(57)【要約】ウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合部位領域、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２領域内の突然変異体である複製コンピテントアデノウイルス変異体からなる、静止正常細胞を残しながら癌細胞及び分割内皮細胞を実質的かつ選択的に除去するための方法及び組成物が記載される。その変異体は、多種腫瘍細胞系において及び増殖性微小血管内皮細胞において野生型アデノウイルスと比べて優れた複製及び効能を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分割細胞及び静止細胞を含む細胞集団において、該分割中の細胞を実質的及び選択的に殺すための方法であって、前記細胞集団を、感染性条件下で、アデノウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を含む複製コンピテントアデノウイルスに接触させ、そして十分な時間、前記アデノウイルスを前記細胞集団に感染させることを含む方法。
【請求項２】
前記分割細胞が癌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分割細胞が内皮細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記静止細胞が内皮細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域内のアデノウイルス突然変異がＥＩＡ−ＣＲ２領域内にある請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＩＡ−ＣＲ２領域内の突然変異が１又は複数のアミノ酸１２２〜１２９の欠失又は置換を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＩＡ−ＣＲ２領域内の突然変異が、１又は複数のアミノ酸１１１〜１２３の欠失又は置換を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記アデノウイルスがｄｌ９２２／９４７である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アデノウイルスがｄｌ１１０７である請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノウイルスがｐｍ９２８である請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
分割及び静止内皮細胞を含む細胞集団において、前記分割内皮細胞を殺し、前記静止内皮細胞を実質的により殺さないための方法前記細胞集団を、感染性条件下で、アデノウイルスのＥＩＡ  ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を含む複製コンピテントアデノウイルスに接触させ、そして十分な時間、前記変異体アデノウイルスを前記細胞集団に感染させることを含み、ここで前記変異体アデノウイルスが野生型アデノウイルスより前記分割細胞内で高いタイターに複製する方法。
【請求項１２】
分割内皮細胞及び癌細胞を、静止内皮細胞と比べて、それら３つの細胞型を含む細胞集団内で実質的かつ選択的に殺すための方法であって、前記細胞集団を、感染性条件下で、アデノウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を含む複製コンピテントアデノウイルスに接触させ、そして十分な時間、前記変異体アデノウイルスを前記細胞集団に感染させることを含む方法。
【請求項１３】
前記分割内皮細胞が微小血管の内皮細胞である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノウイルス変異が、ＥＩＡ−ＣＲ２で領域内の突然変異を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分割微小血管内皮細胞を殺すことにより動物において血管形成を抑制するための方法であって、該抑制の必要を動物に、アデノウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を含む複製コンピテントアデノウイルスを投与し、そして十分な時間、前記変異体アデノウイルスを前記内皮細胞に感染させることを含む方法。
【請求項１６】
前記アデノウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域がＥＩＡ−ＣＲ２領域内にある請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＥＩＡ−ＣＲ２領域内の突然変異が、１又は複数のアミノ酸１２２〜１２９の欠失又は置換を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＩＡ−ＣＲ２領域内の突然変異が、１又は複数のアミノ酸１１１〜１２３の欠失又は置換を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アデノウイルスがｄｌ９２２／９４７である請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスがｄｌ１１０７である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
生理溶液中にＲｂ結合部位アデノウイルス突然変異を含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記アデノウイルス変異体がｄｌ９２２／９４７である請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記アデノウイルス変異体がｄｌ１１０７である請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記アデノウイルス変異体がｐｍ９２８である請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
プロモーターに作用可能に結合したネガティブ選択剤と共にＲｂ結合部位アデノウイルス変異体を含む組成物。
【請求項２６】
前記変異体がｄｌ９２２／９４７である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記変異体がｄｌ１１０７である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記変異体がｐｍ９２８である請求項２５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本明細書に記載される本発明は、過剰増殖又は非制御細胞増殖に関連する疾患、好ましくは癌の、静止細胞に比べてこのような細胞内で選択的に複製する複製コンピテントアデノウイルス変異体を用いる治療又は予防に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトの癌の主な特徴は、制御されない細胞増殖、及び原発腫瘍の転移である。現在の研究は、制御されない細胞増殖が、細胞周期チェックポイントレギュレーションの喪失の作用であることを示している。Ｈａｒｔｗｅｌｌ，Ｌ．Ｈ．＆Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，１８２１〜１８２８（１９９４）を参照のこと。例えば、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ＲＢ）及び関連タンパク質は適切な増殖シグナルを受容するまでＧＩからＳ期への正常細胞の進行を防ぐことにおいて重要な役割を果たす。対照的に、ＲＢ機能はほとんど全ての癌細胞において失われ、ＲＢ又はｐ１６遺伝子変異／欠失、サイクリンＤ増幅／過剰発現又はｃｄｋ４増幅／過剰発現の結果として発生するようである。Ｓｈｅｒｒ．Ｃ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１６７２〜１６７７（１９９６）を参照のこと。結果として、ＲＢ経路における欠陥は、細胞増殖を束縛せず、一回で正常細胞が悪性表現型になる。しばしば、癌細胞が転移する能力は悪性状態と関連する。
【０００３】
アデノウイルス５ＥＩＡ遺伝子は、共通の前駆体の異なるスプライシングの結果として生ずる、各々２８９及び２４３アミノ酸を有するタンパク質をコードする１３５及び１２５の沈降価を有する２つのｍＲＮＡをコードする。２つのタンパク質の間の４ｂのアミノ酸の差は１３５種に起因する。ＥＩＡが細胞ＲＢに結合することにより細胞を形質転換し、これによりその腫瘍サプレッサー機能を終わらせると考えられる。
【０００４】
ＥＩＡ遺伝子は、いくつかの異なる生物活性をコードすることが示されている。１つの例において、ＳＶ４０ウイルスの中央Ｔ抗原又は活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子産物のいずれかと組み合わせて、細胞を形質転換することができる。対照的に、より最近の研究は、それが、特定のオンコジーンと関連するオンコジーン表現型を抑制することができることを示した。米国特許第５，６５１，９６４号を参照のこと。その抗オンコジーン活性に影響を与えるＥＩＡ遺伝子内の突然変異が同定されており、これらの特定のものは化学療法剤と組み合わせて有効であることが示されている。ＰＣＴ／ＵＳ９７／１９０４２を参照のこと。
【０００５】
Ｆｒｉｓｃｈは、ヒト腫瘍細胞におけるアデノウイルスＥＩＡの抗オンコジーン効果を示している。Ｆｒｉｓｃｈ，Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８８，９０７７〜９０８１（１９９１）を参照のこと。
米国特許第５，５１６，６３１号は、アデノウイルスＥＩＡ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いて過剰増殖細胞の複製を阻害する方法を記載する。
【０００６】
ＰＣＴ／ＵＳ９５／１１３４２は、化学療法剤に対してアデノウイルスＥＩＡで腫瘍細胞を感作する方法を記載する。
米国特許第５，６５１，９４６；５，６４３，５６７；６４１，４８４号及びＰＣＴ／ＵＳ９７／０３８３０は、単独で又はＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原と組み合わせてアデノウイルスＥＩＡ遺伝子によりｎｅｕオンコジーンを発現する腫瘍を抑制するための方法を記載する。
【０００７】
アデノウイルスＥＩＡが生体内抗腫瘍の役割を有することを示すものもある。Ｒ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｒｉｅｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１３：１０８３〜９２（１９９６）；及びＲ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｒｉｅｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．５（４）２１５〜２２４（１９９８）を参照のこと。
【０００８】
腫瘍増殖及び転移に重要なのは血管形成である。血管形成は原発性腫瘍の増殖及び転移並びに後の二次腫瘍の転移のために必要である。即ち、腫瘍は、栄養を供給し、代謝廃棄物を除去するための血液供給なしでは生長の持続を維持することができない。これにより、新しい血管の形成、又は脈管形成は腫瘍細胞増殖を容易にし、腫瘍細胞が血流への入口を得ることを許容し、そして体全体に循環させる。これにより、脈管形成の阻害又は予防は腫瘍増殖及び転移を防止するための有効な方法であることが予想される。
【０００９】
脈管形成過程の一部として、正常組織に関連する内皮細胞は本質的に静止しているが、腫瘍関連内皮細胞は増殖することが注目に値する。それゆえ、分割細胞、即ち癌細胞及びそれらの関連する微小血管内皮細胞を標的にする治療剤は、いずれかの細胞型のみを標的とする剤より増強された抗腫瘍効能を有するであろう。明らかに、標的細胞内で複製し、それによりそれを殺し、その過程において更なる標的細胞に広がって攻撃することができる新しいウイルス粒子を放出するものであるこの特性を有するウイルス剤は、主要な医学的適用を有するであろう。
【００１０】
発明の概要
先の記載に従って、本発明は、制御されない過剰増殖細胞の増殖の疾患を治療又は予防するための方法及び複製コンピテントアデノウイルス変異体を供する。
一態様において、本発明は、制御されない又は過剰増殖性の細胞の増殖の疾患、好ましくは癌を含む、血管形成術を必要とし又はそれにより容易化されるこれらの疾患を治療又は予防するための方法及び複製コンピテントアデノウイルス変異体を供する。
【００１１】
本発明の別の態様において、複製コンピテントアデノウイルス変異体は、分割する正常な又は癌細胞内で、野生型アデノウイルスと比べて増強された複製を行なうことができる。ここで、その変異体は、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を示す。
本発明の更に別の態様において、複製コンピテントアデノウイルス変異体は、分割する正常又は癌細胞において野生型アデノウイルスと比べて細胞変性を増強させることができ、ここでその変異体は、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を示す。
【００１２】
本発明の別の態様において、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２領域内に突然変異を示す複製コンピテントアデノウイルス変異体は、分割する正常又は癌細胞において野生型アデノウイルスと比べて複製を増強することができる。
本発明の更なる態様において、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２領域内に突然変異を示す複製コンピテントアデノウイルス変異体は、分割する正常又は癌細胞において野生型アデノウイルスと比べて増強された細胞変性を有し得る。
【００１３】
本発明のこれら及び他の目的は、以下の明細書の本発明の種々の態様の記載を読むことにより当業者に明らかになるであろう。本発明の先の記載及び他の態様は、以下の図面、詳細な記載、及び例により詳細に説明される。
発明の詳細な記載
全体を通して言及される、特許出願を含む全ての出版物は各々の個々の出版物又は特許出願が詳細にかつ個々に引用により組み込まれて示されるのと同程度まで、引用により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
定義
特に示さない限り、本明細書に用いる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書に用いる命名法及び以下に記載の実験手順は公知であり、当業界で一般に用いられる。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、並びに微生物培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な技術を用いる。一般的な酵素反応及び精製ステップは、製造元の明細に従って行う。技術及び手順は、一般に、当業界で慣用的な方法及び本明細書全体にわたって供される種々の一般的引用文献に従って行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。本明細書に用いる命名法及び以下に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬調剤は公知のものであり、当業界で一般に用いられている。化学合成、化学分析、医薬調剤及びデリバリー、並びに患者の処理については標準的技術を用いる。
【００１５】
本開示全体に用いる場合、以下の用語は特に示さなければ以下の意味を有することが理解されよう。
用語“アデノウイルス”は、ヒトから単離された９０を超えるアデノウイルスサブタイプ、並びに他の哺乳動物及び鳥からの多くのものをいう。Ｓｔｒａｕｓｓ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，”ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｔ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ４５１〜５９６（１９８４）を参照のこと。その用語は、好ましくは、２つのヒト血清型Ａｄ２及びＡｄ５に適用される。
【００１６】
“新生物細胞”又は“新（生物）形成”とは、それらが、細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示すような、相対的に自律的な増殖を示す細胞をいう。新生物細胞は、活動的に複製し得る、又は一過性の非複製休止状態にある細胞（Ｇ１又はＧ６）を含み；同様に、新生物細胞は、十分に分化した表現型、ほとんど分化した表現型、又は両方の型の細胞の混合物を有する細胞を含み得る。これにより、全ての新生物細胞が所定の時点で必ずしも複製する細胞ではない。新生物細胞として定義されるセットは、良性新生物の細胞及び悪性（又は明白な（ｆｒａｎｋ）新生物の細胞からなる。本明細書において、明白な新生物細胞は、頻繁に、癌、又は癌細胞、腫瘍、又は腫瘍細胞といい、典型的には、内胚葉もしくは外胚葉の組織学的起源なら癌性、又は中胚葉由来の細胞型起源なら肉腫と呼ぶ。ｐ５３機能を欠如するが、明白な新生物でない細胞は新生物の細胞の定義に入る。米国特許第５，６７７，１７８号を参照のこと。後者のカテゴリーの細胞の例は、バレット症候群、又は白斑症に関連する細胞であろう。
【００１７】
“複製コンピテントアデノウイルス”又は“複製コンピテント変異体アデノウイルス”とは、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２領域内に突然変異を示すアデノウイルスをいう、静止細胞より大きな程度で、これらのウイルスに感染した分割細胞は、次の表現型特徴を示す：（１）後期遺伝子産物、例えばキャプシドタンパク質（例えばアデノウイルスペントン塩基ポリペプチド）又はウイルス後期遺伝子プロモーターから開始されるＲＮＡ転写物の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製又は複製性中間体の形成、（３）ウイルスキャプシド又はパッケージングしたビリオン粒子のアセンブリー、又は（４）感染した細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現、（５）ウイルス溶解サイクルの完了。
【００１８】
“生理条件”又は“生理溶液”とは、完全な哺乳動物細胞中、又は生きている哺乳動物の組織空間もしくは器官内の条件と実質的に類似したイオン強度、ｐＨ、及び温度を有する水性環境をいう。典型的には、生理条件は、約１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ６．５〜７．６、及び約２２〜３７℃の温度を有する水溶液を含む。一般に、生理条件は、生物高分子の分子間会合のための好適な結合条件である。例えば、１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４，３７℃の生理条件が一般に好適である。
【００１９】
“過剰増殖性”細胞増殖に関連する疾患とは、癌ではなく、脈管形成又は再狭容に関連する内皮細胞増殖のような不要な細胞増殖を特徴とする病理的状態を意味する。“制御されない細胞増殖”に関連する疾患は、典型的には、良性又は転移性癌各々をいう。
“ネガティブ選択遺伝子又は剤”とは、そのタンパク質産物が新生物細胞を殺すホストの能力を増強する遺伝子を意図する。これらは、免疫強化剤、又はプロドラッグのその毒性代謝産物への変換を容易にする酵素を含むであろう。
【００２０】
本明細書の化学用語は、引用により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｎ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  Ｌｅｄ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ，．１９８５），ＭｃＧｒａｎ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏに例示されるような、当業界における慣用的な用法に従って用いられる。
【００２１】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連する場合、作用可能に連結する。例えば、プロモーターは、それがその配列の転写を制御するなら、コーディング配列に作用可能に連結し；リボソーム結合部位は、それが翻訳と許容するように位置するなら、コーディング配列に作用可能に結合する。一般に、作用可能に結合とは、隣接しており、及びリーダー配列の場合、隣接して読み枠内にあることを意味する。
【００２２】
複製（する）アデノウイルスベクターとは、癌細胞内で複製することができるアデノウイルス又はその変異体を意味する。これらには、野生型アデノウイルス、又は以下により詳細に議論されるように、特定の型の癌細胞、好ましくは１又は複数の腫瘍サプレッサータンパク質を機能的に欠如するもの内で選択的に複製することができるアデノウイルスの変異体を含み得る。
【００２３】
アデノウイルスにおける“ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域”、“ＲＢ結合部位変異体”又は“ＲＢ変異体”とは、ＲＢへの結合の原因となるＥＩＡの保存された領域２（ＣＲ２）、２つの他のＥＩＡ結合タンパク質、ｐ１０７、及びｐ１３０内のこれらの領域を意味する。図１は、アデノウイルス変異体ｄｌ９２２／９４７，ｄｌ１１０７中に存在する特定のＣＲ２遺伝子欠損、及びｐｍ９２８中の点変異を示す。
【００２４】
本発明の別の実施形態において、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域における変異体であるアデノウイルスは、感染した細胞について毒性であり得る、異種遺伝子産物、又はネガティブ選択剤を発現し得る。このような剤の大規模な選択を用いることができる。例えば、ネガティブ選択遺伝子は、選択されたアデノウイルスＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域構成物に組み込むことができる。好ましい実施形態は、ｔｋ発現カセットを形成するためにポリアデニル化部位を伴う、Ａｄ５  ＮＴ  ｄｌ１１１０のＥ２プロモーター、又はかわりのプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば主要後期プロモーター、Ｅｌａプロモーター／エンハンサー、Ｅｌｂプロモーター／エンハンサー）に作用可能に結合したＨＳＶｔｋ遺伝子カセットである。Ｚｊｉｌｓｔｒａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５；Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８：Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１２３４：Ａｄａｊｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（Ｕ．Ｓ．Ａ）８６：４５７４；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８を参照のこと。ｔｋ発現カセット（又は他のネガティブ選択発現カセット）は、例えばＥ３遺伝子の実質的な欠損のかわりの置換として、アデノウイルスゲノムに挿入される。他のネガティブ選択遺伝子、例えばシトシンデアシナーゼは、当業者に明らかであろう。米国特許第５，３５８，８６６を参照のこと。Ｅ２プロモーターに作用可能に連結したネガティブ選択遺伝子は、本明細書に開示されるＥＩＡ  ＲＢ結合変異体、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２変異体への組込みのための特に好ましい実施形態である。
【００２５】
別の実施形態において、他のネガティブ選択剤は、サイトカイン、好ましくはインターロイキン１−１５、より好ましくはＩＬ−２（米国特許第４，７３８，９２７又は５，６４１，６６５号）、インターロイキン７、（米国特許第４，９６５，１９５又は５，３２８，９８８号）、及びＩＬ−１２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２又は米国特許第５，４５７，０３８号を参照のこと）、又はインターフェロン、例えばインターフェロンガンマ（米国特許第４，７２７，１３８又は４，７６２，７９１号）を含むであろう。腫瘍壊死因子アルファ（米国特許第４，６７７，０６３又は５，７７３，５８２号）又はＧＭ−ＣＳＦ（米国特許第５，３９３，８７０又は５，３９１，４８５号）も含むであろう。更に、免疫調節タンパク質を用いることができ、これはマクロファージ炎症タンパク質、例えばＭＩＰ−３、（Ｗｅｌｌ，Ｔ．Ｎ．ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ，ＭＣ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ  ｖｏｌ  ６１（５）：ｐａｇｅｓ  ５４５−５０，１９９７を参照のこと）、及び細胞自殺、又はアポトーシス誘導タンパク質例えばＢＡＤ及びＢＡＸを含むであろう。Ｙａｎｇ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ  ８０，ｐａｇｅｓ  ２８５−２９１（１９９５）；及びＳｅｎｄｅｅｐ，Ｒ．５，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．９１、ページ２３１〜２４１（１９９７）を参照のこと。
【００２６】
癌を治療するための本組成物の効果は、１又は複数の理論により説明され得るが、本発明のアデノウイルス変異体が単独で又は化学療法と組み合わせて、癌を含む過剰増殖性疾患を治療するよう機能するメカニズムは、現在知られていないことが理解されよう。これにより、本明細書のこのような理論を議論し又は暗示することにおいて、本発明者らは、請求の範囲のこのような考えられる限定を有することにより、それらに結びつけることを意図しない。実際、本発明のＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合変異体アデノウイルスは、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域内の突然変異を特徴とするが、現在知られていないメカニズムによりそれらの生物活性を発揮することに注目することが重要である。
【００２７】
アデノウイルス
本発明はアデノウイルスタイプ５に関して記載されているが、それは、他の類似するアデノウイルス血清型で実施することができることに注目すべきである。アデノウイルスゲノムの一般的な構成は血清型間で保存されており、特定の機能が類似して位置する。更に、アデノウイルス５ゲノムは、Ｇｅｎｂａｎｄ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｍ７３２６０として登録されており、そのウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａから、アクセス番号ＶＲ−５で利用できる。アデノウイルス変異体の作製のための方法は、一般に当業界に知られている、Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，ｖｏｌ：２８，ページ６７〜９０を参照のこと。アデノウイルス変異体を作製するために用いる材料及び方法は、Ｈａｎｒｅ，Ｔ５（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７７，ページ４３７〜４４４；及びＢｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６９，ページ５９１１−５９２１；及びＰＣＴ／ＣＡ９６／００３７５に記載される。Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（３４１  Ｂｅｒｉｎｇ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ）は、アデノウイルス変異体を作製するために用いる材料の多くを販売し、それらの作り方のＰｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｈｅｅｔｓを供する。ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域における突然変異は当業界で知られており、ＰＣＲを含む標準的変異誘発技術を用いて直ちに作り出される。
【００２８】
ＥＩＡ変異体アデノウイルスの特性−複製及び−細胞病原体
ＤＮＡ腫瘍ウイルス、例えばアデノウイルスは、Ｓ期エントリーが誘導されるので、静止細胞に感染し、その中で複製することができる。このＧＩからＳ期への進行は、早期ウイルス遺伝子産物によるＲＢ及び関連する細胞タンパク質の阻害的結合に従う。Ｗｈｙｔｅ，Ｐ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｎ．＆  Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，Ｃｅｌｌ  ５６，６７−７５（１９８９）；Ｍｏｒａｎ，Ｅ．，Ｚｅｒｌｅｒ，Ｂ．，Ｈａｒｉｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３４７０−３４８０（１９８６）を参照のこと。
【００２９】
アデノウイルスによるＲＢ（及びｐ１０７、ｐ１３０、以下に議論）の結合及び不活性化は、ＥＩＡタンパク質保存領域２のアミノ酸１２１〜１２７により容易にされる。Ｍｏｒａｎ，Ｅ．，Ｚｅｒｌｅｒ，Ｂ．，Ｈａｒｉｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３４７０−３４８０（１９８６）；Ｗｈｙｔｅ，Ｐ．，Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．＆  Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２，２５７−２６５（１９８８）を参照のこと。このドメイン内の突然変異は、トランス活性化機能を阻害することなくＥＩＡによる形質転換を喪失させる。Ｍｏｒａｎ，Ｅ．，Ｚｅｒｌｅｒ，Ｂ．，Ｈａｒｉｓｏｎ，Ｔ．＆  Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３４７０−３４８０（１９８６）；Ｗｈｙｔｅ，Ｐ．，Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．＆  Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２，２５７−２６５（１９８８）；Ｊｅｌｓｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１，１２０−１３０（１９８９）を参照のこと。
【００３０】
本発明の一実施形態において、静止した正常細胞においては少い複製能力を有するが、癌細胞及び増殖する正常細胞、例えば重要なのは微小血管内皮細胞の両方で増強された複製を示すアデノウイルスＥＩＡ  ＲＢ結合部位変異体を記載する。これにより、分割及び静止細胞の混合集団において、ウイルス複製は分割細胞を実質的に殺すが、静止細胞に対してはかなり少い効果しか有さない。実施例に記載される実験において、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域内に突然変異を有するウイルスを、野生型アデノウイルスと比べて、静止正常細胞においてかなり削減された複製及び細胞病原性しか示さないことが明らかである。対照的に及び驚くことに、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合部位変異体ウイルスの複製及び細胞病原性は、癌細胞及び増殖する正常細胞、例えば微小血管内皮細胞において、野生型アデノウイルスで見られるより大きい。以下の議論は、分割又は静止のいずれかである種々の細胞型における本発明のアデノウイルス変異体のこれらの特性、複製及び細胞病原性の各々のより詳細な記載を供する。
【００３１】
以下に、特に実施例に詳細に記載される本発明は、そのウイルスのＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域、保存領域２（ＣＲ２）に十分にキャラクタライズされた突然変異を有する３種のアデノウイルス変異体での実験の結果に集中する。それらウイルスは、ｄｌ１１０７，ｄｌ９２２／９４７及びｐｍ９２８と呼ぶ。
【００３２】
野生型アデノウイルスのＣＲ２領域は３つの細胞タンパク質：ｐ１３０，ｐ１０７、及びｐ１０５に結合する。ｐ１０５はＲＢに対応する。他人による先の研究（Ｂａｒｂｅａｕ，Ｄ５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．９，３５９−３７３（１９９４）を参照のこと）、及び我々の未公開の観察結果は、アデノウイルス変異体ｄｌ１１０７，ｄｌ９２２／９４７及びｐｍ９２８のＥＩＡ  ＣＲ２領域における突然変異の、これらの細胞タンパク質への結合への効果を解明している。ｄｌ１００７によりコードされるＥＩＡは実質的にｐ１０７にのみ結合するか、ｄｌ９２２／９４７及びｐｍ９２８によりコードされるＥＩＡは３つの細胞タンパク質のいずれともほとんど又は全く結合を示さない。これにより、以下に供される結果は、本明細書でＥＩＡ  ＲＢ結合部位領域と呼ばれるものの中に少くとも１の突然変異を有するアデノウイルス変異体に適用される。
【００３３】
野生型に対するＥＩＡ−ＣＲ２変異体アデノウイルスの試験管内での複製
本発明の一実施形態において、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域内、好ましくはウイルスのＥＩＡ  ＲＢ結合保存領域２（ＣＲ２）内に十分にキャラクタライズされた突然変異を有するアデノウイルスは、正常細胞及び癌細胞のパネルで複製することが示される（図２）。より好ましくは、１つのこのようなアデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体ｄｌ９２２／９４７は、静止した、非不死化ヒト微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）内で入力タイターを超えるタイターまで複製することができなかった。対照的に、実施例でより議論されるように、このようなＥＩＡ  ＲＢ結合部位を変異体ウイルスは、活性に増殖なＭＶＥＣにおいて野生型アデノウイルスよりかなり良好に複製する。
【００３４】
更に、変異体ＲＢ（Ｃ３３Ａ、子言顕）又は正常ＲＢ発現（ＨＬａＣ，ｎ因候）でのヒト腫瘍細胞におけるこれらＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合変異体アデノウイルスの複製を測定した。ＥＩＡ  ＲＢ結合部位変異体ウイルスは、両方の腫瘍細胞系で野生型アデノウイルスより良好に複製した。同様の結果が、正常なＲＢ発現を有するＡ５４９癌細胞で得られた。
【００３５】
ＲＢ＋細胞系における細胞変性効果
本発明の第２の実施形態において、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合領域、好ましくはウイルスのＥＩＡ  ＲＢ結合部位保存領域２（ＣＲ２）内に十分にキャラクタライズされた突然変異を有するアデノウイルスは、正常なＲＢ発現の細胞（ＨＬａＣ，ＲＫＯ，Ｈ１２９９，Ｕ２０Ｓ及びＡ５４９）、及び異常ＲＢ発現のもの（Ｃ３３Ａ，Ｈ２００９）を含む、テストした全ての腫瘍細胞系に対して、野生型アデノウイルスに対して増強された細胞病原性を示すことが示される（図３）。細胞単層の５０％を破壊するために必要とされるウイルス投与量は、ＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体、ｄｌ１１０７又はｄｌ９２２／９４７についてより野生型アデノウイルスについて１０倍も高かった。同様に、増殖性ＭＶＥＣ、小気適上皮細胞（ＳＡＥＣ）、及び哺乳動物上皮細胞は、野生型ウイルスに対してよりＥＩＡ−ＣＲ２変異体でＣＰＥに対してよりセンシティブであることが示された。野生型ＲＢタンパク質の存在はＣＰＥ結果に影響を与えるようであった。例えば、野生型アデノウイルスに対するＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー結合変異体の優れた細胞病原性は、正常なＲＢ発現の細胞において最も大きかった。対照的に、静止ＭＶＥＣ及び哺乳動物上皮細胞（ＭＥＣ）は、野生型アデノウイルスよりＥＩＡ  ＲＢ結合変異体ウイルスに対してよりセンシティブでなかった。
【００３６】
ＥＩＡ変異体は生体内で腫瘍に対する増強された効能を示す
本発明の更に別の実施形態において、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合部位変異体ウイルス、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ変異体は、野生型アデノウイルスで見られるのと比べて生体内で優れた又は等価な抗腫瘍活性を示した（図４）。
【００３７】
抗腫瘍効能は、実施例に記載されるように、無胸腺マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片を用いて決定した。例えば、ＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー結合部位変異体ウイルスが注入された結腸腫瘍を有する動物は、野生型アデノウイルスで処理したグループで３５日、ビヒクル対照グループで２５日に対して８０日の５０％生存率を有した、更なる結果は実施例に供する。
【００３８】
ＥＩＡ変異体は、野生型ウイルスと比べて生体内で静止正常細胞において減少した複製及び毒性を示す
コトンラットは、ヒトアデノウイルスのための許容されるホストであり（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．らＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，３８２３〜３８２７（１９８９）。その肺は、生体内でアデノウイルス複製及び病理学を研究するための確立されたモデルである。Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，１０１〜１１１（１９９３）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．＆  Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ３，１〜８（１９９４）を参照のこと。これにより、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合部位変異体ウイルス対野生型アデノウイルスに対する静止細胞の実質的な耐性を確認するコトンラットでの実験を行った。ＥＩＡ  ＲＢ結合部位変異体が感染した肺のイン・シトゥハイブリダイゼーションは、１つのケースで複製しないこと、他のケースで低レベルの複製を証明した。対照的に、野生型アデノウイルスが感染した肺のイン・シトゥハイブリダイゼーションは、全ての動物においてより高いレベルの複製を証明した。野生型アデノウイルスは、細気管支上皮全体及び肺実質組織内に拡散して細胞に感染したが、ＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー変異体ウイルス複製は、単離された細気管支上皮細胞に限定された。これらの結果は、実施例に詳細に供される。
【００３９】
これにより、まとめると、本発明の好ましい実施形態は、アデノウイルスＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合変異体、より好ましくは、アデノウイルスＥＩＡ  ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー変異体であり、それは、ＥＩＡのＲＢファミリーメンバー結合領域内に変異される。これらのウイルスは、静止正常細胞内で減少した複製を示す一方、複製及び細胞病原性は、癌細胞及び増殖中の内皮細胞において野生型アデノウイルスより大きい。
【００４０】
増殖中の細胞におけるＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体対野生型アデノウイルスの増強された複製及び細胞病原性は予想されなかった。実際、アデノウイルス及びヘルペスウイルスは、腫瘍細胞において選択的複製を達成するために遺伝子的に弱毒化されていることが知られている。Ｈｅｉｓｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，６３９−６４５（１９９７）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，３７３−３７６（１９９６）；Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，８５４−８５６（１９９１）；Ｍｉｎｅｔａ，Ｔ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １，９３８−９４３（１９９５）を参照のこと。これらの弱毒化ウイルスの各々は、腫瘍細胞内でさえ、その野生型親ウイルスより非効率的に複製するＢｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，３７３−３７６（１９９６）；Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，８５４−８５６（１９９１）；Ｋｉｒｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  ５，７５３−７６２（１９９６）を参照のこと。特定の場合、複製は、野生型ウイルスに対して１０〜１００倍、削減され得る。Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２，８５４−８５６（１９９１）を参照のこと。これは、おそらく、複製を増強する重要なウイルス機能の喪失のためである。野生型アデノウイルスに対するＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合変異体の複製の増強についての理由は未知である。
【００４１】
本明細書に開示されるＥＩＡ  ＲＢ結合部位変異体、好ましくはＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体が、分割及び静止細胞、又はより詳しくは、腫瘍及び増殖性微小血管内皮細胞と静止微小血管内皮細胞との間の大きな治療指数を有することは当業者に明らかであろう。
これにより、本発明のこの好ましい実施形態は、アデノウイルス複製及び細胞病原性効果により、直接、分割中の腫瘍細胞を実質的かつ選択的に殺すために有益に適用することができることが更に認められるであろう。この効果は、アデノウイルスＥＩＡ  ＲＢ結合部位変異体による発達中の血管の除去により増強されて、両方の抗腫瘍効果に、正常静止細胞の最小の死殺と共におこる。
【００４２】
調剤／投与
本明細書に開示されるアデノウイルス変異体は、患者への治療及び診断的投与のために調剤することができる。治療的又は予防的使用のために、薬理的に有効な投与量のアデノウイルスを含む滅菌組成物を、例えば新生物状態の、治療のために、ヒト患者又は獣医的非ヒト患者に投与される。一般に、本組成物は、水性懸濁した中に約 １０３〜１０１５又はそれ超のアデノウイルス粒子を含むであろう。医薬として許容される担体及び賦形剤は、しばしばこのような滅菌組成物中に用いられる。種々の水溶液、例えば水、緩衝水、０．４％塩類溶液、０．３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は滅菌状態であり、一般に、要求されるアデノウイルスベクター以外の粒状物を含まない。本組成物は、好適な生理条件に要求されるような医薬として許容される補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤、好ましくはポリカチオンが含まれ得る。
【００４３】
本発明のアデノウイルス、又はその中に含まれるＤＮＡは、リポソーム又はイムノリポソームデリバリーにより新生物細胞にデリバリーしてもよく；このようなデリバリーは、新生物細胞集団上に存在する細胞表面特性（例えばイムノリポソーム内のイムノグロブソンに結合する細胞表面タンパク質の存在）に基づいて新生物細胞に選択的に標的化することができる。典型的には、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソーム又はイムノリポソーム内に被包される。例えば、アデノウイルスビリオンの懸濁液は、慣用的な方法により、ミセル内に被包してイムノリポソームを形成することができる（米国特許５，０４３，１６４、米国特許４，９５７，７３５、米国特許４，９２５，６６１；Ｃｏｎｎｏｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：５８２；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２７９；Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄｓ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ＬＦ  ａｎｄ  Ｎｉｍｍｏ  ＷＳ：Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：ｐａｇｅ  １５８５）。個体の癌細胞上に存在する癌細胞抗原（例えばＣＡＬＬＡ，ＣＥＡ）に特異的に結合する抗体を含むイムノリポソームを、ビリオン又はビリオンＤＮＡをこれらの細胞に標的化するために用いることができる。
【００４４】
本アデノウイルス又はその混合物を含む組成物は、新生物疾患の予防及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的適用において、組成物は、特定の新生物疾患により概に影響を受けている患者に、その病状及びその合併症を治癒し又は少くとも部分的に拘束するのに十分な量で投与される。これを達成するために適した量は、“治療に有効な（投与）量”又は“有効（投与）量”として定義される。この使用のために有効な量はその病状の激しさ、患者の全般的な状態、及び投与の経路に依存するであろう。本組成物の単一又は複数投与は、投与量レベル及びパターンで行うことができ、それは、治療する医師により選択される。いずれの場合にも、医薬組成物は、患者を有効に治療するのに十分な本発明のＥＩＡ  ＲＢファミリーメンバー結合変異体アデノウイルスの量を供するべきである。
【００４５】
予防的適用において、本発明のアデノウイルス又はその混合物を含む組成物は、癌の再発に対する患者の耐性を増強するため又は緩和時間を延長するため現在、新生物の病状でない患者に投与される。このような量は、“予防に有効な投与量”であると定義される。この使用において、正確な量は、また、患者の健康の状態及び免疫の全般的レベルに依存する。
【００４６】
本発明のアデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル、例えば慣用的な化学療法と、又は他のウイルスと組み合わせることができる。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７８号を参照のこと。化学療法は、全身的、癌への直接の注入を含む当業者に公知の方法により、又は好適な徐放性材料に要求される化学療法剤を会合させることによりもしくは腫瘍を動脈内灌流することにより癌の部位で局在化させることにより投与することができる。好ましい化学療法剤はシスプラチンであり、好ましい投与量は、治療すべき癌の性質、及びシスプラチンを投与することにおいて慣用的に考慮される他の因子に基づき、実施者により選択され得る。好ましくは、シスプラチンは、３〜６時間にわたり、５０〜１２０ｍｇ／ｍ２ の投与量で静脈内に投与されよう。より好ましくは、それは、４時間にわたって、８０ｍｇ／ｍ２ の投与量で静脈内に投与される。シスプラチンと組み合わせて好ましくは投与される第２の化学療法剤は５−フルオロウラシルである。５−フルオロウラシルの好ましい投与量は５連続日で１日当り８００〜１２００ｍｇ／ｍ２ である。
【００４７】
本発明のアデノウイルスを用いるアデノウイルス治療は、他の抗新生物プロトコル、例えば遺伝子療法と組み合わせることができる。米国特許第５，６４８，４７８号を参照のこと。上述の通り、本発明に用いるためのアデノウイルス構成物は、特定の癌細胞死殺を示すであろう。但し、好ましくは、プロドラッグアクティベーター遺伝子の発現は、組織特異的プロモーターを追い払う。米国特許第５，６３１，２３６号を参照のこと。
【００４８】
また、本発明のアデノウイルス変異体がホスト動物においてそれらの効果を鈍らせる免疫応答を誘発する場合、それらは、それらの効果を最大にするために好適な免疫抑制剤と一緒に投与することができる。あるいは、種々の方法が存在しそれによりアデノウイルスの外部タンパク質コートは、より少い免疫原ウイルスを生産するよう改変することができる。ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０３３を参照のこと。アデノウイルスの外部コートの主な免疫原性成分、ヘキソンタンパク質は、免疫原性がより少くなるよう遺伝子的に操作することができる。これは、ヘキソンタンパク質中で通常、見い出されないアミノ酸の配列で、通常のウイルスヘキソンタンパク質エピトープを置換することによりキメラヘキソンタンパク質を作り出すことにより行われる。このようなアデノウイルス構成物に野生型ウイルスより少い免疫原性である。
【００４９】
本発明のアデノウイルスＥＩＡ変異体構成物の効能を増加させるために、それらは、特定の腫瘍細胞型についての増強された向性を示すよう改変することができる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４９６４に示すように、アデノウイルスの外部コート上のタンパク質は、正常細胞より高い程度、腫瘍細胞上に存在するレセプターに結合する化学剤、好ましくはポリペプチドを提示するよう改変することができる。また、米国特許第５，７７０，４４２号及び米国特許第５，７１２，１３６号を参照のこと。そのポリペプチドは抗体であってよく、好ましくは一本鎖抗体である。
【００５０】
アデノウイルス変異体の精製
アデノウイルスは、超遠心を用いて塩化セシウムバンディングを含むいくつかの技術により慣用的に精製される。しかしながら、アデノウイルスの大規模生産のために、塩化セシウム超遠心により直ちに得ることができるものより多い収量を供する方法が要求され、それは１又は複数のクロマトグラフィーステップに関する。好ましい方法は、イオン交換クロマトグラフィーを利用する。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１５０４；及びＨｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．６：１４０３〜１４１６（１９９６）を参照のこと。
【００５１】
以下の実施例は、本発明の例であると確信されるが、本発明の精神及び範囲から離れることなく多くの改良及び変化をこれらの実施例に行うことができることが当業者に認められよう。
実施例１
アデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ  ファミリーメンバー結合変異体の細胞病原性
アデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ  ファミリーメンバー結合変異体の細胞病原性を３つの変異体を用いてテストした。Ｄｌ９２２／９４７は、アミノ酸１２２〜１２９の削除を有し（Ｗｈｙｔｅ，Ｐ，Ｒｕｌｅｙ，Ｈ  ＆  Ｈａｒｌｏｕ，Ｅ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６２，２５７〜２６５（１９８８）を参照のこと）。ｄｌ１１０７は、アミノ酸１１１〜１２３の削除を有する（Ｊｅｌｓｍａ，Ｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１，１２０〜１３０（１９８８）を参照のこと）。Ｐｍ９２８は、システインからグリシンへのアミノ酸２４の変換から生ずる点変異を有する。Ｍｏｒａｎ，Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，３４７０〜３４８０（１９８６）を参照のこと。ｄｌ９２２／９４７及びｐｍ９２８は、両方とも、正常なＥＩＡ発現レベルにかかわらず形質転換に欠損を示している。Ａｄ５及び野生型Ｄを野生型アデノウイルス対照として用いた。これらのウイルスは、野生型Ｄ内のＥ３領域内の欠失を除いてほぼ同一である。Ｂａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６，１０７〜１２１（１９８７）を参照のこと。
【００５２】
増殖性細胞を用いるアッセイのために、細胞を７０％コンフルエンスまで増殖させ（２％  ＦＢＳ）、その時に、細胞に０．００１〜１０の感染の多重度（ＭＯＩ）を感染させた。アッセイは５日間、行った。この時プレートは、ａ）クリスタルバイオレットで染色して写真をとったか、又はｂ）スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）で染色してヒメ色アッセイによりテストした。ＳＲＢアッセイは先に記載されている。Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３０，２４３６（１９８９）を参照のこと。要約すると、細胞を４回重複で９６ウェルプレートにプレートし、６時間、接着させた。連続的に希釈したウイルスをテストウェルに加え、そのプレートを３７℃で、５％ＣＯ２ を含む加湿インキュベーター中でインキュベートした。そのアッセイを、４℃で最小１時間、１０％の最終濃度までトリクロロ酢酸を加えることにより感染後適切な日に停止させた。次にプレートを脱イオン水で洗い、空気乾燥させた。プレート上に残った細胞を１％酢酸中０．２％ＳＲＢ溶液で、２０分、室温で染色し、１％酢酸で洗い、空気乾燥させた。結合した染料をシェーカー上で５〜１０分、１０ｍＭの未結合のＴｒｉｓベースで可溶化した。プレートリーダー上で５１５ｎｍで吸光度を読んだ。コントロール値の割合を、テストウェルの光学密度（Ｏ．Ｄ．）／模擬コントロールのＯ．Ｄ．として計算し、ウイルスの感染の多重度（ＭＯＩ）に対してプロットした。正常細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、次に０．２％ＦＢＳで増殖させた後、静止させた。静止状態を細胞周期分析により確認し、各々のアッセイの前に細胞をカウントした。
【００５３】
以下の腫瘍細胞型を細胞病原性アッセイに用い、それらにＡＴＣＣから得た：非小細胞肺癌腫（Ａ５４９，Ｈ２００９，Ｈ１２９９）、大腸癌腫（ＲＫＯ）、子宮頸癌腫（Ｃ３３Ａ）及び喉頭癌腫（ＨＬａＣ）。ヒトパピローマウイルスＥ７遺伝子を発現するＰＫＯヒト大腸腫瘍細胞は、Ｄｒ．Ｋａｔｈｙ  Ｃｈｏ，Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た。
【００５４】
その結果は、ｄｌ９２２／９４７及びｄｌ１０７の両方が、正常ＲＢ発現（ＨＬａＣ，ＰＫＯ，Ｈ１２９９，Ｕ２ＯＳ及びＡ５４９）及び異常ＲＢ発現（Ｃ３３Ａ，Ｈ２００９）の細胞を含むテストした全ての腫瘍細胞系で野生型アデノウイルスに対して細胞病原性を増加させた（図３）。定量的スルホロダミンＢアッセイ（ＳＲＢ）を用いて、単層の５０％を破壊するために要求されるウイルス投与量は、ｄｌ１１０７についてより野生型アデノウイルスについて１０倍まで高かった。同様に、増殖性ＭＶＥＣ、小気通上皮細胞（ＳＡＥＣ）、及びＭＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡが得られる）はＣＰＥに対してよりセンシティブであり、ＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体は野生型ウイルスよりセンシティブであった。点変異体ｐｍ９２８でのＣＰＥ誘導の比率は、２つのＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位削除変異体及び野生型アデノウイルスで見られるものの間の中間であった。興味あることに、野生型ＲＢタンパク質の存在はＣＰＥ結果に影響するようであった；野生型アデノウイルスに対するＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体の優れた細胞病原性は、正常をＲＢ発現の細胞において最も大きかった。対照的に、静止ＭＶＥＣ及びＭＥＣは野生型アデノウイルスに対してよりＥＩＡ変異体ウイルスに対してよりセンシティブでなかった。
【００５５】
これにより、これらのデータは、直接、又はそれらの下にある血管栄養素内皮細胞支持構造を除去することにより、腫瘍細胞を殺すアデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバーの利用性を支持する。
実施例２
アデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ  ファミリーメンバー結合部位変異体の複製
上述の通りウイルス複製アッセイを行った。Ｂｉｓｃｈｏｆｔ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，３７３〜３７６（１９９６）を参照のこと。要約すると、細胞を、実施例１で細胞変性効果アッセイについて記載されるように増殖させ、各々のウイルスを１０のＭＯＩで感染させた。４８時間後、細胞及び上清の両方をウイルス滴定分析のために収集した。細胞ライゼートに３サイクルの凍結及び解凍、次にソニケーター水溶中３ＯＳパルスを行った。上清及びライゼートの連続希釈物をＨＥＫ２９３細胞（Ａｄ２のＥｌ領域を発現するヒト胚腎臓細胞）で滴定した。
【００５６】
Ｄｌ９２２／９４７は、静止非不死化ヒト微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）でインプットタイターを超えるタイターまで複製することができなかった（図２）。対照的に、両方のＥ１変異体ウイルス，ｄｌ１１０７及びｐｍ９２８は、活性に増殖するＭＶＥＣにおいて野生型アデノウイルスより有意によく複製した。同様の結果が、静止及び増殖ヒト乳上皮細胞で得られた（データは示さない）。ｄｌ９２２／９４７の複製は、非増殖内皮細胞に対して約２５倍（７×１０７ 対２．６×１０６ ｐｆｕ／ｍＬ）、野生型アデノウイルスについて２倍の差（４×１０７ 対２×１０７ ｐｆｕ／ｍＬ）、で増殖が増加した。
【００５７】
我々は次に、変異体ＲＢ（Ｃ３３Ａ、子宮頸）又は正常ＲＢ発現（ＨＬａＣ、喉頭）でヒト腫瘍細胞におけるこれらのウイルスの複製を評価した。３つのＥＩＡ  ＲＢ結合変異体ウイルスは両方の腫瘍細胞系で野生型アデノウイルスより多く複製した。同様の結果が、Ａ５４９癌腫細胞（正常ＲＢ発現）で得られた。
実施例３
アデノウイルスＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ  ファミリーメンバー結合部位変異体は、ヌードマウス−ヒト腫瘍移植片モデルにおいて増強された効能を示す
我々は、無胸腺マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片に対するｄｌ９２２／９４７，ｐｍ９２８及び野生型アデノウイルスの抗腫瘍効能を評価した。雌の無胸腺マウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−ｎｕ）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｕｌｅｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから４〜６週の年齢で得て、それらを少くとも２週間、隔離した後、研究した。ＰＫＯ−ＲＣ７．１４又はＨＬａＣヒト癌腫細胞（２×１０６ 細胞）を６〜８週齢マウスの摘腹に皮下に注入した。腫瘍が最大５〜７ｍｍの直径まで成長した時に、以下の通り直接的腫瘍内投与を行った。
【００５８】
腫瘍に５連続日で各々の日に６０μＬ  ＰＢＳに懸濁した１０８ｐｆｕのウイルスを直接、注入した（グループ当りｎ＝６〜１３）。ビヒクル処理した対照腫瘍には同様の様式でＰＢＳのみを与えた。腫瘍の大きさを、動物を殺す（腫瘍体積＞１ｃｍ３ 又は処理後９０日）まで週２回、測定した。腫瘍細胞にＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢ結合部位変異体（ｐｍ９２８又はｄｌ９２２／９４７）、野生型アデノウイルス又はビヒクルのいずれかを注入した。ｄｌ９２２／９４７を注入した結腸腫瘍を有する動物は、８０日の中間生存率であったのに対し、野生型アデノウイルスで処理したグループでは３５日、ビヒクル対照グループでは２５日であった（ｄｌ９２２／９４７対野生型についてｐ：０．０４）（図４、パネルＡ）。ｄｌ９２２／９４７又は野生型アデノウイルスのいずれかで処理したＨＬａＣ腫瘍を有する動物の中間生存率は処理後９０日を通過して到達せず（各々８０％及び７０％が生き続けた）；ビヒクル対照グループの中間生存率は３０日であった（図４、パネルＢ）、完全な腫瘍退縮は，ｄｌ９２２／９４７で処理した１２のＨＬａＣ腫瘍で８つ、ｐｍ９２８では１３のうち５つ、野生型アデノウイルスでは７のうち３つ、そしてビヒクル注入では８のうち０であった。研究終了（９０日）の時に腫瘍再発の証拠がある完全な腫瘍退縮のマウスはなかった。ＥＩＡ  ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー結合部位変異体での処理後７０日までに収集した腫瘍は、アデノウイルスＤＮＡについてのイン・シトウハイブリダイゼーションにより検出される活動的に複製するウイルスを有する細胞を含んでいた。同様に生存率及び応答データがＣ３３Ａ腫瘍異種移植片でも見られた（データは示さない）。
【００５９】
イン・シトウハイブリダイゼーションは、５μｍ断片に切断したホルマリンで固定し、パラフィンに浸漬した組織で行った。スライドをホシレン中で脱パラフィン化し、エタノールを介して水和し、プロテイナーゼＫで滴化し、後に４％パラホルムアルデヒドで固定した。ハイブリダイゼーションを、一晩、３７℃で０．５μｇ／ｍＬビオチニル化アデノウイルスＤＮＡプローブ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｆａｒｍｉｎｇｄａｔｅ，ＮＹ）で行った。５５℃で１×ＳＳＣ中で３回の連続的洗浄を行った後、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ビオチン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を適用した。ＮＢＴ／ＢＣＩＰを色原体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）として用い、スライドをヌクレアファーストレッドで対比染色した。
【００６０】
実施例４
ＥＩＡ−ＣＲ２  ＲＢファミリーメンバー変異体は、野生型ウイルスと比べて、静止コトンラット肺細胞において減少した複製及び毒性を示す
コトンラットはヒトアデノウイルスのための許容されるホストである。Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．らＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６，３８２３〜３８２７（１９８９）を参照のこと。その肺は、生体内アデノウイルス複製及び病原性を研究するための確立されたモデルである。Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７．１０１〜１１１（１９９３）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．＆Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ  ３，１〜８（１９９４）を参照のこと。コトンラットに、ｄｌ９２２／９４７又は野生型アデノウイルスのいずれかを鼻内接種し、３又は１４日後に殺した（時間点当りグループ当りｎ＝５）。野生型アデノウイルスに対するｄｌ９２２／９４７に対する静止正常細胞の相対的耐性をこのモデルで確認した。
【００６１】
ｄｌ９２２／９４７を感染させた肺のイン・シトウハイブリダイゼーション（実施例３に記載の通り行う）は、感染後３日で、１つのケースで複製がなく、他のケースで低レベルの複製を証明した。対照的に、野生型アデノウイルスが感染した肺のイン・シトウハイブリダイゼーションは、全ての動物においてより高いレベルの複製を証明した。野生型アデノウイルスは細気管支上皮全体及び肺柔組織内に拡散して細胞に感染したが、ｄｌ９２２／９４７複製に単離された細気管支上皮細胞に限定された。肺胞の組織病理も、感染後３日及び１４日の両方で、野生型の感染した肺に対してｄｌ９２２／９４７感染の肺で減少した。
【００６２】
コトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｊｄｕｓ）に、上述のように鼻内接種によりアデノウイルスを感染させた。Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６，３８２３−３８２７（１９８９）；Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７，１０１−１１１（１９９３）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｓ．＆Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｄｉｓ３，１−８（１９９４）を参照のこと。要約すると、動物に１０９ｐｆｕを鼻内に接種し（処理グループ当りｎ＝５）、３日後に殺した；先の実験は、これがこの動物モデルにおけるアデノウイルス複製のためのピーク時間であることを示している。肺を、イン・シトウハイブリダイゼーションのために上述のように処理し、区分した。
【００６３】
実施例６
ＲＢ結合部位変異体のＳ期誘導及びウイルスＤＮＡ合成は、野生型アデノウイルスに対して静止正常細胞において削減される
Ｒｂ結合部位変異体アデノウイルス、ｄｌ９２２／９４７及びｄｌ１１０７が非増殖性正常細胞においてＳ期を誘導する能力を野生型アデノウイルスと比較した。ベースラインでは、非不死化小気道上皮細胞の１０％だけがＳ相にあった。野生型アデノウイルスの感染（１０のｍｏｉ）後２４時間、細胞の６１％がＳ期にあり；ｄｌ１１０７感染はこれらの細胞の４０％においてＳ期に導いた。しかしながら、ｄｌ９２２／９４７はＳ期を誘導することにおいて有意により有効でなく；細胞の２６％のみが２４時間後、Ｓ期にあった。ウイルスＤＮＡ複製を、２４時間後、同じアッセイでドット・ブロット分析により評価した。ウイルスＤＮＡ生産は、野生型アデノウイルス及びｄｌ１１０７についておおよそ等価であったが、ｄｌ９２２／９４７でのウイルスＤＮＡ複製は有意により少かった。（野生型レベルの約３０％；ｐ＜０．０５）。
【００６４】
先の記載から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変化及び改変を行ってそれを種々の利用及び条件に適合させることができる。より詳しくは、請求の範囲に記載される特定の試薬及び条件は、置換又は改変し、そしてクレームされるものと同じ又は同様の結果を作り出すであろう。全てのこのような代替物及び改変は、添付の請求の範囲の精神及び範囲内にあると認められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
アデノウイルスＥＩＡ遺伝子領域。ｐＲＢ（及びｐ１０７．ｐ１３０）への結合の原因であるＥＩＡの保存領域（ＣＲ）を示す。ｄｌ９２２／９４７及びｄｌ１１０７中に存在する特定のＣＲ２遺伝子欠損、並びにｐｍ９２８中の点変異を示す。
【図２】
野生型アデノウイルス複製のパーセンテージとしてのＥＩＡ−ＣＲ２変異体（ｄｌ９２２／９４７）の複製効率。Ｄｌ９２２／９４７及び野生型アデノウイルスを、静止又は増殖中の非不死化ヒト微小血管内皮細胞（各々、Ｑ−ＭＶＥＣ及びＰ−ＭＶＥＣ）、Ｃ３３Ａ子宮頸癌細胞及びＨＬａＣ喉頭癌細胞中での複製についてテストした。細胞に、細胞当り１０ｐｆｕ のＭＯＩで感染させ、ＨＥＫ２９３細胞でのプラークアッセイにより４８時間後にウイルスタイターを測定した。データは、３回重複で２回、行ったアッセイの平均（±ＳＥＭ）である。
【図３Ａ】
腫瘍細胞でのＥＩＡ−ＣＲ２変異体（ｄｌ９２２／９４７又はｄｌ１１０７）対野生型アデノウイルスの細胞変性効果の増強。細胞に示される感染の多重度（ＭＯＩ）で感染させ、５日後に細胞単層を固定化して染色した。Ｈ２００９非小細胞肺癌細胞（パネルＡ）及びＨＬａＣ喉頭癌細胞（パネルＢ）をクリスタルバイオレットで染色した。Ａ５４９非小細胞癌細胞（パネルＣ）及びＵ２ＯＳ骨肉腫細胞（パネルＤ）をスルホロダミンＢで染色した；染色は、非感染対照細胞単層のパーセンテージとして表す（中抜き四角＝野生型アデノウイルス；黒ぬり円＝ｄｌ１１０７）。アッセイは、少くとも２回、行った。
【図３Ｂ】
図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】
図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】
図３Ｃの続きである。
【図４Ａ】
ヌードマウス−ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるＥＩＡ−ＣＲ２変異体（ｄｌ９２２／９４７）の腫瘍内注入後の生存率の向上。ＲＫＯ．ＲＣ７．１４ヒト結腸腫瘍細胞（パネルＡ）又はＨＬａＣヒト喉頭腫瘍細胞（パネルＢ）を、ｎｕ／ｎｕマウスの横腹に皮下注入し、腫瘍が５〜７ｍｍの最大直径に達した時に、それらにビヒクル（中抜き三角）又は１０８ｐｆｕのｄｌ９２２／９４７（黒ぬり円）もしくは野生型アデノウイルス（中抜き四角）を、連続５日間、毎日、注入した（ｎ＝６〜１３／グループ）腫瘍を、死ぬまで週２回、測定し；動物を９０日後又はそれらの腫瘍が１ｃｍ以上の直径に成長した後、殺した。結腸異種移植モデル（パネルＡ）において、ｄｌ９２２／９４７を注入したグループの生存率は、ビヒクル−（ｐ＝０．０２）又は野生型アデノウイルス−注入（ｐ＝０．０４）グループの生存率より有意に大きかった。喉頭腫瘍異種移植モデル（パネルＢ）において、ｄｌ９２２／９４７−及び野生型アデノウイルス処理グループの生存率はビヒクル注入グループより有意に大きかった（ｐ≦０．００１）
【図４Ｂ】
図４Ａの続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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