(57)【要約】本発明は、ＰＳＡ複合体である化合物とグルココルチコイドの組合せを使用して癌を治療する方法であって、少なくとも１つのＰＳＡ複合体と少なくとも１つのグルココルチコイドの一定量をいずれかの順序で連続的に又は同時に、当該哺乳類に投与することを含む方法に関する。本発明はまた、そのような組成物を調製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある哺乳類における癌を治療する方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと少なくとも１つのＰＳＡ複合体の一定量を該哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２】
一定量のグルココルチコイドと一定量のＰＳＡ複合体を連続的に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一定量のグルココルチコイドと一定量のＰＳＡ複合体を同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が、酵素的に活性なＰＳＡを発現する細胞に関連する癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
癌が前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＳＡ複合体が、
ａ）式Ｉ：
【化１】
2004517076.tif 000078
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは存在しないか又は
ａ）フェニルアラニン、
ｂ）ロイシン、
ｃ）バリン、
ｄ）イソロイシン、
ｅ）（２−ナフチル）アラニン、
ｆ）シクロヘキシルアラニン、
ｇ）ジフェニルアラニン、
ｈ）ノルバリン、及び
ｉ）ノルロイシン
から選択されるアミノ酸であり、
Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、
Ｒ１はＣ１〜Ｃ６−アルキル又はアリールである］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｂ）式ＩＩ：
【化２】
2004517076.tif 000079
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは存在しないか又は
ａ）フェニルアラニン、
ｂ）ロイシン、
ｃ）バリン、
ｄ）イソロイシン、
ｅ）（２−ナフチル）アラニン、
ｆ）シクロヘキシルアラニン、
ｇ）ジフェニルアラニン、
ｈ）ノルバリン、及び
ｉ）ノルロイシン
から選択されるアミノ酸であり、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、
Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、
Ｒ１はＣ１〜Ｃ６−アルキル又はアリールであり、
Ｒ１９は水素又はアセチルであり、
ｎは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｃ）式ＩＩＩ：
【化３】
2004517076.tif 000080
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって選択的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、該オリゴペプチドは式：
【化４】
2004517076.tif 000081
［式中、
Ｃ末端カルボニルはドキソルビシンのアミンに共有結合している］
の環状アミノ酸を含み、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【化５】
2004517076.tif 000082
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｒ５はＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１から１０までの整数であり、
ｔは３又は４である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｄ）式ＩＶ：
【化６】
2004517076.tif 000083
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、該オリゴペプチドは式：
【化７】
2004517076.tif 000084
の環状アミノ酸を含み、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【化８】
2004517076.tif 000085
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｒ５はＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ６は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ１９は水素、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯ、又はクロロ置換（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯであり、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｅ）式Ｖ：
【化９】
2004517076.tif 000086
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって選択的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、そのＣ末端カルボニルはドキソルビシンのアミンに共有結合し、Ｎ末端アミンは保護基のカルボニルに共有結合しており、
Ｒは、
【化１０】
2004517076.tif 000087
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｆ）式ＶＩ：
【化１１】
2004517076.tif 000088
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
【化１２】
2004517076.tif 000089
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１９は水素、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯ、又はクロロ置換（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯであり、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｇ）式ＶＩＩ：
【化１３】
2004517076.tif 000090
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【化１４】
2004517076.tif 000091
ｆ）エトキシスクアラート、及び
ｇ）コチニニル
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ポリヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｗはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はビシクロ［２．２．２］オクタニルから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは０、１、２又は３である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び
ｈ）式ＶＩＩＩ：
【化１５】
2004517076.tif 000092
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは、結合、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−Ｏ−及び−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−から選択され、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【化１６】
2004517076.tif 000093
ｆ）エトキシスクアラート、及び
ｇ）コチニニル
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ポリヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｗは、分枝状又は直鎖状Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はビシクロ［２．２．２］オクタニルから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは０、１、２又は３である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩又は光学異性体
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＳＡ複合体が、
【化１７】
2004517076.tif 000094
［式中、Ｘは、
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒ−（配列番号１），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒ−（配列番号２），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒ−（配列番号３），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒ−（配列番号４），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕ−（配列番号５），
ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕ−（配列番号６），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒ−（配列番号７），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＬｅｕ−（配列番号８），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｅｕ−（配列番号９），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１０），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１１），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１２），
Ａｃ−ＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１３），
Ａｃ−ｈＡｒｇＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１４），
Ａｃ−ＬｙｓＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１５），
Ａｃ−ＬｙｓＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＮｌｅ−（配列番号１６）
である］、
【化１８】
2004517076.tif 000095
【化１９】
2004517076.tif 000096
［式中、Ｘは、
【化２０】
2004517076.tif 000097
である］、
【化２１】
2004517076.tif 000098
［式中、Ｘは、
【化２２】
2004517076.tif 000099
2004517076.tif 000100
である］、
【化２３】
2004517076.tif 000101
2004517076.tif 000102
【化２４】
2004517076.tif 000103
2004517076.tif 000104
【化２５】
2004517076.tif 000105
［式中、Ｘは、
【化２６】
2004517076.tif 000106
2004517076.tif 000107
である］、
のうちから選択されるか、又は薬学的に許容されるその塩又は光学異性体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＳＡ複合体が、
【化２７】
2004517076.tif 000108
又は薬学的に許容されるその塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
グルココルチコイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、及びデキサメタゾンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
グルココルチコイドがプレドニゾンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのグルココルチコイドと少なくとも１つのＰＳＡ複合体の一定量を含む、その必要のある哺乳類において治療効果を達成するための薬剤組成物。
【請求項１２】
治療効果が、癌性腫瘍増殖の抑制及び癌性腫瘍の後退から選択される、請求項１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
癌が、酵素的に活性なＰＳＡを発現する細胞に関連する癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
癌が前立腺癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのグルココルチコイドと少なくとも１つのＰＳＡ複合体の一定量を混合することを含む、その必要のある哺乳類における癌の治療のための薬剤組成物を調製する方法。
【請求項１６】
一定量のグルココルチコイドと一定量のＰＳＡ複合体を混合することを含む、請求項１５に記載の薬剤組成物を調製する方法。
【請求項１７】
その必要のある哺乳類において癌を治療する方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと少なくとも１つのＰＳＡ複合体の一定量を該哺乳類に投与し、且つ該哺乳類に放射線療法を適用することを含む方法。
【請求項１８】
一定量のグルココルチコイドと一定量のＰＳＡ複合体を同時に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
一定量のグルココルチコイドと一定量のＰＳＡ複合体を連続的に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
その必要のある哺乳類において前立腺疾患を治療するための方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと少なくとも１つのＰＳＡ複合体の一定量を該哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前立腺疾患が、良性前立腺過形成、前立腺上皮内腫瘍及び前立腺癌から選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療する方法、より特定すると前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生する細胞に関連した癌を治療する方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと、ＰＳＡによって選択的に開裂されるオリゴペプチドと細胞傷害性物質を含む少なくとも１つの複合体をその必要のある患者に投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
１９９９年に、米国では１７９，３００人の男性において前立腺の癌の新しい症例が診断されると予想され、また３７，０００人のアメリカ人男性がこの疾患のために死亡すると予想された（Ｌａｎｄｉｓ，Ｓ．Ｈ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．４９：８−３１（１９９９））。前立腺癌は米国の男性において最も多く診断される悪性疾患（皮膚の悪性疾患以外の）であり、癌に関連した死亡の第二の主要原因（肺癌に次ぐ）である。２０００年には、ｔｈｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙが米国における推定癌発生率、死亡率及び生存率データの所見を報告した。その報告によれば、男性における癌死亡の総数が７０年間で初めて減少していた。１９９６年から１９９７年に起こったこの減少は、最近の、肺及び気管支癌による死亡、前立腺癌による死亡、及び結腸と直腸癌による死亡の減少傾向に帰せられる（Ｒ．Ｔ．Ｇｒｅｅｎｌｅｅら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．（２０００）５０（１）：７−３３）。
【０００３】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、ヒト前立腺上皮組織によってほとんど独占的に産生され、ヒト精液中に０．５ｎｇから４．０ｎｇ／ｍｌのレベルで生じる３３ｋＤａの単鎖状糖タンパク質である（Ｎａｄｊｉ，Ｍ．，Ｔａｂｅｒ，Ｓ．Ｚ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ａ．ら（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１２２９；Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ，Ｌ．，Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．ら（１９８１）、ＪＮＣＩ６６：３７；Ｑｕｉ，Ｓ．Ｄ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｆ．，Ｂｉｈａｒｔｚ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９０）、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４４：１５５０；Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｃ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｌ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．ら（１９７９）、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１７：１５９；Ｗ．Ｊ．Ｃａｔａｌｏｎａら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９１）３２４（１７）：１１５６−６１）。１個の炭水化物単位が４５番のアスパラギン残基に結合して、２ｋＤａから３ｋＤａの総分子量を占める。ＰＳＡはキモトリプシン様の特異性を持つプロテアーゼである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｌａｕｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｉｌｊａ，Ｈ．（１９９０），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：７５５−７６３）。ＰＳＡは主として、精子捕獲ゲル中の主要タンパク質、シーメノゲリンＩ（Ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ  Ｉ）とシーメノゲリンＩＩ（Ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ  ＩＩ）、及びフィブロネクチンのタンパク質分解により、射精時に形成されるゲル構造の溶解の役割を担うことが示された（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．（１９８５），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：１８９９；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｏｌｄｂｒｉｎｇ，Ｊ．，Ｒａｎｎｅｖｉｋ，Ｇ．ら（１９８７）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：２８１；ＭｃＧｅｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．（１９８８）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３９：４９９）。ＰＳＡを介したゲル形成タンパク質のタンパク質分解は、射精によって排出された精液の液状化と斬新的運動性精子の放出を伴っていくつかの可溶性シーメノゲリンＩとシーメノゲリンＩＩフラグメント及び可溶性フィブロネクチンフラグメントを生じる（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｌａｕｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．（１９８４）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４４：４４７；ＭｃＧｅｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．（１９８７）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３７：４３１）。さらに、ＰＳＡはＩＧＦＢＰ−３（インスリン様増殖因子結合タンパク質３）をタンパク質分解して、ＩＧＦにＰＳＡ分泌細胞の増殖を特異的に刺激させる（Ｃｏｈｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．＆  Ｍｅｔａ．７５：１０４６−１０５３）。
【０００４】
α１−抗キモトリプシンに複合したＰＳＡが血清ＰＳＡの主たる分子形態であり、検出される血清ＰＳＡの９５％までを占めると考えられる（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｔ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｏ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００−１０５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５；Ｓｔｅｎｍａｎ，Ｕ．Ｈ．，Ｌｅｉｎｏｖｅｎ，Ｊ．，Ａｌｆｔｈａｎ，Ｈ．ら（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２２２−２２６）。α１−抗キモトリプシンとの複合体形成のためには成熟した酵素的に活性な形態のＰＳＡが必要であるので、前立腺組織（正常、良性過形成、又は悪性組織）は主としてこの形態のＰＳＡを放出することに関与する（Ｍａｓｔ，Ａ．Ｅ．，Ｅｎｇｈｉｌｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｉｚｚｏ，Ｓ．Ｖ．ら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１７２３−１７３０；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｇ．Ｉ．，Ｒｉｖｅｔｎａ，Ｍ．ら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３７５３−３７５７）。それ故、前立腺のＰＳＡ分泌細胞のミクロ環境では、ＰＳＡはいかなる阻害分子にも複合していない成熟した酵素的に活性な形態でプロセシングされ、分泌されると考えられる。ＰＳＡはまた、α２−マクログロブリンとも安定な複合体を形成するが、これはＰＳＡのカプセル化とＰＳＡエピトープの完全な喪失をもたらすので、この複合体形成のインビボでの意味は明らかではない。遊離非複合形態のＰＳＡは血清ＰＳＡの小さな分画を構成する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｔ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｏ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００−１０５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）。この形態の血清ＰＳＡの大きさは精液中のＰＳＡの大きさと同様である（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）が、遊離形態の血清ＰＳＡがチモーゲンであるのか、成熟ＰＳＡの内部開裂した不活性形態であるのか、又は酵素活性を示すＰＳＡであるのかについてはまだ不明である。しかし、検出される遊離３３ｋＤａ形態のＰＳＡの血清レベルに比べて、血清中の非反応α１−抗キモトリプシンとα２−マクログロブリンの両方がかなりの（１００倍から１０００倍）モル過剰であるので、遊離形態の血清ＰＳＡが酵素活性を発現するとは考えにくい（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｔ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｏ．ら（１９９３）、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００−１０５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）。
【０００５】
ＰＳＡの血清測定は前立腺の腺癌の治療を監視するために有用である（Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｓ．（１９８９）、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：３７９−３８７；Ｂｒａｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．とＬａｎｇｅ，Ｐ．Ｈ．（１９８９）、Ｕｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．５：１１−１６；Ｈａｒａ，Ｍ．とＫｉｍｕｒａ，Ｈ．（１９８９）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１３：５４１−５４８）が、良性前立腺過形成及び前立腺の手術時外傷後にも正常値より高いＰＳＡの血清濃度が報告されている（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）。広汎な転移性前立腺癌を示す前立腺切除患者において血清ＰＳＡが高いレベルで検出されることから、前立腺転移も免疫反応性ＰＳＡを分泌することが知られている（Ｆｏｒｄ，Ｔ．Ｆ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ら（１９８５）、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５７：５０−５５）。それ故、ＰＳＡのタンパク質分解活性によって活性化されうる細胞傷害性化合物は前立腺細胞特異的であり、同時にＰＳＡを分泌する前立腺転移に対しても特異的であるはずである。
【０００６】
直接に又はリンカーを通して細胞傷害性物質に結合した酵素活性ＰＳＡによって選択的に開裂されうる、前立腺癌及び良性前立腺過形成の治療において有用なオリゴペプチドを含む複合体がこれまでに記述されている（米国特許第５，５９９，６８６号及び同第５，８６６，６７９号）。
【０００７】
これまでに開示されている治療方法にまさる利益を提供する、癌を治療するための方法、より特定すると前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生する細胞に関連した癌を治療するための方法を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
（発明の要旨）
癌を治療する方法、より特定すると前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生する細胞に関連した癌を治療する方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと、ＰＳＡによって選択的に開裂されるオリゴペプチドと細胞傷害性物質を含む少なくとも１つの複合体の一定量を、そのような治療を必要とする患者に投与することから成る方法を開示する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌を治療する方法、より特定すると前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生する細胞に関連した癌を治療する方法であって、少なくとも１つのグルココルチコイドと、ＰＳＡによって選択的に開裂されるオリゴペプチドと細胞傷害性物質を含む少なくとも１つの複合体（以下ＰＳＡ複合体と称する）の一定量を、そのような治療を必要とする患者に投与することから成る方法に関する。グルココルチコイドとＰＳＡ複合体のそのような組合せはまた、前立腺癌、良性前立腺過形成及び前立腺上皮内腫瘍を含めて、一般に前立腺疾患を治療する上で有用であると考えられる。
【００１０】
本発明の治療方法を実施するに際して、グルココルチコイドとＰＳＡ複合体を１つの薬剤組成物中で同時に又は別々の薬剤組成物中で個別に投与しうることを理解されたい。グルココルチコイドとＰＳＡ複合体を別々の組成物中として投与する場合、そのような組成物は同時に又は連続的に投与しうる。
【００１１】
２又はそれ以上の別個の薬剤組成物の投与に関して使用するとき「連続的に」の語は、別個の薬剤組成物の投与が別々の時点で行われることを意味する。「連続的に」の語はまた、１又はそれ以上の薬剤組成物の投与が長期間にわたる継続的な投与であり、もう１つの組成物の投与が長期間のうちの別個の時点で行われる場合の２又はそれ以上の薬剤組成物の投与を含む。
【００１２】
本発明において投与するＰＳＡ複合体は、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドを含む。このオリゴペプチドは、直接又は化学的リンカーを通して細胞傷害性物質に共有結合されうる。理想的には、ＰＳＡタンパク質分解性開裂部位を含むオリゴペプチドが直接又は化学的リンカーを通して細胞傷害性物質に結合しており、無傷であるとき、細胞傷害性物質の細胞傷害活性が大きく低下するか又は活性が存在しない。同じく理想的には、結合しているオリゴペプチドが開裂部位でタンパク質分解性開裂されるとき、細胞傷害性物質の細胞傷害活性が有意に上昇するか又は修飾されていない細胞傷害性物質の活性に回復する。本発明のこの態様を実施するために必要ではないが、本発明のこの態様の好ましい実施形態は、オリゴペプチドと、存在する場合の化学的リンカーが、遊離ＰＳＡ及び近傍組織中に存在する他の天然タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性によって細胞傷害性物質から切り離され、それによってタンパク質分解性開裂の位置で非修飾細胞傷害性物質を生理環境中に放出する複合体である。複合体の薬学的に許容される塩も包含される。
【００１３】
酵素的に活性なＰＳＡによって選択的に開裂されるオリゴペプチドは多くのアッセイによって、特に実施例の中の生物学的検定法に述べられているアッセイによって同定することができる。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、ＰＳＡ複合体のオリゴペプチド成分は、親水性置換基を持つ環状アミノ酸をオリゴペプチドの一部として組み込んでおり、該環状アミノ酸は複合体の水溶性に寄与する。そのような親水性環状アミノ酸の例は、ヒドロキシル化、ポリヒドロキシル化及びアルコキシル化プロリン及びピペコリン酸部分を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、ＰＳＡ複合体のオリゴペプチド成分は、細胞傷害性物質に結合していない末端アミノ酸部分に保護基を持つことを特徴とする。末端アミノ酸のそのような保護は、温血動物の血漿中に存在する外因性アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼの作用によるそのようなペプチジル治療物質の酵素分解を低下させるか若しくは排除する。Ｎ末端オリゴペプチドのアミノ部分に連結することができる保護基の例は、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、スクシニル、グルタリル、ヒドロキシアルカノイル、ポリヒドロキシアルカノイル、アルカノイルを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を含むが、これらに限定されない。Ｃ末端オリゴペプチドのカルボン酸に連結することができる保護基の例は、アルキル、アラルキル、アリール、ポリエーテルエステル、ホスホリル及びスルフリルのようなカルボン酸の有機又は無機エステルの形成、又はカルボン酸部分の置換又は非置換アミド部分への変換を含むが、これらに限定されない。オリゴペプチドのＮ末端及びＣ末端はまた、β−アラニンのような非天然アミノ酸、又はＤ−バリル又はＤ−アラニル基のようなＤ−アミノ酸で置換しうる。
【００１６】
直接共有結合を通して又は化学的リンカーを通して細胞傷害性物質に複合したオリゴペプチドが、遊離ＰＳＡによって最も多く認識され、遊離ＰＳＡによって最も容易にタンパク質分解性開裂されるオリゴペプチドである必要がないことは明白である。それ故、そのような複合体に組み込むために選択されるオリゴペプチドは、遊離ＰＳＡによるその選択的タンパク質分解性開裂及びそのような開裂から生じる細胞傷害性物質−タンパク質分解性残基複合体（又は、理想的と考えられる状況においては、非修飾細胞傷害性物質）の細胞傷害活性の両方について選択される。
【００１７】
本発明の組成物において有用なＰＳＡ複合体は所与の生物学的応答を改変するために使用できるので、ＰＳＡ複合体の細胞傷害性物質成分は古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、細胞傷害性物質は、所望する生物活性を備えたタンパク質又はポリペプチドでありうる。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素、又はジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、ｂ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子のようなタンパク質；又は、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又は他の成長因子のような生物学的応答調節剤を含みうる。
【００１８】
好ましい細胞傷害性物質は、一般に、アルキル化剤、抗増殖性物質、チューブリン結合物質等を含む。細胞傷害性物質の好ましいクラスは、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカ薬剤、タキサン、ミトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ディーネン（ｄｉｙｎｅｎｅｓ）、及びポドフィトロキシンを含む。それらのクラスの特に有用な成員は、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、ミトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、又はエトポシド又はリン酸エトポシドのようなポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、リューロシジン、ビンデシン、リューロシン等を含む。他の有用な細胞傷害性物質は、エストラムスチン、シスプラチン及びシクロホスファミドを含む。当業者は、当該化合物の反応を本発明のＰＳＡ複合体を調製するのにより好都合にするために、所望する細胞傷害性物質に化学修飾を行うことができる。
【００１９】
好ましくはＰＳＡ複合体の細胞傷害性物質成分は、ビンカアルカロイド薬剤及びアントラサイクリンから選択される細胞傷害性物質のクラスの成員から選択される。
【００２０】
本発明の方法において有用であり、上述した特性によって同定されるＰＳＡ複合体は次のものを含む：
ａ）式Ｉ：
【００２１】
【化１】
2004517076.tif 000002
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは存在しないか又は
ａ）フェニルアラニン、
ｂ）ロイシン、
ｃ）バリン、
ｄ）イソロイシン、
ｅ）（２−ナフチル）アラニン、
ｆ）シクロヘキシルアラニン、
ｇ）ジフェニルアラニン、
ｈ）ノルバリン、及び
ｉ）ノルロイシン
から選択されるアミノ酸であり、
Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、
Ｒ１はＣ１〜Ｃ６−アルキル又はアリールである］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｂ）式ＩＩ：
【００２２】
【化２】
2004517076.tif 000003
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは存在しないか又は
ａ）フェニルアラニン、
ｂ）ロイシン、
ｃ）バリン、
ｄ）イソロイシン、
ｅ）（２−ナフチル）アラニン、
ｆ）シクロヘキシルアラニン、
ｇ）ジフェニルアラニン、
ｈ）ノルバリン、及び
ｉ）ノルロイシン
から選択されるアミノ酸であるか、又は
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−であり、
Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１であり、
Ｒ１はＣ１〜Ｃ６−アルキル又はアリールであり、
Ｒ１９は水素又はアセチルであり、
ｎは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｃ）式ＩＩＩ：
【００２３】
【化３】
2004517076.tif 000004
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって選択的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、該オリゴペプチドは式：
【００２４】
【化４】
2004517076.tif 000005
［式中、Ｃ末端カルボニルはドキソルビシンのアミンに共有結合している］
の環状アミノ酸を含み、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【００２５】
【化５】
2004517076.tif 000006
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｒ５はＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ６は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１から１０までの整数であり、
ｔは３又は４である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｄ）式ＩＶ：
【００２６】
【化６】
2004517076.tif 000007
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、該オリゴペプチドは式：
【００２７】
【化７】
2004517076.tif 000008
の環状アミノ酸を含み、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【００２８】
【化８】
2004517076.tif 000009
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｒ５はＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ６は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＨＯ−及びＣ１〜Ｃ６アルコキシから選択され、
Ｒ１９は水素、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯ、又はクロロ置換（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯであり、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｅ）式Ｖ：
【００２９】
【化９】
2004517076.tif 000010
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって選択的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、そのＣ末端カルボニルはドキソルビシンのアミンに共有結合し、Ｎ末端アミンは保護基のカルボニルに共有結合しており、
Ｒは、
【００３０】
【化１０】
2004517076.tif 000011
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｆ）式ＶＩ：
【００３１】
【化１１】
2004517076.tif 000012
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
【００３２】
【化１２】
2004517076.tif 000013
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１９は水素、（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯ、又はクロロ置換（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−ＣＯであり、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２、３、４又は５である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、
ｇ）式ＶＩＩ：
【００３３】
【化１３】
2004517076.tif 000014
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−であり、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【００３４】
【化１４】
2004517076.tif 000015
ｆ）エトキシスクアラート、及び
ｇ）コチニニル
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ポリヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｗはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はビシクロ［２．２．２］オクタニルから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは０、１、２又は３である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び
ｈ）式ＶＩＩＩ：
【００３５】
【化１５】
2004517076.tif 000016
［式中、
オリゴペプチドは、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって特異的に認識され、遊離前立腺特異抗原の酵素活性によってタンパク質分解性開裂されうるオリゴペプチドであり、
ＸＬは、結合、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−Ｏ−及び−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｕ−Ｗ−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ−から選択され、
Ｒは、
ａ）水素、
ｂ）−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１ａ、
【００３６】
【化１６】
2004517076.tif 000017
ｆ）エトキシスクアラート、及び
ｇ）コチニニル
から選択され、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びアリールから独立して選択され、
Ｒ１ａはＣ１〜Ｃ６アルキル、ヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ポリヒドロキシル化Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキル、ヒドロキシル化アリール、ポリヒドロキシル化アリール又はアリールであり、
Ｗは、分枝又は直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はビシクロ［２．２．２］オクタニルから選択され、
ｎは１、２、３又は４であり、
ｐはゼロ又は１から１００までの整数であり、
ｑは、ｐがゼロであればｑが１であることを条件として、０又は１であり、
ｒは１、２又は３であり、
ｔは３又は４であり、
ｕは０、１、２又は３である］
によって表わされる化合物、又は薬学的に許容されるその塩又は光学異性体。
【００３７】
ＰＳＡ複合体である化合物の例には、以下の
【００３８】
【化１７】
2004517076.tif 000018
［式中、Ｘは
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒ−（配列番号１），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒ−（配列番号２），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒ−（配列番号３），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒ−（配列番号４），
ＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕ−（配列番号５），
ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＧｌｕ−（配列番号６），
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒ−（配列番号７）
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＩｌｅＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＬｅｕ−（配列番号８）
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｅｕ−（配列番号９）
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＡｌａＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１０）
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１１）
Ａｃ−ＡｌａＡｓｎＬｙｓＡｌａＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１２），
Ａｃ−ＳｅｒＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１３），
Ａｃ−ｈＡｒｇＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１４），
Ａｃ−ＬｙｓＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕ−（配列番号１５），又は
Ａｃ−ＬｙｓＴｙｒＧｌｎＳｅｒＳｅｒＮｌｅ−（配列番号１６）
である］、
【００３９】
【化１８】
2004517076.tif 000019
【００４０】
【化１９】
2004517076.tif 000020
［式中、Ｘは
【００４１】
【化２０】
2004517076.tif 000021
である］、
【００４２】
【化２１】
2004517076.tif 000022
［式中、Ｘは、
【００４３】
【化２２】
2004517076.tif 000023
2004517076.tif 000024
である］、
【００４４】
【化２３】
2004517076.tif 000025
2004517076.tif 000026
【００４５】
【化２４】
2004517076.tif 000027
2004517076.tif 000028
2004517076.tif 000029
【００４６】
【化２５】
2004517076.tif 000030
［式中、Ｘは
【００４７】
【化２６】
2004517076.tif 000031
2004517076.tif 000032
である］
又は薬学的に許容されるその塩又は光学異性体が含まれる。
【００４８】
好ましくは本発明の方法は、ＰＳＡ複合体：
【００４９】
【化２７】
2004517076.tif 000033
又は薬学的に許容されるその塩を含む。
【００５０】
ＰＳＡ複合体であり、それ故本発明において有用である化合物、及びそれらの合成の方法は、参照により本明細書に組み込まれる、下記の特許、係属中の特許出願及び特許出願公開の中に見出される：
１９９７年２月４日に授与された米国特許第５，５９９，６８６号；
ＷＯ９６／００５０３号（１９９６年１月１１日）；１９９５年３月１５日出願のＵＳＳＮ０８／４０４，８３３号；１９９５年６月６日出願のＵＳＳＮ０８／４６８，１６１号；
１９９９年２月２日に授与された米国特許第５，８６６，６７９号；
ＷＯ９８／１０６５１号（１９９８年３月１９日）；１９９７年９月９日出願のＵＳＳＮ０８／９２６，４１２号；
ＷＯ９８／１８４９３号（１９９８年５月７日）；１９９９年９月７日に授与された米国特許第５，９４８，７５０号；
１９９８年７月９日出願のＵＳＳＮ０９／１１２，６５６号；１９９７年７月１０日出願のＵＳＳＮ６０／０５２，１９５号；
１９９８年１１月１７日出願のＵＳＳＮ０９／１９３，３６５号；１９９７年１２月２日出願のＵＳＳＮ６０／０６７，１１０号。
【００５１】
活性治療物質が酵素活性ＰＳＡの作用によって放出され、それ故本発明において有用と考えられるプロドラッグとして述べられている化合物、及びそれらの合成方法は、参照により本明細書に組み込まれる、下記の特許、係属中の特許出願及び特許出願公開の中に見出される：ＷＯ９８／５２９６６号（１９９８年１１月２６日）。
【００５２】
同定されるすべての特許、特許出願公開及び係属中の特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
式ＩからＶＩＩＩまでの化合物に関しては、次の定義を適用する：
「アルキル」は、指示された数の炭素原子を含む直線状、分枝状及び環状構造、及びそれらの組合せを意味する。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−及びｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、エイコシル、３，７−ジエチル−２，２−ジメチル−４−プロピルノニル、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロドデシルメチル、２−エチル−１−ビシクロ［４．４．０］デシル等を含む。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「アルキル」及びアラルキルのアルキル部分及び同様の語は、規定された数の炭素原子を持つ分枝状及び直鎖状飽和脂肪族炭化水素基を包含することが意図されている；「アルコキシ」は、酸素架橋を通して結合した指示数の炭素原子を持つアルキル基を表わす。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「シクロアルキル」は、規定された数の炭素原子を持つ非芳香族環状炭化水素基を包含することが意図されている。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。
【００５６】
本明細書で使用するとき「ハロゲン」又は「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【００５７】
「フルオロアルキル」は、１個又はそれ以上の水素がフッ素で置換されているアルキル基を意味する。例は、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＦ３、ｃ−Ｐｒ−Ｆ５、ｃ−Ｈｅｘ−Ｆ１１等である。同様に、フルオロアルコキシは、指示された数の炭素原子を持つ直線状、分枝状及び環状構造を意味する。
【００５８】
本明細書に関して「アルコキシ」は、直鎖状、分枝状、又は環状立体配置の指示数の炭素原子を持つアルコキシ基を意味する。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシ等を含む。
【００５９】
「アルキルチオ」は、直鎖状、分枝状又は環状立体配置の指示数の炭素原子を持つアルキルチオ基を意味する。アルキルチオの例は、メチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、シクロヘプチルチオ、等々を含む。例示として、プロピルチオ基は−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３を意味する。
【００６０】
本明細書で使用するとき、「アリール」、及びアラルキルとアロイルのアリール部分は、各々の環に７成員までを持ち、少なくとも１つの環が芳香環である、何らかの安定な単環式又は二環式炭素環を意味することが意図されている。そのようなアリール成分の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロ−ナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリル又はアセナフチルを含む。
【００６１】
特に異なる定義が為されていない限り、ヘテロアリールは、１個又はそれ以上のヘテロ原子を含む芳香族及び部分芳香族基を含む。このタイプの例は、チオフェン、プリン、イミダゾピリジン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、オキサジン、ピラゾール、テトラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン及びトリアジンである。部分芳香族基の例は、下記で定義するような、テトラヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン、フタリジル及びサッカリニルである。
【００６２】
１つの語を２回又はそれ以上使用する状況において、その語の各々の場合の定義は各々の付加使用における定義とは無関係である。
【００６３】
式ＩＶからＸＩまでの化合物に関しては、次の定義を適用する；
ここで使用するとき、「オリゴペプチド」は、好ましくは約５アミノ酸から約１００アミノ酸を含むペプチドである。より好ましくは、「オリゴペプチド」は、約５アミノ酸から約１５アミノ酸を含むペプチドである。
【００６４】
ＰＳＡによる認識及びタンパク質分解性ＰＳＡ開裂に関連して使用するとき「選択的」及び「選択的に」の語は、ランダムな配列のアミノ酸を含むオリゴペプチドの開裂に比べて、遊離ＰＳＡによる本発明のオリゴペプチド成分の開裂はより大きな割合であることを意味する。それ故、本発明のオリゴペプチド成分は遊離ＰＳＡの好ましい基質である。「選択的」及び「選択的に」の語はまた、オリゴペプチドが、遊離ＰＳＡによってオリゴペプチド内の２個の特定アミノ酸の間でタンパク質分解性開裂されることを示す。
【００６５】
本明細書で使用するとき、「ヒドロキシル化」の語は、ヒドロキシル部分による、そのように記述される環系の置換可能な炭素に関する置換を表わす。本明細書で使用するとき、「ポリヒドロキシル化」の語は、２、３又は４個のヒドロキシル部分による、そのように記述される環系の２個又はそれ以上の置換可能な炭素に関する置換を表わす。
【００６６】
本明細書で使用するとき、「クロロ置換Ｃ１〜Ｃ３アルキル−ＣＯ−」の語は、カルボニル部分に結合した指定数の炭素原子を持ち、炭素原子の１個が塩素で置換されているアシル部分を表わす。そのようなクロロ置換成分の例は、クロロアセチル、２−クロロプロピオニル、３−クロロプロピオニル及び２−クロロブチロイルを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用するとき、「ＰＥＧ」の語は、指定された数のエチレンオキシサブユニットを持つ置換基を含む特定のポリエチレングリコールを表わす。従ってＰＥＧ（２）の語は、
【００６８】
【化２８】
2004517076.tif 000034
を表わし、ＰＥＧ（６）の語は、
【００６９】
【化２９】
2004517076.tif 000035
を表わす。
【００７０】
本明細書で使用するとき、「（ｄ）（２，３−ジヒドロキシプロピオニル）」の語は、次の構造：
【００７１】
【化３０】
2004517076.tif 000036
を表わす。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「（２Ｒ，３Ｓ）２，３，４−トリヒドロキシブタノイル」の語は、次の構造：
【００７３】
【化３１】
2004517076.tif 000037
を表わす。
【００７４】
本明細書で使用するとき、「キニル（ｑｕｉｎｙｌ）」の語は、次の構造：
【００７５】
【化３２】
2004517076.tif 000038
又はそのジアステレオマーを表わす。
【００７６】
本明細書で使用するとき、「コチニニル（ｃｏｔｉｎｉｎｙｌ）」の語は、次の構造：
【００７７】
【化３３】
2004517076.tif 000039
又はそのジアステレオマーを表わす。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「ガリル（ｇａｌｌｙｌ）」の語は、次の構造：
【００７９】
【化３４】
2004517076.tif 000040
を表わす。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「４−エトキシスクアラート（ｅｔｈｏｘｙｓｑｕａｒａｔｅ）」の語は、次の構造：
【００８１】
【化３５】
2004517076.tif 000041
を表わす。
【００８２】
構造：
【００８３】
【化３６】
2004517076.tif 000042
は、環内に５又は６成員を持つ環状アミン部分を表わし、そのような環状アミンは任意にフェニル又はシクロヘキシル環に融合しうる。そのような環状アミン部分の例は、次の特定構造：
【００８４】
【化３７】
2004517076.tif 000043
を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
分子内の特定位置の置換基又は変数（例えばＲ１０、Ｚ、ｎ、等々）の定義は、その分子内の他の部分におけるその定義とは無関係であることが意図されている。従って、−Ｎ（Ｒ１０）２は、−ＮＨＨ、−ＮＨＣＨ３、−ＮＨＣ２Ｈ５、等々を表わす。本発明の化合物に関する置換基又は置換パターンは、化学的に安定的であり、当該技術において既知の手法ならびに下記で述べる方法によって容易に合成できる化合物を提供するように当業者によって選択されうることは明白である。
【００８６】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって塩基性部分を含む本発明の化合物から合成することができる。一般に、塩は、適当な溶媒中又は使用可能な溶媒の様々な組み合わせにおいて、化学量論的量の又は過剰の、所望する塩を形成する無機又は有機酸と遊離塩基を反応させることによって調製され、出発物質としてＮａ−Ｚ−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｆｌｕｋａ）が好ましい。
【００８７】
該化合物は様々な薬学的に許容される塩の形態で有用である。「薬学的に許容される塩」の語は、製薬化学者には明白である塩形態、すなわち実質的に非毒性であり、所望する薬物動態特性、嗜好性、吸収、分布、代謝又は排泄を提供するものを指す。選択の際に同様に重要である、本来、より実際的な他の因子は、原材料のコスト、結晶化の容易さ、収率、生じるバルク薬剤の安定性、吸湿性及び流動性である。好都合には、薬学的に許容される担体と組み合わせて有効成分から薬剤組成物を調製することができる。
【００８８】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば非毒性無機又は有機酸から形成されるような本発明の化合物の常套的な非毒性塩を含む。例えば、そのような常套的な非毒性塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等のような無機酸から誘導されるもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ−安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸等のような有機酸から調製される塩を含む。
【００８９】
「薬学的に許容される塩」の語はまた、無機塩基及び有機塩基を含めた薬学的に許容される非毒性塩基から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛塩等を含む。特に好ましいのはアンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウム塩である。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩は、第一、第二及び第三アミン、天然に生じる置換アミンを含めた置換アミン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン、等のような環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂の塩を含む。
【００９０】
本発明は、上述したような少なくとも１つの複合体と少なくとも１つのグルココルチコイドを投与することを含む。グルココルチコイドは炭水化物の代謝に関わるコルチコステロイド物質（薬剤又はホルモン）である。本願において、グルココルチコイドとコルチコステロイドは互換可能で使用されうる。本発明において使用するグルココルチコイドは、当該技術から既知のいかなるグルココルチコイドでもよい。グルココルチコイドの例は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、及びデキサメタゾン等を含むが、これらに限定されない。好ましくは、グルココルチコイドは、１７，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，１１，２０−トリオンとしても知られるプレドニゾンである。プレドニゾンの化学構造は：
【００９１】
【化３８】
2004517076.tif 000044
である。
【００９２】
グルココルチコイド又はコルチコステロイドは通常、腫脹及び／又は痛みを予防し、軽減するために抗炎症薬として処方される。本発明では、癌を治療するためにＰＳＡ複合体と同時に又は連続的に、グルココルチコイドを併用投与する。ＰＳＡ複合体とグルココルチコイドの組合せを用いるこの方法は、癌、特に前立腺癌を治療するために有用であると考えられる。
【００９３】
化学の説明及び下記の実施例において使用する略語は次の通りである：
Ａｃ２Ｏ        無水酢酸；
Ｂｏｃ          ｔ−ブトキシカルボニル；
Ｂｚｌ          ベンジル；
ＤＡＢＣＯ又はＤａｂｃｏ      １，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン；
ＤＢＵ          １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン；
ＤＣＣ          １，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド；
ＤＩＥＡ        ジイソプロピルエチルアミン；
ＤＭＡＰ        ４−ジメチルアミノピリジン；
ＤＭＥ          １，２−ジメトキシエタン；
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド；
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド；
ＤＰＰＡ        ジフェニルホスホリルアジド；
ＥＤＣ          １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド−ハイドロクロライド；
ＨＯＡＣ        酢酸；
ＨＯＢＴ        １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物；
Ｅｔ３Ｎ        トリエチルアミン；
ＥｔＯＡｃ      酢酸エチル；
ＦＡＢ          高速原子衝撃法；
ＨＯＯＢＴ      ３−ヒドロキシ−１，２，２−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン；
ＨＰＬＣ        高速液体クロマトグラフィー；
ＭＣＰＢＡ      ｍ−クロロペルオキシ安息香酸；
ＭＩＢＫ        メチルイソブチルケトン；
ＭｓＣｌ        塩化メタンスルホニル；
ＭＴＢＥ        メチル−ｔ−ブチルエーテル；
ＮａＨＭＤＳ    ビス（トリメチルシリル）アミドナトリウム；
ＮＭＰ          １−メチル−２−ピロリジノン；
Ｐｙ            ピリジン；
ＴＥＡ          トリエタノールアミン；
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸；
ＴＨＦ          テトラヒドロフラン；
ＴＬＣ          薄層クロマトグラフィー。
【００９４】
式Ｉ、ＩＩＩ及びＶのＰＳＡ複合体は、文献において既知であるか又は実験手順において例示されるように、エステル加水分解、保護基の開裂、等々のような他の標準操作に加えて、スキーム１から５に従って合成することができる。
【００９５】
【化３９】
2004517076.tif 000045
【００９６】
【化４０】
2004517076.tif 000046
【００９７】
【化４１】
2004517076.tif 000047
【００９８】
【化４２】
2004517076.tif 000048
【００９９】
【化４３】
2004517076.tif 000049
【０１００】
スキーム６は、オリゴペプチドがビンカアルカロイド細胞傷害性物質、ビンブラスチンと結合している場合の、本発明の治療方法において使用される複合体の調製を示す。オリゴペプチドのＮ末端のビンブラスチンへの連結を例示している（Ｓ．Ｐ．Ｋａｎｄｕｋｕｒｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：１０７９−１０８８（１９８５））。
【０１０１】
スキーム７は、ビンブラスチンの連結がオリゴペプチドのＣ末端である場合の、本発明のオリゴペプチドとビンカアルカロイド細胞傷害性物質、ビンブラスチンの複合体の調製を示す。１，３−ジアミノプロパンリンカーの使用は単なる例示である；ビンブラスチンのカルボニルとオリゴペプチドのＣ末端の間に他のスペーサー単位も想定される。さらに、スキーム７は、Ｃ−４位のヒドロキシ部分をリンカー単位の付加後に再アセチル化する場合の複合体の合成を示す。出願者は、脱アセチルビンブラスチン複合体も本発明の方法において有用であることを発見した。この複合体は、リンカーの第一アミンを保護し、中間体を無水酢酸と反応させて、その後アミンを脱保護するというスキーム７に示す段階を省略することによって調製しうる。他の位置のオリゴペプチドとビンブラスチンの官能基の複合は当業者には容易に実施でき、やはり本発明の治療方法において有用な化合物を提供すると期待される。
【０１０２】
【化４４】
2004517076.tif 000050
2004517076.tif 000051
［式中、Ｒは−ＮＨ２、−Ｏ−アルキル等である］。
【０１０３】
【化４５】
2004517076.tif 000052
2004517076.tif 000053
【０１０４】
式ＩＩＩ及びＶのＰＳＡ複合体は、文献において既知であるか又は実験手順において例示されるように、エステル加水分解、保護基の開裂、等々のような他の標準操作に加えて、スキーム８から１２に従って合成することができる。
【０１０５】
【化４６】
2004517076.tif 000054
［Ｇは親水性Ｎ−末端保護基である］。
【０１０６】
【化４７】
2004517076.tif 000055
【０１０７】
【化４８】
2004517076.tif 000056
［Ｇ’は親水性Ｃ−末端部分である］。
【０１０８】
【化４９】
2004517076.tif 000057
【０１０９】
【化５０】
2004517076.tif 000058
【０１１０】
スキーム１３は、ビンブラスチンの連結がオリゴペプチドのＣ末端である場合の式ＶＩのＰＳＡ複合体の調製を示す。さらに、スキーム１３は、Ｃ−４位のヒドロキシ部分をリンカー単位の付加後に再アセチル化する場合の複合体の合成を示す。出願者は、脱アセチルビンブラスチン複合体も有効であり、リンカーの第一アミンを保護し、中間体を無水酢酸と反応させて、その後アミンを脱保護するというスキーム１３に示す段階を省略することによって調製しうることを発見した。他の位置のオリゴペプチドとビンブラスチンの官能基の複合は当業者には容易に実施でき、やはり前立腺癌の治療において有用な化合物を提供すると期待される。
【０１１１】
【化５１】
2004517076.tif 000059
2004517076.tif 000060
【０１１２】
式ＶＩＩのＰＳＡ複合体は、文献において既知であるか又は実験手順において例示されるように、エステル加水分解、保護基の開裂、等々のような他の標準操作に加えて、スキーム１４から１５に従って合成することができる。
【０１１３】
反応スキーム１４は、４−デアセチルビンブラスチンの酸素の結合がオリゴペプチドのＣ末端である場合の、本発明のオリゴペプチドとビンカアルカロイド細胞傷害性物質、ビンブラスチンの複合体の調製を示す。反応の他の配列はそのような複合体を形成する上で有用であると考えられるが、最初に４−酸素に１個のアミノ酸を結合し、その後残りのオリゴペプチド配列をそのアミノ酸に結合するのが好ましい方法であることが見出された。また、最終カップリング段階でＨＯＡｔの代わりに３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤＨＢＴ）を使用しうることが見出された。
【０１１４】
反応スキーム１５は、ヒドロキシアルカノリル酸をビンカ薬剤とオリゴペプチド間のリンカーとして使用する場合の本発明のオリゴペプチドの複合体の調製を示す。
【０１１５】
【化５２】
2004517076.tif 000061
2004517076.tif 000062
【０１１６】
【化５３】
2004517076.tif 000063
2004517076.tif 000064
【０１１７】
本明細書で使用するとき、「組成物」の語は、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接又は間接的に生じる何らかの生成物を包含することが意図されている。
【０１１８】
本発明の治療のために有用な薬剤組成物は、標準的な製薬慣例により、好ましくは薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせて、１又はそれ以上のグルココルチコイド、１又はそれ以上のＰＳＡ複合体、又はそれらの組合せを含みうる。該組成物は哺乳類、好ましくはヒトに投与しうる。該組成物は、経口的に又は静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与経路を含めて非経口的に投与することができる。
【０１１９】
ＰＳＡ複合体とグルココルチコイドを同時に投与することを所望する場合には、両方の物質を含有する薬剤組成物が好ましい。そのような本発明の薬剤組成物は、１又はそれ以上のグルココルチコイドと１又はそれ以上のＰＳＡ複合体を組み合わせて含有しうる。また好ましくは、標準製薬慣例により、これらの物質を薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせる。該組成物は哺乳類、好ましくはヒトに投与しうる。該組成物は、経口、非経口（例えば筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下注射、又は移植）、鼻、膣、直腸、舌下、又は局所投与経路によって投与することができ、各々の投与経路に適した投薬形態に製剤化することができる。
【０１２０】
好ましくは本発明による組成物は、経口、非経口又は直腸投与、吸入又はガス注入、あるいは経皮パッチ又は口腔吸収ウエハースによる投与のための錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液又は懸濁液、あるいは坐薬のような単位投与形態である。
【０１２１】
錠剤のような固形組成物を調製するためには、本発明の化合物又はその非毒性の薬学的に許容される塩の均一な混合物を含有する固形予備製剤組成物を形成するために、主要有効成分を製薬担体、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム又はガムのような従来の錠剤成形成分、及び他の製薬希釈剤、例えば水と混合する。これらの予備製剤組成物を均一と称するとき、組成物が錠剤、丸薬及びカプセルのような等しく有効な単位投与形態に容易に細分されるように、有効成分が組成物全体に均一に分散していることを意味する。この固形予備製剤組成物をその後、本発明の有効成分を０．１ｍｇから約５００ｍｇ含有する上述したタイプの単位投与形態に細分する。かかる新規組成物の錠剤又は丸薬は、持続作用の利点をもたらす投与形態を提供するために被覆するか又はさもなければ配合することができる。例えば、錠剤又は丸薬は内部投与成分と外部投与成分を含むことができ、後者は前者のエンベロープ（外被）の形態である。この２つの成分は、胃の中での崩壊に抗する働きをし、内部成分を十二指腸内へと無傷で通過させる又は内部成分の放出を遅延させる腸溶層によって分離することができる。そのような腸溶層又は剤皮（コーティング）のために、多くの高分子酸ならびにセラック、セチルアルコール及び酢酸セルロースのような物質と高分子酸の混合物を含めて、様々な材料が使用できる。
【０１２２】
本発明の新規組成物を経口又は注入による投与のために組み込むことができる液体形態は、水溶液、適切に香味付けしたシロップ、水性又は油性懸濁液、及び綿実油、ゴマ油、ヤシ油、落花生油又はダイズ油のような食用油を含む香味付けした乳剤、ならびにエリキシル及び同様の製薬賦形剤を含む。水性懸濁液のための適当な分散剤又は懸濁化剤（沈殿防止剤）は、トラガカント、アカシア、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニル−ピロリドン又はゼラチンのような合成及び天然ガムを含む。
【０１２３】
注射による投与のための好ましい組成物は、界面活性剤（又は湿潤剤又はサーファクタント）と共に又は乳剤の形態で（油中水型又は水中油型乳剤として）、グルココルチコイドとＰＳＡ複合体を有効成分として含有するものを含む。
【０１２４】
適当な界面活性剤は、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０又は８５）及び他のソルビタン（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０又は８５）のような非イオン性界面活性剤を含む。界面活性剤を含む組成物は、好都合には０．０５％から５％の界面活性剤、好ましくは０．１％から２．５％の界面活性剤を含有する。必要に応じて、他の成分、例えばマンニトール又は他の薬学的に許容される賦形剤を添加しうることは理解されるであろう。
【０１２５】
適当な乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）及びＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）のような市販の脂肪乳剤を用いて調製しうる。有効成分は、予備混合した乳剤組成物に溶解するか、又はその代わりに油（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油又はアーモンド油）に溶解して、リン脂質（例えば卵リン脂質、ダイズリン脂質又はダイズレシチン）及び水と混合して乳剤を形成することができる。乳剤の張度を調節するために他の成分、例えばグリセロール又はグルコースを加えうることは理解されるであろう。適当な乳剤は、典型的には２０％まで、例えば５％から２０％の油を含む。脂肪乳剤は、好ましくは０．１から１．０μｍ、特に０．１から０．５μｍの脂肪小滴を含み、５．５から８．０の範囲内のｐＨを持つ。
【０１２６】
吸入又はガス注入のための組成物は、薬学的に許容される水性又は有機溶媒中の溶液及び懸濁液、又はそれらの混合物、及び粉末を含む。液体又は固体組成物は、上述したような適当な薬学的に許容される賦形剤を含みうる。好ましくは、組成物は局所又は全身作用のために経口又は鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物を、不活性ガスを使用して霧状にすることができる。霧状にした溶液を噴霧器から直接吸い込むか、又は噴霧器をフェースマスク、テント又は間欠的陽圧呼吸器に接続することができる。溶液、懸濁液又は粉末組成物は、製剤を適切に供給送達する装置から、好ましくは経口的又は経鼻的に投与しうる。
【０１２７】
本発明の組成物はまた、従来の技術を用いて経皮パッチの形態での投与用に製剤しうる。組成物はまた、例えば吸収ウエハースを用いて口腔経路でも投与しうる。
【０１２８】
経口投与用の錠剤、丸薬、カプセル又はウエハースの形態の組成物が特に好ましい。
【０１２９】
有効成分を含有する薬剤組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、硬又は軟カプセル、あるいはシロップ又はエリキシルのような、経口使用に適した形態でありうる。経口用の組成物は、薬剤組成物の製造のための当該技術で既知の何らかの方法により調製でき、そのような組成物は、製薬上洗練された美味な製剤を提供するために、甘味料、香味料、着色剤及び保存剤から成る群より選択される１又はそれ以上の物質を含みうる。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として有効成分を含む。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤、例えば微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、ポリビニル−ピロリドン又はアカシア、及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石でありうる。錠剤は被覆されていなくてもよく、あるいは薬剤の不快な味を隠すため又は胃腸管での崩壊と吸収を遅延させ、それによって長期間にわたる持続作用を提供するために既知の手法によって被覆されていてもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性の味覚隠蔽物質、あるいはエチルセルロース、酢酸酪酸セルロースのような時間遅延物質が使用できる。
【０１３０】
経口用の製剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は有効成分がポリエチレングリコールのような水溶性担体又は油性媒体、例えば落花生油、流動パラフィン又はオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供されうる。
【０１３１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として有効成分を含む。そのような賦形剤は、懸濁化剤（沈殿防止剤）、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガム及びアカシアゴムである；分散剤又は湿潤剤は、天然に生じるホスファチド、例えばレシチン、又は脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は長鎖脂肪アルコールとエチレンオキシドの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、又は脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。水性懸濁液はまた、１又はそれ以上の保存剤、例えばエチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１又はそれ以上の着色剤、１又はそれ以上の香味料、及びスクロース、サッカリン又はアスパルテームのような１又はそれ以上の甘味料を含みうる。
【０１３２】
油性懸濁液は、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油、あるいは流動パラフィンのような鉱油に有効成分を懸濁することによって製剤しうる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含みうる。上述したような甘味料及び香味料は、美味な経口製剤を提供するために添加しうる。これらの組成物は、ブチル化ヒドロキシアニソール又はα−トコフェロールのような抗酸化剤を添加することによって保存しうる。
【０１３３】
水を加えて水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁化剤（沈殿防止剤）及び１又はそれ以上の保存剤との混合物として有効成分を提供する。適当な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤（沈殿防止剤）は既に上述したものによって例示される。付加的な賦形剤、例えば甘味料、香味料及び着色剤も存在しうる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を添加することによって保存しうる。
【０１３４】
本発明の治療方法において有用な薬剤組成物はまた、水中油型乳剤の形態をとりうる。油相は、植物油、例えばオリーブ油又は落花生油、あるいは鉱油、例えば流動パラフィン、あるいはこれらの混合物でありうる。適当な乳化剤は、天然に生じるホスファチド、例えばダイズレシチン、及び脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及び該部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。乳剤はまた、甘味料、香味料、保存剤及び抗酸化剤を含みうる。
【０１３５】
シロップ及びエリキシルは、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に製剤できる。そのような製剤はまた、緩和剤、保存剤、香味料、着色剤及び抗酸化剤を含みうる。
【０１３６】
薬剤組成物は無菌注射用水溶液の形態をとりうる。使用しうる許容される賦形剤及び溶媒の中でも特に、リンガー液及び等張食塩水が挙げられる。
【０１３７】
無菌注射用製剤はまた、有効成分が油相に溶けている無菌注射用水中油型ミクロ乳剤でありうる。例えば、有効成分を最初にダイズ油とレシチンの混合物に溶解する。次に水とグリセロールの混合物に油性溶液を導入し、ミクロ乳剤を形成するように処理する。
【０１３８】
注射用溶液又はミクロ乳剤は、局所ボーラス注射によって患者の血流中に導入しうる。その代わりに、本発明の化合物の一定の循環濃度を維持するように溶液又はミクロ乳剤を投与することも有益であると考えられる。そのような一定濃度を維持するために、持続的静脈内送達装置が利用できる。そのような装置の一例はＤｅｌｔｅｃ  ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）５４００型静脈内ポンプである。
【０１３９】
薬剤組成物は、筋肉内及び皮下投与のための無菌注射用水性又は油性懸濁液の形態でありうる。この懸濁液は、上記に挙げた適当な分散又は湿潤剤と懸濁化剤（沈殿防止剤）を使用して既知の技術により製剤しうる。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液でありうる。さらに、無菌固定油（不揮発性油）は溶媒又は懸濁媒体として好都合に使用される。このためには、合成モノ−又はジグリセリドを含めてどのような無刺激性固定油も使用しうる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸も注射用製剤の調製において有用である。
【０１４０】
本発明の組成物はまた、薬剤の直腸投与のための坐薬の形態でも投与しうる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸内で溶けて組成物を放出する、適当な非刺激性賦形剤と本発明の組成物を混合することによって調製できる。そのような物質は、ココアバター、グリセリン化ゼラチン、硬化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルを含む。
【０１４１】
局所用には、グルココルチコイドとＰＳＡ複合体の組合せを含むクリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液、等々が使用される（この適用に関して、局所適用は口腔洗浄液及びうがい薬を含むものとする。）。
【０１４２】
本発明において有用な組成物は、適当な鼻内賦形剤及び送達装置の局所使用を通して、あるいは当業者に周知の経皮パッチの形態を用いて経皮経路によって、経鼻投与形態で投与することができる。経皮的送達システムの形態で投与するためには、薬剤投与は、言うまでもなく、投与レジメン全体を通じて間欠的であるよりはむしろ継続的である。
【０１４３】
本発明の治療方法において有用なグルココルチコイド、ＰＳＡ複合体、又はそれらの組合せの組成物はまた、治療される状態に対する個々の有用性によって選択される他の周知の治療薬と併用投与しうる。
【０１４４】
本発明の治療方法はまた、適切な場合には外科的治療（腫瘍及び／又は前立腺組織の外科的切除のような）と併用しうる。
【０１４５】
固定用量として製剤する場合、本発明において有用な組成物は、下記に述べる用量範囲内のグルココルチコイドとＰＳＡ複合体を使用する。
【０１４６】
本発明による組成物をヒト被験者に投与するとき、一日量は通常処方する医師によって決定され、用量は一般に個々の患者の年齢、体重及び応答、ならびに患者の症状の重症度に応じて異なる。
【０１４７】
本発明の組成物中の有効成分の用量は、しかしながら、変化させることができ、有効成分の量は適当な投与形態が得られるような量であることが必要である。有効成分は、至適薬剤効果を提供する用量で、そのような治療を必要とする患者（動物及びヒト）に投与しうる。選択する用量は、所望する治療効果、投与経路、及び治療期間に依存する。用量は、疾患又は障害の性質と重症度、患者の体重、そのときに患者が摂取している特殊な治療食、併用薬剤、化合物の固有の活性、化合物の経口投与時のバイオアベイラビリティー及び当業者が認識する他の因子に依存して患者ごとに異なる。
【０１４８】
患者において癌を治療する際に使用するために必要な本発明の組成物の量は、選択する個々の化合物又は組成物によってのみならず、投与経路、治療する状態の性質、患者の年齢と状態によっても異なり、最終的には患者の医師又は薬剤師の判断であることを理解されたい。本発明の組成物を投与する期間の長さは個体ベースで異なる。
【０１４９】
ここでの治療への言及は、言及される疾患／障害及び症状の予防ならびに治療に及ぶことは当業者に理解されるであろう。特定患者における慢性非細菌性前立腺炎又は慢性前立腺炎様症候群の特定診断は困難なことがあるので、患者は本発明による当該化合物の予防的投与から利益を受けると考えられる。
【０１５０】
グルココルチコイドについての最小用量レベルは一般に約０．５ｍｇ／日、好ましくは約５ｍｇ／日、特に約１０ｍｇ／日である。グルココルチコイドについての最大用量レベルは一般に約１５００ｍｇ／日、好ましくは約１０００ｍｇ／日、特に約５００ｍｇ／日である。好ましくは、プレドニゾンを使用し、その好ましい用量レベルは約１０ｍｇ／日である。ＰＳＡ複合体の投与は、約１０ｍｇ／ｍ２体表面積から約４ｇ／ｍ２体表面積／日、好ましくは約５０ｍｇ／ｍ２体表面積から約３ｇ／ｍ２体表面積／日の量で行う。
【０１５１】
１つの例示的適用では、適当な量のグルココルチコイドと適当な量のＰＳＡ複合体を、前立腺癌のための治療を受ける哺乳類に投与する。約０．０１ｍｇから約１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日のグルココルチコイドの量で行う投与が上記の状態の治療において有用であり、又は代替的には約０．５ｍｇから約７ｇ／患者／日である。ＰＳＡ複合体の投与は、約１０ｍｇ／ｍ２体表面積から約５ｇ／ｍ２体表面積／日、好ましくは約５０ｍｇ／ｍ２体表面積から約３ｇ／ｍ２体表面積／日の量で行う。
【０１５２】
（実施例）
実施例はさらなる説明のためにのみ提供するものであり、開示する発明への限定を意図するものではない。
【０１５３】
当該工程に関する出発物質と試薬は、市販されているか又は文献において公知である、又は類似化合物について記述されている文献の方法により調製しうる。反応及び生じる反応生成物の精製を実施するのに必要な技術は当業者には公知である。精製手順は結晶化、蒸留、順相又は逆相クロマトグラフィーを含む。
【実施例１】
【０１５４】
［Ｎ−Ａｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの調製
【０１５５】
【化５４】
2004517076.tif 000065
【０１５６】
ステップＡ：［Ｎ−Ａｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ（Ｂｚｌ））］−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂（１−１）
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６７ｇ）から出発して、４３０Å  ＡＢＩペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸を使用した：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｃｈｇ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｎ−Ｂｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ（Ｂｚｌ））。メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢＴの活性化を使用してカップリングを実施した。Ｎ末端アセチル基の導入のために酢酸を使用した。塩化メチレン中５０％ＴＦＡを用いてＢｏｃ基を除去し、ＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中和した。合成が完了した時点でペプチド樹脂を乾燥し、中間体１−１を得た。
【０１５７】
ステップＢ：［Ｎ−Ａｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１−２）
保護されたペプチド樹脂（１−１）、１．２ｇをアニソール（２ｍｌ）の存在下に０℃で１時間、ＨＦ（２０ｍｌ）で処理した。ＨＦを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）で抽出した。ろ液を凍結乾燥して中間体１−２を得た。
【０１５８】
ステップＣ：［Ｎ−Ａｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
上述した中間体（１−２）、１．１５７ｇ（１．４５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（３０ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ（３０ｍｌ）で希釈した。溶液に塩酸ドキソルビシン５１６ｍｇ（０．８９ｍｍｏｌ）、次いでジイソプロピルエチルアミン（１．７８ｍｍｏｌ）０．３１０ｍｌを加えた。攪拌した溶液を冷却し（０℃）、ジフェニルホスホリルアジド（１．２８ｍｍｏｌ）０．２７６ｍｌを加えた。３０分後、さらに０．２７６ｍｌ（１．２８ｍｍｏｌ）のＤＰＰＡを加え、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）でｐＨを〜７．５（ｐＨ紙）に調整した。冷却した反応物（０℃）のｐＨを、その後３時間ＤＩＥＡで〜７．５に保持し、反応物を０−４℃で一晩攪拌した。１８時間後、反応物（分析用ＨＰＬＣ、システムＡによって完了と認められた）を油に濃縮した。分取ＨＰＬＣ、緩衝液Ａ＝０．１％ＮＨ４ＯＡｃ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝ＣＨ３ＣＮによって粗生成物の精製を行った。粗生成物を１００％Ａ緩衝液４００ｍｌに溶解し、ろ過して、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ，１５μＭ、１００Å）で精製した。１００％Ａから６０％Ａまでの階段勾配を７５ｍｌ／分（ＵＶ＝２１４ｎｍ）の流速で使用した。均質な生成物分画（ＨＰＬＣ、システムＡによって評価した）をプールし、凍結乾燥した。生成物をＨ２Ｏ（３００ｍｌ）に溶解し、ろ過して、凍結乾燥し、精製表題化合物を得た。
【０１５９】
物理的性質
ステップＣの生成物の物理／化学的性質を下記に示す：
【０１６０】
【表１】
2004517076.tif 000066
【実施例２】
【０１６１】
［Ｎ−グルタリル−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ（化合物Ｂ）の調製
【０１６２】
【化５５】
2004517076.tif 000067
【０１６３】
ステップＡ：［Ｎ−グルタリル（ＯＦｍ）−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６７ｇ）から出発して、４３０Å  ＡＢＩペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）。メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢＴの活性化を使用してカップリングを実施した。Ｎ末端グルタリル基の導入のために中間体であるグルタル酸のモノフルオレニルメチルエステル［グルタリル（ＯＦｍ）］を使用した。２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した。塩化メチレン中５０％ＴＦＡで酸感受性保護基、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ及びｔＢｕを除去した。ＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中和した。合成が完了した時点でペプチド樹脂を乾燥して、表題化合物を得た。
【０１６４】
ステップＢ：［Ｎ−グルタリル（ＯＦｍ）−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ
ステップＡからの保護されたペプチド樹脂、１．２ｇをアニソール（２ｍｌ）の存在下に０℃で１時間、ＨＦ（２０ｍｌ）で処理した。ＨＦを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して、ＤＭＦで抽出した。ＤＭＦろ液（７５ｍｌ）を濃縮乾燥し、Ｈ２Ｏで粉砕した。不溶性産物をろ過し、乾燥して、表題化合物を得た。
【０１６５】
ステップＣ：［Ｎ−グルタリル（ＯＦｍ）−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
上記のステップＢから調製した中間体（１．３３ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍｌ）及びＤＭＦ（６９ｍｌ）に溶解した。溶液に塩酸ドキソルビシン５９９ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）、次いでジイソプロピルエチルアミン（２．１６ｍｍｏｌ）３７６μｌを加えた。攪拌した溶液を冷却し（０℃）、ジフェニルホスホリルアジド（１．５ｍｍｏｌ）３２４μｌを加えた。３０分後、さらに３２４μｌのＤＰＰＡを加え、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）でｐＨを〜７．５（ｐＨ紙）に調整した。冷却した反応物（０℃）のｐＨを、その後３時間ＤＩＥＡで〜７．５に保持し、反応物を０−４℃で一晩攪拌した。１８時間後、反応物（分析用ＨＰＬＣ、システムＡによって完了と認められた）を濃縮して、表題化合物を油として得た。
【０１６６】
ステップＤ：［Ｎ−グルタリル−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
上記のステップＣからの生成物をＤＭＦ（５４ｍｌ）に溶解し、冷却して（０℃）、ピペリジン１４ｍｌを加えた。溶液を濃縮乾燥し、分取ＨＰＬＣによって精製した。（Ａ＝０．１％ＮＨ４ＯＡｃ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ。）粗生成物を８０％Ａ緩衝液１００ｍｌに溶解し、ろ過して、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ，１５μＭ、１００Å）で精製した。８０％Ａから６７％Ａまでの階段勾配を７５ｍｌ／分（ｕｖ＝２１４ｎｍ）の流速で使用した。均質な生成物分画（ＨＰＬＣ、システムＡによって評価した）をプールし、凍結乾燥した。生成物を上記のＨＰＬＣカラムを用いてさらに精製した。緩衝液Ａ＝１５％酢酸−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝１５％酢酸−メタノール。生成物を２０％Ｂ／８０％Ａ緩衝液１００ｍｌに溶解し、精製した。２０％Ｂから８０％Ｂまでの階段勾配を７５ｍｌ／分（ｕｖ＝２６０ｎｍ）の流速で使用した。均質な生成物分画（ＨＰＬＣ、システムＡによって評価した）をプールし、濃縮して、Ｈ２Ｏから凍結乾燥して精製表題化合物を得た。
【０１６７】
【表２】
2004517076.tif 000068
【実施例３】
【０１６８】
（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）］−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘの調製
【０１６９】
【化５６】
2004517076.tif 000069
【０１７０】
ステップＡ：Ｆｍｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ（Ｂｚｌ））−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６７ｇ）から出発して、４３０Ａ  ＡＢＩペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸を使用した：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｃｈｇ、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｎ−Ｂｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ（Ｂｚｌ））。メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢＴの活性化を使用してカップリングを実施した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｆｍｏｃのスクシナミジルエステル）をＮ末端保護基の導入のために使用した。塩化メチレン中５０％ＴＦＡを用いてＢｏｃ基を除去し、ＴＦＡ塩をジイソプロピルエチルアミンで中和した。合成が完了した時点でペプチド樹脂を乾燥して、表題の中間体を得た。
【０１７１】
ステップＢ：Ｆｍｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ
ステップＡからの保護されたペプチド樹脂、１．１ｇをアニソール（２ｍｌ）の存在下に０℃で１時間、ＨＦ（２０ｍｌ）で処理した。ＨＦを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して、Ｈ２Ｏ（２００ｍｌ）で抽出した。ろ液を濃縮乾燥して、表題の中間体を得た。
【０１７２】
ステップＣ：Ｆｍｏｃ−（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
ステップＢからの中間体、０．２７４ｇをＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ（１０ｍｌ）で希釈した。溶液に塩酸ドキソルビシン１０４ｍｇ、次いでジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）６２μＬを加えた。攪拌した溶液を冷却し（０℃）、ジフェニルホスホリルアジド５６μｌを加えた。３０分後、さらに５６μｌのＤＰＰＡを加え、ＤＩＥＡでｐＨを〜７．５（ｐＨ紙）に調整した。冷却した反応物（０℃）のｐＨをＤＩＥＡで〜７．５に保持した。４時間後、反応物（分析用ＨＰＬＣ、システムＡによって完了と認められた）を油に濃縮した。ＨＰＬＣ条件、システムＡ。
【０１７３】
ステップＤ：（４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｄｏｘ
上記のステップＣからの生成物をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、冷却して（０℃）、ピペリジン４ｍｌを加えた。溶液を濃縮乾燥し、分取ＨＰＬＣによって精製した。（Ａ＝０．１％ＮＨ４ＯＡｃ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ。）粗生成物を９０％Ａ緩衝液１００ｍｌに溶解し、ろ過して、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣラジアル圧縮カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ，１５μ、１００Å）で精製した。９０％Ａから６５％Ａまでの階段勾配を７５ｍｌ／分（ｕｖ＝２１４ｎｍ）の流速で使用した。均質な生成物分画（ＨＰＬＣ、システムＡによって評価した）をプールし、凍結乾燥した。
【０１７４】
【表３】
2004517076.tif 000070
【実施例４】
【０１７５】
ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−４−Ｏ−（Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）エステル
ステップＡ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチンの調製
硫酸ビンブラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｖ−１３７７）の試料２．４０ｇ（２．６３ｍｍｏｌ）をＮ２下に無水メタノール１３５ｍｌに溶解し、無水ヒドラジン４５ｍｌで処理して、溶液を２０℃から２５℃で１８時間攪拌した。反応物を蒸発させて濃厚なペーストにし、それをＣＨ２Ｃｌ２３００ｍｌと飽和ＮａＨＣＯ３１５０ｍｌに分配した。水層を１００ｍｌずつのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗い、３つのＣＨ２Ｃｌ２層の各々を順次、各々１００ｍｌのＨ２Ｏ（２Ｘ）と飽和ＮａＣｌ（１Ｘ）で洗った。混合有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で溶媒を除去して、表題化合物をオフホワイト色の結晶性固体として得た。この物質を使用時まで−２０℃で保存した。
【０１７６】
ステップＢ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン４−Ｏ−（プロリル）エステルの調製
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチンの試料８０４ｍｇ（１．０４７ｍｍｏｌ）を窒素下にＣＨ２Ｃｌ２３ｍｌと無水ピリジン１８ｍｌに溶解し、Ｆｍｏｃ−プロリン酸塩化物（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｌ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）１．３９ｇで処理して、混合物を２５℃で２０時間攪拌した。ＨＰＬＣによる分析で反応していない出発物質ｄｅｓ−アセチルビンブラスチンの存在が明らかになったときには、新たに０．５０ｇのＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｌを加えて、反応が完了するまでさらに２０時間攪拌した。水（約３ｍｌ）を加えて過剰の酸塩化物を反応させ、次に溶液を蒸発乾燥して、ＥｔＯＡｃ３００ｍｌと飽和ＮａＨＣＯ３１５０ｍｌに分配し、その後飽和ＮａＣｌで２回洗った。乾燥後（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で溶媒を除去して橙褐色の残留物を得、それにＤＭＦ３０ｍｌとピペリジン１４ｍｌを加えて、５分後に減圧下で溶液を蒸発させて橙黄色の半個体残留物を得た。真空中で約１時間乾燥したあと、Ｈ２Ｏ約２００ｍｌとエーテル１００ｍｌをこの物質に加え、次いで振とうしながら氷状ＨＯＡｃを滴下して加えて、完全な溶解が起こり、水層が４．５−５．０の安定なｐＨ（湿らせた４−６の範囲のｐＨ紙）に達するまで音波破砕した。次に水相をエーテル１００ｍｌで１回洗い、各々のエーテル層を順次Ｈ２Ｏ５０ｍｌで洗った。混合水層をＷａｔｅｒｓ  Ｃ４  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Ａ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→７０％Ａ／７０分で２つの部分に分けて分取ＨＰＬＣに供した。プールした分画を濃縮し、凍結乾燥して、表題化合物を得た。
【０１７７】
ステップＣ：Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＷＡＮＧ樹脂
０．８２ｍｍｏｌ／ｇで充填したＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＷＡＮＧ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６１ｇ）から出発して、Ｆｍｏｃ／ｔ−ブチルベースの合成に適合させたＡＢＩモデル４３０Ａペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、２倍過剰（１．０ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−ＯＨ；及び酢酸（ダブルカップリング）を使用した。各々のカップリングサイクルの間に、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ保護基を除去し、次いでＮＭＰで洗った。ＮＭＰ中のＤＣＣとＨＯＢｔの活性化を使用してカップリングを実施した。合成が完了した時点でペプチド樹脂を乾燥して、表題化合物を得た。
【０１７８】
ステップＤ：Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ
上記のペプチド樹脂０．５ｍｍｏｌでの１回の生成物をＴＦＡ２５ｍｌに懸濁し、次いでＨ２Ｏとトリイソプロピルシラン各々０．６２５ｍｌを加えて、２５℃で２．０時間攪拌した。開裂混合物をろ過し、固体をＴＦＡで洗って、溶媒を減圧下でろ液から回収し、残留物をエーテルで粉砕して淡黄色の固体を得、それをろ過して分離し、真空中で乾燥して表題の化合物を得た。
【０１７９】
【表４】
2004517076.tif 000071
【０１８０】
ステップＥ：ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−４−Ｏ−（Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）エステル
ステップＤで上述したように調製したペプチドの試料５２２ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）と上記のように調製したステップＢからの４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン４−Ｏ−（プロリル）エステル５５５ｍｇ（約０．６ｍｍｏｌ）をＮ２下でＤＭＦ１７ｍｌに溶解した。次に１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）１６３ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）を加え、２，４，６−コリジンでｐＨを６．５−７に調整して（湿らせた５−１０範囲のｐＨ紙）、その後０℃に冷却し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）１５５ｍｇ（０．８１ｍｍｏｌ）を加えた。２，４，６−コリジンを定期的に加えてｐＨを６．５−７に維持しながら、分析用ＨＰＬＣ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）によってモニターしてカップリングが完了するまで、０℃から５℃で攪拌を続けた。１２時間後、Ｈ２Ｏ〜４ｍｌを加えて反応を終了させ、１時間攪拌した後、真空中で小容量に濃縮し、５％ＨＯＡｃ約１５０ｍｌに溶解して、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Å（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→６５％Ａ／７０分）で２つの部分に分けて分取ＨＰＬＣに供した。両方の工程から後半に溶出した生成物を含む均質な分画（ＨＰＬＣ、システムＡ、９５→６５％Ａ／３０分によって評価した）をプールし、〜５０ｍｌの容量に濃縮して、約４０ｍｌのＡＧ４Ｘ４イオン交換樹脂（アセテートサイクル）に通し、その後凍結乾燥して、表題化合物を凍結乾燥粉末として得た。
【０１８１】
高分解能ＥＳ／ＦＴ−ＭＳ：１６３７．０。
【実施例５】
【０１８２】
ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−４−Ｏ−（Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）エステルアセテート
実施例４、ステップＢで述べたように調製した４−Ｏ−（プロリル）ｄｅｓ−アセチルビンブラスチンＴＦＡ塩の試料４．５０ｇ（３．７ｍｍｏｌ）をＮ２下でＤＭＦ３００ｍｌに溶解し、溶液を０℃に冷却した。次に３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＯＤＨＢＴ）１．７２ｇ（１０．５ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）でｐＨを７．０に調整して（湿らせた５−１０範囲のｐＨ紙）、その後実施例４、ステップＤのＮ−アセチル−ヘプタペプチド４．９５ｇ（５．２３ｍｍｏｌ）を、各々の添加分が完全に溶解するように少しずつ加えた。ｐＨをＮＭＭで再び７．０に調整し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）１．８８ｇ（９．８ｍｍｏｌ）を加えて、その後ＮＭＭを定期的に加えてｐＨを約７に維持しながら、分析用ＨＰＬＣ（システムＡ）によってモニターしてカップリングが完了するまで、０℃から５℃で溶液の攪拌を続けた。分析は、表題化合物のＤ−Ｓｅｒ異性体と同定された少量成分（約１０％）が２６．１分の保持時間、それに続いて主要成分が２６．３分の保持時間であることを示した。２０時間後、Ｈ２Ｏ３０ｍｌを加えて反応を終了させ、１時間攪拌した後、真空中で小容量に濃縮し、２０％ＨＯＡｃ約５００ｍｌに溶解して、８０ｍｌ／分の流速のＷａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Ａ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出８５→６５％Ａ／９０分）で１２の部分に分けて分取ＨＰＬＣに供した。
【０１８３】
操作全体の約４分の１に相当する均質な分画（ＨＰＬＣ、システムＣによって評価した）をプールし、〜１５０ｍｌの容量に濃縮して、約２００ｍｌのＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ４Ｘ４イオン交換樹脂（アセテートサイクル）に通し、その後溶出物を凍結乾燥して、表題化合物の酢酸塩を凍結乾燥粉末として得た：保持時間（システムＡ）２６．７分、純度９８．９％；高分解能ＥＳ／ＦＴ−ＭＳｍ／ｅ：１６３６．８２；アミノ酸組成分析２０時間、１００℃、６Ｎ  ＨＣｌ（理論／実測）、Ｓｅｒ４／３．９１（補正済）、Ｇｌｕ１／０．９２（ＧｌｎをＧｌｕに変換）、Ｃｈｇ１／１．１１、Ｈｙｐ１／１．０７、Ｐｒｏ１／０．９９、ペプチド含量０．５１６ｍｍｏｌ／ｍｇ。
【０１８４】
均質分画と該分画からの精製、約５００ｍｌのイオン交換樹脂を通す上記のようなプロセシングのさらなる組合せにより、さらなる量の表題化合物を得た。
【０１８５】
【表５】
2004517076.tif 000072
【実施例６】
【０１８６】
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（４’−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタン）メチルアミド（ＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチン）の調製
ステップＡ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−ヒドラジドの調製
硫酸ビンブラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｖ−１３７７）の試料３．９９ｇ（４．３８ｍｍｏｌ）をＮ２下に１：１（ｖ／ｖ）の無水エタノール／無水ヒドラジン３０．４ｍｌに溶解し、溶液を６０℃から６５℃の油浴で２３時間加熱した。冷却後、溶液を蒸発させて濃厚なペーストにし、それをＣＨ２Ｃｌ２３００ｍｌと飽和ＮａＨＣＯ３１５０ｍｌに分配した。水層を１００ｍｌずつのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗い、３つのＣＨ２Ｃｌ２層の各々を順次、各々１００ｍｌのＨ２Ｏ（２Ｘ）と飽和ＮａＣｌ（１Ｘ）で洗った。混合有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で溶媒を除去して、真空中で２０時間乾燥したあと、表題化合物をオフホワイト色の結晶性固体として得た。この物質を無水の脱気したＤＭＦ８２ｍｌに溶解して、使用時まで−２０℃で保存した（濃度３６ｍｇ／ｍｌ）。
【０１８７】
ステップＢ：Ｂｏｃ−４−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタンカルボン酸
各々１００ｍｌのＴＨＦとＨ２Ｏ中に懸濁した４−カルボキシビシクロ−［２．２．２］オクタンメチルアミンハイドロクロライド塩の試料８．７９ｇ（４０．０ｍｍｏｌ）をＴＥＡ２０．０ｍｌ（１４．６ｇ＝３．３当量）、次いでＢＯＣ−ＯＮ試薬１１．８ｇ（４７．９ｍｍｏｌ）で処理した。全部を溶液にして、２４時間攪拌した後、溶液を真空中で約５０ｍｌの容量に濃縮し、エーテル１００ｍｌとＨ２Ｏ３００ｍｌに分配した。ＴＥＡ約２ｍｌを加えた後、水層をエーテルで洗い（３Ｘ）、各々のエーテルを順次Ｈ２Ｏで洗って、混合水層を５％ＫＨＳＯ４で酸性化し、ろ過して、真空中で乾燥し、表題化合物を白色固体として得た。
【０１８８】
ステップＣ：Ｂｏｃ−４−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタンカルボキサミド
ＤＭＦ１００ｍｌ中、ステップＢからの生成物１２．０ｇ（４２．５ｍｍｏｌ）をＮ２下で攪拌した溶液をカルボニルジイミダゾール８．０ｇ（４９．３ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後、ＤＭＦを真空中で蒸発させ、５０ｍｌから６０ｍｌの明褐色ペーストを得て、それを攪拌し、濃ＮＨ４ＯＨ７０ｍｌを速やかに加えて処理した。初期溶液は３０分以内に白色ペーストになり、その後Ｈ２Ｏを総容量４００ｍｌまで加えて生成物の沈殿を完了させ、それを粉砕して、ろ過によって分離し、Ｈ２Ｏで洗って、真空中で乾燥し、表題化合物を白色固体として得た。
【０１８９】
ステップＤ：Ｂｏｃ−４−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタンニトリル
ＣＨ２Ｃｌ２５０ｍｌと無水ピリジン８０ｍｌ中のステップＣからの生成物７．５２ｇ（２６．６ｍｍｏｌ）の溶液を１ｇずつの（メトキシカルボニルスルファモイル）−トリエチル−アンモニウムヒドロキシド内部塩（Ｂｕｒｇｅｓｓ試薬）１１．１２ｇで５分間かけて処理した。１時間半攪拌した後、ＴＬＣ（９０−１０−１、ＣＨＣｌ３−ＣＨ３ＯＨ−Ｈ２Ｏ）は生成物への完全な転換を示し、溶液を蒸発させてペーストを生成して、それにＨ２Ｏを４００ｍｌまで加え、粉砕し、攪拌して、２０時間０℃に放置した後、ろ過し、真空中で乾燥して、表題化合物を白色固体として得た。
【０１９０】
ステップＥ：Ｂｏｃ−４−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタンメチルアミン
ＣＨ３ＯＨ２００ｍｌプラスＨＯＡｃ４ｍｌとＨ２Ｏ２ｍｌ中のステップＤからの生成物６．７５ｇ（２５．５ｍｍｏｌ）の溶液を、５５ｐｓｉのＰａｒｒ振とう機においてＰｔＯ２１．６３ｇで２２時間水素化した。セライトを通してろ過して触媒を除去し、ろ液を真空中で濃縮して油性残留物にし、それをＣＨ３ＯＨ（１Ｘ）とＣＨ２Ｃｌ２（２Ｘ）で洗い／蒸発させた。蒸発の終わり頃に生成物が結晶化し始め、エーテル（３００ｍｌまで）を加えて沈殿を完了させた。白色固体を粉砕し、ろ過によって分離してエーテルで洗い、真空中で乾燥した後、表題化合物を酢酸塩として得た。
【０１９１】
４００Ｍｈｚ  １Ｈ―ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ，ＴＭＳ）４．５（１ｓ，Ｂｏｃ−ＮＨ）；２．９（２ｂｒ  ｄ，−ＣＨ２−ＮＨ−Ｂｏｃ）；２．４５（２ｂｒ  ｓ，−ＣＨ２−ＮＨ２）；２．０３（３ｓ，ＣＨ３ＣＯＯＨ）；１．４５（９ｓ，Ｂｏｃ）；１．４０（１２ｓ，ｒｉｎｇ  ＣＨ２）。
【０１９２】
ステップＦ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（４’−アミノメチルビシクロ−［２．２．２］オクタン）メチルアミド（ＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチン）の調製
アルゴン下で−１５℃に冷却した、４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−ヒドラジド（１．４１ｍｍｏｌ）の上記ＤＭＦ溶液の３０ｍｌアリコートを、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＜１．５（湿らせた０−２．５範囲のｐＨ紙）に酸性化し、次に亜硝酸イソアミル０．２７ｍｌ（１．３当量）を加えて、１０℃から１５℃で１時間攪拌することにより、インサイチューでアジドに転換した。ＤＩＥＡを加えてｐＨを７にし、その後ＤＭＦ２０ｍｌ中の上記ステップＥからのＢｏｃジアミン生成物１．２７ｇ（３．８ｍｍｏｌ）のスラリーを加えて、反応物を２時間かけて１５℃から２０℃に緩やかに加温し、分析用ＨＰＬＣ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）によってモニターすると、その時点でカップリングが完了した。真空中で溶媒を除去し、残留物をＥｔＯＡｃと５％ＮａＨＣＯ３に分配して、有機層を５％ＮａＣｌで洗い、水層をＣＨ２Ｃｌ２で逆抽出して中間体Ｂｏｃ−ＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチンを確実に除去した。混合有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で溶媒を除去して、ＣＨ２Ｃｌ２から２回洗浄／蒸発させた後、残留物をＣＨ２Ｃｌ２３０ｍｌに溶解し、ＴＦＡ３０ｍｌで３０分間処理した。溶媒を真空中で速やかに除去し、残留物を１０％ＨＯＡｃ３００ｍｌに溶解して、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ４  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Ａ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→７０％Ａ／６０分、無勾配７０％／２０分で５つの部分に分けて分取ＨＰＬＣによって精製した。５回の工程からの均質な分画（ＨＰＬＣ、システムＡ、９５→５０％Ａによって評価した）をプールし、真空中で濃縮して、その後凍結乾燥して、表題化合物を凍結乾燥ＴＦＡ塩として得た。
【０１９３】
【表６】
2004517076.tif 000073
【実施例７】
【０１９４】
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＢＤＡＭ）アミドアセテート塩の調製
【０１９５】
【化５７】
2004517076.tif 000074
【０１９６】
ステップＡ：Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＰＡＭ樹脂
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６８ｇ）から出発して、ＡＢＩ  ４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２．０ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ；及び酢酸を使用した（２カップリング）。各々のカップリングサイクルの間にＴＦＡを用いてＢｏｃ保護基を除去し、その後ＤＩＥＡで中和した。Ｎ−メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢｔの活性化を使用してカップリングを実施した。合成が完了した時点でペプチド樹脂を乾燥して、表題の化合物を得た。
【０１９７】
ステップＢ：Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ
０．５ｍｍｏｌずつ３回の操作分の上記ペプチド樹脂（３．５ｇ）を一緒にして、アニソール（６ｍｌ）の存在下に０℃で１時間半、液体ＨＦ（６５ｍｌ）で処理した。ＨＦを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して、数回の部分に分けてＤＭＦ１５０ｍｌで浸出し、ＤＩＥＡを加えてｐＨ〜８に調整し、その後真空中でＤＭＦを除去して１００ｍｌの容量にした。濃度は約１１．７ｍｇ／ｍｌと測定された（浸出の前後に乾燥樹脂を計量することによって）。試料の純度はＨＰＬＣによって９６％と測定された。溶液を直接ＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチンとの複合に使用した。
【０１９８】
ステップＣ：４−Ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＢＤＡＭ）アミドアセテート塩
ステップＢからの溶液５８ｍｌ（ペプチド０．８７５ｍｍｏｌに等しい）に、Ｎ２下で０℃に冷却しながら、実施例６、ステップＦで述べたように調製したＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチン５３０ｍｇ（０．５２０ｍｍｏｌ）を加え、ＤＩＥＡでｐＨを〜８（湿らせた５−１０範囲のｐＨ紙）に調整した。次にＤＰＰＡ０．１３４ｍｌ（０．６２ｍｍｏｌ）を加え、その後、ＤＩＥＡを定期的に加えてｐＨを≧７に維持しながら、分析用ＨＰＬＣ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）によってモニターしてカップリングが完了するまで０℃から５℃で攪拌した。２４時間後、Ｈ２Ｏ〜１０ｍｌを加えて反応を終了させ、１時間攪拌して、真空中で小容量に濃縮し、次に１０％ＨＯＡｃ／５％ＣＨ３ＣＮ約１００ｍｌに溶解して、ＮＨ４ＨＣＯ３でｐＨを５に調整し、ろ過して不溶性物質を除去し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ４  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Å（Ａ＝０．１％ＮＨ４ＨＣＯ３／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→４０％Ａ／７０分）で３つの部分に分けて分取ＨＰＬＣに供した。生成物を含む各々の工程からの分画をプールし、氷ＨＯＡｃでｐＨ３に酸性化して、真空中で〜５０ｍｌの容量に濃縮し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Å（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→７０％Ａ／６０分、無勾配７０％／２０分での分取ＨＰＬＣによって精製した。３回の工程全部からの均質な分画（ＨＰＬＣ、システムＡ、９５→５０％Ａ）をプールし、〜１００ｍｌの容量に濃縮して、５％ＣＨ３ＣＮで希釈し、ＡＧ４Ｘ４イオン交換樹脂（アセテートサイクル）に通して、その後凍結乾燥し、表題化合物を凍結乾燥粉末として得た。
【０１９９】
【表７】
2004517076.tif 000075
【実施例８】
【０２００】
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−メトキシ−ジエチレン−オキシアセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＢＤＡＭ）アミドアセテート塩の調製
【０２０１】
【化５８】
2004517076.tif 000076
【０２０２】
ステップＡ：Ｎ−メトキシジエチレンオキシアセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＰＡＭ樹脂
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＰＡＭ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．６８ｇ）から出発して、ＡＢＩモデル４３０Ａペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２．０ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｂｏｃ−４−トランス−Ｈｙｐ（Ｂｚｌ）−ＯＨ；及び２−［２−（２−メトキシエトキシ）−エトキシ］酢酸を使用した（２カップリング）。各々のカップリングサイクルの間にＴＦＡを用いてＢｏｃ保護基を除去し、その後ＤＩＥＡで中和した。Ｎ−メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢｔの活性化を使用してカップリングを実施した。合成が完了した時点で、ペプチド樹脂を乾燥して、表題の化合物を得た。
【０２０３】
ステップＢ：Ｎ−メトキシジエチレンオキシアセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ
０．５ｍｍｏｌずつ２回の操作分の上記ペプチド樹脂（２．４ｇ）を一緒にして、アニソール（４ｍｌ）の存在下に０℃で１時間半、液体ＨＦ（４０ｍｌ）で処理した。ＨＦを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して、数回の部分に分けてＨ２Ｏ１５０ｍｌで浸出し、次にＷａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、１００Ａ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→７０％Ａ／７０分での分取ＨＰＬＣに供して、均質な分画をプールし、凍結乾燥して、表題化合物を凍結乾燥粉末として得た。試料の純度はＨＰＬＣによって９９％と測定された。
【０２０４】
ステップＣ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−メトキシジエチレン−オキシアセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−ＢＤＡＭ）アミドアセテート塩
ステップＢからのペプチドの試料４４０ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）と、実施例６、ステップＦで述べたように調製したＢＤＡＭ−（ｄＡｃ）ビンブラスチン３４０ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下で０℃に冷却しながらＤＭＦ２５ｍｌに溶解した。次に１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）８５ｍｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を加え、２，４，６−コリジンでｐＨを６．５−７に調整して（湿らせた５−１０範囲のｐＨ紙）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）１１７ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）を加えた。２，４，６−コリジンを定期的に加えてｐＨを６．５−７に維持しながら、分析用ＨＰＬＣ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）によってモニターしてカップリングが完了するまで、０℃から５℃で攪拌を続けた。３時間後、Ｈ２Ｏ〜１０ｍｌを加えて反応を終了させ、１時間攪拌して、真空中で小容量に濃縮し、５％ＨＯＡｃ約７０ｍｌに溶解して、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋカラム１５μＭ、３００Ａ（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）、勾配溶出９５→４０％Ａ／７０分）での分取ＨＰＬＣに供した。３回の工程すべてからの均質な分画（ＨＰＬＣ、システムＡ、９５→５０％Ａによって評価した）をプールし、〜５０ｍｌの容量に濃縮して、ＡＧ４Ｘ４イオン交換樹脂（アセテートサイクル）に通し、その後凍結乾燥して、表題化合物を凍結乾燥粉末として得た。
【０２０５】
【表８】
2004517076.tif 000077
【実施例９】
【０２０６】
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−ＨＣＡＰ）アミドアセテート塩（９−７）の調製
ステップＡ：Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−ＯＨ（９−１）
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．８０ｇ）から出発して、ＡＢＩモデル４３０Ａペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２．０ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−４−トランス−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ及び酢酸を使用した（２カップリング）。各々のカップリングサイクルの間にＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｎ−メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢｔの活性化を使用してカップリングを実施した。合成の完了時に、ペプチド樹脂を乾燥した。ペプチド樹脂１．３ｇを、アルゴン下に室温で２時間、９５％ＴＦＡ：２．５％Ｈ２Ｏ：２．５％トリイソプロピルシラン（２０ｍｌ）で処理した。ＴＦＡを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して乾燥し、粗ペプチドを得て、それを、１００％から７０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、表題の化合物を得た。
【０２０７】
ＦＡＢＭＳ：６１５．３
ペプチド含量：１．０３ｎｍｏｌｅ／ｍｇ
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１０．１６分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５０％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【０２０８】
ステップＢ：Ｎ−Ｂｏｃ−（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン（９−２）
１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）及び１Ｎ  ＮａＯＨ（１０ｍｌ）の混合物中の（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン１．５１ｇ（１０ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌し、氷水浴で冷却した。ジ−（ｔ−ブチル）ジカルボネート（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を少しずつ約２０分間かけて加えた。反応物を低温で２時間、次に室温でさらに１時間攪拌した。溶液を濃縮して大部分のジオキサンを除去し、氷浴で冷却して、酢酸エチル（３０ｍｌ）の層で覆い、１Ｎ  ＫＨＳＯ４でｐＨ２に酸性化した。水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した。混合抽出物を水、ブラインで洗い、濃縮して乾燥し、所望する生成物（９−２）を白色結晶性固体として得た。ＦＡＢＭＳ：２５２。
【０２０９】
ステップＣ：Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰ（９−３）
酢酸５０ｍｌ／Ｈ２Ｏ１０ｍｌ中のＮ−Ｂｏｃ−（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン（９−２）２．３８ｇの溶液を、イリジウムブラック触媒５００ｍｇ上でＰａｒｒ装置により６０ｐｓｉで２４時間水素化した。反応物をセライトパッドに通してろ過し、ろ液を真空中で濃縮して、黄褐色の泡（９−３）を得た。ＦＡＢＭＳ：２５８．２。
【０２１０】
ステップＤ：Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓｅｒ−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（９−４）
無水ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍｌ中の、Ｎ−Ｚ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ１．９５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰ（９−３）１．５４ｇ（６．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ１．２６ｇ（６．６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ１４６ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の溶液を処理し、生じた溶液をＮ２ガス体中室温で１２時間攪拌した。真空中で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に溶解して、溶液を０．５Ｎ  ＮａＨＣＯ３（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）及びブラインで抽出し、その後乾燥して濃縮し、粗カップリング産物（９−４）を得た。
【０２１１】
ステップＥ：Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（９−５）
ＥｔＯＨ９０ｍｌ、水２０ｍｌ及び酢酸１０ｍｌの溶液中の（９−４）２．０ｇを、Ｐｄ（ＯＨ）２触媒２００ｍｇ上で５０ｐｓｉのＰａｒｒ装置により３時間水素化した。反応物をセライトパッドに通してろ過し、ろ液を真空中で小容量に濃縮して、その後、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、中間体（９−５）を得た。ＦＡＢＭＳ：４０１．３。
【０２１２】
ステップＦ：Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−ＨＣＡＰアミン（９−６）
ＤＭＦ７ｍｌ中の、Ｎ−アセチル−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−ＯＨ（９−１）６１４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（９−５）４００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ２２９ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）及びＯＤＢＨＴ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）８１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の溶液をＮ２ガス体中０℃で１０時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物をエーテルで洗って乾燥した。粗生成物をアルゴン下に室温で２時間、９５％ＴＦＡ：５％Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）で処理した。ＴＦＡを蒸発させた後、残留物を、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、中間化合物（９−６）を得た。
【０２１３】
ＦＡＢＭＳ：８４１．８
ペプチド含量：８６３．３９ＮＭｏｌ／ｍｇ
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１３．７分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【０２１４】
ステップＧ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−Ａｃ−４−トランス−Ｌ−Ｈｙｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−ＨＣＡＰ）アミドアセテート塩（９−７）
アルゴン下で−１５℃に冷却したＤＭＦ１０ｍｌ中の４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−ヒドラジド（０．６ｍｍｏｌ）０．４６１ｇの溶液を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＜１．５（湿らせた０−２．５範囲のｐＨ紙）に酸性化し、次に亜硝酸イソアミル０．１０５ｍｌ（１．３当量）を加えて、１０℃から１５℃で１時間攪拌することにより、インサイチューでアジドに変換した。ＤＩＥＡを加えてｐＨを７にし、次にステップＦからのアミン誘導体（９−６）５５５ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）を加えて、反応物を０℃で２４時間攪拌し、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系による１５μＭ、１００Ａ、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。均質な分画をプールし、真空中で濃縮して、その後凍結乾燥し、表題の化合物をＴＦＡ塩として生成して、それをＡＧ４ｘ４樹脂（１００−２００メッシュ、遊離塩基形態、ＢＩＯ−ＲＡＤ）（１８−７）によって対応するＨＯＡｃ塩に変換した。
【０２１５】
ＥＳ＋：１５７６．７
ペプチド含量：４６１．８１ＮＭｏｌｅ／ｍｇ
Ｓｅｒ  ３．０４；Ｈｙｐ  １．０７；Ｃｈｇ  １．０２；Ｇｌｕ  １．００
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１８．３１分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【実施例１０】
【０２１６】
４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＨＣＡＰ）アミドアセテート塩（１０−５）の調製
ステップＡ：Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ（１０−１）
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂０．５ｍｍｏｌ（０．８０ｇ）から出発して、ＡＢＩモデル４３０Ａペプチドシンセサイザーで保護されたペプチドを合成した。プロトコールは、４倍過剰（２．０ｍｍｏｌ）の次の各々の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及び酢酸を使用した（２カップリング）。各々のカップリングサイクルの間にＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｎ−メチル−２−ピロリジノン中でのＤＣＣとＨＯＢｔの活性化を使用してカップリングを実施した。合成の完了時に、ペプチド樹脂を乾燥した。ペプチド樹脂１．３ｇを、アルゴン下に室温で２時間、９５％ＴＦＡ：２．５％Ｈ２Ｏ：２．５％トリイソプロピルシラン（２０ｍｌ）で処理した。ＴＦＡを蒸発させた後、残留物をエーテルで洗い、ろ過して乾燥し、粗ペプチドを得て、それを、１００％から７０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、表題の化合物を得た。
【０２１７】
ＦＡＢＭＳ：５８９．５
ペプチド含量：１．０１ＮＭｏｌｅ／ｍｇ
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１０．７分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５０％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【０２１８】
ステップＢ：Ｎ−Ｂｏｃ−（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン（９−２）
１，４−ジオキサン（２０ｍｌ）、水（１０ｍｌ）及び１Ｎ  ＮａＯＨ（１０ｍｌ）の混合物中の（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン１．５１ｇ（１０ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌し、氷水浴で冷却した。ジ−（ｔ−ブチル）ジカルボネート（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を少しずつ約２０分間かけて加えた。反応物を低温で２時間、次に室温でさらに１時間攪拌した。溶液を濃縮して大部分のジオキサンを除去し、氷浴で冷却して、酢酸エチル（３０ｍｌ）の層で覆い、１Ｎ  ＫＨＳＯ４でｐＨ２に酸性化した。水層をＥｔＯＡｃで２回抽出した。混合抽出物を水、ブラインで洗い、濃縮して乾燥し、所望する生成物（９−２）を白色結晶性固体として得た。ＦＡＢＭＳ：２５２。
【０２１９】
ステップＣ：Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰ（９−３）
酢酸５０ｍｌ／Ｈ２Ｏ１０ｍｌ中のＮ−Ｂｏｃ−（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン（９−２）２．３８ｇの溶液を、イリジウムブラック触媒５００ｍｇ上でＰａｒｒ装置により６０ｐｓｉで２４時間水素化した。反応物をセライトパッドに通してろ過し、ろ液を真空中で濃縮して、黄褐色の泡を得た。ＦＡＢＭＳ：２５８．２。
【０２２０】
ステップＤ：Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（１０−２）
無水ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍｌ中の、Ｎ−Ｚ−Ｐｒｏ−ＯＨ１．６２ｇ（６．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰ（９−３）１．５４ｇ（６．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ１．２６ｇ（６．６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ１４６ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の溶液を処理し、生じた溶液をＮ２ガス体中室温で１２時間攪拌した。真空中で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に溶解して、溶液を０．５Ｎ  ＮａＨＣＯ３（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）及びブラインで抽出し、その後乾燥して濃縮し、粗カップリング産物を得た。
【０２２１】
ステップＥ：Ｈ−Ｐｒｏ−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（１０−３）
ＥｔＯＨ９０ｍｌ、水２０ｍｌ及び酢酸１０ｍｌの溶液中の（１０−２）２．０ｇを、Ｐｄ（ＯＨ）２触媒２００ｍｇ上で５０ｐｓｉのＰａｒｒ装置により３時間水素化した。反応物をセライトパッドに通してろ過し、ろ液を真空中で小容量に濃縮して、その後、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、表題化合物号物（１０−３）を得た。ＦＡＢＭＳ：３５６．３。
【０２２２】
ステップＦ：Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＨＣＡＰアミン（１０−４）
ＤＭＦ７ｍｌ中の、Ｎ−アセチル−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ（１０−１）５８９ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｐｒｏ−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ＨＣＡＰエステル（１０−３）３５６ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ２２９ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）及びＯＤＢＨＴ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）８１ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）の溶液をＮ２ガス体中０℃で１０時間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物をエーテルで洗って乾燥した。粗生成物をアルゴン下に室温で２時間、９５％ＴＦＡ：５％Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）で処理した。ＴＦＡを蒸発させた後、残留物を、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系によるＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。少なくとも９９％（ＨＰＬＣ）の純度の生成物を含む分画を合わせて、表題化合物（１０−４）を得た。
【０２２３】
ＦＡＢＭＳ：８２５．５
ペプチド含量：８９３．６ＮＭｏｌｅ／ｍｇ
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１５．２分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【０２２４】
ステップＧ：４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−（Ｎ−Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｃｈｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＨＣＡＰ）アミドアセテート塩（１０−５）
アルゴン下で−１５℃に冷却したＤＭＦ１０ｍｌ中の４−ｄｅｓ−アセチルビンブラスチン−２３−ヒドラジド（０．６ｍｍｏｌ）０．４６１ｇの溶液を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＜１．５（湿らせた０−２．５範囲のｐＨ紙）に酸性化し、次に亜硝酸イソアミル０．１０５ｍｌ（１．３当量）を加えて、１０℃から１５℃で１時間攪拌することにより、インサイチューでアジドに変換した。ＤＩＥＡを加えてｐＨを７にし、次にステップＦからのアミン誘導体（１０−４）５４５ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）を加えて、反応物を０℃で２４時間攪拌し、９５−５０％Ａ、６０分直線勾配を用いた０．１％トリフルオロ酢酸−水性アセトニトリル溶媒系による１５μＭ、１００Ａ、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８カラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。均質な分画をプールし、真空中で濃縮して、その後凍結乾燥し、表題の化合物をＴＦＡ塩として生成して、それをＡＧ４ｘ４樹脂（１００−２００メッシュ、遊離塩基形態、ＢＩＯ−ＲＡＤ）（１９−５）によって表題化合物号物に変換した。
【０２２５】
ＥＳ＋：１５６０．９
ペプチド含量：５８６．８ＮＭｏｌｅ／ｍｇ
Ｓｅｒ  ３．０４；Ｃｈｇ  １．０１；Ｇｌｕ  １．００；Ｐｒｏ  ０．９７
ＨＰＬＣ：純度９９％＠２１４ｎｍ、保持時間＝１３．４分、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、３０分で９５％Ａ／Ｂから５％Ａ／Ｂまでの勾配、Ａ＝０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ；Ｂ＝０．１％ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）。
【０２２６】
生物学的ＰＳＡ複合体アッセイ
【実施例１１】
【０２２７】
遊離ＰＳＡによるオリゴペプチド−細胞傷害性薬剤複合体の認識の評価
上述したように、特に実施例１から１０において調製したＰＳＡ複合体を個々にＰＳＡ消化緩衝液（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン  ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解し、溶液を１００：１のモル比でＰＳＡに加える。代替的には、使用するＰＳＡ消化緩衝液は、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌである。様々な反応時間後、１％の最終濃度（容積／容積）までトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えて反応をクエンチングする。代替的には１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２で反応をクエンチングする。クエンチングした反応物を、水性０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を用いた逆相Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣによって分析する。その後、酵素的に活性な遊離ＰＳＡによる当該オリゴペプチド−細胞傷害性物質複合体の５０％開裂に必要な時間量（分）を算定した。
【実施例１２】
【０２２８】
ドキソルビシンのペプチジル誘導体の細胞毒性のインビトロアッセイ
上述したように、特に実施例１から３において調製した開裂性オリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の、非修飾ドキソルビシンによって死滅することが知られている細胞系統に対する細胞毒性をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイで評価する。詳細には、９６穴プレート中のＬＮＣａｐ前立腺腫瘍細胞（酵素的に活性なＰＳＡを発現する）又はＤｕＰＲＯ細胞の細胞培養を、所与の複合体の様々な濃度を含む培地（ダルベッコ最小必須培地−α［ＭＥＭ−α］）で希釈する（最終的なプレートウエル容量２００μｌ）。細胞を３７℃で３日間インキュベートし、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ２０μｌをアッセイウエルに加える。細胞をさらにインキュベートし、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの添加後４時間目と７時間目に５７０と６００ｎｍの二波長のＥＬ−３１０  ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイプレートを読み取る。その後、試験した複合体の様々な濃度での相対的生存率パーセンテージを対照（複合体なし）培養に対して算定する。
【実施例１３】
【０２２９】
ビンカ薬剤のペプチジル誘導体の細胞毒性のインビトロアッセイ
上述したように、特に実施例４から１０において調製した開裂性オリゴペプチド−ビンカ薬剤複合体の、非修飾ビンカ薬剤によって死滅することが知られている細胞系統に対する細胞毒性をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイで評価した。詳細には、９６穴プレート中のＬＮＣａｐ前立腺腫瘍細胞、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞（Ｃ３２０と称する）又はＴ４７Ｄ細胞の細胞培養を、所与の複合体の様々な濃度を含む培地で希釈する（最終的なプレートウエル容量２００μｌ）。遊離ＰＳＡを発現しないＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を、機序に基づくものでない毒性を測定するための対照細胞系統として使用する。細胞を３７℃で３日間インキュベートし、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ２０μｌをアッセイウエルに加える。細胞をさらにインキュベートし、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの添加後４時間目と７時間目に５７０と６００ｎｍの二波長のＥＬ−３１０  ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイプレートを読み取る。その後、試験した複合体の様々な濃度での相対的生存率パーセンテージを対照（複合体なし）培養に対して算定し、ＥＣ５０を決定した。
【実施例１４】
【０２３０】
ペプチジル−細胞傷害性物質複合体のインビボでの効果
ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ又はＤｕＰＲＯ−１細胞をトリプシン処理し、増殖培地に再懸濁して、２００×ｇで６分間遠心分離する。細胞を無血清α−ＭＥＭに再懸濁し、計数する。次に所望する細菌数を含むこの溶液の適切な容量を円錐形遠心分離管に移し、先のように遠心分離して、適切な容量のα−ＭＥＭ−Ｍａｔｒｉｇｅｌの低温１：１混合物に再懸濁する。動物に接種する時まで懸濁液を氷上に保持する。
【０２３１】
Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雄性ヌードマウス（１０−１２週齢）を麻酔なしで拘束し、２２Ｇ針を用いた皮下注射により左側腹部に細胞懸濁液０．５ｍＬを接種する。マウスに約５×１０５ＤｕＰＲＯ細胞又は１．５×１０７ＬＮＣａＰ．ＦＧＣ細胞のいずれかを投与する。
【０２３２】
腫瘍細胞の接種後、マウスを２つのプロトコールのいずれかの下で処置する：
プロトコールＡ：
細胞接種の１日後に、０．１ｍＬから０．５ｍＬ容量の被験複合体、非複合細胞傷害性物質又は賦形剤対照（無菌水）を動物に投与する。複合体と非複合細胞傷害性物質の用量は、最初は最大非致死量であるが、その後はより低い力価であってもよい。２４時間ごとに同じ用量を５日間投与する。１０日後、マウスから血液試料を採取し、ＰＳＡの血清レベルを測定する。同様の血清ＰＳＡレベルを５−１０日間隔で測定する。５．５週間の終了時に、マウスを犠牲剖検し、存在する腫瘍の重量を測定して、再び血清ＰＳＡを定量する。アッセイの開始時と終了時に動物の体重を測定する。
【０２３３】
プロコールＢ：
細胞接種の１０日後、動物から血液試料を採取し、ＰＳＡの血清レベルを測定する。次に動物をそのＰＳＡ血清レベルにより群に分ける。細胞接種の１４−１５日後、０．１ｍＬから０．５ｍＬ容量の被験複合体、非複合細胞傷害性物質又は賦形剤対照（無菌水）を動物に投与する。複合体と非複合細胞傷害性物質の用量は、最初は最大非致死量であるが、その後はより低い力価であってもよい。２４時間ごとに同じ用量を５日間投与する。同様の血清ＰＳＡレベルを５−１０日間隔で測定する。５．５週間の終了時に、マウスを犠牲剖検し、存在する腫瘍の重量を測定して、再び血清ＰＳＡを定量する。アッセイの開始時と終了時に動物の体重を測定する。
【実施例１５】
【０２３４】
内因性非ＰＳＡプロテアーゼによる複合体のタンパク質分解性開裂のインビトロ測定
ステップＡ：タンパク質分解組織抽出物の調製
すべての手順を４℃で実施する。適切な動物を犠牲剖検し、適当な組織を分離して液体窒素中で保存する。乳鉢と乳棒を用いて凍結組織を粉砕し、粉砕した組織をＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｊｅｈホモジナイザーに移して、２容量の緩衝液Ａ（１．１５％ＫＣｌを含む５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）を加える。その後、最初はゆるく合わせ、次にきつくフィットさせた乳棒を用いて２０ストロークで組織を破壊する。ホモジネートをスイングバケットローター（ＨＢ４−５）において１０，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを廃棄して、上清を１００，０００×ｇ（Ｔｉ７０）で再び遠心分離する。上清（サイトゾル）を保存する。
【０２３５】
緩衝液Ａに関して上記で使用したのと同じ容量を使用して、ペレットを緩衝液Ｂ（１．１５％ＫＣｌを含む１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁する。懸濁液をダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化し、溶液を１００，０００×ｇで遠心分離する。上清を廃棄し、上記で用いた容量の１／２を使用してペレットを緩衝液Ｃ（０．２５Ｍスクロースを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）に再懸濁し、ダウンスホモジナイザーで均質化する。
【０２３６】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて２つの溶液（サイトゾル及び膜）のタンパク質含量を測定する。次にアッセイのアリコートを取り、液体Ｎ２中で凍結する。アリコートを−７０℃で保存する。
【０２３７】
ステップＢ：タンパク質分解性開裂アッセイ
各々の時点で、ＰＳＡ複合体２０μｇと、ステップＡで述べたように調製し、反応緩衝液中Ｂｒａｄｆｏｒｄによって定量した組織タンパク質１５０μｇを、緩衝液（５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中最終容量２００μｌの溶液に入れる。０、３０、６０、１２０及び１８０分間アッセイ反応を実施し、その後０．１Ｍ  ＺｎＣｌ２  ９μｌでクエンチングして、直ちに９０秒間沸騰水中に入れる。水／アセトニトリル中ＶＹＤＡＣ  Ｃ１８  １５ｃｍカラム（３０分間で５％から５０％のアセトニトリル）を用いたＨＰＬＣによって反応産物を分析する。
【実施例１６】
【０２３８】
ＰＳＡ複合体とプレドニゾンの組合せのインビボでの使用
アンドロゲン遮断療法は進行した前立腺癌の患者では一時的にしか有効でなく、標準的な化学療法の組合せは短期間の応答しか誘導しない。腫瘍細胞への薬剤の選択的送達は結果を改善すると考えられる。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は分泌部位に限定された活性を持つ酵素であるので、ＰＳＡ開裂によって活性化される細胞傷害性物質は前立腺癌細胞を選択的に標的すると考えられる。化合物Ｂ（実施例２で述べたような）は、前立腺腫瘍細胞においてＰＳＡによりロイシン−ｄｏｘ（Ｌｅｕ−ｄｏｘ）とＤｏｘに開裂されるドキソルビシン（Ｄｏｘ）のペプチド複合体である。進行したホルモン治療不応性前立腺癌を有する３３名の患者を化合物Ｂで治療した。治験の第Ｉ相部分では、１９名の患者を最初に２０（ｎ＝１）、４０（ｎ＝３）、８０（ｎ＝４）、１６０（ｎ＝２）、２２５（ｎ＝６）、及び３１５ｍｇ／ｍ２（ｎ＝２）の漸増用量レベルで治療した。さらに１４名の患者は、プレドニゾンと２２５ｍｇ／ｍ２によって治療した。化合物Ｂは概して良好に忍容され、２名の患者だけがグレード３の疲労を経験した。３１５ｍｇ／ｍ２用量レベルで２名の患者において用量を制限する好中球減少症が認められ（どちらの患者も２２５ｍｇ／ｍ２で治療を再開することができた）、第ＩＩ相推奨用量は２２５ｍｇ／ｍ２であった。ＰＫ試験は、化合物ＢがＬｅｕ−ｄｏｘとＤｏｘに代謝されることを明らかにした。２２５ｍｇ／ｍ２用量レベルで、化合物Ｂ、Ｌｅｕ−ｄｏｘ及びＤｏｘの平均ＡＵＣはそれぞれ６μＭ×時間、４μＭ×時間及び１μＭ×時間であった；ピーク濃度はそれぞれ１４μＭ、５μＭ及び１００μＭであった。２２５ｍｇ／ｍ２とプレドニゾンなしでの３１５ｍｇ／ｍ２用量で、化学療法未経験患者の２／６がＰＳＡの＞７５％低下（＜４ｎｇ／ｍＬへの低下）を示し、１名の患者は安定したＰＳＡを有していた。化合物Ｂプラスプレドニゾンで治療した化学療法未経験患者の群では、４／１１がＰＳＡの＞５０％低下を示し、１／１１が安定したＰＳＡを有していた。以前に化学療法で治療された患者では、１／３がＰＳＡの＞５０％低下を示した。要するに、化合物Ｂは一般に良好に忍容され、プレドニゾンと共に又はプレドニゾンなしでホルモン治療不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）の患者において活性であった。化合物Ｂは開裂されて検出可能なレベルのＬｅｕ−ｄｏｘとＤｏｘを生じた。
【国際公開パンフレット】
2004517076.tif 000109
2004517076.tif 000110
2004517076.tif 000111
2004517076.tif 000112
2004517076.tif 000113
2004517076.tif 000114
2004517076.tif 000115
2004517076.tif 000116
2004517076.tif 000117
2004517076.tif 000118
2004517076.tif 000119
2004517076.tif 000120
2004517076.tif 000121
2004517076.tif 000122
2004517076.tif 000123
2004517076.tif 000124
2004517076.tif 000125
2004517076.tif 000126
2004517076.tif 000127
2004517076.tif 000128
2004517076.tif 000129
2004517076.tif 000130
2004517076.tif 000131
2004517076.tif 000132
2004517076.tif 000133
2004517076.tif 000134
2004517076.tif 000135
2004517076.tif 000136
2004517076.tif 000137
2004517076.tif 000138
2004517076.tif 000139
2004517076.tif 000140
2004517076.tif 000141
2004517076.tif 000142
2004517076.tif 000143
2004517076.tif 000144
2004517076.tif 000145
2004517076.tif 000146
2004517076.tif 000147
2004517076.tif 000148
2004517076.tif 000149
2004517076.tif 000150
2004517076.tif 000151
2004517076.tif 000152
2004517076.tif 000153
2004517076.tif 000154
2004517076.tif 000155
2004517076.tif 000156
2004517076.tif 000157
2004517076.tif 000158
2004517076.tif 000159
2004517076.tif 000160
2004517076.tif 000161
2004517076.tif 000162
2004517076.tif 000163
2004517076.tif 000164
2004517076.tif 000165
2004517076.tif 000166
2004517076.tif 000167
2004517076.tif 000168
2004517076.tif 000169
2004517076.tif 000170
2004517076.tif 000171
2004517076.tif 000172
2004517076.tif 000173
2004517076.tif 000174
2004517076.tif 000175
2004517076.tif 000176
2004517076.tif 000177
2004517076.tif 000178
2004517076.tif 000179
2004517076.tif 000180
2004517076.tif 000181
2004517076.tif 000182
2004517076.tif 000183
2004517076.tif 000184
2004517076.tif 000185
2004517076.tif 000186
2004517076.tif 000187
2004517076.tif 000188
2004517076.tif 000189
2004517076.tif 000190
2004517076.tif 000191
2004517076.tif 000192
2004517076.tif 000193
2004517076.tif 000194
2004517076.tif 000195
2004517076.tif 000196
2004517076.tif 000197
2004517076.tif 000198
2004517076.tif 000199
2004517076.tif 000200
2004517076.tif 000201
2004517076.tif 000202
2004517076.tif 000203
2004517076.tif 000204
2004517076.tif 000205
2004517076.tif 000206
2004517076.tif 000207
2004517076.tif 000208
2004517076.tif 000209
2004517076.tif 000210
2004517076.tif 000211
2004517076.tif 000212
2004517076.tif 000213
2004517076.tif 000214
2004517076.tif 000215
2004517076.tif 000216
2004517076.tif 000217
2004517076.tif 000218
2004517076.tif 000219
2004517076.tif 000220
2004517076.tif 000221
2004517076.tif 000222
2004517076.tif 000223
2004517076.tif 000224
2004517076.tif 000225
2004517076.tif 000226
2004517076.tif 000227
2004517076.tif 000228
2004517076.tif 000229
2004517076.tif 000230
2004517076.tif 000231
2004517076.tif 000232
2004517076.tif 000233
2004517076.tif 000234
2004517076.tif 000235
2004517076.tif 000236
2004517076.tif 000237
2004517076.tif 000238
2004517076.tif 000239
2004517076.tif 000240
2004517076.tif 000241
2004517076.tif 000242
2004517076.tif 000243
2004517076.tif 000244
2004517076.tif 000245
2004517076.tif 000246
2004517076.tif 000247
2004517076.tif 000248
2004517076.tif 000249
2004517076.tif 000250
2004517076.tif 000251
2004517076.tif 000252
2004517076.tif 000253
2004517076.tif 000254
2004517076.tif 000255
2004517076.tif 000256
2004517076.tif 000257
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517076.tif 000258
【国際調査報告】
2004517076.tif 000259
2004517076.tif 000260
2004517076.tif 000261