(57)【要約】本発明は、ヒト細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質(CGDD)および、CGDDを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、CGDDの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｉ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-21（配列番号１乃至21）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:3-4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8-9, SEQ ID NO:11-12, SEQ ID NO:14-16, SEQ ID NO:18-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも95％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:10からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも98％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｇ）SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｈ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｉ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:22-42からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｋ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:22-25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32-37, SEQ ID NO:39-42からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも92％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも98％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｈ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｉ）（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｊ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17の組成物。
【請求項１９】
機能的CGDDの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項17に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的CGDDの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項21に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項23の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的CGDDの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項24の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のCGDDの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを請求項11に記載の抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
CGDDの被検者での発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項32に記載の組成物。
【請求項３５】
CGDDの被検者での発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-21 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、癌を含む細胞増殖異常、発生または発達障害、神経疾患、自己免疫または炎症性疾患、生殖障害、および胎盤の障害の、診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外因性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの成長と発達とには、細胞分化、細胞増殖、およびアポトーシスの、空間的および時間的な調節を要する。これらのプロセスが、生殖、加齢、胚形成、形態形成、器官形成、並びに組織の修復および維持を、協調的に制御する。細胞レベルでは、成長と発達との支配は、細胞が細胞分裂周期から出たり入ったりする決定に、また、細胞の、最終分化状態へのコミットメントによって成される。これらの決定は、細胞によって、細胞外シグナルと他の細胞が受け取る環境からの合図に応じて成される。以下の考察の焦点は、細胞分裂、胚形成、細胞分化および細胞増殖、並びにアポトーシスの分子機序に置かれ、また、これら機序の破壊に起因しうる癌などの病態に置かれている。
【０００３】
細胞周期
細胞分裂は、全ての生物がこれによって成長し生殖する、基本的プロセスである。酵母菌や細菌などの単細胞生物では、各細胞分裂で生物の数が2倍となる。多細胞の種では、消耗あるいはプログラム細胞死により消失した細胞を置換するために、また新たな組織や器官を作製する細胞分化のために、多数回の細胞分裂が必要とされる。細胞周期の進行は、タンパク質複合体群の複雑な相互作用によって支配される。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接／間接的に調節する分子は、サイクリン、サイクリン依存性プロテインキナーゼ、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャー、シグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質等の複数のカテゴリーに分類される。
【０００４】
細胞周期の進行は、タンパク質複合体群の複雑な相互作用によって支配される。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接／間接的に調節する分子は、サイクリン、サイクリン依存性プロテインキナーゼ、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャー、シグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質等の複数のカテゴリーに分類される。
【０００５】
細胞は、サイクリンと呼ばれる活性化タンパク質ファミリーの合成および分解による調節により、有糸分裂に入ったり有糸分裂から出たりする。サイクリンは一群のサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)へ結合し活性化させて作用する。Cdkは次に、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化し活性化する。サイクリンは、長さが約180アミノ酸であり「サイクリンボックス」と呼ばれる、共有した相同性を持つ広い領域により特徴付けられる(Chapman, D.L及びWolgemuth, D.J. (1993) Development 118:229-40)。さらにサイクリン内には、「destruction box」と呼ばれる、この分子のN末端領域内に保存された9アミノ酸配列を含む。この配列は、ユビキチンが仲介するサイクリンB分解を誘発する認識コードと思われる(Hunt, T. (1991) Nature 349:100-101)。数タイプのサイクリンが存在する(Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21)。G1期とS期との過程は、G1サイクリン類とその触媒サブユニット群(例えばCdk2-サイクリンA、Cdk2-サイクリンE、Cdk4-サイクリンDおよびCdk6-サイクリンDを含む)によって進行される。G2/Mの移行は、Cdc2サイクリンA、Cdc2サイクリンB1、Cdc2サイクリンB2の複合体等の、有糸分裂CDKサイクリン複合体の活性化によって進行される(Yang, J及びKornbluth, S. (1999) Trends in Cell Biology 9:207-210に概説)。
【０００６】
サイクリンは、真核細胞と数種の細菌では、細胞タンパク質の分解の主な経路である、ユビキチン抱合系（ubiquitin conjugation system:UCS）によって分解される。UCSは異常なタンパク質の除去を仲介する。また遺伝子の転写と細胞周期の進行等の細胞過程を制御する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。UCSは、有糸分裂サイクリンキナーゼ、オンコプロテイン(腫瘍性タンパク)、腫瘍抑制遺伝子（p53等）、ウイルス蛋白、シグナル伝達に関係する細胞表面受容体、転写調節因子、および変異タンパク質または損傷タンパク質の分解に関与する（Ciechanover, 前出）。
細胞分裂周期の詳細は異なりうるが、基本的なプロセスは3つの主要な現象からなる。最初の現象である間期には、細胞分裂の準備、DNAの複製、必須タンパク質の作製が含まれる。2番目の現象である有糸分裂では、核物質が分裂して細胞の両側に分離する。最終の現象である細胞質分裂は、細胞質の分配と分裂である。細胞周期移行の順序およびタイミングは、種々のチェックポイント(検問点)で正または負の調節回路によりプロセスを制御する細胞周期調節システムの制御下にある。
【０００７】
有糸分裂は間期の終了を特徴付け、また細胞質分裂の開始で終了する。有糸分裂には4つの段階があり、次の順番で発生する。前期、中期、後期、終期。前期には二極性紡錘体の形成が含まれ、これは微小管と、ダイニンなどの関連タンパク質から構成されており、形成は極性分裂中心から始まる。中期の間、核物質は凝縮する。また、核物質の、紡錘体への物理的な付着を助ける動原体線維を発達させる。続いて核物質は紡錘体に沿って反対の極へ移動するが、それは後期に起こる。終期には、核物質からの紡錘体と動原体線維の消滅が含まれる。有糸分裂は、多数のタンパク質の相互作用に依存する。例えば、CENP-A、B、C等のセントロメア結合タンパク質は、動原体の形成およびアセンブリにおいて構造的役割を果たしている(Saffery, R. 他(2000) Human Mol. Gen. 9: 175-185)。
【０００８】
真核細胞周期のM期に構造的再編成が起こり、娘細胞間の細胞成分の適切な分配を確保する。間期構造の、より小さなサブユニットへの分解は一般的である。核エンベロープは小胞へ分解し、核ラミンは解離する。次にこれらラミンのリン酸化が起こり、リン酸化は終期まで維持される。終期には、核ラミナ構造が再構成される。M期リン酸化(MPP)をコードするcDNA群はU3核小体低分子リボ核タンパク質(snoRNP)の成分であり、これらcDNAは、有糸分裂が完了すると、核小体に再局在する(Westendorf, J.M. 他(1998) J. Biol. Chem. 9:437-449) 。U3 snoRNP類は、RNAプロセシング諸イベントの必須メディエータである。
【０００９】
細胞プロセス（例えば有糸分裂）の調節に関わるタンパク質としては、Ser/Thrプロテインホスファターゼ1型(PP-1)を含む。PP-1類の作用は、中期-後期移行に関わる、鍵となるタンパク質群の脱リン酸化によって成される。遺伝子PP1R7は調節ポリペプチドsds22をコードし、PP1R7は少なくとも6種のスプライス変異体を持つ(Ceulemans, H. 他(1999) Eur. J. Biochem. 262:36-42)。sds22はPP-1類の触媒サブユニットの活性を調節し、有糸分裂基質類の、PP-1依存性脱リン酸化を増進する。
【００１０】
細胞周期調節タンパク質類は、細胞増殖と癌とに重要な役割を果たす。例えば、細胞周期イベントの妥当な実行とタイミングとが不全であると、染色体分配欠損をもたらすことがあり、この結果、異数性または倍数性が生じる。このゲノム不安定性は、癌化した細胞の特徴である (Luca, F.C. and Winey, M. (1998) Mol. Biol. Cell. 9:29-46)。最近同定されたタンパク質であるmMOB1は酵母MOB1の哺乳類相同体であり、MOB1は、有糸分裂の完遂と倍数関係の維持とに必要な必須の酵母遺伝子である。哺乳類mMOB1はプロテインホスファターゼ2A (PP2A)を含むタンパク質複合体類のメンバーであり、mMOB1のリン酸化は、PP2Aによって調節されるようである(Moreno, C.S. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:24253-24260) 。PP2Aは、ヒト癌の発症に関わるとされ、これには肺癌、結腸癌、および白血病を含む。
【００１１】
細胞周期の調節には、連続して相互作用する、多数のタンパク質が関わる。真核生物の細胞周期は幾つかの、高度に制御されたイベントからなり、それらイベントの正確な秩序が、DNA複製と細胞分裂との成功を保証する。細胞は、これらイベントの秩序の維持を、後期イベントを早期イベントの成功裏の完了に依存させることによって行う。この依存性は、チェックポイントと呼ばれる細胞機序によって補強される。更なる細胞周期調節タンパク質の例には、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)類を含む。HDAC類は細胞周期の調節に関与する。また、クロマチン構造を調整する。ヒトHDAC1はin vitroでヒトHus1遺伝子産物と相互作用することが知られている。この産物の分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）相同体は、G2/Mチェックポイント制御に関わると示唆されている(Cai, R.L. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:27909-27916) 。
【００１２】
DNA損傷(G2)とDNA複製(S期)とのチェックポイントは、真核細胞をG2/M移行期に停止させる。この停止は、有糸分裂に入る前に、DNA修復またはDNA複製が起こるための時間を提供する。したがって、G2/Mチェックポイントは、DNA複製が完了し、染色体損傷が無いときにのみ、有糸分裂が起こることを保証する。分裂酵母のHus1遺伝子は細胞周期チェックポイント遺伝子であり、radファミリーの遺伝子(例えばrad1およびrad9)も同様である(Volkmer, E. および Karnitz, L.M. (1999) J. Biol. Chem. 274:567-570; Kostrub C.F. 他 (1998) EMBO J. 17:2055-2066) 。これら遺伝子は有糸分裂チェックポイントに関わる。また、DNA損傷または複製の遮断のいずれかによってこれらの遺伝子が誘導される。DNA損傷または複製遮断の誘発は、Hus1遺伝子の機能の喪失と、続いての細胞死とをもたらす。大多数のrad遺伝子のヒト相同体群が同定されており、これにはATMとATRとを含み、これらはrad3pのヒト相同体である。ATM遺伝子での突然変異群は、重度の先天性疾患である血管拡張性失調症と相関する(Savitsky, K. 他(1995) Science 268:1749-1753）。ヒトHus1タンパク質はrad9と相互作用するrad1タンパク質との複合体の形で作用することが示されており、このことは、これらを、ヒト細胞の、或るDNA損傷応答性タンパク質複合体の中心成分にしている(Volkmer, E. および Karnitz, L.M. (1999) J. Biol. Chem. 274:567-570。
【００１３】
細胞は、サイクリンと呼ばれる活性化タンパク質ファミリーの合成および分解による調節により、有糸分裂に入ったり有糸分裂から出たりする。サイクリンは一群のサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)へ結合し活性化させて作用する。Cdkは次に、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化し活性化する。サイクリンは、長さが約180アミノ酸であり「サイクリンボックス」と呼ばれる、共有した相同性を持つ広い領域により特徴付けられる(Chapman, D.L及びWolgemuth, D.J. (1993) Development 118:229-40)。さらにサイクリン内には、「destruction box」と呼ばれる、この分子のN末端領域内に保存された9アミノ酸配列を含む。この配列は、ユビキチンが仲介するサイクリンB分解を誘発する認識コードと思われる(Hunt, T. (1991) Nature 349:100-101)。数タイプのサイクリンが存在する(Ciechanover, A. (1994) Cell 79:13-21)。G1期とS期との過程は、G1サイクリン類とその触媒サブユニット群(例えばCdk2-サイクリンA、Cdk2-サイクリンE、Cdk4-サイクリンDおよびCdk6-サイクリンDを含む)によって進行される。G2/Mの移行は、Cdc2サイクリンA、Cdc2サイクリンB1、Cdc2サイクリンB2複合体等の、有糸分裂CDKサイクリン複合体の活性化によって進行される(Yang, J及びKornbluth, S. (1999) Trends in Cell Biology 9:207-210に概説)。
【００１４】
サイクリンは、真核細胞と数種の細菌では、細胞タンパク質の分解の主な経路である、ユビキチン抱合系（ubiquitin conjugation system:UCS）によって分解される。UCSは異常なタンパク質の除去を仲介する。また遺伝子の転写と細胞周期の進行等の細胞過程を制御する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。UCSは、有糸分裂サイクリンキナーゼ、オンコプロテイン(腫瘍性タンパク)、腫瘍抑制遺伝子（p53等）、ウイルス蛋白、シグナル伝達に関係する細胞表面受容体、転写調節因子、および変異タンパク質または損傷タンパク質の分解に関与する（Ciechanover, 前出）。
【００１５】
ユビキチン抱合とタンパク質分解のプロセスは５つの主要なステップの形で起こる(Jentsch, S. (1992) Annu. Rev. Genet. 26:179-207)。第１番目にATP依存性反応で、小さな耐熱性タンパク質であるユビキチン(Ub)がユビキチン活性化酵素（E1）により活性化する。この反応はUbのC末端をE1内部システイン残基のチオール基に結合する。２番目に、活性化したUbがUb抱合酵素（E2）のうちの１つに移る。異なるユビキチン依存性タンパク分解経路は構造的に類似するが異なるユビキチン抱合酵素を利用し、これら酵素は特定の分解シグナルを運ぶタンパク質に酵素を誘導する認識サブユニット群と会合する。３番目にE2は、C末端グリシンによりユビキチン-タンパク質リガーゼファミリー、E3のメンバーにUb分子を移す。４番目に、E3はUb分子を標的タンパク質に移す。付加的Ub分子が標的タンパク質に追加され多重Ub鎖構造を形成することがある。５番目に、ユビキチン結合したタンパク質が次に、大きな多サブユニットタンパク質分解酵素複合体であるプロテアソームによって認識され分解される。そして再利用のためにUbが放出される。
【００１６】
活性化の前に、Ubは通常、融合タンパク質（N末端のユビキチンと、C末端延長タンパク質(CEP)で構成）として発現、または、ポリユビキチン蛋白質（Ub単量体群が同じ方向を向いて一列（head to tail）に結合）として発現される。CEP類は種々の調節タンパク質の特徴を持つ。即ち大抵は高度に塩基性であり、最大30%のリジン残基とアルギニン残基とを含み、また、核酸結合ドメインを持つ(Monia, B.P. 他(1989) J. Biol. Chem. 264:4093-4103) 。この融合タンパク質は重要な中間体であり、細胞の翻訳活性とタンパク質分解活性との同時制御と、非活性酵素の、特異的細胞部位への局在とを仲介するようである。送達されると、C末端加水分解酵素がこの融合タンパク質を切断し、機能的Ubを放出する(Monia他、前出)。
【００１７】
Ub抱合酵素（E2）は、種々のUCS経路における基質特異性のために重要である。全てのE2は、UBCドメインと呼ばれるおよそ16kDaの保存されたドメインを有する。UBCドメインは全てのE2において少なくとも35%の同一性があり、ユビキチン-酵素チオールエステル形成に必要な、中心に位置するシステイン残基を含む(Jentsch、前出)。良く保存されたプロリンリッチエレメントが、N末端から活性システイン残基に位置する。この保存されたドメイン以外の構造的変異を用いて、E2酵素を分類する。クラスIのE2は、ほぼ例外なく、保存UBCドメインから成る。クラスIIのE2には、基質特異性および細胞局在に寄与する、多様な関連のないC末端延長がある。クラスIIIのE2には、酵素調節または基質特異性に関与すると思われる特有のN末端延長がある。
【００１８】
有糸分裂サイクリン特異的E2 (E2-C)は、保存されたUBCドメイン、他のE2では見出されない30アミノ酸のN末端延長、この延長に隣接する7アミノ酸特異配列により特徴付けられる。サイクリンへのE2-Cの高親和性と共にこれらの特性はE2-Cを、E2の新しいクラスとして同定する(Aristarkhov, A.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:4294-99) 。
【００１９】
ユビキチン-タンパク質リガーゼ(E3)はユビキチン抱合プロセスの最終ステップ、基質とのユビキチンの共有結合を触媒する。E3は本プロセスの特異性の決定に重要な役割を果たす。現在のところ同定されているE3はわずかである。E3リガーゼの１つのタイプは、HECT(E6-APのC末端に相同的)ドメインタンパク質ファミリーである。HECTファミリーの１つのメンバーであるE6-AP (E6関連タンパク質)は、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV) E6腫瘍性タンパク質と同様に、p53のユビキチン結合と分解のために必要である(Scheffner他(1993) Cell 75:495-505)。HECTタンパク質のC末端ドメインは、高度に保存されたユビキチン結合システイン残基を含む。様々なHECTタンパク質のN末端領域は多様であり、特異的な基質認識に関与すると思われる(Huibregtse, J.M他(1997) Proc.Natl Acad. Sci. USA 94:3656-3661) 。SCF (Skp1-Cdc53/Cullin-Fボックス受容体)ファミリーのタンパク質は、別のグループのユビキチンリガーゼを構成する(Deshaies, R. (1999) Annu. Rev. Dev. Biol. 15:435-467) 。複数のタンパク質がSCF複合体内へ動員される。このタンパク質としては、Skp1、cullin(カリン)、および、或るFボックスドメイン含有タンパク質を含む。このFボックス蛋白質はユビキチン結合反応のために基質に結合する。また、基質特異性を決定し、基質を反応のためにその方向を位置付ける役割を果たす可能性がある。Skp1はFボックス蛋白質とカリンとの双方と相互作用する。また、Fボックス蛋白質とカリンとを、E2酵素からタンパク質基質へのユビキチンの転移のために、複合体内で位置づける過程に関わる可能性がある。SCFリガーゼ類の基質としては、CDK活性の調節、転写の活性化、シグナル伝達、動原体のアセンブリ、およびDNA複製に関わるタンパク質類を含む。
【００２０】
Sgt1は、酵母での、Skp1における突然変異に起因する、動原体機能の欠損を抑止する遺伝子のスクリーニングにおいて同定された(Kitagawa, K. 他(1999) Mol.Cell 4:21-33)。Sgt1は、Skp1と相互作用する。また、SCFユビキチンリガーゼと会合する。Sgt1における欠損は、細胞周期のG1期またはG2期の何れかで細胞の停止を引き起こす。或る酵母Sgt1ヌル変異体は、ヒトSgt1によってレスキューされ得る。これは、多くの種にわたってSgt1機能が保存されていることを示す。Sgt1は、酵母での動原体複合体のアセンブリに必要である。
【００２１】
UCSの異常な活性は、多数の疾患と障害とに関連付けられている。これらには例えば悪液質(Llovera, M. 他 (1995) Int. J. Cancer 61: 138-141) 、腫瘍抑制タンパク質p53の分解 (Ciechanover, 前出) 、および、アルツハイマー病に見られるような神経変性 (Gregori, L. 他 (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1731-1738)を含む。ユビキチン抱合は抗原提示の律速段階なので、ユビキチン分解経路はまた、免疫応答において決定的な役割を持つ可能性がある(Grant E.P. 他(1995) J. Immunol. 155: 3750-3758)。
【００２２】
数種の細胞増殖障害は、細胞周期中の進行を通常は制御するタンパク質複合体の変化により同定され得る。或る初期治療ストラテジーには、細胞周期調節に関与するタンパク質群の操作により、細胞周期進行への制御を再確立することが関係している(Nigg, E.A. (1995) BioEssays 17:471-480)。
【００２３】
腫瘍壊死因子（TNF）と関連サイトカイン類とは、リンパ系細胞においてアポトーシスを誘発する(概説はNagata, S. (1997) Cell 88:355-365)。TNFの、その受容体への結合は或るシグナル伝達経路の引き金となり、その結果、カスパーゼと呼ばれる関連プロテアーゼ群のカスケードの活性化が生じる。このようなカスパーゼの1種であるICE(インターロイキン1β変換酵素)はシステインプロテアーゼであり、ICEは、ICE自己切断によって産生される、2種の大サブユニットと2種の小サブユニットとからなる(Dinarello, C. A. (1994) FASEB J. 8:1314-1325)。ICEは、主に単球で発現される。ICEはサイトカイン前駆体であるインターロイキン1βを活性型へ変換し、その活性型が、急性炎症、慢性炎症、骨吸収、骨髄性白血病、および他の病理プロセスにおいて中心的役割を果たす。ICEと関連カスパーゼ類とは、形質移入した細胞株内で過剰発現すると、アポトーシスを起こす。
【００２４】
アポトーシス性エフェクター経路の最終ステップは、核DNAの断片化である。最近、カスパーゼ活性をDNA断片化に連結する新規の因子が同定された(Xuesong, L. 他(1997) Cell 89:175-184)。この因子、DNA断片化因子45(DFF-45)は、カスパーゼによってタンパク分解的に活性化される。また、DNA断片化に必要である。DFF-45は331アミノ酸の長さである。また、細胞内で、第二の特徴付けられていない因子とのヘテロ二量体として存在する。DFF-45のアミノ酸配列が示すところではDFF-45はヌクレアーゼではなく、このことは、DFF-45が下流ヌクレアーゼを活性化することを示唆する。また、DFF-45に関連する或るタンパク質をコードするmRNAが、マウス脂肪生成細胞から単離されている(Danesch, U. 他(1992) J. Biol. Chem. 267:7185-7193) 。このmRNAの発現は、ステロイド処理した、分化中の脂肪細胞内で誘発される。予測されたタンパク質であるFSP-27(脂肪細胞特異的で27キロダルトン)は高度に塩基性であり、予測等電点は10である。
【００２５】
アポトーシスの調節不全は最近、多くのヒト疾患の発生機序における有意な因子として認識されている。例えば、アポトーシス低下によって生じた過剰な細胞生存は、細胞増殖と免疫応答とに関する諸障害に寄与しうる。これらの障害としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、および炎症を含む。一方、アポトーシス増加によって生じた過剰な細胞死は、変性障害および免疫不全症(例えばAIDS、神経変性疾患、および骨髄異形成症候群)をもたらしうる(Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462)。
【００２６】
胚形成
哺乳類の胚形成プロセスには、受胎後の最初の数週間の発達を含む。この期間に、胚形成は、単一の受精卵から、3種の胚組織の形成へ、次に胚へと進む。この胚は、その殆どの内部器官と、その全ての外的特徴とを持つ。
【００２７】
正常なコースの哺乳類胚形成は、多数の遺伝子と組織との、妥当な時間的および空間的な調節に依存する。これらの調節プロセスは、マウスで熱心に研究されている。依然として理解の乏しい或る必須プロセスが、受精後の胚ゲノムの活性化である。マウス卵母細胞が成長するにつれ、卵母細胞は転写物を蓄積する。転写物は、直接にタンパク質へ翻訳されるか、または調節されたポリアデニル化による後の活性化のために貯蔵されるかの何れかである。その後の減数分裂型成熟と排卵との間、母性ゲノムは転写的に不活性であり、殆どの母性転写物は、2細胞期における接合体遺伝子群の活性化に先立ち、または伴い、脱アデニル化および／または分解される(Stutz, A. 他(1998) Genes Dev. 12:2535-2548)。母性から胚性への移行には、卵母細胞転写物の分解を伴うが接合体転写物の分解は伴わず、また、胚ゲノムの活性化と、早期発達に順応するための細胞周期進行の誘導とを伴う。
【００２８】
MATER (Maternal Antigen That Embryos Require：胚が必要とする母性抗原)は初め、卵巣免疫を持つマウスに由来する抗体群の標的として同定された(Tong, Z-B., and Nelson, L.M. (1999) Endocrinology 140:3720-3726)。MATERをコードする遺伝子の発現は卵母細胞に限られ、この遺伝子を、限られた数の、哺乳類での既知の母性効果遺伝子の1つにしている(Tong, Z-B., 他(2000) Mamm.Genome 11:281-287)。MATERタンパク質は2細胞から先の胚の発達に必要である。これは、この遺伝子が非活性化されたマウスでの予備結果に基づく。1111アミノ酸のMATERタンパク質内には、或る親水性リピート領域(アミノ末端内)と、或る、14ロイシンリッチリピート群を持つ領域(カルボキシル末端内)とを含む。これらリピートは、タンパク質間相互作用に決定的である、ブタのリボヌクレアーゼ阻害剤に見られる配列に似ている。
【００２９】
減数分裂型成熟と排卵との際の母性転写物の分解は、排卵直前のリボヌクレアーゼの活性化に関わる可能性がある。したがって、MATERの機能は、母性リボヌクレアーゼに結合し、接合体転写物の分解を防ぐことである可能性がある(Tong (2000) 前出)。卵母細胞発達と胚形成とにおける役割に加え、MATERはまた、卵巣免疫の発生機序に関わる可能性がある。理由は、MATERが、自己免疫性卵巣炎を持つマウスにおいて自己抗体の標的であるからである(Tong (1999) 前出)。
【００３０】
母性mRNA D7は、アフリカツメガエルでは中程度に豊富な転写物である。その発現は、卵形成と早期胚形成とで最高であり、おそらくこれらの時期に限られる。D7タンパク質は卵母細胞には存在せず、卵母細胞成熟時に初めて蓄積し始める。D7タンパク質レベルは胚の発生の初日に最高であり、その後は減少する。D7タンパク質の損失は、成熟プロセス自体に影響し、胚小胞分解の時間経過を有意に遅らせる。このように、D7は、卵母細胞成熟に関わる、新規に記載されたタンパク質である(Smith R.C., 他(1988) Genes Dev. 2(10):1296-306)。
【００３１】
多くの他の遺伝子が、以後の胚形成の諸ステージに関わる。受精後、卵母細胞の誘導が各卵管の遠位端の卵管采によって成され、卵母細胞は卵管に入り、通過し、そして子宮へ誘導される。子宮内膜で諸変化が起こり、受精卵の着床と胚の発達とを支持する準備ができる。幾つかの段階での分割が起きた後、今や約100細胞を持つ胚盤胞となった分割卵が、子宮に入る。子宮に到達すると、発達中の胚盤胞は通常、子宮腔に更に2〜4日とどまった後、子宮内膜(子宮の内層)内に着床する。着床は、栄養膜細胞の作用による。栄養膜細胞は、胚盤胞の表面を覆って発達する。栄養膜細胞は、タンパク分解酵素群を分泌し、これら酵素が、内膜の細胞を消化し液化する。侵入プロセスの概説は、Fisher および Damsky (1993; Semin Cell Biol 4:183-188)並びにGraham および Lala (1992; Biochem Cell Biol 70:867-874)にある。着床が起きると、栄養膜細胞および他の下層細胞は迅速に増殖し、胎盤および、妊娠の種々の膜を形成する(Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, 8th ed. W.B. Saunders Company, Philadelphia 915-919ページを参照)。
【００３２】
胎盤は、発達する胎児を保護し養う、必須の役割を持つ。大抵の種では、合胞体栄養細胞層が、胎盤の外側の、胎児-母体インターフェースに在る。これは連続構造で、1細胞の深さを持ち、構成物である栄養膜細胞の融合によって形成される。合胞体栄養細胞は、母体-胎児間交換に、胎児発生時の組織リモデリングに、また、発生時の胎児の、母性免疫応答からの保護において重要な役割を果たす(Stoye, J.P. および Coffin, J.M. (2000) Nature 403:715-717)。
【００３３】
syncytin(シンシチン)と言う遺伝子は、ヒトの内因性の欠損性プロウイルスのエンベロープ遺伝子である。syncytinは、高レベルで胎盤に発現し、精巣ではより弱く発現するが、いかなる他の組織にも検出されない(Mi, S. 他(2000) Nature 403:785-789)。胎盤内のsyncytin発現は、合胞体栄養細胞に限定される。レトロウイルスenvタンパク質類はしばしば細胞融合イベント群の促進に関わるので、syncytinは、栄養膜細胞の、合胞体栄養細胞層への融合の調節に関わりうると考えられた。諸実験が示したところでは、syncytinは、細胞融合をin vitroで仲介しうる。また、抗syncytin抗体類は、胎盤の細胞性栄養細胞の融合を阻害しうる(Mi, 前出)。また、或る保存された免疫抑制ドメインが、レトロウイルスのエンベロープタンパク質群に存在し、syncytinのアミノ酸残基373-397に見られるが、このドメインは、発達する胚に対する母性免疫応答の防止に関わる可能性がある。
【００３４】
syncytinはまた、栄養膜侵入性の調節に、栄養膜の融合と最終分化とを誘発することによって関わる可能性がある(Mi, 前出)。子宮壁の不充分な栄養膜浸潤は、胎盤障害（例えば子癇前症）または妊娠誘発高血圧を伴う。一方、無制御な栄養膜侵入は、絨毛癌およびその他の妊娠性の栄養膜疾患で観察される。このように、syncytin機能は、これら疾患に関わる可能性がある。
【００３５】
細胞分裂
細胞分裂は、全ての生物がこれによって成長し生殖する、基本的プロセスである。単細胞生物(例えば酵母や細菌)では、各細胞分裂により生物の数が2倍となる。一方、多細胞の種では、消耗またはプログラム細胞死により消失した細胞を置換するために、また、新たな組織または器官を作製するための細胞分化のために、多数回の細胞分裂が必要とされる。細胞分裂周期の詳細は異なりうるが、基本的なプロセスは3つの主要な現象からなる。最初の現象である間期には、細胞分裂の準備、DNAの複製、必須タンパク質の作製が含まれる。2番目の現象である有糸分裂では、核物質が分裂して細胞の両側に分離する。最終の現象である細胞質分裂は、細胞質の分配と分裂である。細胞周期移行の順序およびタイミングは、種々のチェックポイント(検問点)で正または負の調節回路によりプロセスを制御する細胞周期調節システムの制御下にある。
【００３６】
細胞周期の調節された進行は、成長制御経路群と、基礎的な細胞周期機構との統合に依存する。細胞周期調節因子群は、ヒトcDNAと酵母cDNAから、過剰発現時に酵母接合フェロモン経路の細胞周期停止シグナル群をブロックまたは活性化するcDNAを選択して同定されている。既知の調節因子としては、ヒトCPR（細胞周期進行回復）遺伝子群(例えばCPR8およびCPR2)、並びに酵母CDC(細胞分裂制御)遺伝子群(CDC91を含み、停止シグナル群をブロック)を含む。CPR遺伝子群は、種々のタンパク質(例えばサイクリン、腫瘍サプレッサー結合タンパク質、シャペロン、転写因子、翻訳因子、およびRNA結合タンパク質を含む)を発現する(Edwards, M.C. 他(1997) Genetics 147:1063-1076)。
【００３７】
幾つかの細胞周期移行(細胞が有糸分裂に入ったり出たりすることを含む)は、サイクリン依存性キナーゼ（Cdk）類の活性化および阻害に依存する。Cdk類の構成は、キナーゼサブユニットであるCdkと、活性化サブユニットであるサイクリンとから成り、これらの複合体は、多くのレベルの調節を受ける。単一のCdkが出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）と分裂酵母（Saccharomyces pombe）に在るようである。一方、哺乳類は、種々の特化したCdkを持つ。サイクリンはサイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk)類へ結合し活性化して作用する。Cdkは次に、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質をリン酸化し活性化する。Cdk-サイクリン複合体は、リン酸化によって、また、CDC4およびCDC53等の分子の関わる、標的を定めた分解によって、正負両方に調節される。また、Cdk類は更に、阻害剤その他のタンパク質(例えばSuc1、これはCdkの、調節因子群への特異性またはアクセス可能性を修正)への結合によって調節される(Patra, D. および W.G. Dunphy (1996) Genes Dev.10:1503-1515; 並びにMathias, N. 他(1996) Mol.Cell Biol. 16:6634-6643)。
【００３８】
生殖
男女の生殖系は複雑であり、また、成長と発達との多くの側面に関わる。男女生殖系の解剖学と生理学との概説は（Guyton, A.C. (1991) Textbook of Medical Physiology, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA, 899-928ページ）にある。
【００３９】
男性生殖系としては精子形成のプロセスを含み、ここで精子が形成される。また男性生殖機能の調節は、種々のホルモンと、それらの、付属性器、細胞代謝、成長、および他の身体機能への効果によって成される。
【００４０】
精子形成は思春期に、下垂体前葉から放出される性腺刺激ホルモンによる刺激の結果として始まる。未熟な精子(精原細胞)は数回の有糸細胞分裂を経た後、減数分裂と完全な成熟を経験する。精巣は数種の男性ホルモンを分泌する。最も豊富なものはテストステロンであり、これは、未熟な精子の成長と分裂とに、また、男性の身体の男性的特徴に必須である。3種の他の男性ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、黄体形成ホルモン(LH)、および卵胞刺激ホルモン(FSH)が、性機能を制御する。
【００４１】
子宮、卵巣、卵管、膣、および乳房が、女性生殖系を構成する。卵巣と子宮とは各々、卵子の源泉であり、胎児発達の部位である。卵管と膣とは付属器官であり、それぞれ子宮の上と下に付いている。子宮と卵巣との両方が、女性の生涯における生殖能力の発生と喪失で、更なる役割を有する。乳房の主要な役割は泌乳である。卵巣、子宮、下垂体、視床下部、副腎、その他の組織からの多数の内分泌シグナルが、生殖と泌乳とを協調させる。これらシグナルは毎月の月経周期の期間中および女性の生涯の期間中に変動する。同様に、これら内分泌シグナルへの、生殖器の感度は、女性の生涯の期間中に変動する。
【００４２】
卵巣、下垂体、および視床下部への、正負のフィードバックの組合せが、月ごとの排卵および子宮内膜周期での生理変化を制御する。下垂体前葉は、２種の主要な性腺刺激ホルモンである、卵胞刺激ホルモン(FSH)と黄体形成ホルモン(LH)とを分泌する。これは、ステロイド類の負のフィードバックによって(最も著しくは卵巣エストラジオールによって)調節される。受精が起きない場合、エストロゲンとプロゲステロンとのレベルが低下する。この、卵巣ホルモンの急激な減少は、月経(内膜の剥離)を生じる。
【００４３】
ホルモンは更に、妊娠、分娩、泌乳、および閉経の、全ステップを支配する。妊娠時には、多量のヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、エストロゲン、プロゲステロン、およびヒト絨毛性ソマトマンモトロピン(hCS)が、胎盤によって形成される。hCGは黄体形成ホルモンに似た糖タンパク質であり、黄体が、更なるプロゲステロンとエストロゲンとを産生し続け、卵子が受精しないときに起きるように萎縮することの無い様に刺激する。hCSは成長ホルモンに似ており、胎児の栄養摂取に死活的である。
【００４４】
女性乳房はまた、妊娠時に成熟する。多量のエストロゲンが胎盤から分泌され、乳管系の成長と分枝形成との引き金となる。一方、泌乳の開始は、下垂体によるプロラクチンの分泌によって成される。
【００４５】
分娩には、幾つかのホルモンの変化を伴う。これらの変化が、子宮の収縮性を、妊娠の終了に向けて次のように増大させる。エストロゲンのレベルが、プロゲステロンのレベル以上に増加する。オキシトシンが、神経下垂体によって分泌される。同時に、オキシトシンへの子宮の感度が増加する。胎児自身がオキシトシン、コルチゾル(副腎から)、およびプロスタグランジンを分泌する。
【００４６】
閉経は、大半の卵胞が変性したときに起きる。卵巣はその後、より少ないエストラジオールを産生し、下垂体と視床下部での負のフィードバックを低下させる。循環するFSHとLHとの平均レベルが増加する(排卵周期が続くにも関わらず)。したがって、卵巣は性腺刺激ホルモンへの応答性がより低く、また、月経周期の間の時間が増加する。結果的に、月経出血が止まり、生殖能力が終了する。
【００４７】
細胞分化および増殖
組織成長には、複雑で秩序あるパターンの、細胞増殖、細胞分化、およびアポトーシスが関わる。細胞増殖は、細胞の数と、細胞の空間的構成との双方を維持するために調節される必要がある。この調節は、成長因子や他の有糸分裂促進因子(マイトジェン)などの細胞外信号と、DNA損傷または栄養飢餓などの細胞内合図とに応じて細胞周期の進行を制御するタンパク質の、適切な発現に依存する。細胞周期の進行を直接または間接的に調節する分子は、成長因子とその受容体、セカンドメッセンジャーとシグナル伝達タンパク質、発癌遺伝子産物、腫瘍抑制タンパク質、および有糸分裂促進因子などの、複数のカテゴリーに分類される。
【００４８】
成長因子は初め、細胞増殖の促進に必要な血清因子として記載された。殆どの成長因子は大きな分泌ポリペプチドであり、その局所環境にある細胞に作用する。成長因子は、特異的な細胞表面受容体に結合して活性化させ、細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。多くの成長因子受容体は、リガンド結合時に自己リン酸化を受ける受容体チロシンキナーゼとして分類される。自己リン酸化は、受容体が、SH2ドメインまたはSH3ドメイン(Src相同性領域2又は3)の存在で特徴付けられるシグナル伝達タンパク質と相互作用することを可能にする。これらタンパク質は次に、小さなGタンパク質(例えばRas、Rab、およびRho)の活性状態の調整を、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)、グアニンヌクレオチド放出タンパク質(GNRP)、および他のグアニンヌクレオチド交換因子と共に行う。小さなGタンパク質は、他の下流イベント(例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPキナーゼ）のカスケード)を活性化する分子スイッチとして作用する。MAPキナーゼは最終的に、有糸分裂促進遺伝子の転写を活性化する。
【００４９】
成長因子に加え、小さなシグナル伝達ペプチドとホルモンも、細胞増殖に影響する。これら分子は主に他のクラスの受容体、即ち三量体のGタンパク質共役受容体(GPCR)に結合する。GPCRは、免疫細胞、神経細胞、および神経内分泌細胞の表面に主に見られる。リガンド結合時に、GPCRは三量体Gタンパク質を活性化し、Gタンパク質は次に、細胞内セカンドメッセンジャー（例えばホスホリパーゼC、Ca2+、およびサイクリックAMP）のレベル増加の引き金となる。大抵のGPCR仲介シグナル伝達経路は、直接の分裂促進効果を持つ、他のシグナリング分子の分泌または分解を起こして間接的に細胞増殖を促進する。これらのシグナル伝達カスケードはしばしば、キナーゼとホスファターゼとの活性化を伴う。数種の成長因子(例えばトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）ファミリーの幾つかのメンバー)は、数種の細胞上では細胞増殖を刺激するよう作用し、他の細胞では増殖を阻害するよう作用する。成長因子はまた、或る細胞を或る濃度では刺激し、同じ細胞を他の濃度では阻害することがある。大抵の成長因子はまた、細胞成長と細胞分裂との調節以外に、多数の他の作用を持つ。それら因子は、状況に応じ、細胞の増殖、生存、分化、遊走、または機能を制御できる。例えば腫瘍壊死因子／神経成長因子（TNF/NGF）ファミリーは、細胞死を活性化または阻害でき、また、増殖と分化とを調節できる。細胞応答は、細胞のタイプ、細胞の分化のステージ、トランスフォーメーション状態、どの表面受容体が刺激されるか、および、細胞に作用する刺激のタイプに依存する(Smith, A. 他(1994) Cell 76:959-962; およびNocentini, G. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221)。
【００５０】
組織内で隣接する細胞群は、成長因子について競合する。また、灌流した系内で「無限」量を提供されると、細胞分裂の密度依存性阻害に到達するまでに、一層高い細胞密度まで成長することとなる。細胞はしばしば、細胞分裂の足場依存性をも示す。この足場依存性は、細胞骨格を細胞外マトリクス(ECM)と連結する接着点の形成に関連する可能性がある。ECM成分の発現は、成長因子によって刺激されうる。例えばTGF-βは、線維芽細胞を刺激し、種々のECMタンパク質(これにはフィブロネクチン、コラーゲン、およびテネイシンを含む)を産生させる(Pearson, C.A. 他(1988) EMBO J. 7:2677-2981)。事実、数種の細胞タイプに特異的なECM分子(例えばラミニンまたはフィブロネクチン)は、成長因子として作用しうる。テネイシンCとテネイシンRとは発生期と罹患時との神経組織に発現され、刺激性／抗接着特性または阻害特性を各々、軸索成長に提供する(Faissner, A. (1997) Cell Tissue Res. 290:331-341)。
【００５１】
癌は、正常な細胞遺伝子に由来する発癌遺伝子類の活性化を伴う。これら発癌遺伝子は腫瘍性タンパク質をコードし、このタンパク質が正常な細胞を悪性細胞に転換する。数種の腫瘍性タンパク質は正常タンパク質の突然変異アイソフォームであり、他の腫瘍性タンパク質は、発現の部位または量に関して異常に発現する。後者のカテゴリーの腫瘍性タンパク質は、細胞増殖の転写調節を変更することにより癌の原因となる。5クラスの腫瘍性タンパク質が、細胞周期制御に影響することが既知である。これらクラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質を含む。ウイルス発癌遺伝子は、ヒト細胞が数種のウイルスに感染するとヒトゲノムに組込まれる。ウイルス発癌遺伝子の例としては、v-src、v-abl、およびv-fpsを含む。腫瘍と転移とに関わるタンパク質の過剰発現に関連する多くの症例が報告されている。Mta1遺伝子は、マウスでは、転移性腫瘍を示す細胞株と組織との双方においてクローン化されている(Simpson, A. 他(2001) Gene 273:29-39)。メラノーマ抗原コード遺伝子(MAGE)ファミリーのタンパク質の発現も、多くの腫瘍で検出されている。GAC1はロイシンリッチリピートスーパーファミリーの新規メンバーであり、悪性グリオーマでは増幅され過剰発現する(Almeida, A. 他(1998) Oncogene 16: 2997-3002)。
【００５２】
多くの発癌遺伝子が同定され特徴付けられている。発癌遺伝子としてはerbA、erbB、her-2、突然変異Gs、src、abl、ras、crk、jun、fos、myc、および突然変異した腫瘍抑制遺伝子(例えばRB、p53、mdm2、Cip1、p16、およびサイクリンD)を含む。正常遺伝子から発癌遺伝子への転換は、染色体転座によっても起こりうる。フィラデルフィア染色体は、慢性骨髄性白血病と、或るサブセットの急性リンパ芽球性白血病との特徴であり、これは、9番染色体と22番染色体との間の相互転座の結果である。この転座は、プロトオンコジーンc-ablの或る切り詰められた部分を、22番染色体のブレークポイント(切断点)クラスター領域(bcr)へ移動させる。
【００５３】
腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖の調節に関係する。腫瘍抑制遺伝子の機能を低減または喪失させる突然変異の結果、無制御な細胞増殖が起こる。例えば網膜芽腫遺伝子産物(RB)は、非リン酸化状態では、数種の早期応答遺伝子と結合し、それらの転写を抑制して、細胞分裂をブロックする。RBのリン酸化は、RBをこれら遺伝子から解離させ、抑制を解除し、細胞分裂を進行させる。
【００５４】
SEB（SET結合タンパク質）は新規な核タンパク質である。SEBは酵母2ハイブリッド系とヒト細胞内でSETと相互作用する。SETは転座切断点コード蛋白質であり、急性未分化白血病に見られる。SEBはまた、１つの腫瘍性タンパク質Ski相同領域、６つのPEST配列群、および３つの連続PPLPPPPPリピート群を、C末端に持つ。SEB mRNAの発現は、全ての試験されたヒト成人組織および細胞に遍在的に見られる。SETは、染色体18q21.1にマップされている。この領域にはまた、癌と白血病とでの欠失に関わる腫瘍抑制遺伝子群を含む(Minakuchi, M. 他(2001) Eru. J. Biochem. 268:1340-1351)。
【００５５】
細胞分化
多細胞生物は、各細胞は互いに、その遺伝的資性において類似しているにもかかわらず、構造及び機能が著しく異なる多様な細胞型から構成される。細胞分化のプロセスによって、細胞群は、その構造と生理機能とが異なるようになる。多細胞生物の細胞は全て、単細胞接合体の有糸分裂に起因する。接合体は全能性である。即ち、成体の如何なるタイプの細胞をも生じる能力を持つ。発生中に、接合体の細胞子孫はその全能性を失い、決定されて行く。細胞の予定運命が樹立すると、細胞は分化したと言われる。この細胞の全ての子孫は、同じタイプとなる。
【００５６】
ヒトの成長と発達とには、細胞増殖、および調節された細胞死と共に、細胞分化の空間的および時間的な調節を要する。これらのプロセスは協調し、生殖、老化、胚形成、形態形成、器官形成、ならびに組織の修復および維持を制御する。細胞分化に関わる諸プロセスはまた、病態（癌など）にも関与する。この場合、正常な細胞分化を調節する因子類が変容しており、癌細胞を未分化または低分化状態で増殖させる。
【００５７】
分化の機序には転写と翻訳との細胞特異的な調節を伴うので、異なる遺伝子群が、異なる時期に異なる細胞で選択的に発現する。遺伝実験にショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)を用いて、発生および分化時のパターン形成を制御する転写因子の、調節されたカスケードが同定されている。これらカスケードには、ホメオティック遺伝子群を含む。これら遺伝子は、ホメオボックスモチーフを持つ転写因子群をコードする。ホメオティック遺伝子の産物は、如何にしてこの昆虫の成虫原基が未分化細胞の塊から複雑な器官を持つ特異的な体節へ発達するかを決定する。ショウジョウバエの細胞分化と発達とに関わることが見出された多くの遺伝子は、相同体を哺乳類に有する。数種のヒト遺伝子は、そのショウジョウバエ相同体と等価の発達的役割を持つ。ショウジョウバエeyes absent遺伝子(eya)のヒト相同体はbranchio-oto-renal(鰓弓耳腎)症候群の根底にある。この発達障害は、耳と腎臓とを冒す(Abdelhak, S. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-164)。ショウジョウバエslit遺伝子は、分泌性のロイシンリッチリピート含有タンパク質をコードする。このタンパク質は、正中線膠細胞によって発現される。また、正常な神経発生に必要である。
【００５８】
細胞レベルでは、成長と発達との支配は、細胞が細胞周期に入ったり出たりする決定に、また、細胞の、最終分化状態へのコミットメントによって成される。細胞内の分化遺伝子発現は、細胞外シグナルとその他の環境合図へ応答して誘発される。このようなシグナルとしては、成長因子および他の分裂促進因子(例えばレチノイン酸)、細胞間接触および細胞-マトリクス接触、並びに、環境因子(例えば栄養シグナル、毒性物質、および熱ショック)を含む。分化の役割を果たしうる候補遺伝子群の同定は、in vitroでの細胞分化の誘発時の、変容した発現パターンによって成されうる。
【００５９】
細胞分化の最終ステップの結果、特化が生じる。特化の特徴は、特定タンパク質の産生(例えば筋細胞での収縮タンパク、肝細胞での血清タンパク、および、赤血球前駆体でのグロビン)である。これら特化タンパクの発現は、少なくとも部分的に、細胞特異的転写因子群に依存する。例えばホメオボックス（homobox）含有転写因子PAX-6は、脊椎動物の、早期の眼の決定、眼組織の特異化、および、正常な眼の発達に必須である。
【００６０】
表皮分化の場合、分化特異的遺伝子群の誘発は、成長停止と共にまたはその後の何れかに起こる。また、不可逆的な成長停止を制御する分子イベント群に連関すると思われる。不可逆的な成長停止という早期イベントは、細胞が、皮膚の基底層から、最深部のsuprabasal layer(基底上層)へ移行し、扁平上皮特異的遺伝子群を発現し始めるときに起きる。これら遺伝子としては、架橋したエンベロープの形成に関わる遺伝子(例えばトランスグルタミナーゼIおよびIII、involucrin(インボルクリン)、loricin(ロリクリン)、および、スモールプロリンリッチリピート（SPRR）タンパク等)を含む。SPRRタンパク類は8〜10 kDaの分子量を持ち、プロリン、グルタミン、およびシステインが豊富である。また、類似した反復配列エレメントを持つ。SPRRタンパクは、強い二次構造を持つ構造タンパクであるか、または、金属結合タンパク(メタロチオネインなど)でありうる(Jetten, A. M. および Harvat, B. L. (1997) J. Dermatol. 24:711-725; PRINTS Entry PR00021 PRORICH Small proline-rich protein signature)。
【００６１】
Wnt遺伝子ファミリーの分泌シグナル分子は、真核細胞全体で高度に保存されている。Wntファミリーのメンバーは、軟骨テンプレート(cartilage template)内の軟骨細胞分化の調節に関わる。Wnt-5a、Wnt-5b、およびWnt-4遺伝子の発現は、ニワトリ四肢の軟骨形成領域で成される。Wnt-5aの発現は、軟骨膜(早期軟骨テンプレートのすぐ周辺の間葉細胞)で成される。Wnt-5a誤発現は、ニワトリ四肢で、軟骨細胞の成熟と、bone collar形成の開始を遅らせる(Hartmann, C. and Tabin, C.J. (2000) Development 127:3141-3159)。
【００６２】
グリピカン(glypicans)は細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンの１ファミリーであり、これらは、細胞成長制御と分化とで重要な役割を果たす。cerebroglycanはヘパラン硫酸プロテオグリカンであって神経系に発現される。これは、発達するニューロンの運動性の挙動に関わる(Stipp, C.S. 他(1994) J. Cell Biol. 124:149-160)。
【００６３】
Notchは膠細胞の分化で活性な役割を果たす。また、神経突起の長さと構成とに影響する(概説は、Frisen, J. および Lendahl, U. (2001) Bioessays 23:3-7を参照)。Notch受容体シグナル経路は、多細胞種での多くの器官および組織の、形態形成と発達とに重要である。ショウジョウバエfringeタンパクは、翅の成虫原基の背腹境界でのNotchシグナル伝達経路の活性化を調整する。哺乳類fringe関連ファミリーメンバーは、分節時の境界決定に関与する(Johnston, S.H. 他(1997) Development 124:2245-2254)。
【００６４】
最近、数種のタンパク質に、或る保存されたシステインリッチドメインがあることがわかり、これは約60アミノ酸残基からなり、LIMドメインと呼ばれる(Lin-11、Isl-1、Mec-3に由来) (Freyd G. 他(1990) Nature 344:876-879; Baltz R. 他(1992) Plant Cell 4:1465-1466)。LIMドメインには、７つの保存されたシステイン残基と、１つのヒスチジンとがある。LIMドメインは、2個の亜鉛イオンと結合する(Michelsen J.W. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4404-4408) 。LIMはDNAとは結合せず、むしろ、タンパク間相互作用のインターフェースとして作用するようである。
【００６５】
アポトーシス
多細胞生物の正常な発生、成長、および恒常性には、全身の組織での細胞の産生と破壊との間の慎重なバランスを要する。細胞分裂は、慎重に調整されるプロセスであり、多数のチェックポイントと制御機序とを持つ。これらの機序の設計は、DNA複製を調節し、不適切または過剰な細胞増殖を防ぐように成される。一方、アポトーシスは、遺伝的に制御されたプロセスであり、これにより、不要なまたは欠陥のある細胞が、プログラム細胞死を迎える。壊死細胞または傷害細胞と異なり、アポトーシス細胞は、その潜在的に損傷性の内容物を周辺組織に漏らしたり、炎症応答の引き金となったりすることなく、隣接細胞またはマクロファージに迅速に貪食される。
【００６６】
アポトーシスは遺伝的に制御されたプロセスであり、これにより、不要なまたは欠陥のある細胞が、プログラム細胞死を迎える。細胞の選択的除去は、形態形成と組織リモデリングにとって、細胞増殖および分化と同じく重要である。アポトーシス不足の結果、過形成その他の、増加した細胞増殖に伴う障害を生じうる。アポトーシスはまた、免疫応答の決定的要素である。免疫細胞(例えば細胞障害性T細胞およびナチュラルキラー細胞)は、腫瘍細胞やウイルス感染細胞にアポトーシスを誘発して、疾患が広がるのを防ぐ。また、自己分子と外来分子とを区別しない免疫細胞は、アポトーシスで除去され自己免疫応答を避ける必要がある。
【００６７】
アポトーシス細胞は、明確な形態変化を経る。アポトーシスの特質としては、細胞収縮、核と細胞質との凝縮、および、形質膜トポロジーの変容を含む。生化学的には、アポトーシス細胞の特徴は、増加した細胞内カルシウム濃度、染色体DNAの断片化、および、新規な細胞表面成分の発現である。
【００６８】
アポトーシスの分子機序は高度に保存されており、アポトーシスの鍵となる多くのタンパク調節因子およびエフェクターが同定されている。アポトーシスは一般に、細胞内伝達され結果として変容したパターンの遺伝子発現とタンパク活性とを生じるシグナルに応じて進行する。シグナル分子(例えばホルモンやサイトカイン)は、アポトーシスの刺激と阻害との双方を、細胞表面受容体との相互作用を介して行うことが知られる。転写因子もまた、アポトーシスの開始において重要な役割を果たす。多数の下流エフェクター分子(特にプロテアーゼ)が、細胞成分の分解と、他のアポトーシスエフェクター群のタンパク分解活性化とに関連付けられている。
【００６９】
Bcl-2ファミリーのタンパク質は、他の細胞質タンパクと同様、アポトーシスの鍵となる調節因子である。少なくとも15種のBcl-2ファミリーメンバーが、3種のサブファミリーに存在する。Bcl-2タンパクは、哺乳類細胞とウイルスとで同定されている。また、各々が、4種のBcl-2相同性ドメイン(BH1〜BH4)の少なくとも1つを持つ。これらドメインは高度に保存される。Bcl-2ファミリー蛋白にはBH1およびBH2ドメインが含まれ、これらはプロサバイバル(生存促進)サブファミリーのメンバーに見られるが、Bcl-2に最も似たタンパク類は4種すべての保存ドメインを持ち、種々の細胞障害性の挑戦に遭遇した際のアポトーシスの阻害を可能にしている。プロサバイバルサブファミリーのメンバーとしては、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、およびA1(哺乳類); NF-13 (ニワトリ); CED-9 (線虫Caenorhabditis elegans); 並びにウイルス蛋白であるBHRF1、LMW5-HL、ORF16、KS-Bcl-2、およびE1B-19Kを含む。BH3ドメインは、プロアポトーシスサブファミリー蛋白の機能に必須である。2種のプロアポトーシスサブファミリーである、BaxとBH3とには各々、Bax、Bak、およびBok(別名Mtd)と、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bad、Bid、およびEgl-1 (C. elegans)とを含む。BaxサブファミリーのメンバーはBH1、BH2、およびBH3ドメインを持ち、Bcl-2にかなり良く似ている。一方、BH3サブファミリーのメンバーは9〜16残基のBH3ドメインのみを持つ以外は如何なる既知タンパクとも無関係であり、BikとBlkとのみが配列類似性を共有する。2種のプロアポトーシスサブファミリーのタンパク質は、プロサバイバルサブファミリー蛋白のアンタゴニストの可能性がある。この例証はC. elegansにあり、ここではEgl-1(アポトーシスに必要)が、CED-9に結合し、これを介して作用する(概説はAdams, J.M. および Cory, S. (1998) Science 281:1322-1326を参照)。
【００７０】
プロアポトーシスサブファミリー蛋白および抗アポトーシスサブファミリー蛋白の間のヘテロ二量体化は、これらタンパク質サブファミリーの機能へタイトレーション的効果を持つようであり、これが示唆するところでは、各サブファミリーのメンバーの相対濃度が作用してアポトーシスを調節する。ヘテロ二量体化はプロサバイバル蛋白には不要だが、BH3サブファミリーには必須であり、Baxサブファミリーにはさほどでない。
【００７１】
Bcl-2タンパクは2種のアイソフォーム、αとβとを持ち、これらは選択的スプライシングによって形成される。Bcl-2はホモ二量体を形成し、また、BaxおよびBakタンパク、並びにBcl-XアイソフォームであるBcl-xとのヘテロ二量体を形成する。Baxとのヘテロ二量体化には無傷のBH1およびBH2ドメインを要する。またこれは、プロサバイバル活性に必要である。BH4ドメインも、プロサバイバル活性に関わるようである。Bcl-2はミトコンドリアの内膜と外膜に局在し、また核エンベロープと小胞体内にも局在し、発現は種々の組織で成される。Bcl-2のろ胞性リンパ腫(タイプII慢性リンパ性白血病)での関与が、染色体転座T(14;18) (q32;q21)に見られ、Bcl-2の関与は免疫グロブリン遺伝子領域に関わる。
【００７２】
Bcl-xタンパク質は、アポトーシス細胞死の主要な調節因子である。選択的スプライシングの結果、3種のアイソフォームである、Bcl-xB、長いアイソフォーム、および短いアイソフォームを生じる。長いアイソフォームは細胞死抑制作用を示し、短いアイソフォームはアポトーシスを促進する。Bcl-xLはBaxおよびBakとのヘテロ二量体を形成するが、Baxとのヘテロ二量体化は、プロサバイバル(抗アポトーシス)活性に必要とは見えない。Bcl-xSはBcl-2とのヘテロ二量体を形成する。Bcl-xは、ミトコンドリア膜と、核周囲エンベロープとに見られる。Bcl-xSの高レベルでの発現は、発生中のリンパ球その他の、高速の代謝回転を受けている細胞に見られる。Bcl-xLは、成人の脳に、また、他の組織の、寿命の長い有糸分裂後細胞に見られる。Bcl-2と同様、BH1、BH2およびBH4ドメインは、プロサバイバル活性に関わる。
【００７３】
Bcl-wタンパクは、殆ど全ての骨髄性細胞系の細胞質に、また多数の組織に見られる。最高の発現レベルは、脳、結腸、および唾液腺に見られる。Bcl-wタンパクは、低レベルでは精巣、肝臓、心臓、胃、骨格筋、および胎盤、並びに少数のリンパ性細胞系において発現される。Bcl-wは、BH1、BH2、およびBH4ドメインを持ち、この全ては、その細胞生存促進活性に必要である。Bcl-w遺伝子機能が相同組換えで破壊されたマウスは生存可能で、健康で、外見が正常であり、成体雌は正常な生殖機能を有したが、成体雄は不妊性であった。これら雄では、精子形成の最初の前思春期段階の大部分は無影響で、精巣は正常に発達した。しかし精細管が無秩序で、多数のアポトーシス細胞を有し、成熟精子を作れなかった。このマウスモデルは、数種のヒト男性不妊に適用できる可能性があり、この示唆するところでは、精巣のプログラム細胞死の改変は、生殖力の調整に有用であり得る(Print, C.G. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431)。
【００７４】
ラット虚血脳の研究では、Bcl-wが、非虚血脳で正常なレベル（恒常的に低い）で発現されているのに比して、虚血脳で過剰発現されていた。更に、in vitro試験でBcl-wの作用機序を実験したところ、単離したラット脳ミトコンドリアは、Bcl-wも存在すると、組換えBaxまたは高濃度のカルシウムの添加に応答不能であった。正常な応答であれば、チトクロムcがミトコンドリアから放出されたであろう。また、組換えBcl-wタンパクは、カルシウム誘発によるミトコンドリア膜電位の喪失を阻害することが見られた。これは、透過性の変化を示す。これらの所見が共に示唆するところでは、Bcl-wは、虚血性神経細胞死に対する神経保護作用を示し、この保護を、ミトコンドリア死亡調節経路を介して達成する(Yan, C. 他(2000) J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:620-630)。
【００７５】
bfl-1遺伝子は、Bcl-2ファミリーの更なるメンバーであり、これもアポトーシスの抑制因子である。Bfl-1タンパクは175アミノ酸を持ち、また、BH1、BH2、およびBH3保存ドメインを持つ。これらドメインはBcl-2ファミリーメンバーに見られる。Bfl-1はまた、GlnリッチなNH2末端領域を持ち、NHドメイン1を欠く。これは他のBcl-2ファミリーメンバーと異なる。マウスA1タンパクは、Bfl-1と高い配列相同性を共有し、Bfl-1に見られる3種の保存ドメインを持つ。p53腫瘍抑制タンパクに誘発されるアポトーシスは、Bfl-1によって抑制される。これは、Bcl-2、Bcl-xL、およびEBV-BHRF1の作用に似る(D'Sa-Eipper, C. 他(1996) Cancer Res. 56:3879-3882)。Bfl-1は細胞内に見られる。最高発現は、造血区画(即ち血液、脾臓、および骨髄)に見られ、中等度の発現は肺、小腸、および精巣で、また最少発現は他の組織に見られる。Bfl-1はまた、血管平滑筋細胞および造血器悪性腫瘍(hematopoietic malignancies)に見られる。bfl-1の発現レベルと、胃癌の発症との間の相関が記述されており、その示唆するところでは、Bfl-1タンパクは、癌細胞生存の促進、または癌で胃癌の発症に関わる。(Choi, S.S. 他(1995) Oncogene 11: 1693-1698)。
【００７６】
癌の特徴は、継続的で、または無制御な細胞増殖である。数種の癌には、正常なアポトーシス細胞死の抑制を伴う。治療のストラテジーには、細胞周期進行への制御を再確立することや、癌細胞のアポトーシスを選択的に刺激することを含みうる(Nigg, E.A. (1995) BioEssays 17:471-480)。癌の免疫防御としては、突然変異細胞での、腫瘍抑制因子によるアポトーシスの誘発と、腫瘍抗原の、Tリンパ球による認識とを含む。分裂促進ストレスへの応答は、しばしば転写のレベルで制御される。また、種々の転写因子によって調整される。例えばRel/NF-κBファミリーの脊椎動物転写因子は、放射線への炎症応答および免疫応答で中心的な役割を果たす。NF-κBファミリーとしては、p50、p52、RelA、RelB、cRel他のDNA結合タンパクを含む。p52タンパクはアポトーシスを誘発し、転写因子c-Junを上方制御し、c-Jun N末端キナーゼ１(JNK1)を活性化する(Sun, L. 他(1998) Gene 208:157-166)。大抵のNF-κBタンパクは、DNA結合ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。多くの転写因子の二量体化の仲介は、或る保存された配列が行う。bZIPドメインとして知られるその配列の特徴は、或る塩基性領域とそれに続く1つのロイシンジッパーである。Fas/Apo-1受容体(FAS)は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのメンバーである。そのリガンド(Fasリガンド)と結合すると、膜貫通型のFASは、アポトーシスの誘発を、数種の細胞質タンパクを動員して行う。これらタンパクが死のシグナルを伝達する。FAS関連タンパク因子1 (FAF1)と呼ばれる、このようなタンパク質の1つが、マウスから単離された。また、L細胞でのFAF1の発現が、FAS誘発アポトーシスを増強することが示された(Chu, K. 他(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11894-11898) 。続いて、FAS関連因子群の単離が、多数の他の種(例えばショウジョウバエやウズラ)で成されている(Frohlich, T. 他(1998) J. Cell Sci. 111:2353-2363)。Fasからの死のシグナルの伝達で機能する別の細胞質タンパクがFas会合デスドメイン蛋白、略称FADDである。FADDは、死のシグナルを、FAS媒介およびTNFレセプター媒介アポトーシス経路の双方で、カスパーゼ8を活性化して伝達する(Bang, S. 他(2000) J. Biol. Chem. 275:36217-36222)。
【００７７】
染色体DNAの断片化は、アポトーシスの特質の１つである。DNA断片化因子(DFF)タンパクは、2種のサブユニットからなる。40-kDaのカスパーゼ活性化ヌクレアーゼであるDFF40/CADと、その45-kDaの阻害因子であるDFF45/ICADである。DFF45/ICADの2種のマウス相同体であるCIDE-AおよびCIDE-Bが最近、報告されている(Inohara, N. 他(1998) EMBO J. 17:2526-2533)。哺乳類細胞でのCIDE-AとCIDE-Bとの発現はアポトーシスを活性化し、CIDE-A単独の発現は、DNA断片化を誘発した。また、FAS媒介アポトーシスは、CIDE-AとCIDE-Bとによって増進された。これは、これらタンパク質を、アポトーシスを媒介するエフェクターとして更に関連付ける。
【００７８】
転写因子は、アポトーシスの開始において重要な役割を果たす。多数の下流エフェクター分子、特にプロテアーゼ（例えばカスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼ）が、アポトーシスの開始段階と実行段階に関与している。カスパーゼの活性化は、プロサバイバルおよびプロアポトーシス型Bcl-2関連タンパクの競合作用による(Print, C.G. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12424-12431) 。プロアポトーシス性シグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的なアポトーシス細胞死に導く。2つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機序に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの1つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。
【００７９】
カスパーゼは、不活性酵素前駆体として合成され、この不活性酵素前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される1つの大きな（p20）サブユニットと1つの小さな（p10）サブユニット、および、可変N末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスを高めたりまたは低めたりして影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルは、特異的なアスパラギン酸残基の自己タンパク質分解切断（カスパーゼ1の番号付け規則ではD297）およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、p10/p20ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーの2つが、その小サブユニットを介して相互作用し、触媒的に活性な四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。幾つかのカスパーゼはそのプロドメインに「デスエフェクタードメイン」を含み、それによって、他のカスパーゼおよび、FADDタンパク質会合細胞死受容体（death receptor）との自己活性化複合体に、あるいはTNF受容体複合体に、カスパーゼが補充されうる。さらに、カスパーゼファミリーの異なるメンバーからの2つの二量体が会合して、結果として得る四量体の基質特異性を変えることができる。
【００８０】
アポトーシスの欠陥的調節は、アルツハイマー病でのニューロンの喪失に関わる。アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、老人斑と、神経原線維変化との形成である。これらは、アミロイドβペプチドを含む。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。Bアミロイドペプチドは、アポトーシスを誘発しニューロンの死をもたらすシグナル経路に関わる(Kajkowski, C. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:18748-18756) 。アルツハイマーの病理の早期には、生理変化が帯状皮質で見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスをそこなう。
【００８１】
腫瘍壊死因子（TNF）と関連サイトカイン類とは、リンパ系細胞においてアポトーシスを誘発する(概説はNagata, S. (1997) Cell 88:355-365)。TNFの、その受容体への結合は、或るシグナル伝達経路の引き金となり、その結果、タンパク分解的カスパーゼカスケードの活性化が生じる。このようなカスパーゼの1種であるICE(インターロイキン1β変換酵素)はシステインプロテアーゼであり、ICEは、ICE自己切断によって産生される、2種の大サブユニットと2種の小サブユニットとからなる(Dinarello, C. A. (1994) FASEB J. 8:1314-1325)。ICEは、主に単球に発現する。ICEはサイトカイン前駆体であるインターロイキン1βを活性型へプロセシングし、活性型が、急性炎症および慢性炎症、骨吸収、骨髄性白血病、および他の病理プロセスにおいて中心的役割を果たす。ICEと関連カスパーゼ類とは、形質移入した細胞株内で過剰発現すると、アポトーシスを起こす。
【００８２】
カスパーゼ補充ドメイン(CARD)は、数種のアピカルカスパーゼ（apical caspases）のプロドメインに見られる。また、数種のアポトーシス調節分子、例えばApaf-2、RAIDD、および、アポトーシス蛋白の細胞性阻害物質(IAP)で保存される(Hofmann, K. 他(1997) Trends Biochem. Sci. 22:155-157) 。アポトーシスでのCARDの調節的役割は、Apaf-1等のタンパク質をカスパーゼ9と会合させることでありうる(Li, P. 他(1997) Cell 91:479-489)。骨格筋と心筋との双方で発現する、CARD含有アポトーシス抑制因子（ARC）をコードする或るヒトcDNAが、同定され特徴付けられている。ARCはアポトーシスの阻害因子として機能し、また、カスパーゼと選択的に相互作用する(Koseki, T. 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5156-5160) 。これら全ての相互作用は、アポトーシスの調整に明らかに影響する（Chan S.L.およびM.P. Mattson (1999) J. Neurosci. Res. 58:167-190; Salveson, G.S. および V.M. Dixit (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10964-10967に概説）。
【００８３】
ES18は、アポトーシスの潜在的調節因子として、マウスT細胞で同定された(Park, E.J. 他(1999) Nuc. Acid. Res. 27:1524-1530) 。ES18は428アミノ酸の長さであり、N末端プロリンリッチ領域、1つの酸性グルタミン酸リッチドメイン、および、1つの推定LXXLL核レセプター結合モチーフを持つ。ES18タンパクは、リンパ節と胸腺とで優先的に発現する。ES18発現のレベルは、T細胞胸腺腫S49.1では、デキサメタゾン、スタウロスポリン、またはC2セラミド（これらは、アポトーシスを誘発する）での治療に応じて増加する。ES18は、T細胞でのアポトーシス細胞死の刺激で役割を果たす可能性がある。
【００８４】
ラット腹葉前立腺(RVP)は、ホルモン調節型アポトーシスの研究の或るモデル系である。RVP上皮細胞は、アンドロゲン剥奪に応答してアポトーシスを受ける。アポトーシスRVP内で上方制御されるメッセンジャーRNA(mRNA)転写物群が同定されている(Briehl, M. M. および Miesfeld, R. L. (1991) Mol. Endocrinol. 5:1381-1388)。このような転写物の１つはRVP.1をコードする。アポトーシスでのこれの正確な役割は決定されていない。RVP.1のヒト相同体であるhRVP1は、このラット蛋白に89％同一である(Katahira, J. 他(1997) J. Biol. Chem. 272:26652-26658) 。hRVP1は220アミノ酸の長さであり、4つの膜貫通ドメインを持つ。hRVP1は、肺、腸、および肝臓で高発現される。興味深いことに、hRVP1は、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のエンテロトキシン(ヒト等の動物での下痢の原因物質)の低親和性レセプターとして機能する。
【００８５】
サイトカイン媒介アポトーシスは、造血と免疫応答とにおいて重要な役割を果たす。骨髄性細胞は、マクロファージ、好中球、赤血球など血球の幹細胞前駆体であり、これは、特異的サイトカイン、例えば顆粒球／マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)およびインターロイキン3(IL-3)などに応答して増殖する。GM-CSFまたはIL-3を剥奪すると、骨髄性細胞はアポトーシスを受ける。ネズミrequiem (req)遺伝子は、骨髄性細胞株FDCP-1での、このアポトーシス応答に必要な推定転写因子をコードする(Gabig, T. G. 他(1994) J. Biol. Chem. 269:29515-29519) 。Reqタンパクは371アミノ酸の長さであり、1つの核局在シグナル、単一のKruppelタイプZnフィンガー、1つの酸性ドメイン、および、一群の、4種の独特なZnフィンガーモチーフ(金属結合に関わるシステインおよびヒスチジン残基が豊富)を持つ。reqの発現は骨髄性特異的でもアポトーシス特異的でもなく、これが示唆するところでは、付加的因子群が、骨髄性細胞アポトーシスでのReq活性を調節する。
【００８６】
アポトーシスの調節不全は最近、多くのヒト疾患の発生機序における有意な因子として認識されている。例えば、アポトーシス低下によって生じた過剰な細胞生存は、細胞増殖と免疫応答とに関する諸障害に寄与しうる。これらの障害としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、および炎症を含む。一方、アポトーシス増加によって生じた過剰な細胞死は、変性障害および免疫不全症(例えばAIDS、神経変性疾患、および骨髄異形成症候群)をもたらしうる(Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462)。
【００８７】
アポトーシスの調節不全は最近、多くのヒト疾患の発生機序における有意な因子として認識されている。例えば、アポトーシス低下によって生じた過剰な細胞生存は、細胞増殖と免疫応答とに関する諸障害に寄与しうる。これらの障害としては、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、および炎症を含む。一方、アポトーシス増加によって生じた過剰な細胞死は、変性障害および免疫不全症(例えばAIDS、神経変性疾患、および骨髄異形成症候群)をもたらしうる(Thompson, C.B. (1995) Science 267:1456-1462)。
【００８８】
アポトーシスの欠陥的調節はまた、アルツハイマー病でのニューロンの喪失に関わる。アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、老人斑と、神経原線維変化との形成である。これらは、アミロイドβペプチドを含む。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。Bアミロイドペプチドは、アポトーシスを誘発しニューロンの死をもたらすシグナル経路に関わる(Kajkowski, C. 他(2001) J. Biol. Chem. 276:18748-18756) 。アルツハイマーの病理の早期には、生理変化が帯状皮質で見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。
【００８９】
癌
癌は、主要な公衆保健の関心事であり続けており、現行の予防策と治療とは、大半の患者の要求を満たしていない。癌(別称は新形成)の特徴は、継続的で無制御な細胞増殖である。癌は、３つのカテゴリーに分類できる。癌腫、肉腫、白血病である。癌腫は柔らかい上皮細胞の悪性成長であり、周辺組織を浸潤し、転移性腫瘍を生じうる。肉腫は、上皮起源のものや、結合組織に起因するものがある。白血病は造血組織の進行性悪性疾患であり、特徴は、白血球とその前駆体との増殖であり、骨髄性(顆粒球または単球に由来)或いはリンパ球性(リンパ球に由来)に分類されうる。腫瘍化とは、腫瘍の発端からの成長の進行を指す。悪性細胞は、起源の組織内の正常な細胞に極めて類似のものや、未分化(低分化)なものがある。腫瘍細胞は、少数の核や、１個の大きな多形核を持ちうる。未分化細胞は、無秩序な塊に成長しうる。塊は血管化が乏しく、その結果、大きな領域が虚血壊死となっている。分化した新生細胞は、起源の組織と同じタンパク質を分泌しうる。癌は成長し、周辺組織に浸潤し、侵襲し、破壊する。これは、体腔または体表への直接播種によって、またはリンパ性転移や血行性転移によって成される。癌は、主要な公衆保健の関心事であり続けており、現行の予防策と治療とは、大半の患者の要求を満たしていない。腫瘍化の新形成プロセスの理解は、予後的および診断的重要性を持つ分子マーカー群の同定によって補助されうる。
【００９０】
新形成プロセスの理解は、予後的および診断的重要性を持つ分子マーカー群の同定によって補助されうる。癌は、正常な細胞を悪性細胞へ転換しうる腫瘍性タンパク類を伴う。数種の腫瘍性タンパク質は正常タンパク質の突然変異アイソフォームであり、他の腫瘍性タンパク質は、発現の部位または量に関して異常に発現する。正常な細胞増殖は、成長因子の、細胞膜上のその受容体への結合で始まる。この結果、シグナル系が活性化し、これが核調節因子を誘導し活性化してDNA転写を開始させ、次に細胞分裂を生じる。細胞周期制御に影響する腫瘍性タンパクのクラスとしては、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質を含む。数種の癌特異的遺伝マーカー(例えば腫瘍抗原および腫瘍抑制因子)も同定されている。
【００９１】
癌または悪性腫瘍は継続的な細胞増殖と細胞死によって特徴付けられる。また、３つのカテゴリーに分類しうる。癌腫、肉腫、白血病である。報告の示すところでは、約8人に1人の女性は乳癌にかかり、約10人に1人の男性(50歳以上)は前立腺癌にかかる(Helzlsouer, K. J. (1994) Curr. Opin. Oncol. 6:541-548; Harris, J. R. 他 (1992) N. Engl. J. Med. 327:319-328) 。
【００９２】
癌は、正常な細胞遺伝子に由来する発癌遺伝子類の活性化を伴う。これら発癌遺伝子は、腫瘍性タンパク質をコードし、このタンパク質が正常な細胞を悪性細胞に転換しうる。数種の腫瘍性タンパク質は正常タンパク質の突然変異アイソフォームであり、他の腫瘍性タンパク質は、発現の部位または量に関して異常に発現する。後者のカテゴリーの腫瘍性タンパク質は、細胞増殖の転写調節を変更することにより癌の原因となる。5クラスの腫瘍性タンパク質が、細胞周期制御に影響することが既知である。これらクラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質を含む。場合によっては、発癌遺伝子は、レトロウイルスとDNAウイルスとによって活性化しうる。発癌遺伝子活性化は、ウイルスのゲノムの、宿主細胞のDNAへの組み込みの結果として起こる。これらの場合、感染した細胞を継続的に細胞分裂させる能力のある2つ以上の発癌遺伝子が活性化することもある。
【００９３】
癌の特徴は、継続的で無制御な細胞増殖である。数種の癌には、正常なアポトーシス細胞死の抑制を伴う。新形成プロセスの理解は、予後的および診断的重要性を持つ分子マーカー群の同定によって補助されうる。癌は、正常な細胞を悪性細胞へ転換しうる腫瘍性タンパク類を伴う。数種の腫瘍性タンパク質は正常タンパク質の突然変異アイソフォームであり、他の腫瘍性タンパク質は、発現の部位または量に関して異常に発現する。正常な細胞増殖は、成長因子の、細胞膜上のその受容体への結合で始まる。この結果、シグナル系が活性化し、これが核調節因子を誘導し活性化してDNA転写を開始させ、次に細胞分裂を生じる。細胞周期制御に影響する腫瘍性タンパクのクラスとしては、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および、細胞周期制御タンパク質を含む。数種の癌特異的遺伝マーカー(例えば腫瘍抗原および腫瘍抑制因子)も同定されている。
【００９４】
癌治療の現行の形態としては、免疫抑制剤の使用を含む(Morisaki, T., Matsunaga H., 他(2000) Anticancer Res.20: 3363-3373; Geoerger, B., Kerr, K., 他(2001) Cancer Res. 61:1527-1532)。細胞シグナリングに関わるタンパク質の同定は、また特に、免疫抑制剤の受容体として作用するタンパク質の同定は、抗腫瘍剤の開発を促進しうる。例えばイムノフィリンは、原核生物と真核生物との双方に見られる保存されたタンパク質の1ファミリーであり、免疫抑制剤に、種々の程度の特異性で結合する。このようなimmunophilicタンパク質の1グループが、ペプチジルプロリルシス−トランス異性化酵素(EC 5.2.1.8)ファミリー（PPIアーゼ、rotamase）である。これら酵素は、初めにブタ腎臓皮質から単離され、これらはタンパク折り畳みの加速を、オリゴペプチド内のプロリンイミドペプチド結合のシス-トランス異性化を触媒して行う(Fischer, G. および Schmid, F.X. (1990) Biochemistry 29: 2205-2212)。イムノフィリンファミリーには、シクロフィリン（例えばペプチジルプロリル異性化酵素A、即ちPPIA）とFK結合タンパク(即ちFKBP)とのサブファミリーを含む。シクロフィリンは多機能レセプター蛋白であり、これは、シグナル伝達活性(例えばシクロスポリンが媒介する伝達)に関わる。各ファミリーのPPIアーゼドメインは、種の間で高度に保存される。構造的には異なるが、これら多機能レセプター蛋白は、多数のシグナル伝達系路に関わる。また、折り畳みイベントと輸送イベントとに関連付けられている。
【００９５】
イムノフィリン蛋白であるシクロフィリンは、免疫抑制剤であるシクロスポリンAと結合する。FKBPは別のイムノフィリンであり、FK506(またはラパマイシン)と結合する。ラパマイシンは免疫抑制剤であり、細胞を成長のG1期で停止させ、アポトーシスを誘発する。シクロフィリン同様、このマクロライド抗生物質(産生は放線菌(Streptomyces tsukubaensis)に由来)の作用は、遍在性で主にサイトゾル性のイムノフィリン受容体に結合して成される。これらイムノフィリン／免疫抑制剤複合体(例えばシクロフィリンA／シクロスポリンA(CypA/CsA)、およびFKBP12/FK506)は、その治療成績の達成を、ホスファターゼであるカルシニューリン(カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼであり、T細胞活性化に関与)を阻害して行う(Hamilton, G.S. および Steiner, J.P. (1998) J. Med. Chem. 41: 5119-5143)。ネズミfkbp51遺伝子の豊富な発現は、免疫組織(例えば胸腺およびTリンパ球)に見られる(Baughman, G., Wiederrecht, G.J., 他(1995) Molec. Cell. Biol. 15: 4395-4402) 。FKBP12/ラパマイシン指示型免疫抑制は、TOR(酵母)またはFRAP(FKBP12-ラパマイシン会合タンパク、哺乳類細胞内)に結合して起きる。これらはラパマイシンのキナーゼ標的であり、正常な細胞成長パターンの維持に必須である。機能障害のあるTORシグナル伝達は、種々のヒト疾患(癌など)に連関している(Metcalfe, S.M., Canman, C.E., 他(1997) Oncogene 15:1635-1642; Emami, S., Le Flock, N., 他(2001) FASEB J. 15:351-361)。また、自己免疫にも連関する(Damoiseaux, J.G., Beijleveld, L.J., 他(1996) Transplantation 62:994-1001)。
【００９６】
数種のシクロフィリンイソ酵素が同定されている。例えばシクロフィリンB、シクロフィリンC、ミトコンドリアのマトリクスシクロフィリン、細菌のサイトゾルおよびペリプラズムのPPIアーゼ、並びに、ナチュラルキラー細胞シクロフィリン関連タンパク(シクロフィリン型PPIアーゼドメインを持ち、推定上の腫瘍認識複合体であり、ナチュラルキラー(NK)細胞の機能に関与)を含む。これら細胞は、生得的な細胞免疫応答に、ウイルス感染細胞や癌化細胞を溶解して関与する。NK細胞の特異的標的細胞は、主要組織適合複合体(MHC)クラスI遺伝子の発現を喪失(腫瘍化時に一般的に発生)した細胞であり、この標的化によって、細胞に腫瘍成長減弱の可能性を与える。150-kDaの分子の同定が、ヒトNK細胞の表面で成されている。この分子が持つ或るドメインは、シクロフィリン/ペプチジルプロリルシス-トランス異性化酵素に高度に相同である。このシクロフィリン型タンパクは、推定上の腫瘍認識複合体であるNK腫瘍認識配列(NK-TR)の成分でありうる(Anderson, S.K., Gallinger, S., 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:542-546) 。NKTR腫瘍認識配列は、腫瘍細胞と、大顆粒リンパ球（LGL）との間の認識を媒介する。LGLは白血球の亜集団であり、活性化した細胞障害性T細胞とナチュラルキラー細胞とからなり、腫瘍標的を破壊できる。NKTR遺伝子のタンパク産物はLGLの表面に見られ、腫瘍標的への結合を促進する。最近、マウスNktr遺伝子とプロモーター領域とが、9番染色体に位置づけられた。この遺伝子は、NK細胞特異的150-kDaタンパク(NK-TR)をコードする。これは、シクロフィリン他の腫瘍応答タンパクに相同である(Simons-Evelyn, M., Young, H.A. および Anderson, S.K. (1997) Genomics 40: 94-100。
【００９７】
腫瘍化組織と相互作用する他のタンパクとしては、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子(TNF)を含む。TNFファミリーのサイトカインの産生はリンパ球とマクロファージとが行い、TNFは、癌化した（腫瘍）内皮細胞の溶解を生じうる。内皮タンパク1(Edp1)の同定が、TNFαによって内皮細胞で転写的に活性化されるヒト遺伝子として成されている。また、TNFα誘導可能Edp1遺伝子が、マウスで同定されている(Swift, S., Blackburn, C., 他(1998) Biochim. Biophys. Acta 1442: 394-398)。
【００９８】
発癌遺伝子
多くの発癌遺伝子が同定され特徴付けられている。発癌遺伝子としては、成長因子(sis等)、erbA、erbB、neu、ros等の受容体、src、yes、fps、abl、met等の細胞内レセプター、mos、raf等のタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ、jun、fos、myc、N-myc、myb、ski、relなどの核転写因子、RB、p53等の細胞周期制御タンパク質、mdm2、Cip1、p16、サイクリンD、ras、set、can、sec、gag R10等の突然変異腫瘍抑制遺伝子がある。特に、fosがコードするFOSは、ロイシンジッパー含有リン蛋白であり、細胞の核内にある。FOSは、非共有結合複合体を数種の他のタンパクと形成し、成長促進タンパクの転写を活性化する(Bohmann, D. 他(1987) Science 238:1386-1392; Cohen, D.R. および Curran, T. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2063-2069; 並びにvan Straaten, F. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 3188-3187) 。canは推定上のヒト発癌遺伝子であり、骨髄性白血病誘発に関わる。また、発癌遺伝子としての活性化が、その3'側半分の、他の遺伝子（setなど）との融合によって成される(von Lindern, M. 他(1992) Mol. Cell. Biol. 12: 3346-3355) 。setがコードするSETはホスファターゼ2A(セリン/トレオニンホスファターゼであり、多様な細胞プロセスを調節)の強力な阻害因子であることが示されている(Li, M. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:11059-11062) 。SETのアフリカツメガエル相同体であるNAP1は、B型サイクリンと特異的に相互作用することがわかり、また、細胞周期調節で必須の役割を果たす(Kellogg, D. R. 他 (1995) J. Cell Biol. 130: 661-673) 。SECはsecの遺伝子産物であり、この腫瘍性タンパクは、分泌性上皮の腫瘍で活性である(Lane, M.A. 他(1990) Nuc.Acids Res. 18: 3068)。gag R10はロイシンジッパー含有細胞質タンパクで23 kDaであり、ニワトリ胚視神経網膜細胞から同定されており、キメラmRNAであるRAV-1によってコードされている。これは、細胞を継続的細胞増殖に誘導できる(Proux, V. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:30790-30797)。S-100ファミリーは、小さな二量体の酸性のカルシウム結合および亜鉛結合タンパクであり、脳で豊富に発現する。これらのタンパク質は、細胞成長および分化、細胞周期調節、並びに代謝制御において重要な役割を果たす(Moncrief, N.D. 他(1990) J. Mol. Evol. 30:522-562; 並びにWicki, R. 他(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227: 594-599)。rad1は酵母タンパクであり、DNA修復およびDNA組換えに関与する(Sunnerhagen, P. 他(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3750-3760) 。αLフコシダーゼはリソソーム酵素であり、糖タンパクの、フコースと、糖質部分のNアセチルグルコサミンとの間のα1,6結合を加水分解する。αLフコシダーゼの欠損の結果、フコシドーシス(fucosidosis、リソソーム蓄積症)が起きる(Herissat, B. (1991) Biochem. J. 280: 309-316)。
【００９９】
腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子は発癌遺伝子と呼ばれ、これらは、細胞成長および発達を通常は制御する遺伝子に由来する。多くの発癌遺伝子が同定され特徴付けられている。発癌遺伝子としては、成長因子(sis等)、erbA、erbB、neu、ros等の受容体、src、yes、fps、abl、met等の細胞内レセプター、mos、raf等のタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ、jun、fos、myc、N-myc、myb、ski、relなどの核転写因子、RB、p53等の細胞周期制御タンパク質、mdm2、Cip1、p16、サイクリンD、ras、set、can、sec、gag R10等の突然変異腫瘍抑制遺伝子がある。
【０１００】
ウイルス発癌遺伝子は、ヒト細胞が数種のウイルスに感染するとヒトゲノムに組込まれる。ウイルス発癌遺伝子の例としては、v-src、v-abl、およびv-fpsを含む。正常遺伝子の、発癌遺伝子への転換はまた、染色体転座によっても起こりうる。フィラデルフィア染色体は、慢性骨髄性白血病と、或るサブセットの急性リンパ芽球性白血病との特徴であり、これは、9番染色体と22番染色体との間の相互転座の結果である。この転座は、プロトオンコジーンc-ablの或る切り詰められた部分を、22番染色体のブレークポイント（切断点）クラスター領域(bcr)へ移動させる。ハイブリッドc-abl-bcr遺伝子がコードするキメラ蛋白は、チロシンキナーゼ活性を持つ。慢性骨髄性白血病では、このキメラ蛋白が持つ分子量は210 kdであり、急性白血病では、より活性な180 kdのチロシンキナーゼが形成される(Robbins, S.L. 他(1994) Pathologic Basis of Disease, W.B. Saunders Co., Philadelphia PA)。
【０１０１】
Wnt遺伝子ファミリーの分泌シグナル分子は、真核細胞全体で高度に保存されている。Wntファミリーのメンバーは、軟骨テンプレート(cartilage template)内の軟骨細胞分化の調節に関わる。Wnt-5a、Wnt-5b、およびWnt-4遺伝子の発現は、ニワトリ四肢の軟骨形成領域で成される。Wnt-5aの発現は、軟骨膜(早期軟骨テンプレートのすぐ周辺の間葉細胞)で成される。Wnt-5a誤発現は、ニワトリ四肢で、軟骨細胞の成熟と、bone collar形成の開始を遅らせる(Hartmann, C. および Tabin, C.J. (2000) Development 127:3141-3159)。
【０１０２】
RRP22タンパク/RAS関連タンパク
シグナル伝達は、それによって細胞が細胞外シグナルに応答する、一般的プロセスである。典型的シグナル伝達経路では、ホルモン、神経伝達物質または成長因子など、シグナル分子の、細胞膜受容体への結合が、細胞内セカンドメッセンジャーの作用と共役される。Gタンパク共役レセプター(GPCR)は、細胞内プロセスの制御を、グアニンヌクレオチド結合タンパク(Gタンパク)を活性化して行う。Gタンパクはヘテロ三量体であり、α、β、およびγサブユニットからなる。αサブユニットはグアニンヌクレオチド結合ドメインを含み、GTPアーゼ活性を持つ。GTPがαサブユニットに結合すると、これはβおよびγサブユニットから解離し、細胞性標的分子と相互作用する。GTPの、GDPへの加水分解は、このサブユニットの、他のタンパクとの相互作用を制御する分子スイッチとして働く。GDP結合型のαサブユニットは、その細胞標的から解離し、βおよびγサブユニットと再会合する。多数のアクセサリータンパクが、Gタンパク機能の調整を、それらのヌクレオチドリン酸化状態または膜結合を制御して行う。これら調節分子としては、交換因子(GEF、GDP-GTP交換を刺激)、GTPアーゼ活性化タンパク(GAP、GTP加水分解を促進)、および、グアニンヌクレオチド解離インヒビター(GDI、グアニンヌクレオチド解離を阻害し、GDP結合型を安定化)を含む。Gタンパクを少なくとも５つのサブファミリーに分類しうる。Ras、Rho、Ran、Rab、およびADPリボシル化因子であり、これらは、種々の細胞機能(例えば細胞成長および分化、細胞骨格構成、並びに細胞内小胞輸送および分泌)を調節する。
【０１０３】
Rasスーパーファミリーの小GTPアーゼは、広範な細胞シグナル経路の調節に関わる。Rasファミリー蛋白は膜結合タンパクであり、分子スイッチとして作用し、GTPとGDPとに結合し、GTPをGDPへ加水分解する。活性なGTP結合状態では、Rasファミリー蛋白は種々の細胞標的と相互作用し、下流シグナル経路を活性化する。例えばRasサブファミリーのメンバーは、受容体チロシンキナーゼ(RTK)から、一連のセリン/トレオニンキナーゼへのシグナル伝達に必須である。セリン/トレオニンキナーゼは細胞成長および分化を制御する。活性化したRas遺伝子は初めにヒトの癌で見出され、続いての研究は、細胞が成長を続けるか、最終分化に至るかの決定にRas機能が死活的であることを確認した（Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827, Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-98）。突然変異Rasタンパク（GTPに結合するが加水分解しないRas）は恒久的に活性化されており、継続的細胞増殖または癌を起こす。
【０１０４】
Rasサブファミリーは、チロシンキナーゼ受容体、非チロシンキナーゼ受容体、および、ヘテロ三量体GPCRからのシグナルを伝達する(Fantl, W. J. 他 (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:453-481; Woodrow, M. A. 他 (1993) J. Immunol. 150:3853-3861; 並びにvan Corven, E. J. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1257-1261) 。細胞表面レセプターを刺激するとRasが活性化し、Rasが次に、細胞成長および分化を制御する細胞質キナーゼを活性化する。同定された最初のRas標的は、Rafキナーゼであった(Avruch, J. 他(1994) Trends Biochem. Sci. 19:279-283) 。RasとRafとの相互作用はセリン/トレオニンキナーゼ群のMAPキナーゼカスケードの活性化を生じ、セリン/トレオニンキナーゼ群は遺伝子発現とタンパク質合成とを制御する重要な転写因子を活性化させる（Barbacid, M. (1987) Annu. Rev. Biochem. 56:779-827, Treisman, R. (1994) Curr. Opin. Genet. Dev. 4:96-101）。突然変異Rasタンパク（GTPに結合するが加水分解しないRas）は恒常的に活性化されており、継続的細胞増殖および癌を起こす(Bos, J. L. (1989) Cancer Res.49:4682-4689; Grunicke, H. H. and Maly, K. (1993) Crit. Rev. Oncog. 4:389-402)。
【０１０５】
多くの発癌遺伝子が同定され特徴付けられている。発癌遺伝子としては、成長因子(sis等)、erbA、erbB、neu、ros等の受容体、src、yes、fps、abl、met等の細胞内レセプター、mos、raf等のタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ、jun、fos、myc、N-myc、myb、ski、relなどの核転写因子、RB、p53等の細胞周期制御タンパク質、mdm2、Cip1、p16、サイクリンD、ras、set、can、sec、gag R10等の突然変異腫瘍抑制遺伝子がある。特に、fosがコードするFOSは、ロイシンジッパー含有リン蛋白であり、細胞の核内にある。FOSは、非共有結合複合体を数種の他のタンパクと形成し、成長促進タンパクの転写を活性化する(Bohmann, D. 他(1987) Science 238:1386-1392; Cohen, D.R. および Curran, T. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2063-2069; 並びにvan Straaten, F. 他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 3188-3187) 。canは推定上のヒト発癌遺伝子であり、骨髄性白血病誘発に関わる。また、発癌遺伝子としての活性化が、その3'側半分の、他の遺伝子（setなど）との融合によって成される(von Lindern, M. 他(1992) Mol. Cell. Biol. 12: 3346-3355) 。setがコードするSETはホスファターゼ2A(セリン/トレオニンホスファターゼであり、多様な細胞プロセスを調節)の強力な阻害因子であることが示されている(Li, M. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:11059-11062) 。SETのアフリカツメガエル相同体であるNAP1は、B型サイクリンと特異的に相互作用することがわかり、また、細胞周期調節で必須の役割を果たす(Kellogg, D. R. 他 (1995) J. Cell Biol. 130: 661-673) 。SECはsecの遺伝子産物であり、この腫瘍性タンパクは、分泌性上皮の腫瘍で活性である(Lane, M.A. 他(1990) Nuc.Acids Res. 18: 3068)。gag R10はロイシンジッパー含有細胞質タンパクで23 kDaであり、ニワトリ胚視神経網膜細胞から同定されており、キメラmRNAであるRAV-1によってコードされている。これは、細胞を継続的細胞増殖に誘導できる(Proux, V. 他(1996) J. Biol. Chem. 271:30790-30797)。S-100ファミリーは、小さな二量体の酸性のカルシウム結合および亜鉛結合タンパクであり、脳で豊富に発現する。これらのタンパク質は、細胞成長および分化、細胞周期調節、並びに代謝制御において重要な役割を果たす(Moncrief, N.D. 他(1990) J. Mol. Evol. 30:522-562; 並びにWicki, R. 他(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227: 594-599)。rad1は酵母タンパクであり、DNA修復およびDNA組換えに関与する(Sunnerhagen, P. 他(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3750-3760) 。αLフコシダーゼはリソソーム酵素であり、糖タンパクの、フコースと、糖質部分のNアセチルグルコサミンとの間のα1,6結合を加水分解する。αLフコシダーゼの欠損の結果、フコシドーシス(fucosidosis、リソソーム蓄積症)が起きる(Herissat, B. (1991) Biochem. J. 280: 309-316)。
【０１０６】
Rasは、他のシグナル経路の調節を、種々の細胞標的と直接に相互作用して行う(Katz, M. E. および McCormick, F. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev. 7:75-79) 。このような標的の1つであるRalGDSは、Ras様GTPアーゼであるRalのグアニンヌクレオチド解離刺激因子である(Albright, C. F. 他(1993) EMBO J. 12:339-347)。RalGDSは、RasとRalとのシグナル経路を共役する。上皮成長因子(EGF)は、RalGDSとRasとの会合を、哺乳類細胞で刺激する。この会合は、RalGDSのGEF作用を活性化する(Kikuchi, A. および Williams, L. T. (1996) J. Biol. Chem. 271:588-594; Urano, T. 他(1996) EMBO J. 15:810-816)。Ral-GDSによるRal活性化は、Srcの活性化を生じる。Srcはチロシンキナーゼであり、他の分子(例えば転写因子および、アクチン細胞骨格の諸成分)をリン酸化する(Goi, T. 他(2000) EMBO J. 19:623-630)。Ralは、多数のシグナル分子と相互作用する。例えばRal結合タンパク(Rho様GTPアーゼのGAP)、Cdc42およびRac(細胞骨格再編成を調節)、並びに、ホスホリパーゼD1(小胞輸送に関与)を含む(Feig, L. A. 他(1996) Trends Biochem. Sci. 21:438-441; Voss, M. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:34691-34698) 。
【０１０７】
Nore1の同定は、酵母２ハイブリッドスクリーニングから、RasおよびRas関連タンパクであるRap1bと相互作用するタンパクとして成された(Vavvas, D. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:5439-5442) 。Nore1は塩基性タンパク(pI＝9.4)で413アミノ酸から成り、システイン-ヒスチジンリッチ領域(予測ではジアシルグリセロール/ホルボールエステル結合部位)、N末端のプロリンリッチ領域(SH3結合ドメインの可能性)、および、C末端のRas/Rap結合ドメインを持つ。Nore1は、in vitroで、GTP依存的にRasと結合する。in vivo試験が示すところでは、Nore1のRasとの会合は、COS-7細胞でEGFおよび12-O-テトラデカノイルホルボール-13アセテート活性化に、またはKB細胞でEGFに依存する。
【０１０８】
Ras他のGタンパクは、免疫炎症応答の調節において役割を果たす。顆粒球（好塩基球、好酸球、好中球を含む）は、炎症で決定的役割を果たす。好酸球は毒性顆粒タンパクを放出し、これは微生物を殺す。また、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびサイトカインを分泌し、これらは炎症応答を増幅する。これらはアレルギー反応の炎症を持続させ、その機能不全は、喘息などアレルギー疾患を生じうる。インターロイキン5はサイトカインであり、好酸球の成長、活性化、および生存を調節する。IL-5の、好酸球でのシグナル伝達機序には、Ras-MAPキナーゼ経路とJak-Stat経路とが関わる(Pazdrak, K. 他(1995) J. Exp. Med. 181:1827-1834; Adachi, T. および Ala, R. (1998) Am. J. Physiol. 275:C623-633) 。RasによるRaf-1キナーゼ活性化は、好酸球脱顆粒に関連付けられる。
【０１０９】
好中球は炎症部位に遊走し、ここで病原体の除去を貪食で行い、毒性産物の放出をその顆粒から行って、これが微生物を殺す。GタンパクにはRas、Ral、Rac1、およびRap1を含み、これらは好中球機能を調節する(M'Rabet, L. 他(1999) J. Biol. Chem. 274:21847-21852) 。Rac1は、好中球の呼吸バーストに関わりうる。RasとRap1との活性化は、走化因子であるホルミルメチオニンロイシンフェニルアラニン(fMLP)、脂質メディエータである血小板活性化因子(PAF)、および、サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)に応じて成される。RasとRap1との双方は、好中球活性化で役割を果たすようである。Ralの活性化はfMLPとPAFとによって成されるがGM-CSFでは成されず、Ralは走化性、貪食、または脱顆粒に関与しうる。好中球機能の障害には、種々の炎症疾患と自己免疫疾患とが関わる。
【０１１０】
RRP22は、その発現が中枢神経系に限られる新規な亜群を定義する。RRP22遺伝子の所在は、22番染色体のCpGリッチq12領域内の、40-kbの領域であり、EWSおよびBAM22遺伝子が境界を成す(Zucman-Rossi, J. 他(1996) Genomics 38:247-254)。
【０１１１】
Rasファミリータンパクの活性化の触媒はグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)が行い、GEFは、結合したGDPの解離と、その後のGTPの結合とを触媒する。最近発見されたRalGEF様タンパクであるRGL3は、Rasと近縁タンパクRitの双方と相互作用する。構成的に活性なRitは、Ras同様、癌原性転換を誘発しうるが、Ritは大抵の既知Rasエフェクター蛋白と相互作用しないので、新規な細胞標的が、Rit転換活性に関わる可能性がある。RGL3はRasとRitの双方と相互作用するので、これら蛋白の下流エフェクターとして作用する可能性がある(Shao, H. および Andres, D.A. (2000) J. Biol. Chem. 275:26914-26924)。
【０１１２】
腫瘍抗原
腫瘍抗原は細胞表面分子であり、腫瘍細胞では非腫瘍組織と異なる発現をする。腫瘍抗原は、腫瘍細胞を免疫的に正常細胞と異なるものとし、ヒトの癌での潜在的診断材料である。数種のモノクローナル抗体が、癌細胞と特異的に反応することが同定された(例えばT細胞急性リンパ芽球白血病および神経芽腫)(Minegishi 他(1989) Leukemia Res.13:43-51; Takagi他(1995) Int. J. Cancer 61:706-715)。また、HER2遺伝子の、乳腺腫瘍での高レベル発現の発見は、治療処置の開発を導いた(Liu 他(1992) Oncogene 7:1027-1032; Kern (1993) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:448-454) 。腫瘍抗原は細胞表面に見られ、特徴は、膜タンパクまたは糖タンパクであることである。例えばMAGE遺伝子がコードするファミリーの腫瘍抗原の認識は、メラノーマ細胞表面で、自家細胞溶解性Tリンパ球が行う。12種のヒトMAGE遺伝子が単離された内、半分は、種々の組織学タイプの腫瘍で差次的に発現する(De Plaen 他(1994) Immunogenetics 40:360-369)。しかし、12種のMAGE遺伝子のどの発現も、健常組織では精巣と胎盤と以外では見られない。
【０１１３】
乳癌
180,000例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(K. Gish (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率はきわめて高い(97％)。これに対して、疾患のステージが進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752)。
【０１１４】
2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が、女性の乳癌の大きな素因であることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(Gish, K. (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。しかし、このタイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約5％〜9％であり、大多数の乳癌の原因は非遺伝性突然変異であり、乳腺上皮細胞での変異である。
【０１１５】
上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている(Khazaie, K. 他(1993) Cancer and Metastasis Rev. 12:255-274とその中の参照文献に、この分野が概説されている）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方調節と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇することから、EGFRは腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それは、EGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリ（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu, HER-3およびHER-4）およびそれらのリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, S. S. 他(1994) Am. J. Clin. Pathol. 102:S13-S24)。別の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzled protein mRNA（乳腺腫瘍では下方調節される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方調節）、およびCaN19（S100蛋白ファミリーのメンバーであり、このファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方調節される）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int. J. Cancer 78:95-99; Chen, L. 他 (1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix, W. et al (1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R. 他 (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213:51-64;およびLee, S. W. 他(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2504-2508) 。
【０１１６】
種々の病期のヒト乳癌の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を、長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin.Cancer Res. 4:2931-2938)。このようなモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、種々のステージの悪性転換について比較する場合である。
【０１１７】
腫瘍抑制因子
腫瘍抑制遺伝子の一般的定義は、遺伝エレメントであってその喪失または不活化が、細胞増殖の調節解除と、癌の発生機序と進行とに寄与する要素である。腫瘍抑制遺伝子の正常な機能は、細胞成長の制御または阻害をストレスに応じて行い、細胞の増殖寿命を限定することである。数種の腫瘍抑制遺伝子が同定されており、これには網膜芽腫(Rb)タンパク、p53、並びに乳癌1および2タンパク(BRCA1およびBRCA2)をコードする遺伝子を含む。これら遺伝子の突然変異は、数種の癌の発症への、後天性および先天性の遺伝素因と関連する。
【０１１８】
p53の、癌の発生機序における役割は、広範に研究されている(概説はAggarwal, M. L. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:1-4; Levine, A. (1997) Cell 88:323-331) 。全てのヒト癌の約50％には、p53遺伝子の突然変異を含む。これら突然変異の結果、機能的p53の不在や、より多くは、過剰発現される欠損型のp53を生じる。p53は転写因子であり、DNA結合に必要な中心コアドメインを持つ。p53での大抵の癌関連突然変異は、このドメインに局在する。正常な増殖細胞では、p53は発現が低レベルであり、迅速に分解される。p53の発現と活性との誘発は、DNA損傷、頓座有糸分裂、その他のストレス性の刺激に応じて起こる。これらの場合、p53はアポトーシスを誘発させ又は、細胞成長をストレスが除去されるまで停止させる。p53活性の下流エフェクターとしては、アポトーシス特異的タンパクおよび細胞周期調節タンパク（例えばRb）、発癌遺伝子産物、サイクリン、および細胞周期依存キナーゼなどを含む。
【０１１９】
転移抑制遺伝子であるKAI1（CD82）は、腫瘍抑制遺伝子p53に近縁であるとの報告がある。KAI1は、その発現の低下時に、ヒト前立腺癌の進行、また、おそらく肺癌と乳癌との進行に関わる。KAI1は、構造的に特有な、白血球表面糖タンパク質のファミリーのメンバーをコードする。このファミリーは、テトラスパン膜貫通タンパク質ファミリーまたは膜貫通4スーパーファミリー(TM4SF)として知られる。理由は、このファミリーのメンバーが、形質膜を4回貫通するからである。このファミリーは、内在性膜タンパクからなる。これらはN末端膜固着ドメインを持ち、この機能は、膜アンカーとして、また、タンパク生合成時の移行シグナルとしてのものである。N末端膜固着ドメインは、生合成時に切断されない。TM4SFタンパクは、3つの更なる膜貫通領域群、7個以上の保存システイン残基を持ち、同様のサイズであり(218〜284残基)、全てが、大きな細胞外親水性ドメイン（3つの潜在的Nグリコシル化部位を持つ）を有する。プロモーター領域には種々の転写因子の、多くの推定結合モチーフを持ち、5つのAP2部位と、９つのSpI部位を含む。KAI1と7種の他のTM4SFメンバーとの遺伝子構造比較が示すところでは、予測されたタンパクの種々の構造ドメインに関連したスプライス部位が保存されている。これが示唆するところでは、これら遺伝子は進化的に近縁で、遺伝子重複および分岐進化で生じた(Levy, S. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:14597-14602; Dong, J.T. 他 (1995) Science 268:884-886; Dong, J.T. 他 (1997) Genomics 41:25-32)。
【０１２０】
ロイシンリッチ遺伝子グリオーマ不活化(LGI1)タンパクは、受容体および接着タンパクとして機能する多数の膜貫通および細胞外タンパクとの相同性を共有する。LGI1のコードは或るLRR(ロイシンリッチ、リピート含有)遺伝子が行い、10q24にマップする。LGI1は4つのLRR(システインリッチ領域に隣接)と、1つの膜貫通ドメインとを持つ(Somerville, R.P., 他(2000) Mamm.Genome 11:622-627)。LGI1発現は、主に神経組織、特に脳で見られる。腫瘍抑制作用の喪失は、LGI1タンパクの不活化で見られ、これは、悪性グリオーマの、低から高グレードの腫瘍の移行時に起こる。LGI1発現の、低グレード脳腫瘍での低下と、悪性グリオーマでの発現の顕著な低下または不在とが示唆するところでは、LGI1は、グリア腫瘍進行の診断に用い得る(Chernova, O.B., 他(1998) Oncogene 17: 2873-2881)。
【０１２１】
ST13腫瘍抑制因子の同定は、正常な粘膜組織のcDNAと、結腸直腸癌組織のmRNAとの間のサブトラクションハイブリダイゼーションで、結腸直腸癌に関する因子のスクリーニングで成された(Cao, J. 他(1997) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123:447-451)。ST13は、ヒト結腸直腸癌で下方制御される。
【０１２２】
von Hippel-Lindau (フォン・ヒッペル・リンドウ、VHL)腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、網膜および中枢神経系の血管芽腫、明細胞腎癌、および褐色細胞腫に関わる(Hoffman, M. 他(2001) Hum. Mol. Genet. 10:1019-1027; Kamada, M. (2001) Cancer Res. 61:4184-4189) 。腫瘍進行は、VHL遺伝子の欠損または不活化に連関する。VHLは、トランスフォーミング成長因子α、GLUT-1グルコース輸送体、および血管内皮成長因子の発現を調節する。VHLタンパクは、elongin B、elongin C、Cul2およびRbx1と会合して複合体を形成し、転写アクチベーターである低酸素誘導因子(HIF)を調節する。HIFは血管新生に関わる遺伝子（例えば血管内皮成長因子と血小板由来成長因子B）を誘導する。HIFの制御の喪失はVHLの欠損に起因し、その結果、血管新生ペプチドの過剰な産生を生じる。VHLは、血管新生の阻害、細胞周期制御、フィブロネクチンマトリックスアセンブリ、細胞接着、並びにタンパク分解において役割を果たしうる。
【０１２３】
腫瘍抑制遺伝子の突然変異は多くの癌の一般的特徴であり、しばしば、腫瘍の発生機序と進行との決定的ステップに影響するようである。従ってChang, F. 他(1995; J. Clin. Oncol. 13:1009-1022)が示唆するところでは、この遺伝子または、発現するタンパクの抗体を用いて、1) 癌のリスクの高い患者のスクリーニング、2) 従来の方法で成される診断の補助、および、3) 個々のがん患者の予後の評価が可能である。また、Hamada, K他(1996; Cancer Res.56:3047-3054)は、p53の、子宮頚癌細胞への、アデノウイルスベクターでの導入を、子宮頚癌の実験的治療として試験中である。
【０１２４】
PRドメイン遺伝子は最近、ヒト腫瘍化で役割を果たすことが認識された。PRドメイン遺伝子は通常、2種のタンパク産物を産生する。PRプラス産物(PRドメインを持つ)と、PRマイナス産物(PRドメインを欠く)である。癌細胞では、PRプラスは破壊または過剰発現され、PRマイナスは存在または過剰発現する。これら2種のタンパクの量の不均衡は、悪性疾患の重要な一因の様である(Jiang, G.L. および Huang, S. (2000) Histol. Histopathol. 15:109-117)。
【０１２５】
ヒトにおける多くの腫瘍疾患は、不適切な遺伝子転写によって起こり得る。悪性の細胞成長は、腫瘍促進遺伝子の過剰な発現又は、腫瘍抑制遺伝子の不十分な発現によって起こり得る（Cleary, M. L. (1992) Cancer Surv. 15:89-104）。染色体転座によっても、或る遺伝子のコード配列を別の無関係遺伝子の調節領域と融合させる、キメラ座（chimeric loci）が生成され得る。或る重要なクラスの転写調節因子が、Znフィンガー蛋白である。Znフィンガーモチーフは亜鉛イオンに結合する。このモチーフは一般に、周期的に配置されたシステイン残基とヒスチジン残基からなる約30アミノ酸のタンデムリピート群を持つ。この配列パターンの例としては、C2H2タイプ、C4タイプおよびC3HC4タイプZnフィンガー群、並びにPHDドメインが挙げられる (Lewin, 前出; Aasland, R., 他(1995) Trends Biochem. Sci. 20:56-59) 。臨床的に関連するZnフィンガー蛋白質の一つがWT1であるが、これはウィルムス腫瘍を持つ子供において不活性化されている腫瘍抑制タンパク質である。大細胞リンパ腫で重要な役割を果たすオンコジーンbcl-6もZnフィンガー蛋白質である(Papavassiliou, A.G. (1995) N. Engl. J. Med. 332:45-47)。
【０１２６】
腫瘍応答タンパク質
癌(別称は新形成)の特徴は、継続的で無制御な細胞増殖である。癌は、３つのカテゴリーに分類できる。癌腫、肉腫、白血病である。癌腫は柔らかい上皮細胞の悪性成長であり、周辺組織を浸潤し、転移性腫瘍を生じうる。肉腫は、上皮起源のものや、結合組織に起因するものがある。白血病は造血組織の進行性悪性疾患であり、特徴は、白血球とその前駆体との増殖であり、骨髄性(顆粒球または単球に由来)或いはリンパ球性(リンパ球に由来)に分類されうる。腫瘍化とは、腫瘍の発端からの成長の進行を指す。悪性細胞は、起源の組織内の正常な細胞に極めて類似のものや、未分化(低分化)なものがある。腫瘍細胞は、少数の核や、１個の大きな多形核を持ちうる。未分化細胞は、無秩序な塊に成長しうる。塊は血管化が乏しく、その結果、大きな領域が虚血壊死となっている。分化した新生細胞は、起源の組織と同じタンパク質を分泌しうる。癌は成長し、周辺組織に浸潤し、侵襲し、破壊する。これは、体腔または体表への直接播種によって、リンパ性転移によって、または血行性転移によって成される。癌は、主要な公衆保健の関心事であり続けており、現行の予防策と治療とは、大半の患者の要求を満たしていない。腫瘍化の新形成プロセスの理解は、予後的および診断的重要性を持つ分子マーカー群の同定によって補助されうる。
【０１２７】
癌治療の現行の形態としては、免疫抑制剤の使用を含む(Morisaki, T. 他(2000) Anticancer Res.20: 3363-3373; Geoerger, B. 他(2001) Cancer Res. 61:1527-1532)。細胞シグナリングに関わるタンパク質の同定は、また特に、免疫抑制剤の受容体として作用するタンパク質の同定は、抗腫瘍剤の開発を促進しうる。例えばイムノフィリンは、原核生物と真核生物との双方に見られる保存されたタンパク質の1ファミリーであり、免疫抑制剤に、種々の程度の特異性で結合する。このようなimmunophilicタンパク質の1グループが、ペプチジルプロリルシス−トランス異性化酵素(EC 5.2.1.8)ファミリー（PPIアーゼ、rotamase）である。これら酵素は、初めにブタ腎臓皮質から単離され、これらはタンパク折り畳みの加速を、オリゴペプチド内のプロリンイミドペプチド結合のシス-トランス異性化を触媒して行う(Fischer, G. および Schmid, F.X. (1990) Biochemistry 29: 2205-2212)。イムノフィリンファミリーには、シクロフィリン（例えばペプチジルプロリル異性化酵素A、即ちPPIA）とFK結合タンパク(即ちFKBP)とのサブファミリーを含む。シクロフィリンは多機能レセプター蛋白であり、これは、シグナル伝達活性(例えばシクロスポリンが媒介する伝達)に関わる。各ファミリーのPPIアーゼドメインは、種の間で高度に保存される。構造的には異なるが、これら多機能レセプター蛋白は、多数のシグナル伝達系路に関わる。また、折り畳みイベントと輸送イベントとに関連付けられている。
【０１２８】
イムノフィリン蛋白であるシクロフィリンは、免疫抑制剤であるシクロスポリンAと結合する。FKBPは別のイムノフィリンであり、FK506(またはラパマイシン)と結合する。ラパマイシンは免疫抑制剤であり、細胞を成長のG1期で停止させ、アポトーシスを誘発する。シクロフィリン同様、このマクロライド抗生物質(産生は放線菌（Streptomyces tsukubaensis）に由来)の作用は、遍在性で主にサイトゾル性のイムノフィリン受容体に結合して成される。これらイムノフィリン／免疫抑制剤複合体(例えばシクロフィリンA／シクロスポリンA(CypA/CsA)、およびFKBP12/FK506)は、その治療成績の達成を、ホスファターゼであるカルシニューリン(カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼであり、T細胞活性化に関与)を阻害して行う(Hamilton, G.S. および Steiner, J.P. (1998) J. Med. Chem. 41: 5119-5143)。ネズミfkbp51遺伝子の豊富な発現は、免疫組織(例えば胸腺およびTリンパ球)に見られる(Baughman, G. 他(1995) Molec. Cell. Biol. 15: 4395-4402) 。FKBP12/ラパマイシン指示型免疫抑制は、TOR(酵母)またはFRAP(FKBP12-ラパマイシン会合タンパク、哺乳類細胞内)に結合して起きる。これらはラパマイシンのキナーゼ標的であり、正常な細胞成長パターンの維持に必須である。機能障害性のあるTORシグナリル伝達は、種々のヒト疾患(癌など)に連関している(Metcalfe, S.M. 他(1997) Oncogene 15:1635-1642; Emami, S. 他(2001) FASEB J. 15:351-361)。また、自己免疫にも連関する(Damoiseaux, J.G. 他(1996) Transplantation 62:994-1001)。
【０１２９】
数種のシクロフィリンイソ酵素が同定されている。例えばシクロフィリンB、シクロフィリンC、ミトコンドリアのマトリクスシクロフィリン、細菌のサイトゾルおよびペリプラズムPPIアーゼ、並びに、ナチュラルキラー細胞シクロフィリン関連タンパク(シクロフィリン型PPIアーゼドメインを持ち、推定上の腫瘍認識複合体であり、ナチュラルキラー(NK)細胞の機能に関与)を含む。これら細胞は、生得的な細胞免疫応答に、ウイルス感染細胞や癌化細胞を溶解して関与する。NK細胞の特異的標的細胞は、主要組織適合複合体(MHC)クラスI遺伝子の発現を喪失(腫瘍化時に一般的に発生)した細胞であり、この標的化によって、細胞に腫瘍成長減弱の可能性を与える。150-kDaの分子の同定が、ヒトNK細胞の表面で成されている。この分子が持つ或るドメインは、シクロフィリン/ペプチジルプロリルシス-トランス異性化酵素に高度に相同である。このシクロフィリン型タンパクは、推定上の腫瘍認識複合体であるNK腫瘍認識配列(NK-TR)の成分でありうる(Anderson, S.K. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:542-546) 。NKTR腫瘍認識配列は、腫瘍細胞と、大顆粒リンパ球（LGL）との間の認識を媒介する。LGLは白血球の亜集団であり、活性化した細胞障害性T細胞とナチュラルキラー細胞とからなり、腫瘍標的を破壊できる。NKTR遺伝子のタンパク産物はLGLの表面に見られ、腫瘍標的への結合を促進する。最近、マウスNktr遺伝子とプロモーター領域とが、9番染色体に位置づけられた。この遺伝子は、NK細胞特異的150-kDaタンパク(NK-TR)をコードする。これは、シクロフィリン他の腫瘍応答タンパクに相同である(Simons-Evelyn, M.他(1997) Genomics 40:94-100)。
【０１３０】
腫瘍化組織と相互作用する他のタンパクとしては、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子(TNF)を含む。TNFファミリーのサイトカインの産生はリンパ球とマクロファージとが行い、TNFは、癌化した（腫瘍）内皮細胞の溶解を生じうる。内皮タンパク1(Edp1)の同定が、TNFαによって内皮細胞で転写的に活性化されるヒト遺伝子として成されている。また、TNFα誘導可能Edp1遺伝子が、マウスで同定されている(Swift, S. 他(1998) Biochim. Biophys. Acta 1442: 394-398)。
【０１３１】
加齢および老化
加齢プロセスまたは老化の研究は、多数の特徴的な細胞性変化と分子変化とを示している(Fauci 他(1998) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY, 37ページ)。これら特徴としては、増加した染色体構造異常、DNA架橋、DNAの一本鎖切断の発生、DNAメチル化の喪失、およびテロメア領域の分解を含む。これらDNA変化に加え、蛋白の翻訳後変容が増し、これには脱アミド化、酸化、架橋、および非酵素的糖付加を含む。尚一層の分子変化の発生が、加齢細胞のミトコンドリアに、構造の劣化を通して起こる。これらの変化は最終的に、身体の各器官の機能低下に寄与する。
【０１３２】
肺癌
肺癌は、米国男性の癌死の主因であり、女性の癌死の第2の原因である。肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。3番染色体での欠失はこの疾患に一般的であり、この領域に、腫瘍抑制遺伝子の存在を示すと思われる。K-rasの活性化突然変異は肺癌で一般的に見られ、この疾患のマウスモデルの1つの基礎である。
【０１３３】
ステロイドホルモン
グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。分子レベルでは、非結合グルココルチコイドは容易に細胞膜を越え、特異的細胞質レセプターに高親和性の結合をする。結合後、転写に影響し、最終的に、タンパク合成に影響する。この結果には、炎症部位の白血球浸潤阻害、炎症応答メディエータ機能妨害、および液性免疫応答抑制を含みうる。コルチコステロイドの抗炎症性作用は、ホスホリパーゼA2阻害タンパク類、総称リポコルチンに関わると見られる。リポコルチンは次に、炎症の強力なメディエータ(たとえばプロスタグランジンやロイコトリエン)の生合成を、前駆体分子アラキドン酸の放出を阻害して制御する。更に、コルチコステロイドは、好酸球、好塩基球、および気道上皮細胞機能の阻害を、炎症応答を媒介するサイトカインを調節して行う。これらは、炎症部位の白血球浸潤阻害、炎症応答メディエータ機能妨害、および液性免疫応答抑制を行う。コルチコステロイドを用いて、アレルギー、喘息、関節炎、および皮膚症状が治療される。ベクロメタゾンは合成グルココルチコイドであり、これを用いて、ステロイド依存喘息を治療し、アレルギー性または非アレルギー性(血管運動)鼻炎に伴う症状を軽減し、外科切除後の再発鼻ポリープを予防している。鼻腔内ベクロメタゾンの抗炎症性効果および血管収縮効果は、ヒドロコルチゾンの効果より5000倍大きい。
【０１３４】
発現プロファイル作成
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【０１３５】
新規の細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質、およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫/炎症の疾患、生殖障害、および胎盤障害の、診断・治療・予防において有用であり、また、細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外因性化合物の影響についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０１３６】
本発明は、総称して「CGDD」、個別にはそれぞれ「CGDD-1」、「CGDD-2」、「CGDD-3」、「CGDD-4」、「CGDD-5」、「CGDD-6」、「CGDD-7」、「CGDD-8」、「CGDD-9」、「CGDD-10」、「CGDD-11」、「CGDD-12」、「CGDD-13」、「CGDD-14」、「CGDD-15」、「CGDD-16」、および「CGDD-17」、「CGDD-18」、「CGDD-19」、「CGDD-20」、「CGDD-21」と呼ぶ細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。或る態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施例で本発明は、SEQ ID NO:1-21のアミノ酸配列を持つ、単離されたポリペプチドを提供する。
【０１３７】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:22-42からなる群から選択される。
【０１３８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体を提供する。
【０１３９】
更に本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【０１４０】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【０１４１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【０１４２】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【０１４３】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：22-42からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO：22-42からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。
【０１４４】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様で上記組成物は、SEQ ID NO:1-21からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、機能的CGDDの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者に上記組成物を投与する方法を提供する。
【０１４５】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的CGDDの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【０１４６】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。或いは本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬物として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的CGDDの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【０１４７】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【０１４８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-21からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【０１４９】
更に本発明は、SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１５０】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:22-42からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５１】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１５２】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【０１５３】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１５４】
（定義）
用語「CGDD」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたCGDDのアミノ酸配列を指す。
【０１５５】
用語「アゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を強化、或いは模倣する分子を指す。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物を挙げることができるが、これらはCGDDと直接相互作用することによって、或いはCGDDが関与する生物学的経路の構成成分に作用することによって、CGDDの活性を調節する。
【０１５６】
「対立遺伝子変異体」は、CGDDをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る他、変容したmRNA群を生じ得る。また、生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１５７】
CGDDをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換がありながら、CGDDと同じポリペプチド、あるいはCGDDの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列にとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異体群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、CGDDをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なCGDDとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的あるいは免疫学的にCGDDの活性が保持される範囲で、残基群の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての、類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【０１５８】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１５９】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【０１６０】
用語「アンタゴニスト」は、CGDDの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、CGDDと直接相互作用すること、あるいはCGDDが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってCGDDの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【０１６１】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばFab、F(ab')2 、およびFv断片を指す。CGDDポリペプチド群と結合する抗体類の作製には、免疫抗原として、無傷ポリペプチド群を用いることができ、または、当該の小ペプチド群を有する断片群を用い得る。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１６２】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（すなわちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１６３】
用語「アプタマー（aptamer）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組合せライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（例えば、Brody, E.N.およびL. Gold（2000）J. Biotechnol. 74:5-13を参照）。
【０１６４】
用語「イントラマー（intramer）」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc.Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610) 。
【０１６５】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなどの左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【０１６６】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１６７】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え、または合成CGDD、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞内の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１６８】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１６９】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は、広い意味で、指定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。CGDDをコード、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）および他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど）を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１７０】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems, Foster City CA）を用いて５'および／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEWフラグメント結合システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap（University of Washington, Seattle WA）などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用いて１つ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築(アセンブリ)された核酸配列を指す。伸長および構築の両方を行ってコンセンサス配列を産生する配列もある。
【０１７１】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。
【０１７２】
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【０１７３】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１７４】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１７５】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１７６】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１７７】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１７８】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組合せによって新規のタンパク質群を構築することが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１７９】
「断片」は、CGDDの又はCGDDをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１８０】
SEQ ID NO:22-42の或る断片は、或る固有のポリヌクレオチド配列領域を持つ。この領域は、SEQ ID NO:22-42を特異的に同定するものであり、例えばこの断片を得たゲノム中の他のいかなる配列とも異なる。SEQ ID NO:22-42の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術に、またはSEQ ID NO:22-42を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:22-42の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:22-42の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１８１】
SEQ ID NO:1-21の或る断片は、SEQ ID NO:22-42の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-21の或る断片は、SEQ ID NO:1-21を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持つ。例えば、SEQ ID NO:1-21の或る断片は、SEQ ID NO:1-21を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-21の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するSEQ ID NO:1-21の領域は、その断片に意図する目的に基づき、当業者が慣例的に判定し得る。
【０１８２】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１８３】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１８４】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」および「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１８５】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムなどに組込まれているCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp（1989）CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他（1992）CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。CLUSTAL Vによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてなされる。
【０１８６】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Altschul, S.F. 他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn および blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１８７】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１８８】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得た断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１８９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１９０】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１９１】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる（参照先と共に上述）。ポリペプチド配列をCLUSTAL Vを用いてペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスがデフォルト残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０１９２】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１９３】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１９４】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１９５】
「ヒト人工染色体（HAC）」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１９６】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１９７】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１９８】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびpHにおける特定配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１９９】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２x SSCおよび約０．１％のSDSの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。あるいは、温度は約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃を用い得る。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０２００】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０２０１】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０２０２】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０２０３】
用語「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、CGDDのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、CGDDの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０２０４】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０２０５】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０２０６】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、CGDDの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、CGDDのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０２０７】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０２０８】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０２０９】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０２１０】
CGDDの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成により、あるいは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CGDDの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０２１１】
「プローブ」とは、同一配列あるいは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、CGDDやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０２１２】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０２１３】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Sambrook, J. 他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. 他（1987）Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis, M. 他（1990）PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CAなどを参照されたい。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０２１４】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０２１５】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０２１６】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０２１７】
「調節エレメント」は、或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５'および３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０２１８】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０２１９】
或るDNA配列に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０２２０】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CGDD、CGDDをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０２２１】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０２２２】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０２２３】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０２２４】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０２２５】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０２２６】
「形質転換（transformation）」とは、外因性DNAが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０２２７】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。或いは核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他（1989）などの参考文献に記載されている。
【０２２８】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば、「対立遺伝子」変異体（上述）または「スプライス」変異体、「種」変異体、「多型」変異体と記述され得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０２２９】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０２３０】
（発明）
本発明は、新規のヒト細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質（CGDD）群と、CGDDをコードするポリヌクレオチド群との発見および、これらの組成を、癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、及び胎盤障害の、診断、治療並びに予防に利用する方法の発見に基づく。
【０２３１】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０２３２】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号（GenBank ID NO:）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すと共にGenBank相同体１つ以上の注釈（annotation）を示し、これらは全て引用を以て本明細書の一部とする。
【０２３３】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０２３４】
表２および３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質であることを確立している。
【０２３５】
例えばSEQ ID NO:1は、残基M1から残基L1738までが、マウスのユビキチン蛋白リガーゼE3α(GenBank ID g3170887)に対して92％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、１つの推定ZnフィンガーをN-recogninドメインに有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。更なるBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:1がユビキチン蛋白質リガーゼであることを示す更に確証的な証拠を提供する。
【０２３６】
別の例でSEQ ID NO:3は、残基M1から残基D854までが、マウスのユビキチン蛋白リガーゼNedd4-2 (GenBank ID g12656270)に対して88％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3はまた、HECT(ユビキチン転移酵素)ドメインとWWドメインを有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPSおよびMOTIFS解析からのデータは、SEQ ID NO:3がユビキチン蛋白質リガーゼであることを示す更に確証的な証拠を提供する。
【０２３７】
別の例でSEQ ID NO:5は、残基M27から残基D538までが、ヒトのシスプラチン耐性関連タンパク質CRR9p(GenBank ID g12248402)に対して100％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは8.4e-281であり、これは観測されたポリペプチド配列を偶然に得る確率を示す。更なるBLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:5がアポトーシス関連タンパク質であることを示す更に確証的な証拠を提供する。
【０２３８】
別の例においてSEQ ID NO:9は、残基M1から残基S710までが、マウスのRalGDS様タンパク質3(GenBank ID g8650435)に対して80％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは1.5e-299であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:9はまた、1つのRas会合(RalGDS/AF-6)ドメインと1つのRasGEFドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。更なるBLAST解析にPRODOMおよびDOMOデータベースを用いてのデータは、SEQ ID NO:9がグアニンヌクレオチド解離因子である、更に実証的な証拠を提供する。
【０２３９】
別の例においてSEQ ID NO:12は、残基A64から残基Y365までが77％、残基M1から残基D109までが100％、Sgt1 (GenBank ID g4809026)に対して同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは3.2e-121であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:12はまた、テトラトリコペプチド（tetratricopeptide）(TPR)ドメイン群を残基A45〜N78と残基S79〜T112に有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。TPRリピートは、蛋白間相互作用を媒介すると思われる。また、有糸分裂に関わる多数の蛋白に見られる。更に、SPSCANの同定では、潜在的シグナルペプチドが残基M1〜A68に在る。
【０２４０】
別の例においてSEQ ID NO:13は、残基M1から残基K365までが、ヒトのプロトオンコジーンWnt-5A(GenBank ID g348918)に対して100％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは2.5e-205であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:13はまた、１つのwnt-1ファミリードメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された(表3参照)。BLIMPS解析、MOTIFS解析、およびPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:13 がwnt-1ファミリー蛋白質（wntファミリーの分泌性糖タンパクのメンバー）である、更に実証的な証拠を提供する。
【０２４１】
別の例においてSEQ ID NO:16は、残基A18から残基F1014までが、ヒトのサイクリンE結合タンパク質1(GenBank ID g6630609)に対して50％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは3.6e-252であり、これは観測されたポリペプチド配列を偶然に得る確率を示す。SEQ ID NO:16はまた、1つのHECT(ユビキチン転移酵素)ドメインと、1つの染色体凝縮調節因子(RCC1)蛋白ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:16がサイクリン結合蛋白質である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２４２】
別の例においてSEQ ID NO:17は、残基M1から残基S1462までが、ヒトのシクロフィリン関連蛋白(GenBank ID g5923891)に対して99％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:17はまた、1つのシクロフィリン型ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:17がシクロフィリン関連蛋白質である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２４３】
別の例においてSEQ ID NO:19は、残基K3から残基S175までが34％、残基R40から残基Q327まで26％、ヒトのアポトーシス性プロテアーゼ活性化因子1 (GenBank ID g2330015)に対して同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された(表2参照)。BLAST確率スコアは8.3e-21であり、これは観測されたポリペプチド配列を偶然に得る確率を示す。SEQ ID NO:19はまた、1つのSAMドメインと、G蛋白βWD-40リピート群を有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された (表3参照)。BLIMPS, MOTIFS, PROFILESCAN解析のデータが提供する更に実証的な証拠によれば、SEQ ID NO:19は、多重βG蛋白WD-40シグネチャ（Apaf-1に類似）を持つ。SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:14-15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20-21の分析と注釈も同様に行った。SEQ ID NO:1-21の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０２４４】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せて構築した。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:22-42を同定するため、或いはSEQ ID NO:22-42と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０２４５】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列の構築（アセンブリ）に寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースに由来する場合もあり（すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある（すなわち「NP」の命名を含む配列）。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNAおよびGenscan予測エキソン群の両方からなる構築物を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定される配列は「スティッチされた」配列であり、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの構築物を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子（すなわち、gBBBBB）の代わりに使用され得る。
【０２４６】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2004533829.tif 000003
【０２４７】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列カバレッジと重複するIncyte cDNAカバレッジが得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０２４８】
表５は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これらは、上記のポリヌクレオチド配列を構築および確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２４９】
本発明にはCGDD変異体も含まれる。好適なCGDD変異体は、CGDDの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有し、かつ該CGDDアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する配列である。
【０２５０】
本発明はCGDDをコードするポリヌクレオチド群をも含む。特定の実施態様において、本発明は、CGDDをコードする、SEQ ID NO:22-42からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:22-42のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくてリボースから構成されている。
【０２５１】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の変異体も、本発明に含まれる。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る態様では、SEQ ID NO:22-42からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:22-42からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異体を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、CGDDの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０２５２】
更に又は別の例で本発明のポリヌクレオチド変異体は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。或るスプライス変異体は、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体のいくつかの部分には、CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えばSEQ ID NO:42は、SEQ ID NO:41の配列からなるポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異体は何れも、CGDDの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０２５３】
CGDDをコードする種々のポリヌクレオチド配列が遺伝暗号の縮重によって作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。天然CGDDのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に、これらの組合せが成される。このような全ての変異は明確に開示されていると考慮されたい。
【０２５４】
CGDDとその変異体とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然CGDDのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、CGDD或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、CGDDおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０２５５】
CGDDとその誘導体とをコードするDNA配列またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も、本発明に含まれる。作製後にこの合成配列を、当分野で周知の試薬類を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入できる。更に、合成化学を用いて、CGDDをコード、またはその任意の断片をコードする或る配列の中に突然変異を導入できる。
【０２５６】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:22-42及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる（例えば、Wahl, G.M.およびS.L. Berger（1987）Methods Enzymol.152:399-407; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511を参照)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２５７】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 あるいは 377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野で公知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 7.7ユニット、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページを参照）。
【０２５８】
CGDDをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出するには、当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを用い得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である（例えばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。別の方法に逆PCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えばTriglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む（例えばLagerstrom, M. 他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０２５９】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５'領域を有する配列を含み、オリゴd（T）ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２６０】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザーで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATORなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２６１】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、本発明の別の実施態様では、CGDD、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。CGDDの発現に、遺伝暗号固有の縮重により産生されうる、実質的に同じあるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列群を利用可能である。
【０２６２】
CGDDをコードする配列群を種々の目的で改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０２６３】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、CGDDの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２６４】
CGDDをコードする配列は、別の実施態様では、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（例えば、Caruthers, M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; および Horn, T.他 (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232を参照) 。CGDD自体またはその断片の合成には、或いは化学的方法を用い得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ; および Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。CGDDのアミノ酸配列、または任意のその一部は更に、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組合せることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０２６５】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（例えばChiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（例えば前出のCreighton, 28-53ページを参照）。
【０２６６】
生物活性CGDDの発現には、CGDDをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。CGDDをコードするポリヌクレオチド配列、およびベクターにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が、必要なエレメントに含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。CGDDをコードする配列群の、より効率的な翻訳を、特異的な開始シグナル類を用いて達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。CGDDをコードする配列群、その開始コドン、および上流の調節配列群が、好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばScharf, D. 他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０２６７】
CGDDをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを、当業者に周知の方法を用いて作製し得る。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある（例えばSambrook, J.他(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4, 8, および 16-17章; Ausubel, F.M.他（1995）Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, 9, 13, および 16章を参照)。
【０２６８】
CGDDをコードする配列を、種々の発現ベクター／宿主系を利用して保持および発現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（例えば前出Sambrook; 前出Ausubel; Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ; Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659; および Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（例えばDi Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356; Yu, M.他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344; Buller, R.M.他 (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P.他 (1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226; 並びに Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242を参照)。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２６９】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを、細菌系で選択し得る。CGDDをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には例えば、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Life Technologies）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。CGDDをコードする配列をベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（例えば、Van Heeke, G.およびS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照）。CGDDが多量に、例えば抗体の産生などに必要な場合は、CGDDの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２７０】
CGDDの産生には酵母の発現系を使用できる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列群を組込むことを可能にする（例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; および Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０２７１】
CGDDの発現には植物系も用い得る。CGDDをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組合せて用いられるようなCaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えばCoruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838843; および Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105を参照)。これらの作製物は、直接DNA形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（例えば『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページを参照）。
【０２７２】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、CGDDをコードする配列群をライゲーションし得る。CGDDを宿主細胞内で発現する感染ウイルスを得るため、アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いうる（例えばLogan, J.およびT. Shenk（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２７３】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばHarrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。
【０２７４】
CGDDの、細胞株における安定した発現は、哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のために望ましい。例えばCGDDをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２７５】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えばWigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（例えばWigler, M.他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570; Colbere-Garapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照) 。この他の選択可能な遺伝子（例えばtrpBおよびhisD、これらは代謝物のための、細胞の必要条件を改変）も、文献に記載がある（例えばHartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（例えばRhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131を参照）。
【０２７６】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えばCGDDをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CGDDをコードする配列群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定できる。または、CGDDをコードする１配列とタンデムに、或るマーカー遺伝子を、単一プロモーターの制御下で配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２７７】
CGDDをコードする核酸配列を持ち、CGDDを発現する宿主細胞は一般に、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２７８】
CGDDの発現の検出及び計測のための、特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる免疫学的な方法は、当分野で既知である。このような技法の例には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS、フローサイトメトリー）などがある。CGDD上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である（例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; および Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJを参照)。
【０２７９】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。CGDDをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化)、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。または、CGDDをコードする配列、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２８０】
CGDDをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。CGDDをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのCGDDの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２８１】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２８２】
CGDDをコードする、自然のあるいは修飾された、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることにより、本発明の別の実施態様では、上記した任意の宿主系内で、１融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCGDDタンパク質は、CGDDの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、CGDDをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、CGDDが、精製後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２８３】
放射標識CGDDの合成は、本発明の別の実施態様で、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２８４】
本発明のCGDDまたはその断片を用いて、CGDDに特異結合する化合物をスクリーニングできる。CGDDへの特異的な結合のスクリーニングには、少なくとも１つ、または複数の試験化合物を用いうる。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２８５】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、CGDDの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである（例えばColigan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章を参照）。同様に、この化合物は、CGDDが結合する天然受容体に、或いは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に、密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。或る実施例では、これら化合物のためのスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でCGDDを発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。CGDDを発現する細胞、またはCGDDを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、結合や、CGDDまたは該化合物の何れかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２８６】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体、または他の検出可能な標識により、その結合を検出できる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の、あるいは固体支持物に固定されたCGDDと混合するステップと、CGDDとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２８７】
本発明のCGDDまたはその断片を用いて、CGDDの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングし得る。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、CGDDが少なくとも１つの試験化合物と混合される、CGDD活性が許容される諸条件下で或るアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのCGDDの活性を試験化合物不在下でのCGDDの活性と比較する。試験化合物の存在下でのCGDDの活性の変化は、CGDDの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、CGDDの活性に適した条件下で、CGDDを有するin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。CGDDの活性を調節する試験化合物は、これらアッセイの何れにおいても間接的に調節する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２８８】
別の実施例では、CGDDまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330).  形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０２８９】
CGDDをコードするポリヌクレオチド類はまた、in vitroで、ヒト胚盤胞由来のES細胞において操作し得る。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２９０】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。CGDDをコードするポリヌクレオチドの或る領域を、ノックイン技術を用いて動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。または、CGDDを例えば乳汁内に分泌するなど過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２９１】
（治療）
CGDDの領域群と細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質との間には、例えば配列及びモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。またCGDDを発現する組織の例は乳癌、PBMC細胞、脳帯状組織であり、また表６を見られたい。このように、CGDDは、癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、および胎盤障害で役割を果たすと考えられる。CGDDの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を低下させることが望ましい。CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CGDDの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２９２】
従って一実施態様において、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にCGDDまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、胎盤障害が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己��疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、および外傷が含まれる。生殖障害には、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（cystsphaeochromocytomas）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）を含む。胎盤障害には、子癇前症、絨毛癌、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤梗塞やmaternal floor infarction、癒着胎盤、侵入胎盤(increate)および穿通胎盤、絨毛膜外性胎盤（extrachorial placentas）、絨毛血管腫（chorangioma）、絨毛血管分布過多（chorangiosis）、慢性絨毛炎（villitis）、胎盤絨毛浮腫（placental villous endema）、終末絨毛広範性線維症（widespread fibrosis of the terminal villi）、絨毛間腔血栓(intervillous thrombi)、出血性血管炎、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、非免疫性胎児水腫を含む。
【０２９３】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CGDDまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２９４】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたCGDDを有する組成物を好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２９５】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CGDDの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２９６】
更なる実施態様では、CGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にCGDDのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した癌など細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症の疾患、生殖障害、および胎盤障害が含まれる。一実施態様では、CGDDと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或るいはCGDDを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２９７】
別の実施態様では、CGDDをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、CGDDの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防も可能である。
【０２９８】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組合せて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２９９】
CGDDのアンタゴニストは、当分野で一般に既知の方法を用いて製造し得る。具体的には、精製CGDDを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、CGDDと特異結合するものを同定し得る。CGDDへの抗体も、当分野で周知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えば由来はラクダまたはラマ）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０３００】
CGDD、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって、抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトなどを含む種々の宿主が免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０３０１】
CGDDに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。CGDDアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０３０２】
CGDDに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（例えばKohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; および Cole, S.P.他 (1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120を参照) 。
【０３０３】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えばMorrison, S.L.他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger, M.S. 他 (1984) Nature 312:604-608; および Takeda, S.他 (1985) Nature 314:452-454を参照) 。または、CGDD特異的一本鎖抗体を、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して生成し得る。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばBurton D.R.（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137を参照）。
【０３０４】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリ類またはパネル類のスクリーニングによっても行い得る（例えばOrlandi, R.他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299を参照) 。
【０３０５】
CGDDに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばHuse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281を参照）。
【０３０６】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合試験に対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、CGDDとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性CGDDエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０３０７】
CGDDに対する抗体の親和性を、ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて算定する。CGDD抗体複合体のモル濃度を平衡状態の下で遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる結合定数Kaが親和性を表す。CGDDエピトープ多数に対してポリクローナル抗体類は親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、CGDDに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定CGDDエピトープに対してモノクローナル抗体は単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。CGDD-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイには、Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤を用いるのが好ましい。CGDDが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理には、Ka値が１０６〜１０７L/ｍｏｌの低親和性抗体製剤を用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０３０８】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、CGDD抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば前出のCatty、同Coligan 他を参照）。
【０３０９】
CGDDをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、本発明の別の実施態様では治療目的で使用され得る。ある態様では、CGDDをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。CGDDをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿った、さまざまな位置から、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片を、このような当分野で周知の技術で設計可能である（例えばAgrawal, S.,編集（1996）Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照）。
【０３１０】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばSlater, J.E. 他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475;およびScanlon, K.J.他(1995) 9(13):1288-1296を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばMiller, A.D.（1990）Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.およびW. Walther（1994）Pharmacol. Ther. 63（3）:323-347を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（例えばRossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225; Boado、R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照) 。
【０３１１】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを、本発明の別の実施態様では、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicansおよびParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。CGDDの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCGDDを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０３１２】
本発明の更なる実施例では、CGDDの欠損による疾患や障害を、CGDDをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってCGDD欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０３１３】
CGDDの発現に有効であり得る発現ベクターの例として、限定するものではないがpcDNA 3.1、EpiTag、pRcCMV2、pREP、pVAX、pCRII-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、pCMV-Script、pCMV-Tag、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）およびPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）が挙げられる。CGDDを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. および H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. および H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXRおよびPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. および H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来する、CGDDをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０３１４】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他(1982) EMBO J. 1:841-845)によって、形質転換が実施される。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０３１５】
本発明の別の実施態様では、CGDDの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でCGDDをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029; Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716; Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206; Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290) 。
【０３１６】
または、CGDDの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞に、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDDをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はArmentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 並びに、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０３１７】
または、CGDDの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞に、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CGDDをコードするポリヌクレオチドを送達する。CGDDを単純疱疹ウイルス（HSV）が向性を持つ中枢神経細胞に導入するには、HSV系ベクターの利用が特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res. 169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えHSV d92の利用について記載する。上記特許はまた、ICP4、ICP27、およびICP22を欠失した組換えHSV系統の、作製および使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999) J. Virol. 73:519-532 および Xu, H.他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０３１８】
または、CGDDをコードするポリヌクレオチド群を、或るαウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いて標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、SFVゲノムに基づく（Garoff, H. および K.-J. Li (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは、完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、CGDDをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCGDDをコードするRNAが産生され、高レベルでCGDDが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。CGDDの、様々なタイプの細胞への導入を、αウイルスの広い宿主域が可能にする。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０３１９】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（例えばGee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページを参照）。また、相補配列またはアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳をブロックし得る。
【０３２０】
リボザイム類は、酵素的RNA分子である。RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、CGDDをコードする配列の、内ヌクレオチド分解切断を、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０３２１】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位を先ず同定するため、GUA、GUU、GUC配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンする。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０３２２】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。または、CGDDをコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写によって、RNA分子を産生し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０３２３】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするために、RNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を加える。
【０３２４】
CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法が、本発明の更なる実施態様に含まれる。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、CGDDの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においてはCGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、CGDDの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においてはCGDDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０３２５】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合とである。CGDDをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。CGDDをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するにはCGDDをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いる。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組合せライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０３２６】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitroおよびex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照）。
【０３２７】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０３２８】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。CGDD、CGDDの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどが、このような組成物を構成しうる。
【０３２９】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０３３０】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０３３１】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０３３２】
CGDDを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。または、CGDDまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０３３３】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０３３４】
治療有効量は例えばCGDDやその断片、CGDDの抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど、症状や容態を回復させる活性処方成分の量を指す。治療有効性および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０３３５】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別(ジェンダー)、投与の時間および頻度、薬物の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０３３６】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０.１〜１００,０００μgであり、合計で約１gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０３３７】
（診断）
別の実施態様では、CGDDに特異的に結合する抗体を、CGDDの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、CGDDやそのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。CGDDの診断アッセイには、抗体及び標識を用いて、ヒトの体液において、或いは細胞や組織の抽出物において、CGDDを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０３３８】
CGDDを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が当分野では周知であり、変容した、あるいは異常なレベルのCGDDの発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的CGDD発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験体から採取した体液または細胞抽出物とCGDDに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。CGDDの、被験体、対照および、生検組織からの疾患サンプルでの発現量を、標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０３３９】
CGDDをコードするポリヌクレオチドを、本発明の別の実施態様では、診断目的で用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。CGDDの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を、これらのポリヌクレオチドを用いて検出し定量し得る。CGDDの存在の有無、更には過剰な発現をこの診断アッセイを用いて判定し、治療時のCGDDレベルの調節を監視する。
【０３４０】
CGDDをコードまたは近縁の分子をコードするポリヌクレオチド配列（例えばゲノム配列）を検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションによって一態様では、CGDDをコードする核酸配列を同定できる。CGDDをコードする天然配列のみをプローブが同定するか、または対立遺伝子変異体や関連配列を同定するかは、プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られているか、またはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかという、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーションのまたは増幅のストリンジェンシーとによって決まることになる。
【０３４１】
CGDDをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性をもプローブ類は持ち得る他、関連する配列群の検出に利用され得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:22-42の配列や、CGDD遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０３４２】
CGDDをコードするDNA群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製方法としては、CGDDをコードまたはその誘導体群をコードするポリヌクレオチド配列群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。mRNAプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35Sなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０３４３】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列を、CGDDの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、発達障害、神経疾患、自己免疫／炎症疾患、生殖障害、胎盤障害が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED��、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、および外傷が含まれる。生殖障害には、プロラクチン産生の障害、不妊（例えば卵管疾患、排卵不良、子宮内膜症、性周期の途絶、月経周期の途絶、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜腫瘍や卵巣腫瘍、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、乳癌、乳房線維嚢胞病、乳漏症、精子形成の途絶、異常精子生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳癌、女性化乳房、高ゴナドトロピン性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性腺機能低下症、仮性半陰陽、無精子症、早発卵巣不全、アクロシン欠損症、晩発思春期、逆行性射精、無射精、血管芽腫、嚢胞・クロム親和細胞腫（cystsphaeochromocytomas）、傍神経節腫、精巣上体の嚢胞腺腫、および内リンパ嚢腫瘍）を含む。胎盤障害には、子癇前症、絨毛癌、胎盤早期剥離、前置胎盤、胎盤梗塞やmaternal floor infarction、癒着胎盤、侵入胎盤(increate)および穿通胎盤、絨毛膜外性胎盤（extrachorial placentas）、絨毛血管腫（chorangioma）、絨毛血管分布過多（chorangiosis）、慢性絨毛炎（villitis）、胎盤絨毛浮腫（placental villous endema）、終末絨毛広範性線維症（widespread fibrosis of the terminal villi）、絨毛間腔血栓(intervillous thrombi)、出血性血管炎、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、非免疫性胎児水腫を含む。CGDDをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したCGDD発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するサザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、並びにマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３４４】
CGDDをコードするヌクレオチド配列群は、或る特定の態様では、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類において有用であり得る。CGDDをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のCGDDをコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３４５】
CGDDの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験体から抽出された体液あるいは細胞とCGDDをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３４６】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３４７】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３４８】
CGDDをコードする配列群から設計したオリゴヌクレオチド群の更なる診断的利用には、PCRの利用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーはCGDDをコードするポリヌクレオチドの断片や、CGDDをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を好適には含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０３４９】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、或る特定態様においては、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP（single-stranded conformation polymorphism）および蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPはCGDDをコードするポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形のPCR生成物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３５０】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、単一遺伝子病における疾病転帰における相違を試験するにも有用である。単一遺伝子病としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、または慢性肉芽腫症がある。例えばマンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G. 他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y. および Z. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３５１】
CGDDの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある（例えばMelby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C.他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０３５２】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０３５３】
CGDDやその断片群、CGDDに特異的な抗体類を、別の実施態様では、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０３５４】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０３５５】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３５６】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および薬物の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他（1999）Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S. および N.L. Anderson（2000）Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズすることに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３５７】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０３５８】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３５９】
CGDD特異抗体でCGDD発現レベルを定量することによってもプロテオームのプロファイルを作成し得る。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３６０】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０３６１】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３６２】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３６３】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（例えばBrennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他（1997）米国特許第5,605,662号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集 (1999) Oxford University Press, Londonに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０３６４】
CGDDをコードする核酸配列を用いて、本発明の別の実施態様では、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる（例えばHarrington, J.J.他（1997）Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Lander, E.S.およびD. Botstein（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照）。
【０３６５】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る（例えばHeinz-Ulrich,他(1995) in Meyers, 前出、965-968ページを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。CGDDをコードする遺伝子の物理地図上の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３６６】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他(1988) Nature 336:577-580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３６７】
CGDD、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、本発明の別の実施態様では、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。CGDDと試験する薬剤との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３６８】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（例えばGeysen, 他（1984）PCT出願第WO84/03564号を参照）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。CGDDやその断片と反応してから試験用化合物を洗浄する。結合CGDDを次に当分野で周知の方法で検出する。精製CGDDはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３６９】
CGDDと特異結合可能な中和抗体がCGDDとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを別の実施態様で用いうる。CGDDと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在をも、この方法で抗体を用いて検出できる。
【０３７０】
CGDDをコードするヌクレオチド配列を、別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
【０３７１】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３７２】
上述し後述する全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、米国特許出願第60/286,820号、第60/293,727号、第60/283,294号、第60/282,110号、第60/287,228号、第60/291,846号、第60/291,662号、第60/295,340号、第60/295,263号、第60/349,705号を含め、言及することを以て特に本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３７３】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Life Technologies）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３７４】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３７５】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Pharmacia Biotech）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Life Technologies）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３７６】
２  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３７７】
別法では、高処理フォーマットで直接結合PCR法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B.（1994）Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３７８】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３７９】
Incyte cDNAに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群（例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫（Caenorhabditis elegans）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、および、隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43); 並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART (Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAの構築物を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いて構築し、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAの構築物を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３８０】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析と構築とに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０３８１】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群との構築と分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:22-42のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３８２】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定および編集
推定の細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質は、先ず公共のゲノム配列データベース（例えばgbpriやgbhtg）に対しGenscan遺伝子同定プログラムを実行して同定した。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. および S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質をコードするかを判定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質について問合せて分析した。潜在的な細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質はまた、既に細胞成長、分化および細胞死関連タンパク質としてアノテーションが付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列を構築して得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３８３】
５  ゲノム配列データのcDNA配列データとの統合
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したように構築した部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３８４】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３８５】
６  CGDDをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:22-42を構築するために用いた配列群を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装群を用いて、Incyte LIFESEQデータベースおよび公共ドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:22-42と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップする配列のクラスター群にアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３８６】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。或る区間の地図上の位置(センチモルガン単位)は、染色体のpアームの末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３８７】
この方法で、SEQ ID NO:26は、3番染色体の63.30〜77.40センチモルガンの区間内へマッピングされた。
【０３８８】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０３８９】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのcDNAデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３９０】
【数１】
2004533829.tif 000004
【０３９１】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３９２】
CGDDをコードするポリヌクレオチド配列を別法では、由来する組織に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いて構築される（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリの１つへ分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。CGDDをコードするcDNAの疾患特異的な発現を、得られるパーセンテージが反映する。cDNA配列群およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３９３】
８  CGDDをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３９４】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３９５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と（NH4）2SO4と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Technologies）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３９６】
各ウェルのDNA濃度は、１×TEおよび0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配し、DNAが試薬と結合できるようにして判定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３９７】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を、抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2Xカルベニシリン培養液中の384ウェルプレート群に３７℃で一晩培養した。
【０３９８】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）およびPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量化には、上記したようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３９９】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０４００】
９  CGDDをコードするポリヌクレオチドにおける１塩基多型の同定
１塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:22-42において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたように構築されて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタ群を有する或るアルゴリズムを用いて、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルタ群（preliminary filters）が過半の塩基呼び出し（basecall）エラーの除去を、最少Phred質スコア15を要求することによって行い、また、配列アラインメントエラーと、ベクター配列、キメラ、およびスプライス変異体の不適切なトリミングの結果であるエラーとをも除去した。先進の染色体分析の自動化された手順によって、推定上のSNPの近傍にある、オリジナルのクロマトグラムファイル群を分析した。クローンエラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、実験室でのプロセス中に生じたエラーを同定した。エラーとしては、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または常染色体突然変異によって起きたエラーがある。クラスター化エラーフィルタ群は、統計的に発生させたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体群または偽遺伝子群のクラスター化の結果であるエラーや、非ヒト配列による汚染が原因のエラーを同定した。最終セットのフィルタ群は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体において見られる重複（duplicates）とSNPとを除去した。
【０４０１】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０４０２】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:22-42由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸（Amersham Pharmacia Biotech）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）とを混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０４０３】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水および０.５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０４０４】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweilerなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである（Schena（1999）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばSchena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31を参照)。
【０４０５】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０４０６】
組織または細胞サンプルの調製
全RNAを組織サンプル群から単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ（A）+RNAを精製するためオリゴ（dT）セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ（dT）プライマー（21mer）、１×第一鎖バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、２００ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ（A）+RNA群は、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ3、もう１つはＣｙ5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル群の精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルのエタノール沈殿を、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム、および３００mlの１００％エタノールで行う。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０４０７】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製する。
【０４０８】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、０.１％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０４０９】
米国特許第5,807,522号に記載されている手順を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０４１０】
マイクロアレイをUV架橋するため、STRATALINKER UV架橋剤（Stratagene）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０.２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０４１１】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して１.８cm2のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100に保つため、１４０μlの５×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０４１２】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０４１３】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザーは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０４１４】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０４１５】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０４１６】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０４１７】
発現
正常乳房細胞株を、次のようにして得る。初代乳腺細胞の単離を、線維嚢胞性乳房疾患(fibrocystic breast disease)のドナーから行う。または、初代乳腺上皮細胞の単離を、正常ドナーから行う。乳癌細胞の由来は、in vitroの、腫瘍から遊出した細胞である。正常および、種々のステージの腫瘍化乳房細胞株の購入を、American Type Culture Collection (ATCC), (Manassas, VA)から行った。
【０４１８】
例えばSEQ ID NO:34 は、癌細胞株や腫瘍組織では、非癌細胞株または組織に対して差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。CGDD-13の発現は、少なくとも3倍増が、或る乳腺腫瘍細胞株で見られた。この株の取得ドナーは、腫瘍進行の早期にあった。
【０４１９】
別の例でSEQ ID NO:37は差次的発現を炎症応答で示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:37 の発現は、少なくとも2倍増が、LPS処理したPBMCで見られた。これは無処理PBMCと比較したものである。したがってSEQ ID NO:37は、炎症応答の診断アッセイに有用である。
【０４２０】
またSEQ ID NO:37は、マイクロアレイ分析の判定で、様々な乳癌株と非悪性乳腺上皮細胞とで差次的発現を示した。SEQ ID NO:37 の発現は、非悪性乳腺上皮細胞に比べて乳癌株で少なくとも2倍減少していた。したがってSEQ ID NO:37 は、乳癌検知の診断アッセイに有用である。
【０４２１】
別の例でSEQ ID NO:41 はアルツハイマー病患者の脳帯状回と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。CGDD-19の発現の増加が、アルツハイマー病の帯状組織に見られた。したがってSEQ ID NO:41は、神経疾患、特にアルツハイマー病の診断アッセイに有用である。
【０４２２】
１２  相補的ポリヌクレオチド
CGDDをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然CGDDの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。CGDDのコーディング配列とOligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）とを用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。CGDDをコードする転写物にリボソームが結合するのを阻害するよう相補的なオリゴヌクレオチドを設計すると、翻訳を阻害する。
【０４２３】
１３  CGDDの発現
CGDDの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。CGDDを細菌内で発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNAの転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターに、cDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。CGDDを抗生物質耐性細菌に発現させるには、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発する。CGDDの真核細胞での発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。CGDDをコードするcDNAとバキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他 (1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945)。
【０４２４】
CGDDは殆どの発現系で、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。CGDDから、精製後にGST部分を、特異的に操作した諸部位においてタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。CGDDをこれらの方法で精製し直接用いて、以下の実施例１７、１８及び１９の、適用可能なアッセイを行い得る。
【０４２５】
１４  機能的アッセイ
CGDD機能は、CGDDをコードする配列群の、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの発現によって算定する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現させる強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORT（Life Technologies）およびPCR 3.1（Invitrogen, Carlsbad CA）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および、フルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０４２６】
CGDDの遺伝子発現への影響は、CGDDをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率よく分離できる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、これら細胞から、当業者に周知の方法で精製できる。CGDDと目的の他の遺伝子群とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０４２７】
１５  CGDDに特異的な抗体の産生
CGDDの実質的精製を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol.182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０４２８】
CGDDアミノ酸配列を別法ではLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０４２９】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のAusubel, 1995を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗CGDD活性を検査するには例えば、ペプチドまたはCGDDを基板に結合し、1％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０４３０】
１６  特異抗体を用いる天然CGDDの精製
天然CGDDや組換えCGDDをCGDDに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）などの、或る活性化したクロマトグラフィー用レジンと抗CGDD抗体とを共有結合させることにより構成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０４３１】
CGDDを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CGDDを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCGDDとの結合を切るような条件で（例えば、或るpH２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させCGDDを収集する。
【０４３２】
１７  CGDDと相互作用する分子の同定
CGDDまたはその生物活性断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する（例えば Bolton, A.E.およびW.M. Hunter（1973）Biochem. J. 133:529-539を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識CGDDと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたCGDD複合体を有する全てのウェルをアッセイする。CGDD濃度を様々に変えて得たデータでCGDDの数量、候補分子との親和性および会合についての値を計算する。
【０４３３】
CGDDと相互作用する分子を別法では、Fields, S.およびO. Song（1989, Nature 340:245-246）に記載の酵母2ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの2ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０４３４】
CGDDはまた、ハイスループット型の酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の2大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を判定できる（Nandabalan, K. 他(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０４３５】
１８  CGDD活性の実証
CGDD活性を実証するために、最終分化や細胞周期進行の誘導の測定を、CGDDが哺乳動物細胞培養系において生理的に高まったレベルで発現する際に行う。cDNAを高いレベルで発現させる強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしてはPCMV SPORT（Life Technologies, Gaithersburg, MD）およびPCR 3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、好適には内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP) (Clontech, Palo Alto, CA)、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。フローサイトメトリーは、細胞周期進行か最終分化に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジン取込量の低下によって計測されるDNA合成の上方または下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および、フルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York, NYに記述がある。
【０４３６】
CGDD活性のin vitroアッセイは或いは、アンチセンスCGDD RNAを過剰発現する正常なヒト線維芽細胞の形質転換を測定する(Garkavtsev, I. および Riabowol, K. (1997) Mol.Cell Biol. 17:2014-2019) 。CGDDをコードするcDNAをpLNCXレトロウイルスベクターにサブクローニングし、アンチセンスCGDD RNAの発現を可能にする。結果として得た作成物を、狭宿主性(ecotropic)BOSC23ウイルスパッケージング細胞株に形質移入する。BOSC23培養上澄みが含むウイルスを用いて、両種性CAK8ウイルスパッケージング細胞株を感染させる。CAK8培養上澄みが含むウイルスを用いて、正常なヒト線維芽細胞(Hs68)を感染させる。感染細胞の評価を、次の、転換細胞に特徴的な、定量化できる特性について行う。培地での接触阻害の喪失に伴う高密度の成長、懸濁中またはソフトアガーでの成長、コロニーまたは増殖巣の形成、低下した血清要求性、および腫瘍誘発能(免疫不全マウスへの注入時)である。CGDDの活性は、Hs68細胞の形質転換の程度に比例する。
【０４３７】
CGDDの発現は或いは、哺乳動物細胞株で、CGDDをコードする真核生物発現ベクターで細胞を形質転換させて成し得る。真核生物発現ベクターは市販されており、これらベクターを細胞に導入する技術は当業者に周知である。CGDDの細胞局在をアッセイするには、細胞の分画をJiang H. P. 他 (1992; Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7856-7860)の記載のように行う。簡潔には、低速遠心法でペレット化した細胞の再懸濁を、バッファ中(10 mM TRIS-HCl, pH 7.4/ 10 mM NaCl/ 3 mM MgCl2/ 5 mM EDTAに10 ug/mlアプロチニン, 10 ug/mlロイペプチン, 10 ug/mlペプスタチンA, 0.2 mMフッ化フェニルメチルスルホニル含有)で行い、ホモジナイズする。ホモジェネートの遠心分離を600×ｇで5分間おこなう。その上澄みを100,000×gで60分間、超遠心して、粒子画分とサイトゾル画分の分離を行う。核画分を得るため、600×gペレットの、蔗糖溶液での再懸濁(0.25 M蔗糖/ 10 mM TRIS-HCl, pH 7.4/ 2 mM MgCl2)を行い、再遠心を600×gで行う。各画分からの等量の蛋白をSDS/10%ポリアクリルアミドゲルにかけ、膜にブロットする。ウェスタンブロット分析を行い、これにはCGDD抗血清を用いる。CGDDの局在の評価を、核画分での対応するバンドの、他の画分に比しての強度で行う。CGDDの、細胞画分での存在の試験を或いは、蛍光顕微鏡にCGDD特異的蛍光抗体を用いて行う。
【０４３８】
CGDD活性は、in vitro結合アッセイで、その関連するRasスーパーファミリー蛋白と相互作用する能力として実証され得る。候補Rasスーパーファミリー蛋白はグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-Sepharose上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。100 mM NaCl、2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.2 mM DTT、100 mM AMP-PNP、および10 mM GDPを含む20ｍM Trisバッファー(pH 8.0)、30℃で20分間インキュベーションして、GDPでRasスーパーファミリー蛋白を負荷する。CGDDはバキュロウイルス系でFLAG融合タンパク質として発現される。CGDD-FLAG融合タンパク質を含むこれらのバキュロウイルス細胞の抽出物は、GSTビーズでプレクリアし、次にGST-Rasスーパーファミリー融合タンパク質とインキュベーションする。形成された複合体は、グルタチオン-Sepharoseによって沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロットされ、市販の抗FLAG抗体で探査される。CGDD活性は、複合体中に検出されるCGDD-FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０４３９】
または、LiおよびCohen (Li, L. および S.N. Cohen  (1995) Cell 85:319-329)が実証したように、遺伝子の5'端へのアンチセンス配列を設計し、この配列を転写するベクターでNIH 3T3細胞に形質移入して、CGDDの腫瘍化抑制能の測定を成しうる。内因性遺伝子を抑制すると、形質転換した線維芽細胞は、ヌードマウスに導入すれば転移性腫瘍を形成できる細胞塊を産生しうる。
【０４４０】
CGDD活性のアッセイは或いは、注入CGDDの、母性転写物の分解への効果を測定する。卵母細胞の、Swissアルビノマウスからの収集、注入、培養の手順は、Stutz(前出)に記載がある。母性RNAの分解の、対照卵母細胞に比しての低下が、CGDD活性を示す。CGDD活性の測定は或いは、精製CGDDがRNAアーゼに結合する能力として、実施例１７に記載のアッセイで測定するように成される。
【０４４１】
CGDD活性のアッセイは或いは、CGDD発現プラスミドで形質移入したCOS細胞におけるシンシチウム形成を、2成分融合(two-component fusion)アッセイ(前出Miに記載)で測定する。このアッセイが利用する事実は、ヒトのインターロイキン12 (IL-12)がヘテロダイマーであり、その構成サブユニットの分子量が35 kD (p35) と40 kD (p40)であることである。p35の遺伝子を持つ発現プラスミドで形質移入したCOS細胞を、p40とCGDDとの遺伝子を持つ発現プラスミドを同時移入したCOS細胞と混ぜる。IL-12活性の、結果として得た馴化培地でのレベルが、このアッセイのCGDD活性に相当する。合胞体形成はまた、光顕で測定しうる(Mi他、前出)。
【０４４２】
CGDD活性の別のアッセイは、スイスマウス3T3細胞における新規開始DNA合成の量として細胞増殖を測定する。CGDDをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを当分野で公知の方法を用いて、静止状態の3T3培養細胞に移入する。一過性に形質移入された細胞は次に、[3H]チミジンまたは放射性DNA前駆体([a32P]ATP等)の存在下でインキュベートされる。適用可能な場合には、様々な量のCGDDリガンドが、形質移入された細胞に加えられる。酸によって沈殿され得るDNAへの[3H]チミジンの取込は適切な時間間隔で測定され、その取込量は新規に合成されたDNAの量とCGDD活性に正比例する。
【０４４３】
CGDD活性を、或いはサイクリン-ユビキチンライゲーションアッセイにより測定する(Townsley, F.M. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2362-2367) 。反応液は体積10 μl中に、40 mMのTris.HCl (pH 7.6)、5 mMのMg Cl2、0.5 mMのATP、10 mMのホスホクレアチン、50 μgのクレアチン・ホスホキナーゼ/ml、1 mg還元カルボキシメチル化ウシ血清アルブミン/ml、50 μM ユビキチン、1 μMのユビキチンアルデヒド、1〜2 pmol 125I-標識化サイクリンB、1 pmol E1、1 μMのオカダ酸、M期分画1Aのタンパク質10 μg (活性E3-Cを含み原則的にE2-C不在)と可変量CGDDを含む。反応液を18℃で60分間インキュベートする。次にSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法によりサンプルを分離する。形成された125I-サイクリン-ユビキチンの量をPHOSPHORIMAGER分析で定量する。サイクリン-ユビキチン形成の量は反応物中のCGDDの活性に比例する。
【０４４４】
CGDD活性のアッセイは或いは、放射標識ヌクレオチド、例えば[α32P]ATPを用い、放射ラベルの、DNA合成時のDNAへの取込か、アポトーシスに伴うDNAの断片化を測定する。CGDDをコードするcDNAを持つプラスミドで、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物細胞に形質移入する。次に細胞のインキュベートを、放射標識ヌクレオチドと共に、種々の時間長で行う。染色体DNAを収集し、放射能の検出にシンチレーションカウンターを用いる。放射ラベルの、染色体DNAへの取込は、細胞周期の刺激の程度に比例する。CGDDのアポトーシス促進を判定するには、染色体DNAを上記のように収集し、分析にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、当分野で周知の方法で行う。DNA断片化は定量のため非移入対照細胞と比較し、これがCGDDのアポトーシス活性に比例する。
【０４４５】
CGDDのシクロフィリン活性の別法での測定には、キモトリプシン共役アッセイを用い、シス〜トランス相互転換の速度を測定する(Fischer, G., Bang, H., および Mech, C. (1984) Biomed. Biochim. Acta 43: 1101-1111)。キモトリプシンを用いてXaa-Proペプチド結合でのトランス基質切断活性を推計する。ここでシス〜トランス異性化の速度定数を得るには、緩徐相での基質水解の速度定数を測定する。サンプルのインキュベートを免疫抑制剤CsAかFK506の有無の中で行い、反応開始にはキモトリプシンを添加し、蛍光反応を測定する。酵素的速度定数を求める式は kapp = kH20 + kenzであり、ここでは一次速度式が示され、1単位のPPIase活性の定義は kenz (s-1)である。
【０４４６】
蛍光モニタリングアッセイで活性化Ras検出にRRP22を用いるには次のようにする。c-Raf1(減数分裂の再開時に活性化するキナーゼ)のRRP22結合ドメイン(RRP22BD)の合成は、2つの無保護ペプチドセグメントから、ネイティブ化学ライゲーションで成される。ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとクマリル・クロモフォア（coumaryl chromophores）に基づく構造の2つの蛍光アミノ酸がRRP22BD/RRP22-GTP結合面の近くへ取込まれた後、His(6)からなるC末端タグの導入が起きる。この部位特異的に修飾された蛋白の、Ras-GTPへの結合のKD値を、野生型RBDと比較する。Ras-GTPの検出を、100 nMのレンジ内で、C末端His(6)タグ修飾した蛍光RBDの、Ni-NTAコートした表面への固定化で行う。Ras-GDPは固定化RBDには結合しないので、不活性および活性化Rasを区別できる(Becker, C. F. (2001) Chem. Biol. 8:243-252) 。
【０４４７】
CGDDのRas結合アッセイの方法は、Vavvas他（前出）に見られる。CGDD発現はGST融合タンパク質として成され、GST-CGDD融合体のインキュベーションをRasと共に、GTPγSかGDPβSの存在下で行う。グルタチオン-SEPHAROSEビーズ(APB)を添加し、GST-CGDD融合体とGST-CGDD-Ras複合体を溶液から回収する。蛋白質をグルタチオン-セファロースのビーズからSDSサンプル緩衝液で溶出し、SDS-PAGEで分離する。電気泳動後、タンパク質をPVDF膜(APB)に移し、Rasのプローブをモノクローナル抗Ras抗体で行う。
【０４４８】
Wnt5aの、細胞間接触による調節は、蛋白チロシンキナーゼを選択的にブロックする種々の代謝剤(ゲニステイン)やサイトカラシンDを、HB2 (正常な乳腺上皮細胞株)に添加して見られる。サイトカラシンD処理後の細胞骨格再編成によってWnt5aの誘導が起きる。これは、細胞形態の変化を伴う。サイトカラシンD処理した癌細胞株は、細胞形態の変化もWnt5a誘導も見せない(Jonsson, M. 他(1998) Br. J. Cancer 78:430-438)。
【０４４９】
１９  CGDD結合アッセイ
CGDDシクロフィリンの或る定量イムノアッセイは、その、免疫抑制剤シクロスポリンへの立体特異的結合の親和性を測定する(Quesniaux, V.F., 他(1987) Eur. J. Immunol. 17: 1359-1365)。このアッセイでは、シクロフィリン-シクロスポリン複合体を固相にコートし、結合の検出に、抗シクロフィリンウサギ抗血清を抗グロブリン-酵素抱合体で増強して用いる。CGDDイムノフィリン、シクロフィリンの、免疫抑制剤シクロスポリンとの、決定的残基での複合体形成は、免疫抑制作用(例えば腫瘍化時に発生)を促進する。
【０４５０】
FKBPと免疫抑制剤との気相での非共有結合測定の為に開発された或る結合アッセイは、エレクトロスプレーイオン化質量分析を用いる(Trepanier, D.J., 他(1999) Ther.Drug Monit. 21: 274-280)。エレクトロスプレーイオン化でイオンを発生するには、高電荷の液滴の極細スプレーを強い電場の存在下で発生させる。液滴のサイズが小さいほど、表面の電荷密度が高い。イオンは静電気的に質量分析器に誘導され、ここで反対電荷のイオンの発生が、空間的に分離したソースで成された後、毛細管注入口へ掃引され、ここでイオン流が合流され、反応が起きる。結合と無結合のFKBP/免疫抑制剤複合体の荷電状態を比較して、相対結合親和性を確立でき、in vitroの結合および免疫抑制作用と相関させうる。
【０４５１】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４５２】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０４５３】
表２は、GenBank識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４５４】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０４５５】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNA断片やゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０４５６】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０４５７】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０４５８】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０４５９】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０４６０】
【表１−１】
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【０４６１】
【表１−２】
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【０４６２】
【表２−１】
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【０４６３】
【表２−２】
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【０４６４】
【表２−３】
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【０４６５】
【表３−１】
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【０４６６】
【表３−２】
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【０４６７】
【表３−３】
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【０４６８】
【表３−４】
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【０４６９】
【表３−５】
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【０４７０】
【表３−６】
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【表３−７】
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【０４７３】
【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１７】
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【０４８４】
【表３−２０】
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【表３−２１】
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【０４８６】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【０４９６】
【表４−１１】
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【表４−１２】
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【０４９８】
【表５】
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【０４９９】
【表６−１】
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【０５００】
【表６−２】
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【０５０１】
【表６−３】
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【０５０２】
【表６−４】
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【０５０３】
【表６−５】
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【０５０４】
【表７−１】
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【０５０５】
【表７−２】
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【０５０６】
【表８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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