一つがカルボキシル末端を含む２つの連続した一連の残基の欠失を除き、ＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列を持つ切り詰められたポリペチドを含む。また、αヘリックス、αへリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性部分、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原インデクス（ｈｉｇｈ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｅｘ）領域といった構造的もしくは機能的属性によって特徴付けられるフラグメントもまた好ましい。他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントとは、同様な活性もしくは向上した活性、もしくは減少した望ましくない活性をもつものを含む、受容体活性を媒介するものである。また、動物、特にヒトにおいて、抗原性もしくは免疫原性であるものも含まれる。
【００３５】
このように、本発明のポリペチドには、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２および／もしくはユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を持つポリペチドと少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペチド、または対応するフラグメントと少なくとも８０％が同一であるそのフラグメントを含む。好ましくは、これらのポリペチド・フラグメントのすべてが、抗原活性を含む受容体の生物活性を保持する。また、定義された配列およびフラグメントのバリアントも本発明の一部を構成する。好ましいバリアントは、保存的なアミノ酸置換（すなわち、似た特性の別の残基によって残基を置換するもの）によって基準と異なっているものである。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒの間、酸性残基のＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、塩基性残基のＬｙｓとＡｒｇの間、もしくは、芳香性残基のＰｈｅとＴｙｒの間のものである。特に好ましいものは、数個、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２個のアミノ酸があらゆる組み合わせで置換、欠失もしくは付加されているバリアントである。
【００３６】
本発明のＩＧＳ５８ポリペチドは、あらゆる適当な方法において調製されうる。そのようなポリペチドには、単離された天然に生じるポリペチド、組換えによって生産されたポリペチド、合成的に生産されたポリペチド、もしくは、これらの方法の組み合わせによって生産されたポリペチドを含む。そのようなポリペチドを調製する方法は、当該技術分野おいて公知である。
〔本発明のポリヌクレオチド〕
本発明のさらなる態様はＩＧＳ５８ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ５８ポリヌクレオチドには、ＩＧＳ５８ポリペチドおよびフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにそれらに密接に関係するポリヌクレオチドを含む。より明確には、本発明のＩＧＳ５８ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド（たとえば、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２のＩＧＳ５８ポリペチドをコードすることができるもの）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１の特定の配列を持つポリヌクレオチド、および、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
ＩＧＳ５８ポリヌクレオチドはさらに、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドをコードするヌクレオチド配列に対し、全長にわたって、少なくとも８０％の同一性を持つヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の配列と全長にわたって少なくとも８０％が同一であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、および、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに本質的に対応するポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
この点については、少なくとも９０％の同一性を持つポリヌクレオチドは特に好ましく、少なくとも９５％の同一性を持つものは、ことのほか好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を持つものは非常に好ましく、少なくとも９８〜９９％の同一性を持つものは極めて非常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を持つものは最も好ましい。また、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列に対して、もしくは、ユトレヒト（オランダ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓにおける受託番号ＣＢＳ１０９７１７に含まれるＤＮＡインサートに対して、増幅に使用可能な条件下でハイブリダイズするために、またはプローブもしくはマーカーとして使用するために十分な同一性を持つヌクレオチド配列もＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの下に含まれる。本発明はまた、そのようなＩＧＳ５８ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３９】
本発明のＩＧＳ５８は、ＢＬＡＳＴ検索の結果で示されるように、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。表２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）のアミノ酸配列は、ヒト白血球血小板活性化因子受容体をあらわすと主張される配列に最も類似していた（アライメントされた３１２残基について９２％の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１４９６８；しかし、このタンパク質は３２２残基の長さしかない）。このように、本発明のＩＧＳ５８ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様な生物学的機能／性質を持つことが期待され、そして、それらの実用性は当該技術分野における熟練した誰にとっても明らかである。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのような天然の供給源から取得されうる。特に、特定のＧＰＣＲ遺伝子サブファミリー内で保存されている領域をコードする縮重ＰＣＲプライマーが設計されうる。縮重プライマーを用いたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅反応は、考慮中の遺伝子ファミリーのいくつかのメンバー（既知と新規の両方）の増幅をもたらすであろう（ゲノム鋳型が用いられる場合は、縮重プライマーは同一エキソン内に位置しなければならない）（Ｌｉｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：５６９−５７２）。また、本発明のポリヌクレオチドは、よく知られている商業的に利用可能な技法（たとえば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いて合成されることもできる。
【００４１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるポリペプチドコード配列（ヌクレオチド番号２６〜１４７１）と同一であってもよく、あるいは、それは、遺伝コードの冗長性（縮重）の結果として、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるペプチドコード配列に比べ変更も示すが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチドもコードする、異なるヌクレオチド配列であってもよい。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ５８ポリペチドの組換え体生産のために用いられる場合、ポリヌクレオチドには、成熟ポリペチドもしくはそのフラグメントのコード配列それ自体；リーダー配列もしくは分泌配列、プレもしくはプロもしくはプレプロ・タンパク質配列または他の融合ペプチド部分をコードするもののような他のコード配列と同じ読み枠にある成熟ポリペチドもしくはフラグメントのコード配列を含みうる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされうる。本発明のこの態様のいくつかの好ましい実施態様では、マーカー配列はｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供され、Ｇｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記述されるようなヘキサヒスチジンペプチド、もしくはＨＡタグである。ポリヌクレオチドはまた、転写される非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化のシグナル、リボソーム結合部位および、ｍＲＮＡを安定化する配列といった、非コード性の５’および３’配列も含みうる。
【００４３】
さらなる好ましい実施態様は、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２もしくは１個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、削除もしくは付加されているＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のＩＧＳ５８ポリペチドのアミノ酸配列を含んで成るＩＧＳ５８バリアントをコードしているポリヌクレオチドである。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／もしくは発現の修正を含むがそれらに限定されない種々の目的のためにＩＧＳ５８コード配列を変更するために、当該技術分野において一般に知られている方法を用いて操作されうる。遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのランダムな断片化とＰＣＲによる再集合によるＤＮＡシャッフリングが、ヌクレオチド配列を操作するために使用されうる。たとえば、オリゴヌクレオチドの媒介による部位特異的変異誘発が、アミノ酸置換を行ない、新たな制限部位を創出し、修飾（たとえば、グリコシル化もしくはリン酸化）のパターンを変化させ、コドン優先性を変更し、スプライシング・バリアントを生成するといった変異を導入するために使用されうる。
【００４５】
本発明はさらに、本明細書中において前述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点について、本発明は特に、ストリンジェントな条件下で前述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用される「ストリンジェントな条件」という用語は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、特には少なくとも９９％の同一性が、配列間に存在する場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００４６】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に含まれるヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントと同一もしくは十分に同一である本発明のポリヌクレオチドは、ＩＧＳ５８をコードしている完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、および、ＩＧＳ５８遺伝子に対して高い配列類似を持つ他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローン（ヒト以外の種のホモログおよびオーソログをコードしている遺伝子を含む）を単離するための、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーション・プローブとして用いられうる。当該技術分野における熟練した人々は、そのようなハイブリダイゼーション技法をよく知っている。一般的に、これらのヌクレオチド配列は基準配列に対して８０％の同一性を持ち、好ましくは９０％の同一性を持ち、より好ましく９５％の同一性を持つ。プローブは一般に、少なくとも５ヌクレオチドを含んで成り、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、特には少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成る。最も好ましくは、そのようなプローブは少なくとも３０ヌクレオチドを有し、少なくとも５０ヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【００４７】
ヒト以外の種からホモログおよびオーソログを含むＩＧＳ５８ポリペチドをコードするポリヌクレオチドを得るための一つの実施態様は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１もしくはそのフラグメントを有する標識プローブによりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記ポリヌクレオチド配列を含んで成る完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップを含んで成る。そのようなハイブリダイゼーション技法は、当該技術分野における熟練者にはよく知られている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは上で定義された通り、あるいは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精液ＤＮＡを含んで成る溶液中において４２℃で一晩インキュベートした後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄した下での条件である。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペチドは、動物およびヒトの疾患に対する処置および診断の発見のための研究試薬および材料として用いられうる。
【００４９】
〔ベクター、宿主細胞、発現〕
本発明はまた、ポリヌクレオチドもしくは本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクター、および本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、ならびに、組換え技術による本発明のポリペチドの製造にも関する。本発明のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを使って、そのようなタンパク質を合成するために、無細胞翻訳系もまた用いられうる。
【００５０】
組換え体の生産のためには、本発明のポリヌクレオチドのための発現系もしくはその一部を取り入れるために、宿主細胞が遺伝的に操作されうる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）のような多くの標準的な実験室マニュアルに記述されている方法（たとえば、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション法、電気穿孔法、トランスダクション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入法（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、もしくは感染など）によって実施されうる。
【００５１】
適当な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセスおよび枯草菌のような細菌細胞；酵母細胞およびコウジカビ細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびハスモンヨトウＳｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；および植物細胞を含む。
【００５２】
多種多様な発現系が用いられうる。そのような系には、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルスから誘導された系、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメントから誘導されたベクター、バキュロウイルス、パポバ・ウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスから誘導されたベクター、ならびに、プラスミドとバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものやコスミドとファージミドに由来するものといった、それらの組み合わせから誘導されたベクターを含む。発現系は発現を発生させ、調節する制御領域を含みうる。一般に、宿主細胞中においてポリペチドを生成するためのポリヌクレオチドを維持、増殖もしくは発現するのに適したあらゆる系もしくはベクターが使用されうる。適当なヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（前出）に述べられているもののような、公知のルーチン的な種々の技法のいずれによっても、発現系内に挿入されうる。
【００５３】
小胞体の内腔、細胞膜周辺腔もしくは細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルが望みのポリペチドに取り込まれてもよい。これらのシグナルはポリペチドに内在するものであっても、もしくは異種性のもの（つまり異なる種に由来するもの）であってもよい。
【００５４】
ＩＧＳ５８ポリペチドがスクリーニングアッセイにおける使用のために発現されるものである場合には、一般に、ポリペチドは細胞の表面で生成されることが好ましい。この場合には、細胞はスクリーニングアッセイにおける使用の前に回収されうる。ＩＧＳ５８ポリペチドのアフィニティーもしくは機能活性が受容体活性修正タンパク質（ＲＡＭＰ）によって変更される場合には、最もありそうなことには細胞の表面における関連するＲＡＭＰの同時発現が好ましく、しばしば要求される。また、この場合、スクリーニングアッセイにおける使用の前に、ＩＧＳ５８ポリペチドおよび関連するＲＡＭＰを発現している細胞の回収が要求される。ＩＧＳ５８ポリペチドが培地に分泌される場合は、ポリペチドを回収し、精製するために、培地が回収されうる；細胞内に生成される場合は、ポリペチドが回収される前に、まず細胞が溶解されなければならない。ＩＧＳ５８ポリペチドを発現している膜は、当該技術分野における熟練者にとって公知の方法によって回収されることができる。一般に、そのような方法には、ＩＧＳ５８ポリペチドを発現している細胞の回収および、ポッタリング（ｐｏｔｔｅｒｉｎｇ）のような手法（これに限定はされない）による細胞のホモジナイゼーションを含む。膜は懸濁液を１回もしくは数回、洗浄することによって回収されうる。
【００５５】
ＩＧＳ５８ポリペチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養から精製されうる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製のために使用される。ポリペチドが単離および／もしくは精製の間に変性する場合には、タンパク質の再フォールディングのためによく知られている技法が活性コンフォメーションを再生させるために用いられうる。
【００５６】
〔診断的アッセイ〕
本発明は診断試薬としての使用のためのＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関連したＩＧＳ５８遺伝子の変異型の検出は、ＩＧＳ５８の過少発現、過剰発現もしくは異常発現に起因する疾患もしくは疾患への感受性の診断に加えることができる診断ツール、もしくはそれを明確にすることができるツールを提供するであろう。また、この場合、望まれる品質の診断アッセイを得るためには、関連する受容体活性修正タンパク質の同時発現が要求されうる。ＩＧＳ５８遺伝子に突然変異を有する個体は、さまざまな技法によってＤＮＡレベルで検出されうる。
【００５７】
診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検もしくは死体解剖からの材料のような、被検者の細胞から得られうる。ゲノムＤＮＡは検出のために直接用いられるか、または、解析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることによって酵素的に増幅されうる。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡもまた、同様な方法で使用されうる。欠失および挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化によって検出されうる。点変異は、増幅されたＤＮＡを標識ＩＧＳ５８ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって同定されうる。完全にマッチした配列はＲｎａｓｅ切断によって、もしくは融解温度の差異によってミスマッチを持つ二重鎖から区別されうる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤の存在下もしくは非存在下におけるゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化によって、もしくは、直接的なＤＮＡ塩基配列決定によって検出されうる。Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２を見よ。特定の位置の配列変化は、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクション、もしくは化学切断法）によっても明らかにされうる。Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を見よ。別の実施態様では、ＩＧＳ５８ヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチド・プローブのアレイが、たとえば、遺伝的変異の効率的なスクリーニングを実施するために作製されうる。アレイテクノロジー法は公知であり、一般的な適用性を有しており、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝的多様性を含む分子遺伝学における種々の問題について言及するために使用されうる（例えば、Ｍ．Ｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ　２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を見よ）。
【００５８】
診断的アッセイは、記述された方法によるＩＧＳ５８遺伝子の突然変異の検出を通して、とりわけ、上記のような疾患を診断し、もしくは、それに対する感受性を決定するための方法を提供する。この診断アッセイは特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する感受性を、記述された方法によるＩＧＳ５８遺伝子中の変異の検出を通して、診断もしくは決定するための方法を提供する。
【００５９】
さらに、とりわけ、上記のような疾患は、被検者に由来するサンプルにおいて異常に減少もしくは増加したＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの量を決定することを含んで成る方法によって診断されうる。特に、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（例えば、胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床）に関係する機能不全、障害もしくは疾患は、異常に減少もしくは増加したＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの量を被検者に由来するサンプルから決定することを含んで成る方法によって診断されうる。
【００６０】
減少もしくは増加した発現は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロッティング、および他のハイブリダイゼーション法といったポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野においてよく知られている方法のいずれかを用いて、ＲＮＡのレベルで測定されうる。宿主に由来するサンプル中のタンパク質（例えばＩＧＳ５８）の量を決定するために用いられうるアッセイ技法は、当該技術分野における熟練者にとって公知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、結合蛋白競合測定法、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００６１】
別の態様では、本発明は、とりわけ上述のような疾患もしくは疾患に対する感受性についての診断キットに関する。特に、本発明は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患についての診断キットに関する。
このキットは、
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリヌクレオチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント；および／もしくは
（ｂ）　（ａ）の配列に相補的なヌクレオチド配列；および／もしくは
（ｃ）　ＩＧＳ５８ポリペプチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチド配列、もしくはそのフラグメント；および／もしくは
（ｄ）　ＩＧＳ５８ポリペチドに対する抗体、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドに対する抗体；および／もしくは
（ｅ）　ＩＧＳ５８ポリペチドの関連する生物学的もしくは抗原性の性状のために要求されるＲＡＭＰポリペチド；
を含んで成る。
【００６２】
あらゆるそのようなキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）もしくは（ｅ）が実質的な成分を構成しうることが認識されるであろう。
〔染色体アッセイ〕
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも価値を持つ。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置へと特異的に誘導され、ハイブリダイズできる。本発明に従う染色体への関連する配列のマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾患に関連させることにおける重要な第一段階である。いったん配列が正確な染色体の位置にマップされたならば、染色体上の配列の物理位置は遺伝子地図データと相関付けられることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能）に見出される。同じ染色体の領域にマップされた遺伝子と疾患の間の関係は、それから、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）を通して同定される。
【００６３】
罹患した個体と罹患していない個体の間のｃＤＮＡもしくはゲノム配列中の差異もまた決定されうる。罹患した個体の一部もしくは全部において変異が観察されるが、正常な個体ではまったく見られない場合には、この変異が疾患の原因因子である可能性が高い。
【００６４】
〔抗体〕
本発明のポリペチドもしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの類似体またはそれらを発現している細胞は、もし必要であれば関連するＲＡＭＰと共に、ＩＧＳ５８ポリペチドに免疫特異的な抗体を作製するために、免疫原としても使用されうる。「免疫特異的」という用語は、抗体が本発明のポリペチドに対して、先行技術における関連する他のポリペチドに対するアフィニティーよりも、実質的により大きなアフィニティーを有することを意味する。
【００６５】
ＩＧＳ５８ポリペチドに対して作製された抗体は、ポリペチドもしくはエピトープを含むフラグメント、類似体もしくは細胞を、ルーチン的なプロトコールを用いて動物に、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより取得されうる。モノクローナル抗体の調製のためには、継続的な細胞株培養によって生産される抗体を提供する、あらゆる技法が使用されうる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）を含む。
【００６６】
上述の抗体は、ポリペチドを発現しているクローンを単離するため、もしくは同定するため、もしくはアフィニティー・クロマトグラフィーによってポリペチドを精製するために利用されうる。
【００６７】
また、ＩＧＳ５８ポリペチド自体、もしくはＩＧＳ５８ポリペチドＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、とりわけ、上述のような疾患を処置するために使用されうる。特に、ＩＧＳ５８ポリペプチド自体に対する抗体もしくはポリペプチドＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患を処置するために使用されうる。
【００６８】
〔動物〕
本発明の別の態様は、ＩＧＳ５８の異常な発現もしくは活性から生じる疾患のモデルとして働くヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に基づくモデル系は、ＩＧＳ５８遺伝子の活性をさらに特徴づけるためにも使用されうる。そのような系は、とりわけ、上述の疾患のようなＩＧＳ５８に基づく疾患を処置することができる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部として利用されうる。特に、この系は、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係するＩＧＳ５８に基づく機能不全、障害もしくは疾患を処置することのできる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部として利用されうる。
【００６９】
このようにして、動物に基づくモデルは、ＩＧＳ５８の異常な発現もしくは活性を持つ疾患の処置に有効な製薬化合物、治療、および介入を同定するために使用されうる。さらに、そのような動物モデルは、被検動物におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために使用されうる。これらのデータは、潜在的なＩＧＳ５８疾患処置のｉｎ　ｖｉｖｏにおける効能を決定するために用いられうる。
【００７０】
異常なＩＧＳ５８の発現もしくは活性に基づく、ＩＧＳ５８に基づく疾患の動物に基づくモデル系は、非組換え動物および組換えにより操作されたトランスジェニック動物の両方を含みうる。
【００７１】
ＩＧＳ５８疾患のための動物モデルは、例えば、遺伝的モデルを含みうる。ＩＧＳ５８に基づく疾患のような症状を呈する動物モデルは、例えば、当該技術分野における熟練者に公知のトランスジェニック動物を生成するための技法と組み合わせて、上述のもののようなＩＧＳ５８配列を利用することによって操作されうる。たとえば、ＩＧＳ５８配列は、目的の動物のゲノム内に導入され、過剰発現され、および／もしくは誤発現されることができ、または、内在性のＩＧＳ５８配列が存在する場合には、それらは過剰発現され、誤発現され、あるいは、ＩＧＳ５８遺伝子発現を過少に発現もしくは不活性化させるために乱されることができる。
【００７２】
ＩＧＳ５８遺伝子配列を過剰発現もしくは誤発現させるために、ＩＧＳ５８遺伝子配列のコード部分は、高レベルな遺伝子発現もしくは、その遺伝子が目的の動物種において通常は発現されない細胞型における発現を駆動することのできる制御配列に連結されうる。そのような制御領域は当業者にとって公知であり、過度の実験を行なわずに使用されうる。
【００７３】
内在性ＩＧＳ５８遺伝子配列の過少発現のためには、そのような配列は、目的の動物のゲノム内に再導入されたときに、内在性ＩＧＳ５８遺伝子の対立遺伝子が不活性化つまり「ノックアウト」されるように単離され、操作されうる。好ましくは、操作されたＩＧＳ５８遺伝子の配列は、内在性ＩＧＳ５８配列が、操作されたＩＧＳ５８遺伝子配列の動物ゲノムへの組み込みに伴って乱されるように、遺伝子ターゲティングを介して導入される。
【００７４】
マウス、ラット、ウサギ、リス、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ　ｐｉｇ）、ヤギおよびヒト以外の霊長類動物（たとえば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）をそれらに限定することなく含む任意の種の動物が、ＩＧＳ５８関連疾患の動物モデルを生成するために用いられうる。
【００７５】
当該技術分野において知られているあらゆる技法が、トランスジェニック動物の初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）系統を生成するためにＩＧＳ５８導入遺伝子を動物に導入するために用いられうる。そのような技法には、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．Ｅ．，１９８９，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８７３，１９１）；レトロウイルスの媒介による生殖細胞系列への遺伝子導入（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２，１９８５）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　５６：３１３−３２１，１９８９）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４，１９８３）；および精子の媒介による遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　５７：７１７−７２３，１９８９）などを含むが、それらに限定はされない。そのような技法の総説については、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９，１９８９を見よ。
【００７６】
本発明は、そのすべての細胞中にＩＧＳ５８導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、および、そのすべての細胞ではなく、いくつかのものに導入遺伝子を持つ動物（すなわちモザイク動物）を提供する（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４によって記述された技法を見よ）。導入遺伝子は単一の導入遺伝子として、もしくはコンカテマー（例えば、先頭と先頭の向かい合ったタンデム型、もしくは先頭と尾部の並んだタンデム型）として組み込まれうる。導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏ　ｅｔ　ａｌの教えに従って、特定の細胞型に選択的に導入され、活性化されることもできる（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６，１９９２）。
【００７７】
そのような細胞型に特異的な活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当該技術分野における熟練者にとっては明白である。
【００７８】
ＩＧＳ５８導入遺伝子が内在性ＩＧＳ５８遺伝子の染色体の部位に組み込まれることが要求される場合には、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に述べると、そのような技術が利用される場合、目的の内在性ＩＧＳ５８遺伝子（例えば、マウスＩＧＳ５８遺伝子のヌクレオチド配列）に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同遺伝子組換えを通して内在性ＩＧＳ５８遺伝子もしくは対立遺伝子のヌクレオチド配列内に組み込み、その機能を乱す目的で設計される。導入遺伝子はまた、たとえば、Ｇｕ　ｅｔ　ａｌ．の教えに従って、選択的に特定の細胞型に導入され、よって、その細胞型のみにおいて目的の内在性遺伝子を不活化することもできる。（Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：１０３−１０６，１９９４）。そのような細胞型に特異的な不活化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当該技術分野における熟練者にとっては明白である。
【００７９】
いったんトランスジェニック動物が作製されると、組換えＩＧＳ５８遺伝子およびタンパク質の発現は、標準的な技法を利用して分析されうる。初期のスクリーニングは、導入遺伝子の組込みが起こったか否かを評価するために動物組織を分析するサザンブロット分析もしくはＰＣＲ手法によって達成されうる。また、トランスジェニック動物の組織中のＩＧＳ５８導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット解析、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、およびＲＴ−ＰＣＲをそれらに限定することなく含む技法を用いても評価されうる。また、標的遺伝子を発現している組織のサンプルは、目的の標的遺伝子の導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いた免疫細胞化学分析によっても評価されうる。ＩＧＳ５８遺伝子ｍＲＮＡもしくはＩＧＳ５８導入遺伝子ペプチドを容易に検出可能なレベルで発現するＩＧＳ５８トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対して作製された抗体を用いて、免疫細胞化学的に検出される）は、それから、ＩＧＳ５８に基づく特徴的な疾患症状を呈する動物を同定するために、さらに評価されうる。
【００８０】
いったんＩＧＳ５８トランスジェニック初代動物（つまり、目的の細胞もしくは組織においてＩＧＳ５８タンパク質を発現し、好ましくはＩＧＳ５８に基づく疾患の症状を示す動物）が作製された後は、それらは特定の動物のコロニーを生成するために飼育され、同系交配され、異系交配され、もしくは交雑育種される。そのような育種戦略の例には、別個の系統を確立するための、１つ以上の組み込み部位を持つ初代動物の異系交配；各ＩＧＳ５８導入遺伝子の相加的発現効果のための、目的のＩＧＳ５８導入遺伝子をより高いレベルで発現する複合ＩＧＳ５８トランスジェニック動物を生成するための個別の系統の同系交配；発現を高め、ＤＮＡ解析による動物のスクリーニングの必要の可能性を排除するために、与えられた組み込み部位についてホモ接合性の動物を生成するためのヘテロ接合性のトランスジェニック動物の交雑；合成的なヘテロ接合性もしくはホモ接合性の系統を生成するための別個のホモ接合性系統の交雑；対立遺伝子の修正がＩＧＳ５８導入遺伝子の発現およびＩＧＳ５８様症状の発生に与える影響を調べるための、異なる同系交配遺伝的背景への動物の育種；を含むがそれらに制限はされない。一つのそのようなアプローチは、上述のもののようなＩＧＳ５８関連疾患様症状を示すＦ１世代を生成するために、ＩＧＳ５８トランスジェニック初代動物と野生型系統を交配することである。Ｆ１世代はそれから、ホモ接合性の標的遺伝子トランスジェニック動物が生存可能であることが判明した場合には、ホモ接合性の系統を作製するために同系交配される。
【００８１】
〔ワクチン〕
発明の別の態様は、とりわけ上述の疾患から動物を保護する抗体および／もしくはＴ細胞免疫応答を生じるのに十分なＩＧＳ５８ポリペチドもしくはそのフラグメントを、もし必要であればＲＡＭＰポリペチドと一緒に、哺乳類に対して（たとえば、接種により）投与することを含んで成る、哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関する。特に、本発明は精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺、および中枢神経系（例えば、胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床）に関係する機能不全、障害もしくは疾患から動物を保護する抗体および／もしくはＴ細胞免疫応答を生じるのに十分なＩＧＳ５８ポリペチドもしくはそのフラグメントを、もし必要であればＲＡＭＰポリペチドと一緒に、哺乳類に対して（たとえば、接種により）投与することを含んで成る、哺乳類において免疫応答を誘導する方法に関する。
【００８２】
本発明のさらに別の態様は、疾患から哺乳類を保護するための抗体を生成するような免疫応答を誘導するために、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＩＧＳ５８ポリヌクレオチドの発現を指示するベクターを通してＩＧＳ５８ポリペチドを送達することを含んで成る、前記動物において免疫応答を誘導する方法に関する。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物宿主内に導入されるとＩＧＳ５８ポリペチドに対する免疫応答をその哺乳類において誘導する、ＩＧＳ５８ポリペチドもしくはＩＧＳ５８遺伝子を含んで成る免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関する。そのような免疫学的／ワクチン製剤（組成物）は、治療用の免疫学的／ワクチン製剤、もしくは予防用の免疫学的／ワクチン製剤のいずれかでありうる。ワクチン製剤はさらに適当な担体を含んで成りうる。ＩＧＳ５８ポリペチドは胃の中で分解されうるため、非経口的に投与されることが好ましい（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、その他の注射を含む）。非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および、製剤を受容者の血液と等張性にする溶質を含みうる水性もしくは非水性の滅菌注射溶液、ならびに、懸濁剤もしくは増粘剤を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。この製剤は、例えば、封をされたアンプルおよびバイアルといった単位用量もしくは多用量容器に入れられて提示されることができ、また、使用の直前に無菌液体の添加のみを要求する凍結乾燥条件で保存されうる。ワクチン製剤はまた、たとえば水系中の油および当該技術分野おいて知られている他の系など、製剤の免疫原性を強化するためのアジュバント系を含みうる。投与量はワクチンの特異的な活性に依存し、ルーチン的な実験によって容易に決定されることができる。
【００８４】
〔スクリーニングアッセイ〕
本発明のＩＧＳ５８ポリペチドは、受容体を結合する化合物、および、活性化する化合物（アゴニスト）もしくは、本発明の受容体ポリペチドの活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニング・プロセスにおいて使用されうる。よって、本発明のポリペチドはまた、たとえば、細胞、無細胞調製液、ケミカルライブラリーおよび天然産物混合液における、小分子基質およびリガンドの結合を評価するためにも使用されうる。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドでありえ、または、構造的もしくは機能的な模倣物でありうる。
【００８５】
ＩＧＳ５８ポリペチドは病理を含む生物学的機能をもたらす。したがって、一方ではＩＧＳ５８を刺激し、他方ではＩＧＳ５８の機能を阻害することができる化合物および薬剤を見つけることが望ましい。一般に、アゴニストは、とりわけ上述の疾患のような状態に対する、治療的および予防的な目的のために利用される。特に、アゴニストは、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する治療的および予防的な目的のために利用される。
【００８６】
アンタゴニストは、とりわけ上述の疾患のような状態に対する、さまざまな治療的および予防的な目的のために利用されうる。特に、アンタゴニストは、精巣、前立腺、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎、甲状腺および中枢神経系（胎性脳、脳、小脳、脊髄、尾状核、扁桃体、脳梁、海馬および視床など）に関係する機能不全、障害もしくは疾患に対する、さまざまな治療的および予防的な目的のために利用されうる。
【００８７】
一般に、そのようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペチドをその表面に発現する適当な細胞を生成すること、および、もし必須であればその表面におけるＲＡＭＰの同時発現を含む。そのような細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエもしくは大腸菌からの細胞を含む。受容体を発現している細胞（もしくは発現された受容体を含む細胞膜）はそれから、結合もしくは刺激もしくは機能的反応の阻害を観察するために、試験化合物と接触させられる。
【００８８】
スクリーニング技法には、細胞外ｐＨ、細胞内ｐＨもしくは受容体の活性化に起因する細胞内カルシウムの変化を測定する系における、本発明の受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技法では、化合物は本発明の受容体ポリペチドを発現している細胞に接触させられうる。それから、潜在的な化合物が受容体を活性化するか、もしくは阻害するか否かを決定するために、二次メッセンジャー反応（例えば、シグナル伝達、ｐＨ変化もしくはカルシウム濃度の変化）が測定される。
【００８９】
別の方法は、受容体媒介シグナル（例えば、ｃＡＭＰの蓄積および／もしくはアデニル酸シクラーゼ活性）の変調を決定することによる受容体阻害剤のスクリーニングを含む。そのような方法には、細胞表面上に受容体を発現するために、本発明の受容体を真核細胞にトランスフェクトすることを含む。細胞はそれから、潜在的なアンタゴニストの存在下で、本発明の受容体に対するアゴニストに暴露される。潜在的なアンタゴニストが受容体に結合し、よって受容体結合を阻害するならば、アゴニスト媒介シグナルは変調される。
【００９０】
本発明の受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許第５，４８２，８３５号に記述されているような、酵母に基づく技法である。
【００９１】
アッセイは単に、候補化合物の結合を試験してもよい。そして、ここにおいて、受容体を有する細胞への付着は、候補化合物に直接的もしくは間接的に結合する標識によって、または、標識競合物との競合を含むアッセイにおいて検出される。さらに、これらのアッセイは、受容体をその表面に有する細胞に適した検出系を使用して、候補化合物が受容体の活性化によって発生するシグナルをもたらすか否かを試験しうる。活性化の阻害剤は一般に既知のアゴニストの存在下で分析され、候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響が観察される。
【００９２】
さらに、アッセイは単に、混合液を形成するために候補化合物とＩＧＳ５８ポリペチドを含む溶液を混ぜ合わせるステップ、混合液中のＩＧＳ５８活性を測定するステップ、および、混合液のＩＧＳ５８活性を標準と比較するステップを含んで成りうる。
【００９３】
また、ＩＧＳ５８　ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、添加された化合物が細胞中のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成に与える影響を検出するためのアッセイを構成するためにも使用されうる。たとえば、ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において知られている標準的な方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、ＩＧＳ５８タンパク質の分泌レベル、もしくは細胞に結合したレベルを測定するために構築されることができ、これは、適当に操作された細胞もしくは組織からのＩＧＳ５８の合成を阻害もしくは増進しうる薬剤（それぞれ、アンタゴニストもしくはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用されうる。スクリーニング・アッセイを行なうための標準的な方法は、当該技術分野おいて公知である。
【００９４】
潜在的なＩＧＳ５８アンタゴニストの例には、抗体もしくは、いくつかの場合には、ＩＧＳ５８のリガンドに密接に関係したオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（たとえば、受容体の活性が妨げられるように受容体に結合するが、反応は引き出さないリガンドのフラグメントもしくは小分子）を含む。
【００９５】
このように、別の態様において、本発明はＩＧＳ５８ポリペチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、または、ＩＧＳ５８ポリペチドの合成を減少、増加および／もしくは他の方法で高める化合物を同定するためのスクリーニング・キットであって、
（ａ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチド；
（ｂ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドを発現している組換え細胞；
（ｃ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペチドを発現している細胞膜；もしくは
（ｄ）　ＩＧＳ５８ポリペチド、好ましくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のポリペプチドに対する抗体；
を含んで成るスクリーニング・キットに関する。
【００９６】
そのようなあらゆるキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は実質的な成分を構成しうることが認識されるであろう。
【００９７】
〔予防および治療の方法〕
本発明は、過剰なＩＧＳ５８活性および不十分なＩＧＳ５８活性の両方に関係する異常状態を処置する方法を提供する。
【００９８】
ＩＧＳ５８の活性が過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用できる。一つのアプローチは、リガンドのＩＧＳ５８への結合をブロックすることによって、または、ＲＡＭＰペプチドもしくは二次シグナルとの相互作用を阻害することによって活性化を阻害し、それによって、異常な状態をやわらげるのに有効な量の上に記載されたような阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製薬学的に許容しうる担体と共に患者に投与することを含んで成る。
【００９９】
別のアプローチでは、内在性のＩＧＳ５８と競合してリガンドを結合することができる可溶性形態のＩＧＳ５８ポリペチドが投与されうる。そのような競合剤の典型的な実施態様は、ＩＧＳ５８ポリペチドのフラグメントを含んで成る。
【０１００】
さらに別のアプローチでは、内在性のＩＧＳ５８をコードしている遺伝子の発現が、発現ブロッキング技法を使って阻害されうる。既知のそのような技法には、内部で生成されるか、もしくは別個に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。たとえば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ　ＵＳＡ（１９８８）を見よ。あるいは、遺伝子と三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドが供給されうる。たとえば、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；　Ｃｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；　Ｄｅｒｖａｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を見よ。これらのオリゴマーはそれ自体が投与されることができ、もしくは、関連するオリゴマーがｉｎ　ｖｉｖｏで発現されることができる。合成アンチセンスもしくは三重鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基もしくは修飾された骨格を含んで成りうる。後者の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオネートもしくはペプチド核酸骨格を含む。そのような骨格は、ヌクレアーゼによる分解からの保護を提供するために、アンチセンスもしくは三重鎖オリゴヌクレオチド中に取り入れられ、当該技術分野において公知である。これら、もしくは他の修飾骨格により合成されたアンチセンスおよび三重鎖分子もまた、本発明の一部を構成する。
【０１０１】
さらに、ＩＧＳ５８ポリペチドの発現は、ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げられうる。リボザイムとは、天然もしくは合成の触媒的に活性なＲＮＡである（たとえば、Ｕｓｍａｎ，Ｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３を見よ）。合成リボザイムは、選択された位置でＩＧＳ５８　ｍＲＮＡを特異的に切断し、それによって、ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡが機能的なポリペチドに翻訳されるのを妨げるように設計されうる。リボザイムは、通常ＲＮＡ分子中に見い出だされるような天然型のリボース・リン酸骨格および天然型の塩基によって合成されうる。あるいは、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を提供するために、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡなどの非天然骨格によって合成され、また、修飾された塩基を含んでもよい。
【０１０２】
また、ＩＧＳ５８の過少な発現およびその活性に関係する異常状態の処置のためには、数種のアプローチが利用できる。一つのアプローチは、治療的に有効な量の上述のようなＩＧＳ５８を活性化する化合物（すなわちアゴニスト）を薬学的に許容されうる担体と組み合わせて患者に投与し、それによって、異常状態をやわらげることを含んで成る。あるいは、遺伝子治療が患者の関連する細胞によるＩＧＳ５８の内因的合成をもたらすために使用されうる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上で述べたように、複製に欠陥を持つレトロウイルスベクターによる発現用に設計されうる。レトロウイルス発現コンストラクトはそれから単離され、パッケージング細胞が目的遺伝子を含む感染力を持ったウィルス粒子を生成するように、本発明のポリペチドをコードしているＲＮＡを含むレトロウイルス・プラスミドベクターを形質導入されたパッケージング細胞へと導入されうる。これらの生産細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで細胞を操作するため、また、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるポリペチドの発現のために患者に投与されうる。遺伝子治療の概要については、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｔｒａｃｈａｎ　Ｔ．ａｎｄ　Ｒｅａｄ　Ａ．Ｐ．，ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ（１９９６）の第２０章Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中で引用されている参考文献）を見よ。
【０１０３】
上述の治療方法のいずれもが、そのような治療を必要としているあらゆる患者（たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルのような哺乳類、最も好ましくはヒトを含む）に適用されうる。
〔製剤および投与〕
ＩＧＳ５８ポリペチドの可溶な形態のようなペプチド、およびアゴニスト、およびアンタゴニスト・ペプチド、もしくは小分子は、適当な製薬学的担体と組み合わせて調合されうる。そのような製剤は、治療的に有効な量のポリペチドもしくは化合物、および製薬学的に許容されうる担体もしくは賦形剤を含んで成る。製剤は投与の様式に適合すべきであり、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。発明はさらに、１種以上の本発明の前述の組成物の成分が充填された１つ以上の容器を含んで成る製薬学的パックおよびキットに関する。
【０１０４】
本発明のポリペチドおよび他の化合物は単独で、もしくは、治療薬化合物のような他の化合物との併用で使用されうる。
【０１０５】
本製薬組成物の全身投与の好ましい形態は、一般的には静脈内注射による注射を含む。皮下、筋肉内もしくは腹腔内のような他の注射経路も使用されうる。全身投与のための代替的な手段には、胆汁酸塩もしくはフシジン酸もしくは他の界面活性剤のような浸透剤を用いた経粘膜的および経皮的な投与を含む。さらに、腸溶性もしくは被包性の製剤に正しく調剤されたなら、経口投与もまた可能となりうる。
【０１０６】
必要な投与量の範囲は、ペプチドもしくは化合物の選択、投与の経路、製剤の性質、患者状態の性質、および担当医師の判断に依る。適当な投与量は患者の体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲にある。しかし、利用可能な化合物の種類およびさまざまな投与経路の異なる効率を考慮すると、必要とされる投与量の広い変動が予期される。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予期されるであろう。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野においてよく理解されているように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを使って調節されうる。
【０１０７】
処置に使われるポリペチドは、先に述べたように「遺伝子治療」としばしば呼ばれる処置様式において、患者中で内因的にも生成されうる。よって、例えば、患者由来の細胞は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのようなポリペチドをコードするポリヌクレオチドによって、例えば、レトロウイルス・プラスミドベクターを使用してｅｘ　ｖｉｖｏで操作されうる。細胞はそれから、患者内に導入される。
【０１０８】
【実施例】
以下の例は、本発明をより詳細にさらに具体的に示すことのみが意図されており、したがって、これらの例は決して本発明の範囲を限定するとはみなされない。
例１．新規Ｇタンパク質共役受容体をコードするｃＤＮＡのクローニング。
【０１０９】
未完成のハイスループット・ゲノムＤＮＡ配列（ｈｔｇｓ）のパブリックドメイン・データバンク中に、我々は潜在的に新規のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードするヒト・ゲノム配列（登録番号：ＡＬ１６２４７１）を同定した。我々はこの新規ＧＰＣＲをＩＧＳ５８と呼ぶ。ヒト組織からそのｃＤＮＡをクローニングすることを試みることによって、このゲノム配列が機能的な遺伝子をあらわしているか否かを調査することが決定された。ヒト精巣ポリＡ（＋）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ＃６５３５−１）は酵素の供給元によって推奨されるプロトコールに従って、まず、残存する微量のゲノムＤＮＡを破壊するためにＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって処置され、それから、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使い、逆転写を通してｃＤＮＡに変換された。ＰＣＲプライマーは推定上のＩＧＳ５８コード配列を増幅するように設計された。最初のＰＣＲ反応（５０μｌ体積）はＱｉａｇｅｎによって推奨される条件の下で、それぞれフォワードおよびリバースプライマーのＩＰ１５，０７３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）およびＩＰ１５，０７５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）と共にＨｏｔＳｔａｒＴａｑＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ　＃２０３２０３）を使って、精巣ｃＤＮＡ鋳型（ＤＮａｓｅ　Ｉで処置され、逆転写された５０ｎｇのヒト精巣ポリＡ（＋）ＲＮＡに由来）に対して実施された。ＰＣＲ反応については、反応チューブは１５分間９５℃で加熱され、それから３５サイクルの変性（３０秒、９５℃）、アニーリング（１２０秒、６５℃）および伸長（９０秒、７２℃）に付された。１０分間、７２℃の最終的な伸長が行なわれた。最初のＰＣＲ反応の１／５０希釈の１μｌが、それぞれネステッド・フォワードプライマーＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）および最初のリバースプライマーＩＰ１５，０７５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）と共にＨｏｔｓｔａｒＴａｑＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ　＃２０３２０３）を使用したセミネステッドＰＣＲ反応における鋳型として使用された。その後の便利なサブクローニングを可能とするために、ＢａｍＨＩクローニングサイトがＩＰ１５，０７４の５’末端に追加された。ネステッドＰＣＲ反応のためのサイクリング条件は、最初のＰＣＲのものと同一であった。ＰＣＲ反応産物はアガロースゲル電気泳動によって分析され、エチジウムブロマイドにより染色された。最初のＰＣＲ反応はシグナルを生じなかったが、セミネステッドＰＣＲ反応は約１６００ｂｐの明確なＤＮＡフラグメントを生成した。模擬逆転写したＲＮＡ（逆転写反応中にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ　ＩＩを加えなかったもの）が使用された場合にはＤＮＡ産物は得られず、この１６００ｂｐフラグメントがｃＤＮＡに由来するものであることが示された。この±１６００ｂｐフラグメントは、ＱｉａｑｕｉｃｋＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製され、供給元によって推奨される手順に従って、ｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結された（ｐＧＥＭ−Ｔ　ｓｙｓｔｅｍ，　Ｐｒｏｍｅｇａ）。組み換えプラスミドはそれから、コンピテント大腸菌株ＤＨ５αＦ’バクテリアを形質転換するために使用された。形質転換された細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗布された。プラスミドＤＮＡはＢｉｏＲｏｂｏｔＴＭ　９６００核酸精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、個々の白色コロニーのミニ培養から精製され、シークエンシングされた。ＤＮＡシークエンシング反応は、インサートに隣接するプライマーと内部の（ＩＧＳ５８に特異的な）プライマーを使用し、ＡＢＩ　ＰｒｉｓｍＴＭ　ＢｉｇＤｙｅＴＭ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、精製されたプラスミドＤＮＡに対して実施された。サイクル・シークエンシング反応産物はＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈殿によって精製され、ＡＢＩ３７７自動シーケンサーにセットされた。クローンＩＧＳ５８．６は１６０４ｂｐのＤＮＡ配列を含み、４８２アミノ酸のタンパク質をコードしていた。我々は、このＤＮＡ配列（ＢａｍＨＩクローニングサイトを含まない）およびコードされるタンパク質をそれぞれＩＧＳ５８ＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）およびＩＧＳ５８ＰＲＯＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）と呼ぶ。ＩＧＳ５８ＤＮＡ配列は、１９番目（Ａの代わりにＧ）、３５番目（Ｃの代わりにＴ）および１４３１番目（Ｃの代わりにＴ）のヌクレオチド位置を除き、初めにゲノム・エントリＡＬ１６２４７１内に同定された部分と同一だった。１９番目のヌクレオチドは５’非コード領域中にあり、コードされるタンパク質には影響しない（ヌクレオチド位置１９は実際にはプライマーＩＰ１５，０７４の３’側の最後から２番目のヌクレオチドである。このプライマーはその位置に「Ａ」を持つように設計されたものの、合成中にその位置に「Ｇ」が導入されたらしい）。３５番目のヌクレオチドの変化はＩＧＳ５８のオープンリーディングフレーム内であるが、コードされるアミノ酸の同一性には影響を及ぼさない。しかし、１４３１番目のヌクレオチドの差異は、コードされるタンパク質の変化（Ｖａｌ−＞Ａｌａ）を導く。ＩＧＳ５８ＤＮＡ配列の３’末端と完全に重複するヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）配列エントリＡＷ１９６３３１およびＡＡ６３４４４６もまた、１４３１番目の位置にＴを有している。
【０１１０】
最新のタンパク質データバンクおよび翻訳されたＤＮＡデータバンクのＩＧＳ５８ＰＲＯＴ配列ホモロジー検索が、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　Ｓ．Ｆ．ｅｔ　ａｌ．［１９９７］，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて実施された。これらの検索は、ＩＧＳ５８ＰＲＯＴ配列がヒト白血球血小板活性化因子受容体をあらわすと主張される配列に最も類似することを示した（アライメントされた３１２残基について９２％の同一性；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１４９６８；しかし、このタンパク質は３２２残基の長さしかない）。ＤＮＡレベルでは、ＩＧＳ５８ＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋのＭ７６６７６配列と（アライメントされた１４２６ヌクレオチドについて）９８％が同一だった。ＩＧＳ５８ＤＮＡと比較すると、Ｍ７６６７６ＤＮＡ配列中には多くの挿入／欠失が存在しており、その結果、ＩＧＳ５８ＰＲＯＴ（の一部）と９２％のみが同一の、より短いコードされたタンパク質がもたらされている。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
例２．哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８の作製。
【０１１３】
プラスミドｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８（ヒトＩＧＳ５８タンパク質の完全なコード配列を含む）を保有する大腸菌株ＩＧＳ５８．６が、ＬＢ寒天プレート（１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを含む）上に再塗布された後に再クローニングされ、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社の細菌株コレクション（ＩＣＣＧ　４５８４）とオランダ・ユトレヒトの「Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）」（登録番号：１０９７１７）の両方に寄託された。再クローニングされた単離株から調製したプラスミドＤＮＡは再度シークエンシングされ、以前に決定されたＩＧＳ５８ＤＮＡコンセンサス配列に同一であることが見出された。
【０１１４】
完全なＩＧＳ５８コード配列を含んでいる１５６３ｂｐのＤＮＡフラグメントは、オリゴヌクレオチドプライマーＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびＩＰ１５，０７６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）を用いて、ｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８プラスミド鋳型からＰＣＲ増幅された。オリゴヌクレオチドＩＰ１５，０７４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）およびＩＰ１５，０７６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）は、それらの５’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトを含んでいた。増幅されたＰＣＲフラグメントはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化され、ゲルから精製された（ＭｉｎｉＥｌｕｔｅゲル抽出プロトコール、Ｑｉａｇｅｎ）。ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、直鎖状化された５４１３ｂｐのベクターフラグメントもまたゲルで精製された。消化されたプラスミドとＰＣＲフラグメントは連結され、ライゲーション混合液は熱ショックによってコンピテント大腸菌株ＤＨ５αＦ’バクテリア中に導入された。形質転換された細菌はＬＢ寒天プレート（１ｍｌあたり１００μｇのアンピシリンを含む）上に塗布され、３７℃で一晩インキューベートされた。個々の細菌コロニーが選択され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩で培養された。プラスミドＤＮＡが調製され、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断解析によって分析された。３つのクローン（クローン１７、２３、２６）は正しい制限プロファイルを示し、ＤＮＡ配列解析を通してさらに特徴づけられた。クローン２６はＩＣＣＧ　４７４８としてＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓの細菌培養コレクションに寄託された（プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８を保持）。
【０１１５】
ＩＣＣＧ　４７４８株から調製されたプラスミドＤＮＡであるｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｕＩＧＳ５８のＤＮＡ配列解析は、インサートがＩＧＳ５８ＤＮＡコンセンサスｃＤＮＡ配列と完全に同一であることを示した。
例３．定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）による異なるヒト組織中のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの発現解析。
【０１１６】
ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）およびＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの絶対的発現量は、Ｌｉｇｈｔ　ＣｙｃｌｅｒＴＭ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および遺伝子特異的ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎＴＭプローブをヒトＲＮＡサンプルに対して用いて、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Ｑ−ＰＣＲ）において決定された。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルが、異なるＲＮＡサンプルのｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅の効率のコントロールとして測定された。
【０１１７】
ｃＤＮＡは異なるヒト組織の総ＲＮＡ（ＣｌｏｎｔｅｃｈヒトＲＮＡパネルｃａｔ＃Ｋ４０００−１、Ｋ４００１−１、Ｋ４００２−１、Ｋ４００３−１およびＫ４００４−１）、もしくはヒト脳の異なる小領域に由来するポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ＃６５８０．１，６５７５．１，６５４３．１，６５７４．１，６５７７．１，６５７８．１および６５８２．１）のいずれかからの逆転写を通して合成された。逆転写の前に、ＲＮＡは可能な汚染性ゲノムＤＮＡを破壊するために、供給元によって推奨される手順に従って、ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｃａｔ＃１８０６８−０１５）で処置された。ＤＮａｓｅ　Ｉ反応はＥＤＴＡを添加し（最終濃度＝２．３ｍＭ）、６５℃で１０分間加熱することによって停止された。ＤＮａｓｅ　Ｉで処置されたＲＮＡ（５μｇの総ＲＮＡもしくは９４５ｎｇのポリ（Ａ）＋　ＲＮＡのいずれか）は、２．５μｇのオリゴ（ｄＴ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　＃１８４１８−０１２）にアニーリングさせられ、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ；１００μｌ反応体積；３７℃で１時間）を用いた逆転写に付された（＝ＲＴ＋反応）。逆転写酵素は９３℃で５分間のインキュベーションによって不活化された。ＤＮａｓｅで処置されたＲＮＡの一部は逆転写にかけられず、残存性のゲノムＤＮＡの存在について調べるためのコントロールとして用いられた（ＲＴ−反応）。
【０１１８】
ゲノムＤＮＡの非存在のためのコントロールとして、総ＲＮＡのＲＴ−反応液に対してヒトβ２ミクログロブリンＤＮＡに特異的なＰＣＲ増幅反応が実施された。ＰＣＲ反応は、２．５μｌのＧｅｎｅＡｍｐＴＭ　１０×　ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．５μｌの、ＲＴ−　ｃＤＮＡ合成反応液、各５ｐｍｏｌのＰＣＲプライマーＩＰ３，９８１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）およびＩＰ３，９８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８）、ならびに１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｃａｔ＃Ｎ８０８−０２４４）を含む、２５μｌ反応体積中で実施された。９５℃で１０分間の初期的なインキュベーションの後、反応は以下のようにして３０サイクルが行なわれた：９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング、および７２℃で１分の伸長。最終的な伸長が７２℃で１０分間行なわれた。ポジティブコントロールとして、５０ｎｇのヒト・ゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　＃６５５１−１）が用いられた。予想される長さのアンプリコンが、ゲノムＤＮＡ鋳型から得られたが、ネガティブコントロール（Ｈ２Ｏ）からも、また、ＲＴ−サンプルからも得られなかった（ＩＰ３，９８１／ＩＰ３９８２プライマー対が６１６ｂｐのイントロンを跨いでいるという事実のために、ｃＤＮＡ上およびゲノムＤＮＡで予想されるアンプリコンの長さはそれぞれ２６９ｂｐおよび８８５ｂｐである）。ＲＴ−ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡサンプルは、０．８μｌのＲＴ−　ｃＤＮＡ合成反応液を用いたＧＡＰＤＨ特異的Ｑ−ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡの存在について分析された（下記参照）。ＧＡＰＤＨに特異的なシグナルは得られなかった。我々は、合成されたｃＤＮＡにはゲノムＤＮＡは含まれないと結論した。
【０１１９】
Ｑ−ＰＣＲ反応は、１×　ＴａｑＭａｎＴＭ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｃａｔ＃４３０４４３７）、０．１２ｍｇ　ＢＳＡ／ｍｌ、９００ｎＭのＧＡＰＤＨもしくはＩＧＳ５８のいずれかに特異的なフォワードおよびリバースプライマー（ＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５，５２９［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９］／ＩＰ１５，５３１［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０］、ＩＧＳ５８についてはＩＰ１５，７１４［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１］／ＩＰ１５，７１５［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２］）、２５０ｎＭの遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ（それぞれ、ＧＡＰＤＨについてはＩＰ１５，５３０［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３］、ＩＧＳ５８についてはＩＰ１５，７０５［ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４］）、および１．６μｌの総ＲＮＡ　ＲＴ＋もしくはポリ（Ａ）＋　ＲＴ＋　ｃＤＮＡ合成反応液を含む、２０μｌの反応体積中で実施された。１×　ＴａｑＭａｎＴＭ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘは、ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐＥｒａｓｅＴＭウラシルＮグリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ、Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　１、および最適化されたバッファー成分を含んだ。特異的なプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ　ＥｘｐｒｅｓｓＴＭソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ）により設計された。遺伝子特異的標準曲線は、直鎖状のｐＧＥＭ−ＴｈｕＧＡＰＤＨ（完全長のヒトＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡを含む）もしくはｐＧＥＭ−ＴｈｓＩＧＳ５８プラスミド（ＩＣＣＧ　４５８４）の一連の１／１０希釈（１反応あたり１０８〜１０２コピー）に基づき確立された。ＰＣＲ反応はＬｉｇｈｔ　ＣｙｃｌｅｒＴＭ装置のガラスキャピラリーキュベット中で実施された。（ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ反応を行なわせるための）５０℃で２分間の初期インキュベーションの後、９５℃で１０分間のＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭの活性化が続き、以下のようにして反応が５０サイクル行なわれた：９５℃で１５秒の変性、６０℃で６０秒のアニーリング／伸長（ＧＡＰＤＨおよび１ＧＳ５８の両方）。サンプルの定量はＬｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．０を使って実施された。
【０１２０】
ヒトＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの絶対発現量は、骨格筋（ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約７．４×１０６コピー）、心臓（ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約２．３×１０６コピー）、および膵臓、脾臓、肝臓および胃（それぞれ、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約４×１０５〜約１．５×１０６コピーの範囲）を除くほとんどの組織においてポリ（Ａ）＋　ＲＮＡ　１ｎｇあたり約１〜３×１０５コピーの範囲であった（図１）。
【０１２１】
ＩＧＳ５８　ｍＲＮＡは、精巣においては、２番目に高い発現量を持つ組織（前立腺：ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり６，５０１コピー）よりも、一桁多量に存在することが見出された（図２）。また、比較的高いレベル（ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり１，０００〜４，０００コピー）が中枢神経系の組織（胎性脳、脳、小脳および脊髄）においても観察された。これは、異なる脳小領域から得られたポリ（Ａ）＋　ＲＮＡについて得られたＱ−ＰＣＲのデータによって確証された：この部分のＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ発現量は、黒質（ｍＲＮＡ　１ｎｇあたり２９６コピー）を除き、ｍＲＮＡ　１ｎｇ　あたり５００〜１，０００コピーであった。また、かなりのレベルのＩＧＳ５８　ｍＲＮＡが、子宮、心臓、腎臓、肺、気管、骨格筋、副腎および甲状腺に見出された。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
例４．ＩＧＳ５８をトランスフェクトした細胞の作製。
【０１２４】
ＩＧＳ５８のリガンドを同定するためには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、ＩＧＳ５８オーファン受容体のｃＤＮＡによって安定にトランスフェクトされる。ＩＧＳ５８受容体のＧタンパク質共役機構は未だ不明であるので、ＧＰＣＲのための「万能アダプター」として知られるＧタンパク質Ｇα１６を発現する特異的なＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）が用いられる（Ｍｉｌｌｉｇａｎ　Ｇ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１７：２３５−７）。この細胞株はまた、ミトコンドリアへと誘導されるアポエクオリンを安定に発現する。
【０１２５】
材料には、ＩＧＳ５８　ｐｃＤＮＡ３．１ベクター［ＩＣＣＧ　＃４７４８］；ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）；培養培地：１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ　４００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）；選択培地：１０％　ＦＣＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、ハイグロマイシンＢ　４００μｇ／ｍｌおよびジェネテシン５００μｇ／ｍｌを補充したＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）；ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、２Ｕ／μｌ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　２００Ｕ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を含む。
【０１２６】
ＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６／ｍｔＡＥＱ細胞は、製造業者により記述されたようにして、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクションは２４穴プレート中で行なわれる。培養培地中で２４時間後、培地は取り除かれ、選択培地と取り替えられる。選択培地中でコンフルエントになるまで培養された後、このポリクローナルは一度、２４穴プレート中で継代される。
【０１２７】
ポリクローナルの選抜はＱ−ＰＣＲによって行なわれる。ＲＮＡは、供給されるプロトコールに従って、Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により、モノクローナル（２４穴プレートの１つのコンフルエントなウェル）から単離される。ＲＮＡはサンプルあたり１ＵのＤＮａｓｅ　Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、２Ｕ／μｌ）で処理される。ＲＮＡサンプルの半分はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いたＲＴ−ＰＣＲに使用される。プライマーのアニーリングはＲＮＡとオリゴｄＴ１６（０．６μＭ）によって、６５℃から１５℃で１０分間実施される。Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）と各０．４３ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、２０Ｕ　ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、４０Ｕ／μｌ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　２００Ｕ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、２００Ｕ／μｌ）が３０μｌの最終体積にまで添加され、その後、４２℃で１時間のインキュベーションが続く。
【０１２８】
Ｑ−ＰＣＲはＩＧＳ５８受容体に特異的なＱ−ＰＣＲプライマーを用いて実施される。ＰＣＲ産物の量は、ｄｓＤＮＡに結合するＳｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎの蛍光を測定することによって、各サイクルの後に決定される。ＩＧＳの相対発現量は、染色体ＤＮＡの４つの異なる希釈の標準曲線と関係する。相対的定量はハウスキーピング遺伝子のβチューブリンに対して標準化される。
【０１２９】
２つの最良のポリクローナルが、モノクローナルを得るために用いられる。細胞は限界希釈で播種される。先に述べたように、モノクローナルの選抜はＱ−ＰＣＲによって為される。６種の最良のモノクローナルが、Ｔ７５フラスコ中でコンフルエントになるまで培養され、１０％のＤＭＳＯを含む培養培地中で凍結される。
例５．リガンドの探索。
【０１３０】
特定のＧタンパク質共役受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６−ｍｔＡＥＱ細胞が、例４に記述されるようにして培養され、多くの化合物ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。化合物は１もしくは１０μＭの濃度で試験される。エクオリン・スクリーニングアッセイでは、ＡＴＰ（１０μＭ）もしくはジギトニン（５０μＭ）が、ポジティブコントロールとして用いられる。スクリーニングは下記のように、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ　Ｊｅｔ　１４５０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使って半自動的に実施される。
【０１３１】
一度、化合物が見出されたなら、シグナル活性は第二のエクオリン実験によって確かめられる。その後、それらは用量反応実験において、さらに特徴づけられる。
【０１３２】
ＩＧＳ５８受容体を発現しているＣＨＯ−Ｋ１−Ｇα１６細胞とアポエクオリンを用いてリガンドを見出すことに成功しない場合には、Ｇタンパク質Ｇα１６を持たない対応する細胞株が同様にして作製されることができ（例４参照）、その後、化合物の試験が続く。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
【表６】
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【０１３５】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
異なるヒト組織におけるＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告されている値（＃コピー／ｎｇ　ｍＲＮＡ）は、２回のＱ−ＰＣＲアッセイ（各アッセイは独立に調製したｃＤＮＡに対するもの）の平均値をあらわす。ｍＲＮＡは総ＲＮＡの２％を占め、そのｃＤＮＡ合成は１００％の効率であると仮定された。真の効率はおそらく２０〜５０％に近いことから、実際のコピー数は２〜５倍少なく見積もられている可能性が高い。「＊」の印の付けられた組織ではポリ（Ａ）＋　ＲＮＡが用いられたが、他の全ての組織では総ＲＮＡが用いられた。
【図２】
異なるヒト組織におけるＩＧＳ５８　ｍＲＮＡ発現のＱ−ＰＣＲ分析。報告されている値（＃コピー／ｎｇ　ｍＲＮＡ）は単一の測定からのものである。ｍＲＮＡは総ＲＮＡの２％を占め、そのｃＤＮＡ合成は１００％の効率であると仮定された。真の効率はおそらく２０〜５０％に近いことから、実際のコピー数は２〜５倍少なく見積もられている可能性が高い。「＊」の印の付けられた組織ではポリ（Ａ）＋　ＲＮＡが用いられたが、他の全ての組織では総ＲＮＡが用いられた。精巣におけるＩＧＳ５８　ｍＲＮＡの発現量は、前立腺のものよりも一桁大きく、棒グラフ上にはあらわされていない。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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