(57)【要約】本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成による、たとえば活性汚泥サンプル中の糸状細菌を特異的、迅速に検出するための方法に関する。本発明は、前記方法において使用するのに適したオリゴヌクレオチド・プローブ、さらに前記検出法を行うことを可能にするキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下のヌクレオチド配列（それぞれの場合５’から３’方向の１つを有するオリゴヌクレオチド
2004533252.tif 000006
2004533252.tif 000007
（ｉｉ）（ｉ）からのオリゴヌクレオチドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％同一であり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失および／または付加によって（ｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと異なり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと厳密な条件下でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
サンプル中の繊維状細菌を検出するための方法であって、
ａ）サンプル中に含まれる繊維状細菌を固定する工程、
ｂ）固定した細菌を、
（ｉ）以下のヌクレオチド配列（それぞれの場合５’から３’方向）の１つを有するオリゴヌクレオチド
2004533252.tif 000008
2004533252.tif 000009
（ｉｉ）（ｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％同一であり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失および／または付加によって（ｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと異なり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと厳密な条件下でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートして、ハイブリッド形成を行う工程、
ｃ）ハイブリッド形成しなかったオリゴヌクレオチドを除去する工程、
ｄ）ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを用いて、繊維状細菌の細胞を検出および視覚化、および場合によっては定量化する工程
からなる方法。
【請求項３】
ａ）蛍光マーカー、
ｂ）化学発光マーカー、
ｃ）放射性マーカー、
ｄ）酵素活性基、
ｅ）ハプテン、
ｆ）ハイブリッド形成によって検出可能な核酸
からなる群から選択される検出可能なマーカーに、前記オリゴヌクレオチドを作動可能に連結させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが活性汚泥サンプルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
エピ蛍光顕微鏡法またはフロー・サイトメトリーによって検出を行う、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下の名称の細菌：
０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ、０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩ、０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ、０２１Ｎ  ｌｉｋｅ  ｆｒｏｍ  ＢＩＯ３３  ＥＵ２１、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＥＵ２４  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ（ｅｕｒｏｐａｅａ、ＰＰｘ３、ＭＣ２）、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ  ＭＣ２  ＭＡＣＯＢＳ−ｃｌｏｎｅ２（ＢＩＯ３６）、Ｂａｃｔｏｔｈｒｉｘ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ（ＥＵ３、ＥＵ４、ＥＵ８、ＥＵ９、ＥＵ１１）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｕｒｔｕｎｅｍａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（Ｔｙｐｅ００４１）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ（ＥＵ２１）、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ、ＥＵ２３  ｆｒｏｍ  ＳＡＮ３、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｓｉｄｅｒｅｕｓ  ＥＵ２６  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ／０２１Ｎ−ｌｉｋｅ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｔｅｎａｃｉｓ（ＥＵ１２、ＥＵ５、ＥＵ６、ＥＵ１５、ＥＵ１３、ＥＵ１４）、（ＥＵ１、ＥＵ２、ＥＵ１０）、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ（ＥＵ２４）、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ｎｅｘｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ０２１Ｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＥＵ１、ＥＵ２、ＥＵ１０）、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｒａｍｏｓａ、ｔｙｐｅ０４１１（ＣＦ）、ｔｙｐｅ０８０３、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、
に繊維状細菌が属する、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の繊維状細菌を検出するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項８】
（ｉ）以下のヌクレオチド配列（それぞれの場合５’から３’方向）の１つを有するオリゴヌクレオチド
2004533252.tif 000010
2004533252.tif 000011
（ｉｉ）（ｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％同一であり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失および／または付加によって（ｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと異なり、繊維状細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリッド形成を可能にするオリゴヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）からのオリゴヌクレオチドの１つと厳密な条件下でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２から６のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
【請求項９】
ハイブリッド形成用溶液中に少なくとも１つの該オリゴヌクレオチドを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
洗浄溶液、および場合によっては１つまたは複数の固定溶液、および場合によっては細胞破壊溶液または酵素溶液をさらに含む、請求項８または請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成による、たとえば活性汚泥サンプル中の糸状、いわゆる繊維状細菌を特異的、迅速に検出するための方法に関する。本発明は、前記方法において使用するのに適したオリゴヌクレオチド・プローブ、前記検出法を行うことを可能にするキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
今世紀始め（１９１３）に生物学的廃水処理が導入された後、それが発展して、環境保護の分野の重要な技術となってきている。より良い水保護、および廃水処理プラントから排出される水に関する法的制限の強化に関する、絶えず増大している要求を活気付かせる際に、この方法の有効性が、より一層要求されている。１９８８年の初夏に北海およびバルト海において多量の藻類が増殖したために、ドイツの法律制定者は、１９９０年１月１日の既存の国家的な排水規制の枠内で、ＮおよびＰ含有化合物を減少させるための改善された精製対策を現在求めている。
【０００３】
排水精製中の活性汚泥法の有効性（の存在または不在）は、廃水処理プラントにおける活性汚泥の活発な細菌集団の組成と密接に関連している。１例だけ挙げると、繊維状細菌は２次沈殿槽中でのバイオマスの沈殿性、したがって汚水処理プラントの機能性に直接、決定的な影響を与えるものである。さまざまな繊維状細菌の存在、および特に過剰な増殖によって、活性汚泥の凝集が表面に広がり、汚泥のバルキングおよび浮遊かすが最終的にもたらされる。結果として、精製水をそれ以上、活性汚泥の細菌と物理的に分けることは可能ではない。このことが排水路、したがって近隣の汚水精製プラントの水の細菌汚染をもたらす。繊維状細菌に  よって引き起こされる作用による他の妨害は、過剰な気泡分画の形成である。これらの気泡分画は風によって容易に行われ、したがって細菌による環境の汚染にも貢献する。
【０００４】
バルキング汚泥および浮遊かす、ならびに上述の気泡形成は、すべての汚水処理プラントのほぼ半数において重大な頻発する問題であり（非特許文献１）、これらは方法およびプロセスに関する適切なパラメータを選択することによって、予防または阻止すべきである。精製プロセスを有効に制御するための前提条件は、活性汚泥の細菌集団に関する可能な限り多くの知識を習得することである。特に、適切な技法を使用して、これらの問題を引き起こす繊維状細菌を確実に同定することが可能であることは重要である。
【０００５】
排水精製プロセスの実際の主役としての細菌について、我々の知識はこれまでは非常に限られている。したがって「排水精製のブラッック・ボックス」という語が、この脈絡において頻繁に聞かれる。この分野の知識の不充分さの主な理由は、過去において活性汚泥の細菌集団の分析が、古典的な培養法によって主に行われていたことである。最適化した培養基および培養法にもかかわらず、サンプル中に存在する１〜１５％の細菌のみを、個体培養物として得ることが可能であり（非特許文献２）、一方このタイプの検出法を使用することによって、排水中に存在する９９％までの細菌は依然として同定されていない。長期にわたって、非培養菌体を検出するために、グラムまたはナイセリアの染色などの、単純な方法のみが利用可能であった。それらの形態および染色挙動のために、活性汚泥の細菌の特徴付けは、誤った解釈を繰り返しもたらした。これは、たとえば繊維状細菌中の多数の種が、非常にさまざまな形態を有し（非特許文献３）、グラムおよびナイセリアの染色中にさまざまな挙動も示す（非特許文献４）、という事実によるものである。したがって、これらの細菌の誤りのない同定はほとんど不可能である。
【０００６】
繊維状細菌の検出において、伝統的な方法から生じる難点の理論上の結果として、分子生物学に基づく代替的な検出法が、したがって念頭に浮かぶ。
ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応では、特定の細菌ゲノムの特徴的な断片を、特異的なプライマーを用いて増幅させる。プライマーがその標的部位を発見する場合、ゲノム情報の断片の数百万の増幅物が生成される。後の分析において、たとえばアガロース・ゲルを使用してＤＮＡ断片を分離することによって、定性的評価を行うことが可能である。最も単純な場合は、これによって、使用したプライマーの標的部位が、分析したサンプル中に存在したという情報がもたらされる。他の結論は考えられない。なぜなら、標的部位は生きている細菌、死んだ細菌または裸のＤＮＡに由来する可能性があるからである。ここでは分化は考えられない。他方で、活性汚泥中に存在するさまざまな物質が、ＤＮＡ増幅酵素、Ｔａｑポリメラーゼの阻害を引き起こす可能性がある。これは、偽陰性の結果の頻繁な原因である。ＰＣＲ技法のさらなる発展形は定量ＰＣＲであり、このＰＣＲでは、存在する細菌の量と増幅によって得られるＤＮＡの量の間の、相関関係を生み出すことを試みる。このＰＣＲの利点は、その高い特異性、増幅の容易さ、および時間の支出が少ないことである。重大な欠点は、汚染に対するその高い感受性、およびそれに伴う偽陽性の結果、および生きた細胞と死んだ細胞または裸のＤＮＡをそれぞれ区別する前述の能力の欠如、および最後に、阻害物質の存在による偽陰性の結果の危険性である。
【０００７】
しかしながら、生化学的パラメータも、細菌を同定するために使用される。キノン分析に基づいて細菌のプロファイルを作製することは、できるだけ少ない先入観で細菌集団を表すために役立つ（非特許文献５）。しかしながら、この方法は、個々の細菌の培養にも依存する。なぜなら、個体培養した細菌のキノンのプロファイルが、基準データベースを作製するために必要とされるからである。さらに、細菌のキノンのプロファイルを決定することによって、サンプル中に実際存在する集団の分布の、実際の印象を与えることは可能ではない。
【０００８】
これとは対照的に、抗体による細菌の検出は、より直接的な方法である（非特許文献６）。蛍光標識した抗体をサンプルと混合させ、細菌抗原との非常に特異的な結合を可能にする。エピ蛍光顕微鏡では、したがってそれらが発する蛍光によって、細菌を検出する。このようにして、菌株レベルまで細菌を同定することが可能である。
【０００９】
しかしながら、３つの重大な欠点によって、この方法の適用は制限される。第１に、個体培養は抗体の生成を必要とする。第２に、抗体−蛍光分子の複合体は体積が大きいことが多く、効率の悪いことに、標的細胞を透過する際に問題を引き起こす。第３に、検出は特異的すぎることが多い。抗体を生成させるためには費用がかかり、１つの特定の細菌菌株のみを検出することが多いが、同じ細菌種の他の菌株を検出することは可能ではない。しかしながら、細菌の菌株特異的な検出は必要ではないことが多く、細菌種または細菌群全体の検出が必要とされる。第４に、抗体の生成は、比較的冗長で高価な手順である。
【００１０】
それぞれの方法に関する欠点を取り込まずに、ＰＣＲなどの分子生物学的方法の特異性と、抗体法によって示されるような細菌を視覚化する可能性を組み合わせるための独特の手法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成の方法である（ＦＩＳＨ）、（非特許文献７）。これによって、細菌種、属または群を視覚化し、非常に具体的に同定することが可能であり、必要な場合は、正確な定量化を行うことも可能である。
【００１１】
ＦＩＳＨ技法は、その生命維持に必要な機能のために、進化の過程で非常にわずかな程度で変異した細菌細胞中に、いくつかの分子が存在するという事実に基づくものである。これらは、１６Ｓおよび２３Ｓリボソーム・リボ核酸（ｒＲＮＡ）である。両方共にリボソームの成分、タンパク質生合成の部位であり、その偏在的な分布、その大きさ、およびその構造および機能的不変性のために、特異的なマーカーとして働くことが可能である（非特許文献８）。
【００１２】
比較配列分析に基づくと、系統発生的な関係は、これらのデータからのみ導くことが可能である。このため、これらの配列データは調整しなければならない。これらのマクロ分子の２次および３次構造についての知識に基づく調整では、リボソーム核酸の相同的な位置を関連付ける。
【００１３】
これらのデータに基づいて、系統発生的な計算を行うことが可能である。現況技術のコンピュータ技術を使用することによって、それらが大規模である場合でも、迅速かつ有効な計算が可能であり、および１６ＳｒＲＮＡおよび２３ＳｒＲＮＡの調整した配列を含む、巨大なデータベースの確立が可能である。これらのデータの物質を迅速に入手することによって、新たに得られた配列を、短時間で系統発生的に分析することが可能である。これらのｒＲＮＡのデータベースを使用して、特異的な遺伝子プロ―ブを構築することが可能である。これによって、利用可能なｒＲＮＡ配列すべてが比較され、細菌種、属または群を特異的に検出する、いくつかの配列部分用のプロ―ブが設計される。
【００１４】
ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成）では、リボソーム標的配列上のある領域と相補的なこれらの遺伝子プローブを、細胞中に導入する。通常、遺伝子プローブは小さく、１６〜２０塩基の長さ、一本鎖のデスオキシリボ核酸断片であり、細菌種または細菌群に典型的な標的領域を対象とする。蛍光標識された遺伝子プローブが細菌細胞中でその標的配列を発見する場合、プローブはその標的配列に結合し、その蛍光性によって蛍光顕微鏡で細胞を検出することが可能である。
【００１５】
前に既に示したように、培養依存性の方法によって、微生物の生物集団の組成および動態に関する、非常に偏った見識のみが与えられる。ＦＩＳＨ技法を使用することによって、たとえば活性汚泥の叢を検出する際に、培養によって培養物の変化がもたらされることを、実証することが可能であると思われる（非特許文献９）。
【００１６】
実際の細菌集団構造の、この培地依存性の偏見付けによって、活性汚泥中では従属的な役割を果たしているが、使用する培養条件には充分適合している細菌の重要性が、著しく過大評価される。したがって、このような培養人工産物によって、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌が、排水処理における生物学的なリン酸除去剤としてのその役割に関して、完全に誤って評価されてきたことを実証することが可能であると思われる。このような誤った評価の結果として、コスト集約的な、欠点のある、すなわち不適切なプラントが設計される。このような模擬的計算の有効性および再現性は、わずかである。
【００１７】
培養を使用する細菌の同定と比較して、ＦＩＳＨ技法の利点は多数ある。第１に、遺伝子プローブを使用して、より多くの細胞を検出することが可能である。培養によっては、サンプルの細菌集団の最大わずか１５％を視覚化することが可能であるが、ＦＩＳＨによって、多くのサンプル中の細菌集団全体の１００％までを検出することが可能である。
【００１８】
第２に、集団の活性部分は、細菌すべてを対象とするプローブと非特異的な細胞の染色の間の比によって決定することが可能である。第３に細菌は、それらが働く場所（ｉｎ  ｓｉｔｕ）において、直接視覚化される。したがって、さまざまな細菌集団の間の考えられる相互作用を、認識し分析することが可能である。第４に、ＦＩＳＨ技法を使用する細菌の検出は、培養を使用することよりもはるかに速い。培養を使用した細菌の同定は数日を必要とすることが多いが、細菌を同定するためにサンプルを採取する時間は、種のレベルでも、ＦＩＳＨ技法を使用すると、わずか数時間しかかからない。第５に、遺伝子プローブを、それらの特異性に関してほとんど制限することなく、選択することが可能である。１つのプローブを用いて、個々の種、および属または細菌群全体を検出することが可能である。第６に、細菌種または細菌群全体を、サンプル中において直接正確に定量化することが可能である。培養、および関連する不充分な定量化は必要ではない。
【００１９】
ＦＩＳＨ技術は、従来の染色法（グラムまたはナイサー染色）よりも優れている。特に、これらの従来の技法による、産業汚水処理プラントから採取した繊維状細菌を特徴付けするための試みは、失敗であるとみなさなければならない。多くの細菌は、それらの形態および染色挙動のために、最初は種Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  ｔｙｐｅ  ＩＩに割り当てられた。この場合それは、それらのＤＮＡ中に充分なＧ＋Ｃ含量を有するグラム陽性菌に関する（非特許文献１０）。
【００２０】
したがって、ＦＩＳＨ技法を使用するこれらの繊維状細菌の分析によって、これらの細菌の大部分は、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  ｔｙｐｅ  ＩＩとして指定された繊維状細菌と、共通の性質を有していないことが分かった。多くの場合、最初はＮｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａとして誤って分類された、産業汚水処理プラントからの前記繊維状細菌は、プロテオバクテリアのα亜綱に属した。
【００２１】
したがってＦＩＳＨ技法は、サンプル中において直接、細菌を迅速かつ非常に特異的に検出するための、優れた道具である。培養法とは対照的に、ＦＩＳＨ技法は直接的な手順であり、他の現代の方法とは対照的に、細菌を視覚化するだけでなく、さらにそれらを正確に定量化することを可能にする。
【００２２】
原則として、ＦＩＳＨによる分析はスライド上で行う。なぜなら、高エネルギーの光を用いた照射による評価中に、細菌が可視状態、すなわち目に見える状態になるからである。
【非特許文献１】
Ｂｌａｃｋｂｅａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｏａｍｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ，Ｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｌｕｔ．Ｃｏｎｔｒ．（１９８６）８５：９０−１００
【非特許文献２】
Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅ：ｉｎａｄｅｑｕａｃｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）５９：１５２０−１５２５
【非特許文献３】
ｖａｎ  Ｖｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ、ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（１９７３）３９：１８９−２０５；Ｍｕｄｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｉｎｅｍａ，１９９２，Ｔｈｅ  Ｓｈｅａｔｈｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献４】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｂｕｉｊｓｅｎ，１９９２、Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｓｃｈｅ  Ｓｃｈｌａｍｍｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇ、Ｈｉｒｔｈａｍｍｅｒ，Ｍｕｎｃｈｅｎ
【非特許文献５】
Ｈｉｒａｉｓｈｉ、Ａ．，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）３４：３９−５６
【非特許文献６】
Ｂｒｉｇｍｏｎ、Ｒ．Ｌ．，Ｇ．Ｂｉｔｔｏｎ、Ｓ．Ｇ．Ｚａｍ、ａｎｄ  Ｂ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）６１：１３−２０
【非特許文献７】
Ａｍａｎｎ、Ｒ．Ｉ．Ｗ．Ｌｕｄｗｉｇ、ａｎｄ  Ｋ．−Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９５）５９：１４３−１６９
【非特許文献８】
Ｗｏｅｓｅ、Ｃ．Ｒ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８７）５１：２２１−２７１
【非特許文献９】
Ｗａｇｎｅｒ、Ｍ．，Ｒ．Ａｍａｎｎ、Ｈ．Ｌｅｍｍｅｒ、ａｎｄＫ．Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ：ｉｎａｄｅｑｕａｃｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）５９：１５２０−１５２５
【非特許文献１０】
Ｂｌａｃｋａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，‘Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ’，ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌｕｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）５０：７０３−７０９
【非特許文献１１】
Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ
【特許文献１】
ドイツ特許出願ＤＥ１９９３６８７５．９
【特許文献２】
国際出願ＷＯ／９９／１８２３４
【特許文献３】
ドイツ特許出願１００６１６５５．０
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
たとえば活性汚泥サンプル中の繊維状細菌を、特異的かつ迅速に検出するための、本発明の方法の作業は、以下の工程を含む：
サンプル中に含まれる細菌を固定する工程、
固定した細菌を核酸プローブ分子と共にインキュベートして、ハイブリッド形成を行う工程、
ハイブリッド形成しなかった核酸プローブ分子を除去または洗浄する工程、および
核酸プローブ分子とハイブリッド形成した細菌を検出する工程。
【００２４】
本発明の範囲内では、細菌の「固定」は、核酸プローブ用に細菌の細胞のエンベロープを透過性にする処理を意味する。通常はエタノールが固定用に使用される。これらの対策を使用して細胞壁が核酸プローブによって透過されない場合、同じ結果をもたらす充分な他の対策を、当業者は知っている。これらはたとえば、メタノール、アルコールの混合物、わずかなパーセンテージのパラホルムアルデヒドの溶液、または希釈されたホルムアルデヒド溶液、または類似のものを含む。細菌の完全な分解を引き起こすために、酵素による工程を続けることが可能である。この工程のために使用することが可能な酵素は、たとえばリソチーム、プロテイナーゼＫ、およびミュータノリシンである。充分な他の技法を当業者は知っており、どの細菌が関連するかに応じて、細菌を分解するのにどの試薬が特に有用であるかを容易に見出すであろう。
【００２５】
本発明の範囲内では、蛍光標識した核酸プローブを使用して、固定した細菌を「ハイブリッド形成」用にインキュベートする。オリゴヌクレオチドおよびそれに連結したマーカーからなる、これらの核酸プローブは、したがって細胞のエンベロープを透過して、細胞内の核酸プローブに対応する標的配列に結合することが可能である。この結合は、相補的な核酸領域の間の、水素結合の形成として理解すべきである。
【００２６】
核酸プローブはここでは、検出する微生物の染色体またはエピソームＤＮＡだけでなく、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡとも相補的であってよい。同定する微生物中に２つ以上のコピーで存在する領域と相補的である、核酸プローブを選択することが有利である。検出する配列は、細胞１個当たり５００〜１００，０００個のコピーで存在することが好ましく、１，０００〜５０，０００個のコピーで存在することが特に好ましい。この理由によって、標的部位としてｒＲＮＡを使用することが好ましい。なぜなら、それぞれの活性細胞中に、リボソームはタンパク質生合成の部位として、数千のコピーで存在するからである。
【００２７】
本発明の意味での核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブであってよく、１２〜１０００個のヌクレオチド、好ましくは１２個と５００個の間、より好ましくは１２個と２００個の間、特に好ましくは１２個と５０個の間、１２個と４０個の間、および最も好ましくは１７個と２５個の間のヌクレオチドを通常は含むであろう。核酸プローブの選択は、検出する微生物中に相補配列が存在するかどうかという基準に従って行う。明確な配列を選択することによって、細菌種、細菌属、または細菌群全体を検出することが可能である。１５個のヌクレオチドからなるプローブに関しては、１００％の配列が相補的でなければならない。１５個より多いヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドでは、１個または数個のミスマッチが認められる。
【００２８】
厳密なハイブリッド形成条件を遵守することによって、核酸分子が標的配列と実際にハイブリッド形成することが確実になる。本発明の意味での厳密な条件は、以下でも示すように、たとえば２０〜８０％のホルムアミドをハイブリッド形成緩衝液中に溶かしたものである。さらに、厳密なハイブリッド形成条件は、当然ながら参照の文献および標準的作品中で調べることも可能である（（非特許文献１１）など）。
【００２９】
本発明の方法の脈絡では、本発明の核酸プローブ分子は、以下に述べる長さおよび配列を含む（核酸プローブ分子はすべて、５’から３’方向に示す）。
本発明の核酸プローブ分子は、以下の糸状、いわゆる繊維状細菌を検出するのに有用である：
０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ、０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩ、０２１Ｎ  Ｋａｎａｇａｗａ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ、０２１Ｎ  ｌｉｋｅ  ｆｒｏｍ  ＢＩＯ３３  ＥＵ２１、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＥＵ２４  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ（ｅｕｒｏｐａｅａ、ＰＰｘ３、ＭＣ２）、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ  ＭＣ２  ＭＡＣＯＢＳ−ｃｌｏｎｅ２（ＢＩＯ３６）、Ｂａｃｔｏｔｈｒｉｘ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ（ＥＵ３、ＥＵ４、ＥＵ８、ＥＵ９、ＥＵ１１）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｕｒｔｕｎｅｍａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（Ｔｙｐｅ００４１）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ（ＥＵ２１）、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ、ＥＵ２３  ｆｒｏｍ  ＳＡＮ３、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｓｉｄｅｒｅｕｓ  ＥＵ２６  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ／０２１Ｎ−ｌｉｋｅ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｔｅｎａｃｉｓ（ＥＵ１２、ＥＵ５、ＥＵ６、ＥＵ１５、ＥＵ１３、ＥＵ１４）、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ（ＥＵ２４）、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ｎｅｘｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ（０２１Ｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＥＵ１、ＥＵ２、ＥＵ１０）、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｒａｍｏｓａ、ｔｙｐｅ０４１１（ＣＦ）、ｔｙｐｅ０８０３、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ。
【００３０】
2004533252.tif 000002
2004533252.tif 000003
2004533252.tif 000004
【００３１】
本発明の主題は、前述のオリゴヌクレオチド配列の改変も含み、これらのオリゴヌクレオチド配列は、配列および／または長さが改変されているにもかかわらず、それぞれの細菌の標的核酸配列との特異的なハイブリッド形成を示し、したがって本発明の方法の適用例において有用である。これらは特に以下のものを含む。
【００３２】
ａ）核酸分子、（ｉ）塩基の少なくとも６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８４％、８７％、特に好ましくは少なくとも９０％、９４％、９６％が、前述のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号４２）の１つと同一であり、前に与えたオリゴヌクレオチドの１つの配列領域（配列番号１〜配列番号４２）に対応する、核酸分子の配列領域が考えられ、前に与えた任意のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号４２）と比較して、１個または複数個の塩基分だけ配列が長い可能性がある核酸分子の全体の配列は考えられない）、あるいは（ｉｉ）前述のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号４２）と１個または数個の欠失および／または付加分だけ異なり、繊維状細菌の核酸配列との特異的なハイブリッド形成が可能である。ここで「特異的なハイブリッド形成」は、ここに記載したハイブリッド形成条件下で、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成技法の脈絡において当業者に知られている条件下で、標的生物のリボソームＲＮＡのみがオリゴヌクレオチドに結合し、非標的生物のｒＲＮＡは結合しないことを意味する。
【００３３】
ｂ）ａ）で名付けた核酸分子、またはプローブ配列番号１〜配列番号４２の１つと相補的であり、すなわち厳密な条件下でそれらと特異的にハイブリッド形成する核酸分子。
ｃ）配列番号１〜配列番号４２からのオリゴヌクレオチド配列を含み、あるいはａ）またはｂ）の核酸分子の配列を含み、前述の配列またはａ）またはｂ）のその変形以外に少なくとも１つの他のヌクレオチドを有し、標的生物の核酸配列との特異的なハイブリッド形成が可能である核酸分子。
【００３４】
核酸分子とプローブ配列番号１〜配列番号４２の配列同一性の程度は、通常のアルゴリズムによって決定することが可能である。この点において、たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ（このウエブサイトには、たとえばリンク「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｎ］」が存在する）の下でアクセス可能である、配列同一性を決定するためのプログラムが、ここでは適切である。
【００３５】
本発明では、「ハイブリッド形成」は、「相補的」と同じ意味を有することが可能である。本発明は、本発明の配列番号１〜４２の変形も含めた、本発明のオリゴヌクレオチドの１つの（理論上の）アンチセンス鎖にハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドも含む。
【００３６】
現在初めて、繊維状細菌、特に産業汚水処理プラントに存在する繊維状細菌を、この方法を使用して特異的に検出することが可能であることは、特に本発明の方法の利点である。現在まで従来の検出法は、都市部の汚水処理プラントに存在するような繊維状細菌に限られることが多い。しかしながら、都市部の汚水処理プラントと産業汚水処理プラントの細菌集団は、完全に異なる。都市部の汚水処理プラントに存在する細菌の（部分的な）検出のみを可能にする、従来の方法を、産業プラントに有意に適用することは可能ではない。なぜなら、対応する細菌が、単にそこに存在しないからである。本発明の方法またはプローブを使用することによって、ＦＩＳＨの利点を産業汚水処理の分野にも適用することが初めて可能である。
【００３７】
したがって、本発明の特定の利点は、望むならば、汚泥のバルキングおよび浮遊かすを引き起こす、ここで述べたすべての細菌を、産業汚水処理プラントにおいて同時に検出することが可能であることである。
【００３８】
他の利点は、本発明の特定のプローブ亜群の、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用することによって、標的生物の特定の亜群を選択的に検出することが可能であることである。
【００３９】
ここで、産業プラントにおいて汚泥のバルキングおよび浮遊かすの最も一般的な原因である、繊維状細菌の群を最初に述べなければならない。Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ｎｅｘｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅ、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ（ＥＵ２４）、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ（ｅｕｒｏｐａｅａ、ＰＰｘ３、ＭＣ２）、Ａｌｉｓｐｈａｅｒａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＥＵ２４  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅが、これらの細菌中に数えられる。
【００４０】
本発明のこれらのオリゴヌクレオチドの配列番号２７、４０、４１および４２、および変形からなる群から選択される、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用することによって、この群を同定することが好ましい。
【００４１】
述べておかなければならない細菌の他の亜群は、細菌Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ  ｌｉｍｉｃｏｌａ−ｌｉｋｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍが属する群である。これらの細菌は、配列番号１〜３のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを使用することによって、検出することが好ましい。この群は、産業プラントにおける汚泥のバルキングおよび浮遊かすの、第２の最も一般的な原因である。
【００４２】
細菌Ｂａｃｔｏｔｈｒｉｘ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ（ＥＵ３、ＥＵ４、ＥＵ８、ＥＵ９、ＥＵ１１）も述べておかなければならず、これらは特に製紙の汚水処理プラントにおいて、汚泥のバルキングおよび浮遊かすの主な原因である。この群の細菌は、配列番号６〜９の１つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プローブを使用することによって、特異的に検出するのが有利である。
【００４３】
たとえばＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｕｒｔｕｎｅｍａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（Ｔｙｐｅ００４１）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ（ＥＵ２１）、ＥＰＴ５  ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ０２１Ｎ  ｉｓｏｌａｔｅ、ＥＵ２３  ｆｒｏｍ  ＳＡＮ３、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｄｉｓｃｏｐｈｏｒａ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｓｉｄｅｒｅｕｓ  ＥＵ２６  Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ／０２１Ｎ−ｌｉｋｅ、Ｍｅｇａｔｈｒｉｘ  ｔｅｎａｃｉｓ（ＥＵ１２、ＥＵ５、ＥＵ６、ＥＵ１５、ＥＵ１３、ＥＵ１４）、（ＥＵ１、ＥＵ２、ＥＵ１０）、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ０２１Ｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＥＵ１、ＥＵ２、ＥＵ１０）、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ  ｒａｍｏｓａ、ｔｙｐｅ０４１１（ＣＦ）、ｔｙｐｅ０８０３などの、汚泥のバルキングおよび浮遊かすの他の原因は、本発明の脈絡において与えられる、他のオリゴヌクレオチド・プローブを使用することによって、検出することが好ましい。
【００４４】
本発明の検出法の脈絡において、本発明の核酸プローブ分子を、さまざまなハイブリッド形成溶液と共に使用することが可能である。この目的のために、０〜８０％の濃度のさまざまな有機溶媒を使用することが可能である。厳密なハイブリッド形成条件を遵守することによって、核酸プローブ分子が標的配列と実際にハイブリッド形成することが確実になる。本発明の意味での適度な条件は、以下に記載したように、たとえば０％ホルムアミドをハイブリッド形成緩衝液中に溶かしたものである。本発明の意味での厳密な条件は、たとえば２０〜８０％のホルムアミドをハイブリッド形成緩衝液中に溶かしたものである。
【００４５】
本発明の方法の範囲内では、典型的なハイブリッド形成溶液は、０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０％〜８０％および２０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは３５％のホルムアミドを含み、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は塩化ナトリウムであることが好ましい。さらに、ハイブリッド形成溶液は、たとえばラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗浄剤を、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５％〜０．０５％、より好ましくは０．０１％〜０．０３％、最も好ましくは０．０１％の濃度で通常含む。ハイブリッド形成溶液は、ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝液などの、さまざまな化合物を用いて緩衝することが可能であり、これらは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度、好ましくは６．０〜９．０、特に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で通常使用される。本発明のハイブリッド形成溶液の好ましい実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
【００４６】
当業者であれば、ハイブリッド形成反応の必要な厳密度が得られるような方法で、ハイブリッド形成緩衝液の成分の所与の濃度を選択することが可能であることは理解されるであろう。特に好ましい実施形態は、厳密ないし特に厳密なハイブリッド形成条件で示される。これらの厳密な条件を使用して、当業者は、所与の核酸分子によって標的生物の核酸配列の種特異的な検出が可能であり、したがって本発明の脈絡において信頼して使用することが可能であるかどうかを決定することが可能である。
【００４７】
ハイブリッド形成緩衝液中の核酸プローブの濃度は、標識のタイプおよび予想される標的構造体の数に依存する。迅速かつ有効なハイブリッド形成を可能にするために、核酸プローブ分子の数は、標的構造体の数を数倍超えなければならない。他方では、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）に関して作業するとき、過剰に高レベルの蛍光標識された核酸プローブ分子によって、バックグランド放射線の蛍光の増大がもたらされることを考慮する必要がある。したがって核酸プローブ分子の濃度は、０．５ｎｇ／μｌ〜５００ｎｇ／μｌ、好ましくは１．０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌの間、特に好ましくは１．０ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌの間の範囲内でなければならない。
【００４８】
本発明の方法の脈絡では、好ましい濃度は、ハイブリッド形成溶液１μｌ当たり、使用するそれぞれの核酸プローブ分子が１〜１０ｎｇである。使用するハイブリッド形成溶液の体積は８μｌと１００ｍｌの間でなければならず、本発明の方法の特に好ましい実施形態では、それは４０μｌである。
【００４９】
ハイブリッド形成の時間は、正常では１０分と１２時間の間である。ハイブリッド形成は、約１．５時間続けることが好ましい。ハイブリッド形成温度は、好ましくは４４℃と４８℃の間、特に好ましくは４６℃であり、ハイブリッド形成温度、およびハイブリッド形成溶液中の塩および洗浄剤の濃度のパラメータは、核酸プローブ、特にその長さ、および検出する細胞中の標的配列との相補性の度合いに基づいて、最適化することが可能である。当業者は、適切な計算法に精通している。前に記載した条件は、厳密なハイブリッド形成条件を表す。
【００５０】
ハイブリッド形成が終了した後、ハイブリッド形成しなかった過剰の核酸プローブ分子は除去するかあるいは洗浄しなければならず、通常これは従来の洗浄溶液によって行われる。望むならば、この洗浄溶液は０．００１〜０．１％、好ましくは０．０１％の濃度のＳＤＳなどの洗浄剤、および０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは０．０２ｍｏｌ／ｌの濃度のｔｒｉｓ−ＨＣｌを含むことが可能であり、ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ値は６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０の間の範囲であり、最も好ましくは８．０である。洗浄剤が含まれてよいが、それが絶対に必要なわけではない。洗浄溶液は通常、必要な厳密度に応じて、０．００３ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌの濃度でＮａＣｌも含む。０．０７ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ濃度が、特に好ましい。さらに洗浄溶液はＥＤＴＡを含んでよく、その濃度は０．００５ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。洗浄溶液は、当業者に知られている、適切な量の一般に使用されている防腐剤をさらに含むことが可能である。
【００５１】
一般に、緩衝溶液は洗浄工程で使用され、原則としてこれはハイブリッド形成緩衝液（緩衝塩化ナトリウム溶液）に非常に類似したものであってよく、唯一の違いは、洗浄工程が低塩濃度または高温の緩衝液中で行われることである。
ハイブリッド形成条件を理論的に評価するために、以下の等式を使用することが可能である：
Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４×（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５Ｘ（％ＦＡ）
Ｔｄ＝解離温度、℃
［Ｎａ＋］＝ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ＝塩基の合計数に対する、グアニンおよびシトシン・ヌクレオチドの割合
ｎ＝ハイブリッドの長さ
％ＦＡ＝ホルムアミド含量
この等式を使用して、たとえば洗浄緩衝液中のホルムアミドの割合（ホルムアミドの毒性のためにこれは可能な限り低く保たなければならない）を、対応する低含量の塩化ナトリウムと交換することが可能である。しかしながら当業者は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法に関する広範囲の文献に基づいて、これらの成分を変えることが可能であり、かつどのように変えることが可能であるかを認識している。ハイブリッド形成緩衝液に関して前述したことが、ハイブリッド形成条件の厳密度にも当てはまる。
【００５２】
非結合核酸プローブ分子の「洗浄」は通常、４４℃〜５２℃、好ましくは４４℃〜５０℃の範囲、特に好ましくは４６℃の温度で、１０〜４０分間、好ましくは１５分間行われる。
【００５３】
本発明の方法の他の実施形態では、所与の標的生物を特異的に検出するための、いわゆるＦａｓｔ−ＦＩＳＨ法において、本発明の核酸プローブ分子を使用する。Ｆａｓｔ−ＦＩＳＨ法は当業者に知られており、たとえば（特許文献１）および（特許文献２）中に記載されている。これらの書類中に記載された検出法を行うために、その開示を本願明細書に明確に援用する。
【００５４】
したがって、特異的にハイブリッド形成した核酸プローブ分子を、対応する細胞中で検出することが可能である。ただし、たとえば核酸プローブ分子がマーカーに共有結合する点において、核酸プローブ分子は検出可能である。使用され当業者によく知られている検出可能なマーカーには、ＣＹ２［アメルシャムライフサイエンス社、アルリングトンハイツ、米国（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＵＳＡ）から入手可能である］、ＣＹ３［これもアメルシャムライフサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手可能である］、ＣＹ５［これもアメルシャムライフサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手可能である］、ＦＩＴＣ［モレキュラープローブ社、エウゲン、米国（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）］、ＦＬＵＯＳ［ロッヘディアグノスティク社、マンハイム、ドイツ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である］、ＴＲＩＴＣ［モレキュラープローブ社、エウゲン、米国（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）から入手可能である］、６ＦＡＭまたはＦＬＵＯＳ−ＰＲＩＭＥなどの蛍光基がある。化学マーカー、放射性マーカー、またはホースラディシュペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素マーカーを使用することも可能である。それぞれのこれらの酵素に関する一連の色原体が知られており、これらを天然基質の代わりに反応させ、着色または蛍光生成物を形成することが可能である。このような色原体の例を、以下に与える。
【００５５】
【表１】
2004533252.tif 000005
最後に、その５’または３’端にハイブリッド形成にも適した他の核酸配列が存在するように、核酸プローブ分子を形成することが可能である。したがって、この核酸配列は約１５〜１０００個、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドを含む。したがってこの第２の核酸領域は、前に与えた任意の物質によって検出可能な、核酸プローブ分子によって認識することが可能である。
【００５６】
他に考えられることは、検出可能な核酸プローブ分子のハプテンへの結合である。したがって核酸プローブ分子は、ハプテンを認識する抗体に接触させることが可能である。このようなハプテンの一例は、ジゴキシゲニンである。前述したもの以外の他の例が、当業者によく知られている。
【００５７】
最終的な分析は、使用するプローブの標識のタイプに依存し、光学顕微鏡、エピ蛍光顕微鏡、化学発光測定装置、蛍光光度計などを使用して行うことが可能である。
本発明の方法によって、前述した繊維状細菌の明確で具体的な検出が初めて可能になり、したがって細菌の糸状体の間の識別が初めて可能であるが、一方で古典的な方法（すなわち、たとえば形態学的特徴付け、またはグラムまたはナイセリアの染色）によって、これらの間に明確な境界線を引くことは可能ではないと思われる。
【００５８】
たとえば活性汚泥サンプル中の、繊維状細菌を特異的かつ迅速に検出することに関する、本出願中に記載した方法の重要な利点は、前に記載した従来の検出法と比較した、その速度である。本発明の方法を使用した結果は、３時間以内に入手可能である。
【００５９】
他の利点は、本発明の方法の特異性である。使用する核酸プローブ分子によって、属または群全体を、特異的に検出し視覚化することが可能であり、かつ、これらの属から、ただ１種を非常に特異的に検出し視覚化することが可能である。細菌を視覚化することによって、目に見える対照を同時に行うことが可能である。したがって、偽陽性の結果は除かれる。
【００６０】
本発明の方法の他の利点は、大部分の異なる繊維状細菌を同時的かつ特異的に検出する機会があることである。さまざまに標識された核酸プローブ分子を使用することによって、このことが容易かつ確実になる。
【００６１】
本発明の方法の他の利点は、細菌を視覚化することから生じる、サンプル中に含まれる細菌を容易かつ正確に定量化する機会があることである。
本発明の方法の他の利点は、その取り扱いやすさであり、したがって多量のサンプルを、前述した細菌の存在に関して、容易に試験することが可能である。
【００６２】
本発明の方法は、多方面に適用することが可能である。活性汚泥からのサンプルの分析以外に、空気、水または土壌から採取される、さまざまな他の環境のサンプルを分析するために、本発明の方法を使用することも可能である。
【００６３】
本発明によると、本発明の他の態様では、本発明の方法を施すためのキットを提供する。これらのキット中に含まれるハイブリッド形成配列は、たとえば（特許文献３）中に記載されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成配列に関する、この書物中に含まれる開示を明確に本願明細書に援用する。
【００６４】
記載のハイブリッド形成配列（ＶＩＴ反応器と呼ばれる）以外に、キットの最も重要な成分は、前に記載したような検出する微生物用の特異的な核酸プローブ分子を含む、個々のハイブリッド形成溶液（いわゆるＶＩＴ溶液）である。このキットは常に、対応するハイブリッド形成緩衝液（溶液Ｃ）、および対応する洗浄溶液（溶液Ｄ）の濃縮物も含む。このキットは、必要な場合は固定溶液（溶液Ａおよび溶液Ｂ）、追加的に細胞破壊溶液（Ｂｒｅａｋｅｒ＿２）および必要な場合は包埋溶液（仕上げ剤）も含んでよい。仕上げ剤は市販されており、その活性は蛍光顕微鏡下での蛍光プローブの迅速な漂白の保護も含む。場合によっては、陽性対照と陰性対照を並行して行うための溶液も含んでよい。
【００６５】
以下の実施例は、本発明を記載することを意図するものであるが、しかしながら本発明を制限するものではない。
実施例
たとえば活性汚泥から採取したサンプル中の、繊維状細菌の特異的かつ迅速な検出
分析するサンプル物質の適切な等分試料をスライド上に施し、乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
【００６６】
次いで、乾燥させた細胞を、段階的に脱水させる。
したがって、最初に固定溶液（溶液Ａ、５０％エタノール）を施し、これは４０μｌであることが好ましい。スライドを再び乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
【００６７】
その後、他の固定溶液（溶液Ｂ（無水エタノール）、好ましくは４０μｌ）を加えることによって、乾燥させた細胞を完全に脱水させる。スライドを再び乾燥させる（室温で３分間、あるいは完全に乾燥するまで）。細胞を完全に分解させるために、適切な体積の適切な酵素溶液（Ｂｒｅａｋｅｒ、４０μｌが好ましい）をスライドに施すことが可能であり、次いでスライドをインキュベートする（１０〜３０分間、４〜２５℃）。
【００６８】
チューブ、好ましくは蒸留水を充満させたＶＩＴ反応器にスライドを浸すことによって、酵素溶液を洗浄し、次いでスライドを横方向の位置で乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
【００６９】
その後、検出するそれぞれの微生物用の、前に記載した特異的な核酸プローブ分子を含む、ハイブリッド形成溶液（ＶＩＴ溶液）を、固定および脱水させた細胞に施す。好ましい体積は４０μｌである。次いでスライドを、チャンバ、好ましくはハイブリッド形成緩衝液（オリゴヌクレオチドを含まないハイブリッド形成溶液に対応する、溶液Ｃ）で湿らせたＶＩＴ反応器内で、インキュベートする（４６℃、９０分間）。
【００７０】
次いでスライドを、チャンバ、好ましくはＶＩＴ反応器から除去し、このチャンバ、ここでも好ましくはＶＩＴ反応器を、洗浄溶液（溶液Ｄ、蒸留水に１：１０で希釈させたもの）で充満させ、スライドをその中でインキュベートする（４６℃、１５分間）。
【００７１】
ＶＩＴ反応器に蒸留水を充満させた後、スライドをその中に短時間浸し、次いでスライドを横方向の位置で乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
この目的のために、スライドを適切な媒質（仕上げ剤）で包埋する。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、サンプルを分析する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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