(57)【要約】免疫病態を患っているか、または免疫病態を患いやすい動物において、炎症や癌のような免疫病態を減少するための組成物た開示される。この組成物は、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子に特異的に結合する結合作用物質を含み、その結合作用物質は動物の結合作用物質に対する免疫応答を誘発する。さらに、開示された組成物は、動物に治療有効量が投与された場合に、その動物の炎症や癌を減少させる物質を含む。また、免疫病態を患っているか、または患いやすい動物に前記の組成物を投与する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫病態を患っているか、または免疫病態を患いやすい動物における免疫病態を減少させる方法であって、動物に対して、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子に特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を投与することを含み、ここで、結合作用物質は動物の結合作用物質に対する免疫応答を誘発する。
【請求項２】
接着分子が炭水化物エピトープを含む分子である請求項１の方法。
【請求項３】
炭水化物エピトープがシアリルルイスＸまたはシアリルルイスＡである請求項２の方法。
【請求項４】
接着分子がセレクチンである請求項１の方法。
【請求項５】
セレクチンがＰセレクチンまたはＥセレクチンである請求項４の方法。
【請求項６】
免疫病態が炎症である請求項１の方法。
【請求項７】
血液性細胞が白血球である請求項６の方法。
【請求項８】
白血球が、リンパ球、好中球、多形核白血球および単球から構成される群から選択される請求項７の方法。
【請求項９】
免疫病態が癌である請求項１の方法。
【請求項１０】
血液性細胞が癌細胞である請求項９の方法。
【請求項１１】
癌細胞が、乳癌細胞、メラノーマ細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞から構成される群から選択される請求項１０の方法。
【請求項１２】
結合作用物質が抗体である請求項１の方法。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１２の方法。
【請求項１４】
免疫応答が、結合作用物質に特異的に結合する抗体を結果的に産生する請求項１の方法。
【請求項１５】
免疫応答が、接着分子に特異的に結合する抗体を結果的に産生する請求項１の方法。
【請求項１６】
免疫応答が、体液および細胞性免疫応答を含む請求項１の方法。
【請求項１７】
動物が家畜動物である請求項１の方法。
【請求項１８】
動物がヒトである請求項１の方法。
【請求項１９】
結合作用物質の治療有効量が、動物において抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない結合作用物質投与量である請求項１の方法。
【請求項２０】
結合作用物質の治療有効量が、動物において抗体媒介毒性を誘発しない結合作用物質投与量である請求項１の方法。
【請求項２１】
結合作用物質の治療有効量が、動物３０ｋｇ体重あたり約８ｍｇ未満である請求項１の方法。
【請求項２２】
免疫病態を患っているか、または免疫病態を患いやすい動物における免疫病態を減少させる組成物であって、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子に特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を含み、ここで、結合作用物質は動物の結合作用物質に対する免疫応答を誘発する。
【請求項２３】
接着分子が炭水化物エピトープを含む分子である請求項２２の組成物。
【請求項２４】
炭水化物エピトープがシアリルルイスＸまたはシアリルルイスＡである請求項２３の組成物。
【請求項２５】
接着分子がセレクチンである請求項２２の組成物。
【請求項２６】
セレクチンがＰセレクチンまたはＥセレクチンである請求項２０の組成物。
【請求項２７】
免疫病態が炎症である請求項２２の組成物。
【請求項２８】
血液性細胞が白血球である請求項２７の組成物。
【請求項２９】
白血球が、リンパ球、好中球、多形核白血球および単球から構成される群から選択される請求項２８の組成物。
【請求項３０】
免疫病態が癌である請求項２２の組成物。
【請求項３１】
血液性細胞が癌細胞である請求項３０の組成物。
【請求項３２】
癌細胞が、乳癌細胞、メラノーマ細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞から構成される群から選択される請求項３１の組成物。
【請求項３３】
結合作用物質が抗体である請求項２２の組成物。
【請求項３４】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３３の組成物。
【請求項３５】
免疫応答が、結合作用物質に特異的に結合する抗体を結果的に産生する請求項２２の組成物。
【請求項３６】
免疫応答が、接着分子に特異的に結合する抗体を結果的に産生する請求項２２の組成物。
【請求項３７】
免疫応答が、体液および細胞性免疫応答を含む請求項２２の組成物。
【請求項３８】
動物が家畜動物である請求項２２の組成物。
【請求項３９】
動物がヒトである請求項２２の組成物。
【請求項４０】
結合作用物質の治療有効量が、動物において抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない結合作用物質投与量である請求項２２の組成物。
【請求項４１】
結合作用物質の治療有効量が、動物において抗体媒介毒性を誘発しない結合作用物質投与量である請求項２２の組成物。
【請求項４２】
結合作用物質の治療有効量が、動物３０ｋｇ体重あたり約８ｍｇ未満である請求項２２の組成物。
【請求項４３】
さらに製薬的に許容できる担体を含む請求項２２の組成物。
【請求項４４】
動物に対して治療有効量で投与した時に、この動物の炎症を低下させ、かつ癌を縮小させることができる物質を含む治療用組成物。
【請求項４５】
物質が、接着分子に特異的に結合する結合作用物質である請求項４４の組成物。
【請求項４６】
癌または炎症を患っているか、または癌および炎症を患いやすい動物における免疫病態を減少させるための方法であって、動物に対して、動物中において炎症を低下させ、かつ癌を縮小させることができる物質の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項４７】
物質が、接着分子に特異的に結合する結合作用物質である請求項４６の組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願に対する参照
本出願は、１９９９年８月２５日出願の米国仮出願番号６０／１５０，６５２からの利益を請求しており、その全内容は本文で参考として引用している。
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫病態、特に炎症および癌の治療および／または予防用の組成物類、および上記組成物の製造および使用方法に関するものである。
関連技術の要約
ヒトおよび家畜動物の健康に影響を及ぼす免疫病態２種は、炎症と癌である。Ｇａｌｌｉｎ等（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８）は、炎症とは、感染性薬剤、局所組織傷害、または他の外傷のような種々の刺激によって惹起される複雑な防御性の生理的応答であると教示している。この炎症応答には、多数の媒介因子および種々の免疫細胞が関与する。Ｉｓｓｅｋｕｔｚ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８８：５６９−５７６， １９９６）は、傷害、感染または免疫反応部位への内皮細胞壁を介した血流からの白血球（すなわち、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）の遊走は、前記炎症応答の特徴事項および重要段階として認識されると教示している。炎症を起こした組織への白血球の集積は、内皮細胞活性化および炎症病巣への白血球遊走の結果として起こる。
【０００１】
Ｄｉａｚ−ＧｏｎｚａｌｅｚとＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９（４）：１−３， １９９８）は、白血球遊走プロセスには白血球と血管を裏打ちしている内皮細胞の相互作用を必要とすると教示している。白血球−内皮細胞相互作用は多段階プロセスであり、連続的接着性事象カスケードを伴い、それは、図２に示したような４個の連続的段階に分けることができる。白血球と血管壁との最初の接触は可逆的プロセスであり、それは、活性化内皮上における白血球のロ−リングを伴う（段階１）。内皮細胞上でのこうした白血球ロ−リングは、白血球細胞上のセレクチン分子が内皮細胞上においてそのリガンド（例えばシアリルルイスＸまたはシアリルルイスＡ）と接着することによって促進される。白血球ロ−リングの後、ケモカイン類およびサイトカイン類による白血球活性化（段階２）および内皮への活性化白血球の強固な接着が続く（段階３）。Ｃｒｏｃｋｅｔｔ−ＴｏｒａｂｉとＦａｎｔｏｎｅ（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． １４：２３７−２５１， １９９５）は、最終段階において、白血球それ自体を内皮細胞結合部間に押し出して炎症病巣に移動させることによって、周辺組織中に白血球が溢出することを教示している。
【０００２】
炎症疾患の大半はしばしば期間が慢性であり、特に重要であることとして、自己免疫疾患であることである。自己免疫疾患は慢性疾患群であり、免疫系が侵襲してくる物質から宿主を防御する点においてその制御機能を遂行できないばかりでなく、特に宿主自己抗原の一部に対して反応する。この自己免疫応答は、細胞性、体液性またはその両者の機構によって開始され、局所炎症および組織傷害を伴う疾患につながる。多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、クロ−ン病、およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）は、自己免疫疾患の数例にすぎない。
【０００３】
Ｐｉｔｚａｌｉｓ等（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５３：２８７−２８８， １９９４）は、ＲＡおよび他の自己免疫疾患類の病理における接着分子の役割を考察している。白血球の組織中浸潤は、リウマチ性関節炎を含む慢性関節炎において関節傷害を起こす病理過程の主要構成部であると考えられている。したがって、接着分子類は、ＲＡおよび他の自己免疫疾患類における介入のためのもうひとつの魅力的免疫療法ターゲットを代表している。
【０００４】
セレクチン類およびそれらの炭水化物リガンド類は、炎症部位における白血球と血管内皮との最初の接触においてそれらが重要な役割を有しているがゆえに、炎症状態において極めて重要なターゲットであると考えられてきた。ＭｃＭｕｒｒａｙ， Ｒ．Ｗ．（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２５：２１５−２３４， １９９６）は、セレクチン類が、Ｃａ（２＋）依存性Ｎ末レクチン結合ドメインから構成される共通の構造成分を共有している炭水化物結合接着分子類であることを教示している。ＭｃＥｖｅｒ， Ｒ．Ｐ．（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：７５−８４， １９９４）は、シアル酸、フコース、ガラクトース、マンノース、および／またはシアリルルイスＸ（Ｓｌｅ（ｘ））、シアリルルイスＡ（Ｓｌｅ（ａ））、および関連構造類のような陰イオン性硫酸またはリン酸エステル部分類から構成されるリガンド上において特定の炭水化物構造類を認識し、かつそれに結合することを教示している。
【０００５】
Ｍｕｎｒｏ等（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４１（６）：１３９７−１４０５， １９９２）は、炭水化物リガンドＳｌｅ（ｘ）［ＮｅｕＡｃａ２−３ＧａＩｂ１−４（Ｆｕｃａ１−３）ＧｌｃＮＡｃ−］が、単球類、多形核白血球（ＰＭＮＬ）および約１０％の末梢血Ｔリンパ球上で発現されることを教示している。Ｓｌｅ（ｘ）は全てのセクレチン接着分子類によって認識される。Ｓｌｅ（ｘ）同質異性のエピトープであるＳｌｅ（ａ）［ＮｅｕＡｃａ２−３ＧａＩｂ１−３（Ｆｕｃａ１−４）ＧｌｃＮＡｃ−］（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：１７５−１８７， １９９７）は、ＥおよびＰセレクチン類、およびおそらくＬセレクチンによっても認識され、それらに結合する（Ｐａａｖｏｎｅｎ ａｎｄ Ｒｅｎｋｏｎｅｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４１（６）：１２５９−１２６１， １９９２）。Ｔａｋａｄａ等（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １７９：７１３−７１９， １９９１）は、Ｓｌｅ（ａ）がほとんどの末梢血細胞上に存在していないことを教示している。
【０００６】
セレクチン類およびそれらのリガンド類を抗体類またはオリゴ糖でブロックすることは、種々の動物炎症モデルで試みられてきた。たとえば、Ｗｅｉｓｅｒ等（Ｓｈｏｃｋ ５（６）：４０２−４０７， １９９６）は、後肢止血帯虚血時を経たラットにおいて、抗Ｐセレクチンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＰＢ１．３の投与が後肢傷害を低減するが壊死巣分離は低下させないと主張し述べている。Ｙａｍａｄａ等（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４６：２２２−２２４， １９９８）は、同じ抗ＰセレクチンｍＡｂ ＰＢ１．３が、虚血３０分間の後５時間再潅流したウサギにおいて約３８％（２ｍｇ／ｋｇ）および２８％（５ｍｇ／ｋｇ）だけ梗塞径を縮小したと主張している。Ｔｏｊｏ等（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（４）：４６３−９， １９９６）は、抗ラットＰセレクチンｍＡｂ、ＡＲＰ２−４が、ラット心筋虚血および再潅流傷害モデルにおいて梗塞径を縮小したと主張している。Ｏｈｎｉｓｈｉ等（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１６１−１７０， １９９６）は、抗ラットＰセレクチンｍＡｂ、ＡＲＰ２−４をアーサス（Ａｒｔｈｕｓ）反応で誘発した皮膚傷害を受けたラットに投与すると、これが足蹠腫脹を縮小し、かつ関連多形核白血球（ＰＭＮＬ）集積を阻害したと述べている。
【０００７】
Ａｌｔａｖｉｌｌａ等（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７０：４５−５１， １９９４）は、抗ＥセレクチンｍＡｂ、ＢＢＩＧ−Ｅ５の使用により、げっ歯類モデルにおいて梗塞径の縮小およびＰＭＮＬ集積低下が結果的として得られたと主張している。
【０００８】
マウスにおけるエンドトキシン誘発ブドウ膜炎についての研究（Ｗｈｉｔｃｕｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８３（１）：４５−５２， １９９７）は、眼中への好中球遊走が、エンドトキシン注入の前または後のいずれかにおいて、腹腔内投与した抗Ｅセレクチンおよび抗Ｐセレクチンモノクローナル抗体の併用によって効果的に阻害されたことを報告した。この研究では、抗Ｅセレクチン抗体単独ではエンドトキシン誘発ブドウ膜炎に対してほとんど効果を有していなかったが、一方、抗ＰセレクチンｍＡｂは、エンドトキシン注入時点またはその６時間後に投与した際、眼炎症を３７％低下させた。
【０００９】
Ｍａ等（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：６４９−６５３， １９９３）は、梗塞径の縮小ならびにＰＭＮＬ集積を抗ＬセレクチンｍＡｂ、ＤＲＥＧ−２００をネコモデルに使用した際に観察したことを述べている。Ｐｉｚｃｕｅｔａ ａｎｄ Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４５（２）：４６１−４６７， １９９４）は、腹膜の実験的誘発慢性炎症ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルを開示しており、抗ＬセレクチンｍＡｂ（ＭＥＬ−１４）を静注投与（ｉ．ｖ．）し、単球白血球の慢性炎症部位への循環（４８時間）におけるＬセレクチンの役割を検討した。この研究の結果は、４８時間時点においてマクロファージ類およびリンパ球類の集積をそれぞれ６０％および９０％低下させることを示した。同様に、ＭＥＬ−１４ ｍＡｂは、顆粒球流入を６時間時点で８０％、および２４時間および４８時間時点で５０％、顕著に阻害したと主張している。
【００１０】
セレクチン−炭水化物リガンド類の研究のほとんどは、シアリルルイスＸ（Ｓｌｅ（ｘ））オリゴ糖分子を標的にしてきた。Ｔｏｊｏ等（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（４）：４６３−９， １９９６）は、ラット心筋虚血および再潅流傷害に及ぼすＳｌｅ（ｘ）−オリゴ糖の効果を述べている。この研究では、Ｓｌｅ（ｘ）−オリゴ糖投与が、血液動態パラメータまたは循環白血球数に影響を及ぼすことなく、梗塞径を有意に縮小させたと述べられている。
【００１１】
Ｈａｎ等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５（８）：４０１１−５， １９９５）は、耳血管供給を６時間閉塞させ、その後再潅流させたウサギにおいて、その耳浮腫および壊死に及ぼす可溶性Ｓｌｅ（ｘ）の効果を述べている。この研究では、Ｓｌｅ（ｘ）（２５ｍｇ／ｋｇボーラス静注後、１０時間かけて５０ｍｇ／ｋｇ点滴）処置動物において、組織浮腫および壊死が再潅流と同時に、または１時間だけ遅れて有意に縮小したが、治療を４または１２時間遅らせた動物では縮小しなかったと主張している。
【００１２】
Ｓｃｈｍｉｄ等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅａｒｔ ＆ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｏｔａｔｉｏｎ １６（１０）：１０５４−１０６１， １９９７）は、イヌ左肺アログラフトにおけるＳｌｅ（ｘ）アナログであるＣＹ−１５０３（３５ｍｇ／ｋｇ静注ボーラス）のＰＭＮＬ遊走および再潅流傷害に及ぼす阻害効果を検討した。この場合、レシピエントの逆側右肺動脈および気管支は結索しておいた。この研究では、アログラフトガス交換および血液動態結果は、ＣＹ−１５０３処置群で保存イヌ肺アログラフトにおけるＰＭＮＬ接着、誘導およびその後の再潅流傷害が低下したと述べ、明確にした。Ｂｉｒｎｂａｕｍ等（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２９（８）：２０１３−２５， １９９７）は、ＣＹ−１５０３処置（３０ｍｇ／ｋｇボーラス静注）でも梗塞径を制限しなかったこと、または冠動脈閉塞３０分および再潅流４時間を受けたウサギにおいて“リフローなし”現象を防止しなかったことを開示している。しかしさらに研究では、ネコモデルにおいてＳｌｅ（ｘ）オリゴ糖が梗塞径を８３％だけ縮小したこと、および内皮細胞へのＰＭＮＬ接着を阻害したことを主張し、明らかにしていた（Ｂｕｅｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９３：１１４０−１１４８， １９９４）；およびイヌモデルにおいては、梗塞径を６７％縮小し、心筋におけるＰＭＮＬ集積を６３％改善したと主張している（Ｌｅｆｅｒｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０：２３９０−２４０１， １９９４）。
【００１３】
さらに、抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂの効果およびＳｌｅ（ｘ）の発現を、３０分の虚血後再潅流させたラット心臓で調べた（Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １８０：３０５−３１０， １９９６）。この研究において、虚血心筋組織の再潅流の結果、血管内皮細胞ならびに筋細胞の管腔表面上でのＳｌｅ（ｘ）の発現が増強されることになった。さらに、抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂの投与は、心筋梗塞程度を有意に低下させた。
【００１４】
癌死亡は、しばしば、原発腫瘍部位ではなく転移癌細胞の遊走による続発腫瘍部位から発生する。多くの癌細胞は、多くの血液細胞と同様、シアリルルイスＸおよび／またはシアリルルイスＡを発現する（Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ７９（９）：１６８６−１６９７， １９９７； Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ． １６（２）：３４７−３５３， ２０００；Ｓｋｏｒｓｔｅｎｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｕｒｏｌ． １６１（４）：１３１６−１３２３， １９９９； Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ． １３４（４）：１２２０−１２２５， １９９３； Ｆａｒｍｅｒｅｔ ａｌ．， Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ ２０（８）：７２６−７３１， １９９８）。
【００１５】
Ｆｕｋｕｄａ等（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０（２）：４５０−４５６， ２０００）は、Ｅセレクチンリガンドのペプチド模倣体がシアリルルイスＸを発現するメラノーマ細胞の肺コロニー化を阻害すると主張している。
【００１６】
接着分子の抗体を用いて動物モデルにおける免疫病態を低下させようと多数の研究が試みられてきたが、これらの手法では、高用量抗体が必要なために、ヒト患者では抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または抗体媒介毒性を結果としてもたらすかもしれない。したがって、接着分子に対する低用量の抗体のような結合作用物質を投与可能とする免疫病態低下のための安全な手法を開発する必要が依然として残っている。
発明の要約
本発明は、免疫病態低下のための組成物を提供する。さらに、本発明は、好適には接着分子に対する結合作用物質である物質を、免疫病態にを患っている（または免疫病態を患いやすい）動物に投与する方法を提供し、接着分子は、好適には、白血球または癌細胞の血液から周辺組織への溢出に関与する接着分子である。本発明の組成物および方法によれば、実質的に低用量の前記物質は、処置動物における抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または抗体媒介毒性を発生するリスク低減を可能とする。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、免疫病態を患っている動物における免疫病態を減少させる方法であって、動物に対して、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子に特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を投与することを含み、ここで、結合作用物質は動物の結合作用物質に対する免疫応答を誘発する。好適には、前記動物は、家畜である。さらに好適には、前記動物はヒトのような哺乳類である。
【００１８】
本発明の第１態様のいくつかの実施態様において、前記接着分子は、炭水化物エピトープを含む分子である。一つの実施態様において、前記炭水化物エピトープは、シアリルルイスＸまたはシアリルルイスＡである。いくつかの実施態様において、前記接着分子はセレクチンである。好適な実施態様において、前記セレクチンはＰセレクチンまたはＥセレクチンである。
【００１９】
本発明の第１態様の一つの実施態様において、前記免疫病態は炎症である。一つの実施態様において、前記血液性細胞は白血球である。一つの実施態様において、前記白血球はリンパ球、好中球、多形核白血球および単球から構成される群から選択される。
【００２０】
本発明の第１態様の一つの実施態様において、前記免疫病態は癌である。一つの実施態様において、血液性細胞は癌細胞である。一つの実施態様において、前記癌細胞は、乳癌細胞、メラノーマ細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞から構成される群から選択される。
【００２１】
第１態様の種々の実施態様において、前記結合作用物質は、モノクローナル抗体のような抗体である。好適には、前記結合作用物質はマウスモノクローナル抗体である。
【００２２】
本発明の第１態様の一つの実施態様類において、前記免疫応答の結果、前記結合作用物質に特異的に結合する抗体が産生される。一つの実施態様類において、前記免疫応答の結果、前記接着分子に特異的に結合する抗体が産生される。いくつかの実施態様において、前記免疫応答は、体液および細胞性免疫応答を含む。
【００２３】
第１態様の種々の実施態様において、前記結合作用物質の治療有効量は、動物において抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない結合作用物質投与量である。一つの実施態様において、前記結合作用物質の治療有効量とは、動物において抗体媒介毒性を誘発しない結合作用物質投与量である。一つの実施態様において、前記結合作用物質の治療有効量とは、動物３０ｋｇ体重あたり約８ｍｇ未満である。
【００２４】
本発明の第２の態様は、免疫病態を患っている動物における免疫病態を減少させる組成物であって、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子に特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を含み、ここで、結合作用物質は動物の結合作用物質に対する免疫応答を誘発する。好適には、前記動物は家畜である。さらに好適には、前記動物は、ヒトのような哺乳類である。
【００２５】
本発明の第２態様のいくつかの実施態様において、前記接着分子は、炭水化物エピトープを含む分子である。一つの実施態様において、前記炭水化物エピトープは、シアリルルイスＸまたはシアリルルイスＡである。いくつかの実施態様において、前記接着分子はセレクチンである。好適な実施態様において、前記セレクチンは、ＰセレクチンまたはＥセレクチンである。
【００２６】
本発明の第２態様の一つの実施態様において、前記免疫病態は炎症である。一つの実施態様において、前記血液性細胞は白血球である。一つの実施態様において、前記白血球は、リンパ球、好中球、多形核白血球および単球から構成される群から選択される。
【００２７】
本発明の第２態様の一つの実施態様において、前記免疫病態は癌である。一つの実施態様において、血液性細胞は癌細胞である。一つの態様において、前記癌細胞は、乳癌細胞、メラノーマ細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞から構成される群から選択される。
【００２８】
第２態様の種々の実施態様において、前記結合作用物質は、モノクローナル抗体のような抗体である。好適には、前記結合作用物質は、マウスモノクローナル抗体である。
【００２９】
本発明の第２態様の一つの実施態様において、前記免疫応答の結果、前記結合作用物質に特異的に結合する抗体が産生される。一つの実施態様において、前記免疫応答の結果、前記接着分子に特異的に結合する抗体が産生される。いくつかの実施態様において、前記免疫応答は、体液および細胞性免疫応答を含む。
【００３０】
第２態様の種々の実施態様において、前記結合作用物質の治療有効量は、動物において抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発しない結合作用物質投与量である。一つの実施態様において、前記結合作用物質の治療有効量とは、動物において抗体媒介毒性を誘発しない結合作用物質投与量である。一つの態様において、前記結合作用物質の治療有効量とは、動物３０ｋｇ体重あたり約８ｍｇ未満である。
【００３１】
前記本発明の第２態様の一つの好適な実施態様において、前記組成物はまた、製薬的に許容できる担体を含む。
【００３２】
本発明は、第３の態様として、動物に対して治療有効量で投与した時に、この動物における炎症を低下させ、かつ癌を縮小させることができる物質を含む治療用組成物を提供する。好適には、前記物質は結合作用物質である。
【００３３】
本発明の第４の態様は、癌または炎症を患っているか、または癌および炎症を患いやすい動物において免疫病態を減少させるための方法であって、動物に対して、動物中において炎症を低下させ、かつ癌を縮小させることができる物質の治療有効量を投与することを含む。好適には、前記物質は、結合作用物質である。
【００３４】
本発明によれば、接着分子に特異的に結合することが判明した結合作用物質のような本発明の物質を治療有効量、炎症、癌を患っているか炎症または癌を患いやすい動物に投与できる。たとえば、シアリルルイスＸに特異的に結合する抗体を治療有効量、製薬的に許容できる担体（例えば、生理学的無菌生理食塩水）とともに、いかなる疾患兆候（例えば、壊死）をも結果的に緩和させようとして、炎症を患っている患者に対していかなる投与経路でも投与することができる。たとえば、本発明の物質は、皮下、静脈内、腹腔内、動脈内、皮内、または筋肉内に運搬させることができる。製薬的に許容できる担体類およびそれらの処方類は周知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｅｄ． Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ， １９９０）に総括的に記載されている。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明者は炎症を減少させる方法および治療用組成物を開発した。本発明の方法および治療用組成物は分析手段として、そして治療手段として有用である。本発明はまた、副作用の発生をより少なくしながら、治療すべき状態（単数または複数）に適合するように操作し、そして微調整できる方法および治療用組成物も提供する。本明細書に記載した技術の一般的な原理を述べている標準的な参考研究にはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （Ｅｄ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９５；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｅｄ．， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９１が含まれる。免疫学および炎症の一般的な原理を述べている標準的な参考研究にはＧａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｋｕｂｙ，Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９７； Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；およびＨｕｒｌｅｙ， Ｊ．Ｖ．， Ａｃｕｔｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３が含まれる。
【００３５】
本明細書で参照した公開特許および科学文献は当該技術分野の熟練者に利用可能な知識を確立している。本明細書で引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開された外国特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、あたかもこれらの各々を特定的にそして個々に参照して組み入れるように指示されているかのように、同じ程度に参照して本明細書に組み入れる。これらの刊行物と本発明の開示間の不一致は全て、本発明の開示に有利に解決すべきである。
【００３６】
第１の態様では、本発明は免疫病態を患っているか、または免疫病態を患いやすい動物の免疫病態を減少させる方法を提供し、そしてこの方法は上記動物に、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちする内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子と特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を投与することを含んでおり、ここで、結合作用物質は動物において結合作用物質に対する免疫応答を誘導する。好ましくは、結合作用物質は製薬的に許容可能な担体と一緒に投与される。
【００３７】
第２の態様では、本発明は免疫病態を患っているか、または免疫病態を患い易い動物の免疫病態を減少させる治療用組成物を提供し、そしてこの組成物は、血液性細胞の表面で発現されるかまたは血液性細胞から分泌されるか、もしくは血管を裏打ちしている内皮細胞の表面で発現されるかまたは内皮細胞から放出される接着分子と特異的に結合する結合作用物質の治療有効量を含んでおり、ここで、結合作用物質は動物において結合作用物質に対する免疫応答を誘導する。好ましくは、上記組成物は製薬的に許容可能な担体を更に含んでいる。
【００３８】
第３の態様では、本発明は、治療有効量を動物に投与したとき動物の炎症を減少させ、かつ癌を減少させ得る作用物質を含んでいる治療用組成物を提供する。好ましくは、上記組成物は製薬的に許容可能な担体を更に含んでいる。
【００３９】
第４の態様では、本発明は癌または炎症を患っているか、または癌や炎症を患い易い動物の免疫病態を低下させる方法を提供し、この方法は上記動物に、動物の炎症を減少させ、かつ癌を減少させ得る作用物質の治療有効量を投与することを含んでいる。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「作用物質」とは天然に生起するか、または合成することができる任意の大きさの分子を意味する。それ故、作用物質には化学製品、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、酸、塩基、合成ポリマーおよび樹脂が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「免疫病態」とは癌および／または炎症を意味する。「免疫病態を患い易い」とは、遺伝子的または環境的に免疫病態を患い易くされているが、未だ免疫病態を患っていない動物を意味する。例えば、上記動物は、免疫病態、例えばリウマチ様関節炎を一層発現させ易くしている或るタイプのＭＨＣハプロタイプを有している可能性があるが、未だその状態を発現していない。もう１つの例は、強い日光に暴露されているが未だ日光皮膚炎を発現していない動物である。もう１つの例は、発癌物質に暴露されているが、未だ癌を発現していない動物である。
【００４２】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、上記免疫病態は癌である。本発明によれば、「癌」とは動物の異常細胞が過剰増殖し、その結果、転移細胞が血流を介して異常細胞の最初の解剖学的部位から身体内の他の部分に移動することを意味する。本発明によれば、動物が癌を患っていると診断されるためには、転移細胞の移動によって生じる癌の二次的部位を検出する必要はない。むしろ、動物（例えば、ヒト）は細胞増殖の生検を受けることができる。生検組織を医師が検査しそして生検細胞が悪性であるらしい（即ち、転移の能力がある）と評価されたとき、この動物は本発明に従って治療することができる。
【００４３】
本発明の１つの非限定的な癌はメラノーマである。本発明の他の非限定的な癌には乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、頚癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌が含まれる。
【００４４】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、上記免疫病態は炎症である。本発明によれば、「炎症」とは、毛細管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱および疼痛の任意のものまたはこれら全てによって特徴付けられ、そして炎症誘導抗原や損傷組織の消失を開始するメカニズムとして作用する細胞損傷に対する局所的応答を意味する。この用語には急性炎症、慢性炎症および過剰炎症、例えば炎症性疾患に至るようなものが含まれる。
【００４５】
急性炎症は急速な開始を示し、そして短期間のものである。急性の局所炎症性応答の特徴的な徴候には一般的に膨潤、発赤、発熱、疼痛および機能喪失が含まれる（Ｋｕｂｙ， Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ． Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３６１−３７７， １９９７）。組織中への白血球浸潤は急性の炎症性応答の最初の６時間以内にピークに達し、そしてこれらは殆ど、２４〜４８時間以内に炎症領域から消失する（Ｋｕｂｙ， Ｊ．，上述）。
【００４６】
慢性炎症は、感染または種々の病理学的状態による抗原の持続中に発現する。慢性炎症の特徴的な特質は肉芽腫の形成である。慢性炎症領域の血管外組織中には多数の異なるタイプの細胞を見ることができ、そしてこれらには好中球、好酸球、マクロファージ、上皮様細胞、形質細胞、リンパ球および線維芽細胞の任意のもの、または全てが含まれる（Ｈｕｒｌｅｙ， Ｊ．Ｖ．， Ａｃｕｔｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １３５−１４４， １９８３）。
【００４７】
宿主組織による「外来」としての異常な認識か、またはそれとは異なる正常な炎症応答からの逸脱のどちらかに続発する過剰炎症から炎症性疾患になる（Ｇａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８）。急性および慢性炎症の形態は大部分、体液および細胞応答漸増の結果として増大するだけでなく拡大する（Ｇａｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，上述）。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「免疫病態を減少させる」とは、本発明の作用物質（例えば、結合作用物質）が、免疫病態を患っている（または免疫病態を患い易い）動物（例えば、太陽に暴露されているが、未だ日光皮膚炎を発現していない動物；発癌物質に暴露されているが、未だ癌を発現していない動物；または遺伝子的に免疫病態を発現し易いが、未だ免疫病態を発現していない動物）に投与したとき、この動物における免疫病態の症状を緩和し、そして／またはその開始を防止する能力を意味する。好ましくは、症状緩和および／または開始防止は、本発明の作用物質が投与されていない動物における免疫病態と比較したとき、処置を受けた動物では減少させられる。好ましくは、本発明の結合物質を投与されている動物における免疫病態の減少は、非処置動物と比較したとき、少なくとも１０％の低下であり；更に好ましくは上記の減少は少なくとも２５％の低下であり；更に一層好ましくは、上記の減少は少なくとも５０％の低下であり；更に一層好ましくは、上記の減少は少なくとも７５％の低下であり；そして最も好ましくは、本発明の結合作用物質を投与されている動物における免疫病態の減少は、非処置動物（即ち、本発明の結合作用物質が投与されていない動物）と比較したとき、少なくとも１００％の低下である。動物における免疫病態（その際、この免疫病態は炎症である）の量を測定する方法には、発赤の目視検出およびカリパス方法または以下で記載する水置換方法による膨潤測定が含まれるが、これらに限定されない。動物における免疫病態（その際、この免疫病態は癌である）の量を測定する方法には、転移癌細胞の存在の検出および癌細胞誘導性血管新生の検出が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、免疫病態を患っている動物は好ましくは家畜動物であり、そしてこれには家禽（例えば、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、シチメンチョウ、コーニッシュ種ニワトリおよびダチョウ）、家畜（例えば、ウシ、ラマ、ゾウ、ラクダ、ブタおよびヒツジ）、ペット（例えば、ウマ、ネコ、イヌ、フェレット、ハムスターおよびモルモット）；並びに実験動物（例えば、霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル）および齧歯類（例えば、マウス、ラット））が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の上記の第１、第２、第３および第４の態様の好ましい実施態様では、上記の免疫病態を患っている動物は哺乳動物である。本発明の上記第１および第２の態様の好ましい実施態様では、上記の免疫病態を患っている動物はヒトである。
【００５１】
本発明で使用するとき、「免疫応答を誘導する」とは、細胞性および／または体液性免疫応答が、投与された本発明の結合作用物質に向けられるように、この結合作用物質を投与されている動物において上記免疫応答が誘導されるか、または高められていることを意味する。それ故、本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の好ましい実施態様では、上記免疫応答は体液性および細胞性免疫応答の両方を含んでいる。
【００５２】
上記のような免疫応答の存在は周知の免疫応答検出方法のいずれかで検出することができ、そしてこれらにはＴ細胞レセプターが上記結合作用物質および／または接着分子（主要組織適合遺伝子複合体の文脈で）と特異的に結合するＴ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞）の存在の検出、Ｂ細胞レセプター（即ち、表面で発現されるＩｇＭ）が上記結合作用物質および／または接着分子と特異的に結合するＢ細胞の存在の検出、並びに上記結合作用物質および／または接着分子と特異的に結合する（任意の血清型の）抗体の存在の検出が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、上記免疫応答によって上記結合作用物質と特異的に結合する抗体が産生される。上記結合作用物質と特異的に結合するような抗体は、投与された結合作用物質に対する処置動物内での免疫応答の結果として産生される。このような免疫応答を説明する１つの非限定的な理論は、Ｊｅｒｎｅ（Ｊｅｒｎｅ， Ｎ．Ｋ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １２５Ｃ：３７３−３８９， １９７４）によって最初に記載されたイディオタイプカスケードである。抗体のイディオタイプカスケードを説明しているこの理論では第１の抗体は腫瘍関連抗原と特異的に結合し、そしてこの理論は図２で説明されている（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：９８２−９９１， １９９８）。
【００５４】
この理論を本発明に適用すると、接着分子と特異的に結合する投与された結合作用物質（例えば、抗体）はＡｂ１と呼称される。Ａｂ１は接着分子上のエピトープ決定基と反応する。本発明の結合作用物質が投与されている動物はその結合作用物質に対する免疫応答を産生する。この免疫応答が上記結合作用物質と結合する抗体を含んでいる場合、これらの抗体はＡｂ２と呼称される。或るＡｂ２抗体（即ち、Ａｂ２β）はＡｂ１の接着分子結合部位を認識し、そしてＡｂ１によって認識される最初の接着分子エピトープに似ている。他のＡｂ２抗体は可変領域上のどこかに存在する部位を認識し、そして上記結合部位と干渉できる（Ａｂ２γ）か、または干渉できない（Ａｂ２α）（Ｓｔｅｉｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１：３５１６−３５２２， １９８８）。
【００５５】
更に、イディオタイプネットワーク理論では、各Ａｂ２が更なる抗体（Ａｂ３）の抗原として作用するであろうと仮定された。このＡｂ３抗体は、最初の結合作用物質（Ａｂ１）と同様に、Ａｂ１が特異的に結合した接着分子と特異的に結合する。それ故、本発明の上記第１および第２の態様の一つの好ましい実施態様では、上記免疫応答によって接着分子と特異的に結合する抗体が産生される。
【００５６】
１つの非限定的な例では、セレクチン（例えば、Ｅ−セレクチン）特異的結合作用物質（Ａｂ１）を免疫病態（その際、この免疫病態は炎症である）を患っている動物に注入すると、２つの異なるメカニズムによって、血管壁を裏打ちしている内皮細胞上での白血球（即ち、白血球細胞）ローリングを阻害することができる。この非限定的な例の第１のメカニズムは、白血球表面上または内皮細胞膜上のどちらかでセレクチンを遮断するように作用し、そしてセレクチンリガンド（例えば、シアリルルイスＡ）を有する細胞による結合にセレクチンを利用できないようにするＡｂ１の直接的な効果に依存している。Ａｂ１の効果は直接的であるが、残念なことに、Ａｂ１が循環から急速にクリアランスされるためこの効果はまた短期間でもあろう（Ａｂ１は通常、循環内に数時間または数日間しか残存しなかった）。第２のメカニズムは抗イディオタイプ（Ａｂ２）および抗抗イディオタイプ（Ａｂ３）Ａｂの誘導に依存している。Ａｂ２はセレクチンを模擬しているので、Ａｂ２とセレクチン分子との結合によってセレクチンとセレクチンの天然リガンド間の相互作用を阻害することができる。Ａｂ３はＡｂ１と同様に作用し、そしてそのセレクチンによって結合されている天然に存在する炭水化物セレクチンリガンドと競合し、そしてその結果、競合的阻害によってセレクチンとセレクチンリガンド間の相互作用を阻害することができる。
【００５７】
もう１つの非限定的な例では、炭水化物セレクチンリガンド（例えば、シアリルルイスＡ）特異的結合作用物質（Ａｂ１）を免疫病態（その際、この免疫病態は癌である）を患っている動物に注入すると、２つの異なるメカニズムによって、血管壁を裏打ちしている内皮細胞上での転移性癌細胞（例えば、メラノーマ細胞）ローリングを阻害することができる。第１のメカニズムは、白血球表面上または内皮細胞膜上のどちらかでセレクチンリガンドを遮断するように作用しそしてセレクチンを有する細胞による結合にセレクチンリガンドを利用できないようにするＡｂ１の直接的な効果に依存している。Ａｂ１の直接的な効果は直接的であるが短期間であるかもしれない。第２のメカニズムは、セレクチンリガンドを模擬している抗イディオタイプ（Ａｂ２）抗体およびセレクチンリガンドと特異的に結合するＡｂ１抗体を模擬している抗抗イディオタイプ（Ａｂ３）抗体の誘導に依存している。Ａｂ２はセレクチンリガンドを模擬しているので、Ａｂ２とセレクチン分子との結合によって内皮細胞上での癌細胞ローリングおよび管外遊出を阻害する。Ａｂ３は炭水化物セレクチンリガンドとの結合で、天然に存在するセレクチン分子と競合することによって癌細胞ローリングおよび管外遊出を阻害することができる。
【００５８】
Ａｂ２およびＡｂ３の効果（即ち、Ａｂ１の間接的な効果）は、Ａｂ２およびＡｂ３抗体が処置動物で産生され、そしてかなりの期間（通常、数カ月）循環中に残存するので、白血球または癌細胞移動の阻害に対するＡｂ１の直接的な効果より効率的である。
【００５９】
本明細書で使用するとき、用語「治療有効量」は、処置動物において免疫病態を減少させるのに有効な結合作用物質の投与量および／または処置動物において結合作用物質に対する免疫応答を誘導するのに有効な結合作用物質の投与量を意味するために使用される。好ましくは、このような投与は静脈内、動脈内、皮下、非経口または経皮であろう。好ましくは、本発明の結合作用物質は、処置すべき動物の体重３０ｋｇ当たり約８ｍｇ未満；好ましくは、体重３０ｋｇ当たり約５ｍｇ未満；好ましくは、体重３０ｋｇ当たり約３ｍｇ未満；更に一層好ましくは、体重３０ｋｇ当たり約０．５ｍｇから約２ｍｇまで；更に一層好ましくは体重３０ｋｇ当たり約０．５ｍｇから約１．５ｍｇまでの投与量で投与され；そして最も好ましくは、本発明の結合作用物質は処置すべき動物の体重３０ｋｇ当たり約１ｍｇの投与量で投与される。
【００６０】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、結合作用物質の治療有効量は、動物に投与したとき、その処置動物内で抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない結合作用物質の投与量である。本発明の上記第１および第２の態様の一つの好ましい実施態様では、結合作用物質の治療有効量は、動物に投与したとき、その処置動物内で抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない結合作用物質の最大量である結合作用物質の投与量である。これらの実施態様では、ＡＤＣＣは５１Ｃｒ−標識腫瘍細胞を本発明による結合作用物質と共にインキュベートし、そして新鮮なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、続いて４時間インキュベートし、そしてその後特異的な溶解（５１Ｃｒ放出で測定されるような）を測定することによって評価することができる。特異的な溶解が１５％未満である場合、ＡＤＣＣは存在していない。
【００６１】
本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、結合作用物質の治療有効量は、動物に投与したとき、その処置動物内で抗体媒介毒性を誘導しない結合作用物質の投与量である。本発明の上記第１および第２の態様の一つの好ましい実施態様では、結合作用物質の治療有効量は、動物に投与したとき、その処置動物内で抗体媒介毒性を誘導しない結合作用物質の最大量である結合作用物質の投与量である。「抗体媒介毒性」とは、臨床的毒性、例えば異常な血清化学、腎機能損傷、血清病の徴候および症状、またはアナフィラキシーを意味する。抗体媒介毒性は免疫学者に良く知られており、そして例えば、Ａｂｂａｓｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ １９９７（特に４２５−４３４ページ参照）中に記載されている。一つの実施態様では、上記の単回投与量で動物は治療的に処置される。他の実施態様では、上記処置は、例えば、結合作用物質の投与量を１年に４回、３年間またはそれ以上の間投与し続けることができる。１つの例では、結合作用物質の投与量の投与は１カ月当たり１回の注入を約３カ月から数年の間実施される。
【００６２】
本発明によれば、「血液性細胞」とは血流が有することができる任意の細胞を意味する。それ故、この定義には赤血球や白血球のような骨髄由来細胞が含まれ、そしてこれらにはリンパ球（ＴおよびＢの両方）、天然キラー細胞、好中球（多形核白血球またはＰＭＮＬとも呼ばれる）、好酸球、好塩基球、単球、巨核球および血小板が含まれるが、これらに限定されない。最初の異常細胞の部位から移動した（または移動しようとしている）転移性癌細胞も血液性細胞として含まれる。
【００６３】
それ故、上記免疫病態が炎症であるような本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の実施態様では、上記血液性細胞は白血球である。一つの実施態様では、この白血球はリンパ球、血小板、顆粒球（即ち、好中球、好酸球または好塩基球）または単球であるが、これらに限定されない。
【００６４】
上記免疫病態が癌であるような本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の実施態様では、上記血液性細胞は癌細胞である。血流が有する癌細胞は全て本発明に含まれる。一つの実施態様では、上記癌細胞は乳癌細胞、メラノーマ細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞であるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「接着分子」とは、血液性細胞または血管を裏打ちしている細胞（例えば、内皮細胞）のどちらかの表面で発現されるか、またはこれら細胞のどちらかから放出され、そして血液性細胞または血管を裏打ちする細胞のどちらかの表面で発現されるもう１つの接着分子との結合を形成し得る分子を意味する。「から放出される」とは、指定された細胞の細胞表面から開裂されるか、指定された細胞によって分泌されるか、または指定された細胞の溶解によってその細胞から放出される接着分子を意味する。好ましくは、本発明の接着分子は、血液性細胞または血管を裏打ちしている内皮細胞のどちらかの表面で発現されるか、またはこれら細胞のどちらかから放出され、そして血液性細胞または血管を裏打ちしている内皮細胞上の第２の接着分子との結合を形成する分子であり、その結果、この結合は、血液性細胞から発現されるか、または放出された接着分子と内皮細胞から発現されるかまたは放出された接着分子の間に形成される。好ましくは、本発明の接着分子は、血液から周囲組織中への白血球または癌細胞の管外遊出に関与している分子である。好ましくは、「接着分子」の定義からは、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、および／またはＢ細胞レセプター複合体（例えば、Ｉｇ−α）やＴ細胞レセプター複合体（例えば、ＣＤ３）を含んでいるシグナル形成分子が除外される。結合作用物質によって特異的に結合される本発明の接着分子上の部位は「エピトープ」と呼ばれる。
【００６６】
接着分子の非限定的な例には、タンパク質のインテグリンファミリーのメンバーである分子が含まれ、そしてこれらにはＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）およびＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）が含まれるが、これらに限定されない。接着分子にはまた、タンパク質の免疫グロブリン遺伝子ファミリーのメンバーである分子も含まれ、そしてこれらにはＩＣＡＭ−１、Ｂ７、ＣＤ４およびＣＤ２８が含まれるが、これらに限定されない。接着分子にはまた、分子のセレクチンファミリーのメンバーである分子も含まれ、そしてこれらにはＰ−セレクチン（ＥＬＡＭ−１、ＣＤ６２Ｅ）、Ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭ−１、ＣＤ６２Ｅ）およびＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９１：３７０−３８７， １９９３）が含まれるが、これらに限定されない。それ故、本発明の上記第１および第２の態様の一つの実施態様では、上記接着分子はセレクチン、例えばＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンまたはＬ−セレクチンである。
【００６７】
本発明の接着分子にはまた、糖タンパク質、例えばＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１）、およびシアリルルイスＡ（Ｓｌｅ（ａ））炭水化物エピトープおよびシアリルルイスＸ（Ｓｌｅ（ｘ））炭水化物エピトープを含む炭水化物エピトープを含んでいる分子（例えば、ムチンまたはムコタンパク質）も含まれる。それ故、本発明の上記第１および第２の態様の一つの実施態様では、本発明の接着分子は炭水化物エピトープを含んでいる分子、例えば、シアリルルイスＡエピトープを含んでいる分子である。好ましくは、炭水化物エピトープを含んでいる分子はセレクチン分子によって特異的に結合される。
【００６８】
本発明の上記第３および第４の態様の種々の実施態様では、上記作用物質は接着分子と特異的に結合する結合作用物質である。
【００６９】
本発明で使用するとき、「結合作用物質」とは、水中、生理学的条件下（例えば、動物の体内）、またはイオン強度に関して生理学的状態に近似する条件下、例えば、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２下のどちらかで接着分子と特異的に結合する分子または巨大分子を意味する。「特異的に結合する」とは、本発明の結合作用物質は本発明の接着分子を認識し、そしてそれらと共有結合または好ましくは非共有結合を形成するが、試料中の他の分子、例えば接着分子でないタンパク質を実質的に認識せず、そしてそれらと共有または非共有結合を形成しないことを意味する。同様に、本発明の接着分子と特異的に結合する本発明の結合作用物質によって結合される本発明の接着分子は、上記結合作用物質によって「特異的に結合される」と言われる。好ましくは、本発明の接着分子と特異的に結合する本発明の結合作用物質は、少なくとも１０６Ｍ−１、更に好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、更に一層好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、そして最も好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１の親和性で上記接着分子と結合を形成する。
【００７０】
一つの実施態様では、本発明の結合作用物質はペプチド、ペプチド模擬物または炭水化物である。「ペプチド」とは、ペプチド結合によって直線的配列で互いに結合した２個またはそれより多くのアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味する。「ペプチド模擬物」とは、ペプチドの構造および／または機能を模擬している非ペプチド分子を意味する。「炭水化物またはオリゴ糖」とは、糖残基を含んでいる分子を意味する。炭水化物である結合作用物質にはＳｌｅ（ｘ）オリゴ糖（Ｂｕｅｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９３：１１４０−１１４８， １９９４； Ｌｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０：２３９０−２４０１， １９９４）およびＳｌｅ（ａ）オリゴ糖が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の結合作用物質には抗体が含まれるが、これらに限定されない。それ故、本発明の上記第１、第２、第３および第４の態様の一つの実施態様では、上記結合作用物質は抗体、例えばモノクローナル抗体である。一つの好ましい実施態様では、上記結合作用物質はマウスモノクローナル抗体である。
【００７２】
例えば、本発明のモノクローナル抗体、ＨＢ１（ＡＬＴ−１とも呼ばれる）はＨＢ１ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるマウスＩｇＭモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＨＢ１は炭水化物エピトープのシアリルルイスＡを含んでいる腫瘍マーカー、ＣＡ１９−９と特異的に結合する（Ｍｕｋａｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４８（３）：７４４−７５１， １９９３）。イムノアッセイ分析によって、ＨＢ１はシアリルルイスＡとも特異的に結合することが明らかにされた。ＨＢ１ハイブリドーマ細胞は標準的な培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で維持された。
【００７３】
本発明のもう１つの抗体はＨＢ２（ＡＬＴ−３とも呼ばれる）、即ちＨＢ２ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるＩｇＧ３マウスモノクローナル抗体であるが、これに限定されない。ＨＢ２は腫瘍マーカーのＣＡ１９−９と特異的に結合し、そしてまたシアリルルイスＡと特異的に結合することも示されている。ＨＢ２ハイブリドーマ細胞は標準的な培地中で維持された。
【００７４】
抗体である更に追加的な結合作用物質にはＰＢ１．３、即ち抗Ｐセレクチンモノクローナル抗体（Ｗｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｃｋ ５（５）：４０２−４０７， １９９６； Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４６：２２２−２２４， １９９８）；ＡＲＰ２−４１、即ち抗ラット−Ｐ−セレクチンｍＡｂ（Ｔｏｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（４）：４６３−４６９， １９９６； Ｏｈｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３４：１６１−１７０， １９９６）； ＢＢＩＧ−Ｅ５、即ち抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ（Ａｌｔａｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７０：４５−５１， １９９４）； ＤＲＥＧ−２００、即ち抗Ｌ−セレクチンｍＡｂ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：６４９−６５８， １９９３）； ＭＥＬ−１４、即ち抗Ｌ−セレクチンｍＡｂ（ＭＥＬ−１４）（Ｐｉｚｃｕｅｔａ ａｎｄ Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４５（２）：４６１−４６７， １９９４）；抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂ（Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １８０：３０５−３１０， １９９６）； 抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂ（抗ヒトおよびラット）（クローン番号２Ｈ５；カリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から商業的に入手可能）；抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂ（クローン番号ＣＳＬＥＸ；カリフォルニア州サンノゼのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手可能）；抗Ｓｌｅ（ｘ） ｍＡｂ（クローン番号ＣＳＬＥＸ１；マサチューセッツ州デッドハムのＳｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．社から商業的に入手可能）；抗ＰＳＧＬ−１（ＣＤ１６２）抗体（例えば、メイン州サコのＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｌ．社から商業的に入手可能（例えば、クローン番号３Ｅ２．２５．５（ＰＬ１）（カタログ番号Ｐ９１０９０Ｍ）およびクローン番号５Ｄ８．８．１２（ＰＬ２）（カタログ番号Ｐ９１２０９Ｍ））、およびメイン州サコのＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｌ．社から商業的に入手可能な種々の抗Ｓｌｅ（ａ） ｍＡｂ（例えば、クローン番号２４１（カタログ番号Ｍ３７２４１Ｂ）；クローン番号５９（９５−３３０−０７）（カタログ番号Ｍ３７０５９Ｍ）；クローン番号６２（カタログ番号Ｍ３７０６２Ｍ）；クローン番号６７（カタログ番号Ｍ３７０６７Ｍ）；クローン番号１９２（カタログ番号Ｍ３７１９２Ｍ）；およびクローン番号２３９（カタログ番号Ｍ３７２３９Ｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の更に追加的で結合作用物質には、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ミネソタ州ミネアポリス）から商業的に入手可能な抗ヒトＥ−セレクチンおよび抗ヒトＰ−セレクチン抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
一つの実施態様では、本発明の結合作用物質は、本発明の接着分子と特異的に結合する抗体またはＴ細胞レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいる。「抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）」とはエピトープと特異的に結合する抗体の部分を意味し、そしてこれはこのような結合に必要な任意のフレームワーク領域を含んでおり、そして好ましくは免疫グロブリン遺伝子Ｈ鎖Ｖ、ＤおよびＪ領域、免疫グロブリン遺伝子Ｌ鎖ＶおよびＪ領域、並びに／またはこれらの任意の組合せによってコード化されているアミノ酸残基のサブセットから構成されている。「Ｔ細胞レセプターの相補性決定領域（ＣＤＲ）」とはエピトープ（例えば、主要組織適合遺伝子複合体の文脈で）と特異的に結合するＴ細胞レセプターの部分を意味し、そしてこれはこのような結合に必要な任意のフレームワーク領域を含んでおり、そして好ましくはＴ細胞レセプターβ鎖遺伝子Ｖ、ＤおよびＪ領域、Ｔ細胞レセプターα鎖遺伝子ＶおよびＪ領域、並びに／またはこれらの任意の組合せによってコード化されているアミノ酸残基のサブセットから構成されている。好ましくは、本発明のＣＤＲはヒトまたはマウス抗体から誘導される。
【００７７】
本明細書で開示されている多数の抗体が与えられると、当該技術分野における通常の知識を有する者は、多様な抗体誘導体を作ることができ、そのような抗体誘導体も本発明の結合作用物質として含まれる。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５， １９８６）はヒト抗体のＣＤＲをマウス抗体から得られるＣＤＲで置換することを開示している。Ｍａｒｘ， Ｊ．Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１２）：４５５−４５６， １９８５）は、マウス可変領域とヒト定常領域を有しているキメラ抗体を考察している。Ｒｏｄｗｅｌｌ， Ｊ．Ｄ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２４５）：９９−１００， １９８９）は抗体ＣＤＲ情報に由来する低分子量認識エレメントを考察している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．Ｐ．（Ｂｒ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３０ Ｓｕｐｐｌ ２：３６−３９， １９９１）は、Ｆｖフラグメント誘導体、一本鎖抗体、融合タンパク質、キメラ抗体およびヒト化齧歯類抗体を含む、遺伝子的に操作したモノクローナル抗体を考察している。Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７， １９８８）は、ラット超可変領域がグラフト化されているヒト抗体を開示している。そしてＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６， １９８８）はヒト抗体へのマウス抗原結合部位のグラフト化を教示している。
【００７８】
更に、本明細書で開示されている多数の抗体が与えられと、当該技術分野における通常の知識を有する者は、このような相補性決定領域と類似するか、またはこれらより優れた結合特性を有するペプチド模擬物を設計し、そして製造することができ、このようなペプチド模擬物も本発明の結合作用物質として含められる。ペプチド模擬物は良く知られており、例えば、Ｈｏｒｗｅｌｌ， Ｄ．Ｃ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４：１５７３−１５７６， １９９６； Ｌｉｓｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｌ． Ｔｒａｖ． Ｃｈｉｍ． Ｐａｙｓ−Ｂａｓ． １：１１３， １９９４； Ｇａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． ｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：１６９９， １９９４）；およびＳｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ７９：９１３， １９９６中に記載されている。
【００７９】
本発明の結合作用物質は好ましくは精製した結合作用物質である。「精製した」とは、結合作用物質が、夾雑物、例えばエンドトキシンを、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、更に一層好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％有していないことを意味する。
【００８０】
本発明の結合作用物質がモノクローナル抗体である非限定的な例では、抗体（例えば、ＨＢ１およびＨＢ２）を精製するために、これらの抗体を腹水から精製した。腹水調製物を得るために、成体マウス（６週齢）は、プリスタン（２， ６， １０， １４−テトラメチルデカン酸）０．５ｍｌを腹腔内に（ｉ． ｐ．）注射して抗原感作した。２週間後これらのマウスに、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再度懸濁した５×１０６個のハイブリドーマ細胞（例えば、ＨＢ１またはＨＢ２）をｉ． ｐ．注射した。腹水液は適当な時間に２〜３回マウスから取り出し、集めた液体を室温で１時間インキュベートし、４℃に一夜移した。この液体を２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清液を−２０℃で貯蔵した。
【００８１】
次いで、上記のモノクローナル抗体を精製し、濃縮した。抗体を精製し、濃縮する種々の方法は当該技術分野における通常の知識を有する者に知られているので、以下の精製方法は抗体を腹水から精製するために使用できる方法の非限定的な例である。これらの方法はまた、標準的な組織培養条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させたハイブリドーマ細胞の上清液から抗体を精製し、濃縮するために使用できることも注目すべきる。
【００８２】
マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）アフィニティークロマトグラフィー精製では、ＩｇＭを含有する腹水液を結合緩衝液（１０Ｍｍ トリス、１．２５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２および０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、ｐＨ７．４）で透析し、その後腹水試料を結合緩衝液で１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、０．２ｍｍのフィルターでろ過した。ＭＢＰカラム（米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ社から商業的に入手可能）を２カラム容量（２０ｍｌ）の溶出緩衝液（１０ｍＭ トリス、１．２５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２％のＮａＮ３）で予め洗浄し、そしてその後４カラム容量（４０ｍｌ）の結合緩衝液で平衡化させた。この腹水液（最大１．５ｍｌ／ゲル５ｍｌ）をカラムに適用し、ゲル内に完全に入れ、４℃で３０分間インキュベートした。このカラムを９カラム容量の結合緩衝液で洗浄して、非結合タンパク質を除去した。洗浄は、結合緩衝液を参照として使用して、吸光度を２８０ｎｍで測定してタンパク質の存在についてモニターした。このカラムを冷却物から取り出し、溶出緩衝液と共に室温で１時間インキュベートし、その後カラムを溶出緩衝液で洗浄し、そして各３ｍｌの容量の最小限１４フラクションを集めた。ＩｇＭの溶出は溶出緩衝液を参照として使用し２８０ｎｍで分光光度計によってタンパク質の存在をモニターした。精製完了時に、カラムを２カラム容量の脱イオン水で、そしてその後４℃の結合緩衝液２カラム容量で洗浄し、４℃で貯蔵した。
【００８３】
ユーグロブリン沈降法はマウスＩｇＧ３およびＩｇＭ ｍＡｂの両者を精製するために使用される非クロマトグラフィー方法であり、この方法はこれらのユーグロブリン特性を利用している。この方法は文献（Ｇａｒｃｉａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１１：１７−２３， １９８８）に実質的に記載されているようにして実施した。簡単に述べると、ＣａＣｌ２を腹水液に加えて（最終濃度、２５ｍＭ）フィブリンを形成させた。凝固物が形成されたときはペーパーろ過で除去した。次いで、ろ過した腹水液を１００倍容量の脱ミネラル水（ｐＨ５．５）に対して２０℃で２時間（ＩｇＧ３）または４℃で１５時間（ＩｇＭ）透析した。この腹水液をＢＥＣＫＭＡＮ Ｌ８−５５超遠心分離機中で、２２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収して１Ｍ ＮａＣｌ／０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中に懸濁した。透析および沈殿を２回繰り返した。高い脂質含有量の精製ペレットを１．７Ｍ ＮａＣｌと混合し、２７，０００×ｇで３時間遠心分離した。脂質上清液を廃棄し、清明化したｍＡｂ溶液を０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８で透析し、２２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。精製したペレットをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に懸濁した。
【００８４】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製では、５ｍｌのプロテインＡカラム（米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ社から商業的に入手可能）を２カラム容量の溶出緩衝液（０．１ｍＭグリシン、１ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ４）で洗浄した。次いで、このカラムを５カラム容量の結合緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ ｔｗｅｅｎ ２００、ｐＨ８）で平衡化させた。ＩｇＧ３抗体を含有する腹水試料を結合緩衝液で１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、上記カラムに０．７５ｍｌ／分の速度で加え、次いでこのカラムを結合緩衝液５０ｍｌを用いて１．５ｍｌ／分の速度で洗浄した。非結合タンパク質を含有する集めたフラクションは、結合緩衝液を参照として使用して、分光光度計で２８０ｎｍで検査した。このカラムを溶出緩衝液１５ｍｌで洗浄した。次いで、溶出フラクションを１ｍｌ／分の速度で集め、５０ｍＭトリス−ＨＣｌを使用してｐＨを７に調整した。結合タンパク質の溶出は、溶出緩衝液を参照として使用して、分光光度計で２８０ｎｍでモニターした。
【００８５】
精製した免疫グロブリンからエンドトキシンを除去するために、１０ｍｌのＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌカラム（米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ社から商業的に入手可能）を、５カラム容量の１％デオキシコール酸ナトリウムでゲルを洗浄して再生した。次いで、このカラムを３カラム容量の発熱物質不含水で洗浄した。精製しそして濃縮した免疫グロブリンを上記カラムに入れ、そしてその後試料は、ＰＢＳを溶出緩衝液として使用して、重力流で集めた。
【００８６】
限外フィルターＹＭ−３０膜（３０，０００ダルトンの分子量カットオフ）（カナダ、オンタリオ州ネピアンのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から商業的に入手可能）は、使用前に、蒸留水を使用しそしてこの水を３回取り替えて１時間浮かべた。次に、この膜を限外ろ過セル内にはめ込み、蒸留水を使用して２０ｐｓｉ（３．７気圧）で少なくとも５分間洗浄した。精製したＩｇの試料を上記セルに入れ、限外フィルター膜を通過する試料流は４０ｐｓｉ（４．７気圧）の最大圧力下で操作した。抗体溶液を約１０倍に濃縮した後、ＰＢＳを使用して少なくとも３回洗浄した。
【００８７】
精製したＦ５ ＩｇＭ、７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２ ＩｇＭおよびＦｌｏｐｃ−２１ ＩｇＧ３ ｍＡｂの定量はＥＬＩＳＡ法で行い、その際プレートはヤギ抗マウスＩｇ（米国ミズーリー州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から商業的に入手可能）で被覆した。注入された抗体は全て、ラット内に注入されたマウス抗体であるので、上記ＥＬＩＳＡ法を使用すると、本発明の処置動物におけるＡｂ２抗体の存在またはラット抗マウス抗体の存在のどちらも検出されたことに注意されたい。このアッセイの概要図は図３に示す。
【００８８】
ＨＢ１ ＩｇＭおよびＨＢ２ ＩｇＧ３ ｍＡｂの定量はＥＬＩＳＡ法で行い、その際にプレートはＣＡ１９−９抗原で被覆した。このＥＬＩＳＡ法を使用するとＡｂ３抗体の存在も検出されたことに注意されたい。このアッセイの概要図は図４に示す。
【００８９】
試験した各ｍＡｂについては、アイソタイプが適合している対照ｍＡｂを標準として使用した。マウスＩｇＧ３ｋモノクローナル抗体Ｆｌｏｐｃ−２１を含有する清浄化腹水はＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（米国ミズーリー州セントルイス）から取得した。対照Ｆ５抗体は、Ｆ５ハイブリドーマ細胞株（米国メリーランド州のＡｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから商業的に入手可能）によって分泌されるマウスＩｇＭモノクローナル抗体である。対照７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２抗体は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓと特異的に結合し、７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２ハイブリドーマ細胞株（米国メリーランド州のＡｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから商業的に入手可能）によって分泌されるマウスＩｇＭモノクローナル抗体である。Ｆ５ハイブリドーマ細胞と７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２ハイブリドーマ細胞は共に標準的な培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で維持した。
【００９０】
ｍＡｂの濃度または結合活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイでは、微量滴定ストリップを、ヤギ抗マウスＩｇ（分子全体）２．５μｇ／ｍｌ、ＣＡ１９−９抗原（カナダ、アルバータ州エドモントンのＡｌｔａｒｅｘ Ｃｏｒｐ．から商業的に入手可能）７５Ｕ／ｍｌ、またはポリアクリルアミド−Ｓｌｅ（ａ）（カナダ、アルバータ州エドモントンのＡｌｔａｒｅｘ Ｃｏｒｐ．から商業的に入手可能）２．５μｇ／ｍｌのいずれかを含有するＰＢＳ １００ｍｌで被覆し、４℃で一夜インキュベートした。被覆溶液を棄て、ウエル上での非特異的結合部位を遮断するために、遮断緩衝液（ＰＢＳ中２％のスクロース、２％のＢＳＡ、０．６％のチメロサール）１５０μｌを各ウエルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ｍＡｂを含有する結合緩衝液１００μｌを種々の希釈で加えた。ウエルは全て室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴ（０．１％のｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．１）で３回洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−標識ＨＲＰ（米国アラバマ州バーミンガムのＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）を含有する結合緩衝液１００μｌを１／５０００（ｖ／ｖ）の希釈で各ウエルに加え、１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３回洗浄した。結合ｍＡｂの活性は、ＡＢＴＳ（ペルオキシダーゼ溶液ＢおよびＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質、１：１（ｖ／ｖ）希釈）１００μｌを各ウエルに加えて測定した（ＡＢＴＳペルオキシダーゼ溶液およびＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（オンタリオ州バーリントン）から商業的に入手可能）。光学密度は、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｐｌｕｓ ＭＫ ＩＩ）を使用して、２つの波長、４０５および４９２ｎｍで測定した。
【００９１】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、精製した各ｍＡｂの純度を検査した。Ａｂ試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（ｐＨ６．８の０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、２０％のグリセロール、１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１０％のｂ−メルカプトエタノールおよび０．５％のブロムフェノールブルー）で１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、９５℃で４分間加熱した。トリス−ＨＣＬレディゲルサンドイッチ（１０％アクリルアミド）（米国カリフォルニア州ハーキュールズのＢｉｏＲａｄ社から商業的に入手可能）をＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＩセルクランプアッセンブリ内に挿入し、適切に整列させた。次いで、上記のゲルサンドイッチをＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＩセル（ＢｉｏＲａｄ社から商業的に入手可能）の内部コアに取り付けた。上部および下部緩衝液室に概ね２００ｍｌの１×実行緩衝液（０．３％のトリス塩基、１．４５％のグリシン、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）を満たした。試料緩衝液中の分子量マーカー６μｌをウエルの１つに適用し、一方、各々３０μｌの容量の抗体試料（１．５〜５μｇの抗体）はゲルの残りのウエルに適用した。コアアッセンブリを下部緩衝液タンクに挿入し、上記ゲルを２００Ｖの一定電圧で約４５分間移動させた。次に、ゲルをゲルサンドイッチから取り出し、染色溶液（１０％の酢酸、０．０２５％のクーマシーブルーＧ−２５０、メタノール４０％）に１．５時間浸漬し、所望の脱色に到達するまで脱染色溶液（１０％の酢酸、４０％のメタノール）中で脱染色した。
【００９２】
本発明の抗体を精製し、その後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した。図５に示されているように、マンナン結合タンパク質アフィニティークロマトグラフ（レーン２および４）で、ユーグロビン沈降法（レーン３および７）で、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（レーン６）で精製した抗体は、本発明の目的では「精製されて」いる（精製モノクローナル抗体の旧試料についてのレーン５および８と比較されたい）。
【００９３】
本発明の結合作用物質がモノクローナル抗体である非限定的な実施態様では、種々のマウスモノクローナル抗体と腫瘍抗原ＣＡ１９−９およびシアリルルイスＡとの結合を測定した。上記されそして図４に概要的に描写されているＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＡ１９−９被覆プレートを使用）を使用して、種々の精製モノクローナル抗体を精製ＣＡ１９−９との結合について試験した。０から０．６４ｍｇ／ｍｌまでのｍＡｂ濃度範囲を使用した。図６に見られるように、ＨＢ１（ＡＬＴ−４）およびＨＢ２（ＡＴＬ−３）ｍＡｂでは共に、僅か１０ｎｇ／ｍｌの濃度であってさえ、ＣＡ１９−９との最大結合が観察され、これはＣＡ１９−９抗原内に多数のシアリルルイスＡエピトープが存在しているためであると思われる。予期されたように、２つの対照ｍＡｂ Ｆ５および７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２はＣＡ１９−９抗原とは結合しなかった。しかしながら、驚いたことに、同一の濃度範囲で使用した対照ｍＡｂ Ｆｌｏｐｃ−２１はＣＡ１９−９と、観察された投与量効果で結合した。
【００９４】
ＨＢ１およびＨＢ２で認識されるエピトープを更に詳細に測定するために、第２のＥＬＩＳＡアッセイを実施し（上記したようにして）、このアッセイでは直接的な結合アッセイを行うためにポリアクリルアミドと抱合した炭水化物抗原Ｓｌｅ（ａ）を使用した。図７に示されているように、ＨＢ１（ＡＬＴ−４）およびＨＢ２（ＡＬＴ−３）ｍＡｂは共に炭水化物エピトープＳｌｅ（ａ）を認識した。加えて、図７は、Ｆｌｏｐｃ−２１ ｍＡｂが、ＨＢ２およびＨＢ１によって認識されるＳｌｅ（ａ）エピトープとは異なるＣＡ１９−９エピトープ決定基に向けられており、そしてその結果Ｓｌｅ（ａ）炭水化物オリゴ糖とは相互作用しないことを示した。
【００９５】
Ｓｌｅ（ａ）に対するＨＢ１ ｍＡｂの特異性も研究した。これを行うために、ＨＢ１を先ず、１２５Ｉで放射線標識した（ヨード化した）。５０μｇのＨＢ１ ｍＡｂを約６００μＣｉのＮａ１２５Ｉと混合した。２．５ｍｇ／ｍｌのクロラミン−Ｔ（ＣＴ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から商業的に入手可能）１０ｍｌを反応バイアルに加え、３０秒間静かに振とうした。次いで、５ｍｇ／ｍｌのメタ重硫酸ナトリウム（Ｎａ−Ｍｅｔ）１０μｌを上記混合物に加え、１５秒間静かに振とうした。最後に、１Ｍのヨード化ナトリウム（ＮａＩ）２０μｌを加え、混合物全体を５秒間静かに振とうした。この反応混合物を、ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡで３回予備洗浄したＤｅｓａｌｔｉｎｇ Ｅｃｏｎｏｐａｃ １０ＤＧクロマトグラフィーカラム（米国カリフォルニア州ハーキュールズのＢｉｏＲａｄ社から商業的に入手可能）に入れた。このバイアルをＰＢＳ １００μｌですすぎ、上記カラムに移した。次に、このカラムをＰＢＳフラクション０．５ｍｌで１２〜１４回洗浄した。各溶出物を番号を付した管に別々に集めた。溶出物の放射能はガイガー・カウンターでモニターした。ｍＡｂを含有するフラクションを集め、標識し、鉛容器に入れ、そして４℃で貯蔵した。プールしたフラクション中の１２５Ｉ標識ＨＢ１ ｍＡｂの定量は、ＣＡ１９−９で被覆したプレートを使用して、上記し（そして図４に描写し）たようにしてＥＬＩＳＡ法で行った。非放射性対照ＨＢ１ ｍＡｂを標準として使用した。
【００９６】
競合的阻害アッセイでは、６５Ｕ／ｍｌの腫瘍抗原ＣＡ１９−９を含有するＰＢＳ ５０μｌで被覆したＲＩＡストリップを４℃で一夜インキュベートした。被覆用溶液を棄てた後、非特異的な結合部位を遮断緩衝液（ＰＢＳ中２％のスクロース、２％のＢＳＡ、０．０６％のチメロサール）１５０μｌ／ウエルで遮断した。これらのウエルを室温で１時間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＳＬｅ（ａ）抗原（米国マサチューセッツ州のＯｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）の希釈物は、０から１００μｇ／ｍｌまでの結合緩衝液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、０．０２％のチメロサール）中で連続的に希釈し、ヨード化したＨＢ１ ｍＡｂと混合した。約４０，０００ｃ．ｐ．ｍ．／ウエルの最終的な１分当たりの計数（ｃ．ｐ．ｍ．）濃度を得るために、ヨード化したＨＢ１（ＡＬＴ−４）ｍＡｂの非飽和濃度（０．３３μｇ／ｍｌ）を選択した。各希釈物１００μｌを種々のウエルに加え、１．５時間インキュベートした。その後、上清液を棄て、上記ストリップをＰＢＳＴで３回洗浄し、個々のウエルに分割しそして放射能を測定した（結合フラクション）。
【００９７】
図８に示されているように、ＳＬｅ（ａ）抗原は競合的阻害によって、高濃度、即ち５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌでだけ、ＨＢ１とＣＡ１９−９抗原との結合をそれぞれ３５％および６０％低下させることができた。ＨＢ１ ｍＡｂとＣＡ１９−９との結合を阻害するためにこのような高濃度のＳｌｅａが必要なのは、ＨＢ１ ＡｂがＩｇＭであり、そしてそれ故、各ＳＬｅ（ａ）分子に対して１０個の結合部位を有しているという事実によるものであろう。加えて、ＣＡ１９−９が有するＳＬｅ（ａ）エピトープに対するＨＢ１ Ａｂの親和性は可溶性のＳＬｅ（ａ）に対するＨＢ１ Ａｂの親和性より高いように思われる。親和性におけるこのような差異は、ＣＡ１９−９が有するＳＬｅ（ａ）のより安定した三次元的立体配置および／またはＣＡ１９−９分子内でＨＢ１によって認識されるより長い配列によるものと思われる。
【００９８】
次にＣａ１９−９抗体に対するＨＢ１（ＡＬＴ−４）の親和性を、ヨード化ＨＢ１ ｍＡｂを使用してスキャッチャード分析で測定した。これを行うために、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）ストリップを、６５Ｕ／ｍｌのＣＡ１９−９抗原を含有するＰＢＳ １００μｌを使用して４℃で一夜被覆した。被覆用溶液を棄てた後、非特異的な結合部位を１５０μｌ／ウエルの遮断緩衝液（ＰＢＳ中２％のスクロース、２％のＢＳＡ、０．０６％のチメロサール）で遮断した。上記ウエルを、静かに振とうしながら室温で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．１％ ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７０１）で３回洗浄した。次いで、各ストリップは０．００５から１０．５μｇ／ｍｌまでの濃度範囲のＩ１２５標識ＨＢ１抗体と共に、結合緩衝液（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、０．０２％のチメロサール）１００μｌ中室温で１時間インキュベートした。次に、ＨＢ１上清液５０μｌを各ウエルから取り出し、ガンマ・カウンターで放射能を測定した（遊離フラクション）。上記ストリップをＰＢＳＴで３回再度洗浄し、個々のウエルに分割し、そして各ウエルの放射能をガンマ・カウンターで測定した（結合フラクション）。
【００９９】
以上のようにして、ＣＡ１９−９抗原に対するヨード化ＨＢ１抗体の親和性は、個々のウエル中の遊離および結合フラクションの放射能をガンマ・カウンターで測定することによって決定した。図９に示されているように、この実験から得られるＫｄ値は０．９４ｎＭであると計算された。
【０１００】
以下の実施例は本発明の或る好ましい実施態様を更に説明するように意図されており、そして全く限定するものではない。当該技術分野における通常の知識を有する者は、定型的な実験しか使用しないで、本明細書に記載されている特定の物質および方法の多数の等価物を認識するか、または確認することができよう。このような等価物は本発明の範囲内であると見なされ、そして以下の特許請求の範囲に包含される。
実施例Ｉ
６週齢、体重２７５−３００グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ （ＳＤ）ラットに腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で２５０ｍｇ／ラットの、キーホール リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）−抱合ＨＢ１ ｍＡｂまたは対照ＫＬＨ−抱合Ｆ５ ｍＡｂを５回注入するか、または単にＰＢＳ注入を投与した。
【０１０１】
血清の採集は各免疫化前に定型的に行った。ラットの尾の先端を僅かに切断し、そして血液を血清分離微量容器中に集めた。この方法の間、ラットはエチルエーテルで麻酔した。集めた血液は３００×ｇで５分間遠心分離し；血清を分離し、そしてＲＡＭＡおよびＡｂ３応答の検出を試験するために使用した。動物は炎症が誘導され、測定されるまで保護下で保持した。
【０１０２】
ｍＡｂの免疫原性を高めるためにｍＡｂをＫＬＨと抱合させた。化学的な抱合は通常は効率的であるが、ｍＡｂの結合活性を低下させると思われる。それ故我々は、各抱合についてＫＬＨ−ｍＡｂの残存結合活性を測定した。これは、ＣＡ１９−９被覆プレートを使用して、上記の、そして図４に概要的に描写されている直接ＥＬＩＳＡ法で行った。
【０１０３】
抗体をキーホール リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）と抱合させるために、ＰＢＳ溶液中に懸濁したＨＢ１ ｍＡｂかまたはＦ５ ｍＡｂ（対照）のどちらか１ｍｇをＫＬＨ（米国ミズーリー州セントルイスのＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から商業的に入手可能）１ｍｇおよびグルタルアルデヒド２ｍｌ（最終濃度、２５％）と混合した。この混合物を室温で１時間インキュベートし、その後グリシン７５ｍｇを上記混合物に加えた。この混合物を更に１時間撹拌し、その後蒸留水で３日間透析した。ＣＡ１９−９抗原に対するｍＡｂの結合活性は、ＫＬＨとの抱合前および後にＣＡ１９−９抗原被覆プレートを使用してＥＬＩＳＡ法で測定し、比較した。
【０１０４】
ラット抗マウス抗体（ＲＡＭＡ）およびＡｂ３応答を各注入間で測定した。Ａｂ２（ＲＡＭＡ）およびＡｂ３体液応答を測定するために使用したＥＬＩＳＡアッセイは上記されており、それぞれ図３および４に示されている。
【０１０５】
次いで、ラットは、最後の抗体注入の５日後にカラゲナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ ｌａｍｂｄａ ｔｙｐｅ ＩＶ（ゼラチン、植物性、Ｉｒｉｓｈ ｍｏｓｓ）； Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から商業的に入手可能）を注入して右後足の急性炎症に付した。ラットの右後足に（足底内に）炎症を誘導するために、０．９％のＮａＣｌ中１％のカラゲナン０．０５ｍｌを、抗体（例えば、ＫＬＨ抱合ＨＢ１、Ｆ５またはＰＢＳ単独）による最後の免疫化の５日後にラットに注入した。これらの動物は注入および炎症測定のためにエチルエーテルで軽く麻酔した。
【０１０６】
足の浮腫は炎症の特徴的な徴候として使用し、カラゲナン注入後一定の時間間隔で、合計８回測定して定量した。足の浮腫は２つの異なる方法で測定した。カリパス方法を使用して足の厚さを測定し、水置換方法を使用して足の容積を測定した。ラットの足の厚さは、カラゲナン注入前および後に所望の時間間隔でカリパスデバイスによってインチで測定した。足の容積は、水を満たしたシリンダー内に足を脛骨足根骨関節まで浸漬して測定し、浸漬した足によって置換された液体容量をカラゲナン注入前および後に所望の時間間隔で測定した。
【０１０７】
炎症性応答結果である足の厚さと足の容積の測定は共に同一の方法で分析した。これらの測定値は、効果の曲線下面積（ＡＵＣ）パーセント変化および最大効果のパーセント変化としてプロットした。「効果のパーセント変化」とは、各ラットにおける炎症測定のゼロ時間から各連続時間までの炎症性応答のパーセント変化を意味する。「効果のＡＵＣ（曲線下面積）パーセント変化」とは、各ラットについての炎症測定のゼロ時間から各連続時間までの炎症性応答のパーセント変化の合計を意味する。効果のＡＵＣパーセント変化の平均はラット群当たりで計算した。「最大効果のパーセント変化」とは、各ラットにおいてゼロ時間から最大炎症が生じている時間までの炎症性応答のパーセント変化を意味する。
【０１０８】
足の厚さの測定結果は、図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；そして図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。足の容積の測定結果は、図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；そして図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。
【０１０９】
足の厚さと足の容積の測定の両方で、最小限の浮腫がＨＢ１群で観察されたが、カリパス方法（Ｐ＝０．６３１）または水置換方法（Ｐ＝０．６５５）で測定された効果の変化におけるこの差異は統計的に有意ではなかった。
【０１１０】
Ａｂ３は試験したラット群のいずれにおいても検出されなかった。ＲＡＭＡ免疫応答の測定で得られた結果は図１４に示す。ＲＡＭＡ応答はＨＢ１ ｍＡｂで処置したラット群の１匹のラットでだけ検出された（ラット番号５、図１５）。ＰＢＳだけを注入した群はｍＡｂを全く投与されなかったので、ＲＡＭＡ応答を有していなかった（図１４）。それ故、ＥＬＩＳＡ法で得られたこの吸光度はバックグランドレベルに相当する（図１４）。Ｆ５対照ｍＡｂ注入群はバックグランドレベルを超える吸光度値を示した。これらの値は抗アイソタイプおよび／または抗アロタイプ免疫応答に相当する（ＨＢ１被覆プレートを使用して実施したアッセイではＦ５抗体に特異的な抗イディオタイプ応答を測定することができない）。ＨＢ１治療用ｍＡｂ注入群は、抗アイソタイプ、抗イディオタイプまたは抗アロタイプ免疫応答（これら免疫応答の中でイディオタイプ応答だけが治療効果を有しているであろう）、またはこれらの組合せのいずれかに相当する、バックグランドレベルを超える吸光度値を示した。
【０１１１】
ＨＢ１群では１匹のラット（ラット番号５）が高いＲＡＭＡ応答を有していた（図１４参照）ことは注目に値する。特に興味深いことに、この特別のラットは炎症性応答を全く発現しなかった（図１０Ｂおよび１２Ｂ参照）。
実施例ＩＩ
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢）にｉ．ｐ．経路で５００μｇ／ラットの、ＫＬＨ−抱合ＨＢ１、対照ＫＬＨ−抱合Ｆ５または対照ＫＬＨ−抱合７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２ ｍＡｂを４回注入するか、または単にＰＢＳ注入を行った。
【０１１２】
ＲＡＭＡおよびＡｂ３応答を各注入間で測定した。炎症の誘導および測定は実施例Ｉに記載したものと同一の方法で行った。足の浮腫は時間間隔を置いて観察し、測定した。
【０１１３】
足の厚さと足の容積の測定結果は実施例Ｉに記載したようにして分析し、プロットした。足の厚さの測定結果は、図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。足の容積の測定結果は、図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。
【０１１４】
足の厚さと足の容積の測定の両方で、最小限の浮腫がＨＢ１注入群で観察されたが、カリパス方法（Ｐ＝０．１３４）または水置換方法（０．０７３）で測定された効果の変化におけるこの差異は統計的に有意ではなかった。
【０１１５】
Ａｂ３は試験したラット群のいずれにおいても検出されなかった。非常に低いＲＡＭＡ免疫応答が対照群（Ｆ５および７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２）で検出された。ＨＢ１注入群は、図３に描写されている方法を使用して、高いＲＡＭＡ免疫応答を有する唯一の群であることが決定された（図１９）。ＨＢ１抗体で処置した群が最も高い免疫応答を有していたという事実にも拘わらず、図１９に示されているように、ＲＡＭＡ応答と治療的有効性の間に有意な相関関係は見られなかった。
【０１１６】
種々の測定時間におけるＨＢ１注入ラットの炎症性応答はＲＡＭＡ（Ａｂ２）応答に対する効果のパーセント変化としてプロットした。図２０Ａ〜２０Ｈに示されているように、ＨＢ１群における治療的有効性とＲＡＭＡ間の相関関係が有意であることは炎症測定のどの時間においても見出されなかった。
実施例ＩＩＩ
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢）に皮下（ｓ．ｃ．）経路で５００ｍｇ／ラットの、ＨＢ１またはＱＵＩＬ Ａアジュバント（米国サンジエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から商業的に入手可能）と混合した対照Ｆ５ ｍＡｂを４回注入するか、または単にＰＢＳ注入を行った。ＲＡＭＡおよびＡｂ３応答は一定の間隔で各注入間で測定した。炎症の誘導および測定は実施例Ｉに記載したものと同一の方法で行った。足の浮腫は一定の時間間隔で観察し、測定した。
【０１１７】
足の厚さと足の容積の測定結果は実施例Ｉと同様にして分析し、プロットした。足の厚さの測定結果は、図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。足の容積の測定結果は、図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。
【０１１８】
足の厚さと足の容積の測定の両方で、最小限の浮腫がＨＢ１群で観察されたが、カリパス方法（Ｐ＝０．２５３）または水置換方法（Ｐ＝０．３５８）で測定された効果の変化におけるこの差異は統計的に有意ではなかった。
【０１１９】
Ａｂ３は試験したラット群のいずれにおいても検出されなかった。ＲＡＭＡ免疫応答は、図３に描写されている方法を使用して、図２５に示されているように治療用ＨＢ１群で検出され、そして対照Ｆ５群ではより少ない程度に検出された。
【０１２０】
炎症性応答の程度は、図２６Ａ〜２６Ｇに示されているように、ＨＢ１群のＲＡＭＡ免疫応答レベルの程度と相互に関係していた。特に興味深いことは、ＲＡＭＡ免疫応答と炎症性応答間の良好な相関関係、即ち、ＲＡＭＡ免疫応答が高ければ高いほど、炎症性応答はより低いことがＨＢ１ラット群で示されたことである。驚いたことに、図２７Ａ〜２７Ｇに示されているように、Ｆ５ ｍＡｂで処置した群においても炎症性応答の程度とＲＡＭＡ応答間に或る相関関係が観察された。
実施例ＩＶ
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６週齢）に静脈内（ｉ．ｖ．）経路で５００μｇ／ラットの、ＨＢ１ ｍＡｂを４回注入するか、または単にＰＢＳを注入した。ＲＡＭＡおよびＡｂ３応答は一定の間隔で各注入間で測定した。炎症の誘導および測定は実験１に記載したものと同一の方法で行った。足の浮腫は一定の時間間隔で観察し、測定した。
【０１２１】
足の厚さと足の容積の測定結果は実施例Ｉと同様にして分析し、プロットした。足の厚さの測定結果は、図２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。足の容積の測定結果は、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。
【０１２２】
足の厚さと足の容積の測定の両方で、最小限の浮腫がＨＢ１群で観察されたが、カリパス方法（Ｐ＝０．１１１）または水置換方法（Ｐ＝０．１８８）で測定された効果の変化におけるこの差異は統計的に有意ではなかった。
【０１２３】
Ａｂ３は試験したラット群のいずれにおいても検出されなかった。
【０１２４】
図３２に示されているように、ＲＡＭＡ免疫応答は治療用ＨＢ１群に属する１匹のラットで検出された（図３に描写されている方法を使用して）。カリパスおよび水置換方法の測定から得られた効果のＡＵＣパーセント変化は、治療用ＨＢ１群の１匹のラットが、それぞれ図２８Ｂおよび３０Ｂに示されているように、最小限の炎症性応答で応答していたことを示した。それ故、図２８Ｂおよび３０Ｂに示されている炎症性応答の程度を図３２の各ラットのＲＡＭＡ免疫応答レベルと比較した。実際には、図３２に示されている最も高いＲＡＭＡ免疫応答を示した同じラットがまた、それぞれ図２８Ｂおよび３０Ｂに示されているように、カリパスおよび水置換方法の両方で測定される最小限の炎症性応答も示した。
実施例Ｖ
ラットにｉ．ｐ．経路で５００ｍｇ／ラットの、ＫＬＨ−抱合ＨＢ２または対照ＫＬＨ−抱合Ｆｌｏｐｃ−２１ ｍＡｂを４回注入するか、または単にＰＢＳを注入した。ＲＡＭＡおよびＡｂ３免疫応答は各注入間で測定した。炎症の誘導および測定は実施例Ｉに記載したものと同一の方法で行った。足の浮腫は一定の時間間隔で観察し、測定した。
【０１２５】
足の厚さと足の容積の測定結果は実施例Ｉに記載されているようにして分析し、プロットした。足の厚さの測定結果は、図３３Ａ、３３Ｂおよび３３Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。足の容積の測定結果は、図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃでは効果のＡＵＣパーセント変化として；図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃでは最大効果のパーセント変化として示されている。
【０１２６】
足の厚さと足の容積の測定の両方で、最小限の浮腫がＨＢ１群で観察されたが、カリパス方法（Ｐ＝０．０７４）または水置換方法（Ｐ＝０．０６５）で測定された効果の変化におけるこの差異は統計的に有意ではなかった。
【０１２７】
Ａｂ３は実施例Ｖで試験したラット群のいずれにおいても検出されなかった。図３に描写されている方法を使用することによって、試験した全ての群は図３７に示されているように最小限（バックグランド）のＲＡＭＡ免疫応答を示した。
実施例ＶＩ
ＨＢ１（ＡＬＴ−４）、ＨＢ２（ＡＬＴ−３）並びに対照モノクローナル抗体Ｆ５（ＩｇＭ）、７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２（ＩｇＭ）およびＦｌｏｐｃ−２１（ＩｇＧ３）とＰＭＮＬおよびリンパ球との結合はＦＡＣＳｃａｎおよび蛍光顕微鏡測定で定量した。ＨＢ１、ＨＢ２および対照ｍＡｂとＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞との結合も蛍光顕微鏡測定で試験した。
【０１２８】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ）は、正常なヒト臍帯静脈から誘導され、Ａｍｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州）から入手される内皮細胞系である。ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＨＥＧＦ、１２ｍｇ／ｍｌのＢＢＥ、１ｍｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、０．０５ｍｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンおよび０．０５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを補充したＭＣＤＢ１３１培地中で維持した。
【０１２９】
ヒト白血球を単離するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌ溶液６ｍｌを１５ｍｌ試験管に加え、そしてその後ヘパリンで処理した新鮮なヒト血液６ｍｌを上記勾配物の頂部に注意して積層した。管を１７００ｒｐｍ（４５０×ｇ）で３５分間室温で遠心分離した。上部界面のバンド（単核細胞）を回収し（５ｍｌ）、そして１０ｍｌの０．４５％ＮａＣｌおよび２０ｍｌのＰＢＳ（８ｍＭのオルトリン酸水素二ナトリウム、３ｍＭのオルトリン酸二水素カリウム、０．１４ＭのＮａＣｌ）と混合した。これらの管を１５００ｒｐｍ（４００ｇ）で１５分間２１℃で遠心分離した。ペレットを回収し、そしてマグネシウムおよびカルシウムを有していないＰＢＳ溶液中３ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＦＢＳ １０ｍｌで３回洗浄し、そして８００ｒｐｍ（２５０×ｇ）で１０分間遠心分離した。ペレットを２ｍｌのＲＰＭＩ＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に懸濁した。ヒトＰＭＮＬを単離する場合には、より下部の界面のバンドを回収し、そして単核細胞と同じようにして処理した。精製した細胞ペレット（単核またはＰＭＮＬ細胞）をＲＰＭＩ培地、５％ＦＢＳ中に１×１０７個の細胞／ｍｌで懸濁し、使用するまで３７℃で保持した。細胞生存性は０．４％トリパンブルーの排除によって測定した。
【０１３０】
ＦＡＣＳ分析では、ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で洗浄した１×１０６個の白血球またはＨＵＶ−ＥＣ−Ｃを、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌの濃度の一次抗体（即ち、ＨＢ１、ＨＢ２、Ｆ５、７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２またはＦｌｏｐｐｃ−２１）と共にインキュベートした。インキュベーションは４℃で実施し、４５分後に細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡで３回洗浄した。次いで、これらの細胞をフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抱合ヤギ抗マウス抗体と共に４℃で４５分間インキュベートし、３回洗浄した。染色した細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ中に再度懸濁した。細胞と結合した蛍光はＦＡＣスキャン・フローサイトメトリー（カリフォルニア州マウンテンビューのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）または蛍光顕微鏡検査のどちらかで分析した。陰性対照としての細胞は、同じ手順に従ったが一次抗体を使用しないでインキュベートした。
【０１３１】
ＦＡＣＳ分析で得られたヒストグラムの例を図３８Ａ〜３８Ｈに示す。陽性対照として使用したＣｏｌｏ ２０５細胞（図３８Ａおよび３８Ｂ）はこれらの表面にシアリルルイスＡエピトープを発現することが知られている。Ｃｏｌｏ ２０５細胞は、ＣＡ１９−９抗原を産生する転移性結腸癌から誘導されたヒト腺癌細胞株である。Ｃｏｌｏ ２０５細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国メリーランド州）から入手し、標準的な培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で維持した。
【０１３２】
図３８Ｃ〜３８Ｈに見られるように、試験したｍＡｂは全て、ヒト好中球との有意な結合を示さなかった。試験した抗体はどれも、ラット好中球またはＨＵＶＥＣ細胞との有意な結合を示さなかった。
実施例ＶＩＩ
次に、本発明の治療用抗体によるマイクロチップ上での白血球ローリングのｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を測定した。これらの試験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ローリングおよび接着をフロー条件下で観察できるチャンネルから構成されているマイクロチップガラスウエーハデバイスとｉｎ ｖｉｖｏ細胞ローリングおよび接着事象を模擬しているプロセスを使用した。
【０１３３】
細胞のローリングと接着を調査するために、このアッセイでは、一連の単純な「Ｙ」ミキサーフロー多岐管を有する１０ｃｍ×１０ｃｍのガラスウエーハを使用した。「Ｙ」ミキサーフロー多岐管は、下流へのフロー領域を有する深さ５０ミクロンおよび幅３００ミクロンのチャンネルから構成されていた。これらのチャンネルは毛細管と同じように構築されているので、このようなチャンネルを使用することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞ローリングおよび接着事象を模擬しているｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞ローリングおよび接着を観察することができる。マイクロチップはアルミニウムマイクロチップホルダー内に確保されており、これらのマイクロチップ容器は５分間エポキシ樹脂でマイクロチップ上に接着した。上記チャンネルは各実験の前および後に濃硝酸（ＨＮＯ３）、２Ｍの硫酸（Ｈ２ＳＯ４）および１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で調節した（各１０分間）。次に、チャンネルを２０μｇ／ｍｌの組換えヒトＥ−セレクチンまたはＰ−セレクチン（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手可能）を使用して３７℃で２時間被覆して、血管壁を裏打ちする内皮細胞の表面を模擬した。負の圧力供給源として操作されるマイクロシリンジポンプを使用して、５０ミクロンの深さのデバイスに対して２．５ｍｌ／分の流速度でチャンネル内に細胞を通過させた。この流速度によって、毛細血管内の血流を模擬するのに十分に高い剪断速度（８００ｓ−１）が確保された。チャンネルは、顕微鏡上に搭載したＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｍｉｃｒｏｓｔａｒ（２５倍、２８０×２２０ｍｍの視野）およびＪＶＣカラーＣＣＤカメラを使用してモニターした（図３９Ａ参照）。これらの実験はＪＶ ＶＨＳレコーダーを使用してテープ上に記録した。
【０１３４】
１×１０７個の細胞／ｍｌの、ＲＰＭＩ、５％ＦＢＳ中に懸濁したヒトＰＭＮＬまたはリンパ球（実施例ＶＩで記載したようにして単離した）溶液を注入経路を通して上記チャンネルにポンプで注入し、そしてローリング段階を達成する目的に最適の流速度で移動させた。各チャンネルは２つの側部を有していたので、各チャンネルの１つの側部を使用して試験作用物質を試験し、チャンネルのもう１つの側部は細胞ローリングの対照として使用し、その際作用物質だけは何も加えなかった（図３９Ｂ参照）。チャンネルの異なる側部に加えられた細胞懸濁液は、これらの細胞懸濁液がチャンネルの異なる側部を動き続けることができ、チャンネルの１つの側部から他の側部への細胞拡散を防止できるルミナール・フルイディック・フロー（ｌｕｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄｉｃ ｆｌｏｗ）によって調節した。
【０１３５】
次の作用物質を１０μｌの容量およびＲＰＭＩおよび５％ＦＢＳ中１：１０の希釈物で試験した：新鮮なヒト血清（陰性対照）、新鮮なラット血清、ＨＢ１ラット血清；およびＦ５ラット血清。１００μｇ／ｍｌの抗ヒトＥ−セレクチン抗体（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手可能）１０μｌをＥ−セレクチン被覆チャンネルの陽性対照として使用した。実施例ＩＩＩから得られるＨＢ１モノクローナル抗体で免疫化したラットの血清は、高いＲＡＭＡ応答を示したラット（集合的に、ラット番号２、４、５、６、７および８）から得た。実施例ＩＩＩから得られるＦ５モノクローナル抗体で免疫化したラットの血清は、高いＲＡＭＡ応答を示したラット（集合的に、ラット番号４、６および７）から得た。ローリング段階が達成されたとき、上記各作用物質１０μｌを異なるチャンネルに加えた。加えた試料をポンプでチャンネル内に吸引して阻害段階を開始した。細胞ローリングおよび阻害段階の画像を種々の時間でとらえ、細胞数をチャンネルの両側部で計数した。非接着細胞はビデオ画像で線として現れた。細胞の計数は知覚ビデオボードおよび画像プロプラス（Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ）ソフトウエアをインストールしたＰＣコンピューターで行った。
【０１３６】
同じ作用物質はまた、Ｐ−セレクチン被覆チャンネルでもＥ−セレクチン被覆チャンネルと同一の条件下で試験した。Ｐ−セレクチン被覆チャンネルでは、抗ヒトＰ−セレクチン抗体（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から商業的に入手可能）を陽性対照として使用した。
【０１３７】
組換えヒトＥ−またはＰ−セレクチン被覆チャンネルでのラット白血球の一定したローリングは存在せず、ラットＥ−およびＰ−セレクチンは入手できなかったので、アッセイはヒト白血球でだけ実施した（そしてラット白血球では実施しなかった）。細胞ローリングおよび阻害段階の画像を種々の時間でとらえ、ローリング細胞をチャンネルの両側部で計数した（図３９Ａおよび３９Ｂ参照）。試験した各作用物質の効果は、作用物質を添加しなかった対照チャンネルのパーセント（１００％）からローリングヒトＰＭＮＬのパーセントとして測定した。
【０１３８】
それぞれ図４０および４１に示されているように、正常なヒト血清はヒトＥ−セレクチンまたはヒトＰ−セレクチン被覆チャンネルではヒトＰＭＮＬローリングの減少を引き起こさなかった。正常なヒト血清の代わりに正常なラット血清を使用して実施した同じ実験で、Ｅ−およびＰ−セレクチン被覆チャンネルの両方で、このような処置によって少数の白血球の接着増加が生じることが顕微鏡観察によって明らかになった。しかしながら、この効果は非常に穏和であったので、それぞれ図４０および４１に示されているように、Ｅ−およびＰ−セレクチン被覆チャンネルのどちらにおいても細胞のローリングに影響を与えなかった。
【０１３９】
抗Ｅ−および抗Ｐ−セレクチンｍＡｂを使用して、それぞれ、Ｅ−セレクチン（図４０）およびＰ−セレクチン（図４１）被覆チャンネルにおけるＰＭＮＬの有効なローリング阻害を証明した。抗Ｅ−セレクチンｍＡｂを添加すると、図４０に示されているように、対照ローリング細胞を有する側部と比較して、僅か１．４％のローリング細胞しか観察されず、そして抗Ｐ−セレクチンｍＡｂを添加すると、図４１に示されているように、１４．４％のローリング細胞しか観察されなかった。それ故、組換えヒトＥ−およびＰ−セレクチン被覆チャンネルにおけるヒトＰＭＮＬ白血球のローリングは抗Ｅ−および抗Ｐ−セレクチンｍＡｂによって有意に阻害された（図４０および４１の「＋ｖｅ対照」）。
【０１４０】
ＨＢ１抗体で免疫化したラット（集合的に、ラット番号２、４、５、６、７および８、実施例ＩＩＩ）から得たＲＡＭＡ陽性血清の１：１０希釈物の添加が、ヒトＥ−セレクチンおよびヒトＰ−セレクチン被覆チャンネルの両方でのＰＭＮＬローリングに対して有意な阻害効果を生じさせた（それぞれ、図４１および４２の［ＡＬＴ−４ラット血清Ａｂ２＋］）ことを観察したのは特に重要であった。実際に、ＨＢ１ラット血清（即ち、陽性のＲＡＭＡ応答を示したラットから得たＡＬＴ−４ラット血清）はＥ−セレクチン被覆チャンネルでのＰＭＮＬのローリングを０％まで減少させ、１００％阻害を生じさせることができた（Ｐ＜０．００１）（図４０参照）。これと同じラット血清は、Ｐ−セレクチン被覆チャンネルでのＰＭＮＬのローリングを１００％から２３．２％に減少させることができた（図４１参照）ので、Ｐ−セレクチン被覆チャンネルで７６％阻害を生じさせた（Ｐ＜０．００１）。正常な血清とは反対に、ＨＢ１抗体で免疫化したラット血清を添加すると、細胞接着または細胞形態学の変化は観察されなかった。
【０１４１】
予期されなかったことに、ＲＡＭＡ陽性対照Ｆ５ラット血清も、組換えヒトＥ−およびＰ−セレクチン被覆チャンネルにおいてＰＭＮＬ白血球のローリング阻害を幾らか示した（図４０および４１の「Ｆ５ラット血清Ａｂ２＋」）。しかしながら、この阻害は、治療用モノクローナル抗体ＨＢ１で観察されたものと比べると殆ど目立たなかった。Ｆ５抗体で免疫化され、ＲＡＭＡ応答で陽性であったラット（集合的に、ラット番号４、６および７、実施例ＩＩＩ）から得た血清の添加は、それぞれ図４０および４１に示されているように、Ｅ−セレクチン被覆チャンネルにおいてＰＭＮＬローリングの４５％減少を引き起こし（Ｐ＜０．００１）；そしてＰ−セレクチン被覆チャンネルにおいてＰＭＮＬローリングの３３％減少を引き起こした（Ｐ＜０．００１）。
実施例ＶＩＩＩ
メラノーマの齧歯類モデルを使用して、メラノーマ減少における本発明の結合作用物質の効果を測定する。マウスメラノーマ細胞株、例えばクローンＢ１６（バージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからカタログ番号ＣＲＬ−６３２２として商業的に入手可能）を同系マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）または免疫不全ヌードマウス（これらは共に、メイン州バーハーバーのＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから商業的に入手可能）の確立された一次部位に、メラノーマ細胞がマウスのこの一次腫瘍部位に腫瘍増殖を確立するのに十分な量で皮下または腹腔内注入する。マウスの最初の群に注入し、そしてメラノーマ細胞の転移が生じるのに必要な時間を記録する。
【０１４２】
ラットの実験群にメラノーマ細胞を注入する。マウスの最初の群から得られる結果に基づいて転移が生じることが知られている時間に、実験群を種々の動物群に分け、その各々に、ＨＢ１、ＨＢ２、ＡＲＰ２−４１、ＤＲＥＧ−２００、ＭＥＬ−１４、ＢＢＩＧ−Ｅ５および抗シアリルルイスＸ抗体を含むが、これらに限定されない本発明の種々の結合作用物質の治療有効量を、皮下、腹腔内または静脈内注入によって投与する。対照抗体には７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２およびＦ５が含まれる。
【０１４３】
メラノーマ細胞の細胞表面かまたは血管壁を裏打ちしている内皮細胞の細胞表面のどちらかで発現される接着分子と特異的に結合する本発明の結合作用物質を注入されたマウスは、対照抗体を注入されたマウスより二次的部位（即ち、一次腫瘍部位とは異なる部位）における腫瘍形成数が減少していることが見い出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
白血球と内皮細胞との接着カスケードにおける異なる段階を示した略図である（Ｄｉａｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ ａｎｄ Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９（４）：１−３， １９９８）。
【図２】
本発明の非限定的理論であるイディオタイプカスケードの略図であり、リガンドおよび／またはレセプターとの反応性を鏡像によって示している。この略図では、細胞（例えば、腫瘍細胞）表面でレセプター抗原に特異的に結合し、これをブロックするＡｂ１（注入抗体）が、ひし形を有するものとして描かれている。その際、注入動物はＡｂ１に対して免疫応答をし、その結果、Ａｂ２が産生されることになり、この略図で“Ｙ”形を有するものとして描かれている。この略図で、Ａｂ２は、レセプターの天然リガンド（実線三角形で示した）に特異的に結合する。Ａｂ２が存在する結果、動物免疫系によって第３の抗体Ａｂ３が産生されることになり、それは五角形を有するものとして描かれており、前記レセプターの天然リガンドを模倣する。
【図３】
Ａｂ２抗体検出のためのＥＬＩＳＡの用途を示した略図である。ラットに注入されるＡｂ１抗体がマウス抗体である場合、このＥＬＩＳＡはまた、ラット抗マウス抗体（ＲＡＭＡ）を検出するであろうということに注目されたい。
【図４】
Ａｂ３検出のためのＥＬＩＳＡの用途を示した略図である。このＣＡ１９−９抗原がシアリルルイスＡ抗原を有していることに注目されたい。
【図５】
精製モノクローナル抗体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元条件下１０％アクリルアミド Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を示した略図である。分子量（ＭＷ）は左側に、レーン１にのせた標準に対して示してある。抗体は下記である。Ｆ５（ＩｇＭ）（レーン２；マンナン結合たんぱく質アフィニティクロマトグラフィで精製）；６Ｃ２Ｃ５Ｃ１２（ＩｇＭ）（レーン３；マンナン結合たんぱく質アフィニティクロマトグラフィで精製）；ＡＬＴ−１４（ＨＢ１とも称される；ＩｇＭ）（レーン４；マンナン結合たんぱく質アフィニティクロマトグラフィで精製）；Ａｌｔ−４（ＨＢ１とも称される；ＩｇＭ）（レーン５；精製抗体の旧サンプル）；Ｆｌｏｐｃ−２１（ＩｇＧ３）（レーン６；プロテインＡアフィニティクロマトグラフィで精製）ＡＬＴ−３（ＩｇＧ３）（レーン７；ユーグロビン沈降法によって精製）；およびＡＬＴ−３（ＩｇＧ３）（レーン８；精製抗体の旧サンプル）。
【図６】
種々の代表的、非限定的マウスモノクローナル抗体（７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２、Ｆ５、ＡＬＴ−３、およびＦｌｏｐｃ−２１（示した濃度における））の本発明の非限定的代表的抗原である固定化腫瘍抗原ＣＡ１９−９への結合を示した略図である。
【図７】
種々の代表的、非限定的マウスモノクローナル抗体類（７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２、Ｆ５、ＡＬＴ−３、およびＦｌｏｐｃ−２１（示した濃度における））の本発明の非限定的代表的抗原である固定化ポリアクリルアミド−シアリルルイスＡオリゴ糖への結合を示した略図である。
【図８】
本発明の非限定的代表的治療抗体であるヨウ素−１２５放射標識ＨＢ１（またＡＬＴ−４とも称される）抗体の本発明の非限定的抗原である固定化ＣＡ１９−９抗原への結合に及ぼす本発明の非限定的代表的抗原であるシアリルルイスＡ抗原の阻害効果を示した略図である。ラジオイムノアッセイプレートには６５Ｕ／ｍｌのＣＡ１９−９を塗布し、０．３３μｇ／ｍＬ（非飽和量）の放射標識ＨＢ１およびシアリルルイスＡ抗原濃度を増加させながら（０−１００μｇ／ｍｌ）インキュベーションした。
【図９】
本発明の非限定的代表的抗原であるＣＡ１９−９への本発明の非限定的代表的治療用モノクローナル抗原であるヨウ素−１２５放射標識ＨＢ１ ｍＡｂ（ＡＬＴ−４とも称される）の結合のスキャッチャード解析を示した略図である。ラジオイムノアッセイストリップには６５Ｕ／ｍｌのＣＡ１９−９を塗布し、放射標識抗体を、０．０００５μｇ／ｍＬから１０．５μｇ／ｍＬの範囲の異なる希釈度のストリップに添加した。ＣＡ１９−９へのＨＢ１抗体のアフィニティは、ガンマカウンターでそれぞれのウェル中における遊離および結合分画の放射能を測定することによって求めた。
【図１０】
図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、カリパー法によって測定した実施例Ｉの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、効果のＡＵＣパーセント変化として示してある。図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、同一データを棒グラフとして（図１０Ａ）、カラム分散として（図１０Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１０Ｃ）示した。
【図１１】
図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、カリパー法によって測定した実施例Ｉの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図では、同一データを棒グラフとして（図１１Ａ）、カラム分散として（図１１Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１１Ｃ）示した。
【図１２】
図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、水置換方法によって測定した実施例Ｉの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、効果のＡＵＣパーセント変化として示してある。図１２Ａ、１２Ｂおよび１２２Ｃでは、同一データを棒グラフとして（図１２Ａ）、カラム分散として（図１２Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１２Ｃ）示した。
【図１３】
図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、水置換方法によって測定した実施例Ｉの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図では、同一データを棒グラフとして（図１３Ａ）、カラム分散として（図１３Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１３Ｃ）示した。
【図１４】
図１４は、実施例Ｉの異なるラット群における炎症応答を有するＲＡＭＡ応答を示した略図である。図１０Ｂおよび１２Ｂは、図１４の下に反復して示され、カリパー法（図１０Ｂ）または水置換方法（図１２Ｂ）で測定した炎症応答程度を免疫応答レベル（図１４）と比較できるようにした。
【図１５】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、同一データを棒グラフとして（図１５Ａ）、カラム分散として（図１５Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１５Ｃ）示した。
【図１６】
図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃは、同一データを棒グラフとして（図１６Ａ）、カラム分散として（図１６Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１６Ｃ）示した。
【図１７】
図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図１７Ａ）、カラム分散として（図１７Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１７Ｃ）示した。
【図１８】
図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図１８Ａ）、カラム分散として（図１８Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図１８Ｃ）示した。
【図１９】
図１９は、実施例ＩＩの異なるラット群における炎症応答を有するＲＡＭＡ応答を示したカラム分散グラフの略図である。図１５Ｂおよび１７Ｂが図１９の下に反復して示されているが、カリパー法（図１５Ｂ）または水置換法（図１７Ｂ）で測定した炎症応答程度を免疫応答レベル（図１９）と比較できるようにした。
【図２０】
図２０Ａ−２０Ｈは、実施例ＩＩにおいて、本発明の非限定的代表的治療用抗体であるＨＢ１抗体で処置したラット群における異なる測定時点におけるＲＡＭＡ応答と炎症応答の相関を示した線グラフの略図である。炎症応答は、カラギーナン投与後１．５時間（図２０Ａ）、２．５時間（図２０Ｂ）、３．５時間（図２０Ｃ）、４．５時間（図２０Ｄ）、５．５時間（図２０Ｅ）、６．５時間（図２０Ｆ）、または７．５時間（図２０Ｇ）に測定した。図２０Ｈにおいて、有効ＡＵＣパーセント変化を、ＲＡＭＡ（Ａｂ２）応答に対してプロットした。
【図２１】
図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は７回行い、その結果を、有効ＡＵＣパーセント変化として示してある。図２１Ａ、２１Ｂおよび２１Ｃは、同一データを棒グラフとして（図２１Ａ）、カラム分散として（図２１Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２１Ｃ）示した。
【図２２】
図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は７回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図２２Ａ）、カラム分散として（図２２Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２２Ｃ）示した。
【図２３】
図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は７回行い、その結果を、有効ＡＵＣパーセント変化として示してある。図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、同一データを棒グラフとして（図２３Ａ）、カラム分散として（図２３Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２３Ｃ）示した。
【図２４】
図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＩＩの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は７回行い、その結果を、最大効果におけるパーセント変化として示してある。図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、同一データを棒グラフとして（図２４Ａ）、カラム分散として（図２４Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２４Ｃ）示した。
【図２５】
図２５は、実施例ＩＩＩの異なるラット群における炎症応答を有するＲＡＭＡ応答を示した略図である。図２１Ｂおよび２３Ｂが図２０の下に反復して示されているが、カリパー法（図２１Ｂ）または水置換法（図２３Ｂ）で測定した炎症応答程度を免疫応答レベル（図２５）と比較できるようにした。
【図２６】
図２６Ａ−２６Ｇは、実施例ＩＩＩにおいて本発明の非限定的代表的治療抗体であるＨＢ１抗体で処置したラット群における異なる測定時点におけるＲＡＭＡ応答と炎症応答の相関を示した略図である。この炎症応答は、カラギーナン投与後１．５時間（図２６Ａ）、２．５時間（図２６Ｂ）、３．５時間（図２６Ｃ）、４．５時間（図２６Ｄ）、５．５時間（図２６Ｅ）、６．５時間（図２６Ｆ）、または７．５時間（図２６Ｇ）に測定した。
【図２７】
図２７Ａ−２８Ｇは、実施例ＩＩＩにおいて本発明の非限定的代表的治療抗体であるＦ５抗体で処置したラット群における異なる測定時点におけるＲＡＭＡ応答と炎症応答の相関を示した略図である。この炎症応答は、カラギーナン投与後１．５時間（図２６Ａ）、２．５時間（図２６Ｂ）、３．５時間（図２６Ｃ）、４．５時間（図２６Ｄ）、５．５時間（図２６Ｅ）、６．５時間（図２６Ｆ）、または７．５時間（図２６Ｇ）に測定した。
【図２８】
図２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＶの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図２８Ａ）、カラム分散として（図２８Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２８Ｃ）示した。
【図２９】
図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃは、カリパー法によって測定した実施例ＩＶの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図２９Ａ）、カラム分散として（図２９Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図２９Ｃ）示した。
【図３０】
図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＶの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３０Ａ）、カラム分散として（図３０Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３０Ｃ）示した。
【図３１】
図３１Ａ、３１Ｂおよび３１Ｃは、水置換法によって測定した実施例ＩＶの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３１Ａ）、カラム分散として（図３１Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３１Ｃ）示した。
【図３２】
図３２は、実施例ＩＶの異なるラット群における炎症応答を有するＲＡＭＡ（Ａｂ２）応答を示した略図である。図２８Ｂおよび３０Ｂが図３２の下に反復して示されているが、カリパー法（図２８Ｂ）または水置換法（図３０Ｂ）で測定した炎症応答程度を免疫応答レベル（図３２）と比較できるようにした。
【図３３】
図３３Ａ、３３Ｂおよび３３Ｃは、カリパー法によって測定した実施例Ｖの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３３Ａ）、カラム分散として（図３３Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３３Ｃ）示した。
【図３４】
図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、カリパー法によって測定した実施例Ｖの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果のパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３４Ａ）、カラム分散として（図３４Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３４Ｃ）示した。
【図３５】
図３５Ａ、３５Ｂおよび３５Ｃは、水置換法によって測定した実施例Ｖの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、ＡＵＣパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３５Ａ）、カラム分散として（図３５Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３５Ｃ）示した。
【図３６】
図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃは、水置換法によって測定した実施例Ｖの異なるラット群における炎症応答を示した略図である。測定は８回行い、その結果を、最大効果におけるパーセント変化として示してある。これらの図は、同一データを棒グラフとして（図３６Ａ）、カラム分散として（図３６Ｂ）およびウイッカーボックスとして（図３６Ｃ）示した。
【図３７】
図３７は、実施例Ｖの異なるラット群における炎症応答を有するＲＡＭＡ（Ａｂ２）応答を示したカラム分散の略図である。図３３Ｂおよび３５Ｂは、図３７の下に反復して示されており、カリパー法（図３８Ｂ）または水置換法（図３５Ｂ）で測定した炎症応答程度を免疫応答レベル（図３７）と比較できるようにした。
【図３８】
図３８Ａ−３８Ｈは、シングルステップ間接免疫蛍光フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）によって求めたヒト好中球に対する治療量モノクローナル抗体の結合を示したヒストグラムの略図である。図３８Ａおよび３８Ｂにおいて、シアリルルイスＡエピトープを発現することが公知であるｃｏｌｏ ２０５細胞を陽性対照として用いた。図３８Ｃ−３８Ｈは、対照（一次抗体なし）（図３８Ｃ）、ＡＬＴ−４ ＩｇＭ抗体（図３８Ｄ）、ＡＬＴ−３ ＩｇＧ３抗体（図３８Ｅ）、７Ｃ２Ｃ５Ｃ１２ ＩｇＭ抗体（図３８Ｆ）、Ｆ５ ＩｇＭ抗体（図３８Ｇ）、およびＦｌｏｐｃ−２１ ＩｇＧ３抗体（図３８Ｈ）で染色した好中球である。
【図３９】
図３９Ａおよび３９Ｂは、機器設置を示す略図およびセレクチン被覆したマイクロチップ チャンネルにおける白血球ロ−リングおよび接着のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害の略ダイアグラムである。
【図４０】
図４０は、非限定的に示した本発明の接着分子である組換えＥ−セレクチンを被覆したマイクロチップ チャンネルにおけるヒト多形核白血球（ＰＭＮＬ）ロ−リングの阻害を示す棒グラフの略図である。
【図４１】
図４１は、非限定的に示した本発明の接着分子である組換えＰ−セレクチンを被覆したマイクロチップ チャンネルにおけるヒトＰＭＮＬロ−リングの阻害を示す棒グラフの略図である。この棒グラフは、ヒトＰＭＮＬロ−リングのパーセントを示している。
【図１】
2004507459.tif 000002
【図２】
2004507459.tif 000003
【図３】
2004507459.tif 000004
【図４】
2004507459.tif 000005
【図５】
2004507459.tif 000006
【図６】
2004507459.tif 000007
【図７】
2004507459.tif 000008
【図８】
2004507459.tif 000009
【図９】
2004507459.tif 000010
【図１０】
2004507459.tif 000011
【図１１】
2004507459.tif 000012
【図１２】
2004507459.tif 000013
【図１３】
2004507459.tif 000014
【図１４】
2004507459.tif 000015
【図１５】
2004507459.tif 000016
【図１６】
2004507459.tif 000017
【図１７】
2004507459.tif 000018
【図１８】
2004507459.tif 000019
【図１９】
2004507459.tif 000020
【図２０】
2004507459.tif 000021
【図２１】
2004507459.tif 000022
【図２２】
2004507459.tif 000023
【図２３】
2004507459.tif 000024
【図２４】
2004507459.tif 000025
【図２５】
2004507459.tif 000026
【図２６】
2004507459.tif 000027
【図２７】
2004507459.tif 000028
【図２８】
2004507459.tif 000029
【図２９】
2004507459.tif 000030
【図３０】
2004507459.tif 000031
【図３１】
2004507459.tif 000032
【図３２】
2004507459.tif 000033
【図３３】
2004507459.tif 000034
【図３４】
2004507459.tif 000035
【図３５】
2004507459.tif 000036
【図３６】
2004507459.tif 000037
【図３７】
2004507459.tif 000038
【図３８】
2004507459.tif 000039
【図３９】
2004507459.tif 000040
【図４０】
2004507459.tif 000041
【図４１】
2004507459.tif 000042
【国際公開パンフレット】
2004507459.tif 000043
2004507459.tif 000044
2004507459.tif 000045
2004507459.tif 000046
2004507459.tif 000047
2004507459.tif 000048
2004507459.tif 000049
2004507459.tif 000050
2004507459.tif 000051
2004507459.tif 000052
2004507459.tif 000053
2004507459.tif 000054
2004507459.tif 000055
2004507459.tif 000056
2004507459.tif 000057
2004507459.tif 000058
2004507459.tif 000059
2004507459.tif 000060
2004507459.tif 000061
2004507459.tif 000062
2004507459.tif 000063
2004507459.tif 000064
2004507459.tif 000065
2004507459.tif 000066
2004507459.tif 000067
2004507459.tif 000068
2004507459.tif 000069
2004507459.tif 000070
2004507459.tif 000071
2004507459.tif 000072
2004507459.tif 000073
2004507459.tif 000074
2004507459.tif 000075
2004507459.tif 000076
2004507459.tif 000077
2004507459.tif 000078
2004507459.tif 000079
2004507459.tif 000080
2004507459.tif 000081
2004507459.tif 000082
2004507459.tif 000083
2004507459.tif 000084
2004507459.tif 000085
2004507459.tif 000086
2004507459.tif 000087
2004507459.tif 000088
2004507459.tif 000089
2004507459.tif 000090
2004507459.tif 000091
2004507459.tif 000092
2004507459.tif 000093
2004507459.tif 000094
2004507459.tif 000095
2004507459.tif 000096
2004507459.tif 000097
2004507459.tif 000098
2004507459.tif 000099
2004507459.tif 000100
2004507459.tif 000101
2004507459.tif 000102
2004507459.tif 000103
2004507459.tif 000104
2004507459.tif 000105
2004507459.tif 000106
2004507459.tif 000107
2004507459.tif 000108
2004507459.tif 000109
2004507459.tif 000110
2004507459.tif 000111
2004507459.tif 000112
2004507459.tif 000113
2004507459.tif 000114
2004507459.tif 000115
2004507459.tif 000116
2004507459.tif 000117
2004507459.tif 000118
2004507459.tif 000119
2004507459.tif 000120
2004507459.tif 000121
2004507459.tif 000122
2004507459.tif 000123
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507459.tif 000124
2004507459.tif 000125
2004507459.tif 000126
2004507459.tif 000127
2004507459.tif 000128
2004507459.tif 000129
2004507459.tif 000130
2004507459.tif 000131
2004507459.tif 000132
2004507459.tif 000133
2004507459.tif 000134
2004507459.tif 000135
2004507459.tif 000136
2004507459.tif 000137
2004507459.tif 000138
2004507459.tif 000139
2004507459.tif 000140
2004507459.tif 000141
2004507459.tif 000142
2004507459.tif 000143
2004507459.tif 000144
2004507459.tif 000145
2004507459.tif 000146
2004507459.tif 000147
2004507459.tif 000148
2004507459.tif 000149
2004507459.tif 000150
2004507459.tif 000151
2004507459.tif 000152
2004507459.tif 000153
2004507459.tif 000154
2004507459.tif 000155
2004507459.tif 000156
2004507459.tif 000157
2004507459.tif 000158
2004507459.tif 000159
2004507459.tif 000160
2004507459.tif 000161
2004507459.tif 000162
2004507459.tif 000163
2004507459.tif 000164
2004507459.tif 000165
2004507459.tif 000166
2004507459.tif 000167
2004507459.tif 000168
2004507459.tif 000169
2004507459.tif 000170
2004507459.tif 000171
2004507459.tif 000172
2004507459.tif 000173
2004507459.tif 000174
2004507459.tif 000175
2004507459.tif 000176
2004507459.tif 000177
2004507459.tif 000178
2004507459.tif 000179
2004507459.tif 000180
2004507459.tif 000181
2004507459.tif 000182
2004507459.tif 000183
2004507459.tif 000184
2004507459.tif 000185
2004507459.tif 000186
2004507459.tif 000187
2004507459.tif 000188
2004507459.tif 000189
2004507459.tif 000190
2004507459.tif 000191
2004507459.tif 000192
2004507459.tif 000193
2004507459.tif 000194
2004507459.tif 000195
2004507459.tif 000196
2004507459.tif 000197
2004507459.tif 000198
2004507459.tif 000199
2004507459.tif 000200
2004507459.tif 000201
2004507459.tif 000202
2004507459.tif 000203
2004507459.tif 000204
2004507459.tif 000205
2004507459.tif 000206
2004507459.tif 000207
2004507459.tif 000208
2004507459.tif 000209
2004507459.tif 000210
2004507459.tif 000211
2004507459.tif 000212
2004507459.tif 000213
2004507459.tif 000214
2004507459.tif 000215
2004507459.tif 000216
2004507459.tif 000217
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507459.tif 000218
【国際調査報告】
2004507459.tif 000219
2004507459.tif 000220
2004507459.tif 000221
2004507459.tif 000222
2004507459.tif 000223
2004507459.tif 000224
2004507459.tif 000225