(57)【要約】本発明は、改良された香味、機能性およびＡＣＥ−Ｉ阻害性質を有するＷＰＩ基質からホエータンパク質加水分解物を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） を１種または２種以上の酵素で加水分解することを含んでなる、高度に可溶性である生物活性ペプチドを含有する改良されたホエータンパク質加水分解物の製造方法において、
ｉ）　　 前記酵素が熱不安定性プロテアーゼであり、
ｉｉ）　　前記酵素が中性プロテアーゼであるとき約３．５〜約９．０のｐＨにおいて、前記酵素が酸性プロテアーゼであるとき約２．５〜約６．０のｐＨにおいて、そして前記酵素がアルカリ性プロテアーゼであるとき約５．０〜約１０．０のｐＨにおいて、加水分解を約３０ ℃〜約６５ ℃の温度において実施し、
ｉｉｉ）　 約１０％以下の加水分解度に到達したとき、加水分解を停止し、
ｉｖ）　　前記１種または２種以上の酵素を不活性化することによって、加水分解を停止し、そして
ｖ）　　 前記ｉｖ） の条件は前記加水分解物中のペプチドまたは残留タンパク質の実質的な変性を回避するために十分に温和である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酵素がプロテアーゼＰ６、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、ペプチダーゼ、ニュートラーゼ、バリダーゼ、ＡＦＰ ２０００、および任意の他の熱不安定性プロテアーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素不活性化工程ｉｖ） が加熱不活性化を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱不活性化が前記加水分解物を約１００ ℃までの温度に１０秒間まで加熱することを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解を約６５ ℃以下の温度において実施するとき、前記加熱不活性化工程を約６５ ℃〜約７０ ℃において約１０秒〜約１５分間実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記加水分解を約６０ ℃以下の温度において実施するとき、前記加熱不活性化工程を約６０ ℃〜約６５ ℃において約１０秒〜約３０分間実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ホエータンパク質含有基質のｐＨを前記プロテアーゼが活性でないｐＨに変更することを前記酵素不活性化工程が含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素不活性化工程が請求項３〜６のいずれかに記載の加熱不活性化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素不活性化工程ｉｖ） が約１０〜５００ ｋＤａの範囲の名目分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用して前記加水分解物を限外濾過することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記限外濾過膜が約１０〜２００ ｋＤａの範囲の名目分子量カットオフを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素を前記加水分解工程ｉｉ） 間に不活性支持体上に固定化する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性支持体がレム・エウペルギット （Ｒｏｅｈｍ Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）、カラゲナン粒子、キトサン粒子または任意の他の適当な不活性支持体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
加水分解度が約３％〜約１０％である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
加水分解度が約３％〜約５％である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
そのように製造されたホエータンパク質加水分解物がＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８）から成る群から選択される１種または２種以上の生物活性ペプチドを含んでなる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
そのように製造されたホエータンパク質加水分解物がＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドを、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと組み合わせて含んでなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された１種または２種以上の生物活性ペプチドと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
生物活性ペプチドＭＫＧ （配列番号２） と、薬学上許容される担体とを含んでなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法に従いＷＰＩを加水分解することによって製造された生物活性ペプチドの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物において高血圧症を治療または予防する方法。
【請求項２０】
患者における高血圧症を治療または予防する薬剤を製造するための請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された生物活性ペプチドの使用。
【請求項２１】
前記生物活性ペプチドがＭＫＧ （配列番号２） である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された生物活性ペプチドを含有する、苦くない、高度に可溶性のＷＰＩ加水分解物生成物。
【請求項２３】
ＷＰＩの加水分解度が約３％〜約５％である、請求項２２に記載の生成物。
【請求項２４】
生成物中のホエータンパク質の主要な粒度が約３０ミクロンより小さい、請求項２３に記載の生成物。
【請求項２５】
主要な粒度が約３ミクロンより小さい、請求項２４に記載の生成物。
【請求項２６】
実質的に透明なまたは白色の溶液である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の生成物。
【請求項２７】
前記生物活性ペプチドの１種または２種以上がＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される、請求項２２〜２６のいずれかに記載の生成物。
【請求項２８】
ＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドを、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと組み合わせて含んでなる、請求項２２〜２６のいずれかに記載の生成物。
【請求項２９】
請求項２２〜２８のいずれかに記載のＷＰＩ加水分解物生成物を含有する食物生成物。
【請求項３０】
請求項２２〜２８のいずれかに記載のＷＰＩ加水分解物生成物または請求項２９に記載の前記加水分解物を含有する食物生成物食物生成物の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者における収縮期血圧を減少させる方法。
【請求項３１】
患者における高血圧症を治療または予防する薬剤を製造するための請求２２〜２８のいずれかに記載の生成物の使用。
【請求項３２】
請求２２〜２８のいずれかに記載の生成物と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３３】
ＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される１種または２種以上のペプチドの１つまたは任意の組み合わせ。
【請求項３４】
ＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される任意の１つの生物活性ペプチドと、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドとの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、苦い香味を実質的に含まず、生物活性ペプチドを含有する、改良されたホエータンパク質生成物を製造する方法に関する。この方法の生成物は、高い消化性とすぐれた感覚器官を刺激する性質を有する。生成物は無刺激の味覚を有し、石鹸または肉汁の香味を含まない。改良された加水分解ホエータンパク質生成物は、機能的食物の中へ混入する生物活性ペプチドの有用な源である。
【０００２】
背景の技術
多数の食物の成分および栄養素は、タンパク質源、例えば、ミルクタンパク質、カゼインおよびホエータンパク質の加水分解から製造されてきている。
加水分解タンパク質栄養素は、多数の健康管理において非加水分解タンパク質栄養素を超えた利点を有する。例えば、酵素的に加水分解されたタンパク質はアレルゲン性が低いことが知られている。また、それらは全タンパク質よりもいっそう急速に消化され、吸収される。加水分解されたタンパク質を含有する栄養素は、また、例えば、消化性疾患を有する病院患者の排除において有用である。
【０００３】
ホエータンパク質およびカゼインの加水分解は、多数の生理学的作用を示すことができる生物活性ペプチドを放出することが知られている （Ｍａｕｂｏｉｓ他、１９９１；ＥＰ ４７４５５０６）。多数の刊行物には、このような生物活性ペプチド、例えば、抗高血圧性を有するＡＣＥ阻害性ペプチドがβ−ラクトグロブリンおよびホエータンパク質濃縮物の酵素処理を通して放出されることが記載されている （Ｍｕｌｌａｌｌｙ他、 １９９７）。また、ＡＣＥ阻害性ペプチドは酸っぱいミルク中に、またα３およびカゼインの加水分解物の中に見出される （ＪＰ ４２８２４００；Ｎａｋａｍｕｒａ他、１９９４、Ｙａｍａｍｏｔｏ １９９７）。
【０００４】
ＥＰ ４７４５５０６には、ホエー中のミルクタンパク質ラクトフェリンを加水分解して、ヒトおよび動物における下痢、汗疱状白癬、眼の感染、乳腺炎およびその他の治療に有用な抗菌剤として作用するラクトフェリシンを解放することが開示されている。
しかしながら、大部分の食物タンパク質の加水分解、特にホエーおよびカゼインを含有する生成物は、苦味を発生させることが知られている。これは、特に生物活性ペプチド源としてミルクタンパク質加水分解物を組込んだ経口的に摂取可能な生成物を処方しようと試みるとき、味の良さの問題を引き起こす。
タンパク質加水分解の分野において、２つアプローチの一方または両方が、タンパク質加水分解物における苦味をコントロールまたは除去して、生成物の味の良さを増加させるために普通に使用されている。
【０００５】
タンパク質基質の広範な加水分解はミルクタンパク質加水分解物の苦味を減少させることが知られている （ＥＰ ０６５６６３；ＥＰ ０１１７０４７；ＵＳ ３９７０５２０）。苦味が低い生成物はこのようにして比較的容易にかつ安価に製造される。しかしながら、広範な加水分解は、問題の生物活性ペプチドを包含する、すべてのペプチドの鎖長さを減少させる。タンパク質基質の広範な加水分解は、問題のペプチドの機能性および生物活性を破壊する。さらに、石鹸および肉汁の異臭がしばしば発生し、その結果最終生成物の味の良さはもとの無刺激の味覚のタンパク質基質に比較して劣っている。最後の欠点は、いくつかの加水分解物について、苦味は部分的に除去されるだけであることである （Ｒｏｙ １９９２および１９９７）。
【０００６】
タンパク質加水分解物の苦味をコントロールする第２の方法は、脱苦味性酵素、特にアスペルギルス・オリゼ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｅ） を源とする酵素である。
タンパク質加水分解物における「苦味」の発生は、大きい疎水性の「苦い」ペプチドの存在のためであると考えられる。脱苦味性酵素はタンパク質加水分解物の中に存在する苦いペプチドを選択的に加水分解する。当業者は、脱苦味性酵素および処理条件を賢明に選択することによって、問題の特定の生物活性ペプチドを完全に残してミルクタンパク質加水分解物を効果的に脱苦味する。しかしながら、脱苦味性酵素を使用すると、プロセスはいっそう費用がかかり、生物活性ペプチドのいくつかの保存は容易にまたは首尾よく達成されない。他の欠点は、脱苦味性酵素による処理が遊離アミノ酸を最終生成物中に放出させ、結局、加水分解物は不快な肉汁または石鹸の香味剤を発生させる （Ｒｏｙ １９９２および１９９７）。
【０００７】
タンパク質加水分解物を脱苦味する種々の方法は追加のプロセス工程を生じ、最終生成物の製造にコストを付加する。さらに、また、最終生成物は遊離アミノ酸の供給を過剰とする。
問題の生物活性ペプチドを解放しかつ苦いポリペプチドおよび遊離アミノ酸の生成を制限し、これによりミルクタンパク質基質のもとの無刺激の味覚を保持させる、タンパク質を加水分解する方法を開発できる場合、最も有利である。
いくつかの生物活性ペプチド、特に抗高血圧性ペプチドは、タンパク質加水分解間に比較的安定であり、第１図に示すようにミルクタンパク質基質の加水分解間に非常に早く解放される。
【０００８】
ミルクタンパク質加水分解物の苦い香味は、糖を添加するか、あるいは既にミルクタンパク質加水分解物の中に存在する天然の糖、例えば、ラクトースを加水分解することによって、改良することができる （ＢｅｒｎａｌおよびＪｅｌｅｎ、１９８９）。例えば、酸っぱいホエーおよびチーズをラクトースのβ−ガラクトシダーゼおよびラクターゼ加水分解により甘くすることによって、それらの味をよくする （ＦＲ ２３０９１５４；ＵＳ ４３５８４６４；ＪＰ ８０５６５６８９）。
生物活性ペプチドを含有する加水分解タンパク質生成物について高い香味受容性を達成するために、苦味の発生を防止するために加水分解を正確にコントロールすることが必要である。
【０００９】
加水分解を停止する普通の方法は、高温、典型的には＞９０〜１００ ℃において延長した時間熱不活性化して、酵素を不活性化することによる。しかしながら、この方法はホエータンパク質の加水分解を停止するために使用できない。なぜなら、混合物中に残留する非加水分解ホエータンパク質は変性し、沈降し、最終生成物の溶解度を低下させ、食物成分として使用するための受容性を低くするからである。
このような問題はＷＯ ９９／６５３２６において克服された。ＷＯ ９９／６５３２６には、甘いホエーまたは甘いホエータンパク質濃縮物 （ＷＰＣ） を温和に加水分解して、下記の性質の１または２以上を有する生物活性ペプチドを含有する加水分解物を生成する：
【００１０】
・　　 抗高血圧性ＡＣＥ−Ｉ活性
・　　 ビフィズス増殖促進活性
・　　 非粘着性、非苦味性香味
・　　 わずかに甘い味覚に対する快さ
・　　 すぐれた感覚器官を刺激する性質。
【００１１】
本発明は、ＷＯ ９９／６５３２６において使用するホエータンパク質含有基質と異なる基質を使用するが、同様な加水分解プロセスを使用する。驚くべきことには、この異なる基質はホエー加水分解物の前述の性質、特に生成物の抗高血圧性ＡＣＥ−Ｉ活性、香味および機能性における劇的な改良を示す加水分解物残基を生ずる。
概括的に言えば、本発明は異なるホエータンパク質含有基質を加水分解する方法であり、そして本発明の方法により製造される新規な加水分解物である。
【００１２】
発明の要約
したがって、本発明は、概括的に言えば、ホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） を１種または２種以上の酵素で加水分解することを含んでなる、高度に可溶性である、生物活性ペプチドを含有する改良されたホエータンパク質加水分解物を製造する方法であって、
ｉ）　　 酵素は熱不安定性プロテアーゼであり、
ｉｉ）　　前記酵素が中性プロテアーゼであるとき約３．５〜約９．０のｐＨにおいて、前記酵素が酸性プロテアーゼであるとき約２．５〜約６．０のｐＨにおいて、そして前記酵素がアルカリ性プロテアーゼであるとき約５．０〜約１０．０のｐＨにおいて、加水分解を約３０ ℃〜約６５ ℃の温度において実施し、
ｉｉｉ）　 約１０％以下の加水分解度に到達したとき、加水分解を停止し、
ｉｖ）　　前記１種または２種以上の酵素を不活性化することによって、加水分解を停止し、そして
ｖ）　　 前記ｉｖ） の条件は前記加水分解物中のペプチドまたは残留タンパク質の実質的な変性を回避するために十分に温和である、
ことを特徴とする方法に関する。
【００１３】
ＷＰＩとは、この分野において知られている任意の方法により製造されたホエータンパク質単離物を意味する。好ましくは、ＷＰＩは、当業者は理解するように、ホエータンパク質濃縮物、例えば、チーズ、酸性、または乳酸ホエータンパク質濃縮物からイオン交換法により製造される。
熱不安定性とは、当業者は理解するように、酵素が比較的中程度の温度において不可逆的不活性化に対して感受性であることを意味する。
好ましくは、酵素はプロテアーゼＰ６、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、ペプチダーゼ、ニュートラーゼ、バリダーゼ、ＡＦＰ ２０００、および任意の他の熱不安定性プロテアーゼから成る群から選択される。
【００１４】
酵素加水分解工程は、当業者は理解するように、特定の使用する酵素に適当な条件下に実施することができる。
ホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） は約５〜３５％固形分の範囲の濃度において加水分解することができ、そして酵素または酵素混合物を約０．０１〜約３％ｗ／ｗ全固形分、好ましくは約０．０１〜約１．０％ｗ／ｗ全固形分の酵素／基質の比に添加することができる。
酸性プロテアーゼで処理したＷＰＩは、約２．５〜約６．０のｐＨ、好ましくは約３．０〜約５．０のｐＨにおいて加水分解することができる。
中性プロテアーゼで処理したＷＰＩは、約３．５〜約９．０のｐＨ、好ましくは約６．０〜約８．０のｐＨにおいて加水分解することができる。
【００１５】
アルカリ性プロテアーゼで処理したＷＰＩは、約５．０〜約１０．０のｐＨ、好ましくは約６．０〜約８．０のｐＨにおいて加水分解することができる。
タンパク質の加水分解は約３０〜６５ ℃、好ましくは約５０〜６０ ℃の温度範囲において実施することができる。
１つの態様において、ＷＰＩを選択的に加水分解するために使用する１種または２種以上の酵素を前記加水分解工程ｉｉ） 間に不活性支持体上に固定化し、ここで前記不活性支持体はレム・エウペルギット （Ｒｏｅｈｍ Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）、カラゲナン粒子、キトサン粒子または任意の他の適当な不活性支持体である。次いで、酵素を攪拌した槽または固定床反応器中でまたは膜または中空繊維の反応器上で使用して加水分解反応を実施する。
【００１６】
加水分解反応前に、加水分解のために使用する１種または２種以上の酵素を前記不活性支持体に架橋させることができる。
本発明の加水分解物は、加水分解度、すなわち、酵素の作用により切断されるペプチド結合の百分率が約１０％より低い、「温和な」加水分解物を意味する。こうして、加水分解物はわずかに変性された大きいペプチドをなお含有することがあるが、最終加水分解物生成物は高度に可溶性である。
ＷＰＩ基質の加水分解度は、加水分解停止前に、好ましくは約３％〜約１０％であり、最も好ましくは約３％〜約５％である。
【００１７】
加水分解は酵素不活性化工程ｉｖ） により決定される。好ましくは、酵素の不活性化は加熱不活性化を含む。
加熱不活性化は前記加水分解物を約１００ ℃までの温度に１０秒間まで加熱することを含んでなることができる。
加水分解を約６５ ℃以下の温度において実施するとき、加熱不活性化工程を約６５ ℃〜約７０ ℃において約１０秒〜約１５分間実施する。
加水分解を約６０ ℃以下の温度において実施するとき、加熱不活性化工程を約６０ ℃〜約６５ ℃において約１０秒〜約３０分間実施する。
選択的に、酵素不活性化工程ｉｖ） はホエータンパク質含有基質のｐＨをプロテアーゼが活性でないｐＨに変更することを含んでなる。
【００１８】
１つのオプションによれば、１種または２種以上の使用する酵素に依存して、酵素または酵素混合物を蒸発または乾燥手法により不活性化することもできる。
他のオプションによれば、酵素または酵素混合物を、ｐＨ変化とともにまたはｐＨ変化なしに不活性化することもできる。
選択的に、酵素は単に反応混合物からそれらを除去することによって不活性化することができる。例えば、ＷＰＩを選択的に加水分解するために使用する１種または２種以上の酵素を、例えば、加水分解反応前に前記不活性支持体に架橋させることによって、不活性支持体上に固定化するとき、酵素を引き続いて膜濾過により加水分解反応から分離して不活性化を達成することができる。
【００１９】
選択的に、いったん加水分解完結したとき、約１０〜５００ ｋＤａ、好ましくは約１０〜２００ ｋＤａの範囲の公称分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用して、１種または２種以上の酵素を加水分解混合物から分離することができる。
好ましい態様において、１種または２種以上の酵素が不活性化または低活性であるｐＨに反応混合物のｐＨをまず変化させ、および／または酵素を変性するが、基質中の完全なホエータンパク質を変性しないように熱交換器を使用して比較的温和な温度に反応混合物を加熱して、１種または２種以上のホエータンパク質加水分解酵素を不活性化することによって、加水分解を停止させる。酵素を変性する適当な温度は約５５〜７０ ℃、好ましくは約６５ ℃程度である。
【００２０】
加水分解および酵素の任意の不活性化または除去が完結した後、塩および水を除去する条件下に、必要に応じて加水分解物を逆浸透に付すことができる。次いで、ホエータンパク質、ポリペプチドおよび生物活性ペプチドを含んでなる、精製した脱塩加水分解物を回収する。
必要に応じて、約１０〜５００ ｋＤａのカットオフ、好ましくは約１０〜２００ ｋＤａのカットオフのＵＦ膜で生物活性ペプチド画分を含有する加水分解ＷＰＩを精製することができる。生物活性ペプチド、および他のペプチドは透過液中に回収される。
他のオプションによれば、イオン交換または疎水性吸着または疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはこれらのプロセスの組み合わせを使用して、濃縮された形態の加水分解物から加水分解された生物活性画分を回収することができる。
【００２１】
他の態様において、本発明は、ＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される１種または２種以上の生物活性ペプチドを含有するホエータンパク質加水分解物に関する。
好ましいは、ホエータンパク質加水分解物は、ＬＩＶＴＱ（配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドを、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと組み合わせて含んでなる。
【００２２】
他の面によれば、本発明は、本発明の方法により製造された１種または２種以上の生物活性ペプチドと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、生物活性ペプチドＭＫＧ （配列番号２） と、薬学上許容される担体とを含んでなる。
なお他の面によれば、本発明は、本発明の方法に従いＷＰＩを加水分解することによって製造された生物活性ペプチドの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物において高血圧症を治療または予防する方法を提供する。
なお他の面によれば、本発明は、患者における高血圧症を治療または予防する薬剤を製造するための本発明の方法により製造された生物活性ペプチドの使用を提供する。好ましくは、前記生物活性ペプチドはＭＫＧ （配列番号２） である。
【００２３】
さらに、本発明は、ＷＰＩの加水分解度が約３％〜約１０％である、本発明の方法により製造された生物活性ペプチドを含有する、苦くない、高度に可溶性のＷＰＩ加水分解物生成物を提供する。生成物中のホエータンパク質の主要な粒度は約３０ミクロンより小さく、好ましくは約３ミクロンより小さい。
それ以上の態様において、本発明は、本発明のＷＰＩ加水分解物生成物を含有する食物生成物を提供する。
さらに、本発明は、本発明の新規なＷＰＩ加水分解物生成物または前記加水分解物を含有する食物生成物の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者における収縮期血圧を減少させる方法に関する。
【００２４】
本発明は、さらに、ＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される１種または２種以上のペプチドに関する。
本発明は、さらに、ＬＩＶＴＱ（配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドとの組み合わせに関する。
【００２５】
本発明の加水分解されたＷＰＩ生成物は、下記の性質の１または２以上を有する：
・　　 抗高血圧性ＡＣＥ−Ｉ活性
・　　 プロビオチン （ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ） 増殖促進活性
・　　 非粘着性、非苦味性香味
・　　 わずかに甘い味覚に対する快さ
・　　 すぐれた感覚器官を刺激する性質
・　　 高い溶解度
・　　 すぐれた発泡性
・　　 非常にすぐれたゲル化性
・　　 改良された熱安定性
【００２６】
ホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） 基質に対する温和な加水分解技術の適用は、ＷＯ ９９／６５３２６に開示されているホエータンパク質含有基質として甘いホエータンパク質濃縮物 （ＷＰＣ） に比較して、次のような最終生成物のいくつかの劇的な改良を示した：
・　　 溶解度
プロテアーゼ反応を停止させる加熱条件に対してＷＰＩはなおわずかに変性するが、それは不溶性物質を生成しない。溶解度は約９６％に止まり、これは対応するＷＰＣ加水分解物よりも高い。
【００２７】
・　　 熱安定性
加水分解したＷＰＩは加水分解したＷＰＣよりも有意に熱安定性である。１２０ ℃、５％ＴＳにおいて１０分後、溶解度は９５％に止まる。
・　　 外観
反応条件の適切な選択は、最終加水分解物が白色または透明な溶液であるかどうかを決定することができる。下記の実施例１は不透明の生成物を生成するが、実施例２および３ （下記） は中性ｐＨにおいて透明の生成物溶液を生ずる。ＷＰＣの加水分解物のすべては実質的に白色の外観であった。
【００２８】
・　　 発泡の能力および安定性
加水分解したＷＰＩは、非加水分解ＷＰＩに比較して約２倍の発泡能力および約４倍の発泡安定性を示す。これはヨーグルトおよびデザートの用途のための成分として生成物を非常に適当とする。また、加水分解したＷＰＩは、ＷＰＣ加水分解物に比較して改良された発泡の能力および安定性を示す。
・　　 ゲル強度
温和に加水分解したＷＰＩは、非加水分解ＷＰＩに比較して顕著に増加したＷＰＩを示す。これはヨーグルトおよびデザートの用途のための成分として生成物を非常に適当とする。また、加水分解したＷＰＩは、ＷＰＣ加水分解物に比較して改良されたゲル強度を示す。
【００２９】
・　　 香味
加水分解したＷＰＩは、温和に加水分解したＷＰＣ生成物に比較して、有意に低い苦味を示す。苦味は経時的に加水分解を増加させる傾向を示さず、ＷＰＣ加水分解に比較して、この方法のコントロールを非常に容易にする。
・　　 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＣＥ−Ｉ活性
加水分解したＷＰＩは、匹敵する条件および酵素添加において、温和に加水分解したＷＰＣに比較してほぼ２倍のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＣＥ−Ｉ活性を示す。
・　　 プロビオチン発酵の加速
加水分解したＷＰＩは、１．５％の追加の率において約４０％のプロビオチンヨーグルト発酵時間の率の加速を示す。
本発明を前述したが、また、下記の実施例により本発明をさらに説明する。
【００３０】
発明の詳細な説明
前述したように、本発明は、生物活性ペプチドを含有する加水分解したＷＰＩ生成物を製造する方法を提供し、この方法において、加水分解を高度のコントロール下に実施して加水分解間の望ましくない香味 （例えば、苦味、石鹸および肉汁のような） を防止する。加水分解は、第１図に示すように、「機会のウィンドウ」内に、すなわち、実質的な苦味の発生前に停止させて、すぐれた感覚器官を刺激する性質を有しかつ生物活性ペプチドが最大である加水分解物を提供する。第１図において、加水分解度はｘ軸上に定量的に表示されている。機会のウィンドウは点ｘ１と点ｘ２との間であり、これらの点は使用する酵素に依存して変化するであろう。探求する最適条件は最大の生物活性と許容可能なレベルの苦味である。
【００３１】
本発明の方法の特に好ましい態様において、ＷＰＩを加水分解する酵素は熱不安定性であり、プロテアーゼＰ６、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、ペプチダーゼ、ニュートラーゼ、バリダーゼおよびＡＦＰ ２０００ （すべては本明細書において定義したとおりである）から成る群から選択され、そして高温において短時間 （約８５〜１００ ℃において約１〜１０秒間） 熱処理することによってＷＰＩの加水分解を停止させる。
【００３２】
驚くべきことには、出願人は下記の事実を発見した：上記酵素は （１） すぐれたレベルの生物活性ペプチドを含有するホエータンパク質加水分解物を生成することができ、そして （２） 短時間の、高温処理により不活性化することができ、この処理は加水分解物中のホエータンパク質の部分的変性のみを引き起こし、そして、驚くべきことには、実質的に白色または透明の外観を有する生成物を提供することによって、ホエータンパク質の感覚器官を刺激する性質を改良する。
ここで、ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９５またはＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９４　（ホエータンパク質単離物、ＮＺＤＢから商業的に入手可能である） を使用する下記の実施例により、本発明を例示する。ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９５またはＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９４の生成物の規格書はＩに付属されている。
【００３３】
実施例
実施例１．ＷＰＩ温和な加水分解物のパイロットプラントの製造
タンパク質含量が≧９０％ｗ／ｗであるカチオンイオン交換技術により製造されたホエータンパク質単離物 （ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９５） を、水 （５０ ℃） 中で２０％の全固形分に再構成した。再構成したＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９５を、５０ ℃において１５０リットルの槽に移した。水 （５０ ℃） を槽に添加して最終全固形分を４％にした。この溶液を攪拌し、ニュートラーゼ （Ｅ：Ｓ ０．９％） を添加した。
【００３４】
酵素添加後２時間に、ＵＨＴプラントを通して第１加水分解物をポンプ輸送した。水蒸気を直接注入して加水分解物を８８ ℃に加熱して酵素を不活性化し、加水分解物をその温度に１．５秒間保持した。加水分解物をフラッシュ冷却し、殻・管型交換器に通過させて周囲温度に冷却した。
【００３５】
実施例１の方法に従い製造した加水分解物は下記の特徴を有した：
溶解度：９５％
熱安定性：５％ＴＳ溶解度９５％において１２０ ℃で１０分間
ＡＣＥ−Ｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性：２８９ ｍｇ／ＬのＩＣ５０
発泡性：非加水分解ＷＰＩを超えて顕著に増加した
香味：ＷＰＣをベースとする温和な加水分解物を超えて顕著に改良された
外観：不透明の白色、粒子サイズ、約０．１ μｍ
【００３６】
ＷＰＩ加水分解物の溶解度、熱安定性、発泡性、および外観を当業者に知られている標準的方法により測定した。３０００ ｇにおいて１０分間遠心ことによって、５％の全固形分 （ＴＳ） の溶液の溶解度を測定した。１２０ ℃に１０分間加熱し、急冷し、次いで７００ ｇにおいて１０分間遠心することによって、５％のＴＳ溶液の熱安定性を測定した。上清およびもとの溶液の中に含有されるＴＳを測定した。溶解度をＴＳ （上清）／ＴＳ （もとの溶液） として定義した。ホバート （Ｈｏｂａｒｔ） ミキサー （Ｎ−５０Ｇ型、Ｈｏｂａｒｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） で１５分間泡立てることによって、ｐＨ ７．０において１０％ＴＳ溶液の発泡性を測定した。当業者は理解するように、百分率オーバーラン （ｏｖｅｒｒｕｎ） を使用して試料を比較した。視的観察により５％ＴＳの外観を決定し、マルバーン・マスターサイザー （Ｍａｌｖｅｒｎ ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒ） （ＭＳＥ００ＳＭ型、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ） を使用して粒子サイズを測定した。
【００３７】
Ｄ Ｗ Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｈ Ｓ Ｃｈｅｕｎｇの方法 （１９７１） に従い基質としてＦＡＰＧＧ （Ｐｒｏｄｕｃｔ ３０５−１０ ｅｘ Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ミゾリー州セントルイス） を使用して、乾燥した生成物におけるＡＣＥ−Ｉ活性 （ｉｎ ｖｉｔｒｏ） を測定した。ＡＣＥ−Ｉ活性は、ＡＣＥ−Ｉ酵素の活性を５０％だけ減少させるために必要な物質の量 （ ｍｇ／Ｌ） として表す。
香味を加水分解物の苦味および収斂性を参照して主観的に評価し、特に、形式的感覚パネルにより感覚プロファイルを評価した。多次元スケーリングを使用して、５％ｗ／ｗ試料を２４ ℃において試験した。試料を評価し、１５０ ｍｍの定着ライン上でスコアを付けた （非存在 （０） 〜強い （１５０））。
【００３８】
実施例２．
実施例１について上に概説したように、加水分解反応を反復した （１０％全固形分、Ｅ：Ｓ ０．９％、１５０Ｌ）。不活性化後、加水分解物を直ちに評価し、乾燥した。
この方法により製造した加水分解物は、実施例１について前述したように測定した、下記の特徴を有した：
【００３９】
溶解度：９７％
熱安定性：５％ＴＳ溶解度９５％において１２０ ℃で１０分間
ＡＣＥ−Ｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性：５０３ ｍｇ／ＬのＩＣ５０
発泡性：非加水分解ＷＰＩを超えて顕著に増加した
ゲル化：非加水分解ＷＰＩを超えて顕著に増加した
香味：ＷＰＣをベースとする温和な加水分解物を超えて顕著に改良された
外観：透明の黄色がかった色
【００４０】
実施例３．
上に概説したように、実施例１の加水分解反応を反復した （０．４％全固形分、Ｅ：Ｓ ０．９％、１５０Ｌ）。酵素添加後４時間に、実施例１における条件と同一条件下にＵＨＴプラントを通過させて、第１加水分解物をポンプ輸送した。
この方法により製造した加水分解物は、実施例１について前述したように測定した、下記の特徴を有した：
【００４１】
ＡＣＥ−Ｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性：２３０ ｍｇ／ＬのＩＣ５０
発泡性：非加水分解ＷＰＩを超えて顕著に増加した
ゲル化：非加水分解ＷＰＩを超えて顕著に増加した
香味：ＷＰＣをベースとする温和な加水分解物を超えて顕著に改良された
外観：透明の黄色がかった色
【００４２】
実施例４．
ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９４ （ミクロ濾過したＷＰＩ） の２％溶液を、ｐＨ ３．０に変更した後、３，０００ダルトンの公称分子量カットオフ膜 （ＣＤＵＦ００１ＬＢ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード） を使用して１０ ℃において限外濾過した。保持物質のｐＨを７．０に変更し、２％全固形分に希釈した後、前に使用した同一膜を使用して１０ ℃において限外濾過した。保持物質の全固形分を５．０％に調節した後、５０ ℃においてＥ：Ｓ ０．９％ｗ／ｗのニュートラーゼ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国） で加水分解した。４時間後、試料を８８ ℃において３秒間不活性化し、引き続いて凍結乾燥した。ＡＣＥ−Ｉ活性は２２７ ｍｇ／Ｌであると測定された。
【００４３】
実施例５．
実施例３からの温和に加水分解したＷＰＩは、半脂肪ミルクに１．５％の添加率で添加したとき、プロビオチン （ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ） 微生物の増殖を促進することが示された。ミルクを９０ ℃において１０分間加熱した。３７ ℃に冷却した後、ミルクを０．１％のスフェロバクター・テルモフィルス （Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） および２％のラクトバシラス・ラムノサス （Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＨＮ００１ （ＤＲ２０ＴＭ） を接種した。対照の発酵時間は必要なｐＨ ４．４に到達するために２０時間であった。対照的に、ＷＰＩ加水分解物の添加は発酵時間を１３時間に減少させた。
【００４４】
実施例６．ＷＰＩ加水分解物中のＡＣＥインヒビターペプチドの同定
この実施例の目的は、ＷＰＩ加水分解物の中に存在するＡＣＥインヒビターペプチドを単離し、同定することであった。
【００４５】
方法
・　　 ＡＣＥ−Ｉペプチド単離のための出発物質は、実施例１のもとの加水分解物から得られたＵＦ透過液 （１０ ｋＤａ） であった；
・　　 加水分解物の中に存在するペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離した；
・　　 実施例１に記載されているように、精製したペプチドを、個々にＡＣＥインヒビター活性についてアッセイした；
・　　 質量分析とＮ末端配列の分析との組み合わせにより、各活性ペプチドのアミノ酸配列を同定した；
・　　 活性ペプチドの配列をミルクタンパク質の既知の配列と比較することによって、活性ペプチドの由来を決定した。
【００４６】
ペプチド、それらの由来、活性および既知の類似性を、下記表１に記載する：
【表１】
2004508025.tif 000002
・　　 ＷＰＩ加水分解物からの活性ペプチドの３つ、すなわち、β−ＬＧ （７−９） 、β−ＬＧ （１４２−１４６） およびβ−ＬＧ （１−５） が以前に同定された。
【００４７】
実施例７．温和に加水分解したＷＰＣおよび非加水分解ＷＰＩに比較した温和に加水分解したＷＰＩの感覚的比較
ＷＰＩを実施例１に前述したように加水分解した。
ＷＰＣをＷＯ ９９／６５３２６の実施例１に記載されているように加水分解した。 （ＡＬＡＣＥＮＴＭ ３９２、１０％、加水分解し、２時間後に不活性化した）。
ＡＬＡＴＡＬＴＭ ８１９はニュー・ジーランド・デアリー・ボード （Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｄａｉｒｙ Ｂｏａｒｄ） の商品である；その製品規格の要約を付録Ｉに付属させる。
味覚パネルは評価し、１５０ ｍｍの定着ライン上でスコアを付けた （非存在 （０） 〜強い （１５０））。
Ｆｒｉｓｔｅｒ他 （１９８８） が記載する修飾されたＯ−フタルアルデヒド （ＭＯＰＡ） 法を使用して、加水分解度を測定した。
【００４８】
【表２】
2004508025.tif 000003
【００４９】
温和に加水分解したＷＰＩおよび温和に加水分解したＷＰＣの両方は、期待するように非加水分解ＷＰＩ生成物よりも苦くかつ収斂性であった。しかしながら、これらの生成物はいっそう激しく加水分解したＡＬＡＴＡＬＴＭ ８１９ （Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｄａｉｒｙ Ｂｏａｒｄ、ニュージーランド、の製品） よりも苦味および収斂性が有意に低かった。
【００５０】
温和に加水分解したＷＰＩ生成物は、温和に加水分解したＷＰＣ （ＷＯ ９９／６５３２６に記載されている） に比較して、いっそう許容可能な香味生成物を与え、有意により高いＡＣＥ−Ｉ活性を有した。また、これらの結果が示すように、温和に加水分解したＷＰＩは温和に加水分解したＷＰＣ 生成物よりも有意に低い苦味および収斂性であったが、両方についての加水分解度は類似した。いっそう許容可能な香味プロファイルを有することに加えて、温和に加水分解したＷＰＩのＡＣＥ−Ｉ活性は温和に加水分解したＷＰＣのそれのほとんど２倍であった。
ＷＰＣのそれ以上の加水分解はＡＣＥ−Ｉ活性を増加させることがあるが、温和に加水分解したＷＰＩに比較して香味プロファイルの有意な減少が観測され、苦味および収斂性の増加のために香味プロファイルを弱体化する。
【００５１】
実施例８．
血圧の測定
小さい動物の血圧を測定する尾カフモニターおよび目的設計装置を使用して血圧を測定した （ＩＩＴＣ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州９１３６７、ウッドランドヒルズ、ビクトリー・ビルディング２３９）。各時点はほぼ５〜１０分以内に取った３〜５の読みの平均であった。
【００５２】
動物の系統
自発的に高血圧症のラット （ＳＨＲ） をアニマル・リソース・センター （Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、西オーストラリア） から入手した。
試料の投与量
特記しない限り、被験物質を各ラットにｋｇ体重当たり投与した。各動物についての個々の投与量は、動物が容易に消費する香味添加ゼリーの中に混入した。
【００５３】
短期血圧応答について評価した３つの試料は、温和に加水分解したホエータンパク質濃縮物 （第２図） 、温和に加水分解したホエータンパク質単離物 （第３図参照） および表１からの合成したペプチド、すなわち、ＭＫＧ （配列番号２） （第４図参照） であった。ＷＰＣはＷＯ ９９／６５３２６の実施例１に記載されている方法に従い調製した。
成体ＳＨＲを物質で処置し、次いで下記の時間にわたって血圧の応答を研究することによって、物質の急性または短期作用を測定した。この研究において、物質が既に上昇した血圧を低下するかどうかを検出する。
【００５４】
結果
３．６ ｇ／ｋｇ体重のＷＰＩ加水分解物をＳＨＲに短期投与する （第３図） と、対照ラットに比較して血圧が有意に減少した （ｐ＝０．０３７８）。血圧の減少は６．０ ｇ／ｋｇ体重のＷＰＣ加水分解物を投与したラットにおいて達成された血圧の減少 （第２図） と同様であった。こうして、ＷＰＩ加水分解物は、比較ＷＰＣ加水分解物よりも活性であるように思われるので、成熟ＳＨＲにおいて血圧 （収縮期） を同様に減少させるために、ＷＰＩ加水分解物の必要量はほぼ５０％少ない。
【００５５】
１６５ ｍｇ／ｋｇ体重のペプチドＭＫＧをＳＨＲに短期投与する （第４図） と、対照ラットに比較しならびに温和なＷＰＩ加水分解物および温和なＷＰＣ加水分解物に比較して、血圧が非常に大きく減少した （４時間後 ｐ＝０．００２１；８時間後 ｐ＝０．０００１）。
【００５６】
結論
本発明によるＷＰＩを温和に加水分解乳酸ナトリウム方法は、ＷＯ ９９／６５３２６の加水分解物を超えて有意な機能的改良を示す有用なＷＰＩ加水分解物を提供する。特に、本発明のＷＰＩ加水分解物はいっそう活性なペプチドを含んでなり、ＷＰＣ加水分解物と同一程度に血圧をｉｎ ｖｉｖｏ低下するために必要なＷＰＩ加水分解物の量は有意に少ない。許容可能な香味特性を喪失しないでかつ増加したＡＣＥ−Ｉ活性を維持して、ＷＰＩをより長く加水分解することができる。こうして、全体的に、本発明の方法は、ＷＯ ９９／６５３２６の加水分解物のそれらに比較して、香味、ＡＣＥ−Ｉ活性および機能性が改良された生物活性ホエータンパク質加水分解物を提供する。
【００５７】
工業的応用
本発明の方法は、驚くべきことほどに有益なホスホを有しかつ食物または抗高血圧剤のような薬剤として使用することができる、新規なホエータンパク質加水分解物を製造するために有用である。
理解されるように、本発明を前述の実施例のみに限定することを意図せず、添付された特許請求の範囲から逸脱しないで、種々の変更および変化が可能である。
【００５８】
付録Ｉ
ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９５
ホエータンパク質単離物
Ｐ６１３．０４．０８９８
ＡＬＡＣＥＮ ８９５は可溶性、９３％のミルクタンパク質製品であり、脂肪、ラクトースおよびコレステロールが低く、栄養的利益を与え、ならびに増強された機能的および香味的性質を提供する。
機能的には、ＡＬＡＣＥＮ ８９５は、酸／熱安定性、溶液の透明性および通気安定性を提供する、特殊化されたタンパク質である。
【００５９】
製品の特性
・　　 きわめてすぐれた泡立て能力
・　　 清浄な香味
・　　 低ラクトース
・　　 低脂肪および低コレステロール含量
・　　 酸／熱安定性
・　　 広いｐＨ範囲にわたる可溶性
・　　 きわめてすぐれた栄養的性質
【００６０】
示唆される使用
ＡＬＡＣＥＮ ８９５は、香味感受性であり、かつ栄養的タンパク質生成物を必要とする用途に特に有用である。
・　　 高タンパク質飲料
・　　 低脂肪および低ラクトースの食物
・　　 メレンゲおよび泡立てたトッピング
・　　 タンパク質強化栄養食物
【００６１】
典型的な組成
エネルギー　　　　　　　　　　　　　　　　１６１６ ｋＪ／１００ｇ
タンパク質 （Ｎ×６．３８）
そのまま　　　　　　　　　　　　　　　　　９３．１％
乾燥基準　　　　　　　　　　　　　　　　　９６．６％
脂肪　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．６％
湿分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．６％
灰分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６％
ラクトース （差）　　　　　　　　　　　　　 １．１％
【００６２】
典型的な商業的分析
ｐＨ （５％、２０ ℃）　　　　　　　　　　　　　 ６．８
物理的性質
色　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　クリーム
香味　　　　　　　　　　　　　　　　　　　清浄
沈降物 （５０ ｇ）　　　　　　　　　　　　　　 ディスクＡ
【００６３】
典型的な生物学的分析
好気性平板菌数 （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　　＜３０，０００
コリ型 （１ ｇ）　　　　　　　　　　　　　　　陰性
酵母およびカビ （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　 ＜１０
コアグラーゼ陽性スタフィロコッキ
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ） （１ ｇ）　　　　　　　　　　陰性
サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） （７５０ ｇ）　　　　　 陰性
【００６４】
典型的な無機質組成
ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　４８４ ｍｇ／１００ ｇ
カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　８０．１ ｍｇ／１００ ｇ
塩化物　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１ ｍｇ／１００ ｇ
カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　１０６ ｍｇ／１００ ｇ
リン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５２．５ ｍｇ／１００ ｇ
【００６５】
包装
標準的パックは多壁バッグである。これは湿分バリヤーを組込み、内部のポリテンライナー内に製品を含有する。ステープルまたは金属ファスナーを含まない。
正味重量　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．０ ｋｇ
総重量　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．５ ｋｇ
貯蔵および取扱い
ＡＬＡＣＥＮ ８９５は、冷たい、乾燥した通気した場所に保持すべきである。２５ ℃以下の温度、６５％以下の相対湿度および無臭の環境は貯蔵寿命を延長するであろう。包装は壁または床と接触すべきでない。在庫品は順番に、好ましくはデリバリーの６ヶ月以内に使用すべきである。
【００６６】
品質保証
厳格な品質管理手法が製造中に実施されている。また、製造環境は規則的モニターおよび制御に付されている。
最終生成物は国際的に承認された手法を使用してサンプリングされ、化学的、感覚的および微生物のパラメーターについて試験されている。
貯蔵および輸送の間に、製品の品質が維持されるように予備策が取られている。各包装は個体識別され、追跡可能である。
【００６７】
ＡＬＡＣＥＮＴＭ ８９４
ホエータンパク質単離物
Ｐ４２２．０１．２０００
ＡＬＡＣＥＮ ８９４は、限外濾過 （ＵＦ） および交差流精密濾過 （ＭＦ） により製造された、可溶性、＞９３％ｄｂのホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） 製品である。精密濾過は変性されないタンパク質を自然に単離し、低脂肪および高タンパク質のＭＦホエータンパク質単離物製品を提供する。
【００６８】
ＡＬＡＣＥＮ ８９４はきわめてすぐれた栄養価を有し、真のタンパク質消化性が９９．７％、ＰＤ−ＣＡＡＳ＝１％、およびＰＥＲ＝３．０である。これらの品質により、ＡＬＡＣＥＮ ８９４は、きわめてすぐれた栄養プロファイルおよび／または可溶性を有する、タンパク質強化栄養食物のために特に有用である。
【００６９】
製品の特性
・　　 きわめてすぐれた栄養価
・　　 清浄な香味
・　　 広いｐＨ範囲にわたる可溶性
・　　 低脂肪および低コレステロール含量
・　　 低ラクトース
【００７０】
示唆される使用
・　　 タンパク質強化栄養食物
・　　 メレンゲおよび泡立てたトッピング
・　　 低脂肪および低ラクトースの食物
【００７１】
典型的な組成
タンパク質 （Ｎ×６．３８）　そのまま　　　　　　８９．９％
タンパク質 （Ｎ×６．３８）　乾燥基準　　　　　　９４．１％
湿分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．５％
脂肪　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２％
灰分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．２％
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　０．６％
【００７２】
典型的な商業的分析
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．９
典型的な物理的性質
色　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　クリーム
香味　　　　　　　　　　　　　　　　　　　清浄
焼焦げ粒子 （５０ ｇ）　　　　　　　　　　　　 ディスクＡ
【００７３】
典型的な生物学的分析
好気性平板菌数 （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　　＜１０，０００
コリ型 （／ｇ）　　　　　　　　　　　　　　　検出されず
大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ） （／ｇ）　　　　　　　　　　検出されず
酵母およびカビ （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　 ＜１０
コアグラーゼ陽性スタフィロコッキ
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ） （／ｇ）　　　　　　　　　　検出されず
サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） （／７５０ ｇ）　　　　 非存在
リステリア （Ｌｉｓｔｅｒｉａ）　　　　　　　　　　 非存在
【００７４】
典型的な無機質組成
ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　２８０ ｍｇ／１００ ｇ
カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　９０１ ｍｇ／１００ ｇ
塩化物　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１ ｍｇ／１００ ｇ
カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　３１０ ｍｇ／１００ ｇ
リン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９９ ｍｇ／１００ ｇ
【００７５】
包装
標準的パックは多壁バッグである。これは内部のポリテンライナー内に製品を含有する。ステープルまたは金属ファスナーは使用されていない。
正味重量　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０ ｋｇ
総重量　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．４ ｋｇ
【００７６】
貯蔵および取扱い
ＡＬＡＣＥＮ ８９４は、冷たい、乾燥した通気した場所に保持すべきである。２５ ℃以下の温度、６５％以下の相対湿度および無臭の環境は貯蔵寿命を延長するであろう。
包装は壁または床と接触すべきでない。在庫品は順番に、好ましくはデリバリーの６ヶ月以内に使用すべきである。
【００７７】
品質保証
厳格な品質管理手法が製造中に実施されている。また、製造環境は規則的モニターおよび制御に付されている。
最終生成物は国際的に承認された手法を使用してサンプリングされ、化学的、感覚的および微生物のパラメーターについて試験されている。
貯蔵および輸送の間に、製品の品質が維持されるように予備策が取られている。各包装は個体識別され、追跡可能である。
【００７８】
ＡＬＡＴＡＬ ８１９
ホエータンパク質加水分解物
ＷＰＨ ９２６は、アミノ酸、ペプチド、およびポリペプチドを提供するホエータンパク質のコントロールされた酵素処理により製造された、高い品質の加水分解物である。ホエータンパク質基材は高度に栄養的である。酵素処理は温和であり、かつ注意してモニターされたプロセスであるので、必須アミノ酸は完全なままであり、もとのタンパク質の高い栄養的品質は保持される。ＷＰＨ ９２６は抗原性を１０−１倍に減少させると同時に清浄な香味をなお保持するように設計されている。
【００７９】
典型的な組成分析
タンパク質 （Ｎ×６．３８）
乾燥基準　　　　　　　　　　　　　　　　　８４．５％
そのまま　　　　　　　　　　　　　　　　　８０．９％
灰分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．７％
湿分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．３％
脂肪　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０％
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　３．２％
抗生物質 （ＩＵ／ｇ）　　　　　　　　　　　　　＜０．０１
【００８０】
典型的な無機質分析
ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．６％
カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　０．６％
カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％
リン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３％
マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　０．０２％
塩化物　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３％
【００８１】
示唆される使用
・　　 吸収不良のための腸内製品
・　　 無ラクトース栄養製品
【００８２】
製品の特性
・　　 きわめてすぐれた栄養品質
・　　 減少したアレルゲン性
・　　 非常にすぐれた可溶性
・　　 すぐれた熱安定性
・　　 低い香味プロファイル
【００８３】
典型的な分子分析
アミノ窒素　　　　　　　　　　　　　　　　１．７％
全窒素　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３．４％
ＡＮ／ＴＮ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３％
加水分解度　　　　　　　　　　　　　　　　１０％
推奨される表示
ホエータンパク質加水分解物
【００８４】
典型的な生物学的分析
標準的平板菌数 （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　　＜１０，０００
コリ型 （１ ｇ）　　　　　　　　　　　　　　　＜１０
大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）　　　　　　　　　　　　　陰性
酵母およびカビ （ｃｆｎ／ｇ）　　　　　　　　　 ＜５０
コアグラーゼ陽性スタフィロコッキ
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ） （１ ｇ）　　　　　　　　　　陰性
サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） （７５０ ｇ）　　　　　 陰性
【００８５】
典型的な物理的性質
色　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　クリーム
感覚的　　　　　　　　　　　　　　　　　　清浄、わずかに苦い
嵩密度 （包装、ｇ／ｍＬ）　　　　　　　　　　　０．５０
ｐＨ （５％、２０ ℃）　　　　　　　　　　　　　 ７．２
溶解度　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００％
【００８６】
包装
加熱シールされた、多壁クラフト紙バッグである。ポリエチレンバッグのライナーは個々に閉じられている。ステープルまたは金属ファスナーを含まない。
正味重量　　　　　　　　　　　　　　　　　５０．０ポンド （２２．７ ｋｇ）
総重量　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０．８ポンド （２３．１ ｋｇ）
【００８７】
酵素
ＷＰＨ ９２６において使用されているすべての酵素は食物銘柄であり、米国食品医薬品局により安全であるとして一般的に認識されている （ＧＲＡＳ）。
貯蔵
ホエータンパク質加水分解物は、適切な条件下に貯蔵したとき、消費者が受け取ってから１年以内に使用されることが最良である。加水分解物は吸湿性であり、臭いを吸収することがあるので、２５ ℃以下の温度、６５％以下の相対湿度において、無臭の環境中で製品を貯蔵することが推奨される。
【００８８】
参考文献
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【００９１】
【配列表】
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【００９２】
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【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、横座標上の加水分解度に対して縦座標上に苦味および生物活性をプロットする。加水分解反応が苦いペプチドを生成する前に、生物活性ペプチドを含有しかつ許容可能な大腿静脈を有する本発明による生成物を得る「機会のウィンドウ」は、線ｘ１と線ｘ２との間に存在する。
【図２】
図２は、６．０ ｇのＷＰＣ加水分解物／ｋｇ体重を投与する成熟した自発的高血圧症のラット （ＳＨＲ） の急性短期効果を示す。
【図３】
図３は、３．６ ｇのＷＰＩ加水分解物／ｋｇ体重を投与する成熟した自発的高血圧症のラット （ＳＨＲ） の急性短期効果を示す。
【図４】
図４は、１６５ ｍｇのペプチドＭＫＧ （配列番号２）／ｋｇ体重を投与する成熟した自発的高血圧症のラット （ＳＨＲ） の急性短期効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月31日(2002.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエータンパク質単離物 （ＷＰＩ） を１種または２種以上の酵素で加水分解することを含んでなる、高度に可溶性である生物活性ペプチドを含有する改良されたホエータンパク質加水分解物の製造方法において、
ｉ）　　 前記酵素が熱不安定性プロテアーゼであり、
ｉｉ）　　前記酵素が中性プロテアーゼであるとき約３．５〜約９．０のｐＨにおいて、前記酵素が酸性プロテアーゼであるとき約２．５〜約６．０のｐＨにおいて、そして前記酵素がアルカリ性プロテアーゼであるとき約５．０〜約１０．０のｐＨにおいて、加水分解を約３０ ℃〜約６５ ℃の温度において実施し、
ｉｉｉ）　 約１０％以下の加水分解度に到達したとき、加水分解を停止し、
ｉｖ）　　前記１種または２種以上の酵素を不活性化することによって、加水分解を停止し、そして
ｖ）　　 前記ｉｖ） の条件は前記加水分解物中のペプチドまたは残留タンパク質の実質的な変性を回避するために十分に温和である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酵素がプロテアーゼＰ６、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、ペプチダーゼ、ニュートラーゼ、バリダーゼ、ＡＦＰ ２０００、および任意の他の熱不安定性プロテアーゼから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素不活性化工程ｉｖ） が加熱不活性化を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記加熱不活性化が前記加水分解物を約１００ ℃までの温度に１０秒間まで加熱することを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記加水分解を約６５ ℃以下の温度において実施するとき、前記加熱不活性化工程を約６５ ℃〜約７０ ℃において約１０秒〜約１５分間実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記加水分解を約６０ ℃以下の温度において実施するとき、前記加熱不活性化工程を約６０ ℃〜約６５ ℃において約１０秒〜約３０分間実施する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ホエータンパク質含有基質のｐＨを前記プロテアーゼが活性でないｐＨに変更することを前記酵素不活性化工程が含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素不活性化工程が請求項３〜６のいずれかに記載の加熱不活性化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素不活性化工程ｉｖ） が約１０〜５００ ｋＤａの範囲の名目分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用して前記加水分解物を限外濾過することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記限外濾過膜が約１０〜２００ ｋＤａの範囲の名目分子量カットオフを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素を前記加水分解工程ｉｉ） 間に不活性支持体上に固定化する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記不活性支持体がレム・エウペルギット （Ｒｏｅｈｍ Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）、カラゲナン粒子、キトサン粒子または任意の他の適当な不活性支持体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
加水分解度が約３％〜約１０％である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
加水分解度が約３％〜約５％である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
そのように製造されたホエータンパク質加水分解物がＳＡＰ （配列番号１）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８）から成る群から選択される１種または２種以上の生物活性ペプチドを含んでなる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
そのように製造されたホエータンパク質加水分解物がＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドを、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと組み合わせて含んでなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された１種または２種以上の生物活性ペプチドと、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
生物活性ペプチドＭＫＧ （配列番号２） と、薬学上許容される担体とを含んでなる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法に従いＷＰＩを加水分解することによって製造された生物活性ペプチドの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物において高血圧症を治療または予防する方法。
【請求項２０】
患者における高血圧症を治療または予防する薬剤を製造するための請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された生物活性ペプチドの使用。
【請求項２１】
前記生物活性ペプチドがＭＫＧ （配列番号２） である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法により製造された生物活性ペプチドを含有する、苦くない、高度に可溶性のＷＰＩ加水分解物生成物。
【請求項２３】
ＷＰＩの加水分解度が約３％〜約５％である、請求項２２に記載の生成物。
【請求項２４】
生成物中のホエータンパク質の主要な粒度が約３０ミクロンより小さい、請求項２３に記載の生成物。
【請求項２５】
主要な粒度が約３ミクロンより小さい、請求項２４に記載の生成物。
【請求項２６】
実質的に透明なまたは白色の溶液である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の生成物。
【請求項２７】
前記生物活性ペプチドの１種または２種以上がＳＡＰ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２）、ＡＬＰＭＨ （配列番号３）、ＬＩＶＴＱ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される、請求項２２〜２６のいずれかに記載の生成物。
【請求項２８】
ＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドを、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドと組み合わせて含んでなる、請求項２２〜２６のいずれかに記載の生成物。
【請求項２９】
請求項２２〜２８のいずれかに記載のＷＰＩ加水分解物生成物を含有する食物生成物。
【請求項３０】
請求項２２〜２８のいずれかに記載のＷＰＩ加水分解物生成物または請求項２９に記載の前記加水分解物を含有する食物生成物食物生成物の有効量を患者に投与することを含んでなる、患者における収縮期血圧を減少させる方法。
【請求項３１】
患者における高血圧症を治療または予防する薬剤を製造するための請求項２２〜２８のいずれかに記載の生成物の使用。
【請求項３２】
請求項２２〜２８のいずれかに記載の生成物と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３３】
ＳＡＰ （配列番号１）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される１種または２種以上のペプチドの１つまたは任意の組み合わせ。
【請求項３４】
ＬＩＶＴＱ （配列番号１）、ＭＫＧ （配列番号２） およびＡＬＰＭＨ （配列番号３） から成る群から選択される任意の１つの生物活性ペプチドと、ＳＡＰ （配列番号４）、ＶＳＬＰＥＷ （配列番号５）、ＩＮＹＷＬ （配列番号６）、ＬＫＰＴＰＥＧＤＬＥＩＬ （配列番号７） およびＬＫＧＹＧＧＶＳＬＰＥＷ （配列番号８） から成る群から選択される少なくとも１種の生物活性ペプチドとの組み合わせ。
【国際調査報告】
2004508025.tif 000047
2004508025.tif 000048
2004508025.tif 000049