(57)【要約】本発明は、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリからクローニングされた新規なヌクレオシド／ヌクレオチド一リン酸キナーゼｃＤＮＡを提供する。このキナーゼは、ＵＭＰをリン酸化し、多くのリン酸供与体を利用することができるが、リン酸をＡＴＰまたはＵＴＰからシチジン一リン酸（ＣＭＰ）に転移させる選択性を示した。したがって、このキナーゼはシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼと称される。このキナーゼは、３．２ｋｂと２．０ｋｂの２種の遍在的に転写されるｍＲＮＡスプライス産物をコードするＭｇ２＋依存性ヌクレオチドキナーゼであることが示され、他のヌクレオチド修飾酵素遺伝子を含むことが知られている領域である１番染色体のｐ３２〜３４．１領域にマッピングされた。
2004506440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子。
【請求項６】
６８℃で１時間インキュベート（３０ｎｇ　核酸分子／ｍｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｈｙｂ）し、室温で２×１５分、０．１％ＳＤＳ／２Ｘ　ＳＳＣで洗浄し、次いで、６８℃で２×１５分、０．１％ＳＤＳ／０．２Ｘ　ＳＳＣで洗浄すると、配列番号１の核酸分子の相補的配列にハイブリダイズする単離された核酸分子。
【請求項７】
プラスミドにサブクローニングされている、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
原核細胞または真核細胞発現ベクターにサブクローニングされている、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
異種プロモーターに作動可能に結合している、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項１０】
原核生物または真核生物宿主細胞に安定にまたは一時的に組み込まれている、請求項６に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．　関連出願
本願は、２０００年８月２１日に出願された発明の名称「ヒトシチジン一リン酸（ＣＭＰ）キナーゼ（Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＭＰ）Ｋｉｎａｓｅ　ｃＤＮＡ）」と題する、スティーブン　エム　プレスコット（Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｍ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）、テレス　エー　ピアマン（Ｔｅｒｒｅｃｅ　Ａ．Ｐｅａｒｍａｎ）、ユーゴ　シー　カストロ−ファリア−ネト（Ｈｕｇｏ　Ｃ．Ｃａｓｔｒｏ−Ｆａｒｉａ−Ｎｅｔｏ）、ダイアナ　エム　スタッフォリーニ（Ｄｉａｎａ　Ｍ．Ｓｔａｆｆｏｒｉｎｉ）、ガイ　エー　ジンマーマン（Ｇｕｙ　Ａ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）、およびトーマス　エム　マッキンタイヤ（Ｔｈｏｍａｓ　Ｍ．ＭｃＩｎｔｙｒｅ）の米国仮出願第６０／２２６，６１４号に関し、かつその利益を主張するものであり、この仮出願は本明細書に文献援用される。
【０００２】
２．　発明の分野
本発明は、ヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素に関する。より詳細には、本発明は、遍在的に発現する、ＣＭＰおよびＵＭＰをリン酸化する新規なヒトヌクレオシド一リン酸キナーゼに関する。この新規キナーゼは、多様なリン酸供与体を利用し得る。そのゲノム位置は、この新規キナーゼが疾患の研究やヌクレオシド類縁体薬効増強に焦点を当てた研究に重要になるであろうことを示唆している。
【０００３】
３．　技術背景
ヌクレオチドおよびヌクレオシドは、生命維持に必要な多くの細胞機能に関与する重要な分子である。ヌクレオチドは、化学エネルギーのキャリヤー、細胞シグナル伝達分子、および核酸の基本成分としての役割を果たす。アルバーツら（Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ、第３版、（１９９４年）参照。また、ヌクレオチドは、他の基と共に酵素を形成する。ヌクレオチドは、構造的には、１つ以上のリン酸基がエステル結合によりリボースまたはデオキシリボース糖に結合しているプリンまたはピリミジン塩基からなる。リン酸基を欠くヌクレオチドはヌクレオシドと称される。エネルギーは、リン酸化と称される反応でリン酸基を結合する酵素による結合エネルギーとしてヌクレオチドに貯蔵される。この酵素は、一般に、用語「ホスホキナーゼ」の略語である「キナーゼ」として知られている。
【０００４】
リン酸化によりヌクレオチドに貯蔵されたエネルギーは、リン酸基をヌクレオチドにつなぎ留める結合の結合エネルギーとして存在し、リン酸化化合物が加水分解されると解放され、その結果、遊離リン酸が放出される。キナーゼにより仲介されるエネルギーの貯蔵および伝達は、多くの基本的な細胞プロセスおよび反応経路に極めて重要である。
【０００５】
キナーゼは、ヌクレオチドおよびヌクレオシドに作用する一群のヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素の一員である。これらの酵素は、リン酸化の他に、ヌクレオチド合成からヌクレオチド分解まで多岐にわたる機能を支配する。キナーゼの適正な機能は細胞機能にとって極めて重要である。
【０００６】
例えば新規ヌクレオチド合成経路以外の反応を触媒するキナーゼなどのヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素についてますます明らかにされている重要性の１つの例は、そのようなキナーゼがスカベンジャー経路に関与することである。この作用では、キナーゼはヌクレオチドをリン脂質や他の細胞代謝物に変換する。これらの酵素が極めて重要である理由は、脂質の組成が不適正であると膜特性や機能を不利に変化させるからである。これの１例がエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＣＭＰキナーゼが不活性化すると、リン脂質合成のひどい欠乏が観察される。この異常な膜脂質含量により、細菌に観察可能な低温感受性が生じる。フリックら（Ｆｒｉｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７７巻：５１７〜５２３ページ（１９９５年）。同様に、不適当な膜リン脂質構成は、アデニル酸キナーゼの欠乏に関連する溶血性貧血を引き起こし得る。マツウラら（Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４巻：１０１４８〜１０１５５ページ（１９８９年）。
【０００７】
キナーゼの重要性のもう１つの例は、その機能亢進がピリミジン５′ヌクレオチダーゼの欠乏を伴い、溶血性貧血にも関連する酵素であるピリミジンヌクレオシド一リン酸（ＰＮＭＫ）キナーゼに関連する〔ラシャンら（Ｌａｃｈａｎｔ　ｅｔ　ａｌ）〕。この疾患を有する患者では、赤血球の生存率が低下しており、ＣＭＰおよびＵＭＰの蓄積が観察された。さらに、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ−１）の欠乏は、精神発達または精神運動遅滞を伴うことがある先天性溶血性貧血と関連付けられた。〔セインバーグら（Ｓｚｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ）、１９６９年；ミワら（Ｍｉｗａ　ｅｔ　ａｌ）、１９８３年；ボワバンら（Ｂｏｉｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９７１年；トレンら（Ｔｏｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９９４年〕。
【０００８】
いずれの理論にも限定されるわけではないが、これらの例は、ヌクレオチドレベルが、適切な赤血球の形態、機能および生存率にとって極めて重要であるという結論を暗示しているようである。さらに、他の研究は、ヌクレオチドレベルが神経細胞を含めた他の細胞の挙動にも影響を与え得ることを示唆している。結果として、細胞のヌクレオチド／ヌクレオシドレベルに影響を及ぼす新規なヌクレオチド／ヌクレオシドキナーゼの提供およびキャラクタリゼーションは、当技術分野に重要な改良をもたらすであろう。
【０００９】
ヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素は、ヌクレオシド類縁体の薬理学的用途にも極めて重要である。ヌクレオシド類縁体は、ガン治療、ＨＩＶ療法、およびウイルスとの闘いを含めた多くの治療用途に用いられている。ファーマンら（Ｆｕｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　第８３巻：８３３３〜８３３７ページ（１９８６年）；シハー　＆　チェン（Ｃｉｈａｒ　＆　Ｃｈｅｎ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５０巻：１５０２〜１５１０ページ（１９９６年）。しかし、ヌクレオシド類縁体薬は、機能させるためには、先ず、ヌクレオシドキナーゼで活性化させなければならない。結果として、活性化時にヌクレオチドキナーゼがこれらの化合物をどのように修飾するかを理解していないと、これらの薬剤の効力および有用性が阻害される。
【００１０】
上記から、新規なヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素をコードする新規ｃＤＮＡを提供することが当技術分野に進歩をもたらすであろうことが理解されよう。具体的に言えば、新規キナーゼを提供し、それらの染色体位置および特定の機能を解明することにより、上記のヌクレオシド類縁体薬の半減期をより良く評価することが可能になるであろう。ひいては、これらの薬剤の半減期を延長させることもできるであろう。これによって、多くの患者に対する上記薬剤の薬効および潜在的利点が増大するであろう。したがって、新規なヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素を単離し、その関連生成物、活性および発現パターンを特性決定することは当技術分野に疑う余地のない改良をもたらすであろう。
【００１１】
４．　発明の要旨
本発明は、マクロファージライブラリから単離された新規なヒトヌクレオシド一リン酸キナーゼｃＤＮＡに関する。本発明は、さらに、このキナーゼのクローニングと、その酵素活性、依存性および発現パターンの解明とに関する。配列相同性を調べることにより、ヒトアデニル酸キナーゼ１（ＡＫ−１）がヒトゲノムにおける最も近似した既知のマッチであることが判明した。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離・精製された核酸分子を含む。他の実施形態において、ヌクレオチド配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードする。さらに他の実施形態において、本発明は、６８℃で１時間インキュベート（３０ｎｇ　核酸分子／ｍｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｈｙｂ）した後、室温で１５分間、０．１％ＳＤＳ／２Ｘ　ＳＳＣで２回洗浄し、次いで６８℃で１５分間、０．１％ＳＤＳ／０．２Ｘ　ＳＳＣで２回洗浄すると、配列番号１の核酸分子の相補的配列にハイブリダイズする単離された核酸分子を含む。本発明の他の実施形態は、プラスミド、原核細胞発現ベクター、または真核細胞発現ベクターにサブクローニングされた該核酸分子を含む。本発明のさらに他の実施形態は、異種プロモーターに作動可能に結合した該核酸分子を含む。本発明の他の実施形態は、原核生物または真核生物宿主細胞中に安定にまたは一時的に組み込まれた該核酸分子を含む。
【００１３】
さらに、本発明は、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの触媒活性に関する。特に、このキナーゼに好ましい基質はＣＭＰおよびＵＭＰであることが判明した。本発明の新規キナーゼは、ＣＭＰの存在下ではＵＭＰ存在下に比べて３倍も反応効率が高くなることが観察されたのでＣＭＰキナーゼとも称される。さらに、この酵素にはＡＴＰおよびＵＴＰが好ましいリン酸供与体であり、かつこの酵素の機能はＭｇ２＋依存性であることが判明した。このマクロファージ由来ｃＤＮＡを単離した後で行なわれたクローニングの結果を記載した刊行物に、上記結果を確認するデータが記載された。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）を参照のこと。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトにおけるＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの発現パターンに関する。このＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの発現パターンを調べたところ、免疫組織およびガン細胞系に３．４および２．０ｋｂという２種のサイズのｍＲＮＡ産物があることが判明した。２．０ｋｂのｍＲＮＡはこれまで記載されたことがない。
【００１５】
本発明はさらに、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの配列およびサイズの解明に関する。このｃＤＮＡをクローニングした後で発表された論文で、配列の比較により、本明細書に記載されているものと同じ遺伝子由来であると証明されたｃＤＮＡが開示された。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。しかし、これら２種のクローンには明白な違いが存在する。後の刊行物で開示されたｃＤＮＡの配列は、本発明のマクロファージ由来クローンには見られない、７３個の付加された５′ヌクレオチドを有している。
【００１６】
後の刊行物で開示されたこの延長部は、本発明のマクロファージ由来ｃＤＮＡの最初のＡＴＧに対して５′側の推定翻訳開始部位に位置する（３２推定アミノ酸をコードする）９６ヌクレオチドを含んでいる。本発明の発明者らは、この付加された５′配列は遺伝子産物の酵素活性には不要であることを証明した。本発明のマクロファージ由来ｃＤＮＡによって発現されたタンパク質は、後の刊行物で開示された延長ｃＤＮＡによって生成されたものと同じ相対分子量を有している。これらのデータは、後に記載されたクローンの２番目のＡＴＧが機能開始部位であることを示している。
本発明の上記のおよび他の特徴は、添付図面を参照し、以下の詳細な説明および特許請求の範囲を読めば明らかになるであろう。
【００１７】
６．　発明の詳細な説明
添付図面を参照しながら、上記に簡潔に記載した本発明をさらに詳細に説明する。これらの図面は、本発明の典型的な実施形態に関する情報を提供するに過ぎず、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００１８】
本発明は、遍在的に発現する、ＣＭＰおよびＵＭＰをリン酸化するヒトヌクレオシド一リン酸キナーゼに関する。本発明は、さらに、このキナーゼのクローニング、酵素活性および発現パターンに関する。このキナーゼは、そのヌクレオシド／ヌクレオチド修飾酵素としての機能により、疾患の研究およびヌクレオシド類縁体の薬効増強用の興味深い対象となっている。
【００１９】
ＡＦ０７０４１６のヌクレオチド７４位から始まるオリジナルのＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡは、ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリから単離された。チェルカーら（Ｔｊｏｅｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７４巻：５４９〜５５２ページ（１９９５年）。さらに、そのｃＤＮＡは、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ〔インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）〕のＢｓｔＸＩ部位にクローニングされた。センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡの配列決定はどちらもＡＢＩ自動シークエンサーを用いて行われた。５′および３′非翻訳領域を含むヌクレオチド配列は配列番号１として、図１に示されている。図１は、矢印を付した翻訳開始部位と下線を付した翻訳終結部位とを示している。このｃＤＮＡを配列比較すると、他のヌクレオシド一リン酸キナーゼとの高い相同性を示し、ブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼとは最も高い相同性を示した〔オカジマら（Ｏｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ）、１９９５年〕。このｃＤＮＡは、ヒトゲノム内では、サイトゾルアデニル酸キナーゼ１に対して最も高い類似性を示した〔マツウラら（Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）、１９８９年〕。
【００２０】
全ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡのトランスフェクションにより合成されたタンパク質産物と、７４位から始まるｃＤＮＡのトランスフェクションにより合成されたタンパク質産物とを比較するために、５′ＵＴＲの６５ｂｐ（図８）、全コード領域、および３′ＵＴＲの１０３１ｎｔをコードすることが判明した個々のＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃＤＮＡクローンを得た（ｃｄｎａ　ｉｄ　４６９３３２）。Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅により、ｎｔ　１−１５６１およびｎｔ　７４−１５６１を含む産物を増幅した。ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン社）のＢｓｔＸＩ部位およびＸｂａＩ部位にクローニングした。各クローンの配列を自動配列分析により検証した。
【００２１】
このｃＤＮＡは予測された１９６アミノ酸タンパク質をコードする。このアミノ酸配列（配列番号２）と他の既知配列とを比較すると、他のヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼとの類似性が、特に機能特性を与えることが知られているモチーフ内で示された。図２は、本発明のヒトＣＭＰキナーゼ（配列番号２）と、ブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ（配列番号３）と、ヒトアデニル酸キナーゼ１（配列番号４）のアミノ酸配列を比較したものである。他のＮＭＰキナーゼと有意な類似性を共有するタンパク質領域には、図２に示されているような、リン酸結合ループ（Ｐループ）およびＭｇ２＋結合ループ（Ｍｇループ）が含まれる。図２は、キナーゼ機能に役割を果たすと考えられている高度に保存された残基をアスタリスクで示している。ブクレンチら（Ｂｕｃｕｒｅｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻：２８５６〜２８６２ページ（１９９６年）。これらの比較から、活性部位、カチオン要求量および全体的なタンパク質コンホメーションが他のＮＭＰキナーゼに類似していると考えるのは妥当なようである。
【００２２】
次いで、Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて本発明のｃＤＮＡ配列とデータベースに提出されている他の配列とを比較した。この研究により、本発明のｃＤＮＡのクローニング後にクローニングされたＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ（ＡＦ０７０４１６）とも称される発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンが見出された。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）；（アクセッション番号　ＡＦ０７０４１６）。このＥＳＴクローンは、マクロファージ由来ｃＤＮＡと同じ遺伝子に由来するが、このＥＳＴクローンは、これら２種のクローンの５′末端領域を比較する図８に示されているように５′末端に付加された７３塩基を含んでいることが確認された。さらに、図８には、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．クローン（配列番号８）およびこの配列のタンパク質への予想翻訳も示されている。配列番号５は、ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）に記載されているＥＳＴクローンのｃＤＮＡのこの５′末端の７３塩基部分を含んでいる。配列番号６は、本発明のマクロファージ由来クローンのｃＤＮＡの５′末端を含んでいる。図８は、ＥＳＴクローンの推定Ｎ末端３２アミノ酸を普通の字で示している。これらは、翻訳産物中には存在しないようである。これらの５′ヌクレオチドは、機能性であればタンパク質の３２アミノ酸Ｎ末端延長部となるであろう付加された推定翻訳開始部位を、配列に加えるであろう。図８は、実際に翻訳されると考えられるアミノ酸を太字で示しており、機能開始部位を矢印で示している。機能性タンパク質中に存在する３２推定アミノ酸＋４アミノ酸が配列番号７に含まれている。
【００２３】
Ｎ末端延長部が発現されるかどうかを評価するために、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターにクローニングされたＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で発現させた。発現したタンパク質の相対分子量をウエスタンブロットで測定した。このｃＤＮＡは、図９Ａの左側レーンに見られるように、２５ｋＤａタンパク質を生じた。この産物のサイズは、生（ｒａｗ）配列から予測されたサイズ（２２，２２２Ｄａ）よりわずかに大きいが類似しており、推定Ｎ末端ペプチドを含まない１９６アミノ酸配列に関して予測されたサイズと一致する。その結果が図９Ａに示されている。ＥＳＴクローンはこれと同じ相対分子量を有するタンパク質を生成すると報告されている。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。図９Ａの右側レーンに示されているベクターをトランスフェクトした細胞は、このタンパク質を検出可能なレベルでは発現しない。この結果は、３回繰り返した実験を典型的に表すものである。同じようにＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトしても、同一の結果が得られた。
【００２４】
図９Ｂを見ると、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼを細菌で発現させると、２５ｋＤａタンパク質が生成する。Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた精製組換えＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの２つのアリコート（レーン１：９０ｎｇ；レーン２：９００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析にかけた。その結果は、翻訳後修飾が、トランスフェクト哺乳動物細胞で観察される２２，２２２Ｄａの予測分子量よりわずかに高い分子量［２５ｋＤａ、パネル（Ａ）］の主な原因とはならないことを示している。
【００２５】
図９Ｃを見ると、Ｍｅｔ−１（レーン１）またはＭｅｔ−３３（レーン２）で出発するＵＭＰ−ＣＭＰをコードするｃＤＮＡを、実験方法の欄に記載されているＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。空のベクター（レーン３）はネガティブコントロールとしての役割を果たした。トランスフェクト細胞からの抽出物をウエスタン分析にかけた。どちらの構築物も、２５ｋＤａの見掛け分子量で移動するＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼを生成した。
【００２６】
キナーゼをトランスフェクトした細胞が発現したタンパク質は、それらの遺伝子が最も近接した相同性を示す酵素、すなわち、ブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ（２２．３ｋＤａ、１９６アミノ酸）〔オカジマら（Ｏｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ）、１９９５年〕、ヒトアデニル酸キナーゼ１（２１ｋＤａ、１９４アミノ酸）〔マツウラら（Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）、１９８９年〕、およびＥ．ｃｏｌｉ　ＣＭＰキナーゼ（２４．６ｋＤａ、２２５アミノ酸）〔ブクレンチら（Ｂｕｃｕｒｅｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻：２８５６〜２８６２ページ（１９９６年）〕とサイズが類似している。
【００２７】
ｃＤＮＡによって生成された酵素に関してテストを実施した。ブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼとの配列類似性に基づいて、この酵素のＣＭＰリン酸化能を評価するテストを実施した。本発明のＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼをトランスフェクトした細胞の溶解物は、図３のグラフに示されているように、ｍｇタンパク質／分当たり、ベクターをトランスフェクトした細胞の約６倍のＣＭＰをＣＤＰに変換することが示された。ＣＤＰ生成量は、この反応に添加される総細胞溶解物の量に比例して増大することが示された。図３に示されている結果は、７回繰り返した実験を典型的に表すものである。
【００２８】
上述のように、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼは他のヌクレオシドキナーゼに見出されるＭｇ２＋ループに極めて類似した領域を有しているので、キナーゼ活性に及ぼすＭｇ２＋の影響も調べた。示されている濃度のＭｇ２＋を含有する溶液に、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞の溶解物を添加した。次いで、可変濃度のＭｇ２＋の存在下にＣＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性を測定した。この調査の結果は、図４に示されているように、Ｍｇ２＋が濃度依存的にＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性を増大させるというものであった。Ｍｇ２＋不在下には、ＣＤＰ生成レベルがベクターをトランスフェクトした細胞に認められるレベルまで低下したが、これは、Ｍｇ２＋がキナーゼの絶対必要条件であることを示している。キナーゼの最大活性は３ｍＭのＭｇ２＋の存在下に観察された。いずれの特定の理論にも限定されるわけではないが、これらの知見は、キナーゼの予測アミノ酸配列中の推定Ｍｇ２＋結合ループが機能性であるという結論を促すものであった。
【００２９】
マクロファージ由来ヒトＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼはブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼとの類似性を示すので、新規ヒト酵素はブタキナーゼと類似の基質選択性を示すであろうと予測された。多くのＮＭＰキナーゼは可変相対反応速度で多くのタイプのＮＭＰをリン酸化するので、基質として種々のＮＭＰをテストした。先ず、ＡＴＰまたはＵＴＰからＣＭＰへリン酸を転移させるためのＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ選択性を測定した。図５Ａに示されているように、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼをトランスフェクトするかベクターだけをトランスフェクトした細胞の溶解物を、指定されたＮＴＰとＮＭＰを含有する反応混合物に加えた。反応性ＮＤＰに変換したＮＭＰの量は、各ＮＭＰがＣＭＰキナーゼによってリン酸化される相対速度を示している。このキナーゼは、図５Ａに示されているように、ＧＭＰをリン酸化し得ないことが判明した。さらに、これも図５Ａに示されているように、このキナーゼは、極く僅かに、すなわち、ベクターをトランスフェクトした細胞のものより極くわずかに高いレベルでＡＭＰをリン酸化するに過ぎないことが示された。しかし、基質としてＵＭＰを用いると、ＵＤＰの生成量が２倍に増大することが認められた。図５Ａ参照。基質としてＣＭＰを用いた場合には、ＣＤＰの生成量が６〜７倍に増大することが示された。図５Ａ参照。この結果は、３回の個別実験を典型的に表すものである。
【００３０】
次に、キナーゼの最も好ましいリン酸供与体を調べた。図５Ｂに見られるように、基質としてのＣＭＰと組合わせて図示されたＮＴＰリン酸供与体を含有する反応混合物に、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼをトランスフェクトした細胞の溶解物を加えた。生成されたＣＤＰの量は、各ＮＴＰのリン酸供与体としての能力を示している。リン酸供与体としては、ＣＴＰとＧＴＰよりＵＴＰとＡＴＰの方が選択された。確かに、ＣＴＰは、ＡＴＰまたはＵＴＰの効率の半分しか示さなかったので、最も不適な受容体のようであった。この結果は３回の個別実験を典型的に表すものである。
【００３１】
ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）は、ＣＭＰ、ＵＭＰおよびｄＣＭＰがキナーゼによって効率的にリン酸化されると主張した。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。その研究は、ＣＭＰとＵＭＰの相対的基質選択性の相違を明らかにすることができなかった。（反応時間の相違およびリン酸供与体の選択を含めた）アッセイプロトコルにおける差異が異なる結果の原因であろう。相対反応速度解析によって、これが事実であるかどうかが明らかになる筈である。
【００３２】
次いで、キナーゼの組織分布を調べた。ヌクレオシドキナーゼは、通常、遍在的分布を示すが、このキナーゼが示差的に発現されるかどうかを見極めるべく評価する必要があると判断された。このｃＤＮＡはヒトマクロファージライブラリからクローニングされたので、免疫組織を評価した。結果については図６Ａ参照。ヒト免疫多組織ノーザンブロットでＣＭＰキナーゼのｍＲＮＡレベルを評価した。次いで、膜をヒトβ−アクチンでプローブして、各レーンに等しいＲＮＡが確実に配置されるようにした。２つの異なるサイズのｍＲＮＡが出現した（３．４ｋｂおよび２．０ｋｂ）。ヒトアデニル酸キナーゼ１、すなわち、ヒトゲノム内でマクロファージ由来ｃＤＮＡに最も類似している遺伝子〔マツウラら（Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）〕にも２種の転写産物が記載されており、いずれの理論にも限定されるわけではないが、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼもスプライス変異体を有すると推測された。図６Ａに示されているように、どの組織でも３．４ｋｂ形態が最も目立ち、どの形態のものも組織特異的発現を示さなかった。
【００３３】
さらに、単球がマクロファージ表現型に向かって進むように、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが発達過程で調節される可能性も調べた。これを評価するために、ヒト単球を単離し、マクロファージに分化するように１０日間培養した。細胞をプレーティングした日と、その後の培養期間中にＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、発達過程でのＣＭＰキナーゼのｍＲＮＡレベルに差がないことが示された。この結果を確認するために、ＨＬ−６０細胞を用いた。これらの細胞は単球であるが、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下にマクロファージ様細胞に分化するか〔ムラオら（Ｍｕｒａｏ　ｅｔ　ａｌ）、１９８３年；ロベラら（Ｒｏｖｅｒａ　ｅｔ　ａｌ）、１９７９年〕〕、または、ＤＭＳＯの存在下に好中球に分化する〔コリンズら（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ）、１９７５年〕。ＰＭＡ処理に誘発されて、ＨＬ−６０細胞に、単離された単球がマクロファージに分化するときに認められるものに類似した表現型の変化が生じた。これらの変化には、接着や細胞形状の変化が含まれていた。しかし、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイすると、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ発現には変化が検出されなかった。インキュベーション時間またはＰＭＡ濃度を変えても、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの発現は変わらなかった。同様に、ＤＭＳＯ処理後にも変化は検出されなかった。
【００３４】
細胞の急速増殖時にはＣＭＰキナーゼ活性が要求される可能性があると考えられたので、種々のガン細胞系でこの酵素の発現レベルを評価した。この調査の結果については図６Ｂ参照。Ｋ５６２細胞（ヒト赤白血病細胞系）は、テストした他のガン細胞系よりわずかに高いレベルのｍＲＮＡを発現した。これ以外では、アッセイした細胞系はすべて、正常組織に見られるものと類似の定常状態ｍＲＮＡレベルを示した。要するに、いずれの理論にも限定されるわけではないが、ＣＭＰキナーゼは、アッセイしたすべての組織および細胞系のいずれにも存在するようである。発現は、単球がマクロファージに分化するように発達過程で調節されることはないようである。
【００３５】
また、ＥＳＴクローンには見られるがマクロファージ由来クローンには見られない５′領域は、異なる転写産物が正常細胞よりもガン細胞で発現されることを示しているとも考えられた。この可能性を調べるために、マクロファージ由来クローンには見られない領域または両ｃＤＮＡに共通の領域にハイブリダイズするプライマーを設計した。これらのプライマーをＲＴ−ＰＣＲで用いて、マクロファージ由来クローンにはない５′領域が、初代培養細胞（大動脈平滑筋細胞）で発現されたＲＮＡにもガン細胞系（ＨＣＴ−１１６、ＲＫＯ、Ｃｏｌｏ３２０、ＨＣＡ７、ＬＳ１７４Ｔ）で発現されたＲＮＡにも存在することを確認した。これは、本発明のマクロファージ由来ｃＤＮＡとその後でクローニングされたファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）のｃＤＮＡとの相違がＲＮＡ変異体に起因するものでないことを示唆している。
【００３６】
このｃＤＮＡについてのさらなる研究で、その染色体位置が決定された。ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをプローブとして用い、ヒトゲノムライブラリ（Ｂａｃ）からこの遺伝子のゲノムクローンを得た。次いで、このクローンを使って、蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によりＣＭＰキナーゼ染色体の局在を評価した。図７Ａ参照。このクローンの同一性をサザーンブロットで確認した。次いで、このクローンを用いて、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ遺伝子を１番染色体の短腕、ｐ３４．１〜３２領域に位置決定した。この実験の結果は図７に示されており、図中、ＣＭＰキナーゼの物理的位置は矢印で示されている。バンドの局在は染色体Ｇ−バンド上で確認された。図７Ｂ参照。１０種の異なる細胞系から単離された標的ＤＮＡ上で局在が確認された。興味深いことには、この位置は他のヌクレオシド修飾酵素を含む領域である。
【００３７】
ＣＭＰキナーゼは明らかに新規な酵素ではあるが、ＡＫ−１との著しい類似性を示す。ＣＭＰキナーゼもＡＫ−１も２種のｍＲＮＡをあらゆる細胞で発現し、活性にはＭｇ２＋を必要とする。ＡＫ−１の触媒作用に重要であることが示されただけでなく、ブタＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＣＭＰキナーゼおよび他のＮＭＰキナーゼにも重要であることが示されたタンパク質モチーフ〔ブクレンチら（Ｂｕｃｕｒｅｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻：２８５６〜２８６２ページ（１９９６年）〕は、このヒトＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼに高度に保存されている。正常な赤血球の構造および機能には適正なアデニル酸キナーゼ機能が重要であることを考えれば、適正なＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性も要求されると思われる。確かに、異常活性ピリミジンヌクレオシド一リン酸（ＰＮＭＰ）キナーゼの生化学的結果の１つは、溶血性貧血症患者における過剰なＣＤＰの蓄積であることが明らかにされた。ラシャンら（Ｌａｃｈａｎｔ　ｅｔ　ａｌ）、１９８６年。興味深いことには、ＣＤＰ−エタノールアミンおよびＣＤＰ−コリンを含めたＣＤＰの下流産物も増加したが、これが赤血球表現型のより直接的な原因かもしれない。
【００３８】
明確にされたこの適正ヌクレオシドレベルの重要性は、異常なＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性が１種以上の疾患プロセスに関連している可能性を暗示している。それに対し、この酵素の比較的穏やかなＡＭＰリン酸化能は、この酵素がヒト細胞でＡＫ−１の機能とは完全に別の機能を果たすことを示唆している。これとは対照的に、ＵＴＰに加えてＡＴＰも好ましいリン酸供与体であるとの所見は、適正な相対ヌクレオシドレベルを維持するという任務においてＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼとＡＫ−１とが少なくともある程度協働することを示唆している。得られたデータのこれらの分析結果は、適正なＣＭＰキナーゼ活性の重要性と、不適正な機能が結果としてヒトに異常表現型をもたらす可能性とをさらに支持するものである。
【００３９】
遺伝性下垂症〔エングルら（Ｅｎｇｌｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９９７年〕は、ヒトＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼと同じ染色体領域内に存在する遺伝子によって引き起こされることが知られている唯一の疾患である。しかし、その症状が不適切なヌクレオシドレベルによって引き起こされることは疑わしい。確かに、このＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの一見遍在的な性質は、恐らく、このキナーゼがその生存力に必要であり得るハウスキーピング機能を果たすことを示唆している。Ｅ．ｃｏｌｉのＣＭＰキナーゼ欠失株が存在しないことが公知であることは、そのような突然変異がこの微生物には致命的であり、したがって、ヒトにも有害であり得ることを示しているのかもしれない。フリックら（Ｆｒｉｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９９５年。この結論を支持して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｄＴＭＰキナーゼの条件致死変異株のみが単離され、特性決定された。ブリンクリーら（Ｂｒｉｎｋｅｌｙ　ｅｔ　ａｌ）、１９８６年。さらに、単球からマクロファージ形成に至る発達過程での調節の欠如は、この遺伝子が細胞の発達過程の初めから活発に翻訳されるに違いないことを示唆している。
【００４０】
ヒトではＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性が完全に欠如することはありそうにないが、ＡＫ−１欠失またはＰＮＭＰキナーゼ異常活性を有するファミリーが存在することは、異常ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが生命にも適合し得ることを暗示している。さらに、これは、そのような状態がＡＫ−１異常およびＰＮＭＰキナーゼ異常が引き起こすような有意な生理的欠陥を引き起こす恐れがあるという仮説を支持する。
【００４１】
ある種のガンは、不適正なＣＭＰキナーゼ活性に関連するタイプの疾患に包含されるようである。これを支持して、ＰＮＭＰキナーゼ活性の違いがラット肝腫瘍で正常ラット肝に関して測定された。マネスおよびオレンゴ（Ｍａｎｅｓｓ　ａｎｄ　Ｏｒｅｎｇｏ）、１９７６年。確かに、ヌクレオチドが不均衡な割合で存在すると、ｉｎ　ｖｉｔｒｏＤＮＡ合成時に突然変異が起こる。カッソンおよびマンサー（Ｃａｓｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｎｓｅｒ）、１９９５年。したがって、不適正なＣＭＰキナーゼ活性はランダム突然変異を生起する可能性があると考えられる。
【００４２】
膜リン脂質合成にヌクレオチドが関与することを考えると、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼにはさらなる機能がありそうなことは明らかである。これらのタイプの生物活性脂質は、生体膜の生理特性を規定するシグナル経路に加えて、多くの生化学経路にも関与している。もしＣＭＰキナーゼがこれらの重要な脂質メディエーターのいずれかが関与する反応を変えるようなことがあれば、多くの下流事象が影響を受ける可能性がある。事実、膜脂質含量の偏りは、上述の異常ＰＮＭＰ活性によって生じる奇形赤血球の原因となり得る。先に述べたように、ＰＮＭＰキナーゼ異常活性患者から単離された赤血球では、ＣＤＰ−エタノールアミンおよびＣＤＰ−コリンが増加している。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中の欠失ＣＭＰキナーゼによって膜合成の摂動が生じ、低温感受性表現型が発現するという所見によって支持される。
【００４３】
さらなるＣＭＰキナーゼ機能の洞察は、１番染色体の短腕にマッピングされたヌクレオチド代謝に関与する他の遺伝子、ＣＴＰシンターゼ（１ｐ３４．１）およびミトコンドリアアデニル酸キナーゼ２（１ｐ３４）が共にＣＭＰキナーゼの近くにあるという所見によって与えられた。いずれの理論にも束縛されるわけではないが、ＣＭＰキナーゼとＣＴＰキナーゼは協働して適正なＣＭＰおよびＣＴＰレベルを維持するようである。これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＭＰキナーゼ活性の低下がＣＴＰシンターゼのアップレギュレーションに優勢に働くことから明らかなようである。フリックら（Ｆｒｉｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ）、１９９５年。さらに、グアニル酸シクラーゼ活性化因子２も１番染色体（１ｐ３５〜ｐ３４）に位置する。これらの遺伝子がヌクレオチド代謝遺伝子クラスターの一部であり、かつ他の類似酵素が後に１番染色体のこの領域に存在することが見出されるであろうと考えられる。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＣＭＰキナーゼが正常な細胞倍化時間の維持に必要なｒｐｓＡオペロンの一部であることが判明したという事実は、この理論にさらなる信憑性を与える。１番染色体上にさらなるヌクレオチド代謝酵素が見出されたことにより、ＣＭＰキナーゼの機能がさらに明らかにされるであろう。いずれにせよ、この新規な酵素は、単にＲＮＡおよびＤＮＡ合成に必要とされる新規なヌクレオシド三リン酸合成経路以外の事象に関与する可能性が高い。ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼは、膜脂質構成に関与する可能性があるために、無数の細胞事象を改変する立場に置かれる。
本明細書中に引用されている文献、刊行物、特許、特許出願および商用資料はすべて、その全体が本明細書に文献援用される。
【００４４】
７．　実施例
以下の実施例は、本発明の範囲内で製造された種々の実施形態を例示するために記載されている。以下の実施例は本発明に従って製造し得る多くのタイプの実施形態を包括するものでも網羅するものでもない。
【００４５】
実験方法：
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリからＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡを単離した。チェルカーら（Ｔｊｏｅｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３７４巻：５４９〜５５２ページ（１９９５年）。センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡの配列決定はどちらもＡＢＩ自動シークエンサーを用いて実施した。
【００４６】
一時的トランスフェクション
ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター　ｐＲｃ／ＣＭＶのＢｓｔＸＩ部位にクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍを入れた６ウェルプレート上にプレートした。翌日、製造業者の指示に従って１０μｌ／ウェルのリポフェクトアミン〔ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）〕を用いて１μｇのｃＤＮＡまたはベクターのみをウェルにトランスフェクトした。
【００４７】
ウエスタンブロット
トランスフェクションの１６時間後に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．３）で一度洗浄し、２００μｌの溶解バッファー〔２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１６ｍＭのＣＨＡＰＳ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター、および０．５ｍＭのジチオトレイトール〕に入れた。溶解物を遠心し（１０，０００×ｇ、１０分、４℃）、ウエスタンブロット解析用に上清を取り出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）にかけてタンパク質（５０〜１００μｇ／レーン）を分離し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（ＰＶＤＦ）に５００ｍＡで一晩ブロットした。膜を、室温で１〜２時間、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中５％ｗ／ｖ無脂肪乾燥ミルクでブロックした。精製組換えＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼに対して生成されたウサギ抗ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼポリクローナル抗体（ブロッキングバッファーに１：２５０希釈）を用いて、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼタンパク質を検出した。次いで、ブロットを、ブロッキングバッファーに１：５０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体〔キルケゴール　アンド　ペリー社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ）〕と共にインキュベートした。製造業者の指示に従ってアマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）試薬を用いて免疫反応バンドを視覚化した。
【００４８】
酵素活性アッセイ
ウエスタンブロットの項に記載したように調製した細胞溶解物（２５μｇの総タンパク質）を以下の反応混合物に加えた：８３ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１７ＭのＫＣｌ、６．７ｍＭのＮＴＰ、６．７ｍＭのＮＭＰおよび０．１μＣｉの指標［３Ｈ］−ＮＭＰ（６０．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）。反応は、３７℃で６分間実施し、等量の２Ｍのギ酸を加えて停止させた。非標識ＮＤＰを添加し（最終濃度は６．７ｍＭ）、反応生成物を窒素流下に乾燥させた。生成物を蒸留Ｈ２Ｏに再懸濁し、薄層クロマトグラフィーにかけて分析した。
【００４９】
薄層クロマトグラフィー
先に説明したように、０．２５ＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．４）を用いて室温下に密閉プレキシガラスチャンバ内で上昇展開法（ドライスタート）によりクロマトグラフィーを実施した。キャシェルら（Ｃａｓｈｅｌ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇ．、第４０巻：１０３〜１０９ページ（１９６９年）。生成物をＵＶ光下に視覚化し、基準ヌクレオチドと同時移動させて同定した。異なるヌクレオチドに対応するスポットをプレートからはがし、多目的液体シンチレーションカウンターを用いて放射性反応生成物を定量した。
【００５０】
ノーザンブロット
ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをプローブとして、ヒト多組織ノーザンブロット〔クロンテック社（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）〕を同定した。具体的に言えば、ｃＤＮＡを切り取ってゲル精製し、ＤＩＧ　ＤＮＡ標識キット〔ベーリンガー／マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ）〕を用いて標識した。膜をプレハイブリダイズし〔Ｅｘｐｒｓｓ　Ｈｙｂ（クロンテック社）中６８℃で３０分間〕、次いで、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼプローブにハイブリダイズした（３０ｎｇ　プローブ／ｍｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｈｙｂ、１時間、６８℃）。膜を洗浄した（２×１５分、０．１％　ＳＤＳ／２Ｘ　ＳＳＣ、室温、次いで、２×１５分、０．１％　ＳＤＳ／０．２Ｘ　ＳＳＣ、６８℃）。ＤＩＧ核酸検出キットおよびＣＳＰＤ（登録商標）（ベーリンガー／マンハイム社）を用いてシグナルを検出した。
【００５１】
染色体の位置決定
マクロファージライブラリ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡ〔ゲノム　システムズ、インコーポレーテッド社（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）〕を用いてヒトゲノムライブラリ（細菌人工染色体）をスクリーニングした。７つのクローンを単離し、二次スクリーニングにかけ、次いで、サザンブロット解析によりそれらの同一性を確認した。１つのクローンは、先に記載の蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析による染色体の位置決定に用いた。ピンケルら（Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　第８３巻：２９３４〜２９３８ページ（１９８６年）。
【００５２】
実施例１：　ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡの５′領域：機能性翻訳開始部位の同定
ヒトマクロファージｃＤＮＡライブラリからＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをクローニングした。Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いてこのクローンの配列をデータベースに提示されている他のクローン配列と比較した。このプロセス中にヒトＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼとも称される発現配列タグ（ＥＳＴ）クローン（ＡＦ０７０４１６）が同定され、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡと同じ遺伝子由来であることが確認された。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒａｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。しかし、このＥＳＴクローンはマクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡの後でクローニングされたものであり、マクロファージ由来クローンには存在しない５′末端に付加された７３塩基を有していた。図８参照。この付加配列内には、もし機能性であれば、予測タンパク質産物の３２アミノ酸のＮ末端延長部を生成するであろう付加された推定翻訳開始部位があった。
【００５３】
このＮ末端延長部の存在を確かめるために、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡをトランスフェクト細胞で発現させ、そのタンパク質産物の相対分子量をウエスタンブロットで測定した。マクロファージ由来ｃＤＮＡは２５ｋＤａのタンパク質を生成し（図３Ａ）、その相対分子量から、その配列は遺伝子産物の予測アミノ酸配列（１９６アミノ酸）と一致するが、推定Ｎ末端ペプチドを含んでいないことが示された。ＥＳＴクローンは、発現させると、同じ相対分子量を有するタンパク質を生成した。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。したがって、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡもその後でクローニングされたＥＳＴクローンも、同じ相対分子量を有するタンパク質を発現することが示され、図８に例示されているような第２開始部位を利用するようである。
【００５４】
実施例２：　ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性に好ましいリン酸受容体
ヌクレオチドキナーゼは、多くの場合、可変相対速度で多くのタイプのヌクレオチドをリン酸化し得ることが証明された。ＥＳＴクローンに随伴するこの研究報告は、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが、調べた他のＮＭＰに比べて最も効率的にＣＭＰ、ＵＭＰおよびｄＣＭＰをリン酸化することを示していた。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。この初期研究では、それら３種の基質は等しい効率で利用されたようであった。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。
【００５５】
本発明につながる研究において、テストしたＮＭＰのうち、マクロファージ由来クローンが発現した酵素も、リン酸受容体としてＣＭＰおよびＵＭＰを選択することが確認された。図５Ｂ。ベクターをトランスフェクトした細胞をわずかに超えるＡＴＰリン酸化も測定された。図５Ａ。これらの所見は、本発明のマクロファージ由来ｃＤＮＡには存在しない５′領域が触媒活性酵素の生成には不要であることを証明している。
【００５６】
しかし、ＥＳＴクローンに随伴する結果に反して、本発明に関連する研究では、明らかにＵＭＰよりもＣＭＰの方が選択されることが示された。具体的に言えば、マクロファージ由来ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡ産物は、ベクターをトランスフェクトした細胞に観察されるＣＭＰリン酸化レベルの６〜７倍もＣＭＰリン酸化を増大させることが示された。それに対し、この酵素は、ＵＭＰのリン酸化は２倍に増大させたに過ぎなかった。図５Ａ。相対的基質選択性におけるこの相違は、さまざまな研究グループが利用するアッセイプロトコルの違いによって生じる可能性がある。そのような違いには、許容される反応時間の違い（３０分に対して６分）や、用いられるリン酸供与体の違い（ＣＴＰに対してＡＴＰ）が含まれる。
【００５７】
実施例３：　ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性に好ましいリン酸供与体
図５Ａは、この研究により、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが選択することが示された基質を示している。本発明に関連する研究において、各ＮＭＰ基質にはそれに対応するＮＴＰをリン酸供与体として用いた。それに対し、ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）（１９９９年）で実施された鑑定には、基質に関係なく、すべての反応にＡＴＰがリン酸供与体として用いられた。図５Ａ。
【００５８】
ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性に最適な反応条件をより完全に規定するために、最も好ましいリン酸供与体を吟味した。ＣＭＰが最も理想的なリン酸受容体であると判明したので、ＣＭＰを基質として用いたが、リン酸源として用いたＮＴＰはさまざまであった。リン酸供与体としては、ＣＴＰおよびＧＴＰよりＡＴＰおよびＵＴＰの方が選択されることが確認された。図５Ｂ。これらのうち、ＣＴＰは、リン酸をＣＭＰに転移させる能力が一番低く、ＡＴＰまたはＵＴＰの反応効率の約半分であることが示された。
【００５９】
実施例４：　ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性のＭｇ２＋依存性
マクロファージ由来キナーゼと他のヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）キナーゼの配列を比較すると、類似性が高いことが判明した。この類似性は機能特性を与えることが知られているモチーフ内では特に顕著であった。これらの類似領域にはＭｇ２＋結合ループが含まれていた。図２参照。ブクレンチら（Ｂｕｃｕｒｅｎｃｉ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻：２８５６〜２８６２ページ（１９９６年）。したがって、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼのカチオン要求量は他のＮＭＰキナーゼのカチオン要求量と類似していると考えることは妥当と思われる。
【００６０】
可変濃度のＭｇ２＋の存在下にＵＭＰ−ＣＭＰ活性を測定することにより、Ｍｇ２＋が濃度依存的にＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性を増大させることが立証された。図４。最大活性は３ｍＭのＭｇ２＋の存在下に観察された。Ｍｇ２＋が存在しないと、ＣＤＰ生産量はベクターをトランスフェクトした細胞で観察されるレベルまで低下した。したがって、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性にはＭｇ２＋が絶対必要条件であることが立証された。いずれの理論にも束縛されるわけではないが、これは、予測アミノ酸配列中の推定Ｍｇ２＋結合ループが機能性であることを示しているようである。
【００６１】
実施例５：　ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの発現パターン
ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）（１９９９年）は、さまざまな器官系由来組織におけるＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの定常状態ｍＲＮＡレベルを記載した。さらに、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの組織分布も調査された。本明細書で論じられているｃＤＮＡはヒトマクロファージライブラリからクローニングされたので、ヒト免疫組織での発現をノーザンブロットで評価した。
【００６２】
調べた免疫組織はすべて、２つの異なるｍＲＮＡ種（３．４ｋｂおよび２．０ｋｂ）を発現することが示された。図６Ａ参照。ブロット上のどの組織でも３．４ｋｂ体が最も目だっていた。図６Ａ参照。ヒトアデニル酸キナーゼ１も同様に２種の転写産物を発現する〔マツウラら（Ｍｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４巻：１０１４８〜１０１５５ページ（１９８９年）〕が、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼはさらにスプライス変異型を有すると推定された。それに対し、先の研究で調べたより一般的な多組織ノーザンブロットでは、（図６Ａに示されている大きい方のＲＮＡ種のサイズくらいの）１種の転写産物が検出されただけであった。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。免疫組織では、発現レベルにおける組織特異的変化は検出されなかった（図６Ａ）。
【００６３】
ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが触媒する反応の性質のゆえに、この酵素は細胞の急速増殖時に要求されると仮定された。これをテストするために、種々のガン細胞系でＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼのｍＲＮＡレベルを評価した。Ｋ５６２（ヒト赤白血病）細胞は、わずかに高いレベルのｍＲＮＡを発現することが判明したが（図６Ｂ）、他のガン細胞系は正常組織に見られる低レベルの発現を示した。免疫組織で観察された転写産物はどちらもガン細胞系に存在していた。
【００６４】
また、付加された５′領域がＥＳＴクローンには存在するが、マクロファージ由来クローンには存在しないことは、正常細胞よりガン細胞で異なる転写産物が発現することを示唆するのに役立つと仮定された。これをテストするために、マクロファージ由来クローンには存在しない領域または両ｃＤＮＡに共通の領域のいずれかにハイブリダイズするプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、マクロファージ由来ｃＤＮＡにはない５′領域が初代培養細胞（大動脈平滑菌細胞）で発現したＲＮＡにもガン細胞系（ＨＣＴ−１１６、ＲＫＯ、Ｃｏｌｏ３２０、ＨＣＡ７、ＬＳ１７４Ｔ）で発現したＲＮＡにも存在することを確認した（データは示さず）。これは、マクロファージ由来ｃＤＮＡと、ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）に記載されているＥＳＴ由来のものとの相違がＲＮＡ変異体の結果ではないことを示唆している。
【００６５】
ｃＤＮＡはマクロファージライブラリからクローニングされたので、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの発現も、単球がマクロファージ表現型に向かって進むように発達過程で調節され得ると考えられた。この可能性を評価するために、ヒト単球を単離し、マクロファージに分化するように１０日間培養した。プレートした日と分化期間中に収穫した細胞をＲＴ−ＰＣＲ分析にかけると、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼのｍＲＮＡレベルに差がないことが示された（データは示さず）。この結論を確認するために、ＨＬ−６０細胞を用いた。これらの細胞は単球であり、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下にマクロファージ様細胞に分化する〔ムラオら（Ｍｕｒａｏ　ｅｔ　ａｌ）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、第４３巻：４９８９〜４９９６ページ（１９８３年）、ロベラら（Ｒｏｖｅｒａ　ｅｔ　ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　第７６巻：２７７９〜２７８３ページ（１９７９年）〕か、またはＤＭＳＯの存在下に好中球に分化し得る〔コリンズら（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　第７５巻：２４５８〜２４６２ページ（１９７５年）〕。ＰＭＡは明らかに、ＨＬ−６０細胞の表現型をマクロファージに分化する孤立単球と同じように浮遊細胞から付着細胞へと変えた。しかし、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイすると、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ発現には何の変化も観察されなかった。この結果は、インキュベーション時間またはＰＭＡ用量を変えても変わらなかった。同様に、ＤＭＳＯ処理した後でもこの結果の変化は検出されなかった（データは示さず）。これらのデータは、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼが単球が分化するように発達過程で発現されないことを示している。結論として、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ発現の遍在性は、この酵素がすべてまたはほとんどの細胞型に共通な基本事象に必要であることを示唆している。
【００６６】
実施例６：　染色体の位置決定
プローブとしてマクロファージ由来ｃＤＮＡを用いて、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼのゲノムクローンを得た。このクローンを用いて、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ遺伝子を１番染色体のｐ３４．１〜３２領域に位置決定した。図７参照。これは、後でＥＳＴベースｃＤＮＡをクローニングした人々によって報告された染色体位置と一致していた。（１ｐ３４．１〜１ｐ３３）。ファン　ロンパイら（Ｖａｎ　Ｒｏｍｐａｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第５６巻：５６２〜５６９ページ（１９９９年）。１番染色体のこの領域が、ＣＴＰシンターゼ〔ヤマウチら（Ｙａｍａｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　第４巻：１０８８〜１０９９ページ（１９９１年）〕およびミトコンロリアアデニル酸キナーゼ１〔カリットら（Ｃａｒｒｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ）、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第４６巻：３２９〜３３５ページ（１９８２年）〕を含めた、ヌクレオシド／ヌクレオチド修飾に関与する他の遺伝子を含むことに言及しているのは興味深い。遺伝性下垂症はＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼと同じ場所に局在することが知られている唯一の疾患遺伝子である。エングルら（Ｅｎｇｌｅ　ｅｔ　ａｌ）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第６０巻：１１５０〜１１５７ページ（１９９７年）。しかし、この異常症と不適正なヌクレオチドレベルとを結び付ける証拠は存在しない。それにもかかわらず、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの遍在的発現は、不適正な活性が、致命的でないにしてもかなりの疾患をもたらすであろうことを示唆している。おそらく、今後の研究により、異常なＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性と疾患とが関連づけられるであろう。
【００６７】
本発明は、その必須特性から逸脱することなく他の特定の形態で具現化し得る。記載されている実施形態はすべての点で例証に過ぎず限定的なものではないと理解すべきである。したがって、本発明の範囲は、上述の説明によるのではなく、特許請求の範囲によって示される。請求項の等価物の意味および範囲内に含まれる変化はすべてその請求項の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】５′および３′非翻訳領域を含む本発明のＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【図２】ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼと２種の近似する相同ヒト酵素とのアミノ酸配列の比較。
【図３】ｍｇタンパク質／分当たりの、ベクターをトランスフェクトした細胞の約６倍のＣＭＰをＣＤＰに変換させる本発明のＣＭＰ−ＣＭＰキナーゼの能力を示すグラフ。
【図４】ＣＭＰ−ＣＭＰキナーゼ活性のＭｇ２＋濃度依存性を示すグラフ。
【図５Ａ】ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの好ましい基質を示す図。
【図５Ｂ】ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの好ましいリン酸供与体を示す図。
【図６】免疫組織（図６Ａ）とガン細胞系（図６Ｂ）におけるＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの組織分布を示す図。
【図７】１番染色体の短腕のｐ３２−ｐ３４．１領域上のヒトＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼの位置を示す図。
【図８】Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．クローン（ｃＤＮＡ　４６９３３２）と、ＵＭＰ−ＣＭＰキナーゼに関してすでに発表されているヒトｃＤＮＡ（アクセッション番号　ＡＦ０７０４１６）と、本発明のマクロファージ由来クローンとの５′末端領域の比較を示す図。タンパク質配列への予想翻訳も示されている。
【図９】ＣＭＰキナーゼｃＤＮＡクローンの発現を示し、かつＭｅｔ−３３がインビボでの好ましい翻訳開始部位であることを立証する図。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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