(57)【要約】本発明は、樹脂からエポチロン類、特にエポチロンＡおよび／もしくはエポチロンＢ、の脱着方法ならびに該脱着方法を含むエポチロン類の新しい生産、後処理もしくは精製方法または製造方法、ならびに樹脂からエポチロン類を脱着するための特定の溶媒の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹脂からエポチロン類を脱着する方法であって、弱極性のもしくは無極性の溶媒を使用する方法。
【請求項２】
脱着されるエポチロン類がエポチロンＡもしくはエポチロンＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
樹脂が合成樹脂である、請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
樹脂がスチレン／ジビニルベンゼン共重合体をベースとする合成樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
弱極性のもしくは無極性の溶媒がハロゲン化低級アルキルおよび芳香族溶媒または二つもしくはそれ以上のそのような溶媒の混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ナフタレン、ベンゼンまたは低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキルからなる群から選択される一つもしくはそれ以上の基により置換されたナフタレンもしくはベンゼンからなる群から選択される芳香族溶媒が使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
合成樹脂に吸着したエポチロン類を単離する方法であって、（ｉｉｉ）弱極性のもしくは無極性の溶媒で該合成樹脂からエポチロン類を脱着すること；ならびに
（ｉｖ）適当な溶媒中に溶かすこと、ならびにニトリルおよび水の混合液での溶出により逆相クロマトグラフィーでエポチロン類を分離すること
を含む、方法。
【請求項８】
純粋な形でそれぞれのエポチロン類に達するために望ましいかまたは必要であるさらなる精製工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
反応混合液からのエポチロン類を後処理する方法であって、
−  エポチロン類を弱極性のもしくは無極性の溶媒、特にハロゲン化低級アルキルもしくは芳香族溶媒で脱着し、ここで、さらに完全な脱着を達成するために、脱着工程は繰り返されてもよく；
−  得られた溶液から脱着に使用した溶媒を蒸発により除去すること；
−  所望により、脱着後にエポチロン（類）を結晶化すること；特に、エポチロンＢの結晶化のために、アルコールおよび炭化水素の、特に低級アルカノールおよび３〜１０個の環原子を持つ環状脂肪族炭化水素の、混合液を加えること、およびアルコール相を蒸発乾固すること、ならびにエポチロンＢを適切な混合溶媒から、特にアルコール／環状脂肪族炭化水素混合液から結晶化させること；
−  （必須工程）適当な溶媒、特にニトリルおよび水の混合液、の中に先行の工程からの残渣を溶かし、ニトリルおよび水の混合液で溶出する逆相クロマトグラフィーによるエポチロン類の分離であって、好ましくは、炭化水素鎖、特に１８個の炭素原子を含有する炭化水素鎖を含むＲＰ−１８材料を装てんしている逆相材料のカラム上でクロマトグラフィーを行い、そしてニトリル、特に低級アルキルニトリル、を含む溶出液を用いる、特にニトリル／水の混合液、特にアセトニトリル／水の混合液、を用いることを特徴とする分離；ならびに収集したエポチロンを含むフラクションからニトリルを蒸発により除去すること；所望により、次いで、エポチロンを持つ残存する水を、エステル、特に低級アルキル−低級アルカン酸エステルで抽出し、続いてエポチロンを含有するエステル相を蒸発乾固させること；
−  所望により、特にシリカゲルのカラムに加えることおよび適切な溶媒もしくは混合溶媒で溶出することによる、吸着クロマトグラフィーによりさらに精製すること；ならびに
−  最後に、精製エポチロンを適切な溶媒もしくは混合溶媒から再結晶すること；
を含み、その方法において、必要なおよび／もしくは望ましい場合には、使用されるそれぞれの工程の間に、得られた溶液もしくは懸濁液を濃縮し、そして／または液体および固体の成分を、特に溶液／懸濁液の沈降、ろ過もしくは遠心分離により、互いに分離する方法。
【請求項１０】
エポチロン類の樹脂からの脱着が、特に請求項５もしくは６で好ましいとして記載されるように、弱極性のもしくは無極性の溶媒により達成され；次いで、溶媒を、必要な場合には、好ましくは乾燥残渣が得られるまで、除去し、適切である場合には、残渣をアルコール／炭化水素混合液中に比較的低容量で溶かし；アルコール相を好ましくは蒸発乾固し、次いで、アルコール抽出物をアルコールおよび炭化水素の混合液から結晶化し、次いで、得られた固体の結晶化物を請求項８に記載のようにニトリル／水混合液、特に２：３（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水混合液に溶解し、そして得られた供給液を、必要であれば二回以上の操作に分割後に、分取逆相カラム上に流し込み、ニトリル／水による溶出を続け；次いで、得られたエポチロンを含有するフラクションのニトリルの蒸発による除去に続けそして得られた水相をエステルで抽出し；次いで、該エステル抽出液を蒸発し、引き続いて得られた物を再結晶する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エポチロンＡおよびＢの分離が擬似移動床式（ＳＭＢ）クロマトグラフィーにより達成される、請求項７、９もしくは１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
樹脂からのエポチロン類の脱着のための、弱極性のもしくは無極性の溶媒の使用。
【請求項１３】
弱極性のもしくは無極性の溶媒が、ハロゲン化低級アルキルおよび芳香族溶媒、特にナフタレン、ベンゼンまたは低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキルからなる群から選択される一つもしくはそれ以上の基により置換されたナフタレンもしくはベンゼン；または二つもしくはそれ以上のそのような溶媒の混合液からなる群から選択され；樹脂が合成樹脂である、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、樹脂からエポチロン類、特にエポチロンＡおよび／もしくはエポチロンＢ、の新規脱着方法、ならびに該脱着方法を含むエポチロン類の新しい生産、後処理もしくは精製方法または製造方法、ならびに樹脂からエポチロン類を脱着するための一定の溶媒の使用に関する。
【０００２】
背景技術
エポチロンＡおよびＢは、式
【化１】
2004521879.tif 000002
（式中、Ｒは水素（エポチロンＡ）もしくはメチル（エポチロンＢ）を意味する。）
で示される、新しいクラスの微小管−安定化、細胞毒活性成分（Ｇｅｒｔｈ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ４９， ５６０−３ （１９６６）を参照）を表す。
【０００３】
これらのエポチロン類の記述（ＷＯ  ９３／１０１２１を参照）以来、幾つかの方法がエポチロン類および主として数多くのエポチロン誘導体の両方（以後、総称して“エポチロン類”と呼ぶ）の合成および製造について開示されており、例えば、ＷＯ  ９９／０３８４８、ＷＯ  ００／４９０２０、ＷＯ  ００／４９０２１、ＷＯ  ００／４７５８４、ＷＯ  ００／００４８５、ＷＯ  ００／２３４５２、ＷＯ  ９９／０３８４８、ＷＯ  ００／４９０１９、ＷＯ  ９９／０７６９２、ＷＯ  ９８／２２４６１、ＷＯ  ９９／６５９１３、ＷＯ  ９８／３８１９２、ＷＯ  ００／５０４２３、ＷＯ  ００／２２１３９、ＷＯ  ９９／５８５３４、ＷＯ  ９７／１９０８６、ＷＯ  ９８／２５９２９、ＷＯ  ９９／６７２５２、ＷＯ  ９９／６７２５３、ＷＯ  ００／３１２４７、ＷＯ  ９９／４２６０２、ＷＯ  ９９／２８３２４、ＷＯ  ００／５０４２３、ＷＯ  ００／３９２７６、ＷＯ  ９９／２７８９０、ＷＯ  ９９／５４３１９、ＷＯ  ９９／５４３１８、ＷＯ  ９９／０２５１４、ＷＯ  ９９／５９９８５、ＷＯ  ００／３７４７３、ＷＯ  ９８／０８８４９、ＵＳ  ６，０４３，３７２、ＵＳ  ５，９６９，１４５、ＷＯ  ９９／４００４７、ＷＯ  ９９／０１１２４およびＷＯ  ９９／４３６５３に開示されたものである。エポチロンＡおよびエポチロンＢに加えて、特にＷＯ  ９７／１９０８６およびＷＯ  ９８／２２４６１に記述されているエポチロンＤおよびＥ、ならびにＷＯ  ９８／２２４６１に記述されているエポチロンＥおよびＦ、ならびにＷＯ  ９９／０２５１４に記述されているエポチロン類は、興味深い性質を示す。
【０００４】
治療的使用の一例として、国際出願ＷＯ  ９９／４３３２０は、増殖性疾患、特に腫瘍性疾患、に対する薬剤としてエポチロン類の数多くの投与様式を記載しているが、それらは、それらの同様な機構のために、周知でかつ市販の抗がん剤であるタキソール［登録商標］のそれに同等な様式で作用する。ＷＯ  ９９／３９６９４はエポチロン類、特にＡおよびＢ、のいくつかの特異的製剤を公開している。
【０００５】
エポチロン類、特にエポチロンＡおよび最も好ましくはエポチロンＢ、は既成の処置と比較して、特にまた腫瘍がタキソールによる処置に抵抗性になっている場合において、数多くの利点を提供する。それ故に、それらの大量合成方法は、予期される需要量を満たすために緊急に必要とされる。
【０００６】
これまでの最も効率的な生産方法は、いくつかの生合成工程および培養培地等からエポチロン類の単離を少なくとも含む。
当初、粘液細菌による天然物質、特に細胞株Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏｃｅ９０ （ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｓｉｓｍｓにおいて番号６７７３で寄託されたもの、ＷＯ  ９３／１０１２１を参照）からエポチロン類、の抽出が文献に記載された。該天然物質、特にエポチロン類、の満足すべき濃度を得るために、以前は、ポリスチレンベースの吸着質樹脂、例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１１８０ （Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、が培養培地への吸着のために、該培地に常に添加された。
【０００７】
しかしながら、この方法の不利点は、大規模においては、それが多数の問題につながることである。バルブは樹脂の小球体により損なわれ、パイプは詰まりがちであり、そして装置は機械的摩擦のためにさらに大きい磨耗を受けやすい。樹脂の小球体は多孔性であり、それ故に大きい内部表面積（樹脂１グラム当り約８２５ｍ２）を有する。樹脂内に封入された空気は加圧滅菌されないので、滅菌は問題となる。かくして、この方法を実用的に、エポチロン類を生産する微生物の培養の間に樹脂添加を用いて大規模に行うことはできない。
【０００８】
それ故に、エポチロン類、特にエポチロンＡおよびＢ、の生産のための進歩した方法が見出され、そしてＷＯ  ９９／４２６０２に記載された。この方法は、エポチロンを生産する微生物の培養培地からエポチロン類を複合体化すること、該培養培地はシクロデキストリンもしくは他の複合体形成剤を含むこと、エポチロン類を吸着するために、細胞の無い培養培地（例えば、該培養培地のろ液もしくは遠心分離液）を合成樹脂、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ （Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０ （Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ Ｓ． Ｒ． Ｌ．， Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌｙ）のような、マトリックスとしてスチレン／ジビニルベンゼンをベースとする樹脂と混合すること、および、特にアルコール、最も好ましくはイソプロパノールにより脱着すること、を含む。これに引き続いて、アルコール相へ水の添加、溶媒相の除去（好ましくは蒸発により）、エステル、特に酢酸エチルもしくは酢酸イソプロピルの存在下での得られた残渣の相分離、通常は乾燥エステル相の分子ろ過（ゲルクロマトグラフィー）、得られたエポチロン混合物の逆相ＨＰＬＣ（好ましくは、ニトリル／水、例えばアセトニトリル／水の混合液での溶出）、ならびに任意に、水／エーテル混合液の存在下での相分離、好ましくは、不純物のさらなる除去を達成するために、その後のシリカゲル上の吸着クロマトグラフィーならびに結晶化／再結晶によるさらなる精製を行う。
【０００９】
有用な進歩で工業的規模の生産に適しているが、この方法はなお特定の不利点を受けている。
【００１０】
例えば、十分な純度を得るためには、分子ろ過工程もしくはシリカゲル吸着クロマトグラフィー工程のどちらかまたは両方を使用することが望ましい。さらに多くの困難が、（特に、大工業規模における水／エステル相の相分離のための長時間のために）非常に時間のかかるところの酢酸エチルのようなエステルの存在下での相分離、ならびに、加えて発泡化およびスパッタリング（ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ）の観点から取り扱うことが困難であるところのその後の蒸発から来る。
【００１１】
かくして、上の困難をできるだけ多く回避し、樹脂への吸着後のエポチロン類、特にエポチロンＡおよびＢの単離のための新規かつ有利な様式を見出すことが、本発明が解決しようとする課題である。
【００１２】
発明の一般的な説明
非常に驚くべきことに、脱着溶媒として用いるアルコールを特定の他の溶媒（下記に特定化するような弱極性のもしくは無極性の溶媒と呼ばれる）で単に置換することが、上述の課題を解決することができる真の飛躍的進歩を提供し、改良化された脱着およびより高い最終収率のような追加的な利点をもたらすことが、今回見出された。この追加的利点の中にあるのは、（ｉ）脱着のより高い選択性；（ｉｉ）さらに完全な脱着を示す、より多量の脱着エポチロン類；（ｉｉｉ）極めて問題のある水／エステル相分離におけるエステル（例えば酢酸エチル）での再抽出、およびその後のエーテル蒸発を必要としないこと；（ｉｖ）分子ろ過および通常は吸着クロマトグラフィーを必要としないこと；（ｖ）脱着に必要な時間がかなり減少すること；（ｖｉ）より少ない工程；（ｖｉｉ）汚染リスクの消滅（高毒性のエポチロン類では重要な）；および／もしくは（ｖｉｉｉ）より良いかつより安全な取扱い（脱着＝抽出に用いる溶媒に依存して）；ならびに（ｉｘ）また溶媒に依存して、エポチロン類、特にエポチロンＢ、と同様な極性を有する、予想外なほど少量の副生成物もしくは不純物を逆相クロマトグラフィーの後で除去するだけでよいことである。これらのおよびさらなる利点を、次の発明の詳細な説明で示される詳細から演繹することができる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の一つの態様は、弱極性のもしくは無極性の溶媒を用いて、エポチロン類、特にエポチロンＡおよびＢ、特にエポチロンＢを、樹脂、特に合成樹脂から脱着する方法に関する。
【００１４】
さらなる態様は、エポチロン類を、特に化学合成の標準的媒体中における、または好ましくは、微生物、特に粘液細菌、特に、エポチロン類、特にエポチロンＡおよび／もしくはＢ、を生産するのに適しているＳｏｒａｎｇｉｕｍ属、および複合体−形成成分を含む培養培地中におけるそれらの生産後に、後処理する（もしくは精製する）ための方法に関し、該方法はエポチロン類を樹脂から脱着するために弱極性のもしくは無極性の溶媒の使用を含む。
【００１５】
本発明の第三の態様は、樹脂、特に合成樹脂から、エポチロン類、特にエポチロンＡおよび／もしくはＢ、特にエポチロンＢ、を脱着するための、弱極性のもしくは無極性の溶媒の使用に関する。
【００１６】
上記および下記で使用される一般用語は、好ましくは下記に示す意味を有する：
用語“エポチロン類”は、好ましくは、特許出願のＷＯ  ９９／０３８４８、ＷＯ  ００／４９０２０、ＷＯ  ００／４９０２１、ＷＯ  ００／４７５８４、ＷＯ  ００／００４８５、ＷＯ  ００／２３４５２、ＷＯ  ９９／０３８４８、ＷＯ  ００／４９０１９、ＷＯ  ９９／０７６９２、ＷＯ  ９８／２２４６１、ＷＯ  ９９／６５９１３、ＷＯ  ９８／３８１９２、ＷＯ  ００／５０４２３、ＷＯ  ００／２２１３９、ＷＯ  ９９／５８５３４、ＷＯ  ９７／１９０８６、ＷＯ  ９８／２５９２９、ＷＯ  ９９／６７２５２、ＷＯ  ９９／６７２５３、ＷＯ  ００／３１２４７、ＷＯ  ９９／４２６０２、ＷＯ  ９９／２８３２４、ＷＯ  ００／５０４２３、ＷＯ  ００／３９２７６、ＷＯ  ９９／２７８９０、ＷＯ  ９９／５４３１９、ＷＯ  ９９／５４３１８、ＷＯ  ９９／０２５１４、ＷＯ  ９９／５９９８５、ＷＯ  ００／３７４７３、ＷＯ  ９８／０８８４９、ＵＳ  ６，０４３，３７２、ＵＳ  ５，９６９，１４５、ＷＯ  ９９／４００４７、ＷＯ  ９９／０１１２４および／もしくはＷＯ  ９９／４３６５３に記載されている任意のエポチロンまたはエポチロン誘導体に、さらに好ましくはエポチロンＡおよび特にエポチロンＢに、しかし本発明のさらに広範な態様においてはまた、ＷＯ  ９７／１９０８６およびＷＯ  ９８／２２４６１に記述されているエポチロンＤおよびＥに、ＷＯ  ９８／２２４６１に記述されているエポチロンＥおよびＦに、またはＷＯ  ９９／０２５１４に記述されているエポチロン類に、関する。全てのこれらの資料は、特にエポチロン誘導体および本明細書に記載されている好ましいエポチロン誘導体に関して、出典明示により本明細書の一部とする。
【００１７】
弱極性のもしくは無極性の溶媒は好ましくは以下の特性を有する：
好ましいものは、Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍｔｏｇｒ． Ｓｃｉ． １６， ２２３ （１９７８）、によって決定された溶離力列において、Ｘｅ＋Ｘｄ＋Ｘｎ＝１の条件下で、Ｘｅはプロトン受容体パラメーター（水素受容体として水素結合を形成する傾向の指標）であり、Ｘｄはプロトン供与体パラメーター（水素供与体として水素結合を形成する傾向の指標）であり、そしてＸｎは双極子パラメーター（双極特性を示す）である、以下の特性式：
Ｘｅ＝０．２０〜０．４０；Ｘｄ＝０．１５〜０．３６；およびＸｎ＝０．３８〜０．６０；好ましくは
Ｘｅ＝０．２２〜０．３２；Ｘｄ＝０．１７〜０．３４；およびＸｎ＝０．３９〜０．５４
を示す溶媒、もしくはそのような溶媒の混合液である。
【００１８】
弱極性のもしくは無極性の溶媒の中でも非常に好ましいのは、アセトン、メチルエチルケトン、２−ペンタノン、メチルイソブチルケトンもしくはシクロヘキサノンのような低級アルキル−低級アルキルケトンもしくは環状ケトン；さらに好ましくはエーテル、特に環状エーテル、さらに特にテトラヒドロフランもしくはジオキサン；なおさらに好ましくは脂肪族ハロゲン化合物、特にハロゲン化低級アルキル、特に二塩化メチレン（＝塩化メチレン）もしくは二塩化エチレン；または最も特に芳香族溶媒、特にナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼンまたは低級アルキル、特にメチル、エチルもしくはイソプロピル、低級アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキル、特にエトキシメチルからなる群から選択される一つもしくはそれ以上、好ましくは１〜３個の基により置換されたナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼン；特にトルエン、エチルベンゼン、キシレン、特にｏ−、ｍ−もしくはｐ−キシレン、メシチレン、プソイドクメン、ヘメリテン（ｈｅｍｅｌｌｉｔｅｎｅ）、クメン、イソプロピルトルエン、ハロゲン化フェニル、特にフルオロベンゼン、クロロベンゼン、ブロモベンゼンもしくはヨードベンゼン、低級アルコキシベンゼン、特にエトキシベンゼンもしくはメトキシベンゼン、または低級アルコキシ−低級アルキルベンゼン、特にエトキシメチルベンゼン（ベンジルエーテル）；または二つもしくはそれ以上（例えば、２〜４種類のこれらの溶媒）の任意の混合液であり；最も好ましいのは低級アルキルベンゼン、特にエチルベンゼン、キシレン、特にｏ−、ｍ−もしくはｐ−キシレン、メシチレン、プソイドクメン、ヘメリテン、クメン、イソプロピルトルエン、および最も特にトルエンである。
【００１９】
用語“弱極性のもしくは無極性の溶媒”としてはまた、上記および下記で説明される二つもしくはそれ以上の混合液、例えば２〜４種類のそのような溶媒が挙げられる。
【００２０】
接頭語“低級”は、それに対応して命名される基が、好ましくは最高７個までの炭素原子、特に４個までの炭素原子を含有し、そして分枝もしくは直鎖であることを常に示す。低級アルキルは、例えば、直鎖または一回もしくはそれ以上分枝してもよく、例えば、メチル、エチル、イソプロピルもしくはｎ−プロピルのようなプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルもしくはｎ−ブチルのようなブチル、またはアミルもしくはｎ−ペンチルのようなペンチルである。
ハロゲンは、好ましくは、ヨウ素、臭素、塩素もしくはフッ素である。
【００２１】
好ましくは、炭化水素は、４〜３２個、さらに好ましくは４〜２０個、なおさらに好ましくは６〜１６個の炭素原子を有する有機化合物であり、そして脂肪族、例えば、直鎖、分枝もしくは環状の飽和アルカン、例えばシクロヘキサン、一つもしくはそれ以上の二重および／もしくは三重結合を持つ直鎖、分枝もしくは環状の（非−芳香族）有機化合物、または芳香族炭化水素であり、後者は非置換であるか、または、低級アルキル、特にメチル、エチルもしくはイソプロピル、低級アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキル、特にエトキシメチルからなる群から選択される１個もしくはそれ以上、例えば３個までの置換基により；好ましくは１〜３個の低級アルキル基により置換されている。
アルコールは、好ましくは、ヒドロキシ−低級アルカン、特にメタノール、エタノールまたはｎ−もしくはイソ−プロパノ−ルである。
【００２２】
樹脂は、特に合成樹脂、好ましくはスチレンおよびジビニルベンゼン共重合体をベースとする樹脂、さらに好ましくは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４もしくは好ましくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ （Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）またはＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０ （Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ Ｓ． Ｒ． Ｌ．， Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌｙ）である。本発明にしたがうエポチロンもしくはエポチロン類が脱着されるべき樹脂は、非共有結合的にそれと接触している（例えば、樹脂に可逆的に結合しているかまたは樹脂に吸着した）エポチロン類を有することは言うまでもない。換言すれば、用語“樹脂”が使われる場合には、“樹脂に接触している、特に樹脂に可逆的に結合しているかまたは吸着している、一つもしくはそれ以上のエポチロン類を有する樹脂”を意味することが意図される。
【００２３】
発明の好ましい態様：
本発明の好ましい態様において、本発明は、上記もしくは下記で説明する弱極性のもしくは無極性の溶媒による樹脂からの脱着を含み、純粋な形で、それぞれのエポチロン類、特にエポチロンＡおよび最も特にエポチロンＢ、好ましくは本発明で好ましいとして説明されるものに達するために望ましいか必要である任意のさらなる精製工程を含む方法に関する。
【００２４】
エポチロン類の後処理の前に、後処理されるエポチロン類を含む反応生成物に至る反応もしくは方法が在り、それらは（ｉ）適切な極性水性媒体中に溶解後に化学反応混合液から、または（ｉｉ）さらに好ましくは、エポチロン類を生産する微生物を持つ培養培地の上澄み液（例えば、ＷＯ  ９９／４２６０２に記載されたデキストリン含有のもの）からのどちらかで、特にろ過または遠心分離（管形遠心機もしくは分離機）により、培養物を液体相（例えば遠心分離液もしくはろ液）と固体相（細胞）に分離することにより単離される。
【００２５】
次いで、好ましくは、この前処理に続けて、溶液（（ｉ））もしくは液体相（（ｉｉ））を樹脂、特に合成樹脂、特に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６もしくはＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０のような、マトリックスとしてスチレンおよびジビニルベンゼン共重合体をベースとする樹脂（以後、単にポリスチレン樹脂ともいう）と直接混合する（好ましくは、遠心分離液：樹脂容量の比が約１０：１〜１００：１、好ましくは約５０：１）。好ましくは０．２５〜５０時間、特に０．８〜２２時間の接触期間後に、例えば、ろ過、沈降もしくは遠心分離により、樹脂を分離する。必要であれば、吸着後に、樹脂を強極性溶媒、好ましくは水で洗浄する。
【００２６】
次いで、本発明にしたがう後処理の好ましい方法を開始する：エポチロン類の脱着（本発明の非常に好ましい態様を形成するように）は、弱極性のもしくは無極性の溶媒により、特にハロゲン化低級アルキル、特に二塩化メチレンもしくは二塩化エチレン、またはさらに好ましくは芳香族溶媒、特にナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼンまたは低級アルキル、特にメチル、エチルもしくはイソプロピル、低級アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキル、特にエトキシメチルからなる群から選択される一つもしくはそれ以上、好ましくは１〜３個の基により置換されたナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼン；特に好ましくはトルエンにより達成される。必要であるか望ましい場合には、さらに完全な脱着を得るために、抽出工程を一回もしくはそれ以上の回数、好ましくは０〜３回、特に一回、繰り返してもよい。
【００２７】
好ましくは、かくして得られる脱着されたエポチロン類の溶液（繰返し抽出した液を合わせた場合）の後処理は、得られた溶液から脱着に用いられた溶媒を蒸発（蒸留）により、好ましくは、反応器中のおよびそれに続く真空下でのロータリーエバポレーター中での濃縮により、除去することに続く。
【００２８】
引き続いて、以下の工程を用いるさらなる加工を行うが、そこではニトリルでの溶出による逆相クロマトグラフィーによる精製工程は必須である一方で、他の工程は任意であり：それらは
【００２９】
−  脱着後にエポチロン（類）の結晶化；特に、エポチロンＢの結晶化のために、アルコールおよび炭化水素の、特に低級アルカノールおよび３〜１０個の環原子を持つ環状脂肪族炭化水素の、最も特にメタノールおよびおよびシクロヘキサンの混合液を加える（好ましくは、１：１０〜１０：１、特に１：３〜３：１のｖ／ｖ比で）。水の添加は急速な相分離に至り、そしてアルコール相を、例えば真空下におけるロータリーエバポレーターにより、蒸発乾固する。その後に、エポチロンＢを含むところの得られた抽出物を適切な混合溶媒から、特にアルコール／環状脂肪族炭化水素混合液、最も好ましくはイソプロパノール／シクロヘキサンから、好ましくは、１：１０〜１０：１、さらに好ましくは１：６〜６：１、もっとも好ましくは１：６〜１：４のｖ／ｖ比で結晶化させる；
【００３０】
−  （必須）適当な溶媒、特にニトリルおよび水、好ましくはアセトニトリル／水、の混合液、の中に、１：１０〜１０：１、特に１：３〜１：１の好ましいｖ／ｖ比で溶かすことならびにニトリルおよび水の混合液による溶出によるエポチロン類の逆相クロマトグラフィーによる分離であって、好ましくは、１８個の炭素原子を含有する炭化水素鎖のような炭化水素鎖を装てんしている逆相材料、特にＲＰ−１８材料のカラム上でクロマトグラフィーを行い、そしてニトリル、特に低級アルキルニトリル、特にアセトニトリル、を含む溶出液を用いる、特にニトリル／水の混合液、特にアセトニトリル／水の混合液、を、好ましくは、約１：９９〜９９：１、主に１：９〜９：１、例えば２：８〜７：３、例えば３：７もしくは４：６のニトリル対水の比で用いることを特徴とし；ならびに収集したエポチロン（特にエポチロンＡもしくは最も特にエポチロンＢ）を含むフラクションからニトリルの蒸発（蒸留）による除去；所望により、エポチロンを持つ残存する水をエステル、特に低級アルキル−低級アルカン酸エステル、好ましくは酢酸イソプロピルで次いで、抽出し、エポチロンを含有するエステル相の蒸発乾固（好ましくは、最初は反応器中で、次いで、真空下におけるロータリーエバポレーター中で）に引き続ける；（必要であれば、出発エポチロン溶液を分割して二回以上の逆相分離操作で分離してもよい；）
【００３１】
−  必要なときだけに（例えば、脱着後の結晶化の代わりに）、特にシリカゲルのカラムに加えることおよび適切な溶媒もしくは混合溶媒、特にエステル／炭化水素、例えば低級アルキルアルカン酸エステル／Ｃ４〜Ｃ１０アルカン、特に酢酸エチルもしくはイソプロピル／ｎ−ヘキサン、により、エステルおよび炭化水素の間の比を好ましくは９９：１〜１：９９、好ましくは１０：１〜１：１０、例えば４：１の範囲で、溶出することによる、吸着クロマトグラフィー；ならびに
【００３２】
−  最後に、例えばエステル、エステル／炭化水素混合液もしくはアルコール、特に酢酸エチルもしくはイソプロピル：トルエンを１：１０〜１０：１、好ましくは２：３（エポチロンＡ）またはメタノールもしくは酢酸エチル（エポチロンＢ）からなる、例えば適切な溶媒もしくは混合溶媒からの再結晶；であるが、その方法において、必要なおよび／もしくは望ましい場合には、使用されるそれぞれの工程の間に、得られた溶液もしくは懸濁液を濃縮し、そして／または液体および固体の成分を、特に溶液／懸濁液の沈降、ろ過もしくは遠心分離により、互いに分離する。好ましくは、上記および下記のさらに正確な定義を上の個別の工程において用いることができる。
【００３３】
本発明の好ましい態様はまた、合成樹脂に吸着されたエポチロン類、特にエポチロンＡもしくは最も特にエポチロンＢ、を単離する方法に関するが、この方法は、
（ｉ）エポチロン類の該合成樹脂から、弱極性のもしくは無極性の溶媒による、特にハロゲン化低級アルキル、特に二塩化メチレンもしくは二塩化エチレン、またはさらに好ましくは芳香族溶媒、特にナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼンまたは低級アルキル、特にメチル、エチルもしくはイソプロピル、低級アルコキシ、特にメトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、ニトロおよび低級アルコキシ−低級アルキル、特にエトキシメチルからなる群から選択される一つもしくはそれ以上、好ましくは１〜３個の基により置換されたナフタレンもしくは（好ましくは）ベンゼン；特に好ましくはトルエン；または本発明のさらに広範な態様において二つもしくはそれ以上のそのような溶媒の混合液による脱着；ならびに
（ｉｉ）適当な溶媒、特にニトリルおよび水、好ましくはアセトニトリル／水、の混合液、の中に、１：１０〜１０：１、特に１：３〜１：１の好ましいｖ／ｖ比で溶かすことならびにニトリルおよび水の混合液での溶出によるエポチロン類の逆相クロマトグラフィーによる分離であって、好ましくは、１８個の炭素原子を含有する炭化水素鎖のような、炭化水素鎖を装てんしている逆相材料、特にＲＰ−１８材料のカラム上でクロマトグラフィーを行い、そしてニトリル、特に低級アルキルニトリル、特にアセトニトリル、を含む溶出液を用いる、特にニトリル／水の混合液、特にアセトニトリル／水の混合液、を、好ましくは、約１：９９〜９９：１、主に１：９〜９：１、例えば２：８〜７：３、例えば３：７もしくは４：６のニトリル対水の比で用いることを特徴とする、分離を含む。
【００３４】
本発明のさらに好ましい態様において、工程（ｉ）で開始して工程（ｉｉ）を含む最後の節における方法は、純粋な形で、それぞれのエポチロン類、特にエポチロンＡおよび最も特にエポチロンＢ、好ましくは本発明で好ましいとして説明されるものに達するために望ましいか必要である任意のさらなる精製工程をさらに意味する。
【００３５】
好ましくは、後処理の準備を以下のように行う：特に化学反応混合液から、もしくはさらに好ましくは、微生物の培養培地の上澄み液からエポチロン類の吸着を、ＷＯ  ９９／４２６０２に記載されたようにもしくはそれに類似して達成することができる；簡潔に言えば、エポチロン類は遠心分離液中に見られるが、次いで、それを、合成樹脂、特にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６もしくはＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０のような、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体樹脂と直接混合し（好ましくは、遠心分離液：樹脂容量の比が約１０：１〜１００：１、好ましくは約５０：１）、混合機中で攪拌する。この工程において、エポチロン類を樹脂へ移行させる。吸着に十分な期間、例えば約０．２〜１０時間の接触期間後に、樹脂を遠心分離もしくはろ過により分離する。エポチロン類の樹脂上への吸着はまた、クロマトグラフィーカラム中で、樹脂をカラム中に置き、樹脂の上に遠心分離液を流すことにより達成され得る。吸着後に、樹脂を水で洗浄する。
【００３６】
次いで、本発明にしたがう好ましい方法を開始し以下のように進行させる：好ましくは、エポチロン類の樹脂からの脱着は、本発明にしたがう弱極性のもしくは無極性の溶媒、特に上記および下記で好ましいとして説明されるもの、特に塩化メチレンもしくは最も特にトルエンにより達成される。次いで、溶媒を必要な限り、好ましくは乾燥残渣が得られるまで、除去する。適切である場合には、残渣をアルコール／炭化水素混合液中に、特にメタノール／シクロヘキサン中に、好ましくは上述の比で、比較的低容量で溶かす。アルコール相を好ましくは蒸発乾固し、次いで、アルコール抽出物をアルコール、特にイソプロパノール、および炭化水素、特にシクロヘキサン、の、好ましくは上記の比における、混合液から結晶化する。次いで、得られた固体の結晶化物を、好ましくは上述のような、ニトリル／水混合液、特に２：３（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水混合液に溶解し、そして得られた供給液を、必要であれば二回以上の操作に分割後に、分取逆相カラム上に流し込む。ニトリル／水による溶出を、特に記した通りに、続ける。エポチロン、特にエポチロンＡおよび最も特にエポチロンＢを含有する、得られたフラクションの（アセト）ニトリルを蒸発（蒸留）により除去し、そして得られた水相をエステル、特に酢酸イソプロピル、で抽出する。次いで、エステル抽出液を、好ましくは蒸発乾固し、引き続いて得られた物を再結晶する：例えば、エポチロンＡフラクションをエステル／炭化水素混合液、例えば酢酸エチル：トルエン＝２：３、から直接的に結晶化し、そしてエポチロンＢフラクションをエステル、特に酢酸エチルからもしくは、好ましくはアルコール、特にメタノール、から結晶化する。
【００３７】
特にトルエンは、ＷＯ  ９９／４２６０２で使用されたイソプロパノールで必要とされる脱着時間の半分の時間で約１００％収量を達成することができる、高度に選択的な溶出液（脱着液）であることが発見された。驚くべきことに、脱着されたエポチロン類の量は、イソプロパノール脱着と比較するとき、トルエンでの脱着後に、例えば１３０％増加する。（これは理論的観点から一見不可能に見えるが、それは本発明の利点をよく例示する：この結果は負荷した樹脂の定量に関係する。その定量は脱着にイソプロパノールを使用したので、不完全な脱着手順を、今や当てにならないと判明したところのより低い定量値に元来至る基準として採用しなければならなかった）。エポチロン混合物を（先行する結晶化の有無で）逆相カラムへ直接に加えることができる。
【００３８】
この方法は、溶媒量、攪拌速度および温度に関して高度に頑健（ｒｏｂｕｓｔ）になる。攪拌下のアルコール（例えばエタノールもしくはイソプロパノール）については、第一の量のエポチロンを含む物が最初の期間で脱着され（二つの分布極大を有するポリスチレンＸＡＤ−１６に見られる孔径分布により多分説明可能）、第二の量は後の期間で脱着される、二相脱着が示され得るが一方、この望ましくない挙動は、すべての物が最初の期間で既に脱着される、トルエンもしくはまたジクロロメタンでは見られない。同様な条件下では、エポチロンＡおよびＢを含む蒸発残渣は一例で、イソプロパノールの場合に４０ｇであり、塩化メチレンでは３．３ｇであり、トルエンの場合には、ＷＯ  ９９／４２６０２に記載されているようにシクロデキストリンを含む培養上澄み液から得られるスチレン／ジビニルベンゼン共重合体樹脂からの脱着後に、例えば１７〜１８重量％のエポチロンＢを持つ０．９ｇだけであると見出され、はるかに高い純度を示している。トルエンが最も顕著な利点を有する一方で、ジクロロメタンは、低沸点のために除去が容易であるという一つの利点を有する。
【００３９】
エポチロンＡおよびＢの分離をまた、本明細書に記載したクロマトグラフィーを擬似移動床式（ＳＭＢ）アプローチで行うことにより達成することができる。ＳＭＢ−クロマトグラフィーは、二成分混合物の分離、例えば、キラル固定相上のラセミ化合物の分離、例えば、ＰａｒｅｘもしくはＭｏｌｅｘのように、光化学工業におけるＳＯＲＢＥＸ方法または製糖工業におけるＳＡＲＥＸ方法に広く使用される。バッチクロマトグラフィーに比べて、ＳＭＢ−クロマトグラフィーは、生産性の増加および移動相の消費量の減少に至る、連続向流単位操作（ｃｏｎｔｉｎｏｕｓ ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｕｎｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の利点を提供する。ＳＭＢ−クロマトグラフィーの方法開発のための幾らかの系統的手順は当業者に公知である。そのような手順は、例えば、Ｒ． −Ｍ． Ｎｉｃｏｕｄ， Ｍ． Ｂａｉｌｌｙ， Ｊ． Ｋｉｎｋｅｌ， Ｒ． Ｍ． Ｄｅｖａｎｔ， Ｔ． Ｒ． Ｅ． Ｈａｍｐｅ ａｎｄ Ｅ． Ｋｕｅｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １ｓｔ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， （１９９３）， ＩＢＳＮ ２−９０５−２６７−２１−６， ｐ． ６５−８８； Ｅ． Ｋｕｅｓｔｅｒｓ， Ｇ． Ｇｅｒｂｅｒ ａｎｄ Ｆ． Ｄ． Ａｎｔｉａ， Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ， ４０ （１９９５） ３８７； Ｔ． Ｐｒｏｅｌｌ ａｎｄ Ｅ． Ｋｕｅｓｔｅｒｓ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， ８００ （１９９８） １３５； ｏｒ Ｃ． Ｈｅｕｓｅｒ， Ｅ． Ｋｕｅｓｔｅｒｓ， Ｔ． Ｐｌａｔｔｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｓｅｉｄｅｌ−Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， ８２７ （１９９８） １７５、により記載されている。
【００４０】
ＳＭＢ−クロマトグラフィーによるエポチロンＡおよびＢの分離のための基本パラメーターを、従来のＬＣ分離から直接的に取得することができる。好ましくは、逆相シリカゲル（ＲＰ１８）を固定相としてそして水／アセトニトリル−混合液を移動相として採用する。流速の最終セット（個別のＳＭＢゾーンおよび切換え時間、それぞれについて）を、Ｅ． Ｋｕｅｓｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ， ４０ （１９９５） ３８７、により開発されたような簡単なフロー計画からもしくは、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， ８００ （１９９８） １３５ ａｎｄ Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， ８２７ （１９９８） １７５、の中に規定されたような吸着等温式の注意深い評価の後のどちらかで採用する。抽出液および抽残液流の後処理は、ここでも従来のＬＣ分離について記載されたように行うことができる。
【００４１】
本発明は、最も好ましくは、下記の実施例において記載された方法に関する。
【００４２】
実施例
以下の実施例は、本発明を範囲を限定しないで例示するために役立つものである。
注意：エポチロン類を取り扱うときには、それらの高毒性に鑑み、必要により、適切な防御手段を取らなければならない。
【００４３】
実施例１：エポチロンＢのための後処理手順
装てん樹脂（培養培地からのエポチロンＡおよびＢを装てんしたスチレン／ジビニルベンゼン共重合体樹脂ＸＡＤ−１６）５９１．７ｋｇの脱着は、樹脂を４分割し、それぞれトルエン７２０Ｌで二回約８時間攪拌することにより達成される。樹脂からのトルエン相の分離を吸引漏斗を用いて行う。合併したトルエン相をそれぞれ水２５０Ｌで二回洗浄する。相分離後、トルエン抽出液を１０００Ｌ反応器中で凡そ２０〜４０Ｌに濃縮し、その後に真空下におけるロータリーエバポレーター中で濃縮乾固する。結果は、エポチロンＢ２０９ｇを含有するトルエン濃縮物４．０９５ｋｇである。トルエン濃縮物をメタノール１６．５Ｌおよびシクロヘキサン２４．５Ｌ中に溶解する。水０．８Ｌの添加後、直ちに相分離が起こる。メタノールフラクションを真空下におけるロータリーエバポレーター中で蒸発乾固すると、エポチロンＢ１９４ｇを含有する蒸発残渣１．０２５ｋｇを得る。その後、メタノール抽出物をイソプロパノール２．０５Ｌおよびシクロヘキサン１０．２５Ｌからなる混合溶媒中で結晶化させて、エポチロンＢ１８４ｇを含有する結晶物０．４ｋｇを得る。結晶を３．２Ｌのアセトニトリル／水＝２／３（ｖ／ｖ）中に溶解し、そして得られた供給溶液を三回の別操作で分取逆相カラム（ＲＰ−１８球状シリカゲル２５ｋｇ、ＹＭＣ−Ｇｅｌ ＯＤＳ−Ａ １２０；５〜１５μｍ；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．， Ｍｉｌｆｏｒｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， ＵＳＡ）上に移行する。
【００４４】
移動相としてアセトニトリル／水＝２／３（ｖ／ｖ）を用い、２．３Ｌ／分の流量；エポチロンＡの保持時間＝７７〜９６分、エポチロンＢの保持時間＝９６〜１１９分、で溶出を行う。２５０ｎｍにおけるＵＶ検出器で分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）をモニターする。（三回の操作の）合併したエポチロンＢフラクションのアセトニトリルを留去し、そして残存する水相を酢酸イソプロピル５０４Ｌで抽出する。酢酸イソプロピル抽出液を６３０Ｌ反応器中で凡そ２０〜４０Ｌに濃縮し、その後に真空下におけるロータリーエバポレーター中で濃縮乾固する。エポチロンＢフラクションの蒸発残渣の重量は１７０ｇであり、ＨＰＬＣ（外部標準法）により９８．４％の含量を有する。最後に、得られた物をメタノール２．８９Ｌ中で０〜５℃で結晶化して、エポチロンＢの純結晶１５０ｇを得る。
融点：１２４〜１２５℃；
エポチロンＢの１Ｈ−ＮＨＲデータ（５００ＭＨｚ−ＮＭＲ：溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６。化学シフト：ＴＭＳ基準からのｐｐｍでδ。ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｍ＝多重線）：
【表１】
2004521879.tif 000003
【００４５】
実施例２：エポチロンＢ製造のための異なる脱着方法の比較：
ＷＯ  ９９／４２６０２に記載された方法により粘液細菌の培養培地から得られたエポチロンＡおよびＢを装てんしたスチレン／ジビニルベンゼン共重合体樹脂ＸＡＤ−１６（１９４ｇの未乾Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ［登録商標］ＸＡＤ−１６に相当する）の水性懸濁液のそれぞれ３６０ｍＬを、次表に記載の溶媒および条件を用いて、底に焼結フリットを取り付けたガラス反応器（自家製の固体相バッチ反応器、内径１０ｃｍ×長さ２０ｃｍ、以後“Ｓｔｉｒｒｅｒ／Ｆｒｉｔ”という）中で攪拌して（一般の実験室用錨型スターラーで）抽出する。
【００４６】
表１：エポチロンＢの製造のための脱着方法の比較
出発樹脂（吸着エポチロンを持つ樹脂）：
＃１００１：理論添加量が樹脂懸濁液３６０ｍＬ当り７０ｍｇ（未乾ＸＡＤ−１６の１９４ｇ当り７０ｍｇに相当する）
＃１００３：理論添加量が樹脂懸濁液３６０ｍＬ当り１１４ｍｇ（未乾ＸＡＤ−１６の１９４ｇ当り１１４ｍｇに相当する）
【表２】
2004521879.tif 000004
【表３】
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【表４】
2004521879.tif 000006
【００４７】
注記：
ａ：最適化せず；２回抽出の場合、約５％の収量が失われる。
ｂ：水による３倍逆抽出は極性化合物を除去しない。
ｃ：終夜３相分離の最初
ｄ：酢酸エチル−抽出残渣と比較するとき、この物はシリカゲル上ではるかに良好にクロマトグラフィーにより分離され得る。
ｅ：約２５〜３０ｇの蒸発残渣に相当する
ｆ：週末にかけて、オーブン（高真空）で乾燥
ｇ：多分、使用時間に関して、十分な最初の相分離の結果
ｈ：回収量：第１抽出＝７００ｍＬ；第２抽出＝６６０ｍＬ；第３抽出＝６８０ｍＬ
ｉ：回収量：第１抽出＝６７０ｍＬ；第２抽出＝７１０ｍＬ；第３抽出＝７２０ｍＬ
ｊ：水添加の必要性はまだ確認されていない。
ｋ：元来存在する水（ＸＡＤ−１６は使用時に水で覆われている）の除去を簡略化する
ｌ：バリアント８、１１および１２の結果ならびにトルエンによる全ての実験についての溶出曲線の観点から、さらに少量の樹脂の使用を除外できない。
＊  “Ｅｒｌ．／ｍａｇ． Ｓｔ．”は、エルレンマイヤーフラスコ中での磁気攪拌を意味する。
＊＊  “塩化メチレン”はジクロロメタンである。
【００４８】
これらの実験およびさらなるデータから演繹できることは、イソプロパノールに比較して、塩化メチレン抽出は、より良い選択性、より短い抽出時間（凡そ２倍だけ）、より速い溶媒蒸留（塩化メチレンの沸点は約４０℃であり、イソプロパノールのそれは８１〜８３℃である）、長時間を要しかつ非常に問題のある酢酸エチル／水相分離はもはや必要でない、第二の溶媒蒸留はさらに必要でない、そのために、より低い汚染リスク、より良くかつより安全な取扱いをもたらす、より小数の方法工程を使用できる；半分の容積での後処理（例えば、２０００−Ｌ反応器の代わりに１０００−Ｌ反応器で）が可能である；生成物のエポチロンＢはより良い純度プロフィールを有する（エポチロンＢと同等の極性を持つ副生成物がより少ない）、ならびに蒸発残渣が、酢酸エチル抽出での場合のようにスパッタリングしたり発泡しないことを提供するである。トルエンでの脱着については、イソプロパノール抽出に比較してより高い収率が得られ（約８０％の代わりに約１００％）、より良い選択性を観察できて（イソプロパノールでは、約１０倍量の副生成物が脱着される）、抽出時間が相当短縮され（約３倍だけ）、イソプロパノールでの脱着後の困難なろ過が簡略化され（イソプロパノール抽出は大規模では実施困難であった）、第二の溶媒蒸留はさらに必要でなく、後処理がより小さい反応器で可能であり（ここでも、例えば、２０００−Ｌ反応器の代わりに１０００−Ｌ反応器を使用することが可能である）、シリカゲルクロマトグラフィーを無くすることが可能であり（脱着後の蒸発残渣が既に約４０％のエポチロンＡ／Ｂ混合物を含有する）、そして脱着後の蒸発残渣は酢酸エチル抽出からの残渣で観察された発泡およびスパッタリングを示さない。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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