(57)【要約】式（Ｉ）：【化１】2004530428.tif 000010（式中、ＸはいずれもＯまたはＳ、ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）の構造を有する免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）、並びにそのようなＯＤＮを含む医薬組成物を記載する。
2004530428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004530428.tif 000009
（式中、ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）
の構造を有する免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）。
【請求項２】
ＮＭＰが、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれる、請求項１に記載のＯＤＮ。
【請求項３】
ａ＋ｂが１０〜６０、好ましくは１５〜４０である、請求項１または２に記載のＯＤＮ。
【請求項４】
Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方がＳであり、Ｘ3およびＸ4の少なくとも一方がＯであり、好ましくはＮＭＰがいずれもヌクレオシド−モノチオホスフェートである、請求項１ないし３のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項５】
下記配列：
ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｕ ｔｔｃ ｃｔｇ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔ
ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎ
ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈ
（式中、ｎはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｈはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｕは、デオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｗはいずれも、デオキシアデノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、および
ｄはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート）
を含む、請求項１ないし４のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項６】
２'−デオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートに３'側にて隣接した２'−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートを少なくとも一つ含む、請求項１ないし５のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項７】
下記配列：
ｇａｃｕｔｔ、
ｕａｃｕｔｔ、
ｇａｕｃｔｔ、
ｕａｕｃｔｔ
（式中、ａはデオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｇはデオキシグアノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｕはデオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｃはデオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、および
ｔはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート）
を含む、請求項１ないし６のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項８】
下記配列：
ｗｄｕ、
ｗｄｕｄ、
ｗｄｕｄｎまたは
ｗｄｕｄｕｄ
（式中、ｗ、ｄ、ｕおよびｎは前記と同じ）
を含む、請求項１ないし７のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項９】
ＢおよびＥが、−Ｈ、−ＣＨ3、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ3、−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＰＯ4、−ＰＳＯ3、−ＰＳ2Ｏ2、−ＰＳ3Ｏ、−ＰＳ4、−ＳＯ3、−ＰＯ4−(ＣＨ2)1-6−ＮＨ2または−ＰＯ4−(ＣＨ2)1-6−ＮＨ−標識よりなる群から独立に選ばれる、請求項１ないし８のいずれかに記載のＯＤＮ。
【請求項１０】
医薬、とりわけ免疫促進剤としての請求項１ないし９のいずれかに記載のＯＤＮの使用。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれかに記載のＯＤＮを含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれかに記載のＯＤＮおよび抗原を含む医薬組成物。
【請求項１３】
さらにポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌性ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンを含む、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらに活性成分、とりわけサイトカイン、抗炎症性物質、抗菌性物質またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１ないし１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
さらに補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝液物質、安定化剤またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１ないし１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１ないし９のいずれかに記載の１またはそれ以上のＯＤＮを１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含む、請求項１１ないし１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ワクチンを調製するための請求項１ないし９のいずれかに記載のＯＤＮの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）およびそのようなＯＤＮを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、他のいかなる医学的介入よりも多くの生命（および資源）を救うことができる（ノッサル（Nossal）、１９９８）。世界的なワクチン接種プログラムのおかげで多くの致死的疾患の発症率は急激に減少している。この見方は疾患の完成されたパネル（whole panel）、たとえば、結核、ジフテリア、百日咳、麻疹および破傷風にはあてはまるが、ＡＩＤＳなどの大抵のウイルス感染症を含む多数の感染疾患に対する有効なワクチンは存在しない。また、感染性であるか非感染性であるかを問わず、マラリアおよび癌を含めて毎年何百万もの患者の何百万もの人命を奪う他の疾患に対するワクチンも存在しない。さらに、抗生物質に耐性の細菌および微生物の急激な出現は他の治療を要求しており、ワクチンは必然の選択となってきている。最後に、ワクチンに対する大いなる必要性はまた、心血管性疾患または癌または創傷よりもむしろ感染疾患が世界的に死亡および不具の最大の原因であるという事実によっても説明される（ブルーム（Bloom）およびウィダス（Widdus）、１９９８）。
【０００３】
免疫学的な観点からの今日のワクチンの分野における１つの主要な問題は、伝統的なワクチン（および／またはこれら製剤に含まれる免疫変調化合物）が高レベルの抗体を誘発させるべくデザインされているということである（ハロウ（Harrow）およびレーン（Lane）、１９８８）。しかしながら、抗体自体は、ウイルス、細胞内細菌、ある種の寄生虫および癌によって引き起こされる大抵の病気を含む多数の疾患を防ぐうえでは有効ではない。そのような疾患の例は、これらに限られるわけではないが、上記ＨＩＶウイルスまたはマラリアの場合のPlasmodium種である。多くの実験系で、これら適応症には免疫系の体液性部門よりもむしろＴ細胞を含む細胞性部門が重要であることが示されている。それゆえ、従来のワクチンの限界を克服する新規で革新的な技術が必要とされている。焦点は、抗原特異的なＴ細胞（病原感染細胞上に発現された分子を認識する）を含む細胞性の免疫系を信頼性をもって誘発する技術に対するものでなければならない。理想的には、ワクチンは、正常な細胞から病気になった細胞および／または感染した細胞を識別できるＴ細胞と、それと同時に細胞外画分中の病原体を認識するＢ細胞によって分泌される抗体との両者を誘発させるべくデザインされる。
【０００４】
幾つかの確立されたワクチンは、生きた弱毒化した微生物からなるが、ビルレントな野生株に逆戻りする危険が存在する。この点は、とりわけ免疫無防備状態の宿主では生命を脅かす筋書きともなりうる。別法として、ワクチンは病原体由来の抗原をこれら抗原に対する免疫応答を誘発もしくは促進する化合物（これら化合物は一般にアジュバントと呼ばれる）と組み合わせて投与される。なぜなら、これらサブユニットワクチン自体は一般に有効でないからである。
【０００５】
上記ワクチンが価値ある医学的治療であることに疑問はないわけであるが、その複合性ゆえに、たとえばワクチン接種した個体の細胞によって発現される分子と交差反応性を示すワクチンに含まれる抗原に対して重篤な副作用が惹起されうるという不利がある。さらに、規制当局、たとえば世界保健機構（ＷＨＯ）、食品医薬品局（ＦＤＡ）、およびそれらの対応ヨーロッパ部門による、ワクチンの組成および免疫の誘発機構の正確な記述に対する現存する要求は、満たすのが難しい。
【０００６】
抗原提示細胞は先天免疫系に属しており、先天免疫系は微生物への暴露後の初期に感染を制限する第一線の宿主防御として発展してきたものである（ホフマン（Hoffmann）ら、１９９９）。先天免疫系の細胞は、獲得免疫系によって認識される一層複雑で特異的な構造ではなく、標的上に発現されたパターンないし比較的に非特異的な構造を認識する（ホフマン（Hoffmann）ら、１９９９）。先天免疫系の細胞の例はマクロファージおよび樹状細胞であるが、顆粒球（たとえば、好中球）、ナチュラルキラー細胞その他もそうである。対照的に、獲得免疫系の細胞は、Ｔ細胞の場合にはペプチドを含む特異的で抗原性の構造を認識し、Ｂ細胞の場合にはペプチド並びに三次元構造を認識する。獲得免疫系は先天免疫系に比べてはるかに特異的で複雑であり、所定の病原体／抗原への暴露を繰り返すことにより改善される。系統発生的には先天免疫系は遥かに古く、非常に原始的な生物において既に認めることができる。それにもかかわらず、先天免疫系は抗原暴露の初期相において重要である。というのは、病原体を封じ込める（containing）ことに加えて、先天免疫系の細胞、すなわちＡＰＣは獲得免疫系の細胞の初回抗原刺激を受けさせ（prime）、かくして特異的な免疫応答を惹起して侵入者の排除に導くからである。要約すると、先天免疫系の細胞、とりわけＡＰＣは、（ａ）原始的なパターン認識系により感染を封じ込めること、および（ｂ）獲得免疫系の細胞に初回抗原刺激を受けさせて特異的な免疫応答および記憶に導き、侵入してきた病原体または他の標的の排除という結果となること、によって免疫応答の誘導相の際に重要な役割を果たしている（ロイット（Roitt）ら、１９９８）。これらメカニズムはまた、腫瘍細胞を排除または封じ込めるのにも重要である。
【０００７】
上記のように、先天免疫系の細胞は、その各標的上に発現されたパターンを認識する。例を挙げると、グラム陰性細菌の場合のリポ多糖（ＬＰＳ）、ミコバクテリアの糖脂質、グラム陽性細菌のリポテイコ酸、酵母のマンナンおよびウイルスの二本鎖ＲＮＡである（ホフマン（Hoffmann）ら、１９９９）。さらに、先天免疫系の細胞は、腫瘍細胞上のタンパク質の変化したグリコシル化などのパターンを認識する。
【０００８】
最近の知見は、原生生物または下等真核生物のＤＮＡを哺乳動物（および、おそらく全てではないが大抵の脊椎動物）の先天免疫系（しかしながら、おそらく獲得免疫系も）によって認識されるさらなるパターンとして記載している（クリーグ（Krieg）、１９９６；リップフォード（Lipford）ら、１９９８）。
【０００９】
免疫系は、細菌を含む下等生物を、おそらく病原体と宿主とのＤＮＡの構造上および配列使用上の差異ゆえに認識する。とりわけ、非脊椎動物に由来するＤＮＡの短いストレッチ、あるいはある種の塩基の前後関係での非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短い合成ＯＤＮの形態のものが標的にされる（クリーグら、１９９５）。ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡでは予想された頻度で見出されるが、脊椎動物ＤＮＡでは遥かに低い頻度でしか見出されない（リップロードら、１９９８；ピゼツキー（Pisetsky）、１９９９）。さらに、非脊椎動物（すなわち、細菌）のＣｐＧモチーフはメチル化されていないのに対して脊椎動物のＣｐＧ配列はメチル化されている。これら細菌ＤＮＡと脊椎動物ＤＮＡとの差異は、脊椎動物が非脊椎動物のＤＮＡを危険なシグナルとして認識することを可能にする。
【００１０】
天然のＣｐＧ含有ＤＮＡ（ＯＤＮ）並びにＣｐＧモチーフを含有しチオホスフェート置換（ホスフェートをチオホスフェート残基と交換）されたＯＤＮ（ＣｐＧ−ＯＤＮ）は、免疫細胞増殖および体液性免疫応答の強力なアクチベーターであるのみならず（クリーグら、１９９５）、強い細胞性免疫応答をも刺激する（リップフォードら、１９９８に概説）。非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ／ＯＤＮは、単球（樹状細胞、マクロファージ）およびＢ細胞を直接活性化することができる。同様に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は直接には活性化されないが、単球由来のＩＬ−１２（インターロイキン１２）に応答し、そのＩＦＮ−γ産生は顕著に増大する（チェイス（Chace）ら、１９９７）。その結果、ＣｐＧ ＤＮＡによる単球およびＮＫ細胞の誘発は、Ｔｈ１型応答の誘導および細胞障害性Ｔ細胞の発生を促進する。
【００１１】
ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）などのようなイノシンおよびシトシンに基づくリボ核酸は、Ｔｈ１特異的な免疫応答を促進することが知られている。イノシンおよびシトシンに基づくリボ核酸は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１２などのサイトカインを産生するようにマクロファージを刺激することが知られており（マネッティ（Manetti）ら、１９９５）、強力な１型インターフェロンインデューサー（マネッティら、１９９５）および強力なＮＫ細胞スティミュレーター（カバノー（Cavanaugh）ら、１９９６）としても知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、この作用はイノシンおよびシトシン残基を含むリボ核酸に厳格に限られている（ＷＯ９８／１６２４７）。これに関連してウリジン含有リボ核酸が検討されたことはこれまでにない。
【００１３】
本発明の発明者らによる研究は、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮは免疫系を刺激するうえで有効であるが、本質的な欠点、とりわけ特異性（高いバックグラウンド）および全身的なＴＮＦ−αの高産生などの副作用に関する欠点を有することを示している。高い全身的なＴＮＦ−α放出はトキシックショック症候群を引き起こすことが知られており、これは患者の死を引き起こしうるものである。
【００１４】
それゆえ、本発明の目的は、そのようなＣｐＧ配列に基づくＯＤＮのような激しい副作用を有することのない適当な新規なＯＤＮを提供することである。さらに、本発明の目的は、知られたＯＤＮを含有する医薬組成物の副作用を低減すること、および動物、とりわけヒトを含む哺乳動物のワクチン接種に適した有効な免疫促進特性を備えた、安全かつ有効な充分に許容できる（well-tolerable）医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、式（Ｉ）：
【化１】
2004530428.tif 000003
（式中、ＸはいずれもＯまたはＳ、
ＮＭＰはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ＮＵＣは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシイノシン−、５−メチル−デオキシシトシン−、デオキシプソイドウリジン−、デオキシリボースプリン−、２−アミノ−デオキシリボースプリン−、６−Ｓ−デオキシグアニン−、２−ジメチル−デオキシグアノシン−またはＮ−イソペンテニル−デオキシアデノシンよりなる群から選ばれた２'デオキシヌクレオシド、
ａおよびｂは０〜１００の整数であり、ただしａ＋ｂは４〜１５０である、
ＢおよびＥは核酸分子の５'末端または３'末端の一般的な基）
の構造を有する免疫促進性のオリゴデオキシ核酸分子（ＯＤＮ）によって解決される。
【００１６】
驚くべきことに、デオキシウリジン残基を含むＯＤＮ（Ｕ−ＯＤＮ）がＣｐＧモチーフを含むＯＤＮに匹敵する、または多くの場合ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮよりも良好な免疫促進作用を示すことがわかった。本発明によるＯＤＮは、ＣｐＧ−ＯＤＮに比べて所定の抗原または抗原断片に対して匹敵しうるまたはより多数の特異的Ｔ細胞を誘発する。加えて本発明によるＯＤＮは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６などの炎症前（proinflammatory）サイトカインの全身的産生を誘発することはなく、それゆえ強く有害な副作用の誘発を低減させる。
【００１７】
ポリ−ＩＣすなわちＷＯ９８／１６２４７において言及された分子などのようなイノシン含有ＲＮＡ分子についてある種の免疫促進作用が記載されてはいるが、驚くべきことにデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸分子が良好な免疫促進性のＯＤＮであることがわかった。
【００１８】
さらに、本発明によるＵ−ＯＤＮは、特定のＣｐＧモチーフに基づくＯＤＮとは対照的に、ＣｐＧオリゴヌクレオチドについて記載されているような（たとえば、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５２５８１、ＷＯ９９／５１２５９およびＷＯ９９／５６７５５（すべて参照のため本明細書中に引用する）を参照）特定のモチーフまたはパリンドローム配列には依存しない。それゆえ、本発明によるＵ−ＯＤＮの一つの群はＣＵモチーフを含んでいるのが好ましい（それゆえ、これら引用した文献に記載されたＯＤＮのうちでも１またはそれ以上のグアノシン残基がデオキシウリジン残基で置換されているものは本発明のＯＤＮの好ましい態様である）。ＣＵモチーフはその主たる免疫促進特性には必要ではない、というのはＣＵまたはＵＣの文脈中にウリジンが位置していないＵ−ＯＤＮもまた免疫促進特性を示すからである。
【００１９】
それゆえ、本発明によるＵ−ＯＤＮはデオキシウリジン残基を含むＤＮＡ分子であり、一本鎖の形態で提供されるのが好ましい。
【００２０】
本発明によるＵ−ＯＤＮは、組換え法により単離するかまたは化学的に合成することができる。後者の場合、本発明によるＵ−ＯＤＮはまた修飾したオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、そのような修飾したオリゴヌクレオチドは、メチルホスホネートや他のリンベースの修飾オリゴヌクレオチド、たとえば、ホスホトリエステル、ホスホアミデートおよびホスホロジチオレートなどの標準的な化学変換を用いて合成することができる。しかしながら、他の非リンベースの修飾オリゴヌクレオチドを用いることができ（スターチャック（Stirchak）ら、３月１７日（１９８９）、６１２９−６１４１）、モノホスフェートまたはモノチオホスフェートが本発明に使用するのに好ましい２'デオキシヌクレオシドモノホスフェートである。
【００２１】
本発明によるＵ−ＯＤＮのＮＭＰは、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシイノシン−、デオキシシトシン−、デオキシウリジン−、デオキシチミジン−、２−メチル−デオキシウリジン−、５−メチル−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート（通常通り、ホスフェート基またはチオホスフェート基はデオキシリボースの５'である）よりなる群から選ばれるのが好ましい。ＣｐＧモチーフに基づくＯＤＮでは該モチーフがメチル化されていないことが必須であるが、驚くべきことに、このことは本発明によるＯＤＮの場合には当てはまらない。というのも、たとえば２−メチル−デオキシイノシンや５−メチル−デオキシシトシン残基は本発明によるＯＤＮの免疫促進特性に対していかなる一般的な悪影響をも及ぼさないからである。代わりに、ＮＭＰの２−デオキシ形に代えて、他のとりわけ不活性な基、たとえば、−Ｆ、−ＮＨ2、−ＣＨ3など、特に−ＣＨ3がリボース基の２位に位置していてよい。もちろん、−ＯＨおよびＳＨ基は、リボース、とりわけウリジンＮＭＰについてのリボース残基の２'位に存在することは本発明によるＵ−ＯＤＮでは排除される。
【００２２】
本発明によるＯＤＮの長さは、従来技術に従って使用される標準ＯＤＮの範囲内である。それゆえ、４未満および１５０を超える全長の分子は徐々に低下した免疫促進能を示す。好ましいＯＤＮは１０〜６０、とりわけ１５〜４０の塩基（ヌクレオシド）を含み、これはこれら好ましい態様において式Ｉ中のａ＋ｂが１０〜６０、好ましくは１５〜４０であることを意味する。
【００２３】
これに対して、従来技術で免疫促進性であるとして記載されているイノシンおよびシチジン含有リボ核酸分子は、分子量が２００,０００を遥かに超える大きくて比較的定められていないポリ核酸であった（Sigma Chemicalsより市販されているポリイノシン−ポリシチジン酸の分子量は２２０,０００〜４６０,０００（少なくとも５００〜１０００のＣ＋Ｉ残基）の範囲である）。本発明による分子は遥かに長さが短く、長さおよび組成がよく定められたＤＮＡ分子であり、生成物における再現性の高いものである。
【００２４】
さらに、式Ｉで示されるＵ−ＯＤＮのデオキシウリジン含有ＮＭＰが１〜４の硫黄原子を有するモノチオホスフェートであり、他のＮＭＰ、とりわけ他の全てのＮＭＰがヌクレオシドモノチオホスフェートとして存在するのが好ましい。なぜなら、そのようなＯＤＮは一層高いヌクレアーゼ耐性を示すからである（本発明において「モノチオホスフェート」中の「モノ」はホスフェートに関するものであること、すなわち各ＮＭＰ中に１つのホスフェート基（１つのリン原子）が存在することは明らかである）。好ましくは、本発明によるＮＭＰにおいて、Ｘ1およびＸ2の少なくとも一方はＳであり、Ｘ3およびＸ4の少なくとも一方はＯである。好ましくは、Ｘ3およびＸ4はＯである（Ｘ3は、（ＮＭＰの合成のために）、たとえばホスフェート基からまたはＮＭＰ−リボースの３'基から由来するものであってよい）。
【００２５】
好ましくは、本発明によるＯＤＮは下記配列を含む：
ｔｃｃ ａｔｇ ａｃｕ ｔｔｃ ｃｔｇ ｃｔｇ ａｔｇ ｃｔ
ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎ
ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈ
（式中、ｎはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｈはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシシトシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、
ｕは、デオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｗはいずれも、デオキシアデノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート、および
ｄはいずれも、デオキシアデノシン−、デオキシグアノシン−またはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートよりなる群から選ばれた２'−デオキシヌクレオシドモノホスフェートまたはモノチオホスフェート）。
【００２６】
本発明によるさらに好ましいＯＤＮは下記配列を含む：
ｗｄｕ、ｗｄｕｄ、ｗｄｕｄｎまたはｗｄｕｄｕｄ
（式中、ｗ、ｄ、ｕおよびｎは前記と同じ）。
【００２７】
上記に記載したように、本発明によるＵ−ＯＤＮには特別のモチーフ（ＣｐＧやパリンドロームなどの）は必要ない。
しかしながら、好ましい態様において式ＩによるＯＤＮが２'−デオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートに３'側にて隣接した少なくとも１つの２'−デオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェートを含んでそのような５'−ＣＵ３'−モチーフを形成するように、ＣＵモチーフを含むＯＤＮが好ましい。
【００２８】
本発明による好ましいＯＤＮは、下記配列の１またはそれ以上を含む：
ｇａｃｕｔｔ、
ｕａｃｕｔｔ、
ｇａｕｃｔｔ、
ｕａｕｃｔｔ
（式中、ａはデオキシアデノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｇはデオキシグアノシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｕはデオキシウリジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、
ｃはデオキシシトシン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート、および
ｔはデオキシチミジン−モノホスフェートまたは−モノチオホスフェート）。
【００２９】
本発明によるＵ−ＯＤＮは、医薬の分野への応用、たとえば動物またはヒトに医薬として投与するのに特に適している。本発明によるＵ−ＯＤＮは、とりわけワクチン組成物中またはワクチン組成物とともに免疫促進剤として機能するのに特に適している。
それゆえ、本発明はまた本発明によるＯＤＮを含む医薬組成物にも関する。
【００３０】
本発明による好ましい医薬組成物はワクチンであるので、該組成物は本発明によるＯＤＮの他に抗原を含んでいなければならない。この抗原がワクチン接種した個体の防御／免疫応答を引き起こす能力は、該抗原を本発明によるＯＤＮと組み合わせることにより、とりわけ該ＯＤＮの免疫促進作用によって著しく増大する。
【００３１】
ワクチンは、全く様々な異なる抗原を含んでいてよい。抗原の例は、不活化したウイルスまたは細菌、真菌、原生生物あるいは癌細胞などの殺した全生物体（whole-killed organisms）である。抗原はまた、これら生物／組織の下位画分（subfractions）、タンパク質、または最も単純な形態でペプチドからなっていてもよい。抗原はまた、グリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されてよく、多糖または脂質であるかまたは含んでいてよい。短いペプチドを用いることができる。なぜなら、たとえば細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と結合した通常８〜１１アミノ酸長の短い形態の抗原を認識するからである（ラメンシー（Rammensee）ら、Immunogenetics 41，(1995)，178-228）。Ｂ細胞は約１５アミノ酸から開始して一層長いペプチドを認識する（ハロウ（Harrow）ら、Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)）。Ｔ細胞エピトープとは対照的に、Ｂ細胞抗原の三次元構造もまた抗体による認識には重要である。持続した抗原特異的な免疫応答を得るため、必要な免疫系の全ての細胞が関与する免疫カスケードを誘起するのにアジュバントが役に立つ。主としてアジュバントは、その作用の仕方に制限はないが、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）に作用する。これら細胞は通常、まず抗原と出会い、ついでプロセシングした抗原または非修飾抗原を免疫エフェクター細胞に提示する。媒介する細胞型もまた関与していてよい。適当な特異性を有するエフェクター細胞だけが増殖性の（productive）免疫系において活性化される。アジュバントはまた、抗原および同時に注射した他の因子を局所的に保持する。さらに、アジュバントは他の免疫細胞に対する化学誘引物質として作用し、あるいは免疫系に対する刺激剤として局所的および／または全身的に作用する。
【００３２】
本発明の組成物に使用する抗原は重要ではない。好ましくは、ウイルスまたは細菌病原体に由来する、または真菌または寄生虫に由来するタンパク質またはペプチドをそのような抗原（誘導体化した抗原またはグリコシル化したまたは脂質化した（lipidated）抗原または多糖または脂質を含む）として用いる。他の好ましい抗原の採取源は腫瘍抗原である。好ましい病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型およびＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、クラミジア・ニューモニア（Chlamydia pneumonias）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ミコバクテリウム・チューバーキュローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumonias）、バシラス・アントラシス（Bacillus anthracis）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、プラスモジウム（Plasmodium）種（Pl. falciparum, Pl. vivaxなど）、アスペルギルス（Aspergillus）種またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）から選択される。抗原はまた癌細胞によって発現される分子であってもよい（腫瘍抗原）。入手（derivation）プロセスは、病原体／癌細胞からの特定のタンパク質の精製、該病原体の不活化並びにそのようなタンパク質のタンパク質分解によるまたは化学的な誘導体化または安定化を含む。同様にして、腫瘍抗原（癌ワクチン）または自己免疫抗原もまた本発明による医薬組成物に用いることができる。そのような組成物を用いて腫瘍ワクチン接種または自己免疫疾患の治療を行ってよい。
【００３３】
ペプチド抗原の場合、ペプチドのミミトープ（mimitopes）／アゴニスト／スーパーアゴニスト（superagonists）／アンタゴニストまたは免疫学的特性に影響を及ぼすことなくある位置で変化させたペプチドまたは非ペプチドのミミトープ／アゴニスト／スーパーアゴニスト／アンタゴニスト（スパービエ（Sparbier）およびウォルデン（Walden）、１９９９に概説）が本発明に含まれる。ペプチド抗原はまた、ポリカチオン性化合物または免疫促進性化合物との相互作用を容易にするためにペプチド抗原のカルボキシ末端側かまたはアミノ末端側のいずれかに伸長を含んでいてよい。自己免疫疾患の治療のためにはペプチドアンタゴニストを適用することができる。
【００３４】
抗原はまた、抗原提示および抗原提示細胞への抗原のターゲティングを促進する分子を含むように誘導体化してもよい。
【００３５】
本発明の一つの態様において、本発明の医薬組成物は自己免疫疾患に関与するタンパク質またはタンパク質断片およびペプチドに対する耐性を付与するように働く。この態様に用いる抗原は、免疫系に対して寛容にするかまたは自己免疫プロセスに関与するエピトープに対する免疫応答をダウンレギュレーションするように働く。
【００３６】
好ましくは本発明による医薬組成物、とりわけワクチンの形態の医薬組成物は、ポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチドをさらに含む。
【００３７】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない（ゴールドマン（Goldman）ら（１９８３）に記載のTuftsinを参照）。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００３８】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ガンツ（Ganz）およびレーラー（Lehrer）、１９９９；ハンコック（Hancock）、１９９９に概説されている特性を有するポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい（アンドロー（Andreu）およびリバ（Rivas）、１９９８；ガンツおよびレーラー、１９９９；シマコ（Simmaco）ら、１９９８）。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい（ガンツ、１９９９；ガンツおよびレーラー、１９９９）。そのようなペプチドの配列は、たとえば以下のインターネットアドレスの下に抗菌配列データベース（Antimicrobial Sequences Database）中に見出すことができる：
http://www.bbcm.univ.trieste. it/~tossi/pagl.html。
【００３９】
そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensives）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００４０】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（Ａ１４１６／２０００、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物である。
【００４１】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質である。たとえば、マウスカテリンは、アミノ酸配列：ＮＨ2−ＲＬＡＧＬＬＲＫＧＧＥＫＩＧＥＫＬＫＫＩＧＯＫＩＫＮＦＦＱＫＬＶＰＱＰＥ−ＣＯＯＨを有するペプチドである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、抗原および本発明による免疫原性ＯＤＮと組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫刺激性物質を用いたまたは用いないワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００４２】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸のリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである（Ａ１７８９／２０００、参照のため本明細書中に引用する）。
【００４３】
本発明による医薬組成物の免疫促進作用が、各成分単独の作用の付加から予測されるものと比較して、あるいは抗原とともに用いたＯＤＮまたはポリカチオンの作用の付加から予測されるものと比較してさえも有意に高いことは非常に驚くべきことであった。
【００４４】
式Ｉ中のＢおよびＥは、核酸分子の５'末端および／または３'末端の一般的な基である。そのような基の例は、当業者であれば容易に利用できる（たとえば、“Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach”（１９９１）、エックスタイン（Eckstein）編、オックスフォードユニバーシティープレスを参照）。本発明によるＵ−ＯＤＮについては、Ｂおよび／またはＥは、−Ｈ、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、−ＯＨ、−ＣＨＯ、ホスフェート、チオホスフェート、サルフェートまたはチオサルフェート、またはホスホアルキル基、とりわけＣ1−Ｃ6のアルキル長および／または末端アミノ基を有するもの（アミノ基は本発明によるＵ−ＯＤＮのさらなる標識に用いることができる、たとえば−ＰＯ4−(ＣＨ2)n−ＮＨ2または−ＰＯ4−(ＣＨ2)n−ＮＨ−標識など）から独立に選ばれるのが好ましい。Ｂとして特に好ましいのは、ヌクレオシド、とりわけ上記２'デオキシヌクレオチド（すなわち、ホスフェートまたはチオホスフェート基を含まない）である。あるいは、これら基はまた、他の分子、とりわけ担体分子または標識へのリンカー基を含んでいてよい。ＯＤＮが固相表面または粒子または標識に結合しているＯＤＮのそのような形態では、これら表面、粒子、標識などもＢおよび／またはＥ基の一部である。
【００４５】
もちろん、式Ｉによる分子のイオン化した（塩）形態や互変異性の形態は式Ｉに包含される。
【００４６】
本発明による医薬組成物は、さらなる活性成分（薬理学的に活性な物質）、とりわけワクチンに関連して用いることのできる物質をさらに含んでいてよい。そのようなさらなる活性成分の好ましい態様は、サイトカイン、抗炎症性物質、抗菌性物質またはそれらの組み合わせである。
【００４７】
もちろん、本発明による医薬組成物は、補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝液物質、安定化剤またはそれらの組み合わせをさらに含んでいてよい。
【００４８】
本発明の医薬組成物中の成分の相対量は、個々の抗原の必要性および該医薬組成物を投与する動物および／またはヒトに大きく依存する。それゆえ、本発明による医薬組成物は、本発明の１またはそれ以上のＯＤＮを好ましくは１ｐｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｎｇ〜１ｇ、さらに好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含むのが好ましい。抗原およびポリカチオン性ポリマーは同等の投与量で投与してよく、ワクチン当たり１〜１０,０００μｇの抗原および０.１〜１,０００μｇのポリカチオン性ポリマーが好ましい。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、患者、たとえばワクチン接種候補者に有効量にて、たとえば１週間、２週間または１ヶ月の間隔で投与してよい。本発明の医薬組成物で処置する患者はまた、繰り返しワクチン接種してもよいし、または１回だけワクチン接種してもよい。本発明の好ましい使用は、とりわけヒトまたは動物を特定の抗原に対して防御することなく能動免疫することである。
【００５０】
本発明の医薬組成物の投与経路は重要ではなく、たとえば、皮下、筋肉内、皮内または経皮注射が経口摂取とともに適している。
【００５１】
たとえば抗原／ポリカチオン組成物と別に免疫促進性物質を注射することによって、本発明の医薬組成物を別々に投与することも可能である。それゆえ、本発明はまた、第一の成分として抗原およびポリカチオン性ポリマーを含む組成物、第二の成分として免疫促進性または走化性の物質を含む組成物、を含むキットにも関する。
【００５２】
上記成分は同じ部位に同時に投与することもできるが、異なる部位に異なる時間で、または異なる期間で投与することも可能である。また、組成物または成分の全身性または局所性の投与をそれぞれ変えることも可能である。
【００５３】
本発明による免疫促進性オリゴヌクレオチド自体の有効性は、所定の時間範囲での最小有効投与量の局所的な利用可能性により定められ、オリゴヌクレオチドの半減期（インビボでは実際には殆どヌクレアーゼによる酵素的分解のみによって定められる）によって制限される。必要な時間範囲での必要な投与量の利用可能性を確保するため、（連続）高投与量の投与計画を適用できる（たとえば、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス療法の際など）。第二の好ましい戦略は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によるまたはポリカチオンの添加によるヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの安定化である。実施例に記載するように、安定化の可能性のうちの一つのみ（たとえば、好ましくはホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはポリアルギニンなどのポリカチオン性物質の添加のみ）を提供することにより、高い有効性が容易に利用できる。しかしながら、オリゴヌクレオチドをたとえばホスホロチオエートヌクレオチド間結合およびポリカチオン性物質の添加（ワクチン接種部位での定着（fixation）にも導く）の両者により安定化すれば有効性はさらに一層高くなる。
【００５４】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【００５５】
実施例１
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３を用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００５６】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００５７】
ＣｐＧ１６６８：ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５８】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００５９】
Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ：デオキシウリジンモノホスフェートを含むＯＤＮ（チオホスフェートで置換されていない）：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００６０】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ
４．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
５．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ
６．ＴＲＰ−２181-188＋ ＣｐＧ−ＯＤＮ ＋ ｐＲ６０
７．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ ＋ ｐＲ６０
８．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ ＋ ｐＲ６０
【００６１】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、ｐＲ６０、Ｕ−ＯＤＮ１３およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図１に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００６２】
この実験は、チオホスフェート置換Ｕ−ＯＤＮとともにＴＲＰ−２181-188（疎水性ペプチド）を注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独で注射した場合に比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が強く促進されることを示している。興味深いことに、ＴＲＰ−２181-188／ＣｐＧ−ＯＤＮの注射に比べ、ＴＲＰ−２181-188／Ｕ−ＯＤＮ１３の注射によって一層多数のＴＲＰ−２181-188特異的Ｔ細胞が誘発される。ポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射はこの強い免疫応答に影響を及ぼさない。対照的に、チオホスフェートで置換されていないＵ−ＯＤＮ１３ｂを用いた場合は、ポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射した場合にのみ高い免疫応答が誘発された。
【００６３】
実施例２
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチドは炎症前サイトカインの産生を誘発しない
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００６４】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００６５】
ＣｐＧ１６６８：ＣｐＧモチーフを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acg ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００６６】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００６７】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＣｐＧ１６８８
４．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
５．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ ＋ ｐＲ６０
【００６８】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射１時間後に尾静脈から採血し、血清を調製した。血清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の量を特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。
【００６９】
図２は、ＣｐＧ−ＯＤＮ１６８８の投与とは対照的に、ペプチドと組み合わせたＵ−ＯＤＮ１３の投与が炎症前サイトカインの全身性の産生を誘発しないことを示す。
【００７０】
実施例３
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３を用いたアレルゲン由来ペプチドに対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：ニワトリ卵アルブミンのＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＯＶＡ257-264−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）(Rotzschkeら、1991）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：３００μｇ／マウス。
【００７１】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００７２】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７３】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＯＶＡ257-264
２．ＯＶＡ257-264＋ ｐＲ６０
３．ＯＶＡ257-264＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
４．ＯＶＡ257-264＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ ＋ ｐＲ６０
【００７４】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＯＶＡ257-264ペプチド、無関係のペプチドＴＲＰ−２181-188、ｐＲ６０、Ｕ−ＯＤＮ１３およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図３に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００７５】
この実験は、デオキシウリジンモノホスフェート修飾したＯＤＮもまた、疎水性のペプチド（ＯＶＡ257-264）に対する免疫応答を誘発することを示している。ポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射はこの免疫応答に影響を及ぼさない。
【００７６】
実施例４
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３を用いた肥満細胞腫由来ペプチドに対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウス肥満細胞腫Ｐ８１５由来でＭＨＣクラスＩ（Ｈ２−Ｌｄ）拘束のペプチドＰ１Ａ（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ）（Letheら、１９９２）。投与量：１００μｇ／マウス。
【００７７】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００７８】
Ｕ−ＯＤＮ１３：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：tcc atg acu ttc ctg atg ctをPurimex GmbH、ゲッチンゲンにより合成。投与量：５ナノモル／マウス。
【００７９】
実験群（１群４匹のマウス）
１．Ｐ１Ａ35-43
２．Ｐ１Ａ35-43＋ ｐＲ６０
３．Ｐ１Ａ35-43＋ Ｕ−ＯＤＮ１３
４．Ｐ１Ａ35-43＋ Ｕ−ＯＤＮ１３ ＋ ｐＲ６０
【００８０】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、Ｐ１Ａ35-43ペプチド、無関係のペプチドＣＳＰ（ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ）、ｐＲ６０、Ｕ−ＯＤＮ１３およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図４に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００８１】
この実験は、デオキシウリジンモノホスフェート修飾したＯＤＮが、肥満細胞腫由来ペプチドＰ１Ａ35-43に対する強い免疫応答を誘発することを示している。この応答はポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射することによってさらに促進することができる。
【００８２】
実施例５
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１５、２０ｍｅｒ）のカクテルによるメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の誘発
本発明によるデオキシウリジン塩基に基づくオリゴヌクレオチドの有効性が（たとえば、特定の塩基、塩基モチーフまたは塩基配列により）配列の残りの部分に依存しないことを示すため、これらオリゴヌクレオチドのそれぞれについて別々の形態で試験する可能性が考えられる。しかしながら、このことは実際には不可能であるため（たとえば、２０ｍｅｒであれば２.７×１０11の異なる配列を包含する）、本実施例では配列からのそのような独立性を証明するために他の方法を選択した。本実施例の目的はできるだけ多数の配列を同時に試験することであった。なぜなら合成ではなくインビボ試験のみが制限するものだからである。この理由から９０億以上の異なる配列を含む本実施例のＵ−ＯＤＮ１５（下記参照）を調製した。それゆえ、いずれの単独の免疫促進性の配列についても有効量の１０-9倍に希釈されることになる。デオキシウリジン残基が存在することのみが全ての配列に共通することであり、それゆえ希釈されない。それゆえ、もしもデオキシウリジン以外の配列モチーフが免疫促進性オリゴヌクレオチドの有効性に重要であるのなら、そのようなモチーフは高い希釈ゆえにＵ−ＯＤＮ１５では有効でないであろう。反対に、もしもデオキシウリジンが有効性に必須であり配列の残りの部分が有意でないのであれば、Ｕ−ＯＤＮは有効であるに違いない。
【００８３】
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００８４】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ〜０.１μｇ／マウス。
【００８５】
Ｕ−ＯＤＮ１５：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｎｈｈ ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈｈｈ ｈｈｈ ｗｎ（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル〜０.００５ナノモル／マウス。
【００８６】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０（１００μｇ）
３．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（５ナノモル）
４．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.５ナノモル）
５．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.０５ナノモル）
６．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.００５ナノモル）
７．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０（１００μｇ） ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（５ナノモル）
８．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０（１０μｇ） ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.５ナノモル）
９．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０（１μｇ） ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.０５ナノモル）
１０．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０（０.１μｇ） ＋ Ｕ−ＯＤＮ１５（０.００５ナノモル）
【００８７】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、ｐＲ６０、Ｕ−ＯＤＮ１５およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図５に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００８８】
この実験は、デオキシウリジンモノホスフェート修飾したＯＤＮ（２０ｍｅｒ、５ナノモル）のカクテルとともにＴＲＰ−２181-188（疎水性ペプチド）を注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独の注射と比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が強く促進されることを示している。１０倍少ない量のＵ−ＯＤＮ１５（０.５ナノモル）を用いたときでさえも、強い免疫応答を誘発することができた。ペプチドおよびＵ−ＯＤＮ１５（５ナノモル）とともにポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射してもこの強い応答には影響を及ぼさない。
【００８９】
実施例６
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１６、１０ｍｅｒ）のカクテルによるメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の誘発
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００９０】
Ｕ−ＯＤＮ１６：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈ（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：１０ナノモル／マウス。
【００９１】
ＯＤＮ２０：チオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｈｈｈ ｗｄｄ ｄｈｈ ｈ（ｎ＝ＧＣＡＴ、ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：１０ナノモル／マウス。
【００９２】
実験群（１群４匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ Ｕ−ＯＤＮ１６（１０ナノモル）
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ２０（１０ナノモル）
【００９３】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、Ｕ−ＯＤＮ１６、ＯＤＮ２０およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図６に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【００９４】
この実験は、デオキシウリジンモノホスフェート修飾したＯＤＮ（１０ｍｅｒ）のカクテルとともにＴＲＰ−２181-188（疎水性ペプチド）を注射すると、ＴＲＰ−２181-188単独またはＯＤＮ２０と組み合わせた注射と比べてＴＲＰ−２181-188特異的な免疫応答が強く促進されることを示している。
【００９５】
実施例７
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドＯＤＮ２１またはＯＤＮ２２を用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【００９６】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【００９７】
ＯＤＮ２１：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｕａｕ ａｕａ ｕａｕ ａｕａ ｕａｕ ａｕａ ｕａｕ ａｕａ ｕａをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００９８】
ＯＤＮ２２：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｕｉｕ ｉｕｉ ｕｉｕ ｉｕｉ ｕｉｕ ｉｕｉ ｕｉｕ ｉｕｉ ｕｇをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【００９９】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ２１
４．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ２１
５．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ２２
６．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ２２
【０１００】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、ｐＲ６０、ＯＤＮ２１または２２およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図７に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【０１０１】
実施例８
デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドＯＤＮ２４を用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【０１０２】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【０１０３】
ＯＤＮ２４：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮ：ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｕｕ ｕｔをNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１０４】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ２４
４．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ２４
【０１０５】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、ｐＲ６０、ＯＤＮ２４およびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図８に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【０１０６】
実施例９
種々のデオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴヌクレオチドを用いたメラノーマ由来ペプチド（ＴＲＰ−２181-188）に対する特異的免疫応答の生成
実施例５の結果をさらに説明および強化するため、Ｕ−ＯＤＮ１６（実施例６に記載）に基づくさらなる実施例を行った。比較の理由から、特定の塩基を配列中に含まない変化物を用いた。Ｕ−ＯＤＮ１６−Ａはアデニンを含まず、Ｕ−ＯＤＮ１６−Ｃはシトシンを含まず、Ｕ−ＯＤＮ１６−Ｇはグアニンを含まず、Ｕ−ＯＤＮ１６−Ｔはチミンを含まない。もしもデオキシウリジン以外の特定の他の塩基が有効性にとって必要であるなら、対応するオリゴヌクレオチドは有効性を示さないに違いない。しかしながら、もしもデオキシウリジンが有効性にとって充分であるなら、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞は生成する。
【０１０７】
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan/Olac）
ペプチド：マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）拘束エピトープであるＴＲＰ−２−ペプチド（ＶＹＤＦＦＶＷＬ）(Ｂ１６メラノーマ、Bloom，M．B．ら、J．Exp．Med．1997，185，453-459）を標準固相Ｆ−ｍｏｃ合成法により合成し、ＨＰＬＣ精製し、ついで純度をマススペクトロメトリーにより分析した。投与量：１００μｇ／マウス。
【０１０８】
ポリ−Ｌ−アルギニン６０（ｐＲ６０）：平均重合度が６０アルギニン残基のポリ−Ｌ−アルギニン；SIGMA chemicals。投与量：１００μｇ／マウス。
【０１０９】
ＯＤＮ１６：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｈｈｈ ｗｄｕ ｄｈｈ ｈ（ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１０】
ＯＤＮ１６−Ａ：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ａａａ ｂｃｕ ｃａａ ａ（ａ＝ＣＴ、ｂ＝Ｔ、ｃ＝ＧＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１１】
ＯＤＮ１６−Ｇ：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｈｈｈ ｗｗｕ ｗｈｈ ｈ（ｈ＝ＣＡＴ、ｗ＝ＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１２】
ＯＤＮ１６−Ｃ：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｗｗｗ ｗｄｕ ｄｗｗ ｗ（ｗ＝ＡＴ、ｄ＝ＧＡＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１３】
ＯＤＮ１６−Ｔ：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｅｅｅ ｆｇｕ ｇｅｅ ｅ（ｅ＝ＣＡ、ｆ＝Ａ、ｇ＝ＧＡ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１４】
ＯＤＮ２８：デオキシウリジンモノホスフェートを含むチオホスフェート置換ＯＤＮのカクテル：ｈｈｈ ｘｄＵ ｄｈｈ ｙ（ｈ＝ＣＡＴ、ｘ＝Ｔ、ｄ＝ＧＡＴ、ｙ＝ＧＴ）をNAPS GmbH、ゲッチンゲンにより合成した。投与量：５ナノモル／マウス。
【０１１５】
実験群（１群５匹のマウス）
１．ＴＲＰ−２181-188
２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０
３．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ１６
４．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ１６−Ａ
５．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ１６−Ｇ
６．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ１６−Ｃ
７．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ１６−Ｔ
８．ＴＲＰ−２181-188＋ ＯＤＮ２８
９．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ１６
１０．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ１６−Ａ
１１．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ１６−Ｇ
１２．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ１６−Ｃ
１３．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ１６−Ｔ
１４．ＴＲＰ−２181-188＋ ｐＲ６０ ＋ ＯＤＮ２８
【０１１６】
第０日目にマウスの後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（各足当たり５０μｌ）を注射した。注射４日後に動物を屠殺し、膝窩リンパ節を回収した。リンパ節を７０μｍ細胞濾過器に通し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、SIGMA Chemicals）を含むＤＭＥＭ培地（GIBCO BRL）で２回洗浄した。細胞をＤＭＥＭ／５％／ＦＣＳ中に適当な細胞数に調節した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを記載に従って（Miyahiraら、1995）３回行った。この方法は、抗原特異的なＴ細胞の定量を可能にする方法として広く用いられているものである。リンパ球を培地（バックグラウンド−対照）、ＴＲＰ−２181-188−ペプチド、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、ｐＲ６０、種々のＯＤＮおよびコンカナバリンＡ（ConA）とともに３つずつイクスビボにて刺激した。単一のＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を表しているスポットをカウントし、全ての試料からバックグラウンドスポットの数を差し引いた。ConAで刺激した後に検出されるスポットの数が多いことは（データは示していない）、使用したリンパ球が良好な条件にあることを示している。マウスの各実験群に対してＩＦＮ−γ産生細胞／１×１０6細胞の数を図９に示してあり、イクスビボ刺激した３つの実験の標準偏差を示してある。
【０１１７】
図９は全ての配列が有効であることを明らかに示しており、このことからデオキシウリジン含有オリゴヌクレオチドは有効性のために塩基の周辺または塩基を定めるいかなる特定の配列（たとえば、特定の配列モチーフ）も必要ないという結論が導かれる。この結論はまた、Ｕ−ＯＤＮ２１（デオキシウリジンおよびデオキシアデノシンのみを含有）、Ｕ−ＯＤＮ２２およびＵ−ＯＤＮ２４（天然のＤＮＡ塩基をもはや全く含有しない）によっても証明された。それゆえ、本発明によるオリゴヌクレオチドの有効性はデオキシウリジン自体に基づくものであり、天然のＤＮＡに存在する特定の塩基モチーフや特定の塩基は必要ない。
【０１１８】
参照文献
【表１】
2004530428.tif 000004
【０１１９】
【表２】
2004530428.tif 000005
【０１２０】
【表３】
2004530428.tif 000006
【０１２１】
【表４】
2004530428.tif 000007
【０１２２】
【表５】
2004530428.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、チオホスフェート置換デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１３）が、ポリ−Ｌ−アルギニンの存在下または不在下、メラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対して強い免疫応答を誘発することを示しており、この免疫応答はＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８またはＣｐＧ−ＯＤＮ１６６８／ポリ−Ｌ−アルギニンによって誘発される免疫応答よりも高い。さらに、図１は、チオホスフェートで置換されていないＵ−ＯＤＮ（Ｕ−ＯＤＮ１３ｂ）をポリ−Ｌ−アルギニンの同時注射の後にのみ使用したときに、強いペプチド特異的な免疫応答が誘発されることを示す。マウスの後ろ足にＴＲＰ−２181-188、ＴＲＰ−２181-188とポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ６０）かまたはＵ含有オリゴデオキシヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３／１３ｂのいずれか、またはＴＲＰ−２181-188とｐＲ６０およびＵ−ＯＤＮ１３／１３ｂの両者を注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドＯＶＡ257-264で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をＩＦＮ−γ産生細胞数／１×１０6リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【０１２４】
【図２】デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１３）が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の全身性の産生を誘発しないことを示す。マウスの後ろ足にＴＲＰ−２181-188、ＴＲＰ−２181-188とポリ−Ｌ−アルギニンかまたはＣｐＧ１６８８かまたはＵ−ＯＤＮ１３のいずれか、またはＴＲＰ−２181-188およびポリ−Ｌ−アルギニンとＵ−ＯＤＮ１３との組み合わせを注射した。注射１時間後に尾静脈から採血し、血清を調製した。血清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【０１２５】
【図３】デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１３）が、卵アルブミン由来ペプチドＯＶＡ257-264（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対する免疫応答を誘発することを示す。マウスの後ろ足にＯＶＡ257-264単独、ＯＶＡ257-264とポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ６０）かまたはＵ含有オリゴデオキシヌクレオチドＵ−ＯＤＮ１３のいずれか、またはＯＶＡ257-264とｐＲ６０およびＵ−ＯＤＮ１３の両者の組み合わせを注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＯＶＡ257-264、無関係のペプチドｍＴＲＰ−２181-188（マウスチロシナーゼ関連タンパク質−２、ＶＹＤＦＦＶＷＬ）、Ｕ−ＯＤＮ１３およびｐＲ６０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をＩＦＮ−γ産生細胞数／１×１０6リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【０１２６】
【図４】デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１３）が、肥満細胞腫由来ペプチドＰ１Ａ35-43（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ）に対する強い免疫応答を誘発することを示す。この免疫応答はポリ−Ｌ−アルギニンを同時に注射することによってさらに促進することができる。マウスの後ろ足にＰ１Ａ35-43単独、Ｐ１Ａ35-43とポリ−Ｌ−アルギニンかまたはＵ−ＯＤＮ１３のいずれか、またはＰ１Ａ35-43とｐＲ６０およびＵ−ＯＤＮ１３の両者の組み合わせを注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＰ１Ａ35-43、無関係のペプチドＣＳＰ（ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ）、Ｕ−ＯＤＮ１３およびｐＲ６０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をＩＦＮ−γ産生細胞数／１×１０6リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【０１２７】
【図５】デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１５）のカクテルが、ポリ−Ｌ−アルギニンの存在下または不在下、メラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対して強い免疫応答を誘発することを示す。マウスの後ろ足にＴＲＰ−２181-188、ＴＲＰ−２181-188とポリ−Ｌ−アルギニン（ｐＲ６０）かまたはＵ含有オリゴデオキシヌクレオチドカクテルＵ−ＯＤＮ１５のいずれか、またはＴＲＰ−２181-188とｐＲ６０およびＵ−ＯＤＮ１５の両者の組み合わせを注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、Ｕ−ＯＤＮ１５またはｐＲ６０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をＩＦＮ−γ産生細胞数／１×１０6リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。ｐＲを用いた長期持続免疫応答の誘発を示す。
【０１２８】
【図６】デオキシウリジンモノホスフェート修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（Ｕ−ＯＤＮ１６）のカクテルが、メラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対して強い免疫応答を誘発することを示す。この免疫応答は、ＴＲＰ−２181-188単独またはＯＤＮ２０（デオキシウリジンモノホスフェートを有しないオリゴヌクレオチドカクテル）と組み合わせて注射後の免疫応答に比べて高い。マウスの後ろ足にＴＲＰ−２181-188、ＴＲＰ−２181-188とＵ含有オリゴデオキシヌクレオチドカクテルＵ−ＯＤＮ１６かまたはオリゴヌクレオチドカクテルＯＤＮ２０のいずれかを注射した。４日後、水切りしたリンパ節細胞をイクスビボにてＴＲＰ−２181-188、無関係のペプチドＯＶＡ257-264、Ｕ−ＯＤＮ１６またはＯＤＮ２０で刺激した。２４時間後にＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて決定した。結果をＩＦＮ−γ産生細胞数／１×１０6リンパ節細胞として３回の試行の標準偏差とともに表してある。
【０１２９】
【図７】Ｕ−ＯＤＮ２１およびＵ−ＯＤＮ２２を用いたメラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対する特異的免疫応答の生成を示す。
【０１３０】
【図８】Ｕ−ＯＤＮ２４を用いたメラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対する特異的免疫応答の生成を示す。
【０１３１】
【図９】種々のＵ−ＯＤＮを用いたメラノーマ由来ペプチドＴＲＰ−２181-188に対する特異的免疫応答の生成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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