(57)【要約】本発明は、官能性ポリアルキルシアノアクリレートから成る気体封入マイクロカプセル、並びに気体封入マイクロカプセルの製法及び超音波診断へのそれらの使用に関し、上記マイクロカプセルは１以上のアルキルシアノアクリレートと官能モノマーの共重合及び／又はポリアルキルシアノアクリレートの部分的な側鎖加水分解により製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能性ポリアルキルシアノアクリレートを含むことを特徴とする気体封入マイクロカプセル。
【請求項２】
上記官能性ポリアルキルシアノアクリレートを１以上のアルキルシアノアクリレートと官能モノマーの共重合により製造する、請求項１に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３】
官能モノマーとして使用されるものが以下の：
【化１】
2004500397.tif 000009
ここで、Ｒ１ ＝直鎖又は分枝アルキル・ラジカル、及びＲ２ ＝直鎖又は分枝アルキレン・ラジカル、上記Ｒ１ 及びＲ２ はそれぞれ１〜２０の炭素原子を持ち、そして
ここで、Ｘ′及びＺ′は共に、いずれの場合にも互いに独立にＸ及びＺについて示された意味を持つ。｝、
【化２】
2004500397.tif 000010
ここで、Ｒ１ ＝直鎖又は分枝アルキル・ラジカル、及びＲ２ ＝直鎖又は分枝アルキレン・ラジカル、上記Ｒ１ 及びＲ２ はそれぞれ１〜２０の炭素原子を持つ。｝、あるいは、
重合可能な乳化剤（Ｓｕｒｆｍｅｒ）、官能性を有する重合開始剤（Ｉｎｉｓｕｒｆ）、及び官能性を有する連鎖移動剤（Ｔｒａｎｓｓｕｒｆ）、
である、請求項２に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項４】
官能モノマーとして以下の：
【化３】
2004500397.tif 000011
を使用する、請求項３に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項５】
ブチル、エチル、及び／又はイソプロピルシアノアクリレートをアルキルシアノアクリレートとして使用する、請求項２に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項６】
前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートをポリアルキルシアノアクリレートの部分的な側鎖加水分解により製造する、請求項１に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項７】
ブチル、エチル、及び／又はイソプロピル・シアノアクリレートをポリアルキルシアノアクリレートの製造に使用する、請求項６に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項８】
以下の処理ステップ：
（ａ）前記官能モノマーを１以上のアルキルシアノアクリレートと混合し、
（ｂ）１の処理ステップにおいて、分散条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ共重合させ、かつ、マイクロカプセルを構築する、
を実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセルの製法。
【請求項９】
以下の処理ステップ：
（ａ）前記官能モノマーを１以上のアルキルシアノアクリレートと混合し、
（ｂ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ共重合させ、そして
（ｃ）その共重合とは別に、分散条件下、マイクロカプセルを構築する、
を実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセルの製法。
【請求項１０】
以下の処理ステップ：
（ａ）１の処理ステップにおいて、分散条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、かつ、マイクロカプセルを構築し、
（ｂ）アルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｃ）酸の添加によりその反応を停止させる、
を実施する、請求項１，６又は７のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセルの製法。
【請求項１１】
以下の処理ステップ：
（ａ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中で１以上のアルキルシアノアクリレートをｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、
（ｂ）その共重合とは別に、分散条件下でマイクロカプセルを構築し、
（ｃ）アルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｄ）酸を添加してその反応を停止させる、
を実施する、請求項１，６又は７のいずれか１項に記載の気体封入カプセルの製法。
【請求項１２】
以下の処理ステップ：
（ａ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中で１以上のアルキルシアノアクリレートをｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、
（ｂ）１次分散系へのアルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｃ）酸の添加によりその反応を停止させ、
（ｄ）場合により１以上のアルキルシアノアクリレートの新たな添加を伴い、分散条件下でマイクロカプセルを構築する、
を実施する、請求項１，６又は７のいずれか１項に記載の気体封入カプセルの製法。
【請求項１３】
以下の処理ステップ：
（ａ）マイクロカプセルの構築後に行われる、１回以上の浮揚とそれに続く生理的に適合性のある媒質中への浮揚物質の取り込み、
（ｂ）官能モノマーとの共重合による官能性付与がすでに実施された場合であっても、アルカリ液の添加により部分的に側鎖加水分解させ、そして酸の添加によりその反応を停止させることによるさらなる官能性付与、
（ｃ）精製のためのろ過、限外ろ過、及び／又は遠心分離、
を場合により実施する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の気体封入カプセルの製法。
【請求項１４】
前記の部分的な側鎖加水分解を９〜１４のｐＨ値、かつ、１５分間〜５時間の反応時間で実施する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１５】
酸の添加により７未満のｐＨに合わせることによって、前記の部分的な側鎖加水分解を停止させる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１６】
前記モノマーを酸性の水性溶液に０．１〜６０％、好ましくは０．１〜１０％の濃度で加える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１７】
以下の界面活性剤：
アルキルアリールポリ（オキシエチレン）硫酸アルカリ塩、デキストランポリ（オキシエチレン）、ポリ（オキシプロピレン）−ポリ（オキシエチレン）−ブロック・ポリマー、エトキシル化脂肪アルコール（セトマクロゴール）、エトキシル化脂肪酸、アルキルフェノールポリ（オキシエチレン）、アルキルフェノールポリ（オキシエチレン）（ｓ）及びアルデヒドのコポリマー、ソルビタンの部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンの部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）の部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）の脂肪酸エステル、サッカライドの脂肪酸エステル又はマクロゴールグリセロール・エステル、ポリビニル・アルコール、ポリ（オキシエチレン）ヒドロキシ脂肪酸エステル、多価アルコールのマクロゴール、部分的脂肪酸エステル、の１以上を使用する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１８】
以下の界面活性剤：
エトキシル化ノニルフェノール、エトキシル化オクチルフェノール、アルデヒド及びオクチルフェノールポリ（オキシエチレン）のコポリマー、エトキシル化グリセロール−部分的脂肪酸エステル、エトキシル化水素化ヒマシ油、ポリ（オキシエチレン）−ヒドロキシステアレート、モル質量＜２０，０００を有するポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシエチレン）−ブロック・ポリマー、の１以上を使用する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１９】
以下の界面活性剤：
平均９〜１０エトキシ基を持つパラ−オクチルフェノール−ポリ−（オキシエチレン）（＝オクトキシノール９，１０）、平均３０／４０エトキシ基を持つパラ−ノニルフェノール−ポリ（オキシエチレン）（＝例えば、Ｅｍｕｌａｎ（商標）３０、Ｅｍｕｌａｎ（商標）４０）、平均２８エトキシ基を持つパラ−ノニルフェノール−ポリ（オキシエチレン）−硫酸−Ｎａ塩（例えば、Ｄｉｓｐｏｎｉｌ（商標）ＡＥＳ）、ポリ（オキシエチレン）グリセロール・モノステアレート（例えば、Ｔａｇａｔ（商標）Ｓ）、６００〜７００の重合度及び８５％〜９０％の加水分解度を有するポリビニル・アルコール（＝例えば、Ｍｏｗｉｏｌ（商標）４〜８８）、ポリ（オキシエチレン）−６６０−ヒドロキシステアリン酸エステル（＝例えば、Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標）ＨＳ　１５）、ホルムアルデヒド及びパラ−オクチルフェノールポリ（オキシエチレン）のコポリマー（＝例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＷＲ　１３３９）、約１２，０００のモル質量及び約７０％のポリオキシエチレン割合を有するポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン−ブロック・ポリマー（＝例えば、Ｌｕｔｏｌ（商標）Ｆ１２７）、エトキシル化セチルステアリル・アルコール（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）Ａ２５）、エトキシル化ヒマシ油（＝例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ）、の１以上を使用する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２０】
前記界面活性剤を０．１〜１０％の濃度で使用する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２１】
以下の酸：
塩酸、リン酸、及び／又は硫酸、
を使用する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２２】
前記重合及びマイクロカプセル構築を−１０℃〜６０℃、好ましくは０℃〜５０℃、特に好ましくは５℃〜３５℃の範囲内で実施する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２３】
前記重合及びマイクロカプセル構築の時間が２分間〜２時間である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２４】
前記気体封入マイクロカプセルを浮揚により反応媒質から分離して、生理学的に適合性のある媒質中に取り込み、そして場合により凍結防止剤を加えた後に凍結乾燥する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項２５】
水又は生理学的に一般的な塩溶液を前記浮揚物質の取り込みのために使用する、請求項２４に記載の製法。
【請求項２６】
凍結防止剤としてポリビニルピロリドン、ポリビニル・アルコール、ゼラチン、及び／又はヒト血清アルブミンを使用する、請求項２４に記載の製法。
【請求項２７】
請求項８〜２６のいずれか１項に記載の製法により得られる、気体封入マイクロカプセル。
【請求項２８】
特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を含む、請求項１〜７又は２７のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項２９】
特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質と連結される、請求項１〜７又は２７のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３０】
特異的結合分子、抗体、好ましくは抗ＥＤＢ−ＦＮ抗体、抗エンドスタチン抗体、抗Ｃｏｌｌ　ＸＶＩＩＩ 、抗ＣＭ２０１抗体、抗Ｌ−セレクチン・リガンド抗体、例えば抗ＰＮＡｄ抗体（ＭＥＣＡ７９抗体）、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＩＣＡＭ１抗体、あるいは内因性リガンド、好ましくはＬ−セレクチン、そして特に好ましくはキメラＬ−セレクチンとして使用する、請求項２８又は２９に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３１】
動力学に影響を与える物質として、合成ポリマー、好ましくはポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）、タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミン、及び／又は糖類、好ましくはデキストランを含むか、あるいは結合する、請求項２８又は２９に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３２】
前記特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基に直接連結する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３３】
前記特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基にスペーサー、例えばＧタンパク質を介して連結する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３４】
前記特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基へのストレプトアビジン−ビオチン連結を介してビオチン化する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３５】
前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基を活性化する、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３６】
前記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基をＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸）により活性化する、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセル。
【請求項３７】
超音波診断のための請求項１〜７又は２７〜３６のいずれか１項に記載の気体封入マイクロカプセルの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の対象は、特に超音波診断に使用するための、官能性ポリアルキルシアノアクリレートを含む気体封入マイクロカプセル、並びにそれらの製法である。
【０００２】
本願は以下の定義に基づく：
微粒子：それらの構造設計に関係なく、５００ｎｍ〜５００μｍの寸法の全ての粒子についての総称。
【０００３】
マイクロカプセル：核−殻構造を有する５００ｎｍ〜５００μｍの寸法の全ての粒子。
【０００４】
壁物質＝殻物質：マイクロカプセル殻物質
ナノ粒子：それらの構造設計に関係なく、５００ｎｍ未満の寸法の全ての粒子についての総称。
【０００５】
粒子：ナノ粒子及び微粒子についての総称。
【０００６】
気体封入マイクロカプセル：気体核を持つマイクロカプセル。
【０００７】
ホモポリマー：単一のモノマーから作られるポリマー。
【０００８】
コポリマー：さまざまなモノマーから作られるポリマー。
【０００９】
アルキルシアノアクリレート：シアノアクリル酸のアルキルエステル。
【００１０】
ポリアルキルシアノアクリレート：原則的に遊離酸及びアルコール基を持たない１以上のアルキルシアノアクリレートから作られるポリマー。
【００１１】
官能基：Ｘ＝Ｏ、Ｓ、及びＮを持つ原子のＸ−Ｈ基を伴う少なくとも１の極性、反応性原子化合物を含む分子基。
【００１２】
潜在的官能基：保護基を与えられる官能基、それにより上記保護基はいくつかの官能基をも保護しうる。
【００１３】
官能モノマー：アルキルシアノアクリレートに対するコモノマー、ここで上記コモノマーは、その重合分子基に加え少なくとも１の遊離又は潜在的官能基を含み、そして上記コモノマーにより遊離の官能基を持つコポリマーが直接的に又はその保護基の分離後に製造されうる。
【００１４】
官能性ポリアルキルシアノアクリレート：遊離の官能基を持つポリアルキルシアノアクリレートであり、これは少なくとも１のアルキルシアノアクリレートと少なくとも１の官能モノマーの共重合によるか、あるいはポリアルキルシアノアクリレートのエステル型酸性官能基の部分的な側鎖加水分解により製造されうる。
【００１５】
官能性付与：少なくとも１のアルキルシアノアクリレートと少なくとも１の官能モノマーの共重合によるか、あるいはポリアルキルシアノアクリレートのエステル型酸性官能基の部分的な側鎖加水分解による官能性ポリアルキルシアノアクリレートの製造。
【００１６】
官能性のないポリアルキルシアノアクリレート：ポリアルキルシアノアクリレート。
【００１７】
気相率ΦＧ ：気体容積対反応バッチの総容積の比率＝反応混合物中の気相の容積の割合。
【００１８】
「撹拌」は、その気相率ΦＧ が＜１％のような方法における、液体の液体、固体又は気体物質との混合である。
【００１９】
「分散」は、気相率ΦＧ ＞１％のような方法における、液体の液体、固体又は気体物質との混合である。
【００２０】
「分散系」はコロイド状の（粒子サイズ＜５００ｎｍ）又は粗く分散させた（粒子サイズ＞５００ｎｍ）多相系である。
【００２１】
「１次分散系」は、１以上のモノマーの重合により製造されるポリマー粒子から成るコロイド状分散系である。
【００２２】
「単独気体供給（ｓｅｌｆ−ｇａｓｓｉｎｇ）」は、その気体の動きによるか、あるいは圧力をかけられた動的な流れの発生による液体中への気体の導入である。
【００２３】
「浮揚」は、マイクロカプセルと分散物質の間の密度の違いに基づく、加速力（放射状加速度αに対する重力に起因する加速度）に逆らう方向を持つ気体封入マイクロカプセルの動きである。
【００２４】
「浮揚物質」は、浮揚の後の気体封入マイクロカプセルのクリーム状になった層である。本願に定義したとおり、上記用語ポリマーはホモポリマー及びコポリマーの両者を含み、そして上記用語重合は単独重合及び共重合を含む。
【００２５】
アルキルシアノアクリレート又はポリアルキルシアノアクリレートはさまざまな方法で薬剤及び化学療法に使用される。
【００２６】
医薬製剤Ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌ（商標）は、例えばブチルシアノアクリレートから成り、そして手術において組織接着剤又は血管接着剤として使用される。使用後、そのモノマーは重合し、そして瞬時に組織又は血管を閉じる。
【００２７】
加えて、アルキルシアノアクリレートは、有効成分の徐放性製剤のために提案されもする（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｈａｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３１， ３３１−３３２， １９７９）。この場合、有効成分は対応のポリマーから成る基質中に埋め込まれる。その結果、有効成分の放出の速度及び部位が修飾及び調節されうる。
【００２８】
この場合、アルキルシアノアクリレート又はポリアルキルシアノアクリレートは数センチメートルまでの寸法の有効成分含有インプラントの製造及び数マイクロメートル又は数ナノメートルの寸法の微粒子及びナノ粒子の製造の両方に好適である。
【００２９】
上記アルキルシアノアクリレート又はポリアルキルシアノアクリレートの超音波造影剤の配合物への特別な用途を発見した。
【００３０】
造影剤として、気体を含むか又は放出する物質が医療の超音波診断に一般的に使用される。なぜならこれらの物質により、液体又は固体と血液の間よりもより効果的な密度差、そしてそれにより電気抵抗差を発生しうるからである。
【００３１】
上記用語「微粒子」と「マイクロカプセル」の使用は、従来技術において一様ではなかった。従来技術の以下の記載において、たとえその文献の用語法がそこから逸脱したとしても、この出願が基にする上記の定義を使用する。
【００３２】
欧州特許第０３９８９３５号及び同第０４５８７４５号において、気体含有マイクロカプセルは合成、生分解性ポリマー物質から成る超音波造影剤として記載されている。特にポリアルキルシアノアクリレート及びポリラクチドは壁物質として開示されている。欧州特許第０６４４７７７号に記載の方法の最適化により、欧州特許第０３９８９３５号に記載の気体封入マイクロカプセルの超音波活性は顕著に改善されることができた。上記超音波活性の増加は、一定の粒子直径の場合には広げられたその空気核の直径により達成される。それから得られる薄い壁の厚みにもかかわらず、それでも上記粒子は心肺系を通過して存続する。開示された気体封入マイクロカプセルの殻は、ポリアルキルシアノアクリレート又はα−、β−又はγ−ヒドロキシカルボン酸のポリエステルから構築されている。
【００３３】
ポリアルキルシアノアクリレートから成る気体封入マイクロカプセルの最適化された製法は、そのモノマーを酸性の、気体飽和、水性溶液中に分散し、そして重合させ、かつ、この場合にはマイクロカプセルの構築を直接実施することを特徴とする。この方法において、気体封入マイクロカプセルは有機溶媒なしに製造される。
【００３４】
殻物質がポリアルキルシアノアクリレートから成る従来技術の気体封入マイクロカプセルは多くの欠点を持つが、しかし：
１．アルキルシアノアクリレートのポリマーは末端のアルコール基まで官能基を持たず、その官能基は特異的結合分子又は動力学に影響する物質の直接的な共有結合に必要である。
【００３５】
２．官能基の欠如のために、そして官能性ポリマーとの比較において、アルキルシアノアクリレートのポリマーは分子量が近く、そしてアルキルシアノアクリレートは水溶性ではなく、そして膨らまない。静中投与の場合において、肝臓の細網内皮系による血液循環からのマイクロカプセルの除去は粒子表面の親水性に大きく依存し、そのため疎水性表面は除去を促進する。結果として、有効な時間ウインドを制限する。
【００３６】
３．インビボにおける分解は側鎖の加水分解及び脱重合により行われる。媒質のｐＨ、及び上記ポリマーの分子量に加えて、官能基の存在が血中及び肝臓内での分解に関するより重要なパラメーターであり、そのため分解及び代謝は、官能性付与の程度が高いほどかえって速く行われる。
【００３７】
４．ポリアルキルシアノアクリレートから成る気体封入マイクロカプセルは希釈に対して限られた安定性しか持たず、そのため上記超音波造影剤媒質用量は、投与量によって変化量を投与する場合には大きく変わるが、しかし上記超音波造影剤濃度によって上記変化量を投与する場合には変える必要がない。特に点滴中に行う場合、造影剤媒質を希釈するという選択肢は投与の負担を減少させる。
【００３８】
本発明の目的は、超音波診断に使用するための気体封入マイクロカプセルを提供することであり、このマイクロカプセルは従来技術の欠点を持たない。官能性付与は特異的結合分子又はそのポリマーに対する動力学に影響を与える物質の結合の可能性を広げる。加えて、親水化は、肝臓の細網内皮系を通した血液循環からのマイクロカプセルの排除の遅延、及びそれによる診断時間ウインドの拡張を達成する。加えて、肝臓における上記気体封入マイクロカプセルの分解及び代謝を促進する。さらに、本発明による超音波造影剤は、従来技術の超音波造影剤よりも希釈に対して高い安定性を示し、そのため投与すべき用量の変化及び投与の種類においてさらなる自由度を生み出す。
【００３９】
本発明の目的は超音波診断に使用するための官能性ポリアルキルシアノアクリレートを含む気体封入マイクロカプセルにより達成される。上記官能性ポリアルキルシアノアクリレートは、１以上のアルキルシアノアクリレート、好ましくはブチル、エチル及び／又はイソプロピル・シアノアクリレートの官能モノマー、好ましくはシアノアクリル酸との共重合によるか、並びに／あるいはポリアルキルシアノアクリレート、好ましくはポリブチル、ポリエチル、及び／又はポリイソプロピル・シアノアクリレートの部分的な側鎖加水分解により製造されうる。
【００４０】
官能性ポリアルキルシアノアクリレートを含む気体封入マイクロカプセルの製造はさまざまな方法で実施されうる：
変法Ｉ：
第１の変法は以下の処理ステップにより特徴づけられる：
（ａ）上記官能モノマーを１以上のアルキルシアノアクリレートと混合し、
（ｂ）１の処理ステップにおいて、分解条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ共重合させ、かつ、マイクロカプセルを構築する。
【００４１】
変法ＩＩ
第２の変法は以下の処理ステップにより特徴づけられる：
（ａ）上記官能モノマーを１以上のアルキルシアノアクリレートと混合し、
（ｂ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ共重合させ、そして
（ｃ）上記共重合とは別に、分散条件下でマイクロカプセルを構築する。
【００４２】
変法ＩＩＩ
第３の変法は以下の処理ステップにより特徴づけられる：
（ａ）１の処理ステップにおいて、分散条件下、酸性の水性溶液中でｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、かつ、マイクロカプセルを構築し、
（ｂ）アルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｃ）酸の添加により上記反応を停止させる。
【００４３】
変法ＩＶ：
第４の変法は以下の処理ステップにより特徴づけられる：
（ａ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中で１以上のアルキルシアノアクリレートをｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、
（ｂ）上記共重合とは別に、分散条件下でマイクロカプセルを構築し、
（ｃ）アルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｄ）酸を添加して上記反応を停止させる。
【００４４】
変法Ｖ
第５の変法は以下の処理ステップにより特徴づけられる：
（ａ）撹拌条件下、酸性の水性溶液中で１以上のアルキルシアノアクリレートをｉｎ−ｓｉｔｕ重合させ、
（ｂ）１次分散系へのアルカリ液の添加により部分的な側鎖加水分解を実行し、
（ｃ）酸の添加により上記反応を停止させ、
（ｄ）場合により１以上のアルキルシアノアクリレートの新たな添加を伴い、分散条件下でマイクロカプセルを構築する。
【００４５】
上記変法に関係なく、場合によりマイクロカプセルの構築後に行われる、１回以上の浮揚とそれに続く生理的に適合性のある媒質中への浮揚物質の取り込みを実施する。
【００４６】
加えて、官能モノマーとの共重合による官能性付与がすでに実施された場合でさえ、場合によりさらなる官能性付与が、アルカリ液の添加による部分的な側鎖加水分解、そして酸の添加によるその反応の停止により実施される。加えて、精製のための処理ステップ、例えばろ過、限外ろ過、及び／又は遠心分離が場合により実行される。
【００４７】
上記変法に関係なく、好ましくはシアノアクリル酸のアルキル・エステルがモノマーとして使用される。特に好ましくはブチル、エチル、及びイソプロピル・シアノアクリル酸である。
【００４８】
官能モノマーとして、以下のものが使用される：
【００４９】
【化４】
2004500397.tif 000002
【００５０】
ここで、Ｒ１ ＝直鎖又は分枝アルキル・ラジカル、及びＲ２ ＝直鎖又は分枝アルキレン・ラジカル、上記Ｒ１ 及びＲ２ はそれぞれ１〜２０の炭素原子を持ち、そして
ここで、Ｘ′及びＺ′は共に、いずれの場合にも互いに独立にＸ及びＺについて示された意味を持つ。｝。
【００５１】
【化５】
2004500397.tif 000003
【００５２】
ここで、Ｒ１ ＝直鎖又は分枝アルキル・ラジカル、及びＲ２ ＝直鎖又は分枝アルキレン・ラジカル、上記Ｒ１ 及びＲ２ はそれぞれ１〜２０の炭素原子を持つ。｝。
【００５３】
・重合可能な乳化剤（Ｓｕｒｆｍｅｒ）、官能性を有するイニシエータ（Ｉｎｉｓｕｒｆ）、及び官能性を有する連鎖移動剤（Ｔｒａｎｓｓｕｒｆ）。
【００５４】
好んで使用されるものは以下のとおりである：
【００５５】
【化６】
2004500397.tif 000004
【００５６】
この場合、上記官能モノマーであるシアノアクリル酸が極性の、反応性Ｏ−Ｈ原子基を持つ官能基として遊離のカルボキシル基を生じる。
【００５７】
上記官能モノマーであるグリシジルメタクリレートは２つの極性の、反応性Ｏ−Ｈ原子基を持つ２つの遊離の、隣接アルコール基（ｄｉｏｌ）を生じる。上記アルコール基はグリシジルメタクリレート内のエポキシド基により保護され（潜在的官能基）、そして加水分解により解放される。
【００５８】
変法Ｉ及びＩＩにおいて、その官能性付与は、上記アルキルシアノアクリレートの官能モノマーとの共重合により達成される。
【００５９】
変法ＩＩＩ 〜Ｖにおいて、その官能性付与は、アルカリ液を用いた、１次分散系中か又はマイクロカプセル懸濁液中のいずれかでのポリアルキルシアノアクリレートのその結果生じる処理により達成される。上記アルカリ性媒質中、これはその側鎖内のエステル型酸性官能基のエステル加水分解をもたらす。上記官能性付与の所望の強さに依存して、上記反応は室温で約１５分〜５時間９〜１４のｐＨで実施される。
【００６０】
上記反応を、例えば塩酸を用いて７より低いｐＨに調節することにより停止させる。
【００６１】
上記エステル加水分解のｐＨ及び反応時間の変化により、官能性付与の程度の制御が可能である。純粋な表面官能性付与は、上記反応を注意深く実施した場合に達成される。
【００６２】
重合及びマイクロカプセルの構築を１段階で実施する変法Ｉ及びＩＩＩ の処理ステップは、欧州特許第０３９８９３５号及び同第０６４４７７７号に大筋で記載されている。重合及びマイクロカプセルの構築を、分散条件下、１つの処理ステップの中で実施する。分散手段として、主にローター−ステータ−ミキサーが好適である、なぜなら後者は著しい剪断勾配を生じ、そして単独気体供給による気体の多くの導入を確保する。
【００６３】
重合とマイクロカプセル構築を２段階で実施する変法ＩＩ、ＩＶ、及びＶの処理ステップは、ドイツ特許出願の目的である（特許出願番号第１９９２５３１１．０号）。
【００６４】
そこに記載されている発明は気体封入マイクロカプセルの製造に関する多段階処理に関係し、そこで、殻形成物質の重合処理ステップとマイクロカプセル構築ステップを別々に実施されている。本発明による方法により製造したマイクロカプセルは核−殻構造を持ち、そして定められたサイズ分布により分類される。
【００６５】
上記モノマーの重合は、気相率ΦＧ ＜１％の方法により撹拌条件下、酸性の水性溶液中でこの場合実施される。これらの変法の中間産物として、コロイド状のポリマー粒子から成る１次分散系が観察される。気体の封入のために製造されるポリマー・ラテックス粒子の直径は、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲、好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲、特に有利には６０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲にわたる。
【００６６】
上記コロイド状のポリマー粒子の（例えば、平均直径及び多分散性により特徴づけられる）粒子サイズ、及び（例えばモル−質量分布の最大値及びモル−質量分布により特徴づけられる）上記粒子の分子量は、例えば撹拌媒質のｐＨ、界面活性剤濃度及び界面活性剤の種類により影響を受ける。特に、そのアルコール浴比（界面活性剤の質量とモノマーの質量の商）は重要なパラメーターであり、それによりコロイド状ポリマー粒子の性質が制御される。上記ポリマーの分子量はこの場合のポリマーのガラス転移温度、つまりコロイド状ポリマー粒子から製造される気体封入マイクロカプセルの音波特性についてのより重要なパラメーターであるその弾性に影響を与える。
【００６７】
上記重合のための撹拌成分として、基本的には一般的に使用されるスターラーの全てが企図されるが、特に低い粘性、つまり水のような媒質（＜１０ｍＰａｓ）の十分な混合に使用されるようなものである。これらは、例えばプロペラ式スターラー、羽根式スターラー、傾斜した羽根式スターラー、ＭＩＧ（商標）スターラー、及び円板式スターラー等を含む。
【００６８】
上記重合との関係において、場合により重合の間に生じる大部分は（例えばろ過により）分けられ、故に後者はもはやそのマイクロカプセルの形成工程に破壊的な影響を持たない。
【００６９】
上記気体封入マイクロカプセルの形成は上記コロイド状ポリマー粒子の構造を構築する凝集により実施される。上記ポリマーの１次分散系からのマイクロカプセルの構築は、気相率ΦＧ が＞１％、好ましくは１０％超であるような分散条件下、実施される。血栓状物質の形成がはっきりと確認される。この目的のために、上記１次分散系を分散器具により撹拌しなくてはならず、それにより上記反応混合物中の気相率ΦＧ は値として明らかに１％超、そして一般的には１０％超まで上昇する。
【００７０】
多段階処理による気体封入マイクロカプセルの製造における分散器具として、高い剪断勾配を生じるローター−ステータ−ミキサーが好適でもある。加えて、それらはガスの多くの導入を確保する。
【００７１】
上記分散器具の寸法及び動作サイズがマイクロカプセルの粒子サイズ分布を決定する；それらのサイジングはそのユニットのサイズ及び冷却能力にも依存する。
【００７２】
具体的な変法は、連続反応器における上記１次分散系の製造の実施にあり、そのため、この目的のために、それらの厳密に定められたドエル−時間運転を伴う管状反応器が撹拌容器状反応器より好適である。
【００７３】
重合パラメーターの好適な選択により、上記反応器ジオメトリー及び平均ドエル時間が管状反応器において類似の方法により確保され、このため上記管状反応器の終わりには上記重合が完全に完了される。
【００７４】
上記管状反応器の終わりに、多段階ローター−ステータ・システムがマイクロカプセルの構築反応のために使用される、このため全体の工程は１つの装置において実施されるにもかかわらず、上記２の処理ステップ、つまりポリマー分散系の製造及びマイクロカプセルの構築反応は互いに切り離されている。
【００７５】
他の変法は環状反応器の使用を必要とし、上記環状反応器は、単一又は多段階の一列に並んだ分散ユニットを含む外部環を持つか又は加えて上記外部環のための出力を発生しうる単一又は多段階のローター−ステータ・システムを持つ連続的な撹拌容器か又は場合により断続的な撹拌容器から成る。
【００７６】
この場合、上記１次分散系の製造を、適度な撹拌条件下、上記撹拌容器の領域、並びに上記閉鎖環内か、あるいは上記環が開放され、特に循環条件下にある時に管状反応器全体で実施される、ここで上記循環条件はそれ相応に調節された速度の範囲によりあらゆる単独気体供給をもたらさない。上記反応の終了後、次に上記環を開放し、その環に一体化された上記ローター−ステータ・ユニットによりマイクロカプセル構築反応をさせる。上記環が最初から開放されている場合、上記ローター−ステータ・ユニットの速度範囲はそれ相応に上げられる。
【００７７】
実施例１及び２は、先に触れたドイツ特許出願によるマイクロカプセルの多段階構築方法の例を提供する。
【００７８】
上記変法に関係なく、上記撹拌又は分散媒質は少なくとも１の以下の界面活性剤を含む：
アルキルアリールポリ（オキシエチレン）硫酸アルカリ塩、デキストランポリ（オキシエチレン）、ポリ（オキシプロピレン）−ポリ（オキシエチレン）−ブロック・ポリマー、エトキシル化脂肪アルコール（セトマクロゴール）、エトキシル化脂肪酸、アルキルフェノールポリ（オキシエチレン）、アルキルフェノールポリ（オキシエチレン）（ｓ）及びアルデヒドのコポリマー、ソルビタンの部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンの部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）の部分的脂肪酸エステル、ポリ（オキシエチレン）の脂肪酸エステル、サッカライドの脂肪酸エステル又はマクロゴールグリセロール・エステル、ポリビニル・アルコール、ポリ（オキシエチレン）ヒドロキシ脂肪酸エステル、多価アルコールのマクロゴール、部分的脂肪酸エステル。
【００７９】
以下の界面活性剤の１以上が好ましくは使用される：
エトキシル化ノニルフェノール、エトキシル化オクチルフェノール、アルデヒド及びオクチルフェノールポリ（オキシエチレン）のコポリマー、エトキシル化グリセロール−部分的脂肪酸エステル、エトキシル化水素化ヒマシ油、ポリ（オキシエチレン）−ヒドロキシステアレート、モル質量＜２０，０００を有するポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシエチレン）−ブロック・ポリマー。
【００８０】
特に好ましい界面活性剤は、以下のものである：
平均９〜１０エトキシ基を持つパラ−オクチルフェノール−ポリ−（オキシエチレン）（＝オクトキシノール９，１０）、平均３０／４０エトキシ基を持つパラ−ノニルフェノール−ポリ（オキシエチレン）（＝例えば、Ｅｍｕｌａｎ（商標）３０、Ｅｍｕｌａｎ（商標）４０）、平均２８エトキシ基を持つパラ−ノニルフェノール−ポリ（オキシエチレン）−硫酸−Ｎａ塩（例えば、Ｄｉｓｐｏｎｉｌ（商標）ＡＥＳ）、ポリ（オキシエチレン）グリセロール・モノステアレート（例えば、Ｔａｇａｔ（商標）Ｓ）、６００〜７００の重合度及び８５％〜９０％の加水分解度を有するポリビニル・アルコール（＝例えば、Ｍｏｗｉｏｌ（商標）４〜８８）、ポリ（オキシエチレン）−６６０−ヒドロキシステアリン酸エステル（＝例えば、Ｓｏｌｕｔｏｌ（商標）ＨＳ　１５）、ホルムアルデヒド及びパラ−オクチルフェノールポリ（オキシエチレン）のコポリマー（＝例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）ＷＲ　１３３９）、約１２，０００のモル質量及び約７０％のポリオキシエチレン割合を有するポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン−ブロック・ポリマー（＝例えば、Ｌｕｔｏｌ（商標）Ｆ１２７）、エトキシル化セチルステアリル・アルコール（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）Ａ２５）、エトキシル化ヒマシ油（＝例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）ＥＬ）。
【００８１】
重合の反応速度及びそこから得られる平均粒子サイズの設定が特に、温度に加えｐＨにより行われる、上記ｐＨは、例えば酸、例えば塩酸、リン酸、及び／又は硫酸により酸の作用及び濃度として１．０〜４．５の範囲に設定される。
【００８２】
上記反応速度に影響する他の値は、上記界面活性剤の種類及び濃度、並びに添加剤の種類及び濃度である。
【００８３】
上記モノマーを０．１〜６０％、好ましくは０．１〜１０％の濃度で酸性の水性溶液に加える。
【００８４】
上記重合及びマイクロカプセルの構築を−１０℃〜６０℃、好ましくは０℃〜５０℃の範囲、そして特に好ましくは５℃〜３５℃の温度で実施する。上記重合及びマイクロカプセルの構築の時間は２分間〜２時間にわたる。
【００８５】
上記反応が正確に行われる場合、上述の工程により、原則的にマイクロカプセル中に全ての気体が含まれうる。例として、以下のものが言及される：空気、窒素、酸素、二酸化炭素、希ガス、一酸化窒素、アルカン、アルケン、アルキン、亜酸化窒素、及びパーフルオロ炭化水素。
【００８６】
上記反応バッチをさらに増やしうる。
【００８７】
上記反応媒質からの気体充填マイクロカプセルの分離は望ましい。
【００８８】
これは、浮揚による密度差の使用した単純な方法で行われる。浮揚物質を形成する上記気体封入マイクロカプセルは上記反応媒質から容易に分離される。
【００８９】
得られた浮揚物質を、次に生理学的に適合した媒質、単純な場合には水又は生理学的に一般的な塩溶液に取り込む。
【００９０】
上記懸濁液を直接投与しうる。場合により希釈物が望ましい。
【００９１】
上記分離工程を１回以上繰り返しもする。浮揚の特定の設定により、定められた性質を有する画分を得ることができる。
【００９２】
上記マイクロカプセルのサイズ及びサイズ分布は、さまざまな処理パラメーター、例えば剪断勾配又は撹拌時間により決定される。上記気体封入マイクロカプセルの直径は、０．２〜５０μｌ、非経口物質の場合においては好ましくは０．５〜１０μｍ、そして特に好ましくは０．５〜５μｍにわたる。
【００９３】
上記懸濁液は非常に長期間にわたり安定であり、そして上記マイクロカプセルは凝集しない。
【００９４】
それでもやはり、その耐久性を、場合によりポリビニルピロリドン、ポリビニル・アルコール、ゼラチン、ヒト血清アルブミン又は当業者によく知られる他の凍結防止剤の添加後の、その後の凍結乾燥により向上させる。
【００９５】
本発明による気体封入マイクロカプセルを直接又は場合により特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質の結合のための活性化の後に使用される。
【００９６】
上記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの活性化は場合により特異的結合分子及び／又は動力学に影響を与える物質の結合を促進する。
【００９７】
例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ハイドロクロライド）による活性化を実施し、それによりＯ−アシルウレア基が結合可能な基としてポリマー位置に導入される。この目的のために、結合されるべき上記分子は場合によりアミン化される（例えば：アミン末端ポリエチレン・グリコール）。
【００９８】
特異的結合分子として、抗体、好ましくは抗ＥＤＢ−ＦＮ抗体、抗エンドスタチン抗体、抗Ｃｏｌｌ　ＸＶＩＩＩ 抗体、抗ＣＭ２０１抗体、抗Ｌ−セレクチン・リガンド抗体、例えば抗ＰＮＡｄ抗体（ＭＥＣＡ７９抗体）、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＩＣＡＭ１抗体又は内因性リガンド、好ましくはＬ−セレクチン、そして特に好ましくはキメラＬ−セレクチンを使用する。
【００９９】
動力学に影響を与える物質として、合成ポリマー、好ましくはポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）、タンパク質、好ましくはヒト血清アルブミン、及び／又は糖類、好ましくはデキストランを使用する。
【０１００】
上記特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基に直接結合させるか、スペーサー、例えばプロテインＧを介するか、あるいは気体充填マイクロカプセルへのストレプトアビジン−ビオチン結合を介したビオチン化させるかのいずれかである。
【０１０１】
上記官能性ポリアルキルシアノアクリレートを場合により結合反応前に活性化しうる。
【０１０２】
直接的な結合を行わない場合、上記スペーサー又はストレプトアビジンを最初の処理ステップにおいて上記官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基を介して上記気体封入マイクロカプセルに結合させる。上記特異的結合分子又は動力学に影響を与える物質を次に第２段階において上記スペーサーに結合させるか、あるいはビオチン化型でストレプトアビジンに結合させる。この場合においても、官能性ポリアルキルシアノアクリレートの官能基を場合によりその結合反応前に活性化しうる。
【０１０３】
実施例１：ドイツ特許出願第１９９２５３１１．０号による非官能性気体封入マイクロカプセルの多ステージ製法
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ１．５に合わせ、そして２９０．５Ｋの温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。次に７ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを、上記と同じ撹拌条件下１５分間かけて滴下して加え、そしてそれを２時間撹拌する。
【０１０４】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１０５】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして得られた懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１０６】
（ｃ）凍結乾燥
次に、４０ｇのポリビニルピロリドンをバッチ中に溶解し、上記懸濁液を５ｇ配合し、そして凍結乾燥する。
【０１０７】
（ｄ）１次分散系中のナノ粒子の粒子サイズ
上記（ａ）により得られる１次分散系を動的光散乱（デバイス：Ｎｉｃｏｍｐ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ）を用いて計測する。図１はナノ粒子の計測サイズ分布を示す。８３ｎｍの上記サイズ分布における平均直径は約２５％の多分散指数により強度加重される。
【０１０８】
実施例２：ドイツ特許出願第１９９２５３１１．０号による非官能性気体封入マイクロカプセルの多ステージ製法
（ａ）１次分散系の製造
１ｌのｐＨ２．５の１％オクトキシノールの水性溶液を直径対高さの比が約０．５であり、そして１段階のローター−ステータの混合ユニットを持つ外側の環を有するガラス反応器に移す。１４ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを５分間にわたり滴下して加え、そして３０分間撹拌して空気を含めずに上記反応混合物内に入れる。
【０１０９】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
マイクロカプセル懸濁液の製造のために、上記外側の環を６０分間その回路に適用し、そして上記１次分散系を分散させる。上記ガラス反応器中のスターラーを、上記反応混合物の単独気体供給が行われるような方法で設定する。その反応の終了後、クリーム状の層が形成される。注入目的のために、上記浮揚物をその反応媒質から分離し、そして１．５ｌの水に取り上げる。
【０１１０】
実施例３：粒子特性に対する界面活性剤濃度の影響
（ａ）１次分散系の製造
１次分散系をそれぞれ０．１％（０．５ｇ）、０．５％（２．５ｇ）、１％（５ｇ）、２％（１０ｇ）、及び１０％（５０ｇ）のｔｒｉｔｏｎ濃度を用いて実施例１（ａ）と同じように製造する。
【０１１１】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
気体封入マイクロカプセルを上記（ａ）により得られた１次分散系から構築する。１次分散系を５０ｎｍ、１００ｎｍ、及び２５０ｎｍ（動的光散乱）の平均直径を有する異なるサイズ分布を伴って使用される。
【０１１２】
上記処理を実施例１（ｂ）に記載のとおり実施する。
【０１１３】
（ｃ）１次分散系中のナノ粒子の粒子サイズ
上記１次分散系は、その粒子サイズに関連する動的光散乱の平均により特徴づけられる。図２は計測された平均粒子直径（強度加重）を示す。重合ナノ粒子のサイズは、界面活性剤濃度の上昇と共に一貫して減少する。
【０１１４】
（ｄ）気体封入マイクロカプセルの粒子サイズ
図３は、実施例３（ｂ）により製造された気体封入マイクロカプセルの体積加重サイズ分布（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの粒子カウンター、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ　７７０型）を０．８〜１０μｍの計測範囲で示す。上記初期分散の粒子サイズ分布は気体封入マイクロカプセルのサイズ分布に有意な影響を与えなかった。
【０１１５】
（ｅ）気体封入マイクロカプセルの超音波減衰
超音波場においてその性質を特徴づけるために、実施例３により製造されたマイクロカプセルの周波数依存性超音波吸収（超音波減衰）を測定する。図４は１〜２５ＭＨｚ の超音波周波数範囲における上記気体封入マイクロカプセルの吸収スペクトルを示す。それを減衰の最大値に対して標準化した。マイクロカプセルの製造に使用した１次分散系のサイズが大きくなると共に最大吸収がより高い超音波周波数に移動する。
【０１１６】
（ｆ）マイクロカプセル壁の厚さ
同一の分散条件により、同じ粒子サイズ（実施例３（ｄ））であるが、超音波場内で大きく異なる性質を有する（実施例３（ｅ））マイクロカプセルが得られる。最大吸収の周波数（実施例３（ｅ））をそのマイクロカプセル集団の共振周波数と考える場合、この方法は、超音波と気泡の相互作用における慣例の理論をもって説明され（Ｎ．ｄｅ Ｊｏｎｇ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔｓ， Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ， Ｄｉｓｓ． １９９３）、そしてマイクロカプセル壁の厚さの違いの結果であると考えられる。
【０１１７】
液体中の気泡（殻なし）の共振周波数はその気泡の直径に反比例する。
【０１１８】
【数１】
2004500397.tif 000005
【０１１９】
｛式中、
ｆｏ ＝共振周波数〔Ｓ−１〕；ｒ＝泡の半径〔ｍ〕；γ＝気体の断熱指数（Ｃｐ ／Ｃｖ ；ここでは１．４）；Ｐ＝一般的な圧力（ここでは１×１０５ Ｎ／ｍ２ ）；ｐ＝液体の密度（ここでは１×１０３ ｋｇ／ｍ３ ）｝
上述の理論に従い、マイクロカプセルについてのこの相関関係を、殻パラメーターを含む項の添加により広げる必要がある：
【０１２０】
【数２】
2004500397.tif 000006
【０１２１】
Ｅは、殻物質−−ポリマーの弾性の絶対値〔Ｎ／ｍ２ 〕であり；Ｖはポアソン比（０〜０．５の仮定値）であり、これは延伸に対する要素の体積変化の割合を説明し；そして（ｒ−ｒｉ ）はマイクロカプセルの外側と内側の半径の差−−つまり壁の厚さ〔ｍ〕である。
【０１２２】
図３（実施例３（ｄ））は、異なるサイズ分布の１次分散系を使用した場合にもそのマイクロカプセルのサイズ分布に違いがないことを示す。図４（実施例３（ｅ））は、そのマイクロカプセルの構築に使用した初期粒子のサイズが大きくなるにつれてマイクロカプセルの共振周波数がより高い超音波周波数に移ることを証明する。図３から分かる上記マイクロカプセルの平均サイズ（直径的２．５μｍ）及び図４の計測した共振周波数により、上記殻パラメーターを上記方程式（２）を用いて計算しうる。
【０１２３】
【表１】
2004500397.tif 000007
【０１２４】
上記１次分散系中のナノ粒子の平均直径に対する殻パラメーターのプロッティングは一次従属に従う（図５）。明らかに、初期粒子のサイズがそこから製造されるマイクロカプセルの壁の厚さを直接的に決定している。
【０１２５】
その傾きは弾性の絶対値Ｅ、及びＶを含む（上記：殻パラメーター方程式（３）の定義を参照のこと）。Ｖは０〜０．５の値のみに仮定されるので、１〜２×１０６ Ｎ／ｍ２ の弾性の絶対値が上記傾き（５×１０７ Ｎ／ｍ２ ）から容易に推測され、その弾性の絶対値は高分子ポリアクリル酸エステル（３×１０９ Ｎ／ｍ２ ）と硫化ゴム（３〜８×１０５ Ｎ／ｍ２ ）の間に存在する。
【０１２６】
実施例４：官能性気体封入マイクロカプセル
変法ＩＶ
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を、直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ２．５に合わせ、そして２９０．５Ｋの温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌している間に、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そして上記オクトキシノールが完全に溶解するまで撹拌する。次に７ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを、上記と同じ撹拌条件下で１５分間かけて滴下して加え、そしてそれを２時間撹拌する。
【０１２７】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状層が形成される。
【０１２８】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして製造されたマイクロカプセル懸濁液はｐＨ３．８（２４．１℃）である８．４５ｍｇ／ｍｌのポリマー含量を持つ。
【０１２９】
（ｃ）部分的な側鎖加水分解による気体封入マイクロカプセルの官能性付与
撹拌しながら、５０ｍｌの、実施例４（ｂ）によるマイクロカプセル懸濁液を１００ｍｌの、濃度６．０×１０−５ ｍｏｌ／ｌ（ｃ１）、６．６×１０−４ ｍｏｌ／ｌ（ｃ２）、及び７．２×１０−３ ｍｏｌ／ｌ（ｃ３）の水酸化ナトリウム溶液と混合する。反応バッチ中で、７．７（ｃ１）、１０．６（ｃ２）、及び１１．７（ｃ３）のｐＨ値を生じる。約２時間の反応時間の後、塩酸を用いてｐＨ３に合わせる。
【０１３０】
（ｄ）気体封入マイクロカプセルの粒子サイズ
図６は上記気体封入マイクロカプセルの体積加重サイズ分布（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの粒子カウンター、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ　７７０型）を０．８〜１０μｍの計測範囲で示す。最大の水酸化ナトリウム溶液濃度（ｃ３）でだけ観察されるサイズ分布がわずかに変化した。これはその壁の厚さの減少によると考えられる。本明細書中に記載した条件下、凝集及び粒子濃度の変化は観察されない。
【０１３１】
（ｅ）実施例４によるマイクロカプセルのインビトロにおける超音波効果
超音波場においてそのマイクロカプセルの性質を特徴づけるために、上記マイクロカプセルの周波数依存性超音波吸収（超音波減衰）を測定する。図７は、１〜２０ＭＨｚ の超音波周波数範囲における上記気体封入マイクロカプセルの吸収スペクトルを示す。それを減衰の最大値に対して標準化した。実施例４（ｃ１）及び４（ｃ２）によるマイクロカプセルについての吸収スペクトルは、実施例４（ｂ）による未処理のマイクロカプセルに比べより低い超音波周波数に緩やかに変化する。４（ｃ３）（最も強い水酸化ナトリウムによる表面処理）によるマイクロカプセルについて、最大吸収の範囲はより低い超音波周波数に明らかに変化する。この変化は壁の厚さの減少の結果であると考えられ、そして粒子サイズ分布に関する結果に対応する。
【０１３２】
図７に示される相対的な吸収スペクトルに加え、診断上関係する測定周波数である５ＭＨｚ について超音波減衰の絶対値を図８に示しもする。この比較は、その超音波効果パラメーターが官能性付与の程度（上記水酸化ナトリウム溶液の濃度）が増すにつれて有意に増大することを示している。
【０１３３】
全ての計測を０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００中、２．５×１０６ 粒子／ｍｌの一定のマイクロカプセル濃度で行った。
【０１３４】
実施例６：官能性気体封入マイクロカプセル
変法ＩＩＩ
（ａ）マイクロカプセル懸濁液の製造
７ｌの水性１％オクトキシノール溶液をｐＨ２．５で２０ｌ反応器に入れ、そして泡の強力な形成により単独気体供給が実施されるように高い剪断勾配でローター−ステータ−ミキサーにより混合する。１００ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを素速く（＜１分）加え、そして分散させる。それを単独気体供給により６０分間重合させ、それにより、気体封入マイクロカプセルを形成する。分液漏斗により、浮揚物質を分離し、浮上分離液を排水し、そしてその浮揚物質を３ｌの水性０．０２％オクトキシノール溶液により再懸濁する。こうして得られたマイクロカプセル懸濁液は、９．４６ｍｇ／ｍｌのポリマー含量、０．９４３ｇ／ｍｌの密度、及び３．５のｐＨを有する。
【０１３５】
（ｂ）部分的な側鎖加水分解による気体封入マイクロカプセルの官能性付与
２４１８ｇ（ｂ１）又は２５００ｇ（ｂ２）の（ａ）によるマイクロカプセル懸濁液を２３９ｇ（ｂ１）又は５０１ｇ（ｂ２）の濃度８×１０−２ ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液と撹拌しながら混合する。上記反応バッチ中で１１．８（ｂ１）又は１２．１（ｂ２）のｐＨ値を生じる。それを室温で２０分間撹拌する。次に、そのｐＨを１Ｎ塩酸により３．５に合わせる。
【０１３６】
（ｃ）気体封入マイクロカプセルの粒子サイズ
図９は、上記気体封入マイクロカプセルの体積加重サイズ分布（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの粒子カウンター、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ　７７０型）を示し、これは０．８〜１０μｍの計測範囲で示される。
【０１３７】
（ｄ）凍結乾燥及びブタノール含量の測定
官能性付与の証明
注入目的のために、実施例６（ａ）及び（ｂ）による懸濁液を約４ｍｇ／ｍｌのポリマー含量まで水により希釈する。次に、各バッチにおいて、１０％のポリビニルピロリドン濃度に合わせ、その懸濁液を１０ｇまで配合し、そして凍結乾燥する。
【０１３８】
ガス・クロマトグラフィー（ヘッド−スペース法；キャリア・ガス：ヘリウム；固定相：ＤＢ６２４；デバイス：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＨＳ４０）により、１−ブタノール含量を測定する。実施例６（ａ）による非官能性付与マイクロカプセルに比べ、実施例６（ｂ１）による官能性マイクロカプセルについては５倍高い値が検出され、そして実施例６（ｂ２）により２０倍の１−ブタノールが検出された。
【０１３９】
【表２】
2004500397.tif 000008
【０１４０】
（ｅ）表面電荷測定のための拮抗滴定
官能性付与の証明
電荷測定をＭｕｅｔｅｋ滴定装置ＰＣＤ０２を用いて実施する。サンプルを４の希釈物（０．３％＜ポリマー含量＜１．２％）において、０．１ｍｍｏｌの濃度のＰ−ＤＡＤＭＡＣ溶液により電荷の中立まで滴定する。電荷密度を個々の計測の補償直線（与えられたポリマー含量でのＰ−ＤＡＤＭＡＣ溶液の消費量）、及びそのマイクロカプセルの平均粒子半径から計算する。図１０において、その計測結果を示す。実施例６（ａ）による非官能性マイクロカプセル懸濁液について、この方法により明らかな電荷密度は測定されない。実施例６（ｂ）による官能性マイクロカプセルについて、４．２μＣ／ｃｍ２ （ｂ１）又は５．１μＣ／ｃｍ２ （ｂ２）の表面電荷密度が上記補償直線の傾きから得られる。上記電荷密度は、上記反応における水酸化ナトリウム溶液の濃度が高くなるにつれ増加する。実施例６（ａ）による非官能性マイクロカプセルについて、明らかな傾きを持たない補償直線が作製される。
【０１４１】
（ｆ）希釈安定性
注入目的のために、実施例６（ａ）及び（ｂ）による懸濁液のマイクロカプセル濃度を水により１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子（≧１μｍ）に合わせる（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの粒子カウンター、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ　７７０型）。希釈安定性を検討するために、それぞれの場合において、１ｍｌの上記懸濁液を容量を増やすための等張の一般的塩溶液により希釈し、そして３０分間の耐用年数（その間ゆるやかに撹拌）の後、マイクロカプセルの凝集について視覚的に検討する。
【０１４２】
上記非官能性マイクロカプセルが５００％（１ｍｌのマイクロカプセル懸濁液＋５ｍｌの等張の一般的な塩溶液）までの容量増加の後にすでに明らかに凝集する傾向がある一方で、上記官能性マイクロカプセルは２０００％（１ｍｌのマイクロカプセル懸濁液＋２０ｍｌの等張の一般的な塩溶液）までの容量増加の後でもまだ凝集を含まない。
【０１４３】
（ｇ）インビトロにおける分解
注入目的のために、上記懸濁液のマイクロカプセル濃度を水により１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子（≧１μｍ）に合わせる（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｍｐａｎｙの粒子カウンター、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ　７７０型）。分解動力学の検討のために、曇りの経時計測を７９０ｎｍの波長（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｏｍｐａｎｙ　ＵＶ−２４０１ＰＣの分光器）及び２５℃で行う。この目的のために、０．５ｍｌのそれぞれの配合物をｐＨ１１に合わせるために２．０ｍｌの水酸化ナトリウム溶液（濃度：１．２５×１０−３ ｍｏｌ／ｌ）により計測セル中で直接希釈する。６０秒後、計測を始める。例として、図１１が実施例６（ａ）（非官能性）及び実施例６（ｂ２）（官能性）により製造された気体封入マイクロカプセルについての結果を示す。
【０１４４】
上記未処理サンプルに比べ、上記官能性マイクロカプセルのドエル時間を約７５％まで減少させ、そして最大分解速度（変曲点の上昇）を０．３７％透過／秒（非官能性）から０．８６％透過／秒（官能性）まで高める。
【０１４５】
（ｈ）インビボにおける超音波効果
ビーグル（体重約１２ｋｇ）を麻酔し（吸入麻酔空気＋２〜３％エンフルレン；自然呼吸）、そして心臓の超音波観察の準備をする。その観察をＡＴＬ社の超音波デバイス（ＵＭ９型、Ｌ１０／５トランスデューサ）を用いて、低、中、及び高透過振幅についてスペクトル・ドップラー・モードで行う。
【０１４６】
それぞれの場合において、試験動物は、実施例６（ａ）（非官能性）及び実施例６（ｂ２）（官能性）により製造された試験物質の静中投与を受ける。
【０１４７】
基準物質として、ポリビニルピロリドンを凍結防止剤として用いたＷＯ９３／２５２４２の実施例２３と同じように製造した造影剤を使用する。
【０１４８】
使用される用量は全ての試験に関して体重１ｋｇ当たり３×１０７ 粒子とした。
【０１４９】
図１２は積分ドップラー強度（強度−時間曲線下の面）を示し、そして図１３は基準物質と試験物質の超音波造影時間を示す。
【０１５０】
これは、実施例６（ｂ２）による官能性気体封入マイクロカプセルが従来技術の非官能性気体封入マイクロカプセルより明らかに良好な造影特性を有することを認識させる。これは高い積分強度と診断時間ウインドの延長で明らかである。
【０１５１】
実施例６（ｂ２）による官能性気体封入マイクロカプセルの効果値を５０％まで上昇させ、そしてその造影時間を約２倍まで延長する。
【０１５２】
実施例７：
官能性気体封入マイクロカプセル
変法Ｉ
ｐＨ２．５の７ｌの水性１％オクトキシノール溶液を２０ｌ反応器に入れ、そして泡の強力な形成により単独気体供給が実施されるように高い剪断勾配でローター−ステータ−ミキサーにより分散させる。７５ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステル及び１５ｇのシアノアクリル酸の混合物を素速く（＜１分）加え、そして分散させる。それを単独気体供給下で６０分間重合させ、それにより気体封入カプセルを形成する。分液漏斗により、浮揚物質を分離し、浮上分離液を排水し、そしてその浮揚物質を３ｌの水性０．０２％オクトキシノール溶液により再懸濁する。こうして得られた懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の大きさの気体封入マイクロカプセルを含む。
【０１５３】
実施例８：官能性気体封入マイクロカプセル
変法ＩＩ
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ１．５に合わせ、そして２９０．５Ｋの温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。次に、上記と同じ撹拌条件下１５分間かけて６．０ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを１．０ｇのシアノアクリル酸と一緒に滴下で加え、そしてさらに２時間撹拌する。得られた１次分散系を動的光散乱（デバイス：Ｎｉｃｏｍｐ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ）の手法により計測し、そしてそれは５０〜１２０ｎｍの範囲のナノ粒子を示す。
【０１５４】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１５５】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。そうして得られたマイクロカプセル懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１５６】
（ｃ）凍結乾燥
４０ｇのポリビニルピロリドンをバッチ中に溶解し、上記懸濁液を５ｇ配合し、そして凍結乾燥する。
【０１５７】
実施例９：官能性気体封入マイクロカプセル
変法Ｖ
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ１．５に合わせ、そして２９０．５Ｋの温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。次に、上記と同じ撹拌条件下１５分間かけて７ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを滴下で加え、そしてさらに２時間撹拌する。
【０１５８】
（ｂ）１次分散系の官能性付与
上記１次分散系において、撹拌しながら１６５ｍｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液よりｐＨ１１に合わせ、そしてそれを室温で２０分間撹拌する。次に、１３ｍｌの０．１Ｎ塩酸によりｐＨ３に合わせる。
【０１５９】
（ｃ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記官能性１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度、約毎分２０，５００）。上記分散系により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１６０】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして得られた懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１６１】
実施例１０：官能性、気体封入マイクロカプセルへのＨＳＡの結合
実施例６（ｂ２）によるマイクロカプセル懸濁液を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からの少なくとも５回の浮揚により精製する。１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子の濃度を有する上記精製マイクロカプセル懸濁液１ｍｌを１０μｌの１０％ＨＳＡ溶液と混合し、そして４℃で６０分間撹拌する。次に、１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）を加え、そして０．１Ｎ塩酸を用いてそのｐＨを６．５に合わせる。撹拌しながら、インキュベーションを４℃で約１６時間行う。
【０１６２】
ＨＳＡを結合させた上記気体封入マイクロカプセルを結合していないＨＳＡ及び副産物の浮揚の繰り返しにより分離する。５７％の量のタンパク質が上記マイクロカプセルに結合された（ＵＶ分光法）。
【０１６３】
実施例１１：官能性、気体封入マイクロカプセルへのポリエチレン・グリコールの結合
実施例６（ｂ２）によるマイクロカプセル懸濁液を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からの少なくとも５回の浮揚により精製する。１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子の濃度を有する上記精製マイクロカプセル懸濁液１ｍｌを１０μｌのアミノ末端ポリエチレン・グリコールの１０％溶液（ＨＯ−ＰＯＥ−ＮＨ２ ／３０００ダルトン）と混合し、そして４℃で６０分間撹拌する。次に１０ｍｇのＥＤＣを加え、そして０．１Ｎ塩酸を用いてそのｐＨを６．５に合わせる。撹拌しながら、インキュベーションを４℃で約１６時間行う。ＨＯ−ＰＯＥ−ＮＨ２ を結合させた上記気体封入マイクロカプセルを結合していないＨＯ−ＰＯＥ−ＮＨ２ 及び副産物の浮揚の繰り返しにより分離する。使用したＨＯ−ＰＯＥ−ＮＨ２ の７０％が上記マイクロカプセルに結合された（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅ ｍｉｔｔｅｌｓ Ｉｏｄ−ＰＥＧ Ｋｏｍｐｌｅｘ〔Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｉｏｄｉｎｅ−ＰＥＧ Ｃｏｍｐｌｅｘ〕、Ｇ．Ｅ．Ｃ． Ｓｉｍｓ， Ｔ．Ｊ．Ａ． Ｓｎｏｐｅ， Ａｎｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７， ６０−６３ （１９８０）による）。
【０１６４】
実施例１２：官能性、気体封入マイクロカプセルへのＬ−セレクチンの結合
実施例６（ｂ２）によるマイクロカプセル懸濁液を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からの少なくとも５回の浮揚により精製する。１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子の濃度を有する上記精製マイクロカプセル懸濁液１ｍｌを１０ｍｍｏｌの酢酸、ｐＨ４．０中で再緩衝化し、そして０．１Ｍ　ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化する。次に、それを０．２５ｍｇのＧタンパク質（５倍過剰）と一緒に室温で１時間インキュベートする。１Ｍエタノールアミンと一緒に１５分間インキュベートすることにより上記反応を停止させる。
【０１６５】
Ｇタンパク質を結合させた上記気体封入マイクロカプセルを最大５００ｇでの遠心分離の手法による洗浄の繰り返しにより精製する。精製した気体封入Ｇタンパク質結合マイクロカプセルを１００μｇのＬ−セレクチン−ｌｇ−キメラと一緒に一晩インキュベートする。
【０１６６】
上記Ｌ−セレクチン量の５０％が上記マイクロカプセルに結合された（ＦＡＣＳ計測：抗セレクチン抗体による飽和系）。
【０１６７】
実施例１３：続いてビオチン−金粒子への連結を伴う、官能性、気体封入マイクロカプセルへのストレプトアビジンの結合
実施例６（ｂ２）によるマイクロカプセル懸濁液を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からの少なくとも５回の浮揚により精製する。１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子の濃度を有する上記精製マイクロカプセル懸濁液１ｍｌを１ｍｌの２％ストレプトアビジン溶液と混合し、そして４℃で６０分間撹拌する。次に、１０ｍｇのＥＤＣを加え、そして０．１Ｎ塩酸を用いてそのｐＨを６．５に合わせる。撹拌しながらインキュベーションを４℃で約１６時間行う。ストレプトアビジンを結合させた上記気体封入マイクロカプセルを結合していないタンパク質及び副産物の浮揚の繰り返しにより分離する。
【０１６８】
５００μｌのこうして精製したマイクロカプセル−ストレプトアビジン構築物を、１７〜２３ｎｍの平均直径を有するビオチン−アルブミン−金粒子（Ｓｉｇｍａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の分散系５００μｌと室温で混合する。連結の達成を電子顕微鏡（透過型）の手法により確認する（図１４）。
【０１６９】
実施例１４：窒素封入マイクロカプセル
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を、直径対高さの比が０．５の１ｌ窒素をフラッシュしたガラス反応器に窒素対向流により入れ、そして１Ｎ塩酸を加えることでｐＨ１．５に合わせ、そして２９０．５Ｋの反応器温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。ガラス管を通して、窒素を２４時間その溶液中に送る。
【０１７０】
次に、７ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを同じ撹拌条件下窒素対向流中に１５分間にわたり滴下で加え、そしてそれをさらに２時間撹拌する。
【０１７１】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間、窒素対向流中に分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１７２】
上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる、この水をあらかじめアルゴンにより飽和しておいた。次に、アルゴン対向流中、それぞれ１０ｇまでを静かに注ぎ、そして気体が漏れないように密封をする。こうして得られた懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１７３】
（ｃ）窒素封入の検出
窒素の検出を、ガラス容器に直接入っている上記マイクロカプセル懸濁液の上のガラス・チャンバー中でラマン分光法（デバイス：Ｄｉｌｏｒ　Ｌａｂｒａｍ）を用いて実施する。この目的のために、最初の計測を２２００〜２４００ｃｍ−１及び５０〜１５０ｃｍ−１（ヌル値）の範囲で行なう。次に、上記マイクロカプセルを超音波（３０分間の超音波浴：デバイス：Ｂａｎｄｅｌｉｎ　Ｓｏｎｏｒｅｘ）を用いて破壊し、そして再び計測する。上記マイクロカプセルを破壊した後、２３００ｃｍ−１でＮ２ 振動バンド及び５０〜１５０ｃｍ−１でＮ２ 特異的な旋回バンドがはっきり見られる。
【０１７４】
実施例１５：官能性、気体封入マイクロカプセル
官能モノマーがグリコシジルメタクリレート
（ａ）初期分散の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加により、ｐＨ１．５に合わせ、そして２９０Ｋの反応器温度に合わせる。無水窒素雰囲気下、６．０ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを１．０ｇのグリシジルメタクリレート（２，３−エポキシプロピルメタクリレート）と混合し、そしてさらに１００ｍｇのＡＩＢＮ（アゾ−ビス−イソブチロニトリル）をその混合物中に溶解した。
【０１７５】
次に、その混合物を酸性オクトキシノール溶液に１５分間かけて滴下で加え、その間−−単独気体供給することなしに−−プロペラ・スターラーにより撹拌し続ける、そしてそれを３１８Ｋでさらに２４時間撹拌する。得られた１次分散系を動的光散乱（デバイス：Ｎｉｃｏｍｐ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ）の手法により計測し、そしてそれは３０〜２００ｎｍの範囲のナノ粒子を示す。
【０１７６】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１７７】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして得られたマイクロカプセル懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１７８】
実施例１６：官能性、気体封入マイクロカプセル
官能モノマーが４−アミノスチレン
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ１．５に合わせ、そして２８３Ｋの反応器温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。６．０ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステルを１．０ｇの４−アミノスチレンと混合し、そして上記酸性オクトキシノール溶液に１５分間かけて滴下で加える。この間−−単独気体供給することなしに−−プロペラ・スターラーにより撹拌し続ける。上記反応混合物を実験室のＵＶランプにより照らし、そして２８３Ｋでさらに２４時間撹拌する。得られた１次分散系を動的光散乱（デバイス：Ｎｉｃｏｍｐ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ）の手法により計測し、そしてそれは５０〜２００ｎｍの範囲のナノ粒子を示す。
【０１７９】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。
【０１８０】
注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして得られたマイクロカプセル懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１８１】
実施例１７：官能性、気体封入マイクロカプセル
官能モノマーがＩｎｉｓｕｒｆポリエチレン・グリコール・アゾ重合開始剤（ＰＥＧＡ２００）
（ａ）１次分散系の製造
注入目的のために、５００ｍｌの水を直径対高さの比が０．５の１ｌのガラス反応器に入れ、そして１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ１．５に合わせ、そして２９０Ｋの反応器温度に合わせる。プロペラ・スターラーにより撹拌しながら、５．０ｇのオクトキシノールを加え、そしてそのオクトキシノールを完全に溶解するまで撹拌する。１．０ｇのポリエチレン・グリコール・アゾ重合開始剤（〔ＮＣ（ＣＨ３ ）２ ＣＯＯ（ＣＨ２ ＣＨ２ Ｏ）５ ）Ｈ〕２ ）（Ｔａｕｅｒ， Ｋ．；Ｐｏｌｙｍ． Ａｄｖ． Ｔｅｃｈｎ． ６， ４３５ （１９９５））を６．０ｇのシアノアクリル酸ブチル・エステル中に室温で溶解させる。
【０１８２】
次に、その混合物を酸性オクトキシノール溶液に１５分間かけて滴下で加え、その間−−単独気体供給することなしに−−プロペラ・スターラーにより撹拌し続ける、そしてそれを３１８Ｋでさらに２４時間撹拌する。得られた１次分散系を動的光散乱（デバイス：Ｎｉｃｏｍｐ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｅｒ）の手法により計測し、そしてそれは３０〜２００ｎｍのナノ粒子を示す。
【０１８３】
（ｂ）マイクロカプセル懸濁液の製造
上記１次分散系をＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ（例えば、ＩＫＡ、Ｔ２５型）を用いて高い剪断勾配で２時間分散させる（上記Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘの空運転速度は約毎分２０，５００）。上記分散により、上記処理媒質の単独気体供給を、泡の激しい形成の結果として実施する。
【０１８４】
上記反応の終了後、気体封入マイクロカプセルのクリーム状の層が形成される。注入目的のために、上記浮揚物質を上記反応媒質から分離し、そして３７５ｍｌの水に取り上げる。こうして得られたマイクロカプセル懸濁液は０．５〜１０μｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙのレーザー回折計、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ型）の範囲のマイクロカプセルを含む。
【０１８５】
実施例１８：官能性、気体封入マイクロカプセルへのＭＥＣＡ７９抗体の結合　実施例６（ｂ２）によるマイクロカプセル懸濁液を０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からの少なくとも５回の浮揚により精製する。１ｍｌ当たり５×１０９ 粒子の濃度を有する上記精製マイクロカプセル懸濁液１ｍｌを１０ｎｍの酢酸、ｐＨ４．５中で再緩衝化し、そして０．１Ｍ　ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化する。次にそれを０．２５ｍｇのストレプトアビジン（５倍過剰）と一緒に室温で１時間インキュベートする。１Ｍエタノールアミンと一緒に１５分間インキュベートすることにより上記反応を停止させる。
【０１８６】
ストレプトアビジンを結合させた上記気体封入マイクロカプセルを最大５００ｇでの遠心分離の手法による洗浄の繰り返しにより精製する。精製した気体封入ビオチン結合マイクロカプセルを１ｍｇのビオチン化ＭＥＣＡ７９抗体と一緒に１時間インキュベートし、次に洗浄する。対照マイクロカプセルをビオチン化アイソタイプＩｇＭ抗体（クローンＲ４−２２）を用いて同様に製造した。使用した抗体の５０％の量が上記マイクロカプセルに結合した（ＦＡＣＳ計測：抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ抗体による飽和系）。
【０１８７】
上記ＭＥＣＡ７９抗体は「末梢節アドレシン（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｎｏｄｅ　ａｄｒｅｓｓｉｎ）」、つまり末梢及び腸間膜リンパ節の高内皮性小静脈にのみ存在する構成要素として発生するリガンド群を検出する。
【０１８８】
実施例１９：末梢及び腸間膜リンパ節へのＭＥＣＡ７９抗体−ポリマー・マイクロカプセルの特異的濃縮のインビボ検出及び超音波検出
ＮＭＲＩマウスに１００μｌの実施例１８のＭＥＣＡ７９抗体ポリマー・マイクロカプセル懸濁液を等張水性分散系として静中注射した（マウス体重１ｋｇ当たり１０７ 粒子）。対照マウスは匹敵する量のアイソタイプＩｇＭ抗体ポリマー・マイクロカプセル懸濁液を受けた。３０分後、上記の動物を屠殺した。末梢及び腸間膜リンパ節、脾臓、並びに腎臓を取り出し、そしてゲル・ベッドをイメージング・ファントムとしてはめ込んだ。上記マイクロカプセルの検出をハーモニック・カラー・ドップラー・モードにおける上記ファントムの走査により実施した。両動物群（ＭＥＣＡ７９及びアイソタイプ対照）の脾臓において、マイクロカプセルの定量的に比較しうるシグナルを検出し、これは脾臓マクロファージが非特異的な様式で造影剤を取り込んでいることを示す。上記腎臓において、マイクロカプセルのシグナルは検出されなかった。しかしながら、上記末梢及び腸間膜リンパ節において、マイクロカプセルのシグナルは上記ＭＥＣＡ７９抗体動物群でのみ検出されたが（図１５Ａ）、しかし上記アイソタイプ対照動物群では検出されなかった（図１５Ｂ）−−上記ＭＥＣＡ７９抗体−マイクロカプセル構築物の特異的濃縮についての検出。
【０１８９】
実施例２０：官能性気体封入マイクロカプセルへの抗マウスＣＤ１０５抗体の結合
抗マウスＣＤ１０５抗体を実施例１８と同様に官能性気体封入マイクロカプセルに結合させた。
【０１９０】
実施例２１：腫瘍への抗マウスＣＤ１０５抗体ポリマー・マイクロカプセルの特異的濃縮のインビボ検出及び超音波検出
実施例２０による抗マウスＣＤ１０５抗体ポリマー・マイクロカプセル懸濁液を無毛マウスによるＦ９腫瘍モデルにより検討した。無麻酔状態で上記試験物質を２匹の腫瘍担持無毛マウスに体重１ｋｇ当たり２．１×１０７ 粒子の用量で単回注入の形で静中投与した。２匹の対照マウスは同じ用量で実施例１３によるマイクロカプセル−ストレプトアビジン構築物を受けた。３０分後、上記動物を屠殺した。腫瘍を取り出し、そしてＡＴＬ　Ｃｏｍｐａｎｙの超音波デバイス（ＵＭ９型、Ｌ１０−５トランスデューサー）を用いて高い音波振幅の使用によるハーモニック・カラー・ドップラーにより水槽中で超音波的に生体外で調べた。
【０１９１】
図１６Ｂはマウスの腫瘍におけるカラー・コーディングを示し、上記カラー・コーディングは照射を受けた実施例２０による気体封入マイクロカプセルから生じる。図１６Ａはマイクロカプセルにより引き起こされ、そして上記対照物質を示すカラー・シグナルを含まない。これは腫瘍への抗ＣＤ１０５抗体ポリマー・マイクロカプセル構築物の特異的濃縮の検出である。
【０１９２】
実施例２２：官能性、気体封入マイクロカプセルへの抗マウスＩＣＡＭ−１抗体の結合
抗マウスＩＣＡＭ−１抗体を実施例１８と同様に官能性気体封入マイクロカプセルに結合させた。対照マイクロカプセルをビオチン化アイソタイプＩｇＧ抗体の使用により同様に製造した。
【０１９３】
実施例２３：脳及び脊髄への抗マウスＩＣＡＭ−１抗体ポリマー・マイクロカプセルの特異的濃縮のインビボ検出及び超音波検出
実施例２２による抗マウスＩＣＡＭ−１抗体ポリマー・マイクロカプセルをマウスの実験的自己免疫脊髄炎モデル（ＥＡＥ）において検討した。無麻酔状態で上記試験物質を２匹のマウスに体重１ｋｇ当たり１×１０９ 粒子の用量で単回注入の形で静中投与した。２匹の対照マウスは匹敵する量のアイソタイプＩｇＧ抗体ポリマー・マイクロカプセル懸濁液を受けた。
【０１９４】
４時間後、上記の動物を屠殺した。脳及び脊髄を取り出し、そしてＡＴＬ　Ｃｏｍｐａｎｙの超音波デバイス（ＵＭ９型、Ｌ１０／５トランスデューサー）を用いて高い音波振幅の使用によるハーモニック・カラー・ドップラーにより水槽中で超音波的に生体外で調べた。図１７Ｂ及び図１８はＥＡＥマウスの脳及び脊髄／小脳におけるカラー・コーディングを示し、このカラー・コーディングは照射を受けた実施例２２による気体封入カプセルから生じる。図１７Ａ及び図１８、２Ａはマイクロカプセルにより引き起こされ、そして上記対照物質を示すカラー・シグナルを含まない。
【０１９５】
（図１８、２：上記脊髄／小脳走査の断面画像の合成画像；図１８、１：上記脊髄／小脳の肉眼的解剖画像）。
【０１９６】
これは、脳及び脊髄への上記抗マウスＩＣＡＭ−１抗体ポリマー・マイクロカプセル構築物の特異的濃縮の検出である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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