(57)【要約】【課題】リステリア属の病原性細菌の直接同定を可能にする基質。【解決手段】特異なリステリア・モノサイトゲネス種であるエステラーゼ活性である、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ−ＰＬＣ）の特異的、ホスホリパーゼＣ活性と異なる、エステラーゼ活性の検出、一方が上述のような基質、他方がリステリア属のすべてまたは一部に特異的な基質である、２つの基質の組み合わせ、かかる基質または基質のかかる組み合わせを含む反応媒質及びかかる培養基を用いる同定法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステリア属の病原性細菌の直接同定を可能にする基質において、特異なリステリア・モノサイトゲネスであるエステラーゼ活性が、ホスホリパーゼＣ活性と異なる、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ−ＰＬＣ）の特異的なエステラーゼ活性によって分裂する、ことを特徴とする基質。
【請求項２】
エステラーゼ活性は、特異的な酵素活性であるすなわち基質を構成するマーカ部分と標的部分の間のエステル結合を分割することを特徴とする、請求項１に記載の基質。
【請求項３】
分割された結合はマーカ部分によって担持されたアルコール基と、標的部分を構成する有機酸の間の結合であることを特徴とする、請求項２に記載の基質。
【請求項４】
マーカ部分は下記の成分のいずれか１つによって構成できるインドキシルなどの色原体によって構成されることを特徴とする、請求項３に記載の基質：
・５−ブロモ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、または
・６−クロロ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、または
・６−ブロモ−３−インドキシル。
【請求項５】
標的部分は長さが２から２０炭素原子の間に、好適には４から１０炭素原子の間に含まれる炭素鎖を有する脂肪酸によって構成される、請求項３に記載の基質。
【請求項６】
ブチレート５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、カプリル酸塩５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、ノナン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、デカン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルで構成されることを特徴とする、請求項４と５に記載の基質。
【請求項７】
リステリア種のすべてまたは一部が有する少なくとも１つの別の酵素活性の検出を可能にする少なくとも１つの別の基質に結合されていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１つに記載の基質。
【請求項８】
ＰＩ−ＰＬＣ酵素をのぞいて、エステラーゼ活性の検出を可能にする基質は先に定義したエステラーゼ活性とは異なる酵素活性を検出することを可能にする別の基質のそれと異なる着色を有することを特徴とする、請求項７に記載の基質。
【請求項９】
リステリア種のすべてまたは一部が有する別の酵素活性はオシダーゼまたはホスファターゼまたはアミノペプチダーゼ活性であることを特徴とする、請求項７または８のいずれか１つに記載の基質。
【請求項１０】
前記別の基質のマーカ部分の基礎となるものが：
・５−ブロモ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、または
・６−クロロ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、または
・６−ブロモ−３−インドキシルであることを特徴とする、請求項７から９のいずれか１つに記載の基質。
【請求項１１】
前記別の基質が下記によって構成されることを特徴とする、請求項１０に記載の基質：
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、または
・６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−マンノシド、または
・６−クロロ−３−インドリルホスファート。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１つに記載の少なくとも１つの基質を使用する、リステリア・モノサイトゲネス種の直接同定を可能にする反応性媒質。
【請求項１３】
ＰＩ−ＰＬＣ活性と異なるエステラーゼ活性の検出を可能にする基質は、２０ｍｇ／ｌから３ｇ／ｌの間の、または好適には５０ｍｇ／ｌから１ｇ／ｌの間の、あるいはより好適には１００から６００ｍｇ／ｌの間に含まれる、あるいは２５０ｍｇ／ｌ程度の濃度であることを特徴とする、請求項１２に記載の媒質。
【請求項１４】
オシダーゼ、ホスファターゼまたはアミノペプチダーゼ活性などの別の活性を検出することを可能にする基質は１０ｍｇ／ｌから５００ｍｇ／ｌの間の、または好適には５０から３００ｍｇ／ｌの間の、またさらに好適には１００から２００ｍｇ／ｌの間の濃度を有することを特徴とする、請求項１２または１３のいずれか１つに記載の媒質。
【請求項１５】
媒質は寒天または液状であることを特徴とする、請求項１２から１４のいずれか１つに記載の媒質。
【請求項１６】
リステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリに対してリステリア・モノサイトゲネス種の判別を可能にする手段を備えている、すなわち：
・リステリア・モノサイトゲネスではなくリステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリによって酸性化された少なくとも１つの炭水化合物（例えば、キシロースおよび／またはＤ−タガトース）の添加、あるいは
・リステリア・モノサイトゲネスによって、また必要に応じリステリア・イノキュアおよび／またはリステリア・イバノヴィイおよび／またはリステリア・グラィイによって酸性化された少なくとも１つの炭水化合物の添加、
・リステリア・モノサイトゲネスではなく、少なくともリステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリに特異的なオシダーゼ活性（β−マルトシダーゼ）および／またはホスファターゼおよび／またはアミノペプチダーゼ活（Ｌ−グリシン・アミノペプチダーゼ）活性を明らかにすることができる少なくとも１つの基質の添加、あるいは
・ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）および／またはホスファチジルコリン（ＰＣ）などのホスホリパーゼ（ＰＬＣ）の少なくとも１つの自然基質の添加を備えていることを特徴とする、請求項１２から１５のいずれか１つに記載の媒質。
【請求項１７】
次の少なくとも１つの種に対してリステリア・モノサイトゲネス種の判別を可能にする選択手段を備えていることを特徴とする、請求項１２から１６のいずれか１つに記載の媒質：
・黄色ブドウ球菌、
・バシラス・ツリンギエンシス、
・腸球菌、
・大腸菌、
・緑膿菌、および
・カンジダアルビカンス。
【請求項１８】
選択手段は下記の化合物の少なくとも１つで構成されることを特徴とする、請求項１７に記載の媒質：
・塩化リチウム、
・セフタジジム、
・アンホテリシンＢ、
・ホスホマイシン、および／または
・コリスチン。
【請求項１９】
リステリア・モノサイトゲネス種の病原性細菌同定の過程において、
・請求項１２から１８のいずれか１つに記載の、培養基への病原性細菌を含む可能性のある試料の播種、
・標本を蒔種した培養基の保温、および
・１つまたは複数の基質の特徴をなしている色と強さによる前記病原菌の存在の判定。
【請求項２０】
病原性細菌を含んでいる可能性がある前記標本は予め濃縮してから、請求項１２から１８のいずれか１つに記載の、培養基に細胞を入れることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１８から２４時間保温した後、１つまたは複数の基質の色と特徴的強さによる前記病原性細菌の存在の判定を実施することを特徴とする、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から６のいずれか１つに記載の、標的部分と、阻害部分が放出されたときにリステリア・モノサイトゲネスを特異的に阻害するための阻害部分とから成る基質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリステリア属の病原菌、より詳細にはリステリア・モノサイトゲネス種の直接同定を可能にする色原体基質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明はさらに一方がリステリア・モノサイトゲネス種に特異的で、他方がリステリア属に特異的または非特異的な、２つの基質の組み合わせにも関するものである。それはまたかかる基質を含む培養基あるいはかかる基質の組み合わせにも関するものである。最後にそれはかかる培養基を使用する識別法に関するものである。
【０００３】
ずいぶん以前から、微生物に特徴的な酵素活性の有無を決定するために特別な基質が使用される。反応の有無に応じて基質を選択することによって、微生物群の性質を特性化したり、所与の微生物属の株および／または種の差別化が可能になる。
【０００４】
本発明に使用されるような、酵素の合成基質は、以下に標的部分と呼ばれる、第一の部分が明らかにすべき酵素活性に特異的で、以下にマーカ部分と呼ばれる、マーカの役割を果たす第２の部分の２つの部分で構成される。
これらの特別な基質は蛍光または色原体とすることができる。事実、第２のマーカ部分、あるいは出願人の名前で出願された特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／００７８１に記載の、１つまたは複数の他の化合物との反応生成物が、それがもはや第１の標的部分と組み合わされていないときに、蛍光または色原体となる。
【０００５】
細菌リステリア・モノサイトゲネスの単離と識別は農業食品衛生監視と医療細菌学の大きな問題である。リステリア属の細菌の中ではリステリア・モノサイトゲネス種だけがヒトに対して病原体であることが分かっている。それは免疫が低下したヒト、低年齢の子供、または妊婦の場合は時として死に至る（死亡率２５から３０％）リステリオーズを生み出すことがある。リステリアの他の種は全部、動物だけにしか病原体ではない。これはとくにリステリア・イバノビイに当てはまる。
【０００６】
たとえ、ヒト・リステリオーズの危険性がここ十年間先進国の多くで減少していても、現代社会はますます高い安全性を要求しているので、散発的な症例には順応しても、流行を許容することはできない。
しかるに、例えば、フランスでは、リスク制御政策は上流（家畜の汚染）よりも下流（加工食品の汚染率）を優先している。このため家禽のガラの１５から６０％、ブタの残骸の３から３６％およびウシの残骸７から２８％がリステリアに汚染されている。
ヒトの細菌感染診断の枠内において、したがって、病原性ではないリステリアｓｐｐ．属の他の細菌の中で、リステリア・モノサイトゲネスをはっきり区別することが重要になる。
【０００７】
従来、リステリアｓｐｐ．の検出と単離は選択培養基で実現されていた。選択媒質Ｐａｌｃａｍ（Ｖａｎ　Ｎｅｔｔｅｎら，Ｊ．Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８），６，ｐｐ．１８７−１８８）とＯｘｆｏｒｄ（Ｃｕｒｔｉｓら，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８９），８，ｐｐ．８５−９８）は最も広く使用されている。これらの媒質はリステリアｓｐｐ．属のすべての種の検出を可能にする。したがって、観察された典型的コロニはつぎに、リステリア・モノサイトゲネス種への帰属を確認するように、顕微鏡および／または生化学および／または免疫学および／または遺伝子学試験などの追加の同定試験を受けなければならない。
しかるに、これらの追加操作は分析の時間と費用を増加させる。それには多数の試薬と資格ある人の介入が必要になる。くわえて、同定に用いられるコロニの採取は偶然的なので、追加の操作は多くの場合誤りの元になり、あるいは少なくとも、精度と結果の信頼性の低下の原因となる。これがとくに当てはまるのは、単離媒質の上で、他のリステリア種によって形成された他のコロニに対してリステリア・モノサイトゲネス種がきわめて少ない場合である。
【０００８】
出願人に交付された特許ＥＰ−Ｂ−０，４９６，６８０はリステリア属の他の細菌からリステリア・モノサイトゲネス種を差別化するための細菌学的分析法を記載している。この方法によれば、グリシン・アミノペプチダーゼと呼ばれる酵素によって加水分解される色原体または蛍光体の基質を含む同定媒質が用いられる。使用される媒質はその化学変化によって分析される標本内に存在するリステリア種の特性化を可能にする発酵基質および／または還元基質および／または酵素による加水分解基質、例えば、α−マンノシダーゼの基質も必要に応じて含むことができる。
【０００９】
このきわめて興味深い技術は、リステリア・モノサイトゲネス種がグリシン・アミノペプチターゼ酵素活性を持たない唯一のものであるという事実の中に主要な欠点がある。したがって、病原体である、リステリア・モノサイトゲネス種をのぞいて、すべてのリステリア属を検出することができる。したがって、負の試験の使用には突然変異の場合の特異性が欠けているので、あるいは他の種が応力を受け正常な活性で応答しないとき、負の活性によるリステリア・モノサイトゲネスの検出は容易ではない。
くわえて、リステリア属に特異的なβ−グルコシダーゼ活性の検出を可能にする色原体基質の使用が知られている。他方で、同じく色原体基質の使用によるより正確な判別のために、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ−ＰＬＣ）に固有のホスホリパーゼ活性を明らかにすることによってリステリア・モノサイトゲネス種とリステリア・イバノヴィイを他のリステリアと差別化することができる。
事実、リステリア・モノサイトゲネス種とリステリア・イバノヴィイなどのリステリア属の特定の種が培養基内に分泌されることがＰＩ−ＰＬＣによって証明された（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−ｗａｃｈｔｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｉｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５（２），ｐｐ．３６１−３６６；Ｊ．Ｍｅｎｇａｕｄら、Ｍｏｌ）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５（２），ｐｐ．３６７−３７２；およびＧｏｌｄｆｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９２）６０（１０），ｐｐ．４０５９−４０６７）。間接法によってこれら２つの種を同定することも可能である（Ｎｏｔｅｒｍａｎｓら、Ａｐｐ．ａｎｄ　Ｅｎｖ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌｇｙ（１９９１）、ｖｏｌ．５７　Ｎｏ．９，ｐｐ．２６６６−２６７０。
【００１０】
特許出願ＷＯ−Ａ−９９／０４０３２はリステリア・モノサイトゲネスとリステリア・イバノヴィイの特異的な色原体基質を含む培養基を記載しているが、それはホスファチジルイノシトールの誘導体、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ミオ−イノシトール−１−リン酸塩のアンモニア塩で、これら２つの種の直接検出を、すなわち一段階検出を、したがって、リステリアの他の種に対するそれらの差別化を可能にする。
【００１１】
細菌学的検出のためのＰＩ−ＰＬＣの使用は下記の文献にも取り上げられている：
・ＷＯ−Ａ−９８／３８３３２は主として、基質の残滓の一方が色原体で病原性のリステリアの同定を可能にする、かかる酵素の分割基質によるＰＩ−ＰＬＣの検出方法と試験に関するものである、また
・ＷＯ−Ａ−９９／４８８９９は、数多くのクロストリジウム・スペシエス、リステリア・イバノヴィイ、黄色ブドウ球菌、バシラス・セレウス、バシラス・ツリンギエンシスならびにリステリア・モノサイトゲネスに存在する酵素活性、ＰＩ−ＰＬＣの検出を可能にする４−メチルウンベリフェロン系の蛍光体化合物を提案している。
【００１２】
この最後の文献はホスホリパーゼＣ酵素活性が、別のリステリア、すなわちリステリア・イバノヴィイにも存在するので、リステリア・モノサイトゲネス種に固有ではないという事実を引き合いに出している。
しかしながら、エステラーゼ色原体基質はＰＩ−ＰＬＣの基質よりも合成が単純で、より安価であることに留意しなければならない。くわえて、自然基質よりも色原体基質の使用の方が有利である、なぜなら肉眼での検出が容易だからである：コロニの周囲の暈光の検出の代わりに着色されたコロニが明らかにされる。この利点は、多数の微生物培養の際にも見出される：コロニのそれぞれは特異的な色を有するが、暈光は２つの異なるコロニにわたることがある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リステリアの他のすべての種と比べてリステリア・モノサイトゲネス種の差別化を可能にする検出方法を提案することである。この結果は、リステリアの検出と他のリステリア種に関するリステリア・モノサイトゲネス種の差別化に現在まで使われなかった、少なくとも１つの代謝活性の検出によって得られる。それはリステリア・モノサイトゲネス種では強く発現し、同じ属の他の種ではきわめて弱く発現するエステラーゼ活性であり、また他方では、リステリアのすべてまたは一部の種に存在する少なくとも１つの活性、例えば、オシダーゼまたはホスファターゼまたはアミノペプチターゼであり、リステリア・モノサイトゲネス種と同じ属の他の種の間の着色コントラストを高めることを可能にする。またリステリア・モノサイトゲネス種を、もっとも頻繁に単離される種であり酵素特性がリステリア・モノサイトゲネス種のそれにきわめて近いリステリア・イバノヴィイとリステリア・イノキュアを分離することも可能である。
このため、本発明はリステリア属の病原性細菌の直接同定を可能にする基質において、リステリア・モノサイトゲネス種に固有のエステラーゼ活性であるＰＩ−ＰＬＣ活性と異なるエステラーゼ活性の検出を可能にすることを特徴とする基質に関するものである。
したがって、ＰＩ−ＰＬＣ活性がエステラーゼ活性であれば、リステリア・イバノヴィイは負のエステラーゼであり、一方でそれは正のＰＩ−ＰＬＣであり、それ故にリステリア・モノサイトゲネスと混同されることがある。現状技術および他のリステリアに対してリステリア・モノサイトゲネス種の差別化ができないＰＩ−ＰＬＣの検出とは異なり、本発明はリステリア・モノサイトゲネス種のもっと特異的検出を可能にする。
【００１４】
【発明の実施の形態】
推奨実施態様によれば、エステラーゼ活性は特異的な酵素活性である、すなわち基質を構成するマーカ部分と標的部分の間のエステル結合を分割する。
推奨実施態様によれば、分割された結合はマーカ部分によって担持されたアルコール基と、標的部分を構成する有機酸の間の結合である。
推奨実施態様によれば、マーカ部分は下記の成分のいずれか１つによって構成できるインドキシルなどの色原体によって構成される：
・５−ブロモ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、または
・６−クロロ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、または
・６−ブロモ−３−インドキシル
推奨実施態様によれば、標的部分は長さが２から２０炭素原子の間に、好適には４から１０炭素原子の間に含まれる炭素鎖を有する脂肪酸によって構成される。有利には、基質は酪酸塩５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、カプリル酸塩５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、ノナン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、またデカン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルで構成される。
変型実施態様によれば、基質はリステリア種のすべてまたは一部が有する少なくとも１つの別の酵素活性の検出を可能にする少なくとも１つの別の基質に結合されている。
２つの基質がある場合、ＰＩ−ＰＬＣ酵素をのぞいて、エステラーゼ活性の検出を可能にする基質は先に定義したエステラーゼ活性とは異なる酵素活性を検出することを可能にする別の基質のそれと異なる着色を有する。
推奨実施態様によれば、リステリア種のすべてまたは一部が有する別の酵素活性はオシダーゼまたはホスファターゼまたはアミノペプチダーゼ活性である。
好適には、別の基質のマーカ部分の基礎となるのは：
・５−ブロモ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、または
・６−クロロ−３−インドキシル、または
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、または
・６−ブロモ−３−インドキシルである。
６−クロロ−３−インドキシルに関して、かかる分子は特許ＵＳ−Ａ−５，３６４，７６７にとくに詳しく記載され、そこでは主としてＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、ブチレート、カプリル酸塩、ｐ−トルイジンリン酸塩、硫酸塩またはβ−Ｄ−グルコピラノシドに組み合わされている。それは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルの基礎にもなる。
変型実施態様によれば、別の基質は下記によって構成される：
・５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシド、または
・６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、または
・６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−マンノシド、または
・６−クロロ−３−インドリルホスファート。
【００１５】
本発明は先に定義した１つの基質または２つの基質を使用する、リステリア・モノサイトゲネス種の直接同定を可能にする、反応媒質にも関するものである。より詳細には、ＰＩ−ＰＬＣ活性と異なるエステラーゼ活性の検出を可能にする基質は、２０ｍｇ／ｌから３ｇ／ｌの間の、または好適には５０ｍｇ／ｌと１ｇ／ｌの間の、あるいはより好適には１００から６００ｍｇ／ｌの間の、あるいは２５０ｍｇ程度の濃度である。
より詳細には、オシダーゼ、ホスファターゼまたはアミノペプチダーゼ活性などの別の活性を検出することを可能にする基質は１０ｍｇ／ｌと５００ｍｇ／ｌの間の、または好適には５０ｍｇ／ｌと３００ｍｇ／ｌの間の、またさらに好適には１００と２００ｍｇ／ｌの間の濃度を有する。
媒質は寒天または液状媒質である。
変型実施態様によれば、媒質はリステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリに対してリステリア・モノサイトゲネス種の判別を可能にする手段を備えている、すなわち：
・リステリア・モノサイトゲネス種ではなくリステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリよって酸性にされた少なくとも１つの炭水化合物（例えば、キシロースおよび／またはＤ−タガトース）の添加、あるいは
・リステリア・モノサイトゲネスによって、また必要に応じリステリア・イノキュアおよび／またはリステリア・イバノヴィイおよび／またはリステリア・グライイによって酸性にされた少なくとも１つの炭水化合物の添加、
・リステリア・モノサイトゲネスではなく、少なくともリステリア・ウェルシメイとリステリア・セエチゲリに特異的なオシダーゼ活性（β−マルトシダーゼ）および／またはホスファターゼおよび／またはアミノペプチダーゼ活（Ｌ−グリシン・アミノペプチダーゼ）活性を明らかにすることができる少なくとも１つの基質の添加、あるいは
・ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）および／またはホスファチジルコリン（ＰＣ）などのホスホリパーゼ（ＰＬＣ）の少なくとも１つの自然基質の添加。
特定の実施態様によれば、媒質は次の少なくとも１つの種に対してリステリア・モノサイトゲネス種の判別を可能にする選択手段を備えている：
・黄色ブドウ球菌
・バシルス・ツリンギエンシス
・腸球菌
・大腸菌
・緑膿菌、および
・カンジダアルビカンス
推奨実施態様によれば、選択手段は下記の化合物の少なくとも１つで構成される：
・塩化リチウム
・セフタジジム
・アンホテリシンＢ
・ホスホマイシン、および／または
・コリスチン
【００１６】
本発明はさらにリステリア・モノサイトゲネス種の病原性細菌同定法において、
・先に定義した、培養基への病原性細菌を含む可能性のある試料の播種、
・試料を播種した培養基の保温、および
・１つまたは複数の基質の特徴をなしている色と強さによる前記病原性細菌の存在の判定。
変型実施態様によれば、病原性細菌を含んでいる可能性がある前記試料は予め濃縮してから、先に定義した、培養基上に蒔かれる。
【００１７】
当該方法の別の変型実施態様によれば、１８から２４時間保温した後、１つまたは複数の基質の特徴をなしている色と強さによる前記病原性細菌の存在の判定を実施する。
【００１８】
最後に、本発明は先に定義したような、標的部分と、阻害部分が放出されたときにリステリア・モノサイトゲネスを特異的に阻害するための阻害部分とから成る基質の使用を提案する。
したがって、本発明はリステリア属の他の種に対して、ヒトに対して病原性のリステリア・モノサイトゲネス種の主として同定に関するものである。
【００１９】
エステラーゼ酵素活性は、ＰＩ−ＰＬＣと呼ばれるより特異的なエステラーゼ活性をのぞいて、リステリア属の他の種に対するリステリア・モノサイトゲネス種の優れた識別子である。
このように、前述の現状技術は例えば、リステリア・モノサイトゲネス種とリステリア・イバノヴィイの間の、脂質の１つの類型に特異的な、ＰＩ−ＰＬＣの特異性の欠如を明らかにする。ＰＩ−ＰＬＣはグリセロールと無機リン酸塩の間のホスファチジルイノシトールの誘導体を加水分解する。色原体基質の場合、酵素は後述のごとく、マーカとイノシトールに結合した無機リン酸塩の間を切断する。
【化１】
2004513649.tif 000002
【００２０】
本発明によるエステラーゼは、鎖の長さが有利には７から１０の炭素原子の間に含まれる、１つまたは複数の脂肪酸を含む脂質を加水分解する。これらのエステラーゼは、後述のごとく、アルコールと有機脂肪酸の間のエステル結合を加水分解する。
【化２】
2004513649.tif 000003
【００２１】
実験１：同一の色原体マーカを有するが、脂肪酸鎖の長さが異なる複数のエステラーゼ基質の試験
試験したエステラーゼの色原体基質は：
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリル、以下にブルー−Ｃ８と称す
・ノナン酸５−ブロモ−３−インドリル、以下にブルー−Ｃ９と称す、および
・デカン酸５−ブロモ−３−インドリル、以下にブルー−Ｃ１０と称す。
４０ｇ／ｌのそれぞれの基質の母溶液は４０％ジメチルスルフォキシドと６０％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０）の混合された状態で実現される。基質内の最終濃度が２５０ｍｇ／ｌになるように過融解コロンビア型の３つの媒質に十分な量を添加する。出願人の収集またはＡＴＣＣ収集から得られた微生物は０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液から３つの目盛り盤（ダイヤル）内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。これらのコロニの着色と強さを記録した。結果は下記の表１に示した：
【表１】
2004513649.tif 000004
表１：同一の色原体マーカを有するが、脂肪酸鎖の長さが異なる複数のエステラーゼ基質の比較研究
【００２２】
上記の表１は、後述の表と同様に、Ｃは保温後のコロニの着色を示し、Ｉはこの着色の強さ、符号＜＜−＞＞は色や強さがないことを示し、最後にＴＩは保温時間を定義している。ここで着色強さは恣意的な尺度であるが、それは生物標本と試験した媒質の全体に共通である。この尺度はこの実験について、ならびに以下のすべての実験について有効である。それは次のように定義できる：
・０は活性なしに対応する、
・０．１は微量の着色の存在に対応する、
・０．５はきわめて薄い着色の存在に対応する、
・１は明瞭な弱い着色の存在に対応する、
・１．５は１と２の着色の中間的着色の存在に対応する、
・２は中程度の強さのはっきりした着色の存在に対応する、
・２．５は２と３の着色の中間的着色の存在に対応する、
・３は強い着色の存在に対応する、
・３．５は３と４の着色の中間的着色の存在に対応する、
・４はきわめて強い着色の存在に対応する。
【００２３】
リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イノキュア、リステリア・セエリゲリとリステリア・ウェルシメリの株だけが灰色の着色を有し、したがって、これらの株はエステラーゼ活性を発現する。研究した脂肪酸鎖の長さを問わず、強さについては、最大強さを示すリステリア・モノサイトゲネスの株と最低強さを示すリステリア・イノキュア、リステリア・セエリゲリとリステリア・ウェルシメリの株の間に約１単位の差があることが分かる。
しかしながら、実施例の続きについては、オクタン酸塩とノナン酸塩から誘導した基質だけを研究する。したがって、保温温度に応じてリステリアの他の種からリステリア・モノサイトゲネスを差別化することができる。
【００２４】
実験２：インドキシル系の異なる色原体マーカを有し、脂肪酸として、オクタン酸を有する複数のエステラーゼ基質の試験：
試験したエステラーゼの色原体基質は次の通りである：
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリル、以下にブルー−Ｃ８と称す
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、以下にＸ−Ｃ８と称す、
・オクタン酸６−クロロ−３−インドリル、以下にバラ色−Ｃ８と称す、
および
・オクタン酸５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル、以下にマジェンタ−Ｃ８と称す。
４０ｇ／ｌのそれぞれの基質の母溶液は４０％ジメチルフォキシドと６０％Ｔｗｅｅｎ２０の混合された状態で実現される。基質内の最終濃度が２５０ｍｇ／ｌになるように過融解コロンビア型の４つの媒質に十分な量を添加する。出願人の収集またはＡＴＣＣ収集から得られた微生物は０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液から３つの目盛り盤内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。これらのコロニの着色と強さを記録した。結果は下記の表２に示した：
【表２】
2004513649.tif 000005
表２：インドキシル系の異なる色原体マーカを有し、脂肪酸として、オクタン酸を有する複数のエステラーゼ基質の比較研究
【００２５】
使用する基質にかかわらず、リステリア・モノサイトゲネス株とリステリア・イノキュア株の間の強さの差は変わらない。しかしながらこの差は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルおよび５−ブロモ−３−インドキシルのマーカについてもっとも有意である。
最良のコントラストともっとも強い強さは青緑色に着色するマーカで得られた：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル。
【００２６】
実験３：液体媒質内のエステラーゼ活性の検出
試験したエステラーゼの色原体基質は次の通りである：
・アセテート５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、以下にＸ−Ｃ２と称す・アセテート３−インドリル、以下にＹ−Ｃ２と称す、
・ブチレート５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、以下にＸ−Ｃ４と称す、
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、以下にＸ−Ｃ８と称す、
・オクタン酸５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、以下にＭ−Ｃ８と称す、および
・オクタン酸６−クロロ−３−インドリル、以下にＲ−Ｃ８と称す。
これらの基質はＡＰＩギャラリ型（登録商標）の殻斗内で親脂化された。使用の前に、これらの殻斗内に含まれる基質は寒天なしにコロンビア媒質型の接種媒質を加えて溶液にした。出願人の収集またはＡＴＣＣ収集から得られた微生物は２ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁からこれらの殻斗内に蒔いた。ギャラリは３７℃で８時間保温した。掲載されたコロニは４、６、および８時間の保温後に目視検査した。
これらのコロニの着色強さを記録した。結果は下記の表３に示した：
【表３】
2004513649.tif 000006
表３：インドキシル系の異なる色原体と鎖の長さの異なる脂肪酸とから成る複数のエステラーゼ基質の比較研究
【００２７】
液体媒質で、炭素原子４個未満の鎖の長さを有する基質はリステリアの異なる種を相互に差別化するために判別的ではない。他方で、試験した操作条件で、基質Ｘ−Ｃ４とＸ−Ｃ８は一方のリステリア・モノサイトゲネスと、他方のこの属の他の種の間の着色対比を得ることを可能にする。事実、リステリア・ウェルシメリとリステリア・セエリゲリだけが着色も示すが、これらの着色はきわめて弱い。１に等しい試験の「陽性敷居値」を想像することが可能である。１未満の強さの場合、試験した株は試験について負と見なされるだろう；１を超える強さについて、試験した株は正になるだろう。現在の場合、それはリステリア・モノサイトゲネスの株になるだろう。
【００２８】
実験４：ゲル化した媒質内のエステラーゼ活性とオシダーゼ活性の同時検出
エステラーゼの色原体基質とオシダーゼ色原体基質の異なる対を試験した、それらは下記の通りである：
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、対１に対応
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシド、対２に対応
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、対３に対応
・オクタン酸５−ブロモ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−マンノシド、対４に対応
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、対５に対応
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシド、対６に対応
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコスアミド、対７対応、および
・オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−マンノシド、対８に対応。
４０ｇ／ｌのそれぞれの基質の母溶液は４０％ジメチルフォキシドと６０％Ｔｗｅｅｎ２０の混合された状態で実現される。他方で、それぞれのオシダーゼ基質の母溶液はジメチルフォキシド内で実現される。上述のそれぞれの対に適合した、エステラーゼ基質母溶液の十分な量を、基質内の最終濃度が２５０ｍｇ／ｌになるように過融コロンビア型の８つの媒質に添加する。これと並行して、上述のそれぞれの対に適合した、オシダーゼ基質の十分な量を、基質によって最終濃度が１００から２００ｍｇ／ｌの間になるように、同じくこれら８つの媒質に添加する。出願人の収集またはＡＴＣＣ収集から得られた微生物は０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液から３つの目盛り盤内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。
これらのコロニの着色ならびにこれらのコロニの強さを記録した。結果は下記の表４に示した：
【表４】
2004513649.tif 000007
表４：ゲル化した媒質内のエステラーゼ活性とオシダーゼ活性の同時検出を可能にする色原体基質の異なる対の比較研究
【００２９】
研究した基質の対を問わず、リステリア・モノサイトゲネスの株とリステリア・イノキュアおよびリステリア・イバノヴィイの株の間に着色の差がある。
最良の対比はノナン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと、標的活性を問わず、６−クロロ−３−インドリル系のオシダーゼ基質で得られた。したがって、先験的に、α−オシダーゼであれβ−オシダーゼであれエステラーゼとオシダーゼの基質のすべての異なるタイプを対にすることができる。
しかしながら、最良の結果は６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコシド、６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコスアミドと６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−マンノシドで観察することができる。
【００３０】
試験５：ゲル化した媒質内のエステラーゼ活性とホスファターゼ活性の同時検出：
過融解コロンビア型のゲル化した媒質内に２つの基質の２つの母溶液を順次添加した：オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（Ｘ−Ｃ８）（媒質内の最終濃度：２５０ｍｇ／ｌ）とリン酸６−クロロ−３−インドリル（ピンクＰ）（媒質内の最終濃度７５０ｍｇ／ｌ）。オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルの母溶液は左記の例のごとく調製され、リン酸６−クロロ−３−インドリルの母溶液はジメチルスルホキシド内に５０ｇ／ｌで実現した。
出願人の収集またはＡＴＣＣ収集から得られた微生物は０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液から３つの目盛り盤内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。
これらのコロニの着色ならびにこれらのコロニの強さを記録した。結果は下記の表５に示した：
【表５】
2004513649.tif 000008
表５：エステラーゼ活性とホスファターゼ活性の同時検出
これら２つの活性の同時研究は一方の２群のリステリア、他方のリステリア・モノサイトゲネス、リステリア・セエリゲリとリステリア・ウェルシメリの分離を可能にする。この検出システムは、リステリア属の他のすべての種からリステリア・モノサイトゲネスの分離を可能にする、実験６において後述の、媒質の組成に作用することによって改良することができる。
【００３１】
実験６：エステラーゼ基質とオシダーゼ基質を含むゲル化媒質内でのリステリア・ウェルシメリとリステリア・セエリゲリに対するリステリア・モノサイトゲネスの同定
試験したエステラーゼの色原体基質とオシダーゼ色原体基質の対は次の通りである：オクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルと６−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
媒質と基質の母溶液の調製は上述の例と同様に実現した。この基礎媒質は４つの媒質に分け、それぞれに下記を添加した：
・媒質１に対応する４０ｇ／ｌのキシロース、
・媒質２に対応する４０ｇ／ｌのタガトース、
・媒質３に対応する４５ｇ／ｌの炭水化合物と３０ｇ／ｌのキシロースと１５ｇ／ｌのタガトースの混合物、
・媒質４に対応する６５ｇ／ｌの炭水化合物と３５ｇ／ｌのキシロースと３０ｇ／ｌのタガトースの混合物、
出願人の収集に由来する微生物を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液から３つの目盛り盤内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。
これらのコロニの着色ならびにこれらのコロニの強さを記録した。結果は下記の表６に示した：
【表６】
2004513649.tif 000009
表６：極めて高い濃度の炭水化合物の添加によるリステリア・ウェルシメリとリステリア・セエリゲリに対するリステリア・モノサイトゲネスの特異性の向上
【００３２】
（４０ｇ／ｌ以上の）極めて高い濃度の炭水化合物の添加によってリステリア・モノサイトゲネスをリステリア属の他のすべての種から、それも色彩基準だけから判別できる。しかしながら、ＦＲ−Ｂ−２，７０８，２８５の内容が証明するごとく、１０ｇ／ｌまで行くことができるより低い濃度を用いて種の間の判別を得ることが可能であることが証明された。しかしながら、この特許と異なり、マーカの基礎色と異なる派生色ではなく、酵素活性阻害による色の変化が得られた。
【００３３】
実験７：リステリア以外のグラム陽性細菌とグラム陰性細菌ならびに酵母を阻害するための選択的要因の添加：
コロンビア型基礎媒質には次のものが含まれる：
・４０％ジメチルフォキシドと６０％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０）の混合内に溶液によって導入された２５０ｍｇ／ｌのオクタン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル、
・ＤＭＳＯ内に母溶液によって導入された１５０ｍｇ／ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β――Ｎ−アセチルグルコサミニド、
・１０ｇ／ｌのキシロースと５ｇ／ｌのタガトース、
・下記のように定義される選択的混合物：５ｇ／ｌの塩化リチウム、２０ｍｇ／ｌのセフタジジム、４ｍｇ／ｌのアンホテリシン、１０ｍｇ／ｌのホスホマイシンと５ｍｇ／ｌのコリスチン。
出願人の収集に由来する微生物を０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液から３つの目盛り盤内で単離してこの媒質の上に蒔いた。ボックスは３７℃で４８時間保温した。形成されたコロニは２４および４８時間の保温後に目視検査した。
これらのコロニの着色ならびにこれらのコロニの強さを記録した。結果は下記の表７に示した：
【表７】
2004513649.tif 000010
表７：選択剤を含む／含まない媒質の比較
上記の表７において、Ｃは保温後のコロニの着色を示し、Ｉはこの着色の強さ、符号＜＜−＞＞は成長がないことと同義であり、最後にＴ１は保温時間を定義している。ここで着色強さは恣意的な尺度であるが、それは生物標本と試験した媒質の全体に共通である。
ここで分かるように、選択剤が存在するとき、試験した干渉細菌と酵母の全体（すなわち非リステリア）は成長を示さず、したがって、阻害された。選択剤の存在は試験したリステリアの株の色は変えない。
この実験は、選択剤がない場合でも、一方のリステリア・モノサイトゲネスと、他方の試験した干渉する、すなわち他のリステリアを含む、細菌と酵母の間の差別化が可能であることも示しているが、現状技術に記載された基質と培養あるいは反応性媒質には当てはまらない。
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月16日(2002.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
特異なリステリア・モノサイトゲネスで、リステリアｓｓｐ．属の他の細菌に固有ではないエステラーゼ活性である、ホスホリパーゼＣ活性と異なる、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ−ＰＬＣ）の特異的な、エステラーゼ活性によって分裂された、リステリア・モノサイトゲネス種の病原性細菌の直接同定を可能にする基質。
【国際調査報告】
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