(57)【要約】透過電子顕微鏡のサイドエントリー用クライオ移動ホルダーが提供される。クライオ移動ホルダーは、試料を低温に維持しながらその軸線の周りで回転させたり傾斜させたりできるように構成される。クライオ移動ホルダーは、好ましくは互いに垂直な二組の傾斜データを単一冷凍試料から収集することを可能にする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析すべき試料を支持するようにされた試料グリッドをもつ試料クレードルを備えた試料ホルダーと；
前記試料の平面において前記試料ホルダー内で前記試料クレードルを回転させる移行機構と；
前記試料クレードルを傾斜させる機構と；
クライオ移動中試料を保護しそして試料を覆う第１位置から後退位置へ移動できるクライオシャッターと、を有する電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項２】
前記移行機構が前記電子顕微鏡の外部で操作できる作動機構を備える請求項１の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項３】
前記試料ホルダー用の冷却源を有する請求項１の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項４】
前記移行機構は前記試料クレードルにリンク結合した運動交換機構及び前記運動交換機構にリンク結合した変換シャフトを備える請求項１の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項５】
前記変換シャフトは第１、第２端部をもちかつ前記試料ホルダーの軸線に沿ってのびるロッドを備え、前記ロッドの前記第１端部が前記運動移行機構に接続され、また前記第２端部が前記透過電子顕微鏡の外側へのびるようにされた請求項４の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項６】
前記運動移行機構の作動中、前記透過電子顕微鏡内を真空に維持するように前記変換シャフトと連通する摺動真空シールを有する請求項５の透過電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項７】
前記運動移行機構は前記試料クレードルの周囲における対応する歯付き歯車と連動する歯付きラックを備える請求項４の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項８】
更に前記試料ホルダーにねじ接続されたノブを有し、前記ノブの回転により前記変換シャフトの直線運動を生じさせるように前記変換シャフトの前記第２端部が前記ノブに直線的に結合される請求項５の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【請求項９】
前記クライオシャッターはピンを備え、前記移行機構の直線運動は前記ピンと係合し、そして前記クライオシャッターを、前記試料を覆う前記第１位置から後退位置へ動かすように前記ピンが前記クライオシャッターに接続される請求項２の電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、透過電子顕微鏡用サイドエントリー（ｓｉｄｅ ｅｎｔｒｙ）試料クライオ（ｃｒｙｏ：低温）移動ホルダーに、そして特に試料の平面において試料を回転できかつ電子ビーム軸線のまわりで試料を傾斜できるクライオホルダー（ｃｒｙｏｈｏｌｄｅｒ）に関する。
【０００２】
電子顕微鏡の試料ホルダーは、カートリッジか又はロッド（ｒｏｄ）の形態を取り得る。カートリッジ型のホルダーは対物レンズの上方ポールピース（磁極片）を介して顕微鏡内に垂直に挿入され、一方、ロッド型のホルダーは、上方及び下方ポールピースの間で顕微鏡の側部から水平に挿入される。近年、ロッド型のホルダーは、試料を傾ける機構が比較的簡単でしかも比較的信頼できるので、広く用いられるようになってきた。試料を傾斜させる能力は立体画像形成、三次元再生及び最適な回析状態に同調するために重要である。
【０００３】
ロッド型の試料ホルダーはまた、低温で試料を観察するために好ましい形式となった。これは、試料からの熱の抽出が銅のような熱伝導性材料の試料チップを形成しそして銅ロッドの形態のチップをロッドの他端部に装着した液体窒素又はヘリウムのデューア（ｄｅｗａｒ：断熱瓶）までのばすことによって容易に行なわれるためである。クライオ移動ホルダーは更に近年開発されたロッド型の冷却ホルダーであり、試料は試料を霜付きすることなしに外部クライオステーションから顕微鏡内に低温で移送され得る。
【０００４】
生物試料用の従来の樹脂埋め込み方法は、生体セルにおいて観察した構造に関して分析され得る容易に同定可能な人工物を作るために提案されてきた。人工物を拡散させかつ繊細な構造を潰す水は、樹脂実施中試料から除去されなければならない。これら及びその他の理由により、多くの研究所では、透過電子顕微鏡において検査するための生物試料を用意するのに超急速フリージング（冷凍）技術が用いられる。このアプローチは多くの利益をもたらすが、幾つかの技術的問題を克服しなければならず、すなわち、試料は、アモルファスアイスの形成を促進するために迅速にフリージングされなければならず、また試料は失透を防ぐために−１４０℃以下の温度に維持されなければならない。
【０００５】
クライオ移動ホルダーは、試料を冷凍状態に維持しかつワークステーションから顕微鏡内へ試料を移す際に試料に霜が付着するのを防ぐために設計された。典型的には、試料をホルダーにクランプした際に、クライオシャッターは試料を移送しながら試料を完全に覆うように動かされる。この形式のクライオ移動ホルダーの一例はＳｗａｎｎ等の米国特許第４，７０３，１８１号に開示される。顕微鏡内に挿入すると、シャッターは冷凍試料を露出するため後退される。被検査試料の形態に関連して、ホルダーは記録するために最も有利な特徴を示すように傾斜する必要があり得る。クライオシャッターは、試料を後日再検査する必要がある場合には試料を取り替えられ得る。
【０００６】
電子顕微鏡の分解能は改善されてきたので、生物小器官及び高分子の高分解能構造を解決する努力がなされてきた。三次元電子顕微鏡画像形成すなわち電子断層放射線写真は詳細な量及び表面データを得るのに使用する方法の一つである。この技法は、大きな範囲の試料傾斜にわたって集めた投影データから個々の物体を再生することを含む。電子断層放射線写真に有用であるクライオ移動ホルダーの一例はＳｗａｎｎ等の米国特許第５，７５３，９２４号に開示される。低分解能データセットは１°の間隔で±７０°の単一傾斜範囲を通しての試料の像を含む。理想的には、物体は±９０°傾斜されるべきであるが、既存の顕微鏡構造ではこの範囲の動きはできない。
【０００７】
従って、断層放射線写真（ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）の実質的な限界は、反復照射により試料の受ける損傷及び投影データを発生するのに利用できる試料の傾斜の範囲によって設定される。反復照射による試料の損傷の問題に対処するために、試料はクライオホルダーにおいて低温で検査される。試料の傾斜範囲は、二重傾斜ホルダーでなされるように、第１軸線に垂直な第２軸線において試料を傾斜させることによって拡張され得る。商業上利用できる二重傾斜ホルダーの一例はＧａｔａｎ社、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ ＣＡ、製のモデル９１５Ｄｏｕｂｌｅ Ｔｉｌｔ Ｃｒｙｏｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍである。ほとんどの二重傾斜ホルダーの場合、第２軸線の傾斜範囲は、試料クレードル（ｃｒａｄｌｅ：揺籃）の構成すなわち第２軸線のまわりで傾斜を達成する方法によって±４５°までに制限される。第１軸線における±７０°の傾斜データ及び第２軸線における±４５°の傾斜データを含むデータセットは理想的ではない。試料は顕微鏡から取り出すことができず、一組の傾斜データを取った後手動で再度方向決めされ得ない。というのは、この操作中に試料が溶け、損傷又は汚染されることになる可能性が高いからである。
【０００８】
上述のように、断層放射線写真シリーズを収集するのに従来の単一傾斜クライオ移動ホルダーが用いられる場合には、最新データセットは典型的には単一軸線に関して±７０°までの傾斜範囲をカバーする。断層放射線写真のような高傾斜を要求する応用に用いる場合には、この限定された傾斜範囲は、試料の頂部及び底部表面の三次元再生のための必要な像を得るのを妨げる。これは、検査すべき構造体のデータセットのほぼ１／３から成り、理想的には単一傾斜軸線ステージについては、方向上のゆがみを最小化するには±９０°からの完全なデータセットが必要である。しかし、これは現在利用可能なクライオ移動ホルダーでは不可能である。
【０００９】
Ｇａｔａｎ社によって設計され製造された公知のクライオ移動ホルダーでは、直径３ｍｍの標準の円形グリッド上の冷凍試料は検査のためにクライオステーションから透過顕微鏡に移送され得る。クライオホルダーは試料を常に−１６０℃以下の温度に維持するように設計される。試料チップは、ホルダーの中心線から最近接触表面まで３ｍｍ又はそれ以上の“Ｚ”軸線距離で顕微鏡ポールピースギャップに±７０°の主軸線傾斜を生じるように形成される。試料ロッドのチップは、ワークステーションから顕微鏡への移動中に試料に霜の形成されるのを阻止する可動のクライオシャッターを備える。クライオシャッターはホルダーの外側に位置した手動制御手段によって意のままに操作される。試料グリッドは試料クランプ装置、例えばＣｌｉｐｒｉｎｇ（Ｇａｔａｎ社の商標）によって最適位置に保持される。
【００１０】
従って、この技術においては、冷凍試料を妨げることなく一つ以上の試料方向決めで高い角度での傾斜データを得ることのできるクライオ移動ホルダーの要求がなお存在する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、１６０℃以下の試料温度を維持し、確実に試料をクランプする可動のクライオシャッターを備える標準のクライオ移動ホルダーの構造上の特徴の利益をもたらししかも冷凍試料を妨げることなく（すなわち試料を顕微鏡から取外すことなく）、一つ以上の試料方向決めで高い角度での傾斜データを得ることのできるクライオ移動ホルダーを提供することにより前記要求を満たすことにある。本発明は、理想的には元の軸線に垂直な、別の傾斜軸線に関してホルダーの有効最大傾斜範囲を拡張する、顕微鏡における観察中にクライオ温度で試料の平面において試料を回転する能力を付加する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの特徴に従って、電子顕微鏡用サイドエントリー試料クライオホルダーが提供され、そしてこのクライオホルダーは、分析すべき試料を支持するようにされた試料グリッドをもつ試料クレードルを備えた試料ホルダーと；試料の平面において試料ホルダー内で試料クレードルを回転する移行機構と；試料クレードルを傾斜させる機構と；クライオ移動中試料を保護しそして試料を覆う第１位置から後退位置へ移動できるクライオシャッターとを有する。好ましくは、移行機構は電子顕微鏡の外部で操作できる作動機構を備える。また好ましくは、試料ホルダーは冷却源を有する。
【００１３】
本発明の好ましい実施の形態では、移行機構は、試料クレードルにリンク結合した運動交換機構及び運動交換機構にリンク結合した変換シャフトを備える。変換シャフトは好ましくは、第１、第２端部をもちかつ試料ホルダーの軸線に沿ってのびるロッドを備え、ロッドの第１端部は運動移行機構に接続され、また第２端部は透過電子顕微鏡の外側へのびるようにされる。一つの実施の形態では、運動移行機構は、試料クレードルの周囲における相応した歯付き歯車と連動する歯付きラックを備える。クライオホルダーは更に、試料ホルダーにねじ接続されたノブを有し、ノブの回転により変換シャフトの直線運動を生じさせるように変換シャフトの第２端部はノブに直線的に結合される。
【００１４】
運動移行機構の作動中、透過電子顕微鏡内を真空に維持するように前記変換シャフトと連通する摺動真空シールが設けられる。クライオシャッターはまたピンを備え、移行機構の直線運動はピンと係合し、そしてクライオシャッターを、試料を覆う第１位置から後退位置へ動かすようにピンはクライオシャッターに接続される。冷却源は、好ましくは、熱絶縁導体によって試料ホルダーに接続された液体窒素のデューアを備える。
【００１５】
動作において、試料クライオホルダーは電子顕微鏡に挿入され、そして移行機構はクライオシャッターを後退させるために作動される。第１セットのデータは、試料を第１方向決めし、そして試料クレードルをほぼ±７０°傾斜させて採取される。そして試料は、運動移行機構を用いて試料の平面において好ましくは９０°回転され、そして第２セットの傾斜データはほぼ±７０°を通して採取される。この処理は、ホルダーが顕微鏡から外されそして試料が手動で回転されない限り、従来技術の試料ホルダーから失われる情報を補償するため第２セットの傾斜データを加える。本発明は、冷凍試料を更に処理することなしに検討すべき物体の高分解能再生を容易におこなわせる。
【００１６】
従って、本発明の特徴は、透過電子顕微鏡から試料を外すことなく透過電子顕微鏡における電子ビーム軸線に垂直な平面において試料を回転できる電子顕微鏡用のサイドエントリークライオ移動ホルダーを提供することにある。本発明の別の特徴は、顕微鏡の外部から作動される回転機構を提供することにある。本発明の更に別の特徴は、試料装填ワークステーションから顕微鏡へ移送中に試料を保護し、また試料を観察する前にホルダーを顕微鏡に位置決めする際にグリッドの領域を保護し、そして観察の開始前に取り除かれる可動のクライオシャッターを提供することにある。本発明のこれら及びその他の特徴及び利点は以下の詳細な説明、添付図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
事例として添付図面が参照され、同じ要素は同じ参照符号で示す。本発明を、透過電子顕微鏡用サイドエントリー試料ホルダーとしの好ましい実施の形態に関して詳細に説明する。試料ホルダーは他の形式の電子顕微鏡においても意のままに作動するようにされ得ることが明らかである。更に、本発明の試料ホルダーは好ましい形態では、冷却（例えばクライオ）能力を含む。試料ホルダーは電子顕微鏡のコラムに挿入するように設計され、それでホルダーに支持された試料はコラムを横切る電子ビームと整列され得る。
【００１８】
本発明の目的のため、図１に例示するように、試料ホルダーの運動のＸ軸線及びＺ軸線は次のように定義される。Ｘ軸線は、試料ホルダー１０の長手方向軸線を表し、試料ホルダー１０の遠端すなわちチップに向かう動きはマイナス（−）方向として定義され、また反対方向の動きはプラス（＋）方向として定義される。試料ホルダーの傾斜は、図示したように時計回り（＋）方向か反時計回り（−）方向で第１軸線（しばしばＸ軸線傾斜と呼ばれる）において生じ得る。
【００１９】
試料ホルダー１０は、プラス（＋）の時計回り方向かマイナス（−）の反時計回り（−）方向で全３６０°に対して垂直（Ｚ）軸線のまわりを回転され得る。図１において、Ｚ軸線はホルダーの平面に垂直な線である。
【００２０】
図１に示すように、試料ホルダー１０の遠端すなわちチップ１１は試料クレードル１２を備える。クライオ状態の下で前もって用意された冷凍試料１３は、従来のように、試料ホルダーチップ１１における凹部内に装着され、そして例えばクランプリング又はグリッド１４によってクレードル１２に固定される。試料チップは、液体窒素のデューア（図示していない）のような冷却源に接続された銅導体によるような従来の仕方で冷却される。試料クレードル１２は熱伝導性の高い堅固な材料で構成される。
【００２１】
また、図１に示すように、試料ホルダー１０は、試料の平面においてＺ軸線の周りで試料クレードル１２（及び試料１３）を回転させる、１６で示す移行機構を備える。移行機構１６は以下に詳細に説明するように顕微鏡の外部から作動できる。移行機構は１８で示す運動交換機構を備える。図示実施の形態において、運動交換機構１８はホルダー１０の凹部に沿って摺動するラック２８を備える。ラック２８はクレードル１２における相応した一連の歯３２と係合する一連の歯３０を備える。変換シャフト２０は第１端部２２及び第２端部２４を備え、そしてラック２８を外部作動機構にリンク結合する。変換シャフト２０の第１端部２２はラック２８に接続され、第２端部２４は回転ノブ３６に直線状に接続される。
【００２２】
図示したように、ノブ３６は内部ねじ３８を備え、内部ねじ３８は試料ホルダーにおける相応した外部ねじ４０と係合する。変換シャフト２０はノブ３６における開口４２を通ってのび、そしてこの開口内で自由に回転できる。図示したように、変換シャフト２０の第２端部２４はフランジ４４、４６によってノブ３６に取り付けられ、ノブ３６に直線状に結合される。ノブ３６を例えば時計回り方向に回転すると、回転運動はシャフト２０及びラック２８の順方向直線運動に変換される。ノブ３６を例えば反時計回り方向に回転すると、シャフト２０及びラック２８は後方向に直線運動することになる。ラック２８の平坦な側部は、ラック２８の回転を阻止するために試料ホルダー１０における表面と係合する。
【００２３】
ラック２８の順方向直線運動により、クレードル１２は係合歯３０（ラックにおける）及び３２（クレードル１２における）を介して回転する。クレードル１２はクレードル支持ピン３４によって適切な位置に維持される。従って、オペレーターが顕微鏡の外部からノブ３６を回転させると、変換シャフト２０の直線運動はクレードル１２の回転運動に変換される。顕微鏡内の真空は、試料ホルダー１０と顕微鏡の外部との間の気密シールを維持しながら変換シャフト２０の直線運動を可能にさせる摺動Ｏリング真空シール２６によって維持される。更に、手動型の作動機構について説明したが、モータ駆動型の駆動機構を代わりに用いることができることは明らかである。
【００２４】
図１に示すラック及び歯車の実施の形態によって運動交換機構１８を例示したが、当業者には明らかなように、本発明の範囲内にある他の駆動機構も可能である。例えば、運動交換機構の手動又はモータによる制御は、駆動ベルト、摩擦駆動手段、球形駆動手段、リボン駆動手段、圧電モーター又は機械的ギア手段によって行なうことができる。
【００２５】
再び図１を参照すると、可動クライオシャッター４８は冷凍試料１３を完全に包囲し、そして可動クライオシャッターピン５０に対してラック２８を押圧することにより試料クレードル領域から外される。試料クレードル１２は一側においてクレードル支持ピン３４と密接し、他側ではラック２８の歯３０と接触する。ラック２８の歯３０は試料クレードル１２の外周囲部における相応した歯３２と噛み合う。
【００２６】
次に図２を参照すると、可動クライオシャッター４８は試料１３及び試料クレードル１２を完全に包囲し、電子顕微鏡への移送中に（周囲雰囲気にさらされることにより）冷凍試料に霜が付くのを防止する。電子顕微鏡内へホルダーを挿入する前の最後の操作の一つとして、オペレーターは、ホルダー１０を試料ホルダーワークステーションにおいてクライオ温度に維持しながら、クライオシャッター４８を試料１３上に手で動かす。ホルダー１０を顕微鏡内に入れると、オペレーターは変換シャフト２０に取付けられた回転ノブ３６を回してラック２８を動かす。ラック２８の直線運動により、ラック２８はクライオシャッターピン５０と接触し、クライオシャッター４８を試料チップの方向に動かし、試料を露出させる。こうして、ノブ３６の作動によりクライオシャッター４８を作動すると共に試料クレードル１２を回転させる。
【００２７】
次に図３を参照すると、クライオシャッター４８は完全に引きはずされ、試料は顕微鏡コラムから下方に出てくる電子ビームに晒される。試料１３及び試料クレードル１２を回転するために、オペレーター（又はモータ駆動手段）は変換シャフト２０に取付けられた回転ノブ３６を回して、ラック２８を直線状に動かす。ノブの回転運動は、ラック２８の歯３０及び試料クレードル１２の歯３２の係合により変換される。
【００２８】
上記の説明は構造及び動作の多くの特殊な細部を含むが、これらは本発明の範囲におけるクライオシャッターを順方向に動か限定を構成するものではなく、単に本発明の好適な実施の形態を例示するものである。当業者には本発明の範囲内で他の種々の変更が可能である。例えば、クライオホルダーは二つの駆動シャフトを備えることができ、一つは試料を回転させるためのものであり、他の一つは試料を露出させるためしまたホルダーの顕微鏡への挿入及び顕微鏡からの取出し中に試料を保護するためクライオシャッターを後方向に動かすためのものである。駆動ベルト、摩擦駆動手段、圧電モーター又は機械的ギア手段を用いたクライオシャッター機構の手動又はモータ駆動型の制御装置も利用され得る。また可動クライオシャッターは顕微鏡に内蔵の機構によって動かされ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
可動クライオシャッター、試料クレードルを回転する移行機構、及び移行機構を動かす外部作動型回転ノブを備えたサイドエントリークライオ変換ホルダーの概略頂部断面図。
【図２】
クライオシャッターで試料を完全に覆ったサイドエントリークライオ変換ホルダーを示す概略線図。
【図３】
観察、傾斜及び回転のために試料を露出させるためクライオシャッターを作動させたサイドエントリークライオ変換ホルダーを示す概略線図である。
【国際公開パンフレット】
2004508661.tif 000003
2004508661.tif 000004
2004508661.tif 000005
2004508661.tif 000006
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2004508661.tif 000009
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2004508661.tif 000011
2004508661.tif 000012
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2004508661.tif 000014
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2004508661.tif 000017
2004508661.tif 000018
【国際調査報告】
2004508661.tif 000019
2004508661.tif 000020
2004508661.tif 000021