(57)【要約】本方法は、溶剤を除去した後、形成するために適当な試薬で希釈された少なくとも１つのプローブを含む試薬の微小容量を、少なくとも１つの基板（１８）上に吐出するための少なくとも１つのマイクロプロジェクション装置（Ｄ）からなり、スポット（２０）がプローブを含むことからなるタイプであり、試薬（３）が貯蔵されている少なくとも１つのタンク（１）および加圧下で、タンク（１）に接続される少なくとも１つのガス源（５）からなるマイクロプロジェクション装置（Ｄ）使い、ガスによって発揮される圧の推進下で、吐出ノズル（１４）を通して試薬の微小容量を吐出することからなることを特徴とする。
2004534242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のバイオチップ、特に平面基板を作製するための一群の独立したマイクロプロジェクション装置（Ｄ）からなることを特徴とする少なくとも１つの基板（１８）上に、溶剤の除去後、基板（１８）に付着したプローブからなる少なくとも１つのスポット（２０）を形成するように、適当な溶剤に希釈された少なくとも１つのプローブを含有する微小容量の試薬を吐出する少なくとも１つのマイクロプロジェクション装置を備えるバイオチップのエクス  サイチュー作製機械。
【請求項２】
各々のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）が、
・吐出用の試薬（３）を貯蔵するタンク（１）、
・注入管（７）を通してタンク（１）と接続させる加圧下での少なくとも１つのガス源（５）、
・一端でタンク（１）にディッピングしている排出管（１２）を介してタンク（１）に接続されているアクチュエーター（１０）、および
・アクチュエーター（１０）の排出口に装備され、アクチュエーター（１０）がソレノイドバルブ（２２）からなる制御回路（２２ａ）の制御の下で「開放」状態である場合に、直接タンク（１）と接続している吐出ノズル（１４）
からなることを特徴とする請求項１による機械。
【請求項３】
一群のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）のタンク（１）のすべてが、共通の加圧のガス源（５）に、同時に接続されていることを特徴とする請求項２による機械。
【請求項４】
一群のマイクロプロインジェクション装置（Ｄ）が、複数の列のマトリクスで配列されていることを特徴とする請求項２または請求項３による機械。
【請求項５】
マイクロプロジェクション装置（Ｄ）の吐出ノズルが、ＰＴＦＥのチューブにて構築されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１つによる機械。
【請求項６】
マイクロプロジェクション装置（Ｄ）の吐出ノズル（１４）が、１０μｍ〜１００μｍの直径を有するホールにて貫通されている部分（６０）にて構築され、接続管（６２）を介してアクチュエーター（１０）の排出口に接続されていることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１つによる機械。
【請求項７】
部分（６０）が、サファイア、ルビーまたはシリコンで作製された基板、例えばセラミックまたはステンレス鋼で作製された部分で構築されることを特徴とする請求項６による機械。
【請求項８】
一群のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）の各々の列が、少なくとも
・モジュール（３５）のタンクのセット（１）を支持し、および加圧下で、タンク（１）で貯蔵される試薬（３）を押し出すのに必要とされる流体流の接続を供給するため棒状形態の第一支持ブロック（３７）、および
・モジュール（３５）のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）のアクチュエーター（１０）および吐出ノズル（１４）を支持するための第二支持ブロック（３９）
からなる構造のモジュール（３５）を形成することを特徴とする請求項４〜７のいずれか１つによる機械。
【請求項９】
第一支持ブロックが、加圧ガス源（５）に接続されている一端を有する主要な縦のスルーチャンネル（５５）にて貫通されており、各々が主要なチャンネル（５５）およびタンク（１）のセットで開いているセットの第二の横のチャンネル（５７）にて貫通されており、タンクあたり１つの第二チャンネルが存在し、その結果加圧ガスの単一源（５）をモジュール（３５）のタンク（１）の全てに使用されていることを特徴とする請求項８による機械。
【請求項１０】
第一支持ブロック（３７）が、排出管（１２）がタンク（１）をアクチュエーター（１０）に接続させるように通過する横のスルーオレフィス（５０）でも貫通されており、前記オレフィス（５０）がスタガー配置で配列されていることを特徴とする請求項９による機械。
【請求項１１】
各々の排出管（１２）が、素早いカップリングにて第一支持ブロック（３７）の横のオレフィス（５０）で共に接続されている２つのセグメントで形成されていることを特徴とする請求項１０による機械。
【請求項１２】
２つの支持ブロック（３７、３９）が、固定手段（４８）にてお互いに接続されていることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１つによる機械。
【請求項１３】
各々のモジュール（３５）の構築物（３７、３９）が、機械の構築物（３２）上に移動可能に装備されていることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１つによる機械。
【請求項１４】
少なくとも１つの基板（１８）を支持する支持プレート（２５）、およびプレート（２５）と一群のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）の間の相対移動を付与するための手段からもなることを特徴とする先の請求項のいずれかによる機械。
【請求項１５】
一群のマイクロプロジェクション装置が静止であり、プレート（２５）が２つのモーター（Ｍ）にて交差したＸＹ移動を供給するモーター駆動装置（２８）にて制御される移動プレートであることを特徴とする請求項１４による機械。
【請求項１６】
マイクロプレートの吐出または基板（１８）上でのスポット（２０）の形成をモニターするためのディスプレイシステム（７０）からなることを特徴とする請求項１４または請求項１５による機械。
【請求項１７】
ディスプレイシステム（７０）が、基板−担持プレート（２５）の下に配置されていることを特徴とする請求項１６による機械。
【請求項１８】
ディスプレイシステム（７０）が、交差したＸＹ移動を行うモーター駆動装置（７８）上に装備されていることを特徴とする請求項１７による機械。
【請求項１９】
交差したＸＹ移動を行うモーター駆動装置（７８）が、基板−担持プレート（２５）の中空支持体（４０）内部に搭載されていることを特徴とする請求項１８による機械。
【請求項２０】
交差した移動を行うか、または基板−担持プレート（２５）を動かすためのモーター駆動装置（２８）およびディスプレイシステム（７０）を動かす装置が、各々独立して搭載されていることを特徴とする請求項１８による機械。
【請求項２１】
基板−担持プレート（２５）が、Ｘ軸に沿って移動可能な第一フレーム（８４）上に装備されており、前記第一フレーム（８４）が、静止である第二フレーム（９０）によってＹ軸に沿って移動するように装備されていることを特徴とする請求項２０による機械。
【請求項２２】
ディスプレイシステム（７０）が、カメラ（７２）、４５°ミラー（７４）、ズームレンズ（７６）および照射装置からなる請求項１６〜２０のいずれか１つによる機械。
【請求項２３】
大量生産を可能にするため、平面基板上に、約５０μｍ〜５００μｍのスポット間隔を有して約１００μｍ〜１０００μｍの直径のスポット（２０）を得るように、平面基板上に、約１０ｎｌの容量の微小液滴を、その数が１〜１０，０００の範囲にあって、吐出するのに、試薬の微小液滴を連続方式またはオンザフライ発射方式で吐出するための一群の独立したマイクロプロジェクション装置からなることを特徴とする、基板（１８）に付着されたプローブからなる少なくとも１つのスポット（２０）を溶剤の除去後に形成するように、可動プレート（１５）を担持させた少なくとも１つの基板（１８）上に、適当な溶剤に希釈された少なくとも１つのプローブを含有する微量の試薬を吐出することからなるタイプであるバイオチップのエクス  サイチュー作製法。
【請求項２４】
各々のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）と試薬を含むタンク（１）に排出ノズル（１４）を適合させ、加圧ガス源（５）からの圧にタンク（１）を維持し、同時に一群のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）のタンク（１）の全てを、同時に加圧ガスの単一源（５）からの圧下に置くことからなることを特徴とする請求項２３による方法。
【請求項２５】
各々のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）をタンク（１）と吐出ノズル（１４）との間に介在されたアクチュエーター（１０）を使って接続させ、タンク（１）を吐出ノズル（１４）で直接接続させるために、アクチュエーター（１０）を所定時間「開放」状態を占めるように制御し、その結果試薬の微小容量がタンク（１）でのガス圧の推進力下で吐出されることからなることを特徴とする請求項２４による方法。
【請求項２６】
ガス圧および／またはアクチュエーターが開いている時間を作動させ吐出試薬の微小容量を変化させることからなることを特徴とする請求項２５による方法。
【請求項２７】
アクチュエーターとしてマイクロソレノイドバルブ（２２）を使用し、電子制御装置（２２a）によって開いている時間を制御することからなることを特徴とする請求項２５または請求項２６による方法。
【請求項２８】
単一タイプのプローブと各々のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）と関連さすことからなることを特徴とする請求項２３〜２７のいずれか１つによる方法。
【請求項２９】
プローブを含むタンク（１）を変化させることなく単一経路で、少なくとも１つの基板（１８）上に複数のスポット（２０）を形成させることからなることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれか１つによる方法。
【請求項３０】
チップを作製する前に、基板（１８）上にスポット（２０）の規則的なアレイを得るために校正操作を行うことからなり、前記操作が、
・透明な中間基板上にスポット（２０）を吐出し、
・基板（１８）上に形成されるスポット（２０）の位置を、例えば基板（１８）の下に配置されたカメラによって同定し、
・スポット（２０）の同定された位置と望ましい位置の間の有意差をメモリーで記録し、そして
・チップ作製時に、前記有意差を補正し、スポット（２０）の規則的なアレイを得るためにプレート（２５）と一群のマイクロプロジェクション装置（Ｄ）の間の相対的な配置を自動的に修正する
ことからなることを特徴とする請求項２３〜２９のいずれか１つによる方法。
【請求項３１】
基板（１８）上に実際に形成されたかどうかを証明する品質制御を行うことからなり、前記品質制御がスポット（２０）の形成を観察するために、基板−担持プレート（２５）より下に装備されたディスプレイシステム（７０）を用いることからなることを特徴とする請求項２３〜３０のいずれか１つによる方法。
【請求項３２】
プレート（２５）およびディスプレイシステム（７０）を互いに独立して配置するようにすることからなることを特徴とする請求項３１による方法。
【請求項３３】
チップを作製した後、マイクロプロジェクション装置（Ｄ）の全てを洗浄するために、洗浄液、つまり水を含むタンクを使って試薬を置換し、高速で動かすことからなる除染工程を行うことを特徴とする請求項２３〜３２のいずれか１つによる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低および中集積バイオチップアレイをエクス  サイチュー（ex situ）作製用の方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーの分野において、バイオチップおよび特にDNAチップは、分子生物学に対する実験的な手法に大変革をもたらすことができる全く革新的な手法であると紹介されている。バイオチップの利点は、同一の固形の構築物（ガラス、シリコン、ポリマーなど）上で、異なる組成の数１０〜数１００万のプローブを平行して、標的生物分子を同定する能力にあり、プローブは、プローブとチップとの間での親和性の認識プロセスを行うことで保持される。
【０００３】
例として、ＤＮＡチップは、認識される標的ＤＮＡの鎖と、固形の支持体上で画定された領域に固定されている既知の配列のオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間で行われるハイブリダイゼーションプロセスを使い、そしてハイブリダイズされた領域と、その結果それが保持しているオリゴヌクレオチド配列を同定することで、モノカテナリーDNA鎖を同定し、標的DNA鎖の配列を決定することができる。
【０００４】
バイオチップの集積の程度に応じて、以下に分類することができる：
・２、３００までのプローブを有する低集積チップ、
・数１００〜数１０００のプローブを有する中集積チップ、および
・１００００以上のプローブを有する高集積チップ、
これら様々な型のチップは、同じ目的で使用されないと推測される。
【０００５】
低集積バイオチップの主な用途は、診断の分野である。それゆえ、それらは比較的低コストで大量生産することを意図する。それらの使用は、簡単であり、かつ素早く分析できなければならないという結果に繋がる。それらの作製は、有利には、予め調べられて精製された天然または予め合成された抽出物から得たプローブの直接的な固定化を利用する。その技術は、プローブの純度と、その結果、作製されるチップについてのより高い信頼性を約束する。
【０００６】
中集積バイオチップは、通常、大変厳密な研究に使用され、しばしば低集積チップ、例えば遺伝子または転写物の変異を研究するためのDNAチップを改良する目的で使用される。それゆえ、それらは低集積チップよりもより少量で製造される必要があり、それらの製品は融通性が高い道具であることを必要とする。中集積の小さな目的で、バイオチップについて、固定させることができ、それに対して中集積の大きな目的で、バイオチップについて、直接チップの支持体上で、イン  サイチューでの合成を使用するのに適する。
【０００７】
高集積バイオチップは、大変複雑で費用のかかる研究に使用されている。そのようなチップの製造は、イン  サイチューでの合成に関してのみ想定できる。それは、チップ上で得られ、多数のプローブに関連して、および多数の想定される溶液と関連する多量の情報を、信頼性を持って分析きるため、多数の実験操作が、親和性を認識するプロセス、例えばDNAについてのハイブリダイゼーション／ディネーテュリングおよび多量の数学的な処理を有効にするために要求される。そのような非常に長い展開は、高コストにつながり、高い付加価値を有する研究、例えば薬剤の副作用を研究することへの適用に制限を加える。
【０００８】
複数のバイオチップを作製する方法が知られており、そして、それらは、２つのカテゴリー、すなわち、同時にプローブを基板上で塩基ごとに合成することからなるイン  サイチュー法およびプローブのセットを生産し、次にプローブを基板に固定させることに基づくエクス  サイチュー法に分類される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、プローブをそれ自体公知の方法を使って作製するエクス  サイチュー法の範囲にある。エクス  サイチュー作製法は、プローブを基板と接触させるために使用する方法によって分類できる。すなわちプローブを含む溶液を、基板の全表面に接触させ、次いで、例えばエレクトロ重合を選択的にアドレスされる領域で起こして固定させるか、またはプローブを、基板に付着手段で物理的な接触、あるいは実際に基板と物理的接触、マイクロプロジェクションによって局所的に付着させる。エクス  サイチュー作製法もプローブを基板に結合させる方法に従って分類することができる。様々な可能性のある結合方法は、プローブの基板上で吸着、または生物学的な親和性、例えばビオチン／ストレプタビジン型の、あるいはエレクトロ重合による結合、有利には共有化学結合を形成することによる結合に基づいている。本発明の方法は、これら固定方法の全てと互換できる。
【００１０】
マイクロプロジェクションによって基板に結合されるプローブを使った公知のエクス  サイチュー作製法において、圧電効果または熱効果型の装置が使用されており、これら２つの技術は、インクジェットプリンター用に開発されている。
【００１１】
圧電型マイクロプロジェクション装置は、毛細管現象にておよび／または外部と比べてごく少ない陽圧または陰圧の効果、すなわちミリバールオーダーの違いの下で供給されるプローブタンクからなる装置である。このタンクは、常時開いているオレフィスを有し、そのため、蒸発と大気との接触があるためプローブの保存の問題が生じる。さらに、この型の装置を用いたマイクロプロジェクションは、ミリリッター（ｍｌ）オーダーの容量を有するタンクに対して、４ピコリッター（ｐｌ）〜３０ｐｌのオーダーの最大用量に限定され、このことはプローブ含有溶液を洗浄液と交換することによる除染作業が、容易ではなく、達成できる流速が小さくても空にする操作もできないことを意味している。最終的に、圧電型のマイクロプロジェクション装置は、複雑であり、そして開発するのが困難な制御装置を必要とする。
【００１２】
本発明の対象は、試薬の基板上への液滴を吐出するためのその他のエクス  サイチューでの技術を発明することである。その新規な技術は、高速で行う作製およびチップあたり数ユーロセント〜数ユーロの作製費用で、数百〜数千のプローブを有するバイオチップを作製するのにも十分適しており、その結果低および中積載チップの大量生産に係わる産業の必要性を満たすことができるようにする。
【００１３】
この目的に、本発明は、少なくとも１つのバイオチップのエクス  サイチュー作製法を提供する。その方法は、少なくとも１つのプローブを含む微小容量の適当な溶媒で希釈された試薬を、溶媒の除去後、プローブを含有するスポットを形成するように、基板に吐出することからなり、その方法は試薬を貯蔵する少なくとも１つのタンク、およびタンクと連結させる加圧下の少なくとも１つのガス源を有するマイクロプロジェクション装置を用い、そして試薬上で、ガスにて発揮される圧力の推進力下で、吐出ノズルを介して微小容量の試薬を吐出することからなることを特徴とする。
【００１４】
この目的に、本方法は、マイクロプロジェクション装置と、タンクと吐出ノズルとの間に介在するアクチュエーターとを連結させ、タンクを吐出ノズルに直接接続させるために、所定時間の間、アクチュエーターが「開放」状態に制御することからなり、その結果タンクに存在するガス圧の推進力下で、微小容量の試薬を吐出する
【００１５】
一般に、本方法は、加圧下でタンクに貯蔵される試薬を連続的に保持し、そして加圧下のタンクを隔絶させるために、アクチュエーターが「閉鎖」状態にし、一方で、微小容量の試薬を排出に備えることからなり、その結果、試薬が蒸発することを避けられるようにし、そして不活性な媒体中で貯蔵を可能にする。
【００１６】
有利には、本方法は、少なくとも１つの基板上に多数のスポットを形成するために一群の独立したマイクロプロジェクション装置を使い、そして多数の列を有するマトリクスで多数の一群のマイクロプロジェクション装置を配置し、モジュール形態でマトリクスの各々の列を形成し、ならびにマイクロプロジェクション装置の列の全てのタンクを加圧下で同一の源のガスと連通させることからなる。
【００１７】
一般に、本方法は、少なくとも１つの基板をプレート上に置き、連続またはオンザフライ発射またはインジェクトプロセスを使って基板上に複数のスポットを形成させるために、プレートとマイクロプロジェクション装置との間での相対配置を付与することからなる。
さらに、多数のマイクロインジェクション装置を使って、単一の経路で、少なくとも１つの基板上に複数のスポットを形成させることができ、マイクロプロエクション装置の各々のタンクは単一型のプローブのみを含む。
その方法は、試薬が各々のノズルを通して吐出される指令を制御し、そして品質制御をも行い、微小容量の試薬を基板上に吐出するのを校正することからなる。
【００１８】
実際に、本方法は、約０．１ミリメーター（ｍｍ）〜１０ｍｍ、好ましくは約１ミリメーターの基板から離して吐出ノズルを置き、そして数ナノリットル（ｎｌ）オーダーの容量を有する微小液滴の形態で試薬の微小容量を吐出することからなる。
本発明は、試薬の少なくとも1つの微小液滴を、少なくとも１つの基板上に吐出することからなり、装置が少なくとも
・吐出用の試薬を貯蔵するタンク、
・注入管を通してタンクと連通させる加圧下での少なくとも１つの加圧ガス源、
・一方がタンクにディッピングしている排出管によってタンクに接続されているアクチュエーター、および
・アクチュエーターから出口に載置され、アクチュエーターが制御回路の制御の下で「開放」状態である場合に、直接タンクと連通する吐出ノズル
からなることを特徴とする上記方法を実行するための装置も提供する。
【００１９】
有利には、各々のマイクロプロジェクション装置のアクチュエーターは、電気的に制御されたバルブにて構成される。
有利な実施の形態において、装置はお互いから独立した複数のマイクロプロジェクション装置と、複数の列からなるマトリクスとして配列されている一群のマイクロプロインジェクション装置からなる。
有利には、一群のマイクロプロインジェクション装置の各々の列は、これらの構造が、少なくとも
・モジュールの全てのタンクを支持するため、および加圧下で、試薬をタンクに貯蔵されるのに必要とされる液体の接続を供給する棒状形態の第一支持ブロック、および
・モジュールのマイクロプロジェクション装置のアクチュエーターおよび吐出ノズルを支持するための第二支持ブロック
からなることができるモジュールを形成する。
【００２０】
実施の形態において、第一支持ブロックは、一端が加圧ガス源に接続されている一端を有する主要縦のスルーチャンネルで貫通されており、そしてまた、主チャンネルと全てのタンクに開口するセットの第二チャンネルに貫通されている。そこでタンク当り１つの第二チャンネルがあり、接続数を減少させるためにモジュールの全てのタンクについて、単一の加圧ガス源を使っている。
【００２１】
さらに、支持ブロックは、横スルーオレフィスと貫通し、そのオレフィスはタンクとアクチュエーターを連通する通過する排出管を有し、オレフィスは、モジュールのサイズを減少させるために互い違い配置に配することができる。
【００２２】
有利には、各々の排出管は、急速カップリングによって第一支持ブロックの横のオレフィスで、互いに接続されている２つのセグメントで作製されている。
有利には、各々のモジュールの構築物は、モジュールを装備および除去する作業を容易にするために、機械のフレーム上で取り外しがきくように装備されている。
一般に、機械は、少なくとも１つの基板を支持するためのプレート、およびプレートと一群のマイクロプロジェクション装置との間の相対配置を付与する手段をも含む。
【００２３】
実施の形態において、一群のマイクロプロインジェクション装置は静止であり、プレートは、２つのモーターによって交差したＸＹ移動の制御下で移動する。
【００２４】
本発明に従ってエクス  サイチュー作製法および装置は、これまで不可能であった大量生産を行えるようにする。機械的なマイクロ付着方法を行う機械において、しばしば「スポッター」または「アレイアー」と呼ばれるピペットマトリクスは４〜３２の要素が使用されており、それに対してウエルの数は、一般に１２８または３８４である。その結果、単一の通過で、全てのプローブを付着させることができず、そして各々通過した後に、ピペットを除染および洗浄をする必要もある。同様に、マイクロプロジェクション法を行うための圧電型または熱効果型の機械で、少数のマイクロプロジェクション手段以上の作製を考慮することが困難であり、しばしば洗浄と空にする作業を含む。
【００２５】
試薬をマイクロプロジェクトするために陽圧を使用することは、安定した操作の機械を設計することができる。タンクに貯蔵される試薬を使い切る割合は、マイクロプロジェクション装置が作動する割合に殆ど影響をもたず、それらの気密性が、溶媒が蒸発するのを防ぎ、すなわちプローブ濃度が変化せず、使用されずに、各々のタンクで保存されているプローブを、品質の何らの損失をこうむることなく再使用できる。これは不活性な媒体中で使用中保存されるプローブの性質を損するであろうガスまたは試薬と接触することがないためである。さらに、ガス圧を調節することで、高粘度または様々な粘度のプローブを作動させることができ、このことは、例えばＤＮＡｃプローブを用いたときに特に有利である。
【００２６】
エクス  サイチューで作製するための本発明の方法および機械は、大量生産に対して多数の利点、特に：
・試薬の少ない消費は、集積ノズルを有し、電磁弁を備えたマイクロプロジェクション装置は、通常１０ｎｌの容量の液滴を吐出し、対して「作動」、すなわちタンク内のプローブの吐出可能な容量は１ｍｌオーダーであり、つまり約１００，０００の液滴を吐出し、そして一連の大量生産での作製プロセスにおいて、約１００，０００のチップを作製するのを可能にすることが挙げられ、
・全体としてチップに使用される生物学的材料が少量のため、チップの作製が低コスト；例えば、２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブのタンクのコストは、約３０ユーロであり、そのことは、１００，０００のチップの容量を製造することと比べると、１スポットあたりかつ１チップあたり０．０３ユーロのコストとなり、これは２５６のプローブを有するチップを製造するコストにおいて、作製コストにおけるプローブにて表される値（quantity）は０．１５ユーロよりも低いことを意味しており、
・実施は簡単であり、
・マイクロプロジェクション方法は、多様な物理化学特性（表面張力、粘度、蒸発率）を有する多数の純粋または混合のいずれかの溶媒、例えばアセトニトリル；ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）；水；およびＴＲＩＳ、リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）のような水性溶媒と融和性である。この溶媒は以下の理由で特に有利である。：無害である、均一なスポットを得ることができる生物分子の良好な溶解性を示し、その表面張力が活性化基板に適合され、その結果細かなサイズのスポットを得させることができ、制御された方法において溶媒を除去する、例えば１０ｎｌのプローブのＰＢＳ溶液を吐出することで構築される２５０μｍのスポットについて、溶媒が２１℃で６０秒、および４０℃、１５秒で除去される。および
・生産は柔軟性があり、例えば各２５６の吐出手段を有する４つの装置を使うことで１０２４のプローブを有するチップを大量生産することを可能にし、実験室スケールで、小さなシリーズについて、産物を分画することを可能にし、そして２５６のタンク機械を使って、タンクを４回交換し、中間洗浄作業を行い、そして基板上にマイクロプロジェクションをオフセットすることで１０２４のプローブを得ることを可能にさせることが挙げられる
も提示する。
【００２７】
一般に、バイオチップの使用は、例えば、
・基礎研究：ゲノムシークエンシング、遺伝子の発現および機能の調査、変異調査、種（動物、植物、細菌）の生物多様性の調査、
・医薬分野：感染および遺伝病に関する診断試験、臨床試験をトラックし、治療を適用する上での手助け、
・薬理遺伝学：治療毒性（treatment toxicity）および副作用の同定と、抗ウイルス製剤に対する耐性、新規分子の調査、
・環境：水、空気および土壌の細菌分析による公害のモニタリング、および
・フードビジネス：細菌学的なモニタリング、遺伝的に修飾された生物（ＧＭＯｓ）の同定、など
のような大変多岐にわたる分野において、非常に展望が開かれている。
【００２８】
一般に、プローブは、一端に、基板に結合させるための官能基を有し、他端に、支持体と反応するのを妨げるようにする官能基、できうれば保護基を有する結合分子の層を介して固定できうる。そして、この官能基は共有結合によってプローブを固定するのに用いることができ、官能基は、一旦脱保護され、そして活性化されている。
作製法は、基板上でプローブの共有結合を基にしてもよく、それは以下の化学特性
・基板は、フリーな末端がメチルエステル基を担持するシランで機能化されている、
・シランは、脱保護され、例えば濃塩酸の作用下でカルボン酸を与え、そして、活性化する、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような適当な溶媒中でのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの作用下で活性化エステルを与える、および
・基板上でプローブと結合分子との間での共有アミド結合を形成するために、アミン官能基で供給されるプローブを基板上に付着させる
を基にして、行ってもよい。
【００２９】
本来、例えば以下の基、チオール、エポキシ、カルボン酸（プローブ末端に結合される）、一級アミン（表面末端に固定される）・・・を基にしたその他の化学システムを使用することができる。
【００３０】
概して、本発明は、アレイを、多様な寸法、集積度（基板あたりのプローブの数）、密度（単位面積あたりのプローブの数）、および組成物で作製することを可能にする。すなわちオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＤＮＡｃ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、酵素、免疫タンパク、タンパク質、細胞および一般的な生物学的物質で構成されたプローブを、あらゆる種類の支持体、特に１平方ミリメートル（ｍｍ2）〜０，０００ｍｍ2の面積を有するシリカ、シリコン、金属またはポリマーで作製される支持体上に作製してできる。スポット面積は、１マイクロメーター（μｍ）〜５００μｍの直径を有する円内にある。スポット数は、基板あたり１〜１０，０００の範囲にある。様々な化学種のプローブを、同一の基板、例えばオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびタンパク質上で同時に使用することができる。
【００３１】
本発明のその他の利点、特徴および詳細は、実施の形態を通して、純粋に得た添付図を引用して以下に挙げられる付加的な記載から明らかである。
・図１は、基板上に微小容量の試薬をマイクロプロジェクトするための装置の簡略した概要である。
・図２は、図１に示したマイクロプロジェクション装置用の制御回路の一例である。
・図３は、一群のマイクロプロジェクション装置の概念の概略図解である。
・図４は、２５６の一群のマイクロプロジェクション装置で固定されたモジュラー機械の総括的な例を得るための透視図である。
・図５は、図４で示した機械のモジュールの透視図である。
・図６は、図５の矢印ＶＩに沿って見る概要である。
・図７は、図６の線ＶＩＩ−ＶＩＩ上での切片の概略図である。
・図８は、図７の概略に類似した概略である。
・図９は、図４〜７に示した機械を制御する原理を示す概略図である。
・図１０および１１は、図４〜７に示した型の機械で作製された３２のチップを示す図である。
・図１２および１３は、スポットが、基板上でのそれらの位置を自動的に補正するプロセスの前後で形成される基板を示す。
・図１４は、スポットの形成をモニターするディスプレイシステムで固定された機械の透視図である。
・図１５は、図４の側方図である。
・図１６および１７は、図１４および１５のそれらに類似した断片的な概略図であり、ディスプレイシステム用の様々な装備を示す。
【００３２】
図１に示すように、本発明のマイクロプロジェクション装置は、少なくとも
・適当な溶媒で希釈された少なくとも１つのプローブにて構築される液体形態にある試薬３を貯蔵するタンク１、
・注入管７を介してタンク１に接続された、加圧下のガスの源５であって、該ガスが例えばヘリウムのような不活性ガスであり、
・試薬３に浸っている排出管１２にてタンク１に接続されたアクチュエーター１０
・アクチュエーター１０の排出口に装備されている吐出ノズル１４
からなる。
【００３３】
一般に、アクチュエーター１０の機能は、微小容量の試薬３がノズル１４を介して吐出されるようにすることである。アクチュエーター１０は、少なくとも２つの状態、各々開放状態と閉鎖状態を占めることができる。所定時間の間、開放状態を占めることで、アクチュエーター１０は、タンク１に存在するガス圧の推進力下で、試薬３がノズル１４内に通ることを許容し、そして十分な圧力を提供し、このことは、微小容量が、一旦溶媒が排除されると、スポット２０を形成するように基板１８の活性化表面上に付着されることとなる微小液滴１６の形態に吐出させる。
【００３４】
アクチュエーター１０は、有利にはマイクロソレノイドバルブ２２にて構築される。マイクロソレノイドバルブは、非常に小さなデッド容量を示し、そして、それは、例えば、圧電素子によって制御されるアクチュエーターほど試薬の粘度における多様性に対して感受性ではない。バルブ２２は、表２で図示されているタイプの制御回路２２ａにて制御されており、電気的な見地から、バルブ２２は、連続して接続されている等価抵抗ＲおよびインダクタンスＬを表す。制御回路２２ａは、例えば、ベースがトランジスタ・トランジスタ論理（ＴＴＬ）型制御シグナルにて制御され、およびエミッターが地面に接続されているトランジスタＴを最低限含んでいてもよい。バルブ２２のＲＬ等価回路は、トランジスタＴのコレクターと電源の電圧との間で連続して接続されている。ダイオードＤ１およびツェナーダイオードＺ1の一連の接続は、インダクタンスＬでの振動の寄生効果を減少させるために、ＲＬ回路と並列に、電圧を制限するダイオードとともに接続されるが、ダイオードＤ１は逆流を防止する。
【００３５】
一般に、ノズル１４にて排出される試薬の容量および基板上に散布する程度は、種々の因子、特に
・液圧の接続（hydraulic connection）の材料、特性および形状
・装置におけるヘッドロス、
・吐出ノズルの特性および形状
・タンクに貯蔵される試薬、および
・マイクロソレノイドバルブが開いている時間、試薬が貯蔵されているタンク内の圧力吐出ノズルと基板との間の距離・・・
に依存する。
例として、制御回路２２ａを、約０．０５バール〜１バールであるタンク１内の陽圧の存在下で、約０．１ｎｍ〜１０００ｎｌの範囲にある試薬の容量を排出するために、バルブ２２を約０．０１ミリ秒（ｍｓ）〜１ｓの時間で素早く開閉できるように設計する。
【００３６】
一般に、一群のマイクロプロジェクション装置を、溶媒が一旦蒸発すれば基板上にプローブが結合され、その上にグラフトされた複数のプローブを有する乾燥基板を生じさせることとなる化学反応を進行させるために、溶媒に希釈される試薬（プローブ）の微小液滴を、特に平面な基板上に吐出するのに用いる。有利には、個々の一群のマイクロプロジェクション装置を、複数のバイオチップを同時に作製するために使用し、それは、マイクロプロジェクション装置の配置とバイオチップ上のスポットの配置との間に相関関係がないために、各々のバイオチップがバイオチップ上のプローブの配置に関して、任意に異なってもよいと理解される。さらに、マイクロプロジェクション装置のタンクは、互いに独立して変換することができ、そして一つのマイクロプロジェクション装置を、マイクロプロジェクション装置自体の中で、プローブ間の汚染の問題を回避するように、各プローブに割り当てることができる。
【００３７】
図３ａに示す基本的な構成とともに、独立した一群のマイクロプロジェクション装置Ｄが提供され、１６のそのような装置が一列に並んで配置される。有利には、接続数を減少させるために、加圧下のガスの単一源５をタンク１の全てに供給するために使用し、そのことは安定した条件下で操作し、そして溶媒が蒸発するのを防げることを可能にする。一般に、活性化された複数の基板１８をプレート２５上に配置することができ、そして基板１８上にスポット２０を形成させるために、一群のマイクロプロジェクション装置Ｄとプレート２５との間の相対移動を付与するように提供され、大量生産を行うためにプレート２５が１〜１０，０００の基板、および一般に約１００の基板を有するのに適した寸法であってよいことが理解される。例として、約５０μｍ〜５００μｍのスポット間隔をあけて約１００μｍ〜１０００μｍの直径を有するスポットを形成するために、一群のマイクロプロジェクション装置は１ｎｌ〜３０ｎｌの容量で流体と送達することができ、バルブは約０．１ｍｓ〜２ｍｓの期間開放され、流体は０．０１バール〜０．５バールの加圧下である。
【００３８】
図３で示した実施例で、一群のマイクロプロジェクション装置Ｄは、２つのモーターＭの制御下で、交差したＸおよびＹの動きを付与するために、プレート２５をモーター駆動された装置２８上に実装する間、静止である。有利には、マクロソレノイドバルブは、プレート２５のＹ移動軸に対して平行に、一列に並んで配列されている。
バルブ２２を、制御要素、例えば制御、アドレスおよびデータバスｂ1を通してパーソナルコンピューター（ＰＣ）に、およびバスｂ2を通してマイクロプロジェクション装置Ｄに、およびバスｂ3を通してモーターＭに接続される電子カードＣに関連するＰＣにて制御する。制御ＰＣは、微小液滴を基板１８上に正確に所望の位置に吐出するような方法で、バルブ２２の開放を基板−保持プレート（substrate-carrying plate）２５の位置と同調させるようにする。
【００３９】
そして、チップのバッチを作製するためには、基板１８が通り過ぎて移動するようにしながら試薬の微小液滴の吐出を活性化しながら、プレート２５を素早く連続してマイクロソレノイドバルブ２２の吐出ノズル１４の下に配置すれば十分である。吐出された直後に、溶媒を、一般的な方法で共有結合にて基板１８に固定されたプローブからなるスポット２０を形成するように除去する。
さらに、チップの読み取りを簡単にするのに適したパターンを構築するために、基板１８の上、同一のスポット２０の上またはより有利には複数のスポットの上に渡って数回、同一の試薬の微小液滴を吐出することができ、それによって余剰効果による診断の信頼性を向上させうる。
【００４０】
特に、吐出ノズル１４と基板１８との間の間隔が約０．１ｍｍ〜１０ｍｍ、好ましくは約１ｍｍであり、該間隔は、吐出される試薬の微小液滴の直径よりもかなり大きい場合に、マイクロプロジェクション装置Ｄの間または装置と基板１８の間のいずれかでの汚染の可能性はない。
この基本構成から始まって、試薬は基板と接触することになる機械なしに吐出されるため、高速で操作できる機械３０を設計することが可能である。操作速度は、直流（ＤＣ）モーターＭを使って１秒あたり約１センチメートル（ｃｍ／ｓ）の範囲にあるであろうプレート２５を、磁力リニアモーター１秒あたり約１０メーター（ｍ／ｓ）に置き換えうる速度により本質的に限定される。
【００４１】
有利には、一群のマイクロプロジェクション装置Ｄを、複数の列からなるマトリクスの形態で配置され、各々の列は、モジュール方式の移動可能な様式に設計される。
２５６の一群のマイクロプロジェクション装置Ｄを有する機械３０を、図４に図示する。機械３０は、マイクロソレノイドバルブ２２に接続された１６のタンク１をそれぞれ支持する、それに各々に沿って装備される１６のモジュール３５とともに、１６の相互に平行な二重レール（mutually parallel double rail）３４を支持するクロスバーを含むフレーム３２を表している。活性化基板１８は、大きい振幅で大きい移動速度の交差したＸＹの動きをもたらすモーター駆動装置２８によって可動なプレート２５上に配置される。
【００４２】
モーター駆動装置２８は、縦のガイドブロック（guide block）３７上にスライドするように装備されている横のガイドブロック３９（Ｙ軸）によって、フレーム３２の基板３８上に固定された縦のガイドブロック（Ｘ軸）３７ならびに横のガイドブロック３９上にスライド可能に装備され、プレート２５を支持する支持ブロック４０にて構成されている。
図５〜７に示す実施の形態において、各々のモジュール３５は、以下（図５および６）のように構成される構造４２を含む：
・１６のタンク１を支持し、そして加圧下で、試薬３をタンク１に加圧下に貯蔵するのに必要な流体接続を供給するための棒状形態の第一支持ブロック４４、および
・１６のマイクロソレノイドバルブ２２を支持する水平なクロスバー４６ｂにて相互に連結されている２つの平行な直立部分４６ａを有するＨ−型の第二支持ブロック４６。
【００４３】
２つの直立部分４６ａの上端は、その２つの末端近傍に、留め具４８によって第一支持ブロック４４に連結されており、接続されているバルブ２２の吐出ノズル１４の高さを越える高さでタンク１を位置させることができる。
１６のバルブ２２は、１６の接続されたタンク１に実質的に合うように、クロスバー４６ｂに沿って配置されており、タンクは、有利には、モジュール３５の長さを減少させるように、互い違いの配置に配列されており（図５）、その結果、プレート２５のＹ移動を制限し、そして機械３０の操作速度を増加させていることが理解される。
【００４４】
この目的のため、第一支持ブロック４４は、互い違いの配置に配列されている１６の貫通開口部５０にて貫通されている。開口部５０の各々は、部分５０ｂにて広げられた部分５０ａを示している。タンク１の各々は、例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）でできた排出管１２を介して、接続されたマイクロソレノイドバルブ２２に接続されており、それらは、一方の枝が対応するタンク１に浸され、他方の枝が接続されたバルブ２２への連結のための開口部５０を通して通過する逆Ｕ−型の形態である。
排出管１２の各々は、各々の開口５０の部位５０ａに装備されているスクリュー型などの急速カップリング５２を介して第一支持ブロック４４に固定されていてもよい。有利には、排出管１２の各々は、スクリューカップリング５２を介してリークタイト法で一緒に接続されている２つのセグメントに分割され、よって、タンク１が連結されたバルブ２２と素早く接続および分断されるようにし、その結果作製と維持操作を容易にする。
【００４５】
図６および７を引用して、棒状形態の第一支持ブロック４４も、縦のスルーチャンネルまたはメインチャンネル５５にて貫通されている。このチャンネル５５の一端は、第一支持ブロック４４にて同様に貫通されている横のチャンネル５７を介してタンク１の全てに貯蔵されている試薬３に対して同時に陽圧を得るために、自己シーリング型カップリングにて加圧ガス源５に接続されており、それらの全てはメインチャンネル５５に開放され、それらの各々は各々のタンク１に開放される。メインチャンネル５５の他端は、パージバルブ５８に接続されている。
【００４６】
様々な圧力で、モジュール３５をガス源に接続させることができる。
排出バルブ１４は、基板１８に面し、そしてそこからミリメーターオーダーの距離に位置されるような方法で、並べられ、そして装備されている。吐出ノズル１４の各々は、限定されたマクロソレノイドバルブ２２の排出口に接続されている適当な形状のＰＴＦＥのチューブにて単に構築されていてもよい。
【００４７】
有利には、図７に示すように、吐出ノズル１４の各々は、サファイア、ルビー、シリコン・・・の基板のような部分６０、またはセラミックまたはステンレス鋼で作製された部分で構築されており、それは、約１μｍ〜１００μｍ、一般的には７５μｍの直径を有する排出のオレフィスにて貫通されており、接続管６２にてマイクロソレノイドバルブ２２の排出口に接続されている。
加えて、特に有利には、吐出されることとなる試薬の容量に対してできるだけ少ないヘッドロス（head loss）で、モジュール３５の入口圧を伝導するように、接続管６２の長さを短くすることで、限定されたマイクロソレノイドバルブ２２のできるだけ近くに吐出ノズル１４を配置することである。そのような配置は、より低い入口圧を使用すること、バルブ２２内でより多くの分配を得ること、および吐出される量を減少させることを可能にする。さらに、（下記のような）プライミング段階を減少させることができる。
【００４８】
モジュール３５の通常の操作において、マイクロソレノイドバルブ２２の全てがそうであるように、パージバルブ５８は閉鎖されている。チップを作製する前にモジュール３５をプライムするために、バルブ２２の各々は、タンク１内のガス圧が、排出管１２および接続から空気を追い出すために、所定時間開いており、それによって、それが対応する吐出ノズル１４をフラッシュするまで、試薬を進ませる。
実際、複数の一次のプロジェクション操作は、プレート２５の位置を得るボウルを使って実行される。試薬は一定条件下にあるため、マイクロソレノイドバルブ２２が試薬の微小液滴が吐出されるのを引き起こすように操作すれば十分である。
【００４９】
チップの作製の間、および同一のマイクロプロジェクション装置Ｄからの２つの連続した発射の間での待機時間が非常に長い場合、プレート２５のちり（trash）領域上で非常に少ないマイクロプロジェクション操作を行うことにより、ミニ−プライミング段階を行う必要がある。このミニ−プライミング操作は、吐出ノズル１４からの試薬のあらゆる蒸発を補うことをもたらす。
機械３０のモジュラーデザインは、レール３４に沿ってそれをスライドさせることで、一方のモジュール３５を他方から独立して移動させることを可能にし、その結果タンク１を変化させ、そしてマイクロソレノイドバルブ２２を維持することを可能にする。
【００５０】
一般に、チップは、予め機能化され、そしておそらく様々な形態の、同種または異種の基板である、ガラス、シリコン、金属、金属酸化物またはポリマーの基板上に作製される。
その費用価格が低いので、広い範囲で使用されている基板は、例えば７６ｍｍ×２６ｍｍの寸法を有する顕微鏡スライドである。
さらに、チップの領域を減少させることは、プレート上で作製されるチップの数を増加させ、それによって機械の生産性を増大させることが可能である。しかし、チップ領域を減少させることができる程度は、マイクロプロジェクションシステムの分割（resolution）、すなわちスポットの直径、また例えば吐出される微小容量、吐出の方向安定性、微小液滴が拡がる程度、基板の表面状態・・・のような複数の因子に依存するスポット間の間隔によって限定される。
【００５１】
スポットの直径が１μｍ〜５００μｍのオーダー、より好ましくは２００μｍ〜３００μｍの範囲にあり、スポット間隔が一般にスポット直径の1．２５〜４倍の範囲にあるように機械を設計することが一般に可能である。
図８に示すように、試薬３の容量は、利用可能な容量３ａ、排出管１２より下に配置されているデッド容量３ｂおよび吐出ノズル１４を形成する基板６０への全てにおいてあるプライミング容量３ｃにて構成されている。試薬の吐出されえる容量は、利用可能な容量３ａおよびプライミング容量３ｃにて構成されており、デッド量３ｂを吐出することもでき、ガス圧に供される試薬の領域が、利用可能な量３ａが使用され尽くした後に変化する場合に起こる流速での変動を補うことができることを提供することが理解される。
【００５２】
図９は、機械３０の制御装置３０ａの実施形態を示すブロック図の形態であり、制御装置は、
・加速と減速に要する時間を考慮に入れた２つのパワーカードを介して装置２８の２つのモーターＭを好適に制御することによるプレート２５の移動、
・発射指令（firing instruction）を用いたプレート２５のＸおよびＹ移動の同調、および
・モジュール３５を選択し、そして選択されたモジュールのバルブ２２を選択すること
を支配する一般的な電子制御ユニットＣＥＧと接続するＰＣからなる。
特に、制御装置３０ａは、ランクｉ（ｉ＝１〜１６）の１６のモジュール３５を制御し、各々はランクｊ（ｊ＝１〜１６）の１６のマイクロプロジェクション装置と接続しており、計２５６のマイクロプロジェクション装置（ｉ、ｊ）を与える。
【００５３】
これら２５６のマイクロプロジェクション装置を制御するために、様々な電子装置が当業者に知られている。例として、制御装置は、以下の原理
・計２５６の制御トランジスタを与えるマイクロプロジェクション手段あたり１つの動力回路２２ａ（図２）、
・２５６のパワートランジスタの全てに共通であるトリガー制御、
・各々のトランジスタについての特異的な選択シグナル、および
・
・ランクｉのモジュール、および
・モジュールのセットで同一のランクｊ、すなわち（１，ｊ）〜（１６，ｊ）を有する１６のマイクロプロジェクション手段
を選択することを可能にする２ステージデマルチプレクシングに基づいて記載されており、その結果これら２つの選択の間での交差点におけるトランジスタ（ｉ、ｊ）の選択のためのシグナルが駆動できるようにする。
【００５４】
特に、モジュール３５の各々は、２つの部分、対数部分Ｄiおよび動力部分Ｐiに分割されている電気制御カードに接続されている。
対数部分Ｐiは、そのインプットがカードＣＥＧの４つの制御アウトプットS2、S3、S4およびS5に各々接続されている４−インプットデマルチプレクサーにて構築されており、デマルチプレクサーは、１６の２−インプットＡＮＤゲート（ｉｊ）のインプットの対応するものにそれぞれ接続されている１６のアウトプットを有しており（図示せず）、ＡＮＤゲートのアウトプットは、パワー部分Ｐiの１６のパワートランジスターのベースに接続されており、その結果、１６のＡＮＤゲートは、パワートランジスターを選択するための回路を構築している。
【００５５】
パワー部分Ｐiは、各々が１つのマイクロソレノイドバルブ２２を制御するためであり、そして各々がベースが、対応するＡＮＤゲート（ｉｊ）のアウトプットに接続されている１６の制御回路２２ａに細かく分けられている。
各々のＡＮＤゲート（ｉｊ）のその他のアウトプットは、カードＣＥＧの通常の制御アウトプットに接続されており、それにより通常の発射トリガー制御（特に、マイクロプロジェクション手段が開いたままである時間の長さを調節するのに有利である）を構築する。
【００５６】
さらに、各々のデマルチプレクサーＤiは、無力（disable）なインプットＥiを表し、デマルチプレクサーＤ1〜Ｄ16の１６のインプットＥiは、４つのインプットと１６のアウトプットとを有するデマルチプレクサーＤＸの１６のアウトプットに各々接続されている。デマルチプレクサーＤＸの４つのインプットは、カードＣＥＧの４つの制御アウトプットＳ6、Ｓ7、Ｓ8およびＳ9に各々接続されている。
つまり、機械３０の２５６のマイクロプロジェクション装置の１つを制御するために、ＰＣの制御下のカードＣＥＧは、
・４つの制御アウトプットＳ6〜Ｓ9およびデマルチプレクサーＤＸを介して機械３０の１６のモジュール３５の１つを選択し、それにより１６のデマルチプレクサーＤｉの１つを可能にし、
・４つのアウトプットＳ2〜Ｓ5を介して作用して、活性化されることとなるマイクロプロジェクション装置のランクjに対応するモジュール３５iの１６のパワートランジスターの１つを選択するようにさせ、
・その結果、ＡＮＤゲート（ｉｊ）の第一インプットを活性化させ、そして
・その制御アウトプットＳｉ上で、発射制御シグナルを、すべてのＡＮＤゲートの第二のインプットに送り、それにより、そのＡＮＤゲート（ｉｊ）が、活性化されたそのインプットの両方を有するＡＮＤゲートである、選択されたマイクロプロジェクション装置を活性化する効果を有する。
【００５７】
ソフトウェアーおよび素子は、プレート２５の移動と、試薬の液滴のプロジェクションとの間の同調を達成するのに用いる。有利には、プロジェクションは、その間にプレート２５を保持する移動装置２８のモーターＭが加速／減速に付される段階を短縮させるように、オンザフライ（on-the-fly）発射により行われる。そのようなオンザフライ発射は、モジュール３５に平行なＹ軸に沿っているのが特に有利である。そして、任意には、吐出されている微小液滴を、有利には熱いプレートを使って素早く乾燥させるのが有利であり、その結果プレート２５の素早い移動による試薬の微小液滴が拡がるあらゆる危険性を低減させる。
【００５８】
作製速度を増加させるために、機械は、同時に、基板を加工してもよく、例えば、それを３２のチップを作製するように、顕微鏡スライドの４×８のマトリクスを加工してもよい。
一般的な、つまりヘリウムのような不活性ガスの約０．２５バールの圧力下におけるタンク１を使い、そして約１ｍｓの間、開いているマイクロソレノイドバルブ２２を使った操作で、吐出された試薬の液滴は約１０ｎｌの容量を有している。
【００５９】
そして、機械は、約１００μｍ〜４００μｍの直径と約２００μｍ〜１０００μｍのスポットの中心間の間隔を有するスポットのマトリクスを各々有するチップを作製することができる。
例として、２つの吐出ノズル１４の間で約１０ｍｍの間隔を有し、そして２つの近接したスポットの間での中心間の間隔が、得られたチップの列の上で、約０．５ｍｍを有する場合、プレート２５は、プローブを吐出する前に、約１０．５ｍｍの距離を移動する必要がある。つまり、プレート２５の変換速度が約１５ｃｍ／ｓであると仮定すれば、変換でのこの移動に要する時間は、約７０ｍｓ、言い換えれば、ソレノイドバルブ２２が開いている時間、約１ｍｓよりもより長い期間である。
【００６０】
それゆえ、チップを作製することができる包括的な速度で、プレート２５の変換速度の影響を調べることは有利である。
例として、磁力リニアモーターを用いる場合、約１０ｍ／ｓの変換速度に到達することができる。マイクロソレノイドバルブ２２が開いている時間は、プレートの変換速度が１ｍ／ｓに達しない限りは、機械の操作に影響がないことが判明した。２つのスポット間の距離、つまり１０．５ｍｍを移動するのに約１０ｍｓが必要とされ、期間は、マイクロソレノイドバルブ２が開いている１ｍｓの期間よりもおよそ１オーダー大きい。つまり、チップの作製速度は、プレート２５の移動速度を約１ｍ／ｓまで増加することで向上させることができる。
【００６１】
３２のチップを作製する実施例を、図１０および１１を引用して、以下に記載する。
単純化する目的で、チップはスポットあたり１つのタイプのプローブを有する２５６のスポットで構成されており、機械３０は、１６のモジュールで適合されていると仮定する。ステップバイステップモードにおける、各々の発射または吐出の操作の間での停止とともに、プレート２５を移動すること、およびＹ軸に沿ってオンザフライが行われる発射との一定の速度での移動についても考察を払う。
【００６２】
また、操作条件は、１６×１６スポットチップの作製について、以下のようである
・１つのマイクロソレノイドバルブ２２を、各々のスポットに割り当て、プローブあたりたった１つのスポットが存在する、
・３２のチップを、プレート２５上にＹ軸に沿った８つのバッチ、およびＸ軸に沿った４つの列で配置し、
・各々のモジュール３５の吐出ノズル１４は、１６のチップスポットについて整列し、そしてＹ軸に沿った方向に向けられており、
・いずれの１つのモジュール３５の１６のマイクロソレノイドバルブ２２は、各々のチップの列ｉの１６のスポット上にのみ吐出される必要がある。
【００６３】
操作は、以下のようにして行う：
ａ／工程ａ：８つの第一チップの第一の列における１６のスポットの第一の列を、第一のモジュール３５を構築するマイクロソレノイドバルブ２２の列に整列させるように、プレート２５をＸ軸に沿って配置するが、吐出ノズル１４iが８つのチップの各々におけるスポットi上に吐出して、プレート２５がＹ軸に沿って移動し、そして該吐出ノズルに最も近いスポットを算出する方法は、プレート２５が、スポットの８つの列の末端に達するまで、および全てのスポット上に吐出した後に、反転すらすることなく、Ｙ軸に沿って連続して進行しなければならないという言説に結局なるということが理解される。
【００６４】
ｂ／工程ｂ：プレート２５を、Ｘ軸に沿って配置し、そしてモジュール３５jの１６のマイクロソレノイドバルブ２２の列が、移動工程ａに類似する方法でＹ軸に沿って起こりながら、続く８つの第一のチップの後続の列ｊ上に整列される。
ｃ／工程ｃ：工程ｂを、８つのチップの第一の列の１６番目の列まで繰り返す。
ｄ／工程ｄ：８つのチップの第二の列の上に移動し、そして工程ａ、ｂおよびｃを繰り返す。
ｅ／工程ｅ：８つのチップの４番目の列まで工程ｄを繰り返す。
【００６５】
上記作製プロセスは、停止間で最大速度約１５ｃｍ／ｓを有するステップバイステップモードにおいて３２のチップを作製した場合、約２８分の作製期間がかかり、平均速度はプレート２５を移動させるモーターＭを加速および減速するのに要する時間によって制限され、作製時間は、約１５ｃｍ／ｓの一定した移動速度で、Ｙ軸に沿ってオンザフライ発射モードで同一のプレートを使って、たった約４分間である。
よって、上記実施例における作製速度は、ステッパーモードにおいて、１時間あたり約５０のチップであるが、しかしオンザフライモードにおいて、１時間あたり５００のチップに達することが可能である。
しかし、１ｍ／ｓの速度でＹ軸に沿ってオンザフライ発射モードを使って、より速いモーターＭを使用した場合、機械の生産性は、４５００チップ／時間に達する。
【００６６】
さらに、機械の生産性におけるチップの領域を減少させる影響を評価することも可能である。これまでは、基板あたりたった１つのチップが存在するのに対して４００のスポットを有するチップについては、スポットが２５０μｍの直径を有し、スポットの間隔が３００μｍである場合、動作面積は６ｍｍ×６ｍｍとなると仮定されていた。そのため、チップの総面積は、実施に必要とされる安定したゆとりを与えて、８ｍｍ×８ｍｍである。それゆえ、基板あたり１８のチップ（６×３）を作製し、それによって作製速度を１時間あたり８１，０００チップに上げ、その結果本発明によって実施される吐出の方法および機械が大量生産に十分に適合されることを証明することが可能である。
【００６７】
一般に、試薬３が吐出ノズル１４にて吐出される速度を、マイクロソレノイドバルブ２２が開いている時間、および／またはタンク１内のガス圧を制御することで制御することができる。
本発明は、下記のように、マイクロプロジェクション装置を素早く除染する方法、および校正ならびに品質制御のための方法も行う。
２５６のマイクロプロジェクション装置を備えた前記機械３０を出発点として、１０２４のプローブを有するチップを大量生産することが可能である。この目的のため、機械を、一列に装備されている２５６のマイクロプロジェクション装置を有する４つの装置と適合させることで十分である。
【００６８】
さらに、ガス圧および／またはマイクロソレノイドバルブが開いている期間に作用することで、マイクロプロジェクション装置の流速を変化させることは大変容易である。このことは、バルブの製造におけるばらつきを補正するように、各々のマイクロプロジェクション装置にて吐出される試薬の微小容量を校正することができ、このことは、有利には、オンザフライ発射の間に実施することができる。速度の増加は、各々のマイクロプロジェクション装置を、独立してまたは共同して、大変効果的に洗浄することができる。不慮の詰まりの発生において、マイクロソレノイドバルブの供給圧を増加させることによって、マイクロプロジェクション装置の詰まりを除くことも可能である。
【００６９】
これを行うために、チップを一旦作製すれば、除染プロセスは、プローブを含むタンクと、洗浄溶媒、例えば水を含むタンクとを置き換え、そしてマイクロプロジェクション装置の全てを掃除するために、高い供給速度で、マイクロソレノイドバルブを作動させることからなる。
一般に、厳密な作製を必要とする場合、上記のように機械３０内の幾つかの欠陥を考慮に入れる必要がある。これらの欠陥は、様々なマイクロソレノイドバルブ２２間での発射のばらつき、吐出ノズル１４の整列における不正確さ、モジュール３５の作製における不正確さ、および交差した動きを供給するモーター駆動装置２８の位置におけるばらつきに特に関連する。
【００７０】
つまり、上記欠陥の全てをあわせると、基板１８上に試薬の１６の微小液滴をマイクロプロジェクトすることで構成されるアレイについて図１２で図示したように、不規則なアレイで作製されたチップとなる。
これらの欠陥を緩和するために、操作の良好な再現性を得るため、および溶媒が排除された後に形成されるような微小液滴またはスポットの規則正しいアレイを得るために、本方法は、チップの大量生産を開始する前に機械３０を校正することにある。
【００７１】
例として、この方法は、
・マイクロソレノイドバルブ２２を透明な中間基板上に発射させ、
・スポットの位置を、例えば基板より下に配置されたカメラによって同定し、そしてスポットの同定された位置と望ましい位置との間の有意差を同定し、そして
・マイクロプロジェクションする瞬間に、図１３に示したような規則正しいアレイを得るようにプレートのＸＹオフセットがその他の微小液滴についての衝突位置を補正するように、メモリーに蓄えられている修正テーブルを基にして基板を支持するプレート２５の軌道を修正する
ことにある。
【００７２】
このタイプの修正は、一般にマイクロプロジェクション操作が連続して行われる、つまりマイクロソレノイドバルブ２２が次々に発射されるので可能である。しかし、そのような修正は、ＸＹ移動モードにおけるオンザフライタイプの操作、すなわち複数のマイクロソレノイドバルブを同時に発射する場合と両立させることが困難である。
【００７３】
にもかかわらず、そのような状況下で、有利な妥協点は、
・Ｘ軸に沿った各々の発射の不正確さを修正するように、モジュール３５の設計を修飾し、このことはバルブ２２を機械的な調節により1つずつ整列させること、例えば各々の吐出ノズルについて回転に必要な自由度を提供することにより達成可能である。
・Ｙ軸に沿って校正を進め、
・Ｙ軸に沿ってオンザフライ発射を使って機械を操作し、そして
・Ｘ軸に沿ってステップバイステップモードでプレート２５を動かす
にあることで達することができる。
【００７４】
加えて、マイクロソレノイドバルブによって吐出される試薬の微小容量は、それが開いている時間、および／または試薬上に働くガス圧に特に依存している。しかし、この微小容量は、バルブの機械的な構造にも依存している。２５６のマイクロプロジェクション装置を有する機械にとって、そのことは、吐出される微小容量でのばらつきとなる可能性があり、そして形成される不規則なスポットのアレイとなる可能性がある。
【００７５】
この問題を解決するため、本発明による第一の溶液は、プロジェクション容量にてマイクロソレノイドバルブを分類すること、そして同様な容量を全て有するバルブを備えたモジュールを作製し、そして各々のモジュールでのガス圧を調節することでモジュール間の有意差を補正することにある。
にもかかわらず、より有利な溶液は、それらが吐出する微小容量のばらつきを補正するような方法で、マイクロソレノイドバルブが開いている時間を変えることにある。
【００７６】
吐出された微小容量を校正するためのそのような方法を、大量生産を開始する前に、例えばタンク内またはラインで同一のマイクロソレノイドバルブにて吐出される１０００の微小液滴を秤量し、そして移動プレート上に配置されたクオーツ微量はかりを使ってマイクロソレノイドバルブにて吐出される量を秤量することで行うことができる。そのような校正方法は、吐出された微小容量を、チップを作製する間に規則的な基準で確かめることを可能にし、そして起こりうる問題、例えば偶発的な閉塞、バルブの劣化による容量の変化、突然のマイクロリークなどを検出することを可能にするので有利である。
【００７７】
最後に、本発明では、図１４および１５で図示するように、微小液滴が、ディスプレイシステム７０を使って本当に吐出されたかどうかを確かめることもできる。
ディスプレイシステム７０は、プレート２５より下に配置され、例えばカメラ７２、４５°ミラー７４、拡大ズームレンズ７６、および試薬の微小液滴のプロジェクション、または透明度および下方からの観察による基板１８上でのスポットの形成を観察するための照明装置（図示せず）からなる。
図１４および１５で示した実施形態において、プレート２５の支持体４０は、プレート２５を動かすのに使用したのと同一のタイプの交差したＸおよびＹ移動を付与するための、自身のモーター駆動装置７８上にそれ自体が装備されているディスプレイシステム７０をその中で受取るように中空である。
【００７８】
プレート２５の移動速度が大きくなる場合、大量に分配するように、プレート２５の動きとディスプレイシステム７０の動きとを分離することが有利であり、図１６および１７で示したようなその他の実施の形態において、ディスプレイシステム７０は、支持体４０に固定されていないが、それ自体のモーター駆動装置７８と独立して装備されている。特に、それは機械３０のフレーム３２の基部３８に直接据える。
【００７９】
さらに、プレート２５を動かすためのモーター駆動装置２８を、図４で示したものとは異なるように設計する。より正確には、プレート２５の２つの反対の側を、お互いに平行に伸びる２つの別々の第一のウォームスクリューによって通過し、そして駆動される２つの第一ガイドブロック８０に固定する。各々のウォームスクリュー８２の反対の端は、対応するストリップ８４により、順に支持される。各々のストリップ８４の２つの端を、お互いに平行に伸びる第二ウォームスクリュー８８によって通過し、そして駆動される２つの各々の第二のガイドブロック８６に固定され、および第一のウォームスクリュー８２に対して垂直にも固定される。各々の第二のウォームスクリュー８８の反対の端を、機械３０の構造３２の基部３８に順番に固定されている、対応するストリップ９０にて順に支持されている。
【００８０】
言い換えれば、プレート２５は、Ｘ軸に沿って移動可能な２つのストリップ８４にて形成されている構築物上に装備され、そして前記フレームは、２つのストリップ９０にて形成されているフレーム上でＹ軸に沿って動くようにそれ自体装備されており、フレームは安定であり、機械３０の構築物に固定されている。
シリコン基板を使用する場合、適当な照明と組み合わせて近赤外線で作動するカメラを使って透明度にて観察できるようにするために、基板が両表面上で磨かれるようにすることが有利である。
【００８１】
本発明の機械は、バイオチップを大量生産するような複数のマイクロプロジェクション装置からなり、そのような大量生産を単一の通過で行うことができる。使用されるプローブの全てのタイプを、異なるタンク内で別々に貯蔵することができ、それにより、作製されるバイオチップの数が、機械上で利用可能なマイクロプロジェクション装置の数よりも多い場合、タンクを交換することに由来する汚染の問題を避けることができる。
【００８２】
本発明を、特に以下の
・化学的に安定したバイオチップを得られるような機能化された基板の使用、そのような基板は、フランス特許出願FR-00/00697号で記載されているような自己集合単層（ＳＡＭｓ）を用いる固体支持体をシラン化する方法によって得ることが可能であり、そして
・第一に、核酸ハイブリダイゼーションを検出するための技術、特に放射性または蛍光性の基、特にフランス特許出願FR-99/11799号で記載されている挿入基にてマークする方法と、第二の蛍光分子にてマークする段階を特に排除すようにするフランス特許出願FR-97/07530号で記載されているハイブリダイゼーションを検出する方法を両立し得るチップ構造
を共に行うことが有利である。
【００８３】
製造方法は、バイオチップを大量生産するのに適合されたマイクロプロジェクションシステムに依存しており、それは、２つの
・技術的：システムの小型化および単純化は、１０００の一群のマイクロプロジェクション装置を一緒に配置することを想定可能にするものあり、各々は、完全に独立した方法で、供給され、制御され、そして校正される、および
経済的：完全なマイクロプロジェクション装置の単価（タンク、アクチュエーター、チューブ、接続、および制御電子）は、約１５０ユーロであり、そのことは、方法を実行するための装置が、コストの点から利用しやすいことを意味している、
な利点を提供する。
【００８４】
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】基板上に微小容量の試薬をマイクロプロジェクトするための装置の簡略した概要である。
【図２】図１に示したマイクロプロジェクション装置用の制御回路の一例である。
【図３】一群のマイクロプロジェクション装置の概念の概略図解である。
【図４】２５６の一群のマイクロプロジェクション装置で固定されたモジュラー機械の総括的な例を得るための透視図である。
【図５】図４で示した機械のモジュールの透視図である。
【図６】図５の矢印ＶＩに沿って見る概要である。
【図７】図６の線ＶＩＩ−ＶＩＩ上での切片の概略図である。
【図８】図７の概略に類似した概略である。
【図９】図４〜７に示した機械を制御する原理を示す概略図である。
【図１０】図４〜７に示した型の機械で作製された３２のチップを示す図である。
【図１１】図４〜７に示した型の機械で作製された３２のチップを示す図である。
【図１２】スポットが、基板上でのそれらの位置を自動的に補正するプロセスの前後で形成される基板を示す。
【図１３】スポットが、基板上でのそれらの位置を自動的に補正するプロセスの前後で形成される基板を示す。
【図１４】スポットの形成をモニターするディスプレイシステムで固定された機械の透視図である。
【図１５】図４の側方図である。
【図１６】図１４および１５のそれらに類似した断片的な概略図であり、ディスプレイシステム用の様々な装備を示す。
【図１７】図１４および１５のそれらに類似した断片的な概略図であり、ディスプレイシステム用の様々な装備を示す。
【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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