(57)【要約】アプタマーは、タンパク質またはペプチド等のリガンドに特異的に結合する、核酸およびペプチド核酸の様な類似した分子である。本発明は、塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含むアプタマーを提供する。本発明は、このようなアプタマーの作製方法、および塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸を配列決定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸アプタマーを作製する方法であって、
ａ）特異的リガンドを提供するステップと、
ｂ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸アプタマーのプールを合成するステップと、
ｃ）アプタマーのプールを特異的リガンドと混合するステップと、
ｄ）特異的リガンドに結合する特異的アプタマーを選択して増幅するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記アプタマーが、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基であるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵと、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基対形成ができ、Ｗ−Ｃ標準塩基と異なる塩基が、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジン；および構造式
【化１】
2004514440.tif 000003
（式中、Ｒは、リボース環またはデオキシリボース環の１位への塩基の付着点を示し、Ｘは、置換基Ｚを担持する窒素原子または炭素原子のいずれかである。Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アリール（ａｒｙｌ）基、インドール基若しくはイミダゾリル基を担持する低級アルキル鎖、水素、または非官能化低級アルキル鎖であり、Ｙは、ＮまたはＣＨのいずれかであり、各環は、連続的に結合した３つ以下の窒素を含む）を有する複素環式塩基からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基が、イソＣおよび／またはイソＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｄ）の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施され、前記Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基三リン酸塩が、標準Ｗ−Ｃ塩基三リン酸塩の濃度と異なる濃度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップｄ）の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって実施され、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソＣおよび／またはイソＧであり、イソＣおよびイソＧ三リン酸の濃度が、標準Ｗ−Ｃ塩基三リン酸塩の濃度より低い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、アルカロイド類、テルペン類、補酵素、抗生物質、およびそれらの誘導体およびそれらの複合体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、タンパク質または修飾されたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドの分子量が５，０００ダルトン未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む、単離されたアプタマー。
【請求項１１】
前記アプタマーが、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基であるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵと、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジン；および構造式
【化２】
2004514440.tif 000004
（式中、Ｒは、リボース環またはデオキシリボース環の１位への塩基の付着点を示し、Ｘは、置換基Ｚを担持する窒素原子または炭素原子のいずれかである。Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アリール基、インドール基若しくはイミダゾリル基を担持する低級アルキル鎖、水素、または非官能化低級アルキル鎖であり、Ｙは、ＮまたはＣＨのいずれかであり、各環は、連続的に結合した３つ以下の窒素を含む）を有する複素環式塩基からなる群から選択される、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１３】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソＣおよび／またはイソＧである、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１４】
一本鎖、二本鎖または三本鎖の核酸である、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１５】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１６】
前記アプタマーの塩基数が１〜３００である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１７】
ｉ）請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的アプタマーを提供するステップと、
ｉｉ）前記アプタマーをリガンド類のプールと混合するステップと、
ｉｉｉ）特異的アプタマーに結合した特異的リガンドを回収するステップと
を含む、特異的リガンドをリガンド類のプールから単離する方法。
【請求項１８】
前記リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、アルカロイド類、テルペン類、補酵素、抗生物質、およびそれらの誘導体およびそれらの複合体からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドがタンパク質または修飾されたタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質がリン酸化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アプタマーが、リン酸化リガンドタンパク質と非リン酸化リガンドタンパク質とを識別する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質がグリコシル化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記アプタマーが、グリコシル化リガンドタンパク質と非グリコシル化リガンドタンパク質とを識別する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記アプタマーが不溶性基質上に固定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記アプタマーが、スペーサー配列によって不溶性基質上に固定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記不溶性基質がチップ基質である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記リガンドのプールが標識されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸アプタマーが上に固定された不溶性基質。
【請求項２９】
前記アプタマーが、スペーサー配列によって基質に固定されている、請求項２８に記載の不溶性基質。
【請求項３０】
特定の既知のリガンド類に特異的に結合する複数のアプタマーを含む、請求項２８に記載の不溶性基質。
【請求項３１】
チップ基質である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の不溶性基質。
【請求項３２】
Ｉ）生物学的サンプルからの特異的リガンドに結合することができる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の、少なくとも１つの特異的アプタマーを選択するステップと、
ＩＩ）少なくとも１つの上記特異的アプタマーを生物学的サンプルと混合して、上記リガンドを、少なくとも１つのアプタマーに結合させるステップと、
ＩＩＩ）少なくとも１つのアプタマーに結合した、生物学的サンプルからの特異的リガンドの存在および／または量を検出するステップと
を含む、生物学的サンプルから特異的リガンドを検出する方法。
【請求項３３】
前記アプタマーが溶液の状態であるかまたは基質に固定されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
生物学的サンプル中の前記リガンドが標識されており、上記標識を決定することによって、特異的リガンドの存在および／または量が決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が診断方法であり、疾病の診断がアプタマーに結合したリガンドの量または有無に基づく、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的アプタマーか、または請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の１つ以上のアプタマーが上に固定された少なくとも１つの基質を含むリガンド類のプールから選択される、特異的リガンドを決定するための検出用または診断用キット。
【請求項３７】
リガンド類のプールを標識するための１つ以上の標識をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のアプタマー、および薬学的に好適な希釈剤、賦形剤および／または担体を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ａ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
ｂ）核酸合成酵素、核酸合成酵素基質および核酸酵素基質誘導体の存在下で、プライマーまたはプロモーター、またはプロモーターとイニシエーターとを使用して、前記鋳型を伸長するステップと、
ｃ）ｂ）で得られた伸長産物の配列の相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として前記鋳型の塩基配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
前記ステップｂ）の産物が複数のポリヌクレオチドを含み、前記各ポリヌクレオチドが、１ヌクレオチド分だけ長さが異なるその他のヌクレオチドと分離される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ステップａ）の後で、前記鋳型と前記鋳型にハイブリダイズすることができるプライマーとの間のアニーリング反応が実行される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸鋳型が、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基であるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵと、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記伸長ステップｂ）で、前記標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基三リン酸塩が、標準Ｗ−Ｃ塩基三リン酸塩が存在する濃度と異なる濃度で存在する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジン；および構造式
【化３】
2004514440.tif 000005
（式中、Ｒは、リボース環またはデオキシリボース環の１位への塩基の付着点を示し、Ｘは、置換基Ｚを担持する窒素原子または炭素原子のいずれかである。Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アリール基、インドール基若しくはイミダゾリル基を担持する低級アルキル鎖、水素、または非官能化低級アルキル鎖であり、Ｙは、ＮまたはＣＨのいずれかであり、各環は、連続的に結合した３つ以下の窒素を含む）を有する複素環式塩基からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソＣおよび／またはイソＧである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記伸長ステップｂ）で、前記イソＣおよびイソＧ三リン酸の濃度が、標準塩基三リン酸の濃度より低い、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記鋳型がＤＮＡであり、前記合成酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、前記合成酵素基質が複数のｄＮＴＰであり、基質誘導体がｄｄＮＴＰを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰが標識されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プライマーまたはイニシエーターが標識されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標識が同位元素、発色団またはフルオロフォアである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記鋳型がＤＮＡであり、前記合成酵素がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、前記合成酵素基質が複数のＮＴＰであり、基質誘導体が３’−ｄＮＴＰ誘導体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
ＮＴＰまたは３’−ｄＮＴＰ誘導体が標識されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プライマーまたはイニシエーターが標識されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記標識が同位元素、発色団またはフルオロフォアである、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記鋳型がＲＮＡであり、前記合成酵素がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、前記合成酵素基質が複数のｄＮＴＰであり、前記基質誘導体がｄｄＮＴＰを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰが標識されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記プライマーまたはイニシエーターが標識されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記標識が同位元素、発色団またはフルオロフォアである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記鋳型がＲＮＡであり、前記合成酵素がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、前記合成酵素基質が複数のＮＴＰであり、基質誘導体が３’−ｄＮＴＰ誘導体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
ＮＴＰまたは３’−ｄＮＴＰ誘導体が標識されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記プライマーまたはイニシエーターが標識されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記標識が同位元素、発色団またはフルオロフォアである、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ａ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
ｂ）前記鋳型の一端を標識するステップと、
ｃ）前記標識された鋳型を化学的に分解するステップと、
ｄ）前記産物の増加した長さの配列として鋳型の配列を得る、ｃ）で得られた産物の長さを決定するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
前記核酸鋳型が、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基と、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジン；および構造式
【化４】
2004514440.tif 000006
（式中、Ｒは、リボース環またはデオキシリボース環の１位への塩基の付着点を示し、Ｘは、置換基Ｚを担持する窒素原子または炭素原子のいずれかである。Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アリール基、インドール基若しくはイミダゾリル基を担持する低級アルキル鎖、水素、または非官能化低級アルキル鎖であり、Ｙは、ＮまたはＣＨのいずれかであり、各環は、連続的に結合した３つ以下の窒素を含む）からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基が、イソＣおよび／またはイソＧである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型の塩基配列を決定する方法であって、
Ａ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
Ｂ）核酸合成酵素、核酸合成酵素基質および核酸合成酵素基質誘導体の存在下で、プライマーまたはプロモーター、またはプロモーターとイニシエーターとを使用して、前記鋳型を伸長するステップと、
Ｃ）Ｂ）で得られた伸長産物の塩基配列を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を使用して決定するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型の塩基配列を決定する方法であって、
ａ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ標準塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
ｂ）塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む塩基を有するヌクレオシドの存在下で、プライマー、プロモーター、またはプロモーターとイニシエーターとを使用することにより、第１のヌクレオシド三リン酸を付加してＰＰｉ放出を検出して第１のヌクレオシド三リン酸を分解し、次いで第２のヌクレオシド三リン酸を付加してＰＰｉを検出して第２のヌクレオシド三リン酸を分解し、提供されたヌクレオシド三リン酸の塩基の種類によってこの手順を反復することにより伸長を実行するステップと、
ｃ）配列決定したい鋳型塩基数によって、上記ステップｂ）を反復するステップと
ｄ）付加されたヌクレオシド三リン酸の配列の相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として鋳型の配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６９】
塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型の塩基配列を決定する方法であって、
ａ）チップ上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドが、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、１塩基または２塩基分だけ移動した重複フレームを有することを特徴とするステップと、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドを、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む本発明による標識鋳型とハイブリダイズさせるステップと、
ｃ）前記標識のシグナルを検出するステップと、
ｄ）標識されている重複するオリゴヌクレオチドのセットとして鋳型の配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項７０】
化合物２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸（ｄｄイソＧ）または２’，３’−ジデオキシイソシチジン　５’−三リン酸（ｄｄイソＣ）。
【請求項７１】
ｄｄＡＴＰの二ナトリウム塩とモノペルマレイン酸（ｍｏｎｏｐｅｒｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ）溶液との混合物の沈澱によって、ｄｄＡＴＰの窒素酸化物を調製するステップと、
調製されたｄｄＡＴＰの窒素酸化物を精製し、精製されたｄｄＡＴＰの窒素酸化物に、高圧水銀アークランプからの光を照射するステップと、
最終生成物２’，３’−ジデオキシイソグアノシンＳ’−三リン酸を回収するステップと
を含む、２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸を調製する方法。
【請求項７２】
過酸化水素を炭酸ナトリウム水溶液に加えるステップと、
無水マレイン酸を加え、マレイン酸が全部溶解するまで、前記混合物を攪拌するステップと、
０℃の水中の濃硫酸を加えるステップと、
前記混合物をエーテルで抽出するステップと、
気流中、水の存在下で、エーテル抽出液を蒸発させることにより、モノペルマレイン酸の溶液を得るステップと、
溶液のｐＨを水酸化イオンで７．０に調節するステップと、
ｄｄＡＴＰの二ナトリウム塩の溶液を加えるステップと、
前記反応混合物を室温で攪拌するステップと、
ｐＨを４．５に調節するステップと、
無水ＥｔＯＨを加えるステップと、
結果として生じた沈澱を遠心分離で回収するステップと、
前記沈澱を水に溶解するステップと、
ｐＨを４．５に調節するステップと、
ｄｄＡＴＰの窒素酸化物をエーテルで沈澱ことによって回収するステップと、
ｄｄＡＴＰの窒素酸化物を水に溶解するステップと、
ｄｄＡＴＰの窒素酸化物の溶液を光化学反応チューブに入れ、上記溶液を照射するステップと、
ｐＨを１０に調節するステップと、
室温で溶液を攪拌するステップと、
水を除去するステップと、
生成物をＨＰＬＣで精製するステップと
を含む、２’，３’−ジデオキシイソグアノシン５’−三リン酸を調製する方法。
【請求項７３】
２，５’−アンヒドロ−２’，３’−ジデオキシウリジンおよびメタノールの混合物から２’，３’−デオキシイソシチジンを調製するステップと、
トリエチルアンモニウム炭酸水素塩の溶液を、２’，３’−デオキシイソシチジンに加えて、溶剤を蒸発によって除去するステップと、
上記で得られた生成物をＨＰＬＣで精製するステップと、
２’，３’−ジデオキシイソシチジン５’−三リン酸を回収するステップと
を含む、２’，３’−ジデオキシイソシチジン５’−三リン酸を調製する方法。
【請求項７４】
ジエチルアゾジカルボキシレートを、２’，３’−ジデオキシウリジンと、テトラヒドロフラン中に懸濁されたトリフェニルホスフィンとの混合物に加えるステップと、
前記混合物を室温で一晩攪拌して、２，５’−アンヒドロ−２’，３’−ジデオキシウリジンを含有する淡黄色懸濁液を得るステップと、
前記２，５’−アンヒドロ−２’，３’−ジデオキシウリジンの懸濁液を、ドライアンモニアで飽和されたメタノールに加えるステップと、
前記混合物を室温で攪拌するステップと、
溶剤を除去するステップと、
残渣を水で抽出するステップと、
水を蒸発させて２’，３’−デオキシイソシチジンを得るステップと、
トリメチルホスフェート中に２’，３’−デオキシイソシチジンを含む混合物に、０℃の塩化ホスホリルを加えるステップと、
ジメチルホルムアミド中にトリス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸を含む溶液を、前記混合物に加えて勢いよくかき混ぜるステップと、
トリエチルアンモニウム炭酸水素塩の溶液を加えるステップと、
溶剤を除去するステップと、
生成物をＨＰＬＣで精製するステップと
を含む、２’，３’−ジデオキシイソシチジン５’−三リン酸を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸に関する。本発明は、このような核酸を作製する方法にも関する。
【０００２】
本発明は、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸の配列決定方法にも関する。
【０００３】
背景技術
アプタマーは、リガンドと特異的に結合する核酸である。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法、指数リガンド連続強化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｂｙ　Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））として知られる技術によって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで選択することができる。ＳＥＬＥＸは、ランダム配列ライブラリーから出発して、所与のリガンドに対する高親和性に合わせて、核酸を最適化する方法である。Ｈｅｒｍａｎｎ　Ｔ．ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ　Ｄ．Ｊ．，２０００年２月、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８７：８２０−８２５；Ｔｕｅｒｋ　Ｃ．ａｎｄ　Ｇｏｌｄ　Ｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４９：５０５）。
【０００４】
アプタマーは、溶液中では大部分は構造化されておらず、それらのガンドと結合したとき、リガンドが核酸と特異的に複合体を形成するように分子構造に折り重なる。選択が主としてリガンドの結合に向けられている間に、アプタマー配列に旋回圧が加わるため、アプタマー複合体の三次元構造は、特異的リガンド認識に合わせて高度に最適化された足場を示す。
【０００５】
アプタマー複合体の構造は、分子認識過程の研究に有益であり、多様な三次元モチーフをもたらし、この三次元モチーフは生物学的に適切な核酸折り畳みが再び起こる。小分子ＲＮＡ複合体は、薬物標的として、ＲＮＡの合理的探査に特に役立つことが報告されている。ＲＮＡ複合体における構造データとモデル化技術とを組み合わせる、細胞ＲＮＡ標的用のドラッグデザインアプローチは、高次ＲＮＡ構造の分子モデル化が非常に成功すれば、特に有望である（Ｈｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ，２０００）。核酸アプタマーは、医薬分析およびバイオテクノロジーにおける独特の道具を提供し、治療学としての役割を果たす（Ｈｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ　２０００）。たとえば、Ｂｏｃｋ　Ｌ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３５５：５６４−５６６には、ヒトのトロンビンを結合して阻害するアプタマーが報告されている。
【０００６】
しかし、構造的に同様の４つのヌクレオチドは、任意のリガンドを囲むようにパックする可能な代替法において制限されるため、アプタマーの使用には制約がある。（Ｈｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ，２０００）。
【０００７】
従って、極めて多様でかつ異なる種類のリガンドの選択を可能にするアプタマーの利用価値の新しい解決方法が、科学のこの分野で必要である。
【０００８】
本出願に開示されている本発明は、当技術分野におけるこの問題を解決する。
【０００９】
発明の概要
本発明者は、驚くべきことに、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸アプタマーは、新規かつ特異的なリガンドの選択に特に有用であることを発見した。従って、本発明は、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、上記標準ワトソン−クリック塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミジン（Ａ）およびウラシル（Ｕ）である、核酸アプタマーの作製方法に関する。
【００１０】
本方法は、
ａ）特異的な、目的のリガンドを提供するステップと、
ｂ）塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸アプタマーのプールを合成するステップと、
ｃ）このアプタマーのプールを特異的なリガンドと混合するステップと、
ｄ）特異的リガンドに結合する特異的なアプタマーを選択して増幅するステップと
を含む。
【００１１】
従って、発明は、上述の通りに作製される特異的アプタマーにも関する。
【００１２】
本発明は、
ｉ）塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む少なくとも１つの特異的アプタマーを提供するステップと、
ｉｉ）このアプタマーを、リガンド類（たとえばヒト血清またはそれからのタンパク質）のプールと混合するステップと、
ｉｉｉ）特異的アプタマーに結合した特異的リガンドを回収して決定するステップと
を含む、特異的リガンドを回収して決定する方法にも関する。本発明の別の態様によれば、本発明による少なくとも１つアプタマーを、直接またはスペーサー配列によって、溶性基質、たとえばチップに固定することができる。次いで、基質に固定されたアプタマーをリガンド混合物（たとえばヒト血清）に加え、次いで、アプタマーに結合したリガンドを回収する。個々の溶液によって、基質は、基質上に固定された本発明による幾つかの特異的アプタマーを含む。基質上に固定されたこれらの特異的アプタマーにリガンド類の混合物を加え、次いで、これらのアプタマーに特異的に結合したリガンド類を基質から回収する。リガンド類の混合物は標識されており、アプタマーに結合したリガンドを定量できることが好ましい。
【００１３】
従って、本発明は、
Ｉ）検索された特異的リガンドに結合することができる少なくとも１つの特異的アプタマーを選択するステップであって、上記少なくとも１つの特異的アプタマーが溶液中で使用できるかまたは不溶性基質上に固定されているステップと、
ＩＩ）上記少なくとも１つの特異的アプタマーを生物学的サンプルと混合するステップと、
ＩＩＩ）上記少なくとも１つの特異的アプタマーに特異的に結合した検索された特異的リガンドの存在および／または量を検出するステップと、
を含む、特異的リガンドを検出するための検出方法に関する。
【００１４】
上記方法のある特定の実施形態として、検出方法は、診断方法であってもよい。
【００１５】
従って、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの特異的アプタマー、または（ｉｉ）１つ以上の特異的アプタマーが上に固定された１つ以上の基質、および任意に、リガンド混合物を標識するための１つ以上の標識を含む、検出または診断用のキットにも関する。
【００１６】
さらに、本発明は、薬学的に好適な希釈剤、賦形剤および／または担体の存在下で、本発明によるアプタマーを含む医薬組成物に関する。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸を配列決定する方法に関する。
【００１８】
本発明の詳細な説明
第１の態様によれば、本発明は、塩基対形成ができ、標準ワトソン−クリック塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む新規核酸アプタマーを作製する方法を提供する。これらの新しいアプタマーは、新規かつ特異的なリガンド類の選択に特に有用である。
【００１９】
本発明によるアプタマーの作製は、たとえばＴｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：５０５；Ｔｕｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６９８８に詳細に記述されている、当技術分野で周知のＳＥＬＥＸプロトコールに準拠して実施することができる。
【００２０】
アプタマー選択のためのリガンドは、リガンドとして有用でありかつ本発明によるアプタマーが認識できる任意の産物であってもよい。リガンド類の例は、Ｈｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ，２０００に報告されている。リガンドは、たとえばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、オリゴ糖、アルカロイド、テルペン、補酵素、抗生物質、またはこのような分子の誘導体または複合体であってもよい。
【００２１】
既知の技術に準拠してリガンドを合成することができる。ペプチドまたはタンパク質の場合、リガンドは、ペプチドシンセサイザーを用いて、または組換えＤＮＡテクノロジーにより製造してもよく、または生物学的組織から精製してもよい。
【００２２】
リガンドは、タンパク質であってもよく、修飾されたタンパク質であってもよい。たとえば、タンパク質は、リン酸化されていることもリン酸化されていないこともあり、および／またはグリコシル化されていることもグリコシル化されていないこともあり得る。タンパク質リガンドは、当技術分野で周知の組換え技術に準拠して製造することができ、また、（たとえば、米国特許第６，１４３，５２８号；Ｃａｒｎｉｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３７：３２７−３３６；Ｃａｒｎｉｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７，ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，６１−６６；Ｃａｒｎｉｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０００年１０月、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６１７−１６３０に記載の方法論を使用して）全長ｃＤＮＡライブラリーから作ることができる。
【００２３】
本発明によるリガンドは、分子量によって制限されないが、５，０００ダルトン未満の分子量を有することが好ましい。
【００２４】
塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を有するアプタマーを含む本発明によるアプタマーのプールは、当技術分野で周知の標準技術に準拠して、たとえば自動化シンセサイザー、たとえばＥＸＰＥＤＩＴＥ　８９０９により標準プロトコールを使用して作製することができる。好ましくは、合成されるプールは、鋳型を増幅するための特異的プライマーによって認識される、規定された領域に挟まれた、ランダム配列の領域を含む１本鎖核酸のランダムプールである（これは、ランダムアプタマープールを示す）。生成した鋳型は、たとえば、数回のＰＣＲサイクルを使用して、増幅できることが好ましい。ＰＣＲは、標準条件で実施することができるが、ヌクレオシド三リン酸の濃度は、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる特定の修飾された塩基によって幾分変えることができる。たとえば、実施例３に報告する通り、使用される標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基がイソＣおよびイソＧであったとき、標準Ｗ−Ｃ塩基（Ａ，Ｃ，Ｇ、Ｔ）の標準濃度は、２００μＭであり、イソＣおよびイソＧ濃度は１００μＭであった。
【００２５】
最新技術で利用できるＰＣＲ以外の増幅方法論を、本発明による鋳型の作製に使用することができる。たとえば，ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍｉｃａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｎｏｔｏｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８：ｅ６３頁）；ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｋａｍｉｓａｎｇｏ，Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３１０−３１４）；ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）（ＴＡＫＡＲＡ　ＳＨＵＺＯ　ＣＯ，ＬＴＤ，ＢｉｏＪａｐａｎ２０００年９月２６〜２８日）；ＳＤＡ方法論（Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２０：１６９１−１６９６）。
【００２６】
本発明による鋳型プールに含まれるアプタマーの組成は以下の通りである。
【００２７】
ステップｃ）で、本発明によるアプタマープールを、ステップａ）で作製した特異的リガンドと混合する。
【００２８】
特異的リガンドに結合した特異的アプタマーを回収して増幅する（ステップｄ）。
【００２９】
アプタマーのプールまたはステップｂ）のランダム配列の領域を含む鋳型のプールを構成する、本発明による核酸アプタマーは、以下の通りに説明される。
【００３０】
アプタマーは、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、上記標準Ｗ−Ｃ塩基が、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵとして規定される核酸である。好ましくは、アプタマーは、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基および少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基を含む。
【００３１】
標準Ｗ−Ｃ塩基と異なるこの塩基は、塩基対形成ができる任意の塩基であってもよい。この塩基は、Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．米国特許第５，４３２，２７２号に明示されている非標準Ｗ−Ｃ塩基、たとえばイソＧおよび／またはイソＣであってもよく（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２１，ｐｐ．３６０１−３６０４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ）、または非Ｗ−Ｃ塩基でありかつ疎水性塩基対形成ができてもよい。
【００３２】
非標準Ｗ−Ｃ塩基の例としては、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；図３の構造式からなる群から選択される、他の複素環式塩基などが挙げられる。特に、塩基２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリンおよびピリジン−２−オンは、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ　Ｓｅｒ，４２：１２５−１２６に開示されている。
【００３３】
非Ｗ−Ｃ塩基（たとえば疎水性塩基対形成を示す）の例としては、３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジンなどが挙げられる。特に、塩基７−プロピニルイソカルボスチリルは、それ自身と対形成ができ、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｆ．Ｓｅｒｖｉｃｅ　ｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，２０００年７月，Ｖｏｌ．２８９：２３２−２３５に記載されている。
【００３４】
本発明による、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含むアプタマーは、可能な組合せの高い可変性を示す。本発明による核酸アプタマーは、塩基対形成ができ、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、好ましくは、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基および少なくとも１つ標準Ｗ−Ｃ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を含む。しかし、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基の数は限定されない。従って、本発明による核酸アプタマーは、たとえば、６つの異なる塩基、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、イソＧおよびイソＣを含むことができる。しかし、本発明による核酸アプタマーは、８、１０、１２、１４またはそれより多い異なる塩基を含むことができる（米国特許第５，４３２，２７２号参照）。
【００３５】
本発明による、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基を使用することにより、最新技術で入手できるアプタマーより高い可変性を有する特異的アプタマーを作製することが可能になる。事実、異なる長さを有する核酸を考えるのであれば、下表１に報告する通り、４つの標準Ｗ−Ｃ塩基を使用して作製することが可能なものと異なるアプタマーの数は、本発明による、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基を使用して作製できる異なるアプタマーの数よりはるかに少ない。表１で、「４　Ｗ−Ｃ　Ｓｔ．塩基」は、Ｗ−Ｃ標準塩基のみを含む核酸に関し、「４　Ｗ−Ｃ　ｓｔ．＋ｉＧ＋ｉＣ」は、４つの標準Ｗ−Ｃ塩基および標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる２つの塩基、たとえばイソＧ（ｉＧ）およびイソＣ（ｉＣ）を含む核酸に関する。
【００３６】
【表１】
2004514440.tif 000002
【００３７】
表１から明らかな通り、本発明により開示されるアプタマーの可変性は、最新技術で入手できるアプタマーに比べてかなり改善されている。
【００３８】
本発明によるアプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）であってもよく、また一本鎖、二本鎖または三本鎖核酸であってもよい。アプタマーは、異なる長さ、好ましくは１２〜３００塩基のものであってもよい。
【００３９】
本発明に従って作製されるアプタマーは、リガンド類のプール（またはリガンド類の混合物）または生物学的サンプルからの特異的リガンドを回収して決定するために使用することができる。このような方法は、
ｉ）上述のような、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む少なくとも１つの特異的アプタマーを提供するステップと、
ｉｉ）このアプタマーを、リガンド類のプールまたは生物学的サンプルと混合するステップと
特異的アプタマーに結合した特異的リガンドを回収して決定するステップと、を含む。
【００４０】
ステップｉ）の少なくとも１つの特異的アプタマーは、ステップａ）〜ｄ）に従って、上述の通りに作製される。１つの特異的アプタマーを使用しても、または２以上の異なるアプタマーを同時に使用してもよく、たとえば特異的アプタマーは、不溶性基質、たとえば、チップ上に固定されていてもよい。従って、アプタマーは、溶液で使用することができ、または不溶性基質に固定または結合されていてもよく、チップ基質に固定されていることが好ましい。
【００４１】
ステップｉｉ）のリガンド類のプールは、任意のプールであってもよく、または当該技術で周知の従来の方法で作製されたリガンド類の混合物であってもよく、または生物学的サンプルであってもよい。リガンド類のプールに含まれるリガンドは、好ましくは、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質類、脂質類、多糖類、アルカロイド類、テルペン類、補酵素類、抗生物質類、およびそれらの誘導体およびそれらの複合体から選択することができる。
【００４２】
リガンドプールがタンパク質類および／またはペプチド類を含むとき、それらは、修飾されていても修飾されていなくてもよく、リン酸化されていてもリン酸化されていなくてもよく、および／またはグリコシル化されていてもグリコシルされていなくてもよい。従って、特異的アプタマーは、リン酸化リガンドタンパク質類およびペプチド類と非リン酸化リガンドタンパク質類およびペプチド類、および／またはグリコシル化リガンドタンパク質類およびペプチド類と非グリコシル化リガンドタンパク質類およびペプチド類、および／または修飾リガンドタンパク質類およびペプチド類と非修飾リガンドタンパク質類およびペプチド類とを区別することができる。
【００４３】
リガンド類のプールを構成するリガンド類は、リガンド類のプールを標識と接触させることによって標識できることが好ましい。標識は、当技術分野で周知の検出できる任意の標識、たとえば同位元素、発色団またはフルオロフォア標識であってもよい。あるいは、リガンドは、そのリガンドに特異的に結合する抗体で検出することができる。
【００４４】
ステップｉｉｉ）で、アプタマーに結合したリガンドを検出し、任意にアプタマーから分離して回収する。検出は、定性的または定量的のいずれであってもよい。１つより多い特異的アプタマーが使用される場合（たとえば、その上に固定された、互いに異なる、幾つかの特異的アプタマーを含むチップを使用して）、それぞれ特異的でかつ特異的アプタマーに結合した、１つより多いリガンドを回収できる可能性があることは明白である。選択は、上述の通りに導入された標識を検出することによって、行うことができる。検出、分離および回収は、当技術分野で周知の技術に準拠して実施される。
【００４５】
上述の通り、本発明によるアプタマーは、溶液で使用できるか、または、好ましくは、不溶性基質上、たとえばチップ基質上に固定することができる。本発明による不溶性基質は、任意の種類の不溶性物質、たとえば、ビーズ、注射器、毛細管、チューブ、プレートの、表面であってもよい。不溶性基質は、好ましくは、チップである（米国特許第５，５２５，４６４号）。この不溶性基質は、クロマトグラフィ用フォーマットで使用することができる。
【００４６】
アプタマーは、不溶性基質、好ましくはチップ基質に、標準技術に準拠して、固定することができ、たとえば米国特許第５，８３７，８３２号に記載の通り、チップ上に合成してもよく、またはＥＰ１０４１１６０号に記載の通りに作製し、次いでチップ上に固定してもよい。アプタマーは、チップ基質に直接固定してもよく、または実施例４に記載のスペーサーまたはリンカー配列を用いて固定してもよい。
【００４７】
次いで、基質上に固定されたアプタマーにリガンド混合物（たとえばヒト血清）を加え、アプタマーに結合したリガンドを回収して特性決定する。個々の溶液によって、チップは、幾つかの本発明による特異的アプタマーをその上に固定している。リガンド類の混合物が標識されており、アプタマーに結合したリガンドの定量的量を測定できることが好ましい。
【００４８】
従って、本発明は、
Ｉ）少なくとも１つの所望の特異的リガンドに結合することができる、本発明による少なくとも１つの特異的アプタマーを選択するステップであって、上記少なくとも１つの特異的アプタマーが溶液で使用できるかまたは基質上に固定されているステップと、
ＩＩ）上記少なくとも１つの特異的アプタマーを生物学的サンプルと混合するステップと、
ＩＩＩ）上記少なくとも１つの特異的リガンドの存在および／または量を検出するステップと
を含む特異的リガンドを検出するための検出方法に関する。
【００４９】
上記方法のある特定の実施形態として、検出方法は、生物学的サンプルから選択されるリガンドを検出するための診断方法であってもよい。本発明による診断方法の１例は、特異的リガンドの存在または量が特定の疾病と関連している、疾病を検出するための方法である。本方法は、たとえば、コレステロール濃度の検出、血中薬物濃度のテストおよび最新技術で周知の他の診断用途に使用することができる。また、リガンドは、たとえば、ある特定の機能または活性を有し、その修飾がある特定の疾病の発現に影響を及ぼす、膜受容体であってもよい。
【００５０】
生物学的サンプルは、任意の生物学的ソースのもの、たとえば，植物または動物であってもよい。たとえば、生物学的サンプルは、患者からの血清または血液サンプルであってもよい。
【００５１】
従って、本発明は、本発明による少なくとも１つの特異的アプタマー、または１つ以上の特異的アプタマーが上に固定された少なくとも１つの基質、および任意に、上述のリガンドプールまたは生物学的サンプルを標識するための１つ以上の標識を含む検出用または診断用キットにも関する。
【００５２】
本発明による特異的アプタマーは、たとえば、Ｈｅｒｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ，２０００に開示されている通り、特に有用である。たとえば、本発明による特異的アプタマーは、薬剤としておよび治療的処置に使用することができる。
【００５３】
別の態様によれば、本発明は、薬学的に好適な希釈剤、賦形剤および／または担体の存在下で本発明によるアプタマーを含む、医薬組成物である。本発明は、本発明によるアプタマーを、好ましくは上述の医薬組成物の形態で、投与することを含む、疾病を処置するための治療方法にも関する。
【００５４】
ｉｎ　ｖｉｖｏで処置するためのアプタマーの使用は、文献（たとえば、Ｈｉｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０００年１０月、Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．８；Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．，Ａｐｒ．２０００：１０（２）：６３−７５；およびＦｌｏｅｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４，Ｎｏ．１，Ｊａｎ．１９９９）に開示されている。
【００５５】
Ｆｌｏｏｇｅらは、ヌクレアーゼ抵抗性高親和性オリゴヌクレオチドアプタマーのｉｎ　ｖｉｖｏ作用をラット膜性増殖性糸球体腎炎モデルで評価した。疾病誘導の３〜８日後に、４０−ｋｄポリエチレングルコール（ＰＥＧ）と結合させた２．２ｍｇ／ｋｇ　ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーを１日２回静脈内（ｉ．ｖ．）注射することにより、糸球体の有糸分裂の減少、増殖中のメサンギウム細胞等の減少等々を招いた。
【００５６】
他の実験で、Ｆｌｏｅｇｅらは、処置には、総量２ｍｇという低用量のＰＤＧＦ−Ｂアプタマーで十分なことも確認した。
【００５７】
従って、本発明によるアプタマーは、異なる経路で、好ましくは注射によって、投与される、患者の体重および生理学的条件に応じてある一定量のアプタマーまたはアプタマー物質を含むが、２ｍｇ／ｋｇ体重以上を投与することができる、上述の製剤の作製に使用することができる。
【００５８】
本発明によるアプタマーは配列決定することができる。
【００５９】
Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基のためのターミネーターは従来技術で入手できないため、当技術分野で周知の、たとえばＳａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７；Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３：１６１−１７８，Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８９ａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：６４４７−６４５８；Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８９ｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４０７６−４０８０；米国特許第５，８２１，０５８号）または米国特許第６，０７４，８２４号に記載のいわゆる転写的配列決定（ＴＳ）法に基づいた古典的配列決定方法は、本発明による、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型の塩基配列決定に使用できないことを、本発明者は発見した。
【００６０】
従って、本発明の発明者は、塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型のヌクレオチド塩基配列を決定するための新しいかつ改良された方法を開発した。１つの実施形態によれば、本方法は、
Ａ）塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
Ｂ）核酸合成酵素、核酸合成酵素基質および基質誘導体の存在下で、プライマーまたはプロモーターまたはプロモーターおよびイニシエーターを使用して、上記鋳型を伸長するステップと、
Ｃ）Ｂ）で得られた伸長産物の塩基配列を決定するステップと
を含む。
【００６１】
１つの具体例によれば、ステップＢ）の産物は、複数のポリヌクレオチドを含むことができ、上記各ポリヌクレオチドが、１ヌクレオチド分だけ長さが異なるその他と分離され、その核酸配列は、米国特許第５，８２１，０５８号に記載の方法に従って決定される。
【００６２】
別の具体例によれば、ステップＡ）の後、上記鋳型と、上記鋳型にハイブリダイズできるプライマーとの間のアニーリング反応が実行される。
【００６３】
ステップＡ）による核酸鋳型は、好ましくは、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵと、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む。標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基を有するヌクレオシド三リン酸を、標準Ｗ−Ｃ塩基を有するものと同濃度で提供することができる。使用される、標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基を有するヌクレオシド三リン酸によって、２種の塩基間のヌクレオシド三リン酸濃度は、異なることがある。イソＣおよびイソＧを付加するとき、たとえば、イソＣおよびイソＧ三リン酸の濃度は、標準Ｗ−Ｃ塩基を有するヌクレオシド三リン酸の濃度より低い。
【００６４】
標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基は、塩基対形成ができる任意の塩基であってもよい。標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基は、Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．米国特許第５，４３２，２７２号に規定されている非標準Ｗ−Ｃ塩基、たとえばイソＧおよび／またはイソＣ（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２１，ｐｐ．３６０１−３６０４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ）であってもよく、非Ｗ−Ｃ塩基（標準でも非標準でもない）でかつ疎水性塩基対形成ができてもよい。
【００６５】
非標準Ｗ−Ｃ塩基の例は、イソ−Ｃ；イソ−Ｇ；２，６−ジアミノピリミジン；キサンチン；６−アミノ−５−置換　ピラジン−２（１Ｈ）−オン；１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン；５−アザ−７−デアザグアニン；６−アミノ−３−置換　ピラジン−２（１Ｈ）−オン；３−アミノ−１−メチルプリン−２−オン；２，４−ジアミノ−５，６−ジヒドロピリミジン；２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリン；ピリジン−２−オン；図３の構造式からなる群から選択される他の複素環式塩基である。特に、塩基２−アミノ−６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プリンおよびピリジン−２−オンは、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐ　Ｓｅｒ，４２：１２５−１２６に開示されている。
【００６６】
非Ｗ−Ｃ塩基（たとえば疎水性塩基対形成を示す）の例は、３−メチルイソカルボスチリル；５−メチルイソカルボスチリル；７−プロピニルイソカルボスチリル；ｍ−キシレン；１，３，４−トリメチルベンゼン；２−メチルアナフタレン；１，４−ジメチルナフタレン；１−メチルアナフタレン；ナフタレン；７−アザインドール；イソカルボスチリル；６−メチル−７−アサインドール；３−プロピニル−７−アザインドール；イミダゾピリジン；ピロロピリジンである。特に、塩基７−プロピニルイソカルボスチリルは、それ自身と対形成ができ、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｆ．Ｓｅｒｖｉｃｅ　ｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年７月，Ｖｏｌ．２８９：２３２−２３５に記載されている。
【００６７】
ある特定の具体例によれば、鋳型がＤＮＡであるとき、合成酵素はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、合成酵素基質はｄＮＴＰであり、基質誘導体はｄｄＮＴＰを含む。
【００６８】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌＩクレノー（Ｋｅｌｅｎｏｗ）フラグメント（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；”Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，”　ｐｐ．２０１−２３１．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ内のＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９８９；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔ７　ＤＮＡ　ｐｏｌ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：４７６７−４７７１）；および熱安定性ポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ等々）（Ｅｕｎ，Ｈ−Ｍ．，１９９６，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）である。
【００６９】
使用するｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰは標識されていることが好ましい。さらなる実施形態によれば、ステップＢ）のプライマーまたはイニシエーターは標識されている。標識は、同位元素、発色団またはフルオロフォア標識であってもよい。
【００７０】
別の具体例によれば、鋳型がＤＮＡであるとき、合成酵素はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、合成酵素基質はＮＴＰであり、基質誘導体は３’−ｄＮＴＰ誘導体を含む。
【００７１】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼおよびＳＰポリメラーゼである（Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｖ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：５７１６−５７２３；Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９８６，ＤＮＡ　５：１６７−１７１）。
【００７２】
ＮＴＰまたは３’−ｄＮＴＰ誘導体は標識されていてもよい。ステップＢ）のプライマーまたはイニシエーターは標識されていることが好ましい。標識は、放射性同位元素、発色団またはフルオロフォアであってもよい。
【００７３】
さらなる具体例によれば、鋳型がＲＮＡであるとき、合成酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、合成酵素基質はｄＮＴＰであり、基質誘導体はｄｄＮＴＰを含む。
【００７４】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの例は、ＡＭＶポリメラーゼおよびＭｏＬＶポリメラーゼである（Ｋａｒａｎｔｈａｎａｓｉｓ，Ｓ．，ｌ９８２，Ｆｏｃｕｓ　ＢＲＬ，４：６−７；Ｇｅｌｉｅｂｔｅｒ，Ｊ．，１９８９，Ｆｏｃｕｓ（ＢＲＬ），９：５−８；Ｈａｈｎ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８０：１２１−１３０）。
【００７５】
ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰは標識されていてもよい。ステップＢ）のプライマーまたはイニシエーターは標識されていることが好ましい。標識は、同位元素、発色団またはフルオロフォアであってもよい。
【００７６】
さらに、鋳型がＲＮＡであり合成酵素がＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるとき、合成酵素基質はＮＴＰであり、基質誘導体は３’−ｄＮＴＰ誘導体である。
【００７７】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの１例は、たとえばＱβレプリカーゼ（Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：５３３４−５３３８）である。
【００７８】
ＮＴＰまたは３’−ｄＮＴＰ誘導体は標識されていたもよい。ステップＢ）のプライマーまたはイニシエーターも標識されていてもよい。標識は、放射性同位元素、発色団またはフルオロフォアであってもよい。
【００７９】
塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基は、好ましくは上述の通りである。
【００８０】
塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ標準塩基と異なる非標準Ｗ−Ｃの１例は、イソＣおよび／またはイソＧである。
【００８１】
イソＧおよび／またはイソＣが基質誘導体として使用されるとき、２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸（ｄｄイソＧ）および２’，３’−ジデオキシイソシチジン　５’−三リン酸（ｄｄイソＣ）を、本発明による方法におけるターミネーターとして使用することができる。
【００８２】
従って、本発明は、化合物２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸（ｄｄイソＧ）および２’，３’−ジデオキシイソシチジン　５’−三リン酸（ｄｄイソＣ）を作製するための新しい方法も提供する。
【００８３】
塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む、本発明による核酸鋳型の塩基配列の決定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析（米国特許第５，６９１，１４１号）を使用することによって実施することもできる。
【００８４】
従って、本発明は、
Ａ）塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
Ｂ）核酸合成酵素、核酸合成酵素基質および基質誘導体の存在下でプライマー、またはプロモーター、またはプロモーターとイニシエーターを使用して、上記鋳型を伸長するステップと、
Ｃ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を使用して断片化産物の質量を決定することによって、Ｂ）で得られた伸長産物の塩基配列を決定するステップと
を含む、本発明による核酸鋳型の塩基配列を決定する方法も開示する。
【００８５】
別の実施形態によれば、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型のヌクレオチド塩基配列を決定する方法も、化学分解法（マクサム・ギルバート法またはその改良された変法）に基づいて実施することができる。この方法は、１本鎖鋳型の一端のみの化学的修飾（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，６５：４９９−５５９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，１３．３章）、または二本鎖鋳型の両端の化学的修飾（マクサム・ギルバート法（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５６０−５６４）によって開始して、実施することができる。
【００８６】
二本鎖鋳型は、当技術分野で周知の標準技術に従って、本発明の１本鎖鋳型から作製することができる。たとえば、Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む１本鎖鋳型を作製し、次いで、特異的制限酵素部位（たとえばＦｏｋＩ）を含む少なくとも１つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲ増幅で相補鎖を作製する。次いで、増幅から得られる二本鎖鋳型を特異的制限酵素（たとえばＦｏｋＩ：Ｔｏｙｏｂｏ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）で切断し、得られたフラグメントの両端を化学的に修飾し、化学分解によって配列決定する。
【００８７】
従って、塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、上記標準Ｗ−Ｃ塩基がＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵである、核酸鋳型のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
１）塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
２）上記鋳型の一端を標識するステップと、
３）上記標識された鋳型を化学的に分解するステップと、
４）３）で得られた産物の塩基配列を決定するステップと
を含む方法が提供される。
【００８８】
好ましくは、上記方法において、核酸鋳型は、少なくとも１つの標準Ｗ−Ｃ塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵと、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基とを含む。
【００８９】
塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる塩基は、好ましくは上述の通りである。
【００９０】
塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ標準塩基と異なる非標準Ｗ−Ｃ塩基の１例はイソ−Ｃおよび／またはイソＧである。
【００９１】
塩基対形成ができかつ標準ワトソン−クリック（Ｗ−Ｃ）塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む本発明による核酸鋳型の塩基配列の決定は、たとえば，ピロシークエンシング（リアルタイムピロリン酸ＤＮＡ配列決定法）（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２（１９９６）８４−８９；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１（１９９８）３６３−３６５），またはハイブリダイゼーションによる配列決定に基づくアレイ法（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｉ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４，１９８９，１１４−１２８；ＵＳ　５，２０２，２３１号）のような、当技術分野で周知の他の技術を使用して、実施することもできる。
【００９２】
従って、本発明は、
ａ）塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む核酸鋳型を提供するステップと、
ｂ）塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む塩基を有するヌクレオシド三リン酸の存在下で、プライマー、プロモーター、またはプロモーターおよびイニシエーターを使用し、第１のヌクレオシド三リン酸を付加してＰＰｉ放出を検出して第１のヌクレオシド三リン酸を分解し、次いで第２のヌクレオシド三リン酸を付加してＰＰｉを検出して第２のヌクレオシド三リン酸を分解し、提供されたヌクレオシド三リン酸の塩基の種類によってこの手順を反復することにより伸長を実行するステップと、
ｃ）配列決定したい鋳型塩基数によって、上記ステップを反復するステップと、
ｄ）付加されたヌクレオシド三リン酸の配列の相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として鋳型の配列を決定するステップと
を含む、本発明による核酸鋳型の塩基配列を決定する方法（パイロシーケンシング）を開示する。
【００９３】
本発明は、
ａ）チップ上に固定された短い（好ましくは４〜１２量体）オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、これらのオリゴヌクレオチドが、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含み、１塩基または２塩基分だけ移動した重複フレームを有することを特徴とするステップと、
ｂ）これらのオリゴヌクレオチドを、塩基対形成ができかつ標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる少なくとも１つの塩基を含む標識鋳型とハイブリダイズさせるステップと、
ｃ）上記標識のシグナルを検出するステップと、
ｄ）標識鋳型にハイブリダイズする重複オリゴヌクレオチドのセットを決定することによって鋳型の配列を決定するステップと
を含む、本発明による核酸鋳型の塩基配列を決定する方法（ハイブリダイゼーション配列決定）も提供する。
【００９４】
ハイブリダイゼーション配列決定を実施する条件は、Ｄｒｍａｎａｃ，Ｉ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｒｚｏｍｉｃｓ　４，１９８９，１１４−１２８および米国特許第５，２０２，２３１号に記載されている。
さらに、以下の実施例を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。
【００９５】
実施例１
２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸（ｄｄイソＧ）の作製
過酸化水素（３０％、３．５ｍｌ）を、水（２５ｍｌ）中に炭酸ナトリウム（２．６ｇ、２５ｍｍｏｌ）を含む溶液に加えた。次いで、無水マレイン酸（２．４５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を０℃で３０分間攪拌し、その時点でマレイン酸を全部溶解させた。次いで、０℃にて、水（７．０ｍｌ）中の濃硫酸（１．５ｍｌ）を加えた。この混合物をエーテル（８×２５ｍｌ）で抽出し、合併した抽出液を０℃で保存した。
【００９６】
気流中、水（３６μｌ）の存在下でエーテル抽出液０．３１ｍｌを蒸発させることにより、水中にモノペルマレイン酸を含む溶液を得た。この溶液のｐＨを、ＮａＯＨ（１Ｍ）で７．０に調節し、ｄｄＡＴＰの二ナトリム塩の溶液（水１８μｌ中に、５ｍｇ、１０μｍｏｌ，ＩＣＮ）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間攪拌し、ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨを４．５に調節した。ＥｔＯＨ（無水、５４５μｌ）を加え、結果として生じた沈澱を遠心分離で回収し、水（２．０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを４．５に調節し、エーテル（３．６ｍｇ、７３％）で沈澱させることによって、ｄｄＡＴＰの窒素酸化物を得た。
【００９７】
ＤｄＡＴＰの窒素酸化物（３．６ｍｇ、７．３μｍｏｌ）を水（４．５ｍｌ）に溶解し、この溶液を、光化学反応チューブの中に入れた。この混合物に、高圧水銀アークランプからの光を２時間照射し、ｐＨを１０に調節し（２８％アンモニア水溶液）、この混合物を室温で一晩攪拌した。
【００９８】
水を、真空で除去し、材料をＨＰＬＣ（ＹＭＣ　ＯＤＳ　１２０Ａ　セミ分取カラム、０．２〜８％アセトニトリルの勾配で、２０ｍＭ　トリエチルアンモニウムアセテート水溶液で６０分にわたって溶離）で精製した。
【００９９】
生成物を含有する分画を集め、緩衝液を真空で回収し、２’，３’−ジデオキシイソグアノシン　５’−三リン酸を得た。
【０１００】
２’．３’−ジデオキシイソシチジン　５’−三リン酸（ｄｄイソＣ）の作製
ジエチルアゾジカルボキシレート（トルエン中４０％、１ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を、２’，３’−ジデオキシウリジン（１００ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（１ｍｌ）中に懸濁したトリフェニルホスフィン（０．２６ｇ、１ｍｍｏｌ）との混合物に加えた。この混合物を室温で一晩攪拌し、結果として生じた、２，５’−アンヒドロ−２’，３’−ジデオキシウリジンを含有する淡黄色懸濁液を、精製せずに次の反応で使用した。
【０１０１】
メタノール（１５ｍｌ）を、０℃のドライアンモニアで飽和し、２，５’−アンヒドロ−２’，３’−ジデオキシウリジンの黄色懸濁液を加えた。この混合物を室温で日間攪拌した。ＴＬＣ（シリカゲル、２０％メタノール／ジクロロメタン）は、本質的に完全な転換を示した。攪拌をさらに５日間続け、溶剤を蒸発によって除去した。結果として生じた残渣を水で抽出した（５×２ｍｌ）。
【０１０２】
溶剤の蒸発によって、２’，３’−デオキシイソシチジンを得た（４８ｍｇ、４８％）。
【０１０３】
０℃の、トリメチルホスフェート（０．８２２ｍｌ）中に２’，３’−デオキシイソシチジン（４８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を含む溶液に、塩化ホスホリル（０．０３９ｍｌ）を加え、１．５時間攪拌した。次いで、この混合物に、ジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ）中にトリス（トリブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．２ｍｇ）を含む溶液を急速に加えた。この混合物を、１分間、勢いよくかき混ぜた。
【０１０４】
次いで、トリエチルアンモニウム炭酸水素塩溶液（１Ｍ、ｐＨ８．０、２ｍｌ）を加えた。溶剤を蒸発によって除去し、生成物をＨＰＬＣ（ＹＭＣ　ＯＤＳ　１２０Ａ　半分取用カラム、０．２〜８％アセトニトリルの勾配で、２０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート水溶液で６０分間にわたって溶離）で精製した。
【０１０５】
実施例２
オリゴヌクレオチドの配列決定
ＭＥＧＡＬＡＢＥＬオリゴヌクレオチド標識キット（コード番号６０７Ｏ、Ｔａｋａｒａ、日本）および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（コード番号ＡＡ００１８，６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を使用して、リバース３’プライマー、ＲＥＶ−４：５’−ＡＧＣ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　　ＣＡＣ　ＡＣ−３’（配列番号１）（標準プロトコールに準拠して、ＥＸＰＥＤＩＴＥ　８９０９自動式シンセサイザーで合成）２０ｐｍｏｌを標識した。
【０１０６】
上で作製した標識プライマー１．５ｐｍｏｌおよびオリゴヌクレオチド鋳型、ＰＣＲ４−１：５’−ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＣＧｇ　ｃＡＴ　ＴＧＣ　ｃｇＡ　ＴＧＡ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＡＴＣ　ＣＧＣ　Ｔ−３’（配列番号２）（標準プロトコールに準拠して、ＥＸＰＥＤＩＴＥ　８９０９シンセサイザーで合成）０．７５ｐｍｏｌ、および１０×クレノー緩衝液（コード番号６０１５Ａ，Ｔａｋａｒａ，日本）２．２５μｌを混合し、この混合物の体積を１８μｌに調節した。混合物を９５℃で５分間インキュベートし、氷上に置いた。水３μｌおよび２単位／μｌのクレノーフラグメント１．５μｌを加えて、アニーリング混合物を作った。
【０１０７】
２μｌの終結混合物、ｄｄｄＡ（４１６．７μＭ　ｄＡＴＰ、８３．３μＭ　ｄＣＴＰ、８３．３μＭ　ｄＧＴＰ、８３．３μＭ　ｄＴＴＰ、４０μＭ　ｄｉＧＴＰ、４０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１００μＭ　ｄｄＡＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）、ｄｄｄＣ（８３．３μＭ　ｄＡＴＰ、４１６．７ｎＭ　ｄＣＴＰ、８３．３μＭ　ｄＧＴＰ、８３．３μＭ　ｄＴＴＰ、４０μＭ　ｄｉＧＴＰ、４０μＭ　ｄｉＣＴＰ、５０μＭ　ｄｄＣＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）、ｄｄｄＧ（８３．３μＭ　ｄＡＴＰ、８３．３μＭ　ｄＣＴＰ、４１６．７ｎＭ　ｄＧＴＰ、８３．３μＭ　ｄＴＴＰ、４０μＭ　ｄｉＧＴＰ、４０μＭ　ｄｉＣＴＰ、５８．３μＭ　ｄｄＧＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）、ｄｄｄＴ（８３．３μＭ　ｄＡＴＰ、８３．３μＭ　ｄＣＴＰ、８３．３μＭ　ｄＧＴＰ、４１６．７ｎＭ　ｄＴＴＰ、４０μＭ　ｄｉＧＴＰ、４０μＭ　ｄｉＣＴＰ、２００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）、ｄｄｄｉＧ（８３．３μＭ　ｄＡＴＰ、８３．３μＭ　ｄＣＴＰ、８３．３μＭ　ｄＧＴＰ、８３．３μＭ　ｄＴＴＰ、４１６．７ｎＭ　ｄｉＧＴＰ、４０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）、ｄｄｄｉＣ（８３．３μＭ　ｄＡＴＰ、８３３μＭ　ｄＣＴＰ、８３．３μＭ　ｄＧＴＰ、８３．３μＭ　ｄＴＴＰ、４０μＭ　ｄｉＧＴＰ、４１６．７ｎＭ　ｄｉＣＴＰ、１００μＭ　ｄｄＴＴＰ、１６．７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６６．７μＭ　ＥＤＴＡ）を、５００μｌマイクロューブに分配した。
【０１０８】
異なる終結混合物が入っているチューブ６本のそれぞれに、アニーリング混合物３．５μｌを分配した。各混合物を、３７℃で２０分間インキュベートした。停止溶液（９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）４μｌを各チューブに分配し、９５℃で３分間インキュベートした。インキュベーション後、各チューブを氷上に置いた。
【０１０９】
各混合物２μｌを、７Ｍ尿素と共にＴＢＥ緩衝液（８８．９ｍＭトリス−ホウ酸、ｐＨ８．３、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）を含有する２０％ポリアクリルアミドゲル（２０％Ｔ、５％Ｃ、ここでＴはアクリルアミド＋ビス−アクリルアミドであり、Ｃはビス−アクリルアミドである）に負荷した。電気泳動を、４５Ｗの定電力で４時間実施した。
【０１１０】
電気泳動後、ゲルを、１０％メタノールおよび１０％酢酸で１５分間固定した。固定されたゲルを紙（３ＭＭ　Ｃｈｒ，Ｗｈａｔｍａｎ，ＵＫ）に移し、ラップ用フィルム「サランラップ」（Ａｓａｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｃｏ．，日本）で覆い、真空下、８０℃で１時間、乾燥させた。
【０１１１】
乾燥ゲルを、ＢＡＳイメージ板（富士フィルム、日本）上で１時間露出し、次いでＢＡＳ２０００画像アナライザー（富士フィルム，日本）を使用して、画像を検出した。
【０１１２】
図１に報告する実験で、イソＧおよびイソＣを基質として使用するとき、基質としてのイソＧおよびイソＣの濃度がＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの濃度より低い場合、核酸の配列は容易に判読できることが分かる。そうではなく、イソＣおよびイソＧの濃度が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの濃度と同じであったとき、核酸配列は決定することができなかった。しかしイソＧおよびイソＣ（およびＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）と異なる塩基の場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ濃度と同じ、より低いまたは高い、基質濃度を使用することができる。
【０１１３】
含まれるイソＧおよびイソＣ塩基を含む配列に限定した、図１Ｂ）に示す配列（配列に、小文字の「ｇ」および「ｃ」として、また図に「ｉＧ」および「ｉＣ」として表示）は、ＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴｃｇＧＣＡＡＴｇｃＣＧ（配列番号３）である。
【０１１４】
実施例３
タンパク質結合アッセイ
Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｔｕｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，．ＵＳＡ　８９：６９８８に詳細に記載されているＳＥＬＥＸプロトコールに準拠して、以下の実験を実施した。この実験で、１本鎖ＤＮＡの場合と類似した方式で、ＳＥＬＥＸプロトコールを実施した。
【０１１５】
標的タンパク質の作製
ＲＩＫＥＮマウス全長ｃＤＮＡクローンバンク（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｒｔｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／）からの仮定上のタンパク質を標的タンパク質として選択した。選択されたクローンのｃＤＮＡ配列を配列番号４で報告する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、塩基３００〜９３５である。コードされるタンパク質（ＯＲＦに対応する）の配列を配列番号５で報告する。
【０１１６】
ＯＲＦを、プライマー５’−ＧＴＧ　ＣＣＣ　ＡＣＣ　ＴＣＣ　ＴＣＧ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＣＣ　Ｃ−３’（配列番号６）および５’−ＴＧＡ　ＡＧＴ　ＴＴＣ　ＣＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＡＣ−３’（配列番号７）を用いたＰＣＲで増幅した。増幅生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。消化したＤＮＡを、ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，６９６６２−３，ＵＳＡ）の対応する部位にライゲートした。組換えプラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地で培養した。６００ｎｍにおける光学密度が１．０に達したとき、１００ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、０．４ｍＭの最終濃度まで加えた。３時間培養した後、４℃にて、５，０００×ｇで５分間遠心分離することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を回収した。収穫した細胞を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、超音波処理し、４℃にて、１５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、ニッケル−キレートカラム（ＨｉｓＴｒａｐキット、コード番号１７−１８８０−０１Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）に充填した。吸収されたタンパク質を３００ｍＭイミダゾールで溶離した。発現されたタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥでテストした。発現され、精製されたタンパク質は５０μｇ／リットル培地であった。
【０１１７】
ランダム１本鎖ＤＮＡプールの作製
左フランキング領域５’−ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＡＧＴ−３’（配列番号８）および右フランキング領域５’−ＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ−３’（配列番号９）で挟まれた４０ヌクレオチドランダム領域（［Ｎ４０］として明示）からなる１本鎖ＤＮＡのランダム鋳型プールを、自動化ＤＮＡシンセサイザー（標準プロトコールを使用したＥＸＰＥＤＩＴＥ　８９０９）を使用して合成した。
【０１１８】
従って、１本鎖ＤＮＡのランダム鋳型プールは、このように明示される：
５’ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＡＧＴ−［Ｎ４０］−ＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ３’。
【０１１９】
ランダムプール領域［Ｎ４０］は、アセトニトリル９５％中に５％（ｗ／ｗ）という一定濃度で、全６種のホスホラミダイト（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧイソＣおよびイソＧ）と反応させることによって生じさせた。
【０１２０】
鋳型プールの［Ｎ４０］のフランキング領域に関する、明示されたヌクレオチド配列プライマー（配列番号１および配列番号１０）は、ＰＣＲのためのプライマーアニーリング部位の役割を果たした。鋳型プールの複雑度は、ほぼ１０１４分子程度であると推定された。合成後、イソＧおよびイソＣの濃度（各１００μＭ）が、その他のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、各２００μＭ）の半分の濃度に相当したこと以外は、標準ＰＣＲ条件で、対応するプライマー５’−ＡＧＣ　ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＡＣ（配列番号１）および５’−ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＡＧＴ　−３’（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより、鋳型プールを増幅した。３’プライマーを加えずに、上で得られたＤＮＡを第２のＰＣＲに使用して、１本鎖ＤＮＡを作成した。残りの３’プライマーを失活させ、また５’プライマーの伸長によって生じるランダム１本鎖ＤＮＡを生じさせるＤＮＡ合成分画を最大にするために、３’プライマーの補体である配列５’−ＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ−３’（配列番号１１）を有する１μＭオリゴヌクレオチドを加えた。
【０１２１】
結合アッセイ
上で作製された１本鎖ＤＮＡプール（２００ｐＭ）を、０．０１％ヒト血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ａ１６５３）および１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ結合緩衝液（１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ　ＫＨ２Ｐ０４、１３０ｍＭ　ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中、（上記標的タンパク質の作製で得られた）タンパク質と共にインキュベートした。タンパク質およびランダム１本鎖ＤＮＡプールの混合物を、４℃で一晩インキュベートし、次いで、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、得られたタンパク質−ＤＮＡ複合体を、Ｊｅｌｌｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１０４５０−１０４５６に記載のニトロセルロースフィルター分配方法により、未結合のＤＮＡおよびタンパク質種から分離した。ニトロセルロースフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、孔サイズ０．４５μｍ、タイプＨＡ）をＰＢＳ緩衝液５ｍｌで洗浄してから、選択に使用した。このタンパク質およびランダム１本鎖ＤＮＡプールの混合物を、軽い真空下、４５μｌアリコートでフィルターに加え、ＰＢＳ　５ｍｌで洗浄した。次いで、タンパク質に結合した、選択された１本鎖ＤＮＡをフィルターから抽出し、タンパク質から分離し（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４に準拠）、上述のＰＣＲ法で再度増幅した。このサイクルを２０ラウンド反復した。鋳型１として表示の、選択された１本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドアプタマー配列を含む。実施例２に記載の方法に従って、これを配列決定した。鋳型１の配列は、５’　ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＡＧＴ　ＧＣＧ　ＴＡＡ　ＣｇＧ　ＧＧＴ　ｃＴＡ　ＴＧＴ　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＡＣＡ　ＣｃＧ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＡＡＣ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ　３’（配列番号１２）である。アプタマータンパク質の配列は、５’−ＧＣＧ　ＴＡＡ　ＣｇＧ　ＧＧＴ　ｃＴＡ　ＴＧＴ　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＡＣＡ　ＣｃＧ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＡＡＣ　Ｔ−３’（配列番号１３）である。
【０１２２】
実施例４
アプタマーチップ分析
アプタマー作製
実施例３で選択して配列決定したアプタマー（配列番号１３）を含む鋳型１（配列番号１２）を、１００μＭであったイソＧおよびイソＣの濃度以外は標準条件で（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、２００μＭ）、配列番号１０を有するプライマー、およびＰｌ−ＳｃｅＩの認識部位、５０ｂｐ　５’−ＧＣＡ　ＣＣＣ　ＧＡＣ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＣＧＣ　ＴＣ−３’のスペーサー（配列番号１５）、および１本鎖ＤＮＡ　５’−Ａ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＡＣＡ　Ｃ−３’（配列番号１６）へのアニーリング部位を含むプライマー５’−ＴＧＣ　ＣＡＴ　ＴＴＣ　ＡＴＴ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＴＣＣ　ＧＣＡ　ＣＣＣ　ＧＡＣ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＣＧＣ　ＴＣＡ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＡＣＡ　Ｃ−３’（配列番号１４）を用いた標準ＰＣＲ方法で増幅した。
【０１２３】
スペーサー配列の目的は、アプタマー配列をチップ基質に結合させることである。
【０１２４】
ＰＣＲ後、得られたアプタマー（この二本鎖ＤＮＡは明示された鋳型２である）を含む二本鎖ＤＮＡを、Ｐｌ−ＳｃｅＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、オーバーハンギング３’末端を生じさせた。
【０１２５】
アプタマーチップの作製
以下の通りに、合成した鋳型２（二本鎖ＤＮＡ）の３’末端にアミノ基を導入した。
【０１２６】
１μｇの上記鋳型２を、０．５Ｍ　２’，３’−デオキシ−５−（３−アミノプロピニル）ＵＴＰを含有するＴｄＴ緩衝液５０μｌ中の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）（ＴＯＹＯＢＯ、日本）５０単位と共に、３７℃で１時間インキュベートし、反応混合物１倍量に対して、１／１０倍量の３Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮａおよび２．５倍量のＥｔＯＨを使用して、エタノール（ＥｔＯＨ）沈澱により、ＤＮＡを回収した。
【０１２７】
アプタマーチップの基質を、スライドガラス（Ｓ１２Ｅ　３×１インチ、０．９３〜１．０５ｍｍ）から作製した。このスライドを室温で１時間、１００％トリフルオロアセテートに浸漬し、乾燥させた。次いで、このスライドを、室温で２４時間、２％（ｖ／ｖ）アミノプロピルトリエトキシシランおよび５０％（ｖ／ｖ）アセトンに再度浸漬し、５０％（ｖ／ｖ）アセトンで３回および１００％アセトニトリルで１回洗浄し、次いで乾燥させた。
【０１２８】
３’末端にアミノ基を有する０．５μｇの鋳型２（二本鎖ＤＮＡ）および最終濃度５％の無水コハク酸を１０μｌの体積で反応させ、カルボキシ基をＤＮＡの３’末端に導入した。この溶液を混合し、直ちにスライドガラスへのライゲーションに使用した。
【０１２９】
以下の通りに、カルボキシル化３’末端を有する鋳型２を、アミノ化スライドガラス上に固定した。カルボキシル化３’末端を有する鋳型２を、最終濃度５％のカルボジイミドと混合し、マイクロピペットによりこの混合物０．４μｌをアミノ化スライドガラス上にドットし、次いで、このスライドガラスを５０℃で６時間インキュベートし、１０ｍＭトリス−Ｃｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳ、および０．１Ｍ　ＮａＯＨの溶液で洗浄し、続いて、ｏｆ１０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、および１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液で洗浄した。このようにして、１本鎖ＤＮＡが上に固定されたスライドガラスを得た。これは、プライマー配列、アプタマーおよびペーサーを含む１本鎖ＤＮＡからなる。このＤＮＡを、スペーサー配列によってチップ基質上に固定する。
【０１３０】
ヒト血清中の標的タンパク質の検出
１本鎖ＤＮＡが上に固定されたスライドガラス（３×１インチ、０．９３〜１．０５ｍｍ）（上で作製されたアプタマーガラス）を、３％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有するＰＢＳ中で３７℃にて１０分間インキュベートすることにより前処理し、ＰＢＳ溶液中で維持した。ヒト血清（ＳＩＧＭＡ、製品番号Ｓ７０２３）を、ＰＢＳで（０．１ｍｇタンパク質／ｍｌに）希釈し、１２５Ｉ−ＩＯＤＧＥＮ（Ｐｉｅｒｃｅ）で７０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質の比活性に標識した。ゼラチンを含有するＰＢＳで予備テストしたアプタマーガラス上に、１２５Ｉ標識血清タンパク質の溶液０．５ｍｌを置き、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、アプタマーガラスを、３％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有する新鮮なＰＢＳで室温にて１０回、穏やかに洗浄した。従来のオートラジオグラフィ法で、アプタマーガラス上の放射能を検出した。
【０１３１】
図２は、この実施例４に開示のアプタマーチップを使用した、ヒト血清中のリガンドタンパク質の検出を示す図である。Ａ）は、アプタマーチップガラスである。配列番号４で開示の塩基配列を有するリガンドタンパク質に特異的なアプタマーおよび陰性対照アプタマー５’−ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　ＡＧＴ　ＴＴＣ　ＣｇＧ　ＡＧＴ　ＣＡＣ　ｇＧＣ　ＴＧＣ　ＧＧＧ　ｃＣＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ−３’（配列番号１７）を、それぞれ位置１および２に固定した。Ｂ）は、１２５Ｉ−標識ヒトタンパク質処理後の、アプタマーチップガラスＡに関するオートラジオグラムを示す。
【０１３２】
実施例５
６つの蛍光色素を使用したオリゴヌクレオチドの配列決定
配列決定用に、蛍光色素で標識した６つのプライマーを作製した。４つの蛍光色素プライマーは市販の製品であった（４色素一組として販売）、ＢＯＤＩＰＹ　ｄｙｅ　Ｍ１３フォワードプライマー（カタログ番号：５０１６−ＦＰＷ，ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ　Ｉｎｃ．，ＵＳ；Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ａ．：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｔ　Ｄｙｅｓ　ｆｏｒ　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，１４２０−１４２２，１９９６）。その他の２つの蛍光色素Ｍ１３フォワードプライマーは、Ｇｅｎｓｅｔから得た：１つはＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０（吸収最大：６２５ｎｍ、発光最大：６４０ｎｍ）であり、もう１つはＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ（吸収最大：５８９ｎｍ、発光最大６１７ｎｍ）であった。これらの２つの蛍光色素Ｍ１３プライマーは、配列５’−ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＴ−３’（配列番号１８）（Ｇｅｎｓｅｔ製造）を有するＭ１３フォワードプライマーの５’末端に付着したＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０またはＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ．製造）を含んでいた。色素プライマー配列決定反応用に、マイクロチューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ　Ｒｅａｃｔｉｏｎチューブ、カタログ番号Ｎ８０１−０５３３，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）６本を作製した。各チューブ内で、各蛍光色素プライマー０．１２５ｐｍｏｌ、標準プロトコールに準拠したＥＸＰＥＤＩＴＥ　８９０９自動式シンセサイザーを使用して合成された、オリゴヌクレオチド鋳型５’ＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧｇＴｃＴＣＧＣＣＴＴＧｇＴｃＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＡＣ−３’（配列番号１９）［「ｇ」は、ｄｉＧＴＰ、（デオキシイソＧＴＰ）を示し、「ｃ」は、ｄｉＣＴＰ（デオキシイソＣＴＰ）を示す］４０ｆｍｏｌを含む混合物２μｌおよび水を、反応混合物（１Ｕ　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＤＮＡポリメラーゼ；１５０μＵ　Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ無機ピロホスファターゼ；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭ　ジチオトレイトール、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、５０％グリセロール、６５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）２μｌおよび各終結混合物４μｌと混合して、最終混合物８μｌを生じた。終結混合物の内容は以下の通りであった：
ｄ／ｄｄＡ混合物：３０μＭ　ｄＡＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ
ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＴＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＧＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄＡＴＰ；
ｄ／ｄｄＣ混合物：１５０μＭ　ｄＡＴＰ、３０μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ
ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＴＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＧＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄＣＴＰ；
ｄ／ｄｄＧ混合物：１５０μＭ　ｄＡＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、３０μＭ
ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＴＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＧＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄＧＴＰ；
ｄ／ｄｄＴ混合物：１５０μＭ　ｄＡＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ　ｄＧＴＰ、３０μＭ　ｄＴＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＧＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄＴＴＰ；
ｄ／ｄｄｉＧ混合物：１５０μＭ　ｄＡＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ　ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＴＴＰ、３０μＭ　ｄｉＧＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄイソＧＴＰ；
ｄ／ｄｄｉＣ混合物：１５０μＭ　ｄＡＴＰ、１５０μＭ　ｄＣＴＰ、１５０μＭ　ｄＧＴＰ、１５０μＭ　ｄＴＴＰ、１５０μＭ　ｄｉＧＴＰ、３０μＭ　ｄｉＣＴＰ、１５０μＭ　ｄｄイソＣＴＰ；
【０１３３】
Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｌｔｄ．）に関する標準プロトコールに準拠した、温度サイクラー（４つの独立した温度サイクリングブロックを有する温度サイクラーであり、ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．ＵＳの商品名である、ＤＮＡ　Ｅｎｇｉｎｅ　Ｔｅｔｒａｄ温度サイクラー）を使用して、各チューブの最終混合物を反応させた。ＤＮＡ　Ｅｎｇｉｎｅ　Ｔｅｔｒａｄ　ｆｏｒＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅのサイクル配列決定プログラムの使用に関する説明は、「ポストゲノム時代における大規模ゲノム分析技術および遺伝子機能分析（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｔ−ｇｅｎｏｍｅ　ｅｒａ　）」，Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｎａｋａｙａｍａ−ｓｈｏｔｅｎ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．２００１、日本、に開示されている。反応したサンプルを、０．５ｍｌチューブ（フラットキャップ付ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−ＷａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎチューブ、カタログ番号Ｎ８０１−０７３７，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移し、次いで、以下の手順に従って、ＥｔＯＨで沈澱させた。９９％　ＥｔＯＨ　１６μｌおよび０．３Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ溶液０．８μｌを各チューブに加え、このチューブを、４℃にて１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を除去した後、７０％ＥｔＯＨ２００μｌを各チューブに加え、このチューブを、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去した後、水およびＥｔＯＨを蒸発させるために、チューブを室温で５５分間逆さまにしておいた。このサンプルを、チューブ当たり４μｌの水に溶解し、混合した。６５℃で乾燥させた後、各サンプルを、２μＭ　ＥＤＴＡ溶液４μｌに溶解し、９６ウェルプレート（カタログ番号２１９７１，Ｓｏｒｅｎｓｏｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）に移し、９５℃で５分間インキュベートし、氷上に置いた。
【０１３４】
製造業者の手順に従って、ＳＣＥ　９６１０Ｇｅｎｅｔｉｃ分析システム（ＳｐｅｃｔｒａＭｅｄｉｘ　Ｃｏ．ＵＳ）を使用して、反応生成物の電気泳動および蛍光検出を実施した。フーリエ変換およびローパス濾過関数を使用して平滑化した後、全てのデータについて、バックグラウンド減算を実施した。各ピーク間隔ごとに、局所最小点（その値が、その間隔の中で最小値であった）を選択し、これらの点を結ぶ線を生データのバックグラウンドシグナルと推定した。６×６マトリックスを使用して、６データセットを線形に変換した。このマトリックスは、１つの色素の電気泳動で得た６データを、各色素ごとに、１つの主要データおよび５つの副次的データに変換するために行った。得られた各ピークを、対応塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、イソＧ、またはイソＣ）としてベースコールした（これらの技術は、Ｇｉｄｄｉｎｇｓ　ＭＣ，Ｂｒｕｍｌｅｙ　ＲＬ　Ｊｒ，Ｈａｋｅｒ　Ｍ，Ｓｍｉｔｈ　ＬＭ．，”Ａｎ　ａｄａｐｔｉｖｅ　ｏｂｊｅｃｔ　ｏｒｉｅｎｔｅｄ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｂａｓｅ　ｃａｌｌｉｎｇ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９３年９月２５日；２１（１９）：４５３０−４０；Ｂｅｒｎｏ　ＡＪ．，”Ａ　ｇｒａｐｈ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄａｔａ”Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．１９９６年２月，６（２）：８０−９１）。解析データの電気泳動図（６−チャネルクロマトグラムである）を図４および５に示す（報告される配列は、含まれるイソＧおよびイソＣ塩基を含む部分に限定される）（小文字の「ｇ」および「ｃ」として配列に、また「ｉＧ」および「ｉＣ」として図に表示）。この配列は、ＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡｇＡｃＣＡＡＧＧＣＧＡｇＡｃＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧ（配列番号２０）であった。
【０１３５】
本明細書の全体にわたり、科学文献および特許文献の様々な論文が引用されている。このような各論文を、参照することにより、またそのような引用によりいかなる目的のためにも本明細書に悉く援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例２のジデオキシ法（サンガー法）によるＤＮＡ配列決定のオートラジオグラムを示す図である。カラムＡ）は、基質として使用された非標準Ｗ−Ｃ塩基（イソＧおよびイソＣ）の濃度が、標準塩基（８３．３Ｍ）と同じであった、標準条件で実行された配列決定反応を示す。Ｂ）では、イソＧおよびイソＣ基質の濃度が４０Ｍに低下していたこと以外は、配列決定反応は、Ａ）と同じであった。図１のｉＣおよびｉＧは、それぞれイソＣおよびイソＧを示す。下の大文字は、配列決定反応に含まれる、その対応するジデオキシヌクレオチドを示す。イソＧおよびイソＣを使用し、イソＧおよびイソＣの濃度が、標準Ｗ−Ｃ塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔより低いとき（Ｂ）、配列決定を精確に実施できることが図１からわかる。
【図２】
実施例４に開示のアプタマーチップを使用した、ヒト血清中のリガンドタンパク質の検出に関する図である。Ａ）は、アプタマーチップガラスである。配列番号４で開示の塩基配列を有するリガンドタンパク質に特異的な特異的アプタマーおよび陰性対照アプタマー（配列番号１５）は、それぞれ、位置１および２で固定されている。Ｂ）は、１２５Ｉ−標識ヒトタンパク質処理後の、アプタマーチップガラスＡのオートラジオグラムを示す図である。
【図３】
標準Ｗ−Ｃ塩基と異なる複素環式塩基（「非標準塩基」）の代表的な構造式を示す図である。Ｒは、リボース環またはデオキシリボース環の１位への塩基の付着点を示し、Ｘは、置換基Ｚを担持する窒素原子または炭素原子のいずれかである。Ｚは、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アリール基、インドール基若しくはイミダゾリル基を担持する低級アルキル鎖、水素、または非官能化低級アルキル鎖であり、Ｙは、ＮまたはＣＨのいずれかであり、各環は、連続的に結合した３つ以下の窒素を含む（Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．米国特許第５，４３２，２７２による）。
【図４】
実施例５における配列決定反応の個々の電気泳動図からのデータを示す図である。
【図５】
配列番号２０の配列を得るために、図４のデータを組み合わせることによって得た合成電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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