(57)【要約】本発明は、ＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法を提供する。該方法は、ＡＱＰ８の活性または量を調節するその能力について該化合物をアッセイすることを含む。該アッセイは、ＡＱＰ８を発現する細胞株を用いるかまたは精製ＡＱＰ８タンパク質を用いるＡＱＰ８活性の測定、およびＡＱＰ８を発現する細胞株でのＡＱＰ８の転写または翻訳の測定から選択される。本発明はまた、医薬組成物の製造方法、ＩＢＤに対する感受性を測定するための診断方法、ＩＢＤまたはその素因の診断方法、およびＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用を提供する。
2004534531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＱＰ８の活性または量を調節する化合物の能力について該化合物をアッセイすることを含む、ＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法。
【請求項２】
アッセイが、
ｉ）ＡＱＰ８を発現する細胞株を用いるか、または精製ＡＱＰ８タンパク質を用いるＡＱＰ８活性の測定；および
ii）ＡＱＰ８発現細胞株におけるＡＱＰ８の転写または翻訳の測定
から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＱＰ８の活性の測定に用いられるアッセイが、ＡＱＰ８仲介水輸送の測定を基にする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＱＰ８の転写または翻訳の測定が、
ｉ）ＡＱＰ８ｍＲＮＡの量の測定；
ii）生成されたＡＱＰ８タンパク質の量の測定；または
iii）ＡＱＰ８発現細胞におけるＡＱＰ８活性の測定
のいずれかによって測定される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＡＱＰ８がヒトのリコンビナントＡＱＰ８である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
レポーター遺伝子系を用いてＡＱＰ８プロモーターの活性を測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＡＱＰ８プロモーターがヒトＡＱＰ８プロモーターである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程：
ｉ）請求項１〜７のいずれか一項に記載された方法にしたがってＩＢＤの治療に有用な化合物を特定し；そして
ii）化合物または医薬的に許容できるその塩を医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含む医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
ＢＡＣ ５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、ＢＡＣ Ａ−２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）またはＢＡＣ ＣＴＤ−２５４７Ｇ２３（ＥＭＢＬ ＡＣ００８７４１）に一致する染色体フラグメントに存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無について、患者から得たＤＮＡサンプルを分析することを含む、ＩＢＤに対する感受性を判定する診断方法。
【請求項１０】
ＡＱＰ８に対して向けられる自己抗体を測定することを含むＩＢＤまたはその素因の診断方法。
【請求項１１】
ＩＢＤ治療用医薬の製造におけるＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法、医薬組成物の製造方法、ＩＢＤに対する感受性を測定するための診断方法、ＩＢＤまたはその素因の診断方法、およびＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＢＤは、胃腸管の慢性再発性の腸炎症を特徴とする。ＩＢＤは欧米の国々で１０００人に約１人が罹患し、平均発症年齢は成人初期である。今日まで該疾患の病因は不明である。臨床的および病理組織学的特色に基づいて、ＩＢＤは以下の２つの主なサブタイプに分類される：クローン病（ＣＤ）（オンラインヒトメンデル遺伝（“On Line Mendelian Inheritance in Man"）OMIM 266600）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（OMIM 191390）。ＩＢＤの原因は不明であるが、該疾患の家族内集団発生および一卵性双生児における一致の増加は強い遺伝的感受性を示している。兄弟内発症の危険率の推定値（λｓ）は１０〜５０の範囲であり、遺伝的因子がＩＢＤ素因に重要な役割を果たすことを示唆している。疫学的データによれば、ＩＢＤは、環境因子と同様に多くの感受性遺伝子によって惹起される多因子性異常であると考えられる。本発明ではＩＢＤという用語は、クローン病および潰瘍性大腸炎に加えてＩＢＤも含むことを意図している。
【０００３】
以前のゲノムワイドな連鎖解析によってＩＢＤに対する多数の感受性遺伝子座、例えばＩＢＤ１（OMIM 266600）（Hugot et al. 1996; Brant et al. 1998; Curran et al. 1998; Hampe et al. 1999a）、ＩＢＤ２（OMIM 601458）（Duerr et al. 1998; Parkes et al. 2000）、ＩＢＤ３（OMIM 604519）（Hampe et al. 1999b）、ＩＢＤ７（OMIM 605225）（Cho et al. 1998; Cho et al. 2000）が特定された。ＩＢＤ１遺伝子座は、ヒト染色体１６のペリセントロメア領域に位置し、１６ｐ１２−ｑ１３領域にマッピングされる。
【０００４】
ＡＱＰ８は水分チャネルタンパク質（アクアポリン）群に属する。アクアポリン（ＡＱＰ）は不可欠の膜タンパク質を構成する主要な固有スーパーファミリーに属するメンバーであり、動物、植物および細菌で細胞膜の水分通過を促進する特殊なチャネルとして機能する。これまでのところ０から９の番号を付された１０個のＡＱＰホモログが哺乳類でクローニングされた。これらは広範囲に分布し、２つ以上のＡＱＰが同じ細胞に存在することができる（Echevarria and Ilundain, 1998）。いくつかのヒトＡＱＰ遺伝子がクローニングされ、多くの障害がこれらのタンパク質の機能異常に関連していることが判明した（Echevarria and Ilundain, 1998）。
【０００５】
先ず初めにマウスのＡＱＰ８をコードするｃＤＮＡがMa et al.(1997a)によってクローニングされた。ノザンブロット分析は、多数の組織（胎盤、結腸、肝臓、心臓、膵臓、肺臓、腎臓、精巣、脾臓、胃および脳を含む）での発現を示した。
【０００６】
ヒトのＡＱＰ８をコードするｃＤＮＡは１９９８年にクローニングされ、細胞液輸送に重要であることが示された（Koyama et al. 1998）。該遺伝子の発現はノザンブロットによってヒトの膵臓および結腸の組織で示された（Koyama et al. 1998）。
【０００７】
Koyama et al.（1999）は、ラットではＡＱＰ８は空腸の吸収性柱状細胞、結腸の近位部および遠位部で発現されることをin situハイブリダイゼーションで示し、ＡＱＰ８は胃腸管で水分の取り込みおよび／または排出に役割を有すると提唱した。マウスでは、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４およびＡＱＰ８が結腸上皮表面で発現され、液輸送におけるこれらアクアポリンの共同的役割が示唆された（Ma and Verkman 1999）。
【０００８】
ラット肝細胞におけるＡＱＰ８の発現、非細胞局在および調節がGarcia et al.（2001）によってさらに詳細に調べられた。最近になって、ヒト結腸におけるＡＱＰ８の発現がFischer et al.（2001）によって実証され、さらに正常な増殖中の結腸上皮細胞のマーカーであると提唱された。
【０００９】
アクアポリンは小型で膜に広がる非常に疎水性の固有の膜タンパク質（モノマーサイズは約３０ｋＤａ）であり、液輸送に必要な多くの細胞タイプの細胞質膜で発現される。アクアポリンの構造の基本的特色は、変異誘発、エピトープ付加、並びにスペクトロスコープおよび凍結割断電子顕微鏡法を用いて明らかにされた。アクアポリンは膜でホモテトラマーとして集合するように思われる。このホモテトラマーでは、各モノマー（アミノおよびカルボキシ末端が細胞質に向いている６つのメンブレンスパンニングα−らせんドメインから成る）は明瞭な水の孔を含む。
【００１０】
アクアポリンの構造および機能はVerkman and Mitra（2000）およびKing et al.（2000）が概論している。
稀なコルトン−ヌル（Colton-null）表現型を有するヒトはＡＱＰ１に欠損を有するが、明瞭な臨床的表現型を示さず（Preston et al1994）、尿濃縮能の低下のみが認められる（Mathai et al. 1996）。対照的に、ＡＱＰ１ノックアウトマウスでは顕著な尿濃縮機能不全が示された（Ma et al. 1998）。同様に、ＡＱＰ３ノックアウトマウスでは、重篤な尿濃縮機構の機能不全を示す腎性尿崩症を発症する（Ma et al. 2000）。
【００１１】
ＡＱＰ２の変異は、劇的な臨床的表現型である希な遺伝性腎性尿崩症を惹起する（ＮＤＩ）（Deen et al. 1994）。ＮＤＩは、バソプレッシンに対する腎の耐性が病因の疾患であり、その臨床的特徴は大量の希薄尿の排出である。これはまた、ある環境下でのアクアポリンの発現および／または機能状態がホルモンの影響下にあることを示している。ＡＱＰ２遺伝子に変異を有する常染色体の劣性ＮＤＩをもつ患者は、アクアポリンは水分輸送について律速因子であろうという最初の明瞭な例を提供する。後天的ＮＤＩは遺伝型よりもいっそう一般的であり、多様な原因を有する。リチウム（Marples et al. 1995a）、両側性尿管閉塞（Frφkiaer 1996）および慢性低カリウム血症（Marples et al. 1995b）（公知のＮＤＩの原因である）は全て、動物で顕著なＡＱＰ２発現の低下を生じ、同時に尿濃縮能力を低下させる。水分の不均衡スペクトルのまた逆の面では、ＡＱＰ２発現の増加が、うっ血性心不全（Nielsen et al. 1997; Xu et al. 1997）、肝硬変（Fujita et al. 1995）および妊娠（Ohara et al. 1998）を含む液体停留状態で認められた。
【００１２】
マウスではＡＱＰ４遺伝子を破壊することによって中等度の尿濃縮機能不全が生じたが（Ma et al. 1997b）、結腸の液排出または糞便の脱水に対してはほとんどまたは全く影響は認められなかった（Wang et al. 2000）。
【００１３】
ＡＱＰ１およびＡＱＰ４ノックアウトマウスにおける肺臓の液体輸送がBai et l.（1999）によって調べられた。野生型マウスと比較してＡＱＰ１ノックアウトマウスでは気腔−毛細管の水分透過性が１０倍低下したにもかかわらず、等浸透圧の肺胞液の吸収速度は顕著には相違しなかった。気道の水分チャネルＡＱＰ４の欠損の影響はほとんど存在しなかった。
【００１４】
Ma et al.（1999）はＡＱＰ５を欠くトランスジェニックマウスの唾液分泌が低下することを報告し、ＡＱＰ５の唾液腺機能における生理学的関連が示唆された。Steinfeld et al.（2001）は、ヒト唾液腺にＡＱＰ５が局在することを報告し、ショーグレン症候群患者のＡＱＰ５の唾液腺における異常分布を示し、この異常分布はショーグレン症候群患者の唾液分泌低下の原因であろう。
【００１５】
現在哺乳類アクアポリンの２つの機能群が認識されている（Agre et al. 1998）。第一群（ＡＱＰ０、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ４およびＡＱＰ５を含む）は、古典的に定義されたとおり水に対してのみ浸透性を有する。第二群（ＡＱＰ３、ＡＱＰ７およびＡＱＰ９を含む）は、水に対して強い浸透性を有するが、さらにグリセロールおよび他の小分子も浸透させる。これらの相違の構造的説明および生理学的相関性は不明である。ＡＱＰ６の配列は水選択性群と同様であるが、ゲートコントロール陰イオンコンダクタンス（gated anion conductance）の最近の驚くべき観察は、機能的相違は以前に考えられたものよりも複雑であることを示した（Yasui et al. 1999）。ＡＱＰ８の配列は水に選択性を有する群とグリセロール透過群との中間で、機能的な定義は保留されている（Koyama et al. 1997）。したがって、アクアポリン（ＡＱＰ８を含む）は、水およびおそらくは他の小分子の腸および他の組織の上皮（高い近傍細胞透過性を有すると考えられる）におけるゲートコントロールに重要な役割を果たすであろう。
【００１６】
本発明は、ＡＱＰ８遺伝子の位置にきわめて近傍の染色体１６上の領域に位置する遺伝的マーカーに関連するＩＢＤの遺伝的素因の発見に基づいている。ＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物を使用することは、本発明によるＩＢＤ治療の新規な治療概念として確認された。ＡＱＰ８遺伝子の配列分析はＩＢＤに対する感受性の新規な診断方法を提供するであろう。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の特徴の１つにしたがえば、ＩＢＤ治療のためにＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物の使用が提供される。化合物によるＡＱＰ８の量の調節は、例えば遺伝子発現レベルまたはメッセージの安定性の変更によって達成することができる。化合物によるＡＱＰ８の活性の調節は、例えば化合物をＡＱＰ８タンパク質に結合させることによって達成できる。ある実施態様では、ＡＱＰ８の調節は、ＡＱＰ８の活性または量を減少させることができる化合物を含む。別の実施態様では、ＡＱＰ８の調節は、ＡＱＰ８の活性または量を増加させることができる化合物を含む。
【００１８】
ＡＱＰ８の活性を調節することができる化合物の例は抗体である。抗体は任意の適当な方法を用いて調製することができる。例えば、精製ポリペプチドを利用して特異的抗体を調製することができる。“抗体”という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および種々のタイプの抗体構築物、例えばＦ(ａｂ')2、Ｆａｂおよび単鎖Ｆｖを含むことを意図する。抗体は、約１０7Ｍ-1より大きいかまたは等しいＫaでＳＬＣ１０Ａ２の対立遺伝子変異体と結合する場合は特異的に結合すると定義される。結合親和性は、通常の技術（例えば文献（Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660(1949)に記載された技術）を用いて決定することができる。
【００１９】
ポリクローナル抗体は、多様な供給源（例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラット）から当分野で周知の方法を用いて容易に作製することができる。一般に、抗原は宿主動物に典型的には腹腔注射により投与される。抗原の免疫原性は、アジュバント（例えばフロイントの完全または不完全アジュバント）を使用することによって高めることができる。ブースター免疫の後で、少量の血清サンプルを採集し、抗原に対する反応性を検査する。このような測定に有用な種々のアッセイの例には、以下の文献に記載されたもの（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）の他に、例えば交差免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射性イムノアッセイ、放射性免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイおよびサンドイッチアッセイ（米国特許第4,376,110号および4,486,530号を参照されたい）のような方法が含まれる。
【００２０】
モノクローナル抗体は周知の方法を用いて容易に製造できる。例えば以下の文献に記載された方法を参照されたい：米国特許RE32,011号、4,902,614号、4,543,439号および4,411,993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.), (1980)。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体はまた別の技術、例えばAlting-Mees et al.が記載した技術（“Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)、この文献は参照により本明細書に含まれる）を用いて製造することができる。同様に、結合パートナーはリコンビナントＤＮＡ技術を用いて構築し、特異的な結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込むことができる。そのような技術はLarrick et al.が記載している（Biotechnology, 7:394(1989)）。
いったん単離され精製されたら、その抗体を用いて、確立されたアッセイプロトコルにより抗原の存在を検出することができる（例えば以下を参照されたい：“A Practical Guide to ELISA" , D.M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, England）。
【００２２】
本発明の別の特徴にしたがえば、ＡＱＰ８の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用が提供される。
【００２３】
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、ＩＢＤの治療に潜在的に有用な化合物を特定する方法が提供され、該方法は、ＡＱＰ８の活性または量を調節する化合物の能力についてその化合物をアッセイすることを含む。好ましくは該アッセイは以下から選択される：
ｉ）ＡＱＰ８を発現する細胞株を用いるか、または精製ＡＱＰ８タンパク質を用いるＡＱＰ８活性の測定；および
ii）ＡＱＰ８発現細胞株におけるＡＱＰ８の転写または翻訳の測定。
【００２４】
被検化合物のＡＱＰ８の活性に対する影響を決定するために用いられるアッセイは、ＡＱＰ８仲介水輸送の測定により達成することができる。アクアポリン仲介水輸送は、一般にはアクアポリンのｃＲＮＡを発現するアフリカツメガエル卵母細胞での浸透膨潤アッセイを用いて測定される。最初に記載されたように（Zhang et la. 1990）、定量的画像分析を用い、２００から０〜１００mosmol／ｋｇＨ2Ｏへの細胞外溶液の浸透圧の急激な低下に対する反応で卵細胞膨潤のタイムコースを推定する。アクアポリンをトランスフェクトした哺乳類細胞における水輸送もまた多様な生物物理学的アプローチによって調べられ、該アプローチには以下が含まれる：液流停止光散乱（stopped-flow light scattering）（ Ma et al. 1993）、総内部反射蛍光顕微鏡法（total internal reflection fluorescence microscopy）（Farinas et al. 1995）、レーザーインターフェロメトリー（laser interferometry）（Farinas and Verkman 1996）、およびフーリエ光学暗視野顕微鏡法／位相差顕微鏡法（Farinas et al. 1997）。液流停止光散乱はまた、精製アクアポリンタンパク質を含む酵母由来の小胞（Laize et al. 1995）および再構成プロテオリポソーム（Van Hoek and Verkman, 1992）におけるアクアポリン仲介水輸送のアッセイにも用いられた。
【００２５】
被検化合物のＡＱＰ８の転写または翻訳に対する影響を決定するために用いられるアッセイは以下を基にすることができる：
ｉ）例えばノザンブロット分析または定量的リアルタイムＰＣＲを用いる生成ＡＱＰ８ｍＲＮＡの量の測定；
ii）例えばウェスタンブロット分析または免疫化学的分析（例えばＥＬＩＳＡ）を用いる生成ＡＱＰ８タンパク質の量の測定；または
iii）ＡＱＰ８発現細胞でのＡＱＰ８活性の上記に述べたような測定。
【００２６】
アッセイで用いられる細胞はＡＱＰ８を天然に発現している細胞でも、またリコンビナントＡＱＰ８を発現するトランスフェクト細胞でもよい。好ましくは該ＡＱＰ８はヒトリコンビナントＡＱＰ８である。
【００２７】
ＡＱＰ８は多様な宿主、例えば細菌、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞並びにヒトおよび動物細胞で発現させることができる。真核リコンビナント宿主細胞が特に好ましい。例として、酵母、哺乳類細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株を含む）、および昆虫細胞（ショウジョウバエおよびカイコに由来する細胞株を含む）が含まれる。市販されている使用可能な哺乳類種由来の細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ATCC CCL 1.3）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ATCC CCL 1.2）、ＨＥＫ２９３（ATCC CRL 1573）、Ｒａｊｉ（ATCC CCL 86）、ＣＶ−１（ATCC CCL 70）、ＣＯＳ−１（ATCC CRL 1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651）、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL 61）、３Ｔ３（ATCC CCL 92）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ATCC CRL 1658）、ＨｅＬａ（ATCC CCL 2）、Ｃ１２７Ｉ（ATCC CRL 1616）、ＢＳ−Ｃ−１（ATCC CCL 26）およびＭＲＣ−５（ATCC CCL 171）が含まれる。
【００２８】
以下を含む多数の方法のいずれかを用い、ＡＱＰ８をコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、本発明のポリペプチドを発現させることができる：リン酸カルシウムによる形質転換、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質転換、陽イオン脂質仲介リポフェクチン、電気穿孔または感染。
【００２９】
トランスフェクトした宿主細胞を増殖させ、例えば制限希釈によってクローニングし、さらにリコンビナントＡＱＰ８の発現レベルを決定するために分析する。ＡＱＰ８を発現する形質転換宿主細胞の同定は、抗体との免疫学的反応性および／または本明細書に述べるアッセイによる生物学的活性の検出を含むいくつかの手段によって達成できる。
リコンビナントヒトＡＱＰ１またはＡＱＰ２は酵母内で発現され、分泌小胞内に局在することが判明した。ＡＱＰ１およびＡＱＰ２を含む分泌小胞は、高い水分透過性および水流に対する低い活性化エネルギーを示し、機能的ＡＱＰ１およびＡＱＰ２の発現を示唆した（Coury et al. 1998）。酵母での発現およびそれに続く単離酵母小胞の水透過性の測定を用いて、ＡＱＰ２変異体の機能が調べられた（Shinbo et al. 1999）。
【００３０】
遺伝子発現の転写の調節は転写因子の結合を支配し、それによって遺伝子の転写を仲介するプロモーター中の特定のＤＮＡエレメントによって仲介される。真核生物の転写因子は以下の２つの主な群に分けることができる。ｉ）転写開始部に近位のプロモーター配列と相互作用し、それによってＲＮＡポリメラーゼIIが補充されたとき転写を開始させる基礎転写因子、および ii）特定の遠位プロモーターエレメントに結合し、それによって基礎転写機構と接触したときに転写を仲介する転写因子。真核生物における基礎的な生理学的プロセスは、細胞がその環境とコミュニケーションをもち、シグナリング分子（例えばホルモンおよび増殖因子）を介して細胞外刺激に対して反応することができるということである。そのようなシグナリングのための最終事象は、特定の遠位プロモーターエレメントと転写因子との結合であり、これは、例えば遺伝子発現のアップレギュレーションまたは組織特異的遺伝子の発現をもたらす。それらプロモーターエレメントの調節的な役割のために、プロモーターエレメントは治療薬剤スクリーニングのための仮定的標的である。ヒトＡＱＰ８プロモーター配列（本出願に開示）は、ＡＱＰ８の転写を選択的に調節する治療薬剤のスクリーニングを可能にする。
【００３１】
適当な宿主細胞は、ＡＱＰ８を発現することが判明している細胞、またはＡＱＰ８の転写に影響を与えることができる転写因子を発現することが判明している細胞である。好ましくは、特定の転写因子をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた宿主細胞を用いて、特定の転写因子とＡＱＰ８プロモーターとの相互作用を調べることができる。
【００３２】
被検化合物のＡＱＰ８の転写に対する効果を判定するために用いられるアッセイはまた、レポーター遺伝子系を用いるＡＱＰ８プロモーターの活性の測定を基準にすることができる。該レポーター遺伝子系はＡＱＰ８プロモーターを構成する核酸分子またはそのフラグメントを含む発現系で、この発現系はさらにレポーター遺伝子を含む。これらプロモーターおよびレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現がＡＱＰ８プロモーターによって調節されるように配置されている。生成されるレポータータンパク質の量は、ＡＱＰ８プロモーターの活性の指標として用いられる。
【００３３】
好ましくはＡＱＰ８プロモーターはヒトＡＱＰ８プロモーター、好ましくは配列番号：１のヌクレオチド配列１−１９５６、またはそのフラグメントである。
レポーター遺伝子系の構築に用いることができる適当なレポーター遺伝子は、例えばホタルのルシフェラーゼ遺伝子、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【００３４】
本発明の別の特徴にしたがえば、以下の工程を含む医薬組成物の製造方法が提供される：
ｉ）本明細書に記載される方法にしたがってＩＢＤの治療に有用な化合物を特定し；さらに
ii）該化合物または医薬的に許容できるその塩を医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合する。
【００３５】
本発明のさらに別の特徴では診断方法が提供される。該方法は、患者から得られたＤＮＡサンプルで染色体１６の配列またはその部分をＩＢＤに対する感受性の判定のために分析することを含み、さらにＢＡＣ ５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、ＢＡＣ Ａ−２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）またはＢＡＣ ＣＴＤ−２５４７Ｇ２３（ＥＭＢＬ ＡＣ００８７４１）に一致する染色体フラグメントに存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無を判定することを含む。好ましくは、該方法は、患者から得られたＤＮＡサンプル中のＡＱＰ８遺伝子またはその一部分の配列をＩＢＤに対する感受性の判定のために分析することを含み、さらに患者のＡＱＰ８遺伝子に存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無を判定することを含む。
【００３６】
本発明のまた別の特徴では、ＡＱＰ８タンパク質上の自己免疫エピトープに対する免疫反応を調節する方法が提供される。好ましくは、本方法は免疫学的耐性を誘発する方法を含む。免疫学的耐性は、例えば自己抗原と結合させたV. cholera由来のコレラ毒素（ＣＴ）のＢサブユニットまたは大腸菌（E. coli）由来の易熱性毒素（ＬＴ）を用いた経口免疫によって誘発することができる（Simmons et al. 2001）。自己免疫反応は多数の炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、膵炎および多発性硬化症の原因であることが判明している。
【００３７】
本発明のまた別の特徴では、ＡＱＰ８タンパク質に対して向けられる自己抗体の測定を含むＩＢＤの診断方法が提供される。
【００３８】
略語
アクアポリン：ＡＱＰ
アクアポリン−８：ＡＱＰ８
罹患兄弟ペア：ＡＳＰ
細菌性人工染色体：ＢＡＣ
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：ＣＡＴ
クローン病：ＣＤ
センチモルガン：ＣＭ
コレラ毒素：ＣＴ
グリコサミノグリカン：ＧＡＧ
緑色蛍光タンパク質：ＧＦＰ
炎症性腸疾患：ＩＢＤ
易熱性毒素：ＬＴ
腎性尿崩症：ＮＤＩ
オンラインヒトメンデル遺伝：ＯＭＩＭ
ペディグリー不平衡検査（Pedigree disequilibrium test）：ＰＤＴ
配列付加部位：ＳＴＳ
伝達不平衡検査：ＴＤＴ
潰瘍性大腸炎：ＵＣ
【００３９】
以下の非限定的実施例を用いて本発明をこれから説明する。図１は、該実施例の、問題の染色体領域マップを示す。
アンプリタック（AMPLITAQ（登録商標））（Perkin-Elmer Cetusから入手できる）が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの供給源として用いられる。
以下の文献に記載されている方法のいずれかに由来する一般的な分子生物学的方法にしたがうことができる：“ Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis ( Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) または“Current Protocols in Molecular Biology Vol.1-3, F.M. Asubel, R. Brent and R.E. Kingston (eds), John Wiley発行, 1998。
【実施例１】
【００４０】
本発明者らは、ＳＴＳマーカーおよび未だ公表されていない単一ヌクレオチド多型による高密度遺伝子型決定を用い、続いて標準的な手順の連鎖不平衡検査（Terwillinger, 1995）にしたがって、ＩＢＤ１に関する感受性遺伝子を含む領域の範囲を物理的距離で約７Ｍｂと限定した。ＳＴＳマーカー、Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９とそれぞれ隣接する領域全体に及ぶＴＤＴ検査によって（合計３２マーカー（１３のＳＴＳおよび１９のＳＮＰ）を用いた）最初の連鎖データが確認され、さらに２つの部位における連鎖のゆがみが明らかにされた。本発明者らのデータは、ＩＢＤ１に対する感受性遺伝子が、Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９に隣接する領域におそらく位置することを示した。
【００４１】
１.１  家族確認および表現型：
患者は以下の施設のＩＢＤプログラムから募集された：Charite University Hospital (Berlin)およびthe Ist Department of Medicine at the Christian-Albrechts-University of Kiel。ＩＢＤと診断された２人以上の罹患兄弟を有する小児をサンプルとし、２５０を越える罹患兄弟ペアーが本分析に含まれた。書面によるインフォームドコンセントを全ての研究参加者から得た。募集プロトコルは院内の監査委員会で承認された。ＩＢＤの診断およびＣＤおよびＵＣにおける分類は、Lennard-Jones（1989）およびPodolsky（1991）が記載した標準的な診断基準によって判定した。患者は１人または２人以上の研究責任者が直接診察した。また別には詳細な病歴および全ての診断過程の結果を記載した２つの記録書を各患者について入手し、研究責任者が概覧した。静脈血サンプルを罹患兄弟および可能な場合にはその両親から得た。
【００４２】
１.２  遺伝子型決定：
ピュアージーンシステム（Puregene System）（Gentra Systems）を用いて全血サンプルからゲノムＤＮＡを調製した。個々のＤＮＡサンプルを９６ウェルのマイクロタイタープレートに並べ、個々のマーカーアンプリコンを用いてＰＣＲによる増幅を実施した。マイクロサテライトマーカーを文献（Hall and Nanthakumar (1997)）に記載されたように蛍光法で遺伝子型決定した。データは、ＡＢＩ３７７自動配列決定装置を用いて収集し、データ分析はＧＥＮＥＳＣＡＮ（バージョン２.１）およびＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（バージョン１.１.１）を用いて実施した。対立遺伝子分析および個々のアレルコーリングは、Hall and Nanthakumar (1997)およびIdury and Cardon (1997)が記載したように実施した。ＳＮＰはＡＢＩ３７００自動配列決定装置、ｃＤＮＡ選別および変異検出方法を用いゲノム配列決定によって特定した。情報量の多いＳＮＰの遺伝子型決定は、タックマン（TAQMAN（登録商標））技術（PE Biosystems）を用いるリアルタイムＰＣＲによって実施した。ＰＣＲ反応はＡＢＩ９７００で実施し、蛍光の結果はＡＢＩ７７００シークェンス−ディテクターシングルポイント測定を用いて判定した。対立遺伝子分析および個々の対立遺伝子コーリングは、Hall and Nanthakumar (1997)の記載にしたがって実施した。遺伝子マップは自動マッピングプログラムＭＵＬＴＩＭＡＰ（バージョン２．０、Matise et al. 1994）を用いて構築した。得られたマーカー間の距離（Ｋｏｓａｍｂｉマップアルゴリズムによって決定）はセンチモルガン（ｃＭ）で示される。
【００４３】
１.３  遺伝解析：
遺伝解析は前述の２つの標準的診断カテゴリー、ＣＤおよびＵＣを使用して実施した。第三のカテゴリー、ＡＬＬはＣＤ／ＣＤ、ＵＣ／ＵＣおよびＣＤ／ＵＣ（混合ＡＳＰ）を含み、したがってＩＢＤを分析用単一表現型として表す。各マーカーの対立遺伝子頻度は全ての個体についてのコホート遺伝子型決定データから計算した。関連の統計はＡＮＡＬＹＺＥソフトウェアパッケージのＴＤＴＬＩＫＥプログラムによって計算した（Terwilliger 1995）。検査する対立遺伝子は１０人以上に観察された伝達に限定される。プログラムアルゴリズムは多数の対立遺伝子の検査について修正されたｐ値を提供する。
【００４４】
Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９間の領域のマーカー（１ＳＴＳ，３ＳＮＰ）に関する配列情報
2004534531.tif 000003
【００４５】
ＩＢＤの２００罹患兄弟ペア（ＡＳＰ）の１６ｐ上の陽性マーカーに対するＴＤＴの結果
ａ）ＴＤＴＬＩＫＥ（Terwilliger, 1995）
【表１】
2004534531.tif 000004
【００４６】
ｂ）ＰＤＴ（Martin et al. 2000）
【表２】
2004534531.tif 000005
強い関連が、検査したＳＮＰの３つと同様にＤ１６Ｓ３０６８マーカーについて認められた。
【００４７】
１.４  生物情報科学：
染色体１６に由来する３つのヒトＢＡＣ、マーカーＤ１６Ｓ３０６８を含むＲＰ１１−４５１Ｎ２０（ＥＭＢＬ ＡＣ０６０７８５）、５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、Ａ−２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）を、ＢＡＣ ＣＴＤ−２５４７Ｇ２３（ＥＭＢＬ ＡＣ００８７４１）（部分的にＢＡＣ Ａ−２４９Ｂ１０とオーバーラップする）と同様に潜在的疾患関連遺伝子について解析した。ＡＱＰ８ｃＤＮＡと一致する配列がＢＡＣ ＣＴＤ−２５４７Ｇ２３（ＥＭＢＬ ＡＣ００８７４１）で見出された。
このＢＡＣの配列（ＥＭＢＬで登録番号ＡＣ００８７４１として入手できる）（３４の順不同のフラグメントを含む）をさらに分析し、１つのフラグメントはＡＱＰ８遺伝子（１．９ｋｂのプロモーター領域を含む）を含むことが判明した。
【００４８】
１.５  ＡＱＰ８遺伝子のＳＮＰの特定：
ＡＱＰ８遺伝子のプロモーター領域とともにエキソンに隣接するＤＮＡ配列を基にしてＰＣＲプライマーを構築する。ＰＣＲ増幅の後で、２３人のＩＢＤ罹患個体および２０人の正常コントロールから得られたゲノムＤＮＡサンプル由来のエキソンおよびプロモーター領域の配列を決定する。１０％を越える個体に存在する配列の変異体を特定し、上記で述べたタックマン（登録商標）技術を用いてコホートの残りのＳＮＰの遺伝子型決定のために選択する。
【００４９】
１.６  患者のＩＢＤ感受性を診断する方法：
患者からＤＮＡサンプルを得る。ＩＢＤに対する感受性増加に関連する１つまたは２つ以上の多型マーカーの対立遺伝子の有無を、例えばタックマン（登録商標）技術を用いて判定する。
【００５０】
１.７  ＡＱＰ８アッセイ：
ＡＱＰ８活性は、リコンビナントＡＱＰ８を発現する酵母に由来する酵母の分泌小胞の水の透過性として測定される。
酵母株およびプラスミドの構築：ＡＱＰ８（配列番号：１）をコードするｃＤＮＡを酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Invitrogen, San Diego, CA）で標準的技術（Sambrook et al. 1989）によってクローニングする。酵母のＳＹ１株（Potenza et al. 1992）を、例えばバイオラド（Bio-Rad）遺伝子パルサー（設定は１．５ｋＶ、２００ｏｈｍで２５μＦ）を用いて電気穿孔によって形質転換する。形質転換した酵母を増殖させ、さらに、ウラシルを欠き、炭素源としてラフィノースを含有する限定的培地で維持する。酵母を栄養豊富な酵母抽出物／ペプトン（ＹＥＰ）−ガラクトース培地（０．５％酵母抽出物（ｗ／ｖ）、１.０％バクトペプトン（ｗ／ｖ）および２.０％ガラクトース（ｗ／ｖ））に２５℃で２〜４時間移してタンパク質発現を開始させ、続いて３７℃に一晩切り換えて分泌小胞を蓄積させる。コントロール実験は、バックグラウンド株またはＡＱＰ８挿入物を欠くｐＹＥＳ２ベクターで形質転換した酵母から調製した小胞を用いて実施する。
【００５１】
イムノブロッティング：サンプルを６０−８０℃で５分インキュベートし、続いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。該電気泳動では、４−２０％連続グラディエントのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）−Ｃｌ−グリシンレディゲル（Ready Gel）または１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブを用い、さらにニトロセルロース（Bio-Rad）に移す。リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２５）中の１％粉乳および３％トゥイーン２０から成るブロット緩衝液でブロットをブロックする。抗ＡＱＰ８抗体とともにブロットを一晩４℃でインキュベートし、続いて例えば強化化学発光法（NENまたはAmersham）によって可視化する。
【００５２】
小胞の調製：１００ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ９.４）中の１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で酵母を処理し、細菌で発現させたリコンビナントリチカーゼにより細胞壁を消化することによってスフェロプラストを作製する。細胞質膜をコンカナバリンＡで架橋して、その密度を分泌小胞の密度より高くする。スフェロプラストを５,６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）（７.５ｍｇ／ｍＬ）を含む溶解緩衝液（０.８Ｍソルビトール、１０ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.２）で溶解し、未溶解細胞およびコンカナバリン架橋細胞質膜をソーバルＧＳＡローターで１１０００ｒｐｍ（２０,０００ｇ）１０分、４℃でペレットにする。上清から小胞をペレットにし、さらにソーバルＴＨ−６４１スィングバケットローターで１時間４℃で遠心する（２９０００ｒｐｍ、１４４０００ｇ）ことによって洗浄し小胞外ＣＦを除去する。
【００５３】
水の透過性：溶解中にＣＦをロードされた酵母小胞の完全性は、その蛍光の強さを分光蛍光測定器（例えばＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ ＳＰＦ−５００Ｃ）で最初に測定することによって実証される。続いて小胞外ＣＦを抗ＣＦ抗体の添加によってクエンチし、浸透圧上昇剤（osmoficant）としてシュクロースを用いた高浸透圧溶液の連続添加によって小胞を収縮させる。酵母小胞を液流停止（stopped-flow）装置（例えばApplied Photophysics SF7mv）にロードする。小胞に対して急激に浸透圧を二倍すると小胞は縮み、ＣＦはセルフクエンチする。浸透圧膜の水の透過性は、酵母小胞の初期縮み速度から計算される。
【００５４】
前記アッセイは、縮みおよびＣＦのセルフクエンチによる蛍光の減少を惹起させるようにデザインされる。蛍光の減少を測定し、容積の減少に対して修正を実施する。蛍光は、４９０±１ｎｍの入射光および５１０ｎｍを越える波長で放出される光を測定するカットオンフィルターを用いて測定される。
【００５５】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】染色体領域マップを示す。
【国際公開パンフレット】
2004534531.tif 000006
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2004534531.tif 000038
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534531.tif 000039
2004534531.tif 000040
【国際調査報告】
2004534531.tif 000041
2004534531.tif 000042
2004534531.tif 000043
2004534531.tif 000044
2004534531.tif 000045