(57)【要約】式(Ｉ)の環状ペプチドは、メラノコルチン-４受容体の強力な選択的アゴニストであり、従って、ＭＣ-４受容体の生理学的な役割を確認するための研究用ツールとして有用であり、また、ＭＣ-４受容体が介在する障害又は疾患を診断、治療又は予防するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
【化１】
2004534850.tif 000005
[式中、
ＨisはＬ-ヒスチジルであり；
Ｄ-Ｐhe(Ｘ)は、パラ位が場合によりＦ、Ｃl、Ｂr、Ｍe及びＯＭeから選択される基で置換されていてもよいＤ-フェニルアラニルであり；
ＡrgはＬ-アルギニルであり；
Ｗは、Ｌ-トリプトファニル又は２-ナフチル-Ｌ-アラニルであり；
ＹとＺの一方は-Ｃ(Ｏ)-であって、他方は-ＮＨ-であり；
ｍは１〜４であり；
ｎは１〜４であるが、但し、ｎ＋ｍは４〜６である]
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｚが-Ｃ(Ｏ)-であって、Ｙが-ＮＨ-である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｍが２である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ｎが２〜３である、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
ｍが２であり且つｎが２である、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｄ-Ｐhe(Ｘ)が、パラ位が場合により塩素で置換されていてもよいＤ-フェニルアラニルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙが-Ｃ(Ｏ)-であって、Ｚが-ＮＨ-である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ｍが２であり且つｎが２である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
下記から選択される請求項１に記載の化合物。
【表１】
2004534850.tif 000006
【請求項１０】
下記から選択される請求項１に記載の化合物。
【表２】
2004534850.tif 000007
【請求項１１】
ヒトにおける肥満を予防又は治療する方法であって、前記ヒトに薬理学的に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与することを含んでなる前記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのメラノコルチン-４受容体の強力な選択的アゴニストである環状ペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
メラノコルチンペプチド又はメラノトロピン、α-ＭＳＨ、β-ＭＳＨ、γ-ＭＳＨ及びＡＣＴＨは、脊椎動物、哺乳動物及びヒトの体内で多くの生理学的機能に関与している。それらは、皮膚の色素沈着及びステロイド産生を調節し、免疫反応及び学習プロセスを調節し、エネルギーバランス、神経の成長と再生及び別の幾つかの機能に影響を及ぼす。
【０００３】
ヒトでは、メラノトロピンと相互作用する５種類の受容体(ｈＭＣ-１Ｒ〜ｈＭＣ-５Ｒ)が知られている。これらの受容体は、７ヘリックス膜貫通型受容体であり、Ｇタンパク質共役型受容体のスーパーファミリーに属する。これらの受容体が活性化されると、ｃＡＭＰが増加する。メラノコルチン受容体１、３、４及び５は、α-ＭＳＨ、β-ＭＳＨ及びγ-ＭＳＨを認識するが、メラノコルチン受容体２はＡＣＴＨのみを認識する。
【０００４】
最近では、中枢神経系で広範に発現されるメラノコルチン受容体３及び４や、脳及び種々の末梢組織において見出されるメラノコルチン受容体５が多くの注目を集めている。ｈＭＣ-３Ｒ及びｈＭＣ-５Ｒの生理学的な役割は充分には明らかにされていないが、最近、ｈＭＣ-５Ｒが外分泌腺において脂質及びフェロモンの産生を制御するのに関与していることが示された。急激に増加している薬理学的及び遺伝的な証拠は、ｈＭＣ-４Ｒが齧歯類のエネルギーバランス及び体重の調節に関与していることを示唆している。摂食及び体重の調節におけるＭＣ-４Ｒの役割は、ラットへのアゴニスト/アンタゴニスト投与から得られた結果及びマウスの遺伝学から得られた結果によって支持される。アゴニストＭＴIIを脳室内投与することにより食物摂取量は減少し、逆に、アンタゴニストＳＨＵ９１１９により、食物摂取量及び体重は増加した。メラノコルチン受容体４が遺伝的に欠失しているマウスは肥満になる。従って、ＭＣ-４Ｒに活性を示す化合物は、摂食障害の治療に有効であることが予測された。
【０００５】
メラノコルチン受容体４は、さらに、別の生理学的機能、即ち、グルーミング行動、勃起及び血圧の制御においても役割を果たしているように見える。しかしながら、天然ホルモンであるメラノトロピンは、ｈＭＣ-３Ｒ〜ｈＭＣ-５Ｒに対する親和性が比較的小さく、特に選択性を有するわけではない。メラノコルチン受容体４の生理学的機能を、脳内の別のメラノコルチン受容体、特にＭＣ-３Ｒの生理学的機能から識別するためには、強力な選択的アンタゴニストが必要である。現在利用可能な合成リガンドは、複数のメラノコルチン受容体を区別しない。頻繁に使用される研究用ツールはＳＨＵ９１１９ペプチドであり、これは、メラノコルチン受容体３及び４の強力なアンタゴニストであり、且つ、メラノコルチン受容体５のアゴニストである。ＳＨＵ９１１９は、インビトロ及びインビボで広範囲にわたり研究されている。このペプチドの注入は、ラットの摂食を刺激する。同様のラクタム誘導体であるペプチドＭＴIIは、ｈＭＣ-３Ｒ〜ｈＭＣ-５Ｒの強力な非選択的アゴニストである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒトのメラノコルチン-４受容体の強力な選択的アゴニストである環状ペプチドを提供する。これらの化合物は、ＭＣ-４受容体の生理学的な役割を確認するための研究用ツールとして有用であり、また、ＭＣ-４受容体が介在する障害又は疾患を診断、治療又は予防するのに有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、式(I)：
【０００８】
【化１】
2004534850.tif 000002
[式中、
ＨisはＬ-ヒスチジルであり；
Ｄ-Ｐhe(Ｘ)は、パラ位が場合によりＦ、Ｃl、Ｂr、Ｍe及びＯＭeから選択される基で置換されていてもよいＤ-フェニルアラニルであり；
ＡrgはＬ-アルギニルであり；
Ｗは、Ｌ-トリプトファニル又は２-ナフチル-Ｌ-アラニルであり；
ＹとＺの一方は-Ｃ(Ｏ)-であって、他方は-ＮＨ-であり；
ｍは１〜４であり；
ｎは１〜４であるが、但し、ｎ＋ｍは４〜６である]
で表される化合物又はその塩を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
式(I)の一実施態様において、Ｚは-Ｃ(Ｏ)-であって、Ｙは-ＮＨ-である。前記実施態様の一サブセットにおいて、ｍは２である。前記実施態様の別のサブセットにおいて、ｎは２〜４である。前記実施態様の別のサブセットにおいて、Ｄ-Ｐhe(Ｘ)は、パラ位が場合により塩素で置換されていてもよいＤ-フェニルアラニルである。
【００１０】
別の実施態様において、Ｙは-Ｃ(Ｏ)-であって、Ｚは-ＮＨ-である。前記実施態様の一サブセットにおいて、ｎは２である。前記実施態様の別のサブセットにおいて、ｍは２〜４である。前記実施態様の別のサブセットにより、ＷがＬ-トリプトファニルであり、且つ、Ｄ-Ｐhe(Ｘ)がＤ-フェニルアラニルである化合物が提供される。
【００１１】
本発明の化合物は、メラノコルチン-４受容体の強力な選択的アゴニストであり、従って、メラノコルチン-４受容体の生理学的な役割を研究するための分析的研究用のツールとして有用である。さらに、本発明の化合物は、ＭＣ-４受容体の活性化によって緩和され得る疾患及び障害、特に摂食障害に関連する疾患及び障害を、診断、治療及び予防するのに有用である。
【００１２】
分析目的及び診断目的のために、本発明化合物は、放射性標識などの放射性形態で使用することができる。特に、本発明の化合物は、放射性ヨウ素若しくはトリチウム又は別の適切ないずれかの放射性核種を組み込むように製造し得る。このような放射性標識化合物は、特異的メラノコルチン受容体を定量するため、メラノコルチン受容体の特定のサブタイプと競合する薬物の解離定数(Ｋｉ又はＫｄ)を分析するため、及び、例えば受容体オートラジオグラフィー技術の使用により、組織及び組織切片中のＭＣ-受容体の存在部位を測定するための放射性リガンド結合に使用することができる。放射性リガンド結合及び受容体オートラジオグラフィーの原理は、当技術分野ではよく知られている。代替的な方法として、本発明化合物は、物質を検出し得る任意の別のタイプの標識、例えば、蛍光標識又はビオチンなどを用いて標識し、得られた化合物を、放射性標識化合物と同様の目的に使用してもよい。
【００１３】
本発明化合物は、さらに、光、特に紫外線によって活性化され得る基を組み込むように製造することもできる。そのような活性化の目的は、光親和性標識技術を用いることによるＭＣ-受容体の共有結合標識に有用な化合物を得ることである。光親和性標識は、当技術分野でよく知られている技術であり、本発明においては、ＭＣ-受容体の構造及び位相的な構成を解明するのに有用である。本発明化合物のこのような光活性誘導体も本発明の一部を構成する。さらに、本発明化合物の光活性誘導体は、好ましくは、容易に検出可能な基又は標識、例えば、放射性原子、蛍光性基及び/又はビオチンなどを組み込むように製造してもよい。
【００１４】
本発明化合物は、ガンマ線及び/又は陽電子を放出する１種又は複数種の同位体で標識することができる。そのように標識された化合物は、本発明の極めて特定の実施態様であり、動物、好ましくはヒトに対して、全身的又は局所的に投与し得る。これらの標識された化合物は、公知技術を用いて、ＭＣ-受容体のインビボにおけるレベル及び/又は存在部位を画像化するのに有用である。前記公知技術としては、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影法(ＰＥＴ)及びシングルフォトン断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)などがある。このような方法を用いて、検査対象である動物又はヒトの組織中における特定のＭＣ-受容体の分布及び/又は量に関する情報が得られる。そのような情報は、疾患、特に、ＭＣ-受容体に関連する脳内の機能障害を診断するのに有用である。
【００１５】
分析及び診断における有用性に加えて、本発明のペプチドは、ＭＣ-４受容体において天然のメラノトロピン(例えば、α-ＭＳＨ)に対する細胞の正常な生理学的反応を活性化するのにも使用し得る。従って、式(I)の化合物は、ＭＣ-４受容体の活性化に対して反応性の疾患、障害又は状態を治療、制御又は予防するのに有用であり、例えば、肥満や、さらに、雄及び雌の性的機能不全などを予防及び治療するのに有用である。
【００１６】
本発明の別の態様により、式(I)の化合物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、有効成分として式(I)の化合物又はその製薬上許容される塩を含有し、さらに、製薬上許容される担体及び場合により別の治療用成分を含有し得る。「製薬上許容される塩」という用語は、無機の塩基又は酸及び有機の塩基又は酸を包含する製薬上許容される非毒性の塩基又は酸から調製された塩を意味する。
【００１７】
本発明の組成物には、経口投与、直腸内投与、局所投与、非経口投与(皮下投与、筋肉内投与及び静脈内投与など)、眼内投与、肺内投与(鼻腔内吸入又は口腔内吸入)又は鼻腔内投与に適した組成物が包含されるが、任意の所与のケースにおける最適の投与経路は、治療しようとする状態の種類及び重症度並びに有効成分の種類に依存する。本発明の組成物は、好都合には、単位投与形態で提供し得、調剤の技術分野でよく知られている任意の方法で調製し得る。
【００１８】
実際の使用においては、有効成分としての式(I)の化合物を、慣習的な医薬配合技術に従って製薬用担体と一緒にして充分に混合することができる。前記担体は、例えば経口投与又は非経口投与(静脈内投与など)の投与に望ましい調製物の形態に応じて様々な形態を有し得る。本発明の組成物を経口投与形態に調製する場合、例えば、懸濁液剤、エリキシル剤又は溶液剤などの経口用液体調製物の場合には、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤及び着色剤などの慣用の任意の製薬用媒体を使用でき；又は、例えば、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤及び錠剤などの経口用固体調製物の場合には、デンプン、糖及び微晶質セルロースなどの担体、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤などを使用することができる。液体調製物よりも経口用固体調製物の方が好ましい。
【００１９】
投与が容易であるという理由で、錠剤及びカプセル剤は、最も有利な経口用単位投与形態であり、この場合、明らかに固体製薬用担体を使用する。望ましい場合には、錠剤は、水性又は非水性の標準的な技術によりコーティングし得る。上記のような組成物及び調製物は、少なくとも０.１％の活性化合物を含有している。もちろん、これらの組成物中の活性化合物のパーセンテージは変えることが可能であり、都合よくは、上記単位投与形態の約２重量％〜約６０重量％であり得る。このような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な投与量が得られるような量である。上記活性化合物は、さらに、例えば、液滴又はスプレーなどの形態で、鼻腔内投与することもできる。
【００２０】
錠剤、丸剤及びカプセル剤などは、さらに、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；及び、スクロース、ラクトース又はサッカリンのような甘味剤も含有し得る。単位投薬形態がカプセルである場合、該カプセルは、上記種類の物質に加えて、脂肪油のような液体担体を含有し得る。
【００２１】
コーティングとして、又は、投与単位の物理的形態を改変するために、種々の別の物質が存在してもよい。例えば、錠剤を、シェラック、糖又はシェラックと糖の双方によってコーティングしてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、有効成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、及び、チェリー風味又はオレンジ風味のような香味剤を含有し得る。
【００２２】
また、式(I)の化合物は、非経口的に投与してもよい。これらの活性化合物の溶液又は懸濁液は、ヒドロキシ-プロピルセルロースなどの界面活性剤と適宜混合した水の中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの油中混合物中で調製することができる。通常の保存条件下及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
【００２３】
注射可能な用途に適する製薬形態としては、無菌の水溶液又は水性分散液、及び、無菌の注射可能な溶液又は分散液を用時調製するための無菌の粉末などがある。いずれの場合にも、当該形態は、無菌であること、及び、容易に注射することができる程度の流動性を有することが要求される。当該形態は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌類及び真菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物及び植物油などを含む溶媒又は分散媒体であることができる。
【００２４】
薬理学的に有効な量は、体重１ｋｇ当たり、０.００１ｍｇ/日〜１,０００ｍｇ/日の範囲で変わり得る。本発明化合物の有効な投与量を、哺乳動物、特にヒトに与えるために、任意の適切な投与経路を使用し得る。例えば、経口投与、直腸内投与、局所投与、非経口投与、眼内投与、肺内投与及び鼻腔内投与などを採用し得る。投与形態としては、錠剤、トローチ剤、分散液剤、懸濁液剤、溶液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤及びエアゾールなどがある。使用される有効成分の有効な投与量は、使用される特定の化合物、投与方法、治療される状態及び治療される状態の重症度に応じて変化し得る。そのような投与量は、当業者が容易に確認し得る。
【００２５】
以下の実施例は、本発明を例証するために提供されており、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１〜実施例９
環状ペプチドの合成
ｐ-メトキシベンズヒドリルアミン樹脂上のペプチジル鎖の延長は、431A ABIペプチドシンセサイザーで行った。製造業者から提供されたプロトコルを応用して、Ｎ-メチルピロリドン(ＮＭＰ)中でアミノ酸のヒドロキシベンゾトリアゾールエステルをカップリングさせた。半永久的なα-アミノ保護基としてｔ-ブチルオキシカルボニル(Ｂoc)基を使用し、側鎖保護基は、アルギニンにはトシル、ヒスチジンにはベンジルオキシメチル、リシンにはフルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)、アスパラギン酸にはフルオレニルメチル(Ｆm)であった。シンセサイザーでの鎖の形成は、Ｎ-末端残基のアセチル化によって完了した。ペプチジル樹脂を容器に移し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンを用いて、手動操作でＦmoc基及びＦm基を除去した(室温で２０分間)。
【００２７】
環化するために、ペプチジル樹脂を充分に洗浄し、次いで、ＮＭＰ中の５倍過剰量のベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰyＢoc)及び６倍過剰量のジイソプロピルエチルアミンと一緒に一晩撹拌した。Ｋaiser試験で陰性が観察されるまで前記手順を繰り返した。ペプチジル樹脂をＮＭＰ及びメタノールで洗浄し、乾燥させ、スカベンジャーとしてのアニソール(又はｐ-クレゾール)の存在下における液体フッ化水素(９:１，v/v)で処理した。０℃で１時間維持した後、減圧下にフッ化水素を除去し、樹脂をエーテルで洗浄し、氷酢酸で抽出し、抽出物を凍結乾燥させた。得られた未精製ペプチドを、全自動Ｗisp 712インジェクター及び991フォトダイオードアレイ検出装置の付いたＷaters 600Ｅシステムに接続したＣ18 Ｖydacカラム上の分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー(ＲＰ ＨＰＬＣ)によって分析した。分析には、３０分間での０〜１００％緩衝液Ｂの標準勾配系(Ｇ１)、及び、３０分間での２０〜８０％緩衝液Ｂの勾配(Ｇ２)を使用した。緩衝液Ａは、水中の０.１％トリフルオロ酢酸であり、緩衝液Ｂは、アセトニトリル中の０.１％トリフルオロ酢酸であった。ＨＰＬＣプロフィールを２１０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。半分取Ｃ18 ＲＰ Ｗatersカラムの付いたＷaters Ｄelata Ｐrep 40000システムで分取的分離を行った。水及びアセトニトリルの上記溶媒系を６０分間での２０〜８０％緩衝液Ｂの勾配(Ｇ３)で分離に使用した。
【００２８】
数種類の化合物について、ペプチジル樹脂を容器に移し、Ｎ-メチルピロリドン中の６倍過剰量の無水コハク酸及び６倍過剰量のジイソプロピルエチルアミンと一緒に、Ｋaiser試験で陰性が観察されるまで撹拌し、次いで、Ｎ-メチルピロリドン及びメタノールで充分に洗浄した。続いて、Ｆmoc基の除去、環化、脱保護、樹脂からのペプチドの切断及び粗生成物の精製を上記と同様に行った。
【００２９】
クロマトグラフィー的に均質な化合物を、アミノ酸分析及びエレクトロスプレー質量分析法によって分析した。正確な質量をエレクトロスプレー質量分析法(Ｈewlett Ｐackardシリーズ 1100 MSD質量分析計)によって確認した。上記の一般的な手順に従って調製した化合物の例を下記表に示す。
【００３０】
【表１】
2004534850.tif 000003
【００３１】
実施例１０
競合的結合アッセイ
本発明ペプチドのアゴニスト活性を受容体結合アッセイで評価した。未精製の膜調製物は、ヒトのＭＣ３受容体、ＭＣ４受容体及びＭＣ５受容体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞から得た。細胞を、ＣaＣl２又はＭgＣl２を欠いているリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)で洗浄し、次いで、酵素非含有解離媒体(Specialty Media, Lavellette, NJ, USA)で分離させた。細胞を、２８００×ｇで１０分間ペレット化し、５μｇ/ｍＬのロイペプチン、５μｇ/ｍＬのアプロチニン、４０μｇ/ｍＬのバシトラシン及び２５μｇ/ｍＬのペファブロック(Boehringer Mannheim)を加えた膜緩衝液(２０ｍＭのトリス，ｐＨ７.２，５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸)に再懸濁させた。低速ガラスホモジェナイザー中のモーター駆動テフロン被覆乳棒を使用して１０ストロークで細胞を上記膜緩衝液中に懸濁させた。得られた細胞懸濁液を４℃で２０分間４１００×ｇで遠心した。得られたペレットを、タンパク質分解酵素阻害剤を加えた新しい膜緩衝液に再懸濁させ、アリコートに分け、液体窒素中で急速凍結し、-８０℃で保存した。得られた未精製の膜を滴定して、結合試験を行うのに必要な最適レベルを決定した。
【００３２】
結合反応物(総容積＝２５０μＬ)は、ＭＢＢ(５０ｍＭのトリス，ｐＨ７.２，２ｍＭのＣaＣl２、１ｍＭのＭgＣl２)、０.１％のウシ血清アルブミン、ヒトのＭＣ３受容体、ＭＣ４受容体又はＭＣ５受容体を発現している細胞から調製した未精製膜、２００ｐＭの[１２５Ｉ]-ＮＤＰ-α-ＭＳＨ(Amersham, Arlington Heighs, IL, USA)、及び、ジメチルスルホキシドに溶解させた増加する濃度の未標識被験化合物(最終濃度＝２％)を含んでいた。反応物を、振盪することなく１時間インキュベーションし、次いで、９６-ウェルフィルタープレート(Packard)で濾過し、１％のポリエチレンイミンに予浸した。フィルターをＴＮＥ緩衝液(５０ｍＭのトリス，ｐＨ７.４，５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１５０ｍＭのＮaＣl)で３回洗浄し、乾燥させ、Ｔopcountシンチレーションカウンター(Packard)中でMicroscint-20を使用してカウントした。２μｍの未標識ＮＤＰ-α-ＭＳＨ(Peninsula Laboratories)の存在下で非特異的結合を測定した。結合データをＧraphＰadカーブフィッティングソフトウェア(PRISM, San Diego, California)で分析した。前記データは以下の表に示してある。独立した３つの実験によって活性ペプチドを評価した。
【００３３】
実施例１１
ｃＡＮＰアッセイ
ヒトのメラノコルチン受容体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ(Life Technologies)で洗浄し、酵素非含有解離緩衝液(Ｓ-０１４-Ｂ，Specialty Media)と一緒に５分間インキュベーションすることにり組織培養フラスコから分離した。細胞を遠心によって収集し、１０ｍＭの４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸(Hepes)緩衝液、ｐＨ７.５、５ｍＭのＭgＣl２、１ｍＭのグルタミン及び１ｍｇ/ｍＬのウシ血清アルブミンを加えたアールの平衡塩類溶液(Life Technologies)に、１〜５×１０６細胞/ｍＬの濃度に再懸濁させた。その後、細胞をカウントし、細胞懸濁液を、ホスホジエステラーゼ阻害剤である３-イソブチル-１-メチルキサンチン(０.６ｍＭ以下の濃度)で処理した。
【００３４】
被験化合物をジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ, １０−３〜１０−８Ｍ)に溶解し、緩衝液で希釈し、得られた溶液の０.１容積を０.９容積の上記細胞懸濁液(１〜５×１０５細胞)に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は１％であった。室温で４５分間維持した後、１００℃で５分間インキュベーションすることによって細胞を溶解させ、蓄積されたｃＡＭＰを遊離させた。Ａmersham(Arlington Heights, IL)ｃＡＭＰ検出アッセイキット(ＲＰＡ５５６)を用いて、細胞溶解液のアリコート中のｃＡＭＰの蓄積を測定した。被験化合物に応答して産生されたｃＡＭＰの量を、１００％アゴニストであると定義されているα-ＭＳＨに応答して産生されたｃＡＭＰの量と比較した。全ての活性ペプチドについて、独立した３つの実験で特性決定した。
【００３５】
本発明の代表的な化合物についての結合アッセイ及びｃＡＭＰアッセイ(それぞれ、実施例１０及び実施例１１)の結果を以下に示す。
【００３６】
【表２】
2004534850.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004534850.tif 000008
2004534850.tif 000009
2004534850.tif 000010
2004534850.tif 000011
2004534850.tif 000012
2004534850.tif 000013
2004534850.tif 000014
2004534850.tif 000015
2004534850.tif 000016
2004534850.tif 000017
2004534850.tif 000018
2004534850.tif 000019
2004534850.tif 000020
2004534850.tif 000021
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534850.tif 000022
【国際調査報告】
2004534850.tif 000023