(57)【要約】本発明は、器官機能を測定するための蛍光試薬、機器および技術に関し、より詳細には、器官機能の実時間測定に関する。本発明の目的は、特定の生物体に蛍光因子を提供して、特定の機能をモニタリングすることである。本発明の目的はまた、これらの因子の、標準的でかつ時間分解された経皮的な蛍光測定用の機器を提供することである。さらに、本発明の目的は、実時間測定およびこれらの因子の経皮的な蛍光測定から決定される器官機能のモニタリングのための方法を提供することである。１つの局面において、本発明は、検体のクリアランス機能を検出する方法である。
2004517041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体のクリアランス機能を検出する方法であって、該方法は、以下：
該検体の循環系にエレクトロルミネセンス薬剤を提供する工程；
該薬剤によって吸収されるのに十分なエネルギーおよび強度を有する電磁放射線で組織部位を照射する工程；
該組織部位からの発光の強度を検出する工程；および
既知の時間間隔で検出する工程を繰り返す工程、を包含し、ここで：
該薬剤は、該検体によって代謝されず；
該薬剤は、単一の機構によって浄化されるのみであり；
該薬剤は、血漿タンパク質または細胞外成分と結合せず；そして
該薬剤は、該検体によって再吸収されない、
方法。
【請求項２】
前記組織部位をレーザーで照射する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記照射する工程からの経過時間が、減衰時間の約９０％となるまで、前記繰り返す工程が実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レーザーがパルス化される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
バックグラウンドの発光が、前記検出する工程を実施する前に、不十分なレベルまで減衰するまで待機する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エレクトロルミネセンス薬剤が、５０ｎｓより大きな減衰時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出する工程を、所定の回数繰り返した後に、前記照射する工程を、繰り返す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、糸球体によって排他的に浄化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、エレクトロルミネセンス部分で結合体化されたポリアミノポリ酢酸誘導体を含み、該結合体は、赤色光または赤外線で照射される場合に、蛍光を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記エレクトロルミネセンス部分が、ランタニドイオンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ランタニドイオンが、３価である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ランタニドイオンが、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、およびＴｂ３＋からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、およびポリアミノポリビス（２−アミノエチルエーテル）酢酸からなる群から選択される、方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体は、以下：
【化１】
2004517041.tif 000010
を含み、ここで、Ｓは、酸素および窒素から選択される少なくとも１個の原子を有する環状有機部分であり、そしてＲは、有機官能基である、方法。
【請求項１５】
Ｓが、芳香族、脂肪族、置換、非置換、および上記の任意の組み合わせからなる群からのメンバーによって特徴付けられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｓが、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロイル、ピロリル、および上記の置換誘導体のメンバーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、Ｓが、ＮＯ２、ＮＨ２、イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基、およびカルボキシル基のメンバーで置換される、方法。
【請求項１８】
Ｒが、アセテート基またはｐ−トルエンスルホニル基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
請求項９に記載の方法であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、以下：
【化２】
2004517041.tif 000011
を含み、ここで、Ｒは、有機官能基である、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、Ｒが、置換された芳香性酸である、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、Ｒが、ピコリン酸、ニコチン酸、およびフロン酸のメンバーである、方法。
【請求項２２】
前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、溶解性エンハンサーをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶解性エンハンサーが、Ｎ−アセチルグルカミンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞外流体から物質のクリアランス速度を検出する装置であって、該装置は、以下：
検体の細胞外流体中のエレクトロルミネセンス部分によって吸収されるような、十分な強度の光およびエネルギーを発生し得る、光源；
該光源からの光を該検体に送達するための、光ファイバー；
検出器；
該エレクトロルミネセンス部分によって発光された光を該検出器に送達するための、光ファイバー；および
該検出器によって測定された値に基づいて、該エレクトロルミネセンス部分の減衰の速度を計算する、処理手段、
を備える、装置。
【請求項２５】
前記光源が、パルス化されたレーザーである、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
請求項２５に記載の装置であって、前記レーザーの周波数は、該レーザーが、前記エレクトロルミネセンス部分の減衰時間の所定のフラクションである時間間隔で光を放射させる周波数である、装置。
【請求項２７】
分子であって、該分子は、以下：
ポリアミノポリ酢酸誘導体；および
該ポリアミノポリ酢酸誘導体にキレート化されたエレクトロルミネセンス部分、を含み、結合体は、赤色光または赤外線で照射した場合に、蛍光を示す、分子。
【請求項２８】
前記部分が、ランタニドイオンである、請求項２７に記載の分子。
【請求項２９】
前記ランタニドイオンが、３価である、請求項２８に記載の分子。
【請求項３０】
前記ランタニドイオンが、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、およびＴｂ３＋からなる群から選択される、請求項２９に記載の分子。
【請求項３１】
請求項２７に記載の分子であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、およびポリアミノポリビス（２−アミノエチルエーテル）酢酸からなる群から選択される、分子。
【請求項３２】
請求項２７に記載の分子であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体は、以下：
【化３】
2004517041.tif 000012
を含み、ここで、Ｓは、酸素および窒素から選択される少なくとも１個の原子を有する環状有機部分であり、そしてＲは、有機官能基である、分子。
【請求項３３】
Ｓが、芳香族、脂肪族、置換、非置換、および上記の任意の組み合わせからなる群からのメンバーによって特徴付けられる、請求項３２に記載の分子。
【請求項３４】
Ｓが、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロイル、ピロリル、および上記の置換誘導体のメンバーを含む、請求項３３に記載の分子。
【請求項３５】
請求項３３に記載の分子であって、Ｓが、ＮＯ２、ＮＨ２、イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基、およびカルボキシル基のメンバーで置換される、分子。
【請求項３６】
Ｒが、アセテート基またはｐ−トルエンスルホニル基を含む、請求項３２に記載の分子。
【請求項３７】
請求項２７に記載の分子であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、以下：
【化４】
2004517041.tif 000013
を含み、ここで、Ｒは、有機官能基である、分子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の分子であって、Ｒが、置換された芳香性酸を含む、分子。
【請求項３９】
請求項３７に記載の分子であって、Ｒが、ピコリン酸、ニコチン酸、およびフロン酸のメンバーである、分子。
【請求項４０】
前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、溶解性エンハンサーをさらに含む、請求項３９に記載の分子。
【請求項４１】
前記溶解性エンハンサーが、Ｎ−アセチルグルカミンを含む、請求項４０に記載の分子。
【請求項４２】
前記結合体が、５０ｎｓより大きなエレクトロルミネセンスの減衰時間を示す、請求項２７に記載の分子。
【請求項４３】
請求項２７に記載の分子であって、該分子は、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体に結合した、抗体、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、酵素、または酵素補助因子からなる群からのメンバーをさらに含む、分子。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載の分子。
【請求項４５】
磁気共鳴像を実施する方法であって、該方法は、以下：
請求項２７に記載の分子を患者に注射する、工程；
磁場に該患者を曝す、工程；
水素の吸光エネルギーに対応するエネルギーを有する高周波数のパルスに該患者を曝す、工程；および
該高周波数のエネルギーの除去後に該水素からの発光を検出する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
免疫化学分析を実施する方法であって、該方法は、以下：
第１のリガンドを介して、検体と第１のエレクトロルミネセンス複合体とを会合する、工程；
該第１のエレクトロルミネセンス複合体を、該複合体の吸収波長の光に曝す、工程；ならびに
該第１のエレクトロルミネセンス複合体によって放射された光を検出する、工程、を包含し、
ここで、該第１の複合体は、以下：
ポリアミノポリ酢酸アナログ；および
二環式の該ポリアミノポリ酢酸アナログにキレート化されたエレクトロルミネセンス薬剤、を含有する、
方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、該方法は、以下：
第２の検体と第２のエレクトロルミネセンス複合体とを会合する工程、をさらに包含し、
ここで、該第２の複合体の発光波長は、前記第１の複合体の発光波長と検出可能に異なる、
方法。
【請求項４８】
前記方法が、２以上のエレクトロルミネセンス複合体を用いて実施され得る、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記エレクトロルミネセンス複合体が、５０ｎｓより大きな減衰時間を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記曝す工程および前記検出する工程が、繰り返される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４６に記載の方法であって、第１のリガンドを前記検体に結合する工程をさらに包含し、ここで、前記第１のエレクトロルミネセンス複合体は、前記第１のリガンドへの結合を介して、該検体と会合される、方法。
【請求項５２】
前記第１のエレクトロルミネセンス複合体が、第２のリガンドを介して、前記第１のリガンドに結合される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記検体を支持体上に固定する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記会合する工程が、前記支持体上に結合したリガンドに前記検体を結合する工程を包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項４６に記載の方法であって、前記会合する工程が、以下：
前記検体と会合したエレクトロルミネセンス薬剤を除去する、工程；および
前記エレクトロルミネセンス薬剤をポリアミノポリ酢酸アナログと配位させて、前記第１のエレクトロルミネセンス複合体を形成する、工程、を包含し、ここで、
該ポリアミノポリ酢酸アナログは、該検体に結合せず、そして
該エレクトロルミネセンス薬剤は、リガンドを介して、該検体に結合される、方法。
【請求項５６】
前記ポリアミノポリ酢酸アナログが、ミセル中で隔離される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４６に記載の方法であって、前記リガンドは、抗体、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、酵素、または酵素補助因子からなる群からのメンバーを含む、方法。
【請求項５８】
請求項４６に記載の方法であって、前記ポリアミノポリ酢酸アナログは、以下：
【化５】
2004517041.tif 000014
を含み、ここで、Ｓは、酸素および窒素から選択される少なくとも１個の原子を有する環状有機部分であり、そしてＲは、有機官能基である、方法。
【請求項５９】
Ｓが、芳香族、脂肪族、置換、非置換、および上記の任意の組み合わせからなる群からのメンバーによって特徴付けられる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
Ｓが、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロイル、ピロリル、および上記の置換誘導体のメンバーを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項５９に記載の方法であって、Ｓが、ＮＯ２、ＮＨ２、イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基、およびカルボキシル基のメンバーで置換される、方法。
【請求項６２】
Ｒが、アセテート基またはｐ−トルエンスルホニル基を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
請求項４６に記載の方法であって、前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、以下：
【化６】
2004517041.tif 000015
を含み、ここで、Ｒは、有機官能基である、方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、Ｒが、置換された芳香性酸である、方法。
【請求項６５】
請求項６３に記載の方法であって、Ｒが、ピコリン酸、ニコチン酸、およびフロン酸のメンバーである、方法。
【請求項６６】
前記ポリアミノポリ酢酸誘導体が、溶解性エンハンサーをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記溶解性エンハンサーが、Ｎ−アセチルグルカミンを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記エレクトロルミネセンス薬剤が、ランタニドイオンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ランタニドイオンが、３価である、請求項６８に記載の分子。
【請求項７０】
前記ランタニドイオンが、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、およびＴｂ３＋からなる群から選択される、請求項６９に記載の分子。
【請求項７１】
二環式分子であって、該二環式分子は、以下：
【化７】
2004517041.tif 000016
を含み、ここで、Ｓは、酸素および窒素から選択される少なくとも１個の原子を有する環状有機部分であり、そしてＲは、有機官能基である、分子。
【請求項７２】
Ｓが、芳香族、脂肪族、置換、非置換、および上記の任意の組み合わせからなる群からのメンバーによって特徴付けられる、請求項７１に記載の分子。
【請求項７３】
Ｓが、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロイル、ピロリル、および上記の置換誘導体のメンバーを含む、請求項７２に記載の分子。
【請求項７４】
請求項７２に記載の分子であって、Ｓが、ＮＯ２、ＮＨ２、イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基、およびカルボキシル基のメンバーで置換される、分子。
【請求項７５】
Ｒが、アセテート基またはｐ−トルエンスルホニル基である、請求項７１に記載の分子。
【請求項７６】
分子であって、該分子は、以下：
【化８】
2004517041.tif 000017
を含み、ここで、Ｒは、有機官能基である、分子。
【請求項７７】
請求項７６に記載の分子であって、Ｒが、置換された芳香性酸である、分子。
【請求項７８】
請求項７６に記載の分子であって、Ｒが、ピコリン酸、ニコチン酸、およびフロン酸のメンバーである、分子。
【請求項７９】
前記ポリアミノポリ酢酸誘導体、溶解性エンハンサーをさらに含む、請求項７８に記載の分子。
【請求項８０】
前記溶解性エンハンサーが、Ｎ−アセチルグルカミンを含む、請求項７９に記載の分子。
【発明の詳細な説明】
（発明の分野）
本発明は、器官機能を測定するための蛍光試薬、機器および技術に関し、より詳細には、器官機能の実時間測定に関する。
【０００１】
（発明の背景）
複数の外科的状態、医学的状態および産科学的状態の合併症として、急性呼吸不全（ＡＲＦ）は、個人および大衆の重大な健康問題となる。潜在的な発作を迅速に排除するにより、危険な状態の患者を早期に同定することは、多くの生命を救う大切な原則である。不幸なことに、この原則を徹底して実行しているにもかかわらず、この疾患は依然として、高い羅患率および死亡率（約５０％の生存率を有する）の原因であり、この数字は、１９５０年から実質的に改善されていない（Ｂｕｔｋｕｓ，Ｄ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１４３：２０９〜２１２，１９８３）。この乏しい結果は、一過性の虚血の発病後の機能または毒性誘導細胞破壊を実質的に完全に回復する腎臓の大部分の特有の能力と対照的である。死亡率と可逆性についての可能性との間の矛盾は、ＡＲＦの発病後の器官機能の完全な回復を確実にする目的を持った現在の診断的選択および治療的選択の再考の必要性を強調する。
【０００２】
ＡＲＦを有する患者の臨床的状態は、以前の健康状態および腎不全を引き起こす特定の発作の性質によって、大部分が決定され、ＡＲＦを処置するために使用される任意の治療的アプローチは、同時に、誘発原因および改善された器官機能を正す方に向けられるべきである。腎臓の血液灌流は、外傷、外科手術、出血または脱水症の状況においてＡＲＦを引き起こす、最も頻繁に認識される単回発作である（Ｋｅｌｌｅｎ，Ｍ．，Ｓ．Ａｒｏｎｓｏｎら、Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．，７８：１３４〜１４２，１９９４；Ｈｏｕ，Ｓ．，Ｄ．Ｂｕｓｈｉｎｓｋｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，７４：２４３〜２４８，１９８３）。このような急性の状況における心肺機能の連続的かつ正確なモニタリングは、長年利用可能であり、臨床学的に病気の患者における正常な循環状態を回復させるのに、紛れも無く役立っている。しかしながら、現時点において、腎臓機能のモニタリングは、粗野な測定（例えば、尿の排出量および血清クレアチニン）を用いて行われる。不幸なことに、それらの長い分解能時間（腎臓機能の単一測定を得るために必要とされる時間）のために、これらのパラメータを、腎臓機能の実時間のモニタリングのために使用することができない。例えば、クレアチニンクリアランス測定は、約１２時間の分解能を有する。この時間までに、患者のＡＲＦがこの技術によって認識されるが、患者を処置するのには遅すぎて、腎臓が助かる見込みは全くない。クリティカルケアの間に腎臓機能をモニタリングするための標準的な技術の欠点は、ＡＲＦの予防および器官不全を直すのに適切な治療の決定について、最も顕著に制限されることである。
【０００３】
糸球体濾過率（ＧＦＲ）の測定は、微小穿刺によって直接的にか、またはクリアランス方法によって間接的になされ得る。直接的技術は、実験動物における糸球体の限外濾過の産生および調節の理解に主に寄与するが、手順の可逆性の性質は、ヒトにおいて疑問値を与える。一方、クリアランス技術は、ヒトの腎臓機能を測定するために通常使用される。しかしながら、この技術は、このような長い分解能時間を有するので、異なる生理学的条件および病理学的条件下で生じ得るＧＦＲの急激な変化を検出するのが非常に困難である。例えば、ＧＦＲは、実施中に変化し（Ｂａｒｃｌａｙ，Ｊ．，Ｗ．Ｃｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ），１０４：１４，１９４６）、起立性低血圧症を伴って変化し（Ｐａｐｐｅｒ，Ｅ．およびＳ．Ｎｇａｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，７：２１３〜２２４，１９５６）、そして姿勢の変化を伴って変化する（Ｗｅｒｋｏ，Ｌ．，Ｈ．Ｂｕｃｈｔら、Ｓｃａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１：３２１，１９４９）。実施中のＧＦＲの変化は、実施レベルが非常に激しく、かつ心肺機能の変化が非常に持続的である場合にのみ、検出される（Ｓｅｌｋｕｒ，Ｅ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｌ．Ｆｉｅｌｄ，編、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．，．第２巻、１４５７〜１５１６頁，１９６３）。これらの結果は、低いレベルの実施におけるＧＦＲの変化が、クリアランス技術の乏しい分解能に起因して検出不可能となり得ることを示唆している。この重要な、クリアランス技術の制限を完全に理解するために、腎臓の血液灌流事象に匹敵する理想的な実験条件下で生じ得るＧＦＲの変化が、どれほど速いかを問うべきである。単離された、灌流したイヌの腎臓で行った研究により、灌流圧の（数秒以内の）急激な変化は、ＧＦＲの（２、３秒以内の）変化に、非常に密接に従うことが示されている（Ｈａｒｖｅｙ，Ｒ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，１５：１７８〜１８２，１９６４）。一方、クリアランス技術は、全体的に、異なる分解能時間を有する。尿中の組成物において初期に検出されるＧＦＲの急激な変化のために、かなりの間隔（３０分より多い）が必要とされることが、かなり初期に認識されていた（Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．，Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９５１）。この時間は、膀胱に到達し、そして膀胱内にすでに含まれる尿と平衡化する前に、尿細管、集合管および尿管を通過させるための限外濾過に必要とされる時間をおそらく表しているようである。少なくとも２つのサンプルが、平衡状態において測定が行われていることを判断するのに必要とされるので、この手順に関する最小の理想的な分解能時間は、約１時間である。尿サンプルおよび血液サンプル中の因子の濃度を測定する際の、この時間および通常の減衰は、ＡＲＦを有する患者における腎臓機能のベッドサイドの実時間モニタリングについてのこの手順の使用において、重大な制限を有する。
【０００４】
腎臓機能は、クレアチニンクリアランスによって従来的に測定される。しかしながら、クレアチニン測定および尿収集に伴う技術的な問題に加えて、クレアチニンクリアランスは、ＧＦＲの正確な測定ではない（Ｃａｒｒｉｅ，Ｂ．，Ｈ．Ｇｏｌｂｅｒｔｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６９：１７７〜１８２，１９８０；Ｐｒｉｃｅ，Ｍ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１０７：３３９〜３４０，１９７２）。クリアランス技術を用いて、腎臓糸球体機能および尿細管機能を測定するための定量的な方法は、長年にわたり利用可能である。非内因的に産生された物質であるイヌリンは、おそらく、理想的なＧＦＲ剤の要求を満たす（Ｓｍｉｔｈ，１９５１）。これは、「王道（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」のままであるが、測定の化学方法は、不幸なことに扱いにくいため、定期的に使用することができない。ＧＦＲ剤の要求を満たす物質を探求することに加えて、クリアランス測定、すなわち、尿収集における誤差の他の主要な原因を克服するための研究もまた、必要とされている。２つのアプローチが首尾よく見出されている。最も正確であるが、平衡に到達する（この時点で、血漿レベルは定常である）までに、物質を一定に注入することは、技術的な困難である。次いで、注入速度は、尿の損失速度と等しくなり、尿収集は必要ではない（Ｅａｒｌｅ，Ｄ．およびＲ．Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６２：２６２〜２６４，１９４６）。あるいは、単回静脈内注射の後の基質の血漿消失速度は、ＧＦＲの使用可能な算出値により決定される（Ｓａｐｉｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｄ．Ｖｉｄｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８１：３３０〜３３６，１９５５；Ｃｈａｎｔｌｅｒ，Ｃ．およびＴ．Ｂａｒｒａｔｔ，Ａｒｃｈｓ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．，４７：６１３〜６１７，１９７２）。トレーサの消失は、３〜４時間にわたって複数の血液サンプルを採取し、次いで、これらのサンプルの放射能を測定することによって決定される。ＧＦＲ剤が糸球体によって自由に濾過されなければならないという要件に加えて、尿を収集せずにクリアランスを測定するために物質が使用される場合、４つの他の基本的な判定基準が適用されなければならない：
ａ．ＧＦＲ剤が代謝されてはならない；
ｂ．ＧＦＲ剤が、（腎臓以外の排泄物の他の経路ではなく）糸球体の濾過によって排他的に取り除かれなければならない；
ｃ．ＧＦＲ剤が、血漿タンパク質または細胞外成分に結合されてはならない；そして、
ｄ．ＧＦＲ剤が、ネフロンによって再吸収されてはならない。
【０００５】
５１Ｃｒ−ＥＤＴＡ、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ、および１２５Ｉ−ナトリウムヨータラメート（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｔｈａｌａｍａｔｅ）は、これらの要件を満たし、そして大部分の臨床的研究において、ＧＦＲの測定のための認められた選択である（Ｃｈａｎｔｌｅｒ，１９７２；Ｓｉｇｍａｎ，Ｅ．，Ｃ．Ｅｌｌｗｏｏｄら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，７：６０〜６８，１９６５）。これらのクリアランス技術の大部分は、クレアチニンクリアランスよりも正確ではあるが、それらの技術的な複雑性のために、あまり広範には使用されていない。さらに、これらの方法の全ては、腎臓機能の実時間で正確なモニタリングにひどく不適切である。明確には、急性臨床的設定における実時間で、正確で、かつ連続的なＧＦＲの測定は、ＡＲＦを有する患者またはＡＲＦを発病する危険性のある患者の管理において極めて有用である。
【０００６】
糸球体濾過は尿の生成における第一段階であるので、ＧＦＲの測定は、腎臓機能を評価するための最も簡便でかつ信頼できるパラメータを表す。イヌリンクリアランスがＧＦＲの最良の測定であるという一般的意見が存在しているが、上記のように、この試薬の使用においていくつかの固有の困難性が存在する。イヌリンの代替として、放射活性トレーサで標識された多数の因子が、ＧＦＲの測定のために過去２〜３年に導入されており、これらとしては、以下が挙げられる：数種のキレート化剤（例えば、５１Ｃｒ−ＥＤＴＡ（Ｓｔａｃｙ，Ｂ．およびＧ．Ｔｈｏｒｂｕｒｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５２：１０７６〜１０７８，１９６６）、１１１ｍＩｎ−ＤＴＰＡ（Ｒｅｂａ，Ｒ．，Ｆ．Ｈｏｓａｉｎｔら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，９０：１４７〜１５２，１９６８）、１６９Ｙｂ−ＤＴＰＡ（Ｈｏｓａｉｎ，Ｆ．，Ｒ．Ｒｅｂａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．，２０：５１７〜５２４，１９６９；Ｐｅｒｒｏｎｅ，Ｒ．，Ｔ．Ｓｔａｉｎｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．，１６：２２４〜２３５，１９９０）、ならびに１４０Ｌａ−ＤＴＰＡ（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｃ．およびＭ．Ｂｌａｕｆｏｘ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１２：１１７〜１２２，１９６８））。９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡを迅速かつ簡単に調製するためのキットの導入は、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡを、血液クリアランスによって（Ｋｌｏｐｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｈａｕｓｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ，１３：１０７〜１１０，１９７２；Ｂａｒｂｏｕｒ，Ｇ．，Ｃ．Ｃｒｕｍｂら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ，１７：３１７〜３２０、１９７６；Ｈｉｌｓｏｎ，Ａ．，Ｒ．Ｍｉｓｔｒｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．，４９：７９４〜７９９，１９７６）か、または外部検出（Ｂｌａｕｆｏｘ，Ｍ．，Ｅ．Ｐｏｔｃｈｅｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ，８：７７〜８５、１９６７；Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｐａｔｅｌら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，４８：３７７〜３９１，１９７１；Ｔｈｉｒｉｍｕｒｔｈｉ，Ｋ．，Ｍ．Ｃａｓｅｙら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ａｌｌ．Ｓｃｉ．，２８：２４５〜２５０，１９８４）によるかのいずれかで、ＧＦＲを測定するために使用する最も容易に利用可能な試薬にする。
【０００７】
（腎臓機能についての実時間モニタリング：）
この機会をうまく利用して、本発明者らは、腎臓機能の非侵襲性かつ実時間のモニタリングについての新たなアプローチを開発した（Ｒａｂｉｔｏ，Ｃ．，Ｒ．Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３４：１９９〜２０７，１９９３）。この方法は、単回注入技術（Ｄｏｎａｔｈ，Ａ．，Ａｃｔａ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｃａｎ．，６０：５１２〜５２７，１９７１）のバリエーションに基づき、ここで、放射能の連続的かつ瞬間的な測定は、静脈血の間欠的で遅延性のアッセイではなく外部検出を用いて行われ、これは同一出願人の特許である米国特許第５，６４７，３６３号および同第５，３０１，６７３号（その内容は、本明細書中で参考として援用される）に、より詳細に記載される。微小データロガーに接続された放射線検出器を使用して、細胞外空間からの９９ｍＴｃ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ）のクリアランスをモニタリングした（Ｒａｂｉｔｏ，１９９３）。短い平衡期間の後、このシステムは、一次動力学を用いた画分システムとして挙動した。このシステムにおいて、活性化のログは、時間と共に線形的に変化し、得られた線の傾きによって速度定数が得られる。２つの重要な仮定が、腎臓機能をモニタリングするためのこのアプローチの使用に関与する。１つ目の仮定は、速度定数の測定が実時間状態に近づくのに十分速く行われ得るということである。例えば、傾きまたは速度定数は、たった数分間の短い時間間隔のわずか数秒間に行われた活性のいくつか連続した測定値から算出され得る。この速度定数は、数分毎に、または新たな各個々の測定が入力された後ほどなくアップデートされ得る。２つ目の仮定は、細胞外空間からの「理想的な」糸球体濾過剤のクリアランスに対する速度定数の測定値が、ＧＦＲの正確かつ再現可能な推定値と成るということである。単回注入技術において、ＧＦＲは、通常、速度定数を掛けたＧＦＲ因子の分布容量として算出される。しかしながら、容量分布は、体表面領域によって規格化された後に一定であると推定されるので、速度定数それ自体は、ＧＦＲの正確な推定値を表わす。これらの仮定は、異なる程度の腎臓機能不全を有する５０人の患者における、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡのクリアランスに対する速度定数と、標準的な１２５Ｉ−ヨータラメートクリアランス技術を用いて行われる同時ＧＦＲ測定との間の良好な相関関係によって支持される（図１）。
【０００８】
それらの制限された分解能時間に起因して、腎臓機能を測定するための現在の技術を使用して、この新規なアプローチの分解能時間の改善を実証することはできない。代替として、本発明者らは、医療手順を受けている、高いＡＲＦの発生率を有する患者にデバイスを使用することによって、この技術の応答時間を研究した。理論的根拠は、ＡＲＦの場合において、機器がこの事象の間に生じ得る腎臓機能の任意の急激な変化に密接に従っていることである。しかしながら、介入前および介入後、ならびに一旦腎臓機能が安定になった際の、標準的なクリアランス技術を比較することによって、確認を行うことができた。例えば、この手順を使用して、集中治療室においてまたは血管造影の間の、ＡＲＦの危険性を伴う患者の腎臓機能をモニタリングした。これらの結果は、この技術が２．５〜５分間という短い分解能時間で腎臓機能の急激な変化を検出することを示した（Ｒａｂｉｔｏ，１９９３；Ｒａｂｉｔｏ，Ｃ．，Ｆ．Ｐａｎｉｃｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，４：１４２１〜１４２８，１９９４；Ｒａｂｉｔｏ，Ｃ．，Ｌ．Ｆａｎｇら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１８６：８５１〜８５４，１９９３）。
【０００９】
非常に革新的ではあるが、この技術はいくつかの制限を有する。第一に、厳密な調節および高いコストに起因して、全ての医師または医療機関が、放射活性トレーサ技術を使用できるというわけではない。第二に、被爆の危険性に起因して、外科手術の間、または乳児および妊娠した女性または出産後の女性の腎臓機能を、この技術を使用して測定することができない。これらの制限を克服するために、本発明者らは、蛍光活性化させた腎臓のモニタリングと組み合わせて使用し、それによって現在の放射活性ＧＦＲ因子およびＲＢＦ因子の制限を排除するための、蛍光ＧＦＲ因子および腎臓血流（ＲＢＦ）因子の開発を、本発明において提案する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の目的は、特定の生物体に蛍光因子を提供して、特定の機能をモニタリングすることである。
【００１１】
本発明の目的はまた、これらの因子の、標準的でかつ時間分解された経皮的な蛍光測定用の機器を提供することである。
【００１２】
さらに、本発明の目的は、実時間測定およびこれらの因子の経皮的な蛍光測定から決定される器官機能のモニタリングのための方法を提供することである。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、検体のクリアランス機能を検出する方法である。この方法は、以下の工程を包含する：検体の循環系にエレクトロルミネセンス因子を提供する工程、この因子によって吸収される十分なエネルギーおよび強度を有する電磁放射線で、組織部位を照射する工程、この組織部位からの発光強度を検出する工程、ならびに既知の時間間隔で検出する工程を繰り返す工程。この因子は、検体によって代謝されず、かつ単一の機構によってのみ浄化される。さらに、この因子は、血漿、タンパク質または細胞外成分と結合せず、かつ検体によって再吸収されない。この方法はさらに、組織部位をレーザ（例えば、パルス化したレーザ）で照射する工程を包含する。繰返し工程は、照射工程からの経過する時間が減衰時間の約９０％（例えば、５０ｎｓより大きい）になるまで行われ得る。検出工程が所定の回数繰り返された後、照射工程が繰り返され、そしてバックグラウンド発光が、検出工程が行われる前に不十分なレベルまで減衰され得る。
【００１４】
１つの実施形態において、この因子は、糸球体によって排他的に浄化され得、そしてエレクトロルミネセンス部分（ランタニドイオンを含み得る）に結合体化したポリアミノポリ酢酸誘導体を含み得る。このランタミドイオンは、三価であり得、そしてＣｅ＋＋＋、Ｎｄ＋＋＋、Ｓｍ＋＋＋、Ｅｕ＋＋＋またはＴｂ＋＋＋を含み得る。この結合体は、赤色光または赤外線で照射された場合に、蛍光を示し得る。
【００１５】
ポリアミノポリ酢酸誘導体は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、またはポリアミノポリビス（２−アミノエチルエーテル）酢酸からなる群より選択され得る。このポリアミノポリ酢酸誘導体は、以下：
【００１６】
【化９】
2004517041.tif 000003
を含有し得る。
【００１７】
Ｓは、少なくとも１個の酸素原子または窒素原子を有する環式有機部分であり得、そしてＲは、有機官能基（例えば、アセテートまたはｐ−トルエンスルホン基）であり得る。Ｓは、芳香族、脂肪族、置換または非置換であり得る。例えば、Ｓは、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロニル、ピロリルまたはそれらの置換誘導体を含み得る。例示的な置換基としては、ＮＯ２、ＮＨ２イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００１８】
あるいは、ポリアミノポリ酢酸アナログは、以下：
【００１９】
【化１０】
2004517041.tif 000004
を含み得る。ここで、Ｒは、有機官能基（例えば、有機酸）である。Ｒは、ピコリン酸、ニコチン酸またはフロン酸を含み得る。この分子は、溶解性エンハンサー（例えば、Ｎ−アセチルグルカミン）をさらに含み得る。
【００２０】
別の局面において、本発明は、細胞外流体から物質のクリアランス速度を検出するための装置である。この装置は、以下を備える：検体の細胞外流体中のエレクトロルミネセンス部分によって吸収される十分な強度およびエネルギーを有する光を生成し得る光源、この光源からの光を検体に送達するための光ファイバー、検出器、エレクトロルミネセンス部分によって放射された光をこの検出器に送達するための光ファイバー、ならびにこの検出器によって測定された値に基づいて、エレクトロルミネセンス部分の減衰速度を算出するための処理手段。この光源は、エレクトロルミネセンス部分の減衰時間の所定の画分である時間間隔において光を放射するような周波数を有する、パルス化されたレーザであり得る。
【００２１】
別の局面において、本発明は、エレクトロルミネセンス分子である。この分子は、エレクトロルミネセンス部分に結合体化したポリアミノポリ酢酸誘導体を含み、赤色光または赤外線で照射された場合に、蛍光を示す。この分子は、ポリアミノポリ酢酸誘導体に結合された抗体、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、酵素または酵素補助因子に結合され得る。この分子はまた、オリゴヌクレオチドを含み得る。別の実施形態において、本発明は、患者に対して磁気共鳴画像化を行う方法であり、この方法は、エレクトロルミネセンス分子を患者に注射する工程、この患者を磁場に曝す工程、この患者を高周波数パルスに曝す工程、およこのパルスを除去した後に、患者内の水素イオンの放出を測定する工程を包含する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、免疫化学分析を行う方法である。この方法は、分析物と第一のエレクトロルミネセンス錯体と会合させる工程、この第一のエレクトロルミネセンス錯体を、この錯体の吸収波長の光に曝す工程、およびこの第一のエレクトロルミネセンス錯体によって放射される光を検出する工程を包含する。この第一の錯体は、二環式ポリアミノポリ酢酸アナログ、およびこの二環式ポリアミノポリ酢酸アナログにキレート化されたエレクトロルミネセンス因子を含む。このエレクトロルミネセンス因子は、ランタミドイオンを含み得る。このランタミドイオンは、三価であり得、そしてＣｅ＋＋＋、Ｎｄ＋＋＋、Ｓｍ＋＋＋、Ｅｕ＋＋＋またはＴｂ＋＋＋を含み得る。この方法はさらに、第二の分析物と、第二のエレクトロルミネセンス錯体で標識される第二のリガンドとを会合させる工程を包含し、ここで、第二の錯体の発光波長は、第一の錯体の発光波長と検出可能に異なる。この方法は、２を超えるリガンドおよび錯体を用いて行われ得る。このエレクトロルミネセンス錯体は、５０ｎｓより大きい減衰時間を示し得る。曝露する工程および検出する工程は、繰り返され得る。この方法はさらに、第一のリガンドを分析物に結合させる工程を包含し、ここで、第一のエレクトロルミネセンス錯体は、リガンドへの結合を介して、分析物と会合される；あるいは、第一のエレクトロルミネセンス錯体は、第二のリガンドを介して、第一のリガンドに結合され得る。分析物は、支持体上に、例えば、リガンドを介して固定化され得る。会合は、この分析物と会合したエレクトロルミネセンス因子を除去する工程、およびこのエレクトロルミネセンス因子を、二環式ポリアミノポリ酢酸アナログで配位させて、第一のエレクトロルミネセンス錯体を形成する工程を包含する。この実施形態において、二環式ポリアミノポリ酢酸アナログは、分析物に結合されず、そしてエレクトロルミネセンス因子は、リガンドを介して分析物に結合される。二環式ポリアミノポリ酢酸アナログは、ミセル中で隔離され得る。このリガンドは、抗体、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、酵素または酵素補助因子を含み得る。ポリアミノポリ酢酸誘導体は、以下：
【００２３】
【化１１】
2004517041.tif 000005
を含み得る。
【００２４】
Ｓは、少なくとも１個の酸素原子または窒素原子を有する環式有機部分であり得、そしてＲは、有機官能基（例えば、アセテートまたはｐ−トルエンスルホン基）であり得る。Ｓは、芳香族、脂肪族、置換または非置換であり得る。例えば、Ｓは、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロニル、ピロリルまたはそれらの置換誘導体を含み得る。例示的な置換基としては、ＮＯ２、ＮＨ２イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００２５】
あるいは、ポリアミノポリ酢酸アナログは、以下：
【００２６】
【化１２】
2004517041.tif 000006
を含み得る。
【００２７】
ここで、Ｒは、有機官能基（例えば、有機酸）である。Ｒは、ピコリン酸、ニコチン酸またはフロン酸を含み得る。この分子は、溶解性エンハンサー（例えば、Ｎ−アセチルグルカミン）をさらに含み得る。
【００２８】
別の局面において、本発明は、以下：
【００２９】
【化１３】
2004517041.tif 000007
を含む分子である。
【００３０】
Ｓは、少なくとも１個の酸素原子または窒素原子を有する環式有機部分であり得、そしてＲは、有機官能基（例えば、アセテートまたはｐ−トルエンスルホン基）であり得る。Ｓは、芳香族、脂肪族、置換または非置換であり得る。例えば、Ｓは、フラニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、フロニル、ピロリルまたはそれらの置換誘導体を含み得る。例示的な置換基としては、ＮＯ２、ＮＨ２イソチオシアネート基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、マレイミド基、ブロモアセトミド基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００３１】
別の局面において、本発明は、以下：
【００３２】
【化１４】
2004517041.tif 000008
を含む分子である。
【００３３】
ここで、Ｒは、有機官能基（例えば、有機酸）である。Ｒは、ピコリン酸、ニコチン酸またはフロン酸を含み得る。この分子は、溶解性エンハンサー（例えば、Ｎ−アセチルグルカミン）をさらに含み得る。
【００３４】
本発明を、図面の幾つかの図を参照して記載する。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、実時間の、器官機能（例えば、糸球体濾過速度、腎血流、および腎機能）の経皮的蛍光測定のための、レーザー蛍光色素誘導体およびランタニドキレートを提供する。適切であるとみなされるためには、新規の蛍光試薬は、上記の要求に加えて、幾つかのさらなる特徴を有するべきである。第１に、最適な組織透過および最小限のバックグラウンド干渉のための、新規の試薬の励起波長は、６００ｎｍを越えるべきである。好ましくは、発光波長は、組織透過を最大にするように赤または赤外にある。第２に、新規の試薬は、水溶液中で非常に可溶性かつ安定であるべきである。第３に、この試薬は、非毒性であるべきである。
【００３６】
放射線同位体法と比較して、蛍光アッセイの固有の感度は非常に高い（Ｍａｔｈｉｅｓ，ＲおよびＬ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ  Ｄ．Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ  Ｒ．Ｆ．，Ｃａｎｎｉ  Ｆ．，Ｂｉｒｇｅ  Ｒ．Ｒ．編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１２９−１４０，１９８６）。残念なことに、インビトロでの制御された条件を通じて得られる高い感度は、バックグラウンド干渉の結果としてインビボ環境ではあまり最適ではなくなる（Ｓｏｉｎｉ，Ｅ．およびＩ．Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２５：３５３−３６１，１９７９）。しかし、蛍光分析の固有の感度は、技術（ラジオトレーサーの不利益のない、実時間の腎臓モニタリングのための方法として蛍光光度法を勧める）の時間分解能およびスペクトル分解能の両方の利点を利用して、インビボで再現されるべきである。蛍光分析におけるバックグラウンドレベルは、散乱および他の蛍光化合物の存在を含む、幾つかの因子の合計である。溶媒、溶質、および粒子による散乱は、特に、蛍光プローブの短いストークシフトを測定する場合、蛍光測定におけるバックグラウンド蛍光を生じる。散乱に加えて、タンパク質、ヘミン、ＮＡＤＨなどのようなサンプル構成要素は、３００ｎｍ〜６００ｎｍ付近にわたるバックグラウンド蛍光を生じる（Ｓｏｎｉｎｉ，１９７９）。このバックグラウンド蛍光の別の重要な特徴は、平均減衰時間が、５０ｎｓ未満であることである（Ｍａｔｈｉｅｓ，１９８６）。２つの異なるアプローチを用いて、インビボでの測定におけるバックグラウンド活性を減少または排除し得る。１つは、以前に提唱されるように、６００ｎｍより高い発光波長を有する蛍光試薬を選択することである。他には、時間分解蛍光測定を用いることである。時間分解蛍光分析は、パルス励起後の一定の遅延時間の後に、蛍光発光が計数される方法である（Ｓｏｉｎｉ，１９７９）。このシステムを用いて、バックグラウンド蛍光を排除し得る、但し、特定のシグナルの遅延時間は、バックグラウンドの平均減衰よりも、実質的により長い（図２）。図２は、パルス励起Ａの後、バックグラウンド放射Ｂが迅速に減衰して、引き続いての励起Ａの前に、Ｔｂ（Ｃ）およびＥｕ（Ｄ）からの発光の検出を可能にすることを示す。減衰時間が十分に長い場合、幾つかの測定は時間Ｅ１での励起の後行われ得、その後、発蛍光団は、再励起されなければならない。図２に示すように、一旦、バックグラウンド蛍光が、十分に減衰する（Ｔ１）と、測定は、時間Ｔ１とＴｎまたはＴｎ’との間で繰り返され得、その後、発蛍光団は再励起される。さらに、この技術はまた、クエンチング（発蛍光団が長く励起した場合または頻繁に励起した場合に、発光が止まるプロセス）を防ぐ。時間分解蛍光測定は、励起時間および頻度の両方を減少させ得る。このことは、腎機能が測定され得る間のより長い間隔を可能にする。
【００３７】
遅延時間蛍光測定に関するランタニドキレートの有用性は、これらの錯体の固有の発光特性に起因する。これらの分子の発光は、一般に、蛍光と記載されるが、励起した原子の緩和機構は、実際には、非常により複雑である。図９に示すように、ランタニドキレートが照射される場合、リガンド分子は、Ｓｎ状態まで励起するのに十分なエネルギーを吸収する。このリガンドは、一重項励起Ｓ１状態まれ迅速に緩和する（無放射プロセス）。この状態から基底状態Ｇまでの緩和は、厳密には、蛍光という；しかし、得られた発光は、時間分解技術に有用ではない。このリガンドはまた、無放射機構を介して、一重項状態Ｓ１から三重項状態Ｔまで緩和し得る。この状態からの発光を介する緩和はリン光と呼ばれる。この発光は、蛍光（ナノ秒のオーダー）と比較して、比較的遅い（ミリ秒のオーダー）。しかし、このエネルギーが、金属イオン（ｄ１またはｄ２の状態）に移動する場合；錯体は、ｄ１またはｄ２から直接的にか、あるいはｄ２からｄ１への緩和の後に間接的にかのいずれかで、基底状態へと緩和し得る。図９に示されるように、このプロセスの発光波長は、吸収波長とはかなり異なる。さらに、ｄ１またはｄ２の状態からの緩和は、状態Ｔからの緩和よりもさらに遅い。実際、従来の発蛍光団の蛍光寿命は、１００ｎｓをめったに越えず；ランタニドイオンの蛍光寿命は、１００μｓ〜１０００μｓの間の範囲である（Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅ．Ｐ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１４：８６６−８７５，１９９３）。Ｓ１とｄ２またはｄ１との間の、遅い発光ならびに大きなエネルギー（および発光波長）の差異は、時間分解蛍光測定を非常に強力な技術にする。遅い発光はまた、測定が行われ得る間の間隔を最大にし、そして発蛍光団の再励起に起因する妨害を低下させることによって、実時間のモニタリングを容易にする。
【００３８】
実行可能性の研究：他の錯体、ならびに適切な蛍光ＧＦＲ試薬に関する合成およびスクリーニングを表す時間のかかるプロセスを実行する前に、経皮蛍光測定（ＴＦＭ）を用いて蛍光試薬の組織濃度を測定することの実行可能性を決定した。この研究をレーザー励起蛍光システムを用いて行った（Ｆｒｉｓｏｌｉ，Ｊ．，Ｅ．Ｔｕｄｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：５８５４−５９６１，１９９３）。このシステムの基本的レイアウトを図３に示す。パルス窒素レーザー（ＤＭＬ  ＶＳＬ−３３７ＮＤ；Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、ローダミン６１０色素（Ｅｘｃｉｔｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ）を含むＤｙｅ  Ｌａｓｅｒ２２０（Ｌａｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）をポンピングするために用いた。６１０ｎｍの励起パルスを、５ｍｍの焦点距離を用いて、６００ｎｍの中心径の石英ガラスの光ファイバー（Ｓｕｐｅｒｇｕｉｄｅ−Ｇ；Ｆｉｂｅｒｇｕｉｄｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，ＮＪ）へと送出した。カップリング、反射およびファイバー損失の後の、組織に入射した典型的なパルスエネルギーは、約１０μＪであった。組織からの蛍光を、第２の６００μｍファイバーにより収集し、そして一定の距離（ファイバーの直径およびクラッディングおよびジャケット＝８００μｍ）で分離した。収集ファイバーの出力を、入力側の、環状配置を有する石英ファイバーバンドルに光結合させた。このバンドルの出力端側のファイバーを、直線的に配置し、そしてｆ／３．８、０．２７５ｍポリクロメーター（Ｍｏｎｏｓｐｅｃｔ２７；Ａｎａｓｐｅｃｔ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）のための０．１ｍｍ×２．５ｍｍのエントランススリットとした。ロングパスフィルター（ＣＳ  ２−５９；Ｓｗｉｆｔ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．Ｅｌｍｉｒａ，ＮＹ）を石英ファイバーバンドルの前に挿入して、散乱光を排除した。３００ｎｍから８００ｎｍの間の波長についての蛍光を、マルチチャネル光学分析器（ＯＭＡ  ＩＩＩ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）により制御された増幅型１０２４ダイオードアレイを用いて記録した。増幅器を、３ｎｓのレーザーパルスに集中させた１００ｎｓパルスを用いてゲートさせた。完全なスペクトルを、各励起パルスを用いて記録し、そして５０のスペクトルを各測定について平均化した。大型ではあるが、このレーザー励起蛍光（ＬＩＦ）システムは、ＦＡＲＭの最終的設計に、最も適切な励起光、光学フィルタ、および検出システムの選択のために不可欠な汎用性を有する。
【００３９】
体重１ｋｇあたり１０ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）のクロロアルミニウムスルホネートフタロシアニン（ＣＡＳＰｃ）の静脈内注射後、７５〜１００ｇの雄性Ｓｙｒｉａｎハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において、薬物取り込みおよびクリアランス測定を実施した。ハムスターをＣＯ２雰囲気中への環境投入によって一時的意識消失にした後、蛍光測定を実施した。光ファイバーを組織（舌）と穏やかに接触させて配置し、そして前記のようにスペクトルを得た。６８４ｎｍでの蛍光強度を色素注射後の時間の関数としてモニターした。ある程度の自己蛍光が６１０ｎｍの光で励起されたが、干渉（インターフェアレンス）は６８４ｎｍで最小であり、そして全ての引き続くスペクトルから、各ハムスターについての事前注入（プレインジェクション）のシグナル強度を差引きすることによって消去された。別の群のハムスターを利用する実験においてアルカリ化学抽出によって、組織中の絶対的なＣＡＳＰｃ濃度を決定した。ＬＩＦ装置を用いて２ｍｍ厚のキュベット中で上清の蛍光スペクトルを測定することによって、ＣＡＳＰｃの絶対的な量を決定した。マルチコンパートメントの薬物動態を用いてデータを分析した。この結果によって、色素の抽出後に決定された、ＬＩＦ強度とＣＡＳＰｃ濃度との間に正の直線的相関関係が存在することが示された。さらに、ＣＡＳＰｃ濃度（ＴＦＭから得た）対時間における変化は、色素の抽出後に決定されたように、ＣＡＳＰｃ組織濃度における変化を非常に密接に伴った。これらの結果によって、この因子からの経皮的な蛍光シグナルを測定することにより、蛍光剤の組織濃度における変化を決定できる可能性が高いこと、そしてこのタイプの測定において、異なる組織成分由来の有意な干渉が存在しないことが実証される。さらに、これらの結果によって、腎機能の実時間モニタリングのための蛍光技術の有用性が実証される。ＣＡＳＰｃは、ＧＦＲ剤ではないが、この色素は、一時的な代替物として用いられ、適切な蛍光ＧＦＲ剤の合成を実行する前に、蛍光色素の組織濃度を測定するために、経皮蛍光測定を用いることの可能性を実証する。
【００４０】
（蛍光剤：）２つの異なる手順を用いて新しい蛍光剤を得た。両方のアプローチとも、一時的反応物として、「理想的な」ＧＦＲ剤のクリアランス特徴を有する因子（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、低分子量デキストラン、またはポリアザ大環状分子）を使用した。基本的な開始反応物として安定なＧＦＲ剤を選択することによって、最終蛍光生成物が、最初のＧＦＲ剤の特性の全てでなくともほとんどを保持する確率が増大する。この手順の１つでは、蛍光マーカーは、長放射波長（例えば、ナイルブルー、オキサジン７５０、またはインドシアニングリーン）を有するレーザー色素、および他方では、三価ラニタニド（例えば、ネオジム）であった。
【００４１】
ナイルブルーＤＴＰＡ結合体の合成のために、ＤＴＰＡ二無水物（ｃｃＤＰＴＡ）の０．１ｇを丸底フラスコ中の６ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。９０ｍｇのナイルブルーをＤＭＳＯに溶解し、そして３６μＬのトリエチルアミンを添加して、この溶液を紫に変化させた。攪拌しながらｃｃＤＴＰＡの溶液に、このナイルブルー溶液を、滴下した。この溶液は青（ブルー）に変わった。３８μＬのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を最終混合物に添加し、この溶液を紫に変化させた。混合後、この混合物を６０℃に過熱し、そして２時間攪拌した。次いで、反応混合物をシリカゲルカラムに充填し、そしてアセトン：エチルアセテートで溶出した。ナイルブルーＤＴＰＡ結合体に対する画分をプールしてエバポレートし、マジェンタ（マゼンダ）（深赤）色の油状物を得た。溶離剤としてアセトンを用いて第二のシリカゲルカラム上で、この油状物を再クロマトグラフィーした。ナイルブルーＤＴＰＡ結合体化画分をプールし、そして回転エバポレートしてマジェンタ色の油状物を得た。エチルアセテート：エタノール：ＴＥＡ（４０：４０：１）を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、ナイルブルーＤＴＰＡ結合体が、０．９のＲｆで単一のスポットとして移動したが、ナイルブルー色素は０．５のＲｆで移動したことが示された。蛍光分析（図４）は、ナイルブルーの５−アミノ基へのＤＴＰＡのカップリングによって、６９５ｎｍから５３０ｎｍへの放射蛍光におけるシフトが生じたが、最大励起は、約３９０ｎｍで実質的に変化しないままであったことを示した。放射波長におけるシフトは、結合体に対する過度に小さいストークシフト（λ放射−λ励起）（λｅｍｉｓｓｉｏｎ−λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を生じる。励起スペクトルと放射スペクトルとの間の重複のせいで、実時間測定において２つを識別することは困難である。一方で、ランタニドキレートは、類似の方法を用いて生成され得るが、生成物の励起波長は、遊離イオンの波長と比べて有意に低下していない。
【００４２】
上記で考察したレーザー色素はいずれも、時間遅延型蛍光光度法における使用のために十分に長い減衰時間を有さないので、ランタニドキレートをまた検討した。それらは、蛍光に関して長い減衰時間を有することが公知であり、これによってそれらは時間分解技術の最適の選択となる。三価ランタニドイオン（例えば、Ｃｅ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｅｕ３＋、およびＴｂ３＋）は、狭帯域の励起線、および長い蛍光減衰時間によって特徴づけらた特殊な蛍光を示す。しかし、ランタニドイオンの限界の１つは、それらが非常に弱い蛍光シグナルを生成するということのみである。蛍光シグナルを改善するために、ランタニドイオンは、適切なエンハンサーと組和されることが必要である。適切な光吸収リガンドでキレートした場合、このイオン蛍光は、数ケタの大きさまで強化される。
【００４３】
蛍光ランタニドキレートを生成するために、最も公知でかつ最も用いられたリガンドは、βジケトン、特にそれらのフッ化された芳香族形態である（Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｉ．、Ｓ．Ｄａｋｕｂｕら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：３３５〜３４３，１９８４；Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｉ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，５７：１６７６〜１６８１，１９８５）。ユーロピウムは、βジケトンキレートとして高感度で測定され得るが、このアプローチは、重要な限界を有する。第一に、蛍光ＧＦＲ剤は水性媒体中で分配される（細胞外間隙）ので、βジケトンは、非イオン性界面活性剤の使用で可溶化されなければならない（Ｈｅｍｍｉｌａ，１９８４）。第二に、キレート成分の結合は、水中での自然な溶解（ならびに結果として、蛍光の消失、ならびにランタノイドおよびβジケトンの潜在的な毒性効果の発現）を回避するほど十分強力ではない（Ｈｅｍｍｉｌａ，１９８４）。これらの限界の全てが、強力なキレート化特性を有するエンハンサーの使用によって回避できる。ランタニドは、必要な実験条件下で、非常に緩徐に解離するか、または全く解離しない。
【００４４】
非常に可溶性でかつ安定なランタニドキレートを生成するために公知のキレート剤の唯一のグループは、ポリアミノポリ酢酸アナログである。以前の研究では、この群の最も普通に用いられるメンバー（ＥＤＴＡ）とユーロピウムとの間のキレートは、本質的に非蛍光であること（Ｈｅｍｍｉｌａ，１９８４）、このキレートの蛍光は、ＥＤＴＡ分子の修飾によって大きく強化され得ることが示されている（Ｙｅｈ，Ｓ．Ｄ．Ｓｈｅｒｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：１５２〜１５９、１９７９）。最も簡易な最初のアプローチは、Ｅｕと他の既に市販されているポリアミノポリビス（２−アミノエチルエーテル）酢酸との間のキレートの蛍光特徴を研究することである。エチレングリコールＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）は、２つのアミノエチルエーテル基を有する。この分子構造の結果として、ＥＧＴＡは、その強力な金属キレート化特性に加えて、βジケトンにおいて見出されるものと類似のエネルギー吸収、および移動特性を示すはずである。予想されるとおり、エウロピウムとＥＧＴＡとの間のキレートは蛍光であり、さらなるエンハンサーの必要性を排除する。図５はまた、このキレートがＥｕの狭励起帯域特性（５９０ｎｍおよび６１３ｎｍ）を維持することを示す。
【００４５】
しかし、ＥＧＴＡランタニドキレートの限界の１つは、それらがポリアザ大環状ランタニドキレートがそうであるように水溶液中で安定ではないということである。例えば、ＥＧＴＡ−ランタニド複合体の安定定数は１０１７であるが、ポリアザ大環状ＤＯＴＡ−ランタニドキレートの安定定数は、大きさが数ケタ高い（Ｋ＝１０２０）（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｊ．Ｓ．Ｓａｉｎｉら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１６６：６９３〜６９８，１９８８）。インビトロ安定性とインビボ安全性との間に密接な相関関係が存在する（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ、１９８８）ので、ＥＧＴＡ−ランタニドキレートの安定定数が低いほど、骨および軟部組織における遊離のランタニドの沈着に起因して、潜在的な毒性効果に対してある程度の懸念が生じ得る。しかし、安定定数における著しい差異にもかかわらず、蛍光研究におけるＥＧＴＡキレートの使用は、ＭＲＩ研究におけるＤＯＴＡキレートの使用よりも安全である。この明白な矛盾の理由は、蛍光技術の高い内因性感度に起因して、蛍光剤が、造影剤としてではなく、トレーサーとして用いられるということである。蛍光剤の必要な濃度は、ＭＲＩ造影研究において用いたＤＯＴＡキレートの濃度よりも大きさが数桁小さい。しかし、さらに高い安全性係数にかかわらず、ＥＧＴＡキレートの潜在的な毒性は、特に反復用量後、懸念が残る。
【００４６】
テトラアザ大環状骨格に基づくキレート剤は、水安定性のランタニドキレートを生成するための非常に価値があることが証明されている。このクラスのキレートの優れた性質によって、それらは診断および治療の医療適用に有用になった。例えば、ガンドリニウム（Ｇｄ）に基づくこれらの化合物の常磁性キレートは、核磁気共鳴法（ＭＲＩ）のための造影剤として現在用いられている。不幸にも、ＭＲＩで用いられるＧｄの現在のテトラアザ大環状キレートは、非常に蛍光が弱いか、または全く蛍光を示さないかのいずれかである。しかし、このキレートに対する芳香族部分の付加は、蛍光を増強し得る。例えば、エンハンサー基としてピリジンを組み込む新しく開発されたポリアザ大環状キレートは、励起波長と放射波長との間の大きい差異（＞２８０ｎｍ）および０．５１の量子収量を伴う蛍光放射を示した（Ｃｏｓｔａ，Ｊ．およびＲ．Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，３２：５２５７〜５２５６，１９９３；Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｇ．Ｋｉｅｆｅｒら．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３４：２２３３〜２２４３，１９９５；Ｂｏｒｎｈｏｐ，Ｄ．Ｄ．Ｈｕｂｂａｒｄら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：２６０７〜２６１５，１９９９）。不幸にも、ピリジン部分の導入後の大環状物の可撓性は部分的に損なわれ、一方、エステルアームの方向は、大環状物における非対称性によって影響された。結果として、親和性定数は、ＤＴＰＡの値（ｋ＝２３）よりもさらに低かった（ｋ＝１９．５）（Ａｉｍｅ，Ｓ．、Ｍ．Ｂｏｔｔａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９５：１８８５〜１８８６，１９９５）。さらに、ホスホン酸ｎ−ブチルエステル基についてアセテート基の置換と組み合わせて、ピリミジン基の取り込みは、この化合物の脂質可溶性における増大を生じた。結果として、新しい分子は、腎排出に加えて、有意な肝臓排出および腸排出を示す（Ｂｏｒｎｈｏｐ，１９９９）。この化合物の薬物動態学的特徴によって、これは本出願に全く不適切にされる。対照的に、本発明のために、新しい因子の合成における開始反応物は、十分に認識された器官および機能特異性を有する化合物である。
【００４７】
ランタニドキレートの利点を保持しながらキレート安定性を増すために、２つの新たなＧＦＲ剤が提案される。第一の新たな蛍光剤は、一般式（５）のポリアザ大環状分子化合物から誘導されたランタニドキレートに基づき、ここで、第二の環式基（Ｓ）は、大環状分子骨格の一部である（図６）。第二の環式基（Ｓ）は、フラン、テトラヒドロフラン、ピロール、ピロリジン、または３−フロン酸のような誘導体であり得る。このファミリーの大環状分子リガンドから誘導されるキレートは、とりわけ、熱力学的および反応速度論的に最も安定であるランタニド複合体であり、このことは、金属イオン毒性が主な関心である、ヒトでの研究について重要な考慮事項である。式２５の化合物テトラアザビシクロフラン四酢酸（ＴＡＢＦＴＡ）は、ＭＲＩ造影剤として用いられる化合物テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）に非常に類似する（図７）。その結果、静脈内注射後、ＴＡＢＦＴＡとランタニド（例えば、ネオジム）とのキレートは、糸球体濾過によってのみ排出され、そして細胞外腔分布を有するような、ＤＯＴＡとガドリニウムとのキレートと類似の生物学的特徴を有すると予想される（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，１９８８）。これに関して、腎機能、特に糸球体濾過の測定は、ＴＡＢＦＴＡのさらなる構造的改変を行うことなく遂行される。
【００４８】
提案される第二のＧＦＲ剤は、以下の一般式を有する
【００４９】
【化１５】
2004517041.tif 000009
ここで、Ｒは、フロン酸、ニコチン酸、ピコリン酸、または任意の他の置換された芳香族酸であり得る。置換されたテトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）（ＳＴＡＣＤ）は、アミン基を臭素化酸と反応させることによって生成される。６−ブロモ−ピコリン酸、５−ブロモ−ニコチン酸、および５−ブロモ−フロン酸は、ＳＴＡＣＤを調製するために全て適切である。しかし、これらの分子の全てが、生理学的ｐＨで水性媒質中に可溶性というわけではない。例えば、テトラフロン酸誘導体は生理学的流体に可溶性であるが、テトラニコチン酸誘導体は可溶性ではない。誘導体は、溶解度増強剤（例えば、Ｎ−アセチルグルカミン）と合わされて、ｐＨ７で可溶性である塩を形成するべきである。他の溶解度増強剤をまた用いて、ＳＴＡＣＤ錯体の溶解度を改変し得る。
【００５０】
時間分解型蛍光分析の低いバックグラウンド干渉を利用するために、ＴＡＢＦＴＡおよびＳＴＡＣＤの両方をまた、抗体、抗体フラグメント、ホルモン、ホルモンフラグメント、核酸、神経伝達物質、または生物学的に活性な任意の他の物質を標識するための二官能性キレート剤としても用い得る。例えば、ＴＡＢＦＴＡは、１５位におけるＮＯ２、ＮＨ２、イソチオシアナト（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ）、セミカルバジド、チオセミカルバジド、マレイミド、ブロモアセトミド（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｏｍｉｄｏ）またはカルボキシル基の導入によって、式４５に示されるように改変され得る（図８）このような基はまた、ＳＴＡＣＤ環中の１以上の炭素に添加され得る。
【００５１】
キレートの合成：錯体は、当該分野で周知の方法（ＤｗｙｅｒおよびＭｅｌｌｏｒ，Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９６４；Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｊ．およびＴ．Ａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９６：２２６８−２２７０，１９７４）によって調製される。全ての反応物は市販される。図７は、１つのジメチルフラン部分を保有する、本発明の化合物のうちの１つ、１５員テトラアザ大環状分子構造の調製の詳細な説明を提供する。２，５−ジメチルフラン（１０）は最初に、クロロメチル誘導体（１５）へと変換される。別の工程において、トリエチレンテトラアミンがトシル化され、そしてナトリウム塩へと変換される。次いで、これらの２つの試薬は、ＤＭＦ中で合わされて、Ｎ−トシル化大環状分子（２０）を生じる（Ｒｉｃｈｍａｎ，１９７４）。酢酸（ＡｃＯＨ）およびＨＢｒの混合物中でこの生成物を加熱することにより、保護基がアミン基に提供される。次いで、四酢酸誘導体（２５）は、Ｄｅｓｒｅｕｘ（Ｄｅｓｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９：１３１９−１３２４，１９８０）によって記載されるように、大環状分子の二級アミンをクロロ酢酸と反応させることによって合成される。当業者は、類似の技術を用いて、本明細書中に開示される他の分子を生成し得ることを認識する。
【００５２】
ＴＡＢＦＴＡの第二の環式基Ｓを変化させて、分子の電子密度および骨格に沿った電子分布を改変し得る。例えば、化合物１０は、２，５−ジメチルテトラヒドロフラン（３０）、２，５−ジメチルピロリジン（３３）、２，５−ジメチル−３−フロン酸（３５）、または２，５−ジメチルピロール（４０）によって置換され得る。化合物１５の使用は、中間体として、化合物２０の代わりに化合物５０の生成をもたらす。当業者は、多数の異なる置換基（例えば、化合物４５中のイソチオシアネート基）が、環式基Ｓについての前駆体の適切な選択によって、ＴＡＢＦＴＡ分子上に配置され得ることをわかる。このような置換基はまた、一般的な有機合成技術によってＳＴＡＣＤ環の１以上の炭素へと結合され得る。
【００５３】
これらの化合物をランタニドアセテートを用いて処理すると、所望の蛍光キレートが得られる。ネオジミウムアセテート、テルビウムアセテートまたはユーロピウムアセテート（０．１Ｍ）および等モルのテトラアザシクロアルケンＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ””誘導体を水中８０℃で混合する。濃ＮＨ４ＯＨを添加することによって溶液のｐＨを１０に調節し、そしてこの混合物を２０時間攪拌する。濾過後、冷却した反応溶液をエバポレートして固体にし、減圧オーブン中で一晩乾燥すると、副生成物のアンモニウムアセテートが昇華する。
【００５４】
（検出）：  ＴＦＭのための装置のアセンブリのための全ての要素は、市販されており、日々の適用において、広範囲にわたって試験されている。この装置の必須要素は、以下のとおりである：
ａ）  蛍光励起システム；
ｂ）  蛍光検出システム；および
ｃ）  操作システムおよびデータ記録機。
【００５５】
（ａ．蛍光励起システム）：この励起システムは、高輝度発光ダイオードまたはレーザーダイオードのいずれかを組み込み得る。これらの要素は、安全性および可搬性を高めることによって本発明での適用のために理想的であるいくつかの性質を有する。これらの要素は、出力が低く、作動電圧が低く、高い周波数応答を有する現行の高感度なデバイスである。両方の型のダイオードは、非常に小型で、そして３．５〜５．０ＶのＤＣの入力およびたった５０〜１００ｍＡ入力電流で電池により操作され得る。
【００５６】
標準的な蛍光光度分析に関して、色素励起波長と要素発光波長との間のよりよい適合は、レーザーダイオードよりも高輝度発光ダイオードを用いて得られ得る。高輝度発光ダイオードは、波長を広範囲に選択でき、特定の波長が、蛍光色素の励起波長によりよく適合するように選択され得る。しかし、ネオジミウムキレートを用いる時間分解蛍光光度分析（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）に関して、８３０ｎｍの発光波長を有するレーザーダイオードが好ましい。というのは、それらの発光波長は、ランタニドの励起波長に対して完全に適合するからである。
【００５７】
両方の光源は、非常に高周波数の応答について利点を有する。従って、発光ビームは、光源を点灯したり消灯したりすることによって、調節された電子パルス発生装置を用いてパルスされ得る。この電子ゲートシステムは、光パルスの周波数、持続期間、および強度のよりよい制御を含む機械的システムに関していくつかの利点を有する。レーザー色素を用いて標識されたＧＦＲ薬剤に関して、発光強度の測定は、パルス間で行われ得；ランタニドキレートに関して、測定は、バックグラウンドの蛍光が最小値に減衰した後に、パルス間で行われ得る。
【００５８】
発光ビームからの励起の分離は、長波長透過フィルターを用いることによって達成され、小型かつ軽量であるため、可搬性を高める。このシステムの図を図３に示す。適切なカットオン（ｃｕｔ−ｏｎ）波長を有するフィルターは、例えば、８５０±７ｎｍ（ネオジミウムキレートに関して）または７００±６ｎｍ（インドシアニングリーン−ＥＤＴＡまたはオキサジン−ＥＤＴＡに関して）の使用において、特定の蛍光剤のために選択される。８５０ｎｍのフィルターは、レーザー供給源から組織までの８３０ｎｍのビームを反射および方向転換する一方、１，０５０ｎｍおよび１，３５０ｎｍのネオジミウム−キレートの発光帯を完全に透過し得るべきである。同様に、７００ｎｍのフィルターは、高輝度発光ダイオードから組織までの４２０〜６００ｎｍのビームを反射および方向転換する一方、組織からヨードシアニングリーン−ＥＤＴＡまたはオキサジン−ＥＤＴＡの発光ビームの検出器ユニットまでを完全に透過し得るべきである。励起パルスは、単一または複数の２０００μｍコア直径の溶融シリカ光学ファイバーまたは５ｍｍの焦点距離レンズを有する液体コア光ガイドに向けて発せられる。近位の短い回路配列の後、ファイバーは、直線的に再配列されて、ショートバンド５５に類似の構造を得る（図１０）。この励起バンドは、体の部分の皮膚または粘膜（例えば、指６０）の周りに配置されて固定され、その下の組織を励起する。励起された組織の体積は、励起ビームの強度または液体光ガイドまたはシリカ光学ファイバー６５の数および／またはコア直径を調節することによって変化する。
【００５９】
本発明の技術の重大な関心事は、レーザービームの使用が、組織の損傷を生じ得るということである。しかし、この可能性は、この装置の設計に４つの重要な特徴が組み込まれることによって排除されるかまたは少なくとも最小化され得る。第１に、励起が、非常に低い出力（すなわち、２〜５ｍＷ）を有するレーザーダイオードを使用して達成され、０．００３Ｊ／ｃｍ２の照射線量率を超えるのを防ぐ。第２に、励起ビームが、電子パルス発生装置を用いてパルスされ、たった数ナノ秒の持続時間の非常に短いレーザーパルスを用いて組織を励起する。第３に、励起ビームの波長が、常に、４２０ｎｍを超えて維持される。最後に、励起ビームの伝導が、大きなコアファイバー光学束を用いて行われ、広範囲にわたって励起レーザービームを分配する。励起ビームの出力が低く、パルスが短いことはまた、標準的な蛍光色素を使用して頻繁に観測される光退色の可能性を低減させる。
【００６０】
（ｂ．検出システム）：皮膚または粘膜およびより深い組織からの蛍光は、励起バンドによって収集され、液体光ガイドまたはシリカ光学ファイバーを介して長い波長透過フィルターに対して行われる。フィルターは、上述のように、発光および励起ビームの分離を容易にし、そしてバックグラウンドの寄与を低減する。フィルターを介して透過された蛍光は、種々の積分時間に関して、増感された光ダイオードアレイまたはＩＲ検出器を用いて記録される。増感器／検出器ユニットにより、励起パルスの間（標準的な蛍光光度分析に関して）かまたは励起パルス後（時間分解蛍光光度分析に関して）に発光する蛍光強度を測定するために電気的にゲートする。
【００６１】
（ｃ．操作システムおよびデータ記録機）：  Ｏｎｓｅｔ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒによって設計されたＴａｔｔｌｅｔａｌｅ（登録商標）データ記録機を使用して、システムを作動して蛍光  対  時間を記録する。このデータ記録機のいくつかの特徴は、本発明の適用のために理想的である。８〜２２４Ｋｂの間の一連の範囲のためのデータファイルサイズは、この装置がその予想される機能を全て行いうるのに十分なサイズより大きい。全ての入手可能なモデルは、電池で作動し、２〜３ｍＡの間のドレインを有する低い出力システムである。さらに、全てのＯｎｓｅｔ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＴａｔｔｌｅｔａｌｅ（登録商標）記録機は、ポケットサイズで、軽量で、丈夫なユニットである。データ記録機は、システムおよび検出器を作動するのに必要な電池を伴って、ポケットサイズのプラスチックの箱に収納される。記録機は、文字と数字を組み合わせたディスプレーを有して構築され、予め設定した間隔で、更新された速度定数を示す。この特徴は、操作室および集中ケアユニットのような急激な状況において、特に、有用である。このデータ記録機はまた、十分なメモリーを有し、長時間のデータ収集のためにこの定数の一定値を決定する。
【００６２】
（操作）：この装置の励起／検出器ユニットは、体の部分（例えば、指先）または腕の一部を覆う皮膚あるいは患者の鼻粘膜または口粘膜に取り付けられる。次いで、臓器の機能が、蛍光剤の組織中での減退の速度として実時間で測定され、この蛍光剤は、特定の臓器によって、排他的に除去される。言い換えると、臓器の機能は、特定の臓器が、組織から機能特異的蛍光剤を除去する効率として測定される。薬剤の減退速度は、一定時間にわたる個々の経皮的な蛍光測定における変化から測定される。個々の組織の経皮的な蛍光測定は、励起パルスの間（標準的な蛍光光度分析）または励起パルス後（時間分解蛍光光度分析）に、非常に短い時間（５０ｎｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃ）で発光される組織蛍光を組込むことによって行われる。励起パルスは、非常に短いため、個々の蛍光の測定は、測定の間に最小の妨害で非常に頻繁に行われ得る。次いで、排出速度は、トレーサーをボーラス静脈内注射した後に、個々の経皮的な蛍光測定値を非常に短い時間間隔で（２〜５分間隔）プロットすることによって決定される。このシステム応答が、一次速度式に従う（Ｒａｂｉｔｏ，  １９９４）ため、個々の蛍光強度測定値  対  時間のｌｏｇの相関の勾配は、このシステムの速度定数を表わす。収集されたデータは、繰り返し分析、オンライン分析、最小二乗分析に供され、２〜５分の間隔で、蛍光強度（任意のユニットにおいて）  対  時間（分単位で）のｌｏｇの間で最適な適合を得る。到達後、新規データが加工され、そして相関に加えられ直線の連続的な更新を得る。共分散分析（ＡＮＯＶＡ）が使用され、前の２〜５分間隔および現在の２〜５分間隔の勾配（速度定数）間の違いを評価される。従って、速度定数およびその対応する統計値は、ほとんど連続して作成され得る。速度定数値における減少または増加は、患者が蛍光ＧＦＲ薬剤を注射される場合、ＧＦＲにおける減少または増加を表わすとみなされる。
【００６３】
現在のデータ記録機は、装置上のこの定数の値を決定するために必要なコンピュータ出力を有するが、このデータはまた、専用パーソナルコンピュータに移される。データを移動した後に、所望の曲線のあてはめおよび完全分析は、市販の統計ソフトウェアパッケージを用いて行われる。
【００６４】
（ソフトウェア）：ユニットを操作するための基本的なソフトウェアは、始めは放射能トレーサーを用いて作動する腎臓のモニターのために開発されたプログラムの改変である（Ｒａｂｉｔｏ，１９９４）。このプログラムは、使用される励起の型（連続的励起またはパルス励起）、励起パルスの持続時間、パルス間隔、励起パルスと発光シグナルの測定との間の時間、および発光シグナルの測定のための積分時間を制御するために設計される。標準的な蛍光の決定に関して、発光される蛍光の強度は、各パルスの間に測定される。しかし、時間分解蛍光測定に関して、操作プログラムは、完全にバックグラウンドを減衰し得るためにレーザーパルスの数マイクロ秒後の発光シグナルを積分するように設定される。分析ソフトウェアは、以前に公開されたＢｒｏｃｈｎｅｒ−Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ（Ｂｒｏｃｈｎｅｒ−Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３０：２７１−２７６，１９７４）によって記載される単一の区画モデルに基づく（Ｒａｂｉｔｏ，１９９４）。
【００６５】
（結論−実時間腎臓モニタリング）：ＦＡＲＭは、「バックグラウンド」中に記載される放射能モニタリング技術に対していくつかの明確な利点を有する。第１に、この技術は、その内在性の制限のすべてである放射能の使用を排除する。第２に、ＦＡＲＭは、放射能検出器よりもさらに標準的な要素を用いて構築され得る。例えば、レーザーダイオードおよびレーザー検出器は、非常に安価であり（＄５０〜＄１２５）かつ日々の適用（例えば、ＣＤプレーヤー、プリンター、ファクシミリマシーン、レーザー警備網など）において広範囲に試験されている広範囲に利用可能なレーザー要素である。反対に、放射能トレーサーをモニターするためのカドミウム−テルル検出器は、ＵＳＡにおいて２社の製造業者からしか入手可能でなく、コストは、レーザー要素の約１５倍も高い（＄２，５００）。ＦＡＲＭの別の利点は、より単純な設計の結果として、患者は、延長された時間、装置をより快適に着用できることである。例えば、ＦＡＲＭの励起／検出システムは、放射能アッセイにおいて使用される重い鉛が並べられた腕の外装よりも、より快適にかつかさばらずに指スリーブにおいて配列される。ＦＡＲＭはまた、マルチレベルアッセイのために使用され、その中で、異なる発光波長を有する異なるフルオロフォアが、同時に使用され得る。
【００６６】
ＦＡＲＭにおいて、蛍光シグナルは、レーザービームによって励起される組織体積中に単独で起こり（Ｆｒｉｓｏｌｉ，１９９３）、放射線法で一般的に見い出される隣接する身体構造からの散乱された活性を排除して空間遮蔽の必要を取り除く。この属性は、ＦＡＲＭの全重量を顕著に減少させ、患者のために、具体的には、腎臓機能の延長されたモニタリングの間により快適にさせる。ＦＡＲＭが放射能技術を超える２つの他の重要な利点は、測定の間に検査される組織体積は、比較的一定のままであり、この体積のサイズを励起波長を変化することによって調整し得ることである。この特徴は、注入される蛍光薬剤の用量を変化させることなく、特定の必要に対する装置の感度を調整し得ることである。
【００６７】
結果として、ＦＡＲＭは、特に、本明細書中に開示される新規分子を用いて行われる場合、腎臓機能の実時間モニタリングのための信頼できる方法を提供する。この技術は、適切な薬剤と組み合わせて、他の臓器に対しても同様に代謝機能をモニターするために利用され得る。ヘルスケア提供者のための強力なツールを提供して、腎臓または他の臓器の不全を経験している患者を迅速に確認し、適切な治療法を適用する。
【００６８】
（免疫アッセイ）：本発明の分子はまた、生物分析アッセイのための標識として使用される。この分子は、種々の分析物のために、特異的結合試薬またはリガンドに対して結合し得る。例えば、これらの分子は、免疫アッセイにおいて使用するために抗体に、ハイブリダイゼーションアッセイのためにＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントに、または酵素アッセイのために酵素もしくは酵素補助因子に結合され得る。この分子は、分析物に関する特異的結合剤に直接的に結合され得るかまたは、二次標識として作用するさらに一般的な結合剤に連結され得る。後者の場合において、二次的な薬剤は、一次特異的試薬に結合する。別の実施形態において、分析物は、基材上に固定化され、その後に発光分子で標識された特異的結合剤は、分析物に結合され得る。標識された薬剤は、分析物に結合し得、過剰の未反応の薬剤は洗い流され得る。この点で、この分子は、特異的結合剤から分離され得る。この分子の濃度は、分析物の量にさらに反映するが、この分子の濃度は、固定化された固相の代わりに溶液中で測定され得る。
【００６９】
あるいは、この金属イオンは、非発光標識に対してキレート化されて、特異的結合剤に結合する。過剰の薬剤を洗い流した後、例えば、溶液のｐＨを変えることによって、金属原子のみを分離する。次いで、金属イオンは、有機キレートを保持するミセルへと可溶化され、金属イオンと結合して発光錯体を形成する。適切なミセル状物質としては、リン酸緩衝液中の界面活性剤である、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＣＡＳ  ９００２−９３−１，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が挙げられる。一旦金属イオンが標識されたキレート（例えば、ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ）から分離すると、金属イオンは、ミセルへと組込まれる。キレート化されていないランタニドは、特に激しく発光しないため、このミセルはまた、本発明の分子のようなキレート剤を含む。この方法は、金属イオンとしてＥｕ、キレート剤としてβ−ナフトイルトリフルオロアセトン（ＮＴＡ）およびトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を用いて商品化されている。複数の抗原が、各々の標識に対して異なるイオンを用いることによって同時に検出され得る。
【００７０】
これらの検出方法の全ては、当該分野で周知であり、以下に記載される：例えば、Ｄｉｃｋｓｏｎらによる総説論文（Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．Ｇ．，Ａ．Ｐｏｌｌａｋら，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏ．Ｂ，２７：３−１９，１９９５）。しかし、ランタニドイオンを組込む現在入手可能な蛍光標識は、発光収率が低く、キレート安定性が低く、そして水性媒体中の溶解性が低いという欠点がある。本明細書中に開示されるランタニドキレートは、もともと、血液、水性媒体中の検出のために最適化され、他の水性溶液中の検出のために適切である。これらはまた、高い親和定数および発光収率を与える（量子効率（φ＝０．２〜０．５）。
【００７１】
（磁気共鳴映像法の造影剤）：本発明の分子、特に、ＴＡＢＦＴＡ、ＳＴＡＣＤおよびその誘導体はまた、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための造影剤として使用され得る。ランタニドイオン（例えば、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）またはテクネチウム（Ｔｃ２＋））を用いてキレート化される場合、得られる常磁性化合物は、水素プロトンの緩和を高め、ＭＲＩ映像におけるシグナル強度を高める（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，１９８８）。高められたシグナルは、ノイズに対するシグナルの比を高め、映像時間を減らす。さらに、造影剤は、診断における特異性を高め得る。ＴＡＢＦＴＡおよびＳＴＡＣＤ（または溶解性向上剤とそれらの塩）が水溶性であるために、その錯体は、血液中で造影剤として使用され得、例えば、発作または他の循環機能障害に対するリスクで患者における血流を測定する。もちろん、この薬剤はまた、腎臓および膀胱の機能を映像にするために使用され得る。
【００７２】
患者でＭＲＩを行うことは、当業者に十分に理解される。患者は、高磁場に曝され、その後、放射性周波数パルスが適用され、少量の患者の水素イオンによって吸収される。このパルスは、プロトンのスピン状態を変化させ；一旦ＲＦパルスが取り除かれると、プロトンは、そのもともとのスピン状態に緩和され、蓄えられたエネルギーが解放され、このエネルギーがＭＲＩ装置によって検出され得る。この造影剤は、患者へと注入され、その後、磁場に曝される。上述のように、この薬剤は、装置の性能を高める。
【００７３】
（癌の光線療法）：本発明の分子はまた、癌を処置するために使用され得る。光線療法は、放射能のかわりに光を使用する照射治療である。患者は、腫瘍において蓄積される薬剤を用いて注射される。腫瘍は、この薬剤の吸収波長で照射され、次いで、この薬剤が、腫瘍の周りへとエネルギーを放射する。周囲の組織は、この放射によって影響を受けないが、この薬剤を励起するために使用される高エネルギーレーザーによって損傷され得る。本発明の分子の１つに結合する適切な抗体を含む薬剤を用いることによって、暴露される組織の周りのエネルギー量は、低減される。腫瘍部位を連続的に照射するにもかかわらず、パルスレーザーは、発色団を周期的に励起するために使用され得る。長い発光減衰時間は、発色団が周期的な（および比較的短期的な）励起時間でのみ連続的にエネルギーを放射し得るようにする。
【００７４】
本発明の他の実施形態は、本明細書中に記載される本発明の明細書または実施の考察から当業者には明らかである。明細書および実施例は、上記の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神と共に、例示のみとしてみなされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡのクリアランスに関する速度定数および測定された糸球体濾過速度に関する速度定数に関係するグラフである（破線：９５％の信頼限界；ｎ＝５０）。
【図２】
図２は、遅延型の蛍光光度法の原理を例示するグラフである。
【図３】
図３は、本発明に使用する、レーザー励起蛍光装置の模式図である。
【図４】
図４は、ナイルブルー−ＤＴＰＡの蛍光励起スペクトル（実線）および蛍光発光スペクトル（破線）を示すグラフである。
【図５】
図５は、Ｅｕ−ＥＧＴＡの蛍光励起スペクトル（実線）および蛍光発光スペクトル（破線）を示すグラフである。
【図６】
図６は、本発明の実施形態に従う大環状化合物を示す。
【図７】
図７は、ＴＡＢＦＴＡの生成のための例示的合成経路を示す。
【図８】
図８は、本発明の方法において用いるための例示的な出発物質、中間体、および最終生成物を示す。
【図９】
図９は、ランタニド原子の優位な発光特性を生じる励起プロセスおよび減衰プロセスを示す。
【図１０】
図１０は、本発明に従う装置を操作し得るフィンガースリーブ（ｆｉｎｇｅｒ  ｓｌｅｅｖｅ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517041.tif 000079
2004517041.tif 000080
【国際調査報告】
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