(57)【要約】ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のモジュレーターの同定方法は、第１のＲＮＡＰを発現し、かつ第２のポリヌクレオチド構造体を有する宿主細胞を提供することを含む。第１のポリヌクレオチド構造体は、第１の遺伝子に作動可能に結合された第１のプロモーターを含み、ここで第１の遺伝子は第１のＲＮＡＰにより転写される。第２のポリヌクレオチド構造体は、レポーター遺伝子である第２の遺伝子に作動可能に結合された第２のプロモーターを含み、ここで第２のレポーター遺伝子は第２のＲＮＡＰにより転写される。宿主細胞は、第２のＲＮＡＰの供給源を提供される。試験物質は、試験物質の非存在下で第１と第２の遺伝子の発現を可能にする条件下で、宿主細胞と接触させられる。従って、試験物質がＲＮＡＰを調節するかどうかを決定することができる。
2004520024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＲＮＡＰを発現し、かつ第１の遺伝子に作動可能に結合された第１のプロモーターを含み、該第１の遺伝子が、該第１のＲＮＡＰにより転写される第１のポリヌクレオチド構造体と、レポーター遺伝子である第２の遺伝子に作動可能に結合された第２のプロモーターを含み、該第２のレポーター遺伝子が、該第２のＲＮＡＰにより転写される第２のポリヌクレオチド構造体と、該第２のＲＮＡＰの供給源とを有する、宿主細胞を用意し、
試験物質の非存在下において該第１及び該第２の遺伝子が発現可能な条件で、試験物質に宿主細胞を接触させ、
該接触によって、該試験物質がＲＮＡＰを調節するかどうかを測定する、
ことを含むＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のモジュレーターの同定方法。
【請求項２】
該第１の遺伝子は、レポーター遺伝子を含み、該同定方法は、該第１と該第２のレポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該第１の遺伝子は、該第１の遺伝子の発現が、該第２のレポーター遺伝子の発現を阻害するような、該第２のプロモーターの不定なレプレッサーのようなレプレッサーである、請求項１の方法。
【請求項４】
該第２のＲＮＡＰは、該第１のＲＮＡＰに対して異種生物から得られる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
異種ＲＮＡＰの供給源は、該異種ＲＮＡＰをコードする遺伝子に作動可能に結合された第３のプロモーターを含む第３のポリヌクレオチド構造体である、請求項４の方法。
【請求項６】
該第３のプロモーターは、構造性プロモーターからなる、請求項５の方法。
【請求項７】
該第３のプロモーターは、誘導性プロモーターからなる、請求項５の方法。
【請求項８】
該第２のＲＮＡＰは、ウイルスＲＮＡＰからなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該第２のＲＮＡＰは、該宿主細胞から得られる第２のＲＮＡＰからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該宿主細胞は、細菌細胞からなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該宿主細胞は、細菌細胞からなり、該第１と該第２のＲＮＡＰは、σAとσD/Fからなる、請求項９の方法。
【請求項１２】
該第１および／または該第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該第１と該第２のプロモーターは、同じ刺激に応答して誘導される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該試験物質が、該第１または該第２のＲＮＡＰ活性の１つのみを調節するかどうかを測定することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該試験物質が、該第１のＲＮＡＰを阻害するが、該第２のＲＮＡＰを阻害しないかどうかを測定することを含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
該宿主細胞が細菌であり、該試験物質が、細菌ＲＮＡＰを阻害するが、該第２のＲＮＡＰを阻害しないかどうかを決定することを含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６の方法により同定可能なＲＮＡＰのインヒビター。
【請求項１８】
請求項１５または請求項１６の方法に従って同定されるＲＮＡＰのインヒビター。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の体の治療法に使用するための、請求項１７または請求項１８のインヒビター。
【請求項２０】
抗生物質として使用される細菌ＲＮＡＰを阻害する、請求項１９のインヒビター。
【請求項２１】
請求項１７、１８または１９のいずれか１項に記載のインヒビターと薬剤学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞中の転写モジュレーター、特にＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のモジュレーターを同定する方法に関する。本発明は、ＲＮＡＰのインヒビターを同定するのに使用することができる。そのようなインヒビターは、生物を死滅させるかまたは増殖を制限するのに使用することができる。インヒビターは、ヒトまたは動物の感染症の治療において、例えば、細菌感染を治療するための抗生物質として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡを転写するために、生物により使用される。異なる生物のＲＮＡポリメラーゼは、重要な構造的な差異を示すことがある。例えば、細菌または他の感染体のＲＮＡポリメラーゼは、これらが感染する細胞のＲＮＡポリメラーゼとは、構造が大きく異なることがある。従って、そのＲＮＡポリメラーゼは、調節、特に阻害のための標的となる。宿主細胞の増殖パターンを変化させるのに有用な、ＲＮＡポリメラーゼ調節体を同定することが望まれている。
【０００３】
細菌のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）は、より高等な生物のＲＮＡポリメラーゼと比較して、構造と制御において差異を有するため、抗生物質の有用な標的である。細菌のような宿主細胞中の標的化合物の活性は、レポーター遺伝子を使用して測定することができる。一般に、レポーター遺伝子の転写は、標的化合物の投与と同時にまたはその前に誘導される。もし標的化合物がＲＮＡＰを阻害するなら、レポーター遺伝子の転写が阻止される。しかし、レポーター遺伝子の発現は、翻訳、中間代謝、膜の完全性などの多様な細胞プロセスに対する、非特異的作用によっても阻害される。従って、宿主ＲＮＡポリメラーゼの特異的モジュレーターを同定できる測定法を確立する必要がある。
【０００４】
（発明の概要）
ＲＮＡポリメラーゼのモジュレーターを同定するために使用できる、新規な細胞ベースの測定法が提供される。そのような測定法は、異種ＲＮＡポリメラーゼなどで第２のＲＮＡポリメラーゼは阻害しないＲＮＡポリメラーゼのインヒビターを同定するのに、特に有用である。そのようなインヒビターは、生物の増殖を制限するために、例えば、細菌感染を治療するための抗生物質として使用される。
【０００５】
本発明は、
第１のＲＮＡＰを発現し、かつ第１の遺伝子に作動可能に結合される第１のプロモーターを含み、該第１の遺伝子が、該第１のＲＮＡＰにより転写される第１のポリヌクレオチド構造体と、レポーター遺伝子である第２の遺伝子に作動可能に結合された第２のプロモーターを含み、該第２のレポーター遺伝子が、該第２のＲＮＡＰにより転写される第２のポリヌクレオチド構造体と、該第２のＲＮＡＰの供給源と、を有する宿主細胞を供給し、
試験物質の非存在下において該第１及び該第２の遺伝子が発現可能な条件で、試験物質に宿主細胞を接触させ、
該接触によって、該試験物質が、ＲＮＡＰを調節するかどうかを測定する、
ことを含むＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のモジュレーターの同定方法を提供する。
【０００６】
好適な態様において、第２のＲＮＡＰの供給源は、第２のＲＮＡＰをコードする遺伝子に作動可能に結合される第３のプロモーターを含む、第３のポリヌクレオチド構造体を含む。測定は、宿主細胞内で第２のＲＮＡＰの発現が可能な条件で行われる。１つ以上のプロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。ある好適な態様において、第１のプロモーターと第２のプロモーターは、同じ刺激に応じて誘導することができる。第３のプロモーターは、構成性または誘導性プロモーターからなるものとすることができる。別の好適な態様において、測定は、インデューサーの非存在下で行われる。
【０００７】
好ましくは、この方法は、試験物質が宿主ＲＮＡＰ活性を調節するが、第２のＲＮＡＰ活性を調節しないかどうかを決定するために使用される。好ましくは、同定される試験物質は、細菌ＲＮＡＰを阻害するが、異種ＲＮＡＰは阻害しない。ＲＮＡＰのモジュレーターまたはインヒビターは、ヒトまたは動物の体の治療に使用される。好ましくはインヒビターが同定され、細菌感染の治療に使用することができる。本発明はまた、インヒビターと薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のモジュレーターの同定方法を提供する。特に、本方法は、第２のＲＮＡＰを調節しないＲＮＡＰのモジュレーターを同定するのに使用することができる。本発明は、細胞ベースの測定法である。好ましくはこの方法は、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼの調節を調べるために使用される。
【０００９】
宿主細胞は、例えば、細菌、酵母細胞、または哺乳動物宿主細胞といった原核細胞または真核細胞とすることができる。好ましくは、調査対象のＲＮＡポリメラーゼは、細菌ＲＮＡＰを含む。第２のＲＮＡＰは、異なる生物から得られる異種ＲＮＡＰであってもよい。例えば、宿主細胞が細菌細胞の場合、第２のＲＮＡＰは、ウイルスまたは真核生物由来のものとすることができる。別の実施態様において、第２のＲＮＡＰは、宿主細胞に内因性のＲＮＡＰを含む。その方法は、例えば、細菌細胞の異なるＲＮＡＰのモジュレーターを探すのに使用され、例えば、枯草菌（B. subtilis）のＲＮＡＰσDとσAのモジュレーターを調べるために使用することができる。また、宿主細胞は、宿主細胞ＲＮＡＰに影響を与えない細菌ＲＮＡＰのインヒビターを同定するために、細菌ＲＮＡＰの供給源を付与された真核細胞である。
【００１０】
宿主細胞は、第１の遺伝子に作動可能に結合された第１のプロモーターを含む、第１のポリヌクレオチド構造体を有する。第１のプロモーターは、第１のＲＮＡＰに認識されて、その結果、第１の遺伝子は、第１のＲＮＡＰにより転写される。宿主細胞はさらに、第２の遺伝子、すなわちレポーター遺伝子に作動可能に結合された第２のプロモーターを含む第２のポリヌクレオチド構造体を有し、第２のレポーター遺伝子は、第２のＲＮＡＰにより認識され、その結果、第２の遺伝子は、第２のＲＮＡＰにより転写される。測定は、第１のＲＮＡＰが第２の遺伝子を転写せず、かつ第２のＲＮＡＰが第１の遺伝子を転写しない条件で行われる。さらに、第１の遺伝子と第２の遺伝子は、第１の遺伝子の発現と第２の遺伝子の発現、または両方の遺伝子の発現を区別できるように、選択される。
【００１１】
本発明のある態様において、第１の遺伝子は、第１のレポーター遺伝子を含み、第２の遺伝子は第２のレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、容易に検出できる生成物をコードする。例えば、レポーター生成物は、蛍光、発光、または他の標準的レポート方法により検出される。レポーター遺伝子生成物は、その産生が、発色性または蛍光性酵素基質を使用して同定される、β−ガラクトシダーゼのような酵素を含有してもよい。他のレポーター遺伝子には、β−グルクロニダーゼ、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびこれらの変種、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、カテコールオキシダーゼ、抗体により容易に認識される抗原、他の親和性リガンド（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン）または抗生物質などにより検出されるプロテインＡがある。第１と第２のレポーター遺伝子は、第１のレポーター遺伝子の発現と第２のレポーター遺伝子の発現を区別できるように選択される。
【００１２】
本発明のそのような測定において、第１と第２のレポーター遺伝子の両方の発現は、インヒビターの非存在下で起きる。レポーター遺伝子の１つの発現を妨害するように作用するインヒビターが適用された場合、その他のレポーター遺伝子から検出されるシグナルは、細胞成分に対する競合により増幅されることがある。この作用は、レポーター遺伝子の発現の小さな差を検出しやすくするであろう。
【００１３】
本発明の別の態様において、第１の遺伝子はレプレッサー、特に、発現された時に第２のレポーター遺伝子の転写を妨害する不定のレプレッサーをコードする。この実施態様において、第１の遺伝子の転写によりレプレッサーが発現され、それによって第２のレポーター遺伝子の発現が妨害される。しかし、もし第１の遺伝子の発現が阻害されるなら、レプレッサーは作成されないかおよび／または存在するレプレッサーが崩壊し、第２のレポーター遺伝子の転写が起きるであろう。もし、試験物質が非特異的に第１のＲＮＡＰを阻害するなら、第２のレポーター遺伝子の発現もまた、第２のＲＮＡＰの阻害により、または、翻訳等の他の細胞プロセスの阻害により、阻害されるであろう。しかし、もし第２のレポーター遺伝子が発現されるなら、試験物質は、第１のＲＮＡＰの特異的インヒビターを含むであろう。
【００１４】
レプレッサーの例には、ファージラムダのＸｙｌＲ、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、ｃＩがある。好ましくは、レプレッサーが第１の遺伝子から発現され続けるなら、第２のＲＮＡＰの転写のみが阻害されるように、レプレッサーは不安定である。
【００１５】
上記で概説したように、第１のＲＮＡＰまたはＲＮＡＰサブユニットは、一般に宿主細胞により発現される。ある実施態様において、宿主細胞にとって内因性ではない第１のＲＮＡＰを測定することが望ましいことがある。この実施態様では、第１のＲＮＡＰの供給源はまた、宿主細胞に供給されるであろう。第２のＲＮＡＰは、異種ＲＮＡＰでもよく、宿主細胞に供給される必要がある。適当な異種ＲＮＡＰの例には、ファージＴ７またはＴ３のＲＮＡＰがある。これらのＲＮＡＰは、小さな単一のサブユニット酵素であり、従って、あまり好ましくない多くのサブユニットを含む真核生物または細菌ＲＮＡＰより、宿主細胞に供給することが容易である。
【００１６】
異種ＲＮＡＰは、タンパク質として付与することができ、例えば、ＲＮＡＰを、ウイルス粒子中にパッケージすることができる。細菌宿主細胞のような宿主細胞は、宿主細胞に第２のＲＮＡＰの供給源が付与されるように、試験化合物の添加前または同時に、ＲＮＡＰを含有または産生するファージで感染させることができる。
【００１７】
別の実施態様において、第２のＲＮＡＰは宿主細胞にとって内因性であり、第１のＲＮＡＰが細胞に供給される。例えば、細菌ＲＮＡポリメラーゼのインヒビターを探すために、真核細胞中で測定を行うことができ、細菌ＲＮＡＰが細胞に供給される。
【００１８】
好適な実施態様において、宿主細胞に内因性ではないＲＮＡＰが、ＲＮＡＰをコードする遺伝子に作動可能に結合された第３のプロモーターを含む第３のポリヌクレオチド構造体として提供される。第３のポリヌクレオチド構造体は、このＲＮＡＰが測定条件で発現され、好ましくは試験化合物の添加前に、あるレベルで発現されるように付与される。こうして、ＲＮＡＰの発現は、試験条件により影響を受けず、第２の遺伝子は、試験物質の存在しない試験条件で発現されるであろう。ＲＮＡＰが多くの異なるサブユニットを含む場合、ＲＮＡＰ活性に必要な各サブユニットの発現のためのポリヌクレオチド構造体が、細胞に提供される。
【００１９】
別の実施態様において、第２のＲＮＡＰは異種ＲＮＡＰを含まない。例えば、細菌細胞は、それぞれが５つのサブユニットからなるいくつかの異なるＲＮＡＰを発現する。σサブユニットは、異なるＲＮＡＰ型の間で異なる（例えば、枯草菌（B. subtilis）のσAとσD）。第２のレポーター遺伝子は、これらのＲＮＡＰの１つによってのみ認識されるプロモーターを提供され、第１の遺伝子は、これらのＲＮＡＰの別のものによってのみ認識されるプロモーターを提供される。この測定法は、細菌ＲＮＡＰの１つにのみ特異的に作用するモジュレーターを同定するのに使用される。
【００２０】
各ポリヌクレオチド構造体は、発現される遺伝子に作動可能に結合されたプロモーターを含む。ある態様において、第１と第２のプロモーターは、誘導性プロモーターである。あるいは、第１と第３のプロモーターが、誘導性プロモーターであってもよい。測定の過程で、試験物質を加える時、または試験物質を加える前若しくは後に、これらのプロモーターの１つ以上を誘導するために必要な条件を、宿主細胞に適用することができる。そのような誘導条件は、試験物質の非存在下での遺伝子の発現を可能にする。タンパク質のインデューサーの例には、キシロース、テトラサイクリン、乳糖、およびこれらの誘導体（ＩＰＴＧ、アラビノースおよびグルコン酸塩を含む）、または温度変化がある。例えば、温度感受性レプレッサーによりプロモーターが制御されるなら、プロモーターは、高温で誘導することができる。誘導性プロモーターは、インデューサーの非存在下では完全に不活性なプロモーター（遺伝子は発現されない）と、誘導性であるが、遺伝子発現のためのインデューサーを必要としないプロモーターとを含む。例えば、適当なインデューサーの非存在下では、低レベルの遺伝子発現がまだ起きることがある。別の実施態様において、インデューサーの非存在下で測定を行うことができる。
【００２１】
「作動可能に結合された」という用語は、記載の成分が、目的の方法で機能することを可能にするような関係で並置されていることを意味する。従って、コード配列に「作動可能に結合された」プロモーターのような制御配列は、制御配列に影響を及ぼさない条件でコード配列の発現を行うように位置している。
【００２２】
第１の遺伝子が不定のレプレッサー等のレプレッサーをコードする本発明の実施態様においては、第２のプロモーターは、そのレプレッサーにより制御されるものが選択される。測定開始前にレプレッサーを発現して第２のレポーター遺伝子の発現を妨害するように、第１の遺伝子は、測定開始前に、構成性プロモーターを付与されるか、またはレプレッサーを発現するように誘導される。
【００２３】
ＲＮＡＰがポリヌクレオチド構造体として付与される場合、ＲＮＡＰは、好ましくは構造性プロモーターにより制御する。これが、誘導性プロモーターにより制御される場合には、測定は、試験物質の存在下でこのＲＮＡＰの発現が起きるような条件で行われる。適当な構成性プロモーターは、栄養豊富な培地で増殖中に強く発現されるプロモーターである。適当なプロモーターの例としては、リボゾームＲＮＡ遺伝子プロモーター、および通常制御を受けているが、ファージラムダのＰRまたはＰLの変異または欠如により、および機能性ＬａｃＩの非存在下でファージとＰLacの非存在下で、この制御が解放されるプロモーターがある。第２のレポーター遺伝子が、第１の遺伝子によりコードされるレプレッサーにより制御されるプロモーターを有する場合、第３のポリヌクレオチド構造体は、好ましくはレプレッサーの存在下で第２のレポーター遺伝子の発現が起きないように、適度に低レベルの発現を提供するように選択されるプロモーターを有する。
【００２４】
ポリヌクレオチド構造体は、宿主細胞の形質転換用のベクターとして付与することができる。ポリヌクレオチド構造体は、同じかまたは異なるベクターで提供されてよい。ベクターは、適合性のある宿主細胞中でベクターを複製するように使用される。ベクターは、例えば、複製開始点と任意のプロモーター調節因子を付与されたプラスミドベクターとすることができる。ベクターは、例えば、細菌細胞中での選択のためのアンピシリンまたはクロラムフェニコール耐性遺伝子、或いは哺乳動物細胞中での選択のためのＧ４１８またはゼオシン耐性遺伝子等の１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有することができる。
【００２５】
本発明はまた、第１と第２のレポーター遺伝子の発現のために、第１と第２のポリヌクレオチド構造体で形質転換、結合または形質導入された宿主細胞に関する。場合により、宿主細胞は、第２のＲＮＡＰを発現してもよい。
【００２６】
本発明の好適な態様において、宿主細胞は細菌細胞からなり、細菌ＲＮＡＰの供給源を提供する。そのような細胞は、細菌ＲＮＡＰのモジュレーター、特に細菌ＲＮＡＰのインヒビターを同定するのに有用である。異なる細菌種により発現されるＲＮＡＰの類似性を考慮して、任意の細菌細胞中で測定を行なえばよく、その測定は、任意の細菌ＲＮＡＰを阻害すると予測されるインヒビターを同定するのに有用であろう。また、特異的なまたはいくつかの選択された細菌種からのＲＮＡＰに影響を与えるが、他の細菌ＲＮＡＰには影響を与えないインヒビターを同定できるかどうかを確立するのに、この測定を使用してもよい。上記で概説したように、この方法はまた、例えばσD等の他のσ因子を含む細菌ＲＮＡＰには影響を及ぼさないσAサブユニット、或いは、その逆のσ因子を含む細菌ＲＮＡＰの特異的インヒビターを同定するのに使用することもできる。好ましくは、試験される宿主細胞は、大腸菌（E. coli）または枯草菌（B. subtilis）である。好ましくは、この測定法は、大腸菌（E. coli）、サルモネラ（Salmonella）、バチルス（Bacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、およびメニンゴコッカス（Meningococcus）等の広範囲の細菌を阻害し、それ故、広域スペクトル抗生物質として細菌感染の治療に使用可能な、細菌ＲＮＡＰのインヒビターを同定するのに使用される。この測定法はまた、特定の細菌種に対して作用する抗生物質を同定するために使用することもできる。またこの測定法は、真核生物ＲＮＡＰに影響を及ぼさない細菌ＲＮＡＰのインヒビターを同定するために、細菌ＲＮＡＰの供給源を供給された真核細胞を使用する。
【００２７】
本発明の測定法は、ＲＮＡＰを調節する化合物をスクリーニングするのに使用される。ＲＮＡＰ活性のモジュレーターを同定する測定のために、任意の適切な方式が使用される。本測定の実施方法は、一部、第１と第２のレポーター遺伝子の性質に依存する。ある場合には、単一の試料についてレポータータンパク質の産生について追跡することが可能かも知れないが、ある場合には、第１と第２のレポーター遺伝子の活性を別々に追跡するために、試験物質の投与後に、宿主細胞を含有する試料を分けることが必要かも知れない。この測定の条件は、試験物質の非存在下で宿主細胞が増殖できるように選択される。
【００２８】
追加の対照実験が適切なことがある。その測定の進行は、試験物質の存在下および非存在下で追跡される。試験物質における比較可能なまたは同様の作用を示すために、例えば、細菌ＲＮＡＰのインヒビターであるリファンピシンおよびストレプトリジギン等の既知ＲＮＡＰモジュレーターを陽性対照として使用することができる。
【００２９】
上記測定法で試験される適当な試験物質としては、コンビナトリアルライブラリー、明らかにされている化学物質、ペプチドおよびペプチド類似体、例えば、ファージ表示（phage display）ライブラリー等のディスプレイのようなオリゴヌクレオチド及び天然産物のライブラリー、並びに抗体生成物がある。
【００３０】
試験物質は、例えば、１反応当たり１０個の物質や、阻害または活性化を示し個々に試験されるこれら一群の物質における初期スクリーニングで使用することができる。試験物質は、１μM〜１０００μM、好ましくは１μM〜１００μM、さらに好ましくは１μM〜１０μMの濃度で使用することができる。例えば、細菌培養物からのろ液、または植物抽出物等の天然起源の複合混合物を使用してもよい。
【００３１】
ＲＮＡＰの活性を阻害または活性化する物質は、酵素に結合することにより、そのような作用を発揮することができる。そのような酵素阻害は、可逆性であってもよく、非可逆性であってもよい。非可逆性インヒビターまたはアクチベーターは、共有結合または非共有結合で酵素に非常に強く結合されるため、その標的酵素から非常にゆっくり解離する。可逆性阻害または活性化は、非可逆性阻害または活性化と異なり、酵素−インヒビター／アクチベーター複合体の迅速な解離が特徴である。
【００３２】
試験物質は、競合的インヒビターでもよい。競合的阻害において、酵素は、酵素−基質複合体を形成する基質、または酵素−インヒビター複合体を形成するインヒビターに結合できるが、両方には結合できない。多くの競合的インヒビターは、基質に似ており、酵素の活性部位に結合する。従って基質は、同じ活性部位に結合することが妨げられる。競合的インヒビターは、基質に結合した酵素分子の比率を低下させることにより、触媒速度を低下させる。
【００３３】
インヒビターはまた、非競合的インヒビターとすることもできる。可逆性でもある非競合的阻害において、インヒビターと基質は、酵素分子に同時に結合する。これは、その結合部位が重複しないことを意味し、非競合的インヒビターは、基質に結合した酵素分子の比率を低下させるのではなく、酵素の代謝回転数（モル活性）を低下させることにより作用する。
【００３４】
インヒビターはまた、混合インヒビターでもよい。混合阻害は、インヒビターが、基質の結合に影響するとともに酵素の代謝回転数を変化させる時に起きる。
【００３５】
ＲＮＡＰの活性を阻害する物質もまた、基質に結合することにより、そのような阻害を達成することができる。この物質は、それ自体で、基質の反応を触媒し、その結果、その基質は、その酵素に対し利用できなくなる。また、インヒビターは、単に基質が酵素に結合することを妨害する。
【００３６】
アクチベーターである物質は、酵素に対する基質の親和性、またはその逆を上昇させることができる。この場合には、基質分子に結合する酵素分子の比率は上昇し、従って触媒速度が上昇するであろう。アクチベーターは、酵素若しくは基質または両方に結合することにより、酵素に対する基質の親和性を上昇させる。
【００３７】
ＲＮＡＰ活性のモジュレーターは、上記の測定法において、ＲＮＡＰ活性の測定可能な低下または上昇を引き起こすものである。
【００３８】
好適なインヒビターは、１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml、５００μg/ml、１mg/ml、１０mg/ml、１００mg/mlのインヒビター濃度で、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％まで、ＲＮＡＰ活性を阻害するものである。好ましくは、測定法は、１０μg/mlの濃度で少なくとも８０％または９０％活性を阻害するＲＮＡＰのインヒビターを同定する。
【００３９】
好適なアクチベーターは、１μg/ml、１０μg/ml、１００μg/ml、５００μg/ml、１mg/ml、１０mg/ml、１００mg/mlのアクチベーター濃度で、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％まで、細菌ＲＮＡＰ活性を活性化するものである。好ましくは、アクチベーターは、１０μg/mlで少なくとも５０％まで活性化する。
【００４０】
阻害率または活性化率は、試験物質の存在下および非存在下での測定法と比較した、ＲＮＡＰ活性の低下率または上昇率で表現させる。上記の阻害率または活性化率の程度の組合せが、本発明のインヒビターまたはアクチベーターを規定するために用いられ、低濃度でのより大きな阻害または活性化で定義することが好ましい。
【００４１】
（治療用途）
ＲＮＡＰのモジュレーター、特に細菌ＲＮＡＰ活性のインヒビターは、生体、特に細菌の増殖を制限するために使用することができる。そのようなインヒビターは、ヒトまたは動物の細菌症状を治療するために使用することができ、それ故そのような細菌感染を治療する抗生物質として使用することができる。
【００４２】
ＲＮＡＰ活性のモジュレーターは、種々の投薬形態で投与することができる。従って、それらは、経口的に、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁剤、分散性粉末または顆粒剤として投与することができる。インヒビターはまた、非経口的に、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、経皮的、または点滴によって投与することができる。モジュレーターはまた、坐剤として投与することもできる。各特定の患者についての必要な投与経路は、医師が決定できるであろう。
【００４３】
予防または治療に使用されるモジュレーターの調製は、医薬目的または獣医的目的であっても、まさにそのモジュレーターの特性等の要因に依存する。モジュレーターは、同時、別々、または連続的使用のために調製される。
【００４４】
ＲＮＡＰ活性のモジュレーターは、典型的には、薬理学的に許容される担体または希釈剤とともに、本発明の投与用に調製される。薬理学的に許容される担体または希釈剤としては、例えば、等張溶液がある。例えば、固形経口投与形態ものでは、活性化合物とともに、乳糖、ブドウ糖、サッカロース、セルロース、コーンスターチ、またはジャガイモデンプン等の希釈剤；シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール等の滑沢剤；デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン等の結合物質；デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはナトリウムデンプングリコレート等の崩壊剤；飽和剤；色素；甘味剤；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸等の湿潤剤；および一般に、医薬製剤で使用される非毒性かつ薬剤学的に不活性の物質を含有させることができる。そのような医薬調製物は、公知の方法、例えば混合、造粒、打錠、糖衣、またはフィルム被覆工程により製造される。
【００４５】
経口投与のための脂質分散物は、シロップ剤、乳剤および懸濁剤とすることができる。シロップ剤は、担体として、例えばサッカロース、またはグリセリンを有するサッカロース、および／またはマンニトール、および／またはソルビトールを含有することができる。
【００４６】
懸濁剤および乳剤は、担体として、例えば天然のゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有することができる。筋肉内注射のための懸濁液または溶液は、活性化合物とともに、例えば、無菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールといったグリコール等の薬剤学的に許容される担体、および必要に応じ、適当な量の塩酸リドカインを含有してもよい。
【００４７】
静脈内投与または点滴のための溶液は、担体として、例えば無菌水を含有することができ、また、好ましくは、無菌、水性、等張の食塩水溶液とすることができる。
【００４８】
治療上有効量のモジュレーターが患者に投与される。モジュレーターの投与量は、種々のパラメータ、特に使用される物質；治療される患者の年齢、体重、および症状；投与経路；並びに必要な処方により決定される。ここでも、特定の患者についての必要な投与経路および投与量は、医師が決定できるであろう。典型的な用量は、特異的インヒビターの活性、治療される被験体の年齢と症状、疾患の種類と重症度、および投与の頻度と経路に従って、約０．１〜５０mg/kg、好ましくは約０．１mg/kg〜１０mg/kg体重である。好ましくは、１日の用量レベルは５mg〜２ｇである。
【００４９】
以下の例は、本発明を例示する。
【実施例１】
【００５０】
図１Ａは本発明の実施態様の略図を示す。ＲＮＡポリメラーゼインヒビター試験株は、２つのレポーター遺伝子を含有し、１つは酵素β−ガラクトシダーゼをコードし、他はβ−グルクロニダーゼをコードする。非誘導状態（Ａ）（試験化学物質とインデューサーを加える前）では、レプレッサー（この例ではＸｙ１Ｒ）は、両方の遺伝子のプロモーターに結合し、転写が開始されるのを防止する。本来は、前者のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐ）を含む宿主σAにより、後者のプロモーターは、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等の外因性起源（ＸＰ）の対照ＲＮＡポリメラーゼ、或いは異なるまたは外因性のσ因子（例えば、σD）を含有する宿主ＲＮＡポリメラーゼにより、認識される。
【００５１】
糖キシロースが存在する誘導条件では、ＲＮＡポリメラーゼ機能を阻害可能な化学的インヒビターの存在下で、３つの可能な結果が例示される（Ｂ、Ｃ、Ｄ）。阻害が無いなら、両方のレポーター遺伝子が、それぞれのＲＮＡポリメラーゼ型により認識され、両方の酵素が作成される（Ｂ）。ＲＮＡポリメラーゼ機能の非特異的インヒビターがあるなら（Ｃ）（括弧は、ＲＮＡポリメラーゼが機能しないか無能であることを示す）、いずれの遺伝子も転写されず、いずれの酵素も作成されない（非特異的インヒビターはまた、転写後段階で、両方のレポーター酵素の形成を阻害する）。最後に、宿主ＲＮＡポリメラーゼの特異的インヒビターの存在下（Ｄ）では、β−グルクロニダーゼのみが作成される。
【００５２】
株Ｘは、枯草菌（Bacillus subtilis）１６８の標準的実験室株の誘導体である。これは、３つの点で修飾されている。
【００５３】
１．これは、酵素β−ガラクトシダーゼをコードする公知のレポーター遺伝子ｌａｃＺの転写を進めるキシロース誘導性プロモーターを有する。内因性Ｘｙ１Ｒタンパク質がプロモーター領域に結合して、ＲＮＡＰが転写を開始する能力を低下させるため、このレポーター遺伝子は、キシロースの非存在下でサイレントであるかまたは低レベルで発現される。キシロースまたは同様の糖を添加すると、レプレッサーがプロモーターを離れて、ＲＮＡＰが遺伝子を強く転写することが可能になり、β−ガラクトシダーゼの合成が上昇する。単純な発色基質ＯＮＰＧを使用して、酵素の生成を検出した。
【００５４】
２．Ｘ株は、バクテリオファージＴ７のＲＮＡＰにより認識されるプロモーターを含む第２のレポーター遺伝子を有する。このプロモーターは、第１のプロモーターを制御するのと同じＸｙ１Ｒレプレッサーにより認識され抑制されるように修正されている。従って、キシロースが存在しない場合には、プロモーターはＴ７  ＲＮＡＰにより利用されることができない。プロモーターは、酵素β−グルクロニダーゼをコードする第２のレポーター遺伝子（ｇｕｓ）の転写を進める。この酵素の活性を、蛍光性基質ＭＵＧｌｕｃを使用して、β−ガラクトシダーゼと平行して追跡した。
【００５５】
３．最後に、Ｘ株は、構成性に発現されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子のコピーを有する。従って、その細胞は、Ｘｙ１Ｒプロモーターによる抑制が、キシロースの添加により解放された場合には、上記２に記載のプロモーターで転写を開始できるＴ７  ＲＮＡＰを常に含有する。
【００５６】
この測定は、Ｘ株の培養物をキシロースの非存在下で増殖させ、次に培養物の一部をマイクロタイタープレートのウェルに分注することにより行われる。各ウェルには、２つのレポーター遺伝子の発現を誘導するキシロースを含有させた。一部のウェルには、各菌種の抗生物質または化学物質をさらに含有させた。プレートを３０分インキュベートして、２つのレポーター酵素を蓄積させ、次に細胞を溶解し、２つの酵素の活性を測定した。
【００５７】
３種類の応答が見られた。追加の化合物を加えなかった対照ウェル、または非毒性の化学物質を含有するウェルでは、レポーター活性は影響を受けなかった。転写に無関係の細胞機能の面に影響を与える物質を加えたウェルでは、両方のレポーター活性が低下し排除された。最後に、細菌ＲＮＡポリメラーゼの特異的インヒビター（リファンピシンとストレプトリジギン）を含有するウェルでは、Ｔ７  ＲＮＡＰにより駆動されるレポーター酵素（β−グルクロニダーゼ）のみが活性であった。
【実施例２】
【００５８】
実験法
一般的方法
ＤＮＡ操作と大腸菌（E. coli）形質転換は、既に記載されている（サムブルーク（Sambrook J.）、フリッチュ（E.F. Fritsch）およびマニアティス（Maniatis T.）、(1989), モレキュラークローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス）ように行った。すべてのクローニングは、大腸菌（E. coli）ＤＨ５α（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））中で行った。形質転換体の選択は、アンピシリン（１００μg/ml）を含有するオキソイド（Oxoid）栄養寒天上で行った。枯草菌（B. subtilis）株を、クンスト（Kunst）とラポポルト（Rapoport）（J. Bacteriol. 177:2403-2407 (1995)；Genes Dev. 12:3419-3430 (1998)）、またはアナグノストポウロス（Anagnostopoulos）とスピチチェン（Spizizen）（アナグノストポウロス（Anagnostopoulos, C.）とスピチチェン（Spizizen, J.） (1961) J. Bacteriol. 81:741-746；ジェンキンソン（Jenkinson, H.F.）(1983) J. Gen. Microbiol. 129:1945-1958）の方法を修飾して、形質転換した。形質転換体を、必要に応じて、クロラムフェニコール（５μg/ml）、スペクチノマイシン（７５μg/ml）、カナマイシン（５μg/ml）、テトラサイクリン（１０μg/ml）および／またはＩＰＴＧ（１mM）を含有するオキソイド（Oxoid）栄養寒天上で選択した。この試験で使用した株とプラスミドを、以下の表１に列記する。
【００５９】
2004520024.tif 000003
【００６０】
ＰT7X−ｇｕｓ融合体の構築
２つの重複するオリゴヌクレオチドプライマー、Ｆ１（５’−ＡＣＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣ−３’）とＲ２（５’−ＧＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＡ−３’）を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる末端充填／増幅反応で、鋳型として使用した。増幅した〜１００bp断片は、キシロースオペレーター配列から９bp離れたＴ７プロモーターを含有した（ガートナー（Gartner）ら（1992）、Mol. Gen. Genet. 232:415-422）。この断片を、ＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化し、次に適切に消化したｐＭＬＫ８３に連結して、プラスミドｐＨＴ７を作成した。ｇｕｓ遺伝子の上流の配列を、ＰＣＲ産物から配列決定し、プライマーＧＵＳ−Ｒ３（５’−ＡＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＧＧＣＧ−３’）及び９６６１Ｈ（５’−ＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＣＧＣＧＣＴＧ−３’）と、鋳型としてのｐＨＴ７を使用して増幅した。プライマー９６６１Ｈは、オックスフォード大学のサー・ウィリアムダン（Sir William Dunn）病理学部（School of Pathology）の配列決定サービスで実施された配列決定のために使用された。このプラスミドは、カナマイシン耐性についての選択を用いて、１６８株に形質転換した。アミラーゼ欠損表現型で、一の株（ＰＬ９）を選択し、ａｍｙＥ遺伝子座で２重交差により、構造体が挿入されていることを確認した。
【００６１】
ＰT7X−ｇｕｓ融合体の構築
ファージＴ７プロモーター（ＰＴ７）を、プラスミドｐＥＴ３ａからＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片として切り出し、ゲル精製し、ＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化したｐＭＬＫ８３に連結して、ｐＨＴ９を作成した。このプラスミドは、カナマイシン耐性についての選択を用いて、１６８株に形質転換した。アミラーゼ欠損表現型上で、ある株（ＰＬ２２）を選択し、ａｍｙＥ遺伝子座で２重交差により、構造体が挿入されていることを確認した。
【００６２】
ｙｙｂＣＢ遺伝子間領域中のＰxyl−ｌａｃＺ融合体を有する株の構築
プラスミドｐＭＵＴＩＮ４からのｌａｃＺ遺伝子を、ＰＣＲによりプライマーｌａｃＺ−ｆｗ１（５’−ＧＡＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧ−３’）とＲ−ｌａｃＺ１（５’−ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧ−３’）を使用して増幅して、ｓｐｏＶＧリボゾーム結合部位を含有させ、それぞれＸｂａＩとＰｓｔＩ部位を導入した。ｙｙｂＣＢ遺伝子間領域の上流の断片を、ＰＣＲによりプライマーｙｙｂＥ−Ｆ（５’−ＧＡＴＣＡＣＣＣＡＴＴＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＧ−３’）とｙｙｂＣ−Ｒ（５’−ＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＣＧＡＴＣＣＧ−３’）を使用して増幅し、断片の３’末端にＰｓｔＩ部位を導入した。同様にｙｙｂＣＢ遺伝子間領域の下流の断片を、ＰＣＲによりプライマーｙｙｂＢ−Ｆ（５’−ＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣ−３’）とｙｙａｔ−Ｒ（５’−ＧＧＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＣ−３’）を使用して増幅し、断片の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ｃａｔＰxyl断片を、プラスミドｐＲＤ９６からＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切り出しゲル精製した。ｃａｔＰxyl断片、ＢａｍＨＩ消化した下流ｙｙｂＣＢ断片；ＸｂａＩ−ＰｓｔＩ消化したｌａｃＺ断片、ＰｓｔＩ消化した上流ｙｙｂＣＢ断片の連結物を、１６８に形質転換して、ｃａｔＰxyl−ｌａｃＺをｙｙｂＢＣ遺伝子座中に挿入させた。クロラムフェニコール耐性株（Ｐ１３）を単離し、これは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ；１００μg/ml）を含有する寒天プレート上で青く染色され、β−ガラクトシダーゼの活性を示した。
【００６３】
ｙｗｈＥＤ遺伝子間領域中のスペクチノマイシン耐性決定基を有する株の構築
ｓｐｃＰspacｌａｃＩ断片を、プラスミドｐＳＧ１３０１からＫｐｎＩ−ＳａｃＩ消化により切り出し、ゲル精製し、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ消化したｐＳＧ１４０３に連結して、プラスミドｐＨＴ１２を得た。ｙｗｈＥ−ｙｗｈＤ遺伝子間領域の一部をカバーするｙｗｈＥ遺伝子からの８２０bp断片を、ＰＣＲにより、プラスミドＹＷＨＥ．ＦＷ（５’−ＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣ−３’）とＹＷＨＥ．ＲＶ（５’−ＴＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＡＧＣ−３'）を使用して増幅した。この断片を、ＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩ消化しホスファターゼ処理したｐＨＴ１２に連結して、プラスミドｐＨＴ１３を得た。ｙｗｈＥ−ｙｗｈＤ遺伝子間領域の一部をカバーするｙｗｈＤ遺伝子から６４０bp断片を、ＰＣＲにより、プライマーＹＷＨＤ．ＦＷ（５’−ＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＡＣＴＣＡＴＡＴＣＣ−３'）とＹＷＨＤ．ＲＶ（５’−ＡＧＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＣ−３’）を使用して増幅した。この断片を、ＳｐｅＩとＢａｍＨＩで消化し、ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ消化したｐＨＴ１３に連結して、ｐＨＴ１６を作成した。このプラスミドを、スペクチノマイシン耐性とクロラムフェニコール感受性について選択して株ＰＬ２２中に形質転換し、これは、ｙｗｈＥＤ遺伝子間領域で２重交差により、ｓｐｃＰspacｌａｃＩの組み込みを示す。これで、株ＰＬ２７が作成された。
【００６４】
ｙｗｈＥＤ遺伝子間領域中に挿入されたｒｐｏＴ７を発現する株の構築
プラスミドｐＳＧ１４０３をＳｐｅＩとＢａｍＨＩで切断し、適切に切断したｙｗｈＤ断片に連結し、上記のように増幅して、プラスミドｐＨＴ１５を得た。株ＰＬ２７を、テトラサイクリン耐性とスペクチノマイシン感受性について選択して、プラスミドｐＳＧ１４０４で形質転換した。これでＰＬ２８株が作成され、この株とプラスミドｐＨＴ１５は、Ｔ７  ＲＮＡＰをコードするｙｗｈＤ遺伝子座ｒｐｏＴ７でのクローニングのための多くの相同性の領域（ｓｐｃとｌａｃＩｙｗｈＤ断片）を有し、この株を、大腸菌（E. coli）Ｂｌ２１（ＤＥ３）から、プライマーＴ７Ｆ３（５’−ＡＧＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＣ−３’）とＴ７Ｒ３（５’−ＧＣＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＧＣＧＴ−３’）を使用して、ＰＣＲ増幅し、こうしてｒｐｏＴ７遺伝子の上流に、枯草菌（B. subtilis）リボゾーム結合部位を導入した。ｒｐｏＴ７断片をＳｍａＩとＣｌａＩで消化し、ＳｍａＩ−ＣｌａＩ切断したｐＨＴ１５と連結した。連結混合物を、スペクチノマイシン耐性とβ−グルクロニダーゼを発現する能力［すなわち、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコロニド（５０μg/ml）の存在下で蛍光を発する］について選択して、直接ＰＬ２８に形質転換した。これで、株ＰＬ３１が作成された。次に、株ＰＬ３１からの染色体ＤＮＡを用いて、株１６８をスペクチノマイシン耐性とテトラサイクリン感受性について選択して、ｙｗｈＥＤ遺伝子座で安定に組み込まれたＰspac−ｒｐｏＴ７を含有する株ＰＬ３４を作成した。
【００６５】
機能性２重レポーターシステムを含有する測定株の構築
株ＰＬ３４を、ＰT7X−ｇｕｓ融合体を含有するプラスミドｐＨＴ７を用いて、カナマイシン耐性とアミラーゼ欠損表現型について選択して、形質転換した。これで株ＰＬ３３が作成され、これは、ａｍｙＥ遺伝子座で２重交差により挿入されたＰT7X−ｇｕｓ融合体を含有した。ＰＬ３３はまた、ｒｐｏＴ７遺伝子を有し、これは、ＩＰＴＧ依存性に宿主ＲＮＡＰにより転写される。宿主ＲＮＡＰにより認識される試験レポーター（Ｐxyl−ｌａｃＺ）を、ＰＬ１３染色体ＤＮＡを用いて形質転換して、クロラムフェニコール耐性について選択して、株ＰＬ３３に導入して、測定株ＰＬ３７を得た。
【００６６】
Ｔ７ＲＮＡＰ誘導実験
株ＰＬ９、ＰＬ３４およびＰＬ３７の培養物を、ＰＡＢ中で一晩増殖させた。ｒｐｏＴ７の発現を誘導するために、各培養物を分注し、各分注液に、異なる濃度のＩＰＴＧ（０、０．０１、０．０５、０．１、０．５mM最終）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。この段階で、各培養物を、非添加ＰＡＢ培溶液で希釈した。各培養物の２０μｌの試料を、２％v/v ＤＭＳＯを２０μｌ含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、測定混合物を加えて、レポーター酵素活性を検出した（後述）。
【００６７】
ＰＬ３７のレポーターシステムに及ぼすキシロースの作用
ＰＬ３７を上記のように増殖させ処理した。各培養物の２０μlの試料を、異なる濃度のキシロース（０、０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．４％w/v）を添加した２％v/v ＤＭＳＯを２０μｌ含有するマイクロタイタープレートウェルに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、後述のように測定混合物を加えた。
【００６８】
抗生物質パネルに対するＰＬ３７の試験
２０個の既知の抗生物質を、ある濃度範囲で試験して、測定内の試験レポーターと対照レポーターに及ぼすその作用を調べた。以下の抗生物質について、１２８μg/ml〜０．１２５μg/mlの範囲の濃度で試験した：
カルベニシリン、リンコマイシン、ノボビオシン、トリメトプリムラクテート、クロラムフェニコール、オフロキサシン、モネンシン、ポリミキシン、カナマイシン、ストレプトリジギン、オキソリン酸、ナリジクス酸、スペクチノマイシン、およびバシトラシン。
エリスロマイシン、セファレキシン、ペニシリンＧ、アンピシリンおよびバンコマイシンは、１６ng/ml〜０．０１６μg/mlの範囲の濃度で試験し、リファンピシンは０．５μg/ml〜０．０００５μg/mlで試験して、その低ＭＩＣ値を含めるようにした。ＰＡＢで増殖させたＰＬ３７の培養物を、０．０５Ａ600に希釈し、次に０．０２mM ＩＰＴＧを添加したＰＡＢ中で３７℃で２時間増殖させた。細胞をペレットにし凍結した。後にこれらを、０．０２mMのＩＰＴＧを添加したＰＡＢに再懸濁し、これで希釈し、３７℃で初期指数期まで増殖させた。次に培養物をＰＡＢで０．０５Ａ600まで希釈し、２０μl容量の抗生物質を含有するマイクロタイタープレートのウェルに２０μl容量で加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、測定混合物を加えて、レポーター酵素活性を検出した（後述）。
【００６９】
β−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダーゼ活性の検出
１６０μｌの測定混合物（９４μg/mlのリソザイム、８．４μg/mlの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、０．５３μg/mlのレソルフィン−β−Ｄ−グルクロニドおよび０．０５％のトリトンを含有する１．３×Ｚ緩衝液）を各ウェルに添加後、マイクロタイタープレートを暗所で室温で３０分または１時間インキュベートした。ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙで、励起／蛍光  ３５５／４６０nmと５４４／５９０nmで、ゲインをそれぞれ５と２５に設定して、蛍光を読んだ。
【００７０】
（結果）
測定株ＰＬ３７の構築
株ＰＬ３７（図２）は、試験レポーター、キシロース誘導性Ｐxyl−ｌａｃＺ、およびＴ７  ＲＮＡＰをコードするｒｐｏＴ７のコピー（これは、ＩＰＴＧにより誘導される）を含有する（Ｐspac−ｒｐｏＴ７）。対照レポーターは、ｇｕｓ遺伝子の上流で、キシロースオペレーター配列から９bp離れたＰT7プロモーターを含む（図３）。理由は不明だが、このプロモーターはＸｙ１Ｒにより抑制されず、これは測定の結果に影響しなかった。
【００７１】
対照レポーターの発現はＩＰＴＧ依存性である
ＰＬ３７が、対照レポーター遺伝子ｇｕｓを順に転写するファージＴ７  ＲＮＡＰをコードするｒｐｏＴ７遺伝子の発現を誘導する異なる濃度のＩＰＴＧの存在下で、増殖された。図４Ａに示すように、対照レポーターの活性はＩＰＴＧ依存性であった。これに対して、Ｐspac−ｒｐｏＴ７構造体（ＰＬ８）を欠如している親株からの対照レポーターの発現は、この構造体を含有するがｇｕｓレポーターが欠如した株（ＰＬ３４）と同じバックグランドレベルであった。従って、株ＰＬ３７は、ＩＰＴＧによるｒｐｏＴ７遺伝子発現の誘導に依存するｇｕｓレポーター発現を示し、それによってＴ７  ＲＮＡＰにより転写された。さらに、図４Ｂに示すように、株ＰＬ３７の試験レポーターは、ＩＰＴＧの非存在下で発現され、ＩＰＴＧを加えても変化の無いままであった。
【００７２】
測定に及ぼす抗生物質の作用
図５〜７は、測定株ＰＬ３７に対してある濃度範囲で抗生物質の選択を試験する実験から得られた、蛍光データと対照：試験レポーター（ＲＥＳ：ＭＵＧ）比のデータを示す。希釈１は、試験した最も高い濃度であり、希釈１１は最も低い濃度である。表２は、同じ条件下でのＲＥＳ：ＭＵＧについての個々の値を列記する。
【００７３】
2004520024.tif 000004
【００７４】
実験で得られた結果は、試験した抗生物質の２つ（リファンピシンとストレプトリジギン）のみが、ＲＮＡポリメラーゼの特異的インヒビターとして検出されることを示す。図５に示すように、Ｔ７  ＲＮＡＰ依存性対照レポーターの発現は、それら抗生物質の存在下で上昇した。これに対して、リファンピシンまたはストレプトリジギンの存在下で、試験レポーター（Ｐxyl−ｌａｃＺ）は劇的に低下する（図６）。従って、これらの抗生物質の両方とも、いくつかの濃度の抗生物質の無い対照（ＤＭＳＯ）よりも大きいＲＥＳ：ＭＵＧ比を与える（表２、図７）。他のすべての抗生物質（スペクチノマイシンを除く）の存在下で、両方のレポーターの活性が低下（図５と図６）したが、対照レポーター活性の低下は、しばしばあまり顕著ではなかった。従って、大多数の抗生物質について対照対試験レポーター発現の比（ＲＥＳ：ＭＵＧ）は、抗生物質の非存在下（ＤＭＳＯのみ）で増殖させた細胞に近いものであった。従って、この測定法は、細菌ＲＮＡＰを特異的に標的とする化合物と、枯草菌（B. subtilis）増殖の非特異的インヒビターとを区別するのに使用することができるであろう。ＰＬ３７は、スペクチノマイシンに耐性であり、従ってレポーター発現は変化しないままであった。
【００７５】
（考察）
枯草菌（B. subtilis）ＲＮＡＰのインヒビターについて、スクリーニング測定法で使用される株（ＰＬ３７）が構築された。ＰＬ３７は、枯草菌（B. subtilis）ＲＮＡＰの活性を追跡することが証明されている試験レポーターであるＰxyl−ｌａｃＺと、発現がＴ７  ＲＮＡＰに依存性であり、細菌ＲＮＡＰに非依存性の対照レポーターとを含有する。ＰＬ３７中の対照レポーターは、ｇｕｓ遺伝子の上流のキシロースオペレーター配列から９bp離れているＰT7プロモーターを含有する（ＰT7X−ｇｕｓ）。ＰＬ３７は、対照レポーターの発現についてＩＰＴＧに依存性であり、ＩＰＴＧ誘導性のＰspacプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡＰをコードする遺伝子を制御する。抗生物質パネルの存在下での実験は、ＰＬ３７のレポーター活性を測定する測定法で、ＲＮＡＰのインヒビターが特異的に検出されることを示した。細菌ＲＮＡＰの抗生物質インヒビターであるリファンピシンとストレプトリジギンは、任意の化合物の非存在下または非特異的抗生物質の存在下での比と比較して、対照：試験レポーター活性の比の上昇を引き起こした。
【００７６】
配列検索は、Ｔ７ＲＮＡＰが、いくつかの他のバクテリオファージのＲＮＡＰとのみ、およびいくつかの植物や真菌のミトコンドリアまたは葉緑素ＲＮＡＰと非常に良く似ていることを示した。ＰＬ３７ベースの２重レポーターシステムでは、化合物の無い対照と比較して、ＰT7X−ｇｕｓレポーターの発現の低下とＰxyl−ｌａｃＺの発現が変化しないことにより、バクテリオファージＲＮＡＰの特異的インヒビターが検出されるであろう。従って、そのような化合物の存在下では、試験レポーター発現対対照レポーター発現（ＭＵＧ：ＲＥＳ）の比は、上昇するであろう。従ってこの測定法は、バクテリオファージＲＮＡＰインヒビターを検出するのに使用できるであろう。
【００７７】
文献：
（１）Studier, F.W.とMoffatt, B.A. (1986)。クローン化遺伝子の選択的高レベル発現を指令するためのバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの使用。J. Mol. Biol. 189:113-130。
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（４）Stevens, C.M., Daniel, R.D., Illing, N. とErrington, J. (1991)。枯草菌（Bacillus subtilis）の胞子被膜の形態形成に関与する胞子形成遺伝子ｓｐｏＩＶＡの性状解析。J. Bacteriol. 174:584-594。
（５）Sievers, J. (2000)。枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子ｆｔｓＬとｙｙａＡの性状解析。博士論文, オックスフォード大学。
（６）Daniel, R.D., Harry, E.J., Katis, V.L., Wake, R.G. とErrington, J. (1998)。枯草菌（Bacillus subtilis）の必須細胞分裂遺伝子ｆｔｓＬ（ｙｌｌＤ）の性状解析と分裂装置の組み立てにおけるその役割。Mol. Microbiol. 29:593-604。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の測定法の略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細菌ＲＮＡポリメラーゼのインヒビターの測定系を示す略図である。
【図２】図２は、ＰＬ３７株の遺伝子構成の略図である。Ｐxyl−ｌａｃＺは、ｙｙｂＣＢ遺伝子座中に置かれる。ｒｐｏＴ７遺伝子は、ｙｗｈＥＤ遺伝子座のＩＰＴＧ−誘導性Ｐspacプロモーターの制御下にある。制御レポーターは、ａｍｙＥ遺伝子座に存在する。
【図３】図３は、ＰT7X−ｇｕｓ融合体を含むｇｕｓ遺伝子の上流のＤＮＡ配列を示す。
【図４】図４は、測定株ＰＬ３７の対照（ＰT7X−ｇｕｓ；Ａ）と試験（Ｐxyl−ｌａｃＺ；Ｂ）レポーターの発現に及ぼす、ＩＰＴＧ濃度の作用を示す。ＰＬ３７株（菱形）を、異なる濃度のＩＰＴＧの存在下で増殖させ、β−グルクロニダーゼ（Ａ）とβ−ガラクトシダーゼ（Ｂ）活性について測定した。ｒｐｏＴ７遺伝子を持たない株ＰＬ９（三角）とＰＬ３４（四角）もまた、陰性対照と同じ条件下で調べた。
【図５】図５は、測定株ＰＬ３７の対照（ＰT7X−ｇｕｓ）レポーターの発現に及ぼす、特異的および非特異的抗生物質の作用を示す。ＰＬ３７を、異なる濃度の抗生物質と、化合物の無い対照（ＤＭＳＯ）の存在下で増殖させ、β−グルクロニダーゼとβ−ガラクトシダーゼ活性について測定した（表２のデータも参照）。
【図６】図６は、測定株ＰＬ３７の試験（Ｐxyl−ｌａｃＺ）レポーターの発現に及ぼす、特異的および非特異的抗生物質の作用を示す。ＰＬ３７を、異なる濃度の抗生物質と、化合物の無い対照（ＤＭＳＯ）の存在下で増殖させ、β−グルクロニダーゼとβ−ガラクトシダーゼ活性について測定した（表２のデータも参照）。
【図７】図７は、図５及び図６のデータを、β−グルクロニダーゼとβ−ガラクトシダーゼ活性の比として示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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