(57)【要約】本発明は、ゴーシェ病、ファブリー病、テイ・サックス病など、糖脂質蓄積症の治療に基づく療法を利用しながら二機能性融合タンパク質を投与することによる酵素補充療法および／または糖脂質代謝の増強を目的とした、本質的に免疫グロブリン（Ｉｇ）分子とグルコセレブロシダーゼの生物活性を有するタンパク質（ＧＣＲ様タンパク質）とからなる新規なグルコセレブロシダーゼ二機能性融合タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に免疫グロブリン分子（Ｉｇ）もしくはその断片と免疫グロブリンでない分子とからなる融合タンパク質であって、免疫グロブリンでない分子が、グルコセレブロシダーゼの生物活性を有するタンパク質（ＧＣＲ様タンパク質）である融合タンパク質。
【請求項２】
Ｉｇ分子がＦｃ受容体に特異的である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｉｇ分子のＣ末端がＧＣＲ様タンパク質のＮ末端に共有結合によって結合している請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｉｇ分子とＧＣＲ様タンパク質がリンカー分子によって融合されている請求項１から３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
リンカー分子がプロテアーゼ切断部位を含む請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
プロテアーゼ切断部位がリソソームプロテアーゼに特異的な請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＧＣＲ様タンパク質がＧＣＲである請求項１から６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＧＣＲが切断され（ＧＣＲtrunc）、または突然変異している（ＧＣＲm）請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＧＣＲまたはＧＣＲ様タンパク質が、そのグリコシル化パターンを変更されている、またはグリコシル化されていない請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｉｇ分子がＦｃ部である請求項１から９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｉｇ分子が抗体全体である請求項１から９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｉｇ分子またはその断片が設計されたものである請求項１から１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｉｇ分子のＦｃＲｎ受容体に対する親和性を低下させてある請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
融合タンパク質内のＩｇ分子を二量体化してある請求項１から１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１から１４の融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１６】
請求項１から１４の少なくとも一項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、
（ａ）シグナル／リーダー配列
（ｂ）Ｉｇ分子
（ｃ）ＧＣＲの生物活性を有する標的タンパク質配列
を含むＤＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む、請求項１から１４の少なくとも一項に記載の融合タンパク質を発現させるのに適する宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１から１４の少なくとも一項に記載の融合タンパク質の産生方法であって、前記方法が
（ｉ）分泌のためのリーダー配列；Ｉｇ分子；ＧＣＲ、ＧＣＲmもしくはＧＣＲtrunc部；および任意選択のリンカー配列を含む前駆体タンパク質をコードするＤＮＡを構築すること、
（ｉｉ）適切な発現ベクター中に前記融合ＤＮＡを配置すること、
（ｉｉｉ）真核細胞中で前記融合タンパク質を発現させること、および
（ｉｖ）前記の分泌された融合タンパク質を精製すること
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１から１４の少なくとも一項に記載の融合タンパク質と、少なくとも１種の薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む薬剤組成物。
【請求項２１】
少なくとも１種の追加の薬剤として有効な薬物および／または補助剤を含有する請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
請求項１から１４のいずれかに記載の融合タンパク質の、糖脂質蓄積症治療用薬剤組成物の製造での使用。
【請求項２３】
糖脂質蓄積症がゴーシェ病、ファブリー病、およびテイ・サックス病からなる群から選択される請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
糖脂質蓄積症を患う対象に請求項１６または１７に記載の薬剤組成物を投与することを含む前記疾患の治療方法。
【請求項２５】
糖脂質蓄積症がゴーシェ病、ファブリー病およびテイ・サックス病からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ゴーシェ病、ファブリー病、テイ・サックス病など、糖脂質蓄積症の治療に基づく療法を利用しながら二機能性融合タンパク質を投与することによる酵素補充療法および／または糖脂質代謝の増強を目的とした、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（抗体全体、Ｉｇ重鎖もしくは軽鎖、またはこれらの断片）とグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の生物活性を本質的に有するタンパク質（この用語にはオリゴペプチドも含まれる）（ＧＣＲ様タンパク質）とからなるＧＣＲ二機能性融合タンパク質（ＧＣＲ融合タンパク質）に関する。
【０００２】
Ｉｇ部分のアミノ酸配列を選択的に変更することによって、特性が改良された、たとえば安定性が向上したＧＣＲ融合タンパク質が得られる。さらに、ＧＣＲを短くしたものとＩｇ鎖を使用した融合タンパク質を得ることもできる。
【０００３】
本発明はまた、このようなＧＣＲ融合タンパク質を含む薬剤組成物、治療方法、および治療システム、ならびにゴーシェ病、またはファブリー病やテイ・サックス病などの糖脂質蓄積症によって引き起こされる別の疾患の治療方法であって、この疾患を患う対象に、薬剤として許容される担体中に組換えによって産生した治療量のＧＣＲ融合タンパク質を含む薬剤組成物を投与することを含む治療方法に関する。
【０００４】
（背景）
ゴーシェ病、テイ・サックス病、またはファブリー病のような糖脂質蓄積症を治療するために、脾摘出または骨髄移植ではなく、このような疾患に罹患した生物の酵素を増強するために外来性のβグルコシダーゼを投与することは、リソソーム蓄積欠損症の治療向けにすでに文献に記載されている。たとえば、Ｄｅ  Ｄｕｖｅ，Ｃ．のＦｅｄ．Ｐｒｏｃ．第２３巻、１０４５ページ（１９６４年）、およびＢａｒｔｏｎ，Ｎ．Ｗ．等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８７巻、１９１３ページ（１９９０年）を参照されたい。これらには、ゴーシェ病治療にβグルコシダーゼ、および特にＧＣＲを使用することが記載され、それと共に治療反応を得る難しさも記載されている。しかし、こうした疾患を治療するための酵素の投与量は、２週間毎に体重１キログラムあたり約６０単位であり、７０ｋｇの患者を治療する年間平均費用が、酵素だけで約３８０，０００米ドルになることを意味する。これは、外来性の酸性βグルコシダーゼの細胞内半減期が短いためである。
【０００５】
ｉｎ−ｖｉｖｏでの半減期がかなり改良され、腫瘍細胞など、特定の細胞型への標的指向性を促進する抗体−酵素融合タンパク質が記載されている。たとえば、サイトカインのインターロイキン２（ＩＬ−２）と、腫瘍抗原の上皮性細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）またはジシアロガングリオシドＧＤ２に免疫反応性のある単クローン性抗体重鎖とが、それぞれ抗体ＫＳ１／４およびｃｈ１４．１８を使用することによって２種の独立した融合タンパク質の形で融合されて、それぞれ融合タンパク質ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２およびＫＳ１／４−ＩＬ−２になっている。たとえば、米国特許第５，６５０，１５０号を参照されたい。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、知られているコスト高な手順よりも安価であり、かつ大部分の患者、特に開発途上国にいる患者の相場の範囲に収まる、効率のよい投与方法および方式を可能にする、ゴーシェ病、ファブリー病、テイ・サックス病など、糖脂質蓄積症を有効に治療するのに適する化合物を見出すことであった。本発明の目標は、少ない用量で投与でき、さらに活性がそれほど低下しないままで生物中での半減期がより長く、かつ糖脂質代謝が起こる特定の細胞への標的指向性がより良好であるために、ゴーシェ病、ファブリー病、およびテイ・サックス病をより安価かつ有効に治療できる、これらの疾患を治療する分子を提供することであった。
【０００７】
（発明の概要）
今回、ＧＣＲの生物活性を有するタンパク質を、抗体全体、Ｉｇ重鎖または軽鎖、Ｉｇ重鎖の断片、たとえば重鎖定常部（ＣH）、Ｆｃ断片、もしくはＦａｂ断片のようなＩｇ分子に結合させると、有効性および半減期の延長において予想外の相乗作用が起こることを発見した。
【０００８】
融合タンパク質および特定の融合タンパク質の改変は当技術分野で公知である。たとえば、融合タンパク質は、タンパク分解酵素とタンパク質の主鎖そのものとが物理的に接触するのを効果的に妨げ、したがって分解を予防することができる。ある状況下での追加の利点には、特定の発現系での収率が向上すること、標的タンパク質が正確に折り畳まれること、治療用タンパク質の安定性を向上させ、循環時間を延長させ、かつ生物活性を増強することが含まれる。この種の一変更形態は、免疫グロブリンのＦｃ部を使用することである。抗体は、機能上独立した２個の部分、すなわち抗原を結合する「Ｆａｂ」として知られている可変ドメイン、および補体および食細胞など、エフェクター機能との関連をもたらす「Ｆｃ」として知られている定常ドメインを含む。
【０００９】
免疫グロブリンのＦｃ部は、半減期が特に短い、あるタンパク質に融合させると、血漿半減期を延長させる（Ｃａｐｏｎ等のＮａｔｕｒｅ第３３７巻：５２５〜５３１ページ（１９８９年））。
【００１０】
Ｆｃドメインを使用して、Ｆｃ受容体への結合、タンパク質Ａへの結合、補体の固定化、胎盤通過など、どれも免疫グロブリンのＦｃタンパク質に備わっている機能を組み込んである治療用の融合タンパク質も構築されている。たとえば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域と、ＣＤ３０−ＬのＮ末端、すなわちホジキン病の腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞、および他の悪性細胞型上に発現したＣＤ３０受容体を結合する分子のＮ末端とが融合されている（米国特許第５，４８０，９８１号）。さらに、１９９６年には、免疫グロブリンのＦｃ部とある種の非突然変異体標的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させてから、その標的タンパク質をタンパク質分解によって切断することによって、前記の標的タンパク質の効率的な発現および分泌を実現できることが報告されている（ＷＯ９６／０８５７０、ＵＳ５，５４１，０８７）。
【００１１】
Ｉｇポリペプチド鎖と融合させるのに適するＧＣＲ様タンパク質は、米国特許第５，８７９，６８０号で示されているようなアミノ酸配列および関連するＤＮＡ配列を含むものでもよいが、それから得られた切断型または突然変異型でもよい。米国特許第５，８７９，６８０号の教示では、切断型および突然変異型は除外されているが、これらのタンパク質とその合成方法および条件が具体例として記載されており、調製および使用に関係のあるこの開示を特に参照により本明細書に組み込む。
【００１２】
好ましい切断型は、たとえば、天然のＧＣＲ酵素をカルボキシ末端部位から切断していき、この酵素の約３分の１から２分の１のアミノ酸配列としたものからなる。これらの切断タンパク質は、制限酵素などの適切な試薬を用い、所望の鎖を切断することによって、全長タンパク質から得ることができる。
【００１３】
Ｉｇポリペプチド鎖との融合に適切な候補である有効なＧＣＲ様タンパク質を同定するアッセイ、ならびに本発明による融合化合物の活性を証明するアッセイは、参照文献として引用した米国特許に記載されており、したがって、本発明の実施に向けて、ゴーシェ病、ファブリー病、テイ・サックス病など、糖脂質蓄積症を治療するための代替融合タンパク質を容易に特定できると考えられる。
【００１４】
本発明は、動物のグルコセレブロシドを加水分解する能力の内にＧＣＲ様活性を有し、より高い発現レベル、より高い溶解性、より良好な組織分布、マクロファージへのより良好な標的化など、追加の有利な特性も有する新規なタンパク質を提供する。このような新規なタンパク質には、ＧＣＲ様タンパク質と、抗体全体またはその断片（Ｉｇ重鎖もしくは軽鎖、またはＣH、ＦｃもしくはＦａｂ断片のような重鎖の断片）のようなＩｇ分子との融合タンパク質；このような融合タンパク質のＧＣＲ様タンパク質またはＩｇ部が変更型グリコシル化を経ている形；切断もしくは突然変異アミノ酸配列を含み、たとえば新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）対する親和性が低下しているＧＣＲ融合タンパク質の形；および特定のリンカーを含むＧＣＲ融合タンパク質が含まれる。
【００１５】
（詳細な説明）
本発明の目的は、特性が改良されたＧＣＲ様活性を有するタンパク質を提供することであり、前記タンパク質は、抗体全体、Ｉｇ重鎖もしくは軽鎖、または重鎖の断片（たとえばＣH、ＦｃもしくはＦａｂ断片）のようなＩｇ分子と、ＧＣＲ様タンパク質とを含む融合タンパク質であり、前記Ｉｇ部分が、（リンカー分子を介して）前記ＧＣＲ様タンパク質に共有結合によって直接または間接に融合している。好ましい実施形態では、Ｉｇ部分は、そのＣ末端を介して、（リンカー分子を媒介として）前記ＧＣＲ様タンパク質のＮ末端に共有結合によって直接または間接に融合し、ＧＣＲ部だけでなくＩｇ部も変更または突然変異を経ていてよく、次の群、すなわち、
（I）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−ＧＣＲ−ＣＯＯＨ
（II）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−Ｌ−ＧＣＲ−ＣＯＯＨ
（III）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−ＧＣＲm−ＣＯＯＨ
（IV）Ｈ2Ｎ−Ｉｇm−ＧＣＲ−ＣＯＯＨ
（V）Ｈ2Ｎ−Ｉｇm−ＧＣＲm−ＣＯＯＨ
（VI）Ｈ2Ｎ−Ｉｇm−Ｌ−ＧＣＲ−ＣＯＯＨ
（VII）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−Ｌ−ＧＣＲm−ＣＯＯＨ
（VIII）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−ＧＣＲtrunc−ＣＯＯＨ
（IX）Ｈ2Ｎ−Ｉｇ−Ｌ−ＧＣＲtrunc−ＣＯＯＨ
（X）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲ−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
（XI）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲ−Ｌ−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
（XII）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲm−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
（XIII）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲ−Ｉｇm−ＣＯＯＨ
（XIV）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲm−Ｉｇm−ＣＯＯＨ
（XV）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲ−Ｌ−Ｉｇm−ＣＯＯＨ
（XVI）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲm−Ｌ−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
（XVII）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲtrunc−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
（XVIII）Ｈ2Ｎ−ＧＣＲtrunc−Ｌ−Ｉｇ−ＣＯＯＨ
から選択されていてよい。
【００１６】
本明細書では、Ｉｇは、Ｉｇ重鎖もしくは軽鎖、またはＩｇ重鎖の断片（たとえばＣH、ＦｃもしくはＦＡＢ断片）を意味する。ＧＣＲは、哺乳類、特にヒト由来、特に好ましくはヒトリソソーム由来の天然のＧＣＲを意味し、これには天然の供給源を操作して得た組換え型ＧＣＲも含まれる。
【００１７】
ＧＣＲtruncは、そのアミノ酸配列が切断されているが突然変異はしていない本発明によるＧＣＲである。切断型は、本質的にグルコセレブロシダーゼ生物活性を完全に備えている、またはわずかにしか低下させずに備えているタンパク質断片である。本発明によるＧＣＲの好ましい切断型は、天然のグルコセレブロシダーゼ酵素のＣ末端を詰めた、約３分の１から２分の１のアミノ酸配列からなるものである。
【００１８】
ＧＣＲmは、そのアミノ酸配列が突然変異しているが切断はされていない本発明によるＧＣＲである。突然変異の数は限定しないが、その分子の生物活性が喪失しない範囲に限る。好ましい実施形態では、突然変異の度合は、アミノ酸残基の５パーセントと３０パーセントの間であり、特に好ましい実施形態では、５パーセントと２０パーセントの間である。ＧＣＲ生物活性を向上させた変異体は、当技術分野で述べられている手順によって発生させることができる。
【００１９】
本発明によるＧＣＲ、ＧＣＲm、ＧＣＲtruncは、グリコシル化されているか、グリコシル化されていない、部分的にグリコシル化されている、あるいはそのグリコシル化パターンが変更されている。
【００２０】
ＧＣＲ融合タンパク質は、標準の技術、たとえばタンパク質Ａカラムによって精製できる。
【００２１】
Ｌは、たとえばグリシンおよび／またはセリンなど、一連のペプチドを意味する。ペプチドリンカーは、長さが残基５〜２５個、好ましくは１０〜２０個のグリシンペプチドとセリンペプチドの混合列である。特に好ましいものは、タンパク質分解によって切断できるリンカー、特にカテプシンのようなリソソームプロテアーゼによって切断できるリンカーである。
【００２２】
好ましい実施形態では、Ｉｇ部分は、Ｆｃ受容体を有する細胞に特異的である。したがって、ＧＣＲに結合させるべき好ましいＩｇ分子の断片はＦｃ領域である。免疫グロブリンのＦｃ領域は免疫グロブリン重鎖定常部のカルボキシル末端部側アミノ酸配列である。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの生物学的機能が決定される際に特に重要であり、そのような生物学的機能はエフェクター機能と呼ばれる。公知のとおり免疫グロブリンサブクラスの重鎖は４個または５個のドメインを含む。ＩｇＭおよびＩｇＥは５個の重鎖ドメインを有し、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧは４個の重鎖ドメインを有する。ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧのＦｃ領域はヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3ドメインの二量体であり、ＩｇＭおよびＩｇＥではヒンジ−ＣＨ2−ＣＨ3−ＣＨ4ドメインの二量体である（「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、１９９３年、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク参照）。
【００２３】
本明細書で使用する用語「Ｆｃタンパク質」は、免疫グロブリン重鎖定常部のカルボキシル末端部、またはその類似体もしくは部分を意味する。すなわち、たとえばＩｇ、好ましくはＩｇＧの免疫グロブリンＦｃ領域であり、１個のヒンジ部と１個のＣＨ２ドメインと１個のＣＨ３ドメインの部分を少なくとも１個含むといえる。
【００２４】
Ｆｃ領域は、そのアミノ末端がペプチド結合によってＧＣＲのカルボキシ末端側アミノ酸に連結しており、あるいは、好ましい実施形態では、Ｆｃ領域のカルボキシ末端がペプチド結合によってＧＣＲのアミノ末端側アミノ酸に結合している。
【００２５】
状況によっては、融合タンパク質のＩｇ分子内、特にＦｃ領域中のあるアミノ酸を突然変異させることが役立つ。たとえば、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）はＩｇＧを結合するので、融合タンパク質の臨床上の有効性を低下させることがある。
【００２６】
したがって、Ｆｃmは、上記で定義したＦｃ部のアミノ酸配列を突然変異させ、かつ／またはそのグリコシル化パターンを変更したものである。このようなＦｃ部の変更によって、特性が改良された融合タンパク質がもたらされる。この点から、Ｆｃmには、ＦｃＲｎ受容体に対する融和性が低下した、付加的な変更もしくは突然変異を経たＦｃ部が含まれる。たとえば、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン（３１０と４３３の残基）間の接合部に位置するＩｇＧヒスチジンがＦｃＲｎ受容体とのｐＨ依存的な結合の一因になることが知られている（Ｒａｇｈａｖａｎ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３４巻（４５：１４６４９〜５７ページ（１９９５年））。またＩｌｅ２５３とＨｉｓ４３５および４３６（Ｋｉｍ等のＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３４巻：２４２９〜３４ページ（１９９４年））、ならびに残基３０９（ラット、マウス、およびヒトＩｇＧのＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、またはＭｅｔ）と３１１（ラット、マウス、およびヒトＩｇＧのＧｌｎまたはＡｒｇ）（Ｋａｂａｔ等の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、米保健社会福祉省、米メリーランド州ベセズダ（１９９１年））も、ＦｃＲｎ受容体と相互に作用するようである。したがって、本発明の目的は、ＦｃＲｎ受容体との結合を担うドメイン中の１個または複数のアミノ酸に突然変異、欠失、または挿入があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環半減期が延長されている融合タンパク質を提供することである。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態のＧＣＲ融合タンパク質は、前記突然変異が、２５３位がＩｌｅでなく、３０９位がＬｅｕ、Ｖａｌ、ＧｌｎまたはＭｅｔでなく、３１０位がＨｉｓでなく、３１１位がＧｌｎまたはＡｒｇでなく、４３３位がＨｉｓでなく、４３５位がＨｉｓでなく、さらに４３６位がＨｉｓでないことにあるＩｇＧ１Ｆｃ部を含む。本発明によるこれらおよび他の変異体タンパク質によって、対Ｆｃ受容体結合性の向上、安定性の向上、正確な活性型高次構造選択能の向上、薬物動態特性の向上、合成の向上、または他の有利な特徴が確立することができる。ＧＣＲ融合タンパク質の具体的な改良方法は、部位特異的突然変異誘発技術である。様々な種類の部位特異的突然変異誘発技術が利用でき、これらを代替法として利用して同様の結果が得られることに注目しておきたい。これらの技術の中から選択する戦略は、分子生物学の分野の技術者によく知られている。同様に、標的ＤＮＡの突然変異誘発を無作為および半無作為に実現する技術にも様々な種類がある。このような技術も分子生物学の分野の技術者によく知られている。
【００２８】
本発明によるＩｇ分子およびＧＣＲ様タンパク質は、リンカー分子によって結合されていてもよく、アミノ酸リンカーの長さは様々である。本発明のリンカー（Ｌ）は、以下で定義するリンカー分子であり、プロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。
【００２９】
ペプチドリンカーは多くの場合、たとえばグリシンおよび／またはセリンなど、一続きのペプチドである。ペプチドリンカーは、長さが残基約５〜２５個、好ましくは１０〜２０個のグリシンペプチドとセリンペプチドの混合列である。特に好ましいものは、タンパク質分解によって切断できるリンカー、特にカテプシンのようなリソソームプロテアーゼによって切断できるリンカーである。
【００３０】
好ましいアミノ酸リンカーＬを使用するが、これには以下の配列、すなわち、
１．Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ
２．Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ、
３．Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ、
４．Ｓｅｒ、
５．Ｓｅｒ  Ｓｅｒ、
６．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、
７．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、
８．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、
９．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、
１０．Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ、
１１．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、
１２．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ、およびリンカーがプロテアーゼ切断部位を含むべきならば、
１３．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ
１４．Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ
１５．Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｌｅｕ
１６．Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ、および
１７．小部分１〜１６の任意の組合せが含まれる。
【００３１】
追加の適切なリンカーは、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻５９２９ページに記載されている。
【００３２】
本明細書で使用する「タンパク質分解による切断部位」は、タンパク質分解酵素または他のタンパク質分解性切断剤によって優先的に切断されるアミノ酸配列を意味する。タンパク質分解による切断部位には、タンパク質分解酵素、特にカテプシンまたは他のリソソームプロテアーゼによって識別されるアミノ酸配列が含まれる。
【００３３】
本発明の別の目的は、抗体全体を使用したＧＣＲ融合タンパク質を構築することである。そのような融合分子は、抗体重鎖および軽鎖の可変部と特定の抗原に結合するエピトープを含む。たとえば、抗体重鎖のＣ末端にＧＣＲを融合させる。抗体全体の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、これまでに記載されているように構築することができる（Ｇｉｌｌｉｅｓ等［１９９１年］のＨｙｂｒｉｄｏｍａ第１０巻３４７〜３５６ページ）。
【００３４】
本発明はまた、上記で開示し、特許請求の範囲で叙述する融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ分子に関する。
【００３５】
好ましい実施形態として、上記および特許請求の範囲で定義してある融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、
（ａ）シグナル／リーダー配列
（ｂ）Ｉｇ分子の配列
（ｃ）ＧＣＲの生物活性を有する標的タンパク質の配列
を含むＤＮＡ分子を開示する。
【００３６】
上記で示した本発明のシグナル配列は、小胞体膜を通るタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明で有用となるシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、たとえば抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ等のＪｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、第１２５巻：１９１ページ（１９８９年））、抗体重鎖シグナル配列、たとえばＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ等のＮａｔｕｒｅ第２８６巻：５７７４ページ（１９８０年））、および当技術分野で知られている他の何らかのシグナル配列が含まれる（たとえば、ＷａｔｓｏｎのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１２巻：５１４５ページ（１９８４年）を参照）。この各参考文献を参照により本明細書に組み込む。シグナル配列は、当技術分野でよく特性付けられており、通常１６〜３０個のアミノ酸残基を含むことが知られているが、含んでいるアミノ酸残基がより多いことも、より少ないこともある。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち塩基性のＮ末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性の強いＣ末端領域からなる。中央の疎水性領域は、新生ポリペプチド輸送の際、膜の脂質二重層を貫通する形でシグナルペプチドを固定する４〜１２個の疎水性残基を含む。開始の後、シグナルペプチドは、通常小胞体内腔内でシグナルぺプチダーゼとして知られている細胞酵素によって切断される。
【００３７】
シグナルペプチドの潜在する切断部位は、一般に「（−３、−１）ルール」に従う。したがって典型的なシグナルペプチドは、−１位および−３位に小さな中性アミノ酸残基を有し、この領域内ではプロリン残基を欠いている。シグナルペプチダーゼによって、−１と＋１位のアミノ酸間にあるようなシグナルペプチドが切断されることになる。このようにして、シグナル配列をコードするＤＮＡの部分が、分泌される際に融合タンパク質のアミノ末端から切断されるといえる。これによって、Ｉｇ領域と標的タンパク質からなる融合タンパク質の分泌がもたらされる。ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅがシグナルペプチド配列の詳細な議論を提示している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１４巻：４６８３ページ（１９８６年））。当分野の技術者には明らかであるが、特定のシグナル配列が分泌カセット中での使用に適合するには、いくつかの決まりきった実験法が必要である。シグナル配列は、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」、または「リーダーペプチド」とも呼び、本明細書ではシグナル配列と同義のこれらの各用語を使用することもある。
【００３８】
本発明はまた、標的タンパク質、すなわちＧＣＲ融合タンパク質の発現を促進する前記ＤＮＡ分子を含む発現ベクターに関する。本明細書で使用する「ベクター」とは、宿主細胞中に取り込み、かつ宿主細胞ゲノムと再結合させてそれに組み込むのに適格であるか、あるいは自律的にエピソームとして複製するのに適格なヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターには、線状の核酸、プラスミド、ファージイミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが含まれる。ウイルスベクターの非限定的な例には、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスが含まれる。本明細書で使用する「標的タンパク質の発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、および正確な活性高次構造に折り畳まれたタンパク質産物の分泌を意味するものと理解される。
【００３９】
本発明に従うと、この出願で定義した融合タンパク質の発現に適する、真核生物、好ましくは哺乳類の宿主細胞が使用される。このような宿主細胞に前記ベクターを形質移入し、本発明の融合タンパク質を発現させ、精製し、さらに単離する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００４０】
したがって、本発明による方法は、
(i)分泌のためのリーダー配列；Ｉｇ部；ＧＣＲ、ＧＣＲm、もしくはＧＣＲtrunc部分；および任意にＩｇとＧＣＲ部間のリンカー配列を含む前駆体タンパク質をコードするＤＮＡを構築すること、
(ii)認可された発現ベクター中に前記融合ＤＮＡを配置すること、
(iii)真核細胞中で前記融合タンパク質を発現させること、および
(iv)前記の分泌された融合タンパク質を精製すること
を含む。
【００４１】
本発明はまた、上記および以下で定義してある少なくとも１種のＧＣＲ融合タンパク質、好ましくはＩｇＧＦｃ部のＣ末端アミノ酸がＧＣＲ様タンパク質のＮ末端アミノ酸にペプチド結合によって結合している融合タンパク質、薬剤として許容される担体、希釈剤、および賦形剤を含む薬剤組成物に関する。このような薬剤組成物は、ＧＣＲ欠損疾患を共同で治療する場合に有用な他の薬物または医薬を任意に含んでいてもよい。
【００４２】
この種の薬剤組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、同所注射、同所注入向けでも、経口、経肺、経鼻、経皮、または他の投与形態向けでもよい。投与は、周期的な単位投与、継続的な注入、蠕動による送達、大量注射などによって実施できる。経路は含んでよい。
【００４３】
一般に、本発明に含まれるのは、有効量の本発明のタンパク質または派生産物、ならびに薬剤として許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体を含む薬剤組成物である。このような組成物は、緩衝液の内容（たとえばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の様々な希釈剤；界面活性剤や可溶化剤などの添加剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール）、および充填物質（たとえばラクトース、マンニトール）を含む。
【００４４】
上記および以下で述べる用語「非経口」には、皮下、静脈内、関節内、および気管内の注射および注入技術が含まれる。非経口投与が好ましい。
【００４５】
本明細書で使用する用語「薬剤として許容される担体または賦形剤」は、活性化合物または患者と有害反応を起こさない不活性な非毒性の液体充填剤、希釈剤、溶媒、または溶液を意味する。適切な液体担体は、石油、動物、植物、または合成品由来のものを含めて、無菌水、生理食塩水、水性デキストロース、糖溶液、エタノール、グリコール類、および油類など、当技術分野でよく知られている。非経口投与用の製剤は、補助剤または溶媒の典型的なものを含んでよい。
【００４６】
前記の適切な製剤に関して、本発明の融合タンパク質が、何らかの非毒性の有機もしくは無機酸と共に最終的に薬剤として許容される塩を形成すると、溶解性の変化を示すことが指摘されるはずである。無機酸は、たとえば、塩酸、硫酸、リン酸、およびオルトリン酸一水素ナトリウムや硫酸水素カリウムなどの酸性金属塩である。有機酸の例は、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、およびスルホン酸など、モノ、ジ、およびトリカルボン酸である。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩には、何らかの適切な無機または有機塩基と共に形成された非毒性カルボン酸塩が含まれる。このような塩には、たとえばナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属、およびトリアルキルアミンなど、第一級、第二級および第三級アミンが含まれる。
【００４７】
通常、ゴーシェ病、テイ・サックス病、またはファブリー病のような糖脂質蓄積症の治療でのＧＣＲ融合タンパク質の投与量は、１日あたり体重１キログラムあたり０．０１ｍｇ〜２５ｍｇ、好ましくは約０．１〜２ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１ｍｇである。有効投与量は、従来技術で知られている診断ツールを使用して決定することができる。一般に、所与の患者にとっての治療上許容される最適な投与量および投与速度は、前記の範囲内で、使用する特定の活性材料の活性度、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、クリアランス速度、または治療の目的など、様々な要因に応じて変わる。当分野の技術者であれば、投与を行い、所望の治療効果を観察することによって、有効投与量を突き止められるであろう。投与量も治療の過程で変化してよく、最初は治療利益が見られるまで比較的多い投与量を使用し、治療利益の維持にはより少ない投与量を使用する。
【００４８】
本発明はまた、ＧＣＲ融合タンパク質療法によって、ゴーシェ病、ファブリー病、テイ・サックス病など、様々な糖脂質蓄積疾患を治療し、かつこれらの疾患に関連した酵素を扱うための治療方法および治療システムに関する。
【００４９】
本発明の実施を進め方の点からみると、この治療方法は、様々な様式を含む。たとえば、ＧＣＲ融合タンパク質は、ビタミンなど、他の薬物および／または添加剤と共に、混合物にしてから、すなわち同時に投与することも、逐次投与することもでき、あるいは単独の薬物療法として投与することもできる。さらに、添加剤および／もしくは追加の薬物とこの融合タンパク質は、投与の間に０〜３週間、すなわち最初に活性薬物が投与されたほぼ直後から最初に薬物が投与されてから最高で３週間の間隔を置いて分けて投与することもできる。その上、順序を様々に変える、すなわち融合タンパク質より先に添加剤および／または追加の薬物を投与することも、逆の順序で投与を行うこともできると考えられる。
【００５０】
別の実施形態では、本発明が、たとえば脾臓を部分的にまたはすべて除去してしまう外科的手順と共に実施できると考えられる。これに関しては、本発明方法は外科的手順の後に実行される。あるいは活性薬物の投与の合間に外科的手順を行うこともできる。この方法のよい例は本方法と外科的脾臓除去の併用である。
【００５１】
本方法による治療は、通常、１回または複数の投与サイクルで活性薬物を投与することを含む。たとえば、ＧＣＲ融合タンパク質を単独または同時に投与する場合、１種の脂質蓄積疾患薬、あるいは前記薬物と添加剤および／もしくは別の薬物とを含む治療用組成物を、約２日〜約３週間の期間にわたり１サイクルで投与する。その後は、診療を行う医師の判断に従って、必要に応じてこの治療サイクルを繰り返すことができる。同様に、２種の異なる薬品の逐次投与を考える場合も、投与時期は通常同じ期間に及ぶ。各サイクルの間隔は約０〜２ヶ月で様々である。
【００５２】
本発明は、別の実施形態の形で、骨髄移植、または糖脂質の重要な蓄積部位として働く臓器、たとえば脾臓を除去することによる外科手術と併せて、あるいは糖脂質蓄積疾患に罹患したヒトに前もって酵素増強治療を行うことによって遺伝子治療を成功させる準備を行うために、補助治療として、患者にある量の上記で定義したＧＣＲ融合タンパク質を含む治療用組成物を投与することを含む、ゴーシェ病の治療方法を記載する。
【００５３】
本発明による疾患の１種を酵素補充もしくは増強療法によって補助的に治療する場合、融合タンパク質の投与は、他の手術、すなわち外科処置と分けて、手術と融合タンパク質の投与の間に０〜３週間、すなわち骨髄移植などの手術または活性薬の外科処置のほぼ直後からその薬品が投与されてから最高で３週間の間隔を置いて行うことができる。さらに、順序を様々に変える、すなわち骨髄移植または外科処置より先に融合タンパク質を投与することも、その逆の順序で投与を行うこともできると考えている。
【００５４】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するのに必要な試薬を供給する梱包および／またはキットを含むシステムを企図する。したがって、糖脂質蓄積症を治療するためのキットであって、
ａ）ある量の上記で定義したＧＣＲ融合タンパク質を含む治療用組成物、
ｂ）任意選択の添加剤または前記疾患治療用の補助的な薬物、および
ｃ）ゴーシェ病、テイ・サックス病、またはファブリー病を治療する方法中の試薬の使用についての説明書
を含むパッケージを含むキットを記載する。
【００５５】
本発明のキットに含まれる試薬は、通常本明細書で記載したような治療用組成物として配合され、したがってキットの形で配布するのに適する様々な形態のいずれでもよい。本発明の融合タンパク質、および任意選択の補助的な薬物および／もしくは添加剤を提供する形態には、液体、粉末、錠剤、懸濁液などの製剤が含まれる。パッケージ中の各試薬は、本発明の方法に従って、分割して投与するのに適する別々の容器中に提供してもよく、あるいは組成物の形で合体させて１個の容器中に提供してもよい。
【００５６】
パッケージは、本明細書に記載の本発明の方法による試薬を１または複数回分だけ含有すればよい。通常、パッケージは、本明細書で記載した治療サイクルに足りる量を含有することになる。
【００５７】
本発明のキットは、パッケージ中に含まれる材料の「使用説明書」も含む。この説明書は、融合タンパク質の使用に関するものであり、かつ／または本発明の方法に従う糖脂質蓄積症を治療するための任意の補助的な薬物および／もしくは添加剤についてのものである。方法というものが疾患の相や型、患者、および病態に応じて幅広く変化し得る限り、それに合わせて説明書も様々に変えて、投与の手順を具体的に述べてよい。本発明は、本発明の方法による融合タンパク質の使用に関する特殊性以外の説明書の性質を限定的なものであるとみなさない。
【００５８】
配列の報告
本明細書では以下のアミノ酸配列を使用した。
【００５９】
配列番号１  ヒトリソソームＧＣＲアミノ酸配列（１文字表記コード）
MAGSLTGLLL LQAVSWASGA RPCIPKSFGY SSVVCVCNAT YCDSFDPPTF
PALGTFSRYE STRSGRRMEL SMGPIQANHT GTGLLLTLQP EQKFQKVKGF
GGAMTDAAAL NILALSPPAQ NLLLKSYFSE EGIGYNIIRV PMASCDFSIR
TYTYADTPDD FQLHNFSLPE EDTKLKIPLI HRALQLAQRP VSLLASPWTS
PTWLKTNGAV NGKGSLKGQP GDIYHQTWAR YFVKFLDAYA EHKLQFWAVT
AENEPSAGLL SGYPFQCLGF TPEHQRDFIA RDLGPTLANS THHNVRLLMLD
DQRLLLPHWA KVVLTDPEAA KYVHGIAVHW YLDFLAPAKA TLGETHRLFP
NTMLFASEAC VGSKFWEQSV RLGSWDRGMQ YSHSIITNLL YHWGWTDWN
LALNPEGGPN WVRNFVDSPI IVDITKDTFY KQPMFYHLGH FSKFIPEGSQ
RVGLVASQKN DLDAVALMHP DGSAVVVVLN RSSKDVPLTI KDPAVGFLET
ISPGYSIHTY LWRRQ。
【００６０】
配列番号２  ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域−成熟タンパク質コード配列（１文字表記コード）
EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK。
【００６１】
配列番号３  ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域−成熟タンパク質コード配列（１文字表記コード）
ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY
KCKVSNKGLP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK。
【００６２】
以下の実施例によって、本発明を限定することなくより詳細に述べる。
【実施例】
【００６３】
実施例１
ヒトＦｃ−ＧＣＲの発現
標準の技術によって、ＧＣＲの成熟型をコードする配列をオリゴヌクレオチドから完全に合成した。
【００６４】
合成したＤＮＡが５’末端にＸｍａｌ適合性オーバーハングを有し、かつ３’末端にＸｈｏｌ適合性オーバーハングを有するように操作した。
【００６５】
このＤＮＡをクローン化し、配列解析によって、突然変異のない成熟ＧＣＲタンパクをコードすることを確認した。
【００６６】
発現ベクターｐｄＣｓ−Ｆｃ−ＧＣＲは、以下のように構築した。Ｌｏ等の［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８年）第１１巻：４９５ページ］に従って、ｐｄＣｓ−ＦｃベクターのＸｍａｌ−Ｘｈｏｌ断片に、ＧＣＲｃＤＮＡを含有するＸｍａｌ−Ｘｈｏｌ制限酵素断片を連結させた。得られたベクターｐｄＣｓ−Ｆｃ−ＧＣＲを使用して哺乳類の細胞に形質移入し、Ｆｃ−ＧＣＲの発現に備えた。このベクターは、ヒト免疫グロブリンγ１鎖Ｆｃ領域を発現する。
【００６７】
Ｆｃタンパク質部分は、通常グリコシル化部位も含んでいる。この部位は、任意選択で、標準の手法によって非グリコシル化配列に変化させてもよい。
【００６８】
実施例２
形質導入およびＦｃ−ＧＣＲ融合タンパク質の発現
一過性の形質移入では、ＢＨＫ細胞にプラスミドを導入した。プラスミドＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈殿［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９年）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ、Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク］によって、または供給者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用するリポフェクションを行うことによって、細胞に形質移入を施した。
【００６９】
安定した細胞株を発生するために、一過性の形質移入と細胞株の発生の両方にＮＳ／０細胞を使用した。
【００７０】
安定に形質移入されたクローンを得るために、電気穿孔法によって細胞にプラスミドＤＮＡを導入した。約５×１０6個の細胞をＰＢＳで１度洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。次いで、氷上のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極の間隔０．４ｃｍ、Ｂｉｏ  Ｒａｄ）中、線状にしたプラスミドＤＮＡ１０μｇを細胞と共に１０分間インキュベートした。電気穿孔法は、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を使用して、設定を０．２５Ｖおよび５００マイクロＦとして行った。氷上で細胞を１０分間かけて回復させ、その後これを増殖培地中に再懸濁させ、次いで９６穴プレートに載せた。形質導入後２日目に導入した１００ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）存在下で成長させることによって、安定に形質移入されたクローンを選別した。細胞に３日毎にもう２〜３回供給を行うと、２〜３週間中にＭＴＸ耐性クローンが出現した。クローンの上清を抗ＦｃＥＬＩＳＡによって評価して、高産生株を特定した。高産生クローンを単離し、１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中で増殖させた。
【００７１】
１０％のウシ胎児血清、２ｎＭのグルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地中でＢＨＫおよびＮＳ／０細胞を成長させた。
【００７２】
ゲル電気泳動法による型通りの特徴付けについては、馴化培地中のＦｃ融合タンパク質をプロテインＡセファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）上で捕捉し、次いで、２−メルカプトエタノール添加または無添加のタンパク質試料緩衝液中で煮沸することによって溶離した。ＳＤＳ−ゲルで電気泳動を行った後、クーマシー染色によってタンパク質バンドを可視化した。精製のために、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３、１００ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、プロテインＡセファロース上に結合した融合タンパク質を溶離した。次いで、溶離されたものを、ｐＨ８の２ＭトリスＨＣｌ  ０．１容で直ちに中和した。
【００７３】
実施例３
炭水化物の特徴付け
エンドグリコシダーゼＨをｐＨ６．０、１００ｍＭの酢酸ナトリウムに溶解させ、最終濃度を１０単位／ｍｌとした。Ｎ−グリカナーゼを２５０単位／ｍｌの５０％グリセロール中の懸濁液として補給した。ヒト胎盤酵素、またはＧＣＲ活性を含む５０μｌのアリコートのデシル−アガロース画分を０．５％ＳＤＳ／１Ｍβ−メルカプトエタノールに調整し、２分間沸騰させた。次いで、ｐＨ６．０、２００ｍＭの酢酸ナトリウム（エンドグリコシダーゼＨ用）またはｐＨ８．５、２００ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎ−グリカナーゼ用）に適する緩衝液で試料を希釈して、ＳＤＳ０．１％、ＮＰ−４０  ０．７％、およびβ−メルカプトエタノール０．０２Ｍの最終組成物とした。試料を再度１分間煮沸し、次いでエンドグリコシダーゼＨまたはＮ−グリカナーゼを加えて、最終濃度をそれぞれ５０ｍｕ／ｍｌまたは２０Ｕ／ｍｌとした。消化は、３７℃で約１６時間とした。両方の脱グリコシル化反応のコントロールとしてカルボキシペプチダーゼＹを使用した。
【００７４】
実施例４
アミノ酸配列の解析：
アミノ酸配列の解析用に使用した試料は、上述のように、電気泳動法によってＳＤＳゲル上で分別し、次いで、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（Ｊ．Ｂ．Ｃ．第２６２巻：１００３５ページ、１９８７年）に記載されているとおりにＰＶＤＦ膜に移した。通常、電気泳動の後、ゲルをトランスファー緩衝液（０．１ＭのＣＡＰＳ、１０％のメタノール、ｐＨ１１．０）中で１０分間インキュベートしてからトランスブロットを行った（５０ｍａで４時間）。次いで、ゲルをＨＰＬＣ級の水で５分間洗浄し、（５０％メタノール中）０．１％のクーマシーブルーＲ２５０で５分間かけて染色し、最後に５０％メタノール−１０％酢酸で１０分間かけて脱染した。ＰＶＤＦ膜を再度ＨＰＬＣ級の水で洗浄し、窒素流存在下で乾燥させ、アミノ酸の配列決定に使用するまで密閉袋中、−２０℃で保管した。
【００７５】
アミノ酸配列の解析は、１２０Ａ型オンラインＰＴＨアミノ酸解析装置を装備したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７０Ａ型の気相配列決定装置を使用して行った。膜細片にポリブレンでの前処理を行わずに、直接にプログラム０３Ｒ  ＰＴＨを使用して配列決定を行った。問題のタンパク質バンドを含むＰＶＤＦ膜のおよそ２×８ｍｍの小片を切除し、テフロンシールの中央に据え、配列決定装置のカートリッジブロック内に配置した。このようにしてＰＶＤＦ膜の多数の細片を積み重ねることができるので、配列決定に利用できるタンパク質の量が増大する。組換え型ＧＣＲの配列を決定するために、１００ピコモルのヒト胎盤ＧＣＲを電気泳動にかけ、ＰＶＤＦにトランスブロットし、１０回のアミノ酸配列にかけた後に得られた収率と比較することによって、初回の収率および平均反応収率を算出した。
【００７６】
本文に記載の方法を使用して、成熟ヒト胎盤ＧＣＲのＮ末端アミノ酸配列と組換え型ヒトＧＣＲのＮ末端アミノ酸配列を比較した。直接的な化学的配列決定法によって決定された、成熟ヒトＧＣＲおよび組換え型ＧＣＲのＮ末端アミノ酸は同一であり、組換えによって産生された酵素のシグナル配列が正しくプロセシングされていたことを示唆した。
【００７７】
実施例５
ＧＣＲアッセイ：
ｐＨプロファイルおよび阻害試験については、０．１５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、β−Ｄ−１−14Ｃグルコセレブロシド（５０ｍｇ／ｍｌのタウロコール酸ナトリウム中７．５ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌ、および試料を含有する総体積２００μｌの１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を使用して、ＧＣＲ活性を測定した。コンズリトールＢエポキシドとのプレインキュベーションは、３７℃で３０分間とした。Ｋｍの決定では、０．１５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１２５％のタウロコール酸ナトリウムを含有する１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中で人工基質の４−メチルアンベラファリ（methylumbellifery）−β−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵＧＰ）を使用し、ｐＨを５．９として、βグルコシダーゼ活性を評価した。４ＭＵＧＰを使用して組換え型ＧＣＲの精製もモニタした。
【００７８】
本明細書で記載した実施例および実施形態は、例示的な目的を考えたものに過ぎないこと、ならびに当分野の技術者なら、様々な変更形態またはそれを考えての変更を考え付くことになろうが、それらが本出願および添付の特許請求の範囲の精神および視野に含まれることを理解されたい。
【００７９】
当分野の技術者には、この開示の観点から他の使用法がわかるであろう。
【国際公開パンフレット】
2004525621.tif 000002
2004525621.tif 000003
2004525621.tif 000004
2004525621.tif 000005
2004525621.tif 000006
2004525621.tif 000007
2004525621.tif 000008
2004525621.tif 000009
2004525621.tif 000010
2004525621.tif 000011
2004525621.tif 000012
2004525621.tif 000013
2004525621.tif 000014
2004525621.tif 000015
2004525621.tif 000016
2004525621.tif 000017
2004525621.tif 000018
2004525621.tif 000019
2004525621.tif 000020
2004525621.tif 000021
2004525621.tif 000022
2004525621.tif 000023
2004525621.tif 000024
2004525621.tif 000025
2004525621.tif 000026
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525621.tif 000027
【国際調査報告】
2004525621.tif 000028
2004525621.tif 000029
2004525621.tif 000030