(57)【要約】生物学的に活性な４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを遺伝子操作する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるイソフラボン７−ＯＭＴの位置特異性に基づいて見出された。イソフラボノイドＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）遺伝子で形質転換して、それを発現させるときに、トランスジェニック植物におけるＩＯＭＴのアップレギュレーションを用いて４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンの蓄積を増大させ、植物に対し増大した病害抵抗性を付与することができる。同様の方法を用いて、植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質の蓄積を増大することもできる。天然で４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生する植物におけるＩＯＭＴのダウンレギュレーションのためには、ＩＯＭＴ遺伝子配列がアンチセンス方向で形質転換され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物のレベルを増大する方法であって、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作出し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて該遺伝子を過剰発現させることを含む、上記方法。
【請求項２】
化合物が４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物が４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質である請求項１記載の方法。
【請求項４】
断片が配列番号１を含むものである請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項１、２または３記載の方法。
【請求項６】
４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生しないターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生させる方法であって、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作出し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させることを含んでなり、該トランスジェニック植物は４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するものである、上記方法。
【請求項７】
化合物が４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
化合物が４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質である請求項６記載の方法。
【請求項９】
ターゲット植物の天然のＤＮＡが上記酵素をコードするものである請求項６、７または８記載の方法。
【請求項１０】
ターゲット植物が上記酵素の少なくとも１種をコードするように遺伝的に形質転換されたものである請求項６、７または８記載の方法。
【請求項１１】
断片が配列番号１を含むものである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項９記載の方法。
【請求項１３】
断片が配列番号１を含むものである請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
非植物細胞系において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生させる方法であって、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するように遺伝的に形質転換された細胞において、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて発現させることにより行う、上記方法。
【請求項１６】
断片が配列番号１を含むものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
トランスジェニック飼料用マメ科植物においてホルムオノネチン、少なくとも１種のそのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを低減する方法であって、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の、アンチセンス発現、センス遺伝子介在型サイレンシングまたは核酸介在型挿入不活化を行うことを含む、上記方法。
【請求項１９】
断片が配列番号１を含むものである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
マメ科植物がアルファルファである請求項１８、１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物のレベルを低減する方法であって、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作出し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現、センス遺伝子介在型サイレンシングまたは核酸介在型挿入不活化を誘導することを含む、上記方法。
【請求項２３】
化合物が、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシン、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群より選択されるものである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
断片が配列番号１を含むものである請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２６】
４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質またはそのコンジュゲートの合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質またはこれらの混合物のレベルを低減する方法であって、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作出し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現またはセンス遺伝子介在型サイレンシングを誘導し、それにより対応する非メチル化前駆体、そのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを増大させることを含む、上記方法。
【請求項２７】
断片が配列番号１を含むものである請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の産生方法であって、全植物体または細胞懸濁培養物に７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の非メチル化イソフラボン前駆体を接触させることを含んでなり、該全植物体または細胞懸濁培養物は、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されているものである、上記方法。
【請求項３０】
断片が配列番号１を含むものである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の製造方法であって、可溶性のまたは固定化したイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ酵素と非メチル化イソフラボン前駆体とを接触させて７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物にすることを含んでなり、該酵素は、トランスジェニック植物または異種系における対応するイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の発現により産生されたものである、上記方法。
【請求項３３】
異種系が、トランスフェクトした細菌、酵母および昆虫細胞からなる群より選択されるものである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
断片が配列番号１を含むものである請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３６】
植物における４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのトランスジーン発現を判定するための試薬として使用する、４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼに対する抗血清。
【請求項３７】
ターゲット植物の病害抵抗性を増大させる方法であって、該ターゲット植物をイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換することにより行うものであり、該形質転換植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物における少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドのレベルと比較して、増大した該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルを示すものである、上記方法。
【請求項３８】
断片が配列番号１を含むものである請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含む組成物であって、該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドはイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されたトランスジェニック植物の少なくとも一部から単離されたものであり、該トランスジェニック植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドのレベルと比較して、増大した該４’−Ｏメチル化イソフラボノイドレベルを示すものである、上記組成物。
【請求項４１】
断片が配列番号１を含むものである請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項４０記載の組成物。
【請求項４３】
トランスジェニック植物がマメ科植物である請求項４０、４１または４２記載の組成物。
【請求項４４】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であって、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記トランスジェニック植物。
【請求項４５】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる種子であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記種子。
【請求項４６】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項４７】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物の種子から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項４８】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であって、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記トランスジェニック植物。
【請求項４９】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる種子であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記種子。
【請求項５０】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項５１】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物の種子から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は植物の遺伝子操作に関する。
【０００２】
発明の背景
マメ科植物（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）のイソフラボノイドは、フェニルプロパノイドから誘導される植物性天然産物の最も重要な生物学的活性を有するクラスのものである。ダイゼイン、ゲニステインおよびバイオチャニンＡなどのイソフラボンは、広範囲の薬理作用、例えばエストロゲン様活性、抗脈管形成活性、抗酸化活性および抗癌活性を示すものであり（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ． １９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ： ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｕ． Ｓａｎｋａｗａ編， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ ７７３−８２３）、ダイズ高含有食餌の健康増進活性はイソフラボン成分にあると考えられている（Ｂａｒｎｅｓら、１９９０． ”Ｓｏｙｂｅａｎｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．”， Ｍ． Ｗ． Ｐａｒｉｚａ編， Ｍｕｔａｇｅｎｓ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｅｔ（食餌中の突然変異誘発物質および発癌性物質）， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ ２３９−２５３；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚら、１９９１． ”Ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎａｎｓ ａｎｄ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｍｅｎ ａｎｄ ｗｏｍｅｎ ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ａ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｄｉｅｔ，” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ５４： １０９３−１１００；Ｌｅｅら、１９９１． ”Ｄｉｅｔａｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｂｒｅａｓｔ−ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ ｉｎ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，” Ｌａｎｃｅｔ ３３７： １１９７−１２００）。ダイゼインおよびゲニステインは、多種多様なマメ科植物における種々の抗菌性イソフラボノイドフィトアレキシンの生合成において前駆体として機能する（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ．およびＮ． Ｌ． Ｐａｉｖａ． １９９５． ”Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ”Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７： １０８５−１０９７）。更にそのエストロゲン様活性のために、高レベルのイソフラボノイド（フィトエストロゲンホルムオノネチンなど）は、飼料用マメ科植物を食するヒツジの生殖能に有害な影響を及ぼす可能性がある（Ｓｈｕｔｔ， Ｄ． Ａ． １９７６． ”Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ ７５： １１０−１１３）。
【０００３】
イソフラボノイドは、植物病原菌の相互作用に重要な役割を果たしていると考えられている。その理由は、イソフラボノイドの多くが非常に強力な抗菌活性を有するからである。抗菌性イソフラボノイドは、２つの機能的なクラス、すなわち前産生「フィトアンチシピン類（ｐｈｙｔｏａｎｔｉｃｉｐｉｎｓ）」および誘導性「フィトアレキシン類」に分類される（ＶａｎＥｔｔｅｎら、１９９４． ”Ｔｗｏ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ： ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ ｖｅｒｓｕｓ ｐｈｙｔｏａｎｔｉｃｉｐｉｎｓ，” Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６： １１９１−１１９２）。前者のクラスの例としては、ルピナス（ｌｕｐｉｎ）のプレニル化イソフラボンが挙げられ、これは、幼植物の発育過程で植物の種々の器官において合成されるものである（Ｉｎｇｈａｍら、１９８３． ”Ｆｕｎｇｉｔｏｘｉｃ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｌｕｐｉｎｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ，”Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ｆｕｒ Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ， Ｃ ３８： １９４−２００）。後者の例としては、数種のプテロカルパンが挙げられ、この生合成は、特に、それぞれインゲン、アルファルファ、エンドウおよびダイズに由来するファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｌｉｎ）、メジカルピン、ピサチンおよびグリセオリン（ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ）に関しては、詳細な研究が行われている（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ． １９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ： ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ”Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学）， Ｖｏｌ． １， Ｕ． Ｓａｎｋａｗａ，編， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ７７３−８２３）。
【０００４】
イソフラボノイド化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗菌性であると知られているレベルにまで感染植物細胞中に蓄積することが示されている。この蓄積に関する時間的、空間的および量的特徴は、病害抵抗性に関するこれらの化合物の機能と一致するものである（Ｒａｈｅ， Ｊ． Ｅ． １９７３． ”Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ ｐｈａｓｅｏｌｌｉｎ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ａｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｂｙ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ，” Ｃａｎ Ｊ Ｂｏｔａｎｙ ５１： ２４２３−２４３０；Ｈａｄｗｉｇｅｒ， Ｌ． Ａ．およびＤ． Ｍ． Ｗｅｂｓｔｅｒ． １９８４． ”Ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｖｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｏｆ ｐｅａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｒａｃｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． Ｐｉｓｉ，” Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７４： １３１２−１３１４；Ｌｏｎｇら、１９８５． ”Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｖｅｓ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． Ｇｌｙｃｉｎｅａ，” Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７５： ２３５−２３９；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｍ． Ｋ．およびＥ． Ｗ． Ｗａｒｄ． １９８７． ”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ Ｉ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｗｏｕｎｄｉｎｇ ｏｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ． ｓｐ． Ｇｌｙｃｉｎｅａ，” Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ３１： ３８７−４０５）。ダイズ幼植物に対しＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）阻害剤を作用させることにより生じるグリセオリンの合成阻害は、疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ． ｓｐ． ｇｌｙｃｉｎｅａ）に対する抵抗性を破壊するものである（Ｍｏｅｓｔａ， Ｐ．およびＨ． Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ． １９８２． ”Ｌ−２−Ａｍｉｎｏｏｘｙ−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｗｉｔｈ ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ． ｓｐ． Ｇｌｙｃｉｎｅａ， ”Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ２１： ６５−７０）。真菌性病原体であるネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）の、エンドウのフィトアレキシンピサチンを弱める能力が低減された単離体は、エンドウに対する毒性が低減されたものであり、このことは、ピサチンが病害抵抗性応答に機能的に関与していることを示唆している（Ｋｉｓｔｌｅｒ， Ｈ． Ｃ．およびＨ． Ｄ． ＶａｎＥｔｔｅｎ． １９���４． ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｓａｔｉｎ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｐｉｓａｔｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，” Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏ １３０： ２６０５−２６１３）。
【０００５】
フィトアレキシンは、植物とその微生物病原体との間の抵抗性相互作用の過程で、病害をもたらす罹病性相互作用の過程よりも迅速にそして高いレベルで蓄積する（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ．およびＭ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ． １９９０． ”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，” Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ ２８： １６５−２３４）。従って、フィトアレキシンが蓄積する速度および絶対的なレベルに到達する速度の増大によって、抵抗性が高まると考えられている（Ｌａｍｂら、１９９２． ”Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｒｏｐ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，” Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： １４３６−１４４５）。
【０００６】
イソフラボンの特定のメチル化形態、例えばホルムオノネチン（７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）およびバイオチャニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）は、栄養補助物質としての利点を提供するものと示されている。例えば、バイオチャニンＡおよびホルムオノネチンはフィトエストロゲンであると報告されており、バイオチャニンＡは動物の癌研究モデルにおいて有効であることが示されている（Ｙａｎｇｉｈａｒａら、１９９３． ”Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ， ”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５８１５−５８２１；およびＺｈｏｕ−Ｊｉｎ−Ｒｏｎｇら、１９９８． ”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｂｌａｄｄｅｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｓｏｙ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｖｉａ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ， ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： ５２３１−５２３８）。
【０００７】
上述した例からわかるように、トランスジェニック植物におけるイソフラボノイド生合成の遺伝子操作は、植物、動物およびヒトの健康に対し肯定的に影響を与えるものでありうる（Ｄｉｘｏｎら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｒ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ，” Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： １３３−１６０）。しかしながら、イソフラボノイドフィトアレキシン蓄積の増大に関与する酵素は同定されておらず、イソフラボノイドフィトアレキシン生合成酵素をコードする遺伝子もまだ全てがクローニングされたわけではない。
【０００８】
植物におけるイソフラボンを導く生合成分岐経路は、カルコンシンターゼ反応およびカルコンイソメラーゼ反応によりフェニルプロパノイドおよびアセテート誘導前駆体から産生されるフラバノン中間体のチトクロムＰ４５０が媒介する２−水酸化／アリール移動を含むものである（図１）（Ｋｏｃｈｓ， Ｇ．およびＨ． Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ． １９８６． ”Ｅｎｚｙｍｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ，” Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５５： ３１１−３１８；Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９１． ”Ｐ−４５０ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ−４５０ ａｎｄ ＮＡＤＰＨ： Ｐ４５０ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７： ５９６９−５９７８；Ｓｔｅｅｌｅら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ，” Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６７： １４６−１５０；ならびにＪｕｎｇら、２０００． ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ： ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｉｎ ｌｅｇｕｍｅｓ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８： ２０８−２１２）。アリールの移動後、２−ヒドロキシイソフラバノン中間体は脱水されて、対応するイソフラボンが得られる（Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９８． ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ， ”Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９： ４９７−５０５）。ゲニステイン（４’，５，７−トリヒドロキシイソフラボン）は、ナリンゲニン（４’，５，７−トリヒドロキシフラバノン）のアリール移動／脱水により得られる生成物であるが、ダイゼイン（４’，７−ジヒドロキシイソフラボン）は、リキリチゲニン （４’，７−ジヒドロキシフラバノン）から同様に生成されるものである。ダイゼインの４’−Ｏ−メチル化によってホルムオノネチン（７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）が得られるが、ゲニステインの４’−Ｏ−メチル化からはバイオチャニンＡ（５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）が得られ、このバイオチャニンＡは、ヒヨコマメにおいて見出された抗癌作用を有する重要な化合物である（Ｙａｎａｇｉｈａｒａら、１９９３． ”Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３： ５８１５−５８２１）（図１）。
【０００９】
アルファルファおよび他のある種のマメ科植物（ヒヨコマメなど）において、４’−ヒドロキシルのメチル化は、メジカルピンなどのプテロカルパンフィトアレキシンに至るイソフラボノイドのベンゼン核をさらに置換するための前提条件である（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ． １９９９． ”Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ： ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，” Ｕ． Ｓａｎｋａｗａ編， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ ７７３−８２３）。この反応は、ヒト抗癌活性を有するイソフラボンが、植物に対し抗菌活性を有する下流の代謝産物に変換する経路の開始点であるため、生物学的に重要である。しかしながら、このＯ−メチル化反応の正確な機構には未だ不明な点がある。プテロカルパンメジカルピンにダイゼインではなくホルムオノネチンが導入された銅誘導型アルファルファ幼植物の放射性標識研究に基づいて、４’−Ｏ−メチル化がイソフラボン生合成のアリール移動反応の必要不可欠な部分でありうることが提案されている（Ｄｅｗｉｃｋ， Ｐ． Ｍ．およびＭ． Ｍａｒｔｉｎ． １９７９． ”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎ， ｉｓｏｆｌａｖａｎ ａｎｄ ｃｏｕｍｅｓｔａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ： ｃｈａｌｃｏｎｅ， ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｎｄ ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，” Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５９７−６０２）。しかしながら、アリール移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではメチル化を受けずに起こるものであり（Ｋｏｃｈｓ， Ｇ．およびＨ． Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ． １９８６． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １５５： ３１１−３１８；Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａら、１９９１． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７： ５９６９−５９７８；Ｋｅｓｓｍａｎｎら、１９９０． ”Ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ＩＩＩ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｒｐｉｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｔｒｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ９： ３８−４１；Ｓｔｅｅｌｅら、１９９９． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ，” Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６７： １４６−１５０）、サブタレニアン・クローバ（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ）の突然変異体では、ホルムオノネチンおよびバイオチャニンＡが実際には不在であり、代わりにダイゼインおよびゲニステインが蓄積する（Ｗｏｎｇ， Ｅ．およびＣ． Ｍ． Ｆｒａｎｃｉｓ． １９６８． ”Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ−ＩＩ． ���ｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒａｌｄｔｏｎ ｖａｒｉｅｔｙ，”Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７： ２１３１−２１３７）が、このことは、イソフラボンが４’−Ｏ−メチル化のための天然の基質であることを示している。この問題はまた、ダイゼインの４’−Ｏメチル化を触媒しうるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）依存性Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）を精製できることが証明されていないという事実により生ずるものでもある。その代わりに、アルファルファに由来するＳＡＭ依存性イソフラボンＯＭＴ（Ｈｅ， Ｘ−ＺおよびＲ． Ａ． Ｄｉｘｏｎ． １９９６． ”Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．），” Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３３６： １２１−１２９）によって、７位のヒドロキシル基のメチル化によりｉｎ ｖｉｔｒｏにて７−Ｏ−メチルダイゼイン（イソホルムオノネチン）が産生される。イソホルムオノネチンは、稀少な植物性天然産物であり、アルファルファ由来のものは報告されていない。
【００１０】
イソフラボン ７−ＯＭＴは、アルファルファからクローニングされており、この組換え酵素は、大腸菌において発現された場合にダイゼインを専らイソホルムオノネチンに変換する（Ｈｅら、１９９８． ”Ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ＸＸＩＩ． ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ７−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： ４３−５４）。この酵素活性およびその対応する転写産物は、メジカルピン生合成の他の酵素と同等に、誘発した（ｅｌｉｃｉｔｅｄ）アルファルファ細胞培養物において強力に誘導される（Ｄａｌｋｉｎら、１９９０． ”Ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） Ｉ． Ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９２： ４４０−４４６；Ｈｅら、１９９８． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： ４３−５４）。
【００１１】
多数の植物のＯＭＴ配列が現在データベースにおいて入手可能であり、その大部分は、リグニン生合成のヒドロキシケイ皮酸中間体、またはフラボノイド誘導体に対し作用する酵素をコードするものである（Ｉｂｒａｈｉｍら、１９９８． ”Ｐｌａｎｔ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｃｏｍｍｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”　Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： １−１０；Ｊｏｓｈｉ， Ｃ． Ｐ．およびＶ． Ｌ． Ｃｈｉａｎｇ． １９９８． ”Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７： ６６３−６７４）。ほぼ全ての場合において、この酵素は厳密な位置特異性を示す。例えば、一連の別個の位置特異的ＯＭＴは、クリソスプレニウム・アメリカナム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）におけるポリメチル化フラボノールの合成に関与している（Ｉｂｒａｈｉｍら、１９８７． ”Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｆｌａｖｏｎｏｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｃｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，” Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６： １２３７−１２４５；Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９６． ”ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ３’／５’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｆｌａｖｏｎｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｙｓｏｓｐｌｅｎｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２： １１６３−１１６９）。しかしながら、数種のＯＭＴは、より特異性がなく、フラボノイドおよびヒドロキシケイ皮酸の双方に対し作用する（Ｇａｕｔｈｉｅｒら、１９９８． ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，” Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５１： ２４３−２４９）か、または、リグニン生合成の十分に研究されているカフェー酸／５−ヒドロキシフェルラ酸ＯＭＴなどの１種以上の関連基質に対し特異性があると考えられる（Ｂｕｇｏｓら、１９９１． ”ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅａｓｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ−ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ／５−ｈｙｄｒｏｘｙｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｏｆ ａｓｐｅｎ，” Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １７： １２０３−１２１５；Ｌｉら、２０００． ”５−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒｙｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｙｒｉｎｇｙｌ ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ａ ｎｅｗ ｖｉｅｗ ｏｆ ｍｏ��ｏｌｉｇｎｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ，” Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５： ６５３７−６５４５）。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて異なる位置特異性を示すＯＭＴまたは他の植物性天然産物の生合成酵素に関しては報告されていない。
【００１２】
イソフラボン ７−ＯＭＴの異なる位置特異性をｉｎ ｖｉｖｏにて利用することによって、生物学的に活性な４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを遺伝的に操作することが可能となる。
【００１３】
発明の概要
一態様において、本発明は、ターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物のレベルを増大する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて該イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させることが含まれる。特に、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンであってもよいし、または４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質であってもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１４】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生しないターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、該トランスジェニック植物において適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させることが含まれ、ここで該トランスジェニック植物は４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するものである。特に、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンであってもよいし、または４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質であってもよい。ターゲット植物は、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をコードする天然のＤＮＡを含有していてもよい。あるいは、ターゲット植物がその必要な酵素を欠損する場合には、欠損酵素をコードするＤＮＡ断片を用いて形質転換されたものであってもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１５】
他の態様において、本発明は、非植物細胞系において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生する方法であり、該方法は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質を産生するのに必要な他のイソフラボノイド生合成酵素を全て含有するように遺伝的に形質転換された細胞において、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて発現させることにより行うものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１６】
他の態様において、本発明は、アルファルファなどのトランスジェニック飼料用マメ科植物においてホルムオノネチン、少なくとも１種のそのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを低減する方法であり、該方法には、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いてアンチセンス発現またはセンス遺伝子介在型のサイレンシングを行うことが含まれる。あるいは、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼは、核酸介在型の挿入不活化によりダウンレギュレートされてもよい。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１７】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを低減する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現、センス遺伝子介在型のサイレンシングまたは核酸介在型の挿入不活化を誘導することが含まれる。この方法は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシン、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群より選択される化合物の低減に有用である。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１８】
他の態様において、本発明は、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質またはそのコンジュゲートの合成に必要な酵素を全て含有するターゲット植物において、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質、少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを低減する方法であり、該方法には、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて該ターゲット植物を形質転換することによりトランスジェニック植物を作製し、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にて、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子のアンチセンス発現またはセンス遺伝子介在型のサイレンシングを誘導し、それにより対応する非メチル化前駆体、そのコンジュゲートまたはこれらの混合物のレベルを増大させることが含まれる。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００１９】
他の態様において、本発明は、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の製造方法であり、該方法には、全植物体または細胞懸濁培養物に７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の非メチル化イソフラボン前駆体を接触させることが含まれ、ここで該全植物体または細胞懸濁培養物は、適切な構成または誘導プロモーターの制御下にてイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されているものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２０】
他の態様において、本発明は、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の産生方法であり、該方法には、可溶性のまたは固定化したイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ酵素と非メチル化イソフラボン前駆体を接触させて７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物にすることが含まれ、ここで該酵素は、トランスジェニック植物または異種系における対応するイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の発現により産生されたものである。好ましい実施形態において、異種系は、トランスフェクトした細菌、酵母および昆虫細胞からなる群より選択されるものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２１】
さらに他の態様において、本発明は、植物における４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのトランスジーン発現を判定するための試薬として使用する４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼに対する抗血清である。
【００２２】
さらに他の態様において、本発明は、ターゲット植物の病害抵抗性を増大させる方法であり、該方法は、該ターゲット植物をイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換することにより行うものであり、ここで該形質転換植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物の少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルと比較した場合に該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルの増大を示すものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。
【００２３】
さらに他の態様において、本発明は、食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含む組成物であり、該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドはイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されたトランスジェニック植物の少なくとも一部から単離されたものであり、該トランスジェニック植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルと比較した場合に該４’−Ｏメチル化イソフラボノイドレベルの増大を示すものである。好ましい実施形態において、植物の形質転換に使用するＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである。植物としてはマメ科植物が挙げられる。
【００２４】
他の態様において、本発明は、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であり、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルの増大を示すものである。本発明はまた、上記トランスジェニック植物から得られる種子、子孫、および種子から得られる子孫を包含する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であり、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルの低減を示すものである。本発明はまた、上記トランスジェニック植物から得られる種子、子孫、および種子から得られる子孫を包含する。
【００２６】
詳細な説明
トランスジェニックアルファルファにおいて逆遺伝学および異所性発現手法を利用することにより、アルファルファイソフラボンＯＭＴが、異なる産物、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏではイソホルムオノネチンであるのに対してｉｎ ｖｉｖｏではホルムオノネチンの形成に関与していることが見出された。アルファルファイソフラボンＯＭＴのｉｎ ｖｉｖｏ位置特異性によって、トランスジェニック植物におけるホルムオノネチンレベルは、現在この化合物のレベルを低減させる目的で遺伝的に操作されており、それによって飼料の品質が改善されうる。他の実施形態において、イソフラボン４’−Ｏ−メチル化のトランスジェニック低減を利用すると、この反応の中間体の前駆体、すなわち重要な栄養補助物質であるダイゼインおよびゲニステインのレベルを増大させうる。本明細書では、イソフラボンＯＭＴは、感染したアルファルファ葉において、抗菌性フィトアレキシンメジカルピン産生のための律速酵素として機能的に作用し、その結果トランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボンＯＭＴの過剰発現によって、病原菌による感染後のメジカルピンレベルが有意に増大し、それにより病害抵抗性が強力に増大することが示される。アルファルファＩＯＭＴの機能特定は、ホルムオノネチンまたは他の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養補助物質（例えばバイオチャニンＡ、テキサシン、アフロルモシンおよびプソイドバプチゲニン）のレベルを、これらの化合物を産生する植物において増大または低減する、あるいはメジカルピンまたは関連する４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシン（例えばマアキアインまたはピサチン）のレベルを増大することにより病害抵抗性を改善するために現在可能な方法で行った。従って、マメ科植物におけるイソフラボンＯＭＴのトランスジェニック発現は、病害抵抗性を改善するためのフィトアレキシンレベルおよび健康促進栄養補助用植物化学物質の両者を遺伝子操作するために利用可能である。更に、ＩＯＭＴはまた、天然にはイソフラボノイド類を産生しないが、必要なイソフラボンシンターゼの導入によりイソフラボイド類を遺伝子操作した植物または他の生物においてイソフラボン４’−Ｏ−メチル化を遺伝子操作するために利用しうる。
【００２７】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）が、図１に示す経路によりホルムオノネチン、従ってホルムオノネチンに由来するメジカルピンのｉｎ ｖｉｖｏ産生に関与することを証明するため、ＩＯＭＴを過少発現または過剰発現するトランスジェニックアルファルファ植物を以下のようにして作製した。
【００２８】
実施例１：　典型的なＩＯＭＴ ｃＤＮＡを含む発現プラスミドの構築および特性決定
全長アルファルファＩＯＭＴ８ ｃＤＮＡ（配列番号１および図２）を、アルファルファにおける構成的発現のためにカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下でセンスおよびアンチセンス方向に配置した。全ての組換えＤＮＡ技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載のとおり実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９． 「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第２版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。センスベクターの構築のために、全長ＩＯＭＴ８ ｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐＥＴ１ ５ｂ／ＩＯＭＴ８（Ｈｅら， １９９８． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： ４３−５４）を、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化した。１．２Ｋｂの断片を単離し、プラスミドｐＲＴＬ２（Ｒｅｓｔｒｅｐｏら， １９９０． 「植物性ポリウイルスタンパク質の核輸送（Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｏｌｙｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ９８７−９９８）のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。アンチセンスベクターの構築のために、全長ＩＯＭＴ８ ｃＤＮＡを以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した：５’−ＧＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号２）および５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３）、これらには、Ｋｐｎ１およびＢａｍＨＩ制限部位が加えられており、ＰＣＲ産物をＫｐｎ１およびＢａｍＨＩで消化して、ｐＲＴＬ２にサブクローン化した。ｐＲＴＬ２中にＩＯＭＴ配列を含むプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、タバコエッチウイルス５’非翻訳リーダー配列、ＩＯＭＴ配列、およびＣａＭＶターミネーターを含む２．２Ｋｂの断片を単離し、バイナリーベクターｐＧＡ４８２（Ａｎ， Ｇ． １９８６． 「植物性プロモーター発現ベクターの開発および形質転換されたタバコ細胞におけるノパリン合成酵素プロモーターの示差的活性の分析のためのそれらの利用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌｓ）」， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８１： ８６−９１）のＨｉｎｄＩＩＩ部位へ連結した。該構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４中へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ−ｐｏｒａｔｏｒ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）によって導入した。中間体プラスミドｐＲＴＬ２およびバイナリーベクターｐＧＡ４８２を利用する遺伝子構築物を図３Ａに示す。
【００２９】
実施例２：　アルファルファの形質転換によるＩＯＭＴトランスジーンのゲノム挿入
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ） Ｌ．栽培品種Ｒｅｇｅｎ ＳＹを、選択マーカーとしてカナマシン（２５ｍｇ／Ｌ）を使用して、形質転換し、不定胚形成によって再生した（Ｔｈｏｍａｓら， １９９０． 「アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換組織を使用することによるメディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）における異種間体細胞ハイブリッドの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｉｓｓｕｅ）」， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ６９： １８９−１９８）。三葉性の葉を、７０％エタノールで１０秒間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面を滅菌し、次にＩＯＭＴ構築物または空のベクター（対照）を収容するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４の懸濁液中に１０〜１５分間浸漬した。蒸留水ですすいだ後、組織をペーパータオル上で吸い取らせ、ＭＳ培地上にプレーティングした（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ， Ｔ．およびＳｋｏｏｇ， Ｆ． １９６２． 「タバコ組織培養を用いた迅速な生長およびバイオアッセイのための改変培地（Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）」， Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ １５： ４７３−４９７）。該培地には、Ｂ５ビタミン類、０．２５ｇ／ｌカゼイン加水分解物、１０μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、５μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．１ｍＭ アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）および３０ｇ／ｌスクロースを含む（Ａ１培地）。共培養の３日後に、組織を上記培地であるけれども２μＭ ＢＡＰ、５００μｇ／ｍｌ カルベネシリン、２５μｇ／ｍｌ カナマイシンを含み、アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）を含まない培地（Ａ２培地）に移した。２次培養の４週間後に、胚の成長のためにカルス（ｃａｌｌｉ）を３０ｍＭ Ｌ−プロリン添加するけれども、ＢＡＰは含まないＡ２培地（Ａ３培地）に移した。不定胚を胚の発芽のために２，４Ｄを含まないＡ３培地（Ａ４培地）に移した。発生した幼植物を最終的に根付かせるためにカゼイン加水分解物およびプロリンを含まないＡ４培地に移した。鉢植えのカナマイシン耐性小植物を温室で維持した。
【００３０】
上記の不定胚形成を介する植物再生後、形質転換体を、ＩＯＭＴトランスジーン配列のゲノムへの挿入についてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。ゲノムＤＮＡは、Ｅｄｗａｒｄｓら（Ｅｄｗａｒｄｓら， １９９１． 「ＰＣＲ分析のための植物ゲノムＤＮＡの単純かつ迅速な調製方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ）」， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： １３５９）にしたがって抽出した。形質転換体の葉の組織を、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で抽出し、小型微量遠心機中でで５分間遠心分離した。そして、上清を、２−プロパノールが等量となるように添加した新しいエッペンドルフチューブに移した。室温で２分間インキュベーションした後、ＤＮＡを遠心分離によって沈澱させた。ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で再懸濁した。ＰＣＲ反応を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．４μＭ オリゴヌクレオチドプライマーおよび２００ｎｇの植物ＤＮＡを含む５０μｌ容量中で実施した。ＩＯＭＴ配列のＰＣＲ増幅を、プライマーとしてＩＯＭＴ８の５’（５’−ＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＡＴＧＧＣ−３’）（配列番号４）および３’（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡ−３’）（配列番号５）の配列を用いて実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ４８０ サーモサイクラーを用いて、変性（９４℃、１分間）、アニーリング（５５℃、１分間）、および伸長（７２℃、１分間）を３５サイクルならびに最終サイクルに５分間の伸長を行なう増幅を行った。対照は、空のベクターを形質転換した植物および形質転換しない植物由来のＤＮＡを含んだ。７０％を超える形質転換体が、全長ＩＯＭＴ ｃＤＮＡ挿入物を含んでいた（データは示さず）。作製された全てのトランスジェニック系統は表現型的には正常であった。トランスジーンのゲノムへの組み込みが、サザンブロット分析によって形質転換体のサブセット中に確認された。これを実施するために、ゲノムＤＮＡを葉の組織から単離し（Ｅｄｗａｒｄｓら， １９９１． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： １３５９）、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動し、キャピラリーブロッティングによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ 膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に転写した。この膜を３２Ｐで標識した８００ｂｐのＩＯＭＴプローブ（配列番号１および図２のヌクレオチド２４９−１０３５由来）とハイブリダイズし、０．２ ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において４２℃で２０分間、ならびに６５℃で３０分間を３回の洗浄を行なった。センス形質転換体 ＃５２、＃６１、＃６２、＃６７、＃６９および＃７８は分析した他の系統よりもより多いトランスジーンコピー数を有���ていた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化およびＴ−ＤＮＡ 左境界領域によるハイブリダイゼーションに続くサザンブロット分析によって個々の形質転換体が独立した組み込み事象から生ずることが示唆された。
【００３１】
実施例３：　アルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清の使用によるＩＯＭＴトランスジーンの確認
ＩＯＭＴ転写産物は健常なアルファルファの葉においては発現されず（Ｈｅら， １９９８． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： ４３−５４）、それゆえ、葉におけるＩＯＭＴ活性の存在を実証することによってＩＯＭＴトランス遺伝子の発現が確認される。従って、代表的なセンス形質転換体およびベクター対照トランスジェニックアルファルファ植物由来の葉の組織抽出物を、葉における酵素の異所性発現のレベルを評価するために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において発現されるアルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を使用して、ウェスタンブロット分析を行なった。ＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から発現されたタンパク質抗原を用いてウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．， Ｄｅｎｖｅｒ， ＰＡ）を免疫化することによって産生した（Ｈｅら， １９９８． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６： ４３−５４）。葉の組織由来のタンパク質抽出物をサンプルバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ６．８， １％ＳＤＳ， ２．５％ ２−メルカプトエタノール， ５％グリセロール）中で可溶化した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、転写バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．３， １５０ｍＭグリシン， ２０％ｖ／ｖメタノール）中での電気泳動ブロッティングによってニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に転写した。ブロットを、１次抗体として精製アルファルファＩＯＭＴに対するポリクローナル抗血清を、２次抗体として抗（ウサギＩｇＧ）ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いてプローブした。ＩＯＭＴシグナルを、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）と一緒にインキュベーションした後すぐにブロットをＸ線フィルムに感光させることによって検出した。
【００３２】
実施例４：　トランスジェニック発現ＩＯＭＴの影響
ＩＯＭＴ酵素活性を温室で維持された植物から取られた葉の組織由来の抽出物で測定した。ＩＯＭＴ活性を先に記載された通り分析した（Ｈｅ， Ｘ−ＺおよびＲ．Ａ．Ｄｉｘｏｎ． １９９６． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３３６： １２１−１２９）。葉の組織を液体窒素中で粉末に破砕し、酵素アッセイバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．３， ５ｍＭ ＥＤＴＡ， １４ｍＭ ２−メルカプトエタノール， １０％ＰＶＰＰ）中で抽出した。遠心分離後、上清を酵素活性アッセイのために使用した。該反応混合物は、総容量１２０μｌ中に１００ｎｍｏｌダイゼイン、３００ｎｍｏｌ Ｓ−［３Ｈ−メチル］アデノシル−Ｌ−メチオニンおよび酵素抽出物を含んだ。反応を、３０℃で３０分間行ない、１００μｌの酢酸の添加によって停止させた。反応混合物を０．５ｍｌ酢酸エチルで抽出し、窒素下で酢酸エチルを蒸発させ、そして残渣をメタノール中で再懸濁した。生成物分析のため、再懸濁した残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｓｉ２５０； Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）にアプライした。クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン（８：１：１， ｖ／ｖ）中での展開に続いて、対象の生成物をＴＬＣプレートから掻き取り、放射能を液体シンチレーションカウントによって定量した。ＨＰＬＣによる生成物分析のために、再懸濁した残渣２０μｌをＣ１８カラム（粒径５μｍ， ４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）にアプライし、溶媒Ａ中で溶媒Ｂを増加させる勾配によって溶出した（溶媒Ａ：１％リン酸水溶液；溶媒Ｂアセトニトリル：０〜４０分、２０〜４５％Ｂ；４０〜４２分、４５〜９５％Ｂ）。溶出物を、２８７ｎｍでモニターした。生成物の同定を、ホルムオノネチンおよびイソホルムオノネチンの基準サンプルを用いて共溶出（ｃｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）およびＵＶスペクトルのダイオードアレイ分析によって確認した。
【００３３】
ＩＯＭＴセンス構築物を収容する複数の独立したトランスジェニック系統が高いＩＯＭＴ活性を発現した（図３Ｂ）。しかしながら、高いトランスジーンコピー数を有する＃６２および＃７８系統は、ＩＯＭＴ活性を発現しなかった。免疫ブロッティングによって測定したＩＯＭＴタンパク質レベルと葉から抽出可能な酵素活性との間には直接の関係があった。ダイゼインおよびＳ−［３Ｈ−メチル］アデノシル−Ｌ−メチオニンから形成される標識生成物のＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析によって、イソホルムオノネチンのみが健常な非形質転換アルファルファの葉（データ示さず）から抽出された酵素によって生成されて、これは先にイソフラボン７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの酵素機能とされているものと一致した。
【００３４】
アルファルファの根は、ホルムオノネチンマロニルグルコシド（ＦＭＧ）、メジカルピンおよびメジカルピンマロニルグリコシド（ＭＭＧ）を蓄積する（Ｓｕｍｎｅｒら， １９９６． 「マメ科植物抽出物中のフラボノイドグルコシドについての高性能液体クロマトグラフィー／連続流液体２次イオン質量分光測定（Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ）」， Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ３１： ４７２−４８５）。ＩＯＭＴのダウンレギュレーションが根における上記化合物のレベルに影響を与えるか否かを調べるために、フェノール化合物の抽出およびＨＰＬＣ分析を先に記載の通りに実施した（Ｄａｌｋｉｎら， １９９０． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９２： ４４０−４４６）。等量の組織を液体窒素中で粉砕し、アセトンを用いて一晩室温で２回抽出した。抽出物を、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を回収した。アセトンを窒素下で蒸発させ、残渣をメタノール中に溶解した。不溶性物質を、１２，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。該溶液２０μｌをＣ１８ＨＰＬＣカラム（粒径５μｍ， ４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ）にアプライし、溶媒Ｂを増加させる勾配によって溶出した（溶媒Ａ：１％リン酸水溶液；溶媒Ｂ、アセトニトリル：０〜４０分、２０〜４５％Ｂ；４０〜４２分、４５〜９５％Ｂ）。溶離液の吸光度を２８７ｎｍでモニターした。ホルムオノネチン、イソホルムオノネチン、メジカルピンおよびそれらのコンジュゲートについての保持時間および検量線を基準サンプルにより確立した。温室で生育させた植物からの根の抽出物のＨＰＬＣ分析によって、ホルムオノネチン、ＦＭＧおよびＭＭＧレベルは非常に変化しやすく、代謝産物レベルにおける差異が有意であるか否かを調べるのを困難にしていることが示された。それゆえ、アンチセンストランスジェニック系統の分析のために、代謝産物レベルに基づいて最初に選択された植物を生長繁殖させ、生育チャンバー条件下で生育した。３種類の独立したアンチセンス＃４２、＃５４および＃６０系統が、４６の独立して繁殖させた対照植物の集団の平均値と比較して、ＦＭＧについては３３％〜４４％、メジカルピンについては２９％〜７１％、およびＭＭＧについては１８％〜５１％、これらの化合物レベルの有意な減少を示した。上記結果はＩＯＭＴアンチセンス構築物の発現が構成的根イソフラボンレベルを減少させることを示す。
【００３５】
葉におけるＩＯＭＴの強力な異所性発現を有する多数の独立したアルファルファ形質転換体を、構成的イソフラボノイド中間体レベルについて分析した。イソフラボノイド経路のみ、感染または誘発などのストレスに続いてアルファルファ葉中で有意に発現される（Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｖ．Ｊ． １９７２． 「アルファルファのスリー・リーフ・スポット病（ｔｈｒｅｅ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ）におけるフィトアレキシンであるメジカルピンの役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ ｍｅｄｉｃａｒｐｉｎ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ）」， Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ ２：２８９−３００； Ｐａｉｖａら， １９９４． 「アルファルファにおけるイソフラボノイド代謝の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ）」， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ ３８： ２１３−２２０）。それゆえ、初期イソフラボノイド経路基質を生成する酵素の誘導がない場合に、ＩＯＭＴを過剰発現する葉と対照の葉のＨＰＬＣプロファイルは同一であった（図４Ａおよび図４Ｂ）。イソホルムオノネチンは検出されなかった。Ｐｉバッファーで処理した対照およびＩＯＭＴを過剰発現する植物、ならびに葉にダイゼインを与えた対照植物由来の抽出物中におけるイソホルムオノネチンの保持時間に非常に近似して動く少数の化合物は、フラボノイド生合成の中間体である２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンであることが示された（図４Ａ−４Ｃ）。しかしながら、ＩＯＭＴを過剰発現するトランスジェニックアルファルファの葉に未標識ダイゼインを与えた際にイソホルムオノネチンが生成したのに対して（図４Ｄ）、対照植物の葉に与えた時にはダイゼインは未変換のまま残った（図４Ｃ）。したがって、植物中におけるＩＯＭＴの位置特異性は、ストレスを受けていない組織へ基質を外因的に与えた場合のｉｎ ｖｉｔｒｏで示されるものと同一であり、再度これはイソフラボン７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼという名称の酵素と一致した。
【００３６】
切片を、センス＃６７および＃６９系統から、ならびにある範囲の非形質転換体系統および空のベクターを用いた対照系統から取り、生育チャンバー中で繁殖させた。イソフラボノイド経路の酵素を誘導するために、切断した葉柄から取った三葉性の葉を８時間室温で３ｍＭ ＣｕＣｌ２に曝露することによって誘発した。本方法はアルファルファにおけるイソフラボノイド蓄積の誘発のための信頼し得る方法である（Ｄｅｗｉｃｋ， Ｐ．Ｍ．およびＭａｒｔｉｎ， Ｍ． １９７９． 「アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）におけるプテロカルパンおよびイソフラバンフィトアレキシン類の生合成：プテロカルパンおよび２’−ヒドロキシイソフラバン類の生化学的相互転換（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎ ａｎｄ ｉｓｏｆｌａｖａｎ ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ： ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｔｅｒｏｃａｒｐａｎｓ ａｎｄ ２’−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｓ）， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５９１−５９６）。三葉性の葉をペトリ皿中で２層の湿性フィルターの上に置き、さらに２４時間インキュベートした。次に、誘導したイソフラボノイド類レベルを上記の通りＨＰＬＣによって測定した。銅に曝露しなかった葉は、図５Ｃおよび５Ｄに示すように検出可能なホルムオノネチンまたはメジカルピンを含まなかった。銅処理によって種々の対照系統においてホルムオノネチンおよびメジカルピンの適度な誘導を生ずるが、ＩＯＭＴ過剰発現系統において非常に強力な誘導を生じた（図５Ａおよび図５Ｂ）。イソフラボノイド経路が誘発によって最初に誘導される場合に、誘発したアルファルファの葉におけるＩＯＭＴの過剰発現がホルムオノネチンおよびメジカルピンレベルの有意な増加につながることをそれぞれの系統からの切片の反復分析によって明確に示された（図５Ｃおよび５Ｈ）。重要なことに、対照またはＣｕＣｌ２処理をしたさまざまな系統の葉からの抽出物中でＩＯＭＴ活性を測定した場合に、生成物が常にイソホルムオノネチンであった。これはＣｕＣｌ２自体は酵素の位置特異性に影響を与えないことを示す。誘発した葉のサンプルのいずれにもイソホルムオノネチンは観察されなかった。
【００３７】
上記実験はアルファルファ茎枯病菌（Ｐｈｏｍａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）の胞子による感染を利用して繰り返した。この処理は、アルファルファの葉においてイソフラボノイド経路の酵素を誘導し、結果的にメジカルピンの蓄積が起きる（Ｐａｉｖａら， １９９４． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔ ３８： ２１３−２２０）。アルファルファ茎枯病菌（Ｐ． ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）に曝露した後の対照の空のベクターを用いた植物およびＩＯＭＴを過剰発現する植物（＃６７系統）由来の葉についての代謝産物プロファイルをそれぞれ図６Ａおよび図６Ｂに示す。菌の感染によって対照系統において、ホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンの出現を生ずるが（図６Ａ）、ＩＯＭＴを過剰発現する系統において非常に強力な誘導を生じた（図６Ｂ）。またイソホルムオノネチンは感染させた葉のいずれのサンプルにおいても観察されなかった（図６Ｂ）。感染させていない対照植物においてホルムオノネチングルコシドまたはメジカルピンは観察されなかった（図６Ｃおよび図６Ｄ）。菌感染後さまざまな時間で回収した系統のそれぞれからの切片についての反復分析によって、感染したアルファルファの葉においてＩＯＭＴの過剰発現が、対照系統と比較してホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンをより初期に誘導しレベルを増大させることが明確に示された（図６Ｅおよび図６Ｆ）。
【００３８】
センス形質転換体＃７８は高いトランスジーンコピー数を有するが、葉においてＩＯＭＴタンパク質は発現しなかった（図３Ｂ）。後成的発現（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ） 遺伝子サイレンシングを示すと思われた（Ｍａｔｚｋｅ， Ｍ．Ａ．およびＡ．Ｊ．Ｍ． Ｍａｔｚｋｅ． １９９５． 「いかにそしてなぜ植物は相同的遺伝子（トランスジーン）を不活性化するのか？（Ｈｏｗ ａｎｄ ｗｈｙ ｄｏ ｐｌａｎｔｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ （ｔｒａｎｓ） ｇｅｎｅｓ？）」， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０７： ６７９−６８５）。＃７８系統および空のベクターを用いた対照＃５６Ｃ系統の切片についての反復分析によって、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ． ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）を用いた感染後、＃７８系統におけるホルムオノネチングルコシドおよびメジカルピンの誘導が対照植物におけるものよりも有意に少ないことが示された（図７Ａおよび図７Ｂ）。総体的には、減少はホルムオノネチンコンジュゲートに対して６５％およびメジカルピンに対して５８％であり、これは２種類の系統の植物における相対的ＩＯＭＴ活性を反映するものであった。したがって、誘発または感染させたアルファルファの葉におけるＩＯＭＴのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションに関するデータは、イソフラボノイド経路の残りの部分が誘導される場合に、ＩＯＭＴが、イソホルムオノネチンを生成する７−Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしてよりも、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド（アルファルファにおけるホルムオノネチンおよびメジカルピン）の形成において機能的に作用する。
【００３９】
アルファルファ茎枯病菌（Ｐｈｏｍａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）は、遺伝的形質転換のために利用される栽培品種（Ｒｅｇｅｎ ＳＹ）に対して病状を生じさせる、成功的なアルファルファの病原体である。フィトアレキシンであるメジカルピンのより迅速な蓄積によって、ＩＯＭＴを過剰発現する植物におけるＰｈｏｍａに対する耐性を生じるか否かを決定するために、菌胞子が入り、罹患しやすいアルファルファ栽培種に対して感染を開始させるように、ＩＯＭＴを過剰発現している植物および対照植物の葉の上に小さい傷の線を生じるためにピンホイールを用いて接種した。次いで、感染後５日目に茶色いＰｈｏｍａによる傷のサイズを測定した。結果は、傷のサイズは対照と比較して、ＩＯＭＴを過剰発現している＃６７および＃６９系統において非常に減少していることが示された。図８Ａおよび８Ｂに示すように、感染後５日目の複数の傷の測定によって、平行して生育および感染させた対応する対照系統についての１．１７ｍｍ（ｎ＝１００）に対して、対照植物については０．９６ｍｍ（ｎ＝１００）、および＃６９系統については０．４１ｍｍ（ｎ＝１００）、ならびにＩＯＭＴ過剰発現＃６７系統については０．４６ｍｍ（ｎ＝１００）の平均の傷のサイズが得られた。したがって、ＩＯＭＴのトランスジェニック過剰発現は、アルファルファにおいて、およびその相似性により４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドがフィトアレキシンとして働く他の植物において病気への耐性を操作するための効果的に機能するストラテジーである。
【００４０】
トランスジェニックアルファルファを用いた酵素アッセイ、供給、誘発および感染の研究結果を総合すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび植物中の両方において外因的に供給されるダイゼインからイソホルムオノネチンを生成するようにダイゼインの７位をＩＯＭＴがメチル化するが、ダイゼインが植物中の内因性イソフラボノイド経路を通して供給される場合には、ホルムオノネチンを生成する４’位特異的メチル化に関与することが示される。天然には本酵素を含有するトランスジェニック植物における酵素の発現を改変するためにリバース遺伝子的実験を行なうことによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏと比較してｉｎ ｖｉｖｏにおいてこの珍しい異なるＩＯＭＴ位置特異性が今回見出された。
【００４１】
トランスジェニックアルファルファにおけるＩＯＭＴ発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド類のレベルに対して量的に対応する影響を及ぼし、このことはＩＯＭＴがアルファルファにおけるこれらの化合物の合成のための律速酵素として機能的に作用することを示す。対照的に、イソフラボノイド生合成における主要な律速段階はイソフラボン合成酵素チトクロームＰ４５０によって触媒されるイソフラボノイド分枝経路への導入点であることが先に報告されている（Ｓｔｅｅｌｅら， １９９９． 「ダイズにおけるイソフラボノイド生合成のアリール移動反応を触媒する酵素の分子特性決定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｒｙｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ）」， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３６７： １４６−１５０； およびＪｕｎｇら， ２０００． 「マメ科植物におけるイソフラボン類生合成のための主要酵素であるイソフラボン合成酵素の同定および発現（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ｔｈｅ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ ｉｎ ｌｅｇｕｍｅｓ）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８： ２０８−２１２）。
【００４２】
上記データは、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド類の生成の増大およびＩＯＭＴ過剰発現植物における結果として生じる病気への耐性が、上昇したＩＯＭＴレベルの直接の結果であるかもしれないことを示唆し、それゆえ、律速段階としてのこれらの化合物の合成におけるＩＯＭＴの直接的関与を指摘する。しかしながら、４’−Ｏ−メチル化化合物はアルファルファにおけるストレス誘導性フィトアレキシンであることから、ＩＯＭＴ活性が上昇した系統は、ＩＯＭＴによる流れ（ｆｌｕｘ）とは別に、フィトアレキシンの生成を増大させるようなある種の代謝性ストレスを有する可能性がある。非誘発または非感染ＩＯＭＴ過剰発現植物においては、検出可能なフィトアレキシンが欠如していることを考慮して、代謝性ストレスを有さないと思われる（図５Ｃと５Ｄ、および図６Ｃと６Ｄ）。さらにこの可能性を除外するために、およびイソフラボノイド経路の他の酵素がＩＯＭＴの発現後にモジュレートされるか否かを調べるために、本発明者らは、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ． ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）による感染後の時間の関数として、対照およびＩＯＭＴ過剰発現系統におけるフェニルアラニンからメジカルピンへの変換に関与する８つの酵素をコードする転写産物のレベルを調べた。表１の結果から、先ず第一にＩＯＭＴ転写産物がＰｈｏｍａ感染のない＃６９系統において構成的に高く、トランスジーンが３５Ｓプロモーターの制御下にあることと一致することが確認される。異所的にＩＯＭＴを発現する非感染葉において、フェニルプロパノイド／イソフラボノイド経路の他の酵素の転写産物レベルは、対照レベルよりも有意には上昇しなかった。したがって、ＩＯＭＴの過剰発現は、それ自体では、ストレス応答としてイソフラボノイド経路を誘導せず、このことは図５および６の代謝プロファイルデータと一致する。
【００４３】
イソフラボノイド経路の様々な酵素に対する標識ｃＤＮＡを用いて、空のベクターを用いた対照（＃６４Ｃ系統）およびＩＯＭＴ過剰発現（＃６９系統）アルファルファのＰｈｏｍａを感染させた葉におけるイソフラボノイド経路転写産物のＲＮＡゲルブロット分析を表１に示す。全ＲＮＡを、アルファルファ茎枯病菌（Ｐ． ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）感染（レーンＰ）または水処理（レーンＷ）後、６、２４、および４８時間目に葉から単離し、アルファルファＰＡＬ、アルファルファＣ４Ｈ、アルファルファ アセチルＣｏＡ カルボキシラーゼ、アルファルファＣＨＩ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＩＦＳ、アルファルファＩＯＭＴ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ Ｉ２’ＯＨおよびアルファルファＩＦＲに対する標識ｃＤＮＡプローブを用いてプローブした。ブロットを取り除き、ローディングおよび転写効率を調べるためにリボソームＲＮＡプローブと再プローブした。Ｐｈｏｍａによる感染に後には、空のベクターを用いた対照アルファルファ葉のフィトアレキシン経路酵素転写産物の弱い、比較的緩徐な誘導があった。この応答は、互換性相互作用に見出される典型的なものである（Ｌａｍｂら， １９９２． 「細菌性病原体に対する作物の耐性を増大させるための新進のストラテジー（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｒｏｐ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）」， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４３６−１４４５）。しかしながら、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、シンナマート ４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、およびイソフラボン還元酵素（ＩＦＲ）をコードする転写産物レベルは、感染１２時間後までの対照系統においてよりもＩＯＭＴ過剰発現＃６９系統においてより多い。またこれらの転写産物は、感染６時間後までに＃６９系統で有意に誘導され、一方対照において感染６時間後まででは、ＩＦＳおよびＩＦＲ転写産物は誘導されないままだった。カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）およびイソフラボン ２’−ヒドロキシラーゼ（Ｉ２’ＯＨ）の転写産物レベルは、感染後に対照と比較して＃６９系統においてわずかに上昇した。対照的に、カルコン合成酵素反応のためにマロニルＣｏＡを提供し、誘発アルファルファ細胞においてフィトアレキシン応答の一部分として共誘導（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ）される酵素である（Ｓｈｏｒｒｏｓｃｈら， １９９４． 「アルファルファにおけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの分子クローニング、特性決定および誘発（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ）」， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：４３２３−４３２７）、サイトゾルアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする転写産物は、いずれの処理においても空のベクターを用いた対照系統においてよりも＃６９系統において有意には高くなかった。
【００４４】
【表１】
2004500803.tif 000002
2004500803.tif 000003
【００４５】
さまざまな実施形態において、ＩＯＭＴ遺伝子は、限定されるものではないが、アグロバクテリウム介在型形質転換（Ｈｏｒｓｈ， Ｂ．ら， １９８５． 「植物中へ遺伝子を形質転換するための単純かつ一般的な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１）」またはパーティクル銃撃（Ｋｌｅｉｎら， １９８８． 「パーティクル銃撃工程による天然型のタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）細胞の恒常的遺伝的形質転換（Ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）」， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：８５０２−８５０５）を含む標準的植物形質転換手法により植物中へ導入することができる。
【００４６】
本発明において、４−Ｏ−メチル化フィトアレキシン、栄養補助物質（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、それらのコンジュゲートまたはそれらの混合物の生成を誘導する特性を有するＩＯＭＴをコードする任意のポリヌクレオチドを利用してもよい。本発明において有用なＩＯＭＴをコードするポリヌクレオチドには、ＩＯＭＴの優性陰性型をコードするポリヌクレオチドである配列番号１および図２の配列、ならびに配列番号１および図２の配列と相補的な核酸配列が挙げられる。相補的配列にはアンチセンスヌクレオチドを含んでもよい。配列がＲＮＡである場合、配列番号１および図２の配列のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴは、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵと置き換えられる。本発明においては、上記核酸配列の断片も含まれ、該断片は生理的条件またはＩＯＭＴの近縁のファミリーのメンバーにおいて配列番号１および図２の配列のタンパク質をコードするＤＮＡと選択的にハイブリダイズできる十分な長さのヌクレオチドである。配列番号１および図２の配列の変性変異体、ＴがＵであってもよい配列番号１および図２の配列、ならびにＩＯＭＴをコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズしうるこれらの配列の断片も含まれる。用語「選択的にハイブリダイズする」とは、関連しないヌクレオチドは排除する中程度または高度にストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。
【００４７】
ＩＯＭＴによる速度制御によって、植物の病気への耐性の改良のための機構として抗菌性フィトアレキシンの蓄積の増大を促進するか、またはイソフラボン類のレベルおよび／またはメチル化状態を増大もしくは低減するＩＯＭＴ発現の操作が可能となる。イソフラボン類は栄養補助物質として有益であり（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ， Ｈ．およびＷ． Ｍａｚｕｒ． １９９７． 「植物性エストロゲン化合物と欧米の疾病（ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ）（Ｐｈｙｔｏ−ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ））， Ａｎｎ Ｍｅｄ ２９：９５−１２０）、それらは、天然にはマメ科植物（ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｃ）に限られるが、そこでは４’−ヒドロキシル基がメチル化されているか（ホルムオノネチンおよびバイオチャニンＡ）または遊離している（ダイゼインおよびゲニステイン）。Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＯＭＴ発現修飾を利用して植物イソフラボン類の４’−Ｏ−メチル化を改変することができる。本明細書中で使用する４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンには、限定するものではないが、メジカルピン、マーキアン（ｍａａｃｋｉａｉｎ）、ピサチン、これら各々のコンジュゲート、またはそれらの混合物が挙げられ；４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養補助物質には、限定するものではないが、ホルムオノネチン、バイオチャニンＡ、テキサシン（ｔｅｘａｓｉｎ）、アフロモシン（ａｆｒｏｍｏｓｉｎ）、シュードバプチゲニン（ｐｓｅｕｄｏｂａｐｔｉｇｅｎｉｎ）、これら各々のコンジュゲート、またはこれらの混合物が挙げられる。上記化合物を天然に産生する植物のトランスジェニック植物におけるＩＯＭＴ遺伝子の過剰発現によって、および上記化合物を天然には産生しない植物のトランスジェニック植物におけるＩＯＭＴ遺伝子の発現によって、４’−Ｏ−イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養薬物のレベルが増加しうる。さらに、４’−Ｏ−イソフラボノイド栄養補助物質は非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝子工学的に形質転換されたものなど）で製造することができる、これらは、当技術分野において周知の方法を用いて適切な恒常性または誘導性プロモーターの制御下におけるＩＯＭＴ遺伝子の発現による（Ｆｒｉｃｋ， Ｓ．， Ｋｕｔｃｈａｎ， Ｔ．Ｍ． １９９９． 「イソキノリンアルカロイドおよびフェニルプロパノイド生合成に共通するＯ−メチルトランスフェラーゼの分子クローニングおよび機能発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ｔｏ ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ａｌｋａｌｏｉｄ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， Ｐｌａｎｔ Ｊ １７：３２９−３３９； Ｂａｔａｒｄら， １９９８． 「Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来の生体異物誘導性７−エトキシクマリン Ｏ−デ−エチラーゼである、酵母ＣＹＰ７６Ｂ１における分子クローニングおよび機能発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｏｆ ＣＹＰ７６Ｂ１， ａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ７−ｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎｅ Ｏ−ｄｅ−ｅｔｈｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）」， Ｐｌａｎｔ Ｊ １４：１１１−１２０）。
【００４８】
本発明はまた、食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含有する組成物であって、該組成物中における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドの供給源は本発明のイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植物であるものを含む。４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含むトランスジェニック植物の一部、またはトランスジェニック植物から抽出した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを利用してもよい。
【００４９】
天然に４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドフィトアレキシンおよび４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド栄養薬物を産生する植物におけるＩＯＭＴのダウンレギュレーションのために、ＩＯＭＴ遺伝子配列をアンチセンス方向にトランスフォームすることができ（Ｂｏｕｒｑｕｅ， Ｊ．Ｅ． １９９５． 「植物における遺伝子操作のためのアンチセンス技法 （Ａｎｔｉｓｅｎｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）」， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ １０５：１２５−１４９）、または遺伝子サイレンス化を活性化するように設計されたベクターから発現することができる（Ａｎｇｅｌｌ， Ｓ．Ｍ．およびＤ．Ｃ． Ｂａｕｌｏｃｏｍｂｅ． １９９７． 「複製するポテトウイルスＸ ＲＮＡを発現するトランスジェニック植物における一貫した遺伝子サイレンス化 （Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ ＲＮＡ）」， ＥＭＢＯ Ｊ １６：３６７５−３６８４）。使用するＩＯＭＴ配列は、配列番号１および図２で示したアルファルファＩＯＭＴ８、または、プローブとしてＩＯＭＴ８を用いるハイブリダイゼーション技法によって単離され得るｉｎ ｖｉｖｏ での４’−Ｏ−メチル化特性を有する任意の他のＩＯＭＴ遺伝子であり得る。
【００５０】
７位の位置がメチル化されたイソフラボノイド化合物（例えば、イソホルムオノネチンおよびプルネチン）も栄養補助物質活性を有し得る。またアルファルファＩＯＭＴを用いて、非メチル化イソフラボン前駆体を、全植物体、植物細胞懸濁培養液、または非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝的に形質転換されたものが挙げられる）であって、適した恒常性または誘導性プロモーターの存在下でＩＯＭＴ遺伝子でトランスフォームされているものへ供給することによってこれらの化合物を産生することができる。あるいは、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物を、非メチル化イソフラボン前駆体に単離された可溶性のまたは固定化したイソフラボン−Ｏ−トランスフェラーゼ酵素を接触させることによるｉｎ ｖｉｔｒｏの工程を利用して産生することができる。該イソフラボン−Ｏ−トランスフェラーゼ酵素は、トランスジェニック植物、植物細胞懸濁培養液、または非植物系（限定するものではないが、トランスフェクトされた細菌、酵母、または昆虫細胞であって、イソフラボノイド生合成に必要な他の酵素をすべて含むように遺伝的に形質転換されたものが挙げられる）から産生および単離されている。本明細書中で使用する、７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物には、限定するものではないが、イソホルムオノネチン、プルネチン、これら各々のコンジュゲート、またはこれらの混合物が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
植物におけるイソフラボンの産生およびＯ−メチル化経路を示す。フラバノンナリンゲニンおよびリキリチゲニンは、カルコンシンターゼおよびカルコンイソメラーゼの作用により産生し、リキリチゲニン中の５−ヒドロキシルの欠損によって、カルコンレダクターゼとカルコンシンターゼとの共作用により生じる。Ｂ環のアリール移動は、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼにより触媒されて、脱水後、ダイゼインまたはゲニステインに至る。ホルムオノネチンのメジカルピンへの変換は、２’−水酸化、還元および閉環ステップを介して進行する（Ｄｉｘｏｎ， Ｒ． Ａ． １９９９． Ｕ． Ｓａｎｋａｗａ編， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（総合的な天然産物の化学）， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ ７７３−８２３）。
【図２】
アルファルファイソフラボン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＩＯＭＴ）８ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｂは、ＩＯＭＴ発現を改変したトランスジェニックアルファルファの作製および分子学的分析を示す。図３Ａは、ＩＯＭＴ配列をセンス配向およびアンチセンス配向で含有するバイナリーベクター構築物を示す。図３Ｂは、未形質転換「Ｃ」および空のベクターを用いて形質転換した「Ｖ」対照ならびに一連のＩＯＭＴ８センス形質転換体に由来する葉組織におけるＩＯＭＴの酵素活性を示す。
【図４】
図４Ａ〜４Ｄは、未処理のアルファルファ葉に浸漬した後のダイゼインの代謝を示す。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＰｉバッファー中に浸漬した２４時間後における、空のベクターを用いた対照植物の第６２Ｃ系統およびＩＯＭＴセンストランスジェニックの第６９系統の葉から得たフェノール化合物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のプロフィールを示す。図４Ｃおよび４Ｄは、それぞれ葉をＰｉバッファー中に浸漬することによりダイゼイン供給した２４時間後における、同じベクター対照およびセンストランスジェニックの系統から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールを示す。図４Ｅおよび４Ｆは、それぞれ２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンおよびイソホルムオノネチンのＵＶスペクトルを示す。
【図５】
図５Ａ〜５Ｈは、対照およびＩＯＭＴ過剰発現トランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボノイド化合物の非生物性誘発を示す。図５Ａおよび５Ｂは、れぞれ３ｍＭ ＣｕＣｌ２に暴露した３２時間後における、ベクター対照の第９Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統のＣｕＣｌ２処理植物から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。標識ピークである１〜４は、それぞれアピゲニンコンジュゲート、７，４’−ジヒドロキシフラボン、７，４’−ジヒドロキシフラバノンおよびアピゲニンアグリコンとして同定された。図５Ｃおよび５Ｄは、それぞれ水中に幼植物を移して３２時間後におけるベクター対照である第９Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統の植物から得た葉抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図５Ｅおよび５Ｇは、Ｈ２Ｏまたは３ｍＭ ＣｕＣｌ２に暴露した３２時間後における、栄養増殖させたベクター対照の第９Ｃ系統および第６２Ｃ系統（対照系統）ならびにＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統および第６９系統の葉におけるホルムオノネチンレベルを示し、図５Ｆおよび５Ｈは、メジカルピンレベルを示す。
【図６】
図６Ａ〜６Ｆは、対照およびＩＯＭＴ過剰発現トランスジェニックアルファルファにおける細菌感染に応答したイソフラボノイド化合物の蓄積を示す。図６Ａおよび６Ｂは、フォマ・メジカギニス（Ｐｈｏｍａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）感染の１２時間後における、それぞれ空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統の感染した葉から得た抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｃおよび６Ｄは、それぞれ第６４Ｃ系統および第６７系統の未接種の葉から得た抽出物のＨＰＬＣプロフィールである。図６Ｅおよび６Ｆは、Ｐ． メジカギニスの接種後種々の時間における、栄養増殖させたベクター対照（第６４Ｃ系統）ならびにＩＯＭＴ過剰発現（第６７系統および第６９系統）植物の葉における、それぞれホルムオノネチングルコシドまたはメジカルピンレベルを示す。
【図７】
図７Ａ〜７Ｂは、対照および推定上ＩＯＭＴ遺伝子がサイレンシングされたトランスジェニックアルファルファにおけるイソフラボノイド化合物の蓄積を示す。ホルムオノネチングルコシドレベル（図７Ａ）およびメジカルピンレベル（図７Ｂ）は、フォマ・メジカギニスの胞子を接種した２０時間後における、ベクター対照の第５６Ｃ系統およびＩＯＭＴセンス形質転換体第７８系統の挿し木から得た葉において測定した。
【図８】
図８Ａ〜８Ｂは、イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼの発現を改変したトランスジェニックアルファルファの病害抵抗性を示す。図８Ａは、接種後５日目に測定した、空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統およびＩＯＭＴ過剰発現の第６９系統の葉における１００個の傷のサイズを示す。１００個の傷害部位を有する並行系統のトレースホイール単独のものにより生じた傷のサイズの平均値は減じた。実線は、対照系統の平均値を示し、波線はＩＯＭＴ過剰発現系統の平均値を示す。バーは標準偏差を示す。図８Ｂは、上述のように接種した後５日目に測定した葉の１００個の傷のサイズを示すが、同時に感染させたＩＯＭＴ過剰発現の第６７系統および空のベクターを用いた対照の第６４Ｃ系統の傷を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年9月10日(2001.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３０】
断片が配列番号１を含むものである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物の製造方法であって、可溶性のまたは固定化したイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ酵素と非メチル化イソフラボン前駆体とを接触させて７−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物にすることを含んでなり、該酵素は、トランスジェニック植物または異種系における対応するイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の発現により産生されたものである、上記方法。
【請求項３３】
断片が配列番号１を含むものである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの検出方法であって、以下のステップ：
ａ）４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを含有する可能性のある組織を調製し、
ｂ）該組織を４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼと結合する第１抗体と共にインキュベートし、
ｃ）該組織と結合しなかった抗体を除去し、そして
ｄ）該組織を、第１抗体と結合しかつ検出可能に標識された第２抗体と共にインキュベートすること、
を含む、上記方法。
【請求項３６】
ターゲット植物の病害抵抗性を増大させる方法であって、該ターゲット植物をイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換することにより行うものであり、該形質転換植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物における少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドのレベルと比較して、増大した該４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルを示すものである、上記方法。
【請求項３７】
断片が配列番号１を含むものである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
食料品、栄養サプリメント、動物飼料用サプリメント、機能性食品または医薬品として投与するのに適した少なくとも１種の４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドを含む組成物において、改良点が、４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドはイソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて形質転換されたトランスジェニック植物の少なくとも一部から単離されたものであり、該トランスジェニック植物は、該ＤＮＡ断片を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイドレベルと比較して、増大した該４’−Ｏメチル化イソフラボノイドレベルを示すものである、上記組成物。
【請求項４０】
断片が配列番号１を含むものである請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
断片が配列番号１と少なくとも中程度のハイブリダイゼーションを示す配列を含むものである請求項３９記載の組成物。
【請求項４２】
トランスジェニック植物がマメ科植物である請求項３９、４０または４１記載の組成物。
【請求項４３】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であって、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記トランスジェニック植物。
【請求項４４】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる種子であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記種子。
【請求項４５】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項４６】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物の種子から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、増大した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項４７】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物であって、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記トランスジェニック植物。
【請求項４８】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる種子であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記種子。
【請求項４９】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【請求項５０】
イソフラボンＯ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部をコードする少なくとも１種の組換えＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物の種子から得られる子孫であって、該植物は、該遺伝子の発現時に、該組換えＤＮＡ配列を含有しない同種の植物における４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルと比較して、低減した４’−Ｏ−メチル化イソフラボノイド化合物レベルを示すものである、上記子孫。
【国際調査報告】
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