(57)【要約】植物の開花時期を修飾するための組換えポリヌクレオチドおよび方法が提供される。上記組換えポリヌクレオチドにより形質転換された植物は特定の条件下で加速されたか、遅延されたかまたは誘導された開花時期を有してよい。さらに、形質転換された植物は変更された春化処理の要求を有してよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２８を除く群から選択される配列の、少なくとも６の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物であって、
（ｉ）　組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物と比較して修飾された開花時期を有するか、または（ｉｉ）　組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物と比較して修飾された春化処理要求性を有する、前記トランスジェニック植物。
【請求項２】
ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）の保存ドメインからなる群から選択される保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
組換えポリヌクレオチドが前記ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記プロモーターが構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型である、請求項３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記組換えポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２８を除く群から選択される配列の、少なくとも６の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし；
（ｂ）　前記トランスフォームされた植物を選択し；そして
（ｃ）　開花時期が変更されたトランスフォームされた植物を同定する；
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）の保存ドメインからなる群から選択される保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組換えポリヌクレオチドが前記ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターが構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ−１（ここで、Ｎは１〜２８である）からなるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２７を除く群から選択される配列の、少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし；そして
（ｂ）　前記トランスフォームされた植物を選択する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記組換えポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、
（ａ）　データベース配列を準備し；
（ｂ）　前記データベース配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）から選択されるポリペプチドと比較し；
（ｃ）　選択した配列分類に合致するデータベース配列を選択し；そして
（ｂ）　前記選択されたデータベース配列を植物中にトランスフォームする；
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記組換えポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法であって、
（ａ）　データベース配列を準備し；
（ｂ）　前記データベース配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ−１（ここで、Ｎは１〜２８である）から選択されるポリヌクレオチドと比較し；
（ｃ）　選択した配列分類に合致するデータベース配列を選択し；そして
（ｂ）　前記選択されたデータベース配列を植物中にトランスフォームする；
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記組換えポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここで、Ｎは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＵＳ仮出願シリアル番号６０／１５９，４６４（１９９９年１０月１２日に出願）；６０／１６４，１３２（１９９９年１１月８日に出願）；６０／１６６，２２８（１９９９年１１月１７日に出願）；６０／１９７，８９９（２０００年４月１７日に出願）；そしてＰｌａｎｔ Ｔｒａｉｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＩＩＩ（２０００年８月２２日に出願）から、部分的に優先権を主張する。
【０００２】
発明の属する分野
本発明は、植物分子生物学の分野に属し、そして植物の開花時期または春化処理要求性を修飾するための組成物および方法に関する。
【０００３】
発明の背景
繁殖成功率を最大にするために、植物は、好ましい条件下で開花することを確実にするための複雑なメカニズムを進化させてきた。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における最近の開花変異体および生態型を解析したところ、このようなメカニズムが、８０またはそれ以上の遺伝子が含有されている可能性がある、いくつかの遺伝子経路に基づいていることが示された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ ａｎｄ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９２：７７０−７７６； Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２９：５７−６６； ＥＭ Ｍｅｙｅｒｗｉｔｚ ａｎｄ ＣＲ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ Ｅｄｓ （１９９４） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｐ ４０３−４３３ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。同時に、これらの座位は、環境的変数（たとえば、日照時間、気温、光質（ｌｉｇｈｔ ｑｕａｌｉｔｙ）、そして栄養吸収率（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）など）により、そして植物の発生段階により、開花時期を調整する。
【０００４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、１６時間の長日条件下または連続明期条件下で成長させたときに急速に開花するが、８または１０時間明期の短日条件下では、ずっとゆっくりと開花する。この反応を制御する遺伝子は、光周期経路を構成し、そして長日条件下で開花の遅延を引き起こすが、短日条件においては開花を変化させない変異体により同定された。長日に応答して開花を促進するこの群に由来する例には、ＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）、ＧＩＧＡＮＴＥＡ（ＧＩ）、ＦＴ、ＦＷＡ、ＦＥ、ＦＤ、およびＦＨＡが含まれる。ＬＵＭＩＮＩＤＥＰＥＮＤＥＮＳ（ＬＤ）、ＦＣＡ、ＦＶＥ、ＦＹ、およびＦＰＡを含む遺伝子の第二の群は、全ての日照条件下で活性である自律性経路を形成する。この第二の群の遺伝子についての変異体は、日照条件に関わりなく、野生型対照よりも開花が遅い（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｔ Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ， ２２９：５７−６６； ＥＭ Ｍｅｙｅｒｗｉｔｚ ａｎｄ ＣＲ Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ Ｅｄｓ （１９９４） Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｐ ４０３−４３３ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０００５】
日照条件に対するその応答性が異なることに加えて、光周期経路および自律性経路に由来する変異体は、長時間寒冷条件（春化）処理に対してディファレンシャルな応答性を示す（Ｖｉｎｃｅ−Ｐｒｕｅ， （１９７５） Ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｉｎ Ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｓｍ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ ｐｐ ２６３−２９１， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）。春化処理反応を介して、たとえばＳｔｏｃｋｈｏｌｍなどのより高北緯に由来するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの生態型は、寒冷冬季条件さらされることにより、春の開花に適応している。このことにより、冬季条件の開始により種子の成熟が短縮される可能性がある場合に、夏の終わりに開花することを回避する（Ｒｅｅｖｅｓ ａｎｄ Ｃｏｕｐｌａｎｄ， （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ３：３７−４２）。これらの生態型を研究室内で生育させると、それらは遅くに開花するが、種子の発芽期間に４〜６週間の寒冷期間を設けると、ずっと早くに開花しうる。同様に、自律性経路に由来する変異体は、春化処理に供した場合、開花時期の非常に顕著な短縮を示す。対照的に、光周期経路に由来する変異体は、寒冷処理に対してわずかな応答しか示さない（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １０：６３７−６４４； Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４８：８８５−８９２）。このように、春化処理により、自律性経路条件についての要求性を克服することができる（Ｒｅｅｖｅｓ ａｎｄ  Ｃｏｕｐｌａｎｄ， （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ３：３７−４２）。
【０００６】
２種類のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの遺伝子、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ（開花座位Ｃ、ＦＬＣ）（ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｆ、ＦＬＦとしても知られる）およびＦＲＩＧＩＤＡ（ＦＲＩ）は、一緒になって、春化処理を行わない場合に開花を抑制する様に働く（Ｎａｐｐ−Ｚｉｎｎ， Ｋ． （１９５７） Ｉｎｄｕｋｔ． Ａｂｓｔａｍｍｕｎｇｓ． Ｖｅｒｅｂｕｎｇｓｌ． ８８：２５３２８５； Ｎａｐｐ−Ｚｉｎｎ Ｋ． （１９８５） ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ． １， Ａ． Ｈ． Ｈａｌｅｖｙ， ｐｐ ４９２−５０３； Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｄｅａｎ （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４８：８１−８９； Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：９１１−９１９； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：９０３−９０９．）。ＦＬＣおよびＦＲＩの優勢機能的アリルが、ＰｉｔｚｔａｌやＳｔｏｃｋｈｏｌｍなどの北部ヨーロッパＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型において、ともに見つかっている。これらの生態型は、春化処理しない場合に、極端に遅く開花する。広く使用されている研究室生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａは、これらの２座位のうちの一つのみに機能的アリルを含有し、そしていずれの遺伝子の機能的アリルも持っていないＬａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａなどの系統に比べていくぶん遅く開花する。ＦＲＩＧＩＤＡタンパク質配列は、未だ公開されていない。しかしながら、ＦＬＣ遺伝子は、最近クローニングされ、そしてＭＡＤＳ ｂｏｘタンパク質をコードすることが示された（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：４４５−４５８； Ｍｉｃｈａｅｌｓ Ｓ． ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ， Ｒ．， １９９９， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：９４９−９５６）。ＦＬＣの優勢アリルおよび過剰発現により開花が遅れること、そして一方でヌルｆｌｃ変異体は早期に開花することが報告された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６：９０３−９０９； Ｍｉｃｈａｅｌｓ ａｎｄ Ａｍａｓｉｎｏ， （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：９４９−９５６； Ｓｈｅｌｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７：３７５３−３７５８）。このように、ＦＬＣは成熟前開花を防止する様に働く。
【０００７】
我々は、植物の開花時期または春化処理要求性を制御する転写因子を見いだした。これらの転写因子は、したがって、植物の開花特性を操作するために有用であり得る。
【０００８】
発明の概要
一側面において、本発明は、組換えポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物に関する。組換えポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）からなるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２８を除く群から選択される配列の、少なくとも６の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、組換えポリヌクレオチドの存在は、組換えポリヌクレオチドを含まない別の植物の同一の特性と比較する場合、トランスジェニック植物の開花時期または春化処理要求性を変化させる。
【０００９】
一態様において、ヌクレオチド配列は、１）局在性ドメイン、２）活性化ドメイン、３）抑制ドメイン、４）オリゴマー化ドメイン、または５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）のＤＮＡ結合ドメイン、などの保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。別の態様において、組換えポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む。プロモーターは、構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型であってもよい。
【００１０】
第二の側面において、本発明は、植物の開花時期または春化処理要求性を変更する方法に関する。この方法は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）からなる群から選択した配列の、少なくとも６の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし；（ｂ）トランスフォームされた植物を選択し；そして（ｃ）所望の特性についてトランスフォームした植物を同定する；ことを含む。
【００１１】
一態様において、ヌクレオチド配列は、１）局在性ドメイン、２）活性化ドメイン、３）抑制ドメイン、４）オリゴマー化ドメイン、または５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）であるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２８を除くＤＮＡ結合ドメインなどの保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。別の態様において、組換えポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）からなる群から選択される配列に対して、８４％より高い配列同一性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする。さらなる態様において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列に機能可能に連結したプロモーターをさらに含む。プロモーターは、構成的であるか、または誘導性であるか、または組織活性型であってもよい。
【００１２】
第三の側面において、本発明は、開花時期または植物の春化処理要求性と関連する植物の特性を変更するための別の方法に関する。この方法は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ−１（ここでＮは１〜２８である）からなるがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２７を除く群から選択される配列の、少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドにより、植物をトランスフォームし；そして（ｂ）前記トランスフォームされた植物を選択する；ことを含む。
【００１３】
さらに別の側面において、本発明は、植物の開花時期または春化処理要求性を変更するさらに別の方法である。この方法は、（ａ）データベース配列を準備し；（ｂ）そのデータベース配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ（ここでＮは１〜２８である）から選択されるポリペプチドと比較し；（ｃ）選択された配列分類に合致するデータベース配列を選択し、；そして（ｄ）前記データベース配列を植物中にトランスフォームする；ことを含む。あるいは、このデータベース配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２Ｎ−１（ここでＮは１〜２８である）から選択されるポリヌクレオチドと比較してもよい。
【００１４】
発明の詳細な説明
定義
“組換えポリヌクレオチド”は、遺伝子コード配列またはその断片を含むヌクレオチド配列である（少なくとも１８の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含む）。さらに、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、５’または３’非翻訳領域、リポーター遺伝子、選択可能マーカーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、修飾塩基または修飾バックボーンを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、転写物配列（たとえばｍＲＮＡ）またはプロセスされたヌクレオチド配列（たとえば、ｃＤＮＡ）を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、センス方向かまたはアンチセンス方向かの、いずれかで配列を含んでもよい。
【００１５】
“組換えポリヌクレオチド”は、天然の状態では存在しないポリヌクレオチドであり、たとえば、ポリヌクレオチドが天然では見いだされないヌクレオチド配列を含むか、またはポリヌクレオチドが典型的には近接しているヌクレオチド配列と分離している場合、または典型的には近接していないヌクレオチド配列と隣接している場合である。
【００１６】
“組換えポリペプチド”は、組換えポリヌクレオチドの翻訳に由来するポリペプチドであるか、または野生型細胞において天然の状態であるポリペプチドよりも細胞内で増加している、たとえば５％以上増加している、１０％以上増加している、または２０％以上増加しているものであり、そして野生型植物の天然の反応の結果ではなく、または典型的には細胞中で結合しているその他の構成物質とは分離される。
【００１７】
“トランスジェニック植物”は、同一種の野生型植物中、または天然に存在する品種中、または栽培品種中、には通常は見いだされず、そしてヒトの操作により植物中に導入された、遺伝的物質を含有する植物である。トランスジェニック植物は、発現ベクターまたはカセットを含有していてもよい植物である。発現カセットは、遺伝子コード配列を含み、そして遺伝子コード配列の発現を可能にする。発現カセットは、トランスフォームにより、または親植物のトランスフォームの後に交配により、導入することができる。
【００１８】
トランスジェニック植物は、全体の植物のことだけでなく、たとえば、種子、果実、葉、または根などの植物の部分、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、またはいずれか他の植物物質、そしてその子孫のことをいう。
【００１９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現に関して“変化した発現”という言い回しは、野生型植物における発現パターンとは異なるトランスジェニック植物における発現パターンのことをいい；あるいは、たとえば、野生型植物において配列が発現される細胞型とは異なる細胞型において発現されること、または野生型植物において配列が発現される時期とは異なる時期に発現されること、またはホルモンや環境シグナルなどの異なる誘導性物質に反応すること、または野生型植物において見られる発現レベルと比較して異なる発現レベル（より高い場合かより低い場合かのいずれか）であること、などである。この用語はまた、検出レベル以下まで発現レベルを低下させること、または発現を完全になくすこともいう。結果として得られる発現パターンは、一過性であってもまたは安定的であってもよく、構成的であってもまたは誘導性であってもよい。
【００２０】
“転写因子”（ＴＦ）は、１またはそれ以上の遺伝子の発現を、遺伝子コード配列と結合する１またはそれ以上のヌクレオチド配列を結合することにより直接的に、または遺伝子コード配列と結合する１またはそれ以上のヌクレオチド配列と直接的に調節するかまたは間接的に実際に結合するその他のポリペプチドのレベルまたは活性に影響を与えることにより間接的に調節する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことをいう。ＴＦは、この定義においては、単一の遺伝子または複数の遺伝子の転写を活性化することができるかまたは抑制することができる、いずれかのポリペプチドを含む。このポリペプチドの群には、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、ＧＴＰ−結合タンパク質および受容体が含まれるが、これらのものには限定されない。
【００２１】
転写因子配列は、コード配列の全体またはコード配列の断片またはドメインを含んでもよい。ポリペプチドに関して述べる場合“断片またはドメイン”は、無傷のポリペプチドの少なくとも一つの生物学的機能を、無傷のポリペプチドが機能を発揮するのと実質的に同一の方法でまたは同様の程度まで、発揮するポリペプチドの部分であってもよい。断片は、たとえば、特異的なＤＮＡプロモーター領域に結合するＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのドメインを含んでもよい。断片は、わずか６アミノ酸から無傷のポリペプチドの長さまでのサイズで変化してもよく、しかし好ましくは、長さが少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは長さが少なくとも６０アミノ酸である。ヌクレオチド配列について述べる場合、“断片”は、本明細書中で提供される配列のうちのいずれかの、少なくとも連続した１８ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、の配列のいずれかのことをいう。
【００２２】
典型的なポリヌクレオチドおよびポリペプチドには、配列表中に提供される以下の配列が含まれる：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １：Ｇ１５７（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２：Ｇ１５７（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３：Ｇ８５９（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４：Ｇ８５９（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５：Ｇ８５９．１（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ６：Ｇ８５９．１（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ７：Ｇ８５９．２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ８：Ｇ８５９．２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ９：Ｇ１８４２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １０：Ｇ１８４２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １１：Ｇ１８４２．２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １２：Ｇ１８４２．２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １３：Ｇ１８４２．６（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １４：Ｇ１８４２．６（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １５：Ｇ１８４２．７（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １６：Ｇ１８４２．７（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １７：Ｇ１８４３（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １８：Ｇ１８４３（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １９：Ｇ１８４４（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２０：Ｇ１８４４（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２１：Ｇ１８４４．２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２２：Ｇ１８４４．２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２３：Ｇ８６１（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２４：Ｇ８６１（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２５：Ｇ８６１．１（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２６：Ｇ８６１．１（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２７：Ｇ１７５９（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２８：Ｇ１７５９（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ２９：Ｇ１９２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３０：Ｇ１９２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３１：Ｇ２３４（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３２：Ｇ２３４（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３３：Ｇ３６１（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３４：Ｇ３６１（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３５：Ｇ４８６（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３６：Ｇ４８６（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３７：Ｇ７４８（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３８：Ｇ７４８（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ３９：Ｇ９９４（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４０：Ｇ９９４（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４１：Ｇ１３３５（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４２：Ｇ１３３５（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４３：Ｇ５６２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４４：Ｇ５６２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４５：Ｇ７３６（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４６：Ｇ７３６（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４７：Ｇ１０７３（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４８：Ｇ１０７３（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ４９：Ｇ１４３５（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５０：Ｇ１４３５（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５１：Ｇ１８０（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５２：Ｇ１８０（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５３：Ｇ５９２（ｃＤＮＡ）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５４：Ｇ５９２（タンパク質）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５５：Ｇ２０８（ｃＤＮＡ）；ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： ５６：Ｇ２０８（タンパク質）。
【００２３】
「保存されたドメイン」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを他の植物からの相同な遺伝子又はタンパク質と比較したとき、配列レベルで他の断片よりも保存されたポリヌクレオチド又はポリペプチド断片を指す。この保存されたドメインは１）局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）ドメイン、２）活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ドメイン、３）抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）ドメイン、４）ジメリゼーション（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）又はオリゴメリゼーション（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）ドメイン、５）ＤＮＡ結合ドメインあるいはそれらの組合せであってよい。ＭＡＤＳタンパク質については、保存されたドメインは典型的にはＤＮＡ結合ドメインである。
【００２４】
塩基配列が他の塩基配列と機能的な関係に置かれている場合、「操作可能に結合されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」。例えばプロモーターやエンハンサーは、プロモーターやエンハンサーの存在によりその遺伝子をコードする配列の発現レベルが増加する場合、遺伝子をコードする配列と操作可能に結合されている。
【００２５】
「形質（ｔｒａｉｔ）」は植物や特定の植物材料あるいは細胞の生理的、形態的、生化学的、あるいは物理的性質を指す。この性質は、種子や植物の大きさのようにヒトの目に見えるものであるか、種子や葉のタンパク質、澱粉、あるいは油分含量にように、生化学的技法により、あるいはノーザン、ＲＴＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイあるいはレポータージーン発現系を利用した遺伝子発現レベルの観察により計測されるものであるか、ストレス耐性、収量あるいは病害抵抗性のような農業的観察により計測されるものであってよい。
【００２６】
「形質改変（ｔｒａｉｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現が改変された形質転換植物における性質の、そうでない植物（野生型植物のような）と比較した検出可能な差をいう。形質改変は、観察される形質（差）の少なくとも５％の増加又は減少、少なくとも１０％の差、少なくとも２０％の差、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％、あるいはさらに大きな差に帰結してもよい。改変された形質には自然のばらつきがあろうということは知られている。したがって、観察された形質改変は、野生型植物で観察される分布と比較した、形質転換植物における形質の正常な分布の変化を伴う。
【００２７】
特定の形質改変は、種子（胚）、果実、根、花、葉、茎、軸、若木などの形質改変であり、以下のようなものを含む：凍結、寒冷、熱、渇水、水分飽和、放射、オゾンを含む環境条件への増強された耐性；微生物、菌、ウイルスによる病気への増強された耐性；線虫類への耐性、減少した除草剤感受性、増強された重金属耐性（あるいは増強された重金属取り込み能力）、貧しい光条件下での増強された生育（例えば弱い光／あるいは短い昼時間）、あるいは特定の遺伝子の発現レベルの変化。改変されるかもしれない他の表現形は、タキソール、トコフェロール、トコトリエノール、ステロール、フィトステロール、ビタミン、ワックスモノマー、抗酸化剤、アミノ酸、リグニン、セルロース、タンニン、プレニルリピッド（クロロフィルやカロチノイドのような）、グルコシノレート、及びテルペノイドの生産におけるばらつきのような植物代謝物の生産、増強されたあるいは成分が変化したタンパク質や脂質の生産（特に種子における）、あるいは改変された糖（不溶性あるいは可溶性）及び／又は澱粉の組成、に関する。改変されてもよい物理的な植物の性質は、細胞の発達（例えば突起様構造の数）、果実や種子の大きさ及び数、茎や葉や根のような植物の一部の収量、保存中の種子の安定性、種子のさやの性質（例えば壊れやすさ）、根毛の長さと量、節間距離、あるいは種子殻の質などである。改変されてもよい植物の生育上の性質は、生長速度、種子の発芽速度、植物及び幼植物の勢い、葉及び花の老化、雄性不能、アポミクシス、開花時間、花器官脱離、窒素取り込み速度、バイオマスあるいは蒸散の特徴、並びに、頂部優性、分岐パターン、器官の数、器官の独自性、器官の形と多きさ、などの植物構造の性質、を含む。
【００２８】
特に興味深いものは、昼間時間に反応した、温度に反応した、光の質に反応した開花時間の変化や、栄養分利用可能性、及び植物の発達段階などのような、改変された春化処理要求や開花時間の特徴に関する形質である。
【００２９】
１．配列
我々は、植物の開花時間を改変させるのに利用できる特定の植物転写因子（ＴＦｓ）を見出した。つまり、本発明のＴＦｓを利用すれば特定の条件下で植物の開花時間を減少させたり、増加させたり、誘導可能にしたりできる。さらに、この転写因子は植物の春化処理要求を改変するのに利用できる。
【００３０】
これらの植物転写因子は以下の転写因子ファミリーのひとつに属するであろう：
ＡＰ２ （ＡＰＥＴＡＬＡ２） ドメイン 転写因子ファミリー （Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ （１９９８） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７９：６３３−６４６）； ｔｈｅ ＭＹＢ 転写因子ファミリー （Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｐａｚ−Ａｒｅｓ， （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １３：６７−７３）； ｔｈｅ ＭＡＤＳ ドメイン 転写因子ファミリー （Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ （１９９７） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７８：１０７９−１１０１）； ｔｈｅ ＷＲＫＹ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ （Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４４：５６３−５７１）； ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ−ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ （Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１１４：１５７５−１５８８）； ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｚ） ｆａｍｉｌｙ （Ｋｌｕｇ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｂｅ （１９９５） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： ５９７−６０４）； ｔｈｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ （ＨＢ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ （Ｄｕｂｏｕｌｅ （１９９４） Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｇｅｎｅｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）； ｔｈｅ ＣＡＲＴ−ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ｆｏｒｓｂｕｒｇ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ （１９８９） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ３：１１６６−１１７８）； ｔｈｅ ｓｑｕａｍｏｓａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ （ＳＰＢ） （Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９６ ２５０：７−１６）； ｔｈｅ ＮＡＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ （Ｓｏｕｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８５：１５９−１７０）； ｔｈｅ ＩＡＡ／ＡＵＸ ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１３７１１３７３）； ｔｈｅ ＨＬＨ／ＭＹＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ （Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｔ． Ｐｒｏｆｉｌｅ １：６３９−７０９）； ｔｈｅ ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＤＢＰ） ｆａｍｉｌｙ （Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：２９９４−３００２）； ｔｈｅ ｂＺＩＰ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ （Ｆｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ８：１９２−２００）； ｔｈｅ Ｂｏｘ Ｐ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｔｈｅ ＢＰＦ−１） ｆａｍｉｌｙ （ｄａ Ｃｏｓｔａ ｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４：１２５−１３５）； ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ （ＨＭＧ） ｆａｍｉｌｙ （Ｂｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｒｅｅｖｅｓ （１９９６） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５４：３５−１００）； ｔｈｅ ｓｃａｒｅｃｒｏｗ （ＳＣＲ） ｆａｍｉｌｙ （Ｄｉ Ｌａｕｒｅｎｚｉｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８６：４２３−４３３）； ｔｈｅ ＧＦ１４ ｆａｍｉｌｙ （Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１４：１４２１−１４３１）； ｔｈｅ ｐｏｌ��ｃｏｍｂ （ＰＣＯＭＢ） ｆａｍｉｌｙ （Ｋｅｎｎｉｓｏｎ （１９９５） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２９：２８９−３０３）； ｔｈｅ ｔｅｏｓｉｎｔｅ ｂｒａｎｃｈｅｄ （ＴＥＯ） ｆａｍｉｌｙ （Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８３：７９４−７９９； ｔｈｅ ＡＢ１３ ｆａｍｉｌｙ （Ｇｉｒａｕｄａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１２５１−１２６１）； ｔｈｅ ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ （ＴＨ） ｆａｍｉｌｙ （Ｄｅｈｅｓｈ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１３９７−１３９９）； ｔｈｅ ＥＩＬ ｆａｍｉｌｙ （Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ８９：１１３３−４４）； ｔｈｅ ＡＴ−ＨＯＯＫ ｆａｍｉｌｙ （Ｒｅｅｖｅｓ ａｎｄ Ｎｉｓｓｅｎ （１９９０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６５：８５７３−８５８２）； ｔｈｅ Ｓ１ ＦＡ ｆａｍｉｌｙ （Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１１６５１１６９）； ｔｈｅ ｂＺＩＰＴ２ ｆａｍｉｌｙ （Ｌｕ ａｎｄ Ｆｅｒｌ （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０９：７２３）； ｔｈｅ ＹＡＢＢＹ ｆａｍｉｌｙ （Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６：２３８７−９６）； ｔｈｅ ＰＡＺ ｆａｍｉｌｙ （Ｂｏｈｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ． １７：１７０−８０）； ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ （ＭＩＳＣ） ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ＤＰＢＦ ｆａｍｉｌｙ （Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：１２３７−１２５１） ａｎｄ ｔｈｅ ＳＰＦ１ ｆａｍｉｌｙ （Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ａｎｄ Ｎａｋａｍｕｒａ （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４４：５６３−５７１）； ｔｈｅ ｇｏｌｄｅｎ （ＧＬＤ） ｆａｍｉｌｙ （Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：９２５−９３６）， ａｎｄ ｔｈｅ ＴＵＢＢＹ ｆａｍｉｌｙ （Ｂｏｇｇｉｎ ｅｔ ａｌ， （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：２１１９−２１２５）
特に、我々の見出した、開花時間や春化に関係するＴＦｓはＭＡＤＳ転写ファミリー、ＭＹＢファミリー、ＷＲＫＹファミリー、ＨＬＨ／ＭＹＣファミリー、ＧＬＤファミリー、ＡＴ−ＨＯＯＫファミリー、ＣＡＡＴファミリー、ｂＺＩＰファミリーのメンバー、及び亜鉛協調タンパク質ファミリー（Ｚ−Ｄｏｆ，Ｄ−ＣＬＤＳＨ，及びＺ−ＣＨ２Ｈ２）のメンバーを含む。実際に、我々は植物の開花時間の改変に関連したＷＲＫＹ，ＣＡＡＴ，ｂＺＩＰ，ＡＴ−ＨＯＯＫ，及びＨＬＨ／ＭＹＣファミリーの第一のメンバーを同定した：Ｇ１９２及びＧ１９０（ＷＲＫＹ）、Ｇ４８６（ＣＡＡＴ）、Ｇ５６２（ｂＺＩＰ）、Ｇ１０７３（ＡＴ−ＨＯＯＫ）及びＧ５９２（ＨＬＨ／ＭＹＣ）。
【００３１】
これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドは塩基配列表に載せてあり、図１に作表してある。図１は塩基配列番号、対応するＧＩＤ番号、その配列がポリヌクレオチドかポリペプチド配列か、を示し、保存されたドメインを示している。我々は、塩基配列表の各塩基配列に由来するドメイン又は断片も同定した。断片は配列のいずれの場所からのものでもよく、その配列の長さまでのどのような長さのものであってもよく、タンパク質については６残基、ＤＮＡについては１８塩基ほどに短いものであってよい。ＤＮＡ配列の断片の例は、以下の様である：１−５０、５１−１００、１０１−２００、２０１−２１８、２１８−３００、３０１−４５０、及び４５０−６００；そしてタンパク質配列の断片は以下の様である：１−５０、５１−１００、１０１−２００、２０１−２０６、２０６−２５０、２５１−３００。ＤＮＡ配列に関しては、数はＤＮＡの５’あるいは３’末端から測定された。タンパク質配列に関しては、断片の場所はタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端から決定され、隣接するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号２番のように記載された断片のＮ末端あるいはＣ末端方向にさらに１０、２０、４０、６０または１００アミノ酸を含む。
【００３２】
同定されたポリペプチド断片は他の転写因子由来の断片あるいは配列に結合され、Ｓｈｏｒｔ、ＰＣＴ公開ＷＯ９８２７２３０号”Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”あるいはＰａｔｔｅｎら、ＰＣＴ公開ＷＯ９９２３２３６号”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”、あるいはＭｉｎｓｈｕｌｌとＳｔｅｍｍｅｒ、ＵＳ特許５８３７４５８号に記載された方法を用いて、さらに新規な配列が生成される。あるいは同定された断片は転写活性化ドメインに結合されてもよい。転写活性化ドメインはＤＮＡ結合部位からの転写開始を助ける。いくつかの活性化ドメインの共通の性質は過剰の正又は負の電荷を持つ両親媒性のアルファヘリックスを形成するようにするということである（Ｇｉｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６７０−６７２， Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１：１２１−１２６， Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：３９８３−３９８９）。例としてはＶＰ１６あるいはＧＡＬ４の転写活性化領域（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８）　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ３７６−３８１； ａｎｄ Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：１７７３−１７８５）、細菌の配列由来のペプチド（Ｍａ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１； １１３−１１９）、及び合成ペプチド（Ｇｉｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ， 同上）が挙げられる。
【００３３】
単離されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、改変された植物が野生型植物よりも有利な形質を持つように、植物の発生、生理、あるいは生化学を改変するのに利用されてよい。同定されたポリヌクレオチド断片は核酸プローブやプライマーとしても有用である。核酸プローブはマイクロアレイ実験のプロトコールを含むハイブリダイゼーションプロトコールで有用である。プライマーは核酸ハイブリダイゼーションにより相補的なターゲットＤＮＡ鎖にアニールし、プライマーとターゲットＤＮＡ鎖間のハイブリッドを形成し、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりターゲットＤＮＡに沿って伸長する。プライマー対は例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や他の核酸増幅法による核酸配列の増幅に利用することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ． ２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）及び Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９８）を参照されたい。
【００３４】
２．相同配列（Ｈｏｍｏｌｏｇｓ）の同定
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａあるいは他の植物由来の塩基配列表に載せたものと相同な配列が植物の形質を改変するために利用されてもよい。相同配列は、単子葉植物及び双子葉植物を含むいずれの植物由来であってもよく、限定するものではないが特に以下のような農業上重要な植物種が含まれる、大豆、麦、とうもろこし、じゃがいも、米、ナタネ（カノーラを含む）、ヒマワリ、アルファルファ、サトウキビ及び芝のような穀物；バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、いちご、及びラズベリー、カンタロープ、にんじん、カリフラワー、コーヒー、きゅうり、ナス、ぶどう、ハネジュー、レタス、マンゴー、メロン、たまねぎ、パパイヤ、豆、コショウ、パイナップル、ほうれんそう、かぼちゃ、スイートコーン、タバコ、とまと、すいか、バラ科の果物（りんご、もも、なし、さくらんぼう、プラムなど）、及びアブラナ属の野菜（ブロッコリ、キャベツ、カリフラワー、芽キャベツ、コールラビなど）のような果物や野菜。他の穀物、果物及び野菜で表現型を変えられる物には、大麦、カラント、アボガド、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、タンジェリンのような柑橘系の果物、アーチチョーク、さくらんぼう、クルミやピーナッツのようなナッツ、エンダイブ、ニラネギ、アロールート、ビーツ、キャッサバ、かぶ、ラディッシュ、ヤムイモ、さつまいものような根菜、及び豆類が含まれる。相同配列はマツ、ポプラ、ユーカリのような樹木種に由来してもよい。
【００３５】
配列表に示す配列へ導入される置換、欠失および挿入も、本発明の範囲内に含まれる。そのような配列の修飾は、部位特異的変異により工学的に導入することができる（Ｗｕ （ｅｄ．） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９９３）ｖｏｌ． ２１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。アミノ酸置換は、典型的には一残基置換である；挿入は一般的には約１から１０アミノ酸残基のオーダーである；および欠失は約１から３０残基の範囲である。好ましい態様では、欠失または挿入は、隣接する組で行なわれ、例えば２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらのあらゆる組み合わせは、配列中で組み合わせで起こり得る。転写因子をコードするポリヌクレオチド中で作られる変異は、その配列をリーディングフレームの外に置くものであってはならず、また２次ｍＲＮＡ構造となる相補領域を生じてはならない。
【００３６】
置換とは、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、その場所に一つの異なった残基が挿入されることである。そのような置換は、遺伝子の機能にはほとんど影響を与えない保存的なものであり、例えばアラニンのセリンへの置換、アルギニンのリジンへの置換、グルタメートのアスパルテートへの置換および同類の置換によるものである。保存的でなくタンパク質の特性に大きな変化を生ずるであろう置換は、（ａ）親水性の残基（例えばセリルまたはトレオニル）の疎水性基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）への置換；（ｂ）システインまたはプロリンの他の残基への置換；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えばリジル、アルギニル、またはヒスチジル）の電気陰性残基（例えばグルタミル、またはアスパルチル）への置換；または（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）の側鎖を有していない残基（グリシン）への置換である。
【００３７】
更に、”相同配列”という語には、化学的または酵素的手段により修飾されたポリペプチド配列が含まれる。相同配列は、脂質、糖、ペプチド、有機または無機化合物により修飾された配列、または修飾されたアミノ酸の使用による修飾された配列などであってもよい。タンパク修飾技術は Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９８）に示されている。
【００３８】
相同配列類もまた、データベースサーチ、配列アラインメントおよび比較として利用可能な配列解析プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ， ＦＡＳＴＡ， ＰＩＬＥＵＰ， ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ 等のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０ （ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｉｏｎ， ＷＩ）から）を使用することによって決定されるアラインメントの後、実質的に配列同一性とされるパーセントを有する２つの配列を意味する。ＧｅｎＢａｎｋ， ＥＭＢＬ， Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ および ＰＩＲ のような公共配列データベース、またはＰｈｙｔｏＳｅｑ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）のような私的配列データベースにてサーチすることができる。比較のための配列アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム （１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐ／． Ｍａｔｈ． ２：４８２によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ および Ｗｕｎｓｃｈの相同性アルゴリズム（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３によって、Ｐｅａｒｓｏｎ および Ｌｉｐｍａｎ の類似性サーチ方法によって（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５： ２４４４、それらのアルゴリズムのコンピューターインプリメンテーションによって、行なうことができる。アラインメントの後、２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は典型的には、比較領域全体を、配列類似な局所領域を同定しかつ比較することにより２つの配列の配列比較をすることによって行なわれる。比較領域は少なくとも約２０連続位置のセグメントであってよく、一般的には約５０から約２００、より一般的には約１００から１５０連続位置のセグメントである。該方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） （１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに記載されている。
【００３９】
記載配列のホモログである転写因子は、典型的には少なくとも４０％アミノ酸配列同一性を共有する。より密接に関係するＴＦｓは、記載配列と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％ 配列同一性を有する。開示配列ともっとも密接に関係する因子は、少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。ヌクレオチドのレベルでは、配列は典型的には少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有し、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％の配列同一性を有し、およびより好ましくは８５％、９０％、９５％または９７％配列同一性を有する。遺伝コードの縮重は、コードするタンパク質のアミノ酸配列を維持しつつポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中に主な多様性を持たせることを可能にする。
【００４０】
２つの核酸分子が密接に関係しているか否かを決定する一つの方法は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズするかである。一般的に、ストリンジェントな条件は、決められたイオン強度およびｐＨ下にて特定配列の熱融解温度（Ｔｍ）から約５℃から２０℃低い条件が選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする温度（決められたイオン強度およびｐＨ下）である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ． ２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、および Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−− Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には完全長ｃＤＮＡ またはそのｃＤＮＡ の選択された部分に基づくプローブと、０．２ｘ ＳＳＣ から２．０ ｘ ＳＳＣ、 ０．１ ％ ＳＤＳ、５０−６５℃での洗浄、たとえば ０．２ ｘ ＳＳＣ、０．１ ％ ＳＤＳ、６５℃の洗浄条件でハイブリダイズする。より低い関係にあるホモログの検出では、洗浄は５０℃で行なうこともできる。
【００４１】
通常のハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションプローブを放射活性ラベルのような検出ラベルと結合させ、そして該プローブは少なくとも２０ヌクレオチド長であるのが好ましい。当業者によく知られているように、ハイブリダイゼーションプローブの長さを長くすることは、特異性を増加させる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ヌクレオチド配列由来のラベル化プローブは、植物ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーおよび当業者に知られた手段で検出されたハイブリダイゼーションシグナルとハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズしたコロニーもしくはプラークを（使用したライブラリーのタイプに依存する）精製し、コロニーもしくはプラークを含むクローン化された配列を分離し、性質を調べる。ホモログは（インバースＰＣＲまたはＲＡＣＥのような）ＰＣＲに基づいた技術により、変性プライマーを使用して解析できる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） （１９９８） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ参照。
【００４２】
さらに、ＴＦ ホモログは発現ライブラリーの免疫スクリーニングによっても得ることができる。記載ＴＦ核酸配列が提供されれば、該ポリペプチドは非相同発現システム（例えばＥ． ｃｏｌｉ）によって発現し、精製することができ、そして該ＴＦに特異的な抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を生産するのに使用することもできる。抗体は、ＴＦアミノ酸配列から得られた合成ペプチドに対して生産させることもできる。抗体産生方法は、当業者に周知であり、そして Ｈａｒｌｏｗ および Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。そのような抗体は、上述の方法を用いて、ＴＦホモログをクローン化したい植物から作られた発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。選択されたｃＤＮＡは、配列解析および生物活性によって確認することができる。
【００４３】
３．改良された転写因子の発現
いずれの同定された配列も、植物での発現のためにカセットまたはベクターに挿入される。植物細胞の適切な形質転換に適した、または形質転換植物の樹立に適した数種の発現ベクターが、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ および Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ， （１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， および Ｇｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されているものを含み、報告されている。特徴的な例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ のＴｉプラスミドから得られたもの、並びにＨｅｒｒｅｒａ−ＥｓｔｒｅｌＩａ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０３： ２０９， Ｂｅｖａｎ， Ｍ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８４） １２： ８７１１−８７２１， Ｋｌｅｅ， Ｈ． Ｊ．， （１９８５） ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３： ６３７〜６４２によって記載されているものであって双子葉植物用のものが含まれる。Ｔｉ由来プラスミドは、単子葉植物および双子葉植物の双方に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 仲介形質転換を使用して形質転換することができる（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：７４５−５０； Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３２：１０３３−１０４３）。
【００４４】
あるいは、非Ｔｉベクターを、フリーＤＮＡ移入技術を使用して、植物および細胞内にＤＮＡを移入するのに使用することができる。そのような方法には、例えばリポソーム、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクティルボンバートメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、シリコンカーバイドウィスカー（ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｗｉｓｋｅｒｓ）、およびウイルスの使用が含まれる。それらの技術を使用して、形質転換植物、たとえばコムギ、米（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， Ｐ．， （１９９１） ＢｉｏｌＦｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９６２）、およびコーン（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ， Ｗ．， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ６０３−６１８）を作ることができる。粒子ガンを使用した直接ＤＮＡ移入技術（Ｗｅｅｋｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２： １０７７−１０８４； Ｖａｓｉｌ， Ｖ．， （１９９３） ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ６６７−６７４； Ｗａｎ， Ｙ． および Ｌｅｍｅａｕｘ， Ｐ．， （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４： ３７−４８、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介ＤＮＡ形質転換 （Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： ７４５−７５０）では、未熟胚が単子葉植物でのよいターゲットである。
【００４５】
典型的には、植物形質転換ベクターは、５’ および ３’制御配列および優性選択マーカーの転写コントロール下にある、一つ以上のクローン化された植物コード配列（ゲノムもしくはｃＤＮＡ）を含む。そのような植物形質転換ベクターは、典型的にはプロモーター（例えば、発現が誘導的であるか構成的であるか、環境支配的制御か発生支配的制御か、または細胞または組織特異的であるかをコントロールしている制御領域）、転写開始部位、（イントロンスプライス部位のような）ＲＮＡプロセスシグナル、転写終止部位および／またはポリアデニレーションシグナルも含む。
【００４６】
ＴＦ配列を発現するのに使用できる構成性植物プロモーターの例としては、ほとんどの植物組織で構成的で高レベル発現を与えるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ） ３５Ｓ プロモーター（例えば、Ｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０参照）；ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）合成プロモーター（Ａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８８：５４７）；およびオクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）合成プロモーター（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： ９７７）が含まれる。
【００４７】
環境、ホルモン、化学物質、発生シグナルに反応して、そして組織活性様式で遺伝子発現を制御する、様々な植物遺伝子プロモーターが植物でのＴＦの発現のために使用することができ、以下に示すものなどがある。ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７７３，６９７に記載されている、ナピン（ｎａｐｉｎ）、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）またはＤＣ３プロモーターのような、種子特異的プロモーター、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，６１８，９８８， ５，８３７，８４８ および ５，９０５，１８６に記載されているような根特異的プロモーター；ｄｒｕ １ プロモーター（ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７８３，３９３）、または２Ａ１１プロモーター（ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，９４３，６７４）およびトマトポリガラクツロナーゼプロモーター（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １１：６５１）、のような果実熟成期に活性な果実特異的プロモーター、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，６１８，９８８， ５，８３７，８４８および５，９０５，１８６に記載されているような根特異的プロモーター、ＰＴＡ２９， ＰＴＡ２６ および ＰＴＡ１３ （ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，７９２，９２９）のような花粉活性化プロモーター、維管束組織で活性なプロモーター（Ｒｉｎｇｌｉ および Ｋｅｌｌｅｒ （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７：９７７−９８８）、 花特異的（Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ， （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８：２３１−２４３）、花粉（Ｂａｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：１９４７−１９５９）、心皮（Ｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：８３７−８４８）、花粉および発育初期の種子（Ｂａｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：２５５−２６７）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｐ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｓｉｏｌ． ３９：９７９−９９０ またはＢａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：３２３−３３４）に記載されているようなオーキシン誘導性プロモーター、サイトカイニン誘導性プロモーター（Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３８：７４３−７５３）、ジベレリンに反応するプロモーター（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３８：１０５３−１０６０， Ｗｉｌｌｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ３８：８１７−８２５） 、およびそのようなもの。更なるプロモーターの例として、熱 （Ａｉｎｌｅｙ， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２： １３−２３）、光（例えば、エンドウｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４７１、およびトウモロコシｒｂｃＳプロモーター、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ および Ｓｈｅｅｎ， （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３： ９９７）； 外傷（例えば、 ｗｕｎｌ， Ｓｉｅｂｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： ９６１）；病原菌耐性、およびメチルジャスモンまたはサリチル酸のような化学物質（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９９��） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ８９−１０８） に応答して発現が誘導されるプロモーターがある。更に、種子発達後期で作用するようなプロモーターを使用することによって、発現のタイミングをコントロールすることもできる（Ｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６：４４７−４５８）。
【００４８】
植物発現ベクターは、コード配列の上流または下流内に位置するＲＮＡプロセスシグナルを含むこができる。更に、発現ベクターは、植物遺伝子の３’未翻訳領域、例えばジャガイモのＰＩ−ＩＩターミネーター領域、またはオクトピンまたはノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼ ３’ ターミネーター領域のような、ｍＲＮＡの安定性を増加させる３’ターミネーター領域から、更なる制御配列含むことができる。
【００４９】
最後に、上記したように、植物の発現ベクターは、形質転換体の迅速な選択を可能にする優性選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。このような遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１８、ストレプトマイシン又はスペクチノマイシンに耐性）や除草剤耐性遺伝子（例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を含む。
【００５０】
植物の形質を改変するためのトランスジェニック植物におけるＴＦ発現の減少は、ＴＦｃＤＮＡに基づくアンチセンス構築体を植物に導入することによって得ることができる。アンチセンス抑制のためにＴＦｃＤＮＡは発現ベクターのプロモーター配列に対して逆向きに配置される。導入される配列は全長のＴＦｃＤＮＡ又は遺伝子である必要はなく、ＴＦｃＤＮＡ又はトランスフォームされるべき植物のタイプに見られる遺伝子と同一である必要もない。しかしながら、導入される配列がより短い場合、有効なアンチセンス抑制のためには通常天然のＴＦ配列に対してより相同性が高いことが必要とされるであろう。好ましくは、ベクター中の導入されるアンチセンス配列の長さは少なくとも３０ヌクレオチドであり、アンチセンス抑制の向上は典型的にはアンチセンス配列の長さが増加するにつれて観察されるであろう。ベクター中のアンチセンス配列の長さは１００ヌクレオチド以上であることが好ましい。上記のように、アンチセンス構築体の転写はＲＮＡ分子の産生をもたらし、これは植物細胞中の内在ＴＦ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子と逆向きに相補的である。内在ＴＦ遺伝子発現の抑制はリボザイムの使用により達成することもできる。リボザイムは高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成ＲＮＡ分子である。リボザイムの産生及び使用はＣｅｃｈの米国特許第４，９８７，０７１号及びＨａｓｅｌｈｏｆｆの米国特許第５，５４３，５０８号に開示されている。アンチセンスＲＮＡ内のリボザイム配列の誘導はアンチセンスＲＮＡに対するＲＮＡ分解活性を付与するために用いることができる。それにより、アンチセンスＲＮＡに結合する内在ｍＲＮＡ分子が分解され、アンチセンスによる内在遺伝子発現阻害が高まる。
【００５１】
ＴＦｃＤＮＡ（又はその変異体）にコードされるＲＮＡを過剰発現するベクターを使用して、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎの米国特許第５，２３１，０２０号に記載の方法で内在ＴＦ遺伝子の共抑制することもできる。このような共抑制（センス抑制ともいう）は、完全ＴＦｃＤＮＡを植物細胞に導入することを必要とせず、導入される配列が内在ＴＦ遺伝子と正確に同一であることも必要としない。しかしながら、アンチセンス抑制の場合のように、（１）導入する配列が長く、（２）導入する配列と内在ＴＦ遺伝子との配列相同性が増すほど抑制効率は高まるであろう。
【００５２】
翻訳不可能な形態のＴＦｍＲＮＡを発現するベクターを用いて内在ＴＦ活性の発現を抑制し、形質を転換することもできる。このような構築体を産生する方法はＤｏｕｇｈｅｒｔｙらの米国特許第５，５８３，０２１号に記載されている。好ましくは、このような構築体はＴＦ遺伝子に早期ストップコドンを導入することで作製される。あるいは、２本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子を沈黙させることにより植物の形質を改変することもできる（Ｓｈａｒｐ （１９９９） Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３： １３９−１４１）。このアプローチは、それによりベクターが調製され、ｃＤＮＡ又は遺伝子が重複様式で配置され、発現の際にヘアピン構造を有する２本鎖ＲＮＡ分子の生成を可能にする。この方法は植物の遺伝子活性を改変するために用いられている（Ｃｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７： ４９８５−９４９０）。
【００５３】
遺伝子の発現を無効にする他の方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡを用いた挿入突然変異誘発によるものである。挿入変異体の生成後、変異体をスクリーニングし、ＴＦ遺伝子内に挿入を含む変異体を同定することができる。所望の遺伝子に単一変異イベントを含む変異体は、変異のために交配させてホモ接合型植物を生成することもできる（Ｋｏｎｃｚ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００５４】
植物の形質はをｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて改変することもできる（例えば、米国特許第５，６５８，７７２号に記載されている）。植物ゲノムは第１及び第２ｌｏｘ部位を含むように改変することもできる。そしてこれらの部位をＣｒｅレコンビナーゼと接触させる。これらのｌｏｘ部位が同一向きにあれば、２つの部位間の介在ＤＮＡ配列が切除される。これらのｌｏｘ部位が逆向きであれば、介在配列は反転する。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、内在遺伝子の活性又は発現レベルを他の手段で操作することにより、発現カセットの非存在下で植物中に発現させることもできる。例えば、Ｔ−ＤＮＡ活性化タグにより遺伝子を異所性に発現させることによる（Ｉｃｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３９０ ６９８−７０１， Ｋａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９８２−９８５）。この方法は植物を複数の転写エンハンサーを含む遺伝子タグでトランスフォームすることを必要とし、タグがゲノムに挿入されるとフランキング遺伝子コード配列の発現が脱制御される。他の例では、植物の転写機構を、本発明のポリヌクレオチドの転写レベルが増加するように改変することができる（ＤＮＡ結合モチーフ内の特定のアミノ酸を変えることによるジンクフィンガータンパク質のＤＮＡ結合特異性の改変を記載するＰＣＴ公報のＷ０９６０６１６６及びＷＯ９８５３０５７を参照されたい）。
【００５６】
トランスジェニック植物は、例えば活性化状態に維持するためにポリペプチドのリン酸化状態を変えることにより、内在遺伝子にコードされるポリペプチドの活性を発現又は変化させるために必要な機構を含むこともできる。
【００５７】
４．改変されたＴＦ発現を有するトランスジェニック植物
本発明のＴＦ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを構築すると、植物の形質を改変するために、標準技術を用いてポリヌクレオチドを植物に導入することができる。植物は裸子植物、単子葉植物及び双子葉植物を含むいかなる高等植物であってもよい。好適なプロとコールはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ（アルファルファ、ダイズ、クローバーなど）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（ニンジン、セロリ、パースニップ）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ（キャベツ、ラディッシュ、ナタネ、ブロッコリーなど）、Ｃｕｒｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ（メロン及びキュウリ）、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（コムギ、コーン、コメ、オオムギ、キビなど）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ（ジャガイモ、トマト、タバコ、コショウなど）、及び他の種々の作物に有用である。Ａｍｍｉｒａｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ − Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ． Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４−２７６； Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ８３３−８３９； 及びＶａｓｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ４２９−４３４に記載のプロトコールを参照されたい。
【００５８】
単子葉植物細胞及び双子葉植物細胞のトランスフォーメーション及び再生は今やルーチン化されており、最適なトランスフォーメーション技術の選択は実務者によって決定されるであろう。方法の選択はトランスフォームされるべき植物のタイプによって様々であり、当該技術に熟練した者は与えられた植物のタイプのための特定の方法の好適性を認識するであろう。好適な方法は：植物のプロトプラストのエレクトロポーレーション；リポソーム介在トランスフォーメーション；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在トランスフォーメーション；ウイルスを用いたトランスフォーメーション；植物細胞のマイクロインジェクション；植物細胞のｍｉｃｒｏ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ；真空浸潤法；及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆｉｃｉｅｎｓ介在トランスフォーメーションを含むが、これらに限定されるものではない。トランスフォーメーションとは、その配列の安定な又は一過性の発現を引き起こすような方法で植物にヌクレオチド配列を導入することを意味する。
【００５９】
本分野の現在の知識を具体的に示すのに役立ち、本明細書中に援用される、クローン化配列によるトランスフォーメーションを特徴とする植物改変の成功例としては、米国特許第５，５７１，７０６号；第５，６７７，１７５号；第５，５１０，４７１号；第５，７５０，３８６号；第５，５９７，９４５号；第５，５８９，６１５号；第５，７５０，８７１号；第５，２６８，５２６号；第５，７８０，７０８号；第５，５３８，８８０号；第５，７７３，２６９号；第５，７３６，３６９号及び第５，６１０，０４２号が挙げられる。
【００６０】
トランスフォーメーションの後、植物を、トランスフォーメーションベクターに導入された優性選択マーカーを用いて選択することが好ましい。典型的には、このようなマーカーはトランスフォームされた植物に抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与するであろう。そして、形質転換体の選択は、適当な濃度の抗生物質又は除草剤に植物を曝すことにより達成される。
【００６１】
トランスフォームされた植物が選択され、成熟した後、改変した形質を示すこれらの植物を同定する。改変した形質は上記したいかなる形質でもよい。さらに、改変した形質が、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベル又は活性の変化によるものであることを、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ若しくはマイクロアレイを用いてｍＲＮＡの発現を解析することにより、又はイムノブロット、ウエスタンブロット若しくはゲルシフトアッセイを用いてタンパク質の発現を解析することにより確認することができる。
【００６２】
５． ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの商業的応用
本発明の遺伝子についての具体的な応用は、植物の開花時期または春化処理反応におけるその潜在的な役割に関する。最も近代的な穀物（ｃｒｏｐ）品種は、大規模な交配プログラムの結果であり、そして多世代の戻し交配が所望の特質を導入するために必要とされる場合がある。開花を促進するシステムは、それらにより世代時間が非常に早くすることができるため、このようなプログラムにおいて貴重な応用性を有する可能性がある。さらに、いくつかの事例においては、より早い世代時間により、所定の生育シーズンの中でさらに穀物の収穫を得ることが可能になる。たとえばギネアアブラヤシ（ｏｉｌ ｐａｌｍ）、プラ（ａｓｐｅｎ）、マツ、およびユーカリノキなどの樹木種についてのトランスフォームシステムの出現により、森林バイオテクノロジーが興味の領域として成長しつつある。
【００６３】
同様に、植物の栄養器官の一部が穀物を構成し、そして生殖組織が廃棄される、テンサイなどの種においては、開花を遅延させたり抑制したりすることは都合のよいことであろう。栄養器官の発生を拡張することは、収量を大幅に増大することを引き起こす。
【００６４】
さらに、誘導性のプロモーターを使用して、開花時期調節遺伝子の発現を制御することにより、潜在的には、開花を所望するように引き起こすことができる（たとえば、化学誘導物質を使用することにより）。このことにより、たとえば、穀物を通じて開花を同調させることができ、そしてより効率的な収穫を促進することができる。このような誘導可能なシステムを使用して、穀物品種の開花を異なる緯度に適合させることができる。現在のところ、ダイズおよびワタなどの種が、その開花時期に基づいて異なる緯度に適している一連の成熟群として利用可能である（それは、日照時間により制御される）。開花を化学的に調節することができるシステムにより、単一の高収率の北部成熟群をいずれの緯度においても生育させることができる様になる。南部領域においては、このような植物をより長く生育させることができ、それにより、開花を誘導する前に、収率を増加させることができる。より北部の地域では、誘導を使用して、穀物が最初の冬季氷結（ｗｉｎｔｅｒ ｆｒｏｓｔｓ）の前に開花することを確実にすることができる。現在は、異なる緯度について一連の成熟群が存在することが、新しい貴重な特質を導入するための主要な障壁に相当する。
【００６５】
多くの穀物種について、高収率冬季品種は、冬季シーズンが持続し、春化反応を引き起こすために十分なほど寒冷である、温帯性の領域においてのみ増殖することができる。本発明の遺伝子の変化した発現は、遅れて開花するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの生態型における春化処理を埋め合わせることができた。同様の効果を、穀物植物において達成することができる。たとえば、その後、Ｇ１５７（またはコムギのオルトログ）を過剰発現するコムギの冬季品種を、その方法以外では、暖かすぎて効率的な春化処理ができない、南部カリフォルニアなどの地域で生育させることができる。このシステムの第二の用途は、サクランボ（Ｐｒｕｎｕｓ）におけるものである。地方的に生育するサクラは、冬季が春化処理には暖かすぎて生じないため、カリフォルニアの早春には利用することができない。
【００６６】
さらなる応用がイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）において存在する。イチゴは、開花の開始、休眠、果実の成長およびつるの成長のうまく規定された永久のサイクルを有する。温帯の欧州の国では、初春に植物が開花し、そして果実が５月または６月に生産される。果実がなった後に、つるが生成し、根を採る苗木を運ぶ。次に、植物は全て晩夏から秋に休眠する。植物が冬の冷却処理を受けた後に春の後までは、開花を繰り返すことができない。この春化処理の要求を開扉する計はイチゴの２番目の秋の果実が春の果実に加えて収穫されることを可能にするかもしれない。
【００６７】
最後に、遺伝子それら自体の直接の応用に加え、それらの制御領域も価値があり得る。これらの遺伝子のプロモーターが低温に応答性であれば、凍結に対する寛容を授与する遺伝子の制御のための発現系にそれらを取り込むことができる。そのような遺伝子は次に必要なときに特別にアップ制御されて、それによりそれらの構成的発現によりもたらされるあらゆる毒性作用を最少にする。
【００６８】
６．ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの他の利用性
本発明により提供される転写因子のコーディングは、転写因子の発現に影響するかもしれず且つ開花時期に影響するかもしれない外因性または内因性分子を同定するために使用してよい。これらの分子は有機または無機化合物を含んでよい。
【００６９】
例えば、上記の方法は植物または植物細胞に接触して分子を最初に配置することを必要としてよい。上記の分子は局所投与、例えばスプレーまたは植物の浸潤により導入してよく、そしてＴＦポリペプチドの発現または活性あるいはポリヌクレオチドの発現に対する分子の効果を監視する。ＴＦポリペプチドの発現の変化はポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ゲル電気泳動等の使用により監視してよい。対応するポリヌクレオチド配列の発現の変化はマイクロアレイ、ノーザンまたはｍＲＮＡ発現の変化を監視する他のあらゆる技術の使用により検出してよい。これらの技術はＡｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．（ｅｄｓ）　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９９８）に例示される。発現レベルのそのような変化は修飾された植物の特色に相関するかもしれず、そして即ち同定された分子は、果物、野菜および穀物を浸潤するかまたはスプレーすることにより植物の特色を修飾するために使用してよい。
【００７０】
転写因子は相互作用するかもしれないプロモーター配列を同定するために用いてもよい。プロモーター配列を同定した後に、プロモーター配列中の特定のヌクレオチドまたはプロモーター配列に相互作用して植物の特色を変化させる転写因子中の特定のアミノ酸を変化させることにより、転写因子とプロモーター配列の間の相互作用を修飾してよい。典型的には、転写因子のＤＮＡ結合部位をゲルシフトアッセイにより同定する。プロモーター領域を同定した後に、プロモーター領域の配列を二本鎖ＤＮＡアレイにおいて用いることにより、ＴＦｓとそれらのプロモーターとの相互作用に影響する分子を同定してよい（Ｂｕｌｙｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：５７３−５７７）。
【００７１】
同定された転写因子は、該転写因子の活性を調整するタンパク質の同定にも有用である。そのような調整は、リン酸化あるいはタンパク質−タンパク質（ホモあるいはヘテロポリマー）相互作用のような、共有結合による修飾により引き起こされる。タンパク質−タンパク質相互作用の検出に適したどんな方法でも適用してよい。適用してもよい方法には共免疫沈降、架橋と勾配またはクロマトグラフィーカラムによる共精製、およびツーハイブリッドイーストシステムがある。
【００７２】
ツーハイブリッドシステムはタンパク質相互作用をｉｎ　ｖｉｖｏで検出し、Ｃｈｉｅｎ　ら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，９５７８−９５８２に記載され、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から購入可能である。このシステムでは、プラスミドは二つのハイブリッドタンパク質をコードするように構築される：片方はＴＦポリペプチドと融合した転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、もう一方はｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラスミドに組み換えたｃＤＮＡによってコードされた未知タンパク質と融合した転写アクチベータタンパク質の活性化ドメインからなる。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーは、転写アクチベーター結合サイトを制御領域に有するレポーター遺伝子（たとえば、ＬａｃＺ）を有する酵母サッカロマイセス　セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌種に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化できない。二つのハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的なアクチベータータンパク質を再構築し、結果としてレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される、レポーター遺伝子の発現がおこる。その後、レポーター遺伝子発現を行うことができるライブラリープラスミドは単離し、ライブラリープラスミドによってコードされたタンパク質を同定するために配列同定する。転写因子と相互作用するタンパク質を同定した後、ＴＦタンパク質―タンパク質相互作用を阻害する化合物のアッセイを行ってもよい。
【００７３】
以下の例は本発明を説明するものであるが、限定するものではない。
方法　すべての実験は他に示さない限りは生態型ＣｏｌｕｍｂｉａのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを用いて行った。Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（ＣＳ６８６３）およびＰｉｔｚｔａｌ（ＣＳ６８３２）系列はオハイオ州立大学のＡＢＲＣより調達した。すべての実験において、種子は２分間のエタノール処理につづいて３０分間３０％ブリーチ／０．０１％Ｔｗｅｅｎにつけ、そして蒸留水で５回洗浄して滅菌した。種子は０．１％アガロースのＭＳ寒天培地に植え付け、２０−２５℃の温度の生育室に移す前に、４℃で３−５日間層の間に保存した。ＭＳ培地には形質転換した植物の選択のため５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した。植物はプレート上で７日間栽培した後、土に植え替えた。春化処理には、種子をＭＳ寒天プレートに植え付け、微孔テープでシールし、低光量の４℃の低温室で６−８週間置いた。プレートはその後植え付けたばかりの春化処理していないコントロールを含むプレートと並べ、生育室に移した。生長力のある苗全体は６から９週間後に遺伝子発現解析を行うために収穫した。約３ｃｍの認識できる開花が明らかになったとき、ロゼット葉を数えた。プロジェニー（ｐｒｏｇｅｎｙ）茎上のロゼットと全体の葉の数は開花のタイミングときっちりとした相関がある（Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ　ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．　２２９：５７−６６）。
【００７４】
実施例Ｉ．　全長遺伝子の同定とクローニング
以下の例において、Ｇ１５７は配列ＩＤ番号１および２を参照し、Ｇ８５９は配列ＩＤ番号３−８を参照し、Ｇ１８４２は配列ＩＤ番号９−１６を参照し、Ｇ１８４３は配列ＩＤ番号１７および１８を参照し、Ｇ１８４４は配列ＩＤ番号１９−２２を参照し、Ｇ８６１は配列ＩＤ番号２３−２６を参照し、そしてＦＬＣあるいはＧ１７５９は配列ＩＤ番号２７，２８を参照する。
【００７５】
既知の転写因子に関連した推定の転写因子の配列（ゲノム中のまたはＥＳＴｓ）は、デフォルトパラメータおよび問題の配列の長さによって−４または−５またはそれ以下のＰ値カットオフしきい値を用いて、ｔｂｌａｓｔｎ配列解析プログラムを用いてアラビドプシス　サリアナ（Ａｌａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）ＧｅｎＢａｎｋデータベースで同定した。それから推定の転写因子配列にヒットするものを、特定の配列鎖を含むものを同定するために調べた。もしヒットした配列がそのような配列鎖を含む場合は、該配列は転写因子であることを確認した。
【００７６】
たとえば、我々はＦＬＣに関連したタンパク質をコードすると予測されていた、染色体Ｉ中のＢＡＣ　Ｆ２２Ｋ２０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス　ＡＣ００２２９１）の中からＭＡＤＳ　ｂｏｘ遺伝子Ｇ１５７を同定した。Ｇ１５７の８７２ｂｐ　ｃＤＮＡクローンは葉のｍＲＮＡ由来のライブラリーから単離されたクローンから同定した。コードされたタンパク質は１９６アミノ酸の長さで、全アミノ酸配列の６２％の部分がＦＬＣと一致し、ＭＡＤＳ　ＤＮＡ結合ドメインとは８２％一致した。
【００７７】
Ｇ１５７はまた、しっかりとつながったクラスターとして、染色体Ｖの下流、約２２ｋｂを占有し、ＭＸＫ３、Ｆ１５０５、およびＭＱＮ２３（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＢ０１９２３６、ＡＢ０２６６３３、およびＡＢ０１３３９５）の３つの隣接したクローンにまたがって一緒に位置するＧ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４とも関連する。Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４は複製の課程で創造されるようである；これはそれらの遺伝子制御の異なる側面への発散を許容するものである。それらの物理的な近接は、共通の制御因子によって制御される単位であるように働いていることを示している。
【００７８】
ＦＬＣ、Ｇ１５７、Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４の５７アミノ酸ＭＡＤＳドメインの１対１の比較は表１に示した。該表は、アミノ酸配列の一致の割合を示し、括弧内は、保存性のアミノ酸置換も考慮に入れたときの配列一致の割合を示す。Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４にコードされるタンパク質の該ＭＡＤＳドメインはＦＬＣおよびＧ１５７のそれと高度に保存され：以下に示した１対１の比較によると、これらのタンパク質は７５％から９１％のアミノ酸配列の同一性を共有する。保存性のアミノ置換が起こったときは、これらのタンパク質のＭＡＤＳドメインは８８％−９９％お互いに一致する（括弧内に示した）。
【００７９】
【表１】
2004500044.tif 000002
【００８０】
ＦＬＣのアミノ酸残基３０およびＧ１５７、Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４に関しては酸性残基（ＥまたはＤ）である一方、これまでに同定された他のすべてのアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＭＡＤＳドメインタンパク質においては、その位置はプラスに帯電したリジン残基で占められている。ＤＮＡに結合したヒトＳＲＦ　ＭＡＤＳドメインの結晶構造ではリジン残基（これは、酵母ＭＣＭ１およびヒトＭＥＦ２Ａタンパク質においても保存されている）がＤＮＡターゲットサイトのリン酸バックボーンと接触していることが示されている（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ　ら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　３７６：４９０−４９８）。そのアミノ酸の違いはしたがって、ＦＬＣおよびＧ１５７、Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３、およびＧ１８４４に関してのＤＮＡ結合は、他のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＭＡＤＳドメインタンパク質とは異なる性質を与えるしれない。したがって、位置３０に酸性残基を持つＭＡＤＳドメインタンパク質は特に植物の開花の調整および春化処理の応答に有用であってよい。
【００８１】
これらの遺伝子からの転写物は３’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）によって解析し、対応するｃＤＮＡはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）組織（Ｃｌｕｍｂｉａ生態型）の混合サンプル中からＲＴ−ＰＣＲにより単離した。この分析の間、Ｇ８５９、Ｇ１８４２、およびＧ１８４４の転写物はマルチプルアルタネイティブリースプライストフォームとして検出された。
【００８２】
実施例ＩＩ　開花時期関連遺伝子
同定された各配列のコード領域内の遺伝子特異的プライマーを用い、リバーストランスクリプターゼＰＣＲを行った。可能な場合は、プライマーは最初に同定された各コード配列の３’領域の近くにデザインした。
【００８３】
全ＲＮＡを植物組織から単離して、ＣＴＡＢ法で抽出した。抽出した全ＲＮＡは全ての組織タイプについて濃度を標準化し、２８Ｓのバンドを参照して、各組織のＰＣＲ反応に同じ量のｃＤＮＡテンプレートが使われるようにした。Ｐｏｌｙ Ａ＋ は、Ｑｉａｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ キットバッチのプロトコールを修正したプロトコールを用いて精製した。ｃＤＮＡは標準的プロトコールを用いて合成した。第一鎖ｃＤＮＡ合成の後、アクチン２ のプライマーを用いて、組織タイプにわたってｃＤＮＡの濃度を標準化した。アクチン２ は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ の組織タイプにわたって、ほぼ同じレベルで構成的に発現していることが分かっている。
【００８４】
ＲＴ　ＰＣＲのために、ｃＤＮＡテンプレートは、対応するプライマーおよびＴａｑポリメラーゼと混合した。各反応は、０．２μｌ　 ｃＤＮＡテンプレート、２μｌ　 １０Ｘ　トリシンバッファー、および１６．８μｌ 水、５ｐｍｏｌプライマー１、５ｐｍｏｌプライマー２、０．３μｌ　 Ｔａｑポリメラーゼ、２００μＭ　ｄＮＴＰおよび８．６μｌ の水で構成した。
【００８５】
９６穴のプレートをマイクロフィルムで覆い、熱循環装置にセットして、下記の反応サイクルを開始した。ステップ１　９３℃　３分、ステップ２　９３℃　３０秒、ステップ３　６０−６５℃　１分、ステップ４　７２℃　２分。ステップ２、３および４は２０〜３５サイクル繰り返した。ステップ５　７２℃　５分およびステップ６　４℃。ある場合にはＰＣＲプレートを熱循環装置に戻して、非常に発現の低い遺伝子の同定のために５〜１５回の追加サイクルで、反応産物の量を多くした。その反応サイクルは次のとおりとした。ステップ２　９３℃　３０秒、ステップ３　６５℃　１分、およびステップ４　７２℃　２分，８サイクルの繰り返し、およびステップ４　４℃。　２１および３６サイクルの間に、８マイクロリットルのＰＣＲ産物および１．５μｌ の負荷染料を１．２％アガロースゲルに負荷して分析した。特定の転写物が、ＰＣＲの３５サイクルより遅くやっと検出されたなら、それらの発現レベルは低いと考えられる。観察されたアクチン２ の転写レベルと比較した転写レベルに応じて、発現レベルは中または高と考えられる。
【００８６】
一例として、Ｇ１５７植物中でのＧ１５７　ｍＲＮＡレベルを評価するため、プライマー５’−ＧＧＣＡＴＡＡＣＣＣＴＴＡＴＣＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５７）および ５’−ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＧＡＡＧＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５８） を用いて、２５サイクルにわたるＰＣＲを行った。野生型植物から抽出した別々の組織のｍＲＮＡレベルを評価するため、プライマー５’−ＧＣＡＴＡＡＣＣＣＴＴＡＴＣＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５９）および ５’−ＡＡＣＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６０） を用いて、２５または３０サイクルのＰＣＲを行った。ＦＬＣのＰＣＲは、プライマー５’−ＡＡＣＧＣＴＴＡＧＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＧＡＡＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６１）および５’−ＣＴＣＡＣＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６２）を用いて３５回にわたり、または５’−ＴＴＡＧＴＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６３）および５’ ＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＣＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６４）を用いて３０回にわたり行った。プライマーの特異性は、ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定によた確認された。サンプルは、アクチンプライマーを用いた２０〜２５サイクルのＰＣＲにより標準化した。
【００８７】
実施例ＩＩＩ ．発現ベクターの構築
ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからの配列を、コード領域の上流および下流の配列に特異的なプライマーを用いて、増幅した。発現ベクターはｐＭＥＮ２０またはｐＭＥＮ６５であり、両者ともｐＭＯＮ３１６ （Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ， （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１５４３−５８） に由来して、トランス遺伝子を発現するためのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含んでいる。配列をベクター中にクローニングするため、ｐＭＥＮ２０および増幅したＤＮＡ断片の両者を別々にＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で３７℃２時間消化した。消化産物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。この配列および直線化プラスミドを含むＤＮＡ断片を切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ） を用いて精製した。興味対象の断片を３：１（ベクター対挿入片）の比率で連結した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＭＡ）を用いて、連結反応を１６℃１６時間行った。連結したＤＮＡを、熱ショック法を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ アルファ株のコンピテント細胞に形質転換した。形質転換体は、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマインシ（Ｓｉｇｍａ） を含むＬＢプレートにまいた。
【００８８】
個々のコロニーを、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマインシを含む５ｍｌのＬＢブロスで一夜、３７℃で増殖させた。プラスミドＤＮＡはＱｉａｑｕｉｃｋ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔｓ （Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いて精製した。
【００８９】
実施例ＩＶ　発現ベクターによるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換
遺伝子を含有するプラスミドベクターを構築した後、このベクターを使用して遺伝子産物を発現するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞を形質転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞の形質転換用保存株は、Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｓ ６７： ３２５−３２８ （１９９０）の記載に従って作製した。吸光度（Ａ６００）が０．５〜１．０に達するまで、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＶ３１０１株を２５０ｍｌのＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ）中にて一晩２８℃で振盪培養した。４，０００×ｇで１５分間４℃にて遠心分離を行うことにより細胞を回収した。次いで細胞を、２５０μｌの氷冷バッファー（１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＫＯＨにてｐＨを７．０に調整）へ再懸濁させた。細胞を上述のように再度遠心分離し、１２５μｌの氷冷バッファーへ再懸濁させた。次いで遠心分離と再懸濁をさらに２回繰り返した。その際、上述と同一のＨＥＰＥＳバッファー１００μｌおよび７５０μｌへ細胞を懸濁させた。次いで、再懸濁した細胞を４０μｌずつ分注し、液体窒素中にて急速冷凍させて−８０℃で保存した。
【００９０】
Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｓ ６７： ３２５−３２８ （１９９０）に記載のプロトコールに従い、上述のように調製したプラスミドでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を形質転換した。形質転換すべき各ＤＮＡ構築物当たり、５０〜１００ｎｇのＤＮＡ（通常、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０へ再懸濁）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞４０μｌと混合した。次いで、氷冷キュベット（電極間隔２ｍｍ）へＤＮＡ／細胞混合物を移し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２５μＦおよび２００μＦにて２．５ｋＶの電圧を印加した。エレクトロポレーション後、細胞を１．０ｍｌのＬＢ培地へ直ちに再懸濁させ、抗生物質による選別を行わずに、振盪インキュベーター内で２〜４時間２８℃にて細胞を回復させた。回復後、スペクチノマイシン（Ｓｉｇｍａ）を１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢブロス選択培地へ細胞を播種し、２４〜４８時間２８℃にてインキュベートした。次いで単一コロニーを拾い、新鮮な培地へ接種した。プラスミド構築物の完全性をＰＣＲ増幅および配列分析によって確認した。
【００９１】
実施例Ｖ　 発現ベクターを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体の形質転換
遺伝子を含有するプラスミドベクターでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを形質転換した後、単一のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍコロニーを同定および培養し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体の形質転換に使用した。簡単に言うと、スペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌ含有するＬＢ培地の５００ｍｌ培養物にコロニーを接種し、吸光度（Ａ６００）が２．０を超えるまで２８℃で２日間振盪培養を行った。次いで、４，０００×ｇにて１０分間遠心分離を行うことにより細胞を回収し、浸潤用培地（１／２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ塩 （Ｓｉｇｍａ）、１×Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ−５ビタミン（Ｓｉｇｍａ）、５．０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ）、０．０４４μＭ ベンジルアミノプリン（Ｓｉｇｍａ）、２００μｌ／Ｌ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７ （Ｌｅｈｌｅ Ｓｅｅｄｓ））中に、吸光度（Ａ６００）が０．８になるまで再懸濁させた。
【００９２】
形質転換を行う前に、ガラス繊維メッシュ（１８ｍｍ×１６ｍｍ）で覆ったＰｒｏ−Ｍｉｘ ＢＸ注封材（Ｈｕｍｍｅｒｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上へ、４インチ鉢１つ当たり植物体が約１０体となるような密度にてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの種子（生態型：コロンビア）を蒔いた。連続照明下（５０〜７５μＥ／ｍ２／秒）、２２〜２３℃および相対湿度６５〜７０％にて植物体を栽培した。約４週間後、一次花序茎（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔｅｍ）を刈り取り、二次茎が多く育つようにした。成熟二次茎が開花した後、長角果と開花した花を全て取り除くことにより植物体を形質転換用に調整した。
【００９３】
次いで、上述のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ浸潤培地混合物中へ鉢を上下逆さにして３０秒間浸漬し、プラスチック製のラップで覆った１フィート×２フィートの平面上で鉢を横にして水分を切った。２４時間後、プラスチックラップを外し、鉢を起こした。１週間後に浸漬手順を繰り返し、１鉢につき合計で２回浸漬を行った。次いで、形質転換の済んだ各鉢から種子を回収し、後述のプロトコールに従って分析を行った。
【００９４】
実施例ＶＩ　 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの一次形質転換体の同定
形質転換の済んだ鉢から回収した種子を、基本的に下記のようにして滅菌した。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）と滅菌水を含む溶液へ種子を分散させ、２０分間懸濁液を振盪させることで種子を洗浄した。次いで、洗浄溶液を捨てて新しい洗浄溶液と交換し、振盪させながら種子を２０分間洗浄した。２回目の洗浄溶液を除去した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と７０％エタノール（Ｅｑｕｉｓｔａｒ）を含む溶液を種子へ添加し、懸濁液を５分間振盪した。エタノール／洗剤溶液を除去した後、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と３０％（ｖ／ｖ）漂白剤（Ｃｌｏｒｏｘ）を含む溶液を種子へ添加し、懸濁液を１０分間振盪した。漂白剤／洗剤溶液を除去した後、次いで種子を滅菌蒸留水中で５回洗浄した。最終洗浄水中にて種子を４℃で２日間、暗所にて保存した後、抗生物質選択培地（１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ塩（１Ｍ ＫＯＨにてｐＨを５．７に調整）、１×Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ Ｂ−５ビタミン、０．９％ｐｈｙｔａｇａｒ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および５０ ｍｇ／Ｉカナマイシン）へ播種した。連続照明下（５０〜７５μＥ／ｍ２／秒）、２２〜２３℃にて種子を発芽させた。このような条件で７〜１０日間育成した後、カナマイシン耐性一次形質転換体（Ｔ１世代）を黙視で確認して取得した。これらの実生を、まず、新しい選択プレートへ移してさらに３〜５日間育成し、次いで土壌（Ｐｒｏ−Ｍｉｘ ＢＸ注封材）へ移した。
【００９５】
一次形質転換体を自家受粉させ、後代種子（Ｔ２）を回収した。Ｔ２後代種子を上述のようにカナマイシン上で発芽させ、カナマイシン耐性実生を選別して土壌へ移し、分析を行った。
【００９６】
実施例ＶＩＩ　トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体の分析
第１の実験では、Ｇ１５７植物体（即ち、Ｇ１５７トランスジーンを発現する植物体）を１２時間照明下にて栽培した。４０系統のうち３０系統が、対照ベクターで形質転換した対照植物よりも早く開花した。早咲きのＴ１系統の平均ロゼット葉数は１２．４±０．８であり、対照系統のロゼット葉数は２７±１．２であった。４０系統のＴ１植物体のうち２系統が対照と同時に開花し、４０系統のうち７系統は遅咲きであって、野生型よりも２〜３週間遅れて花序が確認された。
【００９７】
さらなる実験では、２４時間照明下、２０〜２５℃にて植物体を栽培した。このような条件下では、非形質転換対照植物体は、花芽形成前の一次苗条の平均合計葉数が１４．３±０．７であった。花芽は、種を蒔いてから平均で２１．１±０．５日後に初めて確認された（誤差の値は、９５％信頼限界を与える標準誤差を表す）。Ｇ８５９の場合は、Ｔ１植物体の１４／１９が早咲きであり（平均合計葉数は６．４±０．７、花芽は播種後１２．９±０．７日目に確認）、３／１９が野生型であり、２／１９が野生型に比べて若干遅咲きであった（平均合計葉数は１９、花芽は２７日目に確認）。ＲＴ発現研究からは、遅咲きの個体のトランスジーン発現量が最も高いことが判明した。これらの結果はＧ１５７の場合と非常に似通っている。Ｇ１８４２の場合には、Ｔ１植物体の７／１０が早咲きであり（平均合計葉数は７．９±０．６、花芽は１３．９±１．０日目に確認）、３／１０が野生型であった。また、Ｇ１８４２の短鎖スプライス変異体をコードするｃＤＮＡを用いて過剰発現研究を行った。Ｇ１８４２．２（１８５のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード）の場合には、Ｔ１植物体の１５／１８が早咲きであり（平均合計葉数は６．９±０．９、花芽は１４．５±０．６日目に確認）、３／１８が野生型であった。Ｇ１８４２．６（７７のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード）の場合には、Ｔ１植物体の８／１０が早咲きであり（平均合計葉数は６．８±１．６、花芽は１３．９±０．９日目に確認）、２／１０が野生型であった。Ｇ１８４２．７（１１８のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード）の場合には、Ｔ１植物体の８／１０が早咲きであり（正確な葉数は未計測）、２／１０が野生型であった。このように、Ｇ１８４２スプライス変異体では、過剰発現した場合には、完全長ｃＤＮＡクローンに匹敵する効果が得られた。Ｇ１８４３の場合には、７／１１が早咲きであり（平均合計葉数は６．４±０．５、花芽は１６．０±１．６日目に確認）、２／１１が野生型の開花期を示した。しかしながら、Ｇ１８４３のＴ１植物体は生育が悪く、一部の器官の発達が遅れていた。このことから、Ｇ１８４３は、過剰発現した場合には不測の毒性作用を示すことが示唆される。Ｇ１８４４の場合には、Ｔ１植物体の６／１０が早咲きであり（平均合計葉数は６．８±１．７、花芽は１４．７±１．３日目に確認）、４／１０が野生型であった。同様に、Ｇ１８４４の短鎖スプライス変異体をコードするｃＤＮＡを用いて過剰発現研究を行った。Ｇ１８４４．２（１８４のアミノ酸からなるスプライス変異体をコード）を過剰発現させた場合には、Ｔ１植物体の６／１９が早咲きであり（平均合計葉数は７．８±１．７、花芽は１５．７±１．３日目に確認）、１３／１９が野生型であった。Ｇ８５９、Ｇ１８４２、Ｇ１８４３およびＧ１８４４の過剰発現データは、これらが開花期を制御する役割を担っているとの仮説を裏付けるものである。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲはＧ１５７特異的プライマーを用いて約２５サイクルにてＧ１５７植物からの材料上において実施した。高いレベルのＧ１５７発現が、遅く開花する個々の植物または遅く開花する個々を含んだ保存された苗からのサンプル中に検出された。野生型に比較して中度または低いレベルの過剰発現しか示さなかった植物はわずかに開花が早いかまたは正常であた。
【００９９】
Ｇ１５７における増加がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの遅い開花生態型における開花時期に影響するか否かを試験するため、我々は、遅い開花生態型のＳｔｏｃｋｈｏｌｍおよびＰｉｚｔａｌにおいてＧ１５７を過剰発現させた。この実験において、各生態型からの３２の第一期形質転換体を連続光条件下で対照を散りばめて生育させた。両生態型において、約５０％の形質転換体が対処よりも早く開花し、そして少数のＰｉｚｔａｌおよびＳｔｏｃｋｈｏｌｍ形質転換体が対照に比較して明らかに遅い開花であった。
【０１００】
Ｇ１５７トランス遺伝子発現と開花時期の相関もＧ１５７　ＳｔｏｃｋｈｏｌｍおよびＰｉｚｔａｌ　Ｔ１植物において観察された。ＲＴ−ＰＣＲを、各バックグラウンドにおいて２つの早い開花系列及び２つの遅い開花系列を用いて実施した。再び、遅い開花系列は高いレベルのＧ１５７発現を含んだ。即ち、上記因子は定量性様式において開花時期に影響するらしい；中レベルの過剰発現が早い開花を誘因し、開花の遅延が大きく増加する。
【０１０１】
結論として、Ｇ１５７の過剰発現または同族の遺伝子の何れかが植物において開花時期を修飾する：中レベルの過剰発現が早い開花を誘引し、多くが開花を遅延させる。
【０１０２】
上記実施例に記載されたのと類似または同一の方法論を用いて、その変化した発現が開花の遅延または加速に相関した別のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を同定した。これらの遺伝子を表２にそれらの特定の配列番号およびそれらの開花時期への影響と共に図表作成した。
【０１０３】
【表２】
2004500044.tif 000003
【０１０４】
春化処理の応答も調査した。遅い開花の春化処理応答性の生態型および変異体は高い定常レベルのＦＬＣ転写物を有し、春化処理による開花の促進の間は低下する（Ｍｉｃｈａｅｌｓ　ａｎｄ　Ａｍａｓｉｎｏ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１：９４９−９５６；Ｓｈｅｌｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１１：４４５−４５８；Ｓｈｅｌｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：３７３５−３７５８）。ＦＬＣとは対照的に、Ｇ１５７転写物レベルは遅い開花のＳｔｏｃｋｈｏｌｍおよびＰｉｚｔａｌ生態型における春化処理の応答と一致した相関は示さない。さらに、我々は、Ｇ１５７の過剰発現がＦＬＣレベルに影響しなかったことを見いだした。Ｇ８６１，Ｇ（５９，Ｇ１８４３，およびＧ１８４４の発現に対する春化処理の効果も試験した。Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｐｉｚｔａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、ｃｏｎｓｔａｎｓ−１、およびｆｃａ−９の発芽種子をＭＳ寒天プレート上で４℃コールドルームにおいて８週間春化処理し、そして次に連続光生育ルームに移した。春化処理した種子および新たに撒いた非春化処理の対照からの全組織を移し換えから９日後に採集した。ＲＴ−ＰＣＲをＦＬＣ，Ｇ１５７，Ｇ８５９，Ｇ１８４２，Ｇ１８４３，Ｇ１８４４およびＧ８６１及びアクチンに関して実施した。ＦＬＣとＧ１５７を比較すると、どの遺伝子も５つの別々のサンプルセットにおける春化処理に際して明確な一致した低下を示さなかった。しかしながら、Ｇ１８４４はＦＬＣに対して発現の逆パターンを示した：Ｇ１８４４レベルは春化処理と一致して増加した。これは、春化処理の応答の対照においてＧ１８４４を直接に連座させるように、特別顕著である。即ち、Ｇ１８４４は開花を活性化し、そしてＦＬＣと反対の役割を有する可能性がある。
【０１０５】
Ｇ１５７の過剰発現が春化処理に匹敵する効果を有するか否かを探索するため、野生型ＰｉｚｔａｌおよびＳｔｏｃｋｈｏｌｍ苗のバッチを６週間４℃において冷却処理し、次にＧ１５７　Ｔ１　Ｐｉｚｔａｌ、Ｇ１５７　Ｔ１　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍおよび非春化処理の野生型植物の第２選択に対して生育させた。予測されたとおり、春化処理はＰｉｚｔａｌおよびＳｔｏｃｋｈｏｌｍ野生型植物の両方において開花時期を顕著且つ一律に縮めた。Ｇ１５７　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ系列の間では、もっとも早い開花のＴ１グループ（８／２３系列）は春化処理された植物と識別不可能であった。Ｐｉｚｔａｌに関しては、しかしながら、早い開花のＴ１植物は春化処理した植物よりも平均して下限に近いほど遅かった。よって、Ｇ１５７の過剰発現は遅い開花の生態型における春化処理の要求を実質上減少させる。
【０１０６】
さらに、我々は、遅い開花のＧ１５７系列がＦＬＣ発現とは独立しており、そして春化処理に応答しないことを観察した。しかしながら、遅い開花のＧ１５７植物は光周期に応答性である。８時間の光の短日条件下で実施した実験においては、我々は、野生型対照より１カ月遅くに及んで開花した、多数のＧ１５７　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｔ１植物を得た（データは示さず）。Ｇ１５７発現により引き起こされた遅い開花の効果がＦＬＣ転写とは独立であったのか否かを確認するため、我々は、遅い開花のＧ１５７　Ｃｏｌｕｍｂｉａ植物が春化処理に応答性であったか否かを試験した。開花時期における顕著な変化は記録されなかった：連続光条件下で系列４の春化処理したＴ２植物は、全体で、春化処理した場合の３０．１＋／−１．３に比べて３１．３＋／−１．８を有した。対照のｆｃａ植物は、上記の処理が有効であったことを立証した：春化処理した植物は非春化処理の対照の４０より多い葉に比較して、たった１０．３＋／−０．９の葉の後に開花した。即ち、Ｇ１５７により引き起こされた遅い開花の表現型は、ＦＬＣ発現における変化とは独立して遅延が起こったか否かが予測されたように、春化処理により克服することができなかった。
【０１０７】
実施例ＩＸ．相同配列の同定
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物種の相同体をデータベースサーチツール、例えばＢａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて同定した。ｔｂｌａｓｔｘ配列分析プログラムはＢＬＯＳＵＭ−６２スコアリングマトリックスを用いて実施した（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ａｎｄ　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５−１０９１９）。
【０１０８】
全部のＮＣＢＩジェンバンクデータベースをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ以外の全ての植物からの配列に関してフィルターを通したが、ＮＣＢＩ分類ＩＤ３３０９０（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ；全ての植物）を付随したＮＣＢＩジェンバンクデータベース中の全てを選択し、そして３７０１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）に付随した全体を排除することによった。これらの配列をワシントン大学ＴＢＬＡＳＴＸ計算式（バージョン２．０ａ１９ＭＰ）を用いてＳＥＱ　ＩＤｓ　１−５６の遺伝子を表す配列と２０００年９月２６日に比較した。ＳＥＱ　ＩＤｓ　１−５６の各遺伝子に関して個々の比較を確率スコア（Ｐ−値）により整列させたが、但し上記スコアは特定の整列が偶然に起こった確率を反映する。例えば、３．６ｅ−４０のスコアは３．６　ｘ　１０−４０である。１０種までに関しては、もっとも低いＰ値を有する遺伝子（および、従って、最もありそうな相同体）を図２に掲載する。
【０１０９】
Ｐ値に加え、パーセンテージ同一性による比較もスコアした。パーセンテージ同一性は、２つのＤＮＡまたは蛋白質のセグメントが特定の長さにわたり同一である程度を反映する。図２に示す非Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子と配列表の中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子の間のパーセント同一性の範囲は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１：５４％−６７％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｓ．３，５，７：３７％−４７％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｓ．９，１１，１３，１５：５４％−６２％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１７：６２％−７１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｓ．１９，２１：５０％−６７％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｓ．２３，２５：７５％−９１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２７：４６％−６９％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２９：４４％−９０％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３１：５７％−８９％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３３：３７％−７９％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３５：５０％−７１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３７：３９％−６３％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３９：５８％−７０％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４１：４５％−７３％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４３：４２％−８４％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４５：４７％−８１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４７：３１％−７１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４９：４０％−６７％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５１：６９％−５１％；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５３：４３％−８６％；そしてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．５５：７９％−８９％。
【０１１０】
表２の中の遺伝子のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの相同体もＢＬＡＳＴを使用して同定した。これらの遺伝子は、以下のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＢＡＣ配列において見いだされ。それらのジェンバンク配列ＮＩＤ番号：２８２７６９８（２３４相同体）、３２４１９１７（Ｇ７４８相同体）、２６１８６０４（Ｇ９９４相同体）、６５９８５４８（Ｇ１３３５相同体）、７３４０３３１（Ｇ７３６相同体）、６５２３０５１（Ｇ１４３５相同体）、６５９８４９１（Ｇ２０８相同体）および３１７２１５６（Ｇ２０８相同体）により確認される。
【０１１１】
全ての文献（刊行物および特許）はアユるもくてきの為にそれらの全体を引用により本明細書に取り込む。
発明は上記態様および実施例を参照して記載されてきたが、発明の精神を逸脱することなく様々な修飾がなされ得ることは理解されるべきである。従って、発明は以下の請求の範囲のみにより限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の典型的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の表を提供する。この表には、左から右に、それぞれの配列について、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ、内部コード参照番号、配列がポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のいずれであるか、そしてポリペプチド配列についてのいずれかの保存ドメインの同定、が含まれる。
【図２】図２は、配列表中に提供する配列と相同な配列の表を提供する。この表には、左から右に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ、内部コード参照番号、独自のＧｅｎｂａｎｋ配列番号（ＮＩＤ）、比較が偶然に生成される蓋然性（Ｐ−値）、そして相同遺伝子が同定された種、が含まれる。
【図１】
2004500044.tif 000004
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500044.tif 000116
【国際調査報告】
2004500044.tif 000117
2004500044.tif 000118
2004500044.tif 000119
2004500044.tif 000120