(57)【要約】ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットをコードするＤＮＡをクローン化し、そして特性を決定した。組換えタンパク質は生物学的に活性なタンパク質を形成することができる。ＤＮＡは活性な組換えタンパク質を生産する組換え宿主細胞中で発現した。またこの組換えタンパク質は組換え宿主細胞から精製される。さらに組換え宿主細胞を使用してレセプター活性のモジュレーターを同定する方法を確立し、そしてレセプターモジュレーターを同定する。
2004514413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号１４のアミノ酸１〜２６８から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸１５０〜２６８から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んで成るポリヌクレオチド、
から成る群から選択される員を含んで成る上記の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
（配列番号１２）および（配列番号１３）から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
さらに（配列番号１２）および（配列番号１３）の対立遺伝子変異体、突然変異体および機能的誘導体から成る、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
上記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
組換え宿主中でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を発現するための発現ベクターであって、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質およびそれらの機能的誘導体をコードする組換え遺伝子を含む、上記発現ベクター。
【請求項８】
発現ベクターが：（配列番号１２）および（配列番号１３）から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするクローン化遺伝子を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
群がさらに配列番号１２および配列番号１３の対立遺伝子変異体、突然変異体および機能的誘導体から成る、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
発現ベクターが、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードする組換え的にクローン化した遺伝子を含む組換え宿主細胞。
【請求項１２】
上記遺伝子が：（配列番号１２）；（配列番号１３）およびそれらの機能的誘導体から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
上記のクローン化遺伝子がゲノムＤＮＡである、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
細胞中でヒトのαナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質と組み合わせた時に細胞中のナトリウムイオン流を可能とする、配列番号１２または配列番号１３の配列を有するヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列にコードされる単離されたタンパク質。
【請求項１５】
（配列番号１４）およびそれらの機能的誘導体から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１７】
組換え宿主細胞中でのヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現法であって：
（ａ）配列番号１２または配列番号１３の配列を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含んで成る発現ベクターを細胞に導入し；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項１８】
ナトリウムチャンネル活性のモジュレーターをスクリーニングする方法であって：
（ａ）配列番号１２または配列番号１３により表されるヌクレオチド配列またはその相補的配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされるタンパク質およびナトリウムチャンネルαサブユニットタンパク質を同時発現する細胞を提供し、ここで細胞はナトリウムイオン流を誘導し；
（ｂ）細胞を推定上のβ１Ａモジュレート化合物と接触させ；そして
（ｃ）ナトリウムイオン流を改変する細胞について変化を測定する、
ことを含んで成る上記方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのタンパク質が組換えタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ナトリウムイオン流の変化が：
（ａ）Ｎａチャンネルを開く能力の上昇；
（ｂ）Ｎａチャンネルを開く能力の低下；
（ｃ）脱感作率の上昇；
（ｄ）脱感作率の低下；
（ｅ）チャンネルの再感作率の上昇；
（ｆ）チャンネルの再感作率の低下；
（ｇ）β１Ａタンパク質発現レベルの上昇；
（ｈ）β１Ａタンパク質発現レベルの低下；
（ｉ）α／β１Ａ複合タンパク質発現レベルの上昇；および
（ｊ）α／β１Ａ複合タンパク質発現レベルの低下、
から成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法を使用して選択されたヒトβ１Ａの機能をモジュレートする化合物。
【請求項２２】
請求項１９に記載の化合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載のモジュレート化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の神経痛の処置法。
【請求項２４】
患者の脊髄神経節細胞中のヒトβ１Ａサブユニットレベルを改変させることを含んで成る、処置が必要な患者の神経痛の処置法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の慢性的な疼痛の処置法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の熱性痙攣の処置法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の全身癲癇の処置法。
【請求項２８】
請求項２１に記載の化合物を含んで成る鎮痙性医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２１に記載の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の不整脈の処置法。
【請求項３０】
局所麻酔薬として使用するために有用な請求項に記載の化合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３１】
個体に該個体中のナトリウムチャンネル活性を変化させるために効果的な量のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユットのモジュレーターを投与することを含んで成る、個体の神経痛を減少させる方法。
【請求項３２】
モジュレーターが上記個体の細胞中のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの発現を減少させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
個体の細胞表面上のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのレベルを改変させることを含んで成る、個体の神経痛を処置する方法。
【請求項３４】
ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット−結合分子を、ヒトのナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット−発現細胞に投与する工程を含んで成る、ヒトの神経痛を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の背景
本件は、２０００年６月７日に出願され、そして「ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１ＡサブユットをコードするＤＮＡ」という表題をつけられた米国特許仮出願第６０／２９４，４０５号、および２０００年９月２９日に出願され、そして「ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１ＡサブユットをコードするＤＮＡ」という表題をつけられた米国特許仮出願第６０／２３６，６６４号の優先権を主張する。
【０００２】
細胞へのナトリウムイオンの急激な流入は脱分極を引き起こし、そして活動電位を生じる。興奮性細胞の形質膜上の電位変化に反応したそのようなナトリウムイオンの流入は、電位依存性ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）により媒介される。したがって電位依存性ナトリウムチャンネルは、中枢および末梢神経系の神経興奮性の制御に基本的な役割を果たす。ＶＧＳＣは少なくとも大きな（２００〜３００ｋＤａ）、孔を形成するαサブユットおよび２つの小さい（３０〜４０ｋＤ）調節β１およびβ２サブユットを含んで成るタンパク質複合体である（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，１９９２ ＆ １９９３；Ｉｓｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｉｓｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＨＥＫ細胞、ＣＨＬ細胞およびアフリカツメガエル卵母細胞のような異質発現系中でのＶＧＳＣのαサブユットのみの発現は機能的な、しかし改質されたナトリウムチャンネルを合成するために十分であるので、ＶＧＳＣのαサブユットがチャンネルの基本的特性を定めていることは周知である。ＶＧＳＣ β１およびβ２サブユットとαサブユットの同時−発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は通常、異質な発現系でのチャンネルの特性を正常化する。換言すると、ＶＧＳＣ β１およびβ２サブユットは、電位依存性の活性化および不活性化を含むチャンネル特性のほとんどすべての観点をモジュレートし、そして形質膜上の機能的チャンネル数を増す。ＶＧＳＣサブユットはナトリウムチャンネル発現の上昇を制御する律速段階でもある（Ｃａｔｅｒａｌｌ，１９９２；Ｉｓｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
【０００３】
モレキュラークローニングの研究は、多くの異なる型のＶＧＳＣαサブユットがあることを示し、これらはそれらの神経毒およびテトロドトキシン（ＴＴＸ）に対する感受性に基づき分類することができる（Ｍａｒｂａｎ，ｅｔ ａｌ．１９９８）。脳のＶＧＳＣ Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＩ型、骨格筋Ｉ型、ナトリウムチャンネルタンパク質６（ＳＣＰ６）、それに極めて相同的な末梢神経４（ＰＮ４）、および末梢神経１（ＰＮ１）はＴＴＸによりナノモル濃度で遮断されるので、それらはＴＴＸ−感受性感受性（ＴＴＸ−Ｓ）ナトリウムチャンネルと名付けられている。心筋ナトリウムチャンネル（Ｈ１）および末梢神経３（ＰＮ３／ＳＮＳ）およびＮａＮ／ＳＮＳ２は通常、マイクロモル範囲でＴＴＸにより遮断され、そしてＴＴＸ−耐性（ＴＴＸ−Ｒ）ナトリウムチャンネルと名付けられている。
【０００４】
ＶＧＳＣβサブユットの研究は、ＶＧＳＣαサブユットの研究よりもはるかに遅れている。これまで２種類のサブユット、β１およびβ２（Ｉｓｏｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，１９９４ ＆１９９５）がクローン化され、そして特性が決定されただけであった。最近、新規ＶＧＳＣβ１Ａサブユット（β１サブユットのスプライシング変異体）がラットから同定された（Ｋａｚｅｎ−Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，ｅｔ ａｌ．２０００）。ラットＶＧＳＣβ１Ａサブユットは、明らかにイントロン保持反応（ｉｎｔｒｏｎ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）から生じる。ラットのゲノムＤＮＡの分析では、β１Ａの分岐領域（カルボキル領域）が枠内に終止コドンを持つイントロン３によりコードされていることが示された。ＶＧＳＣβ１サブユットと同様に、β１Ａサブユットはナトリウム電流密度および［３Ｈ］サキシトキシン結合部位を増し、そしてＩＩ型ＶＧＳＣの電位依存性活性化および不活性化をモジュレートする。より興味深いことには、脊髄神経節（ＤＲＧ）中のＶＧＳＣ β１Ａの発現レベルおよびパターンが、Ｃｈｕｎｇの動物神経痛モデルにおいて有意に変化し（以下を参照にされたい）、これはナトリウム電流が神経損傷後に上昇するという考察と一致する。ＶＧＳＣ β１およびβ１Ａサブユットは両方とも、カルボキシル末端に１つの膜貫通ドメインを、そして２つの高度に保存されているシステイン残基の間の１つの推定上のジスルフィド架橋により維持されている細胞外アミノ末端免疫グロブリン様の折り畳みモチーフを含有する内在性膜糖タンパク質である（Ｉｓｏｍ，ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｋａｚｅｎ−Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，ｅｔ ａｌ．２０００）。ＶＧＳＣ β１およびβ１ＡはＩｇスーパーファミリーのＶ−組の員として分類することができ、このスーパーファミリーには多くの細胞接着分子が含まれ、β１およびβ１Ａサブユットがナトリウムチャンネル特性をモジュレートするだけでなく、タンパク質ターゲッティングおよび細胞接着にも役割を果たすことを示唆している（Ｉｓｏｍ ａｎｄ Ｃａｔｔｅｒａｌ，１９９６）。
【０００５】
ニューロン中の自然なファイヤリング（ｆｉｒｉｎｇ）率の上昇は、神経損傷後の末梢の知覚神経節でしばしば観察される（Ｏｃｈｏａ ａｎｄ Ｔｏｒｅｂｊｏｒｋ，１９８０；Ｎｏｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｄｅｖｏｒ，１９９４；Ｗｏｏｌｆ，１９９４）。このニューロン中の過剰興奮性は、幾つかの慢性疼痛で改変したナトリウムチャンネル発現によることが示唆された（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ニューロンの不適切で反復的なファイヤリングを導くナトリウムチャンネル数の増加は、末梢レセプターから中枢神経系へ信号を中継するＤＲＧのような種々の末梢神経組織中の損傷した軸索の先で報告された（Ｗａｘｍａｎ ａｎｄ Ｂｒｉｌｌ，１９８７；Ｄｅｖｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｍａｔｚｎｅｒ ａｎｄ Ｄｅｖｏｒ，１９９２；Ｄｅｖｏｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｍａｔｚｎｅｒ ａｎｄ Ｄｅｖｏｒ，１９９４；Ｅｎｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。対照ＤＲＧニューロン中に極めて低いレベルで存在するだけのα−ＩＩＩサブユットをコードする転写産物は、上昇したレベルのα−Ｉおよびα−ＩＩ ｍＲＮＡと一緒に、中から高レベルで軸索切断ニューロン中で発現される（Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。逆に、ナトリウムチャンネルα−ＳＮＳの転写産物は、軸索切断後のＤＲＧニューロン中でダウン−レギュレートされる（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。さらにナトリウム遮断薬の部分的効力は神経痛を処置した患者で十分に証明され（Ｃｈａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｄｅｖｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｏｍａｎａ−Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｉｚｚｏ，１９９７）、上昇したナトリウムチャンネル発現と神経痛との間の重要な関連を提供する。したがってナトリウムチャンネル発現、および続く機能における改変化は、末梢神経損傷後の異常生理学の元になる重要な分子的出来事となり得る。
【０００６】
最近ＶＧＳＣ β１Ａサブユットがクローン化され、そしてＣＨＬ繊維芽細胞中のαＩＩＡサブユットと同時に発現される時、形質膜でナトリウム電流密度を上昇させることが報告された（Ｋａｚａｎ−Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。β１Ａは脳で生育により調節されるが、その神経痛における電位的役割はこれまでに明らかにされていない。したがってＣｈｙｎｇの神経痛モデル（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ，１９９２）を使用したＤＲＧニューロンにおいてβ１Ａタンパク質の発現が、β１には存在しないβ１Ａの独自な細胞外領域に対するポリクローナル抗体を使用して調査された。免疫組織化学およびコンューターによる画像分析は、模擬操作動物（ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｅｄ ａｎｉｍａｌ）に由来するＤＲＧの大変低いレベルに比べて、神経損傷後のＶＧＳＣ β１Ａおよびβ１サブユットの有意なアップ−レギュレーションを示した。末梢神経損傷後のβ１Ａの顕著な斑点および膜標識分布は、細胞下の分布が拡散したままであるβ１とは異なり、活性な翻訳および形質膜への蓄積の可能性を示唆した。
【０００７】
本発明では、ＶＧＳＣ β１Ａサブユットの機能をさらに明らかにするために、ヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユットをクローン化し、そして特性を決定した。
発明の要約
ヒトＶＧＳＣ β１ＡサブユットをコードするＤＮＡ分子をクローン化し、そして特性を決定し、これは神経機能に重要な組織中で優先的に発現されるヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユットの新規アイソフォームを表す。組換え発現系を使用して、チャンネルサブユットをコードする機能的ＤＮＡ分子が単離された。これらのタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列のような生物学的および構造的特性を開示する。組換えＤＮＡおよびそれらの部分は、ＤＮＡ分子の相同体を単離し、同定し、ＤＮＡ分子のゲノム均等物を同定そして単離し、そしてＤＮＡ分子の突然変異体を同定、検出または単離するために有用である。
【０００８】
さらにβ１Ａサブユットは確立された神経痛モデルを使用して証明されるように、神経痛と関係している。
【０００９】
本発明の第１の観点では、本発明はヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユットタンパク質をコードする単離された核酸分子に関し、該ポリヌクレオチドは：（ａ）配列番号１４のアミノ酸１〜２６８から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸１５０〜２６８から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んで成るポリヌクレオチドから成る群から選択される員を含んで成る。１つの態様ではポリヌクレオチドはＲＮＡであり、そして別の態様ではポリヌクレオチドはＤＮＡである。別の態様では、ヌクレオチド配列は（配列番号１２）および（配列番号１３）から成る群から選択される。さらなる群には、（配列番号１２）および（配列番号１３）の対立遺伝子変異体、突然変異体および機能的誘導体から成る単離されたＤＮＡ分子を含む。別の態様では、単離されたＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡである。
【００１０】
本発明はさらに、組換え宿主中でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を発現するための発現ベクターに関し、ここで該ベクターはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質およびそれらの機能的誘導体をコードする組換え遺伝子を含む。１つの態様では、発現ベクターは（配列番号１２）および（配列番号１３）から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするクローン化遺伝子を含み、そして別の態様では、群はさらに配列番号１２および配列番号１３の対立遺伝子変異体、突然変異体および機能的誘導体から成る。別の態様では、発現ベクターは、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含む。
【００１１】
本発明はまた、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質またはそれらの機能的誘導体をコードする組換え的にクローン化した遺伝子を含む組換え宿主細胞に関する。好ましくは遺伝子は、（配列番号１２）；（配列番号１３）およびそれらの機能的誘導体から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する。別の態様では、クローン化遺伝子はゲノムＤＮＡである。
【００１２】
本発明はまた、細胞中でヒトのαナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質と組み合わせた時に細胞中のナトリウムイオン流を可能とする、配列番号１２または配列番号１３の配列を有するヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列にコードされる単離されたタンパク質を企図する。１つの態様では、タンパク質は（配列番号１４）およびそれらの機能的誘導体から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明はまたこれらタンパク質に特異的な抗体および単一特異性抗体、すなわちヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を特異的に認識する抗体のような本発明のヒトタンパク質のみを同定する抗体を企図する。
【００１３】
本発明は組換え宿主細胞中でのヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の発現法に関し、この方法は：（ａ）配列番号１２または配列番号１３の配列を有するヌクレオチド配列またはその相補的配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含んで成る発現ベクターを細胞に導入し；（ｂ）工程（ａ）の細胞を、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程を含んで成る。
【００１４】
さらに本発明は、ナトリウムチャンネル活性のモジュレーターをスクリーニングする方法に関し、この方法は：（ａ）配列番号１２または配列番号１３により表されるヌクレオチド配列またはその相補的配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされるタンパク質、およびナトリウムチャンネルαサブユニットタンパク質を同時発現する細胞を提供し、ここで細胞はナトリウムイオン流を誘導し；（ｂ）細胞を推定上のβ１Ａモジュレート化合物と接触させ；そして（ｃ）ナトリウムイオン流を改変する細胞について変化を測定することを含んで成る。この方法の１つの態様では、少なくとも１つのタンパク質は組換えタンパク質である。ナトリウムイオン流の変化は：（ａ）Ｎａチャンネルを開く能力の上昇；（ｂ）Ｎａチャンネルを開く能力の低下；（ｃ）脱感作率の上昇；（ｄ）脱感作率の低下；（ｅ）チャンネルの再感作率の上昇；（ｆ）チャンネルの再感作率の低下；（ｇ）β１Ａタンパク質発現レベルの上昇；（ｈ）β１Ａタンパク質発現レベルの低下；（ｉ）α／β１Ａ複合タンパク質発現レベルの上昇；および（ｊ）α／β１Ａ複合タンパク質発現レベルの低下、から成る群から好ましく選択される。この方法を使用して同定された化合物も、これらを化合物を含んで成る医薬組成物のように本発明の範囲内に包含される。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の神経痛の処置法を含む動物の多数の処置法に関する。患者の脊髄神経節細胞中のヒトβ１Ａサブユニットレベルを改変させることを含んで成る、処置が必要な患者の神経痛の処置法も本発明で企図する。
【００１６】
また本発明は、本発明の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の慢性的な疼痛の処置法、ならびに本発明の化合物を投与することを含んで成る、処置が必要な患者の熱性痙攣の処置法に関する。
【００１７】
本発明の化合物を含んで成る鎮痙性医薬組成物のような、本発明の化合物を投与することによる全身癲癇の処置法を企図する。さらに方法には本発明の方法により同定される化合物を投与を含んで成る、処置が必要な患者の不整脈の処置法、および本発明の化合物を含んで成る医薬組成物を投与することにより、患者に局所麻酔薬を提供する方法を含む。さらに本発明は、個体に該個体のナトリウムチャンネル活性を変化させるために効果的な量のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユットのモジュレーターを投与することを含んで成る、個体の神経痛を減少させる方法、および個体の細胞中のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの発現を減少させる方法に関する。また本発明は、個体の細胞表面上のナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのレベルを改変させることを含んで成る、個体の神経痛を処置する方法に関する。
【００１８】
３０．ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット−結合分子を、ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット−発現細胞に投与する工程を含んで成る、ヒトの神経痛を減少させる方法。
詳細な説明
定義
本明細書で使用する用語「タンパク質ドメイン」は、残りのタンパク質から独立して安定な３次元構造に折り畳まれることができるタンパク質の領域を称する。この構造は、酵素活性の部位、別の分子に関する認識モチーフの生成を含むタンパク質内の特異的機能を維持し、あるいは特定の環境下で存在するために必要な構造的要素を提供することができる。タンパク質ドメインは通常、タンパク質ファミリーおよび類似の機能を行うタンパク質スーパーファミリーの両方の中でタンパク質の進化的に保存された領域である。本明細書で使用する用語「タンパク質スーパーファミリー」とは、進化的関係が完全に樹立されていないか、または認められた系統発生論的標準により離れているが、類似の３次元構造を示すか、または重要なアミノ酸に独自なコンセンサスを表すタンパク質を称する。本明細書で使用する用語「タンパク質ファミリー」とは、認められた系統発生論的標準により進化的関係が樹立されているタンパク質を称する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「融合タンパク質」とは、多くのタンパク質ドメインまたはリンカー領域を組み合わせた結果であるタンパク質構築物を称する。融合タンパク質は最も多くは、所望のタンパク質をコードする新規ポリヌクレオチド配列の作成をもたらすためのヌクレオチド配列の分子クローニングにより作成される。あるいは融合タンパク質の作成は、２つのタンパク質を一緒に化学的に連結することにより達成することができる。
【００２０】
本明細書で使用する用語「リンカー領域」または「リンカードメイン」または類似のそのような説明的用語は、クローニングベクターまたは融合タンパク質の構造に使用するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の広がりを称する。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列へのクローニング部位の導入、２つのタンパク質ドメインの間に柔軟な成分または空間を作成する領域の導入、または特異的な分子相互作用のための親和性タグの作成を含むことができる。リンカー領域は特別な目的無しに融合タンパク質に導入してもよいが、選択の結果はクローニング中に生成する。
【００２１】
本明細書で使用する用語「クローニング部位」または「ポリクローニング部位」とは、１以上の利用可能な制限エンドヌクレアーゼコンセンサス配列を有する、クローニングベクター中に含まれる、または融合タンパク質内に工作されたヌクレオチド配列の領域を称する。これらのヌクレオチド配列は他のクローニングベクター中に導入してクローニング、新規融合タンパク質の作成をし易くするか、またはそれらは特異的な部位特異的突然変異に導入するために使用することができる。当業者にはサイレント突然変異、保存的突然変異または所望の制限酵素コンセンサス配列を含むリンカー領域の導入により、所望の位置にクローニング部位を工作できることは周知である。また当業者は、クローン化されるタンパク質またはそれらのフラグメントの所望する機能が維持される限り、クローニング部位の正確な位置は柔軟性であり得ることも周知である。
【００２２】
本明細書で使用する用語「タグ」は、タグを含む融合タンパク質の単離、精製または検出を容易にするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を称する。広い種類のそのようなタグは当業者に知られており、そして本発明での使用に適する。適当なタグには限定するわけではないが、ＨＡペプチド、ポリヒスチジンペプチド、ビオチン／アビジンおよび他の抗体エピトープ結合部位を含む。
ヒトの電位依存性ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット核酸の単離
電位依存性ナトリウムチャンネルは、孔形成サブユニットαおよび２つの調節サブユニットβ１およびβ２を含む多−サブユニットタンパク質複合体である。αサブユニットがチャンネルの基本的特性を決定する一方、β１およびβ２サブユニットは電位依存性のゲート間の開閉（ｇａｔｉｎｇ）、電位依存性活性化および不活性化、および最も特徴的には膜上の機能的チャンネル密度の上昇を含むチャンネル特性のほとんどすべての観点をモジュレートする。分子薬理学および電気生理学的視点から、電位依存性ナトリウムチャンネルのより多くのサブタイプはクローン化αサブユニットよりも興奮性細胞中に存在する。これは一部は、クローン化され、そして特性決定されるαサブユニットがより多く自然に存在することによる。一方、１つの型より多くのβ１およびβ２サブユニット型が存在するかもしれないと予想するかもしれない。換言すると、種々の電圧でゲート化されたナトリウムチャンネルが１つの型のβ１およびβ２サブユニットと会合する異なる型のαサブユニットから、またはその逆から生じ得る。実際には生化学的研究により、β１特異的抗体を用いてウエスタンブロットにより決定される１つの型より多くの型のナトリウムチャンネルβ１サブユニットが明らかとなった（Ｓｕｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
【００２３】
最近、β１Ａ（新規な電位依存性ナトリウムチャンネルサブユニットおよびスプライス変異体）がクローン化され、そしてＣＨＬ繊維芽細胞中のαＩＩＡサブユニットと同時発現した時、形質膜でナトリウム電流密度を上げ、そして電位依存性動力学を変化させることが報告された（Ｋａｚａｎ−Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。β１Ａは脳で発育的に調節されている。ラットのＶＧＳＣ β１Ａサブユニットの細胞下分布の研 究により、末梢神経損傷の結果としてＤＲＧニューロンでアップ−レギュレートされることに加えて、これが改変されたことが示された。さらにラットのＶＧＳＣ β１Ａサブユニットは、神経損傷に続いて発現されるナトリウムチャンネルの異常な列の調節に重要となり得る。
【００２４】
ヒトβ１Ａサブユニットを研究するために、我々は最初に相同的クローニング法を使用してサブユニットをクローン化することを試みた。β１Ａはβ１サブユニットのカルボキシル末端でのイントロン保持スプライシング変異体であるので、ヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユニットに基づき前部プライマーを設計した；一方、逆プライマーはラットのＶＧＳＣ β１Ａサブユニットに基づき設計した。予期せぬことに、この対のプライマーはヒトの副腎、胎児脳および成人脳 Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標） ｒｅａｄｙ ＤＮＡライブラリーに由来するいかなるＤＮＡフラグメントを増幅できなかった。次にラットのβ１Ａサブユニットのカルボキシル末端をコードする配列に基づく３種の逆プライマーを設計した。しかし前部プライマーと対をなすこれらのプライマーのいずれも、幾つかのＰＣＲ条件下で上記ｃＤＮＡライブラリーに由来するいずれのＤＮＡフラグメントも増幅することができず、ヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユニットがラットにおけるその対とは大変異なることを示唆した。
【００２５】
ヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユニットのスプライシング変異体をクローン化するために、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ：ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）法を使用した。２つの遺伝子特異的プライマーを要する通常のＲＴ−ＰＣＲとは異なり、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにはＲＴ−ＰＣＲ増幅用のユニバーサルプライマー（ＡＰ１またはＡＰ２）と対をなす唯一の特異的プライマーを必要とするだけである。これにはライブラリーを作る時に各ｃＤＮＡの末端にユニバーサルプライマーにより認識されるアダプターを加えることを必要とする。現在、この種類のｃＤＮＡライブラリーは市販されている（Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡライブラリー、クローンテック：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。したがってこの技法により、ヒトＶＧＳＣ β１Ａサブユニットは、ヒトβ１Ａカルボキシル末端の配列を知ることなく、ヒトβ１Ａ特異的プライマー（ＳＢ１−１０、実施例１を参照にされたい）を用いて増幅することができた。この応用の技術的な難しさは、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ用のβ１サブユニット特異的なプライマーを使用するので、β１サブユニットから新規β１Ａを効果的に識別することである。この問題を解決するために、形質転換体をヒトＶＧＳＣβ１サブユニットのみを認識する１対のプライマーを用いてＰＣＲにより前−スクリーニングし、そして陰性クローン（これはそのようなＰＣＲにより増幅できなかった）をさらなる特性決定およびシークエンシングに供した。この方法により、新規ヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニットがヒト副腎のＭａｒａｔｈｏｎ（商標） ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡライブラリーからクローン化され、そして続いてヒト胎児脳のＭａｒａｔｈｏｎ（（商標） ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡライブラリーからヒトβ１Ａ特異的プライマーを用いて増幅された。
【００２６】
プライマー配列の分析から、ヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニットも保持されたイントロンおよび枠内の終止コドンを含むβ１サブユニットのスプライシング変異体であることが明らかとなった。この新規ＶＧＳＣβサブユニットもＶＧＳＣβサブユニットの基本構造：アミノ−末端細胞外免疫グロブリン−様モチーフおよびカルボキシル−末端膜貫通ドメインを含む。しかしヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニットは、そのラットの対とは有意に異なる。それらはカルボキシル末端コード領域に約３５％の同一性を共有するだけである。
【００２７】
本発明は、ヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニット生産細胞から単離されたヒトＶＧＳＣβ１ＡサブユニットをコードするＤＮＡに関する。本明細書で使用する用語「ヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニット」は、チャンネルサブユニットとして特異的に機能することができるタンパク質を称する。すなわち、これは他のタンパク質サブユニットと組合わさり機能性カルシウムチャンネルを形成することができる。
【００２８】
組換えタンパク質は、機能的なヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニットのモジュレーターを同定するために有用である。ノーザンブロット分析では、ＶＧＳＣβ１Ａサブユニットが限定するわけではないが脳、心臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、腎臓および膵臓を含む様々な組織に広く分布していることが示された。脳では、ＶＧＳＣβ１Ａサブユニットは、小脳領域に最も高く発現する。免疫組織化学的研究でも、ＶＧＳＣβ１Ａは脊髄神経節細胞（ＤＲＧ）に発現しただけでなく、神経損傷後にもアップ−レギュレートされることを示し、神経痛に役割を果たすことを示唆する。ナトリウムチャンネル発現および／または機能における改変は、末梢および中枢ニューロンのファイヤリング（ｆｉｒｉｎｇ）特性、および多くの他の組織に顕著な影響を与えることができる。ＶＧＳＣβ１Ａのモジュレーターは本発明のアッセイで同定することができ、そしてそれらの神経痛、慢性疼痛、熱性痙攣および全身癲癇の治療薬、局所麻酔薬、抗不整脈薬および鎮痙薬、ならびに他のヒトの疾患に関連するナトリウムチャンネルとしての使用が試験された（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｏｒｒｅｃａ，ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｂａｌｓｅｒ １９９９）。ヒトＶＧＳＣβ１Ａは、熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）および先天性長期−ＱＴ症候群（ＬＱＴ）（部分的に長期の心室再分極を特徴とする心律動異常）を伴う全身癲癇のような、他のβ１ナトリウムチャンネルの改変が異常なナトリウムチャンネル活性に関連している場合のヒトの疾患にも有用となり得る。
【００２９】
さらに以下の実施例１２に提供するように、β１Ａサブユニットおよびβ１の発現は、免疫組織化学および画像分析を使用して、ラットにおける神経痛の神経連結モデルからのＤＲＧニューロンで調査した。β１Ａサブユニットおよびβ１の発現レベルは侵害受容のＤＲＧニューロンで最も顕著に増加したが、知覚ニューロンでも増加した。しかしこれら２種類のポリペプチドの細胞下標識では、末梢神経損傷に続くＤＲＧニューロンで劇的に異なった。これらの実験は、末梢神経損傷がβ１Ａサブユニットおよびβ１ナトリウムチャンネルサブユニットのアップレギュレーションと関連し、そしてＤＲＧ中のβ１Ａの細胞分布パターンを変えたことを証明した。これはナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットが神経損傷後のＤＲＧニューロン中の異常なナトリウムチャンネル発現の調節に重要であることの証拠である。
【００３０】
このように本発明はまた、β１Ａサブユニットに結合することができるモジュレーターを同定するためのヒトβ１Ａサブユニットを使用したスクリーニングアッセイの使用も企図する。次にヒトβ１Ａサブユニットに結合することができるモジュレーターは、ヒトの神経痛を減少させるための処置または方法として、医薬組成物中でのような治療薬として使用することができる。ヒトβ１Ａサブユニットのモジュレーターをを含んで成る医薬組成物は、ヒトのナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを発現する細胞に結合する細胞に運ばれ、そして神経痛を減少させるように機能する。
【００３１】
種々の細胞および細胞系が、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットをコードするヌクレオチド配列に基づき選択されたプライマーを使用して、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを単離するために使用できる。
【００３２】
関連する配列または対立遺伝子変異体を得るために、当該技術分野で既知な任意の様々な手法を使用して、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡを分子的にクローニングすることができる。これらの方法には限定するわけではないが、適当な発現ベクター系でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含むｃＤＮＡライブラリーの構築後、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子の直接的な機能的発現を含む。別の方法は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットのアミノ酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルに構築したヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。さらなる方法は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードする部分的なｃＤＮＡを含むバクテリオファージまたはプラスミドシャトル中に構築されたヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含むｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることから成る。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質のアミノ酸配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を通したヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡフラグメントの特異的なＰＣＲ増幅により得られる。
【００３３】
別の方法は、ヒトＶＧＳＣβ１Ａサブユニット生産細胞からＲＮＡを単離し、そしてインビトロまたはインビボ翻訳系を介してＲＮＡをタンパク質に翻訳することである。ＲＮＡのペプチドタンパク質への翻訳は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の少なくとも一部分の生産をもたらし、これは例えば抗−ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体との免疫学的反応性により、またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の生物学的活性により同定することができる。この方法では、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット生産細胞から単離されたＲＮＡのプールを、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。さらにＲＮＡのプールの分画は、非ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＲＮＡからヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＲＮＡの精製をもたらす。この方法により生成されるペプチドまたはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供し、これを次にヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを生産するためのプライマーとして提供するか、あるいは翻訳に使用するＲＮＡを分析してヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットをコードするヌクレオチド配列を提供し、そしてヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを生産するためのプライマーを生成することができる。この方法は当該技術分野では既知であり、そして例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｎｒｏｏｋ，Ｊ．のモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ．１９８９に見いだされる。
【００３４】
当業者には適当なｃＤＮＡライブラリーが、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性を有する細胞または細胞系から調製できることは直ちに明らかである。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製に使用する細胞または細胞系の選択は、最初にヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに関連する生物学的活性の測定またはリガンド結合アッセイを使用して、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを伴う細胞を最初に測定することにより行う。
【００３５】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野で周知な標準的技法により行うことができる。周知なｃＤＮＡライブラリー構築法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｎｒｏｏｋ，Ｊ．のモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ．１９８９）に見いだすことができる。
【００３６】
当業者には、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡが適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離できることも容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野で周知な標準的技法により行うことができる。周知なゲノムＤＮＡライブラリーの構築法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｎｒｏｏｋ，Ｊ．のモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ＮＹ．１９８９）に見いだすことができる。
【００３７】
上記方法によりヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット遺伝子をクローン化するために、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのアミノ酸配列が必要となるかもしれない。これを達成するために、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質が精製され、そして部分的なアミノ酸配列を自動化シークエンサーにより決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡフラグメントの一部分のＰＣＲ増幅のためのプライマーを生成するために、タンパク質から６〜８個のアミノ酸の２つの領域の直線配列を決定する。
【００３８】
いったん適当なアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることができるＤＮＡ配列が合成される。遺伝子暗号は縮重するので、１コドンより多くを使用して特定のアミノ酸をコードすることができ、したがってアミノ酸配列は類似するＤＮＡオリゴヌクレオチド組によりコードされ得る。この組の１員のみがヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット配列と同一であるが、誤対号を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在してもヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡとハイブリダイズすることができるだろう。誤対号を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットをコードするＤＮＡの同定および単離を可能とするために、ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットＤＮＡに十分にハイブリダイズできる。これらの方法により単離されたＤＮＡは、無脊椎および脊椎動物源に由来する種々の細胞型からＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして相同的遺伝子を単離するために使用することができる。
【００３９】
精製された生物学的に活性なヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットは、幾つかの異なる物理的形態を有することができる。ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットは、完全長の新生または未処理ポリペプチドとして、または部分的に処理されたポリペプチドまたは処理されたポリペプチドとの組み合わせ物として存在するかもしれない。完全長の新生ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットポリペプチドは、特異的なタンパク質溶解的開裂反応により翻訳後に修飾されることができ、これは完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成を生じる。フラグメントまたはフラグメントの物理的会合は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性に関する完全な生物学的活性を有することができるが、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性の程度は個々のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットフラグメントおよび物理的に会合したヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットポリペプチドフラグメント間で変動し得る。
【００４０】
遺伝子暗号は縮重するので、１個より多くのコドンを特定のアミノ酸をコードするために使用でき、したがってアミノ酸配列は類似するＤＮＡオリゴヌクレオチド組によりコードされ得る。この組の１員のみがヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット配列と同一であるが、誤対号を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在しても適当な条件下でヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡへハイブリダイズすることができるだろう。別の条件下でも、誤対号を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定および単離を可能とするために、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡに十分にハイブリダイズできる。
【００４１】
特定の生物に由来するヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを使用して、他の生物からヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの相同体を単離そして精製することができる。これを達成するために、最初にヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡを、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの相同体をコードするＤＮＡを含むサンプルと適当なハイブリダイゼーション条件下で混合する。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、そしてそれらから相同的ＤＮＡをコードするＤＮＡを精製することができる。
機能的誘導体／変異体
特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには実質的な量の重複があることは知られている。したがって本発明は最終的には同一のアミノ酸を翻訳するための別のコドンを含むこれらＤＮＡ配列も対象とする。この仕様のために、１以上の置換されたコドンを持つ配列を縮重変異体として定める。また本発明の範囲に含まれるのは、ＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質のいずれかの中の突然変異であり、これは発現されたタンパク質の最終的な物理的特性を実質的に改変しない。例えば脂肪族アミノ酸アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換；ヒドロキシル残基セリンおよびシレオニンの入れ替わり、酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンおよびグルタミン間の置換、塩基性残基リシンおよびアルギニンおよびヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの芳香族残基フェニルアラニン、チロシン間の交換は、ポリペプチドの機能性に変化を生じない。そのような置換は周知であり、そして例えば遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ）、第４版、ベンジャミン カミング（Ｂｅｎｇａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｇ）出版社、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌに記載されている。
【００４２】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、自然に存在するペプチドの特性とは異なる特性を有するペプチドをコードするように改変することができる。ＤＮＡ配列を改変する方法には限定するわけではないが、部位特異的突然変異誘発法、キメラ置換および遺伝子融合を含む。部位特異的突然変異誘発法は、サイレント突然変異、保存的置換または非保存的置換を生じることができる１以上のＤＮＡ残基を変えるために使用することができる。キメラ遺伝子は類似の、または異なる遺伝子のドメインを交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）してヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより調製する。同様に融合遺伝子は、遺伝子の同定および単離を容易にする親和性タグのようなドメインをヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子に加えることにより調製することができる。融合遺伝子は、例えば膜貫通ドメインを除去することによりタンパク質の可溶性変更体を作成するために、または標的配列を加えてタンパク質の正常な輸送を再支配するか、または新たな翻訳後修飾配列をヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子に加えることにより、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子の領域を置き換えるために調製することができる。改変された特性の例には限定するわけではないが、基質に関する酵素の、またはリガンドに関するレセプターの親和性における変化を含む。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそのようなすべての変化は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の元の機能が本明細書に記載されるように維持される限り、有用な変異体であると考える。
【００４３】
当該技術分野で知られているように同一性および類似性は、配列を比較することにより定められる２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野では、同一性はそのような配列の記号間の対合により決定されるような場合であり得るポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列の関連性の程度も意味する。同一性および類似性は容易に計算することができる（コンピューターによる分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８８；バイオコンピューティイング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、アカデミック出版、１９９３；配列データのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｈ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、フマナ（Ｈｕｍａｎａ）出版、ニュージャージー、１９９４；分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．アカデミック出版、１９８７；および配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）出版、ニューヨーク、１９９１）。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定するための多数の方法が存在するが、両方の用語は当業者に周知である（分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．アカデミック出版、１９８７；配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）出版、ニューヨーク、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８），ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８，１０７３）。配列間の同一性または類似性を決定するために通常使用されている方法は、限定するわけではないがＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８），ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８，１０７３に開示されている方法を含む。同一性を決定する好適な方法は、試験する配列間で最も多い対合を与えるように計画する。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムで体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータープログラム法は、限定すわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１），３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）を含む。
【００４４】
ポリヌクレオチド（１つまたは複数）は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを称し、これらは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでよい。このように例えば本明細書で使用するポリヌクレオチドは、とりわけ１本−および２本−鎖ＤＮＡ、１本−および２本−鎖領域、または１本−、２本−および３本−鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本−および２本−鎖ＲＮＡ、ならびに１本−および２本−鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本−鎖または３本−鎖、または１本−および２本−鎖領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子を称する。さらに本明細書で使用するポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んで成る３本鎖領域を称する。そのような領域の鎖は、同じ分子または異なる分子に由来することができる。この領域は１以上の分子のすべてを含んでよいが、より典型的には幾つかの分子の１つの１領域のみを含む。３重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」には、１以上の修飾塩基を含む上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。すなわち安定性または他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、その意味で本明細書で意図する「ポリヌクレオチド」である。さらにただ２つの例として挙げるイノシンまたはトリチル化塩基のような修飾塩基のような普通ではない塩基を含んで成るＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で使用する意味のポリヌクレオチドである。多くの有用な目的のために役立つＤＮＡおよびＲＮＡに施された膨大な種々の修飾は、当業者には既知であると考えられる。本明細書で使用するような用語ポリヌクレオチドは、そのような化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾されたポリヌクレオチド形態、ならびにウイルスおよびとりわけ１つまたは複雑な細胞を含む細胞の特徴であるＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド（１つまたは複数）としばしば呼ばれる短いポリヌクレオチドを含む。
【００４５】
本明細書で使用する用語ポリペプチドは、周知であり、しかも当該技術分野の無数の教科書および他の刊行物に記載されたきた基本的化学構造のポリペプチドを称する。この内容において、この用語はペプチド結合により互いに直鎖状に連結された２以上のアミノ酸を含んで成る任意のペプチドまたはタンパク質を称する。本明細書で使用するようにこの用語は、例えば当該技術分野では通常ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般に当該技術分野ではタンパク質と呼ばれる多くの型が存在するより長鎖の両方を称する。ポリペプチドはしばしば、通常２０種の自然に存在するアミノ酸と呼ばれる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、そして末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような自然なプロセスにより、しかしまた当該技術分野で周知である化学的修飾法によるいずれかで、上記のポリペプチド中で修飾されてもよい。ポリペプチド中に自然に起こる普通の修飾でも、膨大でありここに完全に掲げることはできないが、それらは基本的な教科書に十分に記載され、そしてモノグラフならびに冊数の多い研究文献に詳細に記載され、そして当業者はそれらを周知である。
【００４６】
中でも幾つかを具体例として挙げると、現在ポリペプチドに存在し得る既知の修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、ユビキチン化を含む。そのような修飾は当業者には周知であり、そして科学文献に大変詳細に記載されてきた。幾つかの特に多い修飾、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えばタンパク質−構造および分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＲＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｅ．Ｔ．Ｃｒｃｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）のようなほとんどの基本的教科書に記載されている。この主題に関しては、例えばＷｏｌｄ，Ｐ．，翻訳後のタンパク質修飾：展望および考察（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）、タンパク質の翻訳後共有修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＹＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）の１〜１２頁、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、アカデミック出版、ニューヨーク（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２，６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．、「タンパク質合成：翻訳後修飾および加齢（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ）」（１９９２） Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３，４８−６２により提供されるように多くの詳細な総説が入手可能である。
【００４７】
周知であるように、そして上記のように、ポリペプチドは常に全体が直線状ではないと考えられる。例えばポリペプチドは一般に、自然なプロセッシング反応および自然には起こらない人為的操作によりもたらされる反応を含む翻訳後修飾の結果であり得る。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは、非−翻訳の自然なプロセスにより、および完全な合成法によっても合成することができる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むペプチドのいかなる場所でも起こることができる。実際にはポリペプチド中、共有的修飾によるアミノまたはカルボキシル基または両方の遮断が、自然に起こる、および合成ポリペプチドでは普通であり、そしてそのような修飾は本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の細胞で作られたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質溶解プロセッシングの前はほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである。ペプチドの翻訳後修飾中に、ＮＨ，ｓｕｂ２−末端でメチオニン残基が削除され得る。したがって本発明は、本発明のタンパク質のメチオニンを含むおよびメチオニンを含まないアミノ末端変異体の両方の使用を意図している。
【００４８】
ポリペプチド中に起こる修飾はしばしば、それがどのように作られたかに関係するだろう。宿主中でクローン化した遺伝子を発現させることにより作られたポリペプチドについては、例えば修飾の性質および程度が大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力により定められ、そして修飾シグナルはポリペプチドのアミノ酸配列中に存在するだろう。例えば周知であるように、グリコシル化はしばしば例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中では起こらない。したがってグリコシル化を望む場合、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般には真核細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞は哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行うことが多く、この理由のために、昆虫細胞発現系はとりわけ自然なグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発された。同様の考察は他の修飾にも適用される。同じ修飾型が所定のポリペプチド中の幾つかの部位で同じかまたは異なる程度で存在することができると思われる。また所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含んでもよい。本明細書で使用するように一般に、用語ポリペプチドはすべてのそのような修飾、特に宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現することにより組換え的に合成されたポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００４９】
本明細書で使用する用語であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体（１つまたは複数）は、それぞれ参照とするポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、自然に生じる対立遺伝子変異体のような自然に生じる変異体でよく、または自然には生じると知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド変異体は、別の参照とするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチドである。一般に差異は限定されているので、参照および変異体のヌクレオチド配列は全体的に極めて類似し、そして多くの領域で同一である。以下に記載するように、変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレントであることができる。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を改変させることができない。改変がこの種のサイレント変化に限られている場合、変異体は参照と同じアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドをコードするだろう。また以下に記載するように、変異体中のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することができる。そのようなヌクレオチド変化は、上記のような参照配列によりコードされるポリペプチド中にアミノ酸置換、付加、欠失、融合および短縮を生じることができる。
【００５０】
ポリペプチド変異体は、別の参照とするポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチドである。一般に差異は限定されているので、参照および変異体の配列は全体的に極めて同じ、そして多くの領域で同一である。変異体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在し得る１以上の置換、付加、欠失、融合および短縮によりアミノ酸配列が異なることができる。本明細書で使用するヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの「機能的誘導体」とは、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保有する化合物である。用語「機能的誘導体」は、「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「同族体」および「相同体」を含むことを意図し、またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの「化学的誘導体」を意図する。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野では周知であり、例えば２次的な化学的部分を持つポリペプチド内に含まれる１以上の反応性有機部位の共有的修飾を含む。周知の架橋試薬がアミノ、カルボキシルまたはアルデヒド残基を反応させて、例えばビオチン、蛍光染料を導入するために、またはポリペプチドを固相表面（例えば親和性樹脂を作成するために）に結合させるために有用である。用語「フラグメント」は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの任意のポリペプチドサブセットを指すことを意味する。
【００５１】
分子は、両分子が実質的に類似構造を有するか、または両分子が類似の生物学的活性を有する場合、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに「実質的に類似」する。したがって２つの分子が実質的類似の活性を有する場合、それらはたとえ１つの分子の構造がもう１つの分子中に見いだされなくても、またはたとえ２つのアミノ酸配列が同一でなくても変異体であると考えられる。用語「同族体」は、全ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット分子またはそれらのフラグメントのいずれかと機能が実質的に類似する分子を称する。さらにこれに関して特に好適であるのは、配列番号１３の変異体、同族体、誘導体およびフラグメントをコードするポリヌクレオチド、および配列番号１４のポリペプチドのアミノ酸配列を有するフラグメントの変異体、同族体、誘導体であり、ここで幾つかの、数個の、５〜１０個の、１〜５個の、１〜３個の、２、１個または０個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、削除または付加されている。中でも特に好適なものは、配列番号１３の遺伝子の特性および活性を改変させないサイレント置換、付加および欠失である。またこれに関して特に好適であるのは、保存的置換である。最高に好適であるのは、置換無しの配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５２】
本発明のさらに好適な態様は、配列番号１４に説明するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、全長にわたり少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。本発明のさらに別の好適な態様は、配列番号１４に説明するアミノ酸配列１５０〜２６８を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、その長さの連続する部分にわたり少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。あるいはより好適であるのは、少なくとも８０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチドであり、さらにより好適であるのは少なくとも９０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチドであり、そして好適なポリヌクレオチドの中でも少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチドが特に好適である。さらに少なくとも９７％同一性を有するポリヌクレオチドが少なくとも９５％を有するものの中でより好適であり、そしてこれらの中で少なくとも９８％、そして少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが特により好適であり、そして少なくとも９９％が最も好適である。好適な態様では本明細書に記載するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１４の推定されるアミノ酸配列を特徴とするポリヌクレオチドと同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドをコードする。さらにこの観点において好適な態様は、配列番号１３のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドをコードスルポリヌクレオチドである。本発明はさらに本明細書の上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して本発明は特に、本明細書の上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが配列間で少なくとも９５％そして好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ起こるハイブリダイゼーションを意味する。
【００５３】
当該技術分野で既知の多数のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法が存在し、それらにはＤＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡとＲＮＡおよびＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションカップリングを含む。これらすべての方法は、ハイブリダイズ可能なプローブを標的とする核酸の正確な同定を容易にするストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むことができる。当該技術分野では既知であるように、方法はハイブリダイゼーションに使用する基質に大変依存し、そしてＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．同上ならびに当該技術分野の様々な技術文献に多数のストリンジェントなハイブリダイゼーション法が詳細に記載されている。１例では、プローブで釣るＤＮＡまたはＲＮＡサンプルを、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデン ジフルオリド等のような適当な支持層上に固定化する。好ましくは十分な特異的活性（一般には約１０８ｃｐｍ／μｇプローブより高い）で精製した、実質的に混入ＤＮＡ、タンパク質または非包含ヌクレオチドを含まないプローブを使用する。ニトロセルロースを使用し、そして固定化された核酸がニトロセルロース上に固定化されたＤＮＡである場合、ＤＮＡを含むニトロセルロースを、５０％ホルムアミド−脱イオン化の６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含んで成るハイブリダイゼーション溶液で４２℃にて１５分間インキューベーションする。プローブを加え、そしてニトロセルロースをさらに４２℃で約１２〜１９時間固定化する。次にニトロセルロースを少なくとも２回連続して２２℃で洗浄し、続いて０．０４Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２，１％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡのバッファー中６５℃でのストリンジェントな洗浄を行う。種々のヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増す条件は、当該技術分野では周知である。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書でさらに検討するように、例えば本発明のポリヌクレオチドをＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用して、配列番号１３の配列をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、そして配列番号１３に高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。そのようなプローブは一般に少なくとも１５個の塩基を含んで成るだろう。好ましくはそのようなプローブは少なくとも３０個の塩基を有し、そして少なくとも５０個の塩基を有することができる。特に好適なプローブは少なくとも３０個の塩基を有し、そして５０個以下の塩基を有するだろう。例えば本発明の遺伝子のコード領域は、既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニングすることにより単離して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。次に本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プローブがハイブリダイズしたのはライブラリーのどの員かを決定する。
【００５５】
本発明のポリペプチドは配列番号１４（特に成熟ポリペプチド）のポリペプチドならびに配列番号１４のポリペプチドと少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、好ましくは配列番号１４のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、そしてより好ましくは配列番号１４のポリペプチドと少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチド、そしてさらにより一層好ましくは配列番号１４のポリペプチドと少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを含み、そしてまたそのようなポリペプチドの一部を含み、ポリペプチドのそのような部分は一般に少なくとも３０個のアミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例は、例えば配列番号１４の短縮ポリペプチドを含む。
【００５６】
短縮ポリペプチドには配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの変異体または誘導体を含むが、二重短縮突然変異、２つの連続する一連の残基の欠失、アミノ末端を含むもの、およびカルボキシル末端を含むもののようなアミノ酸末端を含む連続する一連の残基（すなわち連続する領域、部分または一部）、またはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基の欠失は除く。本発明のこの観点において好適であるのは、配列番号１４の配列を特徴とするポリペプチドの構造的または機能的特性を特徴とするフラグメントである。これに関して本発明の好適な態様には、α−ヘリックスおよびα−ヘリックス形成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、回転および回転−形成領域、コイルおよびコイル−形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、柔軟性領域、表面−形成領域、基質結合領域、本発明のポリペプチドの高抗原性指数領域を含んで成るフラグメント、およびそのようなフラグメントの組み合わせを含む。好適な領域は本発明の活性を媒介する領域である。これに関して最高に好適であるのは、本発明の反応調節ポリペプチドの化学的、生物学的または他の活性を有するフラグメントであり、それらには類似活性または改善された活性を持つもの、または望ましくない活性が低下したものを含む。
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの組換え発現
本明細書に記述する方法を用いて得たクローン化（ｃｌｏｎｅｄ）ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡを分子クローニング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）で適切なプロモーターと他の適切な転写調節要素（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含有する発現ベクターの中に組換え的に発現させた後、原核生物または真核生物の宿主細胞の中に転移させることを通して、組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を生じさせることができる。そのような操作技術は前記Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．他に詳細に記述されており、本技術分野で良く知られている。
【００５７】
発現ベクターを、本明細書では、遺伝子のクローン化したコピーの転写そしてそれらのｍＲＮＡの翻訳を適切な宿主中で起こさせるに必要なＤＮＡ配列であるとして定義する。そのようなベクターを用いて真核生物の遺伝子をいろいろな宿主、例えば細菌（大腸菌を包含）、ラン色細胞、植物細胞、昆虫細胞、菌・カビ細胞（酵母細胞を包含）および動物細胞などの中に発現させることができる。
【００５８】
特殊に設計したベクターを用いて宿主間のＤＮＡのシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）、例えば細菌−酵母または細菌−動物細胞または細菌−菌・カビ細胞または細菌−無脊椎動物間のＤＮＡシャトリングを起こさせることができる。適切に構築した発現ベクターは下記を含有すべきである：宿主細胞内で自己複製するための複製源、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数用ポテンシャル（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）および活性プロモーター。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であると定義する。強力なプロモーターはｍＲＮＡに開始を高い頻度で受けさせるプロモーターである。発現ベクターには、これらに限定するものでないが、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特殊に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれ得る。
【００５９】
いろいろな哺乳動物の発現ベクターを用いて組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを哺乳動物の細胞内に発現させることができる。組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの発現で用いるに適切であり得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターには、これらに限定するものでないが、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＴＥＴ−ＯｎおよびｐＴＥＴ−Ｏｆｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ　３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ　３７５６５）が含まれる。
【００６０】
いろいろな細菌の発現ベクターを用いて組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを細菌の細胞内に発現させることも可能である。組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの発現で用いるに適切であり得る商業的に入手可能な細菌発現ベクターには、これらに限定するものでないが、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。
【００６１】
いろいろな菌・カビ細胞の発現ベクターを用いて組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを菌・カビ細胞、例えば酵母の細胞内に発現させることも可能である。組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの発現で用いるに適切であり得る商業的に入手可能な菌・カビ細胞発現ベクターには、これらに限定するものでないが、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００６２】
いろいろな昆虫細胞の発現ベクターを用いて組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを昆虫細胞内に発現させることも可能である。組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの発現で用いるに適切であり得る商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターには、これらに限定するものでないが、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００６３】
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを発現ベクターの中にクローン化して、組換え型宿主細胞内に発現させることができる。組換え型宿主細胞は原核生物または真核生物であってもよく、これには、これらに限定するものでないが、細菌、例えば大腸菌など、菌・カビ細胞、例えば酵母など、哺乳動物細胞（これには、これらに限定するものでないが、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類を源とする細胞系が含まれる）、そして昆虫細胞（これには、これらに限定するものでないが、しょうじょうばえおよび蚕に由来する細胞系が含まれる）が含まれる。哺乳動物種に由来して商業的に入手可能で用いるに適し得る細胞系には、これらに限定するものでないが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）、ＰＣ１２（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７２１）が含まれる。
【００６４】
数多く存在する技術の中のいずれか１つを用いて発現ベクターを宿主細胞に導入してもよく、そのような技術には、これらに限定するものでないが、形質転換、トランスフェクション、プロトプラストフュージョン（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ）、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）およびエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。その発現ベクターを含有させた細胞をクローン的に増殖させて個々に分析することで、それらがヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットタンパク質を産出するか否かを決定する。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを発現する宿主細胞クローンの同定はいくつかの手段を用いて実施可能であり、そのような手段には、これらに限定するものでないが、抗−ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体との免疫学的反応性、そして宿主細胞に関連した（ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性の存在が含まれる。
【００６５】
また、インビトロで生じさせた合成ｍＲＮＡを用いてヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットＤＮＡの発現を実施することも可能である。合成ｍＲＮＡまたはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを産出する細胞から単離したｍＲＮＡを、細胞を含まないいろいろな系（これには、これらに限定するものでないが、麦芽抽出液および網状赤血球抽出液が含まれる）の中で有効に翻訳させることができるばかりでなく、細胞が基になった系の中でも有効に翻訳させることができ、これには、これらに限定するものでないが、カエルの卵母細胞へのミクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が含まれ、一般にカエルの卵母細胞へのミクロインジェクションが好適である。
【００６６】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性および／またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を最適なレベルでもたらすヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡ配列１種または２種以上を決定する時、これらに限定するものでないが、下記を包含するヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡ分子を構築してもよい：ほぼ塩基４からほぼ塩基８０８（これらの番号は１番目のメチオニンの１番目のヌクレオチドそして１番目の終始コドンの前方に位置する最後のヌクレオチドに相当する）に至る３２ｋＤａのタンパク質をコードするヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム、そしてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をコードするｃＤＮＡ部分を含有するいくつかの構築物。全ての構築物の設計をこれらがヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡの５’もしくは３’未翻訳領域のいずれも含有しないか、全部を含有するか、或は一部を含有するように行う。そのような構築物を適切な宿主細胞の中に導入（単独または組み合わせの両方で）した後、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの活性およびタンパク質の発現のレベルを測定してもよい。一過性発現検定（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ａｓｓａｙｓ）で最適な発現をもたらすヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡカセットを決定した後、このヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡ構築物をいろいろな発現ベクターに転移させて、宿主細胞［これには、これらに限定するものでないが、哺乳動物の細胞、バクロウイルスに感染させた昆虫細胞、大腸菌および酵母であるＳ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる］内で発現させる。
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの検定方法
宿主細胞のトランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）およびミクロインジェクションを受けさせた卵母細胞を用い、下記の方法に従って、機能的ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性のレベルおよび全ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の濃度の両方を評価することができる。組換え型宿主細胞の場合のそれは、１つ以上のフラグメントまたはサブユニットをコードするヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットＤＮＡを含有する１つまたは可能ならば２つ以上のプラスミドのコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を伴う。卵母細胞の場合のそれは、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットタンパク質用の合成ＲＮＡを共注入することを伴う。発現が起こるに適切な時間が経過した後、例えば３５Ｓ−メチオニンなどを用いて細胞のタンパク質に代謝的に標識を２４時間かけて付けた後、細胞溶解産物と細胞培養物上澄み液を収穫して、それらにヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質に向かうポリクローナル抗体による免疫沈澱を受けさせる。
【００６７】
宿主細胞に入っているヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の濃度を免疫親和性および／またはリガンド親和性技術で量化する。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを発現する細胞に発現したヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット分子の数に関する検定を細胞膜に結合した放射性［リガンド］の量を測定することで受けさせることができる。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに特異的な親和性を示すビード（ｂｅａｄｓ）またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに特異的な抗体を用いて例えば３５Ｓ−メチオニンの標識が付いているか或は付いていないヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を単離することができる。標識が付いているヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。標識が付いていないヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の検出をヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに特異的な抗体を用いたウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ検定で行う。
【００６８】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性を検出する他の方法は、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡによるトランスフェクションを受けさせた細胞全体またはヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｍＲＮＡおよび場合によりαナトリウムチャンネルサブユニットｍＲＮＡを注入した卵母細胞内のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性を直接測定することを伴う。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性の測定を、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡを発現する宿主細胞を生物学的に特徴付けることで行う。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを発現する組換え型宿主細胞の場合には、パッチ電圧クランプ技術（ｐａｔｃｈ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｃｌａｍｐ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いてチャンネル活性を測定しかつαナトリウムチャンネルサブユニットのイオン流の変化をヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の関数として量化することができる。卵母細胞の場合には、パッチクランプばかりでなく二電極の電圧クランプ技術を用いてナトリウムチャンネル活性を測定しかつヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を量化することができる。
細胞を基にした検定
本発明は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの化合物による修飾（ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を検出する細胞全体もしくは単離細胞膜方法を提供する。この方法は、段階：
１）機能的ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含有する細胞または単離した細胞膜と化合物を接触させ、そして
２）前記化合物で修飾されたヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット機能に応答して起こる前記細胞または単離した細胞膜の変化を測定する、
段階を含んで成る。
【００６９】
細胞もしくは細胞膜と化合物の接触に要する時間を実験的に決定、例えば公知ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットモジュレーターを用いた時の時間的経過を試験しそして細胞の変化を時間の関数として測定することなどで決定する。
【００７０】
本発明の方法の測定手段は、更に、ある化合物に接触させた細胞もしくは細胞膜を前記化合物に同様には接触させなかった同じ細胞もしくは細胞膜調合物と比較することであると定義可能である。別法として、２種類の細胞、即ち機能的ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含有する細胞とこの１番目の細胞と同じであるが機能的ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含有しない２番目の細胞の両方を用いてもよい。両方の細胞もしくは細胞膜を同じ化合物に接触させることで、この２種類の細胞の間の差を比較する。このような技術はまたそのような検定の背景ノイズを確定する時に用いるにも有用である。本技術分野の平均的な技術者は、そのような制御機構を用いてまた機能的ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの修飾に応答して起こる細胞の変化を容易に選択することができることを理解するであろう。
【００７１】
細胞を基にした特に好適な検定（または適切ならば細胞膜検定）は、細胞に内因性もしくは組換え型のナトリウムαチャンネルサブユニットを組換え型ヒトβ１Ａと同時に発現させる検定である。このような検定では、細胞のβ１Ａ発現が変化したか或はα／β１Ａ複合体の発現が変化した時に起こるナトリウム流の電気生理学的変化に対して推定上のモジュレート化合物が示す影響に関してそれを分析することができる。組換え型ヒトβ１Ａを発現する細胞に、本分野の技術者に良く知られておりかつ本明細書に記述する技術（パッチクランプ電圧技術ばかりでなく膜基部電圧感受性染料を包含）を用いて電圧に差を付けて細胞膜を通り抜けるナトリウムイオン（Ｎａ＋）の全流入量を測定する電気生理学的分析を受けさせる。ヒトβ１の本来の機能に影響を与える化合物は、Ｎａチャンネルを開放する能力を高めるか或は弱くする可能性があるか、Ｎａ流入速度を高めるか或は低くする（このように膜電位の変化に影響を与える）可能性があるか、チャンネルの減感または再増感速度を高めるか或は低くする可能性がある。用語「試験化合物」または「モジュレート化合物（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を本明細書でヒトβ１Ａの推定モジュレーターに関連して用いる場合、これは、ヒトβ１Ａの特異的イオンチャンネル活性もしくは細胞表面発現を乱す可能性がある有機分子を指す。例えば、本発明の範囲を限定するものでないが、化合物には小型の有機分子、合成もしくは天然のアミノ酸ペプチド、タンパク質、または合成もしくは天然の核酸配列、または前記の任意の化学誘導体が含まれ得る。
【００７２】
用語「細胞」は少なくとも１個の細胞を指すが、検出方法の感度に適切な複数の細胞も包含する。本発明で用いるに適した細胞は細菌、酵母または真核生物の細胞である。電気生理学的分析を実施する検定の場合の細胞は真核生物の細胞でなければならず、好適にはアフリカツメガエルの卵母細胞またはＰＣ１２、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞から成る群から選択すべきである。
【００７３】
機能的ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの化合物による修飾を測定する検定方法は、通常の実験室方式または高い処理量に適した方式の方法であってもよい。用語「高い処理量」は、複数のサンプルを同時に容易に分析することを可能にしかつロボットによる操作が可能な検定案を指す。高い処理量の検定の別の所望特徴は、所望の分析を達成しようとする時の反応体の使用量を少なくするか或は操作の数を最小限にするに最適な検定案である。検定方式の例にはウエルが９６個またはウエルが３８４個のプレート、空中に浮かぶ液滴（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ　ｄｒｏｐｌｅｔｓ）、そして液体を取り扱う実験で用いられる「ラブオンナチップ（ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ）」ミクロチャンネルチップが含まれる。本分野の技術者は、プラスチック鋳型が小型化されそして液体を取り扱う器具が進展するか或は改良された検定器具が設計されるにつれて本発明のデザインを用いて実施することができるサンプルの数が多くなって行くであろうことを充分に認識するであろう。
【００７４】
本発明の方法で用いるに適した細胞変化には、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの機能または量の変化を直接測定すること、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット機能の下流の影響を測定、例えば二次的メッセンジャーの濃度または転写の変化を測定すること、またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットによって転写的に影響を受けた遺伝子のタンパク質濃度の変化、または細胞内の表現型の変化を測定することが含まれる。好適な測定手段には、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の量の変化、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの機能的活性の変化、ｍＲＮＡ量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質または分泌タンパク質の変化、またはＣａ＋２、ｃＡＭＰまたはＧＴＰ濃度の変化が含まれる。本明細書では、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの量または機能的活性の変化を記述する。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または差次的遺伝子発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を用いてｍＲＮＡレベルの変化を検出する。量化した免疫親和性、リガンド親和性または酵素測定値は宿主細胞に入っているタンパク質の濃度に関して変化する。タンパク質に特異的な親和性を示すビードまたは特異的な抗体を用いて例えば３５Ｓ−メチオニン標識が付いているか或は付けていないタンパク質を単離する。標識が付いているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。標識が付いていないタンパク質をウェスタンブロット法、蛍光細胞選別による細胞表面検出、細胞画像形成分析、ＥＬＩＳＡ、または特異的な抗体を用いるＲＩＡで検出する。タンパク質が酵素の場合には、フルオロジェニック（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）またはカロリメトリック（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）基質の開裂を用いてタンパク質の誘導を監視する。
【００７５】
細胞表面のタンパク質を検出する好適な手段にはフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）または統計学的細胞画像形成が含まれる。両方の技術とも、興味の持たれるタンパク質を細胞の表面に局在化させ、特異的蛍光を発するプローブで標識し、そして細胞の蛍光度合で検出を行う。フローサイトメトリーでは細胞を溶液の状態で分析する一方、細胞画像形成技術では細胞の場（ｆｉｅｌｄ）を相対的蛍光に関して比較する。
【００７６】
分泌されるタンパク質が酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼまたはプロテアーゼなどの場合の好適な検出手段は蛍光もしくはカロリメトリック酵素検定であろう。アルカリ性ホスファターゼの場合の蛍光／発光／着色基質は商業的に入手可能であり、そのような検定はウエルが複数備わっているプレートを用いた高処理量のスクリーン方式に容易に適合可能である。プロテアーゼの検定では蛍光エネルギー伝達が基になった検定を用いる。発蛍光団およびクエンチャー分子をプロテアーゼのペプチド基質の２つの末端部に組み込む。その特定の基質が開裂を起こすと前記発蛍光団とクエンチャーの分離が起こることで蛍光を検出することができる。分泌されるタンパク質を放射能方法で測定することができる場合には、シンチレーションプロキシミティー（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）技術を用いることができるであろう。興味の持たれるタンパク質の基質を蛍光材料を含有する固体状支持体に被覆または組み込むことでそれらを固定する。放射性分子が酵素反応によって固相のすごく近くに来るとそれによって蛍光材料が励起することで可視光を発する。可視光の発光がリガンド／標的相互作用が成功裏に起こったことを検出する基礎を構成しており、これを適切な監視装置で測定する。シンチレーションプロキシミティー検定の例が１９８６年２月４日に発行された米国特許第４，５６８，６４９号に開示されている。このような種類の検定で用いる材料はＤｕｐｏｎｔ　ＮＥＮ（商標）（ボストン、マサチューセッツ州）から商標名ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（商標）の下で商業的に入手可能である。
【００７７】
内因性遺伝子が表現型細胞構造変化をもたらす場合の好適な検出手段は、細胞の形態または細胞内の表現型変化を統計学的に画像で分析する手段である。例えば、決して限定するものでないが、細胞は形態の変化を起こす可能性があり、例えば表面に対して平らなままであることに対比して丸くなると言った変化を起こす可能性があるか、或は成長−表面非依存性（ｇｒｏｗｔｈ−ｓｕｒｆａｃｅ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）になる可能性があり、このように腫瘍細胞生物学の技術で良く知られている形質転換した細胞表現型に類似してくる可能性があるか、或は細胞は新しい生長物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈｓ）を産出する可能性がある。細胞内で起こり得る表現型の変化には、細胞骨格の変化、新しい遺伝子の転写に応答して起こる小胞体／Ｇｏｌｇｉ複合体の変化、または新しい小胞の産出が含まれる。
【００７８】
内因性遺伝子が細胞内の可溶タンパク質をコードする場合に起こる内因性遺伝子の変化は、細胞溶解産物に含まれている特定のタンパク質の変化を用いて測定可能である。そのような可溶タンパク質は本明細書に記述する方法を用いて測定可能である。
【００７９】
本発明は、また、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現ばかりでなくヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の機能をインビボで修飾する化合物を選別する方法にも向けたものである。化合物は、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の機能を増大または減衰させることで修飾をもたらし得る。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の機能を修飾する化合物をいろいろな検定で検出することができる。そのような検定は発現または機能の変化が起こるか否かを決定する単なる「はい／いいえ」検定であってもよい。試験サンプルの発現または機能を基準サンプルが示す発現または機能のレベルと比較することで検定を定量的に行うことも可能である。本方法で同定したモジュレーターは治療剤の候補品として有用である。
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の精製
組換え型宿主細胞内でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを発現させた後、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を回収することを通して、精製されたヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを活性形態で得ることができる。いくつかのヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット精製手順を利用することができ、使用に適切である。この上に記述したように、天然源に由来するヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを精製する場合には、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーおよび抗体／リガンド親和性クロマトグラフィーをいろいろ組み合わせるか或は個別に適用することで、細胞溶解産物または抽出液からか或は条件付けした培養培地から組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを精製してもよい。
【００８０】
全長の新生（ｎａｓｃｅｎｔ）ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットのポリペプチドフラグメントまたはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの複数のサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成した免疫親和性カラムを用いることで、組換え型ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを他の細胞タンパク質から分離することができる。次に、その親和性樹脂（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅｓｉｎ）を適切な緩衝液、例えば燐酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７．３）などに入れて平衡状態にした後、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットまたはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの複数のサブユニットを含有する細胞培養物の上澄み液または細胞抽出液を前記カラムにゆっくり通す。次に、前記カラムを前記緩衝液で光学密度（Ａ２８０）が背景密度にまで降下するまで洗浄した後、緩衝条件を変え、例えば０．２３Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）などの如き緩衝液を用いてｐＨを下げることなどで、タンパク質を溶離させる。次に、そのようにして精製したヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットタンパク質に適切な緩衝液、例えば燐酸塩緩衝化生理食塩水などを用いた透析を受けさせる。
タンパク質を基にした検定
本発明は、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットタンパク質活性の化合物による修飾を検出するインビトロタンパク質検定方法を提供する。この方法は、段階：
１）化合物とヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を接触させ、そして
２）前記化合物によって起こるヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット機能の変化を測定する、
段階を含んで成る。
【００８１】
細胞と化合物の接触に要する時間を実験的に決定、例えば公知ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットモジュレーターを用いた時の時間的経過を試験しそして変化を時間の関数として測定することなどで決定する。
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに結合する抗体の産出および使用
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）な抗体をヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに反応性を示す抗体が入っている哺乳動物の抗血清から精製するか或はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）に元々記述された技術を用いてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに反応性を示すモノクローナル抗体として調製する。免疫学的技術は本技術分野で良く知られており、例えばＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＩＳＢＮ　０８７９６９３１４２が出版したＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌに記述されている。単一特異的抗体を本明細書で用いる場合、これを、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットに対して均一な結合特性を示す単一の抗体種または複数の抗体種であるとして定義する。「均一な結合」を本明細書で用いる場合、これは、この上に記述したように、抗体種が特異的抗原もしくはエピトープ、例えばヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに関連した抗原もしくはエピトープに結合する能力を指す。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを免疫アジュバントの有り無しで適切な濃度で用いて動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマなど（ウサギが好適である）に免疫を与えることを通して、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに特異的な抗体を生じさせる。
【００８２】
最初の免疫化に先立って免疫化前の血清を集める。受け入れられる免疫アジュバントと一緒にヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを約０．００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲の量で各動物に与える。そのような受け入れられるアジュバントには、これらに限定するものでないが、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈降物、油中水エマルジョン［コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）とｔＲＮＡを含有］が含まれる。初期の免疫化は、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを好適にはフロイント完全アジュバントに入れて複数の部位に皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）または両方で与えることから成る。各動物の採血を規則的間隔、好適には週毎に行って抗体タイターを測定する。この初期免疫化を受けさせた後の動物に二次免疫注射をしてもよいか或はしなくてもよい。動物に二次免疫注射をする場合には、一般に、同じルートで前記抗原を同じ量でフロイント不完全アジュバントに入れて与える。二次免疫注射を最大のタイターが得られるまでほぼ３週間の間隔で与える。二次免疫注射による免疫化を行った場合には各場合とも約７日後にか或は単一の免疫化を行った後には約１週間後に動物の採血を行って、血清を集め、そして一定分量を約−２０℃で貯蔵する。
【００８３】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに反応性を示すモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の調製では、同系交配マウス、好適にはＢａｌｂ／ｃにヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットによる免疫を与えることを通して調製を行う。マウスにヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを約０．００１ｍｇから約１．０ｍｇ、好適には約０．１ｍｇ［これを、この上で考察したように、約０．１ｍｌの緩衝液または生理食塩水（これを等しい体積の受け入れられるアジュバントに添加しておく）に入れておく］を用いた免疫化をＩＰもしくはＳＣルートで受けさせる。フロイントアジュバントが好適であり、初期の免疫化でフロイント完全アジュバントを用いそしてその後にフロイント不完全アジュバントを用いる。マウスに初期免疫化を０日に受けさせて約２から約３０週間休ませる。免疫化を受けさせたマウスに約０．００１から約１．０ｍｇのヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット［これを緩衝液、例えば燐酸緩衝生理食塩水などに入れておく］を静脈（ＩＶ）ルートで与える二次免疫注射を１回以上受けさせる。
【００８４】
免疫化を受けさせたマウスから脾臓を本技術分野で公知の標準的手順で取り出すことを通して、抗体陽性のマウスからリンパ球、好適には脾臓のリンパ球を得る。この脾臓のリンパ球を適切な融合相手、好適にはミエローマ細胞と一緒に安定なハイブリドーマの生成を可能にする条件下で混合することを通して、ハイブリドーマ細胞を生じさせる。融合相手には、これらに限定するものでないが、マウスのミエローマであるＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれ得、一般にＳｐ２／０が好適である。抗体を産出する細胞とミエローマ細胞を約１０００モル重量％の量のポリエチレングリコール中で約３０％から約５０％の濃度で融合させる。本技術分野で公知の手順を用いて、ヒポキサンチンとチミジンとアミノプテリンを補充しておいたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で増殖させることを通して、融合したハイブリドーマ細胞を選択する。約１４、１８および２１日目に増殖陽性ウエルから上澄み液を集めて、これにヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを抗原として用いた免疫検定、例えば固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）またはＥＬＩＳＡなどによる選別を抗体産出に関して受けさせる。また、その培養液にＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ沈澱検定試験を受けさせることでｍＡｂのイソタイプを測定することも可能である。Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９７３）の中のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ著「Ｓｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」のソフトアガー（ｓｏｆｔ　ａｇａｒ）技術または制限希釈（ｌｉｍｉｔｅｄ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）技術などの如き技術を用いて、抗体陽性ウエルから得たハイブリドーマ細胞をクローン化する。
【００８５】
プリスタンによる感作を受けさせておいた（ｐｒｉｓｔａｎｅ　ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウス（マウス１匹当たりに約０．５ｍｌ）に約１ｘ１０６から約６ｘ１０６個のハイブリドーマ細胞を感作後少なくとも約４日後に注入することを通して、モノクローナル抗体をインビボで生じさせる。細胞転移後約８−１２日目に腹水液を集めた後、モノクローナル抗体を本技術分野で公知の技術で精製する。
【００８６】
前記ハイブリドーマを本技術分野で良く知られた組織培養培地中で増殖させることを通して、抗−ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｍＡｂのインビボ産出を実施する。本技術分野で良く知られた中空繊維培養技術、エアリフト（ａｉｒ　ｌｉｆｔ）反応槽、ローラーボトルまたはスピナーフラスコ培養技術を用いて、高密度のインビトロ細胞培養を実施することで抗−ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｍＡｂを多量に生じさせてもよい。このｍＡｂの精製を本技術分野で公知の技術を用いて行う。
【００８７】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体タイターをいろいろな血清学もしくは免疫学検定で測定するが、そのような検定には、これらに限定するものでないが、沈澱、受動凝集、エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術が含まれる。同様な検定を用いてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットが体液または組織および細胞抽出液中に存在するか否かを検出する。
【００８８】
単一特異的抗体を産出させる前記方法を用いてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットポリペプチドフラグメントまたは全長の新生ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットポリペプチドまたは個々のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの複数のサブユニットに特異的な抗体を産出させることができることは本分野の技術者に容易に明らかであろう。具体的には、ただ１種のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットまたは完全に機能的なヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質に特異的な単一特異的抗体を生じさせることができることは本分野の技術者に容易に明らかであろう。また、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質の正常な機能を抑制する単一特異的抗体を生じさせることができることも本分野の技術者に明らかであろう。
【００８９】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体をゲル支持体に前記抗体が前記ゲルビード支持体と一緒に共有結合を形成するように添加することを通して、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体親和性カラムを作成する。前記抗体にアミン、アルデヒドまたはスルフヒドリル残基を含めることを通して、好適な共有結合を形成させる。抗体にアルデヒドまたは遊離のスルフヒドリル基を生じさせる方法は本技術分野で良く知られており、アミン基は例えばＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルに反応性を示す。
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット特異的反応体含有キット組成物
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットに対する抗体またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を含有するキット（ｋｉｔｓ）を製造することができる。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡにハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）ＤＮＡを検出するか或はヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質もしくはペプチドフラグメントがサンプルに存在するか否かを検出する目的でそのようなキットを用いる。そのような特徴付けはいろいろな目的で用いるに有用であり、その目的には、これらに限定するものでないが、法医学的分析、診断用途および疫学試験が含まれる。
【００９０】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換え型タンパク質および抗体を用いてヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡ、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＲＮＡまたはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を選別しかつそれらの濃度を測定することができる。本組換え型タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体のそれぞれを用いてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの検出および分類分けで用いるに適したキットを作成することも可能である。そのようなキットに少なくとも１個の容器を密に封じ込めるに適した区分室に分けた（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）担体を含めることになるであろう。そのような担体に更にヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを検出するに適した反応体、例えば組換え型ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質または抗−ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体なども入れることになるであろう。そのような担体にまた検出手段、例えば標識を付けた抗原または酵素基質などを入れてもよい。
遺伝子治療
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をアンチセンス治療の目的で合成することができる。そのようなアンチセンス分子はＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体、例えばホスホロチオエートまたはメチルホスホノエートなど、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体、例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなど、または他のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットアンチセンスオリゴヌクレオチド模擬物であってもよい。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットアンチセンス分子を細胞にミクロインジェクション、リポソームカプセル封じまたはアンチセンス配列を持つベクターを用いた発現などで導入してもよい。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットアンチセンス治療は特にヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性を低くすることが有益である病気の治療で用いるに有用であり得る。
【００９１】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子治療を用いてヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを目標有機体の細胞に導入してもよい。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡの転移を媒介するウイルスであるベクターにヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子を結合させて、これを移植宿主細胞に感染させてもよい。適切なウイルスであるベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。別法として、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡを遺伝子治療を受けさせる細胞に非ウイルス技術で転移させることも可能であり、そのような非ウイルス技術には、リガンド−ＤＮＡ接合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ接合体を用いた受容体媒介標的ＤＮＡ転移、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）膜融合または直接ミクロインジェクションが含まれる。そのような手順およびこれらの変形はエクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）ばかりでなくインビボヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子治療で用いるに適する。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子治療は特にヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット活性を高くすることが有益である病気の治療で用いるに有用であり得る。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子を用いる用途に適した遺伝子治療の分子方法論のプロトコルがＰａｕｌ　Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ編集の「Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔａｗａ　ＮＪ、１９９６）に記述されている。
薬剤組成物
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＤＮＡ、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットＲＮＡもしくはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質またはヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットレセプタ活性のモジュレーターを含んで成る薬学的に有用な組成物の調合を公知方法、例えば薬学的に受け入れられる担体を混合する方法などに従って実施することができる。そのような担体および調合方法の例をＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができる。有効な投与で用いるに適した薬学的受け入れられる組成物を生じさせる時、そのような組成物に前記タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはモジュレーターを有効量で含有させる。
【００９２】
本発明の治療もしくは診断用組成物を個人にヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット関連活性の変化が表れるに充分な量で投与することで病気の治療または診断を行う。その有効量は多様な要因、例えば個人の状態、体重、性および年齢などに応じて変わり得る。他の要因には投与様式が含まれる。この薬剤組成物を個人にいろいろなルート、例えば皮下、局所、経口および筋肉内などで与えることができる。
【００９３】
用語「化学誘導体」は、通常は基本的分子の一部ではない追加的化学部分を含有する分子を記述する用語である。そのような部分は基本的分子の溶解性、半減期、吸収などを向上させ得る。別法として、そのような部分は、基本的分子の望ましくない副作用を減少させるか或は基本的分子の毒性を減少させ得る。そのような部分の例が多様な情報源、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどに記述されている。
【００９４】
本明細書に開示する方法に従って同定した化合物を単独でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットレセプタまたはこれの活性の最適な抑制を得ると同時にいくらか与え得る毒性が最小限になるように常規試験を用いて限定した適切な投薬量で用いることができる。加うるに、他の作用剤を一緒に投与するか或は逐次的に投与するのも望ましい可能性がある。
【００９５】
本発明の目的はまた本発明の新規な治療方法で用いるに適した局所、経口、全身および非経口薬剤調合物を提供することにある。本発明に従って同定した化合物またはモジュレーターをヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの修飾で用いるに適した活性材料として含有する組成物を投与に通常の媒体に入れた幅広く多様な治療投与形態で投与することができる。例えば、そのような化合物またはモジュレーターを錠剤、カプセル［各々に徐放性（ｔｉｍｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ）調合物が入っている］、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、溶液、懸濁液、シロップおよび乳液などの如き経口投薬形態でか或は注射で投与してもよい。それらをまた静脈内（丸薬および輸液の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞を伴うか或は伴わない）または筋肉内形態で投与することも同様に可能であり、これらの使用形態は全部薬剤技術の通常の技術者に良く知られている。この所望化合物を有効量であるが無毒な量でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット修飾剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）として用いることができる。
【００９６】
このような製品の１日当たりの投薬量は１人の患者に１日当たり０．０１から１，０００ｍｇの幅広い範囲に渡って多様であり得る。経口投与の場合には、そのような組成物を、好適には、治療を受けさせるべき患者の症状によって投薬量を調整して活性材料が０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラム入っている錠剤（刻み目が付いているか或は付いていない）の形態で与える。そのような薬剤を有効量で通常は１日に体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇから約１００ｍｇの投薬レベルで与える。その範囲はより特別には１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから１０ｍｇである。所望効果を達成する目的でヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットレセプタモジュレーターを組み合わせる時にはその投薬量を調整する。他方、いずれかの作用剤を単独で用いた場合に比べて症状が軽くなる場合には、そのようないろいろな作用剤の投薬量を個別に最適にして組み合わせることで相乗的結果を達成することも可能である。
【００９７】
有利には、本発明の化合物またはモジュレーターを日に１回の投薬量で投与してもよいか、或は１日当たりの投薬量全体を１日当たり２回、３回または４回に分けて投与することも可能である。その上、本発明の化合物またはモジュレーターを鼻孔内形態で適切な鼻孔内用媒体を局所的に用いることで投与してもよいか、或は本分野の通常の技術者に良く知られた経皮パッチ形態で用いて経皮ルートで投与することも可能である。投与を経皮搬送系形態で行う場合には、勿論、投薬の投与を投薬管理（ｄｏｓａｇｅ　ｒｅｇｉｍｅｎ）全体に渡って間欠的に行うのではなくむしろ連続的に行う。
【００９８】
活性剤が個別の投薬調合物の状態の２種以上の活性剤を組み合わせて用いて治療を行う場合には、そのような活性剤を同時に投与してもよいか、或はそれらの各々を個別に分けて交互に投与してもよい。
【００９９】
本発明の化合物またはモジュレーターを用いた投薬管理を多様な要因に応じて選択するが、そのような要因には、患者の種類、種、年齢、体重、性および医学的状態、治療を受けさせるべき状態のひどさ、投与ルート、患者の腎または肝機能、そして用いる個々の化合物が含まれる。通常の技術を持つ医者または獣医はそのような状態の進行を防止、対抗または阻止するに要する有効な薬剤量を容易に決定して処方することができるであろう。毒性なしに効力をもたらす範囲内の薬剤濃度を達成しようとする時の精度を最適にするには、その薬剤を目標部位が利用する速度を基準にした管理を行う必要がある。これは薬剤の分布、平衡状態および排出の考慮を伴う。
【０１００】
本発明の方法では、本明細書に詳細に記述する化合物もしくはモジュレーターが活性材料を構成するようにしてもよく、そしてこれを典型的には適切な薬剤希釈剤、賦形剤または担体（これらを本明細書では総括的に「担体」材料と呼ぶ）と混合して投与するが、そのような担体を意図した投与形態、即ち経口用錠剤、カプセル、エリキシル、シロップなどに関係させて適切に選択しかつ通常の薬学的実施に一致させる。
【０１０１】
例えば、錠剤またはカプセルの形態の経口投与の場合には、活性薬剤成分を無毒で薬学的に受け入れられる不活性な経口用担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと一緒にしてもよい。その上、望まれるか或は必要な時には、また、適切な結合剤、滑剤、崩壊剤および着色剤をそのような混合物に添加することも可能である。適切な結合剤には、これらに限定するものでないが、澱粉、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはβ−ラクトースなど、トウモロコシ甘味剤、天然および合成ゴム、例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなど、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。そのような投薬形態で用いる滑剤には、これらに限定するものでないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、これらに限定するものでないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが含まれる。
【０１０２】
液状形態の場合には、活性薬剤成分を適切な風味の懸濁もしくは分散剤、例えば合成および天然ゴムなど、トラガカント、アカシア、メチルセルロースなどと一緒にしてもよい。使用可能な他の分散剤にはグリセリンなどが含まれる。非経口投与の場合には無菌懸濁液および溶液が望まれる。静脈内投与が望まれる場合には一般に適切な防腐剤を含有させた等張性調合物を用いる。
【０１０３】
活性薬剤成分を含有させた局所用調合物を本技術分野で良く知られた多様な担体材料、例えばアルコール、アロエベラゲル（ａｌｏｅ　ｖｅｒａ　ｇｅｌ）、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチルなどと一緒に混合して、例えばアルコール溶液、局所用洗浄液、洗浄用クリーム、スキンゲル、スキンローション、そしてクリームもしくはゲル調合物の状態のシャンプーなどを生じさせてもよい。
【０１０４】
本発明の化合物もしくはモジュレーターをまたリポソーム搬送系、例えば小型の単層ベシクル（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、大型の単層ベシクルおよび多層ベシクルなどの形態で投与することも可能である。リポソームを多様な燐脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどから生じさせることも可能である。
【０１０５】
また、モノクローナル抗体を個々の担体として用いて前記担体に本発明の化合物の分子を結合させることを通して、本発明の化合物を搬送することも可能である。また、本発明の化合物もしくはモジュレーターを標的可能（ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ）薬剤担体としての可溶重合体に結合させることも可能である。そのような重合体にはポリビニル−ピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されているポリエチレンオキサイドポリリシンが含まれ得る。更に、本発明の化合物もしくはモジュレーターを薬剤の徐放を達成するに有用な種類の生分解性重合体、例えばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、そして架橋もしくは両親媒性ブロック共重合体であるヒドロゲルに結合させてもよい。
【０１０６】
経口投与の場合には、本化合物もしくはモジュレーターをカプセル、錠剤または丸薬形態で投与してもよいか、或は別法としてそれらを動物の餌に混ぜてもよい。そのようなカプセル、錠剤および丸薬を本活性材料に加えて適切な担体媒体、例えば澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは燐酸ジカルシウムなどで構成させる。そのような単位投薬形態の調製では、本活性材料を均一な混合物が得られるように適切な微粉の不活性材料と一緒に密に混合することで調製を行うが、そのような不活性材料には、希釈剤、充填材、崩壊剤および／または結合剤が含まれる。不活性材料は、本化合物とも本モジュレーターとも反応せずかつ治療を受けさせる動物に対して無毒の材料である。適切な不活性材料には澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴムおよび油などが含まれる。このような調合物の活性材料含有量および不活性材料含有量はいろいろな要因、例えば治療を受けさせるべき動物種の大きさおよび種類、そして感染の種類およびひどさなどに応じて幅広く多様な量であり得る。また、本化合物を単に餌と一緒に混合するか或は本化合物を餌の表面に塗布することで本活性材料を餌への添加剤として投与することも可能である。別法として、本活性材料を不活性な担体と一緒に混合した後、その結果として得た組成物を餌と一緒に混合するか或は動物に直接与えてもよい。適切な不活性担体にはコーンミール、シトラスミール、発酵残渣、大豆グリット、乾燥穀物などが含まれる。本活性材料をそのような不活性担体と一緒に最終組成物の活性材料含有量が０．００１から５重量％になるように粉砕、撹拌、製粉または揺らすことで密に混合する。
【０１０７】
別法として、本活性材料を不活性な液状担体に溶解させることで構成させた調合物を注射することで本化合物もしくはモジュレーターを非経口で投与することも可能である。注射は筋肉内、管内、気管内または皮下のいずれであってもよい。このような注射可能調合物を、適切な不活性液状担体と混合した本活性材料で構成させる。受け入れられる液状担体には植物油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油などばかりでなく有機溶媒、例えばソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセロールホルマールなどが含まれる。代替として、また、水性の非経口用調合物を用いることも可能である。植物油が好適な液状担体である。本活性材料を液状担体に最終調合物の活性材料含有量が０．００５から１０重量％になるように溶解または懸濁させることで、そのような調合物の調製を行う。
【０１０８】
本化合物もしくはモジュレーターを局所に塗布する場合、これは、本化合物もしくはモジュレーターを含有させた液状ドレンチ（ｄｒｅｎｃｈ）またはシャンプーを水溶液もしくは懸濁液として用いることで局所塗布可能である。このような調合物に一般に懸濁剤、例えばベントナイトなどを含有させかつ通常はまた消泡剤も含有させる。本活性材料の含有量が０．００５から１０重量％の調合物が受け入れられる調合物である。好適な調合物は本化合物もしくはモジュレーターの含有量が０．０１から５重量％の調合物である。
【０１０９】
以下に示す実施例で本発明の説明を行うが、しかしながら、本発明をそれに限定するものでない。
【０１１０】
実施例１
ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのクローニング
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）：マラソン−レディー（Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ）ＴＭヒト副腎ｃＤＮＡライブラリー（カタログ番号７４３０−１）をクローンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ） から購入した。一次Ｒａｃｅ　ＰＣＲは５０μｌ最終体積中で行った。反応混合物は、マラソン−レディーＴＭヒト副腎ｃＤＮＡ５μｌ、１０ｘ反応緩衝液５μｌ、２００μＭ　ｄＮＴＰ、２００ｎＭ　ＡＰ１プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 、５’−ＣＣＡ　ＴＣＣ　ＴＡＡ　ＴＡＣ　ＧＡＣ　ＴＣＡ　ＣＴＡ　ＴＡＧ　ＧＧＣ−３’、配列番号０１）、２００ｎＭ　ヒトナトリウムチャンネルβ１サブユニット特異性プライマーＳＢ１−１０（５’−ＴＧＧ　ＡＣＣ　ＴＴＧ　ＣＧＣ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　ＡＣＴＧ−３’、配列番号０２）および５０ｘアドヴァンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ） ２　ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｌを含む。ＲＡＣＥ−ＰＣＲの熱サイクルパラメーターは：最初の変性を９４℃で３０秒間、９４℃／５秒間および７２℃／４分間の５サイクル、９４℃／５秒間および７０℃／４分間の５サイクル、および９４℃／５秒間および６８℃／４分間の２０サイクルであった。
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物の評価：ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応の品質は、ヒトナトリウムチャンネルβ１ サブユニットのカルボキシル末端が増幅されたかどうかを試験して評価した。これは、鋳型としてＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物１μｌ、および２種のヒトナトリウムチャンネルβ１ サブユニット特異性プライマー２００ｎＭを用いるＰＣＲにより行った。特異性プライマーは：ＳＢ１−１０の下流に位置する前進プライマーＳＢ１−１１（５’−ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＧＣ　ＴＴＣ　ＧＡＧ−３’、配列番号３）およびヒトナトリウムチャンネルβ１ サブユニットの末端に位置する逆プライマーＳＢ１−１３（５’−ＣＴＡ　ＴＴＣ　ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＣＴＧ　ＧＡＣ　ＧＣＣ−３’、配列番号４）であった。ＰＣＲ反応パラメーターは：最初の変性を９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の延伸の３０サイクルであった。予想されたように、強い０．５ｋｂ　ＤＮＡフラグメントが観察され、これはＲＡＣＥ−ＰＣＲがヒトナトリウムチャンネルβ１ サブユニットのカルボキシル末端の増幅に成功したことを示唆する。
ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター内へのＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物のクローニング：ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＣＡ）を用いて会社提供のプロトコールに従ってクローニングした。要約すると、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を最初にストラタプレプ（ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ）ＰＣＲ精製カラムにより精製した。次いで、精製ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物１０μｌ、ポリッシング緩衝液１．３μｌ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ　１μｌおよびクローニングされたＰｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ／μｌの１μｌを含む最終体積１３μｌ中で、精製したＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物１０μｌを７２℃、３０分間で平滑末端化した。平滑末端化ＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物４．５μｌ、１０ｎｇ／μｌｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔクローニングベクター１μｌ、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ１０ｘ反応緩衝液１μｌ、１０ｍＭ　ｒＡＴＰ０．５μｌ、ＳｒｆＩ制限酵素５Ｕ／μｌの１μｌおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼの４Ｕ／μｌの１μｌを含む最終体積１０ｍｌ中で、連結を室温、１時間で行った。連結反応は、試料を６５℃で１０分間加熱して停止し、そして最後に、連結混合物２μｌをＸＬ１０−ゴールド（Ｇｏｌｄ）細菌中に形質転換した。
ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａクローンの同定：ヒトナトリウムチャンネルβ１ サブユニット特異性プライマーをβ１Ａサブユニットのカルボキシル末端のＲＡＣＥ−ＰＣＲに使用したので、理論的には、β１ およびβ１Ａサブユニットの双方がクローニングされる。β１ サブユニットを排除するために、β１ サブユニットの特異性増幅のためのプライマーの対を用いて、個々にクローンをＰＣＲにより特性決定した。ＰＣＲに使用したプライマーは：前進プライマーＳＢ１−１７（５’−ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＡＴＧ−３’、配列番号５）および逆プライマーＳＢ１−１３（上記）であった。ＰＣＲ反応パラメーターは：最初の変性を９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の延伸の３０サイクルであった。すべてのＰＣＲ陰性クローンは非β１ サブユニットでありそしてさらに配列分析を行った。
ヒト胎児脳ｃＤＮＡのナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのクローニング：ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより得られたヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット特異性プライマーを用いて、ナトリウムチャンネルβ１Ａもマラソン−レディーＴＭヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号７４０２−１１、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）よりクローニングした。ＰＣＲは、マラソン−レディーＴＭヒト副腎ｃＤＮＡ５μｌ、１０ｘ反応緩衝液５μｌ、２００μＭ　ｄＮＴＰ、２００ｎＭ　ＳＢ−１−６プライマー（５’−ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣ−３’、配列番号６）およびＳＢ１−１９プライマー（５’−ＧＴＧ　ＴＧＣ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＡＡ−３’、配列番号７）および５０ｘアドヴァンテージ２ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｌを含む最終体積５０μｌ内で行った。ＰＣＲ反応パラメーターは、最初の変性を９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の延伸の３０サイクルであった。４種の独立したクローンを採取しそして二重染色ＤＮＡ配列分析にかけた。すべての４種のヒト胎児脳からの独立したクローンは、ヒト副腎からのＲＡＣＥ−ＰＣＲクローニングしたβ１Ａサブユニットと一致する配列を有する。ヒトβ１Ａ核酸のコード領域を配列番号１２に示しそして非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むすべての単離されたｃＤＮＡを配列番号１３に示す。５’非翻訳領域は、ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１サブユニットと同様である。３’非翻訳領域は、ポリＡトラクト（ｔｒａｃｔ） を除いて長さ約１６０ｂｐであった。翻訳は、ヌクレオチド４で始まるＡＴＧで開始しそしてヌクレオチド８０８の終止コドンで終わる。
【０１１１】
実施例２
ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットタンパク質の一次構造およびβ１およびβ１Ａ遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ）のゲノム構造。
【０１１２】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ技術を用いて、新規のヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットをクローニングした。ｃＤＮＡは、２６８アミノ酸の８０７塩基対コード領域および１６４塩基対３’非翻訳領域を含んでいた。翻訳されたアミノ酸配列を配列番号１４に示しそしてこれはシグナル配列および潜在的Ｎ−連結グリコシル化部位ならびに膜貫通ドメインを含む。β１Ａと呼ばれるクローンは、ナトリウムチャンネルβ１サブユニットに関係している。ナトリウムチャンネルβ１サブユニットファミリー内に見いだされる保存されたモチーフは、シグナルペプチド配列、細胞外免疫グロブリン折りたたみドメインおよびカルボキシル末端膜貫通ドメインを含む。予想されたペプチドは、アミノ酸１７〔アラニン〕から始まる成熟タンパク質をもたらすシグナル切断残基を強く予示する配列を有する疎水性アミノ末端残基（１−１６残基）を含む。疎水性カルボキシル末端残基（２４３−２６２残基）は、膜貫通ドメインとして作用するであろう。推定タンパク質分子量は、アミノ末端からシグナルペプチドを除去した後で約２８．８ｋＤである。クローニングしたヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットは、８−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、３２ｋＤの見かけＭｒで移動する。ペプチド配列比較は、予示されたペプチドが、ヒトナトリウムチャンネルβ１サブユニットおよびラットＶＧＳＣ　β１Ａサブユニットの双方に７２％一致することを明らかにする。ラットナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットと同様に、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットもヒトβ１サブユニットと１００％一致するアミノ末端領域（１−１４９）およびヒトβ１サブユニットのものに１７％以下の一致を有する新規のカルボキシル末端領域（１５０−２６８）を含む（図１）。ヒトナトリウムチャンネルβ１サブユニット遺伝子、ＳＣＮ１Ｂ（Ｍａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ． １９９４）のゲノム構成研究は、遺伝子が染色体１９上で６個のエキソンおよび５個のイントロンを有して約９ｋｂにわたる（１９ｑ１３．１−ｑ１３．２）ことを明らかにした。ヒトゲノム配列のブラスト（ｂｌａｓｔ） サーチは、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのアミノ末端領域（１−１４９）がエキソン１−３でコードされ、一方新規のカルボキシル末端領域は、エキソン３に隣接するイントロン３によりコードされることを明らかにした（図２）。β１とβ１ＡサブユニットｃＤＮＡとの間のダイバージェンスの部位はＳＣＮ１Ｂ遺伝子のエキソン３−イントロン３境界に正確に位置するので、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットは、インフレームの終止コドンを有する保持されたイントロンを介するβ１サブユニットのスプライシング変種と考えるべきである。しかし、ヒトＶＧＳＣ　β１Ａサブユニットのカルボキシル末端領域は、ラットＶＧＳＣ　β１Ａサブユニットに３３％以下の一致である。ラットβ１Ａカルボキシル末端をコードするｃＤＮＡを用いるヒトゲノム配列のブラストサーチは、ヒトβ１遺伝子内にいかなる相同性領域も発見できず、これはラットおよびヒトのβ１Ａカルボキシル末端の双方がイントロン３によりコードされそして相違は種の違いによることを強く示唆する。
【０１１３】
ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのカルボキシル末端配列を用いるＮＩＨデータベースのブラストサーチは、５種の標準化されたｃＤＮＡライブラリーのプールよりクローニングされた、ヒトＥＳＴデータベース内の未帰属クローン（受託番号ＡＩ７４２３１０）も明らかにした。クローンＡＩ７４２３１０は、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａのカルボキシル末端領域（１５０−２６８残基）より短いが１００％一致した。同様のブラストサーチは、他のいかなるデータベースからでも２５％を越える一致配列を明らかにできなかった。
【０１１４】
実施例３
ポリクローナル抗体の生成
ヒトβ１Ａサブユニットのカルボキシル末端から誘導した２種のペプチド配列（ＨＢ１Ａ−１およびＨＢ１Ａ−２）が、ラビット中にポリクローナル抗体を生成させるために選ばれた。アミノ酸配列は：（ＨＢ１Ａ−１）ＡＣ−ＲＷＲＤＲＷＱＡＶＤＲＴＧＣ−ＡＭＩＤＥ（配列番号０８）および（ＨＢ１Ａ−２）ＡＣ−ＣＶＰＨＲＲＳＧＹＲＴＱＬ−ＡＭＩＤＥ（配列番号０９）であった。ペプチドを合成しそして抗体を生成しそしてＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃにより精製した。抗体は、抗原ペプチドに対してＥＬＩＳＡにより試験し同じペプチドを用いてアフィニティー精製した。血清およびアフィニティー精製した抗体を免疫分析、例えばウエスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学および免疫組織化学に使用した。
【０１１５】
実施例４
ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの生体外翻訳分析
ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットのｃＤＮＡを最初に、生体外転写および翻訳の高い効率のために操作したｐＡＧＡ３ベクター内にサブクローニングした。要約すると、ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットをコードするｃＤＮＡフラグメントを、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを用いる消化によりｐｃＤＮＡ３．１構築物より切除した（実施例６参照）。約９００ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲルにより分離しそしてキアクイックスピン（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ） 精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ベクターｐＡＧＡ３もＮｃｏＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて消化した、精製した線状ベクターをｃＤＮＡフラグメントと結合しそして細菌内に形質転換した。組換え体を単離しそして制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認した。ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの生体外翻訳は、ＴｎＴＴＭ　Ｔ７クイックカプルド（Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ） 転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ） を用い、販売者の推奨するプロトコールに従って行った。要約すると、１μｇのｈβ１Ａ／ｐＡＧＡ３構築物を、〔３５Ｓ〕メチオニン（１０Ｃｉ／ｍｌで１０００Ｃｉ／ｍｍｍｏｌ）２μｌを含むＴＮＴクイックマスター（Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ）混合物４０μｌに最終体積５０μｌ中で加えた。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベーションした。反応混合物５μｌを等量のＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷緩衝液と混合しそして分析のために８−２０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。電気泳動の後に、クーマシーブルーＲ２５０を用いてゲルを染色し、乾燥しそしてＸ線フィルムに暴露した。ヒトβ１およびヒトβ１Ａの双方共に、相当する核酸配列からのアミノ酸配列の翻訳により予測された分子量に移動した。
【０１１６】
生体外で翻訳されたヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを、ウエスタンブロットおよび免疫沈降法により分析した。
【０１１７】
実施例５
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット発現のノーザンブロット分析
ノーザンブロットは、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットの組織分布を分析するために使用した。ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａの２１７−２６８残基をコードするｃＤＮＡフラグメントをプローブとして使用した。プローブを作製するために、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａの全長ｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物（ＮＱＣ１３０）から、ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａ特異性プライマーＳＢ１−２５（５’−Ｔ　ＣＡＡ　ＡＧＣ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＴＣ　ＣＣ−３’、配列番号１０）およびＳＢ１−２０（５’−ＴＣＡ　ＡＡＣ　ＣＡＣＡＣＣ　ＣＣＧ　ＡＧＡ　ＡＡ−３’、配列番号１１）を用いて１５３ｂｐＤＮＡフラグメントを最初に増幅した。増幅の後に、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に直接クローニングしそしてＤＮＡ配列決定によりさらに確認した。得られた構築物ＮＱＣ２２６を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し次いでＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム抽出の後に沈降した。プローブを標識するために、アンチセンスｃＤＮＡフラグメントをＳｔｒｉｐ−ＥＺＴＭＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ ＴＸ） を用いて線状に増幅した。反応は、２５ｎｇ線状化ＮＱＣ２２６、１０ｘ反応緩衝液２μｌ、１０ｘｄＮＴＰ溶液２μｌ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ〔α−３２Ｐ〕−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２μｌ、１Ｕ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびＳＢ１−２０プライマーの１０ｐｍｏｌ／μｌの２μｌを含み最終体積２０μｌ内で行った。ＰＣＲ反応パラメーターは：最初の変性が９４℃で１分間、次いで９４℃で２０秒間の変性、５５℃で２０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の延伸の３５サイクルであった。次いで、標識したプローブを遊離の〔α−３２Ｐ〕ｄＡＴＰからマイクロスピン（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ） ＴＭＧ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分離した。
【０１１８】
ヒトＭＴＮＴＭ（Ｍｕｉｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ） ブロット（カタログ番号７７６０−１）およびヒト脳ＭＴＮＴＭブロットＩＩ（７７５５−１）をクローンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ） から購入した。ブロットを５ｍｌウルトラハイブ（ＵｌｔｒａＨｙｂ）溶液（Ａｍｂｉｏｎ， ＴＸ）を用いて、４２℃で２時間で前ハイブリダイゼーションし、次いでヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのプローブ１ｘ１０６ ｃｐｍ／ｍｌの存在下、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ブロットを０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の２ｘ２００ｍｌを用いて、６５℃で２時間洗浄した、最後に、ブロットをＸ線フィルムに−８０℃フリーザー中で一晩暴露した。
【０１１９】
ヒトβ−アクチンをコードする２．０ｋｂ　ｃＤＮＡフラグメントを対照プローブとして使用した。同じブロットを６８℃で１５分間、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）により提供されたＳｔｒｉｐ−ＥＺＴＭ除去キットを用いてストリップした。次いでブロットを５ｍｌウルトラハイブ溶液を用いて４２℃で２時間で前ハイブリダイゼーションし、次いでヒトβ−アクチンプローブの存在下で２時間、４２℃でハイブリダイゼーションした。ブロットを０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液の２ｘ２００ｍｌを用いて、６８℃で２時間洗浄した、最後に、ブロットをＸ線フィルムに−８０℃フリーザー中で一晩暴露した。
【０１２０】
ノーザンブロット分析は、ＶＧＳＣβ１Ａサブユニットが、ヒト脳および骨格筋の大部分の領域内で高度に発現されたが、しかしこれらの限定はされなかったことを明らかにした。低いレベルの発現は、心臓、胎盤、肝臓、腎臓および膵臓内に観察された、脳内で、ＶＧＳＣβ１Ａサブユニットは小脳領域内で最も高度に発現された。ＶＧＳＣβ１Ａサブユニット転写産物の大きさは、種々の組織中でわずかに変動した。しかし、主要な転写産物は約７．５ｋｂの大きさであった。
【０１２１】
実施例６
哺乳動物発現ベクター内へのヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡのクローニング
ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットのｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットをコードするｃＤＮＡフラグメントをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＮＱＣ１２８）からＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いる消化により切除し、アガロースゲル電気泳動により分離しそしてキアクイックスピン精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏもＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて線状化しそして精製し、そしてＮＱＣ１２８から単離されたｈｂ１ＡのｃＤＮＡフラグメントを用いて連結した。組換え体を単離し、そして制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認した。次いでヒト神経芽腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）をスーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ， Ｑｉａｇｅｎ） によりトランスフェクションするために販売者のプロトコールに従ってクローンＮＱＣ１４１（ｈβ１Ａ／ｐＩＲＥＳｎｅｏ）を使用した。安定な細胞クローンはＧ４１８の存在下での培養により選択される。単一のＧ４１８耐性クローンを単離しそして不変のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子を含むことを示す。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを含むクローンを発現に関して、免疫学的技術、例えばウエスタンブロット、免疫沈降、およびヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質に対して特異性の抗体を用いる免疫蛍光を用いて分析する。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット配列から予測されるアミノ酸配列から合成されるペプチドを用いて接種されたラビットから抗体を得る。発現は、ナトリウム流入アッセイを用いても分析される。
【０１２２】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入した。ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットをコードするｃＤＮＡフラグメントをＮＱＣ１３０プラスミドからＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いる消化により切除し、そしてｃＤＮＡ挿入物をアガロースゲル電気泳動により単離しそしてキアクイックスピン精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ベクター、ｐｃＤＮＡ３をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そして線状ベクターを電気泳動により単離し、そしてｃＤＮＡ挿入物と連結した。ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを含む組換えプラスミドを単離し、そして制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認した、クローンＮＱＣ１３９（ｈβ１Ａ／ｐｃＤＮＡ３．１）を、スーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）によりヒト神経芽腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）を一過性にトランスフェクションするために使用しそしてナトリウム流入のモジュレーションに対するｈｂ１Ａの機能をナトリウム流入アッセイにより試験した。
【０１２３】
ヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットを安定または一過性に発現する細胞を、チャンネルの発現のためおよびリガンド結合活性のための試験に使用する。チャンネルをモジュレート、阻害または活性化するためおよび放射性リガンド結合に関して競合するための能力に関して他の化合物を同定および試験するためにこれらの細胞を使用する。
【０１２４】
ヒトナトリウムチャンネルβ１ＡサブユニットｃＤＮＡをプロモーターに関して正方向に含むカセットをプロモーターの適当な制限部位３’内に連結し、そして制限部位マッピングおよび／または配列決定により確認する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターは、繊維芽宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）内に、エレクトロポレーション、または化学的方法（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含み、これらの限定はされない標準的方法により導入する。トランスフェクションされた細胞および細胞培養液上清を採取しそしてヒトナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニット発現に関して本明細書中に記載のようにして分析できる。
【０１２５】
哺乳動物一過性発現のために使用されるすべてのベクターは、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを発現する安定な細胞系統を確立するために使用できる。発現ベクター中にクローニングされた非改変ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡ構築物は、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質を産生する宿主細胞をプログラムするとを期待される。さらに、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット構築物を分泌されたタンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡに連結して分泌されるタンパク質として細胞外で発現される。トランスフェクション宿主細胞には、ＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０、およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１，（１９８２）］ が含まれこれらの限定はされない。
【０１２６】
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡを含むあらゆるベクターと、Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを含みこれらに限定はされない薬剤選択プラスミドとの同時トランスフェクションは、安定にトランスフェクションされたクローンの選択を許容するであろう。ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットのレベルは、本明細書中に記載のアッセイによ定量される。
【０１２７】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを最高に可能なレベルで合成する哺乳動物細胞クローンの産生のために、ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡ構築物も、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクター内に連結される。細胞内にこれらの構築物を導入した後に、プラスミドを含むクローンを適当な薬剤を用いて選択し、そしてプラスミドの高いコピー数を有する過剰発現クローンの単離は、薬剤の増加用量の選択により達成される。
【０１２８】
組換えヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの発現は、全長ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡの哺乳動物宿主細胞内へのトランスフェクションにより達成される。
【０１２９】
実施例７
昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター内へのヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから誘導されるバキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系統内のｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ＃１７１１）の高レベル発現を得るために設計する。組換えバキュロウイルス発現ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡは、下記の標準方法により生成される（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａｌ）。ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む種々のバキュロウイルストランスファーベクター内のポリヘドリン遺伝子内に連結する。組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルストランスファーベクターと線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡのＳｆ９細胞内への同時トランスフェクションに続く相同組換えにより産生される［Ｋｉｔｔｓ， Ｐ．Ａ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １８：５６６７（１９９０）］。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは、感染された細胞内の封入細胞の不在により同定されそして組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスは、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定される（Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ． Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ． Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５） 。プラーク精製の後、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット発現が本明細書中に記載のアッセイにより測定される。
【０１３０】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットのための全オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位内に挿入する。正方向の構築物は配列決定により同定されそして線状ＡｃＮＰＶマイルドタイプＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクションするために使用される。
【０１３１】
真正で活性のヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、感染された細胞の細胞質内に見いだされる。活性ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、感染された細胞から等張性または界面活性剤溶解により抽出される。
【０１３２】
実施例８
ヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡの酵母発現ベクター内へのクローニング
組換えヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、酵母Ｓ．セレビシエー（ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）内に、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を作動するように設計された発現ベクター内に最適なヒトβ１ＡナトリウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡシストロンを挿入した後に産生される。細胞内発現の場合に、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのベクターをヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ５４３−５４５（１９９０）； Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現のためには、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットシストロンを、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質のＮＨ２ 末端に分泌シグナル（酵母または哺乳動物ペプチド）を融合する酵母発現ベクター内に連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｍ．Ａ．， Ｇｅｎｅ ８５： ５１１−５１６（１９８９）； Ｒｉｅｔｔ Ｌ． ａｎｄ Ｂｅｌｌｏｎ Ｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８：２９４１−２９４９（１９８９）：。
【０１３３】
これらのベクターには、発現されたｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合するｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ Ｏ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ４２−４６（１９９０）］ 、および発現されたｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合するベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｙ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８： ２７２８−２７３２）］ が含まれるが、これらに限定はされない。さらに、ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、ベクターｐＶＥＰを用いてユビキチンに結合する融合タンパク質として酵母中に発現される［Ｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｊ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：７７１５−７７１９（１９８９）； Ｓａｂｉｎ， Ｅ．Ａ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：７０５−７０９（１９８９）； ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｄ．Ｐ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：５５１７−５５２３（１９８９）］。発現されたヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットのレベルは、本明細書中に記載のアッセイにより決定される。
【０１３４】
実施例９
組換えヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットの精製
組換え産生ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットは、抗体アフィニティークローニングにより精製してもよい。
【０１３５】
ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体アフィニティーカラムは、抗−ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニット抗体をアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ） −１０（Ｂｉｏｒａｄ）、すなわち抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合性連結を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて予備活性化されたゲル支持体に加えて作製される。次いで抗体をスペーサーアームを有するアミド結合を介してゲルにカップリングさせる。次いで残った活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）を用いてクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）を用いて洗浄してあらゆる非結合抗体または外来タンパク質を除く。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で適当な膜可溶化剤、例えば界面活性剤を用いてカラムを平衡化しそして可溶化ヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットを含む細胞培養液上清または細胞抽出液をカラムにゆっくりと通す。次いでリン酸緩衝生理食塩水を界面活性剤と共に用いて、光学密度（Ａ２８０）が背景まで下がるまでカラムを洗浄し、次いで０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）を界面活性剤と共に用いてタンパク質を溶離する。次いで、精製したヒトβ１Ａナトリウムチャンネルサブユニットタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。
【０１３６】
実施例１０
ヒト組織の免疫組織化学
免疫組織化学：免疫組織化学に関するプロトコールは以前に記載した（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ， ｅｔ ａｌ．， １９９８）。すべてのインキュベーションは室温で行った。標的中のスライドをマイクロ波処理した後（Ｄａｋｏ， Ｃａｒｐｅｎｔｕｒｉａ， ＣＡ） 、スライドをＰＢＳ中に置き、次いで３％Ｈ２ Ｏ２ 処理、ＰＢＳ中でリンスし次いで適当な遮断血清を１０分間で加えた。その後、１：２００の力価のラビットポリクローナル抗ヒトβ１Ａ抗体（ＨＢ１Ａ−１、実施例３参照）または１：４００の力価のラビットポリクローナル抗ラットβ１Ａ抗体のいずれかの一次抗体をスライドに３０分間で加えた。負対照のための一次抗体として、適当な種のイソタイプ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ， ＣＡ） を置換した。数回のＰＢＳ洗浄の後、ビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ） をスライドの上に３０分間置いた。その後、スライドをＰＢＳ中で洗浄し次いでアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を細胞に３０分間で加えた。一次抗体の存在は、ＤＡＢ（３’−ジアミノベンジジンＨＣｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を２回、５分間加えて検出した。スライドをマイアー（Ｍａｙｅｒ） のヘマトキシリンに１分間暴露し、脱水しそしてカバーガラスを置いた。
結果：
抗ヒトβ１Ａ抗体使用：我々は、細胞内β１ＡをヒトＤＲＧニューロン内で検出できた。我々は、ＤＲＧの神経繊維内でも膜随伴β１Ａを定位した。我々は、多数のヒト組織もスクリーニングしそしてβ１Ａタンパク質が消化管（刷子縁）、腎臓の集合細管（遠位＞近位）（明確な標識を示す）、および前立腺の上皮細胞内に存在することを決定した。我々は、脳（皮質ピラミッドニューロン、小脳プルキンエ細胞、および脳内の多数のニューロン繊維）内、肺およびその他の組織の上皮細胞、肺および子宮内のマクロファージの膜内、および心臓の心細胞内でβ１Ａに免疫標識も観察した。我々は、下記の組織：甲状腺、脾臓、肝臓、および膵臓内には著しい検出可能レベルのβ１Ａは観察しなかった。我々はこの抗ヒトｂ１ａ抗体を有するラット組織内にも同様のβ１Ａ分布を観察した。
【０１３７】
実施例１１
アフリツノガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ） 卵母細胞内に発現されたＶＧＳＧ　β１Ａサブユニットのパッチクランプ分析
１．ｃＤＮＡの生体外合成：β１ＡおよびＮａｖ １．２（Ｄｒ． Ａ． Ｃｏｒｒｅａ， ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙから入手した電位依存性カルシウムチャンネルタンパク質ファミリーのタイプＩＩアルファサブユニット）の発現構築物を制限酵素を用いて線状化した。ｃＲＮＡは、生体外で、ｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥＴＭ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）の試薬およびプロトコールを用いてＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成したが、ただしＬｉＣｌ沈降工程は２回反復したことを除く。ｃＲＮＡは、最終濃度１〜２ｍｇ／ｍｌのジエチルピロカルボナート（ＤＥＰＣ）処理Ｈ２ Ｏ中に懸濁した。
２．卵母細胞単離：カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ） を水中の０．１５〜０．１７％トリカイン（ｔｒｉｃａｉｎｅ）中への浸漬により麻酔しそしてトリカイン浴から取り出した。次いで卵巣ローブをそれらの腹壁内に作成した小さい切開を通して暴露し、除去しそして滅菌したＣａ２＋を含まないＯＲ−２溶液（無Ｃａ２＋−ＯＲ−２：８２．５ｍＭ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２ および５ｍＭＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．６に調整）内に置きそしてカエルを回復のためにトリケインを含まない水中に戻した。次いで卵巣ローブを滅菌水を用いて洗浄し、細く切開し、そして室温で２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（タイプＩ、ＢＲＬ）を含む無Ｃａ２＋−ＯＲ−２中でインキュベーションして卵母細胞の放出および脱濾胞をさせた。オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）（１分間あたりに約６０サイクル）で１時間処理した後、ＯＲ−２を含むペトリ皿に卵母細胞を移した。死および小さすぎる卵母細胞を吸引して除去しそして選択した卵母細胞を数回、コラゲナーゼを含まない無Ｃａ２＋−ＯＲ−２溶液を用いて洗浄し、溶液を７〜８分毎に交換して攪拌しながらさらに１時間インキュベーションし、そして１９℃のインキュベーター内に置きそしてさらに滅菌したＳＯＳと無Ｃａ２＋−ＯＲ−２溶液（ＳＯＳ：１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、１．８ｍＭ　ＣａＣｌ２ 、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２ 、５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨを用いてｐＨを７．６に調整）の１：４混合物中で１時間、そして１：３ＳＯＳ／無Ｃａ２＋−ＯＲ−２中で３０分間インキュベーションした。次いで卵母細胞を１００％ＳＯＳ中に置き、再度選別しそして１９℃に保持した。
３．注入：それぞれの種の１００μｇ／ｍｌの最終濃度で翻訳されるようなｃＲＮＡ、および指示された濃度のオリゴヌクレオチドを含む５０ｎｌを卵母細胞に注入した。注入は、単離直後またはその後３日間の種々の時間に行った。注入した卵母細胞を１７〜１９℃で５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む滅菌ＳＯＳ中で、電気生理学試験に使用するまで毎日溶液を交換して保持した（注入後４〜６日）。
４．卵母細胞からの電気生理学的記録：卵母細胞の切開したワセリンギャップ電圧クランプ（Ｔａｇｌｉａｌａｔｅｌａ ｅｔ ａｌ， ＭＮ）をＣＡ−１切開卵母細胞クランプ装置（Ｄａｇａｎ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を用いて行った。実験の外部溶液は、１２０ｍＭ　ＮＭＧ−Ｍｅｓ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、および２ｍＭ　Ｃａ（Ｍｅｓ）２ をｐＨ７．４で含んでいた。実験の内部溶液は、１２０ｍＭ　ＮＭＧ−Ｍｅｓ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、および２ｍＭ　ＥＧＴＡをｐＨ７．４で含んでいた。漏洩および線型キャパシティー電流を補償しそして−９０ｍＶ保持電位からｐ／−４プロトコールを用いてオンラインで差し引いた（ＳＨＰ）。
【０１３８】
サンプリング頻度の１／５への８極ベッセルフィルターを用いてシグナルをフィルターした。すべての記録を室温（２〜２３℃）で行った。
５．データ取得および分析：ゲーティングおよびイオン電流をＰＣ４４ボード（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍｏｏｒｐａｒｋ， ＣＡ） を用いて取得し、このボードはＩＢＭコンパチブルＡＴスロットを介してペンチアムに基づく計算機とのインターフェースである。
【０１３９】
ピークＧ−Ｖ曲線は、１５ｍＭ　ＮａＭｅｓの内部溶液および１ｍＭ　ＮａＭｅｓ（残留陽イオンを置換するためにＮ−メチル−グルカミン（ＮＭＧ）を含む）の外部溶液を用いて得た。逆転電位は、ゲーティング成分を差し引いた後の瞬間Ｉ−Ｖから決定し、そしてピークコンダクタンスはピーク電流を逆転電位からの電位差で割って算出した。クランプの時間感度内で、瞬間Ｉ−Ｖ曲線は線型であり、従ってそれ以上の修正は行わなかった。
６．結果：図３に示すように、Ｎａｖ １．２により行ったイオン流は、卵母細胞中のβ１Ａサブユニットとの同時発現により著しく上昇した。１：２０（Ｎａｖ １．２対β１Ａ）のｃＤＮＡ比において、イオン流は約３倍増加した。結果は、細胞表面に存在する機能性ナトリウムチャンネルの数を増加させるためにβ１Ａサブユニットが重要な役割を演じることを示す。
【０１４０】
実施例１２
脊髄神経連結の後のラット後根神経節ニューロン内β１Ａサブユニットの上方制御および再分布
１．脊髄神経連結：動物の使用を含むすべての操作は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ， Ｔｈｅ Ｒ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのガイドラインに従って行った。脊髄神経連結（ＳＮＬ）は、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ（１９９２） の記載と同様に行った。要約すると、体重約２００ｇの雄スプラーグ−ドーレー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（Ｈａｒｌａｎ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）をイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔した。Ｌ５およびＬ６位置の脊髄神経を後根中央線の左で切開して暴露し、次いで左Ｌ６横脊髄除去プロセスの後に６−０シルクに緊密に連結した。次いで切開部を４．０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）（包帯）およびスキンクリップを用いて閉じた。動物を麻酔から回復させそして群収容施設に戻す前に後肢運動機能に関して評価した。ナイーブ動物は外科手術を行わなかった。
２．機械的異疼痛（ａｌｌｏｄｙｎｉａ） の評価：異疼痛は、それぞれの後肢の肢底面が下から刺激できるようにワイヤメッシュプラットフォーム上にラットを個別に配置して評価した。一連の上昇する触覚刺激を補正したフォンフレイ（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）フィラメント（０．２５〜１５ｇ）を用いて迅速な肢持ち上げ反応が観察されるまで加えた。「アップダウン」法（Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）をグラムで表した反応閾値を決定するために使用した。組織を採取した動物を外科手術後の数個の時点で試験して、同側の肢の反応閾値が４ｇの基準またはそれ以下であることを確認した。さらに、別の動物の年齢対応群（連結群ｎ＝３〜１２、ナイーブ群ｎ＝７）を外科手術後の種々の時点（３日、１０日、２１日、および８週）で機械的異疼痛に関して試験して、同側および反対側反応閾値の時間変化、ならびにナイーブ動物の反応のプロフィールを得た。
３．組織調製：外科手術の２日、１４日および８週後に、動物（ｎ＝３〜５）をＣＯ２ 窒息により屠殺しそして心臓経由で４％パラホルムアルデヒドを灌流した。Ｌ４およびＬ４　ＤＲＧを取り出し、マルチ組織フォーマット内にパラフィン埋め込みのために処理し、５μｍに連続的に切りそしてスーパーフロストプラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−Ｐｌｕｓ））スライド（Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ） 上にマウントした。
４．免疫組織化学：日常の免疫組織化学のためのプロトコール（ＩＨＣ）はすでに記載されている（Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， １９９８） 。要約すると、パラフィンスライドを脱ワックス、水和および標的緩衝液中でスライドをマイクロ波処理する（Ｄａｋｏ， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ， ＣＡ） 。切片を冷却し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に置き、次いで３％Ｈ２ Ｏ２ を用いて処理して外因性ペルオキシダーゼを不活性化した。すべてこれ以後の試薬インキュベーションおよび線状は室温で行った。正常遮断血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ） を組織の上に１０分間置き次いでＰＢＳ内で簡単にリンスした。次いで組織を一次抗体を用いて３０分間インキュベーションし、そして洗浄し、次いでビオチン化二次抗体、ヤギ抗ラビット（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｓ） を用いて３０分間処理した。すでに特性試験された（Ｋａｚｅｎ−Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）ラビットポリクローナル抗β１Ａおよび抗β１抗体を１：４００の力価で使用した。ＰＢＳ中のリンスの後、組織をアビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合試薬（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｓ） を用いて３０分間処理した。スライドを２ｘ５分間、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｂｉｏｍｅｄａ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いて処理し、リンスし、ヘマトリキシンを用いて対比染色し、脱水し、キシレン中で清澄化しそしてカバーガラスを置いた。ニューロン特異性核タンパク質に特異性のモノクローナル抗体（ＮｅｕＮ， １：１，０００； Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ） を正対照に使用して組織抗原性および試薬品質を確認した。負対照には、種ＩｇＧイソタイプ非免疫化血清（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｓ） を用いる一次抗体の置換を含んでいた。
５．β１Ａおよびβ１免疫標識の評価：マルチ組織フォーマットでスライドにマウントされた組織を潜在的な染色変動を最小化するために同時に染色した。それぞれの動物のＬ４およびＬ５からの突出した核を有する同側および反対側ＤＲＧニューロンを、直径が２５μｍを越えるかどうかを痛刺激反応性（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ） として特性化した。その他の全てを感覚性ニューロンと呼んだ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８） 。動物あたりのＤＲＧあたりに３０〜４０ニューロンの染色を下記の基準に従って採点した：１）無免疫反応性は０．０と採点される；２）弱い免疫反応性は１．０と採点される；３）中程度の免疫反応性は２．０と採点される；そして４）強い免疫反応性は３．０と採点される。免疫標識強度が整数単位の間にある場合には増分０．５を用いた（すなわち、１．５は弱から中程度の標識である）。次いでこれらのデータを動物あたりおよび群（群あたりにｎ＝３〜５）あたりに平均した。
【０１４１】
Ｌ５痛刺激反応性および感覚性ＤＲＧニューロン内のβ１Ａおよび１Ａ免疫反応性の形態は、１）均質：拡散した標識パターン、２）点状：染色の数個の塊状の細胞内、ニッスル状集積体、および３）膜：主として細胞膜に沿って位置する突出した球状標識としても特性化された。データは、ＤＲＧあたり群あたりに観察されたそれぞれの標識パターンの百分率として提示される（表２）。
【０１４２】
データおよび統計解析：β１Ａおよびβ１染色データをＤＲＧの脊髄レベル（Ｌ４またはＬ５）、左右（反対側または同側）、ニューロンタイプ（小型または大型）、および連結時点（ナイーブ、ＳＮＬ後２日、１４日、および８週）を特定するために群分けした。得られた１６群の中で、タンパク質染色強度尺度および連結時間因子の双方は、自然的に序列化された値を示した。最初のデータ評価は、採点した反応の分布内の正規性の欠如を示し、非パラメーター法によるモデル化を示唆した。従って、片側ジョンキール−テルプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ） テストを、平均タンパク質発現採点の分布が連結時間で変化するという基本仮説を評価するために採用した。
【０１４３】
結果：機械的異疼痛：ＳＮＬラットは、２ｇ以下のフォンフレイ反応閾値の劇的同側低下、次いで損傷の３および１０日後に１ｇの低下をそれぞれ示した。同側肢内の触覚感受性のこの高いレベルは、８週間の試験期間中維持された。反対側肢の反応閾値は、一般にナイーブまたは損傷前反応に類似し、すなわち１３〜１５ｇであった。しかし、高い感受性（８〜１９ｇ）が損傷の３日後に見られ、一般的な外科手術後効果を反映しているのであろう。フォンフレイ刺激に対するナイーブ動物の反応は、いずれの側でも全８週間にわたって１３〜１５ｇの範囲であった。
ＤＲＧにおけるβ１Ａ標識の強度：試験したＤＲＧのそれぞれの群内の平均染色強度の図表示を図４に示す。痛刺激反応性および感覚性ニューロンの双方において、β１Ａ免疫標識は、手術後の時間経過と共に上昇し、この上昇は同側ニューロンに最も顕著であった。試験したＤＲＧのそれぞれの群に対する平均標識強度の図示を図５に示す。表１は、強度対時間関係のジョンキール−テルプストラ解析から得られたｐ値を表示する。
ＤＲＧにおけるβ１標識の強度：試験したＤＲＧのそれぞれの群に対する平均標識強度の図示を図５に示す。β１免疫標識は手術後の時間と共に上昇する傾向があるが、この傾向はＬ４ではＬ５　ＤＲＧより顕著である（表１）。
β１Ａおよびβ１免疫反応性のサブ細胞レベルでの分布：ナイーブラットにおいて、ナトリウムチャンネルβ１Ａおよびβ１サブユニットは、同様のサブ細胞レベルでの局在化を示し、実際的にすべての染色は細胞全体に拡散的に分布していた。しかし、ＳＮＬ後に、サブユニットのサブ細胞レベル分布は著しく分散した。β１サブユニットの染色は局在化しているＤＲＧニューロン内で均一に分布したままであるけれども、痛刺激反応性ニューロンに最も著しいβ１Ａ局在化は、ＳＮＬ後分布の改変されたパターンを取った。β１Ａサブユニットの染色は、細胞膜に近い領域内に離散的に局在化するようになった。β１Ａ染色の実際的に１００％はナイーブラットからのＤＲＧ細胞内に拡散して分布したけれども、２３％のみが痛刺激反応性、同側、Ｌ５、ＤＲＧニューロン内に均一に分布した（表２）。これらの細胞内で、β１Ａに対する染色の５１％は細胞膜の近くに局在化した。同側感覚性ＤＲＧニューロン、ならびに痛刺激反応性および感覚性の反対側ニューロンの双方も、改変されたサブ細胞レベルβ１Ａ分布を示した。これらの細胞内で、β１Ａ染色の５８〜７６％は拡散性のままであり、約２０％は点状またはニッスル状に現れ、そして残りは細胞膜に近接して位置した（表２）。従って、ＳＮＬ後のＤＲＧニューロン内のこれらの標識の強度の差異発現に加えて、ナトリウムチャンネルβ１Ａおよびβ１サブユニットは、それらのＳＮＬ後サブ細胞レベル局在化が著しく異なる。
【０１４４】
実施例１３
ＶＧＳＣβ１Ａと直接相互作用する小型分子のスクリーニングおよび同定
β１Ａサブユニットの調節機能の一つは、細胞表面へのαサブユニットの補充により機能性チャンネルを増加することである。β１Ａサブユニットの正常機能の破壊は、神経損傷後のＤＲＧ内の機能性ナトリウムチャンネルの下方制御をもたらすであろう。β１Ａサブユニットと相互作用する小型分子は、ＣＥＴＥＫ毛管ゾーン電気泳動技術により同定される。最初に、標的タンパク質、ＶＧＳＣβ１Ａサブユニットを細菌内で過剰産生させた。β１ＡサブユニットのｃＤＮＡをｐＥＴ２９ｂ細菌発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ） 内にサブクローンした。次いで発現構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換しそしてβ１Ａの発現をＩＰＴＧを加え、室温で４時間で誘導した。プレートからの単一の新しいコロニーを、カナマイシン１５μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌ　ＬＢ媒体内に接種し、そしてＯＤ６０Ｄ が０．６に達するまで３７℃で振とうしながらインキュベーションした。β１Ａサブユニット融合タンパク質の発現をＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加えて誘導しそして室温で４時間インキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＡ分析のために、ＩＰＴＧ誘導の前後に培養物１００μｌを採取した。細胞を遠心沈降し、ＳＤＳ負荷緩衝液２０ｍｌ中に再懸濁しそして４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動の後、ゲルをＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色しそして水を用いて一晩で脱染色した。レーン１：高分子量タンパク質マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） 、レーン２：誘導前の全細胞溶解物、およびレーン３：誘導後の全細胞溶解物。
【０１４５】
β１Ａサブユニットの得られた融合タンパク質は、そのＮ−末端に１５アミノ酸モチーフのＳ−タグ、およびそのＣ−末端に６個のヒスチジンを有していた。次いで、融合タンパク質をＮｉ＋ カラムを用いてアフィニティー精製し、そしてＳ−タグに蛍光基を用いて非共有結合的に標識した。標的タンパク質のコンフォーメーションまたは表面電荷を変化する小型分子との結合の後の毛管電気泳動におけるβ１Ａサブユニットの移動度シフトをレーザー誘発蛍光により検出する。
【０１４６】
実施例１４
ナトリウムチャンネル機能性アッセイ
β１Ａサブユニットの調節活性も真核細胞内の細孔形成およびイオン誘導性αサブユニットとのその同時発現により試験し、ナトリウムチャンネル活性は機能性バイオアッセイにより試験した。αサブユニットは、それぞれＮａｖ １．２、Ｎａｖ １．３、Ｎａｖ １．６、Ｎａｖ １．８およびＮａｖ １．９であり、しかしそれらの限定はされない。ナトリウムチャンネル活性の決定は、２種の細胞に基づくアッセイを用いて行われる。最初のアッセイは、シンチレーティングベースプレートを含む９６ウエルプレート内で細胞を培養することを含む。〔１４Ｃ〕グアニジンの存在下でベラトリジンまたはその他の適当なナトリウムチャンネル活性化剤を用いて細胞単層を刺激する。ナトリウムチャンネルが開くと、〔１４Ｃ〕グアニジニウムイオンがその濃度勾配を流下して細胞内に入る。細胞はシンチレーティングベースにごく近いので、光が放出される。放出された光の量はナトリウムチャンネル活性のレベルに比例しそしてシンチレーションカウンターを用いて定量化される。第二のアッセイは、蛍光性、電位感受性染料を用いる。細胞の単層に電位感受性染料を３０分間、３７℃で加える。このインキュベーション期間の後、ベラトリジンまたはその他のナトリウムチャンネル活性化剤を用いて細胞を刺激し、そして蛍光の変化を蛍光光度計、または蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）のいずれかにより、または蛍光光度計に基づく細胞イメージング系により測定する。細胞が脱分極すると、染料は細胞膜と結合して増加した蛍光をもたらす。細胞が過分極すると、染料は膜から分離し、低下した蛍光をもたらす。
【０１４７】
実施例１５
細胞接着アッセイ
ナトリウムチャンネルβサブユニットは同種親和性細胞−細胞接着に関係するので、β１Ａサブユニットの細胞接着機能を試験する。接着アッセイはＬ細胞マウス繊維芽細胞を使用し、これは細胞−細胞接着に必要な大部分のマクロ分子を欠いている。これらのＬ細胞をβ１Ａを用いて安定にまたは一過性にトランスフェクションしそして９６ウエルプレート内にプレーティングする。Ｌ細胞−β１Ａトランスフェクション体の別の組に利用可能な蛍光染料を加えそして候補化合物の存在または不在で９６ウエルプレート内の培養基に加える。所定のインキュベーション期間の後、プレートを蛍光プレートリーダー内に置く。同種親和性細胞−細胞接着が起きると、蛍光に検出可能な上昇が観察される。相対活性を決定するために、使用可能な蛍光染料を用いて標識した非トランスフェクションＬ細胞を用いて観察された蛍光シグナルと比較する。
表１．ＤＲＧニューロン内のβ１Ａおよびβ１発現のレベルにおけるＳＮＬ後の時間に対する傾向の統計解析。与えられたｐ値は、図９および１０の基礎となったデータの片側、ジョンキール−テルプストラ解析を用いて得た。
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＊ ｐ値＜０．０５
表２．ＳＮＬ２週間後のＬ５　ＤＲＧニューロン内β１Ａおよびβ１染色のサブユニット細胞レベル分布
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【０１４８】
【表１】
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【０１４９】
【表２】
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【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、（Ａ）ラット電位依存性ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットおよび（Ｂ）ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１サブユニットとを並べた、ヒト電位依存性ナトリウムチャンネルβ１Ａサブユニットのアミノ酸配列を示す。ヒトおよびラットＶＧＳＣ β１Ａサブユニット間の全体の同一性は約７２％であり、一方それらのカルボキシル末端領域の同一性は３３％未満である。ヒトＶＧＳＣ β１Ａおよびβ１サブユニットの全体的な同一性は７５％であるが、それらのカルボキシル末端領域の同一性は１７％未満である。
【図２】
図２はヒトβ１遺伝子（ＳＣＮ１Ｂ）のゲノムおよび転写組織を具体的に説明する。ナトリウムチャンネルβ１およびβ１Ａサブユニットをコードする遺伝子は、染色体１９上約９〜１０ｋｂに広がり、７個のエキソン（１、２、３、４Ａ、４、５および６）および５個のイントロンを含む。択一的なエキソン４Ａはイントロン３の５’領域に位置する。ヒトβ１サブユニットはエキソン１〜３および４〜６によりコードされ、一方ヒトβ１Ａはエキソン１〜３およびエキソン４Ａによりコードされる。
【図３】
アフリカツメガエル卵母細胞中でのβ１ＡおよびＮａｖ１．２サブユニットの同時−発現を示す。Ｎａｖ１．２により伝導されたピーク電流は、卵母細胞中でのβ１Ａサブユニットとの同時発現により用量依存的に上昇した。Ｎａｖ１．２およびβ１ＡサブユニットのｃＲＮＡ比は、棒の底に示す。このデータは、棒の上部に示す卵母細胞の数から平均した。誤差棒はＳＥＭを表す。
【図４】
手術後の種々の時間で、正常ラットおよびＳＮＬラットにおけるＤＲＧニューロンにおけるβ１Ａ標識の強度を具体的に説明する。示した棒は侵害受容（白抜き棒）および知覚（斜線棒）ニューロンにおける標識を表す。各ＤＲＧレベルで各ニューロン型中の標識強度は、術後の時間に伴い増加した（統計分析に関しては表１を参照にされたい）。
【図５】
手術後の種々の時間で、正常ラットおよびＳＮＬラットにおけるＤＲＧニューロンにおけるβ１標識の強度を具体的に説明する。示した棒は侵害受容（白抜き棒）および知覚（斜線棒）ニューロンにおける標識を表す。群あたりＮ＝３〜５動物および各種類の動物あたり３０〜４０ニューロン。標識強度は、術後の時間に伴い変動した（統計分析に関しては表１を参照にされたい）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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