(57)【要約】本発明は、淡水中で海水魚を飼育するための方法、組成物およびキットに関する。該方法は、少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を増大するのに十分な量で淡水に添加する工程；ならびに魚が摂取するための飼料を淡水に添加する工程、ここで飼料は海水魚の血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水に添加する工程；
ｂ）工程ａ）により改変された淡水に海水魚を移す工程；ならびに
ｃ）魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程、ここで飼料は海水魚の血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む
を含む、淡水において海水魚を成長させる方法。
【請求項２】
ＰＶＣＲモジュレーターが、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシミメティック、ＩＩ型カルシミメティック、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
飼料がＰＶＣＲモジュレーターを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
ａ）少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で、淡水に添加する工程；
ｂ）工程ａ）により改変された淡水に海水魚を移す工程；ならびに
ｃ）少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程
を含む、淡水に海水魚を移す方法。
【請求項６】
ＰＶＣＲモジュレーターがＰＶＣＲアゴニストである請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＰＶＣＲアゴニストが、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオンおよびアミノ酸からなる群より選ばれる請求項６記載の方法。
【請求項８】
ａ）淡水中の少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターのレベルを決定する工程；
ｂ）工程ａ）で決定されたレベルに基づいて、該ＰＶＣＲモジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水に添加する工程；
ｃ）工程ｂ）により改変された淡水に海水魚を移す工程；ならびに
ｄ）魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程、ここで飼料は海水魚の血清においてモジュレートされたレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む
を含む、淡水において海水魚を成長させる方法。
【請求項９】
評価されるＰＶＣＲモジュレーターがカルシウムおよびマグネシウムからなる群より選ばれる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
海水魚を移す前に淡水が約０．３ｍＭ 〜約１０．０ｍＭのカルシウムおよび約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭのマグネシウムを有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
海水魚の血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む飼料を淡水に添加する工程を含み、ここで少なくとも１つのＰＶＣＲのモジュレートされた発現が１つ以上の組織において生じる、約０．３ｍＭ〜約１０．０ｍＭのカルシウムおよび約０．５ｍＭ 〜１０．０ｍＭのマグネシウムを有する淡水において海水魚を成長させる方法。
【請求項１２】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ａ）１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水中にマグネシウムおよびカルシウムを有する淡水に海水魚を移す工程、ならびに
ｂ）少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む飼料を淡水に添加する工程
を含む、淡水に海水魚を移す方法。
【請求項１４】
ａ）１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水にフラウンダーを移す工程；ｂ）魚が摂取するための飼料を淡水に添加する工程、ここでフラウンダーの血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む
を含む、淡水においてフラウンダーを成長させる方法。
【請求項１５】
淡水のｐＨが７．０より大きい請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＶＣＲモジュレーターが、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシミメティック、ＩＩ型カルシミメティック、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１からなる群より選ばれる請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
飼料が少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
海水魚を淡水に移すための環境を提供するための、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを含有する水性混合物。
【請求項１９】
ａ）海水魚を成長させる環境を提供するための、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを含有する水性混合物；および
ｂ）約１０，０００ｍｇ／ｋｇ〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇの濃度のＮａＣｌを含有する水性食料組成物
を含有してなる、淡水において海水魚を成長させるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１０月１２日に出願された出願第０９／６８７，３７３号の一部継続出願である。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
海水魚の成長は、一般的に、海岸領域（ｃｏｓｔａｌ ｒｅｇｉｏｎ） または海水タンクに限られたものである。しかしながら、多くの淡水帯水層が、例えば中西部にいる海水魚の飼育のための潜在的な環境として存在する。これまで、淡水中で海水魚を成長させる試みは、成功していない。
【０００３】
淡水中で海水魚を成長させることは、非海岸領域で海水魚を飼育する機会を提供するであろう。淡水中で海水魚を成長させる能力は、これらの領域に新鮮な魚および経済的な成長を提供しうる。
【０００４】
したがって、海水魚を淡水に適合することが可能であるかどうかを決定し、もし可能であるなら、海水魚を淡水に適合することを可能にする生物学的メカニズムを理解する必要性が存在する。特に、淡水において海水魚を成長させる必要性が存在する。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）と呼ばれるレセプターの発現を増大または維持することによる、淡水において海水魚を成長させる方法に関する。海水魚を少なくとも１つのＰＶＣＲのモジュレーターに供することにより、ＰＶＣＲの発現および／または感受性がモジュレートもしくは維持される。海水魚は、モジュレーターが淡水環境に、および任意に飼料に添加される場合、モジュレーターに供される。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水に添加する工程；淡水に海水魚を移す工程、ならびに魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程、ここで飼料は海水魚の血清において該ＰＶＣＲモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するために十分寄与する量のＮａＣｌを含む、を含む淡水において海水魚を成長させる方法に関する。本発明に有用なＰＶＣＲモジュレーターとしては、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、Ｉ型カルシミメティック（Ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃ）、ＩＩ型カルシミメティック、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカイン、およびマクロファージ走化性ペプチド−１が挙げられる。本発明の方法に適切な飼料は、少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含み、任意にＰＶＣＲモジュレーターを含みうる。
【０００７】
本発明はまた、少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）モジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水に添加する工程、淡水に海水魚を移す工程、少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程を含む、淡水に海水魚を移す方法を包含する。ＰＶＣＲモジュレーターは、ＰＶＣＲアゴニスト、二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオンまたはアミノ酸でありうる。
【０００８】
他の態様において、本発明は、淡水中の少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターのレベルを決定する工程、該ＰＶＣＲモジュレーターを、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水に添加する工程、淡水に海水魚を移す工程ならびに魚が摂取するための飼料を改変された淡水に添加する工程、ここで飼料は海水魚の血清において該ＰＶＣＲモジュレーター（カルシウムおよびマグネシウム）のレベルをモジュレートするか、または維持するために十分な量のＮａＣｌを含む、を含む淡水において海水魚を成長させる方法に関する。ＰＶＣＲモジュレーターが評価されうる。ＰＶＣＲモジュレーターは、海水魚を移す前に淡水が約０．３ｍＭ〜約１０．０ｍＭのカルシウムおよび約０．５ｍＭ 〜約１０．０ｍＭのマグネシウムを有するように、淡水に添加される。
【０００９】
本発明はまた、約０．３ｍＭ〜約１０．０ｍＭのカルシウムおよび約０．５ｍＭ 〜１０．０ｍＭのマグネシウムを有する淡水において海水魚を成長させる方法に関する。本方法は、海水魚の血清において該ＰＶＣＲモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するために十分な量のＮａＣｌを含む飼料を淡水に添加する工程を含み、ここで少なくとも１つのＰＶＣＲのモジュレートされるまたは維持される発現は１つ以上の組織においてモジュレートまたは維持される。
【００１０】
他の態様において、本発明は、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量で淡水中にマグネシウムおよびカルシウムを有する淡水に海水魚を移す工程、ならびに少なくとも約１重量％のＮａＣｌを含む飼料を淡水に添加する工程を含む、淡水に海水魚を移す方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、１つ以上の組織において少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性を増大するか、もしくは維持するのに十分な量で少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水にフラウンダーを移す工程、ならびに魚が摂取するための飼料を淡水に添加する工程、ここで飼料はフラウンダーの血清において有意に増大したレベルの該ＰＶＣＲモジュレーターを与えるのに十分な量のＮａＣｌを含む、を含む淡水においてフラウンダーを成長させる方法に関する。淡水のｐＨは、７．０より大きいであろう。
【００１２】
別の態様において、本発明は、淡水に海水魚を移すための環境を提供するための、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを含有する水性混合物に関する。水性混合物は、海水魚の水産養殖期間の淡水への移行に適切な媒体である。
【００１３】
本発明はまた、海水魚を成長させる環境を提供するための、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを含有する水性混合物；および約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇの濃度のＮａＣｌを含有する水性食料組成物を含有してなる、淡水において海水魚を成長させるためのキットに関する。
【００１４】
驚くべきことに、ＰＶＣＲのモジュレートされるか、もしくは維持される発現および／またはＰＶＣＲの感受性の改変により、これらの海水魚が淡水中で生存し、かつ成長することが可能になることが発見された。本発明の発見まで、水産養殖業では、魚をストレス、死および／または疾患に供すること無しには、海水魚を淡水に移すことは不可能であった。この慣例とは異なって、本発明の工程の実施は、ＰＶＣＲの発現をモジュレートするか、もしくは維持し、および／またはＰＶＣＲの感受性を改変し、海水魚を、ストレス、死および／または疾患が最小でまたはそれら無しで淡水に移すのを可能にし、かつ予期しないことに、魚は成長する。実際、淡水で成長する海水魚は、より高い脂肪含量、および穏やかな、「魚くささ」が少ない味を有する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、淡水において海水魚を成長させるまたは飼育する方法に関する。本方法は、多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）（例えば、少なくとも１つのＰＶＣＲ）の発現をモジュレートするか、もしくは維持するおよび／またはその感受性を改変することを含む。本発明は、淡水に適合する魚の能力に影響を与えるＰＶＣＲの発現をモジュレートするか、または維持することに関する。
【００１６】
特に、本発明の方法は、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを淡水に添加する工程、および魚による消費のために特別に作製されたか、または改変された飼料を淡水に添加する工程を含む。飼料は、血清におけるＰＶＣＲモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するのに十分な量の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（例えば、約１重量％〜約１０重量％、または約１０，０００ｍｇ／ｋｇ 〜約１００，０００ｍｇ／ｋｇ）を含む。飼料におけるＮａＣｌのこの量は、海水魚がより多くの淡水を飲むことを引き起こすか、または誘導する。淡水はＰＶＣＲモジュレーターを含み、魚はその増大された量を摂取するので、ＰＶＣＲモジュレーターの血清レベルは魚において有意に増大し、増大したもしくは維持されたＰＶＣＲ発現および／または改変されたＰＶＣＲ感受性を引き起こす。「有意な」増大は、対照または参照と比較したＰＶＣＲまたはＲＶＣＲモジュレーターのレベルまたは量における測定可能な増大のことを言うために本明細書で使用される。ＰＶＣＲまたはＰＶＣＲモジュレーターにおける有意な増大を測定するか、または検出する方法は、本明細書に開示され、当業者に公知である。
【００１７】
本発明の方法は、海水魚を淡水に適合させることに関する。海水魚は、海水で生活する、少なくともその成体の一生のほとんどを海水中で生活する魚である。海水魚としては、例えば、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウインターフラウンダー、およびサマーフラウンダーが挙げられる。海水魚は、ＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水に順応される。
【００１８】
用語「海水魚」は、当業者により理解される。用語「淡水」は、例えば、小川、河川、池、公共の吸水設備に由来する水、または例えば、以下のイオン組成：約２ｍＭ 未満のマグネシウム、カルシウムおよびＮａＣｌを有する他の非海水供給源に由来する水を意味する。「改変された淡水」、「ＰＶＣＲの添加により改変された淡水」および「ＰＶＣＲモジュレーター環境」という熟語は、本明細書で記載される場合、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターが添加されている淡水のことを言う。
【００１９】
ＰＶＣＲモジュレーターは、少なくとも１つのＰＶＣＲの発現をモジュレートするか、もしくは維持するか、またはその感度を改変するのに十分な量で、淡水に添加される。ＰＶＣＲは、いくつかの型の海水魚の種々の組織から、分子生物学的技術を用いて単離されている。例えば、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウインターフラウンダーおよびサマーフラウンダーを含む様々な種の海水魚由来の組織試料から、核酸が単離された。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて増幅された。実施例４に記載するように、増幅ＤＮＡ を精製し、ベクターにサブクローン化し、その配列を決定した。
【００２０】
ＰＶＣＲは、海水魚の種々の組織（例えば、鰓、皮、腸、腎臓、膀胱、脳または筋肉）に位置し、例えば、周囲の水中、それらの血清中または腎臓、膀胱または腸などの体内部の細管の管腔内容物中の種々のイオン（例えば、二価カチオン）を含むＰＶＣＲモジュレーターにおける改変を感じとる。ＰＶＣＲモジュレーターを感じとる能力は、ＰＶＣＲの発現におけるモジュレーションまたは維持を生じ、それにより魚を淡水により良好に順応することを可能にする。ＰＶＣＲのモジュレートされたまたは維持された発現は、例えば、１つ以上の組織において生じうる。本明細書で使用される場合、ＰＶＣＲの「感受性」は、ＰＶＣＲモジュレーターの濃度における変化に応答したＰＶＣＲ発現の改変のことを言う。ＰＶＣＲ発現は、標準法による試料におけるＰＶＣＲポリペプチドまたは核酸分子を測定するか、または検出することにより、評価されうる。
【００２１】
「ＰＶＣＲモジュレーター」は、ＰＶＣＲの発現をモジュレートする、またはＰＶＣＲの感受性もしくは応答性をモジュレートする、または１つ以上の組織においてすでに増大したＰＶＣＲの発現レベルを維持する化合物を意味すると、本明細書で規定される。かかる化合物としては、ＰＶＣＲアゴニスト（例えば、無機ポリカチオン、有機ポリカチオンおよびアミノ酸）、ＩＩ型カルシミメティックス（ｃａｌｃｉｍｉｍｅｔｉｃｓ）、および間接的にＰＶＣＲ発現を改変する化合物（例えば、約３，０００ 〜１０，０００国際単位／ｋｇ飼料の濃度の１，２５ジヒドロキシビタミンＤ ）、インターロイキンβなどのサイトカイン、ならびにマクロファージ走化性ペプチド−１（ＭＣＰ−１））が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするＩＩ型カルシミメティックスの例としては、例えば、ＮＰＳＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．，のＮＰＳ−Ｒ−４６７ およびＮＰＳ−Ｒ−５６８ （Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ， Ｕｔａｈ， Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，９６２，３１４ ；５，７６３，５６９ ；５，８５８，６８４ ；５，９８１，５９９ ；６，００１，８８４）であり、それは約０．１ μＭ 〜約１００ μＭ の濃度の飼料または水で投与されうる。Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．Ｆ．ら、ＰＮＡＳ ９５：４０４０−４０４５（１９９８） を参照。
【００２２】
無機ポリカチオンの例は、約０．３〜約１０．０ｍＭの濃度のカルシウムおよび約０．５ 〜約１０．０ｍＭの濃度のマグネシウムが挙げられる二価カチオン；および限定されないが、約１ 〜約５００ μＭ の濃度のガドリニウム（Ｇｄ３＋）が挙げられる三価カチオンである。
【００２３】
有機ポリカチオンとしては、限定されないが、約１ 〜約８ｇｍ／ｋｇ飼料の濃度のネオマイシンまたはゲンタマイシンなどのアミノグリコシド、ならびにポリアミンを含む有機ポリカチオン（例えば、約１０μＭ〜１０ｍＭ飼料の濃度のポリアルギニン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、スペルミン、カダベリン、プトリシン（ｐｕｔｒｉｃｉｎｅ） 、ポリ　アルギニン／ヒスチジンのコポリマー、ポリ　リジン／アルギニンのコポリマー）が挙げられる。Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２８： ３０４７−３０５４（１９９１）； Ｑｕｉｎｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７３： Ｃ１３１５−１３２３（１９９７） を参照。
【００２４】
さらに、ＰＶＣＲアゴニストとしては、約１〜約１０ｇｍ／ｋｇ 飼料の濃度のＬ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−シスチンなどのアミノ酸が挙げられる。Ｃｏｎｉｇｒａｖｅ，Ａ．Ｄ． ら、ＰＮＡＳ ９７： ４８１４−４８１９（２０００）を参照。モル濃度は、淡水中のＰＶＣＲモジュレーターの遊離またはイオン化した濃度のことを言い、結合したＰＶＣＲモジュレーター（例えば、ガラス、タンパク質、またはプラスチック表面を含む陰性帯電した粒子に結合したＰＶＣＲモジュレーター）の量を含まない。これらのモジュレーターの任意の組合せが、その組合せが少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持する限り、水または飼料に（本明細書に記載のＮａＣｌに加えて）添加されうる。
【００２５】
ＰＶＣＲモジュレーターは、多数の方法で魚に投与されうる。本発明は、ＰＶＣＲの発現をモジュレートするか、もしくは維持するおよび／またはその感受性を改変するのに十分な、任意の方法でのＰＶＣＲの投与を包含する。１つの態様において、ＰＶＣＲモジュレーターは、本明細書に記載のように単純に淡水に添加される。水に添加されるＰＶＣＲモジュレーターは、魚の皮および鰓でのＰＶＣＲの発現を増大するか、もしくは維持するか、もしくは減少するおよび／またはその感度を改変し、特に魚が約１％〜約１０％ＮａＣｌ（例えば、約 １〜約１０ｇｍ／１００ｇｍ飼料の濃度）を有する飼料を与えられる場合に魚により摂取されうる。飼料へのＮａＣｌの添加に加えて、ＰＶＣＲモジュレーターがまた飼料に添加されうる。飼料に添加されるＰＶＣＲモジュレーターの量および型もまた、本明細書に記載される。他の態様は、モジュレーター、例えば有機ポリカチオン中に魚を「浸す」ことにより、魚をＰＶＣＲモジュレーターに供することを含む。有機ポリカチオンは、ＰＶＣＲの発現を増大するか、または維持するのに十分な量でポリカチオンが魚の皮膚および鰓に付着するのを可能にする方法で、処方されうる。
【００２６】
本発明はまた、魚の淡水環境中および血清中に存在するＰＶＣＲモジュレーターの量を評価することを包含する。ＰＶＣＲモジュレーターは、当該分野で公知の方法を用いて評価または測定される。評価後、ＰＶＣＲモジュレーターが水に添加され、少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持するのに十分な量までの濃度がもたらされるか、あるいは規定された範囲内のＰＶＣＲモジュレーターの濃度がもたらされるのに十分な量までの濃度がもたらされる。例えば、わずか０．２ｍＭのカルシウムを有すると評価される帯水層は、約０．３ｍＭ 〜約１０．０ｍＭまでの濃度をもたらすために、さらなるカルシウムを必要とする。
【００２７】
好ましい態様において、本発明は、淡水に２つのＰＶＣＲアゴニストの組合せを添加することにより実施される。特に、それぞれ約０．３ｍＭ 〜約１０．０ｍＭのカルシウム濃度および約０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭのマグネシウム濃度をもたらすために、カルシウムおよびマグネシウムが淡水に添加される。水へのカルシウムおよびマグネシウムの添加に加えて、イオン濃度のこれらの範囲は、魚に対して淡海水（例えば、希釈した海水）環境を提供することにより達成されうる。
【００２８】
カルシウムおよびマグネシウムは、種々の供給源由来であり得、水に添加された場合、カルシウムおよび／またはマグネシウムレベルは、ＰＶＣＲの発現をモジュレートするか、もしくは維持する、および／または規定された範囲内である。カルシウムおよびマグネシウムの供給源は、種々の化合物の混合物であり得、またはそれぞれが実質的に均一または純粋な化合物に由来しうる。カルシウムの供給源としては、例えば、Ｃａ（ＣＯ３）２、ＣａＣｌ２およびＣａＳＯ４ が挙げられ、マグネシウムの供給源としては、例えば、ＭｇＣｌ２ 、ＭｇＳＯ４、ＭｇＢｒ２ 、およびＭｇＣＯ３ が挙げられる。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、ＮａＣｌ食餌と同時に、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水への曝露を断続する（例えば、中断する）こと、ならびに継続する（例えば、中断しない）こと含む。ＰＶＣＲ発現および／または改変した感受性がモジュレートまたは維持されたままである限り、ＰＶＣＲへの断続曝露が生じうる。少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水中における連続した維持または淡水への曝露が、実施例２に示される。
【００３０】
海水魚は海水から移される。用語「海水」は、海に由来する水、または海に由来する水の化学組成および無機物組成に似せて処方されている水である。調製された海水の主な元素組成は、好ましくは天然の海水の主な元素組成の実質的に範囲内にある（例えば、以下のイオン組成を有する：３０ｍＭより多いマグネシウム、約６ｍＭ より多いカルシウム、および約３００ｍＭ より多いＮａＣｌ）。人工海水を調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，３５１，６５１号明細書に記載されている。
【００３１】
１つの態様において、海水魚は、淡水に移す前の一定期間、塩分におけるゆるやかなまたは段階を追った減少と同時のＮａＣｌ食餌の供給に魚を供することによる本発明の方法により処置される。塩分は、水中のイオン濃度（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびナトリウム）のことを言う。魚は、減少する塩分環境中に少なくとも１つのＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、または維持するのに十分な期間維持される。淡水に移す前に減少した塩分に魚を維持する時間の長さに影響を与えうる因子としては、限定されないが、魚の大きさ、もしあれば淡水へのＰＶＣＲモジュレーターの添加前のＰＶＣＲ発現または感受性のレベル、ＰＶＣＲモジュレーターおよびイオンを排出する魚の能力、ならびに魚の表面と容量との比が挙げられる。それゆえ、魚が維持される時間の長さは約５日〜約６０日、好ましくは約１０日〜約２５日の範囲でありうる。
【００３２】
海水のイオン濃度は、約１０％〜約９０％、好ましくは約２５％〜約５０％減少される。減少した塩分と塩分への種々の長さの曝露との組合せが、本発明により包含される。例えば、実施例２に記載されるように、魚は、淡水に移す前に５０％海水（海水の５０％の塩分）に１０日間順応され、次いで２５％海水（海水の２５％の塩分）に１５日間適合された。本明細書で使用される「順応」は、改変した水環境への成功した移行のことを言う。海水と比較して減少した塩分を有する水中での維持の後、次いで本明細書に記載のＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水に海水魚を置く。魚は、ＰＶＣＲの発現および／または感受性がモジュレートされるか、もしくは維持される限り、無期限にＰＶＣＲモジュレーターの添加により改変された淡水中に残り、成長しうる（例えば、改変された淡水中で維持され、ＮａＣｌ食餌を与えられる）。
【００３３】
本発明は、さらに淡水に飼料を添加することを含む。魚に与えられる飼料の頻度および量は、当該分野に教示されている。一般的に、魚は １日に １〜３ 回、総計約０．２５〜０．５ ％体重／日の飼料を与えられる。飼料は、海水魚の血清におけるＰＶＣＲモジュレーターのレベルをモジュレートするか、または維持するのに寄与するのに十分なＮａＣｌを有する。特に、飼料中の十分な量のＮａＣｌの存在は、海水魚に周囲環境由来のより多くの水を飲ませる。ＮａＣｌはＰＶＣＲ感受性を減少するが、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水の摂取は、ＰＶＣＲモジュレーターの血清レベルにおける全般的な増大を生じる。ＰＶＣＲモジュレーターの血清レベルにおける増大は、ＰＶＣＲの発現におけるモジュレーションを生じる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、海水魚を淡水に移すための環境を提供するための、少なくとも１つのＰＶＣＲモジュレーターを含有する水性混合物に関する。「水性混合物」は、本発明の方法による淡水への海水魚の首尾よい移行のための適切な環境を提供する組成物を意味すると本明細書において規定される。水性混合物は、本発明の方法における即座の使用のために使用前に混合されうる。代替的には、水性混合物は、水での再構築を必要としうる。水性混合物は、再構築された時に、約０．３〜１０ｍＭのＣａ２＋および約０．５ 〜１０ｍＭのＭｇ２＋を含有する溶液を与える。水性混合物は、約１ｇｍ／ｋｇ〜約１０ｇｍ／ｋｇの量のアミノ酸を任意に含みうる。
【００３５】
本発明はまた、水性食料組成物に関する。「水性食料組成物」は、本明細書に記載される場合、魚飼料のことを言う。本発明における使用に適切な水性食料組成物または飼料は、約 １重量％〜１０重量％のＮａＣｌ、または約１０，０００ｍｇ ＮａＣｌ ／ｋｇの飼料〜約１００，０００ｍｇ ＮａＣｌ／ｋｇの飼料（例えば、１２，０００ｍｇ／ｋｇ）を含む。飼料は、本明細書において「ＮａＣｌ食餌」と呼ばれる。ＮａＣｌは、ＰＶＣＲ発現をモジュレートまたは維持する、ＰＶＣＲ感受性を改変するおよび／または魚がより多く飲むことを誘導する所望の効果を与えるために、他のナトリウム塩と組み合わされうる。よって、本明細書で使用される場合、用語ＮａＣｌは、実質的に純粋な化合物、ナトリウムの他の供給源とＮａＣｌとの混合物またはナトリウムの他の供給源を含む。飼料はさらにＰＶＣＲモジュレーター、特にアミノ酸などのＰＶＣＲアゴニストを含みうる。１つの態様において、飼料は、約１重量％〜１０重量％のＮａＣｌおよび約 １〜約１０ｇｍ／ｋｇ の量のトリプトファンなどのアミノ酸を有する。この態様は、本明細書において「ＡＰＳ プロセスＩＩ」と呼ばれ、実施例２でさらに規定される。
【００３６】
飼料は、適当な濃度のＮａＣｌが存在する限り、多数の方法で作製されうる。飼料は、例えば、飼料を再処方することにより、または飼料がＮａＣｌを有する溶液を吸収することを可能にし、および任意にＰＶＣＲモジュレーターを添加することにより、作製されうる。さらに、トップドレシング（ｔｏｐｄｒｅｓｓｉｎｇ）が嗜好性のために添加されうる。実施例３は、飼料を作製するための１つの方法を詳細に記載する。魚飼料を調製する代替的な方法は、当業者に公知である。
【００３７】
本発明の別の態様は、約０．３〜約１０．０ｍＭのカルシウムおよび約 ０．５ｍＭ〜約１０．０ｍＭのマグネシウムを有する淡水環境に魚が維持される場合、 １重量％〜１０重量％のＮａＣｌを有する飼料を海水魚に与えることを含む。本発明のこの態様が行われる場合、海水魚の血清中のカルシウム、マグネシウムおよび／またはナトリウムのレベルは、淡水魚において見られるＰＶＣＲ発現および／または感受性と比較して、増大される。
【００３８】
別の態様において、海水と比較して減少した塩分を有する水中にあるか、またはＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水中にある魚はまた、光周期に曝露される。光周期は、魚を光（例えば、日光、白熱光、または蛍光）に曝露することを言う。好ましくは、光周期は、実質的に連続であるか、または成長を増大するのに十分な長さを生じる。光周期は、２４時間の間隔内で少なくとも約１２時間で、または約１４、１６、１８、２０、２２、もしくは好ましくは約２４時間などのより長い期間で生じうる。
【００３９】
本発明の方法は、海水魚におけるＰＶＣＲの発現および／または感受性をモジュレートするか、もしくは維持し、それは低減された浸透性ストレスおよび低減された死亡率を生じる。本発明の方法により淡水中で養殖された海水魚は、飼料を摂取し、成長を示す。対照的に、本発明の方法により淡水中で養殖されていない海水魚は、浸透性ストレス、低減されたもしくは全くない食料摂取、および結果として起こる死を経験する。浸透性ストレスは、周囲環境と魚の体区画との間の浸透圧における差異から生じる。これは、魚のホメオスタシス平衡を乱し、減少した成長、再現される衰え、および疾患に対する低減された耐性を生じる。本発明の工程を受けた魚は、有意な量の浸透性ストレスを経験しない。結果として、魚は成長しうる。驚くべきことに、本明細書に記載され、例示されるように、本発明により適合される海水魚は、海水に維持した海水魚とほとんど同様に成長する（例えば、海水に３７日間維持した魚の６０％の増大した成長と比較して、本発明に３７日間供した魚における５３％の増大した成長）。さらに、本発明の方法により淡水中で養殖した海水魚は、淡水に直接移され、かつ本発明の工程に供されていない海水魚の生存率によりも有意に高い生存率（例えば、約６０〜約１００％）を示す。図１５および１６を参照。
【００４０】
本発明の方法はまた、淡水に移される海水魚中の疾患の発病率を減少する。本発明の方法で処理した魚は、淡水への移行に対してより少ないストレスを経験するので、その免疫機能はより強く、寄生虫性、ウイルス性、細菌性および真菌性疾患を受けにくい。したがって、本発明の方法により養殖される海水魚は、より健康である。
【００４１】
ＰＶＣＲの方法評価
本発明は、魚が、海水から淡水への移送の準備ができているかどうかを決定するためのＰＶＣＲのレベルを検出するための方法を含む。ＰＶＣＲレベルを測定する方法は、いくつかの適切なアッセイを含む。適切なアッセイは、免疫学的方法、例えば、ＦＡＣＳ解析、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および化学発光アッセイを含む。現在公知であるか、または将来開発される任意の方法が、ＰＶＣＲ発現を測定するために使用されうる。
【００４２】
ＰＶＣＲまたはその一部と反応する抗体が使用されうる。好ましい態様では、抗体は、ＰＶＣＲまたはその一部と特異的に結合する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、用語、抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、およびその機能的断片を含むことを意図する。用語、ポリクローナルおよびモノクローナルは、抗体調製の均一性の程度をいい、特定の作製方法に限定されることを意図するわけではない。
【００４３】
いくつかの好ましい態様では、免疫学的技術は、抗−ＰＶＣＲ抗体（すなわち、１つまたはそれより多くの抗体）によりＰＶＣＲレベルを検出する。用語「抗−ＰＶＣＲ」抗体は、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体ならびにその混合物を含む。
【００４４】
抗−ＰＶＣＲ抗体は、単離されたＰＶＣＲおよび／または組換えＰＶＣＲあるいはその一部のような適切な免疫原に対して惹起されうる（合成ペプチドのような合成分子を含む）。ある態様では、抗体は、単離されたＰＶＣＲおよび／または組換えＰＶＣＲあるいはその一部（例えば、ペプチド）に対して惹起されるか、または組換えＰＶＣＲを発現する宿主細胞に対して惹起される。また、トランスフェクト細胞のような組換えＰＶＣＲを発現する細胞は、免疫原として、またはレセプターに結合する抗体についてのスクリーニングにおいて使用されうる。
【００４５】
任意の適切な技術が、免疫抗原を調製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製しうる。技術は、種々のこれらの方法を含む（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７ （１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ５１１−５１９（１９７６）； Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ， ２６６： ５５０−５５２ （１９７７）； Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）； Ｃｕｒｒｎｅｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ２ （’９４年、夏Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７）， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、編、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ： ＮｅｗＹｏｒｋ， ＮＹ）， Ｃｈａｐｔｅｒ １１， （１９９１））。一般に、適切な不死細胞またはＳＰ２／０のようなミエローマ細胞株を用いる融合抗体産生細胞は、ハイブリドーマを産生しうる。例えば、目的の抗原で免疫した動物は、抗体産生細胞、好ましくは、脾臓またはリンパ節由来の細胞を提供する。選択的な培養条件は、抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離し、一方、限界希釈技術は、それらを産生する。研究者は、所望の特異性を有する抗体産生細胞を選択するためのＥＬＩＳＡのような適切なアッセイを使用することができる。
【００４６】
他の適切な方法は、必要な特異性を有する抗体を産生するか、または単離しうる。他の方法の例は、ライブラリーから組換え抗体を選択すること、またはマウスのような動物の免疫を当てにすることを含む。
【００４７】
この方法によれば、アッセイは、生物学的サンプル中のＰＶＣＲのレベルを決定しうる。ＰＶＣＲの量を決定することにおいて、アッセイは、試験対象のサンプルとＰＶＣＲに対して特異性を有する抗体とを、抗体とＰＶＣＲとの間の複合体の形成に適切な条件下で組み合わせること、および複合体の形成を検出または測定すること（直接的または間接的に）を含む。サンプルは、直接的または間接的に得られ得、特定のサンプルおよび選択されたアッセイ形式に適切な方法により調製されうる。
【００４８】
特に、組織サンプル、例えば、鰓組織サンプルは、それらがＭＳ−２２２で麻酔された後に魚から調製されうる。組織サンプルは、魚の重量オスモル濃度に対応する適切なリンガー液中の２％パラホルムアルデヒドでの浸漬により固定化され、リンガーで洗浄され、次いで液体窒素で冷却したメチルブタンを用いて包埋化合物、例えば、Ｏ．Ｃ．Ｔ．ＴＭ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｅｌｋａｈａｒｔ， Ｉｎｄｉａｎａ， ＵＳＡ）中で凍結される。クリオスタットで８〜１０μ組織切片にカットした後に、個々の切片を種々の染色プロトコルに供する。例えば、切片を、１）ヤギ血清または同じ種類の魚から得られる血清でブロックし、２）ウサギ抗ＣａＲまたは抗ＰＶＣＲ抗血清とともにインキュベートし、および３）ペルオキシダーゼ結合親和性精製ヤギ抗ウサギ抗血清で洗浄し、これとともにインキュベートする。結合したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清の位置は、次いで、バラ色（ｒｏｓｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ）アミノエチルカルバゾール反応産物の発色により可視化される。個々の切片は、標準的な光学顕微鏡技術によりマウントされ、観察され、撮影される。魚ＰＶＣＲタンパク質を検出するために使用される１つの抗ＣａＲ抗血清は、ＲａＫＣａＲタンパク質（Ｒｉｃｃａｒｄｉら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９２： １３１−１３５ （１９９５）； アクセッション番号ＮＰ０５８６９２）の細胞外ドメインに位置するアミノ酸番号２１４〜２３６に対応する２３マーペプチドを用いてウサギにおいて惹起される。２３マーペプチドの配列は、ＡＤＤＤＹＧＲＰＧＩＥＫＦＲＥＥＡＥＥＲＤＩＣ（配列番号：２４）である。配列ＤＤＹＧＲＰＧＩＥＫＦＲＥＥＡＥＥＲＤＩＣＩ（配列番号：２５）またはＡＲＳＲＮＳＡＤＧＲＳＧＤＤＬＰＣ（配列番号：２６）を有する小ペプチドはまた、ＰＶＣＲに対する抗体を含む抗血清を作製するために使用されうる。かかる抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたはキメラでありうる。
【００４９】
放射性標識、蛍光標識または化学発光標識等の適切な標識は、直接検出されうる。それらはまた、酵素標識等の標識およびビオチンのような他の抗原性または特異的結合パートナーを用いて間接的に検出されうる。かかる標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光標識、ルシフェラーゼ等の化学発光標識、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等の放射性同位体標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識、およびアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン、アビジン、スピン標識等が挙げられる。複合体中の抗体の検出はまた、次いで検出される（例えば、標識により）二次抗体を用いて免疫学的に行われうる。従来の方法または他の適切な方法は、抗体を直接的にまたは間接的に標識しうる。
【００５０】
本方法を行うことにおいて、ＰＶＣＲのレベルは、対照とは異なる。対照と比べたＰＶＣＲ発現の種々のレベルまたは存在は、統計学的に有意な量の魚が試験された魚または魚の集団が、淡水に移動する用意ができていることを示す。対照は、存在する場合、本発明の工程に供されていない、例えば、ＰＶＣＲモジュレーターを有する淡水に供されていない、および／またはＮａＣｌ食餌を与えられていない魚に由来するＰＶＣＲのレベルをいう。
【００５１】
ＰＶＣＲはまた、組織サンプルに由来するｍＲＮＡのノザンブロット解析によりアッセイされうる。種々のサメ組織に由来するノザンブロット解析は、鰓組織において最も高い程度のＰＶＣＲ発現があり、続いて、腎臓および直腸腺であることを示した。約７ｋｂ、４．２ｋｂおよび２．６ｋｂの少なくとも３つの別個のｍＲＮＡ種が存在するようである。例えば、ＰＶＣＲはまた、ハイブリダイゼーションによりアッセイされ、例えば、本明細書中に提供されるＰＶＣＲ配列（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３）の１つ、その相補物または配列の１つに由来するオリゴヌクレオチドを魚に由来する組織サンプルから精製されたｍＲＮＡにハイブリダイズさせることにより、ＰＶＣＲがアッセイされうる。かかるハイブリダイゼーション配列は、ハイブリダイゼーション産物の検出が可能であるように、付着された検出可能標識、例えば、放射性、蛍光等を有しうる。ハイブリダイゼーション法は、周知であり、かかる方法は、Ｊａｃｏｂｓらによる米国特許第５，８３７，４９０号に提供されており、その全教示が参考として全体として本明細書中に援用される。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、好ましくは、これらのパラメータに従うべきである：（ａ）もし存在する場合、多義性塩基（「Ｎ」）が最も少ない配列の領域に設計されるべきである、ならびに（ｂ）約８０℃のＴｍ（ＡまたはＴ各々について２℃、およびＧまたはＣ各々について４℃を仮定する）を有するように設計されるべきである。
【００５２】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件は、第２の核酸配列への第１の核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする温度および緩衝液組成の条件をいい、ここで、条件は、互いにハイブリダイズする配列間の同一性の程度を決定する。それゆえ、「高ストリンジェンシー条件」は、互いに非常に類似した核酸配列だけがハイブリダイズする条件である。配列は、それらが、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、互いにあまり似ていないこともありうる。２つの配列が低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするには、より低い類似性が必要とされる。ハイブリダイゼーションが生じないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列が、それに最も類似する配列にハイブリダイズする条件が決定されうる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度、温度、およびホルムアミド等の不安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列間のミスマッチ塩基対のパーセント、および他の非同一配列内の配列のサブセット（例えば、小ストレッチのリピート）の出現の頻度等の因子をも含む。洗浄は、互いにハイブリダイズする配列間の最小のレベルの類似性を決定するように条件が設定される工程である。一般に、相同性ハイブリダイゼーションのみが生じる最も低い温度から、２つの配列間の１％のミスマッチは、任意の選択されたＳＳＣ濃度について融点（Ｔｍ）において１℃の減少を生じる。一般に、ＳＳＣの濃度の倍加は、約１７℃のＴｍの増大を生じる。これらのガイドラインを用いて、洗浄温度は、求められるミスマッチのレベルに応じて、経験的に決定されうる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，１９９５， 補遺を含む）、ページ２．１０．１〜２．１０．１６および６．３．１〜６．３．６に説明される。
【００５３】
高ストリンジェンシー条件は、（１）６５℃で、１ｘ ＳＳＣ（１０ｘ ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌでｐＨを７．０に）、１％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ 変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（２）４２℃で、１ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ Ｎａ２・ＥＤＴＡ、０．５ＭＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ４＝１リットル当たり１３４ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ８５％ Ｈ３ＰＯ４）、７％ ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｘデンハルト溶液（１００ｘ ＝１０ｇ Ｆｉｃｏｌｌ ４００、１０ｇ ポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（５）６５℃で、５ｘ ＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、または（６）４２℃で、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションを使用することができ、（１）６５℃で、０．３〜０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、または（２）６５℃で、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）、１％ＳＤＳのいずれかの高ストリンジェンシー洗浄をともなう。上記条件は、５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに使用されることが意図される。ハイブリッドが１８塩基対長未満であると考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍ、ここでＴｍ（℃）＝（２ｘＡおよびＴ塩基の数）＋（４ｘＧおよびＣ塩基の数）よりも５〜１０℃低いべきである。約１８〜約４９塩基対長であると考えられるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度であり、「Ｌ」は、ハイブリッドの塩基対長である。
【００５４】
中程度のストリンジェンシー条件は、（１）６５℃で、４ｘ ＳＳＣ、（１０ｘ ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ， ０．３Ｍ Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ ＨＣｌでｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌの変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（２）４２℃で、４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（３）６５℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭＮａ２・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ４＝１リットル当たり１３４ｇＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ ８５％Ｈ３ＰＯ４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（４）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｘデンハルト溶液（１００ｘ＝１０ｇＦｉｃｏｌｌ ４００， １０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（５）６５℃で、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡまたは（６）４２℃で、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーションを用いることができ、６５℃で、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの中程度のストリンジェンシーの洗浄をともなう。上記条件は、５０塩基対またはそれより長いＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて使用されることが意図される。ハイブリッドが１８塩基対長よりも短いと考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍよりも５〜１０℃低いべきであり、ここで、Ｔｍ（℃）＝（２ｘＡおよびＴ塩基の数）＋（４ｘＧおよびＣ塩基の数）。ハイブリッドが約１８〜約４９塩基対長であると考えられる場合、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度、および「Ｌ」はハイブリッドの長さ（塩基対）である。
【００５５】
低ストリンジェンシー条件は、（１）５０℃で、４ｘＳＳＣ、（１０ｘＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｎａ３−クエン酸・２Ｈ２Ｏ（８８ｇ／リットル）、１ＭＨＣｌでｐＨ７．０に）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（２）４０℃で、６ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（３）５０℃で、１％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭＮａ２・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）（１Ｍ ＮａＨＰＯ４＝１リットル当たり、１３４ｇＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｌ ８５％ Ｈ３ＰＯ４）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（４）４０℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、１ｘデンハルト溶液（１００ｘ＝１０ｇ Ｆｉｃｏｌｌ ４００、１０ｇ ポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、水で５００ｍｌに）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、（５）５０℃で、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、または（６）４０℃で、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡのいずれかでのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、５０℃での２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳまたは（２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ ７．２）、５％ＳＤＳのいずれかの低ストリンジェンシー洗浄をともなう。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて使用されることが意図される。ハイブリッドが１８塩基対長よりも短いと考えられる場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたＴｍよりも５〜１０℃低いべきであり、ここで、Ｔｍ（℃）＝（２ｘＡおよびＴ塩基の数）＋（４ｘＧおよびＣ塩基の数）。ハイブリッドが約１８〜約４９塩基対長であると考えられる場合、Ｔｍ（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）、ここで「Ｍ」は、一価カチオン（例えば、Ｎａ＋）のモル濃度、および「Ｌ」はハイブリッドの長さ（塩基対）である。
【００５６】
従って、本発明は、ＰＶＣＲタンパク質もしくはその一部に特異的な抗体、またはＰＶＣＲの核酸にハイブリダイズしうる核酸配列のいずれかを有する、ＰＶＣＲの検出またはＰＶＣＲの定量のためのキットを含む。
【００５７】
ＰＶＣＲの発現または感受性における変更は、適切なトランスジーンの導入により達成されうる。適切なトランスジーンは、ＰＶＣＲ遺伝子自身、またはＰＶＣＲ遺伝子発現に直接的もしくは間接的に影響する変更遺伝子のいずれかを含む。魚卵母細胞、胚および成体におけるトランスジーンの首尾よい導入、選択および発現のための方法は、Ｃｈｅｎ，ＴＴら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｆｉｓｈ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２０９−２１５（１９９０）に記載されている。
【００５８】
本発明は、以下の実施例によりさらにおよびより詳細に説明されるが、決して限定されることを意図しない。
【００５９】
実施例
実施例１．多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）は魚の塩分センサーとして働く。
多価カチオン感受性レセプター（ＰＶＣＲ）は、魚の塩分センサーとして働く。これらのレセプターは、浸透圧調整を担うことが知られている魚の身体（例えば、鰓、腸、腎臓）の種々の細胞の頂端膜に局在している。ツノザメ由来の全長カチオンレセプター（ＣａＲ）は、ヒトＨＥＫ細胞において発現された。このレセプターは、ＨＥＫ細胞を覆う細胞外液体中のＮａＣｌ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のイオン組成の変化に応答することが知られていた。イオン濃度は、淡水から海水への移行を含む範囲を包囲するように応答した。ＰＶＣＲｍＲＮＡの発現はまた、淡水から海水へのそれらの移行の後に魚において調節され、ＰＶＣＲアゴニストによって調節される。
【００６０】
縮重プライマーを用いた核酸増幅を用いることにより、ＰＶＣＲの部分的ゲノムクローンがまた、タラ（図１Ａ〜Ｂ）、ハドック（図２Ａ〜Ｂ）、ヘイク（図３Ａ〜Ｂ）、オヒョウ（図４Ａ〜Ｂ）、サバ（図５Ａ〜Ｂ）、ポラック（図６Ａ〜Ｂ）、ハタ（図７Ａ〜Ｂ）、メカジキ（図８Ａ〜Ｂ）、マグロ（図９Ａ〜Ｂ）、ウィンターフラウンダー（図１０Ａ〜１０Ｃ）およびサマーフラウンダー（図１１）を含む他の種類の魚から単離されている。ウィンターフラウンダーを除くこれらのクローンを単離するために使用される縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＴＧＴＣＫＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＹＧ ＧＲＡ ＴＣＧ Ｃ−３’（配列番号：２７）および５’−ＧＧＣ ＫＧＧ ＲＡＴ ＧＡＡ ＲＧＡ ＫＡＴ ＣＣＡＲＡＣ ＲＡＴ ＧＡＡ Ｇ−３’（配列番号：２８）であり、ここでＫはＴまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである。縮重オリゴは、標準的な方法（Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．， １９９３， ”Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ，” ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．５８， 編Ａ．Ｈａｒｗｏｏｄ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ３０３−３１２）により得られた。これらの種に由来する核酸を、増幅し、アガロースゲル電気泳動により精製し、適切なプラスミドベクター（ＮｏｖａｇｅｎのｐＴ７ＢｌｕｅまたはＰｒｏｍｅｇａのｐＧＥＭ−Ｔ）に連結し、適切な細菌宿主株（ＮｏｖａｇｅｎのＮｏｖａＢｌｕｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌｓまたはＰｒｏｍｅｇａのＪＭ１０９コンピテント細胞）に形質転換する。プラスミドおよび挿入物を、宿主細胞から精製し、配列決定した。図１３Ａ〜Ｃは、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロおよびウィンターフラウンダーに由来するＰＶＣＲに関する推定されるアミノ酸配列およびアラインメントを示す。
【００６１】
ウィンターフラウンダーλＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｉｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７０：Ｃ３７２−Ｃ２８１， １９９６に記載され、公開されるようにウィンターフラウンダー膀胱組織から単離されたポリＡ＋ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡとともに標準的な市販の試薬を用いて生産した。ウィンターフラウンダー膀胱ｃＤＮＡライブラリーを、プレーティングし、得られたファージプラークを中程度のストリンジェンシー条件（０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃）下で３２Ｐ標識サメ腎臓カルシウムレセプターｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。個々の陽性プラークをオートラジオグラフィーにより同定し、単離し、ファージミド感染を用いてレスキューし、ＫＳＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにｃＤＮＡを移した。ウィンターフラウンダーＰＶＣＲクローンのヌクレオチド（ｎｔ）配列、図１０Ａ、（配列番号：１９）を、ダイデオキシチェーンターミネーション技術を用いてヌクレオチド配列決定を行う商業的に利用可能な自動化配列決定サービスを用いて得た。推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を図１０Ｂおよび１０Ｃに示す。ウィンターフラウンダーＰＶＣＲヌクレオチド配列を、ＧＥＮＢＡＮＫおよびＳＷＩＳＳＰＩＲを含む商業的に利用可能なヌクレオチドおよびタンパク質データベースサービスを用いて他の水性動物ＰＶＣＲと比較した。
【００６２】
実施例２：本発明の方法を用いる淡水中の海水魚の成長
方法：
以下の実施例は、終始ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ ＩおよびＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩに言及する。ＡＰＳは、「ＡｑｕａＢｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ登録商標， Ｌ．Ｌ．Ｃ．」を意味する。ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉはまた、本明細書中では「ＳＵＰＥＲＭＯＬＴ ＴＭ Ｉ Ｐｒｏｃｅｓｓ」または「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ」とも呼ばれる。「ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ」魚またはサケは、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉの工程を受けた魚またはサケをいう。ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉサケはまた、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ ＴＭＩ」または「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ」サケとも呼ばれる。同様に、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩはまた、本明細書中では「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ ＴＭＩＩ Ｐｒｏｃｅｓｓ」または「Ｐｃｏｃｅｓｓ ＩＩ」とも呼ばれる。「ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩ」魚またはサケは、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩの工程を受けた魚またはサケをいう。ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ ＩＩサケはまた、「ＳＵＰＥＲＳＭＯＬＴ ＴＭ ＩＩ」または「Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩ」サケとも呼ばれる。
【００６３】
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ：海水魚を、０．３〜１０．０ｍＭカルシウムおよび０．５〜１０．０ｍＭマグネシウムイオンを含む淡水に供するか、またはそこに維持する。この水は、淡水への炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムならびに塩化マグネシウムの添加により調製する。魚に、１〜７％（重量／重量）ＮａＣｌを含有する固形飼料を与える。飼料に関するさらなる詳細については実施例３を参照のこと。魚を、水混合物のこのレジメ（ｒｅｇｉｍｅｎ）に供するか、またはそこに維持し、標準的な孵化場ケア技術を用いて、合計３０〜４５日間摂食させる。水温は１０〜１６℃間で変化する。魚を、ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉの間、定常明期に供する。蛍光を明期に使用する。
【００６４】
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩ：海水魚を、０．３〜１０．０ｍＭカルシウムおよび０．５〜１０．０ｍＭマグネシウムイオンを含む淡水に供するか、そこに維持する。この水は、淡水への炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムならびに塩化マグネシウムの添加により調製する。魚に、１〜７％（重量／重量）ＮａＣｌおよび飼料の１ｋｇ当たり２ｍｇまたは４ｇｍのＬ−トリプトファンを含有する固形飼料を与える。飼料に関するさらなる詳細については実施例３を参照のこと。魚を、水混合物のこのレジメに供するか、またはそこに維持し、標準的な孵化場ケア技術を用いて、合計３０〜４５日間摂食させる。水温度は１０〜１６℃間で変化した。魚を、ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ ＩＩの間、定常明期に供する。蛍光灯を明期に使用する。
【００６５】
養殖場（Ｇｒｅａｔ Ｂａｙ ＡｑｕａＦａｒｍｓ Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ， ＮＨ）で育てられた動物の単一の均一ストックに全て由来する種々の重量のサマーフラウンダーを、ＡＰＳラボラトリー内の人工海水（ＣｒｙｓｔｒａｌＳｅａ）に輸送し、配置した。これらを、２つの群（ｎ＝１３）に分け、一方を合計８１日間海水（海水対照）に維持し、標準的なフラウンダー食餌（ＣｏｒｅｙＦｅｅｄｓ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， Ｃａｎａｄａ）を与えた。他方（淡水）を、５ｍＭ Ｃａ２＋、８ｍＭ Ｍｇ２＋濃度の水ならびに７０％標準フラウンダー飼料（ＣｏｒｅｙＦｅｅｄｓ， Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， Ｃａｎａｄａ）および３０％基底ヤリイカの１．２％ＮａＣｌ補充食餌からなるＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件に３０日以上順応させた。次いで、これらのフラウンダーを、合計５１日間ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件に維持し、それらの成長を、対応する対のサマーフラウンダーの海水における維持により示される成長と比較した。
【００６６】
フラウンダーを、以下の３０日スケジュールによりＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉに順応させた：
１．海水における５日間の維持
２．５０％に水の塩分を減らした海水に１０日間
３．２５％に水の塩分を減らした海水に１５日間
４．ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ水に魚を入れる（淡水中に５ｍＭ Ｃａ２＋、８ｍＭ Ｍｇ２＋濃度、ｐＨ７．６〜８．０）
【００６７】
魚を、有色エラストマータグを用いて個々に標識し、それらの体重の変化を、５１日の実験間隔の間、特定の時間点で測定した。
【００６８】
飼料変換率（ｆｅｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）またはＦＣＲを、魚の群に与えた食料の量を魚の群により得られる体重により割ることにより得る。魚による体重成長への食料の転換が効率的であるほど、ＦＣＲが小さくなる（小量の食料／魚の大きな体重増加）。非常に少ないＦＣＲ数（１未満）は、魚類の養殖の目標である、体重成長への食料の高度に効率的な転換をもたらす。対照的に、大きなＦＣＲは、体重成長への食餌の非効率的な転換を意味し、一般に所望されない。大きいまたは乏しいＦＣＲは、飼料のコストのため、および所定の重量に魚が成長するのにより多い食餌を使用することが必要であるため好ましくない。本発明の方法に供された魚のＦＣＲ値は、一般に、ほとんどの産業公開値よりも小さく、ある場合には（例えば、魚に乾燥飼料を与える場合）、より望ましい。なぜなら、本発明は、食料を食べても成長しないので全体のＦＣＲを増大させる傾向にある浸透圧的に損傷した魚の存在を排除するからである。本発明の方法は、より低いＦＣＲを生じ、ほとんどの魚の最適な摂食および成長を可能にする。本発明に供される魚のＦＣＲは、魚の大多数の成長および食餌を維持するのに、または好ましくは魚の大多数の成長および飼料消費を増大させるのに十分である。魚が本発明に供される場合、それらはＦＣＲの範囲を示し、例えば、約０．７〜約７．０の間の値を含む。特に、飼料消費または飼料取り込みが改善される。なぜなら、魚が、嗅覚層板または嗅球の細胞においてＰＶＣＲとともに食料の「匂いを嗅ぐ」か、またはそれを「感じる」からと考えられる。
【００６９】
魚の特異的成長率（ＳＧＲ）を、所定の時間点の終わりに魚の重量を、魚の開始重量で割ることにより決定した。
【００７０】
飼料変換率（ＦＣＲ）または特異的成長率（ＳＧＲ）および成長因子（ＧＦ３）を得るための全ての計算を、標準的な一般に認められている式（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｓ．Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｉｄ Ｆａｒｍｉｎｇ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ １９９９）を用いて行った。
【００７１】
結果および考察：
海水魚、サマーフラウンダーを、海水における匹敵する対照サマーフラウンダーによって示されるのと類似した成長速度で長期間（５１日間）ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件下に順応させ、成長させうる。
【００７２】
表ＩおよびＩＩは、海水（海水対照）またはＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ淡水条件下のいずれかに維持したサマーフラウンダーの同一群から得られたデータを示す。水質および温度（１６．３℃対１７．９℃平均）は比較可能であった。フラウンダーは、有意な死亡率を伴うこともなくＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件に首尾良く順応し、それらの全体の外観は海水に維持した匹敵する対照と有意には異ならなかった。
【００７３】
【表１】
2004513627.tif 000002
【００７４】
【表２】
2004513627.tif 000003
【００７５】
５１日試験間隔の間の魚の全体の死亡率は、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件下（５／１３または３８．５％）で維持したフラウンダーと比較して海水（２／１３または１５．４％）でより低かった。ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件下で維持した全てのフラウンダーで増加した平均重量（２７．２ｇｍ）は、海水対照群の全体の重量増加（３８．４ｇｍ）と比べて少なかった。有意な重量増加を、ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ魚の２０日間後および海水で維持したフラウンダーの３７日間後の両方の群で観察した。従って、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉで生存しているフラウンダー間の平均特異的成長率（ＳＧＲ）（１日当たり０．５３％体重）は、海水で維持したそれ（１日当たり０．６％体重）と匹敵した。
【００７６】
対照的に、１００％の海水魚（タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウィンターフラウンダーおよびサマーフラウンダー）は、淡水に移した７２時間内に死亡する。
【００７７】
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ対海水において維持されたフラウンダー間の食料変換率（ＦＣＲ）の比較は、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件下で維持されたフラウンダーが、それらの匹敵する海水対照（１．９９）と比較して、有意により大きなＦＣＲ（３．９６）を示したことを示す。
【００７８】
図１Ａ〜Ｂは、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉまたは海水条件下で維持された標識したフラウンダーの個々の重量増加成績を示す。いくつかのフラウンダー（例えば、番号９および番号１１）がＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉ条件下で安定した有意な成長を示し、一方で他のものが乏しい体重増加（例えば、番号１０）またはさらに体重の減少（例えば、番号１）を示したように、個々の成長率に広範な変化が存在することに注目すべきである。類似した成績特徴が、海水におけるフラウンダーについて観察されたが、個々の成績における変化は、ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ Ｉで維持されたフラウンダーと比較してあまり明白ではなかった。
【００７９】
まとめると、これらのデータは、サマーフラウンダーがＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉを用いる淡水条件下で長期間（５１日間）首尾良く維持されうることを示す。通常の条件下では、サマーフラウンダーの成長および生存は、約２５％海水に通常制限され、そこでフラウンダーは、さらに塩分が減ると死ぬ。これらのデータは、海環境それ自身から離れた淡水環境におけるサマーフラウンダーの培養の基礎を形成し、ここで、フラウンダー切り身の値段は、海水対照と比べて乏しい成績（死亡率の増大ならびに乏しいＦＣＲおよび体重増加）を埋め合わせる以上に優れている。
【００８０】
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩを用いて海水魚を淡水に移すことは、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉで見られるよりもさらに優れた成長率を提供することが予想される。ＡＰＳＰｒｏｃｅｓｓ ＩＩを受けたサケおよびマスは、関連する出願、全て２０００年１０月１２日に出願された特許出願第０９／６８７，３７２； ０９／６８７，４７６；０９／６８７，４７７号、全てタイトルは「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｒａｉｓｉｎｇ Ｐｒｅ−Ａｄｕｌｔ Ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ Ｆｉｓｈ」および特許出願第０９／６８７，３７３号、タイトル「ＧｒｏｗｉｎｇＭａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｗａｔｅｒ」に説明されているように、成長率において有意な増大を示した。
【００８１】
実施例３：飼料
２つの一般的な方法を用いて、ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩおよびＩＩの一部として魚により消費される飼料を調製した。これらの２つのプロセスは、飼料の再処方または飼料による吸収のための濃縮溶液の添加、続いて嗜好のためにトップドレッシングすることを含む。この開示は、これらの２つの方法の各々を用いて飼料を調製するための方法論を記載する。
【００８２】
方法：
サケ実験のための飼料製造
飼料を再処方するために、成分は以下の通りである：基礎飼料を、以下の成分および手順を用いて作製した：３０％ヤリイカ（ブレンダー中で液体化）、７０％ Ｃｏｒｅｙ Ａｑｕａｆｅｅｄｓフラウンダー食餌（ブレンダー中で粉体化）。成分を半湿性「練り粉（ｄｏｕｇｈ）」ボールにブレンドする。ＮａＣｌまたはＰＶＣＲ活性化合物を含む他の成分を、実験的パラメータに従って目方で基礎飼料にブレンドした。
【００８３】
Ｍｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ標準淡水サケ食餌（サイズ１．２、１．５、２．０、２．５、および３．５ｍｍ）もまた使用されうる。トップドレッシングを、トップドレッシングが基礎食餌の重量の４％から構成されるようにペレットに適用した。トップドレッシングは、５０％のオキアミ加水分解物（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭａｒｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）および５０％ニシン魚油から構成される。トップドレッシングを、嗜好のために添加し、添加成分を封着した。
【００８４】
他の成分は、本明細書中に記載されるように、目方で基礎食餌に添加されるＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２またはＬ−トリプトファンを含みうる。
【００８５】
７％（重量／重量）ＮａＣｌを含む飼料の調製：
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉのために：固体ＮａＣｌまたはＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ標準淡水サケ食餌重量の７％の重量の比で分配したＮａＣｌを、ＮａＣｌの重量の約３〜４倍の容積の水道水に添加した。混合物を、マグネティックスターラーバーの使用により混合しながら６０〜７０℃に加熱し、塩を溶解した。次いで、ＮａＣｌ溶液を、携帯型スプレーに注ぎ、１．５立方メートルの動力化セメントミキサーの内側を回転させながらＭｏｏｒｅＣｌａｒｋ標準淡水サケ食餌に適用した。ＮａＣｌリッチ溶液の吸収後、湿ったＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ標準淡水サケ食餌を、ウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび１５００ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進した。約６時間の乾燥の後、乾燥ＮａＣｌリッチペレットをセメントミキサーに戻し、トップドレッシングを適用する。飼料を使用するまで室温で保存する。
【００８６】
ＡＰＳ Ｐｒｏｃｅｓｓ ＩＩのための７％（重量／重量）ＮａＣｌ＋ＰＶＣＲアゴニスト（トリプトファン）を含む飼料の調製：ＭｏｏｒｅＣｌａｒｋ標準淡水サケ食餌重量の７％の重量比で分配した固体の塩化ナトリウムまたはＮａＣｌを、ＮａＣｌの重量の約３〜４倍の容積の水道水に添加した。混合物を、マグネティックスターラーバーの使用により混合しながら６０〜７０℃に加熱し、塩を溶解させた。ＵＳＰＧｒａｄｅ Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを、製剤必要に応じてＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ標準淡水サケ食餌の１ｋｇ当たり２ｇまたは４ｇのいずれかで前記水に添加した。トリプトファンが溶解し、溶液のｐＨが約４．０になるまで、希塩酸を、混合しながら前記水に添加した。次いで、ＮａＣｌ＋トリプトファン溶液を携帯噴霧器に注ぎ、次いで、セメントミキサーの内側を回転させながらＭｏｏｒｅＣｌａｒｋ標準淡水サケ食餌に適用した。ＮａＣｌ＋トリプトファン溶液の吸収後、湿ったＭｏｏｒｅ Ｃｌａｒｋ標準淡水サケ食餌を、次いでウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび１５００ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進した。約６時間の乾燥の後、乾燥ＮａＣｌ／トリプトファン−リッチペレットを次いでセメントミキサーに戻し、トップドレッシングを適用する。飼料を使用するまで室温で保存する。
【００８７】
実施例４：いくつかの種の海水魚のＤＮＡからＰＣＲにより増幅された多価カチオンレセプタータンパク質の部分的ゲノムクローンのＤＮＡおよび推定タンパク質配列。
これらのデータは、１３種類の海水魚において単離された部分的ＰＶＣＲゲノム配列を提供する。これらの各々のヌクレオチド配列は、ユニークであり、従って、各々の種に由来する全長ｃＤＮＡを単離するためのユニークプローブとして使用されうる。さらに、これらのヌクレオチド配列は、これらの魚の種々の組織におけるＰＶＣＲ発現の検出のための特異的アッセイキットの基礎を形成しうる。例えば、前記キットは、任意に、インサイチュハイブリダイゼーションに適切な標識ハイブリダイゼーションプローブを含みうる。
【００８８】
ＰＶＣＲは、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウィンターフラウンダーおよびサマーフラウンダーを含むいくつかの種において単離された。ＳＫＣａＲのヌクレオチド配列をともなう哺乳動物ＣａＲの配列（図１４Ａおよび１４Ｂ）を、標準的な方法（ＧＭｐｒｅｓｔｏｎ， 「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏｃｌｏｎｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ５８， Ａ．Ｈａｒｗｏｏｄ編集、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ， ３０３−３１２頁、１９９３）を用いて多価カチオンレセプタータンパク質の細胞外および膜貫通ドメインの高度に保存された領域に対する変性オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用した。これらのプライマーを用いて、重要な商業的産物を示す種々の魚種のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを標準的なＰＣＲ法を用いて増幅する。次いで、増幅バンドを、アガロースゲル電気泳動により精製し、細菌株に形質転換される適切なプラスミドベクターに連結する。液体培地における成長の後、ベクターおよび挿入物を、標準的な技術を用いて精製し、制限酵素解析により解析し、適切に配列決定した。この方法を用いて、ヌクレオチド配列を増幅した。
【００８９】
この配列データを作成するために、ＤＮＡを、標準的な公開された技術を用いて示された種の各々の組織サンプルから単離した。次いで、２つの縮重ＰＣＲプライマー（ＤＳＫ−Ｆ３（５’−ＴＧＴ ＣＫＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＹＧ ＧＲＡ ＴＣＧ Ｃ−３’； 配列番号：２９）およびＤＳＫ−Ｒ４； （５’−ＧＧＣ ＫＧＧＲＡＴ ＧＡＡ ＲＧＡ ＫＡＴ ＣＣＡ ＲＡＣ ＲＡＴ ＧＡＡ Ｇ−３’配列番号：３０）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法論を用いてＤＮＡを増幅した。次いで、増幅ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製し、標準的な方法を用いて、プラスミドベクターにサブクローニングし、増幅し、精製し、配列決定した。
【００９０】
図１２Ａ〜Ｃは、１２種の海水魚に関する５９３ヌクレオチドの整列したゲノムＤＮＡ配列を示し、各々は、ＰＶＣＲタンパク質の同一領域をコードする。各々の特定の種に由来する各々のヌクレオチド配列がユニークであることに留意されたい。しかし、これらの遺伝子のＤＮＡ配列における変化は、５９３ヌクレオチドの各々の配列内の共通の特異的ヌクレオチドでしばしば生じる。
【００９１】
図１３Ａ〜Ｃは、図１２Ａ〜Ｄに示されるゲノムヌクレオチド配列に由来する整列した対応する予測タンパク質配列を示す。ＰＶＣＲのこの部分のアミノ酸配列における２、３の変化が、図１２Ａ〜Ｄに示されるヌクレオチド配列における変化の結果として生じることに留意されたい。これらの変化（例えば、ＡｌａからＶａｌ；ＡｒｇからＬｙｓ； およびＣｙｓからＴｙｒ）の全ては、ペプチド配列の相対的サイズ、電荷および疎水性の内のいくつかの組み合わせを保存するアミノ酸の「保存的」置換として知られている。
【００９２】
引用した参考文献、特許、および特許出願の全ては、その全体が参考として本明細書中に援用される。また、２００１年１０月１１日出願のタイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｆｉｓｈ ＵｓｉｎｇＯｄｏｒａｎｔ」、特許出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号２２１３．２００４−００１）；２００１年１０月１１日出願のタイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｒａｉｓｉｎｇ Ｐｒｅ−ａｄｕｌｔ Ａｎａｄｒｏｍｏｕｓ Ｆｉｓｈ」、特許出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号２２１３．１００４−００１）；２００１年１０月１１日出願のタイトル「ＰｏｌｙｖａｌｅｎｔＣａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」、国際出願番号がまだ割り当てられていない（代理人管理番号２２１３．１００６−００３）も伴う。さらに、２０００年１０月１２日出願のタイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｒａｉｓｉｎｇ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ」の特許出願第０９／６８７，４７７号；２０００年１０月１２日出願のタイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒＲａｉｓｉｎｇ Ｍａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ」の特許出願第０９／６８７，４７６号；２０００年１０月１２日出願のタイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＲａｉｓｉｎｇＭａｒｉｎｅ Ｆｉｓｈ」の特許出願第０９／６８７，３７３号；２０００年１０月１２日出願のタイトル「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎ−ＳｅｎｓｉｎｇＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」の仮特許出願第６０／２４０，３９２号；２０００年１０月１２日出願のタイトル「ＰｏｌｙｖａｌｅｎｔＣａｔｉｏｎ−Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」の仮特許出願第６０／２４０，００３号の全ても、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、１９９８年９月２８日出願の出願番号第０９／１６２，０２１号、１９９７年３月２７日出願の国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５０３１号、および１９９６年３月２７日出願の出願番号第０８／６２２，７３８号、全てタイトルは「Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ−ＳｅｎｓｉｎｇＲｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」も全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００９３】
本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、記載してきたが、当業者は、種々の変更が、付随の特許請求の範囲により包囲される本発明の範囲から逸脱することなく行われうることを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１Ｂは、タラのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【図２】
図２Ａおよび２Ｂは、ハドックのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。
【図３】
図３Ａおよび３Ｂは、ヘイクのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。
【図４】
図４Ａ〜Ｂ は、オヒョウのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：７）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。
【図５】
図５Ａ〜Ｂ は、サバのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す図である。
【図６】
図６Ａ〜Ｂ は、ポラックのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１１）およびアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す図である。
【図７】
図７Ａ〜Ｂ は、ハタのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す図である。
【図８】
図８Ａ〜Ｂ は、メカジキののＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１５）およびアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す図である。
【図９】
図９Ａ〜Ｂ は、マグロのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。
【図１０】
図１０Ａ 〜Ｃ は、ウインターフラウンダーのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す図である。
【図１１】
図１１は、サマーフラウンダーのＰＶＣＲの部分的ヌクレオチド配列（配列番号：２１）およびアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す図である。
【図１２】
図１２Ａ 〜Ｄ は、タラ（配列番号：１）、ハドック（配列番号：３）、ヘイク（配列番号：５）、オヒョウ（配列番号：７）、サバ（配列番号：９）、ポラック（配列番号：１１）、ハタ（配列番号：１３）、メカジキ（配列番号：１５）、マグロ（配列番号：１７）、ウインターフラウンダー（配列番号：１９）に関する核酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１３】
図１３Ａ 〜Ｃ は、タラ（配列番号：２）、ハドック（配列番号：４）、ヘイク（配列番号：６）、オヒョウ（配列番号：８）、サバ（配列番号：１０）、ポラック（配列番号：１２）、ハタ（配列番号：１４）、メカジキ（配列番号：１６）、マグロ（配列番号：１８）、ウインターフラウンダー（配列番号：２０）に関するアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１４】
図１４Ａ 〜Ｂ は、ＳＫＣａＲの核酸配列（配列番号：２３）を示す図である。
【図１５】
図１５は、ＡＰＳ プロセスＩを受け、かつ総５１日間淡水において成長させた淡水におけるサマーフラウンダーの成長を示すグラフ表示である。フラウンダーの体特徴付けの試料を、（１） 淡水中への配置前；（２）淡水中への配置後２０日；（３） 淡水中への配置後３０日；ならびに（４） 淡水中への配置後５１日に得た。 ＡＰＳプロセスＩ は、実施例２に規定される。
【図１６】
図１６は、総５１日間海水におけるサマーフラウンダーの成長を示すグラフ表示である。フラウンダーの体特徴付けの試料を、（１）海水中への配置前；（２） 海水中への配置後２０日；（３） 海水中への配置後３０日；ならびに（４） 海水中への配置後５１日に得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513627.tif 000108
【国際調査報告】
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