(57)【要約】抗原の三次元エピトープを認識し結合する抗体を調製する方法が提供される。本方法は副甲状腺ホルモンの生理活性三次元アミノ末端に結合する抗体を調製するために特に有用である。このように作製した抗体は診断および治療用途に使用される。
2004536831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）動物を生理活性ヒト副甲状腺ホルモンで免疫感作すること；および、
ｂ）前記動物から抗体を回収すること、
を含み、前記抗体が生理活性ヒト副甲状腺ホルモンの３次元構造を特異的に認識する、生理活性ヒト副甲状腺ホルモンの３次元エピトープに対する抗体を作製する方法。
【請求項２】
さらに、動物から抗体を回収する前に前記動物をヒト副甲状腺ホルモンで２回目の免疫感作をすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒト副甲状腺ホルモンが担体に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項４】
担体がキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
生理活性ヒト副甲状腺ホルモンが配列番号１を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
更に、抗体を単離することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
抗体がアフィニティークロマトグラフィーによって単離される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
固相に連結したヒト副甲状腺ホルモンの断片によって抗体をスクリーニングすることによって抗体が単離される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ）動物を副甲状腺ホルモンで免疫感作すること；
ｂ）前記動物を副甲状腺ホルモンで２回目の免疫感作すること；および、
ｃ）前記動物から抗体を回収すること、
を含み、前記抗体が生理活性ヒト副甲状腺ホルモン３次元エピトープを特異的に認識および結合する、生理活性ヒト副甲状腺ホルモン３次元エピトープを認識および結合する抗体を作製する方法。
【請求項１０】
副甲状腺ホルモンが担体に結合している、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
担体がキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
副甲状腺ホルモンがヒト副甲状腺ホルモンである、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
回収した抗体を単離することを更に含む請求項９記載の方法。
【請求項１４】
抗体がアフィニティークロマトグラフィーによって単離される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
固相に連結したヒト副甲状腺ホルモンの断片によって抗体が単離される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
副甲状腺ホルモンの断片が、配列番号１のアミノ酸１〜１３番、１３〜３４番および３９〜８４番からなる群より選ばれる、請求項１５記載方法。
【請求項１７】
抗体が配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる副甲状腺ホルモンの断片によって単離される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ａ）配列番号１のアミノ酸１〜８４番を含む副甲状腺ホルモンで動物を免疫感作すること；
ｂ）前記動物を副甲状腺ホルモンで２回目の免疫感作すること；および、
ｃ）前記動物から抗体を回収すること、
を含み、前記抗体が生理活性副甲状腺ホルモン３次元エピトープを認識および結合する抗体である、生理活性副甲状腺ホルモン３次元エピトープを認識および結合する抗体を作製する方法。
【請求項１９】
回収した抗体を単離することを更に含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープが配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ａ）キーホールリンペットヘモシアニンに結合した、配列番号１のアミノ酸１〜８４番を含む副甲状腺ホルモンで動物を免疫感作すること；
ｂ）続いて前記動物を副甲状腺ホルモンで免疫感作すること；および、
ｃ）前記動物から抗体を回収すること、
を含み、前記抗体が副甲状腺ホルモンの生理活性３次元アミノ末端を認識および結合するものである、副甲状腺ホルモンの生理活性３次元アミノ末端を認識および結合する抗体を作製する方法。
【請求項２２】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元アミノ末端が配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する単離抗体。
【請求項２４】
生理活性３次元エピトープが副甲状腺ホルモンのアミノ末端である、請求項２３記載の単離抗体。
【請求項２５】
副甲状腺ホルモンがヒト副甲状腺ホルモンである、請求項２３記載の単離抗体。
【請求項２６】
生理活性３次元エピトープが配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
配列番号１の１番の位置のSerから１３番の位置のLysまでのアミノ酸配列を含むペプチドを認識する単離抗体。
【請求項２８】
配列番号１の１番の位置のSerから１３番の位置のLysまでのアミノ酸配列からなるペプチドを認識する請求項２７記載の単離抗体。
【請求項２９】
ヒト副甲状腺ホルモンの生理活性アミノ末端部分と免疫反応性である抗体。
【請求項３０】
生理活性アミノ末端部分が配列番号１の１〜１３番アミノ酸を含む請求項２９記載の抗体。
【請求項３１】
生理活性アミノ末端部分が配列番号１の１〜１３番アミノ酸からなる請求項２９記載の抗体。
【請求項３２】
請求項２９記載の抗体および製薬的に許容できる担体を含む治療組成物。
【請求項３３】
副甲状腺ホルモンの生理活性部分に結合することによりアデニレートシクラーゼ活性を低下させる請求項２９記載の抗体。
【請求項３４】
ポリクローナル抗体である、請求項２３〜３３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項３５】
モノクローナル抗体である、請求項２３〜３３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項３６】
ヒト化抗体である、請求項２３〜３３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項３７】
抗体断片である、請求項２３〜３３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項３８】
検出可能なマーカーに結合した、請求項２３〜３３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項３９】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープに特異的に結合する抗体であって、前記エピトープが配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる前記抗体。
【請求項４０】
以下の工程を含む方法によって作製される、ヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合するポリクローナル抗体：
ａ）キーホールリンペットヘモシアニンに結合したヒト副甲状腺ホルモンで動物を免疫感作する工程；
ｂ）前記動物をヒト副甲状腺ホルモンで免疫感作する工程；および、
ｃ）前記動物から抗体を回収する工程であって、前記抗体がヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する抗体である、前記工程。
【請求項４１】
以下の工程を含む方法によって作製される、ヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合するポリクローナル抗体：
ａ）キーホールリンペットヘモシアニンに結合したヒト副甲状腺ホルモンで動物を免疫感作する工程；
ｂ）前記動物をヒト甲状腺ホルモンで免疫感作する工程；および、
ｃ）前記動物から抗体を回収する工程であって、前記抗体がヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する抗体であり、前記生理活性３次元エピトープが配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなるエピトープである前記工程。
【請求項４２】
生理活性副甲状腺ホルモンに選択的である抗体。
【請求項４３】
生理活性副甲状腺ホルモンに選択的であり、配列番号１の少なくとも最初の１３アミノ酸の一つを認識および結合する、生理活性副甲状腺ホルモンに選択的である抗体。
【請求項４４】
副甲状腺ホルモンまたはその変種の生理活性３次元エピトープを認識および結合する単離抗体。
【請求項４５】
副甲状腺ホルモンまたはその断片の生理活性３次元エピトープを認識および結合する単離抗体。
【請求項４６】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する抗体を含むキット。
【請求項４７】
抗体が検出可能な標識に結合している請求項４６記載のキット。
【請求項４８】
生理活性３次元エピトープが配列番号１のアミノ酸１〜１３番からなる、請求項４６記載のキット。
【請求項４９】
副甲状腺ホルモンを含む生物学的サンプルを患者から得るための道具をさらに含む、請求項４６記載のキット。
【請求項５０】
検出可能な標識が化学発光マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカーおよび酵素マーカーからなる群より選ばれる、請求項４７記載のキット。
【請求項５１】
検出可能な標識がアクリジニウムエステルである請求項４７記載のキット。
【請求項５２】
ａ）副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する抗体にサンプルを曝露すること；および
ｂ）抗体−ホルモン複合体を検出すること、
を含む、サンプル中の生理活性副甲状腺ホルモンを検出する方法。
【請求項５３】
副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する抗体が検出可能なマーカーに結合している、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
工程ｂ）の前に、副甲状腺ホルモンを認識および結合する別の抗体に抗体−ホルモン複合体を曝露することを更に含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
ａ）副甲状腺ホルモンの生理活性３次元エピトープを認識および結合する捕獲抗体にサンプルを曝露すること；
ｂ）捕獲抗体−ホルモン複合体を前記捕獲抗体とは異なるエピトープに結合する検出抗体に曝露すること；および、
ｃ）前記抗体−ホルモン複合体を検出すること、
を含む、サンプル中の生理活性副甲状腺ホルモンを検出する方法。
【請求項５６】
検出抗体が化学発光マーカーに結合している、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
化学発光マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
サンプルが副甲状腺機能亢進症の患者からのサンプルである請求項５２または５５記載の方法。
【請求項５９】
サンプルが副甲状腺機能低下症の患者からのサンプルである請求項５２または５５記載の方法。
【請求項６０】
ヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元アミノ末端を認識および結合する抗体を含む免疫アッセイ。
【請求項６１】
ヒト副甲状腺ホルモンの生理活性３次元アミノ末端が配列番号１のアミノ酸１〜１３番を含む請求項６０記載の免疫アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質の３次元エピトープを特異的に認識する抗体およびその抗体を作製および使用する方法を提供する。ある実施態様においては、副甲状腺ホルモンの生理的に活性な三次元エピトープを認識し結合する抗体を作製する方法が開示される。好ましい実施態様において、本方法によりヒト副甲状腺ホルモンの最初の１３アミノ酸を認識して結合する抗体が作製される。より好ましい実施態様において、本発明の抗体は非生理活性副甲状腺ホルモンとは実質的に交差反応しない。
【０００２】
本発明はまた、抗原（好ましくはヒト副甲状腺ホルモンのような副甲状腺ホルモン）の３次元エピトープと免疫複合体を形成することのできる（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体および抗体の精製調製物を提供する。そのような抗体は抗原、副甲状腺ホルモンまたはその変種を用いて生成される。この抗体は好ましくは副甲状腺ホルモンの生物学的活性（すなわち、天然には副甲状腺ホルモンのそのレセプターへの結合によって始動するカスケードの一つの構成要素）を中和する（すなわち、部分的または完全に阻害する）ことができる。好ましい実施態様において、本発明の抗体は副甲状腺レセプターと免疫複合体を形成することができ、PTHレセプターの生物学的活性（すなわち、アデニレートシクラーゼ活性化またはホスホリパーゼＣ刺激）を中和することができる。
【０００３】
製薬的に許容できる担体中に副甲状腺ホルモンに対する抗体またはその誘導体を含む治療組成物も本発明の範囲内である。これらの治療組成物は、副甲状腺ホルモンによる副甲状腺ホルモンレセプターの過剰刺激によって特徴付けられる種々の疾病を治療する手段を提供する。これらの抗体は、例えば、PTHに関連した高カルシウム血症とPTHと関連しない高カルシウム血症とを区別するためのような診断薬として有用である。
本発明の抗体は上述のいずれかのペプチド、例えば、ヒト副甲状腺ホルモンを認識する。
一つの実施態様において、本抗体は配列番号１の位置１のSerから位置13のLeuまでのアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列に含まれる部分を認識する。
一つの実施態様において、本抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【０００４】
本発明に従って、副甲状腺ホルモン又はその変種を測定するための方法は以下の工程を含む：サンプルと副甲状腺ホルモン、またはその変種を認識する第１の抗体との混合物をインキュベーションする工程；副甲状腺ホルモンまたはその変種を認識する標識した第２の抗体を前記混合物に添加し、さらにインキュベーションする工程；および、前記混合物中に生じる抗原−抗体複合体を検出する工程。
あるいは、本発明に従って、副甲状腺ホルモン又はその変種を測定するための方法は以下の工程を含む：サンプル、副甲状腺ホルモンまたはその変種を認識する第１の抗体、および副甲状腺ホルモンまたはその変種を認識する標識した第２の抗体の混合物をインキュベーションする工程；および、前記混合物中に得られる抗原−抗体複合体を検出する工程。
【０００５】
本発明のペプチドに対する免疫学的アッセイは以下の工程を含む：上述したいずれかのペプチドを含むサンプルを上述した抗体のいずれかと、抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベーションする工程；および、抗原−抗体複合体を定量する工程。
副甲状腺ホルモンの生理活性形態の免疫学的アッセイのためのキットは上述した抗体のいずれかを含む。
本明細書に記載した特徴、または、特徴の組合せは、そのような組合せのいずれかに含まれる特徴が文脈、本明細書、および当業者の知識から明らかであるように相互に矛盾しない限りは、本発明の範囲に含まれる。
本発明のさらなる利点および特徴は以下の詳細な記載および請求の範囲において明らかにされる。
【０００６】
発明の詳細な記載
以下の記載は生理活性副甲状腺ホルモン、特にヒト副甲状腺ホルモンを認識し結合する抗体、および前記抗体を作製および使用する方法を開示するが、この記載は副甲状腺ホルモンのみに限定されると解してはならない。この観点から、本明細書に開示される本方法および使用は、その生理活性が少なくとも部分的にポリペプチド若しくはその一部の三次構造に関連している、いかなるポリペプチドについても実施できる。
【０００７】
Ｉ．定義
別に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明のため、以下の用語は以下に示すように定義される。
本明細書において、用語「PTH」および「副甲状腺ホルモン」は互換的に使用される。副甲状腺ホルモンはカルシウム吸収を腎臓および骨においては直接制御し、腸においては間接的に制御する。成熟副甲状腺ホルモンは「プレプロPTH」のシグナル配列の切断、続いて「プロPTH」から「プロ」配列が切断されることによってin vivoで合成される。本明細書において、副甲状腺ホルモンは、副甲状腺ホルモンを作ることのできるいかなる動物からの甲状腺ホルモンも包含し、それらの動物にはヒト、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、およびげっ歯類が含まれるが、これらには限定されない。加えて、副甲状腺ホルモンには、本明細書において論じる副甲状腺ホルモン変種（天然には副甲状腺ホルモンを発現しない生物において組換え的に合成される副甲状腺ホルモンが含まれる）が包含される。
本明細書において、用語「hPTH」、「ヒトPTH」および「ヒト副甲状腺ホルモン」は互換的に使用される。加えて、hPTHは用語PTHまたは副甲状腺ホルモンに包含される。ヒトPTHは以下で規定される配列（配列番号１）においてアミド結合によって配列した84個のα-アミノ酸残基から本質的になる。
【０００８】
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly
Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu
Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala
Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser
Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val
Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys
Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln
【０００９】
ヒトPTHはin vivoで合成することができ、または、この分野で既知の標準的技術を用いて合成することができる。
当業者はPTHの構造または配列に変動が生じ得ることを理解するであろう。本明細書において、PTHの「変種」とは、PTHの生物学的活性と類似の、または、本質的に類似の生物学的活性を有するポリペプチドとして定義される。一つの分子と他の分子が本質的に類似の構造、または両者が類似の生物学的活性を有する場合に、両者は「本質的に類似」と称される。例えば、PTHの生物学的活性には、PTHのレセプターに対するPTHの結合、そのレセプターにおける続いてのPTHの結合または作用の阻止が含まれる。PTHの別の生物学的活性には、アデニレートシクラーゼ活性の制御が含まれる。PTHの変種には、PTHの類似体、断片または伸長物が含まれる。PTHの変種には、天然に生じるPTHおよび組換え的に合成されたPTHが含まれる。例えば、PTHの「変種」は１以上のアミノ酸置換を含んでよい。アミノ酸置換は、この分野でよく理解されているように保存的でも比保存的でもよい。保存的置換とは、生物学的活性、または三次（例えば、三次元）構造に影響を与えずに一つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することをいう。加えて、PTHの変種には、この分野でよく理解されているように改変アミノ酸側鎖を含むPTH分子が含まれる。従って、ある分子がPTHの活性と類似した生物学的活性を少なくとも一つ有している場合、それはPTHの「変種」と考える。例えば、変種には、1-13領域においてPTHアミノ酸の配列を本質的に有しているペプチド若しくはポリペプチドが含まれる。変種には、およそ１または２個のアミノ酸置換を有するようなペプチドが含まれる。hPTHの変種の更なる例は以下の配列からなる、または以下の配列を含む（配列番号２〜８）：
【００１０】
Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Phe-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Cys-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Phe-Cys-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Cys-His-Asn-Leu-Gly-Lys
Ser- Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Cys-His-Asn-Leu-Gly-Lys
【００１１】
本明細書において、「生理活性PTH」または「生理活性hPTH」とは、PTHの生物学的活性の少なくとも一つを有するPTHまたはhPTHポリペプチドをいう。例えば、ポリペプチドがアデニレートシクラーゼ活性を制御することができる場合にそのPTHは生理活性であると考える。一つの実施態様において、PTHはそのレセプターに結合することによってアデニレートシクラーゼ活性を制御する。他の生物学的活性も生理活性PTHを定義するために使用される。生理活性hPTHには、少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜13番を含むPTH変種が含まれる。生理活性PTHの更なる例には配列番号１のアミノ酸１〜34番が含まれる。配列番号１のアミノ酸１〜84番のような完全長PTH分子も生理活性PTHである。
本明細書において、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子群によって実質的にコードされる、抗原を特異的に認識しそれに結合するポリペプチドまたはその断片を言う。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子および免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体には、Fab'、F(ab)2、Fabc、およびFv断片のような断片も含まれる。本明細書において、用語「抗体」には完全な抗体の改変によって作製された抗体断片または組換えDNA技術によって新たに合成された抗体断片および、さらに今では慣用技術となった技術によって作製される「ヒト化」抗体が含まれる。
【００１２】
抗体はタンパク質との結合反応において機能する場合にその抗体はタンパク質に「特異的に結合する」またはタンパク質に対して「免疫反応性」であるという。タンパク質への抗体の結合は、不均一なタンパク質集団および他の物質の存在下で、サンプル中のそのタンパク質の存在を決定することを可能とする。従って、指定した免疫アッセイ条件下で、特異的な抗体は特定の抗原に優先的に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に有意には結合しない。そのような条件におけるタンパク質への特異的な結合は特定のタンパク質に対する特異性について選別した抗体を必要とする。ペプチドが免疫反応性であるかどうかを決定するためのいくつかの方法がこの分野で知られている。免疫化学発光測定アッセイ(ICMA)、酵素-結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および放射免疫測定（RIA）はその例である。
抗体は、その抗体がPTHの非生理活性形態に比較して優先的にPTHの生理活性形態に結合する場合、生理活性PTHに「選択的」であるという。好ましい実施態様において、抗体が非生理活性PTHよりも少なくとも10倍優先的に生理活性PTHに結合する場合、その抗体は生理活性PTHに選択的である。より好ましい実施態様において、生理活性PTHに選択的な抗体は非生理活性PTHよりも少なくとも100倍優先的に生理活性PTHに結合する。別の実施態様において、生理活性PTHに選択的な抗体は非生理活性PTHよりも少なくとも200倍優先的に生理活性PTHに結合する。さらに別の好ましい実施態様において、生理活性PTHに選択的な抗体は非生理活性PTHよりも少なくとも500倍優先的に結合する。一層好ましい実施態様において、生理活性PTHに選択的な抗体は非生理活性PTHよりも少なくとも1000倍優先的に結合する。
【００１３】
「標識」とは分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な構成成分を言う。例えば、有用な標識には、蛍光色素、化学発光化合物、放射性同位体、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン、またはジゴキシゲニンが含まれる。標識はしばしば放射能、蛍光、着色、または酵素活性のような測定可能なシグナルを生成し、結合した標識の量を定量するためにこれらを使用することができる。
化学発光化合物の例には、ルシフェリン、ルミノール誘導体、ピロガロール、イソルミノール、エクオリン、環式アリールヒドラジド、ジオキセタン、ロジウムキレート（電気化学発光）、オキサレートエステル、熱化学発光標識、アクリジニウムその他が含まれる。これらの標識はこの分野でよく知られた技術を用いて（米国特許第5,284,952号を参照せよ。この特許の開示は参照により全体が本明細書に取り込まれるものとする。）、タンパク質、例えば抗-PTH抗体に結合させることができる。一つの実施態様において、抗-hPTH1-13のような検出抗体は米国特許第5,284,952号、5,110,932号および第5,338,847号（これらの開示は参照により全体が本明細書に取り込まれるものとする。）のような方法を使用することによりアクリジニウムで標識しても良い。
【００１４】
標識のために使用する蛍光物質には、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、ローダミン、テキサスレッド色素、フタロシアニン、クマリン、スクアレン、アントラセン、エリスロシン、ユーロピウムキレートその他が含まれる。
標識のために使用する放射性同位体の例には、14C、3H、32P、18F、または125Iが含まれる。
これまで開発されており、本発明のアッセイに使用できる酵素の例として、米国特許第3,654,090、第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、米国特許第3,817,837号、第3,879,262号、Journal of Immunological Methods 1:247 (1972)および、Journal of Immunology 109:129 (1972)に記載されたものが挙げられる（これらの開示は、引用によりその全体が本明細書に取り込まれるとする）。他の酵素の例には、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコニダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、アルカリホスファターゼその他が含まれるが、これらに限定されない。本発明において有用な補酵素には酵素が反応物を触媒して検出可能な産物、例えば光による検出、を容易にする分子および／またはタンパク質が含まれる。補酵素には、FADおよびNADが含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、抗-PTHはNADで標識することができる。例えば、米国特許第4,380,580を参照せよ（この特許の開示は引用によりその全体が本明細書に取り込まれるものとする）。
【００１５】
着色粒子の例には、金コロイド、またはブルーラテックスが含まれる。ある実施態様において、標識は本発明の抗体とカップリングされて副甲状腺ホルモンの生理活性形態の存在を決定することを可能とする。
他の標識には、分光学的に活性な物質の非活性前駆体（英国特許第９1,392,403号およびフランス国特許第2,201,299号；米国特許第3,880,934号に対応）および電子スピン共鳴部分（米国特許第3,850,578号）が含まれ得る。
用語「単離」された、「精製」された、または「生物学的に純粋」とは、物質がその天然状態にある時に通常付随する構成成分から少なくとも部分的に分離されており、しばしば本質的若しくは実質的にそれらの構成成分を含まない物質についていう。純度および均一性は典型的には、この分野でよく理解されているように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーのような分析的化学的技術を用いて決定される。一般に、単離した抗体は調製物中の全巨大分子種の80％を超えるであろう。好ましくは抗体は調製物中に存在する全巨大分子種の90％より多くを代表するように精製されるであろう。より好ましくは、抗体は95％より高く精製され、さらに好ましくは、本抗体は本質的に均一にまで精製され、その場合、他の巨大分子種は通常の技術では検出されない。
【００１６】
用語「免疫アッセイ」は、分析物に特異的に結合させるために抗体を用いるアッセイである。免疫アッセイは、分析物を単離、標的化、および／または定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
本発明の発明者は、迅速、容易、かつ正確に生理活性PTH、特にhPTHを測定する目的で種々の研究を行った。その結果、hPTHの生理活性形態を特異的に認識する抗体が作製された。本発明者は、これらの、それぞれがhPTHの異なるエピトープを認識する抗体を組み合わせを用いて免疫アッセイを構築した。
【００１７】
II.  本発明の組成物
本発明の抗体はタンパク質の三次元エピトープを認識し、これに結合する。特に本抗体はPTHの生理活性形態を特異的に認識する。本発明の抗体に結合するタンパク質の例の一つはヒトPTHである。
本発明の抗体はアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）(10801 University Blvd.、Manassas, VA 20110-2209, USA)に2001年７月３日に寄託され、アクセッション番号PTA-3496が付与されている。寄託物は寄託時には生存しており、生存しなくなった場合には出願人により代替されるであろう。
寄託物は本出願が継続している間37 CFR 1.14および35 USC §122の下に長官に対して入手可能状態に置かれ、30年間または最新の請求後５年間のいずれか長いほうの期間、寄託機関で維持されるであろう。
【００１８】
本発明の好ましい抗体はhPTHの生理的に活性な形態（生理活性hPTH）を認識し、結合する。本発明をいかなる理論や作用機序にも限定するつもりはないが、hPTHのアミノ末端（N-末端）領域のインタクトなヘリックス構造にそった最初のアミノ酸（配列番号１の位置１のSer）はhPTHが生理的に活性であるためには存在していなければならないと考えられている。さらに、hPTHの生理活性N-末端領域は13アミノ酸（配列番号１のアミノ酸１〜１３番）からなる３次元らせん構造であると考えられている。本発明の抗体は、このN-末端領域の３次元エピトープを認識して結合する。一つの実施態様において、このエピトープはhPTHのこの１３アミノ酸（配列番号１のアミノ酸１〜１３番）のすべてを含む。他の実施態様において、このエピトープはhPTHの最初の１３アミノ酸内のアミノ酸の組み合わせを含む。例えば、このエピトープはアミノ酸３，４番および５番；２、４番および６番；８，10番、および13番；またはこれらの混合を含んでよい。
【００１９】
一つの実施態様において、本発明の抗体は最初の１３アミノ酸の少なくとも１つ、および、アミノ酸14〜84番、好ましくは13〜34番からなる領域内に位置する少なくとも１つの更なるアミノ酸を認識し、結合する。例えば、本発明の抗体はアミノ酸３、７番および14番；４、８番、および33番；または５、14番、および15番を含むエピトープを認識し、結合し得る。
本発明のある実施態様において、本発明の抗体はポリクローナル抗体である。
別の実施態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
本発明の一つの実施態様において、抗体はPTHまたはhPTHの最初の13アミノ酸内のエピトープを認識し結合し、この最初の13アミノ酸の外にあるPTHまたはhPTHのエピトープには結合しない。好ましい実施態様において、本抗体はPTHまたはhPTHの最初の７アミノ酸内のエピトープを認識し結合する。
【００２０】
III.  本発明の組成物の作製方法
副甲状腺ホルモンまたはその変種は当業者に知られた通常の方法のいずれかによる抗体作製に使用することができる。それらの方法にはポリクローナル抗体を作製する方法およびモノクローナル抗体を作製する方法が含まれる。
本発明のポリクローナル抗体は、フロイントの完全アジュバントのようなエマルジョンとしてインタクトなPTH、その変種またはそれらの混合物で動物を免疫することによって作製される。抗体作製に使用する動物の例には、マウス、ラット、ウサギまたはヤギが含まれるが、これらに限定されない。インタクトなPTHは完全長PTH分子として、例えば、「プレ」配列および「プロ」配列が切断された後のPTHポリペプチドとして定義することができる。ヒトPTHが使用される態様においてはインタクトなhPTHは配列番号１に記載したアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様においては、インタクトなPTHは、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような担体タンパク質に連結していることが好ましい。担体タンパク質の他の例には、ウシ血清アルブミン（BSA）、ヘモシアニン、およびウシチオグロブリン（BTG）が含まれる。ある実施態様において、ここに記載するように、担体タンパク質は注目する抗原（例えば、PTH）にグルタルアルデヒドで連結される。他の方法はこの技術分野にてよく知られている。
【００２１】
最初の免疫感作後、動物には実質的に純粋なインタクトな生理活性PTH、その変種またはそれらの混合物の１回以上の追加的免疫感作ブーストを行う。免疫感作は腹腔内投与、皮下投与又は静脈投与で行うことができる。このようにして、PTHの内部エピトープに対する抗体の広いスペクトルを超えて、正しいコンフォーメンションのPTH表面エピトープに対する抗体が上昇する。
免疫原調製物に対する動物の免疫応答はテスト採血および注目するポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによって監視することができる。免疫原に対する抗体のかなりの高力価が得られたならば、その動物から血液を集め抗血清を回収する。
【００２２】
一つの実施態様においては、抗体は血清を抗体アフィニティー精製カラムに曝露することによって単離される。抗体を単離する他の技術がこの分野で知られている。アフィニティーカラムはPTHのペプチド、好ましくはhPTHをカラムの固相に連結させることによって構築する。本発明の好ましい実施態様において、このカラムはhPTHのアミノ酸1-13番(hPTH1-13)、13-34番（HPTH1-34）および39-84番（hPTH39-84）からなるhPTHペプチドを含む。他のペプチド、またはそれらの組み合わせを使用して本発明の抗体を単離することもできる。
当業者には容易に理解されるであろうが、ペプチドhPTH1-13はhPTHの最初の13アミノ酸内にあるhPTHエピトープを認識する抗体に特異的に結合するであろう。同様にペプチドhPTH13-34はhPTHのアミノ酸13〜34番内にあるhPTHエピトープを認識する抗体に特異的に結合するであろう。また、ペプチドhPTH39-84はhPTHのアミノ酸39〜84番内にあるhPTHエピトープを認識する抗体に特異的に結合するであろう。
従って前述した方法により、hPTHの最初の13アミノ酸に特異的に結合する抗体（抗-hPTH1-13抗体）が選択的に単離される。加えて、抗- hPTH1-13抗体によって認識されるエピトープは最初の13アミノ酸内のアミノ酸のどんな組み合わせも含み得る。一つの実施態様において、この抗体はhPTHの13アミノ酸全体（すなわち、配列番号１のアミノ酸１〜13番）からなるエピトープを認識する。
当業者が理解するように、抗体含有血清をペプチド共役アフィニティーカラムへかける順番は本発明を実施する際に決定要因ではない。しかしながら、好ましい実施態様において、まず血清をhPTH39-84ペプチドを含むカラムに曝露し、次に、得られた血清（例えばhPTH39-84に結合する抗体を含まない血清）をhPTH13-34ペプチドを含むカラムに曝露し、続いて得られた血清（例えば、hPTH39-84およびhPTH13-34抗体を含まない血清）をhPTH1-13ペプチドを含むカラムへ曝露することが望ましい。
【００２３】
生理活性PTHを認識し結合するモノクローナル抗体も提供される。モノクローナル抗体はこの分野で知られた通常の方法を用いて作製することができる。例えば、KohlerとMilstein(1975), Nature, 256:495-97を参照せよ。簡単に言うと、マウスのような動物にPTH、好ましくは上述したような担体タンパク質に共役させたPTHを注射する。動物を１回以上の純粋なPTH注射によりブーストし、融合の３日前に経静脈（IV）ブースターによって過剰免疫する。マウスの脾臓細胞を単離し、通常の方法に従ってミエローマ細胞に融合させる。ハイブリドーマを標準的なヒポキサンチン／アミノプテリン／チミン（HAT）培地中で常法に従って選抜する。生理活性PTHを認識する抗体を分泌するハイブリドーマを同定し、培養し、標準的な免疫学的技術によってサブクローニングする。
しばしば、抗体は検出可能シグナルを与える物質と共有結合的または非共有結合的に結合させることにより標識されるであろう。本発明の一つの実施態様において、この標識は化学発光化合物である。好ましい化学発光化合物はアクリジニウムエステルである。
【００２４】
III.  本発明の構成物を使用する方法
A.  免疫アッセイ
本発明の免疫学的アッセイはサンプル中の抗原を定量するために使用することができる。種々のアッセイおよび関連試薬およびパラメータの例は米国、出願番号09/761,969号（2001年１月16日出願）中に提供されている（この内容全体は引用に本明細書に取り込まれるものとする）。
免疫アッセイの一つの例は「サンドイッチ」免疫アッセイである。サンドイッチ免疫アッセイにおいて、抗体は固相に固定化され（捕獲抗体）、抗原とインキュベーションされ、検出可能標識を有する抗体（検出抗体）とさらにインキュベーションされる。本発明の好ましい態様において、PTHの生理的に活性な部分を認識しないPTH抗体を磁性粒子のような固相に共役させ、この抗体をPTHを含むサンプルとインキュベーションし、さらに生理活性PTHに特異的に結合する、検出可能標識と共役した抗体とインキュベーションする。より好ましい実施態様において、PTHのアミノ酸1-13を認識しないhPTH類似体を磁性粒子と共役させ、この抗体をhPTHを含むサンプルとインキュベーションし、さらにアクリジニウムエステルと共役した、生理活性hPTHを認識する抗体とインキュベーションする。本発明のサンドイッチ免疫アッセイにおいて、サンプル、第１の抗体および標識した第２の抗体を同時にインキュベーションしても良い。適切な固相基材の例には、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、膜、フィルター紙またはプラスチックカップが含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
免疫学的アッセイの別の例には、検出可能標識で標識された抗原および非標識抗原を抗体と競合的に反応させるアッセイが含まれる。さらに、抗原を固相に固定化し、希釈血清または精製抗体とインキュベーションし、さらに検出可能標識で標識された抗免疫グロブリンとインキュベーションし、それによって標識された結合物質を得ることもできる。
サンドイッチ技術が使用される場合、PTHの異なるエピトープに対する２種の抗体が使用される。一つの抗体は、検出可能標識で標識され（検出抗体）、他の抗体は固相抗体として固相に結合させ、あるいは、固相に特異的に結合することができるように作製される（捕獲抗体）。これらの抗体を種々の濃度の抗原と反応させ、複数の抗原−抗体複合体を形成させる。この抗原−抗体複合体は固相に結合しているので、固相を複合体から分離し、固相における標識の量を測定する。標識と抗原の濃度との関係をプロットし、標準曲線を得る。
【００２６】
未知の濃度の抗原を含むサンプルを反応系に加えた場合、反応後に測定された標識の量を表準曲線に当てはめることにより抗原の濃度を決定することができる。測定するサンプルの例はPTHまたはその変種を含むサンプルであってよく、血漿、血清、血液、尿その他が含まれる。
本発明の免疫アッセイにはサンドイッチ放射免疫アッセイ（RIA）、サンドイッチ酵素免疫アッセイ（EIA）、サンドイッチ蛍光免疫アッセイ（FIA）、サンドイッチ化学発光免疫アッセイ（CLIA、ICMA）、サンドイッチ化学発光−酵素免疫アッセイ（CLEIA）およびサンドイッチアッセイに基づく免疫クロマトグラフィー法が含まれる。
捕獲抗体の固相へのカップリング、および標識抗体を標識することはこの分野の当業者に知られたどの方法で行うこともできる。本発明の好ましい態様において、捕獲抗体はビオチンにカップリングされ、磁性粒子はストレプトアビジンで被覆される。ビオチンはストレプトアビジンに結合し、それによって捕獲抗体の固相へのカップリングが達成される。
【００２７】
Ｂ．  スクリーニングアッセイ
本発明は更に被験者のPTHレベルを検出するアッセイを提供する。好ましい実施態様において、本アッセイは被験者の血液中のPTHの異常なレベルを検出する方法を提供する。
これらのアッセイはPTH活性を制御する能力を決定するための試験化合物のスクリーニングテストに特に有用である。このような場合、試験化合物が反応系に加えられ、抗体のPTHへの結合に対するその試験化合物の効果が観察される。本発明の抗体の生理活性PTHへの結合を阻害する化合物は潜在的な生理活性PTH阻害因子として考えることができ、さらに、異常なPTH活性または濃度と関連した疾病治療のための潜在的治療薬剤として考慮することができる。
一つの例において、PTHを認識する抗体はPTHレセプターへの結合についてPTHと競合する能力がスクリーニングされる。使用する抗体は粗血清からのものでもよく、細胞培地または腹水でも、または未精製形態であっても良い。PTH類似物のPTHレセプターへの結合を低下させる抗体は競合因子として分類される；低下させない抗体は非競合因子である。
【００２８】
化合物（抗体を含む）はcAMP蓄積、細胞内カルシウム、および／またはイノシトールリン酸アッセイを用いてそのアゴニスト特性又はアンタゴニスト特性についてスクリーニングすることができる。サイクリックAMP蓄積は上述したようにアッセイにより測定することができる。PTHレセプターへの結合についてPTHと競合し、cAMP蓄積に対するPTHの効果を阻害する化合物は競合的PTHアンタゴニストと考えられる。逆に、PTHレセプターへのPTHの結合と競合しないが、（おそらくレセプター活性化部位を遮断することにより）cAMP蓄積のPTH活性化を阻止する化合物は、非競合的アンタゴニストと考えられる。PTHレセプターへの結合についてPTHと競合し、PTHの存在下または非存在下でcAMP蓄積を刺激する化合物は競合的アゴニストである。PTHレセプターへの結合についてPTHと競合はしないが、PTHの存在下または非存在下でcAMP蓄積を刺激することのできる化合物、またはPTH単独の場合よりも高濃度に蓄積を刺激する化合物は非競合的アゴニストとして考えられるであろう。
【００２９】
C.  診断的使用
本発明の抗体は、本発明の細胞レセプターとその特異的なリガンドの間の相互作用に関連していることを特徴とし得る疾病の診断、分類、予後、および／または治療に有用である。例えば、高カルシウム血症または低カルシウム血症のある形態はPTHとPTHレセプターとの相互作用に関連している。高カルシウム血症とは血清カルシウム濃度の異常な上昇がある状態である；これはしばしば、副甲状腺機能亢進症、骨粗鬆症、乳癌、肺および前立腺癌、頭部および頸部癌、扁平上皮癌、食道癌、多発性骨髄腫および副腎腫を含む他の疾病を伴っている。低カルシウム血症とは、血清カルシウム濃度が以上に低い状態であり、有効なPTHの欠損に起因するものであろう。
一つの例において、本発明の化合物は高カルシウム血症の診断、および高カルシウム血症状態、すなわち、PTHによって媒介される高カルシウム血症（例えば、副甲状腺機能亢進症および悪性の液性高カルシウム血症）と、この因子が関与しない疾病（例えば骨と直接接触している転移性腫瘍細胞の存在によって媒介される局所的溶骨性高カルシウム血症、および、破骨細胞刺激因子（インターロイキン）、リンホトキシン、カルシトリオール、E型プロスタグランジン、およびビタミンD−様ステロールのような液性因子の増加によって媒介されるある種の希な悪性腫瘍関連高カルシウム血症）と関連した高カルシウム血症とを区別するために使用される診断薬を製造するために使用される。
【００３０】
診断の一つの方法において、血清中の全カルシウムおよび／またはイオン化カルシウム濃度が本発明のPTHアンタゴニストの投与の前後に標準的な技術によって測定される。
PTH関連高カルシウム血症は本発明のアンタゴニスト投与に続く血清カルシウム濃度の低下として検出することができるであろう。対照的に、PTH以外の因子によって媒介される高カルシウム血症については本アンタゴニストの投与後も血清カルシウム濃度は不変のままであろう。
本発明の他の診断的応用により、PTH関連腫瘍、例えば、悪性の液性高カルシウム血症と関連した腫瘍を診断するため、または、癌治療の間のPTHのレベルを監視するために生物学的サンプル中のPTHレベルの測定が可能である。この方法は、本明細書に記載したアッセイの一つを用いて組織サンプル中に存在するPTHへの副甲状腺ホルモンレセプターの結合をアッセイすることを含む。
【００３１】
高カルシウム血症が疑われる患者は本発明の化合物を用いて治療することができるかもしれない。症状は突然に現れ、戻さないと致死的であり得るので、迅速な干渉が重要である。一つの応用において、血清カルシウム濃度はPTHのアンタゴニストを含む即時的な治療進行によって安定化される。そのようなアンタゴニストにはPTHの生物学的活性を阻止すると（本明細書に記載したアッセイにより）決定された本発明の化合物が含まれる。アンタゴニストを投与するため、適切な抗体は一般に生理食塩水のような適切な担体中で製剤化されることにより医薬製造に使用され、PTHレセプターへのPTH結合に対して充分な競合を生じる用量（例えば、血清カルシウムレベルを10mg/lより低くするために充分な用量）で静脈投与される。典型的な用量は一日に体重１kgあたり1ng〜10mgであろう。許容できるカルシウムレベル（すなわち、10.1mg/dlより低い濃度）を長期間維持するため、治療は必要に応じて繰り返すことができる。加えて、本発明の医薬を投与するために他の投与態様を使用することもできる。これは背景にある高カルシウム血症を引き起こした疾病状態の迅速な治療のために必要かもしれない；あるいは、例えば骨粗鬆症のような疾病の長期治療に使用することもできる。
【００３２】
Ｄ．医薬組成物および治療方法
本発明はさらに本発明の組成物および製薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を含む。そのような医薬組成物は本発明の方法によって同定される少なくとも一つの抗体の治療的または予防的量を含まなければならない。製薬的に許容できる担体は、意図した宿主へこの化合物をデリバリーするために適したどのような共存可能な非毒性物質であってもよい。滅菌水、アルコール、脂質、ワックス、および不活性固体を担体として使用することができる。製薬的に許容できるアジュバント、緩衝剤、分散剤、その他も本医薬組成物に取り込むことができる。活性物質を取り込んだ医薬組成物の調製は医学文献および科学文献によく記載されている。例えば、1982年、レミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第１６版, Mark Publishing Company, Easton, Pa., を参照されたし。この文献は引用により全体が本明細書に取り込まれるものとする。
【００３３】
ここまで記載してきた医薬組成物は、非経口投与および経口投与の両方を含む宿主への全身投与に適している。本医薬組成物は通常非経口的に投与、すなわち、皮下、筋肉または静脈投与されるであろう。従って、本発明は、宿主への投与のための組成物を提供し、前記組成物は上述したように、許容できる担体中の同定された化合物の製薬的に許容できる溶液を含む。
製薬的担体中の化合物の濃度は変動し得る。すなわち、この濃度は0,1質量％以下から約20質量％またはそれ以上にまで変動し得る。筋肉注射用の典型的な医薬組成物は例えば１〜４mlの緩衝化滅菌水と１μg〜１mgの本発明の方法によって同定される化合物を含むように作製されるであろう。静脈内インフュージョン用の典型的な組成物は100〜500mlの滅菌リンガー液と約１〜100mgの化合物を含むように作製することができる。
【００３４】
本発明で開示されるような放出組成物および検出組成物を含む種々のキットをPTH、またはその変種のサンプル中の濃度を決定するために使用することができる。しかしながら、それらは本発明の組成物を使用することのできる多数の可能なキットの例に過ぎない。他のキットも本発明の範囲内として考慮されている。例えば、以下の特許、論文および指示マニュアルは本発明の放出組成物を含むように適合させることができる：米国特許第4,935,339号、第4,121,1978号；第5,232,836号；第5,064,770号；第5,202,266号；第4,816,417号；第5,821,020号および第5,981,779号；これらの開示は引用により全体が本明細書に取り込まれるものとする。適合の一つは、これらで使用されている組成物を本組成物と置換することである。
広い態様において、本発明のキットはPTHまたはその変種の濃度を決定するための自動化アッセイ系に使用するように適合させることができる。例えば、本発明のキットは、好ましくはニコール・アドバンテージ（Nichols Advantage）システムと一緒に使用することができる。
【００３５】
実施例
実施例１
hPTHを認識し結合する抗体の作製
A.  免疫感作
ヒト副甲状腺ホルモン1-84はBACHEM, California Inc., Torrance,CAから購入した。製品番号H-1370.1000である。
KLH,ヘモシアニン、キーホールリンペットはCalbiochem, La Jolla, CAから購入した。製品番号374805。
グルタルアルデヒドはSigma Chemical Co. St. Louis, MOから購入した。製品番号G-6247である。
ヒト副甲状腺ホルモンはモル比200:1で以下のようにKLHにカップリングさせた：
1mgのPTHを0.20mlの0.1 N 酢酸に可溶化した。可溶化PTHは0.1Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.4中で1mg/mlに希釈した。キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を0.1M リン酸ナトリウムpH7.2中に可溶化し、タンパク質含有量10mg/mlの濃度とした。タンパク質含有量として１モルのKLHに対して200モルPTHというモル比を計算し、２種のタンパク質を４℃にて混合した。25％水性溶液を0.1Mリン酸ナトリウムｐH7.2で１％に希釈することによって10mg/ml（１％）のグルタルアルデヒド溶液を調製した。１％グルタルアルデヒドを最終濃度0.655mg/mlで加えることにより、１モルのKLHに対して200モルのPTHという混合物をカッブリングさせた。このグルタルアルデヒド架橋タンパク質混合物を４℃にて５〜８時間保持し、反応を等体積の0.01Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl ｐH7.4を添加して希釈することにより停止させた。PTH-KLHの総タンパク質濃度は架橋効率80％と仮定して計算した。
【００３６】
Strategic BioSolutions、Ramona、CA,から購入したヤギを飼育し、以下のように免疫感作した：
最初の免疫感作については、ヤギを等体積のフロイントの完全アジュバントで可溶化した2mlのPTH-KLH 0.1mgで免疫した。0.1mgPTH-KLH 1mlと１mlのフロイント完全アジュバント。動物の複数の部位に皮内注射した。
続くブーストは３〜４週間ベース（毎月）で、等体積のフロイントの不完全アジュバント中で上述のように調製した2mlの0.05mg PTH-KLHを用いて、前のように動物の側面に皮内注射して行った。少なくとも２〜３回のフロイントの不完全アジュバント中のPTH-KLHによるブーストを行った。
続く全てのブーストについては、次に、0.02mgの純粋なPTH1-84のみを上述のように2mlの抗原についてフロイントの不完全アジュバント中で可溶化し、前のように動物の側面に皮内注射して免疫感作した。このようにして、直線状PTH配列の内部に対するよりも立体配置エピトープに対する抗体クローンが優先的にブーストされる。
純粋なPTH1-84の少なくとも２回のブースト後、動物を採血し、血餅除去血清を集めた。特異性と力価をBIAcore装置を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により決定した。
【００３７】
実施例２
立体配置的PTH1-13に対する抗体の単離
PTHアミノ酸配列PTH38-84、PTH13-34およびPTH1-13に対するアフィニティーカラムを以下のように作製した：
PTH38-84およびPTH13-34はBACHEM、Californiaから購入した（製品番号はそれぞれH-4926,1000およびH-4145.1000）。PTH1-13はResearch Genetics、Huntsville,ALにて化学的に合成した。
各PTHペプチドのそれぞれを、PhrmaciaのCNBr活性化セファロース4-Bに、2mlのセファロース4-Bに対して１〜２mgのペプチドを用いてPharmaciaの手順通りにカップリングさせた。
PTH1-13に対するアフィニティー精製抗体は以下のように調製した：
上述のように調製したヤギ免疫血清をアフィニティーカラム上でまず抗-PTH38-84抗体を取り出し、続いて抗-PTH13-34抗体を取り出し、最後に抗-PTH1-13抗体を取り出すことにより連続的に精製した。全ての３つのアフィニティーカラムについての血清抽出物は同じである：
少なくとも0.5リットルのヤギ免疫血清を上述した順番でそれぞれのアフィニティーカラムに通した。各アフィニイティーカラムはセファロース-4Bに結合した少なくとも10mgのペプチドからなっている。
カラムを0.01Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH7.4で280nmにおける分光学的吸収が変化しなくなるまでよく洗浄した。
【００３８】
非特異的血清タンパク質を除去するため、次にこのカラムを0.1M酢酸ナトリウム、0.15M NaCl pH4.0で洗浄し、再度280nmの吸収をモニターした。次に、ペプチド配列に対する特異的な抗体を0.2M グリシンpH2.3で溶出させた。弱い緩衝剤グリシンによる2.3という低いpHの溶出によりセファロース4-Bに共有結合したペプチドから抗体が解離する。最終的に溶出するPTH1-13に対する抗体を希釈液0.1N NaOHを添加して中和してpHを7.4に戻した。
アフィニティー精製ヤギ抗-PTH1-13は次にHPLC分析によりその純度についてテストする。280nmの吸収におけるモル吸光係数によって測定したタンパク質濃度、1.4 A280＝１mg/ml。次にアフィニティー精製抗体結合性および特異性をBIAcore装置によるSPRを用いて決定した。抗体は４℃で保存し、又は長期保存のためには-70℃で保存する。
【００３９】
hPTH1-13、hPTH13-34、およびPTH39-84からなる抗体アフィニティー精製カラムをそれぞれセファロース4Bに結合したこれらのペプチドを用いて作製する。免疫感作手順により生成される動物血清は以下の手順によりそれぞれの抗体について単離することができる。最初に、hPTH39-84に対する抗体が血清から取り出され、続いてhPTH1-34に対する抗体が取り出される。次に、最後のhPTH1-13のアフィニティーカラムを用いて生理的に活性な立体配置的に正しいhPTHのN-末端配列を認識する抗hPTH1-13抗体が単離される。我々の実験では重複するエピトープが無いことを証明するためにhPTH13-34に対する抗体およびhPTH39-84に対する抗体を初めに取り出したが、生理的に活性なhPTH1-13立体配置抗体を他の抗体を初めに取り出さずに単離することが可能である。
【００４０】
実施例３
アクリジニウムによる抗-PTH1-13抗体の標識
精製した抗-PTH1-13抗体を以下の方法でアクリジニウムで標識した：
抗体のようなタンパク質中のリジンのεアミノ基のアクリジニウムエステルに対する反応によって「スルホニルクロリドエステル」としてアクリジニウムを本発明の抗体に架橋する。反応生成物はセファロースG-25上で0.1M リン酸ナトリウムpH6.0を用いて排除クロマトグラフィーによって分離する。
【００４１】
実施例４
生理活性hPTHに対する免疫測定アッセイ
生理活性N-末端PTHに対するアフィニティー精製した抗体（抗-PTH1-13）を検出のために標識し、抗-PTH39-84抗体を捕獲のために標識する。
ビオチン化捕獲抗体（抗−PTH39-84）はサンプルからのPTHを結合させるために使用する。捕獲抗体は完全長PTH（PTH1-84）およびPTHのC-末端断片の両方を認識する。アクリジニウム標識検出抗体（抗−PTH1-13）はサンプル中のPTHの生理活性N-末端エピトープに結合させるために使用する。捕獲抗体は優先的に生理活性PTH（例えば、立体配置的に正しいN-末端領域を有するPTH）を認識し結合する。捕獲抗体および検出抗体はサンプル中のPTH分子を「サンドイッチ」にする。このサンドイッチ複合体はストレプトアビジン被覆磁性粒子に結合している。次にこの粒子をこの分野で知られた分光計で定量する。この手順は図１に例示してある。
【００４２】
正常な被験者（例えば、一見して健康で、歩行可能で、薬用していない被験者）からサンプルを入手する。正常な被験者は正常なカルシウムレベルおよび25(OH) ビタミンDレベルを有している。またクレアチン浄化にかけ、クレアチン浄化値が70ml/分よりも低い被験者からも血清を入手する。慢性腎不全（CRF）を経験している被験者からもサンプルを入手した。これらのサンプルは透析被験者から得られたEDTA血漿からなっていた。
本発明の好ましい実施態様において、150μlの生物学的サンプルを70μlのビオチン化ヤギ抗-PTH39-84捕獲抗体、25μlのアクリジニウム標識ヤギ抗-PTH1-13抗体、および15μlのストレプトアビジン被覆磁性粒子と合わせた。この組み合わせを37℃にて30分間インキュベーションした。この組み合わせを洗浄し、分光計で読みとった。
【００４３】
抗-PTH1-13が検出のために標識され、抗-PTH39-84が捕獲のために標識されている、PTH1-84のための免疫放射測定アッセイ(IRMA)を用いると以下の観察結果が得られる。断片、PTH1-6およびPTH7-13はこのアッセイを阻害しないであろう。PTH1-34からなるPTH断片はこのアッセイを強く阻害し、PTH断片2-34,3-34、4-34および5-34は、PTH1-34のアミノ酸位置１からアミノ酸が除去されるに従って応答が低下しつつこのアッセイを阻害する（図４）。他の断片による結果は図18に示す。PTH7-84断片による阻害も何の効果も見られなかった。これらのことは立体配置エピトープはPTH1-13中の少なくとも完全な残基配列に強く依存していることを示している。
【００４４】
次に、このアッセイをPTH7-84断片の存在を示す臨床患者サンプルを用いた研究に使用した。以下に示すようにこの研究は、インタクトな生理活性N-末端抗体がインタクトな生理活性PTH1-84のみを検出できるという点でその臨床的有用性を明瞭に示している。本発明の抗体およびNIDインタクト-PTHアッセイを初期および末期腎疾病の患者に使用した相関研究により、PTH断片（PTH7-84）に対するインタクトPTH（PTH1-84）の割合は類似しているが（それぞれ、0.71および0.69という傾き）、正常な被験者（傾き0.52）とは異なっていることが示唆される（図６〜８を参照せよ）。
【００４５】
実施例５
表面プラズモン共鳴（SPR）
表面プラズモン共鳴（SPR）は、表面に結合した物質の質量の関数として表面における光の屈折率の変化により応答を測定する技術である。BIAcoreによる商業的に入手可能な装置を用いてSPRを用いて抗体とそれらの抗原との間の非共有結合的相互作用が測定されてきた。例えば、Malmqvist、M, Curr. Opin. Biotechnol. 5, 282-286、(1993)；O'Shannessy, D.J., Curr. Opin. Biotechnol. 5,65-71,(1993)；Schuck, P., Curr. Opin. Biotechnol. 8, 498-502, (1997)；これらの開示は引用により全体が本明細書に取り込まれるものとする。BIAcore装置は免疫試薬の測定における固有の道具であることが示されている（Adamczyk, M.ら、Bioconjugate Chem. 10, 176-185 (1999)；およびAdamczyk, M.ら、Bioconjugate Chem. 8, 133-145, (1997) ; これらの開示は引用により全体が本明細書に取り込まれるものとする）。
【００４６】
簡単に言うと、共有結合的にウサギ抗-ヤギFc抗体を結合したCM5センサーチップを使用した。使用したバッファーは0.005％界面活性剤P-20を含むpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水である。流速は10μl/分とした。１回の処理あたり本発明の抗体のおよそ500応答単位（RU）を固定化した。この方法は一般に、検出抗体（すなわち抗PTH1-13抗体）を流速40μg/mlで１分間注入し、続いて阻害ペプチド（すなわち本明細書に記載のPTH断片）を流速100μg/mlで２分間注入し、２分間洗浄し、次にPTH1-84を１μg/mlで１分間注入することを含む。各注入が終わった後、抗体とPTH1-84との結合を30秒間測定した。それぞれの実行の後、表面を10mM Gly-HClで再生した。
SPR実験の結果によりN-末端抗-hPTH1-13抗体の立体配置特異性は以下の様に証明される：図10において、PTH配列1-6および7-13は抗-hPTH1-13抗体の結合について単独では競合できず、従って抗体結合に重要である。PTH1-13はPTHの本発明の抗体への結合を阻害する。このデータは本発明の抗体はPTH1-6およびPTH7-13断片両方の中のアミノ酸残基に結合することを示している。結合のためには、少なくとも13アミノ酸からなるインタクトな全三次元エピトープが存在していなければならない。
【００４７】
図11はN-末端のアミノ酸残基１番および２番がN-末端抗-PTH抗体の結合に重要であることを示している。この最初のアミノ酸の除去は正しい立体配置構造が失われるので抗体の結合性を顕著に低下させる。この点について、ペプチドPTH1-34およびPTH2-34はPTHの本発明の抗体への結合に対する最も強い阻害を示す。
図12において、残基10〜13番（特に13番）の除去はN-末端抗-PTH抗体の結合を制限する。PTHペプチドPTH1-6およびPTH1-7はPTH1-84の本発明の抗体への結合を阻害せず、結合の阻害は阻害ペプチドの大きさがPTH1-10からPTH1-13へ増加すると順次顕著になっていく。
図13において、N-末端PTHペプチド1-34、1-38および1-84はPTHのN-末端工程への結合をPTH 1-13よりも強く阻害している。これらの結果はPTH 1-13ペプチドは、立体配置的ではあるが、より大きなPTH分子の一部である場合にPTHアミノ酸1-13がとるであろう三次元配置と正確に同じにはフォールディングしないことを示しており、更に、インタクトな生理活性N-末端PTH1-13抗体の固有の立体配置結合を示している。
これらの結果をまとめると、抗体結合について重要な決定基である、２つの別個のPTH領域中のアミノ酸残基（N-末端領域アミノ酸1-2および10-13）が明らかにされる。これらの領域はPTHの直線配列中で隣接していないので、インタクトな生理活性N-末端抗―PTH1-13抗体はPTHの立体配置（非直線）エピトープを認識する。
【００４８】
実施例６
高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）
被験者から生物学的サンプルを抽出し、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中の80％アセトニトリルで溶出した。得られた濃縮サンプルをスピードヴァキュームで乾燥させた。次に乾燥サンプルを最少体積（例えば0.5ml）の0.1％TFA中に溶解した。
HPLCは分析用C18カラムで行い、流速1.5ml/分とし、0.1％TFA中の直線アセトニトリル勾配をかけ、1.0分間画分を集めた。次に濃縮画分をスピードヴァキュームで乾燥させた。得られた画分を続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.7％ウシ血清アルブミン（BSA）中で可溶化した。続いてこれらの画分をNichols Institute Diagnostics （NID）（ニコール・インスティチュート・ダイアグノスティクス）Advantage（アドバンテージ）にてインタクトPTHを用いてアッセイし、続いて、バイオ-インタクトアッセイ（すなわち、本発明のアッセイ）およびPTH1-38アッセイを行った。
NIDインタクトPTHアッセイはPTH7-84およびPTH1-84を認識する。バイオ-インタクトアッセイはPTH1-84を認識するがPTH7-84を認識しない（図３）。PTH1-38アッセイはPTH1-84、PTH1-34、PTH1-38を認識するがPTH7-84を認識しない。
【００４９】
HPLC実験の結果はHPLCは化学的に合成したPTH断片（PTH1-84、PTH1-34、PTH1-38、およびPTH7-84）を分離することを示している（図14A）。NIDアッセイによって検出されたように、HPLCは患者サンプル中のPTHを主として２つの主要ピークに分離する。最初のピークはPTH7-84断片に対応し、２番目のピークはPTH1-84に対応する（図３、14B、15Aおよび15B）。当業者であれば分かるように実際の保持時間は変動するである。
本発明の抗体を用いた本発明のアッセイにより、おそらくインタクトなアミノ末端部分を有するPTH断片に対応するさらなるピークを検出することも可能である。
ヒト血清患者サンプルのHPLC分析により、インタクトなPTH1-84のみを検出するという本抗体の特異性を証明するという点で、インタクトな生理活性N-末端抗-PTH1-13抗体の臨床的有用性がここでも示される。
【００５０】
種々の刊行物および／または文献が本明細書において引用されており、それらの内容は引用により本明細書に取り込まれるものとする。
本発明は種々の特定の実施例および実施態様について記載されてきたが、本発明はそれらに限定されず、請求の範囲にて種々に実施できることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明において使用される手順の模式的図解である。
【図２】添加(spiked)PTH（ピコモル）に対する観察されたPTH濃度（ピコモル）のグラフを表す。添加PTHはアッセイ反応中に加えた特定の量のPTHをピコモルで表したものとして定義される。図２(A)はNichols Advantage−インタクトPTHアッセイを図示したものである。図２(B)は本発明の抗体を用いたバイオ−インタクトPTHアッセイを図示したものである。
【図３】図３は、（本発明の抗体を用いた）バイオ−インタクトPTHおよび（Nichols Advantage−インタクトPTHアッセイを用いた）インタクト−PTHの画分番号に対するPTH濃度のグラフである。本発明の抗体を用いると（バイオインタクトPTH）、断片、PTH7-87に対応するピークが存在しないことに注意せよ。
【図４】図４は、「競合因子」濃度（ピコモル）の関数としての観察されたPTH濃度（ピコモル）のグラフである。競合因子はPTHのアミノ酸1-34番、2-34番、3-34番、4-34番、および5-34番からなるPTHペプチドである。
【図５】図５は、バイオ−インタクトPTH濃度（ピコグラム/ml）に対する変動のパーセンテージ用量係数のグラフである。
【図６】図６は、「正常な」被験者に関するNichols Advantageインタクト−PTH濃度（ピコグラム/ml）に対するバイオ−インタクトPTH濃度（ピコグラム/ml）のグラフである。
【図７】図７は、腎機能が損傷した被験者に関するNichols Advantageインタクト−PTH濃度（ピコグラム/ml）に対するバイオ−インタクトPTH濃度（ピコグラム/ml）のグラフである。
【図８】図８は、慢性腎不全の患者に関するNichols Advantageインタクト−PTH濃度（ピコグラム/ml）に対するバイオ−インタクトPTH濃度（ピコグラム/ml）のグラフである。
【図９】図９は、バイオ−インタクトPTHに関する、自動化ICMA PTH濃度（ピコグラム/ml）に対する手動免疫放射定量アッセイPTH濃度ピコグラム/ml）のグラフである。ICMAは免疫化学発光定量アッセイ(Immuno Chemiluminescence Metric Assay)として定義される。バイオ−インタクトPTHは、本発明のアッセイであり、PTHは本発明の抗体（例えば、検出（タグ）抗体として抗-PTH1-13抗体、および、捕獲抗体として抗-PTH38-84抗体）により測定される。
【図１０】図１０は、抗-PTH1-13抗体に対するPTHの比を阻害性PTHペプチドの関数として図示したグラフである。「1-6」はPTH（配列番号１）のアミノ酸1-6番からなるペプチドの使用を示す；「7-13」はPTH（配列番号１）のアミノ酸7−13番からなるペプチドの使用を示す；および、「1-13」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-13番からなるペプチドの使用を示す。
【図１１】図１１は、抗-PTH1-13抗体に対するPTHの比を阻害性PTHペプチドの関数として図示したグラフである。「1-34」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-34番からなるペプチドの使用を示す；「2-34」はPTH（配列番号１）のアミノ酸2-34番からなるペプチドの使用を示す；「3-34」はPTH（配列番号１）のアミノ酸3-34番からなるペプチドの使用を示す；「4-34」はPTH（配列番号１）のアミノ酸4-34番からなるペプチドの使用を示す；および、「5-34」はPTH（配列番号１）のアミノ酸5-34番からなるペプチドの使用を示す。
【図１２】図１２は、抗-PTH1-13抗体に対するPTHの比を阻害性PTHペプチドの関数として図示したグラフである。「1-6」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-6番からなるペプチドの使用を示す；「1-7」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-7番からなるペプチドの使用を示す；「1-8」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-8番からなるペプチドの使用を示す；「1-9」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-9番からなるペプチドの使用を示す；「1-10」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-10番からなるペプチドの使用を示す；「1-11」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-11番からなるペプチドの使用を示す；「1-12」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-12番からなるペプチドの使用を示す；および、「1-13」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-13番からなるペプチドの使用を示す。
【図１３】図１３は、抗-PTH1-13抗体に対するPTHの比を阻害性PTHペプチドの関数として図示したグラフである。「1-13」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-13番からなるペプチドの使用を示す；「1-38」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-38番からなるペプチドの使用を示す；「1-34」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-34番からなるペプチドの使用を示す；「1-84」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-84番からなるペプチドの使用を示す；および、「1-13」は、PTH（配列番号１）のアミノ酸1-13番からなるペプチドの使用を示す。
【図１４】保持時間（分）の関数としてPTH濃度（ピコモル）のグラフを表したものである。図14（A）はPTH標準品（PTH1-84；PTH7-84；PTH1-38およびPTH1-34）のHPLC測定値を表している。図１４（B）は、「高」PTH群（例えば、200pg/mlより高い）のHPLC測定値を表したものである。データは「インタクトPTH」（黒い菱形）；PTH1-84（黒四角）；およびPTH1-38（三角）について示してある。
【図１５】保持時間（分）の関数としてPTH濃度（ピコモル）のグラフを表したものである。図１５（A）は、「正常」PTH群に関するHPLC測定値を表した図である。データは「インタクトPTH」（黒菱形）；TH1-84（黒四角）；およびPTH1-38（三角）について示してある。図１５（B）は、「高」PTH群（例えば、500pg/mlより大きい）に関するPLC測定値を表した図である。データは「インタクトPTH」（黒菱形）；TH1-84（黒四角）；およびPTH1-38（三角）について示してある。
【図１６】保持時間（分）の関数としてPTH濃度（ピコモル）のグラフを表したものである。図16（A）はプロテアーゼ阻害因子無しのサンプルについてHPLC測定値を表した図である。図16（B）は、プロテアーゼ阻害因子を含むサンプルについてHPLC測定値を表した図である。データは「インタクトPTH」（黒菱形）；TH1-84（黒四角）；およびPTH1-38（三角）について示してある。
【図１７】保持時間（分）の関数としてPTH濃度（ピコモル）のグラフを表したものである。図１７（A）は、患者KについてHPLC測定値を表した図である。図１７（B）は、患者GについてHPLC測定値を表した図である。図１７（C）は、患者PについてHPLC測定値を表した図である。患者K、G、Pは全て慢性腎不全であった。
【図１８】観察されたPTH濃度（ピコモル）を「競合因子」濃度（ピコモル）の関数として表したグラフである。阻害因子はPTHのアミノ酸1-84番、7-84番、7-13番、1-6番、1-34番、13-34番および1-13番からなるPTHペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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2004536831.tif 000089
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536831.tif 000090
【国際調査報告】
2004536831.tif 000091
2004536831.tif 000092
2004536831.tif 000093