(57)【要約】【課題】骨が採取されてから包装及び貯蔵の操作をへてインプラント化のときまで、凍結乾燥された骨に比べて、骨の生体力学的性質即ちその靭性及び／または寸法をより良く維持する、インプラント化を目的とするモノリシック骨をその包装及び貯蔵前に脱水する方法の提供。【解決手段】モノリシック骨と少なくとも１種の脱水用液体とを接触させ；モノリシック骨を凍結乾燥することなく脱水し；そして脱水した骨を包装することからなるモノリシック骨の脱水方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インプラント化を目的とするモノリシック骨の脱水次の包装及び貯蔵中に生体力学的性質の少なくとも１つを維持する該骨の脱水方法であって、方法が
モノリシック骨と少なくとも１種の脱水用液体とを接触させ；
モノリシック骨を凍結乾燥することなく脱水し；そして
脱水した骨を包装する
ことからなることを特徴とするモノリシック骨の脱水方法。
【請求項２】
脱水用液体を加圧下浸出することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３】
骨及び脱水用液体を超音波で処理することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項４】
低圧雰囲気の存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１の方法。
【請求項５】
交代に変化する真空と正圧との存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１の方法。
【請求項６】
交代に変化するレベルの正圧の存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１の方法。
【請求項７】
インプラント化直前の脱水骨と再水和量の少なくとも１種の再水和溶液とを接触させて骨を再水和することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項８】
脱水用液体が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、エチルブタノール、アセトニトリル、ピリジン、工業用メチル化アルコール、等級に分かれた一連の脱水剤、組織学的溶液、Ｆｌｅｘ　１００（商標）、ジメチルスルホキシド、低分子ケトン、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、塩化エチレン、１２個より少ない炭素の直鎖炭化水素、ヘキサン、ペンタン、低分子量アルケン、エステル、エーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル、クラウンエーテル、アルデヒド、アルデヒドを含む溶液、ホルムアルデヒド、ホルマリン、超臨界流体、液体二酸化炭素、液体硫化水素、及び上記液体の２種以上の混合物からなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項９】
再水和溶液が、滅菌水、生理食塩水、生理学的緩衝塩水、デキストロース溶液、湿潤剤、内科的／外科的に有用な１種以上の物質及び抗生物質溶液からなる群から選ばれる請求項７の方法。
【請求項１０】
内科的／外科的に有用な１種以上の物質が、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ベータ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）（ＩＧＦ−２）、及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）からなる群の少なくとも１員である請求項９の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法により得られることを特徴とするモノリシック骨。
【請求項１２】
請求項７の方法により得られることを特徴とするモノリシック骨。
【請求項１３】
請求項８の方法により得られることを特徴とするモノリシック骨。
【請求項１４】
請求項９の方法により得られることを特徴とするモノリシック骨。
【請求項１５】
請求項１０の方法により得られることを特徴とするモノリシック骨。
【請求項１６】
靭性が、凍結乾燥されたモノリシック骨の同等な試料のそれより少なくとも約５％大きい請求項１１の骨。
【請求項１７】
靭性が、凍結乾燥されたモノリシック骨の同等な試料のそれより少なくとも約１０％大きい請求項１１の骨。
【請求項１８】
靭性が、凍結乾燥されたモノリシック骨の同等な試料のそれより少なくとも約１５％大きい請求項１１の骨。
【請求項１９】
脱水及び次の包装中、インプラント化を目的とするモノリシック骨の靭性を維持しそして骨の貯蔵中その靭性を保持する該骨の脱水方法であって、方法が
骨と少なくとも１種の生体適合性脱水用液体とを接触させ；
脱水用液体を除き；そして
脱水した骨を包装する
ことからなることを特徴とするモノリシック骨の脱水方法。
【請求項２０】
脱水用液体を加圧下浸出することをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
交代に変化するレベルの正圧の存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２２】
骨及び脱水用液体を超音波で処理することをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２３】
低圧雰囲気の存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２４】
交代に変化する真空と正圧との存在下骨と脱水用液体とを接触させることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２５】
脱水用液体が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、エチルブタノール、アセトニトリル、ピリジン、工業用メチル化アルコール、等級に分けた一連の脱水剤、組織学的溶液、Ｆｌｅｘ　１００（商標）、ジメチルスルホキシド、低分子ケトン、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、塩化エチレン、１２個より少ない炭素の直鎖炭化水素、ヘキサン、ペンタン、低分子量アルケン、エステル、エーテル、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル、クラウンエーテル、アルデヒド、アルデヒドを含む溶液、ホルムアルデヒド、ホルマリン、超臨界流体、液体二酸化炭素、液体硫化水素、及び上記液体の２種以上の混合物からなる群から選ばれる請求項１９の方法。
【請求項２６】
脱水段階が、骨と等級に分けた一連の脱水用液体とを接触させることにより、または骨にマイクロ波のエネルギーを与えることにより、または周囲圧力または大気圧下の圧力で骨を加熱することにより、または乾燥剤の存在または不存在下大気圧下の圧力を骨にかけることにより、または前記の１種以上の組み合わせにより実施される請求項１９の方法。
【請求項２７】
脱水用液体の除去の段階が、骨にマイクロ波のエネルギーを与えることにより、または周囲圧力または大気圧下の圧力で周囲温度に骨をおくことにより、または周囲圧力または大気圧下の圧力で骨を加熱することにより、または乾燥剤の存在または不存在下大気圧下の圧力を骨にかけることにより、または前記の１種以上の組み合わせにより実施される請求項１９の方法。
【請求項２８】
篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、頚椎、胸椎、腰椎、仙骨、肋骨、胸骨、鎖骨、肩胛骨、上腕骨、橈骨、尺骨、手根骨、中手骨、指骨、腸骨、座骨、恥骨、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋、踵骨、足根骨及び中足骨からなる群から選ばれる少なくとも１つの骨を修復するための請求項１１の骨を使用する方法であって、方法が
外科部位を露出し、
外科部位に請求項１１の骨をインプラントし、そして
外科部位を閉じる
ことをからなることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨移植に関し、そして凍結乾燥にともなう寸法の変化を減少させるとともに骨に結合した水を除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨移植は、骨折、癒着不能を治療し、そして関節固定を誘導するのに広く使用されている。自家海綿骨は、移植者の１つの部位からとられそして移植者の他の部位にインプラントされ、多くの人々により、最も有効な骨移植であると考えられている。自家海綿骨は、骨の治癒レスポンスの分布を支持する足場を提供する。自家海綿骨は、また、新しい軟骨または骨を形成する結合組織プロジェニター細胞を提供する。しかし、自家細胞骨の採取は、傷、血液の損失、痛み、長い手術時間及びリハビリテーションの時間及び感染のリスクを含む、高いコスト及び合併症を生ずる。その上、いくつかの臨床の設定では、移植部位により要求される移植の体積は、利用できる自家移植の体積を超える。従って、自家移植に代わりうるものが、骨移植の方法の合併症及びコストを低下させる試みにおいて開発されてきている。
【０００３】
同種移植骨または異種移植骨の使用は、ヒト及び動物の両者の医療において周知である。非特許文献１参照。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら「Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ」３２３、６６−７５ページ（１９９６）
【０００５】
特に、移植された骨は、支持具を提供し、治癒を促進し、体腔を満たし、骨の要素例えば椎体を分離し、融合を促進しそして骨折の部位を安定化することが知られている。さらに最近では、加工された骨が、新しい外科的応用に使用される形状に開発されてきているか、または非生物学的由来材料から組織学的に製造されたインプラント用の新しい材料として開発されてきている。
【０００６】
病気にかかったまたは失われた部分を置換するインプラント化を目的とする保存された骨が普通に使用されているため、この骨の適用の成功は、その生物学的性質の正しい知識並びにそれがうけるストレスに抵抗するその能力に基づく。ミネラル化骨が移植に使用されるとき、それは、主に、その固有の強さ即ち受納部位におけるその負荷に耐える能力のためである。インプラント化における骨移植の生体力学的性質は、それから骨が採取される特定の部位；ドナーの年令、性別及び生理学的特徴、並びにインプラント前の骨の調製、保存及び貯蔵するために選ばれる方法を含む、多くの因子により決定される。その保存及び貯蔵について選ばれる方法による骨の生体力学的性質の変更のさらに詳細な説明は、非特許文献２に見いだされる。
【０００７】
【非特許文献２】Ｐｅｌｋｅｒら「Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．１７４、５４−５７（１９８３）
【０００８】
しかし、加工の必要性（例えば、移植片を後日の使用のために保存しそして免疫原性の細胞性物質を除くこと）は、骨の靭性を維持しなければならないことと矛盾する。
【０００９】
インプラントを目的とする骨の調製中、多孔性のマトリックスは、代表的に、骨の清浄、脱脂、滅菌、ウイルスの不活性化、消毒及び／または脱ミネラル化を行うか、または１種以上の薬理学的剤（抗生物質、骨成長因子など）を骨に含浸して骨を医薬伝達システムとして働かせるために、１種以上の処理流体と接触される。インプラントを目的とする骨の処理の詳細な説明について特許文献１を参照。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５８４６４８４
【００１１】
いくつかの処理方法例えば照射及び凍結乾燥が、骨の機械的性質の維持に働くことができ、そして骨の重量に耐える性質を低下させる。加工の必要性は、また、自家移植骨に寸法の変化を生じさせる。寸法のこれらの変化は、組織内に損傷を生じさせ、そしてまた機械加工された片が外科用器具、他の異種移植片、または準備された手術部位と機械的に係合することを困難にする。処理方法は、また靭性のような重要な機械的性質に有害な効果を有する。改善された靭性を示すインプラントは、ある異種移植片の挿入にまさにエネルギーを要する（例えば脊椎固定手術に使用される皮質リングをハンマーで打ち込む）ために重要である。
【００１２】
インプラント化を目的とする骨は、最近、冷凍されるかまたは凍結乾燥されるかの何れかで配布されている。その包装及び貯蔵の前に−７０℃のような冷たい温度にモノリシック骨を冷凍することが、もしあるとすれば、その物理的性質をほとんど変えないことが一般に認められている。しかし、保存技術として冷凍された骨は、コストが高く、そしてロジスティック的（例えば輸送及び貯蔵）に難しい。凍結乾燥（すなわち、冷凍、次に水分の昇華）は、その貯蔵寿命を汚染なく数年間まで可能にするので、よく行われている。
【００１３】
凍結乾燥は、骨から過剰の水分を除き、その抗原性を低下させる。ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｂａｎｋｓ（“Ａ．Ａ．Ｔ．Ｂ．”）によれば、６％以下の水分を含む凍結乾燥された全骨は、処理後５年間まで周囲温度で貯蔵できる。しかし、骨の生体力学的性質の不都合な変化は、凍結乾燥の工程から生ずることが分かっている。凍結乾燥は、冷凍及び脱水の操作の間に生ずる寸法の変化により骨に損傷を生ずる。不都合な機械的変化は、骨マトリックスに生ずる損傷特にコラーゲン繊維に沿う超微細構造のクラックと関連するように思われる。これらの作用は、凍結乾燥及びガンマ照射がともに使用されるとき、拡大するように思われる。海綿骨の圧縮性（尾の椎骨の圧縮強さ）並びに長い骨の曲げ及びねじりの性質に対する凍結乾燥の作用を示すラットの骨を使用する研究は、圧縮強さが３０％以下に低下され、剛性に殆どまたは全く変化が生ずることがないが、曲げ強さは約４０％低下し、そしてねじり強さは６０％以下低下することを示している。これらの変化は、脆い骨を生じ、たとえ骨が再水和された後でも起こることが見いだされている。ミネラル化骨に対する凍結乾燥の作用のさらに詳細な説明は、非特許文献３及び４に見いだされる。
【００１４】
【非特許文献３】Ｋａｎｇら「Ｙｏｎｓｅｉ　Ｍｅｄ　Ｊ」３６、３３２−３３５（１９９５）
【００１５】
【非特許文献４】Ｐｅｌｋｅｒら「Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．」１、４０５−４１１（１９８４）
【００１６】
従って、強靭でありしかも貯蔵及び維持に都合の良いインプラント化を目的とする骨を提供する問題が存在する。骨を冷凍し解凍することは骨の損傷を最小限にとどめ、一方凍結乾燥は骨の靭性を低下させるため、凍結乾燥に伴う寸法の変化を減少させつつ骨に伴う水を除去する方法を使用して骨を脱水することにより、靭性を骨に維持及び／または増大させるのが本発明の目的である。例えばエタノールのような無水極性有機溶媒による処理による組織の脱水は周知である。例えば、特許文献２を参照。
【００１７】
【特許文献２】米国特許５８６２８０６
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、骨にこの技術を適用することが、改善された生体力学的性質例えば靭性を有するインプラントを生成することは従来知られていなかった。それゆえ、骨が採取されるときから包装及び貯蔵の操作をへてインプラント化のときまで、凍結乾燥された骨に比べて、骨の生体力学的性質即ちその靭性及び／または寸法をより良く維持する、その包装及び貯蔵前にインプラント化を目的とするモノリシック骨を脱水する方法を提供することが望ましい。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
従って、その脱水工程及び次の包装及び貯蔵中、骨の生体力学的性質を維持しそしてその再水和そして次のインプラント化を通してこれらの生体力学的性質を実質的に維持するために、インプラント化を目的とするモノリシック骨を脱水する方法を提供するのが本発明の目的である。
【００２０】
骨の凍結乾燥に伴う寸法の変化の少ないモノリシック骨を脱水する方法を提供するのが本発明のさらなる目的である。
【００２１】
骨の移植片の靭性を改善するモノリシック骨を脱水する方法を提供するのが本発明の他の目的である。
【００２２】
骨の移植片の生物学的性質について最小の負のインパクトでモノリシック骨を脱水する方法を提供するのが本発明の目的である。
【００２３】
骨がその靭性の過剰な損失なしに周囲温度で長時間例えば５年以内またはそれ以上貯蔵できる、脱水されたモノリシック骨を包装する方法を提供するのが本発明の他の目的である。
【００２４】
骨の靭性がそのインプラント化の時点で最適であるように脱水されたモノリシック骨を再水和する方法を提供するのが本発明のさらなる目的である。
【００２５】
外科医により適用される挿入力により一部再水和した移植片が骨折する傾向を最小にする方法を提供するのが本発明の他の目的である。
【００２６】
１種以上の内科的／外科的に有用な物質例えば骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）のような骨発生物質を任意に含む脱水されたモノリシック骨インプラントを提供するのが本発明の他の目的である。
【００２７】
これらの目的及び上記に特に示されていない目的は、上記の目的及び前述を参照して当業者にとり明らかであろう。
【００２８】
本発明のこれらの目的及び関連する目的を取り扱うには、脱水工程及び次の包装中骨の生体力学的性質を維持しそしてそのインプラント化前の骨の貯蔵中これらの生体力学的性質を維持する、インプラント化を目的とするモノリシック骨を脱水する方法が提供される。方法は、凍結乾燥することなくモノリシック骨を脱水しそして脱水した骨を包装することからなる。
【００２９】
他の態様では、本発明は、前記の方法の１つ以上により得られる脱水した骨、並びに本発明により得られた骨の用途を含む。
【００３０】
用語「モノリシック骨」は、本明細書で使用されるとき、ヒトまたは動物の骨の比較的大きな片、即ち自家移植、同種移植または異種移植の骨の片を意味し、それらは、機能的な骨が典型的にうける種類の機械的負荷に抵抗できるようなサイズのものである。本発明のモノリシック骨は、米国特許５０７３３７３、５３１４４７６及び５５０７８１３に開示されたように粒子、繊維、糸など（それらの比較的小さい寸法のために、個々にまたは凝集物の何れかで、顕著な機械的負荷に耐えることができない）から区別されなければならない。用語「モノリシック骨」は、完全にミネラル化した骨、即ちその完全な天然のレベルのミネラル含量を有する骨をいい、そしていくらかの少ない程度即ち骨の最初の強さが約５０％以下低下した程度に、脱ミネラル化した骨をいう。モノリシック骨は、骨の単一の全体の片として、または多数のより小さい骨要素から組み立てられた変化しない骨の片（例えば、その内容が本明細書に参考として引用される米国特許５８９９９３９に開示されているような）として提供できる。モノリシック骨は骨形成性である因子を含むことができ、また、例えばその内容が本明細書に参考として引用される米国特許５２９０５５８に開示されたような付加の物質を含むことが可能であり、それらは、その再水和後も骨に残りそしてインプラント化のときに存在する。
【００３１】
用語「強さ」は、本明細書で使用されるとき、特に圧縮強さ、曲げモジュラス、ねじりモジュラス及び降伏強さ並びにこれらの性質の全部（骨の特徴である）を含む骨の主要な生体力学的性質の任意の１つを意味することを目的とする。
【００３２】
用語「靭性」は、本明細書で使用されるとき、骨が破壊する方法として定性的に記述できる任意の特徴、即ちいかに骨の変形が骨折前に行われるかを示すことを目的とする。例えば、靭性に改善を示す骨は、靭性の少ない骨より望ましい。定量的に、「靭性」は、本明細書で使用されるとき、破壊前に骨インプラントにより吸収されるエネルギーの尺度であり、そして力×長さの単位例えばニュートン−ｍｍ（Ｎ−ｍｍ）で表示される。
【００３３】
用語「靭性増大」、「骨の靭性の維持」並びに同様な表現は、本発明に従って脱水されたモノリシック骨が、凍結乾燥された骨に比べたとき、靭性の増大が少なくとも約５％より大きいことを示さねばならないことを意味するものと本明細書において理解されるべきである。即ち、本発明に従って脱水された骨は、凍結乾燥された骨に比べて、インプラント化中生ずる力に抵抗する改善された能力を示す。
【００３４】
用語「寸法維持」及び同様な表現は、本発明により処理されたモノリシック骨が、凍結乾燥された骨に比べて長さの寸法が少なくとも約２％より小さい低下を示さねばならないことを本明細書では意味することを理解すべきである。即ち、本発明に従って脱水された骨は、凍結乾燥された骨より脱水後より小さい収縮を示す。
【００３５】
用語「生体適合性」及び同様な表現は、インプラントに望ましくない激しい、長期にわたるまたは増大する生物学的反応の刺激が存在しないことを意味するものと理解すべきであり、そして本質的にすべての異物の生体中へのインプラント化に伴う緩和な一過性の炎症から区別され、そしてまた正常の治癒レスポンスを伴うものである。本発明にとり有用な物質は、もしインプラント化の時点でそれらが上記で規定した条件が達成されるような十分に低い濃度で存在するならば、生体適合性であると考えるべきである。
【００３６】
図１は、本発明に従って処理されたモノリシック骨を示す。
【００３７】
図２は、圧迫骨折した後の凍結乾燥したモノリシック骨の写真である。
【００３８】
図３は、圧迫骨折した後の冷凍したモノリシック骨の写真である。
【００３９】
図４は、ドナーによる平均の破砕度のグラフである。
【００４０】
図５は、処理による平均の破砕度のグラフである。
【００４１】
図６は、処理による寸法の変化％のグラフである。
【００４２】
インプラント化のための骨は、例えば、ドナー死体から、または手術の切除または切断により得られる生きているドナーの組織から死体置き場または手術室で滅菌して得られる。骨は、例えば７０％のエタノールを使用して清浄にされ、そして注射用の水で洗いそして超音波で処理する。インプラント化用の骨の最初の処理におけるアルコールのこの使用は、業界で普通に行われ、そしていくらかの脱水効果を有することができる。しかし、脱水効果は、もしあるとしてもごくわずかであり、骨の水含量を、インプラント化を目的とする骨の貯蔵前にＡ．Ａ．Ｔ．Ｂ．により要求される６％より低くしないだろう。骨は、抗生物質例えばポリミキシンＢ硫酸塩、バシトラシン及び／またはゲンタマイシンにより処理でき、そして痕跡量の残存する抗生物質を含むことができる。清浄、切断、サイジング、成形、容器の滅菌、充填、脱水及び密封の機能は、組織の取り扱いのための業界の標準による条件の下で行うことができる。本発明で使用される骨は、米国特許５０７３３７３、５３１４４７６及び５５０７８１３に記載されたように、「粒子」、「繊維」、「糸」、「片」などとは対照的にモノリシック部分のものである。従って、本発明の方法に従って処理される骨は、一般に、ドナーの骨の比較的大きな片またはセグメントであり、そしてそれに応じて比較的大きな欠損または他のインプラント部位中へのインプラント化を目的とすることができる。代表的には、本発明の骨は、約２−約５００ｍｍそしてこの少なくとも約５ｍｍから約１００ｍｍのオーダーの長さの寸法を有する。同様に、幅の寸法は、約１−約６００ｍｍそして好ましくは少なくとも約１ｍｍから約１００ｍｍのオーダーである。厚さの寸法は、約１−約３０ｍｍそして好ましくは少なくとも約１ｍｍから約１０ｍｍのオーダーである。切断、成形及び機械処理を含むがこれらに限定されないいくつかの方法の任意の１つにより、このような骨を容易に得ることができる。
【００４３】
用語「脱水用液体」は、本明細書で使用されるとき、高温度（即ち、溶媒が蒸発により容易に蒸気として噴出するような脱水が生じる温度）で蒸気圧を有する任意の好適な溶媒または溶媒の混合物をいうことを目的とする。これらの１種以上の脱水用液体は、もしあるとすればインプラント化の時点で存在する脱水用液体の量が、有毒なレスポンスを生じない限り、たとえ有毒であると通常考えられているとしても、好適である。本発明で有用である脱水用液体の例は、極性有機溶媒、例えばアルコール、代表的には低分子量アルコール例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、エチルブタノール、アセトニトリル、ピリジン、工業用メチル化アルコールなど； 組織学的溶液例えばＦｌｅｘ　１００（商標）；極性溶媒例えばジメチルスルホキシド、低分子ケトン、アセトン；クロロホルム；塩化メチレン及び塩化エチレン；直鎖炭化水素例えばヘキサン、ペンタン、同様なアルカン；低分子量アルケン；エステル；エーテル例えばエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル、クラウンエーテルなど；架橋が生じない低温度でアルデヒドまたはアルデヒドを含む溶液例えばホルムアルデヒド、ホルマリンなど；超臨界圧での超臨界流体例えば二酸化炭素または硫化水素、及び上記液体の任意のものの混合物などを含むが、これらに限定されない。これらの脱水用液体は、骨と不利に反応しないが骨から水を抽出できる能力を有する特性に従って選択できる。これらの脱水用液体は、好ましくは、等級に分けた一連の水性濃度、例えば６０％エタノール、７０％エタノール、９５％エタノール、無水エタノールで存在でき、それはモノリシック骨に付随する水の除去を促進するのに働く。
【００４４】
脱水用液体は、約１４１０ｃｐｓ以下の２０℃での粘度を有しなければならず、好ましくは粘度は約２−約３００ｃｐｓである。好ましい脱水用液体は、等級に分けた一連の脱水用アルコールである。
【００４５】
骨は、機械的撹拌を任意に備えた好適な容器例えば１２０ｍＬ容または５００ｍＬ容のびん中の脱水用液体と接触する。任意に、脱水用液体は、例えば加圧系例えば米国特許５８４６４８４（その内容は参考として本明細書で引用する）に記載されたものを使用して、浸出により適用できる。米国特許５８４６４８４に記載された方法または種々のレベルの正圧を使用する方法を用いる組織の前処理は、脱水用液体が組織に浸透する速度を改善できる。任意に、脱水用液体は、米国特許５５１３６６２（その内容は本明細書に参考として引用される）に記載されたもののような低圧の雰囲気の存在下または骨及び脱水用液体を真空シーラーを利用して真空包装することによりもたらされる低圧雰囲気中で、骨と接触できる。任意に、脱水用液体は、Ｓｈａｎｄｏｎ　Ｌｉｐｓｈａｗ　ＵＳＡから市販されているＨｙｐｅｒｃｅｎｔｅｒ（商標）ＸＰ　Ｅｎｃｌｏｓｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、または好ましくはＳａｋｕｒａ　ＦｉｎｅＴｅｋ，ＵＳＡから市販されているＳａｋｕｒａ　Ｔｉｓｓｕｅ−ＴＥＫ（商標）ＶＩＰ　１５０（商標）真空浸透組織プロセッサーによりもたらされるもののような交代に変化する真空と正圧の存在下骨と接触できる。当業者が容易に理解するように、交代に変化する真空と正圧、または変化する正圧の最適な時間及びレベルは、日常行われる実験により測定できる。組織プロセッサーは、好ましくは等級にわけた一連の異なる脱水用液体が使用されるとき、骨の脱水を可能にする。
【００４６】
脱水用液体が骨の小さい孔に浸透することを助けるために、骨及び脱水用液体は、有利には、超音波処理をうける。超音波浴中で骨と脱水用液体とを接触させることが、組織への液体の浸透を改善することが分かっている。骨の超音波処理は当業者にとり周知であり、そして米国特許５７９７８７１（その内容は本明細書に参考として引用される）に記載されている。もちろん、骨と脱水用液体とを接触させることが、前記の１つ以上の任意の組み合わせにより実施できることは、当業者により理解されるだろう。
【００４７】
骨を約５分から約７日間好ましくは少なくとも約１時間脱水用液体と接触した後、脱水用液体の除去前にそれは任意に成形できる。この成形は、切断、成形、機械処理または他の骨を成形する他の方法により達成できる。従って、骨をざっと切断し、脱水用液体により処理し、さらに望みに応じて成形し、次にもし必要ならばさらに処理する。インプラント化を目的とする骨のこの成形は、当業者にとり周知であり、そして米国特許６０２５５３８（その内容は本明細書に参考として引用される）に記載されている。
【００４８】
成形または他の任意の処理工程後、インプラント化を目的とする骨は、当業者に周知の方法に従ってさらに脱水できる。例えば、骨及び脱水用液体を含む瓶を−７６℃に最初に冷凍し、骨及び脱水用液体は、その後−３５℃以下に温度を維持しつつ１００ミリトルの真空におかれる。方法の終点は、約６％以下の残存水分の測定による。一度骨が脱水されると、そのもとに戻し使用する前に密封した真空下の瓶中に貯蔵されるが、もちろん、任意の好適な包装手段例えばポリマー性トレイ包装（内外を密封したトレー）が完全に好適でありそして本発明の範囲内にあると考えられる。
【００４９】
脱水及び／または脱水用液体の除去の他の方法は、骨と等級にわけた一連の脱水用液体との接触；乾燥剤例えば分子ふるい、無水塩化カルシウム、無水シリカゲルなどの存在または不存在下骨と脱水用液体との接触；米国特許４６５６０４７（その内容は本明細書に参考として引用される）に記載されたようなマイクロ波エネルギーの骨への付加；周囲圧または大気圧下の圧での骨の加熱、例えば約３５−約８５℃好ましくは約４０−約５０℃の温度でのオーブン、または約３５−約８５℃好ましくは約４０−約５０℃の温度での真空オーブンの乾燥；乾燥剤の存在または不存在下大気圧下の圧（例えば乾燥剤例えば無水塩化カルシウム、無水シリカゲルなどを任意に含む真空にされた密封した容器）での骨の保持；代表的に実験室の実験台または都合のよい燻蒸モードで見いだされるような周囲圧または大気圧下の圧で周囲温度での骨の保持；高温度における凍結乾燥サイクルから出発して組織を脱水し次に温度及び圧力を低下させて組織を冷凍し任意の残存する水分を昇華するような交代で変化する凍結乾燥の方法（例えば、Ｂａｌｄｅｒｓｏｎら「Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｂｏｎｅ」ｔｈｅ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｏｃｉｅｔｙの４５回Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ，７８５（１９９９）、その内容は本明細書に参考として引用される）；または前記の１つ以上の組み合わせを含むが、それらに制限されない。本明細書におけるすべての真空とは、それ以外に特定されていない限り、実験室の真空の標準の源例えば真空ポンプ、空気−水のベンチュリ装置などにより通常もたらされるような真空圧をいうことを理解するだろう。
【００５０】
本発明に従って処理されたモノリシック骨は、凍結乾燥されたモノリシック骨の相当する試料のそれより少なくとも約５％好ましくは少なくとも約１０％そしてさらに好ましくは少なくとも約１５％大きいレベルの靭性を示す。さらに、本発明に従って脱水された骨は、凍結乾燥された骨に比べたとき、長さの寸法で少なくとも約２％以下の低下を示す。この点で、骨は、任意にさらに包装前に成形できる。
【００５１】
脱水された骨がインプラント化前に再水和できる種々の条件が存在する。普通の大気圧で再水和用溶液に脱水した骨を浸漬することにより、再水和を行うことができる。別の方法として、脱水された骨は、低い大気圧の環境で再水和でき、例えば再水和溶液は、密封したゴム栓を通して皮下注射針を経て導入できる。
【００５２】
再水和溶液は、多数の好適な剤例えば滅菌水、生理食塩水、生理学的緩衝塩水、デキストロース溶液、及び抗生物質溶液及びこの種類の他のものの任意のものである。任意に、それは、１種以上の湿潤剤例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）剤の任意のもの、または種々の内科的／外科的に有用な物質例えば抗ウイルス剤、特にＨＩＶ及び肝炎に対して有効なもの；抗微生物剤及び／または抗生物質例えばエリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ペニシリンＢ、テトラサイクリン、バイオマイシン、クロロマイセチン及びストレプトマイシン、セタゾリン、アンピシリン、アザクタム、トブラマイシン、クリンダマイシン、ゲンタマイシンなど；アミノ酸、ペプチド、ビタミン、無機元素、蛋白合成のための共因子；ホルモン；内分泌組織または組織フラグメント；合成剤；酵素例えばコラーゲナーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼなど；実質細胞を有するポリマー細胞骨格；血管形成医薬及びこれらの医薬を含むポリマー性担体；抗原性剤；細胞骨格剤；骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ベータ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、成長ホルモン例えばソマトトロピンなどを含むことができる。
【００５３】
本発明に従って製造した再水和したモノリシック骨は、骨欠損部位、例えば損傷から生じたもの、手術、感染、悪性腫瘍または発生奇形の途中で生じた欠損に適用されることを目的とする。要求に応じ好適にサイジイングされそして成形された骨は、広範囲の整形外科、神経外科及び口腔及び顎骨顔面の手術の方法における移植または整復、例えば単純及び複雑の骨折及び結合不能の修復、体外及び体内の固定、関節の再建例えば関節固定、一般的な関節形成、腰のカップ関節形成、大腿及び上腕骨の頭部整復、上腕骨頭部の表面の整復及び全関節の整復、脊椎の修復（脊椎固定及び内部固定を含む）、腫瘍手術例えば欠損の充填、椎間板切除、椎弓切除、脊髄腫瘍の切除、前頚及び胸の手術、脊椎損傷の修復、モノリシック骨を脱水する側弯症、前弯症、後弯症、骨折の顎間固定、おとがい形成、顎関節整復、歯槽堤の強化及び再建、アンレー骨移植、インプラント装入及び変更、洞のリフトなどとして利用できる。本発明の骨由来インプラントにより修復できる特定の骨は、篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、頚椎、胸椎、腰椎、仙骨、肋骨、胸骨、鎖骨、肩胛骨、上腕骨、橈骨、尺骨、手根骨、中手骨、指骨、腸骨、座骨、恥骨、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋、踵骨、足根骨及び中足骨を含む。
【００５４】
本発明は、本発明に従う方法を説明するが本発明を限定しないことを目的とする以下の実施例によりさらに充分に理解されるだろう。
【００５５】
【実施例】
実施例　１
図１のモノリシック骨のサンプルは、同じドナーの材料を利用して得られた。６部位の最初の測定を行った。サンプルを次に処理して、以下の表１に示される条件に従ってＶＩＰ（商標）組織プロセッサーで脱水した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
処理後、試料をＶＩＰ（商標）プロセッサーから取り出し、そして約４時間連続する真空下で密封した容器にいれてすべての残存する溶媒を脱気した。
【００５８】
他の試料を表１の方法を使用して処理した。方法の終りで、試料を真空デシケーター中で４時間２０分間脱気した。試料を０．０００１ｇまで秤量した。
【００５９】
乾燥のレベルを測定するために、試料を次に凍結乾燥ユニットに１晩おいて、試料からすべての残存する水を除いた。凍結乾燥ユニットから取り出した後、試料を再び秤量した。差は、アルコール処理した試料について３．４５重量％の水分含量を示した。
【００６０】
約５分間再水和した後、試料を再び測定して、すべての寸法の変化の存在を求めた。この測定の結果は、以下の表２に示される。寸法の変化％は、予備再水和の寸法と最初の寸法との差を最初の寸法により除しそして１００をかけることにより測定された。そのため、すべての値は、最初の寸法に関する％単位である。
【００６１】
【表２】
2004506660.tif 000003
【００６２】
比較例　１
図１のモノリシック骨のサンプルは、３人の異なるドナーから得られた。骨を次に実施例１の方法に従って処理されるか（但し５分または２時間の水和時間、業界の標準条件下の凍結乾燥）または冷凍された。サンプルを次に２５ｍｍ／分の速度で各テスト品へ一定の圧縮変位を適用する変位コントロール下で１軸のサーボ液圧テスト機（ＭＴＳモデル８５８Ｂｉｏｎｉｘ）を使用して圧縮した。各テストの開始前に、圧縮性の予備負荷を２５０Ｎの試料（負荷コントロール下）に適用し、そして機械の変位をこの点で零にした。これを行って、各テストの安定した零の変位の開始点とした。２．５ｍｍの全圧縮性変位をテスト品に付与したとき、テストを終えた。すべての場合に、破壊（負荷におけるピーク、次に負荷における鋭い低下）が、２．５ｍｍの圧縮性変位に達する前に観察された。テスト品は、テスト品の上端及び下端の隆起のある表面に適合するステンレス鋼挿入物を使用して負荷されたが、但し２つの小さい取り付け孔が下端及び上端の両方の挿入物に存在した。１００ｋＮの範囲にある１００ｋＮ負荷セルの系を使用して負荷の情報を集めた。変位の情報は、テスト系変位トランスジューサー（ＬＶＤＴ）から測定された。破壊時エネルギー及びピーク負荷の値を、Ｔｅｓｔｗｏｒｋｓバージョン３．６テストソフトウエアを使用して負荷対変位の曲線から抽出した。
【００６３】
破壊エネルギーの値の測定は、靭性の指標として求めた。結果は、以下の表３に含まれる。すべての単位はＮ−ｍｍである。
【００６４】
【表３】
2004506660.tif 000004
【００６５】
圧迫骨折をした後、モノリシック骨を、各処理方法の破砕化の相対的程度を求めるために肉眼で評価した。破砕化のこの相対的な程度も靭性の指標である。モノリシック骨の破砕化の度合を、１から１０の相対的スケールで点数をつけ、１は破砕化なしであり、そして１０は高度に破砕していることを表す。結果は以下の表４に含まれる。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
この上記のデータから、エネルギー吸収の２つの別々の測定値は、凍結乾燥が靭性を低下させることを示す。アルコール処理も靭性を低下させるが、相応する凍結乾燥した移植片よりも少ない（ＦＤについては２９％の減少対アルコールについては１６％の減少）。それらは、移植片の挿入時に非常に顕著である。それは、この処理を受ける移植片の多くが、それらを手術部位に配置するために機械的な打撃（ハンマーで打つなど）を受けるからである。２時間の再水和（手術室の容器中でも、または患者の手術部位における再水和でも）後の時点において、移植片はその靭性の特性において冷凍した組織に似た挙動をとる。
【００６８】
種々の改変が本明細書で開示された態様及び例についてなされうることを理解されるだろう。従って、上記の記述が、本発明を制限するものと考えてはならず、好ましい態様の単なる例示である。当業者は、本発明の範囲内にある種々の改変を考え出せるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に従って処理されたモノリシック骨を示す。
【図２】
圧迫骨折した後の凍結乾燥したモノリシック骨の写真である。
【図３】
圧迫骨折した後の冷凍したモノリシック骨の写真である。
【図４】
ドナーによる平均の破砕度のグラフである。
【図５】
処理による平均の破砕度のグラフである。
【図６】
処理による寸法の変化％のグラフである。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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