(57)【要約】本明細書において、生殖能力に不可欠な新規核酸およびタンパク質配列が開示される。特に、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡおよびタンパク質が提供される。機能的なＭＡＴＥＲは女性の生殖能力に必要であり、Ｍａｔｅｒヌル卵母細胞から生ずる接合体は２細胞期を超えて進行することはできない。Ｍａｔｅｒ分子を不妊症および生殖能力低下の診断、予知、および治療に使用するための方法が記載される。ＭＡＴＥＲを避妊薬として用いる方法もまた提供されている。本開示はまた、そのような方法に関係する化合物、およびそのような化合物の同定についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質であって、
（ａ） 配列番号：２；
（ｂ） 配列番号：４；
（ｃ） 配列番号：２４；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と６５％の配列同一性を有する配列；または
（ｅ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の保存的変種
に記載のアミノ酸配列の少なくとも一つを含み、
該ヒトＭＡＴＥＲタンパク質がＭａｔｅｒヌル表現型を補完することができる、単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項２】
タンパク質が自己免疫性不妊症と関連する自己抗原である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
タンパク質が卵母細胞の細胞質で発現する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２および４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項５】
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項６】
配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：２４と７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項７】
配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：２４と８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項８】
配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：２４と９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項９】
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含む、単離ヒトＭＡＴＥＲタンパク質。
【請求項１０】
請求項１記載のタンパク質をコードする単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０記載の単離核酸分子であって、
（ａ） 配列番号：１；
（ｂ） 配列番号：３；
（ｃ） 配列番号：２３；または
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と少なくとも８２％の配列同一性を有する配列
に記載のヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項１２】
配列番号：１および３に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
配列番号：２３に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１１記載の核酸分子に機能的に連結したプロモーター配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項１７】
請求項１２記載の組換え核酸分子により形質転換した細胞。
【請求項１８】
異常Ｍａｔｅｒ核酸または異常ＭＡＴＥＲ発現またはＭＡＴＥＲに対する自己免疫反応と関連した生物学的状態を被検者において検出する方法であって、被検者が異常Ｍａｔｅｒ核酸または異常Ｍａｔｅｒ発現またはＭＡＴＥＲに対する自己免疫反応を有するかどうかを判定することを含む方法。
【請求項１９】
女性の不妊症の原因を評価する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
異常Ｍａｔｅｒ核酸または異常Ｍａｔｅｒ発現が、正常レベルと比較した場合にＭａｔｅｒ核酸またはＭＡＴＥＲタンパク質の細胞レベルの変化を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
生物学的状態が、不妊症もしくは生殖能力低下、または不妊症もしくは生殖能力低下に対する感受性の増加を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
不妊症が自己免疫性不妊症を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
被検者がＭＡＴＥＲタンパク質のエピトープを認識する循環自己抗体を有するかどうかを判定することを含み、そのような自己抗体の存在が、該被検者における不妊症もしくは生殖能力低下、または不妊症もしくは生殖能力低下に対する感受性の増加を示す、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
異常なＭａｔｅｒ発現が、被検者において増加したＭａｔｅｒ発現または減少したＭａｔｅｒ発現を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
被検者の臨床試料に含まれる少なくとも一つのＭａｔｅｒ分子を、Ｍａｔｅｒ特異的結合因子を有する試薬と反応させ、Ｍａｔｅｒ：因子複合体を形成させることを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
Ｍａｔｅｒ分子が、ＭＡＴＥＲをコードする核酸またはＭＡＴＥＲタンパク質である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
Ｍａｔｅｒ特異的結合因子が、ＭａｔｅｒオリゴヌクレオチドまたはＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
試料が生殖細胞を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
不妊症または生殖能力低下の素因を検出するため、または不妊症もしくは生殖能力低下に対する個体の前症状をスクリーニングするために使用される、請求項１８記載の方法。
【請求項３０】
異常Ｍａｔｅｒ核酸を検出する前に、Ｍａｔｅｒ核酸をインビトロ増幅することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項３１】
Ｍａｔｅｒ核酸が、ＭＡＴＥＲタンパク質コード配列由来の少なくとも一つのオリゴヌクレオチド・プライマーによってインビトロ増幅される、請求項１８記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチド・プライマーが、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３に由来する、少なくとも２３個の連続したヌクレオチドを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において使用されるオリゴヌクレオチド・プライマー。
【請求項３４】
請求項３３記載のオリゴヌクレオチド・プライマーを含む、組換えＤＮＡベクター。
【請求項３５】
請求項３３記載のオリゴヌクレオチド・プライマー配列に機能的に連結したプロモーター配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項３６】
核酸配列がプロモーター配列に対してアンチセンス方向にある、請求項３５記載の組換え核酸分子。
【請求項３７】
請求項３５記載の組換え核酸分子により形質転換した細胞。
【請求項３８】
請求項３６記載の組換え核酸分子を含む、非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項３９】
Ｍａｔｅｒ分子がＭＡＴＥＲコード配列である、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】
Ｍａｔｅｒ：因子複合体がヌクレオチド・ハイブリダイゼーションにより検出される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
因子が標識化ヌクレオチド・プローブである、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
ヌクレオチド・プローブが、
（ａ） 配列番号：１；
（ｂ） 配列番号：３；
（ｃ） 配列番号：２３；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と少なくとも８２％の配列同一性を有する核酸配列；および
（ｅ） 長さが少なくとも２３ヌクレオチドである、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の断片
からなる群より選択される配列を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項４１記載の方法において使用されるヌクレオチド・プローブ。
【請求項４４】
Ｍａｔｅｒ分子がＭＡＴＥＲタンパク質である、請求項２６記載の方法。
【請求項４５】
複合体がウエスタンブロット・アッセイ法により検出される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ウエスタンブロット・アッセイ法において、ＭＡＴＥＲタンパク質のＣ末端ペプチドに対して生成された抗体が使用される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
複合体がＥＬＩＳＡにより検出される、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
ＭＡＴＥＲタンパク質が、
（ａ） 配列番号：２；
（ｂ） 配列番号：４；
（ｃ） 配列番号：２４；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｅ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の保存的変種
からなる群より選択される配列を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
ＭＡＴＥＲ特異的結合因子が、ＭＡＴＥＲ特異的抗体またはその機能的断片である、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
因子が抗体である請求項４９記載の因子。
【請求項５１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５０記載の抗体。
【請求項５２】
配列番号：２、配列番号：４、またはそれらの抗原断片の配列を含むペプチドを認識する、請求項４１記載の抗体。
【請求項５３】
ＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子を含む、請求項４４記載の方法を用いて被検者におけるＭＡＴＥＲタンパク質の過剰または欠乏を検出するキット。
【請求項５４】
因子が、
（ａ） 配列番号：２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ） 配列番号：４に記載のアミノ酸配列；
（ｃ） 配列番号：２４に記載のアミノ酸配列；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載される配列と、一つまたは複数の保存的アミノ酸置換により異なるアミノ酸配列；
（ｅ） （ａ）、（ｂ）、または（ｃ） に記載される配列と、少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｆ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の抗原断片、
の中のエピトープと特異的に結合することのできる、請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
ＭＡＴＥＲタンパク質結合因子とＭＡＴＥＲポリペプチドとの結合を検出する方法をさらに含む、請求項５３記載のキット。
【請求項５６】
被検者が哺乳動物である、請求項５３記載のキット。
【請求項５７】
哺乳動物がヒトまたはマウスである、請求項５６記載のキット。
【請求項５８】
前記過剰または欠乏が不妊症の変化を引き起こす、請求項５３記載のキット。
【請求項５９】
ＭＡＴＥＲタンパク質結合因子が抗体である、請求項４３記載のキット。
【請求項６０】
核酸試料中の遺伝子突然変異を検出するキットであって、
（ａ） Ｍａｔｅｒ核酸と特異的にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを含む第一の容器；および、
（ｂ） 該オリゴヌクレオチドと完全相補的な、蛍光標識核酸プローブを含む第二の容器
を含むキット。
【請求項６１】
蛍光標識核酸プローブの長さが５ヌクレオチドから５００ヌクレオチドである、請求項６０記載のキット。
【請求項６２】
被検者由来の組織試料および／または体液試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の欠乏を検出することにより、被検者が異常なＭａｔｅｒ発現と関連する生物学的状態を有するか否かを判定するキットであって、
ＭＡＴＥＲタンパク質に特異的な抗体を含む容器；および
試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の存在を検出する方法を実行する段階と、
該方法によって生成されるデータを解析する段階と
を示す、キットを使用する手引書
を含み、
該手引書により、試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の欠乏が個体が生物学的状況を有するかまたはその素因を有することを示すことが示されるキット。
【請求項６３】
ＭＡＴＥＲタンパク質特異的抗体に結合する検出可能な抗体を含む容器をさらに含む、請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
被検者が異常Ｍａｔｅｒ発現と関連した生物学的状態を有しているか否かを判定するインビトロアッセイキットであって、
ＭＡＴＥＲタンパク質特異的抗体を含む容器；
陰性対照試料を含む容器；および
被検者の組織試料および／または体液試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量を検出する試験アッセイ法を行う段階と、
陰性対照試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量を検出する、陰性対照アッセイ法を行う段階と、
試験アッセイ法および陰性対照アッセイ法によって生成されるデータを比較する段階と
を示す、キットを使用する手引書
を含み、
該手引書により、試験試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量が陰性対照試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量より少ないことが被検者が該生物学的状態を有することを示すことが示されるキット。
【請求項６５】
ＭＡＴＥＲタンパク質に特異的な抗体に結合する検出可能な抗体を含む容器をさらに含む、請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３に記載の配列を含む核酸プローブと、５５℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイズする、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項６７】
配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３に記載の配列を含む核酸プローブと、５０℃、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件下でハイブリダイズする、請求項１０記載の単離核酸分子。
【請求項６８】
被検者中のＭＡＴＥＲタンパク質の発現レベルを核酸分子に機能的に連結したプロモーターを含む組換え遺伝子構築物により改変する方法であって、該核酸分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２３に記載の配列、または配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：２３に記載の配列と少なくとも６５％の同一性を有する配列において少なくとも２３個の連続したヌクレオチドを含み、該核酸分子の発現がＭＡＴＥＲタンパク質の発現を変化させる方法。
【請求項６９】
核酸分子がプロモーターに対してアンチセンス方向にあり、方法が避妊法である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
ＭＡＴＥＲを介する哺乳動物の不妊症に影響を与えるのに有用な化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物が請求項１記載のタンパク質もしくはその変種またはその断片に結合するかあるいは相互作用をするかどうかを判定し、そのように結合した化合物を選択することを含む方法。
【請求項７１】
化合物の結合がＭＡＴＥＲタンパク質の生物活性を阻害する、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
試験化合物を被検細胞に適用する、請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
請求項７０記載の方法により選択された化合物。
【請求項７４】
避妊薬として使用するための請求項７３記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本開示は一般に生殖能力に関し、それを制御する機序、そのような機序の異常から生ずる疾患、および生殖能力に影響を与える（阻害または促進）方法を含む。
【０００２】
背景
早発性卵巣機能不全（ＰＯＦ）は、女性の特定の型の不妊症を表すのに使用される用語である。米国の全女性の１％程度がＰＯＦで悩むと考えられ、それは４０歳未満の女性において不妊症を含む更年期型の症状として発現する。潜在的な染色体疾患（例えば、Ｘ染色体易損性）、化学療法、または放射線治療を含む多くの異なる疾患および条件によって、ＰＯＦが引き起こされる可能性がある。自己免疫は確立された早発性卵巣機能不全の機序である（Ｙａｎら、Ｊ Ｗｏｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｅｎｄ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄ． ９：２７５−２８７、２０００；ＫａｌａｎｔａｒｉｄｏｕおよびＮｅｌｓｏｎ、Ｊ Ａｍ Ｍｅｄ Ｗｏｍｅｎｓ Ａｓｓｏｃ． ５３：１８−２０、１９９８参照）。自己免疫性不妊症では、女性の卵巣は彼女自身の免疫機構の細胞により攻撃され、自己免疫性卵巣炎（卵巣の炎症）として知られる状態を招く。自己免疫疾患は、単一の誘発抗原への応答により発症し、その後広がって同じ臓器の他の抗原分子を含むに至る可能性がある（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：６９〜７２、１９９３）。従って、臓器特異性自己免疫疾患において、自己抗原の標的を同定することは、その病因論の理解に不可欠である。
【０００３】
ヒトの自己免疫性卵巣炎の機序を洞察するために、実験動物（マウス）モデルが用いられてきた。新生期（約３日齢）のマウスの胸腺の除去（胸腺摘出）により、一部の系統のマウスに実験的自己免疫性卵巣炎が誘発される（Ｔａｇｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４２：３２４−３３１、１９８０）。この実験的に誘発された状態は、卵胞の変性を伴う高レベルの抗卵質抗体産生および不妊に至る；この状態の進行はヒト自己免疫性卵巣炎と極めて類似すると思われる（ＫａｌａｎｔａｒｉｄｏｕおよびＮｅｌｓｏｎ、Ｊ Ａｍ Ｍｅｄ Ｗｏｍａｎｓ Ａｓｓｏｃ． ５３：１８−２０、１９９８）。
【０００４】
母性産物は、胚のゲノム活性化が起こるまで発生プログラムを制御する。初期の胚発生に重要な母性効果遺伝子については、ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルにおいて多く記載されてきたが（ＭｏｒｉｓａｔｏおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２９：３７１−３９９、１９９５；ＮｅｗｐｏｒｔおよびＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、Ｃｅｌｌ ３０：６８７−６９６、１９８２）、哺乳類においてはその存在が推測されてきたにすぎない（Ｇａｒｄｎｅｒ、Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｕｐｄａｔｅ ２：１−２７、１９９９）。マウスでは、胚転写は後期１細胞接合体期に最初に検出され、２細胞期を超えて発達するために必要である（Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：５３１−５３８、１９９３；Ｆｌａｃｈら、ＥＭＢＯ Ｊ． １：６８１−６８６、１９８２；Ｌａｎｔｈａｍら、 Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ３５：１４０−１５０、１９９３）。母方から胚ゲノムへのこの遷移を支配する因子は知られていない。
【０００５】
発生における重大な遷移は、卵に蓄えられたタンパク質への依存から胚ゲノムの活性化の結果生じるタンパク質への依存に転換するのに伴って生ずる。マウスの２細胞期に生ずるこの転換は母性因子に依存する。遺伝子の転写やタンパク質の翻訳はネズミ科の卵形成の間に活発であり、卵母細胞にＲＮＡとタンパク質が蓄積する。しかしながら、生殖細胞は卵形成後期には転写が不活性になり、母性ＲＮＡの多くは成熟分裂及び卵が卵管へ排卵する間に分解する。従って、母性遺伝子産物で２細胞胚期を過ぎて存続するものは少なく、初期発生に影響することが直接証明されたものはない（Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：５３１−５３８、１９９３；Ｇａｒｄｎｅｒ、Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｕｐｄａｔｅ ２、３−２７、１９９６）。
【０００６】
開示の概要
本明細書には、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質である、女性の生殖能力に必要な哺乳動物の卵母細胞で発現する約１３５ｋＤａ（予測推定分子量）の細胞質タンパク質が記載される。ＭＡＴＥＲヌル卵母細胞から発生する接合体は２細胞期を超えて進行しない。
【０００７】
いくつかの態様は、推定分子量約１２５ｋＤａから約１３５ｋＤａ、いくつかの態様では、特に約１３４．２ｋＤａと予想される単離されたヒトＭＡＴＥＲタンパク質である。例えばこの推定分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および、例えばマウスＭＡＴＥＲのＣ末端ペプチド（例えば配列番号：６における１０９３残基から１１１１残基）に対して産生された抗体を利用したウエスタンブロッティングによって得ることができる。ＭＡＴＥＲタンパク質は配列番号：２、４もしくは２４に記載のアミノ酸配列、または配列番号：２、４もしくは２４と少なくとも６５％の配列同一性を有する配列を含む。そのようなタンパク質の一部の具体的な例では、一つまたは複数の保存的変種をそのような配列中に含む可能性がある。提供されるヒトＭＡＴＥＲタンパク質は、例えばＭａｔｅｒヌル表現型を相補することができるという意味において、ＭＡＴＥＲタンパク質の生物学的活性を有する。
【０００８】
一部の態様では、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質は自己免疫性不妊症と関連性のある自己抗原である。そのタンパク質は卵母細胞の細胞質、例えば、ヒトのような哺乳動物の卵母細胞の細胞質で発現する可能性がある。
【０００９】
従って、一つの具体的態様は、推定分子量約１３５ｋＤａと予測される単離されたヒトＭＡＴＥＲタンパク質であって、そのヒトＭＡＴＥＲタンパク質は、配列番号：２、および／または配列番号：４、および／または配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含み、自己免疫性不妊症と関連性のある卵母細胞の細胞質特異的な自己抗原であり、胚の２細胞期を超えた発達を可能にすることによりＭａｔｅｒヌル表現型を相補することができる。
【００１０】
さらなる態様は、そのようなＭＡＴＥＲタンパク質をコードする単離核酸分子である。そのような核酸分子の例は、配列番号：１、３もしくは２３に記載の配列、または配列番号：１、３もしくは２３と少なくとも８２％の配列同一性を有する配列を含む。そのような核酸分子のある例では、一つまたは複数の保存的変種がその配列中に含まれうる。特定の例では、５５℃、０．２ＸＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳの洗浄条件、または５０℃、２ＸＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳの洗浄条件下で、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：２３に記載の配列を含む核酸プローブとハイブリダイズする。
【００１１】
また、ＭＡＴＥＲ核酸分子に機能的に連結したプロモーター配列を含む組換え核酸分子、およびそのような組換え核酸分子で形質転換した細胞も提供される。
【００１２】
被検者における異常なＭａｔｅｒ核酸、または異常なＭＡＴＥＲ発現、またはＭＡＴＥＲに対する自己免疫応答と関連性のある生物学的状態を検出する方法も提供される。そのような生物学的状態の例には、不妊症（例えば自己免疫性不妊症）もしくは生殖能力低下、または不妊症もしくは生殖能力低下に対する感受性の増加が含まれる。そのような方法は、被検者における異常なＭａｔｅｒ核酸、または異常なＭＡＴＥＲ発現、またはＭＡＴＥＲに対する自己免疫応答の検出を含みうる。そのような方法の具体的な例において、その異常なＭａｔｅｒ核酸または異常なＭａｔｅｒ発現は、Ｍａｔｅｒ核酸またはＭＡＴＥＲタンパク質の細胞レベルと正常レベルとの比較における変化を含む。異常なＭａｔｅｒ発現は、被検者におけるＭａｔｅｒの増加または減少した発現を含んでよい。
【００１３】
提供される具体的な方法は、被検者がＭＡＴＥＲタンパク質のエピトープを認識する循環自己抗体を持つかどうかを決定することを含み、そのような自己抗体の存在は被検者の不妊症もしくは生殖能力低下、または不妊症もしくは生殖能力低下に対する感受性の増加を示す。その他の具体的方法は、被検者からの臨床試料に含まれる少なくとも一つのＭａｔｅｒ分子を、Ｍａｔｅｒ特異的結合因子（例えばオリゴヌクレオチドまたはＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子（例えば抗体またはその機能的断片））を含む試薬と反応させて、Ｍａｔｅｒ：因子複合体を形成することを含む。
【００１４】
また、不妊症もしくは生殖能力低下についての素因を検出する方法、または個体を不妊症もしくは生殖能力低下について前症状的にスクリーニングする方法も提供される。
【００１５】
本明細書で提供される、生物学的状態を検出する具体的な方法には、異常なＭａｔｅｒ核酸を検出する前にＭａｔｅｒ核酸をインビトロで増幅することが含まれる。増幅は、例えばＭＡＴＥＲタンパク質をコードする配列に由来する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行うことができる。そのようなオリゴヌクレオチドの例には、配列番号：１、３、または２３から少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個または少なくとも２３個の連続したヌクレオチドが含まれうる。
【００１６】
また、そのような方法に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー、そのような核酸分子を含む組換えＤＮＡベクター、およびそのような核酸分子に機能的に（センスまたはアンチセンス方向で）連結したプロモーター配列を含む組換え核酸分子も提供される。そのようなベクターおよび組換え核酸分子は、細胞または動物（例えばヒト以外の動物）を形質転換することができる；そのような形質転換細胞および動物もまた提供される。
【００１７】
提供される方法のうち特定の例では、Ｍａｔｅｒ分子はＭＡＴＥＲをコードする配列である。そのような例のいくつかでは、Ｍａｔｅｒ：因子複合体はヌクレオチド・ハイブリダイゼーションによって検出され、例えば、その因子は標識した核酸プローブである。そのようなプローブは、配列番号：１、３もしくは２３に記載の配列、それらの配列断片（例えば２３個またはそれ以上のヌクレオチド断片）を含むことができる。その他のプローブは、配列番号：１、３、または２３に記載の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むことができる。そのようなヌクレオチドプローブもまた提供される。
【００１８】
提供される方法のその他の例では、Ｍａｔｅｒ分子はＭＡＴＥＲタンパク質であって、配列番号：２、４もしくは２４に記載の配列、配列番号：２、４もしくは２４と少なくとも６５％の配列同一性を有する配列、またはその保存的変種を含むことができる。そのような例のいくつかでは、ＭＡＴＥＲ：因子複合体はウエスタンブロットアッセイ法またはＥＬＩＳＡによって検出される。提供される特定の方法では、そのＭａｔｅｒ特異的結合因子はＭＡＴＥＲ特異的抗体またはその機能的断片であり、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。特定の例においては、抗体は配列番号：２、４もしくは２４に記載の配列を含むペプチド、またはそれらペプチドのうち一つの抗原断片を認識する。
【００１９】
また本明細書で提供されるものにはキットもあり、それはＭＡＴＥＲタンパク質またはＭａｔｅｒ核酸が（例えば、動物のような被検者からの試料において）過剰にあるかまたは欠乏することを検出するキットを含み、そのキットには（例えば抗体またはその機能的断片のような）ＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子が含まれる。ある例では、その因子は、配列番号：２、４もしくは２４に記載のアミノ酸配列、それらと一つもしくは複数の保存性アミノ酸置換により異なるアミノ酸配列、それらの配列と少なくとも６５％の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらのいずれかの配列の抗原断片中のエピトープと特異的に結合することができる。そのようなキットの特定の例は、ＭＡＴＥＲポリペプチドへのＭＡＴＥＲタンパク質結合因子の結合を検出する方法をさらに含む。それらのキットのある例では、検出されるＭＡＴＥＲタンパク質またはＭａｔｅｒ核酸の過剰または欠乏は、不妊症の変化を引き起こす。
【００２０】
提供される他のキットは、核酸試料中の遺伝子変異（例えば、Ｍａｔｅｒ配列中の変異）を検出するためのものである。そのようなキットはＭａｔｅｒ核酸と特異的にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチド（第一の容器に提供してもよい）、および（例えば約５〜５００ヌクレオチドの）本オリゴヌクレオチドと完全に相補的な蛍光標識核酸プローブ（第二の容器に提供してもよい）を含んでもよい。
【００２１】
本明細書に提供される具体的なキットの態様は、被検者が異常なＭａｔｅｒ発現と関連性のある生物学的状態を有しているかどうかを、被検者からの組織および／または体液の試料中にＭＡＴＥＲタンパク質が欠乏することを検出することにより判定するためのものである。そのようなキットはＭＡＴＥＲタンパク質に特異的な抗体とそのキットを使用するための手引書を含む。そのような手引書は（例えば本明細書に記載の方法を用いて）試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の存在を検出する方法の実行のための段階と、その方法により生成されるデータ解析のための段階とを指示することができ、その場合、手引書は、ＭＡＴＥＲタンパク質が試料中に欠乏することが、個体が前記生物学的状態を有するかまたはその素因があることを意味するということを示す。そのようなキットの特定の例は、ＭＡＴＥＲタンパク質特異的抗体に結合する検出可能な抗体をさらに含む。
【００２２】
その他の具体的なキットの態様は、ＭＡＴＥＲタンパク質特異的抗体（一つの容器に提供してもよい）、陰性対照試料（一つの容器に提供してもよい）、そのキットを使用するための手引書を含む。そのような手引書では、被検者の組織および／または、体液の試験試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量を検出する試験アッセイ法（例えば本明細書に提供される試験アッセイ法のような）を実行する段階；陰性対照試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量を検出する陰性対照アッセイ法を実行する段階；ならびにその試験アッセイ法および陰性対照アッセイ法によって生成させるデータの比較をする段階を指示することができる。そのようなキットの特定の例においては、その手引書が、試験試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量が陰性対照試料中のＭＡＴＥＲタンパク質の量より少ないことは、その被検者が前記生物学的状態を有することを意味するということを示す。そのようなキットのいくつかは、ＭＡＴＥＲタンパク質特異的抗体に結合する検出可能な抗体をさらに含む（別個の容器に提供してもよい）。
【００２３】
また、例えば被検者の中で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２３、または配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：２３と少なくとも７０％の同一性を有する配列を含む、少なくとも２３個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子と、（センスまたはアンチセンス方向に）機能的に連結したプロモーターとを含む組換え遺伝子構築物を発現することによって、被検者の中でＭＡＴＥＲタンパク質の発現レベルを改変する方法も提供される。特定の例では、核酸分子の発現はＭＡＴＥＲタンパク質の発現を変化させる。
【００２４】
さらなる態様は、哺乳動物においてＭＡＴＥＲを介する不妊症に影響を与えるのに役立つ化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、試験化合物が、（例えばそれが被検細胞に用いられた場合に）例えばヒトＭＡＴＥＲタンパク質のようなＭＡＴＥＲタンパク質またはその変異体もしくは断片に結合するか、あるいは相互作用するかどうかを判定する段階、およびそのように結合する化合物をスクリーニングする段階を含む。そのような方法の特定の例では、その化合物の結合がＭＡＴＥＲタンパク質の生物活性を阻害する。本明細書にさらに含まれるのは、それらの方法で選別された化合物であり、例えば避妊薬または受精率増強剤として使用するための化合物である。
【００２５】
本発明の前述およびその他の特色および長所は、添付の図面を参照すると共に、続くいくつかの態様の詳細な記載からより明らかになると思われる。
【００２６】
配列表
添付の配列表中の核酸およびアミノ酸配列は、３７連邦規則集１．８２２において定められた定義のとおり、ヌクレオチド塩基においては標準的文字省略形で、アミノ酸においては３文字コードで示される。それぞれのヌクレオチド配列のうち一鎖のみが示されるが、示される鎖へのいずれの言及によっても、相補鎖が含まれるものと理解される。添付の配列表中において、
配列番号：１は、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ断片１の核酸配列を示す；
配列番号：２は、断片１（配列番号：１）によってコードされるヒトＭＡＴＥＲペプチドのアミノ酸配列を示す；
配列番号：３は、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ断片２の核酸配列を示す；
配列番号：４は、断片２（配列番号：３）によってコードされるヒトＭＡＴＥＲペプチドのアミノ酸配列を示す；
配列番号：５は、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１１８６０．１およびＡＦ０７４０１８；個々のエキソンはＡＦ１４３５５９〜ＡＦ１４３５７３にも記載されている）の核酸配列を示す；
配列番号：６は、マウスＭＡＴＥＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３５９９０）のアミノ酸配列を示す；
配列番号：７〜２２は、プローブおよび／またはプライマーとして有用な、いくつかの合成オリゴヌクレオチドを示す；
配列番号：２３は、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの核酸配列、およびコードされたアミノ酸配列を示す；
配列番号：２４は、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２７】
開示の詳細な説明
Ｉ．略語
ＥＳ：胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ）
Ｍａｔｅｒ：胚が必要とする母性抗原（Ｍａｔｅｒｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｈａｔ Ｅｍｂｒｙｏｓ Ｒｅｑｕｉｒｅ）
ＯＰ１：卵質特異的タンパク質１（Ｏｏｐｌａｓｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）
ＰＯＦ：早発性卵巣機能不全（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ Ｏｖａｒｉａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ）
ＴＲＣ：転写関連複合体（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ）
ＺＰ３：透明帯糖タンパク質３（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ３）
【００２８】
ＩＩ．用語
別に記載がなければ、専門用語は従来の方法に従って用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、ベンジャミン・レウィン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ）、「遺伝子 第５版（Ｇｅｎｅｓ Ｖ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９４（国際標準図書番号０−１９−８５４２８７−９）；ケンドリュー（Ｋｅｎｄｒｅｗ）ら編、「分子生物学百科事典（Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、１９９４（国際標準図書番号０−６３２−０２１８２−９）；およびロバートＡメイヤーズ（Ｒｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ）編、「分子生物学と生命工学：総合的机上参考書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．、１９９５（国際標準図書番号１−５６０８１−５６９−８）に見いだすことができる。
【００２９】
本発明の様々な態様の評価を容易にするために、特定の用語について以下に説明を提供する。
【００３０】
異常：正常な特性からの逸脱。正常な特性は、対照、母集団における標準などに見出すことができる。例えば、異常な状態が自己免疫性不妊症のような自己免疫疾患状態である場合において、正常な特性の出所としては、自己免疫障害に罹患していない個体、この疾患に罹患していないと考えられる個体の母標準などを含んでもよい。
【００３１】
いくつかの例では、異常とは、疾患と関連性のある状態を意味する。「と関連性のある」という用語は、疾患自体に加えて、疾患の発症に対する危険性の増大を含む。例えば、ある異常（例えばＭａｔｅｒ核酸、またはＭＡＴＥＲタンパク質発現の異常）について、生殖能力の変化（例えば減少）および自己免疫性不妊症を発症する体質に基づく生物学的状態と関連性がある、というように記載することができる。
【００３２】
異常なＭａｔｅｒ核酸などの異常な核酸とは、正常な（野生型）核酸とある様態において異なる核酸である。そのような異常には、それぞれ対照または標準との比較において、（１）核酸の突然変異（例えば点突然変異（例えば一塩基多型）またはいくつかのヌクレオチドにおける短い欠失または重複）；（２）核酸の複製や発現を変化させるような核酸と関連性のある、対照配列中の突然変異（例えばプロモーターの機能的な不活化）；（３）細胞またはその他の生物試料における核酸の量またはコピー数の減少（例えば、選択的遺伝子欠失または染色体のより広範な部分の欠失による核酸の欠失、またはｍＲＮＡの低発現）；および（４）細胞または試料における核酸の量またはコピー数の増加（例えば、一部もしくは全ての核酸のゲノム増幅、またはｍＲＮＡの過剰発現）が含まれるが、必ずしもそれらに限定されることはない。これらの種類の異常は、同一核酸または同一細胞もしくは試料に共存するものと理解される；例えば、ゲノム増幅した核酸配列は、１つまたは複数の点突然変異も含む可能性がある。加えて、核酸の異常は、対応するタンパク質の発現の異常と関連し、実際にそれを生じさせる可能性があるものと理解される。
【００３３】
異常なＭＡＴＥＲタンパク質発現のような異常なタンパク質発現とは、正常な（野生型）状態におけるタンパク質の発現とある様態において異なるタンパク質の発現を言う。これには、それぞれ対照または標準との比較において、（１）１つまたは複数のアミノ酸残基が異なるような、タンパク質の突然変異；（２）タンパク質配列への、１つまたは数個のアミノ酸残基の短い欠失または挿入；（３）例えばタンパク質のドメインやサブドメイン全体が除去または追加されるような、アミノ酸残基のより広範な欠失または挿入；（４）対照または標準における量と比較して、増加した量のタンパク質発現；（５）対照または標準における量と比較して、減少した量のタンパク質発現；（６）タンパク質の細胞内の局在性または標的化の変化；（７）タンパク質の一過的に調節された発現の変化（例えば、タンパク質が通常は発現しないような時期に発現する、または通常は発現するような時期に発現しない）；および（８）タンパク質の局在化された（例えば、臓器または組織特異的な）発現の変化（例えば、タンパク質が通常は発現するような場所に発現しない、または通常は発現しないような場所に発現する）が含まれるが、必ずしもそれらに限定されることはない。
【００３４】
異常性を決定するために試料と比較するのに適切な対照または標準には、たとえ恣意的な集合である可能性があるにしても、研究室の評価の上では正常と考えられるものが含まれ、そのような評価が研究室ごとに異なる可能性があることに留意する。研究室の標準および評価は、既知のまたは測定された集団値に基づいて設定されたものであってもよく、測定され実験的に決定された値の簡単な比較を可能にするような、グラフや表の様式で提供されたものであってもよい。
【００３５】
アンチセンス、センス、およびアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）：二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、プラス鎖と呼ばれる５’→３’鎖、およびマイナス鎖と呼ばれる３’→５’鎖（逆相補）の二本の鎖を持つ。ＲＮＡポリメラーゼは核酸を５’→３’方向に追加するため、ＤＮＡのマイナス鎖は転写中にＲＮＡの鋳型として作用する。従って、形成されたＲＮＡは（ＴがＵに置換されていることを除き）マイナス鎖と相補的で、プラス鎖と同一な配列を持つと考えられる。
【００３６】
アンチセンス分子とは、ＲＮＡまたはＤＮＡのプラス鎖のいずれかと特異的にハイブリダイズ可能な、または特異的に相補的な分子である。センス分子とは、ＤＮＡのマイナス鎖と特異的にハイブリダイズ可能な、または特異的に相補的な分子である。アンチジーン分子とは、ｄｓＤＮＡを標的とした、アンチセンスまたはセンスのいずれかの分子である。
【００３７】
結合または安定した結合：十分量のオリゴヌクレオチドが塩基対を形成し、または標的の核酸にハイブリダイズして、その結合が検出可能になった場合、オリゴヌクレオチドは標的の核酸に結合または安定して結合する。結合は、標的：オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的な性質により検出できる。標的とオリゴヌクレオチドの結合は、機能的および物理的な結合アッセイ法の両方を含む、当業者に知られた任意の方法により検出できる。結合が、遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳等のような生合成過程に対して観察可能な効果を有するかどうかを決定することにより、結合を機能的に検出することができる。
【００３８】
ＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖の結合を物理的に検出する方法は、当技術分野において公知であり、例えばＤＮアーゼＩまたは化学的フットプリント法、ゲルシフトおよびアフィニティー切断（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｌｅａｖａｇｅ）アッセイ法、ノーザン・ブロッティング、ドット・ブロッティング、ならびに吸光度検出法などの方法が含まれる。例えば、容易かつ信頼性があるために広く用いられている方法として、温度を穏やかに上昇させながら、オリゴヌクレオチド（または類似体）および標的核酸を含む溶液において２２０ｎｍから３００ｎｍでの吸光度の変化を観察することが含まれる。オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合している場合に、オリゴヌクレオチド（または類似体）および標的が固有の温度において、互いに解離または融解するために、吸光度の急激な上昇がある。
【００３９】
オリゴマーとその標的核酸の間の結合は、５０％の標的配列が完全に一致するプローブまたは相補鎖とハイブリダイズした状態を維持する温度（Ｔｍ）によって、しばしば特徴づけられる。高い（Ｔｍ）は、低い（Ｔｍ）と比較して、より強いまたはより安定な複合体を意味する。
【００４０】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：内部に非コードセグメント（イントロン）および転写調節配列を欠失するＤＮＡ断片。ｃＤＮＡはまた、対応するＲＮＡ分子の翻訳を制御する役割を持つ非翻訳領域（ＵＴＲ）も含まれうる。ｃＤＮＡは通常、研究室において、細胞から抽出したメッセンジャーＲＮＡからの逆転写により合成される。
【００４１】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ＤＮＡは、ほとんどの生物の遺伝物質を構成する長いポリマー鎖である（いくつかのウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマーの反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、そのそれぞれは、燐酸基が付いたデオキシリボース糖に結合した、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）の４つの塩基のうちの一つを含む。ヌクレオチドのトリプレット（コドンと呼ぶ）は、ポリペプチド中のそれぞれのアミノ酸または終結シグナルをコードする。コドンという用語は、そのＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡにおいて対応する（かつ相補的な）３つのヌクレオチド配列にも使用される。
【００４２】
他に明記しない限り、ＤＮＡ分子のいずれの言及も、そのＤＮＡ分子の逆相補鎖を含むことを意図する。本明細書の文面において一本鎖であることが要求される場面を除いて、ＤＮＡ分子は、一本鎖のみを表すように記載されている場合であっても、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を包含する。従って、特定のタンパク質をコードする核酸分子またはその断片への言及は、センス鎖およびその逆相補鎖の双方を包含する。従って、例えば、開示された核酸分子の逆相補配列からプローブまたはプライマーを生成することも適当である。
【００４３】
欠失：ＤＮＡの配列の除去であって、除去された配列のそれぞれの側にある領域が互いに結合されること。
【００４４】
遺伝子増幅またはゲノム増幅：遺伝子、または遺伝子の断片もしくは領域、または関連した５’または３’領域のコピー数を、正常組織におけるコピー数と比較した場合のコピー数の増加。ゲノム増幅の例として、癌遺伝子のコピー数の増加がある。「遺伝子欠失」は、遺伝子配列に通常存在する一つまたは複数の核酸の欠失であり、極端な例では、遺伝子全体または染色体の一部の欠失さえ含むことがある。
【００４５】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体は、相補的塩基間において、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によりハイブリダイズする。一般に、核酸は含窒素塩基、すなわちピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかで構成される。それらの含窒素塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンとの結合は「塩基の対合」と呼ばれる。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、二つの別個の核酸配列、または同一核酸配列中の二つの別個の領域の間に生ずる塩基の対合を指す。
【００４６】
「特異的にハイブリダイズする」および「特異的に相補的」は、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）とＤＮＡまたはＲＮＡの標的の間で安定で特異的な結合をするのに十分な程度の相補性を表す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズするためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドまたは類似体と標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げ、例えばインビボのアッセイ法または系の場合の物理的条件のような特異的な結合が要求される状況下で、オリゴヌクレオチドまたは類似体が非標的配列へ非特異的に結合するのを妨げるのに十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドまたは類似体が特異的にハイブリダイズすると言う。そのような結合を、特異的ハイブリダイゼーションと称する。
【００４７】
特定の程度のストリンジェンシーを生ずるハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション方法の特性、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成や長さによって異なると考えられる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、作業時間もストリンジェンシーに影響する。特定の程度のストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、第９章および１１章に論じられており、これは、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４８】
本目的のために、「ストリンジェントな条件」には、ハイブリダイゼーション分子と標的配列との間のミスマッチが２５％未満の場合にのみハイブリダイゼーションを生ずるような条件が含まれる。より厳密な定義においては、「ストリンジェントな条件」は、特定レベルのストリンジェンシーに分類され得る。従って、本明細書で使用される「緩やかなストリンジェント」な条件とは、２５％より多くの配列のミスマッチがある分子はハイブリダイズしないような条件である；また、「中程度のストリンジェント」な条件とは、１５％より多くの配列のミスマッチがある分子はハイブリダイズしないような条件であり、「高ストリンジェント」な条件とは、１０％より多くのミスマッチがある配列はハイブリダイズしないような条件である。「極めて高ストリンジェント」な条件とは、６％より多くのミスマッチがある配列はハイブリダイズしないような条件である。
【００４９】
インビトロ増幅：試料または標本中の核酸分子のコピー数を増加させる手法。増幅の例にはポリメラーゼ連鎖反応があり、被検者から回収した生物試料を、一対のオリゴヌクレオチド・プライマーと、そのプライマーが試料中の鋳型核酸とハイブリダイゼーションすることを可能にする条件の下で接触させる。プライマーを適当な条件で伸長させ、鋳型から解離させて、次いで再びアニーリングして、伸長させ、解離して、核酸のコピー数を増幅させる。インビトロ増幅の生成物は、標準的手法を用いて、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ分解パターン、オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションもしくはライゲーション、および／または核酸配列決定により特徴を調べることができる。他のインビトロ増幅手法の例には、鎖置換増幅（米国特許第５，７４４，３１１号参照）；転写フリー等温増幅（米国特許第６，０３３，８８１号参照）；修復連鎖反応増幅（国際公開公報第９０／０１０６９号参照）；リガーゼ連鎖反応増幅（欧州特許出願公開第３２０ ３０８号参照）；ギャップ補充性リガーゼ連鎖反応増幅（米国特許第５，４２７，９３０号参照）；共役リガーゼ検出およびＰＣＲ（米国特許第６，０２７，８８９号参照）；ならびにＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写フリー増幅（米国特許第６，０２５，１３４号参照）が含まれる。
【００５０】
注入可能な組成物：少なくとも一つの活性成分を含む薬学的に許容される液体組成物。活性成分は、通常生理学的に許容される担体に溶解または懸濁されており、組成物は、１つまたは複数の少量の非毒性の補助物質、例えば乳化剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤等のを追加的に含んでいてよい。提供される核酸およびタンパク質と共に使用するのに有用であるそのような注入可能な組成物は慣例的に用いられており、その適切な製剤化は当技術分野で公知である。
【００５１】
単離された：「単離された」生物成分（例えば核酸分子、タンパク質、または細胞小器官など）は、その生物成分が自然に存在する有機体の細胞中の他の生物成分、すなわち他の染色体、ならびに染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、および細胞小器官から実質的に分離または精製されたものである。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準の精製方法により精製した核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現された核酸およびタンパク質、ならびに化学的合成により得られた核酸を包む。
【００５２】
ＭＡＴＥＲタンパク質：約１２５ｋＤａから約１３５ｋＤａ（ゲル移動度に基づく推定分子量）の女性の生殖能力に不可欠である細胞質局在性タンパク質（配列番号：２４）。頭文字は、胚が必要とする母性抗原（Ｍａｔｅｒｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｈａｔ Ｅｍｂｒｙｏｓ Ｒｅｑｕｉｒｅ）を意味する。Ｍａｔｅｒは、ヒト第１９染色体上に見出された単一コピー遺伝子である。Ｍａｔｅｒヌル（Ｍａｔｅｒ−／−）卵母細胞から生じた接合体は２細胞期を超えて発達しない。従って、Ｍａｔｅｒは、哺乳動物の胚の生存および初期発生に必要な新規の母性効果遺伝子を意味する。
【００５３】
タンパク質は、それらの活性およびその他の物理的性質を、ヒトまたはマウスＭＡＴＥＲタンパク質のような原型的なＭＡＴＥＲタンパク質と比較することにより、ＭＡＴＥＲタンパク質として同定することができる。ＭＡＴＥＲタンパク質の生物学的活性は、タンパク質がＭａｔｅｒヌル変異体を相補する（失われた機能を実質的に置き換える）能力の点から評価できる。タンパク質がＭａｔｅｒ変異体を相補する能力は、そのタンパク質をコードする遺伝子を、標準的な方法によってＭａｔｅｒ変異動物系（本明細書に記載したＭａｔｅｒヌルマウスなど）に導入することにより容易に判別できる。コードされたタンパク質がＭＡＴＥＲタンパク質の生物活性を有している場合、トランスジェニック子孫動物の一部が、Ｍａｔｅｒ変異体に関連した特性（例えば、Ｍａｔｅｒヌル卵母細胞が２細胞期を超えて発達できないことに由来するＭａｔｅｒヌルの雌の不妊症）において、相対的に野生型の表現型を持つことから明らかにされる。
【００５４】
仮定的なＭＡＴＥＲタンパク質を評価する場合に検討することができるその他のＭＡＴＥＲタンパク質の物理的特性としては、タンパク質の分子量（約１２５ｋＤａ〜約１３５ｋＤａ、実施例１参照、但しこの値は種ごとにいくぶん変動する可能性がある）、タンパク質の細胞内局在性（ヒトＭＡＴＥＲは卵母細胞内で発現し（実施例４）、マウスで起こっているように、細胞質に特異的に発現し核には含まれていないと予測される（実施例１参照））、ならびにｍＲＮＡの時間的および空間的な制御（Ｍａｔｅｒ転写物は成熟中の卵母細胞で産生されている、実施例１および実施例３参照）が含まれる。一つのＭＡＴＥＲタンパク質（例えばマウスＭＡＴＥＲ）を認識する抗体は、他種由来のＭＡＴＥＲタンパク質（例えばヒトＭＡＴＥＲ）を認識する可能性がある（実施例４参照）；従って、仮定的なＭＡＴＥＲタンパク質は、他種由来のＭＡＴＥＲタンパク質に対して産生された抗ＭＡＴＥＲ抗体による認識に基づいて、さらに検討および同定をすることができる。従って、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の同一性は、例えばマウスＭＡＴＥＲタンパク質またはそのタンパク質のエピトープに対して産生された抗体を用いる免疫学的同定によって確認できる。
【００５５】
ヌクレオチド：「ヌクレオチド」は、ピリミジン、プリンもしくはそれらの合成類似体のような糖と連結した塩基、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなアミノ酸に連結した塩基を含むモノマーを含むが、それらに限定はされることはない。ヌクレオチドはポリヌクレオチド中の一つのモノマーである。ヌクレオチド配列とは、ポリヌクレオチドにおける塩基配列を指す。
【００５６】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、固有のホスホジエステル結合により結合された複数個の連結したヌクレオチドであり、約６ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチド類似体とは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、自然に存在しない部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドのように、改変した糖部分または糖間の結合のような、自然に存在しない部分を含むことができる。自然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合でき、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【００５７】
特定のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、約２００ヌクレオチドの長さまでの直鎖配列を含んでよく、例えば、その配列（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）は、少なくとも６塩基、例えば少なくとも８塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基、１００塩基もしくはさらに２００塩基の長さ、または約６塩基から約５０塩基、例えば１２塩基、１５塩基、２０塩基もしくは２３塩基のような約１０塩基〜約２５塩基の長さである。
【００５８】
機能的に連結：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に位置する場合に、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合に、同一のリーディングフレーム内にある。
【００５９】
オープンリーディングフレーム：内部に終止コドンを持たない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチド・トリプレット（コドン）。これらの配列は、通常、ペプチドに翻訳可能である。
【００６０】
オルソログ：２つの核酸またはアミノ酸配列が共通の祖先配列を共有し、且つその祖先配列を持つ種が２つの種に分かれるときにそれらが分岐したものである場合、それらは互いにオルソログである。オルソロガスな配列は相同な配列でもある。
【００６１】
非経口：腸管外、例えば、消化管を介さない投与。一般に、非経口製剤とは、経口摂取以外の任意の可能な方法を介した投与によるものである。この用語は、特に、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、または皮下などの注射による投与、ならびに例えば鼻腔内、皮内、および局所投与を含む様々な体表塗布を指す。
【００６２】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）：ペプチド結合で連結したアミノ酸モノマーのような、アミド（ペプチド）結合により連結したモノマーを含む骨格を有するオリゴヌクレオチド類似体。
【００６３】
薬学的に許容される担体：本明細書で提供される組成物と共に有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）らの「レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、マーク出版（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ、第１９版、１９９５において、本明細書で開示したヌクレオチドおよびタンパク質の薬物送達に適した組成物および製剤化が記載されている。
【００６４】
一般に、担体の種類は、使用される特定の投与法に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、媒体として、水、生理食塩水、平衡化された塩溶液、ブドウ糖水、グリセリン等のような、薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射可能な液体を含む。固体組成物（例えば散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形）向けには、慣例的な非毒性の固体担体として、例えば医薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与される薬学的組成物は、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの保湿または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などのような少量の非毒性の補助物質を含み得る。
【００６５】
多形：遺伝子配列中の変種。多形は、個体間、異なる人種集団間、地理的場所の間で一般的に見いだされる変異のように、異なるヌクレオチド配列を有していながら、機能的に等価な遺伝子産物を産生するような変異（ヌクレオチド配列の差異）でありうる。多形という用語は、機能が変化した遺伝子産物を産生する変異、即ち、機能的に等価でない遺伝子産物をもたらす遺伝子配列中の変異をも包含する。この用語は、遺伝子産物を産生しない変異、不活性な遺伝子産物または増加した遺伝子産物を産生する変異をも包含する。多形という用語は、文脈が明らかに別であると指示される場合を除き、対立形質または突然変異と互換的に使用される可能性がある。
【００６６】
多形は、例えば、変異が存在するヌクレオチド部位、ヌクレオチド変異によって生じたアミノ酸配列中の変化、または変異と関連した核酸分子のその他の特性の変化（例えばステム・ループのような二次構造の変化、または、ポリメラーゼ、ＲＮアーゼ等のような関連分子に対する核酸の結合親和性の変化）を意味しうる。
【００６７】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーは、疾患または疾患の進行の指標として提供される核酸分子に基づいて容易に調製できる。核酸分子の断片または部分に基づいてプローブおよびプライマーを生成することが適当である。５’領域または３’領域に対するプローブおよびプライマーに加えて、逆相補鎖に特異的なプローブおよびプライマーも適当である。
【００６８】
プローブは、検出可能な標識またはその他のレポーター分子を付加した単離核酸を含む。典型的な標識には、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光または蛍光物質、ハプテン、および酵素が含まれる。標識の方法、および様々な目的に適した標識の選択についての手引きは、例えば、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウイリーアンドソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８）において考察されている。
【００６９】
プライマーは、例えばヌクレオチドが１０個またはそれ以上の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドのような、短い核酸分子である。より長いＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドが約１５個、２０個、２５個、３０個、または５０個またはそれ以上の長さであってもよい。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニーリングさせ、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成することができ、次にプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で知られている他のインビトロ核酸増幅法を用いて、核酸配列の増幅に使用されうる。
【００７０】
核酸プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えばサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウイリーアンドソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８）、およびイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（「ＰＣＲプロトコール、方法と応用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）に記載されている。増幅プライマー対（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に使用するための）は、本明細書で記載したＭａｔｅｒ配列のような既知の配列から、例えば、プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）（バージョン０．５、１９９１年著作権、ホワイトヘッド生物医学研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｃｈａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のような、その目的向けのコンピューター・プログラムを使用して得ることができる。
【００７１】
特定のプローブまたはプライマーの特異性が、その長さに従って増加することは、当業者に自明である。従って、例えばＭＡＴＥＲタンパク質をコードするヌクレオチドのうちの３０個の連続したヌクレオチドを含むプライマーは、１５個のみのヌクレオチドの対応するプライマーと比較して、例えば指定されたＭＡＴＥＲタンパク質の別の相同体のような標的配列に高い特異性でアニーリングする。従って、より大きい特異性を得るために、プローブおよびプライマーは、ＭＡＴＥＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列のうちの少なくとも２０個、２３個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５、５０個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むように選択してもよい。
【００７２】
また、開示されたＭａｔｅｒヌクレオチド配列のうちの特定の長さを含む単離核酸分子も提供される。そのような分子は、それらの配列またはそれより多くの配列のうちの少なくとも１０個、１５個、２０個、２３個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含んでもよく、また開示された配列のうちの任意の領域から得てもよい（例えば、Ｍａｔｅｒ核酸は、配列の長さに基づき半分または４分の１に分割でき、単離核酸分子は半分にした分子の一つ目もしくは二つ目、または四半分にした分子の任意のものなどから得ることができる）。Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡまたはその他のコード配列は、同様な効果により、例えば約１／８、１／１６、１／２０、１／５０などのより小領域に分けることもできる。
【００７３】
他の分割の様式は、Ｍａｔｅｒ遺伝子に関連した５’（上流）および／または３’（下流）領域を選択することである。
【００７４】
核酸分子は、本明細書で記載したようなヒトＭａｔｅｒ核酸分子またはこの核酸分子の他の部分、および関連する隣接領域の中で任意のもののうち、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、もしくは１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むように選択できる。従って、代表的な核酸分子は、配列番号：１および２に記載のヒトｃＤＮＡ断片、または配列番号：２４に記載の全ヒトＭＡＴＥＲ ｃＤＮＡ断片のうちの、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。
【００７５】
タンパク質：遺伝子または組換えもしくは合成のコード配列によって発現された生体分子であってアミノ酸から構成される分子。
【００７６】
精製された：「精製された」という用語は絶対的な純度を要求するものではない；むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたタンパク質調製物とは、細胞内または（適当な場合には）産生反応チャンバの中の天然の環境におけるタンパク質よりも純粋であるようなタンパク質調製物である。
【００７７】
組換え体：組換え核酸は、自然には存在しない配列、または配列中の別個の異なる２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有する核酸である。この人工的な組合せは、化学合成、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的な操作、例えば遺伝子工学技術によって得ることができる。
【００７８】
配列同一性：２つの核酸配列間の類似性、または２つのアミノ酸配列間の類似性は、特に配列同一性と呼ばない限り、配列間の類似性として表現される。配列同一性は、しばしば同一性％（または類似性％または相同性％）という点で評価される；百分率が高いほど、２つの配列はより類似している。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の相同体またはオルソログ、および対応するｃＤＮＡまたは遺伝子配列は、標準的な方法を用いてアライメントすると比較的高い程度の配列同一性を保有すると考えられる。この相同性は、オルソロガスなタンパク質または遺伝子またはｃＤＮＡが、より遠縁の種の場合（例えばヒト配列とＣ．エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）の配列）と比較して、より近縁な種に由来する場合（例えばヒト配列とチンパンジーの配列）に顕著である。
【００７９】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で既知である。様々なプログラムやアラインメント・アルゴリズムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２、１９８１；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３、１９７０；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４、１９８８；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３、１９８９；コーペット（Ｃｏｒｐｅｔ）ら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１−９０、１９８８；フアン（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５−６５、１９９２；ならびにピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２４、３０７−３１、１９９４、に記載されている。アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０、１９９０）は、配列アラインメントの手法および相同性の計算の詳細な検討を示している。
【００８０】
ＮＣＢＩベイシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ：ＢＬＡＳＴ）（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０、１９９０）は、米国生命工学情報国立センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含むいくつかの供給元より入手でき、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと関連して用いられる。一例として、約３０個より多いアミノ酸のアミノ酸配列比較のために、デフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列をデフォルト・パラメータに設定して用いるＢｌａｓｔ２配列機能が使用される（ギャップ存在コストが１１、および塩基毎ギャップコストが１）。短いペプチド（約３０アミノ酸より少数）をアライメントする場合は、ＰＡＭ３０行列をデフォルト・パラメータに設定して用いるＢｌａｓｔ２配列機能を使用したアラインメントを実行すべきである（開始ギャップ ９、伸長ギャップ １ペナルティ）。
【００８１】
２つの核酸分子が近縁関係にあることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェント条件は配列に依存し、且つ異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジェント条件は、定められたイオン強度およびｐＨにおける特定配列の融解温度（Ｔｍ）より、約５℃から２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブまたは相補鎖とハイブリダイズを維持するような（定められたイオン強度およびｐＨにおける）温度である。核酸のハイブリダイゼーション条件およびストリンジェンシーの計算は、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）およびティジッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（「生化学および分子生物学の実験手法−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション 第一部（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−− Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ＰａｒｔＩ）」、第２章、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３）に見出すことができる。ストリンジェント条件下でヒトＭＡＴＥＲタンパク質コード配列とハイブリダイズする核酸分子は、通常、全ヒトＭＡＴＥＲコード配列またはそのコード配列のいずれかのうちの選択された部分に基づいたプローブと、２×ＳＳＣ、５０℃の洗浄条件下でハイブリダイズする。
【００８２】
高い程度の同一性を示さない核酸配列であっても、遺伝コードの縮重のために、なお類似したアミノ酸配列をコードする可能性がある。この縮重を利用し、全ての核酸分子が実質的に同一のタンパク質をコードするような多数の核酸分子を産生することによって、核酸配列を変化させることができると理解される。
【００８３】
特異的結合因子：実質的に、定められた標的にのみ結合する因子。従ってタンパク質特異的結合因子は、実質的に特定のタンパク質にのみ結合する。一例として、本明細書で使用されるように、「ＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子」という用語は、抗ＭＡＴＥＲタンパク質抗体（およびその機能的断片）ならびにその他の実質的にＭＡＴＥＲタンパク質にのみ結合する因子（可溶性受容体など）を含む。
【００８４】
抗ＭＡＴＥＲタンパク質抗体は、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）を含む多くの教科書に記載される標準的な手段を用いて産生されうる。特定の因子が実質的に特定のタンパク質にのみ結合することの確認は、通常の手法を使用または応用することによって、容易に行うことができる。適切なインビトロアッセイ法として、ウエスタン・ブロッティング法を利用するものがある（ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）を含む多くの標準的教科書に記載されている）。ウエスタン・ブロッティングは、抗ＭＡＴＥＲタンパク質モノクローナル抗体のような所与のタンパク質結合因子が、実質的にＭＡＴＥＲタンパク質にのみ結合することを確認するために用いることができる。
【００８５】
抗体の短い断片も、特異的結合因子として作用する。例えば、特定のタンパク質に結合するＦａｂｓ、Ｆｖｓ、および一本鎖Ｆｖｓ（ＳＣＦｖｓ）は、特異的結合因子となり得る。これらの抗体断片は以下のように定義できる：（１）Ｆａｂ、パパイン酵素による抗体全体の消化により、無傷の軽鎖および重鎖の一部分が生じることで産生された抗体分子の一価の抗原結合性断片を含む断片；（２）Ｆａｂ’、ペプシンによる抗体全体の処理およびその後の還元により、無傷の軽鎖および重鎖の一部分が生じることで得られた抗体分子の断片；抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる；（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体をその後の還元なしにペプシン酵素で処理することにより得られた抗体分子の断片；（４）Ｆ（ａｂ’）２、２つのジスルフィド結合により結合された２つのＦａｂ’断片の二量体；（５）Ｆｖ、二本鎖として発現させた、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された断片；ならびに（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子的に融合した一本鎖分子のように、適当なポリペプチド・リンカーにより連結した軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された分子。これらの断片を作製する方法は通常のものである。
【００８６】
被検者：多細胞の脊椎生物であり、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリー。
【００８７】
標的配列：「標的配列」はｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはＲＮＡの一部であり、治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーションにより、発現の阻害を生ずるもの。例えば、治療的に有効なオリゴヌクレオチドとＭａｔｅｒ標的配列とのハイブリダイゼーションにより、ＭＡＴＥＲ発現が阻害される。アンチセンス分子またはセンス分子のいずれかをｄｓＤＮＡの一部を標的化するために用いることができるが、これは両方ともがｄｓＤＮＡのその部分の発現を妨害するためである。アンチセンス分子はプラス鎖に結合でき、センス分子はマイナス鎖に結合できる。従って、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、およびＲＮＡが標的配列になり得る。
【００８８】
形質転換：形質転換した細胞とは、分子生物学の手法によって核酸分子を導入した細胞である。本明細書で使用されるように、形質転換という用語は、核酸分子がそのような細胞に導入されるであろう手法の全てを包含し、ウイルス・ベクターによるトランスフェクション、プラスミド・ベクターによる形質転換、ならびに電気穿孔法、リポフェクション、およびパーティクルガン法による裸のＤＮＡの導入を含む。
【００８９】
ベクター：宿主細胞に導入されることによって、形質転換した宿主細胞を生成するような核酸分子。ベクターは、複製起点などの、それが宿主細胞内で複製できるようにする核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、一つまたは複数の選択マーカー遺伝子、および当技術分野に知られたその他の遺伝的要素を含んでもよい。
【００９０】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、この発明の属する分野における当業者に一般に理解されるものと同様な意味をもつ。単数用語「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において明白に他の意味を示さない限り複数の対象を含む。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと類似または同等な方法および材料を使用することも可能であるが、以下に適適当な方法および材料を記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合は、用語の説明を含む本明細書が統制する。加えて、方法、材料および実施例は、説明的なものにすぎず、限定することを意図するものではない。
【００９１】
ＩＩＩ．ヒトＭＡＴＥＲタンパク質および核酸配列
態様は、ｃＤＮＡ配列を含むＭＡＴＥＲタンパク質およびＭａｔｅｒ核酸分子を提供する。原型的なＭａｔｅｒ配列はマウス配列およびヒト配列であり、増加または減少したレベルのＭＡＴＥＲタンパク質を有するトランスジェニック動物を産生するためのそれらの配列の使用法、およびＭａｔｅｒ発現またはＭＡＴＥＲタンパク質産生の異常もしくは変化を検出する診断法を提供する。
【００９２】
ヒトＭａｔｅｒの全長ｃＤＮＡ（配列番号：２３）は３９００塩基対長と決定され（これはマウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡよりいくらか長い、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１１８６０．１、配列番号：５）、そのＯＲＦは１２００アミノ酸のタンパク質をコードし、約１３５．２ｋＤａの推定分子量および約６．０８の予測ｐＩを有する。ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡは、配列番号：１および配列番号：３に記載の配列を含み、それらはそれぞれマウスＭａｔｅｒ配列の第７エキソンおよび第１１から第１５エキソンとほぼ一致すると考えられる。ヒトＭａｔｅｒ ｍＲＮＡは、インサイチュー・ハイブリダイゼーション実験（実施例３）により示されるように、卵母細胞で発現する。
【００９３】
免疫蛍光検査法によって、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質（配列番号：２４）が、ヒト卵母細胞に特異的に局在化されていた（実施例４）。Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡのＡＴＧ開始コドンは、脊椎動物の開始コドンと関連するＡＮＮＡＴＧモチーフ（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１９８６７）の文脈中に位置する。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質は、本明細書に記載されるヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列（それぞれ配列番号：１および３）に対応する推定タンパク質配列（配列番号：２および４）を含む。それらのタンパク質断片はマウス由来のＯＰ１／ＭＡＴＥＲタンパク質と、低いながら有意な配列相同性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿０３５９９０、配列番号：６）。特に、配列番号：２はマウスＭＡＴＥＲ（配列番号：６）の２５７〜６３８残基と５４％の同一性を有し、一方、配列番号：４はマウスＭＡＴＥＲの８５４〜１１１１残基と６４％の同一性を有する。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質配列（配列番号：２４）は全体としてマウスＭＡＴＥＲタンパク質配列（配列番号：６）と約５０％の配列類似性を有する；関連する配列アラインメントは図９に示される。図示したヒトおよびマウスＭＡＴＥＲタンパク質間の比較は、ＢＬＡＳＴ２配列プログラムを期待値１０およびフィルターを閉じたパラメータ条件で使用して行った。
【００９４】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの特定の領域は、ヒトＨＴＧＳの配列決定法により同定したが、それらの配列には以前に何の機能または同一性も割り当てられていなかった。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ０２４５８０（ＧＩ＝７７０５１０、２０００年５月４日公表）；ＡＣ０１２１０７（ＧＩ＝６０８８０２０、１９９９年１０月２０日公表、および更新されたＧＩ＝７３２９２５２、２０００年３月２８日公表）；ならびにＡＣ０２３８８７（ＧＩ＝７６３１０５４、２０００年４月２１日公表）を参照のこと。これらの断片的で重複したヒト配列は、長さにおいて最大２０７ヌクレオチドであり、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列の全体に渡り散在する。ヒトＥＳＴは、短い断続的な領域にわたり、個々に、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡと最大８９％の同一性を有する。開示されたオリゴヌクレオチドは、それらのＥＳＴを避けて選択することができる。全体としては、ヒトＭａｔｅｒの最初の７５ヌクレオチド（１〜７５）および対応する推定アミノ酸（１〜２５）は、公表されたヒトゲノムＤＮＡ配列との比較によって決定し、残りのＭａｔｅｒ配列は、ヒト卵巣ｃＤＮＡの直接的なクローニングおよび配列決定により決定された。
【００９５】
Ｍａｔｅｒは、単一コピーの母性効果遺伝子であり、そのタンパク質産物は初期胚の生存に必要である。ＭＡＴＥＲタンパク質を欠失する卵は受精可能であるが、早ければ２細胞期には形態学的な変性の徴候が観察され、変異胚はその時期を超えて発達できない。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質は１２００アミノ酸を有し、マウスＭＡＴＥＲタンパク質（１１１１アミノ酸）に見られるような分子ドメインと同様なものを持つと推定される。トン（Ｔｏｎｇ）ら（Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ １１：２８１−２８７、２０００）に記載されたように、マウスＭＡＴＥＲタンパク質は、そのＮ末端付近における５回の親水性反復（２６〜２７アミノ酸）、短いロイシン・ジッパー、およびそのカルボキシル末端付近における１４回のロイシンリッチ反復（２８〜２９アミノ酸）を含む（トン（Ｔｏｎｇ）ら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １１：２８１−２８７、２０００に記載のように、マウスＭＡＴＥＲタンパク質との比較に基づく）。親水性反復は、細胞骨格タンパク質（神経フィラメント）と低い相同性を有し、本領域がＭＡＴＥＲを細胞質にとどまらせる相互作用を媒介する可能性を提起する。ロイシンリッチ領域および短いロイシン・ジッパーの存在は、いずれもタンパク質間相互作用を媒介することが知られているモチーフであり（カジャバ（Ｋａｊａｖａ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７７、５１９−５２７、１９９８；ブハナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）およびガイ（Ｇａｙ）、Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６５、１−４４、１９９６）、ＭＡＴＥＲが、そのうち一つまたは複数が細胞質でＭＡＴＥＲに直接結合するような介在因子を通して、胚の発達に影響を及ぼす可能性を示唆する。
【００９６】
本発明者らは、マウスＭＡＴＥＲペプチド（マウスＭＡＴＥＲ（配列番号：６）の１０９３から１１１１残基まで）に対する抗血清を用いて、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質がヒト卵巣切片中の卵母細胞に存在することを証明した（実施例４）。同様に、マウス由来のセンスおよびアンチセンス・ヌクレオチド・プローブをインサイチューハイブリダイゼーション実験に使用して、ヒト卵母細胞がＭａｔｅｒ ｍＲＮＡを発現することが証明された（実施例３）。
【００９７】
本発明者らは、マウスＭＡＴＥＲを、哺乳動物の胚形成における機能に関してさらに特徴づけた。このタンパク質は「母性」タンパク質であり、受精に先立ち卵母細胞で生成され、従って母性遺伝子によりコードされる。ＭＡＴＥＲは（タンパク質レベルで測定した場合）、胚発生における後期胚盤胞期まで存続するという点で特有である。機能的なＭＡＴＥＲは雌の生殖能力に必要とされる；Ｍａｔｅｒヌル卵母細胞から生じた接合体は２細胞期を超えて発達しない；どのようなＭａｔｅｒ遺伝子型の雄が精子を産生したかに拘らず、このことは当てはまる。本タンパク質は細胞質性であり、明確に核から除外されている。
【００９８】
本発明は、以下の限定されない実施例によって例示される。
【００９９】
実施例１
マウスＭＡＴＥＲタンパク質の特徴づけ
本実施例は、哺乳動物の系におけるＭＡＴＥＲタンパク質および核酸を調べるためのいくつかの方法を提供する；マウスの系が用いられた。
【０１００】
方法：
卵母細胞、卵および胚の単離  全ての実験は、動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに準拠して、認可された動物研究プロトコールのもとで実施された。休止期、成長期、および成熟した卵母細胞は、１日齢、１０日齢、および２１日齢（ｄ／ｏ）マウス卵巣からそれぞれ解剖分離し、卵は、ゴナドトロピンで刺激した雌マウスから単離した（トン（Ｔｏｎｇ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：８４９−８５３、１９９５；ランキン（Ｒａｎｋｉｎ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：２４１５−２４２４、１９９８）。胚はゴナドトロピンで刺激した雌マウスを雄と交配することにより得られ、１細胞接合体、２細胞胚、桑実胚、および胚盤胞は、ｈＣＧを投与した次の朝を１日目とカウントし、１日目、２日目、３日目、および４日目に卵管より洗い流した。胚は、Ｍ１６培地で培養し（３７℃、５％ＣＯ２）、１％パラホルムアルデヒドで固定してその後の共焦点顕微鏡検査に供するか、または−８０℃で凍結し、ＲＮＡおよびタンパク質の解析に供した。卵巣を固定し（１０％ホルマリン）、パラフィンに包埋した後、切片標本の作製し、ヘマトキシンおよびエオシンで染色した（アメリカンヒストラボ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｉｓｔｌａｂｓ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）。
【０１０１】
転写物およびタンパク質の検出  Ｍａｔｅｒ、ＺＰ３、β−アクチン、シクロフィリン、および２８Ｓ−ｒＲＮＡの転写物は、ＲＰＡ ＩＩキット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、既に記載されたように（トン（Ｔｏｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０、３７２０−３７４６、１９９９；  トン（Ｔｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、８４９−８５３、１９９５）、ＲＮアーゼ保護アッセイ法によって検出した。
【０１０２】
ウサギはＫＬＨを結合したＭＡＴＥＲペプチド（アミノ酸１０９３〜１１１１）によって免疫し、単一特異性抗血清を得た。免疫ブロットをＭＡＴＥＲ抗血清とインキュベート（１：１０００、２時間、２０℃）した後、抗体の結合はＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いてＥＣＬで検出した（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。固定した卵母細胞、卵、または胚は、ＭＡＴＥＲ抗血清とインキュベート（１：８０００、４℃、１６時間）し、Ｃｙ５結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）を用いて共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で画像化した。
【０１０３】
タンパク質合成および免疫ブロッティング  胚は、Ｌ−３５Ｓメチオニン（０．５Ｃｉ／ｍｌ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を含む１００μｌのＭ１６培地中で、３７℃、４時間インキュベートした。放射性同位体による標識化の最後に、１細胞胚および２細胞胚を、ｈＣＧ／交配後それぞれ２６時間および４８時間において回収した。１％ ＢＳＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１４０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、１０個の胚を１０μｌの試料緩衝液に、（１）直接、または（２）２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／０．３Ｍ ＫＣｌで処理してＴＲＣおよびｐ３５を抽出した後に、直接溶解した（コノバー（Ｃｏｎｏｖｅｒ）ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４４、３９２−４０４、１９９１）。既に報告されたようなＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィー（トン（Ｔｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８４９−８５３、１９９５）の後、放射能の取り込みを、ホスホイメージャーおよびイメージクアント・ソフトウエア（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により判定した。
【０１０４】
Ｍａｔｅｒヌル・マウスの産生  Ｍａｔｅｒヌル・マウスを産生するのに用いる構築物を図２に示した。ｐＰＮＴ（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ ６５、１１５３−１１６３、１９９１）において標的化ベクターを構築するため、マウスＭａｔｅｒの最初の２つのエキソンを含む１．５ｋｂｐのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片（トン（Ｔｏｎｇ）ら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １１、２８１−２８７、２０００）をＰＧＫ−ＮｅｏとＰＧＫ−ＴＫカセットの間に挿入し、エキソン３および４を含む２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＰＣＫ−Ｎｅｏの上流に挿入した。直鎖状にして、胚性幹（ＥＳ）細胞への電気穿孔法（レッドモンド（Ｒｅｄｍｏｎｄ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０、３４４−３５１、１９９８）の後、化学的に選別したクローンにおける変異対立遺伝子の存在を、５’および３’（またはＮｅｏ）プローブにより、それぞれ３．５ｋｂｐおよび４．０ｋｂｐのＸｂａＩ断片として検出した。その５’および３’プローブは、いずれも正常対立遺伝子を９．４ｋｂのＸｂａＩ断片として検出する。別々に選別した５つのクローンに由来する８から１２個のＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６の胚盤胞に注入した。毛色キメラ動物を生じる２つの細胞系統をＣ５７ＢＬ／６の雌と交配させ、生殖細胞系を通じてＭａｔｅｒ変異を伝達した。ホモ接合型ヌルの雌におけるＭａｔｅｒ転写物の欠如は、既に記載されるように、ノーザン・ブロット解析によって確認した（トン（Ｔｏｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０、３７２０−３７２６、１９９９）。
【０１０５】
生殖の実行  ６〜１０週齢の雌マウスにおける４回またはそれ以上の発情周期を調べるため、毎日膣スミアを得た（ルフ（Ｒｕｇｈ）、「マウス：生殖と発生（Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ：Ｉｔｓ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｐｏｍｅｎｔ）」 ２１０、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）。稔性の雄との交配の翌朝、交尾行動は膣栓の存在により評価した。
【０１０６】
接合体遺伝子転写アッセイ法  基本的に既に記載されたとおりに（ブーニオル（Ｂｏｕｎｉｏｌ）ら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２１８、５７−６２、１９９５）、ｈＣＧおよび交配に続いて２８時間（１細胞胚）および４８時間（２細胞胚）で単離した胚の細胞質に、１００ｍＭ ＢｒＵＴＰ、１４０ｍＭ ＫＣｌ、および２ｍＭ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ７．４の５〜１０ｐｌアリコートをマイクロインジェクションした。Ｍ１６培地中で、５％ＣＯ２において３７℃１時間インキュベーションした後、インジェクションを行った胚を１％パラホルムアルデヒドで固定した。
【０１０７】
ＲＮＡへのＢｒＵＴＰ取り込みは、マウス抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１：１０００、１６時間、４℃）でアッセイした。３％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、共焦点顕微鏡により胚を画像化した；蛍光は任意の単位で記録した。モノクローナル抗体が核小体にほとんど浸透しないため、リボゾームＲＮＡへのＢｒＵＴＰ取り込み測定が不能であることから、本アッセイ法は主として新規のＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を反映する（ワンシンク（Ｗａｎｓｉｎｋ）ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２、２８３−２９３、１９９３）。
【０１０８】
結果
Ｍａｔｅｒ転写物およびタンパク質発現
Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡは、卵母細胞が成長期に入る時（３０〜５０μｍ）に最初に検出された（図１Ａ）。Ｍａｔｅｒ転写物は、完全に成長した卵母細胞（７０〜８５μｍ）において最も豊富であり、多くの卵母細胞転写物と同様に（バックバロバ（Ｂａｃｈｖａｒｏｖａ）、「発生生物学：卵形成（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ）」 １、４５３−５２４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；  エピファノ（Ｅｐｉｆａｎｏ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１、１９４７−１９５６、１９９５）、成熟分裂およびそれに続く排卵の間に分解した。Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡは初期胚では検出されなかった（図１Ａ）が、初期胚由来のＥＳＴデータベースにこれが存在することは一部の転写物が分解を免れていた可能性を示唆する。
【０１０９】
卵形成の間におけるＭＡＴＥＲタンパク質の最初の蓄積は、Ｍａｔｅｒ転写物において観察されたものと同様であった（図１Ａと図１Ｂを比較のこと）。しかしながら、転写物の実際の消失とは異なり、ＭＡＴＥＲタンパク質は、着床前の発生の間、後期胚盤胞期まで存続した（図１Ｂ）。共焦点顕微鏡によると、ＭＡＴＥＲタンパク質は成長中の卵母細胞の細胞質に局在し、核からは著しく除外されていた。ＭＡＴＥＲは、卵母細胞および初期胚（１および２細胞期）の皮質領域内に濃縮されており、この周辺性パターンは着床前発生の後期まで持続し、内側の胚盤胞細胞塊に比して外側の栄養外胚葉細胞でＭＡＴＥＲが高濃度であった（図１Ｃ）。
【０１１０】
Ｍａｔｅｒヌル動物
ＭＡＴＥＲタンパク質の機能を明らかにするために、ホモ接合型の雌がＭａｔｅｒ転写物またはタンパク質のいずれも発現しないようなＭａｔｅｒヌル・マウス系統を作出した。Ｍａｔｅｒヌル・マウスは、期待されるメンデル比において、等しい性比率で産まれた。誕生から成獣期まで、表現型の異常は観察されなかった。
【０１１１】
Ｍａｔｅｒヌル・マウスの卵巣および子宮は形態学的に正常であった（図６）。Ｍａｔｅｒヌルの卵巣は、原始卵胞の正常必要量を有しており、卵胞発生の全ての期が正常に示された；自発排卵を経たことを示す黄体も存在した（図５）。
【０１１２】
Ｍａｔｅｒを欠失した卵はインビボで正常に受精した（図１）。Ｍａｔｅｒヌルの雌由来の接合体および２細胞胚の数および形態は、正常の雌由来のそれらと同様であった（図５）。しかしながら、交配から３日または４日後までに、Ｍａｔｅｒヌルの雌由来の胚は、２細胞期にとどまるか、または変性し始めていた（図３Ｄおよび図３Ｇを、図３Ｅおよび図３Ｈと比較のこと）。従って、受精はＭａｔｅｒヌルの雌において正常であり、結果として生ずる接合体は最初の卵割を経て進行することができるが、それに続く発生は２細胞期において停止する。これは初期胚形成の停止が、Ｍａｔｅｒヌルの雌における不妊の原因であることを示す。
【０１１３】
Ｍａｔｅｒヌル変異を持つ２つのマウス系統（Ｔ５４およびＴ８５）を作出したが（図２Ａおよび図２Ｂ）、ホモ接合型ヌルの雌において、Ｍａｔｅｒ転写物（図２Ｃ）またはタンパク質（図２Ｄ）のいずれも検出されなかった。
【０１１４】
Ｍａｔｅｒヌル動物の生殖表現型
ヘテロ接合体Ｍａｔｅｒヌルの親の交配により平均数の同腹仔（８．５±１．９）が産まれ、子孫のヌル対立形質は正常なメンデル比および等しい性比率であった。ホモ接合型ヌル動物は正常な様相を呈し、雄は正常の同腹仔と同程度に稔性であった。しかしながら、ホモ接合型ヌルの雌は交配後５月後でも仔を産出せず（表１）、このことはＭａｔｅｒが母性効果遺伝子であることを示唆した。
【０１１５】
【表１】Ｍａｔｅｒ変異を持つマウスの生殖能力およびメンデル対立遺伝子比
2004534504.tif 000002
＊ｎ、交配対の数、†ｎ．ｄ．、行っていない、‡ｎ．ａ．、当てはまらない。
【０１１６】
性的に成熟したＭａｔｅｒヌルの雌は、規則的な５．６７±０．２２日の発情周期を示し、正常の雌において観察された周期（５．４０±０．２３日）と同様であった。Ｍａｔｅｒヌルの雌または正常の雌のいずれにおいても、稔性の雄への接触後に約７０％で膣栓が出現したことから証明されるように、交配は正常に生じた。Ｍａｔｅｒヌルの卵巣は、正常必要量の原始卵胞を有しており、自発排卵を経たことを示す黄体のみならず、卵胞発生の全ての段階が存在した（図５Ａおよび図５Ｂ）。加えて、Ｍａｔｅｒヌルの雌は、外因性のゴナドトロピンによる刺激の後、正常に排卵した。しかしながら、ホモ接合型ヌルの雌は、正常の雄との交配後５ヶ月目にも仔を産生せず、一方ホモ接合型ヌルの雄とヘテロ接合型ヌルの雌は、正常な生殖能力を有した。
【０１１７】
ヌルの雌から回収された排卵した卵の平均数（±標準誤差）（２７．６±４．５、ｎ＝１４）と、正常の雌から得られた平均数（２７．７±４．３、ｎ＝１２）とに統計的な差異はなかった（ｐ＞０．０５）（図５Ｄ）。その２つの群の卵は形態学的に互いに区別がつかなかった（図５Ｃ）。
【０１１８】
Ｍａｔｅｒヌル動物における受精と胚発生
インビボの受精および初期発生を評価するために、正常の雄と交配後１日目、２日目、３日目、および４日目に、正常およびＭａｔｅｒヌルの雌から胚を単離した。２つの前核の存在から証明されるように（矢印、図３Ａおよび図３Ｂ）、ＭＡＴＥＲを欠失した卵において受精が生じた。Ｍａｔｅｒヌルの雌からインビボで得られた１細胞接合体および２細胞胚の数および形態は、正常の雌から得られた数および形態と同様であったが、２細胞変異胚では、細胞質顆粒が表れ（図３Ａ〜図３Ｆ）、健康状態が悪いように思われた。交配から３日または４日後のＭａｔｅｒヌルの雌から得られた胚は、依然として２細胞期に止まっていた（または変性を始めていた）が、一方で、正常マウス由来の胚は、それぞれ桑実胚または胚盤胞期まで発達していた。Ｍａｔｅｒヌルおよび正常の雌由来で同じ割合％（〜７０％）の受精１細胞接合体が、インビトロで２細胞期まで発達した。しかしながら、培養４日後では、ＭＡＴＥＲを欠失した胚は２細胞期で停止したままであった（大部分は変性されていた）（図３Ｋ）；正常の雌からの胚は、同じ時期に胚盤胞期まで成長していた（図３Ｊ）。従って、受精は正常と思われ、ＭＡＴＥＲを欠失した接合体は最初の卵割を経て発達することができても、それに続く胚発生は２細胞期において停止する。
【０１１９】
Ｍａｔｅｒヌル動物における転写の特徴づけ
Ｍａｔｅｒヌル・マウスに見られる初期停止の表現型は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合してジヌクレオチドを超える転写伸長を抑制（バイシアス（Ｖａｉｓｉｕｓ）およびウィーランド（Ｗｉｅｌａｎｄ）、  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１、３０９７−３１０１、１９８２）するキノコ毒であるαアマニチン（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：５３１−５３８、１９９３；フラッハ（Ｆｌａｃｈ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １、６８１−６８６、１９８２）にマウス胚を曝露した後に生ずる、２細胞期における遮断を連想させる。正常な胚転写は１細胞接合体の後期において２細胞胚の転写の〜２０％のレベルで最初に検出されるが（Ａｏｋｉら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １８１、２９６−３０７、１９９７）、それらの初期転写物は、全てであるにしても、不十分にしかタンパク質に翻訳されない（ノシアス（Ｎｏｔｈｉａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １５、５７１５−５７２５、１９９６）。
【０１２０】
初期Ｍａｔｅｒヌル胚の新規のＲＮＡポリメラーゼＩＩ活性を評価するため、ブロモＵＴＰ（ＢｒＵＴＰ）の取り込みを、本質的には既に記載されたように（ブニオル（Ｂｏｕｎｉｏｌ）ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２１８、５７−６２、１９９５）、ＢｒＵＴＰ特異的なモノクローナル抗体により共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いてアッセイした（ブニオル（Ｂｏｕｎｉｏｌ）ら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２１８、５７−６２、１９９５）（図４Ａ〜図４Ｇ）。交配後２８時間（図４Ｂ）および４８時間（図４Ｄ）において正常の胚の核内に検出されるＢｒＧＵＰの量は、ＭＡＴＥＲを欠失した場合（図４Ａおよび図４Ｃ）に比べ、形態学的に劇的な違いがあった。ＭＡＴＥＲを欠失した胚におけるＢｒＵＴＰの取り込みは、非注入対照群（図４Ｅおよび図４Ｆ）より僅かに高く、新規の転写は、正常２細胞胚で観察された転写の５％未満であった（図４Ｇ）。
【０１２１】
Ｍａｔｅｒヌル動物におけるＴＲＣの特徴づけ
成熟分裂と排卵の間、正常マウスにおいては、母性ＲＮＡの５０％より多くが失われる（バックバロバ（Ｂａｃｈｖａｒｏｖａ）、「発生生物学：卵形成（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ）」 １、４５３−５２４、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５）。この分解過程は、ＭＡＴＥＲを欠失した雌においても、リボゾームＲＮＡ（図４Ｈ）および少なくともいくつかのｍＲＮＡ（βアクチン、ＺＰ３、シクロフィリン、およびＧＡＰＤＨ）の損失が起こる。通常、それに続く２細胞期における胚ゲノムの活性化に先立ち、一部の遺伝子産物が一過性に転写および翻訳され、それらのうちいくつかは特徴的な転写関連複合体（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＴＲＣ）を形成する（ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ら、Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ． ７９：１３９−１６３、１９８４；ノシアス（Ｎｏｔｈｉａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １５：５７１５−５７２５、１９９６；コノバー（Ｃｏｎｏｖｅｒ）ら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １４４：３９２−４０４、１９９１）。この複合体は、初期２細胞胚において最初に観察されるが、αアマニチンの存在下では形成されない。
【０１２２】
ＴＲＣをアッセイするために、正常の雄と交配したＭａｔｅｒヌルの雌に由来する１および２細胞胚を３５Ｓメチオニンとインキュベートした。正常の１細胞接合体とＭＡＴＥＲを欠失した１細胞接合体との比較では、３５Ｓメチオニン取り込み量、またはタンパク質特性において、全体的な違いは認められなかった（図４Ｉ、左パネル）。ＭＡＴＥＲを欠失した胚で２細胞期にＴＲＣ複合体が検出されるが（図４Ｉ、中央パネルおよび右パネル）、それらはいくぶん欠乏し（正常の〜６０％）、ＭＡＴＥＲを欠失した胚における異常なタンパク質合成を反映している可能性がある。このことは、ＭＡＴＥＲが、初期胚における全ての転写−翻訳装置の開始に絶対的に重要というわけではないことを示す。
【０１２３】
転写の著しい減少は、胚の全体的な病的状態を反映する可能性もあるが、全く健常に見える１細胞接合体において同様な減少があるほか、新規のタンパク質合成が同様な劇的減少を示さないこと（図４Ｉ）も、転写の減少がＭＡＴＥＲの欠如に直接または間接的に起因することを示す。
【０１２４】
哺乳類ＭＡＴＥＲの提案される機能
哺乳類のＭＡＴＥＲタンパク質のロイシンリッチ反復ドメインとブタのリボヌクレアーゼ阻害因子との相同性は、ＭＡＴＥＲが細胞質ＲＮアーゼの阻害因子として働く可能性を示す。このことが事実であれば、ＭＡＴＥＲを欠失した胚のＲＮＡは、広範な分解を受ける可能性があり、おそらく初期胚における母系から接合体への遷移の間に生じるＲＮＡの正常な代謝回転が強調されると思われる。転写に必要なタンパク質をコードするＲＮＡを含むＲＮＡの分解は、Ｍａｔｅｒヌル胚で観察される表現型を説明するかもしれない。しかし、Ｍａｔｅｒを欠失していても、変異胚は３５Ｓメチオニンをタンパク質に取り込み、正常胚と比べてタンパク質特性に主要な違いが観察されないため、この可能性はありそうにない。これらの結果は、タンパク質合成に補助するのに十分なｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびリボゾームＲＮＡが変異胚に存在することを示すが、初期胚の生存に必要な一群の標的ＲＮＡの分解は阻害されないことを示す。
【０１２５】
２細胞胚における転写依存性のタンパク質合成は、２つの期において生じる：ＴＲＣタンパク質の出現により特徴づけられる初期の主要ではない活性化（最初の有糸分裂から２時間〜４時間後）、およびＧ２において生ずる後期の主要な活性化（最初の有糸分裂から８時間〜１０時間後）。後者の活性化は、２細胞期を超えて発達するために必要な発生プログラムを開始する（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５、５３１〜５３８、１９９３）。ＭＡＴＥＲを欠失した胚で観察された胚転写の減少は、転写装置の変性、ゲノムＤＮＡへのアクセスの低下、または核内のクロマチン鋳型における異常に起因する可能性がある。しかし、Ｍａｔｅｒヌル動物におけるＴＲＣタンパク質の存在は、ＭＡＴＥＲが２細胞胚における転写依存性タンパク質合成の初期局面を決定づけるものではないことを示唆する。それはさらに、転写装置および核ＤＮＡにアクセスする能力が、Ｍａｔｅｒヌル胚においておおむね損なわれていないことを示唆する（転写が活発であるＭａｔｅｒヌル卵母細胞と同様）。
【０１２６】
初期の爆発的な転写の結果生じるＴＲＣタンパク質は、核に関連する（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５、５３１−５３８、１９９３）。これらのタンパク質は、ＭＡＴＥＲを含む機序を介して、２細胞期を超えて発達するのに必要な後期転写抑制を解除する可能性がある。加えて、マウスの卵母細胞および１細胞胚は、２細胞胚におけるエンハンサー依存性転写に必要なコアクチベータを欠失していることが報告されている（ローウィンガー（Ｌａｗｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４、８００２−８０１１、１９９９）。それらのコアクチベータの性質については知られていない；それらは、以前から存在する母性タンパク質の修飾か、または２細胞胚における初期転写依存性のタンパク質合成によって生ずるのかもしれない。そのような過程に細胞質のＭＡＴＥＲが関与するかもしれない。または、ＭＡＴＥＲは、２細胞期を超えた細胞周期の進行に必要な一つまたは複数の相互作用に関与するかもしれない。ＭＡＴＥＲと相互作用するタンパク質の同定および特徴づけをすることによって、胚の生存および初期発生の促進における母性タンパク質の役割に関する洞察が得られると考えられる。
【０１２７】
Ｍａｔｅｒは、初期の哺乳類の発生において不可欠な役割を果たすことが証明された最初の母性効果遺伝子であり、観察された生殖不能の表現型は、同様な分子の欠如によってヒトの生殖不能が生じ得る可能性を提起する。
【０１２８】
実施例２
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの同定
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡは、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列との相同性に基づき、ＮＣＢＩおよび米国国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって維持されるヒトハイスループットゲノム（ＨＴＧ）配列の収集情報を検索することにより同定した。本発明者らは、この検索によって単離された不連続なヌクレオチド断片を用いてオリゴヌクレオチドプライマー対を考案し（例えば、配列番号：７および８、１９および２０、２１および２２）、それらを用いて、標準的な手法の利用により、精製したヒト卵巣ＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡからＭａｔｅｒ配列を増幅し、さらにヒトｃＤＮＡライブラリーから部分的なｃＤＮＡクローンを単離した。
【０１２９】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの二つの長さの断片配列を配列番号：１および３に示す。それらの二つの長いｃＤＮＡ断片を合わせると、完全ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡのうちの２２１３ヌクレオチドを構成する。
【０１３０】
ｃＤＮＡ断片１（配列番号：１）および断片２（配列番号：３）がコードする推定ヒトＭＡＴＥＲタンパク質部分は、それぞれ配列番号：２および４に示す。
【０１３１】
それらの配列を用いて、残りのヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡを同定した；全長ｃＤＮＡの配列を、配列番号：２３に示す。全体として、ヒトＭａｔｅｒの最初の７５ヌクレオチド（１〜７５）および対応する推定アミノ酸（１〜２５）は、公表されたヒトゲノムＤＮＡ配列との比較により決定し、残りのＭａｔｅｒ配列は、ヒト卵巣ｃＤＮＡの直接的なクローニングおよび配列決定により決定した。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の完全配列を配列番号：２４に示す。
【０１３２】
実施例３：
ヒトＭａｔｅｒ転写物の局在性
本実施例は、ヒトＭａｔｅｒ転写物の発現を検出するための方法を提供する。
【０１３３】
インサイチュー・ハイブリダイゼーション・プローブを産生するために、ヒトゲノムＤＮＡを以下のプライマーを用いて増幅した：
2004534504.tif 000003
得られた増幅核酸分子産物の大きさは４９６ｂｐであったが、マウスＭａｔｅｒエキソン−イントロン地図との比較に基づき、これはヒトＭａｔｅｒ遺伝子の第７エキソン中に含まれると予測される。この断片をＤＮＡ鋳型としてｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングした。３５Ｓ−ＵＴＰ標識したセンス配列およびアンチセンス配列は、いずれもＴ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写により合成した。
【０１３４】
インサイチュー・ハイブリダイゼーションは、本質的には既に記載したように行った（トング（Ｔｏｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：３７２０−３７２６、１９９９）。簡単に記すと、プローブはアルカリ加水分解により調製し、凍結ヒト卵巣切片と６０℃で２４時間ハイブリダイズした。スライドガラスは、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ−２エマルジョンに浸した後、フィルムに２〜３日間露出してオートラジオグラフを現像した。
【０１３５】
凍結ヒト卵巣切片は、放射標識したセンスプローブ（図７Ａおよび図７Ｃ）およびアンチセンスプローブ（ＢおよびＤ）とハイブリダイズさせた。スライドガラスは、ヘマトキシンおよびエオシンにより染色した。おのおののプローブにつき、明視野（ＡおよびＢ）および暗視野（ＣおよびＤ）の画像が示されている。Ｍａｔｅｒ転写物は卵母細胞に局在化していた。
【０１３６】
実施例４：
ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の局在性
本実施例は、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の局在性を検討するための方法を提供する。
【０１３７】
インサイチュー局在化は、基本的にマウス試料について記載されたように行った（トン（Ｔｏｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：３７２０−３７２６、１９９９年）。簡単に記すと、マウスＭＡＴＥＲのＣ末端ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体（配列番号：６の１０９３残基から１１１１残基まで）を、実施例９Ｃに記載のように調製した。凍結ヒト卵巣切片をこの抗血清（１：２００）とインキュベートし、２次抗体としてＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清を用いて、卵母細胞中のヒトＭＡＴＥＲタンパク質を検出した（図８Ａ）。図８Ｂは、図８Ａに示す試料に対応する位相差顕微鏡像を示す。
【０１３８】
実施例５：
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡを作製する方法
Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡを同定し取得した最初の方法は、先に記載されている。ＭＡＴＥＲタンパク質の大部分の配列（配列番号：２および４）およびコードする核酸分子（配列番号：１および３）の供給において、現在ではヌクレオチドの増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）を、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡを産生する簡単な手段として利用することができる。
【０１３９】
総ＲＮＡは、当業者に周知の様々な方法のうちいずれか一つによって、ヒト細胞から抽出される。サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９２）により、ＲＮＡ単離の方法が記載されている。ＭＡＴＥＲは卵母細胞で発現するため、卵母細胞または卵巣由来のヒト細胞株は、そのようなＲＮＡの供給源として使用できる。抽出されたＲＮＡは次にｃＤＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を行うための鋳型として用いられる。ＲＴ−ＰＣＲの方法と条件はカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら（「ＰＣＲプロトコール、方法と応用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、２１〜２７頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０）により記載されている。
【０１４０】
増幅プライマーの選択は増幅をするｃＤＮＡの部分に基づいて作製されると考えられる。プライマーはｃＤＮＡのセグメント、またはｃＤＮＡ分子全体を増幅するために選択することができる。異なる長さや組成のプライマーおよび単位複製配列に適応させるために、様々な増幅条件が必要とされる：そのような考察は当技術分野に周知であり、例えばイニスら（「ＰＣＲプロトコール、方法と応用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）に記載されている。一例として、ヒトＭＡＴＥＲ ｃＤＮＡ分子のコード領域の大部分（約２．８ｋｂ）を、以下のプライマーの組合せにより増幅することができる：
2004534504.tif 000004
当業者は、既知の技術を用いてｃＤＮＡ全体を増幅するために用いることが可能なプライマーを考案するために、本明細書に提供される全長ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列（配列番号：２３）を使用することができる。
【０１４１】
以下の４つのプライマーセットは、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの５’末端の〜９５０ｂｐを増幅するために用いることができる。
【０１４２】
５’プライマーは、以下のような５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲのための共通アダプター・プライマー（ＡＤＰ）である（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）：
2004534504.tif 000005
【０１４３】
３’プライマーは、以下のような第７エキソン内のヒトＭＡＴＥＲ ｃＤＮＡの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）である：
2004534504.tif 000006
【０１４４】
ＧＳＰ１はヒト卵巣ＲＮＡの逆転写のためのプライマーとしてｃＤＮＡの合成に使用される。次に逆転写されたｃＤＮＡの５’末端にＡＤＰ１プライマーを結合させ、ＡＤＰ１およびＧＳＰ１プライマーを用いて１巡目のＰＣＲの増幅を行う。１巡目のＰＣＲ産物を鋳型として、ＡＤＰ２およびＧＳＰ２をプライマーとして用い、２巡目のＰＣＲ増幅を行う。
【０１４５】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ（配列番号：１）の断片１は、以下のプライマーの組合せを用いて増幅してもよい：
2004534504.tif 000007
【０１４６】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ分子の３’末端領域（本明細書ではヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ断片２、配列番号：３とも呼ばれる）は、以下のプライマーの組合せを用いて増幅してもよい：
2004534504.tif 000008
【０１４７】
これらのプライマーは例示のためのものにすぎない；ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの配列を完全にするためのみならず、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡの特定の指定領域を増幅するために、多くの異なるプライマーを、提供されたＤＮＡ配列から導き出すことが可能なことが当業者に理解される。
【０１４８】
これらの増幅手段により得られたＰＣＲ産物は、再び配列決定することが推奨される；増幅した配列の確認が容易になり、この配列における異なる集団または種間での自然変異についての情報が得られるためである。提供されたＭａｔｅｒ配列に由来するオリゴヌクレオチドは、そのような配列決定に使用することができる。
【０１４９】
ヒトＭａｔｅｒのオルソログを同様の方法でクローニングすることができ、この場合はヒト以外の種から得た細胞を含む出発材料を用いる。オルソログは、通常、開示されたヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡと少なくとも８０％の配列相同性を有する。ヒト以外の種がヒトとより近縁関係にある場合、一般に配列相同性はより高いと考えられる。近縁関係のオルソロガスなＭａｔｅｒ分子は、開示されたヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡと少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列相同性を有する可能性がある。
【０１５０】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列（配列番号：２３）に由来するオリゴヌクレオチド、またはその断片（例えば配列番号：１および３など）は、本開示の範囲内に含まれる。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｍａｔｅｒ核酸配列の少なくとも２３個の連続したヌクレオチドの配列を含む。増幅の特異性を高めるために、それらの配列の少なくとも２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド・プライマーを用いることもできる。例えばそれらのプライマーは、開示された配列の任意の領域から得ることができる。一例として、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ、ＯＲＦ、および遺伝子配列は、配列の長さに基づき半分または４分の１に分割でき、単離核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）はこの分子を半分にしたうちの一つ目もしくは二つ目、または四半分にしたうちの任意のものから得ることができる。このことを例示するために、配列番号：５に記載のマウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡを用いることができる。ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡは３４４７ヌクレオチド長であり、従って仮定上およそ半分（ヌクレオチド１〜１７２３、および１７２４〜３４４７）、あるいは約四半分（ヌクレオチド１〜８６２、８６３〜１７２３、１７２４〜２５８６、および２５８７〜３４４７）に分けることができる。ヒトｃＤＮＡは同様に分割することができ、または本明細書に提示した断片で表すことができる（例えば、断片１、マウスＭａｔｅｒのヌクレオチド約１７００から約１９５０までに対応；およびヒトｃＤＮＡの断片２、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの３’末端領域、マウスＭａｔｅｒ ｃＤＮＡのヌクレオチド約２５００からポリＡ尾部までに対応）。
【０１５１】
核酸分子はヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡまたは他の部分のうち任意の、少なくとも１５個、２０個、２３個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、または１００個の連続したヌクレオチドを含むように選択できる。従って、代表的な核酸分子は、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ（配列番号：２３）の少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、または開示されたヒトＭａｔｅｒコード配列の断片１もしくは断片２（それぞれ配列番号：１および３）を含む可能性がある。
【０１５２】
実施例６
Ｍａｔｅｒゲノム配列（または遺伝子）のクローニング
上述のＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列および断片は、Ｍａｔｅｒ遺伝子のイントロン、上流の転写プロモーターもしくは調節領域、または下流の転写調節領域を含まない。胚発生の異常、不妊、または生殖能力低下につながるＭａｔｅｒ遺伝子の一部の変異は、ｃＤＮＡ内ではなく、Ｍａｔｅｒ遺伝子の他の領域内に位置する可能性がある。ＭＡＴＥＲタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームの外部に位置する変異は、おそらくタンパク質の機能的活性に影響せず、むしろ細胞内のタンパク質レベルの変化をもたらすと思われる。例えば、Ｍａｔｅｒ遺伝子のプロモーター領域内の変異は、遺伝子の転写を阻害し、その結果、細胞内のＭＡＴＥＲタンパク質の完全な欠如をもたらす可能性がある。
【０１５３】
加えて、ゲノム遺伝子のイントロン配列内の変異もまたＭＡＴＥＲタンパク質の発現を阻害する可能性がある。イントロンを含む遺伝子の転写に続き、イントロン配列は、ＲＮＡ分子の翻訳に先立つスプライシングと呼ばれる過程でＲＮＡ分子から除かれ、その結果コードタンパク質が産生される。イントロンを除くためにＲＮＡ分子をスプライシングする場合に、スプライシング機能を行う細胞の酵素は、イントロンとエキソンの境界の周辺の配列を認識し、そのようにして適切なスプライシング部位を認識する。イントロンとエキソンの接合部に近いイントロン配列内に変異がある場合、酵素はその接合部を認識できない可能性があり、イントロンを除くことができない可能性がある。これが生じた場合に、コードタンパク質は異常を有する可能性があると考えられる。従って、Ｍａｔｅｒ遺伝子のイントロン配列内部の変異（「スプライシング部位変異」と呼ばれる）もまた胚発生の異常の原因となる可能性がある。しかし、それらの異常性の分子的基盤を明確化するために、Ｍａｔｅｒ遺伝子のエキソン構造およびイントロンのスプライシング部位の配列について知識が必要とされる。本明細書におけるＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列の提供により、Ｍａｔｅｒ遺伝子全体（プロモーターおよび他の調節領域ならびにイントロン配列を含む）のクローニングおよびそのヌクレオチド配列の決定を可能にする。この情報が得られた場合、ＤＮＡ分析に基づく生殖能力の異常に対する遺伝的素因の診断は、Ｍａｔｅｒ遺伝子座における全ての可能性のある変異事象を包含すると考えられる。
【０１５４】
Ｍａｔｅｒ遺伝子は、Ｍａｔｅｒ配列を含む一つまたは複数のＢＡＣまたはＰＡＣクローンの直接的配列決定を含む、一つまたは複数の従来法によって単離することができる。
【０１５５】
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡおよび遺伝子の配列が得られた場合、それらの配列に由来するプライマーを、患者のゲノムＭａｔｅｒ遺伝子の任意の部分における変異の存在を判定するための診断検査（以下に記載）に用いることが可能である。そのようなプライマーは、Ｍａｔｅｒ遺伝子配列の断片（イントロン配列、エキソン配列、またはイントロンとエキソンの境界にまたがる配列）を含むオリゴヌクレオチドであると考えられ、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡまたは遺伝子の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含みうる。より長いプライマーを使用することにより、より高い特異性が得られる可能性があることが理解されると思われる。従って、より一層の特異性を得るために、使用されるプライマーは、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡまたは遺伝子の１５個、１７個、２０個、２３個、２５個、３０個、４０個、またはさらに５０個の連続したヌクレオチドを含むことができる。さらに、Ｍａｔｅｒイントロン配列情報の提供により、ミスマッチ化学切断（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１、１９８５；モンタンドン（Ｍｏｎｔａｎｄｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：３３４７‐３３５８、１９８９）および１本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（オリタ（Ｏｒｉｔａ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４‐８７９、１９８９）のような方法を使用して、大きく、未だ行われていない患者材料の供給源についての変異解析が可能になると考えられる。
【０１５６】
Ｍａｔｅｒ遺伝子に隣接する調節要素の同定および特徴づけをするために追加の実験を行ってもよい。推定調節領域のヌクレオチドを除き、その欠失の効果を一過的または長期的な発現解析実験により検討する欠失分析を含む標準的手法を用いて、それらの調節要素を特徴づけることができる。ゲノムＭａｔｅｒ遺伝子に隣接した調節要素の同定および特徴づけは、一過的または長期的な発現解析による哺乳動物細胞の機能的実験（欠失分析など）によって実施することができる。
【０１５７】
ゲノムクローン、ｃＤＮＡ、またはそれらのクローンに由来する配列のいずれかが、Ｍａｔｅｒ遺伝子発現の研究、ＭＡＴＥＲタンパク質機能の研究、ＭＡＴＥＲタンパク質に対する抗体の産生、胚発生の異常を防ぐかまたは治療するためのＭＡＴＥＲが欠失または変異した患者の診断および治療を含むが、これらに限定されることはない応用分野に使用できることは当業者に明らかである。従って、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡまたはその断片の用途を記述した応用例の記載は、ゲノムＭａｔｅｒ遺伝子の使用を包含することを意図する。
【０１５８】
本遺伝子の相同体が、ラットまたはサルのような他種から、標準的なクローニング手法によってクローニングできることもまた、現在、当業者に明らかであると考えられる。そのような相同体は、自己免疫性不妊症の発症および進行、ならびに初期胚形成の動物モデルの産生に有用であると考えられる。一般的にそのようなオルソロガスなＭａｔｅｒ分子は、本明細書に開示されるヒトＭａｔｅｒ核酸と少なくとも７０％の配列同一性を有する；より近縁関係のオルソロガスな配列は、この配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【０１５９】
実施例７
Ｍａｔｅｒ核酸およびアミノ酸配列の変種
本明細書におけるヒトＭＡＴＥＲタンパク質断片および対応する核酸配列の提供により、それらの配列の変種を作製することが現在可能である。
【０１６０】
アミノ酸配列において、変種ＭＡＴＥＲタンパク質は、開示されたヒトＭＡＴＥＲ配列と異なるが、提供されるヒトＭＡＴＥＲタンパク質と少なくとも６５％のアミノ酸配列の相同性を有するタンパク質を含む。その他の変種は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有すると考えられる。そのような変種を産生するために、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲを含む標準的手法を使用した、Ｍａｔｅｒのヌクレオチド配列の操作を用いることができる。最も単純な改変としては、一つまたは複数のアミノ酸を同様な生化学的性質を有するアミノ酸と置換することが含まれる。これらのいわゆる保存的置換は、結果として得られるタンパク質の活性に最小限の影響を与えると思われる。タンパク質の元のアミノ酸から置換してもよく、保存的置換とみなされるアミノ酸を表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2004534504.tif 000009
【０１６２】
酵素機能またはその他のタンパク質の特性のより実質的な変化は、表２に列挙したものより保存性の低いアミノ酸置換を選択することにより得られる。そのような変化は、ポリペプチド骨格構造（例えばシート構造またはヘリックス構造）、その標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または特異的側鎖のかさを維持する効果において、より著しく異なる残基への変化を含む。下記の置換は、一般的に、タンパク質の性質に最も大きな変化をもたらすことが期待される：（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）への（からの）疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）の置換；（ｂ）システインまたはプロリンへの（からの）その他の任意の残基の置換；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジル）への（からの）負電荷の側鎖を有する残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）の置換；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）への（からの）側鎖を欠失した残基（例えば、グリシン）の置換。
【０１６３】
変種ＭＡＴＥＲをコードする配列は、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発などの、標準的なＤＮＡ突然変異誘発技法を用いて産生することができる。それらの技法の詳細は、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）、第１５章に記載されている。そのような技法を用いることにより、開示されたヒトＭＡＴＥＲ配列と僅かに異なる変種を作製することができる。本明細書に具体的に開示されるものの誘導体であり、且つヌクレオチドの欠失、付加、または置換により開示されたものと異なるが、開示されたヒトＭＡＴＥＲコード配列（配列番号：１および３）と依然として少なくとも８２％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が本開示に包含される。また、開示されたＭａｔｅｒ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のヌクレオチド配列相同性を有するより近縁関係の核酸分子も包含される。最も単純な形態においては、そのような変種は、その分子が導入される特定の生物におけるコドン使用の偏りに適合するようにコード領域が改変されていることにより、開示された配列と異なっていてもよい。全長ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ（配列番号：２３）もまた、断片１（配列番号：１）および断片２（配列番号：３）の両方を含み、且つ記載される生理学的特徴および生物学的性質を有するヒトＭＡＴＥＲタンパク質をコードする分子として本開示に包含される。
【０１６４】
または、遺伝コードの縮重を利用することにより、ヌクレオチド配列は実質的に変化するが、それにもかかわらず、開示されたヒトＭＡＴＥＲタンパク質配列と実質的に同様のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするようにコード配列を改変することで、コード領域を改変してもよい。例えば、遺伝コードの縮重のため、４つのヌクレオチド・コドン・トリプレット（ＧＣＴ、ＧＣＧ、ＧＣＣ、およびＧＣＡ）はアラニンをコードする。従って、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質におけるいかなる特定のアラニン残基のコード配列もコードタンパク質のアミノ酸組成または特性に影響を与えることなく、それらの代替的なコドンのうちの任意のコドンに変更され得る。上述のような標準的ＤＮＡ突然変異誘発技法を用い、またはＤＮＡ配列の合成によって、本明細書に開示するｃＤＮＡおよび遺伝子配列から遺伝コードの縮重に基づき変種ＤＮＡ分子を誘導することができる。従って本開示は、ＭＡＴＥＲタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって開示された核酸配列と異なる核酸配列も包含する。
【０１６５】
ＭＡＴＥＲタンパク質変種は、原型ヒトＭＡＴＥＲタンパク質に対するそれらの配列同一性によって定義することもできる。上述のように、ヒトＭＡＴＥＲタンパク質は、本明細書に開示するヒトＭＡＴＥＲタンパク質（配列番号：２４）または断片（配列番号：２および４など）と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する。そのようなタンパク質／断片をコードする核酸配列は、遺伝コードをＭＡＴＥＲタンパク質または断片のアミノ酸配列に単純に適用することによって容易に決定することができ、そのような核酸分子は、配列の部分に対応するオリゴヌクレオチドを組み合わせることによって容易に産生することができる。
【０１６６】
開示されたヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ核酸配列に由来する核酸配列は、開示された原型Ｍａｔｅｒ核酸分子またはその断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする分子を含む。ストリンジェントな条件は、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精巣ＤＮＡ中、６５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、続いて１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、最後に０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、６５℃にて１５〜３０分間連続的に洗浄することである。
【０１６７】
（近縁関係のより低い相同体を検出するための）低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、（ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の両方を）５０℃で行うことを除き、上述のように実施する；しかし、検出シグナルの強さにより、２ｘＳＳＣの洗浄の後、洗浄段階を終了してもよい。
【０１６８】
ヒトＭａｔｅｒ核酸コード分子（配列番号：２３に記載のｃＤＮＡ、配列番号：１および３に記載の断片、ならびにそれらの配列を含む核酸を含む）、ならびにそれらの配列のオルソログおよび相同体を、形質転換用または発現用のベクターに導入してもよい。
【０１６９】
実施例８
ＭＡＴＥＲタンパク質の発現
ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列断片、ならびに全長ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡの決定およびクローニングの方法の提供により、現在、標準的な実験室の手法によるＭＡＴＥＲタンパク質の発現および精製が可能になった。精製したヒトＭＡＴＥＲタンパク質は、機能解析、抗体産生、診断、および患者の治療に用いることができる。さらに、Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は、遺伝子の発現およびその産物の機能を理解する研究において操作することができる。ヒトＭＡＴＥＲの変異型は、本明細書に含まれる情報に基づいて単離することができ、相対量による発現パターン、細胞内局在性、組織特異性、およびコードされた変異ＭＡＴＥＲタンパク質の機能的性質の変化を検出するために調べることができる。被検者タンパク質をコードする部分的および全長ｃＤＮＡ配列は、細菌発現ベクターの中にライゲーションすることができる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に導入したクローニング遺伝子からタンパク質を大量発現させる方法は、タンパク質の精製、局在化、および機能解析のために活用できる。例えば、大腸菌ｌａｃＺまたはｔｒｐＥ遺伝子の一部によりコードされるアミノ末端ペプチドをＭＡＴＥＲタンパク質に連結したものからなる融合タンパク質は、これらのタンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製するために用いることができる。その後これらの抗体を、免疫アフィニティ・クロマトグラフィーによるタンパク質の精製、タンパク質レベルを定量する診断用アッセイ法、ならびに免疫蛍光法による組織および個々の細胞中におけるタンパク質の局在化のために使用することができる。そのような抗体は、同定および／または精製の目的で発現構築物に加えることができるエピトープ・タグに特異的でありうる。
【０１７０】
機能的研究のため、無傷の天然タンパク質もまた大腸菌において大量に産生させることができる。細菌で融合タンパク質および無傷の天然タンパク質を産生するための方法およびプラスミド・ベクターは、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第１７章、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）に記載されている。そのような融合タンパク質は大量に作製可能であり、精製が容易であり、抗体反応を誘発するのに用いることができる。クローニングした遺伝子の上流に、強力な調節プロモーターおよび有効なリボゾーム結合部位を配置することによって、天然タンパク質を細菌で産生させることができる。低レベルのタンパク質が産生される場合は、タンパク質産生を増加させるための追加的処置をとることができる；高レベルのタンパク質が産生される場合は、精製は比較的容易である。適当な方法はサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）に記載されており、当業者に周知である。高レベルで発現したタンパク質は、しばしば、不溶性の封入体中に見出される。それらの凝集物からタンパク質を抽出する方法は、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第１７章、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）に記載されている。ＬａｃＺ融合遺伝子の発現に適したベクター系には、ｐＵＲシリーズのベクター（ルーサー（Ｒｕｔｈｅｒ）およびミュラーヒル（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ）、ＥＭＢＯ． Ｊ ２：１７９１、１９８３）、ｐＥＸ１−３（スタンレー（Ｓｔａｎｌｅｙ）およびルジオ（Ｌｕｚｉｏ）、ＥＭＢＯ．Ｊ ３：１４２９、１９８４）、およびｐＭＲ１００（グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６５９８、１９８２）が含まれる。無傷の天然タンパク質の産生に適したベクターには、ｐＫＣ３０（シマタケ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ）およびローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８、１９８１）、ｐＫＫ１７７−３（アマン（Ａｍａｎｎ）およびブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）、Ｇｅｎｅ ４０：１８３、１９８５）、およびｐＥＴ−３（シュトゥディアー（Ｓｔｕｄｉａｒ）およびモファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３、１９８６）が含まれる。ＭＡＴＥＲ融合タンパク質をタンパク質ゲルから単離し、凍結乾燥し、粉末に磨りつぶし、抗原として用いることができる。ＤＮＡ配列は、既存の状況から、例えば他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルス、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）（ブルケ（Ｂｕｒｋｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−８１２、１９８７）のような、他のクローニング媒体に移すこともまた可能である。これらのベクターは、次に体細胞、ならびに細菌、真菌（ティンバーレイク（Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ���およびマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３１３−１３１７、１９８９）、無脊椎動物、植物、および動物（パーセル（Ｐｕｒｓｅｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８１−１２８８、１９８９）のような単純または複雑な生物を含む様々な宿主に導入してもよく、それらの細胞または生物は、異種Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡの導入により、トランスジェニックとなる。
【０１７１】
哺乳動物細胞で発現させるために、ｃＤＮＡ配列は、例えばｐＳＶ２ベクター（マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーク（Ｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６、１９８１）におけるシミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーターのような、異種のプロモーターにライゲーションし、例えばサルＣＯＳ−１細胞（グルツマン（Ｇｕｌｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２、１９８１）のような細胞に導入して、一過的または長期的な発現を得ることができる。キメラ遺伝子構築物の安定した組み込みは、例えばネオマイシン（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーク（Ｂｅｒｇ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：３２７−３４１、１９８２）およびミコフェノール酸（マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーク（Ｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６、１９８１）のような生化学的選択によって、哺乳動物細胞中に維持することができる。
【０１７２】
ＤＮＡ配列は、例えば制限酵素消化、ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化、エキソヌクレアーゼによる削除、ターミナル・デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼによる伸長、合成またはクローニングしたＤＮＡのライゲーション、一本鎖バクテリオファージ中間体を介した、または特異的ヌクレオチドを核酸増幅と組み合わせて使用することによる特定部位の配列改変などの標準的手順により操作することができる。
【０１７３】
ｃＤＮＡ配列（もしくはそれに由来する部分）またはミニ遺伝子（イントロンおよび自らのプロモーターを持つｃＤＮＡ）は、従来の方法を用いて真核生物の発現ベクターに導入することができる。これらのベクターは、ｃＤＮＡの転写を開始し増加させ、その適切なスプライシングおよびポリアデニル化を確実にするような調節配列を含むことにより、真核細胞においてｃＤＮＡの転写を可能にするように設計されている。ＳＶ４０のプロモーター領域およびエンハンサー領域またはラウス肉腫ウイルスの末端反復（ＬＴＲ）、ならびにＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナルおよびスプライシングシグナルを含むベクターを容易に入手することができる（マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１０７８−２０７６、１９８１；ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：６７７７−６７８１、１９８２）。この種のベクターは、異なる活性を有するプロモーターを使うことによるか（例えば、バキュロウイルスｐＡＣ３７３はＳ．フルギペルダ（Ｓ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞においてｃＤＮＡを高レベルで発現可能であり（サマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、「遺伝的改変ウイルスと環境（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら編、２２：３１９−３２８、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５））、または、例えばマウス乳癌ウイルス由来の糖質コルチコイド応答性プロモーター（リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２２８、１９８２）のような、調節されたプロモーターを含むベクターを使用することにより、ｃＤＮＡの発現レベルを操作することができる。ｃＤＮＡの発現は、導入後２４時間から７２時間に（一過的発現）受容細胞で観察することができる。
【０１７４】
加えて、一部のベクターは、細菌遺伝子のｇｐｔ（マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーク（Ｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６、１９８１）またはｎｅｏ（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）およびバーク（Ｂｅｒｇ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：３２７−３４１、１９８２）のような選択マーカーを含む。それらの選択マーカーは、ベクター（従ってｃＤＮＡ）の安定で長期的な発現を示すトランスフェクション細胞の選択を可能にする。ベクターは、パピローマウイルス（サーバー（Ｓａｒｖｅｒ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：４８６−４９６、１９８１）またはエプスタイン・バーウイルス（スグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：４１０−４１３、１９８５）のような調節因子を用いることにより、エピソーム様の自由に複製する独立体として細胞中に維持することができる。または、ゲノムＤＮＡにベクターが組み込まれた細胞株を作製することもまた可能である。これらの型の細胞株はいずれも継続的に遺伝子産物を産生する。また、高レベルの遺伝子産物を産生可能な細胞株を作製するために、ベクター（従ってｃＤＮＡも同様）のコピー数が増幅した細胞株を作製することもできる（アルト（Ａｌｔ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：１３５７−１３７０、１９７８）。
【０１７５】
真核生物、とりわけヒトまたは他の哺乳動物の細胞へのＤＮＡの導入は、現在では従来技術である。組換え発現ベクターは、例えば、燐酸カルシウム（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファンダーエプ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４６６、１９７３）もしくは燐酸ストロンチウム（ブラッシュ（Ｂｒａｓｈ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．７：２０１３、１９８７）との沈殿、電気穿孔法（ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１、１９８２）、リポフェクション（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３、１９８７）、ＤＥＡＥデキストラン（マックーサン（ＭｃＣｕｔｈａｎ）ら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４１：３５１、１９６８）、マイクロインジェクション法（ミューラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ １５：５７９、１９７８）、プロトプラスト融合（シャフナー（Ｓｃｈａｆｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２１６３−２１６７、１９８０）、または空気銃（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０、１９８７）により、純粋なＤＮＡとして受容細胞に導入（トランスフェクション）することができる。または、ウイルス・ベクターによる感染によって、ｃＤＮＡまたはその断片を導入することができる。例えばレトロウイルス（バーンスタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｇｅｎ． Ｅｎｇｒ’ｇ ７：２３５、１９８５）、アデノウイルス（アーマッド（Ａｈｍａｄ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７、１９８６）、またはヘルペスウイルス（シュペーテ（Ｓｐａｅｔｅ）ら、Ｃｅｌｌ ３０：２９５、１９８２）を使用する系が開発されている。長い転写物をパッケージングする有用な技術は、コーチャネク（Ｋｏｃｈａｎｅｋ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５７３１−５７３９、１９９６）、パークス（Ｐａｒｋｓ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１３５６５−１３５７０、１９９６）、ならびにパークス（Ｐａｒｋｓ）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３２９３−３２９８、１９９７）に見出せる。ＭＡＴＥＲをコードする配列は、非感染系、例えばリポソームを介してインビトロで標的細胞に送達することができる。
【０１７６】
これらの真核生物発現系は、ＭＡＴＥＲコード核酸およびそれらの分子の変異型、ＭＡＴＥＲタンパク質およびそのタンパク質の変異型の研究に用いることができる。そのような用途には、例えば、本明細書に含まれる情報を利用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離することのできるゲノムクローン上にある、Ｍａｔｅｒ遺伝子の５’領域内に位置する調節要素の同定が含まれる。真核生物発現系は、正常な完全タンパク質の機能、タンパク質の特異的部位、または自然に生じたもしくは人工的に産生した変異タンパク質の研究にも使用することができる。
【０１７７】
必要な場合には、上記の技術を使用して、Ｍａｔｅｒ遺伝子配列もしくはｃＤＮＡを含む発現ベクター、またはそれらの断片もしくは変種または変異体を、ヒトの細胞、他種の哺乳動物細胞、または非哺乳動物細胞に導入することができる。細胞の選択は処理の目的によって判断される。例えば、高レベルのＳＶ４０ Ｔ抗原を産生してＳＶ４０の複製起点を含むベクターの複製を可能にするサルＣＯＳ細胞（グルツマン（Ｇｕｌｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２、１９８１）を使用してもよい。同様に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、またはヒト線維芽細胞もしくはリンパ芽球（本明細書に記載のように）を使用してもよい。
【０１７８】
従って本明細書に記載の態様は、適当な宿主における発現のために、Ｍａｔｅｒ遺伝子またはｃＤＮＡまたはそれらの変種のようなＭＡＴＥＲコード配列の全てまたは一部を含む、組換えベクターを包含する。Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡは、ＭＡＴＥＲポリペプチドが発現できるように、ベクターにおいて組換えＤＮＡ分子の発現制御配列に機能的に連結されている。発現制御配列は、原核細胞または真核細胞、およびそれらのウイルスの遺伝子、ならびにそれらの組み合わせの発現を制御する配列からなる群より選択することができる。発現制御配列は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージ・ラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、およびシミアンウイルス由来のプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母アルファ接合因子のプロモーター、ならびにそれらの組合せからなる群より特に選択することができる。
【０１７９】
ベクターでトランスフェクションされうる宿主細胞は、大腸菌、シュードモナス、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、もしくはその他のバチルス属；その他の細菌；酵母；真菌；昆虫；マウスもしくはその他の動物；または植物の宿主；またはヒト組織細胞からなる群より選択することができる。
【０１８０】
変異体または変種Ｍａｔｅｒ・ＤＮＡ配列については、同様な系が変異産物を発現し産生するために使用されることが理解される。
【０１８１】
実施例９
ＭＡＴＥＲタンパク質に対する抗体の産生
正常ＭＡＴＥＲタンパク質またはこのタンパク質の変異型のいずれかに対してモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生することができる。選択的には、ＭＡＴＥＲタンパク質に対して産生された抗体は、ＭＡＴＥＲタンパク質を特異的に検出すると考えられる。すなわちそのような抗体は、ＭＡＴＥＲタンパク質を認識して結合し、実質的にヒト細胞に見出されるその他のタンパク質を認識または結合しないと考えられる。ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の抗体は、マウスＭＡＴＥＲのような他種のＭＡＴＥＲを認識する可能性があり、その逆もまた同様である。
【０１８２】
抗体がＭＡＴＥＲタンパク質を特異的に検出することは、多数の標準的な免疫アッセイ法のうち任意の方法、例えば、ウエスタン・ブロッティング法（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）によって判定される。所与の抗体調製品（例えばマウスで産生したもの）がウエスタン・ブロッティングで特異的にＭＡＴＥＲタンパク質を検出することを確かめるために、全細胞タンパク質をヒト細胞（例えばリンパ球）から抽出し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動する。タンパク質は次にウエスタン・ブロッティングによって膜（例えば、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に転写し、抗体調製品を膜とともにインキュベートする。膜を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去した後、アルカリホスファターゼのような酵素を結合した抗マウス抗体（一例として）の利用により、特異的に結合した抗体の存在を検出する。アルカリホスファターゼ基質−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの使用の結果、濃青色の化合物が、免疫局在性アルカリホスファターゼによって生じる。ＭＡＴＥＲタンパク質を特異的に検出する抗体は、本方法により、ＭＡＴＥＲタンパク質のバンド（分子量によりゲル上の特定の位置に局在化され、マウスＭＡＴＥＲについてはゲル移動度による推定に基づき約１２５ｋＤａである）に結合することが示される。他のタンパク質と抗体との非特異的結合は、ウエスタン・ブロット上で弱いシグナルとして生じ、検出される可能性がある。特異的な抗体とＭＡＴＥＲタンパク質との結合から生ずる強い一次シグナルとの比較におけるウエスタン・ブロット上で得られる弱いシグナルによって、この結合の非特異的な性質は当業者に認識されると思われる。
【０１８３】
免疫原として使用するのに適した実質的に純粋なＭＡＴＥＲタンパク質は、上述のようにトランスフェクション細胞または形質転換細胞から単離される。最終調製品のタンパク質濃度は、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）または同様のフィルター装置による濃縮によって、数マイクログラム毎ミリリットルのレベルに調節する。タンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、以下のように調製することができる。
【０１８４】
Ａ． ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載したように同定および単離したＭＡＴＥＲタンパク質のエピトープに対するモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマから、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５）の古典的な方法またはその派生法に従って調製することができる。簡単には、マウスに数マイクログラムの選択したタンパク質を数週間に渡り繰り返し接種する。次に、マウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞はポリエチレン・グリコールを用いてマウス・ミエローマ細胞と融合させ、過剰の非融合細胞を、系をアミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）中で培養することにより死滅させる。融合に成功した細胞を希釈し、希釈液のアリコートをマイクロタイター・プレートのウエルに撒き、そこで培養物の成長を行う。抗体を産生するクローンは、例えばエングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）（Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７０（Ａ）：４１９−４３９、１９８０）によって最初に記載されたＥＬＩＳＡおよびその派生法のような免疫アッセイ法よって、ウエルの上清液体中で抗体を検出することにより同定される。選択された陽性クローンを増幅し、それらのモノクローナル抗体産物を回収して使用することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順は、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）に記載されている。
【０１８５】
Ｂ． 免疫化によるポリクローナル抗体の産生
単一のタンパク質における異種のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、発現タンパク質（任意で、免疫原性を高めるために修飾されていてもよい）により適当な動物を免疫化することによって調製することができる（実施例８）。抗原および宿主種の両方に関係した多くの要因が、効率的なポリクローナル抗体の産生に影響する。例えば、低分子は他のものより免疫原性が低い傾向にあり、担体およびアジュバント（その例は既知である）の使用を必要とする可能性がある。また、宿主動物は、接種の部位および用量に対する反応性が様々であり、不十分または過剰な用量の抗原では、低い力価の抗血清が生じる。少ない用量（ナノグラムレベル）の抗原を複数の皮下部位に連続的に投与することが最も確実であると思われる。ウサギの効果的な免疫化プロトコールは、バイツカイティス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ）ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ ３３：９８８−９９１、１９７１）に見出すことができる。
【０１８６】
ブースター注射は規則的な間隔で行うことができ（例えば、既知の濃度の抗体に対する寒天中での二倍免疫拡散法により）抗体力価が下がり始めて半量と測定されたときの抗血清を採取する。例としては、アウチターロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）ら（「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、ウィアー（Ｗｉｅｒ）Ｄ．編、第１９章、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９７３）を参照のこと。血清中の抗体のプラトーな濃度は通常約０．１ｍｇ／ｍｌから０．２ｍｇ／ｍｌの範囲にある（約１２μＭ）。抗血清の抗原に対する親和性は、例えばにフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（「臨床免疫学マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第４２章、１９８０）により記載されているように、結合競合曲線を作製することによって判定することができる。
【０１８７】
Ｃ． 合成ペプチドに対して産生された抗体
ＭＡＴＥＲタンパク質に対する抗体産生の第三の方法は、ＭＡＴＥＲタンパク質の推定アミノ酸配列に基づき、市販のペプチド合成機で合成した合成ペプチドの利用である。
【０１８８】
一例にすぎないが、マウスＭＡＴＥＲ Ｃ末端ペプチド（配列番号：６の１０９３位から１１１１位の残基）をＫＬＨと結合させて、２週毎に雌ウサギ（２匹）を免疫化した。３回目の免疫化より、免疫化ウサギから少量（〜３ｍｌ）の血液の採取を開始し、抗ペプチド抗体の力価を、このペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。抗体が最大力価に達成するまで免疫化を続け（これはおよそ十回の免疫化で生じた）、次いで血清を調製するためにウサギを屠殺し抜血した。得られた試料は、マウスＭＡＴＥＲ（実施例１）およびヒトＭＡＴＥＲ（実施例４）の両方を特徴づけるために使用した。
【０１８９】
Ｄ． ＭＡＴＥＲコード配列の注射により産生された抗体
マウスのような実験動物中でＭＡＴＥＲタンパク質を発現する組換えＤＮＡベクターを皮下注射することによって、ＭＡＴＥＲタンパク質に対する抗体を産生させることも可能である。組換えベクターの動物への送達は、タン（Ｔａｎｇ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４、１９９２）により記載されているように、携帯型の遺伝子銃システム（サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）ら、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７−３７、１９８７）によって達成することができる。この目的に適した発現ベクターとしては、ヒトβアクチン・プロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかの転写制御のもとにＭＡＴＥＲコード配列を発現するものが含まれる。
【０１９０】
これらのプロトコールに従って調製した抗体調製物は、生物試料中の抗原性を有する物質の濃度を測定する定量的免疫アッセイ法に有用である；これらはまた、生物試料中の抗原の存在を半定量的または定量的に同定するために使用される。
【０１９１】
実施例１０
ＤＮＡに基づく診断
本明細書に提示したＭａｔｅｒ配列情報は、欠失、重複、または突然変異などのＭａｔｅｒの異常が原因の自己免疫性不妊症のような、生殖能力低下または不妊症に対する病因素質を遺伝子検査する分野で使用することができる。イントロンとエキソンの境界を含むＭａｔｅｒ遺伝子の遺伝子配列も、そのような診断方法に有用である。Ｍａｔｅｒ遺伝子（またはその一部）に変異を有する個体、あるいははＭａｔｅｒ遺伝子の重複またはヘテロ接合性もしくはホモ接合性の欠失を有する個体は、様々な技法を用いてＤＮＡレベルで検出することができる。そのような診断方法を行うため、被検者の生物試料（このような生物試料は被検者由来のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含む）はＭａｔｅｒ遺伝子の変異、重複、または欠失についてアッセイされる。適当な生物試料としては、例えば末梢血、尿、唾液、組織生検、外科試料、羊水穿刺試料、および検死材料に存在するもののような、体細胞から得られたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料が含まれる。変異Ｍａｔｅｒ遺伝子、変異Ｍａｔｅｒ ＲＮＡ、あるいは重複しているかまたはホモ接合もしくはヘテロ接合性で欠失しているＭａｔｅｒ遺伝子のうちいずれかを生物試料において検出することは、多くの方法論によって行うことができ、その例を以下に記載する。
【０１９２】
未知の変異を同定するためのそのような検出技法の一つの態様は、被検者から単離されたＲＮＡの逆転写増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）であり（ＲＴ−ＰＣＲ）、その後、産物の直接的ＤＮＡ配列決定を行う。得られた配列と原型Ｍａｔｅｒ ｃＤＮＡ配列との間の１つまたは複数のヌクレオチドの相違、特にヌクレオチド配列のＯＲＦ部分の相違の存在は、Ｍａｔｅｒ遺伝子突然変異の可能性を示すものと理解される。
【０１９３】
または、生物試料から抽出されたＤＮＡは直接増幅に用いることができる。ゲノムＤＮＡからの直接的増幅は、オープン・リーディング・フレームの上流および下流に位置する調節配列またはイントロンとエキソンの境界を含むＭａｔｅｒ遺伝子の全体を解析するために適当である。直接的ＤＮＡ診断についての総説は、カスキー（Ｃａｓｋｅｙ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２２３−１２２８、１９８９）およびランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７、１９８９）によって記載されている。
【０１９４】
ＤＮＡまたはｃＤＮＡにより単位複製配列中の未知のものを検出するために適当な、その他の突然変異スキャニング技法も行うことができる。それらの技法には、直接配列決定法（配列決定を含まない）、ならびに１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析（例えば、ホンギョ（Ｈｏｎｇｙｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：３６３７−３６４２、１９９３）、化学的切断法（ＨＯＴ切断を含む）（ベイトマン（Ｂａｔｅｍａｎ）ら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ４５：２３３−２４０、１９９３；エリス（Ｅｌｌｉｓ）らの総説、Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １１：３４５−３５３、１９９８）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ライゲーション増幅ミスマッチ保護（ＬＡＭＰ）、および酵素的突然変異スキャニング（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）およびディーブル（Ｄｅｅｂｌｅ）、Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． １４：１８１−１８６、１９９９）が含まれ、次いで、推定変異配列を有する単位複製配列の直接配列決定法が行われる。
【０１９５】
不妊症を呈する女性被検者、特に自己免疫性不妊症の被検者または彼女らの親族から単離されたＭａｔｅｒ遺伝子のさらなる研究によって、その個体集団間で高頻度に生ずる特有の変異、ゲノム増幅、または欠失が明らかになる可能性がある。そのような場合、Ｍａｔｅｒ遺伝子全体の配列決定を行うことなく、最も一般的または最も密接に疾患と関連したＭＡＴＥＲの異常を特異的に検出するようなＤＮＡ診断法を設計することができる。
【０１９６】
特異的ＤＮＡ変異の検出は、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を利用したハイブリダイゼーション法（ワラス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、ＣＳＨＬ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２５７−２６１、１９８６）、直接ＤＮＡ配列決定法（チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５、１９８８）、制限酵素の使用（フラベル（Ｆｌａｖｅｌｌ）ら、Ｃｅｌｌ １５：２５−４１、１９７８；ギーバー（Ｇｅｅｖｅｒ）ら、１９８１）、変性試薬を用いたゲル中での電気泳動移動度に基づく識別法（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５−２８４、１９８６）、ＲＮアーゼ保護法（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２−１２４６、１９８５）、化学的切断法（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１、１９８５）、およびリガーゼを介した検出手法（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０、１９８８）などの方法によって行うことができる。
【０１９７】
正常または変異配列に特異的なオリゴヌクレオチドは、市販の機械を使用して化学的に合成される。次にそれらのオリゴヌクレオチドは、同位体（３２Ｐなど）を用いて放射性標識するか、またはビオチン（ワード（Ｗａｒｄ）およびランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：６６３３−６６５７、１９８１）のようなタグを用いて非放射性標識して、ドットブロットまたは電気泳動後のゲルからの転写によって膜または他の固形の支持体に固定した個々のＤＮＡ試料にハイブリダイズさせる。それらの特異的配列は、オートラジオグラフィーまたは蛍光（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７、１９８９）または比色反応（ゲバイフ（Ｇｅｂｅｙｅｈｕ）ら、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３−４５３４、１９８７）のような方法によって視覚化される。正常対立遺伝子に特異的なＡＳＯを用いた場合、ハイブリダイゼーションの欠如は、遺伝子の特定領域における変異、またはＭａｔｅｒ遺伝子の欠失を示すと考えられる。一方、変異対立遺伝子に特異的なＡＳＯが臨床試料にハイブリダイズした場合、そのことはＡＳＯによって規定された領域における変異の存在を示すと思われる。
【０１９８】
Ｍａｔｅｒ遺伝子の正常型と変異型の間の配列の相違はまた、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５、１９８８）の方法を用いた直接ＤＮＡ配列決定によって明らかにすることができる。クローニングされたＤＮＡセグメントは、特異的ＤＮＡセグメントを検出するプローブとして用いることができる。この方法の感度は、核酸増幅、例えばＰＣＲ（リチニク（Ｗｒｉｃｈｎｉｋ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：５２９−５４２、１９８７；ワン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３０：３８４−３８６、１９８７；ストフレット（Ｓｔｏｆｌｅｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４９１−４９４、１９８８）と組み合わせた場合に著しく高まる。この手法では、増幅された配列内に位置する配列決定用プライマーが、改良されたＰＣＲによって産生した２本鎖ＰＣＲ産物または１本鎖鋳型と共に用いられる。配列決定は、放射性標識した核酸を用いた従来の方法または蛍光タグを用いた自動配列決定法により行う。
【０１９９】
配列の変化は、偶然の制限酵素認識部位を生じるか、または存在する制限酵素認識部位を欠失させる可能性がある。制限酵素認識部位の変化は、適当な酵素消化およびそれに続く慣例的なゲル・ブロット・ハイブリダイゼーションの使用により明らかになる（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８：５０３−５１７、１９７５）。制限酵素切断部位を有するＤＮＡ断片（正常または変異体のいずれか）は、大きさの減少または対応する制限酵素断片数の増加により検出される。ゲノムＤＮＡ試料も、適当な制限酵素による処理に先立ち、ＰＣＲで増幅することができる；次いで、異なる大きさの断片は、ゲル電気泳動後、臭化エチジウムの存在中でＵＶ光下で可視化される。
【０２００】
ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子検査は、変性試薬を含むかまたは含まないゲル中で、ＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することによって行うことができる。高分解能ゲル電気泳動によって、小さい配列の欠失および挿入が可視化できる。例えば、小さい欠失を有するＰＣＲ産物は、８％非変性ポリアクリルアミドゲル上で、正常配列と明らかに区別することができる（国際公開公報第９１／１０７３４号；Ｎａｇａｍｉｎｅら、Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ４５：３３７−３３９、１９８９）。異なる配列組成のＤＮＡ断片は、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別可能であり、そこでは、異なるＤＮＡ断片の移動度はそれらに特有な「部分融解」温度に従い、ゲル中の異なる位置で遅延する（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２−１２４６、１９８５）。または、単一塩基置換またはその他の小さい変化を含む変異を検出する方法が、ＰＣＲにおけるプライマーの長さの差に基づいてもよい。例えば、変異を有さないプライマーを、変異に対して特異的なプライマーに加えて用いてもよい。正常および変異遺伝子のＰＣＲ産物は、そのあとアクリルアミドゲルで区別して検出することができる。
【０２０１】
慣例的なゲル電気泳動法およびブロット・ハイブリダイゼーション法に加えて、個々のＤＮＡ試料が膜に固定されないような方法によってもＤＮＡ断片を可視化することができる。プローブおよび標的配列が共に溶液中にあってもよいし、プローブ配列が固定されていてもよい（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４、１９８９）。放射性同位体、放射性崩壊の直接検出（発光の有無における）を含むオートラジオグラフィー、熱産生反応を含む分光測光、および蛍光発生反応を含む蛍光光度法のような様々な検出方法を、特異的な個体遺伝子型を同定するために用いることができる。
【０２０２】
Ｍａｔｅｒ遺伝子に多数の変異が頻繁に生じる場合、そのような多数の変異の検出可能な系が望ましい可能性があると考えられる。例えば、全ての可能な変異を同時に同定するために、多数の特異的オリゴヌクレオチド・プライマーおよびハイブリダイゼーション・プローブによる核酸増幅反応を使用してもよい（チャンバーライン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１１４１−１１５５、１９８８）。その方法は、固定された配列特異的オリゴヌクレオチド・プローブを含んでもよい（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０−６２３４、１９８９）。
【０２０３】
実施例１１
ＭＡＴＥＲタンパク質の定量
Ｍａｔｅｒ遺伝子の欠失、増幅、または変異を診断する代替法は、被検者の細胞中のＭＡＴＥＲタンパク質レベルを定量することである。この診断ツールは、例えば全Ｍａｔｅｒ遺伝子の欠失のみならず、Ｍａｔｅｒ遺伝子のプロモーター領域の変異、または切断されたポリペプチド、非機能性ポリペプチドもしくは不安定なポリペプチドを産生する遺伝子のコード領域の変異に原因するＭＡＴＥＲタンパク質レベルの減少を検出するのに有用であると考えられる。または、Ｍａｔｅｒ遺伝子の重複は、本タンパク質の発現レベルの増加として検出される可能性がある。減少または増加したＭＡＴＥＲタンパク質レベルの測定は、先に概説した方法によるＭａｔｅｒ遺伝子の欠失、重複、または変異の状況の直接的な判定に代替的な手法、または補足的な手法となると思われる。
【０２０４】
ＭＡＴＥＲタンパク質に特異的な抗体の入手可能性は当業者に周知であり、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ） （「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）に記載されている多数の免疫アッセイ法の一つにより、細胞ＭＡＴＥＲタンパク質の定量が可能になると考えられる。
【０２０５】
ＭＡＴＥＲタンパク質を定量する目的のために、細胞タンパク質を含む、被検者の生物試料が必要である。そのような生物試料は、末梢血、尿、唾液、組織生検、羊水穿刺試料、外科標本、および検死材料の中に存在するような体細胞から得ることができる。特に、女性の生殖細胞（例えば卵）または胚は適切な試料である。ＭＡＴＥＲタンパク質の定量は、免疫アッセイ法により行われ、健常細胞（例えば、生殖能力が低下していないことが分かっている女性の細胞）中に見出されるタンパク質レベルと比較される。正常ヒト細胞におけるＭＡＴＥＲタンパク質の量と比較して、被検者の細胞におけるＭＡＴＥＲタンパク質の量が著しく減少（例えば、１０％またはそれ以上、例えば、２０％、２５％、３０％、５０％またはそれ以上が減少）していることは、著しく増加（例えば、１０％またはそれ以上、例えば、２０％、２５％、３０％、５０％またはそれ以上が増加）していることが重複または変異の増加が生じたことを示すと考えられるのに対し、被検者がＭａｔｅｒ遺伝子座に欠失または変異を持っている可能性を示すものとして解釈されると考えられる。
【０２０６】
実施例１２
ＭＡＴＥＲタンパク質に対する血清抗体の検出
ＭＡＴＥＲファミリーのタンパク質は、自己免疫性不妊症のある種の症例の病原性に関与する自己抗体として初めて同定された。本明細書におけるヒトＭＡＴＥＲタンパク質配列およびコード核酸の提供により、現在、そのような生殖能力不全の検出および診断方法が可能になった。
【０２０７】
ヒトＭＡＴＥＲタンパク質のエピトープを認識する自己抗体は、例えば血清またはその他の液体などの被験者に由来する試料中で、既知の免疫学的技法により検出することができる。そのような自己抗体（例えばＭＡＴＥＲエピトープに特異的な循環自己抗体）の存在は、被検者がＭＡＴＥＲを介する不妊症または生殖能力低下に罹患しているか、またはそれらの状態のうちの一つに罹患する感受性が増加していることを示す。
【０２０８】
抗原の検出および定量のための多くの方法が当技術分野に周知である。最も一般的には、精製した抗原を基質と結合させ、試料中の抗体がＦａｂ部分を介してその抗原と結合し、基質を洗浄した後に標識二次抗体を加え、それがアッセイ法の対象である抗体のＦｃ部分と結合すると考えられる。標識二次抗体は種特異的、即ち、血清がヒト由来である場合に、標識二次抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体となると考えられる。標本を洗浄した後、結合した標識二次抗体の量を標準的な方法により検出し定量する。
【０２０９】
浸漬片またはその他の固定されたアッセイ用の装置を使用した方法を含む、生物試料中の抗体を検出する方法の例は、例えば以下の特許において開示されている：米国特許第５，９６５，３５６号（単純ヘルペスウイルス・型特異的血清アッセイ法）；同第６，１１４，１７９号（抗原および／または抗体を検出するための方法および検査キット）；同第６，０７７，６８１号（抗体の検出による運動神経障害の診断）；第６，０５７，０９７号（自己免疫反応および／または炎症性疾患を含む病状のマーカー）；および同第５，５５２，２８５号（免疫アッセイ法、酸化ＤＮＡ塩基に対する抗体の組成およびキット）。
【０２１０】
実施例１２
ＭＡＴＥＲ発現の抑制
トランスジェニック細胞中のＭＡＴＥＲタンパク質発現の減少は、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡまたはその断片（例えば、配列番号：１および３に記載のｃＤＮＡ断片）またはその遺伝子配列もしくはその隣接領域を含む、Ｍａｔｅｒコード配列に基づくアンチセンス構築物を細胞に導入することにより達成されうる。アンチセンス抑制のために、ＭＡＴＥＲコード配列に由来するヌクレオチド配列、例えばＭａｔｅｒ ｃＤＮＡまたは遺伝子の全てまたは一部を形質転換ベクターのプロモーター配列に関して逆方向に配置する。ベクターのその他の局面は先に記載したように選択することができる（実施例８）。
【０２１１】
導入された配列は完全長のヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡ（配列番号：２３）または遺伝子である必要はなく、形質転換された細胞型に見出される同等な配列と全く相同である必要もない。従って、マウスｃＤＮＡ（配列番号：５）の一部または断片もまたヒトＭａｔｅｒ遺伝子の発現をノックアウトするために使用することができる。しかし、一般的に、導入された配列の長さが短い場合、効果的なアンチセンス抑制のために、天然のＭａｔｅｒ配列へのより高い相同性が必要とされると考えられる。導入されたベクター中のアンチセンス配列の長さは少なくとも３０ヌクレオチドがよく、アンチセンス配列の長さが増せば、一般にアンチセンス抑制に改善がみられると考えられる。ベクター中のアンチセンス配列の長さは、１００ヌクレオチドより長いほうが有利であり、ヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡまたは遺伝子のおよそ全長まで増加させることができる。Ｍａｔｅｒ遺伝子自体を抑制するために、アンチセンス構築物の転写は、細胞の内因性Ｍａｔｅｒ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子に逆相補性であるＲＮＡ分子の産生をもたらす。
【０２１２】
アンチセンスＲＮＡ分子が遺伝子発現に干渉する正確な機序は明らかになっていないが、アンチセンスＲＮＡ分子が内因性ｍＲＮＡ分子に結合することによって、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられている。
【０２１３】
内因性ＭＡＴＥＲ発現の抑制は、リボザイムを使用することによっても行うことができる。リボザイムは、特異性の高いエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成ＲＮＡ分子である。リボザイムの産生および使用については、チェク（Ｃｅｃｈ）の米国特許第４，９８７，０７１号およびヘイセルホフ（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ）の米国特許第５，５４３，５０８号に開示されている。アンチセンスＲＮＡに結合する内因性ｍＲＮＡ分子が切断されるように、アンチセンスＲＮＡにリボザイムの配列を含ませてアンチセンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を与えることが可能であり、その結果、内因性遺伝子の発現のアンチセンス抑制が増強される。
【０２１４】
最後に、内因性ＭＡＴＥＲ活性を阻害するために、ＭＡＴＥＲのドミナントネガティブ変異型を用いることができる。
【０２１５】
実施例１４
ＭＡＴＥＲノックアウトおよび過剰発現トランスジェニック動物
ＭＡＴＥＲタンパク質を低発現、または過剰発現する変異生物は、研究に有用である。そのような変異体は、健常および／または病的な生物におけるＭＡＴＥＲの生理学的および／または病理学的な役割に知見を加えることを可能にする。それらの変異体は「遺伝子操作された」、即ち、ヌクレオチドの形の情報が、通常存在しないと思われる場所または組合せで変異体のゲノムに導入されている。このような方法で導入されたヌクレオチドは、「非天然」と呼ばれる。例えば、天然のＭａｔｅｒ遺伝子の上流に挿入された非Ｍａｔｅｒのプロモーターは、非天然であると呼ばれる。細胞に形質転換されたプラスミド上のＭａｔｅｒ遺伝子またはその他のコード配列の追加的コピーは、追加的コピーが同じ種由来のＭａｔｅｒであっても、または異なる種のものであっても、非天然であると考えられる。
【０２１６】
変異体は、例えば、ＭＡＴＥＲタンパク質を過剰発現もしくは低発現するか、またはＭＡＴＥＲを全く発現しない哺乳動物（マウスなど）から産生させることができる。過剰発現変異体は、生物中でＭＡＴＥＲコード配列（遺伝子など）の数を増加させるか、またはマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、または乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターもしくはメタロチオネインプロモーターのような、構成的もしくは誘導可能な、またはウイルスのプロモーターの制御下にあるＭＡＴＥＲコード配列を生物に導入することにより作製される。ＭＡＴＥＲを低発現する変異体は、誘導可能もしくは抑制可能なプロモーターを用いることにより、またはＭａｔｅｒ遺伝子を欠失させることにより、または例えばトランスポゾン挿入による遺伝子の破壊によりＭａｔｅｒ遺伝子の機能を破壊もしくは制限することにより、作製することができる。
【０２１７】
実施例１３において先に記載したように、ＭＡＴＥＲの発現を減少または阻害するため、構成的または誘導可能なプロモーターの下に、アンチセンス遺伝子を生物中に導入することができる。
【０２１８】
遺伝子工学を用いて、遺伝子発現を無視し得るレベルにまで打ち消すか、または減少させた場合に、遺伝子は「機能的に欠失」される。本出願において、変異体が、改変または機能的に欠失されたＭａｔｅｒ遺伝子を有すると言及された場合、これはＭａｔｅｒ遺伝子およびこの遺伝子の任意のオルソログを意味する。変異体が、「通常のコピー数より多く」の遺伝子を有すると言及された場合、これはその変異体が野生型の生物、例えば二倍体のマウスまたはヒトに見出される通常の数より多くの遺伝子を有することを意味する。
【０２１９】
ＭＡＴＥＲを過剰発現する変異体マウスは、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターまたは乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーターのようなプロモーターによって誘導されるＭａｔｅｒ遺伝子を有するプラスミドを構築することによって作製することができる。プラスミドをマウス卵母細胞にマイクロインジェクションによって導入することができる。その卵母細胞は偽妊娠雌に移植し、同腹仔を導入遺伝子の挿入についてアッセイする。その後、導入遺伝子を含む多数の系統を研究のために利用することができる。
【０２２０】
ＷＡＰは、授乳期間の乳腺発現に極めて特異的であり、ＭＭＴＶは乳腺、唾液腺、およびリンパ系組織を含む様々な組織に発現する。例えば、メタロチオネイン・プロモーターなどの他の多くのプロモーターを様々な発現パターンを得るために使用することができる。
【０２２１】
テトラサイクリンのようにマウスに与えることができる物質によって調節されるプロモーターにより、対象となる発現構築物が誘導されるような、誘導可能な系を作製することができる。そのような技術は当技術分野に周知である。
【０２２２】
Ｍａｔｅｒ遺伝子が欠失されるか、そうでなければ不能になった変異ノックアウト動物（例えばマウス）は、Ｍａｔｅｒ遺伝子のコード領域を胚性幹細胞から除去することで作製することができる。標的化ベクターを用いて欠失変異を作製する方法が記載されている（例えば、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびキャペック（Ｃａｐｅｃｃｈ）、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２、１９８７を参照）。Ｍａｔｅｒヌル・マウスを産生する一つの具体的な例は先の実施例１に記載されている。
【０２２３】
実施例１５
遺伝子治療
被検者のＭＡＴＥＲを介する生殖能力異常を治療するための遺伝子治療法、または被検者にＭＡＴＥＲを介する不妊を生じさせるための遺伝子治療法が、現在可能となった。
【０２２４】
遺伝子治療における実験のために、高い効率での感染ならびに安定な組み込みおよび発現を伴うレトロウイルスが、好ましいベクターであると考えられている（オーキン（Ｏｒｋｉｎ）ら、Ｐｒｏｇ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ７：１３０−１４２、１９８８）。全長のＭａｔｅｒ遺伝子またはｃＤＮＡをレトロウイルスベクターにクローニングし、その内因性プロモーター、または例えばレトロウイルスのＬＴＲ（末端反復配列）から誘導させることができる。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（マクローリン（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３−１９７３、１９８８）、ワクシニアウイルス（モス（Ｍｏｓｓ）ら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：３０５−３２４、１９８７）、ウシパピローマウイルス（ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３９：６４２−６５４、１９８７）、またはエプスタイン‐バーウイルス（マーゴルスキー（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２８３７−２８４７、１９８８）のようなヘルペスウイルス群のメンバーを含むその他のウイルスのトランスフェクション系もこの種の方法に用いることができる。
【０２２５】
遺伝子治療技術の最近の発達には、コールストラウス（Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６−１３８９、１９９６）に記載のような、ＲＮＡ−ＤＮＡ混成オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。この技術はクローニングされた配列の部位特異的な組込みを可能にし、それによって正確に標的化された遺伝子置換を可能にする。
【０２２６】
ウイルスベクターを用いたＭａｔｅｒの細胞への送達に加え、非感染法を送達に用いることが可能である。例えば、リピドおよびリポソームを介した遺伝子送達が、最近、様々な遺伝子のトランスフェクションに成功して利用されている（総説として、テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）およびラシック（Ｌａｓｉｃ）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１：１７５−１８０、１９９９；リー（Ｌｅｅ）およびフアン（Ｈｕａｎｇ）、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４：１７３−２０６；およびクーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２３：１７２−１８７、１９９６を参照）。例えば、陽イオン性リポソームは単球性白血病細胞をトランスフェクトする能力につき解析されており、ウイルスベクターの使用に替わる実行可能な選択肢であることが示された（デリマ（ｄｅ Ｌｉｍａ）ら、Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６：１０３−１０９、１９９９）。そのような陽イオン性リポソームは、例えばモノクローナル抗体またはその他の適当な標的リガンドを含めることによって、特異的な細胞を標的化させることも可能である（カオ（Ｋａｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：２５０−２５６、１９９６）。
【０２２７】
実施例１６
治療化合物の同定
本明細書に開示したヒトＭＡＴＥＲ分子は、ＭＡＴＥＲの活性を遮断（阻害）する（従って、それによる生殖能力低下）か、またはＭＡＴＥＲ活性を増加させる（従って、それによる生殖能力増強）ことによって、哺乳動物におけるＭＡＴＥＲを介した不妊症に影響を及ぼす有用な化合物を同定（選別）するのに用いることができる。
【０２２８】
そのような選別方法には、試験化合物がＭＡＴＥＲタンパク質またはＭＡＴＥＲタンパク質の変種または断片に直接結合するか、そうでなければ相互作用するかどうかを判別することを含みうる。そのような分子に結合するタンパク質は、さらなる特徴づけのために選択される。
【０２２９】
具体的態様において、活性を試験する化合物は、被検細胞（例えば、哺乳動物の発達中の卵母細胞または胚）のような細胞に適用される。次に、例えば卵母細胞または胚が２細胞期を超えて発達するかどうかを判別することにより、被検細胞におけるＭＡＴＥＲタンパク質の活性が測定される。試験化合物の適用により２細胞期を超えて発達する胚の比率が変化した場合には、その化合物は可能性のある候補としてさらなる特徴づけのために選択される。特定の例において、例えばインビボで生殖能力が阻害されるかどうかを判定するために、物質を哺乳動物の雌の生殖系にインビボで曝露することによって、ＭＡＴＥＲ活性を妨害または阻害する試験物質がさらなる研究のために選択される。そのように同定された化合物は避妊薬として有用な可能性がある。
【０２３０】
ＭＡＴＥＲ活性を効率的に阻害し、それ故に避妊薬として有効である可能性を有する化合物の具体的な例には、ＭＡＴＥＲタンパク質のエピトープに特異的に向かう抗体が含まれる。免疫避妊薬の一般的な概念は記載されている（例えば透明帯のタンパク質に対する避妊用抗体が記載される米国特許第５，６３７，３００号および同第６，０２７，７２７号を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【０２３１】
または、２細胞期を超えて発達する胚の比率を増加させる化合物（例えば、生殖能力に障害があるとして知られる動物系において）が、生殖能力を増加させる可能性のある物質としてさらなる研究のために選択される。例えばＭａｔｅｒヌル動物において、ＭＡＴＥＲタンパク質の活性を模倣する化合物を同定するために、同様な選別を用いることができる。
【０２３２】
加えて、ＭＡＴＥＲタンパク質は細胞質内で他の未知のタンパク質と相互作用することによってその機能を果たすことが示唆されている。そのような相互作用の物理的な妨害により、ＭＡＴＥＲの機能が阻害されることが期待される。そのような相互作用の候補は、酵母ツー・ハイブリッド系（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）およびソングス（Ｓｏｎｇｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５、１９８９）における相互作用に基づいて同定される。タンパク質相互作用のための分子ドメインが分かれば、ＭＡＴＥＲタンパク質とそれら他のタンパク質との相相互作用を特異的に阻害するか、そうでなければ干渉することに基づいて分子を直接設計することができる。
【０２３３】
それらの方法を使用して選択した化合物は、本開示に包含される。
【０２３４】
実施例１７
キット
書面による手引書に加えて、Ｍａｔｅｒ遺伝子に特異的なプローブまたはプライマーのような、Ｍａｔｅｒ遺伝子のコピー数を測定するために必要な試薬を含むキットが提供される。Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡ（即ち、プローブを含む）またはＭＡＴＥＲタンパク質（即ち、ＭＡＴＥＲ特異的結合試薬）の異常な発現を判定するキットもまた提供される。診断キットにおいて提供される手引書には、決められた（例えば、実験的に測定された）値と比較するための検量線または図表を含めることができる。
【０２３５】
Ａ． Ｍａｔｅｒゲノム配列を検出するキット
本明細書において開示されるヌクレオチド配列およびその断片を、Ｍａｔｅｒゲノム配列の検出および／または不妊症もしくは生殖能力低下の診断に用いるためのキットの形で供給することができる。そのようなキットでは、適当量の一つまたは複数のＭａｔｅｒ特異的オリゴヌクレオチド・プライマーが、一つまたは複数の容器中に提供される。オリゴヌクレオチド・プライマーを、例えば水溶液に懸濁するか、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥した粉末として供給することができる。オリゴヌクレオチドを供給する容器は、供給される形状を収容可能な任意の通常の容器、例えば微量遠心チューブ、アンプル、または瓶であってよい。一部の応用例では、別々の、典型的には使い捨てのチューブまたは同等の容器に、予め測定した一回分の使用量のプライマー対を供給することができる。そのような準備により、Ｍａｔｅｒゲノム増幅の存在を試験すべき試料を個々のチューブに加え、直接インビトロ増幅を行うことができる。
【０２３６】
キットで供給される各々のオリゴヌクレオチド・プライマーの量は、例えばその製品が向けられた市場に依存した、任意の適当な量でよい。例えば、キットが研究または臨床使用に適合させたものである場合、提供される各々のオリゴヌクレオチド・プライマーの量は、数回のインビトロ増幅反応を開始するのに十分な量であると思われる。当業者には、一回の増幅反応の使用に適当なオリゴヌクレオチド・プライマーの量が既知である。一般的な指針は、例えば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、（「ＰＣＲプロトコール、方法と応用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）、サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）にあると思われる。
【０２３７】
キットは、Ｍａｔｅｒ配列、例えばＭａｔｅｒ遺伝子、遺伝子の特異的エキソンもしくはその他の部分、またはその５’もしくは３’の隣接領域のＰＣＲのインビトロ増幅を容易にするため、二つより多くのプライマーを含んでもよい。
【０２３８】
一部の態様においては、キットは、ＰＣＲのインビトロ増幅反応を行うのに必要な試薬（例えばＤＮＡ試料調製試薬、適当な緩衝液（例えばポリメラーゼ緩衝液）、塩（例えば塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む）を含んでもよい。書面による手引書も含んでもよい。
【０２３９】
キットはさらに、インビトロで増幅したＭａｔｅｒ配列の検出に用いるため、標識または非標識のいずれかのオリゴヌクレオチド・プローブを含んでもよい。そのようなプローブとして適当な配列は、二つの提供されたオリゴヌクレオチド・プライマーのアニーリング部位間に位置する任意の配列となり、そのプローブに相補的な配列がインビトロ増幅反応中で増幅される。
【０２４０】
増幅反応で使用するために、一つまたは複数の対照配列もキットに提供されることは有用であると思われる。適当な陽性対照配列の設計は当業者に周知である。
【０２４１】
Ｂ． Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡ発現を検出するキット
先に開示したものと同様なＭａｔｅｒゲノム配列を検出するためのキットを、Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡ発現レベルを検出するために用いることができる。そのようなキットには、ＲＮＡで使用するための技術的に明らかな改良が加えられ、上記で提供されるものと同様な、逆転写増幅反応に使用するための適当量の一つまたは複数のオリゴヌクレオチド・プライマーを含んでもよい。
【０２４２】
一部の態様では、Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡ発現レベルを検出するキットには、例えばＲＮＡ試料調製試薬（例えばＲＮアーゼ阻害剤を含む）、適当な緩衝液（例えば、ポリメラーゼ緩衝液）、塩（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などの、ＲＴ−ＰＣＲインビトロ増幅反応を行うために必要な試薬を含んでもよい。書面による手引書も含んでもよい。
【０２４３】
キットはさらに、インビトロで増幅した標的配列の検出に用いるため、標識または非標識のいずれかのオリゴヌクレオチド・プローブを含んでもよい。そのようなプローブとして適当な配列は、二つの提供されたオリゴヌクレオチド・プライマーのアニーリング部位間に位置する任意の配列となり、そのプローブに相補的な配列がＰＣＲ反応中で増幅される。
【０２４４】
ＲＴ−ＰＣＲ反応で使用するために、一つまたは複数の対照配列もキットに提供されることは有用であると思われる。適当な陽性対照配列の設計は当業者に周知である。
【０２４５】
または、キットには、Ｍａｔｅｒ ｍＲＮＡの定量的または半定量的なノーザン解析を行うために必要な試薬も提供することができる。そのようなキットには、例えば、プローブとして用いるための少なくとも一つのＭａｔｅｒ特異的オリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、放射性同位体、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光もしくは蛍光試薬、ハプテン、または酵素を含む、選択された任意の従来法により標識することができる。
【０２４６】
Ｃ． ＭＡＴＥＲタンパク質またはペプチド発現を検出するキット
ＭＡＴＥＲタンパク質の発現を検出するキットは、例えば、少なくとも一つの標的（例えばＭＡＴＥＲ）タンパク質特異的結合因子（例えばポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体または抗体断片）および少なくとも一つの対照を含んでもよい。ＭＡＴＥＲタンパク質特異的結合因子および対照は、別個の容器に収容することができる。キットは、ＭＡＴＥＲ：因子複合体を検出する手段を含んでもよく、例えばその因子は検出可能に標識されていてもよい。検出用の因子が標識されていない場合は、一部のキットにおいて一つまたは複数の別個の容器で提供される可能性のある例えば二次抗体またはプロテインＡによって、それを検出することができる。そのような技術は周知である。
【０２４７】
一部のキットにおける補足的な構成要素には、アッセイ法を行うための手引書が含まれる。手引書は、ＭＡＴＥＲの発現レベルが例えば対照試料と比べて変化したかどうか判定することを試験者に可能にすると思われる。キットには、反応容器、および色素原、緩衝液、酵素等の補助的試薬も含むことができる。
【０２４８】
一例にすぎないが、非特異的抗卵巣抗体の検出について報告されているように（ウィートクロフト（Ｗｈｅａｔｃｒｏｆｔ）ら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９６：１２２−１２８、１９９４；ウィートクロフト（Ｗｈｅａｔｃｒｏｆｔ）ら、Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． １２：２６１７−２６２２、１９９７）、酵素免疫吸着法のような効果的で簡便な免疫アッセイキットを、ヒト血清中の抗ＭＡＴＥＲ抗体を試験するために構成することが可能である。細菌またはバキュロウイルスのいずれかにおいて組換えヒトＭＡＴＥＲタンパク質を産生するために、発現ベクターをヒトＭＡＴＥＲ ｃＤＮＡを用いて構築することができる（実施例８において記述のとおり）。アフィニティー精製によって、制限なく純粋組換えＭＡＴＥＲタンパク質を産生することができる。
【０２４９】
アッセイキットは、酵素基質と共に、抗原として組換えタンパク質、および二次抗体として酵素結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを提供し得る。そのようなキットは、患者の血清がヒトＭＡＴＥＲに対する抗体を含む場合の試験に使用することができる。
【０２５０】
本開示は、上述のヒトＭａｔｅｒ分子を含む、Ｍａｔｅｒ核酸およびタンパク質を提供する。本開示はさらにそれらの分子を使用する方法を提供するものであって、女性の不妊症、生殖能力低下、または生殖不全を予測および／または診断する方法に加えて、そのような不妊症および生殖能力低下の治療法、ならびに避妊薬を含む。記載された分子および方法の正確な詳細には変化があること、または低発現もしくは過剰発現もまた考慮されていることが明らかになると思われる。そのようなキットは、記載された発明の精神を逸脱することなく改変されたものを含むと思われる。本発明者らは、特許請求の範囲の範囲および精神に含まれるそのような改変および変形の全ての権利を主張するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】発生時におけるマウスＭＡＴＥＲの発現を詳細に示す２枚のデジタル化ゲル、および一連のデジタル化顕微鏡写真を示す。
【図１Ａ】Ｍａｔｅｒ転写物およびＺＰ３転写物のＲＮアーゼ保護を示すノーザン・ブロットのデジタル画像である。ＲＮアーゼ保護アッセイ法は、５０個の卵母細胞、卵、または胚からの総ＲＮＡを用いて行った。３２Ｐ標識したアンチセンス・プローブならびに保護されたＭａｔｅｒおよびＺＰ３断片の長さは、それぞれ１８０／１３９ｎｔおよび２５７／２０５ｎｔである。
【図１Ｂ】示されたマウス細胞型におけるＭＡＴＥＲタンパク質（約１２５ｋＤ）の量を示す、ウエスタンブロットのデジタル画像である。ＭＡＴＥＲタンパク質は２５個の卵母細胞、卵、または胚において、ＭＡＴＥＲに対する単一特異的な抗血清を用いた免疫ブロッティングによりアッセイした。
【図１Ｃ】ＭＡＴＥＲタンパク質の細胞局在を示す一連のデジタル化顕微鏡写真である。タンパク質の局在は、蛍光標識抗体を用い、共焦点レーザー走査型顕微鏡単独で（上図）、またはノマルスキー画像に重ね合わせてから（下図）、卵母細胞、卵、または胚を画像化することにより決定した。スケールバーは５０μｍ。
【図２】標的化によるＭａｔｅｒ遺伝子座破壊の特徴付けを示す。
【図２Ａ】正常マウスＭａｔｅｒ対立遺伝子（上）、標的化構築物（中央）、およびヌル対立遺伝子（下）の略図である。標的化を評価するのに用いた５’および３’プローブは、ＤＮＡ相同性領域の外にある。
【図２Ｂ】Ｍａｔｅｒヌル対立遺伝子が、ＸｂａＩで消化したＥＳ細胞ＤＮＡにおいて、５’プローブ（左）により３．５ｋｂ断片として、または３’プローブ（中央）およびｎｅｏプローブ（右）により４．０ｋｂ断片として検出されたことを示す一連のデジタル化ノーザンブロットである。
【図２Ｃ】Ｍａｔｅｒ転写物は正常またはヘテロ接合体（正常の半分の量）においては検出されたが、ホモ接合体のヌル卵巣においては検出されなかったことを示す一対のデジタル化ノーザンブロットである（左パネル）。ＺＰ３転写物（対照）は３つの遺伝子型の全てに存在していた（右パネル）。
【図３】Ｍａｔｅｒヌルの雌マウスに由来する胚におけるインビボの発育異常を示す一連のデジタル化顕微鏡写真および対応する棒グラフである。
ゴナドトロピンにより誘導した排卵の後、雌マウスを正常の雄と交配し、正常（図３Ａ、図３Ｄ、図３Ｇ、および図３Ｊ）またはＭａｔｅｒヌル（図３Ｂ、図３Ｅ、図３Ｈ、および図３Ｋ）の雌由来の卵管を、１日（図３Ａおよび図３Ｂ）、２日（図３Ｄおよび図３Ｅ）、３日（図３Ｇおよび図３Ｈ）、ならびに４日（図３Ｊおよび図３Ｋ）後に洗浄した。固定しない胚の写真をノマルスキー光学により撮影した。矢印は１細胞接合体の前核を指す（図３Ａおよび図３Ｂ）。スケールバーは５０μｍ。
棒グラフは、交配後１日（図３Ｃ）、２日（図３Ｆ）、３日（図３Ｉ）、および４日（図３Ｌ）目のＭａｔｅｒヌル（黒四角）および正常（白四角）の雌に由来する、平均胚数の発生の進行を示す。それぞれのバーは４〜５回の実験の平均±標準誤差を示す。
【図４】Ｍａｔｅｒを欠失したマウス胚において新規の転写および翻訳が生ずることを示す。
【図４Ａ〜４Ｆ】マウス胚のデジタル化顕微鏡写真画像である。新規に合成されたＲＮＡは、Ｍａｔｅｒヌル（図４Ａおよび図４Ｃ）および正常（図４Ｂおよび図４Ｄ）の雌に由来する１細胞（図４Ａおよび図４Ｂ）および２細胞（図４Ｃおよび図４Ｄ）胚の核へのＢｒＵＴＰ取り込みにより、共焦点レーザー走査顕微鏡およびＢｒＵＴＰに対するモノクローナル抗体を用いて測定した。
【図４Ｇ】Ｍａｔｅｒの存在下（＋）および非存在下（−）における２細胞胚に取り込まれたＢｒＵＴＰの量を、注入を行っていない対照群で得られる量で差し引いた後、任意の蛍光単位を用いて示した棒グラフである（図４Ｅおよび図４Ｆ）。スケールバーは５０μｍ。
【図４Ｈ】Ｍａｔｅｒの存在下（＋）および非存在下（−）における雌に由来する５０個の発達中の卵母細胞、卵、および２細胞胚からの総ＲＮＡを用いた、２８ＳリボゾームＲＮＡのＲＮアーゼ保護アッセイ法を示す一対のデジタル化ノーザンブロットである。３２Ｐ標識したアンチセンスプローブと２８Ｓ−ｒＲＮＡにおける保護された断片の長さは、それぞれ１５３ｎｔおよび１１５ｎｔであった。
【図４Ｉ】Ｍａｔｅｒを含む（＋）あるいは含まない（−）１細胞接合体（左パネル）および２細胞胚（中央パネルおよび右パネル）における新規のタンパク質合成を示す、一連のデジタル化フルオログラフィーである。それぞれの列は試料緩衝液に直接溶解した（左パネルおよび中間パネル）、またはＴＲＣ（６５〜７５ｋＤａ）およびｐ３５を部分精製抽出後（右パネル）の１０個の胚由来のタンパク質を含む。
【図５】Ｍａｔｅｒヌルの雌由来の卵巣組織像、卵、および産生された卵の数を示す。排卵された卵の数、および成熟または変性を示すそれらの形態は、正常およびＭａｔｅｒヌルのマウスの間で顕著には異なってはいなかった。
【図５Ａおよび５Ｂ】４週齢（図５Ａ）および８週齢（図５Ｂ）のＭａｔｅｒヌルマウス由来の卵巣切片のデジタル化画像である。４週齢のＭａｔｅｒヌルの卵巣組織像（図５Ａ）では卵形成における異なる期の正常の卵巣が見られ、正常の卵巣と組織学的に区別できない。８週齢の試料（図５Ｂ）では、野生型マウス卵巣の卵胞黄体形成と同様に、正常な自発的排卵を示唆する多数の黄体がある。
【図５Ｃ】外因性のＰＭＳＧおよびｈＣＧへの応答によってＭａｔｅｒヌルマウスより産生された、排卵された卵のデジタル化写真である。野生型マウス由来の排卵された卵と形態学的に同様であるように思われる。
【図５Ｄ】Ｍａｔｅｒヌルマウスおよび野生型マウス由来の、排卵した卵の数（平均±標準誤差）を示す棒グラフである。
【図６】正常マウスおよびＭａｔｅｒヌルマウスで、子宮および卵巣の全体の形態学的外見を比較するデジタル化画像である。Ｍａｔｅｒヌルの雌マウスの卵巣および子宮（右）は野生型雌マウスの卵巣および子宮（左）と区別できなかった。
【図７】Ｍａｔｅｒ転写物のヒトにおける卵母細胞特異的な発現を、インサイチュー・ハイブリダイゼーションによって示す一連のデジタル化顕微鏡写真である。［３５Ｓ］標識したアンチセンスプローブおよびセンスプローブは、いずれもクローニングされたヒトＭａｔｅｒ ｃＤＮＡを鋳型として用い、インビトロ転写により合成した。ヒト卵巣凍結切片を放射標識したセンスプローブ（図７Ａおよび図７Ｃ）およびアンチセンスプローブ（図７Ｂおよび図７Ｄ）とハイブリダイズした。スライドはヘマトキシンおよびエオシンにより染色した。各々のプローブにつき、明視野画像（図７Ａおよび図７Ｂ）および暗視野画像（図７Ｃおよび図７Ｄ）が示される。
【図８】ヒトＭＡＴＥＲタンパク質の卵母細胞特異的な発現を示す一対のデジタル化顕微鏡写真である。ヒト卵巣凍結切片を、マウスＭＡＴＥＲタンパク質のＣ末端ぺプチドに対するウサギ抗血清（２００分の１）とインキュベートし、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清を二次抗体として用いて、卵母細胞のヒトＭＡＴＥＲタンパク質を検出した（図８Ａ）。対応する位相差画像を図８Ｂに示す。
【図９】ヒトＭＡＴＥＲタンパク質（配列番号：２４）およびマウスＭＡＴＥＲタンパク質（配列番号：６）のアミノ酸配列のアラインメントである。同一アミノ酸が同定され、類似アミノ酸はプラス（＋）記号で示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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