(57)【要約】表面表現型、構成性及び誘導型の遺伝子発現パターン、ならびに Tリンパ球に対する機能的な効果により定義されるような、機能性の成熟樹状細胞の特徴を有する不死化哺乳動物樹状細胞系が提供される。細胞系を、延長された期間、継続的にインビトロで増殖させることができる。特に興味深いのは、細胞系の、ナイーブT細胞へと刺激的に抗原を提示する能力である。樹状細胞系は、遺伝子の発見、樹状細胞サブセット特異的な抗体及びプローブの作製；樹状細胞の分化及び成熟の段階の決定；リンパ球の抗原特異的刺激の誘導；リンパ球における抗原特異的なアネルギー又は寛容の解明；樹状細胞とナチュラル・キラー細胞との相互作用の特徴決定；樹状細胞と内皮細胞との相互作用のインビトロ及びインビボの分析；並びにスクリーニング・アッセイ法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝学的に改変された前駆細胞であり、樹状細胞において活性なプロモーターの制御調節下にある細胞増殖促進性癌遺伝子を含む前駆細胞から得られた樹状細胞を、Flt-3リガンド及びGM-CSFのうちの1個又は複数を含む培地中で培養する工程；並びに
該培養樹状細胞を、少なくとも2ヶ月間、維持する工程
を含む、不死化樹状細胞を作製する方法であって、
該樹状細胞が、CD11cを発現しており、かつナイーブCD8＋及び／もしくはCD4＋ T細胞並びに／又はB細胞を抗原特異的応答へと刺激するために抗原を提示することが可能である、不死化樹状細胞を作製する方法。
【請求項２】
樹状細胞が、CD86、CD54、及びクラスII MHC抗原を発現している、請求項1記載の方法。
【請求項３】
樹状細胞が、遺伝学的に改変された前駆細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物から得られる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遺伝学的に改変された前駆細胞が幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
樹状細胞への分化を提供するため、幹細胞を動物宿主へ移植する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
樹状細胞への分化を提供するため、幹細胞を培養において増殖させる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
幹細胞がヒト造血幹細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項８】
細胞増殖促進性癌遺伝子がウイルス癌遺伝子である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ウイルス癌遺伝子がSV40ラージT抗原である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
樹状細胞において活性なプロモーターが、樹状細胞において選択的に発現される、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
プロモーターがCD11cプロモーターである、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
樹状細胞又はそれらの前駆体の単離の前に、トランスジェニック動物がFlt-3リガンド及び／又はGM-CSFで刺激される、請求項3記載の方法。
【請求項１３】
培養樹状細胞が、増殖因子非依存性；プログラム細胞死に対する抵抗性、脱分化に対する抵抗性、及び細胞老化に対する抵抗性のうちの1個又は複数に関して選択又は形質転換される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
培養樹状細胞が、末梢組織部位からリンパ器官へとインビボで移行することが可能である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
CD11cを発現しており、かつナイーブCD8＋及び／もしくはCD4＋ T細胞並びに／又はB細胞を抗原特異的応答へと刺激するために抗原を提示することが可能である、不死化樹状細胞系。
【請求項１６】
CD54、CD86、及びクラスII MHC抗原を発現している、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項１７】
遺伝学的に改変された前駆細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物から得られる、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項１８】
遺伝学的に改変された前駆細胞が幹細胞である、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項１９】
樹状細胞への分化を提供するため、幹細胞を動物宿主へ移植する、請求項18記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２０】
樹状細胞への分化を提供するため、幹細胞を培養において増殖させる、請求項19記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２１】
幹細胞がヒト造血幹細胞である、請求項18記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２２】
樹状細胞において活性なプロモーターの制御調節下にある細胞増殖促進性癌遺伝子を含む、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２３】
癌遺伝子がSV40ラージT抗原である、請求項22記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２４】
樹状細胞において活性なプロモーターが、樹状細胞において選択的に発現される、請求項22記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２５】
プロモーターがCD11cプロモーターである、請求項24記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２６】
樹状細胞又はそれらの前駆体の単離の前に、Flt-3リガンド及び／又はGM-CSFで刺激されたトランスジェニック動物に由来する、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２７】
培養樹状細胞が、増殖因子非依存性；プログラム細胞死に対する抵抗性、脱分化に対する抵抗性、及び細胞老化に対する抵抗性のうちの1個又は複数に関して選択又は形質転換される、請求項15記載の不死化樹状細胞系。
【請求項２８】
末梢組織部位からリンパ器官へとインビボで移行することが可能である、請求項15記載の培養樹状細胞。
【請求項２９】
樹状細胞に対する効果に関して候補生物学的応答化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項15記載の不死化樹状細胞を、該候補生物学的応答化合物と接触させる工程；及び
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程が、細胞形態学及び細胞表面マーカー発現の分析を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程が、細胞内の核酸、タンパク質、脂質、及び炭水化物、並びに分泌型細胞外分子のレベル及び構成を含む遺伝子発現変化の分析を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程が、抗原の取り込み、プロセシング、提示、又は細胞分裂の機能分析を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程が、末梢組織部位からリンパ器官へのインビボの移行の機能分析を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
樹状細胞表現型に対する効果を決定する工程が、ナイーブCD8＋及び／もしくはCD4＋ T細胞並びに／又はB細胞を抗原特異的応答へと刺激するための抗原提示の機能分析を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
T細胞において抗原特異的応答を誘導する方法であって、
細胞間相互作用に関与している細胞表面分子及び／又は分泌型分子の樹状細胞による発現を改変するために、請求項15記載の不死化樹状細胞を、抗原及び／又は非特異的刺激により活性化する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
樹状細胞において発現される核酸配列を得る方法であって、
請求項15記載の不死化樹状細胞からmRNAを単離する工程；及び
任意の核酸、タンパク質、炭水化物、又は脂質分子を得る工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
導入
哺乳動物の免疫応答における中心的な成分は、抗原にプロセシングを施し、リンパ球へと提示する樹状細胞（DC）である。樹状細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来すると考えられている。細胞は、分化するにつれ、器官及び末梢組織へと移行し、そしてさらなる分化を遂げる。これらの未熟樹状細胞は、抗原提示能を有しておらず、低レベルのMHCクラスII分子を発現しており、そして同種異系混合白血球反応においてT細胞の増殖を刺激しない。抗原に曝されることにより、未熟細胞は、機能性の抗原提示細胞へと分化し、そしてリンパ節及び脾臓へと移行する。成熟樹状細胞は、高レベルのMHCクラスII分子、アクセサリー分子、及び共刺激分子を示す。
【０００２】
樹状細胞は、稀少であるが、特有の抗原提示効力のため非常に重要である。樹状細胞のみが、ナイーブTリンパ球を感作し、可溶性抗原に対する細胞障害性T細胞の生成を誘発することができる。それらの稀少性のため、前駆細胞からDCを作製するための培養法が、開発されている。培養条件に依って異なる成熟段階（表現型及び抗原捕獲能に基づく）のDCが、入手されうる。これらの方法は、一般に、骨髄、臍帯血、成体血液CD34＋前駆体等から前駆細胞を単離した後、抗原及び／又は1個もしくは複数の増殖因子と共にインビトロ培養することに頼っている。試験されている因子には、特に、Flt3リガンド、GM-CSF、IL-4、幹細胞因子、及びTNF-αなどが含まれる。
【０００３】
樹状細胞の成熟及び活性化における中心的な分子は、Flt3リガンド（Flt3-L）である。Flt3-Lのマウスへのインビボ投与は、DC前駆体の骨髄から末梢器官及びリンパ器官への優先的な移動又は放出をもたらし、循環血中DCの数を10〜30倍に増加させることができる（Maraskovskyら（1996）J. Exp. Med. 184：1953-1962）。それは、インビボの機能的にコンピテントなヒトDCの増幅においても、類似の効果を有していることが示されている（Maraskovskyら（2000）Blood 96（3）：878-84）。GM-CSFの追加によって、機能性DCの産出はさらに増加する（Aviganら（1999）Clinical Cancer Research 5（10）：2735-41）。
【０００４】
継続的に培養されうる細胞は、不死化細胞として知られる。哺乳動物二倍体細胞は、無限の寿命を示し不死である腫瘍由来の細胞系とは対照的に、有限の寿命を有し、最後には複製老化を起こす。不死化細胞は、多数の均一な細胞集団が提供されるよう培養可能であるため、非不死化細胞よりも有利である。不死化細胞は、DNAの複製及び転写、代謝過程、並びに薬物代謝のような細胞内活性の理解のために日常的に使用されている。不死化細胞は、抗原提示のような特異的な細胞間の相互作用の調査においても有用である。しかしながら、多くの細胞型は、未だに単離及び継続的培養が困難である。さらに、多くの細胞は、培養中に、分化した特性のうちのいくつかを喪失する。樹状細胞は、不死化が困難な細胞型の一例である。
【０００５】
いくつかの例において、細胞が、癌遺伝子の導入によって不死化されている。例えば、アカゲザル（rhesus macaque）由来のパポーバウイルスであるシミアンウイルス40（SV40）は、げっ歯動物において腫瘍を誘導し、ヒト由来細胞型を含む多くの細胞型を培養中で形質転換する強力なDNA腫瘍ウイルスである。このウイルスは、真核細胞における分子的過程及び細胞形質転換の機構研究のための好適な研究モデルとなっている。ラージT抗原（T-ag）と命名されたウイルス複製タンパク質も、ウイルス腫瘍性タンパク質である。
【０００６】
トランスジェニック・マウスは、乳腺、唾液腺、膵臓、前立腺、肝臓、肺、腎臓、腸、脳、脈絡叢、眼の水晶体、骨、平滑筋、及び軟骨を含む広範囲の組織においてSV40によって誘導される発癌の過程を研究するために使用されている（Furth（1998）Dev Biol Stand 94：281-7による概説を参照）。これらの研究の焦点は、主として、主要な形質転換性ウイルス腫瘍性タンパク質であるラージT抗原（T-ag）の作用に向けられている。
【０００７】
免疫応答性の協調において樹状細胞は重要であるため、インビボおよびインビトロ培養を用いた両方の研究に対して、それらは極めて重要である。本発明は、この課題を解決するものである。
【０００８】
文献
Gasperiら（1999）J. Leukocyte Biol. 66：263：267は、マウス樹状細胞におけるレトロウイルスによる遺伝子移入、迅速な選択、及び未熟表現型の維持について論じている。Volkmannら（1996）Eur. J. Immunol. 26：2565は、条件付きで不死化された樹状細胞系を記載している。
【０００９】
Steinmanら（1999）の米国特許第5,994,126号は、GM-CSF、IL4、及び／又はTNFαによる樹状細胞前駆体のインビトロ増殖のための方法を提供している。Talmorら（1998）Eur. J. Immunol. 28：811も、Winzlerら（1997）J. Exp. Med. 185：317と同様に、増殖因子カクテルによりインビトロで細胞を増幅している。Girolomoniら（1995）Eur. J. Immunol. 25：2163は、マウス胎仔皮膚からの、初期樹状細胞前駆体の特性を有する細胞系の樹立について論じている。Fairchildら（2000）Curr.Biol.10：1515-1518は、マウス胚性幹細胞からの樹状細胞の定方向分化を記載している。
【００１０】
Yamada及びKatz（1999）J. Immunol. 163：5331は、IL-4、TNF-α、IL-1β、及びアゴニスト性抗CD40モノクローナル抗体により、CD14＋細胞系から樹状細胞を作製している。Pagliaら（1993）J. Exp. Med. 178：1893は、不死化幹細胞系について論じている。
【００１１】
その他の関連特許には、Gopalら（1998）の米国特許第5,811,297号；Moore（1998）の米国特許第5,830,682号；並びにMacKay及びMoore（1997）の米国特許第5,648,219号が含まれる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
不死化哺乳動物樹状細胞系の作製のための方法及び細胞系が提供される。樹状細胞系は、表面表現型、構成性及び誘導型の遺伝子発現パターン、CD8＋及び／又はCD4＋ Tリンパ球に対する機能的な効果、サイトカインの分泌により定義されるような、機能性の成熟樹状細胞の特徴を有しており、さらに、延長された期間、継続的にインビトロで増殖させることができる。特に興味深いのは、細胞系の、ナイーブT細胞へと刺激的に抗原を提示する能力である。樹状細胞系は、DNA、RNA、及びタンパク質に基づくアプローチを使用した分子の発見；樹状細胞サブセット特異的な抗体及びプローブの作製；樹状細胞の分化及び成熟の段階の決定；Tリンパ球及び／又はBリンパ球の抗原特異的刺激の誘導；Tリンパ球及び／又はBリンパ球における抗原特異的なアネルギー又は寛容の解明；樹状細胞とナチュラル・キラー細胞との相互作用の特徴決定；樹状細胞と内皮細胞との相互作用のインビトロ及びインビボの分析；並びに樹状細胞に対する生物学的応答調節物質の効果を決定するためのスクリーニング・アッセイ法において有用である。
【００１３】
態様の詳細な説明
ナイーブCD8＋及び／又はCD4＋ T細胞への抗原提示、並びに刺激に応答して起こる適切なサイトカイン合成を含む、機能性の成熟樹状細胞の特徴を有しうる不死化哺乳動物樹状細胞系が提供される。樹状細胞系には、例えば、樹状細胞特異的試薬の開発；様々な段階の樹状細胞における遺伝子発現パターンの解明；抗原提示；化合物スクリーニング等のような多数の用途が見出されている。
【００１４】
本発明の樹状細胞は、遺伝学的に改変された前駆細胞に由来しており、この細胞は、特異的制御配列を介して樹状細胞へ標的化される発現を伴い、細胞増殖促進性癌遺伝子を発現している。遺伝学的に改変された細胞は、実質的に全ての細胞が遺伝学的改変を含むトランスジェニック動物の状況で提供されてもよく、又は改変された幹細胞もしくは前駆細胞として提供されてもよい。遺伝学的に改変された前駆細胞から発生した樹状細胞は、増殖因子処理によってインビボ又はインビトロで増幅され、次いでインビトロで培養される。培養細胞は、増殖因子非依存性；細胞死に対する抵抗性；及び細胞老化に対する抵抗性のうちの1個又は複数に関して、場合によってさらに形質転換されうる。
【００１５】
樹状細胞系の起源として有用な哺乳動物種には、イヌ；ネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ等、及び霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型の哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等は、実験的検討にとって特に有用である。
【００１６】
本発明の細胞系は、延長された期間、一般的には少なくとも約2ヶ月間、より一般的には少なくとも約4ヶ月間継代されうるが、約18ヶ月もの長期にわたり継代される場合もあるし；不死化されている場合もある。継続的に培養されうる細胞は、不死化細胞として知られる。哺乳動物二倍体細胞は、無限の寿命を示し不死である腫瘍由来の細胞系とは対照的に、有限の寿命を有し、最後には複製老化を起こす。好ましい態様において、本発明の樹状細胞系は、不死化表現型（即ち、細胞周期停止を起こさない）；及び／又は樹状細胞機能を達成する能力、例えば抗原を取り込み、リンパ組織に移行し、かつ／又はナイーブTリンパ球及び／もしくはBリンパ球を刺激する能力の両方を同時に維持している。
【００１７】
細胞は、当業者に周知の従来の方法を使用して保存されうる。例えば、細胞を、増殖培地、又は15％ジメチルスルホキシド（DMSO）が添加された血清の中に再懸濁し、−80℃以下の温度で凍結させてもよい。
【００１８】
樹状細胞：本明細書において使用されるように、この用語は、リンパ組織又は非リンパ組織に見出される形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーをさす。樹状細胞は、「専門的（professional）」抗原提示細胞と呼ばれ、高いMHC拘束性T細胞の感作能を有している。樹状細胞は、機能、表現型、及び／又は遺伝子発現パターン、特に細胞表面表現型によって認識されうる。これらの細胞は、特別な形態学、高レベルの表面MHC-クラスII発現、並びにCD4＋及び／又はCD8＋ T細胞、特にナイーブT細胞へと抗原を提示する能力を特徴とする（Steinmanら（1991）Ann. Rev. Immunol. 9：271；これは、そのような細胞の記載のため参照として本明細書に組み入れられる）。
【００１９】
樹状細胞の細胞表面は、特殊であり、特徴的なベール（veil）様突起を有し、細胞表面マーカーCD11c及びMHCクラスIIの発現を特徴とする。大部分のDCが、T細胞、B細胞、単球／マクロファージ、及び顆粒球を含むその他の白血球系列のマーカーについては陰性である。樹状細胞の亜集団は、33D1、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CD1a-d、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD11b、CD24、CD40、CD48、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86、CD91、CD117、CD123（IL3Rα）、CD134、CD137、CD150、CD153、CD162、CXCR1、CXCR2、CXCR4、DCIR、DC-LAMP、DC-SIGN、DEC205、E-カドヘリン、ランゲリン（Langerin）、マンノース受容体、MARCO、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、及びいくつかのレクチンを含む、付加的なマーカーも発現している場合がある。これらの細胞表面マーカーの発現パターンは、樹状細胞の成熟度、起源の組織、及び／又は起源の種によって変動しうる。本発明の方法によって作製された例示的な細胞系の細胞表面表現型は、実施例の表1に提供されている。対象となる性質を有する細胞、例えば、成熟表現型マーカーのサブセットを有するもの等が、細胞系より選択されうる。
【００２０】
未熟樹状細胞は、低レベルのMHCクラスIIを発現しているが、抗原性タンパク質をエンドサイトーシスし、MHCクラスII分子との複合体として提示するために、それらにプロセシングを施すことができる。活性化された樹状細胞は、高レベルのMHCクラスII、ICAM-1、及びCD86を発現しており、例えば混合白血球反応（MLR）において、ナイーブ同種異系T細胞の増殖を刺激することができる。
【００２１】
機能的には、樹状細胞は、抗原提示の決定のための任意の便利なアッセイ法によって同定されうる。そのようなアッセイ法には、被検抗原の提示、その後のT細胞増殖、IL-2放出等の決定による、抗原感作T細胞及び／又はナイーブT細胞を刺激する能力の試験が含まれてもよい。
【００２２】
前駆細胞：前駆細胞とは、本明細書において使用されるように、最終的に樹状細胞を生じる細胞をさす。そのような細胞には、単一の造血系列への分化が決定されている前駆細胞、全ての造血系列を与えうる造血幹細胞、又は体内の全ての細胞を生じる生殖細胞もしくは胚性幹細胞のような細胞が含まれうる。
【００２３】
本発明の一つの態様において、前駆細胞は、本質的に全ての細胞が対象となる遺伝学的改変を含有しているトランスジェニック動物の作製によって提供される。トランスジェニック動物の作製は、当技術分野において周知である。トランスジェニック動物は、相同組換え、又はベクターのゲノムへのランダム組み込みによって作製されうる。安定的な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス及びその他の動物ウイルス、YAC等が含まれる。
【００２４】
相同組換えのためのDNA構築物は、所望の遺伝学的改変を有する標的化遺伝子の少なくとも一部を含み、標的遺伝子座と相同な領域を含むと考えられる。相同領域は、コード領域を含んでもよく、又はイントロン及び／もしくはゲノム配列を利用してもよい。ランダム組み込みのためのDNA構築物は、組換えを媒介するための相同領域を含む必要がない。便利には、ポジティブ選択及びネガティブ選択のためのマーカーが含まれる。相同組換えによって標的化された遺伝子改変を有する細胞を作製するための方法は、当技術分野において既知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な技術については、Keownら（1990）Methods in Enzymology 185：527-537を参照のこと。
【００２５】
胚性幹（ES）細胞については、ES細胞系が利用されてもよいし、又は胚細胞が宿主、例えばマウス、ラット、モルモット等から新鮮に入手されてもよい。ES細胞又は胚細胞が形質転換された場合、それらはトランスジェニック動物を作製するために使用されうる。形質転換の後、細胞が培養され、キメラ動物を作出し、最終的にはトランスジェニックを作出するため、所望の遺伝学的改変を有するものが、胚処置及び胚盤胞注射のために使用される。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜等のような任意の非ヒト哺乳動物でありうる。
【００２６】
又は、処置された胚性幹細胞をインビトロで培養し、GM-CSF、Flt3L、及び／又はIL-3のようなサイトカインを使用して、樹状細胞へと分化させてもよい（Fairchildら（2000）Curr. Biol. 10：1515）。
【００２７】
本発明の別の態様において、特にトランスジェニック動物を作製することが可能でない場合、その他の前駆細胞及び／又は幹細胞が遺伝学的に改変されうる。この目的のために特に興味深いのは、造血幹細胞である。そのような細胞は、多数の報告において、ウイルスによる形質導入及びその他の手段によって遺伝学的に改変されることが示されている（例えば、Allayら（1998）Nat Med 4（10）：1136-43；Zhaoら、Blood 90（12）：4687-98；Chenら（2000）Stem Cells 18（5）：352-9；Guenecheaら（2000）Mol Ther 1（6）：566-73参照）。外因性DNAの導入が、インビトロ又はインビボ、一般的にはインビトロで達成され、次いで改変された細胞が、宿主動物へと再導入されるか、又は培養において維持される。
【００２８】
前駆細胞が遺伝学的に改変されたことを立証するためには、様々な技術が利用されうる。細胞のゲノムを制限酵素処理し、増幅して、又は増幅せずに使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応；ゲル電気泳動；制限酵素切断分析；サザンブロット、ノーザンブロット、及びウェスタンブロット；配列決定等が、全て利用されうる。細胞が、導入されたDNAを発現する能力を維持しつつ、分化しうることを保証するため、細胞は様々な条件の下で増殖させられうる。インビトロ及びインビボの様々な試験が、細胞の多能性が維持されていることを保証するために、利用されうる。
【００２９】
遺伝学的に改変された前駆細胞の移植に適した免疫無防備状態哺乳動物宿主は、存在するか、又は作出されうる。重要な要因は、免疫無防備状態宿主が、導入された細胞に対する免疫応答を始動し得ないということである。特に興味深いのは、免疫グロブリン及びT細胞抗原受容体をコードする遺伝子座における生殖系列DNA再編成が起こり得ない遺伝学的欠陥のため、又は胸腺発生の遺伝学的欠陥（nu/nu）のため、免疫無防備状態となっている小型の哺乳動物、例えばウサギ、スナネズミ、ハムスター、モルモット等、特にげっ歯動物、例えばマウス及びラットである。
【００３０】
現在入手可能な宿主には、RAG-1及び／もしくはRAG-2と関連したリコンビナーゼ機能を欠くよう（例えば、市販のTIM（商標）RAG-2トランスジェニック）、又はクラスI及び／もしくはクラスII MHC抗原を欠くよう（例えば、市販のC1D及びC2Dトランスジェニック系統）、遺伝子的に操作されたマウスが含まれる。特に興味深いのは、機能的に組換えられる免疫グロブリン及びT細胞受容体の遺伝子の欠如によって顕在化する重症複合免疫不全を引き起こす、scid遺伝子座のホモ接合性変異を有しているマウスである。scid/scid変異を利用することも可能であるし、又は多数の異なる遺伝学的背景、例えばCB.17、ICR（非近交系）、C3H、BALB/c、C57BI/6、AKR、BA、B10、129等へと交配することもできる。レシピエントとして有用なその他のマウスは、NOD scid/scid；SGB scid/scid、bh/bh；CB.17 scid/hr；NIH-3 bg/nu/xid、及びMETA nu/nuである。
【００３１】
遺伝学的に改変された前駆細胞を動物宿主へと再導入する代わりに、細胞を、樹状細胞を作製可能な培養系へと導入することもできる。例えば、Flt-3リガンドが添加され、高密度で培養された骨髄培養物は、CD11c、CD86、及び主要組織適合性複合体（MHC）クラスIIを発現し（Braselら（2000）Blood 2000 96（9）：3029-3039）、かつ樹状細胞のその他の特徴を有する小型のリンパ球サイズの細胞を与えることが示されている。
【００３２】
遺伝学的改変：前記の前駆細胞は、特異的制御配列を介して樹状細胞へ標的化される発現を伴う細胞増殖促進性癌遺伝子の導入によって遺伝学的に改変される。哺乳動物細胞を改変するために適したベクターは、当技術分野において周知である。ベクターは、エピソーム性、例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等のようなウイルス由来ベクターであってもよいし、又は相同組換えもしくはランダム組み込みによって標的細胞ゲノムへと組み込まれるもの、例えばMMLV、HIV-1、ALV等のようなレトロウイルス由来ベクターであってもよい。前駆体及び幹細胞の遺伝学的改変の例については、Svendsenら（1999）Trends Neurosci. 22（8）：357-64；Krawetzら（1999）Gene 234（1）：1-9；Pellegriniら、Med Biol Eng Comput. 36（6）：778-90；及びAlison（1998）Curr Opin Cell Biol. 10（6）：710-5を参照のこと。
【００３３】
細胞増殖促進性癌遺伝子は、当技術分野において既知である。本発明にとって好ましい癌遺伝子は、強力な癌遺伝子であり、このグループには、シミアンウイルス40（SV40）ラージT抗原；ポリオーマウイルス・ミドルT抗原又はラージT抗原；ヒト・パピローマウイルスE7又はE6タンパク質；アデノウイルスE1A、v-ras；v-myc、v-fms、v-erbB等が含まれる。好ましい態様において、癌遺伝子はSV40ラージT抗原である。
【００３４】
癌遺伝子は、例えば適当な増殖因子の存在下で、培養において維持されうる樹状細胞の作製を可能にするよう十分に高いレベルで樹状細胞の発現を誘導するコンディショナル・プロモーターと機能的に連結される。好ましいプロモーターは、樹状細胞を作製するのに十分な期間、動物又は細胞系列が維持されるよう、非樹状細胞における発現レベルが十分に低い、樹状細胞に対して選択的なものである。すなわち、癌遺伝子は、動物又は細胞系列の増殖が致命的に抑止される程、広範には発現されない。
【００３５】
最適なプロモーターは、樹状細胞において強力に、そして場合によっては選択的に発現される遺伝子に由来する。そのようなプロモーターには、CD11cをコードする遺伝子（Lopez-Cabreraら（1993）J Biol Chem. 268（2）：1187-93）；CD1タンパク質、特にCD1aをコードする遺伝子（Blumbergら、Immunol Rev. 147：5-29）；MHCクラスII抗原をコードする遺伝子、例えばヒトHLA-DR、マウスIAα又はβの遺伝子等（GlimcherおよびKara（1992）Annu Rev Immunol. 10：13-49参照）；CD86をコードする遺伝子（Liら（2000）Hum Immunol. 61（5）：486-98参照）；インターロイキン-3受容体αのようなサイトカイン受容体をコードする遺伝子（Miyajimaら（1995）Blood 85（5）：1246-53参照）；樹状細胞マーカー33D1、CD83、CLEC、DCIR、DCL1、DC-SIGN、DEC205、デクチン（Dectin）、ランゲリン、MARCO、TLR3をコードする遺伝子等に由来するプロモーターが含まれる。好ましい態様において、プロモーターはCD11cプロモーターである。
【００３６】
樹状細胞の増幅：宿主内の機能的に成熟した樹状細胞の総数は、場合により、適当な増殖因子の前投与によって増幅される。例えば、flt3-Lは、インビボ及びインビトロの両方において、多数の機能的に成熟した樹状細胞の生成を刺激することが見出されている（1995年10月4日出願の米国特許出願第08/539,142号）。Flt3-Lとは、EP0627487A2及び国際公開公報第94/28391号（いずれも、参照として本明細書に組込まれる）に記載されているポリペプチドの属をさす。ヒトflt3-L cDNAは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection：ATCC）（Rockville, Md., USA）に1993年8月6日に寄託され、アクセッション番号ATCC 69382を授与された。その他の有用なサイトカインには、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（GM-CSF；米国特許第5,108,910号及び同第5,229,496号（各々、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている）が含まれる。市販のGM-CSF（sargramostim、Leukine（登録商標））は、イミュネックス社（Immunex Corp.）、Seattle, Wash.より入手可能である。さらに、GM-CSF/IL-3融合タンパク質（即ち、GM-CSFとIL-3とのC末端−N末端融合体）が使用されうる。そのような融合タンパク質は、当技術分野において周知であり、米国特許第5,199,942号；同第5,108,910号、及び同第5,073,627号（各々、参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００３７】
当技術分野において既知であり、実施されているような、送達のための様々な経路及び計画が、使用されうる。例えば、薬剤がFlt3-Lである場合、Flt3-Lは、体重1kg当たり約1〜5000μg、一般的には体重1kg当たり約10〜1000μg、より一般的には体重1kg当たり約50〜500μgの用量で、毎日、投与されうる。投与は、局所的な部位への投与、例えば皮下投与であってもよいし、又は全身投与、例えば腹腔内投与、静脈内投与であってもよく、そして持続的な送達法、例えば浸透圧ポンプ又は微粒子（後者は、米国特許第6,120,807号「GM-CSFの長期的放出（Prolonged release of GM-CSF）」に記載されている）を含みうる。
【００３８】
インビトロ培養：本発明の細胞は、樹状細胞の起源から単離され、組織は、胎児、新生児、小児、又は成体のものでありうる。血液、骨髄、脳、眼、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、皮膚、脾臓、及び胸腺を含む、前駆細胞、未熟樹状細胞、又は成熟樹状細胞の任意の組織起源が、使用されうる。細胞の起源として使用するための例示的な組織は、脾臓組織又は骨髄組織である。未分離の細胞が培養中に播かれてもよいし、又は、樹状細胞を濃縮するための単離工程が利用されてもよい。濃縮された細胞集団は、約75％が選択された表現型の細胞であってもよいし、より一般的には少なくとも90％が選択された表現型の細胞であってもよい。濃縮された細胞集団は、細胞表面上の特異的マーカーに基づき（マーカーは、アフィニティ試薬、例えば、モノクローナル抗体により同定される）；又は勾配遠心分離後の差異を有する密度に基づき、その他の細胞、例えばリンパ球等から分離される。単離もしくは濃縮の後、又は培養の初期の期間の後、細胞は、好ましくは、例えば、半固体培地におけるコロニー形成、限界希釈、自動細胞沈着（automated cell deposition）等によってクローニングされる。
【００３９】
本発明の細胞を単離するための、又はこれらの細胞もしくはそれらの子孫を維持するための培養培地の選択は、日常的な実験設計の問題であり、当技術分野における通常の技術の範囲内にある。最低限、培養培地は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、及び鉱物を含有している。培地は、タンパク質もしくは血清を含んでいなくてもよいし、又は必要に応じて増殖因子もしくは血清のような成分を含有していてもよい。本発明の樹状細胞のための好ましい増殖培地は、10％FBS、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、2-ME、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン、ピルビン酸Na、及びHEPES緩衝液が添加されたマッコイ（McCoy）培地である。
【００４０】
付加的な増殖因子、好ましくは50〜1000ng/mlの濃度のFlt3-リガンド；好ましくは5〜500U/mlのTNF-α、及び約5〜100ng/mlの濃度のGM-CSFのうちの1個又は複数が、培地に添加される。場合により培養培地に添加されうるその他の因子には、これらに限定はされないが、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF；好ましくは約25〜300U/ml）、単球−マクロファージ・コロニー刺激因子（M-CSF；好ましくは約100〜1000U/ml）、IL-1α（好ましくは約1〜100LAF単位/ml）、IL-1β（好ましくは約1〜100LAF単位/ml）、IL-3（好ましくは約25〜500U/ml）、IL-4（好ましくは約50〜100ng/ml）、IL-6（好ましくは約10〜100ng/ml）、IL-15（好ましくは約50〜500ng/ml）、幹細胞因子（SCF；好ましくは約10〜100ng/ml）、白血病阻害因子（LIF；好ましくは約1〜100ng/ml）、オンコスタチンM（OSM；好ましくは1〜1000ng/ml）、トランスフォーミング増殖因子-β-1（TGF-β1；好ましくは約0.1〜10ng/ml）、及びトロンボポエチン（TPO；好ましくは約1000〜10,000U/ml）が含まれる。場合により培養培地に添加されうるその他の薬剤には、培養物に内在する抗増殖因子、アポトーシス促進因子、又は分化調節因子の活性を阻止するための、抗体（例えば、抗IFNα）、天然又は人工の可溶性分子（例えば、核因子−カッパBリガンドの可溶性受容体；sRANKL）、ペプチド（例えば、Fas由来ペプチド）、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（例えば、アンチBax又はアンチMyD88）等が含まれる。
【００４１】
増殖因子非依存性、細胞死に対する抵抗性、及び／又は老化に対する抵抗性に関する形質転換：継続的に培養可能であり、限定された数の細胞世代の後に死滅しない細胞は、有限の初代培養物とは対照的に「不死化されている」と呼ばれる。細胞の不死化は、自然にも起こりうるし、又は化学的に、もしくはウイルスによっても誘導されうる。発明の樹状細胞系は、場合により、増殖因子非依存性、細胞死に対する抵抗性、脱分化に対する抵抗性、及び／又は老化に対する抵抗性に関して選択又は形質転換されうる。
【００４２】
不死化は、形質転換及び表現型の有意な変化と関連している可能性がある。改変された継続的に培養される能力は、例えば細胞の分裂、老化、もしくは死滅において役割を果たす産物の遺伝子のうちの1個又は複数の欠失もしくは変異、又は分裂、老化、もしくは死滅の遺伝子の作用に優る1個又は複数の癌遺伝子の過剰発現もしくは変異による可能性がある。不死化及び増殖因子非依存性を増強するために細胞へトランスフェクト又は形質導入されうる遺伝子には、ポリオーマ・ミドルT抗原、アデノウイルスE1A、myc癌遺伝子、v-rel融合体、並びにヒト・パピローマウイルス16型又は18型のE6遺伝子及びE7遺伝子が含まれる。老化に対する抵抗性のため細胞へトランスフェクト又は形質導入されうる遺伝子には、テロメラーゼが含まれる。プログラム細胞死に対する抵抗性のため導入されうる遺伝子には、bcl-2ファミリーの抗アポトーシス・タンパク質が含まれる。そのような遺伝子の導入に適したベクター、及びそれらの使用法は、当技術分野において既知である。
【００４３】
樹状細胞系の特徴決定：樹状細胞は、細胞の成熟度と特異的に関連している機能的活性及び表現型を有している。樹状細胞の特徴決定及び分類において有用な細胞表面マーカーには：CD11a；CD11b；CD11c；F4/80；FcγRII/III受容体（FcR）；MHCクラスI；MHCクラスII；CD80；CD86；CD54；CD40；及びCD117が含まれる。本発明の細胞系は、CD11c、CD54、CD86、及びMHCクラスIIの発現を含む成熟樹状細胞のいくつかの表現型特徴を有している。系の大半が、CD40も発現する。
【００４４】
モノクローナル抗体を使用した細胞表面の分析は、フローサイトメーターを使用してなされる（方法の概説については、Viedma Contreras（1999）Clin Chem Lab Med. 37（6）：607-22；MainoおよびPicker（1998）Cytometry 34（5）：207-15；DrouetおよびLees（1993）Biol Cell. 78（1-2）：73-8を参照のこと）。簡単に説明すると、細胞を、蛍光色素と直接接合したモノクローナル抗体と結合させるか、又は未接合一次抗体と結合させた後、蛍光色素と接合した市販の二次抗体と結合させる。染色した細胞を、フローサイトメーター（例えば、Becton Dickinson, Mountain View, Calif.より入手可能なもの）を使用して分析する。樹状細胞の付加的な表現型特徴は、遺伝子発現プロファイル決定により、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により特徴決定されうる。本発明の細胞系は、CCR1、CCR5、及びCXCR4の発現を含む樹状細胞のいくつかの特徴を有している。系の大半が、CCR7も発現する。
【００４５】
成熟樹状細胞の表現型を有している細胞系の同定は、例えば実施例に記載されるように、MLRもしくは増殖アッセイ法又は細胞障害性アッセイ法における、ナイーブCD8＋及び／又はCD4＋ T細胞の増殖、サイトカイン産生、又は細胞障害活性を刺激する細胞の能力によって確認される。簡単に説明すると、樹状細胞系を、予め活性化して、又は活性化せずに、抗原の存在下でナイーブT細胞と共にインキュベートする。より均一なT細胞シグナルを提供するため、ナイーブT細胞は、明確な特異性を有するT細胞受容体導入遺伝子を有するトランスジェニック動物から得られてもよい。次いで、これらのT細胞を、増殖性のサイトカイン産生性かつ／又は細胞障害性のT細胞、即ち分化した又は活性化された細胞へと分化するよう抗原特異的に刺激する樹状細胞の能力が、測定される。
【００４６】
樹状細胞系の使用：本発明の培養細胞は、極めて多様に、例えば遺伝子の発見、樹状細胞サブセット特異的な抗体及びプローブの作製；樹状細胞の分化及び成熟の段階の決定；Tリンパ球及び／又はBリンパ球における抗原特異的応答の誘導；Tリンパ球及び／又はBリンパ球における抗原特異的なアネルギー又は寛容の解明；樹状細胞とナチュラル・キラー細胞との相互作用の特徴決定；樹状細胞と内皮細胞との相互作用のインビトロ及びインビボの分析；並びにスクリーニング・アッセイ法において、使用されうる。
【００４７】
本発明の細胞は、樹状細胞に対する活性を有する因子を検出するためのインビトロ・アッセイ法及びスクリーニングにとって有用である。タンパク質結合に関するイムノアッセイ法；細胞の増殖、分化、及び機能的活性の決定；ホルモンの産生等を含む、極めて多様なアッセイ法が、この目的のために使用されうる。
【００４８】
特に重要であるのは、本発明の樹状細胞における遺伝子発現の調査である。発現された遺伝子のセットは、当技術分野において既知であるような、多様な目的の細胞、例えば造血幹細胞、骨髄への分化が決定されている前駆細胞、未熟樹状細胞等と比較されうる。例えば、発生途中に調節される遺伝子を決定するため、分化途中の異なる段階で発現される遺伝子のセットを比較することができる。
【００４９】
特異的mRNAを検出するための当技術分野において既知の任意の適当な定性的又は定量的な方法が使用されうる。mRNAは、例えば、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより、組織切片におけるインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、逆転写酵素−PCRにより、又はポリA＋ mRNAを含有しているノーザンブロットにおいて、検出されうる。当業者であれば、二つの試料間のmRNA転写物のサイズ又は量の差を決定するために、これらの方法を容易に使用することができると考えられる。例えば、樹状細胞における特定のmRNAのレベルが、基準試料、例えば分化した細胞におけるmRNAの発現と比較される。
【００５０】
試料中のmRNA発現レベルの検出及び比較のための任意の適当な方法が、本発明の方法に関して使用されうる。例えば、試料中のmRNA発現レベルは、試料からの発現配列タグ（EST）のライブラリーの作製によって決定されうる。ライブラリー内のESTの相対出現頻度（relative representation）の計算は、出発試料内の遺伝子転写物の相対出現頻度を概算するために使用されうる。次いで、選択されたポリヌクレオチド、特に本明細書に記載された差異を有して発現された1個又は複数の遺伝子に対応するポリヌクレオチドの相対発現レベルを決定するため、被検試料のEST分析の結果が、基準試料のEST分析と比較されうる。
【００５１】
又は、被検試料中の遺伝子発現は、遺伝子発現の連続分析（serial analysis of gene expression：SAGE）方法論（Velculescuら、Science（1995）270：484）を使用して実施されうる。簡潔に説明すると、SAGEは、各転写物内の特定の位置からの短い特有の配列タグの単離を含む。配列タグが、鎖状に連結され、クローニングされ、そして配列決定される。出発試料内の特定の転写物の頻度が、関連配列タグが配列集団と遭遇する回数によって反映される。
【００５２】
被検試料中の遺伝子発現は、ディファレンシャル・ディスプレイ（DD）方法論を使用しても分析されうる。DDにおいては、特異的配列デリミター（delimiter）（例えば、制限酵素切断部位）によって画定された断片が、発現遺伝子内の断片長又は断片位置に関する情報と結び付けられた、遺伝子の特有の同定剤として使用される。次いで、試料による発現遺伝子の相対出現頻度が、全ての可能な断片のプール内のその遺伝子と関連した断片の相対出現頻度に基づき推定されうる。DDを実施するための方法及び組成物は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,776,683号；及び米国特許第5,807,680号を参照のこと。
【００５３】
又は、試料中の遺伝子発現は、ヌクレオチド相互作用の特異性に基づくハイブリダイゼーション分析を使用して分析される。オリゴヌクレオチド又はcDNAを使用して、特定の配列組成のDNA又はRNAを選択的に同定又は捕獲することができ、そして定性的又は定量的に決定された既知の捕獲配列とハイブリダイズしたRNA又はcCDNAの量が、試料中の細胞メッセージのプール内の特定のメッセージの相対出現頻度に関する情報を提供する。ハイブリダイゼーション分析は、例えば、フィルター、顕微鏡スライド、もしくはマイクロチップを含む高密度フォーマットを有するアレイに基づく技術、又は分光学的分析（例えば、質量分析）を使用した溶液に基づく技術を使用することにより、数百〜何千の遺伝子の相対発現の同時スクリーニングを可能にするよう設計されうる。本発明の診断法における一つの例示的なアレイの使用は、後に、より詳細に記載される。
【００５４】
当技術分野において既知の任意の適当な方法に従い作製されうるアレイへのハイブリダイゼーションが実施されうる。例えば、大きなオリゴヌクレオチド・アレイを作製する方法は、光照射（light-directed）合成技術を使用した米国特許第5,134,854号及び米国特許第5,445,934号に記載されている。コンピューター・コントロール・システムを使用して、不均一なモノマーのアレイが、多数の反応部位における同時カップリングによって、不均一なポリマーのアレイへと変換される。又は、例えば公開された国際公開公報第95/35505号に記載されたように、マイクロアレイは、予め合成されたオリゴヌクレオチドの固体基質上への沈着によって作製される。
【００５５】
試料のアレイとのハイブリダイゼーションからのデータの収集のための方法も、当技術分野において周知である。例えば、細胞試料のポリヌクレオチドを検出可能蛍光標識を使用して作製し、検出可能標識の存在に関してマイクロアレイをスキャンすることにより、試料中のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することができる。装置上の蛍光標示された標的を検出するための方法及び装置は、当技術分野において既知である。一般に、そのような検出装置は、顕微鏡、及び基質に光を照射するための光源を含む。x-yトランスレーション・ステージ（translation stage）が基質の位置を変動させる間、フォトン・カウンター（photon counter）が基質からの蛍光を検出する。本発明の方法において使用されうる共焦点検出装置は、米国特許第5,631,734号に記載されている。走査型レーザー顕微鏡は、Shalonら、Genome Res.（1996）6：639に記載されている。適切な励起線を使用したスキャンが、使用された各フルオロフォアについて実施される。次いで、スキャンから作製されたディジタル画像が、その後の分析のために合成される。任意の特定のアレイ要素について、一つの試料からの蛍光シグナルの比率が、もう一つの試料からの蛍光シグナルと比較され、相対シグナル強度が決定される。
【００５６】
アレイとのハイブリダイゼーションから収集されたデータを分析するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を含む場合、データ分析は、収集されたデータから基質位置の関数として蛍光強度を決定する工程、アウトライアー、即ち予定された統計分布を逸脱しているデータを除去する工程、及び残りのデータから標的の相対結合親和性を算出する工程を含みうる。得られたデータは、画像として表示され、各領域内の強度は、標的とプローブとの間の結合親和性に依って変動する。
【００５７】
パターン・マッチングは、手動で実施されてもよいし、又はコンピュータ・プログラムを使用して実施されてもよい。基質マトリックス（例えば、アレイ）の調製、そのようなマトリックスと共に使用するためのオリゴヌクレオチドの設計、プローブの標識、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイズしたマトリックスのスキャニング、及び比較分析を含む作製されたパターンの分析のための方法は、例えば米国特許第5,800,992号に記載されている。
【００５８】
もう一つのスクリーニング法において、被検試料は、タンパク質レベルでアッセイされる。分析の方法は、二次元ゲル；質量分析；特異的細胞画分（例えばリソソーム）の分析；プロセシングを受けたペプチドのMHC抗原からの溶出；及びその他のプロテオミクス・アプローチを含みうる。
【００５９】
診断は、被検試料中の差異を有して発現されたポリペプチドの欠如もしくは存在又は改変された量を決定するための多数の方法のうちのいずれかを使用して達成されうる。例えば、検出は、従来の方式に従い実施される、標識された抗体を用いた細胞又は組織学的切片（例えば、生検試料由来）の染色を利用することができる。細胞は、細胞質分子を染色するため、透過性化されうる。一般に、本発明の差異を有して発現されたポリペプチドと特異的に結合する抗体が、試料に添加され、エピトープとの結合を可能にするために十分な期間、一般的には少なくとも約10分間、インキュベートされる。抗体は、標識検出のため直接標識されてもよいし（例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、化学発光物質等を使用して）、又は結合を検出するための二次抗体もしくは試薬（例えば、ビオチン及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン、蛍光化合物、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等と接合した二次抗体）と併せて使用されてもよい。抗体結合の欠如又は存在は、解離した細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検、ラジオグラフィー、シンチレーション計数等を含む様々な方法によって決定されうる。差異を有して発現されたポリペプチドのレベル又は量の定性的又は定量的な検出の任意の適当な別法、例えばELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ法等も、使用されうる。
【００６０】
馴化培地、即ち本発明の細胞が培養において可溶性因子の分泌を可能にするのに十分な期間増殖させられた培地は、様々な段階で単離され、樹状細胞により分泌された因子の存在に関して成分が分析されうる。分離は、分子量、分子体積、電荷、それらの組み合わせ等による分離を可能にする、HPLC、逆相HPLC、ゲル電気泳動、等電点フォーカシング、透析、又はその他の非変性性技術を用いて達成されうる。特異的画分をさらに濃縮するため、これらの技術のうちの1個又は複数を組み合わせることもできる。
【００６１】
樹状細胞は、リンパ球の分化及び免疫応答と関連した因子の単離及び評価において培養系と併せて使用されうる。従って、樹状細胞は、抗原提示、並びにMHCクラスI及びクラスIIの認識の、リンパ細胞に対する効果を、細胞挙動、遺伝子発現等の分析によって決定するためのアッセイ法において、かつ／又は抗原特異的応答を誘導するため、使用されうる。本発明の樹状細胞は、インビボ又はインビトロのいずれかで、特異的なT細胞により媒介される免疫応答を誘発するため、抗原、例えば腫瘍抗原を「載せ」られうる。
【００６２】
本発明の樹状細胞は、抗原特異的リンパ球活性化アッセイ法において有利に使用されうる。活性化された樹状細胞を作製するためには、約1〜48時間、抗原を樹状細胞と共にインキュベートすることが好ましい。抗原のエンドサイトーシス、プロセシング、及び提示のために必要な時間は、この目的のために使用されるタンパク質性抗原に依存する。抗原の取り込み及び提示を測定するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、樹状細胞を、可溶性タンパク質抗原と共に3〜24時間インキュベートし、次いで外因性抗原を除去するために洗浄することができる。
【００６３】
次いで、これらの抗原提示刺激細胞は、応答細胞、一般的にはナイーブ又は感作後のCD8＋及び／又はCD4＋ T細胞と混合される。約4〜72時間のインキュベーション（感作後Tリンパ球の場合）又は約0.5〜7日間（ナイーブTリンパ球の場合）の後、プロセシングを受け提示された抗原に応答して起こるT細胞の活性化が測定される。典型的なアッセイ法は、抗原に応答して起こるT細胞増殖のような測定、又はT細胞によって媒介された抗原特異的な死滅の測定を含む。応答細胞活性化は、IL-2のようなサイトカインの産生、又はフローサイトメトリーによるT細胞特異的活性化マーカーの決定、又はRT-PCRによる遺伝子発現変化のアッセイ法によっても測定されうる。
【００６４】
又は、活性化された樹状細胞は、CD8＋又はCD4＋ Tリンパ球における非応答性を誘導するために使用されうる。MHCクラスI又はクラスIIの認識に加え、T細胞活性化は、抗原提示細胞上の補助受容体を必要とする。そのような補助受容体、例えばCD80、CD86の刺激を阻止又は排除することによって、補助受容体欠損抗原提示細胞による抗原の提示が、CD8＋又はCD4＋ Tリンパ球を、非応答性もしくはアネルギー状態にするため、又は抗原に対するサイトカイン応答を改変するために使用されうる。そのようなT細胞の細胞接触依存性の「寛容形成」誘導は、樹状細胞がT調節細胞又はTh2細胞を優先的に誘発するようNotch又はOX2Rのような分子のリガンドを発現するよう誘導又は操作された場合にも、能動的に促進されうる。寛容形成誘導は、IL-10及び／又はIL-12p40ホモダイマー、アルギナーゼ、一酸化窒素（NO）、又はTGF-β1のような樹状細胞から放出された可溶性因子によっても媒介されうる。樹状細胞は、T細胞との相互作用の前に、又はその途中に、そのような因子を優先的に産生するよう選択、活性化、かつ／又は改変されうる。可溶性因子の産生と同様に、成熟樹状細胞は、IL-12産生及び／又はCD40シグナリングのような中心的な特質を「消耗」又は消失させるため、前処理されてもよい。その場合、その後のT細胞接触の後、Th1生成の減少、又はTh1からTh2へのT細胞分化の偏りが起こりうる（Langenkampら（2000）Nat.Immunol. 1：311）。寛容原性樹状細胞の作製及び使用は、これらの方法によって例示されるが、樹状細胞の分化又は機能の改変に基づくその他のアプローチも排除されない。
【００６５】
本明細書に記載された樹状細胞系は、抗原を提示するよう、増殖するよう、抗体を産生するよう、かつ／又は抗体アイソタイプを切り替えるよう、Bリンパ球を、T細胞非依存的に直接的に活性化するためにも使用されうる。次いで、そのようなDCにより改変されたB細胞は、抗原依存的又は抗原非依存的なシグナルによって、T細胞応答を増加させるため、改変するため、又は減少させるため、使用されうる。
【００６６】
本発明の樹状細胞は、樹状細胞のナチュラル・キラー（NK）細胞及び内皮細胞との相互作用のアッセイ法においても使用されうる。前者の場合、MHCクラスI及びクラスIIの認識に加え、NK細胞は、いくつかの樹状細胞型に対して直接的に細胞障害性であるかもしれず、この感受性は、樹状細胞による細胞内分子、表面分子、及び分泌型分子の発現によって改変されるかもしれない。反対に、樹状細胞も、IL-12及びIL-15のようなNK細胞刺激因子を産生しうる。後者の場合、移行樹状細胞は、内皮細胞及びそれらの周囲の細胞外マトリックスの機能を調整するかもしれず、内皮遊出は、活性化状態、生存、及び／又は他の細胞との相互作用の質に影響する特異な影響を樹状細胞に与えるかもしれない。
【００６７】
遺伝子が、様々な目的のため、樹状細胞へ導入されうる。又は、アンチセンスmRNA又はリボザイムを発現し、それにより不要な遺伝子の発現を阻止するベクターが導入される。当技術分野において既知の様々な技術、例えば電気穿孔、カルシウム沈殿DNA、融合、トランスフェクション、リポフェクション等が、標的細胞をトランスフェクトするために使用されうる。DNAが導入される特定の方法は、本発明の実施にとって重要ではない。外因性遺伝子を標的哺乳動物細胞へ移入するのに有用な多くのベクターが、利用可能である。ベクターは、エピソーム性、例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルス等のようなウイルス由来ベクターであってもよいし、又は相同組換え又はランダム組み込みによって標的細胞ゲノムへと組み込まれるもの、例えばMMLV、HIV-1、ALV等のようなレトロウイルス由来ベクターであってもよい。
【００６８】
本発明の細胞は、生物学的応答調節物質、即ち樹状細胞の様々な代謝経路に影響する化合物及び因子をスクリーニングするためにも使用されうる。例えば、本発明の細胞は、樹状細胞の増殖又は分化又は抗原提示自体を増強又は阻害する分子に関してスクリーニングするために使用されうる。典型的には、候補化合物が樹状細胞へと添加され、細胞表面表現型、抗原提示能のような機能的活性、遺伝子発現パターン等の評価によって、樹状細胞の応答がモニタリングされると思われる。特に興味深いのは、ヒト細胞にとって低い毒性を有している薬剤に関するスクリーニング・アッセイ法である。
【００６９】
「薬剤」という用語は、本明細書において使用されるように、樹状細胞の表現型を改変する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質又は医薬品を記載するものである。一般に、様々な濃度に対する差異を有する反応を得るために、多数のアッセイ混合物が、異なる薬剤濃度を用いて平行して実施される。典型的には、これらの濃度のうちの一つは、陰性対照として使用される（即ち、ゼロ濃度又は検出レベル未満）。
【００７０】
候補薬剤は、ポリペプチド、核酸、及び小型の有機化合物、例えば50ダルトン超約2,500ダルトン未満の分子量を有する化合物を含む、多数の化学物質クラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的にはアミン、カルボニル、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を少なくとも1個含み、好ましくは官能化学基のうちの少なくとも2個を含む。候補薬剤は、しばしば、前記官能基のうちの1個又は複数で置換された環式炭素構造もしくは複素環式構造及び／又は芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログ、又は組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。
【００７１】
候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む極めて多様な起源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、極めて多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特異的合成のための多数の手段が利用可能である。又は、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、入手可能であるか、又は容易に作製される。さらに、天然又は合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理学的、及び生化学的な手段により容易に改変され、コンビナトリアル・ライブラリーを作製するために使用されうる。構造アナログを作製するため、既知の薬理学的薬剤に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の特異的又はランダムな化学修飾を施すことが可能である。
【００７２】
さらに、本発明の細胞は、細胞特異的タンパク質に対する抗体を作製するために使用されうる。例えば、細胞表面マーカーに対する抗体を作製し、細胞分別システムを使用して、不均一な細胞集団から亜集団を精製するために使用することができる。発現されたポリペプチド又はタンパク質は、単独で、又は既知の免疫原性担体、例えばKLH、pre-S HBsAg、その他のウイルス又は真核生物のタンパク質等と結合して免疫原として使用される従来の方法に従い、抗体が調製される。様々なアジュバントが、適宜、一連の注射と共に利用されうる。モノクローナル抗体の場合、1回又は複数回の追加注射の後、脾臓が単離され、リンパ球が細胞融合によって不死化され、次いで、高親和性抗体結合に関してスクリーニングされる。次いで、所望の抗体を産生している不死化細胞、即ちハイブリドーマが増幅されうる。さらなる説明については、「Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual」、Harlow及びLane編、Cold Spring Harbor Laboratories、Cold Spring Harbor、New York、1988を参照のこと。望ましい場合には、抗体の親和性をさらに増強するため、重鎖及び軽鎖をコードするmRNAを単離し、大腸菌におけるクローニングにより突然変異を誘発し、そして重鎖及び軽鎖を混合することができる。インビボ免疫感作に代わる抗体生成法には、一般的にはインビトロ・アフィニティ成熟と併せられるファージ・ディスプレイ・ライブラリーとの結合が含まれる。ファージ・ディスプレイは、免疫原性の不充分な細胞表面分子にとって特に有用であり、例えば活性化された樹状細胞又は寛容原性樹状細胞のいずれかにより発現される分子を優先的に選択するためのサブトラクションに基づくアプローチを使用して実施されうる。
【００７３】
樹状細胞は、（タンパク質、糖タンパク質、及びペプチドを含む）外因性抗原を取り込み、プロセシングを施し、そして提示することができるため、これらの細胞は、特定の抗原のドミナントなエピトープを同定するために使用されうる貴重なツールである。樹状細胞は、自然に、外因性タンパク質にプロセシングを施し、提示するため、インビボの過程をより良好に模倣したエピトープ・マッピング研究が許容される。
【００７４】
本発明の樹状細胞は、培養され、有意な数で入手されうる、安定な、再現可能な、均一な細胞集団を提供する。単核細胞調製物中の樹状細胞の低い頻度は、この特有の細胞の分子的、生化学的、及び生理学的な研究の障害となっていた。細胞系は、樹状細胞における遺伝子発現パターン、並びに抗原提示を可能にする分子及び過程の調査を許容する。細胞成分、並びに抗原の取り込み、プロセシング、及び提示に関与している分子及び過程とのそれらの相互作用が、解明されうる。さらに、この均一な樹状細胞系は、樹状細胞の系列特異的マーカーを同定するための免疫原として使用されうる。
【００７５】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物の種又は属、構築物、及び試薬に限定されず、変動しうることを理解されたい。本明細書において使用された語句は、特定の態様を記載することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限するためのものではないことも理解されたい。
【００７６】
本明細書において使用されるように、単数形の「一つの（a）」、「一つの（an）」、及び「その（the）」には、他に特記しない限り、複数形の指示対象が含まれる。従って、例えば、「一つの免疫感作（an immunizaiton）」との言及には、複数のそのような免疫感作が含まれ、「その細胞（the cell）」との言及には、1個又は複数の細胞及び当業者に既知のそれらの等価物への言及が含まれる。本明細書において使用された技術用語及び科学用語は、全て、他に特記しない限り、この発明が属する技術分野の当業者によって通常に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７７】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施法及び使用法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明と見なされるものの範囲を制限するためのものではない。使用された数値（例えば、量、温度、濃度等）に関しては正確さが保証されるよう努力したが、ある程度の実験の誤差及び偏差は斟酌されるべきである。他に特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
【００７８】
実施例1．トランスジェニック・マウスの構築
CD11cプロモーターの調節下にあるSV40ラージT抗原（SV40T-Ag）の発現ベクターの構築：ウサギ・β-グロビンcDNA由来の3'配列と連結された、約5.3kbのマウスCD11c 5'隣接ゲノムDNA配列を含有している、プラスミドpBS5.3kb CD11cプロモーター及びβ-グロビン・カセットは、Brockerら（1997）J. Exp. Med. 185：541；及びRiedingerら（1997）Immunol. Lett. 57：155により記載されている。
【００７９】
スモールT-抗原（T-Ag）及びラージT-抗原（T-Ag）をコードしており、SV40地図5190位のStuIと2533位のBamHIとの間の配列を含有しているSV40初期領域を、平滑末端断片として、平滑末端化されたpBS5.3kb CD11cプロモーター＋β-グロビンのEcoRI部位へクローニングし、pCD11c-T-AGを作製した。得られた構築物の地図は、図1に示される。
【００８０】
ブルースクリプト（Bluescript）骨格、CD11c調節配列、及びウサギβ-グロビン・イントロン＋ポリアデニル化配列は、全て、Brockerら（前記）に記載されている。SV40 T-ag配列（5190〜2533）は、Fiersら（1978）Nature 273（5658）：113-120によって記載されたようなものである。
【００８１】
マウス：CD11c-T-ag配列を、NotI＋XhoI消化によってベクター骨格から切り出し、ゲル電気泳動によって分離し、精製した後、NA45断片を単離し、確立されているトランスジェニック方法論を使用して、C57L/6xDBA/2 F2受精卵の雄性前核へと注射した。注射された卵を、確立されているトランスジェニック方法論を使用して偽妊娠スイス・ウェブスター（Swiss Webster）雌へと移入し、満期まで発達させた。
【００８２】
以下のように、SV40配列に特異的なPCRアッセイ法を使用して、導入遺伝子を保持しているマウスを同定した。耳生検ゲノムDNAを、確立されている手法を使用して調製し、SV40内の381bp配列に特異的なプライマー（配列番号：1）5'-gga act gaa tgg gag cag tgg及び（配列番号：2）5'-gca gac act cta tgc ctg tgt ggを使用して増幅した。
【００８３】
マウスでは、トランスジェニック・マウスにおけるSV40 T-ag発現と関連していることが示されている脈絡叢乳頭腫形成による二次性の水頭症：「大きい頭部」の発達が観察された（Palmiterら（1985）Nature 316：457；Van Dykeら（1987）J. Virol. 61：2029参照）。
【００８４】
実施例2．骨髄及び脾臓からの樹状細胞及び樹状細胞前駆体の単離及び培養
マウス由来の細胞及び初期培養条件：脾臓組織及び骨髄組織を、顕性頭部腫瘍を保持している22日齢CD11c/SV40トランスジェニック・マウスより採集した。これらの組織から単一細胞懸濁液を作製し、赤血球を溶解させ、残りの完全白血球を洗浄した。
【００８５】
洗浄された細胞を、20ng/ml GM-CSF単独、各20ng/mlのGM-CSF＋IL-4、又は100ng/ml Flt3-リガンドのいずれかを含む、10％FBS、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、2-ME、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン、ピルビン酸Na、及びHEPES緩衝液が添加されたマッコイ培地で培養した。Flt3-リガンドで培養された細胞を、106個/mlで15ml、直径10cmのペトリ皿に播種し、GM-CSFで培養された細胞を50万個/mlで播種した。
【００８６】
継代技術及び細胞系作製：付着細胞及び非付着細胞を3日後に継代し、GM-CSF＋IL-4培養物を、GM-CSFが添加され、IL-4は添加されていない培地へと変更した。Flt3-リガンドが添加された培養物は、この時点ではこの添加物と共に維持した。11日目に、付着細胞及び非付着細胞を再び類別した。21日目及び25日目に、培養物を再び類別した。25日後、細胞培養物生存率に基づき、全ての培養物へのFlt3-リガンドの添加を中止し、その後はGM-CSFの添加に交換した。また、この時点以降は、非付着細胞のみを継代した。細胞を7〜9日毎に1：2又は1：4の比率で分割し、＞540日間、培養において維持した。
【００８７】
図2は、培養のためのサイトカインの組み合わせの例を示すフローチャートである。
【００８８】
次いで、全ての細胞系を、限界希釈及び／又は自動細胞沈着によるFACSによりクローニングした。クローニング頻度及びクローン増殖特徴は、異なる細胞系及びサブクローンによって変動したが、現在までに作製されたサブクローンは、全て、継続的な増殖のため外因性GM-CSFに依存していた。図3A及び図3Bは、異なる細胞系に関するクローニング効率及びクローン発達情報を提供する。
【００８９】
樹状細胞の特徴の分析：樹状突起及びクラスタリング傾向を有する非付着細胞は、GM-CSF培養物においては5日目に、Flt3-リガンド培養物においては18日目に、最初に観察された。細胞形態学を、25日目に光学顕微鏡検によって最初に記録し、それ以降は、およそ月に1回記録した。図4は、典型的な樹状細胞系の形態学を示す写真である。
【００９０】
21日目に最初に、フローサイトメトリーにより表面のCD11c及びCD11bに関してDC系を試験し、それ以降、これら及び付加的なマーカーに関して少なくとも3回試験した。外因性の刺激なしに、全ての細胞系が、CD11c、CD54、CD86、及びクラスII MHCを発現し、様々なレベルのCD11b、CD40、CD80、及びCD117を発現する。全ての系が、刺激の非存在下では、表面CD19、F4/80、B220、CD8、33D1、及びCD4については陰性である。全ての系が、細胞内SV40ラージT抗原陽性である。これらの結果は、マクロファージ、顆粒球、NK、Tリンパ球、又はBリンパ球の表現型ではなく、樹状細胞の表現型と一致している。
【００９１】
（表１）DC系パネル表面抗原発現
2004520823.tif 000002
Hi＆Lo＝不均一な発現；＋＝高発現；−／＋＝低発現；＜＝検出不可の発現；nt＝未試験
【００９２】
実施例3．樹状細胞系の機能分析
D011.10 T細胞クローン、OT-IもしくはOT-II TCRトランスジェニック・マウス由来のオボアルブミン特異的T細胞、又は正常C3Hマウス由来の同種異系T細胞のいずれかを使用して、DC系の大部分を、T細胞細胞障害性の感作及びT細胞増殖の刺激に関してスクリーニングした。OT-Iアッセイ法における細胞障害性T細胞活性の感作は、クラスI MHCにより媒介されるDC系によるオボアルブミン・ペプチドのCD8＋ T細胞への提示が成功したことを示す。D011.10アッセイ法又はOT-IIアッセイ法におけるT細胞増殖の刺激は、DC系によるオボアルブミン・タンパク質又はペプチドのCD4＋ T細胞への提示及び／又はプロセシングが成功したことを示す（Daroら（2000）J. Immunol. 165：49参照）。系の大部分が、CTL感作に関してコンピテントであり、試験された系全てが、少なくとも2個のアッセイ法においてT細胞増殖の刺激に関してコンピテントである。親系に由来する長期クローンも、混合白血球反応においてアロ反応性T細胞増殖の刺激に関してコンピテントである。
【００９３】
OTI感作実験は、以下のように実施した。
【００９４】
ナイーブOTI CTLのインビトロ感作：このアッセイ法は、APCの、ナイーブCTL前駆体を感作し増幅する能力を試験する。樹状細胞は、CTLの最高の活性化剤であり、マクロファージは弱い活性を示し、休止B細胞及び非専門的APCは活性を示さない（Sallusto＆Lanzavecchia（1999）J Exp Med 189（4）：611-4参照）。アッセイ法は、樹状細胞、オボアルブミン由来ペプチド、及びオボアルブミン特異的TCRトランスジェニック・マウス由来CD8＋ T細胞を共培養し、次いでCD8により媒介される細胞障害性の生成レベルを測定する（Brossart＆Bevan（1997）Blood 90（4）：1594-1599；Clarkeら（2000）Immunol Cell Biol 78（2）：110-7参照）。
【００９５】
T細胞感作：APCを、OTIペプチド：（配列番号：3）SIINFEKL（OTIp）でコーティングすることにより調製した。約1μMの濃度でそれは飽和し、約50nMの用量が、典型的には、飽和数のDCにおける抗原用量に対するCTL応答の直線的部分にある。APCを、96ウェルU底プレート（104〜102/ウェル）で滴定し、TcRトランスジェニック細胞に添加した（106個の脾細胞もしくはLN細胞／ウェル、又は3×105個の精製されたCD8＋ OTI細胞）。全てのポイントを2つ組でセットアップし、ペプチド・パルスなしのDC対照を含めた。1日目及び2日目に、組織培養培地の半分を交換した。感作を査定するため、標準的なCTLアッセイ法を刺激3日目に実施した。エフェクター細胞を、1：1.5の初期希釈率で滴定した。
【００９６】
エフェクター：溶解活性に関して試験される細胞（エフェクター細胞）を、特異的標的（抗原パルスを受けた、又は標的抗原を発現する細胞）、及び非特異的標的（パルスを受けていない1個又は複数の標的細胞、好ましくは親細胞系、又はAg＋標的細胞と極めて密接な関係にあるその他の何らかの細胞系）の両方に対して試験した。一定の1ウェル当たりの標的細胞数に対し、エフェクターを段階希釈した。希釈率は、状況に依って変動したが（1：2〜1：10）、大部分のアッセイ法について、1：3という希釈率を使用した。150μlのエフェクターを、最上列のウェルに望ましい濃度で添加し、100μlの培地を含有している次の列のウェルへ50μlを移入した（希釈実施後、全てのウェルが、100μl／ウェルを有していた）。
【００９７】
標的細胞：標的細胞は、ペプチドでコーティングされた培養細胞系であった。又は、目的の抗原でトランスフェクトされた細胞であった。培養標的細胞は、良好に増殖し、過剰増殖はしなかった。標的細胞系は、EL-4及びC1498（H-2b）並びにP815（H-2d）を含む。
【００９８】
手法：（CTLアッセイ法のため1×106／プレートを使用して）標的を計数し、およそ5・106/mlで培地に再懸濁させた。エフェクター細胞を、Ag＋標的及びAg−標的に対して試験した。Ag＋標的の場合には、ペプチドを添加した（通常、1μMペプチドという最終濃度）。両方の標的セットに、50μl/1×106個のNa251CrO4を添加した。それらを、チューブの蓋をゆるめて、37℃／7％C02で1〜2時間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄した。自発的溶解を減少させるため場合により行われた工程において、細胞を、15〜30分間37℃で10mlの培地中でインキュベートし、次いでスピンダウンした（これは、バックグラウンドに最も寄与する死後の／瀕死の／傷害を受けた細胞が、アッセイ開始前に51Crを漏出することを可能にする）。培地の容量を1×105/mlにし、希釈されたエフェクター細胞の上に100μl／ウェルでアッセイに添加した。
【００９９】
対照は、アッセイの残部と同時にセットアップした：
自発的溶解：100μlの培地へ100μlの標的細胞を添加。
全溶解：100μlの1％トリトン-X100を含む水（1：500の食品用緑色素を含む）、又は100μlの1N HClへ、100μlの標的細胞を添加。アッセイを、37℃／7％C02で4時間インキュベートした。プレートを5分間1200rpmで遠心し；ラック内のガラス・チューブに100μlの上清を移すことにより採集した。活性は、γ-カウンターで測定し、下記式を使用して、特異的溶解率（％）として算出した：
2004520823.tif 000003
【０１００】
増殖アッセイ法のプロトコルは、Daroら（2000）J. Immunol. 165：49に記載されている。T細胞増殖アッセイ法及びCTL感作アッセイ法におけるDC系の活性に関するデータを、表2に示す。
【０１０１】
（表２）T細胞増殖アッセイ法及びCTL感作アッセイ法におけるDC系の活性
2004520823.tif 000004
＋＝有意な活性；−／＋＝低活性；＜＝検出不可の活性；nt＝未試験
【０１０２】
刺激に対する応答：DC系を、LPS（500ng/ml、24時間）に応答して起こるIL10及びIL-12p40及びIL-12p70の分泌に関してスクリーニングした。サイトカイン分泌は、市販のキットを使用したELISAによって、製造業者によって推奨されたようにして、アッセイした。アッセイ感度は、IL-10及びIL-12p70については＜50pg/mlであり；IL-12p40については＜20pg/mlであった。これらのサイトカインは全て、刺激の非存在下では、いずれのDC系によっても有意なレベルで分泌されなかった。IL-10分泌は、全ての系において様々に誘導可能であり、IL-12p70分泌は、約半分のDC系において誘導された。IL-12p70が検出不可であった系においては、1個を除き全て、高レベルのIL-12p40が分泌された。IL10分泌レベルとIL-12p70分泌レベルとの間には、逆の関係の傾向が存在した。構成性及び誘導型のIL-10、IL-12p70、及びIL-12p40の分泌についてのデータを、図5に示す。IL-12p40ホモダイマーは、IL-12p70のアンタゴニストとして作用しうるため、そしてIL10は、IL-12p70の作用を阻害しうるため、IL-10及びIL-12p40の両方を分泌し、IL-12p70を分泌しない系は、寛容化活性又はTh2偏り活性を有している可能性がある。
【０１０３】
DC系のサブセットを、Taqman PCRによって以下の遺伝子：IL-12p35、IL-12p40、IL6、IL10、41BB、41BBL、CD40、OX40、OX40L、RANK、RANKL、クラスII MHC、MyD88、CCR1、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR3、CXCR4、及びCXCR5の構成性発現に関してスクリーニングした。各細胞系は、これらの遺伝子の特有の発現パターンを有しており、（Sozzaniら（1999）J. Leukoc. Biol. 66：1-9；及びVecchiら（1999）J Leukoc. Biol. 66：489によって記載されたような）古典的な「未熟」又は「成熟」DCの表現型と完全には一致しなかった。しかしながら、これらの遺伝子発現プロファイルと、前述のFACS及び機能データとの組み合わせは、比較的「成熟した」DCの表現型と一致している。遺伝子発現パターンに関するデータを、表3に提供する。
【０１０４】
（表３）DC系の遺伝子発現パターン
2004520823.tif 000005
＋＝検出可能；＜＝検出不可；nt＝未試験
【０１０５】
クローニングされた樹状細胞系の表現型及び機能の安定性：親細胞系のうちの2個、＃44及び＃62を、2回の限界希釈及び／又は自動細胞沈着によってクローニングし、クローン44hi2-15及び62-1-6を得た。これらのクローンを、中心的な構成性及び誘導型の樹状細胞の表現型及び機能の特徴の保存された発現に関してモニタリングした。これらの2個のクローンの特徴は、LPS以外の刺激に応答してIL-12p70を発現するようクローン62-1-6が誘導されうることを除き（下記参照）、表1〜3及び図4〜5に親に関して記載されたものと一致する。これら及びその他の中心的特質は、クローニング後、約6〜12ヶ月間、従ってそれぞれの親系の派生後12〜18ヶ月間、保持されていた。
【０１０６】
ウイルス感染性に関する分析：全ての細胞系を、緑色蛍光タンパク質又はβ-ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子発現に関して操作された組換えレトロウイルス及びアデノウイルスによる感染性に関して試験した。系は、様々な、しかし有意なレトロウイルスによる感染率（0〜15％）を示し、様々な中程度のアデノウイルスによる感染率（5〜50％）を示した。レトロウイルス感染性レベルは、未熟D1マウスDC細胞系に関して最近報告されたものと類似しているか、又はそれを超えており（Gasperiら（1999）J. Leukocyte Biol. 66（2）：263-267）、Flt3L又はGM-CSFで処理されたマウスの脾臓及びリンパ節から単離された初代DCに関して現在達成可能なものを超えている。DC系のレトロウイルス・ベクター及びアデノウイルス・ベクターによる感染の比較的低いレベルを考慮し、本発明者らは、レンチウイルス・ベクター及びヘルペスウイルス・ベクターのような代替物が、改善された感染率を与えるか否かを調査した。これらのベクターは、標的細胞の受容体発現及び複製状態にはさほど依存しておらず、細胞機能を妨害する可能性は低い。クローニングされた系44hi2-15を、緑色蛍光タンパク質発現に関して操作された組換え水疱性口内炎ウイルス・シュードタイプ・レンチウイルス又はヘルペス単純ウイルスに基づくヘルペスウイルスによる感染性に関して試験した。結果は、レンチウイルス及びヘルペスウイルスの両方の標準的なストックにより40〜50％の感染が達成されうることを示し、＞90％の感染率を与えるため、感染多重度を増加させるために濃縮レンチウイルス・ストックが使用されうることを示している。重要なこととして、レンチウイルス感染レベルは、有意な細胞の活性化又は死滅なしに達成され、感染後少なくとも18日間維持された。これらのデータは、新規遺伝子発現のための基質としてDC系を使用したウイルスベクターに基づく発現クローニングの実施可能性を有意に改善する。
【０１０７】
インビボの免疫応答の感作：クローニングされたDC系44hi2-15及び62-1-6を、抗原特異的免疫応答をインビボで開始させる能力に関しても試験した。細胞を、37℃で16時間、タンパク質抗原キーホール・リンペット・ヘモシアニン（KLH）に露し、採集し、洗浄し、同系C57BL/6-DBA/2 F1マウスの足蹠へと養子的に移入した。5日後、流入膝下リンパ節を単離し、KLHでインビトロで再刺激し、再刺激培養における増殖及びサイトカイン応答を測定した（図6A、図6B、及び図6C）。両方のクローニングされたDC系が、ナイーブT細胞感作を示す抗原特異的な増殖応答及びIL-2応答を誘発した。重要なこととして、IL-10及びIL-12p40を発現し、IL-12p70は発現していないDC系44hi2-15は、検出可能なインターフェロン-γ（IFN-g）なしに、高レベルのIL-5も誘発した（Th2偏向応答）。対照的に、IL-10及びIL-12p70の両方を発現するよう誘導されうるDC系62-1-6（上記参照）は、IFN-g及びIL-5を有意なレベルで誘発した（非偏向ThO応答）。これらの結果は、DC系が、タンパク質抗原の取り込み及びプロセシング、末梢組織部位からリンパ器官へのインビボの移行、ナイーブT細胞増殖の刺激、並びにT細胞サイトカイン応答の偏向に関してコンピテントであることを示す。これは、樹状細胞及び／又はリンパ球の機能を改変する新規遺伝子のインビボ選択による、例えば組換えレンチウイルス・ライブラリー（上記参照）を使用した発現クローニング・シナリオにおける系の有用性を増加させる。これにより、新規なマウス疾患モデル、特に感染性疾患、癌、移植、アレルギー、又は自己免疫の、DCにより開始される又は調整されるモデルを開発するために、DC系の養子移入を使用することの可能性が生じる。
【０１０８】
実施例4．IL-12p35及びIL-12p40遺伝子発現の調節
刺激に応答して起こるIL-12の産生を、遺伝子発現のレベルでさらに研究した。IL-12p70は、IL-12p40サブユニットとIL12p35サブユニットとの間のヘテロダイマーとして産生される。前述のように、細胞がIL-12p40サブユニットのみを産生する場合、このサブユニットは、IL-12p70の活性のアンタゴニストとして作用するp80タンパク質へとホモダイマー化しうる。
【０１０９】
3個の異なるサブクローニングされたDC系に、図7に示されるような多様な刺激を与えた。LPS処理（500ng/ml）は、前記と同様に行った。SAC（ホルマリン殺傷されたスタフィロコッカス-アウレウス（Staphyloccus aureus-formalin killed）；20マイクログラム/ml）、IFNγ（20ng/ml）、抗IL-10抗体（BD Pharmingen,CA；5マイクログラム/ml）、CpG1826（1マイクログラム/ml）、及びCpG1982（1マイクログラム/ml）、muCD40L（1マイクログラム/ml）、及びRANKL（100ng/ml）による処理も使用した。処理後のIL-12p40サブユニット及びIL-12p35サブユニットをコードするmRNAの相対遺伝子発現を、Taqman（登録商標）PCRによって測定した。
【０１１０】
図7に示されるように、3個の細胞系は全て、試験された大部分の刺激因子に応答してIL-12p40サブユニットをコードする遺伝子を誘導した。しかしながら、刺激に応答して起こるIL-12p35サブユニットの誘導は、これらの3個の細胞系間で異なっていた。1個の系44Hi2-15は、刺激に応答してIL-12p35サブユニット・メッセージを産生することがなかった。この系は、ホモダイマーIL-12p80アンタゴニストのみを産生する新生児樹状細胞と類似する性質を有しているため、研究にとって特に有用である。IL-12受容体に対する拮抗は、T細胞をよりTH2応答へと駆動することができ、この細胞系は、T細胞活性化のインビトロ・アッセイ法においてもインビボ・アッセイ法においても、この効果を研究するために使用されうる。さらに、そのようなアッセイ法は、分子の発見（例えば、TH2応答の誘導を抑制する分子）のための基礎を形成しうる。さらに、この細胞系は、中心的なIL-12ファミリー・メンバー（IL-12p35）の発現を欠いているため、IL-23p19のようなIL-12ファミリーの新メンバー間の相互作用の同定及び研究にとって有用である。
【０１１１】
その他の2個の細胞系53-1-3及び62-1-6は、ある種の刺激に応答してIL-12p35サブユニットをコードする遺伝子の発現を誘導した。従って、これらの細胞系は、IL-12受容体にアゴニストとして作用し、TH1応答を駆動することができる。62-1-6細胞系は、特に、休止期にはIL-12p35サブユニットの発現を示さず、極めて特異的な誘導プロファイルを示した。従って、この同じ系が、条件に依って、IL-12受容体発現細胞に対してアゴニスト活性を有したり、又はアンタゴニスト活性を有したりする。従って、これらのような細胞系も、T細胞活性化のインビトロ・アッセイ法においてもインビボ・アッセイ法においても有用である。さらに、そのようなアッセイ法は、単独で、又はIL-12アンタゴニスト細胞系と組み合わされて、分子の発見のための基礎を形成しうる。
【０１１２】
本明細書中に引用された全ての出版物及び特許出願は、各々が参照として組み入れられ、特別かつ個別に示されているかのように、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
以上、理解の明確にするための例示及び具体例により、ある程度詳細に本発明を説明してきたが、本発明の開示を考慮すれば、添付の特許請求の範囲の本旨及び範囲を逸脱することなく、ある種の変化及び改変をそれらに施しうることが、当業者には容易に明らかであると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】トランスジェニック・マウスの作製において使用されたSV-40含有ベクターの地図である。
【図２】サイトカイン添加のタイミング及び組み合わせの例を示すフローチャートである。
【図３】図3Aおよび図3Bは、SV40トランスジェニック・マウスから作製された樹状細胞系に関するクローニング頻度の例およびクローン増殖速度の例をそれぞれ示す。
【図４】典型的な樹状細胞系の形態学を示す写真である。
【図５】図5A、図5Bおよび図5Cは、樹状細胞系におけるIL-10及びIL-12の誘導及び発現を示すグラフである。
【図６】図6A、図6Bおよび図6Cは、樹状細胞系による抗原特異的インビボ応答の感作を示すグラフである。
【図７】刺激に応答して起こるIL-12p35サブユニット（左パネル）及びIL-12p40サブユニット（右パネル）をコードするmRNAの相対的な誘導を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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