(57)【要約】可溶性ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体受容体を投与することにより、ＩＬ−１９またはｍｄａ７を治療、低下調節するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１９を下方調節する方法であって、ＩＬ−２０ＲＡの細胞外ドメインおよびＩＬ−２０ＲＢの細胞外ドメインを含むポリペプチドを個体に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＩＬ−２０ＲＡが、配列番号：３、配列番号：３９、または配列番号：４０を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−２０ＲＢが、配列番号：６、配列番号：４１、または配列番号：４２を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
炎症は通常、有害な作用物質および傷ついた組織を破壊したり、希釈したり、または囲んだりする、外傷または微生物の侵入に対する局部的な防御反応である。それは、痛み、発熱、発赤、腫れ、および機能の喪失による急性型で特徴付けられる。微細には炎症は、増加した透過性および血流、血漿タンパク質を含む体液の滲出、および炎症域への白血球の移動を伴う、細動脈、毛細血管および細静脈の拡張を含む複雑な一連の出来事を含む。
【０００２】
炎症により特徴付けられる疾患は、人間の罹患および死亡の重大原因である。一般に炎症は、異物ことに微生物の侵入に対する宿主の防御反応として起こる。機械的外傷、毒素、および新生物に対する反応もまた、炎症反応をもたらすだろう。白血球の蓄積および引き続く活性化は、大抵の炎症型の病因における中心的な出来事である。炎症の欠如は、宿主を傷つける。異物として宿主組織に異常と認識され引き起こされた過剰な炎症、または長引いた炎症過程は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、白内障、再灌流障害、および癌から、伝染性髄膜炎、リュウーマチ熱のような感染後症候群、ならびに全身性紅斑性狼瘡およびリューマチ性関節炎のようなリューマチ疾患にわたる幅広い炎症性疾患を導くだろう。これらの種々の疾患の過程における炎症反応の集中性のため、炎症の調節は人間の疾患の予防制御や治療における主要な要素となる。
【０００３】
炎症過程における重要なサイトカインは、ＩＬ−１９（米国特許Ｎｏ．５，９８５，６１４）およびｍｄａ７（Ｊｉａｎｇ， Ｈ．ら、 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０： ２４７７−２４８６ （１９９５））である。かくて、１つ以上の、上述の炎症関連タンパク質に関わる炎症を阻害する、作用物質を製造する必要がある。
【０００４】
発明の記述
したがって、本発明は、炎症の治療を必要とする哺乳動物に、炎症を治療するための方法を提供することによりこの必要を満たすものであり、ＩＬ−１９またはｍｄａ７に結合する可溶性のＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ受容体を提供することを特徴とする。
ここに引用された全ての参照の教えは、参照により全てここに組み入れられている。
【０００５】
定義
発明を詳細に述べる前に、以下の術語を定義することが、本発明を理解するのを助けるであろう。
「親和性標識」（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）と言う術語を、第２のポリペプチドを精製もしくは検出したりまたは基質に第２のポリペプチドの付加する部位を提供したりするために、第２のポリペプチドに付加できるポリペプチド分節を示すためにここで用いる。原則として、抗体または他の特定結合物質が利用できるいかなるペプチドまたはタンパク質も、親和性標識として使用できる。
【０００６】
親和性標識は、ポリヒスチジン索、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ ら，ＥＭＢＯ Ｊ． ４：１０７５ （１９８５）； Ｎｉｌｓｓｏｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３ （１９９１））、グルタチオンＳ転移酵素（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７： ３１（１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８２： ７９５２−４ （１９８５））、サブスタンスＰ、ＦｌａｇＴＭペプチド  （Ｈｏｐｐら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０ （１９８８））、ストレプトアビジン結合ペプチド、あるいは他の抗原性エピトープまたは結合分域を含む。一般には、Ｆｏｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２： ９５−１０７ （１９９１）を見よ。親和性標識をコード化するＤＮＡは、商業的供給者から入手できる（たとえば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）。
【０００７】
術語「対立遺伝子変異体」を、同一の染色体遺伝子座を占める遺伝子の２個以上の選択の如何なるものも示すためにここで用いる。対立遺伝子変異は天然には突然変異を通じて生じ、また母集団内に表現型の多形を生じるだろう。遺伝子の突然変異は、活動しないことができる（コード化されたポリペプチドに変化を生じない）、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するだろう。対立遺伝子変異体と言う術語を、また遺伝子の対立変異株によりコード化されたタンパク質を示すためにもここで用いる。
【０００８】
術語「アミノ端末」および「カルボキシル端末」を、ポリペプチド内の位置を示すためにここで用いる。文脈が許す所では、これらの術語を、近接性または相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して使う。たとえば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル端末を配置されたある配列は、参照配列のカルボキシル端末の近くに位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル端末に位置しない。
【０００９】
「血管新生」は、単独あるいは１個以上の付加化合物と共同で働いて、現存の血管から新しい血管の形成を誘発するための化合物の能力を示す。血管新生活性は、内皮細胞活性化、内皮細胞によるプロテアーゼ分泌の刺激、内皮細胞移動、毛細管萌芽の形成、および内皮細胞増殖として測定できる。
【００１０】
術語「相補体／抗相補体対」は、適切な条件下で非共有結合的に会合した安定な対を形成する同一でない部分を示す。たとえば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補対の原型の１員である。他の模範的な相補体／抗相補体対は、受容体／リガンドの対、抗体／抗原（または部分抗原あるいはエピトープ）の対、センス／アンチセンスポリヌクレオチドの対、その他である。相補体／抗相補体対の引き続く解離が望ましい場合には、相補体／抗相補体対は、好ましくは１０９Ｍ−１より小さい結合親和性を有する。
【００１１】
術語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列および参照配列に比較して逆配向を有するポリヌクレオチド分子である。たとえば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は、 ５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に対して相補型である。
術語「コンティグ」（隣接）（Ｃｏｎｔｉｇ）は、他のポリヌクレオチドに対して同一のまたは相補的配列の隣接する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）伸長を有するポリヌクレオチドを示す。隣接する配列は、ポリヌクレオチドの全体または一部の伸長に沿って、ポリヌクレオチド配列の与えられた伸長に「オーバーラップする」といわれる。たとえば、ポリヌクレオチド配列５’−ＡＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴ−３’に対する代表的な隣接は、５’−ＴＡＧＣＴＴｇａｇｔｃｔ−３’および３’ｇｔｃｇａｃＴＡＣＣＧＡ−５’である。
【００１２】
術語「縮重ヌクレオチド配列」は、（ポリペプチドをコード化する参照ポリヌクレオチド分子に比較して）１個以上の縮重したコードンを含むヌクレオチドの配列を示す。縮重したコードンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは、それぞれＡｓｐをコード化する）。
【００１３】
術語「発現ベクター」は、その転写を与える追加のセグメントに作用可能に結合した注目のポリペプチドをコードするセグメントを含む、線状または環状の、ＤＮＡ分子を示すために使われる。そのような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、また１又は複数の複製起点、１又は複数の選択カーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、などをも含むであろう。発現ベクターは、一般的にプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されるか、あるいは両方の要素を含むだろう。
【００１４】
術語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用される場合には、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から取り出され、かくて他の、または望ましくないコード配列を含まず、そして遺伝子操作タンパク質製造系での使用に適した型であることを示す。そのような単離された分子は、天然の環境から分離されており、そうしてｃＤＮＡおよびゲノムクローンを含むものである。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関連する他の遺伝子を含まないが、プロモーターおよびターミネーターのような天然に存在する５’および３’の非翻訳領域を含むだろう。関連領域の同定は、当業者には明らかである（たとえば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４−７８ （１９８５）を参照のこと）。
【００１５】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境以外の条件、たとえば血および動物組織から離れて見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形では、単離されたポリペプチドは、本質的に他のポリペプチド、ことに動物起源の他のポリペプチドを含まない。ポリペプチドを高度に純粋な形で、すなわち９５％より高い純度で、より好ましくは９９％より高い純度で提供することが好ましい。この文脈で使われる時に、術語「単離された」は、二量体または他の糖鎖形成されたもしくは誘導された形のような、他の物理的な形状での同一ポリペプチドの存在を除外しない。
【００１６】
術語「作用可能に連結した」は、ＤＮＡセグメントに関する場合には、セグメントが意図した目的のために協力して機能する、たとえば転写がプロモーターで始まり、そうしてターミネーターまでのコード領域を通して進むように、セグメントが配置されていることを意味する。
術語「オルソログ」（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である一つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。オルソログ間の配列の違いは、種分化の結果である。
【００１７】
「パラログ」（ｐａｒａｌｏｇ）は、生物により作られた別個のしかし構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子複製を通じて生ずると信じられている。たとえば、ａ−グロビン、ｂ−グロビン、およびミオグロビンは、お互いにパラログである。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」は、５’から３’端末まで読まれたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または２本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、そうして天然源から単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、または天然および合成分子の組合せから調製されるだろう。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対（「ｂｐ」と省略）、ヌクレオチド（「ｎｔ」）、またはキロ塩基（「ｋｂ」）と表現される。
【００１９】
文脈が許すところでは、後者２つの術語は、単鎖または２重鎖のポリヌクレオチドを表すだろう。本術語が２重鎖分子に適用される時には、それは全長を示すのに使われ、そうして術語「塩基対」と同等であると理解される。２本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は長さが少し異なるだろうし、そうしてその端末は、酵素開裂の結果として食い違うだろうことを当業者は理解する。かくて２重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドは、対とはならないだろう。その様な対を成さない端末は、一般に長さで２０ ｎｔを超えない。
【００２０】
「ポリペプチド」は、天然にまたは合成的に作られたものであれ、ペプチド結合により結ばれたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基よりも小さなポリペプチドは、通常「ペプチド」と言われる。
術語「プロモーター」は、当業界で認識された意味に対して、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の１部を示すためにここで使われる。プロモーター配列は、通常、しかし必ずしもそうではないが、遺伝子の５’の非コーディング領域に見出される。
【００２１】
「タンパク質」は、１個以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、また炭水化物基のような非ペプチド成分を含むことが出来る。炭水化物および他の非ペプチド基質は、タンパク質が作られる細胞によりタンパク質に付加されるだろう、そうして細胞の型により変化する。タンパク質は、ここでそのアミノ酸骨格鎖構造により定義される。炭水化物基のような置換基は、通常詳細に特定されないが、しかしそれにもかかわらず存在するだろう。
【００２２】
術語「受容体」は、生物活性分子（すなわちリガンド）に結合し、そうして細胞へのリガンドの影響を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜に結合した受容体は、細胞外のリガンド結合分域および典型的にはシグナル形質導入に関与する細胞内作用因子分域を含む多分域構造により特徴付けられる。受容体へのリガンドの結合は、作用因子分域と細胞内の他分子との間の相互作用を引き起こす受容体内での立体配座の変化をもたらす。この相互作用は、次いで細胞の代謝を変更する。
【００２３】
受容体−リガンド相互作用に結びつく代謝の出来事は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ産生の増加、細胞カルシウムの起動、膜リピッドの起動、細胞付着、イノシトールリピッドの加水分解、およびリン脂質の加水分解を含む。一般に、受容体は、細胞に結合し、サイトゾルもしくは核であり、また単量体（たとえば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベーターアドレナリン受容体）または多量体（たとえば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポイエチン受容体およびＩＬ−６受容体）であり得る。
【００２４】
術語「分泌シグナル塩基配列」は、より大きなポリペプチドの成分として合成される細胞の分泌経路を通じて、より大きなポリペプチドを支配するポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコード化するＤＮＡ配列を示す。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過中に分泌ペプチドを除くために通常開裂される。
【００２５】
術語「スプライス変異株」は、遺伝子から転写されたＲＮＡの代わりの型を示すためにここに使われている。スプライス変異株は、転写したＲＮＡ分子内、またはより一般的ではないが別々に転写されたＲＮＡ分子の間の、代わりのスプライス部位の使用を通じて天然に生じる、そうして同じ遺伝子から転写された幾つかのｍＲＮＡとなるであろう。スプライス変異株は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するだろう。術語スプライス変異株はまた、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライス変異株によりコード化されたタンパク質を示すためにここに用いられる。
【００２６】
不正確な分析方法（たとえば、ゲル電気泳動）によって測定されたポリマーの分子量および長さは、概略値であることが理解されよう。そのような値が、「約」Ｘまたは「概略」Ｘとして表された時に、Ｘの表示値は±１０％の正確さであると理解されよう。
【００２７】
受容体は、ＩＬ−１９およびｍｄａ７に結合し、そうして「インターロイキン２０受容体アルファＩＬ−２０ＲＡ」と名付けられたポリペプチド、およびインターロイキン２０受容体ベータ「ＩＬ−２０ＲＢ」と名付けられたポリペプチドを含むヘテロ２量体であることが発見されている。ＩＬ−２０ＲＡポリペプチド、それをコード化する核酸、ＩＬ−２０ＲＡに対する抗体およびそれを産生する方法は、１９９９年８月３１日に公布された米国特許Ｎｏ．５，９４５，５１１に開示されている。
【００２８】
配列番号：１〜３は、ＩＬ−２０ＲＡのポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。ＩＬ−２０ＲＡの成熟細胞外配列は、配列番号：３を含む。ＩＬ−２０ＲＢポリペプチド、それをコード化する核酸、ＩＬ−２０ＲＢに対する抗体およびそれを産生する方法は、１９９９年３月８日に出願された国際出願Ｎｏ． ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３７３５（公開ｎｏ． ＷＯ ９９／４６３７９）に開示されている。ＩＬ−２０ＲＢの変異株（以後Ｖ−ＩＬ−２０ＲＢとする）は、クローンされており、そうして配列番号：４〜６により定義されている。ここに配列番号：６は、細胞外ドメインである。
【００２９】
可溶性ＩＬ−２０ヘテロ２量体受容体「ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ」の調製
可溶性ヘテロ２量体受容体は、配列番号：３（以後ＩＬ−２０ＲＡと称する）およびＩＬ−２０ＲＢの細胞外ドメインまたはＩＬ−２０ＲＢのバリアント（ｖＩＬ−２０ＲＢ、配列番号：４〜６）の細胞外ドメイン（配列番号：６）を含む。好ましくは、ＩＬ−２０ＲＡポリペプチドの細胞外ドメインおよびＩＬ−２０ＲＢポリペプチドの細胞外ドメインは、お互いに共有結合している。
【００３０】
好ましい具体例において、１個のポリペプチドは、そのカルボキシ端末に融合した免疫グロブリン重鎖の定常領域を有し、そうして他のポリペプチドは、そのカルボキシ端末に融合した免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常軽鎖を有する。そうしてこれら２個のポリペプチドは、一緒になり、重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合を生じてヘテロ２量体を形成する。他の方法においては、ペプチドリンカーは、ポリペプチドの２個のカルボキシ端末に融合して、共有結合をしたヘテロ２量体を形成する。
【００３１】
ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢの可溶性細胞外ドメインを製造するための方法は、下記を含む：
（ａ） 第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のＤＮＡ配列及びその下流に読み枠を合せて存在するＩＬ−２０ＲＡの細胞外部分をコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入し、
（ｂ）第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のＤＮＡ配列及びその下流に読み枠を合せて存在するＩＬ−２０ＲＢの細胞外部分をコードするＤＮＡ配列ならびにＣＨ１、 ＣＨ２ 、ＣＨ３および ＣＨ４からなる群から選ばれた免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインをコード化するＤＮＡ配列を、宿主細胞に導入し、
【００３２】
（ｃ） ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢの細胞外ドメインを含む２量体化したヘテロ２量体融合タンパク質の分泌を許す生理学的条件下で、適切な増殖培地中で宿主細胞を増殖させ、そして
（ｄ）２量体化したポリペプチドを宿主細胞から単離する。
１具体例において、第２のＤＮＡ配列は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコードする。ここでヒンジ領域は、重鎖定常領域分域に結合している。他の具体例において、第２のＤＮＡ配列は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の上流でおよび適切な読み枠で結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコードする。
【００３３】
他の具体例において、ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢの可溶性２量化細胞外分域を産生する方法は、下記を含む：
（ａ） 第１の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第１のＤＮＡ配列及びその下流に読み枠を合せて存在するＩＬ−２０ＲＢの細胞外部分をコードするＤＮＡおよび免疫グロブリンの軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを、宿主細胞に導入し、
（ｂ）第２の分泌シグナル配列に作用可能に結合した転写プロモーターを含む第２のＤＮＡ構築物及びその下流に読み枠を合せて存在するＩＬ−２０ＲＡの細胞外部分をコードするＤＮＡ配列ならびにＣＨ１、 ＣＨ２ 、ＣＨ３および ＣＨ４からなる群から選ばれた免疫グロブリンの重鎖定常領域ドメインをコードするＤＮＡ配列を、宿主細胞に導入し、
【００３４】
（ｃ） ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢの細胞外ドメインを含む２量体化したヘテロ２量体融合タンパク質の分泌を許す生理学的条件下で、適切な増殖培地中で宿主細胞を増殖させ、そして
（ｄ）２量体化したポリペプチドを宿主細胞から単離する。
１具体例において、第２のＤＮＡ配列は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコードする。ここでヒンジ領域は、重鎖定常領域に結合している。他の具体例において、第２のＤＮＡ配列は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の上流でおよび適切な読み枠で結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコードする（米国特許Ｎｏ．５，８４３，７２５を参照のこと）。
【００３５】
ポリヌクレオチド
一般的に、ｃＤＮＡ配列は、ここに記述されたポリペプチをコードする。本発明のポリペプチをコードするｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドの各アミノ酸残基がコドンによりコードされ、そうして各コドンが３個のヌクレオチドを含む、１連のコドンを含む。該アミノ酸残基は、下記の様に夫々のコドンによりコードされる。
アラニン（Ａｌａ）は、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、またはＧＣＴによりコードされる；
システイン（Ｃｙｓ）は、ＴＧＣまたはＴＧＴによりコードされる；
アスパラギン酸（Ａｓｐ）は、ＧＡＣまたはＧＡＴによりコードされる；
【００３６】
グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、ＧＡＡまたはＧＡＧによりコードされる；
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）は、ＴＴＣまたはＴＴＴによりコードされる；
グリシン（Ｇｌｙ）は、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴによりコードされる；
ヒスチジン（Ｈｉｓ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる；
イソロイシン（Ｉｌｅ）は、ＡＴＡ、ＡＴＣまたはＡＴＴによりコードされる；
リジン（Ｌｙｓ）は、ＡＡＡまたはＡＡＧによりコードされる；
ロイシン（Ｌｅｕ）は、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧまたはＣＴＴによりコードされる；
メチオニン（Ｍｅｔ）は、ＡＴＧによりコードされる；
アスパラギン（Ａｓｎ）は、ＡＡＣまたはＡＡＴによりコードされる；
【００３７】
プロリン（Ｐｒｏ）は、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧまたはＣＣＴによりコードされる；
グルタミン（Ｇｌｎ）は、ＣＡＡまたはＣＡＧによりコードされる；
アルギニン（Ａｒｇ）は、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧまたはＣＧＴによりコードされる；
セリン（Ｓｅｒ）は、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧまたはＴＣＴによりコードされる；
スレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＴによりコードされる；
バリン（Ｖａｌ）は、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧまたはＧＴＴによりコードされる；
トリプトファン（Ｔｒｐ）は、ＴＧＧによりコード化される；および
チロシン（Ｔｙｒ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによりコード化される。
【００３８】
アミノ酸を合成し、そうしてｔＲＮＡをアミノアシル化する方法は、当業界で知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写と変換は、大腸菌Ｓ３０抽出物ならびに商業的に入手出来る酵素および他の試薬を含む無細胞系で達成される。タンパク質は、クロマトグラフィーで精製される。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ら， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３： ２７２２（１９９１）； Ｅｌｌｍａｎ ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２： ３０１（１９９１）； Ｃｈｕｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−８０９ （１９９３）；およびＣｈｕｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−１０１９ （１９９３）を見よ。
【００３９】
第２の方法において、変換は、突然変異したｍＲＮＡおよび化学的にアミノアシル化した抑圧遺伝子ｔＲＮＡの微量注入によりＸｅｎｏｐｕｓ（アフリカツメガエル）の卵胞細胞で達成される（Ｔｕｒｃａｔｔｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９９１−１９９９８ （１９９６））。第３の方法で、大腸菌は、置換されるべき天然アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン）の不在下、および望ましい非天然由来のアミノ酸（たとえば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニンまたは４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【００４０】
非天然由来のアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにタンパク質に組み込まれる。Ｋｏｉｄｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−７４７６ （１９９４）を参照のこと。天然由来のアミノ酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏな化学修飾により非天然由来の種に変換できる。化学修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために、位置指定の変異誘発と組み合わせることができる（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３ （１９９３））。
限定数の非保存的なアミノ酸、遺伝子コードによりコード化されていないアミノ酸、非天然由来のアミノ酸、および非天然のアミノ酸は、アミノ酸残基と置換されるだろう。
【００４１】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、位置指定変異誘発またはアラニン走査式変異誘発のような、当業界で知られた方法に従って同定できる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９）；Ｂａｓｓ ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２ （１９９１））。後者の技術において、単一のアラニン突然変異を、分子の各残基に導入し、そうしてその結果の突然変異分子を、分子の活性に決定的であるアミノ酸残基を同定するために下記に開示した如く生物活性を試験する。Ｈｉｌｔｏｎ ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９− ７０８， １９９６を参照にこと。
【００４２】
リガンド−受容体相互作用の位置は、推定接触部位アミノ酸の突然変異と関連して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識のような技術により決定される如く、構造の物理分析により決定することも出来る。たとえば、ｄｅ Ｖｏｓ ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６  −３１２ （１９９２）； Ｓｍｉｔｈら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）； Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４ （１９９２） を参照のこと。
【００４３】
多数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７ （１９８８）またはＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２１５２−２１５６ （１９８９） により開示されているような、既知の変異誘発および選別の方法を用いて行い、かつ試験することが出来る。 要約すると、これらの著者は、ポリペプチドの２箇所以上を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、そうして各位置で許容出来る置換のスペクトルを決定するために突然変異ポリペプチドの配列を決定するための方法を開示している。使用できる他の方法は、ファージ表示法を含む （たとえば、Ｌｏｗｍａｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０８３２−１０８３７ （１９９１）； Ｌａｎｄｅｒら， 米国特許Ｎｏ．５，２２３，４０９； Ｈｕｓｅ， 世界知的所有機関公布ＷＯ ９２／０６２０４）および領域指定変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら， Ｇｅｎｅ ４６：１４５ （１９８６）； Ｎｅｒら， ＤＮＡ ７： １２７ （１９８８））。
【００４４】
開示されたＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢのＤＮＡの変異株ならびにポリペプチド配列は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−３９１， （１９９４）、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−１０７５１ （１９９４）および世界知的所有機関公布ＷＯ ９７／２００７８に開示されている如く、ＤＮＡシャフリングを通じて産生できる。要約すると、変異株ＤＮＡは、先ず親ＤＮＡを無作為に細分割し、次に無作為に導入された点突然変異をもたらすＰＣＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成する相同組換えにより産生される。この技術は、工程に付加的な変化度を導入するために、対立変異株または他の種からのＤＮＡのような、親ＤＮＡの種を用いて変更できる。変異誘発および分析の追加的反復を伴う望ましい活性のための選択および選別は、一方では致命的な変化に抗する選別を同時に行いながら、望ましい突然変異のための選別による配列の迅速な「進化」を提供する。
【００４５】
ここに開示された如く変異誘発方法は、宿主細胞内のクローンされ、突然変異されたポリペプチドの活性を検出するために、高処理能力の、自動選別方法と組み合わせる事が出来る。活性ポリペプチドをコード化する突然変異ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、そうして新式の設備を使って迅速に配列を決定できる。これらの方法は、関心事のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定でき、そうして未知の構造のポリペプチドに応用できる。
【００４６】
タンパク質の製造
ポリペプチドは、通常の技術に従って、遺伝子操作をされた宿主で製造できる。適切な宿主細胞は、外来ＤＮＡで形質転換または形質移入し、そして培養で育成できる細胞型であり、細菌、菌類細胞、および培養された高等真核細胞を含む。真核細胞、ことに多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、外来ＤＮＡを種々の宿主細胞に導入するための技術は、以下に開示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）、およびＡｕｓｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８７）。
【００４７】
一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内での、一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む発現に必要な他の遺伝子要素に作用可能に連結される。当業者はある系内では選択マーカーが別個のベクターにより提供されるだろうことを認識しているが、ベクターもまた一般に１個以上の選択マーカーおよび１または複数の複写起点を含み、そうして外来ＤＮＡの複写は、宿主細胞ゲノム中に組込みにより提供されるだろう。プロモーターの選択、ターミネーター、選択的標識、ベクターおよび他の要素は、当業界の水準内の通常の設計事項である。多くのその様な要素は、文献に記載されており、商業的供給者を通じて入手できる。
【００４８】
ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）を、発現ベクター中に提供する。分泌シグナル配列は、天然ポリペプチドの配列でり、または他の分泌されるタンパク質（たとえば、ｔ−ＰＡ）に由来し、あるいはそれ自体合成されるであろう。分泌シグナル配列は、ＤＮＡ配列に作用可能に結びついている、すなわち２個の配列は、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、正しい読み枠に入れられ、位置付けられる。分泌シグナル配列は、注目のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して一般に５’に配置される。しかしある種の分泌シグナル配列は、注目のＤＮＡ配列の何処にでも配置されるだろう（たとえば、Ｗｅｌｃｈら，米国特許Ｎｏ．５，０３７，７４３； Ｈｏｌｌａｎｄら，米国特許Ｎｏ．５，１４３，８３０を見よ）。
【００４９】
あるいは、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路に導くために使われる。本発明は、その様な融合ポリペプチドを提供する。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、他のペプチドを分泌経路に導くために、追加のペプチドに、好ましくはアミノ端末で融合する。その様な構築物は、当業界で知られた数多くの応用を有する。たとえば、新規の分泌シグナル配列融合構築物は、受容体のような通常の非分泌タンパク質の活性成分の分泌を指示できる。その様な融合は、分泌経路を通じてペプチドを指示するためにｉｎ ｖｉｖｏ またはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用されるだろう。
【００５０】
培養された哺乳動物の細胞は、本発明内の適切な細胞である。外来ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入する方法は、燐酸カルシウム仲介形質移入（Ｗｉｇｌｅｒら， Ｃｅｌｌ １４： ７２５ （１９７８）； Ｃｏｒａｓｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３ （１９８１）； Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２： ４５６（１９７３））、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎら， ＥＭＢＯ Ｊ １： ８４１−８４５ （１９８２））、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介形質移入（Ａｕｓｂｅｌら，同上）、およびリポソーム仲介形質移入（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら， Ｆｏｃｕｓ １５： ７３ （１９９３）； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら， Ｆｏｃｕｓ １５： ８０ （１９９３））、ならびにウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７： ９８０ （１９８９）； Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｉｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ， ２： ７１４（１９９６））を含む。
【００５１】
培養された哺乳動物細胞内での組換えポリペプチドの製造は、以下に開示されている：たとえば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、 米国特許Ｎｏ．４，７１３，３３９； Ｈａｇｅｎら、 米国特許Ｎｏ．４，７８４，９５０； Ｐａｌｍｉｅｒ、米国特許Ｎｏ．４，５７９，８２１；およびＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許Ｎｏ．４，６５６，１３４。適切な培養哺乳動物細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６３２）、ＢＨＫ ５７０（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １５７３）；Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６： ５９ （１９７７）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞株である（たとえば、ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ ６１）。
【００５２】
追加の適切な細胞株は当業界で知られており、Ｍａｒｙｌａｎｄ州 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅにある Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（国際細菌命名規約）のような公的寄託所から入手できる。一般に、ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルスからのプロモーターのような強い転写プロモーターが好ましい。たとえば、米国特許Ｎｏ．４，９５６，２８８を見よ。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのもの（米国特許Ｎｏ．４，５７９，８２１およびＮｏ．４，６０１，９７８）およびアデノウイルスの主要後期プロモーターを含む。
【００５３】
薬剤選択法は、外来のＤＮＡが挿入された培養哺乳動物細胞を選択するために通常に使われる。その様な細胞を、一般に「トランスフェクタント」と呼ぶ。選択的作用物質の存在下培養され、関心事の遺伝子をその子孫に渡す事の出来る細胞を、「安定なトランスフェクタント」と呼ぶ。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する抵抗性をコード化する遺伝子である。選択は、Ｇ−４１８等のようなネオマイシン型の薬剤の存在下で達成される。選択系はまた、関心事の遺伝子の発現水準を増加するためにも使われ、この工程を「増幅」と呼ぶ。
【００５４】
増幅は、低水準の選択的作用物質の存在下、トランスフェクタントを培養し、そうして導入された遺伝子の高水準の産物を産生する細胞を選択するために、選択的作用物質の量を増加することにより達成される。好ましい増幅可能な選択的標識は、ジヒドロ葉酸塩還元酵素であり、これはメトトレキセートに抵抗性を与える。
【００５５】
他の薬剤抵抗性遺伝子（たとえば、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、多剤抵抗性遺伝子、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた使用できる。緑色蛍光タンパク質のような変更された表現型、またはＣＤ４、ＣＤ８、Ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ、胎盤アルカリ性燐酸酵素のような細胞表面タンパク質を導入する代わりの標識は、ＦＡＣＳ選別または磁気ビーズ分離技術のような方法により、非形質移入細胞から形質移入細胞を選別するために使用されるだろう。
【００５６】
植物細胞、昆虫細胞および鳥の細胞を含む、他の真核細胞もまた、宿主として使用できる。植物細胞内で遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクター・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒら， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７ （１９８７）により検討された。昆虫細胞の形質変換およびそこでの外来のポリペプチドの産生は、Ｇｕａｒｉｎｏら， 米国特許Ｎｏ．５，１６２，２２２および世界知的所有機関公布ＷＯ ９４／０６４６３により開示されている。昆虫細胞は、通常キンウワバ科核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）から誘導される組換えかん状ウイルスで感染できる。
【００５７】
ポリペプチドをコードするＤＮＡは、２つの方法のうちの１法により配列をコードするＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子の代わりに、かん状ウイルスゲノムに挿入される。第１の方法は、野生型のＡｃＮＰＶとＡｃＮＰＶ配列により隣接された遺伝子を含む転写ベクターとの間の均質なＤＮＡの再結合を行う伝統的方法である。適切な昆虫細胞、たとえばＳＦ９細胞を野生型ＡｃＮＰＶで感染し、ＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーターに操作可能に結合したポリヌクレオチド、ターミネーター、およびフランキング配列を含む転写ベクターで形質導入する。
【００５８】
Ｋｉｎｇ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， （Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ， Ｄ．Ｒ．ら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）；およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｄ．編Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ １９９５）を参照のこと。昆虫細胞内の天然の組換えにより、ポリヘドリンプロモーターにより働かされたコーディング配列を含む組換えかん状ウイルスを生ずる。組換えウイルスストックを、業界で通常使用されている方法で作る。
【００５９】
組換えかん状ウイルスを作る第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ， Ｖ．Ａ．ら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６ （１９９３） に記述されている転位因子に基づく系を使う。この系は、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）として売られている。この系は、“ｂａｃｍｉｄ”と呼ばれる巨大プラスミドとして大腸菌に維持されているかん状ウイルスゲノムに、ポリペプチドをコード化するＤＮＡを動かすためにＴｎ７転位因子を含む転写ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使う。ｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭ転写ベクターは、関心事の遺伝子の発現を働かすために、ＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターを使う。しかしながら、ｐＦａｓｔＢａｃ１ＴＭ は相当程度修飾できる。
【００６０】
ポリヘドリンプロモーターは、除去および、かん状ウイルス塩基性タンパク質プロモーター（Ｐｃｏｒ、ｐ６．９またはＭＰプロモーターとしても知られている）で置換可能で、かん状ウイルス感染で既に発現され、そうして分泌されたタンパク質を発現するのに便利である事が示されている。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７１： ９７１ （１９９０）； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７５： １５５１ （１９９４）；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ．Ｄ．， ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：  １５４３（１９９５）を参照のこと。
【００６１】
そのような転写ベクター構築物で、短いまたは長い版の塩基性タンパク質プロモーターが使用できる。さらに、昆虫タンパク質から誘導された分泌シグナル配列で、天然の分泌シグナル配列を置換する転写ベクターが構築できる。たとえば、脱皮ステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、またはかん状ウイルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は、天然の分泌シグナル配列を置換するために、構築物内に使用できる。さらに、転写ベクターは、発現されたポリペプチドのＣ−またはＮ−端末エピトープ標識、たとえば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕエピトープ標識をコードするＤＮＡとの枠内融合を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８２：７９５２ （１９８５））。
【００６２】
当業界で知られた技術を用いて、組換え遺伝子を含む転写ベクターを、大腸菌に形質変換し、組換えかん状ウイルスを表示する遮られたｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄのために選別する。組換えかん状ウイルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、通常の技術を用いて単離し、そうしてスポドフトラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、たとえばＳｆ９細胞を形質移入するために使用する。ポリペプチドを発現する組換えウイルスは、引き続き産生される。組換えウイルス株を、当業界で普通に使われる方法で産生する。
【００６３】
組換えウイルスを、宿主細胞、典型的にはコアオヨトウ、スポドプテラ・フラギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、から誘導された細胞株を感染するために使う。一般には、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４）を参照のこと。他の適切な細胞株は、トリコプルシア・ニイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）から誘導したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ ＯＴＭ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である（米国特許Ｎｏ．５，３００，４３５）。商業的に入手出来る無血清培地が、細胞を育て、維持するために使用される。
【００６４】
適切な培地は、Ｓｆ９細胞用にはＳｆ９００ ＩＩＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥＳＦ９２１ＴＭ （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔ． ｎｉ細胞用にはＥｘ−ｃｅｌｌＯ４０５ＴＭ （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）またはＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。細胞は、組換えウイルス株が０．１から１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、より典型的には３近くで添加される時に、約２〜５ ｘ １０５から １〜２ ｘ １０６細胞の接種密度で育てられる。組換えウイルス感染細胞は、典型的に感染後１２〜７２時間で組換えポリペプチドを産生し、培地に種々の効率でそれを分泌する。
【００６５】
培地は通常感染後４８時間で収穫する。遠心分離を培地から細胞を分離するために使う（上澄み液）。ポリペプチドを含む上澄み液を、通常０．４５μｍの細孔径を有するミクロポアフィルターを通して濾過する。操作は、入手できる実験室マニュアルに通常記述されている（Ｋｉｎｇ， Ｌ．Ａ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， 同上； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ．Ｒ．ら， 同上； Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ．Ｄ．， 同上）。上澄み液からのポリペプチドの引き続く精製は、ここに記述した方法を使って達成できる。
【００６６】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本発明内で使用できる。この観点から特別に関心のある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）および ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）である。外来ＤＮＡでサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質変換しそこから組換えポリペプチドを産生する方法は、下記に開示されている。たとえば、Ｋａｗａｓａｋｉ， 米国特許Ｎｏ．４，５９９，３１１； Ｋａｗａｓａｋｉら，米国特許Ｎｏ．４，９３１，３７３； Ｂｒａｋｅ，米国特許Ｎｏ．４．８７０，００８； Ｗｅｌｃｈ ら，米国特許Ｎｏ．５，０３７，７４３； およびＭｕｒｒａｙ ら，米国特許Ｎｏ．４，８４５，０７５である。
【００６７】
形質変換された細胞は、選択的標識、普通には薬剤耐性または特定の養分（たとえば、ロイシン）の不在下で成長する能力、により決定される表現型により選択される。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｋａｗａｓａｋｉ ら（米国特許Ｎｏ．４，９３１，３７３）により開示されたＰＯＴＩベクター系である。これは、形質変換された細胞がグルコース含有培地での成長により選択されることを許す。
【００６８】
酵母で使用するための適切なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（たとえば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許Ｎｏ．４，５９９，３１１； Ｋｉｎｇｓｍａｎ ら， 米国特許Ｎｏ．４，６１５，９７４；および Ｂｉｔｔｅｒ，米国特許Ｎｏ．４，９７７，０９２を参照のこと）、およびアルコール脱水素酵素遺伝子からのそれらを含む。米国特許Ｎｏ．４，９９０，４４６、Ｎｏ．５，０６３，１５４、 Ｎｏ．５，１３９，９３６および Ｎｏ．４，６６１，４５４も参照のこと。
【００６９】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・グイレルモンディー（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）およびカンジダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）を含む他の酵母用の形質変換系は、当業界で知られている。
【００７０】
たとえば、Ｇｌｅｅｓｏｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１３２： ３４５９（１９８６）およびＣｒｅｇｇ，米国特許Ｎｏ．４，８８２，２７９を参照のこと。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞は、Ｍｃ Ｋｎｉｇｈｔら，米国特許Ｎｏ．４，９３９，３４９の方法に従って、使用されるだろう。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質変換する方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ら， 米国特許Ｎｏ．５，１６２，２２８により開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質変換する方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，米国特許Ｎｏ．４，４８６，５３３により開示されている。
【００７１】
組換えタンパク質の製造用宿主としてのピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の使用は、世界知的所有機関ＷＯ ９７／１７４５０、ＷＯ ９７／１７４５１、ＷＯ ９８／０２５３６およびＷＯ ９８／０２５６５に開示されている。ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質変換するのに使うＤＮＡ分子は、普通２重鎖、環状プラスミドとして調製され、好ましくは形質変換前に線状にされる。ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）でのポリペプチド製造用に、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１またはＡＵＧ２）のようなピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）遺伝子のそれであることが好ましい。
【００７２】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトン合成酵素（ＤＨＡＳ）、蟻酸塩脱水素酵素（ＦＭＤ）、および過酸化水素分解酵素（ＣＡＴ）遺伝子のそれらを含む。宿主染色体へのＤＮＡの組込みを促進するために、宿主のＤＮＡ配列をプラスミドの完全発現分節の両端に配置することが好ましい。ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）で使うための適切な選択できる標識は、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＡＤＥ２遺伝子であり、これはホスホリボシル−５−アミノイミダゾルカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ ４．１．１．２１）をコード化し、そしてこれはアデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞を成長させる。
【００７３】
メタノールの使用を最小にする事が望ましい大規模な工業プロセス用には、メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）両者を除去した宿主細胞の使用が望ましい。分泌タンパク質の製造のために、空胞性タンパク質分解酵素遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）を欠く宿主細胞が好ましい。ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞への注目のポリペプチドをコード化するＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するためにエレクトロポレーション（電気穿孔）を使う。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ ｋＶ／ｃｍの電場強度をもつ指数関数的に減衰するパルス状電場、および１〜４０ミリ秒、最も好ましくは約２０ミリ秒の時間定数（ｔ）を用いる電気穿孔により、ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を形質変換することが好ましい。
【００７４】
大腸菌細菌種を含む原核宿主細胞、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、および他の属もまた本発明内の有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質変換し、そこにクローン化された外来ＤＮＡ配列を発現するための技術は、当業界でよく知られている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 同上を参照のこと）。大腸菌のような細菌中でポリペプチドを発現する時には、ポリペプチドは細胞質中に、典型的に不溶性の顆粒として、維持され、または細菌の分泌配列によりぺリプラズム空間に導かれるだろう。前者の例において、細胞は崩壊し、顆粒を回収し、そうしてたとえばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を使って変性する。
【００７５】
変性したポリペプチドを、次に尿素溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの組合せに対しての透析、次いで緩衝生理食塩水に対しての透析によるような、変性剤の希釈により、再折り畳みおよび２量体化することができる。後者の例においては、周辺細胞質空間の中身を解放するために細胞を破砕し（たとえば、音波または浸透圧の衝撃により）、タンパク質を回収することにより、またそれにより変性および再折り畳みを不要にすることにより、可溶性で機能的な形で周辺細胞質空間からポリペプチドを回収できる。
【００７６】
形質変換されたまたは形質移入された宿主細胞は、選ばれた宿主細胞の成長に必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で普通の手順に従って培養される。確定されたまたは複雑な培地を含む、多くの適切な媒質は、当業界で知られており、通常炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はまた、必要に応じて、成長因子または血清のような成分をも含むだろう。生育培地を、たとえば、発現ベクターに乗せられたりまたは宿主細胞の中に共形質移入されたりする選択的標識で補われる、薬剤選択または必須栄養素の欠乏により、外生的に付加されたＤＮＡを含む細胞用に通常選択する。
【００７７】
ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を、約２５℃から３５℃の温度で、炭素、窒素、および微量の栄養素の適切な原料源を含む培地で培養する。液体培養は、小フラスコの振蕩または発酵器の多孔分散のような通常の方法で十分な空気吹き込みを行う。ピキア・メタノリカ（Ｐ． ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）に対する好ましい培養培地は、ＹＥＰＤ（２％ Ｄ−グルコース、２％ ＢａｃｔｏＴＭ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）、１％  ＢａｃｔｏＴＭ酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．００４％アデニンおよび０．０００６％ Ｌ−ロイシン）である。
【００７８】
タンパク質の単離
本発明のポリペプチドを８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらにより好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そうしてことに好ましくは、製薬的純粋状態であって、汚染性巨大分子、ことに他のタンパク質および核酸に関して９９．９％より高い純度であり、そうして感染性および発熱性物質を含まない。好ましくは、精製ポリペプチドは、本質的に他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを含まない。
【００７９】
発現された組換えポリペプチド（またはキメラポリペプチド）は、分画および／または通常の精製法ならびに培地を用いて精製できる。硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出は、試料の分画に使えるだろう。模範的精製工程は、ヒドロキシアパタイト、粒径排除、ＦＰＬＣおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むだろう。適切なクロマトグラフィーの媒質は、誘導デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ、などを含む。ＰＥＬ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が好ましい。
【００８０】
模範的クロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基の誘導媒質、たとえばＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ ６５０ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など；またはポリアクリル酸樹脂、たとえばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ） などを含む。適切な固体支持物は、使用条件下で不溶な、ガラスビーズ、シリカ基盤の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、その他である。これらの支持物は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、および／または炭水化物部分によりタンパク質を付加させる反応基で修飾されるだろう。
【００８１】
カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学に対するカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒質は、当業界で良く知られておりまた広く使われており、そうして商業的供給者から入手できる。媒質を支持する受容体ポリペプチドを結合する方法は、当業界で良く知られている。特定の方法の選択は、通常の設計の問題であり、選択された支持物の性質により一部分決定される。たとえば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８）を参照のこと。
【００８２】
ポリペプチドは、その性質の活用により単離できる。抗体のＦｃ定常領域に融合するタンパク質は、「プロテインＡ」カラムの方法により単離できる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ， １８２，“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｍ．． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，ｐａｇｅ ５２９−５３９ （Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０））。本発明の追加的具体例で、注目のポリペプチドの融合および親和性標識（たとえば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン分域）は、精製を促進するために構築されるだろう。
【００８３】
さらに、当業界で記述されている方法を使って、ポリペプチド融合または交配タンパク質は、ポリペプチドの領域またはドメインを使って構築される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、 Ａｌｔｓｃｈｕｌら、 同上， Ｐｉｃａｒｄ， Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ５１１ （１９９４））。これらの方法により、より大きなドメインまたは注目のポリペプチドの領域の生物学的重要性を決定できる。その様なハイブリドは、反応動態を変え、結合し、基質特異性を抑制しまたは拡張し、ポリペプチドの組織および細胞局在性を変更するだろうし、また未知の構造のポリペプチドに応用できる。
【００８４】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製しそうして化学的にそれらを結合させることにより、当業界に知られた方法で調製できる。あるいは、適切な読み枠内で融合タンパク質の両成分をコード化するポリヌクレオチドは、既知の技術を使って形成でき、ここに記述した方法で発現される。たとえば、生体機能を与えるドメインの一部または全部は、本発明のポリペプチドと、他のファミリー構成員からの機能的に同等なドメインとの間で交換できる。その様なドメインは、これに限定されるものではないが、分泌シグナル配列、保存された、および重要なこのファミリーのドメインまたは領域を含む。その様な融合タンパク質は、構築された融合に従って、本発明のポリペプチドもしくは他の知られたファミリのタンパク質と同じまたは類似の生体機能の性格特性を持つことが期待されるだろう。
【００８５】
ＩＬ−１９またはｍｄａ７を阻害するのに必要なＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ可溶性受容体の量は、投与法、目標部位、患者の生理学的状態、および他の投与薬物を含む、多くの異なる因子に依存する。かくて治療用量は、安全性および有効性を最適化するために滴定されるべきである。典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使われた用量は、これらの試薬のｉｎ ｖｉｖｏ投与に対する有効量についての有益な指針を与えるだろう。特定の疾患の治療に対する有効用量の動物実験は、ヒトの用量のさらなる予想指標を与える。投与法は、経口、静脈内、腹膜内、筋肉内、経皮、あるいは噴霧形またはネブライザ−もしくはアトマイザーで肺または気管内への投与を含む。
【００８６】
医薬的に受容できる担体は、少し例をあげれば、水、生理食塩水、緩衝剤を含む。用量範囲は、通常１日当たり体重１Ｋｇ当たり１μｇから１０００μｇである。 しかしながら、用量は、通常の技術を有する医者により決定される如く、通常これより多かったり少なかったりする。医薬処方および用量範囲の完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版．， （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎ．， １９９６）およびＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第９版（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を見よ。
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【００８７】
例１． ＩＬ−２０ＲＢ変異株のクローニング
１． ＩＬ−２０ＲＢ
１９９９年３月８日に出願された国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３７３５に、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーの２個の新規構成員が記述された。ＩＬ−２０ＲＢは、１９９９年８月３１日に公布された米国特許Ｎｏ．５，９４５，５１１のクラスＩＩサイトカイン受容体ＩＬ−２０ＲＡと３１％の相同性がある。ＩＬ−２０は、クラスＩＩサイトカインファミリーの１員であるＩＬ−１０の同族体である。ＩＬ−２０ＲＢはクラスＩＩサイトカイン受容体であり、胎性腎臓、胎性小腸、胎性卵巣、正常な皮膚および乾癬皮膚に発現されるという事実から、ＩＬ−２０ＲＢはＩＬ−２０受容体のサブユニットのもっともらしい候補とされた。
【００８８】
２． ＩＬ−２０ＲＢコード領域のクローニング
２個のＰＣＲプライマーは、１９９９年３月８日に出願された国際特許出願Ｎｏ． ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３７３５（公布Ｎｏ．ＷＯ ９９／４６３７９）からの配列に基づいて設計された：ＺＣ２５４８０（配列番号：７）は、ＥｃｏＲＩ制限部位にＡＴＧ（Ｍｅｔ１）コドンを含み、ＺＣ２５４８１（配列番号：８）は、ＸｈｏＩ制限部位に停止コドン（ＴＡＧ）を含む。ＰＣＲ増幅を、ヒトのケラチン細胞（ＨａＣａＴ）ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを鋳型として、ならびにＺＣ２５４８０（配列番号：７）およびＺＣ２５４８１（配列番号：８）をプライマーとして使用して達成した。
【００８９】
ＰＣＲ反応を、以下の様に行った：インキュベーションを９４℃で１分間、ついで９４℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクルを３０回行い、６８℃で４分間の追加的インキュベーションを行った後、反応を４℃で貯蔵した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で移動させ、１ｋｂ ＤＮＡバンドを観察した。ＰＣＲ産物をゲルから切り取り、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＺＰ７Ｎと呼ばれるｐＺＰベクター中にクローン化した。ｐＺＰプラスミドは、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター、ヒトｔＰＡリーダーペプチド、コード配列の挿入のための多重制限部位、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ標識、およびヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。
【００９０】
プラスミドはまた大腸菌の複製起点、ＳＶ４０プロモーターを有する哺乳動物選択マーカー発現ユニット、ＤＨＦＲ遺伝子のみならず、エンハンサーおよび複製起点、ならびにＳＶ４０ターミネーターを有する。幾つかのＩＬ−２０Ｒ？−ｐＺＰ７Ｎクローンの配列を決定した。それらは皆、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０３７３５：（配列ＩＬ−２０Ｒ？−ｐＺＰ７Ｎ）におけるＩＬ−２０ＲＢ？の特許配列、１４６Ｐｒｏ（ＣＣＣ）−Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、１４８Ｈｉｓ（ＣＡＴ）−Ａｓｐ（ＧＡＴ）、および１７１Ｔｈｒ（ＡＣＧ）−Ａｒｇ（ＡＧＧ）と比較して、３個の非保存的突然変異を含む。
【００９１】
ＩＬ−２０Ｒ？−ｐＺＰ７Ｎクローンでの３個の置換を確認するために、鋳型として３個の異なるｃＤＮＡ原料源−−−胎性皮膚マラソンｃＤＮＡ、ＨａＣａＴ ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ、および前立腺平滑筋ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ−−−を用いて、ＰＣＲ増幅作用を遂行した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、配列を決定した。３個のＰＣＲ産物の夫々の配列は、ＩＬ−２０Ｒ？−ｐＺＰ７Ｎクローンのそれと一致した。
【００９２】
例２． ＩＬ−２０ＲＡ受容体−Ｉｇ融合タンパク質
発現ベクターｐＥＺＥ３を、組換えＩＬ−２０受容体−Ｉｇ融合タンパク質を発現するために使用した。ｐＥＺＥ３は、ｐＤＣ３１２から誘導した。ｐＤＣ３１２は、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから許可を受けて得られた。ｐＤＣ３１２および ｐＥＺＥ３は、ＷＯ ９７／２５４２０に記述されているごとく、ＥＡＳＥセグメントを含む。発現ベクターにＥＡＳＥセグメントが存在すると、安定な細胞プール中で組換えタンパク質の発現を２〜８倍に改善できる。
【００９３】
ｐＥＺＥ３は、哺乳動物細胞で、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で、３個までの異なるタンパク質を発現するために使用されるだろう３重シストロン発現ベクターである。ｐＥＺＥ３発現ユニットは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、アデノウイルス３連リーダー配列、第１の組換えタンパク質のためのコード領域の挿入用多重クローニング部位、ポリオウイルス２型内部リボソーム侵入部位、第２の組換えタンパク質のためのコード領域挿入用第２の多重クローニング部位、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位、マウスジヒドロ葉酸還元酵素コードセグメント、およびＳＶ４０転写ターミネーターを含む。さらに、ｐＥＺＥ３は、大腸菌複製起点および細菌のベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
【００９４】
ＩＬ−２０受容体−Ｉｇ融合タンパク質は、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合した２本鎖のヒト細胞外ドメインおよび突然変異したヒトの免疫グロブリンガンマ１定常領域に融合した２本鎖のヒトＩＬ−２０Ｒタンパク質細胞外ドメインからなるジスルフィド結合したヘテロ４量体である。ヒト免疫グロブリンガンマ１定常領域は、ＦｃＲＩ結合を低下させるためのアミノ酸置換およびＣ１ｑ補体結合を含む。
【００９５】
ヒトＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合構築物を、オーバーラップＰＣＲにより形成した。ＩＬ−２０ＲＢコーどドメインは、アミノ酸１〜２３０からなる。ＩＬ−２０ＲＢドメインのＰＣＲ増幅のための鋳型として、前もって形成したＩＬ−２０ＲＢヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９）（ｚｃ２７，５２２）および（配列番号：１０）（ｚｃ２７，６８４）を、ＩＬ−２０ＲＢドメインを増幅するために使用した。野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域全体を使用した。野生型のヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域ドメインのＰＣＲ増幅のための鋳型として、前もって形成したＩＬ−２０ＲＢヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を使用した。
【００９６】
オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１１）（ｚｃ２７，６２５）および（配列番号：１２）（ｚｃ２７，６８５）を、野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を増幅するために使用した。２個のタンパク質コードセグメントを、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）（ｚｃ２７，５２２）および（配列番号：１２）（ｚｃ２７，６８５）を用いるオーバーラップＰＣＲにより結合した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、２個のタンパク質ドメインの間に挿入した。該（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、ＰＣＲプライマー（配列番号：１１）（ｚｃ２７，６２５）および（配列番号：１０）（ｚｃ２７，６８４）上にコードした。
【００９７】
ヒトＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメイン−ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合構築物は、夫々別個のＰＣＲ増幅により形成した４個の別個のＤＮＡ構成体を、オーバーラップＰＣＲすることにより形成した。
第１の構成体は、最適化されたｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）シグナル配列を含んだ。ｏｔＰＡシグナル配列を、先に社内で形成した発現ベクターを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番後：１３）（ｚｃ２７，５２５）および（配列番号：１４）（ｚｃ２７，５２６）を使用して増幅した。
【００９８】
第２の構成体は、アミノ酸１〜２１４からなるＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインコード領域を含んだ。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１５）（ｚｃ２７，５２４）および（配列番号：１６）（ｚｃ２７，６７４）を、先に形成したＩＬ−２０ＲＡのクローンを鋳型として用いて、ＩＬ−２０ＲＡ？セグメントを増幅するために使用した。
【００９９】
ヒトガンマ１重鎖定常領域を、２個のセグメントから形成した。ＣＨ１ドメインを含む第１のセグメントは、野生型ヒトガンマ１重鎖定常領域のクローンを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１７）（ｚｃ２７，６７６）および（配列番号：１８）（ｚｃ２８，０７７）を用いて増幅した。残りのヒンジ、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域のＣＨ２および ＣＨ３ドメインを含む第２のセグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１９）（ｚｃ２８，０７６）および（配列番号：２０）（ｚｃ２７，５２３）を用いてＰＣＲ増幅により形成した。
【０１００】
４個のタンパク質コードドメインは、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１３）（ｚｃ２７，５２５）および（配列番号：２０）（ｚｃ２７，５２３）を用いてオーバーラップＰＣＲにより結合した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、ｚｃｙｔｏｒ７およびＣＨ１タンパク質ドメインの間に挿入した。該（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、ＰＣＲプライマー（配列番号：１７）（ｚｃ２７，６７６）および（配列番号：１６）（ｚｃ２７，６７４）上にコードされた。
ＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合コードセグメントを第２のＭＣＳにクローン化した。一方、ヒトＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合コードセグメントをｐＥＺＥ３の第１ＭＣＳ中にクローン化した。
【０１０１】
プラスミドを、ＣＨＯ細胞を形質移入するために使用した。細胞をヒポキサンチンまたはチミジンを含まない培地内で選択し、形質変換遺伝子をメトトレキセートを用いて増幅した。タンパク質の存在を抗ヒトガンマ１重鎖定常領域および抗ヒトカッパ軽鎖抗体を用いてウェスタンブロット法により分析した。
ＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合タンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号： ２１および２２に示されている。
ＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合タンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号：２３および２４に示されている。
【０１０２】
例３． ＩＬ−２０ＲＡ／Ｂ受容体−Ｉｇ融合タンパク質
発現ベクターｐＥＺＥ３を、組換えＩＬ−２０ＲＡ／Ｂ受容体−Ｉｇ融合タンパク質を発現するために使用した。ｐＥＺＥ３は、ｐＤＣ３１２から誘導する。ｐＤＣ３１２は、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの許可を受けて得られた。ｐＤＣ３１２およびｐＥＺＥ３は、ＷＯ ９７／２５４２０に記述されているごとくＥＡＳＥセグメントを含む。発現ベクターのＥＡＳＥセグメントの存在は、安定細胞プールでの組換えタンパク質の発現を２〜８倍に改善できる。
【０１０３】
ｐＥＺＥ３は、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、３個までの異なるタンパク質を発現するのに使用されるだろう３重シストロン発現ベクターである。ｐＥＺＥ３発現ユニットは、ＣＭＶプロモーター／プロモーター、アデノウイルウス３連リーダー配列、第１の組換えタンパク質のコード領域の挿入のための多重クローニング部位、ポリオウイルス２型内部リボソーム侵入部位、第２の組換えタンパク質のコード領域の挿入のための第２の多重クローニング部位、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位、マウスジヒドロ葉酸還元酵素用コードセグメント、およびＳＶ４０転写ターミネーターを含む。さらにｐＥＺＥ３は、転写の大腸菌複製起点および細菌性ベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
【０１０４】
ＩＬ−２０ＲＡ／Ｂ受容体−Ｉｇ融合タンパク質は、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合した２本鎖ヒトＩＬ−２０ＲＢタンパク質細胞外ドメインおよび組換えヒト免疫グロブリンガンマ１定常領域に融合した２本鎖ヒトＩＬ−２０ＲＡタンパク質細胞外ドメインからなるジスルフィド結合４量体である。ヒト免疫グロブリンガンマ１定常領域は、Ｆｃ？ＲＩ結合を減少させるためのアミノ酸置換およびＣ１ｑ補体結合を含む。
【０１０５】
ヒトＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合構築物を、オーバーラップＰＣＲにより形成した。ＩＬ−２０ＲＢコードセグメントは、アミノ酸１〜２３０からなる。前もって形成したＩＬ−２０ＲＢセグメントのＰＣＲ増幅のために、先に形成したＩＬ−２０ＲＢヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９）（ｚｃ２７，５２２）および（配列番号： １０）（ｚｃ２７，６８４）を用いて、ＩＬ−２０Ｒセグメントを増幅した。全野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を使用した。野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域セグメントのＰＣＲ増幅のために、以前に形成したＩＬ−２０ＲＢヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物を鋳型として使用した。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１１）（ｚｃ２７，６７５）および（配列番号：１２）（ｚｃ２７，６８５）を使用して、野生型ヒト免疫カッパ軽鎖定常領域を増幅した。２個のタンパク質コードするドメイン、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）（ｚｃ２７，５２２）および（配列番号：１２）（ｚｃ２７，６８５）を使用し、オーバーラップＰＣＲにより結合した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、２個のタンパク質分域の間に挿入した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーは、ＰＣＲプライマー（配列番号：１１（ｚｃ２７，６７５）および（配列番号：１０）（ｚｃ２７，６８４）上にコードされた。
【０１０７】
ヒトＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合構成体を、夫々別個のＰＣＲ増幅反応により形成した４個の別個のＤＮＡ構成体をオーバーラップＰＣＲすることにより形成した。
第１の構成体は、最適化されたｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）シグナル配列を含んだ。ｏｔＰＡシグナル配列を、先に社内で形成した発現ベクターを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１３）（ｚｃ２７，５２５）および（配列番号：１４）（ｚｃ２７，５２６）を使用して増幅した。
第２の構成体は、アミノ酸１から２１４までからなるＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインコード領域を含んだ。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１５）（ｚｃ２７，５２４）および（配列番号：１６）（ｚｃ２７，６７４）を、ＩＬ−２０ＲＡの先に形成したクローンを鋳型として用いて、ＩＬ−２０ＲＡ分節を増幅するために使用した。
【０１０８】
ヒトガンマ１重鎖定常領域は、２個のセグメントから形成された。ＣＨ１ドメインを含む第１のセグメントは、野生型ヒトガンマ１重鎖定常領域のクローンを鋳型として使い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１７）（ｚｃ２７，６７６）および（配列番号：１８）（ｚｃ２８，０７７）を用いて増幅した。残りのヒンジ、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域のＣＨ２および ＣＨ３ドメインを含む第２のセグメントを、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１９）（ｚｃ２８，０７６）および（配列番号：２０）（ｚｃ２７，５２３）を用いてＰＣＲ増幅により形成した。
【０１０９】
４個のコードドメインは、オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）（ｚｃ２７，５２５）および（配列番号：２０）（ｚｃ２７，５２３）を用いてオーバーラップＰＣＲにより結合した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーを、ｚｃｙｔｏｒ７およびＣＨ１タンパク質ドメインの間に挿入した。該（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカーは、、ＰＣＲプライマー（配列番号：１７）（ｚｃ２７，６７６）および（配列番号：１６）（ｚｃ２７，６７４）上でコードされた。
ＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合コードセグメントを第２のＭＣＳにクローン化した。一方、ヒトＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合コードセグメントをｐＥＺＥ３の第１ＭＣＳ中にクローン化した。
【０１１０】
プラスミドを用いて、ＣＨＯ細胞を形質移入した。細胞をヒポキサンチンまたはチミジンを含まない培地内で選択し、形質転換遺伝子をメトトレキセートを用いて増幅した。タンパク質の存在を抗ヒトガンマ１重鎖定常領域および抗ヒトカッパ軽鎖抗体を用いてウェスタンブロット法により分析した。
ＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合タンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号：２１および２２に示されている。その成熟ポリペプチド配列は、配列番号：４１に示される。
ＩＬ−２０ＲＡ細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域融合タンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号：２３および２４に示されている。その成熟ポリペプチド配列は、配列番号：３９である。
【０１１１】
例４． ＩＬ−２０受容体ヘテロ２量体の構築
分泌されるｈＩＬ−２０ＲＡ／ｈＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体を発現するベクターを構築した。この構築物において、ｈＩＬ−２０ＲＡの細胞外ドメインをＩｇＧガンマ１（ＩｇＧγ１）の重鎖に融合した。一方、ＩＬ−２０ＲＢの細胞外ドメインをヒトカッパ軽鎖（ヒトκ軽鎖）に融合した。
【０１１２】
ＩｇＧガンマ１およびヒトκ軽鎖融合ベクターの構築
ＩｇＧγ１の重鎖を、Ｚｅｍ２２９Ｒ哺乳動物発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６９４４７）に、５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＮｈｅＩ部位を有する受容体のどの細胞外部分もクローンされ、その結果Ｎ端末細胞外ドメイン−Ｃ端末ＩｇＧγ１融合を生じるように、クローン化した。この構築物に使われたＩｇＧγ１構成体を、鋳型としてＣｌｏｎｔｅｃｈ ｈＦｅｔａｌ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡライブラリーからＩｇＧγ１配列を単離するためにＰＣＲを用いて形成した。ｏｌｉｇｏｓ（配列番号： ２５）ＺＣ１１，４５０および（配列番号：２６）ＺＣ１１，４４３を用いてＰＣＲ反応を以下のように行った：９４℃で６０秒、５３℃で６０秒、および７２℃で１２０秒を４０サイクル、ならびに７２℃で７分間。
【０１１３】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱｉａＱｕｉｃｋＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて精製した。単離した９９０ ｂｐのＤＮＡ構成体を、Ｍ１ｕＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、エタノールで沈殿させ、Ｍ１ｕＩ／ＥｃｏＲＩリンカーからなる ｏｌｉｇｏｓ（配列番号：２７） ＺＣ１１，４４０および（配列番号：２８）ＺＣ１１，４４１と共に、ここに開示された標準的分子生物学技術を用いて、先にＭ１ｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＺｅｍ２２９Ｒ中に結合した。この一般的なクローニングベクターを、Ｖｅｃｔｏｒ＃７６ ｈＩｇＧｇａｍｍａ１ ｗ／Ｃｈ１ ＃７８６ Ｚｅｍ２２９Ｒ（Ｖｅｃｔｏｒ＃７６）と呼ぶ。ＩｇＧγ１の重鎖に融合したｈＩＬ−２０ＲＡの細胞外分域のポリヌクレオチド配列を配列番号：２９に、そして対応するポリペプチド配列を配列番号：３０に示す。その成熟配列は、配列番号：４０である。
【０１１４】
ヒトκ軽鎖をＺｅｍ２２８Ｒ哺乳動物発現ベクター（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６９４４６）に、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＫｐｎＩ部位を有する受容体のどの細胞外部分もクローンされ、その結果Ｎ端末細胞外ドメイン−Ｃ端末ヒトκ軽鎖融合を生じるように、クローン化した。この構築物に使われたヒトκ軽鎖構成体を、上で使われたと同じＣｌｏｎｔｅｃｈ ｈＦｅｔａｌ Ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡライブラリーからのヒトκ軽鎖配列を単離するためにＰＣＲを用いて形成した。ｏｌｉｇｏｓ（配列番号：３１）ＺＣ１１，５０１および（配列番号：３２）ＺＣ１１，４５１を用いてＰＣＲ反応を上述の条件下で行った。
【０１１５】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱｉａＱｕｉｃｋＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて精製した。単離した３１５ ｂｐのＤＮＡ構成体を、Ｍ１ｕＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で消化し、エタノールで沈殿させ、上述したＭ１ｕＩ／ＥｃｏＲＩリンカーと共に、ここに開示された標準的分子生物学技術を用いて、先にＭ１ｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＺｅｍ２２９Ｒ中に結合した。この遺伝子クローニングベクターを、Ｖｅｃｔｏｒ＃７７ｈκｌｉｇｈｔ＃７７４Ｚｅｍ２２８Ｒ（Ｖｅｃｔｏｒ＃７７）と呼ぶ。ヒトカッパ軽鎖に融合したＩＬ−２０ＲＢの細胞外部分のポリヌクレオチド配列を配列番号：３３に、そして対応するポリペプチド配列を配列番号：３４に示す。その成熟配列は、配列番号：４２である。
【０１１６】
融合ベクター構築物へのｈＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢ細胞外ドメインの挿入
上述の構築ベクターを用いて、ヒトＩＬ−２０ＲＡをＩｇＧγ１に融合させた構築物を形成した。この構築は、下記に述べる条件下でｏｌｉｇｏｓ（配列番号：３５）ＺＣ１２，９０９および（配列番号：３６）ＺＣ２６，５６４を有するｈＩＬ−２０ＲＡ／ＩｇＧ Ｖｅｃｔｏｒ＃１０２からのヒトＩＬ−２０ＲＡ受容体をＰＣＲすることにより行った：９４℃で６０秒、５７℃で６０秒、および７２℃で１２０秒を３０サイクル、ならびに７２℃で７分間である。結果のＰＣＲ産物を、ここに記述したごとくＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩで消化し、ゲル精製し、予め消化されたＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩならびにバンド精製したＶｅｃｔｏｒ＃７６（上述）中に結合した。結果のべクターを、ヒトＩＬ−２０Ｒα／ＩｇＧｇａｍｍａ１融合（ｈＩＬ−２０ＲＡ／Ｃｈ１ ＩｇＧ）が正しいことを確認するために配列を決定した。ｈＩＬ−２０ＲＡ／Ｃｈ１ ＩｇＧｇａｍｍａ１＃１８２５ Ｚｅｍ２２９ＲベクターをＶｅｃｔｏｒ＃１９５と名付けた。
【０１１７】
κｌｉｇｈｔにＩＬ−２０ＲＢを融合させた個別の構築物もまた構築した。ＩＬ−２０ＲＢ／ヒトκ軽鎖の構築は、上述のごとくｏｌｉｇｏｓ（配列番号：３７）ＺＣ２６，６０２および（配列番号：３８）ＺＣ２６，５９９を有するＤＲ１／７Ｎ−４からＰＣＲし、結果のバンドを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ついでこの製品を予め消化されたＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩおよびバンド精製したＶｅｃｔｏｒ＃７７（上述）中に結合した。結果のベクターを、ＩＬ−２０ＲＢ／ヒトκ軽鎖融合（ＩＬ−２０ＲＢ／κｌｉｇｈｔ）が正しいことを確認するために配列を決定した。このＩＬ−２０ＲＢ／κｌｉｇｈｔ＃１８３３Ｚｅｍ２２８ＲベクターをＶｅｃｔｏｒ＃１９４と名付けた。
【０１１８】
ヒトＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２０ＲＢ受容体の共発現
上述のＶｅｃｔｏｒ＃１９４およびＶｅｃｔｏｒ＃１９５の夫々約１６μｇを、製造者の指示に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、ＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ− １０３１４）に共形質移入した。形質移入された細胞を、１μＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含むＤＭＥＭ ＋ ５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で１０日間および０．５ ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で１０日間選択した。結果の形質移入物のプールをもう１度、１０μΜ ＭＴＸおよび０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８中で１０日間選択した。
【０１１９】
２重に選択した細胞の生成プールを使用して、タンパク質を形成した。３工場（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）のこのプールを用いて、８ Ｌの無血清順化培地を形成した。この順化培地を、１ ｍＬのプロテインＡカラム上を通過させ、７５０ μＬずつの１０分画を溶出した。最も高濃度の４分画をプールし、ＰＢＳに対して透析した（１０ ｋＤ ＭＷカットオフ）。最後に、透析物は、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）により分析し、３１７ μｇ／ｍＬの濃度を有することを見出した。この８ Ｌの精製から総量９５１μｇを得た。
【０１２０】
例５． Ｂａｆ３／ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ安定細胞系の増殖分析
例の目的：
本例の目的は、ＩＬ−１９がＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体受容体を発現する細胞系に結合できるか否かを決定することであった。
ＩＬ−１９をＢａｆ３／ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ安定細胞系で用量作用増殖分析を行った。増殖分析を以下のように組み立てた：
【０１２１】
−第１日： ９６孔培養皿に１孔当り５０００細胞で、６ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまでのＩＬ−１９および対照物の用量作用を接種し、細胞を３７℃でインキュベートした。
−第４日：２０μＬのＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを各孔に置き、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。
−第５日：培養皿をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｓ Ｕｎｉｔｓ（５４４ｎｍ ｅｘ．／５９０ｎｍ ｅｍ．）の自動化培養皿読取り機にかけた。データを以下に示す。
結果：以下のデータは、各孔の細胞数であり、細胞がＩＬ−１９に対する用量依存性作用で増殖したことを示す。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
例６． ＩＬ−１９の中和分析法
例の目的：
本例の目的は、可溶性ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体受容体がＩＬ−１９を中和できるか否かを決定することであった。
−第１日：ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体受容体を発現する幼児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を１０００細胞／孔で９６孔培養皿にて培養した。
【０１２５】
−第２日：細胞をその作用を下方調整するために無血清培地で再培養した。
−第３日：ＩＬ−１９を含む３つの異なる溶液を調製した。第１の溶液は０．１ｎｇ／ｍＬの濃度を有し、第２は１ｎｇ／ｍＬ、第３は１０ｎｇ／ｍＬの濃度を有した。
対照実験として、夫々のＩＬ−１９溶液の１００μＬ分割を、ＩＬ−１９により引き起こされた細胞増殖の水準を決定するために、異なる細胞を含む孔に置いた。
【０１２６】
第２の実験で、１０μｇ／ｍＬ濃度の可溶性ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢヘテロ２量体受容体を含む１００μＬ溶液を、各ＩＬ−１９溶液の１００μＬ分割と混合し、溶液を完全に混合するために渦巻き攪拌をした。溶液を次に室温で３０分間静置した。混合溶液を次いで、ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ受容体を発現するＢＨＫ細胞を含む３孔に夫々置いた。細胞を含むミクロタイター培養皿を３７℃で４時間インキュベーとし、照度計で読んでデータを集めた。
下表のデータは、実験の最後に存在する細胞数を示す。表示されている如く、可溶性受容体は、３つの全ての濃度（ことに、より高濃度）においてＩＬ−１９単独の活性と比較して、ＩＬ−１９の活性を幾分中和した。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525074.tif 000086
【国際調査報告】
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2004525074.tif 000088
2004525074.tif 000089
2004525074.tif 000090
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