(57)【要約】鎮痛有効量の式（Ｉ）：ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（Ｉ）のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド並びに薬剤学的に許容可能な賦形剤を含んでなる局所投与用の薬剤組成物。ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在しない。ＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである。アルキル基はペプチドのアミノ酸と結合できる。ペプチド、薬剤組成物の製造および哺乳動物における疼痛の局所処置または予防方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸に結合しているペプチド誘導体、
及び薬剤学的に許容可能な賦形剤
を含んでなる局所投与用の薬剤組成物。
【請求項２】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ＸがＡＳＮである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
疼痛の処置または予防のための局所薬剤組成物の製造における、鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸に結合しているペプチド誘導体の使用。
【請求項１０】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
ＸがＡＳＮである請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項９に記載の使用。
【請求項１６】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項９に記載の使用。
【請求項１７】
哺乳動物に対して鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸と結合しているペプチド誘導体
を局所的に投与することを含んでなる該哺乳動物における疼痛の処置または予防方法。
【請求項１８】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＸがＡＳＮである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
またはアルキル基がアミノ酸と結合しており、該アルキルの長さがＣ４またはそれより長い該ペプチドの誘導体であって、
ただしＺがＬ−アミノ酸である場合には、Ｘ＝ＡＬＡであるなら、ＺはＬＥＵまたはＭＥＴでなく、Ｘ＝ＬＹＳであるなら、ＺはＡＬＡまたはＰＲＯでなく、そしてＸ＝ＰＲＯであるなら、ＺはＶＡＬまたはＭＥＴでなく、
そしてさらにただしＺが無である場合には、該ペプチドはそのアミノ酸に結合された該アルキル基を有する
ペプチドまたは該ペプチドの誘導体。
【請求項２６】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項２６に記載のアルキルエステル。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれかに記載のテトラペプチド。
【請求項２９】
請求項２５〜２７のいずれかに記載のトリペプチド。
【請求項３０】
鎮痛有効量の請求項２５に記載のペプチドを含んでなる疼痛の処置または予防のための薬剤組成物。
【請求項３１】
鎮痛有効量の請求項２５に記載のペプチドのアルキルエステルまたはアミドを含んでなる疼痛の処置または予防のための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は鎮痛性ペプチド類およびそれらの誘導体に関する。
発明の背景
疼痛は極めて重要な生理的応答であるが、それは不必要な悩みおよび苦悶ももたらす。疼痛の抑制および緩和が薬品の重要な役割部門である。疼痛は疾病の結果並びに例えば化学療法の如き医学的処置の結果の両者として生じうる。いずれの場合にも、疼痛をできるだけ多く軽減して患者が正常に機能しうるようにすることが重要である。
【０００２】
疼痛に関連する２つの神経経路：（１）組織損傷を感知しそして引き続き疼痛感情を生ずる感覚経路、（２）疼痛感情を減じ且つ中枢神経系（ＣＮＳ）に対する疼痛に関する情報流を妨害して生体が損傷にもかかわらずその正常な活性を維持できるようにする鎮痛経路、が体内で同時に作用する。麻酔は、疼痛感知体として作用する末梢神経を抑制する薬品の使用によりまたは天性の鎮痛系統の増強により実現されうる。これらは異なる経路であるため、それらは異なる物質により影響を受ける。例えば、アスピリンおよびリドカインは末梢感覚経路に対して作用するが、モルヒネおよび関連物質は鎮痛系統に対して作用する。
【０００３】
現在使用中のほとんどの有効鎮痛剤は阿片源のモルヒネ関連物質である。脳が種々の内因性阿片剤を生成し、そしてこのことがこれらの物質の強力な効果を説明することが知られている。ニューロンに対するそれらの作用は特定の受容体により仲介される。これらの受容体により調整される信号が末梢疼痛ニューロンからＣＮＳへの情報流を妨害する。これらのＣＮＳニューロンは、カテコールアミン類（セロトニン、ノルアドレナリンなど）、神経活性ペプチド類（ニューロテンシン）並びに抑制アミノ酸類（グリシンおよびＧＡＢＡ）を包含する種々の他の化学物質に対しても反応性である。
【０００４】
Ｄｉ Ｓｔａｚｉｏに対するＵ．Ｓ．４，６１９，９１６は式ｐＧＬＵ−Ｘ−ＴＲＰの新しいトリペプチド類を開示しており、そこでｐＧＬＵは環化されたグルタミン酸（ピログルタミン酸）でありそしてＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧでありうる。それらの製造方法、それらを含有する経口または非経口投与用の薬調剤並びに低血圧剤および鎮痛剤としてのそれらの使用も開示されている。ペプチド類の製造における保護基としての使用のための、トリプトファン基の低級アルキルエステル類、特にメチルまたはエチルエステル類、も開示されている。保護基は合成工程の完了時に除去される。局所調剤の開示はない。
【０００５】
ＷＯ９２／１９２５４は、肥満症、不安症、胃腸潰瘍、疼痛、発作および炎症の処置において有用なα−置換されたモノ、ジ、トリ、テトラおよびペンタペプチド類を開示している。式ｐＧＬＵ−Ｘ−ＴＲＰのペプチド類は開示されていない。
【０００６】
式ｐＧＬＵ−Ｘ−ＴＲＰ−Ｚの下記のテトラペプチド類が文献に見られる：
Ｘ＝Ｌ−Ａｌａ；Ｚ＝Ｌ−ＬｅｕＯＨ、Ｌ−ＬｅｕＯＣＨ３、Ｌ−ＬｅｕＮＨ２、Ｌ−ＭｅｔＯＨ、Ｌ−ＭｅｔＯＣＨ３、またはＬ−ＭｅｔＮＨ２（ＤＥ３，３４０，２０８）、
Ｘ＝Ｌｙｓ；Ｚ＝Ｌ−ＡｌａＯＨまたはＬ−ＰｒｏＯＨ（Ｆｒｅｅｒ， Ｒ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍ． （１９７１） Ｃｉｅｎｃ． Ｃｕｌｔ． ２３（４）：５３９−４２； Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｂ． ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ， Ｉ．Ｉ． （１９９３） Ｔｏｘｉｃｏｎ ３１（７）：８８９−８９９）；
Ｘ＝Ｌ−Ｐｒｏ；Ｚ＝Ｌ−ＶａｌＮＨ２、Ｌ−ＭｅｔＯＨ、Ｌ−ＭｅｔＯＣＨ３、Ｌ−ＭｅｔＮＨ２、Ｌ−メトスルホキシドＯＨ、Ｌ−メトスルホキシドＯＣＨ３、またはＬ−メトスルホキシドＮＨ２（ＤＥ３，３４０，２０８）。
発明の要旨
本発明の目的は局所的に投与できる鎮痛性薬剤組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は新規なペプチド誘導体を提供することである。
【０００８】
第一の面において、本発明は鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基がペプチドのアミノ酸と結合しているペプチド誘導体、及び薬剤学的に許容可能な賦形剤
を含んでなる局所投与用の薬剤組成物を提供する。
【０００９】
ある種のペプチド類を局所鎮痛性組成物中の活性成分として使用できることが今回発見された。
【００１０】
本発明の組成物の活性成分は式（Ｉ）のペプチドである。本発明に従うペプチド類の例は、ｐＧＬＵがＮＨ２末端アミノ酸であり且つＴＲＰが第三（Ｙ）または第四（Ｚ）アミノ酸位置にあるトリペプチド類およびテトラペプチド類である。好ましいペプチド類の例は、ｐＧＬＵ−ＡＳＮ−ＴＲＰ−ＯＨ（ｐＥＮＷ）、ｐＧＬＵ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＯＨ（ｐＥＥＷ）、ｐＧＬＵ−ＡＳＮ−ＴＲＰ−ＴＨＲ−ＯＨ（ｐＥＮＷＴ）、ｐＧＬＵ−ＡＳＮ−ＴＨＲ−ＴＲＰ−ＯＨ（ｐＥＮＴＷ）、およびｐＧＬＵ−ＡＳＮ−ＴＲＰ−ＬＹＳ−ＯＨ（ｐＥＮＷＫ）である。
【００１１】
本発明に従うペプチド誘導体は、アルキル連鎖がペプチドに結合されたものである。これは、脂肪酸をアミン基に、例えばリシンまたはアルギニン基のε−アミン基に、結合させてペプチドのアルキルアミドを得るか、またはヒドロキシル基に結合させてペプチドのアミドエステルを得ることにより行うことができる。当業者に既知であるように、アルキル連鎖はアルキル連鎖と反応可能なペプチドのアミノ酸類のいずれとも結合することができる。アルキル連鎖はいずれの長さであってもよいが、好ましくは中鎖ないし長鎖、例えば炭素数４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。ペプチド誘導体の例は、ｐＧＬＵ−ＡＳＮ−ＴＲＰ−ＬＹＳ（オクタノイル）−ＯＨ（ｐＥＮＷＫ−Ｃ８）およびｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｏ−オクチル（ｐＥＮＷ−Ｃ８）である。
【００１２】
「鎮痛有効量」は、所望する薬理学的効果、すなわち疼痛の減少または予防をもたらしうる活性成分の量である。この量は、例えば活性成分および担体の正確な組成、投与の位置、疼痛源などの如き多くのパラメーターに依存する。この量は通常の当業者が限定された量の薬用量応答実験を行うことにより、例えばある濃度範囲の特定調剤を身体の特定位置に適用することにより、容易に決めることができる。有効であると見いだされた濃度の例は０．００１５〜０．０２ｍｇ／ｇの担体を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の薬剤組成物は局所投与用に調合される。そのような組成物は１種もしくはそれ以上の薬剤学的に許容可能な担体または賦形剤、例えば軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリームまたは軟膏剤（ｓａｌｖｅ）中での局所使用のためのラノリンおよびワセリンの混合物も含んでなる。局所使用のための他の担体は当業者に既知でありそして本発明の範囲内に包含される。芳香−発生剤、安定剤、着色剤、濃稠化剤および他の従来物質を組成物中に包含することができる。
【００１４】
本発明はまた、疼痛の処置または予防のための局所薬剤組成物の製造における、鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基がペプチドのアミノ酸と結合している
ペプチド誘導体の使用も提供する。
【００１５】
本発明の別の面は、哺乳動物に対して鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基がペプチドのアミノ酸と結合しているペプチド誘導体
を局所的に投与することを含んでなる哺乳動物における疼痛の処置または予防方法である。
【００１６】
ペプチドの局所投与は局所組成物のための通常の方法でよい。
【００１７】
本発明の組成物は時には遅滞期間後に作用するため、それは慢性疼痛に関して特に有効であると予期されるが、いずれのタイプの疼痛を処置するためにも使用することができる。
【００１８】
さらに別の面では、式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
またはアルキル基がアミノ酸と結合しており、アルキルの長さがＣ４またはそれより長いペプチドの誘導体であって、
ただしＺがＬ−アミノ酸である場合には、Ｘ＝ＡＬＡであるなら、ＺはＬＥＵまたはＭＥＴでなく、Ｘ＝ＬＹＳであるなら、ＺはＡＬＡまたはＰＲＯでなく、そしてＸ＝ＰＲＯであるなら、ＺはＶＡＬまたはＭＥＴでなく、
そしてさらにただしＺが存在しない場合には、ペプチドはそのアミノ酸に結合されたアルキル基を有する
ペプチドまたはペプチドの誘導体が提供される。
【００１９】
これらのペプチド類は文献では知られていない。
【００２０】
本発明のこの面の別の態様は、鎮痛有効量の本発明のペプチドまたはそのアルキルエステルもしくはアミドを含んでなる疼痛の処置または予防用の薬剤組成物である。この薬剤組成物は経口的に、非経口的にまたは局所的に投与することができる。
態様の詳細な記述
方法および材料
ペプチドおよび誘導体の製造
１．ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨの合成
本発明の一つの態様では、ペプチドの合成はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−Ｗａｎｇ樹脂上での段階的な９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）工程により手動的に行われた（１ｇの予め充填された樹脂上の０．２５ミリモルの充填量）。
【００２１】
第一段階で、Ｍｔｔ（４−メチルトリチル）保護基がＤＣＭ中１％ＴＦＡを用いる処置により選択的に除去された。ヘキサフルオロ燐酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）試薬をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下で適用する通例のカップリング工程により、オクタン酸が遊離アミノ基に（アミド結合を介して）結合された。同じカップリング方法が他のアミノ酸類の結合に関しても適用された。カップリング段階の完了はカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験により検知された（数個の樹脂ビーズをエタノールで洗浄しそして小さいガラス管の中に移し、２滴の下記の溶液：エタノール中５％ニンヒドリン、エタノール中８０％フェノール、ピリジン中０．００００２Ｍシアン化カリウムを加え、試料を混合しそして１２０℃に４−６分間にわたり加熱する。陽性試験は青色樹脂ビーズにより示される）。Ｆｍｏｃ基を次に２０％ピペリジンにより除去し、そして樹脂の洗浄後に、第二アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ））を導入して別のカップリング段階を再開した。
【００２２】
これらの段階を各回ともペプチド順序に従う追加のアミノ酸を用いて繰り返した。使用されたアミノ酸類はＦｍｏｃ−Ｎα保護された。三官能性アミノ酸類は以下の通りにして側鎖保護された：Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）。各Ｆｍｏｃアミノをその場でＨＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いて活性化しそして引き続き樹脂に５０分間にわたりカップリングさせた。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）をカップリング中に有機塩基として使用した。α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を次にＮ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）中２０％ピペリジンを用いて２０分間にわたり除去した。３当量の活性化されたアミノ酸類をカップリング反応で使用した。ペプチド合成が完了するまで、各々次のアミノ酸の添加で保護基除去およびカップリング段階を繰り返した。ペプチド−樹脂をＮＭＰで、引き続きＤＣＭで洗浄し、そして真空下で乾燥した。
【００２３】
上記の通りにして製造されたこのペプチドを９５％ＴＥＡ、５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）溶液を用いて２時間にわたり室温において樹脂から分けた。生成物を１０容量のエーテルの添加により沈澱させ、濾過しそして真空中で乾燥した。典型的には、１５０ｍｇのペプチドが１ｇのペプチド−樹脂から得られた。それはＬＣ／ＭＳにより同定された（Ｍ＋１＝６８４．７）。
精製
粗製ペプチドを分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８５μｍフェノメネックス・ルナ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ）カラム、１０ｍｍ内径×２５ｃｍ）上で精製した。クロマトグラフィーを下記の条件下で行った：Ａ＝Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ０．０５％；Ｂ＝ＡＣＮ／ＴＦＡ０．０５％；λ＝２１４ｎｍ；流速＝５ｍｌ／分。５０ｍｇのペプチドがカラム上に充填された。１５％から４５分における５０％への勾配が使用された。主要ピークの画分を集めそして分析ＨＰＬＣにより同定した。最良流を一緒にしそして凍結乾燥して要求される生成物を得、それは＞９５％純度であった。
２．ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｏ−オクチルの製造
このペプチドの製造も以下の段階を含む溶液合成処方により行うこともできる：
ａ．Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ｏ−オクチル（Ｂｏｃ−Ｔｒｐのオクチルエステル）の製造
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（６．１ミリモル）、オクタノール（６．８ミリモル）、ＤＭＡＰ（０．７４ｇ、６．１ミリモル）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．４ｇ、６．８ミリモル）をＤＣＭ（４０ｍｌ）に０℃において導入する。混合物を撹拌しそして冷却浴を除去すると温度が室温にゆっくり上昇する。反応物を一晩にわたり撹拌しそして次に濾過してジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を除去した。固体をＤＣＭで洗浄しそして一緒にした母液をＨＣｌ（０．１Ｎ）でｐＨ＝４−５に調節する。有機相を水（３×３０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過しそして蒸発させて粗製生成物を得る。
ｂ．Ｂｏｃ基の除去
Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−Ｏ−オクチルをエーテル中に室温において溶解する。ジオキサン中ＨＣｌ（４Ｎ）を導入し（４：１モル過剰）そして反応混合物を約１時間にわたり撹拌する。保護されていない生成物がＨＣｌ塩として沈澱する。それを濾過し、エーテルで洗浄しそして乾燥する。
ｃ．ＤＣＣ／ＨＯＢｔカップリング工程
ＤＣＭ（３５ｍｌ）中のＢｏｃ保護されたアミノ酸（１４．２ミリモル）を０℃に冷却する。ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（１２．９ミリモル、１．７５ｇ）およびＤＣＣ（１５．５ミリモル、３．２ｇ）を反応混合物に加えそして１時間にわたり激しく撹拌する。ＤＣＭ（２０ｍｌ）およびＴＥＡ（１８．１ミリモル）中に溶解させた保護基除去されたペプチド（Ｂｏｃ基の除去後）を導入しそして混合物をさらに３０分間にわたり０℃において撹拌する。冷却浴を除去しそして反応物を一晩にわたり室温において放置する。
【００２４】
生成物混合物を減圧下で蒸発乾固しそしてＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）を加える。不溶性粒子（ＤＣＵ）を濾過により除去しそして母液を食塩水（２×３５ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（５％、２×３５ｍｌ）、および水（２×３５ｍｌ）で洗浄する。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして減圧下で蒸発させる。
【００２５】
ペプチド合成の終了時に（最終段階はｐＧｌｕのカップリングである）、ペプチドが粗製生成物として得られる。それをＬＣ／ＭＳにより同定しそして第一ペプチド（ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（オクタノイル）−ＯＨ）と同様にして精製する。
３．ヘビ毒からの精製
本発明のペプチド類の一部は、クサリヘビ科（Ｖｉｐｅｒｉｄａｅ）、コブラ科（Ｅｌａｐｉｄａｅ）およびガラガラヘビ科（Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）のヘビから得られる毒を包含するヘビ毒から単離することもできる。例えば、ｐＥＮＷはナジャ・メラノロイカ（Ｎａｊａ ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ）毒からモノＱカラム上でｐＨ７．０の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液を用いて精製することができる。モノＱカラムから１２−１８分間にわたり溶離する画分（１４．３分においてピークを有する）をＨＰＬＣ上で以下の通りにしてさらに精製する。画分をＨＰＬＣスフェリソルブ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ）５カラム、５μ、２５０×４．６ｍｍ、相Ｓｅｐ．Ｓ／Ｎ１４２１１０上に充填し、そして２０ｍＭ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ５．５）およびＡｃＮの勾配を用いて溶離する。別の精製では、毒をモノＱカラム上でｐＨ６．９の２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を用いて精製することができる。１７分でピークを有する画分を上記の通りにしてＨＰＬＣによりさらに精製する。ＮＭＲ、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ分析は合成および天然ペプチド類の同一性を示した。
【００２６】
同様にして、ｐＥＮＷ、ｐＥＥＷおよびｐＥＮＴＷまたはｐＥＮＷＴがクロタルス・アダマンテウス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）毒から精製され、そしてｐＥＮＷがＶ．パレスチナエ（Ｖ． ｐａｌｅｓｔｉｎａｅ）毒から精製された。
効力検定
１．鎮痛効力検定
各試験において、同様な体重および年令の数十匹のハムスターを使用した。ハムスターを試験しようとする試料数に応じて群に分割した。試験物質を含有する軟膏（５０％ラノリンおよび５０％ワセリン）を動物の毛に背中部分に適用した。皮膚に対する損傷が確実に起きないようにするため、毛を除かなかった。ハムスターの対照群は本発明の画分を含まない軟膏で処置した。ハムスターを局所適用により６、１４、２１または２８連続日にわたり処置した。鎮痛性に関する試験を軟膏の最終適用後に行った。別の処方では、鎮痛性を軟膏の１回適用後に試験した。
【００２７】
軟膏の適用後に、ハムスターは軟膏をそれらの身体全体にわたりそれらの舌および足で分布させることによりそれら自身で「みづくろいする（ｃｌｅａｎ）」。それ故、軟膏の一部は口腔内にそして多分ハムスターの腸内にも導入される。
【００２８】
典型的な試験では、鎮痛物質を含むまたは含まない一定量の軟膏を各動物に対して１日もしくはそれ以上の日数の予め決められた期間にわたり適用する。この期間後に、大腿骨領域中への０．５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ／０．１ｋｇの体重の皮下注射により疼痛を誘発させる。ハムスターは注射部位を舌で触ることによりＨＣｌ注射に応答し、これを「舐め（ｌｉｃｋｓ）」と称する。注射から２０分後に、ハムスターを６０分間にわたり観察しそして「舐め」数が計数される。「舐め」数はＨＣｌ誘発疼痛の量的指示値として役立つ。
【００２９】
対照動物における平均「舐め」数を処置した動物における数と比較することにより、鎮痛効果を測定する。差異の有意性をｔ−試験統計を用いて測定した。
実施例１
０．６ｍｇのｐＥＮＷ、ｐＥＮＷＫ−Ｃ８またはｐＥＮＷＧＡＴ（ｐＥＮＷの二量体）を５ｍｌのＤＤＷ中に溶解し、超音波ミキサーにより２分間にわたり混合しそして次に３１５ｇｒの軟膏中に溶解した。最終的なペプチド濃度は０．００２ｍｇ／ｇｒであった。
【００３０】
４週間の期間にわたり６回の適用を行った。鎮痛性に関する試験を軟膏の最終適用から１０日後に行った。結果を以下の表にまとめる：
【００３１】
【表１】
2004513079.tif 000002
【００３２】
トリペプチドの局所適用が動物の疼痛の減少に対して有意な効果を有したこと並びにテトラペプチド誘導体はそれより有効でさえあったことが明らかに見られる。トリペプチドのＣ−末端に対する３個のアミノ酸類の付加がその活性を完全に壊した。
実施例２
以下の活性成分：ｐＥＮＷ、ｐＥＥＷ、またはｐＥＮＴＷもしくはｐＥＮＷＴを含有する組成物を０．０２０ｍｇ／ｇの濃度で実施例１の通りにして製造した。５週間の期間にわたり６回の適用を行った。結果を以下にまとめる：
【００３３】
【表２】
2004513079.tif 000003
【００３４】
評価したペプチド類の全てが有意な鎮痛活性を有することが見られる。
実施例３
ｐＥＮＷ−Ｃ８を０．００２ｍｇ／ｇの軟膏の濃度で含有する組成物を実施例１の通りにして製造した。動物に対して１回の適用を行い、そして適用から１１、２３および４８日後に鎮痛性を評価した。活性物質を含まない軟膏を対照動物に適用した。
【００３５】
試験結果を以下にまとめる：
【００３６】
【表３】
2004513079.tif 000004
【００３７】
結果は、鎮痛効果が時間につれて増加して、約２３日後にピークに達し、そして引き続き低下することを示している。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月4日(2002.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸と結合され、該アルキルがＣ２−Ｃ３０よりなる群から選択されるペプチド誘導体、
及び薬剤学的に許容可能な賦形剤
を含んでなる局所投与用の薬剤組成物。
【請求項２】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ＸがＡＳＮである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
疼痛の処置または予防のための局所薬剤組成物の製造における、鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸と結合しているペプチド誘導体の使用。
【請求項１０】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
ＸがＡＳＮである請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項９に記載の使用。
【請求項１６】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項９に記載の使用。
【請求項１７】
哺乳動物に対して鎮痛有効量の式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
または鎮痛有効量のアルキル基が該ペプチドのアミノ酸と結合しているペプチド誘導体
を局所的に投与することを含んでなる該哺乳動物における疼痛の処置または予防方法。
【請求項１８】
該アルキル基がアミド結合により結合されている請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該アルキル基がエステル結合により結合されている請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＸがＡＳＮである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
該アルキルがＣ４−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該ペプチドがテトラペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
該ペプチドがトリペプチドでありそしてＺが存在しない請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）：
ｐＧＬＵ−Ｘ−Ｙ−Ｚ　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
［式中、ＸはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＧＬＵ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、ＡＬＡ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＰＲＯ、ＬＹＳおよびＡＲＧよりなる群から選択されるアミノ酸であり、
ＹはＴＲＰまたはＴＨＲであり、
そしてＺはＬ−アミノ酸であるか、またはＺは存在せず、
そしてＺがＬ−アミノ酸である場合にはＹおよびＺの両方でなく一方がＴＲＰであり、そしてＺが存在しない場合にはＹ＝ＴＲＰである］
のＬ−アミノ酸類を含んでなるペプチド、
またはアルキル基がアミノ酸と結合しており、該アルキルの長さがＣ５またはそれより長い該ペプチドの誘導体であって、
ただしＺがＬ−アミノ酸である場合には、Ｘ＝ＡＬＡであるなら、ＺはＬＥＵまたはＭＥＴでなく、Ｘ＝ＬＹＳであるなら、ＺはＡＬＡまたはＰＲＯでなく、そしてＸ＝ＰＲＯであるなら、ＺはＶＡＬまたはＭＥＴでなく、
そしてさらにただしＺが存在しない場合には、該ペプチドはそのアミノ酸に結合された該アルキル基を有する
ペプチドまたはペプチドの誘導体。
【請求項２６】
該アルキルがＣ５−Ｃ３０よりなる群から選択される請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
該アルキルがオクチル基（Ｃ８）である請求項２６に記載のアルキルエステル。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれかに記載のテトラペプチド。
【請求項２９】
請求項２５〜２７のいずれかに記載のトリペプチド。
【請求項３０】
鎮痛有効量の請求項２５に記載のペプチドを含んでなる疼痛の処置または予防のための薬剤組成物。
【請求項３１】
鎮痛有効量の請求項２５に記載のペプチドのアルキルエステルまたはアミドを含んでなる疼痛の処置または予防のための薬剤組成物。
【請求項３２】
該ペプチドがｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、またはｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃ８である請求項９に記載の使用。
【請求項３３】
該ペプチドがｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、またはｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃ８である請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ、ｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、またはｐＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃ８である請求項２５に記載のペプチド。
【国際調査報告】
2004513079.tif 000023
2004513079.tif 000024
2004513079.tif 000025