(57)【要約】アンドロゲンレセプターを含む安定な筋肉細胞株、および筋肉細胞バックグラウンド中でアンドロゲンレセプターモデュレーターとしての化合物の有効性を評価するための機能的なトランス活性化アッセイにこれら細胞を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉細胞および該筋肉細胞中に安定に導入した哺乳動物アンドロゲンレセプターを含む、安定な筋肉細胞株。
【請求項２】
該筋肉細胞がＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞を含む、請求項１に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項３】
該哺乳動物アンドロゲンレセプターがラットアンドロゲンレセプターを含む、請求項１に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項４】
安定にトランスフェクションしたエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物をさらに含む、請求項１に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項５】
該エンハンサーがアンドロゲン応答配列を含む、請求項４に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項６】
該エンハンサーが、Ｃ３−１、ＤＲ−１またはＰＢ−ＡＲＥを含む、請求項５に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項７】
該プロモーターがＳＶ４０を含む、請求項４に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項８】
該プロモーターがＨＳＶｔｋを含む、請求項４に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項９】
該リポーター遺伝子がルシフェラーゼを含む、請求項４に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項１０】
該エンハンサー／プロモーター／リポーター構築物がｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼを含む、請求項４に記載の安定な筋肉細胞株。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ受託番号 を含む安定な筋肉細胞株。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号 を含む安定な筋肉細胞株。
【請求項１３】
アンドロゲンレセプターのアゴニストまたは部分的なアゴニストとしての化合物の有効性を評価するための機能的なトランス活性化アッセイであって、
（ａ）請求項１に記載の細胞株を、アンドロゲン応答配列、プロモーターおよびリポーター遺伝子を含むプラスミドで一過性にトランスフェクションし、
（ｂ）一過性にトランスフェクションした該細胞株を化合物と接触させ、ついで（ｃ）一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子の発現を検出し、その際、該化合物の存在下での一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子発現の増大は該化合物がアンドロゲンレセプターのアゴニストまたは部分的なアゴニストであることを示す
を含むアッセイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法に従って同定した化合物を含むアンドロゲンレセプターモデュレーター。
【請求項１５】
アンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストとしての化合物の有効性を評価するための機能的なトランス活性化アッセイであって、
（ａ）請求項１に記載の細胞株を、アンドロゲン応答配列、プロモーターおよびリポーター遺伝子を含むプラスミドで一過性にトランスフェクションし、
（ｂ）一過性にトランスフェクションした該細胞株を化合物およびジヒドロテストステロンと接触させ、ついで
（ｃ）一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子の発現を検出し、その際、該化合物およびジヒドロテストステロンの存在下での一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子発現がジヒドロテストステロンのみに暴露した細胞に比べて低減していることは、該化合物がアンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストであることを示す
を含むアッセイ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法に従って同定した化合物を含むアンドロゲンレセプターモデュレーター。
【請求項１７】
アンドロゲンレセプターのアゴニストまたは部分的なアゴニストとしての化合物の有効性を評価するための機能的なトランス活性化アッセイであって、
（ａ）請求項４に記載の細胞株を化合物と接触させ、ついで
（ｂ）一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子の発現を検出し、その際、該化合物の存在下での一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子発現の増大は該化合物がアンドロゲンレセプターのアゴニストまたは部分的なアゴニストであることを示す
を含むアッセイ。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法に従って同定した化合物を含むアンドロゲンレセプターモデュレーター。
【請求項１９】
アンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストとしての化合物の有効性を評価するための機能的なトランス活性化アッセイであって、
（ａ）請求項４に記載の細胞株を化合物およびジヒドロテストステロンと接触させ、ついで
（ｂ）一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子の発現を検出し、その際、該化合物およびジヒドロテストステロンの存在下での一過性にトランスフェクションした該細胞株でのリポーター遺伝子発現がジヒドロテストステロンのみに暴露した細胞に比べて低減していることは、該化合物がアンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストであることを示す
を含むアッセイ。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法に従って同定した化合物を含むアンドロゲンレセプターモデュレーター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、細胞株、および生物学的活性を有する化合物の同定にこれら細胞株を用いる方法に関する。とりわけ、本発明は、アンドロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプターのモデュレーターである化合物の同定に有用なリポーター遺伝子で安定にトランスフェクションした筋肉細胞株に関する。
【０００２】
（背景技術）
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）はリガンド依存性の転写因子のステロイド核内受容体スーパーファミリーの一員であり、前立腺および精嚢、男性および女性の生殖器、皮膚、精巣、卵巣、軟骨、皮脂腺、毛包、汗腺、心筋、骨格筋および平滑筋、胃腸管の小胞細胞、甲状腺濾胞細胞、副腎皮質、肝臓、松果体、および脳の多くの皮質および皮質下領域（脊髄運動ニューロンを含む）を含む生殖組織および非生殖組織に広く分布している（Ｎｅｇｒｏ−Ｖｉｌａｒ， Ａ． ＪＣＥ＆Ｍ １９９９ ５４（１０）： ３４５９−６２）。ステロイドレセプターファミリーの他の成員と同様、ＡＲは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、およびアンドロゲン結合部位を含みアンドロゲン機能の切り替えを担っている２６１残基のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（Ｍｗ＝３０，２４５Ｄａ）を含む幾つかの機能的ドメインを有している。ヒトおよびラットのアンドロゲンレセプターのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が記載されている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９８８ ８５： ７２１１−７２１５）。
【０００３】
ＡＲは、医薬の発見および患者の治療の多くの領域で重要な標的である。腫瘍学では、たとえば、アンドロゲンレセプター機能のインヒビター（アンタゴニストまたは部分的なアンタゴニスト）はアンドロゲン依存性の前立腺癌の治療に有用であり、一方、ＡＲのアゴニストまたは部分的なアゴニストは乳癌の治療に応用できる。代謝性および内分泌性の疾患障害については、たとえば、アンドロゲンレセプター機能のアゴニストまたは部分的なアゴニストは加齢に関連した疾患および幾つかの疾患状態（ＡＩＤＳを含むがこれに限られるものではない）における悪液質の状態の治療に有用である。機能的なＡＲはまた種々の骨細胞においても同定されており、アンドロゲンの投与は男性および女性において骨格の発達および維持に有益な作用を及ぼす。
【０００４】
アンドロゲン療法の進歩は、アンドロゲンの所望でないまたは投与量を制限する副作用から所望の活性を分離できないことによって制限されてきた。しかしながら、所望でない副作用を排除しながらエストロゲンレセプターのターゲティングにおいて高度の組織選択性を有する選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭＳ）の開発における最近の進展は、ＳＡＲＭｓ（選択的アンドロゲンレセプターモデュレーター）を示唆する結果となっている（Ｎｅｇｒｏ−Ｖｉｌａｒ， Ａ． ＪＣＥ＆Ｍ １９９９ ５４（１０）： ３４５９−６２；レイドＲｅｉｄら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １９９９ １７： ２７１−２８４）。
【０００５】
既知のリガンドまたは未知の化合物に暴露されたときに細胞内レセプターの転写活性を検出する一般的なアッセイおよび方法が記載されている。たとえば、米国特許第５，０７１，７７３号には、ホルモン細胞内レセプター、これらレセプターに対するリガンドおよびホルモン細胞内レセプターを転写的に活性化しうるタンパク質を同定するためのアッセイが記載されている。これらアッセイは、作動可能なリポーター遺伝子に連結したプロモーターなどのホルモン応答配列をコードするＤＮＡおよび細胞内レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含む細胞の使用を包含する。この細胞がホルモンまたはリガンドに暴露されるとホルモン細胞内レセプター複合体が形成されて適当なＤＮＡ結合領域に送達され、それによってホルモン応答配列を活性化し、このことが今度はリポーター遺伝子によってコードされた産物の発現に導く。リポーター遺伝子の活性化は、リポーター遺伝子の検出のための公知の方法に従って検出される。
【０００６】
米国特許第６，０１７，９２４号は、「シス−トランス」または「コトランスフェクション」アッセイに基づいてアンドロゲンレセプターに対する高親和性、高特異性のアゴニスト、部分的なアゴニスト（すなわち、部分的なアクチベーターおよび／または組織特異的なアクチベーター）およびアンタゴニストとして特徴付けられる非ステロイド化合物を開示している。「シス−トランス」または「コトランスフェクション」アッセイによるアンドロゲンレセプターに対する高親和性、高特異性のアゴニスト、部分的なアゴニスト（すなわち、部分的なアクチベーターおよび／または組織特異的なアクチベーター）およびアンタゴニストとして特徴付けられる非ステロイド化合物はまた、ＷＯ０１／１６１０８、ＷＯ０１／１６１３３、およびＷＯ０１／１６１３９にも記載されている。
【０００７】
このコトランスフェクションアッセイ（Ｅｖａｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８ ２４０： ８８９−９５）は、天然のホルモンの作用を擬態する機能的なアゴニストおよび部分的なアゴニストまたは該作用を抑制するアンタゴニストを同定し、応答性の細胞内レセプタータンパク質に対するその作用を定量する方法をもたらすと示唆されている。このアッセイでは、ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓繊維芽細胞）を、ＳＶ４０プロモーターの構成的な制御下にヒトＡＲを含むプラスミドｐＲＳｈＡＲおよびマウス乳腺癌ウイルス（ＭＴＶ）ロングターミナルリピートの制御下にホタルルシフェラーゼのｃＤＮＡを含むリポータープラスミドＭＴＶ−ＬＵＣで一過性にトランスフェクションする。トランスフェクションの有効性および化合物の毒性の評価のための内部標準として、大腸菌β−ガラクトシダーゼの構成的な発現をコードするプラスミドｐＲＳ−β−Ｇａｌを含める。
【０００８】
ヒドロキシフルタミドは大抵の組織における公知のＡＲアンタゴニストであるが、骨芽細胞によるＩＬ−６産生に対する作用に関して選択的ＡＲモデュレーター（ＳＡＲＭ）として機能することも示唆されている（Ｈｏｆｂａｕｅｒら、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ． １９９９ １４： １３３０−１３３７）。ヒドロキシフルタミドの選択性は、この化合物の存在下で成熟骨芽細胞表現型および生理的な数のアンドロゲンレセプターを発現するヒト胎児骨芽細胞株（ＨＦＯＢ／ＡＲ−６）の増殖および分化を評価することにより評定した。
【０００９】
ヒドロキシフルタミドおよびカソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）はともに大抵の組織における完全なＡＲアンタゴニストとして知られるが、ＡＲトランスフェクションしたＰＣ３細胞においてジヒドロテストステロン（ＤＨＴ；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８， ６３２２−６２３９ （１９９９））と同様のＡＲ依存性の仕方でＭＡＰキナーゼＥｒｋ−１およびＥｒｋ−２を活性化することも示されている。
【００１０】
化合物ＬＧＤ２２２６は非ステロイドＡＲアゴニストであるが、上記ＣＶ−１アッセイにおける活性に基づいて、骨粗鬆症、男性のホルモン置換（ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、男性および女性の性的機能不全および悪液質などのアンドロゲン関連疾患の治療に有用な選択的アンドロゲンレセプターモデュレーターとしても特徴付けられている（ＳＣＲＩＰ−ワールド・ファーマシューティカル・ニュー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ）（２０００年５月１２日提出）；ＷＯ０１／１６１０８；ＷＯ０１／１６１３３；およびＷＯ０１／１６１３９）。
【００１１】
米国特許第５，９５２，４８８号には細胞培養におけるアンドロゲン性の物質のバイオアッセイが記載されており、該アッセイではＨｅＬａ細胞またはＰＣ−３細胞が、ＣＡＴリポーター遺伝子に連結したプロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）（ＰＢ）遺伝子プロモーター領域からクローニングしたＤＮＡ配列で一過性にトランスフェクションされるかまたは安定に組み込まれる。
米国特許第５，５０６，１０２号には、ステロイド細胞内レセプターにより媒体された転写の潜在的なアンタゴニストについて化合物をスクリーニングするのに有用な方法およびアッセイが記載されており、該方法およびアッセイでは、細胞が、細胞内レセプターをコードする第一のベクター、ヒトプロゲステロンレセプターのＰＲ−Ａイソ型をコードする第二のベクターおよびリポーター遺伝子をコードする第三のベクターでトランスフェクションされる。
【００１２】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
本願出願人は、このたび、ＡＲおよびリポーターが筋肉組織細胞中に安定にトランスフェクションされた細胞株およびアッセイを初めて開発した。
【００１３】
（その解決方法）
本発明の目的は、哺乳動物アンドロゲンレセプターが安定に導入された筋肉細胞株を提供することである。これら細胞株は、筋肉細胞バックグラウンド中でアンドロゲンレセプターモデュレーターとしての化合物の有効性を評価する機能的なトランス活性化アッセイに有用である。
【００１４】
本発明の他の目的は、これら哺乳動物アンドロゲンレセプターを含む安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株により、筋肉細胞バックグラウンド中でアンドロゲンレセプターモデュレーターとしての化合物の有効性を評価するのに用いる機能的なトランス活性化アッセイを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、哺乳動物アンドロゲンレセプターを含む安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株を用いた機能的なトランス活性化アッセイにより同定した、アンドロゲンレセプターモデュレーター、とりわけ選択的アンドロゲンレセプターモデュレーターを提供することである。
【００１５】
本発明は、哺乳動物アンドロゲンレセプターおよびリポーター遺伝子を安定に導入した筋肉細胞株に関する。
種々の筋肉細胞を本発明に用いることができる。好ましい態様において、筋肉細胞株は安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞を包含する。しかしながら、本発明において有用な他の筋肉細胞の例としては、マウスＧ−７、Ｇ−８、Ｐ１９およびＳｏ１８細胞、ラットＨ９ｃ２（２−１）、Ｌ６およびＬ８細胞、およびヒトＳＪＲＨ３０（ＲＭＳ１３）細胞が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００１６】
本発明の筋肉細胞株は、該筋肉細胞に安定に導入された哺乳動物アンドロゲンレセプターをさらに含む。本発明において有用なアンドロゲンレセプターは種々の哺乳動物種から単離した。これらレセプターおよびその配列は、従来技術に詳細に記載されている。たとえば、米国特許第５，６１４，６２０号を参照。さらに、ラットのアンドロゲンレセプターはジーンバンク受け入れ番号Ｍ２３２６４およびＪＯ５４５４に示されており、Ｃｈａｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８ ２４０ （４８５０）： ３２４−３２６）によっても記載されている。マウスのアンドロゲンレセプターは、ジーンバンク受け入れ番号Ｍ３７８９０に示されており、Ｇａｓｐｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｉｃ． ＵＳＡ １９９１ ８８： ８６０６−８６１０）およびヒー（Ｈｅ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９０ １７１ （２）： ６９７−７０４）によって記載されている。
【００１７】
モルモットのアンドロゲンレセプターもまたＨｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９０ １７１ （２）： ６９７−７０４）によって記載されている。Ｈｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９９０ １７１ （２）： ６９７−７０４）はまた、イヌのアンドロゲンレセプターをジーンバンク受け入れ番号ＡＦ１９７９５０として記載している。ハムスターのアンドロゲンレセプターはＳｈｉｂａら（Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｓｃｉ． ２００１ ２６（３）： １６３−８）によって記載されている。さらに、ヒトのアンドロゲンレセプターはジーンバンク受け入れ番号Ｍ３４２３３に示されており、Ｔｒａｐｍａｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８８ １５３（１）： ２４１−２４８）およびＴｉｌｌｅｙら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８９ ８６（１）： ３２７−３３１）によって記載されている。好ましい態様において、本発明の細胞株はラットのアンドロゲンレセプターを含む。
【００１８】
本発明の細胞株は、筋肉細胞バックグラウンド中でアンドロゲンレセプターモデュレーターとしての化合物の活性を評価するのに有用である。
一つの態様において、本発明の細胞株は、ジーンバンク受け入れ番号Ｍ２３２６４に示されているもののような完全長のラットアンドロゲンレセプターを含む安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞を包含する。この細胞株を本明細書では「ステーブル１（Ｓｔａｂｌｅ １）」と称する。
【００１９】
完全長のラットアンドロゲンレセプター（ｒＡＲ）を含むステーブル１細胞株を生成するため、Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株（Ｙａｆｆｅ， Ｄ．およびＳａｘｅｌ， Ｏ． 、Ｎａｔｕｒｅ １９７７ ２７０： ７２５−７２７）を、完全長ｒＡＲおよびネオマイシン耐性遺伝子を含む２シストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）メッセージをコードするプラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｒＡＲ（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９９０ １５： ４７７−４８３；Ｊａｎｇら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９８８ ６２： ２６３６−２６４３）でトランスフェクションした。詳細には、リポフェクタミンプラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ）ＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造業社の教示に従って１０ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中の２５０μｌのプラス試薬および３７５μｌのリポフェクタミン試薬を用いて５０μｇのｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｒＡＲをＣ２Ｃ１２細胞中にトランスフェクションした。１０ｍｌの増殖培地（１０％ＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウムおよび０．５×アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬから）；以下、本明細書では「ステーブル１増殖培地」と称する）中の細胞（０．７５×１０５）を５つの各１０ｃｍ培養プレートにプレーティングした。翌日、培地を各ディッシュから除去し、４．５ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭで置換した。
【００２０】
ついで、２ｍｌのトランスフェクション混合物を各ディッシュに加えた。３時間インキュベーションした後、トランスフェクション培地を除去し、６．５ｍｌの増殖培地で置換した。細胞を非選択培地で２４時間増殖させた。ｎｅｏ／ｒＡＲで安定にトランスフェクションした個々の細胞を選択するため、細胞を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したステーブル１増殖培地中に１：１５に分け、別個のクローン細胞株として増殖させた。１４日後、全部で８０の耐性クローンが単離された。正常な増殖特性を示すクローンをエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物で一過性にトランスフェクションした。ステーブル１細胞は、０．１μＭのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加したときにＳｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）による測定でルシフェラーゼ活性の有意の増大を示すクローンとして同定される。好ましい態様において、ステーブル１細胞は、ＤＨＴを添加したときにルシフェラーゼ活性の約１２倍またはそれ以上の増大を示す。
【００２１】
完全長のラットアンドロゲンレセプターを含む安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株を包含する本発明のステーブル１細胞は、寄託のため２００１年６月１２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナッサス、バージニア、米国、２０１１０−２２０９に送られた。下記に記載するトランス活性化アッセイにおいて１００ｎＭ ＤＨＴの存在下で約３０，０００相対発光単位（ＲＬＵ）の比活性を示す２５バイアルのステーブル１細胞をＡＴＣＣに発送した。ステーブル１細胞株のＡＴＣＣ受託番号は である。
他の態様において、安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株は、完全長のラットアンドロゲンレセプターとエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物とを含む。この細胞株は、本明細書で「ステーブル２」と称する。
【００２２】
ステーブル２細胞株の構築に種々のエンハンサー／プロモーター構築物を用いることができる。好ましい態様において、エンハンサーはアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を包含する。これら構築物に使用するＡＲＥの例としては、Ｃ３−１、ＰＢ−ＡＲＥ、およびＤＲ１が挙げられるが、これらに限られるものではない。Ｃ３−１は、ラット前立腺結合タンパク質遺伝子のＣ３サブユニットプロモーターから単離したコンセンサスＡＲＥ／ＧＲＥ（グルココルチコイドレセプター応答配列）である。２ＸＣ３（２つのＣ３−１配列を含む）は、ＡＲおよびＧＲのコンセンサスエンハンサー配列を含む（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６ ２７１： １９０１３−１９０１６）。ＰＢ−ＡＲＥは、ラットプロバシン遺伝子のプロモーターから単離したアンドロゲンレセプター特異的な応答配列である（Ｃｌａｅｓｓｅｎｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６ ２７１： １９０１３−１９０１６）。
【００２３】
ＤＲ１応答配列もまたアンドロゲンレセプター特異的であるが、ランダム配列選択および増幅法を用いてコンセンサスＡＲＥ／ＧＲＥを含む変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドのプールから合成により得た。１つのＤＲ−１配列を含む１ＸＤＲ−１、および２つのＤＲ−１配列を含む２ＸＤＲ−１はともにＡＲに特異的であることが報告されている（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７ ２７２： ８２２７−８２３５）。各ＤＲ１配列は、重複する直接繰り返し（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）として配向した２つのＡＲコア結合部位からなる（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７ ２７２： ８２２７−８２３５）。
これら構築物には種々のプロモーターも用いることができる。プロモーターの例としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ベータ−グロビン、およびＨＳＶｔｋが挙げられるが、これらに限られるものではない。しかしながら、当業者が本明細書の開示を読んで理解するであろうように、本発明に有用な他のプロモーターを常法により選択することができる。
【００２４】
好ましい態様において、ステーブル２細胞株のエンハンサー／プロモーター構築物は、より強力なＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１を含む。２ＸＤＲ−１は、ＣＶ−１細胞においてＡＲ特異的な応答配列であることが報告されている（Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７ ２７２： ８２２７−８２３５）。これはＡＲ／ＧＲコンセンサスエンハンサー配列のランダム突然変異誘発により開発された。実施例２に詳細に記載する実験は、２ＸＤＲ−１が、ＤＨＴを添加したときにＡＲＥｓ Ｃ３、１ＸＤＲ−１、およびＰＢ−ＡＲＥを含むエンハンサー／プロモーター構築物に比べて一層良好な刺激および選択性を呈示することを示した。しかしながら、本発明のステーブル２細胞株を構築するのに用いることのできる別のエンハンサー／プロモーター構築物としては、ｐＧＬ３／２ＸＣ３、ｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１、ｐＧＬ３／ＰＢ−ＡＲＥ、ＨＳＶｔｋ／２ＸＣ３、ＨＳＶｔｋ／１ＸＤＲ−１、ＨＳＶｔｋ／２ＸＤＲ−１およびＨＳＶｔｋ／ＰＢ−ＡＲＥが挙げられるが、これらに限られるものではない。これらエンハンサー／プロモーター構築物の構築は、本明細書の実施例１に詳細に記載してある。
【００２５】
構築物には種々のリポーター遺伝子を用いることもできる。例としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、多数のグリーン蛍光タンパク質、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限られるものではない。好ましい態様において、リポーター遺伝子はルシフェラーゼである。
【００２６】
完全長のラットアンドロゲンレセプターとエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物（ｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ）を含むステーブル２細胞株を生成するため、ステーブル１細胞株の細胞を、エンハンサー／プロモーター／リポーター構築物を含むプラスミドおよびハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−／Ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア）でコトランスフェクションした。詳細には、リポフェクタミンプラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ）ＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造業社の教示に従って１２ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中の３００μｌのプラス試薬および４５０μｌのリポフェクタミン試薬を用いて６０μｇのｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼおよび１５μｇのｐＣＤＮＡ３．１−／Ｈｙｇｒｏをステーブル１細胞中にトランスフェクションした。８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した１０ｍｌのステーブル１増殖培地中の細胞（６．０×１０５）を６つの各１０ｃｍ培養プレートにプレーティングした。翌日、培地を各ディッシュから除去し、４．５ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭで置換した。
【００２７】
ついで、２ｍｌのトランスフェクション混合物を各ディッシュに加えた。３時間インキュベーションした後、トランスフェクション培地を除去し、６．５ｍｌのステーブル１増殖培地で置換した。細胞を一夜増殖させ、ついでエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物並びにハイグロマイシンＢ耐性で安定にトランスフェクションした個々の細胞を選択するため、細胞を８００μｇのハイグロマイシンＢを添加したステーブル１増殖培地中に１：１８および１：２４に分け、ついで別個のクローン細胞株として増殖させた。１４日後、耐性クローンを単離し、正常な増殖特性を示すクローンを０．１μＭ ＤＨＴの存在下でルシフェラーゼ活性について試験した。バックグラウンドに対して３〜１２倍増大した活性を有するクローンを拡張した。これらクローンの幾つかについて、参照化合物としてＤＨＴ、フルオキシメステロン、オキシアンドロロンおよび酢酸メドロキシプロゲステロンを用いてさらに特徴付けを行った。好ましい態様において、ステーブル２細胞株はＤＨＴを添加したときにバックグラウンドに比べて１２倍またはそれ以上のルシフェラーゼ活性を示し、ＥＣ５０はナノモル以下の範囲であった。ステーブル２細胞を他の参照化合物に暴露したときも予期される活性が示された。
【００２８】
完全長のラットアンドロゲンレセプターおよび安定にトランスフェクションされたｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼリポーターを含む安定なＣ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株を包含する本発明のステーブル２細胞は、寄託のため２００１年６月１２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ユニバーシティー・ブールバール、マナッサス、バージニア、米国、２０１１０−２２０９に送られた。下記に記載するトランス活性化アッセイにおいて１００ｎＭ ＤＨＴの存在下で約３０，０００相対発光単位（ＲＬＵ）の比活性を示す２５バイアルのステーブル２細胞をＡＴＣＣに発送した。ステーブル２細胞株のＡＴＣＣ受託番号は である。
【００２９】
本発明はまた、リポーター遺伝子の発現の検出により筋肉細胞バックグラウンド中でアンドロゲンレセプターのモデュレーターとしての化合物の活性を評価すべく開発した機能的なトランス活性化アッセイにも関する。「モデュレーター」とは、本発明の目的のためには、ＡＲのアゴニスト、部分的なアゴニスト、アンタゴニスト、および／または部分的なアンタゴニストを包含することを意味する。
【００３０】
これらアッセイでは、アンドロゲンレセプターアゴニストまたは部分的なアゴニストとしての化合物の有効性の評価は、ステーブル１細胞（アンドロゲン応答配列、プロモーターおよびリポーター遺伝子で一過性にトランスフェクションしたもの）かまたはステーブル２細胞を化合物に接触させ、該化合物の存在下で該細胞中のリポーター遺伝子発現を検出することにより行う。該化合物に接触または暴露しなかった対照細胞に比べて該化合物の存在下で該細胞でのリポーター遺伝子発現の増大は、該化合物がアンドロゲンレセプターのアゴニストまたは筋肉細胞における部分的なアゴニストであることを示している。
【００３１】
アンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストとしての化合物の有効性の評価は、ステーブル１細胞またはステーブル２細胞においてＤＨＴによるリポーター遺伝子発現の誘発を該化合物が妨害する能力を決定する競合アッセイにより行う。好ましい態様において、約１ｎＭのＤＴＨをリポーター遺伝子発現を誘発させるアッセイに用いる。ＤＨＴに暴露されたが該化合物とは接触していない対照細胞と比べて該化合物の存在下でのリポーター遺伝子発現の低減は、該化合物がアンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたは筋肉細胞における部分的なアンタゴニストであることを示している。
【００３２】
これらアッセイは、化合物がＤＨＴ誘発を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０とも称する）を決定するのに用いることができる。さらに詳細には、本発明の第一のアッセイ（本明細書では「アンドロゲンレセプタートランス活性化アッセイ（ＡＲＴＡ）ステーブル１」と称する）では、完全長のラットアンドロゲンレセプターを安定に発現するがエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物の一過性のトランスフェクションを必要とするステーブル１細胞株を用いる。このアッセイでは、ステーブル１細胞を、フェノールレッドなしの高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：２１０６３−０２９）［１０％炭末およびデキストラン処理ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３００６８．０２）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１５６３０−０８０）、１×ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１１３６０−０７０）、０．５×アンチバイオティック−アンチマイコティック、および８００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１０１３１−０３５）を含有］中に約５，０００〜１０，０００細胞／ウエル、好ましくは６，０００細胞／ウエルにて、好ましくは９６ウエルフォーマットでプレーティングする。細胞が接着および順化し、トランスフェクションのために最適のコンフルエンシーに達したら（プレーティングしてから約２４時間）、細胞をｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼなどのエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物でトランスフェクションする。
【００３３】
好ましくは、トランスフェクションはリポフェクタミンプラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ）ＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１０９６４−０１３）を用いて行う。この好ましい態様において、ｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼＤＮＡ（約５ｎｇ／ウエル）およびサケ精子ＤＮＡ（５０ｎｇ／ウエル）または一般（ｇｅｎｅｒｉｃ）プラスミドＤＮＡなどの担体を５μｌ／ウエルのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：３１９８５−０７０）に希釈する。これに０．５μｌ／ウエルのプラス試薬を加える。この混合物を室温で１５分間インキュベートする。別の容器に０．３８５μｌ／ウエルのリポフェクタミン試薬を５μｌ／ウエルのＯｐｔｉ−ＭＥＭで希釈する。ついで、ＤＮＡ混合物をリポフェクタミン混合物と混合し、室温でさらに１５分間インキュベートする。この間に細胞からの培地を除去し、６０μｌ／ウエルのＯｐｔｉ−ＭＥＭと置換する。これに１０μｌ／ウエルのＤＮＡ／リポフェクタミントランスフェクション混合物を加える。細胞を４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を細胞から除去し、９０μｌの上記高グルコースＤＭＥＭと置換する。
【００３４】
本発明に用いることのできる他のトランスフェクション法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、直接マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子送達法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００３５】
つぎに、このアッセイで活性を試験しようとする化合物を各ウエルに入れる。好ましい態様において、１０μｌの適当な化合物希釈液を各ウエルに入れる。所定の範囲の濃度の化合物、すなわち約０．００１ｎＭ〜３０００ｎＭの化合物を試験するのが好ましい。また、化合物の最初の希釈はジメチルスルホキシドまたはエタノールで行い、その後の希釈はアッセイ培地で行うのが好ましい。２４時間後に化合物の活性を、Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２５２０）などの検出系により、または他のルシフェリン基質（ＴｒｏｐｉｘまたはＰａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、製造業社の教示に従って検出する。
【００３６】
本発明の第二のアッセイ（以下、「ＡＲＴＡステーブル２」と称する）は、ラットアンドロゲンレセプターおよびＡＲＥエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物の両者を安定に発現するステーブル１由来のステーブル２細胞株を用いる。この系で用いるエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物はｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼを含むのが好ましい。
【００３７】
ＡＲＴＡステーブル２アッセイでは、ステーブル２細胞を、フェノールレッドなしの高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：２１０６３−０２９）［１０％炭末およびデキストラン処理ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３００６８．０２）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１５６３０−０８０）、１×ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１１３６０−０７０）、０．５×アンチバイオティック−アンチマイコティック、８００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１０１３１−０３５）および８００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カタログ番号：１０６８７−０１０）を含有］中に約５，０００〜１０，０００細胞／ウエル、好ましくは６，０００細胞／ウエルにて、好ましくは９６ウエルフォーマットでプレーティングする。約２４時間、細胞上の培地を除去し、９０μｌの新たなアッセイ培地で置換する。
【００３８】
つぎに、このアッセイで活性を試験しようとする化合物を各ウエルに入れる。好ましい態様において、約０．００１ｎＭ〜３０００ｎＭの濃度範囲の化合物の１０μｌアリコートを各ウエルに入れる。化合物の最初の希釈はジメチルスルホキシドまたはエタノールで行い、その後の希釈はアッセイ培地で行うのが好ましい。２４時間後に化合物の活性を、Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ２５２０）により、または他のルシフェリン基質（ＴｒｏｐｉｘまたはＰａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、製造業社の教示に従って検出する。
【００３９】
アゴニストまたは部分的なアゴニストとは、本発明の目的のためには、本発明のトランス活性化アッセイにおいて３０００ｎＭ（３μＭ）またはそれ以下の濃度でＤＨＴの最大活性の５０％を達成する化合物として定義される。
アンタゴニストまたは部分的なアンタゴニストとは、本発明の目的のためには、本発明のトランス活性化アッセイにおいて３０００ｎＭまたはそれ以下の濃度で１ｎＭ ＤＨＴの最大活性を５０％抑制することのできる化合物として定義される。
【００４０】
本発明のアッセイは、特異的または選択的なアンドロゲンレセプターモデュレーター（ＳＡＲＭ）を同定するうえで特に有用である。「ＳＡＲＭ」とは、ある種類の組織、すなわちアンドロゲンレセプターを含む腫瘍での変調が他の組織、すなわちアンドロゲンレセプターを含む非腫瘍組織での変調と対比して種類の異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ−ｉｎ−ｋｉｎｄ）変調を示すアンドロゲンレセプターモデュレーターを意味する。
【００４１】
この態様において、潜在的なＳＡＲＭのアゴニストまたはアンタゴニスト活性を本発明のアッセイで測定して該化合物の活性を筋肉細胞バックグラウンド中で確認する。潜在的なＳＡＲＭの活性はまた、他の非腫瘍細胞株、たとえば、一次ラット前立腺上皮および間質細胞、一次モルモット平滑筋細胞、未熟（Ｉ−ＰＳＭＣ）または成体（Ａ−ＰＳＭＣ）ラットペニスからの一次平滑筋細胞、一次ウサギ平滑筋細胞株、前立腺平滑筋細胞株ＰＳ−１、前立腺平滑筋細胞株ＰＳＭＣ１、マウス骨細胞培養および骨芽細胞および一次ラット精嚢株ＳＶＣ−１およびＳＶＣ−２でも測定することができる。
【００４２】
そのような細胞株は以下に例示する文献およびそれに含まれる文献に記載されている：Ｎｅｍｅｔｈら、Ｊ． Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ １９， ７１８−７２４ （１９９８）、Ｚｈｕａｎｇら、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４１， ６９３−６９６ （１９９２）、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０， １１７−１２９ （１９９７）、Ｒｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら、Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４０， ３７３−３８３ （１９８４）、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９０， ２１９−２２９ （１９９３）、Ｓａｄｅｇｈｉ−Ｎｅｊａｄら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒｅｓ． １０， １６５−１６９ （１９９８）、Ｇｅｒｄｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３９， ３５６９−３５７７ （１９９８）、Ｓａｒａｈら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １８５， ４１６−４２４ （２０００）、Ｃｈｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４９１， ９１−９３ （２００１）およびＴａｊａｎａら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３， ６３７−６４４ （１９８４）。ホルモン依存性の腫瘍に対してアンタゴニスト活性を有するが、アンドロゲンレセプターを含む他の非腫瘍組織に対しては活性を示さないかまたはより好ましくはアゴニスト活性を有するＳＡＲＭを同定するための種々の方法を用いることができる。
【００４３】
ついで、潜在的なＳＡＲＭのアゴニストまたはアンタゴニスト活性はまた、ホルモン依存性の腫瘍細胞株での増殖の抑制についてスクリーニングすることによりホルモン依存性の腫瘍で確認することができる。潜在的なＳＡＲＭのスクリーニングに用いることのできるホルモン依存性の腫瘍細胞株の例としては、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ ＭＢ４５３、ヒト乳癌細胞株ＺＲ−７５−１、マウス乳腺癌細胞株Ｓｈｉｏｎｏｇｉ、ラット前立腺癌細胞株Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＭＤＡ ＰＣａ２ａおよびＰＣａ２ｂ、ヒト前立腺細胞株ＬＮＣａｐ、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＣＷＲ２２、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＬｕＣａｐ３５およびＬｕＣａｐ２３．１２、ヒト前立腺細胞株ＬＡＰＣ−４およびＬＡＰＣ−９、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＰＣ−２９５、ヒト前立腺腫瘍細胞株ＰＣ−３１０、およびヒト骨肉種細胞株ＭＧ−６３が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００４４】
これらの実験用のヒトおよびマウス前立腺および乳腺細胞株は、前立腺癌などのようなヒトホルモン依存性の腫瘍の薬理学を示すものとして当業者によく受け入れられているものである。そのようなモデルとヒト疾患状態との関係の例は、以下に示す文献およびそれに含まれる文献（これらに限られるものではない）に見出すことができる：Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０， ４１６−４２１ （１９９９）、Ｙｅａｐら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０， ３２８２−３２９１ （１９９９）、Ｓｈａｒｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８， ５３４９−５３５５ （１９９９）、Ｉｓａａｃｓ， Ｊ． Ｔ． Ｕｒｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ２， １１５−１１６ （１９９６）、Ｂｅｎｔｅｉら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３５， ６５５−６６２ （１９９９）、Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７， ５５９−５６７ （１９９０）、Ｐｅｅｈｌ， Ｄ． Ｍ． Ｕｒｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ２， １００−１０２ （１９９６）、Ｗｙｔｓｋｅら、Ｕｒｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ２， １２２−１２５ （１９９６）、ＬｅＬａｎｄ， Ｃ． Ｗ． Ｋ． Ｕｒｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． ２， １２６−１２８ （１９９６）、Ｂｕｈｌｅｒら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４３， ６３−７０ （２０００）、Ｎａｖｏｎｅら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６， １１９０−１１９７ （２０００）、Ｅｔｒｅｂｙら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４２， ９９−１０６ （２０００）、Ｊｏｎｇｓｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０， ７４１−７４８ （２０００）、Ｊｏｎｇｓｍａら、Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５４， ５４３−５５１ （１９９９）、Ｙｅら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５， ２１７１−２１７７ （１９９９）、Ｎａｖｏｎｅら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３， ２４９３−２５００ （１９９７）、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３， ４０２−４０８ （１９９７）、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ２７７７−２７８３ （１９９８）、およびＣｒａｆｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９， ５０３０−５０３６ （１９９９）。
【００４５】
本発明のアッセイにより同定される好ましいＳＡＲＭは、腫瘍においてはアンタゴニスト活性を示し、一方、アンドロゲンレセプターを含む他の非悪性組織ではアゴニスト活性を示すものである。これらアッセイに従って筋肉組織におけるアンドロゲンレセプターのアゴニストとして同定されるＳＡＲＭは、癌やＡＩＤＳを患う患者でしばしば観察される筋肉のるいそうおよび悪液質を抑制するのに有用である。
【００４６】
本発明をさらに説明するため、以下に実施例を記載するが本発明はこれらに限られるものではない。
実施例
実施例１：プラスミドの構築
アンドロゲンレセプタープラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ／ｒＡＲ
ラットアンドロゲンレセプター（ジーンバンク受け入れ番号：Ｍ２３２６４）をｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、パロアルト、カリフォルニア）のＮｏｔＩ部位にＮｏｔＩフラグメントとしてサブクローニングした。
ＡＲＥ／ルシフェラーゼリポータープラスミド
既知のアンドロゲンレセプター応答配列（ＡＲＥ）、Ｃ３．ＤＲ−１およびＰＢ−ＡＲＥを含む一連のルシフェラーゼリポーター構築物を、ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウイスコンシン）中に調製した。
【００４７】
ｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ
ＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に等モル量の相補的オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｆ）およびＤＲ−１（Ｒ）をアニールし、ついでライゲートした。オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｆ）は配列：
５’−ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号１）
を有している。オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｒ）は配列：
５’−ＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号２）
を有している。
【００４８】
ｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ
ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼプラスミド中に等モル量の相補的オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｆ）および１ＸＤＲ−１（Ｒ）をアニールし、ついでライゲートすることにより、ｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ中に存在するＤＲ−１配列の上流に第二のＤＲ−１応答配列を挿入した。オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｆ）は配列：
５’−ＣＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡ−３’（配列番号３）
を有している。オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｒ）は配列：
５’−ＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴ−３’（配列番号４）
を有している。
【００４９】
ｐＧＬ３／２ＸＣ３−１／ルシフェラーゼ
等モル量の相補的オリゴヌクレオチドＣ３−１（Ｆ）およびＣ３−１（Ｒ）をアニールし、ついで互いにライゲートした。ついで、ゲル精製した二量体をＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中にライゲートした。オリゴヌクレオチドＣ３−１（Ｆ）は配列：
５’−ＴＣＧＡＧＴＡＣＡＴＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＡＡ−３’（配列番号５）
を有している。オリゴヌクレオチドＣ３−１（Ｒ）は配列：
５’−ＴＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号６）
を有している。
【００５０】
ｐＧＬ３／２ＸＰＢ−ＡＲＥ／ルシフェラーゼ
等モル量の相補的オリゴヌクレオチドＰＢ−ＡＲＥ−２ＦおよびＰＢ−ＡＲＥ−２Ｒをアニールし、ついで互いにライゲートした。ついで、ゲル精製した二量体をＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中にライゲートした。オリゴヌクレオチドＰＢ−ＡＲＥ−２Ｆは配列：５’−ＴＣＧＡＧＴＡＡＴＡＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＣＧＧ−３’（配列番号７）
を有している。オリゴヌクレオチドＰＢ−ＡＲＥ−２Ｒは配列：
５’−ＴＣＧＡＣＣＧＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号８）
を有している。
【００５１】
ｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋ
このベクターは、ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中のＳＶ４０プロモーターをｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのＨＳＶｔｋ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターで置換することにより調製した。両プロモーターはＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント中に含まれるので、ｐＲＬ−ＴＫからのＨＳＶｔｋフラグメントをＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒベクター中にライゲートすることにより容易に交換できた。
【００５２】
ｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋ／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ、ｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋ／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼ、ｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋ／２ＸＣ３−１／ルシフェラーゼおよびｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋ／２ＸＰＢ−ＡＲＥ／ルシフェラーゼ
ＳＶ４０プロモーターの代わりにＨＳＶｔｋプロモーターを含むこれら構築物は、各親プラスミド中のＳＶ４０プロモーターをｐＧＬ３／ＨＳＶｔｋについて記載したようにｐＲＬ−ＴＫからのＨＳＶｔｋプロモーターで置換することにより調製した。
【００５３】
実施例２：エンハンサー／リポーター構築物の選択
リポーターとしてルシフェラーゼを有する２セットのベクターを構築し、Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞株で試験した。ルシフェラーゼリポーター構築物の第一の変異体は、強力なプロモーター、この特定の実施例ではＳＶ４０プロモーターを有していた。ルシフェラーゼリポーター構築物の第二の変異体は、基本的なプロモーター、この特定の実施例ではＨＳＶｔｋプロモーターを有していた。ルシフェラーゼ遺伝子発現を駆動する最も有効なアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を選択するため、ＳＶ４０プロモーターおよびＨＳＶｔｋプロモーターの両者を４つの異なるＡＲＥ、すなわちＣ３、ＤＲ−１（１Ｘおよび２Ｘ）およびＰＢ−ＡＲＥと結合させた。Ｃ３エンハンサーは、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と交叉活性を有する強力なアンドロゲン依存性の制御配列である。ＤＲ−１およびＰＢ−ＡＲＥはともにアンドロゲン応答配列に特異的であると思われる。
【００５４】
リポフェクタミンプラスＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造業社の教示に従ってＣ２Ｃ１２細胞にＣＭＶｒＡＲを上記エンハンサー／プロモーター／リポーター構築物（エンハンサー／プロモーター／リポーターに対してレセプターを１０：１）とともにコトランスフェクションし、各エンハンサー／プロモーター／リポーター構築物の活性を比較する一過性のトランス活性化試験を行った。詳細には、１０，０００細胞／ウエルを増殖培地（１０％ＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウムおよび０．５×アンチバイオティック−アンチマイコティックを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（すべてＧｉｂｃｏ ＢＲＬから））中にプレーティングした。翌日、培地を除去し、ｏｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で置換した。
【００５５】
１０μｌを各ウエルに添加して０．０５μｇ／ウエルのレセプター、０．００５μｇ／ウエルのエンハンサー／プロモーター／リポーター構築物および０．３８５μｌ／ウエルのリポフェクタミンとなるようにトランスフェクション混合物を調製した。３時間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物を除去し、炭末／デキストランＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ）を用いて調製した増殖培地で置換した。使用した検出法はＳｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、カウンティングはＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、ダウナーズ・グローブ、イリノイ）で行った。
【００５６】
結果は、Ｃ３、ＤＲ−１、およびＰＢ−ＡＲＥ／ＳＶ４０ルシフェラーゼリポーター構築物に比べてＣ３、ＤＲ−１、およびＰＢ−ＡＲＥ／ＨＳＶｔｋルシフェラーゼリポーター構築物が低いバックグラウンドシグナルを有することを示した。１μＭのテストステロンを加えると、バックグラウンドに対してＣ３／ＨＳＶｔｋ／ルシフェラーゼでは３．５倍の増大、２ＸＰＢ−ＡＲＥ／ＨＳＶｔｋ／ルシフェラーゼ、１ＸＤＲ−１／ＨＳＶｔｋ／ルシフェラーゼおよび２ＸＤＲ−１／ＨＳＶｔｋ／ルシフェラーゼではそれぞれ２．０倍、２．０倍および６．５倍の増大が得られた。刺激の最大倍数ウインドウを有する構築物、Ｃ３およびＤＲ−１／ＨＳＶｔｋ／ルシフェラーゼはともに、用量応答実験で試験したときにデキサメタゾンに対してテストステロンの最小１００倍の選択性を示した。それゆえ、刺激の倍数ウインドウおよび選択性の観点から２ＸＤＲ−１構築物を選択した。一過性にトランスフェクションしたレセプター系においてＨＳＶｔｋプロモーターはより低いバックグラウンドのために好ましく思われたが、ステーブル１細胞株で試験したときにシグナルは極めて弱かった。それゆえ、ステーブル２細胞株の製造に使用した構築物は、より強力なＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼであった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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