(57)【要約】ＰＤＥ４阻害のための代替的な治療法を開示する。ＰＤＥ４の転位体は、細胞における天然の位置からＰＤＥ４を除き、それにより、この位置でｃＡＭＰ濃度を増す。ＰＤＥ４を転位し、それによりホスホジエステラーゼ阻害剤のうち、触媒の十分保存されている部位に直接作用しないことによって、化合物は、例えばＰＤＥ４の結合ドメインで作用し、それによりＰＤＥ４のイソ型−特異的「阻害剤」を生じる。ＰＤＥ４の転位は、ＧＦＰへの融合を用いて視覚化される。天然の位置は、ロリプラムでの処理で誘導される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−　化合物が、ロリプラム−様基準化合物によって任意に誘導されるＰＤＥ４−スポットを除去するかどうかを試験し、かつ
−　化合物が、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がＰＤＥ４−スポットを除き、化合物がＰＤＥ４の触媒活性を阻害しない場合には、化合物がＰＤＥ４の転位体である、
化合物がＰＤＥ４の転位体であるかどうかを決定する方法。
【請求項２】
ロリプラム−様基準化合物が、ロリプラムである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３】
ＰＤＥ４が、ＰＤＥ４Ａイソ型である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＰＤＥ４が、ＰＤＥ４Ａ１イソ型である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＤＥ４が、ＰＤＥ４Ａ４イソ型である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
−　化合物がＰＤＥ４Ａ１−スポットを除くかどうかを試験し、かつ−　化合物が、ＰＤＥ４Ａ１の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がＰＤＥ４Ａ１−スポットを除き、化合物がＰＤＥ４Ａ１の触媒活性を阻害しない場合には、化合物がＰＤＥ４Ａ１の転位体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
−　化合物が、ロリプラム−様基準化合物によって誘導されるＰＤＥ４Ａ４−スポットを除くかどうかを試験し、かつ
−　 化合物が、ＰＤＥ４Ａ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がＰＤＥ４Ａ４−スポットを除き、化合物がＰＤＥ４Ａ４の触媒活性を阻害しない場合には、化合物がＰＤＥ４Ａ４の転位体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記の請求項のいずれかに記載の方法によって得られるＰＤＥ４転位体。
【請求項９】
ＰＤＥ４の転位体である化合物からなる医薬組成物であって、販売が承認されており、その承認が、ロリプラム−様基準化合物、化合物によって任意に誘導されるＰＤＥ４−スポットの除去及び化合物によるＰＤＥ４の触媒活性阻害の欠失を示すデータからなる承認用の申請に基づく、医薬組成物。
【請求項１０】
ＰＤＥ４が、ＰＤＥ４Ａイソ型である前記請求項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＰＤＥ４がＰＤＥ４Ａ１イソ型で、販売の承認での適応症が中枢神経系の疾患である前記請求項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
適応症がうつ病である前記請求項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＰＤＥ４がＰＤＥ４Ａ４イソ型で、販売の承認での適応症が炎症性疾患である前記請求項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
適応症が、関節炎症、クローン疾患、炎症性腸疾患、呼吸系疾患、喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺気腫、内毒素性ショック、毒性ショック症候群、全身性エリテマトーデス、乾癬、骨吸収疾患、再潅流障害、癌及びＨＩＶ感染からなる群から選択される前記請求項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
−　化合物が、ロリプラム−様基準化合物によって誘導されるＰＤＥ４Ａ４−スポットを分解させるかどうかを試験し、
−　 化合物が、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞で、ＰＤＥ４Ａ１−スポットの再現を誘導するかどうかを試験し、かつ
−　 化合物が、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がロリプラム−様基準化合物で誘導されるスポットを除き、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞でＰＤＥ４Ａ１−スポットの再現を誘導し、化合物がＰＤＥ４の触媒活性を阻害する場合には、化合物が低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤である、化合物が低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤であるかどうかを決定するための方法。
【請求項１６】
低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤である化合物からなる医薬組成物であって、販売が承認されており、その承認が、ロリプラム−様基準化合物によって誘導されるスポットを化合物が除き、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞でのＰＤＥ４Ａ１スポットの再現を化合物が誘導し、かつＰＤＥ４の触媒活性を化合物が阻害することを示すデータからなる承認用の申請に基づく、医薬組成物。
【請求項１７】
販売の承認の適応症が、炎症性疾患である前記請求項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
適応症が、関節炎症、クローン疾患、炎症性腸疾患、呼吸系疾患、喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺気腫、内毒素性ショック、毒性ショック症候群、全身性エリテマトーデス、乾癬、骨吸収疾患、再潅流障害、癌及びＨＩＶ感染からなる群から選択される前記請求項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
（ａ）　ＰＤＥの細胞内分布を記録し；
（ｂ）　ロリプラム−様基準化合物を、（ａ）の細胞もしくは同様の細胞に加え；
（ｃ）　工程（ｂ）の細胞におけるＰＤＥの細胞内分布を記録し；
（ｄ）　工程（ｃ）で記録された細胞内分布と工程（ａ）で記録した細胞内分布を比較することによって、ロリプラム−様基準化合物のＰＤＥの細胞内分布に対する作用を測定する
工程からなる、生細胞でホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の細胞内分布の変化をモニターする方法。
【請求項２０】
工程（ａ）の前に、さらに
（０１）　ＰＤＥの位置を記録できるプローブを構築し；
（０２）　工程（ａ１）の構築プローブで細胞をトランスフェクトする
工程からなる、前記請求項に記載の方法。
【請求項２１】
プローブが、ＰＤＥの位置が連続的に記録できるように構築される、前記請求項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）の後に、さらに
（ｂ１）　工程（ｂ）での化合物処理した細胞又は類似細胞に試薬を加え；
（ｂ２）　工程（ｂ１）の細胞においてＰＤＥの細胞内分布を記録する；
工程を含み、及び
工程（ｄ）の後に、
（ｄ１）　工程（ａ）で記録される細胞内分布と、工程（ｂ２）で記録される細胞内分布を比較して、試薬の作用を測定し；
（ｄ２）　工程（ｄ１）で測定した作用を工程（ｄ）で測定した作用を比較して、試薬の薬理を確立する
工程含む前記請求項のいずれかに記載の方法からなり、
工程（ｄ１）において工程（ａ）で測定される作用と実質的に同一な作用に対し、工程（ｄ）で測定される作用が反対であることが、細胞内分布の変化に関してＰＤＥの触媒部位に親和性を有する化合物に対する試薬のアンタゴニスト作用を示す、
ＰＤＥの細胞内分布に干渉し得る、試薬の同定方法。
【請求項２３】
さらに、
（ｅ） ＰＤＥの触媒活性を測定し得るアッセイで、ＰＤＥの触媒活性に対する試薬の作用を測定する工程
からなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）の後に、さらに
（ｂ１）　工程（ａ）での細胞の類似細胞に試薬を加え；
（ｂ２）　工程（ｂ１）の細胞においてＰＤＥの細胞内分布を記録する；
工程を含み、及び
工程（ｄ）の後に、
（ｄ１）　工程（ａ）で記録される細胞内分布と、工程（ｂ２）で記録される細胞内分布を比較して、試薬の作用を測定し；
（ｄ２）　工程（ｄ１）で測定した作用を工程（ｄ）で測定した作用を比較して、試薬の薬理を確立する工程
を含む前記請求項のいずれかに記載の方法であって、
工程（ｄ１）において工程（ａ）の作用に対して工程（ｄ）で測定される作用がコピーであることが、細胞内分布の変化に関してＰＤＥの触媒部位に親和性を有する化合物に対する試薬のアゴニスト作用を示す方法。
【請求項２５】
試薬が、ＰＤＥ４のドッキング部位に結合しない、前記の２個の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
試薬が、ＰＤＥ４の触媒部位に結合する、前記の３個の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
試薬が、ＰＤＥの触媒活性を阻害する前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
試薬が、ペプチド又はポリペプチドである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
試薬が、小分子である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
ＰＤＥが、ＰＤＥ４である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ロリプラム−様基準化合物が、ロリプラムである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
試薬の作用と化合物の作用との比較が、経時的な測定に基づく前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
試薬の作用と化合物の作用との比較が、終了点の測定に基づく前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記請求項のいずれかに記載の方法によって得られる試薬。
【請求項３５】
触媒部位に親和性を有する化合物がＰＤＥの細胞内分布に対する作用を模倣し得る試薬の薬物製造のための使用。
【請求項３６】
触媒部位に親和性を有する化合物がＰＤＥの細胞内分布に対する作用を後退し得る試薬の薬物製造のための使用。
【請求項３７】
化合物、又は医薬的に許容されるその塩、エステル、アミド又はプロドラッグの個々の有効量を個体に投与することからなり、化合物が、ＰＤＥの触媒部位に親和性を有する化合物の、ＰＤＥの細胞内分布に対する作用を後退でき、ＰＤＥの触媒部位に親和性を有する化合物の、ＰＤＥの触媒活性に対する作用を模倣できる、個体における喘息の治療方法。
【請求項３８】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項３９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４０】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４１】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−△ＬＲ２−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４２】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４３】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４４】
ＨＳＰＤＥ４Ｄ３−ＥＧＦＰの核酸構築物。
【請求項４５】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−Ｅ２２２Ｇの核酸構築物。
【請求項４６】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｅ２２２Ｇの核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背　景
サイクリック ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、偏在性の二次伝達物質である。それはアデニルシクラーゼの作用により生成し、多くのホルモン、ニューロントランスミッター及び他の細胞エフェクターの作用の変換に役立っている。ｃＡＭＰは、特異的な細胞内調節タンパク質への結合能により、細胞でその作用を発揮する。これらには、プロテインキナーゼＡ （ＰＫＡ）、サイクリックヌクレオチドゲートイオン（ｇａｔｅｄ ｉｏｎ）チャンネル（ＣＮＧ チャンネル）及びサイクリックＡＭＰ 刺激性ＧＴＰａｓｅ 交換因子（ｃＡＭＰ−ＧＥＦ、ＥＰＡＣ）がある。このようなエフェクターは、ｃＡＭＰが細胞型に特異的な形態で細胞の変遷を調節することを可能にする。こうして上昇したｃＡＭＰレベルは、例えばＣＮＳ機能（例えばうつ病）、心臓血管機能、炎症性細胞／免疫系、細胞癒着及び代謝過程に影響を及ぼすことができる。しかし、これらの作用は、特定の細胞型ばかりではなく、特定の細胞内部位でのｃＡＭＰの上昇に依存している （Ｈｏｕｓｌａｙ及びＭｉｌｌｉｇａｎ １９９７）。
【０００２】
ｃＡＭＰ を分解する唯一の方法は、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の作用を介する方法である （Ｃｏｎｔｉ及びＪｉｎ １９９９）。これらは、３’，５’ サイクリックアデノシンモノフォスフェート（ｃＡＭＰ）を５’−アデノシンモノフォスフェート（ＡＭＰ）に加水分解する。大きなマルチ−ジーンファミリーがＰＤＥをコードすることは、現在十分に認識されている。しかし、これらの酵素で唯一確かなことは、ｃＡＭＰを加水分解できることである。これらは、ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８及びＰＤＥ１１ファミリーのメンバーである。選択的な阻害剤が、これらのファミリー、例えばＰＤＥ３及びＰＤＥ４酵素に対して生成した。これらの阻害剤は、ｃＡＭＰ の加水分解の阻害を目的としたスクリーンで同定される、酵素触媒単位をターゲットにしている。つまり、このような阻害剤は競合的な阻害キネティクスを示す。例えば、ＰＤＥ３とＰＤＥ４ の選択的阻害剤は、明らかに別個の薬理反応を生ずることが分かっている。例えば、ＰＤＥ３ 阻害剤のミルリノン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）は筋変力作用陽性剤として働き、心臓の収縮力を増加させる。しかし、ＰＤＥ４阻害剤のロリプラムはこのように作用しない（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏら、１９９５）。これに対して、ＰＤＥ４ 阻害剤（ロリプラム、Ａｒｉｆｌｏ（登録商標））は炎症反応を伴う造血源の多くの細胞の作用を阻害し、抗うつ作用を発揮する（ロリプラム）。しかし、ＰＤＥ３阻害剤 （ミルリノン、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ））はこのように作用しない。ＰＤＥのイソ酵素は細胞型特異的な発現パターンを示すが、ＰＤＥ３ 及びＰＤＥ４の酵素は、心筋細胞及び炎症細胞を含む多くの型の細胞でしばしば見られる。つまり、ＰＤＥイソ酵素の選択的阻害剤が特定の細胞型で極めて異なる作用を発揮する能力は、その細胞型で、ある又は他のＰＤＥイソ酵素の発現を欠いているため、必要ではない。当然、幾つかの例では、ＰＤＥイソ酵素−選択的阻害剤について種々の作用が認められる細胞で、ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の酵素活性レベルが非常に異なるため、見かけの選択性が上昇する。しかし、多くの場合、このことは単純には該当しない。この見かけの相違を説明するため、区分されたｃＡＭＰシグナル化の概念が提起された。これは、細胞内ではｃＡＭＰ が一律に分布していないことを認識している。実際、このことを例証した直接的な証拠が存在する （Ｈｅｍｐｅｌら、１９９６）。
【０００３】
ｃＡＭＰは細胞内でｃＡＭＰ−ＰＤＥ によって分解されるに過ぎないので、それらの活性が弱まるとｃＡＭＰレベルと細胞反応の誘因が増すものと期待される。ＰＤＥ３及びＰＤＥ４の酵素は別々の細胞内部位に局在するので、それらはｃＡＭＰの「局在化した貯蔵（ｌｏｃａｌｉｓｄ ｐｏｏｌ）」を制御し、次いで、限定されたＰＫＡ−ＲＩＩ／ＥＰＡＣ／ＣＮＧチャンネルの活性を制御するものと期待される。伝統的な方法は、新規な治療剤を提供するため、活性部位−直接的な選択的ＰＤＥ阻害剤を開発することに主眼を置いている（Ｓｏｕｎｅｓｓ及びＲａｏ １９９７）。しかし、特異的なＰＤＥ４イソ型が正確な細胞内標的を示すとの理解（Ｈｏｕｓｌａｙら、１９９８）は、完全な状態の細胞でＰＤＥの機能を変え、ＰＤＥの機能に影響を及ぼす新規な群の治療剤を創出するといった急進的で新たな手段を提供している。 このことは、特異的なＰＤＥ４イソ酵素の細胞内標的化を撹乱させ、その結果、機能的に関連した細胞内区画から標的のイソ酵素を除去する能力を利用している。そのような再局在化は、特定の細胞下部位（「区画」）内で細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇し、近接するＰＫＡ／ＥＰＡＣ／ＣＮＧチャンネルの活性化をもたらすものと期待される。このことは、細胞内の機能的に関連した（アンカー） 部位から、標的となるＰＤＥ４イソ型に置換する酵素触媒単位に作用するよりむしろ、イソ型−特異的「阻害剤」を創出する可能性を提供している。これは、著しく希釈されるか、又は再標的となるサイトゾルへの酵素の放出を伴う。
【０００４】
ＰＤＥ４酵素ファミリーは、活性部位に直接的な阻害剤が抗−うつ作用と抗−炎症作用を有するファミリーである。ＰＤＥ４イソ型は、独特な細胞型特異的発現パターンを示す（Ｈｏｕｓｌａｙら、１９９８）。加えて、ＰＤＥ４イソ型酵素は、細胞内でも高度に特異的な細胞内分布パターンを示す。したがって、例えばＰＤＥ４Ａ１イソ型は、脳のある領域内でのみ発現すると考えられる（Ｈｏｕｓｌａｙら、１９９８）。実際、ＰＤＥ４Ａ１が様々な細胞型で発現すると、細胞内分布の独特なパターンが示され、標的化された結合を暗示している（Ｐｏｏｌｅｙら、１９９７）。
４つの異なる遺伝子によってエンコードされるＰＤＥ４酵素（Ｈｏｕｓｌａｙら、１９９８）は、特にｃＡＭＰを加水分解する。ＰＤＥ４イソ型の大きなファミリーは、別のプロモーター及び別のｍＲＮＡスプライシングを用いて生じる。
【０００５】
タンパク質の新規補充又は再局在化は、多くの基本的なシグナル化系で主要な役割を果たしている。これは、（ｉ）原形質膜への新規補充がこの酵素の活性化過程の本来部分であるプロテインキナーゼ Ｃ（ＰＫＣ）の活性；（ｉｉ） サイトゾルから膜区画への移動が主要な役割を果たす複合タンパク質に依存したｐ４２／４４ ＭＡＰキナーゼの活性化、及び（ｉｉｉ） その活性化に重要な、ｃＡＭＰ−駆動性のｒａｐ１の再局在化の点で明らかである。したがって、そのような知見は新たな治療剤の同定に新規かつ革新的な手段を提供すると考えられるので、完全な生細胞でＰＤＥ４酵素の位置及び再局在化を見出せることが求められている。
【０００６】
ＰＤＥ酵素の活性に干渉する化合物についての現在のスクリーニングアッセイは、ＰＤＥの触媒活性、つまり、３’５’サイクリックアデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）を５’−ＡＭＰに加水分解する酵素の能力を評価する様々な方法に基づいている。これは、近接（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）−ベース−ラジオヌクライド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）アッセイを用いたｃＡＭＰ加水分解の検出を使ったマルチウェルフォーマットで通常行われる。このようなスクリーンは、触媒活性を変える化合物を検出する。現在までのところ、これらは触媒部位に結合する化合物を競合阻害剤として同定している。つまり、これまでに報告されている化合物は全て、触媒部位に結合し、この結果、ｃＡＭＰ基質と結合を競合する。これらのスクリーンで用いた酵素は、しばしば、部分的に精製されてＰＤＥ４酵素以外のものを除いた内因性ＰＤＥ４酵素の細胞抽出物である。これらは、酵素が、未だに知られていないＰＤＥ種により汚染されている可能性があること、またＰＤＥ４イソ型の混合物を含むとの事実を欠点としている。別の方法は、種々の細胞系／システム、例えばｓｆ９細胞、エス．セレビジエ、イー．コリ及びトランスフェクトした哺乳動物細胞系で発現を行うスクリーンで組換え酵素を用いている。これにより、イソ型を特異的に分析することができる。しかし、ＰＤＥ４酵素の触媒単位は各ＰＤＥ４サブファミリー内のイソ型に同一であるので、イソ型選択的阻害剤をこのような分析で同定できるとするのはほとんど不可能である。加えて、触媒のサブ単位は、４遺伝子のＰＤＥ４ファミリー自体の酵素内で高度に保存されている。このことは、４つの各ファミリー間で高度に選択的な阻害剤を得ることは、極めて難しくはあるが、不可能ではないと考えられることを意味している。現在までのところ、報告されている最も高い選択性は、他の３つのＰＤＥ４ファミリーの酵素に対してＰＤＥ４Ｄファミリーに約８〜１０倍の選択性を示すＡｒｉｆｌｏ（登録商標）の選択性である（Ｂａｒｎｅｔｔｅら、１９９８）。そのため、イソ型−特異的な「阻害剤」として役立つ化合物を同定できるストラテジを開発することが必要である。したがって、（ｉ）生細胞でＰＤＥ４イソ型の標的化を破壊する剤を迅速にスクリーニングでき、かつ（ｉｉ）形態学的に別個の型のＰＤＥ４を生細胞で同定できる手法が求められている。これらの目的に達し得る手法は、新規な治療の開発につながると考えられる。加えて、その手法は、ＰＤＥ４酵素に対し形態学的に異なる作用を発揮する化合物を同定するための診断上の手助けをもたらし、この結果、有益な作用、例えば抗−炎症、抗−うつ性、つまり副作用（例えば吐き気、嘔吐、動脈炎）に対する作用についてスクリーンするための化合物の開発に有用であろう。
【０００７】
発明の要約
本願の実施例は、初めて、選択的ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラムが、多くの細胞での一般的なＰＤＥ４Ａ４の細胞質分布が、細胞質内の幾つかの別個のスポットに局在するＰＤＥ４Ａ４の濃縮物からなる分布に徐々に変化するよう、ＰＤＥ４Ａ４の物理学的特性と作用に影響を及ぼすことを開示している（実施例３）。タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで細胞を前処理すると、ロリプラムによって誘導されるスポットの形成が妨げられ、タンパク質合成は観察されたスポットの形成に必須の要素であることが分かる。いったんスポットが形成されると、ロリプラムの除去により迅速な分解が生じる。しかし、ロリプラムの置換は、スポットを迅速に再形成させる。このことは、ロリプラムの結合が分布変化を誘導することの最初の知見である。
【０００８】
加えて、実施例１５も初めて、ロリプラムはＰＤＥ４Ａ１の物理学的特性と作用に影響を及ぼすものの、一面では、この化合物はＰＤＥ４Ａ４には作用し難いことを開示している。ＰＤＥ４Ａ１は、それ以外は処理していない細胞では小さな核周囲スポットとして蓄積し、ロリプラムで処理すると、これらのスポットを細胞質に分布させる。その後、ロリプラムを除去すると、核周囲のスポットが迅速に再現される。
【０００９】
ロリプラムは、ＰＤＥ４Ａ４とＰＤＥ４Ａ１の両者に基づくプローブの分布に変化を引き起こす。トレキニジン（ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）、エタゾレート（ｅｔａｚｏｌａｔｅ）、ミルリノン、ザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）、カフェイン、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）及びシロスタミドのようなサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼの非ＰＤＥ４−特異的阻害剤は、生理学的に非常に高い濃度でもＰＤＥ４Ａプローブの再分布を生じない。しかし、ＰＤＥ４−特異的阻害剤のデンブフィリン（Ｄｅｎｂｕｆｙｌｌｉｎｅ ）（ＢＲＬ３０８９２）、ＲＳ２５３４４及びＲｏ ２０−１７２４は、ロリプラムでの処理で誘導される変化と区別できない、これらのプローブの分布変化を生じる（実施例５、６、１５及び１６）。極めて効力が強く、特異的なＰＤＥ４阻害剤でもあるピクラミラスト（Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ） （ＲＰ７３４０１）は、ＰＤＥ４Ａプローブの再分布を誘導しない。しかし、ＲＰ７３４０１は、通常ロリプラムの存在で引き起こされる再分布を妨げる（実施例９及び１７）。したがって、ＰＤＥ阻害剤のうち、ＰＤＥ４Ａプローブの細胞内再分布を引き起こすのはある群のみで、これらは全てＰＤＥ４酵素の特異的阻害剤（例えばロリプラム）である；他のあるＰＤＥ阻害剤は、ＰＤＥ４Ａの細胞内再分布を生じることはできないが、再分布を引き起こす化合物の作用と競合し、これを後退させ、又は妨げることは可能で、これらもＰＤＥ４−特異的阻害剤である（非ＰＤＥ４−特異的阻害剤は、例えばロリプラムで引き起こされるＰＤＥ４Ａの細胞内再分布を後退させたり、阻害することはできない）。ＰＤＥ４−特異的阻害剤のある群によるＰＤＥ４Ａプローブの再分布誘導は、ＰＤＥ４Ａタンパク質の異なる領域間の逆の相互作用という概念の新規で発明的な知見である；再分布の刺激は、ロリプラムが結合するＰＤＥ４Ａの触媒溝で生じ、細胞内のある位置に酵素を固定する幾つかの他のドメインで重要なスイッチ様変化をもたらす。この知見により、再分布の誘導を妨げる化合物（アンタゴニスト）からの、ＰＤＥ４Ａの細胞内再分布を誘導する化合物（アゴニスト）のスクリーン、及びこの誘導性再分布に拮抗できる化合物のスクリーンが直接、提供される。
【００１０】
発明の詳細な開示
この供述書で、特異的なＰＤＥ４イソ酵素／イソ型の細胞内標的化を混乱させ、細胞内再分布に変化をもたらすか、これを規定するＰＤＥ４イソ型の特異的な形態状態を検出するか、又はそれを生じる化合物をスクリーンする新たな方法を提案する。
【００１１】
要約すれば、ロリプラムとその他のあるＰＤＥ４阻害剤は、少なくとも２つのＰＤＥ４イソ型の再分布に影響を及ぼす。これらのＰＤＥ４イソ型の再分布にロリプラムと同一の作用を有する化合物も、その他の特性を共有している：
１）　それらは、ＰＤＥ４に対して２．４ μＭ のＩＣ５０を有するＲｏ ２０−１７２４ （Ｓｏｕｎｅｓｓ及びＲａｏ，１９９７）からＩＣ５０が０．２８ ｎＭ のＲＳ２５３４４ （Ｓａｌｄｏｕら， １９９８）まで、親和性の範囲が極めて広範囲であるが、全てＰＤＥ４阻害剤である。これらの化合物は、他のＰＤＥを弱く阻害するか又は全く阻害しないので、ＰＤＥ４に特異的であるとされている。他のｃＡＭＰ−分解ＰＤＥ、例えばＰＤＥ３の阻害に対する、ＰＤＥ４に対する化合物のＩＣ５０の逆比は、しばしば特異性の基準として用いられる。例えば（ＩＣ５０ ＰＤＥ３）／（ＩＣ５０ ＰＤＥ４）の値はロリプラムでは２，２００より大きく、ＲＳ２５３４４では１，１７０，０００であるがトレキニジンでは０．０００４１であり、ロリプラムとＲＳ２５３４４はＰＤＥ４に高度に特異的であるのに対し、トレキニジンはＰＤＥ３酵素の特異的阻害剤であることが明らかにされた。
【００１２】
２）　それらは全て、脳から得られるミクロソーム小胞を用いて通常アッセイされる高親和性ロリプラム結合部位（ＨＡＲＢＳ）として一般に示されるものから、トリチウム化ロリプラムを置換できることが知られている（Ｓｏｕｎｅｓｓ及びＲａｏ （１９９７）参照）。この部位に親和性を有する化合物が、動物である種の薬理学的作用と生理学的作用を伴い、その中には、有用なものもあるが、厄介で、望ましくない副作用、例えば頭痛、吐き気及び嘔吐として特徴付けられるものもあることは、広く認められている。
【００１３】
３）　ＰＤＥ４Ａプローブの再分布を変える化合物は全て、ＰＤＥ４の「ｃＡＭＰ結合部位」に対する親和性がＨＡＲＢに対する親和性よりも比較的低く、そのため、（ＩＣ５０ ＰＤＥ４）／（ＨＡＲＢＳについてのＫｉ）の割合は、ロリプラム様化合物に高く、ＰＤＥ４再分布を変化させない化合物に対しては低いスコアとなる（表１参照）。
【００１４】
【表１】
2004500835.tif 000002
【００１５】
表２に示すように、本発明のアッセイは、ロリプラムが、嘔吐を誘発せずに、抗うつ特性及び／又は抗−炎症特性を共有していることを特に同定している。
【００１６】
【表２】
2004500835.tif 000003
【００１７】
本発明のひとつの態様は、この観察に至ることができた用途の数と種類である。そのような使用例は以下のとおりである：
１）　ロリプラム様特性についての、潜在的な又は新たに発見されたＰＤＥ４阻害剤のスクリーニング。そのようなスクリーンは、嘔吐、吐き気、頭痛及び胃酸過多のような望ましくない副作用を引き起こす化合物の検出に、カウンタースクリーン（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）として最も有用である可能性がある。
２） ロリプラムによって生じるＰＤＥ４の分布変化を後退又は妨害することができる、潜在的な又は新たに発見されたＰＤＥ４阻害剤のスクリーニング。そのような化合物は、有用なＰＤＥ４阻害剤のはずであるが、嘔吐、吐き気、頭痛及び胃酸過多のようなロリプラム様−特性を欠く。
３）　明確かつ新規な作用様式を有するＰＤＥ４細胞活性の潜在的な阻害剤、細胞内の通常の部位から特異的なＰＤＥ４イソ型を転位させ、それによりその有効性を調節して細胞シグナル化で機能することにより作用する阻害剤のスクリーニング。
【００１８】
上記の使用は、ＰＤＥ４の遺伝子ファミリーＢ、Ｃ及びＤにも適用できる。１と２の使用は、例えばＰＤＥ４Ａの構造に触媒ドメインを交換することによって適用できる。そのようなハイブリッドプローブは、細胞での発現時に、ロリプラム及び（上記の例のＰＤＥ４Ｂの）代用触媒部位の特性を反映した親和性を有する他のＰＤＥ４−特異的阻害剤を結合するが、選択されたＰＤＥ４Ａの再分布作用を示す。再分布作用の測定は、導入された触媒部位に特異的な結合特性を反映している。
１と２の使用は、ＰＤＥ４Ａと選択されたＰＤＥ型の触媒ドメインとのハイブリッドプローブを記載されたように構築することによって、ＰＤＥファミリー及びＰＤＥ４酵素の群に属さないそのサブファミリーにむしろ一般に適用することができる。しかし、これらのハイブリッド混合群と共に、触媒ドメインをハイブリッドプローブに付与する特定のＰＤＥ群の特異的阻害剤であることが知られているものから、ＰＤＥ４についてはロリプラムであり得るロリプラム−様基準化合物が選択されるであろう。
【００１９】
したがって、この発明のひとつの観点は、
（ａ）　ＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｂ）　ＰＤＥ４の触媒溝、又は酵素もしくは関連タンパク質の幾つかの他の部分に結合し、それにより、ＰＤＥ４プローブの再分布を誘導するロリプラム−様基準化合物を（ａ）の細胞もしくは類似の細胞に加え；
（ｃ）　工程（ｂ）の細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｄ）　工程（ｃ）で記録された細胞内分布と工程（ａ）で記録した細胞内分布を比較することによって、ロリプラム−様基準化合物のＰＤＥ４の細胞内分布に対する作用を測定する
工程からなる、生細胞でサブタイプ４のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）の細胞内分布の変化をモニターする方法に関している。
【００２０】
発明の別の観点において、複数の細胞タイプを含むことによって、特異的なＰＤＥ４イソ型及び／又はその変異体を組織特異的に特徴づけることができる。
この発明において、群４のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）は、ＩＣ５０が５μＭ未満のロリプラムによって阻害される酵素として理解されるべきである；この特異的な方法で反応し得る酵素は、ＰＤＥ４、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ及びＰＤＥ４Ｄと称される遺伝子の全タンパク質産物（遺伝子から得られる全てのスプライス変異体を含む）のリストから選択される。この出願をとおして、ＰＤＥ４は、この群から選択される。
【００２１】
この発明では、細胞内分布は、細胞体積内における遺伝子産物の分布として理解されるべきである。より具体的には、それが如何に配置するかは、他の同定可能な細胞の特徴もしくは区画、又は細胞小器官、例えば原形質膜、ゴルジ膜、エンドソーム小胞、核、小胞体、ミトコンドリアなどに関連している。それ自体、細胞内分布は、そのような特徴、又は少なくともそれらの特徴と何らかの方法でそれ自体が関連している成分と直接的に関連している可能性を示す。特徴的な非−均一性の分布は、静止状態の固着又は束縛によって維持されるのみならず、結合と解離の速度が結合状態に有利な動的相互変換によって維持され得ることに留意すべきである。この明細書で、位置、場所、局在化及び分布は、相互に使用できる。
この発明では、細胞及び／又は細胞類は、実験のあいだ機械的に無傷で生きている。この発明の別の具体例では、細胞又は細胞類を、反応が著しいことが予定される影響を及ぼした後の一定時間で固定し、任意の経過時間後に記録する。
【００２２】
機械的に無傷な生細胞又は細胞類は、菌類細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞；及び哺乳動物細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択することができる。これらの細胞を、３０℃又はそれ以上の温度、好ましくは３２〜３９℃、より好ましくは３５〜３８℃、もっとも好ましくは約３７℃の温度で、影響が認められる時間のあいだインキュベートする。この発明のひとつの観点で、機械的に無傷な生細胞は、同一又は非同一の細胞のマトリクスの一部である。
この発明で用いられる細胞は、ここに定義されるような融合ポリペプチドをエンコードし、エンコードする配列を発現し得る核酸構築物を含んでもよい。細胞は、菌類細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞；哺乳動物細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される真核細胞である。好ましい細胞は、哺乳動物細胞である。
【００２３】
用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源の生細胞を示すことを意図する。細胞は確立された細胞系であってもよく、その多くは、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡ）又はトランスジェニック動物から得られる組織を含む哺乳動物組織から得られる寿命の限られた始原細胞、又はトランスジェニック組織を含む哺乳動物組織から得られる新たに確立された不死細胞系、又は哺乳動物起源の種々の細胞タイプを融合して得られるハイブリッド細胞もしくは細胞系、例えばハイブリドーマ細胞系から入手できる。細胞は、蛍光プローブの添加前又は添加で、１以上の非天然遺伝子産物、例えばレセプター、酵素、酵素基質を任意に発現してもよい。好ましい細胞系には、繊維芽細胞起源の細胞系、例えばＢＨＫ、ＣＨＯ、ＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３、又は内皮起源細胞系、例えばＨＵＶＥＣ、ＢＡＥ（ウシ動脈内皮）、ＣＰＡＥ （ウシ肺動脈内皮）、ＨＬＭＶＥＣ （ヒト肺微小管内皮細胞）、又は気道上皮起源の細胞系、例えばＢＥＡＳ−２Ｂ、又は膵臓起源の細胞系、例えばＲＩＮ、ＩＮＳ−１、ＭＩＮ６、ｂＴＣ３、ａＴＣ６、ｂＴＣ６、ＨＩＴ、又は造血起源の細胞系、例えば一次単離ヒト単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球及びリンパ球の群、ＡＭＬ−１４、ＡＭＬ−１９３、ＨＬ−６０、ＲＢＬ−１、Ｕ９３７、ＲＡＷ、ＪＡＷＳ、又は脂肪細胞起源の細胞系、例えば３Ｔ３−Ｌ１、ヒト前脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、又は神経性内分泌起源の細胞系、例えばＡｔＴ２０、ＰＣ１２、ＧＨ３、筋肉起源の細胞系、例えばＳＫＭＣ、Ａ１０、Ｃ２Ｃ１２、腎臓起源の細胞系、例えばＨＥＫ ２９３、ＬＬＣ−ＰＫ１、又は神経起源の細胞系、例えばＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＨＣＮ−１Ａ、ＮＴ２／Ｄ１が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明の実施例は、ＣＨＯ細胞に基づいている。それゆえ、ＢＡＬＢ、ＮＩＨ−３Ｔ３及びＢＨＫ細胞のような繊維芽細胞由来細胞系が好ましい。
本発明の別の観点で、細胞は、ここに定義されるような融合ポリペプチドをエンコードする核酸配列をその構成細胞の少なくとも１つに有し、該核酸配列を発現し得る生物に由来する細胞であってもよい。生物は、単細胞生物及び多細胞生物、例えば哺乳動物からなる群から選択される。
【００２５】
細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布は、当業者に公知の非常に多くの方法で記録することができる。ひとつの例は、本質的にＳｈａｋｕｒら（１９９５）によって記載されているようにして抗体を生じ；本質的にＰｏｏｌｅｙら（１９９７）によって記載されているようにして細胞を処理し、染色するＰＤＥ４の抗体染色である。抗血清を得るには、特異的なＰＤＥ４イソ型の分布を同定し、記録できるように、イソ型−特異的なエピトープを使用することが望ましい。ＰＤＥ４の４ファミリーは、各ファミリーにユニークなＣ−末端タンパク質配列の全て又は一部をコピーするペプチドに対して生じる抗血清を用いて個々に認識することができる。個々のＰＤＥ４イソ型は、これらの酵素のユニークなＮ−末端部分に対して同じようにして得た抗血清により認識してもよい。
【００２６】
細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録する好ましい方法は、最初の記録の前に、ＰＤＥ４の位置を記録できるプローブを構築し、次いで構築したプローブで細胞をトランスフェクトすることによる方法である。
この出願をとおして、プローブは、ＰＤＥ４又はその一部からなる、同定可能なタンパク質を遺伝的にエンコードするヌクレオチド配列として理解しなければならない。
【００２７】
ＰＤＥ４の位置を記録できるようなプローブタンパク質は、幾つかの方法で同定することができる。例は、
−　工学的に作成した抗原性タグ、例えば外来性で、そのために哺乳動物細胞内のユニーク抗原であり、生産されるそれぞれの新たなプローブに対する抗体を開発する必要がないように、大量生産された抗体を入手可能とする、「ｆｌａｇ」又は「ｍｙｃ」のタグをプローブに組み込んだ、免疫検出、
−　発行団を捕捉又はキレート化できるか、又はルシフェリンを分解でき、それにより光を生じ、又は着色生成物に基質を変え、それによりその自身の細胞分布を直接現すタンパク質配列を含むようにプローブを工学的に作成する、直接検出である。
【００２８】
ＰＤＥ４の局在化を記録する好ましい方法は、プローブが発光団とＰＤＥ４との融合物で、発光団が蛍光団ＧＦＰのような蛍光タンパク質をエンコードしている蛍光検出によるものである。蛍光検出法を使うことで、ＧＦＰの分布を連続的に視覚化することができる。
【００２９】
この明細書では、「緑蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）の用語は、細胞により発現する際に、（例えばＣｈａｌｆｉｅ，Ｍ．ら、（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３， ８０２−８０５によって記載されるような）正確な励起波長光への暴露によって蛍光を発するタンパク質を意味すること意図する。１以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されているこのような蛍光タンパク質も、「ＧＦＰ」と呼ぶことにする。ここで使用されるような「ＧＦＰ」には、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ又は腔腸動物類の他の膜から得られる野生型ＧＦＰ、例えばＤｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．の赤色蛍光タンパク質（Ｍａｔｚ， Ｍ．Ｖ．ら． １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ９６９−９７３）、又は他の動物、菌類もしくは植物由来の蛍光タンパク質、及びＨｅｉｍら（Ｈｅｉｍ， Ｒ．ら、１９９４， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１：２６， ｐｐ １２５０１− １２５０４）によって明らかにされたＧＦＰの青色蛍光変異体のようなＧＦＰ修飾型、及びＧＦＰ蛍光のスペクトル特性を変える他の修飾型、あるいは１９９７年３月２７日にＷＯ ９７／１１０９４として公開され、ここに引用により導入されたＰＣＴ／ＤＫ９６／０００５１に記載の約３０℃より高温で細胞内に発現される際に増加した蛍光を示す修飾型が含まれ、それは、Ａｅｑｕｏｒｅａの緑蛍光タンパク質から得られる蛍光タンパク質又はその機能類似体からなり、発光団から１つ上流位置にあるアミノ酸が突然変異され、この発明の蛍光タンパク質を細胞で発現する際に蛍光強度を増す。好ましいＧＦＰ変異型は、Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰである。この発明の全ての観点での使用に特に好ましいＧＦＰ変異型は、ＥＧＦＰである（哺乳動物細胞での発現に最適化されたコドンを有するＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ 変異型である、ＥＧＦＰをエンコードするＤＮＡは、ＥＧＦＰ ＤＮＡ配列を含むＣｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏのプラスミドから入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５７６２、 Ｕ５５７６３参照））。別の特に好ましいＧＦＰ変異型は、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰである。
【００３０】
蛍光法によるＰＤＥ４の局在化を記録する別の方法は、標準的な化学的手段を使って、蛍光団、例えばフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹもしくはＣｙダイ、又はローダミンで精製ＰＤＥ４タンパク質をラベルする。ラベリングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ． （Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）により供給されている反応型のこれらのダイを用いて、これらの試薬の製造者が推奨する条件と方法でタンパク質を反応させて行われる。化学的なラベリングと適当な精製の後、当該分野に公知の標準的技術によりプローブを細胞にマイクロインジェクションすることができ、細胞内でのその作用を蛍光技術により観察した。
【００３１】
プローブの同定、つまりその細胞分布は、生細胞で追跡することが望ましいが、必ずしも必要ではない。これにより、分布における過渡的な変化の進行を記録することができる。したがって、この発明の好ましい観点は、試薬の作用と化合物の作用との比較が経時的な測定に基づく、記載したような方法である。
アッセイを開始すると、そのようなアッセイのひとつの観点は、作用が（経時的に）認められる時を正確に知ることである。次に、スクリーニングを最適化するため、まだデータ出力を最小限にするため、この発明は、試薬の作用と化合物の作用との比較が終了点の測定に基づく、記載したような方法に関している。
【００３２】
概して、プローブ、つまり「ＧｅｎｅＸ」−ＧＦＰ融合体又はＧＦＰ−「ＧｅｎｅＸ」融合体は、「ＧｅｎｅＸ」−特異的プライマーで ＰＣＲを用い、次いでクローニング工程により、ＧＦＰのフレームに「ＧｅｎｅＸ」を融合させて構築する。融合体は、「ＧｅｎｅＸ」とＧＦＰとの配列由来のショートベクター（例えばプラスミド中のマルチクローニングサイト領域の一部）を含み、得られた融合タンパク質中で「ＧｅｎｅＸ」とＧＦＰとの間にペプチドリンカーを生じてもよい。
プローブの開発に関わる幾つかの工程には、以下が含まれる：
遺伝子配列の同定。　これは、広範囲に利用可能で、分子生物学者により日常的に使用される遺伝情報受託所、例えば ＧｅｎＢａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅを検索して最も容易に行われる。具体的な例では、当該遺伝子については以下のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号が規定されている。
【００３３】
遺伝子−特異的プライマーのデザイン。　遺伝子配列を調べると、ＰＣＲ反応に使用される遺伝子−特異的プライマーをデザインすることができる。一般に、トップ−鎖プライマーは、遺伝子のＡＴＧ開始コドン、次いで約２０ヌクレオチドを含むが、ボトム−鎖プライマーは停止コドン、及び遺伝子がＧＦＰの後に融合、つまりＧＦＰ−「ＧｅｎｅＸ」融合である場合には、約２０個の先行するヌクレオチドを含む。遺伝子がＧＦＰの前に融合し、つまり「ＧｅｎｅＸ」−ＧＦＰ融合である場合には、停止コドンを除く必要がある。任意に、ＧｅｎｅＸの全長配列を融合で使用しなくともよく、シグナルに応じてＧｅｎｅＸのように局在し、再分布する単なる一部を用いてもよい。遺伝子−特異的配列に加えて、プライマーは、ＰＣＲ産物の以降のクローニングを可能にする、制限酵素用の認識配列を少なくとも１つ含む。その部位は、ＰＣＲ産物にユニークで、クローニングベクターの部位と適合性であるように選択される。さらに、融合遺伝子及び／又は翻訳開始共通配列のリーディングフレームを正確なものとするため、制限酵素部位と遺伝子−特異的な配列とのあいだに正確な数のヌクレオチドを含める必要があり得る。最後に、プライマーは、酵素での効率的な消化を可能にするため、制限酵素部位の前に少数のヌクレオチドを常に含む。
【００３４】
増幅される遺伝子源の同定。　遺伝子−特異的なプライマーを用いて生成物を製造するＰＣＲ反応には、遺伝子−配列が、例えばｃＤＮＡの形態で最初に反応物に存在する必要がある。ＧｅｎＢａｎｋ又は科学文献の情報は、遺伝子が発現される組織（類） を通常示しており、様々な種からの極めて多様な組織もしくは細胞型に由来するｃＤＮＡライブラリーは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ） 及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から一般に市場で入手可能である。多くの遺伝子は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｖｉｒｇｉｎｉａ）からクローン形態でも入手できる。
【００３５】
ＰＣＲ反応の最適化。　プライマーのアニーリング温度、反応物に存在するイオン、特にＭｇ２＋とＫ＋の濃度、ならびに反応物のｐＨを含む幾つかの要因が、ＰＣＲ反応の効率と特異性に影響することが知られている。ＰＣＲ反応の結果が不十分と思われる場合には、上記のパラメータが最適ではなかったことが考えられる。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ）から入手可能な温度勾配が組み込まれたＰＣＲ機器で、様々なアニーリング温度を試験すべきであり、及び／又は例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＯｐｔｉＰｒｉｍｅ バッファーシステムで、様々な緩衝液組成を試験すべきである。
【００３６】
ＰＣＲ産物のクローン。　増幅遺伝子産物をクローンし、ＧＦＰと融合させたベクターは、プライマーのデザイン時にはすでに考慮済みであろう。ベクターを選択する際には、プローブの発現を制御するプロモーターが細胞と適合するよう、プローブがその後発現する細胞型を少なくとも考慮すべきである。多くの発現ベクターは、トランスフェクタントを安定的にすることが望ましい場合には有用な特徴である選択マーカー、例えば薬剤耐性付与マーカーも１以上含む。選択マーカーは、使用される細胞とも適合性であるべきである。
【００３７】
ＰＣＲ産物の実際のクローニングは、通常、同一の２つの酵素で消化したベクターに２つの異なる制限酵素で消化したフラグメントを一工程でクローニングするので、難しくはないはずである。クローニングに問題があることが分かった場合には、制限酵素がＰＣＲフラグメントと十分に作用しなかったことが原因であるかもしれない。この場合、フラグメント末端に近い消化の潜在的な困難性を克服するため、プライマー末端まで長い拡張物を加えるか、又は制限酵素消化に基づかない中間的なクローニング工程を導入することができる。幾つかの会社、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ） 及びＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）は、この方法のためのシステムを提供している。
【００３８】
いったん遺伝子をクローンし、その過程でＧＦＰ遺伝子と融合させたら、得られた生成物、通常はプラスミドを、予想されたものであることを確認するため注意深く試験すべきである。最も正確な試験は、融合−遺伝子のヌクレオチド配列を得ることであろう。
いったんプローブ用のＤＮＡ構築物を生じたら、その機能及び有用性は、プローブを発現し得る細胞にそれをトランスフェクトして評価してもよい。
【００３９】
治療薬剤をスクリーンするためのアッセイのデザイン及び実行で生細胞を使用する利点の幾つかには、細胞内部での標的に対する化合物の有効性を測定するアッセイ本来の能力、またアッセイ中に試験化合物又はその細胞代謝物の潜在的な毒性について本来の評価ができることが含まれる。例えば、ＰＤＥ４Ａ４スポットアッセイは、読み取りもしくは測定に先立って、細胞を試験化合物に２４時間まで暴露することを伴い、その間、試験化合物又はその細胞代謝物の細胞に対する直接的な毒性作用を観察することができる。
【００４０】
トランスフェクションには多くの細胞系が存在する。幾つかの例は、アフリカツメガエルの卵母細胞又はｓｆ９細胞系のような昆虫細胞、又は健康なもしくは罹患している動物から採取した組織あるいは器官から直接単離される哺乳動物細胞（始原細胞）、又は細胞培養条件下で不明確に複製し得る形質転換された哺乳動物細胞（細胞系）である。しかし、使用する細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。このことは、各細胞型に特異的な複雑な生化学的相互作用に起因している。
細胞の蛍光は、直後、一般には翌日に調べられる。この時点で、２つの特徴的な細胞蛍光：トランスフェクション強度及び細胞下局在が認められる。
【００４１】
強度は、通常、細胞における非融合ＧＦＰの強度と少なくとも同じくらい強いはずである。そうでなければ、プローブ−ＤＮＡの配列又は質は不完全であるかもしれず、注意深く試験すべきである。発現が弱い他の原因は、トランスフェクション前にプラスミドＤＮＡを線状化するか、又はトランスフェクション工程に使用するＤＮＡ濃度を増すか、又は多くが当業者に知られている、異なるトランスフェクション剤もしくは方法を選択することによって、しばしば修正することができる。
【００４２】
細胞下の局在は、プローブが十分に作用するかどうかを示す。
当該遺伝子が予想されるように局在化している場合、例えばロリプラムでの処理によってスポットを形成している場合には、すぐに機能試験に進めることができる。プローブがトランスフェクション工程直後に局在化していなければ、それは、通常、細胞が極めて多くのコピーのプラスミドを擁し、この時点では過剰発現しているためであるかもしれず、プラスミドコピー数と発現レベルが低下する時には、局在化は、適当な時期、例えば数週間以内に生じるであろう。局在化が、長期間後に生じなければ、それは、ＧＦＰへの融合が、局在化機能を破壊し、例えばその正常な細胞アンカー−タンパク質との相互作用に必須なタンパク質配列をマスクしているためであるかもしれない。この場合、正反対の融合が作用し、例えばＧｅｎｅＸ−ＧＦＰが作用しない場合には、Ｇｅｎｅ−Ｘの２つの異なる部分がＧＦＰに近いことによって影響を受けるので、ＧＦＰ−ＧｅｎｅＸが作用する可能性がある。これが作用しなければ、どちらかの末端でのＧＦＰの近接に問題がある可能性があり、ＤＮＡ構築物中のＧｅｎｅＸとＧＦＰとのあいだに長いリンカーを導入することによって距離を長くすることができる。適当な局在化の欠如は、細胞内で適当な足場又はスカホールドの部位を欠いていることに起因しており、これは、適当な足場又はスカホールド部位を供する原因であるタンパク質成分又は成分類をコードする遺伝子を同時にトランスフェクションさせることでしばしば修正することができる。
【００４３】
局在化の事前知識がなく、特異的な局在化が認められなければ、それは、ＧＦＰに融合したタンパク質の性質であることから、プローブがこの点で局在化するはずがないためであるかもしれない。次いで、それを機能試験に付すべきである。
機能試験では、プローブを発現する細胞を、少なくとも１つのロリプラム−様基準化合物で処理する。再分布が認められ、事前の知識が、それが位置Ｘから位置Ｙへ転位するはずであることを示唆している場合には、プローブは、最初の重要な試験に合格する。この場合、反応のさらなる特徴づけ及び定量に進めることができる。
【００４４】
予期したように作用しない場合には、細胞が、シグナル化経路の少なくとも１つの成分、例えば細胞表面レセプターを欠いているか、又はアンカー部位がないかもしくは飽和しているか、又は、例えばプローブがヒトの遺伝子産物の配列情報に対して設計され、細胞がハムスター由来である場合には、種が両立し難いためであるかもしれない。いずれの場合にも、これらの潜在的な問題が適用しない試験工程については他の細胞型を同定すべきである。
【００４５】
本発明で好ましい融合プローブを、表３に挙げる。もっとも好ましいプローブはヒト由来のＰＤＥ４プローブ、ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ− ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−△ＬＲ２−ＥＧＦＰのような融合プローブである。本発明の科学的な知見に用いたプローブの構築と試験を、実施例１及び２に記載する。ＰＤＥ４タンパク質についてここで使用した用語は、命名委員（Ｂｅａｖｏら， １９９４）の推奨に従った。委員会の推奨は、初めの２文字は源種（ＨＳ， Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ； ＲＮ， Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）を示し、ＰＤＥはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを意味するのに用い、アラビア数字はスーパーファミリーを示し（この場合は４）、１文字は遺伝子ファミリーを表し（ＰＤＥ４についてはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、別のアラビア数字はスプライス変異体を示し、最後の１文字は当該酵素を述べる報告に用いる（一般には、イソ型の確認及び全記載の後に省略）、というものである。
【００４６】
ＰＤＥ４Ａをベースとしたプローブの作用と使用は、ＰＤＥ４Ａの構造に触媒ドメインを交換することによりＰＤＥ４の遺伝子ファミリーＢ、Ｃ及びＤにも適用できる。４つの遺伝子ファミリーの触媒ドメイン内に同定可能な同族領域が存在するので、ハイブリッド分子は、以下のようにして簡便に構築することができる：保存アミノ酸は、触媒ドメイン内で、異なるＰＤＥ４遺伝子ファミリー由来酵素の相当領域に相同又は好ましくは同一のＰＤＥ４Ａタンパク質の一次配列のストレッチ内で選択される。アミノ酸の同一性についてのそのような領域は、例えば（ＨＳＰＤＥ４Ａ４から数えて）４５７〜４６７アミノ酸で認められる。次いで、標準的な分子生物学的技術を用いて、その位置にＣ−末端であるＰＤＥ４Ａ遺伝子配列中のアミノ酸の全コドンを除き、それらを、異なるＰＤＥ４遺伝子（例えばＰＤＥ４Ｂ）由来の相当するコード配列で置換する。次いで、遺伝子産物が、酵素のＣ−末端に結合したＥＧＦＰを有するように、ＰＤＥ４ハイブリッド配列をＥＧＦＰのようなラベル／マーカーをコードする配列に融合する。
【００４７】
これらのハイブリッドプローブは、細胞での発現時に、ロリプラム及び（上記例のＰＤＥ４Ｂの）代用触媒部位の特定の性質を反映した親和性を有する他のＰＤＥ４−特異的阻害剤を結合するが、選択されたＰＤＥ４Ａについて再分布作用を示す。再分布作用の測定は、導入された触媒部位に特異的な結合特性を反映している。
あるパートナータンパク質とあるＰＤＥ４との結合は、ロリプラムに対する酵素の親和性に影響を及ぼすことが公表されている。酵素に対する特異的な化合物（例えばロリプラム）の結合は、三次元空間で移動する酵素の自主性を変えるので、（足場又はドッキングパートナーに対する結合である）酵素の可動性を変えるものと、現在考えられている。
【００４８】
この発明のひとつの主要な観点は、ロリプラムと一緒に細胞をインキュベーションすると、ＰＤＥ４Ａプローブが再分布されるとの知見に基づいている。この再分布は、ＰＤＥ４活性の阻害で生じるｃＡＭＰの増加の結果ではない。というのは、再分布は、ＩＢＭＸ、又はフォルスコリン±ＩＢＭＸでの処理によっては簡単に模倣されないからである（実施例１０）。
むしろ、ロリプラム及び他のＰＤＥ４阻害剤の結合はＰＤＥ４Ａの形態学的変化を誘発し、そのドッキング又は足場パートナーに対するＰＤＥ４Ａプローブの親和性の変化をもたらし、それらを細胞にその後に再分布させるものと考えられる。
【００４９】
さらに、ロリプラム及びＰＤＥ４Ａ再分布に対するロリプラムの作用を模倣する他の化合物について知られている特性から、ＰＤＥ４Ａプローブの再分布をもたらす変化を特異的に誘発する「高親和性ロリプラム結合部位」（ＨＡＲＢＳ）又は「Ｓｒ」又はＨＰＤＥ４型として一般に称されるもの（Ｓｏｕｎｅｓｓ及びＲａｏ， １９９７）に対するこれらの化合物の結合が推測される。ＲＰ７３４０１及びＳＢ２０７４９９のような特異的ＰＤＥ４阻害剤はＨＡＲＢＳを認識しないが、明らかに触媒ドメイン内の代替部位を認識し、幾分異なる方法で、触媒部位（Ｓｃ）のｃＡＭＰ加水分解能を阻害する；ロリプラムも、この第二の方法で結合し、この場合は「低親和性部位」又はＬＰＤＥ４型への結合（Ｓｏｕｎｅｓｓ とＲａｏ， １９９７）と言う。ＲＰ７３４０１はＰＤＥ４Ａプローブの再分布を引き起こさないので、ＳＢ２０７４９９もこれらのプローブを再分布させることができず、さらにＲＰ７３４０１のように、ＳＢ２０７４９９は、ロリプラム及びＳｒに結合する他の化合物で生じる再分布に対して競合し、これを後退させるものと予想される。現在、ＨＡＲＢＳと低親和性部位（又は部位群）が真に別個で、ＰＤＥ４酵素の触媒溝内の位置に分かれているかどうか、又は、それらが同一部位について形態学的に異なる状態を示すかどうかは、知られていない。ｃＡＭＰの上昇及び細胞反応阻害に関して、Ｓｃ又はＳｒへの結合の役割は、いまだ完全には理解されていない。ＰＤＥ４阻害剤の薬理学的プロフィルへの影響におけるＳｒの重要性は、効力のみならず、吐き気、嘔吐、胃酸過多及び頭痛のようなこれらの薬剤の副作用を予言する意味合いを持ち、これらの副作用のため、今日までＰＤＥ４阻害剤の臨床的な開発が妨げられてきた（Ｓｏｕｎｅｓｓ及びＲａｏ， １９９７）。
【００５０】
この出願における実施例の多くは、ロリプラムの作用に基づいている。したがって、この発明の方法は、基準化合物としてロリプラムを用いて行うことが好ましい。しかし、本発明の別の具体例ではロリプラム−様基準化合物を用いている。ロリプラム−様基準化合物は、使用されるＰＤＥプローブを再分布させることができ、かつＰＤＥ４の触媒活性を阻害できることに関して、ロリプラムの特性を共有する化合物である。
【００５１】
ＰＤＥ４の局在化の変化が、ロリプラム−様基準化合物での処理の結果として認められることは、本発明の重要な態様である。実施例１〜１４は、ロリプラムによって生じるスポットの形成を示す。つまり、方法は、スポットの形成としてのＰＤＥ４の局在変化に関連していることが好ましい。実施例１５は、ロリプラムの処理によって生じるスポットの分布を示す。つまり、方法はスポットの分布としてＰＤＥ４の局在変化に関連していることが、別の好ましい具体例である。
この発明のひとつの観点は、プローブの細胞内分布に明確な変化を生じる化合物、例えばロリプラム−様基準化合物によって生じる局在化における明確な変化を模倣する試験化合物を同定することに関しており、類推によれば、試験化合物とロリプラム−様基準化合物は、共通の薬理学的プロフィルを共有するであろう。
【００５２】
アゴニスト作用を有する化合物のこの同定は、
）任意に、ＰＤＥ４の位置を記録できるプローブを構築し；
）任意に、（０１）工程の構築プローブで細胞をトランスフェクトし；
（ａ）ＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｂ）ＰＤＥ４の触媒溝に結合し得る、ロリプラム−様基準化合物を、（ａ）の細胞又は類似細胞に　加え；
（ｂ１）　 試験化合物を、（ａ）の細胞又は類似細胞に加え；
（ｂ２）　 工程（ｂ１）の細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｃ）　　工程（ｂ）の細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｄ）　　工程（ａ）で記録した細胞内分布を工程（ｃ）で記録した細胞内分布と比較して、ロリプラム−様基準化合物のＰＤＥ４の細胞内分布に対する作用を測定し；
（ｄ１）　　工程（ｂ２）で記録した細胞内分布を工程（ａ）で記録した細胞内分布と比較して、試験化合物の作用を測定し；
試験化合物の薬理を、工程（ｄ１）で測定された作用を、工程（ｄ）で測定された作用と比較して工程（ｄ１）において工程（ｄ）で測定された作用の実質的なコピーであれば、ＰＤＥ４の細胞内分布の変化に関するロリプラム−様基準化合物に対する試験化合物のアゴニスト作用を示すものとして確立する、
工程からなる、試験化合物によって生じる生細胞でのＰＤＥ４の細胞内分布の変化をモニターする方法として行うことが好ましい。
【００５３】
アゴニストは、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブを発現する細胞で、極めて明るいスポット、しばしば一対のスポットの形成を誘導する。あるアゴニスト（ＲＳ２５３４４、但しロリプラムではない）は、このプローブのＨ５０６Ｎ変異体を発現する細胞で同種のスポットの形成を誘導し、ロリプラムの拮抗性を除く突然変異に対するその「架橋」又は競合能を示している。全ての場合に、明るいスポットの形成はタンパク質合成とプローブの蓄積を要する：進行中のスポットの形成を測定するには、ロリプラム又は他のアゴニストとの２時間のインキュベートで十分であるが、試験化合物で合計約６時間インキュベーションした後は、スポットが大きく明るくなり、その結果、測定しやすくなる。６〜２４時間のあいだは、大きさと明るさは増大しつづけるが、スポット数はあまり増えない。固定化前の１６時間に細胞を試験化合物とインキュベーションすることは、多くの細胞プレートの夜間処理、一晩中のインキュベーション、翌朝の固定、染色及び分析を可能にするので、化合物のバッチをスクリーンする簡便かつ信頼性のある方法であることが分かる。
【００５４】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブを用いると、アゴニストは、細胞質の核周囲領域に通常ある明るいスポットの分布を誘導する。スポットの分布は６０〜９０分後に容易に測定でき、このためにＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰでのスポット形成より迅速な処理となる。
いずれかのプローブの使用で認められるアゴニストは、特異的なＰＤＥ４阻害剤であることが予想され、ＰＤＥ４の特異的な阻害に適当な二次スクリーンは、この特性を確認するのに望ましい。
【００５５】
この発明の別の観点は、例えばロリプラム−様基準化合物を置換することによって、ロリプラム−様基準化合物の作用により生じる局在化の明確な変化を妨げ、後退させる試験化合物の同定に関する。
【００５６】
アンタゴニスト作用を有する試験化合物のこの同定は、
０１）　　任意に、ＰＤＥ４の位置を記録できるプローブを構築し；
０２）　　任意に、（０１）工程の構築プローブで細胞をトランスフェクトし；
（ａ）　　ＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｂ）　　ＰＤＥ４の触媒溝に結合し得るロリプラム−様基準化合物を、（ａ）の細胞又は類似細胞に加え；
（ｂ１）　 試験化合物を、工程（ｂ）のロリプラム−様基準化合物を有する細胞又は類似細胞に加え；
（ｂ２）　 工程（ｂ１）の細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｃ）　　工程（ｂ）の細胞におけるＰＤＥ４の細胞内分布を記録し；
（ｄ）　　工程（ａ）で記録した細胞内分布を工程（ｃ）で記録した細胞内分布と比較して、ロリプラム−様基準化合物のＰＤＥ４の細胞内分布に対する作用を測定し；
（ｄ１）　　工程（ｂ２）で記録した細胞内分布を工程（ａ）で記録した細胞内分布と比較して、試験化合物の作用を測定し；
試験化合物の薬理を、工程（ｄ１）で測定された作用を工程（ｄ）で測定された作用と比較して、工程（ｄ１）において工程（ａ）で測定した作用に実質的に同じ作用に対して工程（ｄ）で測定された作用が反対であるとき、細胞内分布の変化に関するロリプラム−様基準化合物に対する試験化合物のアゴニスト作用を示すものとして確立する、
工程からなる、生細胞でＰＤＥ４の細胞内分布の変化をモニターする方放置して行うことが好ましい。
【００５７】
試験化合物の薬理は、工程（ｄ１）で測定された作用を工程（ｄ）で測定される作用と比較して、工程（ｄ１）においてロリプラム−様基準化合物の高い用量で得られた工程（ｄ）の作用に匹敵する、工程（ｄ）で測定された作用より増していれば、細胞内分布の変化に関して、ロリプラム−様基準化合物に対して試験化合物の作用が増加していることを示すものとして確立することも可能である。
【００５８】
アンタゴニストは、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブを発現する細胞でロリプラム−様基準化合物によって形成される極めて明るいスポットの分布を誘導する。明るいスポットの分布はタンパク質合成を要せず、一般に３０〜６０分後に容易に測定できる。濃度の高い化合物の幾つか、例えばＲＰ７３４０１は、極めて迅速にスポットを分布できる；１６時間かけて２μＭのロリプラムによって形成されるスポットは、１μＭのＲＰ７３４０１を用いて１０分以内に分布する。アンタゴニストのスクリーンは、１６時間のあいだロリプラム−様基準化合物（つまりロリプラム３μＭ又はＲＳ２５３４４ ０．５μＭ）で細胞をインキュベートし、次いで試験化合物を加え、固定し、染色し、かつ分析する前に６０分間さらにインキュベートすることを伴ってもよい。
【００５９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブを用いると、アンタゴニストは、ロリプラムのようなロリプラム−様基準アゴニストとの処理に通常起因する核周囲の明るいスポットの分布を後退させる。化合物は、ロリプラム−様基準化合物と同時に、又はそのしばらく後（例えばロリプラム−様基準化合物とのインキュベーションの６０〜９０分後）に加えてもよい。スポットの再現は、２４０分後に容易に測定できる。
【００６０】
実施例１０、１１及び１２に詳述するように、ある処理が、ＣＨＯ細胞にＰＤＥ４Ａ４ロリプラムスポットを分布させることが知られている。これらには、［フォルスコリン＋ＩＢＭＸ］（実施例１０）と［ＰＭＡ±イオノマイシン］（実施例１１）が含まれる。適当なカウンタースクリーンにより、転位をとおしてＰＤＥ４を再分布する化合物が同定される：転位体（ｄｉｓｌｏｃａｔｏｒ）化合物は、触媒溝に結合せず、その結果、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害せず、細胞で（フォルスコリン＋ＩＢＭＸが行うような）ｃＡＭＰ／ＰＫＡ活性化の増加を誘導せず、おそらくは細胞内Ｃａ２＋の長期の増加又はジアシルグリセロールのレベルの増加によって、ＰＭＡ±イオノマイシンの作用を模倣せず、つまりＰＫＣのイソ型を直接刺激する。
【００６１】
ＰＤＥ４Ａ４プローブを用いるアンタゴニストアッセイは、スポットの分布能力によって化合物を検出するので、このアッセイは、その好ましい細胞位置から、ＰＤＥを転位する化合物、つまりそのアンカータンパク質を検出することにも有用である。化合物がＰＤＥ４Ａ４アンタゴニストアッセイでスポットを分布することが分かり、４Ａ１アンタゴニストアッセイでスポットを再形成させるか、あるいは持続させる場合には、その化合物は、ＨＡＲＢ部位にあまり親和性がないＰＤＥ４特異的阻害剤である可能性が高く、ＲＰ７３４０１（また、予想としてＡｒｉｆｌｏ（登録商標）又はＳＢ２０７４９）と同様の性質を有しているはずである。ＰＤＥ４Ａ４アンタゴニストアッセイで認められる化合物が４Ａ１アンタゴニストアッセイでスポットを再形成又は持続させることができず、提案されるカウンタースクリーンでポジティブとしてスクリーンしない場合には、その化合物はＰＤＥ４Ａ４の転位体、つまりそのアンカータンパク質（類）であると思われる。さらに、４Ａ１アゴニストアッセイでは活性を有するが、ＰＤＥ４Ａ４アゴニストアッセイでは活性を有さず、ＰＤＥ４阻害アッセイではポジティブをスクリーンしない化合物は、ＰＤＥ４Ａ１の転位体、つまりそのアンカータンパク質（類）であると考えられる。
【００６２】
この発明の方法で同定される試験化合物には、ロリプラム−様又は非ロリプラム−様阻害剤のいずれかとしてＰＤＥ４Ａプローブの分布に対する作用から類別される、ＰＤＥ４酵素の特異的阻害剤が含まれる。ロリプラム−様阻害剤全体が共有する重要な特性は、ＰＤＥ４酵素の高親和性ロリプラム結合部位への結合能及び／又は触媒溝内の相互作用からＰＤＥ４Ａ酵素の形態学的変化を誘発する能力である。また、この発明の方法で同定される試験化合物は、特定のアンカータンパク質とのＰＤＥ４イソ酵素の結合を崩壊／促進するか、又は細胞内の異なる位置間のＰＤＥ４タンパク質の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）の機械的原因を崩壊／促進する転位体化合物を含むと予測される。こうすることで、化合物が同定され、それを用いることで、細胞内の確立された空間におけるＰＤＥ４イソ酵素の配置を崩壊又は再局在化して、区画化されたｃＡＭＰの機能が増強される。この新規な方法及び適当なアッセイの誘導によって、ＰＤＥ４イソ型−選択的な治療を生じる完全に新たな方法が考えられる。
【００６３】
例えばアゴニスト又はアンタゴニストとして同定される試験化合物は、１以上の化学要素からなる単一物質であることが好ましい。そのような試験化合物の例は、ペプチドである。
「化合物」の用語は、生物学機能を有するか、又は細胞系で生物学的作用を発揮するサンプルを示すことを意図する。サンプルは、血液、血漿、唾液、乳、尿又を含む体液、又は微生物もしくは植物の抽出物のサンプルのような生物物質のサンプル、重金属もしくは毒素を含む汚染物含有環境サンプルであってもよく、または有機合成もしくは遺伝技術で調製される化合物もしくは混合化合物を含むサンプルであってもよい。
【００６４】
この発明の別の観点では、試験化合物は、ＰＤＥ４の触媒溝に結合することが好ましい。ＰＤＥ４の触媒溝は、酵素用の基質が導入されているタンパク質巨大分子内の溝で、基質を含む特異的な化学（又は物理学的）反応の条件が、特定の方向で作動するよう反応に熱力学的に最適化されている。ＰＤＥ４については、溝は保存されている触媒ドメインとして認識される領域内にあり、切断及び欠損を組み合わせた実験から、（ＨＳＰＤＥ４Ａ４からのアミノ酸の番号付けを用いれば）３３２／３６５〜６８０残基間に位置する約３１５〜３４８アミノ酸からなるものとして決定された（Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｓｕｌｌｉｖａｎ及びＢｏｌｇｅｒ， １９９８）。この共通領域内の突然変異及び欠失は、ＰＤＥ４酵素のｃＡＭＰ結合及び加水分解能を廃するか、又は低下させると考えられる。触媒部位と活性部位の用語は、この点で似通った意味を有する。
【００６５】
試験化合物又はロリプラム−様基準化合物が触媒溝に結合する親和性は、標準的な放射性リガンド結合アッセイを使って決定することができる。ここでは、試験化合物を放射線標識し、多少精製した標的ＰＤＥ４酵素の調製物とインキュベートする。そのような酵素調製物は、トランスフェクトされ、選択したＰＤＥ４酵素を発現する細胞から得ることができる。そのような手法に用いられる一般的な系は、Ｓａｌｄｏｕら（１９９８）が記載していることが判っている。あるいは、脳−由来ミクロソーム調製物からのトリチウム化ロリプラムの置換を用いて、ＰＤＥ４酵素のいわゆる高親和性ロリプラム結合部位に対する試験化合物の親和性を測定することができる。
【００６６】
結合親和性、ＰＤＥ４Ａプローブ再分布に対する作用及び触媒活性に対する阻害作用は、相関している必要はない。発明のある観点において、この発明のかかる使用によって見出された試験化合物は、ＰＤＥ４の触媒活性も阻害することが好ましい。ＰＤＥ４の触媒活性に対する試験化合物の作用は、酵素活性に対するＰＤＥ阻害剤とｃＡＭＰとの標準的な競合結合実験によって容易に測定できる。その場合、一定時間のあいだ、既知の量のｃＡＭＰ基質と固定量の酵素を、種々の量の阻害剤基質とともにインキュベートし、その後反応を止め、非加水分解ｃＡＭＰの残量を測定する。これは、シンチラントビーズに結合したｃＡＭＰ−特異的抗体への結合に対する試験サンプルのｃＡＭＰと既知の量の放射ラベルｃＡＭＰとの競合を測定することを目的としたシンチレーション近似ベースアッセイ（ＳＰＡ）を用いて試験サンプルに対して行うことができる。アッセイは、サンプル当たりのカウントが試験サンプ中のｃＡＭＰの量に逆に相関しているシンチレーションカウンターで読み取る。ｃＡＭＰ測定のためのＳＰＡキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）から入手できる。
【００６７】
さらに、この発明の方法で検出できる化合物の別の群は、特に実施例１３に記載されている。これらの化合物は、ＰＤＥ４Ａ４プローブを発現する細胞でスポットの再現を阻害する。スポットの再現過程は、種々の強制条件（ｉｍｐｏｓｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で誘発し、ロリプラム−様ＰＤＥ４−阻害剤（ロリプラム、Ｒｏ ２０−１７２４、ＲＳ２５３４４などから選択されるアゴニスト化合物）の影響下でスポットを生じる細胞に特異的である。また、細胞は、アゴニスト化合物の除去によってスポットをクリアーにした。サリドマイドは、実施例１３に記載されるように、スポット再現阻害剤である化合物の一例である。
【００６８】
スポット再現阻害剤は、細胞のストレス反応を阻害する化合物であってもよい。スポット再現阻害剤としての試験化合物の同定は、
（１）　一定時間のあいだ、基準のアゴニスト化合物でＰＤＥ４Ａ４発現細胞を処理し、スポットを誘導し（例えば７〜２４時間）；
（２）　スポットが形成したことを確認し；
（３）　ロリプラム−様基準化合物を洗い流し、完全に消失するようにスポット用のインキュベーターに細胞を置き（約１５０分）；
（４）　全てのスポットが消失したことを確認し；
（５）　ネガティブコントロールとして幾つかのウェルを保ちながら、試験化合物を加え；
（６）　全細胞を１００ｍＭ塩、４℃で４時間曝すか、又は環境条件で４時間細胞を置いて、２２℃までの冷却、培地のアルカリ化（ｐＨ＝６．５からｐＨ＝８．２まで移動）及び部分的な蒸発（容量で約２０％低下）を可能にし；
（７）　試験化合物で全く処理していない対照のウェルと比較したスポットの再現の程度を測定する工程
からなる方法として行うことが好ましい。
【００６９】
当業者に明らかであるように、ＰＤＥ４の機能を阻害し得る化合物は、炎症及び／又はうつ病を予防／低下させることができる。この発明は、そのような化合物を同定するための少なくとも２つの新規な手法を提供する。全ての手法は、ＰＤＥ４の触媒溝への結合によってロリプラムがＰＤＥ４の細胞分布の変化を誘導するとの最初の知見に基づいている。
【００７０】
ひとつの方法は、
−　ロリプラム−様基準化合物によって任意に誘導され得るＰＤＥ４−スポットを、化合物が除去するかどうかを試験し、かつ
−　化合物が、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がＰＤＥ４−スポットを除き、化合物がＰＤＥ４の触媒活性を阻害しないならば、化合物がＰＤＥ４の転位体である、化合物がＰＤＥ４の転位体であるかどうかを決定する方法である。
【００７１】
ＰＤＥ４転位体は、細胞において天然の位置からＰＤＥ４を除き、それにより、細胞のその天然位置（「区画」）におけるｃＡＭＰの濃度を増す。そのようなｃＡＭＰ濃度の上昇は、ＰＤＥ４の触媒活性の阻害でも認められるが、ＰＤＥ４を転位し、それにより、触媒の十分に保存された部位に直接作用しないことによって、化合物は、例えばＰＤＥ４の結合ドメインで作用し、それにより、ＰＤＥ４のイソ型−特異的「阻害剤」が生じる。
したがって、この発明のひとつの観点は、記載する方法によって得られるＰＤＥ４転位体に関している。そのようなＰＤＥ４転位体は、ＰＤＥ４の転位体である化合物からなる医薬組成物であって、販売が承認されており、その承認が、ロリプラム−様基準化合物、化合物によって任意に誘導されるＰＤＥ４−スポットの除去及び化合物によるＰＤＥ４の触媒活性阻害の欠失を示すデータからなる承認用の申請に基づく、医薬組成物に含まれていることが好ましい
【００７２】
販売の承認の一例は、６５／６５／ＥＥＣに記載されている。必要なデータは、上記指示の第４．８条に詳述されている。
ＰＤＥ４の好ましい転位体は、ＰＤＥ４Ａイソ型、例えばＰＤＥ４Ａ１イソ型及び／又はＰＤＥ４Ａ４のイソ型の転位体である。
ＰＤＥ４Ａ１の転位体は、
−　化合物がＰＤＥ４Ａ１−スポットを除去するかどうかを試験し、そして
−　化合物がＰＤＥ４Ａ１の触媒活性を阻害するかどうかを試験する工程
からなり、化合物がＰＤＥ４Ａ１−スポットを除き、また化合物がＰＤＥ４Ａ１の触媒活性を阻害しない場合には、化合物がＰＤＥ４Ａ１の転位体である方法によって同定される。
【００７３】
記載される方法によって得られるＰＤＥ４Ａ１の転位体は、販売の承認での適応症がうつ病のような中枢神経系疾患である医薬組成物に含まれることが好ましい。
ＰＤＥ４Ａ４転位体は、
−　化合物が、ロリプラム様−基準化合物で誘導されるＰＤＥ４Ａ４−スポットを除去するかどうかを試験し、そして
−　化合物が、ＰＤＥ４Ａ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する工程
からなり、化合物がＰＤＥ４Ａ４−スポットを除去し、化合物がＰＤＥ４Ａ４の触媒活性を阻害しなければ、化合物がＰＤＥ４Ａ４の転位体であるとする方法によって同定される。
【００７４】
記載される方法で得られるＰＤＥ４Ａ４転位体は、販売の承認での適応症が炎症性疾患である医薬組成物に含まれることが好ましい。炎症性疾患の例は、関節炎症、クローン疾患、炎症性腸疾患、呼吸系疾患、喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺気腫、内毒素性ショック、毒性ショック症候群、全身性エリテマトーデス、乾癬、骨吸収疾患、再潅流障害、癌及びＨＩＶ感染である。
【００７５】
この発明による別の方法は、
−　化合物が、ロリプラム−様基準化合物によって誘導されるＰＤＥ４Ａ４−スポットを分解させるかどうかを試験し、
−　 化合物が、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞で、ＰＤＥ４Ａ１−スポットの再現を誘導するかどうかを試験し、かつ
−　 化合物が、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害するかどうかを試験する
工程からなり、化合物がロリプラム−様基準化合物で誘導されるスポットを除き、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞でＰＤＥ４Ａ１−スポットの再現を誘導し、化合物がＰＤＥ４の触媒活性を阻害する場合には、化合物が低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤である、化合物が低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤であるかどうかを決定するための方法である。
【００７６】
低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤は、嘔吐、吐き気、頭痛及び胃酸過多のような副作用を生じずに、抗炎症及び抗−うつ作用を生じ、ＰＤＥ４の触媒活性を阻害する。
低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤は、低嘔吐性のＰＤＥ４阻害剤である化合物からなる医薬組成物であって、販売が承認されており、その承認が、ロリプラム−様基準化合物によって誘導されるスポットを化合物が除き、ロリプラム−様基準化合物に曝された細胞でのＰＤＥ４Ａ１スポットの再現を化合物が誘導し、かつＰＤＥ４の触媒活性を化合物が阻害することを示すデータからなる承認用の申請に基づく、医薬組成物に含まれていることが好ましい。
【００７７】
ある観点では、販売の承認の適応症は炎症性疾患である。
別の観点は、関節炎症、クローン疾患及び炎症性腸疾患を含む炎症性疾患；呼吸系疾患、例えば喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎及び肺気腫；内毒素性ショック及び毒性ショック症候群を含む感染性疾患；全身性エリテマトーデスならびに乾癬を含む免疫疾患；及び骨吸収疾患ならびに再潅流障害を含む他の疾患、及び癌ならびにＨＩＶ感染のような造血細胞の増殖を伴う症状；うつ病を含む中枢神経系疾患の治療用薬剤を製造するための、低嘔吐性ＰＤＥ４阻害剤又はＰＤＥ４転位体、又はその医薬的に許容される塩、エステル、アミドもしくはプロドラッグの使用に関する。
【００７８】
この発明の別の重要な観点は、炎症性疾患、例えばリウマチ性関節炎の治療用薬剤を製造するための、ＰＤＥ４の細胞内分布に対するロリプラム−様基準化合物の作用に対して競合でき、それを後退でき、またＰＤＥ４の触媒活性を阻害できる、低嘔吐性ＰＤＥ４阻害剤、又はその医薬的に許容される塩、エステル、アミドもしくはプロドラッグに関する。
さらに、この発明の別の観点は、化合物、又は医薬的に許容されるその塩、エステル、アミド又はプロドラッグの有効量を個体に投与することからなり、化合物が、ＰＤＥ４の細胞分布に対するロリプラム−様基準化合物の作用に対して競合でき、それを後退もしくは模倣でき、化合物が、ＰＤＥ４の触媒活性に対するロリプラム−様基準化合物の作用を模倣できる、個体における炎症性疾患、例えば喘息、又はうつ病の治療方法である。
【００７９】
さらに、この発明は、この発明による方法によって同定され、又は同定可能な試験化合物、例えば低嘔吐性ＰＤＥ４阻害剤又はＰＤＥ４転位体に関する。
記載される方法によって同定されるＰＤＥ４転位体又は低嘔吐性ＰＤＥ４阻害剤が、ヒトでの試験前にさらに試験を要することは、当業者には明らかである。毒理学の要件とは別に、ＰＤＥ４転位体は、細胞レベルと生物レベルの双方で、関連作用についての機能的アッセイ及びカウンター表示で試験される。
【００８０】
そのようなアッセイの例は、ヒトの末梢血液単核細胞からのＬＰＳ−刺激性ＴＮＦαの放出についてのインビトロ測定（例えばＢａｒｎｅｔｔｅらが記載、１９９８）及び抗炎症作用、例えばラットの肺における抗原−誘導性好酸球増加症ならびに気管支収縮の抑制についてのインビボ測定（例えばＨｕｇｈｅｓらが記載、１９９６、喘息モデル）又は抗うつ機能、例えばラットの海馬における脳−由来神経組織栄養因子（ＢＤＮＦ）の誘導についてのインビボ測定（うつ病モデル； Ｆｕｊｉｍａｋｉら２０００）又はラットにおけるコラーゲンＩＩ−誘導性関節炎の緩和についてのインビボ測定（リウマチ性関節炎モデル； Ｎｙｍａｎら１９９７）である。さらに、フェレットの嘔吐試験での望ましくない潜在的な嘔吐特性について、ＰＤＥ４転位体化合物をスクリーンする（例えばＲｏｂｉｃｈａｕｄらが記載、１９９９）。
【００８１】
ここに記載される医薬組成物は、通常の製薬プラクティスにしたがって製剤化してもよい（例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」及び「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」参照）。
ＰＤＥ４内での個々の突然変異は、ある疾患状態、例えば免疫学的疾患及びうつ病の原因であると思われる。この発明のある観点では、それらの個々は、
−　ＰＤＥ４サブタイプを（例えばＰＣＲで）得て、
−　ＰＤＥ４サブタイプをＧＦＰに融合し、
−　ロリプラムを加え、
−　ＰＤＥ４の分布変化を測定すること
によって、ロリプラムの結合部位又はアンカー結合部位における機能的な突然変異を診断することができる。
【００８２】
この発明の別の重要な観点は、関節炎症、クローン疾患及び炎症性腸疾患；呼吸系疾患、例えば喘息を含む慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎及び肺気腫；内毒素性ショック及び毒性ショック症候群を含む感染性疾患；全身性エリテマトーデスならびに乾癬を含む免疫疾患；及び骨吸収疾患ならびに再潅流障害を含む他の疾患、及び癌ならびにＨＩＶ感染のような造血細胞の増殖を伴う症状に関連するＰＤＥ分布を初期に正確に検出及び定量するための診断方法の基礎となる方法である。
【００８３】
参考文献
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【００８４】
実施例
実施例１：　ＧＦＰ−ラベルＰＤＥプローブのクローニング及び構築
ＧＦＰに融合した特定のＰＤＥ４Ａ変異体のクローニングと構築をここに記載する。現在少なくとも５個のＰＤＥ４Ａスプライス変異体が知られている。これらは全て Ｃ−末端配列を共有しているが、Ｎ−末端を異にしており、そこにＰＤＥ４Ａのターゲット配列が局在していると考えられる。ＰＤＥ４Ａの正常な分布を最も良好に保存するために、ＰＤＥ４Ａ種のＣ−末端とＧＦＰのＮ−末端との融合物をつくる。
【００８５】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ融合物を構築するために、ＨＳＰＤＥ４Ａ１の約１．９５ ｋｂのコード化領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ９７５８４）を、ＰＣＲ及び後述するプライマー ４Ａ１−トップならびに ４Ａ−ボトムを用いて増幅する。トッププライマーには、ＡＴＧ、コザック（ｋｏｚａｃ）配列及びＨｉｎｄ３クローニング部位を随伴する特異的なＨＳＰＤＥ４Ａ１配列が含まれる。ボトムプライマーには、停止コドンのない共通のＰＤＥ４Ａ Ｃ−末端配列、ＢａｍＨ１クローニング部位及びｐＥＧＦＰへの挿入時にリーディングフレームを保護する２つのエキストラヌクレオチドが含まれる。ＰＣＲ生成物を、制限酵素ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で消化し、Ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で切断したｐＥＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５７６２）にクローンする。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下でＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ融合物が生じる。得られたプラスミドをＰＳ４６１とし、ブダペスト条約の下でＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）に２０００年４月１７日にＤＳＭ １３４４９として寄託する。
【００８６】
４Ａ１−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）：
５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣ−３’、ＰＤＥ４Ａ１に特異的、
４Ａ−ボトム （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）：
５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡ−３’
【００８７】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ融合物を構築するために、ＨＳＰＤＥ４Ａ４の共通の約１．９ ｋｂのＣ−末端部分（ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｌ２０９６５）を、後述するプライマー４Ａ−Ｃｔ−トップ及び４Ａ−ボトムでＰＣＲを用いて増幅する。トッププライマーの配列は、共有される４Ａ領域の最初に正確にＤｒａ１部位を導入するサイレント突然変異を含む。ボトムプライマーには、停止コドンのない共通のＣ−末端領域、ＢａｍＨ１クローニング部位及びｐＥＧＦＰ へのクローン時にリーディングフレームを保護する２つのエキストラヌクレオチドが含まれる。ＨＳＰＤＥ４Ａ４のユニークな約０．８ ｋｂ のＮ−末端部分を、後述のプライマー４Ａ４−トップ及び４Ａ４Ｎ−ボトムで５％ ＤＭＳＯ の存在下ＰＣＲを用いて増幅する。トッププライマーには、ＡＴＧ、コザック配列及びＨｉｎｄ３クローニング部位を随伴する特異的なＨＳＰＤＥ４Ａ４配列が含まれる。ボトムプライマーは、ユニークな４Ａ４ Ｎ−末端部分と共通の４Ａ Ｃ−末端部分の接合部にまたがり、共有される４Ａ 領域の最初に正確にＤｒａ１部位を導入するサイレント突然変異を含む。ＰＣＲ生成物を関連制限酵素（ユニークなＮ−末端部分に対してＨｉｎｄ３及びＤｒａ１ならびに共通のＣ−末端部分に対してＤｒａ１及びＢａｍＨ１）で消化し、Ｈｉｎｄ３とＢａｍＨ１で消化したｐＥＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５７６２）にともに連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ融合物が生じる。得られたプラスミドをＰＳ４６２とし、ブダペスト条約の下でＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）に２０００年４月１７日にＤＳＭ １３４５０で寄託する。
【００８８】
４Ａ−Ｃｔ−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）： ５’−ＧＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣ−３’
４Ａ−ボトム （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）： ５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡ−３’
４Ａ４−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）： ５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＣＣ−３’
４Ａ４Ｎ−ボトム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）： ５’−ＧＧＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＣＴＧＡＣ−３’
【００８９】
細胞内で通常再分布する触媒上不活性なＰＤＥ４融合物は、触媒ドメインに特異的な点突然変異を導入することによって構築することができる。そのような融合物の使用は、触媒上活性な ＰＤＥ４の幾つかの過剰発現に細胞が感受性であれば、有用であり得る。多くの突然変異は触媒活性を大きく低下させる ＰＤＥ４Ａで知られており、例えばＨＳＰＤＥ４Ａ４のＨ５０６Ｎが知られている。
プラスミドＰＳ５３５ （ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰ）は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４でＡｓｎへのＨｉｓ−５０６ の置換を含むＰＳ４６２変異体（ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ）である。この置換を、ＰＣＲ−ベースのクイックチェンジ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いて導入する。 この置換をもたらすＰＣＲ反応は、鋳型としてのプラスミドＰＳ４６２及び後述する相補プライマー４ＡＨ−Ｎ−フォワード及び４ＡＨ−Ｎ−リバースを利用する。置換に加えて、これらの２つのプライマーはＸｈｏ Ｉ制限部位を除くサイレント突然変異を含み、その特徴を用いて、最初の鋳型から突然変異を迅速に区別することができる。プラスミドＰＳ５３５は、ブダペスト条約の下Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）に２０００年４月１７日にＤＳＭ １３４５１で寄託されている。
【００９０】
プラスミドＰＳ５３３ （ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ）は、プラスミドＰＳ４６２ （ＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＥＧＦＰ）の欠失変異体である。プラスミドＰＳ５３３で、ＨＳＰＤＥ４Ａ４のリンカー領域２（ＬＲ２）中の領域Ａｌａ−３１３〜Ｇｌｎ−３２０ からなる８アミノ酸残基を、ＰＣＲ−ベースのクイックチェンジ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を用いて欠失させる。この欠失をもたらすＰＣＲ反応は、鋳型としてプラスミドＰＳ４６２と後述するプライマー４ＡΔＬＲ２−フォワードと４ＡΔＬＲ２−リバースを用いる。欠失に加えて、これらの２つのプライマーはサイレント突然変異によりＡｃｃ６５ Ｉ制限部位を導入し、それを用いて最初の鋳型から突然変異を迅速に区別することができる。プラスミドＰＳ５３３は、ブダペスト条約の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （ＤＳＭＺ）に２０００年４月１７日にＤＳＭ １３４５２で寄託されている。
【００９１】
４ＡＨ−Ｎ−フォワード（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）：
５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＣ
４ＡＨ−Ｎ−リバース（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）：
５’−ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣ
４ＡΔＬＲ２−フォワードプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）：
５’−ＣＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＴＡＣＣＡＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＣＣ
４ＡΔＬＲ２−リバースプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）：
５’ＧＧＧＣＴＧＴＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧ
【００９２】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ−ＥＧＦＰ融合物を構築するために、ＨＳＰＤＥ４Ａ４の５’−末端フラグメントとＨＳＰＤＥ４Ｄイソ型の共通の３’−末端触媒領域をＰＣＲで個別に増幅し、ｐＥＧＦＰに連結する。
【００９３】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４ （ヌクレオチド１−１０２３； ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ２０９６５）の５’末端を、鋳型としてのプラスミドＰＳ４６２ （ｐＥＧＦＰ におけるＨＳＰＤＥ４Ａ４）及び後述のプライマー４Ａ４−ＥｃｏＲＩ−トップ及び ４Ａ４−ＨｉｎｄＩＩＩ−ボトムを用いて５％ ＤＭＳＯの存在下のＰＣＲにより増幅する。４Ａ４−ＢａｍＨＩ−トッププライマーは、コザック配列とＨＳＰＤＥ４Ａ４のＡＴＧを随伴するＥｃｏＲＩ制限部位を含む。４Ａ４−ＨｉｎｄＩＩＩ−ボトムプライマーは、２つのサイレント突然変異（プライマー配列中の下線）でプライマーのＨＳＰＤＥ４Ａ４配列に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。これらの突然変異は、タンパク質の正確な翻訳を保護し、ＨＳＰＤＥ４Ｄｃａｔフラグメントへの連結を可能にする。ＨＳＰＤＥ４Ｄイソ型の共通の ３’−末端触媒領域の増幅のため、ＨＳＰＤＥ４Ｄ３イソ型（ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｌ２０９７０）のＨＳＰＤＥ４Ｄｃａｔを、後述のプライマー９８５５ 及び９８５８を用いて胎盤及び胎児脳ｃＤＮＡのプール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）から増幅する。プライマー９８５５は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位及び ＡＴＧ開始コドンを含むＨＳＰＤＥ４Ｄ３の５’−末端に特異的なヌクレオチドを含む。プライマー９８５８は、ＥｃｏＲＩ制限部位及び停止コドンを除くＨＳＰＤＥ４Ｄの３’−末端に特異的なヌクレオチドを含む。このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＥＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）における相当部位に連結する。得られたプラスミドを、ＰＳ４４９と称する。このプラスミドから、ＨＳＰＤＥ４Ｄイソ型の３’−末端触媒領域（ＨＳＰＤＥ４Ｄ３ ｃＤＮＡのヌクレオチド７００−２０１９； ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ２０９７０）を、後述のプライマー４Ｄｃａｔ−ＨｉｎＤＩＩＩ−トップ及び４Ｄｃａｔ−ＳａｃＩＩ−ボトムを用いてＰＣＲにより増幅する。４Ｄｃａｔ−ＨｉｎＤＩＩＩ−トップは、２つのサイレント突然変異（プライマー配列中の下線）によってＨＳＰＤＥ４Ｄ配列に組み込まれたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む。４Ｄｃａｔ−ＳａｃＩＩ−ボトムプライマーは、できるだけＥＧＦＰ へ融合するように、停止コドンを除くＰＤＥ４Ｄ イソ型の３’−末端配列を含む。
【００９４】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４ ５’−末端フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＨＳＰＤＥ４Ｄｃａｔ フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩＩで消化する。これらの２つのフラグメントを、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩで消化したｐＥＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ； ＧｅｎＢａｎｋ アクセス番号Ｕ５５７６２）に三部連結で連結する。これにより、ＣＭＶプロモーターの制御下、ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ−ＥＧＦＰ融合物が得られる。このプラスミドを、ＰＳ６８７とする。
【００９５】
４Ａ４−ＥｃｏＲＩ−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＣ
４Ａ４−ＨｉｎｄＩＩＩ−ボトム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）
５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＡＡＧＴＧ
４Ｄｃａｔ−ＨｉｎＤＩＩＩ−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）
５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＣＣＣＡＡＧＧＴＴＴＧＧ
４Ｄｃａｔ−ＳａｃＩＩ−ボトム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）
５’−ＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣ
９８５５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）：
５’−ＧＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＡＡＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＴＧＡＡＴ
９８５８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）：
５’−ＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＡＴ
【００９６】
プラスミドＰＳ７１６はＰＤＥ４Ａ１とＧＦＰのＥ２２２Ｇ誘導体との融合物を発現し、プラスミドＰＳ７１７はＰＤＥ４Ａ４とＧＦＰのＥ２２２Ｇ 誘導体との融合物を発現する。それらは、プラスミドＰＳ６９９からのＧＦＰのＥ２２２Ｇ誘導体を含む類似のフラグメントで、ＥＧＦＰ配列を含む約０．８ ｋｂの ＢａｍＨ１−Ｘｂａ１フラグメントを置換して作製した。
ＰＳ６９９を、後述のように構築した。
【００９７】
Ｆ６４ＬとＥ２２２Ｇを組合わせたＧＦＰプラスミドの構築及び哺乳動物のコドン使用
プラスミドｐＥＧＦＰ （ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ５５７６２）は、より良い翻訳開始配列（コザック配列）が生じるように１つのエキストラアミノ酸が位置に加えられ、その結果、アミノ酸総数が野生型のＧＦＰで見られる２３８個の代わりに１つだけ２３９個に増えたＧＦＰの誘導体を含む。したがって、これらのプラスミドにおけるＧＦＰでの突然変異の命名は、厳密に例えばＦ６４ＬよりむしろＦ６５Ｌとして示されるべきである。しかし、この由来源の混乱を避けるために、またＧＦＰの群がその群に野生型ＧＦＰの番号付けシステムを採用しているために、ここで使用する番号は、野生型ＧＦＰで一般的に使用される突然変異の命名にならっている。この点で関連する突然変異は、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ及びＥ２２２Ｇである。
【００９８】
プラスミドｐＥＧＦＰは、発色団で以下の突然変異： Ｆ６４Ｌ 及びＳ６５Ｔを含む。ＧＦＰ ＤＮＡ 配列のコドン使用は、哺乳動物細胞での発現に最適化されている。Ｎ１は、ＧＦＰ配列に関連するマルチクローニング部位の位置を示す。
【００９９】
Ｆ６４Ｌ及びＥ２２２Ｇを組合わせたプラスミドを構築するために、まずｐＥＧＦＰを後述のプライマー９８５９ 及び９８６０を用いてＰＣＲに付す。プライマーは発色団領域周囲のＤＮＡ配列に相補的で、位置６５のトレオニンをセリンに変える点突然変異を導入する。さらに、プライマーは、サイレント突然変異によりユニークなＳｐｅ１ 制限部位を導入する。４．７ ｋｂのＰＣＲ生成物をＳｐｅ１で消化し、再連結し、大腸菌に形質転換する。得られたプラスミドをＰＳ３９９とする。このプラスミドは、発色団配列６４−ＬＳＹＧ−６７を含む。プラスミドＰＳ３９９を、後述のプライマー０２２５ と０２２６ でＰＣＲを用いてクイックチェンジ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に付す。これらのプライマーは、ＧＦＰのＣ−末端近くの配列に相補的で、２２２位置のグルタミンをグリシンに変え、さらにサイレント突然変異によりＡｖｒ２制限部位を導入する。得られたプラスミドを、ＰＳ６９９とする。それにより、ＬＳＹＧ発色団をＥ２２２Ｇと組合わせる。
【０１００】
９８５９−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）： ５’−ＴＧＴＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡ−３’
９８６０−ボトム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４）： ５’−ＣＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣ−３’
０２２５−ボトム（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５）：
５’−ＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴＣＧＣＧ−３’
０２２６−トップ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６）：
５’−ＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＡＧＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧ−３’
【０１０１】
【表３】
2004500835.tif 000004
【０１０２】
実施例２：　プローブにより受けた変化のインビボ発現、視覚化及び測定
トランスフェクション及び細胞培養：
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、供給源の推奨する方法にしたがってトランスフェクション剤ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ， ＵＳＡ）を用いて上記の実施例１に記載のプラスミドでトランスフェクトする。Ｇｌｕｔａｍａｘ−１、１０ ％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ μｇ ペニシリン−ストレプトマイシン混合物ｍｌ−１ （ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋからの供給）を有する成長培地ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 栄養ミックス中に１ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８ 硫酸塩（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、安定なトランスフェクタントを選択する。３７℃で１００％湿度かつ ５％ ＣＯ２を補足した通常の雰囲気ガス条件で細胞を培養する。
個々の細胞を単離し、それらを、１ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８ 硫酸塩を有する新鮮な培養培地を含む滅菌培養フラスコに除くことによって安定的にトランスフェクトした細胞の混合群から、特定の性質を有するクローン細胞系をサブ培養する。
【０１０３】
蛍光顕微鏡用に、少なくとも２４時間Ｌａｂ−Ｔｅｋチャンバーカバーガラス （Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ ＵＳＡ）に細胞を接着させ、次いで約８０％の集密まで培養する。また、画像化目的のため、細胞をプラスチックの９６−ウェルのプレート（Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ Ｐａｃｋａｒｄ ９６−Ｖｉｅｗ Ｐｌａｔｅ 又は Ｃｏｓｔａｒ Ｂｌａｃｋ Ｐｌａｔｅ、透明な底；双方とも処理組織培養タイプ）で成長させることができる。実験前に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ μｇ ペニシリン−ストレプトマイシン混合物ｍｌ−１ 及び１０ ％ ＦＢＳを有するＨＡＭ Ｆ１２培地中でＧ４１８ 硫酸塩なしに細胞を一晩培養する。この培地は自身の蛍光発光が低く、インキュベーターからの直接な細胞の蛍光顕微鏡検査を可能にする。特に特定の細胞成長因子の存在に関して所定の組成の培地を要する試験のため、画像化前に、ＨＡＭ’ｓ培養培地を、３．６ ＫＣｌ、１４０ ＮａＣｌ、２ ＮａＨＣＯ３、０．５ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ ＭｇＳＯ４、１．５ ＣａＣｌ２、１０ Ｈｅｐｅｓ、５ グルコース、ｐＨ７．４を（ｍＭで）含む生理緩衝溶液（ＫＲＷ緩衝液）で置換する。
【０１０４】
共焦点画像：
共焦点画像を、４８８ｎｍでのアルゴンイオンレーザー放出励起光を備えるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ４１０ 顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて回収する。 光において、行路はＦＴ５１０二色性ビーム分割器及び５１５ ｎｍ 長−行路フィルター又は５１０〜５２５ ｎｍの帯域放出フィルターである。画像は、一般的にＦｌｕａｒ ４０Ｘ， ＮＡ： １．３ 油浸対物レンズ、（このレンズに最適な）１０単位値に設定した顕微鏡の共焦点開口を用いて回収する。ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ及びＨＳＰＤＥ４Ａ４− Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰ プローブを含むＣＨＯ細胞の一般的領域を、それぞれ図１、 ２、３及び４に示す。
【０１０５】
経時的（ｔｉｍｅ ｌａｐｓｅ）シークエンス及び分析：
時間中（経時的）の生細胞の画像シークエンスを、Ｆｌｕａｒ ４０Ｘ， ＮＡ： １．３ 油浸対物レンズを備え、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣＨ２５０ 電荷結合素子 （ＣＣＤ）カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ ＵＳＡ）に結合したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍ蛍光顕微鏡を用いて集める。細胞を、１００ Ｗ ＨＢＯ アーク灯で照らす。光において、行路は４７０±２０ ｎｍ 励起フィルター、５１０ ｎｍダイクロイックミラー及び最少の画像バックグラウンド用の５１５±１５ ｎｍ 放出フィルターである。細胞を誂えた段階ヒーターで３７℃に維持する。
シークエンス中の各連続画像に同一の座標又は画素にわたって明確に定めた興味領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ （ＲＯＩ））を用いる画像シークエンスから、経時的な反応プロフィルを抽出する：画素値を合計し、各画像で ＲＯＩに対して平均し、得られた値を画像数にプロットして、所定のシークエンス領域に対する経時的な反応プロフィルを得る。ＲＯＩには、多くの細胞、単細胞又は単細胞内の領域を含めることができる。
【０１０６】
自動画像化及び分析：
トランスフェクトしたプローブの細胞分布の変化を画像にし、自動的に定量することができる。この目的のため、細胞をほぼ８０％〜９０％の集密までカバーガラスチャンバー又はプラスチックの９６−ウェルプレートで培養し、関連処理を行い、反応させる。反応段階の最後に、３０分〜２時間４％ ホルムアルデヒド緩衝液（Ｌｉｌｌｉｅｓ 固定緩衝液、ｐＨ７．０： Ｂｉｅ ａｎｄ Ｂｅｒｎｔｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）で細胞を固定し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）で洗浄する。１０分２５℃でＰＢＳ中１μＭの Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ） で核のＤＮＡを染色し、次いで２回ＰＢＳで洗浄する。自動画像を、Ｎｉｋｏｎ Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ２０Ｘ／０．５ＮＡ 対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ３００ （Ｎｉｋｏｎ， Ｊａｐａｎ）で回収する。基本顕微鏡は、自動化した試験片の足場と自動化した焦点制御（Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｆｕｌｂｏｕｒｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）、励起フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｖａｔｏ ＣＡ ＵＳＡ）及びＫＡＦ１４００ ＣＣＤ チップを有するＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＰＸＬシリーズカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ ＵＳＡ）を備える。これらの各品目を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ７２００／９０コンピューター（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ， Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ， ＣＡ ＵＳＡ）の制御下とした。足場位置、焦点、励起フィルター選択及び画像補足の自動化は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＩＰＬａｂ スペクトル下で作動する、内部に書き込まれたマクロス（ｍａｃｒｏｓ）（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ， Ｆａｉｒｆａｘ， ＶＡ ＵＳＡ） を用いて行う。１００ Ｗ ＨＢＯ ランプから、蛍光照明を生じる。最初に３４０／１０ ｎｍ 励起フィルターを用いて、次に４７５ＲＤＦ４０ 励起フィルターを用いて、画像を対で回収する（Ｃｈｒｏｍａ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， Ｖｅｒｍｏｎｔ）。双方の画像を同じダイクロイック放出フィルターで回収し、ＥＧＦＰ用途（ＸＦ１００ フィルターセット， Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， Ｖｅｒｍｏｎｔ）用に最適化する。核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８）画像用のフィルターの選択が色素のスペクトル特性に十分に合っていなければ、画像強度が低下し、同じダイクロイック放出フィルターを用いて双方の画像を回収できることによって、方法のスループットが大きく改善される。これにより、２つの異なるフィルターセットを用いることに起因し、捕捉方法にさらに数段階を要し、克服するのに広範囲な画像処理を要する画像の登録問題及び焦点シフトの問題が排除される。
【０１０７】
必要な画像を以下のとおり回収する： ４個の８−ウェルのカバーガラスチャンバーを含むホルダー又は１つの９６−ウェルプレートを顕微鏡に載せる。プログラムを開始し、第１ウェルの細胞を位置に動かし、技師により手動で粗く焦点を合わす。３４０／１０ 励起を用いる自動焦点の機械的操作で、微細に画像の焦点に合わす。画像を捕捉し、この励起波長で蓄積し（核の画像）、次いで第二画像を捕捉し、長い波長励起で蓄積する（ＧＦＰ画像）。足場を自動的に再度位置付け、顕微鏡の焦点を再度自動的に合わせ、同一ウェル内で第二画像対を捕捉する。この方法を、第一ウェルについて数回（一般に４〜８回）繰り返す。次に、足場を画像位置の隣のウェルに進め、数セットの画像対が各細胞ウェルから捕捉されるまで、方法を繰り返す。
【０１０８】
ＩＰＬａｂ スペクトルソフトウェアで作動する一組のマクロスを用いて、以下のようにして画像対を自動的に分析する： 最初に、核の画像対をデジタルフィルターでフィルターにかけ、同時に縁をシャープにし、核の強度の相違を抑制する。フィルターの選択及びフィルターの定数（ｆｉｌｔｅｒ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、種々のデータセットで実験中に到達された。フィルターにかけた画像を、次いでこの閾値未満の画素が核領域内にないように、またこの閾値より上の画素が核領域内にあるように、所定の強度値でセグメントに分ける。次に、核と核ではない他の対象物とを十分に正確に識別するように予め決定した領域である、ある領域より大きいかある（異なる）領域より小さい隣接領域を除いた後、閾値より上の隣接領域を計測する。最終的な総数は、その範囲で見積もられる核数である。各対のＧＦＰ画像を、次いで実験的に選択したフィルターでデジタルフィルターにかけ、このバックグランドに関して明るいポイント（ｂｒｉｇｈｔ ｐｏｉｎｔ）−様対象物の強度を減じながら、ＧＦＰの一般的な非局在化分布による強度の変動を抑制する。次いで、このフィルターにかけた画像を、スポットである可能性の高い（閾値より上の）画素及びスポットではない可能性の高い（閾値未満の）画素に画像を分けるよう実験的に測定した閾値でセグメントに分ける。スポットの特性を示していることが予め決定された、ある形態学的特性を持たない領域を除いた後、閾値より上の画素の隣接領域を計測する。各対について核の計測に対するスポットの計測の割合は、画像対における細胞当たりの平均スポット数の予測を示す。画像対全てをこうして処理し、最終的な値図を用いて、所定の処理に対する細胞の反応を確立する。自動画像実験から得られるデータを、図１５〜３０及び３５〜３７に示す。
【０１０９】
実施例３：　ロリプラム処理によって生じるプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰの再分布
この実施例は、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現されるようなＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブの物理特性及び挙動にロリプラムが如何に影響を及ぼすかを示す。
安定的にトランスフェクトした（非−クローン）細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地中でチャンバーカバーガラスに接着させる。いったん接着させたら、２ μＭ ロリプラム （４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−２−ピロリドン； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） を培地に加え、細胞を３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベートする。ロリプラムを添加してから一定時間で、ＧＦＰ蛍光の細胞分布変化について細胞を蛍光顕微鏡でチェックする。
【０１１０】
これらの実験は、多くの細胞における蛍光の一般的な細胞質分布は、細胞質内の幾つかの別個のスポットに局在する明白な濃度の（ｂｒｉｇｈｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）蛍光からなる分布に徐々に変わり、幾つかの蛍光は（核ではない）残りの細胞質に依然として均一に分布していることを示している。共通のパターンは、細胞核を横切って正反対に分かれた蛍光のわずか２個の主要な蓄積の存在であると思われる（図５）。スポットは、ロリプラムが存在しつづける限り、細胞内で安定である。
スポットは、２ μＭのロリプラムを加えてから約３時間後に視覚化し始める。作用は、１００μＭ〜０．５ μＭの範囲にわたる濃度のロリプラムで性質上、類似している。５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで細胞を予備処理することによって、ロリプラムで誘導されるスポットの形成が妨げられので、タンパク質合成がスポット形成の必要要素であることが分かる。いったんスポットが生じたら、ロリプラムの除去により３７℃で６０分以内に迅速な分解が生ずる。しかし、ロリプラムの置換は、６０分以内に、再形成のための明るいスポットも生ずる。これは、これらの細胞におけるロリプラムによるスポットのデノボ生産について認められるものよりもかなり迅速である。
【０１１１】
これらの実験は、スポットが、合成され、蓄積されるのに時間を要するアンカータンパク質の周囲につくられることを示している。ロリプラム処理したＰＤＥ４は、この蓄積に必要であると思われる。蓄積がいったん生じると、アンカータンパク質は少なくとも４時間のあいだ細胞内で依然として安定である。
図６は、プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰでトランスフェクトした単一の始原細胞から誘導されるクローン細胞群のロリプラム２μＭに対する同種の応答を示す− ９５％より多くの細胞がロリプラムに曝してから６．７時間後に明るいスポットを生じた。１０％ ＦＢＳの存在は、ロリプラム処理に応じた明るいスポットの形成に必要ではない（図６）。
【０１１２】
実施例４：　 ロリプラム処理によって生じるプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ及びＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰの再分布
この実施例は、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現されるようなＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ 及びＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰのプローブの物理特性と挙動に如何にロリプラムが影響を及ぼすかを示す。プローブの挙動変化は蛍光画像化により容易に測定でき、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムに対して同様の特性を有する化合物の検索にこの方法を用いることができる。野生型酵素に４Ａ４ 変異体の挙動を比較すると、分子のどの領域がロリプラムの反応をもたらす上で重要であるかが示される。
安定的にトランスフェクトした（非クローン）細胞は、１０％ ＦＢＳを含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中でチャンバーカバーガラスに接着させることができる。いったん接着したら、２ μＭ ロリプラム （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を培地に加え、さらに３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気で細胞をインキュベートする。ロリプラムの添加から一定時間で、ＧＦＰ蛍光の細胞分布変化について、細胞を蛍光顕微鏡で確認する。
【０１１３】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞と同一の初期外観を有し（図３）、次いで、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトしたのと同様な方法で３ μＭのロリプラムでの処理に反応させたところ（図７）、ＬＲ２と称される酵素領域の欠失がロリプラムの反応を排除しないことが分かった。ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞は、図４に示す外観を有した。その後、ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳで２３．５時間 １００μＭのロリプラムで処理したところ、わずか約１５％の細胞にスポットが現れる（図８）。この結果は、酵素の触媒溝に局在するタンパク質の一次配列において５０６位置のヒスチジンは、ロリプラムの反応に必須であることを示している。ｃＡＭＰの酵素のＫｍは１１倍増し、その結果その活性は約９０％まで低下するが、このヒスチジンの突然変異は、視覚的には変化していないヒトの組換えＰＤＥ４Ａ 酵素の短縮型についてロリプラム結合親和性を残すことが知られている（Ｊａｃｏｂｉｔｚら、１９９７）。したがって、結論から、酵素の触媒溝内でのロリプラムの結合は、５０６位置のこの重要なヒスチジン残基の存在に依存した機序を介して細胞分布及びＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ とＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰのプローブの挙動の変化を起こすことが推論される。ｃＡＭＰとロリプラムに同時に結合する酵素の能力は、細胞でのスポットの形成にも重要であり得る。
【０１１４】
実施例 ５：　直接ＰＤＥ４酵素を阻害することが知られている幾つかの化合物、又はロリプラムによって阻害されることが知られている工程での処理の ＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＧＦＰの細胞分布に対する作用
この実施例は、ＰＤＥに対して全体的に又は特異的に阻害活性を有するか、及び／又は確定した抗炎症性もしくは抗欝特性を有する種々の化合物が、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現されるようなＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの物理特性と挙動に如何に影響を及ぼすかを示す。これらの実験結果は、化合物で処理した後のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの細胞分布の変化を用いて、哺乳動物、特にヒトにその化合物を投与したことによる生物学的活性及び治療上の結果を予測あるいは推測できることを示している。
【０１１５】
安定的にトランスフェクトした（クローン及び非クローン） ＣＨＯ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中のチャンバーカバーガラスに接着させることができる。いったん接着したら、化合物を各試験チャンバーに一回加え、細胞をさらに３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベートする。化合物を添加してから一定時間後、ＧＦＰ蛍光の細胞分布変化について蛍光顕微鏡で細胞を調べる。異なる化合物は、これらの細胞でのＧＦＰ蛍光パターンに異なる変化を引き起こす。
化合物トレキニジン（ＨＬ−７２５； ９，１０−ジメトキシ−２−メシチルイミノ−３−メチル−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン）及びエタゾレート（ＳＱ２０００９； １−エチル−４−［（１−メチルエチルイデン）ヒドラジノ］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル、ＨＣｌ； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）はいずれも、これらの酵素の特異的阻害剤ではないが、ＰＤＥ４に何らかの阻害活性を有する； ＰＤＥ４に対するトレキニジンのＩＣ５０値は１μＭ （Ｓａｌｄｏｕら； １９９８） 及びエタゾレートのＩＣ５０値は２ μＭ （Ａｈｌｕｗａｌｉａら； １９８２）である。化合物は、いずれもＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトしたＣＨＯクローン細胞でスポットの形成を引き起こさない。
【０１１６】
ロリプラムに構造上無関係の選択的ＰＤＥ４阻害剤（ＰＤＥ４に対してＩＣ５０ １μＭ）であるデンブフィリン（ＢＲＬ ３０８９２， Ｂｅｅｃｈａｍ）は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞でスポットを生じる（図９）。それが生じるスポットは、あまり有効ではないが、ロリプラム処理によって誘発されるスポットと区別できない；わずか４０％の細胞が、化合物１０μＭで２４．５時間後にスポットを生じる。
ＲＳ ２５３４４も、ロリプラムに構造上無関係のＰＤＥ４酵素の特異的阻害剤で、ＰＤＥ４に対して０．０００２８μＭのＩＣ５０ を有する（Ｓａｌｄｏｕら； １９９８）。０．０３μＭのＲＳ２５３４４では、スポットは、２４．５時間後にＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトしたクローン細胞の約４０％で現れた（図１０ａ）。スポットは、ロリプラムによって生じるスポットと区別できない。同様の条件下、１μＭの化合物が、９５％より多くの細胞で、極めて大きく明るいスポットを生じる（図１０ｂ）。
【０１１７】
ＰＤＥ４酵素の特異的阻害剤であるＲＰ ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔとしても公知； Ｒｈｏｎｅ− Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、０．３ ｎＭ〜３μＭの範囲にわたって試験すると、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトしたクローン細胞にスポットを生じない。ＰＤＥ４ に対するＲＰ７３４０１のＩＣ５０は、０．３ ｎＭ （Ｓａｌｄｏｕら、１９９８）である。０．００１μＭのＲＰ７３４０１を加えたロリプラム （２μＭ）は、５％未満の細胞に７．５時間でスポットを生じる（図 １１ｂ）。ＲＰ７３４０１が存在しない以外は同様の条件下では、９５％より多い同一細胞が、その細胞質に明るいスポットを生じて２μＭのロリプラムに反応する（図１１ａ）。０．００３μＭの ＲＰ７３４０１では、２μＭの ロリプラムはこれらの細胞にスポットを全く誘発できない（図１２）。さらに、２μＭのロリプラムのみで［ロリプラム＋ ＲＰ７３４０１］を置換した後にスポットが現れるには４時間以上かかり、ロリプラムとＲＰ７３４０１双方の存在下では、アンカータンパク質が蓄積しないことを示している。
【０１１８】
ロリプラム−様化合物Ｒｏ−２０−１７２４ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、ＩＣ５０が２μＭのＰＤＥ４酵素の特異的阻害剤である（Ｒｕｂｉｎら； １９９１）。１０μＭでは、Ｒｏ−２０−１７２４のスポットは、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトしたクローン細胞の約８０％に４．５時間後に現れる（図１３）。スポットは、ロリプラムによって生じるスポットと区別できない。
非選択的なＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸ （Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ） ５００μＭで非クローン細胞をインキュベーションすると、１４時間のインキュベーション後にわずか約５〜１０％の細胞で認識できるスポットが生じる。これらのスポットは、ロリプラムの存在下で形成されるスポットより各細胞内で小さく数が多い（図１４）。ＩＢＭＸは全ＰＤＥの一般的な阻害剤で、したがって、その存在は処理細胞におけるｃＡＭＰレベルを上昇させる。それは、ＰＤＥの他のファミリーの活性に影響を及ぼさないＰＤＥ４の選択的阻害剤には該当しない。
【０１１９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、１０％ ＦＢＳ が存在又は不在で、５００ μＭ のテオフィリン（一般的なＰＤＥ阻害剤）、又は１００μＭのカフェイン（弱い一般的なＰＤＥ阻害剤）、又は１０μＭのミルリノン（強力なＰＤＥ３阻害剤であるが、ＰＤＥ４に対するＩＣ５０が約１０μＭであることが報告されている）又は０．５μＭのクリオスタマイド（有効なＰＤＥ３阻害剤、ＩＣ５０ ７０ ｎＭ）又は１００μＭのザプリナスト（有効なＰＤＥ５阻害剤、ＩＣ５０ ０．４μＭ）又は４００μＭのサリドマイド（作用様式が特定されていない抗−炎症化合物）を有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２での処理時、スポットを生じない；これら全てのインキュベーションを１〜２４時間にわたって注意深く観察したところ、スポットは生じない。テオフィリン、カフェイン、ミルリノン、クリオスタマイド又はザプリナストのいずれかに加えて２μＭのロリプラムで処理した細胞（前記と同一濃度、同一の処理回数及び条件）は、２μＭのロリプラムのみでの処理時と同数で同タイプの明るいスポットを形成する。
【０１２０】
また、ＰＤＥ阻害剤をＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞と単にインキュベートするこれらの実験は、ロリプラムによって生産されるのと同様のスポットのこれらの細胞における形成は、ＰＤＥ４の有効かつ特異的な阻害剤であるＰＤＥ阻害剤の特定のサブクラスのみに明らかに関連していることを示している。実施例は、これらの細胞でのスポットの形成能について化合物のスクリーニングを用いて如何にＰＤＥ４阻害剤を同定し得るか、また同定された化合物がロリプラムに同様の特性を有することを示している。さらに、実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ−トランスフェクト細胞を用いてロリプラムがスポットを形成するのを妨げる化合物を如何にスクリーンするか、またこうして同定されるこれらの化合物、例えばＲＰ７３４０１が、ロリプラムと異なる性質を有する有効かつ特異的なＰＤＥ４阻害剤であることを示している。
【０１２１】
実施例６： ＣＨＯ 細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの細胞分布に対するロリプラム、ＲＳ２５３４４ 及びＲｏ ２０ １７２４の作用の定量評価
この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞における細胞当たりのスポット数が、如何にしてＰＤＥ４−特異的阻害剤で用量依存的に増すか、この量が自動画像化で容易に測定できること、及びこのような測定からの用量反応データにより、治療上の適用におけるこれらの化合物の生物学的有効性に極めて類似したＥＣ５０値が得られることを示している。
【０１２２】
図１５は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトした安定的なクローンＣＨＯ細胞系に対する３つの異なるＰＤＥ４阻害剤に応じたスポット形成についての用量反応曲線を示す（スポットアッセイ）。３つの阻害剤は、ロリプラム（▼）、ＲＳ２５３４４ （■）及びＲｏ ２０−１７２４ （●）である。異なる阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞からとった平均である。細胞を２３．５時間、１０％ ＦＢＳと種々の濃度の阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長させる。次に、細胞を４％ ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７） で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、２５℃で１０分ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動化画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、ロリプラムについて０．３４μＭ、ＲＳ２５３４４ について０．０１７μＭ及びＲｏ ２０−１７２４について３．７７μＭのＥＣ５０値とした。
【０１２３】
実施例７： ＣＨＯ細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ 及びＨＳＰＤＥ４Ａ４− Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブの細胞分布に対するロリプラムの作用の定量評価
この実施例は、野生型及び突然変異型のＨＳＰＤＥ４Ａ４にＥＧＦＰの種々のＮ１融合物でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において、種々の濃度のロリプラムで誘発される細胞当たりのスポット数の測定を用いて、ロリプラムの反応の感度における酵素の一次配列の異なるアミノ酸の重要性を如何に定量できるかを示している。
【０１２４】
図１６は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ（●）、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ （▽）及びＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ− ＥＧＦＰ （▼）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の３つの安定なクローン細胞系におけるロリプラムに応じたスポット形成についての用量反応曲線を示す。各濃度について細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞からとった平均である。細胞を２３．５時間、種々の濃度のロリプラムと １０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長させる。次に、細胞を４％ ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、２５℃で１０分ＰＢＳ中１ μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動化画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、ＥＣ５０値を、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブについてロリプラム０．３４μＭ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ プローブについてロリプラム０．４１μＭとした。ＨＳＰＤＥ４Ａ４ −Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰ プローブについては、突然変異がこのクローン細胞系のロリプラムにほぼ無反応性にするので、ＥＣ５０値を測定できない。
【０１２５】
実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４のリンカー領域２（ＬＲ２）中の領域Ａｌａ−３１３〜Ｇｌｎ−３２０ からなる８アミノ酸残基を欠失すると、ロリプラム−誘導スポット形成が野生型プローブの場合と比してあまり変化しないことを示している。しかし、アスパラギンへのヒスチジン５０６の突然変異（Ｈ５０６Ｎ）はロリプラムに対する感度をほぼ完全に失わせ、これが、ロリプラムによって活性化されるスポット形成を生じさせるためのタンパク質で必須の残基であることを示している。
【０１２６】
実施例８：　ＣＨＯ細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブの細胞分布に対するロリプラム、ＲＳ２５３４４ 及びＲｏ ２０−１７２４の作用の定量評価
この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で異なるＰＤＥ４阻害剤により細胞当たりに生じるスポット数が、ロリプラムが相互作用するものと異なる、ＨＳＰＤＥ４Ａ４で一組のアミノ酸残基と相互作用する化合物の発見に如何に有用であるかを示している。
【０１２７】
図１７は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する３つの異なるＰＤＥ４ 阻害剤に応じたスポット形成についての用量−応答曲線を示す。３つの阻害剤は、ロリプラム （▼）、ＲＳ２５３４４ （■）及びＲｏ ２０−１７２４ （●）である。異なる阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞からとった平均である。細胞を２３．５時間、種々の濃度の阻害剤と１０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長させる。次に、細胞を４％ ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、２５℃で１０分ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動化画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。ＲＳ２５３４４についての一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、０．１２５μＭのＥＣ５０値とした。ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのＨ５０６Ｎ変異体を含むこれらのクローン細胞は、試験した濃度に関し２つの他の阻害剤にほぼ無反応性である。
【０１２８】
データは、ＲＳ２５３４４が、スポットを生じさせるのに５０６位置のヒスチジンの存在を要しない点でロリプラム及びＲｏ ２０−１７２４と極めて異なることを示しており、これは、ＲＳ化合物が、 ロリプラムとＲｏ ２０−１７２４が相互作用するのと異なる一組のアミノ酸と相互作用していることを示している。したがって、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ− ＥＧＦＰプローブを用いるスポット生産アッセイにより、ロリプラム及びロリプラム−様化合物とはこの点で異なる他の化合物を同定することができる。
【０１２９】
実施例９：　 ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞でのロリプラムのスポット形成能に対するＲＰ７３４０１の作用の定量評価
この実施例は、スポットアッセイを競合的に行って、ロリプラムのスポット形成能を干渉する特異的なＰＤＥ４阻害剤の化合物を同定できること、及びスポットアッセイを用いて、そのような化合物の競合強度を定量できることを示している。
【０１３０】
図１８は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系におけるロリプラム−誘導スポット形成についての競合的な用量−反応曲線を示す。細胞を、固定濃度の２ μＭ ロリプラム 及び異なる濃度の特異的なＰＤＥ４阻害剤ＲＰ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）を用いて誘発試験する。異なる阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞からとった平均である。細胞を２３．５時間、２μＭのロリプラムと種々の濃度のＲＰ７３４０１と１０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長させる。次に、細胞を４％ ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７） で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、２５℃で１０分ＰＢＳ中１ μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動化画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。
２μＭのロリプラムでの処理に起因して通常生じるこれらの細胞のスポット形成反応の５０％を阻害するには、約０．００３μＭのＲＰ７３４０１で十分である。
【０１３１】
実施例１０：　低及び高スループットにおける時間反応プロフィルとして測定される、フォルスコリンを加えた３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）での処理後のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのロリプラム−誘導分布による作用
この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブのロリプラム−刺激蓄積又は大きなスポットが、トランスフェクト細胞でｃＡＭＰレベルを増す化合物の作用によって如何にして固定化され、分散され得るかを示している。このような処理は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの結合型を転位し得る新規化合物の検索を意図したスクリーニングアッセイで正の対照として有用であり得る。また、実施例は、蛍光顕微鏡又は蛍光画像プレートリーダー装置（ＦＬＩＰＲ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を用いる標準的な画像化技術で、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの分布の変更が如何にして定量されるかを示している。さらに、実施例は、ロリプラム−誘導スポットの分散におけるｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼの関与について幾らかの証拠を示している。また、この実施例は、ｃＡＭＰの上昇とＰＫＡの潜在的な活性化により分散を生じる化合物を除外するために、ＰＫＡ活性又は細胞のｃＡＭＰ濃度についてのアッセイが、ロリプラム−誘導スポットの分散に基づくこのＰＤＥ−転位アッセイとともに二次スクリーンとして有用であることを示唆している。
【０１３２】
スポット分散の顕微鏡評価のため、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブで安定的にトランスフェクトした（非クローン）細胞を、１０％ ＦＢＳ を含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地中のチャンバーカバーガラスに接着させる。いったん接着したら、２μＭのロリプラムを培地に加え、スポットが約８０％の細胞に生じるまで（約１２時間以上）、細胞をさらに３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベートする。次に、上記実施例２に記載されるような経時的画像化用のＺｅｉｓｓ １３５倒立顕微鏡に、チャンバーのカバーガラスを移す。実験開始から所定時スポットで、ＩＢＭＸとフォルスコリンの混合物を加え、それぞれ最終濃度を１ ｍＭ 及び５０μＭとする。画像を規則的な間隔で捕捉し、実施例２に記載されるように、反応の経時的な反応シークエンスを得る。シークエンスからの個々のフレームを、図１９ ａ、ｂ、ｃ 及びｄに示す。シークエンスの分析により、図２０ａ 及びｂに示す反応プロフィルを得た。図２０ａは、ＩＢＭＸを加えたフォルスコリンの適用後に、蛍光強度が如何にして経時的に細胞質で増すか；同時に、それぞれの明るいスポットの蛍光強度が低下することを示している（図 ２０ｂ）。全画像についての平均強度は、経時的なシークエンスの期間にわたってあまり変化しない（データ示さず）。これらの測定をひとまとめして考えると、明るいスポットは、ｃＡＭＰのサイトゾルレベルを増す処理であるＩＢＭＸを加えたフォルスコリンの影響下で細胞質に分散していることが確認される。
【０１３３】
ＦＬＩＰＲ測定の場合、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を、集密に近づくまで９６−ウェルのブラックマイクロタイタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓ ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６， Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で培養し、次いで２４時間２μＭのロリプラムで処理する。プレートを２μＭのロリプラムを加えたＫＲＷ緩衝液で洗浄する。プレートの半分を、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼに対して特に有効なキナーゼ阻害剤（ＰＫＡ， ＩＣ５０ 約５０ ｎＭ）である２μＭのＨ−８９ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で処理し、さらに２０分インキュベートする。次に、最初の１分後に５００ μＭ及び５０ μＭの各最終濃度のＩＢＭＸとフォルクスコリンを全ウェルに加え、プレートをＦＬＩＰＲ系に３７℃で作動させる。実験をさらに４５分続行し、１分の間隔で読み取る。図２１の曲線ＡとＢは、ＩＢＭＸとフォルスコリンへの反応に対する各８ウェルの平均を示す。曲線Ｂのウェルは化合物Ｈ−８９で処理し、曲線Ａのウェルは処理しない。
【０１３４】
反応レベルの相違は、上昇したｃＡＭＰによって誘発されるスポット分布にＰＫＡ阻害剤が有意な作用を有していることを示し、この処理におけるＰＫＡについての役割を示唆している。
ＰＫＡ−ＧＦＰ再分布アッセイ又はｃＡＭＰのＳＰＡ−ベースアッセイは、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブベースのロリプラム−誘導スポット−分散アッセイに有用な補助法である。というのは、それらは、ｃＡＭＰの上昇により分散を誘発する化合物をカウンタースクリーンすることができるからである。
【０１３５】
実施例１１：　ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及び／又はイオノマイシンでの処理後のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのロリプラム−誘導分布による作用
この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブのロリプラム−刺激性蓄積又は大きなスポットが、トランスフェクト細胞でサイトゾルのカルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｃｙｔ）を増し、Ｃ−型プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）を活性化する化合物の作用により如何にして固定化され、分散されるかを示している。このような処理は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの結合型を転位しうる新規化合物の検索を意図したスクリーニングアッセイで正の対照として有用であり得る。この実施例は、ＰＫＣ活性又は［Ｃａ２＋］ｃｙｔの変化についてのいずれかのアッセイが、［Ｃａ２＋］ｃｙｔの上昇と潜在的なＰＫＣ活性化により分散を生じる化合物を除外するため、ロリプラム−誘発スポットの分散に基づくこのＰＤＥ−転位アッセイと共に第二のスクリーンとして有用であることも示唆している。
【０１３６】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトした非−クローンＣＨＯ細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中のチャンバーカバーガラスに接着させ、２４時間成長させる。２４時間後、２μＭのロリプラム （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を培地に加え、さらに２４時間細胞を３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベートする。約７０％の細胞は、蛍光顕微鏡での観察時に明るいスポットを含む。
次に、０．２％ ＤＭＳＯ、２００ ｎＭ ＰＭＡ、２μＭ イオノマイシン又は２μＭ イオノマイシンを加えた２００ ｎＭ ＰＭＡのいずれかを含む２μＭ ロリプラムと１０％ ＦＢＳを加えた新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、種々の細胞を処理し、画像化前に５５分インキュベーターに戻す。図２２、２３、２４ 及び２５は、明るいスポットを有する細胞数がＤＭＳＯの制御で影響を受けず（７０％）、イオノマイシン処理で２０〜４０％に低下すること、及び全てのスポットが他の２つの処理で完全に分解することを示している。
【０１３７】
要約すれば、２μＭのイオノマイシンのみが、ＦＢＳを十分に有する（ＦＢＳ−ｒｅｐｌｅｔｅ）細胞に、但しゆっくりと不完全にＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブのロリプラム−誘導スポットを分散でき、他方、２００ ｎＭ ＰＭＡ、±イオノマイシンが、迅速かつ完全にＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの全てのスポットを分散する。
ＰＫＣ−ＧＦＰ再分布アッセイ及び／又は［Ｃａ２＋］ｃｙｔの変化を検出するアッセイ、例えばＦｕｒａ ２−ＡＭ 又はＦｌｕｏ ３−ＡＭ （いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡから入手可能）のような細胞透過性Ｃａ２＋−感受性プローブでの蛍光ベースアッセイは、［Ｃａ２＋］ｃｙｔの上昇及び／又はＰＫＣの活性化により分散を誘導する化合物を除外するので、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブベースのロリプラム−誘導スポット−分散アッセイに有用な補助法である。
【０１３８】
実施例１２：　血清−涸渇細胞内におけるイオノマイシンを加えたホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）での処理後のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのロリプラム−誘導分布による作用
この実施例は、血清が涸渇しているトランスフェクト細胞において、ＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＥＧＦＰ プローブのロリプラム−刺激蓄積又は大きなスポットが、サイトゾルのカルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｃｙｔ）を増し、及び／又はＣ−型プロテインキナーゼ（ＰＫＣ）を活性化する化合物によって通常誘導される固定化又は分散に抵抗することを示している。この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの蓄積と分散が、前記実施例に記載するロリプラム−、ｃＡＭＰ− 及び ［ＰＭＡ ±イオノマイシン］−感受性挙動に加えて、さらに別のコントロールスイッチを包含することを立証している。しかし、このスイッチは、［ＰＭＡ±イオノマイシン］で管理される挙動のみに影響を及ぼす。それ自体、系は相当に内在的な（ｉｎ−ｂｕｉｌｔ）複雑性を有し、その分析は、薬物−スクリーニングの設定で、最も多量の情報のアッセイと、所望の作用様式を有する化合物を明らかに同定し得る二次スクリーンを要する。
【０１３９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を、１０％ ＦＢＳ含有 ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中のチャンバーカバーガラスに接着させ、培地を変えずに５日間成長させ、この時まで血清を涸渇させる。４日後、２μＭのロリプラムを同一の培地に加え、さらに２２時間細胞を３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベートする。約９５％の細胞が、蛍光顕微鏡での観察時に明るいスポットを含む。
次に、ＦＢＳを加えないが２μＭのロリプラムを含むＫＲＷ緩衝液で細胞を洗浄する。次に、個々のウェルを、５００μＭのＩＢＭＸを加えた５０ μＭフォルスコリン又は２μＭイオノマイシンを加えた２００ ｎＭのＰＭＡで処理する。ＩＢＭＸを加えたフォルスコリンでの処理細胞で、１０〜２０分以内にスポットが分散し始めた（図２６ａ 及び２６ｂ）。イオノマイシンを加えたＰＭＡでの処理細胞では、４０分後ですら、細胞に存在するスポットの数や大きさはほとんど変化しないか、全く変化しない（図２７ａ及び２７ｂ）。
【０１４０】
要約すれば、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブのロリプラム−誘導スポットは、ウシ胎児血清に通常みられる物質を細胞が涸渇している際に、ＰＫＣを活性化し、［Ｃａ２＋］ｃｙｔを増す剤による分散に抵抗する。血清涸渇細胞中のスポットは、ｃＡＭＰを増す剤による分散に依然として感受性である。ロリプラム−誘導スポットを分散する化合物の一次スクリーンとして行うと、この実施例で記載されるように新鮮な培地を加えずに５日間の同一の培地で成長した時のように細胞が血清を枯渇していれば、［Ｃａ２＋］ｃｙｔを増すＰＭＡ−様化合物類をアッセイによりカウンタースクリーンする必要はない。［ＩＢＭＸ ＋ フォルスコリン］と同様に作用する剤の二次スクリーンは、そのようなスポット消失アッセイ、例えばｃＡＭＰの増加についての細胞−ベーススクリーンに依然として有用な補助法である。
【０１４１】
実施例１３：　 ＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＥＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においてロリプラムの除去によりクリアーになったスポットからスポットを再現することが認められた処理の説明、及びそのような条件下、明るい細胞質のスポットの再現を阻害する化合物を同定するアッセイにおけるＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの使用
この実施例は、ロリプラムで予め処理したがロリプラムの除去によりスポットをクリアーにした細胞でロリプラム−様スポットの再現を活性化することが分かった条件を記載する。さらに、実施例は、これらの適当な条件にある細胞におけるスポットの再現が、如何にサリドマイドの存在に感受性であるか、またこのために、そのようなアッセイを如何に用いて、同様の性質を有する化合物をスクリーンできるかを示している。
【０１４２】
第一に、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１５．５時間、１０％ ＦＢＳ及び２ μＭロリプラムを有する ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で成長させる。明るいスポットは、９５％以上の細胞に存在する。次いで、ロリプラムを細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳを加える。湿性空気中、細胞を３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻す。１５０分後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。スポットをこれらの方法で再現させる：
【０１４３】
Ａ）　ＮａＣｌを細胞に加え、培地中の塩の最終濃度を増す。図２８ａ、２８ｂ 及び ２８ｃの細胞は全て、ＮａＣｌを加えて、１００ ｍＭまでＮａＣｌ濃度を増したＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳ中のものである。２８ｃ の細胞は、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫ）の特異的阻害剤であるＳＢ２０３５８０ ５μＭでさらに処理する。図２８ｂの細胞を、湿性空気中３７℃＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻し、一方、２８ａと２８ｃの細胞を４℃に冷却する。これらの処理の４時間後、１時間室温で４％ホルムアルデヒドｐＨ ７．０を用いて細胞を固定し、画像化用にＰＢＳ緩衝液で洗浄する。多くの小さなＧＦＰ−明るいスポットが、９０％以上の冷却細胞に生じるが、インキュベーター条件に戻したもののうち（図２８ｂ）、スポットを含む細胞は５％未満である。冷却細胞と ＳＢ ２０３５８０−処理細胞（図２８ｃ）は、図２８ａの細胞よりも細胞当たりでかなり少ないが、大きく明るいスポットを含む。図３０は、培地中の塩濃度を０ ｍＭ、５ ｍＭ、５０ ｍＭ 又は１００ ｍＭまで増加させた種々のＮａＣｌ量に対するこれらの細胞の反応を示す。同じ細胞の第二群を、５μＭのＳＢ２０３５８０を加える以外は同様にして処理する。全処理物を次に冷却し、固定し、次いでＰＢＳ中１ μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、ＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するようにして細胞当たりのスポット数を分析する。細胞当たりのスポット数は、塩濃度の増加と共に用量−依存的に増加する。ＳＢ２０３５８０は、細胞当たりのスポット数を減少させる。ＳＢ２０３５８０処理による画像試験（例えば図２８ｃ）から、減少したスポット数はスポットの大きさの増大に伴うことが示唆される。
【０１４４】
Ｂ）　細胞を環境条件に置く。図２９ａの細胞を、上記のようにロリプラムで予備処理し、洗浄して上記のようにしてスポットを除く。次に、それらを、４時間の間、細胞インキュベーターよりむしろ環境条件下（通常の空気、２２〜２５℃）に置く。この時間中、培地を約２０％まで蒸発させ、培地中のＣＯ２が環境条件で平衡に達するように、培地のｐＨをｐＨ６．５からｐＨ８．１にシフトする。４時間後、最初のロリプラム処理で誘導されるものと区別できないスポットが細胞質で再現する。時間の経過につれて、スポットを含む細胞の割合が、細胞中のスポットの大きさと同様に増す。環境条件下４〜６時間後にインキュベーターへ細胞を戻すと、この作用が完全に後退される。
【０１４５】
図２９ｂの細胞を、上記の（Ｂ）に記載されるプロトコルにしたがって処理し、また　ロリプラムの除去時にサリドマイド４００μＭを与える。サリドマイドは、スポットの消失を早めると思われるが、環境条件下ではスポットの再発を阻害もする。図３１はこの作用についての用量−反応曲線で、一連の細胞をロリプラムの除去時にある濃度範囲のサリドマイドで処理している。４時間後、環境条件下で、細胞を１時間４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、ＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するようにして細胞当たりのスポット数を分析する。この実験の一連のデータを４−パラメーターのＨｉｌｌ方程式に当てはめたところ（図３１の曲線）、これらの条件下のスポットの再現に対し３３μＭのサリドマイド のＩＣ５０値が示された。
【０１４６】
また、サリドマイドは、ＮａＣｌ処理プロトコル下でスポットの再現を阻害する。上記（Ａ）に記載されるようにして１００ ｍＭ ＮａＣｌを加えて処理した細胞は、２時間後に４℃で０．８５６±０．１９５の細胞当たりの平均的なスポットカウント（±ｓｅｍ）を生じる。ロリプラムでの除去時に４００μＭのサリドマイドで処理した同様の細胞では、２時間後４℃でのスポットカウントは０．３６４ ±０．０４７である。
スポットは、細胞をロリプラムで予備処理しない限り、環境又は冷却及び塩−補足条件下、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に再現しない。これらの知見から、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞においてそれ自体でスポットを形成できないか、形成せず、これらの細胞でのスポットの形成防止においてロリプラムと直接競合できないか、競合しない、サリドマイドと同様の化合物をスクリーンする手段として、用いられるスポットを再現させることができる。このような化合物は、サリドマイド及び関連化合物に共通したある特性及び治療上の用途を共有している可能性があり、その多くは、有用な抗炎症特性とともに、ＰＤＥ４酵素に対し中程度〜強力な阻害作用を有することが知られている。
【０１４７】
実施例１４：　血清−涸渇ロリプラム−処理細胞内でのイオノマイシン処理後のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの分布による作用
この実施例は、血清−涸渇培地で長期間成長したか、又はＫＲＷ緩衝液中の血清に涸渇している細胞に限定される、ロリプラム−処理ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブのさらに別の作用を立証している。この作用は、ロリプラム−処理細胞の細胞質内で多少均一に分布していることが分かっている蛍光のみを伴い、これらの細胞に特有な大きな蛍光蓄積を伴わない。この実施例は、１以上の成分がロリプラム−処理細胞でＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの固着に関与していること、及び［Ｃａ２＋］ｃｙｔの変化に対する直接的又は間接的な感度はその成分（又は成分類）に特有であることを立証している。
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯクローン細胞を、１０％ ＦＢＳ 含有ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中のチャンバーカバーガラスに接着させ、培地を変えずに４日間成長させる。細胞を使用する３２時間前にロリプラム ２μＭを培地に加え、３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気でインキュベーションを続ける。蛍光顕微鏡で観察したところ、この時間の最後に約９５％の細胞がスポットを含む。
【０１４８】
次に、細胞を、ロリプラム２μＭを含む以外はＦＢＳを加えないで、ＫＲＷ緩衝液に洗浄する。
次に、個々のウェルを、最初に１ 又は２μＭのイオノマイシンで処理し、次いですぐ後に ５００μＭ ＩＢＭＸを加えた５０μＭフォルスコリンで処理する。１又は２μＭのイオノマイシンでの処理から１分以内に、小さなスポットが細胞の細胞質に生じる（図３２ａ 及び３２ｂ）。これは、大きなロリプラム−誘導スポットを含もうと含まなかろうと、ほぼ全ての細胞で生じる。大きなスポットは、小さなスポットの形成中には全く影響を受けない。小さなスポットは、１０〜２０分以内に自発的に消失する。ＩＢＭＸを加えたフォルスコリンを適用したところ、数分以内にスポットがクリアーになる（図３３ａ）。大きなスポットは、この処理時にも分散するが、但しゆっくりである（図３３ｂ）。小さなスポットは、血清を十分に有する細胞又は４５分以上１０％血清を与えた涸渇細胞では生じない。反応は、ロリプラムが存在しなければ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした細胞に生じない。ＨＳＰＤＥ４Ａ４− ＥＧＦＰ プローブの小さなスポットについての過渡的な出現のタイムコースは、処理細胞でイオノマイシンにより一般に誘発される過渡的なＣａ２＋のそれと矛盾がない。
【０１４９】
この実施例は、ロリプラム−阻害ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブ、又はロリプラム−阻害状態に付随する幾つかの他のアンカー成分が、Ｃａ２＋感受性であることを示唆している。大きな蓄積に対する明らかな作用はないので、細胞質中に分布するＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブを、大きな蓄積又はスポットでみられるのと異なる成分に固着させることができる。これらの条件下のＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの作用を用いて、酵素複合体のカルシウム感度を除いたり、あるいはこれらの小スポットの形成を単に妨げる化合物をスクリーンしてもよい。このような化合物は、好酸球及び他の白血球のようなプロ−炎症細胞の炎症反応の抑制に有用であり得る。
【０１５０】
実施例１５：　ロリプラムでの処理によって生じるＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰの再分布
この実施例は、ロリプラムでの処理時に細胞内でＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブが再分布すること、但し、一面では、それはＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブの作用と極めて異なることを示している。ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰは、プラスミドＰＳ４６１でトランスフェクトした以外は未処理のＣＨＯ細胞で、小さな核周囲のスポットとして蓄積する（図１ 及び３４ａ）。ロリプラムは、これらのスポットを細胞質内に分散させる（図 ３４ｂ）。　ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブは、このイソ型の転位体検索及びプローブに対するロリプラムの作用を模倣又は拮抗する化合物の発見に有用である。このような化合物は、中枢神経系における抑鬱症状及び炎症反応の治療に治療上有用であると思われる。
【０１５１】
図３４ａで、細胞は、１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地でのみ成長している； ＧＦＰの蛍光は、各細胞の核周囲細胞質内で明るい顆粒様スポットに限定される。スポットは、ゴルジ膜の周囲、膜、又は膜上で集中発生してもよい。図３４ｂで、３４ａで見られるのと同様の細胞を、２時間２μＭのロリプラムで処理した。ＧＦＰ−明るいスポットの大多数はロリプラム処理下の全細胞で消失し、細胞質が徐々に明るくなる。大きなスポットは、幾つかの細胞で完全に分布していなくとも良い。ロリプラムを洗い流すと、スポットが１．７５時間以内に再形成する。また、他の化合物はＰＤＥ４Ａ１スポット数を減少させ、これらにはＲｏ ２０−１７２４、ＲＳ２５３４４ 及び低い程度で、デンブフィリン及びＩＢＭＸが含まれるが、後者の化合物は１００μＭの後に作用を開始するにすぎない。ＲＰ７３４０１はスポットを分散せず、ＰＤＥ４の「低親和性結合部位」にのみ親和性を有する他の化合物、例えばＳＢ２０７４９９ 又はＣＤＰ８４０ （ＣｅｌｌＴｅｃｈ／Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）がＰＤＥ４Ａ１のスポットを分布できないものと予測される。
【０１５２】
この実施例は、ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブが、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで示される同一の反応又は作用を共有していないことを示す。４Ａ４及び４Ａ１ プローブは同ゲノムの多く、したがって一次タンパク質配列を共有しているので、作用の相違は、幾らかの確信をもって異なる２つの酵素のそれらの領域に帰することができる。具体的には、これらは、プローブＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰのアミノ酸１〜２２及びプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのアミノ酸１〜２６１に由来する。これらのタンパク質の残りの一次配列は、上記実施例１に記載されるプラスミドにコードされるように、同一である。
【０１５３】
実施例１６：　ＣＨＯ細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰ プローブの細胞分布に対するロリプラム、ＲＳ２５３４４、Ｒｏ ２０−１７２４、トレキニジン及びＲＰ７３４０１の作用の定量評価
この実施例は、種々のＰＤＥ４阻害剤及びＰＤＥ４阻害活性を幾らか有するＰＤＥ３阻害剤が、如何にして用量依存的に４Ａ１プローブの分布に影響を及ぼすか、あるいは分布に有意に作用しないか（この分布とその何らかの変化は自動画像化で容易に測定可能である）を示す。
【０１５４】
図３５は、ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する３つの異なるＰＤＥ４阻害剤に応じたスポット分布についての用量反応曲線を示す。３つの阻害剤は、ロリプラム、ＲＳ２５３４４ （▼） 及びＲｏ ２０−１７２４ （○）である。異なる阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。細胞を、種々の濃度の阻害剤と１０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で２３．５時間成長させる。次に、細胞を１時間４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭの Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。推測されるＥＣ５０値は、ロリプラムについて０．３５μＭ、ＲＳ２５３４４について０．００５μＭ及び Ｒｏ ２０−１７２４について３．５μＭである。これらの値は、かかる実験でスポットを形成し、ここで分布しない以外は、ＣＨＯ細胞でＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブの再分布を生じるこれらの化合物の各ＥＣ５０値に極めて近い（実施例６）。
【０１５５】
また、ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトし、但し種々の濃度のＲＰ７３４０１ （●）、特異的かつ有効なＰＤＥ４阻害剤及びトレキニジン（▽）、ＰＤＥ４に何らかの作用を有するＰＤＥ３阻害剤で処理したＣＨＯ細胞からの自動画像化によって、図３６のデータを得た。また、各濃度の異なる阻害剤に対し細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。細胞を、種々の濃度の阻害剤及び１０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で２３．５時間成長させる。次に、細胞を４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように、細胞当たりのスポット数を分析する。ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するこれらの化合物のアゴニスト活性の欠失に従って、各化合物について試験した濃度範囲にスポットは有意に分布していない。
【０１５６】
実施例１７：　ＣＨＯ細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰプローブの細胞分布に対するロリプラムを加えたＲＰ７３４０１の作用についての定量評価
この実施例は、ＲＰ７３４０１がロリプラムの作用を克服でき、用量依存的にスポットのロリプラム−誘導消失を妨げることを示している。この実施例は、４Ａ１に対するロリプラムの作用のアンタゴニストが如何にして見出されるかを示している。
【０１５７】
図３７は、トランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系におけるロリプラム−誘導スポット分布についての競合的な用量反応曲線を示す。細胞を、３μＭの固定濃度のロリプラムと、次いで異なる濃度の特異的なＰＤＥ４阻害剤ＲＰ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）で誘発試験する。異なる阻害剤の各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。細胞を、１０％ ＦＢＳと３ μＭ ロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で２０時間成長させる。この処理は、全細胞から多くのスポットを除く。次に、種々の濃度のＲＰ７３４０１を加え、さらに６時間インキュベーションを続ける。ロリプラムに対して競合するために存在するＲＰ７３４０１化合物が十分であるとき、スポットが細胞内で再形成する。ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブを発現するＣＨＯ細胞でのスポットの再現過程は、試験化合物（この実施例でＲＰ７３４０１）の添加から６０分後のような短時間後にも、又は試験化合物が十分に安定であれば、添加から２４時間後のような長時間後にも測定することができる。あるいは、ロリプラムと試験化合物の双方をこれらの細胞に同時に添加でき、インキュベーションを１〜２４時間のあいだ続ける。その後、細胞当たりのスポットカウントは潜在的なアンタゴニスト作用を再度示す。
【０１５８】
試験期間後、細胞を４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞当たりのスポット数を分析する。試験化合物の濃度の上昇が細胞当たりのスポットカウントを増す場合には、全ての場合に、その化合物を、４Ａ１に対するロリプラムの作用にアンタゴニスト作用を有するものとして定義付ける。図３７のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、３μＭのロリプラムに対するＲＰ７３４０１についてＩＣ５０を０．０１μＭとした。
【０１５９】
実施例１８：　ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ 又はＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰのいずれかのプローブでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるロリプラム及びＲＳ２５３４４のスポット生成能に対するＳＢ２０７４９９ （Ａｒｉｆｌｏ（登録商標））の作用の定量評価　この実施例は、優れた治療特性と最小限の副作用プロフィルを有する特異的なＰＤＥ４阻害剤であるＡｒｉｆｌｏ（登録商標） （ＳＢ２０７４９９）は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ 又はＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰのプローブでトランスフェクトした細胞でのロリプラム又はＲＳ２５３４４の通常のスポット形成活性を用量依存的に防止するか、又は後退させ得ることを示している。この実施例は、スポットアッセイを競合的に行って、特異的なＰＤＥ４阻害剤であり、ロリプラム−様化合物のスポット形成能を干渉する化合物を同定し得ること、及びスポットアッセイを用いてこのような化合物の競合強度を定量できることを示している。
【０１６０】
Ａｒｉｆｌｏ（登録商標）は、３０〜０．０１μＭの濃度範囲についてＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ 又はＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰのプローブでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に、独力では全くスポットを生じない。
図３８は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェトした安定なクローンのＣＨＯ細胞系におけるロリプラム− 及びＲＳ２５３４４−誘導スポット形成についての競合的な用量−反応曲線を示す。細胞を、固定濃度のロリプラム又はＲＳ２５３４４及び種々の濃度のＡｒｉｆｌｏ（登録商標）で誘発試験する。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のＲＰ７３４０１と２μＭのロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で細胞を１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞当たりのスポット数を分析する。
【０１６１】
ロリプラム５μＭに対するこれらの細胞のスポット形成反応の５０％阻害には、約３．５μＭのＳＢ２０７４９９で十分であり、酵素の触媒溝に対する２つの化合物の競合親和性又は強度がほぼ等しいことを示している。わずか０．５μＭのＲＳ２５３４４２０に対して同一の作用を生ずるには約２０μＭの高濃度のＡｒｉｆｌｏ（登録商標）が必要であることから、触媒溝の位置に対するＲＳ２５３４４の親和性の大きいことが確認される。
図３９は、スポット形成反応を二分するのに必要な Ａｒｉｆｌｏ（登録商標）の量によって分かるように、ＲＳ２５３４４の親和性は、使用されるＨＳＰＤＥ４Ａ４プローブの３つの異なる変異体に同一であることを示している。また、この結果は、Ｈ５０６が触媒溝へのＲＳ２５３４４又はＡｒｉｆｌｏ（登録商標）の結合に関与せず、このスポットに関して重要なＬＲ２領域でもないことを示している。
【０１６２】
実施例１９：　ロリプラムとＲＳ２５３４４の処理によって生じるプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ −ＥＧＦＰの再分布
この実施例は、ロリプラム及びＲＳ２５３４４が、安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現されるＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ−ＥＧＦＰ プローブの物理特性と作用に如何に影響を及ぼすかを示している。
過渡的にトランスフェクトしたか、あるいは安定的にトランスフェクトした（非クローン）細胞を、１０％ ＦＢＳ含有ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中のチャンバーカバーガラスに接着させる。いったん接着したら、ロリプラム （４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−２−ピロリドン； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）又はＲＳ２５３４４を培地に加え、さらに３７℃で５％ ＣＯ２ ＋ 空気で細胞をインキュベートする。ロリプラムを加えてから一定時間で、ＧＦＰ蛍光の細胞分布変化について、蛍光顕微鏡で細胞を調べる。
【０１６３】
これらの実験は、細胞の蛍光の全体的な細胞質分布は、徐々に、細胞質内の幾つかの異なるスポットに局在する明白な濃度の蛍光からなるものに変化し、幾つかの蛍光は、依然として残りの（核でない）細胞質内で均一に分布していることを示している。共通のパターンは、細胞の核を横切って正反対に分かれた蛍光のわずか２個の主要な蓄積の存在であると考えられる（図４０）。スポットは、ロリプラム又はＲＳ２５３４４が存在し続けている限り、細胞で安定している。
スポットは、１μＭのＲＳ２５３４４を加えてから６時間後に視覚化し始める。その作用は、１０μＭ〜０．１μＭ ＲＳ２５３４４、１００μＭ 〜１０μＭ ロリプラムの範囲にわたる濃度で性質上、類似している。細胞を５μｇ／ｍｌ のシクロヘキシミドで予備処理すると、ロリプラム及びＲＳ２５３４４で誘発されるスポットの形成が妨げられ、タンパク質合成がスポットの形成に必要な要素であることが分かる。いったんスポットが生じると、他の化合物の除去は６０分以内に３７℃で迅速に分解する。しかし、ロリプラム又はＲＳ２５３４４で置換すると、明るいスポットも６０分以内に再形成される。これは、これらの細胞でロリプラム又はＲＳ２５３４４によるスポットのデノボ合成に見られるものよりもかなり迅速である。
【０１６４】
これらの実験は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔＤ−ＥＧＦＰプローブが、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブと性質上、同様にロリプラム又はＲＳ２５３４４に反応することを示し、ＰＤＥ４Ａ４酵素へのＰＤＥ４触媒領域のカセット置換はＰＤＥ４のイソ型特異的触媒阻害剤の検索に適した方法であることを示している。ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ及びＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰのプローブの使用について記載した方法から拡張してみると、他のＰＤＥ４イソ型触媒領域のこれらのＰＤＥ４Ａプローブへのカセット置換により、ロリプラム群の化合物又はヒトに嘔吐を引き起こす可能性が低いＰＤＥ４阻害剤の群のいずれかに属すイソ型−特異的触媒阻害剤を発見することができるであろう（この後者の群のメンバーは例えばＡｒｉｆｌｏ（登録商標）及びＲＰ７３４０１である）。
【０１６５】
図４０は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔ４Ｄ−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞群の１ μＭ ＲＳ２５３４４に対する反応を示す。細胞を３２時間ＲＳ２５３４４で処理した。この安定な群の多くの細胞は、細胞質に明るいスポットのペアを形成して反応する。図４１は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔ４Ｄ−ＥＧＦＰで過渡的にトランスフェクトし、１０ μＭ ロリプラムで２６時間処理したＣＨＯ細胞を示す。異種の群の細胞画分は、細胞質に蛍光の明るいスポットを形成して反応する。
【０１６６】
実施例２０：　ＨＳＰＤＥ４Ａ４− Ｅ２２２Ｇプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるストレス−誘導スポットの再現に対するＲＰ７３４０１の作用の定量評価
この実施例は、種々の濃度のＲＰ７３４０１化合物の存在下でストレス−誘導スポットを生じるよう処理した（実施例１３参照）、ＣＨＯ細胞クローンにおける ＨＳＰＤＥ４Ａ４− Ｅ２２２Ｇプローブの作用を記載する。実施例は、（１） Ｅ２２２Ｇ型ＰＤＥ４Ａ４プローブがＥＧＦＰ型と同様に作用すること、つまりＰＤＥ４Ａ４のスポットはストレス条件下で再現すること、及び（２） ストレス条件下で再現する細胞当たりのスポット数は、ＲＰ７３４０１化合物により用量−依存的に阻害されることを立証している。
【０１６７】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｅ２２２Ｇプローブで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、１０％ ＦＢＳと３μＭ ロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で２０時間成長させる。通常はペアになった明るいスポットは、全細胞の９５％以上に存在する。ロリプラムを次いで細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ （添加物なし）を加える。湿性空気中３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり標準的なインキュベーター条件）に細胞を戻す。４時間後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。
次に、ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 中の種々の濃度のＲＰ７３４０１で細胞を処理し、３時間のあいだ環境条件（通常の空気、２２〜２５℃）に置く（ストレス処理）。この時間のあいだ、培地を約１５％まで蒸発させ、培地中のＣＯ２が環境条件で平衡に達するように、培地のｐＨをｐＨ６．５からｐＨ８．１にシフトする。３時間後、スポットが細胞質に再現する。次に、４％ ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で１５分細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１５分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞当たりのスポット数を分析する。
【０１６８】
スポットは、細胞をロリプラムで予備処理しない限り、環境条件下のこれらのＣＨＯ細胞に再現しない。スポットの再現作用は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトした細胞のそれと区別できない（実施例１３）。
図４２は、ストレス処理中のスポットの再現についての用量反応曲線を示す。ＲＰ７３４０１について予測されるＩＣ５０値は、０．３ｎＭである。この値は、この化合物によるＰＤＥ４酵素の阻害について測定したＩＣ５０値に等しい（Ｓａｌｄｏｕら、１９９８）。この結果は、ＲＰ７３４０１の作用は、ロリプラムの不在下、触媒部位への化合物の単純で可逆的な結合によって測定されるキネティクスを有するスポットの形成を妨げることを示している。
【０１６９】
実施例２１：　ＣＨＯ細胞におけるＨＳＰＤＥ４Ａ１− Ｅ２２２Ｇプローブの細胞分布に対するロリプラムの作用の定量評価
この実施例は、ロリプラムが、自動画像化によって測定されるように、用量依存的にＰＤＥ４Ａ１−Ｅ２２２Ｇプローブの分布に如何に影響しているか、及びこのプローブの反応は、ＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰプローブのそれと区別できないことを示している。
図４３は、ロリプラムで処理したＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰ プローブで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞系におけるスポット分布についての用量反応曲線を示す。各濃度のロリプラムに対する細胞当たりのスポット数は３回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２５時間成長させる。次に、４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で１５分細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１５分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞あたりのスポット数を分析する。ロリプラムについて予測されるＥＣ５０値は、０．１μＭである。この値は、ＣＨＯ細胞でＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰ プローブについて測定したＥＣ５０値と極めて類似している（０．３５μＭ、実施例１６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、ひとつの親細胞から派生したクローン群である。ＧＦＰ蛍光は、各細胞の核周囲細胞質内の明るい顆粒様−スポットにほぼ完全に限定されている。プローブは、これらの細胞の核では見えない。
【図２】
１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非クローン混合群である。ＧＦＰ蛍光は非核細胞質全体に多少均一に分布しており、この領域内の暗い部分はおそらくミトコンドリアで、ここからプローブを明らかに排除している。
【図３】
１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、ひとつの親細胞から派生したクローン群である。ＧＦＰ蛍光は非核細胞質全体に多少均一に分布しており、この領域内の暗い部分はおそらくミトコンドリアで、ここからプローブを明らかに排除している。
【図４】
１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、ひとつの親細胞から派生したクローン群である。ＧＦＰ蛍光は非核細胞質全体に多少均一に分布しており、この領域内の暗い部分はおそらくミトコンドリアで、ここからプローブを明らかに排除している。
【図５】
１０％ ＦＢＳと２μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、４２時間ロリプラムで処理した。ＧＦＰ蛍光は、約７０％の細胞群の明るいスポットに集中している。
ガイドのためのスケールとして、核の大きさは一般に８〜１５μｍの範囲である（１１μｍ ｓ．ｄ． ２．５μｍ（ｎ＝１５）の平均）。
【図６】
ＦＢＳを有しないが、２μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非クローン群から単離した単細胞から派生した。細胞を、６．７時間ロリプラムで処理した。ＧＦＰ蛍光は、９５％以上の細胞の明るいスポットに集中している。
ガイドのためのスケールとして、核の大きさは一般に８〜１５μｍの範囲である（１１μｍ ｓ．ｄ． ２．５μｍ（ｎ＝１５）の平均）。
【図７】
１０％ ＦＢＳと３μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞はクローン群で、２３．５時間ロリプラムで処理した。約９０％の細胞で、ＧＦＰ蛍光は、「野生型」プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰでトランスフェクトしたロリプラム−処理細胞で見られるのと区別できない明るいスポットに集中している。
【図８】
１０％ ＦＢＳと１００μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞はクローン群で、２３．５時間ロリプラムで処理した。わずか約１５％の細胞で、ＧＦＰ蛍光は、「野生型」プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰでトランスフェクトしたロリプラム−処理細胞で見られるのと区別できない明るいスポットに集中している。
【図９】
１０％ ＦＢＳと１０μＭデンブフィリン（ＢＲＬ３０８９２）を有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非クローン群から単離した単細胞から派生した。細胞を２４．５時間デンブフィリンで処理した。ＧＦＰ蛍光は、約４０％の細胞の明るいスポットに集中している。
【図１０ａ 及び１０ｂ】
１０％ ＦＢＳと２つの濃度のＲＳ ２５３４４を有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで２４．５時間安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像： １０ａの細胞は０．０３μＭ ＲＳ ２５３４４で処理し、１０ｂの細胞は１μＭで処理する。トランスフェクト細胞は、非クローン群から単離した単細胞から得た。ＧＦＰ蛍光は、図１０ａでは約４０％の細胞の明るいスポットに集中している。図１０ｂでは、ＧＦＰ蛍光の蓄積はかなり多く、９５％以上の細胞に存在する。
【図１１ａ、ｂ】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、クローン群である。図１１ａでは、１０％ ＦＢＳと２μＭロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で細胞を６．７時間成長させる。図１１ｂの細胞は、０．００１ μＭの特異的なＰＤＥ４阻害剤ＲＰ ７３４０１を加えたロリプラムの組合わせで７．５時間処理した。ＲＰ７３４０１は、これらのＣＨＯ細胞でロリプラム−誘導スポットの生成を阻害する； ＧＦＰ 蛍光は、５％未満の細胞群の明るいスポットに集中している。
【図１２】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、クローン群である。２μＭロリプラムと０．００３ μＭの特異的なＰＤＥ４阻害剤ＲＰ ７３４０１を組合わせた１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で細胞を７．５時間成長させる。ＲＰ７３４０１は、これらのＣＨＯ細胞でロリプラム−誘導スポットの生成を阻害する；細胞にスポットは全く形成されない。
【図１３】
１０％ ＦＢＳと１０μＭの特異的なＰＤＥ４阻害剤Ｒｏ−２０−１７２４を有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す広視野蛍光画像。トランスフェクト細胞はクローン群で、Ｒｏ−２０−１７２４ で４．５時間処理した。ＧＦＰ蛍光は、約８０％の細胞群の明るいスポットに集中している。
【図１４】
１０％ ＦＢＳと５００μＭの一般的なＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、ＩＢＭＸで１４時間処理する。ＧＦＰ蛍光は、約１０％の細胞に小さな明るいスポットを生じる。残りの細胞では、分布は細胞質に均一で、非処理細胞（図２）と区別できない。スポットを含む細胞は、それぞれが２個以上の主要な明るいスポットを含む点で、ロリプラム処理細胞（図５ 及び６）と類似していない。
【図１５】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する３つの異なるＰＤＥ４阻害剤に応じたスポット形成についての用量反応曲線。３つの阻害剤は、ロリプラム （▼）、ＲＳ２５３４４ （■）及びＲｏ ２０−１７２４ （●）である。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度の阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、ロリプラムについて０．３４μＭ、ＲＳ２５３４４について０．０１７μＭ及び Ｒｏ ２０−１７２４について３．７７μＭのＥＣ５０値を得る。
【図１６】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ （●）、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ （▽） 及びＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰ （▼）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の安定なクローン細胞系におけるロリプラムに応じたスポット形成についての用量反応曲線。各濃度に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブに対しロリプラム０．３４μＭ、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰプローブに対しロリプラム０．４１μＭのＥＣ５０値を得る。突然変異により、ロリプラムに対してほぼ無反応性になるので、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブについてはＥＣ５０値を測定できない。
【図１７】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する３つの異なるＰＤＥ４阻害剤に応じたスポット形成についての用量反応曲線。３つの阻害剤は、ロリプラム（▼）、ＲＳ２５３４４ （■）及びＲｏ ２０−１７２４ （●）である。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度の阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。ＲＳ２５３４４についての一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、０．１２５μＭのＥＣ５０値を得る。ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰのＨ５０６Ｎ変異体を含むこれらのクローン細胞は、試験した濃度について他の２つの阻害剤にほぼ無反応性である。
【図１８】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系におけるロリプラム−誘導スポット形成についての競合用量反応曲線。固定濃度２μＭのロリプラム及び異なる濃度の特異的なＰＤＥ４阻害剤ＲＰ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）で、細胞を誘発試験する。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のＲＰ７３４０１及び２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。２μＭのロリプラムでの処理に通常起因するこれらの細胞のスポット形成反応の５０％を阻害するには、約０．００３μＭのＲＰ７３４０１で十分である。
【図１９ａ〜ｄ】
図は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトした非クローンＣＨＯ細胞についての経時的なシークエンスからの４つの蛍光画像を示す。細胞を２μＭのロリプラムで２４時間予備処理し、次いで、 １μＭのＩＢＭＸを加えた５０μＭのフォルスコリンを添加する（全て１０％ ＦＢＳを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地中）。図１５ａは、フォルスコリンとＩＢＭＸの添加直前にとった。図１５ｂ、ｃ 及びｄは、その添加から ６、９ 及び２４分後である。図１５ａにＡとＢでマークした２つの興味領域を用いて、図１６ａ及び図１６ｂに示す時間プロフィルをそれぞれ（実施例２の方法にしたがって）作成する。
【図２０ａ】
図１５ａにＡとしてマークした細胞質領域に描いた興味領域（ＲＯＩ） から得た時間プロフィル。ＩＢＭＸとフォルスコリンを、画像化の開始の２分前に加える。シークエンスの各画像に対しＲＯＩ内の画素値を平均化して、曲線を得る。画像は、３０秒間隔でとる。
【図２０ｂ】
図１５ａにＢとしてマークしたひとつの明るいスポットを描くＲＯＩ から得た時間プロフィル。ＩＢＭＸとフォルスコリンを、画像化の開始の２分前に加える。シークエンスの各画像に対しＲＯＩ内の画素値を平均化して、曲線を得る。画像は、３０秒間隔でとる。
【図２１】
この図は、ＦＬＩＰＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ） ９６−ウェルプレートリーダーからの結果を示す。プレートは、２４時間２μＭのロリプラムで処理し、次いで実験操作の直前に２μＭのロリプラムを加えたＫＲＷ緩衝液に洗浄するＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を含む。タイムトレースＡ及びＢは、５０μＭのフォルスコリンを加えた５００μＭのＩＢＭＸへの反応についての各８ウェルの平均を示す。曲線Ｂのウェルは、２μＭの化合物Ｈ−８９で２０分予備処理するが、曲線Ａのウェルは予備処理していない。曲線を標準化し、緩衝液 ＋ ＤＭＳＯの対照に較正する。実験を３７℃で行い、試験化合物を最初の１分後に添加し始める。添加後の読み取りは、１分間隔で行う。反応レベルの違いは、ＰＫＡ阻害剤がフォルスコリンを加えたＩＢＭＸにより誘導されるスポットの分布に著しい作用を有することを示しており、この過程におけるＰＫＡの役割を示唆している。
【図２２】
１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、ロリプラムで４２時間処理し、１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムと０．２％ ＤＭＳＯを加えた新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で５０分さらに処理する。全て、標準的なインキュベーター条件下で処理する。ＧＦＰ蛍光は、約７０％の細胞群の明るいスポットに依然として集中している。
【図２３】
１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、ロリプラムで４２時間処理し、 １０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムと２μＭのイオノマイシンを有する新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で５０分さらに処理する。全て、標準的なインキュベーター条件下で処理する。ＧＦＰ蛍光は、約２０〜４０％の細胞群の明るいスポットに依然として集中している。
【図２４】
１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、ロリプラムで４２時間処理し、 １０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムと２００ｎＭのＰＭＡを有する新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で５０分さらに処理する。全て、標準的なインキュベーター条件下で処理する。ＧＦＰ蛍光は、細胞群の明るいスポットにはもはや全く集中していない。
【図２５】
１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で成長するプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は非クローン混合群で、ロリプラムで４２時間処理し、 １０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムと２００ｎＭのＰＭＡと２μＭのイオノマイシンを有する新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で５０分さらに処理する。全て、標準的なインキュベーター条件下で処理する。ＧＦＰ蛍光は、細胞群の明るいスポットにはもはや全く集中していない。
【図２６ａ 及び２６ｂ】
ＦＢＳがなく、２μＭのロリプラムを有するＫＲＷ緩衝液中のプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。細胞を２２時間以上血清に涸渇させる。図２６ａは処理前、図２６ｂは５０μＭのフォルスコリンと５００μＭのＩＢＭＸの添加から１８分後の細胞を示す。これは、顕微鏡段階で環境条件下で処理する。１８分後、多くの大きなスポットが細胞内に分布した。
【図２７ａ 及び２７ｂ】
ＦＢＳがなく、２μＭのロリプラムを有するＫＲＷ緩衝液中のプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。細胞を２２時間以上血清に涸渇させる。図２７ａは処理前、図２７ｂは２００ｎＭのＰＭＡと２μＭのイオノマイシンの添加から３８分後の細胞を示す。これは、顕微鏡段階で環境条件下で処理する。このプロトコル下、大きな蛍光スポットの分布はあまり著しくない。
【図２８ａ、２８ｂ、２８ｃ】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非クローン群から単離した単細胞から得た。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有する ＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で１５．５時間成長させる。明るいスポットは、９５％以上の細胞に存在する。ロリプラムを次いで細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳを加える。１５０分後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。次に、１モル量のＮａＣｌを細胞に加え、培地中の塩の最終濃度を１００ ｍＭまで増す。図２８ｃの細胞を、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫ）の特異的阻害剤である５μＭのＳＢ２０３５８０でさらに処理する。図２８ｂの細胞は、湿性空気中３７℃＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻すが、２８ａと２８ｃの細胞は４℃に冷却する。これらの処理から４時間後、細胞を４％ホルムアルデヒドｐＨ ７．０で室温で１時間固定し、画像化用にＰＢＳ緩衝液で洗浄する。多くの小さなＧＦＰ−明るいスポットが９０％ 以上の冷却細胞に生じるが、インキュベーター条件に戻したもののうち（図２８ｂ）、スポットを含むのは５％未満の細胞である。冷却細胞とＳＢ ２０３５８０−処理細胞（図２８ｃ）は、図２８ａよりも、数は極めて少ないが大きく明るいスポットを細胞当たりに含む。
【図２９ａ、２９ｂ】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。トランスフェクト細胞は、非クローン群から単離した単細胞から得た。これらの細胞を、ＦＢＳがないが、２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で１２時間成長させる。明るいスポットは、全細胞の９５％以上に存在する。ロリプラムを次いで細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ （ＦＢＳなし）を加える。図２９ｂの細胞を、さらに４００μＭのサリドマイドで処理する。細胞を、湿性空気中３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻す。６０分後、全 ＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。次に、冷却させるため、細胞を含むカバーガラスチャンバー又は９６−ウェルのプレートをさらに４時間環境条件に置き、そのあいだ成長培地を約２０％まで蒸発させる。この時間中、ＧＦＰ−明るいスポットは、サリドマイドで処理していない細胞の約５０％に再現する（図２９ａ）。スポットは、４００μＭのサリドマイドが存在するこれらの条件下では細胞の５％未満に再現する（図２９ｂ）。
【図３０】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対して加えたＮａＣｌの種々の濃度に応じたスポットの再現についての用量反応曲線。各濃度のＮａＣｌに対する細胞当たりのスポット数は２回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳと２μＭのロリプラムを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で１５．５ 時間成長させる。明るいスポットは、細胞の９５％以上に存在する。ロリプラムを次に細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳを加える。細胞を、湿性空気中３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻す。１５０分後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。種々の量の１ ｍｏｌ ＮａＣｌを次いで種々の細胞群に加え、培地中の塩の最終濃度を０ ｍＭ、５ ｍＭ、５０ ｍＭ 又は１００ ｍＭまで増す。別の細胞群を、５μＭのＳＢ２０３５８０、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤を加える以外は同様にして処理する。次に、全処理物を通常の空気中、４時間４℃に冷却する。次いで、細胞を４％ホルムアアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するようにして細胞当たりのスポット数を分析する。細胞当たりのスポット数は、塩濃度の増加とともに用量−依存的に増加する。ＳＢ２０３５８０は、細胞当たりのスポット数を減少させる。ＳＢ２０３５８０処理からの画像の検査から（例えば図２８ｃ）、スポット数の減少は、スポットの大きさの増加に伴うことが示唆される。
【図３１】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対するサリドマイドによる環境条件下のスポットの再現阻害についての用量反応曲線。各濃度のサリドマイドに対する細胞当たりのスポット数は２回の測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳ、２μＭ ロリプラム を有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で１２時間成長させる。明るいスポットは、全細胞の９５％以上に存在する。次に、ロリプラムを細胞から洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ ＋ １０％ ＦＢＳを種々の濃度のサリドマイドとともに加える。細胞を、湿性空気中３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に戻す。６０分後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。細胞を含むカバーガラスチャンバー（又は９６−ウェルのプレート）を、冷却させるためさらに４時間環境条件に置き、そのあいだに成長培地を約２０％まで蒸発させる。次に、細胞を、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中 １μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するようにして細胞当たりのスポット数を分析する。一連のデータを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、これらの条件下で３３μＭのサリドマイドのＩＣ５０値を得る。
【図３２ａ 及び ３２ｂ】
２ μＭのロリプラムで処理したプローブＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。細胞を血清に涸渇させ、次いで、３時間にわたってＦＢＳを加えていないＫＲＷ緩衝液に洗浄する。図３２ａは、処理前の細胞を示し、図３２ｂは２μＭのイオノマイシンの添加から３分後の細胞を示す。極めて多くの小さなスポットが、大きなロリプラム−誘導スポットの大きさ又は数を変えずに細胞質に現れる。
【図３３ａ 及び３３ｂ】
これらの画像は、図３２ａ及び３２ｂに示す処理から続いている。図３３ａに示す画像の７分前に、５０μＭのフォルスコリンと５００μＭのＩＢＭＸで、さらに細胞を処理する。この時まで小さいスポットが有意に分布している。フォルスコリンとＩＢＭＸの処理から２４分後までには（図３３ｂ）、大きなスポットが通常どおり分布し始める。
【図３４ａ 及び ３４ｂ】
プローブＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す共焦点蛍光画像。画像は、強度の直接比較のため、同じ顕微鏡設定で記録する。トランスフェクト細胞は、ひとつの親細胞から派生したクローン群である。図３４ａでは、細胞は、１０％ ＦＢＳを有するＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地でのみ成長する； ＧＦＰ蛍光は、各細胞の核周囲細胞質内の明るい顆粒−様スポットに限定される。図３４ｂでは、３４ａに見られるのと同様の細胞を２時間２μＭのロリプラムで処理した。大多数のＧＦＰ−明るいスポットはロリプラム処理下の全細胞で消失し、細胞質は一般に明るい。大きなスポットは幾つかの細胞では分布しない。ロリプラムを洗い流すと、スポットは１．７５時間以内に再形成する。
【図３５】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する、３つの異なるＰＤＥ４阻害剤に応じたスポットの分布についての用量反応曲線。３つの阻害剤は、ロリプラム （●）、ＲＳ２５３４４ （▼）及びＲｏ ２０−１７２４ （○）である。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度の阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、細胞を４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、ＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するようにして細胞当たりのスポット数を分析する。予測されるＥＣ５０値は、ロリプラムについて０．３５μＭ、ＲＳ２５３４４について０．００５μＭ及び Ｒｏ ２０−１７２４について３．５μＭである。
【図３６】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰ プローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系に対する２つの異なるＰＤＥ阻害剤に応じたスポットの分布についての用量反応曲線。２つの阻害剤は、特異的かつ有効なＰＤＥ４阻害剤であるＲＰ７３４０１ （●）、及びＰＤＥ４に何らかの作用を有するＰＤＥ３阻害剤であるトレキニジン（▽）である。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度の阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、細胞を４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。各々の化合物について試験した濃度範囲に関し、スポットは有意に分布していない。
【図３７】
ＨＳＰＤＥ４Ａ１−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系におけるロリプラム−誘導スポットの分布についての競合的な用量反応曲線。固定濃度の３ μＭのロリプラム、次いで異なる濃度の特異的なＰＤＥ４ 阻害剤ＲＰ７３４０１ （Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）で細胞を誘発試験する。各濃度の種々の阻害剤に対する細胞当たりのスポット数は４回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと３ μＭ ロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 培地で、細胞を２０時間成長させる。種々の濃度のＲＰ７３４０１を次に加え、さらに６時間インキュベーションを続ける。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７） で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。データを４−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、ロリプラム３μＭに対するＲＰ７３４０１のＩＣ５０を０．０１μＭとした。
【図３８】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰプローブでトランスフェクトした安定なクローンＣＨＯ細胞系におけるロリプラム−及びＲＳ２５３４４−誘導スポット形成についての競合的な用量反応曲線。５μＭのロリプラム （◇）又は０．５μＭのＲＳ２５３４４ （◆）の固定濃度と異なる濃度の特異的なＰＤＥ４阻害剤ＳＢ２０７４９９ （Ａｒｉｆｌｏ（登録商標））を用いて細胞を誘発試験する。１０％ ＦＢＳと阻害剤を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次いで、４％ ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１ 時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、ＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞当たりのスポット数を分析する。ロリプラムについての一連のデータを３−パラメータのＨｉｌｌ方程式に当てはめ、この競合におけるＳＢ２０７４９９について３．３７μＭのＩＣ５０値を得た。
【図３９】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−ＥＧＦＰ （●）、ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｈ５０６Ｎ−ＥＧＦＰ （▽）又はＨＳＰＤＥ４Ａ４−ΔＬＲ２−ＥＧＦＰ （□）のプローブで個別にトランスフェクトした３つの安定なクローンＣＨＯ細胞系における、ＲＳ２５３４４−誘導スポット形成についての競合的な用量反応曲線。細胞を、０．５μＭの固定濃度のＲＳ２５３４４と異なる濃度の特異的な ＰＤＥ４阻害剤ＳＢ２０７４９９ （Ａｒｉｆｌｏ（登録商標））で、細胞を誘発試験する。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のＳＢ２０７４９９と２μＭのロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２３．５時間成長させる。次に、４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐＨ７）で１時間細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１０分２５℃で染色し、次にＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載されるように細胞当たりのスポット数を分析する。０．５μＭのＲＳ２５３４４に対するスポット形成反応を５０％まで減少させるには、約２０μＭのＳＢ２０７４９９が必要である。
【図４０】
共焦点蛍光画像は、プローブＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔ４Ｄ−ＥＧＦＰで安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞群の１μＭのＲＳ２５３４４に対する反応を示す。細胞をＲＳ２５３４４で３２時間処理する。この安定な群における多くの細胞は、その細胞質に明るいスポットのペアを形成して反応する。
【図４１】
共焦点蛍光画像は、ＨＳＰＤＥ４Ａ４ｃａｔ４Ｄ−ＥＧＦＰで過渡的にトランスフェクトし、１０ μＭ ロリプラム で２６時間処理したＣＨＯ細胞を示す。異種群における細胞画分は、その細胞質に明るい蛍光スポットを形成して反応する。
【図４２】
ＨＳＰＤＥ４Ａ４−Ｅ２２２Ｇプローブで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞系における、種々の濃度のＲＰ７３４０１が存在するストレス処理下のスポットの再現についての用量反応曲線を示す。ＲＰ７３４０１の各濃度に対する細胞当たりのストレス−誘導スポット数は３回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと３ μＭ ロリプラム を加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２０時間成長させる。
次に、細胞からロリプラムを洗浄し、新鮮なＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ （添加物なし）を加える。湿性空気中３７℃ ＋ ５％ ＣＯ２の条件（つまり、標準的なインキュベーター条件）に細胞を戻す。４時間後、全てのＧＦＰ−明るいスポットが細胞から消失する。次いで、細胞をＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ 中の種々の濃度のＲＰ７３４０１で処理し、３時間のあいだ環境条件（通常の空気、２２〜２５℃）に置く（ストレス処理）。この時間のあいだ、培地を約１５％まで蒸発させ、培地中のＣＯ２が環境条件で平衡に達するように培地のｐＨをｐＨ６．５ からｐＨ８．１へシフトする。３時間後、スポットが細部質に再現する。
次に、４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７） で１５分細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１５分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。予測されるＩＣ５０値は、ＲＰ７３４０１について０．３ｎＭである。この値は、この化合物によるＰＤＥ４酵素の阻害について測定されたＩＣ５０値に等しい（Ｓａｌｄｏｕら、１９９８）。
【図４３】
ロリプラム処理したＨＳＰＤＥ４Ａ１− ＥＧＦＰプローブで安定的にトランスフェクトしたクローンＣＨＯ細胞系におけるスポットの分布についての用量反応曲線を示す。各濃度のロリプラムについての細胞当たりのスポット数は３回測定±ｓｅｍの平均で、各測定は１００個以上の細胞から得た平均である。１０％ ＦＢＳと種々の濃度のロリプラムを加えたＨＡＭ’ｓ Ｆ１２培地で、細胞を２５時間成長させる。次に、４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７）で１５分細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で１５分２５℃で染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄する。自動画像を回収し、実施例２に記載するように細胞当たりのスポット数を分析する。予測されるＥＣ５０値は、ロリプラムについて０．１μＭである。
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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