(57)【要約】鎖伸長分子および鎖終結分子、例えば、dNTP/ddNTPを用いたウォークスルー、それに続く再構築および増幅に基づくポリヌクレオチド配列のランダムインビトロ変異誘発および組換えのシンプルかつ効率的な方法が記載される。タンパク質構造および／または機能を改善するためのこの方法の有用性は、新規サルコシンオキシダーゼバリアントを作製することおよび改善された特性を有するより良好な変異体のためにヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼを組換えることにより示される。
2004533259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つのプライマー、核酸合成活性を有する酵素、および核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物、ならびにテンプレートポリヌクレオチドを含有する反応混合物の存在下で行われる核酸合成により核酸フラグメントラダーを作製する工程、
ｂ）鎖終結分子を除去するか、または鎖終結分子を非終結分子に変化させる工程、
ｃ）核酸合成活性を有する熱安定性酵素の存在下でこれらのフラグメントを互いにハイブリダイズさせること、ならびに
ｉ）核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物の存在下、または
ii）鎖終結分子を含まない核酸鎖伸長分子の反応混合物の存在下
のいずれかで核酸合成を行うことによるポリヌクレオチドの再構築、
ここで、ｉ）の場合には、工程ｂ）およびｃ）を続いて繰り返す、
を含むポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項２】
工程ａ）および／またはｃ）のテンプレートポリヌクレオチドが、種々のテンプレートポリヌクレオチドからなる混合物である請求項１記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項３】
核酸鎖終結分子がddNTPであり、核酸伸長分子がdNTPである請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項４】
核酸合成活性を有する酵素がDNAポリメラーゼであり、テンプレートポリヌクレオチドがDNAである請求項１〜３いずれか記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項５】
核酸合成活性を有する酵素がRNA-依存性DNAポリメラーゼであり、テンプレートポリヌクレオチドがRNAである請求項１〜４いずれか記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の方法により得られるポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
ベクターへの増幅産物のクローニングおよびコードされるタンパク質の発現のようなクローニング手順、
スクリーニングまたは選択手順
の工程をさらに含む請求項１〜５いずれか記載の工程を含む変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。
【請求項８】
再構築産物の増幅工程をさらに含む請求項７記載の工程を含む変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。
【請求項９】
請求項７または８記載の方法より得られる変異体ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１０】
生体分子の最適化のための請求項１〜５および７〜８いずれか記載の方法の使用。
【請求項１１】
酵素の最適化のための請求項１〜５および７〜８いずれか記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
鎖伸長分子および鎖終結分子、例えば、dNTP/ddNTPを用いたウォークスルー（walk-through）、続いて再構築および増幅に基づくポリヌクレオチド配列のランダムインビトロ変異誘発および組換えのシンプルかつ効率的な方法が記載される。タンパク質構造および／または機能を改善するためのこの方法の有用性は、新規サルコシンオキシダーゼバリアントを作製することおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼを組換えることにより示される。
【０００２】
遺伝子アルゴリズム（Holland, J.H. 1975. Adaptation in natural and artificial systems. The University Press, Ann Arbor, Goldberg, D.E. 1989. Genetic algorithms in search, optimization and machine learning. Addison-Wesley. Reading) および進化ストラテジー（Eigen, M. 1971. Naturwissenschaften 58: 465-523, Rechenberg, I.1973. Evolutionsstrategie: Optimierung technischer Systeme nach Prinzipien der biologischen Evolution. Frommann-Holz-boog, Stuttgart）などの種々の最適化手順は、天然の進化により奮起されている。これらの手順は、特定の最適化目的を達成するために、変異（各々の単一メンバーの集団における小さいランダム変化を作製する）ならびにクロスオーバー（これらは、種々の個体の特性を合わせる）を利用する。種々の最適化問題のコンピューターシミュレーションにより示されるように、変異とクロスオーバーとの間に強い相互作用がまた存在する（Brady, R.M. 1985. Nature 317:804-806, Muhlenbein, H. 1991. Parallel Coomputing 17:619-632, Pal, K.F. 1993. Bio.Cybern. 69: 539-546, Pal, K.F. 1995. Bio.Cyberrn. 73, 335-341）。これらの鍵となるプロセスを模倣する効率的かつ実用的な実験技術を開発することは科学的挑戦である。かかる技術の適用は、我々に、インビボまたは生体系の束縛から完全に解放された、例えば、タンパク質および核酸などの生物学的分子の機能を探索し、最適化することを可能にするはずである（Joyce, G.F. 1992. Scientific American, 267:90-97, Shao, Z.およびArnold F.H. 1996.Curr.Opin.Struct.Biol. 6:513-518）。
【０００３】
タンパク質は、それらの機能に基づく分子をより理解し、および実際の適用のためのそれらの性能を大いに改善する目的で操作される。「合理的」および「不合理な (irrational)」デザインを含む種々のアプローチが、タンパク質機能を最適化するために首尾良く使用されている（Shao, Z.およびArnold F.H. 1996. Curr.Opin.Struct.Biol. 6:513-518）。所定の最適化問題のためのアプローチの選択は、配列、構造および機能の間の関係の理解の程度に依存する。酵素の触媒部位の合理的再デザインは、例えば、酵素構造、種々のリガンドとのその複合体および反応中間体のアナログの構造ならびに触媒機構の詳細の広範な知識をしばしば必要とする。かかる情報は、非常に少ない十分に研究された系についてのみ入手可能である；潜在的に興味深い酵素の大多数についてはほとんど知られてない。
【０００４】
タンパク質機能の最適化のために、いくつかの「不合理な(irrational)」最適化アプローチが使用されている（Shao, Z.およびArnold F.H. 1996. Curr.Opin.Struct.Biol.6:513-518により最近レビューされた）。これらの最適化手順は、酵素自身に関する多くの特定の知識を必要とせず、最適化対象の機能の評価のみを必要とする。これらの手順は、機能評価の不正確さおよびノイズにかなり耐性でさえある（Moore, J.C.およびArnold, F.H. 1996. Chem.Eng.Sci.51:5091-5102）。特に望みのあるアプローチは、同時に特定の最適化問題のために、変異およびクロスオーバーの両方を同調的に溶液のプローブ集団に使用することである。スクリーニングまたは選択の複数の世代によって、劣悪な局所的最適条件は逃れられ、徐々により良好な溶液が「育てられる（bred）」（Stemmer, W.P.C. 1994a. Nature, 370:389-391, 1994; Stemmer, W.P.C. 1994b. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91:10747-10751）。過去数年の間、ますます多くの人々は、進化的検索ストラテジーのメリットを認識している。しかし、以下等の数種類のみの実際的な技術、
・経時的変異誘発PCR（Moore, J.C.およびArnold, F.H. 1996. Chem.Eng.Sci. 51:5091-5102）、
・コンビナトリアルカセット変異誘発（Reidhaar-Olson, J.F.およびSauer, R.T. 1988. Science 241:53-57）、
「DNAシャッフリング（shuffiling）」（Stemmer, W.P.C. 1994a. Nature, 370:389-391; Stemmer, W.P.C. 1994b.Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91:10747-10751）
・ランダムプライミング組換え（Shao, Zhixin, H.Zhao, Lori GiverおよびFrances H.Arnold. 1998. Nucleic Acids Res. 26(2):681-683）、
・ねじれ型-伸長（StEP). H.Zhaoら、1998, Nature Biotechnol. 16(3):258-2661)、
・人工組換え（Shao, Zhixin. 1998. Protein Science 8 (Suppl.2):55; Volkov, Alexander,Zhixin ShaoおよびFrances H.Arnold. 1999 Nucleic Acids Res. 27(18)e18:i-vi）
がこれらの問題に首尾よく適用されている。
【０００５】
手順における進化最適化の最も一般的に使用される技術の１つは、「DNA-シャッフリング」であり（米国特許第5,834,252号；米国特許第5,605,793号；米国特許第5,830,721号；米国特許第5,837,458号；米国特許第5,811,238号）、DNA-シャッフリングは以下の工程を含む：
１）種々の二本鎖テンプレートポリヌクレオチドからのランダムな二本鎖フラグメントの作製、該種々のテンプレートポリヌクレオチドは、好ましくは同一のエリアおよび非相同エリアを含む
２）ランダムフラグメントの再構築
３）クローニング
４）発現および
５）スクリーニング。
【０００６】
種々の二本鎖テンプレートポリヌクレオチドは、それらの配列（すなわち同一ではない）および従ってその生物学的活性において異なるが、核酸またはタンパク質の同一のファミリーに属しうる（すなわち、関連する）。DNAseIの使用は、先行技術ではランダムフラグメント化について記載されている。
【０００７】
Stemmerらによって記載されるDNAseフラグメント化を用いるDNA-シャッフリングは、多数の不利な点を有する。まず第１に、DNAseIは、DNAを非ランダムに切断する。反応の初期の間に、切断は、好ましくはDNA配列の真ん中で起こり、フラグメント化の後期に、切断は、好ましくはプリンとピリミジンアナログとの間で起こる。これは、きびしく制御される断片化手順を導く。さらに、所望の遺伝子の最小の長さは、テンプレートポリヌクレオチドの制御可能ではない消化のために限定される。さらに、DNAseは消化工程後に完全に除去されるはずである。なぜなら、それはさらなる再構築反応に妨害を導入するからである。
【０００８】
従って、本発明の目的は、DNA配列の組換えのための新規技術を開発することであった。
【０００９】
本発明の主題は、DNA配列のインビトロウォークスルー組換えのための新規技術である。この技術は、低レベルの点変異を有する3’末端ランダム分布DNAフラグメントのプールを作製するために、鎖伸長分子および鎖終結分子の混合物、例えばdNTP/ddNTPを用いるテンプレート遺伝子をウォークスルーする工程を含む。従って、フラグメントラダーは、配列決定反応間のフラグメントラダーに類似して生成される。終結分子、例えば、ddNMP末端の除去後、これらの短いDNAフラグメントは、相同性に基づいて適切な反応条件下で互いにプライミングし得、従って、熱安定性DNAポリメラーゼの存在下でサーモサイクルを繰り返すことにより全長遺伝子を形成するように再構築されうる。これらの遺伝子は、従来のPCRによりさらに増幅され得、コードされるタンパク質の発現のために適切なベクターにクローニングされうる。発現された変異体のスクリーニングまたは選択は、改善された、またはさらに新規機能を有する新規バリアントにいたる。これらのバリアントは、実際的な問題に対する部分的解法として、すぐに使用されるか、またはそれらがウォークスルー変異誘発および組換えのさらなるサイクルのための新規開始点として役立ちうる。この技術は、Bacillus subtilis BMTU3420サルコシンオキシダーゼバリアントを作製することにより、およびヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼを組換えることにより証明される。技術が簡単で効率的であることが見出された。
【００１０】
それゆえ、本発明の主題は、
ａ）少なくとも１つのプライマー、核酸合成活性を有する酵素、および核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物ならびにテンプレートポリヌクレオチドを含有する反応混合物の存在下で行われる核酸合成により核酸フラグメントラダーを作製する工程、
ｂ）鎖終結分子を除去するか、または鎖終結分子を非終結分子に変化させる工程、
ｃ）核酸合成活性を有する熱安定性酵素の存在下で、これらのフラグメントを互いにまたはテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、
ｉ）核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物の存在下で、または
ii）鎖終結分子を含まない核酸鎖伸長分子の反応混合物の存在下で
のいずれかで核酸合成を行うことによるポリヌクレオチドの再構築
を含み、ただしｉ）の場合、工程ｂ）およびｃ）を続いて繰り返す、ポリヌクレオチド配列の形成方法である。
【００１１】
鎖ターミネーター(terminator)を除去する工程およびフラグメント再構築の工程はまた、同時に行われうる。工程ａ、ｂ、ｃにおけるプロセスの再分化は、３つの別々の工程が行われなければならないことを意味しない。３つの工程はまた、同時に起こりうる。全ウォークスルー組換えがより好ましい形態、例えば、単一のコンテナ、容器またはチューブ中で行われうることも可能である。
【００１２】
１つのプライマーがフラグメント合成（または鎖伸長）に十分であったとしても、その後の再構築のために正しい方向のフラグメントを得るために、異なるフラグメント合成反応のための２つ以上のプライマーが必要である。すなわち、２つ以上のプライマーが、全体のウォークスループロセスのために必要である。
【００１３】
多様性は鎖合成およびフラグメント再構築の間に導入されうる（例えば、DNAポリメラーゼの合成エラーから生じる）ので、１つのみのテンプレートがウォークスループロセスに十分である。このことは、テンプレートポリヌクレオチドが種々のポリヌクレオチドの混合物でない場合には、DNAフラグメントは、いくつかの合成誤差により低レベルの局所変異を含み得、新規配列が作製されることを意味する。
【００１４】
１つ以上のテンプレートを用いることにより、バリアントライブラリーの多様性を有意に増大させ得、結果的に潜在的に陽性のバリアントを見出すことが容易になり得る。好ましくは、工程ａ）および／またはｃ）のテンプレートポリヌクレオチドは、核酸またはタンパク質の同じファミリーに属し得る（すなわち、関連する）が、その配列において異なり（即ち、同一でない）、従って生物学的活性において異なる種々のテンプレートポリヌクレオチドからなる混合物である。この場合、遺伝子シャッフリングが起こりうる。
【００１５】
ウォークスルー技術のための条件は、場合によって変化し得、
（a）鎖ターミネーター（terminator）の存在下でのフラグメント合成、
（b）組み込まれた鎖ターミネーターを除去すること、および
（c）工程（b）由来のフラグメントを再構築すること
の３つの主要な異なるレベルで最適化されうる。
【００１６】
ａ）鎖ターミネーターの存在下でのフラグメント合成
この工程は、通常のポリヌクレオチド配列決定反応になぜか類似し、それゆえ、種々の標的を配列決定するのに適切な種々の条件がこの工程に適用されうる。
【００１７】
ウォークスルー手順を行うために、テンプレートは、直鎖または閉環形態の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドでありうる。テンプレートはまた、天然の、インタクトな、未精製の、またはクローニングされていないゲノムDNAの形態でありうる。ほとんどの場合、テンプレート遺伝子は、更なる変異が導入されずにベクターにクローニングされるので、それらは、通常制限エンドヌクレアーゼで最初に切断され、アガロースゲル電気泳動によりベクターから精製される。例えば、直鎖DNA分子が変性され、鎖伸長分子／鎖終結分子、例えば、dNTP/ddNTPの適切な量の存在下でウォークスルー反応のためにオリゴデオキシヌクレオチドにアニールされる。従って、そのオリゴヌクレオチドは、テンプレートDNAの各鎖に相補的なDNAフラグメントを生成するために伸長された全体の標的領域に沿って異なる位置で目的のDNAをプライミングする。いくらかの合成エラーのために、これらのDNAフラグメントはまた、低レベルの局所変異を含む。ddNMP’の鎖終結末端を除去した後、これらのDNAフラグメントは、相同性に基づく適切な反応条件下で互いにプライミングし得、熱安定性DNAポリメラーゼの存在下でのサーモサイクルの繰り返しにより全長遺伝子に再構築されうる。得られた全長遺伝子は多様な配列を有するが、そのほとんどは、なおも元のテンプレートDNAに類似する。
【００１８】
フラグメント合成は、中温のDNAポリメラーゼを用いる温和な条件下での鎖伸長または熱安定性ポリメラーゼを用いたサーモサイクル配列決定のいずれかにより行われうる。ウォークスルーにPCRを適合させるために、合成は、より初期の（nascent）DNAフラグメントのためのより簡便な方法を提供し、我々の技術をより強固にする。
【００１９】
サーモサイクルがフラグメント合成に使用される場合、サーモサイクルの数は、テンプレートの量およびその純度に応じて、約15〜約55サイクルであり得る。具体的なサイクル数は、新たに合成されたフラグメントの質および量に従ってより容易に決定されうる。
【００２０】
最初のDNAテンプレートの数は、鎖伸長条件に従って変化しうる。通常、0.1〜10pmolのds-DNAはこの種類の反応に十分である。
【００２１】
使用されるプライマーの長さは、14マー〜28マーで変化しうる。選択されたプライマーの長さは、非特異的DNA結合位置へのアニーリングを妨げ、良好なシグナル対ノイズ比を保証するのに十分な長さであるべきである。我々は、通常18〜21マーのプライマーを使用する。
【００２２】
ウォークスループライマー間の距離は、鎖反応様式に依存し、100〜800ヌクレオチドで変化しうる。我々の場合には、２つのプライマー間の平均距離は、通常500ヌクレオチド付近である。
【００２３】
各プライマーの濃度は、使用される連鎖反応の種類に応じて0.05pmol〜２pmolで変化しうる。通常、0.1pmolプライマーは、B.subtilisサルコシンオキシダーゼ遺伝子の鎖伸長に使用され、一方、1.0pmolの各プライマーは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼの鎖伸長のために使用される。
【００２４】
何十というポリメラーゼが現在利用可能であり、ランダムに分布された3’末端を有する初期のDNAフラグメントの合成は、より様々な様式で達成されうる。例えば、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼ（Nossal 1974）またはT7配列バージョン2.0 DNAポリメラーゼ（TaborおよびRichardson 1987, 1989）および／または熱安定性DNAポリメラーゼがウォークスルー合成のために使用されうる。より好ましくは、野生型ポリメラーゼよりも効率的にddNTPを取り込む、他の改変DNAポリメラーゼまたはDNAポリメラーゼの混合物が使用されうる。一本鎖RNAテンプレートのために、逆転写酵素がウォークスルー合成に好ましい。これらの酵素の各々は、通常、鎖伸長を促進するための最適化条件下で使用される。核酸合成活性を有する酵素は、DNAまたはRNA依存性ポリメラーゼでありうる。
【００２５】
種々のDNAポリメラーゼが、一本鎖テンプレートにおけるDNA合成（Klenow, H.およびI.Henningsen. 1970. Pro.Natl.Acad.Sci.65:168）のための基質として2’,3’-ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ddNTP）を使用しうることが長い間知られている（Sanger, F., Nicklen, S.およびCoulson, A.R. 1977. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74:5463-5467, Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B.G., Smith, A.J.M.およびRoe, B.A. 1980. J.Mol.Biol. 143:161-178）。
【００２６】
ddNMPが成長する鎖の3’末端に取り込まれた場合、鎖伸長はＡ、Ｃ、ＧまたはＴで終結する。なぜなら、鎖はいまや3’水酸基を欠乏するからである。４つの鎖ラダーを作製するために、４つの可能なddNTPの内の１つのみが４つの反応の各々に含まれる。各反応におけるddNTP/dNTP比は、伸長鎖の一部が、含まれる相補的ddNTPに対応するテンプレートの塩基の各出現で終結するように調整される。この方法で、４つの伸長反応の各々は、伸長された鎖の集団を含み、その全てがアニールされたプライマーにより決定される固定された5’末端、および特定のジデオキシヌクレオチドで終結した可変性の3’末端を有する。鎖伸長および終結はまた、ddNTP/dNTPの正確な量の存在下で１つの反応中で行われうる。
【００２７】
鎖終結分子は、これらの分子が核酸合成を終結し、それゆえ、フラグメントラダーが作製されることを意味する。フラグメントラダーの作製後、適切な鎖終結分子は除去されうる。適切な鎖終結ヌクレオチドは、例えば、ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP等のジデオキシヌクレオチドまたはその誘導体である。ジデオキシヌクレオチドの誘導体は、サーモサイクル反応において合成される成長するDNA分子に熱安定性DNAポリメラーゼによって導入されうるジデオキシヌクレオチドとして規定される。これらのジデオキシヌクレオチドおよび誘導体は、好ましくは、約20μM〜1.0mMの濃度で使用される。かかる誘導体は、dATP、dGTP、dTTPまたはdCTPに対する置換デオキシヌクレオチドとして使用されうるチオヌクレオチド、7-デアザ-2’-dGTP、7-デアザ-2’-dATPおよびデオキシイノシントリホスフェートを含みうるが、これらに限定されない。これらのデオキシヌクレオチドおよび誘導体は、好ましくは、約４μM〜400μMの濃度で使用される。
【００２８】
ddNTP/dNTPの濃度および比は、より短いまたはより長いフラグメントを得るために場合により変化しうる。1/50〜5/1のdNTP/ddNTPの比は鎖伸長に対して良好に働くが、これは、ランダムに分布した3’末端を有するフラグメントプールを得るために、異なる個々のテンプレートについて最適化されるべきである。これは、テンプレートの全てのヌクレオチドが類似した頻度で産物にコピーされるべきであることを可能にするために非常に重要であり、それらが互いに非常に近接しているにも関わらず、組換えるために、または２つ以上の変異を分析（dissect）するための可能性を提供する。
【００２９】
好ましいウォークスルーバッファー系は、通常、約50〜500mM、好ましくは約100〜250mMの濃度でTris-HClを含む。これらのバッファー系のpH値は、使用されるポリメラーゼに依存してpH6.5〜pH10.0の範囲である。MaCl2は、一般に、1.0〜5.0mMの範囲の濃度でバッファー系に含まれる。KClはまた、２〜80mMの濃度で含まれうる。所定の量のメルカプトエタノール（0.5〜1.5％）、Tween20（0.2〜0.4％）およびDMSO（1〜5％）がバッファーに存在しうる。テンプレートの融点を低下しうるグリセロール、ベタイン等の他の薬剤はまた、ウォークスルー反応を促進するためにバッファーに含まれうる。
【００３０】
ウォークスルーDNA合成は、テンプレートによりガイドされる鎖伸長に基づき、初期の鎖は、ポリメラーゼおよび４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いてプライマーの3’-OH末端から合成され、ddNTP取り込み後に停止する。従って、反応は、DNAテンプレートの長さに依存しない。
【００３１】
（ｂ）取り込まれた鎖ターミネーターの除去
この工程は首尾よいウォークスルー組換えのための第２の鍵工程である。各々の新たに作製されたフラグメントの末端ヌクレオチド、または取り込まれたターミネーターは、各々のかかるフラグメントがさらなるフラグメント再構築に必要な遊離3’-OH基を得るように除去されなければならない。
【００３２】
鎖終結分子を除去する方法は当業者に公知である。鎖終結分子は、例えば、DNAポリメラーゼにより除去され得、多くのDNAポリメラーゼは3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有する。この活性は、１回に単一のヌクレオチドを除去し、ヌクレオチド5’モノホスフェートを放出する。dNTPの非存在下で、この活性は、一本鎖および二本鎖のDNAの3’末端からの段階的分解を触媒する。この目的で働きうるポリメラーゼには、大腸菌ポリメラーゼIのクレノーフラグメント（Jacobsen, H., Klenow, H.およびOvergaard-Hansen, K. 1974. The N-terminal amino-acid sequences of DNA polymerase I from Escherichia coli and of the Large and the small fragments obtained by a limited proteolysis. Eur.J.Biochem. 45:623-627. Joyce, C.M.およびGridley, N.D.F. 1983. Construction of a plasmid that overproduces the large proteolytic fragment (Klenow fragment) of DNA polymerase I of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:1830-1834)、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ（Nossal, N.G. 1984, Prokaryotic DNA replication systems. Annu.Rev.Biochem. 53:581-615. Lin, T.C., Rush, J., Spicer, E.K.およびKonigsberg, W.H. 1987. Cloning and expression of T4 DNA polymerase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7000-7004）、バクテリオファージT7 DNA ポリメラーゼ（Tabor, S.およびRichardson, C.C. 1987. DNA sequencing analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 84:4767-4771）が挙げられる。3’末端ターミネーターは、温和条件下で非常に限定されたdNTPの存在下またはdNTPの非存在下で、3’−＞5’プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼによりフラグメントから除去され得る。あるいは、鎖終結分子はまた、Exonuclease IIIのようなエキソヌクレアーゼにより除去されうる。この酵素は、二本鎖DNAのホスホジエステル結合のいくつかのタイプの加水分解を触媒する多機能性酵素である。ExoIIIの主な適用は、二本鎖DNAの3’末端から3’ヌクレオチドの放出を触媒する3’-5’二本鎖特異的エキソヌクレアーゼとしてである（Roger, S.G.およびWeiss, B. 1980. Exonuclease III of Escherichia coli K-12、an AP exonuclease. Meth.Enzymol. 65:201-211）。
【００３３】
ターミネーター除去反応に使用される好ましい反応バッファーは、通常、約40〜200mM、好ましくは約50〜100mMの濃度でTris-HClを含む。これらのバッファー系のpH値は、使用される3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に応じてpH6.5〜pH9.0の範囲である。MgCl2は、一般に、1.0〜3.0mMの範囲の濃度でこれらのバッファー系に含まれる。KClもまた５〜50mMの濃度で含まれうる。所定の量のメルカプトエタノール（0.5〜1.5％）もまたバッファーに存在しうる。
【００３４】
反応は、通常、37℃で0.5〜2.0時間で行われる。
【００３５】
適切なバッファー中で、かつ最適化された条件下で、熱安定性DNAポリメラーゼおよび3’−＞5’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性酵素を用いて、ターミネーター除去および再構築の工程もまた合わされ、その結果、別々の（B）および（C）工程が必要とされない。本発明のこの方法は、ヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼの組換えの例で示されるように特に好ましい。
【００３６】
（Ｃ）フラグメントの再構築
フラグメントの再構築はPCR様反応であり、DNA変性、アニーリングおよびDNA合成のサイクルを含む。アニーリングの間、ssDNA-フラグメントはホモログ領域でハイブリダイズする。ssDNAのオーバーラップする末端は、ポリメラーゼにより伸長される。この場合、種々のポリヌクレオチド由来のssDNAランダムフラグメントは、ハイブリダイズし、遺伝子シャッフリングが起こる。遺伝子シャッフリングは、ホモログ（homologues）であるが同一でない配列間の組換えを意味する。用語「同一」は、２つの核酸配列が同一の配列または相同性配列を有することを意味する。従って、「同一の領域」は、核酸フラグメントまたはポリヌクレオチドの領域またはエリアが別のポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントに同一または相補的であることを意味する。用語「ホモログ」は、１つの一本鎖（ss）核酸配列が相補的ss核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量ならびに後述されるような温度および塩濃度等のハイブリダイゼーション条件を含む多数の因子に依存しうる。
【００３７】
再構築工程は、工程（Ａ）の間の全ての合成されたフラグメントが、添加されるいかなるさらなるプライマーもなしに伸長について互いにプライミングので、全ウォークスループロセスにおいて最も重要な工程である。
【００３８】
DNAの濃度が最も重要な変数であるので、異なる濃度（高、中、低）を有する３つの別個の反応を設定することは有用である。我々の実験によれば、0.1μg〜2.0μg間のDNAフラグメントの量は、通常、20〜25μlの反応容積で飽和再構築結果を生じる。
【００３９】
再構築の間のデオキシヌクレオチドは、好ましくは、約100μM〜400μmの濃度で使用され、選択される濃度は反応のサイクル数に依存する。
【００４０】
好ましい再構築バッファーは、通常、約５〜50mMの濃度、好ましくは約10mMでTris-HClを含む。これらのバッファー系のpH値は、使用されるポリメラーゼに依存してpH7.5〜pH10.0の範囲である。MgCl2は、一般に、これらのバッファー系に1.0〜5.0mMの濃度範囲で含まれうる。KClはまた、20〜80mMの濃度で含まれうる。所定の量のメルカプトエタノール（0.5〜1.5％）、Tween20（0.2〜0.4％）またはTriton-X100（0.1〜0.5％）もまた、バッファーに存在しうる。
【００４１】
典型的な再構築サイクルは３つの工程からなる：第１の工程は、二本鎖標的核酸の熱変性である。サンプル核酸の変性に必要とされる正確な条件は、サンプル核酸の長さおよび組成に依存する。典型的には、約10秒〜５分間の90℃〜100℃でのインキュベーションは、サンプル核酸を変性するのに効率的である。再構築反応で使用されるアニーリング温度は、約40℃〜70℃であり、通常、約55℃〜65℃の範囲であり、15秒〜60秒の期間続く。伸長は、通常、フラグメント末端にヌクレオチドの重合を提供するのに十分な条件下で行われる。重合条件を達成するために、反応混合物の温度は、最終的に再構築されるDNAの長さに応じて、典型的には約65℃〜75℃、より好ましくは68℃〜72℃の範囲の温度で約15秒〜２分、好ましくは30秒〜１分に維持される。
【００４２】
サーモサイクルの数は、テンプレートの量および最終的に再構築されるDNAの長さに応じて、約15〜約55サイクルでありうる。具体的なサイクル数は、新規に合成されたフラグメントの質および量に従って容易に決定されうる。
【００４３】
異なる合成忠実度を有するいくつかの熱安定性ポリメラーゼが、最終的に再構築された産物がどのようなエラーを有するかに応じて再構築に使用されうる。これらの酵素の各々は、再構築を促進する最適化条件下で通常使用される。目的は、得られる全長遺伝子が、多様な配列を有するが、そのほとんどが元のテンプレートDNAの配列に依然として類似していることである。
【００４４】
再構築工程後に得られるこれらの配列は、従来のPCRによりさらに増幅され、発現のためのベクターにクローニングされうる。適切なベクターは当業者に公知であり、以下の参考文献Kingsman SM, Kingsman AJ. Philos Trans. R.Soc.Lond B. Biol.Sci. 1989, 324(1224):477-485; Bailey JE.Adv.Biochem.Engl.Biotechnol. 1993, 48:29-52に記載されるベクターは参考として本明細書中に援用される。適切な発現系は当該分野で公知であり、以下の参考文献Shatzman AR, Rosenbrg M.Methods Enzymol. 1987; 152:661-73に記載される発現系は参考として本明細書に援用される。発現変異のスクリーニングまたは選択は、改善された、新規でさえある特異的機能を有するバリアントにいたるはずである。適切なスクリーニングおよび選択系は当該分野で公知であり、以下の参考文献に記載されるスクリーニングおよび選択系はKuchner O, Arnold FH. Trends Biotechno. 1997 Dec; 15 (12):523-30; Patel PH, Loeb LA.Procc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000年５月９日;97(10):5095-100は本明細書中に援用される。これらのバリアントは、実際の問題の部分的解法としてすぐに使用されうるか、それらは定方向進化のさらなるサイクルに関する新規出発点として働きうる。
【００４５】
コンビナトリアルカセットおよびオリゴヌクレオチド定方向変異誘発（Reidhaar-Olson, J.F.およびSauer, R.T. 1988. Combinatorial cassete mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241:53-57; Oliphant, A.R., Nussbaum, A. L.,およびStruhl, K. 1986. Cloning of random-sequence oligodeoxy-nucleotides. Gene 44: 173-183, Hermes, J.D., Blacklow, S.C.およびKnowles, J.R. 1990. Searching sequence space by definably random mutagenesis - improving the catalytic potency of an enzyme. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:696-700）、誤りがちなPCR（Leung, D.W., Chen, E.およびGoeddel, D.V. 1989. A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. BioTechnique 1:11-15; Chen K.およびArnold, F.H. 1993. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5681-5622）、またはDNA「シャッフリング」（Stemmer, W.P.C. 1994a. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 370: 389-391; Stemmer, W.P.C. 1994b. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly-in vitro recombination for molecular evolution.Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91:10747-10751）等のタンパク質最適化のために使用される他の技術と比べて、このウォークススルーに基づく技術は、インビトロタンパク質最適化にいくらかの利点を示す。
【００４６】
（１）  ウォークスルー合成に使用されるテンプレートは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかでありうるので、DNA「シャッフリング」(Stemmer,W.P.C. 1994a. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 370: 389-391;)のテンプレートとして二本鎖ポリペプチドを使用する必要があるという１つの限定は、もはや存在しない。本明細書に記載される技術を用いて、任意の潜在的な変異および／またはクロスオーバーが、種々のDNA依存性DNAプライマーを用いることによりDNAレベルで、または種々のRNA依存性DNAプライマーを用いることによりmRNAレベルから直接的にさえ導入されうる。このことは、タンパク質特異的機能を最適化する目的を達成するためのより多くの機会および現実性を提供する。
【００４７】
（２）  ランダムなフラグメントを得るためにDNAse Iを用いて二本鎖DNAテンプレートのフラグメント化を必要とするDNA「シャッフリング」手順(Stemmer,W.P.C. 1994a. Nature, 370: 389-391;Stemmer,W.P.C. 1994b. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751)とは異なり、本明細書に記載される技術は、ウォークスルー合成を使用して、さらなる再構築のための「増殖ブロック」としてランダムに分配された3'末端を有するサイズ制御可能なDNAを得る（図１）。
【００４８】
（３）  ウォークスルー鎖は、位置ごとに各々停止するフラグメントの集団であるので、それらは位置的好ましさにおいて均一であり、配列バイアスを欠如する。配列不均一性は両方を可能にし、変異およびクロスオーバーは、例えば、誤りがちなPCRまたはDNA「シャッフリング」を用いるよりもランダムに起こりうる。
【００４９】
（４）  通常の誤りがちなPCRおよびDNAシャッフリングは、それらが互いに非常に近い場合、２つ以上の変異を効率よく組換えるかまたは分析(dissect)することができない。(Stemmer,W.P.C. 1994a. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 370: 389-391;)。対照的に、ウォークスルーアプローチは、テンプレートの全ての位置で生じる組換えを可能にし、したがってそれらが互いに非常に近い場合でさえも２つ以上の変異を組換えまたは分析する可能性を提供する。
【００５０】
（５）  ウォークスルーDNA合成は、テンプレートにより導かれる鎖伸長に基づき、初期鎖は、ポリメラーゼおよび４つのデオキシヌクレオシド三リン酸を用いてプライマーで3'-OH末端から合成され、ddNTP取り込みの後停止する。したがって、この反応は、DNAテンプレートの長さに依存しない。これは、小さなペプチドまたは大きな酵素あるいは酵素経路の遺伝子工学のために特に有用である。
【００５１】
（６）  DNase Iは、二本鎖DNAを好ましくはピリジンヌクレオチドに隣接する部位で加水分解するエンドヌクレアーゼであるので、DNAシャッフリング(Stemmer,W.P.C. 1994a.. Nature, 370: 389-391; Stemmer,W.P.C. 1994b. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751)におけるその使用は、テンプレート遺伝子消化の工程で偏り(特に、高G+Cまたは高A+T含量を有する遺伝子について)を生じうる。全体の変異率および組換え頻度におけるこの潜在的バイアスの効果はまだ調査されていないが、ウォークスルーアプローチを用いることにより避けられうる。
【００５２】
（７）  十数個のポリメラーゼが現在入手可能であるので、ランダムに分配された3'末端を有する初期DNAフラグメントの合成は、より種々の様式で達成されうる。例えば、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ(Nossal,N.G. 1974.J.Biol.Chem.249:5668-5676)またはT7シークエナーゼバージョン2.0 DNAポリメラーゼ(Tabor,S.およびRichardson,C.C.1987. Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:4767-4771,Tabor,S.およびRichardson,C.C.1989.J.Biol.Chem.264；6447-6458)および／または熱安定性DNAポリメラーゼは、ウォークスルー合成のために使用されうる。
【００５３】
一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートのために（特にRNAテンプレートのために）、ウォークスルー合成について逆転写酵素が好ましい。この酵素は、3'−＞5'エキソヌクレアーゼ活性を欠如するので、したがって、エラーの傾向がある。高濃度のdNTPおよびMn2+の存在下で、500ごとに約１塩基が間違って取り込まれる(Sambrook,J., Fritsch,E.F.およびManiatis,T.1989. Molecular cloning:A Laboratory Manual 第２版、Cold Spring Harbar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.)。
【００５４】
（８）  本発明者らの技術における重要な工程の１つは、ウォークスループロセスの間に合成される初期一本鎖DNAの3'末端を調節することである。一定の条件下で、この工程は、効率のよい末端および／または内部挿入／欠失に使用され、種々のサイズを有する分子を生じうる。標的分子サイズの効率的のよい変更は、誤りがちなPCRまたはDNAシャッフリングを介しては通常達成できない。
【００５５】
（９）  反応条件を改変することにより、初期短鎖DNAフラグメントに対する熱安定性ポリメラーゼを用いるウォークスルー合成に対してPCRが調整されうる。ウォークスルー合成にPCRを適合させることにより、より多くの初期DNAフラグメントに対するより多くの便利な方法が提供され、本発明者らの技術をより確固としたものにする。
【００５６】
しかしながら、本発明の本方法は、それが有利であるような場合、当該分野の他の公知の方法とあわされうる。
【００５７】
ウォークスルーDNA合成は、Bacillus subtilis BMTU3420サルコシンオキシダーゼ遺伝子に対して変性した線状二本鎖DNA（例えば、ゲル電気泳動により精製された制限フラグメント）からのランダムに分配された3'末端を有するDNAフラグメントの作製に使用された。モル過剰のプライマーを用いて混合した精製DNAを変性させ、次にStoffelフラグメントを用いて合成を行なった。この酵素は、5'−＞3'エキソヌクレアーゼ活性を欠如するので、ウォークスルー産物を伸長によりもっぱら合成し、エキソヌクレアーゼにより消化しなかった（例えば、実施例１）。
【００５８】
ウォークスルー組換え技術は、ヒト胎盤アルカリホルファターゼおよびウシ腸アルカリホルファターゼを組換える別の例を用いてさらに証明される。（実施例２を参照）。実施例２では、鎖末端を除去する工程およびフラグメント再構築工程の工程が同時になされうる。
【００５９】
本明細書に記載された技術は、広範囲の適用において最適な挙動に関する潜在的に有用な触媒の巨大な空間を調査するため、ならびに基礎の構造−機能研究のための新規酵素を開発するかまたは発展させるために使用されうる。
【００６０】
本明細書に記載されるほとんどの実験条件は、天然酵素、酵素経路の一部（または全部）、ならびに他の生体分子を最適化するためにほとんど改変することなく潜在的に使用されうる。例えば、タンパク質分解活性の減少、アクチベーター遺伝子のプロービング、分泌機構の増強、または他の基本的な酵素遺伝子工学問題の解決に関しては、本明細書に記載の技術が、直接の適用を見出しうる。
【００６１】
このプロトコルは、テンプレートとしてDNA依存DNAポリメラーゼおよび一本鎖DNAを用いることを記載する一方、別のプロトコルはまた、テンプレートとして一本鎖RNAの使用に適している。テンプレートとして特異的酵素mRNAおよび触媒としてRNA-依存DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用することにより、本発明者らのアプローチは、cDNAクローンに変異およびクロスオーバーを導入するように、およびmRNAレベルから分子多様性を直接作製して酵素機能の最適化の目的を達成するように改変されうる。逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)またはモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)などのレトロウイルスに由来し、それらを使用してRNAゲノムのDNAコピーを作製する。AMVおよびMMLV逆転写酵素(Verma IM. The reverse transcriptase. Biochim. Biophys. Acta. 1977 Mar. 21;473(1):1-38.Roth MJ. Tanese N. Goff SP. Gene product of Moloney murine leukemia virus required for proviral integration is a DNA-binding protein. J. Mol. Biol. 1988; 203(1):131-9)は、RNA指向DNAポリメラーゼとして主に使用される。特異的には、デオキシオリゴヌクレオチドは、RNA（通常メッセンジャーRNA）テンプレートの伸長のためのプライマーとして使用され、相補的なDNAを作製する。
【００６２】
実施例１
１．  適切な制限エンドヌクレアーゼを有する目的のDNAおよび目的の精製DNAフラグメントを、Roche High Pure PCR Prep Kit(Roche Diagnostics GmbH, Germany))を用いてゲル電気泳動により精製した。1つの例として、Bucillus subtilis BMTU3420 サルコシンオキシダーゼ遺伝子を組換えプラスミドpBMTU5823から1.2kb長PstI-Nsilフラグメントとして切断した。
【００６３】
２．  H2Oに溶解した約0.5pmolの二本鎖DNAを、SODF1、SODF2、SODR1およびSODR2プライマーそれぞれの0.1pmolと混合した。３分間、沸騰水中で浸漬した後、ただちに混合物を氷／エタノール浴に配置した。
【００６４】
３．  10μlの10×反応バッファー[10×バッファー：900mMのHEPES、pH6.6; 0.1Mの塩化マグネシウム、10mMのジチオトレイール、5mMの各dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、ならびに2mMの各ddATP、ddCTP、ddGTPおよびddTTP)を変性サンプルに添加し、反応混合物の全容積をH2Oで98μlにした。
【００６５】
４．  10ユニット(約2μl)のStoffelフラグメントを添加した。チューブの外側を穏やかにタッピングすることにより全ての成分を混合し、マイクロフュージ(microfuge)中で1〜2秒間12,000gで遠心分離して、全ての液体を底に移動させた。標準のためのTaq DNA配列決定キットおよびサイクル配列決定キット(Roche Diagostics GmbH, Germany)を用いた標準PCRサイクル配列決定条件下で反応を行った。
【００６６】
５．  Wizard DNAクリーンアップシステム(Promega, WI, USA)、に反応産物を供し、酵素、プライマー、反応バッファー成分およびdNTP/ddNTPを除去した。精製した産物を１×クレノウバッファーおよび10Uのクレノウ中で37℃で40分間インキュベートした。2μlのDpnI(10U/μl)を混合物に添加し、インキュベーションを37℃でさらに40分間続けた。
【００６７】
６．  消化したウォークスルー産物をHigh Pure PCR精製キット(Roche Diagostics GmbH, Germany)を用いて精製し、全体の遺伝子の再構築のために使用した。
【００６８】
全体の遺伝子の再構築
１．  PCRによるSarcOD遺伝子の再構築のために、5μlの精製したウォークスルーDNAフラグメント、20μlの2×PCRプレミックス（5倍希釈のクローン化Pfuバッファー、0.5mMの各dNTP、0.1U/μlのクローン化Pfuポリメラーゼ(Stratagene La Jolla CA)）および15μlのH2Oを氷上で混合した。
【００６９】
２．  96℃での5分間のインキュベーション後、それぞれ95℃で1.0分間、55℃で1.0分間および72℃で0+5秒／サイクル、Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf, Germany)中で72℃で10分間続行する最終サイクルの伸長工程で40サーモサイクルを行った。
【００７０】
３．  20、30、および40サイクルで3μlのアリコートを反応混合物から取り出し、アガロースゲル電気泳動により解析した。40サイクルで再構築したPCR産物は、より大きいサイズおよびより小さいサイズのスミア中に正しいサイズの産物を含んでいた。
【００７１】
増幅
この最初のPCRの正しく再構築した産物を、テンプレートDNAの末端に相補的なPCRプライマーを含む第２のPCR反応においてさらに増幅した。
【００７２】
１．  それぞれ0.2μMのpstF(5'GGTAGAGCGAG-TCTCGAGGGGGAGATGC3'、配列番号：１)およびNsiR(5'AGCCGGCGTGACGTGGGTCAGC3'、配列番号：２)のプライマー、1.5mMのMgCl2、10mMのTris-HCl[pH9.0]、50mMのKCl、それぞれ200μMの４個のdNTP、2.5UのTaqポリメラーゼ(Roche, Germany)、および2.5UのPfuポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla, CA)を含む2.0μlのPCR再構築アリコートを、100μl標準PCR反応におけるテンプレートとして使用した。。
【００７３】
２．  96℃で5分間のインキュベーション後、エッペンドルフマスターサイクラーグラジエント(Eppendorf GmbH Germany)においてそれぞれ95℃で1.0分、および72℃で1.0分と、72℃で10分続くラストサイクルの伸長工程と共に、30サーモサイクルを行なった。
【００７４】
３．  増幅により、サルコシンオキシダーゼ全遺伝子の正しいサイズの大量のPCR産物が生じた。
【００７５】
クローニング
１．  Bs SarcOD遺伝子のPCR産物をPstIおよびNsiI制限酵素を用いて消化し、pBMTU5823(Pst/Nsi)にクローン化した。
【００７６】
２．  大腸菌XL1 F’細胞を上記ライゲーション混合物を用いて形質転換し、変異体ライブラリーを形成した。
【００７７】
結果：
野生型SarcOD遺伝子のこの技術の１ラウンドのみの適用後、２つのHind IIIおよびPvu II耐性変異体が酵素的に活性であることが見出された。
【００７８】
実施例２
ヒト胎盤アルカリホスファターゼおよび子ウシ腸アルカリホスファターゼ遺伝子の組換え
１．  方法の説明
ウォークスルー組換えは、２つ以上のDNA配列をそれらの相同性に基づいて組換えるために使用される方法である。さらなる点変異もまた、組換え工程の間に導入されうる。この方法は、主に５つの工程：
フラグメント合成
テンプレート除去
ターミネーター除去
再構築
増幅
からなる。
【００７９】
１．１  フラグメント合成
フラグメント合成はDNA合成反応から生じ、伸長はジデオキシヌクレオチドの取り込みにより終結される。組換えのために選択される標的DNA配列は、この反応におけるテンプレートとして役に立つ。プライマーの数は、標的DNA配列の長さおよび得られるフラグメントの長さに依存して選択されるべきである。フラグメントの長さはまた、反応条件により調節されうる。さらに、「サイクル配列決定反応」は、そのより高い産物収率および簡単な使用のために好ましい。
【００８０】
１．２  テンプレート除去
再構築工程の妨害を避けるために、フラグメント合成後、テンプレートDNAを完全に除去する必要がある。この目的のために、いくつかの方法が使用されうる。本発明者らは、U-DNAおよびウラシル-DNAグルコシラーゼの使用を選択した。ウラシル-DNAグリコシラーゼを使用して、デオキシウリジレートが取り込まれている部位(U-DNA)でウラシル塩基を除去することができる。得られる非塩基性(abasic部位は、続いてアルカリ処理、高温または特異的エンドヌクレアーゼにより加水分解されうる。本発明者らのアプローチでは、単純な温度処置で十分である。U-DNAは、dTTPの変わりにdUTPを使用するPCR反応により調製されうる。U-DNAはフラグメント合成に対するテンプレートとして役に立った後、全ての反応がウラシル-DNAグリコシラーゼ処理および温度処理に供される。別の対照PCRを使用して完全なU-DNA除去を確認しうる。
【００８１】
１．３  ターミネーター除去
再構築反応のために、フラグメントは3’-OH末端を有する必要がある。本発明者らのフラグメントはジオキシヌクレオチドで終結されるので、このフラグメントは3’-OH末端を保有しない。これらのターミネーターは、数個のヌクレアーゼまたはDNAポリメラーゼの3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性により除去され、3’-OH末端を生じうる。本発明者らは、この工程のために熱安定性エキソヌクレアーゼIIIおよびTaqポリメラーゼを使用することによりターミネーター除去と再構築とを合わせる。エキソヌクレアーゼIIIは、その3’-5’-エキソヌクレアーゼ活性（dsDNAでのみの酵素活性、およびしたがってDNAアニーリング後のみの酵素活性）によりターミネーターを切断し、Taqポリメラーゼは、その5’-3’-ポリメラーゼ活性によりフラグメントを伸長する。
【００８２】
１．４  再構築
再構築は、プライマー無しのPCR様反応であり、フラグメントはそれぞれ互いにその相同性に基づいてアニールし、伸長する。変性の全サイクルを通して、アニーリングおよび伸長フラグメントが、オリジナルDNA配列の長さまで増殖または再構築する。
【００８３】
１．５  増殖
再構築したDNAの増殖は、配列クローニングおよび解析工程に十分な材料を提供するために、配列隣接プライマーを用いるPCRにおいて生じる。
【００８４】
２．  実験プロトコル
２．１  U-DNAの調製
dUTP含有DNAテンプレートを、マニュアル（「ウラシル-DNAグルコシラーゼ」Roche # 1 444 646）に従って2.5mM MgCl2、600μM dUTP、および３つの他のヌクレオチドdATP、dCTPおよびdGTPをそれぞれ200μMで用いるPCRにより作製する。アルカリホスファターゼを組換えるために使用される典型的な反応混合物およびサイクル条件を以下に示す。
テンプレートDNA（プラスミド）      40ng
プライマーAPhpaF                    20pmol
プライマーAPxbaR                    20pmol
10×Taqプッファー(Puffer)          10μl
Taq DNAポリメラーゼ                0.5U
Mg2Cl2                              2.5mM
dATP,dCTP,dGTP(Roche # 1 969 064)  各0.2mM
dUTP(Roche # 1 420 470)            0.6mM
H2O                                100μlまで
【００８５】
2004533259.tif 000003
【００８６】
合成したU-DNAを、調製用アガロースゲル電気泳動（1％アガロース／TAE）およびゲル抽出(「QIAquickゲル抽出キット」Quiagen # 28706)によりテンプレートDNAから分離する。
【００８７】
２．２  フラグメント合成
いくつかの改変を有するサイクル配列決定反応（標準およびサイクル配列決定のための「DIG Taq DNA配列決定キット」Roche # 1449443）を用いてフラグメントを合成する。12個の反応混合物を、全６個のプライマーおよび２個のU-DNAテンプレートに対してセットする。２つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用されるサイクル条件での典型的な反応混合物を以下に示す。
U-DNA                          175ng
プライマー(1μM)                1pmol
プッファー                      3μl
Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl)    0.6μl
終結混合物ddATP/dGTP          2.5μl
終結混合物ddCTP/dGTP          2.5μl
終結混合物ddGTP/dGTP          2.5μl
終結混合物ddTTP/dGTP          2.5μl
H2O                            30μlまで
【００８８】
2004533259.tif 000004
【００８９】
子ウシ腸アルカリホスファターゼ遺伝子(ciap)およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子(hpap)は、81％の配列類似性を示し、約1530bp長を有する。６個のプライマーをフラグメント合成に使用する。２つの外部プライマー(APhpaFおよびAPxbaR)は、同じ配列を共有する。図２は、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ(hpap)および子ウシ腸アルカリホスファターゼ(ciap)遺伝子に沿ったプライマーアレンジメントを示す。
【００９０】
2004533259.tif 000005
2004533259.tif 000006
【００９１】
２．３  ウラシル-DNAグリコシラーゼ処理および温度処理
この工程は、各フラグメント合成混合物への1μlのウラシル-DNAグリコシラーゼ(1U／μl；Roche, # 1775375)の添加、およびU-塩基の切断のための37℃で4時間のインキュベーション、続く非塩基性部位の加水分解および酵素の活性化のための95℃で2分間のインキュベーションにより達成される。別のPCRが、テンプレートU-DNAの完全な除去を制御するために使用されうる。
【００９２】
２．４  再構築
重大な再構築工程において適量の精製DNAを使用することが重要である。DNAフラグメントは、Microcon(Microcon50；Millipore # 42415)を用いることにより切断生成物から精製され、H2O中に残っている。２つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用される典型的な混合物およびサイクル条件を以下に示す。
精製フラグメント                                    xμl（適量）
dNTP(Roche # 1 969 064)                              各0.4mM
Expand High Fidelity10×バッファー(Roche # 1 759 175)  5μl
Taq/Exo IIIミックス                                    1U
H2O                                                    50μlまで
【００９３】
30サイクル後、さらなる再構築のための反応混合物に、1μlのTaq／ExoIIIを添加する。
【００９４】
2004533259.tif 000007
【００９５】
２．５  増幅PCR(対照PCRとしても使用した)
増幅PCRは、２つの配列隣接プライマー(AphpaFおよびApxbaR)を用いる標準的PCRである。以下は、２つのアルカリホスファターゼ遺伝子を組換えるために使用されるサイクル条件での典型的な混合物である。
【００９６】
再構築混合物                                0.5μl
プライマーAPhpaF                            10pmol
プライマーAPxbaR                            10pmol
10×Taqプッファー(＋Mg; Roche # 1 271 318)  5μl
Taq DNAポリメラーゼ(Roche # 1 418 432)      2.5U
dATP,dCTP,dGTP,dTTP(Roche # 1 969 064)    各0.2mM
H2O                                            50μlまで
【００９７】
2004533259.tif 000008
【００９８】
２．６  クローニングおよび発現
増幅産物を、調製用ゲル電気泳動(1％アガロース／TAE)およびゲル抽出(「QIAquickゲル抽出キット」Quiagen # 28076)により精製し、供給者のマニュアルに従ってベクターpCR(登録商標)-XL-TOPO(登録商標)(Invitrogen # K475020)にクローン化し、ベクターと共に送達した大腸菌TOP 10細胞に発現させる。
【００９９】
２．７  配列決定結果
９個の組換えクローンを、１つの配列決定用プライマーを用いる配列決定により解析した。結果を表１に要約する。これらのクローンの８個は、配列決定領域内(445〜645bp)に１つ以上の組換え事象を示す。１つのバリアントは、上記領域内に４つのクロスオーバーを含む。全体の変異率は、約0.25％である。再構築産物は、ベクターに２つの異なる配向でライゲートされ得、１つのプライマーのみを用いるこれらのクローンの配列決定は、Ｎ-末端の配列およびＣ-末端の領域のコーディングの両方を与えた。
【０１００】
2004533259.tif 000009
【０１０１】
２．８  配列
図３は、親ciapおよびhpap遺伝子のN-末端配列アラインメントおよびそれらの組換えバリアント(AP01、AP03、AP05、AP06、AP11およびAP15)を示す。
【０１０２】
図４は、親親ciapおよびhpap遺伝子のC-末端配列アラインメントおよびそれらの組換えバリアント(AP2、AP9およびAP13)を示す。
【０１０３】
図５は、hpap、ciap、AP01、AP03、AP05、AP06、AP11、AP15、AP2、AP9およびAP13の配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、ランダムに分配された3'末端を有するフラグメントの作製のためのdNTP/ddNTPを用いた一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートのウォークスルー、3'末端からのddNMPの除去、DANNポリメラーゼの存在下でのサーモサイクルによる全長DNAの再構築、ならびにさらなるクローニングおよびスクリーニングのための従来のPCRによる再構築した産物の増幅を示す。
【図２】図２は、ヒト胎盤アルカリホルファターゼ(hpap)およびウシ腸アルカリホルファターゼ(ciap)遺伝子に沿ったプライマーアレンジメントを示す。
【図３】図３は、親ciapおよびhpap遺伝子およびその組換えバリアント(AP01、AP03、AP05、AP06、AP11およびAP15)のN-末端配列アラインメントを示す。
【図４】図４は、親親ciapおよびhpap遺伝子およびその組換えバリアント(AP2、AP9およびAP13)のC-末端配列アラインメントを示す。
【図５】図５は、hpap、ciap、AP01、AP03、AP05、AP06、AP11、AP15、AP2、AP9およびAP13の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533259.tif 000086
2004533259.tif 000087
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月17日(2003.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つのプライマー、核酸合成活性を有する酵素、および核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物、ならびにテンプレートポリヌクレオチドを含有する反応混合物の存在下で行われる核酸合成により核酸フラグメントラダーを作製する工程、
ｂ）鎖終結分子を除去するか、または鎖終結分子を非終結分子に変化させる工程、
ｃ）核酸合成活性を有する熱安定性酵素および少なくとも２つのプライマーの存在下でこれらのフラグメントを互いに、またはテンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズさせること、ならびに
ｉ）核酸鎖終結分子および核酸鎖伸長分子の混合物の存在下、または
ii）鎖終結分子を含まない核酸鎖伸長分子の反応混合物の存在下
のいずれかで核酸合成を行うことによるポリヌクレオチドの再構築、
ここで、ｉ）の場合には、工程ｂ）およびｃ）を続いて繰り返す、
を含むポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項２】
工程ａ）および／またはｃ）のテンプレートポリヌクレオチドが、種々のテンプレートポリヌクレオチドからなる混合物である請求項１記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項３】
核酸鎖終結分子がddNTPであり、核酸伸長分子がdNTPである請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項４】
核酸合成活性を有する酵素がDNAポリメラーゼであり、テンプレートポリヌクレオチドがDNAである請求項１〜３いずれか記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項５】
核酸合成活性を有する酵素がRNA-依存性DNAポリメラーゼであり、テンプレートポリヌクレオチドがRNAである請求項１〜４いずれか記載のポリヌクレオチド配列の形成方法。
【請求項６】
ベクターへの増幅産物のクローニングおよびコードされるタンパク質の発現のようなクローニング手順、
スクリーニングまたは選択手順
の工程をさらに含む請求項１〜５いずれか記載の工程を含む変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。
【請求項７】
再構築産物の増幅工程をさらに含む請求項６記載の工程を含む変異体ポリペプチドまたはタンパク質の提供方法。
【請求項８】
生体分子の最適化のための請求項１〜７いずれか記載の方法の使用。
【請求項９】
酵素の最適化のための請求項１〜７いずれか記載の方法の使用。
【国際調査報告】
2004533259.tif 000088
2004533259.tif 000089
2004533259.tif 000090