(57)【要約】改良されたワクチン及びその利用方法を開示する。自己免疫疾患又は移植物を有する個人を治療するための免疫抑制組成物及びその利用方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆを含むポリタンパク質。
【請求項２】
ＨＩＶ Ｖｉｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である、請求項１に記載のポリタンパク質。
【請求項３】
ＨＩＶ Ｖｐｕが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である、請求項１に記載のポリタンパク質。
【請求項４】
ＨＩＶ Ｎｅｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である、請求項１に記載のポリタンパク質。
【請求項５】
ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆが、互いに、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆの順序で存在する、請求項１に記載のポリタンパク質。
【請求項６】
プロテアーゼ開裂部位が、ＨＩＶ ＶｉｆとＨＩＶ Ｖｐｕの間に位置され、プロテアーゼ開裂部位が、ＨＩＶ ＶｐｕとＨＩＶ Ｎｅｆの間に配置された、請求項５に記載のポリタンパク質。
【請求項７】
ＨＩＶ Ｖｉｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である、請求項６に記載のポリタンパク質。
【請求項８】
ＨＩＶ Ｖｐｕが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である、請求項６に記載のポリタンパク質。
【請求項９】
ＨＩＶ Ｎｅｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である、請求項６に記載のポリタンパク質。
【請求項１０】
プロテアーゼ開裂部位が、ＲＥＫＲＡＶＶＧ、請求項６に記載のポリタンパク質。
【請求項１１】
ＨＩＶ Ｖｉｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり；ＨＩＶ Ｖｐｕが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり且つＨＩＶ Ｎｅｆが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である、請求項１１に記載のポリタンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１に記載のポリタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子。
【請求項１３】
前記のコード配列が、調節エレメントに操作可能に結合されている、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記の核酸分子が、プラスミドである、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記のコード配列が、調節エレメントに操作可能に結合されている、請求項１４に記載のプラスミド。
【請求項１６】
請求項１２に記載の核酸分子を含む組換えワクチン又は弱毒化ワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載の主題の物質を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物を含む組成物を投与することを含む、ＨＩＶに対して個人を免疫化する方法。
【請求項１９】
前記の免疫化が、予防のためである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記の免疫化が、治療のためである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、個人をヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して免疫化するための、改良されたワクチン及び方法、タンパク質及び核酸分子、それを含む医薬組成物並びにその利用方法に関係する。
【０００２】
発明の背景
有効なワクチンは、長期間持続する免疫を、如何なる有害な副作用も病状の復帰も引き起こすことなく与えるべきである。伝統的なワクチンは、生弱毒化ワクチン、宿主に対する全殺菌製剤即ち生きてない製剤に集中してきた。これらのワクチンは、多くのウイルスに対する防護のための液性及び細胞性免疫応答の両方の成立において立証された効果を有する。幾つかのウイルス性病原体に対するワクチンの開発は、簡単な仕事ではない。この仕事は、病原体の病理生物学と宿主の免疫応答の特異性を含む幾つかの因子によって、面倒なものとなる。最近、これらの相互作用に関係する免疫成分の理解のための新しいツールが利用可能になった。このツール即ち遺伝子免疫又はＤＮＡワクチン接種は、広範囲の病原体に対する安全で機能的なワクチンを開発する努力に対するユニークな源である。
【０００３】
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）病因子である。ＨＩＶ−１は、ＲＮＡを利用してそのメッセージを標的細胞に伝え、その後、それが、該標的細胞内でｃＤＮＡに変換されてその核に組み込まれるレンチウイルスである。ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換における高率のエラーのために、ＨＩＶ−１は、高度に変異しやすいウイルスであり、これは、それに対する伝統的なワクチンの開発を困難な仕事にしている。全ウイルスゲノムではなくて短いＤＮＡセグメントを用いて患者を免疫化する遺伝子免疫は、このウイルスに対してワクチン接種する安全な方法であることが判明しつつある。現在まで、ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶ−１の構造遺伝子、酵素遺伝子及びアクセサリー遺伝子に対して開発されて、マウス及び霊長類において免疫応答を誘導する能力について試験されてきた。これらのワクチン構築物の幾つかは、現在、フェーズＩの臨床試験にある。
【０００４】
ＨＩＶ−１に対する防護に関係する免疫機構は、不明のままである。様々な宿主免疫応答のスペクトルの内で、細胞媒介の免疫の誘導は、該免疫がウイルス除去において決定的な役割を演じうるので、有効なＨＩＶ−１ワクチン候補の特に重要な必要条件でありえよう。ＣＴＬは、ウイルス粒子中に存在する遺伝子産物を標的とすることができるだけでなく、ウイルスの複製中に発現されたすべてのウイルス遺伝子産物をも標的とすることができる。初期の研究は、ＨＩＶ−１感染した患者において、初期ウイルス血症の制御は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の細胞性応答の存在と関係するということを示した。加えて、ＨＩＶ陽性の長期間進行しないもの及びＨＩＶ感染した母親に生まれた未感染の子供は、ＨＩＶ−１タンパク質に対する非常に高いＣＴＬ応答を示し、これは、ＣＴＬ応答を得ることが抗ＨＩＶワクチンの開発の重要な焦点であろうということを示唆している。特異的ＣＴＬ応答の発生によりウイルスタンパク質に狙いを定めた免疫応答は、ウイルス充填を、ウイルスファクトリーを破壊し、それ故に初期ウイルス充填の確立を低下させることによって低下させるのを助けることができるであろう。
【０００５】
霊長類レンチウイルスゲノムは、新規な調節及びアクセサリータンパク質をコードする遺伝子を、それらの構造遺伝子及び酵素遺伝子に加えて含む。これらの調節遺伝子ｔａｔ及びｒｅｖ、並びにアクセサリー遺伝子ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｖｐｘは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶを含む霊長類レンチウイルスにおいてよく保存されている。これらの遺伝子のよく保存された性質は、それらのタンパク質産物がイン・ビボでのウイルスの病因論において決定的に重要な役割を演じていることを意味する。最近の研究は、これらのアクセサリー遺伝子を増大されたビリオン生成に関連付け、それらをＨＩＶ感染の病因論に帰しており、これらは共に、アクセサリー遺伝子がＨＩＶ−１の実際的な活発な成分であるという考えに支持を与えるものである。これらの遺伝子産物は、このウイルスのオープンリーディングフレームの２０％に相当し、イン・ビボで免疫原性であり、おそらくは一層突然変異生成しやすくなく、従って、それらは、ワクチン開発のための重要な標的に相当する。ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子及び調節遺伝子に対するＤＮＡワクチンの開発は研究されてはいるが、これらの遺伝子は潜在的に正常な細胞活性を破壊しうるという事実が、抗アクセサリー遺伝子ＤＮＡワクチンの開発に更なるレベルの複雑さを加えている。
【０００６】
ＨＩＶに対するワクチンに対する要求がある。ウイルスに感染した標的細胞を種々の分岐群から排除することのできる免疫応答を生成する組成物及び方法に対する要求がある。
【０００７】
図面の簡単な説明
図１Ａ及び１Ｂは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図１Ａは、機能的及び弱毒化ｖｉｆ及びｎｅｆカセットにより誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球活性を研究する実験からのデータを示している。図１Ｂは、Ｔ細胞増殖実験からのデータを示しており、該実験においては、Ｔ細胞増殖を、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ及びｎｅｆを発現するプラスミドでの免疫化により誘導した。
【０００８】
図２Ａは、構築物を描いており、図２Ｂは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図２Ａは、単一発現カセットとしての、ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆの融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質の構築及びデザインを描いている。図２Ｂは、Ｔ７系を利用したイン・ビトロ翻訳後のＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐの発現からのデータを示している。
【０００９】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図３Ａは、免疫沈降によるＨｅＬａ細胞中でのＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関するデータを示している。図３Ｂは、イン・ビボでのＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している。図３Ｃは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ抗原発現の免疫組織化学的分析の結果を示している。
【００１０】
図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、組換えＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆでのイン・ビトロ刺激後にｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウス由来の脾臓細胞のＴ細胞増殖に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。
【００１１】
図５は、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。
【００１２】
図６Ａ及び６Ｂは、ＨＩＶ−１（Ｔ向性及び二向性）感染した標的に対するｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球応答並びにＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現構築物により免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードＣＴＬ応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。図６Ａは、ＨＩＶ−１（Ｔ向性及び二向性）感染した標的に対するｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球応答に関する実験からのデータを示している。図６Ｂは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現構築物で免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードＣＴＬ応答に関する実験からのデータを示している。
【００１３】
発明の説明
ここで用いる場合、用語「ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質」は、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆのアミノ酸配列を単一タンパク質として含むポリタンパク質を指すことを意味する。ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質は、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆの少なくとも１つが弱毒化されたポリタンパク質を含む。ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質は、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆが任意の順序で存在するポリタンパク質を含む。ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質は、コンポーネントタンパク質（ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆ）が他のコンポーネントタンパク質と隣接し又は非コンポーネントタンパク質配列例えばタンパク質分解による開裂部位を作るアミノ酸配列（これらに限らない）によって分離されているポリタンパク質を含む。
【００１４】
ここで用いる場合、用語「ＨＩＶ ＶＶＮ構築物」は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードする核酸分子を指すことを意味する。
【００１５】
ここで用いる場合、用語「弱毒化」は、野生型と免疫学的に交差反応性であるが、機能性でないか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するＨＩＶアクセサリータンパク質を指すことを意味する。一般に、弱毒化タンパク質は、機能的な野生型タンパク質と比較して改変された配列を有する。当業者は、容易に、野生型と免疫学的に交差反応性であるが機能性ではないか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有する改変された配列を有するタンパク質を同定することができる。
【００１６】
ＨＩＶタンパク質Ｖｉｆは、末梢血液リンパ球、マクロファージ及びある種の細胞株においてＨＩＶの複製に必須であると報告された２３ｋＤのポリペプチドである。アッセイを行って、改変配列を有するＶｉｆタンパク質を試験して、その改変型が機能性でないか又は機能的に野生型と比較して血管を有するかどうかを測定することができる。ＨＩＶ Ｖｉｆのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ） 及びＨＩＶ配列データベース（ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）でアクセスすることができる（これらを、各々、参考として本明細書中に援用する）。弱毒化ＨＩＶ Ｖｉｆをコードする遺伝子構築物を、Ａｙｙａｖｏｏ Ｖ、等（１９９７）ＡＩＤＳ １１：１４３３−１４４４（参考として本明細書中に援用する）に記載のようにして製造することができる。好適な弱毒化形態のＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である：
【化１】
2004525604.tif 000002
【００１７】
このｖｉｆ遺伝子は、無症候性のＨＩＶ−１患者から単離される。機能アッセイ例えばトランス相補性研究を行ったところ、それらの結果は、この変異体がイン・ビトロでの無細胞ＨＩＶ−１感染を支持できないことを示している。
【００１８】
ＨＩＶタンパク質Ｖｐｕは、主として細胞の内膜に局在している一体式の膜リンタンパク質である１６ｋＤのポリペプチドである（Ｓａｔｏ Ａ．等、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １９９０；４：３０３−３１２、参考として本明細書中に援用する）。ＨＩＶ感染細胞において、ウイルスレセプターＣＤ４とウイルスエンベロープタンパク質との間で複合体が小胞体中で形成され、この区画内への両タンパク質の捕獲が引き起こされる。従って、細胞内Ｅｎｖ−ＣＤ４複合体の形成は、ビリオンのアセンブリを邪魔する。Ｖｐｕは、Ｅｎｖと複合体化したＣＤ４分子の分解の引き金を引くことによって、ウイルスエンベロープを遊離させる。（Ｗｉｌｌｅｙ Ｒ．Ｌ．等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９２；６６（１２）：７１９３−７２００、参考として本明細書中に援用する。）Ｖｐｕも又、ＨＩＶの感染細胞表面からの放出を増大させる。（Ｋｌｉｍｋａｉｔ Ｔ．等、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９０；６４：６２１−６２９、参考として本明細書中に援用する。）アッセイを行って、改変された配列を有するＶｐｕタンパク質を試験して、その改変型が非機能性であるか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するかを測定することができる。ＨＩＶ Ｖｐｕのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ） 及びＨＩＶ配列データベース（ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）でアクセスすることができる（これらを、各々、参考として本明細書中に援用する）。好適な弱毒化形態のＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である：
【化２】
2004525604.tif 000003
【００１９】
ＨＩＶタンパク質Ｎｅｆは、ＣＤ４の細胞表面での発現のダウンレギュレーション、（Ｇａｒｃｉａ Ｊ．Ｖ．及びＭｉｌｌｅｒ Ａ．Ｄ． Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ １９９２；１４３：５２−５５， 参考として本明細書中に援用する）Ｔ細胞活性化の動揺、（Ｌｕｒｉａ Ｓ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９１；８８：５３２６−５３３、参考として本明細書中に援用する）及びＨＩＶ感染性の刺激を含む複数の活性を有することが示されている。（Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ．Ｄ．等、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９４；１７９：１０１−１１３、参考として本明細書中に援用する。）アッセイを行って、改変された配列を有するＮｅｆを試験して、その改変型が非機能性であるか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するかを測定することができる。ＨＩＶ Ｎｅｆのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ） 及びＨＩＶ配列データベース（ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）でアクセスすることができる（これらを、各々、参考として本明細書中に援用する）。好適な弱毒化形態のＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である：
【化３】
2004525604.tif 000004
【００２０】
このＮｅｆクローンは、やはり長期間進行しない患者から単離されるが、ＣＤ４細胞での発現に際してＣＤ４及びＭＨＣ−１分子を下方調節しない。
【００２１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）アクセサリータンパク質のＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆのタンパク質コンポーネントの配列を含むポリタンパク質に関係する。幾つかの具体例において、このポリタンパク質のコンポーネントタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置される。幾つかの具体例においては、少なくとも１つのタンパク質コンポーネントは、弱毒化形態のアクセサリータンパク質である。幾つかの具体例においては、ヒト免疫不全ウイルスのアクセサリータンパク質のＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆタンパク質コンポーネントの各々は、弱毒化形態である。
【００２２】
幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、ポリタンパク質のタンパク質コンポーネントの間に導入する。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｉｆとＶｐｕの間に含ませる。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｐｕとＮｅｆの間に含ませる。幾つかの具体例においては、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質を、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置し且つプロテアーゼ開裂部位をＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｉｆとＶｐｕの間に含ませ且つプロテアーゼ開裂部位をＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｐｕとＮｅｆの間に含ませる。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位は、ＲＥＫＲＡＶＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。幾つかの好適具体例においては、弱毒化形態のコンポーネントタンパク質をポリタンパク質に含ませ、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質を、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置し、プロテアーゼ開裂部位ＲＥＫＲＡＶＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をＶｉｆとＶｐｕの間及びＶｐｕとＮｅｆの間に含ませる。
【００２３】
本発明は、ＨＩＶアクセサリータンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆのタンパク質コンポーネント配列を含むポリタンパク質をコード配列を含む核酸分子と関係している。幾つかの具体例において、コード配列は、コンポーネントタンパク質がＮ末端からＣ末端へＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置されたポリタンパク質をコードする。幾つかの具体例において、コード配列は、ＨＩＶアクセサリータンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの少なくとも１つの弱毒化形態をコードしている。幾つかの具体例において、コード配列は、ＨＩＶタンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの各々の弱毒化形態をコードする。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、ポリタンパク質のタンパク質コンポーネントをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、ＨＩＶアクセサリータンパク質Ｖｉｆ及びＶｐｕをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、ＨＩＶアクセサリータンパク質Ｖｐｕ及びＮｅｆをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、コード配列は、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質をコードし、該コンポーネントタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置され、１つのプロテアーゼ開裂部位は、ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｉｆとＶｐｕの間に含まれ、１つのプロテアーゼ開裂部位は、ＨＩＶアクセサリータンパク質ＶｐｕとＮｅｆの間に含まれる。幾つかの具体例において、コード配列は、ＲＥＫＲＡＶＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であるプロテアーゼ開裂部位をコードする。幾つかの好適具体例において、コード配列は、ポリタンパク質に含まれるコンポーネントタンパク質の弱毒化形態をコードし、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆの順序で配置され、そしてコード配列は、プロテアーゼ開裂部位ＲＥＫＲＡＶＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をＶｉｆとＶｐｕの間及びＶｐｕとＮｅｆの間にコードする。
【００２４】
幾つかの具体例において、核酸分子のコード配列は、調節エレメントに操作可能に結合される。幾つかの具体例において、核酸分子は、プラスミドである。幾つかの具体例において、核酸分子はプラスミドであり且つ核酸分子のコード配列は、調節配列に操作可能に結合される。
【００２５】
幾つかの具体例において、核酸分子は、組換えワクチン又は弱毒化ワクチンの部分として又は該ワクチンと結合して含まれ、核酸分子のコード配列は、調節エレメントに操作可能に結合される。
【００２６】
本発明は、上記のようなこの発明のポリタンパク質及び／又は核酸分子を含む注射用医薬組成物を含む医薬組成物と関係する。
【００２７】
本発明は、ＨＩＶ感染に対して個人を免疫化する方法に関係する。これらの方法は、上記のようなこの発明のポリタンパク質及び／又は核酸分子を含む組成物を治療又は予防のための免疫応答を誘導するのに有効な量で投与するステップを含む。幾つかの具体例において、個人は、未感染であり、方法は、予防用である。幾つかの具体例において、個人は、感染しており、方法は、治療用である。幾つかの治療方法は、ＨＩＶに感染した個人を同定するステップを含む。ＨＩＶに感染した個人を同定する方法は、当業者には周知である。幾つかの具体例においては、個人に、ポリタンパク質を投与する。幾つかの具体例においては、個人に、ポリタンパク質をコードする核酸分子を投与する。
【００２８】
本発明により、予防及び／又は治療のために個人をＨＩＶに対して免疫化する組成物及び方法を提供する。遺伝物質は、個人の細胞により発現され、免疫原性の標的として働いて、それに対する免疫応答が誘出される。その結果生じる免疫応答は、広域的であり：液性免疫応答に加えて、細胞性免疫応答の両アームが誘出される。本発明の方法は、予防及び治療用の免疫を与えるのに有用である。従って、免疫化方法は、ＨＩＶ感染から個人を防護する方法並びにＨＩＶ感染を患った個人を治療する方法の両方を含む。
【００２９】
細胞により取り込まれると、この発明の遺伝子構築物は、その細胞内に、機能的な染色体外分子として存在し続けることができ及び／又はその細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる。ＤＮＡは、細胞に導入することができ、該細胞においてそれは別個の遺伝物質としてプラスミド形態で存続する。或は、染色体に組み込まれうる直線状ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＤＮＡを細胞に導入する場合には、ＤＮＡの染色体への組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列も又、ＤＮＡ分子に含ませることができる。或は、ＲＮＡを細胞に投与することができる。この発明の遺伝子構築物を、セントロメア、テロメア及び複製起点を含む直線状ミニクロモソームとして与えることも又、企図される。
【００３０】
この発明の遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。これらのエレメントには：プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、エンハンサーが、この発明のタンパク質をコードする配列の遺伝子発現のためにしばしば必要とされる。これらのエレメントは、所望のタンパク質をコードする配列と操作可能に結合されること及びこれらの調節エレメントは、それらが投与される個人において操作可能であることが必要とされる。
【００３１】
開始コドン及び終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分と考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、遺伝子構築物が投与される個人において機能的であることが必要である。開始コドン及び終止コドンは、コード配列とイン・フレームでなければならない。
【００３２】
使用するプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個人の細胞内で機能的でなければならない。
【００３３】
本発明を実施するのに（特に、ヒトのための遺伝子ワクチンの製造において）有用なプロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター例えばＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター並びにヒトの遺伝子例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインに由来するプロモーターが含まれるが、これらに限らない。
【００３４】
本発明の実施（特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造）に有用なポリアデニル化シグナルの例には、ヒト及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限らない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）中にあるＳＶ４０のポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとして言及される）が用いられる。
【００３５】
ＤＮＡ発現に必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントも、このＤＮＡ分子に含ませることができる。かかる追加的エレメントには、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、次のものを含む群から選択することができる（但し、これらに限らない）：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルス性エンハンサー例えばＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ由来のもの。
【００３６】
この発明の遺伝子構築物は、それを染色体外に維持して細胞内に複数コピーを生成するために哺乳動物の複製起点を用いて提供することができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）製のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、エプスタインバールウイルスの複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、組込みを起こすことなく高コピー性のエピソーム的複製を生じる。
【００３７】
免疫化適用に関する幾つかの好適具体例においては、ＨＩＶ ＶＶＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、更に、かかる標的タンパク質に対する免疫応答を増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子を送達する。かかる遺伝子の例は、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＢ７．２をコードするものである。標的タンパク質に対する免疫応答を更に増強するタンパク質の遺伝子の利用は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４３３２（１９９９年２月２６日出願）にも記載されており、国際公開Ｎｏ．ＷＯ９９／４３８３９として１９９９年９月２日に公開されている。
【００３８】
タンパク質生成を最大にするために、構築物を投与する細胞内での遺伝子発現によく適合した調節配列を選択することができる。その上、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を生成することができる。
【００３９】
本発明の方法は、核酸分子を個人の組織に投与するステップを含む。幾つかの好適具体例において、これらの核酸分子は、筋肉内投与され、鼻内投与され、腹腔内投与され、皮下投与され、皮内投与され、静脈投与され、エアゾル投与により肺組織に若しくは局所投与され、又は洗浄により粘膜組織（膣、直腸、尿道、頬及び舌下よりなる群から選択）に投与される。
【００４０】
本発明の一つの面は、本発明の方法において有用な医薬組成物に関係する。これらの医薬組成物は、少なくとも一種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、個人の細胞における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合して含む核酸分子好ましくはＤＮＡ分子を含む。これらの医薬組成物は、製薬上許容しうるキャリアー又は希釈剤を更に含む。用語「医薬」は、当業者に周知で、広く理解されている。ここで用いる場合、用語「医薬組成物」及び「注射用医薬組成物」は、当業者に理解されている普通の意味を有することを意味する。医薬組成物は、無菌性、発熱物質、粒子物質並びに等張性及びｐＨに関する特定の標準に合致することを要する。例えば、注射用医薬品は、無菌であり且つ発熱物質を含まない。
【００４１】
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜１０，０００μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好適具体例において、これらの医薬品は、約２０００μｇ、３０００μｇ、４０００μｇ又は５０００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１０００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜８００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約０．１〜５００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１〜３５０μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約２５〜２５０μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約１００μｇのＤＮＡを含む。
【００４２】
この発明の遺伝子構築物を含む本発明による医薬組成物を、利用すべき投与方法に応じて配合する。当業者は、遺伝子構築物を含むワクチン又は非免疫原性治療剤を容易に配合することができる。筋肉内注射が選択した投与方法である場合には、好ましくは、等張性配合物を用いる。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。幾つかの場合には、等張溶液例えばリン酸緩衝塩溶液が好適である。安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。幾つかの具体例においては、血管収縮剤をこの配合物に加える。本発明のこれらの医薬製剤は、無菌で且つ発熱物質を含まないで提供される。この発明による医薬組成物は、核酸分子と共に送達用成分を含み、更に、製薬上許容しうるキャリアー又はビヒクル例えば塩溶液を含む。任意の媒質を、核酸の上首尾の送達のために利用することができる。当業者は、本発明で利用することのできる多数の製薬上許容しうる媒質を容易に理解することができる。適当な製薬用キャリアーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌ（この分野の標準的参考書）（参考として本明細書中に援用する）に記載されている。
【００４３】
幾つかの具体例においては、核酸分子を、促進剤と共に細胞に送達する。促進剤は又、ポリヌクレオチド機能増強剤又は遺伝子ワクチン進行剤とも呼ばれる。促進剤は、米国特許第５，８３０，８７６号（１９９８年１１月３日発行）、米国特許第５，５９３，９７２号（１９９７年１月１４日発行）及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）（米国特許出願第０８／９７９，３８５号、１９９７年１１月２９日出願）に記載されている（これらの各々を参考として本明細書中に援用する）。加えて、促進剤は、米国特許第５，７３９，１１８号（１９９８年４月１４日発行）、米国特許第５，８３７，５３３号（１９９８年１１月１７日発行）、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２５０２（１９９５年９月２８日出願）及びＰＣＴ／ＵＳ９５／０４０７１（１９９５年３月３０日出願）に記載されている（これらの各々を参考として本明細書中に援用する）。核酸分子と共に投与される促進剤は、核酸分子との混合物として投与することができ、又は核酸分子の投与と同時に若しくは前後して別々に投与することができる。加えて、トランスフェクティング剤及び／又は複製剤及び／又は炎症剤として機能しうる他の薬剤並びに促進剤を伴って又は伴わずに同時投与されうる他の薬剤には、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＢ７．２並びに繊維芽細胞成長因子、表面活性剤例えば免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体及び小胞例えばスクアレン及びスクアレン、及びヒアルロン酸が含まれる。免疫化の方法に関係する具体例においては、好適に免疫応答を増強する協力剤を選択する。免疫抑制方法に関係する具体例においては、免疫応答を増強しない協力剤を選択する。
【００４４】
幾つかの好適具体例において、この発明の遺伝子構築物は、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン及びこれらの塩酸塩例えば局所麻酔剤の系統のものよりなる群から選択する進行剤と配合され又は該剤と共に投与される。
【００４５】
幾つかの好適具体例における進行剤は、下記式の１つを有する化合物であってよい：
【化４】
Ａｒ−Ｒ１−Ｏ−Ｒ２−Ｒ３
又は
【化５】
Ａｒ−Ｎ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３
又は
【化６】
Ｒ４−Ｎ−Ｒ５−Ｒ６
又は
【化７】
Ｒ４−Ｏ−Ｒ１−Ｒ７
｛式中、
Ａｒは、ベンゼン、ｐ−アミノベンゼン、ｍ−アミノベンゼン、ｏ−アミノベンゼン、置換されたベンゼン、置換されたｐ−アミノベンゼン、置換されたｍ−アミノベンゼン、置換されたｏ−アミノベンゼンであり、ここに、これらのアミノベンゼン化合物中のアミノ基は、アミノ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン、Ｃ１〜Ｃ５、Ｃ１〜Ｃ５ジアルキルアミンであってよく、置換された化合物中の置換基は、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ５アルキル及びＣ１〜Ｃ５アルコキシであり；
Ｒ１は、Ｃ＝Ｏ；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル（分枝アルキルを含む）；
Ｒ３は、水素、アミン、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン、Ｃ１〜Ｃ５、Ｃ１〜Ｃ５ジアルキルアミン；
Ｒ２＋Ｒ３は、環状アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換されたヘテロ環（Ｃ１〜Ｃ１０アルキルＮ置換されたヘテロ環を含む）を形成することができ；
Ｒ４は、Ａｒ、Ｒ２若しくはＣ１〜Ｃ５アルコキシ、環状アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換されたヘテロ環及びＣ１〜Ｃ１０アルコキシ置換されたヘテロ環（Ｃ１〜Ｃ１０アルキルＮ置換されたヘテロ環を含む）であり；
Ｒ５は、Ｃ＝ＮＨ；
Ｒ６は、Ａｒ、Ｒ２若しくはＣ１〜Ｃ５アルコキシ、環状アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換されたヘテロ環及びＣ１〜Ｃ１０アルコキシ置換されたヘテロ環（Ｃ１〜Ｃ１０アルキルＮ置換されたヘテロ環を含む）であり；そして
Ｒ７は、Ａｒ、Ｒ２若しくはＣ１〜Ｃ５アルコキシ、環状アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換されたヘテロ環及びＣ１〜Ｃ１０アルコキシ置換されたヘテロ環（Ｃ１〜Ｃ１０アルキルＮ置換されたヘテロ環を含む）である｝。
【００４６】
エステルの例には、安息香酸エステル例えばピペロカイン、メプリルカイン及びイソブカイン；パラ−アミノ安息香酸エステル例えばプロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカイン及びクロロプロカイン；メタブタミン及びプリマカインを含むパラ−アミノ安息香酸エステル；並びにパラ−エトキシ安息香酸エステル例えばパラエトキシカインが含まれる。アニリドの例には、リドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカイン及びプリロカインが含まれる。かかる化合物の他の例には、ジブカイン、ベンゾカイン、ジクロニン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチルブピバカイン、ピクリン酸ブタシン、フェナカイン、ジオタン、ルカイン、イントラカイン、ヌパカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミン及び植物由来の二環式化合物例えばコカイン、シンナモイルコカイン、トラキシリン及びコカエチレン並びにすべてのかかる化合物の塩酸塩との複合体が含まれる。
【００４７】
好適具体例において、進行剤は、ブピバカインである。ブピバカインとメピバカインの間の違いは、ブピバカインが、メピバカインのＮ−メチル基の代わりにＮ−ブチル基を有していることである。化合物は、そのＮにＣ１〜Ｃ１０を有しうる。化合物は、プロカイン及びクロロプロカインのようにハロゲンによって置換されうる。これらのアニリドは好適である。
【００４８】
促進剤は、遺伝子構築物と同時に又はそれと前後して投与される。促進剤と遺伝子構築物は、同じ組成物において配合することができる。
【００４９】
ブピバカイン−ＨＣｌは、２−ピペリジンカルボキサミド、１−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−一塩酸塩、一水化物として化学的にデザインされて、医薬用途のために、Ａｓｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏ在）及びＳａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒｏｐ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ニューヨーク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（ニューヨーク、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ在）を含む多くの供給源から広く商業的に入手可能である。ブピバカインは、メチルパラベンを伴って及び伴わないでそしてエピネフリンを伴って又は伴わないで商業的に配合される。任意のかかる配合を用いることができる。それは、医薬用途のために濃度０．２５％、０．５％及び０．７５％で市販されており、この発明において用いることができる。或は、特に、所望の効果を誘出する０．０５〜１．０％の濃度を適宜調製することができる。本発明により、約２５０μｇ〜１０ｍｇのブピバカインを投与する。幾つかの具体例においては、約２５０μｇ〜７．５ｍｇを投与する。幾つかの具体例においては、約０．０５〜５．０ｍｇを投与する。幾つかの具体例においては、約０．５〜３．０ｍｇを投与する。幾つかの具体例においては、約５〜５０μｇを投与する。例えば、幾つかの具体例においては、約５０μｌ〜約２ｍｌの、好ましくは５０〜１５００μｌの及び一層好ましくは約１ｍｌの０．２５〜０．５０％ ブピバカイン−ＨＣｌ及び０．１％ メチルパラベン（等張医薬用キャリアー中）をワクチンと同じ部位に、ワクチンの投与と同時又は前後して投与する。同様に、幾つかの具体例においては、約５０μｌ〜２ｍｌの、好ましくは５０〜約１５００μｌの及び一層好ましくは約１ｍｌの０．２５〜０．５０％ ブピバカイン−ＨＣｌ（等張医薬用キャリアー中）をワクチンと同じ部位に、ワクチンの投与と同時に又は前後して投与する。ブピバカインと他の任意の類似の作用をする化合物（特に、局所麻酔剤の関連系統のもの）を、所望の遺伝子構築物の細胞による取り込みの促進を与える濃度で投与することができる。
【００５０】
この発明の幾つかの具体例においては、個人に、先ず、進行剤の注射をしてから、遺伝子構築物を投与する。即ち、遺伝子構築物の投与の例えば約１週間から１０日前までに、個人に、先ず、進行剤を注射する。幾つかの具体例においては、この個人に、進行剤を、遺伝子構築物の投与の約１〜５日前又は後（幾つかの具体例においては、２４時間前又は後）に注射する。或は、用いたとしても、進行剤を、遺伝子構築物の投与と同時か又は数分前後して投与する。従って、進行剤と遺伝子構築物を合わせて、単一の医薬組成物を形成することができる。
【００５１】
幾つかの具体例においては、遺伝子構築物を、促進剤なしで、即ち促進剤を含まない配合物にて、遺伝子構築物を促進剤の投与と共には投与しない投与プロトコールを利用して投与する。
【００５２】
免疫化と関連する幾つかの具体例において、この発明の遺伝子構築物は、弱毒化生微生物の遺伝物質又は組換え微生物ベクターの部分のままであってよい。本発明は、改良された弱毒化生ワクチン及びＶＶＮポリタンパク質及び／又は該ポリタンパク質をコードする核酸分子を送達するために組換えベクターを利用する改良されたワクチンに関係する。弱毒化生ワクチン及び外来抗原を送達するために組換えベクターを利用するものの例は、米国特許第４，７２２，８４８号；５，０１７，４８７号；５，０７７，０４４号；５，１１０，５８７号；５，１１２，７４９号；５，１７４，９９３号；５，２２３，４２４号；５，２２５，３３６号；５，２４０，７０３号；５，２４２，８２９号；５，２９４，４４１号；５，２９４，５４８号；５，３１０，６６８号；５，３８７，７４４号；５，３８９，３６８号；５，４２４，０６５号；５，４５１，４９９号；５，４５３，３６４号；５，４６２，７３４号；５，４７０，７３４号；及び５，４８２，７１３号に記載されている（これらの各々を参考として本明細書中に援用する）。
ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は供給され、ワクチン被接種者において機能して発現を達成することのできる調節配列に操作可能に結合されている。これらの遺伝子構築物は、弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンに取り込まれて、この発明の改良されたワクチンを生成する。遺伝子構築物は、組換えウイルスワクチンのゲノムの部分であってよく、遺伝物質は、細胞の染色体に組み込まれてもよいし染色体外に維持されてもよい。
【００５３】
この発明の幾つかの具体例は、タンパク質及びその利用方法に関係する。例えば、幾つかの免疫化方法においては、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質を個人に投与する。ここで用いる場合、用語「この発明のタンパク質」は、この発明の同様の手段により生成することができて、この発明の方法における利用のための同様の仕方で配合して投与することのできるＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質を意味することを意図している。
【００５４】
この発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（組換え発現ベクターを含む）は、日常的に生成することができる。ここで用いる場合、用語「組換え発現ベクター」は、適当な宿主に導入された場合にコード配列の発現を指示するのに必要な遺伝子エレメントを含むプラスミド、ファージ、ウイルス粒子又は他のベクターを指すことを意味する。当業者は、標準的技術及び用意に入手できる出発材料を用いて、この発明のタンパク質をコードする核酸分子を単離し又は合成して、発現ベクターに挿入することができる。このコード配列は、必要な調節配列に操作可能に結合される。発現ベクターは、周知であって、容易に入手できる。発現ベクターの例には、宿主細胞をトランスフォームしてコード配列の発現を即死するのに有用なプラスミド、ファージ、ウイルスベクター及び他の核酸分子含有ビヒクルが含まれる。この発明の幾つかの具体例は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターに関係する。この発明の組換え発現ベクターは、宿主をトランスフォームするのに有用である。本発明は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターに関係する。
【００５５】
本発明は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関係する。タンパク質生成のための周知の組換え発現系において利用するための宿主細胞は、周知であり、容易に入手できる。宿主細胞の例には、細菌細胞例えば大腸菌、酵母細胞例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞例えばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、非ヒト哺乳動物組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト組織培養細胞例えばＨｅＬａ細胞が含まれる。
【００５６】
幾つかの具体例において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、ＤＮＡ分子を市販の発現ベクターに、周知の発現系で用いるために、挿入することができる。例えば、市販のプラスミドプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）を、大腸菌において、ＣＤ８０ΔＣ変異型タンパク質の生成のために利用することができる。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）を、例えば、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中での生成のために利用することができる。市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）を、例えば、昆虫細胞における生成のために利用することができる。市販のプラスミドｐｃＤＮＡＩ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ在）を、例えば、哺乳動物細胞例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞において、生成のために利用することができる。当業者は、日常的技術及び容易に入手できる出発材料を利用して、この発明のタンパク質を生成するために、市販のベクター及び系又は他のものを利用することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）（参考として、本明細書中に援用する）を参照されたい。）従って、所望のタンパク質を、原核生物の系及び真核生物の系（該タンパク質のプロセッシングを受けた形態のスペクトルを生じる）の両方で生成することができる。
【００５７】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を利用し、又は周知の技術と容易に入手できる材料を用いてベクターを生成することができる。必要な制御配列例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、容易に入手でき、様々な宿主について公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。
【００５８】
この発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを利用して、適合性の宿主をトランスフォームし、次いで、それを、外来ＤＮＡの発現が起きる条件下で培養して維持する。こうして生成したこの発明のタンパク質を、適宜、細胞を溶解させることにより又は当分野で公知の培養培地から回収する。当業者は、周知の技術を利用して、かかる発現系を用いて生成されたこの発明のタンパク質を単離することができる。この発明のタンパク質を天然起源から、かかるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて精製する方法は、かかる抗体を生成する方法が日常的であるように日常的なものである（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． 及びＬａｎｅ， Ｅ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（参考として、本明細書中に援用する）を参照されたい）。かかる抗体を利用して、組換えＤＮＡ技術により生成した又は天然起源のタンパク質を精製することができる。
【００５９】
遺伝子構築物の例には、この発明のタンパク質をコードし且つ当該構築物をトランスフェクトされた細胞株において機能的なプロモーターに操作可能に結合されたコード配列 が含まれる。構成的プロモーターの例には、サイトメガロウイルス又はＳＶ４０由来のプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、マウス乳腺白血病ウイルス又はメタロチオネインプロモーターが含まれる。当業者は、この発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を、容易に入手できる出発材料から容易に生成することができる。かかる遺伝子構築物は、この発明のタンパク質の生成に有用である。
【００６０】
この発明のタンパク質の組換え技術による生成に加えて、自動化ペプチド合成を用いて、この発明のタンパク質を生成することもできる。かかる技術は、当業者に周知であり、もしも置換を有する誘導体がＤＮＡにコードされたタンパク質の生成において与えられないならば、有用である。
【００６１】
この発明のタンパク質は、以下の公知の技術の何れかにより調製することができる。都合よく、この発明のタンパク質は、初期にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１５：２１４９−２１５４（１９６３）（参考として、本明細書中に援用する）により記載された固相合成技術を利用して調製することができる。他のタンパク質合成技術は、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ等（１９７６） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， 第二版（参考として、本明細書中に援用する）；Ｋｅｎｔ及びＣｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｐ２９５−３５８， Ａｌｉｔａｌｏ等編、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９８５）（参考として、本明細書中に援用する）；並びに他の当業者に公知の参考文献記載の仕事の中に見出すことができる。合成技術の概略は、Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ及びＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（イリノイ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ在）（１９８４）（参考として、本明細書中に援用する）中に見出されうる。溶液法による合成も又、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ．ＩＩ， 第三版、ｐ．１０５−２３７， Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．等編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在（１９７６）（参考として、本明細書中に援用する）に記載されているように利用することができる。かかる合成において用いるのに適当な保護基は、上記のテキスト並びにＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ在（参考として、本明細書中に援用する）中に見出されよう。
【００６２】
一般に、これらの合成方法は、少なくとも１つのアミノ酸残基又は適当な保護されたアミノ酸残基の成長中のペプチド鎖への順次的追加を含む。通常、第一のアミノ酸残基のアミノ基又はカルボキシル基を適当な選択的に除去できる保護基で保護する。反応性側鎖を含むアミノ酸例えばリジンについては、異なる選択的に除去できる保護基を利用する。
【００６３】
固相合成を例として用いて、保護された又は誘導体化されたアミノ酸を、不活性固体支持体に、その保護してないカルボキシル基又はアミノ基を介して結合させる。次いで、アミノ基又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去して、適当に保護された相補的な（アミノ又はカルボキシル）基を有する次の順番のアミノ酸を混合し、既に固体支持体に結合してある残基と反応させる。次いで、アミノ又はカルボキシル基の保護基をこの新たに加えられたアミノ酸残基から除去して、次のアミノ酸（適当に保護されたもの）を加え、以下これを繰り返す。すべての所望のアミノ酸を適当な順序で結合した後で、任意の残りの末端及び側鎖基の保護基（及び固体支持体）を順次的に又は同時に除去して、最終的なペプチドを与える。この発明のペプチドには、好ましくは、ベンジル化又はメチルベンジル化アミノ酸がない。かかる保護基部分は、合成過程中は利用することができるが、ペプチドを用いる前にそれらは除去される。他所で記載したように、コンホメーションを制限する分子内結合を形成するためには、更なる反応が必要でありうる。
【００６４】
幾つかの具体例において、タンパク質は、トランスジェニック動物中で生成することができる。本発明は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関係する。組換えタンパク質の生成に有用な非ヒトトランスジェニック動物は、必要な発現ベクター及びトランスジェニック動物の生成のための技術が周知であるように周知である。一般に、このトランスジェニック動物は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列が乳腺細胞特異的プロモーターに操作可能に結合された組換え発現ベクターを含み、それにより、そのコード配列は、乳腺細胞でのみ発現されて、そのように発現された組換えタンパク質は、その動物の乳汁から回収される。当業者は、標準的技術例えばＷａｇｎｅｒの米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年１０月１０日発行）及びＬｅｄｅｒの米国特許第４，７３６，８６６号（１９８８年４月１２日発行）（これらの両者を参考として、本明細書中に援用する）に教示されたものを利用して、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質を生成するトランスジェニック動物を生成することができる。好適な動物は、ヤギ及びゲッ歯動物特にラット及びマウスである。
【００６５】
この発明のタンパク質のアミノ酸配列の保存的置換を企図する。ここで用いる場合、用語「保存的置換」は、ＨＩＶ ＶＶＮポリタンパク質のアミノ酸の、他の類似の構造的及び／又は電荷的特徴を共有する残基での置換を指すことを意味する。当業者は、アミノ酸の保存的置換を有するこの発明のタンパク質を周知の保存的基に基づいて、容易にデザインすることができる。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、活性剤を哺乳動物の身体内の該剤の作用部位に到達させることのできる任意の手段によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、局所的治療を希望するか全身的治療を希望するかにより及び処理すべき領域に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、局所投与（眼、膣、直腸、鼻内、経皮投与を含む）、経口投与又は非経口投与であってよい。ペプチドは、経口投与された場合には消化対象であるので、経口用配合物は、活性剤を腸溶性被覆するように、或は、それを胃における分解から保護するように配合される（例えば、予備中和）。非経口投与には、静脈内点滴、皮下投与、腹腔内投与又は筋肉注射、肺投与（例えば、吸入による）、又は髄膜下投与又は脳室内投与が含まれる。好適具体例において、非経口投与即ち静脈、皮下、経皮、筋肉内投与は、通常、吸収を最適にするように用いられる。静脈内投与は、注入ポンプの助成を受けて達成することができる。本発明の医薬組成物は、エマルジョンとして配合することができる。
【００６７】
当業者は、本発明で利用することのできる多くの製薬上許容しうる媒質を容易に理解するであろう。適当な製薬用キャリアーは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， （Ａ．Ｏｓｏｌのこの分野における標準的参考書であり、本明細書中に参考として援用する）に記載されている。局所投与用の配合物には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、リキッド及び粉末が含まれうる。慣用の製薬用キャリアー（水性、粉末又は油ベース）、増粘剤などが、必要又は望ましいことがありうる。経口投与用の組成物には、粉末若しくは顆粒、懸濁液若しくは溶液（水中又は非水性媒質中）、カプセル、サッシェ又は錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいことがありうる。非経口投与、静脈投与、髄膜内投与又は脳室内投与用組成物は、無菌の水溶液を含むことができ、これは又、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含むことができ、好ましくは、無菌であって発熱物質を含まない。本発明による静脈投与に適した医薬組成物は、無菌であって発熱物質を含まない。非経口投与のためには、この発明のペプチドは、例えば、溶液、懸濁液、乳液又は凍結乾燥粉末として、製薬上許容しうる非経口用ビヒクルと共に配合することができる。かかるビヒクルの例は、水、塩溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び５％ ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油も又、用いることができる。このビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）及び化学的安定性を維持する添加剤（例えば、緩衝剤及び防腐剤）を含むことができる。この配合物を、通常用いられる技術によって滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口用組成物を、１．５重量％の活性成分を０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解させることにより調製する。
【００６８】
本発明による医薬組成物は、単一投与量として又は多数回の投与量として投与することができる。本発明の医薬組成物は、個々の治療剤として又は他の治療剤と組合せて投与することができる。本発明の治療剤は、慣用の治療と合せることができ、該治療は、順次に施してもよく、又は同時であってもよい。
【００６９】
投薬量は、公知の因子例えば特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその投与様式及び経路；レシピエントの年齢、健康状態及び体重；徴候の性質及び程度、同時の治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に依って変化する。治療用組成物の配合及びそれらのその後の投与は、当業者の技量の内にあると考えられる。通常、ペプチドの投薬量は、体重５０キログラム当たり約１〜３０００ミリグラム；好ましくは、１０〜１０００ミリグラム；一層好ましくは、２５〜８００ミリグラムであってよい。通常、所望の結果を得るために、１日当たり８００ミリグラムを一日に１〜６回の分割投与量にて投与し、又は持続的放出形態で投与する。
【００７０】
こ（れら）のタンパク質を投与する方法に依って、本発明の医薬組成物を、最も効果的に配合して投与することができる。投与方法は、当業者には、本願の開示に照らして明らかとなろう。
【００７１】
本発明の方法は、ヒトの医学及び獣医学の両分野で有用である。従って、本発明は、哺乳類、鳥類及び魚類の遺伝学的免疫に関係する。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ種を含む哺乳動物種に特に有用である。
【００７２】
本発明は、加えて、弱毒化ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）アクセサリータンパク質Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆ（特に、ここに記載して示したもの）、それらをコードする核酸分子並びにそれらのタンパク質又は核酸を含むここに一般的に開示したワクチン並びにそれらの製造及び利用方法にも関係する。幾つかの具体例において、この発明は、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆよりなる群から選択する単一のアクセサリータンパク質、それらをコードする核酸分子並びにここに一般的に記載したそれらの単一タンパク質又は核酸を含むワクチン並びにそれらの製造及び利用方法に関係する。幾つかの具体例において、この発明は、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆよりなる群から選択する２つのアクセサリータンパク質を含むポリタンパク質、それをコードする核酸分子並びにかかるポリタンパク質又は核酸を含むここに一般的に記載したワクチン並びにその製造及び利用方法に関係する。
【００７３】
下記の実施例は、本発明の代表的な面の例を含んでいる。これらの実施例は、この発明の範囲を制限することを意味せず、むしろ、具体例として役立つものである。加えて、この発明の様々な面を以下の記載によって要約することができる。しかしながら、この記載は、この発明の範囲を制限することは意味せず、むしろ、この発明の様々な面を強調するものである。当業者は、容易に、この発明の更なる面及び具体例を認めることができよう。
【００７４】
（実施例）
ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ Ｖｐｕ及びＨＩＶ Ｎｅｆを含む複数のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）アクセサリー遺伝子を発現するＤＮＡワクチンカセットはＡｙｙａｖｏｏ Ｖ，（２０００）， ＡＩＤＳ １４：１−９（参考として、本明細書中に援用する）に記載されたように生成することができる。
【００７５】
材料と方法
細胞：ＨｅＬａ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる）を、ダルベッコ改変イーグル培地、１０％ ウシ胎児血清、１％ ペニシリン、１％ ストレプトマイシン及び１％ Ｌ−グルタミン中で、５％ ＣＯ２中で、３７℃で、単層で生育させた。ＡＴＣＣから得たＰ８１５細胞を、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ウシ胎児血清、１％ ペニシリン、１％ ストレプトマイシン及び１％ Ｌ−グルタミン中で懸濁培養として、３７℃で、ＣＯ２中で維持した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激した（５μｇ／ｍｌ）ＰＢＬを、１０％Ｔ細胞成長因子を含むＲＰＭＩ １６４０培地中に維持した。
【００７６】
複数の免疫原発現カセットの生成：ＨＩＶ−１ ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子を、ＰＣＲを用いて、個々にクローン化した。弱毒化ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子ｖｉｆ（Ｎ１７）、ｖｐｕ（Ｍ５２５６）及びｎｅｆ（Ｓ３１３）を、複数遺伝子融合カセットを構築するために選択した。融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質を構築するために、我々は、オーバーラップＰＣＲ技術を利用した。ＨＩＶ−１ ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆを、この順序で、下記のプライマーを用いて融合させた：
【化８】
ｖｉｆ（＋） ５’ＡＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
【化９】
ｖｉｆ（−） ５’ＴＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧＧＴＴＧＣＡＴＣＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；
【化１０】
ｖｐｕ（＋） ５’ＧＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＡＧＴＡＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
【化１１】
ｖｐｕ（−） ５’ＴＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＣＣＡＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
【化１２】
ｎｅｆ（＋） ５’ＧＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；及び
【化１３】
ｎｅｆ（−） ５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【００７７】
同じプライマーを用いて、融合タンパク質を構築したが、ｖｉｆ（−）プライマー及びｖｐｕ（−）プライマーは、８アミノ酸（ＲＥＫＲＡＶＶＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の付加的なタンパク質分解性開裂部位を有した。増幅融合遺伝子産物（１．４ｋｂ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し（認識配列のための部位を外側プライマー対に組み込んだ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア）中にクローン化して配列決定して突然変異を確認し且つ融合遺伝子の完全性を確実にした。
【００７８】
Ｔ７系を利用する融合タンパク質のイン・ビトロ翻訳：イン・ビトロ転写及び翻訳を、１μｇの融合タンパク質発現用構築物ＤＮＡにて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用して、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ， ウィスコンシン、Ｍａｄｉｓｏｎ在）の指示に従って行った。５μｌのイン・ビトロ翻訳反応生成物を５００μｌの放射免疫沈降アッセイ緩衝液と合せて、ウサギ抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離してオートラジオグラフィーにかけた。
【００７９】
ウエスタンブロット（イムノブロット分析）：ＨｅＬａ細胞を、２０μｇのｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ発現構築物で、ＤＯＴＡＰ（ＢＭＢ， インディアナ）を利用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、選択培地（４００μｇ／ｍｌのゲネチシンを含むＤＭＥＭ）中に置き、単一細胞クローンを単離した。その発現、機能性及び細胞性プロテアーゼによるタンパク質の適当な開裂を分析するために、安定な細胞を溶解させて、細胞溶解物を抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗体を用いる免疫沈降で利用してからウエスタンブロッティングにかけた。
【００８０】
免疫蛍光アッセイ：ＨｅＬａ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に維持して、ポリ−Ｌ−リジンコートしたカバーガラス上に１×１０６細胞／ディッシュ（３５ｍｍ）の密度で播種した。２４時間後に、それらに、ｖＴＦ７−３を感染させて上記のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの１６〜２４時間後に、それらの細胞をＰＢＳで洗い、メタノールで、室温で３０分間固定した。次いで、これらの細胞をＰＢＳで洗い、一次抗血清（１：５０）と共に９０分間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後に、これらのカバーガラスをＰＢＳで１：１００に希釈したＦＩＴＣ結合体化したヤギの抗ウサギＩｇＧアフィニティー精製Ｆ（ａｂ）’２断片（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；カリフォルニア在）と共に９０分間インキュベートし、ＰＢＳで６回洗った。次いで、カバーガラスを、５分間、ＤＡＰＩ（ＰＢＳ中の０．１％、Ｓｉｇｍａ；ミズーリ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ在）を用いて対比染色し、再度洗ってから、退色抵抗性マウンティング媒質（Ｃｉｔｉｆｌｏｕｒ；英国）を用いてスライドガラスに載せた。すべてのインキュベーションは、保湿チャンバー内で３７℃で行った。
【００８１】
ＣＴＬのためのｈＣＤ４及びＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４を発現するマウス安定細胞株の開発：ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｈＣＤ４発現ベクターとｐＢａｂｅ−Ｆｕｓｉｎ又はｈＣＤ４及びｐＢａｂｅ−ＣＣＲ５発現ベクターでＤＯＴＡＰ（ＢＭＢ， インディアナ）を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を４００μｇ／ｍｌのゲネチシン及び２μｇ／ｍｌのピュロマイシン中に維持した。安定な細胞株を単一細胞クローンから樹立して、ｈＣＤ４及びＦｕｓｉｎ又はＣＣＲ５の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。簡単には、細胞（５×１０５）をＦＩＴＣ又はＰＥ標識したＣＤ４、ＣＣＲ５及びＦｕｓｉｎに対するヒトｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， カリフォルニア）で１時間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液（３％ ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３、１×ＰＢＳ中）で洗い（２×）、２％ パラホルムアルデヒドで固定して、蛍光活性化セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， カリフォルニア）で分析した。
【００８２】
一次分離株によるウイルス感染：ｈＣＤ４／Ｆｕｓｉｎ及びｈＣＤ４／ＣＣＲ５を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、１０〜５０ｎｇのＨＩＶ−１ ｐ２４等量の一次のよく特性決定されたＴ向性（ｐＮＬ４３）及び二向性（８９．６）実験室分離株を感染させた。一次分離株は又、種々のクレードＣ、Ｄ、Ｅ及びＡ（ＷＨＯからＮＩＨ ＡＲＲＰＰを介して入手）に由来するウイルスをも含んでいる。これらの細胞の感染性を、培地に放出されたｐ２４抗原を測定することによりアッセイした。このｐ２４アッセイを、ｐ２４キャプチャＥＬＩＳＡキット（Ｃｏｕｌｔｅｒ， フロリダ）を製造業者の指示に従って用いて行った。
【００８３】
マウス：Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（６〜８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（インディアナ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ在）から購入した。これらのマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ及びペンシルベニア大学のガイドラインにより、温度制御して光サイクルにした部屋に入れた。
【００８４】
ＤＮＡ接種：我々は、プラスミドで送達された遺伝子からの、イン・ビボでの増大された発現レベルを生じる促進されたＤＮＡ接種プロトコールを利用してきた。特に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋に、１００μｌの０．２５％ ブピバカイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ， ミズーリ）を２７ゲージ針を用いて注射した。４８時間後に、１００μｇの関心あるＤＮＡ構築物（リン酸緩衝液中）を、その筋肉のブピバカイン注射と同じ領域に注射した。マウスに注射をしてから２週間後に追加の注射をした。第二回目の注射の２週間後に、各グループのマウスの半分を犠牲にして脾臓を取り、残りのマウスには適当なＤＮＡ構築物の第二回目の追加注射をした。
【００８５】
ヘルパーＴ細胞増殖アッセイ：採収したマウス脾臓からリンパ球を調製した。単離した細胞懸濁液を、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に５×１０６の濃度で再懸濁した。５×１０５細胞を含む１００μｌのアリコートを、アッセイレイアウトにより、９６ウェルの平底ミクロ滴定プレートの適当なウェルに加えた。１００μｌの適当なタンパク質を、１０又は２μｇ／ｍｌで、ウェルに、二連で加えて、それぞれ、タンパク質終濃度を５及び１μｇ／ｍｌとした。これらの細胞を、３７℃で、５％ ＣＯ２中で、３日間インキュベートした。トリチウム化チミジン１μＣｉを各ウェルに加えて、これらの細胞を１２〜１８時間、３７℃でインキュベートした。これらのプレートを採収し、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をベータプレートリーダーにて測定した。細胞が健康であることを確認するために、１０μｇ／ｍｌのＰＨＡをポリクローナル刺激剤陽性対照として利用した。刺激インデックスを次式により測定した：刺激インデックス＝（実験での計数値−自然の計数値）／自然の計数値。
【００８６】
細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ：５時間の５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイを、ワクシニア感染標的又はペプチド処理した標的を用いて行った。リンパ球を脾臓から採収し、赤血球を除去して新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製した。このアッセイを、エフェクターのイン・ビトロ刺激あり又はなしの両方を用いて行った。イン・ビトロ刺激したアッセイの場合には、これらのエフェクター細胞を、１日間、２μｇ／ｍｌの濃度のコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ， ミズーリ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ在）で刺激した。次いで、エフェクターを、３日間、関連ワクシニア感染又は１μＭ ペプチド処理したＰ８１５細胞で刺激し、これらを０．１％ グルタルアルデヒド及び０．１Ｍ グリシンで固定した。ワクシニア感染した標的を、３×１０６のＰ８１５細胞を５〜１２時間３７℃で感染させることにより調製した。ペプチドパルスト標的を、Ｐ８１５細胞を５〜１２時間、ペプチドとインキュベートすることにより調製した。これらの標的細胞を、１００μＣｉ／ｍｌのＮａ２５１ＣｒＯ４で６０〜１２０分間標識し、次いで、刺激した脾臓細胞と共に４〜６時間３７℃でインキュベートした。ＣＴＬを、５０：１〜１２．５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で試験した。上清を採収してＬＫＢガンマカウンターにて計数した。特異的溶解パーセントを、次式により測定した：１００×｛（実験での放出−自然の放出）／（最大放出−自然の放出）｝。最大放出は、５％ トリトンＸ−１００含有培地中での標的細胞の溶解により測定した。組換えワクシニア（ｖＮｅｆ及びｖＳＣ８）を、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。
【００８７】
臨床的ＨＩＶ−１分離株に感染した標的を利用するＣＴＬ：ｈＣＤ４／Ｆｕｓｉｎ又はｈＣＤ４／ＣＣＲ５を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｔ向性及びＭφ向性ウイルスの両方を代表するＨＩＶ−１実験室分離株及び臨床的分離株を感染させた。ＨＩＶ−１感染したＮＩＨ３Ｔ３クローンを、クロムで標識し、ＣＴＬアッセイにおいて標的として利用した。
【００８８】
クロスクレードＣＴＬキリング：種々のクレードから分離されたＨＩＶ−１ウイルスを、ｈＣＤ４／Ｆｕｓｉｎ及びｈＣＤ４／ＣＣＲ５を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞への感染に用いた。感染性を、ｐ２４抗原を測定することによってアッセイし、感染細胞をＣＴＬアッセイにおける標的として用いた。
【００８９】
結果
ＤＮＡ免疫化のための弱毒化ｖｉｆ，ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子の構築及び特性決定：ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆを、ＨＩＶ−１陽性患者からクローン化して、それらの機能及び弱毒化について分析した。これらの遺伝子の生物学的特性決定を、表１に示した標準的機能アッセイの後に行なった。弱毒化ｖｉｆ，ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆクローンを、マウスにおける更なる免疫学的分析のために選択した。機能的（野生型）及び幾つかの非機能的（弱毒化）ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆクローンを用いてマウスを免疫化し、生成された免疫応答を測定した。マウスのグループをワクチン構築物の一つを用いて免疫化し、１５日後に追加免疫化を行った。第二回目の注射の２週間後に動物を犠牲にして、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びリンパ球増殖アッセイで用いるために脾臓を得た。ＣＴＬ用の試薬の利用可能性のために、Ｖｉｆを発現するＰ８１５細胞又はＮｅｆを発現するワクシニアに感染したＰ８１５を標的細胞として用いた。機能的及び弱毒化ｖｉｆ及びｎｅｆ構築物は、両方共、ベクター構築物免疫化マウスと比較して抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。
【００９０】
図１Ａは、機能的及び弱毒化ｖｉｆ及びｎｅｆ構築物の両方により誘導された特異的ＣＴＬ活性のパーセンテージを示している。１００μｇの野生型及び弱毒化ｎｅｆ又はｖｉｆ発現プラスミドをマウスの筋肉内に投与した。最初の注射の２週間後に、それらのマウスに、同じ投薬量の各プラスミドを一回追加投与した。更に２週間後に、ＣＴＬアッセイを、方法に記載したように免疫化マウスから採収した脾臓細胞について行なった。このアッセイを、脾臓採収の日に行ない、特異的及び無関係のワクシニア感染標的からのクロム放出を測定した。ベクター主鎖だけで免疫化した対象用グループは、バックグラウンドレベルを超える標的細胞の特異的溶解を生じなかった。β−ｇａｌを発現するワクシニア（ｖＳＣ８）をｐ８１５に感染させて無関係の標的を調製した。複数の実験において、同様の結果が得られた。５０：１のエフェクター：標的比で、ｖｉｆクローンＴ−３７（機能的）及びＮ−１７（弱毒化）は、それぞれ、１９．９及び２５％の特異的溶解を示した。これらの結果は、異なるｖｉｆ構築物によるＤＮＡ免疫化が抗原特異的なＣＴＬ応答を誘導することを示している。同様に、機能的ｎｅｆクローン（Ｎｅｆ−Ｍｎ）及び弱毒化ｎｅｆクローン（Ｎｅｆ−Ｈｘｂ２）は、Ｎｅｆワクシニア感染標的に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞溶解を誘導することができる。
【００９１】
我々は、弱毒化ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆクローンによりそれぞれの抗原刺激により誘導されるＴ細胞増殖応答をも測定した。図１Ｂは、Ｔ細胞増殖実験からのデータを示しており、該実験においては、Ｔ細胞の増殖が、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ及びｎｅｆを発現するプラスミドでの免疫化により誘導された。１００μｇの各ｃＤＮＡ発現カセットをマウスに筋肉注射し、２週間後に一回、それらのマウスに追加の注射をした。追加の注射の１週間後に、２匹のマウスから脾臓を分離して。Ｔ細胞増殖用に用いた。脾臓細胞を、５及び１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質で３日間刺激した。１μＣｉ３Ｈを加えて、取り込まれたｃｐｍを計数した。抗原特異的な刺激（ＳＩ）を計算し、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆにつき提示した。少なくとも３つの別々の実験において、同様の結果が得られた。結果は、ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆが有意のリンパ球増殖応答誘導することができるが、Ｖｐｒ抗原による刺激はこのアッセイにおいて利益がなかったことを示している。これらの結果及び以前の研究から得られた情報に基づいて、アクセサリー遺伝子ｖｐｒは、本研究にマルチ遺伝子ワクチン構築物の部分として含めない。
【００９２】
我々の結果は、病原性遺伝子を、機能的ドメインを同定して、それらのドメインを抗原の発現を邪魔することなく弱毒化した後で、免疫原として利用することができることを示している。マルチ遺伝子カセットの更なる構築のために、我々は、弱毒化ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆクローンを利用した。
【００９３】
ｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合タンパク質カセット（ｐＶＶＮ）及びタンパク質分解性開裂部位を有するｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合タンパク質構築物（ｐＶＶＮ−Ｐ）の構築及び発現：融合タンパク質としてアクセサリー遺伝子を含むマルチ遺伝子ＤＮＡ発現カセットを構築するために、我々は、弱毒化して尚免疫学的に活性なｖｉｆ（Ｎ１７）ｖｐｕ（Ｍ５２５６）及びｎｅｆ（Ｓ３１３）クローンを出発点として選択した。ｖｉｆ及びｖｐｕの停止コドンを除去して、融合タンパク質が個々の遺伝子と同じエピトープを有するようにイン・フレームで融合した。このｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合遺伝子構築物を、ｐＶＶＮと呼ぶ。我々は、タンパク質分解による開裂部位を有するｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合タンパク質を発現させることによって、天然のアミノ及びカルボキシ末端を保存することをも希望した（該融合タンパク質を、ここでは、ｐＶＶＮ−Ｐと呼ぶ）。図２Ａは、ｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質の単一発現カセットとしての構築及びデザインを描いている。ｖｉｆ及びｖｐｕの停止コドンを削除し、後続の配列をイン・フレームで融合させた。ｐＶＶＮは、ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆの単一遺伝子としての発現を表し；ｐＶＶＮ−Ｐは、ｖｉｆとｖｐｕ及びｖｐｕとｎｅｆの間にタンパク質分解性開裂部位を有するｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆの単独遺伝子としての発現を表す。ｐＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質においては、ｖｉｆ及びｖｐｕの停止コドンを除去して、８つのアミノ酸の細胞性タンパク質分解性開裂部位（ＲＥＫＲＡＶＶＧ）を、それ以降のタンパク質配列からの開裂を可能にするようにイン・フレームで配置した。
【００９４】
新規な融合構築物が融合遺伝子産物の生成において機能的であるかどうかを試験するために、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−ｐの両方についてイン・ビトロ翻訳を行ってから、Ｖｉｆ，Ｖｐｕ及びＮｅｆに特異的な抗体を用いる免疫沈降を行った。それらだけによって、Ｖｉｆ，Ｖｐｕ及びＮｅｆは、それぞれ、２４、１０及び２７ｋＤａのタンパク質を発現する。ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐベクターのイン・ビトロ翻訳は、これらの３つのタンパク質に特異的な抗体を用いて検出可能であると予想される６１ｋＤａの融合タンパク質の発現を生じた。図２Ｂは、Ｔ７系を利用したイン・ビトロ翻訳後のＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐの発現からのデータを示している。１μｇのｐＶＶＮ（クローン＃１４）及びｐＶＶＮ−Ｐ（クローン＃２）ＤＮＡを、このイン・ビトロ翻訳系において用いた。イン・ビトロ翻訳産物を、抗Ｖｉｆ（ａＶｉｆ）、抗Ｖｐｕ（ａＶｐｕ）及び抗Ｎｅｆ（ａＮｅｆ）抗体を用いて免疫沈降させた。
【００９５】
ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質のＨｅＬａ細胞における発現及び細胞内局在性：ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の哺乳動物細胞における発現を、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ構築物をそれぞれ発現するＨｅＬａ−ＶＶＮ及びＨｅＬａ−ＶＶＮ−Ｐ安定細胞株を用いて評価した。これらのＤＮＡベクターを用いたトランスフェクション後に、細胞を選択培地中で２日間成長させ、ＰＢＳで２回洗って、溶解させた。細胞溶解物を、抗ｖｉｆ、抗ｖｐｕ及び抗ｎｅｆ抗体とインキュベートし、免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、イムノブロット分析にかけた。ＨｅＬａ細胞におけるｐＶＶＮのトランスフェクションは、６１ｋＤａの融合タンパク質の発現を生じ、これは、３つのすべての抗体によって検出された（データは、示さない）。対照的に、ｐＶＶＮ−Ｐトランスフェクションは、一層高分子量の種と、抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗体によりそれぞれ認識される２４、１０及び２７ｋＤａのタンパク質の両方を生じた。図３Ａは、ＨｅＬａ細胞におけるＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関する免疫沈降によるデータを示している。ＨｅＬａ細胞に、ｐＶＶＮ−Ｐプラスミドを一晩トランスフェクトした。細胞を４８時間正常に維持してから、Ｇ４１８選択にかけた。Ｇ４１８選択を２週間行ない、それらの細胞を溶解させて、抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）によって分析した。抗血清の指示は上部に示してあり、開裂産物は、矢印で記してある。これらの結果は、ｐＶＶＮのイン・ビボ発現が融合タンパク質を生じ、ｐＶＶＮ−Ｐのイン・ビボ発現が少なくとも部分的に予想通りに細胞性プロテアーゼによって開裂された融合タンパク質を生じるということを示している。
【００９６】
ＨＩＶ−１に感染した細胞において、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆは、細胞膜中に普通に存在している。これらのタンパク質を単一のタンパク質又はタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質に融合することがそれらの細胞内局在性を変化させるかどうかを確認するために、我々は、イン・ビトロ及びイン・ビボでの免疫蛍光及び免疫組織化学的研究を行った。ＨｅＬａ細胞を、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐでトランスフェクトし、ｖｉｆ／ｖｐｕ／ｎｅｆ融合タンパク質及びタンパク質分解部位を有する融合タンパク質の局在性を、抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗体を用いる免疫蛍光法により研究した。図３Ｂは、イン・ビボでの、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している。ＨｅＬａ細胞に、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３を感染させ、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現プラスミドをトランスフェクトした。一晩のトランスフェクション後に、これらの細胞を固定し、抗Ｖｉｆ、抗Ｖｐｕ及び抗Ｎｅｆ抗血清を用い、その後、アフィニティー精製したフルオレセインイソチオシアネート結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧを用いて染色した。すべての抗血清はウサギにおいて高めたものなので、それらは、単一免疫蛍光において結合されえなかった。ＤＡＰＩ、核染色；ＦＩＴＣは、特異的抗血清染色された細胞を表す。図３Ｂのデータは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆが、融合タンパク質であっても、タンパク質分解部位を有する融合タンパク質であっても、それらの野生型の細胞質内局在性パターンを維持していることを示している。これらの結果は、これらの遺伝子の融合が、それらの細胞内分布パターンを変化させなかったことを示しており、両遺伝子産物が野生型遺伝子と同じプロセッシング経路にかけられること従って野生型と同様のＭＨＣ分子に提示されうることを示唆している。加えて、我々は又、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐのイン・ビボでの発現をも、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウスの筋切片について抗Ｎｅｆ抗体を用いる免疫組織化学的分析を行うことによって分析した。筋切片の免疫組織化学は、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の両者が、遺伝子送達により、イン・ビボで高レベルに発現されうることを示した。図３Ｃは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ抗原の発現の免疫組織化学的分析の結果を示している。ネイティブ、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化マウスからの凍結筋切片を、免疫化の５日後に調製して、抗Ｎｅｆ抗体で染色した。パネル（ＤＡＰＩ）は、核染色を表し、パネル（ＦＩＴＣ）は、抗Ｎｅｆ抗体を用いた特異的染色を表している。陽性細胞は、ＦＩＴＣで染色される。５つのパネルを、各実験について各染色につき試験した。
【００９７】
ヘルパーＴ細胞増殖アッセイ：ヘルパーＴリンパ球の活性化及び増殖は、抗原活性化Ｂ細胞の拡張のシグナルを送ることによる液性免疫応答及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の拡張の細胞性シグナルを生じる細胞性免疫応答の両方の誘導において重要な役割を演じる。マウスのグループ（各グループ当たり４匹）に、これら２種の構築物又はベクターのみを注射した。第一のＤＮＡ免疫化の２週間後に、これらのマウスに同量の追加の注射をした。更に２週間後に、脾臓を、免疫化マウスから集めて、それらのリンパ球を分離した。次いで、これらの細胞を、方法に記載したように、Ｔ細胞増殖について試験した。図４は、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウス由来の脾臓細胞の、イン・ビトロでの組換えＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆ刺激後の、Ｔ細胞増殖に関して記載した実験からのデータを示している。１００μｇの各ｃＤＮＡ発現カセットをマウスに筋肉注射し、それらのマウスに２週間後に追加の注射を一回行なった。追加の注射の１週間後に、脾臓細胞を２匹のマウスから分離して、プールし、Ｔ細胞増殖用に用いた。脾臓細胞を、５及び１μｇ／ｍｌの組換えタンパク質で３日間刺激した。１μＣｉの３Ｈを加えて、取り込まれたｃｐｍを計数した。ＰＨＡを陽性対照として加えた。用いたＤＮＡ構築物は、下部に示してある。抗原特異的な刺激（ＳＩ）を計算して、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆについて提示した。同様の結果が、複数の実験において得られた。図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃは、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆタンパク質を抗原として用いて、ＤＮＡワクチンカセットｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウスについての増殖アッセイ結果を示している。組換えタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに入れて、Ｔ細胞の増殖を刺激した。１０μｇ／ｍｌのレクチン（ＰＨＡ）をポリクローナル刺激剤陽性対照として用いた。示したように、低いバックグラウンドレベルの増殖（刺激インデックス０．２〜１）が、ネイティブマウス脾臓の対照グループにおいて認められた。これら３種のタンパク質に対する中位のレベルの増殖が、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したグループからの脾臓細胞において認められた（図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ）。ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐが適合性のＴ細胞増殖を誘導するということを確認するために、我々は、単一遺伝子構築物で免疫化したマウスを用いるＴ細胞増殖も並行して行なった。Ｖｉｆは、それだけで、又はＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質中で、それぞれ、６．５及び５．４のＳＩを生じた（図４Ａ）。同様の結果が、Ｖｐｕタンパク質（図４Ｂ）及び組換えＮｅｆタンパク質（図４Ｃ）を抗原として用いて、得られた。
【００９８】
Ｎｅｆワクシニアを用いる細胞傷害性Ｔリンパ球活性：これらの構築物により生じた細胞性免疫応答の誘導を更に研究するために、我々は、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウスの脾臓細胞について、Ｎｅｆワクシニア感染した又はＮｅｆペプチドパルスしたＰ８１５標的に対して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイを行なった。このＣＴＬアッセイを、免疫化したマウスから採収してイン・ビトロで刺激した脾臓細胞を用いて行ない、特異的及び非特異的ワクシニア感染し又はペプチド処理した標的からのクロム放出につきアッセイした。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１００μｇのｐＶＶＮ、ｐＶＶＮ−Ｐ及び対照用ベクターで免疫化した。脾臓細胞を、これらのマウスから、第一及び第二回目の注射の２週間後に得て、抗原特異的ＣＴＬアッセイを、６時間５１Ｃｒ放出法にて行なった。ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウスからの脾臓細胞により誘導された特異的溶解は、計算して図５に与えた。これらのグラフは、対照用ワクシニアに感染した標的細胞を用いるアッセイにより測定した非特異的溶解を差し引くことにより導かれた特異的溶解のパーセンテージを表している。このＣＴＬアッセイを、上記のように免疫化したマウスから採収した脾臓細胞について行なった。同様の結果が、複数の実験において得られた。５０：１のエフェクター：標的比において、Ｎｅｆワクシニア感染標的を用いて、特異的溶解のパーセンテージは、ｐＶＶＮ−Ｐ及びｐＶＶＮ免疫化マウス由来の脾臓細胞によって、それぞれ、３８及び３１％である。特異的溶解のパーセンテージは、滴定可能であった。同様の結果が、Ｖｉｆを発現するＰ８１５標的を用いて認められた。反復するアッセイにおいて、ｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウスにおいて認められた特異的溶解のパーセンテージは、再現可能に、ｐＶＶＮ免疫化マウスより一層高いようである。
【００９９】
ＨＩＶ−１感染した標的を用いる細胞傷害性Ｔ細胞溶解：一般に、マウスの系においてＨＩＶ−１ウイルスに対するＣＴＬアッセイを行なうことは、ＨＩＶ−１が自然にはマウス細胞に感染しないので困難であった。ＶＶＮ及びＶＶＮ−ＰのＨＩＶ−１感染した標的を溶解させる能力を評価するために、我々は、ｈＣＤ４及びＣＣＲ５又はＦｕｓｉｎ共通レセプターを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を構築した。我々の研究において用いるＢａｌｂ／Ｃマウスに対するＭＨＣ適合性の故に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株を選択した。マウス細胞はＨＩＶ−１感染を支持しないが、これらの安定な細胞株は、１ラウンドの複製につき、種々のＨＩＶ−１株によって感染されうる。我々は、この単一ラウンドの感染は、ＣＴＬアッセイに利用することができるという仮説を設ける。ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ４／Ｆｕｓｉｎ及びＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ４／ＣＣＲ５安定な細胞株に、第一の十分に特性決定されている実験室ウイルスを感染させ、その感染性を、培地に放出されたｐ２４抗原により測定した（表２）。ＨＩＶ−１分離株の第一の及び分子クローンは、これらの細胞株に、検出可能で再現可能な様式で感染することができた。幾つかの主要な分離株（９２ＲＷ００９及びＢＪ）は、これらの細胞に無細胞様式で感染しなかった。ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ構築物での免疫化がＨＩＶ−１感染した標的細胞を殺すことができるかどうかを分析するために、我々は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４及びＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞への感染のために、それぞれ、クレードＢのＴ向性（ＨＩＶ−１ ＮＬ４３）及び二向性（ＨＩＶ−１ ８９．６）ウイルスを用いた。これらの感染細胞を、このＣＴＬアッセイにおいて、標的細胞として用いた。ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化マウスの両方に由来する脾臓細胞は、ネイティブな病原体感染細胞の溶解を誘導した。図６Ａは、ＨＩＶ−１（Ｔ向性及び二向性）感染した標的に対するｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球応答に関係する実験からのデータを示している。ＣＤ４／ＣＣＲ５又はＣＤ４／ＣＸＣＲ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に、二向性（８９．６）及びＴ向性（ｐＮＬ４３）ウイルスを感染させて、ＣＴＬアッセイにおいて標的細胞として用いた。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１００μｇのｐＶＶＮ、ｐＶＶＮ−Ｐ及び対照用ベクターを用いて免疫化した。脾臓細胞を、これらのマウスから、第一及び第二の注射の２週間後に得て、抗原特異的ＣＴＬアッセイを、６時間５１Ｃｒ放出法にて行なった。ＨＩＶ−１感染標的細胞の自然の（非特異的）溶解を計算して、実験試料から差し引いて、このアッセイにおける免疫化マウス由来の脾臓細胞により誘導された特異的溶解を説明した。同様の結果が、複数の独立した実験において認められた。それらのデータは、ＨＩＶ−１に感染したＮＩＨ３Ｔ３／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞を用いるｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐによる特異的溶解のパーセンテージを示している。５０：１のエフェクター：標的比において、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐによる溶解パーセンテージは、二向性イルスに感染した標的では、それぞれ、２９及び４２であり、特異的溶解は、Ｔ向性感染標的において、１６及び２１％である��興味深いことに、ｐＶＶＮ−Ｐ構築物により誘導された特異的ＣＴＬのパーセンテージは、常に、ｐＶＶＮ構築物による免疫化よりも高い。
【０１００】
ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ構築物により誘導されるクロスクレードＣＴＬ：これらの構築物（Ｂクレードウイルス由来の遺伝子）によるクロスクレードＣＴＬ認識を評価するために、我々は、ＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ４／ＣＣＲ５又はＮＩＨ３Ｔ３／ｈＣＤ４／Ｆｕｓｉｎ細胞株に、クレードＤ、Ｅ、Ｃ及びＡからのＨＩＶ−１分離株を感染させた（表２）。一度それらの細胞が中レベルの感染に達したならば、それらの細胞を５１Ｃｒで標識して、ＣＴＬアッセイのための標的として用いた。図６Ｂは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現構築物で免疫化したマウスから分離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードＣＴＬ応答に関する実験からのデータを示している。ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現構築物で免疫化されたマウスから分離された脾臓細胞により誘導されるクロスクレードＣＴＬ応答：ＣＤ４／ＣＣＲ５又はＣＤ４／ＣＸＣＲ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にクレードＢ、Ｃ／Ａから導かれたＨＩＶ−１ウイルスを感染させ、Ｄ及びＥをＣＴＬアッセイにおける標的として用いた。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを１００μｇのｐＶＶＮ、ｐＶＶＮ−Ｐ及び対照用ベクターで免疫化した。脾臓細胞をこれらのマウスから、第一及び第二の注射の２週間後に得て、抗原特異的ＣＴＬアッセイを６時間５１Ｃｒ放出法にて行なった。ＨＩＶ−１感染標的細胞の自然の（非特異的）溶解を計算して実験試料から差し引いて、このアッセイにおける免疫化マウス由来の脾臓細胞により誘導された特異的溶解を説明した。同様の結果が、複数の独立した実験において認められた。図６Ｂに与えた結果は、ｐＶＶＮとｐＶＶＮ−Ｐの両方が、クレードＢ（臨床的分離株）、Ｄ（ＨＩＶ−１Ｚｒ６）及びＥ（９２ＴＨＡ０２２）感染した標的に対するＣＴＬ活性を誘導したことを示している。減少するエフェクター：標的比を有する活性力価。加えて、我々は又、ｐＶＶＮ−Ｐで免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞が、クレードＥ及びＤ感染標的に対して、ｐＶＶＮで免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞よりも一層高いＣＴＬ応答を誘導することにも気付いた。しかしながら、我々は、ｐＶＶＮ又はｐＶＶＮ−Ｐ免疫化の両方によるクレードＣ／Ａ（９２ＲＷ００９）感染標的に対しては如何なるＣＴＬ活性も認めなかった。この結果が、これらのマウス細胞株におけるこの単離株の一層低い感染率を反映しているということはありそうもないことではない（表２）。
【０１０１】
検討
ＵＮＡＩＤＳによる最近の報告は、世界的に３６００万人より多くがＨＩＶ−１に感染しており、この数は、特に開発途上国において急速に増大しているということを示している。抗ウイルス療法は、イン・ビボでＨＩＶ−１の複製を制御するようであるが、それらの高価なコスト及び統制的な投与プロトコールが、世界的なＨＩＶ問題に対する理想的な解決に及ばないものとしている。ワクチンは、ＨＩＶ−１の世界的感染を制御する費用に対し最も効率のよい手段であるようである。ＤＮＡワクチン技術は、抗ウイルスワクチン開発における重要なツールの代表である。ＨＩＶ−１ゲノムの全ゲノムではなくて部分を含むＤＮＡ構築物の注射は、感染の懸念を伴わずに免疫化を誘導することができる。ＤＮＡ接種を利用するイン・ビボでの免疫応答の生成が、種々の研究室によって報告されてきた（我々の他の治療標的及び他の送達技術を用いるものを含む）。以前に我々及び他の研究者は、核酸送達アプローチが、マウスにおいて並びに非ヒト霊長類においてそして現在はヒトにおいて抗ＨＩＶ−１細胞性及び液性免疫応答を生じることを示してきた。
【０１０２】
発生するデータは、細胞媒介の免疫の誘導が、ＨＩＶ−１に対する如何なる候補のワクチンについても重要な特徴でありうることを支持している。自然の感染において、抗ＨＩＶ−１ ＣＴＬ応答は、非常に初期に現われ、一時的に、ウイルスのセットポイントの確立に相関するようである。ＣＴＬは、ウイルス感染細胞をターゲットとして破壊することによるウイルスクリアランスにおいて決定的な役割を演じる。特異的ＣＴＬ応答の生成によって免疫応答をウイルスタンパク質に向けることは、ウイルス内の複数の抗原性標的に対する広範な免疫応答の誘導を可能にするであろう。このウイルスに対するＣＴＬ活性は、健康な感染した患者において、ＡＩＤＳに進行した患者と比べて一層普通に測定される。特異的ＣＴＬは、病気の病因が、ＣＴＬ応答と好適な臨床状態との間のリンクの確立を増すにつれて減少すると報告されている。特異的なＣＴＬ応答は、無症候段階のＨＩＶ−１感染の維持に寄与するようである。従って、強いＨＩＶ−１特異的ＣＴＬのイン・ビボでの誘導は、感染の確立及び最終的なＨＩＶ感染の進行からの宿主の最終的防護において決定的役割を演じうる。
【０１０３】
この報告において、我々は、ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ及びｎｅｆの免疫原としての利用を評価した。一度消耗性であると考えられると、最近の研究は、ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子がＡＩＤＳ病因論において、正常な細胞活性を調節することによって重要な役割を演じうることを示している。例えば、主要細胞における無細胞感染は、機能的ｖｉｆ遺伝子によるトランス相補によって増強されうるが、これは、Ｖｉｆがある種の細胞型においてウイルス複製を相補することを示唆している（４７）。Ｖｐｕ及びＮｅｆの両方とも、内部で発現された場合にＣＤ４及びＭＨＣクラスＩ分子のダウンレギュレーションに関与することが示されている。Ｎｅｆは、感染細胞表面のＭＨＣクラスＩの発現をブロックし、それにより、ウイルス感染細胞をＣＴＬ媒介の破壊から保護する。これらの遺伝子の生物学的機能の適当な弱毒化は、宿主細胞の仮説的な負の効果を、それらの重要な免疫学的エピトープを保持したままで排除するであろう。
【０１０４】
我々の研究において、これらのｖｉｆ、ｖｐｕ及びｎｅｆ遺伝子を、様々な臨床状態の患者から分離したウイルスからクローン化した。これらの遺伝子の機能的及び弱毒化形態の両方を発現するＤＮＡ構築物を、免疫適格マウスにおいて細胞性及び液性応答を誘導する能力について分析した。機能的及び弱毒化遺伝子の免疫原としての利用についての免疫学的データは、全く比較できる。弱毒化並びに機能的クローンの両方が、強いが変化しやすいＣＴＬ及びＴ細胞増殖応答をマウスにおいて誘導することができた。一般に、これらの遺伝子により誘導された液性応答は低レベルであり、その最もありそうな理由は、これらのアクセサリー遺伝子が細胞内で発現され、それ故に、容易にＢ細胞免疫グロブリン認識のために提示されないからである。一つの重要な観察は、ｖｐｕを免疫原として利用することができるということであった（抗原特異的な免疫応答をこれらのモデルにおいて生じる）。
【０１０５】
ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子は、抗ＨＩＶ ＤＮＡワクチンにおける利用のために重要な免疫原でありえよう（何故なら、それらは、全体的に、免疫攻撃下で、感染標的の数を拡大し、そうして、ウイルスが逃れるのを制限するからである）。加えて、それらは、ＨＩＶ−１の表面及びコアタンパク質よりも一層強い選択圧下にありうる。これを評価するために、我々は、マウスモデルにおいて、ＨＩＶ−１の臨床分離株及び実験室分離株に対する細胞性免疫応答を試験するための新しい系を改作した。この単一ラウンド感染の系は、ＨＩＶ−１完全ウイルス標的に対するエフェクター応答を生成する抗原の能力の試験を容易にする（個々のウイルス抗原の組換えベクターの生成を必要としない）。これは、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ構築物で免疫化されたマウスがクレードＢ、Ｅ及びＤのＨＩＶ−１から導かれた標的を溶解させることができるということをここに示すことによって支持される。これは、これらのアクセサリー遺伝子の保存的性質の故に、それらがクロスクレードＣＴＬ応答を誘導することができることを示唆しているが、これは、ワクチン開発における有用な追加的ツールでありうる。加えて、この研究において、我々は、弱毒化形態での病原性遺伝子の利用の実行可能性をも示した。アクセサリー遺伝子をワクチン標的として利用する我々の初期の分析は、これらの構築物が、マウスにおいて十分に許容されて、何らの悪影響も示さなかったことを示している。ここに示された明らかな利益は、アクセサリー遺伝子の、クロスクレード認識及びＣＴＬ応答に参加する能力である。タンパク質分解性開裂部位の挿入は、かかる融合ワクチン抗原の一層自然なプロセッシングを生じるようであり、これは、これらのカセットにより誘導される一層高度な細胞性免疫応答に向かう流れの観察によって、ここに証明されるように、更なる価値をこれらのアプローチに加えることができる。かかる応答が、ワクチンの考察に関して重要であることはありそうなことである。
【０１０６】
構造遺伝子及び酵素遺伝子を含むマルチコンポーネントワクチンカクテルの部分としてアクセサリー遺伝子を結合させることは、感染した個体における治療用ワクチンとして一層活発な免疫応答を誘導することができるであろう。かかるアプローチは、新たな標準的抗レトロウイルス治療養生法に対する興味深い補足たりうるものであり、そうして、治療攻撃下の遺伝子標的の数を増大させる。生弱毒化ＳＩＶワクチンの開発における独創的研究は、ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子のイン・ビボでのウイルス病因の誘因としての重要性を示してきた。理論においては、アクセサリー遺伝子機能を欠くウイルス逸脱変異体を選択するＣＴＬ応答は、イン・ビボで今や弱毒化されているウイルス性表現型を生じることが予想される。そうして、滅菌してない予防用ワクチンでさえも（又は、免疫療法としての治療環境において）、結果は、やはり、２つの特異的な利益を有することが期待されよう。一つの利益は、生成したウイルスが病因の面をゆるめることができるであろうことであり第二の利益は、残りのウイルスが事実上生弱毒化ワクチン防護の面を模倣することができるであろうことである。我々が作成したような多くの遺伝子に対する免疫を誘導することのできる単一ＤＮＡワクチン構築物は、単一遺伝子ＤＮＡワクチンカセットを開発して投与するよりも投与しやすくて一層費用有効性が高い。
【０１０７】
【表１】
2004525604.tif 000005
ＨＩＶ−１アクセサリー遺伝子ｖｉｆ及びＮｅｆを、臨床分離株からクローン化して、それらの機能的アッセイに基づいて特性決定した。突然変異を、Ｖｐｒ及びＶｐｕに、初期の研究に基づいて導入した（４１、５８）。ＮＡ、利用不能。
【０１０８】
【表２】
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ＨＩＶ−１主要分離株を、ＵＮＡＩＤＳから、ＮＩＨ ＡＩＤＳ ＲＲＲＰを介して得て、正常なＰＢＭＣ中で繁殖させた。ｈＣＤ４／ＣＣＲ５を及びｈＣＤ４／ＣＸＣＲ４を発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞に、１０〜５０ｎｇのｐ２４抗原当量のウイルスを、１２時間感染させた。細胞を、ＰＢＳで２回洗って、正常な細胞培地中に維持した。細胞を感染につきモニターして、それらの細胞及び培地を集めてｐ２４産生につきアッセイした。ＮＤ、未測定。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、実施例に記載の実験からのデータを示す図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、実施例に記載の実験からのデータを示す図である。
【図２】
図２は、実施例に記載の実験からのデータ及びＴ７系を利用したイン・ビトロ翻訳後のＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐの発現からのデータを示す図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、免疫沈降によるＨｅＬａ細胞中でのＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関するデータを示している図である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、イン・ビボでのＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している図である。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ抗原発現の免疫組織化学的分析の結果を示している図である。
【図４】
図４は、組換えＶｉｆ、Ｖｐｕ及びＮｅｆでのイン・ビトロ刺激後にｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐで免疫化したマウス由来の脾臓細胞のＴ細胞増殖に関する実施例に記載の実験からのデータを示している図である。
【図５】
図５は、ｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している図である。
【図６Ａ】
図６Ａは、ＨＩＶ−１（Ｔ向性及び二向性）感染した標的に対するｐＶＶＮ及びｐＶＶＮ−Ｐ免疫化により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球応答に関する実験からのデータを示している図である。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ＶＶＮ及びＶＶＮ−Ｐ発現構築物で免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードＣＴＬ応答に関する実験からのデータを示している図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004525604.tif 000072
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