(57)【要約】ＢＰＩタンパク質産物またはそのインヒビターに関連する周皮細胞および上皮細胞の増殖を調節するための、方法および材料が提供される。周皮細胞の増殖を増強する方法であって、この方法は、周皮細胞の増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。糖尿病性網膜症の発症が予防される方法。前記被験体が、糖尿病性多発性神経障害、糖尿病性神経障害、周皮細胞変性後の骨格筋変性、および他の器官の糖尿病合併症からなる群より選択される糖尿病の合併症に罹患している、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
周皮細胞の増殖を増強する方法であって、該方法は、周皮細胞の増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
糖尿病性網膜症の発症が予防される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体は、糖尿病性多発性神経障害、糖尿病性神経障害、周皮細胞変性後の骨格筋変性、および他の器官の糖尿病合併症からなる群より選択される糖尿病の合併症に罹患している、方法。
【請求項４】
前記被験体が、周皮細胞に対する自己抗体の存在に関連する疾患に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、卵巣不全に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が、多発性硬化症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体が、アルツハイマー病、または外傷性脳損傷、または血液脳関門の混乱に関与する他の状態、または部分発作に罹患している、方法。
【請求項９】
前記被験体が妊娠しており、かつ胎盤の発達が増強されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体が、創傷治癒を必要としており、そして前記ＢＰＩタンパク質産物が、線維芽細胞の増殖を増強するに有効な量および条件下で投与される、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体が、骨変性性障害を被っており、そして前記ＢＰＩタンパク質産物が、軟骨芽細胞または骨芽細胞の増殖を増強するに有効な量および条件下で投与される、方法。
【請求項１２】
周皮細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、ＢＰＩタンパク質産物誘導性の周皮細胞増殖を阻害する薬剤の有効量を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
前記被験体が、高血圧症に罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記被験体が、血管のカルシウム沈着およびアテローム硬化性プラークの形成、アテローム硬化症、再狭窄、脳血管性虚血、発作、冠状動脈疾患、心筋虚血、心筋梗塞、末梢血管疾患、レーノー症候群、末梢動脈の初期閉塞、および肺高血圧症に関連する血管再構築からなる群より選択される血管疾患に関連する障害に罹患している、方法。
【請求項１５】
前記被験体が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が、子宮内膜症または腺筋症に罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
網膜上皮細胞増殖を増強する方法であって、該方法は、網膜上皮細胞の増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記被験体が、色素性網膜炎に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、加齢性黄斑変性に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＢＰＩタンパク質産物が、約２０ｋＤ〜２５ｋＤの分子量を有するＢＰＩタンパク質のアミノ末端フラグメントまたはその二量体形態である、方法。
【請求項２１】
前記ＢＰＩタンパク質産物が、ＢＰＩ由来のペプチドである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＰＩ由来のペプチドが、ＸＭＰ．６７９である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＢＰＩ誘導性周皮細胞増殖の候補インヒビターをスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＢＰＩタンパク質産物の存在下、かつ試験化合物の存在下および非存在下で、周皮細胞の増殖を検出する工程；ならびに
（ｂ）該周皮細胞増殖が、該試験化合物の存在下で減少する場合に、ＢＰＩ誘導性増殖の候補インヒビターとして、該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
周皮細胞増殖を増強する能力についてＢＰＩタンパク質産物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＢＰＩタンパク質産物の存在下および非存在下で、周皮細胞増殖を検出する工程；ならびに
（ｂ）該周皮細胞増殖が、ＢＰＩタンパク質産物の存在下で増大する場合に、周皮細胞増殖の候補増強剤として該ＢＰＩタンパク質産物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
周皮細胞増殖の候補増強剤についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）試験化合物の存在下および非存在下で、周皮細胞増殖を測定する工程；
（ｂ）該試験化合物およびＢＰＩタンパク質産物の存在下で、周皮細胞増殖を測定する工程であって、該ＢＰＩタンパク質産物は、周皮細胞増殖を増強するに有効な濃度である、工程；ならびに
（ｃ）周皮細胞増殖が、工程（ａ）において増大するが、工程（ｂ）においてさらには増大しない場合に、周皮細胞増殖の候補増強剤として該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
周皮細胞増殖の候補増強剤についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）試験化合物の存在下および非存在下で、周皮細胞増殖を測定する工程；
（ｂ）該試験化合物およびＢＰＩタンパク質産物の存在下で周皮細胞増殖を測定する工程であって、該ＢＰＩタンパク質産物は、周皮細胞増殖を増強するに有効な濃度である、工程；ならびに
（ｃ）工程（ａ）において測定した周皮細胞増殖の増大が、工程（ｂ）において測定した周皮細胞増殖の増大とほぼ同じであるかまたはそれ未満である場合に、周皮細胞増殖の候補増強剤として該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
上皮細胞増殖を増強する方法であって、該方法は、上皮細胞の増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記被験体が、色素性網膜炎または加齢性黄斑変性に罹患している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上皮細胞のＢＰＩ誘導性増殖の候補インヒビターについてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＢＰＩタンパク質産物の存在下、かつ試験化合物の存在下および非存在下で、上皮細胞増殖を検出する工程；ならびに
（ｂ）該上皮細胞増殖が、該試験化合物の存在下で減少する場合に、ＢＰＩ誘導性の増殖の候補インヒビターとして該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
上皮細胞増殖を増強する能力についてＢＰＩタンパク質産物スクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＢＰＩタンパク質産物の存在下および非存在下で、上皮細胞増殖を検出する工程；ならびに
（ｂ）該上皮細胞増殖が、該ＢＰＩタンパク質産物の存在下で増大する場合に、上皮細胞増殖の候補増強剤としてＢＰＩタンパク質産物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
上皮細胞増殖の候補増強剤についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）試験化合物の存在下および非存在下で、上皮細胞増殖を測定する工程；
（ｂ）該試験化合物およびＢＰＩタンパク質産物の存在下で、上皮細胞増殖を測定する工程であって、該ＢＰＩタンパク質産物は、上皮細胞増殖を増強するに有効な濃度である、工程；ならびに
（ｃ）上皮細胞増殖が、工程（ａ）において増大するが、工程（ｂ）においてさらには増大しない場合に、上皮細胞増殖の候補増強剤として該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、増殖が、ＭＡＰキナーゼのリン酸化の量を測定することによって決定される、方法。
【請求項３３】
糖尿病誘導性の網膜血管透過性を有する被験体において、周皮細胞増殖を増強する方法であって、該方法は、周皮細胞増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記糖尿病誘導性の網膜血管透過性が減少する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
周皮細胞変性障害に罹患している被験体において、周皮細胞増殖を増強する方法であって、該周皮細胞変性疾患は、糖尿病の合併症、周皮細胞に対する自己抗体の存在に関連する疾患、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、卵巣不全、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、血液脳関門の混乱に関連する状態、部分発作、または妊娠中の胎盤発達であり、該方法は、周皮細胞増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
創傷治癒を必要とする被験体において細胞増殖を増強する方法であって、該方法は、線維芽細胞の生成を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
骨変性性障害に罹患している被験体において細胞増殖を増強するための方法であって、該方法は、軟骨芽細胞または骨芽細胞の生成を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
周皮細胞増殖が有害である状態に罹患している被験体において、周皮細胞増殖を減少するための方法であって、該状態は、高血圧症、血管カルシウム沈着、アテローム硬化性プラーク、アテローム硬化症、再狭窄、脳血管性虚血、発作、冠状動脈疾患、心筋虚血、心筋梗塞、末梢血管疾患、レーノー症候群、末梢動脈の初期閉塞、および肺高血圧症に関連する血管再構築、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、子宮内膜症または腺筋症であり、該方法は、ＢＰＩタンパク質産物誘導性周皮細胞増殖を阻害する量の薬剤を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
網膜上皮変性障害に罹患している被験体において、細胞増殖を増強するための方法であって、該網膜上皮変性障害は、色素性網膜炎または加齢性黄斑変性であり、該方法は、網膜上皮細胞増殖を増強するに有効な量のＢＰＩタンパク質産物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項のもと、２０００年１２月１日に出願された米国仮出願識別番号６０／２５０，５４２の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
一般的に、本発明は、望ましい周皮細胞増殖を増強するため、ＢＰＩタンパク質産物（例えばＢＰＩ由来のペプチド）の使用を含む、血管周囲の細胞増殖の調節に関連する、新規の治療上の使用に関する。さらに本発明は、有害な周皮細胞増殖を阻害するための、ＢＰＩタンパク質産物に誘導される周皮細胞増殖のインヒビターの使用にも関する。
【０００３】
（発明の背景）
微小血管の血管周囲の細胞（「周皮細胞」）は、インビボでのそれらの位置により定義される。この周皮細胞は、指の様な多数の突出部を有する、小さな卵形をした細胞であり、毛細管軸と平行し、そして微小血管中の内皮細胞を部分的に囲む。周皮細胞は、共通の基底膜を内皮細胞と共有する。これらは収縮能力を有する、伸長した細胞であり、種々の機能的特性を有することが観察される。周皮細胞は体内に広く分布しており、メサンギウム細胞（腎臓の糸球体内）、ルジェ細胞、または壁細胞（目の網膜中）を含む（ＨｉｒｓｃｈｉおよびＤ’Ａｍｏｒｅ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｏｃｔ；３２（４）：６８７−９８）。インビボおよびインビトロで観察される周皮細胞の機能的特性のいくつかは、内皮細胞の増殖および分化を調節すること、内皮細胞接合部の炎症性の漏出を悪化させるかまたは減少させるかのいずれかの様式で収縮させること、多岐にわたる血管作用性の自己調節アゴニストを合成および分泌すること、そして基底膜および細胞外マトリックスの構造上の構成成分を合成および放出することである（Ｓｈｅｐｒｏら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９３  Ａｕｇ；７（１１）：１０３１−８）。従って、周皮細胞は、血管収縮における役割、ならびに、毛細管血流、脈管形成、免疫応答（特に中枢神経系において）、および外因性の血液凝固経路における役割を果たすとみなされている。腎臓において、メサンギウム細胞の収縮性特性、ならびにそれらの種々の因子および構造タンパク質の合成は、糸球体の機能を調節するために役立つ（Ｓｃｈｌａｎｄｏｉｆｆ，１９８７，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１：２７２−８１）。
【０００４】
周皮細胞が、始原内皮により強化された未分化な間葉細胞から誘導され、次いで微小血管内で周皮細胞に、または大血管内で平滑筋細胞に分化することが示唆されている。周皮細胞はまた、多能性の前駆細胞であり、種々の異なる細胞型（骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、食細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞を含む）に分化することが示されている（Ｓｉｍｓ，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｅｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７：８４２−８４６）。周皮細胞は、鉱化した細胞外マトリックスの形成および骨芽細胞によってもまた発現される多数の遺伝子発現により、インビトロで骨芽細胞と類似の様式で作用する。これらの細胞はまた、インビボで、十分規定された骨マトリックス、軟骨、および線維組織を形成する（ＤｏｈｅｒｔｙおよびＣａｎｆｉｅｌｄ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  ９（１）：１−１７，１９９９；Ｈｉｒｓｃｈｉら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  Ｏｃｔ；３２（４）：６８７−９８，１９９６）。
【０００５】
この周皮細胞は、種々の病態（高血圧、アテローム硬化症、糖尿病（インスリン依存性およびインスリン非依存性の両方）の合併症、卵巣不全、多発性硬化症、および腫瘍脈管新生を含む）ならびに正常な加齢に関係している。
【０００６】
自然発生高血圧ラットの脳の微小血管は、比較的多数の周皮細胞、および内皮細胞に対する周皮細胞の増加した割合を有し、この微小血管の数は、ラットにおける慢性の高血圧の発症後に増加することが示されている。周皮細胞収縮は、脳の微小循環内の血流調節、ならびに、おそらく脳血管疾患の病因および開始において、極めて重要な役割を果たすことが示唆される（Ｈｅｒｍａｎ  ＩＭら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ  １９８７；１９（２）：１９７−２０６）。
【０００７】
周皮細胞は、内側の内膜内、外中膜、ならびに、ヒトの大動脈、中動脈、および小動脈の外膜の血管の血管内で同定されている。最近の研究は、動脈内の周皮細胞が、少なくとも一部、アテローム硬化症と通常関連する血管のカルシウム沈着の媒介を担い得ることを、示唆している（Ｃａｎｆｉｅｌｄら、Ｚ  Ｋａｒｄｉｏｌ  ２０００；８９  Ｓｕｐｐｌ  ２：２０−７）。粘液腫性組織は、ヒト冠状動脈病変の特徴的な構成成分であり、よりしばしば再狭窄病変において見出される。この組織は、遊離した支質に包埋されている未知の組織発生の星状の形をした細胞の大きな蓄積を示し、そして免疫応答に関係し得る。星状細胞は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、マクロファージ、および抗原提示樹状細胞の機能を共有する、不均一な集団を示した。いく人かの研究者は、粘液腫性組織の星状細胞が間葉細胞（おそらく周皮細胞）の特定の表現型を示し、この周皮細胞が抗原提示細胞のいくつかのマーカーを発現するように活性化されると結論している（Ｔｊｕｒｍｉｎら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｊａｎ；１９（１）：８３−９７）。
【０００８】
真性糖尿病において、周皮細胞は、血管障害、網膜症、多発性神経障害および腎症の発生に関与し得る。高血糖は、糖尿病性網膜症発生の極めて初期に、アポトーシス、および網膜の毛細管周皮細胞の喪失を促進し得る（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、１９９７  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２３：３０−４２；ＨｉｒｓｃｈｉおよびＤ’Ａｍｏｒｅ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｏｃｔ；３２（４）：６８７−９８）。糖尿病における網膜周皮細胞の変性に対する感受性は、それらの糖尿病の代謝性損傷に応答して再増殖する低い能力（例えば、脳の周皮細胞と比較して）に起因することが示唆されている（Ｗｏｎｇら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９２  Ｓｅｐ；３５（９）：８１８−２７）。目における周皮細胞／内皮細胞比（１つの内皮細胞につき１つの周皮細胞）にはまた、その他の場所（神経系は１：２であり、末梢は１：２０である）と比して、差異が存在する（Ｓｐｅｉｓｅｒら、１９６８  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ８０：３３２−３３７；ＯｒｌｉｄｇｅおよびＤ’Ａｍｏｒｅ、１９８７，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：１４５５−１４６２；Ｓｉｍｓら、１９９４  Ａｎａｔ  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  ２３：２３２−２３８）。周皮細胞の変性はまた、糖尿病性の多発性神経障害の発生を進めることが観察されており、そして、その重症度と関連している（Ｇｉａｎｎｉｎｉら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９５  Ａｐｒ；３７（４）：４９８−５０４）。周皮細胞は、糖尿病性の網膜症で観察される、糸球体の毛細管基底膜の肥厚に関わっている（Ｋｅｙｓら、２０００，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１４：４３９−４７）。糖尿病の間、メサンギウム細胞は、種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の、増加した合成を示す。このＥＣＭの増加した合成はまた、低下したＥＣＭの分解に付随する。ＥＣＭ分解を担う主要な酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）として集団的に知られている多数の群の酵素である。このメサンギウム細胞とその細胞周囲のマトリックスとは、極めて活性なプラスミノーゲンカスケードを有する。このプラスミノーゲンカスケードは、ＭＭＰを活性化することにより、直接的と間接的との両方でマトリックス分解を媒介するために、プラスミンを局所的に遊離させ得る。従って、メサンギウム細胞の変性が糖尿病性の腎症で見られるＥＣＭ分解の減少を媒介することは、可能である（ＭｃＬｅｎｎａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｔ）１９９９  Ｆｅｂ；４５（１）：１２３−３５）。
【０００９】
周皮細胞の変性はまた、卵巣不全の動物モデルにおいても観察される。テストステロンプロピオン酸塩で処置された成体メスラットの卵巣と中年のメスラットの無排卵の卵巣との両方が、間質腺内の、血管の周皮細胞、Ｔ細胞、および樹状細胞の変性を示した。卵巣のステロイド産生細胞の機能が、間葉細胞によって調節され得るようである（Ｂｕｋｏｖｓｋｙａら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ２０００  Ａｐｒ；６５（４）：１９０−２０５）。
【００１０】
周皮細胞集団の変化はまた、加齢中にも観察される。脳の微小血管系における、加齢性の変化における局所バリエーションが存在するようである。前頭皮質および海馬において、周皮細胞のミトコンドリアの増加に付随して、年齢の増加と共に基底膜の増加が存在するようである。前頭皮質では、毛細管管腔領域は増大するが、海馬では、毛細管管腔領域は縮小する（Ｈｉｃｋｓ  Ｐ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  １９８３  Ｓｐｒｉｎｇ；４（１）：６９−７５）。加齢ラットの脳は、頭頂葉皮質において増加した神経膠星状細胞および周皮細胞集団を有することが見出されている（Ｐｅｉｎａｄｏ  ＭＡら、Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  １９９８  Ｏｃｔ  １：４３（１）：３４−４２）。超微細構造的なレベルで、大脳の微小血管の種々の異常に直面する。これらの異常は、変性過程または、血管周囲の、例えば膠原原線維および他のタンパク質性の細片の沈着のいずれかに帰因し得る（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９９２  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１３（１）：７３〜８１）。
【００１１】
当該、Ｈｕら、Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８９年４月；７０（２）：１１３−２４での公開では、ヘパリンによるマウスの間欠的な処置が、低酸素により引き起こされる右心室肥厚を減少させること；ヘパリンの投与が、特に、周皮細胞が前駆体平滑筋細胞である肺胞間レベルで、筋肉化された動脈の割合を減少させることが示されている。ヘパリン様分子がインビトロでの肺血管の周皮細胞増殖を阻害するという報告（Ｋｈｏｕｒｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７９：Ｌ２５２−Ｌ２６１，２０００）もまた参照のこと。
【００１２】
従って、周皮細胞増殖を調節する薬剤の必要性が存在する。周皮細胞の増殖が望ましい状態では、増強されるべきこのような増殖を許容または増強する薬剤の必要性が存在する。周皮細胞の増殖が有害な状態では、このような増殖を阻害する薬剤の必要性が存在する。
【００１３】
ＢＰＩは、進入する微生物に対する防御に必須の血液細胞である、哺乳動物の多形核球（ＰＭＮまたは好中球）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトＢＰＩタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー（Ｅｌｓｂａｃｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１１０００（１９７９））またはＥ．ｃｏｌｉアフィニティークロマトグラフィー（Ｗｅｉｓｓら、Ｂｌｏｏｄ，６９：６５２（１９８７））のいずれかと組み合わせた酸抽出により、ＰＭＮから単離された。このような様式で得られたＢＰＩは、本明細書中で天然のＢＰＩと呼ばれ、そしてグラム陰性細菌の広域抗菌スペクトルに対し強力な殺菌活性を有することが示されている。このヒトＢＰＩの分子量は、約５５，０００ダルトン（５５ｋＤ）である。この完全なヒトＢＰＩタンパク質のアミノ酸配列とこのタンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列とは、本明細書中で参考文献として援用されている、米国特許第５，１９８，５４１号と、Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：９５０５（１９８９）の図１とに報告されている。Ｇｒａｙらの核酸配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号１および２で示される。米国特許第５，１９８，５４１号は、ＢＰＩホロタンパク質およびＢＰＩのフラグメントを含むＢＰＩタンパク質をコードする組換え遺伝子およびこのＢＰＩタンパク質の発現のための方法を開示する。位置１５１のバリンがＧＴＣではなくＧＴＧによって特定され、残基１８５がリジン（ＡＡＧによって特定される）ではなくグルタミン酸（ＧＡＧによって特定される）、そして残基４１７がバリン（ＧＴＴによって特定される）ではなくアラニン（ＧＣＴによって特定される）である、組換えヒトＢＰＩホロタンパク質もまた、産生されている。ＢＰＩは、強いカチオン性タンパク質である。ＢＰＩのＮ末端側半分は、高い正味の正電荷を担い；この分子のＣ末端側半分は、正味−３の電荷を有する（ＥｌｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓ（１９８１）、前出）。分子量約２５ｋＤを有する、ＢＰＩの蛋白質分解性のＮ末端フラグメントは、天然に誘導された５５ｋＤのヒトＢＰＩホロタンパク質の抗菌効果の実質的に全てを有する（Ｏｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６２：１４８９１−１４８９４（１９８７））。Ｎ末端部とは対照的に、単離されたヒトＢＰＩタンパク質のＣ末端領域は、僅かにのみ検出可能な、グラム陰性生物に対する抗菌活性を示す（Ｏｏｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６４９（１９９１））。「ｒＢＰＩ２３」と呼ばれる約２３ｋＤのＮ末端ＢＰＩフラグメントは、組み換え手段により産生されており、そしてまたグラム陰性の生物に対し抗菌活性を保持する（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４７５４−４７６１（１９９２））。ｒＢＰＩ２１（またｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａｌ３２とも呼ばれる）を表わすＮ末端アナログは、米国特許第５，４２０，０１９号に記載されている。
【００１４】
このＢＰＩの抗菌効果はグラム陰性種に非常に特異的であることが、元来報告されている（例えば、ＥｌｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓ、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，Ｇａｌｌｉｎら編、第３０章、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ（１９９２））。ＢＰＩがグラム陰性細菌を殺す正確なメカニズムは、まだ完全に解明されていないが、ＢＰＩは、カチオン性ＢＰＩタンパク質とＬＰＳ上の負に荷電した部位との間の静電気的相互作用および疎水的相互作用を介して、最初に細菌の表面に結合するに違いないと考えられている。感受性のグラム陰性細菌において、ＢＰＩ結合はＬＰＳ構造を崩壊すると考えられ、リン脂質およびペプチドグリカンを分解する細菌性酵素の活性化を導き、細胞の外膜の透過性を変化させ、そして最終的に細胞死を導く事象を開始する（ＥｌｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓ（１９９２）、前出）。ＬＰＳは、強力な炎症性応答（すなわち、不可逆性の内毒素性ショックを最終的に生じ得る、宿主の炎症性細胞による媒介物質の放出を刺激する）に起因して、「内毒素」と呼ばれる。脂質Ａに結合するＢＰＩは、ＬＰＳの最も有毒且つ最も生物学的に活性な成分であると報告されている。
【００１５】
ＢＰＩタンパク質産物は、広範な種々の有益な活性を有する。ＢＰＩタンパク質産物は、グラム陰性細菌に対して殺菌性である（米国特許第５，１９８，５４１号、同第５，６４１，８７４号、同第５，９４８，４０８号、同第５，９８０，８９７号および同第５，５２３，２８８号に記載される）。国際公開番号ＷＯ９４／２０１３０は、ＢＰＩタンパク質産物を用いて、グラム陰性細菌のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属由来の種による（例えば、胃腸の）感染症に罹患している被験体を処置する方法を提唱する。ＢＰＩタンパク質産物はまた、グラム陰性細菌の感染における抗生物質療法の効果を増強する（米国特許第５，９４８，４０８号、同第５，９８０、８９７号、および同第５，５２３，２８８号ならびに国際公開番号ＷＯ８９／０１４８６（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２７００）およびＷＯ９５／０８３４４（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２５５）に記載される）。ＢＰＩタンパク質産物はまた、グラム陽性細菌感染およびマイコプラズマに対しても殺菌性であり、かつグラム陽性細菌の感染における抗体の効力を増強する（米国特許第５，５７８，５７２号および同第５，７８３，５６１号ならびに国際公開番号ＷＯ９５／１９１８０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００６５６）に記載される）。ＢＰＩタンパク質産物は、抗真菌性活性を示し、かつ他の抗真菌性薬剤の活性を増強する（米国特許第５，６２７，１５３号および国際公開番号ＷＯ９５／１９１７９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００４９８）に記載され、さらにＢＰＩ由来ペプチドに関して、米国特許第５，８５８，９７４号に記載される（米国特許第５，８５８，９７４号はまた、米国出願番号第０８／５０４，８４１号および対応する国際公開番号ＷＯ９６／０８５０９号（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）およびＷＯ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）ならびに米国特許第５，７３３，８７２号、同第５，７６３，５６７号、同第５，６５２，３３２号、同第５，８５６，４３８および対応する国際公開番号ＷＯ９４／２０５３２（ＰＣＴ／ＵＳ／９４／０２４６５）およびＷＯ９５／１９３７２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０４２７）の一部継続出願である）。ＢＰＩタンパク質産物は、抗原虫活性を示す（米国特許第５，６４６，１１４号および同第６，０１３，６２９号ならびに国際公開番号ＷＯ９６／０１６４７（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８６２４）に記載される）。ＢＰＩタンパク質産物は、抗クラミジア属活性を示す（共有に係る米国特許第５，８８８，９７３号およびＷＯ９８／０６４１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３８１０）に記載される）。最後に、ＢＰＩタンパク質産物は、抗マイコバクテリウム活性を示す（共有に係る同時係属中の米国出願番号第０８／６２６，６４６号に記載され、米国出願番号第０８／６２６，６４６号はまた、米国出願番号第０８／２８５，８０３号の継続出願であり、米国出願番号第０８／２８５，８０３号はまた、米国出願番号第０８／０３１，１４５号および対応する国際公開番号ＷＯ９４／２０１２９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４６３）の一部継続出願である。
【００１６】
循環する内因性毒素を有するヒトにおけるＢＰＩタンパク質産物の効果（ＴＮＦ、ＩＬ−６および内毒素への効果を含む）は、米国特許第５，６４３，８７５号、同第５，７５３，６２０号、および同第５，９５２，３０２号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ／９５／１９７８４（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１１５１）に記載される。
【００１７】
ＢＰＩタンパク質産物はまた、特定の疾患状態（例えば、ヒトにおける髄膜炎菌血症（米国特許第５，８８８，９７７号および同第５，９９０，０８６号ならびに国際公開番号ＷＯ９７／４２９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８０１６）に記載される）、ヒトにおける外傷に起因する出血（米国特許第５，７５６，４６４号および同第５，９４５，３９９号、米国出願番号第０８／８６２，７８５号および対応する国際公開番号ＷＯ９７／４４０５６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８９４１）に記載される）、火傷傷（米国特許第５，４９４，８９６号および対応する国際公開番号ＷＯ９６／３００３７（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２３４９）に記載される）、虚血／再灌流障害（米国特許第５，５７８，５６８号に記載される）、および抑制されたＲＥＳ／肝臓切除（共有に係る同時係属中の米国出願番号０８／５８２，２３０号（米国出願番号第０８／５８２，２３０号はまた、同第０８／３１８，３５７号の継続出願であり、同第０８／３１８，３５７号はまた、同第０８／１３２，５１０号、および対応する国際公開番号ＷＯ９５／１０２９７（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４０４）の一部継続出願である）に記載される）の処置に有用である。
【００１８】
ＢＰＩタンパク質産物はまた、内因性ヘパリンの抗血液凝固活性を中和し（米国特許第５，３４８，９４２号に記載される）、インビトロで、ヘパリンを中和し（米国特許第５，８５４，２１４号に記載される）、そして慢性関節リウマチおよび反応性関節炎のような慢性炎症性疾患の処置、上皮細胞の増殖の阻害、ならびに悪性腫瘍、眼の網膜症および子宮内膜炎を含む、新血管形成関連障害の処置に有用である（米国特許第５，６３９，７２７号、同第５，８０７，８１８号、および５，８３７，６７８号ならびに国際公開番号ＷＯ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）に記載される）。
【００１９】
ＢＰＩタンパク質産物はまた、抗トロンビン法において有用である（米国特許第５，７４１，７７９号および同第５，９３５，９３０号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９７／４２９６７（ＰＣＴ／ＵＳ７／０８０１７）に記載される）。
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、網膜の壁細胞および腎臓の血管間膜細胞を含む、周皮細胞の増殖を調節する新規の治療方法を提供する。周皮細胞増殖が所望される状態において、本発明は、周皮細胞増殖を増強するために、治療有効量のＢＰＩタンパク質産物を用いる方法を提供する。そのような状態としては、糖尿病の合併症（インスリン依存およびインスリン非依存の両方）、周皮細胞に対する自己抗体の存在に関連する他の疾患、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、卵巣不全、多発性硬化症、アルツハイマー病、外傷性脳障害または血液脳関門の混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）、部分発作、および妊娠時における胎盤の発達を含む他の状態が挙げられる。特に、真性糖尿病の後遺症としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性多発性神経障害、糖尿病性腎症、周皮細胞変性後の骨格筋変性、または他の組織の合併症が挙げられる。
【００２１】
周皮細胞増殖が有害である状態において、本発明は、ＢＰＩタンパク質産物によって誘導される型の増殖を阻害し得る治療有効量のインヒビター（例えば、ＢＰＩタンパク質産物に結合し得るかまたはそのレセプターもしくはリガンドとの相互作用を阻害し得る抗体または他の薬剤）を用いて周皮細胞の増殖を阻害するか、そうでなければ、そのレセプターもしくはリガンド、あるいはＢＰＩタンパク質を認識する周皮細胞レセプターのアンタゴニストとの相互作用を阻害する方法を提供する。そのような状態としては、高血圧、血管性疾患、血管石灰化およびアテローム硬化症斑の形成を含むアテローム硬化症、再狭窄、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、子宮内膜症または腺筋症、および通常の老化が挙げられる。特に、高血圧、アテローム硬化症および他の血管疾患の後遺症としては、脳血管性の虚血または発作、冠状動脈疾患および心筋虚血または心筋梗塞、末梢血管疾患、レーノー症候群、末梢動脈の早期閉塞あるいは肺高血圧症に関連する血管再造形が挙げられる。
【００２２】
本発明に従うＢＰＩタンパク質産物の使用は、周皮細胞の増殖またはその変性によって媒介されるかまたは悪化する疾患状態（ｓｔａｔｅ）または疾患状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の予防的処置または治療的処置のために、哺乳動物（特にヒト）において特に企図される。
【００２３】
研究は、分化していない間葉細胞または線維芽細胞が、毛細血管周皮細胞へと変換し、次いでその毛細血管周皮細胞が、血管平滑筋および他の関連する細胞（例えば、脂肪細胞、骨芽細胞、および食細胞）へと変換することを示唆する（Ｒｈｏｄｉｎ＆Ｆｕｊｉｔａ  １９８９  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ  Ｃｙｔｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１：１−３４；Ｄｏｈｅｒｔｙ＆Ｃａｎｆｉｅｌｄ  １９９９  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐ  ９（１）：１−１７））。従って、周皮細胞由来の骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、食細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞の産生および形成を増強し、それに従い、損傷した組織を（例えば、創傷において）修復または置換するための方法がさらに提供される。そのような細胞自体の増殖を増強することに加えて、ＢＰＩタンパク質（ＢＰＩ由来ペプチドを含む）は、周皮細胞の、特定の細胞型への分化を増強するか、または最終的に分化した細胞型の増殖の増加を増強すると予想され得る。そのような方法は、種々の状態において有用である（創傷治癒、骨折、または骨の変性障害の処置を増強することを含む）ことが予想される。
【００２４】
例示的なＢＰＩタンパク質産物としては、組換え産生された、ＢＰＩのＮ−末端アナログまたはフラグメント、特に、約２０ｋＤと２５ｋＤとの間の分子量を有するタンパク質（例えばｒＢＰＩ２１、ｒＢＰＩ２３、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ（ｒＢＰＩ（１０〜１９３）ａｌａ１３２とも示される）、それらのＮ末端ポリペプチドの二量体形態（例えば、ｒＢＰＩ４２二量体）、あるいはＢＰＩ由来ペプチドが挙げられる。例示的なＢＰＩ由来ペプチドとしては、ＢＰＩドメインＩＩ由来ペプチド（例えば、ＸＭＰ．６７９（配列番号３））が挙げられ、その構造および活性は、共有に係る米国第０９／６０２，８１１号（２０００年６月２３日出願）に記載され、この米国第０９／６０２，８１１号は、米国第０９／３４４，２１９号（１９９９年６月２５日出願）の一部継続出願である（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【００２５】
ＢＰＩタンパク質産物の投与が、状態に依存して、他の治療的薬剤（例えば、周皮細胞の増殖を増強する増殖因子またはそのような増殖因子のインヒビター）の同時投与に伴われ得ることが企図される。
【００２６】
本発明はまた、周皮細胞の増殖を増強する他のＢＰＩタンパク質産物についてスクリーニングする方法も提供する。そのような方法は、例えば、ＢＰＩタンパク質産物の存在下および必要に応じてその非存在下で、周皮細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を検出または測定する工程を包含する。必要に応じて、そのスクリーニング方法は、増殖が所望の効果を生じるような周皮細胞増殖の動物モデルにおいて、選択された候補化合物を試験するさらなる工程を含む。このスクリーニング方法はまた、選択された候補化合物を、内皮細胞増殖または血管新生（脈管形成）を阻害する能力について試験するさらなる工程を包含し得る。ＢＰＩタンパク質産物（ＢＰＩ由来ぺプチドを含む）は、これらの方法を用いて、増殖促進活性についてスクリーニングされ得る。さらに、周皮細胞増殖を促進するＢＰＩタンパク質産物様に機能する分子の合理的な設計が、企図される。例えば、所望の周皮細胞増殖の増強活性を有するＢＰＩタンパク質産物の構造および機能を模倣するペプチドまたは他の有機分子が、合成され得る。
【００２７】
本発明はまた、以下の工程を包含する、周皮細胞を、候補増強剤についてスクリーニングする方法を提供する：（ａ）試験化合物の存在下および非存在下での周皮細胞の増殖を測定する工程、（ｂ）試験化合物およびＢＰＩタンパク質産物の存在下（好ましくは周皮細胞の増殖を増強するのに効果的な濃度）で増殖を測定する工程、ならびに周皮細胞の増殖が工程（ａ）において増加するが、工程（ｂ）においてさらに増殖しない場合、または工程（ａ）において測定された周皮細胞の増殖が工程（ｂ）において測定された周皮細胞の増殖の増加とほぼ同じであるかまたはそれよりも少ない場合、その試験化合物を、周皮細胞増殖の候補増強剤として同定する工程。
【００２８】
本発明はさらに、有機化合物または無機化合物を、ＢＰＩタンパク質産物によって誘導された増殖を阻害する能力についてスクリーニングする方法を提供する。そのようなスクリーニングアッセイにおける使用に適するスタンダードとしては、周皮細胞の増殖を増強する任意のＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ２１、またはＸＭＰ．６７９）が挙げられる。そのような方法は、例えば、ＢＰＩタンパク質産物を有する周皮細胞と候補化合物とを接触させる工程、および試験化合物の存在下および非存在下で細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を検出または測定する工程を包含する。ＢＰＩタンパク質産物によって誘導された周皮細胞の増殖が、試験化合物の存在下で減少する場合、その試験化合物は、ＢＰＩに誘導された増殖の候補インヒビターとして同定される。必要に応じて、コントロールとして、周皮細胞の増殖はまた、試験化合物のみ（ＢＰＩタンパク質産物の非存在下で）の存在下および非存在下で測定される。このスクリーニング方法は、増殖が有害な効果を生じる周皮細胞増殖の動物モデルにおいて、選択された候補化合物を試験するさらなる工程を含む。本発明に従うこれらの方法は、分子（例えば、無機化合物または有機化合物（細菌、真菌、哺乳動物、昆虫または植物の、ペプチド、ペプチド模倣物および／あるいは有機模倣物を含む））のライブラリーの、ハイスループットのスクリーニングのために用いられ得る。
【００２９】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法によって同定された化合物およびそれらの化合物を用いて、周皮細胞増殖を調節する（増殖を可能とするか、または増強するか、または阻害する）ための処理をする方法が、さらに提供される。
【００３０】
なお本発明の別の局面は、有効量のＢＰＩタンパク質産物を投与することによって、（特に網膜における）上皮細胞増殖を増強するための方法、および特に網膜（例えば、加齢性黄斑変性において見られる網膜の色素沈着または脈絡膜の新生血管形成（Ｃｏｍｐｏｃｈｉａｒｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、１９９９、５：３４（１９９９）））、創傷または骨折における、上皮細胞の増殖を可能とするかまたはそれを増強する化合物（ＢＰＩタンパク質産物、ＢＰＩタンパク質産物模倣物、または低分子のいずれか）についてスクリーニングするための方法を提供する。上皮細胞の変性を含む疾患または上皮細胞（特に網膜の上皮細胞）の増殖から利益を得る疾患を処置するために、医薬の調製におけるＢＰＩタンパク質産物の類似の使用も、企図される。さらに、本発明のこの局面は、他のＢＰＩタンパク質産物を、上皮細胞（特に網膜の上皮細胞の増殖）の増殖を増強する能力についてスクリーニングする類似の方法、および有機化合物または無機化合物を、ＢＰＩタンパク質産物によって誘導される上皮細胞の増殖を阻害する能力についてスクリーニングする方法を含む。
【００３１】
本発明の多くのさらなる局面および利点は、以下の発明の詳細な説明を考慮して当業者に明らかであり、以下の発明の詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を記載する。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
周皮細胞は、以下を含む、微小血管中の内皮細胞の周辺の身体中に見出される：皮膚、網膜、蝸牛（聴覚器）、脳、心臓、筋肉、腎臓、胎盤、肝臓、肺、脾臓および骨髄（網膜の壁細胞を含む）、腎糸球体のメサンギウム細胞、肝臓の伊東細胞、ならびに脾臓および骨髄の細網細胞。本発明は、全身的または局所的な周皮細胞増殖の調節を含む、新規治療的使用およびスクリーニング方法を提供する。本発明は、ＢＰＩタンパク質産物（ｒＢＰＩ２１およびＢＰＩ由来ペプチドを含む）が周皮細胞の増殖を刺激するという、予測されなかった知見に基づく。多くの種々の共有に係る特許および出願（本明細書中上記または下記のものを含む）に記載されてきた、ＢＰＩタンパク質産物の抗脈管形成、抗炎症性、抗微生物性および他の特性とは対照的に、ＢＰＩタンパク質産物の使用に関する本発明は、周皮細胞媒介効果の調節に基づく。
【００３３】
本発明は、周皮細胞の変性に関連するか、それから生じるか、またはそれによって増悪される、疾患症状または状態を処置するための方法を企図し、この方法は、周皮細胞増殖を増強するのに有効量のＢＰＩタンパク質産物を投与することによる。この方法において、周皮細胞増殖を増強する他の増殖因子の同時投与もまた、企図される。周皮細胞の変性は、以下の病理に関連すると考えられている：糖尿病性合併症（インスリン依存性およびインスリン非依存性の両方を含む）、周皮細胞に対する自己抗体の存在に関連する他の疾患［Ａｔｔａｗｉａら、Ｒｅｔｉｎａ、１９９９；１９（５）：３９０−４００（これは、糖尿病性の被験体が微小血管循環における微小血管周皮細胞に対する自己抗体を有することが見出されたことを、報告する］、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）［Ｍｏｎａｃｏ  ＆  Ｗｏｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｏｐｔｉｍ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９９０  Ｊｕｌ；６７（７）：５３２−７；Ｈｏｐｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９９２  Ｊａｎ；７６（１）：１１−１６］、卵巣不全、多発性硬化症［Ｖｅｒｂｅｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：５８７６−８４（１９９５）］、アルツハイマー病［Ｖｅｒｂｅｃｋら、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、６８：１１３５、Ｖｅｒｂｅｅｋら、１９９９、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４５：３７−４６；Ｆａｒｋａｓら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）２０００  Ｏｃｔ；１００（４）：３９５−４０２］、外傷性脳傷害または血管脳関門の混乱に関連する他の状態［Ｄｏｒｅ−Ｄｕｆｆｙら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、２０００、６０（１）：５５−６９］、部分発作［Ｌｉｗｎｃｚら、１９９０  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２６（３）：４０９−４２０］、および妊娠中の胎盤発達［Ｏｈｌｓｓｏｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９：２１２（１）：１２４−３６；Ｃｈａｌｌｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９、４５（１）：８９−１００］。従って、周皮細胞の増殖の増強または周皮細胞の変性の程度を単に改善することでさえ、これらの障害およびそれらの続発症の発症および重篤度を予防または減少し得る。特に、真性糖尿病の続発症としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性多発性神経障害、糖尿病性腎症、周皮細胞変性後の骨格筋変性、または他の器官合併症が挙げられる。
【００３４】
内毒素は、強力な肺周皮細胞マイトジェンであり；敗血症において、周皮細胞は、敗血症後の組織再構成に関与し得る［Ｓｉｍｓ、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｅｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７：８４２；Ｋｈｏｕｒｙら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、１９９８、５６：７１−８４］。
【００３５】
周皮細胞変性は、真性糖尿病の任意の潜在的合併症が観察される前に、真性糖尿病の非常に初期で観察される。従って、周皮細胞増殖の増強を介するこのような変性の逆転は、合併症の発症または発生の前の期間中の真性糖尿病に罹患している被験体に対して、さらには、血管障害または腎症の組織学的または臨床学的変化が観察される前の期間中の真性糖尿病に罹患している被験体に対してでさえ、有益であることが予測される。初期の組織学的変化としては、肥厚した網膜細胞基底膜、周皮細胞変性、毛細血管微細動脈瘤、および小動脈ヒアリン化が挙げられる。疾患の進行が起こるにつれ、増加される血管透過性および進行性の網膜血管閉鎖が、視力の損失および網膜壊死の増加のような、臨床的発現を生じる［Ｈａｍｍｅｒら、１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１１５５５．］。
【００３６】
本発明はまた、周皮細胞増殖に関連するか、それから生じるか、またはそれによって増悪される、疾患症状または状態を処置するための方法を企図し、この方法は、周皮細胞増殖を減少または排除するのに有効量のＢＰＩインヒビターを投与することによる。周皮細胞の増殖は、高血圧、血管疾患、アテローム性動脈硬化症（血管カルシウム沈着およびアテローム性斑の形成を含む）、再狭窄、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）［Ｋｉｍら、１９９８、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３１：５１１−５１５］、子宮内膜症または腺筋症［Ｍａｉら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９７；３０（５）：４３０−４２］、および正常な加齢［Ｈｉｃｋｓら、１９８３、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ４（１）：６９−７５］において役割を果たすと考えられている。従って、周皮細胞の増殖の減少または全体的な予防でさえ、これらの疾患、これらに関連する障害、またはこれらの続発症の発症または重篤度を、予防または減少し得る。特に、高血圧、アテローム性動脈硬化症および他の血管疾患の続発症としては、以下が挙げられる：脳血管性の虚血または発作、冠状動脈疾患および心筋の虚血または梗塞、末梢血管疾患、レーノー症候群、周囲動脈の初期閉塞または肺高血圧症に関連する血管再構築［Ｋｈｏｕｒｙら、２０００、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７９（２）：Ｌ２５２−Ｌ２６１］。
【００３７】
さらに、周皮細胞由来の骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、食細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞の産生または形成または増殖［Ｓｃｈｏｒら、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．、３１３：８１−９１；Ｓｉｍｓ、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｅｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７：８４２−８４６］を増強し、従って、損傷された組織を修復または置換するための方法、が、本発明によって提供される。骨芽細胞または軟骨細胞の形成または増殖を増強することは、以下を含む、本明細書中で「骨変性障害」と呼ばれる、骨または軟骨の損失または変性に関連する状態に有益であることが予測される：骨粗しょう症、骨壊死、骨軟化症、くる病、慢性関節リウマチ［Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、１３：８２８−８３８］、変形性関節症、骨折、骨移植、骨の外科的損失、あるいは腱または靭帯の形成。線維芽細胞の形成または増殖は、火傷、切開、潰瘍、皮膚移植を含む創傷治癒において有益であることが予測される。食細胞の形成または増殖は、感染性因子に対する曝露に関連する状況において有益であることが予測される。
【００３８】
用語「処置する」または「処置」とは、本明細書中で使用される場合、予防的処置および治療的処置の両方を包含し、そして所望の効果を有する他の治療薬剤の同時投与または共投与によって達成され得る。任意の被験体（特に、ヒトのような哺乳動物被験体のみならず、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギまたは家禽類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウ））、家庭動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、イヌまたはネコ）、外来種および／または動物園の動物、あるいは実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはハムスターを含む）を含む））の処置が、企図される。
【００３９】
「同時投与」または「共投与」とは、本明細書中で使用される場合、１以上の薬剤を、共に、組み合わせて、一緒に、あるいは互いに前後で、投与することを含む。これらの薬剤は、同じ経路または異なる経路によって投与され得る。同じ経路を介して投与される場合、これらの薬剤は、これらが、全ての薬剤が作用部位で効果的な濃度を達成するのを可能にするのに十分な様式で与えられる限り、同時にまたは連続的に与えられ得る。
【００４０】
治療組成物は、全身的、適切な領域内に、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、または局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）に投与され得る。全身的な投与経路としては、経口経路、静脈内経路、筋内または皮下の注射（長期放出のためのデポー内を含む）、眼内経路または眼球後経路、髄腔内経路、腹腔内経路（例えば、腹腔内洗浄による）、肺内経路（粉末薬剤を使用するか、あるいはエアロゾル化または噴霧化薬物溶液を使用する）、あるいは経皮経路が挙げられる。いくつかの例において、関与する血管の選択的カテーテル挿入によってか、または局所的な領域への直接注射（例えば、長期放出のためのデポー内を含む）によって、領域的または局所的にＢＰＩタンパク質産物を投与することが、有利である。標的化薬剤（例えば、組織または細胞型に特異的な抗体）に共有結合または非共有結合で連結されたＢＰＩタンパク質産物を投与することもまた、有利であり得る。全身投与または局所投与のための適切な投薬量としては、１日あたり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、または１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が挙げられる。処置は、連続的であっても、または間欠的投与によっても、同時であってもよく、主治医によって決定される限り、１日あたりの用量は減少または増加され得る。
【００４１】
局所投与としては、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、クリーム剤、ゼリー剤、点眼剤または軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）（１９９５年１１月１４日に共に出願された、共有に係る同時係属米国特許出願第０８／５５７，２８９号および同第０８／５５７，２８７号に記載されるような）、点耳剤（ｅａｒ  ｄｒｏｐ）、坐剤、洗浄流体（例えば、創傷の洗浄のための）または薬用シャンプーが挙げられる。例えば、液滴形態での局所投与について、約１０〜２００μＬの治療組成物が、主治医によって決定されるように、１日あたり１回以上適用され得る。
【００４２】
当業者は、良好な医療および個々の被験体の臨床的状態によって決定されるように、治療組成物についての有効投薬量および投与レジメンを容易に最適化し得る。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「ＢＰＩタンパク質産物」としては、天然または組換え産生されたＢＰＩタンパク質；天然、合成または組換え型のＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドフラグメント；ＢＰＩタンパク質またはそのフラグメントの生物学的に活性なポリペプチド改変体（ハイブリッド融合タンパク質またはダイマーを含む）；ＢＰＩタンパク質あるいはそれらのフラグメントまたは改変体の生物学的に活性なポリペプチドアナログ（システイン置換アナログを含む）；またはＢＰＩ由来ペプチドが挙げられる。本発明に従って投与されるＢＰＩタンパク質産物は、当該分野で公知の任意の手段によって生成および／または単離され得る。米国特許第５，１９８，５４１号および同第５，６４１，８７４号（これらの開示は、参考として本明細書中に援用される）は、ＢＰＩタンパク質（組換えＢＰＩホロタンパク質（ｒＢＰＩおよびＢＰＩの組換えフラグメントと呼ばれる）を含む）をコードする組換え遺伝子、およびそれらを発現させる方法を開示する。米国特許第５，４３９，８０７号および対応する国際公開番号ＷＯ９３／２３５４０（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５２）（これは、参考として本明細書中に援用される）は、培養物中の遺伝子形質転換された哺乳動物宿主細胞中で発現されたかまたはそれらから分泌された組換えＢＰＩタンパク質産物を精製するための新規方法を開示し、そして安定で、均質な薬学的調製物への組み込みに適切な大量の組換えＢＰＩ産物を産生し得る方法を開示する。
【００４４】
ＢＰＩの生物学的に活性なフラグメント（ＢＰＩフラグメント）としては、天然ヒトＢＰＩホロタンパク質と、フラグメント分子が、このホロタンパク質の、アミノ末端アミノ酸、内部のアミノ酸、および／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠失していることを除いて、同一または類似のアミノ酸配列を有する生物学的に活性な分子が挙げられ、これらとしては、米国特許第５，１９８，５４１号および同第５，６４１，８７４号に記載されている生物活性分子が挙げられる。このようなフラグメントの非限定的な例としては、Ｏｏｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１７４：６４９（１９９１）に記載されている、約２５ｋＤの天然ヒトＢＰＩのＮ−末端フラグメント、またはＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４７５４−４７６１（１９９２）に記載され、そしてｒＢＰＩ２３と称される、天然ヒトＢＰＩの１から約１９３〜１９９までのＮ−末端アミノ酸をコードするＤＮＡの組換え発現産物が挙げられる。その刊行物において、位置１５１のバリンが、ＧＴＣではなくＧＴＧによって指定され、そして残基１８５が、リジン（ＡＡＧによって指定される）ではなくグルタミン酸（ＧＡＧによって指定される）であることを除いて、Ｇｒａｙら（前出）の図１に述べられているように、成熟ヒトＢＰＩの、３１残基のシグナル配列およびＮ−末端の最初の１９９アミノ酸を有する組み換え発現産物（ｒＢＰＩ２３）をコードするＤＮＡの供給源として、発現ベクターが使用された。Ｇｒａｙら（前出）の図１に述べられている配列（配列番号１および２）を有する組換えホロタンパク質（ｒＢＰＩ）もまた、産生されており、ｒＢＰＩ２３に関する例外および残基４１７が、バリン（ＧＴＴによって指定される）ではなくアラニン（ＧＣＴによって指定される）であるという例外を伴う。ＢＰＩの残基１０〜残基１９３からなる別のフラグメントは、米国特許第６，０１３，６３１号（米国出願番号第０９／３３６，４０２号の一部継続出願、１９９９年６月１８日出願国際公開番号ＷＯ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０に対応）（これらの全てが本明細書中に参考として援用される））に記載されている。他の例としては、米国特許第５，４４７，９１３号、同第５，７０３，０３８号および同第５，８５６，３０２号ならびに対応の国際公開番号ＷＯ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）（これらの全てが本明細書中に参考として援用される）に記載されているような、ＢＰＩフラグメントの二量体形態が、挙げられる。
【００４５】
ＢＰＩの生物学的に活性な改変体（ＢＰＩ改変体）としては、組換えハイブリッド融合タンパク質（ＢＰＩホロタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントおよび少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部を含む）、またはＢＰＩ改変体の二量体形態が挙げられるが、これらに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質および二量体形態の例は、米国特許第５，６４３，５７０号（および対応する国際公開番号ＷＯ９３／２３４３４（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５４）（これらの全てが本明細書中に参考として援用される）に記載され、これらとしては、アミノ末端における、ＢＰＩタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメント、およびカルボキシ末端における、イムノグロブリン重鎖の少なくとも１つの定常ドメインまたはその対立遺伝子改変体（例えば、ＢＰＩ−Ｉｇ融合タンパク質）を含む、ハイブリッド融合タンパク質が挙げられる。
【００４６】
ＢＰＩの生物学的に活性なアナログ（ＢＰＩアナログ）としては、１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置換されているＢＰＩタンパク質産物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，４２０，０１９号、同第５，６７４，８３４号および同第５，８２７，８１６号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９４／１８３２３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３５）（これらの全てが本明細書中に参考として援用される）は、ＢＰＩポリペプチドアナログおよびＢＰＩフラグメント（ここで、システイン残基は、異なるアミノ酸に置換されている）を開示する。本出願によって記載される、安定なＢＰＩタンパク質産物は、ＢＰＩホロタンパク質のＮ−末端アミノ酸のアミノ酸１から約１９３または１９９までをコードするＤＮＡの発現産物であるが、ここで、残基番号１３２のシステインがアラニンに置換され、ｒＢＰＩ２ｌΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ２１と命名される。ＢＰＩのこのＮ−末端アナログ（ｒＢＰＩ２１）の産生は、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８：２８−４０（１９９６）に記載されている。同様に、ＢＰＩの残基１０〜残基１９３からなるアナログ（このアナログにおいて、位置１３２のシステインがアラニンに置換される）（「ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ」または「ｒＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａｌ３２」と命名される）は、米国特許第６，０１３，６３１号（米国出願番号０９／３３６，４０２の一部継続出願、１９９９年６月１８日に出願、および対応する国際公開番号ＷＯ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０））（これらの全てが本明細書中に参考として援用される）に記載されている。他の例としては、ＢＰＩアナログの二量体形態が挙げられる；例えば、米国特許第５，４４７，９１３号、同第５，７０３，０３８号、および同第５，８５６，３０２号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）（これらの全てが本明細書中に参考として援用される）。
【００４７】
本発明の方法より有用な他のＢＰＩタンパク質産物は、合成または組換え手段によって産生された、ＢＰＩ由来か、またはそれに基づくペプチド（ＢＰＩ由来ペプチド）であり、例えば、以下に記載されるペプチドである：国際公開番号ＷＯ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）（１９９６年３月２１日に出願された米国出願番号０８／６２１，２５９に対応する）、および国際公開番号ＷＯ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）（米国特許第５，８５８，９７４号に対応する）、ならびに国際公開番号ＷＯ９５／１９３７２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０４２７）（米国特許第５，６５２，３３２号および同第５，８５６，４３８号に対応する）、および国際公開番号ＷＯ９４／２０５３２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４６５）（米国特許第５，７６３，５６７号（米国特許第５，７３３，８７２号（１９９４年１月１４日出願米国出願番号０８／１８３，２２２（１９９３年７月１５日出願米国出願番号０８／０９３，２０２（米国特許第５，３４８，９４２号の一部継続）の一部継続）の一部継続）の継続）（国際公開番号ＷＯ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）に対応する）に対応する）（これらの全ての開示は、本明細書中に参考として援用される）。組換えペプチド産生の方法は、米国特許第５，８５１，８０２号および国際公開番号ＷＯ９７／３５００９（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５２８７）（これらの開示は、本明細書中に、参考として援用される）に記載される。
【００４８】
代表的なＢＰＩタンパク質産物としては、組み換え的に産生された、ＢＰＩのＮ−末端アナログまたはフラグメント（特に、約２０ｋＤ〜２５ｋＤの間の分子量を有するアナログまたはフラグメント（例えば、ｒＰＢＩ２１、ｒＰＢＩ２３、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ，（ｒＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａ１３２）、これらのＮ−末端ポリペプチドの二量体形態（例えば、ｒＢＰＩ４２ダイマー）、またはＢＰＩ由来ペプチド）が挙げられる。代表的なＢＰＩ由来ペプチドとしては、ＢＰＩのドメインＩＩ由来ペプチドが挙げられる（例えば、ＸＭＰ．６７９［その構造および活性は、１９９９年６月２５日に出願された共有の米国特許番号０９／３４４，２１９の一部継続である、２０００年６月２３日に出願された米国特許番号０９／６０２，８１１（各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている］。
【００４９】
ＢＰＩタンパク質産物の投与は、好ましくは、ＢＰＩタンパク質産物および薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバンド、またはキャリアを含む薬学的組成物を用いて達成される。このＢＰＩタンパク質産物は、既知の界面活性剤または他の治療剤なしで、またはこれらと共に投与され得る。ＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ２３）を含む、安定な薬学的組成物は、０．１％重量のポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）および０．００２％重量のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を含む、クエン酸緩衝化生理食塩水（５または２０ｍＭ  クエン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）中で、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＰＩタンパク質産物を含む。ＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ２１）を含む、別の安定な薬学的組成物は、５ｍＭクエン酸塩，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８および０．００２％ポリソルベート８０中で、２ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＰＩタンパク質産物を含む。このような好ましい組み合わせは、以下に記載される：米国特許第５，４８８，０３４号、同第５，６９６，０９０号および同第５，９５５，４２７号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９４／１７８１９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３９）（これらの全ての開示は、本明細書中に参考として援用される）。米国特許第５，９１２，２２８号および対応する国際公開番号ＷＯ９６／２１４３６（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１０９５）（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、増強した活性を有するＢＰＩタンパク質産物の、他のポロキサマー処方物は、必要に応じて、ＥＤＴＡと共に利用され得る。
【００５０】
本発明の方法に従って企図される増殖因子としては、以下が挙げられる；エンドセリン−１または血小板由来増殖因子−β（ＰＤＧＦ−β）（これらの両方が、周皮細胞増殖を誘導または増大することが示唆されている［Ｙａｍａｇｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９３）Ｍａｒ  ３１；１９１（３）：８４０−６；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９９）Ｊｕｎｅ；１２６（１４）：３０４７−５５］）、ＰＤＧＦ（またはＰＤＧＦ  Ａ鎖またはＰＤＧＦ  ＡＡまたはＰＤＧＦ  ＡＢまたはＰＤＧＦ  Ｂ鎖またはＰＤＧＦ  ＢＢ）およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）（またはＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１．２、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、または潜在的ＴＧＦ−β１）、血管透過性（ｐｅｒｍａｂｉｌｉｔｙ）因子／血管内皮増殖因子（ＶＰＦ／ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−８ｂ、ＦＧＦ−８ｃ、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）またはβ−ＥＣＧＦ、ならびにアンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ）（例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、またはＡｎｇ−Ｙ）、アンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４またはＢＭＰ−１５）、骨形態発生タンパク質レセプターＩＡまたは骨形態発生タンパク質レセプターＩＢ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子（ＣＮＦ）、毛様体神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子レセプターα、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、内皮増殖因子、表皮由来好中球誘引物質、グリア細胞株由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子レセプターα１、グリア細胞株由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子レセプターα２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合表皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子レセプター、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子レセプターα、神経増殖因子、神経増殖因子レセプター、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子レセプターα、血小板由来増殖因子レセプターβ、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子レセプター、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、Ｉ型腫瘍壊死因子レセプター、ＩＩ型��瘍壊死因子レセプター、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子レセプター、血管内皮増殖因子、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的に活性なフラグメントまたは免疫学的に活性なフラグメント。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「ＢＰＩインヒビター」としては、ＢＰＩタンパク質産物によって誘導される型の増殖を阻害する任意の薬剤（ヘパリンおよびヘパリン様分子［Ｋｈｏｕｒｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７９：Ｌ２５２−Ｌ２６１（２０００）；Ｈｕら、Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８９）Ａｐｒ；７０（２）：１１３−２４］については除く）が挙げられ、それゆえ、周皮細胞増殖を増大する際にＢＰＩタンパク質産物の効果または活性を阻害できる、以下の薬剤を含む；ＢＰＩタンパク質産物またはＢＰＩタンパク質産物を認識する周皮細胞レセプターに特異的に結合する抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのフラグメント、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む）、アンチセンスポリヌクレオチド（例えば、三重らせん形成でＲＮＡまたはＤＮＡに結合し得る）、および周皮細胞上のレセプター（ＢＰＩタンパク質産物を認識する）の活性を阻害することによって（例えば、レセプターへの結合、レセプターとの相互作用、またはレセプターのシグナル伝達を阻害することによって）、ＢＰＩの増殖促進活性を阻害する化合物（低分子を含む）。レセプターの活性は、例えば、レセプターに特異的に結合する抗体、レセプターの発現を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、ＢＰＩタンパク質産物のレセプターへの結合を競合的に阻害する分子もしくはペプチド、またはレセプターをアンタゴナイズする分子によって、阻害され得る。
【００５２】
本発明はまた、周皮細胞増殖を増大する他のＢＰＩタンパク質産物をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、例えば、周皮細胞をＢＰＩ産物と接触させる工程、および細胞の成長または増殖を測定する工程から構成され得る。必要に応じて、このスクリーニング方法は、増殖が所望の効果を生じる当該技術分野で公知の周皮細胞増殖のインビトロモデルまたは動物モデルにおいて、選択された候補化合物を試験する工程をさらに含む。動物モデルは、周皮細胞成長については良く規定されていない。現在まで実施された研究は、若年動物対老齢動物における周皮細胞レベルを定量しているが、成体動物（周皮細胞レベルにおける変化に対して）においてではない。通常、インビトロ研究は、周皮細胞同時培養モデルを用いて実施されている。通常、周皮細胞は、内皮細胞または平滑筋細胞とともに培養されるか、または肺、脳、網膜もしくはその他の組織からの始原培養物として単離されおよび維持されている。例えば、Ｋｈｏｕｒｙら、１９９８、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５６：７１；Ｖｅｒｂｅｅｋら、１９９７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６８：１１３５；Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．、１３：８２８；Ｎｅｈｌｓら、１９９４、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４８：３４９−３６３、Ｄ’Ａｍｏｒｅ  Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ３（２）：４９−５６、１９９２、Ｄ’Ａｍｏｒｅ、１９９０、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ」  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ  ＆  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２９９−３１４頁を参照のこと。このスクリーニング方法はまた、例えば、すべてが本明細書に参考として援用される、米国特許第５，６３９，７２７号、同５，８０７，８１８号および同５，８３７，６７８号ならびに国際公開番号ＷＯ  ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）、ならびに同時所有で同時係属中の２０００年６月２３日に出願された米国特許出願番号第０９／６０２，８１１号および対応する国際公開番号ＷＯ  ０１／００６５５（ＰＣＴ／ＵＳ００／１７３５８）に記載のような、当該技術分野で公知の細胞培養アッセイまたは動物モデルにおいて、内皮細胞増殖または血管形成を阻害する能力について選択された候補化合物を試験するさらなる工程を含み得る。ＢＰＩ由来ペプチドを含むＢＰＩタンパク質産物を、これらの方法を用いて増殖促進活性についてスクリーニングし得る。さらに、周皮細胞増殖増大ＢＰＩタンパク質産物のように機能する分子の合理的設計が予期される。例えば、所望の周皮細胞増殖増大活性をもつＢＰＩタンパク質産物の構造および機能を模倣する、周皮細胞またはその他の有機分子が合成され得る。
【００５３】
本明細書に記載のこれらのスクリーニング方法により同定される化合物、および周皮細胞変性にともなうか、それから生じるか、またはそれを悪化する症状を処置するために、これらの化合物を用いる方法がさらに提供される。
【００５４】
本発明はさらに、ＢＰＩタンパク質産物により誘導される増殖を阻害する能力について有機化合物または無機化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなスクリーニングアッセイにおける使用に適切な標準は、周皮細胞増殖を増大する任意のＢＰＩタンパク質産物、例えば、ｒＢＰＩ２１またはＸＭＰ．６７９を含む。このような方法は、例えば、周皮細胞をＢＰＩタンパク質および候補化合物と接触させる工程、および試験化合物の存在および不在下で細胞の成長または増殖を測定する工程を包含する。必要に応じて、コントロールとして、周皮細胞の成長または増殖はまた、試験化合物単独の存在および不在下（ＢＰＩタンパク質産物の不在下）で測定される。このスクリーニング方法は、増殖が有害な影響を生じる当該技術分野で公知の周皮細胞増殖のインビトロモデルまたは動物モデル中で選択された候補化合物を試験するさらなる工程を含み得る。例えば、Ｄ’Ａｍｏｒｅ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｃｙｔｅ」  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ＆Ｖｅｓｓｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２９９−３１４頁（１９９０）を参照のこと。
【００５５】
好ましくは、周皮細胞アッセイは、実施例２に記載のようなウシ網膜周皮細胞の始原培養物を用いて実施される。
【００５６】
あるいは、周皮細胞の表面上に存在するレセプターが、例えば、ＢＰＩタンパク質産物を用いるイムノアフィニティー精製により同定され得、そして、このレセプターを初期スクリーニングで用い、このレセプターを結合する化学的化合物を同定し得る。
【００５７】
本発明によるこれらの方法は、無機化合物または有機化合物（細菌、真菌、哺乳動物、昆虫または植物産物、ペプチド、ペプチド模倣物および／または有機模倣物を含む）のような分子のライブラリーの高スループットスクリーニングに用い得る。
【００５８】
これらのスクリーニング方法により同定される化合物、および周皮細胞変性にともなうか、それから生じるか、またはそれを悪化する症状を処置するために、これらの化合物を用いる方法が、さらに提供される。
【００５９】
スクリーニングされる試験化合物の供給源は、（１）無機化学ライブラリーまたは有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、または（３）ランダムペプチドもしくは模倣物ペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子のいずれかから構成されるコンビナトリアルライブラリーを含む。化学ライブラリーは、容易に合成され得るか、または多くの市販供給源から購入され得、そして公知の化合物の構造的アナログまたは天然産物スクリーニングにより「ヒット」または「リード」として同定される化合物を含み得る。天然産物ライブラリーの供給源は、（細菌または真菌を含む）微生物、動物、植物もしくはその他の栄養体、または海洋生物のコレクションであり、そしてスクリーニングのための混合物のライブラリーは：（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、あるいは（２）生物それら自身の抽出により作製され得る。天然産物ライブラリーは、ポリケチド、非リボソームペプチド、および／または改変体（天然に存在しない）その改変体もを含む。総説には、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）を参照のこと。コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物から構成され、そして伝統的な自動化合成方法、ＰＣＲ、クローニングまたは特許の合成方法により容易に調製され得る。特に重要なのは、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーである。重要な、なお別のライブラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、マルチパラレル合成コレクション、組換え、またはポリペプチドライブラリーが挙げられる。コンビナトリアル化学およびそれから作成されるライブラリーの総説には、Ｍｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照のこと。ペプチド模倣物ライブラリーの総説および例については、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９（３）：２０５−２３（１９９８）；Ｈｒｕｂｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、１（１）：１１４−１９（１９９７）；Ｄｏｒｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、４（５）：７０９−１５（１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照のこと。種々の会社が化学ライブラリーを構築し、そしてスクリーニングのためにそれらの使用を提供しており、例えば、３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ；Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；Ａｌａｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；ＡｒＱｕｌｅ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ；Ａｒｒｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ａｘｙｓ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｂｉｏｃｒｙｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ；Ｃａｄｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；ＣｈｅｍＧｅｎｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｃ��ｍｂｉＣｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃｏｒｖａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｃｕｂｉｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｄａｒｗｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｙｂｒｉｄｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｉｘｓｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｍｏｌｅｃｕｍｅｔｉｃｓ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ、Ｐｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ；ＳＵＧＥＮ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ；Ｔｅｌｉｋ、Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；またはＴｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯを含む。
【００６０】
実施例１は、ウシ網膜内皮細胞に対するＢＰＩタンパク質産物の効果を記載する。実施例２は、ウシ網膜周皮細胞の始原細胞培養物に対する、およびヒト網膜周皮細胞の細胞株に対する、ならびにＭＡＰキナーゼリン酸化に対するＢＰＩタンパク質産物の効果を記載する。実施例３は、ウシ網膜色素上皮細胞に対するＢＰＩタンパク質産物の効果を記載する。実施例４は、網膜新血管形成の新生児マウスモデルを含む、種々の動物モデルにおけるＢＰＩタンパク質産物を用いた研究を記載する。
【００６１】
（実施例１）ウシ網膜毛細管内皮細胞に対する効果
ウシ網膜内皮細胞（ＢＲＥＣ）の始原培養物を、Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８５、７５；１０２８−３６に記載のように、ホモゲナイゼーションおよび一連の濾過工程により単離した。次いで、ＢＲＥＣを、１０％血漿由来ウマ血清（ＰＤＨＳ）、５０ｍｇ／ｌヘパリン、および５０μｇ／ｍｌ内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を補填した内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて培養した。細胞を、抗第ＶＩＩＩ因子抗体とのそれらの免疫活性により均一性について特徴付けた。細胞は、光学顕微鏡により確認されるように、これらの条件下では形態学的に変化しないままであった。２〜７継代の細胞のみを実験に用いた。
【００６２】
細胞増殖アッセイは以下のように実施した：細胞を１２ウェル培養プレート上に配置し、そして一晩インキュベートした。この細胞を、ビヒクル、２５ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、血清、化合物、またはそれらの組合せで処置した。培地を、インキュベーション期間の間に交換し、新鮮培地および新鮮試験化合物を、２日間毎に添加した。示された時間の３７℃でのインキュベーションの後、細胞を０．１％ＳＤＳ中で溶解し、そしてＤＮＡ含量をＨｏｅｃｈｓｔ−３３２５８色素およびフルオロメーター（モデルＴＫＯ−１００、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ  Ｆａｒｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）により測定した。このようにして測定した総細胞ＤＮＡ含量は、トリプシン処理細胞の血球計算板により測定したときの実際の細胞数と緊密に相関することが示された。
【００６３】
決定を３重に行い、そしてすべての実験を少なくとも３回繰り返した。結果は、そうでないことが示されなければ平均±標準偏差として表される。統計学的分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定または分散の分析を採用し、定量データ集団を、正規分散および同量分散と比較した。非正規分布または非同量分散をもつ集団については、データを、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランクサム試験またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を用いて分析した。＜０．０５のＰ値を統計学的に有意であるとみなした。
【００６４】
ビヒクル処理細胞と非処理細胞との間には、総ＤＮＡ含量に関して増殖における差異は観察されなかった。２５μｇ／ｍｌまたは７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１単独（ＶＥＧＦの添加なし）もまた、有意な効果をもたなかった。しかし、２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの添加は、ＤＮＡ含量の量を３〜５倍有意に増大させた（ｐ＜０．０１）。ＶＥＧＦおよびビヒクルまたは２５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１のいずれかの添加は、有意な効果を有さなかった。対照的に、ＶＥＧＦおよび７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１の添加は、ＤＮＡ含量を有意に低減させ（Ｐ＜０．０５）、ｒＢＰＩ２１が、濃度７５μｇ／ｍｌでウシ網膜毛細管内皮（ＢＲＥＣ）細胞のＶＥＧＦ依存性増殖を阻害し得たことを示す。
【００６５】
結果は、ＸＭＰ．６７９が、１５μｇ／ｍｌで、ＢＲＥＣに対し、それ自身が僅かな増殖阻害効果を有するらしいことを示す。しかし、この効果は統計的に有意ではなかった。再び、２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ単独の添加は、ＤＮＡ含量を３〜４倍増大させた。ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９の添加は、効果を有さなかったが、ＶＥＧＦおよび５μｇ／ｍｌそして１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９の添加は、ＢＲＥＣのＶＥＧＦ依存性増殖を完全に防いだ。
【００６６】
さらなる実験では、上記のような細胞増殖アッセイを、２５μｇ／ｍｌもしくは７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１、または５μｇ／ｍｌもしくは１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９を用いて行い（２５ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦの添加ありまたはなしで）、そして同様の結果が観察された。ＶＥＧＦおよび２５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１の添加は、再び、ＤＮＡ含量に対する有意な効果を有さなかった。しかし、ＶＥＧＦおよび７５μｇ／ｍｌ  ｒＢＰＩ２１の添加は、再び、ＢＲＥＣのＶＥＧＦ依存性増殖を防いだ。同様に、ＶＥＧＦおよび５μｇ／ｍｌまたは１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９の添加は、再び、ＢＲＥＣのＶＥＧＦ依存性増殖を防いだ。ＶＥＧＦの添加のありまたはなしの、より低濃度のＢＰＩタンパク質産物を用いた実験は（５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１または１μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９）は、ＤＮＡ含量に対する有意な効果は有さなかった。これらの実験は、例示のタンパク質産物ｒＢＰＩ２１またはＸＭＰ．６７９が、ウシ網膜毛細管内皮細胞のＶＥＧＦ依存性増殖を阻害することを示す。
【００６７】
（実施例２）
（Ａ．ウシ網膜周皮細胞に対する効果）
ウシ網膜周皮細胞（ＢＲＰＣ）の始原培養物を、Ｋｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８５、７５：１０２８−３６に記載のような、ホモジナイゼーションおよび一連の工程により単離した。ＢＲＰＣを、５．５ｍＭグルコースおよび２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補填した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。細胞を、モノクローナル抗体３Ｇ５［Ｎａｙａｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８８、１６７：１００３−１５］とのそれらの免疫活性により均一性について特徴付けた。細胞は、光学顕微鏡により確認されるように、これらの条件下では形態学的に変化しないままであった。２〜７継代の細胞のみを実験に用いた。
【００６８】
細胞増殖アッセイを、上記の実施例１に記載のように実施し、そして培地を交換し、新鮮培地および新鮮試験化合物を、２日または３日毎に、好ましくは２日毎に添加した。５％ＦＢＳで、ＤＮＡ含量は、６日後変化しなかった。２０％ＦＢＳでは、総ＤＮＡの６〜７倍の増加が検出された。
【００６９】
５％ＦＢＳの存在下、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１の添加は、用量依存様式でＤＮＡ含量を増大した。７５μｇ／ｍｌでは、基底レベルを超えてＤＮＡの５倍の増加が注目された。１μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９は、６日目に増殖を増大させた。その一方、１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９は、基底を超えて３または６日のいずれでも周皮細胞の増殖を増大させず、これは、５％ＦＢＳの効果に類似であった。結果を、図１Ａ（ｒＢＰＩ２１）および１Ｂ（ＸＭＰ．６７９）中に示す。
【００７０】
これらの結果は、ｒＢＰＩ２１が網膜周皮細胞の増殖を、用量依存様式で増大させ、７５μｇ／ｍｌで最大が観察され、これは、２０％ＦＢＳの増殖効果とほぼ等しかったことを示す。ＸＭＰ．６７９は、５μｇ／ｍｌで増殖を増大し得、これは、２０％ＦＢＳの約３０〜４０％の能力に到達した。より高い濃度では、ＸＭＰ．６７９は、増殖刺激効果を示さなかった。
【００７１】
実験を、１０％ＦＢＳと組み合わせて繰り返した。再び、類似の知見を得た。ｒＢＰＩ２１の添加は、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび７５μｇ／ｍｌの濃度において、１０％ＦＢＳ中で周皮細胞の増殖を誘導した。興味深いことに、２５μｇ／ｍｌおよび７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１は、２０％ＦＢＳの増殖より高く、増殖を改善したようであった。５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９は、２０％ＦＢＳ中における効果に匹敵したが、１５μｇ／ｍｌでは、あまり増殖効果を有さなかった。これらの結果は、１０％ＦＢＳでは、ｒＢＰＩ２１は、２０％ＦＢＳより大きい増殖効果を有し得ることを示唆した。増殖因子は、網膜周皮細胞の増殖を増強する際に２０％ＦＢＳ中において、増殖効果をあまり改善し得えないので、この結果は、全く異例である。
【００７２】
実験を、１５％ＦＢＳを用いて繰り返し、この実験では、インキュベーションの６日後に周皮細胞の増殖を約６〜８倍刺激し得た。さらに、２０％ＦＢＳは、１５％ＦＢＳより強力であり、かつ６日後に高レベルの増殖に到達した。７５μｇ／ｍｌ  ｒＢＰＩ２１の添加は、２０％ＦＢＳよりも大きく増殖を増強した。比較において、ＸＭＰ．６７９の添加は、１５％ＦＢＳ中の周皮細胞の増殖を任意の有意な量へは、増強しなかった。これらの結果は、１５％ＦＢＳにおいてでさえ、ｒＢＰＩ２１が１５％ＦＢＳまたは２０％ＦＢＳよりも増殖を刺激し得ることを示唆する。ＸＭＰ．６７９の効果は、ｒＢＰＩ２１の効果より低かった。５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９では、１５％または２０％ＦＢＳより大きい増殖効果を有し得る、という傾向がある。
【００７３】
これらのデータによる結論として、ｒＢＰＩ２１およびより少ない程度にＸＭＰ．６７９は、網膜周皮細胞の増殖を増強した。この増殖の増強は、用量依存性であり、７５μｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１を用いて、３倍の刺激をした（コントロールにおいて正味の増殖はない）。ＸＭＰ．６７９は、おそらく、５μｇ／ｍＬにおいて２倍の刺激を示したが、１５μｇ／ｍＬでは、増強を示さなかった。この観察は、再現可能であり、そして５％、１０％または１５％ＦＢＳ中において生じた。
【００７４】
さらなる実験として、ＤＮＡ含有量および１ウェルあたりの総細胞数を、５％ＦＢＳの存在下で５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１で処理したＢＲＰＣ中で決定した。５％ＦＢＳの存在下における５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１の添加は、さらに容量応答性の様式でＤＮＡ含有量を増加させた。同様に、１ウェルあたりの総細胞数はまた、容量応答性の様式で増加した。これらの観察は、ｒＢＰＩ２１が誘導したＤＮＡ含有量の容量依存的な増加が、ｒＢＰＩ２１が誘導したウシ網膜周皮細胞の増殖の容量依存的な増加と相関することを示している。
【００７５】
増殖アッセイをまた、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９およびさらなる濃度の１０％ＦＢＳ中、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９で繰り返した。１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９において、周皮細胞のＤＮＡ含有量の統計学的に有意な増加は、観察されなかった。上記と同様の結果が、５μｇ／ｍｌ  ＸＭＰ．６７９について観察され、再び網膜周皮細胞の増殖について最高の増加を示したが、より高濃度のＸＭＰ．６７９（２０μｇ／ｍｌ）では観察されなかった。
【００７６】
ＭＡＰキナーゼリン酸化のレベルを、７５μｇ／ｍｌ  ｒＢＰＩ２１または５μｇ／ｍｌ  ＸＭＰ．６７９で処理したＢＲＰＣにおいて決定する実験もまた、行った。ＭＡＰキナーゼリン酸化のレベルを、ｒＢＰＩ２１またはＸＭＰ．６７９の添加１分後、３分後、５分後、１５分後、３０分後および６０分後に決定した。ｒＢＰＩ２１は、ｒＢＰＩ２１の添加１５分後の最大リン酸化期間にわたって、ＭＡＰキナーゼリン酸化を増加させ、これは、２０％ＦＢＳの効果にほぼ匹敵した。ＸＭＰ．６７９は、１５〜６０分の間の最大リン酸化期間にわたって、ＭＡＰキナーゼリン酸化を増加した。これらの観察は、例示的なＢＰＩタンパク質産物であるｒＢＰＩ２１およびより少ない程度に、ＸＭＰ．６７９が、ＢＲＰＣにおけるＭＡＰキナーゼリン酸化を増強することを示す。さらに、これらの結果は、ＢＲＰＣ  ＭＡＰキナーゼリン酸化が、この刺激活性についての他の化合物のスクリーニングのために有用であることを示唆する。
【００７７】
（Ｂ．ヒト網膜周皮細胞に対する効果）
上記のウシ網膜周皮細胞の一次細胞培養物での研究に加えて、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た網膜周皮細胞（カタログ番号ＣＣ−２５４２  ＰｙＣＲｔ）のヒト細胞株を用いて実験を行った。これらのヒト網膜周皮細胞（ＨＲＰＣ）を、５．６ｍＭのグルコースおよび２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。
【００７８】
増殖アッセイを以下のように行った：ＨＰＲＣを、５．６ｍＭグルコースを含む５％または１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにおいて２４ウェル培養プレート上にプレートし（３０００細胞／ウェル）、一晩インキュベートした。細胞を、ビヒクルのみまたはビヒクルおよびいくつかの濃度のＸＭＰ．６２７（［配列番号４）］）、ＸＭＰ．６６４（［配列番号５］）、ＸＭＰ．６７９（［配列番号３］）、もしくはＸＭＰ．７２８（［配列番号：６］）を用いて５日または６日間、一度処理した。上記パートＡの実験において記載したように、培地を交換せず、さらなる量の試験化合物も加えなかった。細胞を、固定し、メチレンブルーで染色し、そしてＯＤ６５０の観測により増殖をアッセイした。
【００７９】
５％ＦＢＳの存在下における約０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６７９の添加は、容量応答性の様式でＨＲＰＣ増殖を増加させ、およそ５μｇ／ｍｌで最大値が観察された。結果は、１０μｇ／ｍｌかそれ以上の濃度のＸＭＰ．６７９が、それ自体ＨＲＰＣに対しわずかな増殖阻害効果を有するようであることを示した。実験を、１０％ＦＢＳの存在下で繰り返した場合も、同様の知見が得られた。
【００８０】
約０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６６４の添加は、同様に、５％ＦＢＳの存在下で容量応答性の様式でＨＲＰＣ増殖を増加させ、およそ５μｇ／ｍｌで最大値が観察された。結果は、１０μｇ／ｍｌかそれ以上の濃度のＸＭＰ．６６４が、ＨＲＰＣに対しわずかな増殖阻害効果を有するようであることを示した。実験を、１０％ＦＢＳの存在下で繰り返した場合も、結果は、１０μｇ／ｍｌＸＭＰ．６６４がＨＲＰＣ増殖を増加させるが、１０μｇ／ｍｌ以上のＸＭＰ．６６４は増殖を阻害したことを示した。
【００８１】
５％ＦＢＳの存在下における約０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌのＸＭＰ．６２７の添加は、容量応答性の様式でＨＲＰＣ増殖を増加させ、およそ５μｇ／ｍｌで最大値が観察された。ＸＭＰ．６２７は、１０μｇ／ｍｌ以上でそれ自体ＨＲＰＣに対しわずかな増殖阻害効果を有するようであった。１０％ＦＢＳ存在下におけるＸＭＰ．６２７の添加は、ＨＲＣＰ増殖を増加させなかった。
【００８２】
ＸＭＰ．７２８の添加は、５％ＦＢＳの存在下およそ５μｇ／ｍｌでのみ同様にＨＲＰＣ増殖を増加し、そして１０％ＦＢＳの存在下では、その効果はより少なかった。
【００８３】
これらの結果は、ＸＭＰ．６７９が、ＨＲＰＣの増殖を増強し、およそ５μｇ／ｍｌで最大値が観察されたことを示す。同様に、さらなる例示的なＢＰＩタンパク質産物ＸＭＰ．６２７、ＸＭＰ．６６４、およびＸＭＰ．７２８は、類似のＨＲＰＣ刺激活性を示した。
【００８４】
ＨＲＰＣを用いたｒＢＰＩ２１での最初の実験において、上記パートＡにおいて記載したウシ網膜周皮細胞の一次細胞培養物を用いた結果とは対照的に、ほとんどまたは全く、増殖が、観察されなかった。同様の結果は、ｒＢＰＩ５０、ｒＢＰＩ４２、および融合タンパク質（例えば、ＢＰＩ−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ｒＢＰＩ２３−Ｉｇ）またはＢＰＩ−ＬＢＰ融合タンパク質（例えばＡｂｒａｈａｍｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７２：２１４９−２１５５（１９９７）に記載されるようなＰ４１６１））ならびにＸＭＰ．７１１（［配列番号７］）、ＸＭＰ．８５２（［配列番号８］）、およびＸＭＰ．８６１（［配列番号９］）を用いた最初の実験で得られた。ＸＭＰ．７１８（［配列番号１０］）およびＸＭＰ．３６５（［配列番号１１］）は、最初のアッセイでＨＲＰＣに対して多少の毒性を示すようであった。対照的に、ＸＭＰ．６２９（［配列番号１２］）、ＸＭＰ．６７６（［配列番号１３］）、ＸＭＰ．７６８（［配列番号１４］）、およびＸＭＰ．８５１（［配列番号１５］）は、ＨＲＰＣの増殖を増強した。さらなるアッセイを、ＢＰＩタンパク質産物を用いて行い、ここで、細胞培養培地を、交換し、さらなる量の試験化合物を、上記のパートＡの実験において記載したように加え、ＨＲＰＣの増殖の増強を、上記に記載されたように測定した。
【００８５】
（実施例３）
（ウシ網膜色素上皮細胞に対する効果）
ウシ網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）を、神経網膜を取り除いた後に穏やかな切屑により単離し、Ｋｉｎｇら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８７、３６：１４６０−７において記載されるように０．２％のコラゲナーゼを用いてインキュベートした。ＲＰＥＣを、５．５ｍＭグルコースおよび１０％子ウシ血清を含むＤＭＥＭ（ＣＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２中で培養し、そして培地を１日おきに交換した。細胞を、それらの同質性についてＲＰＥＣの抗サイトケラチン抗体との免疫反応性によってを用いて特徴付けた。光学顕微鏡によって確認されたように、これらの条件下で、細胞は形態学的に変わらないままであった。２から７の継代由来の細胞のみを、この実験のために使用した。
【００８６】
細胞増殖アッセイを、上記で記載される実施例１のように行った。結果を、図２に示す。ｒＢＰＩ２１の添加は、７５μｇ／ｍｌでは効果を有さなかった。ＸＭＰ．６７９は、１５μｇ／ｍｌで同様（およそ２０〜３０％）の成長促進効果を有した。
【００８７】
（実施例４）
（ＢＰＩタンパク質産物のインビボ効果）
（Ａ．新生児期のマウスにおける抗新脈管形成効果についてのインビボアッセイ）
虚血誘導型網膜新生血管形成を生成するために、Ｓｍｉｔｈら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９４，３５；１０１−１１１に記載されるように、７日齢（生後７日、Ｐ７）の同腹子Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよびその保育母（ｎｕｒｓｉｎｇ  ｍｏｔｈｅｒ）を、７５±２％の酸素に５日間曝し、次いでＰ１２齢の時点で外気に戻した。Ｐ１２からＰ１７までの２４時間ごとに、ＸＭＰ．６７９（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内への注射を、行った。コントロールの動物には、生理食塩水を注射した。屠殺および眼球除去の後、平坦に取り付けた、フルオレセイン結合型デキストラン灌流網膜を、網膜血管系を評価するために検査した。
【００８８】
このモデルマウスは、網膜において新脈管形成を誘導する際に低酸素症の効果をもたらす。生後、マウスを、４〜５日間高レベル酸素に曝す。高レベル酸素の効果は、網膜の血管の増殖を減少または妨げる。一旦マウスを、高酸素状態から通常の酸素レベルに移すと、網膜は、血管の欠乏に起因して低酸素症を発生する。網膜における低酸素症は、脈管形成応答を導く多くの成長因子（ＶＥＧＦを含む）を誘導し、この脈管形成応答は、血管における内部境界膜を越えた核酸の数を測定することにより定量化され得る。この新脈管形成のモデルマウスは、早熟の網膜症の良好な動物反映物（ａｎｉｍａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）であると考えられる。このモデルマウスにおいて網膜の新脈管形成を引き起こす主な成長因子は、ＶＥＧＦの発現に起因すると考えられる。
【００８９】
前の研究と同じように平坦に取り付けた、フルオレセイン結合型デキストラン灌流網膜および低酸素症の５日後のコントロール動物に由来するヘマトキシリン−エオシン染色された組織の切片の検査は、特に、中央末梢において、内部境界膜を越えてガラス体に達する、血管新生ラフト（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｕｆｔ）を示した。これらの血管新生ラフトは、Ｐ１７〜Ｐ１９で最も顕著であるが、Ｐ２３以降は、新生血管形成が、退行しそしてＰ２６までには血管パターンは、正常化した。
【００９０】
Ａｉｅｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２：１０４５７−６１に記載されるように、Ｐ１７（ｎ＝５）のマウスを、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｌ）ナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて深く麻酔し、そして４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化生理食塩水の心臓への灌流により屠殺された。目を、摘出し、そして４℃で一晩４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋（ｅｎｂｅｄ）した。視神経乳頭を含む５０を越える連続的な切片（６μｍ）を、顕微鏡のスライドに配置した。過ヨウ素酸／シッフ試薬およびヘマトキシリン染色の後、各々３０μｍ離れた、同じ長さの１０のインタクトな切片を、３００μｍにわたって評価した。十分に遮蔽されたプロトコルにより、各切片において、内部境界膜より前方の全ての網膜血管細胞核を、カウントした。１０のカウントされた全ての切片の平均値により、一つの目あたり６μｍあたりの平均的な血管新生細胞核を得た。内部境界膜の前方の血管細胞核は、操作されていない正常な動物においては観察されない。
【００９１】
毎日の腹腔内注射を介してＸＭＰ．６７９が与えられたマウスの網膜は、コントロールマウスにおいて観察された密度およびねじれより少ない密度およびねじれを有する、より少ない血管を示した。ＸＭＰ．６７９はまた、内部境界膜を越える核の数を減らし、内部境界膜（ｐ＜０．００１）より前方の核の数をおよそ３０％〜４０％減少させた。
【００９２】
上記に記載のような、１０ｍｇ／ｋｇのＸＭＰ．６７９を用いた実験に加えて、２０ｍｇ／ｋｇのＸＭＰ．６７９を用いた実験を行った。同様の知見を観察した。毎日の腹腔内注射を通して２０ｍｇ／ｋｇのＸＭＰ．６７９を与えられたマウス（ｎ＝６）の網膜は、およそ７１％だけ、内境界膜上の核の数の減少かつ内境界膜の前部の核の数の減少（ｐ＜０．０１）を示した。それらの結果、例示的なＢＰＩタンパク質産物のＸＭＰ．６７９が、新生仔のマウスで、用量応答性様式（例えば、１０〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲において）における網膜の新生血管形成を阻害することを示した。
【００９３】
（Ｂ．ラットにおける抗新脈管形成交換についてのインビボアッセイ）
上記Ａ部分に記載される新生仔のマウスにおける、ＢＰＩタンパク質産物の抗新脈管形成についてのアッセイに対比して、実験を新生仔のラットＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｊａｐａｎ）で行った。７５±２％の一定のレベルの酸素に５日間、新生仔のマウスを曝露することによって、虚血誘導性の網膜新生血管形成の生成する、上記Ａ部分での記載される方法とは異なり、新生仔のラットを、以下に記載されるような酸素パルスに曝露した。
【００９４】
生後数時間の新生仔のラットを、酸素チャンバー（７８０ｍｍ×５２０ｍｍ×５２０ｍｍ）に配置した。実験チャンバー内の酸素レベルを、コンピュータープログラム（Ｏｘｙｃｙｃｌｅｒ、Ｒｅｍｉｎｇ  Ｂｉｏｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＮＹ、ＵＳ）で制御した。酸素レベルを、２０．５時間、８０％に維持し、次いで３０分間、２１％に急激に低下し、その後、次の３時間の間に徐々に８０％戻した。プログラムを、１１サイクル行った（２４時間／サイクル）。１１ｔｈサイクル終了後（出生後１１日（Ｐ１１））、母親および新生仔のラットを、大気条件に移しそして７日間保った。７日の期間段階で、新生仔のラットに２ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＸＭＰ．６７９を腹腔内注射した。Ｐ１８において、ラットを屠殺し、そして左眼を眼球摘出した。これらの眼を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１時間、固定した。はさみを用いて、角膜および強膜を眼杯から取り出した。これらのレンズを、ピンセットで取り除き、そして硝子体を、ピンセットおよびはさみで完全に取り出した。半球状の網膜を、４％ＰＦＡで固定し、そしてアデノシンジホスファターゼ（ＡＤＰアーゼ）組織化学の方法を用いて染色した。異常性の新生血管形成を、ＡＤＰアーゼ活性について網膜を組織化学的に染色することによってＰ１８で評価した。この手順は、この日齢のラットにおいて、網膜血管内皮および小神経膠細胞を優先的に染色する。この網膜を、ＡＤＰアーゼのインキュベート培地で穏やかに撹拌しつつ、３７℃にて、１時間インキュベートした。次いでそれを、冷生理食塩水で完全に洗浄し、そして１：１０の希釈度のアンモニウムスルフィドで１時間処理した。この網膜を、次いでシランで洗浄し、スルフィドを除去した。この網膜を、１滴の生理食塩水で被覆したスライドの上に配置した。４つの放射状に網膜曲線を切り放し、上方、下方、鼻側および側頭の四分円に範囲を決める。網膜を、カバーガラスで覆われたＰｅｒｍａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の層に配置した。網膜（ｒｅｇｉｎａ）の表面上の糸球の芽（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｂｕｄ）（小ポップコーン）（ｔｉｎｙ  ｐｏｐｃｏｒｎ）、扇状の新生血管の葉状体、および稜が同定され、ここで、この稜は、網膜表面の明確な伸長の上昇を引き起こし、そして、通常は、毛様体に対して並行に通っているいくつかの血管を含んでいる。
【００９５】
新生血管の強度をスコアづけするための判断基準は、以下のようであった。：０：なし；１：＜５芽；２：＞５芽、または１つの葉状体；３：稜＜四分円の半分；あるいは４：稜＞四分円の半分。網膜の新生血管スコアは、四分円スコアの和と等しかった。それらのスコアは、ビヒクル注入された眼において６．４１であり、そしてＸＭＰ．６７９を注射したラットの眼において、７．２９、４．５９および５．５６であった（それぞれ２ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日および２０ｍｇ／ｋｇ／日）。相違は、統計学的に有意ではなかったが、網膜新生血管形成スコアは、ＸＭＰ．６７９によって６ｍｇ／ｋｇに減少した。
【００９６】
（Ｃ．過剰ガラクトース血（ｈｙｐｅｒｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｃ）ラットにおけるインビボ研究）
さらなるインビボ実験を、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物を用いて、過剰ガラクトース血（ｈｙｐｅｒｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｃ）ラット（ＫｅｒｎおよびＥｎｇｅｒｍａｎｎ、１９９５，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、１１４（８）：９８６−９９０）、またはＳＴＺによる糖尿病の誘発で、血管にＰＫＣβアイソフォームを過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｒｏｂｉｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｅｘｐ．Ｒｅｓ．１０：３３８（１９９１））のいずれかで行った。（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、１９９７  Ｄｉａｂｅｔｅｓ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２３：３０−４２；Ｈｉｒｓｃｈｉ＆Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９６年１０月；３２（４）：６８７９８）
（Ｄ．レーザー処置されたラットにおける脈絡膜の新生血管形成膜形成の研究）
黄斑変性症の加齢性モデルにおける、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の効果はまた、霊長類モデルにおいて研究される（Ｍｏｎａｃｏ＆Ｗｏｒｍｉｎｇｔｏｎ  Ｏｐｔｏｍ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９９０年７月；６７（７）：５３２−７；Ｈｏｐｅら、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９９２年１月；７６（１）：１１−６）。さらに、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の使用（加齢性黄斑変性症の湿潤性（ｗｅｔ）形式のための処置として）を実証するために、レーザー処置されたラットにおいて、脈絡膜の新生血管形成膜（ＣＮＶＭ）形成に対するこれらの効果を研究した。アッセイは、以下のように行った。
【００９７】
雄の成体のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、麻酔（気管支分泌物を最小化するための７５  ｍｇ／ｋｇケタミン、２．５  ｍｇ／ｋｇアセプロマジン、および０．０５  ｍｇ／ｋｇアトロピン）にかけ、そして瞳孔拡大を起こす（局所的に１％シクロペントレート、２．５％フェニレフリン、および１％硫酸アトロピン）。その動物を、メーヨースタンドに配置し、そして眼底を、コンタクトレンズとして、顕微鏡用スライドのカバースリップおよびゴニオゾール（ｇｏｎｉｏｓｏｌ）も用いて可視化する。Ｅｉｇｈｔ  Ｋｒｙｐｔｏｎ赤色光凝固バーン（ｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｒｎ）（１５０ｍＷ，１９９ｕＭ，００．５  ｓｅｃ）視神経円板の周囲の等距離にあるファンド（ｆｕｎｄ）に適用する。この強度が、再現可能なＣＮＶＭ形成を有するブルーフ膜、破裂および中央および内側の網膜に対する最小限の付随的な損傷、を引き起こした。５％プロビドンを、眼球の表面に適用し、そして局所的な麻酔（０．５％塩酸プロポパラカイン）を、硝子体内注射の前に適用する。レーザー光凝固バーンの配置後すぐに（５分で）、動物は、１つの眼に、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の１回の硝子体内注射を受け、そして制御ビヒクルを、対側の眼に注射する。動物の群は、ＢＰＩタンパク質産物のような試験化合物の異なった投与量を、（例えば、腹腔内注射または硝子体内注射によって）受ける。別の群は、硝子体内注射を受けず、そしてレーザーだけのコントロールとして役割を果たす。
【００９８】
処置後１４日で、それぞれの投与量の群から動物の半分が、新生血管形成を評価するための、回収された眼の眼底写真（ｆｕｎｄｕｓ  ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ）、フルオレセイン血管造影法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）および組織病理研究を受ける。処置後２８日で、それぞれの投与量の群の残りの動物は、レーザーだけのコントロールと同様に、新生血管形成の評価を受ける。
【００９９】
眼底のカラー写真を使用して、レーザーでのバーンの大きさ、ならびに網膜下の血管、網膜下の出血および網膜下の体液の存在を測定する。ＣＮＶＭを、フルオレセイン血管造影図分類スキームでランク付けする。（Ｒｅｉｎｋｅら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ（Ｓｕｐｐｌ）１９９６；３７，１２５）。フルオレセイン血管造影図の知見は、組織病理研究からの知見と相関する。組織病理研究のために、眼を摘出し、そして眼杯調製物を、４％リン酸緩衝化パラホルムアルデヒドで、室温にて一晩固定する。細胞切片を、脱水し、パラフィンで包埋し、光学顕微鏡のために６μｍの切片を、ヘキサトキシンおよびエオシンで染色する。組織学的標本を、以下について光学顕微鏡によって調べる：新生血管形成の存在または非存在；脈絡膜、ブルーフ膜および網膜に関しての新生血管形成のレベル；その応答、または元々の損傷および引き続くＣＮＶＭに対するＲＰＥ細胞。さらに、眼における、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の眼球の毒物学を、臨床的に評価し、そしてランク付けし、そして組織的特性および細胞的特性を組織病理学的に評価する。
【０１００】
（Ｅ．インビボでの非透過性研究）
（１．）ＶＥＧＦ誘導性網膜血管透過性における効果）
インビボでのラットモデルにおける、ＶＥＧＦ誘導性血管の透過性での、ＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の効果を、硝子体の蛍光光度分析（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）（Ａｉｅｌｌｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９７；４０：１４７３−１４８０に記載される）によって測定する。アッセイを以下のように行う。
【０１０１】
成体の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、例えば、ＢＰＩタンパク質産物のような試験化合物、またはビヒクルのみを硝子体内または腹腔内に投与によって処理する。カテーテルを、硝子体の蛍光光度分析の２４時間前に、右側の頚静脈に移植する。硝子体の蛍光光度分析測定のベースラインを、全ての動物から得て、内因性の蛍光を補正し、そして全ての引き続く硝子体の蛍光光度分析測定から減算する。ＶＥＧＦ（２ｎｇの眼、２５ｎｇ／ｍｌ最終）を、０時間において１つの眼に眼内注射し、そしてウシ血清アルブミン／生理食塩水コントロールを、対側の眼に投与する。１５分後、３０〜６５μｌの１０％ナトリウムフルオレセイン（Ａｋｏｒｎ，Ａｂｉｔａ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＡ）を、頚静脈のカテーテルを通して注射する。硝子体のフルオレセインの漏出を、硝子体の蛍光光度分析測定のベースラインを作成した４０分後、蛍光光度分析によって測定する。この眼の硝子体における、フルオレセイン色素の蓄積を、フルオレセインの４８８ｎｍの励起波長を利用し、硝子体の中心からの蛍光発光ピーク（５２０ｎｍ）にて中央に位置付けられるように得られた蛍光発光を調整することによって測定する。
【０１０２】
（２．）糖尿病誘導性網膜血管透過性における効果）
糖尿病誘導性網膜血管透過性におけるＢＰＩタンパク質産物を含む試験化合物の効果を、エバンスブルー拡散によって記載されるようにラットにおいて研究する（Ｘｕら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｌａａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００１；４２：７８９−７９４に記載される）。エバンスブルー色素は、血漿アルブミンに結合し、そして一定期間に渡って周囲の細胞に拡散する。色素の濃度は、標的組織から色素を抽出することによって測定し、そして分光測光法によって色素を定量する。網膜組織における、アルブミン結合色素の量は、網膜血管透過性に相関する。アッセイを、以下のように行う。
【０１０３】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病にし、そして２４時間後血液のグルコース測定によって糖尿病を確認する。動物を、例えば、ＢＰＩタンパク質産物のような試験化合物またはビヒクルのみの、腹腔内投与または硝子体注射で処理する。ポリビニルカテーテル（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）を、エバンスブルー色素測定の２４時間前に、麻酔したラットの右側の頚静脈に移植する。実験の日に、エバンスブルー色素（４５ｍｇ／ｋｇ）を、頚静脈のカテーテルに注射する。色素注射の２時間後、さらに麻酔を与え、そして腹壁切開を行い、下行大静脈を露出させる。ヘパリン処理した静脈血（０．９ｃｃ）を、取り出し、平均の血漿色素濃度を測定する。胸部腔を、露出し、そして２５ゲージの蝶型カテーテルを、左心室に移植する。大静脈の弓を、切り、そして３０ｃｃの生理食塩水を、蝶型カテーテルを通して生理学的圧力で、心臓に注入する。生理食塩水注入後、３０ｃｃの１０％ホルマリンを注入し、組織を固定する。組織固定後、眼を摘出する。それぞれの眼からの網膜を、外科用顕微鏡を用いて単離し、そして事前に秤量したエッペンドルフ（ｅｐｅｎｄｏｒｆ）管に配置する。網膜サンプルを、ホルムアミド中で一晩、７２℃にてインキュベートし、エバンスブルー色素を抽出する。インキュベーション後、得られた抽出物を、超遠心分離し、そして上清を、分光光度法測定に用いる。吸光度を、６２０ｎｍ（エバンスブルーの最大）および７２０ｎｍ（エバンスブルー最小）で測定する。
【０１０４】
上述の発明の多数の改変およびバリエーションは、当業者に想到される。従って、添付の特許請求の範囲における限定のみが、その結果として、据えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｂは、ウシ網膜周皮細胞増殖に対するＢＰＩタンパク質産物の効果を示す。
【図２】
図２は、ウシ網膜上皮細胞増殖に対するＢＰＩタンパク質産物の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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