(57)【要約】放線菌によって産生可能な新規なセルラーゼ組成物を提供する。そのセルラーゼは、計算した分子量が約３６ｋＤ であり、かつｐＨ 最適条件が４０ ℃で８ および６０ ℃で７ である。また、前記セルラーゼをコードするＤＮＡ 、前記セルラーゼを作成する方法、およびそれらの用途を提供する。
2004500010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ 記載のアミノ酸配列、セルロース分解活性を有するその断片、またはセルロース分解活性を有するその誘導体に本質的に同一であるセルラーゼ。
【請求項２】
配列番号１ のおよその位置３１ からおよその位置２６１ まで伸びるアミノ酸配列と実質的に同一である連続アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項３】
前記誘導体が、配列番号１ に対して５０％ 以上の配列同一性を有することを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項４】
前記誘導体が、配列番号１ に対して７０％ 以上の配列同一性を有することを特徴とする請求項３ 記載のセルラーゼ。
【請求項５】
前記セルラーゼが：
配列番号２ に対応するＤＮＡ ；高い厳格性条件下において配列番号２ にハイブリッド形成し続けるＤＮＡ ；配列番号２ に対して７６％ 以上の配列同一性を有するＤＮＡ ；および低い厳格性条件下において配列番号２ に基づく配列の少なくとも１ 部分を含む第二ＤＮＡ 分子にハイブリッド形成するＤＮＡ ：より成る群から選択されるＤＮＡ 配列によってコードされることを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項６】
配列番号１ 記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項７】
放線菌から得ることができることを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項８】
切断されて、セルラーゼ活性を有しかつ分子量が約２５ｋＤ である断片を形成することを特徴とする請求項１ 記載のセルラーゼ。
【請求項９】
ＳＤＳ −ＰＡＧＥ で測定して分子量が約３６ｋＤ 、計算した等電点が約５．９ 、ｐＨ 最適条件が４０ ℃で約８ および６０ ℃で７ であることを特徴とする放線菌由来のセルラーゼ。
【請求項１０】
請求項１ 記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
【請求項１１】
請求項２ 記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
【請求項１２】
請求項３ 記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
【請求項１３】
請求項４ 記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
【請求項１４】
請求項５ 記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
【請求項１５】
低い厳格性条件下において配列番号２ に対してハイブリッド形成し続けることを特徴とするＤＮＡ 。
【請求項１６】
中程度の厳格性条件下において配列番号２ に対してハイブリッド形成し続けることを特徴とする請求項１５ 記載のＤＮＡ 。
【請求項１７】
高い厳格性条件下において配列番号２ に対してハイブリッド形成し続けることを特徴とする請求項１５ 記載のＤＮＡ 。
【請求項１８】
セルラーゼを作成する方法において、処理：
（ａ）　　請求項１０ 記載のＤＮＡ 分子を単離する；
（ｂ）　　発現のための適切な生物体を該ＤＮＡ で形質転換する；
（ｃ）　　該セルラーゼをコードする該ＤＮＡ の発現に適した条件下において該形質転換生物体を培養する；
（ｄ）　　得られた該セルラーゼを含む水溶性混合物を採取する：
ことを含むことを特徴とするセルラーゼを作成する方法。
【請求項１９】
前記水溶性混合物から前記セルラーゼをさらに精製することを特徴とする請求項１８ 記載の方法。
【請求項２０】
前記生物体がバシラス種を含むことを特徴とする請求項１８ 記載の方法。
【請求項２１】
前記生物体がストレプトミセス種を含むことを特徴とする請求項１８ 記載の方法。
【請求項２２】
前記生物体がストレプトミセス・リビデンスを含むことを特徴とする請求項２１ 記載の方法。
【請求項２３】
微生物中のセルラーゼをコードするＤＮＡ を同定する方法において、処理：
（ａ）　　第二ＤＮＡ に対してハイブリッド形成することによって検出可能なシグナルを産生し得るような、配列番号２ に対応する配列の少なくとも１ 部分を包含するＤＮＡ プローブを調製する；
（ｂ）　　該第二ＤＮＡ を該微生物から単離し、さらに該第二ＤＮＡ を無作為に切断してＤＮＡ 断片ライブラリーを作成することによって、該第二ＤＮＡ を該微生物から調製する；
（ｃ）　　低い厳格性条件下において前記ＤＮＡ プローブを前記第二ＤＮＡ と反応させる；
（ｄ）　　処理（ｃ） においてハイブリッド形成したＤＮＡ 断片を検出し、さらに単離する；
（ｅ）　　該ＤＮＡ プローブとハイブリッド形成する該第二ＤＮＡ 断片に対応する完全長遺伝子を得る：
ことを含むことを特徴とする微生物中のセルラーゼをコードするＤＮＡ を同定する方法。
【請求項２４】
セルラーゼを作成する方法において：
（ａ）　　発現のための適切な生物体を前記ＤＮＡ で形質転換し；
（ｂ）　　該ＤＮＡ が含む遺伝子の発現に適した条件下で該形質転換生物体を培養し；
（ｃ）　　該セルラーゼを含む水溶性混合物を採取する：
ことを含む請求項２３ に基づき単離した遺伝子がコードするセルラーゼを作成する方法。
【請求項２５】
請求項１ 記載のセルラーゼを含有する洗剤組成物。
【請求項２６】
請求項２ 記載のセルラーゼを含有する洗剤組成物。
【請求項２７】
請求項５ 記載のセルラーゼを含有する洗剤組成物。
【請求項２８】
動物飼料のための添加物としての請求項１ 記載のセルラーゼの使用。
【請求項２９】
織物加工のための請求項１ 記載のセルラーゼの使用。
【請求項３０】
パルプおよび紙の加工における請求項１ 記載のセルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連特許出願に対する相互参照
本出願は、１９９７ 年１１ 月１９ 日に出願し現在放棄されている米国特許出願第０８／９７４，０４２ 号の一部継続出願である１９９８ 年６ 月２４ 日出願の米国特許出願第０９／１０４，３０８ 号の一部継続出願である；前記２ つの特許出願は参照によって全てこの中に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府委託研究および開発
該当しない。
【０００３】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ −グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に３ つのクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼである（Ｋｎｏｗｌｅｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＴＥＣＨ ５： ２５５−２６１ （１９８７）） 。セルラーゼは、多くの細菌、酵母、および真菌によって産生されることが知られている。
【０００４】
セルロース分解酵素の使用のために開発された応用の中で主要なものは、（バイオ）エタノール製造のための（木材）セルロースパルプの糖への分解、“ストーンウォッシュ（ｓｔｏｎｅ ｗａｓｈｉｎｇ） ”および“バイオポリッシング（ｂｉｏｐｏｌｉｓｈｉｎｇ） ”のような織物加工、ならびに洗剤組成物における用途である。またセルラーゼは、泥を除去するため、すなわち洗濯のための洗剤組成物において有用であることが知られている。例えば、英国特許出願第２，０７５，０２８ 号、第２，０９５，２７５ 号、および第２，０９４，８２６ 号は、セルラーゼを加えた洗剤を用いると洗濯能力が改善されることを示している。さらには、英国特許出願第１，３５８，５９９ 号は、洗剤においてセルラーゼを用いると綿混織物のガサガサした感触を減らすことを示している。
【０００５】
織物加工におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、使用済み織物の色を明るく鮮やかにすることによって、それらを再生できることである。例えば、綿混織物を繰り返し洗浄すると、その織物が灰色じみた外観となる。これは、機械的作用によって生じる、しばしば“毛玉（ｐｉｌｌｓ） ”と呼ばれる、破壊されかつ乱れた小繊維のせいであると考えられている。この灰色じみた外観は、特に着色織物において顕著である。結果として、セルラーゼが繊維の乱れた最上層を除去し、従って織物の全体的外観を改善し得ることは価値があると分かっている。
【０００６】
セルラーゼの主要な用途である洗剤は通常アルカリ性条件下で作用するため、ｐＨ７ −１０ で高い活性を示すセルロースが強く要求されている。ヒュミコラ・インソレン（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ） およびトリコダーマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ） 由来のセルラーゼのようなよく特徴付けされている真菌セルラーゼは、中性から低いアルカリｐＨ で十分に機能する。高いアルカリ性ｐＨ でセルラーゼ活性を示す多くの酵素が、バシラス菌および他の原核生物から単離されている（例えば国際特許出願第ＷＯ９６／３４０９２ 号および第ＷＯ９６／３４１０８ 号を参照）。従って、真菌および細菌のセルラーゼは完全に調査されている。しかしながら、第三の群のセルラーゼである放線菌から単離されたセルラーゼは、ほとんど注目されていなかった。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２： ４５−６３ （１９９２） は、サーモモノスポラ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｆｕｓｃａ） 、サーモモノスポラ・カーベイト（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｒｖａｔｅ） 、およびミクロビスポラ・ビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ ｂｉｓｐｏｒａ） によって産生されるセルラーゼについて研究しており、さらにそれらセルラーゼの多くが広いｐＨ 特性および良好な温度安定性を有することを示している。同様に、Ｎａｋａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５１： ３０６１−３０６５ （１９８７） およびＮａｋａｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ６５： ２２９−２３８ （１９８８） は、ストレプトミセス株ＫＳＭ −９ 由来のアルカリ耐性セルラーゼｃａｓＡ について記載している。そのセルラーゼは、アルカリ性ｐＨ での最適条件および優れた温度安定性を有する。
【０００７】
放線菌からのいくつかの例を含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関連する技術における知識にも関わらず、例えば織物加工、洗剤組成物の成分、パルプおよび紙の加工、動物飼料の補助物質、パン作りのための加工助剤、ならびにバイオマスコンバーター（ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｖｅｒｅｒ） 等として有用である様々な領域の特徴を有する新しいセルラーゼに対する要求が続いている。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、放線菌によって産生され得る新規なセルラーゼ組成物、そのようなセルラーゼの誘導体、そのようなセルラーゼを作成する方法、およびそのようなセルラーゼの使用を提供することである。さらに本発明は：洗剤組成物の添加剤として；セルロース含有織物およびそれに用いられ得る繊維のような織物の加工において；動物飼料の添加剤として；パン作りにおける加工助剤として；パルプおよび紙の加工において；ならびに高フルクトール含有コーンシロップ（ｃｏｒｎ−ｓｙｒｕｐ） またはエタノールの製造のためのデンプン加工において：の使用を含む、業界においてセルラーゼの添加が有利であると認められている組成物における新規なセルラーゼの使用に関する。
【０００９】
組換え宿主細胞による異種発現を介してそのような新規放線菌由来セルラーゼ組成物を作成する方法を提供することも本発明の別の目的である。
【００１０】
本発明の新規なセルラーゼ組成物の商業生産を容易にするＤＮＡ およびアミノ酸配列を提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１１】
洗剤、織物加工、飼料補助物質、ならびにパルプおよび紙の加工における使用のための優れた特性を有する新規なセルラーゼを提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１２】
本発明に基づき、放線菌から得ることができる新規なセルラーゼまたは誘導体を提供する。好ましくは、本発明のセルラーゼは、図１ （配列番号１ ）のアミノ酸配列、その断片、またはその活性部分に対して５０％ 以上の配列同一性、好ましくは７０％ 以上の配列同一性、さらにより好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００１３】
別の実施形態に基づき、本発明のセルラーゼをコードするＤＮＡ を含む組成物を提供する。好ましくは、そのＤＮＡ はアミノ酸配列をコードし、かつ図２ （配列番号２ ）に示される核酸配列、その断片、またはそれらの部分に対して７６％ 以上の配列相同性、好ましくは８０％ 以上の配列同一性、およびさらに好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有しかつそれによってセルラーゼが産生されるそれらの誘導体を含む。さらに本発明は、適切な条件下において図２ に表されるＤＮＡ から選んだＤＮＡ プローブに対してハイブリッド形成し、かつそれによってセルラーゼが産生されるようなＤＮＡ を具体的に示す。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態に基づき、本発明に基づくセルラーゼコードＤＮＡ で適切な微生物を形質転換させる方法、およびその形質転換微生物から本発明に基づくセルラーゼを産生させる方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、完全長セルラーゼは放線菌由来であり、かつＳＤＳ −ＰＡＧＥ で測定して約３６ ｋＤ の分子量を有する（この中で３６ ｋＤ セルラーゼとして称されている）。完全長の約３６ ｋＤ のセルラーゼは、等電点が約５．９ であり、さらにＣＭＣ （カルボキシメチルセルロース）におけるｐＨ 最適条件が４０ ℃で約８ でありかつ６０ ℃で７ である。本発明のセルラーゼは、少なくともｐＨ５ からｐＨ１０ の広い活性範囲を有し、４０ ℃よりも６０ ℃においてより高い活性を示す。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、前記の完全長セルラーゼの切断形態である。その分子量は約２５ ｋＤ である。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており（配列番号１ ）、リーダー配列をボールド体で示す。コード化文字はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｎｕａｌ， ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ ｖｅｒｓｉｏｎ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９０ に記載） に基づく。
【００１８】
図２ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼをコードするＤＮＡ 配列を示す（ 配列番号２） 。
【００１９】
図３ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼの４０ ℃および６０ ℃におけるｐＨ ／活性特性を示す。
【００２０】
図４ は、ｐＨＰＬＴ ベクターを示す。
【００２１】
図５ は、ｐＨＰ１１ＡＧ８ ベクターを示す。
【００２２】
図６ は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の１６ｓ ｒＲＮＡ 配列を示す。
【００２３】
図７ は、ｐＩＪ４８８−１０１ の構造を示す。
【００２４】
図８ は、ｐＷＧｘＧＩＴ の構造を示す。
【００２５】
図９ は、ｐＴＺ１８Ｒｓｔｉ の構造を示す。
【００２６】
図１０ は、ｐＷＧｘｓＧＩＴ の構造を示す。
【００２７】
図１１ は、ｐＩＪ４８８ｓｔｉ の構造を示す。
【００２８】
図１２ は、ｐＳＥＧＣｉ の構造を示す。
【００２９】
図１３ は、ｐＳＥＧＣＴ の構造を示す。
【００３０】
図１４ は、ｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【００３１】
図１５ は、ＧＩ プロモーター、ｃｅｌＡ シグナル配列、セルラーゼ１１ＡＧ８ およびＧＩ ターミネーターから成る完全発現カセットのＤＮＡ 配列を示す（ 配列番号４） 。また、１１ＡＧ８ のコードアミノ酸配列を示す（ 配列番号５） 。
【００３２】
図１６ は、ｐＳＥＡＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【００３３】
図１７ は、ｐＳＡＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【００３４】
図１８ は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図１８ａ は、Ｗｉｓｋ（登録商標） において、完全長セルラーゼの毛玉除去能（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ） が切断セルラーゼの毛玉除去能と同等であることを示唆する。図１８ ｂは、切断セルラーゼにおいて、ピーク負荷値（ｐｅａｋ ｌｏａｄ） がわずかに低く、かつＴＳＬ が高いことを示唆する。図１８ ｃは、同じ毛玉除去率において、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いＴＳＬ を有することを示唆する。
【００３５】
図１９ は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図１９ａ は、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ において、切断セルラーゼの毛玉除去能が、完全長セルラーゼの毛玉除去能よりも良いことを示唆する。図１９ ｂは、切断セルラーゼにおいて、完全長セルラーゼよりもピーク負荷値が低いことを示唆する。
【００３６】
図２０ は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図２０ａ は、過ホウ酸一水塩および漂白活性剤の存在下において、切断酵素の毛玉除去能力がわずかに低下することを示唆する。図２０ ｂは、漂白剤の存在下において、切断セルラーゼのピーク負荷値が上昇することを示唆する。
【００３７】
図２１ は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図２１ａ は、プロテアーゼが切断酵素の毛玉除去能力に影響を及ぼさないことを示唆する。図２１ｂ は、プロテアーゼが切断酵素のピーク負荷値に影響を及ぼさないことを示す。
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
この中で別段の定義がなければ、この中で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ２Ｄ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）， ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ， ＮＹ （１９９１） は、本発明において用いられている多くの用語の全般的な辞書を当業者に提供する。この中に記載の方法および材料に類似または等価である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料について記載している。数値範囲は、その範囲を特定する数値を含む。指摘がなければ、核酸は、５ ’から３ ’の方向で左から右に書く；アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で左から右に書く。この中に与えられた見出しは、明細書を全体として参照することによって理解し得る本発明の実施形態の種々の態様を限定するものではない。
【００３９】
「アミノ酸」の用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（総称して「ポリペプチド」）に組み込まれたアミノ酸への言及を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸であって差し支えなく、または別段限定がなければ、天然アミノ酸と同様に機能する天然アミノ酸の公知の類似物を含んでいて差し支えない。
【００４０】
「誘導体」は、天然タンパク質のＣ 末端およびＮ 末端の一方または両方への１ つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列における１ つまたは多くの異なる部位における１ つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の１ 方あるいは両方の末端またはアミノ酸配列の１ つ以上の部位における１ つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは天然アミノ酸配列における１ つ以上の部位への１ つ以上のアミノ酸の挿入により、天然タンパク質から派生する。酵素誘導体の調製は、好ましくは、天然タンパク質をコードするＤＮＡ 配列の修飾、そのＤＮＡ 配列による適切な宿主の形質転換、酵素誘導体を形成するための修飾ＤＮＡ 配列の発現によって達成される。誘導体を調製する別の手段は、当業界で周知であり、例えば天然タンパク質またはその誘導体のタンパク質分解による切断を含む。本発明のセルラーゼの誘導体は、前駆酵素の特徴的な酵素特性を維持するがある特定側面において変化した特性を有するような、前駆酵素アミノ酸配列（例えば本発明に基づく野生型または天然型の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。例えば、変化したセルラーゼは、最適ｐＨ が上昇し、または温度抵抗が上昇し得るが、その特有のセルロース分解活性を有するであろう。
【００４１】
特定アミノ酸配列の「保存的置換」とは、機能活性に重要でないアミノ酸配列のアミノ酸置換、または重要なアミノ酸の置換でさえ本質的に活性を変化させないような類似特性（例えば酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性等）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸置換を称する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｔａｂｌｅｓ） は、当業界で周知である。
【００４２】
２ つのポリペプチドまたは核酸配列の構造における「同一」の用語は、以下の「配列比較アルゴリズム」の１ つを用いて測定して一致が最大となるように並べた場合に、同じとなる２ つの配列中の残基を称する。比較のための配列の最適な整列は、例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ （１９８１） の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ４８： ４４３ （１９７０） の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８） の類似性の調査方法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） 、または目視検査によって実施することができる。
【００４３】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの１ つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０）　に記載のＢＬＡＳＴ アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ 解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる（ 。そのアルゴリズムは、データベース中の長さＷ のワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値Ｔ に適合しまたは充足させる照会配列中の長さＷ の短いワードを同定することによって、高得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ（ＨＳＰｓ）） をまず同定することを含む。それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いＨＳＰｓ を見出すための開始点として働く。累積整列得点（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ） ができるだけ増えるように、比較する２ つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数Ｘ から遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムパラメーターＷ 、Ｔ 、およびＸ は、整列の感度および速さを特定する。ＢＬＡＳＴ プログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ） が１１ 、ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９８９）） 整列（Ｂ） が５０ 、期待値（Ｅ） が１０ 、Ｍ ’５ 、Ｎ ’−４ 、および両鎖の比較を用いる。
【００４４】
さらに、ＢＬＡＳＴ アルゴリズムは、２ つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ （１９９３） を参照）。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムによってもたらされる類似性の１ つの指標は、２ つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ） （Ｐ（Ｎ） ）である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約０．１ より小さく、より好ましくは約０．０１ より小さく、さらに最も好ましくは約０．００１ よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。評価核酸がセルラーゼポリペプチドをコードする場合には、比較によって約０．５ より小さく、より好ましくは約０．２ より小さい最小総確率をもたらす場合に、特定のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【００４５】
２ つのポリペプチドが実質的に同一であるとする別の指標として、第一ポリペプチドが第二ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることが挙げられる。従って、例えば２ つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、そのポリペプチドは第二ポリペプチドと実質的に同一である。
【００４６】
この中で用いられている「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、互換的に使われており、かつアミノ酸残基から成る高分子に対する言及を含む。その用語は、天然アミノ酸高分子に適用されるのと同様に、１ つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似物であるようなアミノ酸高分子にも適応される。またその用語は、そのポリペプチドが機能を維持するような保存的アミノ酸置換を含む高分子にも適用される。
【００４７】
この中で用いられている「組換え」の用語は、天然状態ではそのポリペプチドを発現し得るＤＮＡの内生的複製を持たない宿主細胞を用いて産生されるポリペプチドに対する言及を含む。宿主細胞は、適切な単離核酸配列の導入によって遺伝子的に変化しているため、その組換えポリペプチドを産生する。またその用語は、異種核酸の導入または天然核酸の改変によってその細胞にとって天然でない形態に修飾されている宿主細胞、または核酸、またはベクターに対する言及、あるいは宿主細胞がそのように修飾された細胞由来であることを含む。従って、例えば、組換え宿主細胞は、その細胞の天然の（非組換えの）形態内に認められない遺伝子を発現し、天然の形態内に認められる遺伝子の変異体を発現し、あるいは全く発現されないかまたは発現されたとしても異常に発現される天然遺伝子を発現している。
【００４８】
「宿主細胞」は、宿主として、および本発明に基づく組換えＤＮＡベクターの発現媒体としてとして働く能力を有する細胞を意味する。本発明の好ましい実施形態において、「宿主細胞」はバシラス菌の細胞を意味する。しかしながら、当業者は、例えば細菌、真菌、真核、および植物細胞のような任意の適切な宿主細胞を用い得ることに気が付くであろう。
【００４９】
「ＤＮＡ構造」または「ＤＮＡベクター」は、上記の任意の新規セルラーゼまたはセルラーゼ誘導体をコードする１ つ以上のＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列を意味する。「ＤＮＡベクター」には「発現ベクター」が含まれる。典型的な発現ベクターは、転写および翻訳のターミネーター、転写および翻訳の開始配列、並びに特定核酸の発現を制御するのに有用であるプロモーターを含む。ベクターは、必要に応じて、１ つ以上の独立したターミネーター配列、原核細胞、真核細胞、または両方においてそのカセットの複製を可能とする配列（例えばシャトルベクター）および原核系および真核系の両方のための選択マーカーを包含する遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞、または両方における複製および導入に適している。Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｇｅｎｅ ８： ８１−９７ （１９７９） ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ７３１−７３４ （１９８７） ；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＮＯＬＯＧＹ， ＶＯＬ １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （ 「Ｂｅｒｇｅｒ 」） ；Ｓｃｈｅｉｄｅｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｇ ６４３５： １０ （１９９５） ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ ＥＤ．）ＶＯＬ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （１９８９） （「Ｓａｍｂｒｏｏｋ 」）；ａｎｄ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，（１９９７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ） （「Ａｕｓｕｂｅｌ 」）を参照。
【００５０】
完全長セルラーゼのクローニングおよび発現
本発明の１ つの実施形態において、本発明のセルラーゼは、例えば組換え的に産生されるのではなく、天然供給源から得られる。適切なセルラーゼ産生生物を単離するためにソーダ湖試料をスクリーニングすることによって、セルラーゼを得ることができる。さらに、放線菌のような細菌を増殖させるためにその分野で認められた手段に基づきその生物を培養することができる。
【００５１】
しかしながら、正確なセルラーゼ産生株を単離するよりもむしろ、遺伝子操作技術を利用する方がより効率的である。従って、この中で提供されるＤＮＡ で適切な宿主細胞を形質転換し、さらに宿主細胞の増殖およびセルラーゼ発現に適切な条件下で、得られた組換え微生物を培養することが可能である。
【００５２】
最初の処理として、例えばＳａｉｔｏ ａｎｄ Ｍｉｕｒａ の方法（Ｓａｉｔｏ ＆ Ｍｉｕｒａ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， ７２： ６１９ （１９６３）） または類似の方法によって、供与体である放線菌株から染色体ＤＮＡ を得ることができる。さらに得られた染色体ＤＮＡ の制限酵素切断によって、アルカリセルラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ 断片が得られる。この目的のために、例えば遺伝子のコード領域またはコード領域と遺伝子のプロモーターのような前記遺伝子の所望の領域を切断しないような任意の制限酵素を用いることができる。あるいは、部分的にのみ消化をもたらすために低い酵素濃度または短いインキュベーション時間を用いて遺伝子を切断するような制限酵素を用いることができる。好ましい制限酵素はＳａｕ３Ａ である。得られた消化混合物から、約４−１０ｋｂ の適切な断片を単離し、ＤＮＡ ベクターに挿入し、さらに適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００５３】
例えばλファージ（発現）ベクターおよびＥ．ｃｏｌｉ（ 大腸菌） 宿主細胞を用いて、本発明のセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することができる。（あるいは、保存ドメインに基づき設計した共通プライマーを用いたＰＣＲ を使用しても差し支えない）。Ｅ．ｃｏｌｉ における最初のクローニング処理の後、バシラス菌またはストレプトミセス種のようなより好ましい工業的発現宿主、アスペルギルスまたはトリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） のような糸状菌、あるいはサッカロミセスのような酵母に本発明に基づくセルラーゼ遺伝子を導入することができる。最も好ましいのはストレプトミセスである。また、好ましいのはトリコダーマである。しかしながら、トリコダーマにおいて発酵されたセルラーゼは、例えばストーンウォッシュのような織物加工で用いる場合に、バック染色（ｂａｃｋｓｔａｉｎｉｎｇ） のレベルを上げることが分かっている。理論に制限されないで、発酵培地にプロテアーゼを添加すると許容可能なレベルまでバック染色のレベルを下げると考えられている。従って、トリコダーマもまた、織物加工で用いるためのセルラーゼの条件を満たす宿主細胞を提供することができる。それら宿主生物において得られる高いレベルの発現および分泌によって発酵培地中へのセルラーゼの蓄積が可能となり、その培地から連続的にセルラーゼを回収できる。
【００５４】
遠心または濾過によって培地から細胞を分離し、もし必要であれば細胞を破壊し、さらに細胞断片および破片から上清を除去することを含む従来の方法によって、発酵培地からセルラーゼを回収できる。通常、分画後、上清または濾液のタンパク質成分を例えば硫酸アンモニウムのような塩によって沈殿させる。次にその沈殿タンパク質を溶解させ、さらに例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、またはその分野で認められている別の同様の方法のような種々のクロマトグラフィーによって精製する。本発明に基づくセルラーゼの産生のために、セルロースベースのエネルギー供給源を含む培地を用いて、アルカリ条件下において宿主細胞を培養することが好ましい。
【００５５】
機能活性によって本発明のセルラーゼの精製をモニターすることが好ましい。好ましい機能測定法として、セルラーゼによるＮＰＣ （ ニトロフェニルセロビオシド） の加水分解の速度をモニターする。その方法は以下の通りである：
９６ 穴マイクロタイタープレートのウェルに２ 重または３ 重で２０ μＬ の試料または標準品を添加する。標準品は既に得られておりかつよく特徴づけされているセルラーゼ試料、または商業的に購入したセルラーゼであって差し支えない。測定溶液１００ μＬ を添加する。測定溶液は、濃縮ストック液とリン酸緩衝液を１ 対５ で混合して調製する。濃縮ストック液は、１００ｍＭ のリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０） 中の２５ｍｇ／ｍｌＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ Ｎ４７６４） から成る。測定溶液を希釈するために同じリン酸緩衝液を用いることができる。ＮＰＣ 基質を試料または標準品に添加するとすぐに、３０ ℃で予め保温しておいたマイクロタイタープレートリーダーにプレートを挿入する。１４１０ｎｍ での読出しを１ 分間隔で６ 分間とる。
【００５６】
標準品を用いて標準曲線を作成することができる。曲線のＹ 軸はＶｍａｘ であり、Ｘ 軸は標準品中のセルラーゼの濃度である。もし試料のＶｍａｘ が標準品を用いて作成した標準曲線の範囲を超える場合は、試料を希釈して測定を繰り返す必要がある。
【００５７】
本発明の１ つの実施形態において、発現宿主細胞は、バシラス種、より好ましくはバシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） または枯草菌を含む。しかしながら、より好ましい実施形態において、宿主発現細胞は、ストレプトミセス種、より好ましくはストレプトミセス・リビデンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄｅｎｓ） を含む。プロテアーゼ欠失バシラス菌株のための好ましい一般的な形質転換および発現プロトコールは、この中に引例によって組み込まれているＦｅｒｒａｒｉ， ｅｔ ａｌ．，　米国特許第５，２６４，３６６ 号において提供されている。ストレプトミセス種における形質転換および発現は、この中に引例によってその全体が組み込まれているＨｏｐｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｉｎｎｉｓ （１９８５） において見ることができる。
【００５８】
本発明のＤＮＡ 配列でバシラス菌を形質転換させることは、得られる発現の点で効果的ではないことが見出された。従って、バシラス種を形質転換させる場合には、公知のバシラス種由来シグナル配列および他の調節配列と組み合わせてａｐｒＥ プロモーターを利用することが好ましい。形質転換宿主細胞がアスペルギルスである場合は、好ましいプロモーターはｇｌａＡ である。ストレプトミセスを用いる場合には、好ましいプロモーターは、アクチノプラーネス・ミソウリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ） のグルコースイソメラーゼ（ＧＩ） プロモーターである。
【００５９】
完全長セルラーゼおよびそれをコードするＤＮＡ に加えて、本発明は切断セルラーゼ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ） およびセルラーゼの誘導体、ならびにそれらをコードするＤＮＡ も含む。通常、セルラーゼは２ つの活性ドメイン：触媒活性ドメインおよびセルロース結合ドメイン：を含む。本発明の切断セルラーゼは、本発明の完全長セルラーゼの触媒活性部分を含む。
【００６０】
１ つの実施形態において、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼを切断することによって作成する。完全長セルラーゼは、例えば放線菌のような天然の宿主、または組換え宿主細胞の何れかから単離することができる。理論によって制限されないで、組換え宿主細胞の発酵プロセスの間にプロテアーゼが本発明のセルラーゼを切断すると考えられている。従って、非組換えセルラーゼまたは発酵プロセスの間に切断されない組換えセルラーゼの場合、そのようなプロテアーゼを本発明の完全長セルラーゼに添加して切断形態を作成できると想定される。
【００６１】
切断後、本発明の切断セルラーゼをセルラーゼ結合ドメインから分離することが必要であろう。その分離は、例えば分離用電気泳動、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー、および限外濾過等によって、サイズに基づき実施できる。他の可能な方法は、当業者に明白であり、かつイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー、沈降平衡法等を含んでいて差し支えない。
【００６２】
あるいは、切断セルラーゼは、組換え的に作成しても差し支えない。この態様において、完全長セルラーゼの触媒活性部分のコード領域のみを含むＤＮＡ 配列を調製する。好ましい実施形態において、触媒活性ドメインの２３０ または２３３ アミノ酸をコードするＤＮＡ を調製する。そのＤＮＡ 配列は、合成手段によって、または完全長コード配列の制限酵素消化によって、調製することができる。もし制限酵素を用いる場合は、その酵素に依存して、１ 本鎖ＤＮＡ が突き出た（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ） 末端を平滑末端にすることが必要であろう。そのような平滑末端化は、他方の突き出していない鎖を埋めることによって、または突き出した鎖を切断することによって達成できる。それら両方法の技術は、当業者に周知である。また、終止コドンを所望のコード領域の後に加えなければならないことを等業者は知っているであろう。コード領域の３ ’末端に終止コドンを加える技術は周知であり、かつ例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｏｒ Ｓａｍｂｒｏｏｋ において見ることができる。
【００６３】
ＤＮＡ 配列の合成は、当業界において周知であり、かつ例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ． ２２（２０）： １８５９−１８６２ （１９８１）　において見ることができ、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ６１５９−６１６８ （１９８４） 等に記載のように自動合成装置を用いて実施できる。またＤＮＡ 配列は、例えばＰｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） のような熟練者に知られている種々の商業的供給源から、注文作成することができる。ＤＮＡ 配列の精製は、必要な場合には、通常、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｒｅｇｎｉｅｒ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍ． ２５５： １３７−１４９ （１９８３） に記載のように、天然 （ｎａｔｉｖｅ） アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣ によって実施する。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５： ４９９−５６０ （１９８０） に記載の化学的分解法を用いて確認できる。
【００６４】
別の方法において、完全長セルラーゼ遺伝子のコード領域をそのまま維持しながら所望の切断点に終止コドンを挿入することが好ましいであろう。例えばポリペプチドを切断し得る終止コドンを挿入するために、所定の核酸配列に変異をもたらす多くの方法がある。そのような周知の方法として、特定部位の突然変異誘発、縮退オリゴヌクレオチド（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ） を用いたＰＣＲ 増幅、変性剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作成するために連結および／またはクローニングと併せて）ならびに他の周知技術が挙げられる。Ｇｉｌｉｍａｎ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｇｅｎｅ ８： ８１−９７ （１９７９） ；Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ７３１−７３４ （１９８７） ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ を参照。
【００６５】
本発明は、切断セルラーゼに加えて、完全長および切断セルラーゼの他の誘導体を含む。そのような誘導体は、例えばアミノ酸置換、非天然アミノ酸による置換、Ｄ −アミノ酸による置換または付加、ならびに別の基との結合を含む。終止コドンの挿入のために上述した方法に類似の方法で実施し得るアミノ酸置換を除いて、非天然アミノ酸による置換および他の基との結合は化学的に行うべきである。タンパク質の化学的修飾技術は、当業界で周知であり、かつ例えばＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ， ＰＥＰＴＩＤＥＳ， ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， （ｅｄ．）， Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．２６７ （１９８３） において見ることができる。
【００６６】
本発明のセルラーゼの同定
本発明は、図１ に記載のアミノ酸配列（ 配列番号１） 、その断片、または５０％ 以上の配列同一性、好ましくは７０％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体であるセルラーゼを含む。同様に、本発明は、さらに、図２ に記載のＤＮＡ（ 配列番号２） 、その断片、または７６％ 以上の配列同一性、好ましくは８０％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００６７】
本発明は、完全長セルラーゼに加えて、完全長セルラーゼの切断形態を提供する。好ましくは、切断セルラーゼは、配列番号１ のアミノ酸位置３１ からアミノ酸位置２６１ または２６４ によって表されるアミノ酸配列を有し、あるいは５０％ 以上の配列同一性、好ましくは７０％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有するそのような配列の誘導体である。同様に、本発明はさらに、切断セルラーゼまたはその誘導体をコードするＤＮＡ であって、図２ に示すＤＮＡ 配列（ 配列番号２） または７６％ 以上の配列同一性、好ましくは８０％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは９０％ 以上の配列同一性を有するその誘導体に対応するＤＮＡ を含む。好ましくは、そのＤＮＡ 配列は、配列番号２ の位置９３ で開始し、かつ位置７８３ または７９２ まで包括的に伸長するヌクレオチドを含む。
【００６８】
好ましい実施形態において、所定のＤＮＡ 断片または遺伝子が、この中に記載のセルラーゼＤＮＡ 配列に相当するか否か、および従って本発明の範囲内であるか否かを分析するために、ハイブリダイゼーション法を用いる。ハイブリダイゼーション法は、本質的に以下の通りである：例えばＥｃｏＲ Ｉ 、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、Ｂａｍ ＨＩ 、Ｃｌａ Ｉ 、Ｋｐｎ Ｉ 、Ｍｌｕ Ｉ 、Ｓｐｅ Ｉ 、Ｂｇｌ ＩＩ 、Ｎｃｏ Ｉ 、Ｘｂａ Ｉ 、Ｘｈｏ Ｉ 、およびＸｍａ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ ａｎｄ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ から購入）等の適切な制限酵素を用いて、その取扱い説明書に従って消化することによって、特定の標的供給源由来のゲノムＤＮＡ を断片化する。次に、サイズによるＤＮＡ 断片の分離を可視化し得るように、アガロースゲル（ 例えば０．８％ アガロース） を用いた電気泳動で試料を流した。通常、臭化エチジウム染色によってＤＮＡ 断片を可視化する。ゲルを蒸留水で軽く洗浄し、さらに続いて適切な溶液（例えば０．２５Ｍ ＨＣｌ のような）中において穏やかに振とうして脱プリン化し、その後（例えば０．４Ｍ ＮａＯＨ 中において）３０ 分間、穏やかに振とうして変性させる。ゲルを１．５Ｍ ＮａＣｌ 、１Ｍ Ｔｒｉｓ 、ｐＨ７．０ の溶液中に入れて３０ 分間穏やかに振とうする再生処理が含まれるであろう。次に、トランスファー溶液（例えば６ｘ ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ， ９０ｍＭ　クエン酸３ ナトリウム） ）を用いて、例えば最強ニトランプラス膜（Ｍａｘｍｕｍ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｋｅｅｎｅ， Ｎ．Ｈ．） のような適切な正荷電膜上にＤＮＡ を転写させる。転写が完了するとすぐに（通常約２ 時間後）、例えば２ｘ ＳＳＣ（２ｘ ＳＳＣ＝３００ｍＭ ＮａＣｌ， ３０ｍＭ クエン酸３ ナトリウム） 中で膜を洗浄し、さらに室温で風乾させる。次に、適切なプレハイブリダイゼーション溶液（例えば１００ｍＬ　当たりホルムアミド２０−５０ｍＬ 、２０ｘ ＳＳＰＥ（１ｘ ＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．７） ２５ｍＬ 、２０％ＳＤＳ ２．５ｍＬ 、および１０ｍｇ／ｍｌ の剪断したニシン精子ＤＮＡ １ｍＬ を含有する水溶液）中において、その膜上でプレハイブリッド形成させる（約２ 時間以上）。当業者に公知であるように、プレハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの量は、日常的な方法に従って得られる反応の性質に基づき変化し得る。従って、より少ない量のホルムアミドを用いると、ハイブリッド形成した分子を同定する点において、より多くの量のホルムアミドを用いた同じ方法よりもより完全なハイブリダイゼーションを達成することができる。一方、より多くのホルムアミドを用いると、強いハイブリダイゼーションバンドを視覚によってより容易に同定できる。
【００６９】
図２ の配列から選択した通常１００ から１０００ 塩基の範囲の長さのＤＮＡ プローブは、アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、そのゲルから断片を切り出し、さらに切り出したアガロースから回収しなければならない。さらに詳細な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ を参照。次に、そのＤＮＡ の精製断片を標識し（例えば、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ を用いて、その取扱い説明に従って）、３２Ｐ をＤＮＡ に取り込ませる。９５ ℃で５ 分間加熱することによって標識プローブを変性させ、その後すぐに膜の入ったプレハイブリダイゼーション溶液に添加する。ハイブリダイゼーション反応は、例えば３７ ℃で１８ 時間穏やかに振とうしまたは回転させる等、適切な条件下において、適切な時間進めなければならない。膜をすすぎ（例えば２ｘ ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳ 中において）、さらに適切な洗浄液中において穏やかに攪拌して洗浄する。所望の厳格性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ） は、膜（フィルター）を洗浄する条件を反映するであろう。
【００７０】
具体的には、所定の反応の厳格性（すなわちハイブリダイゼーションの成功のために必要な相同性の割合）は、ハイブリダイゼーション後におけるフィルターの洗浄条件に依存するであろう。この中で定義されている「低い厳格性」条件は、２０ ℃で１５ 分間、０．２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ を用いてフィルターを洗浄することを含む。「高い厳格性」条件は、二回目に３７ ℃で３０ 分間、０．２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ を用いてフィルターを洗浄することを含む更なる洗浄処理を含む。
【００７１】
洗浄後、膜を乾燥させ、さらに結合したプローブを検出する。標識試薬として３２Ｐ または別の放射性同位体を用いる場合は、オートラジオグラフィーによって結合したプローブを検出できる。他のプローブの可視化のための他の技術は、当業者に周知である。結合したプローブの検出は、核酸配列が所望の相同性を有し、および従って配列番号２ に対する同一性を有し、さらには本発明の範囲に含まれることを示唆する。
【００７２】
本発明のセルラーゼタンパク質および誘導体は、物理化学的または機能的の何れか、ならびに好ましくは両方について特徴付けできる。物理化学的特徴付けは：タンパク質の分子量を特定するためのＳＤＳ 電気泳動、ゲル濾過、アミノ酸組成分析、質量分析、および沈降；タンパク質のｐＩ （等電点）を特定するための等電点電気泳動；タンパク質のアミノ酸配列を特定するためのアミノ酸配列決定；タンパク質の三次構造を特定するための結晶解析；ならびにタンパク質に存在する抗原エピトープを特定するための抗体結合：のような当業界における周知技術を駆使して行う。
【００７３】
機能的特徴付けは、セルラーゼの分野の熟練者に周知の技術によって特定され、結晶性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） の加水分解を含むが、それに限定はされない。機能的特徴付けのためのその好ましい技術は、後述の実施例５ においてさらに詳細に記載している。
【００７４】
上に挙げた技術のいくつかを用いて、本発明の完全長セルラーゼが、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ で測定すると、分子量約３０ から４０ ｋＤ であり、好ましくは３４ ｋＤ から約３８ｋＤ であり、さらに最も好ましくは３６ ｋＤ であることを見出した。完全長セルラーゼは、計算された等電点が約４ から約５ であり、好ましくは４．５ であり、かつＣＭＣ でのｐＨ 最適条件が温度に依存して約５ から約１０ であることを見出した。ｐＨ 最適条件は、４０ ℃では８ であり、かつ６０ ℃では７ であることを見出した。本発明の切断セルラーゼは、分子量が２０ から３０ｋＤ の範囲であり、好ましくは約２３ から２６ｋＤ の範囲であり、さらに最も好ましくは２４ から２５ｋＤ の範囲であることを見出した。
【００７５】
本発明のセルラーゼの使用
本発明に基づく織物の加工は、本発明のセルラーゼを含む組成物を用いた織物処理または洗濯を含む。そのような加工として：ストーンウォッシュ；セルロース含有織物の織目、感触および／または外観の改善；またはセルロース含有織物の製造または洗濯／再生の間に用いられる他の技術：が挙げられるが、それらに限定はされない。従って、本発明の背景にある加工とは、セルロース製の織物または繊維から、「未熟な（ｉｍｍａｔｕｒｅ） 」または「だめになった（ｄｅａｄ） 」綿を除去することを意味する。未熟な綿は、成熟した綿よりも顕著にまとまりが無く、例えば染色むらのせいで生じる。さらに、本発明は、染みがついたセルロース含有織物製品を洗濯するのに用いるセルラーゼ成分を含む組成物を考えている。例えば、本発明のセルラーゼは、洗濯用の洗剤組成物において用いることができる。本発明に基いて有用である洗剤組成物は、前洗い用洗剤、浸置き用洗剤、および家庭で用いる色再生用組成物のような調製品を含む。この中に記載されているような加工用組成物は、希釈を必要とする濃縮した形態、あるいは希釈液の形態またはセルロース含有織物に直接用いることができる形態であって差し支えない。セルラーゼの織物加工のための一般的な加工技術は、例えば欧州特許出願公開第２２００１６ 号、ならびに英国特許出願第１，３６８，５９９ 号および台２，０９５，２７５ 号に記載されている。
【００７６】
本発明に基づくセルロース製物質の加工は、さらに、当業界で公知である目的のために、動物飼料、パルプおよび／または紙、食物、および穀物を加工することを含む。例えば、セルラーゼは、動物飼料の価値を高め、木材パルプの乾燥性を改善し、食品を強化し、さらに穀物の湿式製粉工程または乾式製粉工程の間に穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００７７】
本発明に基づく加工は、効果量のセルラーゼ、またはセルラーゼと例えば緩衝剤、界面活性剤、および／または精練剤等の他の最適成分との組合せを含有する水溶液を調製することを含む。セルラーゼ酵素組成物の効果量は、その意図する目的のために十分なセルラーゼの濃度である。従って、例えば、本発明に基づくストーンウォッシュ用の組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば縫い目およびはぎ布に着古したおよび色あせた外観をもたらすため等に所望の効果を提供するような量である。同様に、セルラーゼ含有織物の感触および／または外観を改善することを意図する組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば織物の滑らかさを改善するような感触における適度の改善、または例えば織物の外観における鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維を除去するような外観における適度の改善をもたらす量である。また、用いるセルラーゼの量は、用いる装置、用いる工程のパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液に曝す時間等）、ならびにセルラーゼ活性（例えばより活性が低いセルラーゼ組成物と比較して、より活性が高いセルラーゼ組成物を用いた場合には、より低いセルラーゼ濃度が要求されるであろう）に依存する。加工すべき織物を加える加工用水溶液中の正確なセルラーゼ濃度は、上記因子ならびに所望の結果に基づき、当業者熟練者が容易に特定できる。ストーンウォッシュの工程において、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約０．５ から５，０００ｐｐｍ 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約１０ から２００ｐｐｍ 全タンパク質の濃度で存在することが好ましい。セルラーゼ含有織物の感触および／または外観の改善のための組成物では、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約０．１ から２，０００ｐｐｍ 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約０．５ から２００ｐｐｍ 全タンパク質の濃度で存在することが望ましい。
【００７８】
加工の好ましい実施形態において、緩衝液の濃度が、用いるセルラーゼが活性を示す範囲内に溶液のｐＨ を維持するのに十分であるように、加工用組成物において緩衝液を用いる。セルラーゼが活性を示すｐＨ は、用いるセルラーゼの特性に依存する。用いる緩衝液の正確な濃度は、熟練者が容易に考慮し得るいくつかの因子に依存するであろう。例えば、好ましい実施形態において、緩衝液ならびに緩衝液の濃度は、最終セルラーゼ溶液のｐＨ を最適セルラーゼ活性に必要なｐＨ 範囲内に維持するように選択する。本発明のセルラーゼの最適ｐＨ 範囲の特定は、周知技術に基づいて確かめることができる。
【００７９】
セルラーゼおよび緩衝液に加えて、加工用組成物は、必要に応じて界面活性剤を含んでいて差し支えない。適切な界面活性剤として、例えば陰イオン性、非イオン性、および両性界面活性剤等の、用いるセルラーゼおよび織物と相性の良い任意の界面活性剤が挙げられる。適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝のアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられるが、それらに限定はされない。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムイオンのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；ならびに炭素数２ または３ のアルカノール基を１ から３ つ有するアルカノールアミン：が挙げられるが、それらに限定はされない。両性界面活性剤として、例えばスルホン酸第４ 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。当業者に公知の方法において、界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。
【００８０】
この中に記載の方法での使用のために濃縮セルラーゼ組成物を調製しても差し支えない。そのような濃縮物は、好ましくは水溶液中に、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、緩衝剤、および界面活性剤を含有する。そのように形成した場合、各成分の必要濃度を有するセルラーゼ調製液を迅速かつ正確に調製するために、セルラーゼ濃縮物を水で容易に希釈することができる。濃縮水溶液を形成した場合、上記のように、セルラーゼ溶液中の成分が必要濃度になるようにそれら濃縮液を希釈することができる。そのようなセルラーゼ濃縮物が、セルラーゼ溶液の容易な調製を可能とし、かつ用いる場所にその組成物を便利に運ぶことを可能とすることは容易に理解できる。加工用濃縮物は、例えば液体、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、当業者に周知である。
【００８１】
固形のセルラーゼ濃縮物を用いる場合、そのセルラーゼ組成物は、顆粒、粉末、塊、または固い円盤状の形態（ｓｏｌｉｄ ｄｉｓｋ） であって差し支えない。顆粒は、洗浄液（ｗａｓｈ ｍｅｄｉｕｍ） への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第５，２５４，２８３ 号に開示されている。
【００８２】
また、要望通りに、組成物の最終的な用途に基づいて石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、および再付着防止剤（ａｎｔｉ−ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ） 等の他の物質を本発明のセルラーゼ組成物と共に用いてもよく、あるいはその組成物中に含めても差し支えない。
【００８３】
実施例によって、ストーンウォッシュの方法が詳細に記載されているが、記載のパラメーターは、他の用途、すなわち織物の感触および／外観の改善のため等のために当業者が容易に変更できる。加工用組成物をストーンウォッシュ組成物と混ぜ、さらにセルラーゼ酵素を織物に接近させることによって、セルロース含有織物を効果量のセルラーゼを含有するセルラーゼ含有ストーンウォッシュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼを含む水溶液と織物をかき混ぜる。加工用組成物が水溶液である場合は、繊維を直接その溶液中に浸すことができる。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮物である場合は、セルロース含有織物の入った浴槽でその濃縮物を希釈する。ストーンウォッシュ組成物が例えば前洗い用ゲルまたは固形棒のような固形である場合は、その組成物を直接織物または洗浄液に加えることによって、そのストーンウォッシュ組成物を接触させることができる。
【００８４】
その酵素作用によってセルロース含有織物にストーンウォッシュした外観を与えるのに効果的な条件下において、セルロース含有織物をストーンウォッシュ組成物と共にインキュベートする。例えば、ストーンウォッシュの間、ｐＨ 、液体比、温度および反応時間は、ストーンショッシュ組成物が作用する条件を最適化するように調整することができる。「効果的な条件」とは、必然的に、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反応できるような、すなわちこの場合にはストーンウォッシュ効果が得られるようなｐＨ 、液体比、および温度を称する。本発明に基づくストーンウォッシュ組成物を用いるための条件を最適化することは、慣用技術の範囲内である。
【００８５】
この中で用いられるストーンウォッシュにおける液体比、すなわち織物の重量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の比は、通常、デニムの織物において所望のストーンウォッシュ効果を得るのに十分な量であり、用いる工程に依存する。好ましくは、液体比は：約４ ：１ から約５０ ：１ であり；より好ましくは約５ ：１ から約２０ ：１ であり；さらに最も好ましくは約１０ ：１ から約１５ ：１ である。
【００８６】
本ストーンウォッシュ組成物を用いたストーンウォッシュの間の反応温度は、２ つの競合する因子によって制御される。第一に、高い温度は通常、反応速度を高め、すなわち反応を速くし、より低い温度で必要とされる反応時間よりも反応時間を短くする。従って、反応温度は通常、約１０ ℃以上である。第二に、セルラーゼは、所定の反応温度を超えると活性を失うタンパク質であり、その温度は用いるセルラーゼの特性に依存する。従って、反応温度を過度に高くすると、セルラーゼ変性の結果としてセルロース分解活性を失う。セルラーゼ使用のための標準温度は通常、３５ ℃から６５ ℃であり、かつそれら条件は本発明のセルラーゼにも適していると予想するが、周知技術に基づいて、用いる特定のセルラーゼに関して最適温度条件を確かめるべきであろう。
【００８７】
反応時間は、ストーンウォッシュを行う特定の条件に依存する。例えば、ｐＨ 、温度、およびセルラーゼの濃度は、何れも最適反応時間に影響を及ぼすであろう。通常、反応時間は、約５ 分から約５ 時間であり、好ましくは約１０ 分から約３ 時間であり、さらに好ましくは約２０ 分から約１ 時間である。
【００８８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼを洗剤組成物中において用いることができる。本発明に基づく洗剤組成物は、前洗い用組成物、浸置き用組成物として、または通常の洗浄またはすすぎサイクルによる洗濯のために有用である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果量のセルラーゼ、および界面活性剤を含み、さらに必要に応じて、下記の他の成分を含む。
【００８９】
本発明の洗剤組成物中において用いるセルラーゼの効果量は、例えば毛玉除去、柔軟化、毛玉防止、表面繊維除去、灰色化の防止（ａｎｔｉ−ｇｒａｙｉｎｇ） 、および洗浄のような、セルラーゼによるセルロース含有織物に対する所望の効果をもたらすのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセルラーゼは、洗剤の約１０ｐｐｍ から約２０，０００ｐｐｍ の濃度で使用する。
【００９０】
洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の濃度は、好ましくは、洗浄液への希釈に基づき、セルラーゼ酵素の濃度が約０．０１ から約１，０００ｐｐｍ 全タンパク質の範囲、好ましくは約０．０２ｐｐｍ から約５００ｐｐｍ 全タンパク質の範囲、さらに最も好ましくは約０．５ｐｐｍ から約２５０ｐｐｍ 全タンパク質になるように選択する。洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の量は、洗浄溶液を形成するために水に添加してその洗剤を希釈する程度に依存するであろう。
【００９１】
本発明の洗剤組成物は、例えば、液体、顆粒、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、熟練者に周知である。固形洗剤組成物を用いる場合、好ましくは顆粒としてセルラーゼを形成する。好ましくは、セルラーゼ保護剤を付加的に含むように顆粒を形成することができる。洗浄液への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように顆粒を形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第５，２５４，２８３ 号に開示されている。
【００９２】
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤、すなわち洗剤組成物での使用が周知である陰イオン性、および両性界面活性剤等の界面活性剤を用いる。
【００９３】
本発明の洗剤組成物において用いるための適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝アルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられる。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウム；ならびに炭素数２ または３ のアルカノール基を１ から３ つ有するアルカノールアミン：が挙げられる。両性界面活性剤として、スルホン酸第４ 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステル等を含む。そのような界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。界面活性剤または界面活性剤の混合物は、本発明の洗剤組成物において通常、全洗剤組成物の約１ 重量％ から約９５ 重量％ 、好ましくは全洗剤組成物の約５ 重量％ から約４５ 重量％ の量で使用する。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物は、必要に応じて、１ つ以上の以下の成分を含んでいて差し支えない。
【００９４】
セルラーゼ以外の加水分解酵素
適切な加水分解酵素として、エステル結合に作用する、カルボン酸エステル加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸モノエステル加水分解酵素、およびリン酸ジエステル加水分解酵素；グリコシル化合物に作用するグリコシド加水分解酵素；Ｎ −グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用するチオエーテル加水分解酵素；ならびにペプチド結合に作用するアミノ−アシル−ペプチド加水分解酵素、ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素、アシル−アミノ酸加水分解酵素、ジペプチド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素が挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボン酸エステル加水分解酵素、グリコシド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素である。適切な加水分解酵素として、（１ ）ペプシン、ペプシンＢ 、レンニン、トリプシン、キモトリプシンＡ 、キモトリプシンＢ 、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンＣ 、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼ（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ａ 、コラゲナーゼ、クロストリジウムペプチダーゼ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｐｅｔｉｄａｓｅ）Ｂ 、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンＤ． 、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンＣ 、ペプシンＣ 、アスペルギルスペプチダーゼＢ 、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ およびＢ 、ならびにアミノペプチダーゼのようなペプチジル−ペプチド加水分解酵素に属するプロテアーゼ；（２ ）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、転換酵素、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナーゼのようなグリコシド加水分解酵素（本質的な構成要素であるセルラーゼはこのグループから除かれる）が挙げられる。それらの中でα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼが好ましい。それら酵素は、酸性から中性の系で機能するが、細菌から得られた酵素は、アルカリ系で高い活性を示す；（３ ）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボン酸エステル加水分解酵素。それらの中でリパーゼが特に効果的である。
【００９５】
セルラーゼ以外の加水分解酵素は、その目的に従って要求される量だけ洗剤組成物中に加える。好ましくは、精製タンパク質に関して、０．００１ から５ 重量％ 、さらにより好ましくは０．０２ から３ 重量％ の量で加えるべきである。本酵素は、単独で、あるいは洗剤組成物中の他の成分と組み合わせて、精製していない酵素から成る顆粒の形態で用いるべきである。精製していない酵素の顆粒は、その顆粒中の精製酵素が０．００１ から５０ 重量％ となるような量で用いる。その顆粒は、０．００２ から２０ 重量％ 、好ましくは０．１ から１０ 重量％ の量で用いる。セルラーゼを用いる場合と同様に、それら顆粒は、酵素保護剤および溶解遅延物質（ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ） を含むように形成して差し支えない。
【００９６】
陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩
そのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩として、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエステルカルボン酸塩、３ から４ つのアルキル置換基および１ つまでのフェニル置換アルキル置換基を有するものを含むα−第４ 級アンモニウム塩が挙げられる。適切な陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、英国特許出願第２ ０９４ ８２６ Ａ 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。組成物は、約１ から２０ 重量％ のそのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を含んでいて差し支えない。
【００９７】
ビルダー
Ａ．２価の金属イオン封鎖剤
組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、アミノ酸塩、アミノポリアセテート高分子電解質、非解離性高分子、ジカルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩：のアルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩より成る群から選択した１ つ以上のビルダー成分を約０ から約５０ 重量％ の量で含んでいて差し支えない。適切な２ 価の金属イオン封鎖剤は、英国特許出願第２ ０９４ ８２６ Ａ 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【００９８】
Ｂ．アルカリまたは無機電解質
組成物は、アルカリまたは無機電解質として、１ つ以上の以下の化合物：ケイ酸塩、カルボン酸塩、ならびにトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミンおよびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリ：のアルカリ金属塩をその組成物の約１ から約５０ 重量％ 、好ましくは約５ から約３０ 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【００９９】
再付着防止剤
組成物は、再付着防止剤として、１ つ以上の以下の化合物：ポリチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセルロース：を約０．１ から約５ 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【０１００】
それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび／またはポリエチレングリコールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提供する。
【０１０１】
漂白剤
モノ過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム／過酸化水素付加物のような漂白剤または／およびスルホン化フタロシアニンの亜鉛もしくはアルミニウム塩のような光感受性の漂白色素と組み合わせた本発明のセルラーゼの使用は、洗浄効果をさらに改善する。同様に、欧州特許第６８４ ３０４ 号に記載の漂白剤および漂白触媒を用いることができる。
【０１０２】
青味剤および蛍光色素
もし必要であれば、種々の青味剤および蛍光色素を組成物中に加えても差し支えない。適切な青味剤および蛍光色素は、英国特許出願第２ １９４ ８２６ Ａ に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【０１０３】
粘結阻害剤（ｃａｋｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）
以下の粘結阻害剤：ｐ −トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく粉砕したシリカ、アモルファスシリカ、粘土、ケイ酸カルシウム（Ｍｉｃｒｏ−Ｃｅｌｌ ｏｆ Ｊｏｈｎｓ Ｍａｎｖｉｌｌｅ Ｃｏ． のような）、カルボン酸カルシウム、およびマグネシウムオキシド：を粉末洗剤に加えて差し支えない。
【０１０４】
酸化防止剤
酸化防止剤として、例えばｔｅｒｔ −ブチル−ヒドロキシトルエン、４，４ ’−ブチリデンビス（６ −ｔｅｒｔ −ブチル−３ −メチルフェノール） 、２，２ ’−ブチリデンビス（６ −ｔｅｒｔ −ブチル−４ −メチルフェノール） 、モノスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール、および１，１ −ビス（４ −ヒドロキシ−フェニル） シクロヘキサンが挙げられる。
【０１０５】
可溶化剤
可溶化剤として、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ −トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼン−スルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素が挙げられる。
【０１０６】
本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性にわたる広いｐＨ 範囲で用いることができる。好ましい実施形態において、本発明の洗剤組成物は、約５ から約１２ 以下の範囲のｐＨ を有するわずかに酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤の洗浄液中で用いることができる。
【０１０７】
もし望むのであれば、上記成分の他に、香料、緩衝剤、防腐剤、色素等を本発明の洗剤組成物と共に用いることができる。そのような成分は、等業界で用いられている量で普通に用いる。
【０１０８】
本発明において用いる洗剤基材（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｂａｓｅ） が粉末の形態である場合、スプレー−乾燥法および造粒法等の任意の公知の調製法によって調製される基材であって差し支えない。特に、スプレー−乾燥法、凝集法、乾燥混合法、または非タワールート （ｎｏｎ−ｔｏｗｅｒ ｒｏｕｔｅ） 法によって得られる洗剤基材が好ましい。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、調製条件に関して限定されない。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、界面活性剤およびビルダーのような熱耐性成分の懸濁水溶液を熱い空間にスプレーすることによって得られる中空顆粒（ｈｏｌｌｏｗ ｇｒａｎｕｌｅｓ） である。スプレー−乾燥の後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリビルダーを加えて差し支えない。スプレー−乾燥−造粒または凝集法によって得られた非常に濃厚な顆粒状の洗剤基材と共に、種々の成分をその基材の調製後に加えても差し支えない。
【０１０９】
洗剤基材が液体である場合は、その液体は、均一溶液または不均一な分散液のいずれであっても差し支えない。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐために、組成物中に加える前に、カルボキシメチルセルロースを造粒し、または被覆するのが望ましい。
【０１１０】
工業的および家庭用の用途において、それらの環境で普通用いられている温度、反応時間、および液体比で、例えば汚れた織物のようなセルロース含有織物と共に本発明の洗剤組成物をインキュベートすることができる。
【０１１１】
さらに、本発明に基づく洗剤は、柔軟化、毛玉除去、毛玉防止、表面繊維除去、または洗浄に所望の改善をもたらすのに十分な活性が存在するような中間的ｐＨ の適切な溶液中における前洗い用洗剤として調製しても差し支えない。洗剤組成物が、液体、スプレー、ゲル、またはペースト状である浸置き用（ 例えば前洗い用または前処理用） 組成物である場合、セルラーゼ酵素は、通常、浸置き用または前処理用組成物の全重量の約０．０００１ から約１ 重量％ の範囲で用いる。そのような組成物中において、必要に応じて界面活性剤を用いて差し支えなく、用いる場合は、通常、浸置き用組成物の全重量の約０．００５ から約２０ 重量％ の範囲の濃度で含む。組成物の残りは、浸置き用洗剤において普通用いられている成分、すなわち希釈剤、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等をそれらの普通の濃度で含有する。
【０１１２】
この中に記載のセルラーゼ酵素を含有する組成物は、色あせた織物の色の再生（例えば、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第４，７３８，６８２ 号を参照）に適した単独の組成物として家庭用に使用でき、ならびに染み抜きおよび毛玉除去や毛玉防止のために使用することができる。
【０１１３】
本発明に基づくセルラーゼの使用は、特に、飼料添加物ならびにパルプおよび紙の加工において有用である。それら付加的な産業上の利用は、それぞれ、例えば国際特許出願公開第９５／１６３６０ およびフィンランド特許第８７３７２ 号に記載されている。
【０１１４】
さらに本発明およびその利点を説明するために、以下の特定の実施例を示すが、
本発明を例示するために提示するものであり、何ら本発明の範囲を限定するものとみなしてはならないことを理解すべきである。
【０１１５】
実施例
実施例１
アルカリ性土壌および水の試料からのセルラーゼ産生微生物の単離
アルカリ性泥の試料を４％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ， １％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＣＯ３ 液５ｍＬ 中に懸濁させ、さらに力強く振る。同じ溶液での連続希釈液を５０ μｇ／ｍＬ リファンピシン含有土壌抽出寒天（ｐＨ１０） 上にのせた。
【０１１６】
土壌抽出寒天は、以下のように調製した：庭の土壌１Ｋｇ を脱塩水１Ｌ 中に懸濁させた。その懸濁液を１ ２０ ℃で２０ 分間オートクレーブ処理した。その懸濁液をガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ， ＧＦ／Ａ） で濾過し、さらに残った固形物を脱塩水で２ 回洗浄した（１ｘ２００ｍＬ， １ｘ１００ｍＬ） 。濾液を水で１Ｌ に合わせる。固化のために２％（ｗ／ｖ） 寒天を添加した８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ， ２％（ｗ／ｖ）ＮａＣＯ３ の滅菌溶液と等容量の滅菌濾液を混合した。
【０１１７】
蒸発を避けるために密閉箱において３０ ℃で数週間プレートをインキュベートした。プレートを実体顕微鏡で定期的に観察し、さらに微小コロニーを０．３％（ｗ／ｖ） カルボキシメチルセルロース含有アルカリ性寒天に移した。セルラーゼ活性を検出するために二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ） で培養菌を用いた。プレートを二重で０．１％（ｗ／ｖ） コンゴレッドに１５ 分間浸し、さらに１Ｍ ＮａＣｌ で３０ 分間染みを除く。コロニーの周りの除去地帯（ｃｌｅａｎｉｎｇ ｚｏｎｅ） を表す細胞株を可能性のあるセルラーゼ産生微生物として選択した。
【０１１８】
国際特許出願公開第ＷＯ９６／３４１０８ 号に記載のように、除去地帯を示す菌株を２５ ｍＬ 中で発酵させ、その後ＣＭＣ を添加した。
【０１１９】
上記の方法を用いて、本発明に基づくセルラーゼを産生した菌株を単離し、さらに糸状菌として特徴づけした。外観および部分的な１６ｓ ｒＲＮＡ 遺伝子配列分析（ 実施例４） に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２０】
セルラーゼ産生菌株の形態学的検査を行った。ＰＨ１０ の土壌抽出寒天上で培養した場合、最初の小さな丸いキラキラ光る透明なコロニーが数日後には白から灰−白色の気性菌糸体（ａｅｒｉａｌ ｍｙｃｅｌｉｕｍ） に発達する。アルカリ性寒天上では、その菌株は、成熟すると気性菌糸体を産生する乾燥して固いクリーム色の不透明なコロニーを形成する。顕微鏡下において、その菌株は、不規則な長さに寸断し、芽胞、および鎖内の芽胞を孤立させているような広範囲に分枝した偽似菌糸体を表す。
【０１２１】
実施例２
ＤＮＡの単離、セルラーゼの形質転換および発現
実施例１ に基づき単離した好アルカリ性放線菌をＥ． ｃｏｌｉ． での発現クローニングのための供与菌株として選択した。Ｓａｉｔｏ ＆ Ｍｉｕｒａ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， ７２： ６１９−６２９ （１９６３） に記載の方法に基づき、染色体ＤＮＡ を単離した。
【０１２２】
単離した染色体ＤＮＡ は、供給業者推薦の条件下において、制限酵素Ｓａｕ３Ａ の連続希釈した酵素溶液を用いて、反応緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．， ＵＳＡ） 中、３７ ℃で１時間、部分的に消化した。消化したＤＮＡ をアガロースゲル電気泳動によって分画し、さらに供給業者（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ＵＳＡ） 記載のプロトコールに基づきＱＩＡｑｕｉｃｋ　ゲル抽出キットを用いて、適切な断片（２ −６ｋｂ） をゲルから単離した。
【０１２３】
アルカリ耐性放線菌株のゲノム遺伝子ライブラリーをｐＵＣ１９ 派生プラスミド中に構築した（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３３： １０３ （１９８５）） 。Ｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ．， １６０： ５９−７４ （１９８８）２ 記載のように、寒天ゲル拡散法によって組換えクローンをスクリーニングした。コロニーの周りの除去地帯を示した菌株を単離した。供給業者（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ） 記載のプロトコールに基づき、ＱＩＡｐｒｅｐ プラスミドキットを用いて、セルラーゼ産生組換え体のプラスミドＤＮＡ を単離した。公知の保存セルラーゼ配列に対するその配列の類似性が公開データベースでのＦＡＳＴＡ 調査によって特定されるまで、両方の末端から３．５ｋｂ 断片のヌクレオチド配列を特定した。保存配列の特定に基づき、遺伝子の残りの配列を決定した。
【０１２４】
単離した遺伝子は、２７ アミノ酸のシグナル配列を含む３７１ アミノ酸を有する前駆タンパク質をコードする１１７３ 塩基対を包含する。成熟タンパク質は、推測分子量が３５，７６６ であり、かつ計算したＰＩ が５．９ の３４４ アミノ酸を包含する。セルラーゼをコードするその遺伝子のヌクレオチド配列（ 配列番号１） 、および成熟セルラーゼの推測アミノ酸配列（ 配列番号２） を図１ および図２ に示す。
【０１２５】
上記のように調製した構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のＤＮＡ 断片をベクターｐＨＰＬＴ 中にクローン化した（ 図４ を参照） 。そのベクターは、バシラス・リケニホルミスの耐熱性アミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列をすでに含んでおり、さらにバシラス菌において高い発現をもたらすことが見出されている（図５ を参照）。コンピテントバシラス宿主細胞の形質転換を実施することによって、セルラーゼ産生組換えバシラスクローンを単離し、さらにクローン化セルラーゼの産生に適した条件下で培養した。
【０１２６】
近い類縁関係にある系統を特定するために、種々のライブラリーにおける利用可能な配列データ（ＧｅｎｅＢａｎｋ， Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ， ＥＭＢＬ ａｎｄ ＰＩＲ） と比較することによって、３６ｋＤ セルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を解析した。高い相同性が見出されたのは、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ） 由来のエンドグルカナーゼＩ 、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ） 由来のエキソセルロビオヒドロラーゼ、およびクロストリジウム・セルロボラン（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｂｏｒａｎｓ） 由来のエンドグルカナーゼＣ であった。Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８５： ２４４４−２４４８ （１９８８） に記載のＴＦＡＳＴＡ プログラムを用いると、約３６ｋＤ のセルラーゼは、　アスペルギルス・アキュレアタス由来のエンドグルカナーゼＩ に対して２４２ 残基が一致し、３５．１％ の配列が同一であり、セルロモナス・フィミ由来のエキソセルロビオヒドロラーゼに対して１１２ 残基が一致し、４８．２％ の配列が同一であり、さらにクロストリジウム・セルロボラン由来のエンドグルカナーゼに対して１１４ アミノ酸が一致し、４４．７％ の配列が同一であることが示された。ＴＦＡＳＴＡ データ探索プログラムは、配列解析ソフトウエアパッケージバージョン６（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０）（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖ． Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７０５） において商業的に利用できる。３６ｋＤ セルラーゼをコードするＤＮＡ 配列と公開データベースにおけるＤＮＡ 配列との比較によって、最も近い相同物は、ストレプトミセス・ロケイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｃｈｅｉ） 由来のｅｇｌＳ をコードする遺伝子（８２３ 塩基対が一致し、７５．８％ の同一性） およびストレプトミセス・リビダンス由来のｃｅｌＢ をコードする遺伝子（７６５ 塩基対が一致し、７４．９％ の同一性） であることが示唆された。
【０１２７】
実施例３
セルラーゼの精製
実施例２ によって得たセルラーゼ産生バシラス・リケニホルミスクローンは、３％ のトリプトン大豆培養液（Ｔｒｙｐｔｏｎ Ｓｏｙａ Ｂｒｏｔｈ）（Ｏｘｏｉｄ ＣＭ１２９） および２０ μｇ／ｍＬ ネオマイシンを含む複合培地中において培養した。組換えセルルラ−ゼの精製は、以下のように実施した：遠心（８０００ｒｐｍ） によって培養液から発酵培養液を分離する。硫酸アンモニウム（６５％ 飽和） を用いて上清中のセルラーゼを沈殿させる。伝導率が７ｍＳ／ｃｍ になるまでその沈殿物を５ｍＭ ＥＤＴＡ 含有２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７） に溶解させる。その溶液をＱ −セファロースＦＦ（ 直径５ｃｍ 、長さ１０ｃｍ） 陰イオン交換カラムに添加し、その後、吸光度が０．２ＡＵ になるまで５ｍＭ ＥＤＴＡ 含有２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７） でカラムを洗浄する。８０ 分間に０ から０．５Ｍ ＮａＣｌ（２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７） 中） の勾配をカラムに加え、その後１０ 分間に０．５ から１Ｍ ＮａＣｌ の勾配を加えた。最初の勾配で溶出され得る。溶出後、１Ｍ ＮａＯＨ でカラムを洗浄し（ 逆流させる） 、さらに５ｍＭ ＥＤＴＡ 含有２５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７） で再び平衡化させる。
【０１２８】
実施例４
セルラーゼ産生放線菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡの特徴付け
実施例１ で単離されたセルラーゼ産生生物の１６ｓ ｒＲＮＡ 配列の最初の４００ｂｐｓ
のヌクレオチド配列が得られ、かつ図６ に示されている（ 配列番号３） 。公開データベースにおける配列と比較するために、ＦＡＳＴＡ 配列解析ソフトウェアパッケージを用いてその配列を解析した。解析結果によって、最も近く類縁関係にあるのは４６５ 塩基対が一致し、９５．５％ の１６ｓ ｒＲＮＡ 同一性を有するストレプトミセス・サーモベロラシアウス（ｔｈｅｒｍｏｖｅｌｏｌａｃｅｏｕｓ） であることが示唆された。その菌株の部分的１６ｓ ｒＲＮＡ 断片の同一性の割合（％） は、その菌株が未知の種の放線菌を表すことを強く示唆する。得られた１６ｓ ｒＲＮＡ 配列（ 実施例１ における外観と合せて） の解析に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２９】
実施例５
本発明に基づくセルラーゼの特性
本発明の約３６ｋＤ のセルラーゼのｐＨ ／温度特性を特定するため、様々なｐＨ および温度において、ＣＭＣ 上でセルラーゼ活性を測定した。その測定法は、（全）セルラーゼ活性を特定するための比色分析法であり、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） を利用する。セルラーゼの検出は、セルラーゼによるセルロースからの還元糖の遊離に基づく。遊離した糖は、高いｐＨ および温度で「ＰＡＨＢＡＨ 」と反応する。その反応産物を分光光度計で測定した。活性は、グルコースの標準曲線を用いて特定した。
【０１３０】
薬品
−ＣＭＣ（ 低粘度）（Ｓｉｇｍａ Ｃ−５６７８， Ｂａｔｃｈ＃２３Ｈ０２４４）
−ｐ −ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ 「ＰＡＨＢＡＨ 」， Ｓｉｇｍａ Ｈ−９８８２）
−Ｄ −グルコース１ 水塩（Ｂｏｏｍ ８３４２）
−ＮａＨ２ＰＯ４＊１ａｑ（Ｍｅｒｃｋ ６３４６）
−Ｈ３ＰＯ４（８５％； Ｍｅｒｃｋ ５７３）
−クエン酸＊１ａｑ（Ｍｅｒｃｋ ２４４）
−４Ｎ ＮａＯＨ
−０．５Ｎ ＨＣｌ
インキュベーション緩衝液Ａ（０．０１Ｍ リン酸塩）
１．３８ ｇＮａＨ２ＰＯ４＊１ａｑ を８００ｍＬ の脱塩水（ｄｅｍｉ ｗａｔｅｒ） に溶解させた。４Ｎ ＮａＯＨ
でＰＨ を７ に調整し、さらにその混合物に脱塩水を加えて１０００ｍＬ とした。最終的にｐＨ をチェックし、必要ならば調整した。本緩衝液は、酵素試料を溶解し、かつ希釈するのに用いた。
【０１３１】
インキュベーション緩衝液Ｂ（０．１Ｍクエン酸＋０．１Ｍリン酸塩）
２３．０６ｇ Ｈ３ＰＯ４ を脱塩水に溶解させ、最終容積を２００ｍＬ（＝１Ｍ） にした。４２ｇ クエン酸を脱塩水に溶解させ、最終容積を２００ｍＬ（＝１Ｍ） にした。クエン酸溶液２０ｍＬ をリン酸溶液２０ｍＬ に加え、さらに脱塩水で１５０ｍＬ にした。４Ｎ ＮａＯＨ でｐＨ を調整し（４ から１０ の範囲） 、さらに脱塩水を加えて最終容積を２００ｍＬ にした。本緩衝液は、基質調製液を希釈するのに用いた。
【０１３２】
インキュベーション緩衝液Ｃ（０．０５Ｍクエン酸＋０．０５Ｍリン酸塩）
インキュベーション緩衝液Ｂ を脱塩水で１ ：１ に希釈した。ｐＨ をチェックして、必要ならば補正した。その溶液は、グルコース標準曲線を作成するのに用いた。
【０１３３】
基質調製液（１％）
強く攪拌しながら、１ｇ のＣＭＣ を脱塩水１００ｍＬ にゆっくり添加した。１ 時間以上激しく攪拌し続け、その後３０ 秒間ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ） で処理した。
【０１３４】
酵素溶液
酵素試料をインキュベーション緩衝液に溶解させ、さらに約０．０５Ｕ／ｍＬ の活性（ グルコース標準曲線で５０％） となるように希釈した。
【０１３５】
呈色試薬
５ｇ ＰＡＨＢＡＨ を５Ｎ ＨＣｌ ８０ ｍＬ に溶解させ、その後０．５Ｎ ＨＣ ｌでその溶液を１００ｍＬ にした。使用に先立ち、ＰＡＨＢＡＨ 溶液を０．５Ｎ ＮａＯＨ で１ ：４ に希釈した。
【０１３６】
標準曲線
ストック溶液＃１ ：１０００ｍｇ グルコースを脱塩水１００ｍＬ に溶解させた（１０ｍｇ／ｍＬ） 。
【０１３７】
ストック溶液＃２ ：ストック溶液＃１ ０．５ｍＬ を関心ｐＨ のインキュベーション緩衝液Ｃ ９．５ｍＬ で希釈した（０．５ｍｇ／ｍＬ） 。
【０１３８】
以下の滴定一覧表を用いた：
【表１】
2004500010.tif 000003
測定方法：
（１ ）　　　　グルコース標準品、対照、試料、およびブランク用の試験管を基質（１％）０．５ｍＬ および所望のｐＨ のインキュベーション緩衝液Ｂ ０．５ｍＬ で満たし、さらに所望の温度の浴槽中に置いた；
（２ ）　　　　その溶液を１０ 分間インキュベートした；
（３ ）　　　 １５ 秒間隔で、各ｐＨ のグルコース標準液、対照、または試料１００ｍＬ を基質の入った試験管に添加した；
（４ ）　　　　その溶液を３ 秒間ボルテックスし、さらに浴槽中に戻した；
（５ ）　　　　各試料を３０ 分間インキュベートした；
（６ ）　　　 ＰＡＨＢＡＨ 試薬３ｍＬ を添加することによって、酵素反応を止めた；
（７ ）　　　　得られた溶液を３ 秒間ボルテックスし、さらに浴槽の外のラックに置いた；
（８ ）　　　　全ての反応を止めると、試料１００ μＬ をブランクの試験管に加え、さらに３ 秒間ボルテックスした；
（９ ）　　　　試料を沸騰した水浴中に１５ 分間置いた；
（１０ ）　　　 得られた試料を５ から１０ 分間、冷やした水道水中で冷却し、さらに３ 秒間再度ボルテックスした；
（１１ ）　　　 水を対照として用いて、混合液の４１０ｎｍ での吸光度を測定した。
【０１３９】
結果を図３ に示す。図３ に示すように、３６ｋＤ セルラーゼのｐＨ 最適条件は、４０ ℃で約８ であり、かつ６０ ℃で７ であることが観察された。
【０１４０】
実施例６
ストレプトミセス・リビダンスにおけるセルラーゼ産生
本実施例は、本発明のセルラーゼをコードする核酸を包含しかつストレプトミセス・リビダンスの形質転換に用いる、プラスミドの構築について記載する。最終的なプラスミドベクターは、ｐＳＥＧＣＴ と称する。
【０１４１】
ｐＳＥＧＣＴ の構築は、２ つの他のプラスミド（Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．
２０３： ４６８−４７８ （１９８６） に記載のｐＩＪ４８６ およびｐＩＪ４８８） を利用した。プラスミドｐＩＪ４８８ は、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３３： １０３−１１９ （１９８５）） のＫｐｎＩ 部位にエリスロマイシン耐性をコードするサッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｅａ） 由来の１．５ｋｂ ｅｒｍＥ 断片を挿入したものである。その断片のヌクレオチド配列は特定されている（Ｕｃｈｉｙａｍａ ＆ Ｗｅｉｓｂｌｕｍ， Ｇｅｎｅ ３８： １０３−１１０ （１９８５） ａｎｄ Ｂｉｂｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ３８： ２１５−２２６（１９８５）） 。
【０１４２】
両方のプラスミドは、もともと、天然のストレプトミセスプラスミドｐＩＪ１０１
に由来する（Ｄ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２９： ２２５０−２２６０ （１９８３）） 。ｐＩＪ１０１ は、ストレプトミセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ） 由来のチオストレプトン耐性をコードするｔｓｒ 遺伝子を包含する。しかしながら、ｐＩＪ４８６ およびｐＩＪ４８８ プラスミド中には、ｐＩＪ１０１ の複製起点およびリプリカーゼ遺伝子のみが残存する。プラスミドｐＩＪ４８８−１０１ は、ｐＩＪ１０１ の複製起点およびチオストレプトン耐性遺伝子を包含するｐＩＪ４８６ の大きなＰｓｔＩ 断片をＰｓｔＩ で消化したｐＩＪ４８８ と連結させることによって構築し、プラスミドｐＩＪ４８８−１０１ をもたらした（ 図７ を参照） 。
【０１４３】
適切なプロモーターを挿入するために、上記プラスミドｐＩＪ４８８−１０１ からプラスミドを構築した。アクチノプラーネス・ミソウレイエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｅｉｅｎｓｉｓ） のグルコースイソメラーゼ遺伝子をプラスミドｐＩＪ４８８ に挿入した。その遺伝子（ＧＩ） 、ならびにＧＩＴ として知られているタンパク質工学によって得られた誘導体をコードする遺伝子は、既に記載されており（ 欧州特許出願第３５１０２９ 号） 、かつストレプトミセスにおいて機能する適切なプロモーター配列の供給源として働く。
【０１４４】
詳細には、プラスミドｐＩＪ４８８−１０１ をＥｃｏＲＩ およびＳｐｈＩ で消化し、さらに大きな断片を単離してＥｃｏＲＩ −ＳｐｈＩ 断片上のＧＩＴ 遺伝子に連結させる。得られたプラスミドｐＷＧＥ．ＧＩＴ は構造的に不安定であることが見出された。その不安定性は、ｅｒｍＥ 遺伝子のせいであった。従って、ＸｂａＩ 断片の欠失によって、その構造からｅｒｍＥ 遺伝子を除去し、結果としてプラスミドｐＷＧｘ．ＧＩＴ を得た（ 図８ を参照） 。
【０１４５】
プラスミドｐＷＧｘ．ＧＩＴ はまだ、わずかな分離不安定性を示すことが見出された。全てのここでのプラスミドが由来する天然のストレプトミセスプラスミドｐＩＪ１０１ の複製について記載する研究が報告されている（Ｚ． Ｄｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１４： ２８６−２９４） ）。その研究において、ｐＩＪ１０１ は、「ローリングサークル（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ） 」機構を用いて複製することが示されている。その機構を用いたプラスミド複製は、まず、プラス起点と呼ばれる公知の複製起点を用いて１ 本鎖中間分子を合成する。活性２ 本鎖分子に効率的に変換するには、マイナス起点と呼ばれる第二の複製起点が必要である。ｐＩＪ１０１ のほとんどの誘導体を構築する間に、そのマイナス起点は除去される。
【０１４６】
「ｓｔｉ 」とも呼ばれるマイナス起点をＫｐｎＩ −ＦｓｐＩ 断片として、ｐＩＪ１０１ の誘導体であるプラスミドｐＩＪ２１１ から単離し、さらに一般的なクローニングベクターｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ａｎａｌｅｃｔｓ １３， ｎｏ．４．） に連結させた。そのベクターをＢａｍＨＩ で消化し、さらにＫｐｎＩ で平滑末端にしかつ消化した。その結果、プラスミドｐＴＺ１８Ｒｓｔｉ が得られた（ 図９ を参照） 。
【０１４７】
プラスミドｐＷＧｘＧＩＴ をＫｐｎＩ およびＸｂａＩ で消化した。大きな断片を単離し、さらにｐＴＺ１８Ｒｓｔｉ のＫｐｎＩ およびＸｂａＩ 断片から単離したｓｔｉ −含有断片に連結させた。その方法でプラスミドｐＷＧｘｓＧＩＴ を形成した（ 図１０ を参照） 。
【０１４８】
シャトルプラスミドは、プラスミドｐＩＪ４８８ −１０１ およびプラスミドｐＷＧｘｓＧＩＴ を組み合わせることによって構築した。ｐＷＧｘｓＧＩＴ 由来のストレプトミセス複製機能を含む断片（ プラス起点、ｓｔｉ 、およびｒｅｐ 遺伝子） は、ＸｂａＩ およびＳｐｈＩ で消化後、単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ 複製機能を含む断片は、ＸｂａＩ 、ＳｐｈＩ 、およびＮｃｏＩ で消化後、ｐＩＪ４８８−１０１ から単離した。それら２ つの断片を連結させた後、プラスミドｐＩＪ４８８ｓｔｉ を形成した（ 図１１ を参照） 。
【０１４９】
セルラーゼを発現させるため、ＧＩ プロモーターをストレプトミセス・リビダンスセルラーゼ（ＣｅｌＡ） のシグナル配列と共に用いた。ＧＩ プロモーターとＣｅｌＡ シグナル配列との融合物は、融合−ＰＣＲ 技術によって、ＸｂａＩ −ＥｃｏＲＩ 断片として構築した。クローニングのために、同じ断片上に、ＮｈｅＩ 部位を挿入した。その断片をＸｂａＩ およびＥｃｏＲＩ で消化したプラスミドｐＩＪ４８８ｓｔｉ に連結させ、結果としてプラスミドｐＩＪＳＥＧｉＣｅ を得た（ 図１２ を参照） 。
【０１５０】
発現ベクターを完成させるため、セルラーゼターミネーター配列を挿入した。ストレプトミセス株１１ＡＧ３ は、同一でないとしても、実施例１ で単離したストレプトミセス株（１１ＡＧ８） に非常に関連している。両方の菌株は、同じ試料から単離され、かつ２ つの菌株の配列決定された１６ｓ ｒＲＮＡ は同一であることが見出された。１１ＡＧ３ セルラーゼ遺伝子をＮｈｅＩ −ＥｃｏＲＩ ＰＣＲ 断片として単離した。クローニングを容易にするため、同じ断片上に、ＢａｍＨＩ およびＨｐａＩ 部位を挿入した。ｐＩＪＳＥＧｉＣｅｌ をＮｈｅＩ およびＥｃｏＲＩ で消化し、さらにＰＣＲ −ターミネーター断片をその消化したプラスミドに連結させて、ベクターｐＩＪＳＥＧＣｉ を作成した。次に、内部ＢａｍＨＩ 断片の欠失によって、プラスミドｐＩＪＳＥＧＣｉ からセルラーゼ１１ＡＧ３ コード領域を除去し、結果としてベクターｐＳＥＧＣＴ を得た（ 図１３ を参照） 。
【０１５１】
セルラーゼ１１ＡＧ８ 遺伝子は、ＰＣＲ を用いて、ストレプトミセス・リビダンスＴＫ２３ からＮｈｅＩ −ＢａｍＨＩ 断片として単離した。ベクターｐＳＥＧＣＴ をＮｈｅＩ およびＢａｍＨＩ で消化し、さらに前記ＰＣＲ 断片をその消化したベクターに連結させ、結果としてプラスミドｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ を得た（ 図１４ を参照） 。ＧＩ プロモーター、ｃｅｌＡ シグナル配列、セルラーゼ１１ＡＧ８ およびＧＩ ターミネーターから成る完全発現カセットのＤＮＡ ヌクレオチド配列、ならびにその産物のアミノ酸配列を図１５ に示す（ 配列番号４ および５） 。
【０１５２】
Ｈｏｐｗｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ （１９８５） に記載のプロトプラスト法を用いて、宿主ストレプトミセス・リビデンスＴＫ２３ をプラスミドベクターｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ で形質転換した。
【０１５３】
形質転換細胞の培養を拡大し、２ つの発酵培養を行った。種々の時間に、発酵培養液の試料を分析のため採取した。その実験の目的のため、その試料のＣＭＣ 活性および分子量（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ） を測定した。発酵実験の終わりに、かなりの量（５ −１５％） の完全長セルラーゼがＳＤＳ −ＰＡＧＥ で観察された。
【０１５４】
１ 方の発酵実験では、完全長セルラーゼが約１１０．３ 時間までの間に迅速に蓄積した。その後２０５．５ 時間までに、もう少し完全長セルラーゼが蓄積し、さらに完全長セルラーゼの大部分は、切断形態に進行した。他方の発酵実験では、完全長セルラーゼは、約６６．２ 時間までに、発酵層中に存在する支配的なセルラーゼとなった。その後、セルラーゼの切断形態が蓄積した。従って、それら両方の発酵実験において、宿主細胞は完全長セルラーゼを産生し、そのセルラーゼがその後発酵培地中で切断されて、セルラーゼの切断形態を形成すると思われる。
【０１５５】
実施例７
切断放線菌セルラーゼの発現
実施例６ において認められるように、本発明の３５ｋＤ セルラーゼは、ストレプトミセス・リビデンス発現系で発現した場合、最初に、分子量約３５ｋＤ の全３４０ アミノ酸残基から成りかつ３ つのジスルフィド結合架橋を包含する「完全長」酵素（Ｎ −からＣ −末端：触媒コア、リンカー領域、およびセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）） として細胞外スペースに現れる。発酵がかなりの時間、すなわち約６６ 時間進行した後、セルラーゼは、そのセルロース結合ドメインが短縮されることによって修飾される。得られた「コア」分子は、セルラーゼ活性を維持しており、かつ分子量約２５ｋＤ である。完全長セルラーゼの最初の切断部位は、もし有るとしても特定されていないが、そのコアの正確なアミノ酸配列（ｍｗ） は、精製タンパク質またはＵＦ 濃縮した細胞を含まない培養液のいずれかを用いて特定されている。そのアミノ酸配列から、切断タンパク質の平均分子量を計算した。
【０１５６】
切断コアの配列同一性を以下のように特定した：０．２ｍｇ の可溶化酵素液を冷水（ 試料水溶液の２ 倍以上の容量） で０．４５ｍＬ まで希釈し、次に１Ｎ ＨＣｌ ０．０５ｍＬ と混合し、さらに氷冷しながら１０ 分間インキュベートした。その溶液を１３，０００ ｘｇ で２ 分間遠心し、上清を採り、さらに５０％（ｗ／ｖ） トリクロロ酢酸０．０６５ｍＬ を添加して、氷冷しながら１０ 分間インキュベートした。沈殿したタンパク質を遠心で回収し、沈降物を冷却した９０％（ｖ／ｖ） アセトン１ｍＬ で１ 回洗浄し、さらに０．５Ｍ 重炭酸アンモニウム中の８Ｍ 尿素０．０２５ｍＬ に溶解させた。沈降物を溶解させた後、０．２Ｍ ジチオスレイトール２．５ μＬ を添加し、さらにその溶液を５０ ℃で１５ 分間インキュベートした。その後、０．１Ｍ 重炭酸アンモニウム中の０．４４Ｍ ヨードアセトアミド２．５ μＬ を添加し、さらにその溶液を室温で暗所において１５ 分間インキュベートした。その溶液を０．１％（ｗ／ｖ） ｎ−オクチル−β−Ｄ −グルコシド０．１ｍＬ で希釈し、さらに６ μｇ のトリプシンを用いて３７ ℃で６０ 分間タンパク質を消化した。Ｃ１８ カラムを用いたＲＰ −ＨＰＬＣ によって、得られたペプチドを分離し、さらにＵＶ 吸光度および質量分析の両方で溶出特性をモニターした。所定の配列に対するペプチドの指定は、１３ ピークのうち１１ ピークの部分的配列決定によって支援した。
【０１５７】
質量決定によって、「コア」が２ つの分子、すなわちそれら２ つの分子の各配列から構成されているという情報がすでに得られているが、トリプシンによって生じたペプチドの混合物をエンドプロテイナーゼＡｓｐＮ で消化し、さらにＬＣ／ＭＳ によって再度解析した。その結果は、「コア」たんぱく質が、約１ ：２ の分子比である２ つの分子から成り、１ 方は分子量２４，４６９．０ ダルトン（２３０ アミノ酸残基、２ つのジスルフィド結合架橋を含む） であり、他方は分子量２４，７２４．３ ダルトン（２３３ アミノ酸残基、２ つのジスルフィド結合架橋を含む） である。ＰＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＥＳＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ， ｍｏｄｅｌ Ｍａｒｉｎｅｒ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ） を用いた直接質量測定によって前記結果を確認し、精製した変異コアタンパク質の分子量がそれぞれ、２４，４６７．０ および２４，７２７．６ であることが示唆された。
【０１５８】
実施例８
異なるプロモーターによるセルラーゼの発現
ＧＩ プロモーターは、非常に高い発現をもたらすことが知られている。例えばプロモーターの不安定性のため、セルラーゼの高い発現が望ましくない可能性がある。従って、本発明のセルラーゼ発現ベクターに異なるプロモーターをクローン化した。用いたプロモーターは、ストレプトミセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ） アミノグリコシド３ ’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の弱いａｐｈ プロモーターである。そのプロモーターは、天然のストレプトミセスプラスミドＳＬＰ１ の誘導体であるプラスミドｐＩＪ６１ から単離した。ａｐｈ 遺伝子の完全なヌクレオチド配列は公知であり、かつプロモーター領域は特徴付けされている。
【０１５９】
融合−ＰＣＲ 技術を用いて、ｃｅｌＡ シグナル配列に融合したａｐｈ プロモーターを包含するＳｐｅＩ −ＮｈｅＩ 断片を得た。プラスミドｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ をＳｐｅＩ およびＮｈｅＩ で消化し、大きな断片を単離し、さらにその断片に前記ＰＣＲ −断片を連結させることによって、プラスミドｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ 中のＧＩ プロモーターをａｐｈ プロモーターと置換した。その結果、プラスミドｐＳＥＡＣＴ１１ＡＧ８ を得た（ 図１６ を参照） 。そのプラスミドは、プラスミドｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８（ 図１４ を参照） と等価であり、セルラーゼ遺伝子の発現をもたらすために用いるプロモーター以外においてはベクターｐＳＥＧＣＴ と同一であるベクターｐＳＥＡＣＴ に、ストレプトミセス・リビデンス１１ＡＧ８ 由来のセルラーゼを挿入することによって構築されると考えることができる。
【０１６０】
プラスミドｐＳＥＡＣＴ１１ＡＧ８ から全てのＥ．ｃｏｌｉ 配列を除去するため、そのプラスミドをＳｐｈＩ で消化し、かつ再連結させた。これによって、プラスミドｐＳＡＣＴ１１ＡＧ８ を形成した（ 図１７ を参照） 。その構築物をバシラス宿主細胞にトランスフェクトした。プレート培養では、高いレベルのセルラーゼ発現が認められたが、発酵槽の環境では、バシラス宿主細胞によるセルラーゼの産生は非常に低かった。しかしながら、プロモーター誘導をうまく制御して、ａｐｈ プロモーターの制御下におけるセルラーゼ産生を改善することが可能であろう。
【０１６１】
実施例９
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの比較
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能の比較を実施した。
【０１６２】
Ｗｉｓｋ（登録商標） およびＧｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１　液体洗剤において、２０ ℃および４０
℃で、完全長セルラーゼ（１５．４ｍｇ／ｍＬ） および切断セルラーゼ（ 約１４ｍｇ／ｍＬ） の用量反応を評価するために、３サイクルＤｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ Ｔｅｓｔ（ＤＣＴＴ） を用いた。その試験は、毛玉のできた綿編物の布切れおよび毛織物の布切れの両方を用いて実施した。その試験の条件は：
2004500010.tif 000004
ｐＨ は、酵素の添加前、および試験の間３０ 分ごとにチェックした。
【０１６３】
３ サイクル試験を実施する間、各サイクルの終わりに布切れをテルグポット（Ｔｅｒｇ ｐｏｔ） から取り出し、洗濯機ですすぎ、その後新しい酵素および洗剤を含むテルグポットに戻した。３ 回目のサイクルのすすぎの終わりに、タンブル乾燥機でその布切れを乾燥した。
【０１６４】
データ分析
毛玉除去：図１８ａ は、Ｗｉｓｋ（登録商標） における４０ ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの毛玉除去用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。それらの結果は、Ｗｉｓｋ（登録商標） における４０ ℃での完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能に有意な差は無いことを示唆する。
【０１６５】
ピーク負荷：図１８ ｂは、Ｗｉｓｋ（登録商標） における４０ ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。ピーク負荷値は強度の損失に逆比例し、すなわちピーク負荷値が高いほどＴＳＬ は低い。ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてわずかに低い。従って、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてピーク負荷値がわずかに低くかつＴＳＬ が高いが、２つの酵素は等しい毛玉除去能を有している。
【０１６６】
しかしながら、毛玉除去および％ＴＳＬ を比較した場合、完全長セルラーゼと切断セルラーゼ間で多少の違いが認められる。図１８ ｃは、Ｗｉｓｋ（登録商標） における４０ ℃での％ＴＳＬ 対毛玉除去を完全長セルラーゼと切断セルラーゼで比較して示している。完全長セルラーゼおよび切断セルラーゼの両方のトレンドラインを描くことができ、毛玉除去が上昇するにつれてＴＳＬ が上昇することを示している。そのグラフは、毛玉除去評価が４の時に、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いＴＳＬ を有することを示す。
【０１６７】
Ｗｉｓｋ（登録商標） 液体洗剤に加えて、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ 液体洗剤においても毛玉除去能を評価した。同じ条件下（洗浄溶液のｐＨ が１０．５７ に上昇することを除いて）、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ において、２０ ℃および４０ ℃で、切断セルラーゼに対する完全長セルラーゼの用量反応を比較した。ｐＨ は、酵素添加前および３０ 分ごとにチェックした。
【０１６８】
データ分析
毛玉除去：図１９ａ は、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ における２０ ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。グラフに示すように、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ では、切断セルラーゼの毛玉除去能は完全長セルラーゼよりもよかった。要約すると、毛玉除去評価２に達するのに、完全長セルラーゼは切断セルラーゼと比較して１．６ 倍の量が必要であった。
【０１６９】
ピーク負荷：図１９ ｂは、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ における２０ ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼのピーク負加値およびＴＳＬ を示す。予測した通り、ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼで低かった。完全長セルラーゼデータにおける散乱、および低い相関係数は、完全長セルラーゼが織物に殆ど効果が無く、従ってＴＳＬ が生じないことを示唆した。ＴＳＬ は、Ｗｉｓｋ（登録商標） よりもＧｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ においてかなり低いが、おそらくｐＨ の違いのせいであろう。
【０１７０】
漂白剤の存在下における毛玉除去能を特定するため、漂白剤の存在下で同じ実験を実施した。試験の条件は：
2004500010.tif 000005
ｐＨ は、酵素の添加前および添加後の両方に調整し、その後３０ 分ごとにチェックして必要に応じて調節した。
【０１７１】
毛玉除去：図２０ａ は、アルカリ性洗剤基質±酸素漂白系における、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびＥＧＩＩＩ の毛玉除去能を示す。グラフから分かるように、ＰＢＳ／ＴＡＥＤ を添加すると、毛玉除去能は３ つの全ての酵素において低下した。完全長セルラーゼおよびＥＧＩＩＩ が酸素漂白系の存在下において最も影響を受けた。切断セルラーゼは、酸素漂白系の存在下においてさえ、最も高い毛玉除去能を有し、毛玉除去評価が３．５ であった。このデータは、漂白系の存在下において、切断セルラーゼが、完全長セルラーゼおよびＥＧＩＩＩ よりも安定であることを示唆する。
【０１７２】
ピーク負荷：図２０ ｂは、アルカリ洗剤基質±酸素漂白系における完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびＥＧＩＩＩ のピーク負荷値を示す。グラフから分かるように、漂白系の存在下において、ピーク負荷値は完全長セルラーゼおよびＥＧＩＩＩ で変化しなかったが、切断セルラーゼではピーク負荷値が上昇した。ＴＳＬ はピーク負荷値に反比例した。切断セルラーゼのピーク負荷値は、漂白系の存在下において上昇し、従ってＴＳＬ は低下した。
【０１７３】
漂白剤に加えて、選択洗剤はプロテアーゼを含んでいて差し支えない。従って、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） の存在下において上記の試験を実施した。試験の条件は：
2004500010.tif 000006
毛玉除去：図２１ａ は、アルカリ性洗剤基質±Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標）
プロテアーゼにおける、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびＥＧＩＩＩ の毛玉除去能を示す。セルラーゼ無しの対照±Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） は全く毛玉除去能を示さなかった。完全長セルラーゼの毛玉除去能は、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の存在下において上昇したが、切断セルラーゼの毛玉除去能は変化しなかった。このことは、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼよりもタンパク質分解に対して安定であることを示唆した。完全長セルラーゼ＋Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の毛玉除去能は、切断セルラーゼの毛玉除去能と同じレベルに上昇した。この結果は、アルカリ条件下において、切断セルラーゼの毛玉除去能が完全長セルラーゼよりも良いという初期の観察に一致する。ＥＧＩＩＩ の毛玉除去能は、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） プロテアーゼの存在によって影響を受けない。
【０１７４】
ピーク負荷：図２１ｂ は、アルカリ洗剤基質±Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） プロテアーゼにおける完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびＥＧＩＩＩ のピーク負荷値を示す。ゼロ対照に対するＰｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の添加は、ピーク負荷値に影響を及ぼさなかった。完全長セルラーゼのピーク負荷値は、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の存在下において低下した。ＴＳＬ はピーク負荷値に反比例するため、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の添加により完全長セルラーゼの毛玉除去が上昇すると、同様にＴＳＬ が上昇する。プロテアーゼは、殆ど、または全く切断セルラーゼに影響を及ぼさなかった。ＥＧＩＩＩ のピーク負荷値は、Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ（登録商標） の存在下において影響を受けなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており、リーダー配列をボールド体で示す（配列番号１ ）。
【図２】
図２ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼをコードするＤＮＡ 配列を示す（ 配列番号２） 。
【図３】
図３ は、本発明に基づく約３６ ｋＤ のセルラーゼの４０ ℃および６０ ℃におけるｐＨ ／活性特性を示す。
【図４】
図４ は、ｐＨＰＬＴ ベクターを示す。
【図５】
図５ は、ｐＨＰ１１ＡＧ８ ベクターを示す。
【図６】
図６ は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の１６ｓ ｒＲＮＡ 配列を示す。
【図７】
図７ は、ｐＩＪ４８８−１０１ の構造を示す。
【図８】
図８ は、ｐＷＧｘＧＩＴ の構造を示す。
【図９】
図９ は、ｐＴＺ１８Ｒｓｔｉ の構造を示す。
【図１０】
図１０ は、ｐＷＧｘｓＧＩＴ の構造を示す。
【図１１】
図１１ は、ｐＩＪ４８８ｓｔｉ の構造を示す。
【図１２】
図１２ は、ｐＳＥＧＣｉ の構造を示す。
【図１３】
図１３ は、ｐＳＥＧＣＴ の構造を示す。
【図１４】
図１４ は、ｐＳＥＧＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【図１５】
図１５ は、ＧＩ プロモーター、ｃｅｌＡ シグナル配列、セルラーゼ１１ＡＧ８ およびＧＩ ターミネーターから成る完全発現カセットのＤＮＡ 配列 （ 配列番号４） 、ならびに１１ＡＧ８ のコードアミノ酸配列を示す（ 配列番号５） 。
【図１６】
図１６ は、ｐＳＥＡＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【図１７】
図１７ は、ｐＳＡＣＴ１１ＡＧ８ の構造を示す。
【図１８】
図１８ は、Ｗｉｓｋ（登録商標） における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図１９】
図１９ は、Ｇｅｓｓｙ Ｌｅｖｅｒ＃１ における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２０】
図２０ は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２１】
図２１ は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図１】
2004500010.tif 000007
【図２】
2004500010.tif 000008
【図３】
2004500010.tif 000009
【図４】
2004500010.tif 000010
【図５】
2004500010.tif 000011
【図６】
2004500010.tif 000012
【図７】
2004500010.tif 000013
【図８】
2004500010.tif 000014
【図９】
2004500010.tif 000015
【図１０】
2004500010.tif 000016
【図１１】
2004500010.tif 000017
【図１２】
2004500010.tif 000018
【図１３】
2004500010.tif 000019
【図１４】
2004500010.tif 000020
【図１５】
2004500010.tif 000021
【図１６】
2004500010.tif 000022
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2004500010.tif 000026
【図２１】
2004500010.tif 000027
【国際公開パンフレット】
2004500010.tif 000028
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2004500010.tif 000089
2004500010.tif 000090
2004500010.tif 000091
2004500010.tif 000092
2004500010.tif 000093
2004500010.tif 000094
【国際調査報告】
2004500010.tif 000095
2004500010.tif 000096
2004500010.tif 000097
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