(57)【要約】本発明は、少なくとも生分解性のあるポリマー材料及び直鎖、分枝鎖又は架橋型の骨格を有する多糖から成る制御された化学構造を有する材料に関する。本発明は、それが、少なくとも１つの前記生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つを、その表面に直接的に少なくとも１つの前記多糖分子を共有グラフト結合することによって制御された官能化を行うことによって得られることを特徴とする。本発明はまた、好ましくは前記材料から得られる粒子の形態のベクター及びその生物学的ベクターとしての使用、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生分解ポリマー及び直鎖、分枝鎖又は架橋型の骨格を有する多糖から構成された、制御された化学的構造を有する材料であって、少なくとも１つの前記生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つを、そのポリマー構造に直接的に少なくとも１つの前記多糖分子を共有グラフトすることによって、制御された官能化にかけることによって誘導されることを特徴とする材料。
【請求項２】
少なくとも１つの生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つを、そのポリマー構造に直接的に、直鎖、分枝鎖又は架橋型骨格を有する少なくとも１つの多糖分子を共有グラフトすることによって制御された官能化にかけることから誘導される、重量当たり少なくとも９０％のコポリマーによって構成されることを特徴とする、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
出発産物を含まないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項４】
２以下の多分散性を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項５】
生分解ポリマー分子と多糖分子との間で確立された共有結合が、本質的にエステル又はアミドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の材料。
【請求項６】
共有結合が、多糖分子上に存在するヒドロキシル官能基又はアミン官能基と、生分解ポリマー分子上に存在する、活性化され、又はされていないカルボン酸官能基との反応から誘導されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の材料。
【請求項７】
生分解ポリマーが、一般式：
（Ｒ１）ｎ［生分解ポリマー］（Ｒ２）ｍ
（ここで、
−ｎ及びｍは独立して互いに０又は１を表し、
−Ｒ１はＣ１−Ｃ２０アルキル基、生分解ポリマーとは異なるポリマー、ポリマー上に存在する保護された反応性の官能基（例えば、ＢＯＣ−ＮＨ−）、活性化され又はされていない、カルボン酸官能基、あるいはヒドロキシル官能基を表し、そして
−Ｒ２は、ヒドロキシル官能基又は、活性化され若しくはされていない、カルボン酸官能基を表す）の条件を満たすことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の材料。
【請求項８】
生分解ポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ε−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、並びにそれらのコポリマー、例えばポリラクトグリコール酸（ＰＬＧＡ）、合成ポリマー、例えばポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアミドアミン、ポリメチリデンマロネート、ポリアルキレンｄ−酒石酸塩、ポリカーボネート、ポリシロキサン、ポリエステル、例えばポリヒドロキシ酪酸又はポリヒドロキシ吉草酸、又はポリリンゴ酸、並びにそれらのコポリマー及び誘導体であり、あるいはそれらから誘導されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の材料。
【請求項９】
生分解ポリマーが５０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するポリエステルであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１０】
生分解ポリマーがポリカプロラクトンであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１１】
多糖が６０００ｇ／ｍｏｌ以上の分子量を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１２】
多糖が、デキストラン、キトサン、プルラン、デンプン、アミロース、ヒアルロン酸、ヘパリン、アミロペクチン、セルロース、ペクチン、アルギン酸塩、カードラン、フカン（ｆｕｃａｎ）、スクシノグリカン、キチン、キシラン、キサンタン、アラビナン、カラギーナン、ポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸、及びそれらの誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１３】
１：２０〜２０：１、そして好ましくは２：９〜２：１で変化する質量比の生分解ポリマー及び多糖と関連し、又は関連していない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１４】
２つのブロックコポリマーの形態にあることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１５】
櫛構造又は架橋化型構造を有することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１６】
多糖骨格と生分解ポリマーのグラフトを有するコポリマーであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１７】
デキストラン−ポリカプロラクトン、アミロース−ポリカプロラクトン、ヒアルロン酸−ポリカプロラクトン、及びキトサン−ポリカプロラクトンから選択されるコポリマーから誘導されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の材料。
【請求項１８】
少なくとも１つの反応性の官能基Ｆ１を有する少なくとも１つの生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つと、直鎖、分枝鎖又は架橋型の骨格を有し且つ官能基Ｆ１と反応することができる少なくとも１つの反応性の官能基Ｆ２を保持する少なくとも１つの多糖分子とを、前記分子間で共有結合を確立するためにＦ１とＦ２との間での反応にとって好ましく且つ前記材料が回収される条件下で結合させることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の材料の背製造方法。
【請求項１９】
生分解ポリマーが、例えば請求項７〜１０に定義され、そして多糖が請求項１１又は１２に定義されていることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生分解ポリマーの反応性の官能基が活性化された酸性の官能基であり、且つ多糖のそれがヒドロキシル又はアミンの官能基であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
多糖と生分解ポリマー又は誘導体とが１：２０〜２０：１の質量比で結合されることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の材料。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の材料から得られるベクター。
【請求項２３】
粒子の形態にあることを特徴とする、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
マイクロ粒子又はナノ粒子の形態にあることを特徴とする、請求項２２又は２３に記載のベクター。
【請求項２５】
更に活性物質を含んで成ることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２６】
活性物質が、生物学的効果を誘導することができ、そして／あるいは治療的な活性を有するペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質又は有機若しくは無機分子から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
重量当たり最大９５％の活性材料を含んで成ることを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８】
表面に共有結合した少なくとも１つの分子を更に含んで成る粒子の形態にあることを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９】
表面に共有結合以外のもので結合した少なくとも１つの分子を更に含んで成ることを特徴とする、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３０】
分子が生物学的に活性な分子、ターゲッティングのための分子、又は検出されうるもの、であることを特徴とする、請求項２８又は２９に記載のベクター。
【請求項３１】
抗体並びに、抗体及びレクチンのフラグメントから選択されるターゲッティング分子であることを特徴とする、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアミロースから選択される少なくとも１つの多糖分子に、エステル又はアミド型合によって連結した少なくとも１つのポリエステル分子から誘導される材料によって構成される粒子の形態にあることを特徴とする、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３３】
デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアミロースから選択される少なくとも１つの多糖分子に対するエステル又はアミド型の結合によって連結したポリカプロラクトン又はポリ乳酸のブロックから誘導される材料から構成される粒子の形態にあることを特徴とする、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
−請求項１〜１７のいずれか１項に記載の材料を、必要に応じて別の化合物及び／又は活性材料と一緒に、液体、好ましくは水の中に５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で導入し、
−小滴の形態の分散液が得られるように、前記材料の融解又は軟化にとって好ましい温度まで、撹拌しながら全体を加熱し、
−その様にして得られた構造を固定するように全体を冷却し、
−粒子を回収すること、
を含んで成ることを特徴とする、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の粒子の形態のベクターの製造方法。
【請求項３５】
材料が５００００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するε−ポリカプロラクトンのコポリマーであることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
被包されるべき活性材料の存在下で実施されることを更に特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの活性材料を被包するための、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項３８】
活性材料が、生物学的効果を誘導することができ、そして／あるいは治療的な活性を有するペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質又は有機若しくは無機分子から選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
活性材料として請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のベクターを含んで成ることを特徴とする医薬又は診断用組成物。
【請求項４０】
活性材料として請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のベクターを含んで成ることを特徴とする、診断用組成物。
【請求項４１】
「ステルス」ベクターとしての、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項４２】
生体接着ベクターとしての、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生分解ポリマー及び多糖類を基にした新規材料、これらの材料から誘導した、好ましくは粒子形状のベクター、並びに活性材料のための生物学的ベクターとしてのそれらの使用、に関する。
【０００２】
ベクター化は、物質の分布を、ベクターと称される適当な系に関連づけることによって、調節し、そして可能ならば全体的に制御することを目的とする作業である。
【０００３】
ベクター化の分野において、３つの基本的な機能が提供されなければならない；
−活性材料を生物の生物学的液体中に輸送すること、
−活性材料を処置すべき器官に運ぶこと、及び
−活性材料の放出をもたらすこと、
である。
【０００４】
ベクター化の一般的な原理は、当然のことながら、出来る限り活性物質自体の特性とは独立させて活性材料の分布を提供し、そしてそれを、構想した目的に従い選択された適当なベクターのものに適用することでもある。
【０００５】
事実、当該ベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの成立は、そのサイズ、その物理化学的特性
及び、特に生きている媒体の構成成分との相互作用を決定するその表面特性
によって条件付けられる。
【０００６】
複数のカテゴリーが、既に実在している異なるベクター間で識別されうる。
【０００７】
第一世代のベクターは、目的の標的内で活性成分が放出するように設計された系である。この場合、特定の投与形態に頼る必要がある。比較的大きいサイズ（数十ミクロン超）のこれらのベクターは、固体の系（ミクロスフェア）、又は中空の系（マイクロカプセル）のいずれかであって、当該系の構成材料中に溶解し、又は分散した状態の活性成分、例えば抗ガン物質を含むものである。有用な材料は、天然のもの（ワックス、エチルセルロース、ポリ乳酸、乳酸とグリコール酸のコポリマー）、生分解性のもの又はそうでないものの間で変わることがある。
【０００８】
第二世代ベクターは、特定の投与形態を用いることなく、活性成分を意図した標的に運ぶことができるものである。更に正確には、それらは、サイズが１マイクロメーター未満であって、且つ生物における分布がそれらの独特の物理化学的特性に完全に依存するベクターである。
【０００９】
この第二のカテゴリーには、特に、水層を含む１又は複数の管腔によって構成されるベクターであるリポソーム型の小胞性ベクター、ポリマー性の壁によって覆われた油性の管腔から形成された小胞性ベクターであるナノカプセル、及び脂肪性の乳濁液が属する。活性成分を被包し得るポリマーマトリックスによって構成されるナノスフェアも区別されうる。現在、ナノスフェア及び更にはナノカプセルも、用語「ナノ粒子」のもとにグループ分けされる。当該活性材料は通常、ナノ粒子が由来するモノマーのポリマー化の一連の過程において、又は既に成形したナノ粒子の表面上での吸着によって、又は予備成形したポリマーからの当該粒子の製造の間に、そのいずれかにナノ粒子に組み込まれる。
【００１０】
本発明は、特に、ナノ粒子及びマイクロ粒子型のベクター並びにそれらの利用の分野に関する。
【００１１】
異なるナノ粒子及びマイクロ粒子の型は、既に文献において提示されている。従来、モノマー（例えば、シアノアクリレート）の直接的ポリマー化によって、架橋によって得られる材料に由来し、あるいはそれらは予備成形ポリマー：ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ε−ポリカプロラクトン）（ＰＣＬ）、並びにそれらのコポリマー、例えばポリラクトグリコール酸（ＰＬＧＡ）等から製造される。
【００１２】
更に最近、新たな型の粒子が、多糖の骨格上でのモノマー（例えばラクチド又はカプロラクトン）の触媒によるポリマー化から得られた。
【００１３】
しかしながら、この型の材料は、再現性のある組成物を保証することができないという主な欠点を有する。事実、多糖の骨格上に存在する、検討されている全てのヒドロキシルの官能基が、モノマーのポリマー化を引き起こすことができる。それにより当該骨格上には、当該骨格を「マスク」する、モノマー由来の可変性のサイズの非常に多くの鎖が形成される。これは、粒子の被覆の性質を正確に制御することが努力される、いくつかの利用（生体接着（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」、ターゲッティング等）に適したベクターの製造における主要な欠点である。その結果、このポリマー化の型を用いて、合成の良好な再現性、均一な試料を得ることは困難であり、そして、ポリマー化が一般にまとめて起こるので（溶媒の不在下で）、ポリマー化及び置換の程度を制御することはより一層困難である。事実、材料の合成の間、多糖は、溶解したモノマー中に分散した粒子の形態でしばしば使用され、そしてポリマー化は通常、触媒の存在下で行われる。触媒が無い場合、ポリマー化の程度は非常に低い。
【００１４】
また、米国特許第６，００７，８４５号において、クエン酸及又は酒石酸型の多官能性材料上での、１又は複数の親水性ポリマー分子、例えばポリエチレングリコールの、及び１又は複数の疎水性ポリマー分子、例えばポリ乳酸の、共有結合によって得られる材料に由来する粒子が記載されている。しかしながら、この材料の合成は、２つの型のポリマーの分子間でインサートとして働く付属の化合物の使用を必要とするという重大な欠点を有する。
【００１５】
本発明の第一の目的は、多糖の骨格に対する生分解ポリマーの直接的な結合に由来する制御された構造を有する、新規な混合材料である。
【００１６】
本発明の第二の目的は、この材料を基にした、好ましくは粒子の形態の、そして更に好ましくはナノ粒子の形態のベクターに関する。
【００１７】
第三の目的として、本発明はまた、好ましくは粒子の、特に生物学的担体としてのこのベクターの使用を目的とする。
【００１８】
更に正確には、本発明の第一の観点は、少なくとも１つの生分解ポリマー及び直鎖、分枝鎖又は架橋型の骨格を有する多糖から構成された、制御された化学的構造を有する材料であって、少なくとも１つの前記生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つを、そのポリマー構造に直接的に少なくとも１つの前記多糖分子を共有グラフトすることによって、制御された官能化にかけることによって誘導されることを特徴とする材料に関する。
【００１９】
既に言及した材料と対照的に、本発明に従う完全な材料は、制御された化学的構造を有し、そしてそれ故にそれ自体完全に再現性があるという第一の利点を有する。その化学的組成は完全に同定されている。
【００２０】
このように、本発明の材料は、好ましくは重量当たり少なくとも９０％、そして更に好ましくは完全に、少なくとも１つの生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つを、そのポリマー構造に直接的に、直鎖、分枝鎖又は架橋型骨格を有する少なくとも１つの多糖分子を共有グラフトすることによって制御された官能化にかけることから誘導されるコポリマーによって構成される。
【００２１】
本発明の好ましい形態に従い、本発明の材料は、出発分子、すなわち、前記生分解ポリマー又は前記多糖のものを含まない。
【００２２】
本件において、本発明の材料は、それ故に予想されるコポリマーが存在するが、更に非常に変化しやすい量で、出発ポリマーが残ったままであるポリマー混合物と異なる。その様なポリマー混合物は、ナノ粒子又はマイクロ粒子を製造する場合に使用され得ない。
【００２３】
この場合、本発明の材料は、２以下、そして好ましくは１．５未満の多分散性を有する。
【００２４】
更に正確には、本発明の材料は、同一又は異なる、１又は複数の生分解ポリマー分子が多糖分子に直接的に結合することによって得られる。
【００２５】
２つの型の分子間の共有結合は、本質的に異なることがある。
【００２６】
以下のように、アミン結合を形成するためにアミン官能基と、又はエステル結合を形成するためにヒドロキシル官能基とカルボン酸基との反応に由来することもある。
【００２７】
また、ウレタン型の結合を形成するために、アルコール基とイソシアネート基との反応から生じることもある。
【００２８】
また、チオエステル型の結合を形成するために、カルボン酸基とチオール官能基との反応から生じることもある。
【００２９】
これらの反応の全てが、当業者に周知であり、そしてそれらの実行は彼らの能力の範囲内でされる。
【００３０】
本発明の好ましい変形に従う、２つの分子間で確立される共有結合は、エステル又はアミド型のものである。
【００３１】
更に好ましくは、それは、生分解ポリマー上に存在する、必要により活性化される、カルボン酸官能基と、多糖上に存在するヒドロキシル又はアミン官能基との間の反応に由来する。前記酸の好ましい活性型の官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル、酸塩化物及びカルボニルジイミダゾール由来のイミダゾリド、である。この反応性の官能基、好ましくはカルボン酸は、生分解ポリマー上に天然に存在するか、又は、多糖分子に対してその後結合できるようにその骨格にあらかじめ導入されることがある。
【００３２】
前記分子のうちの１つに存在する官能基、好ましくは生分解ポリマー上のカルボン酸官能基のこの活性化は、特に第二の付随性（ｐａｒａｓｉｔｉｃ）の反応、例えば分子内反応を防ぐことが望まれる場合に有利である。次のように、多糖が、その分子において、互いに反応することができる２つの官能基、例えばヒドロキシル官能基とカルボン酸官能基を有するような特定の場合に、生分解ポリマー上のカルボン酸官能基は、多糖のヒドロキシル官能基とのその結合反応の動態を優先して、多糖分子におけるそれらの分子内反応を失うようにあらかじめ反応する。
【００３３】
相当する材料の再現性及び均一性はこの様に保証される。
【００３４】
本発明に従う材料はまた、構成されるポリマーの性質により、満足行く生分解性を保持するという利点を有する。
【００３５】
本発明の意味の範囲において、用語「生分解性」は、通常、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療が意図される利用にとって許容される期間内に溶解し又は分解する任意なポリマーを表すと理解される。通常、この期間は、相当する生理学的な溶液がｐＨ６〜８且つ２５℃〜３７℃の間の温度に曝露された場合に、５年未満、そして更に好ましくは１年未満のはずである。
【００３６】
本発明に従う生分解ポリマーの鎖は、合成又は天然の生分解ポリマーであり、あるいはそれらに由来する。
【００３７】
従来、最も頻繁に利用される合成の生分解ポリマーはポリエステル：ＰＬＡ， ＰＧＡ， ＰＣＬ， 及びそれらのコポリマー、例えばＰＬＧＡである。事実、それらの生分解性及び生物学的適合性は、広く確立されている。他の合成ポリマーも研究の対象である。これらは、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリアミドアミン、ポリメチリデン（ｐｏｌｕｍｅｔｙｌｉｄｅｎｅ）マロネート、ポリシロキサン、ポリエステル、例えばポリヒドロキシ酪酸又はポリリンゴ酸、並びにそれらのコポリマー及び誘導体、である。天然の生分解ポリマー（タンパク質、例えばアルブミン又はゼラチン、あるいは多糖、例えばアルギン酸塩、デキストラン又はキトサン）も適していることがある。
【００３８】
本件において、合成ポリマーは、それらの生物学的浸蝕が直ちに観察されるので、特に注目すべきものである。しかしながら、これらのポリマーは、特に生分解性ポリエステル（ＰＬＡ， ＰＣＬ等）の場合、それらが、ほとんど反応性の基を持たず、そして／あるいはこれらの反応性の基が鎖の末端にのみ存在するので、１又は複数の多糖との結合に常には適していない。従って、これらのポリマーの多糖との結合は、反応性の基を用いるそれらの鎖の事前の官能化、同時に、鎖の末端に天然に存在する基の性質の制御、を含む。生分解ポリマーの誘導体の用語によって、本発明の範囲内で表すことが意図されるものは、特に上述の様に得られる化合物である。
【００３９】
次のように、生分解ポリマーは、好ましくは一般式：
（Ｒ１）ｎ［生分解ポリマー］（Ｒ２）ｍ
（ここで、
−ｎ及びｍは独立して互いに０又は１を表し、
−Ｒ１はＣ１−Ｃ２０アルキル基、生分解ポリマーとは異なるポリマー［例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はＰＥＧのブロック又はエチレンオキシドの単位を含むコポリマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ポリマー］、ポリマー上に存在する保護された反応性の官能基（例えば、ＢＯＣ−ＮＨ−）、活性化され又はされていない、カルボン酸官能基、あるいはヒドロキシル官能基を表し、そして
−Ｒ２は、ヒドロキシル官能基又は、活性化され若しくはされていない、カルボン酸官能基を表す）の条件を満たす。
【００４０】
本発明に従う生分解ポリマーとして特に好ましいものは、ポリエステル： ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ε−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、並びにそれらのコポリマー、例えばポリラクトグリコール酸（ＰＬＧＡ）、合成ポリマー、例えばポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリアミド（例えばポリカプロラクタム）、ポリアミノ酸、ポリアミドアミン、ポリメチリデンマロネート、ポリアルキレンｄ−酒石酸塩、ポリカーボネート、ポリシロキサン、ポリエステル、例えばポリヒドロキ酪酸又はポリヒドロキシ吉草酸、又はポリリンゴ酸、並びにこれらの物質及びそれらの誘導体のコポリマー、である。
【００４１】
ポリエステルは、更に好ましくは、５０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するポリエステル、そして特にポリカプロラクトンである。
【００４２】
生分解性の観点における有利な特徴に加えて、本発明に従う材料は、それらが由来する粒子の、器官及び／又は細胞に対する生体接着及びターゲッティングの特性の観点において特に注目すべきものである。この第二の特徴がより正確に得られるのは、特に関連する多糖、特に粒子におけるその組成及びその構造的構成、の選択による。
【００４３】
本発明に従い利用される多糖は、修飾され又は修飾されていない、直鎖、分枝鎖又は架橋型の構造を有する。
【００４４】
この定義のもとでは、本発明の分野から、環状構造を有する多糖、例えばシクロデキストリンは除外されることが意図される。
【００４５】
ここで、修飾した多糖とは、その骨格における変化、例えば反応性の官能基の導入、化学的な部分（分子、脂肪族鎖の結合、ＰＥＧ鎖等）のグラフト、を受けている任意な多糖であると理解される。この修飾は、当然のことながら、その後の生分解ポリマーの結合を可能にするために、骨格上に存在するヒドロキシル又はアミン基の幾つかに対し、大部分が遊離するように作用するはずである。その結果、市場にはビオチン、蛍光化合物等によって修飾された多糖が存在している。親水性の鎖（例えば、ＰＥＧ）でグラフトされた他の多糖は文献に記載されている。
【００４６】
用語「架橋された」は、単純な直鎖のポリマーと対照的に、三次元のネットワークを形成するポリマーを言及する。三次元ネットワークにおいて、当該鎖は、共有結合又はイオン結合によって互いに連結され、そしてその結果材料が不溶性となる。
【００４７】
本発明に特に適した多糖は、Ｄ−グルコース（セルロース、デンプン、デキストラン）、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フルクトース（ガラクトサン、マンナン、フルクトサン）であり、又はそれらに由来する。これらの多糖の多くが、炭素、酸素及び水素の元素を含む。本発明に従う多糖は、硫黄及び／又は窒素を含むこともある。この様に、ヒアルロン酸（Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の単位から構成される）、キトサン、キチン、ヘパリン又はオボムコイドは窒素を含み、一方、ゲロース（ｇｅｌｏｓｅ）、海藻から抽出された多糖は、（＞ＣＨ−Ｏ−ＳＯ３Ｈ）の硫酸塩の形態で硫黄を含む。コンドロイチン硫酸は、同時に硫黄及び窒素を含む。
【００４８】
これら全ての多糖は、それらが天然に遊離アミン及び／又はアルコールの官能基を保持する限り、本発明に従う生分解ポリマーで官能化されうる。
【００４９】
本発明の好ましい変形に従い、多糖は、６０００ｇ／ｍｏｌ以上の分子量を有する。
【００５０】
デキストラン及びアミロース（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎの特定の場合において、ｎは１０〜６２０の間で、そして好ましくは３３〜２２０の間で変化する。ヒアルロン酸の場合、分子量は、５ｘ１０３〜２ｘ１０６ ｇ／ｍｏｌの間で、好ましくは５ｘ１０４〜２ｘ１０６ ｇ／ｍｏｌの間で変化する。キトサンの場合、分子量は、６ｘ１０３〜６ｘ１０５ ｇ／ｍｏｌ、好ましくは６ｘ１０３〜１５ｘ１０４ ｇ／ｍｏｌの間で変化する。
【００５１】
本発明に特に適した多糖の例として、ポリデキストロース、例えば、デキストラン、キトサン、プルラン、デンプン、アミロース、ヒアルロン酸、ヘパリン、アミロペクチン、セルロース、ペクチン、アルギン酸塩、カードラン、フカン（ｆｕｃａｎ）、スクシノグリカン、キチン、キシラン、キサンタン、アラビナン、カラギーナン、ポリグルロン酸、ポリマンヌロン酸、及びそれらの誘導体（例えば硫酸デキストラン、アミロースエステル、酢酸セルロース等）が言及されうる。
【００５２】
デキストラン、アミロース、キトサン及びヒアルロン酸並びにそれらの誘導体は、更に特に好ましい。
【００５３】
本発明に従う材料は、コポリマーの形態で、生分解ポリマーと多糖を、１：２０〜２０：１、そして好ましくは２：９〜２：１で変化する質量比で含んでもよい。
【００５４】
本発明の材料の例として、デキストラン−ポリカプロラクトン、アミロース−ポリカプロラクトン、ヒアルロン酸−ポリカプロラクトン又はキトサン−ポリカプロラクトンのコポリマーから構成されるものも更にとりわけ言及されうる。
【００５５】
本発明の材料を構成するコポリマーは、櫛形の構造を有するか、又は架橋型の構造を有する、２つのブロックのコポリマーの形態であってもよい。
【００５６】
好ましい性質の骨格は多糖であり、好ましいグラフトの性質は生分解ポリマーである。
【００５７】
２つのブロックの又は櫛形のコポリマーは、合成の間、多糖：生分解ポリマーのモル比に作用することによって得ることができる。架橋型の構造を有するコポリマーは、少なくとも２つの反応性の官能基を含む生分解ポリマーから得ることができる。
【００５８】
本発明の第二の観点は、本発明の材料を製造する方法に関する。
【００５９】
更に正確には、この方法は、少なくとも１つの反応性の官能基Ｆ１を有する少なくとも１つの生分解ポリマー分子又はその誘導体の１つと、直鎖、分枝鎖又は架橋型の骨格を有し且つ官能基Ｆ１と反応することができる少なくとも１つの反応性の官能基Ｆ２を保持する少なくとも１つの多糖分子とを、前記分子間で共有結合を確立するためにＦ１とＦ２との間での反応にとって好ましく且つ前記材料が回収される条件下で結合させることを含んで成る。
【００６０】
生分解ポリマーがポリカプロラクトンである場合において、本発明の製造方法は、従来の方法のように、触媒の使用を必要としない。それ故に、本発明の方法のこの特性は、生じた材料のレベルで、無害で且つ生分解性の観点から、特に有利である。
【００６１】
有利なことに、それは定量的な反応であり、すなわち、多糖分子上に存在する少なくとも１つの官能基Ｆ１が生分解ポリマー分子上の官能基Ｆ２と反応する。
【００６２】
このためには、当該反応は、あらゆる付随性の反応の徴候、特に、予想される結合反応以外の反応における官能基Ｆ１又はＦ２のうちの一方の関与が妨害されるような条件下で実施される。この様に、これまでに言及した分子内反応を避けることが意図される。
【００６３】
本発明の好ましい変形に従い、生分解ポリマー上に存在する反応性の官能基は、酸の官能基又は活性化された酸の官能基であり、そして多糖上に存在する反応性の官能基は、ヒドロキシル又はアミンの官能基である。好ましくは、多糖と生分解ポリマー又は誘導体とは、１：２０〜２０：１で変化する質量比で結合される。
【００６４】
生分解ポリマー上に存在する反応性の官能基が酸の官能基である特定の場合において、結合反応は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はカルボニルジイミダゾール（ＤＣＩ）を用いる活性化によって実施されうる。このエステル化反応は当業者の能力の範囲内である。
【００６５】
更に好ましくは、多糖と生分解ポリマーは、既に提示した定義の条件を満たす。特に、それらは、天然であり、そして本発明に従い官能化するように修飾された、多糖又は生分解ポリマーの分子に由来することもある。
【００６６】
本発明の第三の観点は、本発明に従う材料によって構成されるベクターに関する。
【００６７】
これらのベクターは、好ましくは５０ｎｍ〜５００μｍ、そして好ましくは８０ｎｍ〜１００μｍに及ぶサイズを有する粒子である。
【００６８】
事実、当該粒子を本発明の材料から製造するために使用される製造のプロトコールに従い、粒子のサイズが一定にされうる。
【００６９】
本発明の好ましい形態に従い、当該粒子は、１〜１０００ｎｍの間で変化するサイズを有し、そしてそれ故にナノ粒子と称される。１〜数千ミクロンで変化するサイズの粒子は、マイクロカプセルと称される。
【００７０】
本発明のナノ粒子又はマイクロ粒子は、文献に既に記載された方法、例えば溶媒の乳濁／蒸発技術［Ｒ． Ｇｕｒｎｙ ｅｔ ａｌ． ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｌａｔｉｃｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｄｒｕｇｓ” Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ． Ｐｈａｒｍ．， ｖｏｌ ７， ｐｐ． １−２５ １９８１）］；水混和性溶媒によるナノ沈殿（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）の技術（ＦＲ２ ６０８ ９８８及びＥＰ ２７４ ６９１）、に従い製造されうる。これらの方法の変形も存在する。例えば、親水性の活性成分の被包のために注目すべきものである、「ダブルエマルジョン（”ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ”）」として知られている技術は、水層中に後者のものを溶解し、ポリマーを含む有機層を用いて水／油型のエマルジョンを形成し、続いて界面活性剤を含む新規の水層によって水／油／水型のエマルジョンを形成することから成る。有機溶媒の蒸発の後、ナノスフェア又はマイクロスフェアが回収される。
【００７１】
本発明の枠組みの中で、本発明者は更に、
−必要に応じて別の化合物及び／又は活性材料と混合される、本発明に従う材料を液体、好ましくは水の中に５０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で導入し、
−小滴の形態の分散液が得られるように、前記材料の融解又は軟化にとって好ましい温度まで、撹拌しながら全体を加熱し、
−その様にして得られた構造を固定するように全体を冷却し、
−粒子を回収すること、
を含んで成る、特に有利な新規方法を完成した。
【００７２】
本発明の材料を構成しているポリマーとコポリマーが、生分解ポリマーとしてポリカプロラクトンの誘導体、そして更に好ましくは５０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するポリカプロラクトンの誘導体を含んで成る場合、この方法が、更にことさらに有利であることに注意すべきである。
【００７３】
本発明に従う材料は、その両親媒性の性質に起因する、界面活性剤の特性をお保持するという主な利点を有する。これらの特性は、それ故に、粒子の製造の間有利に、例えば、上述した方法において体系的に使用される界面活性剤の使用を回避するように、利用されうる。事実、後者のものは、常に生物学的適合性があるわけではなく、そして当該工程の終了時に除去することが困難である。
【００７４】
本発明に従う材料の別の利点は、それが
−生分解ポリマー：多糖の質量比及び／又は
−熟慮中の生分解ポリマーと多糖の分子量の、
選択を介して、粒子を製造するための方法において介在する特性を調節する可能性を提供することである。
【００７５】
この様に、２〜１８の間で変化しうる、親水性−親油性のバランスを有する水溶性又は水不溶性のコポリマーを得ることが可能である（従って、水／油又は油／水のエマルジョンを安定化することが可能となる）。
【００７６】
更に、粒子の製造の間に、前記材料を構成するある多糖の特性を活かすことが可能である。例えば、アルギン酸塩、エステル化の程度が低いペクチン、及びキサンタンガムが、Ｃａ２＋イオンの存在下でゲルを形成しうることが知られている。それ故に、類似の条件下で、多糖−生分解ポリマーの材料によるゲル又は粒子の形成の予見が可能である。これらの粒子は、多糖のみから製造したものと比較して、分解の制御、及び疎水性の性質の活性成分の被包の向上を可能とする、それらのマトリックス内に疎水性の鎖を含み、あるいはあるタンパク質の様な疎水性ドメインを含むという利点を有する。
【００７７】
同様に、本発明に従う２つの型の材料から、例えばアルギン酸塩／生分解ポリマーとキトサン／生分解ポリマーのコポリマーから、粒子の形成を予見することが可能である。
【００７８】
本発明に従う粒子の例として、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアミロースから選択される少なくとも１つの多糖分子に、エステル又はアミド型合によって連結した少なくとも１つのポリエステル分子から誘導される材料によって構成されるものが、よりことさらに引用されることがある。当該粒子は、好ましくは、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアミロースから選択される少なくとも１つの多糖分子に対してエステル又はアミド型の結合によって連結したポリカプロラクトン又はポリ乳酸のブロックから誘導される材料から構成される。
【００７９】
本発明及び上文で言及した方法に従う材料から得られ得る粒子の構造に関して、それらは変更することができる。その結果、
−生分解ポリマー（活性成分を被包し得るもの）の疎水性のコア及び多糖の親水性のコアを有する型の構造であって、上文で言及した方法の１つ又は予備成形した粒子に対する本発明に従う材料の吸着のいずれかによって得られる構造；
−生分解ポリマーのマトリックスが「ダブルエマルジョン」法によって得ることができ、そして疎水性の活性成分の被包に適した水性の包含物を含むことに従う粒子の構造（ここで、選択される作業の形態及び材料の親水性−親油性の平衡に依存して、多糖は、水性の包含物又はこれらの包含物と粒子の表面のいずれかにのみ配置されうる。それはまた、生分解ポリマー及び有機溶媒により、相互作用、しばしば変性に対してカプセルに包まれた活性成分（タンパク質、ペプチド等）を保護することもある。）；
−粒子が油／油のエマルジョン（例えば、シリコン油−アセトン）又は水／油／油から製造される場合の、親水性のコア（多糖）と疎水性の環（生分解ポリマー）の型の構造；
−水層中での本発明に従う材料の自己会合により得られるミセル構造、及び
−少なくとも２つの反応性の官能基を含む生分解ポリマーと多糖の架橋によって形成される、ゲルと称される構造、
によって識別されうる。
【００８０】
本発明の場合において、当該粒子は、好ましくは、１時間〜数週間に及ぶ期間で分解する。
【００８１】
本発明に従う粒子は、親水性、疎水性又は両親媒性であってもよく、且つ天然で生物学的に活性であってもよい活性物質を含むことがある。
【００８２】
活性のある生物学的材料として、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、多糖又はそれらの混合物が、よりことさらに言及されうる。それらはまた、生物学的な効果を誘導し、そして／あるいは治療的な活性を示すことができる、動物又は患者に対してｉｎ ｖｉｖｏで投与される有機又は無機性の合成分子であってもよい。従って、それらは抗原、酵素、ホルモン、受容体、ペプチド、ビタミン、鉱物及び／又はステロイドであってもよい。
【００８３】
これらの粒子に組み込まれることができる薬物の例として、抗炎症性化合物、麻酔薬、化学療法薬、免疫毒素、免疫抑制剤、ステロイド、抗生物質、抗ウイルス剤、抗菌剤、駆虫剤、予防接種物質、免疫調節剤及び鎮痛薬が引用されうる。
【００８４】
同様に、放出プロファイルに干渉することが意図される、これらの活性材料の化合物と関係することも予見することができる。例えば、ＰＥＧ、又はポリエステル（修飾型又は非修飾型）の鎖を、当該粒子の組成に加え、そしてその結果複合材料と称される粒子を得ることが可能である。既に言及したように、被包した材料の放出プロファイルに干渉することを目的とする混合粒子を得るために、そして予見される利用に適した粒子の表面特性を得るために、本発明に従う複数の型の材料を混合することも可能である。
【００８５】
最後に、診断目的を有する粒子化合物に組み込むことも可能である。その結果、これらはＸ線、蛍光、超音波、核磁気共鳴又は放射線によって検出可能な物質であることがある。それにより、当該粒子は、磁気性粒子、放射線不透過性材料（例えば、空気又はバリウム）又は蛍光化合物を含むこともある。例えば、蛍光化合物、例えばローダミン又はナイルレッドも、疎水性のコアを有する粒子に含まれることもある。あるいは、γ放出体（例えば、インジウム又はテクネチウム）もその中に組み込まれることもある。親水性の蛍光化合物も粒子のカプセルの中に包まれることもあるが、マトリックスとのより低い親和性に起因して、疎水性の化合物と比較して収率が低い。
【００８６】
制御された表面特性を有する市販の磁気粒子も、粒子のマトリックスに組み込まれることがあり、又はそれらの構成成分の１つと共有結合することがある。
【００８７】
当該活性材料は、これらの粒子内に、それらの形成工程の間に組み込まれることもあり、一方で一度後者のものが得られると、粒子レベルで充填されることもある。
【００８８】
本発明に従う粒子は、重量当たり最大９５％の活性材料を含んで成ることもある。
【００８９】
当該活性材料は、このように、０．００１〜９９０ｍｇ／ｇ粒子で変化する量で存在することもあり、好ましくは０．１〜５００ｍｇである。ある高分子化合物（ＡＤＮ，オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド等）のカプセル封入の場合、更に低い充填量でも十分なことがある。
【００９０】
本発明に従う粒子は、異なる経路で、例えば経口、非経口、経眼、経肺、経鼻、経膣、経皮、頬側からの投与等によって投与されうる。経口からの低侵襲性投与は選択される経路の１つである。
【００９１】
一般論として、経口から投与される粒子は、異なる経路：転移（完全な粒子による捕捉、その後の通過）、生体接着（接着機構による粘膜表面での粒子の固定化）及び通過、を受けることがある。これらの最初の２つの現象の場合、表面の特性が主要な役割を果たすことがある。
【００９２】
本発明に従う粒子が、表面で多くのヒドロキシル官能基を有するという事実は、そこに、生物学的に活性な分子、標的化のための分子又は検出されうる分子を結合させるために特に有利であることを証明する。それにより、これらの粒子を、それらの表面特性を修飾し、そして／あるいはある組織又は器官に対してより特異的に標的化するように修飾することを予見することも可能である。任意に、この様に多官能化された粒子は、磁気の分野の使用により、医学的な画像化の間又は活性化合物が放出される間に、標的において維持されうる。同様に、標的化する分子の型のリガンド、例えば受容体、レクチン、抗体又はそれらのフラグメントは、粒子の表面に固定されることもある。この官能化の型は、当業者の範囲内に入る。
【００９３】
これらのリガンド又は分子の、粒子の表面に対する結合は、異なる方法で実施されうる。これは、粒子を覆う多糖に対してリガンドを共有結合させることによって、又は非共有結合、すなわち親和性で結合させることによっても行われうる。これにより、あるレクチンは、本発明に従う粒子表面に位置する多糖に対しての特異的な親和性によって結合することができ、それにより当該粒子の細胞認識特性が増強する。スペーサーアームによって、リガンドが最適な配置でその標的に到達できるようにグラフトすることも有利なことがある。あるいは、リガンドは、粒子の組成に侵入する別のポリマーによっても運ばれることがある。
【００９４】
本発明はまた、既に定義したように１又は複数の活性材料をカプセル封入するために、本発明に従い得られるベクター、好ましくは粒子の使用に関する。
【００９５】
本発明の別の観点はまた、本発明に従うベクター、好ましくは粒子を含んで成る医薬又は診断用組成物であって、必要により少なくとも１つの医薬として許容され、且つ適合性のある担体と会合している組成物、に関する。例えば、当該粒子は、胃で耐性のあるカプセルで投与されることもあり、あるいは、ゲル、インプラント又は錠剤に組み込まれることもある。それらはまた、油（例えばＭｉｇｌｉｏｌ（商標））の中で直接的に調製されることがあり、そしてこの懸濁物はカプセルで投与され、又は正確な部位に（例えば腫瘍）に注射されることもある。
【００９６】
これらの粒子は、ステルスベクター、すなわち生物の免疫防御系を免れることができるベクターとして、そして／あるいは生体接着ベクターとして特に有用である。
【００９７】
以後の実施例及び図面は、本発明の例を限定しないものとして提供される。
【００９８】
例１
Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ
Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯ２Ｈ（Ｒ＝Ｃ９Ｈ１９）型の低分子量（２〜４０００ｇ／ｍｏｌ）の単一の機能のＰＣＬポリマーは、５．２ｇのモノマー（新たに蒸留されたε−カプロラクトン）及び０．３ｇの高純度のカプリン酸（Ｃ９Ｈ１９ＣＯ２Ｈ）から得られる。前記酸とε−カプロラクトンは、還流冷却器に載せた丸底フラスコ内に導入した。試薬のパージの後、丸底フラスコを２２５℃にサーモスタットで制御した油槽に導入した。反応は、不活性（アルゴン）雰囲気のもと３時間３０分続けた。氷浴に丸底フラスコを浸すことで停止した。得られた固体を、熱い、１５ｍｌのＴＨＦに溶解し、続いて冷たいメタノールで周囲温度にして沈殿した。
【００９９】
３回の沈殿の後の、反応物の重量当たりの収率は６０〜７０％である。数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）は、立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（溶出液ＴＨＦ １ｍｌ／分、全体の検量はポリスチレンをスタンダードとして実施した。）。Ｍｎは３４２０ｇ／ｍｏｌであり、そしてＭｗは４８９０ｇ／ｍｏｌであり；多分散性の指数はそれ故に１．４である。
【０１００】
３２００ｇ／ｍｏｌに等しい平均分子量は、アセトン／水混合液中に溶解した約１００ｍｇのポリマー試料の、１０−２Ｍ ＫＯＨ／ＥｔＯＨ溶液による滴定によって決定した。
【０１０１】
異なるＲｓを有する他のポリマー、例えばカプロン酸（Ｒ＝Ｃ６Ｈ１３）由来のものは、同じ方法によって得られた。
【０１０２】
例２
ＨＯＯＣ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ
２つの官能基を有するポリマー ＨＯＯＣ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨは、例１の作業形態に従い合成された。
【０１０３】
プライマーとして使用したコハク酸（９９．９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）は、減圧下で、１１０℃で２４時間乾燥した。モノマー（ε−カプロラクトン）は、水素化カルシウム上での蒸留によって精製した。
【０１０４】
０．２ｇのコハク酸と４ｇのε−カプロラクトンからのポリマー化によって、３時間の反応後に、３．２ｇのポリマーが得られた（４回連続した沈殿の後の、重量当たりの収率は７６％）。
【０１０５】
１０−２Ｍ ＫＯＨ／ＥｔＯＨによる末端ＣＯＯＨ基の計量は、３５００ｇ／ｍｏｌの分子量に相当する酸性度を決定することを可能にした。
【０１０６】
ＳＥＣによって、Ｍｎは４０６０ｇ／ｍｏｌであり、そしてＭｗは４８１０ｇ／ｍｏｌであり、多分散性の指数は１．２である。
【０１０７】
質量の異なる他のポリマーは、酸：モノマーのモル比を変化させることによって得られる。
【０１０８】
例３
Ｒ−ＰＬＡ−ＣＯＯＨ（Ｒ＝Ｃ９Ｈ１９）
モノマー（Ｄ，Ｌ−ラクチド）は、酢酸エチル中での再結晶化、続く凝華によって精製した。触媒（スズのオクタン酸塩）は、最高の減圧下での蒸留によって精製した。プライマーとして使用したカプリン酸は、酢酸エチル中での再結晶化によって精製し、続いてベンゼンとの共沸蒸留によって脱水した。
【０１０９】
カプリン酸（０．１２ｇ）とＤ，Ｌ−ラクチド（３．５ｇ）を、真空／アルゴンランプに繋がれた還流冷却器を備え付けた２つの首のフラスコに入れた。丸底反応フラスコは不活性にされ、続いて７ｍｌの無水トルエンがセプタムを介して加えられた。溶解後、０．２８４ｇの触媒が導入され、そして丸底フラスコを１２０℃の油槽に浸すことによって反応が直ちに開始した。４時間後、反応を停止し、トルエンを蒸発させ、そしてＲ−ＰＬＡ−ＣＯＯＨと称されるポリマーをジクロロメタン中に溶解し、そしてエタノールで沈殿させた。４回連続の沈殿の後、一定の酸性度が当該ポリマーにおいて得られ、続いてこれを乾燥させた。
【０１１０】
ＳＥＣによって決定した分子量Ｍｗは２２ｋｇ／ｍｏｌである。１０−２Ｍ ＫＯＨ／ＥｔＯＨによる末端基の計量は、２１ｋｇ／ｍｏｌの分子量に相当する酸性度を決定することを可能にした。
【０１１１】
モノマー／プライマーのモル比及び反応時間を変化させることによって、１０〜５０ｋｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリマーを得ることが可能であった。
【０１１２】
例４
Ｒ−ＰＣＬ−ＯＨ及びＲ−ＰＬＡ−ＯＨ（Ｒ＝アルキル）
アルコール基によって鎖の末端が単官能化されたＰＣＬ又はＰＬＡポリマー（Ｒ−ＰＣＬ−ＯＨ又はＲ−ＰＬＡ−ＯＨ）は、前記酸のプライマーの代わりにアルコールのプライマー、例えば、Ｃ７Ｈ１５ＯＨを用いたことを除き、例３のプロトコールに従い合成された。
【０１１３】
５ｇのカプロラクトン及び０．２９ｇのヘプタノール（ａｌｃｏｏｌ ｈｅｐｔｉｌｉｑｕｅ）を、トルエン中で、還流下で、２時間、不活性雰囲気のもと、且つ、プライマーと等量のスズのオクタン酸塩の存在下で加熱した。２時間の沈殿後の、当該反応の収率は５４％である。分子量Ｍｗは２１００ｇ／ｍｏｌである。
【０１１４】
ＫＯＨ／ＥｔＯＨを用いる試験では、遊離酸の残留物は検出されなかった。
【０１１５】
例５
Ｒ−ＰＥＧ−ＰＬＡ−ＣＯＯＨ（Ｒ＝ＯＭｅ）
酸のプライマーである、鎖の一方の末端にメトキシ基を有し、そして他方の末端にカルボン酸基を有するポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ５０００ｇ／ｍｏｌ）は反応前に乾燥された。ラクチドは、２回の再結晶（酢酸エチル）及び凝華によって精製した。試薬の質量比ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）：触媒は１：１であった。ポリマー化は、不活性雰囲気のもと、トルエン（溶媒）還流下で２時間続けられた。トルエンの蒸発後、コポリマーは、２回連続の沈殿によって精製される。ＳＥＣによって決定した分子量Ｍｗは４２ｋｇ／ｍｏｌである。
【０１１６】
例６
ＮＨＳＩのＲ−ＰＣＬ−エステル（Ｒ＝アルキル）
Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨポリマー（例１）の酸の官能基は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で、１：２（ｖ：ｖ） ＤＭＦ：ＣＨ２Ｃｌ２の混合液中で、それをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳＩ）と反応させることによって活性化エステルへと変化される。ＤＣＣは、Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨに対して若干モル過剰（１．１）で加えられ、そしてＮＨＳＩは−ＣＯＯＨ官能基に対して過剰に加えられた。試薬を、徐々に加熱して最小量の溶媒に溶解した。反応は、不活性雰囲気のもと５０℃で２４時間行う。形成した尿素（ＤＣＵ）の濾過後、溶媒を蒸発させ、そしてＤＭＦがエーテルと共留される。当該ポリマーは、水で洗浄され、そして乾燥される。それぞれの型の各合成において計量したＤＣＵの質量に従い、反応の収率は定量的である。このように得られたエステルはＴＨＦ、アセトン、塩素化溶媒等中で可溶性がある。
【０１１７】
例７
ＰＣＬ−ＤＥＸ
活性エステル官能基を有するＲ−ＰＣＬ−エステルＮＨＳＩ（Ｒ＝Ｃ９Ｈ１９）ポリマー（例６）は、ＤＭＳＯ中で溶解され、続いて等量のデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， 分子量４０，０００ｇ／ｍｏｌ）が導入される。結合反応は、アルゴン下で、７０℃で１４４時間行われる。エステル交換反応は、ＮＨＳＩの放出によって起こる。溶媒の蒸発後、最終産物は、ＮＨＳＩ及び水溶性コポリマーを除去するために水で洗浄され、続いて残りの未反応ポリエステルを抽出するためにジクロロメタンで洗浄した。
【０１１８】
４０％の収率で、櫛形のＤｅｘ−ＰＣＬコポリマーが得られ、これはデキストラン（Ｄｅｘ）骨格（分子量４００００ｇ／ｍｏｌ）及びエステルと架橋したＰＣＬの側鎖結合を有する。当該コポリマーは、反応の最後に精製される。その全体的な組成は、元素の微量分析及びＮＭＲによって決定される。コポリマーは重量当たり３３％のＰＣＬを含む。
【０１１９】
同一のプロトコールが低分子量（６０００ｇ／ｍｏｌ）のデキストラン（Ｆｌｕｋａ）に使用される。
【０１２０】
例８
Ｄｅｘ−ＰＣＬ
３ｇのＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ（例１）が共沸蒸留によって脱水され、続いて、還流冷却器に載せられ、且つ真空／アルゴンランプと繋がれた５０ｍｌの丸底反応フラスコ中で直接的に、減圧下で、４０〜５０℃で一晩乾燥される。５ｍｌの乾燥ＴＨＦが続いて丸底フラスコに加えられる。酸が溶解した後、素速く溶解する０．２４３ｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）が丸底フラスコに加えられる。不活性混合物は、ＴＨＦの還流に供される。ＣＯ２が放出されることが観察される。３時間後、ＴＨＦが蒸発される。
【０１２１】
あらかじめ脱水した１．２９ｇのデキストラン（Ｆｌｕｋａ， 分子量６０００ｇ／ｍｏｌ）が７ｍｌの熱い無水ＤＭＳＯ中で溶解され、続いてＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ酸のイミダゾール中間産物を含む丸底反応フラスコに加えられる。反応混合物を１３０℃で３時間加熱する。溶液は褐色を呈する。ＤＭＳＯを蒸発させ、続いて反応産物がクロロホルム中で溶解され、そしてデカンティングフラスコに導入される。それを蒸留水で抽出する。水層はたくさんの安定なエマルジョンの形態で存在する。溶媒の蒸発後、有機層中に残鎖は実質的に見られない。水層は蒸発され、そして分離されて沈殿が得られる。この様に得られたポリマーはエーテルで洗浄され、そして次に乾燥される。ＳＥＣによって決定される分子量（表１）は１１０００ｇ／ｍｏｌである。迅速且つ選択的な高収率（＞８０％）のこの方法が以降好まれる。
【０１２２】
Ｄｅｘ−ＰＣＬの合成におけるデキストラン：Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨの質量比を変えることによって、可変性の質量比のＤｅｘを含む一連のＤｅｘ−ＰＣＬコポリマーがこの方法で得ることができる。これらのコポリマーは、プルランをスタンダードとして検量したＶｉｓｃｏＧｅｌカラム（ＧＭＨＨＲ−Ｈ， Ｖｉｓｃｏｔｅｋ， ＧＢ）を用いるゲル透過クロマトグラフィー（屈折計及び粘度計、７０℃）によって特徴づけられる。Ｄｅｘ−ＰＣＬコポリマーは５ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）中に溶解された。注入される体積は１００μｌであった。溶出液は、０．５ｍｌ／分の流速の、０．４％ＬｉＢｒを含むＤＭＡＣであった。分子量は、一般的な検量法によって決定された。幾つかの例を表１に示す。
【表１】
2004521152.tif 000002
【０１２３】
Ｄｅｘ−ＰＣＬ７は、５％の割合のデキストランと９５％の割合のＰＣＬを一緒にすることで誘導される。
【０１２４】
Ｄｅｘ−ＰＣＬ５は、２０％の割合のデキストランと８０％の割合のＰＣＬを一緒にすることで誘導される。
【０１２５】
Ｄｅｘ−ＰＣＬ３は、３３％の割合のデキストランと６７％の割合のＰＣＬを一緒にすることで誘導される。
【０１２６】
表１：出発物質のデキストランと、反応混合物中で重量当たり５，２０又は３３％のデキストラン（ＲＰＣＬ−ＣＯＯＨとデキストランの合計重量との比較）を用いることによって合成される、デキストラン骨格にグラフトされるＰＣＬの鎖をそれぞれ７，５又は３つ有する３つのＤｅｘ−ＰＣＬコポリマーの特徴：
Ｍｗ：重量平均分子量
Ｍｎ：数平均分子量
Ｐｄ：多分散性（＝Ｍｗ／Ｍｎ）
Ｉｖｗ：重量平均固有粘度
Ｒｇｗ：重量平均回転半径
ｄｎ／ｄｃ：濃度による特異的な屈折率の変化
【０１２７】
３つのコポリマーは、低い多分散性及び１１０００〜１９０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する。
【０１２８】
例９
アミロース−ＰＣＬ
０．２ｇのアミロース（Ｆｌｕｋａ， ポテトより抽出）を８ｍｌのＤＭＳＯに溶解する。濁った溶液が生じ、これに３ｍｌのＤＭＳＯに溶解した、０．２ｇのＮＨＳＩのＲ−ＰＣＬ−エステル（例６）に加えられる。この混合物は、７０℃で１４４時間インキュベートされる。溶媒の蒸発後、固体をデカンティングフラスコ中の２００ｍｌの水及び２００ｍｌのクロロホルムに溶解する。両親媒性ポリマーを含む中間層が回収され、そしてもう一度抽出され、乾燥される。この処理は、例７の精製方法の変形である。
【０１２９】
２回目の抽出後の重量当たりの収率は３８％（ｗｔ）である。
【０１３０】
微量分析の結果は、重量当たり３２％のＰＣＬを含む、得られた両親媒性コポリマーの全体的な組成を決定することを可能にする。
【０１３１】
例１０
キトサン−ＰＣＬ
キトサン−ポリカプロラクトンコポリマーは、例９のプロトコールに従い得られる。合成は、粗製キトサン（Ｆｌｕｋａ， １５００００ｇ／ｍｏｌ）から実施され、そして得られたコポリマーの収率は重量当たり２２％であった。元素の微量分析に従い、コポリマーは重量当たり６７％のＰＣＬを含む。それは櫛形のものであり、アミド結合によって全体的に結合した、キトサン骨格とＰＣＬの側鎖結合を有する。
【０１３２】
例１１
ＨＡ−ＰＣＬ
カルボン酸ナトリウムの形態のヒアルロン酸（Ａｃｃｒｏｓ， １０６ｇ／ｍｏｌ超の分子量）が、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解され、そして陽イオン交換樹脂によって遊離酸の形態に変換され、そして凍結乾燥される。この様にして得られた生成物は、ＤＭＳＯ中で完全に可溶性であり、そして例７及び９のプロトコールに従い、Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨのＮＨＳＩエステルとの結合を実施することを可能にする。
【０１３３】
ヒアルロン酸−ＰＣＬの櫛形コポリマーは、水層中で回収される。中間層は存在しない。微量分析に従い、このコポリマーは重量当たり１８％のＰＣＬを含む。
【０１３４】
例１２
Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨナノ粒子
例１に従い合成された、質量が明確なＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨは、２０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るために、アセトンに溶解される。アセトンの体積の二倍量に等しい体積の水を一滴ずつ加える。当該ポリマーは、界面活性剤無しに、２１０ｎｍの平均直径（溶媒の蒸後に測定したもの）を有するナノスフェアを自然に形成する。
【０１３５】
例１３
Ｄｅｘ−ＰＣＬナノ粒子
例７に従い合成された、質量が明確なＤｅｘ−ＰＣＬコポリマーは、１０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るために、ジクロロメタン中に導入される。当該ポリマーは溶媒によって分散され、そして膨潤されるが、溶解しない。ジクロロメタンの体積の２〜２０倍の体積の水が加えられる。粗いエマルジョンが最初に形成され、続いて超音波によって細かくされる。両親媒性のコポリマーがエマルジョンを安定化し、それにより界面活性剤を加える必要が回避される。有機溶媒の蒸発後、ナノ粒子が得られる。
【０１３６】
粒子の平均直径は光拡散（ＰＣＳ）によって決定される。通常この方法で３００ｎｍ未満のサイズの粒子は、濃度、水性及び有機性の２つの層の体積比、超音波処理の時間及び強さ、に依存する。
【０１３７】
例１４
２２ｍｇのＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ（例１）が、１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水中に導入され、そして電気攪拌機で８０℃に加熱される。この温度でのポリマーの融合の後、球面粒子が形成された（図１）。続いて、容器の冷却は、その様に形成された構造を固定することを可能にした。当該粒子は、沈積によって回収することが出来た。
【０１３８】
少量のエタノールの添加が、水の表面でのフィルムの形成を回避することによって製造物を改善せしめることが観察された。
【０１３９】
例１５
粒子は、水の代わりに、ｐＨ４．８のキトサン飽和型酢酸緩衝液が使用されたことを除いて例１４の方法に従い形成された。
【０１４０】
例１６
２２ｍｇのＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ（例１）が１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水中に導入され、そして８０℃に加熱された。超音波プローブを容器に投じ、そして超音波を適用した（２０Ｗ， ２０秒）。これにより、１．１μｍの平均流体力学的直径（ＰＣＳによって決定された）を有し、そして低い多分散性を有するマイクロスフェアが得られる（図２）。
【０１４１】
ｕｌｔｒａｔｕｒａｘの使用が、ナノ粒子の形成のための超音波処理の代わりとなること注意しなければならない。
【０１４２】
Ｄｅｘ−ＰＣＬコポリマー（例７）及びキトサン−ＰＣＬコポリマー（例９）もこの方法で粒子を形成したことが観察された。
【０１４３】
水を油（例えばＭｉｇｌｉｎｏｌ（商標））又はポリマー（例えば２００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ）に変えたこの方法で、粒子を形成することも可能であることに注意しなければならない。これらの試験は、５ｍｌの液体中にある２５ｍｇのポリマーを用いることで行われた。
【０１４４】
例１７
生体接着
経口投与が意図される粒子の相互作用モデルとして使用される、培養Ｃａｃｏ２細胞と、本発明に従う粒子の相互作用が研究された。トリチウム化したＰＬＡが、放射性マーカーとして、粒子の位置（細胞の内側又はその表面あるいは培養液中）を正確に決定することを可能にするためにＤｅｘ−ＰＣＬナノ粒子内に包まれた。このマーキングは、培養液中で完全に安定であることが証明され、それ故にこれらの研究が可能となっている。Ｃａｃｏ２細胞は２４穴プレート中で、１又は２日毎に培養液（１．５ｍｌ／穴 ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｌ グルコース、１５％ウシ胎児血清）を交換してコンフルエントになるまで培養された。約４日後に細胞がコンフルエントに達した場合、培養液が除去され、１．５ｍｌのハンクス液が加えられ、そして２日間放置した後、明確な量の粒子を含むナノスフェア懸濁液（全体積１００μｌ）が加えられる。培養液の穴当たりの活性は、０．１μＣｉで固定された。ＣＯ２インキュベーター内での３７℃での、３時間のインキュベーションの後、上清が除去され、細胞がＰＢＳで２回洗浄され、続いて１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解された。放射能は、上清、洗浄水及び細胞のライゼートにおいてカウントされた。この様に、細胞と有効に会合するナノ粒子の量を正確に決定することが可能であった。
【０１４５】
Ｃａｃｏ２細胞と会合するＤｅｘ−ＰＣＬナノ粒子の量は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）の存在下でのナノ沈殿（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）技術（例７）によって製造されるポリエステルのもの（ＰＬＡ， Ｐｈｕｓｉｓ， Ｍｗ ４００００ｇ／ｍｏｌ）と比較した場合、２倍である。その結果、それぞれ２．５％及び１．１％のナノ粒子が細胞と会合する。
【０１４６】
例１８
親和性によるレクチンの結合、ターゲッティング
Ｄｅｘ−ＰＣＬ（例７）から製造された放射性標識したナノ粒子は、粒子に対して過剰の、エンドウ（ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ）由来のレクチンの溶液と、親和性によって吸着されたレクチンで後者のものの表面が飽和するように接触される。この様にしてレクチンで覆われたナノ粒子と、培養Ｃａｃｏ２細胞との相互作用は、これまでのプロトコール（例１６）に従い研究された。
【０１４７】
Ｃａｃｏ２細胞と会合するナノ粒子の量は、レクチンで覆われていないものと比較して、有意に増大する。この様に、レクチン無しの場合での２．５％と比較して、各穴で導入されるナノ粒子の３．５％が細胞と会合する。
【０１４８】
例１９
ステルス
食細胞（Ｊ７７４）による捕捉を回避するための、デキストランで覆われたナノ粒子（Ｄｅｘ−ＰＣＬから製造されたもの、例７）の能力が同一のサイズ（約２００ｎｍ）のものと比較され、そして５０００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ（５００００ｇ／ｍｏｌのＰＬＡのブロックの分子量を有する、５００００ｇ／ｍｏｌのＭｅ−Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨ及びラクチドから、例４に従い合成されたＰＥＧ−ＰＬＡから製造されたもの）で覆われた。Ｊ７７４細胞は、２４穴プレートにおける、４．５ｇ／ｌのグルコース及び１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養された。実験の前に、細胞の上清が新しくされ、そして４時間放置した後、放射性標識したナノ粒子の懸濁液が穴に加えられた。Ｄｅｘ−ＰＣＬナノ粒子及びＰＥＧで覆われた同一サイズの参照ナノ粒子の捕捉は、ナノ粒子を貪食する、この細胞型の周知の能力にも関わらず、実質的に同一であった（１〜２％）。この事は、デキストランで覆われたナノ粒子の「ステルス」特性に関する指標であり、文献において周知の、ＰＥＧで覆われた粒子のものと同様である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、例１３に従い製造されるＲ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ粒子の光学顕微鏡による例示である。
【図２】
図２は、Ｒ−ＰＣＬ−ＣＯＯＨ粒子の流体力学的直径の分布である。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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