(57)【要約】本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも７０％の同一性を有するところのアミノ酸配列を有する鏡像体選択的アミダーゼをエンコードする核酸配列に関する。本発明は発酵培地における微生物の発酵法、バッチ及びフィード相を含む、において、微生物が本発明の核酸を発現し、かつ発酵の間、発酵培地１ｌ当たり０．５〜５０ｍｇのZn2+が供給されるところの発酵方法にもまた関する。本発明は、鏡像体的に濃縮されたカルボン酸及び／又は鏡像体的に濃縮されたカルボン酸アミドの製造方法であって、対応するD−及びL−カルボン酸アミドが０．０１ｍM〜１００ｍMのZn2+の存在下、本発明の発現生成物と接触され、そうすることによりカルボン酸アミドの鏡像体の１つが鏡像体選択的に加水分解されて、対応する鏡像体的に濃縮されたカルボン酸を生成する一方で、カルボン酸アミドの他の鏡像体が変化されないまま残るところの方法にもまた関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも７０％の同一性を有するところのアミノ酸配列を有する鏡像体選択的アミダーゼをエンコードする核酸配列。
【請求項２】
中程度のストリンジェンシー条件下、(ｉ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、(ｉｉ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を含むゲノムＤＮＡ配列、又は(ｉｉｉ)(ｉ)又は(ｉｉ)の相補鎖と、好ましくはハイブリッド化するところの、鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列。
【請求項３】
約１５以下の、より少ないアミノ酸位置における改変を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に従うアミノ酸配列を有する鏡像体選択的アミダーゼをエンコードする核酸配列において、改変が独立して(ｉ)アミノ酸の挿入(ｉｉ)アミノ酸の削除(ｉｉｉ)アミノ酸の置換であるところの核酸配列。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に従うアミノ酸配列のフラグメントに対する抗体と免疫学的交差反応性を示すところの鏡像体選択的アミダーゼをエンコードする核酸配列。
【請求項５】
鏡像体選択的アミダーゼ融合タンパクをエンコードし、かつマーカーポリペプチドをエンコードする１以上の核酸配列に機能的に連結された請求項１〜４のいずれか１項に従うポリペプチドをエンコードする核酸配列からなる核酸配列。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸配列を含むベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸配列を常態では含まず、請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸配列、好ましくは請求項６に従うベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸配列の発現生成物の製造方法において、第１の工程において該核酸配列が適切な宿主に導入され、かつ次に該核酸配列が上記宿主において発現されるところの方法。
【請求項９】
発酵培地における微生物の発酵法、バッチ及びフィード相を含む、において、微生物が請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸を発現し、かつ発酵の間、発酵培地１ｌ当たり０．５〜５０ｍｇのZn2+が供給されるところの発酵方法。
【請求項１０】
鏡像体的に濃縮されたカルボン酸及び／又は鏡像体的に濃縮されたカルボン酸アミドの製造方法において、対応するD−及びL−カルボン酸アミドの混合物が０．０１ｍM〜１００ｍMのZn2+の存在下、請求項１〜５のいずれか１項に従う発現生成物と接触され、そうすることによりカルボン酸アミドの鏡像体の１つが鏡像体選択的に加水分解されて、対応する鏡像体的に濃縮されたカルボン酸を生成し、一方、カルボン酸アミドの他方の鏡像体が変化されないまま残るところの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鏡像体選択的アミダーゼをエンコードする核酸配列に関する。本発明は、本発明に従う核酸配列を含むベクター、宿主細胞、並びに該核酸配列の発現生成物の製造及び使用のための方法にもまた関連する。
【０００２】
アミダーゼはアミダーゼ活性を有するポリペプチドであり、カルボン酸アミドの加水分解を触媒して、対応するカルボンアミドとアンモニアとを生成する能力を有する酵素である。鏡像体選択的なアミダーゼは、カルボン酸アミドの鏡像体のうちの１つを基質として選択するアミダーゼである。鏡像体選択的なアミダーゼは、鏡像体的に濃縮されたカルボン酸の製造における商業的バイオプロセスにおいて重要であることが知られている。カルボン酸は、例えばα−H−αアミノ酸、α、α―ジアルキルアミノ酸、α−ヒドロキシ酸及び／又はそれらの誘導体並びにそれらのペプチドである。鏡像体的に濃縮されたカルボン酸及び／又はそれらの誘導体並びにペプチドは様々な産業、例えば製薬業界、農産業界などにおいて使用される。例えば、アミノ酸L−バリンは、シクロスポリンA発酵における前駆体として非常に適切であり、α―ヒドロキシプロピオン酸は除草剤の製造において使用され、幾つかのα―N−ヒドロキシアミノ酸は抗腫瘍剤として使用され得、そしてD-ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン及びD-フェニルグリシンはある種の半合成な、スペクトルの広いβ―ラクタム抗生物質の製造において使用される。欧州特許第４９４７１６号においてアミダーゼ活性を示す微生物の２つの例、Ochrobactrum anthropi NCIB ４０３２１（NCIMB 40321としてもまた知られる）及びKlebsiella sp．NCIB 40322が与えられる。
【０００３】
本発明は、SEQ ID ：NO．２と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列に特に関する。SEQ ID ：NO．１において、Ochrobactrum  anthropi  NCIB  ４０３２１からのL−アミダーゼをエンコードする核酸配列が示される。SEQ ID：NO．２において、SEQ ID ：NO．１の核酸配列に対応するアミノ酸配列が示される。SEQ ID ：NO．２と少なくとも７０％の同一性を有するところのアミノ酸配列を有する鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列を発現する微生物の発酵培地における発酵、バッチ相及びフィード相を含む、は、もしフィード相において発酵培地１L当たり０．５〜５０ｍｇのＺｎ2+が発酵培地へ供給されると、鏡像体選択的なアミダーゼ活性の増加された生産をもたらすことが驚いたことに見出された。
【０００４】
鏡像体選択的なアミダーゼ活性の増加された生産は、おそらく鏡像体選択的なアミダーゼ自身の活性の増加のため，並びに製造された鏡像体選択的なアミダーゼの量の増加のためである。欧州特許出願公開第１，１７４，４９９号において、Enterobacer  cloacae  N-７９０１からの、鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列が開示された；対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NO：１の核酸配列に対応するアミノ酸配列と６８％の同一性を有する。本発明に従う鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列は従って新規である。Enterobater  cloacae  N-7901の鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列を発現する微生物の発酵のZn2+依存性は、欧州特許出願公開第１，１７４，４９９号においては記載されなかった。
【０００５】
本発明は、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、特に少なくとも９８％、より特には少なくとも９９％、最も特には１００％のSEQ ID NO．２との同一性を有するところのアミノ酸配列を有する鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列に好ましくは関する。
【０００６】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列の間の同一性は、同一性表及び以下の整列パラメーター、即ちミスマッチ＝−１５、ペナルティ＝−３、ギャップ−延長＝１、マッチ−ボーナス＝１、ギャップｘ−ドロフ＝５０、イクスペクト＝１０、ワードサイズ＝３を用いて、BLASTPペアワイズアラインメントアルゴリズム（ＮＣＢＩ）により決定される。
【０００７】
本発明は、鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列に関し、該核酸配列は、中程度の、より好ましくは高いストリンジェンシー条件化、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、(ｉ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、(ｉｉ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．を含むゲノムＤＮＡ配列、又は(ｉｉｉ)(ｉ)又は(ｉｉ)の相補鎖とハイブリッド形成する。
【０００８】
ハイブリッド形成実験は様々な方法によって行われ得、それらは当業者にとって十分に利用可能である。これらの種々の方法から選択するための一般的なガイドラインは、例えばSambrook, J. , Fritsh, E. F., 及び Maniatis, T.著“分子クローニング：実験室マニュアル”第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年の９章に見出されることができる。
【０００９】
ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーにより、実際のハイブリッド形成及び洗浄工程からなるハイブリッド形成が行われるところの条件が意味される。洗浄工程は、例えばニトロセルロースフィルターの上に固定化された標的の核酸とハイブリッド形成しない核酸を洗い流すために用いられる。ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーは、洗浄液の塩濃度を変化させること、及び／又は洗浄工程が行われるところの温度（洗浄温度）を変化させることにより変化されることが可能である。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、洗浄溶液中の塩濃度を下げること、又は洗浄温度を上げることにより増加させられる。この出願の目的のためには、ハイブリッド形成は６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃において約１２時間行われる。５０℃における１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の連続した３０分の洗浄工程は、低ストリンジェンシーの例であり、５５℃においては中ストリンジェンシーの例であり、６０℃においては高ストリンジェンシーの例であり、６５℃においては非常に高いストリンジェンシーの例である。
【００１０】
本発明は、１５以下のアミノ酸位置、好ましくは１０以下のアミノ酸位置、より好ましくは５以下、さらにより好ましくは約３以下のアミノ酸位置において改変を有するＳＥＱ ＩＤ ：ＮＯ．２に従うアミノ酸配列を有する鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列にもまた関し、ここで改変は独立して(ｉ)アミノ酸の挿入(ｉｉ)アミノ酸の削除（ｉｉｉ）アミノ酸の置換である。
【００１１】
多くの改変を有するＳＥＱ ＩＤ ：ＮＯ．２において与えられたアミノ酸配列を有する鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列は、当該技術において公知である方法、例えば核酸配列の部位特異的変異導入により製造されることができる。この方法において所望される変異、例えば特定のアミノ酸位置における置換、挿入又は削除をエンコードする突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドは、所定のＤＮＡの１つの鎖にアニールされ、ＤＮＡ合成開始のためのプライマーとして作用する。ＤＮＡ合成により、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドは、新しく合成された鎖に取り込まれる。しばしば、当該技術において公知である方法は、部位特異的変異導入法の効率を高めるために、突然変異誘発性の核酸配列のための実際的な選択テクニックもまた有する。幾つかの部位特異的変異導入テクニックはＰＣＲを利用し、その方法において突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドはプライマーとして使用される。部位特異的変異を行うための方法は、会社、例えばStratagene社及びInvitrogen社の様々な製品フォルダーにおいて記述され、そして部位特異的変異を行うためのキットが市販入手可能である。
【００１２】
本発明は、鏡像体選択的なアミダーゼをエンコードする核酸配列にもまた関し、SEQ ID：NO．２に従うアミノ酸配列のフラグメントに対する抗体と免疫学的交差反応を示す。各フラグメントの長さは好ましくは少なくとも２０のアミノ酸である。免疫学的交差反応性は、アミダーゼ活性を有する、本発明に従う単離されたポリペプチドの少なくとも１のエピトープに対する抗体又はそれと反応する抗体を用いてアッセイされ得る。抗体はモノクロナール又はポリクロナールであり得、当該技術において公知である方法、例えばHudsonら著、“実用免疫学”第３版、(1989年), Blackwell Scientific Publicationsによって記載される方法によって製造され得る。免疫学的交差反応性は、先行技術において公知であるアッセイを用いて測定され得、その例は例えばHudsonら著、“実用免疫学”第３版、(1989年), Blackwell Scientific Publicationsにおいて記載されるウェスターンブロッティングである。
【００１３】
本発明は、鏡像体選択的なアミダーゼ融合タンパクをエンコードする核酸配列にもまた関し、該核酸配列はマーカーポリペプチドをエンコードする１以上の核酸配列に機能的に連結された、本発明に従うポリペプチドをエンコードする核酸からなる。“機能的に連結された“により、もし発現されたら、そのN-及び／又はC-末端にマーカーポリペプチドを有する鏡像体選択的なアミダーゼ融合タンパクが生産されるように、２つの核酸配列が連結されていることが意味される。マーカーポリペプチドは、多くの目的、例えば融合タンパクの安定性又は溶解度を増大させるために使用され得、分泌物の信号として使用され得、該信号は融合タンパクを細胞中の決まった区画に導く信号である、又は融合タンパクの精製を容易にするために使用され得る。融合タンパクの精製を容易にするために使用されるマーカーポリペプチドの例は、MBP−及びGSTタグである。MBP-又はGST-タグによる融合タンパクの精製は、例えばF. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston、D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, 及び K. Struhl編“分子生物学の現在のプロトコル”, John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク, ニューヨーク州, USA, 1990年に記載される。MBP−タグを有する融合タンパクは、例えばｐMALベクター（ニューイングランド、バイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ州、USA）において、一方GST−タグを有する融合タンパクはｐGEXベクター社（Amersham  Biosciences,  Inc.、ピスキャッタウェイ、ニュージャージー州、USA）において、それぞれの供給元のプロトコルに従うことにより製造され得る。
【００１４】
本発明の核酸配列、例えばSEQ ID：NO．１の配列を有する核酸配列は、標準の分子生物学のテクニックを用いて単離されることができ、配列情報は本明細書に与えられる。例えば、ハイブリッド形成プローブとして、Ochrobactrum anthropi NCIB 40321上のSEQ ID：NO．１の核酸配列の全部又は一部を用いて、本発明に従う核酸配列は、（例えばSambrook, J. , Fritsh, E. F., 及び Maniatis, T.著“分子クローニング：実験室マニュアル”第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年に記載されるような）標準のハイブリッド形成及びクローニングテクニックを用いて単離され得る。
【００１５】
さらに、SEQ ID： NO．１又はSEQ ID： NO．２に含まれる配列情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により、Ochrobactrum anthropi NCIB 40321上のPCRを用いることにより、ＳＥＱ ＩＤ：ＮＯ．１の全部又は一部を含む核酸配列は単離され得、及びオリゴヌクレオチドプライマーが鏡像体選択的なアミダーゼ活性を示す微生物上で使用されるならば、また単離され得る。
【００１６】
本発明の核酸配列は、例えば、鋳型として、鏡像体選択的なアミダーゼ活性を示す微生物からのゲノムDNA、ｃDNA又は適切なｍRNA及び標準の（RT）-PCR増殖テクニックに従う本明細書に与えられた配列情報に基づく適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増殖され得る。そのようにして増殖された核酸は適切なベクターへとクローン化され、DNA配列分析により同定される。
【００１７】
さらに、本発明に従う核酸配列に対応する、又はハイブリッド形成可能であるオリゴヌクレオチドが標準の合成テクニック、例えば自動DNAシンセサイザーを用いて製造され得る。
【００１８】
本発明に従う核酸配列は適切なベクターにおいてクローン化され得、適切な宿主に導入された後、該配列は、当該技術において当業者に公知であるところの、（例えばSambrook, J. , Fritsh, E. F., 及び Maniatis, T.著“分子クローニング：実験室マニュアル”第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989年に記載されるような）標準のクローニング及び発現テクニックに従って発現されて、対応する鏡像体選択的なアミダーゼを生成する。本発明は、本発明に従う核酸配列を含むそのようなベクターにもまた関する。
【００１９】
適切なベクターは、クローニング及び発現において一般的に使用され、当該技術において当業者にとって公知であるベクターである。E.coliにおける発現のための適切なベクターの例は、例えばMakrides, S. C., Microbiological Reviews, 第60巻, 第3号, (1996年), 512〜538頁の表１に与えられる。好ましくは、ベクターはアミダーゼ活性を有するポリペプチドをエンコードする核酸配列を含むクローニング部位の上流にプロモーターを含み、該プロモーターは、宿主が成長した後、アミダーゼ活性を有する対応するポリペプチドを発現するためにスイッチが入れられ得る。スイッチをオン及びオフにされ得るプロモーターは当業者にとって公知であり、例えばlacプロモーター、araBADプロモーター、T７プロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、及びtrpプロモーターである。本発明の枠内で特に有用なものは、例えば国際特許出願公開第00/66751号に記述されたベクター, 例えば pKAFssECtrp又は挿入なしのpKAFssECaro、ペニシリンGアシラーゼ遺伝子である。適切な宿主はクローニング及び発現のために一般的に使用される宿主であり、当業者に公知である。適切な宿主種の例は、Echerichia coli株、例えばE.coli TOP10F'、TOP10、DH10B、DH5a、HB101、W3110、BL21 (DE3) 及びBL21 (DE3) pLysSである。本発明の枠内で特に有用なものは、Escherichia coliK-12株 例えばDH1、HB101、RV308、RR1、W3110、C600である。
【００２０】
ベクターの選択は時々宿主の選択に依存し、その逆も同じである。もし、例えばaraBADプロモーターを有するベクターが使用されている場合、アラビノースインデューサー（ara-）を分解できないE.coli宿主株が特に好まれる。
【００２１】
あるいは、本発明に従う核酸配列は、本発明に従う核酸配列を通常含まないところの宿主細胞のゲノムに取り込まれることができ、そして過剰発現され得る。これは当業者に公知である方法に従って行われ得る。本発明は、本発明に従う核酸配列を通常含まず、本発明に従う核酸配列を含む宿主細胞、好ましくは本発明に従う核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞にもまた関する。
【００２２】
本発明は、請求項１〜５のいずれか１項に従う核酸配列の発現生成物の製造方法に関し、該方法において第１の工程において核酸配列が適切な宿主細胞に導入され、該宿主細胞は通常本発明に従う核酸配列を含まない、及び該方法において該核酸配列が次に上記宿主において発現される方法に関する。核酸配列の導入及び次の発現は、当業者にとって公知である標準的な手法である。
【００２３】
本発明は、発酵培地における微生物の発酵方法であって、バッチ及びフィード相を含み、微生物が本発明に従う核酸配列を発現し、かつ発酵培地１L当たり０．５〜５０ｍｇ（７．７μM及び７７０μM）のZn2+が発酵の間供給されるところの方法にもまた関する。
【００２４】
典型的に、フィード相は約１０時間後に始められる。１ｌの発酵培地当たり０．５〜５０ｍｇのＺｎ2+の量が発酵培地に一度に供給されることができるが、好ましくは分けて添加される、なぜならＺｎ2+の一時の添加は発酵培地の上に泡の生成を起こし、発酵において後で微生物の溶解を起こすからである。Ｚｎ2+は、例えば５〜１０の等しい分量において投与され得るが、もちろんフィード相において異なる分量においてＺｎ2+を投与することもまた可能である。好ましくはＺｎ2+は連続的に発酵培地に供給される。もし連続供給が用いられるならば、１つのフィード中にＺｎ2+を他の成分と混合することは非常に実際的である。
【００２５】
Ｚｎ2+イオンは例えば亜鉛塩中に存在する。本発明に従う方法において、好ましくは水中によく溶けることができる亜鉛塩(リットル当たり０．１モルより上)が使用され、例えばＺｎ（ＮＯ3）2，Ｚｎ（ＣＨ3ＣＯＯ）2，ＺｎＳ０4，ＺｎＣｌ2，ＺｎＢｒ2，Ｚｎｌ2である。
【００２６】
発酵において使用される微生物は、本発明に従う核酸配列を本来的に有し、かつ発現する微生物であるが、好ましくは本発明に従う核酸配列が発現され、より好ましくは過剰発現されるところの宿主である。
【００２７】
本発明に従う核酸配列の発現生成物の鏡像体選択的なアミダーゼ活性もまた、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭＺｎ2+の存在下、改善されることが見出される。従って本発明は鏡像体的に濃縮されたカルボン酸及び/又は鏡像体的に濃縮されたカルボン酸アミドの製造法にもまた関し、該方法において対応するＤ−及びＬ−カルボン酸アミドの混合物が０．０１ｍＭ〜１００ｍＭのＺｎ2+の存在下、請求項１〜５のいずれか１項に従う発現生成物と接触され、そうすることによりカルボン酸アミドの鏡像体の一つが鏡像体選択的に加水分解されて、対応する鏡像体的に濃縮されたカルボン酸を生成し、その一方で他のカルボン酸アミドの鏡像体は無変化のまま留まる。もし所望されるならば、残っている鏡像体的に濃縮されたカルボン酸アミドは加水分解されて、対応する鏡像体的に濃縮された酸を生成する。残っているカルボン酸アミドの加水分解は、当該技術において公知である方法、例えば塩基性又は酸性条件下、又は酵素的に行われることができる。
【００２８】
好ましくは、本発明に従う核酸配列の発現生成物により触媒される鏡像体選択的な加水分解は、０．０１〜５０、より好ましくは０．０５〜２０ｍＭのＺｎ2+の存在下、行われる。
【００２９】
本発明に従う核酸配列の発現生成物により触媒される鏡像体選択的加水分解が起きるところのｐＨは重要ではなく、鏡像体選択的な加水分解は好ましくは５〜９、より好ましくは６．５〜８．５のｐＨにおいて行われる。
【００３０】
本発明に従う核酸配列の発現生成物の存在下、鏡像体選択的な加水分解は好ましくは１０〜７５℃、より好ましくは３０〜６５℃、特には４０〜６０℃において起きる。
【００３１】
混合物として、Ｄ−及びＬ−カルボン酸アミドのラセミ混合物が使用されることが可能であるが、もちろん無差別に選択されたＤ−及びＬ−カルボン酸アミドの混合物を使用することもまた可能である。
【００３２】
適切なカルボン酸アミドの例は、２〜２０のＣ−原子を有するα―Ｈ−αアミノ酸アミド又はそれらの誘導体、例えばアラニンアミド、フェニルグリシンアミド、フェニルアラニンアミド、パラ-ヒドロキシフェニルグリシンアミド、プロリンアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド、メチオニンアミド、プロリンアミド、グルタミン酸アミド、２〜２０のＣ−原子を有するα―Ｈ−α―ヒドロキシ酸アミド、例えばマンデル酸アミド、２〜２０のＣ−原子を有するα―α―ジアルキルーアミノ酸アミド、例えばα―メチルバリンアミド、α―メチルフェニルグリシンアミド、α―エチルフェニルグリシンアミド、α―ブチルフェニルグリシンアミド、α―メチルフェニルアラニンアミド、α―エチルフェニルアラニンアミド、α―エチル−α―ブチルグリシンアミドである。好ましくはｔｅｒｔ−ロイシン又はα―メチルフェニルグリシンが本発明に従う方法において製造される。
【００３３】
本発明の説明のため、以下の実施例が追加された。
【実施例】
【００３４】
実施例１  フィード相における発酵培地へのＺｎ2+の添加による、ＳＥＱ ＩＤ： ＮＯ．１に示された核酸配列を発現するEscherichia coli K-12の発酵
以下のシード培地が調整された。
2004536608.tif 000002
【００３５】
ｐHは、水性NaOHで６．８に調節された。１００及び２００mlのアリコートが５００及び２０００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れられ、殺菌消毒された（１２１℃のいて２０分）。１．１ｍｌの５０％（ｗ/ｖ）グルコース及び２．２ｍｌのネオマイシン（１．２ｇ/ｌ）溶液が無菌的に５００ｍｌのフラスコに添加された（シード相１）。１及び２ｍｌの５０％（ｗ/ｖ）グルコース及びネオマイシン（１．２ｇ/ｌ）溶液が２０００ｍｌのフラスコに添加された（シード相２）。
【００３６】
シード相１のエルレンマイヤーフラスコは次に、ＳＥＱ ＩＤ： ＮＯ．１に従う核酸配列を発現するE.coli K-１２株の５０％ｖ/vグリセロール／水の分散物１．８ｍｌを植え付けられ、定常的なオービタル攪拌の下、全体が２７℃において２２時間培養され、そしてインキュベートされた。SEQ ID： NO．１に示される核酸配列を発現するために、E. coli  K-12株RV３０８において、該核酸配列は、制限部位を含む５’延長を有するアミダーゼに特異的なプライマーを用いるPCRにより増幅された（フォワードプライマーに対してNdel及びリバースプライマーに対してSmal）。得られたフラグメントは、制限酵素Ndel及びSmalを用いて配列をエンコードするE. coliペニシリンGアシラーゼの部位において、E.coliの発現ベクターｐKECｔｒｐの誘導体へとクローン化された。使用された誘導された発現ベクターは、ｔｒｐプロモーターの代わりにE.coli aroプロモーターを含むこと以外、国際特許出願公開第００６６７５１号に記載されるところの、構築体ｐKECｔｒｐに類似する。シード相１のエルレンマイヤーフラスコの全体が、シード相２の２０００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに植え付けるために使用された。シード相２は、定常的なオービタル攪拌下、２７℃において３時間、培養され、そしてインキュベートされた。
【００３７】
２％（ｖ/ｖ）のシード相２が、２０ｌのガラス発酵槽中の６．４ｌのバッチ相培地に植え付けるために使用された。バッチ相培地は以下の組成を有していた。
【００３８】
2004536608.tif 000003
【００３９】
バッチ相の培地は、ｐｈを（ＮａＯＨで）４．５に調節した後、１２１℃において６５分の間殺菌消毒された。１及び２を付けられた培地成分はそれぞれ別々に溶解され、１を付けられた成分を含む溶液は１２１℃において６５分間、殺菌消毒され、２を付けられた成分を含む溶液はフィルター殺菌された。両者とも無菌的に培地に添加された。シード相１の移動の前に、バッチ相培地のｐＨが７．０に調節された。発酵は定常的な攪拌及び最適な通気条件下、２７℃において行われた。５０〜５４時間、発酵の温度は４時間の間に線形的に２７から２５℃へ下がり、その値において発酵の最後まで保たれた。
【００４０】
発酵の間（バッチ及びフィード相）、ｐＨは７．００〜７．３０の間で変化することを許された。バッチ相は、ｐＨが７．１５のレベルに到達したとき、フィード１及びフィード２の開始（フィード相の始まり）により終了された。そのとき、炭素源は使い果たされていた。バッチ相は約９時間の継続時間を有した。フィード１は以下の組成を有した：
【００４１】
2004536608.tif 000004
【００４２】
フィード１は以下のように調整された。まずデキストロースが溶解された。１ｌ当たり約０．４ｍｌの４ＮのＨＣＬが該デキストロース溶液に添加された。該溶液は殺菌消毒された（１２１℃、３０分間）。チアミン、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、プロリン及びグルタミン酸モノナトリウム塩及びＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏが個別に溶解され、該溶液はデキストロース溶液への(無菌的)添加の前にフィルター殺菌された。フィード１をバッチ相培地へ導入するために使用されたプロファイルは下の表１に与えられる。
【００４３】
【表１】
2004536608.tif 000005
【００４４】
フィード２は以下の組成を有した：
2004536608.tif 000006
【００４５】
フィード２は以下のように調整された。まず、酵母抽出ペーストが水の中に溶解された。次に、ｐＨが４．５±０．１に調節された。溶液は殺菌消毒された（１２１℃、３０分間）。フィード２をバッチ相培地に導入するために使用されたプロファイルは下の表２に与えられる。表１及び２のプロファイルにおける“時間”で、“フィード開始後の時間”が意味される。
【００４６】
【表２】
2004536608.tif 000007
【００４７】
フィード１及びフィード２はフィード相培地を構成する。発酵は１２０時間後、停止された。
【００４８】
発酵は、フィード１においてＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏが存在しないことを除いて繰り返された。
【００４９】
フィード相の開始後、発酵培養ブロス(発酵培地及び細胞)におけるＬ−アミダーゼ活性は下に記述される方法において両方の発酵について測定された。
【００５０】
フィード１におけるZn2+あり及びフィード１におけるZn2+なしのＳＥＱ ＩＤ： ＮＯ．１において示される核酸配列を発現するEscherichia coli K-12の発酵から得られた発酵培養ブロス(細胞を含む発酵培地)試料のL-アミダーゼ活性の分析
１．５mlのインキュベーション試薬（１．１重量％のL-フェニルグリシンアミド、０．１１MのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ８．０及び１．１ｍＭのＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏを含む）が湯浴中で５５℃まで加熱された。１０分後、１００μｌの試料溶液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５／２ｍＭのＤＴＴ中で希釈された発酵培養ブロスを含む）が該加熱されたインキュベーション試薬に添加された。試料溶液と混合されたインキュベーション試薬の２０分間のインキュベーション後、反応は１００μｌの混合されたインキュベーション試薬を１．５ｍｌの停止試薬（５３ｍＭリン酸）に添加することにより停止された。停止された反応混合物は５分間１４，０００ｒｐｍにおいて遠心分離された。以下の条件下、上清がＨＰＬＣで分析された：
カラム：ヌクレオシル１２０−３Ｃ１８（１２５×４ｍｍ）
検出器波長：２２０ｎｍ
フロー：１．０ｍｌ／分
注入体積：２０μｌ
溶出液：１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ３．０
Ｌ−フェニルグリシン及びＬ−フェニルグリシンアミドの保持時間はそれぞれ約１．８及び２．７分である。
【００５１】
フェニルグリシンに対応するＨＰＬＣピークの下の面積が計算され、発酵培養ブロスの希釈因子に対する較正後、他の試料からのフェニルグリシンのピークの下の面積に比較された。該試料からの相対ピーク面積は相対Ｌ−アミダーゼ活性に等しく、これは互いに比較される、試料の活性である。Ｚｎ2+を有するフィード１による発酵からの試料（Ａ）及びＺｎ2+無しのフィード１による発酵からの試料（Ｂ）の相対Ｌ−アミダーゼ活性（相対活性）が図１に示され、該図において相対活性はＴ(時間)、試料が採取されたところの（バッチ相の開始後の時間で表された）時間に対してプロットされた。
【００５２】
図１から、もしＺｎ2+がフィード相における発酵にフィードされるならば、より多いアミダーゼ活性が生産されることが見られることができる。
【００５３】
フィード１中におけるＺｎ2+を有する発酵からの酵素溶液ＬＡＭ００１１の製造
フィード１の中にＺｎ2+を有する発酵からの発酵培養ブロスが、発酵中において４ｇ／ｌオクタノールで処理されて、微生物を殺し、高圧ホモジネート化（６００〜７００bars）により２回ホモジネート化された。ホモジネート化後、培養ブロスは、培養ブロスの体積に基づいて計算されて１０ｖ％溶液のC５７７の１０％溶液の添加により凝集された。培養ブロスの体積に基づいて計算されて１０ｖ％のジカライト４４８、濾過助剤、が添加された。得られるスラリーはメンブランフィルタープレス上で濾過され、１ケーキ体積のプロセス水で洗浄された。バイオマスケーキは焼却に送られた。濾液はSeitzの濾過板(サイズ５〜１５μｍ)の上で、続いて０．１〜０．３ミクロメートルの菌濾過板の上で濾過された。得られた濾液は容器に保存され、使用されるまで凍結された。
【００５４】
フィード１中におけるZn2+なしの発酵からの酵素溶液LAM0001の調整
フィード１中におけるＺｎ2+なしの発酵からの発酵培養ブロスが、発酵中において４ｇ／ｌオクタノールで処理されて、微生物を殺し、高圧ホモジネート化（６００〜７００bars）により２回ホモジネート化された。ホモジネート化後、培養ブロスは、培養ブロスの体積に基づいて計算されて１０ｖ％溶液のC５７７の１０％溶液の添加により凝集された。培養ブロスの体積に基づいて計算されて１０ｖ％のジカライト４４８、濾過助剤、が添加された。得られたスラリーはメンブランフィルタープレス上で濾過され、２．２ケーキ体積のプロセス水で洗浄された。バイオマスケーキは焼却に送られた。濾液は５〜１５μｍのサイズのSeitzの濾過板の上で、続いて０．１〜０．３ミクロメートルの細菌濾過板の上で濾過された。その後、得られた濾液は５０ｋＤのポリスルホン膜を用いて３倍に濃縮された。保持物(retentate)は保持物体積の４分の１のＲＯ水で洗浄された。その後、保持物は再び５〜１５μｍのサイズのSeitzの濾過板の上で、続いて０．１〜０．３ミクロメートルの菌濾過板の上で濾過された。得られた濾液は容器に保存され、応用反応における使用まで凍結された（実施例２〜５）。
実施例２
Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321からのL-アミダーゼを用いる、ｐH６．５における様々な濃度のＺｎ2+の存在下におけるＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミドの鏡像体選択的加水分解
O．anthropi NCIMB 40321からのL-アミダーゼによるＤＬ−α―メチルフェニルグリシンの加水分解反応に対するＺｎ2+の濃度の影響が、０．１，０．３，１．０，３．０及び９．０ｍＭのＺｎ2+の存在下においてこの反応を行うことにより測定された。対照として、添加のＺｎ2+無しでの反応もまた行われた。
【００５５】
この実験のために、瓶は、２５ｇの反応混合物、各反応混合物は２．５ｇのＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミドを含む（終わりの濃度１０重量％）、O. anthropi NCIMB 40321バッチ番号ＬＡＭ００１１からの4６μｌ、及び添加のＺｎＳＯ4無しか又は０．１，０．３，１．０，３．０及び９．０ｍＭのＺｎＳＯ4で満たされた。すべての反応混合物のｐＨは６．５であった。反応は酵素液の添加により開始された。
【００５６】
全ての反応混合物は５５℃及び２００ｒｐｍにおいてオービタルシェーカーの上でインキュベートされた。酵素の添加後すぐ（ｔ＝０時）及び１，４，１１時間後、１ｇの試料が採取され、４ｇの１ＭのＨ3ＰＯ4を含むバイアルに移されて反応が直ちに停止された。試料及び停止溶液の正確な量は共に重量測定により測定された。０．２２μMのフィルター上での濾過後、α―メチルフェニルグリシン及びα―メチルフェニルグリシンアミドの濃度が、以下のプロトコルに従ってＨＰＬＣにより測定された：
2004536608.tif 000008
【００５７】
この実験の結果は表３に与えられ、該表において反応の転化率(生成されたアミノ酸の量：出発アミノ酸アミドの量)は相対転化率において与えられる；最も高い転化率は１００に設定された。
【００５８】
【表３】
2004536608.tif 000009
【００５９】
表３から、Ｚｎ2+の存在は、ＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミドに対するO. anthropiのL−アミダーゼの活性に対して強く好ましいことが結論付けられる。添加のZn2+無しでは、この基質の加水分解反応はほとんど起きない(エントリーFを参照)。
実施例３
Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321からのL-アミダーゼを用いる、ｐH６．５における様々な２価金属イオンの存在下におけるＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミドの鏡像体選択的加水分解
実施例２と同様の反応設定において、添加Zn2+が、過剰のZn2+無しに発酵されたところの、O. anthropi NCIMB ４０３２１からのL−アミダーゼによるDL−α―メチルフェニルグリシンアミドの転化率に有利な効果を有するかが調べられた。加水分解反応は、当量のMn2+又はZn2+の存在下行われた。さらに、対照反応が、過剰のZn2+の存在下発酵されたO. anthropi NCIMB ４０３２１からのL−アミダーゼを用いて行われた。
【００６０】
瓶は、２５ｇの反応混合物で満たされ、各反応混合物は２．５ｇのＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミド（終わりの濃度１０重量％）、２４０μｌのO. anthropi NCIMB 40321製造ＬＡＭ０００１からのL−アミダーゼ、及び１ｍMのMnSO4か又はＺｎＳＯ4を含んでいた。１ｍMのZn2+、及び９２μｌのO. anthropi NCIMB 40321製造ＬＡＭ０００１からのL―アミダーゼを含む第３の反応混合物が、製造された（９２μｌのLAM００１１は２４０μｌのＬＡＭ０００１のＬ−アミダーゼ活性に対応する）。基質のインキュベーション、試料採取、及び分析は全て実施例２に記載されたように行われた。この実験の結果は表４に与えられ、該表において反応の転化率(生成されたアミノ酸の量：出発アミノ酸アミドの量)は相対転化率において与えられる；最も高い転化率は１００に設定された。
【００６１】
【表４】
2004536608.tif 000010
【００６２】
表４から、１ｍＭのＺｎ2+の存在下、余分のＺｎ2+ありで及びなしで発酵された酵素によるＤＬ−α―メチルフェニルグリシンアミドの転化の程度は類似しており、両者とも１ｍＭのＭｎ2+の存在下での転化より高かった。
実施例４
Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321からのL-アミダーゼによる、ｐH７．０における様々な２価金属イオンの存在下におけるＤＬ―ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの鏡像体選択的加水分解
実施例２におけるのと同様の設定において、O. anthropi NCIMB４０３２１からのL−アミダーゼを用いるDL−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの加水分解反応における当量のＭｎ2+、Ｚｎ2+、及びＭｇ2+の存在の影響が測定された。対照として、いかなる添加の２価の金属イオンもなしで、反応が行われた。
【００６３】
この実験を行うために、瓶は、２５ｇの反応混合物、各反応混合物は３．１３ｇのＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（終わりの濃度１２．５重量％）、１．４５ｍｌのO. anthropi NCIMB 40321（バッチ番号ＬＡＭ００１１）からのL−アミダーゼ、及び１．０ｍMのＺｎＳＯ4、ＭｇＳＯ4、又はＭｎＳＯ4を含む、で満たされた。さらに別の反応がいかなる２価の金属イオンの添加もなしに行われた。全ての反応混合物のｐＨは７．０であった。反応は酵素液の添加により開始された。
【００６４】
全ての反応混合物はオービタルシェーカーの上で５５℃及び１５０ｒｐｍにおいてインキュベートされた。酵素の添加の直後（ｔ＝０時）、及び１，３、及び６．７時間後、１ｇの試料が採取され、４ｇの１ＭのＨ3ＰＯ4を含むバイアル管に移され、直ちに反応を停止した。試料及び停止液の正確な量は重量測定により決められた。０．２２μＭフィルター上での濾過の後、ｔｅｒｔ−ロイシン及びｔｅｒｔ−ロイシンアミドの濃度はＨＰＬＣにより、以下のプロトコルに従って測定された。
2004536608.tif 000011
検出      ：  ＯＰＡ／ＭＣＥ(a)によるポスト−カラム誘導化後の蛍光検出（λex、３６５ｎｍ及びλem、４２０ｎｍ）(a)ポストカラム誘導化は、o―フタルアルデヒド（OPA）及び２−メルカプトエタノール（MCE）を含む、０．４Mのホウ酸塩バッファーｐH１０を用いて、環境温度において反応コイル中（２ｍ×０．２５ｍｍ内径）において行われた。誘導化試薬のフローは１．０ml／分であった。試薬は、最初に４９．４６ｇのＨ3ＢＯ3及び３５ｇのKOHを２リットルのMilli  Q水において溶解し、続いて、１MのKOHを用いてｐHを１０に調節することにより製造された。次に１．６ｇのＯＰＡ（２０ｍｌのエタノール中）及び２ｍｌのＭＣＥがこのホウ酸塩バッファーに添加された。
【００６５】
この実験の結果は、表５に与えられ、ここで反応の転化率（生成されたアミノ酸：出発アミノ酸アミドの量）は相対転化率において与えられ、最も高い転化率は１００に設定された。
【００６６】
【表５】
2004536608.tif 000012
【００６７】
表５におけるデータは、１ｍＭのＺｎ2+の存在下、O. anthropi NCIMB４０３２１からのＬ−アミダーゼにより、当量のＭｇ2+の存在下、又は追加の２価金属イオンのない状態におけるＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドより速い加水分解反応が得られることを明らかに示す。
【００６８】
実施例５
Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321からのＬ−アミダーゼによる、種々のｐＨにおける、Ｚｎ2+存在下のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの鏡像体選択的な加水分解
DL−tert−ロイシンアミドの鏡像体選択的加水分解へのO. anthropi NCIMB 40321からのL−アミダーゼの活性へのｐHの影響を調べるために、１ｍMのZn2+の存在下、又は存在無しでの反応がｐH７．０，８．０，及び９．０において行われた。
【００６９】
全体の実験の設定は、実施例３の設定と同じであった。これらの実験の結果は表６中に示される。
【００７０】
【表６】
2004536608.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】Ｚｎ２＋を有するフィード１からの試料（Ａ）及びＺｎ２＋無しのフィード１からの試料（Ｂ）の相対Ｌ−アミダーゼ活性（相対活性）
【符号の説明】
【００７２】
Ａ：  Ｚｎ２＋あり
Ｂ：  Ｚｎ２＋なし
【図１】
2004536608.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004536608.tif 000015
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2004536608.tif 000037
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536608.tif 000038
【国際調査報告】
2004536608.tif 000039
2004536608.tif 000040
2004536608.tif 000041