(57)【要約】本発明は、選択配列及び、選択配列と異なる注目のタンパク質をコードし、且つ上流をリボソームに転写を可能にさせる配列が先行している配列を含んで成るプロモーター無しの核酸コンストラクト、並びに生物学及び医学の分野での前記コンストラクトの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）５’位のスプライス供与部位、
ｉｉ）任意に上流が、リボソームによる翻訳を可能にする配列に先行されている、選択配列、
ｉｉｉ）選択配列と異なる注目のタンパク質をコードする配列であって、上流がリボソームによる翻訳を可能にする配列に先行されているコード配列、
ｉｖ）３’位の転写終結配列、
を含んで成る核酸コンストラクトであって、
前記選択配列又は注目のタンパク質をコードする前記配列の転写のためのプロモーターを全く有さず、
更に注目の前記タンパク質がトランス活性化タンパク質ｔＴＡではないと解される、核酸コンストラクト。
【請求項２】
注目のタンパク質をコードする前記配列が誘導性のリコンビナーゼをコードする配列である、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
注目のタンパク質をコードする前記配列が、タモキシフェンによって誘導可能となるように修飾されたＣｒｅリコンビナーゼをコードし、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２と表される配列である、請求項２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４】
上流から下流にかけて
ｉ）スプライス受容部位、
ｉｉ）上流にβ−ガラクトシダーゼをコードする検出可能な配列が先行しているネオマイシン耐性選択配列であって、全体としてβ−ｇｅｏと称されるもの、
ｉｉｉ）上流にリボソームによる翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列が先行しているＣｒｅ ＥＲＴ２配列、
ｉｖ）転写の終結のための、少なくとも１つの停止部位を含む少なくとも１つのポリＡ配列、
を含んで成る請求項２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５】
注目のタンパク質をコードする前記配列が、治療的に注目されるタンパク質又は分化因子をコードする配列である、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項６】
注目のタンパク質をコードする前記配列が、アンチセンス配列によって置換される、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項７】
リコンビナーゼ認識配列、例えばＬｏｘＰ配列が、任意に、リボソームによる翻訳を可能にする配列が上流に先行し、そして、少なくとも１つの追加の転写終結配列が下流に続く前記選択配列によって形成されたカセットであって、注目のタンパク質をコードする前記配列の上流に配置されたカセットを挟む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８】
上流から下流にかけて
ｉ）スプライス受容部位、
ｉｉ）上流から下流にかけて
−任意なある配列、例えば、リボソームによる翻訳を可能にする、それに続く選択配列のＩＲＥＳ配列、
−選択配列、例えばハイグロマイシンに対する耐性のための配列、
−任意な、検出可能なマーカータンパク質をコードする配列、例えばヒトアルカリホスファターゼ（Ａｐｈ）をコードする配列であって、リボソームによる翻訳を可能にする配列が先行したもの、
−複数のポリＡに複数の停止部位を含んで成る転写終結配列、
によって形成されたカセットであって、ＬｏｘＰ配列によって挟まれたカセット、
ｉｉｉ）注目のタンパク質をコードし、上流をリボソームによる翻訳を可能にする配列、例えばＩＲＥＳ配列が先行している配列、
ｉｖ）転写終結配列、
を含んで成る、請求項７に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトが挿入されるベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の少なくとも１つのベクターが安定的に伝達された、宿主細胞。
【請求項１１】
誘導性のリコンビナーゼをコードする配列を含んで成る、請求項２〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸コンストラクト、並びに前記リコンビナーゼの認識のための配列及び注目のタンパク質をコードする配列を含んで成る、請求項７又は８に記載の少なくとも１つの核酸コンストラクトがゲノムに一緒に組み込まれる、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）である、請求項１０又は１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ヒト以外の動物、例えば特にマウスのＥＳ細胞又はＥＧ細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
ゲノムに前記ベクターが特異的に組み込まれた、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞系を含んで成る細胞バンク。
【請求項１５】
請求項１３に記載の幹細胞から得ることができる、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば特にマウス。
【請求項１６】
請求項１２に記載の全能細胞が、分化物質、適当な場合にはリコンビナーゼ誘導物質の存在下で培養される、分化細胞を調製するための方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって得ることができ、且つ特に細胞移植に有用な分化細胞。
【請求項１８】
注目の組換えタンパク質をコードする配列を含んでいる核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれた、請求項１０〜１３又は１７のいずれか１項に記載の細胞が、注目の前記タンパク質の発現のための条件下で培養され、そしてこのようにして産生したタンパク質が回収される、注目の組換えタンパク質を産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項１９】
前記細胞が、誘導性のリコンビナーゼをコードする配列を含んで成る、請求項２〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸コンストラクト、並びに前記リコンビナーゼの認識のための配列及び注目のタンパク質をコードする配列を含んで成る、請求項７又は８に記載の少なくとも１つの核酸コンストラクトがゲノムに一緒に組み込まれた胚性幹細胞であり、当該細胞が分化物質の存在下で培養され、この様に得られた分化細胞が、続いて、注目の前記タンパク質の発現が可能となるように、前記リコンビナーゼを誘導する物質と接触される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
病変に関与する遺伝子を研究するためのモデルとして特に有用なヒト以外のトランスジェニック動物を産生するための方法であって、（ａ）誘導性リコンビナーゼをコードする配列を含んで成る、請求項２〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸コンストラクトが、ヒト以外の動物のゲノムに組み込まれ、且つ（ｂ）この様にして得られたヒト以外の動物が、ゲノムの中の注目の遺伝子が誘導性リコンビナーゼによって認識される２つの部位によって挟まれていて、前記リコンビナーゼを誘導する物質にかけられた場合に、注目の前記遺伝子の欠失を受けるヒト以外のトランスジェニック動物を得るために、ヒト以外の動物と交配される、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって得ることができる、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば特にマウス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞において特に導入遺伝子を発現するために有用な核酸コンストラクトに関する。
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞とも称される）の培養は、生物学及び医学の分野：いわゆる「再生」医療の観点における細胞及び組織の移植、病理学の研究及び薬物の開発のためのこれらの細胞に由来する動物モデルの産生、等における多くの利用に道を開いた。
【０００３】
これらの細胞は、トランスジェニック動物を得るために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子修飾され、そして次にレシピエント胚に再移植されることがある。
【０００４】
特に、遺伝子は相同組換えによって変異され、又は欠失されうる。しかしながら、遺伝子の不活性化は、胚の発育に必須であるが、かなり頻繁にこの発生の終結をもたらす。
【０００５】
これらの問題に打ち勝つために、誘導可能な組換え系が開発されている。Ｆｅｉｌ等（１９９６）及びＺｈａｎｇ等（１９９６）は、単独でタモキシフェンに結合するように変異した、エストロゲン結合ドメインに融合したＣｒｅリコンビナーゼ配列を含んで成るベクターであって、全体が強力なプロモーター（ＣＭＶプロモーター）の制御下にあるベクターを用いることを特に提案している。しかしながら、Ｚｈａｎｇ等によって得られた結果は、バックグラウンドノイズ及び誘導の割合の両方の点で期待はずれである。従って、リコンビナーゼの誘導は、６０％未満の細胞で起こり、一方、バックグラウンドノイズは長時間一定して増大する。８週間の培養後、全ての細胞が誘導物質無しに誘導される。
【０００６】
遺伝子の無効によって提供される機能情報は、対照的に遺伝子を過剰発現することに存する別の技術によって時折補完される。この実験的なストラテジーは、通常、卵母細胞への発現プラスミドの導入を用いてトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することによって使用される。しかしながら、遺伝子の無効の場合のように、所定の遺伝子のためのトランスジェニック動物の産生は、その発現が調和のとれた胚の発育と適合可能なままであることを要する。
【０００７】
反対の場合において、トランスジェニック胚の発育は中断される。活性が組織又は器官特異的であるプロモーター、又は誘導可能な発現系（亜鉛、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって誘導可能な系）、のいずれかを用いる複数の実験のストラテジーが開発されてきた。しかしながら、これらの誘導可能な発現系の使用は、卵母細胞へのＤＮＡのマイクロインジェクション技術によってトランスジェニック動物を産生する効率が低いことを示しており扱いにくい。更に、卵母細胞のゲノム内への導入遺伝子の「ランダムな」組み込みは、しばしば実験者によって必要とされる基準に従うそれらの発現を含んで成る。
【０００８】
同時に、「プロモータートラップ」と称されるアプローチが、マウスにおける発生遺伝子を同定し、且つ変異するために構想されてきた（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ １９９１）。
【０００９】
このアプローチに従い、レポーター遺伝子の発現は、内因性のプロモーターによって開始され、レポーター遺伝子自身は自己のプロモーターを持たない。このアプローチは、更に細胞のゲノムに存在する遺伝子を同定し、そして変異するために、例えばＵＳ ５，９２２，６０１又は特許出願ＷＯ ９８／１４ ６１４において採用された。
【００１０】
更に、ちなみに、テトラサイクリン依存性トランス活性化因子ｔＴＡの発現が意図される、プロモーター無しのベクターは、Ｂｏｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ， １９９９に記載されている。
【００１１】
本発明者は、上文で言及した問題の全てを解決する発現系を今回開発した。
【００１２】
本発明の対象は、更に正確には、少なくとも２つのコード配列を有する核酸コンストラクトであって、一方が選択のためであり、他方が注目のタンパク質をコードするものである核酸コンストラクト、である。このコンストラクトは
ｉ）５’位のスプライス供与部位、
ｉｉ）任意に、リボソームによる翻訳を可能にする配列に上流が先行されている、選択配列、
ｉｉｉ）選択配列と異なる注目のタンパク質をコードする配列であって、リボソームによる翻訳を可能にする配列に上流が先行されているコード配列、
ｉｖ）３’位の転写終結配列、
を含んで成り、
当該コンストラクトは前記選択配列又は注目のタンパク質をコードする前記配列の転写のためのプロモーターを全く有さないものであって、
更に注目の前記タンパク質はトランス活性化タンパク質ｔＴＡではないと解されるものである。
【００１３】
「核酸コンストラクト」の表現は、特定の核酸、例えば直鎖又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡを意味すると解される。
【００１４】
本発明の核酸コンストラクトは、上流から下流にかけて、スプライス受容部位、任意にリボソームによる翻訳を可能にする配列が先行した、選択配列、リボソームによる翻訳を可能にする配列が先行した、注目のタンパク質をコードする配列、及び転写終結配列、を含んで成ることもある。このタイプのコンストラクトが好ましい。
【００１５】
あるいは、本発明の核酸コンストラクトは、しかしながら上流から下流にかけてスプライス受容部位、リボソームによる翻訳を可能にする配列が先行した、注目のタンパク質をコードする配列、好ましくはリボソームによる翻訳を可能にする配列が先行した、選択配列、及び転写終結配列、を含んで成ることもある。
【００１６】
「リボソームによる翻訳を可能にする配列」の表現は、例えばＩＲＥＳ配列（リボソーム内部進入部位）を意味すると解される。それは、特に哺乳類のＩＲＥＳ配列、例えばＢｉｐとも称され、イムノグロブリンの重鎖と結合するタンパク質ＧＲＰ７９をコードする遺伝子のリボソーム内部進入部位であってもよい。ピコルナウイルスのＩＲＥＳ配列、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ配列（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｋａｍｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、好ましくはこの配列のヌクレオチド１６３〜７４６、ポリオウイルスの配列、好ましくはヌクレオチド１８〜６４０、又は手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）の配列、好ましくはヌクレオチド３６９〜８０４を使用することも可能である。レトロウイルス、例えばモロニーマウスウイルス（ＭｏＭＬＶ）から誘導されたＩＲＥＳを使用することも可能である。
【００１７】
更に、転写が単一のプロモーターによって開始される単一のｍＲＮＡから複数のタンパク質の翻訳を可能にする任意な配列を思料することも可能である。例えば、これらの配列は、２つの異なるタンパク質をコードする２つのシストロン間での連続的なリボソームの読み込みを単純に可能にすることがある。
【００１８】
「選択配列」の表現は、本発明の核酸コンストラクトを組み込んだ細胞とトランスフェクションが失敗した細胞を選別することを可能にする配列を意味すると解される。
【００１９】
これらの選択配列は、「ポジティブ」又は「ネガティブ」であってもよく、そして優性又は劣性であってもよい。「ポジティブ」な選択配列は、この遺伝子を有する細胞のみをある条件下で生存させ、そして／あるいは複製させる生成物をコードする遺伝子を言及する。これらの「ポジティブ」な選択配列の中でも、特に抗生物質、例えばネオマイシン（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオイシン（ｚｅｏｙｃｉｎ）、ブラスチシジン、フレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性のための遺伝子配列が言及されることがある。別の可能性のある選択配列として、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）がある。ＨＰＲＴ遺伝子を有する細胞は、ＨＡＴ培地（アミノプテリン、ヒポキサンチン及びチミジン）上で生育することができ、一方、ＨＰＲＴネガティブな細胞は、ＨＡＴ培地上では死滅する。
【００２０】
反対に、「ネガティブ」な選択配列は、当該遺伝子を有する細胞を選択的に死滅させるべく誘導されうる生成物をコードする遺伝子を言及する。このタイプの選択配列の限定しない例として、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）及びＨＰＲＴがある。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有する細胞は、ガンシクロビル又はＦＩＡＵ（１（１，２−デスオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−ラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）の存在下で死滅する。ＨＰＲＴ遺伝子を有する細胞は、６−チオグアニン（６ＴＧ）によって選択的に死滅しうる。
【００２１】
他の「ポジティブ」又は「ネガティブ」な選択配列の例は、当業者に周知である。
【００２２】
有利には、本発明の核酸コンストラクトは更に検出可能な配列を含んで成ることもある。
【００２３】
「検出可能な配列」の表現は、注目のタンパク質の発現レベルを容易に評価するためのマーカーとして有用な、検出可能なタンパク質をコードする配列を意味すると解される。「レポーター遺伝子」の表現も、この場合に使用される。それは、例えば、酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、アルカリホスファターゼ、例えばヒトアルカリホスファターゼ（Ａｐｈ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、又は当業者に周知の任意な他の検出可能なマーカーであってもよい。
【００２４】
好ましくは、前記の検出可能な配列は、選択配列と連結されてもよい。この連結は、上述のようなリボソームによる翻訳を可能にする配列を介して、又は検出可能な配列と選択配列との融合によって実施されうる。それは特に、融合タンパク質β−ガラクトシダーゼ−ｎｅｏｒをコードするβｇｅｏ因子を使用することも可能である（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ， １９９１）。
【００２５】
「転写終結配列」の表現は、転写を停止させることを可能にする任意な配列、特にポリアデニル化（ポリＡ）配列に含まれる停止部位、を意味すると解される。それは、ウイルス由来のポリＡ、特に「シミアンウイルス４０」（ＳＶ４０）のポリＡ、又は真核細胞の遺伝子由来のポリＡ、特にホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｋ−１）のポリＡ、又はウサギβ−グロビンをコードする遺伝子のポリＡであってもよい。
【００２６】
本発明の第一の態様に従う、注目の前記タンパク質は誘導性のリコンビナーゼであってもよい。
【００２７】
好ましくは、Ｐ１バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｓｅ）Ｃｒｅのリコンビナーゼ（Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３）、又は例えば酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｌｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を使用することができる。これらのリコンビナーゼは修飾され、又はそれらに誘導特性を与える配列に作用可能に連結される（特に融合による）。この様に、あらかじめ内因性のエストロゲンと結合しないように変異されたエストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインに融合したリコンビナーゼを使用する事も可能である。他方では、それはタモキシフェン又はその類似体の１つによって活性化されることがある（Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。また、他のドメイン、例えばプロゲステロン受容体（ＰＲ）のリガンド結合ドメイン（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６）又はグルココルチコイド受容体のリガンド結合ドメイン（Ｂｒｏｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８）と融合したリコンビナーゼを使用する事も可能である。これらのドメインは、あらかじめそれらの天然のリガンドによっては活性化されないが、合成分子、例えばデキサメタゾン又はＲＵ４８６によってのみ活性化されるように変異される。
【００２８】
有利には、リコンビナーゼ活性がタモキシフェン又はその類似体によって非常に容易に誘導されるタンパク質をコードするＣｒｅ ＥＲＴ２配列（Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を使用することが出来る。
【００２９】
更に詳細には、本発明は、上文で定義したような核酸コンストラクトであって、
ｉ）スプライス受容部位
ｉｉ）上流にβ−ガラクトシダーゼをコードする検出可能な配列が先行しているネオマイシン耐性選択配列であって、全体としてβ−ｇｅｏと表されるもの、
ｉｉｉ）上流にリボソームによる翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列が先行しているＣｒｅ ＥＲＴ２配列、
ｉｖ）転写の終結のための、少なくとも１つの停止部位を含む少なくとも１つのポリＡ配列、
を含んで成る核酸コンストラクト、を提供する。
【００３０】
本発明の第二の態様に従う、注目の前記タンパク質は、治療的に注目されているタンパク質又は分化因子であることがある。特に、注目のタンパク質として、血液タンパク質、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、神経伝達物質、酵素、抗体、ＤＮＡの修復に関与する因子、ＤＮＡ構造タンパク質、転写因子、転写コアクチベーター又はコリプレッサー、ＨＬＡ系のタンパク質、免疫系のタンパク質、膜受容体、細胞分割に関与するタンパク質、発ガン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ホルモン受容体、プログラム細胞死に関与する因子、細胞遊走に関与するタンパク質、細胞骨格タンパク質、ウイルスタンパク質、原核生物由来のタンパク質等、を言及することができる。
【００３１】
本発明の第三の態様に従う、注目のタンパク質をコードする前記配列をアンチセンス配列で置換して、注目のタンパク質の翻訳を妨害することができる。
【００３２】
本発明の対象は、上文で定義したような核酸コンストラクトであって、リコンビナーゼ認識配列、例えば、ＬｏｘＰ配列が、任意に、リボソームによる翻訳を可能にする配列が上流に先行し、そして、少なくとも１つの追加の転写終結配列が下流に続く前記選択配列によって形成されたカセットであって、注目のタンパク質をコードする前記配列の上流に配置されたカセットを挟む核酸コンストラクトである。
【００３３】
この場合、注目の前記タンパク質は検出可能なマーカータンパク質（研究のプロトコールの観点から有用なもの）、又は有利には治療的に注目されるタンパク質又は分化因子であってもよい。
【００３４】
検出可能なマーカータンパク質をコードし、そして任意にリボソームによる翻訳を可能にする配列が先行している検出可能な配列が、続いて前記カセットに挿入されることがある。
【００３５】
この検出可能な配列は、選択配列のように、本発明の核酸コンストラクトのいずれのプロモーターの制御下にはない。
【００３６】
本発明の１つの対象は、更に詳細には、上文で定義したような核酸コンストラクトであって、上流から下流にかけて
ｉ）スプライス受容部位、
ｉｉ）上流から下流にかけて
−任意なある配列、例えば、リボソームによる翻訳を可能にする、それに続く選択配列のＩＲＥＳ配列、
−選択配列、例えばハイグロマイシンに対する耐性のための配列、
−任意な、検出可能なマーカータンパク質をコードする配列、例えばヒトアルカリホスファターゼ（Ａｐｈ）をコードする配列であって、リボソームによる翻訳を可能にする配列が先行したもの、
−複数のポリＡに複数の停止部位を含んで成る転写終結配列、
によって形成されたカセットであって、ＬｏｘＰ配列によって挟まれたカセット、
ｉｉｉ）注目のタンパク質をコードし、上流をリボソームによる翻訳を可能にする配列、例えばＩＲＥＳ配列が先行している配列、
ｉｖ）転写終結配列、
を含んで成る核酸コンストラクトに関する。
【００３７】
本発明の対象はまた、上文で定義したような核酸コンストラクトが挿入されたベクターである。
【００３８】
それは、細菌起源のプラスミドベクター又は組換えウイルスベクター、例えば修飾されたアデノウイルス又はレトロウイルスベクター、例えばＲＯＳＡ β ＧＥＯベクター（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１）であってもよい。有利には、細菌プラスミドｐＢＳＫ又は細菌プラスミドｐＩｒｅｓＨｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６０６１）を使用することも可能である。
【００３９】
本発明の対象はまた、少なくとも１つのそのようなベクターが安定に伝達された宿主細胞である。
【００４０】
用語「宿主細胞」は、培養中の又はｉｎ ｖｉｖｏの、生物の一部としての、任意な哺乳類細胞又は別の真核細胞であって、あらかじめ融合し、又は遺伝子修飾することが可能なものを含んで成る。それは、例えば、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ＥＧ細胞系（胚性生殖細胞）、奇形ガン幹細胞系、例えばＦ９細胞、不死化線維芽細胞系、例えばＮＩＨ ３Ｔ３、リンパ芽球性細胞系、例えばＪｕｒｋａｔ細胞等であってもよい。
【００４１】
本発明の特定の態様に従い、誘導性のリコンビナーゼをコードする配列含んで成る上文で定義したような少なくとも１つの核酸コンストラクト、及び前記リコンビナーゼの認識のための配列及び注目のタンパク質をコードする配列を含んで成る少なくとも１つの核酸コンストラクトを宿主細胞に伝達し、その結果、これらの２つのコンストラクトが前記細胞のゲノムに一緒に組み込まれる。
【００４２】
宿主細胞への当該ベクターの伝達は、当業者に知られた標準的な技術によって、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、又はリポフェクションによって実施されうる。
【００４３】
通常、本発明のヌクレオチドベクターは、裸の型で、すなわち、トランスフェクションを容易にする任意な物質無しに、又は、例えば細胞透過性を修飾する化学物質（例えばブピバカイン）の様な物質、リポソーム、陽イオン性脂質又は微粒子、例えば金、シリカ又はタングステンの微粒子と組み合わせて放出されることがある。
【００４４】
選択される伝達の形態は、当業者に周知な様に、宿主細胞に主に依存する。
【００４５】
更に詳細には、本発明は、宿主細胞が幹細胞、好ましくは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である場合に関する。
【００４６】
ＥＳ細胞は、胚盤胞期の胚を構成する細胞塊から得られる。それらは成体の生物の全ての細胞型、特に生殖細胞への分化を受けることができる。これらの細胞は、全能性の、すなわち分化細胞の全ての可能な型を与えることができる、又は多能性の、すなわちある型の細胞系（特に造血細胞）を与えることができる、あるいは選択した培養条件（Ｆｒａｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００）に従い分化され、若しくは分化を受ける細胞群を開発するべく培養されることがある。
【００４７】
本発明のＥＳ細胞はヒト細胞であってもよく、又はヒト以外の動物、好ましくは哺乳類に由来してもよい。
【００４８】
本発明の対象はまた、上文で定義したようなベクターがゲノムに機能的に組み込まれた、上文で定義したような宿主細胞から得られる細胞系のバンクである。
【００４９】
特に、本発明者は、タモキシフェン誘導性のＣｒｅリコンビナーゼ、例えばＣｒｅ ＥＲＴ２の発現を可能にする、上文で定義したようなベクターをそれらのゲノムに機能的に組み込んだＥＳ細胞系のバンクを開発した。それらは、３つの基準：
−これらの細胞系が、誘導性リコンビナーゼの、非常に高い発現レベルを有していること、
−リコンビナーゼ活性がタモキシフェン又はその誘導体の不在下で、これらの細胞系において検出不可能であること。他方で、Ｃｒｅのリコンビナーゼ活性がタモキシフェン又はその誘導体によって容易に誘導されること、
−誘導性リコンビナーゼの発現が胚の発育の間安定であるが、偏在性又は組織特異的のいずれかであると思われること、
を特徴とするＥＳ細胞系を選択した。
【００５０】
この様に特徴づけられた細胞は、ゲノムに、誘導性のＣｒｅリコンビナーゼによって注目のタンパク質の発現を可能にする、上文で定義したような第二のベクターが組み込まれる、ＥＳ細胞系の新規バンクを構築するために使用される。
【００５１】
これらの様々なバンクに由来し、且つ、それ故に本発明の核酸コンストラクトを有するＥＳ細胞は、遺伝子を修飾した動物（トランスジェニック動物とも称される）を得るために使用されることもある。ＥＳ細胞からトランスジェニック動物を得るために常用される技術は、胚盤胞への注入技術及び集合技術である（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。これらの技術は、胚盤胞期のレシピエント胚への注入技術又は桑実期のレシピエント胚によるＥＳ細胞の集合（集合技術）に存する。得られたキメラ胚は、キャリアの雌の子宮に再移植される。得られたキメラ動物は、野生型細胞及び遺伝子修飾を有する細胞が混合されたものから成る。トランスジェニック動物を得るために、キメラマウスは、続いて野生型マウスと交配されるはずである。受精は、野生型細胞、又は遺伝子修飾された細胞のいずれかで起こる。
【００５２】
このように、本発明は、注目のタンパク質を誘導的に又は非誘導的に過剰発現することができるトランスジェニック動物を産生するための手段を提供する。ＥＳ細胞における上述した核酸ベクターの使用は、更に、卵母細胞へのＤＮＡのマイクロインジェクション技術と比較して多くの利点を有する。
【００５３】
卵母細胞へのマイクロインジェクション技術を用いて、レシピエントゲノムへの導入遺伝子の挿入は、ランダムに且つあらゆる選択手段無しに起こる。このように、その発現は、挿入部位の染色体の環境によって通常ネガティブに影響を受ける。このネガティブな影響はしばしば、発現の消滅又はこの発現のモザイク現象へと形を変える。多くの場合、導入遺伝子の発現レベルが不十分であることが判明しており、又はその発現を調節するプロモーターの活性は、その組織特異性を修飾する内因性の制御因子によって乱される。対照的に、ＥＳ細胞に対する本発明の系の適用は、実験者が、予想される組織において注目のタンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物を得ることを可能にするＥＳ細胞系をｉｎ ｖｉｔｒｏで選択することを可能にする。クローンの選択は、注目のタンパク質の発現レベル及び発現ドメインに従い事後的に実施される。
【００５４】
上述のベクター由来のプロモーターが無いことは、それらの機能が、それらが組み込まれた宿主ゲノムの部位に厳密に依存することを暗示する。本発明のベクターは、それらが組み込まれた部位の天然の発現特性を自己のものとする。この能力は、ウイルスプロモーター：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターＳＶ４０プロモーターのように常用の発現系で頻発する発現の消滅及びモザイク現象の全ての問題をかなり低下させることができる。
【００５５】
従って、本発明の系は、トランスジェニック動物を産生するためのより単純で且つより費用効果のある手段を提供する。
【００５６】
従って、本発明の対象は、上文で定義したようなＥＳ細胞から得ることができるヒト以外のトランスジェニック動物である。
【００５７】
この様に産生したトランスジェニック動物は、注目の組換えタンパク質、例えば上文で言及した治療的に注目されるタンパク質にとって特に有用であると思われる。また、これらの動物に、注目の組換えタンパク質のように機能的に欠陥のあるタンパク質を過剰発現させることもできる。得られたトランスジェニック動物は、その結果、これらの非機能的タンパク質、例えば短縮型又は変異型タンパク質の発現によって引き起こされる病変の実験モデルとして有用である。それは特に、その変異がヒトの嚢胞性線維症の原因とされるＣＦＴＲ（嚢胞性線維性膜貫通調節因子）タンパク質の場合である。また、これらの動物にｒａｓ， ｊｕｎ， ｆｏｓ又はβ−カテニンタンパク質のようなある発ガン遺伝子を発現させることも可能である。同様に、ｐ５３又はｐＲｂのような、ある抗発ガンタンパク質のネガティブなドメインを発現することもできる。
【００５８】
本発明の核酸コンストラクトを組み込んでいるＥＳ細胞はまた、細胞移植のストラテジーの観点で利用されうる。
【００５９】
このストラテジーの一般的な原理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経又は造血幹細胞等へのＥＳ細胞の分化、及び動物又はヒトへのこれらの「あらかじめ決定された」細胞の注入に基づいている。組織の修復はこの点関連でも語られる（Ｗａｔｔ ａｎｄ Ｈｏｇａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００）。
【００６０】
従って、本発明は、分化細胞を調製するための方法であって、上文で言及した全能性ＥＳ細胞が分化物質、適当な場合には、リコンビナーゼ誘導物質の存在下で培養される、方法に及ぶ。
【００６１】
上述のように、リコンビナーゼで誘導される発現系は、更に詳細には、その活性が幹細胞を特異的な分化経路に据えることを担う、遺伝子の調節された発現を誘導することを可能にする。
【００６２】
前記「分化物質」は当業者に周知である。特にレチノイン酸（ＲＡ）（Ｒｅｎｏｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）（Ｄｉｎｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）が言及されることがある。
【００６３】
同様に、ＥＳ細胞を培養する条件も現在よく確立されている（Ｄｉｎｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｄｉｎｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【００６４】
更に、本発明には、この方法で得ることが出来る細胞が含まれる。
【００６５】
この様に得られた分化細胞は、動物実験の代わりのための細胞モデルとして役割を果たすことができる。事実、上述の方法は、所定の細胞型の大量の分化細胞を産生する事を可能にする。それにより、動物で直接試験する代わり、にこれらの細胞上で、治療効果を有する分子の毒性を容易に試験することを可能となる。
【００６６】
本発明の対象はまた、治療処置の方法であって、あらかじめｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾され、且つ分化した細胞がその様な処置を必要とするレシピエント生物に移植される方法、である。
【００６７】
ＥＳ細胞由来のあらかじめ決定された細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞を用いるこの細胞移植技術は、非常に特異的な代謝的補性について可能性のあるストラテジーを提供する。例えば、神経変性疾患の処置において、ニューロメディエーターを産生する神経細胞の移植は、明らかに臨床的に注目されるものである。特にＥＳ細胞で誘導可能な発現系を用いて、神経伝達物質をコードし、且つその合成を刺激する不活性遺伝子を誘導し、そして次にＥＳ細胞の神経細胞への分化を誘導し、そして当該細胞をレシピエント生物への再移植の際に当該遺伝子の発現を活性化することが可能である。
【００６８】
通常、本発明はまた、治療的処置の方法であって、その様な処置を必要とするレシピエント生物に、誘導性リコンビナーゼをコードする配列、並びに注目の核酸コンストラクト及びリコンビナーゼ認識配列を含んで成る核酸コンストラクトを組み込み、あらかじめｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾され、且つ分化した細胞が移植され、そして注目のタンパク質の発現を可能にするのに十分な一定量の誘導物質が前記レシピエント細胞に投与される、方法に関する。
【００６９】
本発明の対象はまた、注目の組換えタンパク質を産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、注目の組換えタンパク質をコードする配列を含んで成る、上文で定義したような核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれたＥＳ細胞が、注目の前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、そしてこのように産生したタンパク質が回収される方法である。
【００７０】
本発明の特定の態様に従い使用されるＥＳ細胞は、誘導性リコンビナーゼをコードする配列を含んで成る、上文で定義したような少なくとも１つの核酸コンストラクト並びに前記リコンビナーゼの認識のための配列及び注目のタンパク質をコードする配列を含んで成る少なくとも１つの核酸コンストラクトが一緒にゲノムに組み込まれる胚性幹細胞であり、当該細胞は分化物質の存在下で培養され、この様に得られた分化細胞は、続いて、注目の前記タンパク質の発現が可能となるように、前記リコンビナーゼを誘導する物質と接触される。
【００７１】
この方法は、タンパク質を天然に作る細胞型で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで当該タンパク質を産生するのに特に有利である。
【００７２】
事実、機能的であるために、これらの分子はしばしば、それらを産生するために慣習的に使用される微生物で行われないが、時に、上文の分化細胞の場合に、これらの分子を天然に作り出す細胞型でのみ実施される翻訳後修飾を必要とする。
【００７３】
本発明はまた、病変に関与する遺伝子又は分化過程に関与する遺伝子を研究するための動物モデルの開発に関する。
【００７４】
本発明の対象は、更に詳細には、病変に関与する遺伝子を研究するためのモデルとして特に有用なヒト以外のトランスジェニック動物を産生するための方法であって、誘導性リコンビナーゼをコードする配列を含んで成る、上文で定義したような少なくとも１つの核酸コンストラクトがゲノムに組み込まれたヒト以外の動物が、ゲノムの中の注目の遺伝子が誘導性リコンビナーゼによって認識される２つの部位によって挟まれているヒト以外の動物と交配されて、それが前記リコンビナーゼを誘導する物質にかけられた場合に、注目の前記遺伝子の欠失を受けるヒト以外のトランスジェニック動物が得られる方法、である。
【００７５】
誘導性リコンビナーゼによって認識される２つの部位によって挟まれた遺伝子は、「ｆｌｏｘ型」遺伝子と称される。ヒト以外の動物は、野生型の表現型を有しており、このことは、「ｆｌｏｘ型」遺伝子が機能的であり、誘導性リコンビナーゼによって認識される部位が、その機能を破壊しないように誘導されていることを示唆している。この交配に由来する動物のいくつかは、それらゲノムにおいて上文で言及した２つの遺伝子修飾を有する。続いて、誘導物質によってリコンビナーゼの活性を誘導することによって、ｆｌｏｘ型遺伝子を破壊することが可能である。それにより、当該動物は、破壊された遺伝子が重要な機能を有する場合には変異体の表現型を獲得する。
【００７６】
誘導性遺伝子を欠失するこの方法は、あらゆる年齢の動物の任意な遺伝子を破壊することを可能にし、これは現在既存の技術では不可能である。
【００７７】
この方法によって得ることが出来る、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば特にマウス又は上文で言及した別の動物も、本発明に含まれる。
【００７８】
以下の例及び図面は、それらの範囲を限定することなく本発明を例示する。
【００７９】
例
例１：ベクターｐＧＴＥＶ−Ｃｒｅ ＥＲＴ２の構築
本発明者は、タモキシフェンによって誘導されるリコンビナーゼＣｒｅ ＥＲＴ２（Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を発現するためのベクターを構築した。このベクターはプロモーターを含まない。
【００８０】
転写は、組み込み部位付近に位置する細胞のプロモーターからのみ開始され得る。スプライス受容部位（ＳＡ）は、組み込みがイントロンで起こった場合に、メッセンジャーの正確なスプライシング及び融合タンパク質の形成を可能にする。当該ベクターはまた、融合タンパク質β−ガラクトシダーゼ−ｎｅｏｒを発現する（βｇｅｏ遺伝子）。Ｃｒｅ ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現は、ＩＲＥＳ配列（リボソーム内部進入配列）の使用のおかげでβ−ガラクトシダーゼの発現へと結びつく。
【００８１】
このｐＧＴＥＶベクター（図１及び２を参照のこと）は、以下のように構築された：ＳＡ β ｇｅｏ配列を、以下のオリゴヌクレオチド５’ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＡＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＣＧ ＡＧＧ ＴＴＴ Ａ ３’（配列番号１）及び５’ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＧＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＴＡ ＴＧＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＡＴ ＡＧ ３’（配列番号２）を用いて、ＰＣＲによって増幅し、そしてベクターＲＯＳＡ β ｇｅｏ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１）から生成した。このように増幅された３．７キロベース（ｋｂ）のフラグメントを酵素ＳｐｅＩ及びＮｓｉＩで消化し、そして次にあらかじめ同じ酵素で消化したＣＭＶ Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ベクターに粘着性のライゲーションによって導入した。ＣＭＶ Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ベクターは、ＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＣｒｅ−ＥＲＴ２（Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）から得たＣｒｅ ＥＲＴ２カセットを挿入することによって得られた。この様にして得られたフラグメントの末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされた。当該フラグメントは、ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化され、そして末端が同様にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされたベクターｐＩｒｅｓＮｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｃａｔａｌｏｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６０６０−１）へのライゲーションによって導入された。ベクターｐＧＴＥＶもこのようにして得られる。
【００８２】
例２
マウスＥＳ細胞におけるＣｒｅ ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現
２．１．ＥＳ細胞のエレクトロポレーション：
ＥＳ細胞はトリプシン処理にかけられ、そして次にＧＭＥＭ培地中で２回すすがれる。それらは最終的にＧＭＥＭ中で６．２５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁される。安定した発現のために、４０μｇのプラスミドがＳｓｐＩで消化され、そして次に、０．８ｍｌのＥＳ細胞溶液が入ったエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に加えられる。当該細胞は、次に５００μＦのキャパシタンスで、２５０Ｖの電圧でエレクトロポレーションにかけられる。エレクトロポレーションの後、当該細胞はあらかじめ照射したフィーダー細胞中に据えられる。エレクトロポレーションから４８時間後、当該細胞は抗生物質Ｇ４１８と接触される。
【００８３】
２．２．リコンビナーゼの発現レベルの評価：
活性の細胞プロモーター付近にベクターを組み込んだ細胞は、Ｇ４１８に対し耐性があり、且つそれらを容易に選択することを可能にするβ−ガラクトシダーゼを合成する。
【００８４】
リコンビナーゼの産生は更にβ−ガラクトシダーゼの産生に比例しており、本発明者はリコンビナーゼの発現レベルを容易に評価することが出来た。
【００８５】
このベクターの使用は、常用の発現ベクターでは達成され得なかった、β−ガラクトシダーゼ及びＣｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現レベルを得ることを可能にする。そのような発現レベルは、毒性のない濃度のヒドロキシタモキシフェンの存在下で高いリコンビナーゼ活性を得るために必要である（図７Ａ及びＢ）。
【００８６】
例３：
ＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞系の選択
本発明者は、各構成因子が、ベクターＰＧＴＥＶ−Ｃｒｅ ＥＲＴ２の特異的な組み込み部位を特徴とする、１１０ ＥＳ細胞系のバンクを作成した。従って、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現レベル及び発現ドメインは、ベクターの組み込み部位に従い、各系で変化する。最初の事例において、本発明者は、活性がヒドロキシタモキシフェンによって容易に誘導されるような非常に高いリコンビナーゼの発現レベルを特徴とする系を選択した。そのために、本発明者は、あらかじめ最も効率的な系を選択することを可能にする３つの基準を定義した：
【００８７】
１）Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現レベルが、ＥＳ細胞及び分化細胞（分化は胚様体の形成によってｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された）の両方で、非常に高くあるべきである。リコンビナーゼの発現レベルは、β−ガラクトシダーゼの発現レベルを基に評価された（組織化学染色）。
【００８８】
２）Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼ活性は、ヒドロキシタモキシフェンの不在下（バックグラウンドノイズの不在下）ではゼロであるべきであり、そして、ヒドロキシタモキシフェンが培養液に添加された場合には素速く誘導されるべきである。このパラメーターを評価するために、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼ活性のためのレポーターベクターが構築された。ｐＣＡＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡＤＨと称されるこのベクターは、上流から下流にかけて、（１）ＥＳ細胞で機能する非常に強力なプロモーターＣＡＡＧ、（２）ハイグロマイシンに対する耐性のための遺伝子及び転写を停止させるポリアデニル化（ポリＡ）シグナルであって、全体がｌｏｘＰ配列によって挟まれている当該耐性遺伝子及びポリＡ配列によって形成されるもの、（３）組織化学染色後に細胞に灰色を与える、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする配列、及び、最後に、（４）ポリＡ配列、を含んで成る。
【００８９】
ベクターｐＣＡＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡＤＨは以下のように構築された：ベクターｐＰＨＣＡＡＧ−ＢｓｔＸＩ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）を酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで消化した。このようにして得られた４キロベースのフラグメントは、ｐＣＡＡＧプロモーターに相当する。このフラグメントは、粘着性のライゲーションによってあらかじめＳａｌＩで消化したベクターｐＢＳＫ内に導入された。得られた新規ベクターは、ｐＢＳＫ ｐＣＡＧＧと称される。ベクターｐＴ１０２を酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、粘着性のライゲーションによって酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化されたベクターｐＢＳＫ ｐＣＡＡＧ内に導入されたｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰカセットに相当する。得られた新規ベクターは、ｐＣＡＡＧ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰと称される。ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−ＡＤＨ（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６）を酵素ＢａｍＨＩで消化した。このようにして得られたフラグメントの末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にした。当該フラグメントは、ＮｏｔＩで消化され、そして末端が同様にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされたベクターｐＣＡＡＧ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰへのライゲーションによって導入された。ベクターｐＣＡＡＧ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰ−ＡＤＨもこのようにして得られる。
【００９０】
アルコールデヒドロゲナーゼのためのＡＤＨのレポーター遺伝子が、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼが活性である場合にのみ機能するのは、２つのｌｏｘＰ部位によって挟まれた転写停止シグナルがその転写を妨害するためである。ヒドロキシタモキシフェンによるリコンビナーゼの活性化は、ＡＤＨレポーター遺伝子の発現を可能にするために、ｌｏｘＰ部位のレベルでの切除によって、転写停止シグナルを消失させるはずである。それにより、本発明者は上文で定義した２つの基準を満たす系を選択することができた（ヒドロキシタモキシフェンの不在下でリコンビナーゼ活性はゼロであり、ヒドロキシタモキシフェンの存在下で活性は最大である）。
【００９１】
３）Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼの発現は、発育胚へのｉｎ ｖｉｖｏでの分化の後に保全されるべきである。最初の２つの基準を満たしたＥＳ細胞系を、胚盤胞期のレシピエント胚に注入した（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。このようにして得られたキメラ胚を、キャリアマウスの子宮に再移植し、そして次にβ−ガラクトシダーゼの発現ドメインを決定するために、様々な発育段階で解剖した。試験した各系について、偏在性の及び組織特異的なリコンビナーゼの発現をこのようにして定義することができた。
【００９２】
これらの３つの基準は、（ｉ）最初の発育段階の間に、胚の全ての組織でリコンビナーゼの発現を可能にし；（ｉｉ）そのリコンビナーゼ活性がヒドロキシタモキシフェンによってｉｎ ｖｉｔｒｏで極めて厳密に制御される、１５ ＥＳ細胞系を選択することを可能にした。
【００９３】
ＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２と称されるこれらの系は、非常に高レベルで且つ顕著な安定性での導入遺伝子の発現を可能にする、新型ベクターｐＧＴＥＶ−Ｃｒｅ ＥＲＴ２を用いて単離することができた。注意しなければならないのは、遺伝子の過剰発現に常用されている発現プラスミド（強力なウイルスプロモーターを用いるプラスミド）が、ＥＳ細胞でその様な効率を得ることを可能にしないことである。
【００９４】
例４：
注目の導入遺伝子の誘導発現を可能にするＥＳ細胞の産生
ＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞の使用の１つに、これらの細胞における導入遺伝子の誘導発現のための系の産生がある。それを目的として、本発明者は、注目の遺伝子としてヒトアルカリホスファターゼをコードするＡｐｈ遺伝子を含んで成る、ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈと称される別のベクターを構築した（図３Ａ及び図４を参照のこと）。前記遺伝子は、当該ベクターが強力な細胞のプロモーター付近に組み込まれる場合にのみ発現することができる。他方で、その転写は、ｍＲＮＡの合成を停止するｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰカセットによって妨害される。ヒドロキシタモキシフェンの存在下で、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼは活性化され、ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰカセットは切除され、そしてＡｐｈ遺伝子が発現し得る。本発明者は、ゲノムに組み込まれたこのベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈのコピーをも含むＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞のサブクローンを単離した。これらのサブクローンを、Ａｐｈの発現を誘導するために、１μＭのヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）と接触させた。４８時間後、Ａｐｈ活性がＢｉｏｌａｂｓのプロトコール（Ｒｅｆ． １７２−１０６３）に従い測定された。
【００９５】
本発明者は、培養液中のヒドロキシタモキシフェンの存在に密接に依存するアルカリホスファターゼの発現を観察することができた。それにより、幾つかのクローンにおいて、ヒドロキシタモキシフェンの存在下でのアルカリホスファターゼの発現の誘導は、８０の因数に達し、一方、バックグラウンドノイズはゼロである（図８）。
【００９６】
本発明の発現系の比較のために、本発明者はまた、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６のプロトコールに従い、ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｋ−１）のｐｇｋプロモーターを基にした常用の発現系を用いてＣｒｅ−ＥＲＴ２を発現するＥＳ細胞系を確立した。機能もｐｇｋプロモーターに基づいている、Ｃｒｅによって誘導されるβ−ガラクトシダーゼの発現のためのベクターが更に導入された。それにより、ヒドロキシタモキシフェン又はその誘導体の１つの存在下で、β−ガラクトシダーゼの発現がＣｒｅ−ＥＲＴ２によって誘導される。
【００９７】
様々なＥＳ ｐｇｋ Ｃｒｅ ＥＲＴ２／ｐｇｋβ−ガラクトシダーゼ細胞のクローンは、Ａｐｈの発現を誘導するために、ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）と接触された。４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性が組織化学染色によって視覚化された。
【００９８】
得られた最良のクローンを図８Ｂに示す。この写真で、ごくわずかな細胞がβ−ガラクトシダーゼを発現することが見て取れる（約４０％のクローンの細胞が青色に染色される）。この結果は、１００％の細胞が誘導されている、本発明に従う「遺伝子トラップ発現」の技術を用いて得られるＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ−Ａｐｈ細胞系のもの（図９）と同じ誘導条件下で得られるものよりも遙かに低い。
【００９９】
図９Ａは、β−ガラクトシダーゼ活性を検出するための組織化学染色後のＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ系を表す。青色はこの活性に由来する。全ての細胞が非常に暗いことが見て取れ、これは最高のβ−ガラクトシダーゼ活性、つまり高いＣｒｅ−ＥＲＴ２の発現を示している。
【０１００】
図９Ｂは、ヒドロキシタモキシフェンの不在下で培養されたＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ系を表す。アルカリホスファターゼ活性（Ａｐｈ）を検出するための組織化学染色後に、細胞はＡｐｈ活性の特徴である黒色を示さない。従って、ヒドロキシタモキシフェン又はその誘導体の１つの不在下でＡｐｈの発現は誘導されない。
【０１０１】
図９Ｃは、１μＭのヒドロキシタモキシフェンの存在下で４８時間培養したＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ系を表す。アルカリホスファターゼ（Ａｐｈ）活性を検出するための組織化学染色後に、１００％の細胞がＡｐｈ活性の特徴である黒色を示す。従って、誘導物質の存在下で全ての細胞のＡｐｈの発現が誘導される。
【０１０２】
従って、これらの結果は、他の誘導発現系を用いてＥＳ細胞で得られたもの（Ｓａｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９７）よりもかなり高い。
【０１０３】
続いて、本発明者は、機能がｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈのものを基としているＣｒｅ−ＥＲＴ２によって誘導可能なベクターを構築した。しかしながら、ｐＩＧＴＥ３， ｐＩＧＴＥ４及びｐＩＧＴＥ５と表されるこれらのベクター（図３Ｂ〜３Ｄを参照のこと）は、Ａｐｈ以外の注目のタンパク質を誘導可能に過剰発現するために設計された。これにより、本発明者は、これらのベクターにサイクリンＤ１（ｐＩＧＴＥ４−Ｄ１）、サイクリンＤ２（ｐＩＧＴＥ４−Ｄ２）、増殖阻害因子ｐ１８ｉｎｋ４ｃ（ｐＩＧＴＥ４−ｐ１８ｉｎｋ４ｃ）及びｐ２１ｃｉｐ１（ｐＩＧＴＥ４−ｐ２１ｃｉｐ１）をコードする配列を挿入した。エレクトロポレーション後、本発明者は、上文で言及したベクターの少なくとも１つのコピーを組み込んだＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞のサブクローンを単離した。それにより、本発明者は、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、ｐ１８ｉｎｋ４ｃ、又はｐ２１ｃｉｐ１を誘導可能に過剰発現することができるＥＳ細胞系を確立した。
【０１０４】
ベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈは、以下の様に構築した：ベクターＲＯＳＡ β Ｇｅｏ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１）を酵素ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この様にして得られた３００ｂｐのフラグメントは、スプライス受容部位に相当する。このフラグメントは、ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＣＭＶ Ｉｒｅｓ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ベクターへの粘着性のライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターはｐＳＡと称される。
【０１０５】
ベクターｐＴ１０２を酵素ＥｃｏＲＩ及びＢＳＴＥＩＩで消化し、そして再びセルフライゲーションした。この作業は、ＰＴ１０２からＰＧＫ ＴＫフラグメントを排除することを可能にした。この様にして得られた新規ベクターをｐＴ１０２−ＴＫと称する。このベクターを酵素ＮｄｅＩで消化した。得られたフラグメントはカセットｌｏｘＰ−ＰＧＫ ＮｅｏポリＡポリＡ−ｌｏｘＰに相当する。このフラグメントの末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。当該フラグメントは、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化され、そして末端が同様にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされたベクターｐＳＡへのライゲーションによって導入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＳＡ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰと称する。
【０１０６】
ベクターｐＨｙｇＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｃａｔａｌｏｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６０１４−１）を酵素ＢａｍＨＩで消化した。この様にして得られた２ｋｂのフラグメントは、融合タンパク質ＨＹＧＲＯｅＧＦＰをコードする配列に対応する。このフラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。当該フラグメントは、続いてＡｐａＩ及びＮｃｏＩで消化され且つ末端がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にされたベクターｐＳＡ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰに、ライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＩＧＴＥ２と称する。
【０１０７】
ベクターＰＨＷ３（Ｔｏｒｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）をＳａｌＩ及びＳｐｅＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、Ｉｒｅｓ Ａｐｈ配列に相当する。このフラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。当該フラグメントは、続いて、酵素ＸｂａＩで消化し、且つ末端がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にされたベクターｐＩｒｅｓＨｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）へのライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＩｒｅｓＨｙｇ Ｉｒｅｓ Ａｐｈと称した。
【０１０８】
ベクターｐＩｒｅｓＨｙｇ Ｉｒｅｓ Ａｐｈを酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、配列Ｉｒｅｓ ＡｐｈポリＡに相当する。このフラグメントの末端は、続いて、酵素ＸｂａＩで消化し且つ末端がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にされたベクターｐＩＧＴＥ２に、ライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＩＧＴＥ２ Ａｐｈと称した。
【０１０９】
ベクターｐＩＧＴＥ３は以下のように構築した：ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｃａｔａｌｏｇ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６０８５−１）を酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した。この様にして得られた１ｋｂのフラグメントは、ｅＧＦＰタンパク質をコードする配列に相当する。このフラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。当該フラグメントは、続いて、酵素ＢｓｔＸＩ及びＮｏｔＩで消化し且つ末端がＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にされたベクターＰｉｒｅｓＨｙｇに、ライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＥＧＦＰ Ｉｒｅｓ ＨＹＧＲＯと称する。
【０１１０】
ベクターｐＥＧＦＰ Ｉｒｅｓ ＨＹＧＲＯを酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、配列ＥＧＦＰ Ｉｒｅｓ ＨＹＧＲＯに相当する。このフラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。当該フラグメントは、続いて酵素ＡｐａＩ及びＮｃｏＩで消化し且つ末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にしたベクターｐＳＡ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰに、ライゲーションによって挿入された。この様にして得られた新規ベクターをｐＩＧＴＥ３と称する。
【０１１１】
ベクターｐＩＧＴＥ４は以下のように構築した：ベクターｐＳＡ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰを酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、配列ＳＡ ｌｏｘＰに相当する。このフラグメントは、続いて、酵素ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターｐＩｒｅｓＨｙｇ Ｉｒｅｓ Ａｐｈへのライゲーションによって挿入された。ベクター及びインサートの非粘着性の末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にされた。この様にして得られた新規ベクターをｐＳＡ ＨＹＧＲＯ Ｉｒｅｓ Ａｐｈと称する。
【０１１２】
ベクターｐＳＡ ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰを酵素ＣｌａＩで消化した。この様にして得られたフラグメントは、配列ポリＡポリＡ−ｌｏｘＰに相当する。このフラグメントの末端は、続いて、酵素ＸｈｏＩで消化し、末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑にしたベクターｐＳＡ ＨＹＧＲＯ Ｉｒｅｓ Ａｐｈへのライゲーションによって挿入した。この様にして得られた新規ベクターをｐＩＧＴＥ４と称する。
【０１１３】
例５：
選択されたＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞系由来のトランスジェニック動物の産生
ゲノムにベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈを組み込んだＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞系は、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４によるプロトコールに従い胚盤胞内への注入によってトランスジェニックマウスを産生するために使用された。
【０１１４】
ＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ−Ａｐｈ細胞は、桑実期の宿主胚に集合した（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。この様にして得られたキメラ胚をレシピエントマウスに再移植した。Ａｐｈの発現が、続いて、性交後６．５日目（６．５ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ−ｃｏｉｔｕｓ（ｄｐｃ））にヒドロキシタモキシフェンの腹腔内注射によって誘導された。８．５ｄｐｃでの解剖の後、Ａｐｈ活性は組織化学染色によって検出された。これにより、Ａｐｈを発現する細胞は褐色に染色され、一方、Ａｐｈを発現しない細胞は白色のままである。
【０１１５】
同一のプロトコールがネガティブコントロールで行われたが、６．５ ｄｐｃの注射は偽薬で実施した。
【０１１６】
図６で見られるように、ヒドロキシタモキシフェンを用いてｉｎ ｖｉｖｏで誘導された胚（右側と左側）は全ての組織でＡｐｈを強力に発現するが、ネガティブコントロール（中央の胚）は幾つかの細胞でしかＡｐｈを発現しない。
【０１１７】
例６：
誘導遺伝子無効系における本発明に従うＣｒｅ−ＥＲＴ２トランスジェニックマウスの使用
６．１．原理
例５で得られたマウスは、２つのｌｏｘＰ部位に挟まれた遺伝子（「ｆｌｏｘ型」遺伝子）を有するマウスと交配される。ｆｌｏｘ型遺伝子が機能的であるのは、ｌｏｘＰ部位がその機能を破壊しないように導入されたためである。このように、「ｆｌｏｘ型」マウスは野生型の表現型を有する。
【０１１８】
第二世代において、１２．５％の動物が、「ｆｌｏｘ型」遺伝子及びＣｒｅ ＥＲＴ２リコンビナーゼ遺伝子の２つの対立遺伝子を受け継いだ。この方法は、マウスの任意な発生段階での遺伝子の消失を誘導することを可能にする。ヒドロキシタモキシフェンが、続いてリコンビナーゼを活性化し、且つ当該遺伝子の欠失を誘導するために、腹腔内経路によって注射される。
【０１１９】
６．２．ガンの研究に対する適用
ヒトにおいて、Ｒｂ−１遺伝子の欠失は、高い遺伝性の構成成分を伴う複数の型のガン、特に網膜芽細胞腫の出現に関与する。マウスにおいて、Ｒｂ−１遺伝子の１つの対立遺伝子の変異が腫瘍の頻度をほんのごくわずか増大させる。２つの対立遺伝子の変異は、対照的に最初の胚期から致死的である。Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼを発現しているマウスを用いて、出生後のマウスにおけるＲｂ−１遺伝子の２つの対立遺伝子の条件的不活性化を誘導し、且つ様々な組織における腫瘍の出現を研究することが可能である。腫瘍抑制因子をコードする他の遺伝子は、このプロトコールに従い不活性化されうる：結腸ガンに関与するＡＰＣ遺伝子、乳ガン及び卵巣ガンに関与するＢＲＣＡ１遺伝子。
【０１２０】
６．３．急性膵炎の研究に対する適用
ｐ４８遺伝子は、膵臓の分化及び膵外分泌の機能に必要な転写因子をコードする。ｐ４８遺伝子の不活性化は胚の発育を中断する。Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼを発現しているマウスを用いて、成体のマウスにおいてｐ４８遺伝子の２つの対立遺伝子の条件的不活性化を誘導し、それにより膵臓の変性を誘導することが可能である。これらのマウスは、これにより急性膵炎のモデルを構成する。
【０１２１】
例７：
細胞移植に有用な分化細胞の産生
７．１．ＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞の分化
転写因子ｐｄｘ−１及びｐ４８をコードする遺伝子の活性は、膵β細胞への内胚葉の分化の誘導にとって必要十分であるようである。しかしながら、ＥＳ細胞におけるこれらの遺伝子の構成的過剰発現は、当該細胞によって耐用性が示される。本発明者は、「失われた（ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ）」配向でそれらをＣｒｅ−ＥＲＴ２細胞に誘導して内胚葉の細胞への分化を誘導し、そして次にｉｎ ｖｉｔｒｏでの膵臓の分化を促進するためにｐｄｘ−１及びｐ４８の発現を活性化することを提案した。
【０１２２】
発現がＣｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼで誘導可能な注目の誘導遺伝子として、ｐｄｘ−１及びｐ４８を含んで成る、例４で得られたＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２細胞系が、Ｊ． Ｏｄｏｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ． Ｐｏｓｔｅｒ ３２４． Ｋｅｙｓｔｏｎｅ ｓｙｍｐｏｓｉａ． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ． １７−２２ Ｊａｎｕａｒｙ ２０００， Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｃｏｌｏｒａｄｏ ＵＳＡで報告されたプロトコールに従い分化にかけられる。
【０１２３】
胚性幹細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培養液中で、５％ＣＯ２の存在下で懸濁培養される。これらの培養条件は、胚様体へのＥＳ細胞の分化を誘導する。７日後、この様にして得られた胚様体を接着したまた放置し、そして次に同一の培養液のまま１５日間培養する。この様にして分化した細胞の一部は、膵細胞に特異的なマーカー、例えばｐｄｘ−１、インスリンＩ、インスリンＩＩ、グルカゴン又はα−アミラーゼを発現する。
【０１２４】
７．２．細胞移植
これらの細胞は、再移植細胞治療の観点で、動物の膵臓に再移植されうる（Ｄｉｓｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【表１】
2004500865.tif 000002
【表２】
2004500865.tif 000003
【表３】
2004500865.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、誘導性リコンビナーゼＣｒｅ−ＥＲＴ２を過剰発現するために設計された、本発明に従うベクター：プラスミドｐＧＴＥＶ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２の機能の原理を表す。
【図２】
図２は、ベクターｐＧＴＥＶ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２の制限地図を表す。
【図３Ａ】
図３Ａは、ベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈの図を表す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、ベクターｐＩＧＴＥ３の図を表す。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、ベクターｐＩＧＴＥ４の図を表す。
【図３Ｄ】
図３Ｄは、ベクターｐＩＧＴＥ５の図を表す。
【図５】
図４は、ベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈの制限地図を表す。
【図５】
図５は、Ａｐｈを誘導的に発現する過剰発現するように設計された、本発明に従うベクターの機能の原理の図を表す。
【図６】
図６は、受精後８．５日齢のマウスのトランスジェニック胚の写真である。これらの胚は、それらのゲノムにベクターｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈを組み込んだＥＳ Ｃｒｅ ＥＲＴ２細胞を用いて得られた。Ａｐｈ活性は組織化学染色によって検出可能である。この様に、Ａｐｈを発現する細胞は褐色に染色されるが、Ａｐｈを発現しない細胞は白色のままである。この図面に見られるように、ヒドロキシタモキシフェンを用いてｉｎ ｖｉｖｏで誘導された胚（右側と左側）は全ての組織でＡｐｈを強力に発現するが、ネガティブコントロール（中央の胚）は幾つかの細胞でしかＡｐｈを発現しない。
【図７Ａ】
図７Ａは、ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）によるＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２クローンにおけるｅＧＦＰの誘導を示す図を表し、ヒドロキシタモキシフェンの存在下又は不在下でｅＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）によるＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２クローンにおけるｅＧＦＰの誘導を示す図を表し、誘導レベルを明らかにする。
【図８Ａ】
図８Ａは、ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の存在下又は不在下での、様々なＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈマウスの系におけるＡｐｈ活性の誘導の試験結果を表す図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、ＥＳ細胞における、常用の発現系を用いるβ−ガラクトシダーゼの発現の誘導を表す写真である。
【図９Ａ】
図９Ａは、β−ガラクトシダーゼを検出するための組織化学染色後のＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ細胞系を表す写真である。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、ヒドロキシタモキシフェンの不在下でＡｐｈ活性を検出するための組織化学染色後のＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ細胞系を表す写真である。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、ヒドロキシタモキシフェンの存在下でＡｐｈ活性を検出するための組織化学染色後のＥＳ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２／ｐＩＧＴＥ２−Ａｐｈ細胞系を表す写真である。
【図１】
2004500865.tif 000005
【図２】
2004500865.tif 000006
【図３ａ】
2004500865.tif 000007
【図３ｂ】
2004500865.tif 000008
【図３ｃ】
2004500865.tif 000009
【図３ｄ】
2004500865.tif 000010
【図４】
2004500865.tif 000011
【図５】
2004500865.tif 000012
【図７Ａ】
2004500865.tif 000013
【図７Ｂ】
2004500865.tif 000014
【図８Ａ】
2004500865.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004500865.tif 000016
2004500865.tif 000017
2004500865.tif 000018
2004500865.tif 000019
2004500865.tif 000020
2004500865.tif 000021
2004500865.tif 000022
2004500865.tif 000023
2004500865.tif 000024
2004500865.tif 000025
2004500865.tif 000026
2004500865.tif 000027
2004500865.tif 000028
2004500865.tif 000029
2004500865.tif 000030
2004500865.tif 000031
2004500865.tif 000032
2004500865.tif 000033
2004500865.tif 000034
2004500865.tif 000035
2004500865.tif 000036
2004500865.tif 000037
2004500865.tif 000038
2004500865.tif 000039
2004500865.tif 000040
2004500865.tif 000041
2004500865.tif 000042
2004500865.tif 000043
2004500865.tif 000044
2004500865.tif 000045
2004500865.tif 000046
2004500865.tif 000047
2004500865.tif 000048
2004500865.tif 000049
2004500865.tif 000050
2004500865.tif 000051
2004500865.tif 000052
2004500865.tif 000053
2004500865.tif 000054
2004500865.tif 000055
2004500865.tif 000056
2004500865.tif 000057
2004500865.tif 000058
2004500865.tif 000059
2004500865.tif 000060
2004500865.tif 000061
2004500865.tif 000062
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500865.tif 000063
【国際調査報告】
2004500865.tif 000064
2004500865.tif 000065
2004500865.tif 000066
2004500865.tif 000067
2004500865.tif 000068
2004500865.tif 000069
2004500865.tif 000070
2004500865.tif 000071
2004500865.tif 000072
2004500865.tif 000073
2004500865.tif 000074
2004500865.tif 000075
2004500865.tif 000076
2004500865.tif 000077
2004500865.tif 000078