(57)【要約】本発明は、ヒトターゲティングペプチド配列を同定するための方法及び組成物に関する。好ましい態様において、一次ファージライブラリがインビボでヒトに投与され、ターゲティングペプチドを保持しているファージが、選択された臓器、組織、又は細胞型から収集される。より好ましい態様において、収集されたファージは増幅され、プールされ、次回の選択のための第二のヒトに投与される。ペプチドは、遺伝子治療ベクターを含む治療剤の標的化送達に有用である。そのような標的化送達は、ヒト疾患の検出、診断、又は治療用に使用されうる。いくつかの態様において、ペプチドは、造影剤に付着し、画像を得るため又は疾患状態を診断するため、ヒトに投与されうる。また、本発明の方法により得られたヒトの臓器又は組織に選択的な多数のターゲティングペプチド配列及びコンセンサスモチーフも、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲティングペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）ファージディスプレイライブラリを得る段階；
ｂ）ファージディスプレイライブラリをヒトの循環系に注射する段階；
ｃ）ヒトから臓器、組織、又は細胞型の試料を得る段階；及び
ｄ）臓器、組織、又は細胞型に存在するファージから一つ又は複数のターゲティングペプチドを同定する段階。
【請求項２】
ヒトが、脳死状態である、又は終末離脱（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｗｅａｎ）患者である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ライブラリが、約１０１４形質導入単位（ＴＵ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ライブラリが一次ファージライブラリである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ライブラリが、少なくとも１０８個の異なるターゲティングペプチド配列を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
臓器、組織、又は細胞型からファージを回収する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ファージが、細菌を感染させることにより回収される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ファージが、ファージ挿入物を増幅することにより回収される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
挿入物がターゲティングペプチドをコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
新しいファージを作製するため、増幅された挿入物をファージＤＮＡに連結させる段階をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ターゲティングペプチド配列の統計分析を実施する段階；及び
ｂ）統計的に有意なペプチドモチーフを同定する段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ａ）アミノ酸残基配列計数を行う段階；
ｂ）未選択ライブラリにおける頻度と比較した、各トリペプチドモチーフの相対頻度を追跡する段階；及び
ｃ）各相対頻度が観察される確率を計算する段階
をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法により同定されたターゲティングペプチド。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法により同定されたターゲティングペプチドモチーフ。
【請求項１５】
ターゲティングペプチドを同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）ファージディスプレイライブラリをヒトの循環系に注射する段階；
ｂ）ヒトから、複数の臓器、組織、又は細胞型の試料を得る段階；
ｃ）試料からファージを回収する段階；
ｄ）ファージを増幅する段階；
ｅ）増幅されたファージをプールする段階；
ｆ）プールされたファージを第二のヒトの循環系に注射する段階；
ｇ）第一のヒトから得られたのと同じ臓器、組織、又は細胞型の試料を得る段階；及び
ｈ）試料からファージを回収する段階。
【請求項１６】
配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかより選択される配列の少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む、大きさが１００アミノ酸以下の単離ペプチド。
【請求項１７】
大きさが５０アミノ酸以下の、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項１８】
大きさが２５アミノ酸以下の、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項１９】
大きさが１０アミノ酸以下の、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
大きさが７アミノ酸以下の、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
大きさが５アミノ酸以下の、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項２２】
分子に付着している、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項２３】
分子が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、又はホルモンアンタゴニストである、請求項２２記載の単離ペプチド。
【請求項２４】
アポトーシス促進剤が、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号：３）、及び（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号：４）からなる群より選択される、請求項２３記載の単離ペプチド。
【請求項２５】
抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子（ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ）、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ペントサンポリ硫酸（ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロン−α、ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ）Ａ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（Ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ポリアミン、プロテオソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、およびミノサイクリン（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）からなる群より選択される、請求項２３記載の単離ペプチド。
【請求項２６】
サイトカインが、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、又はＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群より選択される、請求項２３記載の単離ペプチド。
【請求項２７】
高分子複合体に付着している、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項２８】
高分子複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳類細胞、又は細胞である、請求項２７記載の単離ペプチド。
【請求項２９】
真核生物発現ベクターに付着している、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項３０】
ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項１６記載の単離ペプチド。
【請求項３１】
配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む融合タンパク質。
【請求項３２】
薬学的に許容される担体中に請求項１６記載の単離ペプチドを含む、組成物。
【請求項３３】
ペプチドが、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、抗原、生存因子、抗アポトーシス剤、又はホルモンアンタゴニストに付着している、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
ペプチドが、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳類細胞、真核生物発現ベクター、又は細胞に付着している、請求項３２記載の組成物。
【請求項３５】
ａ）請求項１６記載の単離ペプチド；及び
ｂ）対照ペプチド
を含む、キット。
【請求項３６】
配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかより選択される配列の単離ペプチドと選択的に結合する抗体。
【請求項３７】
ターゲティングペプチドが配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかより選択される少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む、表面タンパク質の一部としてターゲティングペプチド配列を発現する、遺伝子治療ベクター。
【請求項３８】
請求項１６記載のペプチドをコードする、大きさが３００ヌクレオチド以下の単離核酸。
【請求項３９】
請求項３８記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項４０】
プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルス、又はファージである、請求項３９記載のベクター。
【請求項４１】
疾患状態を治療する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）疾患状態に関連する細胞へ標的化される、請求項１記載のペプチドを選択する段階；
ｂ）疾患状態を治療するために有効な一つ又は複数の分子をペプチドに付着させる段階；及び
ｃ）疾患状態を有する対象へペプチドを投与する段階。
【請求項４２】
疾患状態が、糖尿病、炎症性疾患、関節炎、動脈硬化、癌、自己免疫疾患、細菌感染、ウイルス感染、心臓血管疾患、又は変性疾患からなる群より選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
配列が、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、又は配列番号：１３０より選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４４】
配列が、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、又は配列番号：１３１より選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４５】
配列が、配列番号：４６から配列番号：６５のいずれかより選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４６】
配列が、配列番号：６６から配列番号：８３のいずれかより選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４７】
配列が、配列番号：８４から配列番号：１２９のいずれかより選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４８】
配列が、配列番号：１３２から配列番号：１４８のいずれかより選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項４９】
配列が、配列番号：１４９から配列番号：１７３のいずれかより選択される、請求項２０記載の単離ペプチド。
【請求項５０】
画像化の方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）請求項１記載のペプチドを選択する段階；
ｂ）ペプチドを造影剤に付着させる段階；
ｃ）ペプチド及び薬剤をヒトに投与する段階；並びに
ｄ）ヒトの画像を得る段階。
【請求項５１】
疾患状態を診断する方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）疾患状態に関連する細胞へ標的化される、請求項１記載のペプチドを選択する段階；
ｂ）ペプチドをヒトに投与する段階；及び
ｃ）ヒトにおけるペプチドの分布を決定する段階。
【請求項５２】
ａ）約１０８個以上のターゲティングペプチドを含むファージディスプレイライブラリをヒトの循環系に注射する段階；
ｂ）ファージががヒトと結合するような期間および条件下で、ヒト体内にライブラリを残留させる段階；ならびに
ｃ）結合したファージを含む試料をヒトから得る段階
を含む方法。
【請求項５３】
試料と結合したファージを単離する段階をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ヒトが、脳死のヒトおよび終末離脱のヒト患者からなる群より選択される、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
ライブラリが、約１０１４形質導入単位（ＴＵ）以上を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
ライブラリが一次ファージライブラリである、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
ライブラリが、少なくとも１０９個の異なるターゲティングペプチド配列を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
試料からファージを回収する段階をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
ファージが検出可能標識に付着している、請求項５２記載の方法。
【請求項６０】
試料が、ヒトが死亡した後に、ヒトの罹患組織より得られる、請求項５２記載の方法。
【請求項６１】
ａ）ライブラリは１０８個以上のターゲティングペプチド配列を含み、ファージは検出可能標識に付着しており、かつさらに、ヒトは末期疾患を有し心臓が拍動している、ファージディスプレイライブラリをヒトの循環系に注射する段階；
ｂ）ライブラリのファージがヒトと結合するような期間および条件下で、ヒト体内にライブラリを残留させる段階；
ｃ）試料が結合したファージを含む、ヒトの心臓がもはや拍動しなくなった後で試料をヒトから得る段階；並びに
ｄ）試料からファージを単離する段階
を含む方法。
【請求項６２】
ｅ）ターゲティングペプチド配列の統計分析を実施する段階；及び
ｆ）統計的に有意なペプチドモチーフを同定する段階
をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項６３】
ｇ）アミノ酸残基配列計数を行う段階；
ｈ）未選択ライブラリにおける頻度と比較した、各トリペプチドモチーフの相対頻度を追跡する段階；及び
ｉ）各相対頻度が観察される確率を計算する段階
をさらに含む、請求項６２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号および２００１年１月１７日に提出された米国特許出願第０９／７６５，１０１号の恩典を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金ＤＡＭＤ １７−９８−１−８０４１および１７−９８−１−８５８１ならびに米国国立衛生研究所の助成金１Ｒ０１ＣＡ７８５１２−０１Ａ１、１Ｒ１ＣＡ９０８１０−０１、および１Ｒ０１ＣＡ８２９７６−０１により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００２】
１． 発明の分野
本発明は、分子医学及び治療剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒト体内の臓器、組織、又は細胞型を選択的にターゲティングするペプチドの同定及び使用のための組成物及び方法に関する。
【０００３】
２． 関連技術の説明
多くのヒト疾患状態の治療的治療は、用いる治療剤の全身毒性のために制限される。癌治療剤は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない薬剤の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器、組織、または細胞型限定疾患の治療は、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。
【０００４】
最近、マウスモデル系において臓器、組織、または細胞型ターゲティングペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリを用いるインビボ選択系が開発された。バクテリオファージの表面上にトランスジェニックペプチドを発現するファージディスプレイライブラリは、当初、免疫グロブリンのエピトープ結合部位をマッピングするために開発された（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８６、１９９３）。そのようなライブラリは、ファージの表面タンパク質をコードするｃＤＮＡにランダムオリゴヌクレオチドを挿入すること、独自のペプチドを１０９個もの順列で示すファージ粒子のコレクションを作製することによって作製することができる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【０００５】
ファージディスプレイライブラリをマウスに静脈内投与した後に、個々の臓器からのファージの回収を行った（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。ファージの外部表面上に発現された特異的ターゲティングペプチド配列に基づいて、異なるマウス臓器、組織、または細胞型の血管床に選択的に回帰することができるファージを回収した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。多様な臓器および腫瘍回帰ペプチドがこの方法によって同定されている（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、１９９９；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｂｕｒｇら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。それらのターゲティングペプチドはそれぞれ、マウス標的組織の血管上に選択的に発現される異なる受容体に結合した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９７）。腫瘍回帰ペプチドはマウスの腫瘍新生血管において上方制御されている受容体に結合した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、２０００）。臓器、組織、または細胞型に対して選択的な個々のターゲティングペプチドを同定する他に、（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）、このシステムは、インビボでマウスに発現される内皮細胞表面マーカーを同定するために用いられている（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【０００６】
ターゲティングペプチドに治療剤が結合すれば、マウスモデル系において、作用物質は所望の臓器、組織、または細胞型へと選択的に送達される。化学療法剤およびアポトーシス促進ペプチドを、腫瘍新生血管に存在する受容体に標的送達すると、担癌マウスモデルにおいて治療有効性の著しい増加および全身毒性の減少が起こる（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。
【０００７】
ファージディスプレイライブラリを用いた従来の研究は、ヒトターゲティングペプチドが相同であるという仮定の下で、ターゲティングペプチド及びそれらの受容体を同定するために、マウスモデル系に頼ってきた。しかしながら、ヒトの細胞表面受容体は、マウスとは極めて異なる分布及び機能を有している可能性がある。さらに、マウスモデル系は、ほんの一握りの特異的臓器に対するターゲティングペプチドを特徴決定するためにのみ活用されてきた。治療剤の標的化送達及びインビボ画像化のために臨床的に使用されうる、ヒトにおける臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティング配列の同定のための方法及び組成物が、当技術分野においては必要とされている。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ヒトの臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドを同定し、使用するための組成物及び方法を提供することにより、当技術分野における長年にわたる需要を満たす。
【０００９】
本発明のいくつかの態様は、ファージディスプレイライブラリをヒトの循環系に注射する段階、ヒトから臓器、組織、又は細胞型の試料を得る段階、及び臓器、組織、又は細胞型に存在するファージから一つ又は複数のターゲティングペプチドを同定する段階を含む、ターゲティングペプチドを同定する方法に関する。好ましい態様において、ファージは第一のヒト対象の臓器、組織、又は細胞型より回収され、第二のヒトの循環系へと再注射した後、同じ臓器、組織、又は細胞型の試料を得、ターゲティングペプチドを同定する段階により、さらに選択される。十分に選択的なターゲティングファージを得るため、スクリーニングは複数回実施されうる。
【００１０】
もう一つの好ましい態様において、ヒトは、脳死状態であるか又は終末離脱（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｗｅａｎ）患者である。より好ましくは、個体は臓器ドナーの候補でない。他の好ましい態様において、一つ又は複数の一次ファージライブラリは、ヒト対象への注射の前に、好ましくは１０１４ＴＵ（形質導入単位）以上、より好ましくは２×１０８個以上の異なるクローンという多様度にまで、インビトロで増幅されうる。さらに好ましい態様において、ターゲティングペプチド配列は、統計的に有意なターゲティングペプチド配列を同定するため、下記の実施例に詳述されている特別に設計された統計分析に供される。
【００１１】
さらにもう一つの好ましい態様において、第一のヒトに由来する臓器、組織、又は細胞型より単離されたファージは、共に混合され、第二のヒトの循環系へと再注射された後、第二のヒトの同じ臓器、組織、又は細胞型からのファージの回収及び特徴決定がなされる。
【００１２】
いくつかの態様において、臓器、組織、又は細胞型より収集されたファージは、選択と選択の間に、臓器、組織のホモジネートを、大腸菌Ｋ９１ ｋａｎのような適切な宿主細胞と接触させること、及び宿主細胞においてファージを複製させることにより回収されうる。別の態様において、ファージは、ターゲティングペプチドをコードする配列のＰＣＲ（商標）のような直接的な増幅により回収されうる。
【００１３】
特定の態様において、本発明のターゲティングペプチドは、遺伝子治療ベクターおよび融合タンパク質を含むがこれらに限定されない治療剤を、ヒト患者における特定の臓器、組織、または細胞型に選択的に送達するために用いられる。当業者は、使用される、主張される方法の範囲には、ヒト患者における所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達によって治療することができる任意の疾患状態も含まれることを認識するであろう。そのような疾患状態には、疾患を有する細胞が、非転移性癌のような特定の臓器、組織、または細胞型に限定される疾患が含まれるが、他の疾患状態を臓器、組織、または細胞型ターゲティングアプローチによって治療してもよい。
【００１４】
本発明の一つの態様は、配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも３つの連続するアミノ酸を含む、大きさがアミノ酸１００個またはそれ未満の単離ペプチドに関する。
【００１５】
好ましい態様において、単離ペプチドは、アミノ酸５０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸３０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸２０個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸１０個もしくはそれ未満、またはさらにより好ましくは大きさがアミノ酸５個もしくはそれ未満である。他の好ましい態様において、請求項１記載の単離ペプチドは、配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続するアミノ酸を含む。
【００１６】
特定の態様において、単離ペプチドは分子に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。さらなる態様において、分子は、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞障害剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、ウイルス、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞、核酸または抗原である。それらの分子は、例示目的により挙げたに過ぎない。本発明の範囲に含まれる分子には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の分子が含まれる。好ましい態様において、アポトーシス促進剤は、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２、（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２、（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２、（配列番号：３）、または（ＫＬＧＫＫＬＧ）３、（配列番号：４）である。他の好ましい態様において、抗血管新生剤は、アンジオスタチン５、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドキセタクセル、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤（ＳＵ５４１６またはＳＵ６６６８）（Ｓｕｇｅｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ）、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンである。さらに好ましい態様において、サイトカインは、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。そのような例は、代表として示したに過ぎず、当技術分野で既知の他のアポトーシス促進剤、抗血管新生剤、またはサイトカインを除外すると解釈されない。
【００１７】
他の態様において、単離ペプチドは高分子複合体に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。他の好ましい態様において、高分子複合体はウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁気ビーズ、細胞、酵母細胞、または微小装置である。これらは例示目的で示したに過ぎない。本発明の範囲に含まれる高分子複合体には、ターゲティングペプチドに結合しうり、かつヒトに投与してもよい実質的に任意の高分子複合体が含まれる。他の好ましい態様において、単離ペプチドは、真核細胞発現ベクター、より好ましくは遺伝子治療ベクターに結合する。
【００１８】
もう一つの態様において、単離ペプチドは、固体支持体、好ましくは磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）マトリクス、またはファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に結合する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかから選択される配列の連続アミノ酸少なくとも３個を含む融合タンパク質に関する。
【００２０】
その他の特定の態様は、薬学的に許容される担体において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物に関する。さらなる態様は、一つまたは複数の容器において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含むキットに関する。
【００２１】
その他の態様は、所望の臓器、組織、または細胞型に対するターゲティングペプチドを選択する段階、上記のターゲティングペプチドを分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合させる段階、および上記の分子、複合体、またはベクターに結合した上記のペプチドをヒトに提供する段階を含む、標的化送達方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、配列番号：５から配列番号：３２５のいずれか由来の連続アミノ酸少なくとも３個を含むように選択される。特定の好ましい態様において、臓器、組織、または細胞型は、骨髄、皮膚、骨格筋、前立腺、または脂肪組織である。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドに結合した分子は、化学療法剤、抗原、または造影剤である。当業者は、本明細書の範囲において、任意のヒトの臓器、組織、または細胞型が、任意の分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合したターゲティングペプチドを用いた送達のための標的となりうることを認識するであろう。
【００２２】
本発明のその他の態様は、ターゲティングペプチドをコードする、大きさが３００ヌクレオチドまたはそれ未満の単離核酸に関する。好ましい態様において、単離核酸は、大きさが２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０または１０ヌクレオチドまたはそれ未満である。他の好ましい態様において、単離核酸は、真核または原核細胞発現ベクターに組み入れられる。さらにより好ましい態様において、ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスまたはバクテリオファージである。他の好ましい態様において、単離核酸は、発現されたペプチドを宿主細胞の細胞外表面に局在させるリーダー配列に機能的に結合している。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、疾患状態に関連する細胞を標的とするターゲティングペプチドを選択する段階、疾患状態を治療するために有効な一つまたは複数の分子をペプチドに結合させる段階、および疾患状態を有する被験者にペプチドを投与する段階を含む、疾患状態を治療する方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドには、配列番号：５から配列番号：３２５のいずれかから選択される連続アミノ酸少なくとも３個が含まれる。好ましい態様において、疾患状態は、真性糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム硬化症、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患、変性疾患、又は筋肉変性である。
【００２４】
本発明のもう一つの態様は、ヒト癌に対する腫瘍ターゲティングペプチドを用いる組成物および方法に関する。本出願に開示の方法によって同定されたヒト腫瘍ターゲティングペプチドは、分子または高分子群を含むがこれらに限定されない治療剤に結合させて、癌患者に投与してもよく、治療剤の有効性の増加および全身毒性の減少を提供する。本発明の範囲に含まれる治療剤には、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、細胞障害剤、細胞抑制剤、および遺伝子治療ベクターが含まれるがこれらに限定されない。そのような治療剤のヒト腫瘍への標的化送達は、腫瘍に対する薬剤の送達を増加させながら、患者の正常な臓器および組織に対する薬剤の不適切な送達を減少させることに関して、先行技術に対する有意な改善を提供する。好ましい態様において、腫瘍ターゲティングペプチドは、ファージの送達を腫瘍血管の血管新生内皮細胞にターゲティングするためにファージ遺伝子治療ベクターのカプセルに組み入れられる。
【００２５】
添付の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示す特定の態様の詳細説明と共にこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【００２６】
例示的態様の説明
本明細書において用いられるように、「一つ（ａ）」、または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書の特許請求の範囲において用いられるように、「含む」という用語と組み合わせて用いる場合、「一つ（ａ）」または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書において用いられるように、「もう一つ」とは、項目の少なくとも二番目またはそれ以上を意味してもよい。
【００２７】
「ターゲティングペプチド」とは、連続するアミノ酸配列を含むペプチドであり、ヒトの臓器、組織、または細胞型への選択的局在を特徴とする。選択的局在は例えば、推定のターゲティングペプチド配列が、ファージの外表面上に表示されるタンパク質に組み入れられる、下記に開示する方法によって決定してもよい。異なるアミノ酸配列のそのようなターゲティングペプチドを多数発現するよう遺伝学的に改変されたそのようなファージのライブラリを、ヒトに投与した後、ヒトから一つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型を収集し、その臓器、組織、又は細胞型に見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、対照の組織又は臓器と比較して、より多い結合を、その組織又は臓器において示す場合、その組織又は臓器に選択的に移行するものと見なされる。好ましくは、ターゲティングペプチドの選択的移行は、対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して２倍以上大きい濃縮を、標的の臓器、組織、又は細胞型においてもたらすであろう。又は、選択的移行を示すターゲティングペプチド配列を発現するファージは、好ましくは、標的臓器から回収されたファージを、次回のスクリーニングのため第二の宿主へと再注射した場合に、対照臓器と比較して増加した濃縮を標的臓器において示す。３回目のスクリーニングの後には、さらなる濃縮が示されうる。選択的局在を決定するもう一つの方法は、推定の標的ペプチドを発現するファージが好ましくは、非特異的ペプチドを発現する、または任意の推定の標的ペプチドを発現するように遺伝子操作されていない対照ファージと比較して、標的臓器において２倍、より好ましくは３倍またはそれ以上の濃縮を示すことである。選択的局在を決定するもう一つの方法は、標的ペプチドを発現するファージの標的臓器への局在が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの同時投与によって少なくとも部分的に阻害されることである。「ターゲティングペプチド」および「回帰ペプチド」とは、本明細書において同義に用いられる。
【００２８】
「ファージディスプレイライブラリ」とは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ファージ被膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が２０個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。
【００２９】
「高分子複合体」とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子、磁気ビーズおよび微小装置のような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。
【００３０】
ターゲティングペプチドのための「受容体」には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、「受容体」とは、標的臓器、組織、または細胞型内の血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００３１】
「被験者」とは、一般的に哺乳類を意味する。特定の好ましい態様において、被験者は、マウスまたはウサギである。さらにより好ましい態様において、被験者はヒトである。
【００３２】
ファージディスプレイ
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、および第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む（Ｓｍｉｔｈら、１９８５、１９９３）。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去１０年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体−リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。
【００３３】
ある臓器、組織、又は細胞型をターゲティングするためのアミノ酸配列は、「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」により単離されうる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。簡単に説明すると、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを動物又はヒトに投与し、ファージを含む臓器、組織、又は細胞型の試料を回収する。繊維状ファージを利用した好ましい態様においては、バイオパニングとバイオパニングの間に、線毛陽性細菌においてインビトロでファージを繁殖させることができる。この細菌は、ファージによって溶解せず、特定の挿入物をディスプレイするファージを、多コピー分泌する。標的分子と結合するファージは、標的の臓器、組織、又は細胞型から溶出させ、次いで宿主細菌において増殖させることにより増幅することができる。所望ならば増幅されたファージをヒト宿主に投与し、臓器、組織、又は細胞型の試料を再び収集してもよい。選択的バインダーの集団が得られるまで、複数回のバイオパニングを実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノムにおけるターゲティングペプチド挿入物に対応するＤＮＡを配列決定することによって決定してもよい。次に、同定されたターゲティングペプチドを標準的なタンパク質化学技術によって合成ペプチドとして産生することができる（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｓｍｉｔｈら、１９８５）。このアプローチによって、その標的の特性に関して如何なる概念も予め抱くことなく、循環中のターゲティングペプチドを偏りのない機能的アッセイにおいて検出することができる。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定されると、これを、標準的な生化学的方法を用いて単離、精製、およびクローニングすることができる（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【００３４】
ファージディスプレイ系の選択
マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、ｆＵＳＥ５ベクターにおけるＩＩＩ遺伝子被膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い一次ライブラリを用いることが好ましい（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。ライブラリの調製は、１０８〜１０９形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌのあいだで増幅されうる。好ましくは、ヒト被験者への注射用に、１０１４ＴＵ以上が一次ライブラリから調整される。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
【００３５】
直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを、本発明の範囲内で用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物（ＣＸ３−１０Ｃ）において３〜１０個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリ（ＣＸ３Ｃ Ｘ３ＣＸ３Ｃなど；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。
【００３６】
マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、小腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９により概説）。これらのモチーフには、配列ＲＧＤ−４Ｃ、ＮＧＲ、およびＧＳＬが含まれる。ＲＧＤ−４Ｃペプチドはこれまで、選択的に結合するαｖインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９７）。
【００３７】
腫瘍回帰ＲＧＤ４Ｃターゲティングペプチドの受容体は、αｖインテグリンとして同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。αｖインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導される（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｈａｍｍｅｓら、１９９６）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は最近、ＮＧＲモチーフの血管新生受容体であると同定されている（Ｂｕｒｇら、１９９９）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は、前立腺癌の新生血管および他の血管新生組織において強く発現されている。
【００３８】
腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と同時局在するが、正常組織の非新生血管には存在しない（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するが（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージ（ｆｄファージ）は、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学から、これらの受容体が多くの腫瘍細胞および活性化ＨＵＶＥＣｓにおいて発現されていることが示された（データは示さない）。血管新生受容体は、マウスまたはヒト組織の正常臓器の血管において検出されなかった。
【００３９】
これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αｖインテグリン、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＡ、ＮＧ２、および腫瘍血管における既知の受容体であるＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９は、ヒトおよびマウス起源の双方の新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する（示していない）。
【００４０】
新生血管内皮のマーカーには、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαｖインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれる（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れている（Ｗａｔｓｏｎら、１９９５）。
【００４１】
これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αｖインテグリンは、アデノウイルスの受容体であり（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７ｃ）、ＣＤ１３はコロナウイルスの受容体である（Ｌｏｏｋら、１９８９）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、エコーウイルスの受容体である（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。アミノペプチダーゼＡも同様にウイルス受容体であると考えられる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、インビボファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能を有することを示唆している。
【００４２】
標的化送達
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞障害薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。ＲＧＤ−４Ｃペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【００４３】
ＢＲＡＳＩＬ
好ましい態様において、標的臓器、組織、または細胞型の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、ＢＲＡＳＩＬ技術を用いて行う（２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号；参照として本明細書に組み入れられており、本明細書と共に提出された、Ａｒａｐ、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、およびＧｉｏｒｄａｎｏによる「選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｎｄｓ（ＢＲＡＳＩＬ））」と題する米国特許）。ＢＲＡＳＩＬ（選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析）では、水相に懸濁した、臓器、組織、または細胞型の細胞または小さい細胞塊に穏やかに分離する。水相を適当な密度の有機相の上に層にして、遠心分離する。結合したファージに接着した細胞は遠心管の底に沈殿して、未結合のファージは水相に残ったままとなる。これによって、ファージと細胞との結合相互作用を維持しながら、結合したファージを未結合のファージからより効率よく分離することができる。臓器、組織、または細胞型を静脈内投与によりファージディスプレイライブラリに曝露するようなインビボプロトコールにおいて、または、遠心分離前に水相中で細胞がファージライブラリに曝露されるようなエクスビボプロトコールにより、ＢＲＡＳＩＬを行ってもよい。
【００４４】
特定の態様において、バックグラウンドのファージ結合をさらに減少させるために、ＢＲＡＳＩＬまたは他のスクリーニングプロトコールと共にサブトラクションプロトコールを用いる。サブトラクションの目的は、関心対象の細胞以外の細胞に結合する、または非活性化細胞に結合するファージをライブラリから除去することである。もう一つの態様において、ファージライブラリは、標的細胞、組織、または臓器ではない対照細胞株、組織、または臓器に対してスクリーニングしてもよい。サブトラクションの後、ライブラリを関心対象の細胞、組織、または臓器に対してスクリーニングしてもよい。もう一つの代わりの態様において、刺激していない休止期の細胞株、組織、または臓器を、ライブラリに対してスクリーニングして、結合したファージを除去してもよい。細胞株、組織、または臓器は、例えば、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、またはケモカインを投与することによって活性化して、活性化細胞株を差し引いたファージディスプレイに対してスクリーニングする。
【００４５】
その他のサブトラクションプロトコール法が既知であり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４０，８４１号、第５，７０５，６１０号、第５，６７０，３１２号、および第５，４９２，８０７号に開示されるように本発明の実践において用いてもよい。
【００４６】
大規模一次ファージライブラリの調製
好ましい態様において、一次ファージライブラリは、ヒト対象への注射の前に増幅される。ファージライブラリは、ターゲティングペプチドコーディング配列を、ｆＵＳＥ５のようなファージベクターに連結することにより調製される。ベクターを、ＭＣ１０６１のような線毛陰性宿主大腸菌へと形質導入する。細菌を、一晩増殖させ、次いでその一部を凍結させ、ライブラリ作製のためのストックを得る。線毛陰性細菌の使用は、異なるターゲティングペプチド配列による線毛陽性細菌の差異のある（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）感染から生じるライブラリのバイアスを回避する。
【００４７】
凍結のため、一次ライブラリ培養物（５リットル）の３分の２から、４０００×ｇで１０分間、細菌をペレット化する。細菌を再懸濁させ、５００ｍｌの１０％グリセロール水溶液で２回洗浄し、次いでエタノール／ドライアイス浴中で凍結させ、−８０℃で保存する。
【００４８】
増幅については、１．５ｍｌの凍結細菌を、５リットルの２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢ培地へと接種し、一晩増殖させる。接種から３０分後に、培養物の生存率を確認するため、段階希釈物をＬＢ／ｔｅｔプレートに播く。生存細菌数がライブラリ中の個々のクローンの数（１〜２×１０８）の５倍〜１０倍より少ない場合には、培養物を廃棄する。
【００４９】
細菌培養物を一晩増殖させた後、ファージを沈殿させる。細菌培養物の約１／４〜１／３を５リットルの新鮮培地中で一晩維持して増殖させ、そのサイクルを最大５回繰り返す。全てのサイクルからファージをプールし、ヒト対象への注射のため使用する。
【００５０】
ヒト
マウスモデル系におけるファージディスプレイバイオパニングに使用される方法は、ヒトで使用するには実質的な改良を必要とする。これらの改良を開示している、ヒト患者で使用されるファージディスプレイプロトコルの好ましい例は、下記の実施例１及び実施例２に詳細に記載される。
【００５１】
一般に、ファージディスプレイで使用するのに適したヒトは、脳死患者又は終末離脱患者である。投与に必要とされるファージライブラリ（好ましくは、一次ライブラリ）の量は、好ましくは１０１４ＴＵ以上へと大きく増加させなければならず、好ましくは約２００ｍｌのリンゲル乳酸溶液に入れられて約１０分かけて静脈内に投与される。
【００５２】
ヒトにおける使用に必要とされるファージの量は、マウスプロトコルの改良を必要し、注射に利用可能なファージの量は５桁増加する。そのような大きなファージライブラリを作製するには、最大５００個〜１０００個の形質転換体から回収された形質導入された細菌ペレットを、細菌宿主において１０倍にまで増幅し、各増幅からファージを回収し、さらなるファージの収集のため、ＬＢ Ｔｅｔ培地を細菌ペレットに添加する。これらの条件下でファージ挿入物は安定なままであり、ファージは、ヒトにとって必要とされる大きなファージディスプレイライブラリを形成させるためにプールされうる。
【００５３】
ファージライブラリの注射後、約１５分後から、様々な臓器及び組織の試料が収集される。試料は、下記のように処理され、ターゲティングペプチドのアミノ酸配列を決定するためのＤＮＡ配列決定のため、目的の各臓器、組織、又は細胞型からファージが収集される。
【００５４】
ヒトの場合、マウスモデル系と比較して、複数回のバイオパニングによる濃縮の機会が大きく制限されている。バイオパニング技術の実質的な改良は、多臓器ターゲティングを含む。
【００５５】
多臓器ターゲティング
ファージディスプレイバイオパニングのための標準的なプロトコルにおいては、単一の臓器からファージが収集され、増幅され、次の宿主に注射され、ファージレスキュー及び新しいバイオパニングのため、同じ臓器から組織が収集される。このプロトコルは、動物対象においては実施可能である。しかしながら、ヒト由来の試料の入手可能性は限定されており、その処理には大きな費用がかかることから、プロトコルの改良が必要とされる。
【００５６】
好ましい態様において開示され、下記の実施例３に記載されるように、１回目のバイオパニングの後、複数の臓器から収集されたファージをプールし、プールされた試料を新しい対象に注射し、再びファージレスキューのため複数の臓器を収集することが可能である。多臓器ターゲティングプロトコルは、所望の回数のバイオパニングのため繰り返されうる。この様式においては、臓器回帰ファージの実質的な濃縮を達成しつつ、複数の臓器に対するターゲティングペプチドの単離に必要な対象の数を有意に減少させることが可能である。
【００５７】
好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリのヒト対象への注射の後、ファージは、ヒトの臓器、組織、又は細胞型から回収される。ある種の態様において、ファージは、臓器、組織、又は細胞型の試料を、大腸菌Ｋ９１のような線毛陽性細菌へと曝すことにより回収されうる。別の態様において、ファージは、ファージ挿入物を増幅し、挿入物をファージＤＮＡに連結し、そして連結したＤＮＡから新しいファージを作製することにより回収されうる。
【００５８】
タンパク質とペプチド
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸２００個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；アミノ酸１００個以上のポリペプチド；および／またはアミノ酸約３〜約１００個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５９】
特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において用いられるように、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００６１】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸２０個の少なくとも一つ、または下記の表１に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれな（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００６２】
【表１】改変アミノ酸およびまれなアミノ酸
2004533803.tif 000002
【００６３】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅および／または発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。
【００６４】
ペプチド模倣体
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ペズット（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ニューヨーク（１９９３）内、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、「ペプチド折り返し模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
【００６５】
融合タンパク質
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、Ｎ末端またはＣ末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後のさらなるポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞抑制タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
【００６６】
タンパク質の精製
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために（または均一になるまで精製）、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２０６，３４７号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、速いタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣである。
【００６７】
精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。
【００６８】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、「〜精製倍率」によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００６９】
タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。
【００７０】
タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製「倍率」が得られるであろうと認識される。相対的なより低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収、または発現されたタンパク質の活性を維持するために長所を有する可能性がある。
【００７１】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度等の変化）、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。
【００７２】
合成ペプチド
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９８４；タム（Ｔａｍ）ら、１９８３；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９８６；およびバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９７９を参照のこと。通常、アミノ酸約６個から約３５〜５０個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型ＤＮＡ技術を用いてもよい。
【００７３】
抗体
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、共役、または化学的に結合させてもよい。これは、双特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００７４】
「抗体」という用語は、抗原決定領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である（例えば、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００７５】
サイトカインとケモカイン
特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ムレリアン阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経生長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにＬＴが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
【００７６】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。
【００７７】
造影剤と放射性同位元素
特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器、組織、または細胞型を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である（例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０２１，２３６号および第４，４７２，５０９号を参照のこと）。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの結合物は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
【００７８】
造影剤として用いられる可能性がある常磁性イオンの非限定的な例には、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影のような他の状況において有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特にビスマス（ＩＩ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７９】
造影剤または治療剤として用いられる可能性がある放射性同位元素には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ユーロピウム、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５硫黄、テクネチウム９９ｍ、およびイットリウム９０が含まれる。１２５Ｉは、特定の態様における使用に好ましいことが多く、テクネチウム９９ｍおよびインジウム１１１も同様に、低エネルギーであって、長い範囲の検出に適しているため、好ましいことが多い。
【００８０】
本発明の放射活性標識タンパク質またはペプチドは、当技術分野で周知の方法に従って産生してもよい。例えば、それらは、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤と接触させることによってヨウ化することができる。本発明によるタンパク質またはペプチドは、リガンド交換プロセスによって、例えば、ペルテクネートをスズ溶液によって還元して、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化して、ペプチドをこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えばペルテクネート、ＳＮＣｌ２のような還元物質、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることによって、テクネチウム９９ｍによって標識してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素に結合するために用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィンを含む蛍光標識も同様に用いることが考慮される。
【００８１】
特定の態様において、主張されるタンパク質またはペプチドは、色素産生基質に接触させると着色産物を生じる二次結合リガンドまたは酵素（酵素タグ）に結合してもよい。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の利用は当業者に周知であり、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００８２】
架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的置換基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
【００８３】
リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６０３，８７２号、および米国特許第５，４０１，５１１号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む微小乳化リポソーム（ＭＥＬ）および大きい単層リポソーム（ＬＵＶＥＴ）のような多層小胞（ＭＬＶ）または単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにＰＥを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、１級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のようなリガンドは、ＰＥ−リポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。
【００８４】
もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する（特にその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８８９，１５５号）。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。
【００８５】
核酸
本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または合成ＤＮＡに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
【００８６】
本明細書において用いられる「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子と共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。
【００８７】
ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である（下記の表２を参照のこと）。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。
【００８８】
【表２】
2004533803.tif 000003
【００８９】
所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約５０℃〜約７０℃で約０．０２ Ｍ〜約０．１５ Ｍ ＮａＣｌによって提供される条件のように、低い塩および／または高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。
【００９０】
クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳類起源の双方からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
【００９１】
調節要素
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。
【００９２】
関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。このように、ヒト細胞が標的となる場合、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接してその制御下にあるように核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に、そのようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかが含まれてもよい。
【００９３】
様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳類の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。
【００９４】
ｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。
【００９５】
選択マーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【００９６】
発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳類細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
【００９７】
外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが順応することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。複製欠損ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。
【００９８】
ウイルス送達系を用いる場合、それがベクター構築物を受け入れる細胞、動物または個体において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する好ましい手段は、塩化セシウム勾配遠心のような懸濁密度勾配を用いることを含む。
【００９９】
遺伝子ベクターとして用いられるＤＮＡウイルスは、パポバウイルス（例えば、シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）が含まれる。
【０１００】
インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）その中にクローニングされているアンチセンスまたはセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味するがこれらに限定されない。
【０１０１】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、３６ ｋｂの直線状の二本鎖ＤＮＡウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片を７ｋｂまでの外来配列に置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスＤＮＡがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおける急性呼吸器疾患のようにごく軽度の疾患に関係していると考えられる。
【０１０２】
アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００塩基対〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断（Ｒｅｎａｎ、１９９０）に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。ＭＬＰ（１６．８ ｍ．ｕ．に存在）は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのｍＲＮＡは、５’−３連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいｍＲＮＡとなる。
【０１０３】
現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【０１０４】
複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないため（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３、または双方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃら、１９９１）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂの余分のＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換可能な約５．５ ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は７．５ ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞障害性の原因となる。同様に、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度（ＭＯＩ）で認められる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０１０５】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容される他の哺乳類種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。考察したように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１０６】
レイチャー（Ｒａｃｈｅｒ）ら（１９９５）は、２９３細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地１００ ｍｌ〜２００ ｍｌを含む１Ｌのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。４０ ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラ−セル微小担体（５ ｇ／ｌ）（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔａｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を以下のように用いる。培地５ｍｌに再懸濁させた細胞接種物を２５０ ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ ｍｌ）に加えて、時折攪拌しながら１時間〜４時間静置した。次に、培地を新鮮な培地５０ ｍｌに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の２５％）、アデノウイルスをＭＯＩ ０．０５で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を１００％まで増加させて、振とうをさらに７２時間行う。
【０１０７】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型４２個またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、５型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。
【０１０８】
本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。このように、Ｅ１コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）ら、１９８６によって記載されるようにＥ３置換ベクターにおいて欠失されたＥ３領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補う場合にはＥ４領域の代わりに挿入してもよい。
【０１０９】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。
【０１１０】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）に用いられている。動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位注射（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。
【０１１１】
他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換できることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次に、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１１２】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウムによって）、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分割を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１１３】
レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、今では新しいパッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１１４】
他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１１５】
発現構築物を培養哺乳類細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。
【０１１６】
本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も考慮される。
【０１１７】
リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝腫細胞において外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【０１１８】
ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐａｒｔ細胞においてそれぞれ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを選択するための基礎として用いることができる。
【０１１９】
薬学的組成物
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬剤を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【０１２０】
一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。
【０１２１】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路を介する。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１２２】
注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。
【０１２３】
注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１２４】
治療剤
特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にＤＮＡ損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水溶性型）、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る：アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。
【０１２５】
化学療法剤および投与方法、用量等は、当業者に周知であり（例えば、関連部分が参照として本明細書に組み入れられる、「医師用添付文書集」、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、および「レミントンの薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、を参照のこと）、本明細書に開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。用量の何らかの変更は、治療すべき被験者の状態に応じて必要に応じて起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者に関して適当な用量を決定するであろう。特定の化学療法剤および用量レジメの例も同様に本明細書に記載する。当然、これらの用量および物質および投与レジメは全て、制限するためではなく一例であって、特定の患者または適用に関して当業者は他の用量または物質を用いてもよい。これらの点のあいだの任意の用量、またはそこから誘導されうる範囲も同様に、本発明において用いられると予想される。
【０１２６】
アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムＤＮＡと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬剤である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての相に影響を及ぼす、すなわちそれらは相特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
抗代謝剤
抗代謝剤はＤＮＡおよびＲＮＡ合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のＳ期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２８】
天然物
天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。
【０１２９】
分裂阻害剤には、細胞分裂または分裂に必要ないずれかのタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然物が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期において作用する。分裂阻害剤には、例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１３０】
タキソイドは、トネリコ（ａｓｈ）の木であるタクサス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮から単離された関連化合物の一種である。タキソイドにはドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。パクリタキセルはチューブリンに結合して（ビンカアルカロイドによって用いられるものとは異なる部位で）、微小管の集合を促進する。
【０１３１】
ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有すると同定された植物アルカロイドのタイプである。それらには、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのような化合物が含まれる。
【０１３２】
抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞障害活性の双方を有する。これらの薬剤はまた、酵素および分裂を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、ＤＮＡを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミスラマイシン）、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３３】
ホルモン
コルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法剤と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。
【０１３４】
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳房の癌において用いられてきた。ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、乳房および前立腺のような癌に用いられている。タモキシフェンのような抗エストロゲン剤は、乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンも同様に、乳癌の治療に用いられてきた。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺癌の治療に用いられている。リュープロリドのようなゴナドトロピン放出ホルモン類似体は、前立腺癌の治療に用いられている。
【０１３５】
雑多な物質
いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。
【０１３６】
白金配位複合体には、カルボプラチンおよびシスプラチン（シス−ＤＤＰ）のような化合物が含まれる。
【０１３７】
ミトキサントロンのようなアントラセンジオンは、急性顆粒球白血病および乳癌の治療に用いられている。ヒドロキシウレアのような置換ウレアは、慢性顆粒球白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、および悪性黒色腫を治療するために用いられている。プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）のようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。ミトタンのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質癌を治療するために用いられており、アミノグルテチミドは、ホジキン病を治療するために用いられている。
【０１３８】
プログラムされた細胞死の調節物質
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発達の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスである（Ｋｅｒｒら、１９７２）。Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーおよびＩＣＥ−様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしている（Ｂａｋｈｓｈｉら、１９８５；ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。
【０１３９】
その発見後、Ｂｃｌ−２は、様々な刺激によって誘発された細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するＢｃｌ−２細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２と類似の機能（ＢｃｌＸＬ、Ｂｃｌｗ、Ｂｃｌｓ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）を有するか、またはＢｃｌ−２機能を相殺して細胞死を促進するか（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）のいずれかであることが示されている。
【０１４０】
本発明の範囲内で考慮されるアポトーシス促進剤の非限定的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２、（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２、（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２、（配列番号：３）、または（ＫＬＧＫＫＬＧ）３、（配列番号：４）が含まれる。
【０１４１】
血管新生阻害剤
特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤（例えばＳＵ５４１６またはＳＵ６６６８、Ｓｕｇｅｎ製、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリンのような抗血管新生剤に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。
【０１４２】
用量
当業者は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、第３３章、特に６２４頁〜６５２頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、ＦＤＡの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【０１４３】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【０１４４】
実施例１． ヒト患者を使用したファージディスプレイライブラリによるバイオパニング
本発明の方法及び組成物のいくつかは、インビボバイオパニングによるヒトの臓器、組織、又は細胞型に対するターゲティングペプチドの同定に関する。一般的に、マウスのような動物対象において使用されるプロトコルは、ヒトには適していない。さらに、ヒトプロトコルにおいては、倫理に関する考慮が大きな役割を果たす。以下の新規な方法は、ヒトでの使用にとって好ましいが、当業者であれば、本明細書に開示された方法及び組成物の改変が、本発明の範囲内で使用されうることを理解するであろう。
【０１４５】
ヒト調製物
組み入れ基準及び除外基準に従い、プロトコルのための患者を選択した。組み入れ基準には、以下が含まれる：（１）法的に宣言された脳死患者又は終末離脱患者であること；（２）看護及び／又は治療を行っている医師の承認が得られていること；並びに（３）患者の法的責任を有する家族により署名されたインフォームドコンセント文書が得られていること。排除基準は以下であった：（１）責任を有する家族が存在しないこと；（２）ＨＩＶ陽性患者であること；（３）活動性結核感染を有する患者であること；（４）急性もしくは慢性のＢ型もしくはＣ型の肝炎に感染していること；又は（５）患者が臓器移植ドナーとしての可能性を有すること。好ましい態様において、ペプチド表示ライブラリのために使用されるファージを繁殖させるために使用される細菌宿主に対する有害な効果を回避するため、患者は、過去少なくとも６時間、好ましくは２４時間、抗生物質を与えられていなかった。
【０１４６】
インフォームドコンセントが得られた後、患者に手技のための準備を施す前に、患者の親族には、患者がいる部屋から退室するよう求めた。患者は、ファージライブラリの適用のチャンネルを通って生理食塩水のみが流動している、流動性の高いＩＶライン（好ましくは、中央）を有してした。手技のため必要とされる人員に通知した（即ち、介入放射線科医、内科医、外科医、看護婦、可能であれば神経科医又は神経放射線科医）。生検に必要な材料（骨髄吸入針、腰椎穿刺キット、皮膚生検キット、肝臓、脂質、及び腫瘍のような標的化ペプチド同定のために使用される任意の臓器、組織、又は細胞型の生検標本を採取するための材料、経腹前立腺生検のための材料、血液試料のための４０ｍｌの生理食塩水を含む５０ｍｌシリンジ、ヘパリンを含む１０ｍｌチューブ、並びに実験室試験用の血液試料を採取するための１０ｍｌ血清収集チューブ）を収集した。注射の日からの試験結果が得られていない場合には、ファージライブラリ注射の前に、肝機能、重炭酸塩、電解質、及び血球数のルーチンのスクリーニングのため血液試料を採取した。
【０１４７】
実験室において、ＬＢ−ｔｅｔ／ｋａｎ寒天を含む１２０個の大シャーレ（ｄｉｓｈ）、及び２００個の正規ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレート（１００ｍｍ）を調製した（テトラサイクリン濃度＝４０μｇ／ｍｌ、カナマイシン濃度＝５０μｇ／ｍｌ）。大腸菌Ｋ９１ ｋａｎを、各１０ｍｌのＴＢ培地＋補助剤を含む１０個の独立したチューブで増殖させた。細菌の増殖は、生検開始の約１５分〜６０分前に開始させた。約１０１４ＴＵの（好ましくは一次）ファージライブラリを室温で２００ｍｌのリンゲル乳酸で希釈し、必ずしも無菌ではないが清潔な条件下で、４個の５０ｍｌシリンジへと吸引した。ＬＢ−ｔｅｔ／ｋａｎシャーレ又はプレートを３７℃インキュベーター内で加温した。１リットルの０．２μｇ／ｍｌ ｔｅｔ及び１００μｇ／ｍｌ ｋａｎを含むＬＢ培地を３７℃の水浴中で加温した。４０μｇ／ｍｌ ｔｅｔ及び１００μｇ／ｍｌ ｋａｎを含む１リットルのＬＢ培地を３７℃に加温し、さらに８リットルを室温で調製した。３０個のＡサイズ及びＢサイズのガラスグラインダー及び適当なガラスチューブをオートクレーブ処理した。生検標本が採取される臓器１種類につき３個の５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブを調製した。チューブに１０ｍｌのＤＭＥＭ−ＰＩ（ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ）を充填し、組織収集の約１５分前に氷上に置いた。組織試料が収集された後、実験室を引き継ぐ４つのチームのため、臓器試料を刈り込み、分割し、又は切り刻むためのオートクレーブ処理済み外科器具（すなわち、少なくとも１個の鉗子、並びに１対のハサミ及びメス）を、各１セット調製した。
【０１４８】
ファージライブラリの注射
ファージライブラリ適用のためのポートを通って流動する全ての薬物を、ライブラリの注射の間は中止した。患者の血行力学的安定性が損なわれることなく可能であれば、異なるポートを通って流動する全てのＩＶ薬物を、同様にライブラリの注射の間は中止した。流動生理食塩水注入は、注射の間、ライブラリ注射用のＩＶラインが開いており、流動し続けることを保証した。
【０１４９】
呼吸（機械的に換気されていない場合）、心拍数、及び血圧のような患者の生命機能をモニタリングし、実験計画をたて（ｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎｇ）、２００ｍｌのライブラリ溶液を１０分かけて手動で注射した。ラインの閉塞を示す、流動生理食塩水注入の滴下の停止が起こった場合には、注射を停止させた。注射の開始後１５分目、組織試料収集（生検）を開始した。好ましい生検部位には、骨髄吸引物、肝臓、前立腺、皮膚、骨格筋、腫瘍（適用可能である場合）、脂肪組織、血液（陽性対照として）、血液（赤血球／白血球のため）、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれていた。
【０１５０】
細菌の混入を減少させるため、無菌ではないにしても清潔な条件下で、試料を採取した。可能な限り、異なる試料を同時に採取した。小さい試料の場合には、３通りの生検が好ましかった。注射開始から特定の組織試料の収集までの経過時間を記録した。組織試料は、ＤＭＥＭ−ＰＩを含む準備された５０ｍｌチューブに置き、氷上で保存した。骨髄については、血液と対立するものとして骨髄の吸引物を確認するため、４０ｍｌ生理食塩水で希釈された試料に加えて、通常の診断用試料（ヘパリンを含むシリンジへ希釈されない）を採取した。必要に応じて、組織試料の除去後、抗生物質を含む全てのＩＶ薬物を続行した。
【０１５１】
３通り採取された臓器試料以外は、３個の異なる組織片を得るため、清潔な条件下で分割した。各臓器の３個の試料を、以下のようにして取り扱った。１個はバックアップとして−８０℃で保存した。１個は、試料が目的の臓器を含むことを確認するため、凍結切片を切り出し（又は骨髄については塗沫を作成し）、ＨＥ染色（骨髄についてはパッペンハイム染色）及びファージ染色を実施するため、組織学／病理学の部門へと転送された。いくつかの場合には、組織学試料を、通常のＨＥ染色用、及びＬＣＭ（レーザー捕獲顕微鏡（ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ））又はＬＰＣ（レーザー圧力射出（ｌａｓｅｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃａｔａｐｕｌｔｉｎｇ））用の２個へと分割した。最初の３個のうちの最後のものは、ファージを回収するための細菌感染用に処理した。
【０１５２】
バックアップ組織を凍結させ、病理学用の材料を取り分けた後、ファージレスキューのための試料を計量した。試料は、常に氷上に維持した。試料をガラスチューブ内の１ｍｌのＤＭＥＭ−ＰＩへと移し、グラインダーでホモジナイズした。骨髄、血液、又はＣＳＦのようないくつかの臓器は、ホモジナイゼーションを必要としなかったが、筋肉のような他の臓器は、効率的にホモジナイズされうる前に切り刻む必要があった。血液試料については赤血球の溶解が好ましかった。ホモジナイズされた試料を、オートクレーブ処理された２ｍｌエッペンドルフチューブへと移した。
【０１５３】
組織試料をＤＭＥＭ−ＰＩと混合し、３０秒間ボルテックス処理することにより、組織試料を、１％ＢＳＡを含む氷冷ＤＭＥＭ−ＰＩで３回洗浄した。４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、組織ペレットには触れないように、上清を注意深く廃棄した。ペレットの表面には、少量の培地が残っていた。試料を３０秒間再びボルテックス処理した後、組織の再懸濁を容易にするためさらなる培地を添加した。１．５ｍｌのＤＭＥＭ−ＰＩ＋ＢＳＡを添加した後、試料を再び遠心分離した。複数の試料を処理する場合には、組織を、常に氷上に維持した。
【０１５４】
３回の洗浄後、ペレットを短時間ボルテックス処理し、溶解したペレットを短時間３７℃に加温した後、細菌を添加した。洗浄された組織試料を１．５ｍｌのコンピテントＫ９１−ｋａｎ細菌（１：１０希釈率でＯＤ６００ ０．２）と共に室温で１時間インキュベートし、次いで１０ｍｌの０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地を含むファルコンチューブへと移した。ＲＴで２０分後、複数のアリコートを、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレート又はシャーレに播いた。以下の量（臓器試料１個当たり）を播いた：２個のシャーレには３ｍｌ；２個のシャーレには１ｍｌ；３個のシャーレには３００μｌ；３個のシャーレには１００μｌ；３個のシャーレには３０μｌ。
【０１５５】
ビーズ表面に捕捉された可能性があるファージ感染細菌クローンを全て回収するため、播種に使用されたビーズを、続いて２個の１０ｃｍ ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレートへと継代した。シャーレを３７℃で一晩インキュベートした。
【０１５６】
残りの２ｍｌ〜３ｍｌの感染培養物（ホモジナイズされた組織を含む）を、１０ｍｌの４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎ）へと移し、３７℃で２時間振とうした。この約１２ｍｌの培養物を、１リットルのＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎへと移し、３７℃の振とう器で一晩増殖させた。
【０１５７】
翌日、標準的なプロトコルに従い、バルク増幅された細菌培養物からファージをレスキューし、可能性のある２回目のインビボ選択のため取り分けた。インキュベーター内のプレート／シャーレから、播種された各臓器につき１５００個のよく分離しているコロニーを選出し、１ウェル当たり２０μｌのＰＢＳを含む９６穴プレートへ配列決定のため移した。これは、選出されたコロニーの約３分の２の読み取りから、１０００個の配列が得られることを想定したものである。
【０１５８】
１５００個のコロニーを選出した後、シャーレ／プレート上の残りのコロニーを、１０００ｍｌのＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎ中で３７℃振とう器内で一晩増殖させた。次いで、ファージを、２回目の選択のため、前記と同様に採集した。又は、プレートを冷蔵庫に保存し、１０００個〜２０００個の各コロニーを一度に増殖させた。又は、残りのコロニーをＰＢＳへと移し、必要に応じて感染及び増幅を行うため凍結保存した。
【０１５９】
以下に開示されるように、本発明を使用したインビボバイオパニングにより、ヒトの臓器、組織、及び細胞型に選択的なターゲティングペプチドの多数の非限定的な例が同定された。本発明の方法を使用したヒトバイオパニングの非限定的な例は、本発明により同定されたターゲティングペプチド配列と共に、実施例３に開示される。
【０１６０】
実施例２． インビボファージディスプレイによるヒト血管系のマッピング
ヒト対象においてファージライブラリをスクリーニングするため、インビボ選択法を使用した。ヒトの骨髄、脂質、骨格筋、前立腺、又は皮膚へと移行したペプチドの内部の４７，１６０個のトリペプチドモチーフを調査するため、パターン認識分析プログラムを使用した。この大規模なスクリーニングの結果は、異なる臓器への循環ペプチドモチーフの分布がランダムではないことを示した。各組織において濃縮されたペプチドモチーフのハイスループット分析は、差示的に発現した血管受容体への候補リガンドに存在する配列との類似性を明らかにした。
【０１６１】
これらのデータは、ヒト血管系のリガンド受容体マップの構築のための大きな前進であり、標的化療法の開発にとって広範な意義を有している可能性がある。多くの治療標的は、血管内皮の極めて限定された（しかし、高度に特異的かつ到達可能な）位置に発現する可能性がある。ハイスループットＤＮＡ配列決定又は遺伝子アレイにおいては、通常、細胞の位置、並びに解剖学的及び機能的環境が考慮に入れられないため、これらの手法では、介入のための可能性のある標的が見落とされる可能性がある。本発明に開示されたヒトインビボファージディスプレイスクリーニング法は、様々な疾患状態に対する高度に選択的な療法のための基礎を提供しうる、天然に存在するリガンド−受容体対の同定に、唯一、適している。
【０１６２】
材料及び方法
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（Ｂ細胞悪性疾患）を有すると診断された４８歳の男性カフカス人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）患者は、脾臓摘出、全身化学療法（フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ミトキサントロン、及びデキサメタゾン）、及び免疫療法（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）による治療を以前に受けていた。承認前の数ヶ月、疾患は難治性となり、腹膜後リンパ節腫脹、汎血球減少症、及び顕著な腫瘍細胞による骨髄浸潤を含む臨床的な進行が起こった。血小板減少症の二次性の大量の頭蓋内出血が認められた。迅速な開頭術及び頭血腫の外科的な排除にも関わらず、患者は、独立した臨床神経科医により評価されるような、脳に基づく死亡の決定のための正式な基準を満たすまで、昏睡状態のままであり、脳幹機能の進行性の不可逆性の欠損が起こった。進行した癌のため、患者は移植臓器ドナーとしては拒絶された。代理のインフォームドコンセント文書を法的近親者より得た後、インビボファージディスプレイを実施した。
【０１６３】
インビボファージディスプレイ
ＣＸ７Ｃ（Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）ファージディスプレイランダムペプチドライブラリの大規模調製を、可能な限り高い挿入物多様度が作出されるよう最適化した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）。ライブラリの多様度は、約２×１０８であり、その最終力価は約１０１２形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌであった。ファージライブラリ（１００ｍｌの生理食塩水に懸濁した全用量１０１４ＴＵのファージ）の患者への短時間静脈注入の後、複数の代表的な組織生検を行った。前立腺及び肝臓の試料は、超音波案内の下、針生検により得た。皮膚、脂質組織、及び骨格筋の試料は、外科的切開により得た。骨髄の針吸引物及びコア生検標本も得た。組織病理学的診断は、ベッドサイドで得られた組織から処理された凍結切片を検査することにより決定した。
【０１６４】
宿主細菌感染、ファージ回収、及び組織病理学的分析のため、３通りの試料を処理した。簡単に説明すると、組織を計量し、ガラスのＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで磨砕し、１ｍｌのプロテイナーゼ阻害剤含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−ｐｒｉｎ；１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、及び１μｇ／ｍｌロイペプチン）に懸濁させ、ボルテックス処理し、ＤＭＥＭ−ｐｒｉｎで３回洗浄した。ヒト組織ホモジネートを１ｍｌの宿主細菌（対数増殖期の大腸菌Ｋ９１ｋａｎ；ＯＤ６００が約２）と共にインキュベートした。細菌培養物の一部を、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天プレートに播いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。細菌コロニーを、各組織及び各未選択ファージライブラリから回収されたファージ挿入物の配列決定のため処理した。ヒト試料は、血液及び体液に関するユニバーサルプレコーションに従い取り扱った。
【０１６５】
統計分析
ハイスループット特性パターン認識プログラム（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）は、ファージスクリーニングから得られたペプチドモチーフの分析を自動化するために開発された。ＳＡＳ（バーション８、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及びＰｅｒｌ（バージョン５．０）を使用することにより、プログラムは、徹底的なアミノ酸残基配列計数を行い、両方向の全ての可能性のあるｎ３個の重複トリペプチドモチーフを表しているＮ個の別個のトリペプチドモチーフの相対頻度を追跡する（Ｎ≪ｎ３）。これは、各標的組織及び未選択ＣＸ７Ｃランダムファージディスプレイペプチドライブラリから回収されたファージに適用された。
【０１６６】
「ｐ」を完全無作為の下で特定のトリペプチドモチーフが観察される確率と定義し、ｑ＝１−ｐとすると、ｎ３個の全トリペプチドモチーフ配列のうち特定のトリペプチドモチーフとして特徴決定されたＫ個の配列が観察される確率は二項確率である（ｎ３， ｐ）。その確率は、式；ｐＫ＝Φ［（ｋ＋１）／ｓｑｒｔ（ｎ３ ｐｑ）］−Φ［ｋ／ｓｑｒｔ（ｎ３ ｐｑ）］（式中、Φは累積ガウス確率である）により近似されうる。ｐＫという値は、特定のトリペプチドモチーフの正確にＫ個の配列の観察の完全無作為性についての試験において、Ｐ値として処理されうる。しかしながら、この試験は、実際には得ることが困難な、ｐの真の値の正確な知識を必要とする。
【０１６７】
スクリーニングにおいて濃縮されたモチーフを同定するため、各組織内の各トリペプチドモチーフの計数を、未選択ライブラリ内のトリペプチドモチーフの計数と比較した。ＣＸ７Ｃペプチド挿入物から出発して、リフレクション（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）及びシングルボーティング（ｓｉｎｇｌｅ−ｖｏｔｉｎｇ）の制限のみを受ける、全ての重複内部トリペプチドモチーフの計数を記録した。単一トリペプチドモチーフ（又は、反映されたトリペプチドモチーフ）には、ペプチドを２回以上寄与させなかった。各ペプチドは、５個のトリペプチドモチーフに寄与した。トリペプチドモチーフの計数を、組織内に固定化されている全てのモチーフの総数に対し調整した。ある計数の割り当ての連関の有意性は、フィッシャーの直接法（片側）により査定した。Ｐ＜０．０５の場合に、結果を統計的に有意であると見なした。要約すると、分布の無作為性を試験するため、各標的からの特定のトリペプチドモチーフの相対頻度を、未選択ライブラリからのモチーフの頻度と比較した。この手法は、大規模な分割表連関試験である。
【０１６８】
結果
ヒトファージディスプレイバイオパニングにおいて従った一般的な手法が、図１Ａに図示されている。ヒト対象を用いたバイオパニングの場合には、マウス研究において使用される比較的小規模なライブラリと比較して、大規模なファージディスプレイライブラリ（約２×１０８という多様度）の使用が、有利である。従ったプロトコルは、前記の通りであった。
【０１６９】
極めて大規模にファージディスプレイランダムペプチドライブラリを作製すること、及び全身循環系を介してインビボで異なるヒト臓器へと回帰するファージクローンを選択することの実施可能性が、図１Ｂに示されている。脂質、皮膚、骨髄、骨格筋、前立腺、及び肝臓へと移行するファージを、ヒト対象から回収した（図２参照）。これは、ヒトにおけるインビボファージディスプレイの実施可能性の最初の証明である。
【０１７０】
静脈投与後に特異的部位へと回帰するペプチド挿入物の分布を決定するため、各標的組織からの全てのトリペプチドモチーフの相対頻度を、未選択ライブラリからの頻度と比較した。５個の組織（骨髄、脂質、骨格筋、前立腺、及び皮膚）の代表的な試料、及び未選択ライブラリから回収された４，７１６個のファージ挿入物を分析した。３アミノ酸残基は、構造形成及びタンパク質−タンパク質相互作用のための最小の枠組みを提供すると考えられるため、ファージ挿入物分析にはトリペプチドモチーフを選択した（Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏら、２００１）。生化学的認識単位及びトリペプチドリガンドモチーフの受容体との結合の例には、インテグリンに対するＲＧＤ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）、ＬＤＶ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）、及びＬＬＧ（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２００１）、アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３に対するＮＧＲ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００）、並びにメンブレンジペプチダーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ）に対するＧＦＥ（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）が含まれる。
【０１７１】
分析された各ファージ挿入物は、７アミノ酸残基を含有しており、５個の可能性のあるトリペプチドモチーフに寄与した。反映を考慮に入れ、全部で４７，１６０個のトリペプチドモチーフを調査した。ある臓器におけるモチーフ頻度の、未選択ライブラリにおける頻度との比較は、ペプチド分布の非ランダム性を示した（表３）。インビボスクリーニングは１回しか実施されなかったことから、これは、特に注目すべきことである。組織において濃縮されたトリペプチドモチーフの中には、単一の部位において濃縮されたものもあり、複数の部位において濃縮されたものもあった。データは、組織特異的に回帰するペプチドもあれば、いくつかの組織へとターゲティングされるペプチドもあることと一致している。
【０１７２】
【表３】ヒトにおけるインビボファージディスプレイにより単離されたペプチドモチーフ
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【０１７３】
表３には、標的臓器から単離され、未選択ファージライブラリからは単離されなかったペプチドに存在しているモチーフが挙げられている（フィッシャーの直接法、片側；Ｐ＜０．０５）。臓器１個当たりの分析されたペプチド配列の数は、未選択ライブラリが４４６個；骨髄が５２１個；脂質が９０１個；筋肉が８５０個；前立腺が１０１８個；皮膚が９８０個であった。星型は、単一の組織においてのみ濃縮されたモチーフを示す。略号Ｎ／Ａは適用不可を意味する。
【０１７４】
骨髄（ＧＧＧ、配列番号：５；ＧＦＳ、配列番号：６；ＬＷＳ、配列番号：１３０）、脂肪組織（ＥＧＧ、配列番号：７；ＬＳＰ、配列番号：８；ＬＬＶ、配列番号：９）、骨格筋（ＬＶＳ、配列番号：１０）、前立腺（ＡＧＧ、配列番号：１１）、及び皮膚（ＧＲＲ、配列番号：１２；ＧＧＨ、配列番号：１３；ＧＴＶ、配列番号：１４）を含むトリペプチドモチーフは、特異的なヒトの臓器、組織、又は細胞型にターゲティングされると考えられた（図２Ａ、表３）。複数の臓器、組織、又は細胞型にターゲティングされると考えられたトリペプチドモチーフには、ＧＶＬ（配列番号：１５）、ＥＧＲ（配列番号：１６）、ＦＧＶ（配列番号：１７）、ＦＧＧ（配列番号：１８）、ＧＥＲ（配列番号：１９）、ＳＧＴ（配列番号：２０）、及びＡＲＬ（配列番号：２１）が含まれる（図２Ｂ、表３）。これらの各モチーフは、未選択ファージディスプレイライブラリと比較して統計的に有意な、一つ又は複数の標的の臓器、組織、又は細胞型への移行を示した。
【０１７５】
最初のトリペプチドモチーフを含む７アミノ酸残基の環状ファージペプチド挿入物を分析するため、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＥＭＢＬ）を使用した。分析は、特定の臓器から単離された複数のペプチドに共有されている４〜６残基モチーフを明らかにした（図２Ａ、表４）。各モチーフを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ＃ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄａｔａｂａｓｅｓ）を介して、オンラインデータベース（ＢＬＡＳＴ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰＲＯＤＯＭ、及びＢＬＯＣＫＳを含む）に内で検索した。従来既知のヒトタンパク質内に出現したものもあったし、データベースには見出されなかったものもあった。これらのモチーフは、血管受容体へと回帰する循環リガンド（循環細胞の分泌タンパク質又は表面受容体のいずれか）内に存在している配列を表している可能性が高いため、選択されたペプチドモチーフにより模倣されている可能性のある候補ヒトタンパク質のパネルを編集した（表４）。
【０１７６】
【表４】ペプチドモチーフにより模倣されている可能性のあるヒトタンパク質の例
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【０１７７】
既知のタンパク質と相同な拡張されたターゲティングモチーフが、骨髄（ＧＨＨＳＦＧ、配列番号：２２、ＰＧＧＧ、配列番号：２３）、脂質（ＥＧＧＴ、配列番号：２４、ＴＧＧＥ、配列番号：２５、ＧＰＳＬＨ、配列番号：２６）、骨格筋（ＧＧＳＶＬ、配列番号：２７；ＬＶＳＧＹ、配列番号：２８）、前立腺（ＲＲＡＧＧＳ、配列番号：２９；ＲＲＡＧＧ、配列番号：３０）、皮膚（ＧＲＲＧ、配列番号：３１；ＨＧＧＸＧ、配列番号：３２；ＰＨＧＧ、配列番号：３３；ＶＴＧＸＳＧ、配列番号：３４）、及び複数の臓器（ＧＲＧＥ、配列番号：３５；ＮＦＧＶＶ、配列番号：３６；ＧＥＲＩＳ、配列番号：３７；ＳＩＲＥＧ、配列番号：３８；ＧＶＬＷ、配列番号：３９；ＷＬＶＧ、配列番号：４０；ＧＧＦＲ、配列番号：４１；ＧＧＦＦ、配列番号：４２、ＳＧＧＦ、配列番号：４３；ＰＳＧＴＳ、配列番号：４４；ＴＧＳＰ、配列番号：４５、ＥＧＲＧ、配列番号：１３１）より同定された。
【０１７８】
表４は、選択されたペプチドと候補タンパク質との配列同一性が１００％の領域に相当する配列を示している。保存されたアミノ酸置換は、「＋」により示されている。表３からのトリペプチドモチーフは、太字で示されている。
【０１７９】
このようにして同定された相同タンパク質は、ターゲティングファージと結合したヒト受容体に対する天然リガンドを表している可能性がある。例えば、骨形成タンパク質３Ｂ（ＢＭＰ ３Ｂ）に含まれているペプチドが、骨髄へと移行したファージより回収された。ＢＭＰ ３Ｂは、骨発生を制御することが既知の増殖因子である（Ｄａｌｕｉｓｋｉら、２００１）。従って、このタンパク質は、骨髄組織へと回帰するペプチドにより模倣される候補リガンドである。また、インターロイキン１１は、内皮及び前立腺上皮の受容体と相互作用することが示されている（Ｍａｈｂｏｕｂｉら、２０００）。ＩＬ−１１は、前立腺より回収されたターゲティングペプチドにより模倣されうる（表４）。分泌型リガンドに加え、脂質におけるソルチリンのような、標的組織において選択的に作用しうるいくつかの細胞外又は膜貫通型のタンパク質にも、モチーフが見出された（Ｌｉｎら、１９９７）。ある種のモチーフは、複数の臓器において濃縮されるようである。そのようなペプチドの一つは、血管ホメオスタシスを維持することが既知のタンパク質、パールカンの候補ミメオトープ（ｍｉｍｅｏｔｏｐｅ）である（表４）。
【０１８０】
これらの結果を、ＩＬ−１１受容体αに対するポリクローナル抗体を使用したインサイチュー染色により確認した。ＩＬ−１１は、ヒト前立腺ターゲティングペプチドである、ペプチドモチーフＲＲＡＧＧＳ（配列番号：２９）により模倣されると考えられるサイトカインである。これは、ＩＬ−１１α受容体（ＩＬ−１１Ｒα）が、前立腺血管に過剰発現することを示唆する。培養細胞を用いた研究より、ＩＬ−１１は、内皮及び前立腺上皮の受容体と相互作用することが示されている（Ｍａｈｂｏｕｂｉら、２００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２００１）。しかしながら、前立腺血管におけるＩＬ−１１Ｒαの発現は、今まで調査されていない。
【０１８１】
ＩＬ−１１Ｒαに対する抗体による前立腺薄片の免疫染色は、ＩＬ−１１Ｒαが管腔側前立腺上皮及び前立腺血管に存在することを示した（示していない）。この結果は、ヒトバイオパニングの結果を確認し、ターゲティングペプチド結合により同定された細胞表面受容体の存在が、受容体タンパク質に対する抗体により確認されうることを示している。
【０１８２】
ヒトにおけるインビボファージディスプレイは、個々の患者のレベルで不均一性を示しうる。例えば、試験された患者は、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有していたため、患者における悪性Ｂ細胞浸潤が、骨髄のスクリーニングの結果に影響を及ぼしたか否かは不明である。しかしながら、血管ターゲティングリガンドを臨床使用のため開発するには、それらは、インビボで罹患組織の標的血管をターゲティングするために十分な程度に、分解に対して抵抗性であり、頑強でなければならない。従って、本明細書に記載された方法の大きな利点は、選択されたターゲティングペプチドが、インビボで発現するため、天然の受容体へと結合するという点である。たとえリガンド−受容体相互作用が（直鎖エピトープではなく）立体エピトープを介して媒介されるとしても、スクリーニングにおいてバインダーを選択することが可能である。（タンパク質アレイのような）組み換え系により発現させた膜貫通タンパク質が、インビトロでの精製後、正確な構造及び折り畳みを維持することを保証することは困難であるため、インビボで選択されたペプチドは、天然受容体タンパク質の新規な阻害剤又は活性化剤の同定のような臨床適用に、より適している可能性が高い。
【０１８３】
バクテリオファージは、抗生物質出現前の時代に、ヒトにおいて広範に使用されていたため、ファージが患者へ安全に投与されうることを示唆する先例が存在する。最終的には、肺癌、前立腺癌、乳癌、又は結腸直腸癌の切除の前に全身的に、又は四肢の肉腫の切除の前に局所的に、ファージライブラリを注入することにより、ヒト血管の分子プロファイルを決定することが可能になるかもしれない。本明細書に開示された方法は、各々のヒトの臓器、組織、又は疾患における血管多様性の概要を示す分子マップの構築を可能にするであろう。
【０１８４】
前記方法により同定された、脂質、骨格筋、皮膚、骨髄、前立腺、又は複数の臓器に対するヒトターゲティングペプチド配列を、表５に挙げる。
【０１８５】
【表５】ヒトターゲティングペプチド配列
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【０１８６】
表３に挙げられたトリペプチドモチーフは、片側（ｏｎｅ−ｔａｉｌ）フィッシャー法を使用して同定された。統計的に有意なヒトターゲティングペプチドモチーフの同定は、部分的には、適用された統計分析の型に依存していた。両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌ）フィッシャー法を使用した場合、幾分異なるトリペプチドモチーフのセットが同定された。それを表６に示す。
【０１８７】
【表６】両側フィッシャー法を用いて同定されたヒトトリペプチドモチーフ
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【０１８８】
いくつかのトリペプチドモチーフは、いずれの統計分析によっても有意と同定された（表６中、太字で示されている）。二つの統計分析は幾分異なるトリペプチドモチーフのセットを同定したが、いずれかの統計分析により同定されたトリペプチド配列は、本発明の範囲内でのターゲティング適用のため有用であろうと考えられる。
【０１８９】
当業者であれば、本実施例において同定された複数のターゲティングペプチド配列が、これらに限定されないが、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常及び罹患の臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患の治療的処置を含む、本発明の範囲内の多数の適用にとって有用であろうことを理解するであろう。
【０１９０】
実施例３． 多臓器ターゲティング
動物モデル系で開発された標準的なプロトコルにおいては、ターゲティングファージを単一の臓器、組織、又は細胞型より収集し、増幅し、第二の動物へと再注射し、次いで同じ臓器、組織、又は細胞型より再収集する。ヒトの場合、この方法は非効率的である。いくつかの別の態様において、ヒトの臓器、組織、又は細胞型のターゲティングの効率は、第一のヒトの複数の臓器、組織、又は細胞型よりファージを収集し、プールし、第二のヒトに注射する、多臓器ターゲティングにより改良されうる。
【０１９１】
各生検より回収されたファージを、プールとして再注射用に調製した場合、ヒトにおいて複数回の選択を実施することが可能である。このプロトコルは、以下の例示的な手順を使用して、マウスモデルにおいて良好に証明された。
【０１９２】
ファージライブラリ（ＣＸ７Ｃ）を、麻酔下のマウスへと静脈注射した。入力量は、約１０１０形質導入単位であった。１５分後および（ヒトプロトコルを模擬するために）灌流を行うことなく、脳、腎臓、膵臓、子宮、骨格筋、及び小腸を含む多様な臓器を摘出した。ダウンスガラスホモジナイザーで磨砕した後、組織試料を洗浄した。洗浄後、組織を枯渇状態のコンピテント大腸菌Ｋ９１と共にインキュベートし、細菌の段階希釈物を４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎプレート又はシャーレに播いた。既に開示されたようにして、各臓器試料の異なる希釈物を播いた。次いで、シャーレを３７℃で一晩インキュベートした。いくつかの臓器へのファージプールの所望の濃縮の後、最後の２回の選択からの約５０個のファージクローンを配列決定した。コードされたペプチド配列を、濃縮されたペプチド又はペプチドモチーフを同定するため比較した。回帰を他の臓器と比較し、挿入物を含まないファージクローンの回帰とも比較することにより、選択されたクローンの選択性が、個々に確認された。
【０１９３】
残りの２ｍｌ〜３ｍｌの感染培養物（ホモジナイズされた組織を含む）を、１０ｍｌの４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（ＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎ）へと移し、３７℃で２時間振とうした。この約１２ｍｌの培養物を１リットルのＬＢ ｔｅｔ／ｋａｎへと移し、３７℃の振とう器で一晩増殖させた。翌日、標準的なプロトコルに従い、バルク増幅された細菌培養物からファージをレスキューした。これらの試料をプールし、多臓器ターゲティングのため再注射した。
【０１９４】
２回目及び３回目の選択においては、各臓器より回収された全バルクファージ１ｍｌのうち５０マイクロリットル〜１００マイクロリットルをプールした。得られた混合物を、もう１匹のマウスへ再注射し、同じ臓器を１０分後（灌流なし）に回収した。各臓器からのファージの播種によって、子宮を除く各部位についての濃縮が明らかとなり、このことから、多臓器プロトコルを用いた選択が可能であることが示された。多臓器ターゲティングの回数の関数としての、他の臓器におけるターゲティングファージの進行的な濃縮が示された（示していない）。
【０１９５】
多臓器ターゲティングによる、骨格筋及び腎臓をターゲティングするファージのペプチドモチーフを、下記表７に挙げる。
【０１９６】
【表７】マウスにおける多臓器ターゲティングにより同定されたコンセンサスペプチドモチーフ
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【０１９７】
本実施例より、臓器ターゲティングファージの混合物をプールとして投与する、単一の対象における多臓器ターゲティングの実施可能性が示された。この方法は、ヒトにおける血管ターゲティングにとって特に適切である。可能性のある対象の不足、及び各対象の処理費用の高さのため、一回に、単一の臓器をターゲティングするために単一のファージ集団をヒトへ注射することは、現実的でない。
【０１９８】
本明細書において開示および主張される組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階、または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、精神、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換基および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【０１９９】
参照
以下の参照は、これらが、例示的手法又は本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、全身循環系を介してヒト組織へと回帰するペプチドに関するインビボファージディスプレイスクリーニングを示す。研究の概略的なフローチャート。図１Ｂは、インビボの様々なヒト組織からのファージ回収を示す。実施例３記載のように組織試料が処理され、ファージが回収された。各生検部位より得られた組織１グラム当たりのファージ形質導入単位（ＴＵ）の平均値±標準誤差が示されている。
【図２Ａ】Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＥＭＢＬ）を用いた、拡張回帰モチーフの同定。各単一組織中で濃縮された、選択されたトリペプチド（表３）を含むペプチド配列を、各クラスター由来の異なるペプチドの間で共有されているより長いモチーフを得るため、クラスター内で整列化した。ソフトウェアは、複数のペプチド配列内での配列同一性及び配列類似性を登録し、最も同一性／類似性の高いペプチドを互いの隣に配置することにより、配列を整列化する。最初のペプチドモチーフ及び拡張されたペプチドモチーフは、太字で強調されている。
【図２Ｂ】Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＥＭＢＬ）を用いた、拡張された回帰モチーフの同定。複数の組織中で濃縮された、選択されたトリペプチド（表３）を含むペプチド配列を、各クラスターからの異なるペプチドの間で共有されているより長いモチーフを得るため、クラスター内で整列化した。ソフトウェアは、複数のペプチド配列内での配列同一性及び配列類似性を登録し、最も同一性／類似性の高いペプチドを互いの隣に配置することにより、配列を整列化する。最初のペプチドモチーフ及び拡張されたペプチドモチーフは、太字で強調されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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