(57)【要約】本発明は、可逆性の一過性の低酸素によって生じる記憶喪失および関連するシナプス機能不全を治療するための、アデノシンA1アンタゴニストを含む治療方法および組成物を提供する。
2004534022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素の被験者において低酸素で誘導される学習および／または記憶機能障害を治療するための治療方法であって、被験者の脳のアデノシンA1受容体を遮断することにより、CA1ニューロンのネットワークのシナプス抑止を防止すること、およびシータ活性を維持することを含む方法。
【請求項２】
可逆性の一過性低酸素にさらされた被験者における低酸素で誘導される記憶喪失を軽減するための方法であって、シナプス抑止を防止しておよび／または減少してシータリズムの減少を引き起こすために有効な量のアデノシンA1受容体アンタゴニストを前記被験者の脳に投与することを含む方法。
【請求項３】
前記アデノシンA1受容体アンタゴニストが、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）、1,3-ジエチル-8-フェニルキサンチン（DPX）、8-（p-スルホフェニル）テオフィリン、BWA-844U、XAC、CGS-15943、BWA1433U、CP-68,247、XCC、8-Pt、DPSPX、およびCP-66,713からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記低酸素が少なくとも約50%〜約99%までシータ活性を減少させる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、シナプス伝達および／またはシータ活性および細胞内シータ活性を低酸素前のレベルの少なくとも約75%〜約100%回復することによって低酸素の効果を緩和する、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
アデノシンA-1アンタゴニストを含む薬学的に許容される組成物を含む治療的な製剤であって、前記組成物は、血液脳関門を超えてアンタゴニストを送達し、前記組成物は、低酸素によって引き起こされる学習および／または記憶の喪失に関連した病変の遮断に有効な濃度において、いずれの不必要な副作用も引き起こさない製剤。
【請求項７】
請求項6に記載の薬学的に許容される組成物から本質的になり、低酸素で誘導される病変の緩和に関する使用を指示する説明書と共に梱包された製品。
【請求項８】
アデノシンA1受容体アンタゴニストが8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）、1,3-ジエチル8-フェニルキサンチン（DPX）、8-（p-スルホフェニル）テオフィリン、BWA-844U、XAC、CGS-15943、BWA-1433U、CP-68,247、XCC、8-Pt、DPSPX、およびCP-66,713からなる群より選択される、請求項6の製剤。
【請求項９】
前記アデノシンA-1アンタゴニスト、細胞損傷を逆転させ、および／または細胞消失を防止する薬剤との組み合わせをさらに含む、請求項6に記載の製剤。
【請求項１０】
可逆性の一過性の低酸素にさらされた被験者の脳に、アデノシンA1受容体アンタゴニストの有効な量を含む医薬組成物を投与することを含む治療方法であって、これによりに低酸素で誘導される学習機能障害および／または記憶喪失、並びに関連するシナプス抑止および／または機能障害を治療または防止する方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の治療方法であって、前記関連するシナプス抑止は、海馬のCA1におけるコリン作動性シータ活性およびシナプス伝達の機能障害であり、これにより空間の学習および記憶に影響を与える方法。
【請求項１２】
被験者の神経変性疾患を治療する方法であって、前記被験者に、細胞損傷を逆転させ、および／または細胞消失を防止する薬剤の有効な量と組み合わせてアデノシンA1受容体アンタゴニストの有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
低酸素の間にシータ活性を維持する方法であって、アデノシンA1アンタゴニストを脳組織に投与することを含む方法。
【請求項１４】
低酸素に関連した記憶喪失を治療するために有用な治療的A-1アンタゴニスト化合物を同定する方法であって：
シータ活性をモデリングする制御された条件下で脳組織を提供することと、
シナプス抑止およびシータ活性の減少を引き起こす低酸素条件下に前記組織を配置することと、
低酸素条件下で、脳組織にA-1アンタゴニストの候補化合物を投与することと、および、
前記候補化合物が前記脳組織のシナプス抑止を防止し、および／またはシータ活性を維持するかどうかを決定することと、を含む方法。
【請求項１５】
前記脳組織がCA1錐体細胞を含む、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年5月8日に出願された仮出願USSN60/289,137の利益を主張し、参照により本明細書に援用した。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、アデノシンA1受容体アンタゴニストを投与することを含む、可逆性の一過性の低酸素で誘導され、関連したシナプス機能不全によって生じる記憶喪失を治療または防止するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
低酸素および虚血性発作は、ヒトに対する最も圧倒的な驚異の一つのままである。記憶機能障害は、大脳の低酸素/虚血、バイパス手術または心臓発作の後に共通している1。全ての哺乳類細胞は、低酸素に感受性であり得るし、低酸素に応答すると考えられるが、海馬CA1錐体細胞は、そうでないとしても、最も感受性である。低酸素/虚血の結果には、主に3つの形態が存在する：傷害の重篤度により、機能的分解、細胞傷害、およびアポトーシスまたはネクローシスを介した後発性細胞消失である。それぞれの形態は、異なった病態生理学的な特徴を有し、異なる治療を必要とする。
【０００４】
選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストのDPCPXは、低酸素の間に低酸素で誘導されるアデノシンの蓄積を緩和することが知られている。Pearson Tら、Eur. J. Neurosci. 2000,12 (8): 3064-6。アデノシンは、低酸素の間にラット海馬におけるシナプス反応を抑制するが、その抑制は、A1アンタゴニストの使用により逆転された。Arlinghausら、Brain Res. 1996,724 (2): 265-8。CA1錐体神経におけるアデノシン媒介無酸素症で誘導されるシナプスのグルタミン酸放出は、DPCPCXによる影響を受けなかった。Katchmanら、Hippocampus 1996, 6 (3): 213-24および米国特許第6,166,181号。もう一つのアンタゴニストは、CA1ニューロンにおける低酸素で誘導されるシナプス伝達の抑制を遮断した。Dooletteら、Brain Res. 1995, 677 (1) : 127-3。これらの参照文献は、海馬のシータリズム、注意、学習、もしくは記憶に対する低酸素のいずれの効果についても、または低酸素で誘導される記憶喪失の防止におけるCA1アデノシンA1受容体の遮断に対する効果についても、なにも示さずまたは教示しない。
【０００５】
空間の学習および記憶は、海馬のネットワークによる情報処理に依存し、その機能は、軽症低酸素および一過性虚血に極めて感受性である。しかし、有効な治療的処置の開発を目的とした集中的な研究にもかかわらず、有望な治療がまだない。本発明は、可逆的な一過性低酸素が、海馬CA1におけるコリン作動性のθ活性および関連したシナプスの「抑止」を減少し、これらの反応がアデノシンA1受容体の拮抗作用によって防止できたことを示す。簡単には、低酸素の発症により、モーリス水迷路の空間学習および記憶におけるラットの能力が著しく悪化した。機能障害は、アデノシンA1受容体の拮抗作用によって防止された。このシナプス効率の回復は、短期の低酸素発症による機能的な妨害を除去するための有効な治療ストラテジーを表す。さらに、本発明は、高いlogPを有し、中枢神経系に容易に侵入する分子、またはプロドラッグ技術の使用を通じて、脳に移行されるかもしくは「閉じこめられる」であろう分子を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、低酸素の被験者において低酸素で誘導される学習および／または記憶機能障害を治療するための治療方法であって、被験者の脳のアデノシンA1受容体を遮断することを含み、これによりCA1ニューロンのネットワークにおけるシナプス抑止を防止することと、シータ活性を維持することとを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は、低酸素にさらされた被験者において低酸素で誘導される記憶喪失を軽減するための方法であって、有効な量のアデノシンA1受容体アンタゴニストを被験者の脳に投与して、シータリズムの減少を引き起こすシナプス抑止を防止し、および／または減少することを含む方法を提供する。アデノシンA1受容体アンタゴニストは、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）、1,3-ジエチル-8-フェニルキサンチン（DPX）、8-（p-スルホフェニル）テオフィリン、BWA-844U、XAC、CGS-15943、BWA-1433U、CP68,247、XCC、8-Pt、DPSPX、およびCP-66,713からなる群より選択することができる。低酸素は、少なくとも約50%〜約99%までシータ活性を減少し、およびアンタゴニストは、シナプス伝達および／またはシータ活性および細胞内シータ活性について低酸素前のレベルの約75%〜約100%回復することによって、低酸素の効果を緩和する。
【０００８】
また、本発明は、アデノシンA-1アンタゴニストを含む薬学的に許容される組成物、血液脳関門を超えてアンタゴニストを送達する組成物、低酸素によって引き起こされる学習および／または記憶の喪失に関連した病変の遮断に対して有効な濃度においてどのような不必要な副作用も引き起こさない組成物を含む治療的な製剤に関する。また、本発明は、低酸素で誘導される病変を緩和に関する使用を指示する説明書と共に梱包された薬学的に許容される組成物から本質的になる製造の物品に関する。アデノシンA1受容体アンタゴニストは、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）、1,3-ジエチル-8-フェニルキサンチン（DPX）、8-（pスルホフェニル）テオフィリン、BWA-844U、XAC、CGS-15943、BWA-1433U、CP-68,247、XCC、8Pt、DPSPX、またはCP-66,713であることができる。製剤は、細胞損傷を逆転させ、および／または細胞消失を防止する薬剤と、アデノシンA-1アンタゴニストの組合せを含むことができる。
【０００９】
本発明は、可逆性の一過性の低酸素にさらされた被験者の脳に、アデノシンA1受容体アンタゴニストの有効な量を含む薬学的組成物を投与することを含む治療方法であって、これによりに低酸素で誘導される学習機能障害および／または記憶喪失、並びに関連するシナプス抑止および／または機能障害を治療または防止する方法を提供する。関連するシナプス抑止は、海馬のCA1におけるコリン作動性シータ活性およびシナプス伝達の機能障害であることもでき、これにより空間の学習および記憶に影響を与える。
【００１０】
また、本発明は、被験者の神経変性疾患を治療する方法であって、前記被験者に、細胞損傷を逆転させ、および／または細胞消失を防止する薬剤の有効な量と組み合わせてアデノシンA1受容体アンタゴニストの有効な量を投与することを含む方法に関する。また、これは、低酸素の間にシータ活性を維持する方法であって、アデノシンA1アンタゴニストを脳組織に投与することを含む方法であるることもできる。
【００１１】
本発明は、低酸素に関連した記憶喪失を治療するために有用な治療的A-1アンタゴニスト化合物を同定する方法であって：シータ活性をモデリングする制御された条件下で脳組織を提供することと、シナプス抑止およびシータ活性の減少を引き起こす低酸素条件下に前記組織を配置することと、低酸素条件下で、脳組織にA-1アンタゴニスト候補化合物を投与することと、および前記候補化合物が前記脳組織のシナプス抑止を防止し、および／またはシータ活性を維持するかどうかを決定することとを含む方法に関する。脳組織は、CA1錐体細胞を含み得る。
【００１２】
さらなる目的および利点は、記載、図面、および実施例を考慮することにより明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
詳細な記載
本発明の好ましい態様を記載する際に、理解しやすいように特定の専門用語が使用される。しかし、本発明は、このように選択された特定の専門用語に限定されることは企図されない。それぞれの特定のエレメントは、全ての技術的均等物を含むことが理解され、これは同様の方法で働いて同様の目的を達成する。本明細書で引例したそれぞれの参照は、参照によってそれぞれがあたかも援用されたかのように、参照によって援用される。
【００１４】
本発明は、記憶喪失を引き起こす低酸素によって誘導された病変を標的とした治療方法および組成物を提供する。これらの病変は、生化学的、生理学的、および認識的な側面を有し、その全ては、本発明に従った治療を受ける標的に関し、かつ標的であるとみなされるであろう。本発明の方法および製剤の生化学的な標的は、記憶および学習に関連したニューロン、特に低酸素によって影響を受けるものにおけるアデノシンA-1受容体である。標的とした受容体は、低酸素の間に、アデノシンシグナルに応答し、カスケードにおいて細胞の損傷または死滅を伴わずにシナプス抑止および記憶機能障害を引き起こす。
【００１５】
本発明の標的とされる病変の生理学的な側面は、CA1ニューロンネットワークにおける可逆性条件のシナプス抑止およびコリン作動性シータ誘導の減少である。このネットワークは、CA1錐体神経、および安定なシータ活性の発生に関与し、かつ低酸素の間にシナプス抑止を受けやすいその他のものを含む。低酸素の間に、EPSPsおよびEPSCsは除去されて、CA1ニューロンのネットワークは切断されることとなり、シータ活性は酸素が再び供給されるまで可逆的に消失する。
【００１６】
本発明のに従った治療を受けやすい認知的/行動的病変は、一般に注意機能障害、学習機能障害、健忘症を含む記憶機能障害、記憶、記憶保持、および空間的学習を含む学習の喪失として特徴付けられるであろう。機能障害は、一過性の低酸素として突然のもの、または長期間および段階的なもの、または一過性の低酸素を繰り返して起こす可能性のあるものとして両方であってもよい。その上、このような慢性のまたは繰り返される事変は、その他の病変を引き起こすかもしれない。
【００１７】
本発明の治療を必要とする被験者は、どのような供与源に由来する低酸素にさらされたものであってもよい。通常、治療のための被験者は、老人、慢性閉塞性肺疾患を有する人、手術に入った人、脳卒中のリスクのあるもの、および低酸素の素因のある疾患を有するその他の人を含む低酸素のリスクのあるものである。低酸素は、被験者に細胞死および多種多様なシナプス機能不全を含む多くの病変を誘導する。治療を必要とする被験者は、低酸素で誘導されるシータリズム異常および記憶喪失に直面しているものである。
【００１８】
記憶喪失と関連したシナプス機能不全のみが本発明の治療を受けやすく、その他の低酸素効果は、本発明に従った治療を受けにくい。たとえば、低酸素は、長期増強（LTP）を妨げるが、アデノシンA1受容体アンタゴニストによる治療では、その妨害を緩和しない。
【００１９】
A1アンタゴニストは、含まれるCA1ニューロンおよび／またはシータ活性の発生および記憶保持の補助に関与するその他のものに対して機能するであろうことは、予測できなかった。
【００２０】
本発明に従った治療を受けやすい低酸素は、軽症、すなわち可逆性の効果を生じるが、細胞の減少を引き起こさずにシータ活性および／または細胞内シータを妨害するのに十分のものである。治療を受けやすい低酸素は、低い脳酸素レベルを生じているが、実質的に即時型の細胞死はないものである。本発明による標的とされる病変を誘導する低酸素の原因は、外傷事象、一過性脳虚血発作、手術に関連した低酸素、急性および／または慢性閉塞性肺疾患、髄膜炎脳炎などの中枢神経系感染、および／または中枢神経系のその他の外傷を含む。
【００２１】
治療を受けやすい繰り返される低酸素発症のタイプは、徐々に起こる神経変性に関するものかおよび／または先行するものであろう。このような疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プギリスチア（Pugilistia）または痴呆を含む。
【００２２】
本発明は、低酸素によって誘導される病変を減少または除去する。本発明の治療は、標的とされたニューロンにおいてアデノシンA1受容体を遮断する。この遮断により、シナプス効率を保護および強化して妨害を除去し、または本明細書において安定なシータリズムの減少を引き起こすシナプス抑止のことをいうシナプス機能不全を減少させる。本方法および組成物は、低酸素にさらされた被験者における傷害された記憶の症状のための治療を提供し、記憶喪失を治療または防止し、認識機能障害の程度を遮断または緩和する。
【００２３】
本発明に従った治療は、シータリズム産生に関与するニューロンに、低酸素によって誘導されるシナプス抑止を防止するために有効な量で、アデノシンA1受容体アンタゴニストを投与することを意味する。アンタゴニストは、血液脳関門を超えて、必要とされるときに、すなわち低酸素の間に、遮断効果を提供するために有効な用量および方法で投与されなければならない。
【００２４】
本発明のもう1つの側面は、アデノシンA1受容体アンタゴニストを投与することによって記憶喪失を治療または防止するための方法であって、可逆性の一過性の低酸素および関連するシナプス機能不全の効果を減少する方法に関する。本発明に従った低酸素効果は、シナプス伝達、シータ活性、および／または細胞内シータ活性の約50%〜約95%、たとえば約75%、約80%、または約90%の減少を含んでもよい。本発明に従った選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストの使用は、シナプス伝達および／またはシータおよび細胞内シータ活性の低酸素前のレベルの約75%〜約100%、たとえば約80、90、95、または99%回復するにことよって低酸素の効果を緩和してもよい。
【００２５】
本発明の製剤は、アデノシンA-1アンタゴニストを含む薬学的に許容される組成物である。血液脳関門を横切ることができ、低酸素によって引き起こされる記憶喪失に関連した病変を遮断するために有効な濃度において、いずれの不必要な副作用も引き起こさないアンタゴニストは、特に本発明において有用である。本発明によれば、薬学的に許容される組成物から本質的になり、低酸素で誘導される病変の緩和に関連する使用を指示する説明書と共に梱包された市販の製品が提供される。
【００２６】
本発明は、低酸素にさらされた被験者において低酸素で誘導される記憶喪失を軽減するための方法であって、シータリズムの減少を引き起こすシナプス抑止を防止するために有効な量のアデノシンA1受容体アンタゴニストを被験者に投与することを含む方法を提供する。本発明は、被験者の脳のアデノシンA1受容体を遮断することによって、被験者における低酸素で誘導される可逆性のシナプス抑止を防止するための方法を提供する。
【００２７】
また、本発明は、神経変性疾患を治療する方法であって、アデノシンA1受容体アンタゴニストの有効な量を（これを細胞損傷を逆転させ、および細胞消失を防止する薬剤の有効な量と組み合わせて）投与することを含む方法に関する。本発明は、さらにアデノシンA1受容体アンタゴニストおよび薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物であって、該組成物は、血液脳関門を超えてアンタゴニストを送達する薬学的組成物に関する。もう一つの態様において、本発明は、低酸素の間にシータ活性を維持する方法であって、アデノシンA1アンタゴニストを有効な量で脳に投与することを含む方法に関する。もう一つの側面は、細胞損傷の非存在下で、低酸素によるCA1ニューロンのシナプス抑止を防止または逆転させる方法に関する。
【００２８】
短期の低酸素は、CA1ニューロンのシナプス伝達、グルタミン酸作動性EPSPsおよびコリン作動性θの長期増強（LTP）、一過性の異シナプス性の相互作用に依存する記憶に関連したニューロンの活性の同調における機能を傷害する。さらに、短期の低酸素は、グルタミン酸作動性の入力、GABA作動性の入力、およびコリン作動性の入力のシナプス伝達を遮断し、CA1ニューロンネットワークにおける連絡切断またはシナプス「抑止」を引き起こす。これらの入力およびこれらの相互作用の多くは、学習および記憶におけるシナプス効率の増強において必須の役割を演じる。
【００２９】
発明者によって行われた実験では、短期の低酸素が、一過性にEPSPsおよびEPSCsを除去した。シナプス「抑止」は、再酸素化が開始されたときに、直ちに消滅し、シナプス後性には産生されなかった。低酸素シナプス「抑止」およびコリン作動性θの誘導の減少は、アデノシンA1受容体を遮断することによって防止された。一方、神経保護物質のシチコリンの適用は効果がないことから、細胞損傷が関与しないことが示唆される。
【００３０】
選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストの8-ペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）の存在下では、シナプス伝達は、低酸素の最後まで損なわれなかった。θ活性または細胞内θは、いずれも短期の低酸素による影響を受けなかった。
【００３１】
本発明者は、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）などの選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストを、一過性の低酸素で誘導される記憶喪失および関連したシナプス機能不全と関連した機能傷害を除去するために利用できることを示した。これは、アデノシンA1受容体を遮断することにより、異シナプス性の「抑止」からネットワークを解放することによって達成することができる。
【００３２】
本発明は、細胞損傷を逆転させて細胞消失を防止する薬剤と選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストを組み合わせることをさらに含む。さらに、アンタゴニストは、重篤な低酸素/虚血で誘導される記憶喪失に対する治療において価値があろう。
【００３３】
本発明は、選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストを有効な量で投与することによって障害性神経刺激伝達の疾患を治療するために使用される。このような疾患は、外傷を受けた脳、または脊髄の傷害、または重症筋無力症、多発性硬化症、アルツハイマー病、もしくは脊髄疾患などの神経性のまたは神経筋の疾患を含んでもよい。さらに、本発明は、薬学的組成物および薬学的に許容されるキャリアを提供する。
【００３４】
アデノシンA1受容体を遮断するための一般的な方法は周知である。多くのアデノシンA-1アンタゴニストが知られており、当業者は従来のスクリーニング法によってさらに同定することもできる。たとえば、Jacobsonらに対する米国特許第6,166,181号、およびJoel Lienden, Structure and Function of A1 Adenosine receptor, The FASEB Journal, V5:2668-2676（1991年9月）を参照されたい（参照によりこれらの全体が本明細書に援用される）。アデノシンA-1アンタゴニストの特定の例は、8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）、1,3-ジエチル-8-フェニルキサンチン（DPX）、8-（p-スルホフェニル）テオフィリン、BWA-844U、XAC、CGS-15943、BWA1433U、CP-68,247、XCC、8-Pt、DPSPX、およびCP-66,713である。
【００３５】
薬学的組成物を低酸素にさらされた被験者の脳に投与する治療的な方法。本発明において有用な化学組成物は、適切な薬学的に許容されるキャリアまたは希釈液に溶解および／または添加することによって薬学的組成物に「変換」することができる。したがって、本組成物は、従来の手段を使用して、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、傷薬、溶液、坐薬、注射可能薬物、吸入薬、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、またはガス状標品に処方されてもよい。
【００３６】
活性成分または活性剤が標的細胞または器官に到達するまでにこれらが放出または吸収されることを防止するために、または本薬剤の徐放性を保証するために、既知の方法が使用される。薬学的に許容される形態は、活性剤を不活性化または変性させないものである。本明細書において有用な薬学的用量剤形において、本発明の組成物は、単独で、またはその他の薬学的に活性な化合物と適切に結合して、もしくは組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
したがって、本発明の薬学的組成物は、被験者の多くの部位のどこにでも投与することができ、これにより多くの経路のいずれかを介してデリバリーされ、所望の効果が達成される。局部的または全身的デリバリーは、体の一部分または体腔に注射、注入液、またはシンチレーション（sintillation）を介して薬学的組成物を投与することによって、あるいは経口摂取、吸入、またはエアロゾルのガス吸入法によって達成される。好ましい投与経路は、筋肉内の、頭蓋内の、静脈内の、腹腔内の、皮下皮内の、または局所の経路を含む非経口的な投与を含む。
【００３８】
本組成物は、ユニット用量剤形であって、それぞれの用量ユニット、たとえば小匙、タブレット、注射可能な溶液の定型的体積、または坐薬は、本組成物を単独で、またはその他の薬学的活性剤と適切に組み合わせて、予め定められた量で含む組成物を提供することができる。「ユニット用量剤形」の用語は、ヒトまたは動物被験者に適した物理的に分離したユニットであって、それぞれのユニットは、上述の通りの本薬学的組成物の予め定められた量または所望の効果を生じさせるために十分な量の組合せを含む。薬学的に許容されるどのような希釈液またはキャリアも、たとえば食塩水、緩衝液、もしくはその他の生理的に許容される水溶液などの液状のキャリア、または媒体を、用量ユニットにおいて使用してもよい。本発明の新規ユニット用量剤形のための規格は、達成される特定の効果および特定の宿主における薬学的組成物の特定の薬力学的性質に依存する。
【００３９】
組成物の「有効な量」は、宿主において所望の効果を生じることができる量であって、この効果を当業者に既知の任意の指標を使用してモニターすることができる量である。本明細書に記載された方法は、全てが包括されることを企図せず、当業者に既知のさらなる方法が適切に使用されてもよい。
【００４０】
本発明の脳組織は、シータ活性をモデリングする制御された条件下の、インサイチュウ（被験者の脳において）またはインビトロ（たとえば脳組織生検または切片）のものであってもよい。さらに、本明細書において例示したそれぞれの活性剤の量は、それぞれの成分の範囲の一般的なガイダンスを提供することを企図し、インビトロまたはインビボのいずれかにおける実施のためにこれらの方法を最適化する際に、開業医によって利用されてもよい。さらに、例示した用量範囲は、特定の適用において認可されるかもしれないので、より高い、またはより低い用量の使用を排除しない。たとえば、実際の用量およびスケジュールは、（a)組成物がその他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるかどうか、または（b）薬物動態学、薬物処分、および代謝の個人間の差に従って変更してもよい。同様に、量は、インビトロにおける適用のために変更してもよい。当業者は、特定の状況の要求に従って、任意の必要な調節を容易に行うことができる。
【実施例】
【００４１】
方法
脳切片および電気生理学。雄Sprague-Dawleyラット（150〜200gm）をペントバルビタールで麻酔をかけて、脳を除去し、迅速にaCSF溶液で冷却し、連続的に95%のO2および5%のCO2で泡立たせた。海馬をスライス（400μM）して、酸素を供給したaCSFに置いた（NaCl 124mM；KCl3；MgSO4 1.3；CaCl2 2.4；NaHCO3 26；NaH2PO4 1.25；およびグルコース10）。CA1錐体細胞を、30〜31℃において鋭い電極で記録された（先端抵抗：60-120MΩ）。研究は、-70mVよりも陰性の安定静止状態の膜ポテンシャルのCA1ニューロンにおいて行った。言及しない限り、試験刺激は分あたり1回（0.017Hz）の頻度で与えた。シグナルをAxoClamo-2B増幅器で増幅し、P-クランプデータ収集および解析ソフトウェアによるDigiData 1200（Axon Instruments, Inc）を使用してデジタル化し、保存した。
【００４２】
低酸素。低酸素の発症は、95%のN2/5%のO2/5%のCO2を3分間または95%のN2/5%のCO2を100秒間で酸素供給を置換することによって誘導した。どちらに対するニューロンの応答も、予備実験では同一であるように見えた。低酸素は、シナプス伝達の回復不能な機能障害を生じさせるために他で使用されたものよりも穏やかである25。
【００４３】
組織学。行動検定の終わりに、400mlの10%ホルムアルデヒドによる深い終末ペントバルビタール麻酔下でラットを経心臓で灌流した。灌流した脳をろうに包埋した。7μmの冠状切片を回転ミクロトームによって切断し、および海馬体を介した連続切片をスライドに取り付けてニッスル染色のために処理した。
【００４４】
空間迷路課題。雄の成体ウィスターラット（200〜250gm）をナトリウムペントバルビタール（60mg/kg、i.p）で麻酔をかけて定位的器具（Kopf Instrument, Tujunga、CA）に配置した。2つのステンレスガイドカニューレを、無菌条件下で、座標に配置された先端に配置した（前後、0.5mm；側、1.5mm；水平、3.2mm）。任意のさらなる実験の前に、7日間の回復期間を許した。全てのラットは、ランダムに異なる群に割り当て（各10匹）、1.5m（直径）×0.6m（深度）のプール（22±1℃）で2分間泳がせた。翌日に、ラットには1日に2回の試行を4日間連続して訓練した。それぞれの訓練試行は、固定位置でかつ水表面の約1cm下に沈めて配置された隠れたプラットフォームを見つけることによってラットが水から逃げることを学ぶ間、2分間まで続けた。ラットの航路決定は、ビデオカメラによって追跡した。最後の訓練試行の24時間後、プラットフォームを除去した後に四分円試験（1分間）を行った。
【００４５】
結果
CA1ニューロンの機能に対する短期の低酸素の効果を、シナプス伝達、グルタミン酸作動性EPSPsおよびコリン作動性θの長期活性化（LTP）、一過性の異シナプス性の相互作用に依存する記憶に関連したニューロンの活性の同調についてモニターした。海馬薄片に対してコリン作動性受容体アゴニストのカルバコール（50μm、20分）をバス適用することにより、中隔の活性化および散在性のアセチルコリン伝達を模倣して、CA1θの電場電位を誘導した（図la；ピーク振幅：0.73+0.02mV、n=10、p＜0.05、7.4±0.7Hzにおけるバックグランドノイズからのもの）。θは、アトロピン遮断に感受性であり、3時間以上続いた7。また、膜電位のθ振動（7.5±1.0mV；n=18；p＜0.05）は、CA1錐体細胞においても観察された（細胞内θ；図1b）。θ誘導の約30分後に誘導された短期の低酸素は、θ活性を87.4%に（5.2%；n=8、p＜0.05；図1a）および細胞内θを同程度に（88.24.9%、n=9、p＜0.05；図1b）非常に減少した。しかし、シャファー側副（Sch）グルタミン酸作動性入力（図1c、e）に対するLTPの応答は、低酸素によって減少されないが、増強され（図1d、e）、報告された低酸素LTP8およびLTP発現が低酸素の数分後に一過性に低酸素を受けやすいという観測と一致した。シナプス伝達は、低酸素の3分間の最終期においてのみ短期間に遮断された9。
【００４６】
低酸素の期間は、グルタミン酸作動性入力8、GABA作動性入力8、10、およびコリン作動性入力11、12のシナプス伝達を遮断し、CA1ニューロンネットワークの連絡切断またはシナプス「抑止」を生じることが知られている。これらの入力およびこれらの相互作用は、学習および記憶におけるシナプス効率の増強において本質的な役割を演ずることが知られている13。シナプス伝達における短期の低酸素の効果および低酸素反応に対する薬剤の効果を、Sch活性化に対するCA1錐体細胞の反応についてモニターした。短期の低酸素は、短期間にEPSPsおよびEPSCsを除去した（図2a、b；95.2±5.6%、n=10、および96.8±4.2%、それぞれp＜0.05）。シナプス「抑止」は、再酸素添加が開始されたときに直ちに消失し（図2a、b）、シナプス後性には産生されなかった。3分間の低酸素の最後の数秒間にグルタミン酸を局所的に適用すると、これらのコントロール値（206.8±9.7pA）とほとんど差のないピーク内部電流（201.2±10.5pA）を示した。
【００４７】
低酸素のシナプス「阻止」およびコリン作動性θ誘導の減少は、アデノシンA1受容体を遮断することによって防げられた。一方、神経保護性基質のシチコリンの適用では効果がないことから（図3a；n=6。p＜0.05）、細胞傷害は関与していなかったことを示唆する。選択的アデノシンA1受容体アンタゴニストの8-シクロペンチル-1,3-ジプロピルキサンチン（CPDPX）の存在下では、低酸素の終わりにおいてシナプス伝達は完全なままであった（低酸素の終わりの99.2±2.4%、対、対照の100%、図3b、；n=7。p＞0.05)。θ活性（100.2±3.2%、n=6、p＞0.05）または細胞内θ（99.6±3.0%、n=8、p＞0.05）のいずれも、短期の低酸素による影響を受けなかった（図3c、d）。
【００４８】
一過性の低酸素/虚血の結果の最大の後遺症のうちの1つは、健忘症である。空間学習における短期の低酸素およびCPDPXの効果を、隠れたプラットフォームの水迷路を使用してラットにおいて評価した（図4a）。短期の低酸素の発症による明らかな細胞減少（図3e、f）は、いずれも生じなかった。図4bに示すように、3群の全てのラットのプラットフォームへの逃避までの時間は、トレーニングセッション後に減少した。しかし、群の相違が有意であったことから（F2,27=9.142、p＜0.001）、短期の低酸素（低酸素ラット）に供されたラットの空間学習は、より遅かったことを示す。この後の解析では、第3の試験（p＜0.05）に由来する有意差を示す。最後の訓練試験の24時間後の四分円試験では、低酸素ラット（図4d）が四分円の好みを示さないことが示されたが（F3,36=1.8、p＞0.05）、対照（F3,36=160.3、p＜0.0001；図4c）は、プラットフォームが以前に配置されていた標的四分円（四分円4）において、より多くの時間を費やして探していた。したがって、この空間記憶保持課題において、低酸素ラットでは、これらの対照よりも劣っていた。
【００４９】
短期の低酸素で誘導される記憶の欠乏は、CPDPXに感受性であった。CPDPXの左右の脳室内注射により、空間記憶に対する低酸素機能障害を除去した（図4b）。四分円試験では、CPDPX-低酸素ラットが標的四分円に対して好みを示し（F3,36=169.7、p＜0.05)、対照のものと一致することが示された。しかし、総遊泳距離は、3つの群の間で異ならなかった（図4f；p＞0.05）。
【００５０】
また、CA1細胞消失の程度以外の因子も、行動機能障害に寄与することが知られている15、16。一過性の低酸素/虚血により、アデノシンの放出を誘導し17、19、KATPおよびKCa2+チャンネル開口を生じ20、および刺激で誘導されるシナプス前シナプス後A1受容体における作用を介したニューロンへのカルシウム流入が減少する21。コリン作動性θの減少は、異シナプス性入力の一過性の相互作用が損なわれることを示唆する。安定なθ活性のためには、いくらかのレベルの持続的活性および異シナプス性入力の相互作用が必要であろう。さらに、アデノシンA1受容体は、Gタンパク質に結合し、おそらくこれらを経てカリウムチャネルの開口を容易にする。InsP3感受性の内部貯臓からの内因的なCa2+の放出は、低酸素応答の主成分として関与しているかもしれない22。CA1機能の妨害は、短期の低酸素によって観察される空間記憶欠乏の基礎をなしているであろう。一方、わずかに増強されたEPSPsおよびLTP自体は、空間学習の減少を引き起こしそうにはない。イノシトール1,4,5-三リン酸-3-キナーゼA欠損マウスでは、CA1長期活性化が二倍に増強されており、空間学習は正常であることが報告された23。短期の低酸素の発症は、加齢またはアルツハイマー病の際の段階的な記憶減退に関連しているのであろう。全体的虚血の短期の発症は、脆弱CA1ニューロンにおけるアミロイド前駆体タンパク質の産生を増大させるのに十分であることが報告されている24。低酸素シナプス「阻止」は、脳の学習および記憶するための機能を損ない、低酸素が短期であることがわかった場合、これは不必要な犠牲である。アデノシンA1受容体の遮断を介した異シナプス性「阻止」からのネットワークの救助は、機能損傷を除去するための有効なストラテジの代表例である。細胞損傷を逆転させて細胞消失を防止する薬剤と組み合わせることにより、アンタゴニストは、重篤な低酸素/虚血で誘導される記憶喪失に対する治療のために役立つであろう。
【００５１】
本明細書において例示され、議論された態様は、本発明者が知っている本発明を製作し使用するための最高の方法を当業者に教示することを企図するのみである。本明細書は、本発明の範囲を制限するものとはみなされない。本発明の上記の態様は、上記の教示を考慮して当業者によって認識されるように、本発明から逸脱することなく、修飾または変化され、および要素が付加され、または省略されてもよい。したがって、記載された特徴およびこれらの均等の範囲内で、本発明が特に記載された物の他に実施されてもよいことは理解されることである。
【参照文献】
【００５２】
以下の引用文献は、本願明細書に引用したものとする：
1. Grubb, N. R., O'Carroll, R., Cobbe, S. M., Sirel, J. & Fox, K. A. Chronic memory impairment after cardiac arrest outside hospital. Br. Med. J. 313,143-146 (1996).
2. Semenza, G. L. Perspectives on oxygen sensing. Cell 98, 281-284 (1999).
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本発明は、添付の図に関して上記の詳細な説明を読み込んでよりよく理解がなされる：
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図1a-1、1a-2、1a-3、1b-1、1b-2、1b-3、1c、1d、および1eは、コリン作動性CA10θおよびSch-CA1 EPSPsの長期活性化に対する短期低酸素の特異な効果を示す。記録した電場電位の例：カルバコール前の対照（図1a-1）、カルバコールの間（50μM、30分；図1a-2）、および短期低酸素の10分後（5%のO2、3分；図1a-3）。記録したCA1錐体細胞の膜電位トレース：プレカルバコール（対照；図1b-1）、カルバコール適用の間（50μM、30分；図1b-2）、および短期低酸素の10分後（5%のO2、3分；図1b-3）。膜は、負電流を通すことによってプレカルバコールレベルで維持された（第二のトレース）。HFS後（LTP、HFSの40分後）およびHFS前（対照）の代表的なSch-CA1 EPSPトレース（図1c）。HFS前（対照）、HFS後（LTP、HFSの29分後）、および短期低酸素（5%のO2、3分）直後の代表的なSch-CA1 EPSPトレース（図1d）。図1eは、HFS（第一の矢印で）および短期の低酸素（第二の矢印で）に応答したSch-CA1 EPSPsの時間経過を表す。データポイントは、平均の平均±S.E.である。EPSPsは、1/分で誘起された。明瞭にするために、ポイントおきに示した黒四角：対照；黒丸：5%のO2を3分。
【図２】図は2a、2b、2c、および2dは、短期の低酸素によって明らかな細胞の損失を生じることなく、シナプス抑止が生じたしたことを示す。Sch-CA1 EPSPs（図2a）およびEPSCs（図2b）は、次のトレース（回復）および低酸素前（対照）のものと比較して、短期の低酸素（5%のO2、3分）の終わりに簡潔に消失した。短期の低酸素の前（Glut；10mMを20μ1）（図2c）および終わり（図2d）におけるグルタミン酸の局部的適用に対する膜反応の代表的なトレース；3分間の低酸素の終わりの0.5秒前にグルタミン酸を適用（10mMを20μl）し、その結果ピークは、ほぼ3分の最後であった）。ニッスル染色した背側のCA1野の冠状断面は、対照ラットおよび8発症の短期の低酸素に供したラット（図示せず）において、はっきりした核を有する高密度にパックされた錐体細胞を示した。
【図３】図3a、3b、3c-1、3c-2、3c-3、3d-1、3d-2、および3d-3は、短期の低酸素に応答するシナプス抑止、CA1θに対するアデノシンA1受容体アンタゴニストの効果を示す。シチコリン（100pM）の存在下では、シナプス抑止は、3分間の低酸素の終わりに観察された（図3a）。8-シクロペンチル-1-3-ジプロピルキサンチン（10μM）の存在下では、シナプス抑止がなくなり（図3b)、および短期の低酸素は、CA1錐体細胞（図3d-1-3）のコリン作動性CA1θ（図3c-1〜3）またはコリン作動性細胞内θのいずれも除去しなかった。
【図４】図4a、4b、4c、4d、4e、および4fは、隠れたプラットフォームの水迷路課題におけるラットの生成期に対する短期の低酸素およびアデノシンA受容体アンタゴニストの効果を示す。図は、実験プロトコルを例示し（図4a）、12回の試行にわたる水迷路トレーニングにおける逃避までの時間（平均±SEM）（図4b）（F11,312=50.14、p＜0.0001）、および第12回のトレーニングセッションの終わりに行った四分円の好み（図4c、4d、および4e）、および遊泳距離（1分間において；図4f）を示す。ラットは、第2または第4回の試験日の後のガラスジャー中で約30分間、空気または低酸素（95%のN2/5%のCO2を100秒間）に供した。左右対称i.c.v.CPDPX（400nmoles/部位）または媒体を第2および第4回の試験日の前に投与した。四分円4がトレーニングの間の標的四分円である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004534022.tif 000032
【国際調査報告】
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