(57)【要約】本発明は、式：ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−［式中、各置換基は特許請求の範囲の記載と同意義である］の基で保護されたヒドロキシドまたはアミンを脱保護する方法であって、保護ヒドロキシドまたはアミンを、該保護基の脱離に有効な酵素と接触させ；次いでアミンを回収することを特徴とする脱保護法を提供する。また本発明は、保護基の脱離に有効な酵素を産生するバクテリアを単離する方法であって、上記の如く保護された、成長選別的量のアミン化合物を有する培地で、予期されたバクテリアを成長させ；次いで該培地で成長するバクテリアを単離することを特徴とする単離法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−
［式中、ＲはＨまたは独立してＡｒと同じ、およびｎは０または１〜４で、Ａｒとは、５〜６個の環原子とＯ、ＮまたはＳから選ばれる１〜２個のヘテロ原子を持つ芳香族またはヘテロ芳香族環を指称し、かつアミノ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルキルアミノ、アリル、カルボキシ、シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルもしくはニトロで、または（i）さらなるアリールで置換されない以外は、独立してＡｒと同じであるＡｒ＊、（ii）Ａｒ＊−アルキル−もしくは（iii）Ａｒ＊Ｏ−の１つまでの基で置換することができ；Ｃ＊に隣接するＡｒの環原子は、ＲがＡｒ、ｑが０または１〜２およびｒが０または１〜２のとき、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ(Ｏ)ｑ−または−Ｐ(Ｏ)ｒ−で置換して、Ｒ上の対応する位置に結合の橋を形成することができる］
の基で保護されたヒドロキシドまたはアミンを脱保護する方法であって、
保護ヒドロキシドまたはアミンを、該保護基の脱離に有効な酵素と接触させ；次いで
アミンを回収する
ことを特徴とする脱保護法。
【請求項２】
保護基が、置換することができるフェニルメチルオキシカルボニル基である請求項１に記載の脱保護法。
【請求項３】
ＲがＨのとき、ｎが０である請求項１に記載の脱保護法。
【請求項４】
ＲがＡｒと同じの場合、ｎが１である請求項１に記載の脱保護法。
【請求項５】
酵素が、スフィンゴモナス・パウシモビリスから得られる請求項１に記載の脱保護法。
【請求項６】
酵素が、スフィンゴモナス・パウシモビリス菌株ＡＴＣＣ２０２０２７から得られる請求項１に記載の脱保護法。
【請求項７】
保護化合物が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、ホモセリン、トレオニン、システイン、ホモシステイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、α−アミノ−ε−カプロラクタム（リシンラクタム）、ε−メチルリシン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジンもしくは３−メチルヒスチジンであるアミン、またはこれらのアミンであって、そのアルキル部がヒドロキシもしくはアルキルで置換されたもの、そのアミノが１つまでのアルキルで置換されたもの、そのフェニル成分がアルキル、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、シクロアルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ａｒ＊もしくはＡｒ＊Ｏ−で置換されたもののいずれか、またはアミンもしくはカルボン酸成分との脱水反応により形成される結合を介して、あるいはアミン成分に形成される炭素−窒素結合によって、より大なる分子の一部を形成する前記アミンの誘導体である請求項１に記載の脱保護法。
【請求項８】
アミンが、α−アミノ−ε−カプロラクタムもしくはα−アミノ−δ，δ−ジメチル−ε−カプロラクタム、またはこれらの誘導体である請求項７に記載の脱保護法。
【請求項９】
キラル炭素に直接結合するヒドロキシルまたはアミノ成分を有する化合物のラセミ混合物を分割する方法であって、
該化合物のヒドロキシドまたはアミンが、
式：
ＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−
［式中、ＲはＨまたは独立してＡｒと同じ、およびｎは０または１〜４で、Ａｒとは、５〜６個の環原子とＯ、ＮまたはＳから選ばれる１〜２個のヘテロ原子を持つ芳香族またはヘテロ芳香族環を指称し、かつアミノ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルキルアミノ、アリル、カルボキシ、シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルもしくはニトロで、または（i）さらなるアリールで置換されない以外は、独立してＡｒと同じであるＡｒ＊、（ii）Ａｒ＊−アルキル−もしくは（iii）Ａｒ＊Ｏ−の１つまでの基で置換することができ；Ｃ＊に隣接するＡｒの環原子は、ＲがＡｒ、ｑが０または１〜２およびｒが０または１〜２のとき、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ(Ｏ)ｑ−または−Ｐ(Ｏ)ｒ−で置換して、Ｒ上の対応する位置に結合の橋を形成することができる］
の基で保護された誘導体を準備し；
該保護化合物を、その保護基の脱離に有効な酵素と接触させ；次いで
所定のエナンチオマーでエナンチオマー的に濃縮組成の上記化合物もしくはその保護誘導体を単離する
ことを特徴とする分割法。
【請求項１０】
保護基が、置換することができるフェニルメチルオキシカルボニル基である請求項９に記載の分割法。
【請求項１１】
保護基の脱離に有効な酵素を産生するバクテリアを単離する方法であって、
式：
ＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−
［式中、ＲはＨまたは独立してＡｒと同じ、およびｎは０または１〜４で、Ａｒとは、５〜６個の環原子とＯ、ＮまたはＳから選ばれる１〜２個のヘテロ原子を持つ芳香族またはヘテロ芳香族環を指称し、かつアミノ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルキルアミノ、アリル、カルボキシ、シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルもしくはニトロで、または（i）さらなるアリールで置換されない以外は、独立してＡｒと同じであるＡｒ＊、（ii）Ａｒ＊−アルキル−もしくは（iii）Ａｒ＊Ｏ−の１つまでの基で置換することができ；Ｃ＊に隣接するＡｒの環原子は、ＲがＡｒ、ｑが０または１〜２およびｒが０または１〜２のとき、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ(Ｏ)ｑ−または−Ｐ(Ｏ)ｒ−で置換して、Ｒ上の対応する位置に結合の橋を形成することができる］
の基で保護された、成長選別的量のアミン化合物を有する培地で、予期されたバクテリアを成長させ；次いで
該培地で成長するバクテリアを単離する
ことを特徴とする単離法。
【請求項１２】
さらにバクテリアを、保護基で保護されたアミンと共に培養し；次いで
保護アミンの遊離アミンへの変換を監視することにより、酵素の有効性を確認する
ことを包含する請求項１１に記載の単離法。
【請求項１３】
カルバメート保護基が、置換することができるフェニルメチルオキシカルボニル基である請求項１１に記載の単離法。
【請求項１４】
２種以上のバクテリア単離物の収集物であって、該単離物が、異なるアミンまたは異なる保護基を用い、請求項１１に記載の方法で単離したものである収集物。
【請求項１５】
保護ヒドロキシドまたはアミンと酵素の接触が、下記の反応を実現する請求項１に記載の脱保護法。
【化１】
2004520030.tif 000010
［式中、Ｐｒ−はＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−である］
【請求項１６】
反応が、
【化２】
2004520030.tif 000011
［式中、ＣＢＺ−はＮ−カルボベンジルオキシである］
である請求項１５に記載の脱保護法。
【請求項１７】
保護ヒドロキシドまたはアミンと酵素の接触が、下記の反応を実現する請求項１に記載の脱保護法。
【化３】
2004520030.tif 000012
［式中、Ｐｒ−はＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−である］
【請求項１８】
反応が、
【化４】
2004520030.tif 000013
［式中、ＣＢＺ−はＮ−カルボベンジルオキシである］
である請求項１７に記載の脱保護法。
【請求項１９】
保護ヒドロキシドまたはアミンと酵素の接触が、下記の反応を実現する請求項１に記載の脱保護法。
【化５】
2004520030.tif 000014
［式中、Ｐｒ−はＡｒＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)ｎ−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−である］
【請求項２０】
反応が、
【化６】
2004520030.tif 000015
［式中、ＣＢＺ−はＮ−カルボベンジルオキシである］
である請求項１９に記載の脱保護法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミンおよびヒドロキシド保護基を脱離する、緩和な酵素使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機合成中に、アミノおよびヒドロキシド基を保護するのに、一般にＮ−カルボベンジルオキシ（Ｎ−ＣＢＺ）基が用いられる。他の類似の“カルバメート”保護基も、アミノ基の保護に使用される。化学的脱保護は通常、パラジウム触媒を用いる水素添加などの方法で行なわれる。しかしながら、脱保護条件に影響されやすい他の基（たとえば水素添加中の硫黄）が存在する場合、別の脱保護法が必要となる。
（発明の概要）
【０００３】
かかる保護基を特異的に解放するのに有効な酵素活性をもたらすのに、本発明の選別技法（selection  technique）を用い、土壌サンプルから微生物を容易に単離しうることがわかった。すなわち、緩和な条件（たとえば、室温および大気圧の水性培地）下で行なう脱保護の酵素法が使用でき、これは、影響されやすいあるいは潜在的に影響されやすい基のいずれに対する害も回避する。
【０００４】
本発明は、式：
ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−
［式中、各置換基は下記の記載と同意義である］
の基で保護されたヒドロキシドまたはアミンを脱保護する方法であって、保護ヒドロキシドまたはアミンを、該保護基の脱離に有効な酵素と接触させ；次いでアミンを回収することを特徴とする脱保護法を提供する。
【０００５】
また本発明は、保護基の脱離に有効な酵素を産生するバクテリアを単離する方法であって、上記の如く保護された、成長選別的量（geowth  selective  amount）のアミン化合物を有する培地で、予期されたバクテリアを成長させ；次いで該培地で成長するバクテリアを単離することを特徴とする単離法も提供する。
【０００６】
さらに本発明は、キラル炭素に結合するアミンまたはヒドロキシドの所望エナンチオマーを分割する方法も提供する。かかる基で保護されたアミンまたはヒドロキシドは、本発明の方法によって立体−特異的に加水分解される。所望エナンチオマーは、加水分解されるものあるいは加水分解に耐性のあるもののいずれかである。
１つの具体例において、接触工程は下記の反応を実現する。
【化１】
2004520030.tif 000002
［式中、Ｐr−は上記の保護基である］
【０００７】
他の具体例において、接触は下記の反応を実現する。
【化２】
2004520030.tif 000003
【０００８】
さらに他の具体例において、接触は下記の反応を実現する。
【化３】
2004520030.tif 000004
【０００９】
（発明の詳細）
本発明は、式：
ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−で示される、数多くのカルバメート保護基の脱離に使用することができる。ここで、ＲはＨまたは独立してＡrと同じ、およびｎは０または１〜４である。Ａrとは、５〜６個の環原子とＯ、ＮまたはＳから選ばれる１〜２個のヘテロ原子を持つ芳香族またはヘテロ芳香族環を指称する。Ａrは、アミノ、アルカノイルオキシ、アルコキシ、アルキル、アルキルアミノ、アリル、カルボキシ、シクロアルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルもしくはニトロで、または（ａ）さらなるアリールで置換されない以外は、独立してＡrと同じであるＡr＊、（ｂ）Ａr＊−アルキル−もしくは（ｃ）Ａr＊Ｏ−の１つまでの基で置換されてよい。
【００１０】
Ｃ＊に隣接するＡrの環原子は、ＲがＡr、ｑが０または１〜２およびｒが０または１〜２のとき、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ(Ｏ)q−または−Ｐ(Ｏ)r−で置換して、Ｒ上の対応する位置に結合の橋（bridge）を形成することができる。１つの具体例において、ＲがＨのとき、ｎは０である。他の具体例において、ＲがＡrと同じの場合、ｎは１である。後記実施例（表２参照）で示されるように、該方法は立体特異性であることから、ラセミ混合物の分割に使用できる。
【００１１】
これらの保護基は、９−フルオレニルメチルカルバメート、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２,７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、２,７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０,１０−ジオキソ−１０,１０,１０,１０−テトラヒドロチオキサンチル）メチルカルバメート、ベンジルカルバメート、ｐ−メトキシベンジルカルバメート、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２,４−ジクロロベンジルカルバメート、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンズイソキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート、ｍ−ニトロベンジルカルバメート、３,５−ジメトキシベンジルカルバメート、３,４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメートおよび２,４,６−トリメチルベンジルカルバメートなどの化合物によって例示される。
【００１２】
これらなどの保護基は、ＧreeneおよびＷutsの「Ｐrotective  Ｇroups  in  Ｏrganic  Ｓynthesis」（ション・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９９１年）（特に３１５−３４８頁）などの標準テキストに記載されている。
置換基のアルキル成分はＣ１−Ｃ６またはＣ２−Ｃ６で、ここで、Ｃ１成分は化学的に不適である（たとえばアルカノイルの場合）。シクロアルキル基は、Ｃ３−Ｃ６である。ハロアルキルとは好ましくは、パーハロアルキル、好ましくはトリフルオロメチルを指称する。ハロはクロロまたはフルオロが好ましい。
【００１３】
１つの具体例において、カルバメート保護基はフェニルメチルオキシカルボニル基で、ここで、フェニルは置換可能である。フェニルメチルオキシカルボニルへの置換は、たとえば上記Ａrの場合に列挙したものである。
【００１４】
本発明で用いる酵素の源は、適切な活性を有する単離バクテリアとして単離することができる。単離の方法は好ましくは、培地での成長による選別であって、ここで、アミンが問題のカルバメート保護基、または関連カルバメート保護基で保護されたアミン化合物から、十分な成長を支持する窒素のみしか得ることができない。後記実施例により、バクテリアの非常にありきたりの源、たとえば環境または土壌サンプルから、かかるバクテリアを単離できることが示される。
【００１５】
後記実施例は、本発明者が識別した（identified）選別技法が、普通の実験で適切なバクテリアを単離し、これによって適切な酵素源を単離するのに有効であることを例示する。実施例は、ＣＢＺ−保護された窒素源の成長の選別によって単離されたバクテリアに関する。しかして、この実例は本発明者の理解、すなわち、脱離が求められる保護基に適合する保護基を用いる同じアプローチで、不適当な実験を伴なわずに、適切な酵素を収集できることを確立する。
【００１６】
酵素的脱離に必然的に伴なうアミンまたはヒドロキシドが、提案基質（substrate）の所定酵素による開裂に対して耐性を有する原因の最も有望な候補（candidate）として同定される場合、該アミン（もしくは類縁体、またはヒドロキシドのアミン類縁体）の適切に保護したバージョンを、別のバクテリアの選別、このため別の酵素の選別に使用することができる。代用酵素が必要とされる場合に、異なる脱保護酵素またはそれぞれ有用な酵素を産生するバクテリア培養物の収集物を貯蔵し、スクリーニングすることができる。
【００１７】
保護し、そして脱保護すべきアミンまたはヒドロキシドが、比較的に離れた成分に結合するアミンまたはヒドロキシド部を持つ錯体分子である場合、選別法に用いるアミンモデルを、アミンまたはヒドロキシドに隣接する錯体の部分に作る（modeled）ことができる。錯体分子中で誘導化される成分が近くで類似して誘導化されるように、気をつけることが好ましい。
【００１８】
以下に示されるように、バクテリア全細胞、全細胞の抽出物、または精製した酵素プレパラートを用いて、本発明提供の脱保護を行なうことができる。酵素は、概して少量使用できるように、かつ酵素源が付与する不純物（たとえば純度の低いもの）が、意図される生成物のようにふるまうべき著しい量の物質を生成すべきでないので、触媒的に作用する。
【００１９】
すなわち、酵素源が付与する不純物は、反応後のワークアップに備えて素早く選別される。特に、抽出物を用いる場合、不純物は全般的に高分子であり、そして典型的な意図生成物は概して高分子でないので、不純物は生成物から素早く隔離される。
【００２０】
また以下に示されるように、酵素選別法で用いる基質は、酵素活性を測定し、このため選別的微生物学的濃縮（enrichment）および伝統的たん白化学技法により酵素を単離する、軽便な手段を付与する。
【００２１】
保護基で保護されるアミンまたはヒドロキシドは、いずれの分子上のアミンまたはヒドロキシドのいずれであってもよい。多くの具体例において、分子上のアミンまたはヒドロキシドは、非反復性合成技法に従う大きさのものである（勿論、本発明の脱保護技法は、ペプチドあるいは核酸合成で用いられるような反復性技法においても使用できる）。
【００２２】
１つの好ましい具体例において、アミンまたはヒドロキシドは、経口摂取後の動物に生物学的に利用しうる生活性剤（bioactive  agent）の一部、あるいはかかる生活性剤の先駆物質の一部である。
１つの側面において、アミンはα−またはβ−アミノ酸が好ましく、もっとも好ましくはα−アミノ酸である。
【００２３】
アミンはたとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、ホモセリン、トレオニン、システイン、ホモシステイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、α−アミノ−ε−カプロラクタム（リシンラクタム）、α−アミノ−δ,δ−ジメチル−ε−カプロラクタム、ε−メチルリシン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジンもしくは３−メチルヒスチジン、またはこれらのアミンであって、そのアルキル部がヒドロキシもしくはアルキルで置換されたもの、そのアミノが１つまでのアルキルで置換されたもの、あるいはそのフェニル成分が上記Ａrの場合に列挙した基で置換されたものであってよい。
【００２４】
かかるアミノ酸は、ＬまたはＤアミノ酸であってよい。さらに、かかるアミノ酸は誘導化されて、アミンもしくはカルボン酸成分との脱水反応により形成される結合を介して、あるいはアミン成分に形成される炭素−窒素結合によって、より大なる分子の一部を形成することができる。
【００２５】
特に本発明に有用なアルファアミノ酸の他の種類は、下記式で示される。
【化４】
2004520030.tif 000005
［式中、ｍは０または１；ＹはＣＨ２、Ｓ−(Ｏ)tまたはＯ、但し、ｍが１のときのみ、ＹはＳ−(Ｏ)tまたはＯ；ＸはＳ−(Ｏ)tまたはＯ；ｎは１または２；ｔは０、１または２；Ｒ３は水素、アルキル、置換アルキル、アリール−(ＣＨ２)p−；およびｐは０または１〜６である］
【００２６】
これらのアミンの中で、下式のものが特に好ましいアミンである。
【化５】
2004520030.tif 000006
【００２７】
これらの化合物は、Ｕ.Ｓ.特許Ｎo．５５０８２７２でより詳しく記載されている。該特許のこれら化合物の製造および使用に関する教えを、参考までに導入する。本発明の使用に関して特に興味のある追加の化合物は、ＷＯ  ００／４７２０７およびＵ.Ｓ.特許Ｎo．５５５２３９７に記載されている。これら特許文献に記載の化合物の製造および使用に関する教えを、参考までに導入する。
【００２８】
保護アミンまたはヒドロキシドは一般的に、
ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘ
［式中、Ｘは脱離可能基、ブロモ、クロロ、トシルである］
を対応するアミンまたはヒドロキシドと反応させることによって、形成される。ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−Ｏ−Ｃ(＝Ｏ)−Ｘはたとえば、ＡrＣ＊(Ｒ)Ｈ−(ＣＨ２)n−ＯＨをホスゲン、カルボミル・ジアイダゾール、トリホスゲンまたは匹敵試薬と反応させることによって、形成される。
【００２９】
定義
以下に示す語句はそれぞれ、本発明の目的のため、下記の意義を有する。
生活性剤：
生活性剤は、細胞、ウイルス、組織、器官または有機体に作用しうる化学物質などの物質であって、たとえばこれらに限定されるものでないが、細胞、ウイルス、器官または有機体の機能の変化を起こす、殺虫剤または薬物（すなわち、医薬）が挙げられる。有機体は、哺乳類が好ましく、より好ましいのはヒトである。
【００３０】
成長選別的量のアミン化合物を有する培地：
成長選別的量の保護アミン化合物を有する培地は、該アミン化合物以外の他のアミンの量が、成長−仲介選別法でバクテリア成長を促進するのに有効な量よりも少ない培地である。好ましい保護アミンは、本質的に単独の窒素源である。
【００３１】
（実施例）
実施例１：微生物の単離の選別技法
窒素の単独源としてＮ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシンを利用できる微生物を単離するのに、選別培養技法を用いる。ニュージャージー州の種々の用地から、土壌サンプルを収集する。約１ｇの土壌サンプルを、５mLの水に懸濁し、十分に混合し、サンプルを沈降せしめる。各種サンプルの上層液を、１％Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン含有のＡ培地（グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０.２％、Ｋ２ＨＰＯ４０.２％、ＭgＳＯ４０.０１％、ＦeＳＯ４０.００１％、ＺnＳＯ４０.００１％、pＨ７.０）に接種する。
【００３２】
４日の成長後、培地が濁ってくると、ペトリ平板に入った１.５％寒天含有の上記培地に、培養物を移す。この濃縮培養技法から、８種のコロニーを単離する。１つの培養物（Ｚ−２）をさらに、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓphingomonas  paucimobilis）菌株として同定し、これをＳphingomonas  paucimobilis 菌株ＡＴＣＣ２０２０２７として、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican  Ｔype  Ｃulture  Ｃollection）に寄託した。この培養物（菌）を、ＣＢＺ−脱保護酵素の源として使用する。
【００３３】
実施例２：Ｓphingomonas  paucimobilis の成長
Ｓphingomonas  paucimobilis を窒素の単独源として、Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンまたは［４Ｓ−（４α,７α,１０ａβ）］−オクタヒドロ−５−オキソ−４−［［（フェニルメトキシ）カルボニル］アミノ］−７Ｈ−ピリド−［２,１−ｂ］［１,３］チアゼピン−７−カルボン酸メチルエステル（化合物Ａ）で成長させる。該Ｓphingomonas  paucimobilis 培養物を、１％Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンまたは１％化合物Ａ含有のＡ培地に接種する。２日の成長後、ペトリ平板に入った１％Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンまたは１％ＢＭＳ１９９５４１、および１.５％寒天含有のＡ培地に、培養物を移す。
【００３４】
ペトリ平板から単離したコロニーを、１％Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンおよび／または１％化合物Ａ含有のＢ培地（酵母エキス０.０１５％、グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０.２％、Ｋ２ＨＰＯ４０.２％、ＭgＳＯ４０.０１％およびＮaＣl０.２％、pＨ７）１００mLで成長させる。培養物を回転振とう器で、２８℃および２８０ＲＰＭにて２４時間成長させる。この培養物をバイアルに入れ（２mLバイアル中培養物１mL）、今後の使用に−７０℃で貯蔵する。
【００３５】
１つのバイアル（Ｂ培地中１mLのＳphingomonas  paucimobilis を含有）を用いて、１００mLのＢ培地を接種する。培養物を回転振とう器で、２８℃および２８０ＲＰＭにて４８時間成長させる。１８０００xgで１５分間遠心分離を行って、細胞を採取し、今後の使用まで−７０℃で貯蔵する。
【００３６】
実施例３：全細胞を用いる生体内変化
この方法では、２５０mLフラスコ中、２５mgの基質（化合物ＡまたはＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニン）含有の２５mLのＢ培地にて、Ｓphingomonas  paucimobilis を成長させる。フラスコを振とう器で、２８℃および２５０rpmにて培養する。４８時間の生体内変化後、遠心分離で細胞を取出す。
【００３７】
生成物の［４Ｓ−（４α,７α,１０ａβ）］−オクタヒドロ−５−オキソ−４−アミノ−７Ｈ−ピリド−［２,１−ｂ］［１,３］チアゼピン−７−カルボン酸メチルエステル（化合物Ｂ）またはＬ−フェニルアラニンを含有する上層液を、ＨＰＬＣで分析する。結果を下記表１に示す。
表１：
基質     生成物       転化率（％）
化合物Ａ                化合物Ｂ                          １００
ＣＢＺ−Ｌ−          Ｌ−フェニルアラニン                １００
フェニルアラニン
【００３８】
ＨＰＬＣ分析：
Ｖydac  Ｃ−１８逆相カラムを持つＨewlett−Ｐackard（ＨＰ）１０９０器具を用いて、ＨＰＬＣ分析を行なう。移動相，水中０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有の溶剤Ａおよびアセトニトリル７０％／水３０％中０.１％ＴＦＡ含有の溶剤Ｂ。基質と生成物の分離に、以下に示す溶剤ＡおよびＢの勾配を用いる。
【００３９】
０分：１００％Ａ、０〜１５分：５０％Ｂ、１５〜２５分：１００％Ｂ、２５〜２６分：０％Ｂ、および２６〜３０分：０％Ｂ。流速は１mL／分。カラム温度は周囲温度で、検出波長は２１５nm。これらの条件下で、化合物Ａ、化合物Ｂ、ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−フェニルアラニンそれぞれの保持時間は、１５.４８分、７.２８分、１６.９９分および７.３５分である。他の全てのＣＢＺ−含有化合物も、これらの条件を用いて分析した。
【００４０】
実施例４：Ｓphingomonas  paucimobilis
ＡＴＣＣ  ２０２０２７の細胞抽出物を用いるＣＢＺの脱保護
Ｓphingomonas  paucimobilis  ＡＴＣＣ  ２０２０２７の細胞抽出物の調製：
細胞抽出物の調製を、４〜７℃で実施する。細胞を５０mＭリン酸カリウム緩衝剤（pＨ７.０）で洗い、洗った細胞（１００g）を、５００mLの緩衝剤Ａ（５０mＭリン酸塩緩衝剤、pＨ７.０、１０％グリセロールおよび２mＭ−ＤＴＴを含有）に懸濁する。
【００４１】
かかる細胞懸濁液に、イソプロパノール中の１mＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を加える。細胞懸濁液（２０％Ｗ／Ｖ、湿潤細胞）をミクロフルイダイザー（Ｍicrofluidizer、ミクロ流動化装置）（Ｍicrofluidics，Ｉnc．）に１２０００psiで通し（２回通過）、砕解した細胞を２５０００xgで４℃にて３０分間遠心分離する。遠心分離後に得られる上層液を、細胞抽出物と称す。
【００４２】
細胞抽出物を用いるＣＢＺ−脱保護：
各種化合物からのＣＢＺ−基の脱保護に、細胞抽出物を用いる。それは、各種の方法でＣＢＺ−基を脱保護するのに有用である。種々のＤおよびＬ−ＣＢＺ−保護アミノ酸を、細胞抽出物と共に４２℃で１８〜２０時間培養する。０.４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有の２容量の５０％アセトニトリルを加えて、反応を止める。下記表２に示される結果より、酵素はＣＢＺ−保護Ｌ−アミノ酸のＣＢＺ−基を加水分解するのに特異的であるのが認められる。
【００４３】
表２：
基質   生成物   転化率（％）
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン              Ｌ−チロシン            １００
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｄ−チロシン              Ｄ−チロシン                １.５８
Ｏ−α−ＣＢＺ−Ｌ−チロシン              Ｌ−チロシン            １００
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−ロイシン              Ｌ−ロイシン            １００
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｄ−ロイシン              Ｄ−ロイシン                １.２
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニン      Ｌ−フェニルアラニン    １００
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｄ−フェニルアラニン      Ｄ−フェニルアラニン        ０
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン                Ｌ−リシン                ５２
Ｎ−ε−ＣＢＺ−Ｄ−リシン                Ｄ−リシン                  ７
Ｎ−α−ε−(ＣＢＺ)２−Ｌ−リシン      Ｌ−リシン                ２４
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−プロリン              Ｌ−プロリン            １００
Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｄ−プロリン              Ｄ−プロリン                ０
化合物Ａ                                  化合物Ｂ                  ９５
【００４４】
実施例５：ＣＢＺ−脱保護酵素の精製と、該精製した酵素のＣＢＺ−含有化合物からのＣＢＺ−基の脱保護における使用
酵素アッセイ
０.５mgの化合物ＡまたはＣＢＺ−フェニルアラニンを５０mＭ−リン酸塩緩衝剤（pＨ７）中、４５℃にて０.４mLの細胞抽出物／画分と共に１８時間培養する。０.４％ＴＦＡ含有の１mLの５０％アセトニトリルを加えて、反応を止める。サンプルを濾過し、生成物と出発物質をＨＰＬＣで分析する
【００４５】
たん白アッセイ
Ｂio−Ｒadたん白アッセイを用いて、たん白濃度を測定する。アッセイは、製造（Ｂio−Ｒad）プロトコルに従って行った。
酵素の精製
全ての精製ステップは、室温で実施する。酵素の精製は、基質としてＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニンを用い実施する。
【００４６】
上記調製の細胞抽出物を、ＤＥＡＥ−セルロース（緩衝剤Ａで予め平衡化）と共に２時間回分吸着させる。活性酵素を含有するフォロースルー（follow−through）を、絶えず撹拌しながら、硫酸アンモニウム（５１６g／Ｌ）で２時間沈殿せしめる。遠心分離（１５０００rpm、４℃）で得られる生成沈殿物を、１Ｍ硫酸アンモニウム含有の緩衝剤Ａ中で可溶化し、フェニルセファロース（phenylsepharose）（１Ｍ硫酸アンモニウム含有の緩衝剤Ａで予め平衡させた２０mLカラム）に装填する。
【００４７】
カラムを、１Ｍ硫酸アンモニウム含有の緩衝剤Ａ、０.５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０.２Ｍ硫酸アンモニウムで連続して洗う。最後に、緩衝剤Ａで酵素を溶離する。活性酵素含有の画分をプールし（３０mL）、Ａmicon  ＰＭ−１０膜で濃縮する（８mL）。次いで酵素を、Ｓ−２００ゲル−濾過カラム（４００mLカラム）に装填する。
【００４８】
酵素を流速０.８mL／分にて、緩衝剤Ａで溶離する。これらのステップで、酵素を１５０倍以上に精製し、この場合の比活性は１３.９ユニット／mgたん白である（下記表３）。ユニットは、μモルの形成生成物／分／たん白mgで定義される。酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、分子量〜１５４０００ダルトン、サブユニット分子量４５０００ダルトンの二量体たん白である。
【００４９】
2004520030.tif 000007
【００５０】
このセクションの記載に準じ調製した精製酵素を用いて、下記表４に示すＣＢＺ−含有化合物を脱保護した。
表４：
基  質     生成物   転化率（％）
化合物Ａ                              化合物Ｂ                  １００
ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニン      Ｌ−フェニルアラニン          １００
【００５１】
実施例６：２５０mgプレップ・バッチの化合物Ａの酵素脱保護
細胞抽出物を、上記セクションの記載に準じ調製する。２５０mLの細胞抽出物に、化合物Ａ２５０mgを加え、２８℃および９５rpmで培養する。４０時間の反応後、２５０mLのアセトニトリルを加える。基質と生成物をＨＰＬＣで分析する。化合物Ｂのモル収率は、８７％であった。
【００５２】
実施例７：ＣＢＺ−含有化合物の酵素脱保護
前セクションの記載に準じ、Ｓphingomonas  paucimobilis  ＡＴＣＣ  ２０２０２７から調製した細胞抽出物を用い、［（３Ｓ）−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１−［２−オキソ−２−（１−ピロリジニル）エチル］−１Ｈ−アゼピン−３−イル］カルバミン酸フェニルメチルエステル（化合物Ｃ）を脱保護して、（Ｓ）−１−［（３−アミノヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−アゼピン−１−イル）アセチル］ピロリジン（化合物Ｄ）を形成せしめる。
【００５３】
【化６】
2004520030.tif 000008
【００５４】
実施例８：ＣＢＺ−含有化合物の酵素脱保護
前セクションの記載に準じ、Ｓphingomonas  paucimobilis  ＡＴＣＣ  ２０２０２７から調製した細胞抽出物を用い、６−［（フェニルメトキシ）カルボニル］アミノ］ヘキサヒドロ−２,２−ジメチル−７−オキソ−１Ｈ−アゼピン−１−酢酸エチルエステル・塩酸塩１を脱保護して、６−アミノヘキサヒドロ−２,２−ジメチル−７−オキソ−１Ｈ−アゼピン−１−酢酸エチルエステル・塩酸塩（化合物Ｅ）とする。
【００５５】
【化７】
2004520030.tif 000009
【００５６】
注として、本明細書で引用した、これらに限定されるものでないが、特許および特許出願を含む刊行物や参考文献について、たとえこれらの個々の刊行物や参考文献が、十分な記載で本明細書に導入されていると明確かつ個別的に示されていても、上記引用部分の全体を完全に、参考までに本明細書に導入する。この出願の優先権主張の基礎になるいずれの特許出願も、上記の刊行物や参考文献と同様に、参考までに本明細書に導入する。
【００５７】
本発明を好ましい具体例についてこれを強調して説明したが、好ましい工夫や方法でのバリエーションを使用しうること、および本明細書で明記したものと別の方法で本発明を実施しうることを意図していることについては、当業者にとって自明である。よって、本発明は、特許請求の範囲で規定される精神および技術的範囲に含まれる全ての改変を包含するものである。
【国際公開パンフレット】
2004520030.tif 000016
2004520030.tif 000017
2004520030.tif 000018
2004520030.tif 000019
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520030.tif 000035
【国際調査報告】
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2004520030.tif 000037
2004520030.tif 000038
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2004520030.tif 000040