(57)【要約】本発明は、トランスフォーミング増殖因子−β関連（ＴＧＦ−β−Ｒ）のポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生するための方法も提供する。本発明はさらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態を処置、診断、改善、および／または予防するための方法を提供する。ＴＧＦ−β−Ｒアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこの宿主細胞を培養する工程およびそのようにしてされたポリペプチドを必要に応じてに単離する工程を包含する、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５またはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０パーセント同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）ヌクレオチド配列であって、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、または（ａ）のヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、または少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかの領域であって、該ポリペプチドフラグメントが、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示される該コードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５またはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物の該ヌクレオチド配列、または少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）ヌクレオチド配列であって、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示される該ポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生するプロセスであって、請求項５に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で培養する工程、および必要に応じて、該ポリペプチドを該培養物から単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子が、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＴＧＦ−β−ＲポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、前記パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、核酸分子。
【請求項１２】
化合物が、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５、６または７のいずれかに記載の細胞を、該化合物に曝露する工程、および該細胞中でのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５またはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物によってコードされる、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０パーセント同一のアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；および
（ｄ）アミノ酸配列であって、配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、２、または３のいずれかの核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメントであって、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらのフラグメントを特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ−グラフト化された抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
選択的結合因子またはそのフラグメントであって、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドについての特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識に結合している、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの生物学的活性を拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに関連する、疾患、状態または障害を処置、予防または改善するための方法であって、患者に、請求項１８に記載の有効量の選択的結合因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
動物を、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体または請求項１８に記載のフラグメントを使用して、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項３７】
生物学的サンプル中のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの量を検出または定量するためのキットであって、請求項１８に記載の選択的結合因子を備える、キット。
【請求項３８】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３９】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤または抗酸化剤である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を包含する、ポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ウイルスベクターに含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
医学的状態を処置、予防または改善するための方法であって、請求項１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、２もしくは３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、１４もしくは１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の、サンプル中での存在または量を決定する工程；ならびに
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適する膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞
を備え、該細胞が、請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌し、そして該膜が、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５１】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
該化合物に結合した場合のポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１、２、または３のいずれかに記載の核酸分子を動物に投与する工程を包含する、該動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法。
【請求項５４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５５】
化合物が、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５４に記載のトランスジェニック哺乳動物を、該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物中でのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項５６】
固体支持体に付着された、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５７】
少なくとも１つの、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む核酸分子のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／２５３，４７６号（２０００年１１月２８日出願）からの優先権を主張する。この開示は、参考として本明細書中に明確に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、トランスフォーミング増殖因子−β−関連（ＴＧＦ−β−Ｒ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法に関する。本発明はさらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに関連する疾患、障害および状態の診断、処置、改善および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術的進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規の治療剤の発見を大きく加速した。現在では、高速の核酸配列決定技術により、前例のない速度で配列情報が作製され得、そしてコンピュータ分析と結合されて、部分的または全体的なゲノムへと重複する配列を集合させることが可能であり、そしてポリペプチドコード領域の同定が可能である。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にし得る。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用するために有利な特性を産物に付与し得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における著しい技術的進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づいた新規の治療剤の開発に対する可能性は、未だ広範には実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療的分子に対して「標的」として機能し得る）は、依然として同定されていない。従って、診断的または治療的な利点を有する、新規なポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子およびコードされるポリペプチド関する。
【０００６】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号１または配列番号３のいずれかに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５またはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００７】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１または３のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサート、または（ａ）のヌクレオチド配列に記載のヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサート、または（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列の、領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、ヌクレオチド配列領；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５もしくはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサート、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列のヌクレオチド配列の、領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列。
【０００９】
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸；および
（ｂ）ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５またはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列；
本発明はまた、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のいずれかのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についてのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、アミノ酸配列のフラグメント；および
（ｄ）配列番号２もしくは配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２６６５またはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサート、または（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのアミノ酸配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列。
【００１１】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の切断を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端切断からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
ＴＧＦ−β−Ｒアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこの宿主細胞を培養する工程およびそのようにしてされたポリペプチドを必要に応じてに単離する工程を包含する、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００１４】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現およびレベルの増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子は、内因性ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を抑制する様式で、動物に導入される（すなわち、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック非ヒト動物を生成する）。このトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、そしてより好ましくは、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１５】
本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１６】
さらに、本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニスト性またはアンタゴニスト性であり得る。
【００１７】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチドまたは選択的結合因子、および１以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドの治療的有効量を提供するように使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１８】
本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドおよび核酸分子を使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む疾患および障害を処置、予防、改善、および／または検出し得る。
【００１９】
本発明はまた、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合する試験分子を同定するために試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、試験分子がポリペプチドに結合する程度を決定するために、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと試験分子を接触させる工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子がＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストのどちらであるかを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性に対する、分子の影響を試験する方法を、提供する。
【００２０】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を制御する方法およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのレベルを調節する（例えば、増加および減少させる）方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子を、動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を制御または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例として、さらに本明細書に記載されるような、遺伝子治療、細胞治療、および抗アンチセンス治療が、挙げられる。
【００２１】
本発明の別の局面において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、そのレセプター（「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプター」）を同定するために、使用され得る。「発現クローニング」の種々の形態を広範に使用して、タンパク質リガンドに対するレセプターがクローニングされている。例えば、ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：４３７〜４１ならびにＴａｒｔａｇｌｉａら、１９９５、Ｃｅｌｌ　８３：１２６３〜７１を参照のこと。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターの単離は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストの同定または開発に対して、有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプター、抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプター−選択的結合因子（例えば、抗体およびその誘導体）、低分子、おおびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらの任意のものは、本明細書中で開示される疾患または障害を含む１つ以上の疾患または障害の処置のために、使用され得る。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、そしてそこに記載される内容を限定するように解釈されるべきではない。本願において引用される全ての参考文献が、明確に、本明細書中に参考として援用される。
【００２３】
（定義）
用語「ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子」または「ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子」または「ＴＧＦ−β−Ｒポリヌクレオチド」とは、配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２６６５またはＰＴＡ−２６６６におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
【００２４】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２５】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２６】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、その核酸分子が天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された、本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの、全てまたは一部に連結していない、本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない本発明の核酸分子、をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いずれの他の混入核酸分子も、天然の環境において見出されるいずれの他の混入物（これらは、ポリペプチド産生におけるその使用、またはその治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる）も実質的に含まない。
【００２７】
用語「核酸配列」または「核酸分子」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２８】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００２９】
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞の形質転換に適しており、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指示および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
用語「作動可能に連結される」は、隣接配列の配置をいうために、本明細書中で使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築される。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことが可能であり得る。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在する非翻訳性であるが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結される」とみなされ得る。
【００３１】
用語「宿主細胞」は、核酸配列により形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうために使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、その子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３２】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体、およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体が挙げられ、これらの関連ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、本明細書中に定義される場合成熟ポリペプチドであり得、そしてそれらの調製方法によっては、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３３】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ末端での短縮（リーダー配列を有しても有しなくてもよい）および／またはカルボキシル末端での短縮を含む、ポリペプチドをいう。用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント」とはまた、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体、あるいはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体のアミノ末端短縮および／またはカルボキシル末端短縮をいうか、あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドスプライス改変体によりコードされるポリペプチドのアミノ末端短縮および／またはカルボキシル末端短縮をいう。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメントは、オルタナティブＲＮＡスプライシングから、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの膜結合形態は、本発明によりまた意図される。好ましい実施形態において、短縮および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このように生成されたポリペプチドフラグメントは、約２５の連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメントは、必要に応じてアミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対する抗体を作製するために用いられ得ることが認識される。
【００３４】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３５】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体」とは、配列番号２または配列番号４（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＴＧＦ−β−Ｒ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド対立遺伝子改変体、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ、およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドスプライス改変体）か、または人工的に構築され得る。このようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号１または配列番号３のいずれかに示されるＤＮＡ配列から適宜に変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３６】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ、または、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体をいう。用語「ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体」とはまた、化学的に改変された、本明細書中で定義されるようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド対立遺伝子改変体、またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドスプライス改変体によりコードされるポリペプチドもいう。
【００３７】
用語「成熟ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド」とは、リーダー配列を有さないＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをいう。成熟ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドはまた、他の修飾（例えば、アミノ末端のタンパク質分解性プロセシング（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化など）も含み得る。
【００３８】
用語「ＴＧＦ−β−Ｒ融合ポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドオルソログ、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体、またはＴＧＦ−β−Ｒ誘導体のアミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質または異種ペプチド）の融合をいう。用語「ＴＧＦ−β−Ｒ融合ポリペプチド」とはまた、本明細書中で定義されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド対立遺伝子改変体またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸の融合もいう。
【００３９】
用語「生物学的に活性なＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドに特有の少なくとも１つの活性を有するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをいう。さらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、このＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１エピトープを含む。
【００４０】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然に一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された、本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結（共有結合の相互作用または非共有結合の相互作用によって）されていない、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結されていないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチド、をいう。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療的用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出されるいずれの他の混入ポリペプチドも他の混入物も、実質的に含まない。
【００４１】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチド配列鎖（ｓｔｒｉｎｇ）間または２つ以上のアミノ酸配列鎖間の一致によって決定されるように、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により取り扱われたギャップ整列（存在する場合）との間の同一の一致パーセントを評価する。
【００４２】
用語「類似性」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的であり、「類似性」とは、同一の一致と保存的置換の一致との両方を含む関連性の程度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、両方とも５０％である。同じ例において、保存的置換が存在するさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、これら２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００４３】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」とは、生物学的物質（例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞など）と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」とは、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４４】
用語「有効量」および「治療有効量」とは、各々、本明細書中に示されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用される、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の量をいう。
【００４５】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子、またはＴＧＦ−β−Ｒ選択的結合因子の送達の達成または促進に適した１つ以上の処方物質をいう。
【００４６】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するために使用され得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４７】
用語「選択的結合因子」とは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対して特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合し、かつヒト非ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間変形（例えば、マウスＴＧＦ−β−ＲポリペプチドおよびラットＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド））に結合し得ることが、認識される。
【００４８】
用語「形質導入」は、１つの細菌から別のものへの（通常、ファージによる）遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の獲得および移入をいう。
【００４９】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用される。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ　１３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００５０】
用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変された場合、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、その形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そのＤＮＡが細胞分裂により複製される場合、安定に形質転換されているとみなされる。
【００５１】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１または配列番号３のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を包含すること、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／もしくは欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、そのような関連するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、一つ以上のＮ結合グリコシル化部位もしくはＯ結合グリコシル化部位の付加もしくは欠失または、一つ以上のシステイン残基の付加または欠失を含み得る。
【００５２】
関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または少なくとも約５０個連続したアミノ酸、または少なくとも約７５個連続したアミノ酸、または少なくとも約１００個連続したアミノ酸、または約１００個以上連続したアミノ酸のポリペプチドをコードするＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５３】
さらに、関連するＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子はまた、本明細書中で定義したとおりの中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、もしくは配列番号３のいずれかのＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子またはポリペプチドをコードする分子の十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含し、このポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４、または本明細書中に定義されるような核酸フラグメント、または本明細書中に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるＴＧＦ−β−Ｒ配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを関連する配列についてスクリーニングするために調製され得る。既知配列に対して有意な同一性を示す、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を、スクリーニングのためのプローブの設計に使用し得る。
【００５４】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ有意に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設定された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５℃〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５５】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの割合は影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの割合は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５６】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げられる。
【００５７】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０℃〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７℃〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を許容する。
【００５８】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、これは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００５９】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ　ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃　＋　Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　６８３頁（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００６０】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６１】
別の実施形態では、関連する核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなる。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号３のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一である。関連する核酸配列は、配列番号２、もしくは配列番号４のいずれかに示されるようなポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６２】
核酸配列における相違は、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的および／または非保存的改変をもたらし得る。
【００６３】
配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する、対応する改変）は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生じる。対照的に、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することへの影響が有意に異なる、配列番号２もしくは配列番号４または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートコンホメーションもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００６４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、非ネイティブ残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されていたように、アラニンによって置換され得る。
【００６５】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６６】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６７】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスのメンバーへの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相同であるヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同性領域に導入され得る。
【００６８】
このような変更を作製する場合、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｉｎｄｅｘ）が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられる。この疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【００６９】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える上での疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野で理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が、類似した疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお、類似した生物学的活性を保持することは公知である。疎水性親水性指標に基づいて変更する際、疎水性親水性指標が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、疎水性親水性指標が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして疎水性親水性指標が±０．５内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。
【００７０】
同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得、特に、それによって作製される生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドが本発明における場合と同様に免疫学的な実施形態における使用を意図されていることもまた、当該分野で理解される。タンパク質の最も大きな局所平均親水性は、隣接アミノ酸の親水性によって支配される場合、その免疫原性および抗原性（すなわち、そのタンパク質の生物学的特性）と相関する。
【００７１】
以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に対して割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変更する際、親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして親水性値が±０．５内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。当業者はまた、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」ともいわれる。
【００７２】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関わらず）は、そのような置換が所望される場合に当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの重要な残基を決定するために使用され得るか、または本明細書中に記載されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させるために使用され得る。例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００７３】
【表１】
2004514448.tif 000002
当業者は、周知技術を用いて配列番号２または配列番号４のいずれかに示されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。生物学的活性を損なわずに変化され得る分子の適切な領域を同定するため、当業者は、活性に重要であるとは考えられない領域を標的とし得る。例えば、同種由来または他種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが公知の場合、当業者は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプチドと比較し得る。そのような比較を用いて、当業者は、類似のポリペプチド間で保存されるその分子の残基および部分を同定し得る。そのような類似のポリペプチドに対して保存されていないＴＧＦ−β−Ｒ分子の領域における変化が、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの生物学的活性および／または構造に逆の影響をおそらくはとんど与えないことが、理解される。当業者はまた、たとえ比較的保存された領域であっても、活性を維持した状態で天然に存在する残基を化学的に類似したアミノ酸で代用し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを理解する。従って、生物学的活性または構造に対して重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を損なうことなく、またはポリペプチド構造に逆の影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換を受け得る。
【００７４】
さらに、活性または構造に重要である類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を当業者は、再検討し得る。そのような比較を考慮して、当業者は、類似のポリペプチドにおいて活性もしくは構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのそのような予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【００７５】
当業者はまた、類似したポリペプチドにおける三次元構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。そのような情報を考慮して、当業者は、三次元構造についてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを推測し得る。当業者は、タンパク質の表面上であると推測されるアミノ酸残基に対して根本的な変化を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各々のアミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験改変体を作製し得る。その改変体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。そのような改変体を使用して、適切な改変体に関する情報を収集し得る。例えば、当業者は、特定のアミノ酸残基に対する変更が、崩壊された活性、図らずも減少された活性、または不適切な活性を生じることを発見した場合、そのような変更を有する改変体は、回避される。言い換えると、そのような慣用的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独または他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７６】
多数の科学刊行物が、二次構造の予測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕら、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが二次構造の予測を補助するために現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の予測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳み数を含む）の促進がもたらされた。Ｈｏｌｍら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質における限定された数の折り畳みが存在すること、および一度構造の臨界の数が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【００７７】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−３８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−４３５８）、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）が、挙げられる。
【００７８】
好ましいＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変更されている、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ連結性炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ連結性炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ連結性グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ連結部位が作製される、Ｎ連結炭水化物鎖の再配置もまた、提供される。さらなる好ましいＴＧＦ−β−Ｒ改変体としてはシステイン改変体が挙げられ、ここで、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較された場合、１つ以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換される。システイン改変体は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離後に、生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、非対合のシステインより生じる相互作用を最小にするよう同数のシステイン残基を有する。
【００７９】
別の実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むか（そしてそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）、または、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む（そしてそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体はまた、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含み、ここでそのポリペプチド配列は切り詰められたカルボキシル末端および／またはアミノ末端を有し、且つさらにここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体はさらに、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、切り詰められたカルボキシル末端、および切り詰められたアミノ末端からなる群より選択される、少なくとも１つ以上の改変を有する配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含み、ならびにここでそのポリペプチドは配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する。
【００８０】
さらなる実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、あるいは約９５、９６、９７、９８または９９％、同一なパーセントであるアミノ酸配列を含む。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１っの活性を保持する。
【００８１】
さらに、配列番号２または配列番号４、あるいは他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＴＧＦ−β−Ｒ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部（例えば、細胞外ドメインまたは、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその一部；触媒的に活性である、酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８２】
融合は、配列番号２または配列番号４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基である。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合した部分の分離を可能にするよう、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計され得る。融合ポリペプチドは、一度構築されると、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインと融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分、抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食作用細胞による攻撃といったエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン、を含む。Ｆｃは長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは短寿命である（Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−５３１）。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合機能、プロテインＡ結合機能、補体固着機能、および恐らくは胎盤移入機能すら、組み込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８４】
【表２】
2004514448.tif 000003
一例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメント（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
【００８５】
得られたＴＧＦ−β−Ｒ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用により精製され得る。Ｆｃ領域と融合されたペプチドおよびタンパク質は、非融合の対応物よりも実質的に長い半減期をインビボにおいて示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療的品質、循環時間、もしくは減少した凝集性のような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００８６】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法により容易に計算され得る。そのような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ　１，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　１９９４）；Ｇ．ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｌｅ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８、ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：ｌＯ７３に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を付与するよう設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４ｌ０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ　ＮＬＭ　ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００８８】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、その２配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、要求のポリペプチドの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００８９】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合スパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される；「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各々完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ　２５０またはＢＬＯＳＵＭ　６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、そのアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５　Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３　１９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１０９１９（ＢＬＯＳＵＭ　６２比較行列）を参照のこと）。
【００９０】
ポリペプチド配列の比較のため好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　および　Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ　６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，前出）；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメーターを用いて有用である。上述のパラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用して、ポリペプチドを（末端ギャップに関するペナルティーがなしで）比較するためのデフォルトパラメーターである。
【００９１】
核酸分子配列の比較のための好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出；
比較マトリックス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムはまた、上記のパラメーターを用いて有用である。上述のパラメーターは、核酸分子を比較するためのデフォルトパラメーターである。
【００９２】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値が使用され得、これらは、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に示されるものを含む。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、なされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）に依存し；さらに、その比較が、所定の配列対の間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）かまたは、一つの配列と大きな配列データベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【００９３】
（核酸分子）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９４】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、および／またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．および　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　１９９４）に示される方法である。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９５】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、１つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部が、同じ種からオルソログ遺伝子または関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。そのプローブまたはプライマーは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１または配列番号３のいずれかに示される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度のストリンジェンシーの条件または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用され、そのスクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【００９６】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使用する、発現クローニングによって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表面において発現されそして提示されるクローン化タンパク質への、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、検出可能な標識を用いて修飾されて、所望のクローンを発現する細胞を同定する。
【００９７】
以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを作製し得、そしてコードされるポリペプチドを発現させ得る。例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、大量に産生され得る。
【００９８】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡが、酵素逆転写酵素を使用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡの領域を増幅する。
【００９９】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら，１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法、およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１００】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択される、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度に関する「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの場合において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが望ましくあり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する場合、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成され得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出），およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照）。Ｅｎｇｅｌｓら（前出）によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０２】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。そのベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、そのベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞、および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が、好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０）を参照のこと。
【０１０３】
代表的に、上記宿主細胞のいずれかにて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）としては、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上が挙げられる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０４】
必要に応じて、そのベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；そのオリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）、またはｍｙｃ（これらに関して市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にそのポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって、達成され得る。必要に応じて、タグは、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドからその後除去され得る。
【０１０５】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいはその隣接配列は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、この隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０６】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成または核酸クローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して、合成され得る。
【０１０７】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、その隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえをも含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続いて、アガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって、達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１０８】
複製起点は、代表的に、商業的に購入した原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点部位は、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルスの起点）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むというだけの理由で、しばしば、使用される）。
【０１０９】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として商業的に購入さえされるが、これはまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して、容易に合成され得る。
【０１１０】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１１】
他の選択遺伝子が、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のためにより大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続世代の染色体においてタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に関する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように唯一適合される、選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１２】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのプロモーターの３’側かつコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガーノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン・ダルガーノ配列が、同定されており、そのそれぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【０１１３】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞から外へＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子のコード領域に位置するか、またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域の５’末端に直接位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子に対して同種（天然に存在）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。ほとんどの場合において、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの分泌は、分泌されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはシグナル配列は、ベクターに挿入されたＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の一部であり得る。
【０１１４】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が申し分ないが、他の哺乳動物シグナル配列は適切であり得る。
【０１１５】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するように、種々のプレ配列が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列を付加し得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、全く除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１１６】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについてのような）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子に対するイントロンの位置は、そのイントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＴＧＦ−β−Ｒ　ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側であり、かつ、ポリ−Ａ転写終結配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を中断しないように、ｃＤＮＡの一方の側またはもう一方の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１１７】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には各々、宿主生物によって認識され、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＴＧＦ−β−Ｒプロモーター配列は、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１１８】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、それによって、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらを連結し得る。
【０１１９】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、これには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２０】
ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子発現を制御する際に目的となり得るさらなるプロモーターとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモータ領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ　２２　：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた関心が高い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ　３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ　３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ　４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ　４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−７８）。
【０１２１】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置が独立している。これらは、転写単位に対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側に配置される。
【０１２２】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書に記載される隣接配列の１つ以上が既にベクター内に存在しない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２３】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（国際公開番号ＷＯ　９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２４】
さらなる適切なベクターとしては、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられ、これらに限定されないが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとして、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥ１−ベースのファージミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）のようなプラスミド、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ＫｉｔおよびＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
ベクターが構築され、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドについての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、使用される宿主細胞の型に依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【０１２６】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合にＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを合成し、これは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合）収集され得るか、または直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へと折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１２７】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルのＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株として、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現に関する分野の当業者にとって公知であり入手可能である。
【０１２８】
同様に、本発明のための適切な宿主細胞として有用なのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得る。
【０１２９】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３０】
さらに、望ましい場合には、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３１】
グリコシル化ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物がまた使用され得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳汁中に得ることができる。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生するために、植物もまた使用し得るが、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療の用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３２】
（ポリペプチド産生）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要とされるように血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【０１３３】
代表的に、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって指示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３４】
宿主細胞によって産生されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３６】
宿主細胞の細胞質ゾルおよび／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌に対する封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的技術を用いて宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、均質化、および／または超音波破砕、次いで遠心分離によって溶解されペリプラズム／細胞質の内容物を放出し得る。
【０１３７】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合し得、従って、主に、遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで、ペレット物質は、ｐＨ限局値で処理され得るか、または還元剤（アルカリ性のｐＨでは、例えばジチオトレイトール、または酸性のｐＨでは、例えばトリスカルボキシエチルホスフィン）の存在下カオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）で処理されて、封入体を放出し、分断し、そして可溶化し得る。次いで、可溶化されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載されるような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１３８】
いくつかの場合、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳み」すなわちポリペプチドをその３次構造に変換しジスルフィド結合を生成するための種々の方法を、生物学的活性を回復するために使用し得る。このような方法は、一定のｐＨ（通常は、７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に、可溶化されたポリペプチドを曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体の可溶化に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤はより低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含み、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するため必要とされ得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１３９】
封入体がＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見出される。ポリペプチドはさらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４０】
溶液からのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、このポリペプチドはカラムマトリクスがタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１４１】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド／ポリＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　§　１０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９９３）を参照のこと。
【０１４２】
さらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【０１４３】
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｉｅｖｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）に続くゲル溶出、および分取用等電集束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術を、増加した純度を達成するために組み合わせ得る。
【０１４４】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドはまた、当該分野で公知の技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３２；ならびに、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．１９８４）に記載される技術）を使用する化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さずに合成され得る。化学的に合成されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化され得、ジスルフィド結合を形成する。化学的に合成されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４５】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを得る別の手段は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４６】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．　９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．　３：２６８−７３も参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、この異種プールのオリゴヌクレオチドはそれぞれが、５’ランダム化配列、中央部の予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、予め決定された生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４７】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的な遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、その確率論的な遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１４８】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願された国際公開番号ＷＯ９９／１５６５０に記載される。これは、「Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えまたは変則的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方の裂け目に最終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１４９】
これらの方法はまた、包括的なＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５０】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が組換え手段および他の手段によって産生され得ることは、当業者によって認識される。
【０１５１】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」とは、１つ以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を用いて調製され得る。本発明の例示的なＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド選択的結合因子は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの特定の部分に結合し得、これによってＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターへのこのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１５２】
選択的結合因子（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂｓ）；組換え；キメラ；ヒト化（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ移植片化））；ヒト；単鎖；および／または二重特異性；ならびにそれらのフラグメント；改変体または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のそれらの部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長の抗体の酵素的切断によって生じるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生じるものが挙げられる。
【０１５３】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに指向されたポリクローナル抗体は、一般的に動物（例えば、ウサギまたはマウス）において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって産生される。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを、免疫させる種において免疫原性であるキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）と結合することは、有用であり得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）は、免疫応答を増強するために用いられる。免疫後、これらの動物を採血し、そしてこの血清を抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体力価についてアッセイする。
【０１５４】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに指向されたモノクローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４））；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７）が挙げられる。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１５５】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、この「キメラ」抗体において、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部分は、特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一であるか、または相同であるが、その鎖の残部は、別の種由来の抗体または別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における、対応する配列と同一であるかまたは相同である。このような抗体のフラグメントもまた、これらのフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照のこと。
【０１５６】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載された方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９９８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて、ヒト抗体の対応する領域についてのげっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部分を置換することによって実施され得る。
【０１５７】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合するヒト抗体はまた、本発明に包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて、このような抗体は、必要に応じてキャリアと結合体化される、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド抗原（すなわち、連続した少なくとも６アミノ酸を有する）での免疫によって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、この動物における免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子座を無能力化し、かつそのゲノム中に、ヒト重鎖および軽鎖のタンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって生成される。次いで、部分的に改変された動物（すなわち、全てよりも少ない数の改変を有する動物）を交雑育種して、所望の免疫系の改変を全て有する動物を得る。免疫原を投与された場合、これらのトランスジェニック動物は、（例えば、マウスよりもむしろ）ヒトのアミノ酸配列（これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および第５４６０７３Ａ１号に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってか、またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１５８】
代替実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。これらのプロセスは、糸状バクテイオファージの表面上の抗体レパートリーの提示による免疫選択、および選りぬきの抗原に対するそれらの結合によるファージの次の選択を模倣する。１つのこのような技術は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これは、このようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性かつ機能的アゴニストの抗体の単離を記載している。
【０１５９】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植片化抗体、およびヒト化抗体は、組換え方法によって代表的に産生される。これらの抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書に記載される材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書において記載されるように、宿主細胞において組換えＤＮＡの発現によってかまたはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６０】
本発明の抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体は、以下の任意の公知のアッセイ方法において用いられ得る：例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの検出および定量のための、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。これらの抗体は、用いられるアッセイ方法に適切な親和性を有するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合する。
【０１６１】
診断適用について、特定の実施形態において、抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、もしくは６７Ｇａ）；蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０））であり得る。
【０１６２】
競合的結合アッセイは、限られた量の抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体との結合に関して、試験サンプルの分析物（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド）と競合する、標識された標準物（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量を決定するのを容易にするため、これらの抗体は、競合の前か後に代表的に不溶化され、その結果、これらの抗体に結合された標準物および分析物は、結合されていないままの標準物および分析物から、都合良く分離され得る。
【０１６３】
サンドイッチアッセイは、代表的に、検出および／または定量されるタンパク質の２つの抗体（異なる免疫原性部分、またはエピトープにそれぞれ結合し得る）の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプルの分析物は、代表的に、固体支持体上に固定化される第１抗体に結合し、その後、第２の抗体がこの分析物に結合し、これにより、不溶性の３つの部分の複合体を形成する。米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体に検出可能な部分を標識され得（直接的サンドイッチアッセイ）るか、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１６４】
選択的結合因子（抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体を含む）はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に（好ましくは血流中に）投与され得、そして宿主における標識された抗体の存在および位置が、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物において検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０１６５】
本発明の選択的結合因子（抗体を含む）は、治療剤として用いられ得る。これらの治療剤は、一般に、以下の点において、アゴニストまたはアンタゴニストである：これらのいずれかが、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強するかまたは減少させる。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに特異的に結合し得、そして、インビボまたはインビトロにおいてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％まで、そして好ましくは、少なくとも約８０％まで、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド抗体であり得、これは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これによって、インビボまたはインビトロにおいてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性を阻害または排除する。選択的結合因子（アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６６】
本発明はまた、ＴＧＦ−β−Ｒ選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのレベルを検出するのに有用な他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１６７】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の小型かつ高密度アレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、相補的核酸配列（例えばｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションのための標的として働く単一核酸種の多数のコピーを有する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞サンプルまたは組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素により変換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合する標識されたｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットかつ並列様式で定量化され得る。
【０１６８】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むが、これらに限定されない本発明のＴＧＦ−β−Ｒ分子に関して、広い範囲の適用を有する：治療のための標的としてＴＧＦ−β−Ｒ疾患関連遺伝子の同定および検証；関連ＴＧＦ−β−Ｒ分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定に役立つことによる関連ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド低分子薬物開発の増強。
【０１６９】
（化学的誘導体）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに自然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の自然に結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２もしくは配列番号４または他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７０】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が、示した分子量より多く、いくつかは少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７１】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合で結合したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に包含される。
【０１７２】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化ポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）ポリペプチドと活性化ポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程であって、この反応性が、配列番号２または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、１つ以上のポリマー分子に結合される条件下で行われる、工程、および（ｂ）反応産物を得る工程、を包含する。最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比がより大きくなればなるほど、結合したポリマー分子の割合がより多くなる。１つの実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７３】
ポリペプチドのペグ化は、特に、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかを使用して実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）；欧州特許第０１５４３１６；同第０４０１３８４および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、アナログ反応水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７４】
別の実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合し得る。次いで、結合されたビオチン／ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド分子は、アビジンへの結合が可能となり、その結果、四価のアビジン／ビオチン／ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド分子を生じる。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭとともに沈澱して、結合価が１０の十量体の結合体を形成し得る。
【０１７５】
一般に、本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０１７６】
（遺伝子操作した非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、もしくはヒツジ、または他の家畜）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊（すなわち、「ノックアウト」）され、その結果、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０１７７】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ；ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）を含み、ここで、この動物のＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のネイティブな形態または異種ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰に発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号および国際公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０１７８】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、ここで、本発明の１つ以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのプロモーターは、１つ以上のネイティブなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化させるかまたは不活性化されるかのいずれかである。
【０１７９】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングのために用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの量は、薬物候補への動物の曝露後、測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患状態もしくは病理学的状態を、生じる得るか、または疾患状態もしくは病理学的状態を関連し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力または病理学的状態を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患状態もしくは病理学的状態を、生じ得るか、または疾患状態もしくは病理学的状態と関連し得る。このような場合、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補の能力または病理学的状態を予防するかまたは防止する薬物候補の能力を試験し得る。
【０１８０】
（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、またはインビボ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８１】
「試験分子」とは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価下にある分子をいう。最も一般的に、試験分子は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性を、例えば、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子発現に影響を与えることによってか、またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、間接的に調節し得ることも考慮される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数で、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと結合する。
【０１８２】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、試験分子とＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で試験分子とともにインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態においてかまたは粗混合物においてスクリーニングされ得る。
【０１８３】
特定の実施形態において、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドアゴニストまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドアンタゴニストは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互作用し、その活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現を調節する分子は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸に対して相補的であるか、またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を指示するかまたは制御する核酸配列に相補的である核酸、および発現のアンチセンス調節因子として作用する核酸を含む。
【０１８４】
一旦、試験化合物がＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１８５】
試験分子とＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイで使用され得る。
【０１８６】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるそれらの能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定化される。次いで、放射標識したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナー）および試験分子は、このウェルに、一つづつ（いずれかの順序で）または同時に添加され得る。インキュベーション後に、この壁を洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合する程度を決定する。代表的に、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上の要素を欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替は、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーを固定化する工程）、試験分子および放射標識したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをインキュベートする工程、およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合の程度を決定する工程を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ　１９９５）を参照のこと。
【０１８７】
放射性標識に対する代替として、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジン（これらは比色定量的に検出されるか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る）を使用して検出され得る。ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーに対する抗体（これらは、ビオチンに結合されている）はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【０１８８】
ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補性タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラム内に固定化され得、試験分子および相補タンパク質がこのカラムを通過する。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１８９】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合タンパク質とＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって指定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補性タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補性タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面に物理的に結合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９０】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、本明細書中に記載される。
【０１９１】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９２】
ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる化合物はまた、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーＦのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９３】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９４】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１４）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ　ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１５）（これは、腹腔内投与後に、組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入後に、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９５】
従って、ｔａｔタンパク質配列が、所望されるポリペプチドを細胞中に内部移行するために用いられ得ることが、理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を用いて、ＴＧＦ−β−Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＴＧＦ−β−Ｒ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド）が、ＴＧＦ−β−Ｒ分子の活性を阻害するために細胞内に投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＧＦ−β−Ｒ分子」は、本明細書中で定義されるＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子およびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの両方をいう。所望される場合、ＴＧＦ−β−Ｒタンパク質自体もまた、これらの手順を用いて細胞に内部的に投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１４６６−６７もまた参照のこと。
【０１９６】
（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを用いる細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは、有用であり得る。例えば、疾患または病理学的な状態の起源を決定することは、適切な治療の選択における助けとして有用であり得る。特定の実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸は、そのようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載される細胞を同定するためにプローブとして用いられ得る。他の実施形態において、細胞におけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの存在について試験するために抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド抗体が用いられ得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞であるかどうかが、決定され得る。
【０１９７】
（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的または生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的または生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０１９８】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０１９９】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離もしくは放出の速度、吸着、または透過を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　１９９０を参照のこと。
【０２００】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出を参照のこと。このような組成物は、ＴＧＦ−β−Ｒ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０１】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、事実上、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のために適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充され得る。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な代替物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０２】
このＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する（例えば、経口的）送達のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内にある。
【０２０３】
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（代表的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０４】
非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＴＧＦ−β−Ｒ分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＴＧＦ−β−Ｒ分子は、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分子と、薬剤（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内腐食可能（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物を含み得、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御放出または持続放出を提供する。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環における持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２０５】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、吸入のための乾燥粉剤として処方され得る。ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドまたはＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０６】
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた企図される。本発明の１つの実施形態において、この様式で投与されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わずに処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身的分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合に、胃腸管内の地点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、芳香剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合因子もまた使用され得る。
【０２０７】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合因子（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２０８】
さらなるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続送達処方物または制御送達処方物中にＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体内腐食可能な微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２０９】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１０】
インビボ投与のために使用されるＴＧＦ−β−Ｒ薬学的組成物は、代表的に無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構築の前または後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１１】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉剤もしくは凍結乾燥粉剤として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１２】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットを指向する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットがまた含まれる。
【０２１３】
治療的に使用されるＴＧＦ−β−Ｒ薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って、当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、送達される分子、ＴＧＦ−β−Ｒ分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および全体的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）得、投与の経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、この投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１４】
投薬の頻度は、使用される処方物中のＴＧＦ−β−Ｒ分子の薬物動態学的パラメーターに依存する。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、経時的な単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望される分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者によって慣用的に実施される作業の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１５】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：例えば、経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注射を介して；徐放性系によって；または移植デバイスによって。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、あるいは移植デバイスによって投与され得る。
【０２１６】
あるいはまたはさらに、組成物は、その上に所望の分子が吸収されたかもしくはカプセル化された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２１７】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、または器官が引き続いて患者に移植し戻された後にＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド薬学的組成物に曝露される。
【０２１８】
他の場合において、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、遺伝子操作されて、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを発現および分泌する特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、この細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、代表的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２１９】
本明細書中に記載される場合、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを用いて処置することが所望され得る。これは、単離された細胞を、細胞膜に対して透過性の形態であるポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２２０】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生ならびに遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達の両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換え方法は、通常は転写に対してサイレントなＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子または、過少発現される遺伝子を含む細胞を改変するために使用され得、そしてこれによって、治療有効量のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２１】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ　４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ　５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子内の特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６−７８）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号、および同第５０５５００号；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびに国際公開番号ＷＯ　９１／０９９５５に記載される。
【０２２２】
相同組換えを介して、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的化ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的な（相同な）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的な標的化ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触させられる。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズするＤＮＡの一般的な特性であり、そしてそれ故、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組換わる。この相補鎖が、変異もしくは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、これもまた、組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして作用することが可能である。従って、転移されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２３】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互作用し得るかまたはＴＧＦ−β−Ｒの発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近位および配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの部分を制御する。従って、所望のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現は、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２２４】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットの産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２２５】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、通常は得られたままの細胞においてサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化（または発現させる）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加を包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンの変化させる工程を包含し、その結果、これは、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させる。
【０２２６】
細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る１つの方法は、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内在性ゲノムＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’）に配置する工程を包含する。ゲノムＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドは、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込まれる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている任意の側方配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からの、デノボまたは増加したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を生じる、新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で一体化する。
【０２２７】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他の位置に第２の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。適切な組換え酵素は、次いで、二組換え部位細胞株に導入され、組換え現象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からの、デノボまたは増加したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生を生じる新しいかまたは改変された転写ユニットを作製する。
【０２２８】
細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からの、デノボまたは増加したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子からの、デノボまたは増加したＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２２９】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、代表的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）は、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、調節配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’側である。
【０２３０】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成されるか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限等によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入された際に、標的配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０２３１】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド細胞治療（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた意図される。この実施形態は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの生物学的に活性な形態を合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド産生細胞は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの天然プロデューサーである細胞であり得るか、または組換え細胞であって、そのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する能力が、所望のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子またはＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、その発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを投与されている患者における強力な免疫学的反応を最小化するために、異種のポリペプチドの投与と共に生じる場合、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３２】
移植細胞は、周辺組織の浸透を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０２３３】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（国際公開番号ＷＯ９５／０５４５２および国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、生きた細胞からレシピエント内の特定の部位への分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するためのシステムは、国際公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。国際公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ　３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３４】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘発性プロモーターに作動可能に連結され得るＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内在性ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子に対して相同であるかまたは異種であり得るが、ただし、これは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同性組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を越える選択的優性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含む。
【０２３５】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、次いで、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に導入され得る（エキソビボまたはインビボノいずれか）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの方法は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２３６】
さらに他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の制御された発現のために含められ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して刺激される。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性タンパク質）を二量化する低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（国際公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２３７】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２３８】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダイマーを形成することによって転写を活性化し、次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびに国際公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２３９】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核に転移し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含み、転写を開始する。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８、および国際公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４０】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された、変異したｔｅｔレプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じた変異したｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４１】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）に記載される。
【０２４２】
インビボの遺伝子治療は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子を、ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の局所的な注射を介して、または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することによって達成され得る。Ｈｅｆｔｉ、１９９４、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５：１４１８−３５。例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的には、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結したＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４３】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボのウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療的タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療的タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実行のためのさらなる方法および材料は、アデノウイルスベクターに関する米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６７２，５１０号；およびサイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６３５，３９９号に記載される。
【０２４４】
非ウイルス送達方法は、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡの送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超えて選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全な測定）、細胞特異的結合剤（細胞標的化のための）、細胞特異的内在化因子、ならびにベクターによる発現を増強する転写因子の利用、そしてベクター製造のための方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実行のためのこのようなさらなる方法および材料は、エレクトロポレーション技術に関する米国特許第４，９７０，１５４号；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する米国特許第５，６７９，５５９号；リポソームキャリアに関する米国特許第５，６７６，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；米国特許第４，９４５，０５０号（ここで、生物学的に活性な粒子が、ある速度で細胞に噴射され、それによってこの粒子は細胞の表面を貫通し、そして細胞内部に取り込まれる）および核リガンドに関する国際公開番号ＷＯ９６／４０９５８に記載される。
【０２４５】
ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子治療または細胞治療はさらに、同じ細胞または異なる細胞において１以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることがまた意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のようなカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはこれらの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２４６】
遺伝子治療を介して、細胞における内在性のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現を増大させる手段は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドプロモーター中に１以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の転写活性を増大するように作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この組織においてプロモーターの活性化を与えることが公知のエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｔ細胞において「オンにされる」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、添加されるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメント中に挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列などの中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、エキソビボまたはインビボのいずれかで所望の細胞に導入され得る。
【０２４７】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、代表的には、相同組換え方法を介して達成される。例えば、不活化のために選択されたＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写活性化因子の結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得る；このような欠失は、プロモーターの活性を阻害し得、それによって対応するＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の転写を抑制する。ＴＡＴＡボックスまたはプロモーターの転写活性化因子結合部位の欠失は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドプロモーター（調節されるべきＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子と同種または関連の種由来の）の全てまたは関連部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドの１以上は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性を減少させるかまたは完全に不活化される。この構築物は、代表的には、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブな（内在性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含む。この構築物は、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）、直接または本明細書中に記載のウイルスベクターを介してかのいずれかで導入され得る。代表的には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組み込みは、相同組換えを介してであり、ここで、プロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性の染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して改変されたプロモーター領域を組み込む際の補助として役立ち得る。
【０２４８】
（治療的使用）
ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、多くの疾患、障害、または状態（本発明中に列挙されるものを含む）を処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
【０２４９】
ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドアゴニストおよびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドアンタゴニストとしては、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性を調節し、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少させる分子が挙げられる。アゴニストまたはアンタゴニストは、コファクター（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子）であり得、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと相互作用し、それによりＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性を調節する。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはポリペプチドアンタゴニストとしては、ＴＧＦ−β−Ｒタンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含む、可溶性または膜結合形態のいずれかのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドと反応する抗体が挙げられる。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を調節する分子としては、代表的に、発現のアンチセンスレギュレーターとして作用し得る、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２５０】
配列分析は、本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、ヒト増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）およびマウス増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）と最大程度の類似性を共有することを示した。この配列類似性は、本発明のＴＧＦ−β−ＲポリペプチドがＴＧＦ−βファミリーの新規メンバーであることを示唆する。この類似性は、さらに、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、ＴＧＦ−β−Ｒフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒ改変体、ＴＧＦ−β−Ｒ誘導体、および／またはＴＧＦ−β−Ｒアンタゴニストが、ＴＧＦ−βに関連した、疾患、障害、または状態を、処置、診断、改善、または予防するために用いられ得ることを示唆する。それゆえ、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、ＴＧＦ−β−Ｒフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒ改変体、ＴＧＦ−β−Ｒ誘導体、および／またはＴＧＦ−β−Ｒアンタゴニストは、軟骨、骨、歯、または他の組織（例えば、腎臓または肝臓）の変性障害を予防または処置するため；移植における臓器拒絶を予防するため（免疫系サプレッサーとして）；胃潰瘍または十二指腸潰瘍を処置するため；創傷治癒を促進するため；やけどを処置するため；組織修復を促進するため；腫瘍増殖を抑制するため（特定足場依存性細胞を阻害することによって）；または正常に機能しない受胎能を処置するために用いられ得る（あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、ＴＧＦ−β−Ｒフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒ改変体、および／またはＴＧＦ−β−Ｒ誘導体は、避妊薬として用いられ得る）。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、ＴＧＦ−β−Ｒフラグメント、ＴＧＦ−β−Ｒ改変体、ＴＧＦ−β−Ｒ誘導体および／またはＴＧＦ−β−Ｒアンタゴニストはまた、骨髄保護剤；抗炎症薬剤；心臓保護のメディエイタ、またはＴＧＦ−β−依存性腫瘍のアンタゴニストとして用いられ得る。
【０２５１】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適するように、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗性物質、抗炎症剤性薬剤および／または化学療法の薬剤と組み合わせて（同時にあるいは連続して）用いられ得る。
【０２５２】
望ましくないレベルのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患または障害は、本発明の範囲内に含まれる。望ましくないレベルとしては、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの過剰レベルおよびＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの正常以下レベルが挙げられる。
【０２５３】
（ＴＧＦ−β−Ｒ核酸およびポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、染色体上でＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子および関連遺伝子の位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野において公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によってなされ得る。
【０２５４】
ＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、定量的にまたは定性的にのいずれかで、哺乳動物の組織サンプルまたは体液サンプルにおけるＴＧＦ−β−Ｒ核酸分子の存在を試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２５５】
１以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合、他の方法もまた使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＴＧＦ−β−Ｒ　ｍＲＮＡに相補的であり、かつハイブリダイズする核酸分子によってもたらされ得る。例えば、ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の少なくとも一部に対して相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子が、細胞に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術によって設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各々のＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、このアンチセンス分子が、対応するＴＧＦ−β−Ｒ　ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は阻止されるかまたは減少される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物体におけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する。
【０２５６】
あるいは、遺伝子治療は、１以上のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのドミナントネガティブなインヒビターを作製するために使用され得る。この状況において、選択された各々のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが、調製され得、本明細書中に記載のウイルスによる方法またはウイルスによらない方法のいずれかを使用して患者の細胞に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的には、その生物学的役割において内在性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２５７】
さらに、生物学的に活性であるか否かにかかわらず、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、免疫原、すなわち、抗体を惹起し得る少なくとも１つのエピトープ含むポリペプチドとして使用され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド（本明細書中に記載のような）に結合する選択的結合因子は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、体液または細胞サンプル中でＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの存在を検出するための標識形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体はまた、多くの疾患および障害（本明細書中で列挙したものを含む）を予防、処置、または診断するために使用され得る。これらの抗体は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを減少させるかまたはブロックするように、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに結合し得るか、あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも１つを増大するためにポリペプチドに結合し得る（ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの薬物動態を増大させることによるものを含む）。
【０２５８】
本発明のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドは、発現クローニングストラテジーを用いてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターをクローニングするために使用され得る。放射線標識（１２５ヨウ素）ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドまたは親和性／活性−タグ化ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）を結合アッセイに用いて、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞型または細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、哺乳動物発現ベクター中にクローン化され、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、または２９３細胞）中にトランスフェクトされて、発現ライブラリーを生成し得る。次いで、放射線標識化またはタグ化されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを親和性リガンドとして用いて、表面上にＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞のサブセットをこのライブラリーから同定し得、そして単離し得る。次いで、ＤＮＡが、これらの細胞から単離され、哺乳細胞中にトランスフェクトされて、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターを発現する細胞の画分がもとのライブラリーよりも何倍も高い、２次発現ライブラリーを生成し得る。この富化プロセスは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターを含む単一組換えクローンが単離されるまで、何度も反復され得る。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプターの単離は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニストおよび新規アンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプター、抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドレセプター抗体、低分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。そしてこれらは、本明細書中に記載される１つ以上の疾患または障害を処置、予防または診断するために使用され得る。
【０２５９】
本発明のヒトＴＧＦ−β−Ｒ核酸はまた、対応する染色体ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド遺伝子を単離するために有用なツールである。ヒトＴＧＦ−β−ＲゲノムＤＮＡは、遺伝性の組織変性疾患を同定するために用いられ得る。
【０２６０】
受託番号ＰＴＡ−２６６５またはＰＴＡ−２６６６を有する、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム１およびアイソフォーム２をコードするｃＤＮＡ（ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターにサブクローニングされている）の寄託を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９に２０００年１１月１０日付で行った。
【０２６１】
以下の実施例は、例示目的のみを意図しており、いかようにも本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【０２６２】
（実施例１）
（ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される材料および方法を、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、そして分析するために使用した。
【０２６３】
ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のアイソフォーム１の部分的転写物は、ヒトゲノムクローン（Ｃｅｌｅｒａ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＧＡ＿６７３９４１７）に由来した。全長ヒトＴＧＦ−β−Ｒ　ｃＤＮＡ配列を得るために、部分的転写物の５’末端および３’末端に対応するいくつかのＰＣＲプライマー（アンプライマー）が、様々なｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅における使用のために設計された。アンプライマー２４４５−２７（５’−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１６）、２４４５−２８（５’−ＧＴ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号１７）、２４４５−２９（５’−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号１８）、および２４５０−２１（５’−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−３’；配列番号１９）は、部分的転写物の５’側に対応する。アンプライマー２４４５−３０（５’−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２０）、２４４５−３１（５’−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−３’：配列番号２１）、２４４５−３２（５’−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号２２）、および２４４５−２２（５’−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−３’；配列番号２３）は、部分的転写物の３’側に対応する。
【０２６４】
次に、ＰＣＲ増幅を、製造メーカーの推奨する手順に従って、鋳型として５０ｎｇのｃＤＮＡ（専売のヒト組織ｃＤＮＡライブラリーの７７つのうちの１つから得られる）、適切な５’アンプライマーおよび３’アンプライマーの各々５ｐｍｏｌ、およびＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　ＰＣＲ　Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて実行した。反応は、９４℃で１分を１サイクル；（９４℃で１５秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分）を４０サイクル；および７２℃で７分を１サイクルで実行した。３３９塩基対のＰＣＲ産物が、アンプライマー２４４５−２９および２４４５−３２と、胎児卵巣ｃＤＮＡライブラリー鋳型または胎児皮膚ｃＤＮＡライブラリー鋳型のいずれかとを含む増幅反応において得られた。
【０２６５】
ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの全長ｃＤＮＡ配列を単離するために、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２　ＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、胎児卵巣ｃＤＮＡライブラリーまたは胎児皮膚ｃＤＮＡライブラリーのいずれか５０ｎｇ、「タッチダウン」ＰＣＲプロトコール（Ｄｏｎら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４００８）を用いて実行した。５’−ＲＡＣＥ反応を、アンプライマー２４４５−３２および１９１６−８３（５’−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−３’；配列番号２４）の１０ｐｍｏｌを使用して実行した（後者のアンプライマーは、ｃＤＮＡライブラリー（ｐＳＰＯＲＴ）を構築するために用いられたベクターの核酸配列に対応する）。３’−ＲＡＣＥ反応を、アンプライマー２４４５−２９および１９１６−８０（５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２５）の１０ｐｍｏｌを使用して実行した（後者のアンプライマーは、ｐＳＰＯＲＴの核酸配列に対応する）。反応を、９４℃で２分を１サイクル；（９４℃で５秒および７２℃で４分）を５サイクル；（９４℃で５秒および６９℃で４分）を５サイクル；（９４℃で５秒および６７℃で４分）を２５サイクル；および７２℃で７分を１サイクルで実行した。
【０２６６】
５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥの後、ネストＰＣＲを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　２　ＰＣＲ　ｋｉｔ、１：５０に希釈した１回目の５’−ＲＡＣＥ増幅産物または３’−ＲＡＣＥ増幅産物の１０μｌ、およびアンプライマーの適切な対を用い、５０μ１の容積において実行した。５’−ＲＡＣＥ産物の増幅のために、アンプライマー２４５０−２２および１９１６−８２（５’−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号２６）を使用した。３’−ＲＡＣＥ産物の増幅のために、アンプライマー２４５０−２１および１９１６−８１（５’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号２７）を使用した。反応を、９４℃で２分を１サイクル；（９４℃で５秒および７２℃で４分）を５サイクル；（９４℃で５秒および７０℃で４分）を５サイクル；（９４℃で５秒および６８℃で４分）を２５サイクル；および７２℃で７分を１サイクルで実行した。１％アガロースゲル上での分離後、十分明確にされたＰＣＲ産物をゲルから単離し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、続いて配列決定した。
【０２６７】
ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム１の全長ｃＤＮＡの配列分析によって、このアイソフォーム１遺伝子が、１４０アミノ酸のタンパク質をコードする４２０塩基対のオープンリーディングフレームを含むことが示された（図１）。ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム２の全長ｃＤＮＡの配列分析によって、このアイソフォーム２遺伝子が、１９５アミノ酸のタンパク質をコードする５８５塩基対のオープンリーディングフレームを含むことが示された（図２）。
【０２６８】
ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム１またはアイソフォーム２のアミノ酸配列を使用する、Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースの検索は、これらのタンパク質が、ヒトの増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）およびネズミの増殖分化因子−３（ＧＤＦ−３）と最高の類似性の程度を共有することを示した。最も重要なことに、システイン残基（これは、ＧＤＦ−３の構造において重要な役割を果たす）の位置および間隔のパターンは、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとＧＤＦ−３との間で保存される。ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドとＧＤＦ−３との間の類似性は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドが、ＴＧＦ−βファミリーの新規のメンバーであることを示唆する。図３および図４は、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム１またはヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドのアイソフォーム２のいずれか（各図において下部の配列）、およびヒトＧＤＦ−３（各図において上部の配列）についてのアミノ酸配列アライメントを示す。
【０２６９】
ＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子についてのイントロン−エキソン構造を、ゲノムのクローンＧＡ＿６７３９４１７（Ｃｅｌｅｒａ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から予測した。図５Ａ〜図５Ｃは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子（配列番号６）のアイソフォーム１についてのエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号７）、エキソン２（配列番号８）、およびエキソン３（配列番号９）の推定されるアミノ酸配列の位置を示す。図６Ａ〜図６Ｃは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子（配列番号１０）のアイソフォーム２についてのエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号１１）、エキソン２（配列番号１２）、およびエキソン３（配列番号１３）の推定されるアミノ酸配列の位置を示す。
【０２７０】
（実施例２：ＴＧＦ−β−Ｒ　ｍＲＮＡの発現）
複数のヒト組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）２４４５〜２８およびアンプリマー２４４５〜３１を使用して、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ　ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって産生された５４０ｂｐのプローブと、ハイブリダイズした。製造業者の説明書に従って、Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ　ＩＩキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、このプローブを、放射標識した。ノザンブロットを、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、６０℃で３０分間プレハイブリダイズし、次いで、ハイブリダイゼーションオーブン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において、放射標識したプローブを含有するＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液中において６０℃で１時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションに続いて、このブロットを、室温で２×　ＳＳＣおよび０．１％　ＳＤＳ中で２回洗浄し、次いで、６８℃で１時間、０．１×　ＳＳＣおよび０．５％　ＳＤＳ中で１回洗浄した。ハイブリダイズしたブロットを、オートラジオグラフィーによって試験した。
【０２７１】
ノザンブロット分析は、６ｋｂの転写産物を、前立腺、精巣、卵巣および脂肪肝、ならびに以下の細胞株：Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＭＯＬＴ−４（リンパ芽球性白血病）、およびＧ３６１（黒色腫）において発現することを示した。
【０２７２】
ＴＧＦ−β−Ｒ　ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化する。正常な胎児マウス組織および正常な成熟マウス組織のパネルを、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして５μｍで切片化する。切片化した組織を、０．２Ｍ　ＨＣｌ中で透過処理し、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　８．０、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×　デンハルト溶液、０．２％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ　ｐｏｌｙＡ、２５μｇ／ｍｌ　ｐｏｌｙＣおよび５０％　ホルムアミド）中において６０℃で１時間プレハイブリダイズし、次いで、１０％　デキストラン、およびヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子に対して相補的な２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ標識アンチセンスリボプローブを含有する、同一の溶液中で６０℃で一晩ハイブリダイズする。リボプローブを、標準的な技術を使用してヒトＴＧＦ−β−Ｒ　ｃＤＮＡ配列を含有する、クローンのインビトロでの転写によって入手する。
【０２７３】
ハイブリダイゼーションに続いて、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ハイブリダイズしないプローブを消化するためにＲＮａｓｅＡで処理し、次いで、０．１×　ＳＳＣ中において５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片を、ＮＴＢ−２乳濁液（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）中に浸し、４℃で３週間露光し、現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（１つの矢状断面および２つの冠状断面）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位の結腸、および遠位の結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、男性生殖器官および女性生殖器官（女性では、卵巣、卵管、および子宮；ならびに男性では、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、および精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下の、腎周の）、骨（大腿）、皮膚、胸部、ならびに骨格筋について、暗視野照明および標準的な照明によって同時に解析した。
【０２７４】
（実施例３：ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌中でのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現）
配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを使用して、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅するために、ＰＣＲを使用する。増幅されたＤＮＡ産物を、発現ベクター中への挿入を可能にするための制限酵素部位を含有するように改変し得る。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、そして標準的な組換えＤＮＡ方法論を用いて、発現ベクター中へ挿入する。例示的なベクター（例えば、ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含有するｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３））を、挿入されたＤＮＡの指向性のクローニングのために、Ｂａｍ　ＨＩおよびＮｄｅ　Ｉで消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主系統中に形質転換し、そして形質転換株を、カナマイシン耐性について選択する。選択されたコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そして挿入物の存在を確認するために、ＤＮＡ配列決定に供する。
【０２７５】
形質転換した宿主細胞を、誘導の前に、３０℃で３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中でインキュベートする。遺伝子の発現を、Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンを最終濃度の３０ｎｇ／ｍＬまで添加することによって誘導し、続いて３０℃または３７℃のいずれかで６時間インキュベートする。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２７６】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを含有する封入体を、以下のよう精製する。細菌細胞を、遠心分離によりペレット化し、そして水中に再懸濁する。細胞懸濁物を、超音波破砕により溶解し、そして１９５，０００×ｇで５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。上清を捨て、そしてペレットを洗浄し、そしてホモジナイザーに移す。ペレットを、均一に懸濁されるまで５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）中でホモジナイズし、次いで、希釈し、そして２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含有する勾配画分を、回収しそしてプールする。単離した封入体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２７７】
Ｅ．ｃｏｌｉ産生ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対応する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから摘出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５によって記載されるように決定する。
【０２７８】
（Ｂ．哺乳動物細胞中でのＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現）
配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを使用して、ＴＧＦ−β−ＲポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅するために、ＰＣＲを使用する。増幅されたＤＮＡ産物を、発現ベクター中への挿入を可能にするための制限酵素部位を含有するように改変し得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的な組換えＤＮＡ方法論を用いて、発現ベクター中へ挿入する。エプスタイン−バーウイルスの複製起点を含有する例示的な発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現のために使用し得る。増幅しかつゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクションによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬ　ハイグロマイシン中で選択し、そして得られる薬物耐性培養物を、コンフルエントにまで増殖させる。次いで、細胞を、無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を除去し、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２７９】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現を、銀染色によって検出し得る。あるいは、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）とともに融合タンパクとして作製し、これを、ペプチドタグに対する抗体を使用する、ウエスタンブロット分析によって検出し得る。
【０２８０】
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るか、またはＴＧＦ−β−Ｒ融合タンパクを、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書中に記載されるようなＮ末端アミノ酸配列解析に供し得る。
【０２８１】
（Ｃ．哺乳動物細胞中のＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現および精製）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現構築物を、リポフェクションまたはリン酸カルシウムプロトコルのいずれかを用いて、２９３ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞に導入する。
【０２８２】
産生されるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対する機能的研究を行うために、大量の馴化培地を、ハイグロマイシンで選択した２９３ＥＢＮＡクローンのプールから生成する。この細胞を、５００ｃｍのＮｕｎｃ三連フラスコ（Ｔｒｉｐｌｅ　Ｆｌａｓｋ）中で、８０％のコンフルエンスまで培養し、その後、この培地を回収する１週間前に、無血清培地に切り替える。馴化培地を回収し、そして、増殖まで−２０℃で凍結する。
【０２８３】
馴化培地を、以下に記載されるように、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。培地を解凍し、次いで０．２μｍのフィルターを通過させる。プロテインＧカラムを、ｐＨ７．０のＰＢＳで平衡化し、次いで、濾過した培地を充填する。このカラムを、Ａ２８０での吸収がベースラインに達するまで、ＰＢＳで洗浄する。ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌを用いて、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをこのカラムから溶出し、そして直ちに、ｐＨ８．５の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和する。ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵する。
【０２８４】
ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの、Ｘａ因子切断のために、アフィニティークロマトグラフィー精製タンパク質を、ｐＨ８．０で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２中で透析する。制限プロテアーゼＸａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（重量／重量）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０２８５】
（実施例４：抗ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド抗体の生成）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対する抗体は、生合成または化学合成によって産生される、精製タンパク質またはＴＧＦ−β−Ｒペプチドでの免疫化によって得られ得る。抗体を作製するための適切な手順としては、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載される手順が挙げられる。
【０２８６】
抗体の精製のための１つの手段において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＴＧＦ−β−Ｒ抗原（例えば、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド）を注入し、そして、ＥＬＩＳＡによって決定されるような、十分な血清力価レベルを有する動物を、ハイブリドーマ産生のために選択する。免疫化された動物の脾臓を収集し、そして単細胞懸濁液（ここから、脾細胞を収集する）として調製する。この脾細胞を、マウス骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、そして最初に、２００Ｕ／ｍＬのペニシリン、２００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭのグルタミンを有するＤＭＥＭにおいてインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）においてインキュベートする。選択の後、組織培養上清を、各々の融合ウェルから採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体産生について試験する。
【０２８７】
抗ＴＧＦ−β−Ｒ抗体を得るための代替的な手順（例えば、ヒト抗体の産生のためのヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの免疫化）、および、合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって産生される合成抗体ライブラリー）のスクリーニングもまた用いられ得る。
【０２８８】
（実施例５：トランスジェニックマウスにおけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの発現）
ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異性ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達は、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの機能についての参考となる、病理学的変化を引き起こすと予測される。同様に、全長ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドを含有する構築物を、βアクチンプロモーターの制御下で調製する。この構築物の送達は、遍在的な発現を生じると予測される。
【０２８９】
これらの構築物を作製するために、ＰＣＲを用いて、所望の配列の５’末端および３’末端に対応するプライマーを用いてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドをコードし、そして制限酵素部位を導入して、増幅された生成物の、発現ベクターへの挿入を可能にする、テンプレートＤＮＡ配列を増幅する。増幅の後、ＰＣＲ生成物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、発現ベクター中に連結する。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：２７２〜７４、および、Ｒａｙら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載されるように、増幅されたＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド配列は、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御下で、発現ベクター中にクローン化され得る。
【０２９０】
連結の後、反応混合物を用いて、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株を形質転換させ、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択されたコロニーに由来するプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供して、適切な挿入の存在および変異の欠如を確認する。このＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を介して精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド導入遺伝子を含有する直線化フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。この精製フラグメントを、５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭのＥＤＴＡ中に、２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させる。
【０２９１】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単細胞胚を、記載されるように注入する（国際公開番号ＷＯ９７／２３６１４）。ＣＯ２インキュベーター内で胚を一晩培養し、そして１５〜２０個の二細胞胚を、偽妊娠ＣＤ１雌マウスの卵管に移す。微量注入した胚の移植から得られた子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中の統合導入遺伝子のＰＣＲ増幅によって、スクリーニングする。耳の小片（ｅａｒ　ｐｉｅｃｅ）を、２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、および５００ｍｌ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして、２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応において用いる。
【０２９２】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理学的分析のために屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、この脾臓から総細胞ＤＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から取り出されたＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、以下のようにｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列に位置し、そしてＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド導入遺伝子に対して３’側に位置する）を用いて、導入遺伝子転写物からのｃＤＮＡ合成を開始する。トランスジェニック創始動物およびコントロールに由来する１０ｍｇの脾臓総ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーと共に７０℃で１０分間インキュベートし、そして氷上に置く。次いで、この反応物に、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭのＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃での５０分間のインキュベーションの後、この反応を、７２℃で１５分間加熱することによって停止し、そして反応物を、２ＵのＲＮａｓｅ　Ｈで、３７℃で２０分間消化する。次いで、ＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドに対して特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって、サンプルを増幅する。
【０２９３】
（実施例６：トランスジェニックマウスにおけるＴＧＦ−β−Ｒポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を秤量し、イソフルオレンによって麻酔し、そして心臓穿刺によって血液を引き出す。このサンプルを、血液学分析および血清化学分析に供する。最後の失血の後、ラジオグラフィーを行う。全体の解剖において、主要な内臓器官を重量分析に供する。
【０２９４】
全体の解剖の後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節ならびに骨格筋）を取り出し、組織学的検査のために、１０％緩衝されたＺｎ−ホルマリン中に固定する。固定の後、これらの組織をパラフィンブロックに加工し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエキソシン（ｅｘｏｓｉｎ）で染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０２９５】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節、およびパイアー斑を、Ｂ細胞特異性抗体およびＴ細胞特異性抗体と共に、以下のように、免疫組織学的分析に供する。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を、脱パラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ）し、そして脱イオン水中で水和させる。この切片を、３％の過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）においてインキュベートする。抗体結合を、ビオチン標識化ウサギ抗ラット免疫グロブリン、および、発色原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｃ、Ｓａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用いるペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ　Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）によって、検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０２９６】
剖検の後、ＭＬＮと、トランスジェニック動物およびコントロール同腹仔に由来する脾臓ならびに胸腺の切片とを取り出す。単細胞懸濁液を、１００ｍｍのナイロン細胞染色剤（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の底において、シリンジの平坦な端でこれらの組織を徐々に粉砕することによって、調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで、各組織に由来する約１×１０６個の細胞を、２０μＬの体積中で、０．５μｇのＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックとともに１０分間インキュベートする。次いでサンプルを、０．５μｇの、ＦＩＴＣの抗体またはＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４、もしくはＣＤ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対するＰＥ結合体化モノクローナル抗体を有する、１００μＬの体積のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％のウシ血清アルブミン、および０．０１％のアジ化ナトリウム中で、２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合の後、これらの細胞を洗浄し、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）におけるフローサイトメトリーによって分析する。
【０２９７】
本発明は、好ましい実施形態によって記述されているが、変形および改変が生じることは当業者に理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求されるような本発明の範囲内に生じる、このような等価な変形を網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜図１Ｂは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のアイソフォーム１についてのｃＤＮＡ配列（配列番号１）、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のアイソフォーム２についてのｃＤＮＡ配列（配列番号３）、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒ遺伝子のアイソフォーム２についてのｃＤＮＡ配列（配列番号３）、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３】
図３は、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム１（下の配列；配列番号２）とヒト成長分化因子−３（ＧＤＦ−３）（上の配列；配列番号５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図４】
図４は、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム２（下の配列；配列番号４）とヒト成長分化因子−３（ＧＤＦ−３）（上の配列；配列番号５）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム１（配列番号６）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号７）、エキソン２（配列番号８）、およびエキソン３（配列番号９）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム１（配列番号６）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号７）、エキソン２（配列番号８）、およびエキソン３（配列番号９）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図５Ｃ】
図５Ｃは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム１（配列番号６）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号７）、エキソン２（配列番号８）、およびエキソン３（配列番号９）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図６Ａ】
図６Ａは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム２（配列番号１０）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号１１）、エキソン２（配列番号１２）、およびエキソン３（配列番号１３）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム２（配列番号１０）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号１１）、エキソン２（配列番号１２）、およびエキソン３（配列番号１３）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、ヒトＴＧＦ−β−Ｒポリペプチド、アイソフォーム２（配列番号１０）のエキソン／イントロン構造を示す。エキソン１（配列番号１１）、エキソン２（配列番号１２）、およびエキソン３（配列番号１３）の推定アミノ酸配列の位置が示される。
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514448.tif 000132
【国際調査報告】
2004514448.tif 000133
2004514448.tif 000134
2004514448.tif 000135
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