(57)【要約】免疫化部位に抗原−提示細胞（ＡＰＣ）を豊富化する際に使用するために、生物学的アジュバントとして機能させることにより抗原または免疫学的エピトープに対する免疫学的応答を向上するために、好中球減少症を予防しまたは治療するために、そして骨髄形成異常症候群を治療するために、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする複製−欠損組換えポックスウィルスを開示する。抗原−特異的免疫学的応答を向上させるため、特に抗−腫瘍療法のための腫瘍抗原応答を向上させるため、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損組換えウィルスを、単独でまたは抗原をコードし、そして場合により免疫促進性分子をコードする組換えウィルスを組み合わせて含む組成物を開示する。免疫化部位にＡＰＣを豊富化するための方法およびＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損組換えポックスウィルスを使用して抗原または免疫学的エピトープに対する免疫学的応答を向上させるための方法を開示する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損組換えトリポックスウィルスを使用することの、組換えＧＭ−ＣＳＦを使用することを越える卓越性を記載する。
2004507231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球−単球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする複製−欠損ウィルスおよび薬剤学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
複製−欠損ウィルスがヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ウィルスが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにアクセッション番号Ｎｏ． ＰＴＡ−２０９９として寄託された、ｐＴ５０５２と命名されたプラスミドベクターを使用して産生される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
複製−欠損ウィルスがポックスウイルスである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
複製−欠損ウィルスがアビポックスウイルスである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アビポックスウィルスが鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、ＭＶＡ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
複製−欠損ウィルスが少なくとも一つの抗原またはその免疫学的なエピトープをさらにコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗原が、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織−特異的抗原、細菌性抗原、ウィルス性抗原、酵母性抗原、真菌性抗原、原虫性抗原、寄生虫性抗原およびマイトジェンからなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
免疫学的エピトープが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも一つの共刺激分子をコードするベクターをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
共刺激分子がＢ７．１である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
共刺激分子がＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
αインターフェロン、βインターフェロン、またはγインターフェロンをコードするベクターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
少なくとも一つのサイトカインをコードするベクターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
Ｆｃ受容体−指向的二重特異性抗体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Ｆｃ受容体が、ＦｅγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｅγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
抗体が抗−ＣＤ３−指向的抗体である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
二重特異性抗体が腫瘍−指向的特異性を有する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
特異性がＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ−受容体、ＣＤ１５抗原およびＥｐＣＡＭ分子からなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
少なくとも一つの抗原または免疫学的なエピトープ源、および場合により慣習的なアジュバントをさらに含む、請求項１〜１６に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
慣習的なアジュバントが、Ｒｉｂｉ ＤｅｔｏｘＴＭ、ミョウバン、ＱＳ−２１、フロイントの完全アジュバント、およびフロイントの不完全アジュバントからなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
抗原または免疫学的なエピトープ源が、タンパク質、ペプチド、抗体、抗−イディオタイプ抗体、脂質、炭水化物、細胞、細胞抽出物、細胞フラグメント、抗原またはその免疫学的エピトープをコードするＤＮＡ、抗原またはその免疫学的エピトープをコードするＲＮＡ、または少なくとも一つの抗原またはその免疫学的エピトープをコードするベクターである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
抗原が、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織−特異的抗原、細菌性抗原、ウィルス性抗原、酵母性抗原、真菌性抗原、原虫性抗原、寄生虫性抗原およびマイトジェンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
免疫学的エピトープが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
細菌性抗原が、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、Ａ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｃｉｚｚａｅ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ウィルス性抗原が、レンチウィルス、レトロウィルス、、ヘルペスウィルス、肝炎ウィルス、オルソミクソウィルスおよびパピローマウィルスからなる群から選択されるウィルスに由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
レンチウィルスがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ヘルペスウィルスがＨＳＶまたはＣＭＶである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
肝炎ウィルスが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎またはＥ型肝炎である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
オルソミクソウィルスがインフルエンザウィルスである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原または組織−特異的抗原が、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異させたｒａｓオンコジーン、正常または点変異させたｐ５３、過剰発現されたｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣＡ Ｉ、ＢＲＣＡ ＩＩ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、修飾ＴＡＡ類、ＴＡＡ類のスプライス変異体、これらの機能性エピトープおよびエピトープアゴニストからなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３３】
酵母性抗原または真菌性抗原が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ヒストプラズモーシス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）からなる群から選択される酵母または真菌に由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３４】
寄生虫性抗原がプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノゾーマ（Ｔｒｙｐａｓｏｓｏｍａ）種、またはリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種に由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３５】
抗原またはその免疫学的エピトープをコードするベクターが、ポックスウイルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、アルファウィルス、ピコルナウィルス、イリドウィルス、ＤＮＡプラスミド、およびＲＮＡからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３６】
ポックスウィルスが、オルソポックス、アビポックス、カプリポックスまたはスイポックスである、請求項３５に記載の組成物
【請求項３７】
抗原が、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織−特異的抗原、細菌性抗原、ウィルス性抗原、酵母性抗原、真菌性抗原、原虫性抗原、寄生虫性抗原、およびマイトジェンからなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
免疫学的エピトープが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
抗原または免疫学的エピトープ源が、少なくとも一つの抗原またはその抗原性エピトープをコードするベクターである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４０】
ベクターが、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＯＸ−４０Ｌ、ＶＣＡＭ−１、これらの哺乳動物ホモログおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの共刺激分子をコードする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４１】
共刺激分子がＢ７．１である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
共刺激分子が少なくともＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスがアビポックスであり、抗原源がＣＥＡまたはそのエピトープをコードするベクターであり、および共刺激分子がＢ７またはＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
サイトカイン、ケモカインまたはＦｌｔ−３Ｌをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも一つの抗生物質、抗真菌剤、抗−ウィルス剤またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
エリスロポエチンをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
エリスロポエチンが組換え的に産生される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項１〜１５および２１〜４７のいずれか１項に記載のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスで感染され、トランスフェクトされ、または誘導された宿主細胞。
【請求項４９】
抗原提示細胞またはその前駆細胞、前悪性細胞、過形成細胞、腫瘍細胞、または抗原提示細胞と融合させた腫瘍細胞である、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
抗原提示細胞が樹状細胞またはその前駆細胞もしくは誘導体、単球、マクロファージ、Ｂ−細胞、線維芽細胞または筋肉細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
抗原提示細胞が、骨髄、脾臓、皮膚、末梢血、腫瘍、リンパ節、または筋肉に由来する、請求項４９または５０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
誘導体が、ＴＮＦα−処理樹状細胞、ＣＤ４０−処理樹状細胞、または付着細胞の部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
組換え複製−欠損ウィルスにより提供されるＧＭ−ＣＳＦをコードする外来性核酸配列を含む、樹状細胞またはその前駆細胞。
【請求項５４】
組換え複製−欠損ウィルスにより提供されるＧＭ−ＣＳＦをコードする外来性核酸配列を含む、腫瘍細胞またはその前駆細胞。
【請求項５５】
少なくとも一つの共刺激分子をコードする外来性核酸配列をさらに含む、請求項５３または５４に記載の細胞。
【請求項５６】
共刺激分子が、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＯＸ−４０Ｌ、ＶＣＡＭ−１、これらの哺乳動物ホモログ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
共刺激分子がＢ７．１である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
複数の共刺激分子が少なくともＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３である、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５９】
少なくとも一つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性核酸配列をさらに含む、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６０】
少なくとも一つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性核酸配列が組換えベクター、腫瘍細胞溶解物に由来するＲＮＡまたはＤＮＡにより、または前記配列を含む腫瘍細胞との融合により提供される、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
標的抗原またはその免疫学的エピトープが、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織−特異的抗原、細菌性抗原、ウィルス性抗原、酵母性抗原、真菌性抗原、原虫性抗原、寄生虫性抗原およびマイトジェンからなる群から選択される、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
免疫学的エピトープがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含む、請求項５９または６０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６３】
請求項５３〜６２のいずれか１項に記載の細胞、および場合により標的抗原またはその免疫学的エピトープの外来性供給源を含む、医薬組成物。
【請求項６４】
免疫応答を向上させるために十分な量の請求項１〜１５および２１〜４７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、個体における免疫応答を向上させる方法。
【請求項６５】
投与経路が、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、経膀胱内薬液注入、鼻内、動脈内、嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）または経乱刺（ｖｉａ ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
向上が、注入部位、局所リンパ節、腫瘍部位、またはこれらの組み合わせでの抗原提示細胞の遊走である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
抗原提示細胞がＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋、ＭＨＣクラスＩＩ、またはこれらの組み合わせを発現する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
向上が抗原提示細胞の増殖または機能の向上もしくはこれらの組み合わせである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
免疫応答の向上が、細胞媒介性応答または体液性応答の向上である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
向上が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化の向上、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の向上、またはこれらの組み合わせである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
向上が、ＩＬ−２産生の向上、ＩＦＮ−γ産生の向上、ＴＮＦ−α産生の向上、またはこれらの組み合わせである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
標的抗原またはその免疫学的エピトープに対する個体における抗原−特異的Ｔ−細胞応答を向上させる方法であって、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ポックスウィルスを、標的抗原またはその免疫学的エピトープをコードする核酸配列および場合により少なくとも一つのＢ７分子をコードする外来性核酸配列、ＩＣＡＭ−１をコードする外来性核酸配列、およびＬＦＡ−３をコードする核酸配列もまた含む組換えウィルスとともに、少なくとも一つのＴ−細胞応答を向上させるために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項７３】
向上が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化の向上、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の向上、またはこれらの組み合わせである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
向上が、ＩＬ−２産生の向上、ＩＦＮ−γ産生の向上またはこれらの組み合わせである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
向上が、抗原−特異的細胞傷害性の向上である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
腫瘍を有する個体において抗−腫瘍応答を向上させる方法であって、請求項１〜１５または２１〜４７に記載の組成物を抗−腫瘍応答を向上させるために有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項７７】
標的抗原またはその免疫学的エピトープ、標的抗原またはその免疫学的エピトープを発現する細胞、または標的抗原またはその免疫学的エピトープでパルス化した細胞を投与することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
組成物を、腫瘍中にまたは腫瘍に隣接してｉｎ ｓｉｔｕで直接的に注入する、請求項７６または７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
腫瘍が、頭部腫瘍、頸部腫瘍、メラノーマ、胸部腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、結腸直腸腫瘍、または転移性腫瘍である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
腫瘍が転移性胸部皮膚病変である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
組成物が外科処置中に注入される、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
腫瘍が結腸直腸癌または膵臓癌である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
組成物を腫瘍部位腫瘍部位から離れているリンパ節または腫瘍部位に排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）しているリンパ節に注入する、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
活性化された標的抗原特異的リンパ球を投与することをさらに含む、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
抗−腫瘍応答が、腫瘍退行、疾患が存在しない間隔の増大、または生存の増加である、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の細胞を、免疫応答を向上させるために十分な量で投与することを含む、個体における免疫応答を向上させる方法。
【請求項８７】
請求項４９または５４に記載の腫瘍細胞、またはこの前駆細胞を、免疫応答を向上させるために十分な量で投与することを含む、個体における免疫応答を向上させる方法。
【請求項８８】
細胞が、当該個体の自己由来、当該個体と同系もしくは同種異系である、請求項８６または８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
細胞を標的抗原またはそのエピトープでパルスした、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項９０】
標的細胞、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをさらに含む、請求項８６または８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
活性化された、標的抗原特異的リンパ球を投与することをさらに含む、請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする第一の組換えベクターを投与した後、ＧＭ−ＣＳＦをコードする第二の組換えベクターを投与することを含む、個体における抗原またはその免疫学的なエピトープに対する免疫応答を向上させる方法であって、ここで少なくとも一つの組換えベクターが複製−欠損ウィルスである、前記方法。
【請求項９３】
複製−欠損ウィルスが、ポックスウイルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルスおよびアデノ−関連ウィルスからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ポックスウィルスが、鶏痘ウイルス、カナリアポックスおよび修飾ワクシニアアンカラ系統からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
第二の組換えベクターが、複製能を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
第二のベクターが、ワクシニアである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、好中球減少症を治療するために有効な量で投与することを含む、個体における好中球減少症を治療する方法。
【請求項９８】
抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、または抗ウィルス剤を投与することをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
好中球減少症が、化学療法、コルチコステロイド療法、放射線照射、または感染の結果として生じる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
用量が、好中球カウントを正常レベルまで上昇させる、請求項９７〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、エリスロポエチンとともに、血球減少症を治療するために有効な量で投与することを含む、骨髄性形成異常症候群を有する患者における血球減少症を治療するための方法。
【請求項１０２】
約１０５〜約１０１０ ｐｆｕの範囲の用量のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、１週間おきまたは１ヶ月おきに投与する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
約１５０〜約３００ ｕ／ｋの範囲の用量のエリスロポエチンを投与する、請求項１０１または１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
用量を一日おきに提供する、請求項１０１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
治療により、好中球カウントおよび赤血球前駆細胞が増加される、請求項１０１〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスを、二重特異性抗体と組み合わせて投与することを含む、抗腫瘍免疫応答を向上させる方法。
【請求項１０７】
二重特異性抗体が、腫瘍−指向的特異性を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
二重特異性抗体が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ−受容体、ＣＤ１５抗原およびＥｐＣＡＭ分子からなる群から選択される特異性を有する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
二重特異性抗体が、腫瘍細胞エピトープおよび細胞毒性誘因分子に対して指向性である、請求項１０７〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
ワクチン接種部位または局所性リンパ節に、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスを、ワクチンに対する免疫応答を向上させるために有効な量で投与することを含む、ワクチン接種に対する免疫応答を向上させる方法。
【請求項１１１】
ワクチンが少なくとも一つの腫瘍抗原または腫瘍関連抗原を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
ワクチンが、ＤＰＴワクチン、Ｔｄワクチン、ＤｔａＰワクチン、Ｈｉｂワクチン、ＤｔａＰ−Ｈｉｂワクチン、ＭＭＲワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ライム病ワクチン、インフルエンザワクチン、４価髄膜炎菌多糖、肺炎球菌多糖ワクチン、炭疽菌ワクチン、コレラワクチン、ペストワクチン、黄熱ワクチンおよびカルメット−ゲラン杆菌ワクチンからなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
顆粒球−単球−コロニー刺激因子をコードする複製−欠損ウィルスを含む、免疫学的なアジュバント。
【請求項１１４】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにアクセッションＮｏ． ＰＴＡ−２０９９として寄託された、ヒト顆粒球−単球−コロニー刺激因子をコードするプラスミドベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、免疫応答を向上させる際に使用するための、そして好中球減少症および骨髄形成異常症候群を治療するための、サイトカイン、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する組換え複製−欠損ウィルスに関する。より具体的には、本発明は、免疫応答、特に抗−腫瘍応答を向上させるための、そして好中球減少症および骨髄形成異常症候群を治療するための生物学的なアジュバントとしての使用のための、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え複製−欠損トリポックスウィルスおよびこれを含む組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
ランゲルハンス細胞および樹状細胞のための主要な刺激性サイトカインとしてのその作用により（１−３）、ＧＭ−ＣＳＦ５は、生物学的ワクチンアジュバントとして機能すると考えられる。実験的研究および臨床的研究により、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質により様々な免疫源に向けられた宿主免疫をブーストできることが示唆される（４−１４）。それらの研究のほとんどにおいて、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質（ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ）を、抗原とともに注入することから始めて、４〜５日連続して投与した（１５）。その他のアプローチにより、ＤＮＡプラスミド（１６、１７）、融合タンパク質（１８）、レトロウィルスベクター（１９、２０）および複製能を有するワクシニアベクター（４５）中のＧＭ−ＣＳＦが送達され、それらのすべてが、そのほとんどの部分について、宿主免疫を増大させた。ワクシニア−ＧＭ−ＣＳＦ組換えウィルスを使用することは、宿主抗−ベクター免疫応答のために繰り返し注入が問題のある可能性があることから（２３）、問題である。複製−欠損トリポックスウィルスを、サイトカイン遺伝子産物を発現するように構築し（２４、２５）そしてＧＭ−ＣＳＦを免疫化部位に送達するために先行技術の方法よりも適していることを本明細書中で示した。
【０００３】
発明の概要
本発明の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを単独で、または抗原源またはエピトープ源と組み合わせて含む組成物である。
【０００４】
本発明のさらなる観点は、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗原またはその免疫学的なエピトープ、特に１またはそれより多い腫瘍関連抗原の両方をコードする組換え複製−欠損ウィルスを含む組成物である。
【０００５】
本発明の別の観点は、抗原を発現するベクターと組み合わせたＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは少なくとも一つの免疫促進性分子とともに含む組成物である。
【０００６】
本発明のさらなる観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ポックスウィルスを、単独でまたは少なくとも１つの免疫促進性分子をコードする遺伝子とともにまたは伴わずに少なくとも１つの抗原またはその免疫学的なエピトープを発現するベクターとともに含む組成物である。
【０００７】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換えアビポックスウィルスを、単独でまたは少なくとも１つの免疫促進性分子をコードする遺伝子とともにまたは伴わずに少なくとも１つの腫瘍−関連抗原またはその免疫学的なエピトープを発現するベクターとともに含む組成物である。
【０００８】
本発明の一観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、少なくとも１つの免疫促進性分子をコードする遺伝子とともにまたは伴わずに少なくとも１つの抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する組換え複製−欠損ウィルスとともに含む組成物である。
【０００９】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損トリポックスウィルスを、少なくとも１つの抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する組換え複製−欠損トリポックスウィルスとともに含む組成物である。
【００１０】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製欠損ウィルスを、抗生物質、抗真菌剤、抗−寄生虫剤、抗−ウィルス剤、またはこれらの組み合わせとともに含む組成物である。
【００１１】
本発明のさらに別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスをエリスロポエチンとともに含む組成物である。
本発明はさらに、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、二重特異性抗体とともに含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、宿主細胞中でＧＭ−ＣＳＦの発現を引き起こすＧＭ−ＣＳＦ分子をコードする組換え複製−欠損ウィルスの第一のベクターにより感染させた宿主細胞を提供する。第二のベクターは、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子および／または１またはそれより多い共刺激分子をコードする外来性遺伝子を、宿主細胞に対してさらに提供することができる。
【００１３】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦの発現を引き起こすＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの第一のベクターで感染させた抗原−提示細胞（ＡＰＣ）または腫瘍細胞を提供する。第二のベクターは、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子および／または１またはそれより多い共刺激分子をコードする遺伝子を、宿主細胞に対してさらに提供することができる。
【００１４】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦの発現を引き起こす組換えアビポックスウィルスにより感染させた宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞はまた、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターおよび／または少なくとも１つの免疫促進性分子をコードする組換えベクターで感染させることもできる。
【００１５】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスにより感染させた樹状細胞（ＤＣ）およびその前駆細胞である。ＤＣおよびその前駆細胞をさらに、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子を発現するように操作し、および／または少なくとも１つの免疫促進性分子を発現するように操作することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦおよび少なくとも３種の外来性共刺激分子を共発現するように遺伝子的に操作されたＤＣおよびその前駆細胞である。ＤＣおよびその前駆細胞をさらに、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子を発現するように操作することができる。
【００１７】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ、少なくとも１つのＢ７分子、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を共発現するように遺伝子的に操作したＤＣおよびその前駆細胞をさらに提供する。ＤＣおよびその前駆細胞をさらに、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子を発現するように操作することができる。
【００１８】
本発明はさらに、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスで感染させた宿主細胞を、ＧＭ−ＣＳＦの商業的な産生のための供給源としてさらに提供する。
本発明の目的は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え複製−欠損ウィルスを、抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を向上させるために十分な量で投与することを含む、抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を向上させる方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え複製−欠損ポックスウィルスを、単独でまたは抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を向上させるために十分な量の少なくとも１つの抗原または免疫学的なエピトープ源とともに投与することを含む、抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を向上させる方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの抗原またはその免疫学的なエピトープに対する免疫応答を向上させる方法であって、ＧＭ−ＣＳＦをコードする第一の組換えベクターを投与した後、ＧＭ−ＣＳＦをコードする第二の組換えベクターを投与することを含み、ここで少なくとも１つの組換えベクターが複製−欠損ウィルスである、前記方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を伴う局所リンパ節を向上させる方法を提供することである。
【００２２】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは少なくとも１つの腫瘍抗原源、好ましくは少なくとも１つの腫瘍抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えウィルスとともに投与することを含む、抗腫瘍免疫を発生させる方法をさらに提供する。
【００２３】
免疫学的応答を向上するための別の方法において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスで感染させたＡＰＣまたは腫瘍細胞を、哺乳動物に対して免疫学的応答を向上させるための有効量で提供する。ＡＰＣまたは腫瘍細胞は、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする外来性遺伝子を、単独でまたは免疫応答を向上させるための少なくとも１つの共刺激分子をコードする遺伝子とともに、さらに発現することができる。標的抗原またはその免疫学的なエピトープを、ＡＰＣまたは腫瘍細胞を投与する前に、投与と同時に、またはその投与に引き続いて、哺乳動物に対して投与することができる。さらにまたはあるいは、ＡＰＣまたは腫瘍細胞を哺乳動物に対して投与する前に、少なくとも１つの標的抗原またはその免疫学的なエピトープを用いてパルス化してもよい。
【００２４】
本発明の別の目的は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して、好中球減少症を予防または治療するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスをエリスロポエチンとともに使用して、骨髄形成異常症候群を治療するための方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスを作製する際に使用するための、ＧＭ−ＣＳＦをコードするプラスミドである。
発明の詳細な説明
本発明は、抗原またはその免疫学的なエピトープに対する免疫学的な応答を向上させる際に使用するためのＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスである。本発明において使用するための組換え複製−欠損ウィルスには、複製−欠損ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）および哺乳動物細胞中、特にヒト細胞中で複製することができないその他のベクターが含まれるが、これらには限定されない。特に、本発明は、抗原に対する免疫学的な応答を向上させる際に生物学的なアジュバントとして使用するための、ＧＭ−ＣＳＦをコードする鶏痘ウイルス、カナリアポックスウィルスおよび修飾ワクシニアアンカラ系統（ＭＶＡ）を含む組換え複製−欠損トリポックスウィルスである。
【００２６】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、抗原−提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞などを含む免疫系の細胞に対する免疫学的な応答を向上させることを提供する際に有用性を有する。免疫学的な応答は、サイトカイン放出の増加、免疫細胞による増殖の増加、マイトジェン反応性の増大などにより示されるような、一般化された免疫増強効果または上方制御効果でありうる。特に興味深いのは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの投与により引き起こされる免疫学的な部位でのＡＰＣの遊走および増加である。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、注入部位においてＡＰＣを増加させる様に機能するという点において、生物学的なアジュバントである。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、抗原特異的な免疫学的応答を向上させるため、抗原源と組み合わせて使用することができる。そのような応答には、特異的抗原またはそのエピトープに対する細胞性応答および／または体液性応答を含むことができる。
【００２７】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え−複製欠損ウィルスは、免疫学的な応答の向上および天然のＧＭ−ＣＳＦタンパク質、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ−ＤＮＡプラスミド、ＧＭ−ＣＳＦ−融合タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦをコードするレトロウィルスベクターおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするワクシニアベクターの利点を越える利点を提供する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製欠損ウィルスにより提供される向上は、免疫応答の程度および免疫応答の期間の両方において顕在化する。
【００２８】
宿主細胞に対してＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を送達するための組換え複製−欠損鶏痘ウィルスおよび組換え複製−欠損カナリアポックスウィルスが特に興味を持たれている。
【００２９】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損鶏痘ウィルスの構造は、本明細書中に開示されている。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換えカナリアポックスウィルスの構造は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １９９８ Ｎｏｖ：９（１７）：２４８１−９２中に開示されている。
【００３０】
本発明の組換え複製−欠損ウィルスは、完全長ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． Ｍ１Ｏ６６３）またはＧＭ−ＣＳＦをコードする哺乳動物遺伝子を含む。
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする少なくとも１つの組換え複製−欠損ウィルスを単独でまたは抗原源またはそのエピトープ源と組み合わせて含む組成物、好ましくは医薬的に許容可能な組成物である。組成物は、従来からのアジュバントを含んでいてもよい。抗原またはその免疫学的なエピトープの源には、ペプチド、脂質、リポタンパク質、炭水化物、多糖類、リポ多糖類、細胞、細胞フラグメント、細胞抽出物、抗体、抗−イディオタイプ抗体、アポトーシス小体などが含まれるが、これらのものには限定されない。抗原またはエピトープの源は、天然に存在する源から単離されるか、化学的に合成されるか、または遺伝子的に産生されたものであってもよい。遺伝子的に産生された抗原またはそのエピトープの源には、少なくとも１つの抗原またはそのエピトープをコードするベクターなどが含まれる。抗原またはその免疫学的なエピトープの細胞源には、細菌、真菌、酵母、原虫、ウィルス、腫瘍細胞、ＡＰＣ、樹状細胞（ＤＣ）、ＤＣ−腫瘍細胞融合体などの他に、少なくとも１つの抗原またはそのエピトープをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞またはそれにより形質導入された細胞が含まれるが、これらのものに限定されない。
【００３１】
一つの具体的な態様において、抗原源は、１またはそれより多い抗原をＧＭ−ＣＳＦとともに共発現するために、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルス中に組み込まれた、１またはそれより多い抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする１またはそれより多い遺伝子により提供される。特に興味深いものは、腫瘍抗原または腫瘍−関連抗原をコードする遺伝子である。
【００３２】
別の態様において、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗原源をコードする組換え複製−欠損アビポックスウィルスを、それだけでまたは従来からのアジュバントとともに含む。
【００３３】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする少なくとも１つの組換え複製−欠損ウィルスを、単独であるいは抗原またはそのエピトープをコードしおよび／または１またはそれより多い免疫促進性分子をコードする少なくとも１つのベクター、そして医薬的に許容可能な担体と組み合わせて含む、組成物、好ましくは医薬的に許容可能な組成物を包含する。
【００３４】
別の態様において、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損アビポックスウィルスを、少なくとも１つの抗原またはその免疫学的なエピトープをコードするベクターと組み合わせて含む。本発明において有用性を有する抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする（１または複数の）遺伝子を提供する際に使用するためのベクターには、哺乳動物宿主細胞、好ましくはヒト細胞中で、１またはそれより多い遺伝子産物の機能的発現を引き起こすことができるいずれかのベクターが含まれる。抗原をコードする遺伝子を提供する際に有用なベクターには、ウィルスベクター、核酸ベースのベクターなどが含まれるがこれらのものには限定されず、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アルファウィルス、レトロウィルス、ピコルナウィルス、イリドウィルスなどが含まれるが、これらのものには限定されない。抗原をコードする遺伝子および／または免疫促進性分子をコードする遺伝子を提供する際に有用性を有するポックスウィルスには、複製性ベクターおよび非−複製性ベクターが含まれる。
【００３５】
一態様において、組成物は、少なくとも１つの抗原またはそのエピトープをコードする組換え鶏痘を組み合わせたＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損鶏痘を、単独でまたは１またはそれより多い共刺激分子をコードする遺伝子と組み合わせて含む。別の態様において、組成物は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損アビポックスを、少なくとも１つの抗原をコードしそしてＢ７分子をコードする組換え複製−欠損アビポックスと組み合わせて含む。別の態様において、少なくとも１つの抗原をコードする組換え複製−欠損アビポックスウィルスはまた、複数の共刺激分子、例えばＢ７／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする。本発明の組成物の投与により引き起こされる、抗原、エピトープ、または抗原を発現する細胞に対する免疫応答の程度は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを抗原をコードする組換えウィルスと組み合わせて使用することにより達成される免疫応答よりもずっと大きい。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、標的抗原とは、疾患原因物質または疾患状態の哺乳動物内での、免疫認識および究極的な排除またはコントロールにおいて必須である、抗原または抗原上の免疫学的なエピトープである。免疫認識は、細胞性および／または体液性でありうる。細胞内の病原体または癌の場合には、免疫認識は好ましくはＴリンパ球応答である。
【００３７】
標的抗原には、前新生物性状態または過形成性状態と関連する抗原が含まれる。標的抗原は、癌と関連しているかまたはその原因であってもよい。そのような標的抗原は、腫瘍細胞、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異的抗原、それらのエピトープ、およびそれらのエピトープアゴニストであってもよい。そのような標的抗原には、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄ（４６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ． Ｍ２９５４０）などの癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、ＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０：３４７−３５２， １９９４）、ＭＡＧＥ−１（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７５０，３９５）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，６４８，２２６）、ＧＰ−１００（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：６４５８−６４６２，１９９２）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異したｒａｓオンコジーン、正常ｐ５３ および点変異したｐ５３ オンコジーン（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：３５５１−３５５５， １９９４）、ＰＳＭＡ（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２２７−２３０， １９９３）、チロシナーゼ（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ８４：７４７３−７４７７， １９８７）、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８：２８０７−２８０８， １９９０；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，８４０，８３９）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ９４： １９１４−１９１８，１９９７）、ＴＲＰ−２（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ Ｊ． １１：５２７−５３５，１９９２）、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕｌｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，５５０，２１４）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡの修飾物および組織特異的抗原、ＴＡＡのスプライス変異体、エピトープアゴニスト、などが含まれるが、それらには限定されない。その他のＴＡＡは、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ４，５１４，５０６に開示されるような、当該技術分野において既知の方法により同定し、単離し、そしてクローン化することができる。標的抗原には、１またはそれより多い成長因子およびそれぞれのスプライスバリアントもまた含まれる。
【００３８】
本発明を使用して標的化するための可能性のあるヒト腫瘍抗原および組織特異的抗原並びにそれらの免疫学的なエピトープには、表１に例示されるものが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００３９】
【表１】
2004507231.tif 000003
【００４０】
標的抗原は、ＨＩＶ（Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ ＨＩＶ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ １９７７）、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒトパピローマウィルス（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７１９，０５４）、Ｂ型肝炎（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８０，０３６）、Ｃ型肝炎（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７０９，９９５）、ＥＢＶ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）などを含むウィルスなどの、病原性微生物に関連するもの、病原性微生物に由来するもの、または病原性微生物から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４１】
標的抗原は、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，８６９，６０８）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メニンゴコッカス（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、グループＡストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９５５，５９６）などの、病原性細菌に関連するもの、病原性細菌に由来するもの、または病原性細菌から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４２】
標的抗原は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、侵入性カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，６４５，９９２）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ヒストプラズモーシス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、クリプトスポリジア（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）などを含む、病原性酵母に関連するもの、病原性酵母に由来するもの、または病原性酵母から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４３】
標的抗原は、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ， ５，９６５，２４２）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，５８９，３４３）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉを含むが、これらのものには限定されない、病原性原虫および病原性寄生虫に関連するもの、病原性原虫および病原性寄生虫に由来するもの、または病原性原虫および病原性寄生虫から単離されたもののいずれかであってもよい。
【００４４】
本明細書中で使用する場合の免疫促進性分子には、共刺激分子：Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌなど、並びにＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、Ｆ１ｔ−３Ｌ（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，５５４，５１２；５，８４３，４２３）などを含むがこれらには限定されないサイトカインおよびケモカインが含まれるが、これらには限定されない。
【００４５】
マウスＢ７．１の遺伝子配列は、Ｆｒｅｅｍａｎら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２７１４−２７２２，１９８９）に開示され、そしてＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｘ６０９５８として開示されている。マウスＢ７．２の遺伝子配列は、Ａｚｕｍａら（Ｎａｔｕｒｅ ３６６：７６−７９， １９９３）に開示され、そしてＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｌ２５６０６およびＭＵＳＢ７２Ｘとして開示されている。
【００４６】
マウスＢ７共刺激分子のヒトホモログには、ＣＤ８０、マウスＢ７．１のホモログ、およびＣＤ８６、Ｂ７．２のホモログが含まれる。ヒトＢ７．１（ＣＤ８０）の遺伝子配列は、ＧＥＮＢＡＮＫにアクセッションＮｏ． Ｍ．２７５３３として開示され、ヒトＢ７．２（ＣＤ８６）の遺伝子配列は、アクセッションＮｏ． Ｕ０４３４３およびＡＦ０９９１０５として開示されている。
【００４７】
マウスＩＣＡＭ−１についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｘ５２２６４として開示され、そしてヒトＩＣＡＭ−１ホモログ（ＣＤ５４）についての遺伝子はアクセッションＮｏ． Ｊ０３１３２として開示される。
【００４８】
マウスＬＦＡ−３についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｘ５３５２６として開示され、そしてヒトホモログについての遺伝子はアクセッションＮｏ． Ｙ００６３６として開示される。
【００４９】
マウス４−１ＢＢＬについての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｕ０２５６７として開示される。ヒトホモログ、ｈｕ４−１ＢＢＬ についての遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ． Ｕ０３３９７として開示される。
【００５０】
免疫促進性分子は、免疫促進性分子をコードする組換えベクター単独により、または標的抗原をコードする核酸配列との組み合わせにより、提供することができる。別の態様において、組成物は、標的抗原をコードしそして複数の共刺激分子、Ｂ７／ＩＣＡＭ−Ｉ／ＬＦＡ−３（ＴＲＩＣＯＭ）をコードする組換えベクターを、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて提供する。
【００５１】
本明細書中で使用する場合の従来からのアジュバントには、ミョウバン、Ｒｉｂｉ ＤＥＴＯＸＴＭ、フロイントのアジュバント、フロイントの完全アジュバント、ＱＳ２１などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００５２】
疾患は、本発明を使用することにより治療または予防することができ、そして疾患にはウィルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、ガン細胞などにより引き起こされる疾患が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、汎発性免疫エンハンサーとして使用することができ、そしてそれ自体、未知の病因の疾患を治療する際に有用性を有する。
【００５３】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して治療しまたは予防することができる前新生物状態または過形成状態には、結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乳腺病巣などの前新生物状態または過形成状態が含まれるが、これらのものに限定されない。
【００５４】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して治療することができる癌には、原発性または転移性メラノーマ、アデノカルシノーマ、扁平細胞癌腫、腺扁平細胞癌腫、胸腺腫、リンパ腫、サルコーマ、肺癌、肝臓癌、非−ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頚癌などが含まれるが、これらのものに限定されない。
【００５５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスのいくつかの用途が、表２に概説される。
【００５６】
【表２】
2004507231.tif 000004
2004507231.tif 000005
【００５７】
本発明は、注入部位中に抗原提示細胞を補充するための、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して免疫応答を向上させる方法を提供する。さらに、本方法は、抗原提示細胞による局所リンパ節の強化を提供する。
【００５８】
本発明の方法は、標的抗原またはそのエピトープに対する免疫応答の向上を提供する。
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは抗原源とともに使用して、病原性微生物または癌により引き起こされる疾患を治療または予防する方法もまた包含する。
【００５９】
治療方法において、本発明の組換えベクターの投与は、“予防”または“治療”目的のいずれかの目的でありうる。予防的に提供された場合、本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、いずれかの症候に先だって、単独で提供されるか、または同時的なまたは先立つ抗原源の投与の前に、提供される。組換えベクターの予防的投与は、いずれかの引き続く感染または疾患を予防しまたは改善するために機能する。治療的に提供される場合、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、感染または疾患の症候の開始と同時にまたはその後に提供される。このように、本発明は、疾患−誘引物質または疾患状態への予測される曝露の前に、または感染または疾患の開始の後に、提供することができる。
【００６０】
接種材料に関連する場合の用語“単位用量”は、哺乳動物に対してユニタリーの用量として適切な物理的に別個の単位のことをいい、それぞれの単位は、所望のアジュバントまたは免疫原性効果を産生するように計算されたあらかじめ決められた量の組換えベクターを、必要とされる希釈剤とともに含有する。本発明の接種材料の新規な単位用量に関する詳細は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスおよび具体的なアジュバントの独特な特性および達成すべき免疫原性効果により指示され、そしてそれに依存する。
【００６１】
接種材料は、塩類溶液、リン酸−緩衝塩類溶液またはその他の生理学的に許容できる希釈剤などの許容できる（許容可能な）希釈剤中の溶液として典型的には調製され、水性医薬組成物を形成する。
【００６２】
接種の経路は、乱刺法（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、腫瘍内、局所、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、鼻腔内、動脈内、膀胱内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）などであってもよく、それにより注入部位および局所リンパ節内部へのＡＰＣの遊走および疾患誘引物質に対する免疫応答を向上させるためのＡＰＣ機能の亢進を引き起こす。用量は、少なくとも一度投与される。引き続く用量を、示したように投与することができる。
【００６３】
一例において、宿主をＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを用いて少なくとも一度免疫化し、最適濃度のＡＰＣを標的部位で発生させる。引き続く免疫化は、１またはそれより多い抗原またはエピトープ源により提供される。別の例において、宿主は、タンパク質、ペプチド、多糖類、脂質、リポタンパク質、リポ多糖類、抗体、抗−イディオタイプ抗体、細胞、細胞フラグメント、細胞抽出物、アポトーシス小体、減弱ウィルスまたは不活化ウィルスなどの抗原源により初めに免疫化され、続いてＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを投与される。本発明の別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを抗原源またはエピトープ源と同時に投与する。従来からのアジュバントを場合により提供することができる。
【００６４】
別の態様において、宿主を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにより初回用量として少なくとも１回免疫化する。ブースト用量は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするいずれかの組換えベクター、好ましくはＧＭ−ＣＳＦをコードする組換えウィルスを含むことができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする第二の組換えベクターは、複製能を有するかまたは複製−欠損のいずれかであってもよい。一例において、初回抗原用量を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損組換えアビポックスウィルスにより提供し、その後ブースト用量のＧＭ−ＣＳＦをコードする複製能を有する組換えワクシニアウィルスを提供する。このような異種初回−ブースト計画により、組換えワクシニアベクターの複数回に分けた注入により当該技術分野において知られているような宿主抗−ベクター免疫応答を最小化しまたは減少させる。初回−ブースト方法におけるバリエーションは、本発明の範囲内に包含される。たとえば、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製能を有するベクターを初回用量として提供し、その後ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスの１またはそれより多い注入を行うことができる。ベクターは、１またはそれより多い免疫促進性分子をコードする遺伝子とともにまたは伴わずに、１またはそれより多い抗原をコードする遺伝子を提供することもできる。
【００６５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＰＴ）破傷風−百日咳（Ｔｄ）、ＤｔａＰ、ｂ型インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（Ｈｉｂ）ワクチン、ＤＴａＰ−Ｈｉｂワクチン、ＤＴａＰ−ＩＰＶ−Ｈｉｂワクチン、おたふく風邪−はしか−風疹（ＭＭＲ）ワクチンおよびＡ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ライム病ワクチン、インフルエンザワクチン、髄膜炎菌多糖（四価Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ）、肺炎球菌多糖ワクチン（２３価）、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ペストワクチン、黄熱ワクチン、カルメット−ゲラン杆菌ワクチンなどのワクチンなどの標準的な小児用ワクチンを含む（これらには限定されない）ワクチンと組み合わせて提供することができる。
【００６６】
哺乳動物に、好ましくはヒトに、本発明の組換えベクターを提供する際に、投与された組換えベクターの剤形は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、以前の医学的履歴、疾患の進行、腫瘍負担などの因子に依存して変化するであろう。一般的には、より低い容量またはより高い容量で投与することができるものの、哺乳動物、好ましくはヒト当たり、約１０５〜約１０１０のプラーク形成単位の範囲で、レシピエントにＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの剤形を与えることが好ましい。
【００６７】
腫瘍−関連抗原および腫瘍−特異的抗原の遺伝的定義により、癌治療についての標的化抗原−特異的ワクチンの開発を可能にする。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原をコードする組換えベクターを組み合わせると、癌の発生のリスクが増加した個体における予防における予防に関して特異的な免疫応答を引き起し（予防的免疫化）、外科的処置の前に腫瘍を縮小させ、初回外科的処置の後の疾患再発を予防し（抗−転移ワクチン接種）、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の数を増大させ、それにより拡散する腫瘍の根治におけるそれらの有効性を向上させる（定着した疾患の治療）、強力なシステムである。 自己由来リンパ球（ＣＤ８＋）、細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＮＫ細胞のいずれかを、特定の腫瘍抗原に対してｅｘ ｖｉｖｏで作製して、そして腫瘍抗原源とともにＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて腫瘍を保持する患者に対して移植しなおす（養子免疫療法）ことができる。
【００６８】
癌治療において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、癌のいずれかの証拠の前に哺乳動物中に導入するか、または癌に悩まされている哺乳動物における疾患の軽減を提供するために導入することができる。
【００６９】
治療すべき疾患または症状および治療方法に依存して、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする核酸配列を含む組換えベクターなどの抗原源は、１または複数の共刺激分子、好ましくはＢ７またはＢ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３をコードする遺伝子をさらに含むことができる。標的抗原またはその免疫学的なエピトープを、組換えベクターにより感染させた宿主細胞によりまたは腫瘍関連抗原またはそのエピトープを内在的に発現する腫瘍細胞により提供することができる。腫瘍関連抗原が宿主細胞中に存在しないか、発現されていないか、または低レベルで発現されている場合、外来性腫瘍関連抗原をコードする外来性遺伝子を提供することができる。さらに、いくつかの異なる腫瘍関連抗原をコードする遺伝子を提供することができる。
【００７０】
投与すべきＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせた、１またはそれより多い腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードし、場合により複数の共刺激分子をコードする組換えベクターの量は、ウィルス粒子の力価に基づく。投与すべき免疫源の好ましい範囲は、哺乳動物、好ましくはヒト当たり、１０５〜１０１０ウィルス粒子である。もし免疫化すべき哺乳動物が癌または転移性癌にすでに悩まされているならば、ワクチンをその他の治療的処置と組み合わせて投与することができる。さらに組換え複製−欠損ウィルスそれ自体は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするとともに１またはそれより多いＴＡＡをコードすることができる。
【００７１】
治療の一方法において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、癌を有する患者に対してｉｎ ｖｉｖｏで投与し、そして自己由来細胞傷害性リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球を、血液、リンパ節、腫瘍などから得ることができる。リンパ球は培養中で増殖され、標的抗原−特異的リンパ球は、特異的標的抗原および抗原提示細胞または標的抗原のいずれかでパルスしたＡＰＣの存在下、培養することにより増殖させる。標的抗原−特異的リンパ球をその後、患者体内に再び注入し戻す。
【００７２】
免疫化の後、ワクチンの有効性を、特異的溶解活性または特異的サイトカイン産生により、または腫瘍退行により評価されるように、抗原を認識する抗体または免疫細胞の産生により評価することができる。当業者は、上述したパラメータを評価するための従来法を知ることができる。
【００７３】
抗原−特異的Ｔ−細胞応答を向上させる本方法の一態様において、哺乳動物、好ましくはヒトをｒＦ−またはｒＶ−ＨＩＶ−１エピトープ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３構築物と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにより免疫化する。処置の有効性を、標的抗原−特異的リンパ球増殖、標的抗原−特異的細胞溶解反応、サイトカイン産生、臨床的反応などを測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでモニターすることができる。
【００７４】
抗原−特異的Ｔ細胞応答を向上させる方法を、いずれかの標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して使用することができる。特に興味深いのは、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原および感染性物質の抗原である。
【００７５】
患者に対してＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを投与することに加えて、その他の外来性免疫モジュレーターまたは免疫促進性分子、化学療法薬、抗生物質、抗真菌薬、抗ウィルス薬などを、単独でまたはそれらを組み合わせて、治療すべき症状に依存して投与することができる。その他の外来性に添加される物質の例には、外来性ＩＬ−２、ＩＬ−６、α−、β−またはγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、Ｆｌｔ−３Ｌ、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル、アンホテリシンＢ、５フルオロウラシル、ロイコボリン、ＣＰＴ−１１など、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００７６】
ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えトリポックスウィルス（アビポックス）を、生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦをｉｎ ｖｉｖｏで産生するその能力について調べた。ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え鶏痘ウィルス（Ｆ）およびカナリアポックスウィルス（ＡＬＶＡＣ）を、単回皮下（ｓ．ｃ）注射として投与し、そして局所リンパ節排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）注入部位を異なる時間点での細胞変化、表現形変化および機能的変化について調べた。局所リンパ節における変化を、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの４種の日用量の投与と比較した。結果から、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかの単回注入により、排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節内部で、（ｉ）リンパ節症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）および（ｉｉ）クラスＩＩ−発現およびプロフェッショナルＡＰＣの全数の増加（ＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋が引き起こされたことが示された。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを注入したマウス由来のリンパ節をｉｎ ｖｉｔｒｏ混合リンパ球培養中で使用した場合、より高いレベルのＴ−細胞初回抗原刺激およびより強力なアロ特異的溶解が結果として生じ、そのことはそれらの節内のより多い数の機能的ＡＰＣの存在を示している。時間−経過研究により、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスの局所節内で生じている細胞性変化／表現形変化および機能的変化が２１〜２８日間持続したことが示された。さらに、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ組換えウィルスの繰り返し注入（３×）に際して、クラスＩＩ−発現リンパ節細胞の全数は、マウス血清中の抗−アビポックス抗体力価の存在に関わらず、それぞれの注入後に増加した。
【００７７】
本発明はまた、組換えアビポックスウィルス中でまたは組換えタンパク質として投与したＧＭ−ＣＳＦが、自己の腫瘍抗原に対する宿主免疫を生成するように設計したワクチンプロトコルにおいて生物学的なアジュバントとして機能しうるかどうかについて調べた。自己の腫瘍抗原は、ＣＥＡ、Ｍｒ １８０，０００〜２００，０００の糖タンパク質、であり、大きなパーセントのヒト腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（結腸、膵臓、乳房、肺）上でのそれらの過剰発現により、免疫療法のための魅力的な標的となってきた（２６、２７）。ゲッ歯動物においては、ＣＥＡホモログが同定されていないため、ヒトＣＥＡをトランスジーンとして発現するマウス（２８〜３０）は、異なるワクチン戦略を研究するために使用されている（３１）。本発明において、アビポックス−ＣＥＡ免疫化ＣＥＡ．Ｔｇマウスは、組換えアビポックスウィルスまたは組換えタンパク質のいずれかとしてＧＭ−ＣＳＦを添加することにより向上することができるＣＥＡ−特異的細胞性免疫を発生した。ＣＥＡ．ＴｇにおけるＣＥＡ−特異的細胞性応答の相対強度に基づいて、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスの単回注入は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの複数回の毎日の注入よりも強力な生物学的アジュバントであった。免疫療法プロトコルにおいて、アビポックス−ＣＥＡをアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせて免疫化した後に、ＣＥＡ−陽性腫瘍の完全な退行が、ＣＥＡ．Ｔｇマウスの３０〜４０％において観察された。さらに、それらの腫瘍を持たないマウスは、それに引き続く腫瘍チャレンジから保護された。この知見は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスにより、免疫部位に対して持続レベルのＧＭ−ＣＳＦを送達することができ、そしてそれを相対的に弱い自己抗原を発現する組換えアビポックスウィルスと組み合わせて使用して、宿主免疫を増強しそして抗腫瘍免疫の向上を生成することができることをはじめて示している。
【００７８】
本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、体液性応答の向上を刺激する方法において有用である。このような体液性応答の向上は、その本質においてモノクローナルであってもまたはポリクローナルであってもよい。体液性応答の向上は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞による活性の増大、増殖の増加および／またはサイトカイン分泌の増加、Ｂ細胞による増殖の増加または抗体産生の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、補体−媒介性溶解の増加などにより、調べることができる。本発明のＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用して引き起こされた抗体は、標準的方法により引き起こされる抗体よりも、より高い親和性および／または結合活性およびより高い力価を有することが期待される。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを使用する方法により引き起こされた抗体は、免疫ドミナント（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）標的エピトープまたは非ドミナント標的エピトープを認識することができる。
【００７９】
本発明はさらに、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを本発明の抗原源と組み合わせて免疫化することにより引き起こされた１または複数の抗体を含む。抗体は、目的とした標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して特異的を有し、そしてそれと反応しまたは結合する。本発明のこの態様において、抗体はもともと、モノクローナルであるかまたはポリクローナルである。
【００８０】
例示的な抗体分子は、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、または当該技術分野においてＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として知られる免疫グロブリン分子の部分を含む抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の部分である。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の方法により作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ” ｉｎ Ｂｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） （１９８５） ”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｖｏｌｕｍｅ １３， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。抗体または抗原結合性フラグメントもまた、遺伝子工学により産生することができる。重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をＥ． ｃｏｌｉ中で発現させるための技術は、ＰＣＴ特許出願：公開番号ＷＯ ９０１４４３、ＷＯ ９０１４４３およびＷＯ ９０１４４２４、およびＨｕｓｅら（（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１）の主題である。
【００８１】
一態様において、本発明の抗体を免疫アッセイにおいて使用して、生物学的サンプル中の目的とする新規抗原を検出する。
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ＴＡＡを発現し、そしてＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する組換えウィルスと組み合わせて免疫化することにより産生させた本発明の抗体を使用して、ＴＡＡを発現する癌に悩まされる哺乳動物の組織バイオプシー由来のＴＡＡの存在を、免疫細胞化学を使用して評価する。疾患組織におけるＴＡＡ抗原の描写のそのような評価を使用して、疾患に悩まされる哺乳動物における疾患の進行または免疫療法の有効性を予測することができる。この態様において、ＴＡＡの例には、ＣＥＡ、ＰＳＡ、およびＭＵＣ−１が含まれるが、これらには限定されない。免疫組織化学についての従来法は、以下の刊行物に記載される（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （ｅｄｓ） （１９８８） Ｉｎ ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） （１９８７）． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。
【００８２】
別の態様において、本発明の抗体を、免疫療法のために使用する。本発明の抗体を、受動免疫療法において使用することができる。
患者にレシピエント哺乳動物、好ましくはヒトに対する抗体または抗原結合性フラグメントを提供する際に、投与された抗体または抗原結合性フラグメントの剤形は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、過去の医学的状態などの因子に依存して変化しうる。
【００８３】
本発明の抗体または抗原−結合性フラグメントは、疾患または感染の重症度、程度または持続期間を、妨げ、減少させ、または減弱させるために十分な量で、レシピエント被検体に対して投与することを企図される。
【００８４】
抗−イディオタイプ抗体は、通常は免疫応答の経過の間に生じ、抗−イディオタイプ抗体の部分は、最初の免疫応答を誘導したエピトープに似ている。本発明において、結合部位が疾患状態の標的抗原を反映する抗体の免疫グロブリン遺伝子またはその部分は、ウィルスゲノムのゲノムまたはその部分中に、単独でまたは複数の免疫促進性分子の遺伝子またはその部分と組み合わせて組み込まれる。得られた組換えウィルスは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて使用した抗原に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の向上を引き起こすことができる。
【００８５】
本発明は、ＧＭ−ＣＳＦをコードし、周囲の環境（ｍｉｌｅａｕ）中でＧＭ−ＣＳＦを発現する組換え複製−欠損ウィルスで感染させた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、１またはそれより多い内在性標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現することもでき、または第二の組換えベクターにより提供することができる１またはそれより多い外来性の外来標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現するように操作することもできる。１またはそれより多い標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターは、１またはそれより多い共刺激分子 および／またはサイトカインをコードする外来性核酸配列を有していてもよい。
【００８６】
本発明の宿主細胞には、腫瘍細胞、ＰＢＭＣ、樹状細胞などの抗原提示細胞、皮膚または筋肉の細胞などが含まれるが、これらのものには限定されない。抗原提示細胞には、単球、マクロファージ、樹状細胞、前駆樹状細胞、ランゲルハンス細胞、脾細胞、Ｂ−細胞、腫瘍細胞、筋肉細胞、上皮細胞などが含まれるが、これらのものに限定されない。
【００８７】
一態様において、宿主細胞は腫瘍細胞であり、ここで腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスにｉｎ ｓｉｔｕでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露され、腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦの発現および分泌が引き起こされる。腫瘍細胞は、内在性標的抗原を発現することができるか、または腫瘍細胞は、組換えベクターを使用してさらに遺伝子的に操作して、ＴＡＡまたはその免疫学的なエピトープなどの標的抗原を発現し、そして場合により１またはそれより多い免疫促進性分子を発現することができる。組換え複製−欠損ウィルスにより提供されるＧＭ−ＣＳＦを内在性または外来性に提供されるＴＡＡとともに発現し、そして場合により複数の免疫促進性分子のうちの一つを発現する、腫瘍細胞を、癌に悩まされる哺乳動物において腫瘍減少または排除を引き起こすために有効な量で、哺乳動物に対して投与する。
【００８８】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、腫瘍内部にｉｎ ｓｉｔｕで、例えばメラノーマ中または転移性乳癌皮膚病変中に、直接注入する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスはまた、結腸直腸癌および膵臓癌などの癌のための外科処置の間にｉｎ ｓｉｔｕで投与することもできる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを提供することに加えて、１またはそれより多い免疫促進性分子をコードするベクターを、抗−腫瘍応答を向上させるために提供することができる。一態様において、ベクターは、Ｂ７．１をコードする組換えアビポックスまたはＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えアビポックスである。別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、ＩＬ−１２などのサイトカインまたはＩＬ−１２をコードするベクターと組み合わせて投与する。
【００８９】
別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、リンパ節−内注入により提供される。リンパ節部位は、腫瘍部位から離れていてもまたは腫瘍部位に排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）していてもよい。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独でまたは標的抗原またはその免疫学的なエピトープまたは標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターと組み合わせて提供することができる。標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードする組換えベクターは、１またはそれより多い免疫促進性分子をさらにコードすることができる。一態様において、組み合わせ療法には、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスおよび標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードし、そして共刺激分子Ｂ７．１をさらにコードする組換えベクターが含まれる。別の態様において、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをコードし、そしてＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をさらにコードする組換えベクターを、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）で提供する。
【００９０】
腫瘍細胞は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、単独で、またはワクチンとして使用するための少なくとも１またはそれより多い免疫促進性分子をコードする組換えベクターと組み合わせて使用して、ｅｘ ｖｉｖｏで感染させることもできる。一例において、組換えベクターはＢ７．１をコードする組換えアビポックスである。別の態様において、組換えベクターは、Ｂ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする。別の例において、組換えベクターはγまたはαインターフェロンなどのサイトカインをコードする。腫瘍細胞は、同一の患者由来のものであっても（自己由来）または異なる患者由来の（１または複数の）細胞株由来であっても（同種異系）よい。本発明の腫瘍細胞の投与により、個体に対して抗−腫瘍免疫応答を提供する。腫瘍細胞を、皮下的に、皮内的に、静脈内などに与えることができる。
【００９１】
本発明はまた、前駆樹状細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ＤＣ部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、およびＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を有する組換え複製−欠損ウィルスにより外来的に提供されるＧＭ−ＣＳＦを発現するこれらの誘導体を提供する。前駆樹状細胞および樹状細胞などのＡＰＣはまた、１またはそれより多い内在性標的抗原またはそれらの免疫学的なエピトープを発現することができ、または外来性標的抗原は、組換えベクターにより提供することができる。組換えベクターはさらに、１またはそれより多い共刺激分子をコードしてもよい。一態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスおよび少なくとも１つの標的抗原をコードする組換えベクターにより感染させる。別の態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスによりそして少なくとも１つの標的抗原をコードしそしてＢ７．１をコードする組換えアビポックスにより感染させる。さらに別の態様において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスおよび標的抗原をコードしそしてＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えアビポックスにより感染させる。本発明はさらに、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏでまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する際に、１またはそれより多い標的細胞、標的抗原およびそれらの免疫学的なエピトープに対するワクチン接種および免疫療法的応答のためにＡＰＣを使用する方法を提供する。
【００９２】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを単独でまたはＢ７またはＢ７／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えベクターと組み合わせて感染させた源から単離した、前駆樹状細胞、樹状細胞、ＤＣ部分母集団、およびそれらの誘導体などのＡＰＣを、少なくとも１つのペプチド、タンパク質、抗体、標的細胞、標的細胞溶解物、細胞抽出物、標的細胞膜、アポトーシス小体、標的抗原、またはその免疫学的なエピトープにより、または少なくとも１つの標的細胞のＲＮＡまたはＤＮＡにより、パルス化しまたはインキュベートし、そして関連したＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで活性化させるために十分な量で、種に対して、投与することができる。 別の態様において、抗原提示前駆樹状細胞および樹状細胞はさらに、少なくとも１つの外来性標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する。
【００９３】
宿主細胞は、１０３〜１０９細胞の範囲で提供することができる。使用することができる投与経路には、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、経膀胱点滴注入、経乱刺（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが含まれる。
【００９４】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦ発現抗原提示前駆樹状細胞または樹状細胞を、標的細胞、標的細胞溶解物、標的細胞膜、標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対して曝露するか、または少なくとも１つの標的細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡによりｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露し、そして初回免疫したＴ細胞または初回免疫していないＴ細胞とともにインキュベートして、対応するＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化する。ついで、活性化Ｔ細胞単独、またはこれと前駆ＤＣまたはＤＣとの組み合わせを、標的細胞、標的抗原またはその免疫学的なエピトープに対するワクチン接種または免疫療法のために、ヒトなどの種に対して投与する。一使用方法において、前駆樹状細胞または樹状細胞を好都合にも使用して、癌細胞に対する免疫療法的成長阻害応答を引き起こす。
【００９５】
別の態様において、ＧＭ−ＣＳＦ発現抗原−提示細胞、好ましくは前駆ＤＣまたはＤＣを、対応標的抗原またはその免疫学的なエピトープを発現する標的細胞と融合させ、既知の方法により、ＡＰＣと標的細胞との異核接合体（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ）を形成する（Ｇｏｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６２７９−６２８３， １９９８）。このような融合細胞またはキメラＡＰＣ／標的抗原細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよび標的抗原またはそれらの免疫学的なエピトープの両方ともを発現する。ＡＰＣはまた、少なくとも１つの共刺激分子をコードする、好ましくはＢ７．１またはＢ７．１／ＬＦＡ−３／ＩＣＡＭ−１をコードする組換えベクターで感染することができる。好ましい態様において、標的細胞は、過形成性細胞、前悪性細胞または悪性細胞である。キメラＡＰＣ／標的抗原細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で使用して、ＴおよびＢリンパ球の免疫応答を向上させることができる。
【００９６】
前駆樹状細胞は、患者由来の骨髄、末梢血、リンパ節から入手される。患者は、以前にワクチン接種されていても、あるいはＦｌｔ−３Ｌなどの化合物を用いて治療して抗原−提示細胞の数を向上させていてもよい。樹状細胞は、皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）などのいずれかの組織および脾臓、骨髄、リンパ節、および胸腺中、並びに血液およびリンパを含む循環システムに見いだされるものなどのリンパ様組織（ベールをかけた（ｖｅｉｌｅｄ）細胞）から入手される。臍帯血は、樹状細胞の別の供給源である。
【００９７】
樹状細胞は、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８８，９６３に記載される方法などの当該技術分野において既知の方法を使用して、本発明中で使用するために増強させるかまたは単離することができる。いったん前駆樹状細胞、樹状細胞およびそれらの誘導体が得られれば、それらを適切な培養条件下で培養して、細胞集団を増殖させ、および／または組換えベクターによる最適な感染、トランスフェクション、または形質導入のための状態、そして最適な標的抗原取込み、処理、提示のための状態に、細胞を維持する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中での樹状細胞の成熟の適切な状態の維持に特に有利なことは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）の両方が存在することである。樹状細胞の部分母集団を、接着および／または細胞表面マーカーに基づく成熟度に基づいて、単離することができる。前駆ＤＣ、ＤＣおよびそれらの部分母集団の表現型は、ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ（Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２， １９９８）中に開示される。
【００９８】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、約６日間の期間、約５００単位／ｍｌの濃度でそれぞれ提供される。別の態様において、ＴＮＦαおよび／またはＣＤ４０を使用して、前駆ＤＣまたはＤＣを成熟させる。
【００９９】
前駆樹状細胞または樹状細胞は、処置すべき個体から入手することができ、そしてそれ自体、対応するＨＬＡ抗原に関しては自己由来であり、または細胞は、対応するＨＬＡ抗原（クラスＩおよびＩＩの両方、例えばＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲ）が処置すべき個体に適合する様な個体から入手することができる。あるいは、前駆樹状細胞を操作して、処置を受ける個体の適切で関連したＨＬＡ抗原を発現する。
【０１００】
前駆樹状細胞および樹状細胞を、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ． ５，７８８，９６３に開示されたようなＥＢＶ−形質転換などの方法により、さらに遺伝子的に修飾して、それらの寿命を延長することができる。
【０１０１】
樹状細胞およびそれらの前駆細胞を、生理学的に許容可能な媒体中で医薬組成物の形状で提供することができる。組成物にはさらに、標的細胞、標的細胞溶解物、標的細胞膜、標的抗原またはその免疫学的なエピトープをさらに含むことができる。組成物は、免疫応答をさらに相乗的に向上させるために、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび／またはケモカインを、さらに含むことができる。
【０１０２】
本発明の別の観点は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、好中球減少症の予防または治療のために使用することである。好中球減少症は、循環血液中において好中球が異常に少数である場合についての医学的用語である。好中球減少症には多くの潜在的な原因があり、それらには：あるタイプの白血病、リンパ腫または転移性癌由来の骨髄損傷；利尿剤または抗−うつ薬などの薬剤療法に対する有害反応；放射線治療または化学療法に対する反応；留置静脈内（Ｉ．Ｖ．）カテーテルの存在；感染性単核細胞症またはＨＩＶ感染などのウィルス感染；結核などの細菌感染、全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫疾患、先天性異常；好中球、単球およびマクロファージの食作用、抗微生物作用、および殺腫瘍性作用の低下；栄養障害；二次感染により併発した、呼吸器管、消化管、または尿路の新生物性閉塞；が含まれる。好中球減少症を有する個体は、容易にそしてしばしば感染を受ける。感染のほとんどは、肺、口、および咽頭（粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｏｓｉｓ））、洞および皮膚において生じる。痛みを伴う口腔潰瘍、歯肉（ｇｕｍ）感染、耳感染、そして歯小嚢周囲（ｐｅｒｉｄｏｎｔａｌ）疾患が一般的である。重度の生命を脅かす感染は、病因収容および静脈内抗生物質の必要性を生じる可能性がある。
【０１０３】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、好中球減少症を予防しまたは治療する方法において有用である。ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスは、迅速で持続的な濃度のＧＭ−ＣＳＦを提供し、天然に由来するかまたは組換え的に産生されたＧＭ−ＣＳＦの投与よりも優れている（Ｍａｎｇｉ， Ｍ．Ｈ． ａｎｄ Ｎｅｗｌａｎｄ， Ａ．Ｃ． １９９９， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ． ３５； Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． Ｓ４−Ｓ７）。
【０１０４】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、好中球減少症の発生の前に（予防的に）または後に提供することができる。用量を好中球の数を増加させるために有効な量で、好ましくは正常範囲内にまで好中球数を増加させるために有効な量で、投与する。用量は、１回またはそれより多い回数で提供することができる。
【０１０５】
ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、単独でまたは抗生物質、抗真菌薬、抗ウィルス薬などの感染の治療のための別の療法と組み合わせて提供することができる。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに包含されうる１またはそれより多い抗生物質には、セフタジジム、セフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、アミノグリコシド、バンコマイシン、抗シュードモナスβ−ラクタムなどが含まれるが、これらには限定されない。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに包含されうる１またはそれより多い抗真菌薬には、アンホテリシンＢ、ダプソン、フルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、フルシトシン、グリセオフルビン、イントラコナゾール（ｉｎｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）、ケトコナゾール（ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール、クロトリマゾール、ナイスタチン、それらの組み合わせなどが含まれるが、それらには限定されない。組成物中にＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスとともに１またはそれより多い抗ウィルス剤が含まれていてもよく、そして抗ウィルス剤としては、２’−β−フルオロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン、インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、それらの組み合わせなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０６】
好中球減少症を引き起こす場合がある放射線治療、化学療法またはコルチコステロイド療法の場合において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、放射線照射、化学療法またはコルチコステロイド療法の開始の前に、療法と同時に提供することができ、または、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを放射線照射処置、化学療法的処置、またはコルチコステロイド処置の後に提供することができる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスの用量は、血中の好中球の正常な数を維持するための量で、または好中球の数を増大させて好中球減少症およびその続発症を予防しまたは阻害するための量で、提供される。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え−複製欠損ウィルスを含む組成物もまた、化学療法剤、コルチコステロイド、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０１０７】
本発明の別の観点は、骨髄形成異常症候群および骨髄形成異常症候群に関連する血球減少症を治療するために、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、エリスロポエチン（ＥＰＯ）または好ましくは組換えエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）と組み合わせて使用することである。脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）は、末梢血中の１またはそれより多い造血性細胞系列内部での量的異常並びに質的異常を有する、異常骨髄分化および成熟により特徴づけられるクローン性幹細胞障害の一群である。これらの個体の標準的な治療は、血液産生物、抗生物質、および選択されたより若年の個体における同種異系骨髄移植を伴う、支持的患者管理である。Ｓｔａｓｉ， Ｒらは、ＭＤＳを有する患者において血球減少症を治療するために、組換えＧＭ−ＣＳＦ（ｒｅｃ ＧＭ−ＣＳＦ）をエリスロポエチンと組み合わせて使用することを報告した（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９９， １０５， １４１−１４８）。しかしながら、ｒｈＧＭ−ＣＳＦは、顕著な副作用を伴う。本発明において、ＭＤＳに関連する血球減少症を治療するために、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、ｒｅｃ ＧＭ−ＣＳＦの代わりに、ＥＰＯと組み合わせて使用する。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスを、約１０５〜約１０１０ ｐｆｕの範囲の用量で投与し、そして１回または複数回に分けて提供する。ＥＰＯは、約１５０〜３００ ｕ／ｋｇ体重の範囲の用量で投与し、そして複数回に分けて提供する。組み合わせ用量は、好中球減少症を予防しまたは治療する際に有効であり、ヘモグロビンレベルを増加させおよび／またはＭＤＳを有する個体の輸血の必要性を減少させる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする複製−欠損ウィルスを毎週注入するかまたは毎月注入する使用は、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を毎日投与する必要性を緩和する。
【０１０８】
ＧＭ−ＣＳＦは、癌患者において二重特異性抗体による免疫療法のためのアジュバントとして有用であることも示された（Ｅｌｓａｓｓｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， Ｖｏｌ． ３５， Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． Ｓ２５−Ｓ２８， １９９９）。本発明において、ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、優れたアジュバント効果について、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を毎日投与する必要性を緩和する二重特異性抗体と組み合わせた場合に、ＧＭ−ＣＳＦの代わりになる。二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原／エピトープに対する特異性を免疫エフェクター細胞上で見いだされる細胞傷害性トリガー分子に対する反応性と組み合わせる、化学的にまたは遺伝子的に−構築された分子である。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスは、約１０５〜約１０１０ ｐｆｕの用量範囲で、複数回に分けて提供される。二重特異性抗体は、約０．２〜２００ ｍｇ／ｍ２の用量で、複数回に分けて、例えば毎週、毎月などで提供する。免疫療法的反応の向上についての分類には、特異的溶解活性、特異的サイトカイン産生、抗体−依存性細胞性細胞傷害、腫瘍退行、腫瘍からの保護が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦをコードする組換え複製−欠損ウィルスと組み合わせて使用することができる二重特異性抗体には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ−γＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦ−受容体、ＣＤ１５抗原またはＥｐＣＡＭ分子に対する腫瘍−指向的特異性を有する抗−ＣＤ３−指向性二重特異性抗体が含まれるが、これらには限定されない（ＭｃＣａｌｌ， Ａ．Ｍ．， Ａｄａｍｓ， Ｇ．Ｐ．， Ａｍｏｒｏｓｏ， Ａ．Ｒ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｕ．Ｂ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｈｏｒａｋ， Ｅ．， Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｈ．， Ｓｃｈｌｅｒ， Ｒ．， Ｍａｒｋｓ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｗｅｉｎｄｅｒ， Ｌ．Ｍ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ１６ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ａｎｔｉ−ＣＤ １６ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃＦｖ ｔｈａｔ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ＣＤ１６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：４３３−４４５， １９９９）。
【０１０９】
具体的態様の記載は、本発明の一般的性質を十分記載しているため、その他の者は、包括的な概念から離れることなく、様々な目的のためにそのような具体的な態様を容易に修飾しおよび／または適用することができるだろうし、そしてその結果そのような適用および修飾は、 開示された態様の意味およびその均等な範囲内に包含されることを意図している。
【０１１０】
参照されたすべての参考文献および特許は、参考文献として本明細書中に援用される。
【０１１１】
【実施例】
実施例１
組換えウィルスの作製
組換えポックスウィルスの作製は、ポックスウィルスゲノムＤＮＡおよび挿入すべき異種配列を保有するプラスミドベクターとの間でｉｎ ｖｉｖｏで相同組換えすることを介して達成される。ポックスウィルス中への外来性配列の挿入のためのプラスミドベクターは、組換えＤＮＡ技術の標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９）により構築される。プラスミドベクターは、１またはそれより多いキメラ遺伝子を含有し、そのそれぞれはタンパク質コード配列に連結し、ポックスウィルスゲノムの非−本質的領域由来のウィルス配列に隣接する、ポックスウィルスプロモーターを含む。プラスミドは、親ポックスウィルスで感染させた細胞中にトランスフェクトし、そしてプラスミド上のポックスウィルス配列とウィルスゲノム中の対応ＤＮＡ との間での組換えにより、結果としてウィルスゲノム中へのプラスミド上のキメラ遺伝子の挿入が引き起こされる。組換えウィルスは、様々な選択システムまたはスクリーニングシステム（Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ， １９９３；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ， １９９１；Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４、これらのうちのいくつかを以下に記載する）のいずれかを使用して選択されそして精製される。ワクシニアゲノム中への外来性遺伝子の挿入は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析により確認する。外来性遺伝子の発現は、ウェスタン解析により示される。
【０１１２】
鶏痘親ウィルスの起源
組換え体を作製するために使用された親鶏痘ウィルスは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されＵＳＤＡからライセンスされた家禽ワクチン、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ、のバイアルからプラーク精製された。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの産生のための開始物質は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈにより得られたＶｉｎｅｌａｎｄ研究所のニワトリ胚（ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ）起源鶏痘ワクチンのバイアルである。ウィルスをニワトリ卵の漿尿膜上で２回継代し、マスターの種子ウィルスを産生した。マスター種子ウィルスをさらに２７回、ニワトリ胚線維芽細胞中で継代し、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種子を調製した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ産生物ロットの作製のためのウィルスストックを調製するため、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種子をニワトリ胚線維芽細胞上で２回継代した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの一つのバイアル、シリアル＃９６１２５、を初代ニワトリ胚皮膚細胞上で３回プラーク精製した。
【０１１３】
ワクシニア親ウィルスの起源
ウィルスは、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ系統であり、そしてＷｙｅｔｈによりＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手し、そして仔ウシ体内にて継代し、天然痘ワクシニア種（Ｓｍａｌｌｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｅｄ）を作製した。Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、 天然痘ワクシニア種（Ｓｍａｌｌｐｏｘ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｅｅｄ、Ｌｏｔ ３１９７、２８継代の凍結乾燥バイアルを、Ｄｒ． ＣｈａｎｏｃｋおよびＤｒ． Ｍｏｓｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から受領した。この種ウィルスをエーテル処理し、そして３回プラーク精製した。
【０１１４】
修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）親ウィルスの起源
ＭＶＡは、アンカラワクシニア株ＣＶＡに由来した（Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ， １９７５）。ウィルス減弱化を、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦｓ）における終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）希釈により行った。３６０回の継代後、ウィルスを３回プラーク精製し、その後ＣＥＦｓ中にさらに継代した。５１６回の継代後、減弱化ＣＶＡ ウィルスをＭＶＡと名付けなおした。５７０回の継代後、ウィルスを再びプラーク精製し、さらに継代した。種ウィルス、５７５回継代、をＤｒ． Ａｎｔｏｎ Ｍａｙｒから入手し、そして初代ニワトリ胚皮膚細胞上で２回プラーク精製した。
【０１１５】
組換えポックスウィルスの作製
ｒＦ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製について、ｐＴ５０９１と名付けられたプラスミドベクター（図１）を構築し、外来性配列の鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域中への挿入を行った。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーター（Ｇｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ， １９９０）の制御下である。さらに、鶏痘ウィルスＣ１プロモーター（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ， １９９１）の制御下にあるＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子が、組換え子孫についてのスクリーニングとして含まれる。これらの外来性配列は、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域に由来するＤＮＡ 配列により隣接される。鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ株からプラーク精製された単離物をこの組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換え鶏痘ウィルスの作製は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列とｐＴ５０９１をトランスフェクトした鶏痘ウイルス−感染初代ニワトリ胚皮膚細胞中でのｐＴ５０９１中の対応する配列のあいだでの、相同組換えを介して達成された。組換えウィルスを、以前に記載されたように（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ， １９８５）、ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）の存在下でｌａｃＺ遺伝子産物の発現を検出する、ウィルスプラーク上でｉｎ ｓｉｔｕで行い、発色アッセイを用いて同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。ｖＴ２７７（図４Ａ）と名付けた陽性プラークを細胞単層から取り出し、それらの子孫を再びプレートに播いた。プラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌ存在下での再プレート化を４ラウンド行うと、結果として所望の組換え体の精製が生じた。
【０１１６】
ｒＦ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製について、ｐＴ５０５２と名付けられた（図２）プラスミドベクターを構築し、外来性配列の鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域中への挿入を方向付けた。プラスミドベクターｐＴ５０５２ を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０）に、ブダペスト条約の条件のもと、２０００年６月１５日にアクセッションＮｏ． ＰＴＡ−２０９９として寄託した。ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子はＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ Ｊ領域由来のＤＮＡ配列により隣接される。鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）株由来のプラーク精製された単離物をこの組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製を、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列とｐＴ５０５２でトランスフェクトした鶏痘ウイルス−感染初代ニワトリ胚皮膚細胞中のｐＴ５０５２中の対応する配列とのあいだで相同組換えを介して行った。組換えウィルスを、上述したｌａｃＺ遺伝子産物について発色アッセイを使用して同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。ｖＴ２１５（図４Ｂ）と名付けた陽性プラークを細胞単層から取り出し、それらの子孫を再びプレート化した。プラーク単離およびＢｌｕｏ−Ｇａｌの存在下での再プレート化を５ラウンド繰り返すと、結果として所望の組換え体の精製を引き起こした。
【０１１７】
腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）およびＧＭ−ＣＳＦとを共発現する、ｒＦ−ＴＡＡ／ＧＭ−ＣＳＦと名付けられた組換え鶏痘ウィルスの作製のために、プラスミドベクターを構築して、鶏痘ウィルスゲノム中への外来性配列の挿入を行った。ＴＡＡ遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、複数のプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列が挿入されるべき鶏痘ウィルスゲノム由来のＤＮＡ 配列により隣接される。組換え鶏痘ウィルスの作製は、鶏痘ウィルスゲノム中の鶏痘ウィルス配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされた鶏痘ウィルス−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを上述したように選択条件下細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレート化のラウンドを繰り返すと、結果として所望の組換えウィルス（図５Ａ）の精製を引き起こす。
【０１１８】
ｒＶ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製のために、プラスミドベクターを構築し、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域中に位置するＭ２Ｌ（３０Ｋ）遺伝子中への外来性配列の挿入を方向付けた。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの転写制御下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子はＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ領域に由来するＤＮＡ配列により隣接される。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）株からのプラーク精製単離物を、この組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトしたワクシニア−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成された。組換えウィルスを前述したｌａｃＺ遺伝子産物についての発色アッセイを使用して同定した。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明のバックグラウンドに対して青色を示した。プラーク単離および再プレート化を数ラウンド行うことにより、結果として所望の組換えの精製を引き起こす（図４Ｃ）。
【０１１９】
ｒＶ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のため、ｐＴ５０５１（図３）と名付けられたプラスミドベクターを構築して、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域中に位置するチミジンキナーゼ（Ｍ）遺伝子中への外来性配列の挿入を方向付けた。マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの転写制御下にあり、そしてＥ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は鶏痘ウィルスＣ１プロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｊ領域由来のＤＮＡ 配列により隣接される。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）株からのプラーク精製単離物を、この組換えワクチンのための親ウィルスとして使用した。組換えワクシニアウィルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列とｐＴ５０５１によりトランスフェクトしたワクシニア−感染細胞中のｐＴ５０５１中の対応する配列とのあいだの相同組換えを介して達成される。組換えウィルスを、上述したｌａｃＺ遺伝子産物についての発色アッセイを使用して同定する。ｌａｃＺを発現するウィルスプラークは、透明なバックグラウンドに対して青色を示す。組換えプラークを選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図４Ｄ）。
【０１２０】
腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）およびＧＭ−ＣＳＦを共発現する、ｒＶ−ＴＡＡ／ＧＭ−ＣＳＦと名付けられた組換えワクシニアウィルスの作製のため、プラスミドベクターを構築して、ワクシニアゲノム中への外来性配列の挿入を行う。ＴＡＡ遺伝子およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ポックスウィルスプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列を挿入すべきワクシニアゲノム由来のＤＮＡ 配列により隣接される。組換えワクシニアウィルスの作製は、ワクシニアゲノム中のワクシニア配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされたワクシニア−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを、上述したように、選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてそれらの子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図５Ｂ）。
【０１２１】
ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えＭＶＡの作製のため、プラスミドベクターを構築して、ＭＶＡ ゲノム中への外来性配列の挿入を行う。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、ポックスウィルスプロモーターの制御下にある。これらの外来性配列は、外来性配列を挿入すべきＭＶＡゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば欠失ＩＩＩ（Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９４）により隣接される。組換えＭＶＡの作製は、ＭＶＡゲノム中のＭＶＡ配列とプラスミドベクターによりトランスフェクトされたＭＶＡ−感染細胞中のプラスミドベクター中の対応する配列とのあいだでの相同組換えを介して達成される。組換えプラークを、選択条件下、細胞単層から取り出し、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離と再プレート化のラウンドをさらに行うことにより、結果として所望の組換えウィルスの精製を引き起こす（図４Ｅ）。ＧＭ−ＣＳＦを腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）とともに共発現する組換えＭＶＡのゲノム構造を、図５Ｃに示す。
【０１２２】
実施例２
材料と方法
動物、細胞株、および試薬
ＣＥＡ．Ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）（系統２６８２）は、Ｄｒ． Ｊｏｈｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から提供された（２４）。ヒトＣＥＡ遺伝子の完全コード領域を含有し、３．３ ｋｂの５’−隣接領域および５ ｋｂの３’−隣接領域が含まれるコスミドクローンを使用して、ＣＥＡ． Ｔｇマウスを作製した（３０）。ＣＥＡタンパク質発現は、胃腸管において優勢に見出され、一方でその他の部位、例えば気管、食道、小腸、および肺などにおいてもＣＥＡは発現した。マウスを、マイクロアイソレーターケージ中で、特定病原体フリー条件下にて、飼育し、維持した。系統は、創始動物から、野生型のメスＢ６マウスとの連続的な戻し交配により確立した。ＣＥＡ−陽性子孫を、固相、二重−決定因子抗−ＣＥＡ ＥＬＩＳＡキット（ＡＭＤＬ， Ｉｎｃ． Ｔｕｓｔｉｎ， ＣＡ）を使用して検出した、糞便ＣＥＡの存在により同定した。
【０１２３】
ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２（Ｈ−２ｂ）と命名されたＣＥＡ−発現ＭＣ−３８細胞は、レトロウィルス発現ベクターｐＢＮＣを用いてヒトＣＥＡ遺伝子を形質導入することにより産生された（３２）。株をクローン化し、そしてＣＯＬ−１（３３）反応性により測定するように、安定的ＣＥＡ発現についてフローサイトメトリーにより日常的に調べた。親ＭＣ−３８およびＭＣ−３８−ＣＥＡ−２細胞株の両方を高グルコースおよび１０％加熱不活化ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。ＦＤＣＰ−１細胞は、親切にもＤｒ． Ｊｉｍ Ｉｈｌｅ（Ｓｔ． Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｍｅｍｐｈｉｓ， ＴＮ）から提供され、そして２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１０％加熱不活化ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ ＷＥＨＩ細胞培養上清を添加したＲＰＭＩ １６４０中で増殖させた。凍結乾燥組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）から入手し、そして−８０℃にて使用するまで保存した。使用する前、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを１％マウス血清を含有する塩類溶液により適切な濃度となるように再構成した。再構成したｒｅｃＧＭ−ＣＳＦはまた、−２０℃にて保存し、そしてその生物学的活性をＧＭ−ＣＳＦ−依存性ＦＤＣＰ−１指標細胞を使用して３〜６ヶ月ごとにチェックした（３４）。
【０１２４】
組換えトリポックスウィルス
本研究で使用した組換えトリポックスウィルスは、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）ウィルス−ベースのベクターであった。話の内容を簡単にするため、組換えアビポックスウィルスについて集合的に言及する。それぞれの表および図に示されるデータを生成するために使用した個々の組換えアビポックスウィルスは、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）ベクターのそれぞれについてアビポックス（Ｆ）−およびアビポックス（Ａ）として同定する。
【０１２５】
アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ
ｒＦ−ＧＭ−ＣＳＦの生成のために使用した親ウィルス（すなわち、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ）は、鶏痘ウィルスの組織−培養適合ワクチン系統からプラーク生成された。アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦを、親鶏痘ＤＮＡとマウスＧＭ−ＣＳＦ 遺伝子を含有するプラスミドベクターとのあいだで、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えを介して構築した。ついで、Ｔｈｅｒｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）にて作製された組換えウィルスを使用して種ストックを生成し、これはゲノム解析およびタンパク質発現解析により特性決定された。
【０１２６】
アビポックス（Ａ）−組換え体
アビポックス（Ａ）は、生産的複製のためトリの種に限定される、カナリアポックスウィルス−ベースのベクターである（３５）。カナリアポックス系統は、感染させたカナリアのポックス病変から単離し、そしてニワトリ胚線維芽細胞中で２００回、連続継代することにより減弱化し、そして４回連続のラウンドのアガロースでのプラーク精製に供した。すべての増幅およびプラーク力価測定は、初代ニワトリ胚線維芽細胞上で行った。アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（ｖＣＰ３１９）、アビポックス（Ａ）−狂犬病糖タンパク質Ｇ（アビポックス（Ａ）−ＲＧと命名、ｖＣＰ６５）およびアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ（ｖＣＰ２４８）は、Ｖｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ（Ｔｒｏｙ， ＮＹ）から親切にも供給された。ＧＭ−ＣＳＦ発現は、バイオアッセイ（以下を参照）により確認し、そしてＣＥＡ発現は、マウスモノクローナル抗体ＣＯＬ−１を使用したウェスタンブロット解析により確認した（３２）。
【０１２７】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＧＭ−ＣＳＦ産生
ＭＣ−３８細胞をトリプシン処理し、そして血清−不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）中で２回洗浄した。４×１０６細胞を１５ ｍｌのコニカルポリプロピレンチューブ中に静置し、そして遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で再懸濁し、これに対して１０μｌのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたは適切な対照ウィルスのいずれかを所定のｐｆｕで添加した。感染細胞を３７℃にて１時間インキュベートし、そして１０〜１５分ごとに攪拌した。インキュベーションの後、細胞を、１０％ＦＢＳを添加した１０ ｍｌの増殖培地中で２回洗浄した。生存細胞をトリパンブルー排除法を使用してカウントし、そして６−ウェルプレートのウェルごとに３×１０５個の細胞を添加した。上清を２４、４８および７２時間後に回収し、そして生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦレベルを上述したように測定した。
【０１２８】
局所リンパ節解析
メスＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（Ｈ−２ｂ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｉｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から入手した。６〜８−週齢のマウスを病原体−フリーの条件下で、マイクロアイソレーターケージ中に収容しそして維持した。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルス、適切な対照ウィルス（すなわち、Ｆ−ＷＴ、アビポックス−ＲＧ）および組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を、尾根部に皮下注射により投与した。腸骨下部リンパ節、大動脈周囲リンパ節および仙骨リンパ節を外科的に単離し、細胞を機械的に分散させそして５０ ｍｌのコニカルチューブに移した。それらを１０分間氷上に立て、その後上清を回収した。細胞を遠心分離（５００×ｇ）によりペレット化し、そして氷冷Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋−不含ＤＰＢＳ中で２回洗浄した。２回目の洗浄の後、細胞を、０．５〜１．０×１０６細胞／ｍｌの濃度でＣａ２＋−Ｍｇ２＋不含ＤＰＢＳ中に再懸濁した。それらを分けて、そしておよそ１０６細胞を、１μｇのＦｉＴｃ−標識抗−Ｉ−Ａｂ（ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＩｇＧ２ａ，−ｋ）または適切な対照抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とともに、４℃にて１時間、インキュベートした。サンプルには、Ｆｃ受容体をブロックするため、１μｇの非標識２．２Ｇ２抗体（ＣＤ１６）も含有した。インキュベーションの後、細胞を２回洗浄し、そして４８８ ｎｍで１５ ｍＷの励起を有する青色レーザーを装着したＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用してすぐに解析した。データは、ライブゲートを使用して１０，０００細胞から集め、保存し、そして解析のために使用した。
【０１２９】
ＣＤ１１ｃ＋細胞の単離
非処置マウス群および処置マウス群から、腸骨下部リンパ節、大動脈周囲リンパ節および仙骨リンパ節からなる局所リンパ節を外科的に採取し、プールし、そして１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）および１０％加熱不活化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中に静置した。細胞を７０−μｍ細胞ステイナー（ｓｔａｉｎｅｒ）を通して機械的に分散させ、５０ ｍｌのコニカルチューブに移し、そして氷上に静置した。細胞懸濁液を氷冷ＤＰＢＳ中で遠心分離（５００×ｇ）により２回洗浄し、そして４℃にて１時間、１．５ ｍｌ／１０８細胞のビオチン−抗−ＣＤ１１ｃ（クローンＢ−ｌｙ６、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含有する氷冷ＤＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を遠心分離し、ＤＰＢＳ中で２回洗浄し、そして１００μｌのストレプトアビジン結合−ＭＡＣＳコロイド状超−常磁性マイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｉｎｃ．， Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中に再懸濁し、そして４℃にて１５分間インキュベートした。細胞を氷冷ＤＰＢＳを用いて洗浄し、１０分間遠心分離（２００×ｇ）することによりペレット化し、そして５００μｌのＤＰＢＳ中で再懸濁する。ＭＡＣＳ ＬＳ＋分離カラムをＭＩＤＩ ＭＡＣＳ磁気セパレーター中に静置し、そして製造者の指示にしたがって調製した。細胞懸濁液をカラム上にすぐにアプライし、そして非−磁性細胞を通過させた。カラムを３ ｍｌのバッファーを用いて３回すすぎ、そして磁気セパレーターから取り出し、そしてＭＡＣＳ＋細胞画分をカラムから溶出した。ＭＡＣＳ＋細胞画分をカラムに対する別のアプリケーションを用いて濃縮し、そしてＭＡＣＳ＋画分中の細胞数を血球計算機を使用してそしてＦＡＣＳによりカウントした。ビオチン−ＰＥ結合体および抗−Ａｂ−ＦｉＴｃ抗体（クローンＭ５／１１４．１５．２、ＩｇＧ２ｂ）からなる二重染色を使用したフローサイトメトリー解析により、ＭＡＣＳ＋細胞画分の＞８０％がＣＤ１１ ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋、ＣＤ１９−およびＣＤ３−であることが示された。
【０１３０】
混合リンパ球培養
混合−リンパ球反応のため、精製脾臓ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）Ｔ細胞を、放射線照射Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２６）リンパ節細胞の存在下（１：１比）、１０％加熱−不活化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培養液中で増殖させた。３７℃にて５日間、Ｔ−２５フラスコ中でインキュベーションした後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上での密度遠心分離により培養物から生存Ｔ細胞を回収し、そしてＭＣ−３８（Ｈ−２ｂ）およびＰ８１５（Ｈ−２ｄ）を標的として機能させる一方向性ＣＴＬアッセイにおいて使用した。
【０１３１】
免疫化
ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、尾根部近くに１００μｌのアビポックス−ＣＥＡまたはアビポックス−ＲＧを皮下注入することにより免疫化した。示した場合には、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを注入前にアビポックス−ＣＥＡと混合した。組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質をその後、３〜４日間連続して毎日、免疫化部位に投与した。
【０１３２】
血清抗体応答
血清サンプルを野生型Ｂ６およびＣＥＡ．Ｔｇから回収し、そして適切な標的抗原に対する抗体の存在についてＥＬＩＳＡにより解析した。マイクロタイタープレートを、４℃にて一晩、１００ ｎｇ／ウェルのＣＥＡ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ， ＣＡ）、ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、マウスｒｅｃＧＭ−ＣＳＦまたは５×１０５ ｐｆｕ／ウェルのＡＬＶＡＣにより感作した。ウェルを５％のＢＳＡを含有するＰＢＳによりブロッキングし、その後、希釈化マウス血清（１：１０〜１：３１，２５０）と１時間インキュベーションした。インキュベーション後、過剰な液体を吸引し、そしてプレートをバッファー（１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）にて３〜５回洗浄した。ウェルに結合した抗体をＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）またはＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を用いて検出した。１時間のインキュベーションの後、反応性のレベルをクロモゲンであるｏ−フェニレンジアミンを１０分間添加することにより検出し、そしてＥＬＩＳＡマイクロプレートオートリーダーＥＬ３１０（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， ＶＴ）を使用してＡ４９０ ｎｍを読み取った。陽性対照、陰性対照、および血清サンプルのトリプリケートを、すべてのアッセイについて実行した。ＣＥＡについておよびＡＬＶＡＣについての陽性対照は、それぞれマウスＩｇＧ２ａ抗−ＣＥＡ ＭＡｂ、ＣＯＬ−１（３５）、そしてポリクローナルウサギ抗−ＡＬＶＡＣ ＩｇＧであったが、これらは研究室で開発したものであった。商業的に入手可能なラット抗−マウスＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（クローンＭＰ１−２２Ｅ９、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を、抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイにおける陰性対照として使用した。抗体力価は、０．５のＡ４９０ ｎｍを結果として引き起こす血清希釈の逆数として決定した。
【０１３３】
Ｔ−細胞増殖アッセイ
マウス脾細胞は磁気マウス汎Ｂ（Ｂ２２０）ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ， Ａ．Ｓ．， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）によりＴ細胞のために濃縮され、そしてＦＡＣＳ解析により、得られた細胞集団は＞９５％ ＣＤ３＋であったことが示された。単離されたＴリンパ球を１５ ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、１０％加熱−不活化ＦＢＳ、２ ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ ｍＭの非−必須アミノ酸、１ ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０ ｕ／ｍｌのゲンタマイシン、および５０μＭのβ−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ １６４０中にて再懸濁した。アッセイは、平底９６−ウェルプレートのそれぞれにおいて、５０μｇ／ｍｌのＣＥＡ（Ｖｉｔｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ， ＣＯ）、５０μｇ／ｍｌのＯＶＡまたは培養液のいずれかの存在下にて、免疫化していない同系Ｂ６マウス由来の５×１０５個の放射線照射した脾細胞（ＡＰＣとして機能）および１．５×１０精製脾臓Ｔリンパ球とを同時培養することからなる。培養５日後に、細胞を［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル； Ａｍｅｒｓｈａｍ． Ｃｏｒｐ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）によりパルス化し、そして２４時間後に回収し、そして取り込まれた放射活性を液体シンチレーション分光器（Ｗａｌｌａｃ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）により測定した。
【０１３４】
ＣＴＬ株および細胞傷害性アッセイ
アビポックス−ＣＥＡ／ＲＧ±アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦにより二回目の免疫化をした４週間後に、２〜３匹のマウス／群から得た脾臓をプールし、そして単一細胞懸濁液を作製した。脾細胞を１５ ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．４）、２ ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ ｍＭの非必須アミノ酸、１ ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０％加熱−不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）および５０μＭの２−ＭＥを添加したＲＰＭＩ １６４０中に懸濁した。１Ｏ ｍｌ中で２５×１０６個の脾細胞を、Ｔ−２５フラスコに１０μｇ／ｍｌのＣＥＡ５２６−５３３（ＥＡＱＮＴＴＹＬ）とともに添加した。Ｔ細胞培養物をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上でＴ細胞を回収して死細胞および赤血球を取り除き、２×１０５Ｔ−細胞を５×１０６の放射線照射した同系脾細胞、１０μｇのＣＥＡ５２６−５３３／ｍｌおよび１０ Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ， Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．， ＥｍｅｒｙｖｉｌＩｅ， ＣＡ）の存在下にてインキュベートすることにより、１週間おきに２回刺激した。細胞傷害活性を、２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＣＥＡ５２６−５３３またはＦｌｕ ＮＰ ３６６−３７４のいずれかによりパルス化したマウスリンパ腫細胞株、ＥＬ−４を使用して評価した。
【０１３５】
ＣＴＬ活性は、以前に記載された方法（３６）を修飾することにより評価した。オーバーナイトのインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）放出アッセイを行った。簡単に述べれば、４×１０６のＥＬ−４標的細胞は、（１１１Ｉｎ）−オキシキノリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）中、３７℃にて３０分間、５０μＣｉで放射標識された。ペプチド−パルス化標的細胞を標識した後に、１μｇペプチド／ｍｌでインキュベートした。標的細胞およびエフェクター細胞を適切な比率で混合し、そして３７℃にて１８時間インキュベートした。放出された１１１Ｉｎの量は、ガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ Ａｕｔｏｇａｍｍａ， Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）で測定し、そして特異的溶解のパーセントを以下のようにして計算した：
％特異的溶解＝［（実験的ｃｐｍ − 自発的ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ − 自発的ｃｐｍ）］×１００。溶解ユニット（ＬＵ３０）は、１０，０００ペプチド−パルス化ＥＬ−４細胞の３０％溶解を得るために必要とされるエフェクター細胞の数を示す。
【０１３６】
サイトカイン産生アッセイ
Ｔ細胞株を、２×１０４細胞／ウェルの細胞密度にて、５×１０５放射線照射（２０００ ｒａｄ）同系ＣＥＡ．Ｔｇマウス脾細胞／ウェルおよび様々な濃度のＣＥＡ５２６−５３３ペプチドとともに、平底９６−ウェルプレート中で、インキュベートした。上清を４８時間後に回収し、そしてＩＦＮ−γおよびＩＬ−４レベルを、適切なＥＬＩＳＡアッセイ（Ｅｎｄｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を使用して測定した。
【０１３７】
腫瘍療法の研究
６−〜８−週齢のオスおよびメスＣＥＡ．Ｔｇマウスに、はじめ、２ ｍｇのシクロホスファミドを１回腹腔内（ｉ．ｐ．）注入により与えた。４日後、３×１０５細胞のＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞（１００μｌ中）を右側脇腹に皮下で注入した。注入細胞のＦＡＣＳ解析により、＞８５％の細胞上でＣＥＡ発現（ＣＯＬ−１結合）、強力なＭＨＣクラスＩ発現、およびＮＭＣクラスＩＩ発現の不存在が示された。４〜５日後、腫瘍体積が３０〜５０ ｍｍ３であったとき、マウスに、２００μｌ中、１０８ ｐｆｕのアビポックス−ＣＥＡ／ＲＧを単独で、または１０８ ｐｆｕのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたは２０μｇのｒｅｃＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、初回免疫を与え、１００μｌずつに分けて尾のそれぞれの側に皮下注入した。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを、４日間連続して毎日免疫化部位に投与した。免疫化を、同一部位に２週間後にブーストした。腫瘍を、２〜３回／週測定し、そして体積を以下のようにして計算した：［（ｍｍ、短軸）２×（ｍｍ、長軸）］／２。＞２ ｃｍ３の腫瘍を保持するマウスを人道的理由のために犠死させ、そして死亡日を記録した。腫瘍体積が減少したマウスにおいて、それはおそらく免疫化によるものであると思われるが、データを２つのカテゴリーに分けた：（ｉ）腫瘍退行および（ｉｉ）腫瘍根絶；これらはそれぞれ、測定された腫瘍体積の減少および腫瘍の完全な消滅として定義された。腫瘍が完全に根絶したマウスは、３×１０５細胞のＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞（１００μｌ中）をもう一方の脇腹に、２回目の皮下注入によりチャレンジした。
【０１３８】
統計的解析
Ｔ−細胞増殖／溶解データの統計学的有意性は、スチューデントの両側ｔテストに基づく。それぞれの処置群についての腫瘍体積の変化により測定したＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍の増殖速度の変化を、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵテストを用いて比較した。表３において、個々のＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける腫瘍増殖を、２つのカテゴリーに分類した：（ｉ）測定された腫瘍体積の減少により定義される腫瘍退行、および（ｉｉ）注入部位での腫瘍を測定できないかまたは触診できないことにより定義される腫瘍根絶。報告されたすべてのｐ値は両側性であり、そしてデータに対して実行された様々な評価のためには調整されなかった。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。
【０１３９】
実施例３
組換えアビポックスウィルスによるＧＭ−ＣＳＦ産生
マウスＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスを作製し、そしてＧＭ−ＣＳＦをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するそれらの能力を、ＭＣ−３８腫瘍細胞の感染後に評価した（図６）。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスは、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性細胞株を用いたバイオアッセイにおいて測定した場合、ほぼ等量のＧＭ−ＣＳＦ（すなわち、２２５〜２５０ ｎｇ／１０６細胞／日）を産生した。同一の細胞を同一のＭＯＩの対照ウィルスにより感染した場合、検出できるＧＭ−ＣＳＦは産生されなかった。
【０１４０】
実施例４
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ投与の後の局所リンパ節中の細胞的変化／機能的変化
排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）局所リンパ節でのクラスＩＩ−発現細胞の濃縮は、マウスモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦ生物活性に関するｉｎ ｖｉｖｏ読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）であった（１５、２２）。実際、局所リンパ節症（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ）が、Ｂ６マウスにおいて、１０７または１０８ ｐｆｕの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを投与して７日後に観察され、より低い程度であるが適切な対照ウィルスにより観察された（表３）。
【０１４１】
【表３】
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【０１４２】
ａ　Ｂ６マウス（６〜１０マウス／群）に、材料と方法において概説したように、示された組換えアビポックスウィルスまたはｒＧＭ−ＣＳＦを注入した。対照マウスにはＨＢＳＳを与えた。リンパ節をアビポックス−処置マウスから７日目および２１日目に回収し、そして最終注入の２４時間後にｒＧＭ−ＣＳＦ−処置マウスから回収した。リンパ節細胞の全数およびクラスＩＩ発現レベルを決定した。データは、２つの別個の実験の平均±ＳＥＭである。ＭＦＩ値は、４〜６回の定量の範囲として表している。
ｂ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．対照（ＨＢＳＳ−処置）マウス〕
ｃ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．同ｐｆｕの適切な対照アビポックスウィルス（すなわち、１０７アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ ｖｓ． １０７アビポックス（Ｆ）−ＷＴ）〕
ｄ　ｐ＜０．０５〔ｖｓ．ｒＧＭ−ＣＳＦの１回注入〕。
【０１４３】
細胞／節の全数における最も顕著な増加が、１０８ ｐｆｕのＧＭ−ＣＳＦ−発現組換えウィルスのいずれかを注入したマウスにおいて生じた。リンパ節細胞性における増加とともに、対照ウィルスと比較して、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスで処置したマウスにおけるクラスＩＩ−発現細胞のパーセントの選択的な増加が見られた（表３）。通常、非処置マウスまたはアビポックス−ＷＴまたはアビポックス−ＲＧのいずれかを注入したマウスから得た２５〜２９％のリンパ節細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する。（１０７または１０８ ｐｆｕの）組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかを注入すると、それらのＭＦＩの付随する３−倍のブーストとともに、７日目までに４３〜５１％までそのパーセントが増加した（表３）。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ−処置マウス由来の局所リンパ節を、注入の２１日後に解析した場合、クラスＩＩ＋リンパ節細胞のパーセントの持続的な増加が見いだされた。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの複数回注入が、リンパ節細胞性およびＭＨＣクラスＩＩ発現を向上させるために必要とされた（表３）。ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置を終了する際、リンパ節細胞性およびクラスＩＩ発現の変化は、表３にも示したように、２１日目までに迅速に処置前レベルに戻った。
【０１４４】
アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦを単回注入したマウスにおけるクラスＩＩ−発現リンパ節細胞の増加の時間経過をより徹底的に調査した。図７にまとめたように、マウスに１０７または１０８ ｐｆｕの組換えアビポックスウィルスまたは適切な対照ウィルスのいずれかを注入し、そして局所リンパ節におけるクラスＩＩ−発現細胞の全数を１週間おきに決定した。クラスＩＩ＋細胞／リンパ節の全数レベルの増加が、１０７または１０８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスにおいて、７日目までに観察された（図７）。１０８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスで処置したマウスにおけるクラスＩＩ発現細胞の絶対数は、２１〜２８日間増加したままであった。ｒｅｅＧＭ−ＣＳＦにより４日間処置したマウスにおけるクラスＩＩ−発現リンパ節細胞の全数の変化についての比較の時間経過を示している（図７Ａ、断続線）。
【０１４５】
局所リンパ節におけるクラスＩＩ発現レベルの増加は、Ｂ細胞でのより高いクラスＩＩレベルおよびＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋細胞の流入を含むことが報告された（２１）。ＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋細胞はまた、ＡＰＣ、特にマクロファージおよび樹状細胞の細胞−表面表現型プロファイルと一致する細胞−表面表現型プロファイルである、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、Ｔｅｒ１１９−、ＮＫ１．１−、ＣＤ１１ ｂ＋、ＤＥＣ２０５＋、ＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋であった（３７）。図８は、１０８ ｐｆｕのいずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスまたは適切な対照ウィルスで処置したマウスから単離された局所リンパ節中の、ＡＰＣ集団における一時的変化をまとめている。非処置マウス由来のおよそ１〜２％のリンパ節細胞が、それらの抗原表現型により定義される場合、ＡＰＣであった。１０８ ｐｆｕのいずれかのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの注入の７日後には、そのパーセントは、ほぼ３倍に増加した（データは示していない）。いずれかの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスの注入後７日目の節内でのＣＤ１１ｃ＋／クラスＩＩ＋細胞の絶対数は、１２−倍に増加した（図８）。さらに、ＡＰＣ／節の数の増加についての時間経過は、クラスＩＩ−発現細胞の全数についての時間経過と実質的に同一であった。アビポックス−ＷＴおよび−ＲＧ処置マウス由来のリンパ節は、より多い数のＡＰＣを含有しなかった（図８）。それらの節は、有意により多い数のＢおよびＴ細胞を含有しなかった。
【０１４６】
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたは対照ウィルスを注入したＢ６マウス由来の局所的節を７日後および２１日後に単離し、そして混合リンパ球培養物からアロ反応性ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するために使用した（図９）。アロ特異的溶解活性について調べた際、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ−処置マウスから７日目（図９Ａ）および２１日目（図９Ｂ）に単離されたリンパ節細胞は、非処理マウスまたは対照アビポックスウィルスで処置したマウスのいずれかから得たリンパ節細胞よりも、有意に（ｐ＜０．０５）強力であった。
【０１４７】
実施例５
複数アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ注入の効果
マウスにアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを３回、毎月注入し、そして局所リンパ節をそれぞれの注入後の全クラスＩＩ−発現細胞の変化について調べた研究を行った。血清サンプルを、抗−アビポックスおよび抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体力価の発生についても解析した。初回アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ注入の後７日後に、クラスＩＩ細胞の絶対数は０．５から４．９×１０６／リンパ節へとおよそ１０−倍に増加した（図１ＯＡ）。２８日までに、その数は１．７×１０６まで落ち込み、しかし２８日目にアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの２回目の注入後、３５日目までに４．８×１０６まで増加した。５６日目にアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの３回目の注入を行ったところ、再びクラスＩＩ＋細胞／節の数が２．８から５．７×１０６と増加した（図１ＯＡ）。アビポックス（Ａ）−ＲＧの注入の結果、クラスＩＩ＋リンパ節細胞の数の変化は観察されなかった。
【０１４８】
血清サンプルを、７日目、２８日目、３５日目、５６日目、６３日目、および８４日目に採取し、抗−アビポックスおよび−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ力価の存在について解析した。測定可能な抗−アビポックス抗体力価は、７日目および２８日目に観察された（図１ＯＢ）。２８日目に投与したアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの２回目の注入の後、血清抗−アビポックスＩｇＧ力価は、＞１００，０００にブーストされた。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの３回目の注入の結果、さらに血清抗−アビポックスＩｇＧ力価が＞２００，０００までさらに増加した。検出可能な血清抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ力価は、いずれの時間点でも見いだされなかった（図１ＯＢ）。
【０１４９】
実施例６
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの抗原−特異的免疫に対するアジュバント効果
ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける抗−ＣＥＡ抗体応答
ＣＥＡ．Ｔｇマウスに、アビポックス−ＣＥＡを単独で１ヶ月おきに２回、またはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの単回注入または４日間連続して投与したｒｅｅＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせて２回、ワクチン接種した。マウスの６０％において抗−ＣＥＡ ＩｇＧ血清力価の存在した場合、アビポックス−ＣＥＡ単独でワクチン接種するかまたはアビポックス−ＣＥＡをｒｅｃＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種した（図１１ Ｂおよび１１ Ｃ）。アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦをワクチン接種した１０匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスすべてが（図１１、パネルＤ）、抗−ＣＥＡ ＩｇＧ応答を引き起こした。ＣＥＡ抗体力価は、ナイーブマウスまたは対照ウィルス（アビポックス−ＲＧ）をワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスの血清中には検出されなかった（図１１、パネルＡ）。
【０１５０】
ＣＥＡに対するＴ−細胞増殖性応答
初代ＣＥＡ−特異的脾臓Ｔ−細胞増殖応答を使用して、組換えアビポックスウィルス中のＧＭ−ＣＳＦを送達する効率を、複数のＧＭ−ＣＳＦ注入を使用する場合と比較して評価した（表２）。ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞増殖は、ワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離した脾臓Ｔ細胞を５日間インキュベーションした後、〔３Ｈ〕チミジン取込みにより測定した。ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞増殖は、（ｉ）ＯＶＡがＴ細胞増殖を刺激できないこと、そして（ｉｉ）対照アビポックスウィルスにより免疫化したマウスから単離した脾臓Ｔ細胞が、可溶性ＣＥＡの存在下で増殖できないこと、により示された（表２）。アビポックス−ＣＥＡを、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｅＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて投与した場合、得られた可溶性ＣＥＡに対する脾臓Ｔ細胞増殖応答をブーストした（Ｐ＜０．０５）。ＣＥＡ−特異的リンパ球増殖は、アビポックス−ＲＧ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離した脾臓Ｔ細胞を使用しては見いだされなかった（表４）。
【０１５１】
【表４】
2004507231.tif 000007
【０１５２】
ａ　ＣＥＡ．Ｔｇマウス（２〜３匹／群）に、１０８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＣＥＡまたはアビポックス（Ａ）−ＲＧを、皮下に（１００μｌ）２回、１ヶ月おきに投与した。ＧＭ−ＣＳＦを組換えタンパク質として、または材料と方法に記載した組換えアビポックス（Ａ）ウィルスと組み合わせて投与した。２回目の免疫化の４〜６週後に、マウスを犠死させ、脾臓Ｔ細胞を単離し、処置群にしたがってプールした。可溶性ＣＥＡ、ＯＶＡ、およびＣｏｎＡに対するＴ細胞増殖応答を、３Ｈ−チミジン取込みにより測定した。
ｂ　データは、代表的な実験から得たΔｃｐｍ〔Ｔ細胞、ＡＰＣを含有するウェル、および抗原なしのウェルにおけるマイナスｃｐｍ（２６２１−７９７３）〕±ＳＥＭとして示す。Ｃｏｎ−Ａ刺激ウェルについて、平均ｃｐｍが示される（ＳＥＭ＜１０％）。３回の別個の実験を行い、同様の結果を得た。ｎｅｇ＝ｃｐｍ＜培地対照。
ｃ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ−免疫マウス）
ｄ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ−処置マウス）。
【０１５３】
ＣＥＡペプチド−特異的Ｔ−細胞溶解
ワクチン化ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける検出された主要なペプチド−特異的ＣＴＬ応答に対する繰り返した試みが失敗したため（データは示していない）、脾臓Ｔ細胞を、免疫化ＣＥＡ．Ｔｇマウスから単離し、そしてその後ＣＥＡアミノ酸５２６−５３３をスパンする８−ｍｅｒのペプチドおよびＩＬ−２の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。ＣＥＡ５２６−５３３、ＩＬ−２および放射線照射ＡＰＣに対するＴ細胞増殖応答が、アビポックス−ＣＥＡを単独でまたはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｅＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて免疫化したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて観察された。２回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、３種の細胞集団からの単離Ｔ細胞の＞９０％が、ＣＤ８＋であった。さらに、それらのＴ細胞は、ＣＥＡ５２６−５３３ペプチドによりパルスした同系（ＥＬ−４）標的を殺すことができた（図１２Ａ）。ＣＥＡペプチド−特異的ＥＬ−４溶解は、溶解ユニットにより測定した場合、アビポックス−ＣＥＡをアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種したＣＲＡ．Ｔｇマウスから得たＴ細胞株について、最高であった（ｐ＜０．０５ ｖｓ． アビポックス−ＣＥＡまたはアビポックス−ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ−免疫化マウスのいずれか）（図１２Ａ）。ＥＬ−４標的細胞を無関係なペプチド（すなわち、Ｆｌｕ ＮＰ）によりパルスした場合、バックグラウンドレベルの細胞溶解が観察された（図１２Ａ）。アビポックス−またはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれかと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡによりワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから生成されたＴ細胞株はまた、アビポックス−ＣＥＡを単独でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから生成されたＴ細胞株よりも、高いレベルのγ−インターフェロンを産生した（図１２Ｂ）。ＩＬ−４は、それらの培養物のいずれにも見いだされなかった。
【０１５４】
実施例７
抗腫瘍免疫
ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍を保有するＣＥＡ．Ｔｇマウスを、アビポックス−ＣＥＡ単独でまたはアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、並びに対照ウィルス、アビポックス−ＲＧを単独でまたはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、ワクチン接種した。ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍は、ナイーブＣＥＡ．Ｔｇマウス中でおよびアビポックス−ＲＧを単独でまたはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてワクチン接種したマウス中で、徐々に増殖し、そしてそれらのマウスを腫瘍接種後６〜７週で犠死させた（表３）。アビポックス−ＣＥＡワクチン接種の結果、数匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて腫瘍増殖の一過性な速度低下が引き起こされた；しかしながら、生存は長くなった（図１３Ｃ）。
【０１５５】
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡによるワクチン接種は、１６匹のＣＥＡ．Ｔｇマウスのうち６匹で腫瘍体積の測定可能な減少を引き起こした（図１３Ａ）。３５日目までに、アビポックス−ＣＥＡ＋アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ処置群の平均的腫瘍体積は、非処置群、アビポックス−ＲＧ＋アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ群またはアビポックス−ＣＥＡ−ワクチン接種群ＣＥＡ．Ｔｇマウスよりも、有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。実際、アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦによりワクチン接種した５匹の腫瘍−保持ＣＥＡ．Ｔｇマウスは、２８日目までに腫瘍フリーになり（表３、図１３Ａ）、そしてその状態が１４週間そのままであった（図１３Ｃ）。その時点で、５匹の腫瘍−フリーＣＥＡ．Ｔｇマウスを、ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２ 腫瘍細胞によりチャレンジし、そしてすべてがプロテクトされた（図１３Ｄ）。アビポックス−ＣＥＡおよびｒＧＭ−ＣＳＦをワクチン接種した１４匹のＣＥＡＴｇマウスのうちの４匹もまた、腫瘍フリーになり（表３；図１３Ｂ）、そしてそれらの４匹のマウスのうちの３匹はチャレンジした腫瘍を再び注入した（図１３Ｄ）。
【０１５６】
【表５】
2004507231.tif 000008
【０１５７】
ａ　ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、材料と方法に記載されたように、近似するアビポックス組換え体±アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦのいずれか、により２週間間隔で免疫化した。データは、単一の実験に由来するデータを示すアビポックス（Ａ）−ＲＧ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ群を除き２種の別個の実験から集めた。
ｂ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．対照ＣＥＡ．Ｔｇマウス）
ｃ　ｐ＜０．０５（ｖｓ．アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウス）。
【０１５８】
実施例８
ｒＦ−ＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｎ ｖｉｖｏでＣＥＡワクチンに対するＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答を向上させる
方法
本明細書中およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：５８００−５８０７， １９９９に開示されたとおり、メスＣ５７ＢＬ／６マウスを、１×１０８ ｐｆｕ／マウスのアビポックス（Ｆ）−ＷＴ、ｒＦ−ＣＥＡ、またはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭにより、１回ワクチン接種した。それぞれの群の半数には、１×１０７ ｐｆｕ／マウスのアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとして与え、ＧＭ−ＣＳＦがＴ−細胞応答を向上させるかどうかを調べ、一方で残りのマウスにはアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦを与えなかった（ｎ＝３マウス／群）。１４日後、ワクチン接種群から得た脾細胞を細胞性免疫応答の解析のために回収した。Ｔ−細胞応答を定量するため、いくつかの濃度のＣＥＡタンパク質の存在下、５日間、ワクチン接種マウス由来のＴ細胞を放射線照射脾細胞とともにインキュベートした。Ｔ細胞をまた、陽性増殖対照および陰性増殖対照のために、Ｃｏｎ Ａまたはオボアルブミンとともにインキュベートした。インキュベーションの最後の１８時間のあいだ、３Ｈ−チミジンを添加し、Ｔ−細胞増殖を測定した。
【０１５９】
これらの実験は、ｒＦ−ＣＥＡ、またはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭと組み合わせて投与した場合、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦが、これらのベクターのＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで活性化する能力を向上させることを示す（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【０１６０】
実施例９
β−ガラクトシダーゼに対するＣＤ４応答：鶏痘ウイルス−ＧＭ−ＣＳＦの免疫アジュバント効果
方法
Ｆｐ−ｍｕ−ＧＭ−ＣＳＦとともにまたは伴わずに、不完全フロイントアジュバントと組み合わせたβ−ｇａｌにより免疫化したマウスから単離した脾細胞によるβ−ｇａｌに対するリンパ球増殖性応答を測定した。マウスを、まず不完全フロイントアジュバントと組み合わせた１００μｇのβ−ｇａｌでワクチン接種し（三角）（体積比率あたり１：１に混合）またはアジュバントのみで接種した（丸）。選択した群において、Ｆｐ−ｍｕ−ＧＭ−ＣＳＦ（１０７ ｐｆｕ）（菱形）またはＦｐ−ＷＴ（１０７ ｐｆｕ）（四角）のいずれかを免疫源とともに添加し、そして皮下に注入した。ワクチン接種の３０日後、脾臓を回収し、そしてＴ−細胞を単離し、そしてリンパ球増殖性アッセイにおいて使用し、そこには、β−ｇａｌタンパク質（１００〜６．２５ ｕｇ／ｍｌ）およびナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した５×１０５放射線照射抗原−提示細胞が含まれた。３Ｈ−チミジンをｉｎ ｖｉｔｒｏ培養５日後に添加し、そして取り込まれた量を２４時間後に測定した。
【０１６１】
結果
データは、全タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）を免疫源として使用した場合に、マウスＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルス（鶏痘ウイルス）が、実質的に宿主細胞性（すなわちＣＤ４）免疫応答を増大させることを示した（図１５）。
【０１６２】
実施例１０
膀胱癌を有する患者に対するアビポックス−Ｆ−ＧＭ−ＣＳＦの膀胱内投与
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、膀胱癌を有する患者に対して、膀胱内で投与した。患者には、１０６〜１０１１ ｐｆｕのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦをカテーテルを介して投与し、膀胱癌腫細胞に感染させた。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１〜１０回、１日おき、１週間おき、または１ヶ月おきに投与する。治療の有効性は、臨床的に評価する。
【０１６３】
実施例１１
頭部および頸部癌腫を有する患者における、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦの直接腫瘍内注入
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、頭部および頸部などの腫瘍、皮膚のメラノーマおよび乳癌転移に直接的に注入する。１０５〜１０９ ｐｆｕのあいだのアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１〜１０回、 １日おき、１週間おき、または１ヶ月おきに投与する。
【０１６４】
実施例１２
ＣＥＡ−発現癌腫を有する患者のワクチン化
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭワクチンと組み合わせて使用して、いずれかのＣＥＡ発現腫瘍を治療する。アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭは、鶏痘組換え体が腫瘍抗原ＣＥＡおよび３種の異なる共刺激分子：Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現するワクチンである。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦは、１０６〜１０１０ ｐｆｕ／注入の用量で与える。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭの投与の前（１日〜１週間）、同時、または後（１日〜１週間）のいずれかに投与する。アビポックス−ＣＥＡ−ＴＲＩＣＯＭは、１０６〜１０１０ ｐｆｕ／感染の濃度で与える。
【０１６５】
実施例１３
Ｒｈｅｓｕｓ ＭａｅａｑｕｅｓでのＳＩＶおよびＳＨＩＶチャレンジモデルにおける、ＨＩＶ抗原およびＳＩＶ抗原を発現する組換えポックスウィルスと組み合わせたアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦ
アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、１０６〜１０１０ ｐｆｕ／注入の用量で皮下に与える。アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＨＩＶ抗原−ＴＲＩＣＯＭ、アビポックス−ＳＩＶ抗原−ＴＲＩＣＯＭ、アビポックス−ＨＩＶ抗原−Ｂ７、またはアビポックス−ＳＩＶ抗原−Ｂ７の投与の前（１日〜１週間）、同時、または後（１日〜１週間）のいずれかに、皮下に１０６〜１０１０ ｐｆｕ／注入で投与する。
【０１６６】
検討
ＧＭ−ＣＳＦは、プロフェッショナルＡＰＣを局所注入部位に引き寄せ、その後局所リンパ節中に遊走して宿主免疫応答を媒介する能力により、ワクチンに対する強力な生物学的アジュバントとして作用すると考えられる（１５、２１、２２）。組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質を４〜５日間連続して注入した以前の研究（１５）は、局所リンパ節でクラスＩＩ−発現ＡＰＣが増殖し、その次に宿主免疫におけるブーストと相関関係を有したことを報告した。異なるビヒクルを使用して、ＧＭ−ＣＳＦを免疫化部位に対して送達した。それらのアプローチのいくつかには、腫瘍細胞ワクチン中にレトロウィルスベクターを介してＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入すること（１９、２０）、融合タンパク質（１８）および複製−欠失（２５）組換えポックスウィルスが含まれる。本研究において、ＧＭ−ＣＳＦを発現する複製−欠損組換えアビポックス〔鶏痘ウイルス、カナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）〕ウィルスを、一回、皮下に注入してＢ６マウスに与えた。局所排出性リンパ節内部のリンパ節細胞の絶対数（表３）、パーセント（表３）、ＭＦＩ（表３）、およびクラスＩＩ−発現細胞の絶対数（図７Ａ〜７Ｄ）およびＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋細胞の数（図８）の結果としての増加は、すべて、組換えアビポックスウィルスによる生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦの合成と一致した。ＧＭ−ＣＳＦを発現する２種の異なる組換え体アビポックスウィルス、鶏痘およびカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）を比較し、そして一見した相違は観察されなかった。
【０１６７】
ＧＭ−ＣＳＦを免疫化部位に対して送達するための組換えアビポックスウィルスの使用は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを使用することよりもいくつかの利点を有する可能性がある。局所リンパ節中でのＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋細胞の絶対数の増加の程度は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの場合よりもアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを注入したマウスにおいて、ずっと大きかった。例えば、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置の４〜５日後、ＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋リンパ節細胞の数は、非処置マウスと比較した場合、およそ６−倍に増加した（０．７１ ｖｓ． ０．１２×１０６／節、図３）。１０８ ｐｆｕの組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかの一回注入により、ＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋リンパ節細胞の絶対数をほぼ７０−倍にまでブーストした（１．４４ ｖｓ． ０．１２×１０６／節、図３）。ＧＭ−ＣＳＦを送達するために組換えアビポックスウィルスを使用することの第二の利点は、局所リンパ節内でのＡＰＣの濃縮と関連する一時的な変化である可能性がある。図８に示すように、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦは、局所リンパ節内でのＡＰＣ濃度を増加させるためには、４〜５日間投与することを必要とする。 ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ処置の中止に際して、注入部位内部での変化は、迅速に消滅する（およそ４〜５日）。一方で、クラスＩＩ＋およびＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋リンパ節細胞の絶対数の増加は、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスのいずれかを、２１〜２８日間注入したマウスの局所リンパ節中で持続した（図８）。実際、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ注入の２１日後に単離されたリンパ節細胞は、より強力なアロ特異的なＣＴＬ応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、そのことからそれらの機能的完全性が示される（図９Ｂ）。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスが注入後にＧＭ−ＣＳＦの貯蔵所を作製し、そして局所的節において見いだされる長期的な変化は、サイトカインの遅速放出を示しているだろう、と議論する者もいるかもしれない。ＧＭ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、２〜３日間のオーダーであるため、そのような意見はありそうもない。理論により縛られるものではないが、よりもっともらしい説明は、複製−欠失アビポックスウィルスが注入部位に居続け、そして持続的にＧＭ−ＣＳＦを産生し、これが続いて局所リンパ節においてみられる持続的な変化を媒介する、というものである。
【０１６８】
これらの組換えアビポックスウィルスがワクチン接種部位に対して生物学的に活性なＧＭ−ＣＳＦを送達するために使用すべきであるならば、それらは特定の抗癌ワクチンと融和性でなければならない。そのような仮説を試験するため、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスならびにｒｅｃＧＭ−ＣＳＦを、アビポックス−ＣＥＡを腫瘍ワクチンとして使用する場合に、それらがＣＥＡ−特異的宿主免疫をＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて増強する能力について評価した。アビポックス−ＣＥＡにより、または以前に報告されたとおり組換えワクシニア−ＣＥＡ ウィルスにより（２９）、ＣＥＡ．Ｔｇマウスにワクチン接種すると、ＣＥＡ−特異的体液性−および細胞性−媒介性免疫を誘導する。しかしながら、組換えポックスウィルス−ＣＥＡワクチンによりワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて生成されたＣＥＡ−特異的免疫は、比較的弱かった。実際、本発明において、アビポックス−ＣＥＡワクチン接種により、ＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＣＥＡ−発現皮下腫瘍の一過性増殖阻害が誘導された（図１３Ｂ）。ＧＭ−ＣＳＦを、組換えアビポックスウィルスとしてまたは組換えタンパク質として組み込むことにより、アビポックス−ＣＥＡ−ワクチン接種ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて、ＣＥＡ−特異的ＣＤ４＋−増殖性応答（表４）およびＣＤ８＋−媒介性溶解応答（図１２Ａ）が増大した。実際、抗−ＣＥＡ−特異的細胞性免疫応答は、ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦではなく、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦが生物学的ワクチンアジュバントであるＣＥＡ．Ｔｇマウスにおいて有意により強力であった。したがって、腫瘍抗原およびＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスは融和性であり、そして同時に注入することができる様である。さらに、組換えアビポックス−ＣＥＡ ウィルスがＣＥＡを２１〜２８日間連続的に産生するならば、増大した局所的ＧＭ−ＣＳＦレベルとともに抗原が同時的に存在することは、結果として樹状細胞に腫瘍抗原を持続的に負荷していることになるだろう。
【０１６９】
それは、ＣＥＡに対する細胞応答の改善を説明しうるが、それらの変化が、アビポックス−ＣＥＡおよびアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦでワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおけるより強力な抗腫瘍応答を媒介しなかった理由は、解明されないままである。１つの可能性のある説明は、細胞−媒介性免疫が自己抗原に対して生成される実験的モデルを使用することにより、抗腫瘍応答を埋め合わせうる宿主／腫瘍因子を導入することができる、というものである。
【０１７０】
感染しそして遺伝子産物を発現する能力、および臨床試験において証明されたそれらの安全性のため（３８〜４２）、組換えアビポックスウィルスは、癌ワクチンとして魅力的な候補である。ワクシニアに対して先に曝露すると、組換えアビポックスウィルスに対する免疫応答を変化させず（４３）、そして多様な初回−ブーストプロトコルにおいて、２種のウィルスが、マウスモデルにおいて抗腫瘍免疫を誘導する（３６）。この知見は、組換えアビポックスウィルスを使用することを、免疫化部位でＡＰＣを濃縮するためにＧＭ−ＣＳＦを送達し、それにより抗原−特異的抗腫瘍免疫の生成を増大させることを含むことまで拡張される。別の知見は、繰り返し注入の後のアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦが局所リンパ節でのＡＰＣを濃縮する能力であった。これらの研究およびその他の研究（２４、４４）において観察された抗−アビポックス血清抗体力価の存在にかかわらず、そのことは起こった。事実、最近の臨床試験において、進行したＣＥＡ−陽性腫瘍を伴う患者に対して投与されたアビポックス−ＣＥＡの複数回注入により、ＣＥＡ−特異的Ｔ細胞前駆細胞頻度の進行性の増加が引き起こされた。組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスを使用することの３つ目の利点は、それをアビポックス−ＣＥＡなどの免疫源と容易に混合することができること、そしてｒｅｃＧＭ−ＣＳＦの４〜５回の毎日の注入と比較して、ワクチンを一回注入として投与することができることの容易性である。そのことにより、ワクチンデザインが簡単にすることができ、治療コストを下げることができ、その一方でおそらくは、ＧＭ−ＣＳＦのアジュバント効果を最大にすることができる。
【０１７１】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴および多くの付随する利点は、本発明の詳細な説明を読むことにより、本明細書中に添付する図面とともに考慮した場合に、よりよく理解されるだろう：
【図１】図１は、ｒＦ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０９１を示す。
【図２】図２は、ｒＦ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０５２を示す。
【図３】図３は、ｒＶ−ｈｕＧＭ−ＣＳＦの作製のためのプラスミドベクターｐＴ５０５１を示す。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えポックスウィルスのゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ Ｊは、鶏痘ゲノム中の外来性遺伝子の挿入部位である。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＪまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｍは、ワクシニアウィルスゲノム中の挿入部位である。欠失ＩＩＩは、ＭＶＡゲノム中の挿入部位である。４０Ｋ、Ｃ１、Ｐ１およびＰ２は、ポックスウィルスプロモーターである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦを腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）とともに発現する組換えポックスウィルスのゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ Ｊは、鶏痘ゲノム中の外来性遺伝子の挿入部位である。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｊは、ワクシニアウィルスゲノム中の挿入部位である。欠失ＩＩＩは、ＭＶＡゲノム中の挿入部位である。Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、ポックスウィルスプロモーターである。
【図６】図６は、組換えアビポックス−ＧＭ−ＣＳＦウィルスによるマウスＧＭ−ＣＳＦの産生を示す。ＭＣ−３８細胞を、材料と方法において概説したように、５ ＭＯＩのアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ、５ ＭＯＩのアビポックス（Ｆ）−ＷＴ、５ ＭＯＩのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたは５ ＭＯＩのアビポックス（Ａ）−ＲＧのいずれかにより感染させた。対照細胞には、ウィルスを与えなかった。細胞を３日間増殖させ、そして２４時間ごとに上清を回収した。マウスＧＭ−ＣＳＦレベルを、ＧＭ−ＣＳＦ−依存性ＦＤＣＰ−１指標細胞株を使用して測定し、そしてｎｇ ＧＭ−ＣＳＦ産生／１０６細胞／２４ｈとして示した。データは、同様の結果が繰り返し得られた代表的な実験に由来するトリプリケートウェルからの平均±ＳＥである。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアビポックスウィルスを用いて処置したマウスの局所リンパ節内のＭＨＣクラスＩＩ−発現細胞を示す。図７Ａおよび７Ｂにおいて、Ｂ６マウス群（２０〜３０マウス）には、１０７ ｐｆｕ（２Ａ）または１０８ ｐｆｕ（２Ｂ）のアビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）またはアビポックス（Ｆ）−ＷＴ（白丸）のいずれかを１回ｓ．ｃ．注射（ｄａｙ １、矢印）した。図７Ｃおよび７Ｄにおいて、Ｂ６マウスにはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）またはアビポックス（Ａ）−ＲＧ（白丸）をそれぞれ１０７ ｐｆｕおよび１０８ ｐｆｕで与えた。その他のＢ６マウス（ｎ＝２０）には、２０μｇのｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（図７Ａ、断続線、黒三角）を４日間（黒水平線）、毎日注射した。対照マウス（白三角、すべてのパネル）には、１００μｌのＨＢＳＳを与えた。マウス（４〜６／群）をそれぞれの時点で犠死させ、鼠蹊部リンパ節を回収し、一緒にし、そして全リンパ節細胞を血球計算板を使用して計数した。クラスＩＩ−発現細胞のパーセントを、フローサイトメトリーを使用してＩ−Ａｂ＋細胞により決定し、そしてクラスＩＩ−発現細胞の全数を以下の様にして計算した：全リンパ節細胞×％クラスＩＩ＋細胞＝全クラスＩＩ＋細胞。データは、それぞれの時点が、２〜３の異なる測定法の平均である、３〜４実験から得た結果を示す（ＳＤ≦１５％）。
【図８】図８は、アビポックス−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦにより処置したマウスにおける局所リンパ節あたりのＡＰＣの全数を示す。Ｂ６マウス（８〜１２／群）に対して、図７Ａ〜７Ｄに概説したように、１０８ ｐｆｕ（矢印で示す）のアビポックス（Ｆ）−ＣＭ−ＣＳＦ（黒三角）、アビポックス（Ｆ）−ＷＴ（白三角）、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒四角）またはアビポックス（Ａ）−狂犬病糖タンパク質（ＲＧ）（白四角）を投与した。組換えＧＭ−ＣＳＦ（２０μｇ、黒丸）を、マウスのコホート（ｎ＝１５）に対して、４日間連続して与えた（黒水平線）。対照マウス（破断線）には、ＨＢＳＳを与えた。局所リンパ節を示した時点で回収し、そしてＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋細胞の全数を、材料と方法において概説したように測定した。データは、それぞれの時間点について２〜３回試験した３〜４回の別個の実験に由来する知見の合成の平均±ＳＥを示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、アビポックス（図１０Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦのアロ反応性ＣＴＬの生成に対する効果を示す。ナイーブのＢ６マウスを、１０８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒三角）、１０８ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＲＧ（黒四角）のいずれかにより前述したように処置した。対照マウスには、ＨＢＳＳ（黒丸）を与えた。７日後（図９Ａ）および２１日後（図９Ｂ）に、マウス（３〜４）を犠死させ、局所リンパ節を回収し、そして単一細胞懸濁物を調製した。それらのリンパ節細胞に放射線照射し（５０００ ｒａｄ）そしてＡＰＣとして使用した。一方向性のＭＬＣを設定するため、１：１の比率のレスポンダー（ＢＡＬＢ／Ｃ脾細胞）およびスティミュレーター（照射されたＢ６リンパ節細胞）を、Ｔ−２５フラスコ中の１０ ｍｌの培養液中で、３７℃にて５日間インキュベートした。細胞を回収し、材料と方法において記載したように細胞傷害性を測定した。細胞溶解は、同種異系Ｈ−２ｂ標的細胞（ＭＣ−３８）について示されたが、同系Ｈ−２ｄ細胞（Ｐ８１５）に対する細胞溶解は、すべての群について＜８％であった。データは、同一の結果を繰り返し示した単一の実験に由来する４重の決定値に由来する平均±ＳＥを示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、（Ａ）アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはアビポックス（Ａ）−ＲＧの複数回に分けた注入の後のリンパ節クラスＩＩ−発現細胞の変化を示す。Ｂ６マウス（１５／群）には、１０７ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）、１０７ ｐｆｕのアビポックス（Ａ）−ＲＧ（白丸）またはＨＢＳＳ（黒三角）のいずれかを注入した。それぞれの時点において、２〜５匹のマウス／群を犠死させ、両側性鼠径部リンパ節を単離し、そして図７Ａ〜７Ｄについて概説したように全クラスＩＩ発現細胞を決定した。データは、単一の実験に由来する結果を示す（図１０Ｂ）。マウス由来の血清サンプルを、抗−アビポックス（Ａ）（斜線付き棒）または抗−ＧＭ−ＣＳＦ ＩｇＧ（黒棒）抗体力価の存在について解析した（材料と方法を参照）。血清抗−アビポックス（Ａ）および抗−ＧＭ−ＣＳＦ抗体力価は、それぞれの時点で解析した、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦおよび非処理群からの２匹の別個のマウスから得た平均である（ＳＥ＜１０％）。
【図１１】図１１は、ＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける抗−ＣＥＡ ＩｇＧ血清力価の生成を示す。ＣＥＡ．Ｔｇマウスを、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（１０８ ｐｆｕ、パネルＢ）により、またはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（２０μｇ、パネルＣ）またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１０８ ｐｆｕ、パネルＤ）とともに、材料と方法に概説されたようにワクチン接種した（２×）。その他のマウスは、アビポックス（Ａ）−ＲＧ（１０８ ｐｆｕ）またはＨＢＳＳ（パネルＡ）のいずれかを２回注入した。最終処理の２週間後、マウスから採血し、そして血清を前述したように抗−ＣＥＡ ＩｇＧ抗体の存在について試験した。データは、個々のマウスの血清抗体力価を示す。＜１００の力価は陰性とみなした。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡをアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｅｃＧＭ−ＣＳＦとともにワクチン接種したＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＣＥＡ−５２６−４３３特異的ＣＴＬ 応答の生成を示す。ＣＥＡ．Ｔｇマウスを材料と方法に概説されるようにワクチン接種した。精製脾臓Ｔ細胞を、１０ユニットのＩＬ−２および１μｇのＣＥＡペプチド／ｍｌの存在下にて、３ラウンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に供した。Ｔ細胞株は、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（○、●）、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒四角、□）およびアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋ｒｅｃＧＭ−ＣＳＦ（▲、△）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスから増殖させた。細胞溶解活性は、０．２μｇのＣＥＡ５２６−５２２（黒色）（図１２Ａ）または対照ペプチド（すなわち、Ｆｌｕ ＮＰ３６６−３７４）（白色）の存在下でインキュベートされたＥＬ４標的細胞に対して試験した。それらの同一のＴ細胞株を、新たに単離し放射線照射したＡＰＣおよび０．０１〜１μｇのＣＥＡペプチドとともに４８時間インキュベートし、上清を回収した。ＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳＡにより決定した（図１２Ｂ）。データは、同様の結果が繰り返し得られた代表的な実験における３個の別個のウェルに由来する平均±ＳＥＭであった。検出可能なＩＬ−４レベルは見出されなかった。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１３Ａ）またはｒＧＭ−ＣＳＦ（１３Ｂ）のいずれかと組み合わせたアビポックス（Ａ）−ＣＥＡでワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスにおける、抗腫瘍免疫を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、アビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（１３Ａ、矢印）またはｒＧＭ−ＣＳＦ（１３Ｂ、矢印、黒水平線）のいずれかと組み合わせたアビポックス−ＣＥＡでワクチン接種したＣＥＡ．ＴｇマウスにおけるＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍の増殖を示す。Ｎは、第５６日において腫瘍を有さないマウスの数を示す。データは、２回の別個の実験を組み合わせている。図１３Ａおよび１３Ｂにおける黒線は、腫瘍退行が観察されたマウスを示す。図１３Ｃは、アビポックス（Ａ）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウス、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡ単独（●）、またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ（黒四角）またはｒＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ（▲）でワクチン接種したＣＥＡ．Ｔｇマウスの生存を示す。非処置ＣＥＡ．Ｔｇマウス（破断線）には、ＨＢＳＳを与えた。アビポックス（Ａ）−ＲＧ単独またはアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦまたはｒＧＭ−ＣＳＦのいずれかとの組み合わせでワクチン接種しても、全体の生存は変化しなかった（データは示さない）。図１３Ｄは、アビポックス（Ａ）−ＣＥＡおよびアビポックス（Ａ）−ＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝５、▲）またはアビポックス（Ａ）−ＣＥＡ＋ｒＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝４、●）でワクチン接種した後にＭＣ−３８−ＣＥＡ−２腫瘍を拒絶したＣＥＡ．Ｔｇマウスを、３×１０５のＭＣ３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞でチャレンジした。断続線は、同一の腫瘍用量を投与した１０匹のナイーブなＣＥＡ．Ｔｇマウスの生存を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦがＣＥＡワクチンに対するＣＥＡ−特異的Ｔ−細胞応答を向上させることを示す。図１４Ａ：バッファー（黒ボックス）、アビポックス（Ｆ）−ＷＴ（黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＷＴ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。図１４Ｂ：アビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ（黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。図１４Ｃ：アビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（すなわち、ＣＥＡ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３を発現するアビポックス；黒ダイヤ）、またはアビポックス（Ｆ）−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ＋アビポックス（Ｆ）−ＧＭ−ＣＳＦ（黒丸）でワクチン接種したマウス由来のＴ−細胞応答。それぞれのパネル中の挿入は、Ｃｏｎ Ａ（陽性対照）およびオボアルブミン（陰性対照）に対するＴ−細胞応答が、すべての群について同一であったことを示す。
【図１５】図１５は、不完全フロイントアジュバント（鶏痘マウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｆｐ−ｍｕ ＧＭ−ＣＳＦ）を含むかまたは含まないＩＦＡ）と組み合わせたβ−ｇａｌにより免疫化したマウスから単離した脾細胞による、全タンパク質、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に対するリンパ球増殖応答を示す（●＝非処置；▲＝β−ｇａｌ＋ＩＦＡ；◆＝β−ｇａｌ＋ＩＦＡ＋Ｆｐ−ｍｕＧＭ−ＣＳＦ １０７ ｐｆｕ；黒四角＝β−ｇａｌ＋Ｆｐ−ＷＴ）。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004507231.tif 000155
【国際調査報告】
2004507231.tif 000156
2004507231.tif 000157
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