(57)【要約】本発明は、試験化合物の非特異的毒性による偽陽性結果を排除し、一方で疾病および疾患に関連した、特にアルツハイマー病に関連した代謝経路における細胞代謝産物を特異的に調節する化合物を検出することができる、細胞に基づいたスクリーニング法を記載する。本方法は、細胞に基づいた系において有効な化合物(薬物)を同定するための高スループットスクリーニング技術に特に適している。本発明の方法は、細胞系において目的の代謝前駆体および代謝産物の両方のレベルを決定することを含み、特に、アルツハイマー病などの疾病および疾患の進行に関連した前駆体および代謝産物分子に対する、高スループット薬物発見および同定において広範囲に適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾病または疾患と関連した1つまたは複数の細胞代謝産物の生成を、非特異的な細胞毒性を引き起こさずに減少または阻害する化合物を同定するための、細胞に基づいたスクリーニング法であって：
(a)試験化合物と細胞を接触させる段階；
(b)(i)細胞の前駆体タンパク質、または(ii)細胞の前駆体タンパク質のコンホメーション状態のレベルを決定する段階；および
(c)段階(b)の(i)または(ii)から生成される代謝産物のレベルを決定する段階を含み；細胞における代謝産物のレベルを特異的に減少または阻害する化合物は、非処理細胞における場合と比べて代謝産物のレベルのみの減少を示し、かつ非特異的な細胞毒性がある化合物は、(i)のレベル、および選択的に(i)または(ii)の関連した切断産物のレベル、および代謝産物のレベルの減少を示す、方法。
【請求項２】
高スループットスクリーニング法である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
代謝産物の特異的なエピトープに対する抗体、並びに前駆体タンパク質および選択的に、これに関連した切断産物の特異的なエピトープに対する抗体を使用して、マイクロタイタープレートの単一のウェルにおいて行われる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
細胞の前駆体タンパク質のレベルの測定が、細胞の前駆体タンパク質のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前駆体タンパク質によって生成される代謝産物のレベルの測定が、代謝産物のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
請求項1記載の方法であって、細胞の前駆体タンパク質(i)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)であり、並びに選択的に、関連した切断産物は、αカルボキシ末端断片(αCTF)、βカルボキシ末端断片(βCTF)、およびγカルボキシ末端断片(γCTF)である方法。
【請求項７】
代謝産物が、翻訳後修飾された細胞の前駆体タンパク質、タンパク質またはペプチドのオリゴマー、タンパク質またはペプチドの多量体、プロト原繊維巨大分子、原繊維巨大分子、およびオリゴマー集合からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
代謝産物が、アミロイド前駆体タンパク質APPのタンパク質分解性産物である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
代謝産物が、βカルボキシ末端断片(βCTF)またはαカルボキシ末端断片(αCTF)である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
試験化合物と接触した細胞が、初代哺乳類細胞、哺乳類細胞株、神経芽細胞腫、ニューロン、単離された脳細胞、アミロイド前駆体タンパク質APPをコードする遺伝子でトランスフェクトされ、コードされたAPP産物を発現する細胞、およびアルツハイマー病の病理生物学を模倣するように遺伝的に修飾された細胞から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
細胞がヒト細胞またはヒト細胞株である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
試験化合物が合成有機化合物、化学物質、天然の産物、ポリペプチド、またはペプチドから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
疾病または疾患を発症する可能性の減少、または重篤度の減少と関連した1つまたは複数の細胞代謝産物の生成を、非特異的な細胞毒性を引き起こさずに増大または増強する化合物を同定するための、細胞に基づいたスクリーニング法であって：
(a)試験化合物と細胞を接触させる段階；
(b)(i)細胞の前駆体タンパク質、または(ii)細胞の前駆体タンパク質のコンホメーション状態のレベルを決定する段階；および、
(c)段階(b)の(i)または(ii)から生成される代謝産物のレベルを決定する段階を含み；細胞における代謝産物のレベルを特異的に増大または増強する化合物は、非処理の細胞に比べて代謝産物のレベルの増大を示すが、(i)または(ii)のレベルを有意に変化させない、方法。
【請求項１４】
高スループットスクリーニング法である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
代謝産物の特異的なエピトープに対する抗体、並びに前駆体タンパク質および選択的に、これに関連した切断産物の特異的なエピトープに対する抗体を使用して、マイクロタイタープレートの単一のウェルにおいて行われる、請求項13または請求項14記載の方法。
【請求項１６】
細胞の前駆体タンパク質のレベルの測定が、細胞の前駆体タンパク質のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前駆体タンパク質によって生成される代謝産物のレベルの測定が、代謝産物のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
請求項15記載の方法であって、細胞の前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)またはAPPのその他のタンパク質分解性断片であり、並びに選択的に、関連した切断産物は、αカルボキシ末端断片(αCTF)、βカルボキシ末端断片(βCTF)、およびγカルボキシ末端断片(γCTF)である、方法。
【請求項１９】
代謝産物が、翻訳後修飾された細胞の前駆体タンパク質、タンパク質またはペプチドのオリゴマー、タンパク質またはペプチドの多量体、プロト原繊維巨大分子、原繊維巨大分子、およびオリゴマー集合からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
代謝産物が、アミロイド前駆体タンパク質APPのタンパク質分解性産物である、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
代謝産物が、分泌性APPまたはAPPのαカルボキシ末端断片(αCTF)である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試験化合物と接触した細胞が、初代哺乳類細胞、哺乳類培養細胞株、神経芽細胞腫、ニューロン、単離された脳細胞、アミロイド前駆体タンパク質APPをコードする遺伝子でトランスフェクトされ、コードされたAPP産物を発現する細胞、およびアルツハイマー病の病理生物学を模倣するように遺伝的に修飾された細胞から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
細胞がヒト細胞またはヒト細胞株である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
試験化合物が合成有機化合物、化学物質、天然の産物、ポリペプチド、またはペプチドから選択される、請求項13記載の方法。
【請求項２５】
アルツハイマー病に関連した代謝事象に関与する細胞のタンパク質分解性経路の活性を特異的に減少する化合物と、細胞に対して非特異的な毒性がある化合物とを区別するための、細胞に基づいたスクリーニング法であって：
(a)試験化合物で細胞を処理する段階；
(b)1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物のレベルを検出する段階；
(c)アミロイド前駆体タンパク質(APP)のレベルを検出する段階；
(d)1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物のレベルに対する化合物の効果と、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のレベルに対する化合物の効果とを比較する段階を含み；アミロイド前駆体タンパク質(APP)のレベルの有意な減少を伴わない、1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物のレベルの特異的な減少により、化合物が細胞のタンパク質分解性経路を特異的に阻害し、かつ非特異的な細胞毒性がないことが示される、方法。
【請求項２６】
高スループットスクリーニング法である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
段階(b)において、1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物が、アミロイド前駆体タンパク質APPのタンパク質分解性プロセシングによって生じる、細胞に結合したβカルボキシ末端断片(βCTF)である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
段階(c)において、さらに、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のαカルボキシ末端断片(αCTF)、βカルボキシ末端断片(βCTF)、およびγカルボキシ末端断片(γCTF)を含むタンパク質分解性断片が検出される、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物の特異的エピトープに対する抗体、およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)の特異的エピトープに対する抗体を使用して、マイクロタイタープレートの単一のウェルにおいて行われる、請求項25または26記載の方法。
【請求項３０】
1つまたは複数のアミロイド前駆体タンパク質(APP)代謝産物のレベルの測定が、1つまたは複数のAPP代謝産物のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
アミロイド前駆体タンパク質(APP)のレベルの測定が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体特性を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
試験化合物と接触した細胞が、初代哺乳類細胞、哺乳類培養細胞株、神経芽細胞腫、ニューロン、単離された脳細胞、アミロイド前駆体タンパク質APPをコードする遺伝子でトランスフェクトされ、コードされたAPP産物を発現する細胞、およびアルツハイマー病の病理生物学を模倣するように遺伝的に修飾された細胞から選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
細胞がヒト細胞またはヒト細胞株である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
試験化合物が合成有機化合物、化学物質、天然の産物、ポリペプチド、またはペプチドから選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病に関連した代謝事象に関与する細胞のタンパク質分解性経路の活性を特異的に減少する化合物と、細胞に対して非特異的な毒性がある化合物とを区別するための、細胞に基づいたスクリーニング法であって：
(a)試験化合物で細胞を処理する段階；
(b)アミロイド前駆体タンパク質APPのタンパク質分解性プロセシングによって生じる、細胞に結合したβカルボキシ末端断片(βCTF)のレベルを検出する段階；
(c)アミロイド前駆体タンパク質(APP)並びにこれに関連したαカルボキシ末端断片(αCTF)、βカルボキシ末端断片(βCTF)、およびγカルボキシ末端断片(γCTF)を含む切断断片のレベルを検出する段階；
(d)APPの切断によって生じるβCTFのレベルに対する化合物の効果と、アミロイド前駆体タンパク質(APP)およびこれに関連した切断断片のレベルに対する化合物の効果を比較する段階を含み；対照と比べてアミロイド前駆体タンパク質(APP)およびこれに関連した切断断片のレベルの有意な減少を伴わない、βCTFのレベルの特異的な減少により、化合物が細胞のタンパク質分解性経路を特異的に阻害し、かつ非特異的な細胞毒性がないことが示される、方法。
【請求項３６】
高スループットスクリーニング法である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
βカルボキシ末端断片(βCTF)の特異的エピトープに対する抗体、並びにアミロイド前駆体タンパク質(APP)およびこれに関連した切断断片の特異的エピトープに対する抗体を使用して、マイクロタイタープレートの単一のウェルにおいて行われる、請求項35または36記載の方法。
【請求項３８】
アミロイド前駆体タンパク質APPのタンパク質分解性プロセシングによって生じる、細胞に結合したβカルボキシ末端断片(βCTF)のレベルの決定が、細胞に結合したβカルボキシ末端断片(βCTF)のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
アミロイド前駆体タンパク質(APP)およびこれに関連した切断断片のレベルの決定が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)およびその関連した切断断片のエピトープに特異的な1つまたは複数の検出可能な抗体を含む酵素結合免疫吸着検定法によって行われる、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
試験化合物と接触した細胞が、初代哺乳類細胞、哺乳類培養細胞株、神経芽細胞腫、ニューロン、単離された脳細胞、アミロイド前駆体タンパク質APPをコードする遺伝子でトランスフェクトされ、コードされたAPP産物を発現する細胞、およびアルツハイマー病の病理生物学を模倣するように遺伝的に修飾された細胞から選択される、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
細胞がヒト細胞またはヒト細胞株である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
試験化合物が合成有機化合物、化学物質、天然の産物、ポリペプチド、またはペプチドから選択される、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
アルツハイマー病代謝経路に関与する細胞の代謝産物の活性を減少または阻害する化合物を同定するための、細胞に基づいたスクリーニング法であって：
(a)アミロイド前駆体タンパク質(APP)およびAPPの細胞結合代謝産物に対する1つまたは複数の捕獲抗体で被覆された基質上に配置された細胞を試験化合物で処理する段階；
(b)細胞を破壊する段階であって、抽出されたアミロイド前駆体タンパク質(APP)およびAPPの細胞結合代謝産物を1つまたは複数の捕獲抗体に結合させる、段階；
(c)捕獲抗体に対するタンパク質の結合を検出抗体で検出する段階であって、検出抗体が、(i)1つまたは複数のAPP代謝産物を特異的に認識する標識された抗体、並びに(ii)アミロイド前駆体タンパク質(APP)および選択的に、そのカルボキシ末端のタンパク質分解性産物を特異的に認識する異なる標識を施された抗体を含む、段階；並びに
(d)(i)1つまたは複数のAPP代謝産物、および(ii)アミロイド前駆体タンパク質(APP)および選択的に、そのカルボキシ末端のタンパク質分解性産物のレベルを検出する段階であって、非処理細胞と比べてAPPタンパク質および選択的に、そのカルボキシ末端タンパク質分解性産物のレベルの有意な減少を伴わない、1つまたは複数のAPP代謝産物のレベルにおける減少により、化合物が細胞のタンパク質分解性経路を特異的に阻害し、かつ非特異的な細胞毒性がないことが示される、方法。
【請求項４４】
高スループットスクリーニング法である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
捕獲抗体がアミロイド前駆体タンパク質(APP)のカルボキシ末端に対するものである、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
1つまたは複数のAPP代謝産物が、βCTF、αCTF、およびγCTFから選択される、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
1つまたは複数のAPP代謝産物がβCTFである、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
試験化合物で処理された細胞が、初代哺乳類細胞、哺乳類培養細胞株、神経芽細胞腫、ニューロン、単離された脳細胞、アミロイド前駆体タンパク質APPをコードする遺伝子でトランスフェクトされ、コードされたAPP産物を発現する細胞、およびアルツハイマー病の病理生物学を模倣するように遺伝的に修飾された細胞から選択される、請求項43記載の方法。
【請求項４９】
細胞がヒト細胞またはヒト細胞株である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
試験化合物が、合成有機化合物、化学物質、天然の産物、ポリペプチド、またはペプチドから選択される、請求項43記載の方法。
【請求項５１】
検出抗体が異なるフルオロフォアで標識される、請求項43記載の方法。
【請求項５２】
前駆体および代謝産物が、標識された抗体で検出される、請求項1、13、25、35、および43のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
抗体が、フルオロフォア、酵素、化学発光分子、または放射性同位元素で標識される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
請求項1または請求項13記載の方法によって検出される、疾病の進行に関連した代謝経路に関与する代謝産物の生成を特異的に減少する化合物。
【請求項５５】
請求項1または請求項13記載の方法によって検出される、疾病の進行に関連した代謝経路に関与する代謝産物の生成を特異的に増大する化合物。
【請求項５６】
請求項1、請求項13、請求項25、請求項35、または請求項43記載の方法によって検出される、アルツハイマー病に関連したタンパク質分解性代謝経路における代謝産物の生成を特異的に減少する化合物。
【請求項５７】
3-メチルアデニンまたはその機能的に関連した誘導体もしくは類似体である、請求項56記載の化合物。
【請求項５８】
請求項1、請求項13、請求項25、請求項35、または請求項43記載の方法によって検出される、アルツハイマー病に関連したタンパク質分解性代謝経路における代謝産物の生成を特異的に増大する化合物。
【請求項５９】
αCTFである、請求項58記載の化合物。
【請求項６０】
疾病または疾患に関連した経路における細胞代謝産物を特異的に減少または増大し、かつ一般に細胞に有毒でない化合物を検出するためのキットであって、(i)細胞の代謝前駆体タンパク質または(ii)細胞の前駆体タンパク質のコンホメーション状態のレベルを決定するための1つまたは複数の検出可能な試薬を含む容器；ならびに(iii)1つもしくは複数の(i)または(ii)の前駆体タンパク質の代謝産物；および使用のための説明書を含むキット。
【請求項６１】
請求項60記載のキットであって、検出可能な試薬が、代謝前駆体タンパク質に特異的な1つまたは複数の標識されたまたは標識されていない抗体、および1つまたは複数の代謝産物に特異的な標識されたまたは標識されていない抗体を含み；並びに標識されていない特異的な抗体の示差的検出のための1つまたは複数の標識された二次抗体をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載される研究は、国立保健研究所、国立加齢研究所からの助成金番号P01AG17617によって部分的に支援される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、疾病および疾患の治療および／または予防における治療剤として有用な化合物(薬物)の同定および発見に使用するための、細胞に基づいたスクリーニング法、特に高スループットスクリーニング系に適したものに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病の一様な特徴は、小さな、すなわち、約40〜42残基の、脳実質における不溶性のβ-アミロイドプラークとしてのAβペプチドの沈着である。Aβは、主にトランスゴルジ網(TGN)において、および細胞表面において見出される、広く発現されたタイプ1膜貫通タンパク質の約100kDaのアミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解によって生成される(B. De Strooper および W. Annaert, 2000, 「Proteolytic processing and cell biological functions of the amyloid precursor protein.」 J. Cell. Sci., 113(Pt 11)(7): 1857-1870)。β-アミロイド前駆体タンパク質APPは、D.J. Selkoeら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85 (19): 7341-7345; R.E. Tanziら、1988, Nature, 331 (6156): 528-530；およびE. Levyら、1990, Science, 248 (4959): 1124-1126にさらに記載されている。
【０００４】
APPのβ-切断は、管腔／細胞外のドメイン内のAPPで生じ、2種のAPP断片：(i)細胞から分泌される大きな、可溶性のアミノ末端断片(sAPP)、および(ii)細胞と結合したままである膜貫通カルボキシ末端断片(βCTF)を生成する。このβCTFは、全Aβペプチドを含む99アミノ酸を含み、約10kDaの分子量を有する。
【０００５】
別の経路は、β-切断部位から16残基下流のα-切断部位におけるAPPの切断に関係する。β-切断と同様に、α-切断は、細胞から分泌される分泌型APP(sAPP)断片を生成し、αCTF(の84残基および約8kDa)は、膜に結合したままである。α-切断は、Aβペプチド配列内で生じ、このように、所与のAPP分子からのAβの生成を防止する。Aβは、主に40残基において生じる膜内切断(γ-切断)によってβCTFからより小さな範囲に、β-切断部位から42残基下流において生成され、Aβ140またはAβ142を放出する。
【０００６】
最近、β-およびγ-切断の原因である主なプロテアーゼ／プロテアーゼ複合体(すなわち、β-およびγ-セクレターゼ)の同定において多大な進歩があった。第一に、膜貫通アスパルチルプロテアーゼファミリーのメンバーであるBACEプロテアーゼが、Citronおよび同僚らによって同定され(R. Vassarら、1999, Science, 286 (5440): 735-741)、細胞内におけるβ-セクレターゼ活性の多くについて説明されたように思われる。BACEは、エンドソーム−リソソームパターンの分配、並びに酸性の至適pHを有する(R. Vassarら、1999, Science, 286 (5440): 735-741; A. Capellら、2000, J. Biol. Chem., 275 (40): 30849-30854；およびJ. Walterら、2001, J. Biol. Chem. , 276 (18): 14634-14641)。さらに、エンドサイトーシスの系におけるBACEを媒介したAPPの切断は、初期のエンドソームがAβ生成に重要な部位であることをAPPの種々の輸送変異体を介して同定した、従来の研究と一致する(E.H. Koo および S. L. Squazzo 1994, J. Biol. Chem., 269 (26): 17386-17389; R. Perezら、1999, J. Biol. Chem., 274 (27): 18851-18856; S. Sorianoら、1999, J. Biol. Chem., 274 (45): 32295-32300；並びにA.M. Cataldoら、2000, Am. J. Pathol 157 (1): 277-286)。
【０００７】
プレセリニン(PS)タンパク質は、γ-切断において本質的な役割を果たし：家族性ADの発現を引き起こす変異プレセリニンは、残基42で終わるAβの産生を増大する(D.R. Borcheltら、1996, Neuron, 17 (5): 1005-1013; K. Duffら、1996, Nature, 383 (6602): 710-713)。PSヌル表現型は、Aβを生成する細胞の能力がないこと、およびCTF類の細胞内蓄積を含む(J. Shenら、1997, Cell, 89 (4): 629-639)。最近の研究では、PS自体がγ-セクレターゼとして直接関係していたが(M.S. Wolfeら、1999, Nature, 398 (6727): 513-517)、ニカストリンなどのPS複合体内のその他のタンパク質は、多分にγ-切断に直接関与しているのであろう(G. Yuら、2000, Nature, 407 (6800): 48-54)。
【０００８】
BACEおよびPS複合体は、主要なβ-およびγ-セクレターゼであろうが、実質的な実験的研究では、その他のプロテアーゼ、特にリソソームのものが関与していた(R.A. Nixonら、2000, Neurochem. Res., 25 (9-10): 1161-1172；およびP.M. Mathewsら、2002, J. Biol. Chem., 277: 5299-5307)。これらのその他のプロテアーゼの相対的な寄与により、これらがエンドサイトーシス区画に誤って輸送されるために、ADにおいて増加している可能性がある(A.M. Cataldoら、1995, Neuron, 14 (3): 671-680; A.M. Cataldoら、1996, Adv. Exp. Med. Biol., 389: 271-280; A.M. Cataldoら、1997, Neuroscience, 17 (16): 6142-6151.; A.M. Cataldoら、2000, Am. J. Pathol., 157 (1) : 277-286; R.A. Nixonら、2000, Neurochem. Res., 25 (9-10): 1161-1172; O.M. Grbovicら、2001, Society for Neuroscience annual meeting 2001 ；および2000年4月28日に出願されたR.A. Nixonらによる米国特許出願第09/560,124号"Methods for the identification of compounds for the treatment of Alzheimer's disease"; to )。
【０００９】
実質的な努力は、現在、Aβを引き起こす種々のタンパク質分解性事象を阻害する薬物の同定に向けられている。現在のアプローチは、典型的には、精製された酵素を使用するスクリーニングに基づく。これらのアプローチの限界には多種があり、(1)単にインビトロ阻害剤をインビボでの使用に移行することの困難性；(2)本来の仮定がプロテアーゼ標的の同定についてなされること、およびおそらく最も有意には；(3)このようなアプローチは、数ある要因の中で、タンパク質輸送、局所的環境(たとえばpH)、および複雑な酵素相互作用が関連する、細胞の複雑な環境におけるAβの発生に影響を及ぼすであろう化合物を検出しないことを含む。この例には、エストロゲン置換療法がADに対して保護性であろう機構によるものであり：エストロゲンは、非Aβ生成経路に沿ってAPPの細胞内輸送を促進することによって作用すると考えられる(A.B. Jaffeら、1994, J. Biol. Chem., 269 (18): 13065-13068; H. Xuら、1998, Nat. Med., 4 (4): 447-451；およびS. Gandy and S. Petanceska, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1502 (1) : 44-52)。
【００１０】
本発明によって提供されるスクリーニング法は、細胞に基づいたスクリーニングの労働集約的なおよび技術的な限界の多くを克服し、一方では同時に、使用者が、細胞応答の複雑さを利用することを可能にし、現在治療することが困難である疾病および疾患、たとえばAD、パーキンソン病、ハンチントン病、リソソームの貯蔵疾患、プリオン疾患、タウに基づく神経変性疾患(tauopathies)、およびその他の非ADアミロイドーシスの治療に有益であると考えられる。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、疾病および疾患、好ましくは1つまたは複数の代謝産物が代謝前駆体または前駆体類から生成され、かつ経路における1つまたは複数の代謝産物の増加または減少が疾病に関連した、代謝および／またはタンパク質分解経路に関連した疾病および疾患を治療するための新規薬物の同定および発見のための、高スループットスクリーニング解析に特に適した、新規な細胞に基づいたスクリーニング法を提供する。
【００１２】
本発明の細胞に基づいたスクリーニング法は、細胞に基づいた高スループットアッセイスキームにおいて典型的に得られる偽陽性結果の数を劇的に減少する効果を提供する。本発明の使用により、有利には代謝および／またはタンパク質分解経路を特異的に調整する化合物の同定を可能にする。さらに、本発明の方法は、高スループットスクリーニング解析を受けている細胞に対して一般的および非特異的な毒性があり、その他のアッセイでは潜在的な治療剤として誤って同定され得る化合物を同定する能力を提供する。したがって、本発明は、このような化合物が非特異的におよび／または一般的に細胞に対して毒性がある場合に、潜在的な治療剤としての化合物を除去することができる。
【００１３】
本発明の1つの局面は、好ましくは、高スループットスクリーニング系において、検出される偽陽性の数を減少させて、効率的かつ確実なスクリーニング技術を得るために、代謝前駆体タンパク質(たとえば、APP)および対応する代謝産物(たとえば、βCTF)の両方、好ましくは、生物学上意味がある代謝産物のレベルが決定される、多用途の細胞に基づいたスクリーニング法を提供することである。また、本発明によれば、本明細書に記載されたスクリーニング法により、疾病または疾患に関連した経路における前駆体タンパク質の種々のコンホメーション状態のレベルの検出が提供される。このような方法において、代謝前駆体および代謝産物は、たとえば、プリオン病におけるものなどの、それぞれ同じタンパク質の異なるコンホメーション状態であり得る。もう一つの例として、前駆体タンパク質は、リン酸化されていないこともでき、かつ代謝産物は、前駆体タンパク質のリン酸化された形態である。
【００１４】
このようなスクリーニング技術は、代謝前駆体タンパク質(たとえば、APP)による細胞のプロセシング事象(たとえば、β-セクレターゼ切断)を最終的に調整、たとえば減少または阻害または増加または増大し、これによりアルツハイマー病などの疾病の進行に関与する1つまたは複数の代謝産物の生成に影響を与える化合物の同定を可能にする。
【００１５】
本発明の特定の局面は、アルツハイマー病の治療、治療法、および／または予防のための薬物および新規薬物を見出すまたは同定するために、好ましくは高スループットスクリーニング技術と連動して、β-切断阻害剤のための特異的かつ高感度なアッセイ／検出系を提供することである。本スクリーニング法は、本発明に従って、アルツハイマー病の治療のためのおよび／またはアルツハイマー病に関する疾病および症状の治療、たとえばβ-アミロイド関連疾患のための薬物開発に使用することができる、Aβの発症に重要なタンパク質分解事象の阻害剤の検出を可能にする。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの局面は、アミロイド前駆体タンパク質APPの、細胞に結合したタンパク質分解または切断代謝産物を検出するために、好ましくは高スループットスクリーニング技術と連動して、非常に感受性があり、かつ特異的な新規免疫アッセイ法、すなわち、ELISAを提供することである。本発明によれば、1つの新規ELISAにより、経路に沿って、APPのタンパク質分解性プロセシングから生じる小ペプチドのAβに産生され、およびアルツハイマー病の発生の中心であると考えられる、鍵となるペプチド断片のβCTFの特異的な検出が可能となる。本発明に従った第二の新規ELISAにより、APPホロタンパク質および既知の全てのAPP CTF類(すなわち、αCTF、βCTF、およびγCTF)の検出が可能となる。これらのELISAは、APPのβ-セクレターゼ切断を阻害するであろう化合物を処理した生細胞のAβ産生経路に沿ったAPPの代謝を決定するための強力な手段として、組み合わせて使用することもできる。
【００１７】
本発明のさらなる局面、特徴、および利点は、添付の図／図面と共に考慮して発明の詳細な説明を読むことにより、より良く認識される。
【００１８】
発明の説明
本発明は、好ましくはその代謝前駆体から生じる代謝産物もしくは産物の生成を調整する、または影響を及ぼす薬物に化合物または薬物のための試験を受けている細胞における、代謝前駆体およびその生物学的に関連した代謝産物または産物の両者のレベルを決定するための、効率的かつ経済的である、感受性がありかつ特異的なスクリーニング法／系を記載する。調整するとは、分子の生理活性を変化させること、すなわち、減少させる(すなわち、減少し、阻害し、もしくは遮断する)、または増加させる(すなわち、活性化し、増大し、もしくは増強する)ことを意味する。本明細書において使用されるものとして、化合物は、生物学的薬物もしくは生理活性薬物、または薬物、または物質、または成分、または生体分子、たとえば、さらに本明細書に記載したものをいう。実例として、標的分子の機能もしくは活性または疾病もしくは疾患に関連した代謝的なまたはタンパク質分解性のプロセスは、たとえば、減少され、低下され、もしくは阻害され；または、増加され、増強され、もしくは増大されることによって調整される。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、標的分子または代謝的もしくはタンパク質分解性のプロセスの機能または活性は、減少され、低下され、または阻害される。好ましくは、本発明のスクリーニング法／系は、高スループットスクリーニング法を使用して行われ、より好ましくは、細胞に基づき、したがって、検出可能およびアッセイ可能な代謝前駆体(たとえば、タンパク質)、並びにこれに関連したその代謝産物(たとえば、タンパク質のタンパク質分解性断片)を有する種々の疾病および疾患のための多くの薬物発見スキームに対する適応性を提供する。
【００２０】
より詳細には、特にアルツハイマー病のための治療および治療法に関して、本発明は、効率的かつ経済的な方法で、細胞によって生成されるAβ産物の量を最終的に減少する治療薬、化合物、または薬物を同定する方法および手順を提供する。上述したように、Aβペプチドは、アルツハイマー病の衰弱効果の一部としての脳実質における不溶性のβ-アミロイドプラークを形成する。本方法は、アルツハイマー病の新たな治療および／または予防の決定および利用を可能にする。また、本発明の方法は、たとえば、代謝産物の産生を減少することによって影響を与える、タンパク質分解性もしくは代謝的な経路またはその他の細胞の事象を調整する分子のスクリーニングおよび決定を可能にする。したがって、本発明の細胞に基づいた方法は、有利には、タンパク質、たとえばタンパク質分解性酵素と、その標的、たとえば基質、たとえばβ-セクレターゼおよびAPPとの相互作用を阻止する細胞プロセスを調整する化合物または生理活性薬物を同定するために使用することができる。
【００２１】
生細胞における高スループット薬物スクリーニングでは、特に活性の減少をアッセイするときに、圧倒的な数の偽陽性ヒットを生じることが多い。これは、試験を行う多くの化合物および薬物が単に毒性があり、往々にして非特異的な毒性が標的の活性を減少させるという理由のためである。この理由のため、所望の結果が特定の細胞活性の減少であるときは、生細胞の高スループットスクリーニングは、まず行われない。特に本明細書において記載したとおり、細胞によるAβ生成を減少する化合物(D.J. Selkoe, 1999, Nature, 399 (6738 Suppl): A23-31; D.J. Selkoe, 2001, Physiol. Rev., 81 (2): 741-66)および／または脳におけるAβ蓄積を減少する化合物(C. Janusら、2000, Nature, 408 (6815): 979-82; D. Morganら、2000, Nature, 408 (6815): 982-985)は、治療的価値を有していそうであるので、これがアルツハイマー病薬物発見に対する難しいハードルである。
【００２２】
本発明に従って、新規なスクリーニング法、好ましくは細胞に基づいた方法であって、非特異的な毒性による偽陽性ヒットを排除でき、一方で種々の疾病状態に関連または連結した産物の経路において、たとえばアルツハイマー病に関連したAβ生成の経路に沿って生成される、特に有益な細胞の代謝産物を検出することができる方法が開発された。疾病状態に関連し、おそらく疾病状態の原因であり、および／または疾病状態を悪化させる、代謝経路において機能的に作用している分子を標的とする化合物を同定するために、細胞毒性に関連した偽陽性を克服することにより、高スループットの細胞に基づいたスクリーニングを実用的な、経済的な、かつ魅力のあるアプローチにする。
【００２３】
実際に、一旦化合物が細胞に基づいた系において有効であると同定されたならば、たとえば精製された酵素、または同様の、より複雑ではないインビトロ系を使用して同定された化合物またはその他の分子のものよりも大きな、インビボにおける有効性および臨床実務への移行の確率を有する。
【００２４】
本発明の好ましい態様は、アミロイド前駆体タンパク質β-セクレターゼ、たとえば膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼBACE(R. Vassarら、1999, Science, 286 (5440): 735-741)などの、標的タンパク質分解酵素の修飾因子またはエフェクター、好ましくはアンタゴニストまたは阻害剤をスクリーニングするために特異的にデザインされた、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)に基づいた方法およびアプローチである。本発明に従った方法は、アミロイド前駆体タンパク質APPおよびその切断断片(代謝産物)、すなわち、αCTF、βCTF、およびγCTFを単独で、または組み合わせて検出することを含む。
【００２５】
本発明に係る方法は、関心対象の代謝前駆体のレベルおよび代謝産物のレベルの両者を細胞系内で決定するために、一般に適用することができる。これらの方法により、タンパク質分解性経路を含む代謝プロセスまたは経路に関与する前駆体および分解分子に影響を及ぼす(たとえば、代謝前駆体からの代謝産物の生成を阻害する、またはたとえば、前駆体もしくはタンパク質の産生もしくは分泌を増大する)修飾因子、たとえば阻害剤、遮断薬、もしくはアンタゴニスト；またはアゴニストもしくは活性化因子を同定することができる。
【００２６】
アルツハイマー病治療のためのスクリーニング法を提供することに加えて、特に本明細書において例示したとおり、本発明は、その他の多くの疾病および疾患に関連した代謝産物およびそれらの前駆体の細胞環境においてスクリーニングするための方法を提供する。このような疾病および疾患の非限定的な例には、アミロイドまたは異常に蓄積された産物を生成する酵素の系が標的とされる、リソソーム貯蔵疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、ニューロンのセロイド・リポフスチノーシス、タウに基づく神経変性疾患(tauopathies)、および非ADアミロイドーシス(たとえば、封入体筋炎)、並びにアッセイ可能な代謝分解タンパク質もしくはペプチド産物、または前駆体ポリペプチドから誘導される代謝産物の生成があるその他の症状を含む。更なる例には、プリオン病などの、ユニークなコンホメーション状態のタンパク質が蓄積する疾病を含む。
【００２７】
このような疾患において、および本発明の目的のために、正常な、非病理学的なコンホメーションが前駆体であり、一方、有毒なオリゴマーのペプチドを含み得る異常なコンホメーション状態が代謝産物であり、特異的かつ検出可能な抗体などの適切かつ特異的なプローブを使用して、両者をアッセイすることができる。代謝産物と前駆体の関連性には、リン酸化などのその他の翻訳後修飾を含むことができる。ここで、前駆体タンパク質基質および翻訳後修飾されたポリペプチドは両方とも、たとえばタウ症(tauopathies)によされ示したようにアッセイすることができる。さらに、本発明の代謝産物は、タンパク質またはペプチド複合体(たとえば、二量体、三量体、多量体)、オリゴマー、ポリマー、オリゴマー集団、またはたとえば原繊維(protofibrillar)および小繊維分子もしくは巨大分子、たとえばAβ、または巨大分子複合体などの2つ以上のペプチドもしくはタンパク質の結合により生じる分子を含むβシートまたはその他の配置のタンパク質もしくはペプチド集合を含む。好ましくは、代謝産物または一つもしくは複数のその部分は、抗原性であり、抗体によって検出可能である。
【００２８】
好ましい態様において、細胞に結合したAPPのタンパク質分解性または切断代謝産物を検出するための非常に感受性があり、かつ特異的な新規のELISA、たとえばサンドイッチELISAが、特に高スループットスクリーニング方法論に関して開発され、本明細書に記載されている。多くの最近の研究は、ADの発病において中心的であると思われるAPPのタンパク質分解性プロセシング(これにより、小ペプチドAβが生じる)を修飾することに向けられている。本明細書に記載されたELISAのうちの1つは、Aβ-βCTF経路に沿って生成される重要なペプチド断片を特異的に検出することができる。第二のELISAでは、APPホロタンパク質、および選択的に、全ての既知のAPP CTF類(すなわち、αCTF、βCTF、およびγCTF)を検出することができる。合わせると、これらのELISAは、APPのβ-セクレターゼ切断を阻害する可能性のある化合物で処理した生細胞において、Aβ生成経路に沿ってAPPの代謝を決定するための強力な手段である。
【００２９】
さらにサンドイッチELISAを単一の系、好ましくは高スループット系と組み合わせることにより、細胞に対して毒性のある化合物を、重要なAPPタンパク質分解工程を特異的に減少するものから迅速に区別することができる。毒性の薬物および化合物は、細胞増殖の減少、細胞生存率の減少、タンパク質生合成毒としての作用、または細胞の代謝を全体的に損なわせるその他の方法などの機構により、APPホロタンパク質、並びに細胞に基づいたスクリーニングにおいて検出されるCTF切断産物のレベルを減少する可能性がある。このような毒性作用は、APP／全CTF ELISAにおいて、シグナルの減少によって検出されるであろう。
【００３０】
しかし、βCTF生成を特異的に減少する化合物およびβCTF ELISAシグナルのみの減少を示す化合物は、APP／全CTF ELISAからのシグナルを減少させる可能性はない。したがって、高スループットスクリーニングでは、非処理の細胞からのシグナルと比較して、化合物での処理によって生じるβCTF ELISAシグナルの減少を容易に基礎付けることができるが、同じ化合物での処理では、非処理の細胞と比較して、APP／全CTF ELISAシグナルに変化を示さない。したがって、βCTF生成を特異的に減少させる化合物は、βCTF ELISAにおいてβCTFレベルの減少を示し、APP／全CTF ELISAのレベルの有意な減少を示さないと考えられる。対照的に、一般的に毒性の化合物は、ELISAに基づいたアッセイ法においてシグナルの減少によって検出されるものとして、βCTF ELISAレベルおよびAPP／全CTF ELISAレベルの両者を低下させる可能性がある。したがって、本発明に従った方法により、当業者は、非特異的な細胞毒性、または一般的な細胞毒性のある化合物から、β-切断特異的な阻害剤化合物を区別することができる。
【００３１】
高スループットスクリーニングにおけるさらなる利益は、経時的なアッセイ法において上記2つのELISAを重ね合わせることであり、これにより、並列に96ウェルマイクロタイタープレート(たとえば、図9A〜9Dおよびその記載を参照されたい)を使用する必要がなくなる。このようなプロトコルにより、1つまたは複数の標的前駆体タンパク質および1つまたは複数の標的代謝産物に対して特異的な抗体を使用して、アッセイ細胞が培養されている同じウェルにおいて、本方法を実施することができる。本明細書に記載された特定のELISAが、細胞を培養している単一のウェルを使用してうまく行われるのは、一部はC1/6.1およびC2/7.1モノクローナル抗体によって検出されるユニークな細胞内APPエピトープのためである。APPおよび代謝産物などの前駆体タンパク質を含む特定のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の産生およびスクリーニングは、当業者には周知である。さらに、必要なプレートおよび行われるアッセイの数を減少させることにより、明らかに費用的利益を有し、かつそれぞれの測定が同じウェル内で行われる対照測定を有するので、アッセイの信頼性が高まる。
【００３２】
本発明の細胞に基づいた方法を行う際に、修飾因子、好ましくはアンタゴニストまたは阻害剤化合物を同定するために、試験化合物による試験および処理を受けている細胞は、ヒト細胞もしくは細胞株を含む培養されたか、または確立された哺乳類細胞もしくは細胞株、神経細胞、ニューロン、神経芽腫細胞、アミロイド前駆体タンパク質(APP)をコードする遺伝子でトランスフェクトされ、APPを発現する細胞、アルツハイマー病発病に関連したタンパク質(たとえば、プレセニリン(R. Sherringtonら、1995, Nature, 375 (6534): 754-760)をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞、およびrab5過剰発現(O. M. Grbovicら、2001, Society for Neuroscience, annual meeting 2001)などの、アルツハイマー病発病の側面を模倣するように遺伝的に改変された細胞を含みうるが、これらに限定されない。
【００３３】
アルツハイマー病発病の側面を模倣するように遺伝的に改変された細胞のさらなる例は、2000年4月28日に出願されたR.A.Nixonらによる特許出願の米国出願番号第09/560124号「アルツハイマー病の治療のための化合物の同定のための方法」；Alzheimer's Disease:Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics (Iqbal K, Sisodia SS, Winblad B, editors), John Wiley & Sons, Ltd. , Chichester, UK, 461-467；および P.M. Mathewsら、2002, J. Biol. Chem., 277: 5299-5307)に記載されたものを含むが、これらに限定されない。適切な細胞は、脊椎動物、好ましくはヒトを含む哺乳類、脳組織から単離された初代細胞、たとえば、またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection：ATCC)、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209から入手可能なものなどの、確立された細胞株、および／またはトランスフェクトされたか、もしくは形質転換された細胞培養であってもよい。
【００３４】
本発明のスクリーニング法において使用される試験化合物は、本明細書に記載されたものであり、たとえば、合成有機化合物、化学物質、天然物、ポリペプチド、およびペプチド含むがこれらに限定されない。
【００３５】
さらに、本発明のスクリーニング法は、阻害剤化合物、特に、アルツハイマー病に関連したAβの生成において重要なタンパク質分解性事象の阻害剤の、効率的な細胞に基づいたスクリーニングを可能にする。本発明のスクリーニング法および検出法は、APP代謝産物のβCTFのレベルを特異的に減少し、ADの進行に関連した代謝経路に関与する、化合物3-メチルアデニン(3MA)を使用する非限定の方法において示されている(実施例6および図10A〜10Dを参照されたい)。
【００３６】
さらに、本発明の代謝前駆体および生物学上意味がある代謝産物の両方のレベルが両方とも決定される方法は、その他の細胞に基づいたアッセイ法のための高スループットスクリーンに適応性を有する。実例として、本発明は、対となったらせんフィラメントの異常な蓄積に関連するタウのホスホ-エピトープの特異的な減少または増加をスクリーニングするための方法を想定する。たとえば、このような条件において、代謝前駆体は、タウであり、生物学上意味がある代謝産物は、特異的にリン酸化された形態のタウ(すなわちホスホ-タウ)である。
【００３７】
さらに、タンパク質またはペプチド、たとえばAPP前駆体または1つもしくは複数の特定の代謝産物、たとえば分泌されたAPPの増大を可能にする化合物の検出は、有益であろう。たとえば、分泌されたAPPは、神経保護効果を有しているかもしれない。さらに、αCTFの生成は、Aβ生成を妨げ、したがって防護効果を有し得る。
【００３８】
したがって、その局面の1つにおいて、本発明は、疾病または疾患に関連した1つまたは複数の細胞の代謝産物の生成を調整する(すなわち、(i)減少する、阻害する、低下する、もしくは阻害する；または(ii)増加する、増強する、または増大させる)化合物を、非特異的細胞毒性を引き起こさずに同定するための、細胞に基づいたスクリーニングまたは検出方法を包含する。本方法は、試験化合物と細胞を接触させることと；細胞の前駆体タンパク質のレベル、または細胞のタンパク質の前駆体コンホメーション状態のレベルを決定することと；次いで細胞の前駆体タンパク質から生成される代謝産物のレベルを決定することとを含む。代謝産物は、前駆体タンパク質の分解産物または切断産物であることもでき、または、これは修飾された形態の前駆体ポリペプチドの状態、たとえば翻訳後修飾されたポリペプチドであることもできる。本方法によれば、細胞における代謝産物のレベルを特異的に減少させるまたは阻害する試験化合物は、非処理の細胞と比較して代謝産物のレベルのみの減少を示し、非特異的な細胞毒性のある試験化合物は、細胞の前駆体タンパク質、並びに選択的に、その関連した切断産物および代謝産物のレベルの両方の減少を示す。
【００３９】
そのもう一つの局面において、本発明は、疾病もしくは疾患を発症する可能性の減少または重篤度の減少と関連した1つもしくは複数の細胞の代謝産物の生成を増大または増強する化合物を、非特異的な細胞毒性を引き起こさずに同定するための、細胞に基づいたスクリーニング法および検出法を包含する。これらの方法は、試験化合物と細胞を接触させることと；細胞の前駆体タンパク質のレベルまたは細胞のタンパク質の前駆体コンホメーション状態のレベルを決定することと；次いで、細胞の前駆体タンパク質から生成される代謝産物のレベルを決定することとを含む。代謝産物は、上記の通りである。この方法に従って、細胞における代謝産物のレベルを特異的に増大するまたは増強する化合物は、非処理の細胞と比較して、代謝産物のレベルの増加を示すが、有意に前駆体のレベルを変化させない。
【００４０】
したがって、本発明は、多くの薬物の同定および発見スキームに、好ましくは高スループットスクリーニング型式における用途に適している幅広い細胞に基づいたスクリーニングアプローチを提供する。自動化された高スループットスクリーニングは、たとえばBurbaumら、1997, Current Opinion in Chemical Biology, 1: 72-78 ；およびSchullekら、1997, Analyt. Biochem., 246: 20-29に記載されている。限定されない例として、本発明に従った高スループットスクリーニングにおいて、液体を取り扱う操作は、Microlab 2000(商標)ピペット操作台(たとえば、Hamilton Instruments)によって行うことができる。スクリーニングに必要とされるその他の設備(たとえば、インキュベーター、プレート洗浄器、プレートリーダー)は、自動化機能に適しているか、または必要に応じて、自動化モジュールとして商業的に購入することもできる。アッセイを介した試料の移動は、ロボット、たとえばXP(商標)3m長トラックを搭載するロボット(Zymark, Hopkinton, MA)によって行うことができる。
【００４１】
本発明に係るスクリーニング方法を介して、合成有機化合物、天然物、ペプチド、およびオリゴヌクレオチドのライブラリーを、これらが疾患プロセスを反映するか、または寄与する特定の標的代謝タンパク質およびこれらの産物(たとえば、切断産物)を調整する能力について評価すことができる。特に、化合物が、疾病または疾患に関連した代謝経路において標的とされる成分、たとえば前駆体のプロセシングに関与する代謝前駆体またはタンパク質分解性酵素であることを同定することができる。たとえば、疾患を引き起こすか、もしくは悪化させ得る、生じた細胞の代謝産物への変換または蓄積を防止するために、化合物が、APPに対するβ-セクレターゼのタンパク質分解活性を特異的に阻害することを検出または同定することができる。
【００４２】
さらにもう一つのその局面において、本発明は、活性化合物または本明細書に記載された方法の実施において試験され、同定され、もしくは検出された化合物を包含する。非限定的に、本発明の方法(実施例6)において有効性を示す代表的な化合物は、3-メチルアデニン(3MA)およびその関連した誘導体、類似体、または修飾された形態であり、好ましくはその機能または活性を変化しないものである。
【００４３】
活性化合物は、必要に応じて医薬品化学を経て最適化することができる。まず最初に、たとえばファルマコフォア(類)は、現代の計算機化学的手段を使用して定義することができ、これは、高スループットスクリーンにおいて活性があることが見出された構造を表す。一旦コンセンサスファルマコフォアが同定されると、構造活性の相関を探索するために、集中した化合物のコンビナトリアル・ライブラリーをデザインすることができる。最後に、効力および効率などのリード構造のセットの生物薬物学的性質は、臨床試験のための適切な化合物を同定するために改善することができる。
【００４４】
したがって、本発明は、疾病もしくは疾病の増強を引き起こす産物の産生または増強の原因となる細胞内前駆体産物の活性により生じる疾病および症状を治療するための治療的な方法に利用することができる化合物を同定するための新規の細胞に基づいた方法を提供する。
【００４５】
抗体および抗体産生
抗体という用語は、エピトープに結合することまたは抗原性を決定することができる、無処理の分子並びにFab、F(ab')2、Fvなどのその断片を指す。代謝タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、たとえばAPPに結合する抗体は、無処理のポリペプチドまたは関心対象の小ペプチドを含む断片もしくは免疫抗原として使用するために組換えで調製された断片を使用して調製することができる。(表1、実施例1を参照されたい)。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳に由来するか、または化学的に合成することができ、必要に応じてキャリアータンパク質との複合体とすることもできる。化学的にペプチドに連結する、共通して使用されるキャリアは、ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、およびサイログロブリンを含む。次いで、結合したペプチドを、動物を免疫にするために使用する(たとえば、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、またはウサギ)。
【００４６】
「ヒト化された」抗体という用語は、たとえば、限定されない例であるが、C. L. Queenらにより米国特許第5,585,089号に記載されたような、ヒト抗体により近く似せるために、非抗原結合領域、たとえば相補性決定領域(CDR)のアミノ酸が置換されているが、元の結合能力を保持する抗体分子をいう。トランスジェニックにより、または組換えにより産生されたものなどの完全にヒト化された抗体も、本明細書に包含される。
【００４７】
「抗原性決定基」というの用語は、特定の抗体と接触する分子の一部分(すなわちエピトープ)を指す。宿主動物を免疫するためにタンパク質またはタンパク質の断片を使用するときは、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導する可能性があり；これらの領域または構造は、抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体に対する結合において、無処理の抗原(すなわち、免疫応答を誘発するために使用した免疫原)と競合するであろう。
【００４８】
「特異的な結合」または「特異的に結合」という用語は、タンパク質またはペプチドとアゴニスト、アンタゴニスト、または抗体などの結合分子との間の相互作用を指す。相互作用は、結合分子によって認識されるタンパク質の特定の構造(たとえば、抗原決定基もしくはエピトープ、または構造決定基)の存在に依存する。たとえば、抗体がエピトープ「A」に特異的な場合、標識された「A」を含む反応中にエピトープA(またはフリーの、標識されていないA)を含むタンパク質および抗体が存在することにより、抗体に結合する標識されたAの量が減少すると考えられる。
【００４９】
代謝前駆体ポリペプチド、たとえばAPPまたは代謝産物、たとえばβCTFもしくはAβ、またはその免疫原性ペプチド断片に特異的な抗体は、当該技術分野において既知であり、従来法で実施されている方法を使用して生成させることができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーによって産生される断片を含んでもよいが、これらに限定されない。中和抗体、(すなわち、2量体形成を阻害するもの)は、特に治療的な使用のために好ましい。
【００５０】
抗体を作成するために、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主を、適切なポリペプチドまたはその免疫原性を有するペプチド断片もしくはオリゴペプチドのいずれかを注射することによって免疫することができる。宿主種に依存して、免疫応答を増大させるために種々のアジュバントを使用してもよい。適切なアジュバントの非限定の例は、フロイント(不完全な)のもの、水酸化アルミニウムまたはシリカなどのミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、KLH、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質を含む。ヒトにおいて典型的に使用されるアジュバントは、BCG(Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvumn)を含む。
【００５１】
好ましくは、ポリペプチドに対する抗体を誘導するために使用されるペプチド、断片、またはオリゴペプチド(すなわち免疫原)は、少なくとも5アミノ酸、およびより好ましくは、少なくとも6〜10アミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。また、免疫原は、天然のタンパク質の一部のアミノ酸配列と同一であることが好ましく；これらは、小さな天然に存在する分子の全てのアミノ酸配列を含んでもよい。ペプチド、断片、またはオリゴペプチドは、単一のエピトープもしくは抗原決定基または多数のエピトープを含んでいてもよい。タンパク質またはペプチドを含む短いひと続きのアミノ酸は、KLHなどの別のタンパク質に融合することができ、この場合には、抗体はキメラ分子に対して産生される得る。
【００５２】
代謝前駆体タンパク質および代謝産物ポリペプチド、ペプチド、またはその免疫原の断片に対するモノクローナル抗体は、培養において、継続的な細胞株による特異的な抗体分子の産生を提供するどのような技術を使用して調製されてもよい。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない(G. Kohlerら、1975, Nature, 256: 495-497; D. Kozborら、1985, J. Immunol.  Methods, 81: 31-42; R. J. Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030；およびS. P. Coleら、1984, Mol. CellBiol., 62: 109-120)。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングは、当該技術分野において周知で、かつルーチンで使用される。
【００５３】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして、適切な抗原特異性および生物学的活性を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術を使用することもできる(S. L. Morrisonら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 ; M. S. Neubergerら、1984, Nature, 312: 604-608；およびS. Takedaら、1985, Nature, 314: 452-454)。または、当該技術分野において既知の方法を使用する、単鎖抗体を産生するために記載された技術を、特定のタンパク質またはペプチドに特異的な単鎖抗体を産生するために適応してもよい。関連した特異性を有するが、異なったイディオタイプの組成物の抗体は、ランダム・コンビナトリアル・免疫グロブリンライブラリーから鎖シャッフリングによって生成されてもよい(D. R. Burton, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11120-3)。また、抗体は、リンパ性の細胞群においてインビボでの産生を誘導することによって、または非常に特異的な結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリーまたはパネルを、文献に開示されたようにスクリーニングすることによって産生されてもよい(R. Orlandiら、1989, Proc. Natl.  Acad. Sci. USA, 86: 3833-3837 and G. Winterら、1991, Nature, 349: 293299)。
【００５４】
また、所与のタンパク質またはペプチドに特異的な結合部位を含む抗体断片を、作製してもよい。たとえば、このような断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成させることができるF(ab')2断片およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成させることができるFab断片を含むが、これらに限定されない。または、Fab発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片(W. D. Huseら、1989, Science, 254.1275-1281)による迅速かつ容易な同定を可能にしてもよい。
【００５５】
種々の免疫アッセイ法を、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに使用することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する競合的結合アッセイ法または免疫放射定量アッセイ法のための多数のプロトコルは、当該技術分野において周知である。このような免疫アッセイ法は、典型的には、特定のタンパク質またはポリペプチドとその特異抗体との間の複合体の形成を測定することを含む。
【００５６】
スクリーニング法
タンパク質またはペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、タンパク質およびペプチドを検出し、かつ測定するための様々なプロトコルは、当該技術分野において既知であり、実施されている。例には、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、放射免疫アッセイ法(RIA)、および蛍光標示式細胞分取器(FACS)を含む。競合的結合アッセイ法ができるので、ポリペプチド上の2つの干渉しないエピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する、2つの部位のモノクローナルに基づいた免疫アッセイ法を使用することができる。これらのおよびまた他のアッセイ法は、R. Hamptonら、1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN and D. E. Maddoxら、1983 ; J. Exp. Med. , 158: 1211-1216の刊行物によって示されるように、従来技術に記載されている。
【００５７】
本明細書に記載された新規の細胞に基づいたスクリーニングアッセイ法は、代謝前駆体の機能または生理活性を調整する、好ましくは減少する、または阻害する候補物質生理活性剤または薬物を同定するために使用することができる。この方法では、たとえば標的前駆体タンパク質(たとえば、タンパク質分解性酵素)を収容している細胞を死滅させるか、または増殖を停止することができるように、タンパク質分解による分解産物の産生によって特徴づけられる疾病および疾患の治療に使用するために、薬物を同定することができる。
【００５８】
一般に、スクリーニング法を行う際に、単離された試料を受ける領域を有する不溶性の支持体(たとえばマイクロタイタープレート、アレイ、その他)に、細胞または特定の代謝経路に関与するポリペプチドまたはペプチド類でさえも、拡散されないように結合することができる。適切な不溶性の支持体の条件は、これらが、細胞またはポリペプチドを結合することができるどのような組成物で作製されることもでき；これらが、容易に可溶性物質から分離され；および、これらが、他の全ての点でスクリーニング方法の全体にわたって適合性を有することである。このような支持体の表面は、固体または多孔質であってもよく、任意の便利な大きさまたは形であってもよい。適切な不溶性の支持体の例は、マイクロタイタープレート、アレイ、膜、およびビーズを含む。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック(たとえばポリスチレン)、多糖、ナイロン、またはニトロセルロースでできている。
【００５９】
マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量の試薬および試料を使用して多数のアッセイを同時に実行することができるので、特に便利である。ポリペプチドを結合する詳細な方法は、本発明の試薬および全体的な方法に適合性を有し、ペプチドの細胞生存率をまたは活性を維持し、かつ拡散されない限り重要ではない。
【００６０】
好ましい結合の方法は、抗体、「粘着質」に対する直接の結合、またはイオン支持、化学的架橋、その他の使用を含む。細胞またはポリペプチドの結合後、過剰な未結合物質を洗浄することによって除去する。次いで、試料を受ける領域を、必要に応じて、たとえばウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、またはその他の無害な／非反応性のタンパク質とインキュベーションすることにより遮断してもよい。
【００６１】
候補生物活性剤または薬物をアッセイに添加する。新規の結合剤は、特異抗体、化学物質ライブラリーのスクリーニングで同定された非天然の結合剤、ペプチド類似体、その他を含むことができる。ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬物のスクリーニングアッセイに、特に興味が持たれる；しかし、本発明によれば通常は細胞に対して毒性のある薬物を、本明細書に記載したとおりの細胞に基づいた方法において効率よくアッセイすることができる。
【００６２】
ELISA免疫アッセイ法は、本発明の適切な薬物または生理活性薬物を同定するために好ましい。さらに、標識されたインビトロにおけるタンパク質タンパク質結合アッセイ法、電気泳動易動度変化アッセイ法、タンパク質結合のためのその他の免役アッセイ法などを含むその他のアッセイ法も、この目的に使用することができる。本明細書において使用されるものとして、「剤」の用語は、代謝前駆体ポリペプチドなどの標的分子の活性および機能を直接的または間接的に変化させる能力を有する、たとえばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、ポリヌクレオチド、その他のあらゆる分子をいう。通常、種々の濃度に対して異なった反応を得るために、複数のアッセイ混合液を種々の薬物濃度で並列して実施する。典型的には、これらの濃度のうちの1つは、ネガティブ対照として、すなわちゼロ濃度でまたは検出レベル以下で行う。
【００６３】
候補物質、化合物、薬物などは、典型的には、これらが有機分子、好ましくは、限定されない例として、100以上で約10,000ダルトン未満、好ましくは約2000〜5000ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物であるにもかかわらず、多くの化学物の分類を包含する。候補薬物は、タンパク質と構造上の相互作用、特に水素結合形成のために必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは機能の化学基のうちの少なくとも2つを含む。候補薬物は、多くの場合、上記の官能基の一つまたは複数で置換された、環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。また、候補薬物は、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組み合わせを含む生体分子の中で見出される。
【００６４】
候補となる生物活性剤、化合物、薬物、生体分子などは、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な供与源から得られる。たとえば、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムかつ定方向合成のために、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む多くの手段を利用できる。または、細菌の、真菌の、植物の、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能である、または容易に作製される。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を介して容易に修飾される。既知の薬理学的薬物は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化(amidification)して構造類似体を産生するなどの、定方向のまたはランダムな化学的処理を行ってもよい。
【００６５】
様々なその他の試薬を、本発明に従ったスクリーニングアッセイ法に含めてもよい。このような試薬は、塩、中性タンパク質、たとえばアルブミン、界面活性剤、その他を含み(これらに限定されない)、これらを最適なタンパク質-タンパク質結合を容易にするために、および／または非特異的またはバックグランドの相互作用を減少するために使用してもよい。さらに、プロテアーゼ阻害剤、抗菌因子、その他などの別な方法でアッセイ法の効率を改善する試薬を使用してもよい。さらに、本方法における成分の混合液は、どのような順序で添加して要求される結合を提供しもよい。
【００６６】
キットは、本発明の一態様として含まれ、試験化合物をスクリーニングするために必要な試薬を有する容器を含む。試験のデザインおよびスクリーニングされる化合物のタイプに依存して、このようなキットは、代謝前駆体ポリペプチドもしくはペプチドに対する抗体および／または代謝産物の標識されまたは標識されていないものに対する抗体、およびアッセイ法を行うための説明書を含む。
【００６７】
実施例
以下の実施例は、本発明を例示する特定の本発明の態様を記載し、当業者に本方法の記載を提供する。本実施例は、本発明およびその種々の局面の理解および実施に有用な特定の方法論を単に提供するだけであるので、本実施例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００６８】
実施例1
細胞株、cDNA構築物、およびトランスフェクション  Ltk細胞(マウスの繊維芽細胞様細胞株；(S. Kitら、1967, J. Virol., 1 (1) : 238-240)を、10%のウシ胎児血清(Gemini, Woodland, CA)、2mMのグルタマックスI(glutamaxI)(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)、およびペニシリン／ストレプトマイシン(Cellgro)を含むように補った高グルコースDMEM(Cellgro, Herndon, VA)において、37℃および5%のCO2で維持した。ヒトAPP695をコードするcDNAおよびヒトrab5を、哺乳類発現ベクターpcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, CA)に挿入した。リポフェクチンを使用するトランスフェクション(製造業者のプロトコル；Gibco/BRLL)に続いて、APP695を過剰発現する安定L細胞株を400μg/mlのG418(Gemini)中で選択して、発現をスクリーニングした。一過性のrab5のトランスフェクションは、製造者のプロトコルに従って、リポフェクトアミン(lipofectAMINE)(Gibco/BRL)またはフュージーン(fugene)(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)を使用して行った。
【００６９】
抗体  表1は、本発明に係る方法に使用したモノクローナル抗体を記載する。
（表１）  モノクローナル抗体
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【００７０】
表1は、免疫化に使用した免疫原ペプチドに基づくモノクローナル抗体および既知のエピトープの特異性、並びにさらなる合成ペプチドに対するELISAによる抗体の結合を示す。さらに、種々のAPPタンパク質分解種に対するこれらの抗体の結合を、本明細書に記載してある。Aβに対するJRF/AN/25およびJRF/Aβtot/17の特異性およびAβサンドイッチELISAにおけるこれらの2つのモノクローナル抗体の使用は、(C. Janusら、2000, Nature, 408 (6815): 979-982; S. D. Schmidtら、2001, Society for Neuroscience, annual meeting 2001)に記載されたとおりである。
【００７１】
C1/6.1抗体は、APP(APP695の残基676〜695)(配列番号：2)の保存されたカルボキシ末端の20残基に対して生じさせ、免疫ラベリング、免疫沈降、およびウエスタンブロット解析に有用である(C. Janusら、2000, Nature, 408 (6815): 979-982も参照されたい)。C2/7.1抗体は、APP695の残基644〜676(配列番号：3)に対して生じさせ、また、免疫ラベリング、免疫沈降、およびウエスタンブロット解析に有用である。JRF/AN/25は、ヒトAβの1〜7残基を包含する合成ペプチドに対して生じさせた。JRF/AN/25は、Aβの残基1におけるβ-切断を必要とするという多彩な証拠を本明細書に示してある。その他の抗体、これらの特異性、およびサンドイッチELISAにおけるこれらの使用は、(C. Janusら、Id.)に記載されたとおりである。
【００７２】
サンドイッチENLISA  表1に示した抗体を使用するサンドイッチELISAは、細胞に結合したAPP代謝産物を検出するために修飾し、本質的に報告されたとおりに行った(C. Janus et al. Id. ; R. Rozmahelら、Neurobiology of Aging, 23: 187-194；およびP. M. Mathewsら、2002, J. Biol. Chem., 277: 5299-5307)。ヌンク-イムノプレートの(Nunc A/S, Roskilde, Denmark)のウェルを20μg/mlのC1/6.1を使用して4℃で一晩被覆し、および残りのタンパク質結合部位を、1%のブロックエース(Block Ace)(Yukijirushi Milk, Sapporo Japan)のPBS溶液(200μl/ウェル)で4時間において室温でインキューベートすることによってブロックした。
【００７３】
CTF ELISAのために、JRF/AN/25のエピトープ(配列番号：4)およびC1/6.1のエピトープ(配列番号：2)の両方を含む合成ペプチド、すなわち
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を調製した(表1を参照されたい)。APP/全CTF ELISAのために、ヒトAPPのC末端の99残基を含むグルタチオンSトランスフェラーゼ融合タンパク質(GST-PP672〜770；(K. Islam and E. Levy, 1997, Am. J. Pathol. 151 (1) : 265-71)を調製した。この融合タンパク質は、C1/6.1およびC2/7.1エピトープの両方を含む。原液として調製したこれらの標準は、DMSOに溶解して-70℃貯蔵し、使用直前に20mMのリン酸Na、2mMのEDTA、400mMのNaCl、0.2%のBSA、0.05%のCHAPS、0.4%のブロックエース、および0.05%のNaN3を含む緩衝液pH7.0にさらに希釈する。
【００７４】
ELISAプレートを、試料および標準と共に4℃で一晩インキューベートした。試料は、本明細書に記載したとおり、1%のトリトンX-100(登録商標)、140mMのNaCl、25mMのトリス(pH7.4)、0.5mMのEDTA、およびプロテアーゼ阻害剤中に調製された細胞溶解物であった。溶解液を簡潔にボルッテックスにかけて、氷上に30分間おいてエッペンドルフ遠心機において6,000rpmで遠心した。上澄をELISAのために使用した。APPおよびAPP代謝産物を捕獲抗体(C1/6.1)に対して一晩結合させた後、ウェルを0.5%のトリトンX-100(登録商標)/0.05%のTween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、続いてPBSで2回洗浄した。次いで、20mMのリン酸Na、2mMのEDTA、400mMのNaClおよび1%のBSA、pH7.0を含む溶液を、室温で1時間ウェルに添加した。
【００７５】
APPおよび細胞に結合したAPP代謝産物は、20mMのリン酸Na、2mMのEDTA、400mMのNaCl、1%のBSA、pH7.0に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合C2/7.1またはJRF/A N/25と共に室温で4時間インキューベートすることによって検出した。その後、ウェルを再び0.5%のトリトンX-100(登録商標)/0.05%のTween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、続いてPBSで2回洗浄した。ELISAプレートを呈色反応を使用して発色させ(TMB Microwell Peroxidase Substrate System, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD)、OD450を読んだ。ELISAシグナルは、標準と比較して、mlにつきフェムトモルの2つ以上のウェルの平均+SEとして記録した。
【００７６】
代謝性標識、免疫沈降、およびウエスタンブロット解析  APPおよびCTF類を検出するために、5×105の細胞を35mmの直径の組織培養皿にまき、続いて20mMの酪酸塩で24時間、ヒトAPP695発現を誘導した(P. M. Mathewsら、1992, J. Ce//. Biol., 118 (5): 1027-1040; P. M. Mathewsら、2000, Mol. Med., 6 (10): 878-891)。培養液は、メチオニン／システインを20分間枯渇させ、100μCi/mlのTRANS35S-LABEL(Dupont-NEN)で15分間パルス標識して洗浄し、2mMの標識されていないメチオニンを含む完全培地中で追跡した(P. M. Mathewsら、1992, J. Cell. Biol., 118 (5): 1027-10400)。本明細書に記載したとおり、メチオニン／システイン枯渇の前に3時間、カルパイン阻害剤を細胞増殖培地に添加し、次いでパルスラベリングを介して追跡した。
【００７７】
細胞溶解物(1%のトリトンX-100、140mMのNaCl、25mMのトリス、pH7.4、0.5mMのEDTA、10mMのメチオニンおよびプロテアーゼ阻害剤中に調製；(P. M. Mathewsら、1992, J. Cell. Biol., 118 (5): 1027-1040; A. Beggahら、1996, J. Biol. Chem., 271 (34): 20895-209022)を、実施例2に記載したとおり、種々のモノクロナール抗体による免疫沈降に供した。免疫沈降されたタンパク質をSDS-PAGEによって大きさで分け、標識されたタンパク質をX線膜に暴露することによって視覚化し、ストーム840ホスホイメージャー(Storm 840 @jps@jpo,ager)(Molecular Dynamics/Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA)を使用し、および／またはスキャン解析(NIHImage)によって定量的に解析した。
【００７８】
ウエスタンブロット解析のためには、細胞溶解物中のタンパク質濃度を決定し(BioRad DC Protein Assay, BioRad, Rockville Center, NY)、同量のタンパク質をSDS-PAGEによって分離してPVDF膜へ転写した。膜をC1/6.1(2μg/ml)中で一晩インキューベートし、洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIgGと共に1.5時間インキューベートした。膜をECL基質(Amersham, Arlington Heights, IL)中でインキューベートしてX線膜に暴露した。
【００７９】
ELISAのための細胞溶解物の調製  細胞を6ウェルのディッシュにまいて一晩おいた。L細胞におけるヒトAPP695の発現を20mMの酪酸塩で約40時間誘導し(P. M. Mathewsら、1992, J. Cell. Biol., 118 (5): 1027-1040)、細胞を0.5mlの細胞溶解緩衝液(1%のトリトンX100、140mMのNaCl、25mMのトリス、pH7.4、0.5mMのEDTA、プロテアーゼ阻害剤)に抽出する前に、ハンクのBSSで2回洗浄した。細胞溶解物を簡潔にボルッテックスにかけて、氷上に約15分間おき、エッペンドルフ遠心機で6,000rpmで穏やかに回転した。上澄を回収して、ELISAのために手際よくロードした。
【００８０】
実施例2
モノクロナール抗体の特異性  実施例1の表Iは、本発明に従った方法に使用したモノクロナール抗体、並びにそれぞれの抗体を生成するために使用した合成ペプチドの配列を示す。APPホロタンパク質およびCTF類を、APPのカルボキシ末端の99残基内で異なったエピトープを認識するモノクローナル抗体：C1/6.1、JRF/AN/25およびJRF/Aβtot/17を使用して免疫沈降した(表Iおよび図1を参照されたい)。
【００８１】
特定のモノクロナール抗体がAPPホロタンパク質および／またはαCTFおよび／またはβCTFまたは両方ともを検出したかどうかを決定するために、ヒトAPP695(L/APP細胞)を過剰発現するL細胞を15分間代謝的に標識し、次いで1時間追跡した(図1、レーン1〜6)。
【００８２】
カルパイン阻害剤は、APP CTF類のレベルを細胞内で増大させることが知られている(H. Klafkiら、1996, J. Biol. Chem. , 271 (45): 28655- 28659; L. Zhangら、1999, J. Biol. Chem., 274 (13): 8966-9872 ; G. Verdileら、2000, J. Biol. Chem., 275 (27): 20794-20798)。以前の報告とは逆に、カルパインを阻害することにより、α-およびβ-切断されたCTF類の両方の生合成を増大することによって、CTF類のレベルを増大させることが報告された(P. M. Mathewsら、2001, Society for Neuroscience, annual meeting 2001)。
【００８３】
したがって、対照条件に加えて、パルスおよび追跡の期間の前に、並びにその際に、示したカルパイン阻害剤(図1、レーン7〜18)で細胞を3時間処理して、免疫沈降の前に代謝的に標識されるCTF類のレベルを増大させる。パルスおよび追跡の期間から調製した界面活性剤可溶化液の同体積を、それぞれのモノクロナール抗体による免疫沈降に供し、標識されたAPP種を4〜20%勾配のSDS-PAGEにおいて解析した。
【００８４】
非処理のL/APP細胞(図1、レーン1〜6)において、C1/6.1は、パルス期間に由来する標識されたホロタンパク質を免疫沈降した(図1、レーン1)。1時間の追跡に続き、C1/6.1の免疫沈降では、2つの迅速に移動するAPP断片も示した(図1レーン4；矢印は、αCTFおよびβCTFを示している)。JRF/AβN/25の免疫沈降では、APPホロタンパク質(図1、レーン2および5)を沈降することができず、したがって、JRF/AβN/25のためのエピトープは、APの残基1で切断されたアミノ末端を必要とすることが確認された。1時間の追跡後、このJRF/AβN/25を免疫沈降して、C1/6.1免疫沈降によってCTF類のうちの1つと共に移動したことが示されたタンパク質を(図1、レーン4および5を比較する)、結論的にAPPのβ-切断されたCTFとしてこれを同定した。
【００８５】
Aβの残基1〜16内のエピトープを認識するJRF/Aβtot/17により、パルスおよび追跡の期間におけるAPPホロタンパク質、並びに追跡後のβCTFを免疫沈降した(図1、レーン3および6)。これらの3つのモノクローナル抗体の特異性およびこれらが免疫沈降したCTF類のSDS-PAGEにおける移動度を考えると、C1/6.1によって同定される最も迅速に移動する種が、α-切断CTFであったと結論付けられた。
【００８６】
10μMのカルペプチンまたは10μMのカルパイン阻害剤IIIのいずれかで処理した細胞では、パルス標識した可溶化液からの免疫沈降パターンが、非処理の細胞において見られるものと同じであった(図1、レーン7〜9およびレーン13〜15とレーン1〜3を比較)。しかし、カルパインの阻害では、CTF類の存在量における著しい相違が、1時間の追跡後に見られた。C1/6.1の免疫沈降では、いずれのカルパイン阻害剤によっても、αCTF類およびβCTF類の両方のレベルに実質的にかつ明らかに比例して増加することを示した(図1、レーン10および16とレーン4を比較)。αCTFにおけるこの増加は、JRF/AβN/25およびJRF/Aβtot/17による免疫沈降によって確かめられた(図1、レーン11、12、17、および18)。
【００８７】
C1/6.1の免疫沈降に由来するこれらのバンドの濃度測定の数量化により、βCTFに対するαCTFの比(約2：1のまま)は、両CTF類の生合成が約4倍増加するにもかかわらずカルパイン阻害による影響を受けないと思われるという本明細書に記載した観測を確証させた。最後に、APPホロタンパク質が、CTF類が含むよりも5倍以上多くのメチオニンを含み、したがって、代謝ラベリングでは、実質的にCTF類の相対的な存在量が過小評価されることは重要である。
【００８８】
図2Aおよび2Bに示したパルスチェイス実験は、C1/6.1がその他のCTF類種(たとえばγCTF)を検出することができるかどうかを決定するためにデザインした。したがって、C1/6.1で可溶化液を免疫沈降する前に、L/APP細胞を15分間パルス標識して6時間までの示された時間追跡した。図2Aは、対照(レーン1〜6)におけるAPPホロタンパク質の代謝回転を示し、10μMのカルペプチンを処理した細胞(レーン7〜12)においても同様であることを示す。これらのデータの数量化により、APPホロタンパク質の代謝回転がカルペプチン処理によって変化しないことが確認された。
【００８９】
図2Bは、同じ免疫沈降においてより長時間暴露したものでは、CTF類の生成および代謝回転を示すことを示している。図1におけるデータと一致して、10μMのカルペプチン処理では、追跡の最初の１時間の間にαおよびβCTF類の両方の生成を実質的に増大した(図2B、レーン7から9とレーン1〜3を比較)。以前の解釈とは対照的に(L. Zhangら、ｌ1999, J. Biol. Chem., 274 (13): 8966-8972)、このカルペプチン濃度は、CTF類の代謝回転を減少しないように思われた。CTF類の生成は、実質的に増加するが、それらの分解速度は、APPの代謝回転と同様に、カルペプチン処理による影響を受けないように思われた。
【００９０】
さらに、図2Bに示した長時間の曝露では、絶えず検出されるその他のCTF類がめだった。これには、βCTFより上に移動するC1/6.1によって認識される断片(図2B、レーン9)、並びにαCTFより迅速に移動し、かつ長期間の追跡後(＞2時間)に現れる断片を含む(図2B、レーン10〜12、標識されたγCTF)。より大きな断片は、β切断部位に対する不均一なアミノ末端の切断を示唆する。αCTFより小さい断片は、外観の大きさおよび時間経過において、APPのγCTFと一致している。
【００９１】
したがって、実施例2の結果から、C1/6.1抗体がAPP(APPホロタンパク質およびCTF類)の全ての既知の細胞に結合した代謝産物を検出し、JRF/AβN/25抗体がβ-切断されたCTFを特異的に検出したと結論づけられる。また、C2/7.1抗体は、APPのカルボキシ末端に対して生じ、C1/6と同じであるので、C2/7.1モノクローナル抗体を使用した結果は、C1/6.1を使用して得られたものと同様であり、C2/7.1も、APPホロタンパク質および全てのCTF類を検出すると結論づけられた。
【００９２】
実施例3
βCTF特異的なELISA  捕獲抗体としてC1/6を、および検出抗体としてJRF/AβN/25を使用して、細胞に結合したβCTF類を特異的に認識するELISAを開発した。図3は、そのアミノ末端(太字のもの)にJRF/AβN/25のエピトープ(配列番号：4)およびそのカルボキシ末端(イタリックのもの)にC1/6.1のエピトープ(配列番号：2)を含む合成ペプチド
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に対するこのELISAの感受性および直線性を示す。
【００９３】
この図3のELISAは、AβサンドイッチELISAで得られた範囲と同様の、低いfmole/ml範囲(示した範囲は、3〜100fmole/mlである)において、かつインビボで細胞によって生成されるβCTF類を検出するために十分に必要な範囲内で直線状の検出を示す(C. Janusら、2000, Nature, 408 (6815): 979-982; S. D. Schmidtら、2001, Society for Neuroscience. annual meeting 2001)。
【００９４】
このようなELISAプロトコルを、細胞から単離したβCTF類を検出するために使用することができるかどうかを決定するために、同密度のL/APP細胞および10μMカルペプチンで6時間処理したL/APP細胞から調製した界面活性剤可溶化液を検査した。非処理のL/APP細胞では、5.8±0.3fmole/mlのβCTF類が検出された(図4)。10μMのカルペプチンの6時間の添加では、カルペプチン処理後のβCTF類の増大を示すパルス標識法のデータと一致して、ELISAによって検出されるβCTF類のレベルをほぼ2倍にした(10.0±0.6fmole/ml)。この結果は、βCTF ELISAが細胞内で生成されるβCTF類のレベルの変化を定量的に検出することができることを示す。
【００９５】
図5Aおよび5Bに示したさらなる結果は、細胞によって生成されるβCTF類の量の変化を検出するために、このβCTF ELISAを使用することができることを確信させる。初期の段階の散発性アルツハイマー病において見られる、ニューロンのエンドソーム系の異常(たとえば、A. M. Cataldoら、1997, J. Neurosci., 17 (16): 6142-6151. (1998); A. M. Cataldoら、2000, Am. J. Pathol., 157 (1) : 277-286; R. A. Nixonら、2000, Neurochem. Res. , 25 (9-10): 1161-1172を参照されたい)は、エンドサイトーシスの重要な調節タンパクのrab5を過剰発現することによってモデルされた(P. Chavrierら、1990, Cell, 62 (2): 317329.; J. P. Gorvelら、1991, Cell, 64 (5): 915-925; C. Bucciら、1992, Cell, 70 (5): 715-728; M. A. Barbieriら、1996, Biocell, 20 (3): 331-338；およびG. Li, 1996, Biocell, 20 (3): 325-330；および特許出願では、2000年４月28日にR. A Nixonらによって出願された、米国特許出願第09/560,124号、表題「Methods for the identification of compounds for the treatment of Alzheimer's disease」)。
【００９６】
このrab5の過剰発現実験において、L/APP細胞には、DNAなしで(図5A、レーン1および2)またはrab5 cDNA(図5A、レーン3〜5)を一過性にトランスフェクションさせ、APPホロタンパク質およびCTF類のレベルをC1/6.1を使用するウエスタンブロット解析によって決定した。(図5A)。予想されるとおり、10μｍのカルペプチンでの処理では、検出されるCTF類レベルが非常に増大され(図5A、レーン1および2を比較する)、パルスチェイスのデータでは、主にαCTF類を、およびより小量のβCTF類およびγCTF類を含むことを示す。
【００９７】
rab5過剰発現によるエンドサイトーシス刺激では、ウエスタンブロット解析によって検出されるCTF類のレベルが増大したが(レーン5において最も明らかである、図5A)、カルペプチン処理のものとは同程度ではなかった。ウエスタンブロット解析に加えて、それぞれの可溶化液の一定分量を、ELISAによって検査して、細胞におけるβCTF類のレベルを決定した(図5B)。図4に見られるように、カルペプチン処理では、ELISAによって検出されるβCTF類の量を実質的に増大させた(すなわち、16.1から26.0fmole/mlに)。さらに、rab5の過剰発現でも、ELISAによって検出されるβCTF類の量を、カルペプチン処理したものとほとんど同程度に増大したことから、rab5過剰発現に続くC1/6.1ウエスタンブロット解析によって検出されるCTF類は、主にβCTF類であり、さらにこのELISAのβCTFに対する特異性を支持することが示唆される。
【００９８】
これらの結果は、βCTF ELISAが感受性があり、特異的であり、生細胞によって生成されるβCTF類を検出することができ、薬理学的並びに遺伝的操作から生じるβCTF類レベルの変化を検出することができることを示す。
【００９９】
実施例4
APP／全CTF ELISA  βCTF ELISAに加えて、APPホロタンパク質、並びに(APP／全CTF ELISA)からの全ての細胞に結合したCTF類を検出する新規のELISAを開発した。このELISAは、βCTF ELISAと同様に、捕獲抗体としてC1/6.1を使用するが、検出抗体としてJRF/AβN/25抗体よりむしろC2/7.1抗体を使用する。
【０１００】
図6は、細菌の融合タンパク質として発現されたAPPのカルボキシ末端の99アミノ酸からなる標準を検出するためにこのELISAを使用する例を示す(GST-βPP672〜770(K. Islam and E. Levy, 1997, Am. J. Pathol., 151 (1) : 265-271)。この融合タンパク質は、C1/6.1およびC2/7.1エピトープの両方を含む。βCTF ELISAと同様に、APP/全CTF ELISAは、(図6に示したとおり、100〜800fmole/ml)標準の低いfmole/ml下までの幅広い直線的範囲を示した。
【０１０１】
APPおよび全CTF類のレベルを、このELISAを使用して細胞から調製した可溶化液において検討した。図7Aは、C1/6.1ウエスタンブロット解析による、ヒトAPP695を過剰発現するL細胞株(L/APP)に対するL細胞におけるAPPホロタンパク質発現の相対的レベルを示す。図7Bでは、対照条件下で培養されたか、またはカルペプチン処理に供されたこれらのいずれかの細胞から調製した可溶化液を、C1/6.1-C2/7.1のサンドイッチELISAを使用して検討した。予想されるとおり、ウエスタンブロット解析によって検出されるAPPのレベルを考えると、L/APP細胞は、親L細胞よりも有意に高いELISAシグナルを示した。カルペプチンの添加により、L細胞におけるシグナルが増大したが、統計学的に有意な程度ではなかった。しかし、L/APP細胞では、カルペプチンの添加により、有意にELISAシグナルを増大し、これは、この系におけるCTF類の生成のためであることが予想される。この結果は、APP/全CTF ELISAを、細胞によって生成される細胞に結合したAPP代謝産物のレベルの飛跡変化について使用することができることを確信させる。
【０１０２】
実施例5
毒性とβCTFレベルに対する特異的な効果との識別  βCTF ELISAおよびAPP/全CTF ELISAの組み合わせにより、毒性効果とβCTFレベルに対する特異的な効果の間の区別ができるかどうかを決定するために、タンパク合成阻害剤シクロヘキサミドを、毒性化合物をモデルするために使用した。シクロヘキサミドは、多くの化合物の特徴を有し、これが、細胞生存率を減少し、したがって劇的にAβ生成を減少することにより、標準的なスクリーンにおいて偽陽性を与えるであろう。
【０１０３】
スクリーニングプロトコルは、唯一の結果測定としてのAβの減少に依存するが、シクロヘキサミド処理では、Aβ産生を減少して潜在的に治療的であるとみなされる；しかし、シクロヘキサミドは非常に有毒である。図8Aおよび8Bは、対照L/APP細胞を、10μMのカルペプチンまたは75μg/mlのシクロヘキサミドで6時間処理した同密度のL/APP細胞と比較した実験の結果を示す。図8Aは、βCTFレベルを示し、図8Bは、ELISAによって決定したAPPホロタンパク質／CTFのレベルを示す。カルペプチン処理では、βCTFレベルの有意な増大が見られたが(約2.7から5.4fmole/ml細胞溶解物へ2倍になる)、APP／全CTF ELISAを使用して、APP／全CTFレベルのより少ない相対的増大を示した。シクロヘキサミド処理では、βCTFレベルが減少したが(78%間で、2.7fmole/mlから0.6fmole/mlまで)、同時に、劇的にAPP／全CTFレベルも減少した(88%まで、対照における608fmole/mlからシクロヘキサミド処理したL/APP細胞における74fmole/mlまで)。
【０１０４】
これらの結果は、組み合わせると、これらの2つのELISAが、有利にはβCTFレベルの減少を検出するために使用することができ、一方で、β-切断(望ましい結果)を特異的に減少する化合物と一般的な細胞毒性を経てβCTFレベルを減少する化合物を区別するために使用することができる(たとえば、シクロヘキサミドを使用して示したように)。
【０１０５】
実施例6
本発明にしたがって、βCTFおよびAPP／全CTFを使用する、βCTF生成の選択的阻害剤の検出  細胞の自己貪食阻害剤の3-メチルアデニン(3mA)(P. O. Seglen and P. B. Gordon, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 (6): 1889-1892; P. E. Schwarze and P. O. Seglen, 1985, Exp. Cell. Res. , 157 (1) : 15-28；およびP. O. Seglenら、1986, Exp. Cell. Res. , 162 (1) : 273-277)は、ADおよび／またはその他のニューロンの萎縮に関連した発狂疾患において潜在的な治療的価値を有することが報告された(特許出願、2000年4月28日に出願されたR. A. Nixonらによる米国特許出願第09/561582号「ニューロンの萎縮に関連した痴呆の治療のための方法」)。
【０１０６】
本実施例は、本方法およびその利点を示すために、試験化合物として3MAを使用して行った実験結果を記載する。図1OA-10Dは、これらの実験の結果を示し、L/APP細胞におけるβCTF生成およびAβ産生の3MAによる特異的な減少を示す。図10Aは、3MA処理では、非処理の対照細胞におけるAPPレベルと比較して細胞のAPPレベルを減少させないが、シクロヘキサミド処理では、減少することを示す。図10Bは、3MA処理では、対照と比較して50%までβCTFレベルを減少したが、シクロヘキサミド処理では、βCTFレベルをいくぶん多く減少したことを示す。これらの結果は、シクロヘキサミドが全細胞のAPPレベルを減少する非特異的な細胞毒があることに対応し、これによりβCTFレベルを減少させる。これらの結果は、βCTFレベルに対する3MAの効果が特異的であり、一般的な細胞毒性の結果ではないことをさらに示す。本実験は、本発明に従って、ELISAを組み合わせて、潜在的に治療的な化合物(たとえば3MA)と毒性化合物(たとえば、シクロヘキサミド)を区別することができることを示す。
【０１０７】
さらに、増殖培地におけるAβレベルを、これらの試験細胞により検討した。図10Cは、対照と比較して、3MAおよびシクロヘキサミド処理の両者で観察されるAβ1〜40のレベルの減少を示す。図10Dは、対照と比較して、両者の処理で顕著であるAβ1〜42のレベルにおける同様の減少を示す。また、シクロヘキサミド処理で得られるAβ生成の減少は、非特異的細胞毒性によるが、3MA処理後に得られるAβ生成の減少は、βCTF生成の特異的な減少に関連する。
【０１０８】
これらの所見は、生細胞系を使用して、前駆体のレベルおよび代謝産物のレベル、特に、AD経路に関与するβCTF ELISAおよびAPP/全CTF ELISAの両方をアッセイして、一般に有毒な化合物と潜在的な治療的価値を有する化合物を区別する、本発明の細胞に基づいたスクリーニング方法の有用性を示す。
【０１０９】
全ての特許、特許出願、公開された米国およびPCT出願、論文、本、参照、参照マニュアル、配列表、および本明細書において引用される抄録の内容は、本発明が属する技術水準をより完全に記載するために、参照としてその全体を本明細書に引用したものとする。
【０１１０】
本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、上述した主題に種々の変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、または添付の特許請求の範囲において定義される全ての主題は、本発明を記述しかつ図示するものとして解釈されることが企図される。上記の開示を考慮して、本発明の多くの改変および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
（図１）APPホロタンパク質およびCTF類に対するモノクロナール抗体の特異性  ヒトAPP(L/APP)を過剰発現しているL細胞株を15分間代謝的に標識して、示したとおりに1時間追跡した。細胞には、代謝標識する前に、並びに標識および追跡の際に、示したカルパイン阻害剤で前もって3時間処理した。細胞溶解物を調製し、3つのモノクローナル抗体：APPの20カルボキシ末端の大部分の残基内のエピトープを認識するC1/6.1；APの残基1〜7内のエピトープを認識するJRF/AβN/25；およびADの残基1〜16内のエピトープを認識するJRF/Aβtot/I7のうちの1つで同体積を免疫沈降した。(表1、実施例1)。標識された免疫沈降タンパク質をSDS-PAGEにおいて大きさによって分離し、実施例1の方法に記載したとおりに検出した。矢印は、APPホロタンパク質(APPn)並びにα-およびβ-切断されたCTF類(それぞれαCTFおよびβCTF)を示す。
（図２）C1/6.1によるAPPホロタンパク質およびαCTF類、βCTF類およびγCTF類の検出  APPを過剰発現しているL細胞株を代謝的に標識して、示した時間追跡した。カルパイン処理は、図1に記載したとおりに行った。細胞溶解物は、実施例2に記載とおりに、C1/6.1モノクロナール抗体で免疫沈降した。図2Aは、APPホロタンパク質(APPfl)の代謝回転を示す短い暴露を表す。図2Bは、APPホロタンパク質並びにα-、β-、およびγ-切断されたCTF類(αCTF、βCTF、γCTF；星印および矢印によって示した)を示すより長い暴露を表す。
（図３）βCTFのELISA  ELISAプレートをC1/6.1モノクロナール抗体で被覆し、合成ペプチド標準
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を結合させて、実施例1の方法および実施例3に記載したとおりに、結合したペプチドをJRF/AβN/25で検出した。光学濃度(450nmにおけるもの)は、それぞれのウェルに添加したペプチドのフェムトモル/mlの関数としてグラフに示した。値は、2回の測定の平均である。
（図４）細胞から単離されたβCTF類の定量的検出  L細胞(L/APP)を過剰発現しているヒトAPPを培養し、実施例1の方法に記載したとおりに、ヒトAPP695の発現を誘導した。界面活性剤可溶化液を対照ウェルおよび抽出前に10μMカルパインで6時間処理したウェルから調製した。βCTFレベルは、捕獲抗体としてC1/6.1および検出抗体としてJRF/AβN/25を使用するELISAによって決定した。値は、2回のELISA読み込みの平均±SDとして報告する。(実施例3)。
（図５）薬理学的および遺伝的操作後のβCTFレベルの変化の定量的ELISA検出  (実施例3)。図5Aは、記載されたとおりに培養したL/APP細胞のC1/6.1を使用するウエスタンブロット解析を示す。レーン1は、非処理のL/APP細胞をロードした；レーン2、抽出前に10μMカルパインで6時間処理した細胞；レーン3、抽出48時間前に5μg/ウェルrab5cDNAを一過性トランスフェクトした細胞；レーン4、フュージーン(fugene)を使用して1.0μg/ウェルrab5cDNAを一過性トランスフェクトした細胞；レーン5、リポフェクトアミン(lipofectAMINE)(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)を使用して1.0μg/ウェルrab5cDNAを一過性トランスフェクトした細胞。APPホロタンパク質(APPfl)およびCTF類を示してある。図5Bは、これらの可溶化液からELISAによって検出されるβCTF類のレベルを示す。カルペプチン処理とは異なり、rab5の過剰発現により、細胞におけるβCTFレベルを増大したが、αCTFレベルは増大しない(O.M.Grbovicら、2001, Society for Neuroscience annual meeting 2001)。
（図６）APP／全CTFのELISA  ELISAプレートをC1/6.1で被覆した。GST-βPP672-770の融合タンパク質標準を結合させて、実施例1方法および実施例4に記載したとおり、結合したGST-βPP672-770をC2/7.1で検出した。光学濃度(450nmにおけるもの)は、それぞれのウェルに添加したペプチドのフェムトモル/mlの関数としてグラフに示した。値は、2回の測定の平均である。
（図７）細胞におけるAPPホロタンパク質および全CTF類のELISAによる定量  同数の親L細胞およびL/APP細胞をまき、APP695発現を誘導した。細胞溶解物を調製し、図7Aには、C1/6.1モノクロナール抗体を使用するウエスタンブロットによって解析した(APPホロタンパク質を示してある)。図7Bでは、同様の細胞溶解物を捕獲抗体としてC1/6.1および検出のためにC2/7.1を使用するELISAによって解析した。上記のように、抽出前に6時間10μMカルペプチンで細胞を処理した(実施例4)。
（図８）シクロヘキサミド処理により、βCTFおよびAPP／全CTFの両者のレベルを減少する。L/APP細胞を同密度でまき、APP発現を誘導した。誘導の最後の6時間の間に、示したとおりに、細胞を10μMのカルペプチンまたは75μg/mlのシクロヘキサミドで処理した。可溶化液を調製して、実施例1の方法および実施例5に記載したとおりに、βCTFレベル(図8A)について、およびAPP／全CTFレベル(図8B)について、ELISAによって解析した。結果は、2回の測定の平均であり、標準と比較して細胞溶解物のfmole/mlとして表してある。
（図９）高スループットスクリーニングプロトコルの図解  (図9A)：ELISAウェルを、まず最初にAPPの細胞内カルボキシ末端特異的に結合するC1/6.1モノクローナル抗体(捕獲抗体)またはAPPの細胞代謝産物(APPのカルボキシ末端断片、すなわち、αCTF、βCTF、またはγCTF)に特異的に結合する抗体で被覆する。(図9B)：関心対象の細胞(すなわち、ヒトを含む哺乳類、細胞および細胞株、神経芽細胞腫などの細胞タイプ、APPもしくはその他のADの発病に関連したタンパク質を発現するようにトランスフェクトした細胞；またはAD病理生物学の側面を模倣するように遺伝的に改変された細胞)をウェルにまいて、定着させ、試験化合物を添加した。
増殖培養液に分泌されたAβの代謝回転と比較して、βCTFの迅速な代謝回転のために、薬物の処理は、Aβを測定する場合に必要なものよりも、非常に短い期間であることができる(たとえば1〜2時間)。さらに、増殖培地の交換は不要である。(図9C)：細胞をインサイチューで分離し(溶解させ)、界面活性剤で抽出したAPP断片を、予め被覆した捕獲抗体(類)に結合させた。または、細胞を別々のウェルで培養し、細胞溶解物を捕獲抗体に添加する。洗浄後、異なった標識がされた(たとえば、異なるフルオロフォアによる)2つの検出抗体を結合させる。(図9D)：検出抗体のうちの一方のJRF/AβN/25(黒抗体)は、βCTFのみを認識し、他方の検出抗体C2/7.1は、APPホロタンパク質およびβCTF(灰色抗体)を含む全てのAPP CTF類を認識する。次いで、これらの抗体の結合を、たとえば、C. Janusら、2000, Nature, 408(6815): 978-82によって記載された呈色反応などの標準的なアッセイ法を使用して、またはフルオロフォア結合抗体および蛍光検出を使用することによって、定量的に検出する。
βCTFおよびAPPおよびその切断代謝産物のレベルは、対照と比較した呈色反応または蛍光シグナルの強度に基づいて決定される。APPおよび全てのAPP切断代謝産物(すなわち、αCTF、βCTF、およびγCTF)に結合する特異的な抗体と、βCTFに結合する特異的な抗体の比を決定することができ(灰色抗体に対する黒抗体の比)、対照における同じ比と比較することができる。必要であるか、または技術的理由のために望まれるならば、これらの2つの抗体を使用する検出により、このスクリーンがβ-切断を特異的に減少する化合物と細胞に対して単に毒性がある化合物とを区別する能力に障害を生じさせずに、異なるウェルにおいて行うことができる。
（図１０）3-メチルアデニンは、全細胞APPの減少を伴わずに、βCTF生成およびAβ産生を選択的に阻害する。L/APP細胞を同密度でまき、APP発現を誘導した。次いで、10μg/mlのシクロヘキサミドまたは10μg/mlの3-メチルアデニン(3MA)の処理を伴わずに、または添加して、細胞を6時間インキューベートした。次いで、細胞溶解物におけるAPP／全CTFレベル(図10A)およびβCTFレベル(図10B)をELISAによって決定した。この6時間のインキュベーションの間に増殖培地中に分泌されるAβ1〜40(図10C)およびAβ1〜42(図10D)のレベルをELISAによって決定した(C. Janusら、2000, Nature, 408 (6815): 979-982)。データは、それぞれのアッセイについて非処理の対照細胞において見られるレベルのパーセンテージとして表してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536600.tif 000089
【国際調査報告】
2004536600.tif 000090
2004536600.tif 000091
2004536600.tif 000092
2004536600.tif 000093
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