(57)【要約】生物物質を配列することによって生配列の集合を生成するステップと、ダイタグを生配列の集合から分離するステップと、タグをダイタグから分離するステップと、タグの存在量を決定するステップと、タグを同定するステップとを含む遺伝子転写物を同定するための方法であって、配列エラーのための統計モデルを使用することによって配列エラーの量を減少させるステップを提供する方法。
2004500640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子転写物を同定するための方法であって、該方法は、
ａ）少なくとも第１のタイプの生物物質を配列することにより、少なくとも生配列の第１の集合を生成するステップと、
ｂ）第１のダイタグを前記少なくとも生配列の第１の集合から分離するステップと、
ｃ）第１のタグを前記分離された少なくとも第１のダイタグから分離するステップと、
ｄ）前記第１のタグの存在量を決定するステップと、
ｅ）前記第１のタグを同定するステップとを含み、
該方法はさらに、
ｆ）前記分離された第１のタグに適用される配列エラーのための統計モデルを使用することによって配列エラーの量を減少させるステップを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ステップｆ）の前記統計モデルが、ベースコール法の信頼レベルに基づくことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法において、
前記ステップｆ）が、
ｇ）ベースコール法を介して前記分離された第１のダイタグまたはタグの適切性をチェックすることによって配列エラーの量を減少させるステップの後に、
適用されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載の方法において、前記ベースコール法が、Ｐｈｒｅｄ（登録商標）ベースコール・ソフトウェアを介して行われることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４の何れか１項に記載の方法において、前記ダイタグが、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のための方法を介して生配列の前記集合から分離されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の何れか１項に記載の方法において、
前記ステップａ）〜前記ステップｆ）、または前記ステップａ）〜前記ステップｇ）が、
少なくとも生配列の第２の集合と、それぞれの第２のダイタグおよび第２のタグとに適用され、
ｂ）前記第１のタグおよび前記第２のタグを比較してその相対存在量を決定するステップが、適用されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６の何れか１項に記載の方法において、該方法はさらに、
前記タグについて余分の塩基対を予測するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、
前記タグについて余分の塩基対を予測する前記ステップが、
少なくとも所定の数の塩基対のダイタグが分離されるたびに、余分の塩基対をダイタグの各タグに割り当てるステップと、
余分の塩基対が割り当てられたタグのそれぞれが所定の閾値と同じ量になるように強いるステップと、
残りのタグのそれぞれについて、その最も優勢な余分の塩基対を選択するステップと、
前記最も優勢な余分の塩基対について、少なくとも前記タグの発生数の一定の割合を表すように強いるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８の何れか１項に記載の方法において、該方法はさらに、
前記ダイタグの長さに基づいて前記分離されたダイタグの適切性をチェックするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項８の何れか１項に記載の方法において、該方法はさらに、
前記ダイタグの発生に基づいて前記分離されたダイタグの適切性をチェックするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０の何れか１項に記載の方法において、前記ステップｆ）の前記統計モデルが、平均配列エラー率に基づくことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記平均配列エラー率が、規則
【数１】
2004500640.tif 000122
を介して計算され、
上式でｑは前記平均配列エラー率を表すことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１２の何れか１項に記載の方法において、
前記ステップｆ）が、
ｆ１）配列エラーによって影響されないタグの存在量の推定値を計算するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記ステップｆ１）が、まばらな対角ドミナント線形システムを介して行われることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の方法において、
前記ステップｆ）がさらに、
ｆ２）タグの存在量の前記推定値とタグの前記カウントされた存在量との差を計算するステップと、
ｆ３）前記差が所与の閾値より大きいタグを解消するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項６〜請求項１５の何れか１項に記載の方法において、
前記第１および少なくとも第２のダイタグを比較してその相対存在量を決定する前記ステップｈ）が、
ｈ１）前記第１および第２のタグを合併するステップと、
ｈ２）前記第１および第２のタグの存在量を正規化するステップと、
ｈ３）前記第１と第２のタグの間の存在量の差を決定するステップと、
ｈ４）前記差の適切性を推定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記差の適切性を推定する前記ステップｈ４）が、Ｃｌａｖｅｒｉｅ法を適用することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項７または請求項８に基づくとき、請求項６〜請求項１７の何れか１項に記載の方法において、
前記第１および第２のダイタグを比較してその相対存在量を決定する前記ステップｈ）がさらに、
ｈ５）予測される余分の塩基対の一貫性をチェックするステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１８の何れか１項に記載の方法において、
前記少なくとも第１のタグを同定する前記ステップｅ）が、
ｅ１）第１のデータベースとの比較によってタグの第１の同定を行うステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
前記少なくとも第１のタグを同定する前記ステップｅ）がさらに、
ｅ２）前記第１の同定によって同定されたタグのそれぞれにスコアを割り当てるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９または請求項２０に記載の方法において、
前記第１および第２のタグを同定する前記ステップｉ）がさらに、
ｅ３）少なくとも第２のデータベースとの比較によって少なくともタグの第２の同定を行うステップと、
ｅ４）前記少なくとも第２の同定によって同定されたタグのそれぞれにスコアを割り当てるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法において、前記第１のデータベースが、ＥＳＴデータベースであることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記ステップｂ）が、制限酵素としてＭｍｅＩを使用することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１〜請求項２３の何れか１項に記載の方法において、該方法はさらに、同定されたタグを可視化するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、該方法はさらに、前記同定されたタグに関する情報にアクセスするための手段を提供するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の方法において、該方法はさらに、同定されたタグごとに固有の番号を割り当てるためのステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２４〜請求項２６の何れか１項に記載の方法において、該方法はさらに、同定されたタグごとに画面上で固有の位置を割り当てるためのステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（説　明）
本発明は、エラーの処理の効率を改善した、ＲＮＡまたはそれ対応するｃＤＮＡなどの遺伝子転写物を同定するための方法に関する。この方法を応用し、たとえばＤＧＥ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）調査を参照して、いくつかの細胞タイプから情報を収集することができる。
【０００２】
具体的には、データを配列するＳＡＧＥ法を応用する方法を開示する。次いで、こうして得られた結果を比較による方法で使用し、遺伝子同定を実現する。
Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに譲渡された米国特許第５　６９５　９３７号（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕらの「Ｓｅｒｉａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：　４８４〜４８７，１９９５年、および「Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ　Ｔａｎｔａｌｉｚｉｎｇ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，　ＳＡＧＥ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｇｌｏｂａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｓｃｉｎｅｃｅ　２８６：　１４９１〜１４９２，　１９９９年をも参照）によれば、タグを得て、その後２量体化してからそのヌクレオチド配列を決定する。２量化されたタグは、「ダイタグ（ｄｉｔａｇ）」という用語で知られる。より詳細には、米国特許第５　６９５　９３７号は、遺伝子発現をシリアル解析するための方法であって、１）ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを産生するステップと、２）第１の定義済みヌクレオチド配列タグを第１のｃＤＮＡオリゴヌクレオチドから分離し、かつ、第２の定義済みヌクレオチド配列タグを第２のｃＤＮＡオリゴヌクレオチドから分離するステップと、３）第１のオリゴヌクレオチド・リンカーに第１のタグをリンクするステップであって、第１のオリゴヌクレオチド・リンカーが増幅プライマのハイブリッド形成のために第１の配列を含むステップと、第２のオリゴヌクレオチド・リンカーに第２のタグをリンクするステップであって、第２のオリゴヌクレオチド・リンカーが増幅プライマのハイブリッド形成のために第２の配列を含む、ステップと、４）発現された遺伝子に対応するタグのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む方法を述べている。
【０００３】
上述の手順に伴う主な欠点は、それに伴うエラーの割合が高くなる点にある。
ＤＧＥ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法は、たとえば、Ｋａｌら「Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｉａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｆｒｏｍ　ｙｅａｓｔ　ｇｒｏｗｎ　ｏｎ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ」，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ，１０：　１８５９〜１８７２，１９９９年、およびＩｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．名義のＷＯ　９５／２０６８１から周知である。そこには、２つ以上の生物標本からの遺伝子転写物イメージ解析を比較し、２つの標本間で異なって発現する１つまたは複数の遺伝子を同定する方法が述べられている。
【０００４】
本発明による方法の第１の目的は、エラー率を推定し、その結果として危険なタグを拒絶することにより、たとえばＳＡＧＥ法のような方法を介して得られたタグのエラー率を大幅に減少させる方法を提供することである。
【０００５】
本発明の第２の目的は、改善されたグラフィカル・インターフェースを使用することにより、同定済みタグを調べる簡単な方法を提供することである。タグに関する情報の全セット（全同定ストーリーおよび他のライブラリ内の存在量）へのアクセスを提供する。
【０００６】
本発明は、遺伝子転写物を同定するための方法を提供することによって、前述の問題を解決し、該方法は、
ａ）少なくとも第１のタイプの生物物質を配列することにより、少なくとも生配列の第１の集合を生成するステップと、
ｂ）第１のダイタグを前記少なくとも生配列の第１の集合から分離するステップと、
ｃ）第１のタグを前記分離された少なくとも第１のダイタグから分離するステップと、
ｄ）前記第１のタグの存在量を決定するステップと、
ｅ）前記第１のタグを同定するステップと、を含み、
該方法はさらに、
ｆ）前記分離された第１のタグに適用される配列エラーのための統計モデルを使用することにより、配列エラーの量を減少させるステップを含む。
【０００７】
本発明の有利な実施形態を、特許請求の範囲の従属請求項に開示する。
「生物物質」という用語は、真核細胞または原核細胞から、直接または間接的に導出される物質に関連し、そのような細胞内にどのようにしても存在するリボ核酸の少なくとも一部を含む。
【０００８】
「生配列」および「生データ」という用語は、当技術分野で周知である技法を介して生物物質から導出されたヌクレオチドの配列に関連する。
「タグ」という用語を用いて、遺伝子セグメントに対応する転写物の部分的な定義済み配列を意図する。したがって、タグは、たとえば細胞、組織、または抽出物内で発現する遺伝子のためのマーカである。タグは、一般に９から１０塩基対の短いヌクレオチド配列であり、転写物内で定義された位置から分離されているという条件で、転写物を一義的に同定するための情報内容を含む。異なる尺度のタグも得ることができる。
【０００９】
本発明による方法の主な利点は、配列エラーの問題を大幅に減少させることができる。この目標は、配列エラーのための統計モデルを応用することによって達せられる。
【００１０】
この方法の第２の利点は、複数のデータベースを使用してユーザがこの同定を確認することをも可能にすることにより、同定の適切性の尺度を提供することができる。たとえば、まずＥＳＴデータベースを使用することができ、次いで、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのようなタンパク質データベース内での検索を介して肯定的な整合を確認することができる。
【００１１】
さらなる利点が、結果の提示方法にある。この方法は、同定されたタグに関する情報の点からみると同様なデータ（たとえばＳＡＧＥデータ）のための他のインターフェースより豊富なテキスト形態だけでなく、改善されたグラフィカル・インターフェースも提供する。このグラフィカル・インターフェースは、結果の容易な解釈と、たとえばＫＥＧＧ経路への容易なアクセスとを可能にする。
【００１２】
他の利点および特徴は、以下の詳細な説明を読めば、当業者には容易に明らかになろう。
添付の図を参照しながら、本発明の好ましい、非制限の例示的実施形態を参照することができる。
【００１３】
次に図１を参照すると、本発明による方法の一般的な概要が示されている。この方法は、４つのステップを含む。
第１のステップでは、生物物質から始めて生データが処理される。具体的には、細胞の生物物質から始めて、ＲＮＡが分離され、それに対応するｃＤＮＡが構成され、タグとそれに続いてダイタグが互いに連鎖され、したがってＳＡＧＥ法に従う。
【００１４】
好ましい実施形態では、このステップ１が、生データの２つの異なるライブラリに適用され、生データの各ライブラリは、特定の細胞タイプ関連する。たとえば、図１の「マイナス」ライブラリは、中性の細胞タイプに関連することがあり、一方、図１の「プラス」ライブラリは、悪性の細胞タイプに関連することがある。このようにして、細胞または細胞の母集団内の遺伝子転写物の相対存在量と相関する、特定の生物学的状態、疾病または条件を決定することができる。当然ながら、このステップも、単一のデータ・ライブラリに適用することができ、この場合、相対存在量は、同じ細胞の転写物間で計算される。
【００１５】
これに引き続いて、タグがダイタグから抽出され、カウントされる。これにより、検出されたタグそれぞれのリストと、対応する存在量、すなわちそのタグがライブラリ内にある回数とを含むファイルが生成される。
【００１６】
第２のステップでは、マイナス・ライブラリのデータとプラス・ライブラリのデータとの間で比較が行われる。このステップでは、各細胞タイプ内で検出されたタグが編成され、その存在量が（たとえばそれらの間の比を計算することによって）比較され、結果としてアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションに関する有用な情報が生み出される。
【００１７】
第３のステップでは、タグ同定が行われる。タグは、発現されたｍＲＮＡ配列の一種の「指紋」であり、これは発現された遺伝子に対応することに留意されたい。したがって、このステップでは、検出されたタグに対応する遺伝子が同定される。同定ステップは、検出されたタグそれぞれと、たとえばＵｎｉｇｅｎｅおよび／またはＥＭＢＬなど、ヌクレオチド配列のデータベースとの間の比較を必要とする。このステップの他の目的はまた、たとえばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（タンパク質データベース）、ＫＥＧＧ、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｐｉｒ、Ｐｆａｍなど、他のデータベースの参照を提供するものである。これらデータベースの背景材料は、たとえば、Ｓｔｏｅｓｓｅｒらの「Ｔｈｅ　ＥＭＢＬ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　１８〜２４，１９９９、Ｏｇａｔａらの「ＫＥＧＧ：　Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　２９〜３４，１９９９年、Ｂａｔｅｍａｎらの「Ｐｆａｍ　３．１：　１３１３　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｆｉｌｅ　ＨＭＭｓ　Ｍａｔｃｈ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　２６０〜２６２，１９９９年、Ｂａｒｋｅｒらの「Ｔｈｅ　ＰＩＲ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　３９〜４３，１９９９年、Ｈｏｆｆｍａｎｎらの「Ｔｈｅ　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ＴｒＥＭＢＫ　ｉｎ　１９９９」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　４９〜５４，１９９９年、Ｂａｉｒｏｃｈらの「Ｔｈｅ　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ＴｒＥＭＢＫ　ｉｎ　１９９９」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２７：　４９〜５４，１９９９年、Ｗｅｌｌｅらの「Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ−Ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｍＲＮＡｓ　ｉｎ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｅｎ」，Ｇｅｎ．Ｒｅｓ．，５：　５０６〜５１３，１９９９年、Ｙｅｒｍｏｌａｅｖａらの「Ｄａｔａ　ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｒｒａｙｓ」，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．，２０：　１９〜２３，１９９８年、Ｃｈｅｎらの「Ｒａｔｉｏ−ｂａｓｅｄ　ｄｅｃｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙ　ｉｍａｇｅｓ」，Ｊ．Ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｏｐｔｉｃｓ，２：　３６４，１９９７年、Ｓｃｈｕｌｅｒらの「Ａ　ｇｅｎｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：　５４０〜５４６，１９９６年に見出すことができる。
【００１８】
したがって、ステップ３を行った後で、同定されたタグ、その存在量、その対応する遺伝子説明に関する情報を含むデータベースが、様々なタンパク質およびヌクレオチド・データベースへのリンクと共に得られる。
【００１９】
第４のステップでは、結果が表示される。可視化ソフトウェアが、ウェブベースのユーザ・インターフェース上で、得られたデータを提示するためにテキストおよびグラフィカル・モードを提供する。これにより、ユーザは、簡単な方法で所望の情報すべてにアクセスすることができる。
【００２０】
以下、この方法について、図２から１４を参照してより詳細に説明する。
図２は、図１のステップ１に含まれる様々なサブステップを示す。
第１のステップ１１は、ＳＡＧＥ法のような方法を生物物質１０に適用するものである。
【００２１】
後続のステップ１２では、たとえば、ＡＢＩ（登録商標）ソフトウェアまたはＰｈｒｅｄ（登録商標）ソフトウェアなど、ベースコール・ソフトウェアを介して行われるベースコール（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ）法が、生配列１３を生み出すことにより、ＳＡＧＥ法で得られたタグの鎖を配列する。これら生配列は、一連の交互の塩基であり、依然として適切に同定する必要がある。引用したソフトウェアの詳しい説明について、文献「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ．  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｕｓｅｒ′ｓ    Ｍａｎｕａｌ」，ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９６年、Ｅｗｉｎｇらの「Ｂａｓｅ−Ｃａｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｔｒａｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｒｅｄ」，Ｇｅｎ．Ｒｅｓ．，８：  １７５〜１８５，  １９９８年、Ｃｏｎｎｅｌｌらの「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５：  ３４２〜２４８を参照することができる。
【００２２】
ステップ１４では、生配列１３は、第２のコンピュータ・システムに転送され、且つたとえばフォーマット化動作を介して、第２のコンピュータ・システムによって使用できるタイプの生配列１５に変換される。
【００２３】
他の手順１６は、たとえば部分列ＣＡＴＧに遭遇した際に、分割によりダイタグを各生配列１５から分離することによって動作する。一例として、ＢｓｍＦＩ、ＭｍｅＩ、ＦｏｋＩなど、ＩＩＳ型酵素に従って動作する手順を使用することができる。
【００２４】
ダイタグの分離を行った後で、本発明による方法は、不適切な、または誤った物質を除去するために、分離（抽出）されたダイタグをチェックする手順１７を行うことが有利である。具体的には、ダイタグは、以下の４つの規則に基づいて拒絶される。
【００２５】
使用する特定のベースコール・ソフトウェアに基づく規則。ＡＢＩ（登録商標）ソフトウェアは、不良品質信号を検出するたびに「Ｎ」を設ける。したがって、Ｎに遭遇するたびに、対応するダイタグが拒絶される。Ｐｈｒｅｄ（登録商標）ソフトウェアは、各塩基対の信頼レベルを推定する。したがって、ダイタグの信頼レベルが所定の閾値より低いたびに、ダイタグが拒絶される。
【００２６】
ダイタグの長さに基づく規則。ダイタグが小さすぎる、すなわち２０塩基対より小さい場合は、２つの完全なタグを含まないため拒絶される。
ダイタグの長さに基づく規則。ダイタグが大きすぎる、すなわち２４塩基対より大きい場合は、通常ＳＡＧＥ法で使用される分割ＢｓｍＦＩ酵素がそのような大きなタグを生み出さないはずであるため拒絶される。
【００２７】
あるいは、ダイタグが２回発生した場合は、過剰なＰＣＲ増幅の危険性があるため拒絶される。実際に、タグがランダムに対をなしてダイタグを形成すると仮定した場合には、同じダイタグが２回になる確率は非常に低い。
【００２８】
この選択が行われた後、手順１８で、分離され、かつ選択されたダイタグからタグを抽出する。各２０塩基対の長さのダイタグは、２つの１０塩基対の長さのタグを含み、一方はその５’端から始まり、相補的に逆コード化された他方はその３’端から始まる。なお、２０塩基対の長さのダイタグは、第１の１１塩基対の長さのタグと第２の９塩基対の長さのタグとを含むことができる。しかし、好ましい実施形態では、この状況を無視する。なぜならば、たとえばＢｓｍＦＩ酵素を採用したとき、このサイズのタグを有することは、非常にまれであるからである。
【００２９】
多形性（すなわち、同じ遺伝子についての様々な配列）の場合に関しては、考慮することができるであろう例示的な一手法は、遺伝子が既知である場合に、１つの決定された配列（したがって、１つの決定されたタグ）を選択してその遺伝子を表す手法である。遺伝子が既知でなく多形である場合は、当然ながら、実際には同じ遺伝子に関する２つの異なるタグを検出する可能性がある。
【００３０】
抽出されたタグもまたカウントされる。本発明の好ましい実施形態では、手順１９で、カウント動作中に各異なるタグについて余分の塩基対を予測しようと試みられる。この予測は、たとえばＢｓｍＦＩ酵素を使用することによってＳＡＧＥ法を採用したとき可能である。この酵素では、一般に１０塩基対を超える長さのタグが得られる。
【００３１】
予測ステップ１９は、以下のサブステップを含む。
各タグの異なる発生は、ダイタグの５’端および３’端で均等に分布すると仮定する。これは、ダイタグの中央に位置する可能な余分の塩基対が、タグに対称で割り当てられることがあることを意味する。
【００３２】
ダイタグに遭遇するたびに、その長さが少なくとも所定の塩基対数（本実施形態では２２塩基対）の場合には、１つの余分の塩基対が、その２つのタグのそれぞれに割り当てられる。上述の仮定を考慮して、余分の塩基対割り当ては簡単である。
【００３３】
タグがすべてダイタグから抽出された後で、余分の塩基対を予測するために合理的な可能性があるかどうか判断するために、それらのそれぞれを連続的に考慮する。最初に、１１番目の塩基対の統計が意味を有するように、タグを少なくとも一定の閾値と同じ量としなければならないことが強いられる。そのような基準を満たすタグの場合、最も優勢な１１番目の塩基対を選択し、そのタグのそのような最も優勢な１１番目の塩基対が、タグの発生数の少なくとも一定の割合を表さなければならないことが強いられる。そうなっている場合には、余分の塩基対を受け入れられるものとみなす。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、予測ステップ１９が、タグおよび１１番目の塩基存在量に対する固定閾値にもはや依拠しないダイタグ処理のために改善された方法を適用して行われる。その代わりに、仮説試験技法を使用して、予測される１１番目の塩基の関連性を予測する。たとえば９５％のような最低の関連性を選択し、対応する予測だけを受け入れることは可能である。
【００３５】
手順は、各塩基が同じ確率で配列されると仮定し（帰無仮説：ｎｕｌｌ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）、以下のアルゴリズムを適用してこの方法を行うことができる。
【００３６】
（アルゴリズム）
ｃ（ｔ）をタグｔに伴うカウンタとする。Ａ（ｔ）、Ｃ（ｔ）、Ｇ（ｔ）、Ｔ（ｔ）をタグｔの各可能な余分の塩基に伴うカウンタとする。ｓを配列とし、Ｒ（ｓ）を、ｓの相補的な逆をとる演算とする（ｓを逆の順序で読み取り、文字「Ａ」を「Ｔ」と、「Ｃ」を「Ｇ」と交換する）。
【００３７】
ａ）長さｋの各ダイタグｄについて、
ｄの各端部で１０塩基対をとり、２つのタグｔ１およびｔ２を得る（ｔ１＝ｄ［１．．１０］およびｔ２＝Ｒ（ｄ［ｋ−１０．．１］））。
【００３８】
カウンタｃ（ｔ１）およびｃ（ｔ２）を増分する。
ｋ≧２２の場合、各タグについて１つの余分の塩基を抽出する。ｂ１＝ｄ［１１］およびｂ２＝Ｒ（ｄ［ｋ−１１］）。
【００３９】
たとえば、ｂ１＝「Ａ」の場合、Ａ（ｔ１）を増分するなど、それぞれの塩基カウンタを増分する。ｂ２についても同じ。
ｂ）所与の閾値より大きい関連度、たとえば下表１のデータによる９５％または９９％を有する余分の塩基を選択する。
【００４０】
【表１】
2004500640.tif 000003
【００４１】
この表では、各関連度についてのタグ存在量に関する統計が、平均および中央値カウントとして与えられている。カッコ内は特有の関連度だけについての統計である。
【００４２】
ｃ）０でない少なくとも１つの余分の塩基カウンタを有する各異なるタグについて、選択された余分の塩基のそれぞれが関連している（複数の余分の塩基が関連している可能性がある）かどうか試験する。
【００４３】
ステップｃ）は、観察された頻度を等確率の仮説状況と比較して行うことができる。具体的には、
Ｄを、試験する余分の塩基のカウンタとし、Ｑを他のカウンタの合計およびＮ＝Ｄ＋Ｑとする。Ｎが４の倍数でない場合は、Ｎに１、２、または３を加算してＮを４の倍数にする。
【００４４】
Ｄ＞Ｎ／４の場合は、試験された余分の塩基を、関連すると見なすことができる。
Ｄ≦Ｎ／４の場合は、試験された余分の塩基を、関連しないと見なすことができる。
【００４５】
予測される余分の塩基ごとの関連性は、「Ｅｖｅｒｉｔｔ　ＢＳ：　Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ　ｔａｂｌｅｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：　Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ，１９７７」に開示されているように、分割表を使用し、１自由度でカイ２乗統計を適用することによって、またはＦｉｓｈｅｒ直接確率法を計算することによって計算される。カイ２乗統計は、帰無仮説からの逸脱の有意性を推定することを可能にする。
【００４６】
可能な分割表は、下表２である。
【００４７】
【表２】
2004500640.tif 000004
【００４８】
上記で開示されたアルゴリズムでは、少なくとも２２塩基の長さのダイタグだけ考慮されている。２１塩基の長さのダイタグは考慮されていない。なぜならば、ダイタグ長さの分布により２２塩基の長さのダイタグが十分にあることがわかり、かつ２１塩基の長さのダイタグは非常に多数の誤った１１番目の塩基カウントを生成するからである。したがって仮説試験の適用をより困難にするであろうため、これを下表３に示す。
【００４９】
【表３】
2004500640.tif 000005
【００５０】
この可能な余分の塩基対の一貫性のチェックは、後にこの説明の中で説明する。
これまでに述べたタグ抽出ステップは、生データの１つまたは複数の集合について繰り返し、その存在量に関する情報をも含むタグのリストをそれぞれ生成して終了することができる。図１ですでに述べたことを考慮して、本発明の好ましい実施形態は、２つのそれぞれ異なる生データの集まりを参照して、２つの異なるタグ抽出ステップを提供する。
【００５１】
後続の図３は、図１のステップ１と２との間で行うことが好ましい、配列エラーを減少させるステップを示す。
このステップの目的は、誤った情報の生成を回避するために、適切に配列されなかったタグを解消または拒絶するものである。好ましい実施形態では、このステップが２回、すなわち各ライブラリについて１回行われる。
【００５２】
実際、適切に配列されていない各タグは、誤った情報を生成する。ゴースト・タグと呼ばれる存在しないタグを生成し、あるいは、本当に存在する他のタグの発生数を増やす。最初の場合には、ゴースト・タグが同定される可能性があり、それによりユーザが誤って対応する遺伝子が存在すると考え、あるいは、同定されず、それによりユーザが誤って新しい遺伝子を発見する可能性があると想像する可能性がある。第２の場合には、本当に存在するタグの発現レベルが不適切に修正される。
【００５３】
配列エラーの影響を減少させるための第１の手法は、ベースコール用のＡＢＩ（登録商標）ソフトウェアを使用し、少なくとも１つの未同定の塩基対を有するタグ／ダイタグを単純に拒絶するものであろう。
【００５４】
同様な手法は、予測される塩基対それぞれに信頼レベルを割り当てるＰｈｒｅｄ（登録商標）または何らかのベースコール法を使用し、信頼レベルが所与の閾値を下回る少なくとも１つの塩基対を有するタグ／ダイタグを拒絶するものであろう。
【００５５】
しかし、本発明によれば、配列エラー統計モデルを定義することによって、かつ、この方法をベースコール法またはＡＢＩ（登録商標）およびＰｈｒｅｄ（登録商標）のようなソフトウェアと有利に組み合わせることによって、より良好なスループットが得られた。
【００５６】
第１の実施形態では、統計モデルの適用を、ベースコール法を使用することなく、またはその使用後に行う。第２の実施形態では、統計モデルの適用そのものをＰｈｒｅｄ（登録商標）のようなベースコール・ソフトウェアと混合する。具体的には、この後者の組み合わせは、信頼レベルを塩基対が適切でない確率に変換することによって、したがってＰｈｒｅｄ（登録商標）のようなベースコール・ソフトウェアの信頼レベルを特定の統計モデルとして扱うことによって可能となった。
【００５７】
２つの実施形態について、統計モデルを定義した後、および一例を提示した後で詳しく開示する。
統計モデルによって、
Ｆ：ＳＴ　ｘ　ＳＴ　→　［０，１］
というタイプの関数を意図し、上式でＳＴは、
【００５８】
【数２】
2004500640.tif 000006
【００５９】
で考慮されるあらゆる可能なタグの集合である。
関数Ｆは、所与のタグａ、すなわち対応するｃＤＮＡ配列をｂとして配列することができる確率をモデル化するものとする。この確率は、関数Ｆ（ａ，ｂ）によって得られる。可能な関数Ｆの簡単な一例が以下に続く。
【００６０】
（可能な関数Ｆの例）
塩基対が適切に配列されない平均確率、すなわち平均配列エラー率は、一般に約１％であるため、１０塩基対タグ（ＢｓｍＦＩ酵素）内に１つのエラーを有する確率は、以下のように推定することができる。
【００６１】
【数３】
2004500640.tif 000007
【００６２】
ここでは複数のエラーの影響は無視し、各タグについて１つのエラーが可能な場合だけ考慮する。考慮すべき可能なエラーは、次のとおりである。
塩基交換。ある塩基対がもう１つのものとして配列される（たとえば、ＧについてＡ、またはＡについてＴ、など）。
【００６３】
挿入。１つのランダムな塩基対が２つの塩基対または少なくともタグの始めに挿入される。これは、１つの塩基対がタグの端部で失われることを意味する。
抑圧。１つの塩基対が削除され、ランダムな塩基対がタグの端部に追加される。
【００６４】
すべてのタグａ∈ＳＴについて、Ｆ（ａ，ｂ）の値、∀ｂ∈ＳＴは、次のように定義する。
ｉ）ｂ＝ａ
【００６５】
【数４】
2004500640.tif 000008
【００６６】
ｉｉ）ｂ≠ａ
Ｖａ⊂ＳＴは、上記で考察した３つのタイプのエラーの１つによりａから「到達する」ことが可能なあらゆる「隣接する」タグｂ∈ＳＴの集合とする。
【００６７】
Ｎａ＝＃Ｖａ、すなわち集合Ｖａ内の要素の数とする。
次いで、Ｆ（ａ，ｂ）を以下のように定義する。
【００６８】
【数５】
2004500640.tif 000009
【００６９】
【数６】
2004500640.tif 000010
【００７０】
ＳＴについて可能な選択は、観察されたタグの集合である。
次に、各タグの実存在量を推定するために導入される上記の２つの異なる実施形態について詳しく論じる。
【００７１】
（第１の実施形態）
この実施形態によれば、好ましくは第１のステップで、まずＡＢＩ（登録商標）またはＰｈｒｅｄ（登録商標）のようなベースコール・ソフトウェアをダイタグに、またはタグに適用し、その後にだけ、後続の手順が続く。
【００７２】
【数７】
2004500640.tif 000011
は、あらゆる訂正済みタグ存在量のリスト（ベクトルとして示される）とする。平均配列エラー率を仮定した後、かつ配列エラーを表すために統計モデルを仮定した後で、ｘが実存在量の推定値であり配列エラーによって影響されないとして、Ａｘ＝ｙ、
【数８】
2004500640.tif 000012
、
【数９】
2004500640.tif 000013
のタイプの線形システムを記述し、
線形システムの解法として見出すことができる。
【００７３】
ａｉｊをＡの行列要素とし、ｉはその行インデックス、ｊはその列インデックスである。
行列Ａのラインｊは、観察されたもの（配列エラー後）へのあらゆるタグ（配列エラー前）の寄与を表す。行列Ａは、以下の手順を適用することによって満たされる。
【００７４】
各ｔａｇｉについて、１≦ｉ≦ｎ（図３の手順２１）
ａｉｉ＝Ｆ（ｔａｇｉ，ｔａｇｉ）
ａｋｉ＝Ｆ（ｔａｇｉ，ｔａｇｋ）、ｔａｇｋ∈Ｖｔａｇｉ
ｔａｇｉの場合、存在量がベクトルｙおよびｘ内に位置ｉで記憶されるタグを意図した。
【００７５】
先の例の関数Ｆを適用するとき、
【００７６】
【数１０】
2004500640.tif 000014
【００７７】
に従い、したがってＡは、まばらな、かつ対角のドミナントであることに留意されたい。これは、ＡＸ＝Ｙ（図３の手順２２）が、たとえばＢｉＣＧＳＴＡＢのようなＬａｎｃｚｏｓタイプの方法によって効率的に解決することができることを意味する。
【００７８】
システムの解決後、カウントされた存在量と、上記計算された推定存在量との間の差が所与の閾値より大きい各タグを拒絶するために、判断手順２３を行うことができよう。
【００７９】
別法として、この最後の手順は可視化インターフェースによって行うことができ、推定存在量値は、タグとそのカウントされた存在量が記憶されるファイルに単純に追加し、ユーザにこの情報をも提供することができよう。
【００８０】
（第２の実施形態）
この実施形態では、Ｐｈｒｅｄ（登録商標）によって（または信頼レベルを生み出す同様なソフトウェアによって）得られる信頼レベルを、式
信頼レベル＝−１０ｌｏｇ１０（確率）
で、塩基対が適切でない確率に変換する。
【００８１】
その後、異なる関数Ｆを定義して、実データに最適にフィットさせるために、このようにして得られた確率を、統計モデル定義で直接使用することができる。そのような統計モデルを適用する前に、上述のベースコール・ソフトウェアを有利に適用することができる。
【００８２】
生配列が通常のように切り落とされず、その代わりにＳＡＧＥ特有の品質チェック手順が適用される一実施形態では、通常の１％平均配列エラー率が適切かどうか、明確でない可能性がある。
【００８３】
この問題を解決するために、次に、有利な手順について述べる。これにより、塩基対が適切でない平均確率を、計算することができる。
所与の細胞タイプで発現された遺伝子の数に関して、長さｍ＜ｎのタグから得られる情報が少なくならないようにするために、ｎが十分大きい長さｎのタグを生成する酵素を、使用すると仮定する。これは、第１のｍ塩基対が得られたら直ちに、より長いタグ内で使用可能なｎ−ｍの余分の塩基対が、異なるｍＲＮＡ配列を同定するのに役立たないと仮定することを意味する。
【００８４】
また、配列エラー・モデルとして、平均配列エラー率ｑがあり、かつ、各塩基対が同じ確率で誤りとなると仮定する。さらに、誤って配列されたタグが他の配列されたタグと等しくなる確率を、無視できるものと仮定する。
【００８５】
Ｎを、配列されるタグの総数とし、ｋｎ、ｋｍを、ｎおよびｍ塩基対のタグを連続的に考慮することによる異なる検出済みタグの数とする。
ｄを、異なるタグの適切な数と定義することにより、次のシステムが得られる。
【００８６】
【数１１】
2004500640.tif 000015
【００８７】
このシステムは、Ｇｒｏｂｎｅｒ基底と、ｄだけでなくｑも得られる解法とを使用することによって容易に解決され、配列エラー率の推定値が得られる。この方法は、ｎ＝１９（ＭｍｅＩ酵素）およびｍ＝１４、１５、１６、１７について発明者が適用に成功した。得られた近似値は、０．００３＜ｑ＜０．００６（したがって０．３％と０．６％との間）であり、ｑの正確な値は、ライブラリに応じて決まる。
【００８８】
配列エラーを減少させるステップでは、これまでに述べた好ましい実施形態において、２つの別個のリストが生み出される。図３の数字２４で示すこれらのリストの一方は、その推定存在量と共に観察されたタグを含み、数字２５で示す他方は、各タグについて隣接リストを含む。
【００８９】
生物物質を「過剰配列」する問題を回避するために、本発明による方法を使用して、いくつのタグが配列されたかに対していくつの異なるタグが検出されたかを監視することができる。この点について、図４Ａは、デカルト座標系でプロットされたそのような曲線の一例を示し、上例でｘ軸上には配列されたタグの数、ｙ軸上には検出されたタグの数が各ライブラリについて示されている。この曲線によれば、オペレータは、配列をいつ停止するか判断するための客観的情報を得られる。
【００９０】
可能な興味深い適用例は、配列エラーの寄与が無視できるようになったと仮定し、所与の細胞タイプ内で発現される遺伝子の数を推定することである。各配列されるタグにランダムな「日付」を割り当てることにより、タグがランダムな順序で配列されるため、曲線を、一種の年表を維持することによって計算することができる。
【００９１】
図４Ｂは、ｘ軸上には配列されたタグの数、ｙ軸上には信頼性率が示される曲線、すなわち、配列されたタグと検出されたタグの間の比を示す。
タグ数曲線の場合のように、実数またはランダムで年表が得られ、したがって各「日付」について１対のライブラリが得られ、それぞれが一定数の異なるタグをその存在量と共に含む。
【００９２】
したがって、「日付」ごとに、いくつかの信頼レベルについてＣｌａｖｅｒｉｅらの提示された方法を適用し、信頼性比率の数を推定することができる。結果を曲線としてプロットし、プロジェクトの進捗を監視するのに効率的な方法（タグ数曲線より多い情報）を得ることができる。そのような方法の適用について、本説明の他の段階で論じる。
【００９３】
図５Ａおよび５Ｂは、図１のステップ２を詳細に示す。
図５Ａでは、タグの２つのリスト、すなわち、どちらも配列エラーを減少させる前ステップによって生成されたマイナス・ライブラリ２４−とプラス・ライブラリ２４＋とが、２つの細胞タイプについて存在量情報をも含む新しいリストを生成するソフトウェア手順３２によって合併される。
【００９４】
各タグの発生数はまた、各ライブラリが異なる数の配列タグを含むため、正規化される。この演算は、ソフトウェア手順３３によって行われ、たとえば第２のライブラリ内のタグの存在量に、係数を単純に加えることによって行うことができる。この係数は、第１のライブラリについて配列されたタグの総数を、第２のライブラリについて配列されたタグの総数で割ることによって得られる。
【００９５】
他の正規化モードは、ハウスキーピング遺伝子を使用するものとすることができよう。
次に、手順３４で、以下の規則を適用することにより、先に行われた１１番目の塩基対予測の一貫性について、各タグをチェックする。
【００９６】
タグが一方のライブラリ内にだけ存在する場合には、１１番目の塩基対予測が保存される。
タグが両方のライブラリ内に存在し、１１番目の塩基対予測が符合する場合、それが保存される。
【００９７】
タグが両方のライブラリ内に存在し、１１番目の塩基対予測が符合しない場合、各ライブラリ内のタグの存在量が考慮される。具体的には、そのタグが、第１のライブラリ内で所与の閾値より多くカウントされ、第２のライブラリ内で他の閾値より少なくカウントされた場合、第１のライブラリに由来するタグについてだけ１１番目の塩基対予測を保存する。
【００９８】
他の状況では、１１番目の塩基対予測が拒絶される。
このチェック演算の後、手順３５で、２つの細胞タイプの間で観察された差の有意性について統計を計算する。たとえば、タグＴａが、第１のライブラリ内で１に等しい存在量と第２のライブラリ内で２に等しい存在量とを有し、タグＴｂが、第１のライブラリ内で１００に等しい存在量と第２のライブラリ内で２００に等しい存在量とを有する場合、第２のタグＴｂは、第１のタグＴａよりも、差の有意性が大きいことが容易に理解される。
【００９９】
観察された差が適切である確率を推定するために、手順３５で、Ｃｌａｖｅｒｉｅらの「Ｔｈｅ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ」，Ｇｅｎ．Ｒｅｓ．，７：９８６〜９９５，１９９７年に述べられている改善された方法を適用する。これらの統計結果は、図の番号３６によって示すように、タグとその存在量のリストと共に新しいファイル内に記憶される。
【０１００】
Ｃｌａｖｅｒｉｅらのものと同様な統計を使用することにより、図４Ｂに示すように、新しい１組の曲線を計算する。これらの曲線は、配列されたタグの総数に対して、少なくとも一定の信頼レベルを有するタグの数を提供し、したがって、シーケンサの使用のよりよい計画を可能にする。
【０１０１】
次に図５Ｂを参照すると、後で述べるように、後続の可視化インターフェースによって使用される新しい共通隣接リスト４０を形成するために、それぞれのマイナス・リスト２５−およびプラス・リスト２５＋（図３をも参照）に由来する隣接情報もまた、ステップ３９で合併される。
【０１０２】
図６は、図１のタグ同定ステップ３を詳しく示す。
タグ同定ステップは、ヌクレオチド配列データベース（たとえば、ｍＲＮＡエントリだけ参照するＥＭＢＬ、ＥＧＡＤまたはＵｎｉｇｅｎｅ）の各エントリから、ＳＡＧＥタグを抽出することによって、かつ、データベースから抽出されたタグを、同定するためのタグと比較することによって行われる。
【０１０３】
いくつかは、この手順が行われる有利なモードである。
最初に、遺伝子で表すことにより、すなわち、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースを使用して、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリで表すことにより、タグの同定を提供することを試みる。これは、最初にタグをこの種のエントリと比較するために、新しいデータベースを構築することによって行われ、新しいデータベースは、少なくとも１つのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリによって指し示されるＥＭＢＬエントリをすべて含む。このようにして、ＥＭＢＬからＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴへの最大数のリンクを得る。
【０１０４】
他の有利な実施形態は、各同定にスコアを割り当てることにある。このスコア割当て手順は、データベースの種類に依存しないで、データベース内に含まれる冗長な情報および／または部分的な情報を削減するために役立つ。たとえば、そのようなデータベースにとって、いくつかのエントリが同じ遺伝子に関係し、部分的な配列、および発現された物質もゲノム物質も提供することは非常に一般的である。同定を軽視しない他の理由は、ＳＡＧＥタグが、ポリＡ（ｐｌｏｙ−Ａ）の前に最後のＮＩａＩＩＩ制限サイト（ＧＡＴＧ）部で始まることである。データベース内では、所与の配列が、ポリＡまで進むかどうか明確でない。これは、データベースが、「完全コード化配列」または「．．．部のポリＡ」のような情報を含まない場合、データベース・エントリが実ＳＡＧＥタグと同じでない危険性があることを意味する。
【０１０５】
スコア割当て手順は、使用される特定のデータベースに応じて決まる。
図６は、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベース（ステップ４２）とＥＭＢＬデータベース（ステップ４１）とを使用することにより、リスト３６内に存在するタグを同定するために使用される手順を示す（図５をも参照）。
【０１０６】
Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースを参照して、新しいデータベースを構築するためにタグが抽出される（３’端および５’端の両方）。次いで、ＳＡＧＥタグがこの新しいデータベースと比べられ、発生を検索する。新しいデータベースの典型的なエントリは、以下のようになっている。
ＵＧ          Ｈｓ＃Ｓ４３８４，  ２５３２
ＤＥ          アルコール・デヒドロゲナーゼ２（クラスＩ）、ベータ・ポリペプチド
ＧＥＮＥ      ＡＤＨ２
ＴＡＧ        ＣＡＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＴ，  ＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡ
ＳＰＴＲ      Ｐ００３２５，ＡＤＨＢ＿ＨＵＭＡＮ
ＤＥ          アルコール・デヒドロゲナーゼ・ベータ鎖（ＥＣ  １．１．１．１）
ＧＮ          ＡＤＨ２
ＫＷ          オキシドリダグターゼ；亜鉛；ＮＡＤ；多重遺伝子族；アセチル化；多形性；３次元構造
ＳＵＢＬＯＣ  細胞質
ＰＲＯＳＩＴ  ＰＲＯＳＩＴＥ；ＰＳ０００５９；ＡＤＨ＿ＺＩＮＣ；１．＼
ＰＦＡＭ      ＰＦＡＭ；ＰＦ００１０７；ａｄｈ＿ｚｉｎｃ；１．＼
スコアは、各同定に割り当てられ、以下の規則に従って計算される。
【０１０７】
スコアには、初期値０を与える。
Ｕｎｉｇｅｎｅ配列の長さが所与の閾値より長い場合は、値に１を加算する。この長さは、エントリのＵＧ行上で第２項目である（上記の例では２５３２）。この基準を使用して、Ｕｎｉｇｅｎｅ配列が実ＳＡＧＥタグを含むように確率を測定する。
【０１０８】
タグの１１番目の予測される塩基対が使用可能であり、Ｕｎｉｇｅｎｅエントリ・タグと整合する場合は、値に１を加算する。
Ｕｎｉｇｅｎｅの説明（ＤＥ行）に「ｃｃｄｓ」という語が含まれ、これで完全なコード化配列を示す場合は、値に１を加算する（これは上記の例の場合ではない）。
【０１０９】
タグが３’端Ｕｎｉｇｅｎｅタグと整合し、Ｕｎｉｇｅｎｅの説明に「３’」が含まれる場合、または、タグが５’端Ｕｎｉｇｅｎｅタグと整合し、Ｕｎｉｇｅｎｅの説明に「５’」が含まれる場合は、値に１を加算する。
【０１１０】
Ｕｎｉｇｅｎｅ配列の長さが所与の閾値より小さい場合は、値から１を減算する。
Ｕｎｉｇｅｎｅの説明に「ｐｃｄｓ」という語が含まれ、部分的なコード化配列を示す場合は、値から１を減算する（これは上記の例の場合ではない）。
【０１１１】
タグが３’端Ｕｎｉｇｅｎｅタグと整合し、Ｕｎｉｇｅｎｅの説明に「５’」が含まれる場合、または、タグが５’端Ｕｎｉｇｅｎｅタグと整合し、Ｕｎｉｇｅｎｅの説明に「３’」が含まれる場合は、値から１を減算する。
【０１１２】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴの説明が使用できる場合、「断片」という語が含まれる場合は、値から１を減算する。
市販のデータベースＥＧＡＤは、同様に使用することができよう。
【０１１３】
次に、ＥＭＢＬおよびＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースを参照して、Ｕｎｉｇｅｎｅについては、ＳＡＧＥの新しいデータベースを構築し、ＳＡＧＥタグを整合するために使用する。また、この場合には、以下の規則に従って同定スコアを計算する。
【０１１４】
スコアには、初期値０を与える。
ＥＭＢＬ配列の長さが所与の閾値より長い場合は、値に１を加算する。
タグの１１番目の予測される塩基対が使用可能であり、ＥＭＢＬエントリ・タグと整合する場合は、値に１を加算する。
【０１１５】
ＥＭＢＬの説明（ＤＥ行）に「ｃｃｄｓ」という語が含まれる場合は、値に１を加算する。
ＥＭＢＬエントリの特徴に、配列がポリＡに進むことの表示が含まれる場合は、値に１を加算する。
【０１１６】
ＥＭＢＬ配列の長さが所与の閾値より小さい場合は、値から１を減算する。
ＥＭＢＬの説明に「ｐｃｄｓ」という語が含まれる場合は、値から１を減算する。
【０１１７】
タグの１１番目の予測される塩基対が使用可能であるが、ＥＭＢＬエントリ・タグと整合しない場合は、値から１を減算する。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴの説明が使用できる場合、「断片」という語が含まれる場合は、値から１を減算する。
【０１１８】
それぞれの場合で、同定スコアが−４から＋４に及ぶことを確かめるのは容易である。
後続の手順４３で、先の同定ステップの結果を単一の新しいファイルに合併し、手順４４で、そのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号およびＫＥＧＧデータベースを使用することにより、同定されたタグ、またはその対応する遺伝子が生物学的経路のメンバであるかどうか調べる。この新しい情報もまたファイルに追加される。
【０１１９】
これまでに述べた同定手順は、ＥＳＴデータベース内に記憶された情報を使用せず、ＥＭＢＬのゲノム（ＤＮＡ）物質も使用しない。発明者は、ＥＳＴデータベース（たとえば、ｄｂＥＳＴ）内でタグを探す手法を試験して肯定的な結果を得て、発見された各ＥＳＴについて、タンパク質データベース（たとえば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に対してＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌらの「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：  ４０３〜４１０，１９９０年参照）またはＦａｓｔａ（Ｐｅａｒｓｏｎの「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：  ２４４４〜２４４８，１９８８年参照）を適用する。この場合、小さいタグ（１４または１５塩基対、タグに含まれる初期ＧＡＴＧ）を処理するとき、偽の肯定が生成される不都合を回避するために、１９塩基対タグを生み出すＭｍｅＩ制限酵素を使用することが有利であった。
【０１２０】
タグ同定ステップが完了した後で、オペレータは、テキスト・ウェブ・インターフェースもグラフィック・ウェブ・インターフェースも含むユーザ・インターフェースによって情報のすべてにアクセスすることができる。
【０１２１】
テキスト・ウェブ・インターフェースは、タグ同定の後で生み出される情報にアクセスを可能にするように設計され、次の図７〜１２に詳しく示す。
図７は、いくつかのパラメータを設定し、次いで考慮しようと思うデータのサブセットを選択するために、ユーザが埋めることのできる第１の入力フォームを示す。これまでに述べた本発明の様々なステップのため、ユーザは豊富なパラメータを選択することができる。
【０１２２】
この選択の結果は、後続の図８〜１２で示すいくつかの異なるウェブ・ページを介していくつかの異なるモードで表示することができる。
図８は、各タグについて、情報が４つのフィールドを用いて単一行内に要約されるウェブ・ページを示す。これらのフィールドは、以下を表す。
【０１２３】
タグ番号。この番号はタグごとに固有である。項目は、タグに関する情報の全セット（タグ・フル・ストーリー）にユーザを導くハイパーリンク（下線）である。番号の後に続くアスタリスクは、配列エラーに関連してタグが安全か否かを示す。
【０１２４】
率。これは、正規化後、マイナスおよびプラス・ライブラリ内の各タグの存在量を考慮することによって計算される。ｎをマイナス・タイプ内の存在量とし、ｍをプラス・タイプ内の存在量とすると、
率＝ｍ／ｎ    ｍ＞ｎの場合
率＝−ｎ／ｍ    それ以外
信頼度統計（この説明の中で前述）
異なるデータベースへのハイパーリンク（下線項目）によって補われる短い説明（データベースへの識別およびリンク）
である。
【０１２５】
図９は、各タグについて情報がより詳しいウェブ・ページを示す。具体的には、各ライブラリ内のタグの存在量が示され（数字６０および６１参照）、同じタグについて複数の同定が表示されている。これらの同定は、同定スコア６２（より高い方からより低い方）に対して分類され、起点のデータベースを示すラベル６３でマークされる。
【０１２６】
「全」と標示されたハイパーリンクは、ユーザを再度タグ・フル・ストーリーに導き、一方、「表示」と標示されたボタンは、グラフィック・ディスプレイに対応する。
【０１２７】
図１０は、説明のない標準モードを示し、タグの説明をなくして、同定について可能な第２の列の空間を設けている。
図１１は、タグの全ストーリーを示し、選択されたタグに関してあらゆる可能な情報が表示される。これは、その同定のあらゆる詳細７０、隣接情報７１、存在量７２、他のライブラリ内の存在量７３を含む。あらゆる存在量が現行の比較に対して正規化され、それにより各データを容易に比較することができる。
【０１２８】
図１２は、ユーザが現行の比較に関して統計情報にアクセスすることができるページを示す。このページはまた、すでに述べた図４Ａおよび４Ｂのプロットへのハイパーリンクを含む。
【０１２９】
図１３および１４は、グラフィック・ウェブ・インターフェースを示す。タグの同定は、タグを一義的な形で識別する番号を各同定されたタグに割り当てることを含む。
【０１３０】
この番号から始めて、各タグについて画面上の位置が計算され、それにより、各タグが、使用されているデータベースに依存しないで、グラフィック・インターフェース上で異なる画素によって表される。この特有の手法は、１９９９年にＬａｒｓｏｎによって開発された「バーチャル・チップ」概念を改善する。
【０１３１】
以下、人の細胞タイプのための方法について述べる。
人は、約１００，０００個の遺伝子を有する。方形のグラフィック・ディスプレイ上でタグを表示するために、方形である数、たとえば３２０×３２０に相当する１０２，４００が選択される。これに対してさらに、以下のように０と１０２，３９９との間の番号がタグに割り当てられる。
【０１３２】
始めに、０から１０２，３９９のあらゆる番号が使用可能に設定される。
新しいタグが検出されるたびに、使用可能な番号が残りの使用可能な番号のうちからランダムに選択される。
【０１３３】
グラフィック・インターフェースは、データを全体的に閲覧することを可能にすることが意図されている。図１３および１４に示す２つの動作モードを有する。
【０１３４】
図１３は、主モードを示す。
このモードで、タグに関連付けられたポイントは、固有のタグ番号に応じて決まる。３２０×３２０マトリクス内でのこの点の座標は、
タグ番号を３２０で整数除算した結果に等しいライン（ｙ座標）と、
上記整数除算の余りに等しい列（ｘ座標）とによって得られる。
【０１３５】
ポイントの色もまた選択され、発現率に応じて決まる。カーソルがポイントの上を通過したとき、このモードでは、率の数値、同定されたタグの遺伝子名、タグ番号のような他の情報も提供する。
【０１３６】
ユーザは、ポイントをクリックすることにより、選択されたタグをテキスト・ディスプレイの上部に置く。このときから、タグに関する完全な情報にアクセス可能である。
【０１３７】
図１４は、データを表す他のモードを示す。同定されたタグだけが、指定のプロパティに従って、たとえばＫＥＧＧ経路に対して多分グループ化されて示される。
【０１３８】
図１５〜１８は、ＣＩＩＴＡと呼ばれる本発明による方法の一例を示し、欠如した遺伝子のプロモーターが回復している。この遺伝子は、免疫遺伝子ＨＬＡを制御する。
【０１３９】
ちなみに、すでに論じた図１２は、ライブラリ・サイズ、リンカー・コンタミネーション、同定されたタグ、信頼性比率、信頼度値を指し示してこの実験の統計を示す。マイナス細胞はプロモーターを伴わない細胞であり、一方、プラス細胞は、回復されたプロモーターを有する細胞であり、ＨＬＡ細胞がプラス細胞内で発現している。
【０１４０】
図１５は、この例について、図４Ａを参照してすでに論じたタイプのグラフを示す。
図１６は、この例について、図４Ｂを参照してすでに論じたタイプのグラフを示す。
【０１４１】
図１７は、この例について、偽警告に関するグラフを示す。
図１８は、この例について最も調節された遺伝子のリストからの抽出を示す。  付録１〜８（Ａｎｎｅｘ１〜８）を本説明に添付し、本発明による方法を実施するための例示的なプログラム・コードに関連する。
【０１４２】
付録１〜３（Ａｎｎｅｘ１〜３）は、ダイタグおよびタグ処理に関連し、手続きＳａｇｅｐｒｏｃｅｓｓＥｘｔ．ｐｌ、Ｕｂｇｅｎｅ６．ｃ、ＳａｇｅｃｏｍｐａｒｅＥｘｔ．ｐｌをそれぞれ含む。
【０１４３】
付録４〜６（Ａｎｎｅｘ４〜６）は、ＥＭＢＬの場合に関連して特別なデータベース構造に関連し、少なくとも１つのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリによって参照されるエントリを受け取る手続きＭａｋｅＤＢｌｎｄｅｘ．ｐｌ（付録４）、手続きＥｘｔｒａｃｔＤａｔａ．ｐｌ（付録５）、特別なライブラリを使用してタグを同定する手続きＩｄｅｎｔｉｆｙＲｎａ．ｐｌ（付録６）を含む。
【０１４４】
付録７〜８（Ａｎｎｅｘ７〜８）は、インターフェースに関連し、選択基準に従ってデータを表示するｈｔｍｌページを作成する手続きＤｉｓｐｌｉｓｔ．ｐｌと、グラフィック・インターフェース・アプレットを表すＳａｇｅＣｈｉｐ．ｊａｖａを含む。
【０１４５】
本発明について、これまでに好ましい実施形態を参照しながら開示した。しかし、本説明を読んだとき、当業者には他の実施形態が明らかとなろう。
たとえば、異なる数の塩基対を有するタグを、これまで述べたものに容易に変更して処理することができよう。
【０１４６】
本発明の範囲から逸脱することなく、タグ・データへの、およびＫＥＧＧ経路へのアクセス性を改善するために、他の特徴をグラフィック・ウェブ・インターフェースに追加することができることも理解されたい。
【０１４７】
【表４】
2004500640.tif 000016
【０１４８】
2004500640.tif 000017
【０１４９】
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【０１５０】
2004500640.tif 000019
【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
【表５】
2004500640.tif 000022
【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
【表８】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
【表９】
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【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０５】
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【０２０６】
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【０２０７】
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【０２０８】
【表１０】
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【０２０９】
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【０２１０】
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【０２１１】
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【０２１２】
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【０２１３】
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【０２１４】
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【０２１５】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
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【０２２０】
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【０２２１】
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【０２２２】
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【０２２３】
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【０２２４】
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【０２２５】
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【０２２６】
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【０２２７】
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【０２２８】
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【０２２９】
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【０２３０】
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【０２３１】
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【０２３２】
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【０２３３】
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【０２３４】
【表１１】
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【０２３５】
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【０２３６】
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【０２３７】
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【０２３８】
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【０２３９】
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【０２４０】
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【０２４１】
2004500640.tif 000110
【０２４２】
2004500640.tif 000111
【０２４３】
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【０２４４】
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【０２４５】
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【０２４６】
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【０２４７】
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【０２４８】
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【０２４９】
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【０２５０】
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【０２５１】
2004500640.tif 000120
【０２５２】
2004500640.tif 000121
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による方法の一般的な概要を表すフローチャートである。
【図２】
生物物質からタグを抽出するステップを表すフローチャートである。
【図３】
配列エラーを減少させるステップを表すフローチャートである。
【図４】
図４Ａおよび図４Ｂは、検出されたタグの数を示すグラフである。
【図５】
タグの２つの集合を比較するステップを表すフローチャートである。
【図６】
タグを同定するステップを表すフローチャートである。
【図７】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図８】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図９】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図１０】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図１１】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図１２】
同定されたデータの可視化ディスプレイ図である。
【図１３】
データの全体的ビューおよび／または特定のビューを提供するための異なる動作モードの図である。
【図１４】
データの全体的ビューおよび／または特定のビューを提供するための異なる動作モードの図である。
【図１５】
本発明にしたがって処理された特有の例に関する結果の図である。
【図１６】
本発明にしたがって処理された特有の例に関する結果の図である。
【図１７】
本発明にしたがって処理された特有の例に関する結果の図である。
【図１８】
本発明にしたがって処理された特有の例に関する結果の図である。
【図１】
2004500640.tif 000123
【図２】
2004500640.tif 000124
【図３】
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【図４】
2004500640.tif 000126
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004500640.tif 000130
【図８】
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【図９】
2004500640.tif 000132
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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