(57)【要約】ＮＮＴ−１インヒビターを使用してＩｇＥ関連疾患を治療するための方法および組成物を開示する。１つの実施形態においては、本発明は、ＮＮＴ−１に対する選択的結合剤を使用するＩｇＥ関連疾患の治療方法に関する。もう１つの実施形態においては、本発明は、ＮＮＴ−１発現モジュレーターを使用するＩｇＥ関連疾患の治療方法に関する。ＮＮＴ−１インヒビターを使用してＩｇＥレベルをモジュレーションする、ならびに或る型のアレルギー疾患を診断、予防および／または治療する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の治療方法。
【請求項２】
該インヒビターが、
ａ）配列番号２、４または５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号１または３の核酸配列によりコードされるポリペプチド、
ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの生物学的に活性な断片、あるいは
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）の天然に存在する変異体
よりなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドへの結合を抑制しうる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該インヒビターが選択的結合剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該インヒビターがＮＮＴ−１発現モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該選択的結合剤が抗体またはその断片（フラグメント）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該選択的結合剤がヒト化抗体もしくはその断片である、または該選択的結合剤が、ヒトアミノ酸配列を有する抗体もしくはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該選択的結合剤が、ヒトアミノ酸配列およびヒト化学的修飾を有する抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
該選択的結合剤がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
該選択的結合剤がポリクローナル抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
該選択的結合剤がキメラ抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
該選択的結合剤がＣＤＲグラフティング抗体またはその断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
該選択的結合剤が二重特異性、一本鎖もしくは異種抗体またはそれらの断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
該選択的結合剤が更に可変領域断片を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
該選択的結合剤が更にＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）フラグメントを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
該選択的結合剤が更にＦｃフラグメントを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
該選択的結合剤が、検出可能な標識に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
該選択的結合剤がハイブリドーマから産生される、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
治療的に有効な量のＮＮＴ−１選択的結合剤を患者に投与することを含んでなる、患者におけるＩｇＥレベルのモジュレーション方法。
【請求項１９】
該選択的結合剤がアンタゴニスト抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該ＮＮＴ−１選択的結合剤がＮＮＴ−１の発現、活性または産生を減弱または抑制する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
該ＮＮＴ−１選択的結合剤がＮＮＴ−１のインビボレベルを減弱または抑制する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＩｇＥのレベルが抑制、減少または改善される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、アレルギー疾患の治療方法。
【請求項２４】
該アレルギー疾患がＩ型アレルギー疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該アレルギー疾患がアレルギー性鼻炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該アレルギー疾患が湿疹である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該アレルギー疾患が皮膚炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該アレルギー疾患が花粉症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該アレルギー疾患が喘息である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
患者におけるＩｇＥのレベルをモジュレーションするためのＮＮＴ−１インヒビターの使用方法。
【請求項３１】
ａ）ｉ）配列番号２、４または５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ）配列番号１または３の核酸配列によりコードされるポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）またはｉｉ）のポリペプチドの断片、
ｉｖ）ａ）、ｂ）またはｃ）の天然に存在する変異体
よりなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドの発現の存在または量を測定し、
ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づき、ＩｇＥ関連疾患またはＩｇＥ関連疾患に対する感受性を診断することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患またはＩｇＥ関連疾患に対する感受性の診断方法。
【請求項３２】
治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の予防方法。
【請求項３３】
該ＮＮＴ−１インヒビターがアンタゴニスト抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該ＮＮＴ−１インヒビターが可溶性受容体タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
該ＮＮＴ−１インヒビターが発現モジュレーターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の治療において使用するための医薬組成物。
【請求項３７】
該ＮＮＴ−１インヒビターが、
ａ）配列番号２、４または５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号１または３の核酸配列によりコードされるポリペプチド、
ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの断片、および
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）の天然に存在する変異体
よりなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドに結合し又はそれを抑制する、請求項３６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景）
発明の分野
本発明は、全般的には、ＮＮＴ−１インヒビターを使用してＩｇＥ関連疾患を治療するための新規方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、新規神経栄養（Ｎｏｖｅｌ　ＮｅｕｒｏＴｒｏｐｈｉｃ）因子１（「ＮＮＴ−１」）として最近同定された神経栄養因子の産生、活性および／または発現を抑制または減弱することによりＩｇＥ関連疾患を治療するための新規方法および組成物に関する。
【０００２】
関連技術の説明
神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長および／または形態学的可塑性を刺激または調節しうる内因性可溶性タンパク質である（ＦａｌｌｏｎおよびＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ［１９９３］を参照されたい）。この生理的役割により、神経栄養因子は、神経損傷から生じる神経細胞の変性および分化機能の喪失の治療において有用であることが公知である。
【０００３】
公知神経栄養因子は、それらのアミノ酸配列相同性および／またはそれらの三次元構造に基づき、ポリペプチド成長因子の幾つかの異なるタンパク質スーパーファミリーに属する（ＭａｃＤｏｎａｌｄおよびＨｅｎｄｒｉｋｓｏｎ，Ｃｅｌｌ，７３：４２１−４２４［１９９３］）。１つの神経栄養因子ファミリーはニューロトロフィンファミリーである。このファミリーは現在のところ、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４（ニューロトロフィン−４）およびＮＴ−６（ニューロトロフィン−６）よりなる。
【０００４】
ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）およびＬＩＦ（白血病阻害因子）は、神経栄養活性を有するサイトカインポリペプチドである。それらの構造的特徴および受容体成分のため、これらのポリペプチドは、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、インターロイキン−１１（インターロイキン−１１）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）およびオンコスタチンＭを含む造血サイトカインのファミリーに関連している。
【０００５】
最近、いくつかの天然に存在する神経栄養因子が、種々のニューロンに対するそれらの栄養活性に基づき同定された。「新規神経栄養因子」または「ＮＮＴ−１」と称されるこれらの新規ポリペプチドは、米国特許第５，７４１，７７２号（Ｃｈａｎｇ）に開示されており、その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。ＮＮＴ−１はＩＬ−６ファミリーのサイトカインであり、ニューロン再生の促進および神経機能の回復に有用であることが判明した。そのＣｈａｎｇの特許は、新規ＮＮＴ−１ポリペプチドに加えて、とりわけ、関連した生物学的に活性なポリペプチド断片およびその誘導体（すなわち、神経栄養活性を有するもの）、そのようなポリペプチドをコードする新規核酸分子、これらの核酸分子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、ＮＮＴ−１に対する抗体、ＮＮＴ−１ポリペプチドの製造方法、ＮＮＴ−１ポリペプチドを含有する治療用組成物、ＮＮＴ−１のインヒビターに関してスクリーニングするためのアッセイ、ＮＮＴ−１のヒト等価体をコードする遺伝子が破壊（「ノックアウト」）されたトランスジェニック哺乳動物、ならびにＮＮＴ−１を使用する神経系の疾患および障害の治療方法を開示している。
【０００６】
また、あるＩｇＧおよびＩｇＭ関連免疫疾患を治療するためのＮＮＴ−１の使用が、係属中のＰＣＴ　ＷＯ　９８／３３９２２（同様にその開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において同定され記載されている。その出願には、免疫系をモジュレーションする及び特にＢ細胞およびＴ細胞産生の増加を引き起こす生物学的活性をＮＮＴ−１化合物が有しうるという証拠が記載されている。したがって、神経栄養特性に加えて、ＮＮＴ−１は、リンパ様過形成の誘導と血清ＩｇＧおよびＩｇＭの上昇とよりなるＢ細胞刺激活性を示す。また、Ｓｅｎａｌｄｉら，Ｎｏｖｅｌ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−１／Ｂ　Ｃｅｌｌ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ−３：Ａ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　ＩＬ−６　Ｆａｍｉｌｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１１４５８−１１４６３（１９９９年９月）も参照されたい。
【０００７】
免疫障害の領域において特に関心が持たれているのは、アレルギーおよび喘息である。アレルギーおよび喘息は、先進国の人口の約２０％を悩ます衰弱性疾患である。尚も十分には理解されていない理由により、アレルギー個体は、「アレルゲン」と総称される花粉、動物の毛、ある種の食物などのような通常は無害の抗原に対して結合特異性を有する増量したＩｇＥを産生する。これらのＩｇＥ分子は血中を循環し、好塩基球およびマスト細胞の表面上のＩｇＥ特異的受容体に結合する。
【０００８】
アレルギー反応においては、吸入または摂取されたアレルゲンがこれらのマスト細胞または好塩基球上のＩｇＥに結合し、ＩｇＥ分子を架橋し、下方の受容体を凝集させて、該細胞にヒスタミンおよび症候性アレルギー応答のその他の薬理学的メディエーターを放出させる。このように、抗原特異的ＩｇＥは、アレルギー障害の病態生理学において中心的な役割を果たすことが示されている。Ａｒｍ，Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５１：３２３−３８３（１９９２）；Ｒｏｓｅｎｗａｓｓｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０５：Ｓ５８６−５９１（２０００）；Ｃｈａｎｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：１５７−１６２（２０００）を参照されたい。
【０００９】
アレルギー個体をその他の個体から区別する少なくとも１つの共通の特徴は、それらの異常に高レベルのＩｇＥであることが、十分に確認されている。現在のところ、アレルギーに対する信頼しうる治療方法は存在せず、ＩｇＥの過剰産生を矯正する承認された治療方法は存在しない。抗ヒスタミン薬、コルチコステロイドおよび気管支拡張薬（β−アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）のようなアレルギー疾患に対する現在の薬物は、アレルギー症状およびそれに付随する炎症反応を治療するものである。抗原（アレルゲン）での脱感作免疫は、主として米国においてアレルギー性鼻炎に用いられているが、治療を受けた患者の約半数には有効でない。したがって、アレルギー過程を標的とし、その発生を妨げ、現在の薬物より少ない副作用を有する治療方法が望まれている。
【００１０】
したがって、本発明の１つの目的は、アレルギーおよび喘息のようなＩｇＥ関連疾患を治療および／または予防するための方法および組成物を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、あるＩｇＥ関連免疫疾患および障害の治療におけるＮＮＴ−１インヒビターの新規使用を提供することにある。
【００１１】
本発明の更にもう１つの目的は、ＮＮＴ−１の活性、産生および／または発現を抑制することにより抗原特異的ＩｇＥ産生を抑制する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の更にもう１つの目的は、ＮＮＴ−１インヒビターを使用してＩｇＥ関連疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
【００１３】
これらの及び他の目的は、本開示から当業者に明らかであろう。
【００１４】
（発明の概要）
１つの実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の治療方法に関する。もう１つの実施形態においては、本発明は、
ａ）配列番号２、４または５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号１または３の核酸配列によりコードされるポリペプチド、
ｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドの生物学的に活性な断片、あるいは
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）の天然に存在する変異体
よりなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドへの結合を抑制しうるＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の治療方法に関する。
【００１５】
もう１つの実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを該患者に投与することを含んでなる、患者におけるＩｇＥレベルの新規モジュレーション方法を提供する。
【００１６】
更にもう１つの実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、アレルギー疾患の新規治療方法を提供する。
【００１７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、患者におけるＩｇＥのレベルをモジュレーションするためのＮＮＴ−１インヒビターの使用方法を提供する。
【００１８】
更にもう１つの実施形態においては、本発明は、
ａ）ｉ）配列番号２、４または５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ）配列番号１または３の核酸配列によりコードされるポリペプチド、
ｉｉｉ）前記ｉ）またはｉｉ）のポリペプチドの断片、
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の天然に存在する変異体
よりなる群から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドの発現の存在または量を測定し、
ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づき、ＩｇＥ関連疾患またはＩｇＥ関連疾患に対する感受性を診断することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患またはＩｇＥ関連疾患に対する感受性の診断方法に関する。
【００１９】
更にもう１つの実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを患者に投与することを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の予防方法に関する。
【００２０】
更にもう１つの実施形態においては、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを含んでなる、ＩｇＥ関連疾患の治療において使用するための医薬組成物に関する。
【００２１】
（図面の簡単な記載）
図１は、ヒトＮＮＴ−１をコードするｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１）を示す。
【００２２】
図２は、ＮＮＴ−１のヒトゲノムＤＮＡの核酸配列（配列番号３）を示す。
【００２３】
図３は、該ｃＤＮＡ（配列番号１）から翻訳されたとおりのヒトＮＮＴ−１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。最初の２７アミノ酸はシグナルペプチド配列に相当する可能性があり、番号１として示されたロイシンからＮＮＴ−１の成熟形態が始まる。＊は終結コドンを示す。
【００２４】
図４は、マウスＮＮＴ−１をコードするｃＤＮＡの核酸配列（配列番号４）を示す。
【００２５】
図５は、該ｃＤＮＡ（配列番号４）から翻訳されたとおりのマウスＮＮＴ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。最初の２７アミノ酸はシグナルペプチド配列に相当する可能性があり、番号１として示されたロイシンからＮＮＴ−１の成熟形態が始まる。＊は終結コドンを示す。
【００２６】
図６は、ＮＮＴ−１で若しくは対照としてのＮＮＴ−１溶媒で数日間処理したＢａｌｂ／ｃマウスにおける又はＮＮＴ−１トランスジェニックマウス（Ｔｇ＋）における及び同腹子対照（Ｔｇ−）における抗ＫＬＨ　ＩｇＥの血清レベルを示す。
【００２７】
図７は、ＮＮＴ−１トランスジェニックマウス（Ｔｇ＋）および同腹子対照（Ｔｇ−）（第７、１４および２１日に採血したもの）における抗ＫＬＨ　ＩｇＥの血清レベルを示す。
【００２８】
（発明の詳細な記載）
驚くべきことに、新規神経栄養因子ＮＮＴ−１がまた、血清中の全ＩｇＥの上昇を誘導しうること及び抗原特異的ＩｇＥ産生を刺激しうることが見出された。ＮＮＴ−１が血清ＩｇＥのレベルをモジュレーションしうるという知見は、ＮＮＴ−１がアレルギーおよび喘息のようなＩｇＥ関連疾患の病理発生に関与している可能性があることを強く示唆している。薬理学的にＮＮＴ−１を攻撃または抑制することは、あるＩｇＥ関連疾患および障害の治療および／予防に対する新規治療アプローチの１つでありうる。
【００２９】
したがって、本発明は、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビター、例えば抗ＮＮＴ−１アンタゴニスト抗体を投与することによる、ＩｇＥ関連疾患の治療方法を提供する。本発明に特に含まれるのは、ＮＮＴ−１の産生、発現または活性を抑制または減弱する物質（抗体、ペプチド、融合ペプチド、オリゴヌクレオチド、小分子、可溶性受容体タンパク質、およびＮＮＴ−１の活性、産生または発現を抑制または減弱するよう機能する他の物質、および／またはその関連する生物学的に活性なポリペプチド断片、誘導体および変異体を含むが、これらに限定されるものではない）の使用である。また、ＮＮＴ−１受容体に同様に影響を及ぼす物質（すなわち、ＮＮＴ−１受容体におけるシグナル伝達を妨げる物質）、およびＮＮＴ−１またはその受容体の発現をモジュレーションする物質も含まれる。
【００３０】
本明細書中に用いる小節の題名は、系統化のみを目的としたものであり、記載されている内容を限定するものではないと解釈されるべきである。この節において引用されているすべての参考文献を、参照により明示的に本明細書に組み入れることとする。
【００３１】
Ｉ．ＮＮＴ−１タンパク質／ポリペプチド、その断片、誘導体および変異体
本発明で用いる「ＮＮＴ−１タンパク質」または「ＮＮＴ−１ポリペプチド」なる語は、米国特許第５，４７１，７７２号に開示もしくは記載されている又はそれに記載された特性を有する任意のタンパク質またはポリペプチドを意味する。例えば、ＮＮＴ−１タンパク質またはＮＮＴ−１ポリペプチドは以下のものを意味する：
（１）（ａ）配列番号１の核酸分子、
（ｂ）配列番号３の核酸分子、
（ｃ）配列番号２のポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸分子、
（ｄ）配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの相補体である核酸分子、および
（ａ’）配列番号４の核酸分子、
（ｂ’）配列番号５のポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸分子、
（ｃ’）配列番号５のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、
（ｄ’）前記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、
（ｅ’）前記（ａ’）〜（ｄ’）のいずれかの相補体である核酸分子のいずれかにおいて定義されるＮＮＴ−１核酸分子にコードされるアミノ酸配列、
（２）関連する生物学的に活性なポリペプチドならびにその断片および誘導体、
（３）配列番号２または配列番号５のＮＮＴ−１ポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を引き起こす、ＮＮＴ−１遺伝子の天然に存在する対立遺伝子変異体、および／または
（４）化学的に修飾された誘導体ならびに核酸および／またはアミノ酸配列変異体、スプライス変異体、誘導体およびオルソログ。
【００３２】
該ＮＮＴ−１ポリペプチドは、天然に存在する完全長ポリペプチドまたはトランケート化（短小化）ポリペプチドまたはペプチド（すなわち、「断片」）でありうる。該ポリペプチドは成熟形態でありうる。あるいは、それらは天然または異種シグナルペプチドに結合したものでありうる。例えば、ヒトおよびマウスＮＮＴ−１は、それぞれ配列番号２および５のアミノ酸−２７〜−１のシグナルペプチドを有する。
【００３３】
該ポリペプチドまたは断片は、後記のとおり、化学的に修飾されていること、すなわち、グリコシル化、リン酸化されているおよび／または重合体に結合していることが可能であり、それらは、それらの製造方法に応じてアミノ末端メチオニンを有しうる。また、該ポリペプチドまたは断片は、天然に存在するＮＮＴ−１ポリペプチドの変異体でありうる（すなわち、天然に存在するＮＮＴ−１と比較して１以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を含有しうる）。
【００３４】
本発明で用いる「断片」なる語は、天然に存在するＮＮＴ−１タンパク質の完全長未満のアミノ酸配列であるペプチドまたはポリペプチドを意味する。それは、配列番号２に記載のポリペプチドのアミノ末端のトランケート化体（リーダー配列を伴う又は伴わない）および／またはカルボキシ末端のトランケート化体、対立遺伝子変異体、オルソログ、スプライス変異体、および／または配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸の付加または置換または内部欠失を有する変異体（ここで、生じたポリペプチドは少なくとも６アミノ酸長以上である）を含みうる。ＮＮＴ−１断片は、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボプロテアーゼ活性から生じることが可能であり、さらに、可溶性形態、例えば、膜貫通または膜結合ドメインを欠く可溶性形態を含みうる。さらに、そのような断片は、化学的に修飾されていることが可能であり、および／または、アミノ末端メチオニンを伴う又は伴わないように製造されうる。
【００３５】
本発明で用いる「生物学的に活性な断片」なる語は、前記の完全長成熟ＮＮＴ−１ポリペプチドと定性的に実質的に類似したタイプの生物活性を有する断片を意味する。好ましくは、該断片の活性は、標準的な活性アッセイにより測定した場合に、該完全長ポリペプチドの活性の＞５０％、より好ましくは、＞６５％、最も好ましくは、＞８０％である。いくつかの典型的な断片には、該ＮＮＴ−１ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端または両末端から１〜２０アミノ酸が除去されたポリペプチドが含まれる。生物活性の具体例には、ニューロン（例えば、運動ニューロンおよび／または交感神経ニューロン）に対する成長因子として作用する能力、または免疫系をモジュレーションする（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の産生の増加を引き起こす）能力が含まれる。
【００３６】
活性アッセイにおいてそれ自体は活性でない、ＮＮＴ−１の断片および／または誘導体は、インビトロまたはインビボにおけるＮＮＴ−１受容体のモジュレーターとして、あるいはＮＮＴ−１ポリペプチドに対する抗体を製造するのに有用でありうる。
【００３７】
本発明で用いる「対立遺伝子変異体」なる語は、生物集団または染色体上の与えられた遺伝子座を占める遺伝子の、いくつかの可能な天然に存在する代替形態の１つを意味する。
【００３８】
本発明で用いる「誘導体」なる語は、１）例えば、１以上のポリエチレングリコール分子、糖、ホスファート、または野生型ＮＮＴ−１ポリペプチドに天然では結合していない他のそのような分子の付加により化学的に修飾された、および／または２）図３（ヒト）または図５（マウス）に記載のＮＮＴ−１アミノ酸配列と比較して１以上の核酸またはアミノ酸配列の置換、欠失および／または挿入を含有するＮＮＴ−１ポリペプチド、タンパク質、断片、対立遺伝子変異体、オルソログ、スプライス変異体またはその変異体を意味する。
【００３９】
本発明で用いる「オルソログ」なる語は、配列番号２に記載のＮＮＴ−１ポリペプチドアミノ酸配列に対応する別の種に由来するポリペプチドを意味する。例えば、マウスＮＮＴ−１ポリペプチドとヒトＮＮＴ−１ポリペプチドとは、お互いのオルソログであるとみなされる。本発明で用いる「スプライス変異体」なる語は、配列番号２に記載のＮＮＴ−１ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写産物のイントロン配列の選択的プロセシングにより生じる核酸分子、通常はＲＮＡを意味する。
【００４０】
本発明で用いる「変異体」なる語は、（リーダー配列を伴う又は伴わない）配列番号２に記載のＮＮＴ−１アミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸の置換、欠失（例えば、内部欠失および／または断片）および／または付加（例えば、内部付加および／または融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＮＮＴ−１ポリペプチドを意味する。変異体は天然で生じたり（例えば、ＮＮＴ−１ポリペプチド対立遺伝子変異体、オルソログおよびスプライス変異体）、あるいは人工的に構築されうる。そのようなＮＮＴ−１変異体は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列から相応に変化したＤＮＡ配列を有する対応核酸分子から製造することができる。例えば、ＮＮＴ−１変異体は、１〜１００（または１００を超える）アミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有することが可能であり、ここで、該置換は、同類置換または非同類置換またはそれら任意の組合せでありうる。ＮＮＴ−１のアミノ酸変異体は、好ましくは、配列番号２または配列番号５のいずれかに対して少なくとも７０％同一、より好ましくは、少なくとも約８０％同一、より一層好ましくは、少なくとも約９０％同一である。
【００４１】
配列同一性（％）は、２つのポリペプチドのアミノ酸の所定の位置における類似性を比較するために一般に用いられる標準的な方法により決定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを用いて、配列同一性を決定しようとする２つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適なマッチング（「マッチ伸長」；これは、一方または両方の配列の完全長、または一方または両方の配列の所定の部分を含みうる）が得られるように整列（アライン）させる。各コンピュータープログラムは、「デフォルト」・オープニング・ペナルティーおよび「デフォルト」・ギャップ・ペナルティー、およびスコアリング・マトリックス、例えばＰＡＭ　２５０を与える。標準的なスコアリング・マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆら，ｉｎ：Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３［１９７８］を参照されたい）を該コンピュータープログラムと共に用いることができる。ついで、ＦＡＳＴＡのようなプログラムに含まれているアルゴリズムを用いて、以下のとおりに同一性（％）を計算することができる。
【数１】
2004513081.tif 000002
【００４２】
少なくとも７０％同一であるポリペプチドは、典型的には、野生型ＮＮＴ−１と比較して１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有するであろう。通常、該置換が該タンパク質の全体の実効電荷、極性または疎水性にほとんど又は全く影響を及ぼさないが場合によってはＮＮＴ−１の活性を増加させうるためには、該置換は同類的なものになるであろう。同類置換を以下の表１に記載する。
【００４３】
【表１】
2004513081.tif 000003
【００４４】
本発明はまた、ＮＮＴ−１の種ホモログまたはオルソログを含む。例えば、ヒトに加えてイヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、ウマ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジなどのような哺乳類種からのＮＮＴ−１オルソログが意図される。マウスｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を配列番号４および５に記載する。
【００４５】
前記のとおり、本発明で言及するＮＮＴ−１ポリペプチドには、化学的に修飾された誘導体、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較してグリコシル化部位の数および／またはタイプが改変されたグリコシル化変異体が含まれる。例えば、ＮＮＴ−１変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列より多数の又はより少数のＮ結合型グリコシル化部位を含有しうる。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここで、Ｘで表されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基でありうる）により特徴づけられる。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去するであろう。また、１以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、１以上の新たなＮ結合型部位が生じる、Ｎ結合型炭水化物鎖の再構成も予想される。更なる変異体には、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して１以上のシステイン残基が欠失した又は別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されたシステイン変異体が含まれる。
【００４６】
ＩＩ．核酸
本発明で用いる「ＮＮＴ−１」なる語は、核酸分子を説明するために用いている場合には、前記のとおりの核酸分子またはその断片を意味する。
【００４７】
「核酸配列」または「核酸分子」なる語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。これらの用語は、以下のような（それらに限定されるものではない）ＤＮＡおよびＲＮＡの公知塩基類似体のいずれかから形成される分子を含む：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリン。
【００４８】
核酸分子、ポリペプチドなどのような生物学的物質に関して用いられている場合の「天然に生じる（天然に存在する）」または「天然」なる語は、天然で見出され人間により操作されていない物質を指す。同様に、本発明で用いる「非天然に生じる（非天然に存在する）」または「非天然」は、天然では見出されない又は人間により構造的に修飾または合成された物質を指す。
【００４９】
「ストリンジェントな条件」なる語は、高度に相同な配列に対する核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ分子プローブ）の結合のみを許容する条件下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄を意味する。１つのストリンジェントな洗浄溶液としては、５５℃〜６５℃の温度で使用する０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　クエン酸Ｎａおよび０．１％　ＳＤＳが挙げられる。もう１つのストリンジェントな洗浄溶液としては、５０℃〜６５℃の温度で使用する０．２×ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳが挙げられる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするためにオリゴヌクレオチドプローブを使用する場合には、以下のストリンジェントな洗浄条件を用いることができる。１つのプロトコールにおいては、オリゴヌクレオチドプローブの長さに応じて３５℃〜６２℃の温度で０．０５％　ピロリン酸ナトリウムと共に６×ＳＳＣを使用する。例えば、１４塩基対のプローブは３５〜４０℃で洗浄し、１７塩基対のプローブは４５〜５０℃で洗浄し、２０塩基対のプローブは５２〜５７℃で洗浄し、２３塩基対のプローブは５７〜６３℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高いと考えられる場合には、該温度を２〜３℃上昇させることが可能である。もう１つのプロトコールにおいては、オリゴヌクレオチドプローブを洗浄するためにテトラメチルアンモニウム　クロリド（ＴＭＡＣ）を使用する。１つのストリンジェントな洗浄溶液として、３Ｍ　ＴＭＡＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．２％　ＳＤＳが挙げられる。この溶液を使用する洗浄温度はプローブの長さと相関する。例えば、１７塩基対のプローブは約４５〜５０℃で洗浄する。
【００５０】
活性アッセイにおいて活性であるポリペプチドをそれ自体はコードしないＮＮＴ−１核酸分子、断片および／または誘導体は、哺乳類組織または体液サンプル中のＮＮＴ−１　ＤＮＡまたはＲＮＡの存在に関して定性的または定量的に試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用でありうる。
【００５１】
本明細書中に前記したとおりの天然または異種シグナルペプチドに結合したＮＮＴ−１ポリペプチドをコードするＮＮＴ−１核酸分子も意図される。
【００５２】
ＩＩＩ．ＮＮＴ−１インヒビター
本発明で用いる「ＮＮＴ−１インヒビター」なる語は、ＮＮＴ−１（前記のとおり）またはその受容体の産生、活性または発現を抑制しうる物質を意味する。特に、ＮＮＴ−１ポリペプチドおよび／またはＮＮＴ−１受容体に結合し、それらを拮抗、抑制またはモジュレーションする物質が意図される。また、ＮＮＴ−１ポリペプチドまたはその受容体に影響を及ぼす発現モジュレーター（リボザイムおよび小分子が含まれるが、これらに限定されるものではない）も意図される。
【００５３】
そのようなインヒビターの下位概念の１つは、「選択的結合剤」または「ＳＢＡ」と称されうる。本発明で用いる「選択的結合剤」なる語は、ＮＮＴ−１ポリペプチド、その断片、誘導体もしくは変異体またはＮＮＴ−１受容体に特異的に結合しうる分子を意味する。適当な選択的結合剤には、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、融合ポリペプチド（すなわち、部分ペプチド、部分抗体）、可溶性受容体タンパク質、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および結合特異性を有する他の分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＳＢＡは、活性または不活性形態のＮＮＴ−１ポリペプチド、ＮＮＴ−１ポリペプチドのいずれかの部分、および／またはＮＮＴ−１受容体に結合しうる。適当なＳＢＡは、当技術分野で公知の方法を用いて製造することができる。
【００５４】
本発明の典型的なＮＮＴ−１ポリペプチド選択的結合剤は、ＮＮＴ−１ポリペプチド（前記で広く定義されたもの）の或る部分に結合しＮＮＴ−１のその受容体への結合を部分的または完全に抑制しうる抗体、ペプチド、融合ペプチドまたは可溶性ＮＮＴ−１受容体タンパク質である。同様に、ＮＮＴ−１受容体の部位において結合する又はシグナル伝達を妨げる抗体、ペプチド、融合ペプチド、不活性形態のＮＮＴ−１または小分子のような選択的結合剤が意図される。
【００５５】
本発明で用いる「特異的」および「特異性」なる語は、該選択的結合剤がＮＮＴ−１ポリペプチドには結合しうるが非ＮＮＴ−１ポリペプチドには結合し得ないことを指す。しかし、該選択的結合剤は、配列番号２に記載のポリペプチドのオルソログ（すなわち、マウスおよびラットポリペプチドのようなその種間形態）にも結合しうると理解されるであろう。
【００５６】
Ａ．抗体およびその誘導体
本発明の好ましい実施形態は、ＮＮＴ−１ポリペプチド自体またはその受容体に結合する抗体および抗体フラグメント、その誘導体および／または変異体のような選択的結合剤の使用を含む。該抗体は、単一特異性ポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）グラフティング抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体および／または二重特異性、異種抗体、ならびにそれらのフラグメント（断片）、変異体または誘導体であって、ＮＮＴ−１に結合しＮＮＴ−１活性を部分的または完全に中和しうる或いはＮＮＴ−１受容体に結合してシグナル伝達を遮断しうるものでありうる。
【００５７】
抗体フラグメントには、該ＮＮＴ−１ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体の部分、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ）’フラグメント、またはそれらの他の断片、変異体または誘導体が含まれる。そのようなフラグメント（断片）の具体例には、完全長抗体の酵素的切断により生成するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが含まれる。他の結合性フラグメントには、抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ技術により得られるものが含まれる。
【００５８】
ＮＮＴ−１ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般には、ＮＮＴ−１ポリペプチドおよび適当なアジュバントの複数の皮下または腹腔内注射により動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＮＮＴ−１ポリペプチドを、免疫する種において免疫原性である担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）に共役させることが有用かもしれない。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンのような凝集剤を使用する。免疫後、該動物を出血させ、該血清を抗ＮＮＴ−１ポリペプチド抗体力価に関してアッセイする。
【００５９】
ＮＮＴ−１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養内の連続継代細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を製造するための適当な方法の具体例には、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７））が含まれる。また、ＮＮＴ−１ポリペプチドに反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も意図される。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために修飾することができる。１つの実施形態は「キメラ」抗体であり、この場合、重および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同であるが、該鎖の残部は、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である。また、そのような抗体のフラグメント（断片）も、それが所望の生物活性を示す限り、本発明に含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照されたい。
【００６１】
また、「ヒト化」抗体（すなわち、患者に投与された場合に該抗体に対する免疫反応を妨げる又は最小限に抑えるよう製造されたもの）の使用も意図される。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野でよく知られている。米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６２号を参照されたい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト起源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当技術分野において記載されている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて、げっ歯類ＣＤＲの少なくとも一部をヒト抗体の対応領域で置換することにより行うことができる。
【００６２】
本発明はまた、ＮＮＴ−１ポリペプチドに結合するヒト抗体を含む。内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体のレパートリーを産生しうるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、そのような抗体を、所望により担体に共役していてもよいＮＮＴ−１抗原（すなわち、連続した少なくとも６アミノ酸を有するもの）での免疫により製造することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｃｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。１つの方法においては、そのようなトランスジェニック動物は、それにおける重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子座を不能にし、ヒト重および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノム内に挿入することにより作製される。ついで、部分修飾動物、すなわち、修飾の必要因子の全てを有するには満たない動物を交雑育種させて、所望の免疫系修飾の全てを有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的である可変領域を含むヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照されたい。更なる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７ならびにＥＰ　５４６０７３Ｂ１およびＥＰ　５４６０７３Ａ１に記載されている。また、該アミノ酸配列がヒトのものであるばかりではなく該抗体のグリコシル化または他の化学修飾もヒトのものである「完全」ヒト抗体も意図される。
【００６３】
ヒト抗体は、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ内での発現によっても製造することができる。そのようなハイブリドーマは、公知技術により、選択した哺乳動物にＮＮＴ−１またはその断片を抗原として提示し次いで該哺乳動物の細胞（例えば、脾臓細胞）を或る癌細胞と融合させて不死化細胞系を得ることにより作製する。そのような細胞系、およびヒトＮＮＴ−１ポリペプチドの全部または一部に対する抗体を作製するために用いる方法は、Ｃｈａｎｇ（米国特許第５，７４１，７７２号）に更に詳しく開示されている。
【００６４】
もう１つの実施形態においては、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから製造することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。これらの方法は、線状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示およびそれに続く選択抗原へのその結合によるファージの選択により免疫選択を模擬するものである。１つのそのような技術は、そのようなアプローチを使用してＭＰＬ−およびｍｓｋ−受容体に対する高アフィニティーかつ機能的な作動性抗体を単離することを記載しているいるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されている。
【００６５】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフティング抗体およびヒト化抗体は、典型的には、組換え法により製造する。本明細書に記載の材料および方法を用いて、該抗体をコードする核酸を宿主細胞内に導入し、発現させる。１つの実施形態においては、該抗体を、ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞内で産生させる。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現により又はハイブリドーマ細胞内での発現（本明細書に記載のとおり）により製造することができる。
【００６６】
本発明の抗ＮＮＴ−１抗体は、ＮＮＴ−１ポリペプチドの検出および定量のための競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））のような任意の公知アッセイ法において使用することができる。該抗体は、使用しているアッセイ法に適したアフィニティーでＮＮＴ−１ポリペプチドに結合するであろう。
【００６７】
抗ＮＮＴ−１抗体を含む該選択的結合剤は、インビボイメージングにも有用である。検出可能な部分で標識された抗体を、動物に、好ましくは血流中に投与することが可能であり、該宿主内の該標識抗体の存在および位置をアッセイする。該抗体は、核磁気共鳴、放射線学または当技術分野で公知の他の検出手段のいずれによるかにかかわらず動物において検出可能な任意の部分で標識することが可能である。
【００６８】
抗体を含む本発明の選択的結合剤は、治療剤として使用することができる。アレルギーの領域においては、これらの治療剤は、それらがＮＮＴ−１ポリペプチドの生物活性の少なくとも１つを減弱または抑制する点でアンタゴニストである。例えば、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＮＮＴ−１ポリペプチド（またはその受容体）に特異的に結合しうる或いはインビボまたはインビトロにおけるＮＮＴ−１の機能的活性を抑制または消失しうる抗体（またはそのフラグメント）である。好ましい実施形態においては、該選択的結合剤、例えば、アンタゴニスト抗体は、ＮＮＴ−１ポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％抑制する。もう１つの実施形態においては、該選択的結合剤は、ＮＮＴ−１結合相手（リガンドまたは受容体）と相互作用してインビトロまたはインビボにおけるＮＮＴ−１活性を抑制または消失しうるＮＮＴ−１ポリペプチド抗体でありうる。選択的結合剤は、当技術分野でよく知られたスクリーニングアッセイにより同定される。
【００６９】
Ｂ．ペプチドおよびその誘導体
ＮＮＴ−１ポリペプチド、その断片、誘導体、変異体および／またはＮＮＴ−１受容体に特異的に結合しうるペプチド、修飾ペプチドおよび融合ペプチドの使用も、本発明に含まれる。
【００７０】
特に、相同ポリペプチドと融合してホモ二量体を形成しうる又は異種ポリペプチドと融合してヘテロ二量体を形成しうるペプチドが意図される。異種ペプチドおよびポリペプチドには、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびデキストランのような重合体への結合および免疫グロブリン定常領域（「Ｆｃドメイン」）のような安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｆｃドメインは、治療用タンパク質と共に構築された場合には、例えば、より長い半減期をもたらしたり、あるいはＦｃ受容体結合のような機能を取り込ませる。そのような修飾は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｇｅｎｔｓ」の発明の名称を有する特許出願である米国特許出願第０９／４２８，０８２号、ＰＣＴ出願番号ＷＯ．９９／２５０４４（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳しく記載されている。
【００７１】
ＩＶ．治療用組成物およびその投与
本発明で用いる「有効（な）量」および「治療的に有効な量」なる語は、１）ＮＮＴ−１の発現、活性または産生の抑制または減少、２）ＮＮＴ−１ポリペプチドの受容体に結合するＮＮＴ−１ポリペプチドの能力の抑制または減少、３）ＮＮＴ−１ポリペプチドおよび／またはその受容体の拮抗、４）ＮＮＴ−１のインビボレベルの減少、および／または５）ＩｇＥの血清レベルの減少の生物活性の１以上を支持するのに必要なＮＮＴ−１インヒビターの量を意味する。
【００７２】
ＮＮＴ−１インヒビターを含有する治療用組成物を使用する、種々のＩｇＥ関連疾患または障害の治療方法が、本発明の範囲内である。そのような組成物は、医薬上許容される担体と共に、治療的に有効な量のＮＮＴ−１インヒビターを含みうる。該担体物質は、好ましくは、哺乳動物への投与用の溶液において一般的な他の物質で補足された注射用水でありうる。典型的には、ＮＮＴ−１インヒビター治療化合物は、精製されたＮＮＴ−１インヒビターと１以上の生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む組成物の形態で投与する。血清アルブミンと混合された食塩水または中性緩衝食塩水が、典型的な適当な担体である。好ましくは、該産物は、適当な賦形剤（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。所望により、他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤を含有させることが可能である。典型的な組成物は、ＮａＣｌを更に含みうるｐＨ約４．０〜４．５のクエン酸バッファーを含む。
【００７３】
該ＮＮＴ−１インヒビター組成物は、非経口的に全身投与することができる。あるいは、該組成物は、静脈内または皮下に投与することができる。本発明で使用する治療用組成物は、全身投与する場合には、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態でありうる。ｐＨ、等張性、安定性などに相当な配慮をして、そのような医薬上許容されるタンパク質溶液を製造することは、当業者の技量の範囲内である。
【００７４】
本発明の実施に有用なＮＮＴ−１インヒビター組成物の治療用製剤は、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、所望により使用する生理的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）と、所望の純度を有する選択された組成物とを混合することにより、保存用に製造することができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、被投与者に無毒性であり、好ましくは、用いる投与量および濃度で不活性であり、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩または他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓまたはＰＥＧを含む。
【００７５】
インビボ投与に使用するＮＮＴ−１インヒビター組成物は無菌性でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成される。該ＮＮＴ−１インヒビター組成物を凍結乾燥する場合には、これらの方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行なってもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保存することになろう。
【００７６】
治療用組成物は、一般に、無菌の入口を有する容器、例えば静脈内用溶液バッグ、または皮下注射針が貫通しうる栓を有するバイアル内に入れる。
【００７７】
該組成物の投与経路は、公知方法に従い、例えば、経口的に、または静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内または病巣内経路による注射または注入により、または徐放系または埋め込み装置（これは、所望により、カテーテルの使用を伴うものでありうる）によるものである。必要に応じて、該組成物は、注入、ボーラス注入または埋め込み装置により連続的に投与することができる。その代わりに又はそれに加えて、ＮＮＴ−１インヒビター組成物を吸収している膜、スポンジまたは他の適当な物質を罹患領域内に埋め込むことにより、ＮＮＴ−１インヒビター組成物を局所的に投与することができる。
【００７８】
埋め込み装置を使用する場合には、適当な任意の組織または器官内、例えば、脳室内または脳実質内に該装置を埋め込むことができ、ＮＮＴ−１インヒビター組成物の運搬は、ボーラスまたは連続投与による装置から直接的なもの、または連続的注入を用いるカテーテルを介したものでありうる。
【００７９】
ＮＮＴ−１インヒビター組成物は、徐放性の処方または製剤として投与することができる。徐放製剤の適当な具体例には、成形品（例えば、フィルム）の形態の半透性重合体マトリックス、またはマイクロカプセルが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ　５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミンとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７［１９８１］およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５［１９８２］）、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ　１３３，９８８）が含まれる。徐放性組成物にはまた、リポソームが含まれ、これは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより製造することができる（例えば、ＤＥ　３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２［１９８５］；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０−４０３４［１９８０］；ＥＰ　５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ　８８，０４６；ＥＰ　１４３，９４９）。
【００８０】
場合によっては、エクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）法（すなわち、患者から取り出した細胞または組織を処理し、ついで該患者に移植しなおすためのもの）により、ＮＮＴ−１インヒビター組成物を使用するのが望ましいかもしれない。
【００８１】
その他の場合においては、ＮＮＴ−１インヒビターを発現し分泌するよう遺伝的に操作された或る細胞を患者の体内に移植することにより、ＮＮＴ−１インヒビター組成物を運搬することができる。そのような細胞は動物またはヒトの細胞であることが可能であり、患者自身の組織または別の起源（ヒトまたはヒト以外）に由来することが可能である。所望により、該細胞を不死化することができる。該細胞は患者の脳、副腎または他の適当な身体組織または器官内に移植することができる。
【００８２】
場合によっては、ある免疫障害に罹患した患者にＮＮＴ−１インヒビターを投与するために遺伝子治療法を用いるのが望ましいかもしれない。これらの場合においては、ＮＮＴ−１インヒビターまたはその断片もしくは変異体をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのアンチ鎖を、該組成物が注入される組織内で活性な構成的または誘導的プロモーターに作動的に結合させることができる。このアンチセンスＮＮＴ−１インヒビターオリゴヌクレオチドは、ベクター内に挿入されているものも、ベクターを伴わない単独のものも、直接的に注入することができる。あるいは、アンチセンスＮＮＴ−１インヒビターＤＮＡ構築物を筋肉組織内に直接的に注入することが可能であり、該アンチセンスＮＮＴ−１インヒビターＤＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）または筋クレアチンキナーゼプロモーターのような筋肉組織内で活性なプロモーターに作動的に結合している限り、該部位において、該構築物は該細胞内に取り込まれ、該細胞内で発現されうる。典型的には、該ＤＮＡ構築物は、（アンチセンスＮＮＴ−１インヒビターＤＮＡおよびプロモーターに加えて）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび／またはヘルペスウイルスベクターのようなベクターから得たベクター配列を含みうる。該ベクター／ＤＮＡ構築物は、注射用の医薬上許容される担体と混合することができる。
【００８３】
治療的に使用するＮＮＴ−１インヒビター組成物の有効量は、例えば、治療目的（例えば、ＮＮＴ−１インヒビターが使用される適応症）、投与経路および患者の状態に左右されるであろう。したがって、治療実施者は投与量を力価測定し、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与経路を改変する必要があろう。典型的には、臨床家は、所望の効果を与える投与量に達するまでＮＮＴ−１インヒビター組成物を投与するであろう。したがって、該ＮＮＴ−１インヒビター組成物は、１回の用量で、または時間を隔てて２回以上の用量（これらは、同じ量のＮＮＴ−１インヒビターを含有していても含有していなくてもよい）で、または埋め込み装置またはカテーテルによる連続的注入により投与することができる。
【００８４】
さらなる研究が行なわれるにつれて、種々の患者における種々の状態の治療のための適当な投与量レベルに関する情報が得られるであろう。当業者は、治療状況、治療中の障害のタイプ、被投与者の年齢および全身健康状態に応じて、適切な投与を確認することができるであろう。
【００８５】
Ｖ．ＮＮＴ−１インヒビター組成物で治療される状態
ＮＮＴ−１は免疫系細胞内および造血細胞内で発現されるため、ＮＮＴ−１インヒビターは、免疫障害により引き起こされる疾患および／または造血系の障害により引き起こされる疾患の治療に有用でありうる。特に、ＮＮＴ−１インヒビターは、ＩｇＥ関連免疫疾患および障害に罹患した患者を治療するために使用することができる。ＮＮＴ−１インヒビターの潜在的標的である幾つかの主要ＩｇＥ関連免疫障害が存在する。そのような疾患の具体例には、Ｉ型アレルギー疾患、アレルギー性鼻炎、湿疹、皮膚炎、花粉症、皮膚炎、アナフィラキシーショックおよび喘息が含まれるが、これらに限定されるものではない。アレルギー応答の機能不全により影響を受ける他の疾患または障害も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８６】
重要なことに、ＮＮＴ−１が抗原特異的ＩｇＥ産生を刺激するという知見は、ＮＮＴ−１がアレルギーの病理発生に特異的に関与していることを示唆している。ＮＮＴ−１インヒビターを使用してＮＮＴ−１の活性、発現または産生を抑制または有意に減少させることにより、血清ＩｇＥのレベルが減少しうる。血清ＩｇＥレベルの減少は、ＩｇＥ関連疾患の症状を軽減することが示されている。
【００８７】
ＮＮＴ−１インヒビターを使用することにより治療、診断、改善または予防されうる追加的な急性および慢性ＩｇＥ関連疾患の非限定的な一覧には、以下のものが含まれる：
・癌、動脈硬化症および血管再発狭窄症を含む（これらに限定されるものではない）異常な細胞増殖が関わる疾患。細胞の不適当な増殖により影響を受ける他の疾患も、本発明の範囲内に含まれる。
・慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、炎症性関節炎、骨関節炎、炎症性関節疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症、狼瘡、糖尿病、炎症性腸疾患、移植拒絶および移植片対宿主疾患を含む（これらに限定されるものではない）免疫系の機能不全に関する疾患の診断および／または治療。免疫系の機能不全により影響を受ける他の疾患も、本発明の範囲内に含まれる。
・不妊症、流産、早期分娩および出産ならびに子宮内膜症を含む（これらに限定されるものではない）生殖疾患および障害。生殖系に関わる他の疾患も本発明の範囲内に含まれる。生殖系の他の疾患も、本発明の範囲内に含まれる。
・望ましくないレベルのＩｇＥにより引き起こされる又はそれに関連している他の疾患も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８８】
ＶＩ．ＮＮＴ−１インヒビターの診断用途および他の関連用途
本明細書に開示するＮＮＴ−１インヒビター組成物は、治療剤としての用途に加えて、更なるＩｇＥ関連用途を有しうる。例えば、これらの組成物は更に、例えば、体液中のＮＮＴ−１および／またはＩｇＥの存在を検出するための標識化形態で、インビボおよびインビトロでの診断目的に使用することができる。
【００８９】
また、ＮＮＴ−１インヒビター、特に抗体は、血清ＩｇＥレベルの指標としてのＮＮＴ−１ポリペプチドの検出および定量のための競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））のような任意の公知アッセイ法において使用することができる。該抗体は、使用しているアッセイ法に適したアフィニティーでＮＮＴ−１ポリペプチドに結合するであろう。
【００９０】
診断用途の場合、ある実施形態においては、ＮＮＴ−１インヒビターを、検出可能な部分で標識することができる。該検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成しうる任意のものでありうる。例えば、該検出可能部分は、放射性同位体、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ、蛍光性または化学発光性化合物、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンまたはルシフェリン；または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０））でありうる。
【００９１】
競合結合アッセイは、標識標準体（例えば、ＮＮＴ−１ポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）が、一定量の抗ＮＮＴ−１抗体との結合に関して、試験サンプル被検体（ＮＮＴ−１ポリペプチド）と競合しうることに基づく。該試験サンプル中のＮＮＴ−１ポリペプチドの量は、該抗体に結合した標準体の量に反比例する。結合した標準体の量の測定を促進するために、該競合の前または後に、該抗体を典型的には不溶化して、該抗体に結合した標準体および被検体が、未結合のままの標準体および被検体から簡便に分離されうるようにする。
【００９２】
サンドイッチアッセイは、典型的には、２つの抗体の使用を伴い、各抗体は、検出および／または定量されるタンパク質の、異なる免疫原性部分またはエピトープに結合しうる。サンドイッチアッセイにおいては、該試験サンプル被検体は、典型的には、固体支持体上に固定化された第１抗体に結合し、ついで第２抗体が該被検体に結合して、不溶性の三要素複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。該第２抗体自体を、検出可能な部分で標識することが可能であり（直接サンドイッチアッセイ）、あるいは検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定することが可能である（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイは、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、該検出可能部分は酵素である。
【００９３】
後記のアッセイは、ＮＮＴ−１活性を抑制しうる化合物を同定するのに有用な方法の具体例を提供する。解釈を簡明にするために、本発明においては、アッセイの説明のために以下の定義を用いる。「試験分子」は、典型的には、ＮＮＴ−１とその受容体との相互作用を遮断するその潜在的能力に基づき、ＮＮＴ−１のインヒビターとして評価中の分子を意味する。
【００９４】
ＮＮＴ−１受容体は、例えば、標識（例えば、ヨウ素化）ＮＮＴ−１を使用する発現クローニングにより単離することができる。
【００９５】
ＮＮＴ−１活性を抑制する化合物を同定するためには、精製タンパク質を使用するいくつかのタイプのインビトロアッセイを行うことができる。そのような抑制は、典型的にはＮＮＴ−１とその受容体との相互作用を抑制する化合物により達成されうる。
【００９６】
１つのアッセイにおいては、精製されたＮＮＴ−１タンパク質またはその断片（例えば前記の方法を用いて製造したもの）をマイクロタイタープレートのウェルの底に固定化することができる。ついでＮＮＴ−１受容体および該試験分子を、１つずつ一度にまたは同時に該ウェルに加えることができる。インキュベーション後、該ウェルを洗浄し、シンチレーションカウンターを使用して放射能を計数して、該試験分子の存在下でのＮＮＴ−１／受容体結合の度合を測定することができる。典型的には、該分子を或る範囲の濃度にわたり試験し、該試験アッセイの要素の１以上を欠く一連の対照ウェルを使用して、該結果の評価を正確なものとすることができる。このアッセイの変法は、該受容体を該ウェルに結合させ、放射能標識ＮＮＴ−１を該試験分子と共に該ウェルに加えることを含む。インキュベーションおよび洗浄後、該ウェルを放射能に関して計数することができる。
【００９７】
ＮＮＴ−１を「マークする」ためには、放射能標識を含むいくつかの手段が利用可能である。例えば、ＮＮＴ−１タンパク質は、１２５−Ｉまたは３５−Ｓを使用して放射能標識することができる。あるいは、ＮＮＴ−１をコードするＤＮＡがｃ−ｍｙｃエピトープのようなペプチドのコード配列に融合されたＮＮＴ−１の融合タンパク質を使用することができる。ＮＮＴ−１−ｍｙｃ融合タンパク質は、ｍｙｃに対する商業的に入手可能な抗体で容易に検出することができる。
【００９８】
マイクロタイタープレートタイプの結合アッセイの代替手段は、ＮＮＴ−１またはその受容体をアガロースビーズ、アクリルビーズまたは他のタイプのそのような不活性固相基体上に固定化することを含む。該ＮＮＴ−１またはその受容体を含有する不活性基体を、放射能標識または蛍光標識された相補的成分（受容体またはＮＮＴ−１タンパク質）と共に試験分子を含有する溶液中に配置することができる。インキュベーション後、該不活性基体を遠心分離により沈殿させ、ＮＮＴ−１と受容体との結合の量を、前記の方法を用いて評価することができる。あるいは、該不活性基体複合体をカラム内で固定化し、該試験分子および相補的成分を該カラムに通過させることができる。ついでＮＮＴ−１／受容体複合体の形成を、前記の技術（すなわち、放射能標識、抗体結合など）のいずれかを用いて評価することができる。
【００９９】
ＮＮＴ−１活性を抑制する分子を同定するのに有用なもう１つのタイプのインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出系を製造業者のプロトコールに従い使用するＢｉａｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。このアッセイは、実質的には、検出器中に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＮＮＴ−１またはその受容体の共有結合を伴う。ついで該試験分子および該相補的成分を、該センサーチップを含有するチャンバー内に同時または連続的に注入し、ＮＮＴ−１／受容体の結合の量を、該センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に会合した分子量の変化に基づき評価することができる。分子量の変化は、該検出系により測定されうる。
【０１００】
いくつかの場合には、ＮＮＴ−１活性の減弱または抑制における使用のために、２以上の試験化合物を一緒に評価することが望ましいかもしれない。これらの場合には、前記アッセイは、そのような追加的な試験分子を第１試験分子と同時にまたはそれに続いて加えることにより、容易に修飾することができる。該アッセイの残りの工程は、前記のとおりのものでありうる。
【０１０１】
抗ＮＮＴ−１抗体を含む本明細書に開示するＮＮＴ−１インヒビターは、インビボイメージングにも有用である。検出可能な部分で標識された抗体を、動物に、好ましくは血流中に投与することが可能であり、該宿主内の該標識抗体の存在および位置をアッセイする。該抗体は、核磁気共鳴、放射線学または当技術分野で公知の他の検出手段のいずれによるかにかかわらず動物において検出可能な任意の部分で標識することが可能である。
【０１０２】
ＶＩＩ．トランスジェニック哺乳動物の使用
本発明の範囲内には、ＮＮＴ−１のヒト等価体をコードする遺伝子が破壊（「ノックアウト」）されていてこの遺伝子の発現レベルが有意に減少または完全に喪失しているマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはヒツジのような非ヒト哺乳動物を使用して、ＩｇＥレベルをモジュレーションする方法も含まれる。そのような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されているような技術および方法を用いて作製することができる。本発明の方法は更に、ＮＮＴ−１をコードする遺伝子（哺乳動物のＮＮＴ−１の天然形態または異種ＮＮＴ−１遺伝子）が哺乳動物により過剰発現されることにより「トランスジェニック」哺乳動物となったマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはヒツジのような非ヒト哺乳動物を使用するＩｇＥレベルのモジュレーションを含む。そのようなトランスジェニック哺乳動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ　９４／２８１２２（１９９４年１２月８日付け公開）に記載されているような良く知られた方法を用いて作製することができる。
【０１０３】
これらの非ヒト動物は、薬物候補のスクリーニングのために使用することができる。そのようなスクリーニングにおいては、該動物に対する薬物候補の影響を測定することができる。例えば、薬物候補は、該ＮＮＴ−１遺伝子の発現を減少または増加させうる。ある実施形態においては、該動物を該薬物候補にさらした後、産生されたＮＮＴ−１ポリペプチドの量を測定することができる。また、ある実施形態においては、該動物に対する該薬物候補の実際の影響を検出することができる。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を招いたり、あるいはそれに関連している可能性がある。そのような場合、該病理学的状態を予防または抑制する薬物候補の能力を試験することができる。他の具体例においては、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドの断片）の過剰産生が、疾患または病理学的状態を招いたり、あるいはそれに関連している可能性がある。そのような場合、薬物候補がそのような代謝産物の産生を減少させる能力またはそれが病理学的状態を予防または抑制する能力を試験することができる。
【０１０４】
以下の実施例は、単なる例示目的のものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【０１０５】
（実施例）
ライブラリー調製、ＤＮＡクローニングおよびタンパク質発現のための標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［１９８９］）およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ［１９９５］）に記載されている。
【０１０６】
実施例Ｉ
抗キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）および全ＩｇＥの誘導
抗ＫＬＨ（すなわち、抗原特異的）ＩｇＥを誘導するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇのＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の皮下注射により、マウス（９〜１１週および１９〜２１ｇのＢａｌｂ／ｃの雌、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を第０日に免疫した。第０日から開始して、マウスに５ｍｇ／ＫｇのＮＮＴ−１またはＮＮＴ−１溶媒のみ（対照）の７回の毎日のｉ．ｐ．注射を行い、ついで該マウスを第４、７および１４日に採血した。３ｍｇ／ＫｇのＮＮＴ−１を使用し、ＫＬＨ免疫の前および７および１４日後にマウスを採血して、この前記実験を繰返した。血清抗ＫＬＨ　ＩｇＥの検出可能レベルは、ＫＬＨ免疫の７日後には、８匹中２匹のＮＮＴ−１処理マウスおよび１０匹中０匹の対照において観察され、ＫＬＨ免疫の１４日後には、８匹中６匹のＮＮＴ−１処理マウスおよび１０匹中２匹の対照において観察された。ＫＬＨ免疫の４日後には、該マウスのいずれにおいても抗ＫＬＨ　ＩｇＥは検出可能ではなかった。該実験を繰返した場合、ＮＮＴ−１処理マウスは、ＫＬＨ免疫の１４日後、対照マウスより高レベルの抗ＫＬＨ　ＩｇＥを示した（図６）。抗ＫＬＨ　ＩｇＥ抗体は、ＫＬＨ免疫前には該マウスのいずれにおいても検出可能ではなく、ＫＬＨ免疫の７日後には該マウスの数匹においてのみ検出可能であった。
【０１０７】
実施例ＩＩ
ＮＮＴ−１トランスジェニック（Ｔｇ＋）マウスおよび対照同腹子（Ｔｇ−）を、前記のとおりに免疫し（５ｍｇ／Ｋｇ）、免疫の前ならびに７および１４日後に採血した。ＮＮＴ−１　Ｔｇ＋マウスは、肝特異的ａｐｏＥプロモーターを含有する遺伝子内で操作されたＮＮＴ−１コード配列を過剰発現する。全ＩｇＥを誘導するために、マウス（前記のとおりのＢａｌｂ／ｃ）に、５ｍｇ／ＫｇのＮＮＴ−１の１日１回のｉ．ｐ．注射を７日間連続して行った。対照マウスには、ＮＮＴ−１溶媒のみを投与した。ついで最終注射の日の翌日、マウスを採血した。ＮＮＴ−１　Ｔｇ＋マウスは、ＫＬＨ免疫の１４日後に、対照同腹子より高いレベルの抗ＫＬＨ　ＩｇＥ抗体を示した（図６）。抗ＫＬＨ　ＩｇＥ抗体は、ＫＬＨ免疫前にはＴｇ＋またはＴｇ−マウスのいずれにおいても検出可能ではなく、ＫＬＨ免疫の７日後にはそれらの数匹においてのみ検出可能であった。全ＩｇＥ誘導の実験においては、ＮＮＴ−１処理マウスは、対照マウスと比較して血清全ＩｇＥの２２％の増加を示した。
【０１０８】
実施例ＩＩＩ
抗ＫＬＨ　ＩｇＥおよび全ＩｇＥの検出
ＥＬＩＳＡにより血清中の抗ＫＬＨ　ＩｇＥ抗体を測定した。簡単に説明すると、プレートをＰＢＳ中のＫＬＨでコートし、ブロッキングし、標準体および試験サンプルの希釈物を加えた。抗マウスＩｇＥビオチン化抗体およびニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）共役ホースラディッシュペルオキシダーゼを使用して、捕捉された抗ＫＬＨ　ＩｇＥを現像した。ＥＬＩＳＡにより血清中の全ＩｇＥも測定した。このアッセイにおいては、プレートをＰＢＳ中の抗マウスＩｇＥ抗体でコートし、ブロッキングし、標準体および試験サンプルの希釈物を加えた。捕捉されたＩｇＥを、前記のとおりに現像した。結果をμｇ／ｍｌの単位で表し、スチューデントｔ検定で解析した。
【０１０９】
本発明は好ましい実施形態に関して記載されているが、改変および修飾が当業者において見出されると理解される。したがって、特許請求の範囲は、特許請求されているとおりの本発明の範囲内に含まれるすべてのそのような等価な改変を含むと意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトＮＮＴ−１をコードするｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】
ＮＮＴ−１のヒトゲノムＤＮＡの核酸配列（配列番号３）を示す。
【図３】
該ｃＤＮＡ（配列番号１）から翻訳されたとおりのヒトＮＮＴ−１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。最初の２７アミノ酸はシグナルペプチド配列に相当する可能性があり、番号１として示されたロイシンからＮＮＴ−１の成熟形態が始まる。＊は終結コドンを示す。
【図４】
マウスＮＮＴ−１をコードするｃＤＮＡの核酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】
該ｃＤＮＡ（配列番号４）から翻訳されたとおりのマウスＮＮＴ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。最初の２７アミノ酸はシグナルペプチド配列に相当する可能性があり、番号１として示されたロイシンからＮＮＴ−１の成熟形態が始まる。＊は終結コドンを示す。
【図６】
ＮＮＴ−１で若しくは対照としてのＮＮＴ−１溶媒で数日間処理したＢａｌｂ／ｃマウスにおける又はＮＮＴ−１トランスジェニックマウス（Ｔｇ＋）における及び同腹子対照（Ｔｇ−）における抗ＫＬＨ　ＩｇＥの血清レベルを示す。
【図７】
ＮＮＴ−１トランスジェニックマウス（Ｔｇ＋）および同腹子対照（Ｔｇ−）（第７、１４および２１日に採血したもの）における抗ＫＬＨ　ＩｇＥの血清レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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