(57)【要約】本発明は、ＳＡＭの検出および製造に関する新規な方法、並びにそれらの方法に使用するための新規なＳＡＨＨ酵素活性を提供する。新規なＳＡＨＨに関する更なる方法、組成物、およびキットも提供する。
2004508005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的液体サンプル中のＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の治療レベルを評価する方法であって、以下：
グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＭＴ）、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）またはＨｉｓ・ＳＡＨＨ、およびグリシンを該サンプルに提供し；そして
そのレベルがサンプル中のＳＡＭのレベルに正比例する、該サンプル中の１つ以上の反応生成物を測定する、
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
検出される生成物がホモシステイン（ＨＣ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ＨＣを、ホモシステイナーゼ（ＨＣＹアーゼ）でサンプルを処理し、ＨＣＹアーゼと該ホモシステインとの反応によって得られる少なくとも１つの生成物の濃度を測定する、ことを含む方法によって測定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
測定される生成物がＨ２Ｓである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該Ｈ２Ｓを蛍光によって測定するか、または吸光度によって測定する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＳＡＨＨが配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＳＡＭを含有するサンプルをアッセイするためのキットであって、ＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨ、ＧＭＴ、グリシン、および使用説明書を含む、上記キット。
【請求項８】
ＳＡＭを含有する生物学的サンプル；および
ＧＭＴ、グリシン、およびＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨ、
を含むアッセイであって、ＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨ活性によって、サンプル中のＳＡＭの量を決定するために測定することのできる生成物が得られる、上記アッセイ。
【請求項９】
配列番号１を含む、単離された核酸分子。
【請求項１０】
Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグをコードする配列を更に含有する、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項９記載の核酸分子を含有するカセットの発現を含む、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの効率的な製造方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸分子を含有するカセットの発現を含む、Ｈｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの効率的な製造方法。
【請求項１３】
該カセットが大腸菌で発現される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該カセットが大腸菌で発現される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
Ｈｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの精製方法であって、以下：
請求項１２記載の方法によって製造されるＨｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼを含有する懸濁液を硫酸アンモニウムで沈殿させて上清および沈殿を製造し；そして
上清をＨｉｓタグを認識するアフィニティー・クロマトグラフィーに施与することを含む、上記方法。
【請求項１６】
Ｈｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼを１段階クロマトグラフィーで精製する方法であって、以下：
請求項１２記載の方法によって製造されるＨｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼをＮｉ−ＮＡＴアフィニティー・クロマトグラフィーに施与する、
ことを含む、上記方法。
【請求項１７】
生物学的液体中のホモシステインを測定する方法であって、該液体を請求項１５記載の方法によって製造されるＨｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼと接触させ、該液体中におけるホモシステインからＳＡＨへの変換を測定する、ことを含む、上記方法。
【請求項１８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析でシングルバンドを生じるＨｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼを含有する組成物であって、該Ｈｉｓ・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼが請求項１５記載の方法によって調製される、上記組成物。
【請求項１９】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで生物学的液体中の過剰のホモシステインを枯渇させる方法であって、該液体を請求項１５記載の方法によって製造されるＳＡＨＨと接触させることを含む、上記方法。
【請求項２０】
請求項９記載の核酸分子を含有する大腸菌宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１０記載の核酸分子を含有する大腸菌宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は仮出願第６０／１７６，４４４号（２０００年１月１４日出願）からの合衆国法典第３５編§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するもので、その内容は参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
技術分野
本発明は新規な組み換えＳ−アデノシルホモシステイナーゼ（ＳＡＨＨ）およびそれらのＳＡＨＨを使用する方法に関する。また本発明はＳＡＨＨを使用してＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を投与した被験体をモニタリングするための診断法に関する。本発明の改善された方法はＳＡＭ濃度の迅速かつ正確な評価を提供する。
【０００３】
技術背景
「機能食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）」または処方薬としてのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の投与は近年、抗うつ剤、肝疾患の改善における予防または治療成分、および関節炎の症状を低減するための手段としての提案がなされてきた。ＳＡＭが作用すると信じられている機構は完全には理解されていないが、ＳＡＭおよびホモシステイン（ＳＡＭの代謝産物）の相対濃度はメチル化のレベルに影響し、次にはこれが重要な生理学的影響を有すると信じられている。この薬剤の重要性の点から、投与した医薬の濃度をモニタリングするための確実で容易に実施される方法が望まれるだろう。本発明はＳ−アデノシルホモシステイナーゼ（ＳＡＨＨ）を使用してこの薬剤を投与した被験体におけるＳＡＭの治療レベルを評価するための改善された方法を提供する。本発明はまた、これまで報告されているＳＡＨＨとは異なる、組み換えによって製造されるＳＡＨＨにも関する。
【０００４】
Ｓ−アデノシルホモシステイナーゼ（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ；ＳＡＨＨ、ＥＣ ３．３．１．１）はＳＡＨのホモシステインおよびアデノシンへの可逆的変換を触媒する（ｄｅ ｌａ ＨａｂａおよびＣａｎｔｏｎｉ， １９５９）。アデノシンの種々の構造類似体は多くの生物由来のＳＡＨＨを不活性化し、細胞毒性を誘引する（Ｕｅｌａｎｄ， １９８２）。ヌクレオシド類似体によるＳＡＨＨ活性の阻害は阻害剤の構造並びに酵素の供給源に依存する。ＳＡＨＨは膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）遺伝子から最初にクローニングされ、既に特性付けられている（Ｂａｇｎａｒａら， １９９６）。
【０００５】
Ｍｉｎｏｔｔｏ， Ｌ．、Ｋｏ， Ｇ． Ａ．、Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｍ． Ｒ．、およびＢａｇｎａｒａ， Ａ． Ｓ．［「組み換えＳ−アデノシルホモシステイナーゼの膣トリコモナス発現および特性付け（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅ）」， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ９０， １７５−１８０， １９９８］は更に膣トリコモナスＳＡＨＨを特性付けた。膣トリコモナスにおけるＳ−アデノシルホモシステイナーゼをコードする遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてｐＱＥ−３０上で発現させることで、酵素の特性付けを容易にした。６ｘＨｉｓ Ｎ末端タグ発現系（ＱＩＡＧＥＮ）によって、ニッケル−ＮＴＡマトリックスを使用したアフィニティー・クロマトグラフィーによって１００ｍｌの細菌培養物から得た６ ｍｇのｒＳＡＨＨの１段階精製が可能となった。組み換え酵素は約５６，０００の分子量を有することが明らかになった。ｒＳＡＨＨの特性には、同様の見かけのＫｍ（組み換え体については、２０〜２５μＭのアデノシン）およびアラビノシルアデニン（ａｒａ−Ａ）のようなアデノシン類似体での同様の阻害／不活性化様式が含まれる。
【０００６】
Ｍｉｎｏｔｔｏら（１９９８）の結果は、ヒドロラーゼが酵素の供給源に応じて種々のオリゴマー形態で存在できるという他者の発見とは異なる。原核生物からのＳＡＨＨ活性は６量体（Ｓｈｉｍｉｚｕら， １９８４）または４量体（Ｐｏｒｃｅｌｌｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １１６４， １７９−１８８， １９９３）である。ラット肝臓（ＦｕｊｉｏｋａおよびＴａｋａｔａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５６，１６３１−１６３５， １９８１）、子ウシ肝臓（Ｒｉｃｈａｒｄｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５３， ４４７６−４４８０， １９７８）、および他の動物（ＤｏｓｋｅｌａｎｄおよびＵｅｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ７０８， １８５−１９３， １９８２）由来の酵素は４量体であるが、サブユニットが同一であるか、または類似であるかは不確実である。植物由来のＳＡＨＨはホモダイマーで機能性である（ＧｕｒａｎｏｗｓｋｉおよびＰａｗｅｌｋｉｅｗｉｃｚ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８０， ５１７−５２３， １９７７）。これはＳＡＨＨ活性が単量体形態で機能性であるという初めての報告である（Ｍｉｎｏｔｔｏら， １９９８）。
【０００７】
発明の開示
本発明はサンプル中のＳＡＭレベルを分析するための改善された新規の方法に関する。本発明の一態様では、この方法を使用して被験体（例えば、限定されないが、ＳＡＭを投与した患者）由来のサンプル中のＳＡＭの治療レベルをアッセイすることができる。また、該方法を使用して生物学的液体（例えば、限定されないが、被験体の血液または他の生物学的液体）中のＳＡＭレベルをアッセイすることができる。このような方法は血流中のようなｉｎ ｖｉｖｏ、または被験体から採取したサンプルを用いるようなｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。該方法を診断プロトコールの一部として、または治療プロトコールの一部として使用してもよい。治療プロトコールの一部として、該方法は治療の状態または経過のモニタリングの一部に役立ちうる。
【０００８】
本発明の一実施形態では、サンプルをグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＭＴ）、グリシン、およびＳＡＨＨ活性と接触させることによってアッセイ法を実施することができる。次いでサンプル中のＳＡＭレベルの測定を、サンプル中の１以上の反応生成物を測定することによって行うことができ、ここで反応生成物の量はサンプル中のＳＡＭレベルに正比例する。本発明の一実施形態では、反応生成物ホモシステイン（ＨＣ）を直接または間接的に測定する。ＨＣの間接的測定はいずれの方法によって行ってもよく、それらは限定されないがホモシステイナーゼ（ＨＣＹアーゼ）での処理および１以上の反応生成物（例えばαケトグルタル酸、Ｈ２Ｓ、またはＮＨ３）のレベルの測定を含む。Ｈ２Ｓ反応生成物は吸光度または蛍光の測定によって直接または間接的に測定することができる。蛍光を測定する１つの方法は蛍光生成試薬の使用によるものである。
【０００９】
本発明はまた、新規なＳＡＨＨ、それをコードする核酸、それを含有する組成物、およびその調製および使用のための方法を提供する。ＳＡＨＨは配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を含有する。本発明のＳＡＨＨをコードする核酸を増殖、増幅、または発現のために好適ないずれの核酸ベクター中に配置してもよい。また該核酸を他の核酸に機能しうる形で連結することで、１個以上の付加的なアミノ酸に共有結合したＳＡＨＨの発現を可能にすることができる。付加的なアミノ酸によってＳＡＨＨを含有するハイブリッドまたはキメラタンパク質が製造される。本発明の好ましい実施形態では、付加的なアミノ酸はヒスチジン・タグ（Ｈｉｓタグ）のものであり、これによってその後の本発明のＳＡＨＨの精製が向上される。
【００１０】
本発明の核酸をいずれの適切な宿主細胞または生物、例えば、限定される訳ではないが細菌、真菌、およびより高等な真核細胞に導入してもよい。これらの細胞を使用して本発明の核酸を組み換え発現し、必要によってその後発現したタンパク質を単離および／または精製してもよい。あるいはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏの発現系を使用して核酸を発現させてもよい。
【００１１】
本発明のＳＡＨＨの精製はいずれの便宜な、または適切な方法によって行ってもよく、それらは例えば、限定されないが沈殿および／またはクロマトグラフィーである。本発明の好ましい実施形態では、精製の全体または一部を、Ｈｉｓタグとの相互作用に基づくアフィニティー・クロマトグラフィーによって行う。本発明の別の好ましい実施形態では、ＳＡＨＨを精製して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析する際に単一のバンドとなるようにする。
【００１２】
本発明のＳＡＨＨを組成物、例えば薬剤または賦形剤を含有するものに調製してもよい。またＳＡＨＨを本発明の方法、例えば上記のアッセイ法、並びに更なる方法、例えばサンプル中のホモシステインのＳＡＨへの変換をアッセイしてホモシステインのレベルを測定する方法に使用してもよい。本発明の別の態様では、ＳＡＨＨを、ＳＡＨへの変換によってｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでサンプル中の過剰のホモシステインを枯渇させる方法に使用してもよい。もちろん、本発明のサンプルは目的の生物学的液体のいずれであってもよい。
【００１３】
本発明の実施形態
本発明は配列番号１を含むＳＡＨＨをコードする単離された組み換え核酸、並びに対応するＳＡＨＨアミノ酸配列を提供する。別の態様では、ＳＡＨＨ遺伝子を余分の６個のヒスチジンを有する修飾されたＨｉｓ・ＳＡＨＨをコードするようにＳＡＨＨ遺伝子のＮ末端を修飾する。
【００１４】
本発明の別の態様では、本発明は核酸の増殖および保持のための方法、およびＳＡＨＨタンパク質の発現におけるそれらの使用法を提供する。本発明は更に１段階または２段階の精製法によるＳＡＨＨの精製方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は生物学的液体中のＳＡＭの測定に関する。本明細書で使用する「生物学的サンプル」とは個体から単離した組織または液体のサンプルを意味し、それらには、限定されないが、例えば血液および血液画分、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、尿、皮膚の外部切片（ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ）、気道、腸管、尿生殖路、体分泌液、涙液、唾液、乳汁、リンパ管または動物から採取した他の抽出物、細胞（限定されないが血液細胞が挙げられる）、腫瘍、臓器、およびｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物構成要素のサンプルが挙げられる。血漿または血清での測定が好ましい。
【００１６】
本明細書で使用する「発現」は転写および／または翻訳を含む。
【００１７】
本明細書で使用する「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびそれと同種のものは包括的な意味で使用する。すなわ「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびそれに相当する同種のものと同等に使用する。
【００１８】
特に記載しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１９】
ＳＡＨＨはＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）からホモシステインへの変換に関わる酵素であり、最終的にはＳＡＭのレベルを低下させる。治療の目的で投与したＳＡＭのレベルはＳＡＨまたはホモシステイン（ＨＣ）のいずれの内因性レベルの割には非常に高いので、以下のスキームをこの化合物を投与した被験体中のＳＡＭレベルのアッセイに使用することができる。従ってこのアッセイはキットの形態にすることができる薬剤モニタリングデバイスとして役立つ。アッセイの概要を以下のスキームに示す。
【００２０】
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【００２１】
本明細書に記載するように、ＳＡＭをアッセイするためのこの一般的な方法は、ＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨの効率的製造およびホモシステインに対する高度の特異性を有するホモシステイナーゼの選択によって改善される。ホモシステインのレベルはＳＡＭのレベルに比較して少量であり、そのためにＳＡＭの評価は内因性ＳＡＨまたはＨＣによって曲解されることはないことが確実であるが、特異性が不十分である酵素を使用する場合、体液中にシステインがホモシステインのレベルより有意に高いレベルで存在することによって干渉されうる。本発明の方法で測定される最終生成物は蛍光生成試薬の存在下において硫化水素である。
【００２２】
ＳＡＨＨはまた、ホモシステインからＳＡＨへ変換する逆反応を触媒し、最終的にＳＡＭのレベルを上昇させる。こうした反応は別の型のアッセイ、すなわちホモシステインを測定するホモシステインの酵素変換イムノアッセイにおいて有用である。特に、本発明のＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨを使用してホモシステインをＳＡＨに定量的に変換し、その後、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して最終生成物ＳＡＨを測定する。これは、十分量またはそれ以上（過剰でもよい）の量のＳＡＨを提供することによって行うことができる。あるいはまた、ＳＡＨに対する蛍光抗体を、得られるＳＡＨの定量に使用することもできる。こうしたイムノアッセイをキットとして使用することができ、これは血漿ホモシステインを、例えば約１〜１００μＭの範囲で測定するのに有用でありうる。
【００２３】
また本発明のＳＡＨＨまたはＨｉｓ・ＳＡＨＨは、特に、試薬そのものおよび治療薬となりそうなもの（例えば癌、マラリア、関節炎、および他の疾患において）として使用するための酵素の阻害剤および不活性化剤のスクリーニングにおける試薬としても使用できる。好ましくはＳＡＨＨ試薬はアッセイを含むキットの形態であり、これはホモシステインとのカップリング、および生ずる硫化水素のジアルキルフェニレンジアミン試薬（例えばＤＢＰＤＡ）を用いた測定により、簡易である。
【００２４】
組換えＳＡＨＨの他の使用には、ＳＡＨ類似体と組み合わせるための治療癌遺伝子が挙げられ、これはＳＡＨＨによって放出される毒性アデノシン類似体によって提供される毒性を有する酵素活性化型プロドラッグとして作用するだろう。このようなアデノシン類似体は、ＳＡＨ類似体としてＨｃｙにコンジュゲートされる場合、毒性を有さないだろう。ホモシステインの類似体を使用することもでき（アデノシンまたはアデノシン類似体とコンジュゲートしたセレノホモシステインのように）、これをＳＡＨＨおよびｒＭＥＴａｓｅ遺伝子治療と組み合わせると非常に毒性の高い水素セレノール（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｅｌｅｎｏｌ）並びに毒性アデノシン類似体が、２つの遺伝子を形質導入した癌細胞において放出されるだろう。
【００２５】
好ましい実施形態はサンプルをアッセイするキットを含む。好ましくはキットはアッセイを実施するための説明書を含み、この説明書はパッケージの折り込み、包装、またはキットに含まれるラベルに印刷されていてもよい。印刷物はキットに含まれる容器に含まれていてもよく、サンプルの印および試薬の容量が試験容器に示されていてもよい。正確な説明は検出すべき物質および／または使用する検出法によって様々であるが、以下のうちの１つ以上の説明を含んでもよい：キット成分および／または必要によってサンプルの希釈の説明、それぞれのアッセイで使用する酵素の容量または濃度の説明、アッセイに添加すべきサンプルの容量、蛍光生成試薬の添加についての説明、生成物の測定のための説明、好ましい温度条件、および成分の添加および混合のタイミング、ならびに試験結果を較正するための標準の使用。
【００２６】
本発明のＳＡＨＨの製造はいずれの従来法によって実施してもよい。例として、本発明の範囲を制限するものではないが、本発明のＳＡＨＨをコードする適切なベクターを使用して、酵素を発現するのに使用する細菌をまず形質転換することができる。その後、形質転換した細菌を液体培地中で長時間、それらが高密度となるまで培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ／ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ）ことができる。ＳＡＨＨをコードする配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、適切なインデューサーを添加してもよい。培養後、遠心分離によって細胞を回収し、使用まで凍結保存することができる。
【００２７】
凍結細胞を解凍し、成分添加前に溶菌して細胞片を沈殿させてもよい。細胞片を遠心分離によって回収し、ＳＡＨＨ活性を含有する上清を回収してもよい。上清を適切なバッファーで希釈した後、調製したクロマトグラフィーカラムにローディングすることができる。ＳＡＨＨを勾配で、またはより好ましくは１段階溶出で少量で溶出してもよい。その後、使用に先立ってＳＡＨＨを保存用調製物に調製できる。
【００２８】
上記の１段階精製プロトコールに加え、Ｈｉｓタグを含有するＳＡＨＨをアフィニティー・クロマトグラフィーで精製してもよい。例として、本発明を制限するものではないが、ＨｉｓタグＳＡＨＨを発現する細菌細胞を上記のように培養し、回収してもよい。その後、凍結細胞を解凍し、上記のように破壊して細胞懸濁液を調製してもよい。次いで、固体硫酸アンモニウムを懸濁液に添加し、混合物を氷上に放置した後、遠心分離してもよい。その後ＳＡＨＨ活性を含有する上清を回収し、あらかじめ調製した（平衡化した）Ｎｉ−ＮＡＴクロマトグラフィー媒体に適用する。次いでカラムを洗浄した後、１段階溶出で展開する。活性画分をプールし、透析した後、凍結保存の条件に調製してもよい。
【００２９】
以下の実施例で例証するように、以下に示す方法に従ってＳＡＨＨコード配列を膣トリコモナスからクローニングし、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現させた。ＳＡＨＨをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、野生型配列と比較して共に本明細書に提供する（これは図６ａ〜ｃに示されているようにＭｉｎｏｔｔｏら（１９９８）が開示する配列と同等である）。２つの配列の比較により１１の点突然変異が明らかとなり、これは以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
2004508005.tif 000004
【００３１】
本発明のＳＡＨＨ酵素は好ましい特性を有する。例えば、ＳＡＨＨは少なくとも１．５Ｕ／ｍｌの高い比活性を有する。更に、本発明のクローン化ＳＡＨＨは総細胞タンパク質の２０％という高い発現を提供する。更に、本発明の方法に従って製造したＳＡＨＨは添付の図２および５に示すように高い安定性を有する。例えば、ＳＡＨＨおよびＳＡＨＨ・Ｈｉｓはそれぞれ図２および５に示すように、４５℃で３日間活性を失わずに安定である。
【００３２】
以下の実施例は例証を意図するものであり、本発明を制限するものではない。
【００３３】
実施例
実施例１
ＳＡＨＨ遺伝子のｐＱＥ−３０発現ベクターへのクローニング
膣トリコモナスにおけるＳＡＨＨをコードするゲノム配列（Ｂａｇｎａｒａら， １９９６）をＰＣＲによって増幅したが、これには、それぞれ上流（センス）および下流（アンチセンス）プライマーにＢａｍＨＩおよびＰｓｔ１の操作された制限酵素部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（どちらの場合も制限部位には下線を付した）：上流プライマー　５’ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣ３’；下流プライマー　３’ＣＴＧＣＴＡＴＣＧＡＧＧＧＧＧＡＣＧＴＣＴＴＴＴ５’。組み換え発現ベクターｐＱＥ−３０で大腸菌宿主株Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（ＶｉｌｌａｒｅｊｏおよびＺａｂｉｎ， １９７４）（ＱＩＡＧＥＮ）を形質転換した。
【００３４】
実施例２
組み換えＳＡＨＨの発現、精製、および分析
ｐＱＥ−３０−ＳＡＨＨ構築物を含有するクローンを大腸菌Ｍ１５中でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）と共に一晩増殖させた。０．１ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導し、その後激しく振とうしながら３９℃で１４時間増殖させた。回収した細胞を５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ中で音波処理して破壊し、１２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次いで組み換え酵素を、種々の濃度のイミダゾールを含有する５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールでＮｉ−ＮＴＡカラムから分画溶出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ）して単離した。精製した組み換え酵素のアリコートを更なるグリセロールを添加せずに４℃で保存し、他のアリコートはグリセロールと混合して（最終濃度５０％）−２０および−７９℃で保存し、酵素活性に対する保存の影響を決定した。また活性組み換え酵素のサイズを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴクロマトグラフィーシステムでサイズ排除キャピラリークロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＣカラム）を使用して非変性条件下で分析した。
【００３５】
実施例３
大腸菌におけるＳＡＨＨの発現
ＳＡＨＨ遺伝子の発現は、ＳＡＨＨ陰性バックグラウンドを提供する宿主である大腸菌で行われている（Ｓｈｉｍｉｚｕら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．．， １４１， ３８５−３９２， １９８４）。組み換えＳＡＨＨ遺伝子配列を含有する大腸菌クローンは１〜２ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３７℃で誘導すると酵素の高度の発現を示すが、これは主として不溶性の「封入体」であった。温度を３０℃に低下させ、ＩＰＴＧの濃度を０．１ｍＭに低下させると発現レベルは低下し、より高い割合の酵素が可溶性の活性型で発現されるようになった。組み換えＳＡＨＨは総可溶性タンパク質の約１２％で含まれていた。
【００３６】
実施例４
組み換えタンパク質の精製および特性付け
組み換えＳＡＨＨをＮｉ−ＮＴＡカラムでアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製した。酵素の見かけの分子量は５５，０００〜５６，０００であった（図１）。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＣキャピラリーカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーの結果は組み換え酵素の分子量が非変性条件下で約５５，０００であることを示した。酵素はこれらの条件下で活性であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはサブユニットの分子量が約５５，０００〜５６，０００であることを示し、これらのデータから膣トリコモナス酵素が単量体で機能性であることが示されている。この結果は、ヒドロラーゼがオリゴマー形態で、酵素の供給源に応じた４次構造をもって存在できることを示した他者の発見とは異なる。
【００３７】
実施例５
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼの培養および精製
培養：
１．肥満細胞バンク由来の細菌１０μｌを５ｍｌ Ｌ．Ｂ．に接種し、振とうしながら３７℃で６時間培養した。
２．段階１からの細菌０．５ｍｌを４００ｍｌ Ｌ．Ｂ．のボトル３本に移し、振とうしながら３７℃で一晩培養した。
３．３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離して細胞を回収し、Ｌ．Ｂ．に懸濁し、接種して培養した。
４．細胞をファーメンターで２８℃で約６時間、細胞密度がＯＤ６００で７に達するまで培養した。
５．０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して細胞を誘導し、２８℃で一晩培養した。
６．４０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離して細胞を回収し、精製まで−８０℃で保存した。
【００３８】
精製：
１．ホモジナイザーに３回通して細胞を溶解した。
２．細胞溶解物を２％ ＰＥＩ、３０％ アルコール、および８％ ＰＥＧと混合し、水浴中で温度が３７℃に達するまで加熱した。
３．１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞片を廃棄し、上清を回収した。
４．２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．３）、１ｍＭ ＤＴＴ、およびＥＤＴＡを添加して上清を２倍に希釈した。
５．上清をあらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムにローディングした。
６．カラムを２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＥＤＴＡで、ＯＤ２８０が０．２未満となるまであらかじめ洗浄した。
７．２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、およびＥＤＴＡでＳＡＨＨを溶出した。
８．３０％グリセロールおよび１ｍＭ ＮＡＤをＳＡＨＨ溶出液に添加して最終生成物を調製した。
【００３９】
特異性
高発現クローンは総タンパク質の２０％のＳＡＨＨを発現した。精製後、ＳＡＨＨの比活性は１．６４単位／ｍｇタンパク質であった。純度は９０％を上回った。
【００４０】
安定性
酵素を以下のように調製した：２０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、３０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ。図２を参照。
【００４１】
実施例６
ＳＡＨＨ活性の測定
試薬：
アッセイバッファー：２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ。
２ｍＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）
ｒＨＣＹアーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）
Ｌ−ホモシステイン（種々の濃度）
４０ｍＭ ＤＢＰＤＡ（６Ｍ ＨＣｌに溶解）
４０ｍＭ フェリシアン化カリウム
【００４２】
アッセイ法：
ブランク　　　　標準曲線　　　　試験
アッセイバッファー（μｌ）　　 ９４０ 　　　　　　９７０ 　　　　　９２０
ｒＨＣＹアーゼ（μｌ）　　　　　　 １０　　　　　　　１０　　　　　　 １０
Ｌ−ホモシステイン（μｌ）　　　 −−−　　　　　　 ２０　　　　　　−−−
ＳＡＨ（μｌ）　　　　　　　　　　 ５０　　　　　　 −−−　　　　　　５０
サンプル（μｌ）　　　　　　　 −−−　　　　　　 −−−　　　　　　２０
十分混合し、３７℃で５分間インキュベートする。
【００４３】
ＤＢＰＤＡ（μｌ）　　　　　　　　　５０ 　　　　　　 ５０　　　　　　 ５０
フェリシアン化カリウム（μｌ）　５０ 　　　　　　 ５０　　　　　　 ５０
十分混合し、３７℃で１０分間インキュベートし、６７５ｎｍの吸光度またはＥＸ６６５ｎｍ／ＥＭ６９０ｎｍの蛍光を測定する。１単位は、１μモルのＳ−アデノシルホモシステインが過剰のｒＨＣＹアーゼの存在下で３７℃で１分間に加水分解される（ｈｙｄｒｏｌａｔｅｄ）ものと定義する。
【００４４】
実施例７
ｒＳＡＨＨ・Ｈｉｓタグの調製
発現ベクターを構築するために、ＳＡＨＨ遺伝子をＰＣＲで修飾した。５’−プライマーはＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧ（下線は６ｘＨｉｓタグ）、そして３’プライマーはＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＣＡＴＣ（下線はＢａｍＨＩ部位）である。ｐＴｒｃ ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を発現ベクターとして使用した。ＳＡＨＨ遺伝子のＮ末端に余分の６個のヒスチジンコードを有する修飾Ｈｉｓ・ＳＡＨＨをＮｃｏ Ｉ平滑部位およびＢａｍＨＩ部位に挿入した。大腸菌ＪＭ１０９をＨｉｓ・ＳＡＨＨ発現の宿主株として使用した。
【００４５】
実施例８
Ｈｉｓタグを用いた組み換えＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼの精製
細胞の破壊：
ＳＡＨＨを発現させた大腸菌の凍結細胞（−８０℃）５００ｇを解凍し、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）５００ｍｌに懸濁した。ホモジナイザー（ＨＣ−８０００， Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて５，０００ｐｓｉで３回、細胞を破壊した。
【００４６】
硫酸アンモニウム沈殿：
結晶硫酸アンモニウム（２０％ｗ／ｖ）を破壊した細胞懸濁液に添加した。氷上で２０分間混合した後、調製物を１２，０００ｒｐｍ、４℃で、３０分間遠心分離し、更なる精製のために上清を回収した。
【００４７】
Ｎｉ−ＮＡＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗクロマトグラフィー：
１０ｍＭイミダゾールを含有する透明の上清を、結合バッファー（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０１％ α−メルカプトエタノール）で平衡化したＮｉ−ＮＡＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（２．０ｘ２０ｃｍ）にかけた。カラムを３カラム床体積の結合バッファーで、２８０ｎｍでの吸光度が基準線に達するまで洗浄し、その後洗浄バッファー（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０１％ α−メルカプトエタノール）で、２８０ｎｍでの吸光度が基準線に達するまで洗浄した。溶出バッファー（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）で酵素を溶出した。活性画分をプールし、１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．６）５０容量に対して透析した。３０％グリセロールおよび１ｍＭ ＮＡＤを含む最終生成物を−８０℃で保存した。
【００４８】
組み換えＳＡＨアーゼを２段階法、すなわち硫酸アンモニウムおよびアフィニティー・クロマトグラフィーで精製したが、これは特に迅速かつ効率的である。精製した調製物はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドとなった。精製したｒＳＡＨアーゼの比活性は、上記の方法によれば１．７９単位／ｍｇタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｐＴｒｃのマルチクローニング部位ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩに挿入したｐＴｒｃＳＡＨＨを図示する。
【図２】
図２は、ＳＡＨＨの安定性試験の結果を含む。
【図３】
図３は、ＳＡＨＨのスクリーニングクローンを示す。
【図４】
図４は、ｐＴｒｃのマルチクローニング部位ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩに挿入したｐＴｒｃＨｉｓ・ＳＡＨＨを図示する。
【図５】
図５はＨｉｓ・ＳＡＨＨの安定性試験の結果を含む。
【図６】
図６ａ〜ｃは、本発明のＳＡＨＨのヌクレオチド配列と野生型配列とのアラインメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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