(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム内の遺伝子によりコード化されるペプチド、本発明の薬剤代謝酵素ペプチドのアミノ酸配列を提供する。特に本発明は、単離ペプチドと核酸分子、薬剤代謝酵素ペプチドのオルソログとパラログを特定する方法、及び薬剤代謝酵素ペプチドの変調剤を特定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列。
（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であり、該対立変異体が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子により、コード化されるもの。
（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列であり、該オルソログが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされる核酸分子によりコード化されるもの。
（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
【請求項３】
請求項２のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のオルソログアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子の対立鎖に対して、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされるもの。
（ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であり、該フラグメントが少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含むもの。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組換動物。
【請求項８】
請求項５の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項１のペプチドのいずれかを製造する方法。
【請求項１１】
（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列のいずれかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、ペプチドが該ヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、請求項２のペプチドのいずれかを製造する方法。
【請求項１２】
請求項２のペプチドのいずれかの存在をサンプル中に検出する方法であり、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出できる検出試薬にサンプルを接触させ、該ペプチドの存在を検出することを含む方法。
【請求項１３】
請求項５の核酸分子の存在をサンプル中に検出する方法であり、ストリンジェント条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させ、オリゴヌクレオチドがサンプル中の核酸分子に結合するかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１４】
請求項２のペプチドの変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１５】
該ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に試薬が投与される請求項１４の方法。
【請求項１６】
請求項２のペプチドのいずれかに結合する試薬を特定する方法であり、ペプチドを該試薬に接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が成形されているかどうかを判断することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法により特定される試薬、及びその薬剤的に許容できる媒体を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒト薬剤代謝酵素タンパクにより媒介される疾患又は状態の治療方法であり、請求項１６の方法により特定される試薬を薬剤的に効果的な量、患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項２のペプチド発現の変調剤を特定する方法であり、該ペプチドを発現する細胞を試薬に接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調するかどうかを判断することを含む方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％が相同であるアミノ酸配列を有する単離ヒト薬剤代謝酵素ペプチド。
【請求項２１】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％が相同である請求項２０のペプチド。
【請求項２２】
ヒト薬剤代謝酵素ペプチドをコード化する単離核酸分子であり、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子と少なくとも８０％が相同である核酸分子。
【請求項２３】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１又は３に示される核酸分子と少なくとも９０％が相同である請求項２２の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年８月３０日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６０／２２８，８９３（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００７６３−ＰＲＯＶ）、及び２００１年２月１６日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／７８４，３４０（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００７６３）の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーに関連する薬剤代謝タンパク、組換え体ＤＮＡ分子、及びタンパク製造に関する。特に本発明は、新規な薬剤代謝ペプチドとタンパク、及びそのようなタンパク分子をコード化する核酸分子を提供し、ヒト治療学の発展と、ヒト治療の発展のために有益である。
【０００３】
背景技術
薬剤代謝タンパク
薬剤代謝酵素（ＤＭＥ）の誘発は、生体異物への共通の生物学的反応であり、これらの機序と結果は、学術、産業、及び薬理学と毒物学の規定する範囲において重要である。
【０００４】
ほとんどの薬剤において、薬剤代謝酵素は、どれほどの時間、どれほどの量、薬剤が体内に残留するかを決定している。従って、薬剤開発者は、候補薬剤と酵素との相互作用を特徴付けることが重要であることを認識している。例えば、薬剤代謝酵素ＣＹＰ２Ｄ６の多型は、チトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）スーパーファミリーのメンバーであり、抗鬱薬、抗精神病薬、β−ブロッカー、及び抗不整脈薬を含む広範囲の薬剤の緩慢又は超急速な代謝剤の表現型を産出する。このような薬剤代謝の異常な速度は、薬剤を無効にする、あるいは薬剤が全身に蓄積したり毒性を引き起こしたりすることがある。
【０００５】
候補薬剤を開発している薬剤科学者にとって、候補薬剤を代謝する酵素、及び代謝速度を、設計段階においてできるだけ早く知ることが重要である。歴史的に、薬剤代謝経路上の酵素は、動物での代謝研究を通じて決定されたが、現在この方法は、酵素の各形態の特有な役割を洞察するために、主としてヒトの組織又はクローンされた薬剤代謝酵素の使用に代替されている。これらのツールを使うことにより、ヒトへの最初の投薬に先行して、候補薬剤の質的・量的な運命を予測することができる。結果として、代謝の望ましい特性の選別と最適化が、開発の早い段階で可能となり、薬剤の臨床試験後に起こる予期せぬ毒性問題及び関連したコストを避けることができる。さらに、ある薬剤の別の処置への効果が推定できる。
【０００６】
公知の薬剤代謝酵素には、チトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）サブファミリー、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、メチルトランスフェラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）、ＮＡＤＰＨ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ 又は ＤＴジアフォラーゼ）、カテコール Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）、チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）、及びエポキシドヒドロキシラーゼが含まれる。薬剤代謝酵素は、それらの代謝機能によって、一般に二種類に分類される。第一類の酵素は、官能基の修飾に触媒作用を及ぼし、第二類の酵素は、内生的な置換基との共役に触媒作用を及ぼす。薬剤代謝の他の機序が発見されたので、これらの分類は、排他的、徹底的であると解釈されるべきではない。例えば、能動輸送の機序の利用は、解毒の方法の一部として見なされる。
【０００７】
第一類の反応は、アミナーゼの脱アミノ反応、エステルやアミドの加水分解反応、グリシンやスルフェート等との共役反応、チトクロムＰ４５０酸化／還元酵素系による酸化、及び脂肪酸経路での分解等の異化作用の工程を含む。加水分解反応は、様々な非特定ハイドロラーゼ及びエステラーゼにより、主に肝臓及び血漿において起こる。また、デアミラーゼ及びアミダ−ゼも、肝臓と血清に位置し、異化作用工程の大部分を遂行する。還元反応は主に、小胞体の細胞内において起こる。
【０００８】
第二類の酵素は、水溶性物質との共役に触媒作用を及ぼすことにより、毒素の水溶性を増大させ、それらの排出率を増大させ、有毒物質を無毒にする。加えて、共役は、毒素の生物学的反応性を減少する。第二類の酵素の例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ及びＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼがあり、これらはそれぞれグルタチオンとグルクロン酸との共役に触媒作用を及ぼす。トランスフェラーゼは、主に腎臓と肝臓において共役反応を行う。
【０００９】
肝臓は、精神薬を含むほとんどの薬剤を排除する主要な部位であり、薬剤を酸化又は共役させる大多数の第一類及び第二類酵素を含んでいる。
【００１０】
医師は、現在、母集団平均に基づいて薬剤及びそれらの投与量を規定しているが、遺伝的変動性の考慮に失敗することがある。薬剤代謝における個人間の変動性は、通常遺伝及び環境因子に起因し、特に薬剤代謝酵素がどのようにコントロールされるかによる。ある酵素においては、遺伝的要素が支配し、変動性は正常、野生型の酵素の変化と関連する。
【００１１】
ほとんどの薬剤代謝酵素は臨床的に関連のある遺伝子多型を明示している。官能基の修飾、又は内生的な置換基との共役に関係する主要なヒト酵素のすべては、本質的に、遺伝子レベルで共通の多型を明示している。例えば、無機能の異なる酵素を表す多型は、母集団において、薬剤の濃縮依存の作用を受けやすい従属群の患者を生じる。この従属群の患者は、一般母集団では副作用が起こらなかった薬剤の服用量において有毒な副作用を示すことがある。最近の遺伝子分類研究により、影響を受けた個人の特定ができる。結果として、影響があった酵素により代謝された薬剤への変則的な代謝及び考えられる反応が理解され、予測できるため、医師が薬剤の投与量を調整することによって、改善された療法を受けることができる。
【００１２】
同様な方法は、様々なガンの開発と関連する危険因子の特定においても重要である。なぜなら薬剤代謝に関する酵素が、化学系発ガン剤の活性化及び解毒に関係するからである。特に、新生物の発達は、発ガン物質を活性化する第一類の酵素とそれらを無毒にする第二類の酵素のとのバランスにより調節される。従って、個人のガンへのかかりやすさは、しばしば、これらの二工程のバランスに関係し、これらは一部、遺伝的に決定され、適切な遺伝子分類テストによりスクリーニングできる。第二類の酵素に比べての第一類の酵素が多く誘発されると、莫大な求電子試薬及び反応性酸素種が生成し、ＤＮＡと膜の損傷、及び新形成をもたらす他の反作用が起こる可能性がある。逆に、第二類の酵素の発現が多ければ、様々な化学化合物から細胞を保護できる。
【００１３】
薬剤代謝酵素の異常な活性は、ガン、パーキンソン病、筋萎縮症、及び発育上の障害を含むヒト疾患の範囲に関連する。
【００１４】
チトクロムＰ４５０
第一類薬剤代謝酵素の例は、その一部が肝臓で発現する主要な薬剤代謝酵素を含むチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）スーパーファミリーである。ＣＹＰスーパーファミリーは、多くの内生的及び外因的な親油性化合物の酸化と脱水素反応に触媒作用を及ぼすヘムタンパクを含む。ＣＹＰスーパーファミリーはその機能に膨大な多様性を持ち、多くの化学反応に触媒作用を及ぼす多種において、数百の異性体が存在する。ＣＹＰスーパーファミリーは、少なくとも３０個の関連した酵素を含み、それらのアミノ酸相同性に従って種々のファミリーに分割される。ＣＹＰファミリーの例はＣＹＰファミリー１、２、３、及び４を含み、それは、薬剤及び他の生体異物の代謝に関係する小胞体タンパクを含む。これら４つのファミリーの約１０〜１５個の各遺伝子生成物が、数千個の構造多様な化合物を代謝する。ヒトに使用される入手可能なすべての薬剤の８０％以上の代謝において、集合的にＣＹＰスーパーファミリーの酵素が関与すると見積もられている。例えばＣＹＰ １Ａサブファミリーは、ＣＹＰ １Ａ２を含み、アセトアミノフェン、アミトリプチリン、カフェイン、クロザピン、ハルペリドール、イミプラミン、オランザピン、オンダンセトロン、フェナセチン、プロパフェノン、プロプラノロール、タクリン、テオフィリン、ベラパミルを含むいくつかの広く使用されている薬剤を代謝する。さらにＣＹＰ酵素は、プロスタグランジン及びステロイドを含むいくつかの内生的な基質の代謝において、さらなる役割を果たす。
【００１５】
多型には、いくつかのＣＹＰ酵素が存在し、これは母集団中の少ない割合において、通常活性を減少又は停止することにより、酵素の活性を変える変異遺伝子が存在することを意味している。例えば、遺伝子多型はＣＹＰ ２Ｃ１９とＣＹＰ ２Ｄ６遺伝子により、よく特徴付けられていた。ＣＹＰ ２Ｃ１９の基質は、クロミプラミン、ジアゼパム、イミプラミン、メフェニトイン、モクロベミド、オメプラゾール、フェニトイン、プロプラノロール、及びトルブタミドを含む。
【００１６】
ＣＹＰ ２Ｄ６の基質は、アルプレノロール、アミトリプチリン、クロルフェニラミン、クロミプラミン、コデイン、デシプラミン、デキシトロメソルファン、エンカイニド、フルオキセチン、ハロペリドール、イミプラミン、インドラミン、メトプロロール、ノロトリプチリン、オンダンセトロン、オキシコドン、パロキセチン、プロプラノロール、及びプロパフェノンを含む。これらの遺伝子多型は、異なる速度でこれら基質を代謝し、患者の治療に効果的な投薬量に影響する。
【００１７】
これら化合物のすべての代謝に適応するためにＣＹＰの基質特異性は非常に広くなければならないので、各ＣＹＰ遺伝子生成物は、その結合と触媒部位により定義された、より狭い基質特異性を持つ。従って、薬剤代謝は、具体的なＣＹＰ遺伝子生成物の量あるいは活性の変化により調節される。ＣＹＰ調節の方法は、ＣＹＰ遺伝子生成物（すなわち遺伝子多型）の発現、ＣＹＰに結合する他の生体異物によるＣＹＰ代謝の抑制、及び薬剤自身又は他の生体異物によるあるＣＹＰ誘発等の遺伝の変化を含む。
【００１８】
ＣＹＰの抑制と誘発は、薬剤反相互作用の最も一般的な機序の１つである。例えば、ＣＹＰ３Ａサブファミリーは、心臓の不整脈を生じうる非鎮静抗ヒスタミン剤とシサプリドに関係する臨床的に重要な薬剤相互作用に関連する。別の例では、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ１Ａ２酵素は、テオフィリンに関係する薬剤相互作用に関連する。別の例では、ＣＹＰ２Ｄ６は多くの精神療法薬剤の代謝に関係がある。加えて、ＣＹＰ酵素は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者の治療に用いられるタンパク分解酸素阻害剤を代謝する。これら酵素に特異的な機能と特性を理解することによって、医師は薬剤相互作用を予測管理し、特定の治療処方計画への個人の反応を予測し、説明できる。
【００１９】
ＣＹＰスーパーファミリーにより触媒作用を及ぼされる反応の例は、水酸化反応の酸素供与体として、還元β切断の基質として、及びギ酸塩とアルケンへのアルデヒドの分割におけるペルオキシヘミアセタール中間体として過酸化物を利用する過酸化反応を含む。脂質ハイドロ過酸化物は、炭化水素とアルデヒド酸を得る還元β開裂を受ける。これらの生成物、トランス−４−ヒドロキシノネナールはＣＹＰを不活性化し、特にアルコールを誘発する２Ｅ１は、負の調整工程であるかもしれない。ＣＹＰ鉄−オキセン種は、ほとんどの水酸化反応において酸素供与体であると信じられているが、鉄−ペロキシ種は、明らかに芳香族反応において残留構造の不飽和化による多くのアルデヒドの脱ホルミル化に関係する。
【００２０】
ＣＹＰ酵素と関連する酸化的な代謝を行う薬剤の例は、アセトアミノフェン、アルフェンタニル、アルプラゾラム、アルプレノロール、アミノダロン、アミトリプチリン、アステミゾール、ブスピロンカフェイン、カルバマゼピン、クロルフェニラミン、チサプリド、クロミプラミン、クロザピン、コデイン、コルヒチン、コルチゾール、シクロホスファミド、サイクロスポリン、ダプゾン、デシプラミン、デキソトロメソロファン、ジアゼパム、ジクロフェナック、ジルチアゼン、エンカイニド、エリスロマイシン、エストラジオール、フェロジピン、フルオキセチン、フルヴァスタチン、ハロペリドール、イブプロフェン、イミプラミン、インジナビア、インドメタシン、インドラミン、イルベサラタン、リドカイン、ロサルタン、マクロライド抗生物質、メフェニトイン、メタドン、メトプロロール、メキシリテン、ミダゾラム、モクロベミド、ナプロキセン、ネファゾドン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニトレンジパン、ノルトリプチレン、オランザピン、オメプラゾール、オンダンセトロン、オキシコドン、パクリタキセル、パロキセチン、フェナセチン、フェニトイン、ピロキシカム、プロゲステロン、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、リトナビア、サクイナビア、セルトラリン、シルデナフィル、Ｓ−ワルファリン、タクリン、タモキシフェン、テノキシカム、テルフェナジン、テストステロン、テオフィリン、チモロール、トルブタミド、トリアゾラム、ベラパミル、及びビンブラスチンを含む。
【００２１】
第一類酵素の異常な活性がヒト疾患の範囲に関連付けられてきた。例えば、ＣＹＰ２Ｄ活性の減少が、パーキンソン病の危険の増大と結び付けられたのに対して、ＣＹＰ２Ｄ６活性の強化は、膀胱、肝臓、咽頭、胃、及び肺への悪影響と関連付けられてきた。ＣＹＰスーパーファミリーにおける欠乏と関連した他の症候群及び発達的障害は、脳腱黄色腫症、副腎過形成、女性化乳房、及び筋萎縮症を含む。
【００２２】
ＣＹＰスーパーファミリーは薬剤作用と開発の主要な対象である。従って、ＣＹＰスーパーファミリーの未知のものを特定し特徴付けることは、薬剤開発の分野において価値のあることである。
【００２３】
ＵＤＰ−グルクロノジートランスフェラーゼ
第二類代謝に関係する潜在的な薬剤相互作用が、次第に認識されてきている。薬剤代謝に関係する第二類酵素の重要なグループは、グルクロノシルトランスフェラーゼ、特にＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）スーパーファミリーである。ＵＧＴスーパーファミリーの酵素は、油溶性の化学薬品への糖供与体としてのＵＤＰグルクロン酸の付加に触媒作用を及ぼし、その工程は、それらの水溶性を増大させ、排出の割合を増大させる。哺乳動物ではグルクロン酸は、代謝残留物及び環境からの油溶性化学薬品が、体に有毒なレベルに積算するのを防止するために使われる主要な糖である。グルクロノシルトランスフェラーゼの誘発剤と阻害剤の両方が知られており、これらは向精神薬を含む重要な薬剤の血漿濃縮と作用に影響する可能性を持っている。
【００２４】
ＵＧＴスーパーファミリーは、ＣＹＰスーパーファミリーのメンバーを定義するのと同様な命名法によって定義された、ある種の酵素のいくつかのファミリーを含む。動物、酵母、植物、及びバクテリアには、最低１１０の別個に知られているＵＧＴスーパーファミリーの酵素が存在する。ちょうど３３ファミリーが、ヒトで特定された３ファミリーによって定義された。種々のＵＧＴファミリーは、４５％未満のアミノ酸配列相同性を持っていると定義される；サブファミリー内には、約６０％の相同性がある。ＵＧＴスーパーファミリーの酵素は、動物、植物、及びバクテリアに発見されたＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼのさらなるスーパーファミリーの一部である。
【００２５】
第二類酵素、特にＵＧＴ酵素の役割は、精神薬理学において重要であることが次第に認識されてきている。ＵＧＴ酵素は、多くの重要な向精神薬を共役し、薬剤反応と薬剤相互作用の変動の重要な源である。例えば、ベンゾジアゼピン、ロラゼパン、オキサゼパン、及びテマゼパンは、尿に排出される前に、第二類反応を独占的に受ける。
【００２６】
第二類酵素は発ガン物質などの危険物質を代謝し、無毒にする。第二類酵素をコード化している遺伝子の発現は、数百の薬剤により、上昇変調されることが知られている。例えばオルチプラズは、第二類酵素発現を上昇変調すると知られている。発ガン物質に先行して、選択された第二類酵素誘発剤が与えられると、発ガン物質のガン発症作用から保護されることが研究により示された。
【００２７】
発ガン物質への露呈と関連するガン防止のための、ヒトの第二類酵素誘発剤の潜在的な使用により、それら分子の効果を理解するための研究が促進された。現在の生化学及び分子生物学研究方法は、選択的な第二類酵素誘発剤及びそれらの対象を特定し、特徴付けるよう用いられうる。ガン化学抑制剤に反応する遺伝子の特定は、それらの基本的な機序の研究を容易にし、遺伝子変調、酵素多型及び発ガン物質解毒の関係についての洞察を提供する。
【００２８】
ＵＧＴ酵素と関連した共役代謝を持つ薬剤の例は、アミトリプチリン、ブプレノルフィン、クロロプロマジン、クロザピン、コデイン、シプロヘプタジン、ジヒドロコデイン、ドキセピン、イミプラミン、ラモトリジン、ロラゼパン、モルヒネ、ナロルフィン、ナルトレキソン、テマゼパン、及びヴァルプロエートを含む。
【００２９】
第二類酵素の異常な活性は、ヒト疾患の範囲に含まれる。例えば、ギルバート症候群は、ＵＧＴ１遺伝子において変異により起こされた常染色体支配的な疾患であり、ＵＧＴ１Ａ１酵素での変異は、クリグラー−ナジャー症候群に関連があることが示された。
【００３０】
ＵＧＴスーパーファミリーは薬剤作用と開発のための主要な対象である。従って、ＵＧＴスーパーファミリーの公知でない酵素を特定し、特徴付けることは、薬剤の開発の分野において価値のあることである。
【００３１】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼのさらに詳しい論評は、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９３ Ｊｕｌ １５；１９４（１）：４９６−５０３； Ｂｅａｕｌｉｅｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８ Ｊｕｌ ９；２４８（１）：４４−５０； Ｂｅｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７ Ｏｃｔ；１６（１０）：１１９５−２０５； Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９８７ Ｍａｒ １；２４２（２）：５８１−８； Ｔａｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０００ Ｊｕｌ １４；２７３（３）：１０４８−１０５２； Ｂｕｒｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０： ４８７−４９４， １９９１； Ｋｒａｓｎｅｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １３： １７９−１８２， １９８７； Ｍｏｎａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３： ４９６−４９９， １９９４； Ｍｏｎａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３： ９０８−９０９， １９９２； 及びｄ Ｒｉｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １０： ２５１−２６０， ２０００を参照。
【００３２】
薬剤代謝酵素、特にＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーのメンバーは、薬剤作用と開発のための主要な対象である。従って、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーの未知のメンバーを特定し特徴付けることは、薬剤開発の分野において重要である。本発明は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーのメンバーにホモロジーを持つ、未確認のヒト薬剤代謝タンパクを提供することにより、技術段階を向上する。
【００３３】
【発明の概要】
本発明は、一部ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーと関連するヒト薬剤代謝酵素ペプチド及びタンパクのアミノ酸配列、及びその対立変異体や、その他の哺乳動物のオルソログの特定に基づく。これらの特有なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒト治療対象の開発のためのモデルとして用いることができ、治療タンパクの特定を補助し、薬剤代謝酵素を発現する細胞及び組織における薬剤代謝酵素活性を調節するヒト治療薬剤の発展のための対象として役立つ。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。
【００３４】
［発明の詳細な説明］
一般説明
本発明は、ヒトゲノム配列に基づく。ヒトゲノム配列及び構築において、配列情報の分析は、薬剤代謝酵素タンパク及び薬剤代謝酵素タンパクの一部として当技術で特定され特徴付けられている、タンパク／ペプチド／ドメインへの構造及び／又は配列相同性を提供するペプチドをコード化するヒトゲノムの、未知のフラグメントを明らかにしており、これはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーと関連している。これらの配列を利用することによって、付加的なゲノム配列が組み立てられて、転写及び／又はｃＤＮＡ配列は単離され、特徴付けられた。この分析に基づき、本発明は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーに関連するヒト薬剤代謝酵素ペプチド及びタンパクのアミノ酸配列、転写配列型の核酸配列、これらのヒト薬剤代謝酵素ペプチド及びタンパクをコード化するｃＤＮＡ配列及び／又はゲノム配列、核酸変異（対立変異体情報）、発現の組織分布、及び本発明の薬剤代謝酵素と相同性を有する構造又は配列を有する公知タンパク／ペプチド／ドメインに関する近似技術の情報を提供する。
【００３５】
本発明において提供されるペプチドは、未知なだけでなく、商業的に重要な製品及びサービスの発展に有用である能力により選択される。特に、本発明のペプチドは、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーの公知の薬剤代謝酵素タンパクへの相同性及び／又は構造上の相関及び観察される発現パターンに基づき選択される。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。これらの技術は、これらタンパク群及び本遺伝子と同様な発現型を持つタンパクの商業的な重要性を明確に確立した。本発明のペプチドクのより具体的な機能、及びその使用のいくつかは、ここに説明されており、特に発明の背景、及び図面の説明に説明されており、及び／又は薬剤代謝酵素タンパクの公知のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼファミリー又はサブファミリーの技術において知られている。
【００３６】
具体的な実施例
ペプチド分子
本発明により、薬剤代謝酵素タンパクファミリーのメンバーであると特定され、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ薬剤代謝酵素サブファミリーと関連するタンパク分子をコード化する核酸配列が提供される（タンパク配列は図２、転写／ｃＤＮＡ配列は図１、ゲノム配列は図３において提供される）。ここに示した明らかな変異体と共に、図２に提供されたペプチド配列、特にここで特定され、図３における情報を用いる対立遺伝子変異は、本発明の薬剤代謝酵素ペプチド、薬剤代謝酵素ペプチド、あるいは本発明のペプチド／タンパクとしてここに参照される。
【００３７】
本発明は、図２に示される薬剤代謝酵素ペプチドのアミノ酸配列（図１の転写／ｃＤＮＡ、又は図３のゲノム配列の核酸分子よってコード化される）から成っているか、実質的に成っているか、又はそれを含む単離ペプチド及びタンパク分子とともに、製造と用途の当技術におけるこれらペプチドのすべての明らかな変異を提供する。これらの変異は以下に詳細に説明される。
【００３８】
ここでペプチドは、それが細胞物質を実質的に含まないか、又は化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは均一に、又はある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用目的に基づく。その臨界的な特徴は、相当量の他成分が存在したとしても、調製物がペプチドの所望の機能を発揮すれば許容されることである（単離核酸分子の特徴については以下に記述される）。
【００３９】
ここで、「細胞物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の他のタンパク（即ち汚染タンパク）、２０％以下の他のタンパク、１０％以下の他のタンパク、又は５％以下の他のタンパクを有するペプチド組成物を含む。ペプチドが組替えにより生産される場合、タンパク調製物の容量に対して培養体が約２０％以下の場合、培養体が実質的に存在しないとすることができる。
【００４０】
「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、その合成時において関与する化学前駆体又は他の化学物質が除去された該ペプチドの調製を含む。ある実施例においては、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％（乾燥重量）以下の化学前駆体又は他の化学物質、２０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、１０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は５％以下の化学前駆体又は他の化学物質を有する薬剤代謝酵素ペプチド組成物を含む。
【００４１】
単離薬剤代謝酵素ペプチドは、自然にそれを発現する細胞から精製することができ、それを発現するように変異した細胞（組換体）から精製することができ、或いは公知のタンパク合成手法を用いて合成され得る。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。例えば、薬剤代謝酵素ペプチドをコード化する核酸分子は、発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、そしてタンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準的なタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【００４２】
したがって、本発明は、図２で与えられたアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）からなるタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。このようなタンパクのアミノ酸配列は図２に提供される。アミノ酸配列がタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、タンパクはそのアミノ酸配列からなる。
【００４３】
本発明はさらに、図２で与えられたアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から実質的になるタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が、例えば最終タンパク中に約１〜１００の付加的な残基、典型的には約１〜２０の付加的残基のように少ない付加的アミノ酸残基のみが存在する場合、タンパクは実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【００４４】
本発明はさらに、一種又はそれ以上の図２に与えられるアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を含むタンパクを提供する。例えば、図１に示された転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）、及び図３に示されたゲノム配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）によってコード化されたタンパクである。アミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、タンパクはこのアミノ酸配列を含む。このように、タンパクは該ペプチドのみからなることができ、又は通常そのタンパクに関連する又は非相同アミノ酸残基／ペプチド配列であるアミノ酸残基（隣接コード化配列）のような、付加的アミノ酸分子を有することもできる。このようなタンパクは、わずかな付加的アミノ酸残基を有することができ、又は数百或いはそれ以上の付加的アミノ酸を有することもできる。本発明の薬剤代謝酵素ペプチドを含む好ましいタンパクは、成熟タンパクに自然に生じる。これらの各種タンパクを調製／単離する方法を、以下に簡潔に説明する。
【００４５】
本発明の薬剤代謝酵素ペプチドは、キメラ又は融合タンパクを形成するために非相同性配列と接合することができる。このようなキメラ又は融合タンパクは、薬剤代謝酵素ペプチドと実質的に相同でないアミノ酸配列を有する非相同性タンパクに作用的に結合された薬剤代謝酵素ペプチドを含む。「作用的に結合された」とは、薬剤代謝酵素ペプチドと非相同性タンパクとがフレーム内に融合することを示す。非相同性タンパクは、薬剤代謝酵素ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００４６】
ある用途において、融合タンパクは薬剤代謝酵素ペプチドのタンパクの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合体、ポリ−Ｈｉｓ融合体、ＭＹＣ付加体、ＨＩ付加体、及びＩｇ融合体等の酵素融合タンパクを含むがこれらに限定されない。このような融合タンパク、特にポリ−Ｈｉｓ融合体は、薬剤代謝酵素ペプチドの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）では、タンパクの発現及び／又は分泌は非相同的信号配列を用いることで増加する。
【００４７】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組替えＤＮＡ技術により生産することができる。例えば、異なるタンパク配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に配置される。他の例では、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成を含む従来技術により合成され得る。あるいは、二つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、その後アニールし、キメラ遺伝子配列を再増幅することにより、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、すでに融合半部をコード化している多くの発現ベクターが商業的に入手可能である（例えばＧＳＴタンパクが挙げられる）。薬剤代謝酵素ペプチドをコード化した核酸は、発現ベクター等へクローニングすることができるので、融合半部は薬剤代謝酵素ペプチドにフレーム内で結合される。
【００４８】
上述のように、本発明は、ペプチドの自然由来の成熟型、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、自然由来でない組換えによるペプチドの変異体、及びペプチドのオルソログとパラログ等の本発明のタンパクのアミノ酸配列の明らかな変異体も提供し、使用可能にする。このような変異体は、組換え核酸技術及びタンパク生化学の分野において公知の技術を用い、容易に生成することができる。しかしながら、変異体は、本発明以前に公開されたいずれのアミノ酸配列をも除外する。
【００４９】
このような変異体は、分子技術とここに開示された配列情報を用いて、容易に特定／製造できる。さらに、このような変異体は、薬剤代謝酵素ペプチドに相同である配列及び／又は構造に基づき、他のペプチドと容易に区別できる。相同性／同一性の程度は、第一にペプチドが機能的変異体であるか非機能的変異体であるか、パラログ群に存在する分化量及びオルトログ間の進化的相違に基づき、判断される。
【００５０】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性％を決定するために、配列は最適な比較ができるように並べられる（例えば、ギャップは、最適配列のため第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方あるいは両方に導入され、非相同性配列は比較目的のため無視し得る）。好ましい例においては、参照配列の長さの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上が比較目的に応じて並べられる。対応するアミノ酸配置あるいはヌクレオチド配置に対応したアミノ酸残基あるいはヌクレオチドが比較される。第一配列の配置が、第二配列の対応した配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、分子はその位置で同一である（ここで、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性％は、配列の同一位置の数に相関があり、相違数と各相違の長さを考慮し、相違は２つの配列の最適配置に導入されることが必要である。
【００５１】
２つの配列間の配列比較と、同一性％と類似性の定量は、数学的アルゴリズムを使って遂行できる。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）．好ましい例において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに装着されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３ （１９７０））アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍより入手可）を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ　６２　ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０　ｍａｔｒｉｘ、及び１６，１４，１２，１０，８，６，４の相違重量、及び１，２，３，４，５又は６の長さ重量の両者を用いて決定される。さらに別の好ましい例において、２つのヌクレオチド配列の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１）：３８７（１９８４）（ｈｔｔｐ：／／ｇｃｇ．ｃｏｍより入手可））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０，５０，６０，７０又は８０の相違重量、及び１，２，３，４，５，又は６の長さ重量を用いて決定される。異なる例において、２つのアミノ酸あるいはヌクレオチド配列の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に装着されたＥ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））アルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティー及び４の相違ペナルティーを用いて決定される。
【００５２】
本発明の核酸及びタンパクの配列は、例えば他のファミリーメンバー又は関連配列の特定のため配列データペースに対する調査を行う「クエリー配列」を用いることができる。このような調査は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて行われる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は、ＮＢＬＡＳＴプログラムにより行われ、スコア＝１００、ワードレングス＝１２で、本発明の核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク調査は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、スコア＝５０、ワードレングス＝３で、本発明のタンパクに相同であるアミノ酸配列性を得ることができる。比較目的のためのギャップ配列を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、対応プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。
【００５３】
成熟処理型（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｏｒｍｓ）と同様、全長前処理型（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｆｏｒｍｓ）及び薬剤代謝酵素ペプチドの一つを含む結合変異タンパクは、ここで提供される薬剤代謝酵素ペプチドと同じ遺伝子位置によってコード化されるだけでなく、少なくとも薬剤代謝酵素ペプチドの一つと完全配列同一性を有するものとして、容易に特定できる。
【００５４】
本発明の新規な薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子は、図３において示されるように、ヒトの染色体４にマップしたゲノム成分に位置し、これはＳＴＳ、ＢＡＣマップデーター等の多数の証拠によりサポートされる。
薬剤代謝酵素ペプチドの対立変異体は、ここで提供される薬剤代謝酵素ペプチドと同じ遺伝子位置でコード化されたものと同様、少なくとも薬剤代謝酵素ペプチドの部位で配列相同性／同一性の高い程度（重大な）を有するヒトタンパクとして容易に確認される。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマップされたゲノム配列のように、図３で提供される遺伝子情報に基づき容易に決定される。本発明の新規な薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子は、図３において示されるように、ヒトの染色体４にマップしたゲノム成分に位置し、これはＳＴＳ、ＢＡＣマップデーター等の多数の証拠によりサポートされる。ここで用いられるように、２つのタンパク（あるいはタンパクの領域）は、アミノ酸配列が典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、及びより典型的には少なくとも約９０〜９５％あるいはそれ以上の相同性を有するとき、強い相同性を有する。強い相同性を有するアミノ酸配列は、本発明によれば、より詳細には以下に示されるストリンジェント条件下で、核酸分子をコード化する薬剤代謝酵素ペプチドに対してハイブリダイズされる核酸配列によりコード化される。
【００５５】
図３は、本発明の薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子に発見されたＳＮＰの情報を提供する。ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。これらのＳＮＰのいくつかが、制御／調節要素に影響しうる。
【００５６】
薬剤代謝酵素ペプチドのパラログは、ヒト遺伝子によりコード化されるものとして、また同様の活性又は機能を有するものとして、少なくとも薬剤代謝酵素ペプチドの領域に対し、強い配列相同性／同一性の程度を有することが容易に確認できる。アミノ酸配列が典型的には少なくとも約６０％以上、より典型的には約７０％以上、与えられた領域あるいはドメインに相同性を有する場合、２つのタンパクは典型的にはパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された核酸分子をコード化する薬剤代謝酵素ペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００５７】
薬剤代謝酵素ペプチドのオルトログは、他の生物の遺伝子にコード化されたものと同様、少なくとも薬剤代謝酵素ペプチドの領域に対し、強い配列相同性／同一性の程度を有することが容易に確認できる。好ましいオルトログは、哺乳類、好ましくは霊長類から単離され、ヒト治療対象及び薬剤として開発される。このようなオルトログは、詳細には以下に述べられるストリンジェント条件で変調された、核酸分子をコード化する薬剤代謝酵素ペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコード化され、タンパクを産生する２つの生物の相関性の程度に依存する。
【００５８】
薬剤代謝酵素ペプチドの自然由来でない変異体は、組換え技術を用いて容易に調製することができる。このような変異体は、薬剤代謝酵素ペプチドのアミノ酸配列の削除、付加、置換を含むがこれに限られない。例えば、置換の１種として、維持アミノ酸置換が挙げられる。これらの置換は、近似した性質を有する他のアミノ酸により薬剤代謝酵素ペプチドのアミノ酸を置換するものである。維持置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ及びＩｌｅ間の一方から他方への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎ間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換；及び芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒ間の置換に典型的に認められる。いずれのアミノ酸置換が表現型的に活動的でないかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に記載されている。
【００５９】
変異体薬剤代謝酵素ペプチドは完全に機能することもあり、あるいは例えば基質結合能、基質脱リン酸化能、信号調整能等の１つ以上の活性において機能を失うこともある。完全に機能する変異体は、典型的には維持変異あるいは非致命的残基又は非致命的領域の変異を含む。図２はタンパク分析の結果を提供し、致命的ドメイン／領域の特定に用いることができる。機能的変異体は、変化のない、あるいは機能の重要ではない変更を生じる近似アミノ酸の置換を含む。異なる例では、このような置換はある程度、ポジティブ又はネガティブに作用する。
【００６０】
非機能的変異体は、典型的には、１つ以上の非維持的アミノ酸置換、欠失、挿入、転化、移動、又は致命的残基あるいは致命的領域における置換、挿入、転化又は欠失を含む。
【００６１】
機能に必須なアミノ酸は、特定部位の変異誘発あるいはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））等の当該分野で公知の方法によって特定され、特に図２に示す結果が用いられる。後者の手法は分子のすべての残基において１つのアラニン変異を導入するものである。得られた変異分子は、薬剤代謝酵素活性等の生物学的活性あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの延命活性等の活性について試験される。対象／基質結合に重要な位置は、また、結晶化、核磁気共鳴又は光学親和性標識（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２））； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２）） 等の構造分析により決定できる。
【００６２】
本発明はさらに、薬剤代謝酵素ペプチドのフラグメントを含む及び該フラグメントからなるタンパク及びペプチドに加えて、薬剤代謝酵素ペプチドのフラグメント、特に図２に特定される残基を含むフラグメントを提供する。しかしながら、本発明が関連するフラグメントは、本発明以前に公知のフラグメントを含まない。
【００６３】
ここで、フラグメントは、薬剤代謝酵素ペプチドの少なくとも８，１０，１２，１４，１６あるいはそれ以上の隣接アミノ酸残基を含む。このようなフラグメントは薬剤代謝酵素ペプチドの生物学的活性の一つ以上を有する能力に基づき選択され、あるいは、例えば基質に結合する又は抗原として働くなどの機能を果たす能力により選択される。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、ペプチドは、例えば８あるいはそれ以上のアミノ酸長を有する。このようなフラグメントは、典型的には活性部位、膜スパニングドメイン、あるいは基質結合ドメイン等の薬剤代謝酵素ペプチドのドメインあるいはモチーフを有する。さらに、可能性を有するフラグメントは、フラグメントを含むドメインあるいはモチーフ、可溶性ペプチドフラグメント、及び抗原構造を有するフラグメントを含むが、これに限定されない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者に容易に利用可能な、よく知られたコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ ａｎａｌｙｓｉｓ）により容易に特定可能である。このような分析の一つの結果は図２に示されている。
【００６４】
ポリペプチドは、２０天然由来アミノ酸と通常呼ばれる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、加工や翻訳後修飾等の自然の過程、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。薬剤代謝酵素ペプチドに自然に起こる典型的な修飾は、基本テキスト、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている。（図２において、これらの機能のいくつかが特定される）
【００６５】
知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパクへの転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【００６６】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に大いに詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びＡＤＰリボシル化はほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＡＮＤ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄＥｄ．， Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）が挙げられる。この主題についての多くの詳細な評論が入手でき、例えば Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）） ＡＮＤ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２））が挙げられる。
【００６７】
したがって薬剤代謝酵素ペプチドは、置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコード化されたものではない誘導体又は類似体；置換基が含まれる誘導体又は類似体；薬剤代謝酵素ペプチドの半寿命を増加する化合物等の他の化合物（例えばポリエチレングリコール）が薬剤代謝酵素ペプチドの成熟タンパクに融合した誘導体又は類似体；主又は副配列、成熟薬剤代謝酵素ペプチド精製のための配列、又はプロタンパク配列、等の付加的なアミノ酸が成熟薬剤代謝酵素ペプチドに融合した誘導体又は類似体を含む。
【００６８】
タンパク／ペプチドの使用
本発明のタンパクは、抗体を引き起こす又は別の免疫応答を引き出すため；生物的液体のタンパク（又はその結合相手又はリガンド）のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識試薬を含む）として；対応したタンパクが優先的に発現される組織（形成的に、組織の分化又は発達の特別な段階において、あるいは病気の状態において）のマーカーとして；図に提供された機能的な情報と関連した現実的及び特異的なアッセイにおいて使われうる。タンパクが、別のタンパク又はリガンドに結合する又は潜在的に結合する所（例えば、薬剤代謝酵素エフェクタータンパク相互作用又は薬剤代謝酵素リガンド相互作用等において）では、タンパクは、結合相互作用の阻害剤を特定する系を発達させるために、結合相手／リガンドを特定するために使用できる。いずれかの又は全てのこれらの使用は、研究用製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。
【００６９】
上記の使用を達成するための方法は、当業者によく知られている。このような方法を示す文献には、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９， や ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， １９８７ 等がある。
【００７０】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパクの種類／作用と同様にタンパク源に基づく。例えば、ヒト及びヒト／哺乳動物オルソログから単離された薬剤代謝酵素は、哺乳動物治療剤、例えば特に、薬剤代謝酵素を発現する細胞又は組織における生物学又は病理学的反応を調整するヒトの薬剤を使うための特定薬剤としての対象として役立つ。図１は、本発明にかかる薬剤代謝酵素タンパクをコード化するｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を提供する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）。加えて、この分子配列に基づく発明の具体的な使用を容易に決定できる、ＡＴＧ開始、終止、及び組織分布等、構造と機能情報を提供する。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。調剤の大部分は薬剤代謝酵素タンパク、特にＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼサブファミリー（発明の背景を参照）の活性を調整するよう開発されている。背景や図における構造及び機能的な情報により、特に図１において提供された発現情報との組み合わせにおいて、本発明の分子の特有及び現実の用途が提供される。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮におけるの発現を示している。さらに、本発明のタンパクは、イオウを付加した薬剤を標識するために、産業において使用できる。このような使用は、当技術において公知のここに提供された情報、及び規定通りの実験を使って容易に決定できる。
【００７１】
薬剤代謝酵素ポリペプチド（本発明以前に開示された変異体とフラグメントを含む）は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼサブファミリーのメンバーと関連する薬剤代謝酵素と関連する生物学的アッセイとして有用である。このようなアッセイは、本発明の酵素が属している薬剤代謝酵素サブファミリー、特に薬剤代謝酵素を発現する細胞と組織においてに具体的である薬剤代謝酵素に関連した状態の診断及び治療に有用な、すべての公知薬剤代謝酵素の機能、活性、又は性質をも伴う。
【００７２】
図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。
【００７３】
薬剤代謝酵素ポリペプチドは、また、細胞ベース系又は無細胞系での薬剤スクリーニングアッセイにおいて有益である。細胞ベース系は、ネイティブ、すなわち薬剤代謝酵素を生体組織検査又は細胞培養拡張として正常に発現する細胞であるかもしれない。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。他の実施例において、細胞ベースアッセイは、薬剤代謝酵素タンパクを発現する組換えの宿主細胞に関係する。
【００７４】
ポリペプチドは、自然状態で薬剤代謝酵素活性を変調する化合物、又は薬剤代謝酵素に関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型を同定するために用いることができる。本発明の薬剤代謝酵素及び適切な変異体とフラグメントは、候補化合物の薬剤代謝酵素に結合する能力をアッセイするために、ハイスループットスクリーンにおいて使用できる。これらの化合物は、薬剤代謝酵素活性の化合物の効果を決定するために、機能的な薬剤代謝酵素についてさらにスクリーニングされうる。さらに、これらの化合物は、動物又は無脊椎の系において活性／有効性を決定する試験ができる。化合物は、薬剤代謝酵素を望ましい程度に、活性化（作動薬）、又は不活性化（拮抗薬）すると特定される。
【００７５】
さらに薬剤代謝酵素ポリペプチドは、薬剤代謝酵素タンパクと、該薬剤代謝酵素タンパクと通常相互作用する分子との相互作用を誘発する又は阻害する能力を、化合物についてスクリーニングするのに用いられ得る。このようなアッセイは、典型的には、薬剤代謝酵素タンパクと候補化合物を、薬剤代謝酵素タンパクあるいはフラグメントが対象分子と相互作用し得る状態下で結合させ、タンパクと対象分子との複合物の生成を検出する、あるいは薬剤代謝酵素タンパクと対象分子との相互作用の生化学的結果を検出することを含む。
【００７６】
候補化合物には、例えば、１）Ｉｇテールド融合ペプチド及びランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（１９９１）） 、及びＤ型及び／又はＬ型アミノ酸で作られる組み合わせ化学誘導分子ライブラリーを含む可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えばランダムあるいは部分的変質、指示されたホスホペプチドライブラリー（例えばＳｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３） 参照）； ３）抗体（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、抗体のエピトープ結合フラグメントだけでなく、ポリクロナール、モノクロナール、ヒューマナイズド、抗イディオティピック、キメラ、及び単一鎖抗体）；及び４）小有機及び無機分子（例えば組み合わせ及び天然産物ライブラリーから得られる分子）等が例示的に含まれる。
【００７７】
ある候補化合物は、基質結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物は、変異薬剤代謝酵素又は薬剤代謝酵素機能に影響する変異を有する適当なフラグメントを含み、この結果基質と競合する。従って、発明には基質に競合するフラグメントは、例えばより高い親和性を持ち、又は基質を結合するが解放しないフラグメントが含まれる。
【００７８】
薬剤代謝酵素により調整された生物学又は生化学の機能のいずれもが、末端アッセイとして使われうる。これらは、ここに記載され、ここに文献が参照され、これらエンドポイントアッセイの対象に関する文献に参照され、及び当業者が知る他の機能あるいは図、特に図２に提供される情報により容易に特定される機能による生化学的、あるいは生化学／生物学的挙動のすべてを含む。特に、薬剤代謝酵素を発現する細胞又は組織の生物学的機能が試験できる。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。
【００７９】
結合及び／又は活性化化合物は、アミノ末端細胞外ドメイン、あるいはその一部、膜スパニングドメイン全体あるいは一部、例えば７種の膜スパニングセグメントあるいは細胞内又は細胞外ループ及びカルボキシ末端細胞内ドメイン、あるいはその一部が非相同性ドメインあるいはサブレジオンに置換されたキメラ薬剤代謝酵素タンパクを用いスクリーニングすることができる。例えば、基質結合領域は、異なる基質と相互作用し、天然薬剤代謝酵素により認識されるものとして用いることができる。従って、信号転換要素の異なる組は活性化のエンドポイントアッセイに有用である。これは、薬剤代謝酵素が誘導される特定宿主細胞以外で行われるアッセイを可能とする。
【００８０】
薬剤代謝酵素ポリペプチドは、薬剤代謝酵素と相互作用する化合物（例えば結合相手及び／又はリガンド）を発見するために設計された方法である競合結合アッセイに有用でもある。従って、化合物がポリペプチドに結合する又は相互作用することができる条件下で、化合物は薬剤代謝酵素ポリペプチドに接触する。可溶性薬剤代謝酵素ポリペプチドも混合物に加えられる。被検化合物が薬剤代謝酵素ポリペプチドの可溶性タンパクと相互作用する場合には、形成される複合物の量、あるいは薬剤代謝酵素対象物からの活性が増加する。この種のアッセイは、特に薬剤代謝酵素の特定領域に相互作用する化合物を探索する場合に有用である。そして、対象薬剤代謝酵素領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象の特定領域に対応するペプチドを含むよう設計される。
【００８１】
無細胞薬剤のスクリーニングアッセイを行うため、薬剤代謝酵素タンパク又はフラグメント、あるいはその対象分子を免疫化することが好ましい場合があり、アッセイの自動化を可能とするだけでなく、タンパクの１つあるいは両方の非複合化形態から複合化形態を分離するのを効率化する。
【００８２】
基質上のタンパクを免疫化する技術は、薬剤スクリーニングアッセイに用いられる。ある実施例において、融合タンパクは、タンパクが基質に結合することを可能にするドメインを付加するものである。例えば、グルタチオン−Ｓ−トラスフェラーゼ融合タンパクは、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞ライセート（ｌｙｓａｔｅｓ）（例えば３５Ｓ−ｌａｂｅｌｅｄ）、対象化合物、又は複合物形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）下で培養された混合物と結合する。培養に続いて、ビーズは、結合していない標識を除くため洗浄され、基質は免疫化され、放射性ラベルが直接測定され、あるいは複合物を解離した後上澄みを測定する。異なる例では、複合体は基質から解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ビーズ断片中に見出される薬剤代謝酵素結合タンパクのレベルを、標準的な電気泳動技術によりゲルから定量する。例えば、ポリペプチドあるいはその対象分子のいずれかは、周知の方法により、ビオチン及びストレプトアビジンの共役を用いて免疫化する。異なる例では、タンパクと反応するが該タンパクが対象分子と結合することを妨げない抗体をプレートのウェルに誘導し、抗体結合によりタンパクをウェルに取り付ける。薬剤代謝酵素結合タンパク及び候補化合物の組成物は、薬剤代謝酵素タンパク存在ウェル中で培養され、ウェルに取り付けられた複合物の量を定量することができる。ＧＳＴ−免疫化複合物に関する上記記載に加えて、このような複合物の検出方法は、対象分子と関連する酵素活性を検出する酵素リンクアッセイと同様に、薬剤代謝酵素タンパク対象物質と反応する抗体、あるいは薬剤代謝酵素タンパクとの反応性を持ち、対象分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫学的検出を含む。
【００８３】
本発明の薬剤代謝酵素の一つを調整する薬剤は、上記アッセイの１つ以上を単独あるいは組み合わせて用いることで特定することができる。一般的には最初に細胞ベース系又は無細胞系を用い、その後動物又は他のモデル系で活性を確認することが好ましい。このようなモデル系は当技術界において周知であり、この記載において容易に用いることができる。
【００８４】
このような薬剤スクリーニングアッセイよって特定される薬剤代謝酵素タンパク活動度の変調剤は、薬剤代謝酵素を発現する細胞又は組織を扱うことで、薬剤代謝酵素経路の異常制御の患者を治療するのに用いることができる。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。これらの治療方法は、医薬組成物中の薬剤代謝酵素活性の変調剤を治療に必要な量、患者に投与する工程を含み、変調剤はここに記載されたように特定されたものである。
【００８５】
本発明の他の形態において、薬剤代謝酵素タンパクは、ツーハイブリッドアッセイあるいはスリーハイブリッドアッセイにおいて「バイトタンパク（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」として用いることができ（例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； 及びＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）、薬剤代謝酵素と結合あるいは相互作用し、薬剤代謝酵素活性に関与する他のタンパクを特定する。このような薬剤代謝酵素結合タンパクは薬剤代謝酵素阻害剤でありうる。
【００８６】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ−結合及び活性化ドメインからなる多くの転写因子の変調性に依存する。簡潔に言えば、このアッセイは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。１つの構造においては、薬剤代謝酵素タンパクをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化する遺伝子に融合されている。他方の構造においては、ＤＮＡ配列のライブラリーから得られたＤＮＡ配列は、未知のタンパク（“ｐｒｅｙ”あるいは“ｓａｍｐｌｅ”）をコード化し、前記公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子が融合されている。“ｂａｉｔ”及び“ｐｒｅｙ”タンパクは相互作用が可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏで薬剤代謝酵素依存複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ−結合及び活性化ドメインは近くに接近する。この接近は、転写因子に応答する転写制御サイトへ動作可能に結合するリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能性転写因子を含む細胞コロニーが単離され、薬剤代謝酵素タンパクと相互作用するタンパクをコード化するクローン化遺伝子を得るのに用いることができる。
【００８７】
本発明はさらに前記スクリーニングアッセイにより特定された新規薬剤に関する。従って、ここで記述された特定薬剤を適当な動物モデルで使用することも本発明の範囲内である。例えば、ここで記述された特定薬剤（例えば、薬剤代謝酵素調整薬剤、反増感薬剤代謝酵素核酸分子、薬剤代謝酵素特異的抗体、あるいは薬剤代謝酵素結合対象）は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤で処理した場合の有効性、毒性、あるいは副作用を判定するために用いることができる。異なる例では、ここで記述された特定薬剤は、動物あるいは他のモデルにおいて、それらの薬剤の挙動機構を判定するために用いることができる。さらに、本発明は前記スクリーニングアッセイで特定された新規薬剤の、ここで記述された治療のための使用を含む。
【００８８】
薬剤代謝酵素タンパクは、また、ペプチドにより調整される疾患又は疾患の傾向を診断する対象を提供するのに有効である。従って本発明は、細胞、組織、又は生体中でのタンパク（あるいはコード化したｍＲＮＡ）の存在又は程度を検出する方法を提供する。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。この方法は、生物サンプルと、薬剤代謝酵素タンパクと相互作用する化合物との接触を含み、このような相互作用を検出することができる。このようなアッセイは、抗体チップアレイのようなシングル検出形態あるいはマルチ検出形態を提供することができる。
【００８９】
サンプル中のタンパクを検出するある薬剤は、タンパクと選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルは、患者から単離した組織、細胞、及び生物的液体、同様に患者中の組織、細胞及び生物的液体を含む。
【００９０】
本発明のペプチドは、また、変異ペプチドを有する患者の活性タンパクの活性度、疾患、疾患の傾向、特に本発明のタンパクが属するタンパク群の他のものにおいて知られている活性度及び状態を診断する対象を提供する。そして、生物サンプルからペプチドを単離することができ、変異ペプチドを生じる遺伝子変異の存在をアッセイすることができる。これはアミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常組織挙動の結果）、及び適当でない後翻訳変異を含む。分析方法は、変更された電気泳動、変更されたトリプティックペプチド消化、細胞ベースあるいは無細胞における変更された薬剤代謝酵素活性のアッセイ、基質あるいは抗体結合パターンの変化、変化した当電点当電点、直接アミノ酸配列、及びその他のタンパク中の変異を検出するのに有用な公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、抗体チップアレイのような、シングル検出形態あるいはマルチ検出形態に適用できる。
【００９１】
ペプチドのＩｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。異なる例では、ペプチドは、標識された抗ペプチド抗体あるいは他種の検出薬剤を対象中に導入し、対象中でｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。例えば、抗体は放射性のマーカーにより標識することができ、その対象中における存在及び分布は標準的なイメージ化技術により検出することができる。特に有用な方法は、対象中に発現したペプチドの対立変異体の検出方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントの検出方法である。
【００９２】
ペプチドはまた、薬理学的分析に有用である。薬理学では、変更された薬剤位置による薬剤への反応、及び影響されたヒトの異常挙動において、臨床的に重要な遺伝変異態を扱う。例えばＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））、及びＬｉｄｅｒ， Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照。これらの変異体から生じる臨床結果は、個人の代謝の変動により、ある個人に対しては治療用薬剤の重篤な毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗となる。そして、個人の遺伝子型は、体への治療薬剤の作用、あるいは薬剤の体内代謝を決定する。さらに、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤挙動の強度と存続期間の両方に影響を与える。そして、個人の薬理学は、個人の遺伝子型に応じて、予防あるいは治療処置に効果的な薬剤及び効果的な薬剤の投与量の選択を可能とする。ある薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見は、なぜある患者に対しては期待された薬剤効果が得られず、または過大な薬剤効果を示し、あるいは標準的な薬剤投与量において重大な毒性を示すのかを明らかにするものである。多型は、強い代謝表現型と弱い代謝表現型とで表現される。従って、遺伝子多型は、ある集団に見られる薬剤代謝酵素機能の１つ以上が他の集団のそれとは異なり、薬剤代謝酵素の対立タンパク変異体を導き出すものと思われる。よってペプチドは、治療方法に影響を与える遺伝子配置を確かめる対象となる。よってリガンドベース治療において、多型は、結合している基質で多少活動的であるアミノ末端細胞外ドメイン及び／又は他の基質結合領域、及び薬剤代謝酵素の活性化を引き起こす。従って、基質投与量は、多型を含む集団に対する治療効果を最大とするように調整されることが必要である。遺伝子型の代わりに特定の多型ペプチドを特定することもできる。
【００９３】
ペプチドはまた、タンパクの発現の欠如、不適切あるいは好ましくない状態による異常を処置するためにも有用である。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。従って、処置方法は、薬剤代謝酵素タンパクあるいはフラグメントの使用も含むものである。
【００９４】
抗体
本発明はまた、その変異やフラグメントだけでなく、本発明のタンパク及び該ペプチドを含むペプチドの一つに、選択的に結合する抗体を提供する。ここで抗体は、対象ペプチドと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない場合、選択的に対象ペプチドと結合する。抗体は、それが対象ペプチドと実質的に同種ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、このタンパクが抗体の対象ペプチドのフラグメント又はドメインと同一性を有する限り、なお選択的にタンパクと結合するとみなされる。この場合、そのタンパクに結合している抗体は、ある程度の妨害的な再反応性にもかかわらず、なお選択的であることが理解される。
【００９５】
ここで抗体は、当技術において認識されるものと一致する用語で定義される：それらは、抗原の攻撃に応答して哺乳類生物により生産された、マルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、このような抗体のフラグメントだけでなく、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体も含み、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントを含むがこれに限定されない。
【００９６】
与えられた対象に対する抗体を生成及び／又は特定する多くの方法が知られている。このような方法の幾つかは、Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記述されている。
【００９７】
一般的に、抗体を生成するには、単離されたペプチドを免疫原として用い、これを哺乳動物、例えばラット、ウサギあるいはマウスに投与する。全長タンパク、抗原ペプチドフラグメント又は融合タンパクを使用することができる。特に重要なフラグメントは、図２に示すドメインのような機能性ドメイン、及び図に示されているタンパク配列方法を用いて容易に特定されるような相同配列又は群の中での分化配列のドメインである。
【００９８】
抗体は、好ましくは薬剤代謝酵素ペプチドの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに開示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能／活性、及び／又は薬剤代謝酵素／結合相手相互作用を伴う領域を含む。対立変異体が維持された独特の配列フラグメントを特定するのに使用することができるのに対して、図２は特に重要な領域を特定するのに使用することができる。
【００９９】
抗原性フラグメントは通常、少なくとも８個の隣接アミノ酸残基を含む。該抗原性ペプチドは、しかしながら、少なくとも１０、１２、１４、１６又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域のようなタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメントのような、物理的性質により選択され得る、又は独特の配列に基づき選択され得る（図２を参照）。
【０１００】
本発明の抗体の検出は、抗体を検知可能な物質へカップリング（即ち、物理的な結合）させることにより行うことができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適当な補綴基複合物の例としては、ストレプタビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる；発光物質の例としては、ルミノールが含まれる；バイオ発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１０１】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術により、本発明のタンパクを単離するために使用することができる。該抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組替え的に生産されたタンパクからの自然タンパクの精製を容易にすることができる。加えてこの抗体は、通常の発達の進行に渡って、生物の様々な組織間における本発明のタンパクの発現パターンを決定するために、細胞又は組織中における該タンパクの存在を検知するために有用である。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。さらにこの抗体は、発現の豊富さ及びパターンを評価するために、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又は細胞溶解液あるいは上澄み中におけるタンパクを検知するために使用することができる。また、この抗体は、発達中における異常な組織分布又は異常な発現を検知するために使用することができる。全長タンパクの循環フラグメントの抗体検知は、タンパク循環率を特定するために使用することができる。
【０１０２】
さらに、この抗体は、病気の活性段階における、又はタンパク機能に関連する病気を起こす可能性がある個人における発現を評価するために使用することができる。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現／加工された型により引き起こされる場合、抗体は、通常のタンパクに対して調製することができる。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。もし変調がタンパクの特異的な変異により特徴付けられる場合には、この変異タンパクに特異的な抗体を、特異的な変異タンパクの存在のアッセイに使用することができる。
【０１０３】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用することができる。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニターするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに対して向けられた抗体を、治療効率をモニターするために使用することができる。
【０１０４】
加えて、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を特定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常型タンパクのための免疫的マーカーとしての診断ツールとしても有用である。
【０１０５】
この抗体は、組織分類のためにも有用である図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。従って、特異的なタンパクが特異的な組織の発現と関係づけられているところでは、このタンパクに特異的な抗体は、組織タイプを特定するために使用できる。
【０１０６】
抗体は、タンパク機能の阻害、例えば、基質等の結合相手への薬剤代謝酵素ペプチドの結合の阻害にも有用である。これらの使用は、治療がタンパク機能の阻害を伴う治療状況にも適用することができる。抗体は、例えば結合を阻害し、これによりペプチド活性を変調（作動又は拮抗）するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞あるいは細胞膜と関連している完全なタンパクに対して調製することができる。構造の情報としては、本発明のタンパクと関連する図２を参照。
【０１０７】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包含する。このキットは、標識化又は標識可能な抗体のような抗体及び、生物サンプル中のタンパクを検知するための化合物又は試薬；該サンプル中のタンパクの量を決定する手段；該サンプル中のタンパクの量を基準と比較する手段；及び使用のための手引きを含むことができる。このようなキットは、単一のタンパク又はエピトープを検出するために供給される、又は抗体検出配列において多数のエピトープのうちの１つを検出するために設定できる。核酸アレイは以下に詳細に記述されるが、同様な方法が抗体アレイのために開発された。
【０１０８】
核酸分子
本発明はさらに、本発明の薬剤代謝酵素ペプチドあるいはタンパクをコード化する単離核酸分子を提供する（ｃＤＮＡ、転移、及びゲノム配列）。該核酸分子は、本発明の薬剤代謝酵素ペプチドの１つ、その対立変異体、又はそのオルソログあるいはパラログをコード化するヌクレオチド配列からなる、本質的に該ヌクレオチド配列からなる、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の自然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは「単離」核酸は、本来核酸が誘導された有機体のゲノムＤＮＡ中で核酸を側面に配置する配列（すなわち、核酸の５´又は３´末端に位置する配列）ではない。しかしながら、いくらか側面に配置するヌクレオチド配列を含むことができ、その例としては約５ＫＢ，４ＫＢ，３ＫＢ，２ＫＢ，又は１ＫＢ以下であり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンから離れた配列である。重要な点は、核酸が離れた重要でない隣接配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【０１１０】
さらに、転移／ｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、又は組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【０１１１】
例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は単離されていると考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、又は溶液中の精製（部分的に又は実質的に）されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明の単離ＤＮＡ分子のＲＮＡ転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【０１１２】
従って、本発明は、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３のゲノム配列）よりなる核酸分子、又は図２ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【０１１３】
本発明はさらに、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３のゲノム配列）より実質的になる核酸分子、又は図２ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。核酸分子は実質的に、最終的な核酸分子中に幾つかの付加的核酸残基が存在するヌクレオチド配列よりなる。
【０１１４】
本発明はさらに、図１又は３に示されるヌクレオチド配列（（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の転移配列、及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３のゲノム配列）を含む核酸分子、又は図２ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のタンパクをコード化するいくつかの核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の少なくとも一部である核酸配列である時、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同性ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子は少しの付加的ヌクレオチドを有する、あるいは数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして製造され／単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【０１１５】
図１，３には、コード化及び非コード化配列の両方が提供されている。本発明のヒトゲノム配列（図３）、ｃＤＮＡ／転移配列（図１）源であるので、図中の核酸分子は、ゲノムイントロニック配列、５´及び３´非コード化配列、遺伝子規定領域、及び非コード化相互ゲノム配列を含むことがある。一般的には、このような配列特徴は図１、３のどちらかに表示されており、当技術分野で知られている計算機を使って容易に特定できる。以下に述べられるように、いくつかの非コード化領域、特にプロモーターのような遺伝子特定要素は、例えば、非相同遺伝子発現の変調、化合物を変調する遺伝子活性を特定する対象として様々な目的に有用であり、ここに与えられるゲノム配列のフラグメントとして特にクレームされる。
【０１１６】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば成熟形態が１つ以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、アッセイ又は製造の際のタンパク操作の効率化、あるいは他の事由に役割を果たす。一般にｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【０１１７】
上記のように、単離核酸分子は、薬剤代謝酵素ペプチドのみをコード化する配列、主又は副配列（例えばｐｒｅ−ｐｒｏ又はｐｒｏ−タンパク配列）等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化５´及び３´配列のような転写はされるが翻訳はされず、転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシング及びポリアデニル化信号を含む）、リボゾーム結合及びｍＲＮＡの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【０１１８】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ形態、あるいはｃＤＮＡ及びクローニング又は化学合成技術又はこれらの組み合わせで得られたゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態でありえる。核酸、特にＤＮＡは二重鎖又は一重鎖である。一重鎖核酸はコード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）でありえる。
【０１１９】
本発明はさらに、先に述べた本発明のペプチドの明らかな変異をコード化する核酸分子だけ出なく、薬剤代謝酵素タンパクのフラグメントをコード化する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、対立変異体（同じ位置）、パラログ（異なる位置）、オルソログ（異なる生物）等の自然に由来する、又はＤＮＡ組換え法あるいは化学合成により構成される。このような自然に由来しない変異は、核酸分子、細胞、又は生物に適用されるものを含む変異誘発技術により作られる。よって、上記に述べたように、変異はヌクレオチドの置換、欠失、転化、及び挿入を含む。変異はコード化領域、非コード化領域の一方あるいは両方に起こりうる。変異は維持又は非維持アミノ酸置換を作る。
【０１２０】
本発明はさらに図１，３に示される核酸分子の非コード化フラグメントを提供する。好ましい非コード化フラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサー配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が挙げられるが、これに限定されない。このようなフラグメントは非相同遺伝子発現を調整し、遺伝子変調薬剤を特定するスクリーンを発現するのに有用である。
【０１２１】
フラグメントは、１２又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも３０，４０，５０，１００，２５０，又は５００のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動領域をコード化し、又はＤＮＡプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。標識されたプローブは、コード領域に対応する核酸を単離するｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー、又はｍＲＮＡをスクリーニングするために用いることができる。さらにプライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするＰＣＲ反応を用いることができる。
【０１２２】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるストリンジェント条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１２３】
オルソログ、相同、及び対立変異体は、当技術においてよく知られている方法により特定できる。ペプチドの項で記載したように、これらの変異体はペプチドをコードする核酸配列を含み、図面に示された核酸配列あるいはこの配列のフラグメントに対し、典型的には６０〜７０％、７０〜８０％，８０〜９０％、及びより典型的には９０〜９５％あるいはそれ以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図に記載されたヌクレオチド配列あるいはその配列のフラグメントに対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるものとして、容易に特定することができる。対立変異体は遺伝子をコード化する遺伝子座により容易に決定することができる。本発明の新規な薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子は、図３において示されるように、ヒトの染色体４にマップしたゲノム成分に位置し、これはＳＴＳ、ＢＡＣマップデーター等の多数の証拠によりサポートされる。
【０１２４】
図３は、本発明の薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子に発見されたＳＮＰの情報を提供する。ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。これらのＳＮＰのいくつかが、制御／調節要素に影響しうる。
【０１２５】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも６０〜７０％の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％以上の相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、約４５℃において６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイズし、続いて５０〜６５℃において、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで一回以上洗浄するという条件である。低いストリンジェントハイブリダイズ条件へ加減する例は、当技術においてよく知られている。
【０１２６】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、及び生物学的アッセイに有用である。核酸分子は、図２に表現されたペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡとゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同じ又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルソログ等）に関連するｃＤＮＡとゲノムクローンを単離するためのｍＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡへのハイブリダイズプローブとして有益である。図３で示されているように、ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。
【０１２７】
プローブは図に示した核酸分子の全長にわたっていずれかの配列にかかるものでありえる。従って、それは５´非コード化領域、コード化領域、及び３´非コード化領域から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【０１２８】
核酸分子は、ＰＣＲによる核酸分子のいずれかの与えられた領域のプライマーとして有用であり、また、所望の長さ及び配列の反増感分子の合成に有用である。
【０１２９】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び／又は遺伝子生成物の発現状態をｉｎ ｓｉｔｕで変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について１以上の特に変異を引き起こすコード化領域に相同的に組換えることができる。
【０１３０】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部位を示すのにも有用である。
核酸分子はまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズ法によって、核酸分子の染色体位置を決定するプローブとして有用である。本発明の新規な薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子は、図３において示されるように、ヒトの染色体４にマップしたゲノム成分に位置し、これはＳＴＳ、ＢＡＣマップデーター等の多数の証拠によりサポートされる。
【０１３１】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子特定領域を含むベクターを作るのに有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のｍＲＮＡに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【０１３２】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
【０１３３】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはＤＮＡ又はＲＮＡで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で、発現及び／又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、薬剤代謝酵素の発現が増加又は減少することを含む異常の診断に等価である。
【０１３４】
ｍＲＮＡの検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、ノーザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。ＤＮＡ検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、サザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。
【０１３５】
プローブは、薬剤代謝酵素タンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の薬剤代謝酵素コード化核酸、例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのレベルを測定すること、又は薬剤代謝酵素遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。
【０１３６】
核酸発現アッセイは、薬剤代謝酵素核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【０１３７】
従って本発明により、薬剤代謝酵素遺伝子の核酸発現に関連した異常を処置するために用い得る化合物の特定のための方法、特にそれを発現する細胞及び組織において、薬剤代謝酵素により媒介される生物学、病理学の方法が提供される。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。この方法は、典型的には薬剤代謝酵素核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくない薬剤代謝酵素核酸発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞ベース系及び無細胞系で行うことができる。細胞ベースのアッセイは、核酸を自然に発現している細胞、又は特定の薬剤代謝酵素の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【０１３８】
よって、薬剤代謝酵素遺伝子発現の変調剤は、細胞を候補化合物に接触させ、決定されたｍＲＮＡを発現させるという方法で特定される。候補化合物存在下での薬剤代謝酵素ｍＲＮＡの発現のレベルは、候補化合物非存在下での薬剤代謝酵素ｍＲＮＡの発現のレベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づく核酸発現の変調剤として特定でき、例えば異常な核酸によって特徴付けられる異常の処置に使用できる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡ発現が、候補化合物非存在下でのｍＲＮＡ発現と比較して顕著に大きい場合、候補化合物は核酸発現の誘発剤として特定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡ発現が、候補化合物非存在下でのｍＲＮＡ発現と比較して顕著に少ない場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【０１３９】
本発明はさらに、核酸を対象として、薬剤代謝酵素を発現する細胞又は組織において、薬剤代謝酵素核酸発現を変調する遺伝子変調剤として薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。変調は、向上調整（例えば活性化又は作動化）又は低下調整（抑制又は拮抗）の両方の調節、または核酸発現を含む。
【０１４０】
あるいは、薬剤代謝酵素核酸発現の変調剤は、その薬剤又は小分子がそのタンパクが発現している細胞又は組織中で薬剤代謝酵素核酸発現を阻害するものである限り、ここに記述されたスクリーニングアッセイを用いて特定された小分子又は薬剤である。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。
【０１４１】
核酸分子はまた、臨床試験又は処理管理において、薬剤代謝酵素遺伝子発現又は活性に対する変調化合物の有効性のモニターに有効である。よって、遺伝子発現パターンは化合物により処理の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは化合物に影響された細胞の生理的反応を示すマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは、化合物の投与量の増加、あるいは患者が耐性を示さない別の化合物の投与を認める。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【０１４２】
核酸分子はまた、薬剤代謝酵素核酸発現の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状を導き出す質的変化に有用である。核酸分子は薬剤代謝酵素遺伝子の及びｍＲＮＡのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子は薬剤代謝酵素遺伝子中で自然に生じた遺伝子変異を検出するハイブリダイズプローブとして用いることができ、そして変異を有する対象に変異により生じる異常の危険性があるか否かを判定することができる。変異は、遺伝子中の１以上のヌクレオチドの欠如、付加、置換；転置又は転移のような染色体再配置；異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの変化；増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。逆機能に関連した薬剤代謝酵素遺伝子の変異形態の検出は、疾患が薬剤代謝酵素タンパクの過剰発現、過小発現、又は変異発現に由来する場合には、活性疾患又は疾患に対する感受性の診断方法となる。
【０１４３】
薬剤代謝酵素遺伝子に変異を有する個体は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。図３は、本発明の薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子に発見されたＳＮＰの情報を提供する。ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。これらのＳＮＰのいくつかが、制御／調節要素に影響しうる。本発明の新規な薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子は、図３において示されるように、ヒトの染色体４にマップしたゲノム成分に位置し、これはＳＴＳ、ＢＡＣマップデーター等の多数の証拠によりサポートされる。ゲノムＤＮＡは直接分析されるか、又は分析前にＰＣＲにより増幅できる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも同様に使われうる。変異の検出は、ある用途では、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ　ＰＣＲのようなポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２参照）、又は異なるものではリゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）参照）。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程；細胞サンプルから核酸（例えばゲノム，ｍＲＮＡ又は両者）を単離する工程；核酸サンプルを遺伝子のハイブリダイズ及び増幅（もし存在すれば）が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした１以上のプライマーと接触させる工程；増幅生成物の存在又は不存在を検出する、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程を含む。欠失及び挿入は増幅生成物を正常遺伝子型と比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅ＤＮＡを正常ＲＮＡ又は不増感ＤＮＡとハイブリダイズすることで特定することができる。
【０１４４】
あるいは、薬剤代謝酵素遺伝子の変異は、例えば変形された限定酵素消化パターンをゲル電気泳動で決定することで直接に特定することができる。
さらに、配列−特定リボザイム（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４９８，５３１）を、リボザイム分裂サイトの成長又は減少により特定変異の存在をスコア化することができる。完全に一致した配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ又は融点の相違により、一致しない配列から区別することができる。
【０１４５】
特定領域の配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異薬剤代謝酵素遺伝子と野性型遺伝子との間の配列の相違は、直接ＤＮＡ配列化により決定できる。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）、マススペクトルによる配列化を含む（ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８；１４７−１５９（１９９３）参照）。
【０１４６】
遺伝子の変異を検出する他の方法には、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の不適合塩基を検出するため開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６；２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；及びＨａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、及び変性グラジェントゲル電気泳動を用い、変性剤の傾斜濃度を含むポリアクリルアミドゲル中で変異又は野性型フラグメントの移動をアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１４７】
核酸分子はまた、疾患を不要に起こさせず、治療様相に影響を与える遺伝子型の個体を試験するためにも有用である。そして、核酸分子は個体の遺伝子型と、治療に用いられた化合物に対する個体の反応との相関の研究に用いることができる（薬理ゲノム相関）。従って、ここに記述された核酸分子は、好ましい化合物あるいは治療のための投与量を選択するため、ある個体の薬剤代謝酵素遺伝子の変異量を評価するために用いることができる。図３は、本発明の薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子に発見されたＳＮＰの情報を提供する。ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。これらのＳＮＰのいくつかが、制御／調節要素に影響しうる。
【０１４８】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個体に対するテーラー治療に用いることのできる診断対象を提供する。従って、これらの多型を有する組換細胞及び動物の製造は、治療化合物及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【０１４９】
核酸分子は、細胞、組織及び生体中での薬剤代謝酵素遺伝子発現の調整する不増感性の形成として有用である。ＤＮＡ不増感核酸分子は、転写に関連する遺伝子の領域に相補的に設計され、転写及びその後の薬剤代謝酵素タンパクの製造を阻止する。不増感ＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ｍＲＮＡの薬剤代謝酵素タンパクへの翻訳を阻止する。
【０１５０】
あるいは、不増感分子の一種は、薬剤代謝酵素核酸の発現を減少させ、ｍＲＮＡを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくない薬剤代謝酵素核酸発現により特徴づけられる異常を処置することができる。この技術は、ｍＲＮＡの１以上の部分に、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減じるヌクレオチド配列を相補的に含むリボザイムによる開裂に関する。可能な部分はコード領域、特に基質結合領域のような薬剤代謝酵素タンパクの触媒活性及び他の機能的活性に関連したコード領域である。
【０１５１】
核酸分子はさらに、薬剤代謝酵素遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。組み換え細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞が含まれ、個人の体内に導入されて、そこで個人の治療のために、細胞は望ましい薬剤代謝酵素タンパクを生成する。
【０１５２】
本発明はまた、生物的サンプル中の薬剤代謝酵素核酸の存在を検知するキットを含む。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。さらに、ＰＣＲ−ベースの組織スクリーニングパネルはヒト胎児の肝臓での発現を示している。例えば、このキットは、標識されたあるいは標識できる核酸又は生物的サンプル中の薬剤代謝酵素核酸を検知することのできる薬剤；サンプル中の薬剤代謝酵素核酸の量を決定できる手段；及びサンプル中の薬剤代謝酵素核酸量を標準と比較する手段を含む。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにｍＲＮＡ又はＤＮＡの薬剤代謝酵素タンパクを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【０１５３】
核酸アレイ
さらに本発明により、図１，３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，３）で与えられる配列情報に基づく核酸分子のアレイまたはマイクロアレイのような核酸検出キットが提供される。
【０１５４】
ここで用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」とは、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイを表す。１つの具体例において、マイクロアレイはＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２，Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）及びＳｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９）に記載された方法にしたがって調製され且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の具体例では、このようなアレイはＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８０７，５２２に記載される方法により製造される。
【０１５５】
マイクロアレイ又は検出キットは、好ましくは多くの特異な単鎖核酸配列を含み、通常、固形担体に固定された合成不増感オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡのフラグメントのいずれかを含む。オリゴヌクレオチドは好ましくは約６〜６０のヌクレオチド長で、より好ましくは１５〜３０のヌクレオチド長、もっとも好ましくは約２０〜２５のヌクレオチド長である。ある種のマイクロアレイあるいは検出キットでは、好ましくはわずか７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いる。マイクロアレイあるいは検出キットは、既知の５’あるいは３’配列を包含するオリゴヌクレオチド、全長配列を包含する配列化オリゴヌクレオチド、あるいは配列の長さに沿った特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含む。マイクロアレイあるいは検出キットに用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子あるいは対象遺伝子群に特異的なオリゴヌクレオチドである。
【０１５６】
マイクロアレイあるいは検出キット用に公知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するため、対象となる遺伝子（あるいは本発明により特定されるＯＲＦ）は、典型的にはヌクレオチド配列の５’あるいは３’末端から開始する、コンピュータアルゴリズムを用いて検査される。典型的なアルゴリズムは、遺伝子に特異的な長さであり、ハイブリダイズに適した範囲にＧＣ含有量を有し、ハイブリダイズを妨害する二次構造を有さないとされたオリゴマーを特定する。ある条件下で、マイクロアレイあるいは検出キット上のオリゴヌクレオチド対を用いることが好適である。「対」は同一で、好ましくは配列の中央部に位置する一つのヌクレオチドを除く。対の第二オリゴヌクレオチド（一方とは整合しない）はコントロールとなる。オリゴヌクレオチド対の数は２から百万である。オリゴマーは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロンあるいは多種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、あるいは他の適当な固体担体である。
【０１５７】
他の例では、オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはＰＣＴ出願 ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等）に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列は、ドット（又はスロット）がｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な機械（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（適当な固体担体のいずれか）及び機械（ロボット化設備）により製造され、８，２４，９６，３８４，１５３６，６１４４又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は市販の設備の効率的な用途に適している２〜１００万のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５８】
マイクロアレイあるいは検出キットを用いたサンプル分析を行うため、生物サンプルから得られたＲＮＡあるいはＤＮＡをハイブリダイズプローブに調製する。ｍＲＮＡは単離され、ｃＤＮＡは製造され、不増感ＲＮＡ（ａＲＮＡ）を製造する型として使用される。ａＲＮＡは蛍光ヌクレオチドの存在下に増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイあるいは検出キットとともに培養され、プローブの配列はマイクロアレイあるいは検出キットのオリゴヌクレオチドに相補的にハイブリダイズされる。正確に相補性を持つ、又は様々な程度の少ない相補性を持つ程度で、ハイブリダイズが起こるよう、培養条件が調整される。非ハイブリダイズプローブが除かれた後、蛍光レベル及びパターンを決定するためスキャナーが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイあるいは検出キット上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的存在度を決定する検査を行う。生物的サンプルはいずれの体液（血液、尿、唾液、たん、胃液等）、培養細胞、バイオプシー、あるいは他の組織調製物からも得ることができる。検出システムは、すべての区別される配列についてハイブリダイゼーションの欠如、存在、及び量を測定するのに用いられる。このデータは、配列、発現パターン、変異、変異体、あるいはサンプル間の多型に関する大規模相関研究にも用いられる。このデータは、配列、発現型、変異、変異体又はサンプル間の多型の大規模な相互関係研究のために使用することができる。
【０１５９】
このようなアレイを用い、本発明は、本発明の薬剤代謝酵素タンパク／ペプチド発現を特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを１以上の核酸分子と共に培養し、被検サンプル中の成分への核酸分子の結合をアッセイすることを含む。このアッセイは、典型的には多くの遺伝子を含む配列を含み、少なくとも１つは本発明の薬剤代謝酵素遺伝子及び／又は本発明の薬剤代謝酵素遺伝子の対立遺伝子である。図３は、本発明の薬剤代謝タンパクをコード化する遺伝子に発見されたＳＮＰの情報を提供する。ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。これらのＳＮＰのいくつかが、制御／調節要素に影響しうる。
【０１６０】
被検サンプルと核酸分子の培養条件は変化する。培養条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、一般的な適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイ形態を、ここに記述されたヒトゲノムの新規なフラグメントを用いるのに適したように調製することができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３）， Ｖｏｌ．３ （１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５） に記載されている。
【０１６１】
本発明の披検サンプルは、細胞、タンパク、又は細胞から得られる細胞膜抽出物を含む。上記の方法により使われた披検サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変化する。核酸、又は細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と互換のサンプルを得るために、容易に適応できる。
【０１６２】
本発明の他の例では、キットは本発明のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むように規定される。
【０１６３】
特に本発明は、（ａ）核酸プローブの一つ、例えばここに記述されるヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる核酸分子を含む第一の容器；及び（ｂ）洗浄剤又は結合核酸の存在を検出することのできる試薬の一つ以上を含む一以上の容器を含む、小さく仕切られ、コンパートメント化されたキットを提供する。
【０１６４】
詳細には、コンパートメント化されたキットは、隔離された容器に試薬が入る各キットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ化材料を含む。このような容器は、一つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等）を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。当業者は、本発明の未特定薬剤代謝酵素遺伝子は、ここに開示された配列情報を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式、特に発現アレイに折り込んで用いることができる。
【０１６５】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ここに記載の核酸分子を含むベクターを提供する。「ベクター」とは、核酸分子を輸送するビヒクル、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、その核酸分子は共有結合でベクターの核酸と結合されている。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、一本鎖又は二本鎖のファージ、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体を含み、例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＭＡＣなどが挙げられる。
【０１６６】
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込み、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【０１６７】
本発明は、維持のためのベクター（クローニングベクター）あるいは核酸分子発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、あるいはその両者において機能することができる（シャトルベクター）。
【０１６８】
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第２の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクター自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【０１６９】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを含む。これは、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含むが、これらに限定されない。
【０１７０】
発現ベクターは、転写を促進するコントロール領域の他に、レプレッサー結合領域やエンハンサー等の転写調節領域をも含むことができる。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサーを含む。
【０１７１】
発現ベクターは、転写を開始及びコントロールするための領域を含む他、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される領域においては、翻訳のためのリボソーム結合領域を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化シグナルと共に、開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ （１９８９） に記載されている。
【０１７２】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このような発現ベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来、バクロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ （１９８９） に記載されている。
【０１７３】
調節配列は１つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく（すなわち、組織特異的）、あるいは、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような一つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【０１７４】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するＤＮＡ配列は、一つ以上の制限酵素によりＤＮＡ配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに結合することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び結合反応の手順は、当業者に良く知られている。
【０１７５】
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖あるいは発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ）を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、ＣＯＳやＣＨＯ細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパクの発現を増大し、組換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部位の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部位から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、 ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、及び目的とする組換えタンパクに対してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク、あるいはプロテインＡとそれぞれ融合するｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を含む。
【０１７７】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ （Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）） 及び ｐＥＴ　１１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））を含む。
【０１７８】
組換えタンパクの発現は、宿主細胞の組換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する能力が減じられている遺伝的背景を与えることにより、宿主細菌において最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、関係のある核酸分子の配列は、大腸菌などの特定の宿主細胞のための優先的コドンの使用を提供するように変更することができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１７９】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、 ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、 ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、 及び ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。
【０１８０】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ ９ 細胞）中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３）） 及び ｐＶＬ系 （Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９）） を含む。
【０１８１】
本発明のある実施例においては、ここに記載の核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを用い、哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７）） 及び ｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））を含む。
【０１８２】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用な技術における当業者が利用可能な周知のベクターの単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖あるいは発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に認められる。
【０１８３】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向きにベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスＲＮＡの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コード領域及び非コード領域の両方を含むここに記載の核酸分子配列の全てあるいは一部に対して生産することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関する上記各パラメータに従う（調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現）。
【０１８４】
本発明は、また、ここに記載のベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。従って、宿主細胞は、原核細胞、酵母のような下等真核細胞、昆虫細胞のような他の真核細胞、及び哺乳類細胞のような高等真核細胞を含む。
【０１８５】
組換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
宿主細胞は、一つのベクター以上を含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、あるいは発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。一つ以上のベクターを細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、あるいは核酸分子ベクターに結合することができる。
【０１８７】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルスあるいはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製能コンピテント（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）あるいは複製能欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、複製は欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において起こる。
【０１８８】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構成物を含む細胞亜集団が選択できる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、あるいは別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン抵抗性を含む。しかしながら、表現型形質を選択する何れのマーカーも効果的であろう。
【０１８９】
成熟タンパクは、細菌、酵母、哺乳類細胞、及び他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、無細胞転写及び翻訳系をここに記載のＤＮＡ構成物に由来するＲＮＡを用いて、これらタンパクを生産するのに使用することも可能である。
【０１９０】
ペプチドの分泌が必要な場合には、適当な分泌シグナルをベクター中に加える。シグナル配列は、ペプチドに対して内因性であるか、あるいはこれらのペプチドに対して異型であることができる。
【０１９１】
ペプチドを媒体中に分泌しない場合、タンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【０１９２】
ここに記載のペプチドの組換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によっては細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれないが、様々なグリコシル化パターンを有する可能性があることも理解される。さらに、宿主媒介工程の結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【０１９３】
ベクターと宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、細胞は、薬剤代謝酵素ペプチドの生産、あるいは、さらに精製して所望量の薬剤代謝酵素ペプチドやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【０１９４】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットだけでなく、前記のような薬剤代謝酵素ペプチドあるいは薬剤代謝酵素ペプチドフラグメントに関連する細胞ベースアッセイにも有用である。従って、天然薬剤代謝酵素ペプチドを発現する組換え宿主細胞は、薬剤代謝酵素ペプチド機能を刺激あるいは抑制する物質アッセイに有用である。
【０１９５】
宿主細胞はまた、その機能に影響がある薬剤代謝酵素ペプチド変異体の特定にも有用である。その変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その変異を含む宿主細胞は、天然薬剤代謝酵素ペプチドに対しては示さないかもしれない効果であり、薬剤代謝酵素ペプチド変異体に対しては望ましい効果（例えば、誘発機能や抑制機能）を有する化合物の分析に有用である。
【０１９６】
一般的に、設計された宿主細胞は、さらにヒト以外の形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくは哺乳類、例えば、ラットやマウス等の齧歯類であり、その動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の一つ以上の細胞型あるいは組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡである。これらの動物は、薬剤代謝酵素ペプチドの機能の研究、並びに薬剤代謝酵素タンパク活性の変調剤の特定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例として、ヒト以外の霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【０１９７】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えば微量注入法、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。核酸配列をコード化する薬剤代謝酵素タンパクは何れも、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
【０１９８】
発現ベクターにおいて有用な調節配列あるいは他の配列は何れも、形質転換配列の部位を形成することができる。これは、既に含まれていない場合には、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対して薬剤代謝酵素タンパクの発現を指示する。
【０１９９】
胚操作及び微量注入法による形質転換動物の生成方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、米国特許公報第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号（共にＬｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許公報第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、並びにＨｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物は、そのゲノム中の導入遺伝子及び／又はその動物の組織あるいは細胞中の形質転換ｍＲＮＡの発現の存在に基づき特定することができる。形質転換の基礎動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組換え宿主細胞を用いて完全な動物あるいはその動物の組織を生産する動物も含む。
【０２００】
別の例において、ヒト以外の形質転換動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１））。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、”複”形質転換動物の構築を通じて、例えば、２つの形質転換動物、すなわち、一つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む２つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【０２０１】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７） 並びにＰＣＴ国際公開公報 ＷＯ ９７／０７６６８及びＷＯ ９７／０７６６９に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルから脱してＧ０期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
【０２０２】
休止細胞は、その後、例えばその休止細胞を単離したのと同種の動物からの無核卵母細胞に対して電気パルスを使用することにより、融合することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚又は尾胞に発達し、疑似妊娠雌養育動物に転移する。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物からのクローンであろう。
【０２０３】
ここに記載のペプチドを発現する組換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをｉｎ ｖｉｖｏ状況下で行うのに有用である。従って、ｉｎ ｖｉｖｏで存在し、リガンド結合、薬剤代謝酵素タンパク活性化、及びシグナル形質導入を果たすことができる様々な生理的因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ の無細胞分析あるいは細胞ベース分析から明らかでないかもしれない。従って、ヒト以外の形質転換動物の提供は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬剤代謝酵素タンパク機能、例えば、基質相互作用、薬剤代謝酵素タンパク機能と基質相互作用に対する特異的変異薬剤代謝酵素タンパクの影響、並びにキメラ薬剤代謝酵素タンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル変異、すなわち、実質的にあるいは完全に一つ以上の薬剤代謝酵素タンパク機能を除去する変異の影響を評価することもできる。
【０２０４】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施例に関連して記載しているが、クレームしたように本発明はこのような特定の実施例に不当に限定されないことが理解されるべきである。特に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な前記本発明の実施態様の様々な修飾は、クレームの範囲内であることを意図するものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明にかかる薬剤代謝酵素タンパクをコード化するｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を提供する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）。加えて、この分子配列に基づく発明の具体的な使用を容易に決定できる、ＡＴＧ開始、終止、及び組織分布等、構造と機能情報を提供する。図１の実験データは、ヒトの腎臓（過腎腫腎臓を含む）、肝臓（胎児の肝臓、ＨｅｐＧ２細胞系、及び肝細胞ガン腫を含む）、及び網膜色素上皮における発現を示している。
【図２】
図２は、本発明にかかる薬剤代謝酵素の予測されるアミノ酸配列を提供する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）。加えて、タンパクファミリー、機能、及び修飾部位等、構造と機能情報を提供しており、この分子配列に基づく発明の具体的な使用を容易に決定できる。
【図３】
図３は、本発明にかかる薬剤代謝酵素タンパクをコード化する遺伝子を補足するゲノム配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を提供する。加えて、イントロン／エキソン構造、プロモーター位置等の構造と機能情報を提供しており、この分子配列に基づく発明の具体的な使用を容易に決定できる。図３において説明されるように、ＳＮＰは１７の異なるヌクレオチド位置で特定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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