(57)【要約】好ましくは最高６アミノ酸残基の連結ペプチド（ミニＣ−ペプチド）を含み、少なくとも１つのＰｒｏを含む新規なインシュリン前駆体が提供される。この前駆体は、ヒトインシュリン又はｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンに転化することができる。ある実施態様において、当該インシュリン前駆体は、式Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）（式中、Ｘ１は少なくとも１つがＰｒｏである１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、Ｙは切断部位である）を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有するインシュリン前駆体。
Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）
（式中、
Ｘ１は少なくとも１つがＰｒｏである１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Ｙは切断部位である）
【請求項２】
Ｘ１が１〜４アミノ酸残基である、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項３】
Ｘ１が１〜３又は１〜２アミノ酸残基である、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項４】
ＹがＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項５】
Ｘ１がＧｌｕＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項６】
Ｘ１がＡｓｐＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項７】
Ｘ１がＧｌｎＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１に記載のインシュリン前駆体。
【請求項８】
１つのＰｒｏのＮ末端がＹの直近にある、請求項１から５の一項に記載のインシュリン前駆体。
【請求項９】
以下の式を有するインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列。
Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）
（式中、
Ｘ１は少なくとも１つがＰｒｏである１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Ｙは切断部位である）
【請求項１０】
Ｘ１が１〜４、１〜３又は１〜２アミノ酸残基である、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
１つのＰｒｏがＹのN末端の直近に位置する、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
Ｘ１がＧｌｕＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
Ｘ１がＡｓｐＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
Ｘ１がＧｌｎＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
ＹがＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項９〜１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
インシュリン前駆体を作製するための方法であって、
（ｉ）以下の式
Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）
（式中、
Ｘ１は少なくとも１つがＰｒｏである１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Ｙは切断部位である）
を有するインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を前記インシュリン前駆体の発現に適した培養条件下で培養することと、
（ｉｉ）発現されたインシュリン前駆体を単離することと、
を備えた方法。
【請求項２０】
Ｘ１が１〜４アミノ酸残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘ１が１〜３アミノ酸残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｘ１が１〜２アミノ酸残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
１つのＰｒｏがＹのN末端の直近に位置する、請求項１９から２２の一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘ１がＧｌｕＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘ１がＡｓｐＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
Ｘ１がＧｌｎＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
ＹがＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が酵母細胞である、請求項１９から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン又はヒトインシュリンを作製するための方法であって、
（ｉ）以下の式
Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）
（式中、
Ｘ１は少なくとも１つがＰｒｏである１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Ｙは切断部位である）
を有するインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、前記インシュリン前駆体の発現に適した培養条件下で培養すること、
（ｉｉ）前記インシュリン前駆体を培地から単離すること、及び
（ｉｉｉ）インビトロでの化学的転化又は酵素による転化によって、前記インシュリン前駆体をｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン又はヒトインシュリンに転化すること
を含む方法。
【請求項３０】
Ｘ１が１〜４アミノ酸残基である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｘ１が１〜３アミノ酸残基である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘ１が１〜２アミノ酸残基である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
１つのＰｒｏのＮ末端がＹの直近にある、請求項２９から３２の一項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｘ１がＧｌｕＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
Ｘ１がＡｓｐＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
Ｘ１がＧｌｎＰｒｏであり、ＹがＬｙｓである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
ＹがＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
Ａ鎖及びＢ鎖から切断可能な連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）を含むインシュリン前駆体であって、前記連結ペプチドが少なくとも１つのＰｒｏとＡ鎖及び連結ペプチドの間のペプチド結合の切断を可能にする切断部位とを含み、１つのＰｒｏが前記切断部位のN末端の直近に位置するインシュリン前駆体。
【請求項４０】
連結ペプチドが最高１０アミノ酸残基の長さである、請求項３９に記載のインシュリン前駆体。
【請求項４１】
Ａ鎖及びＢ鎖から切断可能な連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）を含むインシュリン前駆体であって、前記連結ペプチドが少なくとも１つのＰｒｏを含み、連結ペプチドが最高６アミノ酸残基の長さであるインシュリン前駆体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
酵母菌は、細胞外で機能する多数のタンパク質を産生する。このようなタンパク質を分泌タンパク質と称する。これらの分泌タンパク質は、まず、前駆体すなわち小胞体（ＥＲ）の膜を横切って発現産物を確実に効果的に誘導（トランスロケーション）するプレペプチド配列を含むプレ体（ｐｒｅ−ｆｏｒｍ）として細胞の内部で発現する。このプレペプチドは、通常シグナルペプチドと称し、一般に、トランスロケーション中に所望の産物から切り離される。このタンパク質は、分泌経路に入ったのちゴルジ装置に輸送される。ゴルジから、このタンパク質は細胞の空胞又は細胞膜などの区画に通じる様々なルートを通ることができ、あるいは細胞外のルートを通って外部の媒体に分泌される（Ｐｆｅｆｆｅｒ等（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：８２９〜８５２）。
【０００２】
インシュリンは、膵臓のβ細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであり、２本のポリペプチド鎖Ａ及びＢからなり、２本の鎖間ジスルフィド架橋で連結されている。また、Ａ鎖は、１本の鎖内ジスルフィド架橋を特徴としている。
【０００３】
このホルモンは、２４アミノ酸のプレペプチドからなる単鎖前駆体プロインシュリン（プレプロインシュリン）、次いで８６アミノ酸を含むプロインシュリンとして合成され、プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ  Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ  Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは３１アミノ酸の連結ペプチドである）の構造を有する。Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｒｇは、Ａ鎖及びＢ鎖から連結ペプチドが切断される切断部位である。
【０００４】
微生物でヒトインシュリンを産生するため、主に３通りの方法が使用されてきた。２つの方法はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによるものであり、細胞質中で大きな融合タンパク質を発現し（Ｆｒａｎｋ等（１９８１）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｒｉｃｈ＆Ｇｒｏｓｓ編）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．中のｐｐ７２９〜７３９）、あるいはシグナルペプチドを使用して細胞膜周辺腔への分泌を可能にする（Ｃｈａｎ等（１９８１）ＰＮＡＳ  ７８：５４０１〜５４０４）。３番目の方法では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを利用してインシュリン前駆体を媒体中に分泌させる（Ｔｈｉｍ等（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：６７６６〜６７７０）。従来技術は、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのいずれかで発現する限られた数のインシュリン前駆体を開示している（米国特許第５，９６２，２６７号、国際公開第９５／１６７０８号、欧州特許第００５５９４５号、欧州特許第０１６３５２９号、欧州特許第０３４７８４５号及び欧州特許第０７４１１８８号参照）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、トランスフォームした微生物、特に酵母中で発現すると、インシュリン前駆体分子の産生収率を増加させる新規な連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）を特徴とする。次いで、このようなインシュリン前駆体を、１以上の適切で周知の転化ステップによって、ヒトインシュリン、ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン又は特定のアシル化されたヒトインシュリンに転化することができる。
【０００６】
本発明の連結ペプチドは、少なくとも１つのＰｒｏを含み、一般に比較的短く、通常は長さが１０アミノ酸残基以下で、好ましくは６〜４アミノ酸残基以下である。
【０００７】
この連結ペプチドは、Ａ鎖から連結ペプチドをインビトロで切断できるようにする切断部位をそのＣ末端に含む。このような切断部位は、当分野で既知の任意の好都合な切断部位とすることができ、例えば臭化シアンで切断可能なＭｅｔ、トリプシン又はトリプシン様プロテアーゼ、すなわちＡｃｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ  ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼ又はカルボキシペプチダーゼプロテアーゼによって切断可能な単一の塩基性アミノ酸残基又は一対の塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）とすることができる。Ａ鎖からの連結ペプチドの切断を可能にするこの切断部位は、好ましくは単一の塩基性アミノ酸残基Ｌｙｓ又はＡｒｇ、好ましくはＬｙｓである。
【０００８】
連結ペプチドのＢ鎖からの切断は、ｄｅｓＢ３０インシュリン前駆体を生じる、Ｂ鎖中の天然ＬｙｓＢ２９アミノ酸残基での切断によって可能になる。このインシュリン前駆体をヒトインシュリンに転化しようとする場合、Ｂ３０  Ｔｈｒアミノ酸残基（Ｔｈｒ）を、周知のインビトロでの酵素学的手順によって付加することができる。ｄｅｓＢ３０インシュリンは、米国特許第５，７５０，４９７号及び同５，９０５，１４０号に記載されているように、アシル化インシュリンに転化することもできる。
【０００９】
一実施態様では、この連結ペプチドは、２つの隣接する塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を含まない。この実施態様では、Ａ鎖からの切断は、Ａ鎖のＮ末端に位置する単一のＬｙｓ又はＡｒｇで好ましくは行われる。
【００１０】
本発明の別の実施態様では、Ａ鎖に隣接する切断部位のＮ末端の直近にＰｒｏが位置する。この連結ペプチドは、１を超えるＰｒｏを含むことができるが、好ましくは３以下のＰｒｏ残基を含むことができる。
【００１１】
したがって、一側面では本発明は、Ａ鎖及びＢ鎖から切断可能な連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）を含み、少なくとも１つのＰｒｏ及びＡ鎖と連結ペプチドの間のペプチド結合の切断を可能にする切断部位を含み、１つのＰｒｏが前記切断部位のＮ末端の直近に位置するインシュリン前駆体に関する。
【００１２】
別の側面では、本発明は、Ａ鎖及びＢ鎖から切断可能な連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）を含み、少なくとも１つがＰｒｏである最高６つのアミノ酸残基からなるインシュリン前駆体に関する。
【００１３】
別の側面では、本発明は、以下の式を有するインシュリン前駆体に関する。
【００１４】
Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｙ−Ａ（１−２１）
式中、
Ｘ１は少なくとも１つのＰｒｏを含む１〜５アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Ｙは切断部位である。
【００１５】
一実施態様では、Ｘ１のアミノ酸残基の総数は１〜４、１〜３又は１〜２アミノ酸残基である。Ｘ１のアミノ酸残基は、任意のコード可能なアミノ酸残基とすることができ、少なくとも１つがＰｒｏであることを唯一の条件として同じでも異なっていてもよい。
【００１６】
別の実施態様では、ＹはＭｅｔ又は二塩基性アミノ酸配列ＬｙｓＬｙｓ、ＡｒｇＡｒｇ、ＡｒｇＬｙｓ又はＬｙｓＡｒｇである。さらに別の実施態様では、Ｙは単一の塩基性アミノ酸残基Ｌｙｓ又はＡｒｇである。
【００１７】
別の実施態様では、配列Ｘ１−Ｙは、２つの隣接する塩基性アミノ酸残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）を含まず、さらに別の実施態様では、Ｘ１は遊離のＣＯＯＨ基を有するアミノ酸残基（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）又は遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ）を含む。
【００１８】
Ｘ１−Ｙ配列の例はＧｌｎＰｒｏＬｙｓ、ＴｈｒＰｒｏＬｙｓ、ＧｌｕＰｒｏＬｙｓ、ＧｌｙＰｒｏＬｙｓ、ＭｅｔＰｒｏＬｙｓ、ＳｅｒＰｒｏＬｙｓ、ＡｓｐＰｒｏＬｙｓ、ＡｌａＡｓｐＰｒｏＬｙｓ（配列番号８）、ＡｓｎＡｓｐＰｒｏＬｙｓ（配列番号９）、ＧｌｕＡｓｐＰｒｏＬｙｓ（配列番号１０）及びＡｌａＡｓｐＰｒｏＬｙｓ（配列番号１１）である。
【００１９】
本発明は、特許請求の範囲に記載されているインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列にも関する。別の側面では、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含むベクター及びこのようなポリヌクレオチド配列又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２０】
別の側面では、本発明は宿主細胞内でインシュリン前駆体を産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明のインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を前記インシュリン前駆体の発現に適した条件下で培養すること、及び（ｉｉ）インシュリン前駆体を培地から単離することを含む。
【００２１】
さらに別の側面では、本発明はｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン又はヒトインシュリンを産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明のインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養すること、（ｉｉ）インシュリン前駆体を培地から単離すること、及び（ｉｉｉ）インビトロでの酵素による転化によってインシュリン前駆体をｄｅｓＢ３０ヒトインシュリン又はヒトインシュリンに転化することを含む。
【００２２】
さらに別の側面では、本発明はアシル化ｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンを産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）本発明のインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養すること、（ｉｉ）インシュリン前駆体を培地から単離すること、（ｉｉｉ）インシュリン前駆体をｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンに転化すること、及び（ｉｖ）都合の良いアシル化方法を用いてｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンをアシル化誘導体に転化することを含む。
【００２３】
本発明の一実施態様では、宿主細胞は酵母宿主細胞であり、別の実施態様では酵母宿主細胞をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属から選択する。別の実施態様では、酵母宿主細胞をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種から選択する。
【００２４】
略語及び命名法
「連結ペプチド」又は「Ｃ−ペプチド」は、単鎖プレプロインシュリン様分子のＢ−Ｃ−Ａポリペプチド配列の連結部分「Ｃ」を意味する。具体的には、天然インシュリン鎖では、Ｃ−ペプチドはＢ鎖の３０位とＡ鎖の１位を連結する。本明細書に記載したものなどの「ミニＣ−ペプチド」又は「連結ペプチド」はＢ２９をＡ１に連結し、天然Ｃ−ペプチドのそれとは配列及び長さが異なる。
【００２５】
「ＩＰ」は、ｄｅｓＢ３０鎖がインシュリンのＡ鎖に連結ペプチドを介して連結された単鎖インシュリン前駆体を意味する。単鎖インシュリン前駆体は、ヒトインシュリンのように、正確に配置されたジスルフィド架橋（３）を含む。
【００２６】
「ｄｅｓＢ３０」又は「Ｂ（１−２９）」は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠いた天然インシュリンＢ鎖を意味し、「Ａ（１−２１）」は、天然インシュリンＡ鎖を意味する。ミニＣ−ペプチド及びそのアミノ酸配列を、３文字のアミノ酸コードで示す。
【００２７】
「インシュリン前駆体」は、１以上の後続の化学及び／又は酵素プロセスによってヒトインシュリン又はｄｅｓＢ３０ヒトインシュリンに転化可能な単鎖ポリペプチドを意味する。
【００２８】
「Ｎ末端の直近に」という語は、アミノ酸残基又はペプチド配列がＣ末端で別のアミノ酸残基又はアミノ酸配列のＮ末端にペプチド結合によって直接連結している状況を示すものである。
【００２９】
本発明は、インシュリンＢ鎖の２９位とインシュリンＡ鎖の１位を連結し、酵母宿主細胞の産生収率を著しく増加させた新規なミニＣ−ペプチドを特徴とする。「産生の著しい増加」「発酵収率の増加」などの語は、本発明によるＣペプチドとは異なるＣペプチドを含むインシュリン前駆体の収率に比べて、培養上清中に存在するインシュリン前駆体分子の分泌量が増加することを意味する。「増加した」発酵収率は、対照よりも大きな無名数であり、好ましくは、増加は対照よりも５０％以上大きく、より好ましくは、増加は対照レベルよりも１００％以上大きい。
【００３０】
「ＰＯＴ」はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「ＴＰＩ１」はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
【００３１】
「リーダー」は、プレペプチド（シグナルペプチド）及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
「シグナルペプチド」という語は、タンパク質の前駆体上にＮ末端配列として存在するプレペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質が小胞体中へ容易にトランスロケーションできるようにすることである。シグナルペプチドは、通常このプロセス中に切り離される。シグナルペプチドは、タンパク質を産生する酵母菌と異種でも同種でもよい。本発明のＤＮＡ構築物とともに使用できる多数のシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド又は任意の機能的な類縁体（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ等（１９９０）ＹＥＡＳＴ  ６：１２７〜１３７及び米国特許第５，７２６，０３８号）及びＭＦα１遺伝子のα因子シグナル（Ｔｈｏｒｎｅｒ（１９８１）、“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ等編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ中のｐｐ１４３〜１８０及び米国特許第４，８７０，００号）が含まれる。
【００３３】
「プロペプチド」という語は、発現されたポリペプチドが小胞体からゴルジ装置、さらには培地中に分泌するための分泌小胞に誘導（すなわち、細胞壁を横切って又は少なくとも細胞膜を通って酵母細胞の細胞膜周辺腔内へポリペプチドが移出）されるようにする機能を有するポリペプチド配列を意味する。プロペプチドは、酵母α因子プロペプチドとすることができる（米国特許第４，５４６，０８２号及び同４，８７０，００８号参照）。あるいは、プロペプチドを合成プロペプチド、すなわち天然には見られないプロペプチドとすることができる。適切な合成プロペプチドは、米国特許第５，３９５，９２２号、同５，７９５，７４６号、同５，１６２，４９８号及び国際公開第９８／３２８６７号に開示されたものである。プロペプチドは、好ましくは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列又はその機能的な任意の類縁体などのエンドペプチダーゼ処理部位をＣ末端に含む。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチド配列は、確立された標準法、例えばＢｅａｕｃａｇｅ等（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜１８６９に記載された亜リン酸アミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ等（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：８０１〜８０５に記載された方法によって合成して調製することができる。亜リン酸アミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドが例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、二重鎖にされ、連結されて合成ＤＮＡ構築物が形成される。ＤＮＡ構築物を調製する現時点で好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ及び合成由来のものの混合物でもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させ、その後所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドをこのＤＮＡ配列のある部位に挿入して改変し、周知の手順に従って相同組換えすることができ、又は好ましくは適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって所望の配列を生成することができる。
【００３６】
本発明は、選択した微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、且つ本発明のインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを包含する。組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の存在物（ｅｎｔｉｔｙ）として存在するベクターとすることができ、その複製は染色体の複製とは無関係であり、例えば、プラスミド、細胞外エレメント、微小染色体又は人工染色体などである。ベクターは、自己複製を確実にするあらゆる手段を備えることができる。あるいは、ベクターを、宿主細胞に導入されたときに、ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターとすることができる。また、単一のベクター若しくはプラスミド、又はともに宿主細胞のゲノム中に導入しようとする全ＤＮＡを含む２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを使用することができる。ベクターは、線状プラスミドでも閉環状プラスミドでもよく、好ましくは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの安定な組み込み、又は、ゲノムとは無関係な細胞内でのベクターの自己複製を可能とするエレメントを含む。
【００３７】
好ましい実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。酵母中でのベクターの複製を可能にする配列の例は、酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１〜３及び複製起点である。
【００３８】
本発明のベクターは、好ましくは、トランスフォームされた細胞を容易に選択できるようにする１以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に原栄養性などをその産物が与える遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞中で使用される選択マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）などである。酵母宿主細胞に適切なマーカーはＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。酵母の好ましい選択マーカーは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｐｅ  ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１２５〜１３０）である。
【００３９】
ベクターでは、ポリヌクレオチド配列が適切なプロモーター配列に作用可能に連結されている。プロモーターは、突然変異体、短縮されたプロモーター及びハイブリッドプロモーターを含めて最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列とすることができ、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００４０】
細菌宿主細胞中で転写を誘導する適切なプロモーターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞中で転写を誘導する適切なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファアミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定型アルファアミラーゼに対する遺伝子から得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、通常、適切なターミネーターにも作用可能に連結されている。酵母では、適切なターミネーターは、ＴＰＩターミネーター（Ａｌｂｅｒ等（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４）である。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチド配列、プロモーター及びターミネーターそれぞれを連結し、選択した宿主中で複製するのに必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するのに使用する手順は、当業者には周知である。ベクターは、本発明のインシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列全体を含むＤＮＡ構築物をまず調製し、続いてこの断片を適切な発現ベクター中に挿入するか、（シグナル、プロペプチド、ミニＣ−ペプチド、Ａ鎖及びＢ鎖などの）個々のエレメントに対する遺伝情報を含むＤＮＡ断片を順次挿入してその後連結するかして構築することができることを理解されたい。
【００４３】
本発明は、本発明のインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞にも関する。このようなポリヌクレオチド配列を含むベクターを、このベクターが前述した染色体構成要素又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように宿主細胞中に導入する。「宿主細胞」という語は、複製中に起こる突然変異のために親細胞とは同一でない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞微生物、例えば、原核生物又は非単細胞微生物、例えば、真核生物とすることができる。有用な単細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞を含むグラム陽性細菌又はＥ．ｃｏｌｉ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種などのグラム陰性細菌などの細菌細胞であるが、これらに限定されない。真核生物細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞とすることができる。好ましい実施態様では、宿主細胞は酵母細胞である。本発明の方法に使用する酵母菌は、培養によって多量の本発明のインシュリン前駆体及びインシュリン前駆体類縁体を産生する任意の適切な酵母菌とすることができる。適切な酵母菌の例は、酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ種及びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓから選択される菌株である。
【００４４】
酵母細胞のトランスフォーメーションは、例えば、それ自体公知の方法でプロトプラストを形成した後にトランスフォーメーションすることによって実施することができる。細菌を培養するのに使用する培地は、酵母菌を増殖させるのに適切な任意の慣用培地とすることができる。本発明の分泌インシュリン前駆体は、そのかなりの部分が培地中に正確に処理された形で存在し、遠心分離、ろ過によって酵母細胞を培地から分離し、又はイオン交換マトリックス若しくは逆相吸収マトリックスによってインシュリン前駆体を補足し、上清のタンパク質成分を沈殿させ又は塩、例えば硫酸アンモニウムを用いてろ過し、その後様々なクロマトグラフィ操作、例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィなどによって精製することを含めて、従来の手順によって培地から回収することができる。
【００４５】
本発明のインシュリン前駆体は、米国特許第５，３９５，９２２号及び欧州特許第７６５，３９５Ａ号（両方の特許を参照により本明細書に組み込む）に記載されているように、Ｎ末端アミノ酸残基伸長部分とともに発現させることができる。この伸長部分は発酵中本発明のインシュリン前駆体に安定に結合し、インシュリン前駆体又はインシュリン前駆体類縁体のＮ末端をＤＰＡＰなどの酵母プロテアーゼのタンパク質分解活性から保護することが判明している。インシュリン前駆体にＮ末端伸長部分が存在することで、タンパク質の化学処理中にＮ末端アミノ基の保護として働くこともでき、すなわちＢＯＣ（ｔ−ブチル−オキシカルボニル）の置換基又は類似の保護基として働くことができる。Ｎ末端伸長部分は、塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）に特異的なタンパク質分解酵素によって末端伸長部分をＬｙｓ残基で切り離して、回収したインシュリン前駆体から除去することができる。このようなタンパク質分解酵素の例は、トリプシン又はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼである。
【００４６】
培地への分泌及び回収後に、本発明のインシュリン前駆体を様々なインビトロでの操作にかけて存在し得るＮ末端伸長配列及びミニＣ−ペプチドを除去してｄｅｓＢ３０インシュリンを生成する。次いで、Ｂ３０位にＴｈｒを付加してＤｅｓＢ３０インシュリンをヒトインシュリンに転化することができる。米国特許第４，３４３，８９８号又は同４，９１６，２１２号又はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ、１９９４年９月／４８７（これらの開示物を参照により本明細書に組み込む）に記載されたように、インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は、Ｌ−トレオニンエステルの存在下でトリプシン又はＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓプロテアーゼを用いて適切な酵素転化を行い、その後塩基又は酸加水分解によってインシュリンのトレオニンエステルをインシュリンに転化して行う。米国特許第５，７５０、４９７号及び米国特許第５，９０５，１４０号（これらの開示物を参照により本明細書に組み込む）に開示されたように、ＤｅｓＢ３０インシュリンはアシル化誘導体にも転化することができる。
【００４７】
以下に記述するように、少なくとも１つのＰｒｏを特徴とし、合成Ｃ−ペプチドを含むインシュリン前駆体を構築した。特許請求の範囲に記載したインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミドをＰＣＲで構築し、それを使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞をトランスフォームした。発現産物の量を、発現した対照の量に対する百分率として測定した。本発明の新規なＣ−ペプチドは、最高１００％まで収率を増加させた。
【００４８】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは特許請求した本発明の範囲を決して限定するものではない。添付の図は、本発明の明細書及び記載の一部分とみなすべきものである。引用したすべての参考文献のそこに記載されているすべてを参照により本明細書に組み込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
一般的な手順
発現プラスミドはすべて欧州特許第１７１，１４２号に記載のものに類似したＣ−ＰＯＴタイプであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのプラスミドの選択及び安定化のためにＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）を含むことを特徴とする。このプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーターも含む。これらの配列は、リーダーとインシュリン前駆体産物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の配列以外のすべての配列が（国際公開第９０／１０００７５号に記載の）プラスミドｐＫＦＮ１００３の対応する配列に類似している。異なる融合タンパク質を発現するために、対象となるリーダー−インシュリン前駆体融合物をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片でｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を単純に置き換える。このようなＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、標準技術に従い合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを用いて合成することができる。
【００５０】
宿主菌株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＭＴ６６３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα  ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３  ＨＩＳ４／ｈｉｓ４  ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２  Ｃｉｒ＋）のトランスフォーメーションによって酵母の形質転換体を調製した。国際公開第９２／１１３７８号の出願に関連して酵母菌株ＭＴ６６３をＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託し寄託番号ＤＳＭ６２７８を受けた。
【００５１】
ＭＴ６６３は、ＹＰＧａＬ（１％Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２％Ｂａｃｔｏペプトン、２％ガラクトース、１％ラクテート）上で増殖して６００ｎｍでのＯ．Ｄ．が０．６になった。培養物１００ｍｌを遠心分離により収集し、水１０ｍｌで洗浄し、再び遠心分離し、１．２Ｍソルビトール、ｐＨ＝８．０の２５ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ及びジチオスレイトール６．７ｍｇ／ｍｌを含有する溶液１０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞を１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ０５．８及びＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）２３４  ２ｍｇを含有する溶液１０ｍｌに再懸濁した。この懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離により回収し、１．２Ｍソルビトール１０ｍｌ及びＣＡＳ（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭトリスＨＣｌ（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ＝７．５）１０ｍｌで洗浄し、ＣＡＳ２ｍｌに再懸濁した。トランスフォーメーションするために、ＣＡＳに懸濁した細胞１ｍｌをプラスミドＤＮＡ約０．１ｍｇと混合し、室温で１５分間放置した。（２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．５）１ｍｌを添加し、この混合物をさらに３０分間室温で放置した。この混合物を遠心分離し、固形物をＳＯＳ（１．２Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖＹＰＤ、６．７ｍＭＣａＣｌ２）０．１ｍｌに再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離し、固形物を１．２Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。次いで、１．２Ｍソルビトールと２．５％寒天を含有する５２℃の上層寒天（Ｓｈｅｒｍａｎ等（１９８２）“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＳＣ培地）６ｍｌを添加し、同じ寒天で凝固したソルビトール含有培地を含むプレート上にこの懸濁液を注いだ。
【００５２】
発現プラスミドでトランスフォームしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＭＴ６６３を、ＹＰＤ中７２時間３０℃で増殖させた。培養上清中のインシュリン前駆体収率を、外部標準としてヒトインシュリンを用いて逆相ＨＰＬＣ分析により定量した（Ｓｎｅｌ＆Ｄａｍｇａａｒｄ（１９８８）Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ．Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｒｅｓ．２０：４７６〜４８８）。
【実施例１】
【００５３】
プレペプチド（シグナルペプチド）及びプロペプチドからなるリーダー配列を伴うインシュリン前駆体からなる融合タンパク質をコードする合成遺伝子を、標準条件下のＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）及びＥ．Ｈ．Ｆ．ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、Ｓａｎｄｈｏｅｆｅｒ  Ｓｔｒａｓｓｅ  １１６、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて作製した。得られたＤＮＡ断片を単離し、エンドヌクレアーゼで消化し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。標準方法を用いてＤＮＡを連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のトランスフォーメーションをＣａＣｌ２法によって実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）同上）。ＱＩＡＧＥＮカラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、トランスフォームしたＥ．ｃｏｌｉ細胞からプラスミドを精製した。ＡＬＦ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＤＮＡ配列決定システムを使用しテンプレートとして精製した二本鎖プラスミドＤＮＡを用いてヌクレオチド配列を決定した。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｒｈｕｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。
【００５４】
インシュリン前駆体の分泌は、ＴＡ５７リーダー又はＴＡ３９リーダーによって促進されたが（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ等、１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．１４、３０９〜３１６）、様々な既知の酵母リーダー配列を使用することができる。
【００５５】
図１及び２に示すように、ＴＡ５７リーダー−ＥＥＧＥＤＫ（配列番号１）−インシュリン前駆体融合タンパク質を発現するｐＡＫ８５５  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルＰＯＴプラスミドに基づいて作製した（米国特許第５，８７１，９５７号）。図１で、Ｌ−ＩＰはリーダー−インシュリン前駆体融合タンパク質をコードする融合タンパク質発現カセットを示し、ＴＰＩ−ＰＲＯＭＯＴＯＲはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＰ／１プロモーターであり、ＴＰＩ−ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＰ／１ターミネーターであり、ＴＰＩ−ＰＯＭＢＥはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択に使用されるＳ．ｐｏｍｂｅＰＯＴ遺伝子を示し、ＯＲＩＧＩＮは２μｍプラスミドから誘導されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ複製起点を示し、ＡＭＰ−Ｒはアンピシリン耐性を付与しＥ．ｃｏｌｉにおける選択を容易にするβ−ラクタマーゼ遺伝子を示し、ＯＲＩＧＩＮ−ＰＢＲ３２２はＥ．ｃｏｌｉ複製起点を示す。
【００５６】
異なるミニＣ−ペプチドとともにリーダー配列とインシュリン前駆体の多数の融合タンパク質をコードするＤＮＡを、プライマーとして適切なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより下記のようにして作製した。標準法を用いて、リーダー−インシュリン前駆体−融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、以下の構造、すなわち、リーダー−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−スペーサー−インシュリン前駆体（Ｌｙｓ−Ａｒｇは、二塩基性エンドプロテアーゼ処理候補部位及びスペーサーはＮ末端伸長部分である）で、ＣＰＯＴ発現ベクター中にサブクローニングした。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼによる融合タンパク質の処理を最適にするため、スペーサーペプチド（Ｎ末端伸長部分）、例えばＥＥＧＥＰＫ（配列番号１）をコードするＤＮＡを、リーダーとインシュリン前駆体をコードするＤＮＡの間に挿入した（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ等  １９９９ｂ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７５，１９５〜２０８）。しかし、スペーサーペプチドは必ずしも存在する必要はない。インシュリン前駆体は、ＬｙｓＢ２９とＧｌｙＡ１を連結するミニＣ−ペプチドを含むＮ末端が伸長された単鎖インシュリン前駆体として分泌された。インシュリン前駆体を精製しＮ末端伸長部分及びミニＣ−ペプチドをタンパク質分解により除去した後、酵素によって媒介されたペプチド転移によってアミノ酸ＴｈｒＢ３０をＬｙｓＢ２９に付加して、ヒトインシュリンを生成することができる（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ等（１９８７）、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９８６」（Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｓ、Ｄ．編）、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ＆Ｃｏ．、Ｂｅｒｌｉｎ中のｐｐ．１８９〜１９４）。
【００５７】
ミニＣ−ペプチド中のアミノ酸をコードする１以上のコドンをランダム化して合成ミニＣ−ペプチドの開発を行った。合成ミニＣ−ペプチドは、一般に、合成ミニＣ−ペプチドの酵素による除去を可能にするＣ末端の酵素処理部位（Ｌｙｓ）を特徴とする。合成ミニＣ−ペプチドの１以上の位置のコドンを変化させたドープ化オリゴヌクレオチド（ｄｏｐｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いてランダム化を実施した。通常、ＰＣＲに用いた２つのプライマー（オリゴヌクレオチド）のうち１つがドープされた。一般式Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＸＰＫ）を有する合成ミニＣ−ペプチドを生成するために使用したランダム化合成ミニＣ−ペプチドを含むリーダー−インシュリン前駆体のＰＣＲ生成に使用するオリゴヌクレオチドペアの例は、以下の通りである。
【００５８】
プライマーＡ：
５’−ＴＴＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣ−３’（配列番号４）
プライマーＢ：
５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＭＮＮＣＴＴＡＧＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号５）
Ｎ＝ＡＣＴＧ
Ｍ＝ＡＣ
ポリメラーゼ連鎖反応法。ＰＣＲを一般に以下に示すように実施した。プライマーＡ（２０ｐｍｏｌ）５μｌ、プライマーＢ（２０ｐｍｏｌ）５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液１０μｌ、ｄＮＴＰ混合物８μｌ、Ｅ．Ｈ．Ｆ．酵素０．７５μｌ、テンプレートとしてｐＡＫ８５５プラスミド１μｌ（ＤＮＡ約０．２μｇ）及び蒸留水７０．２５μｌ。
【００５９】
通常１０〜１５サイクルを実施し、１サイクルは通常９５℃４５秒、５５℃１分、７２℃１．５分であった。続いてＰＣＲ混合物を２％アガロースゲル上に載せ、標準技術により電気泳動を実施した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキットで単離した。
【００６０】
図２に、ＰＣＲ用テンプレートとして使用したｐＡＫ８５５ＤＮＡ発現カセットのヌクレオチド配列及びコードされた融合タンパク質（ＴＡ５７−リーダー−ＥＥＧＥＰＫ（配列番号１）−ｐＡＫ８５５のインシュリン前駆体（配列番号２及び３））の推測されるアミノ酸を示す。
【００６１】
融合タンパク質ＴＡ３９リーダー−ＥＥＧＥＥＰＫ（配列番号１）−インシュリン前駆体をコードする同様の発現カセット
標準技術に従って、精製したＰＣＲ  ＤＮＡ断片を水と制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えばＢｇｌ  ＩＩ及びＸｂａ  Ｉ）で消化した。ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ  ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にかけ、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【００６２】
消化され単離されたＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び標準条件を用いて適切な（例えば、ＣＰＯＴタイプの）ベクターとともに連結した。続いて連結混合物をコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ菌株にトランスフォームし、その後アンピシリン耐性を用いて選択した。得られたＥ．ｃｏｌｉ菌株からＱＩＡＧＥＮカラムを用いてプラスミドを単離した。
【００６３】
次いで、このプラスミドを用いて適切なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主菌株、例えば、ＭＴ６６３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα  ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３  ＨＩＳ４／ｈｉｓ４  ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２  Ｃｉｒ＋）をトランスフォーメーションした。個々のトランスフォームされたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクローンを液体培養で増殖させ、培養上清に分泌されたインシュリン前駆体の量をＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。次いで、量の増したインシュリン前駆体を分泌するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクローン由来の発現プラスミドの合成ミニＣ−ペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した。続いて、同定した合成ミニＣ−ペプチド配列を別の一連のランダム化による最適化にかけることもできる。
【００６４】
表１は、上記方法により生成されたインシュリン前駆体及び対照に対する百分率で表した産生収率を示す。ＹＰＤ５ｍｌ中で３０℃７２時間発酵を行った。インシュリン前駆体の収率を培養上清のＲＰ−ＨＰＬＣにより測定し、ミニＣ−ペプチド  Ａｌａ−Ａｌａ−ＬｙｓによってＢ２９残基がＡ１残基に連結されたリーダー−インシュリン前駆体融合タンパク質を発現する対照菌株の収率に対して表示した。ＹＡＰ３はＹＡＰ３シグナル配列である。配列ＥＥＧＥＰＫ（配列番号１）はＢ鎖へのＮ末端伸長部分であり、ＴＡ５７は合成プロ配列
ＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号６）である。
【表１】
2004533821.tif 000002
【実施例２】
【００６５】
実施例１に記載した手順と類似した手順によって、合成リーダーＴＡ３７  ＱＰＩＤＤＴＥＳＮＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＲＦＡＴＮＴＴＬＡＧＧＬＤＶＶＮＬＩ−ＳＭＡＫＲ（配列番号７）及びＹＡＰ３シグナル配列の制御下にありミニＣ−ペプチド中にＰｒｏを含むインシュリン前駆体を酵母宿主ＭＴ６６３中で発現させた。前駆体はすべてＮ−末端伸長部分ＥＥＧＥＰＫ（配列番号１）を含んでいた。対照と比較した発現収率の増加を表２に示す。
【表２】
2004533821.tif 000003
【実施例３】
【００６６】
実施例１に記載した手順と類似した手順によって、α因子リーダー配列の制御下にありミニＣ−ペプチド中にＰｒｏを含むインシュリン前駆体を酵母宿主ＭＴ６６３中で発現させた。Ｎ−末端伸長部分ＥＥＡＥＡＥＡＰＫ（配列番号１２）を含むインシュリン前駆体と含まないインシュリン前駆体が発現した。対照と比較した発現収率の増加を表３に示す。
【表３】
2004533821.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＴＡ５７リーダー−ＥＥＧＥＰＫ（配列番号１）−Ｂ（１−２９）−ＡｌａＡｌａＬｙｓ−Ａ（１−２１）前駆体を発現するｐＡＫ８５５  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現プラスミドを示す図である。
【図２】ｐＡＫ８５５酵母発現プラスミドの発現カセットのヌクレオチド配列及び推測されるアミノ酸配列（配列番号２及び３）を示す図である。
【図１】
2004533821.tif 000005
【図２】
2004533821.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004533821.tif 000007
2004533821.tif 000008
2004533821.tif 000009
2004533821.tif 000010
2004533821.tif 000011
2004533821.tif 000012
2004533821.tif 000013
2004533821.tif 000014
2004533821.tif 000015
2004533821.tif 000016
2004533821.tif 000017
2004533821.tif 000018
2004533821.tif 000019
2004533821.tif 000020
2004533821.tif 000021
2004533821.tif 000022
2004533821.tif 000023
2004533821.tif 000024
2004533821.tif 000025
2004533821.tif 000026
2004533821.tif 000027
2004533821.tif 000028
2004533821.tif 000029
2004533821.tif 000030
2004533821.tif 000031
2004533821.tif 000032
【国際調査報告】
2004533821.tif 000033
2004533821.tif 000034
2004533821.tif 000035
2004533821.tif 000036
2004533821.tif 000037