(57)【要約】本発明は、高アフィニティー中和ＭＡｂ由来のキメラ、ヒト化および他のＲＡＮＫ−Ｌ ＭＡｂ、それらを含む医薬組成物、治療および診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体１９Ｈ２２の識別特性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体１９Ｈ２２である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体１９Ｈ２２の免疫グロブリン相補性決定領域を含む抗体。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
【請求項６】
配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
【請求項７】
配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現ベクターが適合宿主細胞中に存在する場合、抗体を産生することのできる、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、該発現ベクターを含む組換え宿主細胞とから成る発現系。
【請求項１０】
配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培地から該抗体を回収する工程を含む方法。
【請求項１１】
発現ベクターが適合宿主細胞中に存在する場合、抗体を産生することのできる配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、該発現ベクターを含む組換え宿主細胞とから成る発現系。
【請求項１２】
配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培地から該抗体を回収する工程を含む方法。
【請求項１３】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症（ＯＡ）を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患を治療または予防する方法であって、該治療または予防を必要とする患者に、有効量の請求項１、２、３、５または６記載の抗体またはポリペプチドを投与することによる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、ＲＡＮＫリガンドにより介在される症状の治療および診断に有用な抗体に、さらに詳細には、ＭＡｂ、改変、Ｆａｂ、キメラおよびヒト化抗体に関する。
【０００２】
（従来技術）
ＲＡＮＫ−Ｌは腫瘍壊死スーパーファミリーの一の構成員である。
ヒトＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）は、免疫系、骨の発育およびホメオスタシスの重要な調節物質であることが知られている腫瘍壊死因子ファミリーの蛋白の一の構成員である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５−１７９、１９９７）。このリガンドはまた、腫瘍壊死因子関連の活性化誘発のサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８６：２０７５、１９９７）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５、１９９８）および破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）（Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９５：３５９７、１９９８）と称される。腫瘍壊死因子ファミリーの構成員は、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化などの多様な、時に正反対の生物学的応答を媒介する。今日まで記載されているＴＮＦファミリーのリガンドのさらなる構成員として、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−アルファ、ＬＴ−ベータ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＴＷＥＡＫが挙げられる（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．：６５ ７１５、１９９９およびＫｗｏｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１：３４０、１９９９を参照のこと）。これらの他のリガンドのうち、ＲＡＮＫＬは、ＣＤ４０Ｌと最大の相同性を共有する（細胞外領域にて約２８％の同一性を有する）。
【０００３】
ＴＮＦリガンドファミリーの他の構成員と同様に、ＲＡＮＫ−Ｌは、ショート細胞質テイルと、ＲＡＮＫ−Ｌ受容体、すなわちＲＡＮＫのための結合部位を含む、細胞外ＴＮＦ核ドメインとを有するＩＩ型膜蛋白として発現される。その受容体結合ドメインは蛋白分解的に切断され、一定の距離にある受容体の機能を刺激することが可能な、可溶性ＲＡＮＫＬを放出することができる。この切断はメタロプロテアーゼの阻害剤により遮断され、精製されたＴＮＦアルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）が切断を誘発することができる。このことはこのプロセシングがＴＡＣＥにより、あるいは類似する酵素により媒介されることを示唆する（Ｌｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４：１３６１３、１９９９）。ＲＡＮＫ−Ｌは活性化されたＴ−細胞、活性化された骨芽細胞および骨髄間質細胞上で発現され、免疫系生態学と骨生態学とを関連付ける。生化学的な証拠はＲＡＮＫ−Ｌがグリコシル化されていることを示している。細胞質テイルはＳＨ３ドメイン含有蛋白のためのドッキング部位として働きうるモチーフを有し、したがって受容体との結合の際に逆シグナル化を媒介する可能性がある。
【０００４】
ＲＡＮＫ−Ｌの受容体
ＲＡＮＫ−Ｌについての２つの受容体、ＲＡＮＫおよびＯＰＧが同定された。ＲＡＮＫはＣＤ４０と最も関連しているＴＮＦ受容体ファミリーの構成員である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５、１９９７）。ＲＡＮＫは、１８４個のアミノ酸の細胞外ドメイン、貫膜ドメインおよび３８３個のアミノ酸のラージ細胞質ドメインを有する６１６個のアミノ酸のＩ型膜受容体である。ｍＲＮＡとして広範囲にわたって発現するが、ＲＡＮＫ蛋白の細胞表面での発現は脾臓、リンパ節および骨髄由来の樹状細胞および破骨細胞先祖細胞に限定されるようである（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８６：２０７５、１９９７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５、１９９７；ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５、１９９８）。ＴＮＦ受容体ファミリーの多くの構成員と同様に、ＲＡＮＫの細胞質ドメインはＴＮＦ−受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られているアダプター分子との相互作用を介してシグナル変換を媒介していると考えられる。ＴＲＡＦは、順次、ＮＦ−ｋＢおよびミトゲン−誘発の蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ）、例えば、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端蛋白キナーゼ（ＪＮＫ）および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）などのいくつかの異なる経路を活性化する。これらの異なるシグナル変換経路は、多方面にわたり、細胞生存シグナル、アポトーシス、分化、サイトカイン分泌および／または細胞活性化を媒介している。したがって、ＲＡＮＫ−ＬとＲＡＮＫの相互作用は、免疫機能および骨ホメオスタシスの制御において一の重要な役割を果たしている可能性がある。生化学的および遺伝学な遺伝子ノックアウトの研究により、ＴＲＡＦ−６ならびにＴＲＡＦ−２およびＴＲＡＦ−５もまた、ＲＡＮＫの細胞質領域と結合するこのファミリーの主たる構成員であることがわかる。
【０００５】
第２の同定されたＲＡＮＫ−Ｌ受容体がオステロプロテゲリン（ＯＰＧ）であり、それは貫膜領域を欠き、ＲＡＮＫ−Ｌとその同族細胞表面受容体ＲＡＮＫの間のシグナル化を遮断するように作用する可溶性デコイ受容体ＲＡＮＫとして機能するようである。ＯＰＧは骨吸収の強力な阻害剤であることが知られており、インビトロおよびインビボにてＲＡＮＫ−Ｌ介在破骨細胞形成を阻害することができる（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５、１９９８；Ｙａｓｕｄａら、ＰＮＡＳ ９５：３５９７、１９９８；Ｔｏｍｏｙａｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２４５：３８２、１９９８；ＴｓｕｄａおよびＨｉｇａｓｈｉｏ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ５６：１４３５、１９９８）。ＯＰＧはまたＴＮＦリガンドのＴＲＡＩＬと結合する（Ｅｍｅｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：１４３６３、１９９８）。
【０００６】
樹状細胞生態学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割
成熟骨髄樹状細胞および脾臓樹状細胞はその細胞表面上で高レベルのＲＡＮＫを発現し、このことはＲＡＮＫ−Ｌが樹状細胞生態学の制御において中心的な役割を果たしていることを示唆する（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：２０７５、１９９７）。ＲＡＮＫ−Ｌの一の主たる作用は、おそらく、十分に研究されているアポトーシスのサプレッサーである、Ｂｃｌ−ｘＬをアップレギュレートさせて、成熟樹状細胞の生存率を向上させることである（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：２０７５、１９９７）。ＤＣ生存率の向上は、抗原／ＭＨＣ複合体および共同刺激性細胞、例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２の刺激表示を伸ばすことにより、順次、Ｔ細胞増殖応答の強化をもたらすことができる（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：２０７５、１９９７）。ＲＡＮＫ−Ｌによる樹状細胞の刺激はまた、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１およびＩＬ−６などの数種のサイトカイン遺伝子の転写を誘発することも知られている（Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ． ６５：７１５、１９９９）。これらのサイトカインは免疫応答の強度および型を制御する。ＣＤ４０Ｌのノックアウト実験において、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ経路が残りのウイルス耐性を媒介する（Ｂａｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８９：１０１７−１０２０）。また、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫのノックアウトマウスはリンパ節器官形成の機能を欠いており、ＢおよびＴ細胞の初期発生にていくつかの欠損を示す（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：３１５、１９９９；Ｄｏｕｇａｌｌら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：２４１２、１９９９；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９７：１５６６、２０００）。このように、ＲＡＮＫ−Ｌは、免疫系の発生において、および免疫応答の特性および強度の制御において一の役割を果たしているようである。
【０００７】
骨生態学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割
ＲＡＮＫ−Ｌは破骨細胞の発生および活性化のための重要な分化因子であり、それ自体が骨ホメオスタシスおよびカルシウム代謝を維持するのに主たる役割を果たしている。ＲＡＮＫ−Ｌは骨吸収性破骨細胞の脊髄前駆体からの分化を刺激することができる（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ ９３：１６５、１９９８；Ｙａｓｕｄａら、ＰＮＡＳ ９５：３５９７、１９９８）。このように、ＲＡＮＫ−ＬおよびＲＡＮＫのノックアウトマウスは、破骨細胞の分化機能を完全に欠くため、重度の骨石化症を有すると特徴付けられた（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７：３１５、１９９９；Ｄｏｕｇａｌｌら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３：２４１２、１９９９；Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９７：１５６６、２０００）。さらには、トランスジェニックマウスにおけるＲＡＮＫ−Ｌデコイ受容体ＯＰＧの組織的過剰発現も、可溶性ＲＡＮＫドメイン外蛋白の組織的投与（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８８：９９７、１９９８）と同様に、骨石化症を発症することが判明した（Ｓｉｍｏｎｅｔら、Ｃｅｌｌ ８９：３０９、１９９７）。ＲＡＮＫ−Ｌはまた破骨細胞を刺激し、成熟破骨細胞の運動性、拡張および生存率の増加をもたらす。この刺激は、破骨細胞の活性化により、順次、より効果的な骨吸収をもたらす。かくして、骨ホメオスタシスは、少なくともいくらかはＲＡＮＫ−ＬとＯＰＧの発現の均衡に依存しているようである。したがって、骨の疾患は、ＲＡＮＫ−Ｌの作用を亢進または減衰させることにより治療することができる。例えば、Ｔ細胞を活性化することでＲＡＮＫＬの発現がアップレギュレートされ（Ｊｏｓｉｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：２５６２−２５６８、１９９９；Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ４０２：３０４−３０９、１９９９）、ポリクローナル活性化されたｃｔｌａ４ノックアウトマウスから由来のＴ細胞はｒａｇノックアウトマウスへの養子免疫伝達により骨喪失を誘発するが、それはＯＰＧを投与することで阻害される（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ４０２：３０４−３０９、１９９９）。また、ラットにおけるアジュバント誘発の関節炎において、ＯＰＧ蛋白の投与は、炎症性反応に影響を及ぼすことなく、骨および軟骨喪失を阻害する（Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ４０２：３０４−３０９、１９９９）。
【０００８】
要約すれば、ＲＡＮＫとＲＡＮＫ−Ｌのライゲーションは、骨髄における破骨細胞の分化、または骨吸収の亢進および免疫応答の強化に至る、リンパ器官における樹状細胞の生存およびサイトカインの産生をもたらす。したがって、ＲＡＮＫ−Ｌは免疫系障害および骨ホメオスタシスの疾患の新規な療法を開発するための望ましい標的である。
中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体はヒトにおける病理学的な骨喪失および関連する徴候を緩和するのに有用でありうる。中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体はまたヒトにおける炎症および自己免疫疾患および関連する徴候を緩和するのに有用である可能性がある。かくして、当該分野において、ＲＡＮＫ−Ｌ介在の破骨細胞の分化および活性化ならびにそのような骨疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体を創製することについて一の要求がある。さらに、当該分野において、ＲＡＮＫ−Ｌの介在する免疫応答の強化ならびにそのような免疫系の疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体などの高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌアンタゴニストを創製することについて一の要求がある。アンタゴニストであるＲＡＮＫＬモノクローナル抗体は、ＴＲＡＩＬなどの他のＴＮＦ関連のリガンドと相互作用する可能性のあるＯＰＧ蛋白よりもその作用においてより選択的であると考えられる。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、第１の態様において、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的であり、次に記載されているように結合アフィニティーが約１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられる、中和モノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル抗体の具体例がマウスモノクローナル抗体１９Ｈ２２である。本発明のもう一つ別の態様はＭＡｂ １９Ｈ２２を産生するハイブリドーマ細胞である。本発明は、関連する態様において、本発明の齧歯動物の中和モノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失させることで産生されるヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的な中和ＦａｂフラグメントまたはそのＦ（ａｂ’）２フラグメントを提供する。
【００１０】
さらに別の関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは約１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）から由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的な改変抗体およびその抗体をコードする核酸分子を提供する。改変抗体がヒト化抗体である場合、ヒト以外の生物の免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列を、第１免疫グロブリンパートナーの少なくとも１つの、好ましくはすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト以外の生物のモノクローナル抗体から由来のＣＤＲによって置き換えられている、その第１免疫グロブリンパートナーに挿入する。その上、第１免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン定常鎖のすべてまたは一部を含む、第２免疫グロブリンパートナーに作動的に連結していることが好ましい。
【００１１】
関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは約１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）から由来のＣＤＲおよびかかるＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。
もう一つ別の態様において、ヒト重鎖および軽鎖定常領域と、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは約１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体から由来の重鎖および軽鎖可変領域とを含有する、キメラ抗体が提供される。
さらにもう一つ別の態様において、本発明は、１（またはそれ以上）の上記した抗体および医薬上許容される担体を含有する、医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、免疫系または骨の疾患、特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症についての、ヒトにおける過剰量のＲＡＮＫ−Ｌに付随する症状の治療方法であって、ヒトに有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）から由来の改変抗体（例えば、操作された抗体、ＣＤＲ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメントまたはそのアナログ）の組換え体を産生する方法、およびその産生に有用な成分を提供する。これらの成分は、その成分をコードする単離された核酸配列、および組換えプラスミドであって、選択された制御配列の下で、その組換えプラスミドをトランスフェクトした宿主細胞（好ましくは哺乳動物細胞）にてその発現を指令する能力を有する、その核酸配列を含有する組換えプラスミドを包含する。この産生方法は、改変抗体、好ましくはヒト化抗体が該細胞にて発現されるような条件下で本発明のトランスフェクトされた宿主細胞系を培養し、その発現産物をそこから単離することを含む。
【００１４】
本発明のさらにもう一つ別の態様は、ヒトにおいて、Ｔｈ１Ｔ細胞の過剰な活性または破骨細胞の発生および活性化に付随する症状、特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を診断する方法であって、患者から由来の生物学的流体の試料を得、ＲＡＮＫ−Ｌ／抗体（モノクローナルまたは改変抗体）の複合体が形成されるような条件下で本発明の抗体および改変抗体をかかる試料と接触させるようにし、そのＲＡＮＫ−Ｌ／抗体の複合体の有無を検出することを含む方法である。
本発明の他の態様および利点を、以下の記載およびその好ましい具体例に詳述する。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
表Ｉはマウス抗体１９Ｈ２２に関する軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列（各々、配列番号：１および２）を示す。囲まれている領域（表Ｉのボックス内）は３つのＣＤＲ（配列番号：５、６および７）およびＣＤＲをコードする各々のポリヌクレオチド（配列番号：１３、１４および１５）を示す。太字領域は縮重プライマー配列（配列番号：１１）を示す。
【００１６】
【表１】
2004520011.tif 000002
【００１７】
表ＩＩはマウス抗体１９Ｈ２２の重鎖可変領域のｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列（各々、配列番号：３および４）を示す。囲まれている領域（表ＩＩのボックス内）は３つのＣＤＲ（配列番号：８、９および１０）およびＣＤＲをコードする各々のポリヌクレオチド（配列番号：１６、１７および１８）を示す。太字領域は縮重プライマー配列（配列番号：１２）を示す。
【００１８】
【表２】
2004520011.tif 000003
【００１９】
本発明は、その可変軽鎖および重鎖領域を表ＩおよびＩＩに示す、マウスモノクローナル抗体１９Ｈ２２に例示されるように、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ結合特異性、中和活性およびヒトＲＡＮＫ−Ｌとの高アフィニティーにより特徴付けられる、種々の抗体、改変抗体およびそれらのフラグメントを提供する。モノクローナル抗体、１９Ｈ２２を従来のハイブリドーマ技法により調製し、新規な中和抗体を生成した。本発明の抗体は、ＲＡＮＫ−Ｌ介在障害、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症（ＯＡ）を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患の治療用の治療的組成物および医薬組成物に有用である。また、この生成物は、ヒトにおける内因性ＲＡＮＫ−Ｌレベルまたは活性化細胞からのエクスビボで放出されるＲＡＮＫ−Ｌを測定すること（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によるＲＡＮＫ−Ｌ介在症状の診断にも有用である。
【００２０】
Ｉ．定義
「抗体」は、モノクローナル抗体、改変抗体、ヒト化抗体、操作された抗体およびキメラ抗体を包含するが、これらに限定されない。
「モノクローナル抗体」とは、ポリクローナル抗体と反対のものであり、慣用的なハイブリドーマ技法、ファージ表示コンビナトリアルライブラリー、免疫グロブリンチェーンシャフリングおよびヒト化技法により調製することができる、免疫グロブリンをいう。
「改変抗体」とは、改変免疫グロブリンのコード化領域によりコードされた蛋白をいい、かかる蛋白は選択された宿主細胞中で発現させることにより得ることができる。かかる改変抗体は操作された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）あるいは免疫グロブリンの定常領域、例えばＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２などのすべてまたは一部を欠いている抗体フラグメントである。
「改変免疫グロブリンのコード化領域」とは、本発明の改変抗体をコードする核酸配列をいう。改変抗体がＣＤＲ−グラフトまたはヒト化抗体である場合、第１免疫グロブリンパートナーを含むヒト可変フレームワーク配列がヒト以外の生物の免疫グロブリンから由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列と置き換えられている。所望により、第１免疫グロブリンパートナーは第２免疫グロブリンパートナーと作動的に結合していてもよい。
【００２１】
「第１免疫グロブリンパートナー」とは、未変性（または天然に存在する）ＣＤＲ−コード化領域がドナー抗体のＣＤＲ−コード化領域により置き換えられているところの、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリンの可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンの重鎖または軽鎖（または両鎖）、そのアナログあるいは機能的フラグメントとすることができる。抗体（免疫グロブリン）の可変領域内にあるかかるＣＤＲ領域は、当該分野にて既知の方法により決定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））は、ＣＤＲを位置付けるためのルールを開示している。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するのに有用なコンピュータープログラムも知られている。
【００２２】
「中和」とは、ヒトＲＡＮＫ−Ｌとその特異的受容体との結合を妨げることにより、あるいは結合が生じたとしても、ＲＡＮＫ−Ｌのその受容体を介するシグナル化を阻害することにより、ＲＡＮＫ−Ｌ活性を阻害する抗体をいう。ＲＡＮＫ−Ｌ中和アッセイにて測定した場合に、ＲＡＮＫ−Ｌ活性を阻害するのにＭＡｂが９０％効果的、好ましくは９５％効果的、最も好ましくは１００％効果的であるならば、そのＭＡｂは中和抗体である。
「高アフィニティー」なる語は、光バイオセンサー分析法により測定した場合に、ヒトＲＡＮＫ−Ｌと１０−１０Ｍ以下のＫｄにより特徴付けられる結合アフィニティーを有する抗体をいう。
「ヒトＲＡＮＫ−Ｌとの結合特異性」とは、ネズミＲＡＮＫ−Ｌまたは他のＲＡＮＫ−ＬよりもヒトＲＡＮＫ−Ｌとより高いアフィニティーを有することを意味する。
【００２３】
「第２免疫グロブリンパートナー」とは、第１免疫グロブリンパートナーがフレームにて融合するか、または任意の従来のリンカー配列により融合している（すなわち、作動的に結合した）蛋白またはペプチドをコードするもう一つ別のヌクレオチド配列をいう。免疫グロブリン遺伝子であることが好ましい。第２免疫グロブリンパートナーは、目的とする同じ抗体（すなわち、相同的抗体−第１および第２改変抗体が同じ供給源から誘導されている）または付加的な抗体（すなわち、異種抗体）のその全体の定常領域をコードする核酸配列を含んでいてもよい。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖（あるいは単一ペプチドの一部としての両鎖）であってもよい。第２免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリン種またはイソ型に限定されるものではない。加えて、第２免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２に見られるような、免疫グロブリン定常領域の一部（すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分）を含んでいてもよい。かかる第２免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、ファージ表示ライブラリーの一部として、宿主細胞の表面で曝される内在性膜蛋白をコードする配列、あるいは分析または診断検出のための蛋白、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードする配列を含んでいてもよい。
【００２４】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２なる語は標準的な意味で用いられる（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。
本明細書中で使用される「操作された抗体」とは、一定の型の改変抗体、すなわち、選択された受容体の抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部が選択されたエピトープに対して特異性を有する１またはそれ以上のドナー抗体から由来の類似する部分により置き換えられているところの、全長の合成抗体（例えば、抗体フラグメントとは反対のキメラまたはヒト化抗体）として記載する。例えば、かかる分子は非修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）と関連するヒト化重鎖により特徴付けられる抗体、またはその逆の抗体を包含する。操作された抗体はまた、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列を変更することで特徴付けることもできる。これらの抗体はアクセプター抗体からの１またはそれ以上のＣＤＲ（好ましくはすべてのＣＤＲ）を本明細書に記載のドナー抗体からのＣＤＲと置き換えたものとすることができる。
【００２５】
「キメラ抗体」とは、ドナー抗体から由来の天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を、アクセプター抗体から由来の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含有する一の型の操作された抗体である。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の生物のドナー免疫グロブリンから由来のＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導の部分が１の（またはそれ以上の）ヒト免疫グロブリンから由来している、操作された一の型の抗体をいう。加えて、フレームワーク支持残基を改変し、結合アフィニティーを保存させることもできる（例えば、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３２（１９８９）；Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１（１９９１）を参照のこと）。
【００２６】
「ドナー抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンのコード化配列を提供し、ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有する改変抗体の発現が得られるように、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントあるいはそのアナログの核酸配列を第１免疫グロブリンパートナーに寄与する、抗体（モノクローナルまたは組換え抗体）をいう。本発明における使用に適する一のドナー抗体は、１９Ｈ２２と称される、ヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体である。抗体１９Ｈ２２はヒトＲＡＮＫ−Ｌと高アフィニティーを有し、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ特異的（すなわち、ネズミＲＡＮＫ−Ｌを認識しない）である、イソ型ＩｇＧ２ｂ／カッパの中和抗体として定義される。この抗体は、適当なネズミＩｇＧ定常領域上に、各々、配列番号：１および２の可変軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列；および各々、配列番号：３および４の可変重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を有する。
【００２７】
「アクセプター抗体」なる語は、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域および／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードする核酸配列のすべて（またはいずれかの部分であるが、好ましくはすべてである）を第１免疫グロブリンパートナーに寄与する、ドナー抗体に対して異種構造を有する抗体（モノクローナルまたは組換え抗体）をいう。ヒト抗体はアクセプター抗体であることが好ましい。
【００２８】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照のこと。免疫グロブリンの可変部には３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。かくして、本明細書中で用いる「ＣＤＲ」とは、３つすべての重鎖ＣＤＲまたは３つすべての軽鎖ＣＤＲ（または、適当ならば、すべての重鎖およびすべての軽鎖の両方のＣＤＲ）をいう。
【００２９】
ＣＤＲは抗体の抗原またはエピトープとの結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明で目的とするＣＤＲはドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列から誘導され、そのＣＤＲが誘導されるドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有するかまたは保持する、天然に存在するＣＤＲのアナログを包含する。
抗原結合特異性または中和能を共有するとは、例えば、ＭＡｂ１９Ｈ２２は特定レベルの抗原アフィニティーにより特徴付けることができるが、適当な構造環境下で１９Ｈ２２の核酸配列によりコードされるＣＤＲはより低いまたはより高いアフィニティーを有するかもしれないことを意味する。にもかかわらず、そのような環境下で、１９Ｈ２２のＣＤＲは１９Ｈ２２と同じエピトープを認識すると考えられる。１９Ｈ２２の代表的な軽鎖ＣＤＲは、配列番号：５；配列番号：６；配列番号：７を包含し、１９Ｈ２２の代表的な重鎖ＣＤＲとして、配列番号：８；配列番号：９；配列番号：１０が挙げられる。
【００３０】
「機能的フラグメント」とは、フラグメントを誘導した抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端で少し欠失した配列）である。
「アナログ」とは、少なくとも１個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列をいい、かかる修飾は化学的であってもよく、あるいは少しの（例えば、好ましくは１０個以下の）アミノ酸の置換または再配列とすることができる。かかる修飾はアミノ酸配列が生物学的特性、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高アフィニティーを保持することを可能とする。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がＣＤＲ−コード化領域の範囲内であるいはその周辺で形成される場合、置換を介して（サイレント）変異を構築することができる。
【００３１】
アナログはまた、対立遺伝子変形として生成することもできる。「対立遺伝子変形または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の変化である。かかる変形または修飾は遺伝的コードの縮重によるものであっても、あるいは所望の特性を得るために意図的に操作したものであってもよい。これらの変形または修飾はコードされたアミノ酸配列に変化を与えても与えなくてもどちらでもよい。
フラグメント、アナログおよび対立遺伝子変形の概念は「同一性」なる語で表すこともできる。例えば、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択される配列と少なくとも９０％、より好ましくは９５％同一である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。
【００３２】
「同一性」は、当該分野で公知であり、配列を比較することで決定されるような、２またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によっては、配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，ＨおよびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法（これらに限らない）を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一性を決定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プログラムに集成されている。２つの配列の間の同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータ・プログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＦ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０））を包含するが、これに限らない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手できる。また、周知のスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを用いて同一性を決定することもできる。
【００３３】
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ ６２
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４。
これらのパラメーターを用いて有用なプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ．から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップについてペナルティーを伴わない）。
【００３４】
ポリヌクレオチドの比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含する：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ．から「ギャップ」プログラムとして利用できる。これらは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００３５】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号：１の対照となる配列と同じ、すなわち１００％同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または挿入からなる群より選択され、その変化は対照となるヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のヌクレオチドにおいて個々に、あるいは対照となる配列中の１またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。ヌクレオチドの変化した数は、配列番号：１中の全ヌクレオチド数と個々の同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号：１中の全ヌクレオチド数から差し引くことにより、あるいは
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
式中、ｎｎはヌクレオチドの変化した数であり、ｘｎは配列番号：１中の全ヌクレオチド数であり、ｙは、例えば、７０％ならば０．７０であり、８０％ならば０．８０であり、８５％ならば０．８５であり、９０％ならば０．９０であり、９５％ならば０．９５などであり、ｘｎとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをｘｎから差し引くことにより、決定される。配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード化配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性があり、それゆえ、かかる変化に伴ってポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変化する。
【００３６】
同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号：２の対照となる配列と同じ、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（同類または非同類置換を含む）または挿入からなる群より選択され、該変化は対照となるポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のアミノ酸において個々に、あるいは対照となる配列中の１またはそれ以上の連続した群として散在してもよい。所定の％同一性についてのアミノ酸の変化した数は、配列番号：２中のアミノ酸の総数と個々の同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号：２中のアミノ酸の総数から差し引くことにより、あるいは
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸の変化した数であり、ｘａは配列番号：２中のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、７０％ならば０．７０であり、８０％ならば０．８０であり、８５％ならば０．８５などであり、ｘａとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、それをｘａから差し引くことにより、決定される。
【００３７】
「エフェクター剤」なる語は、改変抗体および／またはドナー抗体の天然または合成軽鎖または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントが常套手段により結合しうる非蛋白キャリア分子をいう。かかる非蛋白キャリアは、診断の分野にて使用される通常のキャリア、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、例えば、ＢＩＡコア（ファルマシア）系にて用いられるような多糖類、あるいは医薬の分野にて、さらにはヒトおよび動物に安全に投与するために有用な他の非蛋白物質を包含しうる。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同位元素をキレートするためのマクロサイクリルを包含しうる。かかるエフェクター剤、例えばポリエチレングリコールはまた、改変抗体の半減期を伸ばすのに有用でありうる。
【００３８】
ＩＩ．高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌモノクローナル抗体
本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントを構築するのに用いるために、ヒト以外の種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯動物（例えば、ネズミおよびラット）など）を利用し、未変性ヒトＲＡＮＫ−Ｌまたはそのペプチドエピトープと一緒に表示して望ましい免疫グロブリンを生成することができる。一般的なハイブリドーマ技法を利用してヒト以外の生物のＭＡｂ ＲＡＮＫ−Ｌを分泌するハイブリドーマ細胞系を生成する。ついで、かかるハイブリドーマを、実施例のセクションに記載されるように、９６−ウェルプレートにコーティングしたＲＡＮＫ−Ｌを用いるか、あるいはまた、ストレプタビジンをコーティングしたプレートに結合したビオチニル化ＲＡＮＫ−Ｌを用いて、結合についてスクリーニングする。
【００３９】
本発明の一の具体例である高アフィニティー中和抗体が、以下の実施例により詳細に記載されている、キメラまたはヒト化抗体の形成に用いることができる、ＭＡｂ１９Ｈ２２（その重鎖および軽鎖可変領域を表ＩおよびＩＩに示す）、マウス抗体である。１９Ｈ２２ＭＡｂは約Ｋｄ１０−１０ＭのヒトＩＬ−１ＲＡＮＫ−Ｌとの抗原特異性により特徴付けられる。このＭＡｂはイソ型ＩｇＧ２ｂ／カッパであることで特徴付けられる。
本発明は１９Ｈ２２またはその超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されるものではない。ヒトＲＡＮＫ−Ｌおよび対応する抗−ＲＡＮＫ−ＬＣＤＲとの約１０−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられる他の適当な高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌ抗体を代わりに用いることもできる。以下の記載において、ドナー抗体が１９Ｈ２２として同定されている場合にはいつも、この明示は説明のためであって、単に記載を簡単にするためのものである。
【００４０】
ＩＩＩ．抗体フラグメント
また、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対するＭＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用を含む。これらのフラグメントはＲＡＮＫ−ＬおよびＴｈ１Ｔ細胞介在症状に対してインビボで保護剤として、またはインビボで、特に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症（ＯＡ）を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患のＲＡＮＫ−Ｌ診断剤の一部として有用である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部を含有し；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは２個のＦａｂをジスルフィド結合により結合させることにより形成されるフラグメントである。ＭＡｂ１９Ｈ２２および他の類似する高アフィニティーのＲＡＮＫ−Ｌ結合抗体はＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの供給源を提供し、それらは、例えば、そのＭＡｂを適当な蛋白分解酵素、パパインおよび／またはペプシンを用いて切断する、常套手段により、あるいは組換え技法により得ることができる。これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、それ自体が治療薬、予防薬または診断薬として有用であり、また可変領域および本明細書に記載の組換え体またはヒト化抗体の形成に有用なＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。
【００４１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはコンビナトリアルファージライブラリー（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３−４５５（１９９４）を参照のこと）を介して、あるいは免疫グロブリンチェーンシャフリング（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３（１９９２）を参照のこと、この両方を出典明示により本明細書の一部とする）を介して構築することができ、この場合、選択された抗体（例えば、１９Ｈ２２）から由来のＦｄまたはＶＨ免疫グロブリンが軽鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＬ（またはＶＫ）と結合し、新規なＦａｂが形成される。反対に、選択された抗体から由来の軽鎖免疫グロブリンが重鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＨ（またはＦｄ）と結合し、新しいＦａｂを形成することもできる。
【００４２】
ＩＶ．目的とする抗−ＲＡＮＫ−Ｌアミノ酸およびヌクレオチド配列
上記したＭＡｂ１９Ｈ２２または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴付けられる種々の改変抗体を設計および獲得するのに有用な、可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能性配列およびそのアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列などの配列を付与することができる。
一例として、本発明は、ＲＡＮＫ−ＬＭＡｂ１９Ｈ２２からの可変軽鎖および可変重鎖配列およびそれらから由来の配列を提供する。
【００４３】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする、本発明の核酸配列またはそのフラグメントはまた、特定の変化をＣＤＲをコードする核酸配列またはフレームワーク領域内で変異誘発を導入するのに、および得られた修飾または融合核酸配列を発現プラスミドに組み込むのに有用である。
遺伝コードの縮重を鑑みれば、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列、ならびにドナー抗体の抗原特性を共有する機能性フラグメントおよびそのアナログをコードする種々のコード化配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする、本発明の単離された核酸配列またはそのフラグメントを用いて、第２免疫グロブリンパートナーと作動的に組み合わせた場合に、本発明の改変抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは他の操作された抗体を産生することができる。
【００４４】
一の具体例において、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択される構成員と、少なくとも９０％同一の、より好ましくは９５％同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。さらにもう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号：２、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも９０％同一の、より好ましくは９５％同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【００４５】
本発明は、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体に関する。配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【００４６】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
本発明はまた、配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００４７】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞もまた含まれる。さらに、配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系もまた包含される。さらに、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【００４８】
本発明はまた、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【００４９】
発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができる、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。
【００５０】
本明細書に記載の改変抗体の一部をコードする単離された核酸配列に加えて、未変性ＣＤＲコード化配列に相補的な核酸配列またはＣＤＲコード化領域を囲む修飾ヒトフレームワーク領域に相補的な核酸配列などの、他の核酸配列も本発明に包含される。有用なＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ配列にとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）、３８７ないし３８９頁を参照のこと）下で、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするものを包含する。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例が、６５℃で４ＸＳＳＣとハイブリダイズさせ、つづいて６５℃で０．１ＸＳＳＣ中にて１時間洗浄するものである。また、一の代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、４２℃で５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣを用いるものである。これらのハイブリダイズに付すＤＮＡ配列は長さが少なくとも約１８個のヌクレオチド、すなわち、略ＣＤＲの大きさであることが好ましい。
【００５１】
Ｖ．改変された免疫イムノグロブリン分子および改変抗体
改変された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの操作された抗体を含む、改変抗体をコードすることができる。望ましい改変された免疫グロブリンコード化領域は、ＲＡＮＫ−Ｌ抗体、好ましくは本発明により提供されるような第１免疫グロブリンパートナー（ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域）に挿入された高アフィニティー抗体、の抗原特異性を有するポリペプチドをコードするＣＤＲコード化領域を含有する。
第１免疫グロブリンパートナーは第２免疫グロブリンパートナーと作動的に連結していることが好ましい。第２免疫グロブリンパートナーは上記に定義したとおりであり、目的とする第２抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含んでいてもよい。第２免疫グロブリンパートナーはまた、軽鎖または重鎖の定常領域がフレームにてまたはリンカー配列により融合する別の免疫グロブリンをコードする配列を含んでいてもよい。ＲＡＮＫ−Ｌの機能性フラグメントまたはアナログに拮抗するように指令された操作された抗体は同じ抗体との結合の強化を惹起するように設計することができる。
【００５２】
第２免疫グロブリンパートナーはまた、その第２免疫グロブリンパートナーが常套手段により作動的に連結することができる、非蛋白キャリア分子を含む、上記したエフェクター剤と結合してもよい。
第２免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間の融合または連結は、適当な手段のよるもの、例えば慣用的な共有またはイオン結合、蛋白融合または異種二機能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技法は当該分野にて知られており、一般的な化学および生化学のテキストに広く記載されている。
【００５３】
加えて、第２免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に望ましい大きさの空間を簡単に付与する従来のリンカー配列もまた、改変された免疫グロブリンをコードする領域中に構築させてもよい。かかるリンカーの設計は当該分野にて周知である。
加えて、本発明の分子のシグナル配列を修飾して発現を強化することもできる。
代表的な改変抗体は、ＭＡｂ１９Ｈ２２の抗原特異性を有する可変重鎖および／または軽鎖のペプチドまたは蛋白配列、例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖を含有する。本発明のさらに別の望ましい改変抗体は、アミノ酸配列がマウス抗体分子１９Ｈ２２の重鎖および／または軽鎖の可変領域の少なくとも１個の、好ましくはすべてのＣＤＲを含有し、残りの配列がヒト供給源から由来するか、またはその機能性フラグメントまたはアナログであることにより特徴付けられる。
【００５４】
さらなる態様において、本発明の操作された抗体は付加的な物質が結合していてもよい。例えば、組換えＤＮＡ技法の操作を用いて、完全な抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）で置き換えられている、本発明の操作された抗体を産生してもよい。
第２免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、マウス１９Ｈ２２の抗原特異性を有するＣＤＲ−含有配列と異種構造の非免疫グロブリンのペプチド、蛋白またはそのフラグメントと作動的に連結していてもよい。得られた蛋白は抗−ＲＡＮＪ−Ｌ抗原特異性および非免疫グロブリンの発現に関する特性の両方を示すかもしれない。融合パートナーそれ自体が治療蛋白であるか、または付加的な抗原特性を有するならば、その融合パートナー特性は、例えば、別の結合または受容体ドメインまたは治療特性などの機能的特性であってもよい。
【００５５】
本発明のもう一つ別の望ましい蛋白は、全長の重鎖および軽鎖、またはＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのその別個のフラグメント、重鎖ダイマー、またはＦｖまたは一本鎖抗体（ＳＣＡ）などのその最小組換えフラグメントあるいは選択されたドナーＭＡｂ、例えばＭＡｂ１９Ｈ２２と同じ特異性を有する別の分子を有する、完全な抗体分子を含んでいてもよい。かかる蛋白は改変抗体の形成に用いてもよく、あるいは融合していない形態にて用いてもよい。
第２免疫グロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、イソ型またはイソ種の免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域から誘導される場合は必ず、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、一の供給源、例えば、アクセプター抗体からの免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域と、可変フレームワーク領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書に記載の抗−ＲＡＮＫ−Ｌ抗体から由来の１またはそれ以上の（好ましくはすべての）ＣＤＲを含むことができる。加えて、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために、核酸またはアミノ酸レベルでアクセプターＭＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域を、またはドナーＣＤＲ領域を、改変、例えば、欠失、置換または付加に付すこともできる。
【００５６】
かかる操作された抗体は、ＲＡＮＫ−ＬＭＡｂ（所望により、上記したように修飾されていてもよい）の１の（または両方の）可変重鎖および／または軽鎖あるいは１またはそれ以上の下記の重鎖または軽鎖ＣＤＲを用いて設計される。操作された抗体が中和抗体であると、すわなち、それらは望ましくはＲＡＮＫ−Ｌ蛋白の受容体との結合を遮断し、ＲＡＮＫ−Ｌ依存性細胞の増殖を遮断または防止すると考えられる。
かかる操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域またはサブタイプを含有するヒト化抗体、あるいはＲＡＮＫ−Ｌ抗体機能性フラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含有するキメラ抗体を包含する。適当なヒト（または他の動物）アクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との相同性により、通常のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）データーベース、Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸を基礎として）により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖定常または可変フレームワーク領域の付与能を有する適当なアクセプター抗体は同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体を起源とする必要はない。
【００５７】
異種構造のフレームワークおよび定常領域は、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどのヒト免疫グロブリン種およびイソ型から選択されることが望ましい。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブリン蛋白配列だけを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードするＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子などの免疫グロブリンでないアミノ酸配列に融合されるところの、遺伝子を構築することもできる。
特に望ましい一例としてのヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域に挿入された１９Ｈ２２のＣＤＲを含有するであろう。中和ヒト化抗体の場合、ＲＡＮＫ−Ｌ抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からの１、２または好ましくは３個のＣＤＲを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿入し、その後者の抗体の未変性ＣＤＲと置き換える。
【００５８】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインが１またはそれ以上のＣＤＲ置換により操作されている。６個すべてのＣＤＲまたは６個よりも少ないＣＤＲを種々組み合わせて用いることが可能である。好ましくは６個すべてのＣＤＲを置き換える。軽鎖としてヒトアクセプター抗体からの非修飾軽鎖を用い、ヒト重鎖におけるＣＤＲだけを置き換えることも可能である。さらに別法として、一般的な抗体データベースに基づいて別のヒト抗体から適合可能な軽鎖を選択することもできる。残りの操作された抗体は適当なアクセプターヒト免疫グロブリンから誘導することができる。
かくして、操作されたヒト化抗体は、天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、有効な治療に用いるのに必要な、例えばヒトにおけるＲＡＮＫ−Ｌ介在炎症性疾患の治療にまたは診断薬として使用するのに必要な特性を組み合わせて有することが好ましい。
【００５９】
ドナー抗体の特異性および高アフィニティーに必ずしも影響を与えることなく、可変ドメインアミノ酸にて変形することにより改変抗体をさらに修飾できること（すなわち、アナログ）は当業者であれば理解できるであろう。重鎖および軽鎖アミノ酸は可変ドメインフレームワークまたはＣＤＲあるいはその両方で他のアミノ酸で置換することができる。
加えて、定常領域を改変し、本発明の分子の選択特性、例えば、二量化、Ｆｃ受容体との結合または補体を結合させ、活性化する能力を亢進または減少させることもできる（例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：１０５−１０８（１９９３）；Ｘｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：３４６９−３４７４（１９９４）；Ｗｉｎｔｅｒら、ＥＰ ３０７４３４−Ｂを参照のこと）。
キメラ抗体である改変抗体は、フレームワーク領域を含め、両鎖のためのヒト免疫グロブリン定常領域と一緒になって、完全なヒト以外の生物のドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を提供することで、上記したヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に関連する付加的なヒト以外の生物の配列を保持するキメラ抗体はヒトにおいて有意な免疫応答を惹起することができると考えられる。
【００６０】
かくして、一の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択される構成員と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一の、１またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。もう一つ別の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号：２、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一の、１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。
かかる抗体は、上記したような、ＲＡＮＫ−Ｌ介在障害の予防または知慮に有用とすることができる。
【００６１】
ＶＩ．改変抗体の産生および改変抗体
好ましくは、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築においては、ＭＡｂ１９Ｈ２２または他の適当なドナーＭＡｂの可変軽鎖および／または重鎖配列およびＣＤＲ、ならびにそのコード化核酸配列を以下の方法にて利用する。また、同じまたは類似する方法を用いて本発明の他の具体例を形成することもできる。
一般には、選択されたドナーＭＡｂ、例えばマウス抗体１９Ｈ２２を産生するハイブリドーマをクローン処理に付し、当業者に公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））に記載の方法により重鎖および軽鎖の可変領域のＤＮＡを得る。少なくともＣＤＲコード化領域、およびドナーＭＡｂ結合特異性を保持するために必要なアクセプターＭＡｂ軽鎖および／または重鎖の可変ドメインフレームワーク領域の部分、ならびにヒト免疫グロブリンから由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分を含有する１９Ｈ２２の可変重鎖および軽鎖領域は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得ることができる。ＣＤＲのコード化領域を既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することにより同定する。
【００６２】
ついで、マウス／ヒトのキメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイしてもよい。かかるキメラ抗体は、両方の鎖のためのヒトＩｇ定常領域と一緒に、完全なヒト以外の生物のドナー抗体ＶＨおよびＶＬ領域を含有する。
ヒト化抗体はキメラ抗体から誘導してもよく、あるいは重鎖および軽鎖からのドナーＭＡｂＣＤＲコード化領域を選択された重鎖および軽鎖フレームワークに挿入することにより合成して製造することが好ましい。別法として、本発明のヒト化抗体は標準的な変異誘発技法を用いて調製することもできる。かくして、得られたヒト化抗体はヒトフレームワーク領域およびドナーＭＡｂＣＤＲ−コード化領域を含有する。その後でフレームワークの残りを操作してもよい。得られたヒト化抗体を組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞中で発現させることができる。他の適当なＲＡＮＫ−Ｌ特異的であり、中和作用を示す、高アフィニティーのヒト以外の生物の抗体にこの技法を用い、他のヒト化抗体を調製してもよい。
【００６３】
通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、改変抗体についてのこれらのコード化配列を、宿主細胞での複製および発現を、および／またはその細胞からの分泌を調節する能力を有する通常の調節制御配列と作動的に共同して置くことにより産生することができる。調節配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーターおよびシグナル配列を包含し、それらは他の既知の抗体から誘導することができる。同様に、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２発現ベクターを産生することもできる。好ましくは、この第２発現ベクターは、ポリペプチド鎖が、各々、できる限り多く機能的に発現するように、そのコード化配列および選択可能なマーカーが関連付けられる範囲では、第１のものと同じである。また、改変抗体の重鎖および軽鎖のコード化配列が単一のベクター上に存在していてもよい。
【００６４】
選択された宿主細胞を慣用的技法により第１および第２の両方のベクターを用いて共同してトランスフェクトし（あるいは単一のベクターで簡単にトランスフェクトし）、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含むトランスフェクトされた本発明の宿主細胞を創製する。ついで、そのトランスフェクトされた細胞を慣用的技法により培養し、本発明の操作された抗体を産生する。組換え重鎖および／または軽鎖の両方を含むヒト化抗体をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適当なアッセイにより培養物からのスクリーニングに付す。類似する慣用的な技法を用いて本発明の他の改変抗体または分子を構築することもできる。
本発明の方法および組成物の構築に利用されるクローニングおよびサブクローニング工程に適するベクターは当業者により選択される。例えば、従来のｐＵＣシリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される一のベクターはｐＵＣ１９であり、そのベクターは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）またはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）などの会社から商業的に入手可能である。加えて、容易に複製することができ、一の存在量のクローニング部位および選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、そして操作が簡単なベクターはいずれもクローニングに用いることができる。
【００６５】
同様に、本発明に係る操作された抗体の発現のために利用されるベクターは、当業者によって一般的なベクターから選択され得る。ベクターはまた、選択された宿主細胞にて異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令する選択された調節配列（ＣＭＶプロモーターなど）を含有する。これらのベクターは操作された抗体または改変された免疫グロブリンのコード化領域をコードする上記されたＤＮＡ配列を含有する。加えて、ベクターは、操作を容易にするために望ましい制限部位を挿入することによって修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込むこともできる。
発現ベクターはまた、異種ＤＮＡ配列の発現を増幅するのに適する遺伝子、例えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）により特徴付けることもできる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロビンプロモーター配列（ベータグロプロ）からなどの、ポリＡシグナル配列を包含する。本明細書にて有用な発現ベクターは当業者に周知の技法を用いて合成することができる。
【００６６】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列等は、市販のまたは天然の供給源から得てもよく、あるいは選択された宿主にて組換えＤＮＡの産物を発現および／または分泌するのに関連して使用される既知の操作により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現について当該分野にて公知である多種の他の適当な発現ベクターをこの目的のために選択することもできる。
本発明はまた、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコード化配列を含有する組換えプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞系を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた一般的なものである。しかしながら、イー・コリの種々の菌株から由来の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の工程に使用するのが最も望ましい。
【００６７】
本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適する宿主細胞または細胞系は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および脊髄細胞などの哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯまたは脊髄細胞がより好ましい。ヒト細胞を用いて、その分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することもできる。別法として、他の真核細胞系を利用することもできる。適当な哺乳動物の宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の産生および精製の方法の選択は当該分野にて知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲を参照のこと。
【００６８】
細菌細胞が宿主細胞として本発明の組換えＦａｂの発現に適することを証明することができる（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｍ，Ａ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１３０：１５１−１８８１９９２）を参照のこと）。しかしながら、細菌細胞中で発現される蛋白は折りたたまれていないか不当に折りたたまれた形態あるいはグリコシル化されていない形態であるため、細菌細胞中で産生された組換えＦａｂは抗原結合能の保持についてスクリーニングする必要がある。細菌細胞により発現された分子がうまく折りたたまれた形態にて産生されたならば、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現のために使用されるイー・コリの種々の菌株は生物学の分野における宿主細胞として周知である。ビー・サチリス、ストレプトマイセス、他の細菌等の種々の菌株もまた、この方法にて利用することができる。
【００６９】
望ましい場合には、当業者に公知の酵母菌の細胞、ならびに昆虫細胞、例えば、ドロソフィラおよびレピドプテラ、およびウイルス発現系を宿主細胞として利用することもできる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８：２７７−２９８、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）およびその中で引用されている文献を参照のこと。
本発明のベクターを構築する一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション方法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変抗体を産生するのに必要な培養方法は、そのすべてが慣用的な方法である。同様に、一旦産生されれば、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該分野の標準的操作に従って細胞培養基から精製することもできる。かかる技法は当該分野における技術の範囲内にあり、本発明を制限するものではない。
【００７０】
ヒト化抗体を発現させるもう一つ別の方法は、米国特許第４８７３３１６号に記載されるように、トランスジェニック動物での発現を利用する。この方法は、トランスジェニック操作により哺乳動物に組み込まれた場合に、雌体の乳中に所望の組換え蛋白を産生させる、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
所望の方法により発現されると、次に操作された抗体を適当なアッセイを用いて試験する。現在のところ一般的なＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを利用して操作された抗体とＲＡＮＫ−Ｌとの定量的および定性的結合を評価する。加えて、また、通常のクリアランス機構にも拘わらずに体内で残っている操作された抗体を評価するのになされるその後のヒト臨床実験の前に、別のインビトロアッセイを用いて中和効率を検証してもよい。
【００７１】
ヒト化抗体の産生について記載されている一般的操作に従って、当業者はまた、本明細書に記載の他のドナーＲＡＮＫ−Ｌ抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することもできる。操作された抗体は、その改変抗体の受容体により「自己」として認識される可能性のある可変領域のフレームワークを有するように産生できる。可変領域のフレームワークを少し修飾して、受容体に対する免疫原性を著しく増大させることなく、抗原結合を大きく増大させることができる。かかる操作された抗体はＲＡＮＫ−Ｌ介在状態についてヒトを効果的に治療することができる。かかる抗体は上記した症状の診断においても有用である。
【００７２】
ＶＩＩ．治療的／予防的使用
また、本発明は慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症（ＯＡ）を含む骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患を患っているヒトを治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の１つまたはそれ以上の改変抗体または変質抗体またはそのフラグメントを含む抗体を投与することを含む方法に関する。
【００７３】
本発明の分子の使用により誘発される治療的応答はヒトＲＡＮＫ−Ｌとの結合により形成され、したがって、続いて破骨細胞および樹状細胞の発達および機能を阻害する。したがって、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、限定するものではないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解または変形性関節症（ＯＡ）を含む骨減少性疾患を含む骨ホメオスタシス、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患の障害を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。また、本発明の分子は、治療的使用に適当な製剤および処方である場合、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発骨溶解もしくは変形性関節症（ＯＡ）、または乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む免疫疾患を患っているヒトに対して非常に望ましいものである。
【００７４】
本発明の抗体およびそのフラグメントはまた、サイトカイン抑制性抗炎症薬（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇｓ（ＣＳＡＩＤＳＴＭ）または他の抗体、特に本発明の抗体と関連する症状の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応的なヒトＭＡｂなどのサイトカイン阻害剤と一緒に用いることができる。
本発明の治療薬は、２日ないし６月の、あるいは必要に応じて、骨減少症または自己免疫症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を治療する場合には、より長期の治療が望ましい。用量および治療期間は、本発明の分子がヒトの循環下にある相対的な期間と関連しており、当業者が患者の治療されるべき状態および一般的な健康に応じて調節することができる。
【００７５】
本発明の治療薬の投与方法は、該薬を宿主に送達する任意の適当な経路とすることができる。本発明の抗体およびそのフラグメント、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内投与に特に有用である。
【００７６】
本発明の治療薬は、活性成分として有効量の本発明の抗体（例えば、ヒト化抗体）を医薬上許容される担体中に含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の予防薬において、抗体を含有する水性懸濁液または溶液で、好ましくは生理的ｐＨに緩衝され、すぐに注射できる形態のものが好ましい。非経口投与用組成物は、通常、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本発明の抗体またはそのカクテルの溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば、０．４％セイライン、０．３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知られた滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌することができる。組成物は、生理学的状態に近づけるために必要な医薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤等を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃度は広範囲に変えることができ、すなわち、約０．５重量％未満、通常約１重量％または少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで変化し、主に流体の体積、粘度等に応じて、選択される具体的な投与方法に従って選択される。
【００７７】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇまたはより好ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の抗体を含むように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように調製することができる。実際の非経口投与可能な組成物の調製法は当業者に周知であるか明らかであり、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにおいてより詳細に記載されている。
【００７８】
医薬調製物である場合の、本発明の治療薬は、単位投与形であることが好ましい。治療的に有効な適当な用量は当業者が容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における炎症性障害を有効に治療するために、体重７０ｋｇあたり０．１ｍｇないし約２０ｍｇの一回用量の本発明の蛋白または抗体を非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与する。かかる投与は、必要ならば、その疾患の間、医師により適当に選択される適当な間隔で繰り返すことができる。
本発明の抗体はまた、例えば、ＲＡＮＫ−Ｌ介在障害を測定するための、またはかかる障害の治療の進行度を追跡するための診断用方法にて用いることもできる。診断薬としてのこれらの抗体は、一般に、ＥＬＩＳＡにて、ならびに血清、血漿または他の適当な組織中のＲＡＮＫ−Ｌレベルを測定するための、もしくは培養基中でのヒト細胞の放出を測定するための他の慣用的アッセイフォーマットにて用いるために標識されていてもよい。抗体を使用するアッセイの特性は標準的なものであり、この開示を限定するものではない。
【００７９】
かくして、本発明の一の具体例は、患者における、骨ホメオスタシスの障害または自己免疫疾患および破骨細胞またはＴ細胞活性の過剰または不足に付随する他の症状（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症）の診断を補助する方法であって、その患者から得られる試料（血漿または組織）中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの量を測定し、その測定した量と正常な集団のヒトＲＡＮＫ−Ｌの平均の量とを比較し、それによれば、患者の試料中でＲＡＮＫ−Ｌが有意に高い量で存在することは骨または自己免疫疾患および破骨細胞またはＴ細胞の過剰な数または活性に付随する疾患を意味する、方法に関する。同様に、患者の試料中でＲＡＮＫ−Ｌが有意に低い量で存在することは破骨細胞の数または活性の不足に伴う骨疾患を意味する。
【００８０】
本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントは貯蔵のために凍結乾燥させ、使用前に適当なキャリアー中で復元することができる。これらの技法は通常の免疫グロブリンで効果的であることがわかっており、当該分野にて公知の凍結乾燥法および復元法を利用することができる。
かくして、本発明は（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２の識別特性を有するモノクローナル抗体；および（ｃ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２に関する。
本発明はまた、（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド；（ｂ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２の抗体特性の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド；および（ｃ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチドに関する。さらに本発明は（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、とりわけ、配列番号：５、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるポリペプチドを含む、免疫グロブリン相補性決定領域に関する。本発明のポリヌクレオチドは、とりわけ、配列番号：５、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。本発明は（ａ）免疫グロブリン相補性決定領域が配列番号：５、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるポリペプチドを含むところのヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体；（ｂ）配列番号：２に示されるようなポリペプチドの重鎖可変領域および／または配列番号：４に示されるようなポリペプチドの軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体に関する。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号：２および配列番号：４からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明はモノクローナル抗体１９Ｈ２２の識別特性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２の識別特性を有するモノクローナル抗体；および（ｃ）モノクローナル抗体１９Ｈ２２を含む医薬組成物も含まれる。
【００８３】
本発明は、試料中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの存在を検出する方法であって、
ａ）該試料をヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体に曝し；および
ｂ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体を検出する、ことを含む方法に関する。
抗体に曝露する前に、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ蛋白が抗体による結合の影響を受けやすいように、試料が処理されている方法が好ましい。ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する好ましい抗体はモノクローナル抗体１９Ｈ２２の識別特性を有しており、より好ましいのはモノクローナル抗体１９Ｈ２２そのものである。
【００８４】
以下の実施例は、代表的な操作された抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を含む、本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。アミノ酸はすべて慣用的な３文字または１文字コードで同定されている。必要な制限部位、プラスミド、ならびに他の試薬および材料はすべて、特記しない限り、商業的に入手されたものである。一般的なクローニングライゲーションおよび他の組換えＤＮＡ方法は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）または同じ出版人（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」ら）による、その第二版（１９８９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編に記載されるように行った。
【００８５】
（実施例）
実施例１−ＲＡＮＫ−Ｌに対するＭＡｂの産生
Ａ．ＣＢ６ｆ１マウスに可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白を複数回投与して免疫処理することでモノクローナル抗体を産生した。免疫処理したマウスから抗血清を採取し、抗−ＲＡＮＫＬ抗体について力価測定を行った。出血免疫アッセイ試験に基づいて、反応の最も優れたマウスを脾摘出術の３日および１日前にブースター処理に付した。脾臓を摘出し、ポリエチレングリコール方法を用いてその脾臓細胞をＸ６３ＡＧ８６５３骨髄腫細胞と融合させた。ついで、その融合細胞を２０ｘ９６ウェルの組織培養プレートにて培養した。融合した１４日後に、そのハイブリドーマをＲＡＮＫＬ蛋白との抗体結合についてアッセイした。ＲＡＮＫＬとの抗体結合を有するそれらのハイブリドーマをそのハイブリドーマの成長速度に合わせて段々により大きな組織培養プレートに広げた。そのハイブリドーマからの上澄を免疫アッセイにて使用し、抗体特異性およびＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ結合を中和することにおけるその生物学的活性を確認した。活性が確認されたならば、そのハイブリドーマ細胞系を低温保存し、血清不含培地にて抗体を産生するために秤量した。
【００８６】
ＲＡＮＫＬ蛋白に対する抗体を産生する際の大きな問題はハイブリドーマ培養物のアポトーシスにあった。このことは、通常、ハイブリドーマ拡張の初期の段階で起り、細胞系を完全に死滅させるか、あるいは生産体でないハイブリドーマ細胞系を産生し、これにより抗体合成のスイッチはオフとなる。この問題は、我々の行った１００種以上の他の抗原を用いる観察との関連で、どちらかと言えばＲＡＮＫＬ抗原に独特であった。この作用は、おそらく、ＲＡＮＫＬ抗体のネズミＲＡＮＫＬとの弱い交差反応性に由来するものである。ＲＡＮＫＬがハイブリドーマ細胞上にあるならば、そのハイブリドーマ培養基にある相対的に高い濃度のＲＡＮＫＬ抗体はＲＡＮＫＬと結合し、アポトーシスの誘発をもたらしうる。ハイブリドーマ成長因子を添加してその成長を刺激し、アポトーシスの作用をオフセットしようとする試みがなされたが、大部分のハイブリドーマ細胞系で効果がないことが実証された。この問題の結果は、細胞系の死滅か、ＩｇＧ合成のシャットダウンのいずれかであり、ハイブリドーマの９０％より多くがその融合体から失われた。ある融合体では、この方法ですべてのハイブリドーマが喪失した。
この作用を根絶するために、多数のマウスを免疫処理し、その脾臓を連続的に使用し、生物学的アッセイにおける評価のための抗−ＲＡＮＫＬ抗体を分泌する一連の安定したハイブリドーマを産生した。
【００８７】
Ｂ．１９Ｈ２２ＭＡｂの精製および配列決定
製造業者の指示に従ってＰｒｏｓｅｐＡ（Ｂｉｏ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｃｏｎｓｅｔｔ、ＵＫ）クロマトグラフィーにより１９Ｈ２２ＭＡｂを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによればそのＭＡｂは＞９５％純度であった。Ｎ−末端配列を分析するために、重鎖および軽鎖のポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜に移し、直接配列決定した（Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６２：１００３５−１００３８、１９８７）。
Ｃ．ＭＡｂのイソ型化
ネズミＲＡＮＫＬ  ＭＡｂ１９Ｈ２２を市販のキット（Ｚｙｍｅｄ、Ａｍｅｒｓｃｈａｍ）でイソ型化し、ＩｇＧ２ｂ／カッパであることが判明した。
【００８８】
実施例２−アッセイ
Ａ．競合ＥＬＩＳＡを、溶液での検出のため、プラスチック上にコートしたヒトＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白およびビオチニル化可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白を用いて確立した。ＲＡＮＫ−ＦｃおよびＲＡＮＫＬ蛋白を、各々、ＣＨＯ細胞およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で産生し、＞９０％の均一性に精製した。ｓｈＲＡＮＫＬ（可溶性、ヒトＲＡＮＫＬ）蛋白を、製造業者の説明に従って、ＮＨＳ−ビオチンと蛋白（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のモル比を２０：１でビオチニル化した。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６のカルボネート−ビカルボネート緩衝液中、４℃で一晩、５０ｎｇ／ウェル（０．５３ｎｍｏｌ）のＲＡＮＫ−Ｆｃでコートした。プレートを０．１％のトウィーン２０を含有するｐＨ７．４のトリス−生理食塩水緩衝液で洗浄し、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で室温で２時間遮断した。競合蛋白（ＲＡＮＫ−Ｆｃ；死滅受容体５（ＤＲ５）−Ｆｃ；ＯＰＧ−Ｆｃ；ＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２）を０．０１％のトウィーン２０／ＰＢＳで希釈し、ビオチニル化ｓｈＲＡＮＫＬ（０．４３ｎＭ）を添加する前にウェルに加え、組合わせた試料を室温で２時間インキュベートした。コートしたＲＡＮＫ−Ｆｃ（＋／−競合物）に結合したビオチニル化ｓｈＲＡＮＫＬの量を、アルカリホスファターゼ複合ストレプタビジンを用いて測定した。シグナル検出に関する基質は１０５ＰＮＰＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）であり、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ３４０プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。ＤＲ５−Ｆｃ蛋白は、ＲＡＮＫＬと相互作用しないことを示している種々の他の研究から考えられる阻害を示さなかった。いくらかの並行したアッセイにおいて、ＯＰＧ−ＦｃはＲＡＮＫ−Ｆｃよりも強力な阻害剤であり、各々、約０．５および６ｎＭのＩＣ５０を有している。１９Ｈ２２ ＭＡｂは約２ｎＭのＩＣ５０を有するＯＰＧ−Ｆｃにより類似した効力を示した。
【００８９】
Ｂ．培養物中のヒト単球由来の樹状細胞の成熟の阻害。勾配単離により精製された新鮮なヒト単球を組換えヒトＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と培養物中で６日間処理し、抗原捕獲表現型の樹状細胞（未成熟ＤＣ）を産生した。培地を６日目に、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（３０μｇ／ｍｌ）またはＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２（３０μｇ／ｍｌ）の存在または不存在下、組換えヒトＴＮＦ−アルファ（３０ｎｇ／ｍｌ）または可溶性ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを添加することにより培養物を変化させた。ＴＮＦ−アルファまたはＲＡＮＫＬは、単独で、表現型、形態学および機能的特性により測定されるような、成熟ＤＣの形成を誘発した。したがって、細胞は細胞表面ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＭＨＣＩＩのアップレギュレーションを示し、ＣＤ１ａのダウンレギュレーションを示した。未成熟細胞は、マクロ飲作用を示す、ＦＩＴＣ−デキストランの著しい接取を示すのに対して、成熟細胞は、実質的には、この能力を喪失していた。ＴＮＦ−アルファは、成熟を誘発することにおいてＲＡＮＫＬよりもより効果的であり、本質的に、成熟ＤＣの同種の集合体を生じる。対照的に、ＲＡＮＫＬでの処理は、類似の表現型の細胞の集合体を産生するが、細胞の１つのフラクション（異なるドナーから得られた単球での異なる実験において３０ないし８０％）だけが、ＲＡＮＫＬで処理した細胞においてこの表現型を示した。ＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２はｓＲＡＮＫＬで処理した細胞の成熟を遮断するが、ＴＮＦ−アルファで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。同様に、ＴＮＦＲＩ−ＦｃはＴＮＦ−アルファで処理した細胞の成熟を遮断するが、ｓＲＡＮＫＬで処理した細胞に対して影響を及ぼさなかった。したがって、ＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２はＤＣ成熟のＲＡＮＫＬ誘発の機能的活性を特異的に阻害するものである。
【００９０】
Ｃ．細胞培養物中のヒトｓＲＡＮＫＬ刺激骨髄ネズミ破骨細胞形成の阻害。骨髄細胞を生後６週のＢａｌｂ／Ｃマウスの大腿骨から集め、３回洗浄し、計数し、ついで培地（１０％のＦＣＳを捕捉したＲＰＭＩ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＲＡＮＫＬ）に再懸濁させた。これらの細胞を、Ｎｕｎｃ２４−ウェルマルチウェルプレート（４通り）中、５×１０５／ウェルでプレートし、７ないし１０日間、培養（３７℃、５％のＣＯ２）した。試験物質（例えば、抗体、ＯＰＧ−Ｆｃ）を培養の開始時に添加した。培地および試験物質を３ないし４日毎に交換した。培養期間の最後に、細胞を固定し、Ｓｉｇｍａキット３８６−１を用いて、製造業者の説明に従って、酒石酸耐性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に対して染色した。各々のウェル中の破骨細胞（３個以上の核を有するＴＲＡＰ陽性細胞として定義する）の数を顕微鏡で数えた。ＲＡＮＫＬ ＭＡｂ１９Ｈ２２およびＯＰＧ−Ｆｃは両方とも、ウェル当たりに発達した破骨細胞の数により測定する場合、１μｇ／ｍｌの濃度で完全に破骨細胞形成を阻害し、両方ともこのアッセイにおいて約２００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を示した。対照的に、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白は、１０μｇ／ｍｌで完全に阻害されたが、２μｇ／ｍｌでは効果なしであった。
【００９１】
Ｄ．ＲＡＮＫＬにより介されるヒト単球破骨細胞形成の阻害。ヒト単球を上記セクションＢの樹状細胞成熟に関して記載したように調製した。これらの細胞を６ないし８日間、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦを捕捉した５０ｎｇ／ｍｌのヒト可溶性ＲＡＮＫＬの存在下で培養し、骨吸収活性を有する破骨細胞を形成させた。阻害実験に関しては、ＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２またはＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白を培養開始時に加え、破骨細胞の形成を多核細胞の形成によりモニターした。一のアッセイにおいて、ネズミ破骨細胞形成アッセイ（上記パートＣ）における観察とは対照的に、ＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白は約５００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０でさらに活性であったのに対して、１９Ｈ２２ ＭＡｂは約４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を与えた。
要約すれば、これらの結果はＲＡＮＫＬ ＭＡｂ １９Ｈ２２はヒトＲＡＮＫＬとその受容体ＲＡＮＫの間の相互作用の強力な阻害剤である。この阻害はＲＡＮＫＬ介在ＤＣ成熟ならびに破骨細胞発達および機能の拮抗効果を導く。
【００９２】
実施例３−ＣＤＲ配列
遺伝子クローニングおよび配列分析：
可変重鎖および軽鎖遺伝子を、以下に簡単に記載する標準的な分子生物学的方法を用いてハイブリドーマ細胞からクローニングした。すべてのＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ． ＃ １５５９６−０２６）を用い、製造業者の指示に従って、ハイブリドーマ細胞から単離した。ＲＮＡをプライミング用のポリｄＴオリゴヌクレオチドを用いて、製造業者の説明（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔ． Ｎｏ． １４８３−１８８）に従って、ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて逆転写した。第１のストランドｃＤＮＡ合成に続いて、重鎖および軽鎖Ｖ領域を３’不変領域特異的プライマーおよび縮重５’プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。縮重５’プライマー配列は、可変重鎖または軽鎖領域の前もって測定されたＮ末端アミノ酸配列をコードするように設計された。多数のクローン由来の全長配列を、各々のＰＣＲ増幅物から得、一列に並べてコンセンサスを得た。したがって、重鎖および軽鎖両方に関するＤＮＡ配列の最初の１７個の塩基は、生成されたＰＣＲプライマーであるが、翻訳された蛋白の配列は天然のものである。
【国際公開パンフレット】
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