(57)【要約】本発明は、修飾されたパントテネート生合成酵素活性を有し、かつ修飾されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素活性とを有する微生物を利用して、パントエートとパントテネートの産生を増強するための改良法を特徴とする。特に本発明は、その合成に寄与する酵素により、主要な中間体であるケトパントエートのレベルを上昇させることにより、所望の生成物の産生を増強する方法を特徴とする。組換え微生物とこれを培養する条件も特徴である。また、このような微生物により産生される組成物も特徴である。
2004533213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路を有する微生物を、パントテネート産生が増強されるような条件下で培養することを含む、パントテネートの産生増強法。
【請求項２】
パントテネートの産生増強法であって、
（ｉ）制御解除されたパントテネート生合成経路、と
（ii）制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路
とを有する微生物を、パントテネート産生が増強されるように条件下で培養することを含む、上記方法。
【請求項３】
微生物が、制御解除された少なくとも２つのパントテネート生合成酵素を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物が、制御解除された少なくとも３つのパントテネート生合成酵素を有する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
微生物が、制御解除された少なくとも４つのパントテネート生合成酵素を有する、請求項２記載の方法。
【請求項６】
微生物が、制御解除されたケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、制御解除されたケトパントエート還元酵素、制御解除されたパントテネートシンセターゼ、および制御解除されたアスパルテート-α-脱炭酸酵素を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
微生物が、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路をさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
微生物が、制御解除された少なくとも２つのイソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
微生物が、制御解除された少なくとも３つのイソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素を有する、請求項７の方法。
【請求項１０】
微生物が、制御解除されたアセトヒドロキシ酸酸性シンセターゼ、制御解除されたアセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素、および制御解除されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼを有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
微生物が、制御解除された少なくとも１つのMTF生合成酵素を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、制御解除されたglyA遺伝子を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
微生物が、制御解除されたserA遺伝子を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
微生物が、制御解除されたglyA遺伝子と制御解除されたserA遺伝子とを有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
パントテネートの産生が増強されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路、および制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路とを有する微生物を培養することを含む、パントテネート産生増強法。
【請求項１６】
微生物の36時間の培養後に、少なくとも50g/Lのパントテネートが産生されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路、および制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路とを有する微生物を培養することを含む、パントテネート産生法。
【請求項１７】
微生物の36時間の培養後に、少なくとも60g/Lのパントテネートが産生されるように、微生物を培養することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
微生物の36時間の培養後に、少なくとも70g/Lのパントテネートが産生されるように、微生物を培養することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
微生物の48時間の培養後に、少なくとも60g/Lのパントテネートが産生されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路、および制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路とを有する微生物を培養することを含む、パントテネート産生法。
【請求項２０】
微生物の48時間の培養後に、少なくとも70g/Lのパントテネートが産生されるように、微生物を培養することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
微生物の48時間の培養後に、少なくとも80g/Lのパントテネートが産生されるように、微生物を培養することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
パントテネート産生は、パントテネートキナーゼ活性を制御することにより、さらに増強される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
パントテネートキナーゼ活性が低下している、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
CoaAは欠失され、CoaXはダウンレギュレートされている、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
CoaXは欠失され、CoaAはダウンレギュレートされている、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
CoaXとCoaAはダウンレギュレートされている、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
微生物は、過剰セリンの条件下で培養される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
パントテネートが産生されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路を有する微生物を、過剰セリンの条件下で培養することを含む、パントテネート産生法。
【請求項２９】
パントテネート産生が、β-アラニン供給から非依存性であるように、微生物は、制御解除されたパントテネート生合成経路を有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
微生物が、グラム陽性微生物である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
微生物がバチルス（Bacillus）属に属する、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
微生物が枯草菌（Bacillus subtilis）である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法により合成される、生成物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法により産生されるパントテネートを含む組成物。
【請求項３５】
パントテネート組成物の産生増強のための組換え微生物であって、制御解除されたパントテネート生合成経路、および制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路とを有する微生物。
【請求項３６】
パントテネート組成物の産生増強のための組換え微生物であって、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路、および制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）経路とを有する微生物。
【請求項３７】
低下したパントテネートキナーゼ活性をさらに有する、請求項３５または３６に記載の微生物。
【請求項３８】
グラム陽性微生物である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３９】
バチルス（Bacillus）属に属する、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項４０】
枯草菌（Bacillus subtilis）である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、2002年１月11に出願された先の仮特許出願第60/XXX,XXX号、標題「パントテネートの産生増強のための微生物と方法」（係属中）、2001年１月19日に出願された先の仮特許出願第60/263,053号（係属中）、および2001年１月19日に出願された先の仮特許出願第60/262,995号（係属中）の利益を主張する。本発明はまた、2000年９月21日に出願された米国特許出願第09/667,569号（係属中）にも関し、これは、1999年９月21日に出願された米国特許出願第09/400,494号（放棄された）の一部継続出願である。米国特許出願第09/667,569号はまた、2000年６月７日に出願された先の仮特許出願第60/210,072号（失効）、2000年７月28日に出願された仮特許出願第60/221,836号（失効）、および2000年８月24日に出願された仮特許出願第60/227,860号（失効）の利益を主張する。上記で参照した出願のそれぞれの全内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
パントテン酸またはビタミンB5としても知られているパントテネートは、ビタミンのＢ複合体のメンバーであり、家畜やヒトを含む哺乳動物にとって必須の栄養素である（例えば、食品源から、水溶性ビタミン補助食品または食品添加物として）。細胞では、パントテネートは主に、補酵素Ａ（CoA）とアシルキャリアータンパク質（ACP）の生合成に使用される。これらの補酵素は、これらの分子の4'-ホスホパントテイン部分のスルフヒドリル基とチオエステルを形成する、アシル残基の代謝で機能する。これらの補酵素は、すべての細胞で必須であり、細胞代謝の100を超える異なる媒介反応に参加している。
【０００３】
パントテネート（特に、生物活性Ｄ異性体）合成の従来法は、多量の化学物質からの化学合成のために、過剰の基質コストとラセミ体中間体を光学的に分離する必要性が障害になっている。従って、研究者達は最近、パントテネート生合成プロセスで有用な酵素を産生する細菌または微生物系に注目している（細菌はそれ自身がパントテネートを合成することができる）。特に、生物変換プロセスは、パントテン酸の好適な異性体の産生を促進する手段として評価されている。さらに最近、直接微生物合成法が、D-パントテネート産生を促進する手段として評価されている
しかし、改良されたパントテネート産生法、特により多量の所望の生成物を産生するために最適化した微生物法に対する大きなニーズがある。
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
本発明は、例えば、パントテネート産生ための改良法（例えば、微生物合成）に関する。パントテネート産生方法は、関連する出願に記載されており、例えば、パントテネート生合成経路およびイソロイシン−バリン生合成経路の主要な酵素を、過剰発現するように作成した微生物を特徴とする（例えば、図１参照）。標準的発酵法において、＞50g/lのパントテネートを産生することができる株が作成されている（例えば、国際特許公報 WO 01/21772号、および米国特許出願第60/262,995号を参照）。特に、panB、panC、panD、およびpanE1遺伝子の発現を上昇させ、ilvBNCおよびilvD遺伝子の発現を上昇させると、グルコース（ピルビン酸）を商業的に魅力的な量のパントテネートに変換する株が得られる。
【０００５】
例えばパントテネートの産生レベルを増強するために、上記方法に対する種々の改良が開発されている。例えば、米国特許出願第09/667,569号は、修飾された（例えば、欠失されたまたは活性が低下した）パントテネートキナーゼ酵素を有する産生株を記載する。そのような株では、補酵素A（「CoA」）合成のためのパントテネートの使用を減少させることにより、パントテネートレベルは有効に上昇している。米国特許出願第60/262,995号は、種々のパントテネート生合成酵素および／またはイソロイシン−バリン生合成酵素、および／またはその各基質が、HMBPAとして認識される別の生成物を産生するために使用されることを最小にするように作成された、改良されたパントテネート産生株をさらに記載している。
【０００６】
本発明は、パントテネート生合成経路の基質を供給する生合成経路、すなわちメチレンテトラヒドロ葉酸（「MTF」）生合成経路を調節することにより、パントテネート産生をさらに増強する方法を特徴とする。特に、MTF生合成経路を修飾することによりMTFレベルを上昇させると、主要なパントテネート生合成経路中間体であるケトパントエートのレベルが上昇することが、発見されている。次に、上昇したケトパントエートレベルは、適切に作成した株におけるパントテネート産生レベルを有意に上昇させる。要するに、本発明者らは、例えばpanB、panC、panD、panE1、ilvBNC、およびilvD遺伝子を過剰発現するように作成した株により、パント化合物（例えば、パントテネート）の産生における律速段階を同定し、本明細書において、MTF生合成経路の修飾によりこの制限を克服する手段を記載する。
【０００７】
MTF生合成経路を修飾するための少なくとも３つの有効な手段が、本明細書に記載される。１つの態様において、パントテネート産生微生物の培地中のセリンレベルを上昇させると、パント化合物産生が上昇することが証明された。また、3-ホスホグリセレート脱水素酵素（serA遺伝子産物）の合成もしくは活性、またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（glyA遺伝子産物）の合成もしくは活性を上昇させ、こうして適切に作成した微生物中のセリンおよびメチレンテトラヒドロ葉酸生合成を増強させると、パント化合物の産生が上昇することも証明された。
【０００８】
従って、１つの態様において本発明は、修飾されたパントテネート生合成酵素活性および修飾されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素活性を有する微生物を、パントテネート産生が増強されるような条件下で培養することを含む、パントエートとパントテネートの産生増強法を特徴とする。別の態様において本発明は、修飾されたパントテネート生合成酵素活性、修飾されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素、および修飾されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素活性を有する微生物を、パントテネート産生が増強されるような条件下で培養することを含む、パントエートとパントテネートの増強された産生増強法を特徴とする。特に本発明は、その合成に寄与する酵素により、主要な中間体であるケトパントエートのレベルを上昇させることにより、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生を増強する方法を特徴とする。好適な方法は、微生物の36時間の培養後に、50、60、70g/Lもしくはそれ以上のレベルのパントテネート、または微生物の36時間の培養後に、少なくとも60、70、80、90g/Lもしくはそれ以上のレベルのパントテネートが産生されるような、方法である。組換え微生物およびこれを培養する条件も特徴とされる。また、そのような微生物により産生される組成物も特徴である。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明と請求の範囲から明らかであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、パント化合物（例えば、ケトパントエート、パントエートおよび／またはパントテネート）の改良された産生方法、および該改良法で使用するために作成された株に関する。＞50g/lのパントテネートを産生できる株は、国際特許出願 WO 01/21772号と米国特許出願第60/262,995号に記載のように構築することができる。panB、panC、panD、およびpanE1遺伝子の発現を上昇させることにより、およびilvBNCとilvD遺伝子の発現を上昇させることにより、グルコース（ビルベート）を商業的に魅力的な量のパントテネートに変換する株（例えば、バチルス（Bacillus）株）を設計することができる。
【００１１】
しかし、高レベルのpanB遺伝子産物、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現するように作成された株（例えば、米国特許出願第09/667,569号に記載のPA824、および米国特許出願第60/262,995号に記載のPA668-24）において、パントテネート産生のさらなる上昇のための律速段階は、いまだα-ケトイソバレレート（α-KIV）からケトパントエートへの変換であることが発見された。α-KIVの合成を上昇させる方法は、すでに国際特許出願 WO 01/21772号および米国特許出願第60/262,995号に記載されている。本明細書において我々は、パントテネート産生におけるさらなる上昇は、MTFのレベルまたはMTF合成の速度を上昇させるように設計することにより達成されることを開示する。
【００１２】
従って本発明は、メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路の調節を特徴とする。特に、パント化合物産生微生物中のMTFレベルの上昇は、ケトパントエート産生を増強する有効な手段であり、これが次に、適切に作成した組換え微生物のパントエートおよび／またはパントテネート産生を増強させる。
【００１３】
ケトパントエートヒドロキシメチレントランスフェラーゼは、α-ケトイソバレレート（α-KIV）とMTFからのケトパントエートの産生を触媒する（例えば、図１参照）。特にこの酵素は、ケトパントエートを得るためのMTFからα-KIVへのヒドロキシメチル基の転移を触媒する。α-KIVとMTFの両方ともこの反応の基質であり、その合成を上昇させて、ケトパントエート産生を改良することができる。大腸菌（E. coli）（およびおそらくは、枯草菌（Bacillus subtilis）も）におけるMTF生合成の経路を、図２に概説する。MTFは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするglyA遺伝子により触媒される反応で、テトラヒドロ葉酸とセリンから合成される。MTF合成の改良のために、細胞は基質とglyA遺伝子産物の両方の増加を必要とする。
【００１４】
ある実施形態において本発明は、（ｉ）制御解除されたパントテネート生合成経路（例えば、制御解除された１、２、３または４つのパントテネート生合成酵素を有する）、および（ii）制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路（例えば、制御解除された少なくとも１つまたは２つのMTF生合成酵素を有する）とを有する微生物を、パントテネート産生が増強される条件下で培養することを含む、パントテネートの産生増強法を特徴とする。パントテネート生合成酵素の例には、ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ケトパントエート還元酵素、パントテネートシンセターゼ、およびアスパルテート−α-脱炭酸酵素がある。またMTF生合成酵素の例には、serA遺伝子産物およびglyA遺伝子産物がある。
【００１５】
別の実施形態において本発明は、（ｉ）制御解除されたパントテネート生合成経路（例えば、制御解除された１、２、３または４つのパントテネート生合成酵素を有する）、（ii）制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路（例えば、制御解除された１、２または３つのilv生合成酵素）、および（iii）制御解除されたMTF生合成経路（例えば、制御解除された少なくとも１つまたは２つのMTF生合成酵素を有する）とを有する微生物を、パントテネート産生が増強される条件下で培養することを含む、パントテネートの産生増強法を特徴とする。ilv生合成酵素の例には、アセトヒドロキシ酸酸性シンセターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼがある。
【００１６】
別の実施形態において本発明は、微生物を36時間培養後に少なくとも50g/Lのパントテネートが産生されるように、好ましくは微生物を36時間培養後に少なくとも60g/Lのパントテネートが産生されるように、およびさらに好ましくは微生物を36時間培養後に少なくとも70g/Lのパントテネートが産生されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたilv生合成経路、および制御解除されたMTF生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生法を特徴とする。
【００１７】
別の実施形態において本発明は、微生物を48時間培養後に少なくとも60g/Lのパントテネートが産生されるように、好ましくは微生物を48時間培養後に少なくとも70g/Lのパントテネートが産生されるように、およびさらに好ましくは微生物を48時間培養後に少なくとも80g/Lのパントテネートが産生されるように、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたilv生合成経路、および制御解除されたMTF生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生法を特徴とする。
【００１８】
本発明はさらに、パントテネートキナーゼ活性を制御することにより、パントテネート産生がさらに増強される（例えば、パントテネートキナーゼ活性が低下する場合）、上記方法を特徴とする。ある実施形態において、CoaAは欠失され、CoaXはダウンレギュレートされる。別の実施形態において、CoaXは欠失され、CoaAはダウンレギュレートされる。さらに別の実施形態において、CoaXとCoaAはダウンレギュレートされる。本発明はさらに、微生物が過剰のセリン条件下で培養される、上記方法を特徴とする。本発明はさらに、パントテネート産生がβ-アラニン供給に非依存性であるように、微生物が、制御解除されたパントテネート生合成経路を有する、上記方法を特徴とする。
【００１９】
本発明の方法により合成される生成物もまた特徴であり、該方法により産生されるパントテネートを含む組成物も特徴である。本発明の方法で使用される組換え微生物もまた特徴である。ある実施形態において本発明は、制御解除されたパントテネート生合成経路と制御解除されたMTF生合成経路とを有する、パントテネートの産生増強のための組換え微生物を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除されたパントテネート生合成経路、制御解除されたMTF生合成経路、および制御解除されたilv経路とを有する、パントテネートの産生増強のための組換え微生物を特徴とする。微生物はさらに、低下したパントテネートキナーゼ活性を有することができる。好適な微生物は、バチルス（Bacillus）属に属するものであり、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）である。
【００２０】
上記したように、本発明のいくつかの態様は、少なくとも制御解除されたパントテネート生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パント化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生増強のための方法を特徴とする。「パントテネート生合成経路」という用語は、パントテネートの生成または生合成で利用される、パントテネート生合成酵素（例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、基質、中間体または生成物）、補助因子などを含む生合成経路を含む。「パントテネート生合成経路」という用語は、微生物中のパントテネートの合成に至る生合成経路、ならびにインビトロのパントテネートの合成に至る生合成経路を含む。
【００２１】
本明細書において、「制御解除されたパントテネート生合成経路を有する」微生物は、パントテネート産生が増強される（例えば、該生合成酵素の制御解除前の該微生物中のパントテネート産生と比較して、または野生型微生物と比較して）ように、制御解除された（例えば、過剰発現された）（両方の用語が本明細書において規定される）少なくとも１つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を含む。「パントテネート」という用語は、パントテネートの遊離の酸の形（パントテン酸と呼ぶ）およびその任意の塩を含む（例えば、パントテネートまたはパントテン酸の酸性水素を、陽イオン、例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウムで置換することにより得られる）（パントテンネートとも呼ぶ）を含む。「パントテネート」という用語はまた、パントテネートのアルコール誘導体を含む。好適なパントテネートは、カルシウムパントテネートまたはナトリウムパントテネートである。好適なアルコール誘導体は、パントテノールである。本発明のパントテネートおよび／またはアルコールは、従来法を使用して本明細書に記載の遊離の酸から調製される塩および／またはアルコールを含む。ある実施形態において、パントテネートは、本発明の微生物により直接合成される。本発明のパントテネートは、同様に、従来法によりパントテネートまたはパントテン酸の遊離の酸の形に変換することができる。「パントテネート」という用語はまた、本明細書において「Pan」とも略される。
【００２２】
好ましくは、「制御解除されたパントテネート生合成経路を有する」微生物は、パントテネート産生が１g/L以上であるように、少なくとも１つの制御解除された（例えば、過剰発現された）パントテネート生合成酵素を有する微生物を含む。さらに好ましくは、「制御解除されたパントテネート生合成経路を有する」微生物は、パントテネート産生が２g/L以上であるように、少なくとも１つの制御解除された（例えば、過剰発現された）パントテネート生合成酵素を有する微生物を含む。さらにより好ましくは、パントテネート産生が、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/Lまたはそれ以上であるように、「制御解除されたパントテネート生合成経路を有する」微生物は、制御解除（例えば、過剰発現）された少なくとも１つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を含む。
【００２３】
「パントテネート生合成酵素」は、パントテネート生合成経路の化合物（例えば、中間体または生成物）の生成に使用される任意の酵素を含む。例えば、α-ケトイソバレレート（α-KIV）からのパントエートの合成は、中間体であるケトパントエートを経由して進む。ケトパントエートの生成は、パントテネート生合成酵素PanBまたはケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（panB遺伝子産物）により触媒される。パントエートの生成は、パントテネート生合成酵素PanE1またはケトパントエート還元酵素（panE1遺伝子産物）により触媒される。アスパラギン酸からのβ-アラニンの合成は、パントテネート生合成酵素PanDまたはアスパルテート-α-脱炭酸酵素（panD遺伝子産物）により触媒される。パントエートとβ-アラニンからのパントテネートの生成（例えば、縮合）は、パントテネート生合成酵素PanCまたはパントテネートシンセターゼ（panC遺伝子産物）により触媒される。パントテネート生合成酵素はまた、本明細書に記載のHMBPA生合成経路中の酵素としての代替機能を果たす。
【００２４】
従って、ある態様において本発明は、制御解除された（例えば、パントテネート産生が増強されるように、制御解除された）少なくとも１つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該酵素は、例えばPanB（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、PanC（またはパントテネートシンセターゼ）、PanD（またはアスパルテート-α-脱炭酸酵素）、PanE1（またはケトパントエート還元酵素）よりなる群から選択される方法を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除された少なくとも２つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該酵素は、例えばPanB（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、PanC（またはパントテネートシンセターゼ）、PanD（またはアスパルテート-α-脱炭酸酵素）、およびPanE1（またはケトパントエート還元酵素）よりなる群から選択される方法を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除された少なくとも３つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該酵素は、例えばPanB（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、PanC（またはパントテネートシンセターゼ）、PanD（またはアスパルテート-α-脱炭酸酵素）、およびPanE1（またはケトパントエート還元酵素）よりなる群から選択される方法を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除された少なくとも４つのパントテネート生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、微生物は、例えば制御解除されたPanB（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）、PanC（またはパントテネートシンセターゼ）、PanD（またはアスパルテート-α-脱炭酸酵素）、およびPanE1（またはケトパントエート還元酵素）を有する方法を特徴とする。
【００２５】
別の態様において本発明は、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法を特徴とする。「イソロイシン−バリン（ilv）生合成経路」という用語は、ビルベートからバリンまたはイソロイシンへの変換の生成または合成で利用される、イソロイシン−バリン生合成酵素（例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、基質、中間体または生成物）、補助因子などが関与する生合成経路を含む。「イソロイシン−バリン生合成経路」という用語は、微生物（例えば、in vivo）中のバリンまたはイソロイシンの合成に至る生合成経路、ならびにin vitroでバリンまたはイソロイシンの合成に至る生合成経路を含む。
【００２６】
本明細書において、「制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）経路を有する」微生物は、イソロイシンおよび／またはバリンおよび／またはバリン前駆体であるα-ケトイソバレレート（α-KIV）の産生が増強される（例えば、該生合成酵素の制御解除前の該微生物中のイソロイシンおよび／またはバリンおよび／またはα-KIVと比較して、または野生型微生物と比較して）ように、制御解除された（例えば、過剰発現された）（両方の用語が本明細書において規定される）少なくとも１つのイソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素を有する微生物を含む。図１は、イソロイシン−バリン生合成経路の略図を含む。イソロイシン−バリン生合成酵素は、太字の斜体で示し、その対応する遺伝子は斜体で示す。「イソロイシン−バリン生合成酵素」という用語は、イソロイシン−バリン生合成経路の化合物（例えば、中間体または生成物）の生成に使用される任意の酵素を含む。図１において、ビルベートからのバリンの合成は、中間体であるアセトラクテート、α,β-ジヒドロキシイソバレレート（α,β-DHIV）およびα-ケトイソバレレート（α-KIV）を経由して進む。ビルベートからのアセトラクテートの生成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸シンセターゼ（ilvBN遺伝子産物、またはalsS遺伝子産物）により触媒される。アセトラクテートからのα,β-DHIVの生成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるアセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素（ilvC遺伝子産物）により触媒される。α,β-DHIVからのα-KIVの合成は、イソロイシン−バリン生合成酵素であるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD遺伝子産物）により触媒される。さらに、バリンとイソロイシンは、分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ により、それぞれα-ケト化合物を用いて相互に変換することができる。イソロイシン−バリン生合成酵素はまた、本明細書に記載のHMBPA生合成経路における酵素としての代替機能を果たす。
【００２７】
従って、ある実施形態において本発明は、制御解除された（例えば、バリンおよび／またはイソロイシンおよび／またはα-KIV産生が増強されるように、制御解除された）少なくとも１つのイソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該酵素は、例えばIlvBN、AlsS（またはアセトヒドロキシ酸シンセターゼ）、IlvC（またはアセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素）およびIlvD（またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）よりなる群から選択される方法を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除された少なくとも２つのイソロイシン−バリン生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該酵素は、例えばIlvBN、AlsS（またはアセトヒドロキシ酸シンセターゼ）、IlvC（またはアセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素）およびIlvD（またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）よりなる群から選択される方法を特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除された少なくとも３つのイソロイシン−バリン生合成酵素を有する微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法であって、該微生物は、例えば制御解除されたIlvBN、AlsS（またはアセトヒドロキシ酸シンセターゼ）、IlvC（またはアセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素）およびIlvD（またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）を有する方法を特徴とする。
【００２８】
本明細書に記載のように、パントテネート生合成経路および／またはイソロイシン−バリン（ilv）経路の酵素は、[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸（「HMBPA」）の合成において、または[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸（「HMBPA」）生合成経路において、代替活性を有することが発見されている。「[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸（「HMBPA」）生合成経路」という用語は、HMBPAの生成または合成に利用されるパントテネート生合成経路および／またはイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路に、伝統的に関連する生合成酵素と化合物（例えば、基質など）が関与する代替生合成経路を含む。「HMBPA生合成経路」という用語は、微生物（例えば、in vivo）のHMBPAの合成に至る生合成経路、ならびにin vitroのHMBPAの合成に至る生合成経路を含む。
【００２９】
「HMBPA生合成酵素」という用語は、HMBPA生合成経路の化合物（例えば、中間体または生成物）の生成に利用される任意の酵素を含む。例えば、α-ケトイソバレレート（α-KIV）からの2-ヒドロキシイソ吉草酸（α-HIV）の合成は、panE1またはpanE2遺伝子産物（PanE1は、本明細書においてケトパントイン酸還元酵素とも呼ぶ）により触媒され、および／またはilvC遺伝子産物（本明細書において、アセトヒドロキシ酸イソメロ還元酵素とも呼ぶ）により触媒される。β-アラニンとα-HIVからのHMBPAの生成は、panC遺伝子産物（本明細書において、パントテネートシンセターゼとも呼ぶ）により触媒される。
【００３０】
「[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸（「HMBPA」）」という用語は、HMBPAの遊離の酸（[R]-3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオネートとも呼ぶ）ならびにその任意の塩（例えば、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸または3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオネートの酸性水素を、陽イオン、例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウムで置換することにより得られる）（「3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオネート」または「HMBPA塩」とも呼ぶ）を含む。好適なHMBPA塩は、HMBPAカルシウムまたはHMBPAナトリウムである。本発明のHMBPA塩は、本明細書に記載の遊離の酸から従来法により調製される塩を含む。本発明のHMBPA塩は同様に、従来法により、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸または3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオネートから、遊離の酸に変換することができる。
【００３１】
好適な実施形態において本発明は、制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路を有する微生物を培養することを含む、パント化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生増強法を特徴とする。「メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路」という用語は、PanB基質であるMTFの生成または合成に使用される、MTF生合成酵素（例えば、生合成酵素をコードする遺伝子によりコードされるポリペプチド）、化合物（例えば、基質、中間体または生成物）、補助因子などを含む生合成経路を意味する。「メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路」という用語は、in vivo（例えば、図２に記載のように大腸菌（E. coli）中の経路）でのMTFの合成に至る生合成経路、ならびにin vitroでのMTFの合成に至る生合成経路を意味する。「メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素」という用語は、メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路の化合物（例えば、中間体または生成物）の生成に使用される任意の酵素を含む。
【００３２】
本発明は、少なくとも一部は、いくつかのMTF生合成酵素の制御解除により、MTFの産生が増強されるという発見に基づく。その制御解除によりMTF産生が増強されるMTF生合成酵素は、「MTF生合成増強酵素」と呼ばれる。「MTF生合成増強酵素」の例は、serA遺伝子産物（3-ホスホグリセレート脱水素酵素）およびglyA遺伝子産物（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）である。「制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路を有する」微生物は、MTF産生または生合成が増強される（例えば、該生合成酵素の制御解除の前の該微生物中のMTF産生と比較して、または野生型微生物と比較して）ように、制御解除された（例えば、過剰発現された）少なくとも１つのMTF生合成増強酵素を有する微生物である。
【００３３】
ある実施形態において本発明は、本明細書に記載のように、制御解除された「メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路」を有する微生物を培養することを含む、パント化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生増強法と特徴とする。別の実施形態において本発明は、制御解除されたMTF生合成増強酵素を有する微生物を培養することを含む、パント化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生増強法と特徴とする。好適な実施形態において本発明は、制御解除されたglyA遺伝子産物（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）および／または制御解除されたserA遺伝子産物（3-ホスホブリセレート脱水素酵素）を有する微生物を培養することを含む、パント化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生増強法と特徴とする。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、例えば培地中の過剰のセリン（glyA基質）で微生物を培養することにより、パントテネート産生を促進するように選択された培養条件下で微生物を培養することを含む、パントテネートの産生増強法を特徴とする。「過剰のセリン」という用語は、問題の微生物を培養するのにルーチンに使用されるものより上昇しているかまたは高いセリンレベルを含む。例えば、本明細書の実施例に記載のバチルス（Bacillus）微生物は、約０〜2.5g/Lセリンの存在下でルーチンに行われる。従って、過剰のセリンレベルは、2.5g/Lセリンより高いレベル、例えば、2.5〜10g/Lセリンを含むことができる。過剰のセリンレベルは、５g/Lを超えるセリンレベル、例えば約５〜10g/Lセリンを含むことができる。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態は、例えば本明細書に記載のように、パントテネートおよび／またはイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路前駆体および／または中間体を上昇させる（例えば、過剰のβ-アラニン、バリンおよび／またはα-KIVの存在下で微生物を培養する）ことにより、またはβ-アラニン供給の非存在下で、有意なレベルのβ-アラニンを産生することができるように、微生物（すなわち、β-アラニン非依存性の微生物、米国特許出願第09/09/667,569号に記載されている）をさらに修飾することにより、パントテネート産生がさらに上昇するような条件下で、本明細書に記載の微生物を培養することを特徴とする。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、パントテネート産生が増強されるように、パントテネート産生株中のパントテネートキナーゼ活性をさらに制御することを特徴とする。パントテネートキナーゼは、パントテネートからの補酵素A（CoA）の生成を触媒する主要な酵素（米国特許出願第09/09/667,569号を参照）である。パントテネートキナーゼの制御（例えば、パントテネートキナーゼの活性またはレベルを低下させる）は、CoAの産生を低下させ、パントテネート蓄積を促進する。ある実施形態において、パントテネートキナーゼ活性は、CoaAを欠失しCoaX活性をダウンレギュレート（CoaAとCoaXは、いくつかの微生物でCoA生合成の最初の工程を触媒することができる）することにより低下する。別の実施形態において、パントテネートキナーゼ活性は、CoaXを欠失しCoaAをダウンレギュレートすることにより低下する。さらに別の実施形態において、パントテネートキナーゼ活性は、CoaAとCoaX活性をダウンレギュレートすることにより低下する。
【００３７】
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
【００３８】
I.  種々のパントテネートおよび／またはイソロイシン−バリン（ilv）および／またはメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素をコードする遺伝子のターゲティング
ある実施形態において本発明は、パントテネートおよび／またはイソロイシン−バリン（ilv）および／またはメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路の種々の生合成酵素のレベルを修飾または上昇させることを特徴とする。特に本発明は、該生合成酵素をコードする遺伝子を修飾または改変することにより、該経路に関連する種々の酵素活性を修飾することを特徴とする。
【００３９】
「遺伝子」という用語は本明細書において、生物中で、他の遺伝子から、遺伝子内DNA（例えば、生物の染色体DNA中の遺伝子に天然にフランキングするかおよび／または遺伝子を分離する介在またはスペースDNA）により分離することができる核酸分子（例えば、DNA分子またはそのセグメント）を含む。あるいは、遺伝子は、他の遺伝子とわずかに重複（例えば、第２の遺伝子の5'末端と重複する第１の遺伝子の3'末端）してよく、重複遺伝子は、遺伝子内DNAにより他の遺伝子から分離される。遺伝子は、酵素または他のタンパク質分子の合成を指令する（例えば、コード配列、例えばタンパク質をコードする連続的読みとり枠（ORF）を含む）か、またはそれ自体が生物中で機能性でもよい。生物中の遺伝子は、本明細書で定義されるように、オペロン中で集まっており、オペロンは、遺伝子間DNAにより、他の分子および／またはオペロンから分離している。本明細書において「単離された遺伝子」は、そこから遺伝子が得られる生物の染色体DNA中の遺伝子に天然にフランキングする配列を実質的に含まない遺伝子（すなわち、第２のまたは顕著なタンパク質、隣接構造配列などをコードする配列を含まない）を含み、5'および3'制御配列（例えば、プロモーター配列および／またはターミネーター配列）を随時含む。ある実施形態において、単離された遺伝子は、主にタンパク質のコード配列を含む（例えば、バチルス（Bacillus）タンパク質をコードする配列）。別の実施形態において、単離された遺伝子は、タンパク質（例えば、バチルス（Bacillus）タンパク質）のコード配列、および遺伝子が得られる生物の染色体DNAからの隣接5'および3'制御配列（例えば、隣接5'および／または3'バチルス（Bacillus）制御配列）を含む。好ましくは、単離された遺伝子は、遺伝子が得られる生物の染色体DNA中の、遺伝子に天然にフランキングする約10kb、5kb、2kb、1kb、0.5kb、0.2kb、0.1kb未満の50bp、25bpまたは10bpのヌクレオチド配列を含有する。
【００４０】
「オペロン」という用語は、少なくとも１つの遺伝子またはORFの5'末端または3'末端のいずれかの配列が随時重複している、少なくとも２つの隣接遺伝子またはORFを含む。「オペロン」という用語は、１つ以上の隣接遺伝子またはORFと結合した、プロモーターおよび制御要素（例えば、酵素、例えば生合成酵素をコードする構造遺伝子）を含有する遺伝子発現の統合されたユニットを含む。遺伝子（例えば、構造遺伝子）の発現は、制御要素に結合する制御タンパク質により、または転写の抗停止により、統合的に制御することができる。オペロンの遺伝子（例えば、構造遺伝子）は転写されて、タンパク質のすべてをコードする単一のmRNAを与えることができる。
【００４１】
本明細書において「変異を有する遺伝子」または「変異遺伝子」は、該変異体によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質が、野生型の核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質とは異なる活性を示すように、少なくとも１つの変化（例えば、置換、挿入、欠失）を含むヌクレオチド配列を有する遺伝子を含む。ある実施形態において、変異を有する遺伝子または変異遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質と比較して、例えば同様の条件（例えば、同じ温度で培養した微生物で測定）下で、上昇した活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする。本明細書において「上昇した活性」または「上昇した酵素活性」は、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質より少なくとも５％大きく、好ましくは野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質より少なくとも５〜10％大きく、さらに好ましくは少なくとも10〜25％大きく、そしてさらに好ましくは少なくとも25〜50％、50〜75％、または75〜100％大きいものである。上記の値の中間の範囲、例えば75〜85％、85〜90％、90〜95％もまた、本発明に包含される。本明細書において、「上昇した活性」または「上昇した酵素活性」はまた、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性より、少なくとも1.25倍大きく、好ましくは、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性より、少なくとも1.5倍大きく、さらに好ましくは少なくとも２倍大きく、そしてさらに好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、10倍、20倍、50倍、100倍大きい。
【００４２】
別の実施形態において、変異を有する遺伝子または変異遺伝子は、変異を有する遺伝子または変異遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質と比較して、例えば同様の条件（例えば、同じ温度で培養した微生物で測定）下で、低下した活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする。変異遺伝子はまた、ポリペプチドをコードしないか、または野生型ポリペプチドの産生レベルが低下している。本明細書において「低下した活性」または「低下した酵素活性」は、野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質より、少なくとも５％小さく、好ましくは野生型核酸分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質より少なくとも５〜10％小さく、さらに好ましくは少なくとも10〜25％小さく、そしてさらに好ましくは少なくとも25〜50％、50〜75％、または75〜100％小さいものである。上記の値の中間の範囲、例えば75〜85％、85〜90％、90〜95％もまた、本発明に包含される。本明細書において、「低下した活性」または「低下した酵素活性」はまた、欠失されたかまたは「ノックアウトされた」活性を含む（例えば、野生型分子または遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性より、約100％小さい）。
【００４３】
活性は、目的の特定のタンパク質の活性を測定するための、充分に受け入れられているアッセイに従って測定することができる。活性は直接測定またはアッセイすることができ、例えば粗細胞抽出物中の、または細胞もしくは微生物から単離または精製されたタンパク質の活性を測定する。あるいは活性は、細胞または微生物内または細胞外媒体中で測定またはアッセイすることができる。例えば、変異遺伝子（すなわち、低下した酵素活性をコードする該変異体）についてのアッセイは、微生物（例えば、酵素が温度感受性である変異体微生物）中で変異遺伝子を発現させ、酵素活性についての温度感受性（Ts）変異体を補足する能力について測定することにより、行われる。「上昇した酵素活性」をコードする変異遺伝子は、例えば対応する野生型より有効に、Ts変異体を補足するものでもよい。「低下した酵素活性」をコードする変異遺伝子は、例えば対応する野生型より低い有効性で、Ts変異体を補足するものである。
【００４４】
核酸または遺伝子配列中の単一の置換（例えば、対応するアミノ酸配列中のアミノ酸変化をコードする塩基置換）であっても、対応する野生型ポリペプチドまたはタンパク質と比較して、コードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性に大きな影響を与えることは、当業者により理解されるであろう。本明細書に記載の変異遺伝子（例えば、変異体ポリペプチドまたはタンパク質をコードする）は、変異遺伝子は、野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、該変異遺伝子を発現するかまたは該変異タンパク質またはポリペプチドを産生する微生物（すなわち、変異微生物）中で、異なるまたは明確な表現型として随時観察される、変化した活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする点で、タンパク質同族体をコードする核酸または遺伝子から容易に区別できる。これに対して、タンパク質同族体は、野生型遺伝子を発現する対応する微生物と比較して、微生物中で産生される時、随時表現型が区別できない、同一または実質的に同様の活性を有する。従って、同族体と変異体との区別に役立つのは、核酸分子、遺伝子、タンパク質またはポリペプチドの間の配列同一性の程度ではなく、同族体と変異体とを区別するのは、コードされるタンパク質またはポリペプチドの活性である（例えば、低い（例えば、30〜50％の）配列同一性を有する同族体が、実質的に同等の機能活性を有し、例えば99％の配列同一性を共有する変異体が、大きく異なるまたは変化した機能活性を有する）。
【００４５】
本発明で使用される核酸分子、遺伝子、タンパク質またはポリペプチドは、MTF生合成経路、ilv生合成経路、またはパントテネート生合成経路を有する任意の微生物から得ることができることも、当業者により理解されるであろう。このような核酸分子、遺伝子、タンパク質またはポリペプチドは、相同性スクリーニング、配列比較などの公知の技術を使用して、当業者が同定することができ、これらの核酸分子、遺伝子、タンパク質またはポリペプチドの発現または産生が、組換え微生物中で起きるように、（例えば、適切なプロモーター、リボゾーム結合部位、発現ベクターまたは組み込みベクターを使用して、転写が上昇するように遺伝子の配列を修飾（好ましいコドン使用を考慮して）することにより、本明細書に記載のかつ当業者に公知の方法に従って）当業者が修飾することができる。
【００４６】
ある実施形態において本発明の遺伝子は、グラム陽性微生物（例えば、微生物の周りのグラム陽性壁の存在により、塩基性色素（例えば、クリスタルバイオレット）を有する微生物）から誘導される。「から誘導される」という用語（例えば、グラム陽性微生物「から誘導される」）は、微生物中に天然に存在する遺伝子を意味する（例えば、グラム陽性微生物中に天然に存在する）。好適な実施形態において、本発明の遺伝子は、バチルス（Bacillus）、コリネバクテリウム（Corrynebacterium）（コリネバクテリウム・グルタミクム（Corrynebacterium glutamicum）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococci）およびストレプトミセス（Streptomyces）よりなる群から選択される属に属する微生物から誘導される。より好適な実施形態において、微生物から誘導される本発明の遺伝子は、バチルス（Bacillus）属のものである。他の好適な実施形態において、本発明の遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・レンチモルブス（Bacillus lentimorbus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・パントテンチクス（Bacillus pantothenticus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ツリギエンシス（Bacillus thurigiensis）、バチルス・ハロズランス（Bacillus halodurans）、および他の第１群バチルス（Bacillus）種（例えば、16D rRNA型を特徴とする）よりなる群から選択される微生物から誘導される。別の好適な実施形態において、遺伝子は、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）またはバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）から誘導される。別の好適な実施形態において、本発明の遺伝子は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）よりなる群から選択される微生物から誘導される。特に好適な実施形態において、遺伝子は、枯草菌（Bacillus subtilis）から誘導される（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）由来である）。「枯草菌（Bacillus subtilis）から誘導される」または「枯草菌（Bacillus subtilis）由来」という用語は、微生物枯草菌（Bacillus subtilis）中に天然に存在する遺伝子を含む。本発明の範囲には、バチルス（Bacillus）由来遺伝子（例えば、枯草菌（B. subtilis）由来遺伝子）、例えばバチルス（Bacillus）または枯草菌（B. subtilis）coaX遺伝子、serA遺伝子、glyA遺伝子、coaA遺伝子、pan遺伝子、および／またはilv遺伝子が含まれる。
【００４７】
別の実施形態において本発明の遺伝子は、グラム陰性（塩基性色素を排除）微生物から誘導される。好適な実施形態において本発明の遺伝子は、サルモネラ（Salmonella）（例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium））、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia）およびプロテウス（Proteus）よりなる群から選択される属に属する微生物から誘導される。より好適な実施形態において本発明の遺伝子は、エシェリキア（Escherichia）属の微生物から誘導される。さらに好適な実施形態において本発明の遺伝子は、大腸菌（Escherichia coli）から誘導される。別の実施形態において本発明の遺伝子は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae））から誘導される。
【００４８】
II.  組換え核酸分子とベクター
本発明は、本明細書に記載の遺伝子（例えば、単離された遺伝子）、好ましくはバチルス（Bacillus）遺伝子、さらに好ましくは枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子、さらに好ましくは枯草菌（Bacillus subtilis）パントテネート生合成遺伝子、および／またはイソロイシン−バリン（ilv）生合成遺伝子、および／またはメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成遺伝子を含む組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）を特徴とする。「組換え核酸分子」という用語は、組換え核酸分子が誘導された（例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換により）未変性のまたは天然の核酸分子からのヌクレオチド配列が異なるように改変、修飾または作成された、核酸分子（例えば、DNA分子）を含む。好ましくは、組換え核酸分子（例えば、組換えDNA分子）は、制御配列に機能できる形で結合した本発明の単離された遺伝子を含む。「制御配列に機能できる形で結合した」という用語は、目的の遺伝子のヌクレオチド配列が、遺伝子の発現（例えば、増強、上昇、構成性、基礎的、減弱、低下、または抑制された発現）、好ましくは遺伝子によりコードされる遺伝子産物の発現（例えば、組換え核酸分子が、本明細書で定義された組換えベクター中に含まれ、微生物に導入される時）、を可能にするように、制御配列に連結したことを意味する。
【００４９】
「制御配列」という用語は、他の核酸配列（すなわち、遺伝子）の発現に影響を与える（例えば、調節または制御）核酸配列を含む。ある実施形態において、制御配列は、天然に出現するように（例えば、未変性の位置および／または配向で）目的の制御配列と遺伝子について観察されるように、特定の目的の遺伝子に対して、同様または同一の位置および／または配向で、組換え核酸分子に含まれる。例えば、目的の遺伝子は、天然の生物中で目的の遺伝子に伴うまたは隣接する制御配列に機能できる形で結合した（例えば、「未変性の」制御配列（例えば、「未変性の」プロモーター）に機能できる形で結合した）組換え核酸分子中に含まれることができる。あるいは、目的の遺伝子は、天然の生物中で別の（例えば、異なる）遺伝子に伴うまたは隣接する制御配列に機能できる形で結合した組換え核酸分子中に含まれることができる。あるいは、目的の遺伝子は、別の生物からの制御配列に機能できる形で結合した組換え核酸分子中に含まれることができる。例えば、他の微生物からの制御配列（例えば、他の細菌制御配列、バクテリオファージ制御配列など）は、目的の特定の遺伝子に機能できる形で結合することができる。
【００５０】
ある実施形態において、制御配列は、未変性ではないまたは天然には存在しない配列である（例えば、化学合成された配列を含む、修飾、変異、置換、誘導体化、欠失を受けた配列）。好適な制御配列は、プロモーター、エンハンサー、停止シグナル、抗停止シグナル、および他の発現制御要素（例えば、レプレッサーまたはインデューサーが結合する配列、および／または、例えば転写されたmRNA中の、転写および／または翻訳制御タンパク質のための結合部位）を含む。このような制御配列は、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E.F., およびManiatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。制御配列には、微生物中のヌクレオチド配列の構成性発現を指令するもの（例えば、構成性プロモーターおよび強い構成性プロモーター）、微生物中のヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、誘導性プロモーター、例えばキシロース誘導性プロモーター）、および微生物中のヌクレオチド配列の発現を弱めるまたは抑制するもの（例えば、減衰シグナル、またはレプレッサー配列）を含む。制御配列を除去または欠失して、目的の遺伝子の発現を制御することもまた、本発明の範囲内である。例えば、転写の陰性制御に関与する配列は、目的の遺伝子の発現が増強されるように、除去することができる。
【００５１】
ある実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、プロモーターまたはプロモーター配列に機能できる形で結合した少なくとも１つの細菌の遺伝子産物をコードする核酸配列または遺伝子（例えば、パントテネート生合成酵素、イソロイシン−バリン生合成酵素および／またはメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成酵素）を含む。本発明の好適なプロモーターは、バチルス（Bacillus）プロモーターおよび／またはバクテリオファージプロモーター（例えば、バチルス（Bacillus）に感染するバクテリオファージ）を含む。ある実施形態において、プロモーターはバチルス（Bacillus）プロモーター、好ましくは強いバチルス（Bacillus）プロモーターである（例えば、バチルス（Bacillus）中の生化学的ハウスキーピング遺伝子に関連するプロモーター、またはバチルス（Bacillus）中の解糖系に関連するプロモーター）。別の実施形態において、プロモーターはバクテリオファージプロモーターである。好適な実施形態において、プロモーターはバクテリオファージSP01由来である。特に好適な実施形態において、プロモーターは、例えば以下の各配列を有するP15、P26またはPvegよりなる群から選択される：
2004533213.tif 000003
追加の好適なプロモーターには、tef（翻訳伸長因子（TEF）プロモーター）とpyc（ビルベートカルボキシラーゼ（PYC）プロモーター）があり、これらは、バチルス（Bacillus）（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis））中での高レベル発現を促進する。例えば、グラム陽性微生物で使用される追加の好適なプロモーターには、特に限定されないが、amyとSPO2プロモーターがある。グラム陰性微生物で使用される追加の好適なプロモーターには、特に限定されないが、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIQ、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRまたはλ-PLがある。
【００５２】
別の実施形態において本発明の組換え核酸分子は、ターミネーター配列（例えば、転写停止配列）を含む。「ターミネーター配列」という用語は、mRNAの転写を終止させるように機能する制御配列を含む。ターミネーター配列（またはタンデム転写ターミネーター）はさらに、例えばヌクレアーゼに対するmRNA（例えば、mRNAに構造を付加する）を安定化させるのに機能する。
【００５３】
さらに別の実施形態において本発明の組換え核酸分子は、配列（すなわち、検出および／または選択マーカー）を含有するベクターの検出を可能にする配列、例えば栄養要求性変異を克服する抗生物質耐性配列をコードする遺伝子、例えば、trpC、薬剤マーカー、蛍光マーカー、および／または比色マーカー（例えば、lacZ／β-ガラクトシダーゼ）、を含む。さらに別の実施形態において、本発明の組換え核酸分子は、人工的リボゾーム結合部位（RBS）または人工的RBS中に転写される配列を含む。「人工的リボゾーム結合部位（RBS）」という用語は、未変性のRBS（例えば、天然に存在する遺伝子中のRBS）とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なる、リボゾームが結合する（例えば、翻訳を開始するために）mRNA分子内の部位を含む。好適な人工的RBSには、約５〜６、７〜８、９〜10、11〜12、13〜14、15〜16、17〜18、19〜20、21〜22、23〜24、25〜26、27〜28、29〜30、またはそれ以上のヌクレオチドを含み、そのうち約１〜２、３〜４、５〜６、７〜８、９〜10、11〜12、13〜15、またはそれ以上は、未変性のRBS（例えば、目的の遺伝子の未変性のRBS、例えば、未変性のPanB RBS  TAAACATGAGGAGGAGAAAACATG（配列番号４）、または未変性のpanD RBS  ATTCGAGAAATGGAGAGAATATAATATG（配列番号５））と異なる。好ましくは、異なるヌクレオチドは、比較のために最適に整列した時、理想的なRBSの１つ以上のヌクレオチドと同一であるように、置換される。理想的なRBSは、特に限定されないが、
AGAAAGGAGGTGA（配列番号６）、
TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG（配列番号７）
TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG（配列番号８）、
AGAAAGGAGGTGANNNNNNNATG（配列番号９）、および
AGAAAGGAGGTGANNNNNNATG（配列番号10）を含む。人工的RBSは、特定の遺伝子に関連する天然に存在するまたは未変性のRBSを置換するのに使用することができる。人工的RBSは、好ましくは特定の遺伝子の翻訳を上昇させる。好適な人工的RBS（例えば、PanB、例えば枯草菌（B. subtilis）PanBの翻訳を上昇させるRBS）は、CCCTCTAGAAGGAGGAGAAAACATG（配列番号11）およびCCCTCTAGAGGAGGAGAAAACATG（配列番号12）を含む。好適な人工的RBS（例えば、PanD、例えば枯草菌（B. subtilis）PanDの翻訳を上昇させるRBS）は、
TTAGAAAGGAGGATTTAAATATG（配列番号13）、
TTAGAAAGGAGGTTTAATTAATG（配列番号14）、
TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG（配列番号15）、
TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG（配列番号16）、
ATTCGAGAAAGGAGGTGAATATAATATG（配列番号17）、
ATTCGAGAAAGGAGGTGAATAATAATG（配列番号18）、および
ATTCGTAGAAAGGAGGTGAATTAATATG（配列番号19）を含む。
【００５４】
本発明はさらに、本明細書に記載の核酸分子（例えば、遺伝子、または該遺伝子を含む組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えベクター）を特徴とする。「組換えベクター」という用語は、該組換えベクターが誘導される未変性のまたは天然の核酸分子中に含まれるものより、多い、少ないまたは異なる核酸配列を含有するように、改変、修飾、または操作されているベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、または他の精製核酸ベクター）を含む。好ましくは、組換えベクターは、本明細書に記載のように、制御配列、例えばプロモーター配列、ターミネーター配列および／または人工的リボゾーム結合部位（RBS）に機能できる形で結合した、生合成酵素コード遺伝子または該遺伝子を含む組換え核酸分子を含む。別の実施形態において本発明の組換えベクターは、細菌中の複製を増強する配列（例えば、複製増強配列）を含む。ある実施形態において、複製増強配列は大腸菌（E. coli）中で機能する。別の実施形態において、複製増強配列は、pBR322から誘導される。
【００５５】
さらに別の実施形態において本発明の組換えベクターは、抗生物質耐性配列を含む。「抗生物質耐性配列」は、宿主生物（例えば、バチルス（Bacillus））上の抗生物質に対して耐性を促進または付与する配列を含む。ある実施形態において、抗生物質耐性配列は、cat（クロラムフェニコール耐性）配列、tet（テトラサイクリン耐性）配列、erm（エリスロマイシン耐性）配列、neo（ネオマイシン耐性）配列、kan（カナマイシン耐性）配列、およびspec（スペクチノマイシン耐性）配列よりなる群から選択される。本発明の組換えベクターはさらに、相同的組換え配列を含む（例えば、宿主生物の染色体中への目的の遺伝子の組換えを可能にするように設計された配列）。例えば、bpr、vpr、またはamyE配列は、宿主染色体への組換えのための相同性標的として使用することができる。さらに当業者は、ベクターの設計は、遺伝子操作する微生物の選択、所望の遺伝子産物の発現レベルなどの要因に依存して、行うことができることを理解するであろう。
【００５６】
IV. 組換え微生物
本発明はさらに、本明細書に記載のようにベクターまたは遺伝子（例えば、野生型および／または変異遺伝子）を含む微生物、すなわち組換え微生物を特徴とする。本明細書において「組換え微生物」という用語は、それが誘導される天然に存在する微生物と比較して、改変、修飾または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子修飾は、微生物のコード核酸配列に影響を与える）を示すように、遺伝的に改変、修飾または操作（例えば、遺伝子操作）された微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞など）を含む。
【００５７】
ある実施形態において本発明の組換え微生物は、グラム陽性菌（例えば、微生物の周りのグラム陽性壁の存在により、塩基性色素（例えば、クリスタルバイオレット）を有する微生物）である。好適な実施形態において、各微生物は、バチルス（Bacillus）、コリネバクテリウム（Corrynebacterium）（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corrynebacterium glutamicum））、ラクトバチルス（Lactobacillus）、コクトコッカス（Lactococci）およびストレプトミセス（Streptomyces）よりなる群から選択される属に属する微生物である。より好適な実施形態において、組換え微生物は、バチルス（Bacillus）属のものである。他の好適な実施形態において、組換え微生物は、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・レンチモルブス（Bacillus lentimorbus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・パントテンチクス（Bacillus pantothenticus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ツリギエンシス（Bacillus thurigiensis）、バチルス・ハロズランス（Bacillus halodurans）、および他の第１群バチルス（Bacillus）種（例えば、16D rRNA型を特徴とする）よりなる群から選択される微生物である。別の好適な実施形態において、組換え微生物は、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）またはバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）である。別の好適な実施形態において、組換え微生物は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、およびバチルス・プミルス（Bacillus pumilus）よりなる群から選択される。
【００５８】
別の実施形態において組換え微生物は、グラム陰性（塩基性色素を排除）微生物である。好適な実施形態において組換え微生物は、サルモネラ（Salmonella）（サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium））、エシェリキア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia）およびプロテウス（Proteus）よりなる群から選択される属に属する微生物である。より好適な実施形態において組換え微生物は、エシェリキア（Escherichia）属の微生物である。さらに好適な実施形態において組換え微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である。別の実施形態において組換え微生物は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae））である。
【００５９】
本発明の好適な「組換え」微生物は、制御解除されたパントテネート生合成経路もしくは酵素、制御解除されたイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路もしくは酵素、および／または修飾もしくは制御解除されたメチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）生合成経路もしくは酵素を有する微生物である。「制御解除された」または「制御解除」という用語は、微生物の生合成酵素のレベルまたは活性が改変または修飾されるように、生合成経路中の酵素をコードする微生物中の少なくとも１つの遺伝子の改変または修飾を含む。好ましくは、生合成経路中の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、遺伝子産物が増強または上昇されるように、改変または修飾される。「制御解除された経路」という用語はまた、２つ以上の生合成酵素のレベルまたは活性が改変または修飾されるように、生合成経路中の酵素をコードする２つ以上の遺伝子が、改変または修飾された生合成経路を含む。ある場合に微生物中の経路を「制御解除する」（例えば、特定の生合成経路中の２つ以上の遺伝子を同時に制御解除する）能力は、２つ以上の酵素（例えば、２つまたは３つの生合成酵素）が、「オペロン」（本明細書で定義される）と呼ぶ遺伝物質の連続的切片上で、互いに隣接する遺伝子によりコードされる微生物の特定の現象により生じる。オペロン中に含まれる遺伝子の協調的制御により、単一のプロモーターおよび／または制御要素の改変または修飾により、オペロンによりコードされる各遺伝子産物の発現が改変または修飾され得る。制御要素の改変または修飾には、特に限定されないが、遺伝子産物の発現が修飾されるように、内因性プロモーターおよび／または制御要素の除去、強いプロモーター、誘導性プロモーターもしくは複数のプロモーターの付加、または制御配列の除去、オペロンの染色体位置の修飾、リボゾーム結合部位のようにオペロンに隣接するまたはオペロン内の核酸配列の改変、、オペロンのコピー数の増加、オペロンの転写および／またはオペロンの遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、制御タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）の修飾、または当該分野でルーチン的な遺伝子発現の制御解除のための任意の従来法（例えば、特に限定されないが、レプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用）がある。制御解除はまた、例えばフィードバック耐性であるかまたは比活性が高いかまたは低い酵素を与える、１つ以上の遺伝子のコード領域の改変を含んでよい。
【００６０】
他の好適な実施形態において組換え微生物は、少なくとも１つのパントテネート生合成酵素、少なくとも１つのイソロイシン−バリン生合成酵素、および／または少なくとも１つのMTF生合成酵素が、過剰発現されるように設計または操作される。「過剰発現された」または「過剰発現」という用語は、微生物の操作前に、または操作されていない匹敵する微生物で発現されるレベルより、高いレベルでの遺伝子産物（例えば、生合成酵素）の発現を含む。ある実施形態において微生物は、操作されていない匹敵する微生物で発現されるレベルより高いレベルの遺伝子産物を過剰発現するように、設計または操作される。
【００６１】
遺伝子操作は、特に限定されないが、特定の遺伝子の発現に関連する制御配列または部位の改変または修飾（例えば、強いプロモーター、誘導性プロモーターもしくは複数のプロモーターの付加により、または発現が構成性になるように制御配列を除去することにより）、特定の遺伝子の染色体位置の修飾、リボゾーム結合部位のような特定の遺伝子に隣接する核酸配列の改変、特定の遺伝子のコピー数の増加、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、制御タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）の修飾、または当該分野でルーチン的な特定の遺伝子の発現の制御解除のための任意の従来法（例えば、特に限定されないが、レプレッサータンパク質の発現を阻止するためのアンチセンス核酸分子の使用）がある。遺伝子操作はまた、例えば経路を阻止するかまたはレプレッサーを除去するための、遺伝子の欠失を含む。
【００６２】
別の実施形態において、微生物は、微生物の操作前に、または操作されていない匹敵する微生物で発現されるレベルより、高いレベルの遺伝子産物（例えば、生合成酵素）を過剰発現するように、部分的または環境的に操作することができる。例えば、微生物は、転写および／または翻訳が増強または上昇させられるように、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を上昇させることが知られているかまたは疑われる物質で処理されるか、またはこの物質の存在下で培養することができる。あるいは、転写および／または翻訳が上昇させられるように、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳を上昇させるように、選択された温度で培養することができる。
【００６３】
V.  組換え微生物の培養と発酵
「培養」という用語は、本発明の生きた微生物を維持および／または増殖させることを含む（例えば、培養物または株を維持および／または増殖させる）。ある実施形態において本発明の微生物は、液体培地で培養される。別の実施形態において本発明の微生物は、固体培地または半固体培地で培養される。好適な実施形態において、本発明の微生物は、微生物の維持および／または増殖に必須であるかまたは有利である栄養物（例えば、炭素源または炭素基質、例えば炭水化物、炭化水素、油、脂肪、脂肪酸、有機酸、およびアルコール；窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、大豆粉（soy meal）、大豆粉（soy flour）、大豆グリット（soy grits）、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸、そのナトリウムおよびカリウム塩；微量元素、例えばマグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、銅、亜鉛、ホウ素、モリブデン、および／またはコバルト塩；ならびに増殖因子、例えばアミノ酸、ビタミン、増殖促進物質など）を含む培地（例えば、無菌、液体培地）中で培養される。
【００６４】
好ましくは本発明の微生物は、調節されたpHで培養される。「調節されたpH」という用語は、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生を引き起こす任意のpHを含む。ある実施形態において微生物は、約７のpHで培養される。別の実施形態において微生物は、6.0〜8.5のpHで培養される。所望のpHは、当業者に公知の任意の方法で維持される。
【００６５】
また好ましくは、本発明の微生物は、調節された通気下で培養される。「調節された通気」という用語は、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生を引き起こす充分な通気（例えば、酸素）を含む。ある実施形態において、通気は、例えば培地中に溶解した酸素の量を制御することにより、培養物中の酸素レベルを制御して調節される。好ましくは、培養物の通気は、培養物を攪拌することにより調節される。攪拌は、プロペラまたは同様の機械的攪拌装置により、培養容器（例えば、試験管またはフラスコ）を回転または振盪することにより、または種々のポンプ装置により、提供される。通気は、無菌空気または酸素を媒体（例えば、発酵混合物）中を通過させることによりさらに調節される。また好ましくは、本発明の微生物は、過剰の発泡無しで（消泡剤を添加することにより）培養される。
【００６６】
さらに本発明の微生物は、調節された温度で培養することができる。「調節された温度」という用語は、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生を引き起こす任意の温度である。ある実施形態において、調節温度は、15℃〜95℃の温度を含む。別の実施形態において調節温度は、15℃〜70℃の温度を含む。好適な温度は、20℃〜55℃、さらに好ましくは30℃〜50℃である。
【００６７】
微生物は液体培地中で培養（例えば、維持および／または増殖）することができ、好ましくは、連続的にまたは間欠的に、従来の培養法、例えば靜置培養、試験管培養、振盪培養（例えば、ロータリー振盪培養、振盪フラスコ培養など）、通気スピナー培養、または発酵により培養される。好適な実施形態において微生物は、振盪フラスコで培養される。さらに好適な実施形態において、微生物は、発酵槽中で培養される（例えば、発酵法で）。本発明の発酵法には、特に限定されないが、バッチ式、フェドバッチ式、連続的発酵法がある。「バッチプロセス」または「バッチ発酵」という用語は、培地、栄養物、補助添加物などが、発酵の最初にセットされ、発酵中に変更されないシステムを意味するが、培地の過剰の酸性化および／または微生物の過剰の死滅を防ぐために、pHや酸素濃度のような因子を制御する試みは行われる。「供給バッチプロセス」または「供給バッチ式」発酵という用語は、発酵が進むにつれて、１つ以上の基質または保持物が加えられる（量を増やしながら、または連続的に加えられる）バッチ発酵を意味する。「連続的プロセス」または「連続的発酵」という用語は、規定の発酵培地が、発酵に連続的に加えられるシステムを意味し、好ましくは所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の回収のために、等量の使用済みまたは「調節」培地が同時に採取される。種々のこのような方法が開発されており、当該分野で公知である。
【００６８】
「所望の化合物が産生されるような条件下で培養する」という用語は、所望の化合物を産生するのに、または産生される特定の化合物の所望の収率を選るのに、適切なまたは充分な条件（例えば、温度、圧力、pH、持続時間など）下での、微生物の維持および／または増殖を含む。例えば、培養は、所望の量の化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）を産生するのに充分な時間行われる。好ましくは、化合物の適切な産生を実質的に達成するのに充分な時間（例えば、パントエートおよび／またはパントテネートの適切な濃度、またはパントエートおよび／またはパントテネート：ハイブリドーマの適切な比を達するのに）充分な時間連続的に培養される。ある実施形態において、培養は、12〜24時間続けられる。別の実施形態において、培養は、24〜36時間、36〜48時間、48〜72時間、72〜96時間、96〜120時間、120〜144時間、または144時間以上行われる。さらに別の実施形態において微生物は、約36時間で少なくとも約５〜10g/Lの化合物が産生されるような、約48時間で少なくとも約10〜20g/Lの化合物が産生されるような、または72時間で少なくとも約20〜30g/Lの化合物が産生されるような、条件下で培養される。さらに別の実施形態において微生物は、約36時間で少なくとも約５〜20g/Lの化合物が産生されるような、約48時間で少なくとも約20〜30g/Lの化合物が産生されるような、または約72時間で少なくとも約30〜50または60g/Lの化合物が産生されるような、条件下で培養される。さらに別の実施形態において微生物は、約36時間で少なくとも約40〜60g/Lの化合物が産生されるような、約48時間で少なくとも約60〜90g/Lの化合物が産生されるような、条件下で培養される。記載の範囲の上限を超える値は、例えば特定の発酵実験で、または特定の作成株を用いて、本明細書に記載の方法により得られることは、当業者により理解されるであろう。
【００６９】
好ましくは、本発明の産生法は、「適切な対照と比較して増強している」パントテネートレベルの産生を引き起こす。本明細書において「適切な対照」という用語は、当業者により、所望の生成物の増強、増加、または上昇したレベルを測定するのに適しているとして認識されている任意の対照を含む。例えば、この方法が、制御解除されたパントテネート生合成経路を有する微生物を培養することを特徴とする場合、および該微生物が、制御解除されたMTF生合成経路をさらに有する場合（すなわち、少なくとも１つのMTF生合成酵素が制御解除、例えば過剰発現されるように、作成されている）、適切な対照は、MTF酵素または経路の操作の前または操作が無い場合（すなわち、パントテネート生合成経路のみが制御解除された）の、微生物の培養物を含む。同様に、この方法が、制御解除されたパントテネート生合成経路と制御解除されたilv生合成経路とを有する微生物を培養することを特徴とする場合、および該微生物が、制御解除されたMTF生合成経路を有する場合（すなわち、少なくとも１つのMTF生合成酵素が制御解除、例えば過剰発現されるように、作成されている）、適切な対照は、MTF酵素または経路の操作の前または操作が無い場合（すなわち、パントテネート生合成経路とilv生合成経路のみが制御解除された）の、微生物の培養物を含む。本発明で行われる各方法で、比較をする必要は無い。例えば当業者は、例えば同じまたは同様の条件下で、一連の反応（例えば、試験管培養、振盪フラスコ培養、発酵）を行うことにより、適切な対照を経験的に決定することができる。例えば特定の株により、ルーチンの産生レベルを評価することにより、当業者は、そのようなレベルより、増強、増加または上昇しているレベルを認識することができる。すなわち、適切な対照との比較は、あらかじめ決められた値（例えば、あらかじめ決められた対照）との比較を含む。
【００７０】
すなわち、適切に作成した株が、36時間で40g/Lのパントテネートを産生する（パントテネート産生が増強されるような、操作の前に）実施形態において、50、60、70g/Lまたはそれ以上のパントテネートの産生（例えば、少なくとも１つのMTF生合成酵素が過剰発現されるような操作後）は、増強産生を例示する。同様に、適切に作成した株が48時間で50g/Lのパントテネートを産生する（パントテネート産生が増強されるような、操作の前に）実施形態において、60、70、80、90g/Lまたはそれ以上のパントテネートの産生（例えば、少なくとも１つのMTF生合成酵素が過剰発現されるような操作後）は、増強産生を例示する。
【００７１】
本発明の方法はさらに、所望の化合物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）を回収する工程を含む。所望の化合物を「回収する」という用語は、培地から所望の化合物を、抽出、採取、単離または精製することを含む。化合物を回収することは、当該分野で公知の従来の単離または精製法に従って行われ、特に限定されないが、通常の樹脂（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）、通常の吸着物質による処理（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）、pHの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの通常の溶媒）、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などの方法がある。例えば、化合物は、培地から、まず微生物を除去することにより回収される。次に培地を、陽イオン交換樹脂中または上を通して陽イオンを除去し、次に陰イオン交換樹脂中または上を通して、目的の化合物より強い酸性を有する無機陰イオンと有機酸を除去する。次に、本明細書に記載のように、生じる化合物を塩（例えば、カルシウム塩）に変換することができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の所望の化合物は、生じる調製物が、他の培地成分を実質的に含まない（例えば、培地成分および／または発酵副産物を含まない）ように、「抽出」、「単離」または「精製」される。「他の培地成分を実質的に含まない」という用語は、化合物が、培地成分から、またはそこから産生される培養物の発酵副産物から分離されている、所望の化合物の調製物を含む。ある実施形態において調製物は、約80％（乾燥重量）以上の所望の化合物（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約20％未満）、さらに好ましくは約90％以上の所望の化合物（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約10％未満）、さらに好ましくは約95％以上の所望の化合物（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約５％未満）、および最も好ましくは約98〜99％以上の所望の化合物（例えば、他の培地成分または発酵副産物が約１〜２％未満）を有する。所望の化合物が誘導体化されて塩にされると、化合物は好ましくはさらに、塩の生成に関連する化学的混入物質を含まない。所望の化合物が誘導体化されてアルコールにされると、化合物は好ましくはさらに、アルコールの生成に関連する化学的混入物質を含まない。
【００７３】
別の実施形態において所望の化合物は、例えば微生物が生物学的に有害ではない（例えば、安全）時、微生物から精製されない。例えば、全培養物（または培養上清）は、生成物の供給源（例えば、粗生成物）として使用することができる。ある実施形態において培養物（または培養上清）は、修飾することなく使用される。別の実施形態において培養物（または培養上清）は、濃縮される。さらに別の実施形態において培養物（培養上清）は、乾燥または凍結乾燥される。
【００７４】
さらに別の実施形態において、所望の化合物は部分的に精製される。「部分的に精製される」という用語は、少なくともある程度の処理、例えば市販の樹脂による処理（例えば、バッチ処理）を受けた媒体調製物を含む。好適な実施形態において、「部分的に精製された」調製物は、約30％（重量％）を超える所望の化合物、好ましくは約40％を超える所望の化合物、より好ましくは約50％を超える所望の化合物、さらに好ましくは約60％を超える所望の化合物、および最も好ましくは約70％を超える所望の化合物を有する。「部分的に精製された」調製物はまた、好ましくは80％（重量％）またはそれ以下の所望の化合物を有する（すなわち、本明細書に記載のように、「抽出された」、「単離された」、または「精製された」調製物より少ない）。
【００７５】
操作される生合成酵素または生合成酵素の組合せに依存して、所望の化合物が産生されるように、本発明の微生物に少なくとも１つの生合成前駆体を提供（または供給）することが好ましいかまたは必要なことがある。「生合成前駆体」または「前駆体」という用語は、微生物の培地に提供された時、接触させられた時、または含まれた時、所望の生成物の生合成を増強または上昇させるように機能する物質または化合物を含む。ある実施形態において、生合成前駆体または前駆体はアスパラギン酸塩である。別の実施形態において、生合成前駆体または前駆体はβ-アラニンである。加えられるアスパラギン酸塩またはβ-アラニンの量は、好ましくは微生物の生産性を増強するのに充分な培地中の濃度（パントエートおよび／またはパントテネートの産生を増強するのに充分な濃度）を与える量である。本発明の生合成前駆体は、濃縮溶液または懸濁液の形（例えば、水または緩衝液のような適当な溶媒中）で、または固体型（例えば、粉末の形）で加えることができる。さらに、本発明の生合成前駆体は、単一のアリコートとして、ある期間をかけて連続的または間欠的に加えることができる。「過剰のβ-アラニン」という用語は、問題の混合物を培養するためにルーチンに使用されるものより、上昇したまたは高いβ-アラニンレベルを含む。例えば本発明の実施例に記載のバチルス（Bacillus）微生物は、約０〜0.01g/Lのβ-アラニンの存在下でルーチンに培養される。従って、過剰のβ-アラニンレベルは、約0.01〜１、好ましくは約１〜20g/Lのレベルを含むことができる。
【００７６】
さらに別の実施形態において、生合成前駆体はバリンである。さらに別の実施形態において、生合成前駆体はα-ケトイソバレレートである。好ましくはバリンまたはα-ケトイソバレレートは、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の生産が起きるのに充分な、培地中の濃度を与える量である。「過剰のα-KIV」という用語は、問題の混合物を培養するためにルーチンに使用されるものより、上昇したまたは高いα-KIVレベルを含む。例えば本発明の実施例に記載のバチルス（Bacillus）微生物は、約０〜0.01g/Lのα-KIVの存在下でルーチンに培養される。従って、過剰のα-KIVレベルは、約0.01〜１、好ましくは約１〜20g/Lのα-KIVを含むことができる。「過剰のバリン」という用語は、問題の混合物を培養するためにルーチンに使用されるものより、上昇したまたは高いバリンレベルを含む。例えば本発明の実施例に記載のバチルス（Bacillus）微生物は、約０〜0.5g/Lのバリンの存在下でルーチンに培養される。従って、過剰のバリンレベルは、約0.5〜５g/L、好ましくは約５〜20g/Lのバリンを含むことができる。
【００７７】
さらに別の実施形態において、生合成前駆体はセリンである。好ましくはセリンは、所望の生成物（例えば、パントエートおよび／またはパントテネート）の産生が起きるのに充分な、培地中の濃度が得られるような量で加えられる。過剰のセリン（本明細書に記載のように）もまた、例えばパントテネートの産生増強のために、本明細書に記載の産生法に従って、加えることができる。当業者は、極端に過剰の生合成前駆体が、微生物に毒性を与え得ることを理解するであろう。生合成前駆体はまた、本明細書において「補助生合成基質」と呼ばれる。
【００７８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の組換え微生物を特徴とする生物形質転換プロセスである。「生物形質転換プロセス」という用語（本明細書において「生物変換プロセス」とも呼ぶ）は、適切な基質および／または中間体化合物の所望の生成物への産生を引き起こす生物学的プロセスを含む。
【００７９】
生物形質転換反応で使用される微生物および／または酵素は、これらがその目的の機能（例えば、所望の化合物の生産）を果たすことを可能にする形である。微生物は細胞全体でもよいか、または所望の最終結果を得るのに必要な細胞の部分のみでもよい。微生物は、懸濁（例えば、緩衝液または緩衝培地のような適切な溶液中）、洗浄（例えば、微生物を培養する培地を洗い除去）、アセトン乾燥、固定化（例えば、ポリアクリルアミドゲル、またはk-カラゲナンまたは合成支持体、例えば、ベース、マトリックスなど）、固定、架橋または透過性化（例えば、化合物、例えば基質、中間体または生成物が、より容易に該膜または壁を通過できるように、透過性にした膜および／または壁）されてよい。
【００８０】
本発明を以下の実施例でさらに例示するが、これらは決して限定するものではない。本明細書を通して引用されたすべての文献、特許および公開された特許出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８１】
実施例
【実施例１】
【００８２】
実施例Ｉ：パント化合物産生株
パントテネートの産生のためのバチルス（Bacillus）株の開発において、米国特許出願第09/400,494号、および米国特許出願第09/667,569号に記載のように、パントテネート生合成経路とイソロイシン−バリン（ilv）経路（図1）に関与する遺伝子と酵素に、種々の遺伝子操作を行った。例えば、制御解除されたpanBCDオペロンを有するかおよび／または制御解除されたpanE1を有する株は、パントテネート産生の増強を示す（β-アラニンとα-ケトイソバレレート（α-KIV）の存在下で培養した時）。ilvBNCとilvDについてさらに制御解除された株は、β-アラニンの存在下でパントテネート産生の増強を示した。さらに、panDをさらに制御解除することにより、β-アラニン非依存性を達成することができる。
【００８３】
パントテネート産生株の例はPA824であり、これは、トリプトファン原栄養体で、SpecとTet耐性で、panBCD遺伝子座でpanBCDについて制御解除され、panE1遺伝子座でpanE1について制御解除され（枯草菌（B. subtilis）ゲノム中の２つの遺伝子は、大腸菌（E. coli）のpanEであるpanE1とpanE2と相同的であり、前者は、パントテネート産生に関与する主要なケトパントインエステル還元酵素をコードし、panE2は、パントテネート合成に寄与しない（米国特許出願第09/400,494号））、ilvD遺伝子座でilvDについて制御解除され、amyE遺伝子座でilvBNCカセットを過剰発現し、bpr遺伝子座でpanDを過剰発現する。PA824は、標準的発酵法（例えば、仮特許出願第60/263,053号、または仮特許出願第60/262,995号、参照することにより本明細書に組み込まれる）に従って、14リットルの発酵槽で48時間培養されると、約40〜50g/Lのパントテネートをルーチンに産生する。簡単に説明すると、微量元素を含有するバッチ培地（4.5リットル）を、PA824の振盪フラスコ培養物に接種する。発酵は、温度（例えば、43℃）、溶存酸素、およびpHについて調節され、グルコース制限供給バッチ法として行われる。最初のバッチのグルコースが消費された後、新鮮なFEED培地の連続的供給により、グルコース濃度は、約０〜１g/Lで維持される。pHは7.2に設定され、モニターされ、NH3-またはH3PO4-溶液を供給することにより維持される。溶存酸素濃度［pO2］は、攪拌と通気速度の制御により、約10〜30％に維持される。発泡は、適切な消泡剤を加えることにより制御される。発酵ブロス中のパントテネート力価は、滅菌して遠心分離により細胞を除去した後に測定される（HPLC分析による）。
【００８４】
第２の株の例は、PA668である。PA668は、vprおよび／またはpanB遺伝子座で増幅されたP26panBの追加のコピーを含有する。PA668は、クロラムフェニコールを使用することにより複数のコピーの選択を可能にするpanB発現ベクター（pAN636）を使用して構築された。簡単に説明すると、pAN636 NotI制限断片（ベクター配列を除く）を連結し、次にこれを使用して、５μg/mlクロラムフェニコールを含有するプレート上での選択により、PA824を形質転換した。30μg/mlクロラムフェニコールに耐性の形質転換体を分離し、48時間試験管培養物のパントテネート産生についてスクリーニングした。分離株は、PA824より10パーセント多いパントテネートを産生する。10リットルの発酵では、最初の株（PA668-2A）は、同様の条件下で培養したPA824に匹敵する量（例えば、36時間目に約45〜50g/L）のパントテネートを産生する。36時間後、パントテネート産生が、PA824でルーチンに遅くなり始める時も、PA668-2Aは、高レベルのパントテネート（例えば、48時間で約60〜65g/Lのパントテネート）を産生し続ける。第２の株（PA668-24）は、より速い速度でパントテネートを産生し、48時間後に60〜70g/Lに達する。
【００８５】
第３の産生株（PA721B-39）を、以下のように増幅可能なP26 panBpanDカセットをさらに含むように作成した。まず、panBとpanDの両方をbpr遺伝子座に組み込むことができる単一の発現カセットを構築した。両方の遺伝子を１つの発現カセット中に組合せると、抗生物質耐性マーカーを排除することにより、生じる株が単純化される。２つの異なるpanDリボゾーム結合部位（国際特許公報 WO 01/21772号および米国特許出願第60/262,995号ですでに合成され試験されたRBS）のそれぞれを含むように、P26 panBpanD発現カセットを構築した。このカセットは、合成panB遺伝子リボゾーム結合部位（RBS1）を含有したが、そのデザインは、将来簡単なオリゴヌクレオチドカセット置換によりpanB RBSを変更することを可能にする。構築の最初の工程で、pAN665の構築のために図３に示すように、panB遺伝子はpanD遺伝子カセットに結合された。次に、生じるpanBpanDカセットを、図４に例示するように、枯草菌（B. subtilis）発現ベクターpOTP61に移した。構築した各プラスミド（pAN670とpAN674）の基本的な特徴の要約を表１に示す。
【表１】
2004533213.tif 000004
【００８６】
これらの新しいプラスミドは、単一のベクターからの追加のPanBとPanDの産生を組合せており、PA668中に存在するpanB発現ベクター（pAN636）に対して上昇したレベルのPanBを産生すると予測された。パントテネート産生株においてP26 panBpanDベクターを入れる方策は、bprとpanE1との遺伝子連鎖を利用した。まず、PA930（panE1::cat）から分離した染色体DNAでPA824を形質転換して、クロラムフェニコールへの耐性について選択することにより、固有のpanD発現カセットを処理したPA824の誘導体を構築した。生じる形質転換体を、テトラサイクリンに対する耐性についてスクリーニングし、PA715と呼ぶ２つのTet感受性分離株を取って置いた。この株は、P26 panBpanDベクター（下記）を試験するための宿主株である。PA715中のP26 panE1カセットを回復するために、各ベクターをまず、P26 panE1を含有するが、bpr遺伝子座に組み込まれたカセットを含有しない株（PA328）中に形質転換した。PA328はP26 panBCD遺伝子座を含有するが、α-KIVの過剰産生のためには作成されていない。２つのベクターから適切なNotI制限断片を使用して、テトラサイクリンに耐性のPA328の形質転換体を得て、得られた株をPA710とPA714と名付けた。
【００８７】
次の工程は、カセットをPA715中に転移させて、これらがPA824株のバックグランド中で評価できるようにすることであった。これは、PA710とPA714株から染色体DNAを単離し、この２つの各DNAを別々に使用してPA715を形質転換し、テトラサイクリンに対する耐性について選択して行った。テトラサイクリン耐性形質転換体を、クロラムフェニコールに対する感受性についてスクリーニングした。これにより、bpr遺伝子座でP26 panBpanDカセットとの連鎖により、ドナーDNAからのP26 panE1遺伝子も獲得した、所望の形質転換体が同定される。PA710とPA714染色体DNAをドナーとして使用した形質転換体から、クロラムフェニコール感受性分離株を得た。試験管培養物アッセイで最も高いパントテネート力価を与えた分離株を、取って置いた。これらの株を、それぞれPA717とPA721と名付けた。新しい株の２重の試験管培養物、ならびにPA824とPA715を、SVY+10g/Lアスパラギン酸中で43℃で48時間増殖させ、次にパントテネート、HMBPA、およびβ-アラニンについて測定した。さらに、各株からの抽出物を、SDS-PAGEゲルにかけた。試験管培養物アッセイの結果を表２に示す。
【表２】
2004533213.tif 000005
【００８８】
予測されたように、新しい株のそれぞれは、PA715より多くのパントテネートとβ-アラニンを産生した。２つの株（PA717-24とPA721-39）は、PA824とほぼ同じパントテネートを産生し、PA721-35は、PA824より多くのパントテネートを産生した。新しい株の３つは、PA824より少ないHMBPAを産生した。タンパク質ゲル分析は、３つの新しい株が、どの対照株よりも多くのPanBを産生することを示した。
【００８９】
株PA717-24、PA721-35、およびPA721-39も、大豆粉ベースの培地で振盪フラスコ培養で評価した。表３に示すように、増幅可能なP26 panBpanDカセットを有するこれらの株は、PA668-2とPA668-24（両方とも、分かれた増幅可能なP26 panBとP26 panDカセットを含有する）で見られたものと同様のレベルで、パントテネートとHMBPAを産生した。
【表３】
2004533213.tif 000006
条件：40ml 培地／200mlじゃま板付き振盪フラスコ、４×バイオシールドカバー、300rpm、2.5％接種（1.0ml）。
【００９０】
大豆培地：20g/l Cargill 200/20 大豆粉、８g/l (NH4)2SO4、５g/l グルタミン酸、１×PSTE、0.1M リン酸塩  pH7.2 および0.3M MOPS pH7.2、60g/l グルコースまたはマルトース w/10mM Mgおよび1.4mM Ca。
【００９１】
二重測定のフラスコの平均。
【００９２】
パントテネート（および、図１と本明細書に記載の他のパント化合物）を産生する以外に、商業的量の所望のパント化合物を産生するように作成したいくつかの株は、3-(2-ヒドロキシ-3-メチル-ブチリルアミノ)-プロピオン酸（HMBPA）（「β-アラニン2-(R)-ヒドロキシイソバレレート」、「β-アラニン2-ヒドロキシイソバレレート」、「β-アラニル-α-ヒドロキシイソバレレート」および／または「ファントテネート」とも呼ぶ）（「ファントテネート」という用語はまた、本明細書において「Fan」と略される）として同定される副産物も産生することが証明された。
【００９３】
HMBPAは、PanC酵素により触媒される、[R]-α-ヒドロキシイソバレレート（α-HIV）とβ-アラニンの縮合産物である。α-HIVは、α-KIVの還元により産生され、これは、α-ケト還元酵素PanE（例えば、PanE1および／またはPanE2）および／またはIlvCにより触媒される反応である。すなわち、微生物中にα-KIV（生合成酵素PanBの基質）に競合する少なくとも２つの経路、すなわちパントテネート生合成経路とHMBPA生合成経路）が存在することが、証明されている。（α-KIVに競合する第３のおよび第４の経路は、α-KIVからバリンまたはロイシンを産生させるものである、例えば図１を参照）。少なくともパントテネート生合成経路とHMBPA生合成経路は、酵素PanCの競合的基質（すなわち、α-HIVとパントエート）を、さらに産生する。HMBPAの産生は、パントテネート産生に対して大きな作用を有する。例えば、HMBPA経路は、前駆体（α-KIVとβ-アラニン）およびいくつかの酵素（PanC、PanD、PanE1、および／またはIlvC）に対して、パントテネート経路と競合している。さらに、HMBPAの構造はパントテネートの構造と似ているため、これは、パントテネート経路の１つ以上の工程を陰性に制御する好ましくない性質を有するかも知れない。HMBPAの本体に基づき、米国特許出願第60/262,995号は、HMBPA生合成プロセスと比較して、パントテネート生合成プロセスでの基質（α-KIVとβ-アラニン）および／または酵素（PanC、PanD、PanE1、および／またはIlvC）の使用を促進する任意の手段により、パントテネートの産生を改良または最適化することができることを教示している。
【実施例２】
【００９４】
実施例II：セリン利用可能性を上昇させることによりパントテネート産生を上昇させる
パントテネート産生を最適化する少なくとも１つの方法は、微生物培養物中のセリンの利用可能性を制御することである。特に、セリンの利用可能性を上昇させると、（例えば、HMBPA産生に対して）パントテネート産生を上昇でき、一方セリンの利用可能性を低下させると、HMBPA産生に対してパントテネート産生を低下できることが証明できる。この方法は、セリンから誘導される化合物メチレンテトラヒドロ葉酸（MTF）が、パントテネート生合成反応中にヒドロキシメチル基をα-KIVに与えることにより、ケトパントエートを生成する（例えば、図１と図２を参照）という理解に基づく。従って、セリンレベルを制御することは、適切に作成した微生物中で、ケトパントエートレベルを有効に制御し、次にパントエートおよび／またはパントテネート産生を制御するする１つの手段である。この制御を証明するために、PA824を、SVYグルコース＋５g/Lβ-アラニンおよび±５g/Lセリンの試験管培養で43℃で48時間増殖させた。
【表４】
2004533213.tif 000007
【００９５】
表４に示すデータにより証明されるように、セリンの添加は、パントテネートの産生レベルを上昇させる（一方、HMBPA産生を低下させる）。
【実施例３】
【００９６】
実施例III：増加量のglyA遺伝子産物セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを有する細菌細胞を作成する
セリンを供給する代わりに、パントテネート産生レベルを制御するためにセリンレベルおよび／またはセリン利用レベル（従って、メチレンテトラヒドロ葉酸レベル）を上昇させる別の方法は、3-ホスホグリセレート脱水素酵素またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（それぞれserAとglyAの遺伝子産物）の合成または活性を上昇させることであり、こうして適切に作成した微生物中のセリンとメチレンテトラヒドロ葉酸生合成が上昇する。
【００９７】
glyA遺伝子の発現は、強い構成性プロモーターの下流にクローン化した枯草菌（B. subtilis）glyA遺伝子を含有する発現カセットで、枯草菌（B. subtilis）細胞を形質転換することにより上昇させた。発現カセットを構築するために、表５に記載のプライマーRY417とRY418を使用して、枯草菌（B. subtilis）PY79から単離した染色体DNAからPCRによりglyA遺伝子を増幅した。
【表５】
2004533213.tif 000008
【００９８】
RY417は、XbaI部位のすぐ下流にRBS2リボゾーム結合部位を含有する。次に、増幅したDNAをXbaIとBamHIで切断し、ベクターpAN004（図５）のXbaIとBamHI部位の間にクローン化して、プラスミドpAN396を得た（図６：配列番号24）。pAN004ベクターは、XbaIクローニング部位のすぐ上流にファージSP01P26プロモーターを含有して、クローン化glyA遺伝子の発現を指令する。発現カセットのすぐ下流に、pAN396は、枯草菌（B. subtilis）で機能するcat遺伝子を含有する。枯草菌（B. subtilis）を形質転換するために、P26 glyAカセットとcat遺伝子とを含有するNotI DNA断片を、pAN396から単離し、自己結合させ、枯草菌（B. subtilis）PY79のコンピタントな細胞中に形質転換した。いくつかのクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、PA1007およびPA1008と名付けた。これらの株のそれぞれから染色体DNAを単離し、これを使用して、PA721B-39とPA824のコンピタントな細胞を形質転換して、それぞれPA1011とPA1014を得た。PA1011とPA1014の選択した分離株の細胞抽出物のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、これらの株が、親株PA721B-39（実施例Ｉに記載）とPA824（国際特許公報 WO 01/21772号に記載）と比較して、増加した量のglyA遺伝子生成物を含有することが確認された。パントテネート産生に及ぼすglyA発現上昇の作用を試験するために、PA1011とPA1014を、SVYグルコース＋５g/Lβ-アラニンおよびの試験管培養で43℃で48時間増殖させた。表６のデータから明らかなように、PA1014は、その親株PA824（3.2g/L）より多くのパントテネート（4.5g/L）を産生した。同様にPA1011は、平均してその親株PA721B-39（4.05g/L）より多くのパントテネート（4.35g/L）を産生した。
【表６】
2004533213.tif 000009
【実施例４】
【００９９】
実施例IV．増加量のserA遺伝子産物3-ホスホグリセレート脱水素酵素を有する細菌細胞を作成する
serA遺伝子の生成物3-ホスホグリセレート脱水素酵素は、セリン生合成への経路の最初の専用の酵素である（図２を参照）。セリンはMTF合成の基質の１つであるため、我々は、細胞中のセリンレベルを上昇させるために、serA遺伝子の過剰発現を作成した。実施例IIIのglyA遺伝子について上記したように、強い構成性プロモーターの下流にクローン化した枯草菌（B. subtilis）glyA遺伝子を含有する発現カセットを用いて枯草菌（B. subtilis）細胞を形質転換して、serA遺伝子の発現を上昇させた。発現カセットを構築するために、表５に記載のプライマーRY405とRY406を使用して、枯草菌（B. subtilis）PY79から単離した染色体DNAからPCRにより、serA遺伝子を増幅した。次に、増幅したDNAをXbaIとBamHIで切断し、ベクターpAN004（図５）のXbaIとBamHI部位の間にクローン化して、プラスミドpAN393を得た（図７：配列番号25）。枯草菌（B. subtilis）を形質転換するために、P26 serAカセットとcat遺伝子とを含有するNotI DNA断片を、pAN393から単離し、自己結合させ、枯草菌（B. subtilis）PY79のコンピタントな細胞中に形質転換した。いくつかのクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、PA1004およびPA1005と名付けた。これらの株のそれぞれから染色体DNAを単離し、これを使用して、PA721B-39とPA824のコンピタントな細胞を形質転換して、それぞれPA1010とPA1013を得た。PA1010とPA1013の選択した分離株の細胞抽出物のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、これらの株が、親株PA721B-39とPA824と比較して、増加した量のserA遺伝子生成物を含有することが確認された。
【０１００】
パントテネート産生に及ぼす上昇するserA発現の作用を試験するために、PA1010とPA1013を、SVYグルコース＋５g/L β-アラニンの試験管培養で43℃で48時間増殖させた。表７のデータから明らかなように、PA1010は、平均してその親株PA721B-39（4.1g/L）より多くのパントテネート（4.7g/L）を産生した。同様にPA1013は、その親株PA824（3.1g/L）より多くのパントテネート（4.1g/L）を産生した。
【表７】
2004533213.tif 000010
【実施例５】
【０１０１】
実施例Ｖ．serAとglyA発現の上昇した株を用いる振盪フラスコと発酵槽実験
試験管での結果に基づき、増幅可能なserAカセットを有する２つの株と、増幅可能なglyAカセットを有する２つの株を選択し、２つの親（PA824とPA721B-39）から１つずつを選択した。４つの株を親とともに、振盪フラスコで増殖させた（表８）。大豆粉MOPSグルコース（SMG）培地では、４つのすべての株が、その親株より多くのパントテネートを産生した。大豆粉MOPSマルトース（SMM）培地では、４つの株のうちの１つが、親株より優れているようであった。
【０１０２】
各親からのserA過剰発現株とglyA過剰発現株を、10リットルのChemapベンチ発酵槽で、同時に実験した。SMM中で最も高いパントテネート力価を与えたPA824からのglyA過剰発現株であるPA1014-3は、発酵槽中でも最高であった（表９）。PA1014-3株は、培養上清中で36時間で71g/lのパントテネートを産生し、培養上清中で48時間で86g/lのパントテネートを産生し、これに対して親PA824は、それぞれ41g/lと46g/lパントテネートを産生した。serA株PA1012-4もまた、培養上清中でPA824対照より有意に多いパントテネート（36時間と48時間でそれぞれ52g/lと60g/l）を産生した。これらの結果は、glyAとserAの両方を上昇させることの有効性を、明瞭に示している。
【０１０３】
PA721B-39のserA過剰発現およびglyA過剰発現誘導体は、その親株よりも明瞭に改良された。両方とも、培養上清中で48時間で80g/lのパントテネート（それぞれ、82g/lと79g/l）を産生した。PA721B-39誘導体対PA824誘導体中の上昇したPanBレベルの作用は、HMBPAの還元に現れる。PA721B-39とその誘導体は、48時間後にPA824またはPA668-24より少ないHMBPAを産生する。GlyAを上昇させると、HMBPAへの炭素の流れを低下させるようでもある。
【表８】
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すべてのデータは、48時間後の振盪フラスコの二重測定の平均である。
【０１０４】
条件：40ml 培地／200mlじゃま板付き振盪フラスコ、４×バイオシールドカバー、300rpm、2.5％接種、および43℃。
【０１０５】
培地：20g/l Cargill 200/20 大豆粉、１×PSTE、８g/l (NH4)2SO4、５g/l グルタミン酸、
緩衝液：0.1M リン酸塩  pH7.2 および0.3M MOPS pH7.2
炭素源（20×ストックとして別々に滅菌した）：60g/l グルコースまたはマルトース w/10mM Mgおよび1.4mM Ca。
【表９】
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使用した培地は、PFM-222である。これは、以下を除いて、米国特許出願第60/262,995号（2001年１月19日出願）に記載の培地PFM-155と同じである：(1) バッチ材料：Amberex 1003は無し。Cargill 200/20（大豆粉）40g/Lは、Cargill 20-80（大豆グリット）50g/Lに変更した。MgSO4・7H2Oは、MgCl2/7H2O、１g/Lに交換し、SM-1000Xは、PSTE-1000×（PSTE-1000×＝MnCl2・4H2O、2.0g/L；ZnSO4・7H2O、1.5g/L；CoCl2・6H2O、2.0g/L；CuSO4・5H2O、0.25g/L；Na2MoO4・2H2O、0.75g/L）に交換した。Feed材料：SM-1000×を、PSTE-1000×に交換した。
【０１０６】
パントテネート産生の上昇はまた、単一の株でのserAとglyAをの組合せ過剰発現により、および／またはフィードバック耐性serAまたはglyA、または両方を引き起こす変異を導入することにより、達成することができる。
【０１０７】
同等性  当業者は、ルーチン以上の実験をすることなく、本発明で上記したものの具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識することができる。このような同等物は、以下の請求の範囲に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、パントテネートとイソロイシン−バリン（ilv）生合成経路の略図である。パントテネート生合成酵素は、太字で示し、その対応する遺伝子は、斜体で示す。イソロイシン−バリン（ilv）生合成酵素は、太字の斜体で示し、その対応する遺伝子は、斜体で示す。
【図２】図２は、大腸菌（E. coli）（および、おそらくは枯草菌（B. subtilis））のメチレンテトラヒドロ葉酸（「MTF」）生合成経路の略図である。
【図３】図３は、プラスミドpAN665構築の略図である。
【図４】図４は、プラスミドpAN670構築の略図である。
【図５】図５は、プラスミドpAN004の略図である。
【図６】図６は、プラスミドpAN396の略図である。
【図７】図７は、プラスミドpAN393の略図である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533213.tif 000088
【国際調査報告】
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2004533213.tif 000090
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