(57)【要約】本発明は、一般にＭＨＣ陽性細胞によって提示されるペプチドリガンドの単離、精製および同定の方法に関する。特に、本発明の方法は、未感染、感染または腫瘍形成性であることがある可溶性のクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子からのこれらのペプチドリガンドの単離、精製および同定に関する。本発明の方法により、広義にはこれらのペプチドリガンドおよびそれらの付随する供給源タンパク質を感染対未感染細胞、および／または腫瘍形成対非腫瘍形成細胞のマーカーとして同定しおよび用いることができ、上記同定は、細胞を治療の目的でマーキングまたはターゲッティングに有用であり、または感染細胞に対する免疫応答のプライミングに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々のクラスＩ分子についてのペプチドリガンドを単離する方法であって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填することが可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子を分泌する前にペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する、個々の可溶性のクラスＩ分子を単離し、
ペプチドリガンドを個々の可溶性のクラスＩ分子から分離する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系を用意する工程において、構造体が更に個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し且つ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞系を用意する工程において、細胞系がクラスＩ陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞系を用意する工程において、細胞系が内生性のクラスＩ分子を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞系を用意する工程において、細胞系が微生物、微生物由来の遺伝子、または腫瘍遺伝子の少なくとも１つに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞系がＨＩＶに感染している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞系を用意する工程において、細胞系が腫瘍細胞系となるように細胞系を形質転換する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系を用意する工程において、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系が、以下の工程：
少なくとも１種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、これによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクターにクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を細胞系にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって得られるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系を用意する工程において、構造体が更に可溶性のクラスＩ分子に付着し且つ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タグを個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子をＰＣＲ増幅する工程で用いるＰＣＲプライマーによってコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
タグを、ＰＣＲ生成物をクローニングする発現ベクターによってコードする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドリガンドを同定する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドリガンドを与える供給タンパク質を同定する工程をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内性的に装填させる条件下で細胞系を培養し、
分泌された、内性的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を単離し、
ペプチドリガンドを個々の可溶性のクラスＩ分子から分離する
工程を含んでなる方法によって単離された、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項１７】
配列番号：２９を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項１８】
ペプチドリガンドがＨＩＶ−１ＭＮ， ＥＮＶから得られる、請求項１７に記載のペプチドリガンド。
【請求項１９】
配列番号：３０を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２０】
ペプチドリガンドがコリン作動性受容体，α−３ポリペプチドから得られる、請求項１９に記載のペプチドリガンド。
【請求項２１】
配列番号：３１を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２２】
ペプチドリガンドがユビキチン特異的プロテアーゼから得られる、請求項２１に記載のペプチドリガンド。
【請求項２３】
配列番号：３２を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２４】
ペプチドリガンドがβ−会合転写体タンパク質３（ＢＡＴ３）から得られる、請求項２３に記載のペプチドリガンド。
【請求項２５】
配列番号：３３を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２６】
ペプチドリガンドがＨＬＡ−Ｂ重鎖リーダー配列から得られる、請求項２５に記載のペプチドリガンド。
【請求項２７】
配列番号：３４を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２８】
配列番号：３５を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項２９】
ペプチドリガンドがＲＮＡポリメラーゼＩＩポリペプチドＡから得られる、請求項２８に記載のペプチドリガンド。
【請求項３０】
配列番号：３６を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項３１】
ペプチドリガンドがＥＵＫ，翻訳開始因子４から得られる、請求項３０に記載のペプチドリガンド。
【請求項３２】
配列番号：３７を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項３３】
ペプチドリガンドＳＰＡＲＣ−１様タンパク質から得られる、請求項３２に記載のペプチドリガンド。
【請求項３４】
配列番号：３８を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項３５】
ペプチドリガンドがテネイシン−Ｃから得られる、請求項３４に記載のペプチドリガンド。
【請求項３６】
配列番号：３９を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項３７】
ペプチドリガンドがポリピリミジントラクト結合タンパク質１から得られる、請求項３６に記載のペプチドリガンド。
【請求項３８】
配列番号：４０を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項３９】
ペプチドリガンドがレティキュロカルビンから得られる、請求項３８に記載のペプチドリガンド。
【請求項４０】
配列番号：４１を含んでなる、個々のクラスＩ分子のペプチドリガンド。
【請求項４１】
ペプチドリガンドがＥＬＡＶ（ＨｕＲ）から得られる、請求項４０に記載のペプチドリガンド。
【請求項４２】
感染細胞を未感染細胞から識別する、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する方法であって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から分離し、個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと、未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項４３】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、構造体が更に個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し且つ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
未感染細胞系がクラスＩ陰性である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
未感染細胞系が内生的に性のクラスＩ分子を発現する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系が、以下の工程：
少なくとも一種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、それによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクター中にクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を未感染細胞系中にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって得られるものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、構造体が更に可溶性のクラスＩ分子に付着し、かつ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
タグを、個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子をＰＣＲ増幅する工程で用いるＰＣＲプライマーによってコードする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
タグを、ＰＣＲ生成物をクローニングする発現ベクターによってコードする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示され且つ未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを与える供給タンパク質を同定する工程をさらに含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞系上では提示されない少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する工程において、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドが細胞系が感染して感染細胞系を形成する微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも一種類によってコードされるタンパク質から得られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞系上では提示されない少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する工程において、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドが未感染細胞系によってコードされるタンパク質から得られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドが得られる未感染細胞系によってコードされるタンパク質の腫瘍細胞系での発現が増加する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
未感染細胞系の一部に感染する工程において、未感染細胞系の一部にＨＩＶを感染させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
感染細胞を未感染細胞から識別する少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する方法であって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から分離し、個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと、感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項５７】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、構造体がさらに個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し、かつ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
未感染細胞系がクラスＩ陰性である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
未感染細胞系が内生的に性のクラスＩ分子を発現する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系が、以下の工程：
少なくとも一種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、これによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクターにクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を細胞系にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって得られるものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、構造体がさらに個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し且つ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
タグを個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子をＰＣＲ増幅する工程で用いるＰＣＲプライマーによってコードする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
タグを、ＰＣＲ生成物をクローニングする発現ベクターによってコードする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示され、かつ感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを与える供給タンパク質を同定する工程をさらに含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
未感染細胞系の一部に感染する工程において、未感染細胞系の一部にＨＩＶを感染させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが未感染細胞上では提示されない内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項６８】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：２９を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項６９】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３０を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７０】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３１を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７１】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３２を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７２】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３３を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７３】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３４を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７４】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３５を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７５】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３６を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７６】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３７を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７７】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３８を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７８】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３９を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項７９】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４０を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項８０】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４１を含んでなる、請求項６７に記載の内生的に装填したペプチドリガンド。
【請求項８１】
少なくとも一種類のペプチド断片に自然に処理することができる自己タンパク質であって、少なくとも一種類のペプチド断片が感染細胞上のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつこれによって提示される、自己タンパク質。
【請求項８２】
少なくとも一種類のペプチド断片が未感染細胞上のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつこれによって提示される、請求項８１に記載の自己タンパク質。
【請求項８３】
感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞上では提示されないペプチドリガンドであって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと、感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定する
工程を含んでなる方法によって同定されるペプチドリガンド。
【請求項８４】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系を用意する工程において、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系が、以下の工程：
少なくとも一種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、それによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクター中にクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を未感染細胞系中にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって得られるものである、請求項８３に記載のペプチドリガンド。
【請求項８５】
構造体がさらに個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し、かつ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項８４に記載のペプチドリガンド。
【請求項８６】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項８５に記載のペプチドリガンド。
【請求項８７】
タグを個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子をＰＣＲ増幅する工程で用いるＰＣＲプライマーによってコードする、請求項８５に記載のペプチドリガンド。
【請求項８８】
タグを、ＰＣＲ生成物をクローニングする発現ベクターによってコードする、請求項８５に記載のペプチドリガンド。
【請求項８９】
少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドが、未感染細胞系の一部が感染して感染細胞系を形成する微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つによってコードされたタンパク質から得られる、請求項８３に記載のペプチドリガンド。
【請求項９０】
少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドが未感染細胞系によってコードされるタンパク質から得られる、請求項８３に記載のペプチドリガンド。
【請求項９１】
未感染細胞系の一部がＨＩＶに感染している、請求項８３に記載のペプチドリガンド。
【請求項９２】
請求項８３に記載のペプチドリガンドを与える、供給タンパク質。
【請求項９３】
個々のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつ未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示される、ペプチドリガンド。
【請求項９４】
ペプチドリガンドが個々のクラスＩ分子に内生的に装填されておらず、かつ感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示される、請求項９３に記載のペプチドリガンド。
【請求項９５】
少なくとも一種類のペプチド断片に処理することができる自己タンパク質であって、少なくとも一種類のペプチド断片が個々のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつ未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示される、自己タンパク質。
【請求項９６】
少なくとも一種類のペプチド断片が個々のクラスＩ分子に内生的に装填されておらず、感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示される、請求項９５に記載の自己タンパク質。
【請求項９７】
個々のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつ未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが感染細胞上では提示されないペプチドリガンドであって、以下の工程：
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定すること
を含んでなる方法によって同定されるペプチドリガンド。
【請求項９８】
構造体がさらに個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し、かつ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項９７に記載のペプチドリガンド。
【請求項９９】
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系が、以下の工程：
少なくとも一種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、それによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクター中にクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を未感染細胞系中にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって得られるものである、請求項９７に記載のペプチドリガンド。
【請求項１００】
構造体がさらに個々の可溶性のクラスＩ分子に付着し且つ個々の可溶性のクラスＩ分子の単離を促進するタグをコードする、請求項９９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０１】
タグがＨＩＳテイルおよびＦＬＡＧテイルからなる群から選択される、請求項９９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０２】
タグを個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子をＰＣＲ増幅する工程で用いるＰＣＲプライマーによってコードする、請求項９９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０３】
タグを、ＰＣＲ生成物をクローニングする発現ベクターによってコードする、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項９７に記載のペプチドリガンドを与える、供給タンパク質。
【請求項１０５】
処理を行って少なくとも一種類のペプチド断片とする自己タンパク質を同定する方法であって、ここで少なくとも一種類のペプチド断片が個々のクラスＩ分子に内生的に装填され、かつ感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが未感染細胞上では提示されないものであり、該方法が以下の工程：
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
内生的に装填したペプチドリガンドを結合した分泌した個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定し、
少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを与える供給タンパク質を決定し、
供給タンパク質が、感染細胞系が感染する微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子によってコードされないが、未感染細胞系によってコードされるときには、供給タンパク質を自己タンパク質として同定すること
を含んでなる、方法。
【請求項１０６】
処理を行って少なくとも一種類のペプチド断片とする自己タンパク質を同定する方法であって、ここで少なくとも一種類のペプチド断片が個々のクラスＩ分子に内生的に装填され、且つ未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが感染細胞上では提示されないものであり、該方法が以下の工程：
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質をクラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる未感染細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合して保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定し、
少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを与える供給タンパク質を決定すること
を含んでなる、方法。
【請求項１０７】
個々のクラスＩ分子についての内生的に装填されたペプチドリガンドを同定するキットであって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができ、この細胞系を個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件下で培養するとき、細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前に、ペプチドリガンドがそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内部装填されるようにする細胞系を含んでなる、キット。
【請求項１０８】
細胞系が、以下の工程：
少なくとも一種類のクラスＩ分子をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを得て、
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中の個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を同定し、
個々のクラスＩ分子をコードする対立遺伝子を遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅して、それによって生成したＰＣＲ生成物が個々のクラスＩ分子の切断した可溶性形態をコードするようにし、
ＰＣＲ生成物を発現ベクターにクローニングすることによって、個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を形成し、
構造体を未感染細胞系にトランスフェクションすること
を含んでなる方法によって生成する、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
疾病状態を検出する方法であって、
個々のクラスＩ分子中で内生的に装填したペプチドリガンドを検出する手段を用意し、内生的に装填したペプチドリガンドが未感染細胞上ではなく感染細胞上で個々のクラスＩ分子によって提示される
工程を含んでなる、方法。
【請求項１１０】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：２９を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３０を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３１を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３２を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３３を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３４を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３５を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１７】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３６を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１８】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３７を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１９】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３８を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３９を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２１】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４０を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２２】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４１を含んでなる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２３】
疾病状態がＨＩＶ感染症である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２４】
疾病状態を検出するための方法であって、個々のクラスＩ分子中で内生的に装填したペプチドリガンドを検出する手段を用意し、内生的に装填したペプチドリガンドが感染細胞上ではなく未感染細胞上で個々のクラスＩ分子によって提示される工程を含んでなる、方法。
【請求項１２５】
疾病状態を検出するためのキットであって、個々のクラスＩ分子中で内生的に装填したペプチドリガンドを検出するための手段であって、内生的に装填したペプチドリガンドが未感染細胞上ではなく感染細胞上で個々のクラスＩ分子によって提示されることを含んでなる、方法。
【請求項１２６】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：２９を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３０を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３１を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３２を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３３を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３１】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３４を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３２】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３５を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３３】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３６を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３５】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３７を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３６】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３８を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３７】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：３９を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３８】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４０を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３９】
内生的に装填したペプチドリガンドが配列番号：４１を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１４０】
疾病状態を検出するためのキットであって、個々のクラスＩ分子中で内生的に装填したペプチドリガンドを検出するための手段であって、ペプチドリガンドが感染細胞上ではなく未感染細胞上で個々のクラスＩ分子によって提示されることを含んでなる、キット。
【請求項１４１】
個々のクラスＩ分子によって提示される内生的に装填したペプチドリガンドのモティーフを同定する方法であって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる細胞系を用意し、
構造体から個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分泌される前にペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る条件下で、細胞系を培養し、
内生的に装填したペプチドリガンドを結合した分泌した個々の可溶性のクラスＩ分子を単離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを個々の可溶性のクラスＩ分子から分離することによって、内生的に装填したペプチドリガンドのプールを形成し、
内生的に装填したペプチドリガンドのプールを配列決定し、内生的に装填したペプチドリガンドの特異的位置における特定アミノ酸のドミナント・オカーレンス（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）に基づいて内生的に装填したペプチドリガンドのモティーフを誘導する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１４２】
化合物を感染細胞にターゲッティングする方法であって、
個々の可溶性のクラスＩ分子をコードする構造体を含む未感染細胞系であって、タンパク質を、クラスＩ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然に処理することができる細胞系を用意し、
未感染細胞系の一部に微生物、微生物由来の遺伝子または腫瘍遺伝子の少なくとも１つを感染させることによって、感染細胞系を用意し、
個々の可溶性のクラスＩ分子を発現させる条件であり、かつ細胞から個々の可溶性のクラスＩ分子が分される前に、ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩ分子の抗原結合溝に内生的に装填させる条件下で、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
分泌された、内生的に装填したペプチドリガンドを結合て保持する個々の可溶性のクラスＩ分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
個々の可溶性のクラスＩ分子由来の内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
内生的に装填したペプチドリガンドを未感染細胞系から、および内生的に装填したペプチドリガンドを感染細胞系から単離し、
感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドと未感染細胞系から単離した内生的に装填したペプチドリガンドとを比較し、
感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によって提示されるが、未感染細胞系上の個々の可溶性のクラスＩ分子によっては提示されない、少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを同定し、
化合物を、細胞の表面上の個々のクラスＩ分子によって提示される少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドを有する細胞にターゲッティングする
工程を含んでなる、方法。
【請求項１４３】
化合物を細胞にターゲッティングする工程において、化合物が薬剤である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
化合物を細胞にターゲッティングする工程において、化合物が抗体である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
化合物を細胞にターゲッティングする工程において、化合物が少なくとも一種類の内生的に装填したペプチドリガンドと個々のクラスＩ分子から形成される複合体を認識する、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
リガンドを単離する方法であって、
所望により、細胞系を用意し、
所望により、細胞系を培養し、
リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１４７】
所望により、細胞系を用意し、
所望により、細胞系を培養し、
リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離する
工程を含んでなる方法によって単離されるリガンド。
【請求項１４８】
少なくとも一種類のリガンドを同定する方法であって、
所望により、細胞系を用意し、
所望により、細胞系の一部を感染させ、
所望により、細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離し、
所望により、リガンドを単離し、
少なくとも一種類のリガンドを同定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１４９】
少なくとも一種類のリガンドを同定する方法であって、
所望により、未感染細胞系を用意し、
所望により、未感染細胞系の一部を感染させ、
所望により、未感染細胞系と感染細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を未感染細胞系と感染細胞系から単離し、
所望により、分子由来のリガンドを未感染細胞系から分離し、かつ分子由来のリガンドを感染細胞系から分離し、
所望により、リガンドを未感染細胞系から、およびリガンドを感染細胞系から単離し、
所望により、未感染細胞系から単離したリガンドと感染細胞系から単離したリガンドとを比較し、
未感染細胞系上の分子によって提示されるが、感染細胞系上の分子によって提示されない少なくとも一種類のリガンドを同定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１５０】
感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが、所望により未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によっては提示されない、リガンド。
【請求項１５１】
処理を行って少なくとも一種類のペプチド断片とすることができるタンパク質であって、少なくとも一種類のペプチド断片がクラスＩ分子に装填されおよび／またはこれによって提示されることを特徴とする、タンパク質。
【請求項１５２】
所望により、細胞系の一部を感染させ、
所望により、細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離し、
所望により、リガンドを単離し、
少なくとも一種類のリガンドを同定する
工程を含んでなる方法によって同定される、リガンド。
【請求項１５３】
分子に装填され、且つ細胞上の分子によって提示される、リガンド。
【請求項１５４】
処理を行って少なくとも一種類のペプチド断片とすることができるタンパク質であって、少なくとも一種類のペプチド断片がクラスＩ分子に装填されており、かつ所望により未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示される、タンパク質。
【請求項１５５】
所望により、未感染細胞系を用意し、
所望により、未感染細胞系の一部を感染させ、
所望により、未感染細胞系と感染細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を未感染細胞系と感染細胞系から単離し、
所望により、分子由来のリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
所望により、リガンドを未感染細胞系から、およびリガンドを感染細胞系から単離し、
所望により、未感染細胞系から単離したリガンドと感染細胞系から単離したリガンドとを比較し、
未感染細胞系上の分子によって提示されるが、感染細胞系上の分子によって提示されない、少なくとも一種類のリガンドを同定する
工程を含んでなる方法によって同定される、リガンド。
【請求項１５６】
自己タンパク質を同定する方法であって、
所望により、細胞系を用意し、
所望により、細胞系の一部を感染させ、
所望により、細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離し、
所望により、リガンドを単離し、
所望により、少なくとも一種類のリガンドを同定し、
少なくとも一種類のリガンドが得られる供給タンパク質を決定し、
所望により、供給タンパク質を自己タンパク質として同定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１５７】
自己タンパク質を同定する方法であって、
所望により、未感染細胞系を用意し、
所望により、未感染細胞系の一部を感染させ、
所望により、未感染細胞系および感染細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を未感染細胞系および感染細胞系から単離し、
所望により、分子由来のリガンドを未感染細胞系および感染細胞系から分離し、
所望により、リガンドを未感染細胞系から、およびリガンドを感染細胞系から単離し、
所望により、未感染細胞系から単離したリガンドを感染細胞系から単離したリガンドと比較し、
所望により、未感染細胞系上の分子によって提示されるが感染細胞系上の分子によって提示されない少なくとも一種類のリガンドを同定し、
少なくとも一種類のリガンドが得られる供給タンパク質を決定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１５８】
リガンドを同定するためのキットであって、
クラスＩ分子をコードする構造体を含む細胞系
を含んでなる、キット。
【請求項１５９】
疾病状態を検出する方法であって、
分子中でリガンドを検出する手段を用意する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１６０】
疾病状態を検出する方法であって、
分子中でリガンドを検出する手段を用意し、リガンドが所望により未感染細胞上の分子によって提示される、
工程を含んでなる、方法。
【請求項１６１】
疾病状態を検出するためのキットであって、
分子中でリガンドを検出する手段
を含んでなる、キット。
【請求項１６２】
疾病状態を検出するためのキットであって、
分子中でリガンドを検出する手段を含んでなり、リガンドは所望により未感染細胞上の個々のクラスＩ分子によって提示されるが、感染細胞上のの個々のクラスＩ分子によっては提示されない、キット。
【請求項１６３】
リガンドについてのモティーフを同定する方法であって、
所望により、細胞系を用意し、
所望により、細胞系を培養し、
所望により、リガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離することによって、リガンドのプールを形成し、
リガンドのプールを配列決定し、リガンドのモティーフを誘導する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１６４】
化合物を細胞にターゲッティングする方法であって、
所望により、細胞系を用意し、
所望により、このような細胞系の一部を感染させ、
所望により、細胞系を培養し、
所望により、内生的に装填したペプチドリガンドを結合した分子を単離し、
所望により、リガンドを分子から分離し、
所望により、少なくとも一種類のリガンドを同定し、
化合物を、少なくとも一種類のリガンドを有する細胞にターゲッティングする工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、２０００年１０月１０日出願の「Ｃ−末端エピトープタギングがＭＨＣクラスＩ陽性細胞からの比較リガンドマッピングを促進する」という名称の仮特許出願米国連続番号６０／２４０，１４３号明細書、２００１年６月２０日出願の「ＭＨＣクラスＩ陽性細胞からの比較リガンドマッピングのためのＣ−末端タギングの方法によって同定されるＨＩＶエピトープ」という名称の仮特許出願米国連続番号６０／２９９，４５２号明細書、２０００年１２月１８日出願の「ゲノムＤＮＡからＨＬＡの生成」という名称の仮特許出願米国連続番号６０／２５６，４１０号明細書、２０００年１２月１８日出願の「ｃＤＮＡからのＨＬＡの生成」という名称の仮特許出願米国連続番号６０／２５６，４０９号明細書、および２００１年１０月９日出願の「ゲノムＤＮＡから可溶性のヒトＨＬＡクラスＩタンパク質の生成」という名称の仮特許出願米国の明細書であって、連続番号は未だ指定されていないものの利益を主張するものであり、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０００２】
連邦政府の援助による研究または開発に関するステートメント
この研究は、国立衛生研究所からの契約：「ウイルスエピトープのマッピングおよび特性決定」という名称の契約番号ＮＯ１−ＡＩ−９５３６０によって部分的に資金援助を受けた。厳密な意味で、政府は本出願に対して一定の権利を有することができる。
【０００３】
【発明の背景】
１．発明の分野
本発明は、一般にＭＨＣ陽性細胞によって提示されるペプチドリガンドの単離、精製および同定の方法に関する。特に、本発明の方法は、未感染、感染または腫瘍形成性であることがある可溶性のクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子からのこれらのペプチドリガンドの単離、精製および同定に関する。本発明の方法により、広義にはこれらのペプチドリガンドおよびそれらの付随する供給タンパク質を感染対未感染細胞、および／または腫瘍形成対非腫瘍形成細胞のマーカーとして同定し、および用いることができ、上記同定は、細胞を治療の目的でマーキングまたはターゲッティングに、または感染細胞に対する免疫応答のプライミングに有用である。
【０００４】
２．背景技術
ヒトではＨＬＡクラスＩと呼ばれるクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子は、細胞表面でペプチド抗原リガンドと結合し、表示する。クラスＩＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原リガンドは、通常の内生的にタンパク質（「自己」）または細胞に導入される異種タンパク質（「非自己」）から誘導される。非自己タンパク質は、悪性形質転換またはウイルスのような細胞内病原体であることがある。このように、クラスＩＭＨＣ分子は、「非自己」ペプチドとの相互作用によって活性化されるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などこれに限定されない免疫エフェクター細胞に細胞の内部適合性に関する情報を伝達し、これによって「非自己」ペプチドを提示する細胞をリーシスし、または殺す。
【０００５】
ヒトではＨＬＡクラスＩＩと呼ばれるクラスＩＩＭＨＣ分子も、細胞表面でペプチド抗原リガンドと結合し、表示する。実質的に総ての核形成した細胞上で発現するクラスＩＭＨＣ分子とは異なり、クラスＩＩ ＭＨＣ分子は通常はＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、およびエンドサイトーシス経路によって細胞外流体から異種抗原を吸収する他の抗原提示細胞のような分化細胞に閉じ込められている。これらが結合して提示するペプチドは、細胞の外側で増殖する細菌の産物のような細胞外異種抗原から誘導され、このような産物としては、宿主（例えば、ヒト）に有害であり且つ致命的でさえある効果を有することが多い細菌によって分泌されるタンパク質毒素が挙げられる。このように、クラスＩＩ分子は、クラスＩＩ分子を展示する細胞の近傍の細胞外空間の適合性に関する情報をＣＤ４ヘルパーＴ細胞などこれに限定されない免疫エフェクター細胞に伝達することによって、これらの病原体を除去させ、これらの病原体の検討はＢ細胞に、微生物並びにこのような微生物によって産生される毒素に対する抗体を作らせることによって、またマクロファージを活性化して摂取された微生物を破壊することによって達成される。
【０００６】
クラスＩおよびクラスＩＩＨＬＡ分子は、体系的再結合および点突然変異によって生じる広汎な多型を示し、それ自体、数百の異なる種類のＨＬＡが世界の個々群中に存在し、大きな免疫学的多様性を生じている。個々群中のこのような広汎なＨＬＡ多様性により、個々間での組織または臓器移植拒絶反応、並びに感染性疾患に対する感染性および／または耐性の差が生じる。ＨＬＡ分子は、自己免疫および癌にもかなり寄与する。ＨＬＡ分子は、総てではないにしてもほとんどの適応免疫応答を伝達するので、移植、自己免疫疾患を効果的に研究し、ワクチンを開発するには多量の純粋な単離ＨＬＡタンパク質が必要である。
【０００７】
精製した個々のクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質が極めて有用である幾つかの応用がある。このような応用としては、疾患耐性／自己免疫の免疫診断試薬としてのＭＨＣ−ペプチドマルチマーの使用、潜在的治療ペプチドの結合の評価、ワクチン候補を同定するためのＭＨＣ分子からペプチドの溶出、予備形成したＭＨＣ特異抗体に対する移植患者のスクリーニング、および患者から抗ＨＬＡ抗体の除去が挙げられる。各個々は異なるＭＨＣ分子を有するので、多数の個々ＭＨＣ分子の試験が個々間の疾病感染性の差を理解する上での必要条件である。従って、世界の個々群中に存在する数百種類の異なるＨＬＡを代表する精製したＭＨＣ分子は、疾病感染性および耐性を解明し、並びにワクチンのような治療薬をデザインする上で極めて望ましい。
【０００８】
クラスＩＨＬＡ分子は、宿主細胞内で疾患に対する免疫応答を警告する。細胞内のウイルスおよび腫瘍特異タンパク質から誘導されるペプチドを細胞の小胞体中のクラスＩ分子の抗原結合溝に装填した後、細胞表面に運搬する。クラスＩＨＬＡ分子とその装填したペプチドリガンドが細胞表面にあるときには、クラスＩ分子およびそのペプチドリガンドは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に接近することができる。ＣＴＬはクラスＩ分子によって提示されたペプチドを精査し、その細胞内の感染性または腫瘍性因子から誘導されるリガンドを収容している細胞を破壊する。
【０００９】
特異的ＣＴＬターゲットは同定されているが、疾病細胞の表面に提示されたリガンドの広さおよび性質についてはほとんど知られていない。基本的な科学的見地から、多くの未解決の疑問がペプチド提示に関する技術に広がっている。例えば、ウイルスは所定の遺伝子座由来のＨＬＡクラスＩ分子の発現を優先的にブロックし、他の遺伝子座の発現はそのままにすることができることが示されている。同様に、特定の遺伝子座のクラスＩＨＬＡを発現することができない癌細胞が多数報告されている。しかしながら、３種類の古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子座は、それらが結合する免疫調節リガンドについてどのように異なっているか（または異なっているかどうか）について説明しているデータはない。従って、異なる遺伝子座由来のクラスＩ分子がウイルスおよび腫瘍由来のリガンドとの相互作用およびそれぞれが提示するペプチドの数でどのように変化するかは明らかでない。
【００１０】
ＣＴＬ認識についての識別用のウイルスおよび腫瘍特異リガンドは、ワクチンデザインの重要な成分である。腫瘍形成または感染細胞に特有のリガンドを試験して、防御的ＣＴＬ応答を引き起こすようにデザインされたワクチンに組込むことができる。幾つかの方法が、現在潜在的に防御的ペプチドリガンドを同定する目的で用いられている。一つの方法では、Ｔ細胞系またはクローンを用いて、溶出したペプチドのクロマトグラフィー画分中の生物活性リガンドをスクリーニングする（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ ２６４， １９９４， ｐａｇｅｓ ７１６−７１９， この文献の内容は、特にその開示の一部として本明細書に引用されている）。この方法は、癌細胞に特異的なペプチドリガンドの同定に用いられている。第二の手法では、以前に決定されたモティーフおよび／または個々のリガンド配列に基づいて特定のクラスＩ分子に結合することができるペプチドを同定するためのアルゴリズムによる予測を用いている（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， （７） ４， ２００１， この文献の内容は、特にその開示の一部として本明細書に引用されている）。次に、目的とする病原体からの結合の確率が高いことが予想されるペプチドを合成して、前駆体、テトラマーまたは ＥＬＩＳｐｏｔ分析におけるＴ細胞反応性について試験することができる。
【００１１】
しかしながら、個々ＨＬＡ分子の容易に入手可能な供給源はなかった。入手可能なＨＬＡタンパク質の量は少量であり、典型的には異なるＨＬＡ分子の混合物からなっていた。ＨＬＡ分子の製造は、伝統的には複数のＨＬＡ分子を発現する細胞の増殖およびリーシスを伴っている。個々数の９０％はＨＬＡ遺伝子座のそれぞれでヘテロ接合性であり、共優性発現により、それぞれのＨＬＡ遺伝子座で発現した複数のＨＬＡタンパク質が生じる。哺乳類細胞から本来のクラスＩまたはクラスＩＩ分子を精製するには、時間がかかり且つ煩雑な精製方法が必要であり、それぞれの細胞は典型的には多数の表面に結合したＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子を発現するので、ＨＬＡ精製は多くの異なるＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子の混合物を生じる。このようなＨＬＡ分子の混合物を用いて実験を行い、または複数の表面に結合したＨＬＡ分子を有する細胞を用いて実験を行うと、結果の解釈において異なるＨＬＡ分子を直接には識別することができず、任意の特定のＨＬＡ分子が所定の結果に関与していることを確信することができない。従って、当該技術分野では、実質的な量の個々ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子を生成し、他のＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子から独立して容易に精製し、単離することができる方法が求められた。このような個々ＨＬＡ分子は、十分な量および純度で用意されると、免疫応答の研究および測定の強力な手段となる。
【００１２】
従って、当該技術分野では、未感染／非腫瘍細胞から感染／腫瘍細胞を識別する方法を含んでなるクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子についてのエピトープ検出および比較リガンドマッピングの改良法が求められている。本発明は、可溶性のＨＬＡ分子の生成をエピトープ単離、検出および直接比較法と組み合わせることによってこの要望を解決する。
【００１３】
【発明の具体的説明】
具体例の図面、実験、結果、および実験室の手順によって本発明の少なくとも１つの態様を詳細に説明する前に、本発明はその応用において下記の説明に記載されまたは図面、実験および／または結果に例示されている構成の詳細および成分の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明によれば、他の態様が可能であり、あるいは本発明は様々な方法で実施または実行することが可能である。従って、本明細書で用いられる術語は最も広い可能な範囲および意味を与えようとするものであり、態様は例示的であり、限定的なものではないことを意味する。また、本明細書で用いられる表現および用語は説明のためのものであり、限定的なものと考えるべきではないことを理解すべきである。
【００１４】
本発明は、一般的にはエピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法、並びに未感染／非腫瘍細胞から感染／腫瘍細胞を識別する方法に関する。本発明の方法は、広義には下記の（１）個々可溶性のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子をコードする構造体を含む細胞系（この細胞系は自己または非自己タンパク質をクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子の抗原結合溝に装填可能なペプチドリガンドに自然処理することができる）を用意し、（２）構造体から個々の可溶性のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子を発現させる条件であり、かつ結合するペプチドリガンドを有する可溶性のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子が分泌される前に（自己または非自己の処理したタンパク質由来の）ペプチドリガンドをそれぞれの個々の可溶性のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子の抗原結合溝に内生的に装填させ得る（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｏａｄｉｎｇ）条件下で、細胞系を培養し、（４）ペプチドリガンドを個々の可溶性のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子から分離すること、を含む。
【００１５】
本発明の方法は、一態様では、バイオリアクターユニットで哺乳類細胞から分泌される（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の）ＭＨＣ分子の産生方法を用いることができる。クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子を改質して、それらを分泌させ、単離し、精製することができるようにすることによって、相当な量の個々のＭＨＣ分子が得られる。可溶性のＭＨＣ分子の分泌により、産生したＭＨＣ分子の量および純度に関する従来技術の不利な点および欠陥が解消される。量の問題は克服され、ＭＨＣを産生する細胞を界面活性剤でリーシスしまたは殺してＭＨＣ分子を得る必要がないからである。この方法では、分泌ＭＨＣを産生する細胞は生きたままであり、従ってＭＨＣを産生し続ける。細胞から分泌されるＭＨＣ分子だけが分泌のために特異的に構築されたものであるから、純度の問題は克服されている。従って、このような分泌されたＭＨＣ分子をコードするベクターを内生性の表面結合ＭＨＣを発現することができる細胞にトランスフェクションすることによって、高濃縮形態のトランスフェクションしたＭＨＣ分子をこれが細胞から分泌されるときに得る方法が用意される。分泌したＭＨＣ分子をＭＨＣ欠乏細胞系にトランスフェクションすることによって、一層高純度が確保される。
【００１６】
中空繊維バイオリアクターユニットでのＭＨＣ分子の生産では、従来の液相組織培養によって許容されるより実質的に高密度で細胞を培養する。ＭＨＣ分子を分泌する細胞の密集培養により、トランスフェクションしたＭＨＣ分子を連続的に収穫する能力がさらに増幅される。ＭＨＣ分泌細胞系の密集バイオリアクター培養により、高濃度の個々ＭＨＣタンパク質を得ることができる。高濃縮の個々のＭＨＣタンパク質には、精製タンパク質の濃度が増加するのでほとんどの下流タンパク質精製法は一層良好に行われるという利点がある。このように、バイオリアクターでのＭＨＣ分泌細胞の培養により、個々ＭＨＣタンパク質を濃縮形態で連続的に産生することができる。
【００１７】
本発明で用いられるＭＨＣ分子の産生方法は、所望なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子をコードするゲノムまたは相補的ＤＮＡを得ることによって開始する。所望なＭＨＣ分子をコードする遺伝子座の対立遺伝子は、遺伝子座特異的にＰＣＲ増幅される。これらの遺伝子座特異的なＰＣＲ生成物は、ＭＨＣ分子の全コード領域またはその一部を含むことがある。一態様では、ネステドまたはヘミネステドＰＣＲを応用して切断形態のクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子を産生し、細胞表面に固定されるよりはむしろ分泌されるようにする。もう一つの態様では、ＰＣＲにより、直接ＭＨＣ分子を切断する。
【００１８】
遺伝子座特異的ＰＣＲ生成物を哺乳類発現ベクターにクローニングし、様々なな方法でスクリーニングして所望なＭＨＣ分子をコードするクローンを同定する。クローニングしたＭＨＣ分子のＤＮＡ配列決定し、ＰＣＲの適合性を確保する。次に、所望なＭＨＣ分子の忠実な切断クローンを、哺乳類細胞系にトランスフェクションした。このような細胞系を組換えクラスＩ分子をコードするベクターでトランスフェクションすると、このような細胞系は内生性のクラスＩＭＨＣ分子の発現を欠くかまたは内生性クラスＩＭＨＣ分子を発現することがある。当業者であれば、本発明を考慮すれば、内生性のクラスＩＭＨＣ分子を発現する細胞は、自然な細胞死に際してＭＨＣを自発的に溶液中に放出することの重要性に注目するであろう。この少量の自発的に放出されたＭＨＣが重要である場合には、トランスフェクションしたクラスＩＭＨＣ分子に「タグを付けて」、これがクラスＩ分子を発現する細胞における自発的に放出された内生性のクラスＩ分子から特に精製されるようにすることができる。例えば、ＨＩＳテイルをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ反応によってタンパク質に結合させることができ、またはＰＣＲ断片がクローニングされるベクターによってコードすることができるので、このようなＨＩＳテイルは内生性のクラスＩ分子からクラスＩＭＨＣ分子の精製をさらに促進する。ヒスチジンテイルのそばのタグも役立つことが示されており、下流精製のためのタンパク質にタグを付ける当業者であれば、ＭＨＣ分子を一層容易に精製することができるようなやり方でＭＨＣ分子にタグを付ける方法を理解し、知っているであろう。
【００１９】
クローニングしたゲノムＤＮＡ断片は、エキソンおよびイントロン、並びに遺伝子の５’および３’末端における他の非翻訳領域を含む。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＲＮＡに転写する細胞系にトランスフェクションした後、クローニングしたゲノムＤＮＡはタンパク質生成物を生じ、これによりイントロンを除去しＲＮＡをスプライシングしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成し、これが次にＭＨＣタンパク質に翻訳される。従って、ｇＤＮＡによってコードされたＭＨＣ分子のトランスフェクションは、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、およびタンパク質の再単離を促進する。昆虫および細菌細胞のような非哺乳類細胞系でのＭＨＣ分子の産生には、これらの種類の下等細胞はｇＤＮＡクローンから転写されたＲＮＡからイントロンをスプライシングする能力を持たないので、ｃＤＮＡクローンが必要である。これらの場合に、本発明の哺乳類ｇＤＮＡトランスフェクタントは、逆転写してＭＨＣ ｃＤＮＡを形成することができるＲＮＡの重要な供給源を用意する。次に、ｃＤＮＡをクローニングし、細胞に導入した後、タンパク質に翻訳することができる。従って、分泌ＭＨＣの産生の他に、このようなｇＤＮＡトランスフェクタントはｍＲＮＡの容易な供給源、および従ってｃＤＮＡクローンを用意し、次にこれを非哺乳類細胞にトランスフェクションしてＭＨＣを産生させることができる。従って、ＭＨＣゲノムＤＮＡクローンから出発する本発明は、様々な種由来の細胞でＭＨＣを産生することができる。
【００２０】
ｇＤＮＡから出発することの重要な利点は、目的とするＭＨＣ分子を含む増殖可能な細胞を必要としないことである。個々群中の総ての個々は異なるＭＨＣレパートリーを有するので、所望な個々と同一のＭＨＣ補体を有するものを見出すには５０００００種類を上回る個々を検索する必要があり、この原理の実際的な例は骨髄移植のための被移植者に適合するドナーを見出そうとするときに見られる。従って、実験または診断で用いるための特定のＭＨＣ分子を産生させることが所望なときには、目的とするＭＨＣ対立遺伝子を発現するヒトまたは細胞を最初に同定する必要がある。あるいは、本発明の方法では、ｇＤＮＡを単離するには、唾液試料、毛根、古いフリーザー試料、または１ｍＬ未満（０．２ｍＬ）の血液が必要なだけである。次に、ｇＤＮＡから出発して、目的とするＭＨＣ分子を本明細書に記載のｇＤＮＡクローンを介して得ることができ、このようなクローンを哺乳類細胞にトランスフェクションした後、所望なタンパク質を直接哺乳類細胞に、または本明細書に記載の本発明の方法を用いて幾つかの種の細胞のｃＤＮＡから産生させることができる。
【００２１】
タンパク質発現のＭＨＣ対立遺伝子を得るための現在の実験は、典型的にはｍＲＮＡから出発し、これは目的とするＭＨＣ分子を発現する哺乳類細胞の新鮮な試料を必要とする。ｇＤＮＡからの作業は、遺伝子発現または新鮮な生物学的試料を必要としない。ＲＮＡは本質的に不安定であり、ｇＤＮＡのように容易には得られないことに留意することが重要である。従って、ｃＤＮＡクローンから出発する特定のＭＨＣ分子の産生が所望なときには、ＲＮＡを得る目的で目的とする対立遺伝子を発現するヒトまたは細胞系を伝統的には最初に同定しなければならない。次に、血液または細胞の新鮮な試料を得なければならないが、本発明の方法を用いる実験は、３日経過未満の血液≧５ｍＬがＭＨＣのｃＤＮＡ合成に十分なＲＮＡを得るのに必要であることを示している。従って、ｇＤＮＡから出発することによって、容易に産生することができるＭＨＣ分子の幅は広がる。これはＭＨＣ系程度の多型の系において重要な因子であり、数百のＭＨＣ分子が存在するが、総てのＭＨＣ分子が容易に利用可能であるというものではない。このことは、特に孤立した個々群に特有のＭＨＣ分子または少数民族に特有のＭＨＣ分子については真実である。ゲノムＤＮＡの点からクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子発現を開始すると、目的とする遺伝子の単離が簡単になり、研究用のＭＨＣ分子を産生する一層公正な手段が確保されるが、そうでなければ、どのＭＨＣ分子を研究用に選択し、および選択しないかの決定、並びに新鮮な試料を得ることができず従って診断分析にそれらのＭＨＣ分子を含めるべきではない民族個々群の決定を行うことが残される。
【００２２】
ｃＤＮＡを出発材料としてのゲノムＤＮＡの代わりに用いることができるが、所望なＨＬＡクラスＩのそれぞれについてのｃＤＮＡの産生には、数百種類の異なるＨＬＡ型の増殖可能な細胞系であって、それぞれが異なる種類のＨＬＡクラスＩを発現するものが必要である。あるいは、様々な所望なＭＨＣ型を有する個々からの新鮮な試料が必要である。ゲノムＤＮＡを出発材料として用いると、増幅工程を再結合および遺伝子転換を模倣するように操作することができるので、単一のゲノムＤＮＡ配列から多くのＨＬＡ分子のクローンを産生できる。幾つかの突然変異誘発法があり、これによって、所定のクラスＩｇＤＮＡクローンをｇＤＮＡのレベルでまたはこのｇＤＮＡクローンから生成するｃＤＮＡのレベルで改質することができる。本発明で用いられるＭＨＣ分子を産生する方法は増殖可能な細胞を必要とせず、従ってＲＮＡを悩ませる減成は問題とはならない。
【００２３】
本明細書に記載の方法によって産生した可溶性のクラスＩＭＨＣタンパク質を、本発明のエピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法に利用する。分泌個々ＭＨＣ分子を用いる本明細書に記載のエピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法は、多数の膜結合ＭＨＣを発現する細胞由来のＭＨＣを用いる従来の技術と比較して幾つかの利点を有する。従来技術による方法は細胞の表面上にエピトープが存在するかどうかを識別することができるが、この従来技術による方法はペプチドエピトープが結合している特異的なＭＨＣ分子を直接識別することはできない。長たらしい精製工程を用いて、単一のＭＨＣ分子を試験し、得ることができるが、このようなことを行うと得られるタンパク質の量および有用性が限定される。本発明の新規性および柔軟性は、組換え体の可溶性ＭＨＣタンパク質を用いることによって個々のＭＨＣ特異性を十分な量で用いることができることである。
【００２４】
クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子は、実際にはα鎖、β鎖およびα／β鎖のペプチドカーゴ（すなわち、ペプチドリガンド）からなる三分子複合体であって、細胞表面上で免疫エフェクター細胞に提示されるものである。これはペプチドカーゴであり、ＭＨＣαおよびβ鎖ではなく、細胞に感染、腫瘍形成性、または罹患のマークを付けるので、特定のＭＨＣ分子に結合したペプチドリガンドを同定し、特性決定する大きな必要がある。例えば、このようなペプチドリガンドの特性決定により、ＭＨＣ随伴糖尿病の患者によって提示されるペプチドが糖尿病耐性と関連したＭＨＣ分子によって提示されるペプチドとどのように異なるかの決定が著しく促進される。上記のように、個々ＭＨＣ分子を十分に供給し、従ってＭＨＣ分子が結合したペプチドは、このような疾患の研究手段を提供する。本発明の方法により以前は得られなかった多量のＭＨＣタンパク質が提供されるので、ＭＨＣ分子およびそれらの重要なペプチドカーゴの前例のない研究を促進することができる。
【００２５】
従って、本発明は、疾病または非疾病状態のＭＨＣ分子によって提示される特有のエピトープによって感染／腫瘍細胞を未感染／非腫瘍細胞から識別するのに用いることができるエピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法にも関する。
【００２６】
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から ｓＨＬＡ分子の作製
１． ゲノムＤＮＡ抽出
２００μＬの血液、血漿、血清、バフィコート、体液試料、または５×１０６個までのリンパ球／２００μＬリン酸緩衝食塩水を用い、ＱＩＡａｍｐ（商品名）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ血液および体液スピンプロトコールを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの品質および量は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの光学濃度の読みを用いて評価した。
【００２７】
２．１ＰＣＲ法
二段階ＰＣＲ法を用いてヒトクラスＩＭＨＣの切断体を増幅するため、プライマーをＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ遺伝子座についてデザインした。第一段階のＰＣＲでは、５’未翻訳領域からイントロン４までを増幅するプライマーセットを用いる。このアンプリコンは、エキソン４に陣取る３’プライマーを用いることによってＭＨＣクラスＩ遺伝子の切断体を生じる第二のＰＣＲの鋳型として用いられ、５’プライマーは最初のＰＣＲと同一である。概観を、図１に見ることができる。それぞれの遺伝子座についてのプライマーを表Ｉに示す。異なるＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の対立遺伝子は、対立遺伝子のヌクレオチド配列によって異なる制限切断部位を有するプライマーを必要とする。従って、−Ｂ遺伝子座には、２個の５’および２個の３’切断プライマーがある。
【００２８】
【表１】
2004536554.tif 000002
【００２９】
２．２一次ＰＣＲ
材料：
総てのＰＣＲに、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒを用いる。（１） Ｈ２Ｏ：脱イオン限外濾過水（ＤＩＵＦ）Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗ２−４，４１。（２） ＰＣＲヌクレオチドミックス（１０ｍＭのそれぞれデオキシリボヌクレオシド三リン酸［ｄＮＴＰ］）， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ， ＃１８１４， ３６２。（３） １０× Ｐｆｘ 増幅緩衝液， ｐＨ９．０， ＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標）， 部品番号５２８０６， 処方は特許登録情報である。（４） ５０ｍＭ ＭｇＳＯ４， ＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標），部品番号５２０４４。（５） Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ （Ｂ遺伝子座のみ）， ＧｉｂｃｏＢＲＬ（登録商標）， １１７０８−０１３。（６） ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＡおよびＣ遺伝子座）， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍ７７４１。 （７） ＭｇＳＯ４を含むＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０×反応緩衝液、２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍｇ／ｍＬヌクレアーゼ不含ＢＳＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００。（８） 増幅プライマー（ｎｇ／μＬ）（表Ｉ参照）：Ａ遺伝子座：５’センスＰＰ５ＵＴＡ （３００）；３’アンチセンスＰＰＩ４Ａ （３００）；Ｂ遺伝子座（Ｂ＊３９ではない）：センスＰＰ５ＵＴＢ （３００）；アンチセンスＰＰＩ４Ｂ （３００）；Ｂ遺伝子座（Ｂ＊３９）：センス５ＵＴＢ３９ （３００）；アンチセンスＰＰＩ４Ｂ （３００）；Ｃ遺伝子座：センス５ＰＫＣＥ （３００）；アンチセンスＰＰＩ４Ｃ （３００）。（９）ｇＤＮＡ鋳型。
【００３０】
２．３ 二次ＰＣＲ（コロニーＰＣＲにも使用）。（１） Ｈ２Ｏ：脱イオン限外濾過水（ＤＩＵＦ）Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗ２−４，４１。（２） ＰＣＲヌクレオチドミックス（１０ｍＭのそれぞれデオキシリボヌクレオシド三リン酸［ｄＮＴＰ］），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ， ＃１８１４， ３６２。（３） ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ＡおよびＣ遺伝子座），Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍ７７４１。（４） ＭｇＳＯ４を含むＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ １０×反応緩衝液、２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８，１００ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１ｍｇ／ｍＬヌクレアーゼ不含ＢＳＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００。（５） 増幅プライマー（ｎｇ／μＬ）表Ｉ参照：Ａ−遺伝子座：５’センスＰＰ５ＵＴＡ （３００），３’アンチセンスＰＰ３ＰＥＩ （３００）；Ｂ−遺伝子座：センスＰＰ５ＵＴＢ （３００），アンチセンスＰＰ３ＰＥＩ （３００）；Ｂ−遺伝子座：センスＰＰ５ＵＴ （３００），アンチセンスＰＰ３ＰＥＩＨ （３００）；Ｂ−遺伝子座 Ｂ３９：センス５ＵＴＢ３９ （３００），アンチセンスＰＰ３ＰＥＩＨ （３００）；Ｃ−遺伝子座：センス５ＰＫＣＥ （３００），アンチセンスＰＰ３ＰＥＩ （３００）；Ｃ−遺伝子座 Ｃｗ＊７’：センス５ＰＫＣＥ （３００），アンチセンス３ＰＥＩＨＣ７ （３００）。（６）鋳型一次ＰＣＲ生成物の１：１００希釈。
【００３１】
２．４ ＰＣＲ生成物およびベクターのゲル精製
（１） Ｄａｒｋ Ｒｅａｄｅｒ Ｔａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ＤＲ−４５Ｍ， Ｃｌａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ。（２） ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ。（３） Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｆｒｅｅｚｅ ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｒｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ７３２−６１６５。
【００３２】
２．５ 制限消化、連結反応および形質転換。
（１） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製の制限酵素：（ａ） ＥｃｏＲＩ ＃Ｒ０１０１Ｓ；（ｂ） ＨｉｎｄＩＩＩ ＃Ｒ０１０４Ｓ；（ｃ） ＸｂａＩ＃Ｒ０１４５Ｓ。（２） Ｔ４ＤＮＡリガーゼ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＃Ｍ０２０２Ｓ。（３） ｐｃＤＮＡ３．１（−）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｖ７９５−２０。（４） １０×Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製緩衝液：（ａ） ＥｃｏＲＩ緩衝液，５００ｍＭ ＮａＣｌ，１０００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００，ｐＨ７．５；（ｂ） Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液，５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ＤＴＴ，１０ｍＭ ＡＴＰ，２５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ，ｐＨ７．５；（ｃ） ＮＥＢ緩衝液 ２，５００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＤＤＴ，ｐＨ７．９。（５） １００×ＢＳＡ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ。（６） Ｚ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ， Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｔ３００２。（７） Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９。（８） １００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート。（９） １００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢプレート。
【００３３】
２．６ プラスミド抽出。
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶｍｉｎｉｐｒｅｐｓ， Ｐｒｏｍｅｇａ， ＃Ａ１４６０。
【００３４】
２．７ クローンの配列決定。
（１） Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅプライマーＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ２５−２５３８−０１。（２） ＣＹ５標識プライマー（表ＩＩ参照）。（３） ＡｌｆＥｘｐｒｅｓｓ自動ＤＮＡシークエンサー， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ。
【００３５】
【表２】
2004536554.tif 000003
【００３６】
２．８ ゲルキャスティング。
（１） ＰａｇｅＰｌｕｓ ４０％濃縮物，Ａｍｒｅｓｃｏ， Ｅ５６２， ５００ｍＬ。（２） 尿素， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １７−０８８９−０１，５００ｇ。（３） ３−Ｎ′Ｎ′Ｎ′Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ），ＡＰＢ。（４） 過硫酸アンモニウム（１０％溶液），ＡＰＢ。（５） ホウ酸， ＡＰＢ。（６） ＥＤＴＡ−二ナトリウム塩， ＡＰＢ。（７） Ｔｒｉｓ，ＡＰＢ。（８） Ｂｉｎｄ−Ｓａｌｉｎｅ， ＡＰＢ。（９） イソプロパノール， Ｓｉｇｍａ。（１０） 氷酢酸， Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ。（１１） ＤＩＵＦ水， Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。（１２） ＥｔＯＨ ２００−検定品。
【００３７】
２．９ 電気穿孔用のプラスミド調製。Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキット， Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， １２１４３。
【００３８】
３．０ 電気穿孔。（１） キャパシタンスエキステンダーを含むＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。（２） Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。（３） Ｃｙｔｏｍｉｘ：１２０ｍＭ ＫＣｌ，０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．６，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．６，２ｍＭ ＥＧＴＡ，ｐＨ７．６，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．６（ＫＯＨを含む）。（４） ＲＰＭＩ １６４０＋２０％ 子牛胎児血清＋Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ。（５） 血球計。（６） 光学顕微鏡。（７） ＣＯ２ ３７°インキュベーター。（８） 対数期の細胞。
【００３９】
【表３】
2004536554.tif 000004
【００４０】
ＰＣＲのゲル精製（総てのＰＣＲおよびプラスミドゲル精製する）
一次ＰＣＲを１×ＳＹＢＲグリーン５μＬと混合し、室温にて１５分間インキュベーションした後、１％アガロースゲル上に装填する。Ｄａｒｋ Ｒｅａｄｅｒ上で可視化し、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ ＦｒｅｅｚｅおよびＳｑｕｅｅｚｅ抽出キットを用いて製造業者の指示に従って精製する。
【００４１】
【表４】
2004536554.tif 000005
用いた酵素は、それぞれ個々のＰＣＲについてＰＣＲプライマーに組込まれた切断部位によって決定される。発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）を、同様の方法で切断する。
【００４２】
連結反応
ＰｃＤＮＡ３．１（−） ＰＣＲと同じ酵素で切断    ５０ｎｇ
ＰＣＲ切断                                      １００ｎｇ
１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液                      ２μＬ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ                                  １μＬ
ＤＩＵＦ Ｈ２Ｏ                                  ２０μＬまで
【００４３】
形質転換
Ｚ−コンピテントＥ． ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＢｕｆｆｅｒ Ｓｅｔを用いて作製したコンピテント細胞を用いてＪＭ１０９を形質転換し、製造業者の指示に従う。
【００４４】
コロニーＰＣＲ
これは任意の形質転換細胞におけるインサートについてチェックする。二次ＰＣＲについてと同じプロトコールに従う。
【００４５】
インサートを有するコロニーのミニ調製
Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶミニ調製を用い、製造業者の指示に従う。抽出プロトコールを開始する前に、グリセロールストックを作製する。
【００４６】
【表５】
2004536554.tif 000006
６μＬのホルムアミド装填緩衝液を加え、１０μＬをシークエンシングゲルに装填する。ミスインコーポレーション（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔイオン）のない良好なクローンについて配列分析する。
【００４７】
ミディ調製
Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用い、製造業者の指示に従って電気穿孔用プラスミドを調製する。
【００４８】
電気穿孔
電気穿孔は、「ＨＬＡ−Ｂ分子のＢｗ４という有名なエピトープは、推定的ＨＬＡ受容体であるＮＫｂ１を発現する天然のキラー細胞クローンとの反応性を付与する。Ｇｕｍｐｅｒｚ， Ｊ． Ｅ．， Ｖ． Ｌｉｔｗｉｎ， Ｊ ．Ｈ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｌ． Ｌ． Ｌａｎｉｅｒ ａｎｄ Ｐ． Ｐａｒｈａｍ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１：１１３３−１１４４， １９９５， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている」に記載されている通りに行う。
【００４９】
可溶性ＨＬＡの産生のためのスクリーニング
ＥＬＩＳＡを用いて、可溶性のＨＬＡの産生についてスクリーニングする。生化学分析には、同型のモノクローナル抗体がＨＬＡ遺伝子座産物およびそれらのサブタイプの同定に特に有用である。
【００５０】
Ｗ６／３２は、ヒトクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子を特性決定するのに用いられる最もありふれたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の一つである。これは、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ ＨＣ上の同型決定基に対して指定され、成熟したクラスＩ分子複合体のみを認識し且つβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）と重鎖（ＨＣ）を含む完全なＭＨＣ分子上でコンホメーションエピトープを認識する。Ｗ６／３２は、β２ｍの残基３と重鎖の残基１２１を両方とも含むクラスＩ分子上のコンパクトエピトープに結合する（Ｌａｄａｓｋｙ Ｊ Ｊ， Ｓｈｕｍ Ｂ Ｐ， Ｃａｎａｖｅｚ Ｆ， Ｓｅｕａｎｅｚ Ｈ Ｎ， Ｐａｒｈａｍ Ｐ． β２−マイクログロブリンの残基３はＷ６／３２抗体によるクラスＩＭＨＣ分子の結合に影響を与える。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｐｒｉｌ １９９９； ４９（４）： ３１２−２０．）。分子Ｗ６／３２の定常部分は、ＣＴＬによって認識されるので、細胞傷害性を抑制することができる。Ｗ６／３２の反応性はヒトβ２−マイクログロブリンのアミノ末端に感受性である（Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｍ Ｊ， Ｒｉｂａｕｄｏ Ｒ Ｋ． モノクローナル抗体Ｗ６／３２のマッピング：β２−マイクログロブリンのアミノ末端に対する感受性。Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｍａｙ １９９８； ５１（５）： ５６７−７０）。ＨＬＡ−ＣはＷ６／３２による免疫沈澱では明確に同定することはできず、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子座産物がｂ２ｍとごく弱く会合している可能性があることを示唆しており、ＨＬＡ−Ｃ抗原の生化学的研究で見られる問題点の幾つかを説明している［Ｓｔａｍ， １９８６ ＃１］。Ｃ−遺伝子座産物と相関するポリペプチドはＷ６／３２よりはＨＣ−１０によって遙かに良好に認識され、Ｃ産物の少なくとも幾つかはＨＬＡ−Ａおよび−Ｂよりも弱くｂ２ｍと会合していることがあることが確かめられる。Ｗ６／３２は利用可能なビオチン化（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ８１Ｂ）であり、ＥＬＩＳＡ法でさらに変法を提供する。
【００５１】
ＨＣ−１０は、ほとんど総てのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座不含重鎖と反応性である。Ａ２重鎖は、ＨＣ−１０によって極めて弱くしか認識されない。さらに、ＨＣ−１０は、数種類のＨＬＡ−Ａ遺伝子座重鎖としか反応しない。さらに、ＨＣ−１０は、ＨＬＡ−Ｃ型の遊離の重鎖と良好に反応すると思われる。ＨＣ−１０と重鎖／ｂ２ｍ複合体との反応性についての証拠は得られていない。ＨＣ−１０を用いて得た免疫沈澱生成物のいずれにも、ｂ２ｍは含まれていなかった［Ｓｔａｍ， １９８６ ＃１］。これは、ＨＣ−１０が、β２ｍとの相互作用に関与する部分を含むＨＬＡクラスＩ重鎖の部位に対して指定されていることを示している。ＨＣ−１０で沈澱した材料のパターンは、定性的にはＷ６／３２を用いて単離したものと異なっている。
【００５２】
ＴＰ２５．９９は、ＨＬＡ−ＡＢＣのα３ドメインにおいて決定基を検出する。これは、変性ＨＬＡ−Ｂ（Ｗｅｓｔｅｒｎ）並びに部分的にまたは完全に折り畳まれたＨＬＡ−Ａ，Ｂ，およびＣに見られている。これはペプチドまたはβ２ｍを必要とせず、すなわちペプチドなしで折り畳めるα３ドメインを処理する。これにより、ＨＣ決定に有用となる。
【００５３】
抗ヒトβ２ｍ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯ Ｐ０１７４）は、変性および複合β２ｍを認識する。原則的には抗−β２ｍ試薬はＨＬＡ分子の同定に用いることができるが、それらは重鎖とβ２ｍの会合が弱いときには余り適当でない。Ｗ６／３２および抗−β２ｍを用いて沈澱したクラスＩ分子のパターンは、通常は識別不能である［Ｖａｓｉｌｏｖ， １９８３ ＃１０］。
【００５４】
ウサギ抗−β２−マイクログロブリンは、結合の結果として重鎖からβ２−マイクログロブリンを解離する（Ｒｏｇｅｒｓ， Ｍ． Ｊ．， Ａｐｐｅｌｌａ， Ｅ．， Ｐｉｅｒｏｔｔｉ， Ｍ． Ａ．， Ｉｎｖｅｒｎｉｚｚｉ， Ｇ．， ａｎｄ Ｐａｒｍｉａｎｉ， Ｇ． （１９７９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７６， １４１５−１４１９）。ウサギ抗ヒトβ２−マイクログロブリンは、結合時にＨＬＡ重鎖からβ２−マイクログロブリンを解離する（Ｎａｋａｍｕｒｏ， Ｋ．， Ｔａｎｉｇａｋｉ， Ｎ．， ａｎｄ Ｐｒｅｓｓｍａｎ， Ｄ． （１９７７） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３２， １３９−１４６．）。この抗−ヒトβ２ｍ抗体も、非接合体で入手可能である（ＤＡＫＯ Ａ００７２）。
【００５５】
Ｗ６／３２−ＨＬＡサンドイッチＥＬＩＳＡ。サンドイッチ分析法を用いて、多数の態様のタンパク質複合体を研究することができる。抗体をヘテロポリマーの様々な成分に利用可能であるときには、二抗体分析法をデザインして、複合体の存在について試験することができる。これらの分析法の変法を用いて、所定の抗原がマルチマー性であるかどうかをモノクローナル抗体を用いて試験することができる。同じモノクローナル抗体を固相およびラベルの両方に用いるときには、モノマー性抗原を検出することができない。しかしながら、このような組合せでは、抗原のマルチマー形態を検出することができる。これらの分析法では、好ましくない立体的位置に固定されたマルチマー性抗原およびモノマー性抗原のいずれによっても、陰性な結果が得られることがある。
【００５６】
Ｗ６／３２−抗−β２ｍ抗体サンドイッチ分析法は、ｓＨＬＡの存在および量を決定するための最善の手法の一つである。二抗体サンドイッチ分析法は迅速且つ正確であり、純粋な抗原の供給源が入手可能であるときには、この分析法を用いて未知試料中の抗原の絶対量を測定することができる。この分析法には、抗原上の非重複エピトープに結合する２種類の抗体が必要である。この分析法は、タンパク質複合体の多数の態様の研究に特に有用である。
【００５７】
抗原（ｓＨＬＡ）を検出するため、マイクロタイターのウェルに特異（捕獲）抗体Ｗ６／３２をコーティングした後、抗原を含む試験溶液と共にインキュベーションする。未結合抗原を洗浄し、ＨＲＰに接合した異なる抗原に特異的な抗体（抗−β２ｍ）を加え、さらにインキュベーションを行う。未結合接合体を洗浄し、基質を加える。さらにインキュベーションした後、基質の加水分解度を測定する。加水分解した基質の量は、試験溶液中の抗原の量に比例する。
【００５８】
この手法の主な利点は、抗原を使用する前に精製する必要がなく、この分析法が極めて特異的であることである。分析法の感度は、４個の因子（１） 捕獲抗体の数、（２） 捕獲抗体の抗原に対する親和性、（３） 第二の抗体の抗原に対する親和性、（４） 標識した第二の抗体の特異活性によって変化する。
【００５９】
ＥＬＩＳＡプロトコール鋳型用いて、透明な９６穴のポリスチレン分析プレートを標識する。ポリスチレンは、通常はマイクロタイタープレートとして用いられる。（これは半透明でないので、プレートリーダーによって定量を行う酵素分析法を、ＰＶＣプレートではなくポリスチレンで行うべきである）。
【００６０】
Ｗ６／３２のコーティングを、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ），ｐＨ８．５で行う。特異的Ｗ６／３２抗体をＴＢＳ（ｐＨ８．５）に溶解した８．０μｇ／ｍＬのコーティング溶液を調製する。（−２０℃で保管し、濃度０．２ｍｇ／ｍＬおよび容積１ｍＬの青色試験管製剤であり、試験管当たり０．２ｍｇを生じる）。
【００６１】
表ＩＩＩ
プレートの数    全容積    Ｗ６／３２抗体    ＴＢＳ，ｐＨ８．５
１            １０ ｍＬ    ４００μＬ             ９．６ ｍＬ
２            ２０ ｍＬ    ８００μＬ          １９．２ ｍＬ
３            ３０ ｍＬ    １２００μＬ          ２８．８ ｍＬ
４            ４０ ｍＬ    １６００μＬ          ３８．４ ｍＬ
５            ５０ ｍＬ    ２０００μＬ          ４８．０ ｍＬ
【００６２】
これはマイクロタイタープレートの容量を十分に上回っているが、結合は一層速やかに起こる。濃度が高くなれば、抗原のポリスチレンへの結合スピードが上がるが、プラスチックの容量は約１００ｎｇ／ウェル（３００ｎｇ／ｃｍ２）に過ぎず、余剰タンパク質は結合しない。（未知組成または濃度のＷ６／３２を用いるときには、固定した高濃度の標識抗原に対してプレートをコーティングするのに必要な標準抗体溶液の量を滴定する。値をプロットし、強いシグナルを生じる最低レベルを選択する。西洋ワサビペルオキシダーゼを検出に用いるときには、いずれの溶液にもアジ化ナトリウムを加えない。
【００６３】
マイクロタイタープレートにウェル当たり１００μＬの抗原溶液をマルチチャンネルピペットを用いて直ちにコーティングする。タンパク質をプラスチックと単にインキュベーションするときには、標準ポリスチレンが抗体または抗原に結合する。タンパク質を固定する結合は非共有的であるが、相互作用の正確な型は知られていない。プレートを振盪して、抗原溶液がそれぞれのウェルの底に均一に分布するようにする。プレートをプレートシーラー（シールプレート（ｓｅａｌｐｌａｔｅ）接着シールフィルム，非滅菌，ユニット当たり１００； Ｐｈｅｎｉｘ； ＬＭＴ−Ｓｅａｌ−ＥＸ）またはシーリングテープＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）Ｍｏｄｕｌｅｓ（＃ ２３６３６６）でシールする。４℃で一晩インキュベーションする。界面活性剤および異種タンパク質は用いない。翌日、液体を流し、または適当な廃棄物容器に払い落としてウェルの内容を除く。プレートを逆さまにして清浄な紙タオルにブロットすることによって、溶液を最後の痕跡まで除く。それぞれの段階で液体を完全に除去することは、実験を良好に行う上で本質的なことである。
【００６４】
マルチチャンネルＥＬＩＳＡ洗浄装置を用いて、プレートをＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄する。最後の洗浄の後、プレートを逆さまにして清浄な紙タオルにブロットすることによって、残っているＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを除去する。Ｗ６／３２を結合した後、プレートの残っている部位は３％ＢＳＡ／ＰＢＳから作製したブロッキング緩衝液とインキュベーションすることによって飽和しなければならない。ウェルに２００μＬのブロッキング緩衝液を満たす。プレート接着ストリップで覆い、４℃で一晩インキュベーションする。あるいは、室温で少なくとも２時間インキュベーションを行うが、これは標準的手続きではない。ブロックしたプレートは、４℃で少なくとも５日間保管することができる。良好なピペット採取の実施は、信頼性のある定量的結果を得るために極めて重要である。チップは、ピペット自身と同様に系の一部として重要である。それらが不良品質のものであったり、または正確にフィットしないものであれば、最良のピペット採取を行っても満足な結果は得られない。ピペットの操作位置は、常に垂直である。そうでなければ、吸引される液体が多くなりすぎる。浸漬深度は、数ミリメートルに止めるべきである。ピペット採取ボタンを徐々に引っ込めて、充填操作を観察する。チップに動揺が発生してはならず、さもなければ、エアゾールが形成されガスが溶液から発生する危険がある。
【００６５】
最高水準の精度が求められるときには、プレウェッティングを総ての場合に用いるべきである。これを行うため、要求された設定容積を最初に同一チップを用いて１または２回吸引した後に、戻す。３％ＢＳＡのようなさらに困難な液体では、プレウェッティングが絶対に必要である。採取した試料を既にある溶液と十分に混合しようとするときには、プレウェッティングを行わない。しかしながら、１０μＬを上回る容積についてのみプレウェッティングを行う。容積が１０μＬ未満のピペットの場合には、器具をデザインし調節するときに、残留液体フィルムを原則として考慮する。チップは、個々の試料毎に取り換えなければならない。容積が＜１０μＬのときには、液体をゆっくり吸引するように留意しなければならず、さもなければ、試料は発生した摩擦熱によってかなり暖められることになる。次に、外側にくっついている滴を拭き取る必要があるときには、チップを液体から徐々に引き上げる。
【００６６】
設定容積を分配するには、チップを僅かな確度に固定し、最初に停止するまで均一に押し下げる。界面張力の影響を少なくするため、液体を分配するときには、チップを容器の側に接触させるべきである。液体を計量ストロークで排出した後、短時間を置いて、チップの内側を流下する液体が下端に集まるようにする。次に、第二の停止位置まで速やかに押し下げ、残留液体を噴出させることができる延長ストロークでチップが噴出させる。問題がない（例えば、水溶液）場合には、これによって設定容積が迅速且つ実質的に完全に排出される。さらに困難な場合には、延長ストロークを指導させる前の排出を一層ゆっくりして且つ間を一層長くすることによって容易になる。抗原（ｓＨＬＡ）の絶対量を決定するため、試料の値を標準曲線における純粋な未標識抗原の既知量を用いて得たものと比較する。
【００６７】
正確な定量のために、総ての試料を３回測定しなければならず、標準抗原−希釈シリーズをそれぞれのプレートに入れるべきである。ピペット採取は、遅延なく行い、試料間のインキュベーション時間の差をできるだけ少なくすべきである。総ての希釈は、ブロッキング緩衝液中で行うべきである。例えば、均質な抗原ストックを３％ＢＳＡに溶解したものをＰＢＳブロッキング緩衝液で連続希釈することによって標準抗原−希釈シリーズを調製する。試験試料中の抗原の量を測定するために、標準抗原−希釈シリーズは結合の動的範囲のほとんどに及ぶ必要がある。この範囲は、５〜１００ｎｇ ｓＨＬＡ／ｍＬである。ストック溶液Ｅ１μｇ／ｍＬを調製し、３００μＬずつの容積に分け、４℃で保管する。このときに、５０ｍＬバッチの標準を調製する。（新たなバッチは、定量に使用する前に、古いバッチと比較する必要がある。）
【００６８】
標準ストック溶液Ｅの試験管を用いて、連続希釈を調製する。試験試料中の抗原の量を正確に測定するには標準曲線が必要であるが、それらは定性的な「有無」の判定には必要ない。正確な定量には、ｓＨＬＡを含む試験溶液を少なくとも４回の希釈にわたって分析し、標準曲線の範囲内にあるようにすべきである。それぞれの抗原試験溶液をブロッキング緩衝液で連続希釈したものを調製する（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）。混合した後、使い捨てのＵ型底の９６穴マイクロタイタープレートで総ての希釈物を調製した後、それらをＷ６／３２をコーティングしたプレートにマルチピペットで加える。１５０μＬを、それぞれのウェルに加える。さらに処理を行うため、残っているブロッキング緩衝液を完全に除去し、プレートを上記の通りに洗浄する。これで、プレートは試料を添加する準備が整っている。ｓＨＬＡを含む試験溶液および標準抗原希釈物１００μＬを、抗体をコーティングしたウェルに加える。
【００６９】
プレートを接着ストリップで覆い、室温で正確に１時間インキュベーションする。インキュベーションの後、未結合抗原を、プレートを上記の通りにＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄することによって除去する。適当な展開試薬を調製して、ｓＨＬＡを検出する。第二の特異抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合した抗−ヒトβ２ｍ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ Ｐ０１７４／０．４ｍｇ／ｍＬ）を用いる。抗−ヒトβ２ｍ−ＨＲＰを、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１０００の比に希釈する。（西洋ワサビペルオキシダーゼを検出に用いるときには、いずれの溶液にもアジ化ナトリウムを加えない。）
【００７０】
表ＩＶ
プレートの数  全容積  抗−β２ｍ−ＨＲＰ抗体  ３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
１          １０ ｍＬ    １０μＬ            １０ ｍＬ
２          ２０ ｍＬ    ２０μＬ             ２ ｍＬ
３          ３０ ｍＬ    ３０μＬ            ３０ ｍＬ
４          ４０ ｍＬ    ４０μＬ            ４０ ｍＬ
５          ５０ ｍＬ    ５０μＬ            ５０ ｍＬ
【００７１】
第二の抗体希釈物１００μＬをそれぞれのウェルに加える。総ての希釈は、ブロッキング緩衝液中で行うべきである。新たな接着ストリップで覆い、室温で２０分間インキュベーションする。洗浄段階の前に適量の基質を調製する。基質を室温にする。
【００７２】
ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）は、ＥＬＩＳＡ法で用いるのに適したペルオキシダーゼ基質である。この基質は、黄色の可溶性最終生成物を生成する。ＯＰＤ反応を３Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止し、橙褐色生成物を生成し、４９２ｎｍで読み取る。ＯＰＤを新たに錠剤から調製する（Ｓｉｇｍａ， Ｐ６７８７； ２ｍｇ／錠剤）。固形錠剤は、少量の基質が必要なときに使用に好都合である。第二の抗体インキュベーションの後、未結合の第二の試薬を、プレートをＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄することによって除去する。最後の洗浄の後、１００μＬのＯＰＤ基質溶液をそれぞれのウェルに加え、室温で１０分間展開させる。展開系の試薬は光感受性であるので、直接光にプレートを置くことを避ける。３Ｎ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を調製する。１０分後、１００μＬの反応混合物当たり１００μＬの停止溶液をそれぞれのウェルに加える。プレートを軽く叩いて、完全に混合させる。
【００７３】
反応を停止した後１５分以内に、ＥＬＩＳＡプレートを４９０ｎｍの波長で読み取る。バックグラウンド約０．１とすべきである。バックグラウンドが高めであれば、基質にペルオキシダーゼを加えることができる。基質バックグラウンドが低く且つ分析におけるバックグラウンドが高ければ、これはブロッキングが不十分であることによる可能性がある。最後に、読み取り値を解析する。標準抗原の連続希釈によって生成したデータから構築した標準曲線を調製する。抗原の絶対量を決定するため、これらの値を標準曲線から得たものと比較する。
【００７４】
トランスフェクタントの作製および可溶性クラスＩ分子の産生
トランスフェクタントは、下記の修正を加えた以前に報告された方法で設定した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：３７９， １９９７， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）：表Ｖに示されるプライマー５ＰＸＩ（５９−ＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣ ＧＣＣＧＡＧ−３９）および３ＰＥＩ（５９−ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）を用いて細胞質ドメインを欠く構造体を生成させるために分子の全コード領域を含むＢ＊１５０１のｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅した。６個の連続したヒスチジンまたはＦＬＡＧエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）からなるＣ−末端エピトープタグを含む構造体も作製した。Ｂ＊１５０１−ＨＩＳおよびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧを作製するのに用いた表Ｖプライマーは、５ＰＸＩおよび３ＰＥＩＨＩＳ（５９−ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）、または３ＰＥＩＦＬＡＧ（ ５ ９ −ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）であった。ＰＣＲアンプリコンは、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｌｅｖｓｄｅｎ， オランダ国）を用いて精製し、哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カールスバード， カリフォルニア， 米国）にクローニングした。表Ｖ。二方向ＤＮＡシークエンシングによってインサートの完全性を確認した後、構造体をクラスＩ陰性Ｂ−リンパ芽球様細胞系７２１．２２１ （Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， 本明細書で上記に参考として引用）に電気穿孔した。トランスフェクタントをＧ４１８電気穿孔後を含む媒質に保持し、サブクローニングを行い、ＥＬＩＳＡによって決定された通りの可溶性のクラスＩの効率的プロデューサーを単離した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， 本明細書で上記に参考として引用）。
【００７５】
【表６】
2004536554.tif 000007
可溶性Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳ、およびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧを、Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ ｅｔ ａｌ， １９９７によって以前に記載された通りにＣＰ３０００中空繊維バイオリアクターで設定したトランスフェクタントを培養することによって産生し、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用した。可溶性のクラスＩ分子を含む上清をバイオリアクター収穫物に集め、Ｗ６／３２アフィニティーカラムで精製した。分子当たり少なくとも２回のカラム精製を行った。
【００７６】
ペプチドのリガンド精製、Ｅｄｍａｎシークエンシング、および逆相ＨＰＬＣ分離
ペプチドリガンドを酸溶出によってクラスＩ分子から精製し（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４８：８９， １９９８；この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）、さらに３Ｋｄカットオフ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた攪拌細胞中を通過させることによって重および軽鎖から分離した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ベッドフォード， マサチューセッツ， 米国）。Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳまたはＢ＊１５０１−ＦＬＡＧから溶出したペプチドを含む約１／１００容の攪拌細胞流に、４９２Ａパルス状液相タンパク質シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ノルウォーク，コネチカット， 米国）上でシステインの誘導体形成なしに１４サイクルのＥｄｍａｎ減成を行った。Ｅｄｍａｎモティーフは多重カラム溶出からそれぞれのアミノ酸のピコモル収量を合わせた後、文献（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）に記載され且つ図２に示されているように前回に対する倍数増加を計算することによって誘導した。
【００７７】
プールしたペプチド溶出物を、以前に記載した通りにＲＰ−ＨＰＬＣによって画分に分離した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）。簡単に説明すれば、ペプチドの４００ｍｇ分量を１０％酢酸１００ｍＬに溶解し、２．１ ３ １５０ ｍｍ Ｃ１８カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， オーバーン， カリフォルニア， 米国）に装填し、０．０６％ＴＦＡを含む２％〜１０％アセトニトリルのグラディエント０．０２分の後に同じものの１０％〜６０％のグラディエント６０分を用いた。画分を、１分間隔で１８０ｍＬ／分の流速で自動的に集めた。
【００７８】
マススペクトル分析法によるリガンド分析
ＲＰ−ＨＰＬＣ画分を急速真空乾固し、４０ｍＬの５０％メタノール，０．５％酢酸で再構成した。選択した画分からの約６ｍＬを、ＮａｎｏＥＳイオン化源入口（Ｐｒｏｔａｎａ， オーデンス， デンマーク国）を用いてＡＰＩ−ＩＩＩトリプル四重極型マススペクトル分析計（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ， フォスターシティー， カリフォルニア， 米国）に噴霧した。下記の装置設定条件を用いてスキャンを集めた：極性−正；ニードル電圧−１３７５Ｖ；オリフィス電圧−６５Ｖ；Ｎ２カーテンガス−０．６ｍＬ／分；ステップサイズ−０．２ａｍｕ；滞在時間−１．５ｍｓ；および質量範囲−３２５〜１４００。それぞれの分子から生じた総イオントレースを視覚によって比較し、分子間で重複するイオンを同定した。イオンマッチの同定の後に、個々のイオンを選択して、ＭＳ／ＭＳシークエンシングを行った。
【００７９】
配列は、ＢｉｏＭｕｌｔｉＶｉｅｗプログラム（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）アルゴリズム予想配列を用いて予想し、フラグメンテーションパターンを手動で評価した。現在編集されている配列に対するイオン配列相同性は、非重複のヒトで発現した配列タグに対する最新のＢＬＡＳＴ検索およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立衛生研究所， ベセズダ， メリーランド， 米国）から現在入手可能な未完の高処理量ゲノム配列ヌクレオチドデーターベースを用いて決定した。
【００８０】
本発明の方法は、クラスＩＨＬＡ分子から溶出したペプチドリガンドの直接的比較分析を提供する。このような比較分析を行うために、クラスＩリガンド産生用の中空繊維バイオリアクターを、溶出リガンド分画化の逆相ＨＰＬＣ、およびペプチドリガンドのマッピングおよびシークエンシングのためのマススペクトル分析法と共に用いた。比較リガンドマッピングの応用は、内生性クラスＩを発現する細胞系にも応用可能である。クラスＩ陽性細胞系でのペプチド配列決定の前に、Ｃ末端エピトープタグをトランスフェクションしたクラスＩ分子に加える効果は、有害な効果を持たないことを見出した。６個のヒスチジン（６−ＨＩＳ）からなるタグまたはエピトープＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＦＬＡＧ）を含むタグを、ＰＣＲ中の可溶性のＢ＊１５０１のＣ末端に加えた。これらの構造体を、次にクラスＩ陰性７２１．２２１細胞にトランスフェクションし、以前に設定した通りにペプチド精製した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 本明細書で上記に参考として引用）。２個のテイルのあるトランスフェクタントをテイルのない可溶性のＢ＊１５０１と比較することによって、タグ付加はクラスＩ分子のペプチド結合特異性に影響せず、従って直接ペプチドリガンドマッピングおよびシークエンシングに有害な効果を持たないと決定することができた。
【００８１】
Ｅｄｍａｎモティーフ
特定のクラスＩ分子によって提示されるリガンドを識別するための最も一般的な手段は、その分子から溶出したペプチドのプールのＥｄｍａｎシークエンシングである。Ｃ末端タグを有するテイルのあるクラスＩ分子が内生性ペプチド装填を中断しないことを示すため、Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳ，およびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧからのペプチドプールのＥｄｍａｎ配列を、以前に公表されたＢ＊１５０１データー図２と比較した。モティーフを、図２に示される様々なＢ＊１５０１分子のそれぞれに割り当てた。アンカー位置２（Ｐ２）では、ドミナントＱおよびサブドミナントＭが、Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ． （Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１６５， １９９５）およびＢａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８４： ７３５， １９９６）によって以前に公表されているようにモティーフ中に見られた。さらに異なるＰ３は総ての分子で見られ、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＹが現れており、これらの結果も、ＦａｌｋおよびＢａｒｂｅｒによって以前に報告されている。また、三種類総ての分子では、ドミナントＹおよびＦがＣ末端アンカーとしてＰ９に見られる。従って、三種類総ての分子についてのモティーフデータは、公表された標準モティーフとほとんど一致している。
【００８２】
マススペクトル分析法によるプロフィール
表面に結合した、テイルのない、およびテイルのあるＢ＊１５０１分子のモティーフの比較では、試験した様々な形態のＢ＊１５０１によって結合したプールペプチドには実質的な差がなかった。しかしながら、本発明の目的は、罹患および健康な細胞からクラスＩ分子によって結合された個々のペプチドを消去法により比較することである。消去式分析は、マススペクトル分析法によるイオンマップの比較によって行い、従って、テイルのあるおよびテイルのないクラスＩ分子のイオンマップを比較して、比較ペプチドマッピング時のテーリングの効果を決定した。
【００８３】
テイルのあるおよびテイルのないＢ＊１５０１由来のペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分画に分離した。次に、それぞれの画分をＡＰＩ−ＩＩＩマススペクトル分析計を用いてスキャンニングし、それぞれの漢文に存在するイオンを同定した。ＲＰ−ＨＰＬＣ画分９、１０、１１、１８、１９および２０からの全般的イオンスキャンを得て、視覚で比較し、３種類の分子間で重複しているペプチドを表すイオンを評価した。図３は、分子のそれぞれから生じたイオンマップの典型的な部分を示す。この比較は、同じイオンのパターンがここで分析した異なるＢ＊１５０１分子によって生成することを示している。３種類の画分のそれぞれからのイオンマップを手で比較したところ、３分子のそれぞれが結合したペプチドにはほとんどないしは全く差が見られなかった。
【００８４】
リガンド配列
３分子のそれぞれのＭＳクロマトグラムにおけるイオンマッチの同定の後、ここのイオンをタンデムマススペクトル分析法によるシークエンシング用に選択し、イオンが本当にペプチド−配列レベルでマッチしているかどうかを決定した。それぞれの画分からの１０個のイオンを、最初にＭＳ／ＭＳ配列生成に選択した。それぞれの分子からのイオンのそれぞれについてのフラグメンテーションパターンを手動で比較し、図４に示されるように、同一のフラグメンテーションパターンをペプチド−配列レベルマッチと見なした。検討を行ったペプチドフラグメンテーションパターンの中、５２／５７（９１％）は、テイルのない分子と６−ＨＩＳのテイルのあるタンパク質の間で正確なマッチであった（表ＶＩ）。フラグメンテーションのさらに異質なパターンは、ＭＳ／ＭＳシークエンシングの目的で選択されたＦＬＡＧ−テイルのあるイオンで同定され、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーション比較の目的で選択した５７個のイオンの中、３９（７０％）のフラグメンテーションパターンがＦＬＡＧ−テイルのあるおよびテイルのない分子の間でマッチした。全般的には、検討を行った１１３のスペクトルの中９１（８１％）がテイルのある分子と可溶性のＢ＊１５０１との間で一致した。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
幾つかのリガンド配列を、生成したフラグメンテーションパターンから明確に決定した。ヒトペリプラキン（ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ）由来のリガンドＱＧＬＩＳＲＧＹＳＹを、画分１８で溶出したペプチドから配列決定した。４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２６の範囲がマッチする１１マーである第二のリガンドＡＶＲＤＩＳＥＡＳＶＦを、画分２０で同定した。特に、これら２種類のペプチドは、Ｂ＊１５０１溶出リガンドのシークエンシングの際に本発明者らの実験室によって以前に報告された現象であるモティーフデータによって予想されたストロングコンセンサスグルタミンを欠いていた（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９７， 本明細書で参考として上記に引用）。しかしながら、これらのリガンドは芳香族性のチロシンまたはフェニルアラニンで終わっており、これらのアミノ酸はいずれもＥｄｍａｎシークエンシングデータおよび以前に公表された観察結果によってストロングアンカーであることが予想された（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 本明細書で参考として上記に引用）。
【００８７】
本発明の一態様は、所定のクラスＩ分子をクラスＩ陰性細胞系にトランスフェクションすることによってその分子が結合したペプチドリガンドを特性決定し、クラスＩ分子と結合ペプチドのアフィニティー精製しようとするものである。しかしながら、クラスＩ分子を既に有している細胞系を選択して検討するときには、問題が複雑になる。この場合には、一つのクラスＩ分子に特異的な抗体を用いて細胞によって発現された他のものからそのクラスＩ分子を選択的に精製しなければならない。対立遺伝子特異抗体はペプチド結合溝中および附近でエピトープを認識するので、溝に見出されるペプチドの変化によってクラスＩ分子に対する抗体親和性が変化する可能性がある（Ｓｏｌｈｅｉｍ， Ｊ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：５３８７， １９９３； およびＢｌｕｅｓｔｏｎｅ， Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：１７５７， １９９２）。次に、変化した抗体認識が、溶出およびその後の配列分析で利用可能なペプチドを偏向させる可能性がある。
【００８８】
クラスＩ陽性細胞からトランスフェクションしたクラスＩ分子およびそのペプチドリガンドを偏向しない方法で選択的に精製するには、非クラスＩ陽性細胞でのクラスＩ精製の態様を偏向する必要があった。既に広汎に特性決定されているクラスＩ陽性分子Ｂ＊１５０１へのＦＬＡＧおよび６−ＨＩＳタグのＣ末端付加は、ペプチド結合にほとんどまたは全く影響しないことが示された。この方法は、内生的に発現したクラスＩ分子の複雑な混合物から単一のクラスＩ特異性を精製できるようにデザインされた。テイルのあるおよびテイルのないＢ＊１５０１分子から溶出したリガンドを比較して、ペプチドレパートリーに対するテイルの付加の影響を評価した。
【００８９】
プールドＥｄｍａｎシークエンシングは、所定の分子の結合指紋を決定する目的で一般に用いられる方法であり、この方法を用いてテイルの付加のペプチド結合に対する大規模な効果を確かめた。本発明者らは、それぞれのクラスＩＭＨＣ分子から溶出したペプチドの１／１００にＥｄｍａｎ減成を行い、分子のそれぞれについてモティーフを誘導した。ＨＩＳ−およびＦＬＡＧのテイルのあるモティーフは、可溶性で膜に結合したＢ＊１５０１について公表されたモティーフとマッチした。分子のそれぞれはＱのドミナントＰ２アンカー、多数の残基を見出すことができる一層異質のＰ３、およびＰ９におけるＹまたはＦのもう一つのドミナントアンカーを有するモティーフを示した。Ｅｄｍａｎシークエンシング中に検出されたアミノ酸のそれぞれのピコモル量の小さな差は、同じ分子を用いる連続実験で以前に言及されており、結合ペプチドの不均衡よりは細胞処理および／またはペプチド単離の差を反映しているものと思われる。極めて類似したペプチドモティーフは、クラスＩＭＨＣ分子のペプチド結合能がタグの付加によって急激に変化しないことを示していた。
【００９０】
リガンドがタグ付加の後に歪まないことを確かめるため、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳをそれぞれ個々ペプチドのマッピングおよびシークエンシングに用いた。ＭＳを行ったペプチド混合物はイオンクロマトグラム（図３）を提供し、これを用いて３種類の検討を行った分子間のイオンオーバーラップの程度を比較した。広汎なイオンオーバーラップは、これらのテイルのあるおよびテイルのないＢ＊１５０１分子が結合したペプチドはほとんど同一であることを示している。
【００９１】
次に、選択したイオンＭＳ／ＭＳシークエンシングし、３種類の分子間のフラグメンテーションパターンを比較することによってマッピングしたイオンオーバーラップが実際に正確なリガンドマッチを表していることを確かめた（図４）。約６０種類のペプチドを最初にＭＳ／ＭＳ用に選択した−それぞれの画分から１０。全般的には、フラグメンテーションパターン検討を行ったペプチドの大部分では正確にマッチした（表ＶＩ）。非マッチとして分類されたフラグメンテーションパターンは同じ質量／電荷比で存在するペプチドの混合物から生じ、それらの１個以上はタグ付き分子に存在し、Ｂ＊１５０１からの同一イオンのスペクトルでは明らかではなかった。配列−レベルマッチの中、ＨＩＳのテイルのある分子由来のリガンドは、ＦＬＡＧのテイルのある分子から溶出したものよりＢ＊１５０１由来のものに一層緊密にマッチした。全体では、５２／５７のＨＩＳペプチドが正確なマッチであり、３９／５６のＦＬＡＧペプチドは同等であった。従って、このデーターは、６−ＨＩＳタグがＦＬＡＧタグよりも内生性ペプチド結合を妨害しないが、いずれのタグもＢ＊１５０１が結合したペプチドを劇的に変化させないことを示している。
【００９２】
３種類総ての分子から溶出したペプチドの画分に存在する小数の個々リガンド配列は、ＭＳ／ＭＳによって決定した。２個の最も明確な配列ＡＶＲＤＩＳＥＡＳＶＦおよびＱＧＬＩＳＲＧＹＳＹは、テイルのあるクラスＩ分子が実際に内生性ペプチドリガンドを装填したことを示している。これは、Ｃ末端タグの付加が可溶性のＨＬＡ−Ｂ＊１５０１分子が自然に内生性ペプチドに結合することができることを排除しないという仮説を支持している。さらに、いずれのペプチド配列も、フェニルアラニンまたはチロシンからなる一層保存されたＣ−末端と対になった異質なＮ−末端を有するＢ＊１５０１から溶出したペプチドについて以前に報告されているものと厳密にマッチした。均質なＥｄｍａｎ配列、ほぼ同一のフラグメンテーションパターン、および３分子間で共有されているペプチドリガンドを考慮して、本発明者らはＣ末端タグの付加がＢ＊１５０１を結合したペプチドを著しく変化させないと結論した。溶出したペプチドのマッピングおよび消去式比較は、クラスＩＨＬＡ分子が結合した個々のリガンドの差および類似性を確認するための直接的手段である。実際に、消去式比較は、オーバーラップしているリガンドが密接に関連したＨＬＡ−Ｂ１５サブタイプを横切ってどのように結合しているかを示し、並びにどのリガンドがウイルス感染細胞に特有であるかを指摘している。溶出したペプチドリガンドの直接的比較分析は多くの目的に極めて適しており、それらの目的の少なからぬものがウイルスおよび癌ＣＴＬエピトープ検出である。Ｃ末端エピトープタグの付加により、クラスＩ分子、従って、図５に示されるように、ウイルス感染を持続しまたは腫瘍形成性薬剤を収容することができる細胞系におけるペプチドリガンドの産生および精製の可能な方法が提供される。このような系からの直接的ペプチド分析は病原性要素の宿主コントロールについて重要な情報を生じるものであり、同時に合理的なワクチン開発のための重要な基礎単位を提供するものである。
【００９３】
本発明は、具体的には、未感染／非腫瘍細胞から感染／腫瘍細胞を識別するペプチドエピトープを検出するための新規な方法にも関する。本発明の方法によって得られる結果は予測したりまたは間接的に確かめることができず、直接エピトープ検出法によってのみ、本明細書に記載の独特なエピトープを同定することができる。さらに、この直接法によってのみ、供給タンパク質が潜在的に免疫原性のペプチドエピトープに分解されることを確かめることができる。最後に、この独特な方法は、タンパク質が感染／腫瘍細胞でユニークにアップおよびダウンレギュレーションされることについて若干の知見を提供する。
【００９４】
感染／腫瘍細胞をマークするこのようなＨＬＡによって提示されるペプチドエピトープの有用性は三倍である。第一に、疾病状態 （すなわち、感染症または癌）を検出する目的でデザインされた診断薬は感染／腫瘍細胞に特有のエピトープを用いて腫瘍／ウイルスの存在／非存在を確かめることができる。第二に、感染／腫瘍細胞に特有のエピトープはワクチンの候補である。ここで、本発明者らは、ＨＩＶに感染した細胞の表面に生じるエピトープを記載している。このようなエピトープは、自然のウイルス感染および直接エピトープ検出なしには予測できなかった。検出したエピトープは、ウイルス感染および腫瘍細胞に特有のタンパク質に由来する。これらのエピトープは、ウイルス／腫瘍ワクチン開発およびウイルス／腫瘍診断薬に用いることができる。第三に、この方法は、ウイルス感染細胞に特有な特定のタンパク質が宿主細胞のコンパートメントに見出され、そうでなければ、そこには見出されないものである。従って、本発明者らは、薬剤ターゲッティングの目的でユニークにアップレギュレーションまたは転送された宿主タンパク質を同定して、感染細胞を殺す。
【００９５】
本発明は、特にＨＩＶ感染細胞に特有なペプチドエピトープを記載する。ＨＩＶ感染細胞のＨＬＡ分子に特有なペプチドエピトープを、未感染細胞由来のＨＬＡペプチドエピトープと直接比較した。
【００９６】
従って、例えば、本発明の方法は、（１）細胞内宿主タンパク質から誘導され、感染細胞には特有であるが未感染細胞では見られないＨＬＡによって提示されたペプチドエピトープを同定することができ、および（２） ペプチドの細胞内供給源−タンパク質はＨＩＶ感染細胞でユニークに発現／処理されて、タンパク質のペプチド断片が感染細胞上のＨＬＡによって提示されるが、未感染細胞上では提示されないことが示されている。
【００９７】
従って、本発明の方法は、感染細胞でのタンパク質のユニーク発現、または正常に発現した宿主タンパク質のユニークな転送および処理によってそのペプチド断片が感染細胞上のＨＬＡ分子によって提示されることを記載する。細胞内タンパク質のこれらのＨＬＡによって提示されたペプチド断片は、ウイルス感染細胞の診断および感染細胞をターゲッティングして破壊する（すなわち、ワクチン開発）ための強力な代替物である。
【００９８】
ＨＩＶ感染細胞に特有なＨＬＡによって提示されるペプチドエピトープの宿主供給源−タンパク質の溝（ｇｒｏｏｖｅ）は、癌細胞でユニークに発現する供給源−タンパク質である。例えば、本発明の方法を用いることによって、レティキュロカルビンのペプチド断片がＨＩＶ感染細胞上にのみ見出される。文献検索は、レティキュロカルビン遺伝子は癌細胞（乳癌、肝臓癌、結直腸癌）でユニークにアップレギュレーションされることを示している。従って、ＨＩＶ感染細胞を未感染細胞から識別するＨＬＡによって提示されたレティキュロカルビンのペプチド断片は、さらに腫瘍細胞を健康な非腫瘍細胞から識別すると推測することができる。従って、宿主遺伝子のＨＬＡによって提示されたペプチド断片、および腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を健康な細胞と識別する遺伝子産物が直接同定された。本発明のエピトープ検出法は、ウイルスに感染したまたは腫瘍細胞上でユニークに発現しまたはユニークに処理される宿主タンパク質を同定することもできる。このようなユニーク発現しまたはユニークに処理されたタンパク質のＨＬＡによって提示されるペプチド断片を、ワクチンエピトープとしておよび診断手段として用いることができる。
【００９９】
ウイルス感染細胞をターゲッティングし検出する方法は、ウイルス由来のペプチドをターゲッティングするものでないことがある。むしろ、本発明の方法は、感染細胞を健康な細胞から識別する方法は、宿主によってコードされるタンパク質発現および処理における変更によることを示している。これは、癌並びにウイルス感染細胞について真実である。本発明による方法により、タンパク質／ペプチドがウイルス／腫瘍細胞を健康な細胞から識別することを無条件で示しているデータが得られる。
【０１００】
感染および未感染細胞での比較リガンドマッピングの例
可溶性クラスＩ構造体の作製
目的とする対立遺伝子（特に、Ａ＊０２０１、Ｂ＊０７０２、およびＣｗ＊０７０２）を発現するＥＢＶによって形質転換された細胞系を増殖させ、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １６１ （３） １４０６−１３およびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２８７，７６４号明細書に記載のシークエンシングに基づく分類法（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ−ｂａｓｅｄ−ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）によってクラスＩＨＬＡを分類した（上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）。全ＲＮＡは５ｐＸＩおよび３ｐＥＩであり、細胞質および膜貫通ドメインを欠いている産物を生成した。あるいは、ヘキサ−ヒスチジンまたはＦＬＡＧエピトープタグをコードする３’プライマーを、プライマー３ｐＥＩＨＩＳまたは３ｐＥＩＦＬＡＧ（表Ｖ）を用いてＣ末端に置いた。Ｃ−遺伝子座については、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列をコードする５’プライマーを用いた（Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９： １２６５−１２７４）。それぞれの構造体を適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し（表Ｖ参照）、Ｇ４１８硫酸塩またはＺｅｏｃｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についての耐性遺伝子をコードする哺乳類の発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カールスバード， カリフォルニア）にクローニングした。
【０１０１】
Ｓｕｐ−Ｔ１細胞でのトランスフェクション。Ｓｕｐ−Ｔ１Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋２０％子牛胎児血清中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。細胞を毎日分離して、対数相増殖を保持した。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ， サンタクラリタ）またはＢｉｏｒａｄ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｂｉｏｒａｄ， ハーキュリーズ， カリフォルニア）を用いて、製造業者のプロトコールに従って精製し、滅菌したＤＮＡｓｅ不含水に再懸濁した。細胞を、プラスミドＤＮＡ３０μｇを用いて４００ｍＶの電圧および９６０μＦのキャパシタンスで電気穿孔した。崩壊定数を電気選考中を通じて観察し、２５ｍＳを下回る崩壊時間のトランスフェクションのみを選択した。選択は、トランスフェクションの４日後に、３０％子牛胎児血清を含みｐＨを中性より若干高く視覚的に調整した０．４５ｍｇ／ｍＬ Ｚｅｏｃｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）選択培地を用いて行った。細胞を選択培地に２×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁し、それらが（ｐＨを指示したＰｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ （Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いて）ウェルを黄変しなくなるまで供給し、細胞分裂が開始するまでそのままにした。分裂が活発になった後、細胞が中位の（Ｔ−７５）組織培養フラスコに達するまで選択培地を徐々に供給した。次に、細胞を０．５、１および１．５個の細胞／ウェルの限定希釈で、９６穴組織培養プレートでサブクローニングした。細胞が十分に黄変するまで放置した後、それらを徐々に２４穴プレートおよび小さな（Ｔ−２５）組織培養フラスコに移した。試料を可溶性クラスＩＥＬＩＳＡ用に採取し、クラスＩの最良のプロデューサーを５×１０６個の細胞／ｍＬで後で使用するために凍結し、−１３５℃で保管した。
【０１０２】
可溶性ＭＨＣクラスＩＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡを用いて、細胞培養上清中のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の濃度を試験した。モノクローナル抗体Ｗ６／３２（ＡＴＣＣ， マナッサス， バージニア）を用いて、９６穴Ｎｕｎｃ Ｓｔａｒｗｅｌｌ Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレート（ＶＷＲ， ウエストチェスター， ペンシルバニア）をコーティングした。クラスＩを含む試験試料１００μＬを、プレートのそれぞれのウェルに装填した。検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合した抗−βＢ２マイクログロブリン（軽鎖）抗体を用い、次いでＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ， セントルイス， ミズーリー）と共にインキュベーションした。ＥＬＩＳＡ値は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のプログラムＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．１を用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ ００Ａ， Ｒｏｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０４， Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９６によって読み取った。親和性精製（下記参照）の前に、かご入り大型ガラス瓶のＭＨＣクラスＩ複合体を測定するため、それぞれの試料を少なくとも２枚の異なるプレートで３回試験した。未感染および感染採取物濃度を同一プレート上で読み取り、未感染試料を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００に溶解した後、ＥＬＩＳＡプレートに装填した。これは、親和性カラムに装填したペプチドの量の差が大きいことによって生じるマススペクトルの変動性を最小限にする試みにおいてであった。
【０１０３】
完全長の構造体の作製。完全長の構造体（ｐＣＤＮＡ３．１−／Ｇ４１８硫酸塩耐性ベクター中）を作製し、クラスＩ陰性Ｂ−ＬＣＬ７２１．２２１およびＴ２にトランスフェクションした。これらの細胞系を、対数相で増殖するまで、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％子牛胎児血清中で培養した。細胞を、０．２５Ｖおよび９６０μＦキャパシタンスで電気穿孔した。２日後、細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ＦＣＳ＋１．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８硫酸塩（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ， ハーンドン， バージニア）からなる選択培地に再懸濁した。細胞を、この時点以後、上記と同じ方法で処理した（Ｓｕｐ−Ｔ１トランスフェクション）。
【０１０４】
セルファーム産生。Ｓｕｐ−Ｔ１可溶性のＭＨＣクラスＩトランスフェクタント８リットルをＲＰＭＩ−１６４０＋１５％ＦＣＳ＋１００Ｕペニシリン／ストレプトマイシン中でローラーボトルで培養したものを、１１００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、全部で３×１０９個の細胞総数を、コンディショニングを行った培地２００ｍＬに再懸濁した。次に、感染細胞を供給ボトルに加え、Ｕｎｉｓｙｎ ＣＰ２５００セルファーム（ｃｅｌｌ ｐｈａｒｍ）のＥＣＳ供給ポンプを通って２０％子牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を予め加えた３０ｋＤ分子量カットオフ中空繊維バイオリアクター（Ｕｎｉｓｙｎ， ホプキントン， マサチューセッツ）に接種した。細胞を、３７℃の温度および系の培地溜にＣＯ２を注入することによって自動的に保持されている７．２０のｐＨで、バイオリアクター中で一晩インキュベーションした。この時期には、新たな培地を系に導入せず、ＩＣＳ再循環を４００ｍＬ／分の低い値に保持した。ＥＣＳ供給を接種から１２時間後に１５％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０を用いて１００ｍＬ／日の速度で開始し、ＩＣＳ供給も同様に１リットル／日の速度で開始した。ＥＣＳ再循環を、接種から２日後に４リットル／日の速度で開始した。ＥＣＳおよびＩＣＳ試料を２４時間間隔で採取し、ｓＨＬＡＥＬＩＳＡ（上記参照）およびグルコース試験を行った。ＥＣＳおよびＩＣＳ供給速度並びにＥＣＳおよびＩＣＳ再循環速度を、採取物中のｓＨＬＡの増加濃度およびＩＣＳ培地中のグルコースの減少濃度に基づいて調整した。
【０１０５】
ウイルス産生および感染ＨＩＶ ＭＮ−１産生。ＨＩＶ ＭＮ−１クローニングウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１７４４９）を凍結ストックから融解し、標準的方法を用いて２５×１０６個の非トランスフェクションＳｕｐ−Ｔ１（Ｄｅｎｎｙ Ｃ Ｔ， ｅｔ． ａｌ． １９８６． Ｎａｔｕｒｅ． ３２０：５４９．５１， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）Ｔ細胞の感染に用いた。細胞をＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ウシ胎児血清（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ）中で５日間培養し、合胞体形成を観察した。合胞体が形成したならば、新たな細胞を新鮮なＲＰＭＩ−１６４０／２０％ＦＣＳに加えた。培養をさらに５日間継続し、感染細胞１００ｍＬを取り出した。上清を０．４５μｍフィルターを通過させ、無細胞ウイルスを分割して、−８０℃で保管した。この工程を、適当量のウイルスが得られるまで継続した。
【０１０６】
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３産生。感染性分子クローンｐＮＬ４−３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ３２４４９３）をＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カールスバード， カリフォルニア）に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， サンタクラリタ， カリフォルニア）またはＢｉｏｒａｄ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｂｉｏｒａｄ， ハーキュリーズ， カリフォルニア）を用いて製造業者の指示に従って形質転換細胞からミディプレパレーションした（ｍｉｄｉｐｒｅｐｐｅｄ）。プラスミドＤＮＡを用い、Ｒｏｃｈｅ’ｓ Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ， バーゼル， スイス国） を用い製造業者の指示に従って２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ナッシュビル， テネシー）をトランスフェクションした。ウイルスを含む上清を２４、４８および７２時間後に回収し、５００×ｇで１０分間遠心分離を行って透明にし、分割して、−８０℃で保管した。可溶性のＡ＊０２０１、Ｂ＊０７０２またはＣｗ＊０７０２を含むＳｕｐ−Ｔ１トランスフェクタントを、高力価ウイルスを生成するウイルスと共に同時培養した。７２時間後、感染細胞を１１００×ｇで１０分間遠心分離した。無細胞ウイルスを含む上清を取り出し、０．４５μｍフィルターを通過させ、分割し、−８０℃で保管した。ウイルスに感染した細胞を、フリーズ培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ＦＣＳ＋１０％ＤＭＳＯ）に約６×１０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、−８０℃で保管した。
【０１０７】
ウイルス力価測定。ＨＩＶのいずれかの菌株由来の凍結したウイルスストック１バイアルを融解し、１）少なくとも３個の合胞体を含むウェルを陽性と考え、または２）ＥＬＩＳＡによって測定したとき５０ｎｇ／ｍＬを上回るｐ２４抗原を含むウェルを陽性と考える２つのやり方で得点を付けたＴＣＩＤ５０分析法に用いた。次に、ＴＣＩＤ５０を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（ＤＡＩＤＳ ＨＩＶ実験室用のウイルス学便覧（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ＨＩＶ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）， Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）を用いて計算した。両得点法の平均値を、ウイルスの最終力価として用いた。ウイルス力価観察の第二の手段としては、ウイルスストックｐ２４ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， マイアミ， フロリダ）中で希釈せずに使用し、無細胞ウイルス中に存在するｐ２４のｎｇ数を測定した。
【０１０８】
Ｐ２４ＥＬＩＳＡ。ＨＩＶｐ２４メジャーコアタンパク質は、試料を１０％ Ｔｒｉｎｔｏｎ−Ｘ １００で処理した後にＢＳＬ−３設備から除くので、キットに含まれる不活性化培地は用いないという変更を除き製造業者の指示に従って市販のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒｐ２４ＥＬＩＳＡによって測定した。次に、試料を水で連続希釈した後に使用した。
【０１０９】
感染細胞の中空繊維バイオリアクター培養。ＨＩＶの大規模培養を含む総ての操作は、国立衛生研究所によって設定された指針に準じて、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｌｅｖｅｌ ３ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで行った。ＨＩＶ ＭＮ−１の凍結ウイルスストックの分量を融解し、約５．５×１０６のＴＣＩＤ５０を含む総容積１００ｍＬにプールした。ローラーボトルにおいてＲＰＭＩ−１６４０＋１５％ＦＣＳ＋１００Ｕペニシリン／ストレプトマイシン中で培養したＳｕｐ−Ｔ１可溶性のＭＨＣクラスＩトランスフェクタント８リットルを、１１００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、総数が３×１０９個の細胞を、コンディショニングした培地２００ｍＬに再懸濁した。次に、無細胞ＨＩＶ ＭＮ−１１００ｍＬを再懸濁した細胞に加え、５％ＣＯ２中３７℃で２０分毎に緩やかに振盪しながら２時間インキュベーションした。次に、感染細胞を供給ボトルに加え、Ｕｎｉｓｙｎ ＣＰ２５００セルファーム（ｃｅｌｌ ｐｈａｒｍ）（Ｕｎｉｓｙｎ， ホプキントン， マサチューセッツ）のＥＣＳ供給ポンプを通って２０％子牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を予め加えた３０ｋＤ分子量カットオフ中空繊維バイオリアクターに接種した。細胞を、３７℃の温度および系の培地溜にＣＯ２を注入することによって自動的に保持されている７．２０のｐＨで、バイオリアクター中で一晩インキュベーションした。この時期には、新たな培地を系に導入せず、再循環を４００ｍＬ／分の低い値で保持した。ＥＣＳ供給を接種から１２時間後に１５％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０を用いて１００ｍＬ／日の速度で開始し、ＩＣＳ供給も同様に１リットル／日の速度で開始した。ＥＣＳおよびＩＣＳ試料を２４時間間隔で採取し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を１％まで加えて不活性化し、ｓＨＬＡＥＬＩＳＡ、ｐ２４ＥＬＩＳＡおよびグルコース試験は上記の通りに行った。ＥＣＳおよびＩＣＳ供給速度並びにＥＣＳおよびＩＣＳ再循環速度を、採取物中のｓＨＬＡの増加濃度およびＩＣＳ培地中のグルコースの減少濃度に基づいて調整した。
【０１１０】
可溶性ＨＬＡ精製。可溶性−ＨＬＡを含む上清を、感染した中空繊維バイオリアクターから１．９リットルの容積で採取した。２０％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を滅菌し、５０ｍＬの分量を６０ｍＬシリンジに入れ、２シリンジを、セルファーム（ｃｅｌｌ ｐｈａｒｍ）から取り出したときにそれぞれ１．９リットルの採取物ボトルに注入し、最終的なＴＸ １００の割合を１％とした。ボトルを緩やかに数回反転してＴＸ １００を混合し、４℃で最低１週間保管した。１週間後、採取物を２０００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞破片を除き、１０リットルのかご入り大型ガラス瓶にプールした。次に、プールしたＨＩＶ不活性化上清から少量を採取し、定量的ＴＣＩＤ５０分析法（上記）に用い、Ｓｕｐ−Ｔ１との同時培養に用いた。同時培養が完全に陰性でありおよびＴＣＩＤ５０の後にのみ、採取物をＢＳＬ−３から取り出した。
【０１１１】
クラスＩ／ペプチド産生および感染細胞からのＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体のペプチド特性決定処理。セルファーム採取物を、セルファーム実験中に経時的に厳密に分離した。（これは、一層包括的に起こる可能性があるものとは異なり、観戦時に一時的に起こる可能性があるエピトープ変化を評価しようとするものであった。）採取物を、ウイルスの感染性を測定するためにＴＣＩＤ５０分析および細胞同時培養分析法のいずれにおいても試験用に２ｍＬ分量を採取したことを除き、採取物は正確に上記の通りに処理した。
【０１１２】
感染および未感染ＭＨＣクラスＩ複合体のアフィニティー精製。ＣＰ２５００装置から採取した未感染および感染した採取物を、セルファームから採取後同様に処理した。Ｗ６／３２ＥＬＩＳＡ（上記参照）によって測定した総量が５０ｍｇのクラスＩを、Ｗ６／３２抗体に結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４Ｂマトリックス５０ｍＬを充填したＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ピスカタウェイ， ニュージャージー）カラム上を通過させた。結合したクラスＩ複合体を、最初に１リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウム洗浄緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭの濃度の双性イオン性界面活性剤Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−０８ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ， ダルムシュタット， ドイツ国）、およびＮａＣｌを５０ｍＭおよび２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液で洗浄した。双性イオン性界面活性剤洗浄液を２１６ｎｍの波長でＵＶ吸収を観察し、ペプチド複合体に疎水的に結合したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を除去した。洗浄液１リットルがカラムを通過した後（ＵＶをベースラインに戻すのに十分な量を上回る）、双性イオン性界面活性剤緩衝液を２０ｍＭリン酸ナトリウム洗浄緩衝液２リットルで除去した。ペプチドは、洗浄後に新たに作製した０．２Ｎ酢酸，ｐＨ２．７で溶出した。
【０１１３】
ペプチド単離および分離。溶出後、ペプチドを含む溶出物画分に、１００％氷酢酸を加えて、１０％氷酢酸濃度とした。次に、画分を、３ｋＤ分子量カットオフ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む８０５０型攪拌セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ベッドフォード， マサチューセッツ）限外濾過装置にプールした。装置に蓋をし管材料をパラフィルムで覆って漏れを防止し、７８℃水槽に１０分間入れた。取り出した後、ペプチドを含む溶出緩衝液を室温まで放冷した。攪拌セルを窒素気流下５５ｐｓｉの圧力で操作した。ペプチドを５０ｍＬ円錐形の遠心分離管（ＶＷＲ， ウエストチェスター， ペンシルバニア）に集め、過冷却エタノールでフラッシュ凍結し、凍結乾燥した。ペプチドを、１０％酢酸または１０％アセトニトリルに再懸濁した。ペプチドを、ＨａｉｓｉｌＣ−１８カラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， マウンテンビュー， カリフォルニア）上で１００％Ｂ（１００％アセトニトリル，０．０１％ＴＦＡ）のイソクラティックフローを用いて４０分間ＨＰＬＣを１回行うことによって精製した。溶出の後に、ペプチドを含む画分をプールし、急速真空乾燥して、１０％１５０μＬに再懸濁した。塩基メチルバイオレット２μｇをペプチド混合物に１０％酢酸中で加え、これをＨａｉｓｉｌ Ｃ−１８カラムに装填して分画化を行った。ペプチドは２つの方法の一方で分画化したが、後者の方がペプチド分離が増加した。最初の分画化プログラムは２〜１０％Ｂで２分、１０〜６０％Ｂで６０分、および画分回収１分であった。第二のＲＰ−ＨＰＬＣグラディエントは、２〜１４％Ｂで２分、１４〜４０％Ｂで６０分、４０〜７０％Ｂで２０分、および画分回収１分からなっていた。所定の画分に溶出するペプチドを、２１６ｎｍのＵＶ吸光度によって観察した。離れているが同一の（同じ緩衝液調製物に対して下降）ペプチド精製を、未感染および感染細胞からのそれぞれのペプチドバッチについて行った。
【０１１４】
分画化ペプチドのマススペクトル分析法によるマッピング。分画化ペプチドをマススペクトル分析法によってマッピングして、画分に基づくイオンマップを得た。画分を急速真空乾燥して、１２μＬの５０：５０メタノール：水＋０．０５％酢酸に再懸濁した。２μＬを採取し、ナノエレクトロスプレー（Ｐｒｏｔａｎａ， オーゼンセ， デンマーク国）によって飛行時間型検出器を備えたＱ−Ｓｔａｒ四重極型マススペクトル分析計（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＳＣＩＥＸ， フォスターシティー， カリフォルニア）に噴霧した。スペクトルは、それぞれのスプレーした画分について同一のマススペクトル分析計の設定条件を用いて５０〜１２００ａｍｕの範囲の質量について生成した。次に、スペクトルからベースラインを差し引き、プログラムＢｉｏＭｕｌｔｉｖｉｅｗ １．５ｂｅｔａ９版（Ｐｅｒｓｃｅｐｔｉｖｅ ＳＣＩＥＸ）またはＢｉｏＡｎａｌｙｓｔ １．０版（Ｐｅｒｓｃｅｐｔｉｖｅ ＳＣＩＥＸ）を用いて分析した。未感染／感染細胞における同じ画分からのスペクトルを手動で同じ質量範囲に整列し、固定し、スペクトルによって表されるイオンの差の存在について１５ａｍｖ増加を視覚的に評価した（例えば、Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２０００． Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ６１：１３３９−１３４６を参照；この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）。イオンを選択して、未感染細胞における同じイオンに対して１．５倍のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、または感染細胞中のイオンの存在または非存在に基づいてＭＳ／ＭＳシークエンシングを行った。このようにして、イオンを多数の種類に分類した後、ＭＳ／ＭＳシークエンシングを行った。
【０１１５】
選択されたペプチドのタンデムマススペクトル分析。下記の種類のそれぞれに相当するイオン質量のリストを得た：１） 感染細胞中でアップレギュレーション、２） 感染細胞ダウンレギュレーション、３） 感染細胞のみに存在、４） 感染細胞には存在しない、および５） 感染細胞では変化なし。最後の部類は一般にＭＳ／ＭＳ分析には無視され、最初の４種類のものをＱ−Ｓｔａｒマススペクトル分析計でＭＳ／ＭＳシークエンシングを行った。ペプチドを含む画分を、３μＬの分量でマススペクトル分析計にスプレーした。総てのＭＳ設定条件は、Ｑ０およびＣａｄガス設定条件を最良のフラグメンテーションが達成されるように変化させたことを除き、一定にした。生成したフラグメンテーションパターンを手動およびＢｉｏＭｕｌｔｉＶｉｅｗ １．５ ｂｅｔａ ９版を用いて解釈した。シークエンシングアルゴリズムをデーターの解釈に用いなかったが、ＭＡＳＣＯＴ （Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｄ Ｎ ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２０（１８）：３５５１−３５６７）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ （Ｃｌａｕｓｅｒ Ｋ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ７１：２８７１）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｒａｄｏｒ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＧｒｏｕｐＰａｇｅｓ／ＰａｇｅＬｉｎｋ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓｅａｒｃｈｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）、およびＢＬＡＳＴ検索 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などのマルチウェブアプリケーションを用いて、ペプチド同定を促進した。
【０１１６】
エピトープ変化の品質コントロール。上記の方法で同定したペプチドが「アップレギュレーション」、「ダウンレギュレーション」しているなどと判断する前に、複数のパラメーターを設定した。最初に、ペプチドを同定した画分の前および後のペプチド画分に、目的とするペプチドのフラグメンテーションに用いた同一衝突条件下で同じａｍｕでＭＳ／ＭＳを行い、生成したスペクトルを重ねて、比較した。これは、（メチルバイオレット塩基Ｂ標準化によっても）ペプチドが異なる分画化をした場合には、未感染または感染ペプチドの初期または後期画分にはペプチドがないこと（およびペプチドが同一の仕方で正確に分画化したこと）を確かめるために行った。第二に、最初のペプチドを同定するのに用いた同じａｍｕを、次に（ペプチドを同定した画分の逆の感染または未感染の）別の画分でＭＳ／ＭＳを行った。スペクトルを再度重ね合わせて、フラグメンテーションパターンがマッチせず、従ってペプチドが未感染細胞には存在しないこと、またはフラグメンテーションパターンがマッチした場合には、ペプチドが感染細胞でアップレギュレーションしていることを最終的に検証した。最後に、同定したそれぞれのペプチドについて、合成ペプチドを生成した。これらのペプチドを１０％酢酸に再懸濁し、最初の分画化に用いたのと同一条件下でＲＰ−ＨＰＬＣ分画を行い、同定したと推定されているペプチドが断片化したイオンＭＳ／ＭＳと同じ疎水性を有することを確かめた。この合成ペプチドを、重ねたスペクトルと同じ衝突条件下でＭＳ／ＭＳ断片化し、元のペプチド断片と正確にマッチすることをチェックした。
【０１１７】
機能分析／文献検索。エピトープを同定した後、供給タンパク質について文献検索を行い、感染細胞内でのそれらの機能を決定した。タンパク質の機能から、広汎な推理を行うことができる。供給タンパク質を、細胞内部での機能によって溝（ｇｒｏｏｖｅ）に分類した。また、感染細胞についてのみ特異的提示に利用可能なタンパク質の溝についても、広汎な推理を行うことができる。第二に、供給タンパク質を、他のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子によって結合することができる他の可能なエピトープについてスキャンニングした。ペプチド結合予想（Ｐａｒｋｅｒ， Ｋ． Ｃ．， ｅｔ． ａｌ． １９９４． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３）を用いて、供給タンパク質から得られる他のペプチドが結合予想されたかどうかを決定した。プロテアソーマル予想アルゴリズム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ） （Ａ． Ｋ． Ｎｕｓｓｂａｕｍ， ｅｔ． Ａｌ． ２００１． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５３：８７−９４）も同様に用いて、ペプチドがプロテアソームによって生成されている可能性を検討した。
【０１１８】
配列同定。一例としてペプチドＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬを用いてこの処理手続きの適用によって見られる結果が、包含される。この方法によって得られた他の例およびデーターを、表ＶＩＩに示す。
【０１１９】
【表８】
2004536554.tif 000009
【０１２０】
未感染細胞上にのみ存在するエピトープの同定の第一段階は、ＭＳイオンマッピングを行うことである。この場合には、上記で開示したようにＨＩＶから得た逆相ＨＰＬＣ画分３０（全クラスＩペプチドの画分を含む）をマススペクトル分析計に噴霧し、イオンスペクトルを作製した。図６に、イオンがアップレギュレーションしているものとして最初に同定されたイオンマップの一部を示す。４８４．７４のイオンが上部のマップで目立っていることが分かり、このマップは感染細胞からのペプチドから生成したスペクトルである。未感染細胞同士の一方のスペクトルからもう一方のものと強度が異なっている他のペプチドがあることも分かる。ペプチドを最初に同定した後、ペプチドが見出されているスペクトルの面積を拡大して、隣接領域の総てのイオンをさらに完全に見た（図７）。４８２−４８８ ａｍｕの部分に関して拡大すると、４８４．７２のイオンは感染細胞にしか存在しないことが分かる（上部のスペクトルで見られる）。このような大きな差は常に見られるものではなく、時には、配列決定のためさらに小さな差が選択されることがある。しかしながら、このイオンは、さらに分析を行うための極めて良好な候補と考えた。
【０１２１】
イオンを同定した後、この工程の次の段階は、タンデムマススペクトル分析法を用いることによってペプチドを配列決定することである。図８は、ペプチドを断片化するときに生成したスペクトルを示す。これらの断片を用いて、ペプチドのアミノ酸配列を識別する。このペプチドの配列は、ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬであると決定した。このペプチドを、感染したＨＬＡ−Ｂ＊０７０２分子から単離した。初期の品質管理段階は、ペプチドの配列を検討して、この分子によって提示されることが以前に示された配列に適合するかどうかを見た。Ｂ＊０７０２は、その第二の位置（Ｐ２）にＧ、およびそのＣ末端アンカーとしてＬを有するペプチドを結合する。この情報に基づけば、この配列はＢ＊０７０２によって提示されたペプチドであると思われる。
【０１２２】
ペプチドの特性決定の説明。ペプチド配列を得たならば、供給タンパク質についての情報が得られ、これからペプチドが感染細胞の細胞質ゾルに誘導される。最初に、ＢＬＡＳＴ検索（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイトで利用可能）を行って、ペプチドについてのタンパク質情報を提供する。配列ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬを用いるＢＬＡＳＴ検索によって、タンパク質であるレティキュロカルビン２が引き寄せられた。供給タンパク質を知った後、タンパク質についての情報を最初にＰｕｂＭｅｄ（これもＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイトで利用可能）から確かめ、図９に見られるように容易に参照することができるフォーマットにする。タンパク質についての総ての取得番号、およびタンパク質のオリジナルの記載が包含される。これによって、将来の使用についての情報に戻りやすくなる。また、タンパク質配列をコピーして、貼り付け、後での検索用に組込むためのテキスト文書として保存する。ペプチドはタンパク質全体で強調され、何に由来するかおよび全タンパク質がどの程度の大きさかについて幾らかの情報が提供される。これが、配列決定後の最初のデーター収集段階である。
【０１２３】
リガンドの特性決定の次の段階は、ペプチドが誘導される供給タンパク質についての文献検索を行うことである。タンパク質をＰｕｂＭｅｄデーターベースに入れ、「レティキュロカルビン」という単語を有する総ての収録語を検索する。図１０は、このタンパク質について以前に記載されてきたものをまとめているリストを示している。レティキュロカルビンについて、このタンパク質を含む複数の論文が公表されていることが分かる。文献はＰｕｂＭｅｄリストに続く段落にまとめられており、レポートに挿入されている。レティキュロカルビンについて、非常に興味深い点の幾つかは、これがＥＲ常在性タンパク質であり、感染細胞に提示される理由について推測することができることである。第二に、これは、乳癌および結直腸癌のような幾つかの他の種類の癌においてアップレギュレーションされることが見出されている。このタンパク質は、ＨＩＶによって引き起こされるもの以外の疾患の治療にも広汎に応用することができると思われる。このタンパク質が、ＨＩＶと相互作用しまたは干渉するものとして以前に引用されているかどうかも決定される。これは（幾つかの場合には見られるが）、レティキュロカルビンについては見られておらず、従ってレポートには示されていなかった。タンパク質の一般的理解が、文献検索によって得られる。
【０１２４】
ペプチドの特性決定の予想。  文献検索の後、幾つかの二次的検索を行う。図１１は、（上記で説明した）Ｐａｒｋｅｒ’ｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎを用いて行ったペプチド結合アルゴリズムの結果を示している。入力には、全供給タンパク質を用い、コンピューターによって、選択されたＨＬＡ対立遺伝子によって結合されるペプチドのリストが得られる。この場合には、Ｂ＊０７０２が選択されたが、これは、このペプチドが誘導される対立遺伝子であったからである。図の黒矢印から、マススペクトル分析法によって配列決定されたペプチド配列ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２に高親和性で結合することが予想されることが分かる。同様に結合することが予想される幾つかの他のペプチドが、示されている。図１２には、もう一つの周知の検索エンジンＳＹＰＥＩＴＨＩを用いて供給源ペプチドで行った同じ処理手続きが示されている。（このエンジンは、ＵＲＬ： ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐＰｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍを用いるワールドワイドウェブに見出すことができる。）また、Ｂ＊０７０２についてのこの検索エンジンからの結果は、このペプチドがＨＬＡ−Ｂ＊０７０２に高親和性で結合することが予想されることを示している。また、多数の他のペプチドがこの供給タンパク質から誘導され、結合されることも予想される。この予想により、幾つかのことを決定することができる。第一に、ペプチドが以前のアルゴリズムによって結合されることが予想されるかどうかを告げることができる。これにより、プログラムがどの程度良好に作業するか、および／または第三者が（供給タンパク質を持っているときには）ペプチド結合アルゴリズムからこのペプチドを同定することができるかどうかを知ることができる。この情報の総てを、ペプチドだけでなく供給タンパク質自身についての本発明の方法にとって一層重要なものに変換することができる。
【０１２５】
ペプチド結合アルゴリズムを行った後、タンパク質からペプチドへの通常の処理中に、ペプチドをプロテアソームによって生成させることができるかどうかを決定する目的で、検索を行う。クラスＩペプチド装填のための多数の経路が現在示されており、ヒトプロテアソームについての開裂アルゴリズムはいかなる手段によっても良好には設定されていない点に十分留意すべきである。正の結果は、プロテアソームが開裂に大きく関わっていることを示すことがあるが、負の結果は、ペプチドがクラスＩ分子で提示されないことを決して示していない。図１３に、開裂プレディクターＰａＰｒｏＣ （ＵＲＬ で入手可能）を用いて供給タンパク質のレティキュロカルビンについて行った第一のプロテアソーム開裂の結果を示す。エピトープの概略を示す。この予測ソフトウェアによっては、ペプチドが正常なプロテアソームによって開裂されることは予想されない。このことは、感染細胞では、特にレティキュロカルビンペプチドに関して代替経路のＭＨＣクラスＩ提示が用いられていることを意味する。これは、また、ウイルス感染の際の新規な治療方法を提示することもできる。第二のプロテアソーム開裂検索も、図１４に示されるように、予測ソフトウェアＮｅｔＣｈｏｐ（ワールドワイドウェブで入手可能）で用いられる。この予測法および当該技術分野における現在用いられている文献からの他のデータによって、ペプチドをプロテアソームによって作製し、開裂して、同定されるＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬを形成する。
【０１２６】
第三段階の分析は、供給タンパク質のみを含んでいる。総ての他の対立遺伝子をペプチド結合について試験し、最高の結合剤のリストを生成する。次に、プロテアソーム開裂予想を参照して、これらのペプチドがどのようにして生成するかを解明する。この情報は、ペプチドの下流試験、およびこのタンパク質が広汎なＨＬＡ対立遺伝子をカバーするワクチン試験に応用可能であるかどうかの決定に有用である。レティキュロカルビンについては、異なるＨＬＡ対立遺伝子に対して多数の高親和性ペプチドが示された（幾つかの例を、図１５に示す）。この図では、レティキュロカルビン由来の幾つかの高親和性ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＡ＊０１０１について同定された。
【０１２７】
配列決定の品質管理。現在のところ、ＭＳ／ＭＳ配列データの品質を評価する直接的手段はない。総ての記述され且つ予測された段階が終了したならば、再度品質管理のために元のペプチド配列に戻り、このペプチドが本当にアミノ酸配列として同定したものであり且つペプチドが実際に感染細胞のみに存在することを確かめる。本発明者らは、これらの多数の段階を用いており、従ってこの配列が実際に、ペプチドを包含する下流応用へ進む前に主張しているものであることには疑問の予知がない。
【０１２８】
最初に、本発明者らは、ペプチドが本当にアップレギュレーションされており、または感染細胞のみに存在することを決定する。レティキュロカルビンペプチドについては、このペプチドが恐らくは感染細胞のみに存在することを決定した。ペプチドが実際に未感染細胞にはなく、且つ（分画化にも同様に内部コントロールを用いることを考えれば）ＲＰ−ＨＰＬＣによる分画化が異なる可能性が全くないことを確かめるために、同定を行った前後の画分からＭＳを用いてイオンスペクトルを生成した。レティキュロカルビンペプチドの場合には、画分３０のペプチドを同定し、従って画分２９および３１についてＭＳを行った（図１６）。図１６では、ｍ／ｚ ４８４．７２には実質的なピークがないことが分かる。これは、差別的な分画化がなく且つペプチドが本当に未感染細胞からはなかったことを示していた。前後の画分の一方にペプチドピークがある場合には、ＭＳ／ＭＳにより、このピークが特性決定しているイオンまたは同一の質量／電荷比を有する別のイオンを表すかを決定した。
【０１２９】
ペプチドが別の画分には存在しないことを確定した後、ＭＳ／ＭＳを未感染スペクトル（同一画分）の同一ｍ／ｚについて行い、未感染細胞には同一配列を有するペプチドはないことを最終的に証明した。図１７では、同一ＭＳ衝突条件下で生成したフラグメンテーションパターンは全く異なることが分かる。このことは、未感染細胞にはレティキュロカルビンペプチドがないことを示している。
【０１３０】
最後に、ペプチド配列が最初に同定したものと同じであることを最終的に立証するため、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンから同定したペプチド配列と同じアミノ酸からなる合成ペプチドを合成した。レティキュロカルビンペプチド（すなわち、４８４．７２における画分３０のイオン）については、ペプチド「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」を合成した。次に、このペプチドを採用して、以前に用いたのと同一条件下でＭＳ／ＭＳを行った。図１８は、内生的に装填したレティキュロカルビンペプチドのＭＳ／ＭＳから生成したスペクトルを示す。これに見られるように、ほとんど総てのアミノ酸の組合せは断片の生成および存在する断片の強度のいずれについても全く異なる断片の組を生じるので、スペクトルのマッチングは、このペプチド配列がＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬであることを示している。図１８は、同一衝突条件下での内生性および合成「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」ペプチドのＭＳ／ＭＳを示す。ＭＳ／ＭＳグラフは実質的に同一であることが分かる。
【０１３１】
本発明によれば、ペプチドリガンド（すなわち、「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」）が、ＨＩＶ ＭＮ−１ウイルスに感染した細胞のＢ＊０７０２クラスＩＭＨＣ分子によって提示されるが未感染細胞では提示されないものとして同定された。当業者であれば、このようなペプチドリガンドの直接同定における本発明の方法の新規性および有用性、およびこのような同定が多数の治療（ワクチン開発、薬剤ターゲッティング）および診断手段に対して有する重要性を理解することができる。多数の他のペプチドリガンド自体が、（未感染細胞とは反対に）ＨＩＶ ＭＮ−１に感染した細胞でのみ同定されており、これらの結果を表ＶＩＩにまとめている。当業者であれば、本明細書を考慮すれば、「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」ペプチドリガンド、並びに目的とする微生物に感染した細胞および／または腫瘍形成性細胞に見られる他の唯一提示されるペプチドリガンドを完全に同定することができる。
【０１３２】
上記のように、表ＶＩＩは、ＨＩＶ感染細胞に特有なものとしてこれまでに同定されたペプチドリガンドの配列を同定する。クラスＩ ｓＨＬＡＢ＊０７０２を、ＨＩＶに感染したおよび感染していないＴ細胞について採取した。ペプチドリガンドをＢ＊０７０２から溶出させ、感染細胞に特有のイオンが明らかとなるようにマススペクトル分析計で比較マッピングした。感染細胞に特有のイオン（および未感染細胞に特有の１個のリガンド）にマススペクトル分析法によるフラグメンテーションを施し、ペプチドシークエンシングを行った。第１欄はシークエンシング用に選択したイオンを示しており、第２欄はＨＰＬＣ画分であり、第３欄はペプチド配列であり、第４欄は予想分子量であり、第５欄は実測分子量であり、第６欄は配列決定したエピトープの供給タンパク質であり、第７欄は、供給タンパク質の配列におけるエピトープが出発する場所であり、第８欄は取得番号であり、第９欄はそのエピトープおよび／またはその供給タンパク質について知られていることを簡潔に示しているデスクリプターである。
【０１３３】
本発明で用いる方法は、健康な細胞と比較して不健康な細胞に特有なものを決定する目的でｓＨＬＡを用いることである。細胞の内容を精査する目的でｓＨＬＡを用いることにより、処理されてペプチドとなるタンパク質に関して不健康な細胞に特有なものが考察される。表ＶＩＩは、エピトープおよびＨＩＶ感染細胞に特有なそれらの供給タンパク質を見出すための本明細書に記載された方法の有用性を示している。レティキュロカルビン由来のペプチドの詳細な説明は、上記に提供されている。表ＶＩＩに記載されている他のエピトープおよび相当する供給タンパク質を、レティキュロカルビンエピトープおよび供給タンパク質と同じ方法で、すなわち、本明細書で上記した通りに処理した。表ＶＩＩにまとめたデーターは、本明細書に記載のエピトープ検出法は、ｓＨＬＡ結合エピトープ、および感染した／不健康な細胞に特有なそれらの相当する供給タンパク質を同定することができることを示している。
【０１３４】
同様に、表ＶＩＩに示されているように、未感染細胞の個々のクラスＩＭＨＣ分子ペプチドによっては提示されない未感染細胞の個々のクラスＩＭＨＣ分子で提示されるペプチドリガンドを同定することもできる。例えば、ペプチド「ＧＳＨＳＭＲＹ」は、本発明の方法によって、未感染細胞では提示されるが感染細胞では提示されない個々のクラスＩＭＨＣ分子として同定された。
【０１３５】
このデーターの有用性は、少なくとも３つある。第一に、このデーターは、ＨＬＡを有する細胞から出てくるものを示している。このようなデーターを用いて、ＣＴＬを不健康な細胞にターゲッティングすることができる。第二に、記載したリガンドを有するＨＬＡ分子を特異的に認識するようにターゲッティングすることができる。第三に、供給タンパク質の実現により、この供給タンパク質をターゲットとする治療法および診断法を得ることができる。従って、不健康な細胞に特有なエピトープは、供給タンパク質が不健康な細胞で特有であることも示している。
【０１３６】
本明細書で記載したエピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法は、ＨＩＶのような微生物に感染した細胞に限定されない。本明細書で記載したエピトープ検出法によって解析される不健康な細胞は、ウイルス感染や癌性の悪性転換から生じる可能性がある。さらに、不健康な細胞の状態を、ウイルス感染や腫瘍形成の際に発現することが知られている特定の遺伝子をトランスフェクションすることによって模倣することもできる。例えば、ＨＩＶの特定の遺伝子を文献記載の方法で細胞系で発現させ（Ａｃｈｏｕｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １９９４． １０（１）： ｐ． １９−２５；およびＣｈｉｂａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，ＣＴＬ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ， １９９９． １４４（８）： ｐ． １４６９−８５，これらの文献の総ての内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）、次に、エピトープ検出法を行って、導入遺伝子の発現によってｓＨＬＡによるエピトープ提示がどのように修正されるかを確認することができる。同様にして、癌の際にアップレギュレーションすることが知られている遺伝子（Ｓｍｉｔｈ， Ｅ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２００１． ７（８）： ｐ． ９６７−７２，上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）ｓＨＬＡと共に細胞に導入した後、エピトープ検出を完了することができる。従って、本明細書で記載されているｓＨＬＡを用いるエピトープ検出は、完全な病原体、癌細胞または細胞系、または特定の癌、ウイルス、または細菌遺伝子を導入した細胞で完成することができる。これら総ての場合に、本明細書で記載されているｓＨＬＡは、エピトープ提示およびエピトープの供給タンパク質に関して何か変化するかを検出する手段を提供する。
【０１３７】
従って、本発明によって、エピトープ検出および比較リガンドマッピングの方法であって、本明細書で上記した目的および利点を完全に満足するｇＤＮＡ由来のクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子を産生し且つ操作する方法を含むものが提供された。本発明を、本明細書で上記した特定の図面、実験、結果および術語に関連して説明してきたが、多くの変更、修正および変化は当業者には明白となることは明らかである。従って、本発明は、本発明の精神および広汎な範囲内にある総ての変更、修正および変化を包含するものと解釈される。
【０１３８】
本願明細書（例および特許請求の範囲を含む）に記載の総ての数値および定量測定値は、近似値である。
【０１３９】
本明細書で例示的に開示しまたは特許請求してきた発明は、本明細書では具体的に開示または特許請求されていない任意の要素の非存在下で適当に実施することができる。従って、本発明は、本明細書で開示または特許請求した要素を含んでなり、そのような要素からなり、またはそのような要素から本質的になることができる。
【０１４０】
下記の特許請求の範囲は、本願明細書と矛盾しない最も広い可能な範囲に対して権利が付与される。特許請求の範囲は、好ましい態様または例に示される態様に必ずしも限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトのクラスＩＭＨＣの切断体を増幅するための二段階ＰＣＲ法の概観。
【図２】
可溶性Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳおよびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧのエドマン配列分析。残基強度をドミナント（前回に対して３．５倍以上のピコモル増加）またはストロング（前回に対して２．５〜３．５倍の増加）として分類した。
【図３】
分子間のイオンオーバーラップを説明する可溶性Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳおよびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧからの典型的なＭＳイオンマップ。プールした酸溶出ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって分画化し、個々の画分をＭＳスキャンニングした。
【図４】
Ｂ＊１５０１、Ｂ＊１５０１−ＨＩＳおよびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧ間の配列−レベルオーバーラップを説明する３種類の分子の画分１１から選択したイオンについてＭＳ／ＭＳによって生成したフラグメンテーションパターン。
【図５】
Ｃ末端にタグを付けたｓＨＬＡ分子のエピトープ検出のフローチャート。クラスＩ陽性トランスフェクタントを、選択した病原体およびタグを用いて優先的に精製したｓＨＬＡに感染させる。ＭＳイオンマップの差し引き比較により、感染細胞でのみ見られるイオンを生じ、これを次にＭＳ／ＭＳ配列決定し、クラスＩエピトープを誘導する。
【図６】
ＨＩＶ ＭＮ−１に未感染のおよび感染した可溶性Ｂ＊０７０２ＳｕｐＴ１細胞からのＭＳイオンマップ。プールした酸溶出ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって分画し、画分番号３０をＭＳスキャンニングした。
【図７】
４８２〜４８８ａｍｕの領域を拡大して総てのイオンを現下の面積で一層明確に同定するようにしたことを除き、図６と同様のＭＳイオンマップ。
【図８】
感染した可溶性Ｂ＊０７０２ＳｕｐＴ１細胞から単離したペプチドイオン４８４．７２のタンデムマススペクトル分析法によって生成したフラグメンテーションパターン。
【図９】
図８で同定した配列ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬによるＰｕｂＭｅｄ ＢＬＡＳＴ検索の結果。
【図１０】
「レティキュロカルビン」という用語についてのＥｎｔｒｅｚ−ＰｕｂＭｅｄ検索の結果の概要。
【図１１】
Ｂ＊０７０２ＨＬＡ対立遺伝子によって結合されているペプチドのリストを生成する全供給タンパク質レティキュロカルビンを用いるパーカー予測を用いて行ったペプチド結合アルゴリズムの結果。
【図１２】
Ｂ＊０７０２ＨＬＡ対立遺伝子によって結合されているペプチドのリストを生成する全供給タンパク質レティキュロカルビンを用いるラメンゼーのＳＹＰＥＩＴＨＩ予測を用いて行ったペプチド結合アルゴリズムの結果。
【図１３】
開裂プレディクターＰａＰｒｏＣを用いる完全なレティキュロカルビンタンパク質の予想プロテアソーム開裂の結果。
【図１４】
開裂プレディクターＮｅｔＣｈｏｐ ２．０を用いる完全レティキュロカルビンタンパク質の予想プロテアソーム開裂の結果。
【図１５】
レティキュロカルビン由来の幾つかの高親和ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＡ＊０１０１によって提示されることが予測されるペプチドとして同定した。
【図１６】
イオン４８４．７２が存在しないことを決定するための、画分２９および３１の可溶性のＢ＊０７０２未感染ＳｕｐＴ１細胞からのＭＳイオンマップ。
【図１７】
未感染細胞にレティキュロカルビンペプチドが存在しないことを説明するための可溶性の 同一のＭＳ衝突条件下でＢ＊０７０２未感染のＳｕｐＴ１細胞画分３０のイオン４８４．７２のフラグメンテーションパターン。
【図１８】
合成ペプチドＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬと感染した可溶性のＢ＊０７０２ＳｕｐＴ１細胞から単離したペプチドイオン４８４．７２のＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンの比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536554.tif 000159
【手続補正書】
【提出日】平成14年6月26日(2002.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
トランスフェクタントの作製および可溶性クラスＩ分子の産生
トランスフェクタントは、下記の修正を加えた以前に報告された方法で設定した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４５：３７９， １９９７， 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）：表Ｖに示されるプライマー５ＰＸＩ（５９−ＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣ ＧＣＣＧＡＧ−３９）（配列番号：１９）および３ＰＥＩ（５９−ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）（配列番号：２５）を用いて、細胞質ドメインを欠く構造体を生成させるために分子の全コード領域を含むＢ＊１５０１のｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅した。６個の連続したヒスチジンまたはＦＬＡＧエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：４３）からなるＣ−末端エピトープタグを含む構造体も作製した。表ＶプライマーＢ＊１５０１−ＨＩＳおよびＢ＊１５０１−ＦＬＡＧを作製するのに用いたプライマーは、５ＰＸＩおよび３ＰＥＩＨＩＳ（５９−ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）（配列番号：２６）、または３ＰＥＩＦＬＡＧ（ ５ ９ −ＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ−３９）（配列番号：２７）であった。ＰＣＲアンプリコンは、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｌｅｖｓｄｅｎ， オランダ国）を用いて精製し、哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カールスバード， カリフォルニア， 米国）にクローニングした。表Ｖ。二方向ＤＮＡシークエンシングによってインサートの完全性を確認した後、構造体をクラスＩ陰性Ｂ−リンパ芽球様細胞系７２１．２２１ （Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， 本明細書で上記に参考として引用）に電気穿孔した。トランスフェクタントをＧ４１８電気穿孔後を含む媒質に保持し、サブクローニングを行い、ＥＬＩＳＡによって決定された通りの可溶性のクラスＩの効率的プロデューサーを単離した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７， 本明細書で上記に参考として引用）。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
本発明の方法は、クラスＩＨＬＡ分子から溶出したペプチドリガンドの直接的比較分析を提供する。このような比較分析を行うために、クラスＩリガンド産生用の中空繊維バイオリアクターを、溶出リガンド分画化の逆相ＨＰＬＣ、およびペプチドリガンドのマッピングおよびシークエンシングのためのマススペクトル分析法と共に用いた。比較リガンドマッピングの応用は、内在性クラスＩを発現する細胞系にも応用可能である。クラスＩ陽性細胞系でのペプチド配列決定の前に、Ｃ末端エピトープタグをトランスフェクションしたクラスＩ分子に加える効果は、有害な効果を持たないことを見出した。６個のヒスチジン（６−ＨＩＳ）（配列番号：４４）からなるタグまたはエピトープＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＦＬＡＧ）（配列番号：４３）を含むタグを、ＰＣＲ中の可溶性のＢ＊１５０１のＣ末端に加えた。これらの構造体を、次にクラスＩ陰性７２１．２２１細胞にトランスフェクションし、以前に設定した通りにペプチド精製した（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 本明細書で上記に参考として引用）。２個の尾のあるトランスフェクタントを尾のない可溶性のＢ＊１５０１と比較することによって、タグ付加はクラスＩ分子のペプチド結合特異性に影響せず、従って直接ペプチドリガンドマッピングおよびシークエンシングに有害な効果を持たないと決定することができた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
幾つかのリガンド配列を、生成したフラグメンテーションパターンから明確に決定した。ヒトペリプラキン（ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ）由来のリガンドＱＧＬＩＳＲＧＹＳＹ（配列番号：４５）を、画分１８で溶出したペプチドから配列決定した。４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２６の範囲がマッチする１１マーである第二のリガンドＡＶＲＤＩＳＥＡＳＶＦ（配列番号：４６）を、画分２０で同定した。特に、これら２種類のペプチドは、Ｂ＊１５０１溶出リガンドのシークエンシングの際に本発明者らの実験室によって以前に報告された現象であるモティーフデーターによって予想されたストロングコンセンサスグルタミンを欠いていた（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９７， 本明細書で参考として上記に引用）。しかしながら、これらのリガンドは芳香族性のチロシンまたはフェニルアラニンで終わっており、これらのアミノ酸はいずれもＥｄｍａｎシークエンシングデーターおよび以前に公表された観察結果によってストロングアンカーであることが予想された（Ｐｒｉｌｌｉｍａｎ， Ｋ Ｒ ｅｔ ａｌ， １９９８， 本明細書で参考として上記に引用）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
クラスＩ陽性細胞からトランスフェクションしたクラスＩ分子およびそのペプチドリガンドを偏向しない方法で選択的に精製するには、非クラスＩ陽性細胞でのクラスＩ精製の態様を偏向する必要があった。既に広汎に特性決定されているクラスＩ陽性分子Ｂ＊１５０１へのＦＬＡＧおよび６−ＨＩＳタグ（配列番号：４４）のＣ末端付加は、ペプチド結合にほとんどまたは全く影響しないことが示された。この方法は、内在発現したクラスＩ分子の複雑な混合物から単一のクラスＩ特異性を精製できるようにデザインされた。テイルのあるおよび尾のないＢ＊１５０１分子から溶出したリガンドを比較して、ペプチドレパートリーに対するテイルの付加の影響を評価した。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
次に、選択したイオンＭＳ／ＭＳシークエンシングし、３種類の分子間のフラグメンテーションパターンを比較することによってマッピングしたイオンオーバーラップが実際に正確なリガンドマッチを表していることを確かめた（図４）。約６０種類のペプチドを最初にＭＳ／ＭＳ用に選択した−それぞれの画分から１０。全般的には、フラグメンテーションパターン検討を行ったペプチドの大部分では正確にマッチした（表ＶＩ）。非マッチとして分類されたフラグメンテーションパターンは同じ質量／電荷比で存在するペプチドの混合物から生じ、それらの１個以上はタグ付き分子に存在し、Ｂ＊１５０１からの同一イオンのスペクトルでは明らかではなかった。配列−レベルマッチの中、ＨＩＳのテイルのある分子由来のリガンドは、ＦＬＡＧのテイルのある分子から溶出したものよりＢ＊１５０１由来のものに一層緊密にマッチした。全体では、５２／５７のＨＩＳペプチドが正確なマッチであり、３９／５６のＦＬＡＧペプチドは同等であった。従って、このデーターは、６−ＨＩＳタグ（配列番号：４４）がＦＬＡＧタグよりも内生性ペプチド結合を妨害しないが、いずれのタグもＢ＊１５０１が結合したペプチドを劇的に変化させないことを示している。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
３種類総ての分子から溶出したペプチドの画分に存在する小数の個々リガンド配列は、ＭＳ／ＭＳによって決定した。２個の最も明確な配列ＡＶＲＤＩＳＥＡＳＶＦ（配列番号：４６）およびＱＧＬＩＳＲＧＹＳＹ（配列番号：４５）は、尾のあるクラスＩ分子が実際に内在性ペプチドリガンドを装填したことを示している。これは、Ｃ末端タグの付加が可溶性のＨＬＡ−Ｂ＊１５０１分子が自然に内在性ペプチドに結合することができることを排除しないという仮説を支持している。更に、いずれのペプチド配列も、フェニルアラニンまたはチロシンからなる一層保存されたＣ−末端と対になった異質なＮ−末端を有するＢ＊１５０１から溶出したペプチドについて以前に報告されているものと厳密にマッチした。均質なＥｄｍａｎ配列、ほぼ同一のフラグメンテーションパターン、および３分子間で共有されているペプチドリガンドを考慮して、本発明者らはＣ末端タグの付加がＢ＊１５０１を結合したペプチドを著しく変化させないと結論した。溶出したペプチドのマッピングおよび消去式比較は、クラスＩＨＬＡ分子が結合した個々のリガンドの差および類似性を確認するための直接的手段である。実際に、消去式比較は、オーバーラップしているリガンドが密接に関連したＨＬＡ−Ｂ１５サブタイプを横切ってどのように結合しているかを示し、並びにどのリガンドがウイルス感染細胞に特有であるかを指摘している。溶出したペプチドリガンドの直接的比較分析は多くの目的に極めて適しており、それらの目的の少なくともからぬものがウイルスおよび癌ＣＴＬエピトープ検出である。Ｃ末端エピトープタグの付加により、クラスＩ分子、従って、図５に示されるように、ウイルス感染を持続しまたは腫瘍形成性薬剤を収容することができる細胞系におけるペプチドリガンドの産生および精製の可能な方法が提供される。このような系からの直接的ペプチド分析は病原性要素の宿主コントロールについて重要な情報を生じるものであり、同時に合理的なワクチン開発のための重要な基礎単位を提供するものである。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
配列同定。一例としてペプチドＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）を用いてこの処理手続きの適用によって見られる結果が、包含される。この方法によって得られた他の例およびデータを、表ＶＩＩに示す。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
イオンを同定した後、この工程の次の段階は、タンデムマススペクトル分析法を用いることによってペプチドを配列決定することである。図８は、ペプチドを断片化するときに生成したスペクトルを示す。これらの断片を用いて、ペプチドのアミノ酸配列を識別する。このペプチドの配列は、ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）であると決定した。このペプチドを、感染したＨＬＡ−Ｂ＊０７０２分子から単離した。初期の品質管理段階は、ペプチドの配列を検討して、この分子によって提示されることが以前に示された配列に適合するかどうかを見た。Ｂ＊０７０２は、その第二の位置（Ｐ２）にＧ、およびそのＣ末端アンカーとしてＬを有するペプチドを結合する。この情報に基づけば、この配列はＢ＊０７０２によって提示されたペプチドであると思われる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
ペプチドの特性決定の説明。  ペプチド配列を得たならば、供給源タンパク質についての情報が得られ、これからペプチドが感染細胞の細胞質ゾルに誘導される。最初に、ＢＬＡＳＴ検索（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイトで利用可能）を行って、ペプチドについてのタンパク質情報を提供する。配列ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）を用いるＢＬＡＳＴ検索によって、タンパク質であるレティキュロカルビン２が引き寄せられた。供給源タンパク質を知った後、タンパク質についての情報を最初にＰｕｂＭｅｄ（これもＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイトで利用可能）から確かめ、図９に見られるように容易に参照することができるフォーマットにする。タンパク質についての総ての取得番号、およびタンパク質のオリジナルの記載が包含される。これによって、将来の使用についての情報に戻りやすくなる。また、タンパク質配列をコピーして、貼り付け、後での検索用に組込むためのテキスト文書として保存する。ペプチドはタンパク質全体で強調され、何に由来するかおよび全タンパク質がどの程度の大きさかについて幾らかの情報が提供される。これが、配列決定後の最初のデーター収集段階である。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
ペプチド結合アルゴリズムを行った後、タンパク質からペプチドへの通常の処理中に、ペプチドをプロテアソームによって生成させることができるかどうかを決定する目的で、検索を行う。クラスＩペプチド装填のための多数の経路が現在示されており、ヒトプロテアソームについての開裂アルゴリズムはいかなる手段によっても良好には設定されていない点に十分留意すべきである。正の結果は、プロテアソームが開裂に大きく関わっていることを示すことがあるが、負の結果は、ペプチドがクラスＩ分子で提示されないことを決して示していない。図１３に、開裂プレディクターＰａＰｒｏＣ （ＵＲＬ で入手可能）を用いて供給源タンパク質のレティキュロカルビンについて行った第一のプロテアソーム開裂の結果を示す。エピトープの概略を示す。この予測ソフトウェアによっては、ペプチドが正常なプロテアソームによって開裂されることは予想されない。このことは、感染細胞では、特にレティキュロカルビンペプチドに関して代替経路のＭＨＣクラスＩ提示が用いられていることを意味する。これは、また、ウイルス感染の際の新規な治療方法を提示することもできる。第二のプロテアソーム開裂検索も、図１４に示されるように、予測ソフトウェアＮｅｔＣｈｏｐ（ワールドワイドウェブで入手可能）で用いられる。この予測法および当該技術分野における現在用いられている文献からの他のデータによって、ペプチドをプロテアソームによって作製し、開裂して、同定されるＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）を形成する。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
最後に、ペプチド配列が最初に同定したものと同じであることを最終的に立証するため、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンから同定したペプチド配列と同じアミノ酸からなる合成ペプチドを合成した。レティキュロカルビンペプチド（すなわち、４８４．７２における画分３０のイオン）については、ペプチド「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」（配列番号：４０）を合成した。次に、このペプチドを採用して、以前に用いたのと同一条件下でＭＳ／ＭＳを行った。図１８は、内在装填したレティキュロカルビンペプチドのＭＳ／ＭＳから生成したスペクトルを示す。これに見られるように、ほとんど総てのアミノ酸の組合せは断片の生成および存在する断片の強度のいずれについても全く異なる断片の組を生じるので、スペクトルのマッチングは、このペプチド配列がＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）であることを示している。図１８は、同一衝突条件下での内在性および合成「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」（配列番号：４０）ペプチドのＭＳ／ＭＳを示す。ＭＳ／ＭＳグラフは実質的に同一であることが分かる。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
本発明によれば、ペプチドリガンド（すなわち、「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」（配列番号：４０））が、ＨＩＶ ＭＮ−１ウイルスに感染した細胞のＢ＊０７０２クラスＩＭＨＣ分子によって提示されるが未感染細胞では提示されないものとして同定された。当業者であれば、このようなペプチドリガンドの直接同定における本発明の方法の新規性および有用性、およびこのような同定が多数の治療（ワクチン開発、薬剤ターゲッティング）および診断手段に対して有する重要性を理解することができる。多数の他のペプチドリガンド自体が、（未感染細胞とは反対に）ＨＩＶ ＭＮ−１に感染した細胞でのみ同定されており、これらの結果を表ＶＩＩにまとめている。当業者であれば、本明細書を考慮すれば、「ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ」（配列番号：４０）ペプチドリガンド、並びに目的とする微生物に感染した細胞および／または腫瘍形成性細胞に見られる他の唯一提示されるペプチドリガンドを完全に同定することができる。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
同様に、表ＶＩＩに示されているように、未感染細胞の個々のクラスＩＭＨＣ分子ペプチドによっては提示されない未感染細胞の個々のクラスＩＭＨＣ分子で提示されるペプチドリガンドを同定することもできる。例えば、ペプチド「ＧＳＨＳＭＲＹ」（配列番号：４２）は、本発明の方法によって、未感染細胞では提示されるが感染細胞では提示されない個々のクラスＩＭＨＣ分子として同定された。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
図８で同定した配列ＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）によるＰｕｂＭｅｄ ＢＬＡＳＴ検索の結果。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
開裂プレディクターＰａＰｒｏＣを用いる完全なレティキュロカルビンタンパク質（配列番号：４７）の予想プロテアソーム開裂の結果。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
開裂プレディクターＮｅｔＣｈｏｐ ２．０を用いる完全レティキュロカルビンタンパク質（配列番号：４７）の予想プロテアソーム開裂の結果。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
合成ペプチドＧＰＲＴＡＡＬＧＬＬ（配列番号：４０）と感染した可溶性のＢ＊０７０２ＳｕｐＴ１細胞から単離したペプチドイオン４８４．７２のＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンの比較。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2004536554.tif 000160
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2004536554.tif 000161
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2004536554.tif 000162
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５ａ】
2004536554.tif 000163
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５ｂ】
2004536554.tif 000164
【国際調査報告】
2004536554.tif 000165
2004536554.tif 000166
2004536554.tif 000167
2004536554.tif 000168
2004536554.tif 000169
2004536554.tif 000170
2004536554.tif 000171