(57)【要約】少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体を含むワクチン、並びに少なくとも１つの抗原に対する免疫応答促進用アジュバントを調製するためのカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体の使用を記載する。
2004506019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗原および少なくともカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
カテリシジンが動物のカテリシジンである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
カテリシジンがマウスカテリシジンである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
マウスカテリシジン由来の抗菌ペプチドが配列番号１に示す配列を含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
カテリシジンがヒトカテリシジンである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項６】
ヒトカテリシジン由来の抗菌ペプチドが配列番号２に記載の配列を含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
動物のカテリシジン由来の抗菌ペプチドがインドリシジンペプチドである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項８】
インドリシジンペプチドがウシインドリシジンペプチドである、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
ウシインドリシジンペプチドが配列番号３に示す配列を含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
動物のカテリシジン由来の抗菌ペプチドが、配列番号４に示す配列を含むウシの環状および／または線状ドデカペプチドである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１つのさらなる免疫応答促進物質を含む、請求項１ないし１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
免疫応答促進物質がサイトカインである、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
少なくとも１つの抗原に対する免疫応答促進用アジュバントを調製するための、カテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体の使用。
【請求項１４】
該アジュバントが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における少なくとも１つの抗原の取り込みを促進する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
カテリシジンが動物のカテリシジンである、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
カテリシジンがマウスカテリシジンである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドが配列番号１に示す配列を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
カテリシジンがヒトカテリシジンである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドが配列番号２に示す配列を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドがインドリシジンペプチドである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２１】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドがウシインドリシジンペプチドである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドが配列番号３に示す配列を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドが、配列番号４に示す配列を含むウシの環状および／または線状ドデカペプチドである、請求項１５に記載の使用。
【請求項２４】
アジュバントをワクチンに加える、請求項１３ないし２３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、少なくとも１つの抗原および免疫促進物質を含むワクチンに関する。
【０００２】
（背景技術）
侵入する病原体からの宿主の防御には細胞系のエフェクターおよび体液系のエフェクターが関与しており、非適合（ｎｏｎ−ａｄａｐｔｉｖｅ）（生得）免疫および適合（ａｄａｐｔｉｖｅ）（獲得）免疫の両者の協調作用の結果得られる。後者はレセプターによって媒体される特異的な免疫学的認識に基づくものであり、最近獲得された免疫系であり、脊椎動物にのみ存在する。前者は適合免疫が発達する前から進化しており、あらゆる生物にわたって分布する様々な細胞および分子からなり、潜在的な病原体を制御下におくことを役目としている（Ｂｏｍａｎ ２０００）、（Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９７）。
【０００３】
ＢおよびＴリンパ球は獲得された抗原特異的な適合免疫のメディエーターであり、免疫学的記憶の発達を含むが、これはワクチンの製造を成功させる主たる目標である（Ｓｃｈｉｊｎｓ ２０００）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原をプロセシングし、プロセシングしたその断片をリンパ球の活性化に必要な分子とともに細胞表面に提示することのできる高度に特殊化した細胞である。このことは、特異的な免疫応答の開始にはＡＰＣが非常に重要であることを意味する。Ｔリンパ球活性化のための主たるＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、およびＢ細胞であり、一方、Ｂリンパ球活性化のための主たるＡＰＣは濾胞樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）である。一般に、ＤＣが、休止したナイーブなおよびメモリーＢおよびＴリンパ球を刺激する免疫応答を開始させる観点から最も強力なＡＰＣである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ， Ｂｒｉｅｒｅら、２０００）。
【０００４】
末梢にあるＡＰＣ（たとえば、ＤＣやランゲルハンス細胞）の天然の役目は抗原を捕捉しプロセシングすることであり、それによって活性化されてリンパ球コスティミュレート分子の発現を開始し、リンパ器官に移動し、サイトカインを分泌して抗原を異なる集団のリンパ球に提示し、かくして抗原特異的な免疫応答を開始させる。ＡＰＣは、ある環境下でリンパ球を活性するのみならず、抗原に対してＴ細胞を寛容にもする（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ １９９８）。
【０００５】
Ｔリンパ球による抗原の認識は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）により拘束されている。ある特定のＴリンパ球は、ペプチドが特定のＭＨＣ分子に結合している場合にのみ抗原を認識する。一般に、Ｔリンパ球は自己のＭＨＣ分子の存在下でのみ刺激され、抗原は自己のＭＨＣ分子に結合したペプチドとしてのみ認識される。ＭＨＣ拘束は、認識される抗原の観点から、およびそのペプチド断片に結合するＭＨＣ分子の観点から、Ｔリンパ球の特異性を定めるものである。
【０００６】
細胞内および細胞外の抗原は、認識および適切な応答の両観点から免疫系に対して極めて異なった攻撃を提示する。Ｔ細胞への抗原の提示は、２つの別個のクラスの分子、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）によって媒体され、これらは別個の抗原プロセシング経路を利用している。大概は、発達してきた２つの主要な抗原プロセシング経路を識別することが可能である。細胞内抗原に由来するペプチドはＭＨＣクラスＩ分子（該分子は実質的にあらゆる細胞で発現される）によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されるのに対し、細胞外抗原に由来するペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される（Ｍｏｎａｃｏ １９９２）、（Ｈａｒｄｉｎｇ １９９５）。
【０００７】
しかしながら、この二分法にはある種の例外が存在する。エンドサイトーシスされた粒状または可溶性のタンパク質に由来するペプチドが、マクロファージ並びに樹状細胞のＭＨＣ−Ｉ分子上に提示されることを幾つかの研究が示している（Ｈａｒｄｉｎｇ １９９６）、（ＢｒｏｓｓａｒｔおよびＢｅｖｅｎ １９９７）。それゆえ、樹状細胞のように末梢に存在するＡＰＣは、細胞外抗原を捕捉およびプロセシングし、これら抗原をＭＨＣ−Ｉ分子上でＴリンパ球に提示する高い潜在能力を発揮し、インビトロおよびインビボにて抗原で細胞外にて追跡する（ｐｕｌｓｉｎｇ）ための興味深い標的である。
【０００８】
様々なタイプの白血球に対する刺激活性を含むＡＰＣの重要かつ独特の役割は、ワクチン開発を成功させるに際して適切な戦略のための標的としての中心的な位置を反映している。理論的には、このことを行う一つの方法は、ＡＰＣの天然の役割である抗原の取り込みを促進または刺激することである。ワクチンの対象とされる適当な抗原を適用されたら（ｐｕｌｓｅｄ）、ＡＰＣは取り込まれた抗原のプロセシングを開始し、それによって活性化され、リンパ球コスティミュレート分子を発現し、リンパ器官に移動し、サイトカインを分泌し、リンパ球の異なる集団に抗原を提示し、かくして免疫応答を開始するに違いない。
【０００９】
活性化されたＴ細胞は、一般に多数のエフェクターサイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を含む）を高度に制御された仕方で分泌する。特定の抗原（たとえば、腫瘍抗原、一般にワクチンにて投与される抗原）に対する細胞障害性Ｔリンパ球応答の機能的検出は、サイトカイン産生を単一細胞レベルで分析する技術であるＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（酵素結合免疫スポットアッセイ）によって一般にモニターされる。本発明では細胞免疫促進促進サイトカインＩＦＮ−γのためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、首尾よいペプチド特異的Ｔ細胞活性化をモニターするのに用いた。
【００１０】
以前にポリカチオンがＭＨＣクラスＩ適合（ｍａｔｃｈｅｄ）ペプチドの腫瘍細胞中への取り込みを有効に促進することが示されており、これは「トランスローディング（ＴＲＡＮＳｌｏａｄｉｎｇ）」と呼ばれるペプチドまたはタンパク質適用（ｐｕｌｓｉｎｇ）法である（Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）。さらに、本発明者らは、ポリカチオンがペプチドまたはタンパク質を抗原提示細胞中に「トランスロード」できることをインビボおよびインビトロで示した（Ｂｕｓｃｈｌｅ １９９８）。さらに、ポリＬ−アルギニンまたはポリＬ−リシンとワクチンとしての適当なペプチドとの混合物を同時に注射すると、マウスモデルにおいて動物が腫瘍増殖から保護される（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｂｕｓｃｈｌｅら、１９９７）。この化学的に規定されたワクチンは、非常に多数の抗原／ペプチド特異的なＴ細胞を誘発することができる。これは、少なくとも部分的にはポリカチオンによって媒体されたＡＰＣ中へのペプチドの促進された取り込みによるものであることが示されており（Ｂｕｓｃｈｌｅ １９９８）、ＡＰＣはインビボで抗原を適用されたときに該投与抗原に対してＴ細胞媒体免疫を誘発しうることを示している。
【００１１】
獲得免疫（高度に特異的だが応答が比較的遅い）とは異なり、生得免疫は宿主と比較して微生物成分の構造上の差異により誘起されるエフェクター機構に基づいている。これら機構はかなり迅速な初期応答を開始することができ、これは主として有毒物質の中和に導く。生得免疫の反応は低級な門の動物の唯一の防御戦略であり、獲得免疫系が動員される前の第一線の宿主防御として脊椎動物でも保持されている。
【００１２】
より高等な脊椎動物では、生得免疫のエフェクター細胞は、好中球、マクロファージおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびおそらく樹状細胞であるのに対し（Ｍｉｚｕｋａｗａ， Ｓｕｇｉｙａｍａら、１９９９）、この経路の体液成分は補体カスケードおよび種々の異なる結合性タンパク質である（Ｂｏｍａｎ ２０００）。
【００１３】
生得免疫の迅速かつ有効な成分は、長さが１２から１００アミノ酸残基の間の非常に様々な殺菌性ペプチドの産生である。数百の異なる抗菌ペプチドが、海綿動物、昆虫から動物およびヒトにいたる様々な生物で単離されており、これら分子の広範な分布を指し示している。抗菌ペプチドはまた、競合生物に対する拮抗物質として細菌によっても産生される。
【００１４】
抗菌ペプチドの主たる源は、呼吸器管、胃腸管および尿生殖器管に整列している好中球および上皮細胞の顆粒である。一般に、これらペプチドは微生物の侵入に最も暴露される解剖学部位で認められ、内部の体液中に分泌されるかまたは専門の食細胞（好中球）の細胞質顆粒中に貯蔵される（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９７）、（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９８）、（ＬｅｈｒｅｒおよびＧａｎｚ １９９９）、（ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＡｇｅｒｂｅｒｔｈ １９９９）。
【００１５】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
本発明の目的は、同時に投与した特定の抗原に対する免疫応答を強力に促進するアジュバント／「担体ペプチド」を提供することである。
本発明のさらなる目的は、アジュバント／「担体ペプチド」（ヒトを含む動物、とりわけ哺乳動物において生体所持（ｂｏｄｙ−ｏｗｎ）分子として知られる）を提供することであり、所定のアジュバント／「担体ペプチド」に対してヒトを含む動物において免疫応答が開始されるリスクを低減することである。
【００１６】
（その解決方法）
これら目的は、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体を含むワクチンによって解決される。
抗菌ペプチドは、公知のまたは予測される３Ｄ構造に基づいて５つのクラスに分類することができる（Ｂｏｍａｎ ２０００）。
【００１７】
抗菌ペプチドの殺菌活性に感受性の生物のスペクトルは広く、種々の細菌（グラム陽性および陰性）、原生動物、真菌およびある場合にはウイルス感染細胞および腫瘍細胞を含む。
一般に、各種は、異なる整列（ａｒｒａｙ）のこれらペプチドを備えており、これはある特定の種との微生物の特定の集合の優先的な関係によって記述される進化的な選択の結果を表しているように思われる。
【００１８】
知られている抗菌ペプチドは全て、前駆体分子からのタンパク質加水分解プロセシングによって生成する。さらに、エフェクターの生合成の重要な部分は様々な形態の転写後修飾であり、これはＣ末端アミド化（たとえば、インドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）、ＰＲ−３９、幾つかのベータ−デフェンシン（ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）（ＢｒａｄｂｕｒｙおよびＳｍｙｔｈ １９９１））、Ｄアミノ酸置換（Ｋｒｅｉｌ １９９７）またはＮ末端のピログルタミン酸ブロッキング（たとえば、アタシン（ａｔｔａｃｉｎｓ）および幾つかのベータ−デフェンシン）などのように最終的な機能にとって重要である。
【００１９】
動物およびヒトにおけるカチオン性抗菌ペプチド（ＣＡＰ）の１つの主要なファミリーはカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎｓ）である（Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、２０００）。カテリシジンは骨髄細胞に由来し、幾つかの哺乳動物種で同定されている。これまでのところ、１６〜２６ｋＤａの範囲の質量のカテリシジンが、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギおよびラットの骨髄細胞で主として発現されている。カテリシジンは前駆体として生成され、該前駆体では高度に同一のＮ末端プレプロ配列に高度に変化するＣ末端配列（特定の開裂部位でプロ配列が除去された後の抗菌ペプチドに対応する）が続いている（図３に示す、Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９７から）。
【００２０】
これら全ての同属物（ｃｏｎｇｅｎｅｒｓ）のプロ配列は、カテリンと称するタンパク質（ブタ白血球から最初に単離された）の配列に高度に相同である。この高度に保存されたカテリン様ドメインが共通して存在することに基づき、これら前駆体はカテリシジンと称するファミリーに分類された。
【００２１】
カテリン様プレプロ領域は、ウシの７５％から幾つかのブタ同属物の完全な同一性にいたるまで高度の種内同一性を示す。カテリン様プロピース（ｐｒｏｐｉｅｃｅ）のＣ末端領域に集まっている４つの不変のシステインは、２つの分子内ジスルフィド結合を形成するように配列されており、分子に構造的な制約を付している。カテリン様プロ領域は、既知のチオールプロテアーゼ阻害機能を有するタンパク質であるシスタチンファミリーとは限られたホモロジーしか示さない。このことは、システインプロテイナーゼカテプシンＬ（カテリンの頭字語に基づく）の活性に対して幾つかのカテリシジンが穏やかな阻害作用しか奏しないことによってさらに支持される。このプロ配列に特異的な機能は確立されていないが、進化的な圧力がその保存へと向かわせたことは、該配列が重要な生物学的機能、たとえば、抗菌ペプチドの顆粒へのターゲティングや正しいタンパク質加水分解による成熟の援助を果たしていることを示唆している。
【００２２】
カテリシジンのプレプロ領域は１２８〜１４３アミノ酸残基長であり、推定の２９〜３０残基のシグナルペプチドおよび９９〜１１４残基のプロピースを含み、一方、Ｃ末端ドメインは１２〜１００残基長である。これらのプロペプチドが分泌されると限定タンパク質加水分解を受ける。ウシおよびブタの好中球ではカテリシジンはエラスターゼによって媒体される開裂によって放出され（Ｃｏｌｅ， Ｓｈｉら、２００１）、一方、ヒトのカテリシジンｈＣＡＰ−１８は細胞外でプロテイナーゼ３によって抗菌ペプチドＬＬ−３７にプロセシングされ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ｆｏｌｌｉｎら、２００１）、共通のプロタンパク質からの活性な抗菌ペプチドの生成が関連する種で異なって生じることを示している。
【００２３】
カテリシジンは好中球の二次顆粒で最初に見つかった（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ， Ａｇｅｒｂｅｒｔｈら、１９９６）、（ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＡｇｅｒｂｅｒｔｈ １９９９）。それゆえ、カテリシジンは炎症液（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆｌｕｉｄｓ）中に放出され、そこで比較的高濃度で見つかった（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、１９９９）、（ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＡｇｅｒｂｅｒｔｈ １９９９）。これまでにヒトで見つかった唯一のカテリシジンであるペプチドＬＬ−３７（ｈＣＡＰ−１８／ＦＡＬＬ−３９）は、好中球の顆粒中に発現され、骨髄および精巣で生成される（Ｃｏｗｌａｎｄ， Ｊｏｈｎｓｅｎら、１９９５）、（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ａｒｎｌｊｏｔｓら、１９９７）。さらに、ＬＬ−３７は、口、舌、食道、頚部および膣の鱗状上皮（Ｆｒｏｈｍ Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｓａｎｄｓｔｅｄｔら、１９９９）、肺上皮（Ｂａｌｓ， Ｗａｎｇら、１９９８）および精巣上体の上皮（Ｍａｌｍ， Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、２０００）で構成的に発現される。さらに、高レベルのＬＬ−３７が精液プラスマ（ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ）で認められた（Ｍａｌｍ， Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、２０００）。さらに、ＬＬ−３７は炎症を起こした皮膚のケラチノサイトで誘発され（Ｆｒｏｈｍ， Ａｇｅｒｂｅｒｔｈら、１９９７）、血漿のリポタンパク質画分（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ｂｒａｔｔら、１９９９）および気管支肺胞の洗浄液（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｇｒｕｎｅｗａｌｄら、１９９９）に高濃度で見つかっている。最近、ＮＫ、γδＴ細胞、Ｂ細胞および単球／マクロファージでのＬＬ−３７の発現が記載されている（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｃｈａｒｏら、２０００）。
【００２４】
Ｃ末端に対応する成熟抗菌ペプチドは構造的に多様な配列であり（図１に示す、Ｐｏｐｓｕｅｖａ， Ｚｉｎｏｖｊｅｖａら、１９９６から）、それらに与えられた個々の名前は以下のとおりである：
ウシカテリシジン（Ｓｔｏｒｉｃｉ， Ｔｏｓｓｉら、１９９６）、（Ｓｋｅｒｌａｖａｊ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９６）、（Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｓｃｏｃｃｈｉら、１９９８）：Ｂａｃ１（バクテネシン１）、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、インドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）、ＢＭＡＰ−２７（ウシ骨髄抗菌ペプチド２７）およびＢＭＡＰ−２８；
ブタカテリシジン（Ｈａｒｗｉｇ， Ｋｋｒｙａｋｏｖら、１９９５）：ＰＲ−３９（プロリン−アルギニンリッチ３９アミノ酸ペプチド）、ＰＭＡＰ−３６（ブタ骨髄抗菌ペプチド３６）、ＰＭＡＰ−３７、ＰＭＡＰ−２３、プロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎｓ）、およびプロフェニン（ｐｒｏｐｈｅｎｉｎｓ）；
ウサギカテリシジン：ＣＡＰ１８（カチオン性抗菌タンパク質１８）；
【００２５】
ヒトカテリシジン（Ｃｏｗｌａｎｄ， Ｊｏｈｎｓｅｎら、１９９５）、（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ， Ａｇｅｒｂｅｒｔｈら、１９９６）：ｈＣＡＰ−１８／ＦＡＬＬ−３９／ＬＬ−３７（ヒト抗菌タンパク質／Ｃ末端由来ドメインはＦＡＬＬ−３９またはＬＬ−３７と呼ばれる）；
マウスカテリシジン（Ｇａｌｌｏ， Ｋｉｍら、１９９７）、（Ｐｏｐｓｕｅｖａ， Ｚｉｎｏｖｊｅｖａら、１９９６）：ｍＣＲＡＭＰ（マウスカテリン関連抗菌ペプチド）、ＭＣＬＰ（マウスカテリン様タンパク質）；
ラットカテリシジン：ｒＣＲＡＭＰ（ラットカテリン関連抗菌ペプチド）；
ヒツジカテリシジン（Ｍａｈｏｎｅｙ， Ｌｅｅら、１９９５）、（Ｂａｇｅｌｌａ， Ｓｃｏｃｃｈｉら、１９９５）：ＳＭＡＰ２９（ヒツジ骨髄抗菌ペプチド２９）およびＳＭＡＰ３４。
カテリシジン以外にも動物およびヒトで同定されている抗菌ペプチドの他のファミリーが存在する：主としてセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）およびデフェンシン（ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＡｇｅｒｂｅｒｔｈ １９９９）、（Ｂｏｍａｎ ２０００）。
【００２６】
デフェンシンは４ｋＤａペプチドのファミリーであり、その活性は正味の陽イオン電荷およびその３Ｄ構造の両者に依存する。デフェンシンは、微生物膜を透過性にする多量体で電圧依存性の孔を形成する（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９４）、（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９９）。βデフェンシンはαデフェンシンと形状は似ているが、βデフェンシンの方がわずかに大きく、６つの保存されたシステイン残基の配置および連結性が異なっている（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９８）。
【００２７】
ヒトのαデフェンシン（ヒト好中球ペプチド；ＨＮＰ１−４）は主として好中球の顆粒で見つかっており、食作用を受けた微生物を殺すことに参画している（Ｌｅｈｒｅｒ， Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら、１９９３）。さらに最近、ヒトでのこのファミリーの２つの成員、ＨＤ−５およびＨＤ−６（ヒトαデフェンシン５および６）が、小腸陰窩にある特殊化された分泌細胞であるパーネト細胞によって構成的に生成されることがわかった。ＨＤ−５はまた、女性の生殖管でも構成的に生成される（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９９）。
【００２８】
βデフェンシンの２つのクラスは、その発現パターンを比較することによって定めることができる。構成的に発現されるβデフェンシンは、上皮で発現されるヒトβデフェンシン１（ｈＢＤ１）およびウシ好中球βデフェンシン（ＢＮＢＤ−１−１３）（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９８）である。対照的に、ウシ舌抗菌ペプチド（ＬＡＰ）（Ｓｃｈｏｎｗｅｔｔｅｒ， Ｓｔｏｌｚｅｎｂｅｒｇら、１９９５）、ウシ気管抗菌ペプチド（ＴＡＰ）およびそのヒトホモログβデフェンシン２（ｈＢＤ２）などのβデフェンシンの発現は、感染攻撃の際にアップレギュレーションされる（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９８）。誘導性の発現はまた、他の知られたヒトベータデフェンシンｈＢＤ−３およびｈＢＤ−４で記載されている（Ｈａｒｄｅｒ， Ｂａｒｔｅｌｓら、２０００）、（Ｇａｒｃｉａ， Ｋｒａｕｓｅら、２００１）。
【００２９】
抗菌ペプチドのさらなるクラスはセクロピンである。セクロピンは動物で最初に見つかった抗菌ペプチドであった。細菌が、ヤママユガＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａの休眠中のさなぎでこれら化合物を誘発することが示された（Ｂｏｍａｎ １９９１）。その３Ｄ構造は、間にヒンジを挟んだ２つのαヘリックスからなる。これまでセクロピンは高等昆虫で見つかっており、哺乳動物のセクロピンはブタの腸から単離されている（Ｂｏｍａｎ ２０００）。セクロピン様ペプチドは、海綿動物、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉのリボソームタンパク質Ｌ１から単離されている（Ｐｕｔｓｅｐ， Ｂｒａｎｄｅｎら、１９９９）、（Ｐｕｔｓｅｐ， Ｎｏｒｍａｒｋら、１９９９）。
【００３０】
炎症部位で非常に高濃度が記録されていることから（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００）（たとえば、嚢胞性線維症の患者の痰では３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上；舌背（ｄｏｒｓａｌ ｔｏｎｇｕｅ）では２０〜１００μｇ／ｍｌ；敗血症の個体の血漿では１７０μｇ／ｍｌまで）、感染に対処するうえでのＣＡＰの重要な役割を推定することができる。さらに、ＣＡＰは、粘膜および上皮表面、および消化管、肺、腎臓および皮膚で見つかっている。炎症の際のＣＡＰの誘発は、炎症応答の補助および／または指令における主たる役割と相関付けられる。実際、上昇レベルのＣＡＰは、多くの臨床および実験室誘導の感染および炎症状態で観察されている（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００）。
【００３１】
最近、プレプロデフェンシンを活性な成熟形にプロセシングするのに必要な単一の酵素が同定された。この単一の遺伝子（マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）；マトリックス−メタロプロテイナーゼ７：ＭＭＰ−７）を遺伝的に不活化すると活性なデフェンシンの産生が完全に阻害され、その結果、経口で導入した毒性細菌による感染に対する感受性が１０倍増大することが観察された（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅら、１９９９）。さらに、広範囲の動物実験および初期の臨床研究は、天然および非天然のＣＡＰが、外部から加えたときに細菌および真菌による局所または全身感染に対して防御することを示した（（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００）、（Ｈａｎｃｏｃｋ １９９９）に概説）。
【００３２】
しかしながら、ＣＡＰの作用は微生物を殺すことを指令することに限られない。それよりも、ＣＡＰは、とりわけ免疫応答の質および有効性に影響を及ぼす様々なさらなる活性を有している。ＣＡＰは以下の事柄に関与していることが報告されている：
（ａ）リポ多糖（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）またはＣｐＧなどの炎症刺激を放出する細菌菌体の初期溶解（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００）、（ＨａｎｃｏｃｋおよびＳｃｏｔｔ ２０００）；
（ｂ）ＬＰＳおよびＬＴＡを中和し、かくしてマクロファージによるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を抑制する（＝防腐活性）（Ｓｃｏｔｔ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、２０００）、（Ｓｃｏｔｔ， Ｙａｎら、１９９９）、（Ｓｃｏｔｔ， Ｇｏｌｄら、１９９９）、（Ｇｏｕｇｈ， Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６）；
【００３３】
（ｃ）肥満細胞の脱顆粒。αデフェンシンはヒスタミン放出および血管拡張を誘発することが示されている（Ｂｅｆｕｓ， Ｍｏｗａｔら、１９９９）。さらに、ｈＢＤ−２およびＬＬ−３７は、肥満細胞においてヒスタミン放出および細胞内カルシウム移動を誘発するが、ｈＢＤ−１は誘発しないことが示されている。さらに、ｈＢＤ−２は肥満細胞においてプロスタグランジンＤ２を産生させるが、ＬＬ−３７およびｈＢＤ−１は産生させない（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ， Ｓｏｍｅｙａら、２００１）。
【００３４】
（ｄ）組織プラスミノーゲンアクチベーターによるフィブリン溶解を抑制し、かくして細菌の拡散を低減する（Ｈｉｇａｚｉ， Ｇａｎｚら、１９９６）；
（ｅ）繊維芽細胞の化学走性および増殖の促進による組織／創傷の修復（Ｇａｌｌｏ， Ｏｎｏら、１９９４）、（ＣｈａｎおよびＧａｌｌｏ １９９８）；
（ｆ）フリンやカテプシンなどのある種のプロテアーゼの阻害による組織傷害の抑制（Ｂａｓａｋ， Ｅｒｎｓｔら、１９９７）、（Ｖａｎ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ， Ｍａｎｎｅｓｓｅ−Ｌａｚｅｒｏｍｓら、１９９７）；
（ｇ）免疫抑制性コルチゾールの放出の抑制（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００）；
【００３５】
（ｈ）種々の免疫細胞集団の補給（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）。αデフェンシンは気道上皮細胞においてＩＬ−８産生を誘発し、好中球の補給に導くことが示されている（Ｖａｎ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ， Ｍａｎｎｅｓｓｅ−Ｌａｚｅｒｏｍｓら、１９９７）。さらに、αデフェンシンは、ナイーブなＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対しては化学走性活性を発揮するが、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞に対しては発揮しないことが報告されている（Ｃｈｅｒｔｏｖ， Ｍｉｃｈｉｅｌら、１９９６）、（Ｙａｎｇ， Ｃｈｅｎら、２０００）。同様に、αデフェンシンおよびβデフェンシンは、単球由来の未熟な樹状細胞の移動は誘発することができるが、単球および成熟樹状細胞の移動は誘発することができないことが示されている（Ｙａｎｇ， Ｃｈｅｒｔｏｖら、１９９９）、（Ｙａｎｇ， Ｃｈｅｎら、２０００）。さらに、このβデフェンシンの化学走性活性は、成熟樹状細胞ではなく未熟な樹状細胞上で発現されたケモカインレセプターの１つであるＣＣＲ６（ケモカインレセプター６）との相互作用によって媒体されることが示されている（Ｙａｎｇ， Ｃｈｅｒｔｏｖら、１９９９）。
【００３６】
ヒトＬＬ−３７やブタＰＲ−３９などのカテリシジンは、好中球に対して化学走性活性を発揮することが示されている（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｃｈａｒｏら、２０００）、（Ｄｅ， Ｃｈｅｎら、２０００）。さらに、ＬＬ−３７は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対しては化学走性活性を発揮するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対しては発揮しない（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｃｈａｒｏら、２０００）、（Ｄｅ， Ｃｈｅｎら、２０００）。さらに、ＬＬ−３７は、ホルミルペプチドレセプター様１（ＦＰＲＬ１）を利用して、末梢血の単球、好中球およびＣＤ４＋Ｔ細胞の化学走性を誘発することが最近示された（Ｄｅ， Ｃｈｅｎら、２０００）。しかしながら、未熟な樹状細胞および成熟樹状細胞に対するＬＬ−３７の化学走性活性は観察されていない。これら知見は、未熟な樹状細胞への単球の分化に伴ってＦＰＲＬ１発現は廃棄されるという事実によって支持された（Ｙｎａｇ， Ｃｈｅｎら、２００１）。しかしながら、ＦＰＲＬ１の発現は骨髄由来の細胞に限られることが記載されており、Ｔリンパ球については記載されていない（Ｍｕｒｐｈｙ １９９４）。それゆえ、好中球や単球と同様にＴリンパ球や骨髄由来の細胞に対して化学走性活性を発揮するに際して、ＬＬ−３７は異なるレセプターを利用しているようである。
【００３７】
（ｉ）獲得した全身免疫応答の促進。αデフェンシンと卵アルブミン（ＯＶＡ）との鼻内送達は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＯＶＡ特異的な血清ＩｇＧ抗体応答を促進した（Ｌｉｌｌａｒｄ， Ｂｏｙａｋａら、１９９９）。さらに、通常のアジュバントである水酸化アルミニウムに吸着したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をαデフェンシンと組み合わせて腹腔内投与すると、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＫＬＨ特異的な抗体の産生が増大した。さらに、αデフェンシンは、同系の腫瘍抗原、リンパ腫Ｉｇイディオタイプに対する抗体応答を促進し、腫瘍攻撃に対する抵抗性も増大させた（Ｔａｎｉ， Ｍｕｒｐｈｙら、２０００）。
【００３８】
獲得免疫応答の指示に重要な多様なＣＡＰ（たとえば、デフェンシン、カテリシジン）の様々な活性が今日まで記載されている。種々のＣＡＰの共通する活性および多様な活性が明らかにされている。樹状細胞に対するそれらの化学走性活性に関して幾つかの明らかな相違が示されている。αデフェンシンおよびβデフェンシンは樹状細胞に対して化学走性を発揮するが、この特殊化された細胞型に対するカテリシジンの化学走性活性は欠如している。
【００３９】
驚くべきことに、本発明の範囲内において、異なる種からのカテリシジン由来の抗菌ペプチド（ウシインドリシジン、ウシドデカペプチド、マウスｍＣＲＡＭＰおよびヒトＬＬ−３７）が、マウスおよびヒトの樹状細胞において抗原の取り込みを促進する能力を発揮することが示される。さらに、カテリシジン由来の抗菌ペプチドとともに腫瘍抗原を皮下投与すると、注射した腫瘍抗原に対する免疫応答が顕著に促進された。
【００４０】
米国特許第５，８３７，２４８号にはデフェンシンペプチドによるＴ細胞化学走性の刺激が開示されているが、デフェンシンおよびＣＡＰ３７／アズロシジン（ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ）以外の他のＴ細胞化学走性ペプチドは好中球に存在しないことが言及されている。
【００４１】
しかしながら、抗菌ペプチドの多用なファミリーが同じ細胞型（たとえば、好中球、小腸パーネト細胞）に存在するけれども（ＧａｎｚおよびＬｅｈｒｅｒ １９９９）、これら抗菌ペプチド間で重要な変異が存在する（このことは、ある１つのファミリーの特徴が必ずしも他のファミリーでも生じるとは限らないことを意味する）。一般に、この変異は、アミノ酸配列の発散によるばかりでなく、抗菌ペプチドをコードする局所的に発現された遺伝子産物の数および夥しさにも適用されると思われる。この変異の観点から、これらエフェクターが進化を通じて保存されてきた存在であることが明らかである。おそらく、抗菌ペプチドの変異は、その標的の特性：宿主−微生物相互作用に関する迅速な獲得進化変異を反映している。
【００４２】
免疫応答の誘発は、リンパ器官で利用できる抗原に決定的に依存している。排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節に到達しない抗原に対する応答は存在しない（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ， Ｅｈｌら、１９９７）。かくして免疫応答の開始はリンパ器官でしか起こらない。リンパ器官で抗原を負荷されたＡＰＣとＴ細胞および／またはＢ細胞との最初の相互作用が免疫カスケードの開始を可能にする（Ｋｕｒｔｓ， Ｈｅａｔｈら、１９９６）。
【００４３】
これらを考慮すると、増大された免疫応答性は、単に注射した末梢部位から排出局所リンパ節へのワクチン抗原の移動の増大の結果である。このプロセスでは、樹状細胞やランゲルハンス細胞などの末梢に存在する天然の抗原提示細胞が中心的な役割を果たしている（Ｓｃｈｉｊｎｓ ２０００）。これらは「天然アジュバント」として記載される。なぜなら、これら末梢に存在する天然の抗原提示細胞は抗原を非常に有効に捕捉する用意のできた番人として殆どの組織に存在しており、抗原の捕捉はこれら細胞の二次リンパ器官への移動を誘発し、該リンパ器官で該細胞はナイーブなＴ細胞およびＢ細胞を初回抗原刺激することができるからである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ １９９１）。これら末梢に存在する天然の抗原提示細胞は、生きたまたは不活化したウイルスまたは細菌の接種に応答して組織傷害部位に速やかに補給される（ＭｃＷｉｌｌｉａｍ， Ｎａｐｏｌｉら、１９９６）。
【００４４】
セクロピンが同様のカテリシジン様構造特性（αヘリックスコンホメーション）に類似している事実にもかかわらず、セクロピンはカテリシジンとは対照的に抗原適用能（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｕｌｓｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）は示さない（実施例参照）。カテリシジン由来の抗菌ペプチドが抗原適用能を有し、それゆえ免疫応答促進活性を有するのは驚くべきことである。このことは、異なるクラスの抗菌ペプチドが異なる機能を有すること、それゆえ、報告されたデフェンシンペプチドによるＴ細胞化学走性の刺激は、生得免疫と獲得免疫との間に同様の関連が存在することを当業者に示すものでないことを確認するものである。
【００４５】
それゆえ、ともに炎症性組織で放出されるカテリシジンおよびデフェンシンは、異なる仕方で適合免疫応答を指令する。デフェンシンは樹状細胞を誘引することによって参画するけれども、カテリシジンは本発明で示されるように樹状細胞の活性化にとって中心となるものである。それゆえ、カテリシジンは免疫応答促進活性を媒体するうえでの中心的な成分であり、それゆえワクチン開発にとって非常に有効なアジュバントを構成する。
【００４６】
今や驚くべきことに、カテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体が免疫応答促進活性を有すること、それゆえ非常に有効なアジュバントであることが本発明に従って示された。
【００４７】
本発明の範囲において、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは、カルボキシ末端抗菌ペプチド（カテリシジン遺伝子の第四エクソンによって優先的にコードされるが該第四エクソンのみによってコードされるわけではない）に続いてカテリシジンのカテリン様プレプロ領域（カテリシジン遺伝子の最初の３つのエクソンによって優先的にコードされるが該３つのエクソンのみによってコードされるわけではない）を含むもの、またはその誘導体として理解される。カテリシジンプレプロ領域は、ウシで７５〜８７％の同一性およびブタのプレプロ領域で９０〜９７％の範囲の同一性（Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９５）の高い種内同一性を有し、該領域はまた５１〜６５％の範囲（プログラムｂｌａｓｔｐを用いてｈＣＡＰ−１８と比較（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｍａｄｄｅｎら、１９９７））の高い種間同一性を有するため、種内および種間のホモロジーを有している。
【００４８】
このようにカテリシジンプレプロ領域の高い種内および種間でのタンパク質配列同一性が知られていることに鑑み、本発明では、カテリシジンプレプロ領域に対して４５％以上（≧）、有利には６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のタンパク質配列同一性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインに由来し、それゆえカテリシジン由来の抗菌ペプチドとして理解されるべきこれらタンパク質の抗菌ドメインであるのであれば、全ての抗菌ペプチドをカテリシジン由来の抗菌ペプチドと称する。
【００４９】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドの例は、たとえば、ＰＭＡＰ−３７、ｈＣＡＰ１８、ＢＭＡＰ−２７、ＣＡＰ１８、Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、ＰＲ−３９、インドリシジン、ウシドデカペプチド、プロテグリンＰＧ−２などである。
抗菌ペプチドは、通常用いられるアッセイである最小阻害濃度アッセイ（ＭＩＣ）で活性を示すときに抗菌性または殺菌性であるといわれる（ＧｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎおよびＡｇｅｒｂｅｒｔｈ １９９９）、（Ｂｏｍａｎ ２０００）。
【００５０】
一定範囲の微生物に対する物質のＭＩＣは、とりわけ正確な方法であるブロス希釈法により決定するのが好ましい。各物質の系列希釈を９６ウエルプレート中、ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で行う。各ウエルに１０４〜１０５コロニー形成単位／ｍｌの被験生物１０μｌを接種する。プレートを３７℃で３６〜４８時間インキュベートした後にＭＩＣを決定する。ＭＩＣは、増殖を抑制する最低の抗菌濃度として扱われる。
【００５１】
本発明の範囲において、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは、グラム陽性細菌および／またはグラム陰性細菌、真菌または原生動物に対して被験物質の５００μＭ未満、好ましくは３００μＭ未満、さらに好ましくは２００μＭ未満、さらに好ましくは０．０５〜１６０μＭの範囲のＭＩＣ（Ｔｒａｖｉｓ， Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０００）を示すときに抗菌性または殺菌性であるといわれる。
【００５２】
本発明の範囲において、カテリシジン由来の抗菌ペプチドの誘導体は、たとえば、カテリシジン由来の抗菌ペプチドの断片、並びに置換、欠失、付加などの１またはそれ以上の変異を有するカテリシジン由来の抗菌ペプチド、および修飾したあらゆるカテリシジン由来の抗菌ペプチド、たとえば、塩、エステルなどを含む。好ましくは、本発明による所定のカテリシジン由来の抗菌ペプチドのアミノ酸の１０％以下が置換、欠失または付加される。そのような変異は、標準的な知見に従って行う、たとえば、疎水性アミノ酸残基を他の疎水性アミノ酸残基で置換するなど。
【００５３】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドの誘導体は、ＭＩＣが５００μＭ未満、好ましくは３００μＭ未満、さらに好ましくは２００μＭ未満、さらに好ましくは０．０５〜１６０μＭの範囲である限りカテリシジン分子として理解されなければならない。本発明によるカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体の長さは重要ではない。長さは、上記ＭＩＣを発揮する限り、たとえば５アミノ酸からそのような抗菌ペプチドまたはその誘導体を含むタンパク質の長さまで、好ましくは１０〜６０アミノ酸であってよい。タンパク質は、たとえば、カテリシジン、たとえば、ＭＣＬＰ（マウスカテリン様タンパク質）、ｈＣＡＰ−１８などである。本発明による分子はまた、天然のカテリシジン由来ペプチドに匹敵する、とりわけ同じかまたは一層優れた化学走性活性をも示すのが好ましい。
【００５４】
ワクチンは、少なくとも１つのカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体と免疫応答が向けられた少なくとも１つの抗原とを含む。もちろん、ワクチンは所望の免疫応答に依存して２またはそれ以上の抗原を含んでいてよい。抗原はまた、免疫応答をさらに促進すべく修飾してよい。
【００５５】
好ましくは、ウイルスまたは細菌病原体に由来する、真菌または寄生虫に由来するタンパク質またはペプチド、並びに腫瘍抗原（癌ワクチン）または自己免疫疾患において推定の役割を有する抗原を用いる（グリコシル化、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）、糖脂質付加（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄａｔｅｄ）またはヒドロキシル化した抗原などの誘導体化抗原を含む）。さらに、炭水化物、脂質または糖脂質を抗原自体として用いてよい。誘導体化のプロセスとしては、病原体からの特定のタンパク質またはペプチドの精製、病原体の不活化並びにそのようなタンパク質またはペプチドのタンパク質加水分解もしくは化学的誘導体化または安定化が挙げられる。別のやり方として、病原体自体を抗原として使用してもよい。抗原は、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質またはそれらの混合物であるのが好ましい。
【００５６】
好ましくは、抗原は、５〜６０、好ましくは６〜３０、とりわけ８〜１１のアミノ酸残基からなるペプチドである。この長さの抗原は、Ｔ細胞を活性化するのに特に適していることがわかっている。抗原はさらに、Ａ６５７／２０００に従ってテールとカップリングすることができる。また、抗原はカテリシジン由来の抗菌ペプチドにカップリング、たとえば共有結合させることができる。もちろん、得られた化合物は天然に存在するカテリシジンであってはならない。
【００５７】
本発明の組成物の成分の相対的な量は、個々の組成物の必要性に大きく依存する。好ましくは１０ｎｇ〜１ｇの抗原およびカテリシジン由来の抗菌ペプチドを投与する。抗原／カテリシジン由来の抗菌ペプチドの好ましい量は、ワクチン接種当たり０．１〜１０００μｇの範囲の抗原および０．１〜１０００μｇのカテリシジン由来の抗菌ペプチドである。
本発明による組成物はさらに、緩衝剤、塩、安定化剤、抗酸化剤などの補助物質、または抗炎症剤や抗刺激剤（ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ）などの作用物質を含んでいてよい。
【００５８】
本発明の組成物は、患者、たとえばワクチン接種候補者に、有効量で、たとえば１週間毎、２週間毎または１ヶ月毎の間隔で投与することができる。本発明の組成物で処置する患者は、繰り返しワクチン接種することもできるし、または１回だけワクチン接種することもできる。本発明の好ましい使用は、特定の抗原に対して保護することのない、とりわけヒトまたは動物の能動免疫処置である。
【００５９】
本発明の組成物は、皮下、筋肉内、直腸内、静脈内、皮内、耳介内（ｉｎｔｒａｐｉｎｎａｌｙ）、経皮並びに経口摂取により投与してよい。
ワクチンが１を超えるカテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体を含んでいるなら、これらカテリシジン由来の抗菌ペプチドは抗原に対する免疫応答をさらに促進して強めるべく相互作用するであろう。
【００６０】
もちろん、本発明によるワクチンは、たとえば他の薬理学的に許容しうる担体などのさらなる物質を含んでいてよい。本発明によるワクチンは、公知の方法に従って、たとえば静脈内ワクチン、ＤＮＡワクチン、経皮ワクチン、局所ワクチン、鼻内ワクチンおよびコンビネーションワクチンとして製剤化することができる。公知のワクチンの改良である投与量をワクチンの標準法により選択することができるが、公知のワクチンよりも低い投与量も同じ保護に対して可能であり、それゆえ好ましい。
好ましくは、ワクチンは貯蔵安定な形態で提供され、たとえば凍結乾燥して適当な再構成溶液と任意に組み合わせて提供される。
【００６１】
好ましくは、カテリシジンは動物のカテリシジンである。本発明の範囲内において、「動物のカテリシジン」はヒトカテリシジン、とりわけ哺乳動物のカテリシジンを含む。とりわけカテリシジンがワクチンをデザインした動物種に由来するときは、これらカテリシジンに由来する抗菌ペプチドはその動物の免疫系によって認識されることはなく、かくして該動物においてカテリシジン由来の抗菌ペプチドに対する免疫応答を引き起こすリスクが低減するであろう。
【００６２】
好ましい態様によれば、動物のカテリシジンはマウスカテリシジンであり、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは配列番号１に示す配列を含むのが好ましい。このワクチンがマウスに投与されると、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは認識されることはなく、該カテリシジン由来の抗菌ペプチドに対する免疫応答は引き起こされないであろう。しかしながら、このカテリシジン由来の抗菌ペプチドはまた、ヒトを含む他のいかなる動物に投与されるワクチンとしても適している。配列番号１に示す配列を含むカテリシジン由来の抗菌ペプチドは特に有効であることが示されている。
【００６３】
好ましい態様によれば、カテリシジンはヒトカテリシジンであり、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは配列番号２に示す配列を含むのが好ましい。このワクチンがヒトに投与されると、該カテリシジン由来の抗菌ペプチドは免疫系によって認識されないので該カテリシジン由来の抗菌ペプチドに対する免疫応答は誘発されないであろう。配列番号２に示す配列を含むカテリシジン由来の抗菌ペプチドは、少なくとも１つの抗原を含むワクチンに加えたときに特に有効であることが示されている。
【００６４】
本発明の好ましい態様によれば、動物のカテリシジン由来の抗菌ペプチドはインドリシジンペプチド、好ましくはウシインドリシジンペプチドであり、配列番号３に示す配列を含むのが特に好ましい。
科学文献には、カルボキシ末端のグリシンを有する（（Ｄｅｌ Ｓａｌ， Ｓｔｏｒｉｃｉら、１９９２）、（Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９５）、（Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｇｅｎｎａｒｏら、１９９７））および有しない（（Ｓｅｌｓｔｅｄ， Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９２）、（Ｆａｌｌａ， Ｋａｒｕｎａｒａｔｎｅら、１９９６）、（ＡｎｄｒｅｕおよびＲｉｖａｓ １９９８）、（ＨａｎｃｏｃｋおよびＤｉａｍｏｎｄ ２０００））ウシインドリシジンの様々な配列が公開されている。トリプトファンに富むウシインドリシジンがウシ好中球からアミド化トリデカペプチドとして精製されている（Ｓｅｌｓｔｅｄ， Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９２）。精製したインドリシジンには認められないさらなるグリシンが、導かれたｃＤＮＡ配列のカルボキシル末端に存在するのが見つかっており、翻訳後のアミド化に関与しているものと思われる（Ｄｅｌ Ｓａｌ， Ｓｔｏｒｉｃｉら、１９９２）。
【００６５】
本発明では、ウシインドリシジンは、Ｃ末端がアミノ化された形態の配列番号３に示す配列：ＮＨ２−ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ＣＯＮＨ２を含む、ウシ好中球から精製したペプチド（Ｓｅｌｓｔｅｄ， Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９２）に従って合成するのが好ましい。このカテリシジン由来の抗菌ペプチドは、ウシに対してデザインしたワクチンとして用いるのが特に好ましい、というのはこの動物種では該カテリシジン由来の抗菌ペプチドに対して免疫応答が誘発されないだろうからである。しかしながら、このカテリシジン由来の抗菌ペプチドはまた、ヒトを含む他のいかなる動物種に対するワクチンとしても適している。配列番号３に示す配列を含むカテリシジン由来の抗菌ペプチドは、アジュバントとして特に有効であることがわかった。
【００６６】
好ましい動物のカテリシジン由来の抗菌ペプチドは、配列番号４に示す配列を含むウシの環状および／または線状のドデカペプチドである。このカテリシジン由来の抗菌ペプチドはかなり短いが、ワクチンに含まれる抗原に対する免疫応答を有効に促進することが示された。
【００６７】
理論的には、ワクチンは少なくとも２つの成分：（１）免疫応答を引き起こすべき抗原および（２）免疫応答を促進および／または指令すべきアジュバントを含んでいなければならない。免疫アジュバントは、もともと「特定の抗原と組み合わせて用いられ、抗原単独の場合よりも高い免疫を生成する物質」として記載された（ＳｉｎｇｈおよびＯ’Ｈａｇａｎ １９９９）。免疫促進能に関してアジュバントの高い多様性が得られることが知られている（Ｓｃｈｉｊｎｓ ２０００）。それゆえ、特異に作用するアジュバントをワクチン調製のために組み合わせた場合に改良された効能が記載されている。
【００６８】
たとえば、皮膚リーシュマニア症の霊長類モデルにおける組換えヒトサイトカインＩＬ−１２および水酸化アルミニウムを用いた保護免疫が示された（Ｋｅｎｎｅｙ， Ｓａｃｋｓら、１９９９）。さらに、組換えマウスサイトカインＩＬ−１２の同時投与による樹状細胞ワクチンの改良された効能および腫瘍抗原ペプチド適用末梢血単核球での免疫の成功が示された（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ， Ｕｙｔｔｅｎｈｏｖｅら、１９９９）。しかしながら、他のアジュバントと組み合わせて相乗作用の示されたのはサイトカインのみではなかった。たとえば、ポリ（Ｉ−Ｃ）またはサイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２とともにアジュバントしたジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドが、結核サブユニットワクチンに対して免疫応答の変調作用を示す（Ｌｉｎｄｂｌａｄ， Ｅｌｈａｙら、１９９７）。
【００６９】
好ましくは、ワクチンは少なくとも１つのさらなる免疫応答促進物質を含む。免疫応答促進物質としては、アジュバントとして作用することが知られているいかなる物質をも用いることができる。そのような物質は、ＷＯ９３／１９７６８に開示されている。他の物質は、たとえばポリリシンやポリアルギニンなどのポリカチオンである。他のアジュバントは、細胞の内部に入れるように充分に小さな粒子の形態、たとえばシリカゲルやデキストランビーズの形態の成分であってよい。このさらなる免疫応答促進物質の添加は、ワクチンをさらに一層有効なものとするであろう。
【００７０】
好ましくは、免疫応答促進物質はサイトカインである。サイトカインは、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞および免疫応答の誘発に参画する他の様々な細胞を活性化および刺激するうえで重要な役割を果たしている。抗原に対する免疫応答をさらに促進するいかなるサイトカインをも用いることができる。
【００７１】
本発明の他の側面は、少なくとも１つの抗原に対する免疫応答促進用アジュバントを調製するための、カテリシジン由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体の使用である。本発明のこの側面に従っても、「カテリシジン由来の抗菌ペプチド」、「カテリシジン」、「誘導体」および「抗原」は上記と同様に理解されなければならない。
【００７２】
好ましくは、アジュバントは抗原提示細胞（ＡＰＣ）において少なくとも１つの抗原の取り込みを促進する。抗原提示細胞において一層多くの抗原が取り込まれるので、Ｔ細胞などの抗原特異的な免疫エフェクター細胞の誘発に導くＡＰＣ誘発カスケードが促進される。それゆえ、ＡＰＣにおける抗原の取り込みの促進はこれら抗原に対する免疫応答を促進する。
【００７３】
好ましくは、カテリシジンは動物のカテリシジンである。特に好ましいのは、カテリシジンを投与した個体において免疫応答を引き起こさないカテリシジンである。
本発明の好ましい態様によれば、カテリシジンはマウスカテリシジンであり、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは配列番号１に示す配列を含むのが好ましい。
【００７４】
さらなる有利な態様によれば、カテリシジンはヒトカテリシジンであり、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは配列番号２に示す配列を含むのが好ましい。
好ましくは、カテリシジン由来の抗菌ペプチドはインドリシジンペプチド、好ましくはウシインドリシジンペプチドであり、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは配列番号３に示す配列を含むのがさらに好ましい。
【００７５】
好ましくは、カテリシジン由来の抗菌ペプチドは、配列番号４に示す配列を含むウシの環状および／または線状ドデカペプチドである。
これら上記のカテリシジン由来の抗菌ペプチドの利点は上記に記載したものと同じである。
本発明の好ましい態様によれば、アジュバントをワクチンに加える。もちろん、アジュバントを動物に直接、好ましくはワクチン接種をする前に投与することが可能である。しかしながら、アジュバントをワクチンに加え、ついでこれを動物に１度に投与するのが一層容易である。
【００７６】
さらなる側面によれば、本発明は、特定の抗原または特定の抗原群に対してヒトを含む動物をワクチン接種する方法に関し、該方法は、ワクチン接種すべき該動物（ヒトを含む）に有効量の本発明のワクチンを投与することを含む。あるいは、該方法は、カテリシジン由来の抗菌ペプチドを含む有効量のアジュバントを投与することを含み、その後、ワクチンを投与する。
【００７７】
本発明を下記実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれらに限られるものではない。
図１には種々のカテリシジンタンパク質の類似性を示す。ＭＣＬＰ（マウスカテリン様タンパク質、配列番号５）の推論アミノ酸配列を、ウサギ（カテリン、配列番号６、およびＣＡＰ１８、配列番号７）、ウシ（バクテネシン、配列番号８、Ｂａｃ５、配列番号９、インドリシジン、配列番号１０）、ヒト（ＦＡＬＬ−３９、配列番号１１）からのペプチド抗生物質の前駆体配列とアラインメントする。これらは、本発明によるカテリシジン由来の抗菌ペプチドの例示である。システインは枠で囲んである。二塩基性のプロテアーゼプロセシング部位には下線を引いてある。アラインメントはプログラムＤＮＡ−ＳＵＮを用いて行った。
【００７８】
図２はプロＦＡＬＬ−３９／ｈＣＡＰ１８についてのヒト遺伝子の配置を示す。３つの保存されたエクソン（ｅ１〜ｅ３）の全体の構造は、全てのカテリシジン遺伝子で同じである。変異する部分は常にエクソン４であり、このエクソンは、ヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、マウスおよびヒツジで完全に異なるエフェクターをコードすることができ、抗菌ペプチドの最初の４つのクラスに属する。領域１は、ＮＦ−ＫＢ、ＮＦ−ＩＬ６、ＡＰＲＦなどの転写因子の制御部位を示す。矢印２はエクソンシャフリングの仮定部位を示し、領域３はシグナルペプチドを示し、領域４はカテリン由来の前駆体を示し、領域５は一次翻訳産物を示す。領域６はエクソン４の産物を示し、ここでＦＡＬＬ−３９およびＬＬ−３７はｈＣＡＰ−１８に由来するＣ末端抗菌ペプチドの略語である。ＦＡＬＬ−３９のプロセシングは未だに行っていない。
【００７９】
図３は、カテリシジンファミリーのプロペプチドの模式図を示す。Ｃ末端抗菌ペプチドの幾つかを示してあり、代表例は、αヘリックス配列（ＰＡＭＰ−３７、配列番号１２；ｈＣＡＰ１８、配列番号１３；ＢＭＡＰ−２７、配列番号１４；ＣＡＰ１８、配列番号１５）、ＰｒｏおよびＡｒｇに富む配列（Ｂａｃ５、配列番号１６；Ｂａｃ７、配列番号１７；ＰＲ−３９、配列番号１８）、Ｔｒｐに富む配列（インドリシジン、配列番号３）、１つのジスルフィド架橋を含む配列（ドデカペプチド、配列番号４）、および２つのジスルフィド架橋を含む配列（プロテグリンＰＧ−２、配列番号１９）である。これらは、本発明によるカテリシジン由来の抗菌ペプチドの例示である。領域１は保存されたプレプロ領域を示し、領域２は変異する抗菌ドメインを示し、矢印３はシグナルペプチダーゼの部位を示し、矢印４はエラスターゼの開裂部位を示す。３つの領域（ｐｒｅ、ｐｒｏ、ｐｅｐ（ｔｉｄｅ））の下の数字は、これらペプチドのアミノ酸残基の数を示す。
【００８０】
実施例
ＡＰＣ中への標識抗原ペプチドの取り込みを促進する種々のペプチドの能力（トランスローディングアッセイ；Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）およびインビボでのペプチド特異的なＴ細胞応答の誘発の試験
多様なカテリシジンまたはセクロピン由来の抗菌ペプチドが抗原に対する「担体ペプチド」として機能しうるか否かを試験するため、ＡＰＣをインビトロでトランスローディングすべく（これはＡＰＣ中への抗原の取り込みの促進を意味する）、蛍光標識したペプチドを抗原ペプチドとして用いた。これらを、多様なタイプおよび濃度の所定の「担体ペプチド」と混合した。
【００８１】
これら多様な「担体ペプチド」のペプチド送達の有効性を比較するため、Ｐ３８８Ｄ１細胞（マウス単球−マクロファージ抗原提示細胞株；ＡＴＣＣ（ＴＩＢ−６３）から購入）、またはヒトＣＤ１ａ陽性（ヒトＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから、ＣＤ１４＋陽性ＰＢＭＣ）樹状細胞を、３７℃で１時間、一定量のフルオレセイン標識ペプチドを単独かまたは所定の濃度の多様な「担体ペプチド」と組み合わせてインキュベートすることによって、ＡＰＣ中へのペプチド取り込みの量をモニターした。細胞をフローサイトメトリーによって分析する前に、細胞を充分に洗浄して遊離のペプチドを除去した。細胞によって取り込まれたフルオレセイン標識ペプチドの相対量をフローサイトメトリーにより測定した。
【００８２】
実施例１
「担体ペプチド」としてのカテリシジン由来の抗菌ペプチドによるマウスマクロファージのトランスローディング
ウシインドリシジン（配列番号３）、線状または環状ウシドデカペプチド（配列番号４）、マウスカテリシジン由来の抗菌ペプチド（配列番号１）を、等価な量の正の荷電を示す濃度にて用いた。使用した抗原ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素由来ＭＨＣクラスＩ（Ｋｄ）結合性ペプチド（Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）である。使用した抗原ペプチドおよび担体ペプチドの量は以下のとおりであった（図４参照、蛍光強度は対数スケール）：
【００８３】
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ（ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋６３μｇのウシインドリシジン（配列番号３）
（４）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋７５μｇの環状ウシドデカペプチド（配列番号４）
（５）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋７５μｇの線状ウシドデカペプチド（配列番号４＊）
（６）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋２０μｇのポリＬ−アルギニン
（７）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋５８μｇのマウス抗菌ペプチド（配列番号１）
【００８４】
ペプチドのみで処理した細胞では蛍光は疎らであると思われるが、カテリシジン由来の抗菌ペプチドを「担体ペプチド」としてトランスローディングした細胞では全て「トランスローディングした」細胞の強い蛍光が認められ、これら抗菌ペプチドが抗原ペプチドでＡＰＣを非常に有効に適用しうることを示していた。試験した全てのカテリシジン由来の抗菌ペプチドはペプチドの送達を大きく促進し、ＡＰＣへの良好な「担体ペプチド」として機能する。
【００８５】
実施例２
セクロピン由来の抗菌ペプチドとカテリシジン由来の抗菌ペプチドとのトランスローディング活性の比較
ウシインドリシジン（配列番号３）、線状または環状ウシドデカペプチド（配列番号４）およびセクロピン様Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ＲｐＬ１由来のペプチド（Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０）（アミノ酸残基２〜２０）（（Ｐｕｔｓｅｐ， Ｎｏｒｍａｒｋら、１９９９）、（Ｂｏｍａｎ ２０００））を、等価な量の正の荷電を示す濃度にて用いた。使用した抗原ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素由来ＭＨＣクラスＩ（Ｋｄ）結合性ペプチド（Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）である。使用した抗原ペプチドおよび担体ペプチドの量は以下のとおりであった：
【００８６】
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ（ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋４７μｇのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０
（４）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋６３μｇのウシインドリシジン（配列番号３）
（５）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋３７．５μｇの環状ウシドデカペプチド（配列番号４）
【００８７】
カテリシジン由来の抗菌ペプチドが明瞭かつ有意のトランスローディング活性を示すのに対し、セクロピン由来の抗菌ペプチドはペプチド取り込みのわずかな促進のみを示す（図５参照、蛍光強度は対数スケール）。
【００８８】
実施例３
増大濃度の線状ウシドデカペプチド
使用した抗原ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素由来ＭＨＣクラスＩ（Ｋｄ）結合性ペプチド（Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）である。使用した抗原ペプチドおよび担体ペプチドの量は以下のとおりであった：
【００８９】
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ（ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋１８．７５μｇの線状ウシインドリシジン（配列番号４）
（４）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋３７．５μｇの線状ウシインドリシジン（配列番号４）
（５）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋７５μｇの線状ウシインドリシジン（配列番号４）
（６）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋１５０μｇの線状ウシインドリシジン（配列番号４）
カテリシジン由来の抗菌ペプチド（ウシドデカペプチド：配列番号４）の量が増大するとともに適用作用もまた有意に増大することが示された（図６参照、蛍光強度は対数スケール）。
【００９０】
実施例４
増大濃度のセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１由来抗菌
使用した抗原ペプチドは、インフルエンザ赤血球凝集素由来ＭＨＣクラスＩ（Ｋｄ）結合性ペプチド（Ｂｕｓｃｈｌｅ， Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）である。使用した抗原ペプチドおよび担体ペプチドの量は以下のとおりであった（図７参照、蛍光強度は対数スケール）：
【００９１】
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ（ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋２５μｇのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０
（４）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋５０μｇのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０
（５）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋１００μｇのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０
（６）２μｇのＦＬ−ＬＦＥＡＩＥＧＦＩ＋２００μｇのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１ ２−２０
図７は、セクロピン由来の抗菌ペプチドの量の増大は適用作用を有効に増大させないことを示している。
【００９２】
実施例５
ＬＬ−３７によるＭＨＣクラスＩペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドのヒトＤＣへのトランスローディング
マウスＡＰＣのみならずヒトＡＰＣもカテリシジン由来の抗菌ペプチドによってトランスローディングされることを示すため、ヒトＣＤ１ａ陽性（ヒトＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来、ＣＤ１４＋陽性ＰＢＭＣ）樹状細胞を標的ＡＰＣとして用い、該ＡＰＣをインフルエンザマトリックスタンパク質Ａ由来のＭＨＣクラスＩ結合性ペプチド（アミノ酸残基５８〜６７）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｅｌｖｉｎら、１９９２）かまたは破傷風毒素由来のＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチド（アミノ酸残基８３０〜８４３）（Ｖａｌｍｏｒｉ， Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、１９９４）で適用した。これら２つのクラスの抗原性フルオレセイン標識ペプチドを用いた。ヒトカテリシジン由来の抗菌ペプチドとしては公知のＬＬ−３７ペプチド（配列番号２）（Ｃｏｗｌａｎｄ， Ｊｏｈｎｓｅｎら、１９９５）を用いた。
【００９３】
使用したヒトカテリシジン由来の抗菌ペプチドＬＬ−３７および抗原ペプチドの濃度は以下に示すとおりである：
図８ａ：
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（ＭＨＣクラスＩ；ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬＴ（ＭＨＣクラスＩ）＋３０μｇのＬＬ−３７（配列番号２）
図８ｂ：
（１）ペプチドなし（細胞のみ）
（２）２μｇのＦＬ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（ＭＨＣクラスＩＩ；ペプチドのみ）
（３）２μｇのＦＬ−ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（ＭＨＣクラスＩＩ）＋３０μｇのＬＬ−３７（配列番号２）
【００９４】
図８ａおよび図８ｂに示すように、ヒトカテリシジン由来の抗菌ペプチドＬＬ−３７は、両クラス（ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ）の抗原ペプチドでヒト樹状細胞を有意な程度まで適用した。
それゆえ、多様な種からのカテリシジン由来の抗菌ペプチドが異なる起源のＡＰＣを適用する「担体ペプチド」として機能しうる。
【００９５】
実施例６
ペプチド特異的なＴ細胞応答の誘発をインビボで促進する能力の試験
これらのカテリシジン由来の抗菌ペプチドがペプチド特異的なＴ細胞応答の誘発をインビボで促進する能力を試験するため、ＴＲＰ−２（マウスチロシナーゼ関連タンパク質２：アミノ酸配列１８１〜１８８；ＶＹＤＦＦＶＷＬ）（Ｂｌｏｏｍ， Ｐｅｒｒｙ−Ｌａｌｌｅｙら、１９９７）由来の抗原性メラノーマペプチド（１００μｇ）と種々の「担体ペプチド」、すなわちポリＬ−アルギニン、マウスカテリシジン由来の抗菌ペプチド（配列番号１）またはウシインドリシジン（配列番号３）との混合物を用いて、１群４匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢、Ｈ−２ｂ）の脇腹に３回（０日目、７日目、および１４日目）皮下注射した。
【００９６】
マウス群は以下の注射を受けた（マウス当たりの量を示す）：
（１）１００μｇのＶＹＤＦＦＶＷＬ
（２）１００μｇのＶＹＤＦＦＶＷＬ＋１００μｇのポリＬ−アルギニン
（３）１００μｇのＶＹＤＦＦＶＷＬ＋１０００μｇのマウスカテリシジン由来の抗菌ペプチド（配列番号１）
（４）１００μｇのＶＹＤＦＦＶＷＬ＋５００μｇのウシインドリシジン（配列番号３）
【００９７】
３回目のワクチン接種の２週間後に、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）（鼠蹊部）リンパ節を取り出し、リンパ節細胞（図９）および脾細胞（図１０）をＴＲＰ−２由来（マウスチロシナーゼ関連タンパク質２：アミノ酸配列１８１〜１８８：ＶＹＤＦＦＶＷＬ）ペプチドでエクスビボで活性化してＩＦＮ−γ産生特異細胞（それぞれ、１００万の脾細胞およびリンパ節細胞当たりのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔの数）をＥＬＩＳｐｏｔアッセイで決定した。
【００９８】
図９は、ペプチドとウシインドリシジン（配列番号３）とを注射したマウスで、ペプチド単独またはペプチドとポリＬ−アルギニンとを注射したマウスに比べて一層多くのＩＦＮ−γ産生特異細胞という結果となったことを示す。
図１０は、ペプチドとウシインドリシジン（配列番号３）とを注射したマウスおよびペプチドとマウスカテリシジン由来の抗菌ペプチド（配列番号１）とを注射したマウスの両者で、ペプチド単独またはペプチドとポリＬ−アルギニンとを注射したマウスに比べて一層多くのＩＦＮ−γ産生特異細胞という結果となったことを示す。
【００９９】
この実施例は、カテリシジン由来の抗菌ペプチドがペプチド特異的なＴ細胞応答の誘発をインビボで促進することを明らかに示している。
要約すると、試験した全てのカテリシジン由来の抗菌ペプチドは高い「トランスローディング」および免疫変調能を示し、カテリシジン由来の抗菌ペプチドがＡＰＣをインビトロおよびインビボにて抗原ペプチドで適用することができ、適合免疫応答を誘発するに際して抗原ペプチドの良好なアジュバント／「担体ペプチド」であることを示している。
【０１００】
参照文献
【表１】
2004506019.tif 000003
【０１０１】
【表２】
2004506019.tif 000004
【０１０２】
【表３】
2004506019.tif 000005
【０１０３】
【表４】
2004506019.tif 000006
【０１０４】
【表５】
2004506019.tif 000007
【０１０５】
【表６】
2004506019.tif 000008
【０１０６】
【表７】
2004506019.tif 000009
【０１０７】
【表８】
2004506019.tif 000010
【０１０８】
【表９】
2004506019.tif 000011
【０１０９】
【表１０】
2004506019.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】カテリシジンタンパク質間の配列類似性を示す。
【図２】プロＦＡＬＬ−３９／ｈＣＡＰ１８についてのヒト遺伝子の配置を示す。
【図３】カテリシジンファミリーのプロペプチドの模式図を示す。
【図４】「担体ペプチド」としてのカテリシジン由来の抗菌ペプチドによるＰ３８８Ｄ１のトランスローディングを示す。
【図５】「担体ペプチド」としてのセクロピンまたはカテリシジン由来の抗菌ペプチドによるＰ３８８Ｄ１のトランスローディングを示す。
【図６】「担体ペプチド」としてのカテリシジン由来の抗菌ペプチド（ウシ線状ドデカペプチド配列番号４）の増大量によるＰ３８８Ｄ１のトランスローディングを示す。
【図７】「担体ペプチド」としてのセクロピン様Ｈｐ ＲｐＬ１（アミノ酸残基２−２０）由来の抗菌ペプチドの増大量によるＰ３８８Ｄ１のトランスローディングを示す。
【図８】ＬＬ−３７によるＭＨＣクラスＩペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドのヒトＤＣへのトランスローディングを示す。
【図９】ワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生細胞の量を示す。
【図１０】ワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生細胞の量を示す。
【図１】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004506019.tif 000078
2004506019.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506019.tif 000080
2004506019.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506019.tif 000082
【国際調査報告】
2004506019.tif 000083
2004506019.tif 000084
2004506019.tif 000085