(57)【要約】ｄｓＲＮＡに基づいて哺乳動物細胞中で標的遺伝子の発現を阻害する方法ならびに本発明を行うのに有用な構築物およびそこで得られる細胞とトランスジェニック哺乳動物を提供する。
2004536572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの干渉性遺伝エレメントを有し、かつ、少なくとも１つの転写ユニットを含んでなるウイルスベクターであって、少なくとも１つの遮断配列が該転写ユニットの転写開始部位の５'側であって、かつ、該干渉性遺伝エレメントの３'側に位置する、ウイルスベクター。
【請求項２】
遮断配列が該転写ユニットの転写開始部位の５'側の３０００ヌクレオチド以下に存在する、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
転写ユニットがウイルスベクターの５'末端からの最初の転写ユニットである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
遮断配列が終結シグナル配列である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
終結シグナルがポリアデニル化シグナル配列である、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列である、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列である、請求項５に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
治療遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
請求項１に記載のウイルスベクターを含む、ウイルスベクター粒子。
【請求項１０】
請求項９に記載のウイルスベクター粒子で感染させた真核生物細胞。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項１２】
ベクター構築物がアデノウイルス５'ＩＴＲ、アデノウイルス３'ＩＴＲおよびアデノウイルス・パッケージング・シグナルを含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
干渉性遺伝エレメントが５'ＩＴＲ内に位置する、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
干渉性遺伝エレメントが、＋１のＥ１ａ転写開始部位に対して、−１４１〜−３０５の間に位置する、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
終結シグナル配列の５'側の欠失をさらに含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
パッケージング・シグナルが非機能的になるように、終結シグナル配列の５'側のパッケージング・シグナルにおいて欠失を含む、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
欠失が少なくともヌクレオチド１８９〜５５１にわたる、終結シグナル配列の５'側の欠失を含む、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
欠失が少なくともヌクレオチド１０３〜５５１にわたる、終結シグナル配列の５'側の欠失を含む、請求項１７に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１９】
パッケージング・シグナルが終結シグナル配列の３'側に位置する、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２０】
転写ユニットが複製に必須の遺伝子を含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２１】
複製に必須の遺伝子が、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２およびＥ４コード配列からなる群から選択される、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
複製に必須の遺伝子が、Ｅ１ａおよびＥ１ｂコード配列からなる群から選択される、請求項２１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
組織特異的転写調節配列が、複製に必須の遺伝子に作動可能に結合している、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
組織特異的転写調節配列がプロモーターまたはエンハンサーである、請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
プロモーターが、Ｅ２Ｆ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１／ＤＦ３、α−フェトタンパク質、ｅｒｂ−Ｂ２、界面活性剤、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＴＫ、ｐ２１、ｈＴＥＲＴ、ｈＫＬＫ２、プロバシンおよびサイクリン遺伝子由来プロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
エンハンサーがＤＦ３、乳癌特異的エンハンサー、ウイルスエンハンサー、およびステロイド受容体エンハンサーからなる群から選択される、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
Ｅ３領域においてさらに欠失を含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
治療遺伝子をさらに含む、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
請求項１１に記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクター粒子。
【請求項３０】
請求項２９に記載のアデノウイルスベクター粒子で感染させた真核生物細胞。
【請求項３１】
転写ユニットとの関係で、エンハンサーまたはプロモーター活性を示す干渉性遺伝エレメントに起因するウイルスベクター内の転写ユニットの転写レベルを減少させる方法であって、適当な遮断配列を同定する工程、および該転写ユニットの転写開始部位の５'側に該遮断配列を該ウイルスベクターへと挿入する工程を含んでなる方法。
【請求項３２】
遮断配列が該転写ユニットの転写開始部位の５'側の３０００ヌクレオチド以下に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
遮断配列が終結シグナル配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
終結シグナル配列がポリアデニル化シグナル配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ベクター構築物がさらに治療遺伝子を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
治療遺伝子をさらに含む、請求項２０、２１または２２のいずれかに記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３９】
治療遺伝子がサイトカインである、請求項３８に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４０】
サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである、請求項３９に記載のアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００１年２月２３日に出願された米国特許出願第６０／２７０,８８５号の利益享受を主張するものであり、これを引用することにより本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、組換えＤＮＡ技術および遺伝子発現の調節に関する。特に、遺伝子治療の分野における制御された遺伝子発現を提供するウイルスベクターに関する。
【０００３】
発明の背景
原核生物および真核生物の細胞における遺伝子発現は、転写レベルおよび翻訳レベルが調節されている。転写が開始されるためには、ＲＮＡ合成が酵素ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される。転写は、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の開始位置の特定の領域、すなわちプロモーターに結合した場合に、開始する。プロモーターは、通常、ＲＮＡへと転写される最初の塩基対、開始点の前に位置する。この点から、ＲＮＡポリメラーゼは鋳型に沿って移動し、それが終結配列(termination sequence)に到達するまで、ＲＮＡを合成する。この作用は、転写開始部位(開始点)からターミネーターにわたるＤＮＡ分子上の転写ユニットを規定する。
【０００４】
該転写レベルでの遺伝子発現の調節は、様々なメカニズムで起こる。遺伝子発現は、プロモーターおよびエンハンサーのような特定の調節配列により制御され、それらに対して細胞性因子が結合し、その結果、隣接遺伝子の発現率が変化し得る。このような細胞性因子としては、例えば、いわゆる転写因子が挙げられ、これはＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子中の特定の結合配列の認識に必要とされるタンパク質である。
【０００５】
組換えＤＮＡ技術の一定の適用は、遺伝子がそのプロモーターにより緊密に調節されること、すなわち、該遺伝子の転写レベルがプロモーターそれ自体以外のいかなるシス作用性エレメントにも依存しないこと、を必要とする。例えば、遺伝子治療の文脈において、治療目的で投与されたウイルスベクターの組織選択性は、したがって、そのプロモーターにより緊密に調節されるべき遺伝子の特異的調節に依存し得る。１つのこのような遺伝子治療のアプローチは癌を目的とし、そして、いわゆる「腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクター」を利用する(例えば、US 5,998,205 (Hallenbeck et al.)を参照)。
【０００６】
腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターは、腫瘍特異的でありかつ生物における標的細胞の感染後に複製能を有する、アデノウイルスベクターである。このアプローチにおいて、アデノウイルスベクターの複製に必須の遺伝子は、組織特異的プロモーターにより調節され、そしてその結果、該ベクターの複製の組織特異性を提供する。したがって、このアプローチにおいて、もし複製に必須の遺伝子が、もっぱら、腫瘍特異的であるプロモーターの制御下にあるならば、アデノウイルスベクターは特異的に複製され、腫瘍細胞を溶解し、そして組織特異性のないさらなる遺伝エレメント(genetic element)により誘導されることはない。
【０００７】
本発明の目的の１つは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターなどを提供することであり、それはウイルスベクター内で目的の遺伝子の特異的かつ緊密な調節を可能にする。腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターの文脈において、本発明のさらなる目的は、高度の組織特異性を有するベクターを提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１：ＳＶ４０初期ポリ(Ａ)部位のための切断およびポリアデニル化プロセス。
【図２】図２：Ｅ１Ａ転写制御領域。
【図３．１】図３：ウイルスＤＮＡの左端および右端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。ＤＮＡ配列決定により確認されたＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域。パネルＡ。最初の１８０２ヌクレオチド中の領域は、ＩＴＲ(ヌクレオチド１〜１０３)、ポリアデニル化シグナル(ヌクレオチド１１６〜２６１)、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター(ヌクレオチド２８３〜５５５)、Ｅ１ａ遺伝子(ヌクレオチド５７４〜１６４７)およびＥ１ｂ遺伝子の一部(ヌクレオチド１６４８〜１８０２)である。パネルＢ。最後の５３１ヌクレオチドにおける領域は、ＰａｃＩ制限部位(ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４)(下線部)、パッケージング・シグナル(ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７)およびＩＴＲ(３４３１０〜３４４１２)である。
【図３．２】ウイルスＤＮＡの左端および右端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。
【図３．３】ウイルスＤＮＡの左端および右端からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの配列。
【図４】図４：ウイルスＤＮＡの左端からのＡｒ６Ｆの配列。Ａｒ６Ｆの左端の最初の６６０ヌクレオチド。ＩＴＲ(ヌクレオチド１〜１０３)、マルチクローニング部位(ＭＣＳ)(ヌクレオチド１０４〜１３４)およびＥ１ａ遺伝子の一部(ヌクレオチド１３５〜６６０)を示す。
【図５】図５：ウイルスＤＮＡの左端からのＡｒ６ｐＡＦの配列。Ａｒ６ｐＡＦの左端の最初の６６０ヌクレオチド。ＩＴＲ(ヌクレオチド１〜１０３)、ＳＶ４０初期ポリＡシグナル(ヌクレオチド１０４〜１３４)およびＥ１ａ遺伝子の一部(ヌクレオチド２９８〜６６０)を示す。
【図６】図６：Ａｒ６ｐＡＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの概略図。バックボーン・アデノウイルス配列は、ｐＡｒ６ｐＡＦおよびｐＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦ感染性プラスミド由来である。中間ベクター・バックボーン・アデノウイルス配列は、Ａｄｄｌ３２７、Ｅ３欠失アデノウイルス・タイプ５由来であり、これにおいてパッケージング・シグナルは、右のＩＴＲの、直近の上流に位置する。Ｅ１ａプロモーターにおいてはＡｒ６ｐＡＦベクター・バックボーンを欠失し、そしてＳＶ−４０ポリ(Ａ)シグナルは左のＩＴＲの後に挿入される。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクター・バックボーンには、ＳＶ−４０ポリ(Ａ)シグナル配列の後に、Ｅ２Ｆ−１プロモーター(ｂｐ−２１２〜＋５１)、４つのインタクトＥ２Ｆ、１つのＮＦ−ｋＢおよび４つのＳｐ１コンセンサス配列のＤＮＡセグメントを含む。
【図７】図７：ベクターＡｄｄｌ３２７、ＡｖＥ１ａＰＡ０９Ｉｘｉ、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、Ａｄｄｌ３１２の投与後の体重変化の比較。
【図８】図８：ベクターＡｄｄ１３２７、ＡｖＥ１ａ０９ｉ、ＡｖＰＡＥ１ａ０９ｉ、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦ、Ａｄｄｌ３１２のバックボーン。
【０００９】
発明の要約
本発明は、ウイルスベクター内に１もしくはそれ以上の遺伝子の改善された調節を示す新規ウイルスベクターを提供する。このようなベクターにおいて、転写はそのプロモーターにより緊密に調節され、そして例えばウイルスベクター構築物自体の中に位置するシス作用性エレメントのような干渉性遺伝エレメントから本質的に独立している。
【００１０】
したがって、１つの観点において、本発明は、少なくとも１つの干渉性遺伝エレメントを有し、少なくとも１つの転写ユニットを含んでなる、ウイルスベクターであって、少なくとも１つの遮断配列(insulating sequence)が該転写ユニットの転写開始部位の５'側であって、かつ、該干渉性遺伝エレメントの３'側に位置するウイルスベクターを提供する。
【００１１】
本発明の別の観点において、本発明のウイルスベクターを含むウイルスベクター粒子が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる観点において、本発明のウイルスベクター粒子でトランスフェクトされた真核生物細胞が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の観点において、干渉性遺伝エレメントに起因するウイルスベクター内の転写ユニットの転写レベルを減少させる方法であって、適当な遮断配列を同定する工程、および該転写ユニットの転写開始部位の５'側に該遮断配列を該ウイルスベクターへと挿入する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、新規ウイルスベクター、特に、新規アデノウイルスベクターを提供する。このようなベクターは、ウイルスベクターの遮断配列の挿入、例えば、非特異的読み通し転写(transcriptional read-through)を遮蔽するための、転写ユニットの開始位置(転写開始部位)の上流の終結シグナル配列の挿入により、得られ得る。本発明のウイルスベクターは、遮断配列を含まないウイルスベクターと比較して、目的の遺伝子の「漏出性発現(leaky expression)」の量の減少を示す。
【００１５】
一般に、タンパク質の発現には、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれる。使用される文脈に応じて、「発現」なる用語は、ＲＮＡ、タンパク質またはその両方の生成を意味し得る。本発明は、主に、ｍＲＮＡへの転写およびその調節方法に関する。
【００１６】
漏出性発現は、遺伝子の直近の上流のプロモーターから独立した遺伝子発現である。遺伝子治療の文脈において、漏出性遺伝子発現は一定の治療アプローチの特異性を低下させ得る。例えば、異種性遺伝子の送達は、特定の細胞環境において該遺伝子を駆動する組織特異的プロモーターの活性化に依存し、その結果、組織特異的プロモーターを活性化する因子を産生しない組織においては該遺伝子が発現することを防止し得る。このようなアプローチは、もし異種性遺伝子の漏出性発現が起きる場合には、あまり特異的とはならないであろう。
【００１７】
今回、本発明は、ウイルスベクターにおける干渉性遺伝エレメントの望まない調節上の影響から転写ユニットを遮蔽する方法を提供する。
【００１８】
本発明の意味での転写ユニットは、１もしくはそれ以上の遺伝子を含み得る。ＲＮＡポリメラーゼが特定の領域、すなわち遺伝子の開始位置(開始点または転写開始部位)のプロモーターに結合すると、転写が始まる。開始点は、ＲＮＡへと転写される最初の塩基対である。この点から、ＲＮＡポリメラーゼは鋳型に沿って移動し、それが終結配列に到達するまで、ＲＮＡを合成する。この作用は、転写開始部位からターミネーターにわたる転写ユニットを規定する。一般に、転写物における最初のヌクレオチドは、転写ユニットの＋１位と定義される。対応するＤＮＡ鎖上の、直近のこれに先行するヌクレオチドは、−１位と定義される。
【００１９】
転写ユニットは、「調節エレメント」に「作動可能に連結」していてもよい。核酸配列は、それが別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」している。例えば、調節エレメントは、もしそれが転写ユニットの転写に影響するのであれば、転写ユニットと作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、典型的に、隣接している。しかしながら、プロモーターから数千塩基離れそしてイントロン配列の長さが変動し得る場合に、エンハンサーは、一般的に、機能するので、いくつかの核酸配列は作動可能に連結しているが隣接していないこともあり得る。本明細書において使用されるように、「調節エレメント」なる語は、核酸配列の転写のある面を制御する遺伝エレメントを意味する。調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。
【００２０】
１つの観点において、本発明は、少なくとも１つの干渉性遺伝エレメントを有し、かつ、少なくとも１つの転写ユニットを含んでなる、ウイルスベクターであって、少なくとも１つの遮断配列が該転写ユニットの転写開始部位の５'側であって、かつ、該干渉性遺伝エレメントの３'側に位置するウイルスベクターを提供する。
【００２１】
本明細書において使用されるように、「ウイルスベクター」なる用語は、当分野において認められている意味にしたがって使用される。当該用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、そしてウイルスベクター粒子へとパッケージングされ得る、核酸ベクター構築物を意味する。ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのどちらかで、細胞内にＤＮＡを運ぶ目的で利用され得る。後者の目的でよく使用されてきたウイルスベクター粒子としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、およびヘルペスウイルスに基づく粒子が挙げられる。
【００２２】
「干渉性遺伝エレメント」なる用語は、広い意味で解釈されるべきである。干渉性遺伝エレメントは、転写ユニットとの関係で望ましくないエンハンサーまたはプロモーター活性を示し得る。特に、本発明の干渉性遺伝エレメントは、問題の遺伝子に直接隣接しそして目的の遺伝子の上流にあるプロモーターの活性に影響し得る。干渉性遺伝エレメントは、特に、干渉性プロモーターまたはエンハンサーであり得る。エンハンサーまたはプロモーター活性は、転写レベル、すなわち、問題の転写ユニットからの一次ＲＮＡ転写産物の検出可能な量、を増加させる任意の活性として理解されるべきである。したがって、干渉性遺伝エレメントは、任意の下流の遺伝子の転写を測定することにより、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザン検出システムにより、アッセイされ得る。
【００２３】
干渉性遺伝エレメントは、ウイルスベクターにおいて保存されるべき重要な機能を有し得る。例えば、アデノウイルスベクター構築物の分野において、ＩＴＲはアデノウイルスＤＮＡ複製に極めて重要である。さらに、左のＩＴＲの下流の配列は、ウイルスゲノムの適切なパッケージングに必要である。したがって、ウイルスベクターを構築する場合に、転写ユニットとの関係でエンハンサーまたはプロモーター活性を示すすべての干渉性遺伝エレメントを同定および／または削除することは、必ずしも、可能ではない。
【００２４】
「プロモーター」なる用語は、当分野において認められている意味にしたがって使用される。該用語は、通常、遺伝子のコード配列の上流のＤＮＡ領域を意味することが意図され、これはＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして該酵素を正しい転写開始部位(転写開始部位)に方向付ける。プロモーターは、転写の開始部位から直近の上流(５'側)に位置する。プロモーター配列は、転写の正確かつ効率的な開始に必要とされる。典型的なプロモーターとしては、ＴＡＴＡボックスと呼ばれるＡＴが多い領域が挙げられ、これは典型的には転写開始部位から５'側に約３０塩基対のところに位置する。
【００２５】
「エンハンサー」なる用語は、当分野において認められている意味にしたがって使用される。該用語は、遺伝子から数千塩基までに位置する場合、遺伝子からの転写を増加させることができる真核生物および一定の真核生物ウイルスにおいて見出される配列を意味することが意図されている。これらの配列は、通常、目的の遺伝子の５'側(上流)に存在する場合に、エンハンサーとして作用する。しかしながら、いくつかのエンハンサーは、遺伝子の３'側(下流)に置かれた場合に、活性を有する。
【００２６】
いくつかの場合においては、エンハンサーエレメントは、未知のプロモーターとともに遺伝子からの転写を活性化し得る。したがって、エンハンサーはプロモーター配列からの転写速度を増大させる。その増加は、主に、プロモーターを有する配列特異的転写因子と、哺乳動物細胞が組織特異的遺伝子発現を達成することを可能にするエンハンサー配列との間の相互作用によるものである。プロモーターと結合したこれらの転写タンパク質因子およびエンハンサーの存在は、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写機構の他の構成成分が組織特異的選択性および正確性を有する転写を開始することを可能にする。
【００２７】
ウイルスベクターの好適な実施態様において、遮断配列は、干渉性遺伝エレメントから遮蔽された調節エレメントの直近の上流に位置する。調節エレメントのサイズに依存して、好ましくは、遮断配列は、転写ユニットの転写開始部位の３０００ヌクレオチド、さらに好ましくは５００、３００または２００ヌクレオチド以内の上流(５'側)に位置する。しかしながら、最小のプロモーターが使用される場合、遮断配列は、転写ユニットの転写開始部位の１７ヌクレオチド以内の５'側に位置する。好ましくは、遮断配列はウイルスベクターの５'末端から最初の転写ユニットの上流に位置する。特に、遮断配列は、好ましくは、個々のベクターにおいて複製に必須の遺伝子をコードする最初の転写ユニット(ウイルスベクターの５'末端から見られる)の上流に位置し得る。例えば、もしウイルスベクターがアデノウイルスベクターであるならば、遮断配列は、好ましくは、Ｅ１ａ転写ユニットの上流に位置する。アデノウイルスベクターの文脈において、「５'」および「上流」なる用語は、アデノウイルスベクターの左のＩＴＲに対応することを意味すると理解されるべきである。
【００２８】
遮断配列は、例えば、隣接する遺伝子のプロモーターからの一方の遮断配列上のエンハンサー間の相互作用をブロックすることにより遺伝子を分離する役割を有するＤＮＡのセグメントである。本発明の目的のために、該用語は広い機能的意味で理解されるべきである。本発明の意味の範囲内の遮断配列の定義的特徴は、干渉性遺伝エレメントと遮断された転写ユニットの調節配列との間に位置する場合に、上流の干渉性遺伝エレメントの影響から、調節エレメントと作動可能に連結した所定の転写ユニットを遮断または保護する能力である。好ましくは、本発明の遮断配列は、それらの遺伝子源から分離されたＤＮＡのセグメントである。次いで、遮断配列は、本明細書においてさらに記載されているように、適当な位置でウイルスベクター中に挿入され得る。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様において、遮断配列は、終結シグナル配列であり；特に好ましくは、ポリアデニル化シグナル配列である。任意のポリアデニル化シグナル配列が、本発明の目的のために有用であり得る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様において、終結シグナル配列は、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列またはＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル配列のどちらかである。好ましくは、終結シグナル配列は、その遺伝子源から単離され、そして本明細書においてさらに記載されているように、適当な位置でウイルスベクター中に挿入される。
【００３０】
本発明の意味の範囲内の終結シグナル配列は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる任意の遺伝エレメントであり得る。ポリアデニル化シグナル配列は、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断に必要な認識領域(recognition region)であり、その後に、ポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが続く。ポリアデニル化シグナル配列は、「ポリＡ部位」、すなわち、アデニン残基が転写後のポリアデニル化により加えられるＲＮＡ転写物上の部位、を提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、真核生物および真核生物ウイルス内の転写ユニットに有用な遮断配列である。
【００３１】
一般に、ポリアデニル化シグナル配列には、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントからなるコアポリ(Ａ)シグナルが含まれる(図１)。典型的に、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡヘキサマーが、ＵまたはＧＵ残基に富むより可変性のエレメントの２０〜５０ヌクレオチド上流に存在する。これら２つのエレメントの間の切断は、通常、３'側のＡ残基上であり、そしてインビトロで、大きな、多成分タンパク質複合体により仲介される。該複合体は、切断およびポリアデニル化特異的因子(ＣＰＳＦ)(これはＡＡＵＡＡＡモチーフに結合する。)；切断刺激因子(ＣｓｔＦ)(これは下流のＵに富むエレメントに結合する。)；およびあまりよく特徴付けられていない２つのさらなる切断因子(ＣＦ ＩおよびＣＦ ＩＩ)、を含む。
【００３２】
また、ポリ(Ａ)ポリメラーゼは、切断の工程のほとんどの場合にも、存在しなければならない。適当なポリアデニル化シグナル配列の選択には、ポリアデニル化プロセスの終了がポリ(Ａ)部位の強度に相関するので、ポリアデニル化シグナル配列の強度を考慮する(Chao et al., Molecular and Cellular Biology, Aug. 1999, pp5588-5600)。例えば、強いＳＶ４０後期ポリ(Ａ)部位は、より弱いＳＶ４０初期ポリ(Ａ)部位よりも速く切断される。非特異的転写のさらに実質的な減少が特定のベクター構築物において要求される場合、当業者はより強いポリアデニル化シグナル配列を選択することを想到するであろう。
【００３３】
本発明は、また、遮断配列としてのサイレンサー(silencer)の使用も包含する。「サイレンサー」は、エンハンサー活性で干渉することにより転写の開始を阻害するＤＮＡ領域である。遮断配列は、また、リプレッサータンパク質の結合部位でもあり得る。
【００３４】
本発明の別の好適な実施態様において、ベクター構築物は、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターにおいて、ベクター構築物は、アデノウイルス由来の遺伝エレメントを含んでなる。好適な実施態様において、それはアデノウイルス５'ＩＴＲ、アデノウイルス３'ＩＴＲおよびアデノウイルス・パッケージング・シグナルを含む。Ｅ３領域は、欠失していてもいなくてもよい。したがって、１つの実施態様において、アデノウイルスベクターは、さらに、Ｅ３領域における欠失を含む。
【００３５】
アデノウイルス(Ａｄ５)Ｅ１ａ領域の周りのヌクレオチドエレメントの特徴の解析により、エンハンサーのような特性を有するエレメントが、＋１位のＥ１ａキャップ部位に対して−１４１〜−３０５位の間に存在することが示される(図２)。このエンハンサーエレメントは、ウイルスＤＮＡのパッケージングのための、シスの必要とされる配列に非常に近接して位置する。エンハンサーエレメントの欠失は、ウイルスに感染した細胞において、Ｅ１ａ ｍＲＮＡの転写速度および定常状態のレベルの両方を低減させる。Ｅ１ａエンハンサーは、１１ｂｐの反復エレメント(repeat element)を含み、これは調整配列の極めて重要な構成成分である(５'−ＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡ−３)。
【００３６】
反復配列の１つのコピーを取り除いた場合、Ｅ１ａの発現は２〜３倍減少するが、両方のコピーを取り除いた場合には発現は１５〜２０倍減少する(Hearing and Shenk, Cell vol. 33, pp.695-303, July 1983)。しかしながら、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含むＥ１ａキャップ部位に対して−３９３〜＋１０位のすべての領域を欠いているにもかかわらず、欠失変異体はそれでもＥ１ａ特異的ｍＲＮＡの合成を指示することが見出された。どの配列がこの転写に関与しているかは明らかではない。したがって、アデノウイルスベクターの文脈において、干渉性遺伝エレメントは、５'ＩＴＲ内に位置し得、これはアデノウイルスの複製に必要な領域である。
【００３７】
１つの特定の実施態様において、本発明は、Ｅ１ａプロモーターの上流からの読み通し転写をブロックすることによりアデノウイルスベクターのＥ１ａ遺伝子の非特異的活性化を減少させるストラテジーを記載する。Ｅ１ａエンハンサーエレメント(＋１位のＥ１ａキャップ部位に対して−１４１〜−３０５位)の除去および左端のＩＴＲの下流のポリ(Ａ)シグナル配列の挿入は、効率的な転写の終結に充分であることが見出される。１０４〜５５１位のヌクレオチドが欠失したアデノウイルスバックボーン(Ａｒ６Ｆ)、および別のアデノウイルスバックボーンＡｒ６ｐＡＦ(これは、Ｅ１ａの欠失、およびＳＶ４０初期ポリ(Ａ)シグナルの、Ｅ１ａ遺伝子上流への挿入を組み合せたものである。)を作製する(実施例１参照)。
【００３８】
両方のベクターにおいて、パッケージング配列は、右のＩＴＲの上流に移動している。Ｅ１ａ遺伝子の上流での読み通しを測定するために、Ｅ１タンパク質のレベルを定量するＥ１ａ ＦＡＣＳアッセイを使用する(実施例２参照)。作製した２つのアデノウイルス・バックボーンのうち、Ａｒ６ｐＡＦは約９６％のＥ１ａ発現の減少を示す。これらの結果により、もし遮断配列がプロモーターの直近の上流に置かれるならば、組織特異的プロモーターの制御下に遺伝子を置くことにより、Ｅ１ａ遺伝子活性を選択的に制御することが可能であることが示される。
【００３９】
したがって、好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、終結シグナル配列の５'側の欠失を含む。終結シグナル配列の５'側のパッケージング・シグナルにおける欠失は、パッケージング・シグナルが機能を果たさないようなものであり得る。１つの特異的な実施態様において、欠失には、欠失が少なくともヌクレオチド１８９〜５５１にわたる、終結シグナル配列の５'側の欠失が含まれる。別の好ましい実施態様において、欠失には、欠失が少なくともヌクレオチド１０３〜５５１にわたる、終結シグナル配列の５'側の欠失が含まれる。これらの場合において、パッケージング・シグナルが、終結シグナル配列の３'側の位置に位置する(すなわち再挿入される)ことが好ましい。
【００４０】
本発明のウイルスベクターは、「複製条件付きベクター(replication-conditional vector)」であり得る。複製条件付きベクターは、組織内に導入されたときに、そのベクター内の転写調節配列がその組織内で活性化または抑制されない限り、複製しないかまたは最低限の量でのみ複製するベクターである。例えば、複製に必須の遺伝子は、遺伝子の転写が通常依存している転写調節配列を異種性の転写調節配列と置き換えることにより改変され得る。この転写調節配列は、転写調節因子の存在または転写調節阻害剤の非存在に依存する。所定の組織におけるこれらの因子の存在または所定の組織におけるこのような阻害剤の非存在は、条件付きの複製を提供する。代わりに、天然の転写調節配列は、部分的除去または他の変異(１またはそれ以上の塩基の変更、挿入、逆位など)により無力化されるかまたは機能不全にされ得る。複製条件付きベクターおよびこのようなウイルスベクターを得る方法は、さらに、米国特許５,９９８,２０５号(Hallenbeck et al)に記載されており、これを引用することにより、その全体を本明細書の一部とする。
【００４１】
「複製」なる語は、当分野において認められている意味にしたがって使用される。その本質的特徴は、オリジナルのウイルスベクターの核酸コピーを合成することである。ＤＮＡウイルスの場合において、核酸レベルでの複製は、ＤＮＡ複製である。ＲＮＡウイルスの場合において、核酸複製は、プラス鎖もしくはマイナス鎖(またはその両方)への複製である。レトロウイルスの場合において、核酸レベルでの複製は、ｃＤＮＡの産生ならびにＲＮＡウイルスゲノムのさらなる産生を含む。複製は、また、感染性ＤＮＡまたはＲＮＡウイルス粒子の形成も含む。このような粒子は、所定の標的組織中の細胞に感染し、かくして、標的組織のすべてのまたはかなりの部分を通じてベクターを分配し得る。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様において、干渉性遺伝エレメントから遮蔽されるべき転写ユニットは複製に必須の遺伝子を含む。例えば、もし本発明のベクター構築物がアデノウイルスベクターであるならば、複製に必須の遺伝子は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２およびＥ４コード配列からなる群から選択され得、そして最も好ましくは、複製に必須の遺伝子は、Ｅ１ａコード配列およびＥ１ｂコード配列からなる群から選択される。複製に必須の遺伝子としては、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子が特に好ましい。「複製に必須の遺伝子」なる用語は、標的細胞においてベクターが複製されるのにその転写が必要とされる、遺伝子配列を意味する。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様において、組織特異的転写調節配列は、複製に必須の遺伝子に作動可能に連結されている。
【００４４】
「組織特異的」なる用語は、複製に必須の遺伝子が作動可能に連結した転写調節配列が、複製が組織内で進行するように、組織において特異的に機能することを意味することを意図する。これは、転写調節配列を活性化する転写因子の、組織における存在、および非標的組織における非存在、により起こり得る。それは、また、非標的組織において通常起こりそして転写調節配列の結果として転写を妨げる転写阻害因子の非存在によっても起こり得る。組織特異性は、特に、正常組織の異常な対応物の処置において関連する。このような対応物には、肝組織と肝癌、肺組織と肺癌、乳腺組織と乳癌、結腸組織と結腸癌、前立腺組織と前立腺癌、およびメラノーマと正常皮膚組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
組織特異性は、また、例えば肝臓のような組織内への結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌などの転移の場合のように、異なるタイプの組織の正常組織が分散した異常なタイプの組織の存在を含む。この場合において、標的組織は異常組織であり、そして組織特異性は、正常組織に分散した異常組織に対するベクター複製の制限を反映する。処置の文脈において、組織特異性は特にインビボに関連する。しかしながら、エキスビボ(ex vivo)処置および組織置換は、また、本発明にしがう組織特異性の概念の範囲内である。
【００４６】
「転写調節配列」なる用語は、結合遺伝子が、特定の細胞においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを引き起こし得る任意のＤＮＡ配列、例えばプロモーターおよびエンハンサーなどを意味することを意図されている。転写調節配列の様々な組合せを、ベクター内に含み得る。１つまたはそれ以上が異種性であり得る。さらに、１またはそれ以上が組織特異性を有し得る。例えば、単一の転写調節配列は、複製に必須の１以上の遺伝子による複製を駆動するために使用され得る。これは、例えば、遺伝子のうちの１つの遺伝子産物がさらなる遺伝子(複数を含む)の転写を駆動する場合が当てはまる。アデノウイルスベクターの場合の例は、Ｅ１ａコード配列(Ｅ１ａプロモーターが欠失している)およびＥ１ｂ遺伝子全体を含むカセットに連結した異種性プロモーターである。このようなカスケードにおいて、１のみの異種性転写調節配列が必要であり得る。しかしながら、遺伝子が個別的に(分離して)制御される場合、もし１以上のそのような遺伝子が複製を制御することが望まれるならば、１以上の転写調節配列が使用され得る。
【００４７】
好ましい実施態様において、組織特異的転写調節配列はプロモーターまたはエンハンサーである。好ましくは、プロモーターは、Ｅ２Ｆ−応答性プロモーター、好ましくはＥ２Ｆ−１、ＣＥＡ、ＭＵＣ１／ＤＦ３、α−フェトタンパク質、ｅｒｂ−Ｂ２、界面活性剤、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＴＫ、ｐ２１、ｈＴＥＲＴ、ｈＫＬＫ２、プロバシン(probasin)およびサイクリン遺伝子由来プロモーターからなる群から選択される。エンハンサーは、好ましくは、ＤＦ３、乳癌−特異的エンハンサー、ＰＳＡ、ウイルスエンハンサー、およびステロイド受容体エンハンサーからなる群から選択される。
【００４８】
本発明のアデノウイルスベクターは、特に、腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターであり得る。腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞中で選択的に複製し、そしてそれらが複製している細胞を破壊するが、非腫瘍細胞中では有意な程度には複製しないアデノウイルスベクターである。例えば、腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターは、上記の複製に必須の遺伝子に作動可能に連結した組織特異的転写調節配列を有し得る。代わりに、腫瘍細胞崩壊性アデノウイルス粒子は、アデノウイルスの複製に必須の遺伝子、例えばＥ１ａまたはＥ１ｂ遺伝子における変異を含み得る。このような変異は、例えば、もし組織の細胞がｐ５３またはＲｂ経路において欠陥を有するならば、アデノウイルスの複製を、腫瘍組織特異的にし得る。腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターは、複製に必須のアデノウイルスエレメントに加えて、異種性の遺伝子を含んでも含まなくてもよい。
【００４９】
本発明は、Ｅ１ａ遺伝子の発現を駆動するためのＥ２Ｆ−１プロモーターを利用する腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクター、Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを提供する。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞において選択的に活性化される。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦを用いるＡ５４９細胞の形質導入は、Ｅ１ａの発現をもたらし、この発現はＥ２Ｆ−１プロモーターの活性に依存していることが示される。この結果は、Ａ５４９細胞がＲｂ経路のメンバーであるｐ１６が欠けている事実と矛盾しない。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦにおけるＥ２Ｆ−１プロモーターの活性は、また、いくつかの腫瘍細胞株においても確認されている。
【００５０】
腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターを用いる癌治療の分野において、遮断配列の使用が非標的細胞における腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターの複製および毒性を減少させるので、治療効果を増大させ得る。Ｅ１ａコード領域の上流に挿入されたポリアデニル化シグナルを有する本発明の腫瘍細胞崩壊性ベクターは、それらが最低レベルのＥ１ａ発現を示すので、それらの非修飾対応物より優れている(実施例２参照)。したがって、左のＩＴＲからの非特異的転写を停止させるポリアデニル化シグナル配列の挿入は、それぞれのプロモーターからのＥ１ａ発現の特異性を改善するだろう。ポリアデニル化シグナル配列の挿入は、非標的細胞中の腫瘍細胞崩壊性アデノウイルスベクターの複製を、およびそれゆえ毒性を、減少させるであろう。
【００５１】
１つの観点において、本発明は、また、転写ユニットとの関係でエンハンサーまたはプロモーター活性を示す干渉性遺伝エレメントに起因するベクター構築物における転写ユニットの転写レベルを低減させる方法であって、適当な遮断配列を同定する工程、および該転写ユニットの５'側の該ベクター構築物中に遮断配列を挿入する工程を含んでなる方法を提供する。好ましい実施態様において、転写レベルは、遮断配列を含まないウイルスベクターの対応する導入量と比較して、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約２０、５０、または２００倍減少している。
【００５２】
さらなる実施態様において、本発明は、治療遺伝子を含むベクター構築物を提供する。治療遺伝子は、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルでその効果を発揮するものであり得る。例えば、治療遺伝子によりコードされたタンパク質は、遺伝病の処置において使用され得、例えば嚢胞性繊維症の処置において嚢胞性繊維症の経膜的伝導性レギュレーターをコードするｃＤＮＡが使用され得る。さらに、治療遺伝子によりコードされたタンパク質は、細胞死を引き起こすことによりその治療効果を発揮することができる。
【００５３】
例えば、タンパク質の発現それ自体が、ジフテリア毒素Ａの発現のように、細胞死をもたらすことができるか、あるいはタンパク質の発現が細胞を一定の薬物に選択感受性にし得る、例えば単純ヘルペス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ遺伝子は、細胞を抗ウイルス化合物、例えばアシクロビル、ガンシクロビルおよびＦＩＡＵ(１−(２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル)−５−ヨードウラシル)に感受性にする。代わりに、治療遺伝子は、ＲＮＡレベルで、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム、スプライシングもしくは３'プロセシング(例えば、ポリアデニル化)に影響するタンパク質、または細胞内の別の遺伝子の発現レベルに影響するタンパク質をコードすることにより、例えば、改変された速度のｍＲＮＡ蓄積、ｍＲＮＡ輸送の改変、および／または転写後調節の変更を媒介することにより、その効果を発揮する。
【００５４】
ベクター構築物中に入れられ得る治療遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)遺伝子、例えばＴＮＦ−αをコードしているＤＮＡ配列；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γのようなインターフェロンをコードする遺伝子；ＩＬ−１、ＩＬ−１β、およびインターロイキン２〜１４のようなインターロイキンをコードする遺伝子；ＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子；アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)をコードする遺伝子；細胞増殖因子、例えばリンフォカイン(これはリンパ球の増殖因子である。)をコードする遺伝子；可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子；第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；Ｔ細胞受容体；ＬＤＬ受容体、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、ＡｐｏＡＩ、ならびにコレステロール輸送および代謝に関与する他の遺伝子；アルファ−１ アンチトリプシン遺伝子、オルニチン トランスカルバミラーゼ遺伝子、ＣＦＴＲ遺伝子、インスリン遺伝子、ネガティブ選択マーカーまたは「自殺(suicide)」遺伝子、例えばウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、および水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；抗体の抗原結合ドメインのＦｃ受容体、およびウイルス複製を阻害するアンチセンス配列を含むが、これらに限定されない。治療遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、Ｎｏｓ、ＦａｓＬ、またはｓＦａｓＲ(可溶性Ｆａｓ受容体)のいずれかから選択され得る。
【００５５】
治療剤をコードしているＤＮＡ配列は、また、アデノウイルスゲノムの一部、例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子である配列であり得る。１つには、Ｅ１ａはアデノウイルス複製サイクルを駆動し、これが細胞溶解をもたらす。したがって、Ｅ１ａは、例えば腫瘍組織に投与された場合には、本発明の意味での治療剤をコードするＤＮＡ配列とみなし得る。さらに、このような遺伝子は、例えば、感染した細胞を一定の薬剤および／または照射に対して敏感にすることにより、さらなる治療上の利点を提供し得る。
【００５６】
ヒト患者に関して、治療遺伝子は一般的にヒト由来であるが、もし遺伝子がレシピエントにおいて有害な免疫反応を生じないならば、ヒトにおいて高い相同性ならびに生物学的に同一または等価な機能を示す密接に関連した種の遺伝子が使用され得る。核酸配列または治療遺伝子の治療上有効量は、所望の結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効な量である。この量は、対象の性別、年齢、体重などを含む(しかし、これらに限定されない)さまざまな因子にしたがって変動し得る。
【００５７】
少なくとも１つの治療遺伝子をコードしているＤＮＡ配列は、適当なプロモーターの制御下にある。使用され得る適当なプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；または異種性プロモーター、例えばサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター；ラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター；誘導可能なプロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；およびＡｐｏＡＩプロモーターを含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、本発明のプロモーターはＥ２Ｆ−応答性プロモーター、特にＥ２Ｆ−１プロモーターである。本発明の１つの実施態様において、Ｅ２ＦプロモーターはＥ１ａ遺伝子に作動可能に連結している。
【００５８】
Ｅ２Ｆプロモーターに加えて、下記の腫瘍選択的プロモーターが、好ましくは、本発明に含まれる：オステオカルシン、Ｌ−プラスチン、ＣＥＡ、ＡＶＰ、ｃ−ｍｙｃ、テロメラーゼ、ｓｋｐ−２、ｐｓｍａ、サイクリンＡ、およびｃｄｃ２５プロモーター。しかしながら、本発明の範囲は、特異的な外来遺伝子またはプロモーターに限定されないことが理解されるべきである。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、どのタイプの細胞を使用して目的のタンパク質を発現させるかに依存する。いくつかの真核細胞プロモーターおよびエンハンサーは、広い宿主範囲を有する。一方、他のものは、限定されたサブセットの細胞タイプにおいて機能的である。
【００５９】
本発明のウイルスベクターは、例えば、送達された遺伝子を発現しそしてそれらの個々の機能を研究するために、真核生物の細胞に遺伝子を送達するのに有用である。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましくは、哺乳動物細胞は、霊長類の細胞である。最も好ましくは、霊長類の細胞はヒト細胞である。ウイルスベクターは、また、動物モデルにおける細胞形質導入および遺伝子発現の研究において有用である。
【００６０】
ウイルスベクターは、また、遺伝子治療に有用である。特に、本発明のウイルスベクターにより送達された遺伝子の発現は、疾患の予防または治療のために、あらかじめ決められた方法でトランスフェクトされた細胞の性質を改変するのに有用である。
【００６１】
したがって、さらなる観点において、本発明は、また、本発明のベクター構築物でトランスフェクトされた真核生物細胞を提供する。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましくは、哺乳動物細胞は、霊長類の細胞である。さらに好ましくは、霊長類の細胞はヒト細胞である。
【００６２】
本明細書において使用される「トランスフェクション」なる用語は、真核生物の細胞への外来ＤＮＡの導入を意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱法、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在性トランスフェクション、ポリブレン−介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合法、リポフェクション、プロトプラスト融合法、遺伝子銃、およびウイルス感染法を含む当分野で既知のさまざまな方法により達成され得る。
【００６３】
本発明のベクター構築物によりトランスフェクト／感染され得る細胞には、初代培養細胞(primary cell)、例えば初代有核血液細胞、例えば白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球(Ｔ−リンパ球およびＢ−リンパ球を含む)、全能性幹細胞、および腫瘍湿潤リンパ球(ＴＩＬ細胞)；骨髄細胞；活性化された内皮細胞を含む内皮細胞；上皮細胞；ケラチノサイト；幹細胞；肝細胞前駆細胞を含む肝細胞；繊維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管平滑筋細胞；脳細胞および他の神経細胞；腸細胞(gut enterocyte)；腸幹細胞；筋芽細胞を含むが、これらに限定されない。さらに感染し得る細胞には、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、肺癌(小細胞性肺癌および非小細胞性肺癌の両方を含む)、結腸癌、および肝臓癌を含む(しかし、これらに限定されない)初代および転移性癌細胞が含まれ得る。
【００６４】
細胞は、単一の実在物(single entity)として存在するか、または、細胞のより大きなコレクションの一部であり得る。このような「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、細胞培養物(混合物または純品のいずれか)、組織、例えば新生物(良性または悪性)組織のような上皮または他の組織、器官(例えば、心臓、肺、肝臓および他の器官)、器官系(例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、または他の器官系)、または生物(例えば、鳥、哺乳動物、など)を含み得る。１つの実施態様において、標的にされる細胞は、循環器系(例えば、心臓、血管および血液を含むが、これらに限定されない。)、呼吸器系(例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺、など)、または胃腸系(例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢、およびその他のものを含む。)のものである。好適な実施態様において、新生物組織(すなわち、「腫瘍組織」)の細胞は、本発明の標的分子／アデノウイルス粒子複合体で標的化される。
【００６５】
実施例
ここで、下記の実施例に関して本発明を記載する；しかしながら、本発明の範囲を、それによって限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００６６】
実施例１：複製選択的アデノウイルスＡｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの構築および分子的特徴化
Ｅ１ａ遺伝子の非特異的活性化を最小化すると期待される２つのアデノウイルス・バックボーンを開発した。Ａｒ６Ｆアデノウイルスベクターは、干渉性ヌクレオチドを欠失し(Ａｄ５配列中のヌクレオチド１０４〜５５１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ７３２６０)そしてマルチクローニング部位で置換された、Ｅ１ａコード領域に直接結合した左側ＩＴＲを含む(図４)。Ａｒ６ｐＡＦアデノウイルスベクターは、左ＩＴＲとＥ１ａコード領域との間に挿入された１４５ヌクレオチドのＳＶ−４０初期ポリ(Ａ)シグナルを含むもの以外のＡｒ６Ｆと同一である(図５)。これらのベクターの両方において、左ＩＴＲの近くに通常存在するパッケージング・シグナルは右ＩＴＲへと移動する(図３、パネルＢ)。これは、右ＩＴＲを、左ＩＴＲおよびパッケージング・シグナルを含むＡｄ５の最初の３９２ｂｐの逆相補的配列で置換することにより行われた。最後に、アデノウイルスベクターＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを作製するために、腫瘍選択的プロモーターＥ２Ｆ−１を、ＳＶ−４０初期ポリ(Ａ)シグナルとＡｒ６ｐＡＦに存在するＥ１ａコード領域との間に挿入した(図３、パネルＡ)。
【００６７】
ＩＴＲ、ポリ(Ａ)、Ｅ２Ｆ−１プロモーターおよびＥ１ａ遺伝子を含むＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦアデノウイルスベクターの最初の１８０２ヌクレオチドを、ＤＮＡ配列決定により確認した。さらに、パッケージング・シグナルおよび右ＩＴＲを含むベクターの右端の最後の５３１ヌクレオチドを、シーケンシングにより確認した(図３)。
【００６８】
これらの修飾を含むアデノウイルスゲノムを、細菌性プラスミドにおける常法によりクローン化した。Ｅ.ｃｏｌｉにおける相同組換えを、完全長感染性ウイルスゲノムを含むプラスミドを作製するためにＡｄゲノムのフラグメントを含むこれらの細菌性シャトルプラスミドの間で行った(He et al., 1998. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. PNAS 95, 2509-2514)。完全長アデノウイルスゲノムを含むこれらのプラスミドを、細菌性プラスミド配列からアデノウイルスゲノムＤＮＡを遊離させるための制限酵素を用いて線状化した。次いで、アデノウイルスＤＮＡを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａＡＭＩＮＥ−ＰＬＵＳ試薬システム(Life Technologies, Rockville, MD)を用いて、補足的細胞株(complimenting cell line)ＡＥ１−２ａ(Gorziglia et al., 1996. Elimination of both E1 and E2a from adenovirus vectors further improves prospects for in vivo human gene therapy. J. Virol 6, 4173-4178)へとトランスフェクトした。細胞を、３７℃で約５〜７日間インキュベートした。アデノウイルスを、記載の通りＣｓＣｌグラジエントにより増幅および精製した(Jakubczak et al., 2001 Adenovirus type 5 viral particles pseudotyped with mutagenized fiber proteins show diminished infectivity of coxsackie B-Adenovirus receptor-bearing cells. J. Virol. 75: 2972-2981)。ウイルス粒子の濃度を、分光光度的分析により測定した(Mittereder et al., 1996. Evaluation of the concentration and bioacitivity of adenovirus vectors for gene therapy. J Virol 70, 7498-7509)。
【００６９】
１.２  ウイルスＤＮＡ分離およびサザン分析
ＤＮＡを、記載の通り、ＣｓＣｌ−精製ウイルス製造から単離した(Puregene Kit, Gentra)。ウイルスＤＮＡを、示した制限酵素で消化し、そしてエチジウムブロマイドを含む１％アガロース／ＴＡＥゲルで解析した。１μｇの各ＤＮＡサンプルの総計を、ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、ＨｐａＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして標準的手順にしたがってサザン解析に付した。プローブは、ランダムオリゴヌクレオチドプライミングにより作製され、そしてＥ２Ｆ−１を含む。
【００７０】
図６は、Ａｒ６ｐＡＦおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのクローニングおよび構造を要約したものである。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの研究用ロットのＤＮＡ構造は、サザン解析により確認された。予想される左ＤＮＡ領域フラグメントは、５つの独立した制限エンドヌクレアーゼを用いて得られた。Ｅ２ＦプロモーターＤＮＡプローブを用いるサザンブロット解析により、すべての制限エンドヌクレアーゼの予想されるハイブリダイゼーションパターンが例証された。したがって、これらの結果により、正しい位置においてＥ２Ｆ−１プロモーターの存在が確認され、ウイルスＤＮＡの完全性が立証された。
【００７１】
１.３  ＰＥＲ.Ｃ６細胞中のＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターの限界希釈クローニング(Limiting Dilution Cloning)
Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦベクターのシード用ロットを、さらなる評価のために作製した。ウイルスの純粋なシード用ロットを得るために、単一のウイルス粒子由来のクローンを単離することが必要である。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦウイルスのクローニングは、下記のウイルス限界希釈を通して達成された。
【００７２】
ＰＥＲ.Ｃ６細胞の１０の９６ウェルプレート(Fallaux et al., 1998. New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Human. Gene Ther 9, 1909-1917)を、０.０４ｍｌ容積／ウェル中に５×１０３細胞／ウェルで培養した。ＰＥＲ.Ｃ６細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加したＤＭＥＭ中で成長させた。１×１０−２粒子／μｌを含む１０μｌのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを各ウェルに加え、０.１粒子／ウェルの最終感染を得た。感染した細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて４時間インキュベートし、その後、１５０μｌの培地を加えた。ウイルス感染細胞を、３７℃および５％ＣＯ２にて１２日間インキュベートし、続いて、ＣＰＥに関して点数を記録した。ＰＥＲ.Ｃ６細胞からの０.１粒子／細胞クローン７〜９を、１３日目(day 13)に回収した。３つのクローン７〜９はＣＰＥを示し、そして５回冷凍解凍し、６ウェル皿中で培養されたＰＥＲ.Ｃ６細胞上で増殖させた。３日目に、ＣＶＬをクローン７〜９から調製し、、そしてクローン７を、さらに、ＰＥＲ.Ｃ６細胞のＴ１５０中で増殖させた。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦクローン７Ｔ１５０を、感染後２日に回収した。この日に、細胞は完全ＣＰＥに達していた。ＣＶＬを５回冷凍解凍し、そして細胞細片を遠心分離で除いた。ＰＥＲ.Ｃ６細胞のＴ７５フラスコを培養し、そして０.５ｍｌの上記のＣＶＬで感染させた。
【００７３】
０.１粒子／細胞で感染させた９６０ウェルのうち、３つのウェルがＣＰＥを示した。これら３つのクローンは、予想されたクローンの理論的数値の範囲内である。統計学的には、１０のプレートのうち４つのウエルのみがＣＰＥを示すはずである。これは、粒子：ｐｆｕ比を２５と仮定した場合、１より多い感染性粒子／ウェルが存在する１：２５００の確率を与える。これら３つのクローンをＰＥＲ.Ｃ６細胞中で増幅し、そしてクローン７のゲノムは、ＨｐａＩ、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて解析した場合、予想されたサイズのＤＮＡフラグメントを示した。
【００７４】
１.４  配列解析
５'末端の最初の１８０２ヌクレオチドならびにプラスミドｐＤＬ６ｐＡＥ２ｆおよびＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦクローン７の３３８８１〜３４４１２塩基対からの最後の３'末端のヌクレオチドを、直接的に配列決定した。
【００７５】
ＤＮＡ配列決定により確認された追加的シードロット中の領域。
【表１．１】2004536572.tif 000003
【表１．２】2004536572.tif 000004
【表１．３】2004536572.tif 000005
【００７６】
ＤＮＡ配列決定により確認されたシードロット＃ＴＣＡ２５４からのＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦの領域。最初の１８０２ヌクレオチド中の領域は、示した通り、ＩＴＲ(ヌクレオチド１〜１０３)、ポリアデニル化シグナル(ヌクレオチド１１６〜２６１)、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーター(ヌクレオチド２８３〜５５５)、Ｅ１ａ遺伝子(ヌクレオチド５７４〜１６４７)およびＥ１ｂ遺伝子の一部(ヌクレオチド１６４８〜１８０２)である。最後の５３１ヌクレオチド中の領域は、ＰａｃＩ制限部位(ヌクレオチド３３９６７〜３３９７４)(下線部)、パッケージング・シグナル(ヌクレオチド３４０２０〜３４２１７)およびＩＴＲ(３４３１０〜３４４１２)である。
【００７７】
実施例２：ＦＡＣＳによるＥ１ａ発現の特徴化
エンハンサーエレメントの欠失およびポリＡシグナルの挿入が効率的な転写終結に充分であり得るかどうかを調べるために、定量的Ｅ１ａ ＦＡＣＳアッセイを使用して、非相補的Ａ５４９細胞バックグラウンド(ｐ１６−ｐ５３＋Ｒｂ＋)におけるＥ１ａ発現を評価した。
【００７８】
我々は、細胞あたり１０、５０、２５０および１２５０ウイルス粒子(ＶＰＣ)の投与量で、Ａｄｄｌ３２７、Ａｄｄｌ３１２、Ａｒ６Ｆ、Ａｒ６ｐＡＦまたはＡｒ６ｐＡＥ２ｆＦを感染させた細胞からのＥ１ａの発現を比較した(表１)。Ｅ１ａ発現の最高のレベルは、すべての投与量の範囲で、Ａｄｄｌ３２７で観察された。対照的に、予想されたとおり、Ｅ１ａ欠失変異体Ａｄｄｌ３１２は、Ｅ１ａ発現を示さなかった。本実験において使用された条件下(１０〜１２５０ＶＰＣ)で、Ａｒ６Ｆを形質導入した細胞中で検出されるＥ１ａは、Ａｄｄｌ３２７を形質導入したものよりも、約８０％〜２２％少ない。Ａｒ６ｐＡＦを形質導入した細胞におけるＥ１ａ発現は、Ａｄｄｌ３２７を感染させた細胞からの発現と比較して、すべての投与量で、約１００％〜９６％有意に減少した。Ａｒ６ｐＡＥ２ｆＦ腫瘍細胞崩壊性ベクターを感染させた細胞からのＥ１ａの発現は、５０ＶＰＣの投与量でのＡｄｄｌ３２７ウイルスと比較して、５０％減少した。
【００７９】
結論として、Ａｒ６ｐＡＦベクターにおけるポリ(Ａ)シグナルの挿入は、Ａ５４９細胞におけるＥ１ａの発現を減少させた。対照的に、Ｅ２Ｆ−１プロモーターの挿入はＥ１ａの発現を再確立し、したがって、Ｅ１ａの発現は、もっぱら、挿入されたプロモーターによるものであることが示される。
【表２】2004536572.tif 000006
表１.  Ａ５４９非相補細胞におけるＥ１ａの発現
非相補Ａ５４９細胞を、１０、５０、２５０および１２５０ＶＰＣで、いずれかのベクターに感染させた。Ｅ１ａの発現を、感染の２４時間後にＦＡＣＳにより測定した。
【００８０】
Ｅ１ａ ＦＡＣＳアッセイのためのプロトコール
細胞を、感染の前日に１２ウェルプレート中で培養した。翌日に、培地を細胞から吸引し、細胞あたりの粒子数に基づくウイルス投与製剤を該ウェルに加え、そしてプレートを３７℃で４時間揺り動かした。ウイルス／培地を吸引し、１回洗浄し、次いで、完全成長培地で置換し、そして３７℃で２０時間インキュベートした。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ消化液で回収し、そして７０％エタノール中で室温にて２０分間固定した。次いで、細胞を１回洗浄し、そしてＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、０.１％ＮａＮ３)中で再懸濁した。まだ結合していない抗−Ｅ１ａ抗体(Calbiochem, Anti-Adenovirus 2E1A, Human (Ab-1))またはマウスＩｇＧ２ａイソタイプ対照(Sigma M-5409)の１：１０希釈液の１０μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、ＧＡＭ ＰＥ(Sigma P-9670)の１：４０希釈液の５０μｌを加え、そして室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳＣＡＮで２０,０００事象が得られた。
【００８１】
実施例３：アデノウイルスベクターの毒性
Ｂａｌｂ／ｃ  ＳＣＩＤ雄性マウスにおける急性肝毒性を使用して、異なるレベルのＥ１ａ活性を有するアデノウイルスベクターを区別する。血清肝酵素の上昇における充分な相違が、野生型Ｅ１ａ発現を有するベクターと最小限またはＥ１ａを発現しないものとの間で観察される。
【００８２】
各群あたり１０の動物での研究が計画された。対照群は、ＨＢＳＳビヒクル単独、陰性対照Ｅ１ａ欠失Ａｄｄｌ３１２およびＥ１ａ含有陽性対照Ａｄｄｌ３２７であった。ウイルスを、１０ｍｌ／ｋｇの容量で、６.２５×１０１１粒子／ｋｇの投与量で尾静脈中に静脈注射した；等価の投与量のＨＢＳＳ(１０ｍＬ／ｋｇ)をビヒクル対照群に注射した。動物に、実験１日目に注射し、実験４日目に各群の半分を中間屠殺し、そして実験１５日目に残りの動物を最終屠殺した。実験４および１５日目に、すべてのマウスから血清を回収し、そして屠殺群の動物(５／群)から肝臓を除去した。さらに、実験−３、１、３、４、８および１５日目に、生存しているすべてのマウスの体重を測定した。
【００８３】
バックボーンＡｒ６Ｆ、Ａｒ６ＰＡＦ中のＥ１ａ含有アデノウイルスベクターの急性毒性はを比較した。ウイルスは、実施例１において記載したように製造される。体重変化(図７、構築物のマップ、図８参照)および血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベル(表２)に基づいて、Ａｒ６Ｆの肝毒性はＡｒ６ｐＡＦよりも高かった。
表２
【表３】2004536572.tif 000007
*Ar6Fに対する有意差(ｐ＜０.０５)
【００８４】
本明細書において引用されたすべての特許、刊行物(公開特許公報を含む)およびデータベースのアクセス番号は、これらのそれぞれの特許、刊行物およびデータベース番号が具体的かつ個別的に引用によりその全体が本明細書に取り込まれていると記載されているのと同様に、引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【図１】
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【図２】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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