(57)【要約】本発明は、遺伝的に改変されたハイブリドーマ、骨髄腫およびＢ細胞に関する。本発明はまた、モノクローナル抗体を作製する方法において、遺伝的に改変されたハイブリドーマ、骨髄腫およびＢ細胞を利用することに関する。本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製するために利用され得るハイブリドーマおよびＢ細胞の集団を提供する。１つの実施形態では、本発明のハイブリドーマ細胞集団は、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマ細胞集団であって、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項２】
ハイブリドーマ細胞集団であって、該集団中の２５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項３】
ハイブリドーマ細胞集団であって、該集団中の５０％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項４】
ハイブリドーマ細胞集団であって、該集団中の７５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞であって、２０を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項６】
ハイブリドーマ細胞であって、５０を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項７】
ハイブリドーマ細胞であって、１００を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項８】
ハイブリドーマ細胞であって、２５０を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項９】
ハイブリドーマ細胞であって、５００を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１０】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現し、そしてここで２０を超えるモノクローナル抗体分子が、該集団中の、モノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１１】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現し、そしてここで５０を超えるモノクローナル抗体分子が、該集団中の、モノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１２】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の２５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現し、そしてここで２０を超えるモノクローナル抗体分子が、該集団中の、モノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１３】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の２５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現し、そしてここで５０を超えるモノクローナル抗体分子が、該集団中の、モノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１４】
ハイブリドーマ細胞であって、ここで、該ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の１５％を超えるハイブリドーマ細胞が、該細胞表面で該ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現する、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１６】
ハイブリドーマ細胞集団であって、ここで、該集団中の１５％を超えるハイブリドーマ細胞が、該細胞表面で該ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現し、そしてここで、２０を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合している、ハイブリドーマ細胞集団。
【請求項１７】
ベクターを含むハイブリドーマ細胞であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１８】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１９】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つのキメラ表面発現抗体レセプターを含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２０】
前記ハイブリドーマ細胞が、Ｉｇαを含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２１】
前記ハイブリドーマ細胞が、Ｉｇβを含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２２】
前記ハイブリドーマ細胞が、ＩｇαおよびＩｇβを含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２３】
前記変異したＩｇαレセプターが、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項１８に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２４】
前記変異したＩｇαレセプターが、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項１８に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２５】
前記変異したＩｇαレセプターが、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を含む、請求項１８に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２６】
前記変異したＩｇβレセプターが、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項１８に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２７】
前記ベクターが、Ｉｇαをコードする核酸を含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２８】
前記ベクターが、Ｉｇβをコードする核酸を含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項２９】
前記ベクターが、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含む、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３０】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする前記核酸が、発現配列に機能的に連結している、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３１】
前記発現配列が、誘導性発現配列である、請求項３０に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３２】
前記ベクターが、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３３】
前記ベクターが、前記細胞のゲノムに組み込まれていない、請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項３４】
ベクターを含むハイブリドーマ細胞であって、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、ここで、該核酸は、誘導性の機能的発現配列に連結されている、ハイブリドーマ細胞。
【請求項３５】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を作製するための方法であって、ベクターを含む骨髄腫細胞をＢ細胞と融合して、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を産生する工程を包含し、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、方法。
【請求項３６】
前記ベクターが、前記ハイブリドーマ細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ベクターが、前記ハイブリドーマ細胞のゲノムに組み込まれない、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記表面発現抗体レセプターをコードする前記核酸が、誘導性発現配列に機能的に連結されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記骨髄腫細胞が、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含み、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸が、誘導性発現配列に機能的に連結されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記骨髄腫細胞が、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記骨髄腫細胞が、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇβレセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３５に記載の方法によって産生される、ハイブリドーマ細胞。
【請求項４３】
ベクターを含むＢ細胞であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、Ｂ細胞。
【請求項４４】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを含む、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項４５】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つのキメラ表面発現抗体レセプターを含む、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項４６】
前記ベクターが、Ｉｇαをコードする核酸を含む、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項４７】
前記ベクターが、Ｉｇβをコードする核酸を含む、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項４８】
前記ベクターが、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含む、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項４９】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする前記核酸が、発現配列に機能的に連結している、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項５０】
前記発現配列が、誘導性である、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項５１】
前記変異Ｉｇαレセプターが、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項４４に記載のＢ細胞。
【請求項５２】
前記変異Ｉｇαレセプターが、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を含む、請求項４４に記載のＢ細胞。
【請求項５３】
前記変異Ｉｇβレセプターが、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項４４に記載のＢ細胞。
【請求項５４】
前記ベクターが、前記Ｂ細胞のゲノムに組み込まれている、請求項４３に記載のＢ細胞。
【請求項５５】
ベクターを含むＢ細胞であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、ここで該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含み、そしてここで該ベクターは、該Ｂ細胞のゲノムに組み込まれている、Ｂ細胞。
【請求項５６】
請求項４３に記載のＢ細胞を作製する方法であって、Ｂ細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含むベクターでトランスフェクトする工程を包含し、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸は、発現配列に機能的に連結されている、方法。
【請求項５７】
前記発現配列が、誘導性発現配列である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ベクターが、前記Ｂ細胞のゲノムに組み込まれる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５６に記載の方法によって産生される、Ｂ細胞。
【請求項６０】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞であって、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸が、誘導性発現配列に機能的に連結されている、骨髄腫細胞。
【請求項６１】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞であって、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸が、誘導性発現配列に機能的に連結されている、骨髄腫細胞。
【請求項６２】
前記変異Ｉｇαレセプターが、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇαレセプターである、請求項６１に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６３】
前記変異Ｉｇβレセプターが、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇβレセプターである、請求項６１に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６４】
前記変異Ｉｇαレセプターが、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を含むＩｇαである、請求項６１に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６５】
前記ベクターが、Ｉｇαをコードする核酸を含む、請求項６０に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６６】
前記ベクターが、Ｉｇβをコードする核酸を含む、請求項６０に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６７】
前記ベクターが、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含む、請求項６０に記載の骨髄腫細胞。
【請求項６８】
請求項６０に記載の骨髄腫を作製する方法であって、骨髄腫細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている、方法。
【請求項６９】
請求項６１に記載の骨髄腫を作製する方法であって、骨髄腫細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここで、該表面発現抗体レセプターをコードする該核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている、方法。
【請求項７０】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）ハイブリドーマ細胞集団を、検出可能な標識に連結されている抗原と接触させる工程であって、ここで、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現しており、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る、工程；
ｂ）該検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、該目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびに
ｃ）該目的のモノクローナル抗体を該ハイブリドーマ細胞から作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項７１】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）ハイブリドーマ細胞集団を、抗原と接触させる工程であって、ここで、該集団中の１５％を超える細胞が、該細胞表面に結合しているモノクローナル抗体を発現しており、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合する、工程；
ｂ）検出可能な標識を該抗原に添加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を与える工程；
ｃ）該検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、該目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびに
ｄ）該目的のモノクローナル抗体を該ハイブリドーマ細胞から作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
請求項７０に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項７５】
請求項７１に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項７６】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）ハイブリドーマ細胞集団を、検出可能な標識に連結されている抗原と接触させる工程であって、ここで、２０を超えるモノクローナル抗体分子が、該細胞表面に発現されて結合しており、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を与える、工程；
ｂ）該検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、該目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；
ｃ）該目的のモノクローナル抗体を該ハイブリドーマ細胞から作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項７７】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法であって：
ａ）ハイブリドーマ細胞を抗原と接触させる工程であって、ここで、２０より多くのモノクローナル抗体分子が発現されて該細胞表面に結合しており、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合する、工程；
ｂ）検出可能な標識を該抗原に添加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る工程；
ｃ）該検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、該目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびに
ｄ）該目的のモノクローナル抗体を該ハイブリドーマ細胞から作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
請求項７６に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項８１】
請求項７７に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項８２】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、該方法は：
ａ）ベクターを含むＢ細胞を、検出可能な標識に連結した抗原と接触させる工程であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたＢ細胞が得られる、工程；
ｂ）該検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って、該目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程；ならびに
ｃ）該目的のモノクローナル抗体を作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項８３】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、該方法は：
ａ）ベクターを含むＢ細胞を、抗原と接触させる工程であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、工程；
ｂ）該抗原に結合する検出可能な標識を添加して、検出可能に標識されたＢ細胞を得る工程；
ｃ）該検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って該目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程；ならびに
ｄ）該目的のモノクローナル抗体を作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項８４】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
請求項８２に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項８７】
請求項８３に記載の方法によって産生される、モノクローナル抗体。
【請求項８８】
選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する方法であって：
ａ）マウスを該抗原で免疫する工程；
ｂ）該免疫されたマウス由来のＢ細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む黒色腫細胞と融合して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を産生する工程であって、ここで、該ハイブリドーマ細胞によって産生される該モノクローナル抗体は、発現されて該細胞表面に結合される、工程；
ｃ）該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を該抗原と接触させる工程であって、ここで、該抗原は、該細胞表面上の該モノクローナル抗体に結合して、検出可能なハイブリドーマ細胞を産生する、工程，
ｄ）該ハイブリドーマ細胞を検出する工程；ならびに
ｅ）該ハイブリドーマ細胞を単離し、従って特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する工程；
を包含する、方法。
【請求項８９】
前記抗原が、検出可能な標識に連結している、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する方法であって：
ａ）請求項４３に記載のＢ細胞を抗原と接触させる工程であって、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合して、検出可能なＢ細胞を生じる、工程；
ｂ）該Ｂ細胞を検出する工程；
ｃ）該Ｂ細胞を単離し、従って目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程；および
ｄ）該目的のモノクローナル抗体を産生する該Ｂ細胞を黒色腫細胞と融合して、選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生する工程；
を包含する、方法。
【請求項９１】
前記抗原が、検出可能な標識に連結している、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ベクターを含むＢ細胞を含むトランスジェニック動物であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、トランスジェニック動物。
【請求項９３】
前記Ｂ細胞が、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含む、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９４】
前記Ｂ細胞が、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターを含む、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９５】
前記Ｂ細胞が、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つのキメラ表面発現抗体レセプターを含む、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９６】
変異したＩｇαレセプターが、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９７】
変異したＩｇβレセプターが、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９８】
請求項９２に記載のトランスジェニック動物を作製する方法であって：
ａ）発現配列に機能的に連結された、Ｉｇαをコードする核酸を含む導入遺伝子、および／または発現配列に機能的に連結された、Ｉｇβをコードする核酸を含む導入遺伝子を胚に注入する工程；
ｂ）該胚を動物へと発生させる工程；
を包含する、方法。
【請求項９９】
請求項７３に記載の動物を、第二の動物と交配して、第三の動物を産生する工程をさらに包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記動物が、マウスである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記動物が、ウサギである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記動物が、ラットである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記動物が、モルモットである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記導入遺伝子の発現が、誘導性である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０５】
前記導入遺伝子の発現が、ｃｒｅ−ｌｏｘ発現系によって制御される、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０６】
前記導入遺伝子の発現が、誘導性テトラサイクリンプロモーター系によって制御される、請求項９２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０７】
特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生する細胞を同定する方法であって：
ａ）請求項９２に記載の動物を、前記抗原で免疫する工程；
ｂ）前記Ｂ細胞を工程ａ）の動物から単離する工程；
ｃ）工程ｂ）の該細胞を、該抗原と接触させる工程であって、ここで、該抗原は、該モノクローナル抗体に結合して、検出可能なＢ細胞を生じる、工程；
ｄ）該検出可能なＢ細胞を単離し、従って特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生する細胞を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０８】
前記検出可能な標識が、蛍光標識であり、そして前記ハイブリドーマ細胞が、蛍光活性化細胞選別を介して単離される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
請求項９８に記載の方法によって産生される、トランスジェニック動物。
【請求項１１０】
請求項９２に記載の動物から得られる、Ｂ細胞。
【請求項１１１】
ベクターを含む造血幹細胞であって、ここで、該ベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、造血幹細胞。
【請求項１１２】
Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする余分なコピーの核酸を含む、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１１３】
前記核酸が、Ｉｇαをコードする、請求項１１２に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項１１４】
Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞集団であって、該細胞集団は、該細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、該モノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、該細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、細胞集団。
【請求項１１５】
前記蛍光強度が、少なくとも５倍強い、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１１６】
前記蛍光強度が、少なくとも１０倍強い、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１１７】
前記蛍光強度が、少なくとも２５倍強い、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１１８】
前記蛍光強度が、少なくとも５０倍強い、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１１９】
前記蛍光強度が、少なくとも１００倍強い、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１２０】
前記ハイブリドーマ細胞が、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１２１】
前記集団が、２５細胞と２５０細胞との間である、請求項１１４に記載の集団。
【請求項１２２】
Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む形質細胞集団であって、該細胞集団は、該細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、該モノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、該細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、細胞集団。
【請求項１２３】
前記蛍光強度が、少なくとも５倍強い、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２４】
前記蛍光強度が、少なくとも１０倍強い、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２５】
前記蛍光強度が、少なくとも２５倍強い、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２６】
前記蛍光強度が、少なくとも５０倍強い、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２７】
前記蛍光強度が、少なくとも１００倍強い、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２８】
前記形質細胞が、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１２９】
前記集団が、２５細胞と２５０細胞との間である、請求項１２２に記載の集団。
【請求項１３０】
Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞集団であって、該細胞集団は、該細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、該モノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、該細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、細胞集団。
【請求項１３１】
前記細胞の少なくとも２５％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３２】
前記細胞の少なくとも５０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３３】
前記細胞の少なくとも７５％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３４】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも３倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３５】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも５倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３６】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも１０倍強い、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３７】
前記ハイブリドーマ細胞が、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３８】
前記集団が、２５細胞〜２５０細胞の間である、請求項１３０に記載の集団。
【請求項１３９】
Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む形質細胞集団であって、該細胞集団は、該細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、該モノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、該細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、細胞集団。
【請求項１４０】
前記細胞の少なくとも２５％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４１】
前記細胞の少なくとも５０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４２】
前記細胞の少なくとも７５％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４３】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも３倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４４】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも５倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４５】
前記細胞の少なくとも１０％の蛍光強度が、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも１０倍強い、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４６】
前記形質細胞が、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含む、請求項１３９に記載の集団。
【請求項１４７】
前記集団が、２５細胞〜２５０細胞の間である、請求項１３９に記載の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年２月２０日出願の米国仮出願番号６０／２７０，３２２（その全体が、本明細書によって参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、遺伝的に変更されたハイブリドーマ、骨髄腫およびＢ細胞に関する。本発明はまた、モノクローナル抗体を作製する方法において、遺伝的に変更されたハイブリドーマ、骨髄腫およびＢ細胞を利用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
機能的ゲノミクスおよびプロテオミクスにおける広範な試みは、タンパク質機能研究のために使用されるモノクローナル抗体についての空前の需要を創出している。モノクローナル抗体は、タンパク質標的の発見および特徴付け（精製、定量ならびに器官および細胞局在を含む）を含む、研究のすべての段階において、使用され得る。プロテオミクスにおける最近の進歩は、高スループット研究における使用およびタンパク質チップ上での使用のための、多数の抗体についての必要性を創出している。モノクローナル抗体は、数十年間にわたって、臨床的診断における重要な試薬として使用されており、重要な新規クラスの治療剤として浮上している。
【０００４】
ハイブリドーマ技術は、モノクローナル抗体を入手するために最も一般に使用される方法である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞から分泌され、正常な抗体産生脾臓Ｂ細胞を、不死化骨髄腫細胞または他の不死化細胞と融合させることによって作製される。ハイブリドーマ作製は、２６年前に始まったときからほとんど変化していない（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５）。
【０００５】
ハイブリドーマ作製のための代表的なプロトコールは、以下を含む：（ｉ）動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を、精製タンパク質抗原で免疫する工程；（ｉｉ）抗体産生Ｂ細胞を、代表的には脾臓から回収する工程；（ｉｉｉ）Ｂ細胞を、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠失した非分泌骨髄腫細胞株（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス株由来のｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合させる工程；（ｉｖ）ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含む選択培地中で、ハイブリドーマ細胞を増殖させる工程；および（ｖ）所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングする工程；および（ｖｉ）限界希釈クローニングをして、抗体を分泌する同質な細胞株を獲得する工程（Ａｎｔｃｚａｋ、１９８２）。
【０００６】
従来のハイブリドーマ技術では、異なる抗原に対する多数の抗体、または単一の標的抗原に対する多数の抗体を、効率的な様式で研究者が入手することはできない。限界希釈によってクローニングされるハイブリドーマ細胞は、モノクローナル抗体の産生において、おそらく最も問題があり、時間を消費し、そして労働集約的な工程である（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９８）。この工程において、細胞を、繰り返し希釈して細胞数を減らし、そしてその上清を、分泌されたモノクローナル抗体についてアッセイした。スクリーニングは、所望のハイブリドーマが失われていないことを確認するために、巧妙に実行する必要がある。迅速に増殖するハイブリドーマの場合、細胞は、より大きい管または新鮮な培地に直ちに移されない場合、栄養素の枯渇によって、マイクロタイターウェルの中で死ぬ。また、いくつかのハイブリドーマを含む代表的なウェルにおいて、所望でないハイブリドーマは、所望のハイブリドーマよりも連続的に増殖し過ぎ得る。このことは、限界希釈工程を、数週間または数ヶ月まで引き伸ばし得、重要なハイブリドーマの損失を生じさえし得る。ハイブリドーマがアッセイ時間までに妥当なサイズまで増殖しない場合、これらは、検出に十分な抗体を産生し得ない。従って、上清をスクリーニングする時間は、慎重に選択されるべきである。最初のスクリーニングについて利用可能な「ウインドウ」は大きくなく、通常２〜３日にわたって拡大する（Ａｎｔｃｚａｋ、１９８２）。一旦開始されると、純粋な細胞株の限界希釈単離は、代表的には任意の１つのハイブリドーマについて３〜４週間にわたって続く。
【０００７】
所望のハイブリドーマ細胞を単離するより迅速な方法についての必要性が存在する。少なくとも２つの研究室が、抗体の表面提示の追跡に基づいて、正常なハイブリドーマを分類することを試みた（Ｐａｒｋｓら、１９７９；Ｍｅｉｌｈｏｃら、１９８９）。彼らは、任意の集団中のハイブリドーマ細胞のサブセットが、小さいが測定可能な数（約２０）の表面抗体分子を提示したことを示した。抗原が高度に蛍光性のマイクロスフィアと連結されて、蛍光シグナルを増大させた場合、このことは、抗原で標識された場合にこれらの細胞を分類するために十分である。これらの高度に蛍光性のスフィアを用いてさえ、このシグナルは、バックグラウンドの数倍でしかなかった。
【０００８】
ハイブリドーマ細胞上の表面抗体提示の有意な増加についての必要性、および任意の集団中の表面抗体を提示するハイブリドーマ細胞の割合を有意に増加させて、迅速なスクリーニングを可能にする必要性が存在する。本発明は、ＤＩＳＨ（ハイブリドーマ細胞の直接的スクリーング）を提供することによって、これら両方を提供する。本発明のＤＩＳＨ技術は、数週間ではなく数時間で達成され得る、単純で迅速かつ信頼性のあるハイブリドーマ細胞の選択を提供する。ＤＩＳＨは、従来のハイブリドーマ技術を超えるいくつかの有意な改善を提供し、これにより、研究者が、有効な様式で多数の抗体レパートリーを入手することを可能にする。現在のハイブリドーマプロトコールを使用して、約４０，０００の融合体が、代表的には調製される。より多い融合体が作製されない主な理由は、限界希釈を使用して所望のクローンを単離する際に遭遇する困難である。ＤＩＳＨは、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）および他の様式を使用して、非常に迅速で高スループットの細胞選択を可能にする。ＦＡＣＳ技術は、数百万の細胞が、数時間で分別されることを可能にするので、ＤＩＳＨ技術を使用してスクリーニングされ得るハイブリドーマ融合体の数は、限界希釈によるよりも規模が大きい。重要なことに、ＦＡＣＳ分類は、別個のウェルへの所望の単一細胞のハイブリドーマ堆積を可能にする。従って、所望ではあるがゆっくり増殖する細胞が失われる問題は、ＤＩＳＨを使用して排除される。従って、ＤＩＳＨは、現在の抗体スクリーニングおよび限界希釈手順を、迅速で高スループットの選択プロセスで置換する。本発明はまた、適切な免疫グロブリンを表面提示する形質細胞の集団を提供するために利用されて、単一の形質細胞が標的抗原と反応する免疫グロブリンを産生するか否かを決定するために使用される、高スループットの蛍光活性化細胞分別技術を可能にし得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の１５％より多くの細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する。
【００１０】
また本発明は、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の２５％より多くの細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する。
【００１１】
さらに、ハイブリドーマ細胞集団が提供され、ここで、集団中の５０％より多くの細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する。
【００１２】
また本発明は、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の７５％より多くの細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する。
【００１３】
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、２０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００１４】
本発明はさらに、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、５０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００１５】
また本発明は、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、１００より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００１６】
本発明はさらに、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、２５０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００１７】
また本発明は、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、５００より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００１８】
本発明はさらに、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の１５％より多い細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、そして２０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そしてモノクローナル抗体を発現する集団中の細胞の細胞表面に結合している。
【００１９】
また本発明は、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の１５％より多い細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、そして５０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そしてモノクローナル抗体を発現する集団中の細胞の細胞表面に結合している。
【００２０】
本発明はさらに、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の２５％より多い細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、そして２０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そしてモノクローナル抗体を発現する集団中の細胞の細胞表面に結合している。
【００２１】
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の２５％より多い細胞が、この細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、そして５０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そしてモノクローナル抗体を発現する集団中の細胞の細胞表面に結合している。
【００２２】
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００２３】
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の１５％より多いハイブリドーマ細胞が、ハイブリドーマ細胞によってこの細胞表面上に産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現する。
【００２４】
本発明はさらに、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、ここで、集団中の１５％より多いハイブリドーマ細胞が、ハイブリドーマ細胞によってこの細胞表面上に産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現し、そして２０より多いモノクローナル抗体が発現され、そして細胞表面に結合している。
【００２５】
本発明はまた、ベクターを含むハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【００２６】
本発明はさらに、ベクターを含むハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、この核酸は、誘導性の機能的発現配列に連結されている。
【００２７】
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を作製する方法を提供し、この方法は、ベクターを含む骨髄腫細胞をＢ細胞と融合させて、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を作製する工程を包含し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【００２８】
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【００２９】
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含み、そしてこのベクターは、Ｂ細胞のゲノムに組み込まれている。
【００３０】
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む、骨髄腫細胞を提供し、ここで、この表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【００３１】
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異した表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む、骨髄腫細胞を提供し、ここで、この表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【００３２】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞集団を、検出可能な標識に連結された抗原と接触させる工程であって、この集団中の１５％より多い細胞は、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、この抗原は、このモノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る、工程；ｂ）検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびにｃ）このハイブリドーマ細胞から、目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３３】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞集団を抗原と接触させる工程であって、この集団中の１５％より多い細胞は細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、この抗原はこのモノクローナル抗体に結合する、工程；ｂ）検出可能な標識を抗原に付加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る工程；ｃ）検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびにｄ）このハイブリドーマ細胞から、目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３４】
本発明はさらに、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞を検出可能な標識に連結された抗原と接触させて、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る工程であって、ここで、２０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合し、この抗原はモノクローナル抗体に結合する、工程；ｂ）検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびにｃ）このハイブリドーマ細胞から、目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３５】
本発明は、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞を抗原と接触させる工程であって、ここで、２０より多いモノクローナル抗体分子が発現され、そして細胞表面に結合し、この抗原はモノクローナル抗体に結合する、工程；ｂ）検出可能な標識を抗原に付加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る工程；ｃ）検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ならびにｄ）このハイブリドーマ細胞から、目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３６】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ベクターを含むＢ細胞を検出可能な標識に連結された抗原と接触させて、検出可能に標識されたＢ細胞を得る工程であって、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、この抗原は、このモノクローナル抗体に結合する、工程；ｂ）検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程；ならびにｃ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３７】
本発明はまた、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ベクターを含むＢ細胞を抗原と接触させる工程であって、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、工程；ｂ）抗原に結合する検出可能な標識を付加して、検出可能に標識されたＢ細胞を得る工程；ｃ）検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、それによって、目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程；ならびにｄ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【００３８】
本発明はまた、選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）この抗原でマウスを免疫する工程；ｂ）免疫されたマウス由来のＢ細胞を骨髄腫細胞と接触させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を作製する工程であって、この骨髄腫細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含み、ここで、このハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体が発現され、細胞表面に結合している、工程；ｃ）このモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を抗原と接触させて、検出可能なハイブリドーマ細胞を作製する工程であって、この抗原は、細胞表面上のモノクローナル抗体に結合する、工程；ｄ）このハイブリドーマ細胞を検出する工程；ならびにｅ）ハイブリドーマ細胞を単離し、それによって、特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する工程。
【００３９】
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を含むトランスジェニック動物を提供し、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【００４０】
本発明はまた、ベクターを含む造血幹細胞を提供し、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【００４１】
本発明はさらに、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞集団を提供し、このハイブリドーマ細胞は、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、このモノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、この細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍大きい。
【００４２】
本発明はまた、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む形質細胞集団を提供し、この形質細胞は、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、このモノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、この細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍大きい。
【００４３】
本発明はまた、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞集団を提供し、このハイブリドーマ細胞は、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、このモノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、この細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍大きい。
【００４４】
本発明はさらに、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む形質細胞集団を提供し、この形質細胞は、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現し、ここで、このモノクローナル抗体が蛍光によって検出される場合、この細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞集団の蛍光強度よりも少なくとも２倍大きい。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。
【００４６】
本発明の方法を開示および記載する前に、本発明は、特定の構築物、分子、および方法に限定されず、当然変化し得ることが理解される。本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定することを意図しないこともまた理解される。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明確に示されない限り、複数の参照を含むことに注意されたい。例えば、細胞（ａ  ｃｅｌｌ）は、単一の細胞または１つより多い細胞を意味し得る。
【００４８】
（ハイブリドーマ）
本発明は、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。この集団中の細胞の１５％よりも多くは、細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現する。その集団中の細胞の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％（またはその中間の数値）より多くが、細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明により提供される。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「ハイブリドーマ」は、抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞）と不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）とを融合することにより作製される細胞または細胞株である。本明細書中で使用する場合、「Ｂ細胞」は、未成熟Ｂ細胞、成熟ナイーブＢ細胞、成熟活性化Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ系統リンパ球、形質細胞、あるいはヒト起源または非ヒト動物供給源由来の任意の他のＢ系統細胞を意味する。本発明のハイブリドーマは、ヒト起源または非ヒト動物供給源由来のＢ細胞と不死化細胞株とを、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて融合し、ハイブリドーマ細胞を形成することにより作製され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。
【００５０】
ハイブリドーマの作製のためにＢ細胞を獲得するために、マウスまたは他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫剤または抗原で免疫されて、その免疫剤または抗原に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るＢ細胞が誘発される。あるいは、Ｂ細胞は、インビトロで免疫され得る。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地において培養され得る。培養培地は、好ましくは、融合していない、不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む。例えば、ＨＡＴは、ＤＩＳＨのために必要でないけれども、代表的に、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００５１】
好ましい不死化細胞株は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の高レベルの発現を支持し、そして培地に感受性である細胞株である。不死化細胞株は、ＨＡＴ培地に感受性であり得る。より好ましい不死化細胞株は、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手可能なマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。例えば、以下の骨髄腫細胞株が、ＡＴＣＣから入手され得る：ＭＯＰＣ−３１Ｃ、ＲＰＭＩ８２２６、ＩＭ−９、ＭＰＣ−１１、ＣＣＬ−１８９、ＨＫ−ＰＥＧ−１、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ、Ａ２Ｂ５クローン１０５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４／ＳＦ、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、ＨＦＮ３６．３ＨＦＮ７．１、４５．６ＴＧ１．７、ＡＲＨ−７７、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＳＪＫ−１３２−２０、ＳＪＫ−２８７−３８、およびＳＪＫ−２３７−７１。
【００５２】
本発明のハイブリドーマ細胞は、表面発現についてアッセイされ得、そしてハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、当該分野で公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、磁気分離等）により、所望の免疫原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞により分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性は、例えば、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定され得る。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析により決定され得る。
【００５３】
表面発現をアッセイすることによるか、または培養培地をアッセイすることによるかのいずれかによって、所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、選択されたハイブリドーマ細胞は、標準的な方法により増殖され得る。この目的のために適切な培養培地として、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭｅｄｉｕｍおよびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで増殖され得る。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「ハイブリドーマ細胞の集団」は、抗体を発現する細胞のパーセンテージが決定され得るような十分な数の細胞を意味する。この集団のハイブリドーマ細胞は、この系統の細胞の全てが特定の抗原に特異的な１つのみのモノクローナル抗体を産生する純粋なハイブリドーマ細胞株由来の細胞か、または複数のモノクローナル抗体を産生する細胞の混合物であり得る。従って、ハイブリドーマ細胞の集団は、１つより多いモノクローナル抗体を産生し得、その結果、いくつかの細胞は、１つの抗原を認識するモノクローナル抗体を産生し、そしてこの集団の他の細胞は、第２の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生し、そしてこの集団の他の細胞は、第３の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生する、などである。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「発現する」は、モノクローナル抗体が、当該分野で標準的な手段（例えば、現在当該分野で実施されているような、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、溶血アッセイ、蛍光活性化細胞分離（ＦＡＣＳ））により検出され得ることを意味する。
【００５６】
抗体は、代表的に、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質である。ネイティブの抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロテトラマー糖タンパク質である。代表的に、各々の軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各々の重鎖および軽鎖は、規則正しい間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有し得る。各々の重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））およびそれに続く多くの定常ドメインを有し得る。各々の軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））および他方の末端に定常ドメインを有し得る。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられている。任意の脊椎種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つの明らかに異なる型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）のうちの１つを割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスを割り当てられ得る。現在、５つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、そしてこれらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）に分類され得る。本発明は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβへの結合を通じて全ての免疫グロブリンクラスの提示を提供する。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００５７】
免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖遺伝子は、代表的に、複数のポリ（Ａ）部位を有する複雑な転写単位であり、切断およびポリアデニル化機構における変化がＢ細胞の部位特異的な発現において重要な役割を果たし得る。Ｉｇμ重鎖は、プレ、未成熟、成熟Ｂ細胞およびＩｇＭ＋形質細胞において発現され得る。α、ε、およびγ重鎖は、それぞれ、メモリー形質細胞ならびにＩｇＡ＋、ＩｇＥ＋、およびＩｇＧ＋形質細胞において発現され得る（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、１９９４）。５つのクラスのＩｇ重鎖遺伝子（α、δ、ε、γ、μ）の各々由来のＲＮＡは、選択的なプロセシングを受けて、２つの型のｍＲＮＡを生成し得る：１つは、Ｉｇタンパク質の分泌形態をコードし、形質細胞におけるプロモーターに近位の弱いＩｇ  ｓｅｃ（分泌特異的）ポリ（Ａ）部位の使用により産生される；もう一方のｍＲＮＡは、成熟Ｂ細胞またはメモリーＢ細胞の表面上の抗原に対する膜結合（ｍｂ）レセプターをコードし、そして、下流の強力なＩｇ膜ポリ（Ａ）部位の使用により産生され得る［Ａｌｔ、１９８０；Ｒｏｇｅｒｓ、１９８０；Ｒｏｇｅｒｓ、１９８１］。
【００５８】
異なるＢ細胞段階におけるＩｇ遺伝子の転写速度において、２〜５倍の変化が存在し得る（ＫｅｌｌｙおよびＰｅｒｒｙ、１９８６）。末端部位は、μにおいて変化し得る（Ｇａｌｌｉら、１９８７；Ｇｕｉｓｅら、１９８８；ＹｕａｎおよびＴｕｃｋｅｒ、１９８４）が、γおよびα遺伝子においては変化しない（Ｆｌａｓｐｏｈｌｅｒら、１９９５；ＦｌａｓｐｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９０；Ｌｅｂｍａｎら、１９９２）。ＲＮＡプロセシング事象は、１９８５年に最初に示されたように、２つの形態のＩｇＧ重鎖ｍＲＮＡの比率を決定する上で重要な役割を果たし得る（ＭｉｌｃａｒｅｋおよびＨａｌｌ、１９８５）。ＲＮＡプロセシングについての厳格な役割は、さらに実証されている（Ｅｄｗａｌｄｓ−ＧｉｌｂｅｒｔおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９５；Ｅｄｗａｌｄｓ−ＧｉｌｂｅｒｔおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９５；Ｆｌａｓｐｏｈｌｅｒら、１９９５；ＦｌａｓｐｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９０；Ｇｅｎｏｖｅｓｅら、１９９１；ＧｅｎｏｖｅｓｅおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９０；ＨａｌｌおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９８９；Ｋｏｂｒｉｎら、１９８６；Ｌａｓｓｍａｎら、１９９２；ＬａｓｓｍａｎおよびＭｉｌｃａｒｅｋ、１９９２；Ｍａｔｉｓら、１９９６；Ｍｉｌｃａｒｅｋら、１９９６を参照のこと）。（Ｅｄｗａｌｄｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９７）もまた参照のこと。弱い分泌特異的ポリ（Ａ）部位（膜特異的ポリ（Ａ）部位に対してプロモーター近位である）でのポリアデニル化および最後の分泌特異的なエキソンにおける最適以下のスプライス部位での膜特異的エキソンに対するスプライシングは、相互に相容れない事象であり得る。前駆体ＲＮＡの切断およびポリアデニル化における変化は、第１の弱いポリ（Ａ）部位の使用に対する形質細胞におけるバランスを壊すことが示される。
【００５９】
用語「可変」は、抗体間で配列が異なり、そして各々の特定の抗体のその特定の抗原への結合および特異性において使用される可変ドメインの特定の部分を記載するために本明細書中で使用される。しかし、可変性は、通常、抗体の可変ドメインを通して等しく分散していない。それは、代表的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントまたは軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方における超可変領域に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、３つのＣＤＲ（これらは、βシート構造を連結し、そしていくつかの場合、β−シート構造の一部を形成するループを形成する）により接続された４つのＦＲ領域（大部分が、βシート構造を取っている）を含み得る。各々の鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され得、そして他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与し得る（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）を参照のこと）。定常ドメインは、代表的に、抗体の抗原への結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存的細胞毒性における抗体の関与）を示す。
【００６０】
本明細書中で使用する場合「モノクローナル抗体」は、単一の抗体を産生する細胞型に全て由来する細胞により産生され、そして抗原に対する特異的な親和性を有する抗体をいう。モノクローナル抗体は、実質的に均一な集団の抗体から獲得される（すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異を除いて同一である）。本発明のハイブリドーマ細胞により分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー）により、培養培地または腹水液から単離または精製され得る。
【００６１】
一旦、本発明によりハイブリドーマが単離されると、ハイブリドーマの抗体コード領域は、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号または同第６，３３１，４１５号に記載される方法）によりモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として利用される。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いで、宿主細胞（例えば、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代りに置換することによるか（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得、１つの抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する第２の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体が作製される。
【００６２】
本発明はまた、２０よりも多いモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞を提供する。５０よりも多いモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞もまた、本発明により提供される。１００より多いモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞がさらに、本発明により提供される。本発明はまた、２５０よりも多いモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞を提供する。５００よりも多いモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞もまた、本発明により提供される。これらの数の間の抗体数もまた、提供される。
【００６３】
集団中の１５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００６４】
集団中の１５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【００６５】
集団中の１５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、１００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００６６】
本発明はまた、集団中の１５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。
【００６７】
集団中の１５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００６８】
集団中の２５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００６９】
集団中の２５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【００７０】
集団中の２５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、１００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７１】
本発明はまた、集団中の２５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。
【００７２】
集団中の２５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７３】
集団中の５０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７４】
集団中の５０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【００７５】
集団中の５０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、１００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７６】
本発明はまた、集団中の５０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。
【００７７】
集団中の５０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７８】
集団中の７５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００７９】
集団中の７５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【００８０】
集団中の７５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、１００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００８１】
本発明はまた、集団中の７５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。
【００８２】
集団中の７５％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００８３】
集団中の９０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００８４】
集団中の９０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【００８５】
集団中の９０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、１００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００８６】
本発明はまた、集団中の９０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、２５０個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団を提供する。
【００８７】
集団中の９０％より多くの細胞が、その細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現し、そして、５００個より多くのモノクローナル抗体分子が、発現され、かつその集団中のモノクローナル抗体を発現する細胞の細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。
【００８８】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約０．００１％〜約１０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００８９】
上記の細胞のパーセンテージと細胞当たりの抗体数との任意の組み合わせもまた提供され、特に列挙される細胞のパーセンテージおよび細胞当たりの抗体数の間の数も同様に提供される。
【００９０】
細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量は、当該分野の標準的な方法のうちのいずれか（これには、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光およびＦＡＣＳが挙げられるが、これらに限定されない）によって決定され得る。これらの方法を利用して、細胞によって培地中に分泌された抗体の量、細胞表面に結合した抗体の量、および細胞中に存在する細胞内抗体の量を測定する。当業者は、細胞によって産生される抗体の総量を得るために上記の技術もしくは当業者に公知の他の技術を用いてこれらの量を測定する方法を認識し、その結果、発現され、かつ細胞表面に結合した抗体の総量のパーセンテージが得られる。
【００９１】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約０．０１％〜約１０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９２】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約１０％〜約２０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９３】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約２０％〜約３０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９４】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約３０％〜約４０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９５】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約４０％〜約５０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９６】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約５０％〜約６０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９７】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約６０％〜約７０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９８】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約７０％〜約８０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【００９９】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約８０％〜約９０％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【０１００】
ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量のうちの約９０％〜約１００％が発現され、そして細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞もまた、本発明によって提供される。
【０１０１】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０２】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０３】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０４】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０５】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０６】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０７】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０８】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１０９】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１０】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団が、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％をその細胞表面上に発現する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１１】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１２】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１３】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１４】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１５】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１６】
集団中の１５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％をその細胞表面上に発現し、そして２０個より多くのモノクローナル抗体が、発現され、かつその細胞表面に結合する、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によってさらに提供される。集団中の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くのハイブリドーマ細胞が、そのハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％をその細胞表面上に発現し、そして、その集団の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くは、２０個より多くのモノクローナル抗体が発現されかつその細胞表面に結合するハイブリドーマ細胞である、ハイブリドーマ細胞の集団もまた、本発明によって提供される。
【０１１７】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％を発現し、そして２０個を超えるモノクローナル抗体が、発現されそしてその細胞表面に結合される。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、２０個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１１８】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％を発現し、そして２０個を超えるモノクローナル抗体が、発現されそしてその細胞表面に結合される。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、２０個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１１９】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％を発現し、そして２０個を超えるモノクローナル抗体が、発現されそしてその細胞表面に結合される。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、２０個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２０】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％を発現し、そして２０個を超えるモノクローナル抗体が、発現されそしてその細胞表面に結合される。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、２０個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２１】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約０．０１％〜約１０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２２】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約１０％〜約２０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２３】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約２０％〜約３０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２４】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約３０％〜約４０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２５】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約４０％〜約５０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２６】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約５０％〜約６０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２７】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約６０％〜約７０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２８】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約７０％〜約８０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１２９】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約８０％〜約９０％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１３０】
本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの１５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。本発明によって、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団において、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、細胞表面上にそのハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の総量の約９０％〜約１００％を発現し、そして、その集団中のハイブリドーマ細胞のうちの２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より多くが、５０個、１００個、２５０個または５００個を超えるモノクローナル抗体が発現されそしてその細胞表面に結合されるハイブリドーマ細胞である。
【０１３１】
本発明によって、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を含む、ハイブリドーマ細胞集団がまた提供され、この集団は、コントロール細胞（すなわち、標準的ハイブリドーマ細胞）よりも細胞表面上に約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍多くの抗体を有する。
【０１３２】
本発明によって、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、ハイブリドーマ細胞集団がさらに提供され、この集団において、そのモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、その細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度より少なくとも２倍大きい。
【０１３３】
本発明はまた、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、この集団において、そのモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、その細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍またはその間の任意の量大きい。その蛍光強度の増加倍数はまた、上記に列挙した増加倍数の間の任意の量であり得る。その蛍光強度の増加倍数は、当該分野で標準的な方法および実施例において本願明細書中に記載される方法によって、測定され得る。
【０１３４】
蛍光強度を測定するために利用され得るハイブリドーマ細胞の集団は、２５個の細胞と５００個の細胞との間であり得る。従って、その集団は、約２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個の細胞、またはこれらの値の間の任意の数の細胞であり得る。
【０１３５】
この集団中のハイブリドーマは、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含み得る。
【０１３６】
本発明によって、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、ハイブリドーマ細胞集団がさらに提供され、この集団において、そのモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、それらの細胞のうちの少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度より少なくとも２倍大きい。
【０１３７】
本発明はまた、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、この集団において、そのモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、それらの細胞のうちの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの間の任意のパーセンテージの蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度より少なくとも２倍大きい。
【０１３８】
本発明はまた、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、ハイブリドーマ細胞集団を提供し、この集団において、そのモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、それらの細胞のうちの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの間の任意のパーセンテージの蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まないハイブリドーマ細胞集団の蛍光強度より少なくとも２倍、３倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１，０００倍またはこれらの間の任意の量大きい。
【０１３９】
さらに、本発明によって、ベクターを含むハイブリドーマ細胞が提供され、この細胞において、そのベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。従って、このハイブリドーマは、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含み得るか、またはこのハイブリドーマは、Ｉｇβをコードする核酸を含むベクターを含み得るか、またはこのハイブリドーマは、Ｉｇαをコードする核酸およびＩｇβをコードする核酸の両方を含み得る。ＩｇαまたはＩｇβをコードする核酸は、単一のベクター中に存在しても、または複数のベクター中に存在してもよい。例えば、このハイブリドーマは、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターとＩｇβをコードする核酸を含むベクターとを含み得るか、またはＩｇαの核酸配列およびＩｇβの核酸配列の両方を含むベクターを含み得る。これらのベクターのいずれかが、上記細胞のゲノム中に組み込まれ得るか、またはＩｇαおよび／またはＩｇβの一過性発現が可能であるように染色体外に保有され得る。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡでもあっても、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい、一本鎖または複数鎖の分子を指し、それらの核酸に対する改変を包含する。この核酸は、コード鎖もしくはその相補体、またはそれらの任意の組み合わせを示し得る。核酸は、本明細書中に考察されるＩｇαレセプターおよびＩｇβレセプターについて天然に存在する配列と、配列が同一であり得るか、または天然に存在する配列中に見出されるのと同じアミノ酸をコードする代替的コドンを含み得る。その核酸が機能的レセプターをコードする限り、欠失、置換、変異、およびそれらの組み合わせを含む、Ｉｇαをコードする核酸配列およびＩｇβをコードする核酸配列もまた、企図される。これらの核酸はまた、その代表的構造から改変され得る。そのような改変としては、メチル化核酸、硫黄によるリン酸残基上の非結合酸素の置換（ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドを生じる）、セレニウムによるリン酸残基上の非結合酸素の置換（ホスホルセレノエートデオキシヌクレオチドを生じる）、またはメチル基によるリン酸残基上の非結合酸素の置換（メチルホスホネートデオキシヌクレオチドを生じる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
Ｉｇαレセプターの核酸配列は、登録番号ＮＭ＿００７６５５を介してＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、この核酸配列によりコードされるポリペプチドは、登録番号ＮＰ＿０３１６８１を介してＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。本明細書中に記載される実施例において利用されたＩｇαをコードする核酸配列は、登録番号ＮＭ＿００７６５５を介してＧｅｎＢａｎｋから入手可能本来のＩｇαレセプターとは異なるが、Ｓａｋａｇｕｃｈｉらにより提供される配列と一致する。この配列は、図３に提供される。
【０１４２】
Ｉｇαをコードする核酸分子およびＩｇβをコードする核酸分子は、それが通常見出される生物から単離され得る。例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーが、目的の核酸の存在下で構築およびスクリーニングされ得る。このようなライブラリーを構築およびスクリーニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてその構築工程およびスクリーニング工程を実施するためのキットは、市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。一旦単離されると、その核酸は、適切なベクター中に直接クローニングされ得るか、または必要な場合は、その後のクローニング工程を容易にするように改変され得る。このような改変工程は、慣用的であり、その例は、制限酵素切断部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーをその核酸の末端に付加することである。一般的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に示されている。
【０１４３】
一旦、所望のＩｇαおよび／またはＩｇβの核酸配列が得られると、特定のアミノ酸をコードする配列が、当該分野で周知の技術によって、任意の特定のアミノ酸一で改変または変化され得る。例えば、そのアミノ酸位置に広がり、かつ任意のアミノ酸を別のアミノ酸で置換し得る、ＰＣＲプライマーが設計され得る。その後、核酸は、増幅され、そして野生型レセプターコード配列中に挿入され得、そのレセプターの任意の位置のアミノ酸の多数の可能な組み合わせが得られ得る。あるいは、当業者は、点変異誘発のための技術を介して、特定の核酸配列中の任意の点にて特異的変異を誘導し得る。一般的方法は、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，１９：４２３−４６２（１９８５）およびＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．「Ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１：６０５−６１０（１９９１）に示される。これらのような技術は、コードされるアミノ酸配列を変更することなく、コード配列を変更するために使用され得る。
【０１４４】
ＩｇαをコードするＤＮＡ分子を得る方法の別の例は、Ｉｇαをコードする組換えＤＮＡ分子を合成することである。Ｉｇβをコードする核酸もまた、この様式で得られ得る。例えば、オリゴヌクレオチド合成手順は、当該分野で慣用的であり、そして特定のタンパク質領域をコードするオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成を介して容易に入手可能である。二本鎖分子のうちの１本の核酸が、合成され得、そしてその相補鎖にハイブリダイズされ得る。生じる二本鎖分子が、適切なベクター中へのクローニングのために、内部制限酵素切断部位または末端に適切な５’突出もしくは３’突出のいずれかを有するように、これらのオリゴヌクレオチドを設計し得る。比較的大きなタンパク質をコードする二本鎖分子が、まず、そのタンパク質の特定の領域をコードするいくつかの異なる二本鎖分子を構築すること、ついで、これらの分子を一緒に連結することによって、容易に合成され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１３３０−１３３６（１９８９）は、まず、重複する相補的合成オリゴヌクレオチドを構築し、これらのフラグメントを一緒に連結することによって、ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする合成遺伝子を構築した。また、Ｆｅｒｒｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５９９−６０３（１９８６）も参照のこと。Ｆｅｒｒｅｔｉｉらにおいて、合成オリゴヌクレオチドからの１０５７塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成が、開示されている。この様式で核酸を構築することによって、当業者は、ＩｇαまたはＩｇβ内の任意の特定の位置に所望のアミノ酸を有する、任意の特定のＩｇαまたはＩｇβを容易に入手し得る。また、合成遺伝子を作製する酵素鋳型反応方法を記載する、米国特許第５，５０３，９９５号も参照のこと。このような技術は、当該分野で慣用的であり、そして十分に記載されている。その後、これらの核酸またはＩｇαもしくはＩｇβをコードする核酸のフラグメントが、下記のようにインビボまたはインビトロで発現され得る。同様に、核酸または核酸フラグメントが、インビボまたはインビトロで発現され得る。
【０１４５】
一旦、Ｉｇαをコードする核酸またはその核酸の領域が、構築され、修飾され、または単離されると、その核酸は、適切なベクターにクローン化され得、その核酸は、その野生型および／または改変されたＩｇαレセプタータンパク質のインビボまたはインビトロの合成を指向し得る。また、一旦、Ｉｇαをコードする核酸またはその核酸の領域が、構築され、修飾され、または単離されると、その核酸は、適切なベクターにクローン化され得、その核酸は、その野生型および／または改変されたＩｇβレセプタータンパク質のインビボまたはインビトロの合成を指向し得る。そのベクターは、その挿入された遺伝子または核酸の転写を指向または調節するのに必要な機能エレメントを有することが企図される。これらの機能エレメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロモーター、そのプロモーターの上流または下流の領域（例えば、そのプロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサー）、複製起点、そのプロモーターに隣接する挿入物のクローニングを容易にする適切な制限部位、そのベクターを含む細胞またはその挿入物を含むベクターを選択する役割を担い得る抗生物質抵抗性遺伝子または他のマーカー、ＲＮＡスプライスジャンクション、転写停止領域あるいは挿入された遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現を容易にすることを担い得る任意の他の領域（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。Ｉｇαおよび／またはＩｇβの余分なコピーをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、Ｉｇαおよび／またはＩｇβがそのレセプターの発現の増大を生じる限り、さらなる機能エレメント（例えば、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ）の非存在下で、直接的に細胞にトランスフェクトし得た。
【０１４６】
本発明のＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含むベクターは、当該分野において公知であるような真核生物細胞における核酸の発現に適切な任意のベクターであり得る。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１  ＮｅｏＲベクターまたはｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）が、使用され得る。他のベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製２ベクター誘導系（ｐＩＮＤプラスミドおよびｐＶｇＲＸＲプラスミド）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製２ベクター誘導系（ｐＴｅｔ−ＯＮプラスミドまたはｐＴｅｔ−ＯｆｆプラスミドおよびｐＴＲＥ２プラスミド）、Ｐｒｏｍｅｇａ製の構成性発現のための単一プラスミド（ｐＣＩプラスミドベクターまたはｐＳＩプラスミドベクター）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製２ベクター誘導系（ｐＣＭＶＬａｃＩプラスミドおよびｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳプラスミド）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製の単一プラスミド誘導系（ｐＥＲＶ３プラスミドまたはｐＥＧＳＨプラスミド）ならびにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製の単一レトロウイルス誘導系（ｐＣＦＢ−ＥＧＳＨレトロウイルスまたはｐＦＢ−ＥＲＶレトロウイルス）。このベクターはまた、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプレトロウイルスベクター（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）またはポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター）のようなウイルスベクターであり得る。
【０１４７】
本発明はまた、ベクターを含むハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。従って、本発明は、変異Ｉｇαレセプターをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞、変異Ｉｇβレセプターをコードする核酸を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞、ならびに変異Ｉｇαレセプターをコードする核酸および変異Ｉｇβレセプターをコードする核酸の両方を含むベクターを含むハイブリドーマ細胞、を提供する。
【０１４８】
変異Ｉｇαレセプターおよび変異Ｉｇβレセプターは、変化した細胞質ドメインを有する非シグナル伝達レセプターを含む。このような変異レセプターの例は、アミノ酸残基１７６、１８２、１９３、および２０４で変異を含むＩｇαレセプターである。本発明の変異したＩｇαレセプターはまた、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３ＦおよびＹ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異したＩｇαを含む。本発明によってさらに提供されるのは、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を含む変異したＩｇαレセプターである。変異表面発現抗原レセプターの別の例は、アミノ酸残基１９０および２０６で変異を含む変異したＩｇβレセプターである。本発明の変異したＩｇβレセプターはまた、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される、１以上の変異を含む変異Ｉｇβレセプターを含む。このＩｇαおよびＩｇβについて、本明細書中に記載されるこれらの変異は、このレセプターが、抗体を結合する能力を保持するが、シグナル伝達レセプターとして作用し得ないように設計される。当業者は、上記のようなＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を操作する方法ならびに本明細書中で記載される変異レセプターおよび他の変異レセプターを得るための当該分野で公知の他の技術を知っている。
【０１４９】
本発明はまた、ベクターを含むハイブリドーマ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つのキメラ表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。この用途に使用されるとき、「キメラ」とは、その細胞表面レセプターが、ある種（例えば、ヒト）のレセプター配列および別の種に由来する配列および別の種由来のレセプター配列を含み得ることを意味する。例えば、キメラＩｇαは、ヒトＩｇα細胞外ドメインならびにマウスＩｇα膜貫通ドメインおよびマウス細胞内（細胞質）ドメインを含み得るか、または、キメラＩｇαは、ヒトＩｇα細胞外ドメインおよびヒト膜貫通ドメインならびにマウス細胞内ドメインを含み得る。同様に、キメラＩｇβは、ヒトＩｇβ細胞外ドメインならびにマウスＩｇβ膜貫通ドメインおよびマウス細胞内ドメインを含み得るか、または、キメラＩｇβはヒトＩｇβ細胞外ドメインおよびヒト膜貫通ドメインならびにマウス細胞内ドメインを含み得る。他の種（例えば、ニワトリ、イヌ、ウサギ、ラット、スナネズミおよびハムスター）に由来するレセプター配列はまた、本発明のキメラレセプターを作製するために使用され得る。キメラレセプターの他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウサギＮ末端細胞外レセプタードメイン、マウス膜貫通ドメインおよびマウスＣ末端細胞内ドメインを含む、キメラＩｇαレセプターまたはキメラＩｇβレセプター；ニワトリＮ末端ドメイン、マウス膜貫通ドメイン、およびマウスＣ末端ドメインを含む、キメラレセプター；マウスＮ末端細胞外ドメイン、ニワトリ膜貫通ドメインおよびニワトリＣ末端細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラレセプター；マウスＮ末端細胞外ドメイン、ウサギ膜貫通ドメインおよびヒトＣ末端細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラレセプター；マウスＮ末端細胞外ドメイン、ヒト膜貫通ドメインおよびマウス由来の変異Ｃ末端細胞内非シグナル伝達ドメインを含むキメラレセプター。
【０１５０】
本発明のキメラレセプターはまた、ＩｇαまたはＩｇβ由来の配列および別の非関連配列を含むキメラレセプターも含む。例えば、本発明は、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインＩｇαドメインおよび細胞内Ｉｇドメインを伴って、非関連タンパク質（例えば、ＣＤ８または任意の他のタンパク質）由来の細胞外ドメインを含むキメラＩｇαレセプターを企図する。
【０１５１】
本発明はさらに、ベクターを含むハイブリドーマ細胞を提供し、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、ここで、この核酸は、誘導的な機能発現配列に連結する。
【０１５２】
ＩｇαおよびＩｇβをコードする全ての配列は、発現配列に機能的に連結する。この発現配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ならびに必要な情報処理部位（例えば、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写停止配列）を含み得る。使用されるプロモーターは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。
【０１５３】
本発明の組成物および方法のために使用され得る誘導性発現系は、ＩＰＴＧに基づく調節系、テトラサイクリンに基づく調節系、ＣＩＤに基づく調節系、エクジソンに基づく調節系、およびエストロゲンに基づく調節系を含む。Ｂｕｒｃｉｎら，”Ａ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ，３：１−７（１９９８）は、これらの系を、詳細に記載し、これらの誘導性発現系を記載する目的のために、本明細書中でその全体が参考として援用される。使用され得る別の誘導系は、ｃｒｅ−ｌｏｘ系である（Ｌａｋｓｏ”Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：６８６１−６５（１９９２）；Ｏｒｂａｎら，”Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６８６１−６５（１９９２）；Ｇｕら，”Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３−１０６（１９９４）を参照のこと）。本発明の核酸はまた、誘導性メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターの制御下であり得る（ＣｏｘおよびＭａｎｅｓｓ”Ｎｅｕｒｉｔｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖ−ｓｒｃ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  ＰＣ１２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ”Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９５：４２３−３１（１９９１）を参照のこと）。
【０１５４】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される、少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含むベクターを含むことに加えて、本発明のハイブリドーマはまた、分泌形態の免疫グロブリンＭ発現を阻害することに関連する酵素であるＵ１Ａをコードする核酸を含むベクターを含み得る（Ｐｈｉｌｉｐｓら，”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍＲＮＡ”，  ＥＭＢＯ  ２２：６４４３−６４５２（２００１）を参照のこと）。
【０１５５】
この用途において記載される全てのハイブリドーマ細胞は、目的のモノクローナル抗体を作製するために本明細書中に記載される方法において使用され得る。
【０１５６】
（ハイブリドーマの作製方法）
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を作製する方法もまた、本発明によって提供され、この方法は、ベクターを含む骨髄腫細胞とＢ細胞とを融合して、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを含むハイブリドーマ細胞を生成する工程であって、このベクターがＩｇαおよび／またはＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む、工程を包含する。
【０１５７】
本発明のハイブリドーマ細胞を作製する方法において、このベクターは、細胞のゲノムに組みまれ得る。このベクターはまた、この細胞内で染色体外に保持され得、従って、ＩｇαおよびＩｇβの一過性発現を可能にし得る。本発明のハイブリドーマを作製する方法において、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結し得る。誘導性発現系は、上記において議論される。
【０１５８】
本発明の骨髄腫細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含み得、ここで、この表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結する。本発明の骨髄腫細胞はまた、変異Ｉｇαレセプターおよび／または変異Ｉｇβレセプターを含み得る。このような変異レセプターの例は、アミノ酸残基１７６、１８２、１９３、および２０４において変異を含むＩｇαレセプターである。本発明の変異Ｉｇαはまた、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３ＦおよびＹ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異されたＩｇαを含む。本発明によってさらに提供されるものは、アミノ酸１７６〜２２０の欠失を含む変異Ｉｇαレセプターをコードする核酸を含む骨髄腫細胞である。変異表面発現抗体レセプターの別の例は、アミノ酸残基１９０および２０６での変異を含む変異Ｉｇβレセプターである。本発明の変異Ｉｇβレセプターはまた、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇβレセプターを含む。本発明の骨髄腫細胞は、変異Ｉｇαレセプターをコードするベクターを含む骨髄腫細胞、変異Ｉｇβレセプターを含むベクターを含む骨髄腫細胞、または変異Ｉｇαレセプターおよび変異Ｉｇβレセプターを含むベクターを含む骨髄腫細胞であり得る。
【０１５９】
本発明の方法において使用される骨髄腫細胞はまた、キメラＩｇαレセプターおよび／またはキメラＩｇβレセプターをコードする核酸を含み得る。
【０１６０】
（Ｂ細胞）
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される、少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む。従って、本発明のＢ細胞は、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターまたはＩｇβをコードする核酸を含むベクター、あるいはＩｇαおよびＩｇβの両方をコードする核酸を含むベクターを含み得る。
【０１６１】
本発明のＢ細胞はまた、変異Ｉｇαレセプターおよび／または変異Ｉｇβレセプターをコードする核酸を含むベクターを含み得る。このような変異レセプターの例は、アミノ酸残基１７６、１８２、１９３および２０４での変異を含むＩｇαレセプターである。本発明の変異Ｉｇαレセプターはまた、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３ＦおよびＹ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇαを含む。アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を含む変異Ｉｇαレセプターをコードする核酸を含むベクターを含むＢ細胞が、本発明によってさらに提供される。変異表面発現抗体レセプターの別の例は、アミノ酸残基１９０および２０６での変異を含む変異Ｉｇβレセプターである。本発明の変異Ｉｇβレセプターはまた、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を含む変異Ｉｇβレセプターも含む。本発明のＢ細胞は、変異Ｉｇαレセプターをコードするベクターを含むＢ細胞、変異Ｉｇβレセプターをコードするベクターを含むＢ細胞、または変異Ｉｇαレセプターおよび変異Ｉｇβレセプターをコードするベクターを含むＢ細胞であり得る。本発明のＢ細胞はまた、キメラＩｇαレセプターおよび／またはキメラＩｇβレセプターをコードする核酸を含み得る。
【０１６２】
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸を含み、ここで、ＩｇαおよびＩｇβをコードするこの核酸は誘導性発現配列に機能的に連結し、そして、ここで、ＩｇαおよびＩｇβをコードするこの核酸は、この細胞のゲノムに組み込まれる。このようなＢ細胞は、本明細書に記載のトランスジェニック動物から得られ得る。
【０１６３】
本発明はまた、ベクターを含むＢ細胞を作製する方法を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含み、この方法は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含むベクターでＢ細胞をトランスフェクトする工程を包含し、ここで、この表面発現抗体レセプターをコードする核酸は機能的に発現配列に連結している。本発明のＢ細胞を作製する方法において、ＩｇαおよびＩｇβをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結され得る。本発明のＢ細胞を作製する方法において、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含むベクターは、このＢ細胞のゲノムに組み込まれ得る。あるいは、このベクターは、この細胞のゲノムに組み込まれず、そして、このベクターは、染色体外に保持され、Ｉｇαおよび／またはＩｇβの一過性発現を可能にする。
【０１６４】
本発明のベクターは、当該分野で公知の任意の技術を使用して細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達および粒子銃衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が、全て、細胞へのベクター送達を行うために使用され得る。
【０１６５】
動物の脾臓から取り出したＢ細胞をトランスフェクトするために、Ｂ細胞を２４〜４８時間、これらが分裂するように、培養物の中で増殖させる。次いで、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能にコードする少なくとも１つの核酸を含む核酸を含むレトロウイルスベクターは、この細胞にトランスフェクトされ得る。増殖を促進するために、サイトカインが、この培養物に添加され得る。これらの方法において使用され得るサイトカインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、および／またはＴＧＦ−β。次いで、これらの細胞表面に結合した抗体を産生するＢ細胞は、当該分野で公知であり、そして、本明細書中に記載される方法（例えば、ＦＡＣＳ、細胞パニング、ＥＬＩＳＡ、など）によって検出され得る。あるいは、例えば、以下のようなウイルスベクターが、Ｂ細胞をトランスフェクトするために使用され得る；アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ワクシニアウイルスベクター、シュードタイプレトロウイルスベクター。当業者は、ベクターによってトランスフェクトされる能力についてＢ細胞を試験して、これらの細胞に核酸を導入するのに最も適切なベクターを選択する方法を理解している。当業者はまた、本発明のＢ細胞を操作し、特定のベクターによって認識される細胞表面レセプターを産生し得る。例えば、本発明のＢ細胞は、アデノウイルスに対する細胞表面レセプターが、このＢ細胞表面上に存在させ、このＢ細胞へのこのアデノウイルスベクターの侵入を容易にするように、操作され得る。あるいは、このＢ細胞に導入された（ＩｇαおよびＩｇβ以外の）レセプターに結合するリガンドを含む、ウイルスベクターがまた、ベクター移入を行うために使用され得る。これらの細胞表面レセプターの存在は、本明細書または当該分野のほかの場所に記載される、誘導性発現系によって制御され得、その結果、トランスフェクション後に、ウイスルの侵入に必要な細胞表面レセプターの発現は、もはや誘導されず、従って、このレセプターは、もはや、このＢ細胞の細胞表面に発現されない。次いで、これらのＢ細胞は、不死化細胞（例えば、天然に存在する骨髄腫細胞）または遺伝的に改変された骨髄腫細胞（例えば、目的のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を作製するために本明細書中で提供された骨髄腫細胞株）と融合され得る。あるいは、この抗体のアミノ酸配列もしくはその所望の一部分（例えば、このようなＢ細胞によって産生された可変領域）、またはこのような抗体もしくはその一部分をコードする核酸（ｃＤＮＡ）が、決定または単離され得る。次いで、このようなＤＮＡ配列は、このような抗体の発現および分泌を指向するベクターに取りこまれ得、そして、このようなベクターは、宿主細胞（例えば、骨髄腫または他の適切な不死化細胞）にトランスフェクトされ得る。このような抗体配列決定をトランスフェクトし、そして、発現するための技術は、米国特許第５，６２７，０５２号および米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている。
【０１６６】
本発明のＢ細胞はさらに、検出可能な標識を含み得る。
【０１６７】
本発明はまた、テロメラーゼをコードする核酸でＢ細胞をトランスフェクトすることによって作製される不死化Ｂ細胞を提供する（Ｂｕｎｋ”Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １４：１９（２０００）を参照のこと）。不死化Ｂ細胞は、増強されたテロメラーゼ発現に加え、ｐＲＢ／ｐｌ６（ＩＮＫ４ａ）を不活化することによって、作製され得る（Ｋｉｙｏｎｏら，１９９８；Ｄｉｃｋｓｏｎら，２０００を参照のこと）。さらに、不死化細胞は、ｃ−ｍｙｃおよびシミアンウイルス４０ラージＴ抗原を過剰発現することによって作製され得る（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，１９９９；Ｋｉｍら，２００１）。不死化Ｂ細胞はまた、サイクリンＤ１を過剰発現させ、かつｐ５３を不活化することによって（Ｏｐｉｔｚら，２００１を参照のこと）か、あるいは、ＳＶ４０ラージＴ抗原のみを過剰発現することによって（Ｒｕｓｓｏら，１９９８）、作製され得る。Ｂ細胞を不死化する他の方法として、ｒａｓ遺伝子を過剰発現すること、ならびにヒト乳頭腫ウイルス１６Ｅ６遺伝子およびヒト乳頭腫ウイルスＥ７ウイルスを過剰発現することが挙げられる（Ｃｏｕｒｓｅｎら，１９９７を参照のこと）。使用され得る遺伝子の別の組み合わせは、ｈＴＥＲＴ、ｓｖ４０ラージＴ癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）およびＨｒａｓの癌対立遺伝子である。
【０１６８】
いくつかの用途のために、１つ以上のＩｇレセプターを発現し得、かつ不死化しているＢ細胞を作製することが所望され得る。これを達成するための１つの手段は、１つ以上の不死化遺伝子についてトランスジェニック性である動物由来の胚を使用することである。このような動物の１つのは、ＩＭＭＯＲＴＯＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスであり、これは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている。このようなマウスは、ほとんどの細胞において温度感応性ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を有している。当業者は、不死化Ｂ細胞は、ｈＴＥＲＴまたはＨ  ｒａｓのような上述の細胞を不死化することが知られているさらなる遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用することによって、取得され得ることを認識する。
【０１６９】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含むベクターを含むことに加えて、本発明のＢ細胞はまた、Ｕ１Ａをコードする核酸を含むベクターを含み得、このＵ１Ａは、分泌形態の免疫グロブリンＭの発現を阻害することに関連する酵素である（Ｐｈｉｌｉｐｓら、”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍＲＮＡ”，ＥＭＢＯ  ２２：６４４３−６４５２（２００１）を参照のこと）。
【０１７０】
本明細書中に記載のベクターを含むＢ細胞の全ては、ハイブドーマを作製するための骨髄腫細株または他の不死化細胞株に融合され得る。得られるハイブリドーマ細胞は、本明細書中に記載の目的のモノクローナル抗体を作製する方法において使用され得る。
【０１７１】
（形質細胞）
代表的なマウスの脾臓において、約１０８のＢ細胞が存在する。このようなＢ細胞表面の約９９％が、抗体を提示する。しかし、このような細胞のうちの１％の細胞、すなわち１０６の細胞は、形質細胞であり、そして、代表的な表面は、ごく微量の抗体のみを提示する。形質細胞は、特定の標的抗原に対して、高度に特異的であり、かつ強い親和性のある免疫グロブリンを産生することが知られている。本発明は、単一の細胞が、標的抗原と反応する免疫グロブリンを産生しているか否かを決定するのに使用されるハイスループットな蛍光活性化細胞分類技術を可能にする十分な量の免疫グロブリンを表面提示する、形質細胞の集団を提供する。このような形質細胞は、任意の動物（例えば、本明細書中で提供されるようなトランスジェニック動物）から得られ得、そして、そのＢ細胞内でヒト抗体をコードする核酸を発現するトランスジェニック動物から単離される場合、完全ヒト免疫グロブリンを産生し得る。
【０１７２】
上述のように、形質細胞は、標的抗原に対して非常に特異的、高親和性の抗体を作製する。従って、形質細胞を分類する前のＢ細胞の大きな集団から形質細胞を単離し、所望の抗体を産生する細胞を同定することが所望され得る。マーカーＳＹＮＤＥＣＡＮ−１は、他のＢ細胞よりも形質細胞において高度に発現される。さらに、形質細胞は、ＩＧＤもＢ２２０も発現しないが、他のＢ細胞は、両方のマーカーを発現する。ＳＹＮＤＥＣＡＮ、ＩＧＤおよびＢ２２０についての市販の抗体が、利用可能であり、そしてこれらの３つのマーカーは、当該分野で公知の手段によって、Ｂ細胞集団から形質細胞を分離するために当業者によって使用され得る。形質細胞はまた、密度に基づく遠心分離によって他の細胞から分離され得、ここで、形質細胞を含む画分は、溶離器（ｅｌｕｔｒｉａｔｏｒ）を使用して回収される。あるいは、精製された形質細胞集団は、分離／精製カラム（例えば、磁気ビーズを使用するカラム）を使用して達成され得る。
【０１７３】
本発明は、形質細胞集団を提供し、ここで、この集団中の５％より多い細胞が細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現する。また、本発明によって提供されるものは、集団中の細胞の、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のより多い細胞が、細胞表面に結合するモノクローナル抗体を発現する形質細胞集団である。
【０１７４】
本発明はまた、形質細胞を提供し、ここで、２０を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている。５０を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている形質細胞もまた、本発明により提供される。１００を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている形質細胞が、本発明によりさらに提供される。本発明はまた、２５０を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている形質細胞を提供する。５００を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている形質細胞もまた、本発明により提供される。
【０１７５】
本発明により、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、形質細胞の集団がさらに提供される。ここで、このモノクローナル抗体が、蛍光により検出される場合、この細胞の集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞の集団の蛍光強度より、少なくとも２倍大きい。
【０１７６】
本発明はまた、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、形質細胞の集団を提供する。ここで、モノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、この細胞集団の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞の手段の蛍光強度より、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１００倍、２５０倍、５００倍または１０００倍大きい。この蛍光強度の倍数はまた、上記の倍数の増加の間の任意の量であり得る。蛍光強度の倍数増加は、当該分野で標準的な方法により測定され得、実施例で本明細書中に記載される。
【０１７７】
蛍光強度を測定するために利用される形質細胞の集団は、２５細胞と５００細胞との間であり得る。従って、この集団は、約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００細胞またはこれら値の間の任意の細胞数であり得る。
【０１７８】
集団中の形質細胞は、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターを含み得る。
【０１７９】
本発明により、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、形質細胞の集団がさらに提供される。ここでモノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、細胞の少なくとも１０％の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞の集団の蛍光強度より、少なくとも２倍大きい。
【０１８０】
本発明はまた、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、形質細胞の集団を提供し、ここで、モノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の割合の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞の手段の蛍光強度より、少なくとも２倍である。
【０１８１】
本発明はまた、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含む、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する、形質細胞の集団を提供し、ここで、モノクローナル抗体が蛍光により検出される場合、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の割合の蛍光強度は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβをコードする核酸を含むベクターを含まない形質細胞の集団の蛍光強度より、少なくとも２倍、３倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、またはその間の任意の量である。
【０１８２】
本明細書中に記載の形質細胞の集団の全ては、本発明により提供される抗体を作製する方法において利用され得る。その結果、本発明の形質細胞は、単離され得、引き続き生成され得るモノクローナル抗体生成細胞を同定するために、抗原と接触され得る。
【０１８３】
（骨髄腫細胞）
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞を提供する。ここで表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１８４】
本発明により、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異した表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞がさらに提供される。ここで、表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１８５】
本発明により、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞もまた提供される。ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１８６】
本発明により、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞がさらに提供される。ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１８７】
本発明はさらに、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇβレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞を提供する。ここで表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１８８】
本発明により提供されるベクターを含む骨髄腫細胞はいずれも、Ｂ細胞（本発明のベクターを含むＢ細胞を含む）と融合されて、ハイブリドーマ細胞が作製される。次いで、得られたハイブリドーマ細胞は、本明細書中に記載のモノクローナル抗体を作製する方法において使用され得る。
【０１８９】
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞を作製する方法を提供する。ここで表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。この方法は、骨髄腫細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される数なくとも１つの表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸で、トランスフェクトする工程を包含し、ここで、表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１９０】
本発明はまた、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異した表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞を作製する方法を提供する。ここで、表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。この方法は、骨髄腫細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異した表面発現抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここで表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１９１】
本発明により、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞を作製する方法がさらに提供される。ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。この方法は、骨髄腫細胞を、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここで表面発現抗体レセプターは、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１９２】
本発明は、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇβレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞を作製する方法を提供する。ここで表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。この方法は、骨髄腫細胞を、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される１以上の変異を有する変異Ｉｇβレセプターを機能的にコードする核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１９３】
本発明は、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸を含む骨髄腫細胞を作製する方法を提供する。ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。この方法は、骨髄腫細胞を、アミノ酸残基１７６〜２２０の欠失を有する変異Ｉｇαレセプターを機能的にコードする核酸でトランスフェクトする工程を包含し、ここでこの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、誘導性発現配列に機能的に連結されている。
【０１９４】
ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含むベクターを含むことに加えて、本発明の骨髄腫細胞はまた、免疫グロブリンＭの分泌形態の発現を阻害することに関与する酵素Ｕ１Ａをコードする核酸を含むベクターを含む（Ｐｈｉｌｉｐｓら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｍＲＮＡ」ＥＭＢＯ  ２２：６４４３−６４５２（２００１）を参照のこと）。
【０１９５】
本発明はまた、骨髄腫細胞または他の不死化細胞を、それらの表面上のＩｇαおよびＩｇβの存在についてスクリーニングする方法を提供する。ＩｇαおよびＩｇβを天然に発現する骨髄腫細胞または不死化細胞が同定されると、この細胞は、Ｂ細胞と融合されて、それらの細胞表面にモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞が生成される。Ｉｇαを天然に発現する骨髄腫細胞または不死化細胞が同定されると、この細胞は、本発明のＢ細胞と融合されて、それらの細胞表面にモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞が生成される。あるいは、この細胞は、Ｉｇβをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされ得、次いで、それらの細胞表面にモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を生成するために、Ｂ細胞と融合され得る。Ｉｇβを天然に発現する骨髄腫細胞または不死化細胞が同定されると、この細胞は、本発明のＢ細胞と融合されて、それらの細胞表面にモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞が生成され得る。あるいは、この細胞は、Ｉｇαをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされ得、次いで、それらの細胞表面にモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞を生成するためにＢ細胞に融合され得る。
【０１９６】
骨髄腫細胞はまた、骨髄腫細胞のどれが、ハイブリドーマを作製するために適切な融合パートナーであるかを決定するためにスクリーニングされ得る。当業者は、どの骨髄腫細胞がＢ細胞と融合するに最も適しているかを決定するために、Ｉｇαおよび／またはＩｇβの存在についてスクリーニングする前または後のいずれかに、所望の融合特徴について骨髄腫細胞をどのように試験するかを分かっている。あるいは、一旦骨髄腫細胞または不死化細胞が融合に適しているとみなされると、この骨髄腫細胞は、Ｂ細胞と融合する前にＩｇαおよび／またはＩｇβでトランスフェクトされ得る。さらに、ＨＡＴ選択が必要ないので、所定のプロトコルにおけるＢ細胞についての融合パートナーとして使用される細胞の本発明者の選択は、大きく拡げられる。ＤＩＳＨを使用すると、骨髄腫または他の候補融合パートナーは、今日使用されている標準的な骨髄腫を超える、より大きな細胞節約（ｃｅｌｌ  ｓｐａｒｉｎｇ）であるかまたは他の利点を提供することが同定され得る。
【０１９７】
（モノクローナル抗体を作製する方法）
本発明は、以下の工程を包含する、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供する：ａ）ハイブリドーマ細胞の集団（ここで、この集団中の細胞の１５％超が細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する）を検出可能な標識に連結された抗原（ここでこの抗原は、モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を生じる）と接触させる工程；ｂ）検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離して、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ｃ）目的のモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞から作製する工程。
【０１９８】
また、目的のモノクローナル抗体を作製する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞の集団（ここで、この集団中の細胞の１５％超が細胞表面に結合したモノクローナル抗体を発現する）を抗原と接触させる工程であって、その抗原は、そのモノクローナル抗体と結合する、工程；ｂ）検出可能な標識を抗原に付加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得る工程；ｃ）この検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ｄ）このハイブリドーマ細胞から目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【０１９９】
本明細書中に記載のモノクローナル抗体を作製する方法において、抗原／抗体複合体が形成され得る条件、ならびに抗原／抗体複合体の形成の検出のためのアッセイおよび検出されたタンパク質の定量のためのアッセイは、当該分野で標準的である。このようなアッセイとしては、当業者に周知であるように、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光、免疫細胞化学、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫磁性アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｃｏｌｉｇａｎら，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））、凝集アッセイ、フロキュレーション（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）アッセイ、細胞パニング、磁性分離など。
【０２００】
本発明の抗原は、基材（例えば、ビーズ、チューブ、スライド、プレート、ニトロセルロースシートなど）に結合され得るか、または検出可能な標識（部分）と結合体化され得るか、または両方が結合体化され得る。本発明について意図される検出可能な部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：免疫蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン）、放射活性部分（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ）、酵素部分（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、金コロイド部分、色素およびビオチン部分。このような結合体化技術は、当該分野で標準である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｙａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：３１９−３２４（１９９６））。標識は、抗原に直接的または間接的のいずれかで結合され得る。間接的結合の１つの例は、スペーサー部分の使用である。これらスペーサー部分は、続いて、不溶性または可溶性のいずれかであり得る（Ｄｉｅｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１４８（１９８６））。
【０２０１】
当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法が存在する。本発明において使用され得る型の標識の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、ミクロスフィア色素および生物発光化合物が挙げられる。さらに、本発明の実施に必要な、これら標識の抗原への結合は、当業者にとって通常の標準的な技術を使用して行われ得る。
【０２０２】
本明細書中に記載のハイブリドーマの集団は、１より多くのモノクローナル抗体を生成するので、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法を提供する。ここで、細胞の集団は、１を超える抗原と接触される。一旦各抗原が、目的のモノクローナル抗体に結合すると、それぞれ１つが、分離可能な標識により検出され得、従って、細胞の集団中で目的の１を超えるモノクローナル抗体を同定し得る。例えば、この集団は、３種類の抗原と接触され得、ここで各抗原は、異なる蛍光標識で直接的または間接的のいずれかで標識される。モノクローナル抗体生成細胞が検出され得、３種類の異なるモノクローナル抗体生成細胞が、異なる標識と関連する蛍光の差異に基づいて区別され得る。従って、本発明は、細胞の集団からの、１を超えるモノクローナル抗体の単離および生成を可能にする。この同じアプローチが、本発明のＢ細胞からの複数のモノクローナル抗体単離および生成（本発明の形質細胞からのモノクローナル抗体の単離および生成を含む）に適用され得る。
【０２０３】
目的のモノクローナル抗体を作製する上記方法において、ハイブリドーマ細胞の集団（２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える）は、抗原と接触され得る。
【０２０４】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞（ここで、２０を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている）を、検出可能な標識に連結された抗原（ここでこの抗原は、モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を生じる）と接触させる工程；ｂ）この検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ｃ）目的のモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞から作製する工程。
【０２０５】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法は、以下の工程を包含する：ａ）ハイブリドーマ細胞（ここで、２０を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合されている）を、抗原（ここでこの抗原は、モノクローナル抗体に結合する）と接触させる工程；ｂ）この抗原に検出可能な標識を付加して、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を生じる工程；ｃ）この検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定する工程；ｄ）目的のモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞から作製する工程。
【０２０６】
目的のモノクローナル抗体を作製する上記方法において、５０、１００、２５０、または５００を超えるモノクローナル抗体分子が発現され、細胞表面に結合したハイブリドーマ細胞は、抗原と接触され得る。
【０２０７】
目的のモノクローナル抗体を作製する方法全てにおいて、ハイブリドーマ細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含むベクターを含み得る。ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、変異Ｉｇαおよび／または変異Ｉｇβであり得、上記のように、キメラＩｇαおよび／またはキメラＩｇβであり得る。
【０２０８】
本発明はまた、以下を包含する、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供する：ａ）ベクター（ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む）を含むＢ細胞を、検出可能な標識と連結された抗原（ここでこの抗原は、このモノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたＢ細胞を生じる）と接触させる工程；ｂ）この検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するＢ細胞を同定する工程；ｃ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【０２０９】
本発明はまた、以下を包含する、目的のモノクローナル抗体を作製する方法を提供する：ａ）ベクター（ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む）を含むＢ細胞を、抗原と接触させる工程；ｂ）この抗原に結合する検出可能な標識を付加して、検出可能に標識されたＢ細胞を生じる工程；ｃ）この検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するＢ細胞を同定する工程；ｄ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。
【０２１０】
本発明はさらに、以下を包含する、目的のモノクローナル抗体を作製する方法をさらに提供する：ａ）ベクター（ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む）を含むＢ細胞を、検出可能な標識に連結された抗原（ここで、この抗原は、モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたＢ細胞を生じる）と接触させる工程；ｂ）この検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するＢ細胞を同定する工程；ｃ）このモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を決定する工程；およびｄ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。このモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列は、抗体生成細胞（例えば、Ｂ細胞）からＲＮＡを得て、ｃＤＮＡを構築し、この免疫グロブリン鎖の可変領域中のＤＮＡ配列に対応するプライマーを使用してこのｃＤＮＡを増幅し、ヌクレオチド配列を決定し、このモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を得るために、ヌクレオチド配列を翻訳することにより決定され得る。モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を決定する目的に関しては、米国特許第５，６２７，０５２号（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２１１】
本発明はさらに、以下の工程を包含する、目的のモノクローナル抗体を作製する方法をさらに提供する：ａ）ベクター（ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含む）を含むＢ細胞を、検出可能な標識に連結された抗原（ここで、この抗原は、モノクローナル抗体に結合して、検出可能に標識されたＢ細胞を生じる）と接触させる工程；ｂ）この検出可能に標識されたＢ細胞を単離し、従って、目的のモノクローナル抗体を生成するＢ細胞を同定する工程；ｃ）このモノクローナル抗体の可変領域をコードする核酸を得る工程；およびｄ）目的のモノクローナル抗体を作製する工程。このモノクローナル抗体の可変領域をコードする核酸は、抗体生成細胞（例えば、Ｂ細胞）からＤＮＡを単離することにより得られ得る。一旦ＤＮＡが単離されると、再配置された可変領域をコードするＤＮＡ配列（相補性決定領域を含む）がＰＣＲにより増幅され、得られた増幅産物が配列決定される。モノクローナル抗体の可変領域をコードする核酸を得る目的については、米国特許第５，６２７，０５２号（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０２１２】
Ｂ細胞から目的のモノクローナル抗体を作製する方法全てにおいて、そのＢ細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸を含むベクターを含み得る。ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現抗体レセプターをコードする核酸は、変異Ｉｇαおよび／または変異Ｉｇβ、キメラＩｇαおよび／またはキメラＩｇβであり得る。
【０２１３】
本発明はまた、選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）この抗原でマウスを免疫する工程；ｂ）この免疫されたマウスからのＢ細胞を、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターを機能的にコードする少なくとも１つの核酸を含む骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を産生する工程であって、ここで、；このハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体は、発現されて、細胞表面に結合される、工程；ｃ）このモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を、抗原に接触させる工程であって、ここで、この抗原は、細胞表面上のモノクローナル抗体に結合して、検出可能なハイブリドーマ細胞を産生する、工程；およびｄ）検出可能なハイブリドーマ細胞を単離し、よって特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する工程。この方法において、抗原は、検出可能に標識されたハイブリドーマ細胞を得るために直接標識され得る。
【０２１４】
本明細書中で使用される場合、「抗原」は、ペプチド、ポリペプチド、組換えポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ポリペプチドのフラグメント（例えば、Ｃ末端フラグメントまたはＮ末端フラグメント）、有機化合物、合成化合物、細菌供給源、植物供給源、動物供給源、原生動物供給源または真菌供給源由来の天然に存在する化合物であり得る。抗原はまた、細胞表面レセプターの結合部位を含み得、その結果、その特定の部位に対するモノクローナル抗体は、細胞表面レセプターを標的化するように作製され得る。
【０２１５】
選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製する方法は、以下の工程を包含する：ａ）ベクターを含有するＢ細胞を接触させる工程であって、ここで、このベクターは、抗原とともに、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターをコードする核酸を含み、ここで、この抗原は、検出可能なＢ細胞を得るためにモノクローナル抗体に結合する、工程；ｂ）この検出可能なＢ細胞を単離し、よって目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を同定する工程
；およびｃ）目的のモノクローナル抗体を産生するＢ細胞を、選択された抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生する骨髄腫細胞に、融合させる工程。この方法において、抗原は、検出可能に標識されたＢ細胞を得るために直接標識され得る。
【０２１６】
また、ベクターを含有するＢ細胞を含むトランスジェニック動物が、本発明によって提供され、ここで、このベクターは、発現配列（プロモーター、イントロン配列およびポリアデニル化シグナル配列を含むが、これらに限定されない）に機能的に連結されるＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターをコードする核酸を含む。ベクターを含有するＢ細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの変異された表面発現された抗体レセプターを含み得る。ベクターを含有するＢ細胞は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現されたキメラ抗体レセプターを含み得る。ベクターを含有するＢ細胞は、Ｙ１７６Ｆ、Ｙ１８２Ｆ、Ｙ１９３Ｆ、Ｙ２０４Ｆからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、変異されたＩｇαレセプターを含み得る。ベクターを含有するＢ細胞は、Ｙ１９０ＦおよびＹ２０６Ｆからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、変異されたＩｇβレセプターを含み得る。
【０２１７】
本発明のトランスジェニック動物は、当該分野において公知の方法によって作製され得る。トランスジェニック動物を作製する目的、導入遺伝子の存在についてトランスジェニック動物をスクリーニングする目的およびトランスジェニック動物に関する他の方法論について、米国特許第６，１１１，１６６号（本明細書中にその全体が参照として援用される）を参照してください。例えば、本発明のトランスジェニック動物は、ａ）発現配列に機能的に連結された、Ｉｇαをコードする核酸を含む導入遺伝子、および／または発現配列に機能的に連結された、Ｉｇβをコードする核酸を含む導入遺伝子を、胚中に注入すること、ならびにｂ）この胚を動物中で発達させること、によって作製され得る。これはさらに、この動物を第２の動物と交雑させて第３の動物を産生させることを含む。導入遺伝子を含むＢ細胞（ここで、この導入遺伝子は、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターをコードする核酸を含む）は、本発明のトランスジェニック動物より単離され得る。本発明のトランスジェニック動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１８】
本発明のトランスジェニック動物において、導入遺伝子は、未成熟Ｂ細胞、ネイティブな成熟Ｂ細胞、活性化した成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ系統リンパ球および／または形質細胞中で発現され得る。よって、発現配列は、この導入遺伝子の発現がＢ細胞を指向する（しかし、排他的にＢ細胞を指向するのではない）ように選択され得る。発現配列は、以下の型のＢ細胞の１つ以上または全てに対して発現を指向し得る：未成熟Ｂ細胞、ネイティブな成熟Ｂ細胞、活性化した成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ系統リンパ球および形質細胞。
【０２１９】
本発明のトランスジェニック動物において、導入遺伝子の発現は、誘導性プロモーターによって制御され得る。本発明のトランスジェニック動物は、誘導性発現系（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ系、メタロチオネインまたはテトラサイクリン−調節トランス活性化因子系）を利用し得る。ｃｒｅ−ｌｏｘ系の例を使用して、目的の遺伝子（ＩｇαおよびＩｇβ）は、交差する部位の遺伝子座（ｌｏｘＰ）に隣接する停止コドンを含むプラスミドまたは適切なウイルスベクターに挿入される。この遺伝子座は、８つの塩基対スペーサー領域によって分けられた、繰り返される反転した２つの１３塩基対を含む。このカセットは、特定のプロモーター（例えば、免疫グロブリンκプロモーター、免疫グロブリンλプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０プロモーター、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）プロモーターまたはＣＤ１３８（シンデカン１）プロモーター）の制御下である。目的の遺伝子は、細胞特異的プロモーターから逆側のｌｏｘＰ−停止−ｌｏｘＰ領域でプラスミド中に挿入される。別のプラスミドにおいて、ｃｒｅリコンビナーゼは、その発現が制御され得るプロモーター（ｐｒｏＩ）の次に挿入される。各プラスミドは、分離した胚の前核にマイクロインジェクトとされ、そしてこの胚は偽妊娠雌性に移植される。さらに、これらのプラスミドを使用して、適切な動物から胚性幹細胞を形質転換し得る。その後、後者は、同一または同様の非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わされ、そしてキメラ動物を作製するために導入遺伝子を含有するプラスミドを含む偽妊娠の義母に再度移植される。さらに、当該分野において周知のトランスジェニック動物を作製する方法（例えば、リポフェクチンまたは胚性幹細胞またはプレ移植胚のウイルス性トランスフェクション）もまた、使用され得る。あるいは、ｐｒｏＩ−ｃｒｅ導入遺伝子を保有するマウスは、既に確立されたマウス（例えば、Ｋｕｈｎらによる、インターフェロン誘導性「Ｍｘ−Ｃｒｅ」マウス（以下を参照のこと））を含み得る。
【０２２０】
トランスジェニック動物を交尾させ、そして生じたＦ１動物を、ＰＣＲおよび／またはサザンブロッティング分析を介して遺伝子についてスクリーニングする。導入遺伝子についてのホモ接合が確立される後、次いで、ｐｒｏＩ−ｃｒｅ配列を有する動物を、インタクトなｐｒｏ−１ｏｘＰ−停止−ＩｏｘＰ−Ｉｇα−Ｉｇβを有する動物と交配させる。次いで、生じたＦ１動物を、ＰＣＲおよび／またはサザンブロッティング分析を介して両方の導入遺伝子を保有する個体についてスクリーニングする。「Ｍｘ−Ｃｒｅ」ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子の場合、ｐｒｏ−ｌｏｘＰ−停止−ｌｏｘＰ−Ｉｇα−Ｉｇβ導入遺伝子の発現は、「Ｍｘ−Ｃｒｅ」ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子を有する場合と同様に、１型インターフェロン（ＩＦＮ）の注入を介するようにｃｒｅリコンビナーゼの発現を開始させることによって達成される。次いで、ｃｒｅリコンビナーゼは、１つのｌｏｘ部位の反転した反復で結合し、そして第２の部位とのシナプスを形成することによって、ｌｏｘＰ部位で標的化される組換え事象を開始させる。次いで、ｃｒｅリコンビナーゼは、スペーサー領域中のＤＮＡを切断し、シナプス化したｌｏｘＰ部位の間での鎖交換を開始させる。このことは、停止コドン、ならびにＩｇα遺伝子およびＩｇβ遺伝子を介するプロモーターからの転写の欠失を生じる。同様な方法が、Ｍ．Ｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，”ＰＮＡＳ，８９，６２３２−６２３６，Ｊｕｌｙ  １９９２（その全体が本明細書中に援用される）によって詳述される。これは、ｃｒｅ／ｌｏｘ系を使用する唯一の方法であるが、同様の結果が、プラスミドまたはウイルスベクターへのＩｇα遺伝子およびＩｇβ遺伝子を、プロモーターに対して逆方向に、そして逆方向（ｐｒｏ−ＩｏｘＰ−Ｉｇβ−Ｉｇα−ＩｏｘＰ）でｌｏｘＰ部位の間に挿入することによって達成され得る。このシナリオにおいて、一旦組換え事象が開始されると、遺伝子は、転写を可能にする逆方向（ｐｒｏ−Ｉｇα−Ｉｇβ）であり得る。この例示が、Ｍ．Ｍｉｔｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，６３６−６４２，Ｏｃｔ．５，２０００（その全体が本明細書中に援用される）に実証される。Ｍｘ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス、および誘発因子としての１型ＩＦＮの使用は、Ｒ．Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９（５２２９）：１４２７−１４２９，Ｓｅｐｔ．８，１９９５（その全体が本明細書中に参考として援用される）によって公開された。
【０２２１】
別のアプローチにおいて、インタクトなｐｒｏ−ｌｏｘＰ−停止−ｌｏｘＰ−Ｉｇα−Ｉｇβを有する動物由来のＢ細胞は、インビトロで細胞透過性Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質（例えば、Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．”Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：９２９−９３３，２００１（その全体が本明細書中に参考として援用される）によって記載される）で処理される。
【０２２２】
本発明のトランスジェニック動物はまた、テトラサイクリン系を利用し得、ここで、目的の遺伝子（Ｉｇαおよび／またはＩｇβ）がテトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）に隣接するプラスミドまたはウイルスベクターに挿入される。別のプラスミドにおいて、テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）は、Ｂ細胞に発現を指向し得るプロモーターまたは構成的プロモーターの次に挿入される。ｃｒｅ−ｌｏｘ系同様に、トランスジェニック動物は、前核のマイクロインジェクションまたは幹細胞形質転換によって作製され得る。生じたＦ１動物は、遺伝子についてスクリーニングされる。ｐｒｏ−ｒｔＴＡ配列を保有する動物を、ホモ接合性に交配させ、次いで、インタクトなＴＲＥ−Ｉｇα−Ｉｇβを有する動物と交配させる。次いで、生じたＦ１動物を、両方の導入遺伝子を有する個体についてスクリーニングする。導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンまたは適切な誘導体（例えば、ドキシサイクリン）の注入によって達成される。ｄｏｘは、ｒｔＴＡに結合して、ＴＲＥへの結合ならびにＩｇα遺伝子および／またはＩｇβ遺伝子の転写促進を可能にする。テトラサイクリン誘導性系の使用は、Ｄ．Ｙ．Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，”Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４１（１−２）：２００−２０９，Ｓｅｐｔ．５，１９９６；Ｙ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，”ＶＳＶ−Ｇ−ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３２（２）：３７９−３８２，Ｍａｒ．１７，１９９７；Ａ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒａｐｉｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，”ＰＮＡＳ，９３（１１）：５１８５−５１９０，Ｍａｙ，２８，１９９６；ａｎｄ  Ｂ．Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，”Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２（３）：２２８９−２２９６，Ｍａｒ．１９９８（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）に例証される。
【０２２３】
また、特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生する細胞を同定する方法が、本発明によって提供され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）ベクターを含有するＢ細胞を含むトランスジェニック動物を免疫する工程であって、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターをコードする核酸を含む、工程；ｂ）工程ａ）の動物からＢ細胞を単離する工程；ｃ）工程ｂ）の細胞を、抗原と接触させる工程であって、ここで、この抗原は、検出可能な標識細胞を得るためにモノクローナル抗体に結合する、工程；および、ｄ）この検出可能な標識細胞を単離して、よって、特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を産生する細胞を同定する工程。
【０２２４】
本発明はまた、ベクターを含有する造血幹細胞を提供し、ここで、このベクターは、ＩｇαおよびＩｇβからなる群より選択される少なくとも１つの表面発現された抗体レセプターをコードする核酸を含む。
【０２２５】
本発明は、以下の実施例により詳細に記載される。この実施例は、その中の多くの改変および変更が当業者に明らかであるので、例示的としてのみ意図される。
【実施例】
【０２２６】
本発明は、ハイブリドーマにおける抗体の表面提示の主要な限定である、抗体レセプターＩｇαおよび／またはＩｇβの欠損を示す。抗体の膜形態は、図１に示すような全長重鎖のＣ末端（ｍＨＣ）上の膜にわたるドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を介する、これらの２つのレセプターを結合する。ほとんどの骨髄腫は、Ｉｇαおよび／またはＩｇβの産生能を喪失しており、生じたハイブリドーマ融合物は、もはや表面ｍＡｂを提示しない。なぜなら、これらは、Ｉｇαレセプター、またはＩｇαレセプターおよびＩｇβレセプターを欠くからである（Ｋａｎａｖａｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。多くのハイブリドーマは、これら自体は表面ｍＡｂを提示する初期段階または中期段階（ｍｉｄ  ｓｔａｇｅ）のＢ細胞由来であるが、骨髄腫は、抗体の表面提示のこの欠損を、ほとんどのハイブリドーマ細胞株に伝達する（Ｍｉｌｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０２２７】
（Ｉｇαおよび／またはＩｇβの構成的発現の操作）
２つのレセプター配列ＩｇαおよびＩｇβをコードするｃＤＮＡを、マウス脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。制限エンドヌクレアーゼクローニング部位を、図２Ａに示すようにＰＣＲ増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの一部として付加し、そして適切なサイズのＰＣＲ産物を得た（図２Ｂ）。ＩｇαおよびＩｇβについてＰＣＲ増幅したレセプターを確認した配列を、それぞれ図３および図４に示す。Ｉｇαを含むＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｎｅｏ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の対応する置換領域にクローニングした。Ｉｇβ配列を含むＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の対応する置換領域にクローニングした。これら２つの関連するｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターの構造を、それぞれ図５および図６に示す。これら２つのベクターは、それぞれネオマイシンＧ４１８およびＺｅｏｃｉｎに対する耐性マーカーを保有することのみ異なる。生じたプラスミドを、それぞれｐ３．１ＮｅｏＩｇαおよびｐ３．１ＺｅｏＩｇβと称した。両方のｐｃＤＮＡ３．１ベクターは、強力な構成的ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨターミネーターの制御下で、クローニングされた配列を発現する。組換えプラスミドＤＮＡを、トランスフェクションについての調製において、エンドトキシンのない精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を介して精製した。
【０２２８】
十分に特徴付けられたハイブリドーマ細胞株であるＨＧＳ１（Ｓｐ２／０とマウスＢ細胞との融合物）を、利用した（クローニングされた株１２Ｇ７）。この株は、以前に記載されたように、Ｅ．ｃｏｌｉグルタチオン合成酵素（ＧＳ）に対するモノクローナル抗体を作製する。この抗体は、ＧＳ配列または全長ＧＳタンパク質から設計された合成ペプチドの両方と十分反応する。
【０２２９】
骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０は、ハイブリドーマを産生する際に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａのモノクローナル設備で１０年にわたって使用されている標準的融合物パートナーを形成する。Ｓｐ２／０および誘導体化されたハイブリドーマを、２０％仔ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）で補充したＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０，Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）で増殖させ、そして５％  ＣＯ２にて３７℃で増殖させた。
【０２３０】
（トランスフェクションおよび選択の最適化）
構成的β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）レポータープラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｌａｃＺ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、ＨＧＳ１ハイブリドーマおよびＳｐ２／０骨髄腫細胞株でのリポフェクション技術を最適化および定量化した。６〜８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡと、血清を減少させたＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）培地１ｍｌ中で３７℃で５時間混合することによって、トランスフェクションを行った。生じたリポフェクション頻度は比較的低く、平均して５００，０００個の細胞当たり約３０個の形質転換体であったが、骨髄腫細胞について以前に報告されているもの（Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）よりも高かった。２つのＤＮＡの同時トランスフェクション頻度を、平均して５００，０００個当り約６〜１０個の細胞と決定した。いくつかのトランスフェクションにおいて、トランスフェクトする頻度または線状化プラスミドＤＮＡもしくはスーパーコイル化したプラスミドＤＮＡを発現する頻度の間に、ほとんど差異はなかった。従って、スーパーコイル化したＤＮＡを、引き続く実験に使用した。ネオマイシン（Ｎｅｏ）（Ｇ４１８，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）およびＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の殺傷曲線を、同一の細胞で確立し、７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および７５０ｍｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎに対するコントロール細胞の１００％殺傷は、７日間を超えて生じる。この選択の最初の期間の後、Ｇ４１８濃度は、同一であり続けるが、Ｚｅｏｃｉｎ濃度を、４５０μｇ／ｍｌに減少させる。細胞を、連続選択下で増殖させる。
【０２３１】
（Ｉｇレセプター遺伝子のトランスフェクションおよび発現）
レセプタータンパク質レベルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した粗抽出物のウエスタンブロットで評価した。２つのレセプターに対するウサギポリクローナル抗体は、Ｄｒ．Ｌｉｎｄａ  Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ（Ｕｎｉｖ．Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）によって提供された。強力なレセプター発現を、図７に示すような脾臓細胞コントロール（ＳＣ）について３０〜４０ｋＤａの範囲で観察するが、より高い分子量バンドは、バックグラウンドを示す。ネオマイシンおよびＺｅｏｃｉｎの二重薬物選択を使用して、単離されたいくつかの、独立して、安定に同時トランスフェクトした細胞株（ＨＧＳ１αβ１−ＨＧＳ１αβ１６）を、単離した。これらの細胞株は、２つの構築物ｐ３．１ＮｅｏＩｇαおよびｐ３．１ＺｅｏＩｇβを含有する。これらの細胞株のいくつかを、ウエスタンブロットでＩｇαおよびＩｇβの発現について試験した。測定可能なレベルのＩｇαタンパク質を産生する、５つの株のうち２つ（ＨＧＳ１−Ｉｇαβ２およびＨＧＳ１−Ｉｇαβ５）を、本発明者らの実験において試験した（図７）。この実験はまた、試験した全ての細胞株が、ｐＮｅｏ３．１Ｉｇα構築物およびｐ３．１ＺｅｏＩｇβ構築物でのトランスフェクションを行ってかまたは行わないで、有意な量のＩｇβを産生したことを、示した。Ｉｇβのこのバックグラウンド発現を、骨髄腫Ｓｐ２／０、ハイブリドーマ株ＨＧＳ１（Ｓｐ２／０とマウスＢ細胞との間の融合物由来）、ＨＧＳ１由来の全ての株、およびＳｐ２／０由来の他のハイブリドーマ株において観察した。
【０２３２】
（トランスフェクトしたハイブリドーマ株において増加した抗体の表面提示）
ｐ３．１ＮｅｏＩｇαからのＩｇαを高レベルで発現する株を、図８で抗体の表面提示について試験した。ＦＩＴＣ標識されたヒツジポリクローナル抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用して、コントロール細胞ＨＧＳ１ａの表面上のマウス抗体の基準レベルを測定した。低頻度のコントロール細胞は、図８Ａ〜Ｂに示されるいくつかの実験から典型的な結果を伴う抗体を示す。顕著には、両方のレセプタープラスミド（αβ６、αβ７、αβ９、αβ１０）でトランスフェクトした６つのＨＧＳ１αβ細胞株のうち４つが、それぞれ図８Ｃ、Ｄ、ＦおよびＧに示すように、これらの細胞の１００％の表面上に多量の抗体を提示する。各野（ｆｉｅｌｄ）において、わずかな細胞が、焦点外であるが、この野の細胞の焦点試験は、４つの集団の各々における細胞の９９％が検出可能なレベルの表面抗体を提示することを示す。明らかに、これらの細胞集団の試験は、抗体を提示する細胞のコントロールＨＧＳ１細胞に関する頻度の有意な増加、および発現レベルの増加を示す。Ｇ４１８耐性およびＺｅｏｃｉｎ耐性にトランスフェクトされた２つの細胞株（αβ８、αβ１１）は、有意な抗体の表面提示を示さなかった（図８Ｅおよび８Ｈ）。驚くことに、これらの細胞株は、コントロール細胞より低い表面の抗体を提示し、試験した１００個以上（ｐｌｕｓ）の細胞のいずれも、検出可能な表面発現を示さなかった。
【０２３３】
（表面抗体を提示するハイブリドーマ細胞におけるＩｇレセプター発現の試験）
図８で試験した同一の細胞サンプルのアリコートを、引き続くレセプタータンパク質レベルの試験のために凍結した。コントロールＨＧＳ１、ならびにトランスフェクトしたＨＧＳ１αβ細胞株におけるＩｇαレセプタータンパク質およびＩｇβレセプタータンパク質の発現を比較した最初の結果を、それぞれ図９および１０に示す。Ｉｇレセプタープラスミドの４つをトランスフェクトしたＨＧＳ１αβ細胞株は、コントロールＨＧＳ１細胞における検出可能でないレベルと比較してより多いＩｇαレセプターを発現する。Ｉｇαを発現するこれらの細胞株は、１００％の抗体の表面提示を図８に示す同一の株である（Ｃ  αβ６、Ｄ  αβ７、Ｆ  αβ９、Ｇ  αβ１０）。αβ７株は、強力な表面発現を示す他の３つの株より有意に低いＩｇαタンパク質発現を示した。αβ７株は、試験した基本的に全ての細胞において抗体の表面発現を示した（図８Ｄ、αβ７）が、他の３つの表面発現株よりも低い強度であった。このことは、Ｉｇαレベルと表面提示との間の直接的定量的関係を示す。２つのＨＧＳ１αβ細胞株は、ウエスタンでＩｇαタンパク質発現を示さず（αβ８およびαβ１１）、これら２つは、コントロールよりも表面提示が低いことを示した。Ｉｇα活性の同時抑制のいくつかの形態がこれら２つのネガティブ株において生じた可能性があるようである。高レベルのＩｇβタンパク質を、試験した細胞株由来のＨＧＳ１全てにおいて検出し、そしてこれらのレベルは、抗体の表面提示と相関しなかった（図１０）。よって、ＨＧＳ１株上の増加した表面抗体提示は、Ｉｇαレセプタータンパク質発現と直接相関し、そして半定量的である。
【０２３４】
各集団における５０個の細胞の平均蛍光強度の定量は、図１１Ａに示すように、トランスジェニックＩｇα発現細胞（αβ６、αβ７、αβ９およびαβ１０）が、コントロール細胞よりも約５倍多い抗体を提示することを、示す。Ｉｇαを強く発現する細胞の高パーセント（６０〜８０％）は、Ｉｇαを発現しない細胞についての平均よりも３倍強い平均蛍光強度を示す（図１１Ｂ）。コントロール細胞の０〜６％のみが、このレベルの強度に達する。これらのデータの定量は、Ｉｇαを発現する細胞の蛍光の実際の増加を過小評価した。これらのアッセイは、ほとんどの蛍光トランスジェニック細胞を測定するための、本発明者らの装置（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のダイナミックレンジ、および単一の焦点平面において全ての細胞をアッセイする能力がないことによって制限される（すなわち、多くのＩｇα細胞が、本発明者らの装置の能力を超えて明るい）。さらに、本発明者らは、標識細胞中の低レベルの自己蛍光、およびＦＩＴＣ標識コントロール抗体で処理した細胞中での弱いバックグラウンド蛍光を観察する。このバックグラウンドは、コントロール細胞で見られるいくらかの蛍光の原因であり得る（図８ＡおよびＢ）。
【０２３５】
さらなる実験は、Ｉｇレセプターの過剰発現、および抗体の増加した表面提示が、ハイブリドーマ細胞からの正常な抗体分泌を妨げないことを示した。図８〜１１で試験した８つの細胞株からの細胞上清での最初のアッセイは、各細胞株が、有意なレベルのｍＡｂ  ＧＳ１モノクローナル抗体をなお分泌することを示した。
【０２３６】
（骨髄腫）
上記で利用する、ハイブリドーマ細胞での同一の遺伝子変更を、標準的骨髄腫融合パートナーＳｐ２／０で行った。Ｓｐ２／０は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＢＡＬＢ／ｃ））より得られた骨髄腫細胞株である。Ｓｐ２／０は、ハイブリドーマ融合物を作製するために使用されるファウンダー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ）骨髄腫細胞株の１つである（Ｆｒａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｅｒ，１９８０；Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。第一に、Ｓｐ２／０細胞を、ｐ３．１ＮｅｏＩｇα構築物およびｐ３．１ＺｅｏＩｇβ構築物で同時トランスフェクトし、そしてＧ４１８耐性およびＺｅｏｃｉｎ耐性について選択して、新たな細胞株Ｓｐ２αβ１、Ｓｐ２αβ２などを産生させた。これらのＳｐ２αβ株を、図１２に示すように、ウエスタンブロットでＩｇαレセプター発現およびＩｇβレセプター発現について特徴付けした。Ｓｐ２αβ１株およびＳｐ２αβ２株は、Ｉｇαの強い発現を示し、そして骨髄腫細胞におけるレセプター発現を増加させる転写後バリアは存在しないことを実証する。これは、コントロールＳｐ２／０コントロール細胞においてＩｇβが測定可能なレベルですでに発現されていることを示す。これらの骨髄腫細胞株を、ハイブリドーマを作製するためにＢ細胞と容易に融合する。当該分野におけ標準法によって、骨髄腫細胞を、Ｂ細胞または他の抗体産生細胞に融合し得る。
【０２３７】
（蛍光活性化細胞ソーティングは、表面抗体提示の増加をさらに定量化し、Ｉｇα発現に連結される）
ＨＧＳ１細胞およびＨＧＳ１αβ１０細胞の表面上の全ての抗体をＦＩＴＣ標識し、そしてこれらの細胞を、図１３に示すように、ＦＩＴＣ蛍光に基づいてソートした。パネルＡとＢとの比較は、ＨＧＳ１Ｉｇαβ１０細胞の平均蛍光が、ＨＧＳ１コントロール細胞の蛍光より約１０倍高い（すなわち、ＢにおけるＨＧＳ１αβ１０細胞のＦＬ１レベルは、ＡにおけるコントロールＨＧＳ１細胞の右へ約１ログ（ｌｏｇ）シフトする）ことを示す。パネルＣは、これらの細胞の混合物のソーティングを試験し、同様の結果を示す。蛍光の平均レベルにおけるこの差異は、図１１に対して、Ｉｇα発現の効果の独立した定量として働く。Ｉｇα発現の増加は、ハイブリドーマ細胞におけるマウス抗体の表面提示の増加を生じる。脾臓Ｂ細胞から新鮮に調製した正常ハイブリドーマ細胞集団のソーティングにおいて、ＧＳ抗体提示に起因するバックグラウンド蛍光はなかった（Ａにおけるピークの右肩）。なぜなら、ほとんどの細胞は、ＧＳ以外の抗原に対する抗体を作製するからである。結論として、Ｉｇα発現に起因する蛍光の明らかな増加は、ＤＩＳＨがハイブリドーマの直接選択に使用され得ることを実証する。
【０２３８】
本出願を通して、種々の刊行物が、参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する分野の状態をより完全に記載するために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２３９】
【表１】
2004525627.tif 000002
2004525627.tif 000003
2004525627.tif 000004
2004525627.tif 000005
2004525627.tif 000006
2004525627.tif 000007
2004525627.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】図１は、Ｂ細胞におけるｍＩｇＭのような抗体の表面提示が、１種または２種の膜レセプター（Ｉｇαおよび／またはＩｇβ）の存在を必要とすることを示す。Ｂ細胞において、これらのレセプターは、ｍＩｇＭのような抗体の重鎖（ｍＨＣ、濃い灰色）部分の膜形態の膜ドメインに結合する。小さい免疫グロブリン軽鎖に、黒く線を引いた。ほとんどの骨髄腫において、ここに示すＩｇα（白）レセプターは、欠如しているか、非常に低いレベルで発現されている。いくつかの骨髄腫において、Ｉｇαおよび／またはＩｇβは、存在しないか、または低レベルで発現され得る。結果として、ほとんどのハイブリドーマは、その表面上に有意な量のｍＩｇＭを提示できない。
【図２】図２は、プライマーオリゴヌクレオチドならびにＩｇα  ｃＤＮＡおよびＩｇβ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。（Ａ）ＩｇαおよびＩｇβをコードするｃＤＮＡを増幅するために使用される、センス（Ｓ）プライマーおよびアンチセンス（Ａ）プライマーの配列。これらのオリゴは、重要な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位および５’翻訳シグナル（ＧＣＣＡＣＣ）を、レセプター配列に付加する。（Ｂ）予測された大きさのＰＣＲ増幅産物を、塩基対（ｂｐ）で示す。分子量標準が、ＰＣＲ産物に隣接する。
【図３】図３は、Ｉｇα発現プラスミドｐ３．１ＮｅｏＩｇαを構築するために使用した、ＰＣＲ改変された、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位からＥｃｏＲＩクローニング部位にわたるマウスＩｇα  ｃＤＮＡの配列を示す。タンパク質配列を、ＤＮＡ配列の上に示す。ＩｇαについてＧｅｎＢａｎｋに列挙される主なＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ、登録番号ＮＭ＿００７６５５およびＮＰ＿０３１６８１を有する。得られたｃＤＮＡ配列は、この元のＩｇα配列とは小領域で一致しないが、Ｓａｋｉｇｕｃｈｉら（「Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｂ−１，ａ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ３−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３４５７−６４（１９８８））によって与えられたデータとは一致して、太字で列挙した６アミノ酸をコードする配列を有するタンパク質をコードする。
【図４】図４は、Ｉｇβ発現プラスミドｐ３．１ＮｅｏＩｇαを構築するために使用した、ＰＣＲ改変された、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位からＥｃｏＲＩクローニング部位にわたるマウスＩｇβ  ｃＤＮＡの配列を示す。タンパク質配列を、ＤＮＡ配列の上に示す。ＩｇβについてＧｅｎＢａｎｋに列挙される主な配列は、登録番号ＮＭ＿００８３３９を有する。
【図５】図５は、トランスジェニック細胞においてＩｇαレセプタータンパク質を発現するために使用した、ｐｃＤＮＡ３．１ＮｅｏＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の構造を示す。
【図６】図６は、トランスジェニック細胞においてＩｇβレセプタータンパク質を発現するために使用した、ｐｃＤＮＡ３．１ＺｅｏＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の構造を示す。
【図７】図７は、Ｉｇαタンパク質およびＩｇβタンパク質のレベルについての、ウエスタンブロットでのトランスフェクトされたＨＧＳ細胞のスクリーニングを示す。タンパク質サンプル（ＳＤＳサンプル緩衝液中、２５μｇの総細胞タンパク質）を、１２％のアクリルアミドゲルで分解し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、ウサギポリクローナル抗マウスＩｇα抗体（Ａ）またはＩｇβ抗体（Ｂ）と反応させ、次いでロバ抗ウサギ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と反応させ、そして公開されたプロトコールに従って発色させた（Ｋａｎｄａｓａｍｙら、１９９９）。分子量標準（ＭＷ  Ｓｔｄｓ）の位置を、左側に示す。Ｉｇαの種々の改変形態のＭＷ範囲を、括弧で示す。他のより高いバンドおよびコントロールＷＴレーン中のバンドは、バックグラウンドであるようである。細胞株からの抽出物を、以下のように命名する：ＳＣ、脾臓細胞抽出物；ＨＧＳ１、ＧＳに対する抗体を産生する親ハイブリドーマ細胞株；そしてＨＧＳ１αβ１〜５およびＥＣＳ１αβ１〜３は、レセプター遺伝子がトランスフェクトされた細胞株である。ＵＧＡのＭｅａｇｈｅｒ研究室の研究ノートにおける、株の名称に対するこれらの単純化した記号の言及は、以下の通りである：ＨＧＳ１αβ１、ＧＳ−ＴＳＣ；ＨＧＳ１αβ２、ＧＳ−ＴＳＣ−１Ｃ；ＨＧＳ１αβ３、ＧＳ−ＴＥ４；ＨＧＳ１αβ４、ＧＳ−Ｔ５Ｄ−Ｌ；およびＨＧＳ１αβ５、ＧＳ−ＴＳＣ−３Ｄ。ＩｇαおよびＩｇβに特異的なウサギポリクローナル抗体（それぞれ、抗ＭＢ−１およびＳＦ２Ｂ）を、Ｌｉｎｄａ  Ｍａｔｓｕｕｃｈｉ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から得た（Ｃｏｎｄｏｎら、２０００）。抗体を、Ｉｇαの細胞質テイルおよびＩｇβのドメイン外（ｅｃｔｏ−ｄｏｍａｉｎ）に対する合成ペプチドに対して調製した。
【図８−１】図８は、トランスジェニックＩｇレセプターを発現するハイブリドーマ細胞における抗体の増加した表面提示の顕微鏡試験を示す。示される全ての細胞を、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗血清で処理した。４０×ＺｅｉｓｓレンズおよびＨａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラ（モデルＣ−４７４２−９５）を用いて、同一の照明および露光条件の下で、全てのプレートの写真を撮影した。非標識抗体で処理した細胞は、有意なレベルの自己蛍光を有さない。示される細胞株は、ラボノートの名称を参照して示される。ＡおよびＢ．非トランスフェクトＨＧＳ１コントロール細胞；Ｄ〜Ｈ．ｐｃＤＮＡ３．１−ＩｇαおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｉｇβでトランスフェクトした細胞。Ｃ  ＨＧＳ１αβ６、ＳＣ−１Ｃ＃２；Ｄ  ＨＧＳ１αβ７、ＳＣ−１ＣＦ２；Ｅ．ＨＧＳ１αβ８、ＳＣ−１Ｃ＃３；Ｆ．ＨＧＳ１αβ９、ＳＣ−３ＤＦ３；Ｇ．ＨＧＳ１αβ１０、ＳＣ−３ＤＦ４：Ｈ．ＨＧＳ１αβ１１、ＳＣ−Ｆ１。（Ｉ）最も明るい細胞は、図８Ａの細胞の領域（ＨＧＳ１ａコントロールハイブリドーマ細胞）から拡大し、そして矢印で示した。（Ｊ）最も明るい細胞は、図８Ｃの細胞の領域（ＨＧＳ１αβ６レセプターでトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞）から拡大し、そして矢印で示した。
【図８−２】図８は、トランスジェニックＩｇレセプターを発現するハイブリドーマ細胞における抗体の増加した表面提示の顕微鏡試験を示す。示される全ての細胞を、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗血清で処理した。４０×ＺｅｉｓｓレンズおよびＨａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラ（モデルＣ−４７４２−９５）を用いて、同一の照明および露光条件の下で、全てのプレートの写真を撮影した。非標識抗体で処理した細胞は、有意なレベルの自己蛍光を有さない。示される細胞株は、ラボノートの名称を参照して示される。ＡおよびＢ．非トランスフェクトＨＧＳ１コントロール細胞；Ｄ〜Ｈ．ｐｃＤＮＡ３．１−ＩｇαおよびｐｃＤＮＡ３．１−Ｉｇβでトランスフェクトした細胞。Ｃ  ＨＧＳ１αβ６、ＳＣ−１Ｃ＃２；Ｄ  ＨＧＳ１αβ７、ＳＣ−１ＣＦ２；Ｅ．ＨＧＳ１αβ８、ＳＣ−１Ｃ＃３；Ｆ．ＨＧＳ１αβ９、ＳＣ−３ＤＦ３；Ｇ．ＨＧＳ１αβ１０、ＳＣ−３ＤＦ４：Ｈ．ＨＧＳ１αβ１１、ＳＣ−Ｆ１。（Ｉ）最も明るい細胞は、図８Ａの細胞の領域（ＨＧＳ１ａコントロールハイブリドーマ細胞）から拡大し、そして矢印で示した。（Ｊ）最も明るい細胞は、図８Ｃの細胞の領域（ＨＧＳ１αβ６レセプターでトランスフェクトしたハイブリドーマ細胞）から拡大し、そして矢印で示した。
【図９】図９は、ＨＧＳ１  ＷＴおよび図８において表面提示抗体が示されたＨＧＳ１αβ細胞のアリコートにおけるＩｇαタンパク質レベルを示す。タンパク質サンプルを、ＰＡＧＥにより分離し、そしてＩｇαタンパク質レベルを、図７Ａにおけるように、マウスＩｇαに対するウサギ抗体を用いたウエスタンにおいて測定した。二連サンプルの（Ａ）Ｉｇαウエスタン（Ｂ）クマシー染色ゲル（充填されたタンパク質の相対レベルを示す）。染色された分子量標準（ＭＷ  Ｓｔｄｓ）を、左側にキロダルトン（ｋＤａ）で示す。種々の改変形態のＩｇαのＭＷの範囲を括弧で示す。Ｍｅａｇｈｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｎｏｔｅｂｏｏｋにおいて議論された細胞株由来の抽出物の名称は、以下の通りである：ＷＴ、ＨＧＳ１非トランスフェクトコントロール；ＨＧＳ１αβ６、ＳＣ−１Ｃ＃２；ＨＧＳ１αβ７、ＳＣ−１ＣＦ２；ＨＧＳ１αβ８、ＳＣ−１Ｃ＃３；ＨＧＳ１αβ９、ＳＣ−３ＤＦ３；ＨＧＳ１αβ１０、ＳＣ−３ＤＦ４；およびＨＧＳ１αβ１１、ＳＣ−Ｆ１。図８において１００％の抗体の表面提示を示す細胞株をプラス＋で示し、提示しないものをマイナスで示し、そして１〜５％提示を有するＨＧＳ１ハイブリドーマＷＴコントロールを＋／−で示す。Ｉｇαアイソフォームの移動範囲を括弧で示す。
【図１０】図１０は、図８において示されるＨＧＳ１細胞およびＨＧＳ１αβ細胞のアリコートにおけるＩｇβ発現を試験したウエスタンブロットを示す。タンパク質サンプルを、ＰＥＧＥにより分離し、そしてＩｇβタンパク質レベルを、図７ＢにおけるようにＩｇβに対する抗体を用いたウエスタンにおいて測定した。タンパク質サンプルは、図１０Ａおよび１０Ｂにおいて示されるものと同一のアリコートである。Ｉｇβアイソフォームの移動範囲を括弧で示す。
【図１１】図１１は、Ｉｇα発現ハイブリドーマにおける抗体の表面提示の定量を示す。（Ａ）蛍光強度をＨＧＳ１細胞と、検出可能なレベルのＩｇαレセプターを発現するトランスジェニック細胞または発現しないトランスジェニック細胞との間で比較した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＯｐｅｎＬａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、図８において撮られた画像と同様の画像から、顕微鏡領域において個々の細胞について測定した。各々の集団における個々の細胞の間のＭＦＩの標準誤差を示す。ＭＦＩは、コントロールとトランスジェニック細胞との間の実際の強度の差を過小評価する。なぜならば、最も明るい細胞の１０％が電子カメラのダイナミックレンジを超過し、そしていくつかの細胞は焦点面から外れ、ＭＦＩは、正確に測定できないからである。８つの細胞集団の各々についてｎ＝５０細胞を試験した。（Ｂ）コントロールＨＧＳ１細胞（８９ＭＦＩ）についての平均よりも３倍高い強度を有する各集団における個々の細胞の頻度。
【図１２】図１２は、トランスフェクトされた骨髄腫細胞株におけるＩｇαおよびＩｇβのタンパク質レベルを試験したウエスタンブロットを示す。（Ａ）Ｉｇαおよび（Ｂ）Ｉｇβの免疫検出を、図７に記載されるように実施した。試験した細胞株は以下の通りである：ＳＣ、脾臓細胞；ＩｇαおよびＩｇβをコードする遺伝子（αβ１、Ｍ−Ｔ４；αβ２、Ｍ−Ｔ４Ｄ；αβ３、Ｍ−Ｔ６；αβ４、Ｍ−Ｔ４−３Ａ；αβ５、Ｍ−Ｔ３ＳＣ；αβ６、Ｍ−Ｔ１ＳＣ；およびαβ７、Ｍ−Ｔ４Ｄ−６）でトランスフェクトされたＳｐ２／０骨髄腫野生型（ＷＴ）またはＳｐ２／０由来株。ＩｇαおよびＩｇβの移動範囲を括弧で示す。より高い分子量のバンドは、抗体におけるバックグラウンドの活性に起因する。
【図１３】図１３は、Ｉｇα発現が抗体表面提示を８倍増大することを実証する蛍光活性化細胞分離（ＦＡＣＳ）を示す。ＨＧＳ１およびＨＧＳ１αβ１０細胞を図８に示すように調製し、そしてＦＩＴＣ標識したヤギ抗マウス抗体で標識した。以下の細胞の２００μｌのサンプルを、Ａ５２０発光（ＦＬ１）を用いてＦＡＣＳにより計数した（カウント）。底軸における完全スケールは、蛍光強度の４−ｌｏｇを表す。Ａ．ＨＧＳ１  ＷＴコントロール細胞。Ｂ．ＨＧＳ１αβ１０細胞。Ｃ．ＨＧＳ１およびＨＧＳ１αβ１０細胞の混合物。
【図１】
2004525627.tif 000009
【図２】
2004525627.tif 000010
【図３】
2004525627.tif 000011
【図４】
2004525627.tif 000012
【図５】
2004525627.tif 000013
【図６】
2004525627.tif 000014
【図７】
2004525627.tif 000015
【図８−１】
2004525627.tif 000016
【図８−２】
2004525627.tif 000017
【図９】
2004525627.tif 000018
【図１０】
2004525627.tif 000019
【図１１】
2004525627.tif 000020
【図１２】
2004525627.tif 000021
【図１３】
2004525627.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004525627.tif 000023
2004525627.tif 000024
2004525627.tif 000025
2004525627.tif 000026
2004525627.tif 000027
2004525627.tif 000028
2004525627.tif 000029
2004525627.tif 000030
2004525627.tif 000031
2004525627.tif 000032
2004525627.tif 000033
2004525627.tif 000034
2004525627.tif 000035
2004525627.tif 000036
2004525627.tif 000037
2004525627.tif 000038
2004525627.tif 000039
2004525627.tif 000040
2004525627.tif 000041
2004525627.tif 000042
2004525627.tif 000043
2004525627.tif 000044
2004525627.tif 000045
2004525627.tif 000046
2004525627.tif 000047
2004525627.tif 000048
2004525627.tif 000049
2004525627.tif 000050
2004525627.tif 000051
2004525627.tif 000052
2004525627.tif 000053
2004525627.tif 000054
2004525627.tif 000055
2004525627.tif 000056
2004525627.tif 000057
2004525627.tif 000058
2004525627.tif 000059
2004525627.tif 000060
2004525627.tif 000061
2004525627.tif 000062
2004525627.tif 000063
2004525627.tif 000064
2004525627.tif 000065
2004525627.tif 000066
2004525627.tif 000067
2004525627.tif 000068
2004525627.tif 000069
2004525627.tif 000070
2004525627.tif 000071
2004525627.tif 000072
2004525627.tif 000073
2004525627.tif 000074
2004525627.tif 000075
2004525627.tif 000076
2004525627.tif 000077
2004525627.tif 000078
2004525627.tif 000079
2004525627.tif 000080
2004525627.tif 000081
2004525627.tif 000082
2004525627.tif 000083
2004525627.tif 000084
2004525627.tif 000085
2004525627.tif 000086
2004525627.tif 000087
2004525627.tif 000088
2004525627.tif 000089
2004525627.tif 000090
2004525627.tif 000091
2004525627.tif 000092
2004525627.tif 000093
2004525627.tif 000094
2004525627.tif 000095
2004525627.tif 000096
2004525627.tif 000097
2004525627.tif 000098
2004525627.tif 000099
2004525627.tif 000100
2004525627.tif 000101
2004525627.tif 000102
2004525627.tif 000103
2004525627.tif 000104
2004525627.tif 000105
2004525627.tif 000106
2004525627.tif 000107
2004525627.tif 000108
2004525627.tif 000109
2004525627.tif 000110
2004525627.tif 000111
2004525627.tif 000112
2004525627.tif 000113
2004525627.tif 000114
2004525627.tif 000115
2004525627.tif 000116
2004525627.tif 000117
2004525627.tif 000118
2004525627.tif 000119
2004525627.tif 000120
2004525627.tif 000121
2004525627.tif 000122
2004525627.tif 000123
2004525627.tif 000124
2004525627.tif 000125
2004525627.tif 000126
【国際調査報告】
2004525627.tif 000127
2004525627.tif 000128