(57)【要約】サンプル中の複数の異なる分析物（例えば、核酸、タンパク質、糖類など）標的の、それらを「相補的な」結合相手（例えば、相補的核酸、リガンド、抗体など）と結合させることによる検出のためのフロースルーマイクロチャネル（例えばキャピラリー）バイオセンサが記載される。結合相手はマイクロチャネル（例えば、溶融シリカキャピラリー）の異なるセクションに固定化される。バイオセンサの製作の後、サンプルがキャピラリー内に流され、サンプル内に含まれるいずれかの標的分析物はマイクロチャネル壁の固定化された結合相手と結合し、結合複合体を形成する。最後に、結合複合体はキャピラリーの全長に沿って同時に変性され、下流に配備された検出器を通過して流され、分析物濃度が（例えば、シヌソイドボルタンメトリーを用いて）測定される。
2004500549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の２つ以上の標的分析物を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ｉ）該２つ以上の分析物の各々に対する結合対がその中に固定されているチャネルを提供する工程であって、ここで該２つ以上の分析物の各々に対する結合対は、該チャネルの異なる領域に位置づけられ、そして該チャネルは、十分に小さい断面積を有し、その結果、該２つ以上の結合対から、該チャネルを通って流れている流体に分析物が放出される場合に、該分析物が該結合対から下流にある該チャネルの検出点に到達するまで、該分析物が空間的に隔離されたままである、工程；
ｉｉ）サンプルを含む流体を、該流体中に存在する該標的分析物がそれらのそれぞれの結合対と結合するような条件下で、該チャネルを通して流す工程であって、それによって該分析物を該チャネルに沿って空間的にコード化する、工程、
ｉｉｉ）該分析物を、該結合対から、該チャネルに沿って流れている流体へ放出する工程；および
ｉｖ）該結合対から下流にある該チャネルに沿った位置で、該分析物を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記分析物が標識されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チャネルが毛細管である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記毛細管がキャピラリー電気泳動管である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記チャネルが、表面にエッチングされたチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記チャネルが、ガラス表面にエッチングされたチャネルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記チャネルが成型されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記チャネルが、ポリマー材料で成型されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記チャネルが、約１未満のレイノルズ数（Ｒｅ）を提供する断面積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記チャネルが、約１００μｍ未満の断面直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上の標的分析物が、少なくとも３つの異なる分析物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合対が、抗体、結合タンパク質、および核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合対が核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記流体を流す工程が、圧力差によって誘導される流体流れである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体を流す工程が、電気浸透流体流れである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流体が、血液、血漿、血清、尿、口腔液、脳脊髄液、およびリンパからなる群より選択されるサンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程が、吸光分光法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出工程が、シヌソイドボルタンメトリーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析物が核酸であり、前記検出工程が、１×１０−９Ｍ未満の濃度で標的分析物を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中の２つ以上の分析物を検出するためのデバイスであって、該デバイスは、以下：
該２つ以上の分析物の各々に対する結合相手がその中に固定されているチャネルであって、ここで該２つ以上の分析物の各々に対する該結合相手は、該チャネルの異なる領域に位置づけられ、そして該チャネルは、十分に小さい断面積を有し、その結果、該２つ以上の結合相手から、該チャネルを通って流れている流体に分析物が放出される場合に、該分析物が該結合相手より下流にある該チャネルに沿った検出点に到達するまで、該分析物が空間的に隔離されたままである、チャネル；および
該分析物を、該チャネル内の該検出点で検出する、検出器、
を備える、デバイス。
【請求項２１】
前記チャネルが毛細管である、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記毛細管が、キャピラリー電気泳動管である、請求項２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記チャネルが、表面にエッチングされたチャネルである、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記チャネルが、ガラス表面にエッチングされたチャネルである、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記チャネルが、約１未満のレイノルズ数（Ｒｅ）を提供する断面積を有する、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記チャネルが、約１００μｍ未満の断面直径を有する、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記２つ以上の標的分析物が、少なくとも３つの異なる分析物を含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記結合相手が、抗体、結合タンパク質、および核酸からなる群より選択される、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記結合相手が核酸である、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記検出器が、吸光分析計を備える、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記検出器が、シヌソイド電圧電流計を備える、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項３２】
流体中の２つ以上の標的分析物の検出のためのキットであって、該キットは、該２つ以上の分析物の各々に対する結合相手がその中に固定されているチャネルを備え、ここで該２つ以上の分析物の各々に対する該結合相手は、該チャネルの異なる領域に位置づけられ、そして該チャネルは、十分に小さい断面積を有し、その結果、該２つ以上の結合相手から、該チャネルを通って流れている流体に分析物が放出される場合に、該分析物が該結合相手より下流にある該チャネルに沿った検出点に到達するまで、該分析物が空間的に隔離されたままである、
キット。
【請求項３３】
前記キットが、複数の前記チャネルを備える、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記複数のチャネルを含む前記チャネルの各々が、結合相手の固有の収集を有する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記チャネルが毛細管である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記毛細管が、キャピラリー電気泳動管である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記チャネルが、表面にエッチングされたチャネルである、請求項３３に記載のキット。
【請求項３８】
前記チャネルが、ガラス表面にエッチングされたチャネルである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記チャネルが、約１未満のレイノルズ数（Ｒｅ）を提供する断面積を有する、請求項３３に記載のキット。
【請求項４０】
前記チャネルが、約１００μｍ未満の断面直径を有する、請求項３３に記載のキット。
【請求項４１】
前記チャネルが、少なくとも３つの異なる種の結合相手を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項４２】
前記結合相手が、抗体、結合タンパク質、および核酸からなる群より選択される、請求項３３に記載のキット。
【請求項４３】
前記結合相手が核酸である、請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、すべての目的で本明細書中にその全体が参考として援用される、１９９９年７月２１日出願の米国特許出願第０９／３５８，２０４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（連邦後援研究開発の下で行われる発明の権利に関する申し立て）
本研究は、国立予防衛生研究所（ＧＭ４４１１２−０１Ａ１）およびＵＣ　ＢｉｏＳＴＡＲプロジェクトによって支援された。アメリカ合衆国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、診断の分野に関する。詳細には、本発明は、複数の分析物の迅速な検出および／または定量を可能にしながらも、標識または標識づけ工程の使用を必要としないデバイスおよび方法を提供する。
【０００４】
（発明の背景）
イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーション化学は、遺伝的欠陥を検出する、疾病診断を実行する、および予後の評価を実行するという目標に向けて急速に開発されている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１１９−１１２３）。抗体、核酸結合タンパク質、レセプターリガンドおよび核酸は、非常に特異的にかつ高効率で、適切な条件下で各自の同系の「結合相手」と結合することが知られている。この現象は、病原体（例えばＨＩＶ）、病理学的状態（例えば、癌、肝臓病、腎臓病、変性関節疾患など）、薬物乱用（例えば、コチニンなどといった生成物の検出）などの認識および診断に頻繁に使用されている。
【０００５】
多数の疾病マーカーおよび病原体マーカー（例えば、タンパク質および／または核酸）が周知であり、完全に特徴づけられてきた。従って、そのようなマーカーと特異的に結合する結合相手（例えば、核酸、抗体など）は、合成および／または単離され、疾病状態または病原体の認識のためのマーカーとして使用することができる（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：２２９、Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，８：１５−１９）。様々なアッセイが、そうした方法を用いて微生物学実験室または病理学実験室において日常的に行われている。
【０００６】
核酸ハイブダイゼーション、抗体結合反応、タンパク質結合反応およびレクチン結合反応は一般に、分子に（例えばＤＮＡの二重らせんに）挿入するかまたは、標的もしくはプローブ分子のどちらか一方に共有結合で固定されるかのどちらかである標識の使用によって検出される（例えば、Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１１９−１１２３、ＬｅＰｅｃｑおよびＰａｏｌｅｔｔｉ（１９６６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７：１００−１０７、ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＳｋｏｃｚｙｌａｓ（１９７７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８３：２５２−２５７参照）。場合によっては、電気化学発光もまた、挿入された電気活性発光マーカーを検出するために使用されている（Ｐｏｌｌａｒｄ−Ｋｎｉｇｈｔら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８５：８４−８９、Ｐｏｌｌａｒｄ−Ｋｎｉｇｈｔら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８５：３５３−３５８、Ｔｉｚａｒｄら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１２：４５１４−４５１８）。これらの検出戦略の全部は、プローブと標的分子との間の結合反応の前（例えば共有結合標識づけのために）または後（例えば挿入または間接的標識づけのために）のどちらか一方で、標的またはプローブ分子の誘導体化を必要とする。これは汚染問題をもたらす。さらに、複数の分析物が同時に分析される場合、複数の標識が使用されなければならない。さらに、煩雑なサンプル取扱が要求され、それはさらに、汚染のリスクを増大しかつ／または誤った分析につながる。上記および他の問題は、本発明によって克服される。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、サンプル中の複数の分析物を検出および／または定量化する新規なデバイスおよび方法を提供する。本発明は、各自の同系の「結合相手」（例えば、核酸、抗体、レクチンなど）と結合した後に、サンプル中の異なる標的分析物（例えば、核酸）を検出するフロースルー微小流体（例えばキャピラリー）バイオセンサを提供する。一般に、各種分析物に特異的な結合相手「プローブ」が、例えば感光性ビオチン／アビジン技術を用いるなどして、キャピラリーチャネルの異なるセクションに固定化される。サンプルがその後キャピラリー内にフラッシュされ、その結果、標的分析物はキャピラリー壁に固定化された結合相手（捕獲剤）と結合し、残りのサンプルはキャピラリーから溶離される。最後に、複合体を形成した（結合した）分析物は、チャネルの全長に沿って放出され、検出器を通過してフラッシュされる。好ましい実施形態において、脱着した標的−分析物は、下流に配備された銅電極においてシヌソイドボルタンメトリーを用いて検出される（ＳｉｎｇｈａｌおよびＫｕｈｒ（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：３５５２−３５５７、Ｓｉｎｇｈａｌら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６６２−１６６８）。標的分析物の溶離から検出までの時間は、個々の分析物の正体を決定するために使用される。同一種の分子の（例えば、すべて核酸）、または異なる種（例えば、タンパク質および核酸）の複数の分析物が、このようにして単一のバイオセンサを用いて診断できる。センサは、特異的な結合相手の使用により高度に特異的であり、電気化学的検出により極めて高感度である。
【０００８】
従って、１実施形態において、本発明は、サンプル中の２以上の分析物を検出するデバイスを提供する。このデバイスは、２以上の分析物の各々の結合相手が固定されているチャネルを含み、ここにおいて、２以上の分析物の各々の結合相手はチャネルの異なる領域に配置されており、チャネルは十分に小さい断面積を有しており、それによって分析物が２以上の結合相手からチャネル内を流れる流体に放出されたときに、分析物は、結合相手から下流のチャネルに沿った検出ポイントに、またはその端に、そして検出ポイントで分析物を検出する検出器に到達するまで、空間的に分離されたままである。
【０００９】
チャネルは、例えば毛細管、キャピラリー電気泳動管、表面にエッチングされたチャネル、表面上にプリントされた疎水剤により形成されたチャネルなど、あらゆる便宜的なチャネルであり得る。チャネルは、分析物が、チャネルにおける検出領域またはチャネル端に到達したときに識別されるように十分に分離され続ける限り、本質的にあらゆる寸法を有することができる。好ましいチャネルは、約１未満のレイノルズ数（Ｒｅ）を与える断面積を有する。好ましいチャネルは、約５００μｍ以下の、より好ましくは約１００μｍ以下の、最も好ましくは約５０μｍ以下の、断面直径または幅を有する。特に好ましいデバイスにおいて、２以上の標的分析物は、少なくとも３、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも５００の異なる分析物（および、それゆえその多数の異なる結合相手）を含む。以下に限らないが、抗体、結合タンパク質および核酸を含め、多種多様な結合相手が適切である。同様に、多くの検出器が適切であり、分光光度計（例えば、吸光度分光光度計）および（本質的にあらゆる電流測定および／またはボルタンメトリーおよび／または電位差および／または電量分析検出器を含む）電気分析的検出器が挙げられる。好ましい検出器としては、電圧電流計、特にシヌソイド電圧電流計が挙げられる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、サンプル中の２以上の標的分析物を検出する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載される検出デバイスを提供する工程；ｉｉ）サンプルを含む流体を、流体に存在する標的分析物がそれぞれ各自の結合相手と結合する条件下でチャネルを通過させ、それにより分析物をチャネルに沿って空間的にコード化する工程；ｉｉｉ）チャネルに沿って通過している流体の流れに分析物を結合相手から放出する工程；ｉｖ）結合相手から下流のチャネルに沿った位置で分析物を検出する工程を包含する。好ましい方法において、分析物は標識づけされない。特に好ましい実施形態において、分析物は標識づけされない。特に好ましいデバイスにおいて、２以上の標的分析物は、少なくとも３、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも５００の異なる分析物を含む（そしてそれゆえ、その多数の異なる結合相手が検出デバイスを含むチャネルに存在する）。いくつかの好ましい実施形態において、流体流れは、圧力差および／または電気浸透流によって誘起される。流体流れ。分析物の検出のために好ましい「サンプル」流体としては、血液、血漿、血清、尿、口腔内液、脳脊髄液およびリンパが挙げられる。検出は、分光光度計（例えば、吸光度分光光度法）および（本質的にあらゆる電流測定および／またはボルタンメトリーおよび／または電位差および／または電量分析法を含む）電気分析的方法を含む、多様な方法によることができる。好ましい検出方法は、ボルタンメトリー、特にシヌソイドボルタンメトリーである。特に好ましい方法において、分析物は核酸であり、検出は１×１０−９Ｍ未満の濃度で標的分析物を検出する。
【００１１】
（定義）
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中では、アミノ酸残基の重合体を指すために互換可能に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸重合体だけでなく、天然に存在するアミノ酸重合体にもあてはまる。
【００１２】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される通り、インタクトな免疫グロブリン、軽鎖および重鎖の可変領域だけを含んでいるＦｖフラグメント、ジスルフィド結合により結合されたＦｖフラグメント（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５４７−５５１）、可変領域と定常領域の部分を含んでいるＦａｂまたは（Ｆａｂ）’２フラグメント、一本鎖抗体などを含む、様々な形態の修飾または改変された抗体を含む（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２４−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）。抗体は、動物（特にマウスまたはラット）またはヒト由来であり得るか、またはキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）もしくはヒト化（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；および公開イギリス特許出願＃８７０７２５２）であり得る。
【００１３】
用語「結合相手」または「捕獲剤」または「結合ペア」のメンバーは、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどといった結合複合体を形成するために他の分子と特異的に結合する分子をいう。特に好ましい実施形態において、結合は、非共有結合（例えばイオン、疎水）相互作用によって主として成立する。
【００１４】
用語「特異的に結合する」は、本明細書中で使用されるように、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を指す場合に、分子（例えば、タンパク質および他の生物学的製剤）の異種集団における生体分子の存在を決定づける結合反応をいう。従って、指定された条件下で（例えば、抗体の場合におけるイムノアッセイ条件、または核酸の場合におけるストリンジェントハイブリダイゼーション条件）、特定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」分子と結合し、サンプル中に存在する他の分子と有意な量で結合しない。
【００１５】
用語「チャネル」は、流体の流れを特定の方向に導く経路をいう。チャネルは、底部および側部を有する溝もしくはトレンチ、または完全に包囲された「管」として形成することができる。一部の実施形態では、チャネルは「側部」を有する必要さえない。例えば、疎水性ポリマーを平坦な表面に適用し、それによって狭い（例えば親水性）範囲でその表面での流体の流れを制限および／または誘導することができる。チャネルは好ましくは、結合相手（捕獲）薬剤が固定され得る少なくとも１つの表面を備える。
【００１６】
「標的分析物」は、サンプルにおいて検出および／または定量化されるべきあらゆる単数または複数の分子である。好ましい標的分析物としては、核酸、抗体、タンパク質、糖類などの生体分子が挙げられる。
【００１７】
用語「マイクロチャネル」は本明細書中で、低レイノルズ数操作（Ｒｅ≦１、好ましくはＲｅ≦０．１、より好ましくはＲｅ≦０．０１、最も好ましくはＲｅ≦０．００１）を可能にする寸法を有するチャネルについて使用される。一般に低レイノルズ数操作、流体力学は、慣性力よりもむしろ粘性力によって支配される。
【００１８】
用語毛細管（キャピラリー）は、狭い寸法の管（例えば一般に低Ｒｅの流れを与える）をいう。開放端毛細管は、水と接触したときに、一般に毛管作用によって水を吸い上げる。毛細管は、以下に限らないが、ガラス、プラスチック、石英、セラミックおよび各種ケイ酸塩を含む、多くの材料で製作することができる。
【００１９】
「キャピラリー電気泳動管」は、キャピラリー電気泳動デバイスにおいて、そのために設計および／または一般に使用される、または使用されるように意図された「毛細管」をいう。
【００２０】
用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に同等の語句は本明細書中で、共有結合により一体に結合された少なくとも２個のヌクレオチドをいう。本発明の核酸は好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては以下に概説するように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５）およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１  ：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７参照）を含む、交互骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。他の類似の核酸は、陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、ならびに米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号ならびに前掲書第６章およ���第７章（ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編）に記載のものを含む、ノンリボース骨格を備えるものを含む。１以上の炭素環式糖類を含有する核酸もまた、核酸の定義の内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９−１７６頁参照）。いくつかの核酸アナログがＲａｗｌｓ（Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．２，１９９７，３５頁）に記載されている。リボース−リン酸塩骨格のこれらの修飾は、標識といった付加的部分の付加を容易にするか、または生理学的環境における当該分子の安定性および半減期を増大させるために行うことができる。
用語「と特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」および「と選択的にハイブリダイズする」は、本明細書中で使用される通り、ストリンジェント条件の下で特定のヌクレオチド配列に対する選択的な、核酸分子の結合、二重化またはハイブリダイジングをいう。用語「ストリンジェント条件」は、プローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズし、そして他の配列とは少ない程度にするかまたはまったくしない条件をいう。核酸ハイブリダイゼーションの状況におけるストリンジェントハイブリダイゼーションおよびストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件は、配列依存的であり、異なる環境パラメータの下で異なる。核酸ハイブリダイゼーションの包括的な手引きは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  第Ｉ節，第２章，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（Ｔｉｊｓｓｅｎ）に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いものであるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度およびｐＨの下で）標的配列の５０％が、完全に合致したプローブとハイブリダイズする温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しいように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットにおいてアレイまたはフィルタに１００を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、標準ハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹおよび以下の詳細な説明を参照）、ハイブリダイゼーションは終夜で実行される。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、約１５分間、７２℃での０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェント洗浄条件の一例は、ＳＳＣ緩衝液の種目の場合、１５分間、６５℃での０．２×ＳＳＣ洗浄である（例えば前掲Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。たいてい、バックグラウンドプローブ信号を除去するために、高ストリンジェンシー洗浄には低ストリンジェンシー洗浄が先行する。例えば１００を超えるヌクレオチドの二重化のための中程度のストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間、４５℃での１×ＳＳＣである。例えば１００を超えるヌクレオチドの二重化のための低ストリンジェンシー洗浄の一例は、１５分間、４０℃での４×〜６×ＳＳＣである。
【００２１】
「空間的分離」は、流体ストリームにおける２以上の種の分子（例えば分析物）の濃度分布の局在化の相違をいう。分析物が空間的に分離された（すなわち、フローコード化された）場合、たとえ分析物の全部の信号のタイプが同一であったとしても、目的の個々の分析物の個別の信号を検出することが可能である。従って、分析物の正体は検出の「流路」に沿った位置または時間によって決定することができ、個々の分析物に関係する標識の相違は要求されない。
【００２２】
電気分析的方法は、その系に関する情報を取り出すために系または分析物の「電気的」特性（例えば、抵抗、コンダクタンス、キャパシタンス、インピーダンスなど）を利用する方法をいう。電気分析的方法としては、本質的にあらゆる電流測定および／またはボルタンメトリーおよび／または電位差および／または電量分析方法が挙げられる。好ましい電気分析的方法としては、サイクリックボルタンメトリー、交流、直流または回転リングディスクボルタンメトリー、シヌソイドボルタンメトリー、インピーダンス分光法などが挙げられる。
【００２３】
用語「サイクリックボルタンメトリー」または「経時変化ボルタンメトリー」は、サイクリックボルタンメトリーを指すために互換可能に使用される。用語「シヌソイドボルタンメトリー」は、一般に（例えば、以下に限らないが、方形波、三角波などを含むいずれかの経時変化電圧による）サイクリックボルタンメトリーを指すため、または例えば米国特許第５，６５０，０６１号に記載の通り、サイクリックボルタンメトリーと類似の態様で使用される大振幅正弦波電位波形の使用を指すために使用される。
【００２４】
（詳細な説明）
（Ｉ．複数分析物の効率的検出方法）
本発明は、サンプル中の複数の分析物の迅速な検出および／または定量化のための新規な方法および器械を提供する。好ましい１実施形態において、本発明は、検出が望まれる分析物に特異的な結合相手をその中に固定したチャネルを含む。異なる結合相手がチャネルの異なる領域に配置されるので、分析物が結合された時に、それらはチャネルに沿った各自の位置によって「空間的にコード化される」。結合された分析物は後に結合相手から解放されるか、または、結合相手／分析物複合体はチャネルの壁から、チャネル内を流れる流体中に放出される。チャネルの寸法は、分析物が上記結合相手から下流のチャネルの検出ポイントに到達するまで分析物が空間的に分離され続けるようなものである。
【００２５】
分析物または分析物／結合相手複合体が流れに放出されると、それらは空間的にコード化される。すなわち、ストリームでの相互に対する各自の位置は、それらがチャネル壁に固定されていた時の結合相手の位置に依存する。従って、放出と検出との間の時間差は、出力信号を生成する（または生成しない）特定の分析物を特異的に識別するために使用することができる。
【００２６】
分析物が各々、それらを他の分析物から区別するために標識を使用することなく特異的に識別され得るので、多数かつ冗長なサンプル取扱および標識化工程が排除される。これは多数の標識化および汚染問題を取り除く。また、偽陽性の高い発生率につながり得るサンプル汚染のリスクも低減または排除される。
【００２７】
チャネルが使用前に良好に準備でき、各種微小流体構造（例えばチャネル）がサンプル取扱、流体の流れおよび分析物検出を行うデバイスの内外へ交換できることが特筆される。異なるチャネルが異なる集合の分析物に合わせて備えることができ、同一または異なる複数のチャネルが同時に実行され得る。
【００２８】
従って、本発明の方法およびデバイスは、臨床環境における分析物の検出に良好に適する。非誘導体化分析物（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、等）を検出する能力は、手順を著しく簡素化し、サンプル汚染および誤った識別の問題の防止を助成する。
【００２９】
特に好ましい１実施形態において、サイクリック（例えばシヌソイド）ボルタンメトリーによる銅電極の使用は、従来の電気化学的測定法が遭遇する問題の多くを克服し、それによって分析物の検出を可能にする。その検出戦略の高感度は、周波数ドメインにおける容量性バックグラウンド電流からのファラデー信号の効果的な減結合に起因している。従って、例えばｓｓＤＮＡやｄｓＤＮＡはピコモル濃度レンジにおいて検出することができ、電気化学的信号は、同じサイズのｓｓＤＮＡに比べて、ＤＮＡ二重らせんの外周の容易にアクセスできる糖類の酸化に起因する。
【００３０】
ただ１個の検出器を使用して複数の標的を検出できるセンサが、製作も容易なより安価かつ小型の検出システムを提供する。
【００３１】
（ＩＩ．システム構成要素）
（Ａ）チャネル）
（１）チャネルのタイプおよび寸法）
チャネルは、チャネルに沿った異なる位置で溶液中の成分間の本質的な混合を伴わずにチャネル内部の物質の通過を可能にする限り、事実上どのようなタイプのチャネルでも本発明の実施に適する。すなわち、好ましいキャピラリーにおいて、チャネルに沿った個別の場所で最初に放出された分析物（または他の検出可能な試薬）は、初期放出ポイントから「下流」の検出ポイントで空間的に分離され続ける。空間的分離とは、たとえ分析物の全部に関する信号のタイプが同一であったとしても、目的の各分析物の個別の信号を検出できる能力をいう。従って、分析物の正体は「流路」に沿った位置または検出の時間によって決定することができ、個々の分析物に関係する標識の相違は要求されない。
【００３２】
しかし、空間的分離は分析物相互の完全な分離を要求するものではない。反対に、相当の重なり合いが存在することができ、ピーク濃度が検出でき、関係する濃度プロフィールが測定および／または計算されて陽性／陰性検出および／または完全な分析物定量化を与えることができる。
【００３３】
本発明での使用に特に好ましいチャネルは、「マイクロチャネル」である。本明細書中で用語「マイクロチャネル」は、低レイノルズ数操作を可能にする寸法を有するチャネル、すなわち、流体の動力学が慣性力よりもむしろ粘性力により支配されるものについて使用される。粘性力に対する慣性力の比とも時にいわれるレイノルズ数は、以下により与えられる。
【００３４】
Ｒｅ＝ρｄ２／ητ＋ρｕｄ／η
ここに、ｕは速度ベクトル、ρは流体の密度、ηは流体の粘度、ｄはチャネルの特性寸法、τは速度が変化する時間スケールである（ここでｕ／τ＝δｕ／ｄｔ）。用語「特性寸法」はここで、当業で周知の通り、レイノルズ数を決定する寸法について使用されている。円筒形チャネルの場合、それは直径である。矩形チャネルの場合、それは基本的に幅および深さのうちの小さい方に依存する。Ｖ字形チャネルの場合、それは「Ｖ」の頂部の幅に依存する、といったことになる。様々な形態学的チャネルに関するＲｅの計算は、流体力学の標準的な教科書に見ることができる（例えば、Ｇｒａｎｇｅｒ（１９９５）Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，Ｄｏｖｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｍｅｙｅｒ（１９８２）ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｄｏｖｅｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【００３５】
定常状態（τ→∞）における流体の流れの挙動は、レイノルズ数Ｒｅ＝ρｕｄ／ηによって特徴づけられる。マイクロ加工された流体システムは、小サイズおよび低速度のために、たいてい低レイノルズ数レジーム（Ｒｅはほぼ１未満）にある。このレジームでは、乱流および二次流れ、従って流れ内部での混合を生じさせる慣性効果が無視でき、粘性効果が動力学を支配する。こうした条件下では、チャネル内の流れは一般に層状である。
【００３６】
レイノルズ数が、チャネル寸法だけでなく、流体密度、流体粘度、流体速度および、速度が変化する時間スケールにも依存するので、チャネル直径の絶対上限は明確には規定されない。実際、良好に設計されたチャネル幾何学形状によれば、乱流はＲ＜１００について、ことによるとＲ＜１０００について回避することができ、従って相対的に大きいチャネルサイズを有する高処理能システムが可能である。好ましいチャネル特性寸法範囲は、約０．５μｍないし１００ｍｍである。約１μｍ〜約１００μｍの特性寸法のチャネルレンジが特に好ましく、約５μｍ〜約１００μｍが最も好ましい。より好ましいレンジは、約５μｍないし５０μｍである。
【００３７】
本発明のデバイスは低レイノルズ数操作に制限される必要はない。結合プローブが広く離間され、それゆえ放出された分析物が流れにおいて広く離間される場合、異なる分析物が互いの信号を「オーバラップしたり」マスクすることなく、かなりの対流混合がチャネルにおいて生起し得る。さらに、２分析物のかなりの混合が生起し得て、２分析物のピーク濃度間に著しい（例えば、統計的に有意な）空間分離が存在する限り、信号は区別可能であり、各分析物の検出が行い得ることが理解されよう。しかし、分析物が混合し合うにつれて、各個別の分析物の定量化は次第により難しくなるかもしれない。それにもかかわらず、そうした状況でさえ、各分析物に積分信号の近似を与えるために濃度ピークの位置およびフォールオフ率に基づく分析物の空間分布を評価またはモデル化することによって、定量化を得ることができる。
【００３８】
上述の通り、上述の混合要求条件が満たされる限り、あらゆるチャネル構成が適格である。従って、適切なチャネルには、以下に限定されないが、対向する障壁、無蓋溝、閉渠などによって形成されるチャネルを含む。チャネルは、例えば円形、方形、矩形、三角形、ｖ字状、ｕ字状、六角形、八角形、不規則形など、事実上あらゆる断面を有することができる。本発明において使用されるチャネルは連続的である必要もない。従って例えば、チャネルは、多孔性粒子の集合体、共重合体または架橋重合体などによって形成することができる。
【００３９】
その中を通過する溶液に対し材料が本質的に安定している限り、あらゆるチャネル材料が本発明の実施に適する。好ましい材料は、結合相手と結合できるかまたは結合するように誘導体化することができる、または結合相手のリンカーである。さらに、好ましい実施形態において、材料は、それが分析物と実質的に結合しないように選択および／または改質される。また好ましい材料は、プローブを固定することが望まれる所以外の領域においてプローブと結合しないか、または別様に相互作用しない。
【００４０】
特に好ましい材料は、以下に限定されないが、ガラス、ケイ素、石英または他の鉱物、プラスチック、セラミックス、金属、紙、メタロイド、半導体、セメントなどを含む。さらに、タンパク質（例えばゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドといったゲルを形成する物質を使用することができる。天然および合成両方の、多種多様な有機重合体および無機重合体が、固体表面の材料として使用され得る。例示的な重合体は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどを含む。
【００４１】
導電性または半導電性基板の場合、好ましくは基板に絶縁層が存在する。これは、デバイスが電気的要素を組み込む場合（例えば、電気的流体方向システム、センサなど、または電気浸透力を使用してシステムの周りで材料を移動させる）、特に重要である。重合体基質の場合、基質材料は、それらが意図される用途に応じて、硬質、半硬質、または非硬質、不透明、半透明または透明とすることができる。例えば、光学的または視覚的検出要素を含むデバイスは一般に、その検出を可能にするか、または少なくとも助成するために、少なくとも部分的に、透明材料により製作される。あるいはまた、例えばガラスまたは石英の透明な窓が、こうした形式の検出要素についてデバイスに採り入れられ得る。付加的に、重合体材料は、直鎖または枝分かれ主鎖を有し、架橋されるか、または非架橋とすることができる。特に好ましい重合体材料の例は、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＶＰＣ）、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネートなどを含む。
【００４２】
チャネルはより大きい物体の構成要素とすることができる。従って、チャネルは、多数のチャネルを得るために１個以上の他のチャネルと組み立てることができ、それによって複数の異なるアッセイを同時に実行することができる。チャネルは、適切な液体取扱および／または検出および／またはサンプル取扱／適用機能を含む器械の構成要素とすることができる。
【００４３】
また、チャネルは、本発明のアッセイを実行する器械に適宜「プラグイン」できる再使用可能または使い捨てのユニットとして製作することができる。チャネルは、以下に限定されないが、マイクロ滴定皿（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレンまたはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、計量棒（例えばガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、マイクロ遠心分離管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属または重合体ビーズを含む、多種多様な物体のうちのいずれか１個以上に備え得ることが理解される。
【００４４】
特に好ましい実施形態では、１個以上のチャネルが、キャピラリー管（例えばキャピラリー電気泳動管）として、ガラスまたはケイ素スライドに、キャピラリーチャネルとして設けられるか、または液体の流れの制御、サンプルの適用および／または信号の検出のためのオンボード回路要素を有する「集積回路」の要素として製作される。最も好ましい実施形態において、チャネルは、本明細書中の実施例において例示したように、例えばキャピラリー電気泳動管などのキャピラリーとして備えられる。
【００４５】
（２）チャネル製作）
本発明のチャネルを製作する方法は、当業者には公知である。例えば、チャネルが１個以上のキャピラリーから形成される場合、キャピラリーは市販業者（例えばＰｏｌｙｍｉｃｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｚ）から購入するか、または従来のキャピラリー「引抜き」械によって引抜きまたは押出しすることができる。
【００４６】
表面上にチャネルを製作する場合、それらは標準の技法によって形成でき、例えば、機械加工、成形、彫刻、エッチング、積層、押出または堆積などが可能である。
【００４７】
好ましい１実施形態において、チャネルは、固体電子産業で公知のマイクロマシニングプロセス（例えばフォトリソグラフィ）を用いて製作される。通例、マイクロデバイス、例えばマイクロチャネルは、集積回路を製造するために使用される半導体ウェーハの形で広範に入手可能な結晶ケイ素といった半導体基板から、またはガラスから作成される。材料の共通性のため、半導体ウェーハ基板からのマイクロデバイスの製作は、集積回路（ＩＣ）製造のために半導体加工業によって開発された表面エッチング技法およびバルクエッチング技法両方の幅広い経験を活用できる。
【００４８】
ＩＣ製造において半導体ウェーハに薄い表面パターンを形成するために使用される表面エッチングは、可動要素を作成するために半導体材料の薄層の犠牲アンダーカットエッチングを可能にするように修正できる。ＩＣ製造において一般に、異方性エッチングプロセスを用いてウェーハに深いトレンチを形成する際に使用されるバルクエッチングは、マイクロデバイスにおいてエッジまたはトレンチを精密に機械加工するために使用することができる。ウェーハの表面エッチングおよびバルクエッチングは両方とも、ウェーハからマスクされていない材料を取り去るために水酸化カリウム溶液といった化学薬品を使用する、「ウェット処理」により行うことができる。マイクロデバイス作成には、各種チャネル要素を形成するために、材料の示差的な結晶方位に頼る、または電気化学的エッチストップの使用に依存する、異方性ウェット処理技法を使用することさえ可能である。
【００４９】
マイクロデバイス設計の相当の自由を許す別のエッチング処理技法は、一般に「ドライエッチング処理」として知られている。この処理技法は、微細構造の異方性エッチングに特に適する。ドライエッチング処理は、ウェーハ原子を気相に移すためにウェーハを高エネルギー原子またはイオンで衝撃する高異方性スパッタリングプロセスから（例えば、イオンビームミリング）、揮発性反応生成物の形成を誘起するために化学的反応性イオンを含んでいるプラズマストリームをウェーハに対して誘導するやや等方性の低エネルギープラズマ技法にまで及ぶ、多くの気相またはプラズマ相エッチング技法を含む。
【００５０】
高エネルギースパッタリング技法と低エネルギープラズマ技法との中間には、反応性イオンエッチングとして知られる特に有用なドライエッチングプロセスがある。反応性イオンエッチングは、同時的なスパッタリングおよびプラズマエッチングのためにイオン含有プラズマストリームを半導体または他のウェーハに対して誘導することを伴う。反応性イオンエッチングは、ウェーハとの反応性プラズマイオンの接触に応答した気相反応生成物の形成のために反応性プラズマイオンを供しながらも、スパッタリングに関係する異方性の利益のいくつかを保持する。実際、ウェーハ材料除去の速度は、単独で行うスパッタリング技法または低エネルギープラズマ技法のどちらか一方に対して著しく増強される。従って、反応性イオンエッチングは、相対的に高い異方性エッチングレートが持続可能であることにより、マイクロデバイス作成のための優れたエッチングプロセスとなる可能性を有する。上述のマイクロマシニング技法は、他の多くのことと同様、当業者には公知である（例えば、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ（１９９７）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｃ．Ｐｈｏｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ，Ｂａｒｄ  ＆  Ｆａｕｌｋｎｅｒ（１９９７）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ参照）。さらに、ケイ素またはホウケイ酸ガラスチップでのマイクロマシニング技法の使用の実例は、米国特許第５，１９４，１３３号、同第５，１３２，０１２号、同第４，９０８，１１２号および同第４，８９１，１２０号に見ることができる。
【００５１】
１実施形態において、チャネルは、ケイ素（１００）ウェーハにおいて、チャネルおよび接続をパターン形成するために標準のフォトリソグラフィ技法を用いて微細加工される。エチレンジアミン，ピロカテコール（ＥＤＰ）が２段エッチングに使用され、閉液系を付与するためにパイレックス（登録商標）（Ｐｙｒｅｘ）７７４０カバープレートをケイ素の面に陽極接合することができる。この場合、液体接続はケイ素の背部に作ることができる。
【００５２】
上述の通り、好ましい実施形態において、チャネルは、ガラス、石英または、キャピラリー電気泳動管といった他のキャピラリーから製作することができる。
【 ００５３】
他の実施形態では、チャネルは、チャネル壁を形成するために基板に材料を堆積させることによって（例えば、スパッタリングまたは他の溶着技術を用いて）製作できるか、またはチャネルは材料において注型／成形され得る。注型／成形チャネルは、以下に限らないが、様々な金属、プラスチックまたはガラスを含む、多種多様な材料から容易に製作される。特定の好ましい実施形態において、チャネルは各種エラストマー（例えば、アルキル化クロロスルホン化ポリエチレン（Ａｃｓｉｕｍ（登録商標））、ポリオレフィンエラストマー（例えばＥｎｇａｇｅ（登録商標））、クロロスルホン化ポリエチレン（例えばＨｙｐａｌｏｎ（登録商標））、ペルフルオロエラストマー（例えばＫａｌｒｅｚ（登録商標））、ネオプレンポリクロロプレン、エチレン−プロピレン−ジエンターポリマー（ＥＰＤＭ）、塩素化ポリエチレン（例えばＴｙｒｉｎ（登録商標））、各種シロキサン重合体（例えばポリジメチルシロキサンなど）で注型される。
【００５４】
（Ｂ）結合相手）
好ましい実施形態において、本発明で使用されるチャネルは、１以上の表面に固定された１個以上の生物学的「結合相手」を保持する。生物学的「結合相手」または「結合ペア」の構成員は、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどといった結合複合体を形成するために、他の分子と特異的に結合する分子または組成をいう。
【００５５】
用語「特異的に結合する」は、本明細書中で使用されるように、生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）を指す時に、タンパク質および他の生物学的製剤の生体分子異種集団の存在を決定づける結合反応をいう。従って、指定された条件下で（例えば、抗体の場合におけるイムノアッセイ条件、または核酸の場合におけるストリンジェントハイブリダイゼーション条件）、指定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」（例えば、タンパク質または核酸）と結合し、他の分子と有意な量で結合しない。
【００５６】
本発明において使用される結合相手は、識別／定量化される標的に基づいて選択される。従って、例えば、標的が核酸である場合、結合相手は、好ましくは核酸または核酸結合タンパク質である。標的がタンパク質である場合、結合相手は好ましくは、そのタンパク質と特異的に結合するレセプター、リガンドまたは抗体である。標的が糖類または糖タンパク質である場合、結合相手は、好ましくはレクチンなどである。
【００５７】
適格な結合相手（捕獲剤）は、以下に限らないが、核酸、タンパク質、レセプター結合タンパク質、核酸結合タンパク質、レクチン、糖類、糖タンパク質、抗体、脂質などを含む。そのような結合相手の合成または単離方法は、当業者には公知である。
【００５８】
（１）結合相手（捕獲剤）の調製）
（ａ）核酸）
本発明において結合相手として使用するための核酸は、当業者に公知の多数の方法のいずれかに従って製造または単離することができる。１実施形態では、核酸は、単離された自然発生核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）とすることができる。自然発生核酸を単離する方法は当業者には公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００５９】
しかし、好ましい実施形態において、核酸は例えば化学合成によって新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）作成される。好ましい実施形態では、核酸（例えばオリゴヌクレオチド）は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：６１５９−６１６８）に記載の通り自動合成デバイスを用いるなどして、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，２２（２０）：１８５９−１８６２）が記載した、固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学的に合成される。必要な場合、オリゴヌクレオチドの精製は一般に、ＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅｇｎｉｅｒ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｎｉｅｒ（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９）に記載の通り、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのどちらか一方によって実行される。合成オリゴヌクレオチドの配列は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄａｖｅ（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５６０）の化学的減成法を用いて確認できる。
【００６０】
（ｂ）抗体／抗体フラグメント）
結合相手（捕獲剤）として使用するための抗体または抗体フラグメントは、当業者に公知の多くの方法によって製造することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ａｎｄ  Ａｓａｉ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３７巻：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．参照）。１方法において、抗体は、認識／捕獲したいと望むエピトープを含んでいる免疫原により動物（例えばウサギ）を免疫にすることによって産生される。多数の免疫原が特異反応性抗体を産生するために使用できる。組換えタンパク質は、モノクロナール抗体またはポリクローナル抗体の産生に好ましい免疫原である。また天然に存在するタンパク質も、純粋または不純な形態のどちらか一方で使用できる。合成ペプチドも同様に、標準のペプチド合成化学によって作成される（例えば、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４頁、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ参照）。
【００６１】
ポリクローナル抗体の産生方法は当業者に周知である。簡単にいえば、好ましくは精製した細胞骨格成分である免疫原を、アジュバントと混合し、動物を免疫にする。その動物の免疫原製剤に対する免疫反応を、試験ブリードを行い、細胞骨格成分および試験組成への反応性の力価を決定することによって監視する。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られた場合、血液を動物から採集し、抗血清が準備される。所要の場合、細胞骨格成分に反応性の抗体について濃縮するために抗血清のさらなる画分を行うことができる。（前掲Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅを参照）。
【００６２】
モノクロナール抗体は、当業者にはなじみの各種技法によって得ることができる。簡単にいえば、所望の抗原で免疫にされた動物からの脾臓細胞を、一般に骨髄腫細胞との融合によって、不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９参照）。不死化の代替方法は、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスまたは当業で周知の他の方法による形質転換を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、抗原について所望の特異性およびアフィニティーの抗体の産生のためにスクリーニングし、そしてそのような細胞により産生されるモノクロナール抗体の収率は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入を含む各種技法によって増強できる。あるいはまた、Ｈｕｓｅら（Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）により概説された一般プロトコルに従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクロナール抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ塩基配列を単離することも可能である。
【００６３】
例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖまたはその他）などの抗体フラグメントも、ファージディスプレイ技術を用いて産生／選択することができる。バクテリアを感染させるウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面に抗体フラグメントを発現できる能力は、１０１０を超える非結合クローンのライブラリーから単一の結合抗体フラグメントを単離することを可能にする。ファージの表面に抗体フラグメントを発現させる（ファージディスプレイ）ために、抗体フラグメント遺伝子がファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子に挿入され、そして抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質がファージ表面にディスプレイされる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。
【００６４】
ファージの表面上の抗体フラグメントが機能性であるので、抗原結合抗体フラグメントを保持するファージは、抗原アフィニティークロマトグラフィー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）によって非結合ファージから単離できる。抗体フラグメントのアフィニティーに依存して、一回のアフィニティー選別について２０倍〜１，０００，０００倍の濃縮率が得られる。しかし、溶離されたファージにバクテリアを感染させることによって、より多くのファージを増殖させ、そしてもう１回の選別を受けさせることができる。このようにして、１回での１０００倍の濃縮が２回の選別において１，０００，０００倍になり得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）。従って濃縮が低い時でさえ（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）、複数回のアフィニティー選別は、稀少ファージの単離をもたらし得る。抗原のファージ抗体ライブラリーの選別が濃縮を結果として生じるので、大多数のクローンは、３〜４回程度の選別の後に抗原を結合する。従って、比較的少数（数百）のクローンを抗原との結合のみについて分析する必要がある。
【００６５】
ヒト抗体は、ファージ上で非常に大きくかつ多様なＶ遺伝子レパートリーをディスプレイすることによって従来の免疫法によらず産生できる（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。１実施形態において、ヒトの末梢血リンパ球に存在する自然のＶＨおよびＶＬレパートリーが、非免疫化ドナーからＰＣＲによって単離された。Ｖ遺伝子レパートリーは、ＰＣＲを用いて無作為に共にスプライスされ、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製し、これはファージベクターにクローンされて３０００万ファージ抗体のライブラリーを作製した（同書）。この単一の「未処理の」ファージ抗体ライブラリーから、結合抗体フラグメントが、ハプテン、多糖類およびタンパク質を含む、１７を超える異なる抗原に対して単離された（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓら（１９９３）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。抗体は、ヒトのサイログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子およびＣＥＡを含む、自己タンパク質に対して産生された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）。また、そのままの細胞で直接選別することによって細胞表面抗原に対する抗体を単離することも可能である。抗体フラグメントは、選別に使用される抗原について非常に特異的であり、１：Ｍ〜１００ｎＭの範囲のアフィニティーを有する（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）。より大きなファージ抗体ライブラリーは、より大きい割合の抗原に対する高い結合アフィニティーの、より多数の抗体の単離を結果として生じる。
【００６６】
（ｃ）結合タンパク質）
１実施形態において、結合相手（捕獲剤）は結合タンパク質であり得る。適格な結合タンパク質は、以下に限らないが、レセプター（例えば、細胞表面レセプター）、レセプターリガンド、サイトカイン、転写因子および他の核酸結合タンパク質、成長因子などを含む。
【００６７】
タンパク質は、天然源から単離するか、単離されたタンパク質から突然変異を誘発させるか、または新規に合成することができる。天然に存在するタンパク質を単離する手段は、当業者に公知である。そのような方法は、以下に限らないが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、周知のタンパク質精製方法を含む（一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．参照）。
【００６８】
タンパク質が標的を可逆的に結合する場合、標的を保持するアフィニティーカラムが、タンパク質をアフィニティー精製するために使用され得る。あるいは、タンパク質は、ＨＩＳタグと組換え的に発現され、そしてＮｉ２＋／ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて精製されることもできる。
【００６９】
別の実施形態では、タンパク質は、標準の化学的ペプチド合成技法を用いて化学的に合成され得る。所望の配列が比較的短い場合、分子は、単一の連続的なポリペプチドとして合成され得る。より大きい分子が所望される場合、部分配列は（１以上の単位で）別個に合成され、その後、一方の分子のアミノ末端と他方の分子のカルボキシル末端との縮合によりペプチド結合を形成することによって融合できる。これは代表的に、商業用ペプチド合成機において単一のアミノ酸を結合するために使用されるのと同じ化学（例えば、Ｆｍｏｃ、Ｔｂｏｃ）を用いて行われる。
【００７０】
配列のＣ末端アミノ酸が不溶性担体に固定された後、配列の残りのアミノ酸の順次的付加を伴う固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成のために好ましい方法である。固相合成の技法については、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６２）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４頁，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６）および、Ｓｔｅｗａｒｔら（Ｓｔｅｗａｒｔら（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）により記載されている。
【００７１】
好ましい実施形態において、それは、組換えＤＮＡ方法論を用いて合成され得る。一般に、これは、結合タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列を作成する工程、特定のプロモーターの制御下の発現カセットにＤＮＡを置く工程、宿主においてタンパク質を発現させる工程、発現したタンパク質を単離する工程、さらに必要な場合、タンパク質を再生させる工程を包含する。
【００７２】
本発明の結合タンパク質または配列をコードするＤＮＡは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限または、Ｎａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）、Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２）および、米国特許第４，４５８，０６６号の固体担体法といった方法による直接的化学合成を含む、上述のような任意の適切な方法によって調製することができる。
【００７３】
所望の結合タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびにＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株および骨髄腫細胞系などの様々な高次の真核細胞を含む、多様な宿主細胞において発現され得る。組換えタンパク質遺伝子は、個々の宿主について適切な発現調節配列と作動可能に連結され得る。大腸菌の場合、これは、Ｔ７、ｔｒｐまたはλプロモーターといったプロモーター、リボソーム結合部位および、好ましくは転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合、調節配列はプロモーターおよび好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどから誘導されたエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含み、また、スプライスドナーおよびレセプター配列を含むこともある。
【００７４】
プラスミドは、大腸菌の場合の塩化カルシウム形質転換および、哺乳動物細胞の場合のリン酸カルシウム処理または電気穿孔といった公知の方法によって、選択された宿主細胞に移入され得る。プラスミドにより形質転換される細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子といったプラスミドに含まれる遺伝子により与えられる抗体への耐性によって選択されることができる。
【００７５】
一旦発現されると、組換え結合タンパク質は、上述のような当業の標準のプロトコルに従って精製され得る。
【００７６】
（ｄ）糖類および炭水化物）
他の結合相手としては糖類および炭水化物を含む。糖類および炭水化物は、天然源から単離するか、酵素により合成するかまたは、化学的に合成することができる。特定の少糖類構造の産生のための経路は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそれらを作製する酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）の使用によるものである。そうした酵素は、少糖類のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成のためのレジオ選択的およびステレオ選択的触媒として使用され得る（Ｉｃｈｉｋａｗａら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：２１５−２３８）。シアリルトランスフェラーゼは補助的なグリコシルトランスフェラーゼとの組合せで使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せを使用することができる。所望の少糖類構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用する多くの方法が公知である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３）ならびに、米国特許第５，３５２，６７０号、第５，３７４，５４１号および第５，５４５，５５３号に記載されている。酵素および基質は初期の反応混合物において組合せられるか、または代わりに、酵素および第２のグリコシルトランスフェラーゼ回路の試薬を、最初のグリコシルトランスフェラーゼ回路が完成に近づいた時に反応媒体に添加することができる。単一の容器において２つのグリコシルトランスフェラーゼ回路を順番に実施することによって、全体の収率は、中間種が単離されるプロトコルよりも改善される。
【００７７】
化学合成の方法はＺｈａｎｇ（Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１（４）：７３４−７５３）により記載されている。簡単にいえば、この方法では、糖ベースの基本単位のセットは、異なる保護基をプレロードされた各基本単位により作成される。基本単位は各保護基の反応性によって格付けされる。その後コンピュータプログラムが、最速のものから最緩のものまで一連の反応が所望の化合物を産生するように、どの基本成分が反応に追加されなければならないかを正確に決定する。
【００７８】
（２）チャネルへの結合相手の付着）
生体分子を多様な固体表面に固定化する多くの方法が当該分野で公知である。所望の成分は、共有結合されるかまたは、特異的または非特異的な結合を介して非共有結合で固定され得る。
【００７９】
化合物と表面との間に共有結合が望まれる場合、表面は通常、多官能性であるか、または多官能化できるものである。表面に存在しそして結合に使用され得る官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などを含み得る。多様な化合物を各種表面に連結する方法は、周知であり、そして文献に豊富に例示されている。例えば、Ｉｃｈｉｒｏ  Ｃｈｉｂａｔａ（Ｉｃｈｉｒｏ  Ｃｈｉｂａｔａ（１９７８）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｈａｌｓｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，（１９７０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９）を参照されたい。
【００８０】
共有結合に加え、アッセイ成分を非共有結合で結合する各種方法を使用することができる。非共有結合は一般に、表面への化合物の非特異的な吸着である。通常、表面は、標識されたアッセイ成分の非特異的な結合を防止するために第２の化合物でブロックされる。あるいは、表面を、それが１成分と非特異的に結合するが別のものとはほとんど結合しないように設計する。例えば、コンカナバリンＡといったレクチンを保有する表面は、炭水化物含有化合物とは結合するが、グリコシル化を欠く標識されたタンパク質とは結合しないであろう。アッセイ成分の非共有結合での固定に使用するための各種固体表面は、米国特許第４，４４７，５７６号および同第４，２５４，０８２号において概説されている。
【００８１】
結合相手が核酸またはポリペプチドである場合、分子は、ｉｎ  ｓｉｔｕで化学的に合成することができる。これは、光不安定性保護基を通常の保護基（例えば、核酸合成において使用されるジメトキシトリチル基（ＤＭＴ））で置換する実質的に標準の化学合成方法を含む。離散した位置でのマイクロチャネルの照射は、モノマー（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）と、照射された部位の成長ポリペプチドまたは核酸との選択的結合を結果として生じる。光指向性重合体合成の方法は当業者には周知である（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９３／０９６６８、さらにＦｏｄｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７参照）。
【００８２】
好ましい実施形態において、結合相手はリンカー（例えば、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカー）を使用して固定され得る。生物学的結合相手を結合するために適格なリンカーは、当業者に周知である。例えば、タンパク質または核酸分子は、以下に限らないが、ペプチドリンカー、直鎖または枝分れ鎖炭素鎖リンカーを含む多様なリンカーのうちのいずれかによって、または複素環式炭素リンカーによって結合され得る。Ｎ−エチルマレイミドの活性エステルといったヘテロ二官能性架橋試薬は、広く使用されている（例えば、Ｌｅｒｎｅｒら（Ｌｅｒｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：３４０３−３４０７）、Ｋｉｔａｇａｗａら（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：２３３−２３６）、ＢｉｒｃｈおよびＬｅｎｎｏｘ（Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ（１９９５）第４章，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．）参照）。
【００８３】
好ましい１実施形態では、結合相手は、ビオチン／アビジン相互作用を用いて固定される。この実施形態において、光不安定性保護基を有するビオチンまたはアビジンが、チャネルに配置され得る。個別の位置のチャネルの照射は、その位置におけるチャネルへのビオチンまたはアビジンの結合を生じる。その後、各々のビオチンまたはアビジンを保持する結合剤がチャネルに配置されて、それは各々の結合相手と結合し、照射部位において局在化される。このプロセスが、結合相手を固定することが望まれる各個別位置において繰り返され得る。
【００８４】
別の適切な光化学的結合方法は、Ｓｉｇｒｉｓｔら（Ｓｉｇｒｉｓｔら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１０２６−１０２８）が記載している。この方法では、有機表面または無機表面とのリガンドの相互作用は、リンカー分子として働くトリフルオロメチル−アリール−ジアジリンを生成するカルベンを有する光活性化可能な重合体によって仲介される。３５０ｎｍにおけるアリール−ジアジリノ官能基の光活性化は高反応性カルベンを産出し、そして共有結合はリガンドおよび不活性表面両方への同時カルベン挿入によって達成される。従って、反応性官能基はリガンドまたは支持材料のどちらにおいても必要ではない。
【００８５】
最も好ましい実施形態において、溶融シリカ（ｆｕｓｅｄ  ｃｉｌｉｃａ）キャピラリー（内径５０μｍ）は、有機塗料で溶融シリカ表面を被覆するためにエポキシ樹脂（Ｅｐｏｔｅｋ３５０）の薄層を塗被される。表面の有機塗料は、キャピラリー壁へのＤＮＡ吸着を最小限にするだけではなく、ＤＮＡプローブが直接固定化できる重合化表面を提供する。エポキシ樹脂でキャピラリー表面を被覆するプロトコルは、Ｌｉｕら（Ｌｉｕら（１９９６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７２３：１５７−１６７）が記載している。簡単にいえば、キャピラリーを、最初にアセトンで１５分間すすぎ洗いした後、２０ｐｓｉの窒素圧下で１時間、１００℃でオーブンにて乾燥した。エポキシ樹脂３１４ＮＤ（Ｅｐｏ−Ｔｅｋ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、エポキシ樹脂混合物のアセトン溶液を吸引することによってキャピラリー表面に動的に被覆した。残留溶剤は、室温で３０分間、窒素を流すことによってエポキシ樹脂被覆キャピラリーから除去された。エポキシ樹脂塗料を８０℃で３０分間、その後２０ｐｓｉの窒素圧下で１５０℃で２時間、架橋した。塗被したキャピラリーは、使用前に３０分間緩衝液で洗浄する。
【００８６】
その後、エポキシ樹脂被覆キャピラリーの１ｃｍセクションに、特定のＤＮＡプローブ溶液を流す。ＤＮＡプローブ溶液は、ＤＮＡプローブを疎水性相互作用および静電相互作用によってキャピラリー壁と結合させるために一晩キャピラリー片と反応させる。他のＤＮＡプローブは、同様の１ｃｍ長の被覆キャピラリー片に同様にして固定される。一旦それがキャピラリー壁に固定化されると、それらのハイブリダイゼーション領域は、脱イオン水ですすいだ後、異なる位置に異なる結合相手を有するキャピラリーバイオセンサに組み立てる準備が整う。
【００８７】
（Ｃ）分析物検出方法）
生物学的分子検出の事実上あらゆる方法が、本発明の方法に従って使用されることができる。各種分析物の正体が、チャネル内を動いている流れにおけるそれらの空間位置によって決定されるので、個々の分析物に関して異なる標識化システムの必要がない。それどころか、このアッセイシステムの１つの利点は、分析物に標識を付ける必要がまったくないということである。
【００８８】
分析物を検出する方法は当業者に周知である。分析物が（例えば、放射性、蛍光性、磁気または質量標識により）標識化されている場合、分析物は、標識を検出することによって検出される。しかし、好ましい実施形態では、分析物は標識化されず、そして好ましい検出方法は分析物に付けられた標識の使用に依存しない。そうした検出方法は、以下に限らないが、光信号の検出（例えば、放射および／または吸収分光学）、電気および磁気的信号の検出、分析物を含有する媒体の電気的特性（例えば、コンダクタンス／抵抗、キャパシタンス、インピーダンスなど）の変化の検出を含む。
【００８９】
単純な１実施形態では、分析物を含有する流体の光学的吸収が、（例えば、標準の紫外線）検出器により監視される。しかし、好ましい実施形態では、電気分析的検出器が使用される。最も好ましい実施形態では、電気分析的検出器は（例えばシヌソイド）ボルタンメトリーを使用する。
【００９０】
特に好ましい実施形態において、シヌソイドボルタンメトリーは、少量の目的の分析物をボルタンメトリー電極に供給することを含む。正弦（または他の経時変化する）電圧が電極に適用される。経時変化する（例えば正弦）電圧は、所定の周波数の単一周期で目的のレドックス種の形式電位を掃引するために十分に大きい振幅を有する。正弦波電圧に対する分析物の応答は、経時変化電圧の基本周波数の高調波で選択的に検出される。経時変化ボルタンメトリーを実行する方法は、米国特許第５，６５０，０６１号およびその中で引用された参考文献において提供されている。
【００９１】
特に好ましい実施形態はシヌソイドボルタンメトリーを利用するが、他のボルタンメトリー方法も本発明に良好に適する。上述の通り、経時変化ボルタンメトリー方法が特に好ましく、そしてそうしたボルタンメトリー方法は正弦波の経時変化する電圧の使用に制限されない。また他の波形も適切である。そのような方法は、以下に限らないが、方形波および三角波（ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｗａｖｅ）の使用を含む。そうした経時変化ボルタンメトリー方法は当業者に周知である（例えば、Ｃｕｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｕｈｒ  （１９９６）  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，  ７（１）：  １−６参照）。
【００９２】
本発明の発見は、シヌソイドボルタンメトリー検出と空間的にコードされた分析物単離との組合せが、複雑なサンプル（例えば血清）において極めて低いレベルで高度に特異的な分析物の検出／定量を提供することであった。
【００９３】
（ＩＩＩ．統合アッセイデバイス）
薬品製造、環境分析、医学診断および基礎実験室分析において使用される最新の化学分析システムは、好ましくは全自動化の能力がある。そうした総合分析システム（ＴＡＳ）（Ｆｉｌｌｉｐｉｎｉら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１５３；Ｇａｒｎら（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３４：４２３；Ｔｓｈｕｌｅｎａ（１９８８）Ｐｈｙｓ．Ｓｃｒ．Ｔ２３：２９３；Ｅｄｍｏｎｄｓ（１９８５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４：２２０；Ｓｔｉｎｓｈｏｆｆら（１９８５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５７：１１４Ｒ；Ｇｕｉｂａｕｌｔ（１９８３）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１７：６３７；Ｗｉｄｍｅｒ（１９８３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２：８）は、システムへのサンプルの導入から、システム内のサンプルの輸送、サンプル調製、単離、精製および、データ収集および評価を含む検出に及ぶ機能を自動的に実行する。
【００９４】
近年、サンプル調製技術は、小型化された形態に首尾よく縮小されている。従って例えば、ガスクロマトグラフィー（Ｗｉｄｍｅｒら（１９８４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１８：１）、高圧液体クロマトグラフィー（Ｍｕｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１４：１７４；Ｍａｎｚら（１９９０）Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ１：２４９；Ｎｏｖｏｔｎｙら編（１９８５）Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｃｉｌｌａｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｌｉｂｒａｒｙ，第３０巻；Ｋｕｃｅｒａ編（１９８４）Ｍｉｃｒｏ−Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｓｃｏｔｔ編（１９８４）Ｓｍａｌｌ  Ｂｏｒｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．；Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら（１９８３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２５５：３３５；Ｋｎｏｘら（１９７９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１８６：４０５；Ｔｓｕｄａら（１９７８）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５０：６３２）および、キャピラリー電気泳動法（Ｍａｎｚら（１９９２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５９３：２５３；Ｏｌｅｆｉｒｏｗｉｃｚら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２：１８７２；Ｓｅｃｏｎｄ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐ．Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆ．Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９０）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５１６；Ｇｈｏｗｓｉら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６２：２７１４）は、小型化された形態に首尾よく縮小されている。
【００９５】
同様に、別の実施形態において、本発明は、多数の分析物を検出および／または定量化する統合アッセイデバイス（例えばＴＡＳ）を提供する。アッセイデバイスは、上述の通り固定された結合相手を備えるチャネルを含む。さらに、好ましい統合アッセイデバイスは、以下の１つ以上も含む：検出システム（例えば、電極および／または関係するエレクトロニクスを含むボルタンメトリーシステム）、緩衝液および／またはフラッシング流体を供給する１つ以上のリザーバ、サンプルアプリケーションウェルおよび／または注入口、（ポンプ、リザーバフロー切り替え、検出器およびシグナル分析システムなどの制御のための）コンピュータコントローラ。
【００９６】
特に好ましい実施形態では、統合アッセイデバイスはチャネルを「着脱可能な」ユニットに備える。従って例えば、付随デバイスから容易に挿入および着脱できるキャピラリーがモジュールにチャネルとして設けられ得る場合、それによりデバイスは分析物の異なるセットのアッセイで容易に稼働できるようになる。
【００９７】
デバイスで使用されるチャネルが管（例えば、キャピラリー電気泳動管）である場合、従来のキャピラリー電気泳動デバイスは、多くの、本発明に従った「統合」アッセイデバイスのための付随的配管、サンプル取扱い構成要素および送給構成要素およびコンピュータコントローラを備えている。多様な分析物の検出および／または定量に良好に適する統合アッセイデバイスを提供するために、本発明に従った検出器（例えば、シヌソイドボルタンメトリー検出器）および関係するエレクトロニクスのかなり単純な導入／追加以外ほとんど必要ではない。
【００９８】
（ＩＶ．アッセイの実行）
一般に、アッセイは、固定された結合相手を有するチャネルにサンプルを導入することによって実行される。サンプルは、それぞれの結合相手が、サンプルに存在し得る標的分析物と特異的に結合できるようにする条件下に好適に保たれる。その後、サンプルは、一般に結合した分析物の放出を助成する緩衝液の導入によって、チャネルからフラッシュされる。その後放出された分析物は下流の検出ポイントで検出され、そして分析物の正体が放出から検出までの時間によって決定される。
【００９９】
（Ａ）サンプルの調製）
事実上あらゆサンプルが、この有利なデバイスおよび方法を用いて分析できる。しかし、好ましい実施形態では、サンプルは生物学的サンプルである。用語「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用されるように、生物体または生物体の構成要素（例えば細胞）から得られるサンプルをいう。サンプルはあらゆる生物学的組織または流体のものとし得る。多くの場合、サンプルは、患者に由来するサンプルである「臨床的サンプル」である。そのようなサンプルは、以下に限らないが、喀痰、脳脊髄液、血液、血液画分（例えば血清、血漿）、血球（例えば白血球）、組織または細針生検サンプル、尿、腹水および胸水、またはそれらに由来する細胞を含む。また、生物学的サンプルは、組織学上の目的で得られた凍結切片といった組織切片も含み得る。
【０１００】
生物学的サンプル（例えば血清）は直接分析されるてもよいし、それらは本発明のアッセイでの使用前に何らかの調製に供されてもよい。そのような調製は、以下に限らないが、水または適切な緩衝液におけるサンプルの懸濁／希釈または、例えば遠心分離などによる細胞残屑の除去、または分析前のサンプルの特定の画分の選択を含み得る。
【０１０１】
（Ｂ）システムへのサンプルの送給）
サンプルは、当業者に周知の標準方法に従って本発明のデバイスに導入できる。従って例えば、サンプルは、高圧液体クロマトグラフィーシステムにおいて使用されるもののような注入口を通じてチャネルに導入することができる。別の実施形態では、サンプルはチャネルと連絡しているサンプルウェルに適用できる。さらに別の実施形態において、サンプルはチャネル内にポンプ送給され得る。サンプルをチャネルに導入する方法は周知であり、キャピラリー電気泳動法およびクロマトグラフィーの技術において標準である。
【０１０２】
（Ｃ）結合条件）
一旦チャネルに入ると、サンプルは、サンプルと結合相手との間での特異的な結合を促進する条件のもとに保たれる。結合相手と分析物との間での特異的な結合に適合する条件は、当業者に周知である。例えば、抗体と標的タンパク質との間の結合を促進するために適切な緩衝液がイムノアッセイ技術において周知である（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号および第４，８３７，１６８号；Ａｓａｉ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ（１９９１）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ参照）。同様に、核酸が相互に特異的にハイブリダイズする際の条件も当業者に周知である（前掲Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）参照）。特定の結合条件は、当業者に周知の標準方法に従って、結合相手と標的分析物との特定のセットについて最適化される（例えば、前掲Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号および第４，８３７，１６８号；Ａｓａｉ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ（１９９１）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ参照）。
【０１０３】
（Ｄ）放出条件）
サンプル中の分析物がチャネルに固定した結合相手と特異的に結合された後、それらは放出される。放出は、結合相手／分析物複合体を緩衝液と接触させることによってまたは、結合相手／分析物の相互作用を破壊する温度条件によって好適に行われる。そのような会合は、特定の分析物／結合相手のペアに応じて、高温、変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）、高または低ｐＨ、高または低塩類、および様々なカオトロピック試薬（例えば塩酸グアニジン）の使用によって破壊され得る。
【０１０４】
（Ｅ）チャネル内の分析物／流れ）
サンプルおよび／またはキャリヤー／緩衝液流体は、標準の方法に従ってチャネルへ導入し、かつ／または、チャネル内を移動させることができる。例えば、流体は「リザーバ」からの単純な重力給送によってチャネル内へ導入され、そして移動され得る。あるいはまた、流体は、ガス圧力、または多様な適切なポンプ（例えば、ぜん動ポンプ、計量ポンプなど）のうちのいずれかによって生じた液圧、変形可能なチャンバ／ダイヤフラムへの圧力などによってチャネル内を移動され得る。また分析物も、電気浸透方法によってチャネル内を移動され得る。
【０１０５】
（Ｆ）検出）
上述の通り、分析物検出は、上述のような当業者に周知の多くの方法のいずれかによることができる。好ましい実施形態において、電気化学的検出方法が使用され、最も好ましい実施形態では、検出はシヌソイドボルタンメトリーによっている。
【０１０６】
シヌソイドボルタンメトリーを実行するためのプロトコルは、既に記載されている（Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４８２８−４８３２；および米国特許第５，６５０，０６１号）。簡単にいえば、２Ｈｚ、０．７Ｖｐ−ｐ、＋０．３５Ｖ直流オフセットの正弦波が、ソフトウェアプログラムを用いてデジタル生成される。この正弦波は、銅電極への印加電位として働く。電極からの電流応答は、単一の溶出ランの全長の間、リアルタイムでソフトウェアによって収集される。この時間ドメイン電流応答はその後、高速フーリエ変換によって周波数ドメインに変換される。周波数スペクトルを分析するためのプロトコルは既述されている（Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：１６６２−１６６８）。分析物に対応するスペクトルは、既述の通り（前掲Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７））バックグラウンドサブトラクションおよびデジタル位相ロックの後に得られる。
【０１０７】
（Ｖ．複数分析物検出用キット）
１実施形態において、本発明は、サンプル中の多数の分析物の存在または不在を識別するまたは定量化するためにスクリーニングするキットを提供する。キットは、本明細書中に示される通り各自の表面に固定された各種結合相手を保持する本発明のチャネルを含む。チャネルは、例えば、本明細書中に説明した通り、電気化学的検出器（例えば、シヌソイドボルタンメトリー）回路、サンプルの管理およびチャネル内の流体の流れの維持のための適切な配管、およびサンプルの適用、流体の流れおよび信号出力の分析の制御のためのコンピュータ制御システムを備えるデバイスといった、一体型アッセイデバイスへの単純かつ迅速な組込みのために設計され得る。キットは、本明細書中に述べたアッセイ方法での使用に適切な緩衝液ならびに他の溶液および標準物質をさらに含むことができる。
【０１０８】
さらに、キットは、本発明の方法を実施するための指示（すなわち、プロトコル）を含む教材を含み得る。教材は一般に、書面または印刷物を含むが、それらはそうしたものに制限されない。そのような指示を格納し、それらをエンドユーザに伝達することができるあらゆる媒体が本発明によって考慮されている。そのような媒体は、以下に限らないが、電子格納媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学式媒体（例えばＣＤ−ＲＯＭ）などを含む。そうした媒体は、そのような教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０１０９】
（実施例）
以下の実施例は、本願発明を例示するために提示するものであり、限定するためではない。
【０１１０】
（実施例１）
（ＤＮＡハイブリダイゼーションのナノリットル体積の電気化学的検出）
（材料および方法）
（試薬）
使用する水は脱イオン化した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を通過させた。結核（ＴＢ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の同定に特異的なビオチン化ＤＮＡプローブおよびｃＤＮＡ標的を、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）を通じて特注合成した（表１）。ＤＮＡプローブ溶液は、脱イオン水に溶解させたＤＮＡプローブの１００μｇ／ｍｌ溶液をＤＮＡ結合溶液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）との１：１混合物に希釈することによって作製した。この結合溶液は、疎水および静電相互作用によって重合化表面にＤＮＡを結合するのを容易にする。溶融シリカキャピラリー（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＡＺ）を、キャピラリーバイオセンサを作製するために使用した。これらのキャピラリーをアセトンでフラッシュせず、キャピラリー表面に何らかの誘導体化を行う前に乾燥させた。
【０１１１】
（ＤＮＡプローブのキャピラリー誘導体化および固定化）
溶融シリカキャピラリー（内径５０μｍ×外径１５０μｍ、長さ１ｍ）をバイオセンサに使用した。キャピラリーを、有機被覆で溶融シリカ表面を被覆するために、エポキシ樹脂（Ｅｐｏｔｅｋ３５０）の薄層で被覆した。表面の有機被覆は、キャピラリーの壁のＤＮＡ吸着を最小限にするだけでなく、ＤＮＡプローブが直接固定化され得る重合化表面を付与する。キャピラリー表面をエポキシ樹脂で被覆するプロトコルは、Ｌｉｕら（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７２３：１５７−１６７）が正確に説明した通りであった。簡単にいえば、キャピラリーを、最初にアセトンで１５分間すすぎ洗いした後、２０ｐｓｉの窒素圧下で１時間、１００℃でオーブンにて乾燥した。エポキシ樹脂３１４ＮＤ（Ｅｐｏ−Ｔｅｋ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、エポキシ樹脂混合物のアセトン溶液を吸引することによってキャピラリー表面に動的に被覆した。残留溶媒を、室温で３０分間、窒素でフラッシュすることによってエポキシ樹脂被覆キャピラリーから除去した。エポキシ樹脂被覆は８０℃で３０分間、さらに２０ｐｓｉの窒素圧下で１５０℃で２時間、架橋した。被覆したキャピラリーを、使用前に３０分間緩衝液で洗浄した。
【０１１２】
次いで、エポキシ樹脂被覆キャピラリーの１ｃｍセクションを、特定のＤＮＡプローブ溶液でフラッシュした。ＤＮＡプローブ溶液を一晩キャピラリー片と反応させて、ＤＮＡプローブを疎水および静電相互作用によってキャピラリー壁と結合させた。他のＤＮＡプローブを、同様の１ｃｍ長の被覆キャピラリー片に同様にして固定した。プローブがキャピラリー壁に固定化されると、それらのハイブリダイゼーション領域を脱イオン水ですすいだ後、キャピラリーバイオセンサに組み立てる準備が整った。これらのハイブリダイゼーション領域を、入口から第１のプローブ（ＴＢプローブ）までの距離が約２５ｃｍであり、２つのプローブが１５ｃｍ離れた、２つの異なる位置で「分離カラム」にエポキシ樹脂で接着した。これにより、第２のプローブ（ＨＩＶプローブ）から検出器まで約６０ｃｍの距離が残された。キャピラリーの異なるセグメントを、やはり各々約１ｃｍの長さであるスリーブ（１８０×３６０μｍキャピラリーセクション）にキャピラリーをエポキシ樹脂で接着することによってともに連結した。キャピラリーバイオセンサの全長は約１ｍであった。
【０１１３】
（ＤＮＡ標的のハイブリダイゼーション、溶出および検出）
キャピラリーを、商業用キャピラリー電気泳動デバイス（Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に取り付け、このデバイスをその加圧フローおよびオートサンプラー機能のために使用した。これらのＤＮＡプローブに相補的標的を高ストリンジェンシーでハイブリダイズするために使用されるプロトコルは、文献に広範に記載されている。この実験に使用された特定のプロトコルは次の通りである。
【０１１４】
最初に、ｃＤＮＡ標的をプローブと選択的に結合させるために、キャピラリーを、プレハイブリダイゼーション緩衝液（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０、０．１％Ｎ−ラクトイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド中、４０℃）でフラッシュした。ＴＢおよびＨＩＶ標的両方のＤＮＡ標的溶液を、プレハイブリダイゼーション緩衝液に溶解し、フラッシュし、キャピラリーにて約３０分間インキュベートし、表面固定化プローブの完全なハイブリダイゼーションおよび飽和を得た。
【０１１５】
次いで、余剰標的溶液をハイブリダイゼーション緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０、０．１％ＳＤＳ）ですすぎ出した。その後ストリンジェント洗浄を、いずれの非特異的結合したＤＮＡ標的も除去するために、ストリンジェント洗浄緩衝液（７５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０、０．１％ＳＤＳ、４０℃）により行った。このストリンジェント洗浄により、他のすべてのものはこれらのストリンジェント条件のもとで洗い出されるので、完全に相補的ＤＮＡ標的だけがキャピラリーバイオセンサ内部に残されることが保証された。
【０１１６】
次いで、キャピラリーを、（界面活性剤の存在のために）銅電極と適合しない高ストリンジェンシー洗浄緩衝液をすすぎ出すために、電気化学的洗浄緩衝液（８９ｍＭ  ＴＲＩＳ、８９ｍＭホウ酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝１０）で充填した。
【０１１７】
一旦、キャピラリーを電気化学的洗浄緩衝液で充填すると、銅電極はバイオセンサキャピラリー出口に保たれた。電極を、ツーパート機械加工設計（ｔｗｏ−ｐａｒｔ  ｍａｃｈｉｎｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ）（Ｋｕｈｒ（１９９３）米国特許第５，６５０，０６１号）によりキャピラリー出口と自動的に整列させた。次いで、キャピラリーを、溶出緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝１１）を（１００ｐｓｉで）迅速に満たし、室温で３０分間インキュベートした。溶出緩衝液は、ハイブリダイズしたＤＮＡ標的の変性を促進し、それによって、特異的な位置でキャピラリー内部の溶液中にオリゴマーを放出した。
【０１１８】
次いで、脱ハイブリダイズされた標的ＤＮＡを含む溶出緩衝液を、約５ｐｓｉで加圧誘起フローを用いて一定の流速でポンプ送給し、それによってそれらが緩衝液とともに移動する際に放出されたＤＮＡ標的を溶出した。ＤＮＡ標的オリゴマーが検出器を通過して流れると、ＤＮＡは銅電極で電気触媒作用で酸化され、それにより、既述の通り（米国特許第５，６５０，０６１号参照）シヌソイドボルタンメトリーを用いて検出され得る信号を発生させた。その後ＤＮＡの各個別のゾーンが、ＤＮＡが検出器を通過して移動する際に出口の銅電極で検出された。
【０１１９】
（電気化学的検出）
直径４０ミクロンの銅微小電極を、５ｃｍ、５０×３６０μｍ溶融シリカキャピラリーの内側に製作した。キャピラリーを、シリンジを用いてガリウムで満たした。次に、小さい長さの銅ワイヤを一端でキャピラリーに挿入した後、５分のエポキシ樹脂接着によって適所に密封した。別のワイヤを、キャピラリーの後端から挿入して、銅ワイヤとの電気接続を与えた。キャピラリー内部のガリウムが２個のワイヤ間の電気接続を与えた。これらのキャピラリー微小電極は、非常に丈夫であり、研磨後に再使用可能である。これらの電極を、６００粒度のサンドペーパーを用いた手による研磨以外、いかなる形態でも前処理しなかった。
【０１２０】
脱ハイブリダイズされたＤＮＡ標的を、それがキャピラリーから溶出した場合に銅微小電極で検出するために、シヌソイドボルタンメトリーを使用した。シヌソイドボルタンメトリーを実行するためのプロトコルは既述されている（Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４８２８−４８３２；米国特許第５，６５０，０６１号）。簡単にいえば、２Ｈｚ、０．７Ｖｐ−ｐ、＋０．３５Ｖ直流オフセットの正弦波を、企業内ソフトウェアプログラムを用いてデジタル生成した。この正弦波は、銅電極への印加電位として働いた。電極からの電流応答を、単一の溶出ランの全長の間、リアルタイムでソフトウェアによって収集した。次いで、この時間ドメイン電流応答を、高速フーリエ変換によって周波数ドメインに変換した。周波数スペクトルを分析するためのプロトコルは既述されている（Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：１６６２−１６６８）。分析物に対応するスペクトルは、既述の通り（前掲Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７））バックグラウンドサブトラクションおよびデジタル位相ロックの後に得られた。
【０１２１】
（結果および考察）
ＤＮＡハイブリダイゼーションの低量、直接的な検出は、疾患の指標としてＤＮＡが臨床的に重要であるために望ましい。一旦、特定のヌクレオチド配列が所定のマーカー（例えば、感染因子、遺伝形質、腫瘍タイプ）と特有にまたは識別可能に関係づけられることが示されれば、その配列は、大量に合成され、その特定の配列が存在するかどうかを決定するために他の供給源から核酸のプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーションに基づくＤＮＡアッセイは多くの異なる用途のために開発されており、多くの場合、存在するＤＮＡを完全にフィンガープリントし、そして同定するためにすべてのサンプルについて複数の試験が実行される必要がある。
【０１２２】
周波数ドメインボルタンメトリー検出技術であるシヌソイドボルタンメトリーは、糖類の検出に使用されるものと同様の実験条件の下で核酸を検出するために使用できる。ヌクレオチドも核酸塩基にアミン部分を含み、そしてそれらも銅表面で電気活性であるので、ヌクレオチドの何らかの信号が糖主鎖によるものとは別にそれらの塩基によって寄与され得ることが可能であった。
【０１２３】
非誘導体化ＤＮＡの検出は、あらゆるサンプル取扱損失および汚染問題を回避するために非常に望ましい。電気化学的検出は、高感度な検出器としてその能力を犠牲にすることなく容易に小型化できる（ナノリットルからピコリットル容量で作業し得る）ことから、ＤＮＡ分析の概してサンプルの限られた場合に特に適する。
【０１２４】
このキャピラリーバイオセンサの開発において、ＤＮＡの特定の配列を、連続する微小流体チャネル（すなわち、溶融シリカキャピラリー）内部の異なる領域に固定化した。２０ｎＬのサンプル体積に一致する内径５０μｍキャピラリーの１ｃｍセクションを、センサの認識領域を付与するために使用した。サンプルを、個々の領域を通して順次的にポンプ送給し、そこで、適切なＤＮＡ標的（存在すれば）が個々の固定化ＤＮＡプローブと独立して結合し得る。一旦、サンプルが個々の固定化された標的と相互作用する機会を持てば、それはキャピラリーから溶出され、キャピラリー全体は一連のストリンジェント洗浄で洗浄されて、それによって、材料を汚染するあらゆる可能性が排除された。次いで、固定化されたプローブの各領域と結合したままの標的ＤＮＡを、空間的にコードされた様式で溶出した。
【０１２５】
図１は、単一の実験において複数のハイブリダイゼーション事象を観察する可能性を与えるためにこの設計において使用された基本的アプローチを示す。ゾーン１および２は、ＴＢおよびＨＩＶのＤＮＡプローブがそれぞれ固定された固定化ゾーンである。これらのゾーンは後に、ＤＮＡ標的を含有するサンプルの１回だけの注入を使用するために、単一のキャピラリーシステムを作製するために組み合わされた。極めて高いストリンジェンシーでより複雑なサンプル（すなわち、タンパク質、他の細胞株などのような多数の他の生体分子を含んでいる臨床的サンプル）を洗浄するために必要な試薬は、キャピラリーの先頭のリザーバから加圧誘起された流れによって導入することができる。銅微小電極は、キャピラリーの出口端に配備され、それは、電極とのキャピラリーの自動整列を可能にする機械加工ツーパートシステムを用いて配置される（Ｋｕｈｒらの米国特許第５，６５０，０６１号）。従って、システムは組み合わせるのが非常に容易であり、一旦稼働すると頑強である。
【０１２６】
特異的ハイブリダイゼーション、洗浄および、変性した標的オリゴヌクレオチドの溶出を実行するために使用される工程の順序は、図２に示されている。同様な工程は、それらの相補的プローブへのＤＮＡ標的のあらゆる種類のストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる。このスキームにおいて、
１）ハイブリダイゼーションは、キャピラリー壁、または標的分析物に対して完全な相補体ではないプローブへの標的のあらゆる非特異的な結合を回避するために、ストリンジェント条件のもとで実行される。その結果、ＴＢ標的（ＴＢをコードするＤＮＡに特徴的な配列を有するオリゴマー（ゾーン１）は、固定化されたＴＢプローブ（相補的配列）にハイブリダイズするだけであり、ＨＩＶ標的は、ストリンジェント条件下で固定化されたＨＩＶプローブ（ゾーン２）にハイブリダイズするだけである。これらのゾーンは空間的に隔離しており、ストリンジェント洗浄は、各ゾーンからだけでなく、それらのゾーンを分離するキャピラリーからも、全部の干渉成分を除去する。
【０１２７】
２）溶出緩衝液（ＴＢＥ、ｐＨ＝１１）による最終洗浄は、ハイブリダイズした相補的核酸を同時に変性させ、それによって、結合したＤＮＡ標的をキャピラリーの固定化プローブに直接隣接する溶液に放出する。これらの２つの標的の空間的選択性は保たれる。なぜならその緩衝液は（脱ハイブリダイゼーションが生じ得るよりもずっと高速な時間スケールで）適所に迅速に移動し、そしてキャピラリー内の流れは停止し、変性プロセスは３０分のインキュベート後に完了するからである。
【０１２８】
３）最後に、「自由な」空間的に分離した標的ＤＮＡオリゴマーを含有する溶液が溶出される。その２つの標的を含んでいるゾーンが空間的に別個であるので、それらは、異なる時間に出口に配置された銅電極を過ぎて流れる。図３に示されたスキームは、溶出しているＤＮＡ標的を検出するその局面を例示している。検出器における各標的の溶出時間はその正体を示し、それによりＤＮＡハイブリダイゼーションの部位をコード化する。
【０１２９】
固定化ＤＮＡプローブの１ｃｍゾーンによるキャピラリーバイオセンサを用いたＨＩＶ標的ＤＮＡの検出は、図４に示されている。１０μｇ／ｍｌの合成ＨＩＶ標的の１００μＬを含有するサンプルを、ＨＩＶプローブが固定化されたキャピラリーバイオセンサ内を通してフラッシュした。サンプルのＨＩＶオリゴヌクレオチド標的の検出を可能にするために、図２に記載した工程の順序に従った。本来、その順序は電気化学的洗浄緩衝液（８９ｍＭ  ＴＲＩＳ、８９ｍＭホウ酸および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝１０）を含まなかった。これを、溶出緩衝液が銅電極に攻撃する時に観察される人工産物を最小限にするために添加した。この緩衝液のｐＨは重要である。なぜなら、過度に高いｐＨは標的ＤＮＡの脱ハイブリダイゼーションにつながり、信号の損失をもたらす一方、過度に低いｐＨは溶出緩衝液が検出器に到達した時に大きな人工産物を結果として生じるからである。
【０１３０】
図４に示すように、シヌソイドボルタンメトリーで得られた信号は、溶出緩衝液での脱ハイブリダイゼーションの後にＤＮＡ標的の溶出を実証する。ブランク溶液の溶出は、信号が非常に安定していることを示すが、単一プローブシステムによるＨＩＶ標的の結合の特異性を評価することは困難である。従って、この種の検出はＤＮＡ試験において偽陽性をもたらす可能性がある。
【０１３１】
複数プローブシステムは、核酸サンプルの並行処理の問題に取り組むことができるだけでなく、その固有の設計において非特異的なハイブリダイゼーションに対する内部基準を付与する。非特異的なハイブリダイゼーションが所与のサンプルで生起した場合、それは複数プローブシステムにおいて複数のピークを与えるであろう。これは、単一の注入した標的について単一のピークが検出されるまで、よりいっそうストリンジェントなハイブリダイゼーションプロトコルの必要性を直接示すことになる。このシステムのハイブリダイゼーションの特異性は、図５（Ａ）に例証されており、ＴＢおよびＨＩＶの特異的標的のハイブリダイゼーションの検出が同一サンプルにおいて同時に存在する。サンプルは各ＤＮＡプローブと１回だけ相互作用させられたが、２つの標的は１回のランで同時に検出することができる。２つのゾーンに関する移動時間は、図５（Ｂ）および５（Ｃ）にそれぞれ示されたＴＢおよびＨＩＶ標的の内部基準と合致する。従ってこれは、２つの標的が同時に検出できるだけではなく、使用されているハイブリダイゼーション条件のもとで生起するいかなる非特異的なハイブリダイゼーションが存在しないことも示している。そうでなければ、内部基準ランは１つではなく２つのピークを示したであろう（すなわち、ＴＢ特異的標的は自己の完全に相補的なプローブおよびＨＩＶ特異的プローブに対しハイブリダイズしたであろうし、ＨＩＶ特異的標的についても同様である）。従って、図５（Ａ）における２つのピークの検出は、合成のＴＢおよびＨＩＶ特異的標的の検出を同時にはっきりと示しており、非特異的なハイブリダイゼーションの不在を例証しており、あらゆる偽陽性の結果の発生の見込みを低減させる。
【０１３２】
ハイブリダイゼーションによるＤＮＡシークエンシングは、サンプル（例えば、標的）ＤＮＡ分子の固定化プローブＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって与えられる分子認識に依存する。好ましいプローブオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約７のヌクレオチドであり、より好ましくは長さが少なくとも約１０のヌクレオチドであり、さらに好ましくは長さが少なくとも１５または２０のヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが少なくとも３０、４０または５０のヌクレオチドである。このプローブは、標的の少なくとも１領域に相補的である既知の配列を有する。多数の異なるアッセイ形式が存在するが、プローブは代表的に、ニトロセルロース、アガロース、プラスチックまたは、サンプルと接触して置かれ、非認識ＤＮＡをきれいに洗浄した後、含量についてアッセイすることができる、他の不活性基質に固定化される。ハイブリダイズしたＤＮＡのアッセイは、本明細書中に記載したシステムにおいて、ＤＮＡの変性、キャピラリーまたはチャネルからの溶離、銅微小電極でのＳＶによる検出を伴って遂行できる。
【０１３３】
（結論）
新しいキャピラリーベースのＤＮＡバイオセンサを、複数のＤＮＡオリゴマーを同時に検出することができる直接的な電気化学的検出を利用して開発した。この検出スキームは、キャピラリー表面の様々な位置に固定化された様々なＤＮＡプローブにより、サンプル中のＤＮＡ標的のフローコード化ハイブリダイゼーションアッセイを利用した。各種タイプのＤＮＡ標的の同時ハイブリダイゼーションは、それらが溶離されると、シヌソイドボルタンメトリーを使うことによる銅電極におけるそれらの標的の直接検出によって補足される。疾患特異的なオリゴヌクレオチド配列のそのような並行的かつ生の検出は、頑強で、耐久性がありかつ安価な複数疾患ＤＮＡセンサへの道を開くことができる。従って、それは、実行がオペレータ集約的で高価である各種光学式検出スキームに基づく既存のＤＮＡセンサに伴う問題を回避する。
【０１３４】
（実施例２）
（シヌソイドボルタンメトリーによるアミノ酸およびペプチドの高感度かつ選択的検出）
（実験パラメータ）
（試薬）
使用する水は脱イオン化した後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓ．）を通過させた。アミノ酸およびインスリン（９８〜９９％、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．）、および残りのペプチド（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，  ＣＡ）を、受領したまま使用した。全ての実験を、泳動電解質として０．１０水酸化ナトリウム（Ａ．Ｃ．Ｓ等級、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ  ＮＪ）により行った。０．１０Ｍの原液を脱イオン水にて調製した。以後の希釈を泳動電解質を用いて行った。
【０１３５】
（銅微小電極）
銅微小電極は、最初に微小電極プラー（Ｍｏｄｅｌ  ＰＥ−２，  Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，  Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）によりガラスキャピラリーを引張ることによって作製した。その後、顕微鏡下でキャピラリーの端をスカルペルで切り取った。その後、直径２０μｍの銅線（９９．９９％、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を、新しく切り取られた端部に挿入し、エポキシ樹脂で密封した（Ｅｐｏｘｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。電極は、ダイヤモンド研磨ホイールで研磨し、脱イオン水での超音波処理によって清浄した。銅線との電気接続を作るために、キャピラリーの後端をガリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で充填し、直径１５０μｍ銅線をガリウムに挿入した。代替として、キャピラリーの後端をエポキシ樹脂で充填し、より大径の銅線を、それが２０μｍワイヤと物理的に接触するまで、エポキシ樹脂充填キャピラリーに入れた。いかなる電気化学的前処理も実行せず、電極は、実験条件下で約１時間の間、または安定した応答が観察されるまで、安定化させた。
【０１３６】
（電気化学的計測および実験条件）
フローセルはプレキシガラスで構成し、管は拡散的広がりが回避されるように整合した。サンプルプラグの導入は、電磁弁により制御される空気式アクチュエータによって制御した。流速は、フローセルの１９ｃｍ上に緩衝液リザーバを保つことによって重力流れにより維持した。流速を０．５ｍｌ／分であると決定し、サンプルの体積を注入の流速および長さから決定した。注入時間は、電極が分析物の完全な濃度を見るように決定した。
【０１３７】
報告された実験の条件をここで説明する。アミノ酸およびペプチドの場合、２Ｈｚ正弦波（０〜６９０ｍＶ対Ａｇ／ＡｇＣｌ）が、Ｌａｂｖｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘ．）で著者によって書かれたソフトウェアにより適用した。波形は、基本周波数の３倍（６Ｈｚ）の３ｄｂ点によりｃｙｂｅｒａｍｐ（Ｍｏｄｅｌ  ３８０，  Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ．）を用いて４極低域濾過フィルタでろ波した。出力電流は４極低域通過フィルタでろ波した。フィルタは４０Ｈｚに設定された（観察された最大周波数の４倍、第１０高調波または２０Ｈｚ）。電流は、３００ＭＨｚ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ＩＩパーソナルコンピュータを用いて１６ビットアナログ−ディジタル変換器（ＰＣＩ−４４５１，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりディジタルからアナログに変換した。単一のスキャンは４正弦波周期から構成された。
【０１３８】
収集された時間ドメインは、Ｌａｂｖｉｅｗソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって周波数ドメインに変換し、Ｍａｔｌａｂプログラミング（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ  ＮＪ）を用いてさらに処理した。注入前に得られたバックグラウンドベクトルを瞬時信号電流ベクトルから引くことによって信号だけのスペクトルを得た。時間ドメインスペクトルを取得するためにディジタルロックイン増幅法を使用した。時間スペクトルは、各周波数高調波（最大第１０高調波まで）の振幅および位相角を生成するために５１２ポイントのレートでフーリエ変換した。各高調波の位相情報は、信号だけのベクトルを使用して、それをバックグラウンド減算信号ベクトルに投影することによって得た。最後に、位相分解ベクトルは、移動平均平滑化（箱形積分）を用いて低域ろ波通過した。
【０１３９】
（結果）
図６は、銅微小電極でのアルギニンのバックグラウンド減算周波数スペクトルを示す。実験は１μＭアルギニンを用いて実行した。励起信号は２Ｈｚ、０〜６９０ｍＶ対Ａｇ／ＡｇＣｌの正弦波であった。５１２ポイント（全体時間＝１秒）から成る４正弦波周期からの電流を、各周波数スペクトルを生成するために使用した。三次元グラフは、第１０高調波までの、周波数（ｘ軸）、振幅（ｚ軸）および位相角（ｙ軸）情報から成っている。
【０１４０】
図７は、第５高調波（１０Ｈｚ）での１μＭアルギニンからの正弦波時間ドメイン応答を示す。この高調波は、最高の信号／雑音比および３９ｎＭの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）を与えた。
【０１４１】
図８は、様々なアルギニン濃度の線形ダイナミックレンジを示す。１、１０、１００および１０００μＭのアルギニン濃度をフロー注入分析システムに注入した。第５高調波（１０Ｈｚ）の振幅が、注入された４つの異なる濃度に対してプロットされている。このプロットは、第５高調波での３オーダにわたる優れた直線性（Ｒ＝０．９９９７）を示す。
【０１４２】
図９は、銅微小電極でのアスパラギンおよびグルタミンの減算周波数スペクトルを示す。四角形は１０μＭアスパラギンを表し、円は１０μＭグルタミンを表している。実験条件は、図１を生成するために使用したものと同じである。
【０１４３】
図１０Ａおよび１０Ｂは、第６高調波（１２Ｈｚ）でのアスパラギンおよびグルタミンの正弦波時間ドメイン応答を示す。図１０Ａは１０μＭアスパラギンを示し、図１０Ｂは１０μＭグルタミンを示す。第６高調波は、それらの２つのアミノ酸の最適化位相角が９０°分離に最も近いものである。この高調波は、それらの２つの分析物間で最大の選択性を与える。アスパラギンの場合この高調波での検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は４００ｎＭであり、グルタミンの場合５００ｎＭである。
【０１４４】
図１１は、１０μＭインスリンＢ鎖のバックグラウンド減算周波数ドメインスペクトルを示す。図１と同じ条件を使用した。
【０１４５】
図１２は、第４高調波（８Ｈｚ）でのインスリンＢ鎖の正弦波時間ドメイン成分を示す。第４高調波は、最大の信号／雑音比および５００ｎＭの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）を与えた。
【０１４６】
図１３は、銅微小電極での黄体形成ホルモン放出ホルモン（円）およびブラジキニン（四角形）の減算周波数スペクトルを示す。
【０１４７】
図１４Ａおよび１４Ｂは、第２高調波（４Ｈｚ）でのブラジキニンおよび黄体形成ホルモン放出ホルモンの時間ドメイン応答をそれぞれ示す。
【０１４８】
図１５は、ニューロテンシン（四角形）およびＰ物質（円）のバックグラウンド減算周波数ドメイン応答をそれぞれ示す。
【０１４９】
図１６Ａおよび１６Ｂは、基本周波数（２Ｈｚ）でのニューロテンシンおよびＰ物質の時間ドメイン応答をそれぞれ示す。
【０１５０】
ここで説明した実施例および実施形態は例示目的だけのためであり、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提起され、本願の精神および本文ならびに添付請求の範囲の内に含まれるはずであることが理解される。従って、ここに引用された全部の出版物、特許および特許出願は、すべての目的で完全な形で参照によりここに採り入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、電気化学的検出によるキャピラリーベースのＤＮＡバイオセンサの略図を示す。キャピラリーには２つの異なるプローブセクションが存在する。ＴＢ特異的プローブのプローブ１およびＨＩＶ特異的プローブのプローブ２である。ＨＰＣＥオートサンプラーは、これらの固定化されたプローブのｃＤＮＡ標的の特異的ハイブリダイゼーションに必要な様々なストリンジェント洗浄およびリンスに使用される。銅電極は、機械加工ツーパートシステムを使用してキャピラリーバイオセンサの出口に配置される。
【図２】
図２は、キャピラリーバイオセンサ内部でＤＮＡ標的のストリンジェントハイブリダイゼーションおよびアルカリ変性を実行するためのプロトコルを示す。（１）キャピラリー表面に固定化されたプローブに各種ＤＮＡ標的をハイブリダイズする。（２）その後ストリンジェント洗浄が、いずれかの非特異的吸着またはハイブリダイズしたＤＮＡを除去するために実行される。（３）最後に、キャピラリーバイオセンサから以前にハイブリダイズしたＤＮＡ標的を溶離するめにアルカリ変性が実行される。
【図３】
図３は、アルカリ変性されたＤＮＡ標的のキャピラリーバイオセンサからの溶離、および引き続く電気化学的検出の略図を示す。電極は、自動整列を容易にするためにバイオセンサキャピラリーと同じ直径を備えるキャピラリー片の内側に製作される。電極はバイオセンサキャピラリーの出口に極めて近く（＜５μｍ）位置する。下側のトレースは、それらがバイオセンサキャピラリーから溶離する際のＤＮＡ標的の検出の略図を示す。
【図４】
図４は、キャピラリーバイオセンサおよびシヌソイドボルタンメトリー検出を用いたＨＩＶ特異的標的の検出を例示する。１０μｇ／ｍｌのＨＩＶ特異的標的が、ＨＩＶ特異的プローブだけが固定化されたキャピラリーバイオセンサ内部に流される。すべてのハイブリダイゼーション条件は本明細書中に記載の通りである。シヌソイドボルタンメトリー励起波形は０〜７００ｍＶｐ−ｐで２Ｈｚであった。図示された信号は第５高調波で得られた。
【図５】
図５は、フローコード化ハイブリダイゼーションアッセイを同時に用いた複数のＤＮＡ標的の検出を示す。使用したサンプルは、ＨＩＶおよびＴＢの特異的標的のそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度の１：１混合物を含んでいた。すべてのハイブリダイゼーションおよび溶離条件は、図４でのものおよび実施例１で説明したものと同じである。図示された信号は、それが検出に最良の感度を有するとわかったので、第５高調波で得られた。
【図６】
図６は、銅微小電極でのアルギニンのバックグラウンド減算周波数スペクトルを示す。三次元グラフは、第１０高調波までの、周波数（ｘ軸）、振幅（ｚ軸）および位相角（ｙ軸）情報から成っている。
【図７】
図７は、第５高調波（１０Ｈｚ）での１μＭアルギニンからの正弦波時間ドメイン応答を示す。
【図８】
図８は、様々なアルギニン濃度の線形ダイナミックレンジを示す。
【図９】
図９は、銅微小電極でのアスパラギンおよびグルタミンの減算周波数スペクトルを示す。四角形は１０μＭアスパラギンを表し、円は１０μＭグルタミンを表している。
【図１０】
図１０Ａおよび１０Ｂは、第６高調波（１２Ｈｚ）でのアスパラギンおよびグルタミンの正弦波時間ドメイン応答を示す。図１０Ａは１０μＭアスパラギンを示し、図１０Ｂは１０μＭグルタミンを示す。
【図１１】
図１１は、１０μＭインスリンＢ鎖のバックグラウンド減算周波数ドメインスペクトルを示す。
【図１２】
図１２は、第４高調波（８Ｈｚ）でのインスリンＢ鎖の正弦波時間ドメイン成分を示す。
【図１３】
図１３は、銅微小電極での黄体形成ホルモン放出ホルモン（円）およびブラジキニン（四角形）の減算周波数スペクトルを示す。
【図１４】
図１４Ａおよび１４Ｂは、第２高調波（４Ｈｚ）でのブラジキニンおよび黄体形成ホルモン放出ホルモンの時間ドメイン応答をそれぞれ示す。
【図１５】
図１５は、ニューロテンシン（四角形）およびＰ物質（円）のバックグラウンド減算周波数ドメイン応答をそれぞれ示す。
【図１６】
図１６Ａおよび１６Ｂは、基本周波数（２Ｈｚ）でのニューロテンシンおよびＰ物質の時間ドメイン応答をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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