(57)【要約】（ａ）トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行うことができるオキシゲナーゼを発現する微生物細胞を含む培養基をＤ−リモネンの存在下でインキュベートすること、および（ｂ）該培養基からトランス−カルベオールを回収することを含む、トランス−カルベオールの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行うことができるオキシゲナーゼを発現する微生物細胞を含む培養基をＤ−リモネンの存在下でインキュベートすること、および（ｂ）該培養基からトランス−カルベオールを回収することを含む、トランス−カルベオールの製造方法。
【請求項２】
微生物細胞が真菌、細菌または酵母のものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞が細菌のものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
オキシゲナーを発現する細胞が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の菌株およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来の菌株から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
菌株がロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）が、ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
オキシゲナーゼをコードする遺伝子が細菌または酵母菌株においてクローン化されそして発現される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ｄ−リモネンが、気相でまたは液相で培養基中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
インキュベーションが、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度で行われる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＰＷＤ８を含む培養基をリモネンの存在下でインキュベートすること、および（ｂ）該培養基からカルベオールおよび／またはカルボンを回収ことを含む、トランス−カルベオールおよび／またはカルボンの製造方法。
【請求項１１】
形成されたトランス−カルベオールがカルボンに転化される、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行って対応するジヒドロジオールにすることができるオキシゲナーゼを発現する微生物細胞培養物を使用してモノテルペン、特にトランス−カルベオール（ｔｒａｎｓ−ｃａｒｖｅｏｌ）、を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−リモネンは、オレンジジュース工業での年に約５００００トンの量の副生物であるオレンジおよびレモンの皮油の主成分である。その低い価格は、それを、同じ炭素骨格を有する、工業的に関連した精薬品および風味化合物、例えばカルベオール、カルボン（ｃａｒｖｏｎｅ）およびペリリルアルコール、のための魅力的な出発化合物にしている。しかし、化学触媒作用によってカルボニルまたはヒドロキシ基を位置特異的（ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）に導入することは困難である。なぜならば、アリル性メチレン基（炭素１および２）およびアリル性メチル基（炭素５および６）の電子特性がかなり似ているからである。この理由のために、１９６０年代には早くも酵素的酸化が考えられ、そして以来、Ｄ−リモネンを変形する（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）多くの細菌および植物細胞が報告されている。
【０００３】
今まで、絶対的位置特異性を示す生体触媒のみが植物から誘導された。Ｐ４５０酵素リモネン３−ヒドロキシラーゼおよびリモネン６−ヒドロキシラーゼ（セイヨウハッカおよびオランダハッカのミクロソームから単離された）は、それらの天然基質Ｌ−リモネンおよびより少ない割合のＤ−リモネンを各々、イソピペリテノールおよびカルベオールに転化する。別の例は、ソラナム・アビキュラレ（Ｓｏｌａｎｕｍ ａｖｉｃｕｌａｒｅ）およびジオスコレア・デルトイデア（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｄｅｌｔｏｉｄｅａ）によるＤ−リモネンの６位におけるシス−およびトランス−カルベオールへの酸化である。しかし、これらの植物酵素の比活性は、工業的適用には不充分である。
【０００４】
Ｄ−リモネンの生体転化を可能にし得ることが今までに見出された微生物株は一般に、酸化生成物の混合物を生じた。最近の例は、Ｄ−リモネンの、ナラタケ　アルミラレイラ・メラエ（Ａｒｍｉｌｌａｒｅｉｒａ ｍｅｌｌａｅ）によるα−テルピネオールおよび６−ヒドロキシカルベオールへの転化；アスペルギルス・セルロサエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａｅ）によるイソピペリテノン、リモネン−１，２−トランスジオール、シス−カルベオールおよびペリリルアルコール、イソピペリテノール、およびα−テルピネオールへの転化；Ｄ−リモネン分解性菌株バシラス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＢＲ３８８によるカルベオールα−テルピネオール、ペリリルアルコールおよびペリリルアルデヒドへの転化；およびこの菌株からの染色体挿入物を有するプラスミドを含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）構築物による同じ転化である。今まで報告された最も位置特異的微生物生体触媒は、比較的低い速度であるとはいえ、Ｄ−リモネンをシス−およびトランス−カルベオールおよびカルボンに転化する担子菌プロイロタス・サピダス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓａｐｉｄｕｓ）である。
【０００５】
多くの研究において、唯一の炭素およびエネルギー源としてＤ−リモネンを使用するための能力を有する菌株が単離され、次いで増殖中の分解経路中間体の蓄積が評価された。これらの研究のほとんどは決定的ではなかった。というのは、酸化生成物の混合物が検出され、そしてこれらが、真の経路中間体であるかまたは経路酵素の不完全な位置特異性から生じるゆきづまり生成物であるかが一般に不明瞭なままであったからである。最近のより成功した例は、Ｖａｎ ｄｅｒ ＷｅｒｆおよびＤｅ Ｂｏｎｔの研究である。彼らは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＤＣＬ１４がＤ−リモネンを１，２−位でのエポキシ化により分解することを示し、そしてそのエポキシダーゼをコードする遺伝子を大腸菌において首尾よくクローン化し、その結果、Ｄ−リモネン−１，２−エポキシドを高収率で製造するための生体触媒を得た。
【０００６】
米国特許第５６８８６７３号は、カルベオール、カルボン、ペリリルアルコールおよびテルピネオールの混合物をバシラス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡセグメントを使用して製造する方法を開示している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、Ｄ−リモネンからトランス−カルベオールを製造することができるオキシゲナーゼを発現する一連の菌株を今発見した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、（ａ）トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行うことができるオキシゲナーゼを発現する微生物細胞を含む培養基をＤ−リモネンの存在下でインキュベートすること、および（ｂ）該培養基からカルベオールを回収することを含む、トランス−カルベオールの製造方法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、純粋なトランス−カルベオールを提供するだけでなく、この生成物をＤ−リモネンから有意な収率で提供するために比類無く適する細菌を使用するための唯一知られた方法である。さらに、本発明方法は、比較的簡単かつ経済的であり、したがって工業的適用での使用のために魅力的である。
【００１０】
本発明の方法は、トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行うことができるオキシゲナーゼを発現する微生物株を使用してＤ−リモネンからトランス−カルベオールを製造するための方法に関する。微生物株は、適切には、細菌、真菌または酵母のものであり得る。好ましくは、上記株が細菌のものである。トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行うことができる株は、最初の分解工程として芳香族環の二原子酸素添加を含む経路（一般には「トッド（ｔｏｄ）」経路と呼ばれる）によってトルエンを分解することができる株として定義される。
【００１１】
本発明方法は、そのようなオキシゲナーゼを発現する細胞を含む細胞培養物を用意すること、および単離できる量のトランス−カルベオールを製造するためにＤ−リモネンの存在下で細胞をインキュベートすることを含む。本発明での使用に適する菌株は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、例えばロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）およびロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、由来の、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来の菌株を包含する。好ましい菌株は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のもの、特にロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４（ＤＳＭＺ４４３１３）である。
【００１２】
オキシゲナーゼをコードする遺伝子は、適切には、細菌または酵母菌株中でクローン化され、そして発現され得る。
【００１３】
オキシゲナーゼを発現する菌株は、トルエンおよび／またはナフタレンを許容することができ、好ましくは、トルエンおよび／またはナフタレンの二原子酸素添加を行って対応するジヒドロジオール、トルエン−シス−１，２−ジヒドロジオールおよびシス−１，２−ジヒドロキシナフタレンにすることができなければならない。
【００１４】
インキュベーションは、適切には、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度で行なわれ得る。
【００１５】
Ｄ−リモネンは、好ましくは、気相でまたは、純粋なもしくは不活性溶媒（例えばヘキサデカン）中に溶解された、液体の第二相として、培養基中に供給される。適切には、Ｄ−リモネンは、時間にわたって少しずつ、培養基に直接添加される。そのような手法は周知である。
【００１６】
細胞培養で使用される増殖培地は、適する誘導物質、例えばトルエン、の存在下で適する炭素源を含む任意の適する鉱物培地であり得る。
【００１７】
トランス−カルベオール生成物は、固相抽出または適する有機溶媒による抽出によって培養基から単離され得る。Ｄ−リモネンが純粋な形態で使用されるとき、生成物はＤ−リモネン相中に連続的に抽出され得る。転化されていないＤ−リモネンは、減圧蒸留によって除去され得る。
【００１８】
また、本発明のトランス−カルベオール生成物は、特定の菌株の酵素が使用されるとき、部分的にまたは全体的にカルボンに転化され得る。すなわち、本発明の別の局面によれば、（ａ）ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＰＷＤ８（ＤＳＭＺ４４３０６）を含む培養基をＤ−リモネンの存在下でインキュベートすること、および（ｂ）培養基からカルベオールおよび／またはカルボンを回収することを含む、トランス−カルベオールおよび／またはカルボンの製造方法が提供される。
【００１９】
【実施例】
次に、本発明を、以下の実施例および添付した図１を参照して説明する。
【００２０】
材料および方法
（１）スクリーニング：１つの単一の９６ウェルマイクロタイタープレートに−８０℃で貯蔵された多菌株を、先に記載されたスプリング付きの９６ピンレプリケーター（Ｋｕｈｎｅｒ（スイス国バーゼル））を使用して同時に（残りの培養物を温めることなく）サンプリングし、そして、その各々のウェル（許容容積３５０μｌ）に、Ｃ源を何ら有しない固形の寒天（２％（重量／体積））鉱物培地の１８０μｌが充填されている、標準の滅菌ポリスチレンマイクロタイタープレートに移した。接種されたマイクロタイタープレート（上のふたは、ウェルを出たり入ったりする気体拡散の十分なレベルを可能にするために、ウェルから２ｍｍの距離で保持された）を、水のビーカーおよびヘキサデカン中のトルエンの１０％溶液（体積／体積）１０ｍｌを含む５０ｍｌビーカーと共にデシケーター中に置いた。
【００２１】
環境温度（２２〜２５℃）での７日間の増殖の後、寒天表面上に生育した細胞塊を以下のように採取した。１１０μｌのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を各ウェルに添加した。スプリング付きレプリケータ−をウェル中で横方向に繰り返し動かすと、細胞塊の広い部分の懸濁物を生じた。懸濁物を次いで、０．５ｍｌの円錐形のウェルを有するマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉ−ｐｌａｑｕｅ， Ｐｏｌｙｌａｂｏ（ジュネーブ））に移した（１２チャネルマルチピペットおよびワイドオリフィス先端を使用）。マイクロタイタープレートを、遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、５４０３型）中で、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞を、ワイドオリフィスのピペット先端に充填しそして空にすることを繰り返すことにより（１２チャネルマルチピペットを使用）、１００μｌのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。次いで、光学的に純粋なＤ−リモネン（Ｆｌｕｋａ， ｐ．ａ．）の２μｌを各ウェルに添加し、そのウェルを、先に記載されたように（１２）、サンドイッチカバー（硬質のポリプロピレンプレートと組み合わさった軟質シリコーンの穴のあいた層）を使用して閉じた後、３００ｒｐｍで、５ｃｍの振動振幅で、２５℃で２時間の軌道振動（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ）を行った。次いで、マイクロタイタープレートを、４０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。５０μｌの上清（残りのＤ−リモネン相を有しない）を、１２チャネルマルチピペットを使用して、半面積のマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９６型、Ｃｏｒｎｉｎｇ（ニューヨーク））に移した。
【００２２】
（２）分析法：生成物を、ＨＰＬＣおよびＧＣによって分析した。ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）には、ダイオードアレイ検出器（１９０ｎｍに設定）およびマス検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ）を直列に備えた。ＧＣ（Ｖａｒｉａｎ ３４００）には、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えた。
【００２３】
結果を下記表１に示す。結果から分かるように、トルエンの二原子酸素添加を行うことができるオキシゲナーゼを発現する細菌株は、Ｄ−リモネンをトランス−カルベオールヘ転化することができ、一方、他の菌株は、Ｄ−リモネンをトランス−カルベオールヘ転化することができない。
【００２４】
【表１】
2004513640.tif 000002
ａ）菌株型との１００％１６ＳＲＮＡ遺伝子配列同一
ｂ）菌株型との９９．０〜９９．８％１６ＳＲＮＡ遺伝子配列同一
ｃ）芳香族環のジヒドロキシル化を含むトルエン分解経路
ｄ）メチル基のモノヒドロキシル化を含むトルエン分解経路
ｅ）パラ位におけるモノヒドロキシル化を含むトルエン分解経路（３３）
ｆ）オルト位におけるモノヒドロキシル化を含むトルエン分解経路（２８）
ｇ）トランス−カルベオール濃度の８〜１６％の濃度のカルボンの共産生
ｈ）トランス−カルベオール濃度の１〜３％の濃度のカルボンの共産生
【００２５】
実施例１：ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４を使用するトランス−カルベオールの製造
１．１．　ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４の増殖：
ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）を、１００ｍｌのエルレンマイヤー形ケモスタット中で、５ｍＭのグルコースが補充された鉱物培地上で、０．０３ｈ−１の希釈速度で増殖させた。トルエンを、先に記載された気相を介して追加のＣ源として供給し、細胞を、約１ｇ乾燥重量／リットルの乾燥重量に到達させた。
【００２６】
１．２．ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４を使用するトランス−カルベオールの製造：
ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４を、気相を介して供給された、主Ｃ源としてのトルエンを有する鉱物培地上で、０．０３ｈ−１の希釈速度でキモスタット中で培養した。培養物が、１．２５ｇ乾燥重量／リットルの一定乾燥重量に達した後、細胞を採取し、そしてトルエンの存在下および不存在下でＤ−リモネンの生体変形動力学を研究するために使用した。トルエンの不存在下では、トランス−カルベオールの最大濃度が２時間後に測定された（１．２１ｍＭ）（図１）。検出された唯一の他の酸化生成物は、カルボン（約１５μｌ、すなわち、生成されたトランス−カルベオールの１．３％）であった。トルエンを用いない実験でのトランス−カルベオールのモル収率は、カルベオールの標準が１００％純粋であると仮定すると、約９７％（モル／モル）であり、カルベオールの標準が９７％（供給者によって最小純度として示される）に過ぎないならば９４％（（モル／モル）であった。この生体変形のクロロホルム抽出物のガスクロマトグラムは、１つの有意なピークのみを示した。これは、トランス−カルベオールの保持時間に正確に対応する（図１）。初期の比活性は、１４．７Ｕ（ｇ細胞乾燥重量）−１であった。
【００２７】
実験は、４３ｍｌの総容積を有する閉じられた頭隙バイアル中で行われた。点線は、Ｄ−リモネンに関するモル収率が１００％であるならばトランス−カルベオールの理論的濃度を示す。
【００２８】
トルエンの存在下では、トランス−カルベオール形成の比活性が０．８Ｕ（ｇ細胞乾燥重量）−１であった。最初の１時間のインキュベーションにおける平均の水性トルエン減少速度は２２μＭ／分であり、これは、５８Ｕ（ｇ細胞乾燥重量）−１のトルエン消費（頭隙中に気体状態で存在するトルエン（総量の６８％）のための較正後）の比活性に対応した。全てのトルエンが消費された後、比トランス−カルベオール形成速度は９倍増加して７．８Ｕ（ｇ細胞乾燥重量）−１になった。最高のトルエン分解速度と、測定された最高のトランス−カルベオール形成速度との比較は、Ｄ−リモネンに関する相対活性が２５％であることを示す。これらの結果は、トルエンが、Ｄ−リモネンのトランス−カルベオールへの生体変形の可逆的拮抗阻害剤であることを示す。
【００２９】
実施例２：ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＰＷＤ８を使用するトランス−カルベオールおよびカルボンの共製造
菌株ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＰＷＤ８のトルエン誘導細胞を、Ｄ−リモネンと共にインキュベートした。初期のトランス−カルベオール濃度（最初の１時間の平均）は、０．７３ｍＭｈ−１であり、３Ｕ（ｇ乾燥重量）−１の比活性に相当した。２時間後には、添加されたＤ−リモネンの９０％より多くが変形されてトランス−カルベオールになり（１．１ｍＭ）、そして、０．０８ｍＭの濃度のカルボンが形成された。カルボの濃度は徐々に増加して２７時間後には最大０．２９ｍＭになった。一方、トランス−カルベオール濃度はそれに応じて減少し、これは、形成されたトランス−カルベオールがカルボンにゆっくり転化されたことを示す。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ロドコッカス・オペイカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）ＰＷＤ４の存在下でのＤ−リモネンからのトランス−カルベオール形成の動力学のグラフである。
【図２】
図２は、カルベオールのＨＰＬＣ分析によるクロマトグラムである。
【図１】
2004513640.tif 000003
【図２】
2004513640.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004513640.tif 000005
2004513640.tif 000006
2004513640.tif 000007
2004513640.tif 000008
2004513640.tif 000009
2004513640.tif 000010
2004513640.tif 000011
2004513640.tif 000012
2004513640.tif 000013
2004513640.tif 000014
2004513640.tif 000015
2004513640.tif 000016
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513640.tif 000017
【国際調査報告】
2004513640.tif 000018
2004513640.tif 000019
2004513640.tif 000020