(57)【要約】標的の同定と標的の機能の同定を含む創薬の新しい諸方法が開示されている。本方法は、病状を治療するための薬学療法を開発するための、標的の高速な同定と高処理スクリーニングを供給する。
2004508552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む方法：
（ａ） 以下によって標的をアッセイする；
（ｉ） 標的に推定の機能を割り当てる；
（ｉｉ） 相互作用候補のライブラリーを提供する；
（ｉｉｉ） 標的を含む反応混合物を提供する；
（ｉｖ） 標的を、相互作用候補のライブラリーのメンバー一つまたはそれ以上に接触させ、相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つの選ばれたメンバーについて、熱出力の結果的変化に相当する値を計測する；
（ｂ） その標的を使用し、相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つの選ばれたメンバーの少なくとも一つの薬理学的特性を決定することを含むような創薬に着手する。
【請求項２】
標的をアッセイする前に標的を処理することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
標的をアッセイする前に標的を性格づけることをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
標的をアッセイする前に標的を同定し選択することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
標的を同定し選択することが以下を含むような、請求項４の方法。
（ａ） 標的を病状に関連づけ、そして
（ｂ） 関連づけられた標的を選択する。
【請求項６】
標的を同定し選択することが以下を含むような、請求項４の方法。
（ａ） 病状を同定し、
（ｂ） 関連づけられた病状に関連づけられた標的を同定し、そして
（ｃ） 同定された標的を選択する。
【請求項７】
標的を処理することが標的の分離と精製を含む、請求項２の方法。
【請求項８】
標的を性格づけることが標的の一つまたはそれ以上の物理的特質を決定することを含む請求項３の方法。
【請求項９】
標的の物理的特性が、ＮＭＲ、ＥＰＲ、蛍光法、リン光法、光散乱法、円偏光二色性法、紫外視吸収法、赤外分光法、そして熱量測定法のうち少なくとも一つの技法を使って決定される、請求項８の方法。
【請求項１０】
第二のライブラリーメンバーあるいは第二の基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを使用し、（ｃ）〜（ｆ）の段階を繰り返すことをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
標的がタンパク質か酵素である、請求項１の方法。
【請求項１２】
標的をランクづけすることをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
標的が、タンパク質機能、酵素活性、酵素代謝回転に従ってランクづけられている、請求項１２の方法。
【請求項１４】
創薬着手のために、相互作用候補のライブラリーのメンバーに結合する標的が選ばれる、請求項１の方法。
【請求項１５】
創薬着手が以下をさらに含む、請求項１の方法。
（ａ） 化学ライブラリーを合成する；
（ｂ） 以下により、選ばれた標的を使って化学ライブラリーをアッセイする；
（ｉ） 選ばれた標的に推定された機能を割り当てる；
（ｉｉ） 相互作用候補のライブラリーを供給する；
（ｉｉｉ） 選ばれた標的を含む反応混合物を供給する；
（ｉｖ） 選ばれた標的に、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを以って接触する；
（ｖ） 反応混合物の熱出力の変化を評価する；そして
（ｖｉ） 選択的に、得られた熱変化の値を規定値と比較する；
（ｃ） 標的に結合する化学ライブラリーのメンバーを選択する。
【請求項１６】
治療行為のために、インビボまたはインビトロの化学ライブラリーの選ばれたメンバーをテストすることをさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
合成された化学ライブラリーが、標的に結合する基質ライブラリーのメンバーの類似物または派生物である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
基質ライブラリーの一つまたは複数のメンバーが、未変性基質、基質類似物、基質派生物、遷移状態類似物、酵素生成物、酵素生成物の類似物、そして酵素生成物の派生物を含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
哺乳類に、化学ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーの薬理学的に有効な分量を投与することをさらに含む、請求項１５の方法。
【請求項２０】
化学ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーの、投与された薬理学的に有効な分量が存在するなかで病状をモニタリングすることをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
以下を含む、薬学療法の高速な同定のための創薬の方法：
（ａ） タンパク質標的を同定して選択する；
（ｂ） タンパク質標的を以下によりアッセイする；
（１） タンパク質標的に推定される機能を割り当てる；
（２） 相互作用候補のライブラリーを供給する；
（３） タンパク質標的を含む反応混合物を供給する；
（４） 相互作用候補のライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを以って標的に接触する；
（５） 反応混合物の熱出力の変化を評価する；
（６） 選択的に、得られた熱変化の値を既定値と比較する；
（ｃ） 熱出力の変化を誘発する相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つのメンバーを使って創薬に着手する。
【請求項２２】
基質ライブラリーのメンバーと結合する一つまたはそれ以上のタンパク質標的が選ばれる、請求項２１の方法。
【請求項２３】
第二のライブラリーメンバーあるいは第二の基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを使用し、（ｂ）（１）〜（ｂ）（６）の段階を繰り返すことをさらに含む、請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｒｉａｇｅ（熱量測定による標的選別試験法）」という表題で２０００年９月５日に提出された米国特許出願第６０／２３０，５４８号と、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｒｉａｇｅ（熱量測定による標的選別試験法）」という表題で２０００年１０月２６日に提出された米国特許出願第６０／２４３，４９６号に優先することを請求するものである。
【０００２】
導入
本発明は、創薬、薬剤開発、製品商品化を可能にするために、標的の機能と得られたデータの利用法を決定するような、標的（例えばタンパク質）と基質ライブラリーのメンバーの間の反応の熱量探知を含む創薬の方法とプロセスに関連するものである。
【０００３】
背景
新しい薬物療法学的薬物の発見は典型的に、特定の種（例えばタンパク質）を標的にする手順をふみ、インビトロな、またはインビボな生化学アッセイ法を利用してこれらの種に結合するような化合物を探すことによってなされる。したがって、創薬の主な難しさは新しい標的の同定にある。現在の市場にのっている人間薬物療法を全部あわせて５００種以下のタンパク質が標的にされていると見積られている。最近１０年間で、ヒトゲノム、およびバクテリアや菌類を含むその他の重要な生物体のゲノムの配列決定により、創薬の標的になる数多くの新しいタンパク質を含むプロテオームに関する我々の知識が大きく拡大した。次の１０年間で、５，０００から１０，０００の新しいタンパク質が創薬の標的として得られるようになるだろうと信じられている。これは、薬物標的の非常に多くが未だ未発見だということを示唆している。本発明は、有益な新薬の発見に使用できる効率的な創薬方法と手順を提供する。
【０００４】
要約
第一の様相において、創薬標的の同定の新しい方法が開示される。 ここで言う標的とは、タンパク質、脂質、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれに類するものを言う。好ましくは、標的は、膜タンパク質、複合タンパク質、末梢タンパク質、細胞外タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、細胞小器管タンパク質、細胞核タンパク質、繊維タンパク質、球状タンパク質、シャペロン、およびそれに類するタンパク質を指す。より好ましくは、標的は、酵素特性および／もしくは輸送特性を持つタンパク質を指す。つまり、もっとも好ましくは、標的は、一つまたはそれ以上の化学的、生物学的、あるいは生化学的反応を触媒することができるタンパク質を指す。好ましくは、複数段階の手順は、一つまたはそれ以上の標的を同定するのに使われる。しかし、複数段階の手順の一つまたはそれ以上の段階は、標的について知られている情報次第では省略することができるかもしれない。加えて、標的について知られている情報や当明細書で概要を説明される段階を通して発見される結果次第では他の段階を足す必要があるかもしれない。方法は以下の段階を含む：
（ａ） 以下によって標的をアッセイする；
（ｉ） 標的に推定の機能を割り当てる；
（ｉｉ） 相互作用候補のライブラリーを提供する；
（ｉｉｉ） 標的を含む反応混合物を提供する；
（ｉｖ） 標的を、相互作用候補のライブラリーのメンバー一つまたはそれ以上に接触させ、相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つの選ばれたメンバーについて、熱出力の結果的変化に相当する値を計測する；
（ｂ） その標的を使用し、相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つの選ばれたメンバーの少なくとも一つの薬理学的特性を決定することを含むような創薬に着手する。
【０００５】
ある態様においては、熱出力の結果的変化に相当する値が例えば他の既定値と比較することができる。ある好ましい態様において、方法は以下の段階を含む：
（ａ） 以下によって標的をアッセイする；
（ｉ） 標的に推定された機能を割り当てる；
（ｉｉ） 相互作用候補のライブラリーを供給する；
（ｉｉｉ） 標的を含む反応混合物を供給する；
（ｉｖ） 標的に、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを以って接触する；
（ｖ） 反応混合物の熱出力の変化を評価する；そして
（ｖｉ） 選択的に、得られた熱変化の値を規定値と比較する；
（ｂ） 選択的に、その標的を他の標的に対してランクづけする；
（ｃ） 標的もしくは相互作用候補のライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーの少なくとも一つの薬理学的特性を決定することによって、標的を利用した創薬に着手する。
【０００６】
さらに別の態様において、方法は以下の段階を含む：
（ａ） タンパク質標的を同定して選択する；
（ｂ） タンパク質標的を以下によりアッセイする；
（１） タンパク質標的に推定される機能を割り当てる；
（２） 相互作用候補のライブラリーを供給する；
（３） タンパク質標的を含む反応混合物を供給する；
（４） 相互作用候補のライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを以って標的に接触する；
（５） 反応混合物の熱出力の変化を評価する；
（６） 選択的に、得られた熱変化の値を既定値と比較する；
（ｃ） 熱出力の変化を誘発する相互作用候補のライブラリーの少なくとも一つのメンバーを使って創薬に着手する。
【０００７】
当明細書における薬理学的特性とは、薬効力、生体利用度、有効性、解離定数、結合親和性、毒性、代謝、薬物動態、薬動力学、生体内変換、排出、清掃率、分布、半減期、吸収率、投与量、初回投与量、維持投与量、作用機序、受容体結合などを指す。当明細書における基質ライブラリーとは、潜在的相互作用（例えば酵素活性）のために標的をスクリーニングできるような化合物の集合を指す。典型的な基質ライブラリーは、未変性基質（知られているものあるいは予測されるもの）、基質類似物質、遷移状態類似物質、潜在的生成物、基質派生物質、および類するものを含むかもしれない。典型的には、相互作用（例えば酵素活性）の結果、ＡＣＴＴのような当明細書で開示される方法を含む多くの方法によって検知されるかもしれない熱出力の変化が起こる。多くの場合、標的の機能、配列、特性などは未知であるかもしれない。本明細書で開示される方法は、標的を同定し、これら標的の機能を同定し、標的に結合し、標的を阻害あるいは場合によっては活性化することができる基質ライブラリーと化合物を同定するようにデザインされている。例えば、ある態様においては、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーは一つまたはそれ以上の標的に結合してその酵素活性を阻害するが、その一方、他の態様においては、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーは一つまたはそれ以上の標的に結合して活性化する。当分野に熟練した者は、当開示の恩恵を以ってして、当明細書記載の方法での使用に適した標的を選ぶことができるであろう。以下に詳述するように、方法はさらに標的を同定し選択すること、そして標的を特徴づけることをも含む。
【０００８】
別の様相において、標的の同定と選択は、好ましくは病理生物学のような、病状または医学的状況と潜在的標的の間に関連や結び付きを確立することができる情報に基づく。このような情報は配列情報、生物情報学的情報、病理学あるいは臨床情報、ゲノム研究から得られた情報、およびそれらの類似を含むかもしれないがそれらに限定されるものではない。標的の選択は、好ましくは、標的がある病状に関連づけられる、あるいは関わっているかもしれない可能性に基づいて行われる。つまり、選択は、一つまたはそれ以上の標的が病状に関連づけられる確率に基づくものである。よって、標的に結合し阻害する基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーの同定は、例えば、標的に関与する病状を治療することができる薬物治療のデザインにつながるものである。それゆえ、当明細書に記載の諸方法を使えば、標的の高速な同定と標的に結合し好ましくは阻害する薬物治療とが容易に同定可能となる。
【０００９】
さらに別の様相において、標的は、好ましくはそのアッセイに先んじて処理される。そのような処理は、宿主系、例えば標的のＤＮＡ配列を含む適合的ベクターを持つバクテリア系の中の標的を発現させたり、クロマトグラフィー、電気泳動法およびそれに類したような標準的化学的生物学的技術を使っての標的を精製したりすることを含むかもしれないがそれらに限定されるものではない。処理はまた、未変性標的を試験したり比較したりするための標的の変種（例えば変異体）の準備を含むかもしれない。標的の変種を準備するために適した方法は当分野に熟練した者には良く知られており、点変異、ランダム変異、およびその類いを含むがそれらに限定されるものではない。当分野に熟練した者は、当開示を以ってすれば、当明細書に記載の方法で使用するための変種を準備することができるだろう。
【００１０】
さらに別の様相において、標的は好ましくは、選択と同定と処理のあとに特徴づけられる。特徴づけの適した方法は化学的生物学的方法を含む。例えば、ＮＭＲ、ＥＰＲ、蛍光法、リン光法、光散乱法、円偏光二色性法、紫外視吸収法、赤外分光法、分光学法、光音響分光学法、熱量測定法などの分光学的技術が、標的を特徴づけるのに使うことができる。他の特徴づけの方法には、標的の構成（例えば標的の配列など）を同定するための物理学的特性や標的の潜在的機能を同定するための酵素アッセイ法がある。標的がタンパク質である態様においては、分離した標的が未変性形である（例えば、正しく折り畳まれている）ことを証明するために、示差走査熱量測定などの他の適した方法を使うことができる。
【００１１】
さらに別の様相において、標的のアッセイは、好ましくは、標準的結合分析（例えばスキャッチャード分析や競合分析）を使って達成されるかもしれない。ある好ましい態様においては、下に記述するように、また、開示内容すべてが当明細書に全用途について参照として組み入れられるところの米国特許出願第０９／４５３，１２２号に記載されているように、アルセクシス熱量測定標的選別試験法Ａｌｔｈｅｘｉｓ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｔａｒｇｅｔ Ｔｒｉａｇｅ （ＡＣＴＴ）が標的をアッセイするのに用いられる。ＡＣＴＴは、典型的には、標的の高速で高処理のスクリーニングを提供し、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーに結合しない一つまたはそれ以上の標的を排斥する。例えば、一つまたはそれ以上の精製された標的（例えば精製されたタンパク質）は、試験官、エッペンドルフ、バイアルなどの容器に、その標的のための基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバー（例えば一つまたはそれ以上の潜在的基質または基質類似物質）とともに置くことができる。その容器は、熱量計、より好ましくは微熱量計、最も好ましくは高処理微熱量計に置くことができ、基質のいずれかに酵素代謝回転があるかを決定することができる。このプロセスは、標的に関連する活性があるかどうかを同定し、どの特異的基質が活性を生成したかを決定するを可能にし、続いてどの基質が標的に結合したかを同定する。どの特異的基質が標的に結合したかを決定することは、もとの基質全部より少数の基質でもってさらに熱量測定を複数回実行して排斥するか、他の適した手段（例えば基質ライブラリーの放射線でラベルづけされたメンバーを使うスキャッチャード分析）を利用することにより可能になる。このステップは、基質ライブラリーをもう一つ構築することが含まれる。標的のアッセイと、使用可能な標的と基質ライブラリーの種類については、以下の「熱化学センサーとその使用」と題された節で例示とともに議論する。
【００１２】
さらに別の様相において、標的は、基質同定後の分析を利用してさらにアッセイすることができる。基質同定後の分析では、基質転換の生成物を決定することができる。つまり、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーが存在する中での酵素代謝回転による生成物を決定することができる。生成物を同定することにより、酵素またはタンパク質がもたらす完全な反応があきらかになる。次に、当該基質、基質類似物質、遷移状態類似物質、生成物および生成物の類似物質に基づく高処理アッセイを設定することができる。そのような高処理アッセイは典型的には、当該酵素の活性との干渉のための化合物ライブラリーを試験するようデザインされた酵素アッセイである。例えば、試験は、基質を酵素とともに容器に加え、生成物の出現または基質の消失をモニタリングすることを含むかもしれない。次に、創薬計画への適性を決定するために、既知の創薬技術と手順を利用して、反応プロセスに干渉する化合物（例えば競合、非競合、そして不競合阻害剤）をテストする。次に、再び既知の創薬技術と手順を利用して、化合物をさらに精製、最適化する。精製と最適化の後、一つまたはそれ以上の化合物は、臨床前および臨床開発候補へと前進し、最終的には有効な市販薬となる。例えば、一つまたはそれ以上の化合物は、病状を治療するために、選択的には一つまたはそれ以上の結合剤とともに、薬剤的に効果的な分量を哺乳類に投与することができる。そのような化合物は、標準的投与量および投与計画（例えば、日に一度、日に二度、など）に従って投与することができる。適した投与量（例えば、体重１ｋｇにつき１〜１０μｇの化合物、体重１ｋｇにつき１〜１００μｇの化合物、体重１ｋｇにつき１〜１０ｍｇの化合物、体重１ｋｇにつき１０〜１００ｍｇの化合物など）は、当分野に熟練した人々ならば、当開示の恩恵を以ってすれば、容易に決定することができるだろう。
【００１３】
さらに別の様相において、基質同定後の分析はまた、酵素の活性の機序の解明に貢献することが可能である。酵素の活性の機序の知識により、酵素機序に基づく阻害剤（例えば分割不可能な、あるいは加水分解不可能な遷移状態類似物質）をデザインするために使う酵素の遷移状態に関連した情報が供給される。基質同定後の分析はまた、当該タンパク質の三次元構造についての研究としての側面をも持っている。構造は、例えば、分子モデリング研究と連動して、Ｘ線結晶法や高場核磁気共鳴分析法を通して決定することができる。基質が結合するタンパク質の部位（例えば活性部位）の詳細な知識により、そのタンパク質の近くの原子との特異的相互作用をしばしば利用する潜在的阻害剤の化学構造についての洞察が得られる。したがって、基質同定後の分析は、薬物としての小分子の最適化のために使える方法を少なくとも三つ供給する：（１）創薬のための手がかりの同定への、設定可能な高処理アッセイの基盤を形成することができる、（２）薬物としての酵素阻害剤をデザインする古典的な方法である酵素機序についての情報を提供できる、そして（３）基質一般の（阻害剤に比しての）高溶解度のおかげで、基質または基質類似物質が結合した状態の標的の構造を解くことを容易にし、潜在的ファルマコフォアおよび分子間相互作用の性質についての洞察を提供する。
【００１４】
さらに別の様相において、選択的に、標的はランクをつけることができる。標的のランクづけは創薬の標的としてのタンパク質の選択の助けとなり、典型的にはいくつかの基準を含む。例えば、標的は、最も高いランクの標的が創薬のために選択される風にランクづけることができる。このようなランクづけは、触媒される反応のタイプ、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーの結合親和性、酵素代謝回転数、溶解度、分子重量、標的の局在性（例えば細胞外、細胞質ゾル、細胞小器管など）を含むかもしれないがそれらに限定されるものではない。標的は、病状への関連性（例えば標的と関心の病状との関係）に従ってランクづけすることができるかもしれない。この関係を決定する研究は、細菌、菌類、動物細胞もしくは人間細胞における遺伝子ノックアウトテクノロジーを使った研究を本質的には含むかもしれない。これらの研究によって、細胞から除去することによって細胞が生き残ることができなければ、遺伝子と遺伝子生成物が必須であるということが示されうる。他の基準としては、タンパク質の化学的構造の適性やタンパク質の小分子阻害剤の開発の可能性などがある。いくつかの場合には、タンパク質の構造と機能の知識によって、タンパク質の有益な阻害剤となるかもしれない化合物の種類をの手がかりを得られるだろう。この情報のために、化学合成の取り扱いやすさ、医薬使用への適性、および計画の市場的実行可能性を見積ることができる。当分野に熟練した者は、当開示の恩恵を以ってすれば、創薬に適した標的および基質ライブラリーをランクづけして選択することができるであろう。
【００１５】
さらに別の様相において、ある標的は創薬のために選ばれる。標的の選択は典型的には、病生物学、計算化学、生物情報学、機構酵素学、基質と標的の特徴に基づく潜在的化学、および特定標的の構造的情報の知己に基づく。好ましくは、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーに結合する標的が選ばれる。他の様相においては、選ばれた標的を用いて創薬に着手する。そのプロセスは、好ましくは良く知られた創薬プロトコールと方法に従ってとりおこなわれ、アッセイの「当たり」を同定すること、それらを「手がかり」への発展させること、化合物最適化へと前進すること、そして最終的には臨床前および臨床開発を開始することを含む。そのような臨床前および臨床試験方法は、当分野に熟練した者には良く知られたものであり、インビトロおよびインビボな試験、動物試験（例えばラットや人間など哺乳類へのテスト）、および潜在的薬物治療学の臨床試験のためのその他の標準ＦＤＡ認可手順を含むものである。
【００１６】
当明細書において開示され記述されている新しい複段階創薬の方法の好ましい態様が規模調整できることは重要な利点である。つまり、当明細書に記載の方法は、製薬産業の現在の要求に合わせて規模調整することができる。方法はさらに、未来の製薬産業のニーズに合うように規模調整して、商業的時間枠および実際的資源の範囲内で何千もの標的を扱うことができる。
【００１７】
本発明のある好ましい態様は、添付された図を参照しつつ以下に記述されることになる。
【００１８】
いくつかの好ましい態様の詳細な記述
Ｉ． 創薬
いくつかの好ましい態様において、標的は、多くの方法論によって同定、選択することができる。好ましくは、標的は一つまたはそれ以上の病状に潜在的標的を関連づけることによって同定、選択する。このような関連づけは典型的には臨床および実験室研究を利用して解明される。例えば、欠陥遺伝子によって症状が引き起こされる病状は、例えば適したタンパク質の不在や欠陥タンパク質の存在に関連づけることができるかもしれない。つまり、欠陥遺伝子によって、正常な細胞機能が維持できないレベルまで活性が減退しているタンパク質（例えば、細胞の正常な機能に必須であるようなタンパク質）が生成されるかもしれない。あるいは欠陥遺伝子によって、細胞の細胞性特性を変えてしまうようなタンパク質が生成されるかもしれない（例えば、欠陥タンパク質によって、一つまたはそれ以上の遺伝子の転写の開始をはじめとする望ましくない副作用があらわれたりする）。それゆえ、タンパク質の活性化および／あるいは阻害は、病状を治療する潜在的方法の一つとなりうる。従って、タンパク質それぞれに結合する基質ライブラリーのメンバーを同定するために、欠陥タンパク質だけでなく未変性タンパク質も選ぶことができる。そのような比較によって、細胞機能におけるタンパク質の役割に対する洞察が得られる。
【００１９】
好ましい態様において、図１と２にあるように、標的は、良く知られている化学的、生物学的および分子生物学的技術を利用して同定し、選択することができる。例えば、病状に関連している欠陥遺伝子は、適切な発現系（例えば、バクテリア発現系、酵母菌発現系、哺乳類細胞発現系やそれに類するもの）を使ってクローニングすることができる。クローニングされた遺伝子の生成物（例えばＲＮＡやタンパク質）は、あるいくつかの化合物（例えばｌａｃオペロンを含む誘導性ベクターの場合はラクトース）が存在する中でタンパク質を過発現するようにデザインされた発現系を選択することによって大量に生成することができる。標的の発現のあと、標的は、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術（例えば、親和性クロマトグラフィー、カラム・クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＬＣ、キャピラリー電気泳動法、ゲル泳動法など）を用いて分離することができる。存在する選択タグ（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ・タグ、ヒスチジン・タグおよびそれに類するもの）はどれも、発現タグの除去の分野に熟練した者に既知の良く知られた技術を使ってテストする間に、発現したタンパク質から取り除いてもよい。一つまたはそれ以上の精製した標的は、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーに対して個別に試験することができる。あるいは、精製標的は、下に詳述するように、基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーに対して試験するためにプールしておくことができる。
【００２０】
ある好ましい態様において、図３にあるように、精製された標的は典型的には、その標的のアッセイ以前に特徴づけられる。つまり、標的の物理的、化学的、および／もしくは物理化学的な特性のいくつかは、基質ライブラリーのメンバーに対して標的を試験する前に解明される。そのような試験は典型的に、標的の潜在的機能（例えば潜在的酵素機能）だけでなく標的の物理的構造や特性（例えば、二次元、三次元構造）を示差するものである。標的の特徴づけによって、典型的には、標的に結合するかもしれない基質ライブラリーのメンバーを同定する可能性がでてくる。つまり、標的の特徴づけによって、標的に結合する可能性の高い基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーを選択できる。加えて、標的に結合しそうにない基質ライブラリーの一つまたはそれ以上のメンバーも、コントロールとして選択することができる。そのような方法によって、標的に結合することができる基質、つまるところは潜在的薬物療法を同定するのに必要な時間が減少する。他の態様においては、基質ライブラリーはランダムに選ばれる。基質ライブラリーのランダム選択は、標的の特性や機能についてほとんどあるいは何も情報がない場合に適当かもしれない。当分野に熟練した者ならば、当開示を以ってすれば、標的を特徴づける適切な技術を選ぶことができるであろう。技術の例としては、ＮＭＲ、ＥＰＲ、円偏光二色性法、光散乱法、紫外視吸収法、赤外分光法、酵素アッセイ法、蛍光法、リン光法、光音響分光学法、大量分光学法、およびそれらに類するものがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
ある好ましい態様において、図４〜７にあるように、一つまたはそれ以上の標的に結合する一つまたはそれ以上の化合物を同定するために基質ライブラリーのメンバーを使って標的をアッセイすることができる。そのようなアッセイ法は当分野に熟練した者に良く知られた標準結合方法論を使うことによって取り行うことができる。好ましくは、そのような標的アッセイ法は、下記に詳述するように、ＡＣＴＴのような熱量測定法を使って取り行う。好ましい態様において、温度変化は、一つまたはそれ以上の標的に一つまたはそれ以上の基質が結合するのをモニタリングするのに使われる。温度変化は直接的に、例えば温度計、熱電計およびそれに類したものを使ってモニタリングできるかもしれない、もしくは熱量測定法を使ってモニタリングできるかもしれない。好ましくは、基質ライブラリーのメンバーはバッチ式に試験する。つまり、基質ライブラリーの１０、２０、３０、あるいはそれ以上のメンバーを一つまたはそれ以上の標的について試験する。熱が上がらない場合（発熱反応）または要求されない場合（吸熱反応）、試料のなかの全ての基質は標的のための潜在的基質として排除することができる。熱が上がるか要求される場合は、試料は追試のために下位分割することができる。例えば、基質ライブラリーの１０のメンバーと一つの標的を含む試料が熱を生みだすなら、その試料の中の基質ライブラリーメンバーは５メンバーずつそれぞれ含む２つの試料に下位分割してもよい。その標的を使って再び手順を取り行うことができる。つまり、５メンバーを含む２つの試料のそれぞれについて、標的に対して試験することができる。熱を生み出さない、あるいは熱を要求しない試料はどれも廃棄することができ、一方で、熱を生み出す試料はさらに下位分割して、例えば標的に結合する基質ライブラリーのメンバーを同定するために個別に試験する。当分野に熟練した者ならば、当開示の恩恵を以ってすれば、一つまたはそれ以上の標的に結合する基質ライブラリーのメンバーを高速に決定する適切な試験方法を選択することができるであろう。
【００２２】
ある好ましい態様において、基質ライブラリーと標的を使った酵素反応の生成物は、同定可能である。つまり、生成物は、良く知られた化学技術（例えば透析、濾過、クロマトグラフィー、およびその類）を使って分離することができ、良く知られた化学技術（例えばＮＭＲ、ＨＰＬＣ、大量分光法など）を使って同定することができる。生成物と基質の比較によって、活性部位幾何学と酵素機能についての情報が得られる。そのような情報としては、遷移状態の構造（例えば遷移状態幾何学）や反応の種類（例えば、添加、酸化、減少など）があるがそれらに限定されるものではない。この情報は、阻害剤、基質類似物質、遷移状態類似物質などのデザインや合成をする際に有用であるかもしれない。当分野に熟練した者は、当開示の恩恵を以ってすれば、活性部位幾何学や酵素機能を決定する適切な方法を選択することができるであろう。
【００２３】
ある好ましい態様において、創薬は、一つまたはそれ以上の標的に結合したり阻害したり活性化したりする基質ライブラリーのメンバーに基づいて立ちあげることができるかもしれない。標的に結合するライブラリーメンバーに似た化合物を含む化学的ライブラリーが合成されるかもしれない。例えば、派生物質、類似物質、相同体などを合成して、例えばＡＣＴＴを使って標的に結合するか、試験することができる。好ましくは、標的の未変性基質より低い解離定数を持っている化合物が、創薬目的で選ばれる。好ましくは、未変性基質の解離定数より５倍、１０倍、２０倍、５０倍、あるいは１００倍低い解離定数を持っている化合物が、創薬立ち上げのために選ばれる。創薬手順は、インビボな試験、インビトロな試験、動物試験、人間での試験、臨床前試行、臨床試行などを含む。当分野に熟練した者は、当開示の恩恵を以ってすれば、病状を治療する薬物療法を開発するための適切な創薬手順を選ぶことができるであろう。
【００２４】
ＩＩ． 熱化学センサーとその使用
以下の節では、当明細書において開示される方法に適用可能であり、主に、当明細書において開示される複段階プロセスのうち、少なくとも４番目の段階（「要旨」の段階（ｄ））を実行するための熱化学センサーとその使用について議論する。
【００２５】
Ａ． 熱化学センサーの要旨
本明細書に記載の方法は、被験化合物（例えば、被験リガンドまたは被験基質）と標的（例えば、標的タンパク質または核酸）との相互作用（例えば、結合）を熱の変化と関連付ける。熱出力は熱量計により検出される。本発明の方法より、標的の活性の種類、範囲、または特定の同一性に制限を課し、厳しく強いることなく、相互作用を分析することができる。一例として、本発明の方法より、未知の十分に特徴付けられていない、または単に推定されただけの、もしくは大まかに述べられた活性を有する標的に対する相互作用物質（例えば、基質）を同定することができる。本発明の方法は、例えば、標的が酵素である場合、１つまたは複数の被験基質を１つまたは複数の産物に変換した際に発生する熱の変化を検出するか、標的および相互作用物質がリガンドおよび対応リガンドである場合、結合した際に発生する熱の変化を検出する。熱の吸収または放出は化学反応の普遍的な特性であり、従って、本発明の方法の法的権限は、過度に制限を強いて標的の性質または標的と他の分子との相互作用についての仮説を立てる方法の法的権限を超えることができる。本発明の態様の中には、標的の性質または標的とその相互作用物質（例えば、天然のリガンド、基質、または結合パートナー）との相互作用についての仮説を必要としないものもある。本発明の他の方法は、可能性のある相互作用物質を選択する指針に、標的（および／もしくは相互作用物質）の知識、または標的（および／もしくは相互作用物質）についての仮説を取り入れている。例えば、本発明の態様は、相互作用物質の選択を最適化し、優先順位をつけて標的を試験するために、標的のゲノム分析または他のバイオインフォマティクス分析を使用する。
【００２６】
従って、１つの局面において、本発明は、標的（例えば、タンパク質）を分析する方法を特徴とする。（前記方法をタンパク質に関して説明するが、本明細書に記載の方法により他の標的分子（例えば、他の高分子、例えば、核酸）を分析することができる。）
【００２７】
本方法は、以下の段階を含む：
（１）選択的に、標的（例えば、タンパク質）に推定の機能を割り当てる段階。推定の機能は、任意の手段（例えば、標的が有する（または場合によっては有さない）特徴の同定）により割り当てることができる。例示的な特徴として、構造的特徴（例えば、タンパク質の場合、別のタンパク質との予め選択されたレベルの配列同一性）；配列もしくはモチーフ、またはタンパク質折り畳みの保有；標的と別の分子（例えば、機能既知のタンパク質）との３次元構造の類似性；プロモーター構造または他の３’、５’、もしくは他の調節構造；染色体上の位置または他の遺伝的特性（例えば、サプレッサー、栄養要求体、透過酵素、薬物抵抗性、薬物感受性、または他の類似する活性もしくは特性）；発現プロフィール（例えば、組織特異性、疾患または障害特異的発現、一過性発現パターン）；供給源（例えば、標的が得られた種が挙げられる。標的と機能既知の分子（例えば、タンパク質）が共有する（または場合によっては共有しない）特徴を同定すると、機能既知の分子（例えば、タンパク質）の活性を標的に割り当てることができる。例えば、推定の機能は、例えば、タンパク質またはこのタンパク質をコードする核酸の配列と参照配列とを比較することにより（例えば、標的タンパク質が予め選択された配列（例えば、予め選択されたモチーフ、例えば、コンセンサス配列）を含むかを確かめることにより）、またはタンパク質と、既知の３次元構造を有する別のタンパク質とを比較することにより（例えば、タンパク質折り畳みの有無を確かめることにより）、または標的タンパク質の結晶の３次元構造と機能既知の他のタンパク質の結晶の３次元構造とを比較することにより割り当てることができる；
（２）候補相互作用物質のライブラリー（例えば、タンパク質の可能性のある基質または結合リガンドのライブラリー）を提供する段階（好ましくは、ライブラリーは、少なくとも１つの、より好ましくは複数のメンバーを含み、各メンバーは、割り当てられた推定の機能を有するタンパク質と相互作用することが知られている。一例として、ライブラリーは複数のプロテアーゼ基質を含むことができる。推定の機能の割り当ては、例えば、特定の相互作用物質ライブラリーの選択を助けることでスクリーニングストラテジーを最適化することができる）；
（３）標的（例えば、タンパク質）を含む反応混合物を提供する段階；
（４）標的（例えば、タンパク質）をライブラリーのメンバーに接触させる段階；
（５）反応混合物の熱出力の変化を評価する段階；
（６）選択的に、得られた熱の変化の値を既定の値と比較することによって、例えば、標的（例えば、タンパク質）の基質またはリガンドであるライブラリーメンバーを同定することで標的（例えば、タンパク質）を分析する段階。（この方法ならびに本明細書に記載の他の全ての方法において、方法の段階への文字または数字の指定は、単に読者の便宜を図るためのものであり、特に必要のない限り、これらの段階が列挙された順番で行われなければならないという意味ではない。）
【００２８】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体、例えば、原核生物病原体または真核生物病原体により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【００２９】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【００３０】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【００３１】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有する。好ましい態様において、タンパク質は既知の第１の活性を有し、第２の活性（例えば、未知の活性）によって、このタンパク質と相互作用する相互作用物質を含むライブラリーに対して試験される。
【００３２】
好ましい態様において、標的は、天然に存在するタンパク質またはその断片；機能および／または構造が未知のタンパク質；リガンド、基質、または他の相互作用分子が未知のタンパク質である。他の態様において、タンパク質は少なくとも１つの酵素活性を有する。
【００３３】
好ましい態様において、標的は、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、構造ＲＮＡ、例えば、リボザイム）である。
【００３４】
好ましい態様において、複数のライブラリーメンバーが、例えば、同じ反応混合物中で同時に試験され、これにより、本発明の方法の処理量を増大することができる。複数のライブラリーメンバー（例えば、プラスの結果を生じるもの）をさらに小さな群に分け、これらのさらに小さな群を試験することができる。複数のライブラリーメンバーまたは小さな群（例えば、プラスの結果を生じるもの）から、１つまたは複数のライブラリーメンバーを個々に試験することができる。
【００３５】
好ましい態様において、本方法は、異なる条件下で（例えば、異なる塩濃度、異なるｐＨ、または異なる補因子の存在下で）、１つまたは複数の段階（例えば、段階（４）および（５）の一方または両方）を繰り返すことをさらに含む。
【００３６】
好ましい態様において、本方法は、ライブラリーの第２のメンバーまたはその後のメンバーを使用して、少なくとも１つの段階（例えば、段階（３）〜（６））を繰り返すことをさらに含む。好ましい態様において、複数のライブラリーメンバー（例えば、候補物質または被験リガンド）が試験される。好ましい態様において、複数のライブラリーメンバーには、少なくとも１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、または１０８個の化合物が含まれる。好ましい態様において、複数のライブラリーメンバーの少なくとも１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、または１０８個が構造的特徴または機能的特徴を共有する。
【００３７】
好ましい態様において、ライブラリーには、共通の特徴を有する複数のメンバーが含まれる。例えば、複数のメンバーの全てが、酵素補因子；（例えば、生合成酵素もしくは消化酵素の）基質（例えば、プロテアーゼ基質）（炭水化物、ヌクレオシド／ヌクレオチド、アミノ酸、脂質を含む）；ビタミン；ホルモン；核酸；例えば、ＤＮＡ分子；または天然物（例えば、細菌由来の天然物）である。ライブラリーには、前記のメンバーの任意の代謝産物、前駆体、または中間体が含まれ得る。
【００３８】
好ましい態様において、ライブラリーは、基質ライブラリー；補因子ライブラリー；炭水化物生合成および／もしくは分解ライブラリー；プリンおよびピリミジン生合成および／もしくは分解ライブラリー；アミノ酸生合成および／もしくは分解ライブラリー；脂質生合成および／もしくは分解ライブラリー；ビタミンおよび／もしくはホルモンライブラリー；核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリー；または天然物ライブラリー（例えば、細菌由来の天然物ライブラリー）である。
【００３９】
好ましい態様において、ライブラリーメンバーは、標的（例えば、標的タンパク質）と相互作用する可能性を有する化学種である。好ましくは、ライブラリーメンバーは候補基質または被験リガンドである。
【００４０】
好ましい態様において、ライブラリーメンバー（可能性のある相互作用物質または候補相互作用物質）は、酵素基質、代謝産物、補因子、天然物（例えば、細菌由来の天然物）、炭水化物、多糖類、核酸（例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド前駆体、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ）または一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子、環状核酸、超コイル核酸）、アミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸もしくはＬアミノ酸またはその前駆体）、ビタミン、ホルモン、脂質、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、遷移状態の類似体、およびその組合わせからなる群より選択される。
【００４１】
好ましい態様において、本方法は、第２のライブラリーの少なくとも１つのメンバーに対してタンパク質を試験することをさらに含む。
【００４２】
好ましい態様において、２つまたはそれ以上のライブラリーが同時に試験される。一例として、標的を、第１のライブラリー（例えば、補因子ライブラリー）の各メンバー（または一部のメンバー）に対して試験し、第２のライブラリー（例えば、可能性のある基質のライブラリー）の各メンバー（または一部のメンバー）に対して試験することができる。従って、第１のライブラリーが５０個のメンバー（第１１、第１２、．．．第１５０）を有し、第２のライブラリーが５０個のメンバー（第２１、第２２、．．．第２５０．．．）を有する２つのライブラリーの場合、標的を、全てまたは複数の新規の組合わせ（例えば、（第１１、第２１）、（第１１、第２２）．．．（第１１、第２５０）など）に対して試験する。
【００４３】
好ましい態様において、ライブラリーメンバーは、コンビナトリアルライブラリーのメンバーである。
【００４４】
好ましい態様において、標的は、被験化合物と相互作用する（例えば、被験化合物に結合し、好ましくは被験化合物を修飾する）。本明細書で使用する「修飾する」とは、被験化合物または標的において結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生じる、または結合を破壊することを含む。修飾として、切断、分解、加水分解、リン酸化標識レベルの変化、連結、合成、および同様の反応が挙げられる。修飾として、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理的変化、凝集または重合の変化が挙げられ得る。
【００４５】
好ましい態様において、本方法は、標的の構造または機能を分析し（例えば、標的の物理的特性を分析し；標的のインビトロ活性またはインビボ活性を分析し；例えば、保存アミノ酸ドメインの存在について標的の配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）を分析し）、それにより標的の構造または機能を予想することをさらに含む。好ましい態様において、標的とライブラリーとを接触させる前に、標的の構造または機能の分析を行う。
【００４６】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいてライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）を選択し、候補基質または被験リガンドがそれぞれ基質またはリガンドであることを確認することをさらに含む。
【００４７】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいてライブラリーメンバーを選択し、ライブラリーメンバーと細胞（例えば、培養細胞）または動物とを接触させ、選択的に、ライブラリーメンバーが細胞または動物に影響を及ぼすかどうかを確かめることをさらに含む。
【００４８】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、ライブラリー（例えば、候補基質または被験リガンド）を精製し、ライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）を結晶化し、ライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）の物理的特性（例えば、分子量、等電点、配列（関連する場合）、または結晶構造）を評価することをさらに含む。ライブラリーメンバーを単独で結晶化してもよく、標的と複合体化させてもよい。
【００４９】
好ましい態様において、本方法は、標的と相互作用するために選択されたライブラリーメンバーを使用して、標的と選択されたライブラリーメンバーとの相互作用を調節する薬剤を（例えば、選択されたライブラリーメンバーに結合するか、または選択されたライブラリーメンバーと相互作用することにより）同定することをさらに含む。
【００５０】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、選択されたライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）の特性を最適化すること（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変化させる（例えば、分子量を小さくする）、または溶解度を変化させる（例えば、大きくする）こと）をさらに含む。本明細書に開示された既知の１つまたは複数の方法を使用して、最適化を行うことができる。
【００５１】
好ましい態様において、熱出力の変化は微小熱量計で測定される。
【００５２】
好ましい態様において、本方法は、タンパク質とライブラリーメンバーとの相互作用の物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、またはＫＤ）を決定することをさらに含む。
【００５３】
好ましい態様において、本方法は、本明細書の他の場所に記載のように結合反応（例えば、代理リガンド（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｌｉｇａｎｄ））を使用することを含んでもよい。
【００５４】
別の局面において、本発明は、相互作用物質（または標的）を混合物から精製または単離する方法を特徴とする。（以下に記載の態様において、アッセイ試薬として標的を使用して相互作用物質（例えば、基質または対応リガンド）を精製または単離するが、アッセイ試薬として相互作用物質（例えば、基質）を使用して標的を単離または精製する同様の方法もまた本発明の範囲内である。）相互作用物質は、例えば、標的（例えば、タンパク質）と相互作用するリガンド、受容体、対応リガンド、補因子、または基質であり得る。混合物は、多くの成分からなる生物学的試料（例えば、全血）、細胞ホモジネートまたは溶解物、組織試料、生物学的液体試料であり得る。（前記方法をタンパク質に関して説明するが、本明細書に記載の方法により他の分子（本明細書では標的（例えば、他の高分子、例えば、核酸）と呼ぶ）を分析することができる。）本方法は、以下の段階を含む：
（１）混合物を提供する段階；
（２）混合物を、第１の画分および第２の画分（例えば、可溶性画分および膜画分）を含む複数の画分に分ける段階；
（３）標的と第１の画分とを接触させて、第１の反応混合物を形成する段階；
（４）第１の反応混合物の熱出力の変化を評価する段階；
（５）選択的に、得られた熱の変化の値を既定の値と比較する段階；
（６）標的と第２の画分とを接触させて、第２の反応混合物を形成する段階；
（７）第２の反応混合物の熱出力の変化を評価する段階；
（８）選択的に、得られた熱の変化の値を既定の値と比較する段階；
（９）例えば、第１の反応の熱の変化を第２の反応の熱の変化と比較することにより評価を行い、画分を選択して、相互作用物質（例えば、標的（例えば、タンパク質標的）のリガンドまたは基質）を精製または単離する段階。
【００５５】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体（例えば、原核生物病原体または真核生物病原体）により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【００５６】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【００５７】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【００５８】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有する。
【００５９】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、天然に存在するタンパク質またはその断片；機能および／または構造が未知のタンパク質；リガンド、基質、または他の相互作用分子が未知のタンパク質である。他の態様において、標的（例えば、タンパク質）は少なくとも１つの酵素活性を有する。
【００６０】
好ましい態様において、標的は、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、構造ＲＮＡ、例えば、リボザイム）である。
【００６１】
好ましい態様において、本方法は、異なる条件下で（例えば、異なる塩濃度、異なるｐＨ、または補因子の存在下で）、１つまたは複数の段階（例えば、段階（４）および（５）の一方または両方）を繰り返すことをさらに含む。
【００６２】
好ましい態様において、標的は、相互作用物質と相互作用する（例えば、相互作用物質に結合し、好ましくは相互作用物質を修飾する）。本明細書で使用する「修飾する」とは、被験化合物または標的において結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生じる、または結合を破壊することを含む。修飾として、切断、分解、加水分解、リン酸化標識レベルの変化、連結、合成、および同様の反応が挙げられる。修飾として、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理的変化、凝集または重合の変化が挙げられ得る。
【００６３】
好ましい態様において、本方法は、相互作用物質の構造または機能を分析すること（例えば、相互作用物質の物理的特性を分析すること）をさらに含む。
【００６４】
好ましい態様において、本方法は、例えば、標的との相互作用に基づいて相互作用物質を選択し、相互作用物質が、例えば、基質またはリガンドであることを確認することをさらに含む。
【００６５】
好ましい態様において、本方法は、精製または単離された相互作用物質と、細胞（例えば、培養細胞）または動物とを接触させ、選択的に、精製または単離された相互作用物質が細胞または動物に影響を及ぼすかどうかを確かめることをさらに含む。
【００６６】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、精製または単離された相互作用物質を精製し、精製または単離された相互作用物質を結晶化し、精製または単離された相互作用物質の物理的特性を評価することをさらに含む。
【００６７】
好ましい態様において、本方法は、精製または単離された相互作用物質の特性を最適化すること（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変化させる（例えば、分子量を小さくする）、または溶解度を変化させる（例えば、大きくする）こと）をさらに含む。本明細書に開示された既知の１つまたは複数の方法を使用して、最適化を行うことができる。
【００６８】
好ましい態様において、熱出力の変化は微小熱量計で測定される。
【００６９】
好ましい態様において、本方法は、標的と精製または単離された相互作用物質との相互作用の物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、またはＫＤ）を決定することをさらに含む。
【００７０】
好ましい態様において、本方法は、本明細書の他の場所に記載のように結合反応（例えば、代理リガンド）を使用することを含んでもよい。
【００７１】
別の局面において、本発明は、標的を分析する（例えば、相互作用物質（例えば、タンパク質の基質またはリガンド）を発見する）方法を特徴とする。本方法は、以下の段階を含む：
（ａ）標的を含む反応混合物を提供する段階；
（ｂ）標的と候補相互作用物質（例えば、候補基質または被験リガンド）とを接触させる段階；
（ｃ）反応混合物の熱の変化を評価する段階；
（ｄ）選択的に、得られた熱の変化の値を既定の値と比較し、それにより標的を分析する（例えば、標的の基質を発見する）段階。以下の議論の多くがタンパク質およびその相互作用物質（例えば、基質または対応リガンド）に向けられているが、本方法を他の標的および他の相互作用物質に適用できることが理解されると思われる。
【００７２】
好ましい態様において、相互作用物質（例えば、基質またはリガンド）は、反応混合物の熱の変化（例えば、既定の値を超える変化）により同定される。
【００７３】
好ましい態様において、複数の候補相互作用物質（例えば、候補基質または被験リガンド）（例えば、候補相互作用物質のライブラリー）が試験される。好ましい態様において、複数の候補基質または被験リガンド（例えば、候補基質または被験リガンドのライブラリー）には、少なくとも１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、もしくは１０８個の候補基質または被験リガンドが含まれる。従って、好ましい態様において、方法は、以下の段階を含む：
（ａ）複数の候補相互作用物質のうちの第１の相互作用物質および標的を含む反応混合物を提供する段階；
（ｂ）第１の相互作用物質と標的分子とを相互作用させる段階；
（ｃ）反応混合物における熱の変化を測定する段階；ならびに
（ｄ）選択的に、複数の候補相互作用物質のうちの残った各相互作用物質について段階（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を行い、それにより複数の相互作用物質を試験して、複数の相互作用物質のうちの１つまたは複数が標的と相互作用することを確かめる段階。
【００７４】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体（例えば、原核生物病原体または真核生物病原体）により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【００７５】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【００７６】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【００７７】
好ましい態様において、標的は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有する。好ましい態様において、標的は、既知の第１の活性を有し、第２の活性（例えば、未知の活性）によって、標的と相互作用する相互作用物質を含むライブラリーに対して試験される。
【００７８】
好ましい態様において、標的は、天然に存在するタンパク質またはその断片；機能および／または構造が未知のタンパク質；リガンド、基質、または他の相互作用分子が未知のタンパク質である。他の態様において、標的（例えば、タンパク質）は少なくとも１つの酵素活性を有する。
【００７９】
好ましい態様において、標的は、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、構造ＲＮＡ、例えば、リボザイム）である。
【００８０】
好ましい態様において、複数の候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）が、例えば、同じ反応混合物中で同時に試験され、これにより、本発明の方法の処理量を増大することができる。複数のライブラリーメンバー（例えば、プラスの結果を生じるもの）をさらに小さな群に分け、これらのさらに小さな群を試験することができる。複数のライブラリーメンバーまたは小さな群（例えば、プラスの結果を生じるもの）から、１つまたは複数のライブラリーメンバーを個々に試験することができる。
【００８１】
好ましい態様において、本方法は、異なる条件下で（例えば、異なる塩濃度、異なるｐＨ、または異なる補因子の存在下で）、１つまたは複数の段階を繰り返すことをさらに含む。
【００８２】
好ましい態様において、本方法は、候補相互作用物質ライブラリーの第２のメンバーまたはその後のメンバーを使用して、少なくとも１つの段階を繰り返すことをさらに含む。好ましい態様において、複数の候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）が試験される。好ましい態様において、複数の候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）には、少なくとも１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、または１０８個の化合物が含まれる。好ましい態様において、ライブラリーメンバーの少なくとも１０個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、または１０８個が構造的特徴または機能的特徴を共有する。
【００８３】
好ましい態様において、候補相互作用物質ライブラリーには、共通の特徴を有する複数のメンバーが含まれる。例えば、複数のメンバーの全てが、酵素補因子；（例えば、生合成酵素もしくは消化酵素の）基質（例えば、プロテアーゼ基質）（炭水化物、ヌクレオシド／ヌクレオチド、アミノ酸、脂質を含む）；ビタミン；ホルモン；核酸；例えば、ＤＮＡ分子；または天然物（例えば、細菌由来の天然物）である。ライブラリーには、前記のメンバーの任意の代謝産物、前駆体、または中間体が含まれ得る。
【００８４】
好ましい態様において、候補相互作用物質ライブラリーは、基質ライブラリー；補因子ライブラリー；炭水化物生合成および／もしくは分解ライブラリー；プリンおよびピリミジン生合成および／もしくは分解ライブラリー；アミノ酸生合成および／もしくは分解ライブラリー；脂質生合成および／もしくは分解ライブラリー；ビタミンおよび／もしくはホルモンライブラリー；核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリー；または天然物ライブラリー（例えば、細菌由来の天然物ライブラリー）である。
【００８５】
好ましい態様において、候補相互作用物質は、標的（例えば、標的タンパク質）と相互作用する可能性を有する化学種である。好ましくは、候補相互作用物質は候補基質または被験リガンドである。
【００８６】
好ましい態様において、候補相互作用物質は、酵素基質、代謝産物、補因子、天然物（例えば、細菌由来の天然物）、炭水化物、多糖類、核酸（例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド前駆体、ｄｓまたはｓｓ ＤＮＡ分子、環状核酸、超コイル核酸）、アミノ酸（例えば、Ｄアミノ酸もしくはＬアミノ酸またはその前駆体）、ビタミン、ホルモン、脂質、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、遷移状態の類似体、およびその組合わせからなる群より選択される。
【００８７】
好ましい態様において、本方法は、第２のライブラリーの少なくとも１つのメンバーに対して候補相互作用物質を試験することをさらに含む。
【００８８】
好ましい態様において、２つ以上の候補相互作用物質ライブラリーが同時に試験される。一例として、標的を、第１のライブラリー（例えば、補因子ライブラリー）の各メンバー（または一部のメンバー）に対して試験し、第２のライブラリー（例えば、可能性のある基質のライブラリー）の各メンバー（または一部のメンバー）に対して試験することができる。従って、第１のライブラリーが５０個のメンバー（第１１、第１２、．．．第１５０）を有し、第２のライブラリーが５０個のメンバー（第２１、第２２、．．．第２５０．．．）を有する２つのライブラリーの場合、標的を、全てまたは複数の新規の組合わせ（例えば、（第１１、第２１）、（第１１、第２２）．．．（第１１、第２５０）など）に対して試験する。
【００８９】
好ましい態様において、候補相互作用物質ライブラリーのメンバーは、コンビナトリアルライブラリーのメンバーである。
【００９０】
好ましい態様において、標的は、候補相互作用物質と相互作用する（例えば、候補相互作用物質に結合し、好ましくは候補相互作用物質を修飾する）。本明細書で使用する「修飾する」とは、候補相互作用物質または標的において結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生じる、または結合を破壊することを含む。修飾として、切断、分解、加水分解、リン酸化標識レベルの変化、連結、合成、および同様の反応が挙げられる。修飾として、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理的変化、凝集または重合の変化が挙げられ得る。
【００９１】
好ましい態様において、本方法は、標的の構造または機能を分析し（例えば、標的の物理的特性を分析し；標的のインビトロ活性またはインビボ活性を分析し；例えば、保存アミノ酸ドメインの存在について標的の配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）を分析し）、それにより標的の構造または機能を予想することをさらに含む。好ましい態様において、標的と候補相互作用物質とを接触させる前に、標的の構造または機能の分析を行う。
【００９２】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、標的と相互作用する候補相互作用物質が、例えば、それぞれ標的の基質またはリガンドであることを確認することをさらに含む。
【００９３】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、ライブラリーメンバーと細胞（例えば、培養細胞）または動物とを接触させ、選択的に、ライブラリーメンバーが細胞または動物に影響を及ぼすかどうかを確かめることをさらに含む。
【００９４】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、ライブラリー（例えば、候補基質または被験リガンド）を精製し、ライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）を結晶化し、ライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）の物理的特性（例えば、分子量、等電点、配列（関連する場合）、または結晶構造）を評価することをさらに含む。
【００９５】
好ましい態様において、本方法は、標的と相互作用するために選択されたライブラリーメンバーを使用して、標的と選択されたライブラリーメンバーとの相互作用を調節する薬剤を（例えば、選択されたライブラリーメンバーに結合するか、または選択されたライブラリーメンバーと相互作用することにより）同定することをさらに含む。
【００９６】
好ましい態様において、本方法は、標的との相互作用に基づいて候補相互作用物質（例えば、ライブラリーメンバー）を選択し、選択されたライブラリーメンバー（例えば、候補基質または被験リガンド）の特性を最適化すること（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変化させる（例えば、分子量を小さくする）、または溶解度を変化させる（例えば、大きくする）こと）をさらに含む。本明細書に開示された既知の１つまたは複数の方法を使用して、最適化を行うことができる。
【００９７】
好ましい態様において、熱出力の変化は微小熱量計で測定される。
【００９８】
好ましい態様において、本方法は、タンパク質とライブラリーメンバーとの相互作用の物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、またはＫＤ）を決定することをさらに含む。
【００９９】
好ましい態様において、本方法は、本明細書の他の場所に記載のように結合反応（例えば、代理リガンド）を使用することを含んでもよい。
【０１００】
本方法の態様は、本明細書に記載のように結合反応（例えば、代理リガンド）を使用することを含んでもよい。従って、好ましい態様において、１つまたは複数の段階（例えば、段階（ｂ））は、代理リガンドおよびシグナル発生実体を含めること、代理リガンド（例えば、置換代理リガンド）とシグナル発生実体とを相互作用させることをさらに含む。
【０１０１】
別の局面において、本発明は、化合物の構造を修飾する（例えば、最適化する）方法を特徴とする。最適化されるパラメーターは、例えば、化合物が標的と相互作用する能力（例えば、標的に結合する能力または標的を修飾する能力）であり得る。本方法は、以下の段階を含む：
（ａ）標的を準備する段階；
（ｂ）例えば、結合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）を生じる、または結合を破壊することを伴う工程により、被験化合物の構造を修飾して、修飾された化合物を得る段階；
（ｃ）標的分子と修飾された化合物とを接触させて、反応混合物を得る段階；
（ｄ）反応混合物に関連する熱の変化を評価する段階；
（ｅ）選択的に、（ｄ）で測定された値を既定の値と比較し、それにより修飾された化合物を得る段階。
【０１０２】
好ましい態様において、本方法は、以下の段階を含む：
（ａ）標的を準備する段階；
（ｂ）標的分子と被験化合物とを接触させて、反応混合物を得る段階；
（ｃ）反応混合物に関連する熱の変化を測定する段階；
（ｄ）選択的に、（ｃ）で測定された値を既定の値と比較する段階、および値と既定の値が既定の関係を示す場合（例えば、値が既定の値と等しいか、または既定の値より小さい場合）、
（ｅ）例えば、結合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）を生じる、または結合を破壊することにより被験化合物の構造を修飾して、化合物を得、それにより修飾された化合物を得る段階。好ましい態様において、本方法は、以下の段階の１つまたは複数の繰り返しを含む：
（ｆ）標的分子と修飾された被験化合物とを接触させて、反応混合物を得る段階；
（ｇ）反応混合物に関連する熱の変化を測定する段階；
（ｈ）選択的に、（ｇ）で測定された値を既定の値と比較する段階、および
値と既定の値が既定の関係を示す場合（例えば、値が既定の値と等しいか、または既定の値より小さい場合）、
（ｉ）例えば、結合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）を生じる、または結合を破壊することにより、修飾された被験化合物の構造を修飾して、化合物を得る段階。
【０１０３】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体、例えば、原核生物病原体または真核生物病原体により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【０１０４】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【０１０５】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【０１０６】
好ましい態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有するものである。好ましい態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、既知の第１の活性を有し、該タンパク質と相互作用する相互作用物質を含むライブラリーに対して第２の活性（例えば、未知の活性）による該タンパク質の試験を行う。
【０１０７】
好ましい態様においては、標的は、天然に存在するタンパク質もしくはその断片、未知の機能および／もしくは構造を有するタンパク質、リガンド、基質、または相互作用するその他の分子が未知であるタンパク質等である。他の態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、少なくとも一種類の酵素活性を有する。
【０１０８】
好ましい態様においては、標的は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、構造化されたＲＮＡ（例えば、リボザイム））等の核酸である。
【０１０９】
好ましい態様においては、被験化合物（潜在的な相互作用物質もしくは候補相互作用物質）は、標的（例えば、標的タンパク質）と相互作用する可能性のある分子種である。好ましくは、被験化合物は候補基質もしくは被験リガンドである。
【０１１０】
好ましい態様においては、被験化合物は、共通の性質を有する複数のメンバーを含むライブラリーにおけるメンバーの一つである。例えば、該複数のメンバーすべてが、酵素補因子である、または炭水化物、ヌクレオシド／ヌクレオチド、アミノ酸、脂質を含む、例えば、生合成酵素もしくは分解酵素の基質（例えば、タンパク質分解酵素の基質）である、または、ビタミン、ホルモン、核酸（例えば、ＤＮＡ分子）、もしくは天然物（例えば、細菌由来の天然物）である。該ライブラリーは、上記のメンバーの代謝産物、前駆体、もしくは中間体を含む。
【０１１１】
好ましい態様においては、被験化合物は、以下のものからなる群より選択されるライブラリーのメンバーの一つである。すなわち、基質ライブラリー、補因子ライブラリー、炭水化物の生合成および／もしくは分解ライブラリー、プリンおよびピリミジンの生合成および／もしくは分解ライブラリー、アミノ酸の生合成および／もしくは分解ライブラリー、脂質の生合成および／もしくは分解ライブラリー、ビタミンおよび／もしくはホルモンライブラリー、核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリー、もしくは天然物ライブラリー（例えば、細菌由来の天然物ライブラリー）である。
【０１１２】
好ましい態様においては、被験化合物は、以下のものからなる群より選択されるライブラリーのメンバーの一つである。すなわち、酵素基質、代謝産物、補因子、天然物（例えば、細菌由来の天然物）、炭水化物、多糖類、核酸（例えば、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド前駆体、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子、環状核酸、超らせん核酸等）、アミノ酸（例えば、Ｄ− もしくはＬ−アミノ酸もしくはそれらの前駆体）、ビタミン、ホルモン、脂質、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、遷移状態類似体、およびそれらの組合わせである。
【０１１３】
好ましい態様においては、被験化合物は、コンビナトリアルライブラリーのメンバーである。
【０１１４】
好ましい態様においては、標的は被験化合物と相互作用、例えば、結合し、好ましくは修飾する。本明細書に記載の「修飾する」とは、被験化合物もしくは標的において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０１１５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、被験化合物もしくは修飾被験化合物の構造または機能を分析する、例えば、被験化合物もしくは修飾被験化合物の物理的性質を分析する、被験化合物もしくは修飾被験化合物のインビトロもしくはインビボでの活性を分析する段階を含む。
【０１１６】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、被験化合物もしくは修飾被験化合物を選択し、これを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させ、および選択的に被験化合物もしくは修飾被験化合物が該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０１１７】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、（例えば、標的に対する相互作用に基づいて）被験化合物もしくは修飾被験化合物を選択する段階、被験化合物もしくは修飾被験化合物を精製する段階、被験化合物もしくは修飾被験化合物を結晶化する段階、被験化合物もしくは修飾被験化合物の物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０１１８】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、（例えば、標的に対する相互作用に基づいて）被験化合物もしくは修飾被験化合物を精製する段階、被験化合物もしくは修飾被験化合物の性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０１１９】
好ましい態様においては、熱出力の変化を微小熱量計で測定する。
【０１２０】
好ましい態様においては、本方法はさらに、標的と被験化合物もしくは修飾被験化合物間の相互作用に関する物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、もしくはＫＤ）を調べる段階を含む。
【０１２１】
好ましい態様においては、本方法は、結合反応（例えば、本明細書の別の部分に記載の代理リガンド）の利用を含むことができる。
【０１２２】
別の局面では、本発明は二つの相互作用物質（例えば、リガンド）を比較する（例えば、もとのリガンド構造と修飾後の構造を比較する）方法を特徴とする。該相互作用物質は、例えば、標的との相互作用能、例えば、標的への結合能もしくは標的の修飾能等に関して比較することができる。該方法は、以下の段階を含む：
（ａ）標的を提供する段階、
（ｂ）標的を第１の相互作用物質（例えば、第１のリガンド）と接触させ、反応混合物を提供する段階、
（ｃ）反応混合物における熱の変化を測定する段階、
（ｄ）修飾相互作用物質（例えば、修飾リガンド、すなわち、リガンド分子中の一箇所もしくは複数箇所に変化の起こったもの）を提供する段階、
（ｅ）標的を修飾相互作用物質（例えば、修飾リガンド）と接触させ、反応混合物を提供する段階、
（ｆ）（ｅ）の反応混合物における熱の変化を測定する段階、および
（ｇ）（ｃ）と（ｆ）の測定を比較し、これによって、二つの相互作用物質もしくはリガンド（例えば、もとの構造と修飾後の構造）を比較する段階。
【０１２３】
好ましい態様においては、これらの段階はいずれの順番で実施してもよい。例えば、まず、（ａ〜ｃ）の段階を実施し、その後（ｄ〜ｆ）の段階を行うこともできるし、また別の好ましい態様においては、（ａ〜ｃ）の段階と（ｄ〜ｆ）の段階を、全く同時にもしくは部分的に同時に実施することも可能である。
【０１２４】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体、例えば、原核生物病原体または真核生物病原体により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【０１２５】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【０１２６】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【０１２７】
好ましい態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有するものである。
【０１２８】
好ましい態様においては、標的は、天然に存在するタンパク質もしくはその断片、未知の機能および／もしくは構造を有するタンパク質、リガンド、基質、または相互作用するその他の分子が未知であるタンパク質等である。他の態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、少なくとも一種類の酵素活性を有する。
【０１２９】
好ましい態様においては、標的は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、構造化されたＲＮＡ（例えば、リボザイム））等の核酸である。
【０１３０】
好ましい態様においては、本方法はさらに一段階もしくは複数段階を異なる条件（例えば、異なる塩濃度、異なるｐＨ、もしくは異なる補因子の存在下で）で繰り返す段階を含む。
【０１３１】
好ましい態様においては、標的は相互作用物質と相互作用、例えば、結合し、好ましくは修飾する。本明細書に記載の「修飾する」とは、被験化合物もしくは標的において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０１３２】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、相互作用物質の構造または機能を分析する、例えば、相互作用物質の物理的性質を分析する、相互作用物質のインビトロもしくはインビボでの活性を分析する段階を含む。
【０１３３】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、（例えば、標的に対する相互作用に基づいて）相互作用物質を選択する段階、これを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させる段階、および選択的に相互作用物質が該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０１３４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、（例えば、標的に対する相互作用に基づいて）相互作用物質を選択し、相互作用物質、および、相互作用物質の物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０１３５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、例えば、標的に対する相互作用に基づいて相互作用物質を精製し、相互作用物質の性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０１３６】
好ましい態様においては、熱出力の変化を微小熱量計で測定する。
【０１３７】
好ましい態様においては、本方法はさらに、該タンパク質と相互作用物質間の相互作用に関する物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、もしくはＫＤ）を調べる段階を含む。
【０１３８】
好ましい態様においては、本方法は、結合反応（例えば、本明細書の別の部分に記載の代理リガンド）の利用を含むことができる。
【０１３９】
別の局面では、本発明は被験分子とその修飾産物を比較する（例えば、もとの構造と修飾後の構造を比較する）方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
（ａ）被験分子を提供する段階、
（ｂ）被験分子を第２の分子と相互作用させる（例えば、リガンドとの結合）、もしくは被験分子の第１の部分と被験分子の第２の部分を相互作用させる段階、
（ｃ）相互作用に伴う熱の変化を測定する段階、
（ｄ）分子中の一箇所もしくは複数箇所に変化の起こった修飾被験分子を提供する段階、
（ｅ）修飾被験分子を第２の分子と相互作用させる（例えば、リガンドとの結合）、もしくは被験分子の第１の部分と被験分子の第２の部分を相互作用させる段階、
（ｆ）（ｅ）の相互作用に伴う熱の変化を測定する段階、および
（ｇ）（ｃ）と（ｆ）の測定を比較し、これによって、被験分子とその修飾産物を比較する段階。
【０１４０】
好ましい態様においては、これらの段階はいずれの順番で実施してもよい。例えば、まず、（ａ〜ｃ）の段階を実施し、その後（ｄ〜ｆ）の段階を行うこともできるし、（ａ〜ｃ）の段階と（ｄ〜ｆ）の段階を、全く同時にもしくは部分的に同時に実施することも可能である。
【０１４１】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する修飾分子を選択する段階、および第２の試験において、（例えば、代理修飾分子の非存在下で）該修飾分子が該標的と相互作用する（例えば、結合する）ことを確認する段階を含む。
【０１４２】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する修飾分子を選択する段階、および（例えば、代理修飾分子の非存在下で）インビトロで該修飾分子を該標的と接触させることによって、該修飾分子が該標的と相互作用する（例えば、結合する）ことを確認する段階を含む。
【０１４３】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する修飾分子を選択する段階、および該リガンドを細胞（例えば、培養細胞、もしくは動物）と接触させる段階、および選択的にリガンドが細胞もしくは動物に効果を示すか否か調べる段階を含む。
【０１４４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、被験リガンドを精製する段階、被験リガンドを結晶化する段階、被験リガンドの物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０１４５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、選択した被験リガンドの性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０１４６】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０１４７】
別の局面においては、本発明は化合物（例えば、タンパク質もしくは核酸、例えば、構造化したＲＮＡ、もしくはその他の標的）を分析する方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
（ａ）標的を含む反応混合物を提供する段階、
（ｂ）相互作用もしくは作用分子の非存在下で（例えば、リガンド（もしくはライブラリーのメンバー）に対する相互作用が起こらない、またはリガンド（もしくはライブラリーのメンバー）非存在下で）、標的を構造変化させることを含む段階、
（ｃ）該構造変化に伴って起こる熱の変化を測定する段階、
（ｄ）相互作用もしくは作用分子の存在下で（例えば、リガンド（もしくはライブラリーのメンバー）に対する相互作用が起こる、またはリガンド（もしくはライブラリーのメンバー）存在下で）、標的を構造変化させることを含む段階、
（ｅ）該構造変化に伴って起こる熱の変化を測定する段階、および
（ｇ）（ｃ）で得られた値と（ｅ）で得られた値を比較し、これによって、標的を分析する段階。
【０１４８】
好ましい態様においては、変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩、尿素、もしくは類似の薬剤）を反応混合物に添加する。
【０１４９】
好ましい態様においては、測定は微小熱量計を用いて実施する。
【０１５０】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。
すなわち、
（ａ）標的を含む反応混合物を提供する段階、
（ｂ）相互作用もしくは作用分子の非存在下で（例えば、リガンドに対する相互作用が起こらない、またはリガンド非存在下で）、該反応混合物を加熱する段階、
（ｃ）例えば、見かけの特異的熱出力を得るために、該構造変化に伴って起こる熱の変化を測定する段階、
（ｄ）相互作用もしくは作用分子の存在下で（例えば、リガンドに対する相互作用が起こる、またはリガンド存在下で）、該反応混合物を加熱する段階、
（ｅ）例えば、見かけの特異的熱出力を得るために、該構造変化に伴って起こる熱の変化を測定する段階、および
（ｇ）（ｃ）で得られた値と（ｅ）で得られた値を比較し、これによって、例えば、標的に対するリガンドの結合を調べるために、標的を分析する段階。
【０１５１】
好ましい態様においては、標的はタンパク質もしくはポリペプチド、核酸（例えば、ＲＮＡ）である。これは、精製されたものでも、部分精製された物でも、もしくは粗製のものでもよい。
【０１５２】
好ましい態様においては、変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩、尿素、もしくは類似の薬剤）を反応混合物に添加する。
【０１５３】
好ましい態様においては、相対的によりコンパクトに折り畳まれた状態のものに結合するリガンドの存在によって、熱に関し比較的大きな変化が得られるように、一種もしくは複数種類の条件（例えば、変性剤および標的の濃度、もしくは温度）を選択する。例えば、標的分子に折れ畳まれた状態をとらせることによってこれを行う。
【０１５４】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０１５５】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、細菌、原生動物、ウイルス（例えば、ファージ）、または真菌を含む病原体、例えば、原核生物病原体または真核生物病原体により産生される。例えば、タンパク質は、以下の任意の種により産生されるタンパク質であり得る：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ． 、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ． 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッツカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ． 、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２または３、１型、２型、または３型デングウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルスＢ、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトアデノウイルス１２型または２型、ヒトヘルペスウイルス１〜４、ヒト免疫不全症ウイルス１〜２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒト呼吸器系合包体ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、および麻疹ウイルス。本発明の方法を使用して試験される標的を産生する種のさらなる例を以下で説明する。
【０１５６】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、真核生物（例えば、単細胞生物または多細胞生物）により産生される。このような真核生物の例として、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。好ましくは、標的はヒトにより産生される。
【０１５７】
好ましい態様において、標的（例えば、タンパク質）は、生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）により産生される。
【０１５８】
好ましい態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、既知の活性（例えば、酵素活性）を有さないか、または測定が困難な活性を有するものである。好ましい態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、既知の第１の活性を有し、該タンパク質と相互作用する相互作用物質を含むライブラリーに対して第２の活性（例えば、未知の活性）による該タンパク質の試験を行う。
【０１５９】
好ましい態様においては、標的は、天然に存在するタンパク質もしくはその断片、未知の機能および／もしくは構造を有するタンパク質、リガンド、基質、または相互作用するその他の分子が未知であるタンパク質等である。他の態様においては、標的（例えば、タンパク質）は、少なくとも一種類の酵素活性を有する。
【０１６０】
好ましい態様においては、標的は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、構造化されたＲＮＡ（例えば、リボザイム））等の核酸である。
【０１６１】
好ましい態様においては、ライブラリーの複数のメンバーに対して同時に試験を行う。例えば、本方法の処理量を増加させることが可能であるならば、同一の反応混合物で行う。結果が陽性であるならば、ライブラリーの複数のメンバーをさらに小さな群に分け、それぞれの群について試験を行うことができる。結果が陽性であるならば、ライブラリー中の該複数のメンバーもしくは群分けした小群から得られたメンバーの一種もしくは複数について、個々に試験を行うことができる。
【０１６２】
好ましい態様においては、本方法はさらに一段階もしくは複数段階を異なる条件（例えば、異なる塩濃度、異なるｐＨ、もしくは異なる補因子の存在下で）で繰り返す段階を含む。
【０１６３】
好ましい態様においては、本方法はさらに、ライブラリーの第１のメンバーの次に第２のメンバーに対して繰り返す、もしくはその次のメンバーもしくはその他のメンバーに対して繰り返す段階を含む。好ましい態様においては、ライブラリーの複数のメンバー（例えば、候補基質、もしくは被験リガンド）に対して試験を実施する。好ましい態様においては、ライブラリーの複数の該メンバーは、少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８種の化合物を含む。好ましい態様においては、ライブラリーを構成する少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８種のメンバーは、同一の構造的と機能的特徴を有する。
【０１６４】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、共通の特徴を有する複数のメンバーを含む。例えば、該複数メンバーのすべてが、酵素の補因子である、または炭水化物、ヌクレオシド／ヌクレオチド、アミノ酸、脂質を含む、例えば、生合成酵素もしくは分解酵素の基質（例えば、タンパク質分解酵素の基質）である、または、ビタミン、ホルモン、核酸（例えば、ＤＮＡ分子）、もしくは天然物（例えば、細菌由来の天然物）である。該ライブラリーは、上記のメンバーの代謝産物、前駆体、もしくは中間体を含む。
【０１６５】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、基質ライブラリー、補因子ライブラリー、炭水化物の生合成および／もしくは分解ライブラリー、プリンおよび／もしくはピリミジンの生合成および／もしくは分解ライブラリー、アミノ酸の生合成および／もしくは分解ライブラリー、脂質の生合成および／もしくは分解ライブラリー、ビタミンおよび／もしくはホルモンライブラリー、核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリー、もしくは天然物ライブラリー（例えば、細菌由来の天然物ライブラリー）である。
【０１６６】
好ましい態様においては、ライブラリーのメンバー（潜在的な相互作用物質もしくは候補相互作用物質）は、標的（例えば、標的タンパク質）と相互作用する可能性のある分子種である。好ましくは、ライブラリーのメンバーは候補基質もしくは被験リガンドである。
【０１６７】
好ましい態様においては、ライブラリーのメンバーは、以下のものからなる群より選択される。すなわち、酵素基質、代謝産物、補因子、天然物（例えば、細菌由来の天然物）、炭水化物、多糖類、核酸（例えば、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド前駆体、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子、環状核酸、超らせん核酸等）、アミノ酸（例えば、Ｄ− もしくはＬ−アミノ酸もしくはそれらの前駆体）、ビタミン、ホルモン、脂質、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、遷移状態類似体、およびそれらの組合わせである。
【０１６８】
好ましい態様においては、本方法はさらに第２のライブラリーの少なくとも一種類のメンバーに対して該タンパク質を試験する段階を含む。
【０１６９】
好ましい態様においては、二種もしくはそれ以上の種類のライブラリーを同時に試験する。一例として、標的を第１のライブラリー（例えば、補因子ライブラリー）の各々（もしくは複数）のメンバーに対して試験し、第２のライブラリー（例えば、可能性のある基質ライブラリー）の各々（もしくは複数）のメンバーに対して試験する。このように、第１のライブラリーが５０個のメンバー（第１１、第１２、．．．第１５０）を有し、第２のライブラリーが５０個のメンバー（第２１、第２２、．．．第２５０．．．）を有するライブラリーを用いる場合には、該標的は全組合わせもしくは複数の新規の組合わせ（例えば、（第１１、第２１）、（第１１、第２２）．．．（第１１、第２５０）など）に対して試験する。
【０１７０】
好ましい態様においては、ライブラリーのメンバーはコンビナトリアルライブラリーのメンバーである。
【０１７１】
好ましい態様においては、標的はライブラリーのメンバーと相互作用、例えば、結合し、好ましくは修飾する。本明細書に記載の「修飾する」とは、被験化合物もしくは標的において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、活性（例えば、酵素活性）の変化、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０１７２】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、ライブラリーのメンバーの構造または機能を分析する、例えば、標的の物理的性質を分析する、ライブラリーのメンバーのインビトロもしくはインビボでの活性を分析する段階を含む。
【０１７３】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、ライブラリーのメンバーを選択する（例えば、標的に対する相互作用に基づいて候補基質もしくは被験リガンドを選択する）段階、および候補基質もしくは被験リガンドが、それぞれ基質もしくはリガンドであることを確認する段階を含む。
【０１７４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的に対する相互作用に基づいてライブラリーのメンバーを選択する段階、これを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させる段階、および選択的にライブラリーのメンバーが該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０１７５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的に対する相互作用に基づいて相互作用物質（例えば、ライブラリーのメンバー）を選択する段階、該ライブラリー（例えば、候補基質もしくは被験リガンド）を精製する段階、ライブラリーのメンバー（例えば、候補基質もしくは被験リガンド）を結晶化する段階、ライブラリーのメンバー（例えば、候補基質もしくは被験リガンド）の物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０１７６】
好ましい態様においては、本方法はさらに標的と相互作用するように選択されたライブラリーのメンバーの利用を含む。その利用の目的は、例えば、ライブラリーから選択した該メンバーと結合もしくは相互作用させることによって、標的とライブラリーから選択した該メンバーとの間の相互作用を調整する作用因子を同定するためである。
【０１７７】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的に対する相互作用に基づいて相互作用物質（例えば、ライブラリーのメンバー）を選択する段階、該ライブラリー（例えば、候補基質もしくは被験リガンド）を精製する段階、およびライブラリーのメンバー（例えば、候補基質もしくは被験リガンド）の性質を最適化する段階（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０１７８】
好ましい態様においては、熱出力の変化を微小熱量計で測定する。
【０１７９】
好ましい態様においては、本方法はさらに、該タンパク質とライブラリーのメンバーとの間の相互作用に関する物理定数（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭ、もしくはＫＤ）を調べる段階を含む。
【０１８０】
別の局面では、本発明は相互作用物質（例えば、基質）を分析する方法（例えば、基質を修飾する標的分子を発見する方法）を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
相互作用物質（例えば、基質）を含む反応混合物を提供する段階、
該相互作用物質を候補標的と接触させる段階、
反応混合物における熱の変化を評価する段階、
選択的に、得られた該熱の変化の値と既定の値とを比較する段階を含み、これによって、相互作用物質を分析する（例えば、相互作用物質の標的を発見する）。
【０１８１】
好ましい態様においては、反応混合物における熱の変化（例えば、既定の値よりも大きい変化値）によって、該相互作用物質を同定する。
【０１８２】
好ましい態様においては、複数の候補標的を試験する。好ましい態様においては、複数の候補標的は少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８種の候補標的を含む。
【０１８３】
好ましい態様においては、標的は基質と相互作用、例えば、結合し、好ましくは修飾する。「修飾する」とは、代理リガンド（もしくは、シグナルを生成する物質）において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０１８４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、候補標的を選択する段階、および候補標的が標的を修飾したことを確認する段階を含む。
【０１８５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、候補標的を選択する段階、候補標的を細胞（例えば、培養細胞、もしくは動物）と接触させる段階、および選択的に候補標的が細胞もしくは動物に効果を示すか否か調べる段階を含む。
【０１８６】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、候補標的を精製する段階、候補標的を結晶化する段階、候補標的の物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０１８７】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、選択した候補標的の性質を最適化する（例えば、基質に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０１８８】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０１８９】
別の局面においては、本発明は標的を分析する（例えば、標的と第２の物質間の相互作用を分析する）方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
標的を含む反応混合物を提供する段階、
相互作用させる段階（ここで、相互作用は結合相互作用（例えば、結合反応）に関係するもの（例えば、代理リガンドの解離、もしくは構造変化）である）、
該結合反応の生成物を第２の反応（例えば、代理リガンドの切断もしくは分解）に加える段階、および
第２の反応における熱の変化を測定する段階を含む。これにより、標的の相互作用を分析することができる。
【０１９０】
好ましい態様においては、該結合反応もしくは第２の反応は相変化を含むことができる。
【０１９１】
好ましい態様においては、別の一つもしくは複数の反応を該結合反応と第２の反応との間に挿入することができる。
【０１９２】
好ましい態様においては、標的の相互作用は、例えば、標的と別の分子（例えば、リガンドもしくは溶質分子）との相互作用、もしくは該標的の第１の部分と標的の第２の部分との相互作用（例えば、自己リン酸化、もしくは標的の構造（例えば、標的の二次構造、三次構造、四次構造）の変化）でもよい。
【０１９３】
好ましい態様においては、該反応混合物は透明ではなく、該反応混合物は有色のもの、あるいは該反応混合物は混濁したのものであり、該反応混合物は蛍光検出もしくは比色検出を阻害する物質を含み、または該反応混合物は純粋な溶液ではなく、例えば、標的以外の産物を含む。好ましい態様においては、該反応混合物は放射性分析を阻害する物質、分光学的分析（例えば、ＮＭＲ分析）を阻害する物質を含む。
【０１９４】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０１９５】
別の局面においては、本発明は被験リガンド、標的、もしくはこれら二つの間の相互作用を分析する方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
代理リガンドと標的を含む反応混合物を提供する段階、
反応混合物を代理リガンドおよびシグナル生成物質と接触させる段階（ここで、シグナル生成物質は代理リガンドと相互作用可能な条件下で代理リガンドと共存させる（例えば、被験リガンドを標的と結合させることによって、代理リガンドを標的から解離させる））、および反応混合物における熱の変化を測定する段階を含む。これにより、被験リガンド、標的、もしくはこれら二つの間の相互作用を分析することができる。
【０１９６】
好ましい態様においては、代理リガンドは、標的と結合できる被験リガンドに関して負の異所性結合を示す（すなわち、被験リガンドの標的への結合によって解離する）。これは、好ましい態様であり、本明細書における説明の主題をなす。しかしながら、本発明は、被験リガンドに依存して代理リガンドが標的に結合し、これによって代理リガンドの濃度を下げ、シグナル生成物質と相互作用する代理リガンドを減少させる態様をも含むものである。
【０１９７】
好ましい態様においては、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の場合において、より容易に起こる。一例として、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、もしくは１０８倍、より起こり易いのである。しかしながら、本発明は、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用がシグナル生成物質と（遊離のものに対し）標的に結合した代理リガンド間でより起こり易い態様をも含むものである。一例として、シグナル生成物質と標的に結合した代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用がシグナル生成物質と（遊離のものに対し）標的に結合した代理リガンド間で、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、もしくは１０８倍、より起こり易い。
【０１９８】
好ましい態様においては、代理リガンドはイオン、例えばプロトンである。好ましい態様においては、シグナル生成物質はバッファー分子、例えば、イオン化熱の比較的大きなバッファー分子（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）である。
【０１９９】
好ましい態様においては、代理リガンドは、シグナル生成物質の活性を調整する（例えば、増加もしくは減少させる）因子である。一例として、代理リガンドはシグナル生成物質である酵素を活性化する（もしくは、阻害する）金属イオンであってもよい。
【０２００】
好ましい態様においては、シグナル生成物質は、代理リガンド（例えば、遊離の代理リガンド）と相互作用（例えば、結合）し、好適にはこれを修飾する。「修飾する」とは、代理リガンド（もしくはシグナル生成物質）において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０２０１】
好ましい態様においては、標的はタンパク質もしくはポリペプチドであり、代理リガンドは核酸であり、シグナル生成物質は核酸の結合を切断する酵素（例えば、ヌクレアーゼ）である。
【０２０２】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用するリガンドを選択する段階、および第２の試験（例えば、代理リガンドが共存しない条件）において該リガンドが標的と相互作用する、例えば、結合することを確認する段階を含む。
【０２０３】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および、インビトロで該リガンドを標的と（例えば、代理リガンドが共存しない条件下で）接触させることによって、該被験リガンドが標的と相互作用する、例えば結合することを確認する段階を含む。
【０２０４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用するリガンドを選択する段階、および、該リガンドを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させる段階、さらに、選択的に該リガンドが該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０２０５】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、該被験リガンドを精製する段階、該被験リガンドを結晶化する段階、該被験リガンドの物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０２０６】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、選択した該被験リガンドの性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０２０７】
好ましい態様においては、該代理リガンド（例えば、ある種の代理リガンド、例えば、核酸）は、シグナル生成物質と相互作用させる前に、例えばＰＣＲによって、もしくは、より好適には等温条件下で増幅する方法を用いて増幅を行う。
【０２０８】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０２０９】
好ましい態様においては、該シグナル生成物質は代理リガンドと直接相互作用する。別の態様においては、間接的に相互作用する。例えば、代理リガンドから生成した増幅産物と相互作用する。あるいは、該代理リガンドと別の物質との間の反応の産物に作用する。
【０２１０】
別の局面においては、本発明は標的、被験リガンド、もしくはこれらの間の相互作用を分析する方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
代理リガンドと該標的を含む反応混合物を提供する段階、
反応混合物を被験リガンドおよびシグナル生成物質と接触させる段階（ここで、シグナル生成物質は、遊離の代理リガンドと相互作用可能な条件下で代理リガンド（例えば、被験リガンドの結合によって、標的から解離した被験リガンド）と共存する）、および反応混合物における熱の変化を測定する段階を含む。これにより、被験リガンド、標的、もしくはこれら二つの間の相互作用を分析することができる。
【０２１１】
好ましい態様においては、代理リガンドは、標的と結合できる被験リガンドに関して負の異所性結合を示す（すなわち、被験リガンドの標的への結合によって解離する）。これは、好ましい態様であり、本明細書における説明の主題をなす。しかしながら、本発明は、被験リガンドに依存して代理リガンドが標的に結合し、これによって遊離の代理リガンドの濃度を下げ、シグナル生成物質と相互作用する代理リガンドを減少させる態様をも含むものである。
【０２１２】
好ましい態様においては、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の場合において、より起こり易い。一例として、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、もしくは１０８倍、より起こり易いのである。しかしながら、本発明は、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用がシグナル生成物質と（遊離のものに対し）標的に結合した代理リガンド間でより起こり易い態様をも含むものである。一例として、シグナル生成物質と標的に結合した代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用がシグナル生成物質と（遊離のものに対し）標的に結合した代理リガンド間で、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、もしくは１０８倍、より起こり易い。
【０２１３】
好ましい態様においては、シグナル生成物質は、遊離の代理リガンドと相互作用、例えば、結合し、好ましくはこれを修飾する。「修飾する」とは、代理リガンド（もしくはシグナル生成物質）において、結合（例えば、非共有結合もしくは共有結合）を生成もしくは切断することを含む。「修飾」は、切断、分解、加水分解、リン酸化標識の程度の変化、ライゲーション、合成、および類似の反応を含む。「修飾」は、相の物理学的変化、会合もしくは重合の変化であってもよい。
【０２１４】
好ましい態様においては、シグナル生成物質は分解酵素である。
【０２１５】
好ましい態様においては、代理リガンドは核酸であり、シグナル生成物質は核酸を修飾する酵素もしくは核酸を基質または鋳型として用いる酵素である。例えば、シグナル生成物質は酵素（例えば、ヌクレアーゼ、（例えばＤＮＡａｓｅ、（例えばエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）、）である。あるいは、シグナル生成物質はタンパク質を修飾し（例えば、代理リガンド（もしくは、該物質自体）において、共有結合もしくは非共有結合を生成または切断することによって修飾する（例えば、ペプチド結合を切断する（例えば、プロテアーゼである）））、該代理リガンドはペプチド結合を含む（例えば、タンパク質である）。
【０２１６】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用するリガンドを選択する段階、および第２の試験（例えば、代理リガンドが共存しない条件）において該被験リガンドが標的と相互作用する、例えば、結合することを確認する段階を含む。
【０２１７】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および、インビトロで該被験リガンドを標的と（例えば、代理リガンドが共存しない条件下で）接触させることによって、該リガンドが標的と相互作用する、例えば結合することを確認する段階を含む。
【０２１８】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および、該被験リガンドを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させる段階、さらに、選択的に該被験リガンドが該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０２１９】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、該被験リガンドを精製する段階、該被験リガンドを結晶化する段階、該被験リガンドの物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０２２０】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、選択した該被験リガンドの性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０２２１】
好ましい態様においては、該反応混合物は透明ではなく、該反応混合物は有色のもの、あるいは該反応混合物は混濁したのものであり、該反応混合物は蛍光検出もしくは比色検出を阻害する物質を含み、または該反応混合物は純粋な溶液ではなく、例えば、標的以外の産物を含む。好ましい態様においては、該反応混合物は放射性分析を阻害する物質、分光学的分析（例えば、ＮＭＲ分析）を阻害する物質を含む。
【０２２２】
好ましい態様においては、該代理リガンド（例えば、核酸）は、シグナル生成物質と相互作用させる前に、例えばＰＣＲによって、もしくは、より好適には等温条件下で増幅する方法を用いて増幅を行う。
【０２２３】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０２２４】
好ましい態様においては、該シグナル生成物質は代理リガンドと直接相互作用する。別の態様においては、間接的に相互作用する。例えば、代理リガンドから生成した増幅産物と相互作用する。あるいは、該代理リガンドと別の物質との間の反応の産物に作用する。
【０２２５】
別の局面においては、本発明は標的、被験リガンド、もしくはこれらの間の相互作用を分析する方法を特徴とする。該方法は、以下の段階を含む：
核酸である代理リガンドと該標的を含む反応混合物を提供する段階、
反応混合物を被験リガンドおよびシグナル生成物質（ここで、シグナル生成物質は、代理リガンド中において、結合（例えば、共有結合もしくは非共有結合）を生成するもしくは切断する分子である）と接触させる段階（ここで、シグナル生成物質は、遊離の代理リガンドと相互作用可能な条件下で代理リガンド（例えば、被験リガンドの結合によって、標的から解離した被験リガンド）と共存する）、および反応混合物における熱の変化を測定する段階を含む。これにより、被験リガンド、標的、もしくはこれら二つの間の相互作用を分析することができる。
【０２２６】
好ましい態様においては、代理リガンドは、標的と結合できる被験リガンドに関して負の異所性結合を示す（すなわち、被験リガンドの標的への結合によって解離する）。
【０２２７】
好ましい態様においては、シグナル生成物質と代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の場合において、より起こり易い。一例として、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間の相互作用は、シグナル生成物質と（標的に結合したものに対し）遊離の代理リガンド間において、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、もしくは１０８倍、より起こり易いのである。
【０２２８】
好ましい態様においては、シグナル生成物質は分解酵素である。
【０２２９】
好ましい態様においては、シグナル生成物質は核酸を修飾する酵素もしくは核酸を基質または鋳型として用いる酵素である。例えば、シグナル生成物質は例えば、ヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ））等の酵素である。
【０２３０】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および第２の試験（例えば、代理リガンドが共存しない条件）において該被験リガンドが標的と相互作用する、例えば、結合することを確認する段階を含む。
【０２３１】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および、インビトロで該被験リガンドを標的と（例えば、代理リガンドが共存しない条件下で）接触させることによって、該リガンドが標的と相互作用する、例えば結合することを確認する段階を含む。
【０２３２】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、標的と相互作用する被験リガンドを選択する段階、および、該被験リガンドを細胞（例えば、培養細胞もしくは動物）と接触させる段階、さらに、選択的に該リガンドが該細胞もしくは動物に効果を示すか否かを調べる段階を含む。
【０２３３】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、該被験リガンドを精製する段階、該被験リガンドを結晶化する段階、該被験リガンドの物理的性質（例えば、分子量、等電点、（該当するなら）配列、結晶構造）を評価する段階を含む。
【０２３４】
好ましい態様においては、本方法はさらに以下の段階を含む。すなわち、選択した該被験リガンドの性質を最適化する（例えば、標的に対する親和性を最適化する、分子量を変える（例えば、分子量を減らす）、溶解度を変化させる（例えば、溶解度を増加させる））段階を含む。既知の方法もしくは本明細書に開示する方法を用いて最適化を行うことができる。
【０２３５】
好ましい態様においては、該代理リガンドは、シグナル生成物質と相互作用させる前に、例えばＰＣＲによって、もしくは、より好適には等温条件下で増幅する方法を用いて増幅を行う。
【０２３６】
好ましい態様においては、熱の変化を微小熱量計で測定する。
【０２３７】
好ましい態様においては、該シグナル生成物質は代理リガンドと直接相互作用する。別の態様においては、間接的に相互作用する。例えば、代理リガンドから生成した増幅産物と相互作用する。あるいは、該代理リガンドと別の物質との間の反応の産物に作用する。
【０２３８】
別の局面においては、本発明は候補相互作用物質に関するライブラリー、例えば、本明細書に記載の候補基質もしくは被験リガンドライブラリーを特徴とする。該方法は、以下の段階を含む。好ましくは、該ライブラリーは標的と相互作用することが知られている少なくとも一種類のメンバーを含む。
【０２３９】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、基質ライブラリー、補因子ライブラリー、炭水化物の生合成および／もしくは分解ライブラリー、プリンおよび／もしくはピリミジンの生合成および／もしくは分解ライブラリー、アミノ酸の生合成および／もしくは分解ライブラリー、脂質の生合成および／もしくは分解ライブラリー、ビタミンおよび／もしくはホルモンライブラリー、核酸（例えば、ＤＮＡ）ライブラリー、もしくは天然物ライブラリー（例えば、細菌由来の天然物ライブラリー）である。
【０２４０】
好ましい態様においては、ライブラリーのメンバーは標的と相互作用しうる分子種であり、例えば、タンパク質である。好ましくは、ライブラリーのメンバーは候補基質もしくは被験リガンドである。
【０２４１】
好ましい態様においては、被験化合物は、以下のものからなる群より選択されるライブラリーのメンバーの一つである。すなわち、酵素基質、代謝産物、補因子、天然物（例えば、細菌由来の天然物）、炭水化物、多糖類、核酸（例えば、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド前駆体、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ分子、環状核酸、超らせん核酸等）、アミノ酸（例えば、Ｄ− もしくはＬ−アミノ酸もしくはそれらの前駆体）、ビタミン、ホルモン、脂質、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、遷移状態類似体、およびそれらの組合わせである。
【０２４２】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、共通の特徴を有する複数のメンバーを含む。例えば、該複数メンバーのすべてが、酵素の補因子である、または炭水化物、ヌクレオシド／ヌクレオチド、アミノ酸、脂肪等を含む、例えば、生合成酵素もしくは分解酵素の基質（例えば、タンパク質分解酵素の基質）である、または、ビタミン、ホルモン、核酸（例えば、ＤＮＡ分子）、もしくは天然物（例えば、細菌由来の天然物）である。該ライブラリーは、上記のメンバーの代謝産物、前駆体、もしくは中間体を含む。該ライブラリーは、異なる性質を有するメンバーの組合わせを含むこともできる。例えば、補因子ライブラリーは生合成酵素もしくは分解酵素基質ライブラリーと組合わせることもできる。
【０２４３】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８種の化合物を含む。
【０２４４】
好ましい態様においては、該ライブラリーは、同一の構造的もしくは機能的特徴を有する少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８個のライブラリーメンバーを含む。別の態様においては、該ライブラリーは、構造的もしくは機能的特徴を共有するメンバーの組合わせを含むことができる。例えば、該ライブラリーは、同一の構造的もしくは機能的特徴を有する少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８個のライブラリーメンバーと別の構造的もしくは機能的特徴を有する少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、もしくは１０８個のライブラリーメンバーを含むことができる。
【０２４５】
好ましい態様においては、二種もしくはそれ以上のライブラリーを単一の標的に対し同時に試験する。一例として、標的を第１のライブラリー、例えば補因子ライブラリーの各々（もしくは複数）のメンバーに対して試験し、第２のライブラリー、例えば可能性のある基質ライブラリーの各々（もしくは複数）のメンバーに対して試験する。このように、第１のライブラリーが５０種のメンバー（第１１、第１２、〜第１５０）を有し、第２のライブラリーが５０種のメンバー（第２１、第２２、〜第２５０）を有するライブラリーを用いる場合には、該標的は全組合わせもしくは複数の新規の組合わせ、例えば（第１１と第２１）、（第１２、第２２）〜（第１５０、第２５０）等に対して試験を実施する。
【０２４６】
Ｂ． 熱化学センサーのいくつかの好ましい態様とその使用の記述
熱の吸収または放出は、化学反応の普遍的な性質である。本明細書に記載された方法は、被験化合物、または相互作用物質（たとえば、被験リガンドまたは候補基質）の標的（たとえば、標的タンパク質または核酸のような、標的高分子）との相互作用（たとえば、結合）を熱における変化に関連づけている。熱出力は熱量計で検出される。これは、標的の活性の型、範囲、または特殊な性質について明確な制限を強いることなく、相互作用の分析が可能である。例として、活性が知られていない、不十分にしか活性の特性がわかっていない、またはただ推定のもしくはおおまかの記載しかない活性をもつ標的への相互作用物質、たとえば物質の同定をすることができる。本発明の方法は、たとえば、標的が酵素である場合は、試験物質の生成物への転換において、または標的および相互作用物質がリガンドおよび対（ｃｏｕｎｔｅｒ−）リガンドである場合は、結合において、生じた熱における変化を検出する。本発明のいくつかの態様において、標的の性質および、たとえば天然物のリガンド、物質または結合相手などのその相互作用物質との相互作用について、仮定条件を必要としない。本発明の他の方法として、標的（および／または相互作用物質）についての知識または仮定を、可能性のある相互作用物質の選択において指針となるように組込んでいる。本発明の態様として、たとえば、相互作用物質に対する標的を試験するための相互作用物質の選択を最適化するおよび／または優先させるために、標的のゲノムの、または他の生物情報学的分析を使用する。
【０２４７】
相互作用の候補物質ライブラリー、たとえば、本明細書に記載されているような候補基質または被験リガンドのライブラリーもまた、本発明の範囲内である。本出願の方法およびライブラリーなどの構成物は、診断的試験、研究目的、またはたとえば薬剤などの物質についてスクリーニングするために使用することができる。本明細書において記載された方法を使って同定された薬剤などの物質もまた、本発明の範囲内である。
【０２４８】
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語は最初に定義しておく。
【０２４９】
本明細書における用法として、「相互作用物質」とも呼ばれる「被験化合物」とは、たとえば標的高分子（たとえば、タンパク質または核酸）などの標的と相互に作用する可能性をもつ種類のものである。被験化合物は、候補基質または被験リガンドでもありえる。被験化合物は、制限なく、有機低分子、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、糖タンパク質、糖脂質、炭水化物、多糖類、核酸（たとえば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド前駆体、二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡ分子、環状核酸、超らせん核酸）、アミノ酸（たとえば、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸またはそれらの前駆体）、ビタミン、ホルモン、酵素基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、天然物（たとえば、細菌由来の天然物）、およびそれらの組合せを含む、どんな物質でもよい。ライブラリーは、被験化合物の複数を含んでもよい。
【０２５０】
本明細書における用法として、「混合物」または「反応混合物」とは、物質の複合の組合せであってもよく、たとえば、懸濁液、天然物の抽出物、細胞ホモジェネート、細胞溶解物、もしくは細胞抽出物のような不純な試料、全細胞、再構成されたシステム、生化学的混合物、生物学的試料、組織試料、生物学的液体、または染色された溶液などの物質などがあり、一つ以上の被験化合物を含んでもよい。
【０２５１】
本明細書における用法として、「候補基質」とは、作用させられた時に異なる化学的存在物を生じさせる物質である。典型的な候補基質は、数ある中で、酵素基質、代謝産物、補因子（たとえば、基転移およびエネルギー共役の分子）、たとえば細菌由来の天然物などの天然物、炭水化物、多糖類、たとえば、ヌクレオシドまたはヌクレオチド前駆体、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ分子、たとえば、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸、またはそれらの前駆体などのアミノ酸、ビタミン、ホルモン、脂質が含まれる。
【０２５２】
本明細書における用法として、「被験リガンド」とは、組合せのライブラリーの中の一つであり、候補薬であり、化合物のライブラリー、たとえば菌類の生産物または発酵生産物などの自然化合物のライブラリー、有機合成のライブラリー由来のものである。好ましい態様として、そのリガンドとは、たとえば、ｃＤＮＡライブラリー、特異的に発現させたｃＤＮＡライブラリー、ゲノムのライブラリー、発現特性化によって作製されたライブラリー、あらかじめ決められた組織において、あらかじめ決められた発生時期において、またはあらかじめ決められた疾患においてもしくは疾患の非存在下において発現させた種を濃縮させたライブラリー、たとえば注文されたプローブの二次元アレイへのハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションにより選択された多数の核酸、たとえば薬などで処理された細胞または生物体のその処理後に作製されたライブラリーなどの、核酸の集団由来の核酸から発現されたポリペプチドである。
【０２５３】
本明細書における用法として、「ライブラリー」とは、標的と相互作用することができる可能性がある収集物質である。好ましくは、そのライブラリーは、標的と相互作用することが知られている少なくとも一つ含む。
【０２５４】
本明細書における用法として、「基質ライブラリー」とは、それに対する標的、たとえばタンパク質で、たとえば機能が未知のもの（本明細書では「未知物」とも呼ばれている）を、たとえば酵素活性などの相互作用の可能性についてスクリーニングすることができるような化合物を収集したものである。相互作用、たとえば酵素活性では、熱量計で検出される熱出力における変化を生じるであろう。
【０２５５】
本明細書における用法として、「標的」という用語は、対象となる任意の分子を指す。好ましい態様として、標的はタンパク質またはポリペプチドであり、たとえば、天然物のタンパク質またはそれらの断片、機能が未知のタンパク質、 それに対するリガンド、基質、または他の相互作用する分子が知られていないようなタンパク質がある。標的は核酸であってもよく、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（たとえば、リボザイムなどの構造ＲＮＡ）がある。標的は、構造または機能が公知または未知である分子（たとえば、ペプチド、タンパク質または核酸）を含む。好ましい態様として、その標的は、触媒活性をもたない、公知の触媒活性をもたない、または測定が困難な触媒活性をもつタンパク質である。標的は、数ある中でも、炭水化物、多糖類、および糖タンパク質であってもよい。
【０２５６】
本明細書における用法として、「代理リガンド」という用語は、たとえば標的タンパク質などの標的と相互作用する（たとえば、結合する）因子を指す。代理リガンドは、その標的と本来関連していても、または、その標的と本来は関連していなくてもよい。好ましい態様として、代理リガンドは、少なくとも、１０−１ Ｍ−１、１０−２ Ｍ−１、１０−４ Ｍ−１、１０−６ Ｍ−１、１０−８ Ｍ−１、１０−１０ Ｍ−１、１０−１２ Ｍ−１、１０−１５ Ｍ−１、１０−２０ Ｍ−１、１０−２５ Ｍ−１、１０−３０ Ｍ−１の標的に対するＫＤをもつ。好ましくは、代理リガンドは、次の特徴を満たす：（１）代理リガンドは被験リガンドに関してヘテロトロピックリンケージ（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ）を示す（すなわち、それは被験リガンドの結合に置換されなければならない（負のヘテロトロピックリンケージ）、または、その標的への結合は被験リガンドに関して可能である（正のヘテロトロピックリンケージ）。）、および（２）その「遊離した」または置換された形の代理リガンドは、増幅されたシグナルを発生させるためのスイッチとして働く。たとえば、置換された代理リガンドは、酵素の基質として働く。好ましくは、代理リガンドは、標的の、任意の表層もしくは内部配列、または配座領域と相互作用する（結合する）ことができる。他の態様として、代理リガンドは標的を触媒的に変化させることができる、または標的の機能的活性を変化させることができる。天然の代理リガンドの例として、陰イオン、陽イオン、プロトン、水が含まれ、他の溶液相の成分も標的に関連して見つけられる。非天然の代理リガンドの例としては、合成タンパク質、ペプチドおよび核酸配列（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）が含まれる。
【０２５７】
本発明の代理リガンドは、たとえば酵素の活性部位、抗体の抗原結合部位、受容体のホルモン結合部位、補因子結合部位などの標的タンパク質の認められている機能的領域と相互作用する（たとえば、結合する）因子に限定されない。
【０２５８】
好ましい態様として、代理リガンドは核酸分子（本明細書において「代理核酸リガンド」とも呼ばれる）である。本明細書における用法として、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの一本鎖または二本鎖、および任意の化学的修飾を指す。典型的な修飾は、その核酸に、付加的な電荷、分極性、水素結合および静電気の相互作用を組み込む他の化学基を提供するものを含むが、それらに限定されるものではない。このような修飾は、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−ウラシルまたは５−ヨード−ウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、キャッピングのような３’および５’修飾と同様に、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアニジンのような塩基対の組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０２５９】
本明細書における用法として、「代理核酸リガンド」という用語は、２から４０までのヌクレオチド、好ましくは１０から３０までのヌクレオチド、より好ましくは１５から２５までのヌクレオチド、最も好ましくは２０のヌクレオチドを含む、核酸分子を含む。したがって、好ましい態様として、代理リガンドはオリゴヌクレオチドである。一つの態様として、代理核酸リガンドは、詳細は下に記載されているように、ＳＥＬＥＸ工程を使って同定される；ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、（１９９５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３−７９７、「オリゴヌクレオチド機能の多様性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」；米国特許第５，２７０，１６３号、「核酸リガンドを同定するための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ）」、１９９３年１２月１４日登録、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら；米国特許第５，５６７，５８８号、「指数関数的濃縮化溶液Ｓｅｌｅｘによるリガンドの組織体系的進化（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｓｅｌｅｘ）」、１９９６年１０月２２日登録、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら；米国特許第５，７６３，１７７号、「指数関数的濃縮化によるリガンドの組織体系的進化：核酸リガンドの光選択および溶液Ｓｅｌｅｘ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｓｅｌｅｘ）」、１９９８年６月９日登録、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら；米国特許第５，８７４，２１９号、「核酸リガンドを使って物質における標的化合物を検出する方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎ ａ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ）」、１９９９年２月２３日登録、ドロレット（Ｄｒｏｌｅｔ）ら；これらのすべての内容は、参照として本明細書に明白に組み入れられている。
【０２６０】
本明細書における用法として、「シグナル発生物」という用語は、非等温の過程において、好ましくは発熱を伴う過程において、代理リガンドと相互作用する存在である。好ましくは、シグナル発生物は、被験リガンドにより発生したシグナルを増幅する。たとえば、そのシグナル発生物は、たとえば熱出力のようなシグナルを生じる形式において、代理リガンドと相互作用してもよい（たとえば、結合する）し、そして好ましくは、代理リガンドを修飾してもよい。典型的なシグナル発生物は、代理リガンドで発熱または吸熱反応をうける酵素である。
【０２６１】
好ましくは、シグナル発生物は、標的に結合された代理リガンドとは対照的に、遊離した代理リガンドとはより容易に相互作用する。特定の態様として、シグナル発生物は、たとえば共有結合または非共有結合を形成または切断することにより、遊離した（標的に結合させたものとは対照的に）代理リガンドを修飾する。たとえば、修飾段階は、分割、分解、リン酸化、重合、または、たとえば熱シグナルなどのシグナルを発生する任意の他の事象を含んでもよい。シグナル発生物は、分解酵素（たとえば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ）であってよい。または、シグナル発生物は、たとえばポリメラーゼなどの重合化酵素であってもよい。例を挙げれば、それらの態様として、遊離した代理リガンドがＤＮＡ分子である場合、シグナル発生物は、ブドウ状球菌のヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）、霊菌のヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）、ウシの膵ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ Ｉ）、またはヒト（ＩＶ型）ヌクレアーゼのようなヌクレアーゼでもよい。または、シグナル発生物は、たとえばＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼでもよい。それらの態様として、遊離した代理リガンドがＲＮＡ分子である場合、シグナル発生物はリボヌクレアーゼ（たとえばＲＮＡｓｅ）でもよい。それらの態様として、遊離した代理リガンドがタンパク質またはペプチドである場合、シグナル発生物はプロテアーゼでもよい。典型的なプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、サーモリシン、パパインおよびスブチリシンが含まれるが、それらに限定されるものではない。代理リガンドが金属イオンである態様において、活性化のために金属を要求する酵素はシグナル発生物として使用することができる。
【０２６２】
他の態様として、シグナル発生物は、被験リガンドが標的（たとえば標的タンパク質）に結合する場合に起こるその分子の発生を増幅する溶液（たとえば緩衝溶液）であってもよい。例を挙げれば、多くの標的タンパク質が被験リガンドに結合する場合に、多数のプロトンを放出または結合する。これらの放出または吸収の事象は、「リンケージ（ｌｉｎｋａｇｅ）」事象と言われている。リンケージ過程は、たとえばトリスＨＣｌのようなイオン化の大きな熱をもつ緩衝液分子を溶液に導入することにより、増幅させることができる。さらに他の態様として、シグナル発生物は相においての変化、または物質の凝集もしくは重合であってもよい。
【０２６３】
本明細書における用法として、第一の分子の第二の分子との相互作用は、２つの分子の会合における変化、２つの分子の結合における変化、または分子の一方もしくは両方の修飾における変化を含んでもよく、たとえば増加または減少がある。本明細書における用法として、修飾とは、結合、たとえば非共有結合または共有結合を形成または切断することを含む。それは、分割、分解、加水分解、リン酸化レベルでの変化、標識化、ライゲーション、合成、および同様の反応を含む。修飾は、相の物理的変化、凝集または重合における変化を含んでもよい。
【０２６４】
シグナル発生物との相互作用の場合、修飾は等温ではなく、好ましくは発熱を伴う。
【０２６５】
本明細書における用法として、「リガンドを分析すること」という用語は、そのリガンドが標的に結合するかどうかを決定すること；被験リガンドの標的に対する親和力を評価することの、一つまたは複数を含んでもよい。
【０２６６】
標的の生成
本発明の方法において使用される標的は、対象となる任意の分子であってよい。好ましくは、標的は、タンパク質またはポリペプチド（本明細書では「標的タンパク質」とも呼ばれる）であり、たとえば、自然発生のタンパク質またはそれらの断片；機能が未知のタンパク質；それに対するリガンド、基質、または他の相互作用する分子が知られていないタンパク質がある。典型的な標的タンパク質は、制限はなく、受容体、酵素、腫瘍遺伝子の産生物、腫瘍抑制遺伝子の産生物、転写因子、および感染性タンパク質（例として、感染性生物体、たとえばウイルス、寄生虫、細菌、および／または菌類のタンパク質から得られるタンパク質）を含む。さらに、標的タンパク質は、野生型タンパク質、または安定性、活性もしくは他の種々の性質が変わっているものを含む突然変異体もしくは異型のタンパク質、または外来アミノ酸配列、たとえば精製を容易にする配列が加えられたハイブリッドタンパク質（たとえばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の一部）を含んでもよい。
【０２６７】
標的タンパク質は、純粋な形か不純な形（たとえば、本明細書に記載されているように、タンパク質および他の化合物の複合の混合物の一部として）かのいずれでもよい。特定の態様として、標的タンパク質は、組換えタンパク質または生化学的単離物であってもよい。たとえば、標的は、原核生物または真核生物から単離された遺伝子によってコードされた任意のタンパク質であってもよい。単離された遺伝子は、発現ベクターへクローニングされ、標準的分子生物学的技術を実行することによりクローニングされた遺伝子の発現が可能である条件の下で、適当な宿主細胞へ導入させることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．ら、編集、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９， Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， 「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９を参照されたい）。ベクターは、たとえば、数ある中で、プラスミド、ウイルスベクターでもよい。好ましくは、ベクターは、たとえば、標的タンパク質の適当な発現が得られるように、標的タンパク質をコードする遺伝子を適当な調節配列に連結することにより、修飾させる。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含む（たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ； （１９９０）「遺伝子発現技術：酵素学における方法１８５（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。
【０２６８】
標的は、微生物（たとえば、細菌、ウイルス、寄生虫）、脊椎動物または非脊椎動物（たとえば、哺乳類（例：ヒト））のような、原核生物または真核生物から得てもよい。
【０２６９】
典型的な原核生物は、以下のものを含む：アクイフェックス アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、トレポネーマ パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、アルカエグロブス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノバクテリウム サーモ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、マイコプラズマ ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、リケッチア プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ピロコッカス アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｃ−１２５、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖ、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＣＳＵ９３、ナイセリア ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｈｅａ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ボレリア ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、カウロバクター クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、クロロビウム テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、デイノコッカス ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、エンテロコッカス フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、メタノコッカス ジャナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ナイセリア メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ポルフィロモナス ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ プトレファシエンス（���ｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、 肺炎連鎖菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サーモトガ マリチン（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）、トレポネーマ デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、チオバチルス フェロキシダンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｘｉｄａｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、エンテロコッカス ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、バルトネラ ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、カンピロバクター ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、フランシセラ ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ハロバクテリウム サリナリウム インスティチュート（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、リステリア モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、結核菌サンガー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｓａｎｇｅｒ）、マイコプラズマ ミコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、ナイセリア メニンギディティス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）株、ストレプトマイセス コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、スルホロバス ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ＰＣＣ６８０３、サーモプラズマ アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、キシレラ ファスチジオサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、アクチノバチルス アクチノマイセ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＮＲＣ−１、マイコプラズマ カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、ナイセリア ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロバクラム アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ロドバクター カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトコッカス ピオゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ウレアプラズマ ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、クレナーチャエウム シンビオサム（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｓｉｄａ）、エセリシア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）種（ＨＧＥ剤）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉｉ）、及びストレプトマイセス ハイグロスコピウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｕｓ）。
【０２７０】
典型的な真核生物は、以下のものを含む：アスペルギルス ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、リーシュマニア メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トリパノソーマ クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）種、クリプトスポリジウム パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、シロイヌナズナＭ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｍ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、シストソマ マンソニ（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）、シストソマ ジャポニカム（Ｓｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、および哺乳動物（例えば、ヒト）。
【０２７１】
標的は、真核生物の細胞小器官によって生成させることができる。たとえば、標的は、ミトコンドリアの酵素であってよい。細胞小器官のゲノムが公知である生物体の例として、以下のものを含む：クロララクニオン（Ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｎ）、グイラルディア　セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）、シアノフォラ パラドクサ（Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ ｐａｒａｄｏｘａ）、エピファガス ビルギニアナ（Ｅｐｉｆａｇｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、グイラルディア セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）、マルカンティア ポリモルファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ニコチアナ タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、オドンテラ シネンシス（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、オリザ サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ポルフィラ プルプリア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ピナス サンバーギアナ（Ｐｉｎｕｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎａ）、アカンタモエバ カステラニー（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）、アロマイセス マクロジーナス（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ ｍａｃｒｏｇｙｎｕｓ）、ボス タウラス（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）、カフェテリア ロエンバージェンシス（Ｃａｆｅｔｅｒｉａ ｒｏｅｎｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、クリソディデュマス シンウロイデウス（Ｃｈｒｙｓｏｄｉｄｙｍｕｓ ｓｙｎｕｒｏｉｄｅｕｓ）、コンドラス クリスパス（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ）、クラミドモナス レインハルディティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ドロソフィラ ヤクバ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙａｋｕｂａ）、イキュウス アシナス（Ｅｑｕｕｓ ａｓｉｎｕｓ）、ホモ サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、マス マスカラス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、オクロモナス ダニカ（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ ｄａｎｉｃａ）、ポルフィラ プルプリア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、プロトセカ ビッケルハミー（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、レクリノモナス アメリカナ（Ｒｅｃｌｉｎｏｍｏｎａｓ Ａｍｅｒｉｃａｎａ）、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、テトラヒメナ ピリフォルミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）。
【０２７２】
標的はまた、ファージによっても生成させることができ、制限はなく、以下のものを含む：アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）バクテリオファージ、アコレプラズマ ファージ／ウイルス、バクテリオファージｂＩＬ６７、バクテリオファージＣｐ−１、バクテリオファージＧ４、バクテリオファージＨＰ１、バクテリオファージＩＫｅ、バクテリオファージλ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＰＲＤ１、バクテリオファージＰＺＡ、バクテリオファージＴ４およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）バクテリオファージＣ２。
【０２７３】
標的はまた、ウイルスのタンパク質であってもよい。標的を生成できるウイルスの例として、以下のものを含む：アベルソンマウス白血病ウイルス、アデノ随伴ウイルス２、アデノ随伴ウイルス３、アフリカブタ熱ウイルス、アルファルファモザイクウイルス、リンゴ白化リーフスポットウイルス（Ａｐｐｌｅ ａｈＩｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、リンゴステムグルービングウイルス（Ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、ハタザオモザイクウイルスサテライト（Ａｒａｂｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）、北極グラウンドリスＢ型肝炎ウイルス（Ａｒｅｔｉｃ ｇｒｏｕｎｄ ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、アーティチョーク斑紋縮葉ウイルス（Ａｒｔｉｃｈｏｋｅ ｍｏｔｔｌｅｄ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ）、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、トリ癌腫ウイルス（Ａｖｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、トリ白血病ウイルス、トリ肉腫ウイルス、ＢＫウイルス、ヒヒ内生ウイルス（Ｂａｂｏｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓ）、ヒヒ内生ウイルス（ＢａＥＶ）、タケモザイクウイルス、オオムギ黄化ウイルス、バーマーフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ，）、ビーンゴールデンモザイクウイルス（Ｂｅａｎ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ビートカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ）、ビート黄化ウイルス、ゴキブリウイルス（Ｂｌａｃｋ ｂｅｅｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、カイコ核多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ボーダー病ウイルス、ボルナ病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブロームモザイクウイルス（Ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、カカオスウォーレンシュートウイルス（Ｃａｃａｏ ｓｗｏｌｌｅｎ ｓｈｏｏｔ ｖｉｒｕｓ）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（Ｃａｐｒｉｎｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、タネツケバナクロロティックフレックウイルス（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ）、ニンジン斑紋ウイルスＡ（Ｃａｒｒｏｔ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ａ）、キャッサバコモンモザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、キャッサバ潜在ウイルス（Ｃａｓｓａｖａ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、カリフラワーモザイクウイルス、チキン貧血ウイルス、クロリスストリエートモザイクウイルス（Ｃｈｌｏｒｉｓ ｓｔｒｉａｔｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、シトラストリステザウイルス（Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ）、クローバ黄化モザイクウイルス、ココナッツ葉腐れウイルス（Ｃｏｃｏｎｕｔ ｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙ ｖｉｒｕｓ）、コメリナ黄化斑紋ウイルス（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、キュウリ緑斑紋モザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、キュウリネクローシスウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）３、デング熱ウイルス１型、デング熱ウイルス２型、デジタリア条斑ウイルス、カモＢ型肝炎ウイルス、エボラウイルス（構築された）、ナスモザイクウイルス、脳心筋炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、フォックステールモザイクウイルス（Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、フレンドマウス白血病ウイルス（Ｆｒｉｅｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、フレンド脾臓フォーカスフォーミングウイルス（Ｆｒｉｅｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、フジナミ肉腫ウイルス、グラウンドリス肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルスＢ、ヘロンＢ型肝炎ウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ヒトＴ細胞白血病ウイルス２型、ヒトアデノウイルス１２型、ヒトアデノウイルス２型、ヒトフォーミーウイルス（Ｈｕｍａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス３、ヒトヘルペスウイルス４、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒト免疫不全ウイルス２型、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヒトＲＳウイルス、伝染性造血壊死ウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、ＪＣウイルス、日本脳炎ウイルス、ジェムブラナ病ウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、ケネディア黄化モザイクウイルス（Ｋｅｎｎｅｄｙａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇性ウイルス（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、レイシュマニアＲＮＡウイルス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ）、レイシュマニアＲＮＡウイルス１、ルツェルン一過性条斑ウイルス（Ｌｕｃｅｒｎｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ）、トウモロコシ条斑ウイルス、マールブルクウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）、メーソン−ファイザーサルウイルス（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｖｉｒｕｓ）、はしかウイルス、メロンネクロティックスポットウイルス（Ｍｅｌｏｎ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、マウスミニットウイルス（Ｍｉｃｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ）、軟属腫伝染性ウイルス亜類型１（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ ｌ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス骨肉腫ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マッッシュルーム桿状ウイルス（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ）、スイセンモザイクウイルス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、オニョン−ニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）、オドントグロッサム輪点ウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）、オリ���ブ潜在ウイルス１、オノニス黄化モザイクウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、キビ条斑ウイルス、パパイヤモザイクウイルス、パパイヤ輪点ウイルス、エンドウ幼期褐変ウイルス、エンドウ種起因性モザイクウイルス、ピーナッツ白化条斑ウイルス、ピーナッツ縞葉枯ウイルス、ピーナッツ矮化病ウイルス、ペパーヒュアステコウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ ｈｕａｓｔｅｃｏ ｖｉｒｕｓ）、ペパー斑紋ウイルス、プラムポックスウイルス（Ｐｌｕｍ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス株ａ２（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ａ２）、ポリオーマウイルス株ａ３、ジャガイモ葉巻きウイルス、ジャガイモモップ−トップウイルス（Ｐｏｔａｔｏ ｍｏｐ−ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモウイルスＡ、ジャガイモウイルスＭ、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、プンタトロウイルス（Ｐｕｎｔａ Ｔｏｒｏ ｖｉｒｕｓ）、ウサギ出血病ウイルス、狂犬病ウイルス、イネタングロスフェリカルウイルス（Ｒｉｃｅ ｔｕｎｇｒｏ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ）、イネ黄化斑紋ウイルス、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ラウス肉腫ウイルス、ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ）、サッカロマイセスセレビシエウイルスＬａ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖｉｒｕｓ Ｌａ）、サグアロカクタスウイルス（Ｓａｇｕａｒｏ ｃａｃｔｕｓ ｖｉｒｕｓ）、サテライトタバコネクローシスウイルス（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、サルフォーミーウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、サルウイルス４０、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）、シンドビス様ウイルス、ソンチュス黄化ネットウイルス（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔ ｖｉｒｕｓ）、インゲンマメモザイクウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、大豆白化斑紋ウイルス（Ｓｏｙｂｅａｎ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、スピラプラズマウイルス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｖｉｒｕｓ）、イチゴバインバンディングウイルス（Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｖｅｉｎ ｂａｎｄｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、スルフォロバスウイルス様粒子ｓｓｖ１（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｓｖＩ）、ブタ水疱病ウイルス（Ｓｗｉｎｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、テイラーの脳脊髄炎ウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介脳炎ウイルス、タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ）、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｉｌｄ ｇｒｅｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、タバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、タバコネクローシスウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、タバコ葉脈斑点ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｍｏｔｔｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、トマトブッシースタントウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ）、トマトゴールデンモザイクウイルス（Ｔ��ｍａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、トマト葉巻きウイルス、トマト黄化葉巻きウイルス、カブバイン−クリアリングウイルス（Ｔｕｒｎｉｐ ｖｅｉｎ−ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、カブ黄斑モザイクウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ビスナウイルス（Ｖｉｓｎａ ｖｉｒｕｓ）、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、Ｙ７３肉腫ウイルスおよび黄熱病ウイルス。
【０２７４】
標的のバイオインフォマティクス分析
好ましい態様においては、仮想的な機能または推定される機能が、好ましくは、標的を被験化合物で検討する前に割り当てられる。仮想的な機能を標的（例えばタンパク質）に割り当てる際に、いくつかのバイオインフォマティックス技術を使用することができる。標的および分子（例えばタンパク質）が共有する（または、場合によっては共有しない）既知の機能の特徴を同定することで、分子（例えばタンパク質）の有する該当する活性、または任意の活性を標的に割り当てることができる。タンパク質の機能を予測するために現在使用されている方法の例には、配列に基づく検索、折りたたみ認識法（スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）アルゴリズムおよびニューラルネットワークを含む）、ホモロジーモデリング、および構造に基づく分析が含まれる。
【０２７５】
例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎｎ）アルゴリズムを用いて、機能が既知であるあらゆる配列に対する任意の配列と１対１の比較を行うことができる（Ｓｈｐａｅｒ， Ｅ．Ｇ．ら （１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８（２））。タンパク質の保存領域（例えば、機能が予測可能な配列モチーフ）を同定するために二つの手法を用いることができる。一つはＰＲＯＳＩＴＥ［ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ］であり、もう一つはＢＬＯＣＫＳ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｂｌｏｃｋｓ／］である。ＰＲＯＳＩＴＥによる分析は、コンセンサス配列またはモチーフを使用した場合のアミノ酸残基のマッチングパターンに基づく。第２のアプローチであるＢＬＯＣＫＳは、単なるコンセンサス配列ではなく、保存領域の完全でギャップのない複数の配列整列に対して配列をマッチさせることで、近縁関係にない配列を高感度で選び出すことができる。
【０２７６】
標的アミノ酸配列はまた、クラス、構造、トポロジー（折りたたみファミリー）および相同性スーパーファミリー（Ｃｌａｓｓ， Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ， Ｔｏｐｏｌｏｇｙ（ｆｏｌｄ ｆａｍｉｌｙ）， ａｎｄ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）（ＣＡＴＨ）データベース［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｃａｔｈ］を用いて、タンパク質の折りたたみの有無を分析することもできる。現在６７０種を超える種々のタイプのタンパク質の折りたたみがこのデータベースに収載されている。一次配列を元にした、このような構造モチーフの予測能力は、スレッディング法（すなわち、対象タンパク質のアミノ酸配列を既知の３次元タンパク質構造に適合させる手法）で改善することができる（Ｂｒｙａｎｔ， ＳＨら （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １６：９２〜１１２）。また、ニューラルネットワークを用いてタンパク質の折りたたみを予測することも可能である（Ｂｏｈｒ， Ｈら （１９９０） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２６１、４３〜４６）。
【０２７７】
既知機能を有する別のタンパク質に相同的な（少なくともアミノ酸配列の３０〜３５％が同一な）標的タンパク質の機能の正確さを予測する別の方法にホモロジーモデリングがある。ホモロジーモデリング（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＭＳら （１９９４） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：１〜６８）は、対象タンパク質のアミノ酸配列を、３次元構造が既知である別の関連タンパク質と計算アルゴリズムを用いて比較する。
【０２７８】
また、構造に基づいてタンパク質の機能を決定することで、標的の生物学的機能を推定することができる。この分析法では、標的タンパク質の結晶構造を決定し、次にその３次元構造を、機能が既知である他のタンパク質と比較する。適合する部分があれば、標的の生物学的機能を他のタンパク質の既知の機能を元に推定することができる。このアプローチを用いることで、最近ではＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｉｉに由来する新規ＮＴＰａｓｅが同定されている（Ｈｗａｎｇ， ＫＹら （１９９９） Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：６９１〜６９６）。
【０２７９】
被験化合物の作製
被験化合物（相互作用物質）は、化合物、分子、または複合体であり、標的（例えば標的タンパク質）との相互作用力（例えば結合力）を検討することができる。一つの態様において、被験化合物は有機低分子（例えば、合成または天然の非タンパク質性分子）である。被験化合物は、標的と相互作用するように設計することができるほか、所望の活性を元に、多様な化合物からなるライブラリー（例えば、基質ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー）から選択することができる（例えば所望の活性（例えば標的との相互作用能力）を元にした薬剤のランダムスクリーニング）。
【０２８０】
ライブラリー
本発明の方法は、候補相互作用物質（例えば、標的との相互作用能力の検討対象となる候補薬剤）の供給源としてライブラリーを使用する。ライブラリーには構造的または機能的に関連する複数のメンバーを含めることができる。しかし、ライブラリーを構成する因子群は構造的および機能的に無関係であってもよい。
【０２８１】
機能的または構造的に関連する複数のメンバーを含むライブラリーは、特に標的を活性または仮想的な活性を割当可能な場合に有用となりうる。例えば標的がヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼの基質からなるライブラリーを標的に対して検討することができる。ヌクレアーゼの基質からなるライブラリーには、さまざまな基質または仮想的な基質を含めることができる。
【０２８２】
ライブラリーは、広範囲にわたる標的「活性」を対象とすることができる。ライブラリーの例については後述する。新たに発見された酵素の基質の要件は、基質ライブラリーを系列的に分類することで決定可能である。本明細書では、この方法を基質プロファイリングと呼ぶことにする。
【０２８３】
補因子ライブラリー
「補因子」ライブラリーには、基移動、ならびにエネルギー共役分子、補酵素（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、ＦＡＤＨ、ホスホエノールピルビン酸、補酵素Ａ、リポアミド、Ｓ−アデノシルメチオニン、チアミンピロリン酸、ビオチン、テトラヒドロ葉酸、ウリジン二リン酸グルコース、シチジン二リン酸ジアシルグリセロール、およびスクシニル−ＣｏＡなどの既知のすべてのＣｏＡ修飾分子）を任意に含めることができる。補因子と呼ばれるこれらの分子群は、極めて多数の種々の酵素反応に関与する。下記の実施例５に記載して検討する補因子ライブラリーの例には、以下のメンバーが含まれる：ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、フラビン、チアミン一リン酸塩化物、ピリドキサル５’−リン酸、補酵素Ａ、およびコカルボキシラーゼ。
【０２８４】
好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種の基質を含む。多くの場合、補因子ライブラリーは、他のライブラリーとともに検討される。例えば補因子ライブラリーは、炭水化物ライブラリーと組合わせて検討される（実施例５参照、後述）。
【０２８５】
炭水化物代謝ライブラリー
炭水化物代謝ライブラリー（例えば生合成ライブラリーおよび／または分解ライブラリー）を使用して、炭水化物修飾酵素をスクリーニングすることができる。このライブラリーには、例えば、長い単位、短い単位、および一単位の炭水化物、ならびにリン酸化された炭水化物などの既知の生化学経路に由来する修飾型炭水化物を含む、既知の生化学経路にかかわる炭水化物を含めることができる。このタイプのライブラリーには、任意の酵素の基質であることが未知である炭水化物または修飾型炭水化物を含めることができる。使用される炭水化物の例には、グルコース、フルクトース、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、およびリボースを含めることができる。炭水化物ライブラリーに使用可能な他の基質の例は、代謝経路チャート（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ Ｃｈａｒｔ）、１９９７、第２０版（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載されている。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種のメンバーを含む。炭水化物ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２８６】
下記の実施例５に記載して検討する炭水化物ライブラリーの例には、以下のメンバーが検討対象として含まれる：Ｄ−グルコース、アラビノース、スクロース、リボース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、およびキシロース。
【０２８７】
プリンおよびピリミジン代謝ライブラリー
プリンおよびピリミジン代謝ライブラリー（例えば生合成および／または分解ライブラリー）には、ヌクレオシド／ヌクレオチド前駆物質を含めることができる。またこのライブラリーを使用して、プリンおよびピリミジンの生合成または分解に関与する酵素をスクリーニングすることができる。使用されるプリンおよびピリミジン化合物の例には、グリシンアミド−リボース−リン酸、尿素、ホルミルグリシンアミド−ＲＰ、５−アミノイミダゾールカルボキシレート−ＲＰ、イノシン−Ｐ、ホルミルアミド−イミダゾール−カルボキサミド−ＲＰを含めることができる。プリンおよびピリミジンライブラリーに使用可能な他の基質の例は、代謝経路チャート（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ Ｃｈａｒｔ）、１９９７、第２０版（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載されている。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種の基質を含む。プリンおよびピリミジン代謝ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２８８】
アミノ酸代謝ライブラリー
アミノ酸代謝ライブラリー（例えば生合成および／または分解ライブラリー）には、Ｄ型ならびにＬ型のアミノ酸、およびアミノ酸の前駆体を含めることができる。これには、既知のプロテアーゼドメインを有し、現行のあらゆる既知プロテアーゼの基質としてはたらくペプチドを含めることができる。このライブラリーはまた、未発見または未分類のタンパク質分解活性を検討して新しいクラスのプロテアーゼを見出すことを可能とするＢＳＡなどのいくつかの酵素以外のタンパク質を含む場合がある。アミノ酸代謝ライブラリーに使用されるアミノ酸の例には、アラニン、アスパラギン酸、システイン、ヒスチジン、グリシン、およびイソロイシンが含まれる。アミノ酸代謝ライブラリーに使用可能な他の基質の例は、代謝経路チャート（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ Ｃｈａｒｔ）、１９９７、第２０版（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載されている。プロテアーゼの基質として使用可能なペプチドの例には、アセチル基−セリン−グルタミン−アスパラギン−チロシン−プロリン−バリン−バリン−アミド基（Ｓｉｇｍａ製、１９９９年版カタログの１１３２ページ、Ａ０８０６番）、およびセリン−プロリン−アルギニン（Ｓｉｇｍａ製）が含まれる。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも、１、２、５、または１０種のメンバーを含む。アミノ酸代謝ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組みあわせて検討することができる。
【０２８９】
脂質代謝ライブラリー
脂質代謝（例えば生合成および／または分解ライブラリー）には、脂肪酸、脂肪酸前駆物質、ステロイド、およびステロイド前駆物質について、既知の酵素の基質として既に発見されたもの、ならびに酵素の基質として未発見または未分類の脂肪酸およびステロイドの両方を含めることができる。このライブラリーを使用して、脂肪酸代謝に関与する酵素をスクリーニングすることができる。脂質代謝ライブラリーに使用される基質の例には、コレステロール、デスモステロール、チモステロール、ラノステロール、コリン、レシチン、セファリン、リノール酸、カルジオリピン、およびアセチルコリンが含まれる。脂質の生合成および分解ライブラリーに使用可能な他の基質の例は、代謝経路チャート（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ Ｃｈａｒｔ）、１９９７、第２０版（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載されている。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種のメンバーを含む。脂質代謝ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２９０】
ビタミンおよびホルモンライブラリー
このクラスのライブラリーには、ビタミンおよびホルモン、ならびにそれらの代謝前駆物質を含めることが可能で、ホルモンまたはビタミンの合成、分解、または修飾に関与する酵素のスクリーニングに使用することができる。ビタミンおよびホルモンライブラリーに使用される基質の例には、レチノイン酸、メタロドプシン、ロドプシン、ビタミンＫ、オプシン、およびビタミンＥが含まれる。ビタミンおよびホルモンライブラリーに使用可能な他の基質の例は、代謝経路チャート（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ Ｃｈａｒｔ）、１９９７、第２０版（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に記載されている。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種のメンバーを含む。ビタミンおよびホルモンライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２９１】
ＤＮＡ分子ライブラリー
このクラスのライブラリーを使用して、ＤＮＡ修飾酵素をスクリーニングすることができる。これには、２本鎖および１本鎖のＤＮＡ分子、ならびに部分的に２本鎖であるＤＮＡ分子、および子ウシ胸腺ＤＮＡなどのランダムな配列のＤＮＡを含めることができる。これには、共有結合で結合した閉環状ＤＮＡを、スーパーコイル状態および弛緩状態のものを問わず含めることができる。これらのＤＮＡ分子は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）などの業者から入手することができる。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種のメンバーを含む。ＤＮＡ分子ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２９２】
天然物ライブラリー
天然物ライブラリー（例えば細菌由来の天然物ライブラリー）には、生物体（例えば細菌類）に由来する天然物を含めることができる。このライブラリーを使用することで、未知の物質から未知の酵素活性をスクリーニングすることができる。天然物ライブラリーの基質の要件は、クロマトグラフィー法による天然物の逆重畳により決定することができる。好ましい態様において、このライブラリーは、本明細書に記載される少なくとも１、２、５、または１０種のメンバーを含む。天然物ライブラリーは、他のライブラリー（例えば補因子ライブラリー）と組合わせて検討することができる。
【０２９３】
ある態様において、天然物（例えば細菌由来の天然物）は例えば、非許容条件（例えば、非許容温度、または必須栄養素の非存在下）で成長させると任意の代謝物を蓄積する、変異体の生物（例えば温度感受性の細菌変異体、または栄養要求体）によりインビボで生じる。蓄積した代謝物は次に、生物体から精製してから検討することができる。
【０２９４】
種々の基質ライブラリーはそれぞれ、標的タンパク質／タンパク質群と補因子ライブラリーとともに、いくつかの異なるｐＨ値で、また種々の塩を含む一般的な混合物とともに溶液としてインキュベートすることができる。酵素活性は、熱量計で検出される熱出力の変化として検出することができる。これにより、新規タンパク質が有する広範なタイプの酵素活性を速やかに分類することが可能となる。その後、基質が満たすべき厳密な要件は、基質ライブラリーを系統的に分けることで決定することができる。なお、新規発見された酵素の基質の要件および溶液条件は最適化することが可能であり、ｋｃａｔ、ｋＭ、および／またはｋＤなどの重要なパラメータを決定することができる。
【０２９５】
別の態様においては、被験化合物はコンビナトリアルライブラリーを構成するメンバーである。コンビナトリアルライブラリーは、当技術分野において周知の方法で合成することが可能であり、例えばゴードン（Ｅ．Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎ）らの論文（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ （１９９４） ３７：１３８５〜１４０１）；デヴィット（ＤｅＷｉｔｔ， Ｓ．Ｈ．）；チャルニック（Ｃｚａｒｎｉｋ， Ａ．Ｗ．）らの論文（Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． （１９９６） ２９：１１４）；アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｒ．Ｗ）；コームス（Ｃｏｍｂｓ， Ａ．Ｐ）；テンペスト（Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ．Ａ．）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ， Ｓ．Ｄ．）；キーティング（Ｋｅａｔｉｎｇ， Ｔ．Ａ）らの論文（Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ （１９９６） ２９：１２３；エルマン（ＥＩｌｍａｎ， Ｊ．Ａ．）の論文（Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． （１９９６） ２９：１３２；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ， Ｅ．Ｍ．）；ギャロップ（Ｇａｌｌｏｐ， Ｍ．Ａ）；パテル（Ｐａｔｅｌ， Ｄ．Ｖ．）らの論文（Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． （１９９６） ２９：１４４）；レーベ（Ｌｏｗｅ， Ｇ．）の論文（Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． （１９９５） ３０９）、ブロンデージュ（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ）らの論文（Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９５） １４：８３）；チェン（Ｃｈｅｎ）らの論文（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （１９９４） １１６：２６６１）に概説されているほか、米国特許第５，３５９，１１５号、５，３６２，８９９号、および第５，２８８，５１４号；国際公開公報第９２／１００９２号、９３／０９６６８号、第９１／０７０８７号、第９３／２０２４２号、第９４／０８０５１号に記載されている。
【０２９６】
被験リガンドのライブラリーは、当技術分野において周知のさまざまな方法で調製することができる。例えば「スプリット−プール」法は以下の手順で実施する：官能基を付けたポリマー支持体のビーズを複数の反応容器内に置く；固相支持体ペプチドの合成に適した種々のポリマー支持体が知られており、また一部は市販されている（例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ 「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン（１９９３）を参照）。ビーズの各アリコートに、個別に活性化させたアミノ酸の溶液を添加して反応させ、各反応容器内で複数の固定化したアミノ酸を生成させる。次に、誘導体化したビーズのアリコートを洗浄し、「プールし（すなわち再結合させ）」、さらにビーズのプールを分け、各アリコートを個別の反応容器内に置く。次に、別の活性化アミノ酸を各ビーズアリコートに添加する。合成のサイクルは所望の長さになるまで繰り返す。各合成サイクルで付加される残基はランダムに選択することができる；または、「バイアスのかかった」ライブラリーを提供するように残基を選択することができる。多様なペプチド、ペプチド模倣体、または非ペプチド性化合物が、この方法で容易に作製できる。
【０２９７】
別の例証となる合成法では、「ディヴァーソーマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）ライブラリー」が、デヴィット（Ｈｏｂｂｓ ＤｅＷｉｔｔｅ）らの方法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９０：６９０９ （１９９３））で作製される。他の合成法には、ホートン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）の「ティーバッグ」法（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８６ （１９９１）を参照）などもあり、本発明による化合物ライブラリーの合成に使用することができる。
【０２９８】
化合物のコンビナトリアルライブラリーは、ライブラリーを構成する各メンバーの印となる「タグ」を付けて合成することができる（例えば、Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌらによる米国特許第５，５６５，３２４号、ならびに国際公開公報第９４／０８０５１号および第９５／２８６４０号を参照）。一般にこの方法は、固相支持体または化合物に結合する不活性であるが検出しやすいタグを使用することを特徴とする。活性化合物を（例えば上述の方法の一つで）検出する場合、化合物の正体は、結合した固有のタグを目印として判定する。このタグ付加法を採用することで、極めて低いレベルにおける同定に使用可能な化合物の大規模ライブラリーを合成することができる。このようなタグ付加法は、ビーズから遊離した化合物を同定する際に有用となる。
【０２９９】
好ましい態様において、被験化合物のライブラリーは少なくとも３０種の化合物、より好ましくは少なくとも１００種の化合物、またさらにより好ましくは少なくとも５００種の化合物を含む。好ましい態様において、被験化合物のライブラリーは、１０９種未満の化合物、より好ましくは１０８種未満の化合物、またさらにより好ましくは１０７種未満の化合物を含む。
【０３００】
フォーマット
本明細書において記載の方法は、多くの物理的なフォーマットにおいて行うことができる。好ましい態様において、測定は、等温滴定熱量計において行う。熱量計、例えば等温滴定熱量計は、フローセルを備えることができる。好ましい態様において、標的をフローセルに固定する。試料は、多区画の試料ホルダー、例えばマイクロタイタープレート、例えば９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートからフローセルに導入することができる。試料は、試料ホルダーの区画の中で予め混合することができる。
【０３０１】
他の好ましい態様において、各分画がサーモピルル（ｔｈｅｒｍｏｐｙｌｅ）を含み、それぞれが熱量計セルである、多区画の試料ホルダー、例えば、マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルプレートのようなマルチウェルプレートを用いることができる。区画に液体を輸送するためのチャネルを含めることができる。
【０３０２】
好ましい態様において、方法は、その中で適当なウェルチャネルと他の成分が、例えば食刻または沈着によって形成されているマイクロチップ上で行うことができる。液体は電気運動法によってポンプで送られ、移動させることができる。
【０３０３】
本明細書に記載の方法において、反応混合物は、単一の標的または多数の標的を含みうる。同様に、一つまたは複数のリガンドを反応混合物に加えることができる。例えば、多数の種をスクリーニングするために、これらの要素の一つまたは双方を多重にすることが有用であるかもしれない。例えば、多数のリガンドを評価しなければならない場合、最初の群の候補物質をプールすることができ、一つのプールが有望な結果を示す場合、プールのメンバーを評価する。同様に、基質を評価する方法では、候補物質をプールすることができる。
【０３０４】
大規模スクリーニングの場合、熱量計をハイスループットなスクリーニングフォーマットと組合わせることができる。ハイスループットなスクリーニングの目的に関して、上記の実験条件は、スクリーニングした総化合物に対して、「陽性」化合物またはリガンドとして同定される被験リガンドの閾値比率が得られるように調節する。好ましくは、この閾値は、２つの基準に従って設定する。第一に、陽性化合物の数は実際的な意味において処理可能でなければならない。第二に、陽性化合物の数は、標的タンパク質に対して認識可能な親和性を有するリガンドを反映しなければならない。好ましい閾値は、総被験リガンドの０．１％〜１％が、所定の標的のリガンドであることが示される場合に得られる。
【０３０５】
ＩＴＣは市販されており、当業者によって日常的に用いられている。例えば、１９９８年９月２９日にプロトニコフ（Ｐｌｏｔｏｎｉｋｏｖ， Ｖ．Ｖ．）に対して与えられた米国特許第５，８７３，７６３号；インディク（Ｉｎｄｙｋ）ら（１９９８、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２９５：３５０〜３６４）：ブランツ（Ｂｒａｎｄｔｓ）ら（１９９０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ３０〜４１）を参照のこと。ＩＴＣは、二セル示差装置である。これは、試料中の液体を絶えず攪拌しながら固定温度で操作する。この装置は、被験リガンドが標的に結合した結果として発生した、または吸収された熱を測定する。
【０３０６】
他の態様において、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて熱出力を検出することができる。ＤＳＣは、市販されており、当業者によって日常的に用いられている。例えば、プロトニコフ（Ｐｌｏｔｏｎｉｋｏｖ， Ｖ．Ｖ．）らに与えられた米国特許第５，８７３，７６３号；フライア（Ｆｒｅｉｒｅ、１９９５、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４０：１９１〜２１８）を参照のこと。示差走査熱量計は、セル間の温度差をモニターしながら所定の速度で自動的に温度を上昇または低下させる。温度差の情報から、試料セルと対照セルのあいだの熱容量の小さい差を決定して、この差を被験物質に帰因することができる。
【０３０７】
好ましい態様において、反応混合物は透明ではない；反応混合物は着色している；反応混合物は混濁している；反応混合物は蛍光または比色検出を妨害する物質を含む；反応混合物は純粋な溶液ではない、例えば標的以外の産物を含む。好ましい態様において、反応混合物は、放射活性分析を妨害する物質：分光光度分析、例えばＮＭＲ分析を妨害する物質を含む。好ましい態様において、物質の複雑な混合物、例えば、一つ以上の被験化合物を含んでもよい懸濁液、天然物抽出物、細胞抽出物、生化学混合物、または着色溶液のような不純物試料を試験する。
【０３０８】
代理リガンドに基づく方法
代理核酸リガンドの同定
代理リガンドは核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）となりうる。ＳＥＬＥＸ技法を用いて代理リガンドを同定することができる。ＳＥＬＥＸ技法（ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、（１９９５）、上記）を用いて、多数のランダム配列オリゴヌクレオチドを、標的、例えば標的タンパク質に対して高親和性で結合するか否かを調べることができる。ヌクレオチドライブラリーが大きければ、ピコモルからナノモル範囲の解離定数で標的に結合する少なくとも一つの配列を発見する機会は大きくなる。好ましくは、リガンドは長さが約２０ヌクレオチドであり、より長いオリゴヌクレオチドはおそらく、その長さの一分画を用いて結合するに過ぎず、いくつかの残基は、たとえリガンドが標的に結合していても、シグナル発生物質による分解またはプロセシングを受けやすい。例えば、代理核酸リガンドの場合、より長いオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮアーゼを用いる場合にバックグラウンド加水分解を受ける可能性がある。
【０３０９】
一つの態様において、本発明の方法において用いられる標的は、タンパク質（例えば、標的タンパク質）である。最初に、標的タンパク質は、ＨＰＬＣおよびイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーのような標準的な生化学技術を用いて同定および精製することができる。好ましくは、高度に精製された標的タンパク質試料を得る。次に、ＳＥＬＥＸ法を用いて、高親和性（＞ｎＭ）でタンパク質に結合する一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）リガンドを同定する。このプロセスの第１段階は、下記に示す５’から３’末端への構造を有する１０１４〜１０１５個の一本鎖ＤＮＡ配列ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの作製を必要とする。
2004508552.tif 000003
式中、固定Ａおよび固定Ｂは、ライブラリーの各メンバーの５’および３’末端に存在する一定の配列を意味する。これらの一定の配列はランダム配列に隣接し、それによってＳＥＬＥＸプロセスの各ラウンド終了後に転写およびその後のプール増幅を行うことができる（ツエルク＆ゴールド（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５〜５１０）。好ましくは、ランダム配列は、長さが２０ヌクレオチドを超えてはならない（リガンドがより大きければその残基の中央領域を用いて標的に結合する可能性があり、このためその末端は、それらがなお標的タンパク質に結合していても、ＤＮアーゼの活性に暴露される可能性がある）。
【０３１０】
次に、ライブラリーを標的タンパク質と混合して、次に、ニトロセルロースメンブレンを通過させることによって分配する。次に、タンパク質によってフィルターに結合したそれらのＤＮＡ配列を溶出させて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、その後、ＳＥＬＥＸの第２ラウンドにおいて（現在修飾された）ライブラリーの転写を行う。プロセスは、所望の親和性で結合するリガンドが得られるまで繰り返す。
【０３１１】
方法の各ラウンドによって、高親和性リガンドの平均で１０倍濃縮が得られること（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、（１９９２）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２８：８６２〜８６９）、そしてナノモル範囲のＫｄで結合するリガンドを同定するためには、ＳＥＬＥＸの１０〜２０ラウンドの範囲が通常必要であること（ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、１９９５、上記）が示されている。最初のラウンドにおいて、さらにより豊富な低親和性リガンドがライブラリーに存在する場合、全ての高親和性リガンドが確実に保持されるようにかなり大量のタンパク質を用いることが勧められる。ＳＥＬＥＸプロセスの選択性は、高親和性リガンドが競合的な結合状態を生き延びるために十分に濃縮されている場合、後のラウンドにおいて標的（例えば、標的タンパク質）の低い量を用いることによって増加させることができる。このプロセスは、３０個以上のタンパク質について試みられており、ほとんど全ての場合において、ｎＭ以上の親和性で結合するオリゴヌクレオチドリガンドが認められた（ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、１９９５、上記）。
【０３１２】
シグナル産生物質の選択
代理リガンドを同定した後、代理リガンドに対して高い特異的活性を有する適したシグナル産生物質を選択する。好ましくは、シグナル産生物質は、標的に結合した代理リガンドと比較して、遊離の代理リガンドとより容易に相互作用（例えば、結合）する。好ましくは、そのような相互作用は、リガンドを増幅し、例えば熱シグナルを産生する。特定の態様において、シグナル産生物質は、例えば、共有結合または非共有結合を形成または切断することによって遊離の代理リガンドを修飾する。例えば、修飾段階は、切断、分解、リン酸化、重合化、およびシグナル、例えば熱シグナルを産生する他の事象を含んでもよい。シグナル産生物質は、分解酵素（例えば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ）となりうる。または、シグナル産生物質は、重合化酵素、例えばポリメラーゼとなりうる。
【０３１３】
シグナル産生物質は、固定する、例えば、固相支持体に結合する、またはクロスリンクさせることができる。例えば、シグナル産生物質が酵素であるそれらの態様において、酵素をクロスリンクさせて、結晶酵素を形成することができる。
【０３１４】
例えば、遊離の代理リガンドがＤＮＡ分子であるそれらの態様において、シグナル産生物質はヌクレアーゼとなりうる。用いることができる例としてのヌクレアーゼには、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（ＳＮアーゼ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ（ＳＮアーゼ）、ウシ膵臓ヌクレアーゼ（ＤＮアーゼＩ）、またはヒト（ＩＶ型）ヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定しない。活性は、単一のヌクレアーゼの場合でも、そして多様なオリゴヌクレオチド基質に関して何１０倍も変化する可能性があるが、最適なＤＮアーゼを選択してもよい。例えば、ｐＨ、温度、および溶媒条件のような最適な溶液条件も同様に選択してもよい。特異的代理リガンドに対する特定のＤＮアーゼの活性は、フリートホフ（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ）ら（１９９６、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４１：５７２〜５８０）およびフリートホフ（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ）ら（１９９９、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４４３：２０９〜２１４）に記載されている方法を用いてアッセイすることができる。例としてのいくつかのＤＮアーゼを、特定の基質に対するその活性と共に下記の表に記載する。表は、決して完全ではなく、本発明の範囲を制限すると解釈されない。
【０３１５】
【表１】いくつかのヌクレアーゼによる様々な核酸基質切断に関する定常状態パラメータ
2004508552.tif 000004
ａ　ブドウ球菌ヌクレアーゼ
ｂ　ウシ膵臓デスオキシリボヌクレアーゼ
ｃ　セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ（ＳＮアーゼ）
ｄ　オオムギヌクレアーゼ
【０３１６】
シグナル産生物質はまた、ポリメラーゼ、例えばＴａｃポリメラーゼとなりうる。遊離の代理リガンドがＲＮＡ分子であるそれらの態様において、シグナル産生物質はリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）となりうる。
【０３１７】
遊離の代理リガンド（標的結合リガンドに対して）がタンパク質またはペプチドである他の態様において、シグナル産生物質はプロテアーゼとなりうる。本発明を実践するために有用なプロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、プロテナーゼＫ、サーモリシン、およびサブチリシン（その全てがシグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州から得ることができる）が含まれるがこれらに限定しない。本発明を実践するために用いられる１つまたは複数のプロテアーゼを選択するために最も重要な基準は、プロテアーゼが、選択したインキュベーション条件で特定の標的タンパク質を消化できなければならないことである。プロテアーゼを直接阻害する被験リガンドによって引き起こされる「偽陽性」結果を回避するために、一つ以上のプロテアーゼ、特に異なる酵素作用機序を有するプロテアーゼを同時または平行アッセイ法において用いることができる。さらに、プロテアーゼの活性にとって必要な補因子は、これらの因子を隔離する可能性がある被験リガンドによる偽陽性結果を回避するために、過剰に提供される。
【０３１８】
代理核酸を用いる熱量計リガンドスクリーニング
下記の説明は、代理核酸リガンドおよび標的タンパク質を用いる例を示す、本明細書に記載の実験条件は、当業者が他の代理リガンド（例えば、標的リガンド）および標的を用いる場合にも容易に拡大することができる。簡単に説明すると、適した解離定数で標的タンパク質に結合する代理リガンド（例えば、代理核酸リガンド）が同定されれば、標的タンパク質と代理核酸リガンドの溶液を１：１で調製し（濃度は約１０ ｍＭ）、シグナル産生物質のかなり低い濃度と共に微小熱量計セル内部を数分間平衡にする。例えば、濃度約１ｎＭの特異的デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼをＳＥＬＥＸプロセスにおいてが同定された代理核酸に対する活性が高いために選択した。本発明における一つの仮定は、代理核酸リガンドは標的タンパク質に結合するが、遊離の代理核酸リガンドほど急速なＤＮアーゼによる分解を受けないという点である。
【０３１９】
より詳しく述べると、標的タンパク質、代理核酸リガンドおよび特異的ヌクレアーゼを溶液中で混合して反応混合物を形成する。標的タンパク質と代理核酸リガンドはいずれも約１μＭで存在しうるが、ヌクレアーゼは約１ｎＭで存在する。試料の総容積は約１ｍｌである。試料を微小熱量計セルにおいてインキュベートする（例えば、等温滴定熱量計のセル）。２つのセルを絶縁容器に収容する。セルとその内容物を実験温度に維持するために熱エネルギーが必要となるように、容器を冷却する。２つのセルを互いに熱平衡に維持する。次に、標的タンパク質におそらく結合している被験リガンドの少量（５〜２５ μｌ）を試料セルに加える、被験リガンドが有意な親和性で標的タンパク質に結合すれば（オリゴヌクレオチドと比較して）、それぞれの結合定数の程度に応じて代理リガンドの一部の分画を溶液に放出すると考えられる。次に、この新たに放出された代理リガンドは溶液中に存在するヌクレアーゼによって加水分解され始め、このようにして、被験化合物の当初の競合的結合によって産生される熱出力より大きい熱出力（出力）を発生する。熱出力は、約１分間記録することができる。所定の試験に関する総熱出力は、標的タンパク質に対する代理リガンドと被験リガンドとの親和性の比に関連させることができる（例えば、比例する）。
【０３２０】
他の態様において、被験リガンドが結合した場合の標的の構造変化を測定することができる。タンパク質標的と構造ＲＮＡ標的（例えば、リボザイム）は、一つの共通の特徴を有する：それらは、変性剤を溶液に加えるか、または温度を上昇させることによって熱を加えると、立体構造が変化してあまり圧縮されない型となる。タンパク質またはＲＮＡが受ける立体構造変化は熱の大きい変化を伴い、これを熱量計によって簡便に検出してもよい。被験リガンドが標的タンパク質またはＲＮＡのより圧縮型に結合すれば、立体構造変化を阻害して、それによって被験リガンドを加えない対照溶液と比較して、熱出力の差を検出することができる。この検出の詳細な説明を実施例３および実施例４に提供する。
【０３２１】
方法はまた、標的が細胞表面、例えば細菌細胞壁成分に存在する場合、標的に結合する物質を分析する（例えば、同定する）ために用いることができる。このように、方法は、細胞表面分子と相互作用する（例えば、結合する）物質を同定するために用いることができる。
【０３２２】
標的と代理リガンド、被験リガンドおよび／または基質との相互作用は、インビトロ（例えば、無細胞系）またはインビボ（例えば、細胞、例えば原核細胞または真核細胞）で起こりうる。例えば、この相互作用は、これらの化合物を熱量計内部に置いた細胞、例えば生存細胞に加えることによって試験することができる。
【０３２３】
本明細書に記載の本発明をより十分に理解するために、以下の実施例を述べる。これらの実施例は、説明目的のために述べるのであって、本発明をいかなるようにも制限すると解釈してはならないと理解すべきである。
【０３２４】
実施例１：標的タンパク質に結合することができる化合物のスクリーニング
第一に、高親和性で関心対象の標的タンパク質に結合するＤＮＡの一本鎖オリゴヌクレオチドを同定する。この実施例の目的に関して、リガンドは、長さが２０残基でＫｄ＝１ｎＭであると仮定する。濃度が各１０ μＭのタンパク質およびオリゴヌクレオチドリガンドを互いに混合する。リガンドに対して高い活性を有することが知られているデオキシリボヌクレアーゼの少量（１ｎＭ）を加える（溶液の総量５００ μｌ）。標的タンパク質（Ｐ）とリガンド（Ｌ）との結合反応は、以下のように記載することができる：
Ｋｄ
ＰＬ＝Ｐ＋Ｌ、および以下の等式に書き直される：
Ｋｄ＝［Ｐ］［Ｌ］／［ＰＬ］（等式１）
【０３２５】
タンパク質リガンド複合体［ＰＬ］の濃度がわかれば、溶液中の遊離のタンパク質および遊離のリガンドの量を以下の式から計算することができる
［Ｐτ］＝［Ｐ］＋［ＰＬ］（等式２）および［Ｌτ］＝［Ｌ］＋［ＰＬ］（等式３）
【０３２６】
等式２と３を等式１に置換して、［ＰＬ］に関して解くと二次式が得られる：
［ＰＬ］２−（ＬＴ＋ＰＴ＋Ｋｄ）［ＰＬ］＋ＰＴＬＴ＝０
これを［ＰＬ］に関して解くことができる。この場合、［ＰＴ］と［ＬＴ］はいずれも１０ μＭで、Ｋｄ＝１ｎＭであり、［ＰＬ］は０．９９ μＭに等しく、これはリガンドの１％が溶液中において遊離であることを意味する（等式３から）。この小さい分画は、タンパク質リガンド溶液をＤＮアーゼと組合わせると加水分解し始めるであろう（いくつかの基準値熱出力：７０ μｃａｌ／秒×１０秒−１＝７００ μｃａｌ／秒を生じる）。
【０３２７】
標的タンパク質、リガンドおよびヌクレアーゼの最初の溶液を試料セルにおいて平衡にした後、被験化合物を最終濃度１０ μＭで加える。この実施例の目的に関して、これが標的に対して当初のオリゴヌクレオチドと同じＫｄを有すると仮定すると、被験化合物は最終的に半数のＤＮＡと競合して、ＤＮアーゼによって分解されるであろう。セル中のＤＮＡの総量は、約５×１０−９モルである。この半数が完全に加水分解されると、これは（２０）（２．５×１０−９）＝５×１０−８モルのホスホジエステル結合が切断され、総熱出力（７０ ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（５×１０−８モル）（１０ 秒−１）＝３５，０００ μｃａｌ／秒を生じることを意味する。これは、当初の１％の遊離のリガンドからの基準値熱出力より５０倍大きい。
【０３２８】
実施例２：酵素の代謝回転と阻害の熱量計検出
酵素反応の活性の測定は、基質の産物への触媒された変換に起因する熱量測定セルにおける示差出力に直接比例する。酵素反応の検出シグナル（力）は、熱量計によってモニターすると、以下の等式によって示されるように、反応の熱の１秒あたりの基質代謝回転に等しい：
ΔＰ＝ΔＨ×Ｖ＝ΔＨ［−ｄＳ／ｄｔ］
式中、Ｓは基質濃度であり、Ｖは酵素速度である。
【０３２９】
５％という小さい変化を測定するために、必要な熱量計の出力の変化は０．５ μｃａｌ／秒を超えないであろう。この出力の変化は、基質の典型的な反応熱が１０ ｋｃａｌ／モルであると仮定して、５×１０−１１モル／秒という基質の代謝回転が原因であろう。酵素の代謝回転数は、１０〜１０，０００／秒の範囲であるため、それぞれの薬剤スクリーニングアッセイ法を行うために必要な量は、熱量計における酵素のピコモルまたはフェントモルもの少量に過ぎないと思われる。
【０３３０】
最大のシグナルの変化が確実に得られるように熱量計アッセイ法を最適にするために、以下を検討すると有益である。酵素の速度を基質と阻害剤の濃度に関係させる等式の単純な式は：
Ｖ＝Ｖｍａｘ｛１＋Ｋｍ／Ｓ［１＋Ｉ／Ｋｉ］｝−１
式中、ＳおよびＩはそれぞれ、基質と阻害剤の濃度であり、Ｋｉは阻害剤の解離定数、Ｋｍは基質のミカエリスメンテンパラメータである。Ｋｍ値は、主に１０−１〜１０−６ Ｍの範囲で変化する。酵素活性は、基質濃度がＫｍに等しい場合に阻害剤の低濃度における変化に対して最も感受性が高い。阻害剤をＫｉに等しい濃度で基質濃度Ｋｍの酵素溶液に加えると、酵素速度（したがって、出力）は３４％減少する。
【０３３１】
実施例３：等温熱量計を用いて標的の立体構造変化の熱を測定することによる被験リガンドの検出
関心対象の標的（例えば、標的タンパク質または構造ＲＮＡ）を精製した後、塩酸グアニジンまたは尿素のような変性剤である緩衝溶液を、熱量測定反応セルに導入する。次に、シリンジにタンパク質を特定の濃度（〜１００ μＭ）満たす。約１０ μｌ（標的１ナノモルを含む）を熱量測定セルに導入する。典型的なタンパク質の場合、タンパク質の立体構造があまり圧縮されない状態に変化すると、変性剤の希釈による熱作用を差し引いた後、１００マイクロカロリーを検出できるように１００ ｋｃａｌ／ｍｏｌが吸収される。変性剤の希釈による熱効果は、溶液１０００ μｌに対して滴定液１０ μｌを加えることから、小さいであろう。しかし、この希釈効果の実際の値は、変性剤の溶液にタンパク質を加えずに緩衝液１０ μｌを加えることによって決定することができる。
【０３３２】
被験リガンドがタンパク質に結合するか否かを検出するために、被験リガンドが変性剤溶液およびタンパク質溶液に等しい濃度で導入されるように、上記の実験を繰り返すことができる。被験リガンドがタンパク質の圧縮状態に結合すれば、熱量計に注入された際に、少量のタンパク質があまり圧縮されない状態に変換され、総熱出力が変化するであろう。注入プロセスは、各試料が同じ大量の変性剤に導入されるように、フローインジェクションシステムをタイタープレートにカップリングさせることによって容易に自動化することができる。
【０３３３】
実施例４：示差走査熱量計を用いて標的の立体構造変化の熱を測定することによる被験リガンドの検出
精製標的（例えば、関心対象の標的タンパク質）を含む緩衝液を示差走査熱量測定反応セルに導入する。溶液の温度を上昇させて熱を加える。タンパク質の立体構造ががあまり圧縮されない型に変化すると、熱が放出される。見かけの比熱容量曲線を積分すると、立体構造の変化による見かけの比熱出力が得られる。実験は、いくつかの被験リガンドを加えているタンパク質の新鮮な溶液について繰り返す。被験リガンドがタンパク質に結合すれば、見かけの比熱容量曲線を先の実験と同じ２つの温度の時点で積分することによって得られる見かけの比熱出力は減少するであろう。この差は、どのリガンドがタンパク質に結合するかを示す都合のよいシグナルとして役立つ。
【０３３４】
実施例５：ヘキソキナーセ基質のプロフィールを調べる実験
本実施例は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いてヘキソキナーゼによるグルコースのリン酸化に起因する熱発生速度のモニタリングを示す。
【０３３５】
材料と方法：
パン酵母からのＦ−３００型ヘキソキナーゼをシグマ社から購入して、これ以上精製せずに用いた。基質のプロフィールを調べるために用いるＡＴＰと炭水化物および補酵素のキットも同様に、シグマ社から得た。試薬は全て、１００ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．０）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ ｍＭ ＫＣｌ、および１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液（反応緩衝液）に懸濁した。炭水化物と補酵素混合物の多数の組合わせを作製するために（下記のフローチャートを参照のこと）、反応緩衝液による最終希釈によって１ｍＭ炭水化物と０．５ ｍＭ補酵素が得られるように、各個々の成分の溶液をそれぞれ２ｍＭおよび１ｍＭに調製した。ヘキソキナーゼは、反応緩衝液において５０単位／ｍｌ保存液として調製した。
【０３３６】
酵素の代謝回転を反映する反応のエンタルピーは、ＶＰ−ＩＴＣ微小熱量計（マイクロカルインク、ノザンプトン、マサチューセッツ州）によって得たサーモグラムから得た。ＶＰ−ＩＴＣ装置は、反応物質の正確な量を熱平衡反応セルに注入した結果として、液体試料において放出または吸収された熱を直接測定する。反応セルの容積は約１．７ ｍｌであり、断熱性の外部遮蔽体の内側の断熱性の内部遮蔽体の中で同一の対照セルに封入されている。回転するシリンジと共に装置を完全に組み立てた後、これを所望の実験温度にする。セルが熱平衡に達すると、対照セルと試料セルのあいだの温度差を測定する。対照セルと試料セルのあいだの示差力（ＤＰシグナル）の較正は、セル上の抵抗性加熱エレメントを通じて既知の力の量を与えることによって電気的に得られる。注入によって、試料セルにおいて化学的放出（放熱）または熱吸収（吸熱）が起こり、これは放熱反応の場合にはＤＰシグナルに負の変化を引き起こし、吸熱反応の場合にはＤＰシグナルに正の変化を引き起こす。これらの化学変化によって、最初の（電気平衡）ＤＰシグナルを平衡からそらせる熱が発生するため、これらの変化を代償するために、装置のＤＰフィードバックがセルに電力を再度与える。このように、ＤＰシグナルディスプレイは電力単位（μｃａｌ／秒）を有し、ピークを時間で積分すると、熱エネルギーΔＨの測定値が得られる。
【０３３７】
ヘキソキナーゼ基質のプロフィールを決定するための反応条件は以下の通りであった：試料セルに２ｍｌの上記の基質／補酵素溶液を満たした。アッセイ法は、試料セルに５０単位／ｍｌヘキソキナーゼ溶液６μｌを注入することによって開始した。各熱量測定アッセイ法の際の温度は各実験について２５℃の一定に保持した。本明細書に紹介した実験条件では、希釈および混合熱（基質の非存在下で放出された熱によって測定）は、酵素反応に関して測定された総熱量の５％未満であった（図３Ｂを参照のこと）。酵素反応を通じて、発熱速度は図３Ａ〜図３Ｂに示すように絶えずモニターした。熱流は、酵素を反応セルに加えた後まもなく最大に達し、その後、基質レベルが枯渇すると基準値に戻る（図３Ａを参照のこと）。図３Ａおよび図３Ｂからわかるように、発生した熱量は基質が存在するか否かを直接反映する。
【０３３８】
実際の実験プロトコールを図４に示すフローチャートに要約する。例えば、第１の実験においてヘキソキナーゼを完全な炭水化物ライブラリーに注入する。用いる炭水化物ライブラリーは：補因子ライブラリーの存在下で調べたＤ−グルコース、アラビノース、スクロース、リボース、ラクトース、ガラクトース、マルトース、およびキシロースを含み、補因子にはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＦＡＤ、フラビン、塩化チアミン一リン酸、ピリドキサル５’−リン酸、補酵素Ａ、およびコカルボキシラーゼが含まれる。
【０３３９】
熱シグナルは、図３Ａに示されるものと類似のシグナルが認められる。このシグナルは、酵素の代謝回転、したがって基質の存在を示している。次のセットの実験に関して、完全な炭水化物ライブラリーを２つに分け、１つは基質を含み（炭水化物ライブラリー２Ａ）、もう一つは基質を含まない（炭水化物ライブラリー２Ｂ）（図４）。実験をこれまでと同様に繰り返すが、今回は一つの試料のみが炭水化物ライブラリー２Ａの熱シグナルを発生する。炭水化物ライブラリー２Ｂの熱シグナルは観察されないことから（図４参照）、この回収物は廃棄する。次に、炭水化物ライブラリー２Ａを２つに分ける。実験をこれまでと同様に繰り返すが、今度も一つの試料のみが熱シグナルを発生する。基質を含む試料を再度半分に分け、消去プロセスによって、適当な酵素基質であるグルコースを含む単一の成分試料に達するまで、プロセス全体を繰り返す。
【０３４０】
上記に引用した参考文献と出版物はすべて、参照として本明細書に組み入れられる。
【０３４１】
本発明は特異的諸態様として上記に記述されてきたが、本発明の他の使用、改変、修正は、本開示のもたらす益を以ってすれば、当分野に熟練した人々にとって明らかになるだろう。次に挙げる請求は、本発明の真の趣旨と範囲のうちにあるそのような改変や修正を含むと理解されるべく意図するものである。また、本請求に含まれる名詞は特に明示のなくても単数と複数の両方を含意することを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】潜在的標的の同定と選択を表わしたもの。
【図２】選択された標的の処理を表わしたもの。
【図３】標的を特徴づけるようすを表わしたもの。
【図４】ＡＣＴＴを利用して標的をアッセイするようすを表わした第一のもの。
【図５】ＡＣＴＴを利用して標的をアッセイするようすを表わした第二のもの。
【図６】創薬のための標的を選択するようすを表わしたもの。
【図７】創薬立ち上げを表わしたもの。
【図８】試験物質の、生成物への標的媒介性転換の概略図を描いたもの。このような転換は熱シグナルを発生する。本方法は、試験物質と標的（たとえば、標的タンパク質）間の相互作用から発生する熱出力を測定する。示されたように、試験物質の生成物への標的媒介性転換は、熱シグナルを発生する。熱シグナルは熱量測定的に検出されうる。
【図９】被験リガンドの結合を検出するための分子検出スイッチの概略図を描いたもの。方法は、被験リガンドの標的（たとえば、標的タンパク質）との相互作用を同定するために、熱シグナルの発生を利用する。示されたように、代理リガンドは、相互作用（たとえば結合）が起きるように、標的の存在下でインキュベートされる。被験リガンドが結合するとすぐ、代理リガンドが置換される。遊離代理リガンド（すなわち、置換された代理リガンド）は、熱シグナルが発生するように、シグナル発生物、たとえば酵素、に対する基質として働く。シグナル発生物の重要な特徴は、単位時間あたり多量の熱を発生させたことである（すなわち、結合シグナルを増幅する）。熱シグナルは熱量測定的に検出されうる。
【図１０Ａ〜１０Ｂ】ヘキソキナーゼによる基質スクリーニング間に発生した熱の割合（μｃａｌ／秒）の測定値を時間（秒）に関して描いたもの。図１０Ａは基質存在下での熱の流れを示しており、反応細胞への酵素の添加後すぐに最大に達し、その後基質が欠乏するレベルの基線まで減少している。図１０Ｂは、対照（基質を含まない炭水化物ライブラリー）を示す。
【図１１】ヘキソキナーゼを用いた基質スクリーニングに関する実験的流れ図を描いたもの。
【図１２ａ（ｉ）】時間経過に伴う、ヘキソキナーゼのグルコースへの結合において放出される熱を示したもの。時間が経つにつれて、細胞中の一定量のヘキソキナーゼが結合され、このため更にグルコースを添加してもほとんど熱を発生しない。５０ ｎＭヘキソキナーゼ溶液２ ｍｌを含む熱量測定用の細胞へ５ μＭグルコース溶液を５ μｌずつ注入して滴定した。ＡＴＰは存在しないので、グルコースはタンパク質と結合するにすぎない。各注入により放出された熱は測定され、結合定数はそれらの測定から計算された。
【図１２ａ（ｉｉ）】ヘキソキナーゼがＡＴＰの存在下でグルコースをリン酸化し、ＡＴＰがＡＤＰへ転換される時に放出される熱を示したもの。１００ μＭグルコースおよび１ ｍＭ ＡＴＰ溶液２ ｍｌを含む熱量測定用の細胞へ、２０ μＭヘキソキナーゼ溶液５ μｌが１回注入され滴定された。ヘキソキナーゼがグルコースに作用する時、多量の負の熱が観察される。本発明者らは反応のタイムコースをたどるために時間に対して放出される熱を統合した。
【図１２ｂ】２つの異なる技術、ＵＶ分光測光法および熱量測定法により測定された、ヘキソキナーゼにより触媒されるグルコース及びＡＴＰの反応の速度を比較したもの。図１２ａ（ｉｉ）からの反応の熱出力を時間に対してプロットしている。反応はまた、２番目のアッセイ法を使っても測定されたが、どちらの方法も反応について同じ速度を示している（実験的誤差範囲内）。
【図１３】ＵＶ分光測光法および熱量測定法を用いた、標識されたペプチドの基質（ＳＡＲ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−パラニトロアニリド）のトロンビン触媒性切断の反応速度を比較したもの。切断において、ＰＮＡ（パラニトロアニリド）標識はより多くの紫外線を吸収し、熱が放出される。トロンビン１８６ ｎＭおよび基質２５０ μＭを含む溶液２ ｍｌを反応させて、反応を熱量測定法および分光測光法でモニターした。再び、異なるアッセイ法を使っても、ほとんど同一の速度が計測された。
【図１４Ａ〜１４Ｄ】化合物の混合物を逆重畳積分する（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）ための本発明の利用を示したもの。ヘキソキナーゼおよびグルコースは各試験において存在した。補因子の様々な混合物を各試験に加えた。混合物中にＡＴＰが存在している場合のみ、有意量の熱が発生した。１００ μＭグルコースおよび一つまたは複数の「補因子」を含み、全部で濃度１ ｍＭになるような溶液に、２０ μＭヘキソキナーゼ溶液を５ μｌずつ注入して滴定した。１５の補因子が存在するライブラリー全体を用いた最初の実験では、酵素的代謝回転が観察された（図１２ａ（ｉｉ）を参照）。次に、本発明者らは、続く実験において補因子を選別し、ヘキソキナーゼがグルコースを代謝回転させるためにどれが実際に必要であるかを決定することに成功できた。細胞内の補因子の混合物中に、正しい補因子であるＡＴＰが存在している場合はいずれも、タンパク質の最初の注入において多量の負の熱が観察される。ＡＴＰが存在していない場合は、わずかな希釈熱のみが観察される。
【図１５】天然産物の複合混合物の存在下における、ヘキソキナーゼ触媒作用によるグルコースリン酸化の熱量測定法を示したもの。１００ μＭグルコースおよび１ ｍＭ ＡＴＰおよび濃度が増加していく茶（ｔｅａ）の溶液に、２０ μＭヘキソキナーゼ溶液５ μｌずつを注入して滴定した。茶溶液は、天然産生物抽出物、すなわち複合混合物に似ている。最高濃度の茶の場合以外にはすべて、有意な酵素的活性（代謝回転）が観察された。
【図１６】潜在的なタンパク質の機能の決定を助ける熱量測定法の利用を示したもの。大腸菌タンパク質ＹＪＥＱは、ＧＴＰ類似体ＧＴＰ−γ−Ｓに結合する。１１５ μＭのＫＤが測定された。機能があらかじめ知られていない大腸菌タンパク質３８５ μＭを含む溶液２ ｍｌに、１１ ｍＭ ＧＴＰ−γ−Ｓ溶液５ μｌずつが注入され滴定された。図１２ａ（ｉ）に示すように、実験は、タンパク質がこの分子（ＧＴＰの類似体）に結合することを示しており、本発明者らが推定的にこのタンパク質にＧＴＰ結合性特性を与えることを可能にする。
【図１】
2004508552.tif 000005
【図２】
2004508552.tif 000006
【図３】
2004508552.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508552.tif 000145
2004508552.tif 000146
【国際調査報告】
2004508552.tif 000147
2004508552.tif 000148
2004508552.tif 000149