(57)【要約】塩基対２２７〜塩基対１８３１のオープンリーディングフレームを有する配列番号：８で示される配列、または上記配列と少なくとも５０％の相同性を有するかもしくはストリンジェント条件下で上記配列とハイブリダイズする配列、または遺伝子コードのため上記ＤＮＡ配列と縮重した配列を含む、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする配列またはそれと相補的な配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
2004500096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基対２２７〜塩基対１８３１のオープンリーディングフレームを含む配列番号：８で示される配列、または上記配列と少なくとも５０％ホモローガスであるかもしくはストリンジェント条件下で上記配列とハイブリダイズする配列、または該遺伝子コードにより上記ＤＮＡ配列と縮重している配列を含むことを特徴とする、キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする配列もしくはそれと相補的な配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項２】
β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号：８で示される配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９５％ホモローガスであることを特徴とする請求項１または２記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
１７８０〜１８８０、詳細には１８３１塩基対を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
検出可能なマーカー物質と共有結合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
該ＤＮＡ配列が欠失、挿入および／または置換突然変異を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
それぞれが少なくとも１０〜１５塩基対の長さを有し、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列部分と相補的である２配列部分を有し、リボザイムが天然のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼＤＮＡ分子により転写されるｍＲＮＡを合成し、切断することを特徴とするリボザイムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なベクター。
【請求項９】
プロモーターに対して逆方向を向いている請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なベクター。
【請求項１０】
請求項６または７に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なベクター。
【請求項１１】
ＲＮＡが植物細胞、特に葉細胞から単離され、逆転写酵素およびプライマー添加後に該ＲＮＡを用いて逆転写することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡ分子の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分子をベクタ中にクローンし、次いで宿主細胞または宿主にトランスフェクションし、活性なβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを発現する細胞系をトランスフェクションされた宿主細胞の選択および増幅により得ることを特徴とするβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのクローニング法。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれかに記載の少なくとも１つのベクターがそれぞれ該宿主細胞または植物中に挿入されることを特徴とするβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成が抑制されるかまたは完全に止まる、組換え宿主細胞、詳細には植物細胞または植物の製造法。
【請求項１４】
請求項６記載のＤＮＡ分子がそれぞれ該宿主細胞または植物のゲノム中の突然変異していないホモローガスな配列の位置に挿入されることを特徴とする、組換え宿主細胞、詳細には植物細胞または植物の製造法。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の方法に従って製造され、そのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成が抑制されるかまたは完全に止まることを特徴とする組換え植物または植物細胞。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列と相補的な塩基配列を含むことを特徴とするＰＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列に対応する塩基配列を含むことを特徴とするＰＮＡ分子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のＰＮＡ分子が挿入されることを特徴とする、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現が転写または翻訳レベルでブロックされる植物または植物細胞、詳細には植物細胞の製造方法。
【請求項１９】
請求項１５記載の系、またはそれぞれ請求項１８記載の方法に従って製造される植物もしくは細胞を該糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクションして組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換え糖タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１５記載の系、またはそれぞれ請求項１８記載の方法に従って製造される植物もしくは細胞を該糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクションして組換えヒト糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換え糖タンパク質の製造方法。
【請求項２１】
請求項１５記載の系、またはそれぞれ請求項１８記載の方法に従って製造される植物もしくは細胞を該糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクションして組換えヒト糖タンパク質を発現させることを特徴とする医療用の組換え糖タンパク質の製造方法。
【請求項２２】
請求項１９記載の方法に従って植物系中で製造され、ペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ減少植物系で発現したタンパク質に存在する５０％以下、詳細には２０％以下、特に好ましくは０％のβ１，２−結合キシロース残基を有することを特徴とする組換え糖タンパク質。
【請求項２３】
請求項２０記載の方法に従って植物系中で製造され、ペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ減少植物系で発現したタンパク質に存在する５０％以下、詳細には２０％以下、特に好ましくは０％のβ１，２−結合キシロース残基を有することを特徴とする組換えヒト糖タンパク質。
【請求項２４】
請求項２１記載の方法に従って植物系中で製造され、ペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ減少植物系で発現したタンパク質に存在する５０％以下、詳細には２０％以下、特に好ましくは０％のβ１，２−結合キシロース残基を有することを特徴とする医療用の組換えヒト糖タンパク質。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれかに記載の組換え糖タンパク質を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２６】
請求項５記載のＤＮＡ分子を試料に加え、該分子がβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と結合することを特徴とする試料中のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の選択方法。
【請求項２７】
該試料が植物または非脊椎動物生物体のゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７記載の方法に従って選択し、次いで試料から単離することを特徴とするβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子。
【請求項２９】
ｐＩ値が６．０〜９．０、詳細には７．５０〜８．００のアイソフォームを有することを特徴とする請求項１２記載の方法に従ってクローンされるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの製造方法。
【請求項３０】
ｐＩ値が７，５２のアイソフォームを有することを特徴とする請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
それぞれ炭化水素単位もしくはあらゆる糖コンジュゲートまたは糖タンパク質を含む試料に請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子によってコードされるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−キシロースを加え、キシロースがβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼによりβ１，２位でそれぞれ該炭化水素単位もしくは糖コンジュゲートまたは該糖タンパク質と結合することを特徴とするヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質のプランティファイド（ｐｌａｎｔｉｆｉｅｄ）炭化水素単位の製造方法。
【請求項３２】
例えば、植物または非脊椎動物における発現試験、またはホモローガスな配列を見つけるための、請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ、またはＤＮＡミクロアレイを用いて固定化するための部分配列または部分配列の組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、これらポリヌクレオチドを含むベクター、それぞれ該ポリヌクレオチドまたはそれから誘導されたＤＮＡでトランスフェクションされた組換え宿主細胞、植物および昆虫、ならびにこれらの系を用いて製造された糖タンパク質に関する。
【０００２】
糖タンパク質は、炭化水素の組成物および配置が異なる生物体に特徴的な種々の複雑な炭化水素単位を有する。糖タンパク質のオリゴ糖単位は多くの働きを持っており、例えば、代謝調節に重要であり、細胞−細胞相互作用の伝達に関与し、循環中のタンパク質の循環期間を決定し、抗原抗体反応においてエピトープ認識の決め手となる。
【０００３】
糖タンパク質のグリコシル化は、小胞体（ＥＲ）中で始まり、そこで、オリゴ糖はＮ−グリコシド結合によりアスパラギン側鎖にかまたはＯ−グリコシド結合によりセリンまたはトレオニン側鎖のいずれかに結合している。Ｎ−結合オリゴ糖は、３個のマンノースと２個のＮ−アセチルグルコースアミン残基からなる五糖単位由来の共通コアを含む。さらに炭化水素単位を修飾するため、該タンパク質はＥＲからゴルジ複合体に輸送される。糖タンパク質のＮ−結合オリゴ糖単位の構造は、その配座とそれらがプロセスされるゴルジ装置のグリコシルトランスフェラーゼの組成により決定される。
【０００４】
ある種の植物のＮ−グリカンのコア五糖単位は、β１，２−結合キシロースおよびα１，３−結合フコースにより置換されることが示されている（Ｌｅｒｏｕｇｅら、１９９８， Ｐｌａｓｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３８，３１−４８； Ｒａｙｏｎら、１９９８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ４９，１４６３−１４７２）。七糖「ＭＭＸＦ３」は、植物中の主要オリゴ糖タイプを構成する（Ｋｕｒｏｓａｋａら、１９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６，４１６８−４１７２； ＷｉｌｓｏｎおよびＡｌｔｍａｎｎ， １９９８， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １５，１０５５−１０７０）。これら構造は、それぞれ複合体Ｎ−グリカンまたはマンノース欠損もしくは切断型（トランケーテッド）Ｎ−グリカンとも呼ばれる。α−マンノシル残基はさらにＧｌｃＮＡｃにより置換され、これにガラクトースおよびフコースが結合してヒトルイスａ−エピトープに対応する構造を生成することができよう（Ｍｅｌｏら、１９９７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１５，１８６−１９１； Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａｉｎｅら、１９９７， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １２，１４１１−１４１７）。
【０００５】
β１，２−キシロースとα１，３−結合フコースはいずれもも哺乳動物糖タンパク質中には存在しない。β１，２−キシロースはα１，３−フコースとともに植物Ｎ−結合オリゴ糖に対する抗体のエピトープ認識に重要な役割を演じ、それによりこれらオリゴ糖に対するヒトまたは動物身体における免疫応答を誘導することがわかった （Ｆａｙｅら、１９９３， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０９，１０４−１０８）。さらに、Ｎ−グリカンを含有するβ１，２−キシロースおよび／またはα１，３−フコースは、種々の植物および昆虫アレルゲン間の広範なアレルギー性交差反応の主な原因の一つのようであり、「交差反応炭化水素決定基」（ＣＣＤ）とも呼ばれる。免疫学的交差反応がしばしば起きることにより、さらにＣＣＤはアレルギー診断を覆い隠す。
【０００６】
植物タンパク質によりヒト身体中に誘導される免疫応答は、植物を用いて製造される組換えヒトタンパク質の医療的使用における主な問題である。この問題を回避するにはβ１，２−キシロシル化をα１，３−フコシル化とともに妨げる必要があろう。ある試験によれば、複合体グリカンの生合成における第１酵素であるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの活性がない植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの突然変異体が単離された。この突然変異体における複合体糖タンパク質の生合成は妨げられる。それにも関わらず、これら突然変異体植物はある条件下では正常に発育することができる（Ａ． Ｓｃｈａｅｗｅｎら、１９９３， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２； １１０９−１１１８）。
【０００７】
他のグリコシル化工程に干渉することなくβ１，２−キシロースのオリゴ糖への伝達を特異的にブロックするには、この特異的グリコシル化を直接担う酵素、すなわちβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを単に不活化する必要があろう。植物およびある種の非脊椎動物種、例えばＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｓｐ． （Ｋｈｏｏら、１９９７， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ７，６６３−６７７）およびカタツムリ（例えば、Ｍｕｌｄｅｒら、１９９５， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３２，２７２−２８３）にのみ生じるこのトランスフェラーゼ（まだヒトまたは他の脊椎動物においてではなく）を故意に不活化して抑制し、それぞれ植物または植物細胞において生成されるヒトタンパク質がこれまでの場合のように、この免疫応答誘発エピトープをもはや含まないようにする必要があろう。
【０００８】
β１，２−キシロシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−キシロースから植物Ｎ−連結オリゴ糖のβ−連結マンノースにＤ−キシロースを伝達する。
この酵素は１９９７年にダイズミクロソームから精製された（Ｚｅｎｇら： Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２，３１３４０−３１３４７，１９９７）。この論文によれば、キシロース伝達のための最良のアクセプターはＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−Ｔであるが、３−分枝上にＧＬｃＮＡｃを有するＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もよいアクセプターである。さらに、多くの他のＮ−連結オリゴ糖、特に非還元末端にガラクトース単位を有するものはアクセプターとして不充分である。
【０００９】
Ｒａｙｏｎら、（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １９９９，１１９，７２５−７３３）の論文には、アラビドプシスタンパク質が高マンノースタイプのＮ−グリカン、およびオリゴ糖含有キシロースおよびフコースによりＮ−グリコシル化されることが記載されている。ＴＥＺＵＫＡら（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０３，４０１−４１３（１９９２））は、シカモアの懸濁培養細胞のゴルジ分画中の異なる酵素、例えばβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの活性を測定した。彼らは、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼにより内部マンノース上にキシロースが伝達されたことを証明した。さらに、彼らは、Ｎ−連結オリゴ糖含有キシロースは腹足類動物（ｇａｓｔｒｏｐｏｄｓ）およびＣｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ由来の糖タンパク質中にもみられたが、オリゴ糖含有キシロースは植物界中に広く分布することを示した。
タンパク質の特異的抑制または不活化には、これをそれぞれ転写および翻訳工程のレベルで行うことが最良である。これには、活性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を単離し、シーケンス（配列決定）する必要がある。
【００１０】
上記のように、ダイズβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼは１９９７年に単離、精製された。該キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡの部分のみが単離された（ｓ． Ｗ０９９／２９８３５ Ａ１；配列番号：６および７）が、活性タンパク質をコードする完全ｃＤＮＡはこれまで単離も特徴づけもできなかった。例えばダイズのように、生物体において該キシロシルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡの発生量は非常に低いため、これまで同定されていなかった該ヌクレオチド配列が該方法において大きな問題になるかもしれない。今まで、数グループが通常ダイズからのこの遺伝子の完全ヌクレオチド配列の同定を試みたが、通常の場合に有効であることが知られている従来の方法、例えばＲＡＣＥ−増幅（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）の助けを借りて該キシロシルトランスフェラーゼｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡを生成することができなかった。この方法を用いると、未知の配列が特異的増幅プライマーの助けを借りて増幅される。５’−ＲＡＣＥ実験が成功しなかった理由として考えられるのは、特異的ＰＣＲプライマーの不適切な選択とｃＤＮＡ合成時における逆転写酵素阻害成分の存在である。
【００１１】
単離ダイズβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの１つの問題は、その溶解性と活性が界面活性剤の存在に依存することである。
きわめて低濃度のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの問題に加えて、さらに該ＲＮＡの５’−末端の二次構造がこの領域の増幅を妨げるらしいという問題がある。これらの場合では、それ自身鋭敏な方法であるＲＡＣＥ増幅は、正しく、完全なキシロシルトランスフェラーゼ−ｃＤＮＡ配列を生じない。
もちろん、該ｍＲＮＡおよびそれから誘導されたｃＤＮＡは、非常に低濃度しか存在しないという事実に加え、種々の増幅の過程で非常に容易に組み換えられ、突然変異することも大いにあり得る。これらおよび他の考えられる理由により、この特異的遺伝子のクローニングと発現は今まで不可能であった。
【００１２】
本発明のある目的は、植物β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするする全遺伝子をクローンおよびシーケンスし、この遺伝子または変化したＤＮＡ、またはそれらから誘導されたＤＮＡを含むベクターを調製し、植物およびその細胞をこれらベクターの一つでトランスフェクションし、正常に生じるβ１，２−キシロースを含まない糖タンパク質を生成し、そのための対応する方法を提供することである。
【００１３】
さらなる目的は、β１，２−キシロースを含む同種Ｎ−グリカンまたは糖コンジュゲートをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる大量の生成組換え酵素の製造方法である。これは、植物糖タンパク質の免疫原性とアレルギー誘発性におけるβ１，２−キシロースの役割をさらに解明する助けとなろう。
【００１４】
本発明の目的は、塩基対２２７〜塩基対１８３１のオープンリーディングフレームを有する配列番号：８の配列、または上記配列と少なくとも５０％ホモローガスであるかもしくはストリンジェント条件下で上記配列とハイブリダイズする配列を含むか、あるいは該遺伝子コードにより上記ＤＮＡ配列と縮重した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ）配列、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする配列またはそれらの相補的な配列を含むＤＮＡ分子により達成される。未だかつて記載されていないこの完全配列は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性に関する実験、分析および製造方法において特に有用である。この配列は、特にβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの不活化もしくは抑制、および該組換え酵素の過剰発現と生成に用いることができる。
【００１５】
上記のごとくダイズキシロシルトランスフェラーゼ誘導ペプチドを用いてＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢデータベースを検索することにより、有意な相同性を有する数種のポリペプチド配列（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（アラビドプシス）およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）由来）が回収された。しかしながら、これら配列は別の方法では互いに、そして最終的に同定されたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ配列と関係がなかった。β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの候補配列の回収成功は、３つのダイズβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ誘導ペプチド配列を単一配列に適切に組み立てることによってのみ可能であった。当該分野の現状に従って本発明者らが用いたすべての検索戦略 （すなわち、ペプチド配列を別個にかまたは互いに組み合わせて用いる）はβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの正しい配列の回収の成功をもたらさなかった。
【００１６】
この遺伝子の単離および精製は、ＤＤＢＪ＋ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＰＤＢ−データベースを用い、ダイズキシロシルトランスフェラーゼの３つの既知ペプチドに対応する配列を検索することにより達成された （特許Ｗ０９９／２９８３５ Ａ１、配列番号：３および５）。以前にいかなるタンパク質にも割り当てられていないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのあるＤＮＡ配列が該３つのペプチドの２つとの相同性を示すことがわかった。遺伝子発見者プログラムの助けを借りて、予測タンパク質配列をみいだし、それに従ってＲＴ−ＰＣＲのための配列特異的プライマーを設計した。Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに対応する第１鎖ｃＤＮＡを生成し、次いで該第１鎖ｃＤＮＡを特に設計したプライマーを用いるＰＣＲにかけることができた。Ａ． ｔｈａｌｉａｎａキシロシルトランスフェラーゼ−ｃＤＮＡの生成が成功した理由は、一方ではＡ． ｔｈａｌｉａｎａのキシロシルトランスフェラーゼ−ｍＲＮＡが他の植物種に比べて問題性が低く、他方ではＰＣＲが最適に設計された遺伝子特異的プライマーを用いて行われたためであろう。
配列番号：８のオープンリーディングフレームは、５３４アミノ酸および理論分子量６０．２ｋＤａの、貫膜部分がおそらくＩｌｅ１１とＰｈｅ２９の間の領域に存在するタンパク質をコードする。配列番号：９の配列のコードされたタンパク質のｐＩの計算値は７．５２である。
【００１７】
植物β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの活性は、該キシロシルトランスフェラーゼをＵＤＰ−キシロースおよび標識アクセプターを含む試料に加える（例えば、糖ペプチドまたは標識オリゴ糖）方法により検出され、測定される。反応時間後、結合したキシロースの量を測定する。この場合、該キシロシルトランスフェラーゼの活性は、該活性測定値が陰性コントロールの活性測定値より少なくとも１０〜２０％、特に少なくとも３０〜５０％高ければ陽性とみなす。該オリゴ糖の構造はさらにＨＰＬＣにより証明することができよう。そのようなプロトコールは従来技術である（Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒら、１９９８， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４６，９６−１０１； Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒら、１９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９，７４５−７５１）。キシロースがアクセプター物質と結合するかしないかはさらに質量分析法により生成物の質量を測定することにより決定することができる。２つのＤＮＡ分子のペアリングは、試料の温度とイオン強度を選択することにより変化させることができる。ストリンジェント条件により、本発明の条件では正確でストリンジェントな結合が生じるものと理解される。例えば、ＤＮＡ分子を５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせ、４２℃の１％ ＳＤＳで洗浄する。
配列が配列番号：８と少なくとも５０％の相同性を有するか否かは、例えばＥＭＢＬまたはＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータバンクのプログラムＦａｓｔＤＢにより決定することができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ分子によってコードされる組換えβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼとＷ０９９／２９８３５ Ａ１に記載のダイズ由来の各酵素の間には多くの関連する違いが存在する：
１． 該組換え酵素は界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を用いることなく溶解するが、ダイズ由来酵素の溶解性は界面活性剤の存在に依存する。
２． 該組換え酵素は、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の非存在下で完全に活性である。
３． 該組換え酵素はＮ−グリコシル化されているが、ダイズ由来酵素はグリコシル化されていないと記載されている。
４． Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ由来酵素は、３２ Ｎ−末端アミノ酸を欠く切断型としても完全な酵素活性を示す。
５． ダイズ由来酵素と対照的にＡ． ｔｈａｌｉａｎａ由来酵素は広いｐＨ−最適性を有し、ｐＨ６−８の範囲で顕著な活性を示す。
６． ダイズ酵素をコードするｃＤＮＡ配列は、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａタンパク質のアミノ酸（ａａ）１９９−４６９のみに対応する。図１１参照。
７． Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ キシロシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、ダイズ酵素の部分配列と比べて２つの挿入物（推定タンパク質配列のａａ３７５−３８２およびａａ４２５−４２９に対応する）を含む。図１１参照。
８． ダイズ酵素から単離した５つのペプチド（Ｗ０９９／２９８３５ Ａｌの図４参照）はいずれもＡ． ｔｈａｌｉａｎａ由来酵素の対応領域と同一ではなかった：
ペプチド配列番号１： Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ酵素のａａ４１１−４２２とホモローガス。
ペプチド配列番号２： Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ酵素のａａ１９２−２０５とホモローガス。
ペプチド配列番号３： Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ酵素のａａ４５１−４７７とホモローガス。
ペプチド配列番号４： Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ酵素のａａ１９１−２０５とホモローガス。
ペプチド配列番号５： Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ酵素のａａ５０３−５１２とホモローガス（注：Ｗ０９９／２９８３５ Ａｌに記載のｃＤＮＡ配列はペプチド５のコーディング配列を含まない）。
【００１９】
したがって、本発明のＤＮＡ分子は、既知の精製酵素より驚くべき好都合な特性と効果を示す活性な組換え酵素をコードしているので特に好都合である。
好ましくは、本発明のＤＮＡ分子の配列は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。この特異的タンパク質はβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼに関連する分析、実験、および製造方法に特に有用である。
【００２０】
好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は配列番号：８の配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９５％ホモローガスである。この配列は特に活性なβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードする。相同性は、挿入および欠失を認識し、相同性計算においてこれらを考慮しないプログラムを用いて決定することが好ましい。さらに好都合な態様では、該ＤＮＡ分子は１７５０〜１８５０、特に１８３１塩基対を含む。
【００２１】
そうするときに、上記ＤＮＡ分子の１つが検出可能なマーカー物質と共有結合していると特に好都合である。マーカー（標識）物質として、あらゆる普通のマーカー、例えば蛍光、ルミネッセント、放射活性マーカー、ビオチンなどを用いることができる。このように、ハイブリダイゼーション法による固体組織試料（例えば植物由来）または液体試料中の対応ＤＮＡ分子の検出、選択、および定量に適した試薬を提供する。
【００２２】
好ましくは、本発明のＤＮＡ分子には、欠失、挿入および／または置換突然変異を含む配列が含まれる。突然変異体ヌクレオチドの数は変化しやすく、１個から数個の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドまで変化する。リーディングフレームは突然変異によりシフトする。そのような「ノックアウト遺伝子」では、単に、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現が妨げられ、活性な機能的酵素の形成が妨げられることが重要である。そうするときには、酵素的に活性なタンパク質の発現が妨げられる限り突然変異の部位は変動しうる。好ましくは、Ｃ末端領域に位置する該酵素の触媒領域の突然変異。ＤＮＡ配列に突然変異を挿入する方法は当業者によく知られているので、突然変異誘発の種々の可能性をここで詳細に議論する必要はない。この場合には、同時（共）突然変異誘発、および特に指向性突然変異誘発、例えば部位指向性突然変異誘発、オリゴヌクレオチド制御突然変異誘発、または制限酵素の助けによる突然変異誘発を用いてよい。
【００２３】
さらに本発明は、天然のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼＤＮＡ分子により転写される該ｍＲＮＡと複合体を形成し、開裂する、上記の本発明ＤＮＡ分子の配列部位と相補的な少なくとも長さ１０〜１５塩基対の２つの配列部位を含むリボザイムをコードするＤＮＡ分子を提供する。Ｊｏｈｎ Ｍ． Ｂｕｒｋｅの刊行物「Ｃｌｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ」（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ４１４−４１５； １９９７）はリボザイム機能の一般的様式に関する。リボザイムは、ｍＲＮＡとの相補的塩基対化によりβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡを認識するであろう。次に、リボザイムは該酵素を翻訳する前に配列特異的に該ＲＮＡを開裂し、破壊するであろう。開裂した基質から分離した後、リボザイムは、ＲＮＡ分子と反復してハイブリダイズし、特異的エンドヌクレアーゼとして作用する。一般に、該タンパク質をコードする完全なＤＮＡ配列が知られていなくても、ある種のｍＲＮＡを不活化するためにリボザイムを特に製造することができよう。リボザイムは、該ｍＲＮＡに沿って徐々に移動するならば特に有効である。その場合、リボザイムがｍＲＮＡ上の無リボソーム部位をみいだすことはより容易である。このため、遅（ｓｌｏｗ）リボソーム突然変異体もリボザイムのための系として適している（Ｊ． Ｂｕｒｋｅ， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； １５，４１４−４１５）。
【００２４】
１つの可能な方法は、種々の形のリボザイム、すなわちミニザイムを用いることである。ミニザイムはより大きなｍＲＮＡ分子を開裂させるのに特に有効である。ミニザイムは、ステム／ループＩＩの代わりに短いオリゴヌクレオチドリンカーを有するハンマーヘッドリボザイムである。二量体ミニザイムが特に有効である（Ｋｕｗａｂａｒａら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６； ９６１−９６５）。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、上記ＤＮＡ分子の１つを含む生物学的に機能的なベクターに関する。宿主細胞へのトランスフェクションには増幅することができる独立ベクターが必要であり、宿主細胞、トランスフェクションメカニズム、該ＤＮＡ分子の役目とサイズに応じて適切なベクターを用いることができる。多くの異なるベクターが知られており、それらを列挙することは本出願の限界を越えるので、特にベクターは当業者によく知られているため（本明細書で用いたベクター、すべての技術および用語は当業者に知られていると思われるため、Ｍａｎｉａｔｉｓも参照）ここ以外で行う。理想的には、ベクターは低分子量であり、ベクター含有および無ベクター宿主細胞を容易に選択できるように細胞に容易に認識可能な表現型をもたらすように選択可能な遺伝子を含むべきである。ＤＮＡおよび対応する遺伝子産物を高収量で得るには、ベクターは強いプロモーター、エンハンサー、遺伝子増幅シグナル、および制御配列を含むべきである。ベクターの自律複製にはさらに複製起点が重要である。ポリアデニル化部位はｍＲＮＡの正しいプロセシングを担い、スプライスシグナルはＲＮＡの転写を担う。ファージ、ウイルスまたはウイルス粒子をベクターとして用いる場合は、パッケージングシグナルはベクターＤＮＡのパッケージングを制御するであろう。例えば、植物における転写では、Ｔｉプラスミドが適切であり、昆虫細胞における転写にはバクロウイルスが、また昆虫ではトランスポゾン、例えばＰエレメントが適している。
【００２６】
上記本発明ベクターを植物または植物細胞に挿入する場合、内因性β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現の翻訳後抑制は、それとホモローガスな導入遺伝子またはその部分のセンス方向への転写により達成される。このセンス技術については、さらに、刊行物、Ｂａｕｃｏｍｂｅ １９９６， Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９： ３７３−３８２，およびＢｒｉｇｎｅｔｉら、１９９８， ＥＭＢＯ Ｊ． １７： ６７３９−６７４６を参照。「遺伝子スプライシング」のこの戦略は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制する有効な方法である。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： １３９５９−１３９６４も参照。
【００２７】
さらに、本発明は、プロモーターと逆方向の、上記態様の１つのＤＮＡ分子を含む生物学的に機能的なベクターに関する。このベクターを宿主細胞にトランスフェクションする場合、「アンチセンスｍＲＮＡ」は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡと相補的であり、それと複合体を形成するものと解釈されよう。この結合は、正しいプロセシング、輸送、安定性を妨げるか、またはリボソームアニーリングを妨げることにより翻訳およびβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの正常な遺伝子発現を妨げるであろう。
【００２８】
該ＤＮＡ分子の完全配列をベクターに挿入することができるかもしれないが、その部分配列もサイズが小さいためある種の目的には好都合かもしれない。アンチセンスを用いる局面では、例えば、該ＤＮＡ分子は、トランスフェラーゼｍＲＮＡと結合する十分に大きなアンチセンスｍＲＮＡを形成するように十分大きいことが重要である。多くの知られた天然のアンチセンスＲＮＡ分子は約１００ヌクレオチドを含むので、適切なアンチセンスＲＮＡ分子は、例えば５０〜２００ヌクレオチドを含む。
【００２９】
活性β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現を特に効果的に阻害するには、センス技術とアンチセンス技術を組み合せることが適切である（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９５： １３９５９−１３９６４）。
好都合には、急速にハイブリダイズするＲＮＡ分子を用いる。サイズが５０ヌクレオチド以上のアンチセンスＲＮＡ分子の効率はｉｎ ｖｉｔｒｏのアニーリング速度論に依存する。すなわち、例えば急速にアニーリングするアンチセンスＲＮＡ分子は、徐々にハイブリダイズするＲＮＡ分子よりタンパク質発現の大きな阻害を示す（Ｗａｇｎｅｒら、１９９４， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ４８： ７１３−７４２； Ｒｉｔｔｎｅｒら、１９９３， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２１： １３８１−１３８７）。特に、そのような急速にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ分子は多数の外部塩基（遊離末端および結合配列）、多数の構造サブドメイン（成分）、および低次のループ（Ｐａｔｚｅｌら、１９９８； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６； ６４−６８）を含む。アンチセンスＲＮＡ分子の仮説的二次構造は、例えば適切なアンチセンスＲＮＡ ＤＮＡ配列を選択するためのコンピュータープログラムの助けを借りて決定してよい。
【００３０】
該ＤＮＡ分子の異なる配列領域をベクターに挿入してよい。１つの可能性は、例えば、リボソームアニーリングを担う部分のみをベクターに挿入することにある。該ｍＲＮＡのこの領域のブロッキングは完全な翻訳を止めるのに十分であろう。特に高効率のアンチセンス分子は、該遺伝子の５’−および３’−非翻訳領域をも生じる。
【００３１】
本発明は、２つの最後に記載のＤＮＡ分子（突然変異またはリボソーム−ＤＮＡ分子）の１つを含む生物学的に機能的なベクターにも関する。ベクターに関して先に述べたことはこの場合にも適用される。
本発明によれば、逆転写を逆転写酵素およびプライマーの添加後に行うことにより植物細胞、特に葉細胞からＲＮＡを単離する、本発明ＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡの製造方法を提供する。この方法の個々の工程は、実質的に知られたプロトコールに従って行われる。逆転写については、一方ではオリゴ（ｄＴ）プライマーの助けにより完全ｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成し、次いで、選択したプライマーによりＰＣＲを実施するだけで、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ分子を製造することが可能である。他方で、選択したプライマーを直接逆転写に用い、短い特異的ｃＤＮＡを得てよい。適切なプライマーは、例えば、該トランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列パターンに従って合成的に製造してよい。
【００３２】
さらに本発明は、本発明のＤＮＡ分子をベクター中にクローンし、次いでこれを宿主細胞または宿主にトランスフェクションし、トランスフェクションした宿主細胞の選択および増幅により活性β１，２−キシロシルトランスフェラーゼを発現する細胞系を得ることを特徴とするβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのクローニング方法に関する。該ＤＮＡ分子を、例えば制限エンドヌクレアーゼの助けにより該ベクターに挿入する。ベクターについては、すでに上記したものを適用した。本方法で重要なことは効率的な宿主−ベクター系を選択することである。活性酵素を得るには真核宿主細胞が特に適している。１つの可能な方法は、昆虫細胞に該ベクターをトランスフェクションすることである。そうするには、特に昆虫ウイルス、例えばバクロウイルスなどをベクターとして用いる必要があろう。
もちろん、植物や植物細胞、ヒトもしくは他の脊椎動物細胞をトランスフェクションすることもでき、この場合、後者はそれらに外来性の酵素を発現するであろう。
【００３３】
好ましくは、本発明のベクターの少なくとも１つ、すなわち、本発明のＤＮＡ分子、突然変異体ＤＮＡ分子またはリボザイムをコードするＤＮＡ分子を含むもの、または該ＤＮＡ分子をプロモーターと逆方向に含むものをそれぞれ宿主細胞または植物に挿入することを特徴とする、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成が抑制または完全に停止した組換え宿主細胞、特に植物細胞または植物の製造方法を提供する。トランスフェクションについて先に記載したものをこの場合に適用することもできる。
【００３４】
例えば、宿主細胞として植物細胞を用いてよく、例えば、ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（アグロバクテリウム）系とＴｉプラスミドが好適である。アグロバクテリウム系を用いて、植物を直接トランスフェクションすることができ、アグロバクテリアは植物に根幹粒（ｒｏｏｔ ｓｔｅｍ ｇａｌｌｓ）を生じる。アグロバクテリアが損傷した植物に感染すると、該細菌自身は植物内に入り込まずに、環状の染色体外腫瘍−誘導Ｔｉ−プラスミドからの組換えＤＮＡ部分、いわゆるＴ−ＤＮＡを植物細胞に挿入する。Ｔ−ＤＮＡおよびその中に挿入されたＤＮＡ分子は、Ｔ−ＤＮＡの遺伝子を植物中で発現させるのに適した方法で該細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる。
【００３５】
種々の宿主系のための効率的なトランスフェクションメカニズムが多数知られている。いくつかの例としてエレクトロポーレーション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、リボソーム法がある。
次に、トランスフェクトした細胞を、例えば、ベクターが含む遺伝子の抗生物質耐性または他のマーカー遺伝子に基づいて選択する。次に、トランスフェクトした細胞系を、少量、例えばペトリ皿中、または多量、例えば発酵器中で増幅する。さらに、植物は特定の特性を有する。すなわち、植物はそれぞれ１つの（トランスフェクトした）細胞またはプロトプラストから成長し得る完全な植物を再発生させることができる。
【００３６】
用いるベクターに応じて、酵素発現が抑制または完全にブロックされるように宿主中でプロセシングされる。
欠失、挿入または置換突然変異を有するＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェクトする場合は、ホモローガスな組換えが生じ、突然変異体ＤＮＡ分子は、突然変異にも関わらず宿主細胞のゲノム中の同一配列を認識し、「ノックアウト」遺伝子が形成されるその位置に正確に挿入されるであろう。このようにして、突然変異をβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの遺伝子に導入し、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの完全な発現を阻害することができる。上記したように、この技術を用いて突然変異が活性タンパク質の発現をブロックするのに十分であることが重要である。選択および増幅後、それぞれホモローガスな組換えの成功または突然変異の程度を決定するための更なるチェックとして遺伝子のシーケンシングを行ってよい。
【００３７】
リボザイムをコードする該ＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェクトする場合、活性リボザイムが宿主細胞中に発現するであろう。リボザイムがβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの相補的ｍＲＮＡ配列と少なくとも一定の部位で複合体を形成し、この部位で開裂し、そしてこのようにして、該酵素の翻訳を阻害することができる。この宿主細胞およびそれから誘導された細胞系または所望により植物はβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを発現しないであろう。
【００３８】
ベクターがプロモーターに対してセンスまたは逆方向に本発明のＤＮＡ分子を含む場合は、センスまたはアンチセンス−ｍＲＮＡがトランスフェクトした細胞（または植物、それぞれに）中で発現するであろう。アンチセンスｍＲＮＡは、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ配列の少なくとも部分に相補的であり、同様に該酵素の翻訳を阻害してよい。アンチセンス技術により遺伝子の発現を抑制する方法の例として、トマトの成熟過程に関与する遺伝子の発現を阻害することを記載の、Ｓｍｉｔｈら、１９９０， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２４： ４７７−４８１の刊行物が参照される。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、線虫、植物、トリパノソーマ、ミバエおよびプラナリアを含む種々の生物体における配列特異的遺伝子サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を引き起こすことが最近示され、まだ特徴づけされていないＲＮＡトリガーは、種々の異なる植物系においてＤＮＡのメチル化を誘導し、遺伝子機能との選択的な干渉をもたらすことが示された（概説については、Ｆｉｒｅ Ａ．， １９９９， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５ （９）： ３５８−３６３参照）。
【００３９】
すべての系において、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現は少なくとも抑制され、好ましくは完全にブロックされる。該遺伝子発現の妨害の程度は、複合体形成の程度、ホモローガスな組換え、該ゲノム領域中の考えられる次の同時突然変異および他のプロセスに依存する。トランスフェクトした細胞のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性をチェックし、選択した。
【００４０】
さらに、上記ベクターの挿入に加え、哺乳動物タンパク質、例えばβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによりβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ発現の上記抑制をさらに増大させることができる。他の哺乳動物酵素の作用によりキシロシル化を減少させてよく、本発明のベクターおよび特に効率的な哺乳動物酵素ベクターによる活性β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現の阻害の組み合わせが特に効率的である。
【００４１】
あらゆるタイプの植物、例えば、ミドリマメ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）、タバコ植物、トマトおよび／またはジャガイモ植物をトランスフェクションに用いてよい。
【００４２】
組換え宿主細胞、特にそれぞれ植物細胞または植物を製造するための別の有利な方法は、突然変異していないホモローガスな配列の代わりに突然変異を含むＤＮＡ分子をそれぞれ宿主細胞または植物のゲノム中に挿入することからなる（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、１９９７， Ｐｌａｎｔ Ｊ．； １１ （６）： １１９５−１２０６）。すなわち、この方法はベクターでは機能しないが純粋なＤＮＡ分子で機能する。ＤＮＡ分子は、３つの例を示すために、例えば、遺伝子衝撃、マイクロインジェクションまたはエレクトロポーレーションにより宿主中に挿入される。すでに説明したように、該ＤＮＡ分子は、宿主のゲノム中のホモローガスな配列と結合し、ホモローガスな組換えおよび欠失、挿入または置換突然変異を受けることで該ゲノムを生じ、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現をそれぞれ抑制または完全にブロックすることができるであろう。
【００４３】
好ましくは、上記方法の１つにより製造された組換え植物または植物細胞がそれぞれ提供され、そのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成がそれぞれ抑制または完全にブロックされる。好ましくは、それらのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性はそれぞれ天然の植物または植物細胞のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％である。これら植物または植物細胞それぞれの利点は、それらが生成する糖タンパク質がいかなるβ１，２−結合キシロースも含まないかまたはほとんど含まないことである。これら植物の生成物がヒトまたは脊椎動物の身体に取り込まれてもβ１，２−キシロースエピトープによる免疫応答はみられないであろう。
【００４４】
本発明は、本発明のＤＮＡ分子の配列と相補的な塩基配列を含むＰＮＡ分子にも関する。ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、核酸塩基が偽（ｐｓｅｕｄｏ）−ペプチドバックボーンと結合しているＤＮＡ様配列である。一般にＰＮＡはワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対化およびラセン形成により相補的ＤＮＡ−、ＲＮＡ−、またはＰＮＡ−オリゴマーとハイブリダイズする。該ペプチドバックボーンは酵素分解に対する強い耐性を保証する。すなわち、ＰＮＡ分子は改良アンチセンス物質である。
【００４５】
ヌクレアーゼとプロテアーゼはいずれもＰＮＡ分子を攻撃することができない。相補的配列と結合する場合のＰＮＡ分子の安定性には、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、およびリボソームの十分な立体阻害が含まれる。Ｐｏｏｇａらの刊行物、「Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ＰＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇａｌａｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｙ ｐａｉｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ」（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ８５７−８６１； １９９８）は、一般にＰＮＡ分子、特にヒトゼラチンレセプタータイプ１ ｍＲＮＡと相補的なＰＮＡ分子に関する。
【００４６】
ＰＮＡ分子が上記配列を含む場合は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＤＮＡの部位と結合するであろうし、このようにしてこの酵素の転写を阻害することができる。ＰＮＡ分子は転写も翻訳もされないので、例えば、ｔ−Ｂｏｃ技術の助けにより合成的に製造されよう。
【００４７】
好都合には、本発明のＤＮＡ分子の配列に対応する塩基配列を含むＰＮＡ分子が提供される。このＰＮＡ分子はβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部位と複合体を形成し、該酵素の翻訳が阻害される。アンチセンスＲＮＡについて記載の同様の議論がこの場合に適用される。すなわち、例えば特に効率的な複合体形成領域はｍＲＮＡの翻訳開始領域または５’−非翻訳領域である。
本発明のさらなる目的は、転写または翻訳レベルでβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現をブロックすることを含む、本発明のＰＮＡ分子が該細胞中に挿入されることを特徴とする、植物または植物細胞、特に植物細胞の製造方法に関する。細胞にそれぞれＰＮＡ分子またはＰＮＡ分子（複数）を挿入するのにも、例えば、エレクトロポーレーションまたはマイクロインジェクションのような従来の方法を用いる。ＰＮＡオリゴマーを細胞貫通ペプチド、例えばトランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）またはｐＡｎｔｐと結合するときは挿入が特に有効である（Ｐｏｏｇａら、１９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６； ８５７−８６１）。
【００４８】
本発明は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成が抑制または完全にブロックされた本発明の組換え植物または植物細胞、または本発明の方法に従ってＰＮＡ分子が挿入された植物または細胞を、糖タンパク質を発現する該遺伝子でトランスフェクトし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換え糖タンパク質の製造方法を提供する。そうするには、すでに先に記載したように、所望のタンパク質の遺伝子を含むベクターをすでに先に記載したように宿主または宿主細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした植物細胞は所望のタンパク質を発現し、いかなるβ１，２−結合キシロースもほとんどまたは全く持たないであろう。すなわち、該細胞は、ヒトまたは脊椎動物の身体中で上記免疫応答を引き起こさない。この系を用いてあらゆるタンパク質を製造してよい。
【００４９】
好都合には、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成が抑制または完全にブロックされる組換え植物または植物細胞、またはＰＮＡ分子が本発明の方法にしたがって挿入された植物もしくは細胞を糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクションし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする組換えヒト糖タンパク質の製造方法を提供する。この方法により、植物（植物細胞）中で、ヒト身体に取込まれても、β１，２−結合キシロース残基に対して生じるいかなる免疫応答も引き起こさないヒトタンパク質を製造することが可能になる。そこで、食物原料として用いられる組換え糖タンパク質を製造するための植物種、例えば、バナナ、ジャガイモおよび／またはトマトを利用することができる。この植物の組織は、例えば、該組織から組換え糖タンパク質を抽出し、次いで投与するかもしくは植物組織を直接食べることによりヒト身体に取込まれる該組換え糖タンパク質を含む。
【００５０】
好ましくは、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成が抑制または完全にブロックされた本発明の組換え植物または植物細胞、または本発明の方法に従ってＰＮＡ分子が挿入された植物または細胞を、糖タンパク質を発現する該遺伝子でトランスフェクトし、該組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする医療用の組換えヒト糖タンパク質の製造方法が提供される。そうするには、医療的関心があるあらゆるタンパク質を用いることができる。
【００５１】
さらに、本発明は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ−減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ１，２−結合キシロース残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む、植物系において製造された上記方法による組換え糖タンパク質に関する。もちろん、β１，２−結合キシロース残基を含まない糖タンパク質が好ましい。β１，２−結合キシロースの量は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの上記抑制の程度に依存するであろう。
【００５２】
好ましくは、本発明は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ−減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ１，２−結合キシロース残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む、植物系において製造された上記方法による組換えヒト糖タンパク質に関する。
特に好ましい態様は、そのペプチド配列が非キシロシルトランスフェラーゼ−減少植物系に発現したタンパク質に生じるβ１，２−結合キシロース残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む、植物系において製造された上記方法による医療用の組換えヒト糖タンパク質に関する。
【００５３】
本発明の糖タンパク質は、植物に特異的な他の結合オリゴ糖単位を含んでいてよいので、ヒト糖タンパク質の場合、それらはこれら天然の糖タンパク質と異なる。それにも関わらず、本明細書の序論部分ですでに説明したように、β１，２−結合キシロース残基はα１，３−フコース残基とともに、植物糖タンパク質に対する免疫応答もしくは交叉免疫応答の主な原因であるので、本発明の糖タンパク質によりヒト身体にわずかな免疫応答が引き起こされるか、または全く免疫応答は生じない。
【００５４】
更なる目的には、本発明の糖タンパク質を含む医薬組成物が含まれる。本発明の糖タンパク質に加え、医薬組成物はそのような組成物に一般的なさらなる添加剤を含む。これらには、各処置に適した、例えば、種々の緩衝内容物の適切な希釈剤（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート、ｐＨおよびイオン強度）、添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、アジュバント、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、乳化剤、充填剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、該タンパク質に対するポリマーの共有結合物、例えばポリエチレングリコール、重合化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸などの粒状組成物またはリポソームへの該物質の取込み、助剤および／または担体物質がある。そのような組成物は、健康状態、安定性、本発明の糖タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ遊離速度およびｉｎ ｖｉｖｏ排出速度に影響されるであろう。
【００５５】
本発明は、標識された本発明のＤＮＡ分子またはその部分配列を試料に加えβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と結合させるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の選択方法も提供する。ハイブリダイズしたＤＮＡ分子を検出し、定量し、選択することができる。標識ＤＮＡ分子がハイブリダイズすることができる一本鎖ＤＮＡを含む試料については、試料を例えば加熱により変性させる。
１つの可能な方法は、おそらくエンドヌクレアーゼを加えた後にアガロースゲル電気泳動によりアッセイすべきＤＮＡを分離することである。ニトロセルロース膜に移した後、本発明の標識ＤＮＡ分子を混合し、次いで対応するホモローガスなＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる（「サザンブロッティング」）。
別の可能な方法は、本発明のＤＮＡ分子の配列から誘導された特異的および／または変性プライマーを用いるＰＣＲ依存法により他の種からホモローガスな遺伝子をみつけることにある。
【００５６】
好都合には、標識された本発明のＤＮＡ分子またはその部分配列を担体マトリックス上に固定化する。ＤＮＡミクロアレイ（「遺伝子チップ」）の使用は、ホモローガスな遺伝子をみいだすか、またはホモローガスな遺伝子の発現レベルを試験するためのさらなる可能な方法である。このためには、完全なゲノム遺伝子配列、完全長ｃＤＮＡ配列、これら配列の部分、または部分配列のあらゆる組み合わせのいずれかを示すＤＮＡを担体マトリックス上に固定化し、試料を担体マトリックスに加えた後にホモローガスな遺伝子を標識ＤＮＡ分子とハイブリダイズさせる（例えば、Ｆｅｒｅａ Ｔ． Ｌ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｐ． Ｏ．， １９９９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９： ７１５−７２２およびその中の引用文献参照）。
【００５７】
好ましくは、上記の本発明の方法のための試料は植物生物体のゲノムＤＮＡを含む。この方法により、多数の植物または他の種のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在が非常に急速かつ効率的にアッセイされる。このようにして、上記方法によりこの遺伝子を含むそのような植物または他の生物体におけるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現を抑制または完全にブロックするかまたはこの遺伝子を含まない植物または他の種の個体を選択し、次いでそれらを（ヒト）糖タンパク質の生成およびトランスフェクションに用いることができる。
【００５８】
本発明は、３つの先に記載の方法に従って選択され、次いで試料から単離されたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子にも関する。これら分子はさらなるアッセイに用いることができる。それらをシーケンシングし、次いでβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをみいだすためのＤＮＡプローブとして用いることができる。これら標識ＤＮＡ分子は、該ＤＮＡ分子が単離された生物体に関して本発明のＤＮＡ分子より効率的にプローブとして生物体に機能するであろう。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、ｐＩ値が６．０〜９．０、詳細には７．５０〜８．００のアイソフォームを含む、本発明に従ってクローンされたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの製造方法に関する。タンパク質のｐＩ値は、その正味荷電が０になるｐＨ値であり、該タンパク質のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、および空間的構造に依存する。β１，２−キシロシルトランスフェラーゼはこの範囲のｐＩ値を有する種々のアイソフォームを含んでいてよい。該トランスフェラーゼの種々のアイソフォームがある理由は、例えば、異なるグリコシル化があり、タンパク質分解が限られているからである。タンパク質のｐＩ値は、当業者に知られた等電点電気泳動により決定することができる。
該酵素の主なアイソフォームの見かけの分子量は６０，２ｋＤａである。
特に、本発明の製造方法は、ｐＩ値が７．５２のアイソフォームを含む。
【００６０】
本発明は、上記ＤＮＡ分子によりコードされるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−キシロースを炭化水素単位または糖タンパク質をそれぞれ含む試料に加え、β１，２−位のキシロースがβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼによりそれぞれ炭化水素単位または糖タンパク質と結合する、ヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質または他の糖コンジュゲートの「プランティファイド（ｐｌａｎｔｉｆｉｅｄ）」炭化水素単位の製造方法にも関する。β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをクローニングするための本発明の方法により、多量の精製酵素を製造することができる。完全に活性なトランスフェラーゼを得るための適切な反応条件が提供される。
【００６１】
下記実施例および図面により本発明をより詳細に説明するが、これらはもちろん本発明を限定するものではない。詳細には、図面において、
図１は、ダイズペプチド２および３のアミノ酸配列 （特許Ｗ０９９／２９８３５；配列番号：３および５）、これらペプチドとＡ． ｔｈａｌｉａｎａ配列の相同性、および４つのプライマー１−４のＤＮＡ配列を示す。
図２は、２２６ｎｔの５’−非翻訳領域を含むβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示す。
図３は、上記配列から導かれたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列。
図４ａ、４ｂおよび４ｃは、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ β１，２−キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、あるゲノムＤＮＡおよびあるＥＳＴ配列のアラインメントを示す。
図５は、該ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＥＳＴ配列から導かれたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図６は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、ＰＣＲ−生成物およびアミノ酸残基の疎水性の概略図である。
図７は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性と陰性コントロールのそれの比較を示す。
図８ａおよび８ｂは、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す。
図９はマススペクトルを示す。
図１０は、逆層ＨＰＬＣによるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す。
図１１は、ダイズから精製したβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と本出願のｃＤＮＡから誘導した推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００６２】
実施例１：
ＲＴ−ＰＣＲおよびｃＤＮＡクローニング
ＲＴ−ＰＣＲにより推定β１，２−キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ増幅用プライマーを以下のごとく設計した。２つのダイズペプチド（配列番号：１および２、特許Ｗ０９９／２９８３５ Ａｌの図４の配列番号：３および５に対応するが、Ｃ末端アミノ酸ＬＧが配列番号：５から省略された）（図１参照）を用いるＤＤＢＪデータベースのＢＬＡＳＴＰ検索は、相同性８０％以上のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ゲノムＤＮＡ配列（Ａｃｃ． Ｎｒ． ＡＢ０１５４７９）から導かれたあるタンパク質配列を示した（配列番号：３）。プライマー３（配列番号：４）および４（配列番号：５）はダイズペプチド２および３とホモローガスなＡ． ｔｈａｌｉａｎａ配列に基づいた。ＢＣＭ Ｓｅａｒｃｈ ＬａｕｎｃｈｅｒのＧｅｎｅ−Ｆｉｎｄｅｒを用いる該ホモローガスなゲノムＤＮＡ配列の分析により１つの推定タンパク質を得た。プライマー１（配列番号：６）は、該推定タンパク質の出発コドンを含むように設計したが、プライマー２ （配列番号：７）は該推定タンパク質の終止コドンを含む。
【００６３】
完全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬 （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｖａｒ Ｃｏｌｕｍｂｉａの若葉から単離された。該ＲＮＡをＤＮアーゼ （Ｐｒｏｍｅｇａ、ＲＱ１ ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ）で処理して微量のゲノムＤＮＡを除去した。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｉｇｍａ）およびＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、４２℃で総ＲＮＡ １μｇから合成した。
【００６４】
第１鎖ｃＤＮＡを、センスおよびアンチセンスプライマーの異なる組み合わせを用いるＰＣＲにかけた（図６に示す）。プライマー３およびプライマー４の生成物は長さ１７４ｂｐ（Ｐ１）のＤＮＡ断片であり、プライマー１およびプライマー２の生成物は１６０５ｂｐ（Ｐ２） ＤＮＡ断片であり、プライマー１およびプライマー４の生成物は長さ１５２５ｂｐ（Ｐ３）のＤＮＡ断片であり、また、プライマー３およびプライマー４は２５４ｂｐ（Ｐ４）のＤＮＡを生成した。推定オープンリーディングフレームを増幅するためにプライマー１およびプライマー２を用いた。ＰＣＲ反応物は、総量５０μＬ中に各プライマー０．２μｍｏｌ、０．０５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．２、２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， １０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ヌクレアーゼ不含ＢＳＡ ５μｇ、およびＰｒｏｍｅｇａのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を含んだ。９４℃、２分間の第１変性工程後、９２℃で１分間、５３℃で４０秒間、および７２℃で３分間および３０秒間を３０サイクル実施した。最後の伸張工程を７２℃で８分間実施した。ＰＣＲ生成物をＳｍａＩ線状化、脱リン酸化ｐｕｃ１９ベクターにサブクローンし、次いでシーケンシングした。サブクローンした断片の配列をジデソキシヌクレオチド法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ分析器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））により得た。ＲＴ−ＰＣＲの結果、３つのわずかに異なるｃＤＮＡ配列が観察された。理論ｐＩ値が７，５２であり、分子量が６０，２ｋＤＡの５３４アミノ酸のタンパク質をコードするサイズ１６０５ｂｐ（ｘｔ−Ａｔｈ６、配列番号：８）のｃＤＮＡ ６の配列（図３参照）は、２つのイントロンを除去した後にゲノムクローンから誘導されたヌクレオチド配列（ｘｔ−Ａｔｈｇｅｎ． ｓｅｑ）と同一である。ｃＤＮＡ ９は、ｃＤＮＡ ６と比べて４塩基対の変化を示すがｃＤＮＡ １６はｃＤＮＡ ６と比べて６塩基対の変化を示す（図４ａ、４ｂおよび４ｃに示す）。したがって、ｃＤＮＡ ９から誘導したアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ ６から誘導したアミノ酸配列（配列番号：８）と比べて２つの変化を含み、ｃＤＮＡ １６のアミノ酸配列は、４つの変化した残基を示す（図５に示す）。
【００６５】
図３は、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ（ｘｔ−Ａｔｈ６；配列番号：８）のｃＤＮＡ由来アミノ酸配列（配列番号：９）を示す。アスパラギン−結合グリコシル化の潜在的部位はＡｓｎ５１、Ａｓｎ３０１およびＡｓｎ４７９である。
【００６６】
図４ａ， ４ｂおよび４ｃは、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ ６ （ｘｔ−Ａｔｈ６；配列番号：８）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ ９ （ｘｔ−Ａｔｈ９）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ １６ （ｘｔ−Ａｔｈ１６）、２つのイントロン（ｘｔ−Ａｔｈｇｅｎ）除去後のＡ． ｔｈａｌｉａｎａ ゲノムＤＮＡ配列、およびＡ． ｔｈａｌｉａｎａ ＥＳＴ配列 （ｘｔＡｔｈＥＳＴ）からのβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼヌクレオチド配列のアラインメントを示す。点線はコンセンサス配列を表し、断続線はギャップを表す。ゲノム配列 （ｘｔ−Ａｔｈｇｅｎ； Ａｃｃ． Ｎｏ． ＡＢ０１５４７９、ゲノムＤＮＡの５８１８５−５８１８７位に開始コドン、６０２１４−６０２１６位に終止コドン）は、スプライス部位予測サーバーＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅを用い、２つの推定イントロン（イントロン１： ゲノムＤＮＡの５８８８１〜５９１１６位、イントロン２：ゲノムＤＮＡの５９２６８〜５９４５８位）を除去することにより生じる。Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ＥＳＴ配列 （ｘｔ−ＡｔｈＥＳＴ； Ａｃｃ． Ｎｏ． ＡＩ９９４５２４）は、ＢＬＡＳＴＮを用いるデータベース検索の結果である。
【００６７】
図５は、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ ６ （ｘｔ−Ａｔｈ６； 配列番号：９）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ ９ （ｘｔ−Ａｔｈ９）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡ １６ （ｘｔ−Ａｔｈ１６）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ゲノム配列 （ｘｔ−Ａｔｈｇｅｎ）、およびＡ． ｔｈａｌｉａｎａ ＥＳＴ配列 （ｘｔ−ＡｔｈＥＳＴ）から誘導したβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼからのアミノ酸配列のアラインメントを示す。点線はコンセンサス配列を表し、断続線はギャップを表す。
【００６８】
図６に、略図的予測β１，２−キシロシルトランスフェラーゼタンパク質（先端）およびコードされたタンパク質のＰｒｏｔＳｃａｌｅを用いる誘導疎水性指数（底部）を示し、陽性疎水性指数は疎水性の増加を意味する。４つの上記ＰＣＲ生成物（Ｐ１−Ｐ４）のサイズをｃＤＮＡに関して示す。「Ｃ」は該トランスフェラーゼの仮定細胞質領域をコードし、「Ｔ」は仮定貫膜領域を、また「Ｇ」は仮定ゴルジ腔触媒領域をコードする。「ＴＭｐｒｅｄ」（ＥＭＢｎｅｔ）によるタンパク質配列の分析によりＩｌｅ１１〜Ｐｈｅ２９の仮定貫膜領域を得た。おそらく該酵素のＣ末端領域は触媒領域を含むので、ゴルジ装置の腔中を指すべきである。これによれば、このトランスフェラーゼは、糖タンパク質の生合成に関与する今までに分析されたすべてのグリコシルトランスフェラーゼのようなタイプＩＩ貫膜タンパク質であるようである（Ｊｏｚｉａｓｓｅ， １９９２， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２， ２７１−２７７）。灰色領域は、２つのペプチドの位置を示し、六角形は潜在的Ｎ−グリコシル化部位を示す。ＮＣＢＩを介してアクセスできるデータバンクのＢＬＡＳＴ検索は、他の１つの植物配列とのみ高い相同性を示した（ハイブリッドアスペン、Ａｃｃ． Ｎｏ． ＡＩ６２６４０）。
【００６９】
実施例２：
昆虫細胞における組換えβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼの発現
細胞質および貫膜領域を含む推定β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの完全なコーディング領域を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化によりｐｕｃ１９ ベクターから取り出し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化、脱リン酸化バクロウイルストランスファーベクター ｐＶＬ １３９３ （ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にサブクローンした。正しいクローニングを、ｐＶＬ１３９３順（方向）プライマー５’ＡＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡ−３’ （配列番号：１０）およびｐＶＬ１３９３逆（方向）プライマー５’−ＧＴＣＧＧＧＴＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＴＣ−３’ （配列番号：１１）を用いてシーケンシングすることにより確認した。ホモローガスな組換えを保証するため、トランスファーベクター１μｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者のプロトコールに従って用い、ＩＰＬ−４１培地中の１ ｘ １０６Ｓｆ−９細胞に線状Ｂａｃｕｌｏ−ＧｏｌｄウイルスＤＮＡ （ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） ２００ｎｇを共トランスフェクションした。２７℃で５日間インキュベーションした後、種々の容量の組換えウイルス上清を用いてＳｆ−２１昆虫細胞を感染させた。細胞を５％加熱不活化ウシ胎児血清添加ＩＰＬ−４１培地中で、２７℃、４日間インキュベーションし、次いで回収し、リン酸緩衝生理食塩水溶液で２回洗浄した。細胞を下記緩衝液に再懸濁し、ホモゲナイズし（１ｍｌ／１０７細胞）、氷上で３０分間インキュベーションした： １００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌ Ｅ−６４ （Ｓｅｒｖａ）。
【００７０】
実施例３
β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性のアッセイ
細胞乳剤のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性をアッセイした。陰性コントロールを同数の非感染細胞を用いて実施した。アッセイ混合物は、総容量２０μｌ中に、乳化細胞１３μｌ、アクセプター基質として２ｎｍｏｌダブシル化ＧｎＧｎヘキサペプチドまたはＧｎＧｎ−ピリジルアミン（図８ａ）、ドナー基質として１ｍＭ ＵＤＰ−キシロース、１０ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、ならびにＮ−アセチルヘキソサミニダーゼによる生成物の分解を防ぐために１ｍＭ ２−アセトアミド−１，２−ジデオキシ−ノジリマイシンを含んだ。試料を３７℃で１時間インキュベーションし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。
【００７１】
図７は、組換えβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよび陰性コントロールの酵素活性の測定値を示す。灰色のバーはＧｎＧｎ ヘキサペプチドを基質に用いた時の活性を示し、黒色のバーはＧｎＧｎ−ピリジルアミンを基質に用いたことを示す。共トランスフェクションした細胞の酵素活性は陰性コントロールより３０倍高かった。
β１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアクセプター基質の構造を図８ａに示し、仮定生成物を図８ｂに示す（ここで、Ｒはピリジルアミンまたはダブシル化ヘキサペプチド残基を表す）。
【００７２】
実施例４
キシロシルトランスフェラーゼ生成物の質量分析
質量分析は動的抽出 （遅延（ｌａｔｅ）抽出と同義）を可能にするＤＹＮＡＭＯ （ＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ， ＳａｎｔａＦｅ， ＮＭ）、ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳを用いて行った。２タイプの試料マトリックス調製物を用いた。ダブシル化グリコペプチドを５％ギ酸に溶解し、部分標本を標的に適用し、空気乾燥し、および１％α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸で被った。ピリジルアミノ化グリカンを水で希釈し、標的に適用し、空気乾燥した。２％ ２．５−ジヒドロキシ安息香酸を添加後、試料を急速に減圧乾燥した。
【００７３】
図９は、これら試料のマススペクトルを示し、（Ａ）は陰性コントロールであり、主なピーク（Ｓ）は、ダブシル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−（ＧｌｃＮＡｃ４Ｍａｎ３） Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ基質を示し、理論［Ｍ＋Ｈ］＋値は２２６２．３である。この基質は、（Ｓ＊）のダブシル基のＡｚｏ機能の崩壊により形成されたより小さなイオンおよびナトリウム付加生成物としても出現する。ｍ／ｚ ＝ ２４２４．４のピークは、該基質の不完全な脱ガラクトシル化を示す。マススペクトル（Ｂ）は、３７℃で１時間インキュベーション後の組換えβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼを含む試料を示す。［Ｍ＋Ｈ］＋値が２３９３．４の主要ピーク（Ｐ）はキシロシル化生成物を示す。
【００７４】
実施例５
キシロシルトランスフェラーゼ生成物のＨＰＬＣ分析
キシロシルトランスフェラーゼアッセイはＧｎＧｎ−ピリジルアミン１０ ｎｍｏｌをアクセプター基質として用いる以外は実施例３に記載のごとく行った。４時間インキュベーションした後、試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および逆相ＨＰＬＣの両方で分析して生成物の構造を確認した。基質ｎＧｎ−ＰＡのわずか前方に溶出する推定生成物ピークを回収した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより生成物の質量は１５５０．９と決定され、これはＧｎＧｎＸ−ＰＡの結果とよく一致する。ウシ腎臓由来のβ−Ｎ−アセチルグルコミニダーゼ（酵素２５ｍＵ含有５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中、３７℃２０時間）で消化すると、グリカンがほぼＭＭの保持（時間）で溶出された。これはＭＭ−ＰＡおよびＭＭＸ−ＰＡの保持時間に関する公表データと一致する （Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ， １９９８， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １５，１０５５−１０７０）。選択した条件下（酵素５０ｍＵと共に３７℃で２０時間）でタチナタマメ由来のα−マンノシダーゼでさらに消化すると２つの新しいピークが出現した。α１，３−結合マンノースはα１，６−結合マンノースよりマンノシダーゼにかなりより感受性であるから、該ピークを００ＸおよびＭ０Ｘ（溶出順に）割り当てる。特に、酸でデフコシル化することによりブロメラインから調製したＭ０Ｘ−ピリジルアミンは、キシロシルトランスフェラーゼ生成物から誘導した推定Ｍ０Ｘと共溶出された。α−１，３−結合マンノース残基の除去による溶出時間のかなり高度なシフトはβ−マンノースがキシロースで置換されていることを強く示唆する （Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ， １９９８， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １５， １０５５−１０７０； Ａｌｔｍａｎｎ， １９９８， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １５，７９−８２）。
【００７５】
図１０は、逆相ＨＰＬＣによるキシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す。 （Ａ）トランスフェラーゼインキュベーション混合物、（Ｂ）単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物、（Ｃ） β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで消化後の単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物、（Ｄ）さらにα−マンノシダーゼで消化後の単離キシロシルトランスフェラーゼ生成物。ピークの割り当ては以下の通りである。１、ＧｎＧｎ−ＰＡ； ２、ＧｎＧｎＸ−ＰＡ； ３、ＭＭＸ−ＰＡ ； ４、Ｍ０Ｘ−ＰＡ； ５、００Ｘ−ＰＡＡ； ６、Ｍ０−ＰＡ （単離生成物中の微量の基質由来）。Ｎ−グリカン構造の略号については、Ｗｉｌｓｏｎ Ｉ． Ｂ． Ｈ．およびＡｌｔｍａｎｎ， Ｆ．， １９９８， Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ． Ｊ． １５，１０５５−１０７７参照。
【００７６】
図１１は、ＷＯ９９／２９８３５ Ａｌの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、精製ダイズ酵素のアミノ酸配列が本発明のｃＤＮＡから誘導した配列のアミノ酸１９９−４６９のみに対応することを示す。さらに、本発明のｃＤＮＡから誘導した推定アミノ酸配列は精製ダイズ酵素の配列と比べて２つの挿入物（予測配列のａａ３７５−３８２およびａａ４２５−４２９に対応）を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】ダイズペプチド２および３のアミノ酸配列 （特許Ｗ０９９／２９８３５；配列番号：３および５）、これらペプチドとＡ． ｔｈａｌｉａｎａ配列の相同性、および４つのプライマー１−４のＤＮＡ配列を示す図である。
【図２】２２６ｎｔの５’−非翻訳領域を含むβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】上記配列から導かれたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４ａ】Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ β１，２−キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、あるゲノムＤＮＡおよびあるＥＳＴ配列のアラインメントを示す図である。
【図４ｂ】Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ β１，２−キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、あるゲノムＤＮＡおよびあるＥＳＴ配列のアラインメントを示す図である。
【図４ｃ】Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ β１，２−キシロシルトランスフェラーゼｃＤＮＡ、あるゲノムＤＮＡおよびあるＥＳＴ配列のアラインメントを示す図である。
【図５】該ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＥＳＴ配列から導かれたβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図６】β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、ＰＣＲ−生成物およびアミノ酸残基の疎水性の概略図である。
【図７】β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞のβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性を陰性コントロールと比較した図である。
【図８ａ】β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す図である。
【図８ｂ】β１，２−キシロシルトランスフェラーゼの生成物とアクセプター基質の構造を示す図である。
【図９】マススペクトルを示す図である。
【図１０】逆層ＨＰＬＣによるβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ生成物の分析結果を示す図である。
【図１１】ダイズから精製したβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と本出願のｃＤＮＡから誘導した推定アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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