(57)【要約】本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に部分的に関する。また、本発明は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターおよび組換え宿主、関連するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルおよびこれらのタンパク質を含む組換え膜分画の実質的に純粋な形態、関連する突然変異タンパク質、および関連するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを調節し、殺虫剤として有用と思われる化合物の同定に関わる方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする精製された核酸分子であって、
（ａ）配列番号２、４、６および８から成る群から選択されたアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｂ）配列番号２、４、６および８をコードする第２の核酸分子の相補体と、中度ないし高度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子、または
（ｃ）配列番号１、３、５および７に示す第２の核酸分子の相補体と中度のストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸分子であって、配列番号１、３、５および７に示す第２の前記核酸分子の少なくとも１種と少なくとも約５５％の同一性を有する核酸分子
を含む核酸分子。
【請求項２】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質であって、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項２に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
組換えＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項６】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質をコードし、配列番号１に示すヌクレオチド配列から成る精製されたＤＮＡ分子。
【請求項７】
約３３１位ヌクレオチドから約１６８３位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列から成る請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質であって、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項８に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
組換えＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項１２】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質をコードし、配列番号３に示すヌクレオチド配列から成る精製されたＤＮＡ分子。
【請求項１３】
約５０２位ヌクレオチドから約１８５４位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列から成る請求項１２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１４】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質であって、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１４のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１６】
組換えＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項１６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項１８】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質をコードし、配列番号５に示すヌクレオチド配列から成る精製されたＤＮＡ分子。
【請求項１９】
約６１７位ヌクレオチドから約２１７０位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列から成る請求項１８に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２０】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質であって、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製されたＤＮＡ分子。
【請求項２１】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項２０に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項２２】
組換えＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
組換え宿主細胞においてＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項２１に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項２４】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質をコードし、配列番号７に示すヌクレオチド配列から成る精製されたＤＮＡ分子。
【請求項２５】
約１３１位ヌクレオチドから約１３８７位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列から成る請求項２４に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２６】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項２７】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項２６に記載のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組換え宿主細胞から精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項２９】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項３０】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項２９に記載のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項３１】
請求項２０に記載の組換え宿主細胞から精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項３２】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項３３】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項３２のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組換え宿主細胞から精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項３５】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質。
【請求項３６】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項３５に記載のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組換え宿主細胞から精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項３８】
配列番号２、配列番号４、および配列番号６に示す各アミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列から成るＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質。
【請求項３９】
配列番号８に示すアミノ酸配列から成るＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質。
【請求項４０】
ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から成る群から選択されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質と試験化合物を接触させること、および
（ｂ）試験化合物のそのＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に対する作用を測定すること
を含む方法。
【請求項４１】
段階（ａ）のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質が、組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
グルタミン酸依存性チャネルタンパク質活性を調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）少なくともその一部分が、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から成る群から選択されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする核酸分子の集団を、核酸分子の前記部分の発現によって、活性なグルタミン酸依存性チャネルが生じるように、宿主細胞溶液中に注入すること、
ｂ）試験化合物を前記溶液中に添加すること、および
ｃ）塩素イオンに対する逆転電位より陽性の保持電位で宿主細胞膜電流を測定すること
を含む方法。
【請求項４３】
前記核酸分子が、相補的ＤＮＡ、ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡおよび相補的ＲＮＡから成る群から選択される請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年３月３１日出願の米国暫定特許出願第６０／１９３９３４号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に優先権を請求している。
【０００２】
米国政府支援研究開発に関する申立て
該当せず。
【０００３】
マイクロフィッシュ補遺の参照
該当せず。
【０００４】
発明の分野
本発明は、部分的に、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（褐色イヌダニ）のグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。また、本発明は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターおよび組換え宿主、関連するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルおよびこれらのタンパク質を含む組換え膜分画の実質的に純粋な形態、関連する突然変異タンパク質、および関連するＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを調節し、殺虫剤として有用と思われる化合物の同定に関わる方法にも関する。
【０００５】
発明の背景
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル、またはＨ受容体は、節足動物の神経および筋肉において同定された（Ｌｉｎｇｌｅ　ｅｔ　ａｌ、１９８１、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．２１２：４８１−４８８；Ｈｏｒｓｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８５：６５−７０；Ｗａｆｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｓａｔｔｅｌｌｅ、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．１４４：４４９−４６２；Ｌｅａ　ａｎｄ　Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ、１９７３、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．４：３３３−３５０；およびＣｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ、１９７６、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５：４４９−４６４）。
【０００６】
無脊椎動物のグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、汎用されているアベルメクチン群の駆虫性および殺虫性化合物の重要な標的である。アベルメクチン類は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓから最初に分離された大環ラクトンの一群である。半合成アベルメクチン誘導体のイベルメクチン（２２，２３−ジヒドロアベルメクチン　Ｂ１ａ）は、人間や動物の寄生虫および害虫を駆除するために、世界中で使用されている。アベルメクチン類は、今尚、宿主に対して低毒性の最も有効な広範囲殺風土病虫剤である。多年にわたる野外使用においても、昆虫集団の中にアベルメクチンに対する耐性は殆ど残らない。治療指数が良好であることと低い耐性が低いことが相俟って、グルタミン酸依存性塩素イオン（ＧｌｕＣｌ）チャネルは依然として殺虫剤開発の望ましい標的であることが、強く示唆される。
【０００７】
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、土壌線虫のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃｕｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ．、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ　３７１：７０７−７１１；米国特許第５５２７７０３号およびＡｒｅｎａ　ｅｔ　ａｌ．、１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１５：３３９−３４８も参照されたい）およびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ　ｆｅｌｉｓ（ノミ；国際公開第９９／０７８２８号を参照されたい）からクローニングされた。
【０００８】
その上、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から得られるグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする遺伝子が、以前に同定された（Ｃｕｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ．、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０１８７−２０１９１；米国特許第５６９３４９２号も参照されたい）。
【０００９】
ＧｌｕＣｌチャネルをコードする前記のｃＤＮＡクローンが同定されてはいたにもかかわらず、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよび他の農業上重要な動物にはびこるダニやダニ類の処置に特に関連する動物の健康のために、殺虫性、殺コナダニ性および／または殺線虫性を有し得る新規なＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための、改良されたスクリーニングを可能とするなら、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルをコードするそれ以外の遺伝子を同定することは、有利であると思われる。本発明は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＧｌ１およびＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＧｌ２チャネルを発現する新規な遺伝子であって、これらのＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ　ＲＮＡのアフリカツメガエル卵母細胞や他の適当な宿主細胞における発現によって活性なＧｌｕＣｌチャネルを生じる遺伝子を開示することによって、これらの必要性に対処し、それを満足させる。本発明のＧｌｕＣｌチャネルの異種発現によって、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種、特にイヌやネコにはびこるダニの駆除に活性な化合物の薬理学的分析が可能になると思われる。活性なＧｌｕＣｌチャネルを発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【００１０】
発明の概要
本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（褐色イヌダニ）の新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質をコードする分離または精製された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、実質的な量の単一の発現した機能的なホモ多量体またはヘテロ多量体ＬＧＩＣの実質的なレベルの供給源となる。このような機能的なリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドによって、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための別のスクリーニング標的が付与されると思われる。
【００１１】
本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質をコードする分離または精製された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。
【００１２】
更に、本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規なＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３および配列番号５と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
更に、本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規なＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号７と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
また、本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ１またはＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を各々発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、５および７の生物活性を有する断片または突然変異体に関する。任意のこのような生物活性を有する断片および／または突然変異体は、配列番号２、配列番号４および配列番号６に示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質、ならびに配列番号８に示した個々のＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を含むが、それらに限らないＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能的なＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルを発現するｍＲＮＡをコードすることによって、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ活性の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限るものではない。
【００１５】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規なＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質をコードする図１（配列番号１；Ｔ１２と命名）、図３（配列番号３；Ｔ８２と命名）および図５（配列番号５；Ｔ３２と命名）、ならびに新規なＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質をコードする図７（配列番号７；Ｂ１と命名）に開示されている。
【００１６】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００１７】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主細胞にも関している。
【００１８】
また、本発明は、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および図６（配列番号６）に開示したアミノ酸配列を含んだＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質、ならびに図８（配列番号８）に開示したアミノ酸配列を含んだ新規なＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質の実質的に精製された形態にも関している。
【００１９】
本発明のこの部分の好ましい態様は、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）および図６（配列番号６）に開示したアミノ酸配列から成るＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質である。
【００２０】
本発明のこの部分の他の好ましい態様は、図８（配列番号８）に開示したアミノ酸配列から成るＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質である。
【００２１】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または７に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各々のＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２前駆体タンパク質を発現するＤＮＡ発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、（任意のタンパク質分解処理、グリコシル化および／またはリン酸化を含めて）十分に処理された成熟ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らず真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００２２】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、５および／または７に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能形態の各ＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２チャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または細胞溶解物に関する。（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換またはトランスフェクションの安定な細胞および一過性の細胞の）組換え宿主細胞から得た細胞内膜分画および／または膜含有細胞溶解物は、本発明の核酸によってコードされた機能性タンパク質を含んでいる。組換え体に基づくこの膜調製物は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルを含む可能性があり、かつＴ１２（配列番号２）、Ｔ８２（配列番号４）、Ｔ３２（配列番号６）のＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質および／またはＢ１（配列番号８）のＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現する組換え細胞から得られる他のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ起源タンパク質や宿主タンパク質を含むが、これらのタンパク質に限らず本質的に汚染性タンパク質を含んでいない。したがって、本発明の好ましい一態様は、図２（配列番号２；Ｔ１２）、図４（配列番号４；Ｔ８２）および図６（配列番号６；Ｔ３２）に開示した完全長ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質の機能形および／または図８（配列番号８；Ｂ１）に開示した完全長ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質の機能形を含むＧｌｕＣｌタンパク質を含んだＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルを含んでいる膜調製物である。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルの生物学的に機能的な形態、それらの任意のホモ多量体やヘテロ多量体の組合せ（例えば、Ｔ１２／Ｔ１２　ＧｌｕＣｌ１ホモ多量体チャネル、Ｔ１２／Ｔ３２　ＧｌｕＣｌ１ヘテロ多量体チャネル、またはＴ１２／Ｂ１　ＧｌｕＣｌ１／ＧｌｕＣｌ２ヘテロ多量体チャネルを含むが、これらのチャネルに限らない）である野生型または突然変異型の変異を含み、したがって本明細書を通して記載される様々な試験において有用と思われる。また、開示したチャネルタンパク質が、単独または組合せにより、未だ同定されていないチャネルタンパク質を有する機能的な多量体系チャネルを形成することも可能である。本発明のグルタミン酸依存性チャネルを発現するために選択した好ましい真核宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞である。
【００２３】
また、本発明は、配列番号２、４および／または６に示したアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体、ならびに配列番号８に示したアミノ酸配列を含むＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、かつＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルの薬理作用に対する作動薬および／または拮抗薬を含むが、それらに限らず選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限定されないものにも関する。
【００２４】
本発明の好ましい一態様は、本発明のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１およびＧｌｕＣｌ２タンパク質を各々含む各アミノ酸配列に関して、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）および図８（配列番号８）に開示されている。これらのチャネルタンパク質の１個または複数を特定することによって、動物の健康または作物保護のために殺昆虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性を有し得る新規なＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するためのスクリーニング法が可能となる。前記のように、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルの異種発現によって、動物や人間の健康、特に、頻繁にダニに寄生されることが知られているイヌやネコに関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物の薬理分析が可能になると思われる。機能的なＲｓＧｌｕＣｌ１チャネル（例えば、配列番号２、４および／または６の機能形）またはＲｓＧｌｕＣｌ２チャネル（例えば、配列番号８の機能形）を発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【００２５】
また、本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌ１および／またはＲｓＧｌｕＣｌ２の開示形、またはその生物活性断片に反応して増加するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも関する。
【００２６】
また、本発明は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）、ＭＹＣエピトープおよびＧＳＴを含むが、これらに全く限定されず様々な標識に結合したＲｓＧｌｕＣｌの一部を発現する融合構築体を含むが、これらに限定されずＲｓＧｌｕＣｌ１および／またはＲｓＧｌｕＣｌ２融合構築体にも関する。このような任意の融合構築体を、所望の細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の１種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００２７】
本発明は、本明細書に開示するＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１および／またはＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質および生物学的等価物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いた試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含んだ組換え宿主細胞、およびこれらの試験によって同定され、ＧｌｕＣｌチャネル活性の作動薬または拮抗薬として作用する化合物に関する。
【００２８】
本発明の一目的は、配列番号２、４、６および８で各々示したタンパク質である、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌの新規な形態、あるいはＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２の断片、突然変異体または誘導体をコードする分離核酸分子（例えば、配列番号１、３、５および７）を提供することである。任意のこのようなポリヌクレオチドは、場合によっては、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を発現するｍＲＮＡをコードし、無脊椎動物ＧｌｕＣｌ薬理作用の選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限定されるものではない。
【００２９】
本発明の更なる目的は、前段落で述べた核酸分子によってコードされるＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質またはタンパク質断片を提供することである。
【００３０】
本発明の更なる目的は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質またはその生物学的同等物をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提供することである。
【００３１】
本発明の一目的は、配列番号２、４、６および８で示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１またはＧｌｕＣｌ２各タンパク質の実質的に精製された形態を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５および７に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能性で処理された形態の各ＲｓＧｌｕＣｌチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質の実質的に精製された組換え形態を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系等の真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の一目的は、配列番号２、４、６および８に示したような各Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１またはＧｌｕＣｌ２タンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療および／または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供するように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限定されない。
【００３４】
更に、本発明の一目的は、薬理作用があり、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１またはＧｌｕＣｌ２を含む単一のホモ多量体またはヘテロ多量体各チャネルを含む組換え細胞から得た、実質的に精製された細胞内膜調製物、部分的に精製された膜調製物または未精製溶解物、特に、図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）および図８（配列番号８）に示したアミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んだＤＮＡベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞から得た細胞内分画を提供することである。
【００３５】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、５および／または７に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能性で処理された形態の各ＲｓＧｌｕＣｌチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または未精製溶解物を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００３６】
Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネル活性のモジュレーター、好ましくは選択的モジュレーターをスクリーニングするために、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質、またはＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質を含む膜調製物、または生物学的同等物を使用することも、本発明の一目標である。このような任意の化合物は、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物をスクリーニングし、選択する際に有用となり得る。このような種は、蠕虫、ノミ、ダニ、ダニ類およびシラミを含むが、これらに限定されない。これらの膜調製物は、これらのＧｌｕＣｌを発現する異種細胞系から作出されてもよく、完全長タンパク質、完全長タンパク質の生物活性断片を構成するか、または当業界で入手できる物質で構築し得る様々な溶融構築体から発現される溶融タンパク質に依存してもよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他の核酸を含まないことを意味する。用語を入れ換えて使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」、「実質的に精製された」、「分離された核酸」、「精製された核酸」のいずれも、他の細胞成分から分離・精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質に対するコード領域を含むＤＮＡ分子を指す。したがって、他の核酸を実質的に含まないＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ　ＤＮＡ調製物は、全核酸に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ核酸を含むものと思われる。所与のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ　ＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかを、適当な染色法、例えば臭化エチジウム染色と組合せた、例えば、アガロースゲル電気泳動のような従来の核酸純度分析法、または配列決定によって、決定することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他のタンパク質を含まないことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含まないＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質調製物は、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質を含むものと思われる。所与のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかを、適当な検出法、例えば銀染色またはイムノブロッティングと組合せた、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のような従来のタンパク質純度分析法によって、決定することができる。「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」という用語と入れ換えて使用する場合、「分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質」または「精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質」という用語も、天然の供給源から分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質を指す。「分離された」または「精製された」という用語の使用は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質が普通の細胞環境から取出されたことを示す。したがって、分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質は、無細胞溶液中にあるか、または自然に生成する環境とは異なる細胞環境中に置かれてもよい。分離されたという用語は、分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質が存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、むしろ分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質が、他のタンパク質やｉｎ　ｖｉｖｏでＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質と自然に結びつく非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含んでいないことを意味している。したがって、原核または真核細胞中に組換えによって発現され、このＧｌｕＣｌタンパク質を自然には（即ち、介在なしには）発現しないこの宿主細胞から実質的に精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質は、本明細書で言及する如何なる状況下でも、当然「分離されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質」である。前記のように、分離または精製されたＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質であるＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質調製物は、他のタンパク質を実質的に含まず、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌタンパク質を含むものと思われる。
【００３９】
本明細書で入れ換えて使用する場合、「機能的同等物」または「生物活性同等物」とは、スプライシング、欠失、突然変異、置換、付加のいずれかのために、天然のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌと正確には同じアミノ酸配列を有していないが、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌと実質的に同じ生物活性を保持しているタンパク質を意味する。このような機能的同等物は、天然のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌと顕著なアミノ酸配列の同一性を有すると思われ、このような機能的同等物をコードする遺伝子およびｃＤＮＡは、天然のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡ配列との低ストリンジェントなハイブリッド形成によって、検出することができる。例えば、本明細書で開示する天然のＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質は、配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、配列番号１によってコードされる。機能的同等物をコードする核酸は、ヌクレオチドのレベルで配列番号１と少なくとも約５０％の同一性を有する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基の他の化学的に類似したアミノ酸残基による置き換えを指す。このような保存的置換の例は、１つの疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン、またはメチオニン）による他の疎水性残基の置換、および１つの極性残基による同じ電荷の他の極性残基の置換（例えば、リジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸）である。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＬＧＩＣ」とは、リガンド依存性イオンチャネルを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「ＧｌｕＣｌ」とは、Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ＲｓＧｌｕＣｌ」とは、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４４】
その上、本明細書で使用する場合、「ＲｓＧｌｕＣｌ」とは、ＲｓＧｌｕＣｌ１および／またはＲｓＧｌｕＣｌ２を指してもよい。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「哺乳類の」という用語は、人間を含めた任意の哺乳類を指すことにする。
【００４６】
図面の簡単な説明
図１は、配列番号１に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ１２のヌクレオチド配列を示す。
図２は、配列番号２に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ１２のアミノ酸配列を示す。
図３は、配列番号３に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ８２のヌクレオチド配列を示す。
図４は、配列番号４に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ８２のアミノ酸配列を示す。
図５は、配列番号５に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ３２のヌクレオチド配列を示す。
図６は、配列番号６に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ３２のアミノ酸配列を示す。
図７は、配列番号７に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２のｃＤＮＡクローン、Ｂ１のヌクレオチド配列を示す。
図８は、配列番号８に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質、Ｂ１のアミノ酸配列を示す。
図９は、ＲｓＧｌｕＣｌ１［Ｔ１２（配列番号２）、Ｔ８２（配列番号４）、Ｔ３２（配列番号６）］およびＲｓＧｌｕＣｌ２（Ｂ１、配列番号８）の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す。
図１０は、ＲｓＧｌｕＣｌ１　Ｔ１２　ＲＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸活性化電流を示す。活動電流活性は１０μＭのグルタミン酸で最大であり、未注入の卵母細胞では電流が認められなかった。
図１１は、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したＲｓＧｌｕＣｌ２のイベルメクチンによる活性化を示す。活動電流活性は〜１μＭのイベルメクチンで最大であった。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ無脊椎動物ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の分離または精製核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。多くのクローニングの場合、ＤＮＡが好ましい核酸である。前記のように、本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、単一の発現した機能的なホモ多量体またはヘテロ多量体ＧｌｕＣｌチャネルの実質的なレベルでの供給源となる。このような機能的なリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドによって、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための追加のスクリーニング標的が付与されると思われる。本明細書では、ＲｓＧｌｕＣｌ　１がグルタミン酸に反応して電流を示し、かつ、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現されたＲｓＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質が、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示すことが示してある。しかし、機能的なホモ多量体を発現しないＧＡＢＡ−Ａサブユニットγに見られるように、チャネルの単一サブユニットタンパク質では機能性チャネルを形成しないと思われることに注意すべきである。したがって、本発明の発現タンパク質は、本明細書に開示するチャネルタンパク質を含め、幾つかの附属および／またはチャネルタンパク質を含んだ野生型リガンド依存性イオンチャネルの成分として、ｉｎ　ｖｉｖｏで機能し得る。しかし、本発明のＧｌｕＣｌタンパク質が、当業者にとって有用となるために、野生型チャネルを直接模倣する必要はない。むしろ、これらのタンパク質は、組換え宿主細胞内に機能性で単一の膜結合チャネルを形成できるので、当業界で公知で、本明細書内に一部記載したスクリーニング手順になじみすい。したがって、本明細書内に記述したように、完全な機能性ＧｌｕＣｌチャネルに寄与し得る追加のＲｓチャネルサブユニットタンパク質や附属タンパク質を含むか、または含まない本明細書内に開示した様々なタンパク質を有する単一の機能性チャネルとして、またはホモ多量体チャネルとして、またはヘテロ多量体チャネルとして、本発明の開示Ｒｓチャネルタンパク質は、有用である。前記のように、本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、単一の発現した機能的なホモ多量体またはヘテロ多量体ＧｌｕＣｌの実質的レベルで供給源となる。このような機能的なリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドによって、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための追加のスクリーニング標的が付与されると思われる。
【００４８】
本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するもので、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３および配列番号５と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号７と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
本発明のＲｓＧｌｕＣｌ核酸分子の分離および特定は、実施例１に詳述するように確認された。殺虫剤の新規なスクリーニングを確立し、特にウシ、イヌおよびネコへのダニやダニ類の寄生を処置するのに使用するためか、または他のクモ形類動物を殺すために、殺虫剤活性を有して可能性のある鉛化合物を実証し、かつ追加の殺虫剤スクリーニングを確立するために、これらの新規なｃＤＮＡ配列をハイブリッド形成プローブとして使用することによって、他の生物から関連遺伝子を分離するのに、本明細書で考察するこれらのｃＤＮＡ分子は、特に有用である。本発明のＲｓＧｌｕＣｌ１およびＲｓＧｌｕＣｌ２コード化ｃＤＮＡは、褐色イヌダニ種Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓから分離された。そのＤＮＡ配列は、グルタミン酸およびイベルメクチンに感受性の塩素イオンチャネル群と共通の特徴を共有するタンパク質を予測する。ＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２　ｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞中に発現するとき、グルタミン酸およびイベルメクチン感受性チャネルを認める。これらのチャネルで作用する化合物の薬理作用は、これらの種の間で恐らく示差されると思われる。クモ形類動物のチャネルをスクリーニングすることによって、クモ類動物に特異的な化合物を発見する可能性が高まると思われる。したがって、本発明のｃＤＮＡを、細胞系や他の発現系で発現させることができ、かつ、チャネルを活性化し、阻止し、または調節する化合物をスクリーニングするために、競合結合実験や機能性塩素イオンチャネル試験に使用することができる。
【００５１】
無脊椎動物グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル（ＧｌｕＣｌ）は、グリシン依存性およびＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャネルと関係しており、興奮性グルタミン酸受容体（例えば、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体）とは異なる。駆虫薬イベルメクチンの受容体に対する機能性スクリーニングの後に、ＧｌｕＣｌファミリーの最初の２種の構成体が、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて確認された。現在では、更に他の無脊椎動物種の数種のＧｌｕＣｌがクローニングされた。しかし、脊椎動物においてＧｌｕＣｌに相当するものが存在する証拠は未だない。このために、ＧｌｕＣｌは駆虫剤、殺虫剤、殺ダニ剤等にとって優れた標的である。ノジューリスポア酸（ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｃ　ａｃｉｄ）およびその誘導体のような特異的ＧｌｕＣｌモジュレーターは、脊椎動物において構造に基く毒性を欠いているので、理想的な安全性プロファイルを有する。本発明は、３種の新規なＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１クローン、Ｔ１２、Ｔ８２およびＴ３２、およびＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２クローン、Ｂ１に部分的に関するものである。ＲｓＧｌｕＣｌ１の各ｃＤＮＡは、推定膜貫通ドメイン、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３に相当するショウジョウバエ ＧｌｕＣｌプローブを用いた低ストリンジェントなハイブリッド形成によって分離された。ＲｓＧｌｕＣｌ２　ｃＤＮＡは、ショウジョウバエ、ノミ（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）および線虫のＧｌｕＣｌタンパク質のアミノドメインおよびＭ２ドメイン中の保存領域に相当する縮重プライマーを用いたＰＣＲによって分離された。ＲＮＡ編集（ＡからＧへの転位）がこれらのｃＤＮＡ中で生じ、幾つかのアミノ酸変化が起ったと思われる。ＲｓＧｌｕＣｌ１　Ｔ１２およびＴ８２は、１個のアミノ酸の相違を除いて類似しているが、ＲｓＧｌｕＣｌ１　Ｔ３２はコード領域中に更に２個のエクソンを含んでいる。
【００５２】
本発明は、図１（Ｔ１２）に記載し、配列番号１として示した分離または精製ＤＮＡ分子に関するもので、そのＤＮＡ分子は図２に記載し、配列番号２として示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質をコードし、Ｔ１２のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５３】
【化１】
2004500118.tif 000002
【００５４】
本発明は、図３（Ｔ８２）に記載し、配列番号３として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図４に記載し、配列番号４として示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質をコードし、Ｔ８２のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５５】
【化２】
2004500118.tif 000003
2004500118.tif 000004
【００５６】
本発明は、図５（Ｔ３２）に記載し、配列番号５として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図６に記載し、配列番号６として示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質をコードし、Ｔ３２のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５７】
【化３】
2004500118.tif 000005
【００５８】
本発明は、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質をコードする分離または精製ＤＮＡ分子にも関する。１個のこのような核酸は、図７（Ｂ１）に記載し、配列番号７として示したもので、その核酸は図８に記載し、配列番号８として示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質をコードし、Ｂ１のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５９】
【化４】
2004500118.tif 000006
【００６０】
各々図１、３、５および７に示し、前に例示した分離ＤＮＡ分子は、次の特性を有する。
【００６１】
Ｔ１２（配列番号１）：
２１３８ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基３３１〜３３３位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１６８１〜１６８３位）で、読み取り枠が、配列番号２に示したアミノ酸４５０個の発現タンパク質を生じる。
【００６２】
Ｔ８２（配列番号３）：
２２８９ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基５０２〜５０４位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１８５２〜１８５４位）で、読み取り枠が、配列番号４に示したアミノ酸４５０個の発現タンパク質を生じる。
【００６３】
Ｔ３２（配列番号５）：
２４００ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基６１７〜６１９位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基２１６８〜２１７０位）で、読み取り枠が、配列番号６に示したアミノ酸５１７個の発現タンパク質を生じる。
【００６４】
Ｂ１（配列番号７）：
１４０２ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基１３１〜１３３位）および「ＴＡＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１３８５〜１３８７位）で、読み取り枠が、配列番号８に示したアミノ酸４１８個の発現タンパク質を生じる。
【００６５】
また、本発明は、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓの新規な無脊椎動物ＧｌｕＣｌ１またはＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡを各々コードする配列番号１、３、５および７の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片および／または突然変異体は、配列番号２、配列番号４および配列番号６に示したＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１チャネルタンパク質、ならびに配列番号８に示した個々のＧｌｕＣｌ２チャネルタンパク質を含むが、それらに限らないＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能的なＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルを発現するｍＲＮＡをコードすることによって、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ活性の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限られるものではない。
【００６６】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規なＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質をコードする図１（配列番号１；Ｔ１２と命名）、図３（配列番号３；Ｔ８２と命名）および図５（配列番号５；Ｔ３２と命名）、ならびに新規なＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質をコードする図７（配列番号７；Ｂ１と命名）に開示されている。
【００６７】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００６８】
遺伝暗号の縮重は、２種以外の全てのアミノ酸に対して、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードするようなものである。これによって、ＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２タンパク質をコードする合成ＤＮＡであって、そのヌクレオチド配列が配列番号１、３、５および７のヌクレオチド配列と有意に異なるが、それでもなお配列番号１、３、５および７と同じＲｓＧｌｕＣｌタンパク質をコードする合成ＤＮＡの構築が可能となる。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲に含まれることを意図している。このような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞や生物において発現させることを所望する場合、このような合成ＤＮＡのコドン使用法をその特定の宿主のコドン使用法を反映するように調節することによって、宿主内でのＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の発現量を増加させることができる。換言すれば、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンのこの重複は、本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は、以下に示すように、最終的に同一のアミノ酸を翻訳するためにコードする代替コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も対象としている。
【００６９】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン　ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン　ＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン　ＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン　ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン　ＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン　ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン　ＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン　ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドン　ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン　ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン　ＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドン　ＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン　ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン　ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン　ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン　ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン　ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン　ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン　ＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン　ＵＡＣ、ＵＡＵ
【００７０】
したがって、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なったＤＮＡ分子を生じ得るコドンの重複を開示する。本明細書のために、１個または複数の置換コドンを有する配列を縮重変異配列と定義することにする。他の配列変異源は、以下に考察するように、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。このようなＲＮＡ編集は、読み取り枠の変化が発現タンパク質中のアミノ酸残基の変化を起こさない他の形式のコドン重複を生じ得る。発現タンパク質の最終的な物性を実質的に変化させないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中の突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、またはグルタミンの代わりにアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化が起こらないかもしれない。
【００７１】
あるペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然のペプチドと異なる性質を有するペプチドをコードするように変化させ得ることは知られている。ＤＮＡ配列を変化させる方法は、部位特異的突然変異誘発を含むが、それに限定されない。変化した性質の例は、酵素が基質に対して、または受容体がリガンドに対して示す親和性の変化を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５および７とハイブリッドを形成するＤＮＡ配列は、本発明に含まれる。制限するためでなく、例として、高ストリンジェントな条件を用いる手順は次のとおりである：ＤＮＡを含むフィルタの予備的ハイブリッド形成を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、および変性サケ精子ＤＮＡ　１００μｇ／ｍｌから成る緩衝液中、２時間から終夜の間６５℃で行う。フィルタを、変性サケ精子ＤＮＡ　１００μｇ／ｍｌおよび３２Ｐ標識プローブ５〜２０×１０６ｃｐｍを含む予備ハイブリッド形成混合物中、１２時間から４８時間６５℃でハイブリッド形成させる。フィルタの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、３７℃で１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間洗浄し、次いでオートラジオグラフィを行う。高ストリンジェントな条件を用いる他の手順は、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド中、４２℃で１２から４８時間行うハイブリッド形成段階、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０から６０分間行う洗浄段階のいずれかを含むと思われる。高ストリンジェントなハイブリッド形成を行うための前記手順で述べた試薬は、当業界で周知である。これら試薬の組成の詳細は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに見出すことができる。前記のこと以外に、使用し得る他の高ストリンジェントな条件は当業界で周知である。
【００７３】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の指標である。一般に、最高次の一致が得られるように、各配列が配列される。「同一性」自体は、当業界で認識されており、公知技術を用いて計算することができる。例えば、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ　Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの２個の配列間の同一性を測定する幾つかの方法があるが、「同一性」という用語は技術者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ　ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ　Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ　４８：１０７３）。２個の配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法は、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｈｕｇｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ　Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ　ａｎｄ　Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ　Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ　４８：１０７３に開示されている方法を含むが、これらに限られるものではない。同一性や類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム中に体系化されている。２個の配列間の同一性や類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ　ａｌ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ　ａｌ．、１９９０、Ｊ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）を含むが、これらに限られるものではない。
【００７４】
一例として、配列番号１の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号１の参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド各１００個当たり５点までの突然変異や代替ヌクレオチドを含み得ることを除けば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失するか、または他のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異や代替ヌクレオチド置換は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在するか、または参照配列内の１個または複数の隣接グループ中に散在することで、両末端位間の何処で起こってもよい。１００％未満の同一性を生じるこのような「突然変異」または変化の発生源の一つのは、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。ＲＮＡ編集の過程は、修飾されたｍＲＮＡをクローニングされるｃＤＮＡを生成する鋳型として使用したとき、コドン変化が起こる場合も起こらない場合もある１個または複数のヌクレオチド変化が起こるように、ｍＲＮＡ分子の修飾を起こす。このＲＮＡ編集は、ＲＮＡエディターゼによって触媒されることが知られている。このようなＲＮＡエディターゼはＲＮＡアデノシンデアミナーゼであり、それはシトシン残基を模倣する傾向のあるイノシン残基にアデノシン残基を変換する。この目的のために、ｍＲＮＡ残基のＡからＩへの変換が、クローニングされるｃＤＮＡのコードおよび非コード領域においてＡからＧへの転位を起こすと思われる（例えば、Ｈａｎｒａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、１９９９、Ａｎｎａｌｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６８：５１−６６を参照されたい。総説としては、Ｂａｓｓ、１９９７、ＴＩＢＳ　２２：１５７−１６２を参照されたい）。同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列に、少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が、配列番号２の参照アミノ酸のアミノ酸各１００個当たり５個までのアミノ酸の修飾を含み得ることを除けば、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失するか、または他のアミノ酸で置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中の残基間に個々に散在するか、または参照配列内の１個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで起こってもよい。前記のように再び、ＲＮＡ編集が、ゲノム配列の読み取り枠に直接対応する「非ＲＮＡ編集」転写体から発現する他のタンパク質と、「同一性」の異なる発現タンパク質を生じるコドン変化を起こし得る。Ｔ１２およびＴ８２の各クローンの読み取り枠は、単一のアミノ酸変化（配列番号２および４のアミノ酸残基４４７位における、Ｔ１２の「ｇａｇ」／Ｇｌｕ対Ｔ８２の「ａａｇ」／Ｌｙｓ）を起こす単一のヌクレオチド変化を除けば同一である。Ｔ１２／Ｔ８２クローンは、ヌクレオチドレベルでＢ１クローンと約５７％の同一性を示すが、Ｔ３２クローンは、ヌクレオチドレベルでＢ１クローンと約５７％の同一性を示す。
【００７５】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主にも関している。ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を全体として、または部分的にコードする本発明の核酸分子は、他のＤＮＡ分子、即ちＲｓＧｌｕＣｌコード配列が自然には連結されないＤＮＡ分子と連結されることによって、各ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成することができる。本発明の新規なＤＮＡ配列を、ＲｓＧｌｕＣｌをコードする核酸または機能的同等物を含むベクター中に挿入することができる。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡで構成されてもよいが、クローニングの大部分ではＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、修飾ウィルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードし得る他の形態のエピソームや組込み型ＤＮＡを含む。特定の遺伝子導入や他の用途のために適切なベクターを決定することは、技術者が十分に扱い得る範囲に入る。
【００７６】
また、本発明は、図２、図４、図６および図８に開示し、配列番号２、、６および８で各々示したアミノ酸配列を含む、各ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の実質的に精製された形態にも関する。開示した各ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質は、図２、４、６および８に示すように、長さがアミノ酸４５０個（各々Ｔ１２およびＴ８２、配列番号２および４）、アミノ酸５１７個（Ｔ３２、配列番号６）、およびアミノ酸４１８個（配列番号８）の読み取り枠を含んでおり、次のとおりである。
【００７７】
【化５】
2004500118.tif 000007
【００７８】
Ｔ１２およびＴ８２の各クローンの読み取り枠は、配列番号２および４の残基４４７位における単一のアミノ酸変化を起こす単一のヌクレオチド変化を除けば同一である。Ｔ３２の読み取り枠は、Ｔ１２／Ｔ８２の読み取り枠と比較すると２個の別のエキソンを含み、これらがＴ３２タンパク質のアミノ末端領域に３５個のアミノ酸挿入（配列番号６のアミノ酸残基３０〜６４位）およびＣＯＯＨ末端領域内に他の３２個のアミノ酸挿入（アミノ酸残基４１０〜４４１位）を起こす。Ｔ１２／Ｔ８２クローンは、ヌクレオチドレベルでＢ１クローンと約５７％の同一性を示すが、Ｔ３２クローンは、ヌクレオチドレベルでＢ１クローンと約５７％の同一性を示す。
【００７９】
また、本発明は、配列番号：２、４、６および８に示したようなアミノ酸配列を含むＲｓＧｌｕＣｌ１およびＲｓＧｌｕＣｌ２タンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、ＲｓＧｌｕＣｌ機能の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限定されない。
【００８０】
この目的のために、本発明の好ましい一態様は、単一のチャネルタンパク質か、または、本明細書でホモ多量体チャネルまたはヘテロ多量体チャネルと称し、多数のサブユニットを含むチャネルのいずれかから成る機能性ＲｓＧｌｕＣｌチャネル受容体である。したがって、単一のチャネルは、配列番号：２、４、６または８に開示したタンパク質、またはその生物学的活性を有する同等物（即ち、野生型チャネル受容体に類似の態様で尚も機能する修飾チャネルタンパク質）から構成され得る。ホモ多量体チャネル受容体複合体は、配列番号：２、４、６および８の開示群、ならびに生物学的活性を有する同等物から選択される複数のポリペプチドを含んでいると思われる。ヘテロ多量体チャネル受容体複合体は多数のサブユニットを含んでいると思われ、その複合体中では、本明細書に開示した３種のタンパク質中の少なくとも２種がチャネル形成に寄与しているか、または、活性を有するチャネル受容体複合体を提供するために、それらのタンパク質の少なくとも１種が別のタンパク質またはチャネル成分と結合している。したがって、更に本発明は、本明細書に記載の実質的に精製されたチャネル、ならびに、実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物、または本明細書に記載の機能的な単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体のチャネルを含む細胞溶解物にも関する。これらの実質的に精製され、完全に処理されたＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を、配列番号：１、３、５および／または７に示したヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現ベクターを含み、各ＲｓＧｌｕＣｌ前駆体タンパク質を発現する組換え宿主細胞から得ることができる。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らず真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００８１】
多くのタンパク質と同様に、ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質のアミノ酸の多くを修飾し、それでも、野生型タンパク質と実質的に同じ生物活性を保持することが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、それでも、対応する各ＲｓＧｌｕＣｌと実質的に同じ生物活性を保持する修飾ＲｓＧｌｕＣｌポリペプチドを含む。単一のアミノ酸置換では、通常、タンパク質の生物活性は変化しないことが、一般に受入れられている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、Ｗａｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８７、Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄ．Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ｐａｇｅ　２２６およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ　＆　Ｗｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５）。したがって、本発明は、配列番号：２、４、６および／または８で１個のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＲｓＧｌｕＣｌタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドを含む。また、本発明は、配列番号：２、４、６または８で２個以上のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＲｓＧｌｕＣｌタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドも含む。特に本発明は、前記置換が保存的置換である実施形態を含む。
【００８２】
当業者であれば、ＲｓＧｌｕＣｌの機能的同等物であって、アミノ酸の小さな欠失または挿入をＲｓＧｌｕＣｌアミノ酸配列からの変化とするポリペプチドも、同様の指針によって、即ちＲｓＧｌｕＣｌと関連タンパク質とのアミノ酸配列の差を模倣することによって、産生し得ることを認識するであろう。小規模の欠失または挿入は、一般に約１個から５個のアミノ酸の範囲にある。このような小規模の欠失または挿入の修飾ＲｓＧｌｕＣｌポリペプチドの生物活性に対する効果は、そのポリペプチドを合成するか、あるいは、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡに必要な変異を誘発した後、そのＤＮＡを組換え発現させ、組換え発現で生成したタンパク質を検定することによって、容易に試験できる。本発明は、酵素の活性部位を含む領域を含んだＲｓＧｌｕＣｌの末端切断形も含んでいる。このような末端切断タンパク質は、本明細書に記載の様々なアッセイ、結晶化研究、および構造活性相関の研究において有用である。
【００８３】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含んだ（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換またはトランスフェクションの安定な細胞および一過性の細胞の）組換え宿主細胞から得た、膜含有未精製溶解物または実質的に精製された細胞内膜分画にも関する。これらの組換え宿主細胞は、翻訳後に生物学的に活性体となって細胞膜と結合する、ＲｓＧｌｕＣｌまたは機能的同等物を発現する。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のＲｓＧｌｕＣｌの野生型または突然変異体を含み、したがってＲｓＧｌｕＣｌタンパク質またはチャネルのモジュレーターを選択する試験において有用と思われる。換言すれば、このような細胞内膜分画の特定の用途には、組換え細胞内でＲｓＧｌｕＣｌを発現後、他の細胞成分からその膜を分離、実質的に精製し、その後、タンパク質あるいは本明細書に開示するタンパク質の１種または複数を含む生物活性なチャネルの作動薬や拮抗薬等のモジュレーターを選択する試験に使用することが必要である。あるいは、その膜を含む溶解細胞を、組換えで発現した本明細書に開示するタンパク質のモジュレーターを選択する試験に直接使用してもよい。したがって、本発明の他の好ましい態様は、配列番号：１、３、５および／または７に示す完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現するＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた結果、機能形の各ＲｓＧｌｕＣｌチャネルを生じる組換え宿主細胞から得られた膜を含む、実質的に精製された膜調製物または溶解組換え細胞成分に関する。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系およびＳ２細胞系等の昆虫細胞系を含むが、これらの細胞に限らず真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００８４】
また、本発明は、野生型ＲｓＧｌｕＣｌ活性を調節する化合物を同定する試験において有用な融合タンパク質を発現するばかりでなく、ＲｓＧｌｕＣｌに対する抗体も発生させる融合構築体の分離核酸分子に関する。本発明のこの部分の一態様は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲｓＧｌｕＣｌ融合構築体を含むが、それに限定されない。組換えＧＳＴ−ＲｓＧｌｕＣｌ融合タンパク質を、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現系で発現させてもよい。他の態様は、ＧＦＰ（グリーン蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープおよびＧＳＴを含むが、これらに限らず様々な標識に連結したＲｓＧｌｕＣｌ融合構築体に関する。上述と同様に、このような任意の融合構築体を所望の細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の１種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００８５】
ＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性のモジュレーターをスクリーニングする好ましい一態様は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中に本発明のＤＮＡ分子を注入することを含む、グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル活性測定の電気生理学的試験用発現系である。イオンチャネル活性の研究におけるアフリカツメガエル卵母細胞の一般的使用は、当業界で公知である（Ｄａｓｃａｌ、１９８７、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３１７；Ｌｅｓｔｅｒ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０５７−１０６３；また、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２０７、１９９２、Ｃｈ．１４−２５、Ｒｕｄｙ　ａｎｄ　Ｉｖｅｒｓｏｎ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。チャネル活性、および作動薬および／または拮抗薬による調節を測定する改良法で、以前の技術より感度が７倍高い。アフリカツメガエル卵母細胞に、依存性チャネルをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含むが、これらに限定されない核酸物質を注入し、そのチャネルの活性ならびに様々なモジュレーターに対するチャネルの反応を測定する。塩素イオンに対する逆転電位より陽性の（即ち、−３０ｍＶより大きい）、好ましくは約０ｍＶの保持電位を利用することによって、イオンチャネル活性が測定される。試験測定条件のこの変化によって、リン酸イベルメクチンによる調節に対する試験感度が１０倍増加する。したがって、この改良試験は、以前には検出不能と考えられた水準のＧｌｕＣｌ活性を調節する化合物のスクリーニングおよび選択を可能とする。
【００８６】
ＲｓＧｌｕＣｌをクローニングするために、様々な手順のいずれを使用してもよい。これらの方法は以下の方法を含むが、それらに限定されない。（１）ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎ、ｅｔ　ａｌ．、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：８９９８−９００２）。完全長ｃＤＮＡ配列を作出するために、５’および／または３’ＲＡＣＥを行ってもよい。この戦略は、ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。これらの遺伝子特異的プライマーは、入手可能な任意数の核酸およびタンパク質データベースを検索して同定された、発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定によって設計される；（２）適切な発現ベクター系においてＲｓＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリを構築した後の、ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡの直接的な機能性発現；（３）ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＲｓＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索；（４）ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＲｓＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この部分的ｃＤＮＡは、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質と関連する他のＧｌｕＣｌチャネルに対して知られているアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計による、ＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる；（５）ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質と相同性を有する部分的ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＲｓＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この戦略には、前記のＥＳＴとして同定された、ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーも必要となるかもしれない；あるいは、（６）鋳型として配列番号：１、３および５を用いて５’および３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計することによって、完全長ｃＤＮＡを公知のＲＡＣＥ法で作出するか、または、ＲｓＧｌｕＣｌをコードする全長型のヌクレオチド配列を分離することを目的として、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリの多数の型のひとつを検索するプローブとして使用するコード領域の一部を作出し、分離するために、同様に公知のＲＡＣＥ法でコード領域の一部を作出すること。あるいは、本発明のＲｓＧｌｕＣｌ１およびＲｓＧｌｕＣｌ２　ｃＤＮＡを、実施例１の記載に従ってクローニングしてもよい。ＲｓＧｌｕＣｌ１　ｃＤＮＡクローンについては、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ（商標）ｍＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて成虫褐色イヌダニのポリＡ＋ＲＮＡを分離した。ダニｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＺＡＰ　ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成し、ｃＤＮＡサイズ分画カラム（ＢＲＬ）を用いて＞１ｋｂのｃＤＮＡを選択した。ダニｃＤＮＡライブラリは、ＧＩＧＡＰＡＣＫ（登録商標）ＩＩＩゴールドクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＬａｍｂｄａ　ＺＡＰ（登録商標）ＩＩベクター中に構築した。Ｍ１からＭ３領域にまたがるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ断片を、ダニｃＤＮＡライブラリの低ストリンジェントな検索に使用した。フィルタを１１日間暴露し、６個の陽性断片を配列分析のために分離した。クローン中の３種（Ｔ１２、Ｔ８２およびＴ３２）がＧｌｕＣｌ関連のタンパク質をコードし、これらの配列を両端から決定した。ＲｓＧｌｕＣｌ２　ｃＤＮＡの分離のために、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９２．Ｓｈｏｒｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．、−２ｎｄ．ｅｄ．（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ−２ｎｄ　ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等の参考文献から得られた標準的手順に従って、大部分の分子的手順を再び行った。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをダニの頭部から分離した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプレアンプリフィケーションシステム（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、５０ｎｇのＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第一鎖反応の十分の一量をＰＣＲに用いた。利用した縮重オリゴを、土壌線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、およびノミ（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）のＧｌｕｃｌから得た配列に基いて設計した。「２７Ｆ２＋３ＡＦ１の後、２７Ｆ２＋３ＢＦ２」の組合せを用いた２回のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応生成物の十分の一量をサザンブロット分析で試験することによって、汚染配列のＰＣＲクローニングを同定し、防止した。適当な大きさの新規なＰＣＲ産物を、「ＴＡ」クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてｐＣＲ２．１プラスミドベクター中にクローニングした。配列分析（ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ、ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の後、選択されたＰＣＲクローンインサートを放射能標識し、前記ＲＮＡ調製物を用いてＵｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）中に作出したｃＤＮＡライブラリの検索に、プローブとして使用した。完全長ｃＤＮＡクローン由来の配列を、ＧＣＧ　Ｉｎｃ．のパッケージを用いて分析した。ＲｓＧｌｕＣｌ２の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングを、Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ｐＢＳプラスミド由来のクローンＲｓＧｌｕＣｌ２　Ｂ１の元のインサートから１．８５ｋｂコード化領域含有断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ消化物）を切出した後、ＴｅｔＳｐｌｉｃｅ（登録商標）ベクター（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）中に連結することによって行った。
【００８７】
他の型のライブラリ、ならびに他の細胞型や種型から構築したライブラリが、ＲｓＧｌｕＣｌコード化ＤＮＡまたはＲｓＧｌｕＣｌ相同体を分離するために有用であることは、当業者には容易に理解できる。他の型のライブラリは、他の褐色イヌダニ細胞型に由来するｃＤＮＡライブラリを含むが、それに限定されない。
【００８８】
ＲｓＧｌｕＣｌ活性を有する細胞や細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリを調製し得ることは、当業者には容易に理解できる。ＲｓＧｌｕＣｌをコードするｃＤＮＡを分離するための、ｃＤＮＡライブラリの調製に使用する細胞や細胞系は、このような目的に利用できる任意の既知の試験を用いて、最初に細胞結合ＲｓＧｌｕＣｌ活性を測定することによって選択し得る。
【００８９】
ｃＤＮＡライブラリの調製は、当業界で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のｃＤＮＡライブラリ構築法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載されている。相補的ＤＮＡライブラリを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅを含むが、これらに限らず多数の市販源から得てもよい。
【００９０】
ＲｓＧｌｕＣｌをコードするｃＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリから分離し得ることも、当業者には容易に理解できる。ゲノムＤＮＡライブラリの構築は、当業界で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリの構築法は、前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されている。特に、Ｐ１人工染色体ベクター中にゲノムライブラリを調製し、そこから本明細書に開示するＲｓＧｌｕＣｌヌクレオチド配列に基くプローブを用いて、ＲｓＧｌｕＣｌを含むゲノムクローンを分離してもよい。このようなライブラリを調製する方法は、当業界で公知である（Ｉｏａｎｎｏｕ　ｅｔ　ａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
【００９１】
好ましい方法でＲｓＧｌｕＣｌ遺伝子をクローニングするために、ＲｓＧｌｕＣｌまたは相同タンパク質のアミノ酸配列やＤＮＡ配列が必要となるかもしれない。このために、各々のＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を精製し、部分的アミノ酸配列を自動化配列分析装置で決定してもよい。アミノ酸配列を全て決定する必要はないが、部分的なＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために、６から８アミノ酸の２つの領域のリニアな配列を決定することができる。適当なアミノ酸配列を同定すれば、それらをコードし得るＤＮＡ配列が合成される。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンを使用してもよく、したがって、そのアミノ酸配列は、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードされ得る。その一組中の１種だけがＲｓＧｌｕＣｌ配列と同一であると思われるが、その一組中の他のものも、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡとハイブリダイズできると思われる。ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それでも、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡを同定および分離し得るＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡと十分にハイブリダイズし得る。あるいは、発現された配列の一領域のヌクレオチド配列を、１個または複数の入手可能なゲノムデータベースの検索によって同定してもよい。ｃＤＮＡライブラリとｃＤＮＡ集合体のいずれかから、所望のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために、遺伝子特異的プライマーを使用してもよい。前記のように、ＲｓＧｌｕＣｌをコードする完全長配列を作出するために、重複する５’および３’ＲＡＣＥ産物を分離する目的で、あるいは、ＲｓＧｌｕＣｌまたはＲｓＧｌｕＣｌ類似タンパク質をコードする完全長配列を分離するために、１種または複数のｃＤＮＡ系またはゲノム系ライブラリを検索するプローブとして用いる、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列の一部を分離する目的で、ＰＣＲ基準法に用いる適当なヌクレオチド配列を配列番号：１、３、５または７から得てもよい。
【００９２】
本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌ遺伝子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、およびＲｓＧｌｕＣｌ遺伝子を宿主細胞に導入する段階、およびＲｓＧｌｕＣｌの生成に適当な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む実質的に純粋なＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を生産する方法も含んでいる。このようにして生産したＲｓＧｌｕＣｌを従来の方法で宿主細胞から獲得してもよい。したがって、本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質および本明細書で開示する生物学的同等物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いる試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含む組換え宿主細胞、およびこれらの試験により、ＲｓＧｌｕＣｌ活性の作動薬や拮抗薬として作用することが確認された化合物にも関する。
【００９３】
前記の方法で得たクローニングしたＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡを、適当なプロモーターおよび他の転写調節因子を含む（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８、ならびに以下に列挙する他の例等の）発現ベクター中への分子クローニングによって組換えで発現させ、かつ原核または真核宿主細胞中に導入することによって、組換えＲｓＧｌｕＣｌを産生させてもよい。本明細書では、発現ベクターを、適当な宿主細胞において、クローニングしたＤＮＡを転写し、そのｍＲＮＡを翻訳するのに必要なＤＮＡ配列と定義する。このようなベクターの使用によって、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の様々な宿主細胞中に真核細胞ＤＮＡを発現することができる。適切に構築されたベクターは、細菌−酵母、細菌−動物細胞等の宿主間でのＤＮＡの往復移動を可能にする。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞中における自己複製用複製源、選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数能力、および活性なプロモーターを含むはずである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、高い頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。最適量のＲｓＧｌｕＣｌを産生するＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ配列を決定するために、以下を含むが、それらに限らずｃＤＮＡ分子を構築することができる：ＲｓＧｌｕＣｌに対する完全長読み取り枠を含むｃＤＮＡ断片、ならびにそのタンパク質の特異的ドメインまたはそのタンパク質の再配列ドメインだけをコードするｃＤＮＡ部分を含む様々な構築体。ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を全く含まないか、その全部または一部を含むように、全ての構築体を設計することができる。これらの構築体を適当な宿主細胞中に単独および組合せて導入した後、ＲｓＧｌｕＣｌの発現量および活性を決定することができる。一過性発現において最適な結果が得られるようにＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡカセットを決定し、このＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ構築体を、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌、および酵母細胞用のものを含むが、それらに限定されない（組換えウィルスを含む）様々な発現ベクターに導入する。このような操作の技法は前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されており、それらは当業者に周知で利用可能である。したがって、本発明の他の態様は、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡ配列を含み、かつ／または発現するように処理された宿主細胞を含む。組換え宿主細胞中にＲｓＧｌｕＣｌを発現させるために、ＲｓＧｌｕＣｌ様タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを使用してもよい。ＲｓＧｌｕＣｌまたは生物学的等価体を産生するために、該組換え宿主細胞を適当な条件下で培養できる。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、適切に構築されたプラスミドまたはウィルスを含むが、それらに限定されない。組換えＲｓＧｌｕＣｌの発現に適当な市販の哺乳細胞用発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８〜２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２〜１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）を含むが、それらに限定されない。また、細菌細胞中に組換えＲｓＧｌｕＣｌを発現させるために、様々な細菌用発現ベクターを用いてもよい。組換えＲｓＧｌｕＣｌの発現に適当な市販の細菌用発現ベクターは、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ　ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、それらに限定されない。その上、菌類細胞中に組換えＲｓＧｌｕＣｌを発現させるために、様々な菌類細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＲｓＧｌｕＣｌの発現に適当な市販の菌類細胞用発現ベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、それらに限定されない。また、昆虫細胞中に組換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＲｓＧｌｕＣｌの組換え発現に適当な市販の昆虫細胞用発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むが、それらに限定されない。
【００９４】
組換え宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、酵母等の菌類細胞、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類起源の細胞系を含むが、それらに限らず哺乳類細胞、およびＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓや蚕由来の細胞系を含み、それらに限らず昆虫細胞を含み、それらに限らず原核または真核細胞であってもよい。例えば、昆虫の一発現系は、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、適当な市販の哺乳細胞種は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１７１）およびＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２０９）を含むが、それらに限定されない。
【００９５】
ＲｓＧｌｕＣｌに対して親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、または機能性で単一のホモ多量体またはヘテロ多量体膜チャネルを形成するこれらの細胞由来の膜に対する、その化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＲｓＧｌｕＣｌに結合するか、またはＲｓＧｌｕＣｌの既知の放射能標識リガンドのこれらの細胞やこれらの細胞由来の膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングによって、ＲｓＧｌｕＣｌに対して高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法が提供される。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合している放射能標識化合物に置換させるために使用し得るか、機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、ＲｓＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性の有機または無機分子であるかもしれない。
【００９６】
ＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性のモジュレーターをスクリーニングする好ましい一態様は、リガンド依存性チャネル活性（ＧｌｕＣｌチャネル活性など）を測定する電気生理学の試験であって、本発明のＤＮＡやＲＮＡ分子をアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中に注入することを含む試験に用いる発現系である。イオンチャネル活性の研究にアフリカツメガエル卵母細胞を使用することは、当業界で公知である（Ｄａｓｃａｌ、１９８７、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７〜３１７；Ｌｅｓｔｅｒ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０５７〜１０６３；また、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２０７、１９９２、Ｃｈ．１４〜２５、Ｒｕｄｙ　ａｎｄ　Ｉｖｅｒｓｏｎ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。アフリカツメガエル卵母細胞には、リガンド依存性チャネルをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＲＮＡを含むが、それらに限定されずに核酸分子を注入し、その後でチャネル活性ならびにチャネルの様々なモジュレーターに対する反応を測定することができる。
【００９７】
したがって、本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物、ならびにＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の機能を変化させる化合物をスクリーニングする方法を対象とする。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は、当業界で周知であり、それらをＲｓＧｌｕＣｌチャネルの作動薬および拮抗薬を確認するように適合させることができる。例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ等（１９９２、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０９６〜１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に結合する作動薬を阻害し、したがってニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る物質を確認する方法を記載している。その方法は、ＣＯＳ細胞にラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターをトランスフェクトし、ニューロキニン受容体の発現を可能とするに十分な期間、トランスフェクトした該細胞を培養し、トランスフェクトしたその細胞を回収し、ニューロキニン受容体の既知の放射活性標識作動薬を含む試験緩衝液中に、その物質の存在下または不在下のいずれかでその細胞を再懸濁し、次いでニューロキニン受容体の既知の放射活性標識作動薬のニューロキニン受容体への結合を測定する。既知の作動薬の結合量がその物質の不在下より存在下で少ない場合、その物質はニューロキニン受容体のリガンドとなり得る。作動薬、拮抗薬等のその物質のＲｓＧｌｕＣｌへの結合を測定する場合、標識リガンドを用いることによって、このような結合を測定することができる。当業界で公知の任意の適切な方法、例えば、放射活性、蛍光、酵素によって、リガンドを標識することができる。
【００９８】
したがって、本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物をスクリーニングする方法を対象とする。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機または無機分子であるかもしれない。化合物は、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはＲｓＧｌｕＣｌ系チャネルの機能を増強または減弱させることによって、調節すると思われる。ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能を調節する化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。ＲｓＧｌｕＣｌ、ＲｓＧｌｕＣｌに対する抗体、または修飾ＲｓＧｌｕＣｌを含むキットを、これらの用途として公知の方法で調製してもよい。
【００９９】
この目的のために、本発明は、ＲｓＧｌｕＣｌ受容体活性を調節する物質を同定する方法に部分的に関するものであって、その方法では、
（ａ）配列番号：２，６および／または８に示すアミノ酸配列を含むＲｓＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の存在下、および不在下で試験物質を添加し、かつ
（ｂ）ＲｓＧｌｕＣｌ受容体タンパク質または各機能性チャネルの存在下および不在下で、その試験物質の作用を測定し、比較すること
が必要である。
【０１００】
その上、ＲｓＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の発現を指示する発現ベクターと共に当業者に利用可能な、多様なスクリーニングまたは選択試験の幾つかの特定の実施形態を本明細書に開示している。他の受容体のリガンドの同定方法は当業界で周知であり、それらをＲｓＧｌｕＣｌのリガンドに適合させることができる。したがって、これらの実施形態を例として提示するが、制限するためのものではない。このために、本発明は、（作動薬、拮抗薬等の）ＲｓＧｌｕＣｌモジュレーターを同定し得る試験を含む。したがって、本発明は、ある物質がＲｓＧｌｕＣｌの作動薬または拮抗薬となり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＲｓＧｌｕＣｌの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）ＲｓＧｌｕＣｌの発現を可能にするのに十分な時間の間、かつ機能性チャネルが作出するように、その試験細胞を培養させること、
（ｃ）その物質の存在下、および不在下で、その細胞をＲｓＧｌｕＣｌの標識リガンドに曝すこと、
（ｄ）その標識リガンドのＲｓＧｌｕＣｌチャネルへの結合量を測定することを含み、その標識リガンドの結合量がその物質の不在下より存在下で少ない場合、その物質がＲｓＧｌｕＣｌのリガンドとなり得る方法を含む。
【０１０１】
この方法の段階（ｃ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当業界で通常使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の通常用いられる緩衝液で代表され、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を収穫し、その物質およびその標識リガンドの存在下で再懸濁してもよい。前記方法の一変法としては、その細胞を収穫し、再懸濁するのではなく、細胞を基材、例えば組織培養皿に付着させた状態で、細胞に公知の放射能標識作動薬およびその物質を接触させるように、段階（ｃ）を改良する。
【０１０２】
また、本発明は、ある物質がＲｓＧｌｕＣｌと結合することができるか否か、即ちその物質がＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性化のモジュレーターとなり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＲｓＧｌｕＣｌの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）その試験細胞をその物質に曝すこと、
（ｃ）その物質のＲｓＧｌｕＣｌへの結合量を測定すること、
（ｄ）その試験細胞におけるその物質のＲｓＧｌｕＣｌへの結合量を、ＲｓＧｌｕＣｌでトランスフェクトされていない対照細胞へのその物質の結合量と比較すること
を含み、その物質の結合量が、対照細胞と比較して試験細胞中で大きい場合、その物質はＲｓＧｌｕＣｌに結合することができるとする方法も含む。次いで、その物質が実際に作動薬または拮抗薬であるか否かを、本明細書に記載の電気生理学的試験等の機能性試験で決定することができる。
【０１０３】
この方法の段階（ｂ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当業界で通常使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の通常用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を回収し、その物質の存在下で再懸濁する。
【０１０４】
前記試験は機能性試験であってよく、その場合、電気生理学的試験（例えば、実施例２を参照されたい）をトランスフェクトした哺乳類細胞系、昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞中で行うことによって、試験化合物が（グルタミン酸等の）既知リガンドのチャネル活性化能力に及ぼす様々な効果を測定するか、あるいは、本質的に活性を調節する（知られているＧｌｕＣｌチャネルに対するイベルメクチンの作用に類似した）試験化合物を探索してもよい。したがって、当業者であれば、本発明の機能性ＧｌｕＣｌチャネルを結合および／または活性化する化合物を選択する一次および二次スクリーニング用の公知の技法に、本発明のｃＤＮＡクローンを適用できる。
【０１０５】
ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質のモジュレーターを同定する好ましい方法は、第一に、配列番号：２、４、６および８から成る群から選択されるＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質と、試験化合物を接触させること、および第二に、その試験化合物のＲｓＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に対する作用を測定することを含む。好ましい一態様は、組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物であるＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を用いることである。
【０１０６】
ＲｓＧｌｕＣｌグルタミン酸依存性チャネルタンパク質の活性を調節する化合物を同定する他の好ましい方法は、第一に、少なくともその一部が配列番号：２、４、６および８から成る群から選択されるＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする、核酸分子群を宿主細胞内に注入することによって、核酸分子の前記部分の発現により、活性なリガンド依存性チャネルを生じること、第二に、試験化合物の存在下、および不在下で宿主細胞膜電流を測定することを含む。相補的ＤＮＡ、ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡおよび相補的ＲＮＡを含むが、それらに限らず多数の鋳型を使用してもよい。
【０１０７】
ＲｓＧｌｕＣｌの量をスクリーニングし、測定するために、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用してもよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ＲｓＧｌｕＣｌの検出およびタイピングに適したキットの処方に有用である。このようなキットは、少なくとも１個の容器を緊密に閉じ込めるのに適した仕切り付き運搬具を含むと思われる。更に、その運搬具は、組換えＲｓＧｌｕＣｌまたはＲｓＧｌｕＣｌの検出に適した抗ＲｓＧｌｕＣｌ抗体のような試薬を含むと思われる。また、その運搬具は、標識抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。
【０１０８】
本明細書に記載の試験は、ＲｓＧｌｕＣｌで一過性または安定にトランスフェクトした細胞を用いて実行することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むが、それらに限らず多数の技術の任意の一法を介して、宿主細胞中に導入してもよい。トランスフェクションとは、試験細胞中にＲｓＧｌｕＣｌを導入するための、当業界で公知の任意の方法を含むことを意味している。例えば、トランスフェクションは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、ＲｓＧｌｕＣｌを含んだレトロウィルス構築体による感染、およびエレクトロポレーションを含む。発現ベクター含有細胞は、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を産生するか否かを決定するために、個別に分析する。ＲｓＧｌｕＣｌ発現細胞の同定は、抗ＲｓＧｌｕＣｌ抗体を用いた免疫反応性、標識リガンド結合、または機能的な非内因性ＲｓＧｌｕＣｌ活性を含むが、それらに限らず幾つかの手段によってなし得る。
【０１０９】
ＲｓＧｌｕＣｌに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＲｓＧｌｕＣｌに結合するか、またはＲｓＧｌｕＣｌの知られているリガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＲｓＧｌｕＣｌに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射活性、蛍光、または酵素で標識した化合物に置換させるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、ＲｓＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われる。
【０１１０】
したがって、ＲｓＧｌｕＣｌに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＲｓＧｌｕＣｌに結合するか、またはＲｓＧｌｕＣｌの（グルタミン酸、イベルメクチン、ノジューリスポア酸等の）知られている放射能標識リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＲｓＧｌｕＣｌに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射活性、蛍光、または酵素で標識した化合物に置換させるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、やはりＲｓＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われる。本明細書の他の箇所に記述したように、化合物は、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を増加または減少させることによって、あるいはＲｓＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の作動薬または拮抗薬として作用することによって調節すると思われる。ＲｓＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能を調節するこれらの化合物は、やはり、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。
【０１１１】
ＲｓＧｌｕＣｌ１および／または２依存性塩素イオンチャネルの機能性試験は、チャネルの全体または一部がＲｓＧｌｕＣｌチャネルで構成される場合の１種または複数のリガンド依存性塩素イオンチャネル活性を測定する。ＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性は、本明細書に記載のチャネルを単独で使用して測定することができる。あるいは、サブユニットとして、リガンド依存性塩素イオンチャネルの１種または複数の追加のサブユニット（好ましくは１種または複数のＲｓＧｌｕＣｌ）であって、一緒になって機能的なチャネル活性をもたらすサブユニットを併用して、その活性を測定することができる。ＲｓＧｌｕＣｌ依存性塩素イオンチャネル活性を測定する試験は、３６Ｃｌを用いる機能性スクリーニング、パッチクランプによる電気生理学的試験を用いる機能性スクリーニングおよび蛍光色素を用いる機能性スクリーニングを含む。このような試験一般を行う技術は、当業界で良く知られている。（例えば、Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．、１９９８、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１５９：２６１〜２６９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ａｎｄ　Ｔｓｉｅｎ、１９９７、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４：２６９〜２７７；Ｍｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．２５８：３０７〜３１４；Ｒａｕｈ　ｅｔ　ａｌ．、１９９０　ＴｉＰＳ　１１：３２５〜３２９およびＴｓｉｅｎ等、米国特許第５６６１０３５号を参照されたい）。機能性試験は、個々の化合物または異なる化合物を含んだ調製物を用いて行うことができる。異なる化合物を含み、１種または複数の化合物がＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性に影響する調製物は、ＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性に影響する化合物を確認するための、より小規模の化合物群の中に分類することができる。本発明の一実施形態では、少なくとも１０種の化合物を含む試験調製物が、機能性試験において使用される。組換えで産生し、様々な環境中に存在するＲｓＧｌｕＣｌチャネルを、機能性試験において使用することができる。適当な環境は、ＲｓＧｌｕＣｌチャネルを含んだ生細胞および精製細胞抽出物、および活性に適した膜と、更に、ＲｓＧｌｕＣｌチャネル活性の測定に適した異なる環境中に導入される組換え手段によって産生される精製ＲｓＧｌｕＣｌチャネルの使用を含む。チャネルにおいて活性となっている化合物を試験し、かつチャネルの異なる領域に関する情報を得るために、ＲｓＧｌｕＣｌ誘導体を使用することができる。例えば、生来のチャネル中の各アミノ酸領域が修飾されたＲｓＧｌｕＣｌ誘導体を産生することができ、その修飾されたチャネル活性に対する効果を測定することによって、異なる領域に関する情報を得ることができる。
【０１１２】
ＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡの発現を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生成した合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦の麦芽抽出物および網状赤血球抽出物を含むが、それらに限らず様々な無細胞系において有効に翻訳できるだけでなく、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含み、それに限らず細胞に基く系においても有効に翻訳することができるが、後者の場合、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションが好ましい。
【０１１３】
宿主細胞中でのＲｓＧｌｕＣｌの発現後、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の回収によって活性体のＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を提供してもよい。ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質についての幾つかの精製手順が利用でき、使用に適している。塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組合せや個々の適用によって、組換えＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を細胞溶解物および抽出物から精製してもよい。その上、完全長ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質、またはＲｓＧｌｕＣｌタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で作製したイムノ親和性カラムを用いて、組換えＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を他の細胞タンパク質から分離することができる。
【０１１４】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生成した合成ｍＲＮＡを用いてＲｓＧｌｕＣｌ　ＤＮＡの発現を、行ってもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦の麦芽抽出物および網状赤血球抽出物を含むが、それらに限らず様々な無細胞系において有効に翻訳できるだけでなく、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含み、それに限らず細胞に基く系においても有効に翻訳することができるが、後者の場合、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションが好ましい。
【０１１５】
宿主細胞中でのＲｓＧｌｕＣｌの発現後、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の回収によって活性体ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を提供してもよい。ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質の幾つかの精製手順が利用でき、使用に適している。塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組合せや個々の適用によって、組換えＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を細胞溶解物および抽出物から精製してもよい。その上、完全長ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質、またはＲｓＧｌｕＣｌタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で作製したイムノ親和性カラムを用いて、組換えＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を他の細胞タンパク質から分離することができる。
【０１１６】
ＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２、あるいは配列番号２、４、６および／または８に開示したＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２の一部に由来する（普通、長さが約９個から約２５個のアミノ酸の）合成ペプチドに対する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。ＲｓＧｌｕＣｌに対する単一特異性抗体は、ＲｓＧｌｕＣｌに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７）の技法を用いて、ＲｓＧｌｕＣｌと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体とは、ＲｓＧｌｕＣｌに対する均一結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種と定義する。本明細書で使用する均一結合は、その抗体種が、前記のＲｓＧｌｕＣｌと結合する種のように、特異的な抗原やエピトープとの結合能を指す。ヒトのＲｓＧｌｕＣｌ特異的抗体は、免疫アジュバントと共に、またはそれなしに、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質、またはＲｓＧｌｕＣｌの一部分から作出した合成ペプチドの適当な濃度で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を免疫することによって産生する。
【０１１７】
一次免疫の前に、免疫前血清を回収する。許容し得る免疫アジュバントと共に、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を約０．１ｍｇから約１０００ｍｇ各動物に投与する。このような許容し得るアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍを含む油中水乳濁液およびｔＲＮＡを含むが、それらに限定されない。初回免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）またはその両径路による多部位における、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のＲｓＧｌｕＣｌタンパク質またはそのペプチド断片から成る。各動物から一定の間隔、好ましくは毎週採血することによって、抗体価を決定する。動物には、初回免疫後、追加免疫注射を行ってもよく行わなくてもよい。追加免疫注射を受けるそれらの動物には、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量のＲｓＧｌｕＣｌを同じ径路によって与えられる。最大の力価が得られるまで、約３週間隔で追加免疫注射を与える。各追加免疫から約７日後、または単回免疫から約１週後に、各動物から採血し、血清を収集し、その各分量を約−２０℃で保存する。
【０１１８】
ＲｓＧｌｕＣｌと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配のマウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＲｓＧｌｕＣｌタンパク質で免疫することによって調製される。約０．５ｍｌの緩衝液または塩水を、前記のような同量の許容し得るアジュバント中に導入し、その中のＲｓＧｌｕＣｌタンパク質約１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇでＩＰまたはＳＣ径路によりマウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。初回免疫を０日にマウスに与え、約３週から約３０週の間休息させる。免疫マウスに、リン酸緩衝塩水等の緩衝液中、ＲｓＧｌｕＣｌ約１ｍｇから約１００ｍｇの追加免疫を１回または複数回、静脈内（ＩＶ）径路により与える。抗体陽性のマウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球は、当業者に公知の標準的手順で、免疫マウスから脾臓を除去することによって得られる。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を適当な融合相手の細胞、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすると思われる条件下で混合することによって産生される。融合相手の細胞は、各マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を含んでもよいが、それらに限らず、好ましくはＳｐ２／０である。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、分子量約１０００、濃度約３０％から約５０％のポリエチレングリコール中で融合する。融合ハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン添加ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）での増殖によって、当業者に公知の手順により選択される。上清液を約１４、１８および２１日に増殖陽性ウェルから収集し、抗原としてＲｓＧｌｕＣｌを用いて、固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降検定で試験することによって、そのｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９７３、Ｓｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓの軟寒天法等の技法によってクローニングした。
【０１１９】
モノクローナル抗体は、元の感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに、感作後約４日に約２×１０６から約６×１０６のハイブリドーマ細胞を１匹当たり約０．５ｍｌで注入することによって、ｉｎ　ｖｉｖｏで産生される。細胞導入後約８〜１２日に腹水を収集し、モノクローナル抗体を当業界で公知の技法で精製する。
【０１２０】
抗ＲｓＧｌｕＣｌ　ｍＡｂのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの産生は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることによって行われる。そのｍＡｂを当業界で公知の技法で精製する。
【０１２１】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降、受動凝集、酵素連結イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含むが、それらに限らず様々な血清学的または免疫学的試験によって同定される。体液または組織および細胞抽出液中のＲｓＧｌｕＣｌの存在を検出するために、同様の試験を用いる。
【０１２２】
ＲｓＧｌｕＣｌペプチド断片、または各完全長ＲｓＧｌｕＣｌに対する特異抗体を産生するために、単一特異性抗体を産生する前記方法を利用し得ることは、当業者には容易に理解できる。
【０１２３】
ＲｓＧｌｕＣｌ抗体親和性カラムを、例えば、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）にその抗体を添加することによって作製する。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ　エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ　グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、完全長ＲｓＧｌｕＣｌまたはＲｓＧｌｕＣｌタンパク質断片を含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムをリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を０．２３Ｍ　グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＲｓＧｌｕＣｌをリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【０１２４】
また、本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの培養に細胞を提供することによって、ＲｓＧｌｕＣｌまたは機能性ＲｓＧｌｕＣｌの任意の代替チャネルのモジュレーターとして、ｉｎ　ｖｉｖｏで作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するに当たって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当業界で公知の方法によって、動物の細胞中の１個または複数の染色体の中に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも一ヵ所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のｃＤＮＡクローンの１種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および／または導入遺伝子も、当業界で公知の遺伝調節因子および／または構造因子を含み得る。遺伝子導入のための標的細胞型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養した着床前の胚からＥＳ細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：２５５〜２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９０６５〜９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２２：４４５〜４４８）。ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準的技法、またはレトロウィルスによる形質導入によって、導入遺伝子をＥＳ細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ＥＳ細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ＥＳ細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４６８〜１４７４）。土壌線虫ＧｌｕＣｌサブユニットの一方または両方をノックアウトされた土壌線虫突然変異体において、野生型土壌線虫のＧｌｕＣｌバックグランド中にＲｓＧｌｕＣｌ導入遺伝子をも発現するトランスジェニックまたはノックアウト無脊椎動物（例えば、土壌線虫）を作製することも、当該技術者の範囲内にあると思われる。
【０１２５】
薬剤として許容し得る担体の混合物のような知られている方法により、ＲｓＧｌｕＣｌのモジュレーターを含む薬剤として有用な組成物を処方し得る。このような担体の例および処方の方法を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見出し得る。有効投与に適した、薬剤として許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲｓＧｌｕＣｌ、あるいは、チロシンキナーゼ活性化剤または阻害剤を含むＲｓＧｌｕＣｌ作動薬または拮抗薬のいずれかを含むと思われる。
【０１２６】
本発明の治療または診断用組成物は、障害の治療または診断に十分量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢等の様々な要因に応じて変化し得る。他の要因には投与方式が含まれる。
【０１２７】
その薬剤組成物を、皮下、局所、経口、筋肉内等の多様な径路によって個体に供してよい。
【０１２８】
「化学的誘導体」という用語は、普通は基本分子の一部でない追加の化学的部分を含んだ分子を指す。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改良し得る。あるいは、その部分が、基本分子の好ましくない副作用を弱めるか、または基本分子の毒性を減少させるかもしれない。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等の様々なテキスト中に記載されている。
【０１２９】
本明細書に開示した方法に従って確認した化合物は、単独で適当な投与量で使用してもよい。あるいは、他の剤の同時投与または逐次投与が望ましいかもしれない。
【０１３０】
本発明は、本発明の新規な治療法に使用する適当な局所用、経口用、全身用および非経口用薬剤処方を提供する目的も有している。本明細書に従って確認した化合物を活性成分として含む組成物は、従来の投与用媒体中の非常に多様な治療剤形で投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤（適時放出および持続的放出処方を各々含む）、丸剤、散在、顆粒剤、エリキシール剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の経口剤形で、または注射によって、それらの化合物を投与することができる。同様に、静脈内（ボーラスでも輸液でも）、腹腔内、皮下、閉塞を伴っているか、または伴っていない局所、または筋肉内の剤形で、全て製剤技術者によく知られた剤形を用いて、それらを投与することもできる。
【０１３１】
本発明の化合物を１日１回の用量で投与するか、または１日の全投薬量を１日２回、３回または４回の分割用量で投与するのが有利であるかもしれない。更にまた、適当な鼻腔内媒体の局所使用を介して鼻腔内剤形で、または、当業界の技術者によく知られた経皮性皮膚パッチの形態を用いて経皮径路で、本発明の化合物を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、投薬プログラムを通して、投薬は当然間欠的ではなく連続的になると思われる。
【０１３２】
投薬が別々に処方されている複数の活性剤を用いる併用療法に対しては、各活性剤を同時に投与するか、または時間をずらしてそれらを投与することができる。
【０１３３】
本発明の化合物を利用する投薬プログラムは、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき状態の重度；投与径路；患者の腎、肝および心血管機能；および使用する特定の化合物を含む様々な要因に応じて選択される。平均的技量の医師または獣医であれば、病状の進行を防止、阻止または抑止するのに必要な有効量の薬物を容易に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を示す範囲内に、薬物濃度を最適な精度で実現するためには、標的部位に対するその薬物のアベイラビリティーの動態学に基く投薬プログラムが必要である。これには、薬物の分布、平衡、および消失に関する考察が必要である。
【０１３４】
以下の実施例を、本発明を例示するために提供するが、制限するために提供するものではない。
【０１３５】
実施例１
ＲｓＧｌｕＣｌおよびＲｓＧｌｕＣｌ２をコードするＤＮＡ分子の分離および特定
大部分の分子手順を、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９９２．Ｓｈｏｒｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．、−２ｎｄ．ｅｄ．（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ−２ｎｄ　ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等の参考文献で入手できる標準的手順に従って行った。
【０１３６】
ＲｓＧｌｕＣｌ１：Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ（商標）ｍＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて成虫褐色イヌダニのポリＡ＋ＲＮＡを分離した。ダニｃＤＮＡは、オリゴ−ｄＴプライマーおよびＺＡＰ　ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成し、ｃＤＮＡサイズ分画カラム（ＢＲＬ）を用いて＞１ｋｂのｃＤＮＡを選択した。ダニｃＤＮＡライブラリは、ＧＩＧＡＰＡＣＫ（登録商標）ＩＩＩゴールドクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＬａｍｂｄａ　ＺＡＰ（登録商標）ＩＩベクター中に構築した。Ｍ１からＭ３領域にまたがるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ断片を、ダニｃＤＮＡライブラリの低ストリンジェントな検索［４２℃において、２５％ｖ／ｖホルムアミド／５×ＳＳＣＰ（１×ＳＳＣＰ＝１２０ｍＭ　ＮａＣｌ／１５ｍＭクエン酸ナトリウム／２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）／０．１％　ＳＤＳ／１０×デンハルト溶液／サケ精子ＤＮＡ（２５０μｇ／ｍｌ）；４２℃において、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄］に使用した。そのプローブのヌクレオチド配列は次のとおりである。
【０１３７】
【化６】
2004500118.tif 000008
【０１３８】
フィルタを１１日間暴露し、６個の陽性部を配列分析のために分離した。クローン中の３種（Ｔ１２、Ｔ８２およびＴ３２）がＧｌｕＣｌ関連のタンパク質をコードし、これらの配列を両鎖について決定した。
【０１３９】
ＲｓＧｌｕＣｌ２：ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを褐色イヌダニの頭部から分離した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ予備増幅系（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５０ｎｇ　ＲＮＡから合成した。第一鎖反応の十分の一量をＰＣＲに用いた。利用した縮重オリゴを、土壌線虫、ショウジョウバエ、およびノミのＧｌｕＣｌから得た配列に基いて設計した。
【０１４０】
【化７】
2004500118.tif 000009
【０１４１】
「２７Ｆ２＋３ＡＦ１の後、２７Ｆ２＋３ＢＦ２」の組合せを用いた２回のＰＣＲを行った。そのサイクルは次のとおりであった：１×（９５℃、１２０秒間）、次いで３０×（９５℃、４５秒間；５０℃、９０秒間；および７２℃、１２０秒間）、次いで１×（７２℃、１２０秒間）。各試薬はＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．から入手した。そのオリゴヌクレオチドの濃度は５μＭであった。ＰＣＲ反応生成物の十分の一量をサザンブロット分析で試験することによって、汚染配列のＰＣＲクローニングを同定し、防止した。適当な大きさの新規なＰＣＲ産物を、「ＴＡ」クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてＰＣＲ２．１プラスミドベクター中にクローニングした。配列分析（ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ、ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の後、選択したＰＣＲクローンインサートを放射能標識し、前記ＲＮＡ調製物を用いてＵｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）中に作出したｃＤＮＡライブラリの検索に、プローブとして使用した。完全長ｃＤＮＡクローン由来の配列を、ＧＣＧ　Ｉｎｃ．のパッケージを用いて分析した。Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ｐＢＳプラスミド由来のクローンＲｓＧｌｕＣｌ２　Ｂ１の元のインサートから１．８５ｋｂコード化領域含有断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ消化物）を切出した後、ＴｅｔＳｐｌｉｃｅ（登録商標）ベクター（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）中に連結することによってＲｓＧｌｕＣｌ２の哺乳類発現ベクター中へのサブクローニングを、行った。ｃＤＮＡクローンＴ１２およびＴ８２は、恐らく自然に起こる多型性である、単一のアミノ酸置換を生じる単一のヌクレオチドの違いを別とすれば、コード領域が同一である。Ｔ３２クローンは、Ｔ１２およびＴ８２のｃＤＮＡには存在しない２個の別のエキソンを有するが、一方はコード領域の５’末端近傍（１３５ｂｐエキソン）にあり、他方はＭ３−Ｍ４細胞内リンカー中（９６ｂｐエキソン）にある。その上、これらの別のエキソンはＤｒｏｓＧｌｕＣｌ−１　ＯＲＦ中には含まれていない。これらのｃＤＮＡクローンを、ＲｓＧｌｕＣｌ−１Ｌ（Ｔ３２：２．４８ｋｂ）およびＲｓＧｌｕＣｌ−１Ｓ（Ｔ１２およびＴ８２：２．１２６ｋｂ）とも表示する。予想されるＲｓＧｌｕＣｌ−１Ｓタンパク質は、ＤｒｏｓＧｌｕＣｌ１タンパク質と約７１％同一性を示す。
【０１４２】
実施例２
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるＲｓＧｌｕＣｌ１およびＲｓＧｌｕＣｌ２クローンの機能性発現
Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓの卵母細胞を調製し、以前に記載の標準的方法［Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．＆　Ｃｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，３６８〜３７４（１９９１）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．＆　Ｃｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．１５，３３９〜３４８（１９９２）］を用いてそれを注入した。成体雌Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓを０．１７％トリカインメタンスルホン酸で麻酔し、その卵巣を外科的に除去し、次の成分（ｍＭ）から成る溶液中に入れた：ＮａＣｌ　８２．５、ＫＣｌ　２、ＭｇＣｌ２　１、ＨＥＰＥＳ　５、ピルビン酸ナトリウム　２．５、ペニシリンＧ　１００，０００ユニット／Ｌ、硫酸ストレプトマイシン　１０００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．５（Ｍｏｄ．ＯＲ−２）。卵巣葉を開き破り、Ｍｏｄ．ＯＲ−２中で数回濯ぎ、軽く振とうしながら室温で、Ｍｏｄ．ＯＲ−２中０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１型）の中でインキュベートした。１時間後にコラゲナーゼ溶液を更新し、約５０％の卵母細胞が卵巣から放出されるまで、卵母細胞を更に３０〜９０分間インキュベートした。Ｖ期およびＶＩ期の卵母細胞を選択し、注入前の１６〜２４時間の間、次の成分（ｍＭ）を含んだ媒体中に入れた：ＮａＣｌ　９６、ＫＣｌ　２、ＭｇＣｌ２　１、ＣａＣｌ２　１．８、ＨＥＰＥＳ　５、ピルビン酸ナトリウム　２．５、テオフィリン　０．５、ゲンタマイシン　５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５（ＮＤ−９６）。卵母細胞に５０ｎｌのＤｖ８、Ｄｖ９、ＲｓＧｌｕＣｌ１またはＲｓＧｌｕＣｌ２　ＲＮＡを濃度０．２ｍｇ／ｍｌで注入した。卵母細胞をＮＤ−９６中、１８℃で１〜６日間インキュベートした後、記録をとった。
【０１４３】
記録は、次の成分（ｍＭ）から成る修飾ＮＤ−９６中、室温でとった：ＮａＣｌ　９６、ＭｇＣｌ２　１、ＣａＣｌ２　０．１、ＢａＣｌ２　３．５、ＨＥＰＥＳ　５、ｐＨ７．５。マッキントッシュ７１００／８０コンピュータにインターフェースで接続したＤａｇａｎ　ＣＡ１二微小電極増幅器（Ｄａｇａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、卵母細胞を電位で締付けた。電流通過電極は０．７Ｍ　ＫＣｌ、１．７Ｍ　クエン酸カリウムで満たし、電位記録電極は１Ｍ　ＫＣｌで満たした。実験の間中、卵母細胞に、修飾ＮＤ−９６（対照溶液）、またはチャネル活性化剤および阻止剤の可能性がある物質を含むＮＤ−９６を約３ｍｌ／分の速度で注いだ。ＨＥＫＡ　Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ（Ｌａｍｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のパルスソフトウェアを用いて、データを１００Ｈｚで取得し、３３．３Ｈｚでフィルタにかけた。全ての記録を、０または−３０ｍＶのいずれかの保持電位で行った。
【０１４４】
ｃＲＮＡをＲｓＧｌｕＣｌ　１ＳクローンＴ１２から合成し、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現させた。ＲｓＧｌｕＣｌ−１でコードされるチャネルは、ＩＭＶ−ＰＯ４によって活性化されるグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルである。
【０１４５】
図１０は、ＲｓＧｌｕＣｌ１　Ｔ１２　ＲＮＡを注入した卵母細胞におけるグルタミン酸活性化電流を示す。電流活性化は１０μＭのグルタミン酸で最大であり、未注入の卵母細胞には電流を認めなかった。イベルメクチン１００ｎＭの施用によって、類似してはいるが、非不活性化性の電流が生じる。
【０１４６】
図１１は、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したＲｓＧｌｕＣｌ２のイベルメクチンによる活性化を示す。電流活性化は約１μＭのイベルメクチンで最大であり、単一の機能性チャネルとして発現したとき、グルタミン酸は電流を活性化することができなかった。
【０１４７】
実施例３
哺乳類細胞におけるＲｓＧｌｕＣｌクローンの機能性発現
ＲｓＧｌｕＣｌを哺乳類発現ベクター中にサブクローニングし、選択した哺乳類細胞にトランスフェクトするために使用することができる。Ｇ４１８の存在下での増殖によって、安定な細胞クローンを選択する。Ｇ４１８耐性単一種クローンを分離し、無傷のＲｓＧｌｕＣｌ遺伝子の存在を確認するために試験をする。次いで、ＲｓＧｌｕＣｌを含んだクローンを、ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質特異抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫蛍光等の免疫学的技法を用いて、発現について分析した。抗体は、ＲｓＧｌｕＣｌ配列から予測されるアミノ酸配列から合成したペプチドを接種したウサギから得られる。パッチクランプ電気生理学法および陰イオンフラックスアッセイによっても、発現は分析される。
【０１４８】
活性なチャネルタンパク質の発現を試験するために、ＲｓＧｌｕＣｌを安定に、または一時的に発現している細胞が使用される。これらの細胞は、各チャネルを調節、阻害または活性化する他の化合物の能力を確認し、調べるために、使用される。
【０１４９】
プロモーターに対してポジティブな方位にＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡを含むカセットは、プロモーターの３’に対して適当な制限部位中に連結され、制限部位地図作製および／または配列決定によって確認される。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、繊維芽細胞性宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１ｔａｔ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５）、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）中に、エレクトロポレーションまたは化学的手順（陽イオンリポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むが、それらに限らない標準的方法で導入してもよい。トランスフェクトした細胞および細胞培養液上清を収穫し、本明細書に記載のＲｓＧｌｕＣｌ発現の分析をすることができる。
【０１５０】
哺乳類細胞での一時的発現に使用するベクターは全て、ＲｓＧｌｕＣｌを発現する安定な細胞系を樹立するために使用することができる。発現ベクター中にクローニングされた未修飾のＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ構築体は、宿主細胞がＲｓＧｌｕＣｌタンパク質を産生するようにプログラムすると予想される。その上、分泌タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡにＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ構築体を連結することによって、ＲｓＧｌｕＣｌは分泌タンパク質として細胞外で発現する。トランスフェクション宿主細胞は、ＣＶ−１−Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５）、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ　ａｌ．、１９７７，Ｃｅｌｌ　１１：２２３）、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１）を含むが、それらに限定されない。
【０１５１】
Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂ　ホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グァニン　ホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、それらに限らない薬物選択プラスミドによる、ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡを含んだベクターの同時トランスフェクションは、安定にトランスフェクトされるクローンの選択を可能にすると思われる。ＲｓＧｌｕＣｌのレベルは、本明細書に記載の試験によって定量化される。可能な限り多量のＲｓＧｌｕＣｌを合成する哺乳細胞クローンを作製するために、ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ構築体を、増幅可能な薬物耐性マーカーを含んだベクター中に連結してもよい。これらの構築体を細胞に導入後、プラスミドを含むクローンを適当な作用剤で選択し、その作用剤の用量増加による選択によって、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの分離が実現する。組換えＲｓＧｌｕＣｌの発現は、完全長ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡの哺乳類宿主細胞へのトランスフェクションによって実現される。
【０１５２】
実施例４
昆虫細胞中での発現を目的とした、バキュロウィルス発現ベクター中へのＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウィルスのゲノム由来のバキュロウィルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ＃１７１１）内で高水準のｃＤＮＡ発現量をもたらすように設計する。ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウィルスは、次の標準的方法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｍａｘｂａｃマニュアル）によって作製される。ＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡ構築体を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含む多様なバキュロウィルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウィルスは、バキュロウィルス移入ベクターおよび線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｋｉｔｔｓ，１９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７）の、Ｓｆ９細胞中への同時トランスフェクション後に起こる相同的組換えによって作出される。組換えｐＡＣ３６０ウィルスは、感染細胞中に封入体がないことによって確認され、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウィルスは、ｂ−ガラクトシダーゼの発現に基いて確認される（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５）。プラークの精製後、本明細書に記載の試験によってＲｓＧｌｕＣｌ発現を測定する。
【０１５３】
ＲｓＧｌｕＣｌＧｌｕＣｌに対する読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位中に挿入する。ポジティブ方位の構築体を配列分析で確認し、線状ＡｃＮＰＶのマイルドタイプＤＮＡの存在下、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトするために使用する。
【０１５４】
実施例５
酵母発現ベクター中へのＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡのクローニング
異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を指示するように設計した発現ベクター中に、最適なＲｓＧｌｕＣｌ　ｃＤＮＡシストロンを挿入した後、組換えＲｓＧｌｕＣｌが酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に産生される。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４やその類似体等のベクターをＲｓＧｌｕＣｌシストロンに連結する（Ｒｉｎａｓ，ｅｔ　ａｌ．、１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：５４３〜５４５；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９〜４１９２）。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母または哺乳類ペプチド）をＲｓＧｌｕＣｌタンパク質のＮＨ２末端に融合する酵母発現ベクター中に、ＲｓＧｌｕＣｌＧｌｕＣｌシストロンを連結する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，１９８９，Ｇｅｎｅ　８５：５１１〜５１６；Ｒｉｅｔｔ　ａｎｄ　Ｂｅｌｌｏｎ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１〜２９４９）。
【０１５５】
これらのベクターは、ヒト血清アルブミンシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するｐＡＶＥ１−６（Ｓｔｅｅｐ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：４２〜４６）、およびヒトリゾチームシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するベクターｐＬ８ＰＬ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８〜２７３２）を含むが、それらに限定されない。その上、ベクターｐＶＥＰを利用して、ＲｓＧｌｕＣｌはユビキチンと複合した融合タンパク質として酵母中に発現する（Ｅｃｋｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５〜７７１９；Ｓａｂｉｎ，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：７０５〜７０９；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９：５５１７〜５５２３（１９８９））。ＲｓＧｌｕＣｌの発現量は、本明細書に記載の試験によって決定される。
【０１５６】
実施例６
組換えＲｓＧｌｕＣｌの精製
抗体親和性クロマトグラフィによって、組換え産生ＲｓＧｌｕＣｌを精製し得る。ＲｓＧｌｕＣｌ　ＧｌｕＣｌ抗体親和性カラムは、抗ＲｓＧｌｕＣｌ　ＧｌｕＣｌ抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に、その抗体を添加することによって作製される。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ　エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ　グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、洗剤等の適当な膜溶解剤と共に、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、可溶化ＲｓＧｌｕＣｌを含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムを洗剤と共にリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を洗剤と共に０．２３Ｍ　グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＲｓＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
配列番号１に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ１２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】
配列番号２に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】
配列番号３に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ８２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】
配列番号４に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ８２のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】
配列番号５に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１のｃＤＮＡクローン、Ｔ３２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図６】
配列番号６に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ１タンパク質、Ｔ３２のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】
配列番号７に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２のｃＤＮＡクローン、Ｂ１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図８】
配列番号８に示した、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ　ＧｌｕＣｌ２タンパク質、Ｂ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】
ＲｓＧｌｕＣｌ１（Ｔ１２（配列番号２）、Ｔ８２（配列番号４）、Ｔ３２（配列番号６））およびＲｓＧｌｕＣｌ２（Ｂ１、配列番号８）の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１０】
ＲｓＧｌｕＣｌ１　Ｔ１２　ＲＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸活性化電流を示す図である。電流活性化は１０μＭのグルタミン酸で最大であり、未注入の卵母細胞では電流を認めなかった。
【図１１】
アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したＲｓＧｌｕＣｌ２のイベルメクチンによる活性化を示す図である。電流活性化は〜１μＭのイベルメクチンで最大であった。
【図１】
2004500118.tif 000010
【図２】
2004500118.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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