(57)【要約】抗生剤非依存性構成的高発現ベクター新規高発現ベクターを利用した遺伝子発現方法。本発明は抗生剤非依存性構成的高発現ベクターに関する。より詳しくは、本発明はアンピシリンなどのような抗生剤マーカーを使用せず、微生物の成長及び分裂に必須な遺伝子をマーカーとして用いて安定性が確保されたプラスミドによって組換え遺伝子の発現が安定的に維持され、高発現が可能な新規高発現ベクターと、その新規高発現ベクターを利用した遺伝子発現方法に関する。
2004517624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を構成する主要アミノ酸、Ｄ−グルタミン酸合成に関与する酵素遺伝子をマーカーとして用いた抗生剤非依存性プラスミドベクターを構成する配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡまたはその断片。
【請求項２】
抗生剤非依存性プラスミドベクターに外来遺伝子を配置した場合、抗生剤の非存在下で該遺伝子を発現することができることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡまたはその断片。
【請求項３】
細菌でＤ−グルタミン酸合成活性を有し、請求項１に記載のＤＮＡまたはその断片とのハイブリダイズ可能なＤＮＡまたはその断片。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項によるＤＮＡまたはその断片と外来遺伝子が、該外来遺伝子の発現可能な状態で配置されている組換えＤＮＡ。
【請求項５】
前記外来遺伝子が、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸からなる群より選択された核酸であることを特徴とする請求項４に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項によるＤＮＡまたはその断片の一部を含有してなる遺伝子発現ベクター。
【請求項７】
前記ベクターはプラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択される１種であることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子発現ベクター。
【請求項８】
前記プラスミドベクターが、配列番号２で示される塩基配列を有する請求項７に記載の遺伝子発現ベクター。
【請求項９】
請求項４または請求項５に記載の組換えＤＮＡを含有してなる発現ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、プラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターからなる群より選択された１種であることを特徴とする請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項４または請求項５に記載のＤＮＡまたはその断片、あるいは、請求項９または請求項１０に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換細胞を培養して得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のＤＮＡまたはその断片、請求項６乃至請求項８のいずれか一項に記載の遺伝子発現ベクターを含有するタンパク質の製造用キット。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載のＤＮＡまたはその断片を含み、細胞壁を構成する主要アミノ酸であるＤ−グルタミン酸及びＤ−アラニン合成が可能な酵素遺伝子を栄養要求性指標として用いた抗生剤非依存性発現ベクターの製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換細胞の培養培地内に抗生剤を添加することなく、発現ベクターの安定性が維持される方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換細胞を培養して得られた培養物からタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は抗生剤非依存性構成的高発現ベクターに関する。より詳しくは、本発明はアンピシリンなどのような抗生剤マーカーを使用せず、微生物の成長及び分裂に必須な遺伝子をマーカーとして用いて安定性が確保されたプラスミドによって組換え遺伝子の発現が安定的に維持され、高発現が可能な新規高発現ベクターと、その新規高発現ベクターを用いた遺伝子発現方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
有用な遺伝子産物を遺伝工学的方法で製造するために、目的に応じて培養方法が確立された宿主に適したプロモーターを使用する発現系が利用されてきた。大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが宿主として用いられ、該宿主で安定的なプラスミド複製のために抗生剤耐性遺伝子をクローニングベクターに入れて培養培地内に抗生剤を添加し、目的遺伝子の高発現のために適当な誘導物質を用いて発酵させる方法などを利用した。
【０００３】
アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンなどは、遺伝学的なクローニングと組換え産業用酵素及び組換え医薬用タンパク質を生産するための発酵工程で、最も一般に使用する選択的マーカーである。しかし、このような抗生剤耐性遺伝子は連続発酵工程で宿主細胞による培養物の分解または継代数増加による希釈などの理由で時間が経過するに従って機能が消滅する。これによって、培地に添加した抗生剤が分解され、高感度なプラスミドの安定性が弱化し、導入された外来遺伝子の発現タンパク質量が減少する。また、発現させようとするタンパク質が食品添加物と関連した場合には、発現のために培養期間中に添加した抗生剤の除去工程が要求される。さらに、遺伝子物質の大量生産のための高価な誘導物質であるＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ティオガラックトピラノシド）の使用などいろいろな問題点を有している。
【０００４】
このような問題点を解決するために多くの研究が行われ、このうちの韓国特許第０２３１９１９号は、高価なＩＰＴＧの代りにファージλプロモーターの温度誘導を利用した抗生物質耐性遺伝子を有する発現ベクターを応用して使用したが、誘導物質以外に温度などのような他の誘導方法を使用する場合には、昇温の適切な時点を管理することが難しく、既存の誘導物質を使用する発現方法より発現率が低下することもある。米国特許第６９７７０６号では、抗生物質耐性遺伝子の使用を避けながら変形されたｐｕｒ  Ａ（アデニロスクシナート合成酵素）ベクターを用いてプラスミド安定性の維持を可能にし、この時、目的のアミノ酸合成阻害に関与するアミノ酸と副産物の生成を最少化した栄養要求性株を利用した。しかし、細胞生育に必須なアミノ酸を合成する遺伝子が欠損された変異株を使用する場合、複合培地ではなくＬ−アミノ酸の含量を調節しなければならない。即ち、培地成分を定量化した調製培地を使用しなければならない短所などが依然として残っている。
【０００５】
したがって、安定的な遺伝子の発現と費用節減などの産業的利用価値が優れた遺伝子発現システムを開発しなければならない必要性が要求されている。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、アンピシリンなどのような抗生剤マーカーを使用せずに微生物の成長及び発現に必須な遺伝子をマーカーとして用いて安定性が確保されたプラスミドによって組換え遺伝子の発現が安定的に維持され、高発現が可能な新規高発現ベクターとその新規高発現ベクターが導入された形質転換細胞を提供することを目的とする。また、遺伝子発現を誘導しなくても目的遺伝子が高水準に発現できるプロモーター、細胞内必須遺伝子を含む組換えＤＮＡ、それを利用した遺伝子発現ベクター及びその発現ベクターが、導入された新規高発現ベクターを利用して発現する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは抗生剤耐性遺伝子を使用する代わりに、微生物の生育に必須な遺伝子のうち細胞壁合成に関与するグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子をマーカーとして用いてプラスミドの安定性を維持する。細胞壁の物理的力と、細胞固有の形態を維持することに必要なペプチドグリカンの構成成分であるＤ−グルタミン酸及びＤ−アラニンは、生合成経路が非常に制限されており、グルタミン酸ラセマーゼはこのような必須成分であるＤ−グルタミン酸合成経路に関与する。Ｄ−グルタミン酸栄養要求性変異株を宿主としてこれに相補性を与える遺伝子をクローニングし、これを新規発現ベクター内への導入に利用する。既存の高発現ベクターである（株）バイオリーダース社のｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）の構成的高発現プロモーターと前記クローニングした遺伝子を導入して新たな発現ベクターを収得する。新たな前記発現ベクターであるｐＨＣＥ（ＩＩＩ）の遺伝子の大きさは４，６６５ｂｐであり、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬを宿主細胞に入れて形質転換させ９回継代培養した結果、安定性が維持されることが確認できた。さらに、安定性を確保すると共に大量生産が可能であるかを確認するために、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを大腸菌ＷＭ３３５に形質転換させて培養した結果、生産量がＩＰＴＧプロモーターを使用したものより約９．２倍増加することを確認した。
【０００８】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明では微生物の生存に必須な遺伝子であって、細胞壁構成に関与する必須遺伝子のうちのブレビバチルスボーステレンシスに由来したグルタミン酸ラセマーゼ（ＧｌｕＲａ）をコードする遺伝子をマーカーとして用いる。この時、細胞壁構成に関与する必須遺伝子は、グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子だけではなく、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニンなどのアミノ酸合成が可能な酵素遺伝子であればマーカーとして使用可能である。宿主としてはＤ−グルタミン酸に依存的な菌株であるＤ−グルタミン酸生合成経路に突然変異が起こった大腸菌菌株（例；ＷＭ３３５）を使用する。
【０００９】
Ｄ−グルタミン酸栄養要求性変異株であるＷＭ３３５（Ｊ．  Ｂａｃ．  Ｍａｙ  １９９３、２９７０−９）にバチルス菌の染色体を制限酵素で切断した後、断片をｐＵＣ１９ベクターにクローニングして導入する。Ｄ−グルタミン酸が含まれていない培地内で成長するコロニーを獲得してグルタミン酸ラセマーゼＤＮＡを収得する。
【００１０】
また、前記ＤＮＡの相補序列と特定条件でハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡ、該ＤＮＡに基づいて一般的な方法により設計し、化学的に合成したオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用して得られるＤＮＡでありながらＤ−グルタミン酸を提供することができる遺伝子を収得することができる。
【００１１】
オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は特別な制限がなく、特定条件で前記ＤＮＡまたは前記ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡとのハイブリダイゼーションが可能なものであれば使用できる。ここで‘特定条件’とは、例えば次のような条件を意味する。すなわち、使用するプローブのＴｍ−２０若しくは３０℃に該当する温度で、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１若しくは０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１若しくは０．０２Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５若しくは７．５）、０．３若しくは０．７％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液（０．０５若しくは０．１５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５若しくは０．１５％ポリビニルピロリドン、０．０５若しくは０．１５％フィコール４００）及び８０若しくは１２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中に１２ないし３６時間放置する条件をいう。
【００１２】
オリゴヌクレオチドプローブの長さは特別に限定されるものではないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止するために１５塩基配列、好ましくは１８塩基配列以上である。
【００１３】
プライマーの塩基配列にも特別な制限がなく、通常のＰＣＲ反応条件で前記ＤＮＡまたは前記ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するＤＮＡにアニーリングすることができ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を開始することができるものであれば使用できる。
【００１４】
プライマーの場合も、その長さは特別に限定されるものではないが、例えば、１５若しくは４０塩基序列、好ましくは１７若しくは３０塩基序列である。前記プライマーはＰＣＲ法を最初に実施する種の遺伝子増幅に利用することが可能である。
【００１５】
ハイブリダイゼーション方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓなど、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）に記載された方法を使用した。
【００１６】
高発現ベクターである（株）バイオリーダース社のｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）に前記グルタミン酸ラセマーゼＤＮＡを導入して抗生剤非依存性構成的高発現ベクターを収得し、このベクターはＤ−グルタミン酸栄養要求性変異株である宿主で安定的に発現される。
【００１７】
具体的に、この発現ベクターは既存の商業的に販売・利用されているｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）を図１に示すようにＮｄｅ  Ｉ制限酵素で切断した後、クレノウ断片でフィリングする。そして、前記クローニングされたグルタミン酸ラセマーゼＤＮＡを鋳型として一般的な方法により設計し、化学的に合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を通じてＤＮＡを収得する。ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）のＮｄｅ  Ｉで切断された部位に前記ＤＮＡを挿入して新たなｐＨＣＥ（ＩＩＩ）発現ベクターを収得する。
【００１８】
本発明に利用されたｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）は、ＩＰＴＧのような高価な誘導物質を利用しなくても目的の遺伝子産物を高水準に発現させることが可能な構成的プロモーターで構成されているため、特にタンパク質をコードする外来遺伝子の発現に適している。
【００１９】
前記発現ベクター内で発現されるタンパク質の量は、全可溶性タンパク質の約３０〜５０％水準で構成的に発現される。
【００２０】
前述した構成的高発現ベクターは本発明の目的ではないが、抗生剤非依存性ベクターに一層高い効率を付与し、当業界における通常の知識を有する者が容易に類推することができるので本発明に含む。
【００２１】
ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）内のグルタミン酸ラセマーゼの発現程度は、細胞成長に十分なＤ−グルタミン酸を提供することができながらその発現量が過多でないため、他の目的遺伝子産物の発現程度に害を与えない。また、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）ベクターを利用した形質転換細胞は、複合培地、ＬＢ培地などに他の濾過過程を必要とせず、直ちに用いることができる長所を有する。従来の技術は、栄養要求性変異株の培養において、培地内のイオンや金属性物質の除去、特異なアミノ酸または他の炭素有機物の添加などが必要であるという短所が存在したが、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）の場合においては、このような短所が克服されたといえる。
【００２２】
本発明による遺伝子発現ベクターｐＨＣＥ（ＩＩＩ）に形質転換された大腸菌をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ−ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ｂｌｕｅ／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）と命名し、２０００年１２月２９日にＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託して寄託番号ＫＣＴＣ０９２５ＢＰが付与された。該遺伝子発現ベクターｐＨＣＥ（ＩＩＩ）は寄託された大腸菌から抽出して得る。
【００２３】
この発現ベクターに導入される外来遺伝子の種類は、特別に限定されないが、例えば、タンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸及びリボザイムをコードする核酸などが挙げられる。前記のような外来遺伝子を提供することができる菌体は、特別に限定されるものではないが、例えば、細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類などの微生物、植物、昆虫、動物などに由来することができ、場合によっては人工的に合成された遺伝子であることもできる。
【００２４】
より具体的に、インターロイキン１若しくは１２遺伝子、インターフェロンα、β、γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質転換増殖因子β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子及び西洋ホタルシフェラーゼ遺伝子などを例として挙げることができるが、これらに限られるわけではない。
【００２５】
本明細書において‘デコイ’とは、細胞に由来する転写因子結合タンパク質をコードする核酸または転写因子の結合部位の配列または類似した配列を有するＤＮＡを示し、これらが細胞内に導入されれば転写因子の作用を抑制する機能を果たすＤＮＡを言う。また、本明細書において‘リボザイム’とは、特定タンパク質のｍＲＮＡを切断するものであって、特定タンパク質の翻訳を阻害する酵素を言う。ハンマーヘッド形リボザイムだけでなく、ヘアピン形リボザイム、デルタ形リボザイムなどその種類に拘らず、特定タンパク質ｍＲＮＡを切断して特定タンパク質の翻訳を阻害するものであれば本明細書におけるリボザイムに該当する。
【００２６】
本発明において組換えＤＮＡ及び発現ベクターによって、該組換えＤＮＡを保持している形質転換細胞、または該発現ベクターを保持している形質転換細胞を収得する。また、組換えＤＮＡ及び発現ベクターによって、形質転換細胞を培養し、得られた培養物からタンパク質を収得することを特徴とするタンパク質製造方法が提供される。これと関連するタンパク質の製造方法も本発明の範囲に属する。
【００２７】
より具体的には、前記組換えＤＮＡを含有するベクターを利用して宿主細胞を形質転換する工程で形質転換細胞を得て、これを培養して得られた培養物から前記タンパク質を収得する。
【００２８】
組換えＤＮＡを宿主に導入する方法としては、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第５２巻、第４５６項、１９７３年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（第４１巻、第４５１項、１９６８年）に記載の方法を適用した。
【００２９】
発現ベクターを宿主に導入する方法としては、リン酸カルシウム法（参考文献：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７巻、第２７４５項）、電気穿孔法（参考文献：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ、第８１巻、第７１６１項、１９８４年）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（参考文献：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２８３項、ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ、１９９１年発行）及びリポゾーム法（参考文献：Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ、第６巻、第６８２項、１９８９年）などに記載の方法を使用した。
【００３０】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは当業界における通常の知識を有する者において自明である。
【００３１】
実施例１：ブレビバチルスボーステレンシスからのグルタミン酸ラセマーゼ分離
ブレビバチルスボーステレンシスからグルタミン酸ラセマーゼＤＮＡを分離するために、ブレビバチルスボーステレンシスをＬＢ培地に接種して５５℃で振盪培養し、遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体をリゾチームで処理して原形質体細胞を作った後、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を加えて細胞を完全に破壊した後、全反応液に塩を加えてタンパク質を沈殿させた。これを遠心分離して上澄液だけを取り、フェノールを上澄液と同一の体積で添加して液中のタンパク質などの不純物を除去した。この過程を数回繰り返した。フェノール混合液（フェノール：クロロホルム＝１：１体積比）を同一体積で加えて不純物を除去し、２倍の体積のエタノールを添加して沈殿させた。沈殿物をガラス棒で巻いて分離し、７０％エタノールで洗浄した。前記ペレットをリボヌクレアーゼが含まれているＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝溶液に溶解してＲＮＡを除去したＤＮＡを収得した。
【００３２】
前記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を通じて大きさが９１０ｂｐである遺伝子をクローニングした（参照、配列番号１）。
【００３３】
ブレビバチルス属ボーステレンシス由来のグルタミン酸ラセマーゼのプロモーターとそのＯＲＦをコードする遺伝子上流のプライマー１及び遺伝子下流のプライマー２を利用してグルタミン酸ラセマーゼＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
プライマー１：５’ａｇｃ  ｇａａ  ａａｔ  ａａａ  ａｇｇ  ａａｇ  ｔｇ−３’（２０ｍｅｒ）
プライマー２：５’ｇｃｇ  ｔｔｔ  ａｔｔ  ｔｇｃ  ｃｇａ  ｃｔｃ  ａｇ−３’（２０ｍｅｒ）
【００３４】
＜ＰＣＲの反応液＞
プライマー１と２（濃度１０ｍＭ）：各１μｌ
ｄＮＴＰ混合物（各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ；１０ｍＭ、各２．５ｍＭ）：４μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝溶液：５μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ製品）：０．２μｌ
鋳型として用いられたＤＮＡ：２μｌ（２００ｎｇ）
最終体積：５０μｌ
【００３５】
ＰＣＲの条件はホットスタート法とし、９５℃で５分間反応させた後、９５℃で３０秒間変性、５５℃で１分間プライマーアニーリング、７２℃で２分間重合反応をすることを１サイクルとして、３０サイクルを行った後、最後に７２℃で１０分間仕上げをした。
【００３６】
増幅されたグルタミン酸ラセマーゼを内在する断片をクレノウ断片（Ｂｏｒｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理してブラントエンド状態で精製した。
【００３７】
実施例２：抗生剤非依存性構成的高発現ベクター（ｐＨＣＥ（ＩＩＩ））及び形質転換細胞の作製
（１）抗生剤非依存性構成的高発現ベクターの作製
ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）をＮｄｅ  Ｉ制限酵素で処理（１×緩衝溶液、Ｎｄｅ  Ｉ酵素  ２ｕｎｉｔ、ＤＮＡ  ２μｇ）した後、クレノウ断片でフィリングして精製（ＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅ  ｃｌｅａｎ  ｋｉｔ、ｓｐｉｎ  ｔｙｐｅを利用）した。前記ｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）断片とグルタミン酸ラセマーゼ断片を約１対３のモル濃度比で混合し、ＤＮＡ連結反応混合液（Ｔａｋａｒａ、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２）をＤＮＡの量と同一の体積で十分混合した後、１６℃で１２時間連結反応させてｐＨＣＥ（ＩＩＩ）遺伝子発現ベクターを収得した（参照、配列番号２）。
【００３８】
Ｄ−グルタミン酸栄養要求性変異株での安定的なプラスミドｐＨＣＥ（ＩＩＩ）遺伝子発現ベクターの製作のために市販されているゲル精製用酵素及びキット（ＢＩＯ１０１社製品）、プラスミド精製用酵素及びキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製品）を利用した。
【００３９】
図１に遺伝子発現ベクターｐＨＣＥ（ＩＩＩ）の作製過程を概略的に示した。
【００４０】
（２）形質転換細胞の製作
十分乾燥したＤＮＡを再びＴＥ緩衝溶液に溶解した後、遺伝子トランスファ（Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製品）を用いてＤ−グルタミン酸依存性栄養要求性変異株（大腸菌  ＷＭ３３５）に電気穿孔法で形質転換させた。大腸菌を１００ｍｌのＬＢ培地でＯＤ値が０．６になるまで培養した後、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００ｍｌの１０％グリセロールで３回洗浄し、０．２ｍｌの１０％グリセロールを添加して懸濁液を作った。該懸濁液に５μｌプラスミド１μｇを添加して十分混合した後、０．２ｃｍキュベットに移して氷の中に１０分間放置した。キュベット０．２ｃｍ、静電容量２５μＦ、２００ｏｈｍ、２．５ｋＶ、持続時間３ｍｓの条件で電流を流した。ＬＢ培地１ｍｌを加えて３７℃で１時間培養した後、寒天培地に塗抹した。Ｄ−グルタミン酸のない複合培地で成長し、形質転換されたコロニーからプラスミドＤＮＡを大量精製した（プラスミド精製キット；Ｊｅｔｓｔａｒ２．０  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｇｅｎｏｍｅｄ社製品）。
【００４１】
実施例３：抗生剤非依存性構成的高発現ベクターの細胞内安定性確認
実際に抗生剤が含まれていない培地内でｐＨＣＥ（ＩＩＩ）発現ベクターの安定性が保持するかどうかを確認するため、産業的に有用な酵素であるＴＰＬ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｈｅｎｏｌ  ｌｙａｓｅ）の遺伝子をベクター内に導入した。
【００４２】
（１）ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）内にＴＰＬ遺伝子を挿入した発現ベクターの製作
図２に示すようにｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬを製作した。
まず、ＴＰＬ遺伝子を内在するｐＴＰＬを鋳型としてＰＣＲ法でＴＰＬ遺伝子を増幅した。プライマーは次のものを用いた。
プライマー１：５’ａａｔ  ｔａｔ  ｃｃｇ  ｇｃａ  ｇａａ  ｃｃｃ  ｔｔｃ−３’（２１ｍｅｒ）
プライマー２：５’ｃｇｇ  ａｔｃ  ｃａａ  ｇｃｔ  ｔａｔ  ｔａｇ  ａｔａ  ｔａｇ  ｔｃａ  ａａｇ  ｃｇｔ  ｇｃａ  ｇｔ−３’（３８ｍｅｒ）
【００４３】
増幅されたＴＰＬ遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩで処理して精製した。ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）はＮｃｏＩで処理し、クレノウ断片で末端を修復した後、ＨｉｎｄＩＩＩで再処理した。ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＨＣＥ（ＩＩＩ）の断片のうち、分子量が大きい断片と上記で得られたＴＰＬ遺伝子とを連結してｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬを得た。
【００４４】
（２）形質転換細胞の製作
実施例２で使用した電気穿孔法を同一の条件として使用し、遺伝子トランスファ（Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置）を用いて形質転換細胞を製作した。Ｄ−グルタミン酸依存性栄養要求性宿主である大腸菌  ＷＭ３３５［ｌｅｕ  ｐｒｏ  ｔｒｐ  ｈｉｓ  ａｒｇ  ｔｈｙＡ  ｄｅｏＢ  ｍｅｔ  ｌａｃ  ｇａｌ  ｘｙｌ  ａｒａ  ｍａｌ  ｌａｍ  ｐｈｘ  ｒｐｓＬ  ｈｓｄＳ−Ｋ１２  ｇｌｔ］にｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬを導入して形質転換した。
【００４５】
形質転換細胞を、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製品）１０ｇ／ｌ、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製品）５ｇ／ｌ及びＮａＣｌ１０ｇ／ｌを含有するＬＢ培地で培養した。
【００４６】
（３）ＴＰＬの高発現確認
抗生剤が添加されない培養条件でｐＨＣＥ（ＩＩＩ）プラスミドの安定性及び目的のＴＰＬが発現されるかを確認した。
【００４７】
上記で獲得した形質転換細胞を９回継代培養し、各時期毎の細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離して、得た菌体からプラスミド精製キット（Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ製品）を用いてプラスミドを精製し、その安定度を確認した。
【００４８】
図３ａに示すように９回継代培養までプラスミドの安定度が維持されることを確認できた。
【００４９】
また、同じ時期の形質転換細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離して得た菌体を１×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄した。回収した菌体を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に懸濁した。得られた細胞を超音波粉碎機（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製品）で破砕した後、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞残留物を除去した。
【００５０】
ＴＰＬの高発現を確認するために上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。その結果、図３ｂに示すように誘導物質の添加無しでＴＰＬの発現が全菌体内可溶性タンパク質の約４０％以上発現されることを確認した。
【００５１】
実施例４：抗生剤非依存性構成的高発現ベクターを利用した酵素ＴＮＡの発現
実施例３で確認されたように、本発明で収得したｐＨＣＥ（ＩＩＩ）ベクターが安定性を有することを確認した。このような安定性を有するベクターを利用して目的とするタンパク質の大量生産が可能であるかを確認するために、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）を利用して好熱性細菌シンバイオバクテリウム堆肥（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏｅｂｉｉ）ＳＣ−１由来のトリプトファンインドールリアーゼ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｄｏｌ  ｌｙａｓｅ、ＴＮＡ）遺伝子をクローニングしてＤ−グルタミン酸依存性栄養要求性変異宿主  ＷＭ３３５でＴＮＡ大量生産実験を行った。
【００５２】
（１）ＴＮＡ遺伝子を内在する発現ベクターの製作
図４に示すようにｐＨＣＥ（ＩＩＩ）を利用してｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを製作した。
【００５３】
ＴＮＡ遺伝子を内在するｐＴＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でＴＮＡ遺伝子を増幅した。プライマーとしては次のものを使用した。
プライマー１：５’ｃｃａ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ｃｃｃ  ｔｔｔ  ａａ−３’（２０ｍｅｒ）
プライマー２：５’ｔｇａ  ｃｔａ  ａｇｔ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａｔｔ  ａｇａ  ｃｃａ  ｇａｔ  ｃｇａ  ａｇｔ  ｇｇｃ−３’（４２ｍｅｒ）
【００５４】
増幅されたＴＮＡ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、精製した。また、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）をＮｃｏＩで処理してクレノウ断片で末端を修復した後、ＨｉｎｄＩＩＩで再処理した。ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＨＣＥ（ＩＩＩ）の断片のうち、分子量が大きい断片と上記のＴＮＡ遺伝子とを連結してｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを収得した。
【００５５】
（２）形質転換細胞の製作
遺伝子トランスファ（Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置）を利用して実施例２の電気穿孔法と同様の方法で形質転換細胞を製作した。Ｄ−グルタミン酸依存性栄養要求性宿主である大腸菌  ＷＭ３３５［ｌｅｕ  ｐｒｏ  ｔｒｐ  ｈｉｓ  ａｒｇ  ｔｈｙＡ  ｄｅｏＢ  ｍｅｔ  ｌａｃ  ｇａｌ  ｘｙｌ  ａｒａ  ｍａｌ  ｌａｍ  ｐｈｘ  ｒｐｓＬ  ｈｓｄＳ−Ｋ１２  ｇｌｔ］に前記ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを導入して形質転換した。
【００５６】
形質転換細胞を、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製品）１０ｇ／ｌ、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社製品）５ｇ／ｌ及びＮａＣｌ１０ｇ／ｌを含有するＬＢ培地で培養した。
【００５７】
（３）プラスミド安定性の確認
前記（２）の形質転換細胞を１００ｍｌフラスコで抗生剤を添加せずに３回継代培養した後、各時期毎の細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離して得た菌体からプラスミド精製キット（Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ社製品）を用いてプラスミドを精製し、プラスミドの安定度を確認した。図５ａに示すようにプラスミドが持続的で且つ安定的に細胞内に存在することを確認した。
【００５８】
（４）ＴＮＡの高発現確認
前記（２）の形質転換細胞を５，０００×ｇで２０分間遠心分離して得た菌体を１×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄した。回収した菌体を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に懸濁した。懸濁された細胞を超音波粉碎機（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製品）で破砕した後、２０，０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞残留物を除去した。その上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動してＴＮＡの高発現を確認した結果、図５ｂに示すように持続的に高発現されたＴＮＡを確認することができた。
【００５９】
（５）ＴＮＡの大量生産
ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを保持している大腸菌（ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡ）を培養してＴＮＡを大量生産した。その結果、ＴＮＡが大腸菌全細胞内タンパク質の約４０％に至るように発現された。回分培養による高細胞成長によるＴＮＡの大量生産を達成するために大腸菌（ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡ）をグリセロール５０ｇ／ｌを含有する複合培地で培養した。
【００６０】
３７℃、７００ｒｐｍの条件下で２．５Ｌ発酵槽で成長した大腸菌（ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡ）の回分培養生育曲線を図６に示す。図６において−○−表示は細胞の乾燥重量（ｇ／ｌ）、−△−表示はＴＮＡの合成活性（単位／ｍｌ）、−□−表示はグリセロールの濃度（ｇ／ｌ）を示したものである。３時間培養後にＴＮＡの生産は細胞の生育と共に増加し、全ての生育時間において構成的に高発現量を維持しながらＴＮＡが生産されることを確認した。２４時間培養後の最終細胞濃度は６００ｎｍで吸光度が７５であり、ＴＮＡ最大活性は３．４５０単位／ｍｌであった。
【００６１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って生成されたタンパク質バンドをスキャニング濃度計で解析した結果、可溶性酵素のＴＮＡ含有量は図７に示すように大腸菌抽出物による全細胞内タンパク質の約４０％と推定された。
【００６２】
大腸菌（ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡ）の高濃度菌体回収のための回分式培養で抗生剤の添加無しで発現ベクターの安定的な維持及び高発現結果は、他の組換えタンパク質の生産でも効率的に高発現が可能であることを示唆する。
【００６３】
以上で詳細に説明し、立証したように、本発明はアンピシリンなどのような抗生剤マーカーを使用せず、微生物の成長及び分裂に必須な遺伝子をマーカーとして用いて安定性が確保されたプラスミドによって組換え遺伝子の発現が安定的に維持され、高発現が可能な新規高発現ベクターとその新規高発現ベクターを利用した遺伝子発現方法に関する。
【００６４】
本発明の新規の抗生剤非依存性高発現ベクターの使用は、既存の問題点であった高価な誘導物質の使用と抗生剤耐性遺伝子の使用による問題点を克服することができ、さまざまな有用なＤＮＡ及びタンパク質の高発現及び組換えタンパク質の清浄生産への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）ベクターの作製過程を示した模式図である。
【図２】
図２は、発現ベクターの安定性試験のためのｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬの作製過程を示した模式図である。
【図３】
図３ａは、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＰＬプラスミド安定性確認のためのアガロースゲル電気泳動写真であり、図３ｂは、９回継代培養までのＴＰＬの高発現確認のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図４】
図４は、ＴＮＡ遺伝子を内在するｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡ発現ベクターの作製過程を示した模式図である。
【図５】
図５ａは、ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡプラスミド安定性確認のためのアガローズゲル電気泳動写真であり、図５ｂは、ＴＮＡの高発現確認のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図６】
図６は、組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを利用した生物触媒ＴＮＡの大量生産を示したグラフである。
【図７】
図７は、組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＷＭ３３５／ｐＨＣＥ（ＩＩＩ）−ＴＮＡを利用した生物触媒ＴＮＡの大量生産確認のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真である。
【図１】
2004517624.tif 000003
【図２】
2004517624.tif 000004
【図４】
2004517624.tif 000005
【図６】
2004517624.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2004517624.tif 000007
2004517624.tif 000008
2004517624.tif 000009
2004517624.tif 000010
2004517624.tif 000011
2004517624.tif 000012
2004517624.tif 000013
2004517624.tif 000014
2004517624.tif 000015
2004517624.tif 000016
2004517624.tif 000017
2004517624.tif 000018
2004517624.tif 000019
2004517624.tif 000020
2004517624.tif 000021
2004517624.tif 000022
2004517624.tif 000023
2004517624.tif 000024
2004517624.tif 000025
2004517624.tif 000026
2004517624.tif 000027
2004517624.tif 000028
2004517624.tif 000029
2004517624.tif 000030
2004517624.tif 000031
2004517624.tif 000032
2004517624.tif 000033
2004517624.tif 000034
2004517624.tif 000035
2004517624.tif 000036
2004517624.tif 000037
2004517624.tif 000038
2004517624.tif 000039
2004517624.tif 000040
2004517624.tif 000041
2004517624.tif 000042
2004517624.tif 000043
2004517624.tif 000044
2004517624.tif 000045
2004517624.tif 000046
2004517624.tif 000047
2004517624.tif 000048
2004517624.tif 000049
2004517624.tif 000050
2004517624.tif 000051
【国際調査報告】
2004517624.tif 000052