(57)【要約】Ｓｋｐ２プロモーター配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このプロモーターは腫瘍および癌の治療、特に周囲の非腫瘍または非癌細胞に対して腫瘍または癌細胞を選択的に死滅させる、あるいは増殖、分裂または活性を低下させることを意図した療法に有用である。また、Ｓｋｐ２プロモーター活性の阻害剤をスクリーニングする方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｋｐ２プロモーター配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
プロモーター配列が少なくとも１５、所望により少なくとも２５、所望により少なくとも５０、所望により少なくとも１００、もしくは所望により少なくとも５００、またはストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列が１０ｋｂ未満、所望により５ｋｂ未満、所望により１ｋｂ未満からなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１もしくは配列番号２で示される配列、またはその断片、またはストリンジェント条件下でそれとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１または配列番号２の全体または一部と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、いっそう好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは断片。
【請求項６】
プロモーター配列に作動可能なように連結された転写配列をさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
転写配列の発現産物が細胞死を引き起こすか、または細胞の分裂もしくは活性を阻害し、好ましくは転写配列がプロアポトーシス遺伝子である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
転写配列の発現産物が毒素である、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
転写配列の発現産物が抗腫瘍薬または抗腫瘍療法、例えば放射線療法または化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高める、請求項４から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
細胞を死滅させる、またはそれらの分裂もしくは活性を阻害するという点で発現産物と抗腫瘍薬または抗腫瘍療法の間に相乗効果がある、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
レポータータンパク質またはペプチドをコードする転写配列を含む、請求項６から１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
レポーターが酵素、リガンド結合タンパク質、蛍光タンパク質またはリン光性タンパク質の１以上から選択される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
レポータータンパク質がホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質またはヒト分泌型アルカリ性ホスファターゼから選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
転写配列がアンチセンス配列である、請求項６または７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝構築物。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項１８】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
ウイルス、好ましくはアデノウイルスである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１から１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを細胞へ導入することを含む、腫瘍細胞死滅法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドまたはベクターがｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へ導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターの有効量を個体に投与することを含む、癌の治療法。
【請求項２４】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを細胞へ導入することを含む、細胞においてＳｋｐ２の発現を阻害する方法。
【請求項２５】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
１以上の医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクターの医薬としての使用。
【請求項２８】
癌治療薬の製造に用いる、請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のプラスミド、または請求項１８もしくは１９に記載のベクター。
【請求項２９】
癌が乳癌、頭頚部癌から選択されるものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
Ｓｋｐ２プロモーター活性を調節する化合物を同定する方法であって、請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと化合物を接触させ、ポリヌクレオチドを発現系下に置き、転写配列の発現量を測定することを含む方法。
【請求項３１】
発現系が細胞フリー系である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｓｋｐ２プロモーター活性を調節する化合物を同定する方法であって、転写配列を発現する請求項２０の細胞を化合物と接触させ、転写配列の発現量を測定することを含む方法。
【請求項３３】
発現量が転写配列の発現産物の活性量を測定することにより求められる、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む、細胞においてＳｋｐ２プロモーターを阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は腫瘍および癌治療の分野、より詳しくは、周囲の非腫瘍または非癌細胞に対して腫瘍または癌細胞を選択的に死滅させる、あるいは増殖、分裂または活性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を低下させることを意図した療法に関する。本発明の関連分野の１つの態様は、腫瘍または癌細胞における遺伝子の選択的発現であり、それにより腫瘍または癌細胞は死滅するか、それらの活性（ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）が阻害されるか、あるいは既存の治療薬、例えば電離放射線に対する感受性が高くなるというものである。本発明はまた、周囲の非腫瘍または非癌細胞に対して腫瘍細胞または癌細胞で特異的に発現する、または過剰発現する遺伝子のプロモーター配列を含む核酸、核酸構築物（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、ベクターおよび組換えウイルスに関する。また、癌治療の方法および癌治療の医薬製剤も本発明の関連分野である。
【０００２】
世界の豊かな国々では、癌が約５人に１人の死亡原因となっている。１９９３年のＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙは、五大癌が肺癌、胃癌、乳癌、結腸／直腸癌および子宮頚癌であると報告している。癌は全てのケースで死に至るわけではなく、癌を発症した人の約半数だけが死に至る。癌患者とその医師が直面している問題は、癌を治癒させることは雑草を抜き去ろうとするようなものだということである。癌細胞は外科的に摘出したり有毒化合物や放射線で破壊したりすることができるが、癌化細胞（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｃｅｌｌ）の全てを取り去るのは極めて困難である。一般的な目標としては、身体の非罹患正常細胞を残しつつ癌細胞を選択的に死滅させるよりよい方法を見出すことである。
【０００３】
過去１０年間で、癌の分子的基礎の理解は指数関数的に高まって来ており、数系統の証拠によりヒトにおける腫瘍発達が多段階のプロセスであることが示されている。これらのステップは正常なヒト細胞の、高い細胞増殖、低い細胞死、遺伝的不安定性および脈管形成の持続を特徴とする悪性性の高い派生物への進行的悪性転換を誘導する遺伝変異を反映している（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ． ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｒ．Ａ． （２０００） Ｃｅｌｌ １００： ５７−７０）。これらの洞察はまた、腫瘍細胞において変化している分子の相互作用および生化学経路を特異的にターゲッティングする新たな治療アプローチを示唆するものであった。この試みはますます増える癌の分子的基礎の理解を癌治療における改良へと翻訳するということである。
【０００４】
腫瘍細胞は細胞周期の正常な制御を失っているので、正常細胞に匹敵する制御を外れて分裂する。細胞周期を制御する細胞下機構（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）は、細胞の内容物の複製と分裂の必須プロセスを誘導および統制する１組の相互作用タンパク質からなる複合型生化学装置である。正常な細胞周期では、この制御系は周期内の特定のポイントで停止できるように調節される。この停止点は複製または分裂のプロセスからのフィードバック制御系を考慮したものである。それらはまた環境シグナルによる調節に関するポイントも備えている。
【０００５】
遺伝子発現は細胞分裂およびその制御において重要な働きをする。細胞分裂の制御の欠如は遺伝子発現における変化に端を発する場合がある。腫瘍または癌細胞における遺伝的変化の分析により、細胞分裂の制御に何らかの関連があるタンパク質をコードする多くの遺伝子が明らかにされてきた。
【０００６】
癌遺伝子はこのような遺伝子の１ファミリーである。癌遺伝子は変異型の癌細胞で発現するか、あるいは正常型で過剰発現する。かかる癌遺伝子の産物は細胞増殖を促進する。非変異型、すなわち正常に発現する形態の癌遺伝子は原癌遺伝子として知られ、これは正常細胞で発現し、正常な細胞機構の構成タンパク質をコードしている。
【０００７】
癌と関連のある別の種の遺伝子産物として、腫瘍抑制遺伝子によって発現されるものがあり、これらの遺伝子産物は細胞増殖を抑制する働きをする。一例として網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐＲＢ）がある。腫瘍抑制遺伝子の突然変異または遺伝子産物の機能欠損は正常な増殖制御の欠如をもたらし、細胞は制御を外れて分裂する。
【０００８】
腫瘍細胞およびそれらの癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の研究は、細胞内シグナル伝達カスケードの複雑なネットワークにより、正常な細胞において、増殖因子がいかに細胞増殖を調節しているのかを示す助けとなっている。これらのカスケードは最終的に遺伝子転写ならびに細胞周期制御系の構築および活性化を調節する。最近の分子腫瘍学の進展は癌細胞において量的または質的に変化しているタンパク質の同定をもたらした。多くの場合でこれらのタンパク質は細胞分裂の制御において重要な鍵経路に関与している。これらの分子経路を同定することは、推定治療標的（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ）を同定する助けとなる。さらに、これらの標的は腫瘍において回帰的に変化を受けるという意味において遺伝的基礎を持つことが示され、悪性表現型の維持の原因となる役割を果たしている可能性がある。特異的治療は推定標的に対して、非腫瘍性の相手に寛容でありつつ、癌細胞を抑制または排除するように工夫することができる。
【０００９】
正常な細胞周期制御系は２種類の主要なファミリーのタンパク質に基づいている。１つはサイクリン依存性タンパク質キナーゼ（Ｃｄｋ）ファミリーであり、これにはいくつかの変種、例えばＣｄｋ １およびＣｄｋ ２が存在する。Ｃｄｋはセリンおよびトレオニン残基で選択されたタンパク質をリン酸化する。もう１つのタンパク質種はＣｄｋ分子と結合し、それらの標的をリン酸化する能力を制御するサイクリンと呼ばれる特殊な活性化タンパク質ファミリーである。サイクリン自体は細胞周期の各分裂の中で合成および分解を受ける。例えばサイクリンＡおよびサイクリンＢなど様々な種のサイクリンが存在する。
【００１０】
Ｃｈａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ９８５−９９０は、患者のサイクリンＡの過剰発現と正常なサイクリンＡレベルを発現する患者と比較した腫瘍細胞の増殖活性との間の関係を報告している。サイクリンＡを過剰発現する患者は過剰発現しない人より中度の無病生存時間が短かった。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ （１９９８）はまた、サイクリンＡ相互作用タンパク質（Ｓｋｐ２）が過剰発現した場合にはサイクリンＡと同様の腫瘍細胞活性との関連を示さなかったことを報告している。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ （１９９８） はＳｋｐ２の発現がどのように細胞周期の進行の制御に関与していると考えられるかについて述べているが、Ｓｋｐ２の実際の生化学的機能はまだ分かっていないとも注記している。
【００１１】
もっと最近の報告では、Ｃｈａｏ Ｙ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １３９： １−６は、サイクリンＡが新しい抗肝細胞癌（ＨＣＣ）治療薬の推定のための有用な標的となり得るものと結論付けている。特に、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ （１９９９）は、ＨＣＣ細胞におけるサイクリンＡの過剰発現がサイクリンＡ遺伝子のアンチセンスｍＲＮＡで阻害することができたとしている。Ｓｋｐ２の過剰発現はまた明らかにＨＣＣ細胞増殖と関連しているが、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ （１９９９）はＳｋｐ２の生化学的機能はまだ分かっていないとしている。例えば、アンチセンスｍＲＮＡを用いたＳｋｐ２の過剰発現を阻害しようとした実験の結果は、異常なＳｋｐ２発現がＨＣＣ増殖とは直接的な関係がないことを示唆している。
【００１２】
ＣＤＫの活性は細胞内で調節を受け、ＣＤＫ阻害剤タンパク質（ｐ２７）が同定されている。正常細胞では、ｐ２７はＤＮＡ複製に必要なＣＤＫの作用を調節することが示されている。ｐ２７のレベルは休止細胞で高く、分裂刺激細胞では低いことが分かっている。ｐ２７は、それ自体細胞分裂を駆動する活性型のＣＤＫを阻害することで細胞分裂のブレーキとして働くと考えられる。ｐ２７レベルの低下は活性化ＣＤＫを阻害から解放し、細胞分裂を駆動する。このｐ２７の活性は、一般に癌患者の腫瘍の攻撃性および予後の悪さと関連する経過と一致する。
【００１３】
細胞周期制御系は動的な系であって、ｐ２７それ自体が細胞内で一定のレベルに維持されるわけではない。ｐ２７レベルの低下はユビキチン化とそれに次ぐプロテオソームを媒介とする分解によるブレークダウンによって起こる。ｐ２７のユビキチンを媒介とする分解の必要条件は活性化ＣＤＫによるトレオニン残基１８７（Ｔ１８７）のリン酸化である。
【００１４】
細胞内タンパク質ブレークダウンのユビキチン系は通常の生物機能の媒介であり、腫瘍発達を伴うある種の異常である（Ｋｏｅｐｐ Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｃｅｌｌ ９７： ４３１−４３４； ａｎｄ Ｋｒｅｋ Ｗ． （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ８： ３６−４２）。リン酸化ｐ２７のユビキチン化に必要な酵素はまだ分かっていないが、酵母などの系におけるユビキチン化の知見からはｐ２７に特異的なヒトユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）である可能性があると予測される。Ｆボックス／ロイシンリッチリピートを含む癌タンパク質Ｓｋｐ２は腫瘍のシグナル伝達に役割を持つようである。Ｓｋｐ２はユビキチン化機構の基質特異的レセプターとして機能すると考えられる（ユビキチン化および分解に関するタンパク質をターゲッティングするＳＣＦユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｌｉｓｚｔｗａｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ． １７： ３６８−３８３）。Ｓｋｐ２は細胞周期導入動態の調節に重要な役割を果たし、哺乳類細胞に存在し、ユビキチン化および分解に関してサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり多組織型腫瘍サプレッサーであるｐ２７Ｋｉｐ１をターゲッティングすることが示されている。そうすることで、Ｓｋｐ２は拘束を受けない細胞周期進行を促進する（Ｓｕｔｔｅｒｌｕｅｔｙ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １（４）： ２０７−２１４）。
【００１５】
より詳しくは、Ｓｕｔｔｅｒｌｕｅｔｙ Ｈ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １： ２０７−２１４により、Ｓｋｐ２はユビキチン化経路によって細胞のｐ２７分解を促進していることが報告されている。Ｓｋｐ２はＦボックスタンパク質（ＦＢＰ）ファミリーのメンバーであることが確認されている。Ｓｋｐ２はＳｋｐ １、ＣｕｌＩ（Ｃｄｃ５３）、Ｆボックスタンパク質（ＳＣＦ）複合体のｐ２７特異的レセプターであると思われる。かかる複合体は酵母で知られており、ユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）として作用し、そこではＦＢＰサブユニットがユビキチン化の基質に特異性を有する。Ｅ３はユビキチンコンジュゲート酵素（Ｅ２）から分解される基質への、活性化ユビキチン分子の転移を促進する。同様に、ヒトではＳＣＦ複合体が存在し、Ｓｋｐ２は、ｐ２７と特異的に相互作用する能力を有してかつ、ユビキチンを媒介とするｐ２７の分解に不可欠であると思われるＦＢＰである。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、Ｓｋｐ２はリン酸化されたｐ２７をユビキチン化して分解する細胞機構の律速成分であることが分かっている。
【００１６】
Ｓｕｔｔｅｒｌｕｅｔｙ ｅｔ ａｌ （１９９９）（上記）は、ＳＣＦ複合体へと組み込まれないＳｋｐ２の変異体が、異所産生された野生型ｐ２７の排除を促すのに欠陥があることを見出した。また、変異型Ｓｋｐ２はサイクリン−Ｅ／Ａ会合キナーゼの活性化とＳ期の誘導をもたらした。Ｓｋｐ２はまたＣＤＫに対して非依存的な結合部位を有するものと思われるが、活性化されたＣＤＫはｐ２７のＴ１８７残基のリン酸化に関与する。Ｓｕｔｔｅｒｌｕｅｔｙ ｅｔ ａｌ （１９９９）（上記）はまた、サイクリン−Ｅ／Ａ依存性キナーゼの活性化およびＳ期への導入が非分解性ｐ２７変異体の発現によって阻害されている場合であっても、正常なＳｋｐ２がいかにしてサイクリンＡの集積を誘導するのかを示している。結論としては、Ｓｋｐ２はサイクリンＡをアップレギュレートし、これとは無関係にｐ２７をダウンレギュレートするということである。Ｓｋｐ２がサイクリンＡをアップレギュレートする機構は分かっていない。形質転換細胞で見られた高レベルのＳｋｐ２は少なくともある部分では腫瘍抑制剤ｐ２７の分解速度を高めることで腫瘍形成のプロセスに寄与する可能性があるという示唆がある。ｐ２７発現の欠如は結腸直腸癌および乳癌患者の無病生存率の低さと相関している。また、ｐ２７は腫瘍抑制に関してはハプロインサフィシエント（ｈａｐｌｏ−ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）であることも分かっている。
【００１７】
Ｃａｒｒａｎｏ Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １： １９３−１９９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの双方でＳｋｐ２がいかにしてリン酸化されたｐ２７と物理的に相互作用するかを報告している。ｐ２７のユビキチン化に必要とされるリガーゼ機構のどの成分もまだ発見されておらず、Ｃａｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ （１９９９）はＳｋｐ２がこの機構の一部であって、ｐ２７の基質認識と特性を与えることを示している。Ｓｋｐ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞のＳｋｐ２発現を低下させ、それによって内在するｐ２７のレベルの上昇をもたらすことが分かっている。Ｃａｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ （１９９９） はまた、ｐ２７のユビキチン化が起こるためのサイクリンＥ−ＣＤＫ ２またはサイクリンＡ−ＣＤＫ ２のさらなる必要性を確認している。細胞におけるｐ２７分解は細胞分裂後のＳｋｐ２およびサイクリン両者の集積によって二重の制御を受けると思われる。
【００１８】
ヒト癌において変化している遺伝子の多くは細胞周期および遺伝子転写の制御の中枢である分子経路を規定するものである。例えば、大部分のヒト癌は網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐＲＢ）を直接または間接的に不活性化して、Ｇ１期からＳ期に入る細胞の脱調節移行をもたらす突然変異を有している。ｐＲＢを直接または間接的に不活性化する突然変異の例としては、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、Ｃｄｋ４およびサイクリンＤ１など、アンタイムリーな（ｕｎｔｉｍｅｌｙ）ｐＲＢのリン酸化をもたらし、ゆえにその機能の不活性化をもたらす突然変異作用遺伝子が挙げられる。
【００１９】
ｐＲＢはＥ２Ｆ細胞周期型調節転写因子ファミリーのメンバーと結合し、そうすることでそれらを転写アクチベーターから転写レプレッサーへと変換する（Ｓｈｅｒｒ Ｃ．Ｊ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： １６７２−１６７７）。従って機能的ｐＲＢを欠いた細胞はｐＲＢ−Ｅ２Ｆ転写レプレッサー複合体の欠損および転写を活性化し得る過剰量の遊離型Ｅ２Ｆを特徴とする。Ｅ２Ｆレベルの上昇は細胞で細胞増殖を誘導することができるが、数系統の証拠が、遊離型Ｅ２Ｆの増加は、癌細胞の、ｐ５３依存的およびｐ５３非依存的経路によるアポトーシスによる細胞死の受けやすさと相関があることを示唆している（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １１： １８５３−１８６３； Ｑｉｎ Ｘ．−Ｑ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０９１８−１０９２２； Ｗｕ Ｘ． ＆ Ｌｅｖｉｎｅ Ａ．Ｊ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ３６０２−３６０６）。Ｅ２Ｆの後者の特性は、多くの腫瘍がｐ５３機能を欠損していることから癌治療で注目されている（Ｌｅｖｉｎｅ， Ａ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ８８： ３２３−３３１）。このように、正常細胞と癌細胞の間には特定の違いが存在し得る。これらの違いの同定および推定は、それらの正常な相手には手を付けずに癌細胞を選択的にターゲッティングできる新しい機会を提供し得る。
【００２０】
高レベルのＥ２Ｆ−１がＧ１期からＳ期へ入る好適な移行物質であることが分かっている（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｄ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６５： ３４９−３５２）。Ｓ期で、Ｅ２Ｆ−１活性もまたサイクリンＡ−サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）２によってダウンレギュレートされる（Ｄｙｎｌａｃｈｔ Ｂ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８： １７７２−１７８６； Ｋｒｅｋ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ８： ３６−４２）。Ｓ期においてサイクリンＡ−Ｃｄｋ２がＥ２Ｆ−１を不活性化できないことでアポトーシスがもたらされる（Ｃｈｅｎ Ｙ．−Ｎ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ４３２５−４３２９ ａｎｄ　Ｋｒｅｋ Ｗ． ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｃｅｌｌ ８３： １１４９−１１５８）。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）（上記）は、腫瘍細胞が、不活性化されたｐＲＢ経路による高レベルのＥ２Ｆ−１活性のためにサイクリンＡ−Ｃｄｋ２アンタゴニストに独自に感受性がある可能性あることを示唆している。実際、サイクリンＡ−Ｃｄｋ２とＥ２Ｆ−１の相互作用を阻害する細胞膜透過性ペプチドは多様な腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するが、非形質転換細胞では誘導しない（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）（上記））。その他のシグナル伝達経路としては、ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）により調節されるものをはじめ、多くのタイプの癌で破壊されていることが分かっている（Ｋａｅｌｉｎ Ｗ．Ｇ． ＆ Ｍａｈｅｒ Ｅ．Ｒ． （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １４： ４２３−４２６）。
【００２１】
放射線療法は頭頚部癌の重要な治療法であり、最終的な結果は固有の放射線感受性をはじめとする種々の腫瘍および宿主因子によって異なる（Ｐｅｒｅｚ Ｂ． （１９９２）”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ”： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。治療指数を高める療法、すなわち放射線療法が腫瘍細胞を死滅させ、正常な組織の損傷がなお修復可能であるという一定の領域が必要とされる。腫瘍の放射線感受性を少しでも高めれば、腫瘍の制御という点で大きな利益が得られる。正常組織の構造は多くの場合、安全に受けることができる放射線総量に限りがあるので、従って腫瘍の放射線感受性を操作することで腫瘍制御の著しい向上がもたらされる可能性がある。（Ｆｉｓｈｅｒ Ｄ．Ｅ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７８： ５３９−５４２）。
【００２２】
マウス腫瘍モデルではｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、Ｅ２Ｆ−１レベルを高めると電離放射線の細胞傷害作用を高めることができる。このことは、Ｅ２Ｆ−１の細胞内レベルを操作すれば腫瘍細胞をアポトーシス経路に追いやり、それらの放射線感受性を高められるという見解と一致している（Ｐｒｕｓｃｈｙ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １０： １４１−１４６）。同様に、神経膠腫におけるＥ２Ｆ−１の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでもアポトーシスを誘発して腫瘍増殖を抑制することが示されている（Ｆｕｅｙｏ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ６８５−６９０）。
【００２３】
癌治療の可能性の１つの一般的な方向性は、腫瘍細胞選択的な導入遺伝子の発現を可能とする戦略にある（Ｂｉｎｌｅｙ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６： １７２１−１７２７； Ｈｅｉｓｅ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３： ６３９−６４５； ａｎｄ Ｐａｒｒ Ｍ．Ｊ．　ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３： １１４５−１１４９）。アデノウイルスに基づくベクターをはじめ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて導入遺伝子を腫瘍へ送達するにはいくつかのアプローチを利用することができる（Ｂｅｎｉｈｏｕｄ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： ４４０−４４７）。
【００２４】
本発明の目的は癌患者の現行の治療計画を改良することにある。
【００２５】
本発明者らは、広範な腫瘍細胞種でＳｋｐ２の存在度がこれまでに予想されていたものよりも著しく上昇していることを見出した。本発明者らはまた、癌細胞ではＳｋｐ２の発現を調節する経路が一般的に調節を受けていないということを始めて明らかにした。
【００２６】
本発明者らは予期しないことに、多くの癌細胞においてＳｋｐ２ ｍＲＮＡの発現の脱調節（ｄｅｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ）がＳｋｐ２タンパク質発現の脱調節の原因であることを見出した。
【００２７】
本発明者らはまたＳｋｐ２プロモーターを同定、限局化および配列決定した。本発明者らは、驚くことに、腫瘍細胞におけるＳｋｐ２ ｍＲＮＡの発現の脱調節とＳｋｐ２プロモーター活性の間に関連を見出した。すなわち、Ｓｋｐ２プロモーターは主としてある種の腫瘍細胞では活性であるが、それらの対応する正常細胞では活性でない。
【００２８】
総じて、本発明者らは予期しないことに、好適な導入遺伝子、例えばアポトーシスを引き起こす遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍細胞特異的発現を駆動する方法として、癌細胞特異的遺伝子発現法においてＳｋｐ２プロモーター、例えば組合せウイルスベクター、より詳しくはアデノウイルスベクターを用いることができる。
【００２９】
従って第一の態様では、本発明はＳｋｐ２プロモーター配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このプロモーター配列を含むポリヌクレオチドは単離された形態であるという点で天然のプロモーター配列とは異なっている。単離された形態には様々な程度の純度が付随するが、ポリペプチドは実質的に純粋な形態であることが好ましい。これは数値の上では、サンプル中に他の夾雑核酸（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）またはポリヌクレオチドを含まないという意味において約６０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、いっそう好ましくは９５％または９９％の純度を意味する。純度は多くの方法で確認できるが、一つの便宜な方法として、当業者に周知のように例えばゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を行うことが挙げられる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは合成品であっても、クローニングなどの組換え手段によって得てもよく、これらの方法はいずれも当業者に周知である。
【００３１】
ポリヌクレオチドは約１５を超える、所望により約２５を超える、所望により約５０を超える、所望により約１００を超える、所望により約２００を超える、または約５００を超えるヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの最大数はその用途に用いる手法に関してポリヌクレオチドの安定性によって決まる。せいぜい１０ｋｂ、所望により５ｋｂまたは１ｋｂのポリヌクレオチドが本発明の範囲内である。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドの全体または一部はＳｋｐ２プロモーター配列を含み、この配列は少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも５０、いっそう好ましくは少なくとも１００、最も好ましくは少なくとも３５０ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、プロモーター配列は３６０〜３７５ヌクレオチド、好ましくは３６４〜３７０ヌクレオチド、最も好ましくは３６５、３６６または３６７ヌクレオチドを含む。好ましいプロモーター配列としては、例えば図３に示されているようなＳｍａ Ｉ断片がある。
【００３３】
従って本発明は配列番号１（図１Ａ−１Ｃ）もしくは配列番号２（図２）で示されるポリヌクレオチド、またはその１以上の断片を含む。いずれの断片も連続するように連結することができ、すなわち、除かれた部分および残っている部分を有する配列番号１のポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドは連続するように連結される。
【００３４】
好ましい実施形態としては、ポリヌクレオチドがＳｋｐ２プロモーターの１以上の機能的特性または活性、例えば転写因子結合部位または調節因子結合部位、例えばＥ２Ｆ１結合部位または相同配列を有するものがある。かかる結合部位は、経験的に決定するか、プロモーター配列中の結合のための共通配列を同定することを通じて決定するか、またはその両方により決定することができる（タンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究することによる）。特に、好ましいポリヌクレオチドは領域１〜４（図２）の少なくとも１つ、好ましくは領域２および３の少なくとも１つ、またはそれらの組合せを含む。
【００３５】
配列番号１および配列番号２（またはその断片）と比較した場合の配列変異は本発明の範囲内にあり、変異の程度（すなわち、相同性の程度）はストリンジェント条件、例えば高塩濃度条件下でハイブリダイゼーションを行うことで確認することができる。あるいは、相同性の程度は直接の配列比較により、かつ／または当業者に周知のコンピューター解析法により確認してもよい。本発明は配列番号１または配列番号２の全体または一部と少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、いっそう好ましくは少なくとも７５％、なお好ましくは少なくとも９０％または９５％、最も好ましくは少なくとも９９％相同または同一であり得るポリヌクレオチドを含む。当業者には明らかであろうが、配列番号１または配列番号２で示されるポリヌクレオチド配列のある部分では実質的な配列変異（１００％まで）がＳｋｐ２プロモーター機能の欠損なく許容されるが、小さい変異はＳｋｐ２プロモーターの機能または活性にとって重要な領域にも許容され得る。例えば、ヒトＳｋｐ２プロモーター配列などの種ホモログが領域１〜４（図２）の配列番号１または配列番号２、好ましくは領域２および３と、これらの領域以外の配列よりも高い程度の相同性を有すると予測される。
【００３６】
同様に当業者ならば、Ｓｋｐ２プロモーターの機能または活性にとって重要な１以上の領域の互いの配向およびそれと作動可能なように連結された転写配列はプロモーター活性に影響を及ぼし得ることがわかるであろう。このように好ましい実施形態では、この配向は天然に存在する配列（例えば、配列番号２）で見られる。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその他いずれの形態の核酸（例えば、ヘテロ二重らせん）であってもよい。このように本発明のポリヌクレオチドが一本鎖である場合には、本発明は相補鎖を含む。
【００３８】
Ｓｋｐ２プロモーターの断片であって、少なくとも６から８のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０または１２のヌクレオチドのポリヌクレオチドであるが、Ｓｋｐ２プロモーター活性を持たないものは、ゲノム解析、診断アッセイまたは単にＰＣＲにおいてツールとして用いるプライマーおよびプローブとしての用途を持ち得る。当業者には明らかなように、かかるポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドの組合せ）はＳｋｐ２プロモーター配列に特異的なものである。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドはヌクレオチド類似体、例えば非天然合成ヌクレオチド類似体であるキューオシンまたはワイブトシンおよびアセチル−、メチル−、チオ−またはその他エンドヌクレアーゼによって認識されない標準的ヌクレオチドの化学修飾形態から、全体であれ一部であれ、作製されたものが挙げられる。また、例えばホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの主鎖修飾類似体を含むポリヌクレオチドも含まれる。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドはプロモーター配列に作動可能なように連結された転写配列を含んでもよい、あるいはさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、転写配列の発現産物は細胞死または活性の低下を引き起こすか、あるいは細胞分裂を阻害する。転写配列は直接または間接的にその作用を発揮し得る。従って転写配列はアポトーシスと関連があるものであり得る。転写配列は潜伏していて何らかの方法で活性化され得る産物をコードするか、あるいは基質、例えば活性な医薬へ変換されるプロドラッグに作用する産物をコードする。別の例では、転写配列はチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードしてもよく、ガンシクロビルを投与した際にＴＫ発現細胞は選択的に破壊される。好ましい実施形態では、転写配列はプロアポトーシス遺伝子であり得る。他の好ましい実施形態では、細胞の照射と発現配列の発現産物、特に適宜形質転換された細胞におけるプロアポトーシス遺伝子の産物との間の相乗作用的関係に利点がある。
【００４１】
転写配列のその他の好ましい発現産物として毒素がある。転写配列のなおさらに好ましい発現産物としては、放射線療法または化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高めるものがある。
【００４２】
その他の有用な実施形態は、レポータータンパク質またはペプチドをコードする転写配列を有し得る。レポーターは例えば酵素、リガンド結合タンパク質、蛍光タンパク質またはリン光タンパク質の１以上から選択できる。このレポータータンパク質はホタル・ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質もしくは他の蛍光タンパク質、またはヒト分泌型アルカリ性ホスファターゼから選択できる。腫瘍細胞における可視マーカーの存在が、例えばレーザーによる腫瘍細胞の除去によるなど、患者から細胞を切除しようとする外科医の指標となり得るのが有利である。マーカータンパク質は腫瘍細胞が鮮明になり、容易に識別できるようにレーザー光線の周波数を調節するように（またはその逆）選択することができる。
【００４３】
さらなる実施形態では、転写配列は抗体フラグメントまたはマーカータンパク質、好ましくは細胞表面マーカーであってもよい。かかるマーカーは細胞死滅剤と結合されたマーカーまたは物理的マーカー、例えば患者から腫瘍細胞を切除しようとする外科医の指標となる蛍光タンパク質に特異的な抗体に対する標的として働き得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、転写配列としてプロアポトーシス遺伝子を含む。
【００４５】
特定の実施形態では、転写配列はアンチセンス配列であり得る。
【００４６】
本発明のもう１つの態様は以上に記載されたポリヌクレオチドのいずれかに対してアンチセンスであるポリヌクレオチドである。
【００４７】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝構築物が提供される。遺伝構築物は通常、例えば発現プラスミドまたはミニ遺伝子を構成する中間体となる。好適な構築物としては、リンカー、制限部位または選択マーカーが挙げられる。
【００４８】
もう１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。プラスミドは本発明のポリヌクレオチドをクローニングする好適な手段を提供することができるか、細胞内で、または細胞フリー系での発現を達成するのに便宜なビヒクルを提供し得る。
【００４９】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターが特に有用である。これらのベクターはトランスフェクションおよび理想的には細胞の形質転換を可能とする。またこれらのベクターは、宿主細胞での転写配列の発現を得ることを目的とする、本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞への導入を可能とする。
【００５０】
本発明の性能において有用なベクターとしては、ウイルス性のものであっても非ウイルスのものであってもよい。非ウイルスベクターとしては、典型的にはタンパク質およびヒト人工染色体を発現するための発現カセットを伴ったプラスミドおよびエピソームベクターが挙げられる。転写配列の発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ならびにその他の市販のものが挙げられる。
【００５１】
有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアおよびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を基にしたものが挙げられる。アデノウイルスが好ましい。これらのウイルスはしばしば、改変されたウイルスゲノムとそれを封入する外被の２成分からなっている。ウイルスベクターはまた、外被を欠いているという意味において裸のものであってもよい。
【００５２】
ベクターはエンハンサー配列、ならびにエピソームの維持、染色体組込みまたは高レベル転写に必要なその他のいずれかの調節エレメントをさらに含んでもよい。選択マーカーおよびその他の識別配列もベクターの有用な成分となり得る。細胞の内外でベクターの安定を与える、またはそのベクターを所定の細胞種のトランスフェクションに向ける、または細胞への侵入を媒介する助けとするため、なおさらなる配列を含んでもよい。ウイルスベクターの一部として特に有用なのは腫瘍細胞表面特異的マーカーに結合するリガンドである。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドはリポソームまたは免疫リポソームによって標的細胞へ導入してもよい。リポソーム組成物はリポソームをある細胞種または組織と融合するように選択的に向けることができる。リポソームは標的細胞種に特異的な細胞表面マーカーに特異的な結合タンパク質またはリガンドを含み、それにより本発明のポリヌクレオチドの優先的に、またはもっぱら所望の腫瘍細胞への侵入を助けることができる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドを細胞へ送達する他の方法としては、直接的細胞取り込みまたは衝撃法によるものがある。
【００５５】
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたは好ましくはアデノウイルスを含有する細胞を含む。
【００５６】
もう１つの態様では、本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ウイルスまたはアデノウイルスを導入することを含む、腫瘍細胞死滅法を提供する。導入はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも起こり得る。例えば、ベクターが複製してさらなる細胞、好ましくは特に癌細胞に感染することが可能である場合、患者から癌細胞を抽出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させ、再び患者に導入することができる。
【００５７】
従って本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスの有効量を個体に投与することを含む癌の治療または予防方法を提供する。
【００５８】
もう１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスを細胞へ導入することを含む、細胞においてＳｋｐ２の発現を阻害する方法を提供する。この阻害は部分的なものであっても全体的なものであってもよい。
【００５９】
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスを含む医薬組成物を提供する。好ましい医薬組成物は１以上の医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、水またはデキストロースをさらに含む。非経口または経口などのあらゆる投与形が本発明の範囲内にあり、これらの製剤は同時投与用であれ、個別投与用であれ、逐次投与用であれ、その他の有効薬、例えばタキソールなどの化学療法薬を含んでもよい。
【００６０】
結果として本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスの医薬としての使用を含む。
【００６１】
本発明は癌の治療または予防用医薬の製造に用いる、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスを含む。癌は高いｓｋｐ２プロモーター活性（すなわち、ＳＫＰ２発現）を示すことが好ましい。癌は例えば肺癌、胃癌、乳癌、結腸／直腸癌、子宮頚癌および頭部または頚部癌から選択されるものであり得る。
【００６２】
もう１つの態様では、本発明は、Ｓｋｐ２プロモーター活性を調節する化合物を同定する方法であって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスと化合物を接触させ、プロモーター活性の変化を検出することを含む方法を提供する。プロモーター活性は、転写配列の発現量（または対照と比較した相対的レベル）を測定する発現系で求めることができる。あるいは、プロモーターに結合する転写因子（例えば、Ｅ２Ｆ１）に対する作用またはプロモーター活性を求めるその他いずれかの方法を用いることができる。試験する化合物は合成品であっても天然に存在するものであってもよい。
【００６３】
Ｓｋｐ２プロモーター活性を調節する化合物を同定するもう１つの方法は、Ｓｋｐ２プロモーターの制御下で転写配列を発現する形質転換宿主細胞を化合物と接触させた後、その転写配列の発現量を測定することを含む。
【００６４】
Ｓｋｐ２プロモーター調節化合物を同定する上記の方法において、発現量を測定するのに用いる発現系はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよく、すなわち、後者の場合の系は細胞フリー系であり得る。発現量は転写配列の発現産物の量を測定することで求めればよく、例えば蛍光、酵素活性またはリガンド結合アッセイなど、産物に組み込まれた標識の検出、あるいは産物の天然（または誘導型）の特性の検出がある。測定したプロモーター活性における低下は、その試験化合物がＳＫＰ２プロモーター活性の阻害剤であることを示す。
【００６５】
本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ウイルスまたはアデノウイルスを細胞へ導入するか、または本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定された化合物を投与することを含む、細胞においてＳｋｐ２プロモーターを阻害する方法を含む。
【００６６】
当業者には明らかなように、本明細書に記載の方法および材料は、抗癌薬および癌治療薬のスクリーニングに特に有用であるが、不適当なＳｋｐ２プロモーター活性によるいずれの疾病または疾患にも有用である。
【００６７】
以下、本発明の好ましい実施形態を図面を参照しながら特定の実施例によって説明する。
【００６８】
以下の実施例は単に例示を目的として示すものであって、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００６９】
実施例
細胞培養。以下の実施例で用いる細胞は、ラット胚繊維芽細胞ＲＥＦ５２、継代回数の少ないネズミ胚繊維芽細胞ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、形質転換ヒト胚腎細胞Ｃｒｅ８；ＡＣＨＮ腎腺癌（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１１）、ヒト胚肺繊維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＧ０５９６５Ｂ）、ＭＲＣ５−ＳＶ４０（ＡＧ１００７６）、ＩＭＲ９０（ＩＭＲ９０）、ＩＭＲ９０−ＳＶ４０（ＡＧ０３２０４Ａ）（全てｔｈｅ ＮＩＡ Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ （Ｃａｍｄｅｎ， ＮＪ）から）、およびヒト乳房上皮細胞ＨＭＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅから）であった。ＨＭＥＣは供給者から購入した添加剤（ウシ下垂体抽出物、ヒト組換えＥＧＦ、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびゲンタマイシン）を添加した乳房上皮細胞基本培地で培養した。その他の乳房細胞としては、ＳＫＢＲ−３（乳腺癌ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３０由来の悪性胸膜滲出液）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳腺癌ＡＴＣＣ ＨＴＢ ２６由来の胸膜滲出液）、ＢＴ４７４（乳腺管癌細胞ＡＴＣＣ ＨＴＢ ２０）であった。ＲＰ−ＴＥＣ はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｅｕｒｏｐｅから購入し、供給者が奨励する培地で培養した。ＨＭＥＣおよびＲＰＴＥＣ以外の全ての細胞は１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭで維持した。
【００７０】
実施例１　マウスＳｋｐ２プロモーターのクローニング
Ｔｈｅ ＧＩ−Ｈ３（５’−ＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＣ−３’； 配列番号３）およびＧＩ−Ｈ４（５’−ＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＡＣＴＡＡＧ−３’； 配列番号４）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりＢＡＣ（細菌人工染色体）マウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（図３）。このゲノムライブラリーは胚幹細胞ＤＮＡから作製したものである（Ｓｈｉｚｕｙａ ｅｔ ａｌ， （１９９２） ＰＮＡＳ ８９： ８７９４−８７９７）。かかるＤＮＡライブラリーは市販されている。Ｈ３およびＨ４プライマーを用いたマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅の産物はマウスＳｋｐ２遺伝子のエクソン２に相当する２７７ｂｐの断片である。
【００７１】
標準的な技術を用い、２７７ｂｐ断片を含むことが分かっているＢＡＣクローンからＤＮＡを調製した。ＢＡＣクローンのＤＮＡをＳｐｅ Ｉ（図３）で消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へサブクローニングした。Ｈ３およびＨ４を含むサブクローンを同定および単離して、ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂと呼称した。このクローンを外部（Ｔ３およびＴ７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター特異的）および内部（クローン特異的）オリゴヌクレオチドならびに標準的な技術を用いて配列決定した。
【００７２】
ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂｂの配列決定に用いた内部オリゴヌクレオチドは
ＧＩ−Ｈ３： ５’−ＴＡＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＣ−３’ （配列番号３）
ＧＩ−Ｈ４： ５’−ＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＡＣＴＡＡＧ−３’ （配列番号４）
ＧＩ−Ｉ１： ５’−ＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡ−３’ （配列番号５）
ＧＩ−Ｉ２： ５’−ＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＧ−３’ （配列番号６）
ＧＩ−Ｉ５： ５’−ＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＣＴＧＧ−３’ （配列番号７）
ＧＩ−Ｉ６： ５’−ＣＧＣＧＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧ−３’ （配列番号８）
ＧＩ−Ｉ７： ５’−ＣＡＴＴＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＣＣ−３’ （配列番号９）
ＧＩ−Ｉ８： ５’−ＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＴＧＴＧ−３’ （配列番号１０）
ＧＩ−Ｉ９： ５’−ＴＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣ−３’ （配列番号１１）
ＧＩ−Ｊ１： ５’−ＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＴＴＡＣＧ−３’ （配列番号１２）
ＧＩ−Ｊ２： ５’−ＡＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣ−３’ （配列番号１３）
であった。
【００７３】
ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂは全長４６０２ｂｐで、マウスＳｋｐ２遺伝子のエクソン１および２、ならびに約３０００ｂｐの上流５’配列を含む（図３参照）。図２（配列番号２）は図３で示されるＳｐｅ Ｉ断片のＳｍａ Ｉ消化のＤＮＡ配列を示す。このＳｍａ Ｉ断片も図３で示され、ｐＧＬ３＃２１と呼ぶ。図１Ａ〜１ＣはｐＢＡＣ８４Ｇ１のＤＮＡ配列（図３のＳｐｅ Ｉ断片の誘導体であるが、エクソン２のコード領域をいくらか欠いている）を示す。
【００７４】
転写開始部位の同定にはＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）解析を用いた。要するに、ネズミ精巣から単離した全ＲＮＡを、エクソン２（５’ＣＴＣＣＣＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＡ３’； 配列番号１４）においてハイブリダイズするＳｋｐ２特異的プライマーを用いたＡＭＶ−ＲＴで逆転写した。製造業者が奨励する手順を用い、ｃＤＮＡを精製し（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ， Ｒｏｃｈｅ）、ＯｌｉｇｏｄＴアンカー（Ｒｏｃｈｅ）で末端処理した。１回目のＰＣＲはＯｌｉｇｏｄＴアンカーとネスティッドＳｋｐ２特異的プライマー（５’ＧＡＧＣＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＣＡ３’； 配列番号１５）を用いて行った。２回目のＰＣＲはＯｌｉｇｏｄＴアンカーと別のネスティッドＳｋｐ２特異的プライマー（５’ＣＡＴＣＣＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴ３’； 配列番号１６）を用いて行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳａｌＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へサブクローニングした。ＲＡＣＥ解析によれば、約２５０ｂｐのＰＣＲ断片が優勢であり、それにより主要転写開始部位が確認された。
【００７５】
４種類の異なるＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂ断片を、それら各々の特異的プロモーター活性を研究するため、ｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のルシフェラーゼ遺伝子の上流にサブクローニングした。これらのクローンは図４にグラフで示されている。
ｉ）　ｐＧＬ３ ＃５−ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂの塩基１番から３６５８番にわたるＳｐｅＩ−ＰｍｌＩ断片
ｉｉ）　ｐＧＬ３ ＃１５−ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂの塩基１番から３０１９番にわたるＳｐｅＩ−ＳｍａＩ断片
ｉｉｉ）　ｐＧＬ３ ＃２１−ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂの塩基２６５４番から３０１９番にわたる３６６ｂｐのＳｍａＩ−ＳｍａＩ断片
ｉｖ）　ｐＧＬ３ ＃２８−ＢＡＣ８４−Ｓｐ１Ｂの塩基１番から６５４番にわたるＳｐｅＩ−ＳｍａＩ断片
【００７６】
ｐＧＬ３＃２１は、ＢＡＣ８４−ＳＰ１ＢをＳｍａＩで消化し、その断片をｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結することで構築した。ｐＧＬ３＃２１は強力なレポーター発現を駆動し、Ｅ２Ｆ−１によって活性化されるに十分な情報を含むことが分かった。
【００７７】
実施例２　ＭＥＦ、ＩＭＲ９０およびＭＲＣ５細胞におけるｐＧＬ３＃２１の特性決定
２つの異なる系を用いてＳｋｐ２プロモーターを同定した。一次マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）およびそれらと対応するＥ１Ａ／ｒａｓ形質転換誘導体（ＭＥＦ−Ｅ１Ａ／ｒａｓ）をＳｋｐ２プロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクトし、プロモーター活性を測定した。Ｓｋｐ２プロモーターはＭＥＦではレポーター活性をほとんど示さなかったが、形質転換誘導体では活性が高まった。
【００７８】
ノーザンおよびウエスタンブロット解析によれば、ＭＥＦ−Ｅ１Ａ／ｒａｓ細胞ではＳｋｐ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルも同様に高まったが、このことはＳｋｐ２の発現がＥ１Ａおよびｒａｓ癌タンパク質によって影響を受けることを示唆している。前者はｐＲＢ経路を破壊し、それによりＥ２Ｆを遊離することがよく知られている。
【００７９】
ヒト細胞株でも同じタイプの分析を行った。具体的には一次ヒト肺繊維芽細胞ＩＭＲ９０（またはＭＲＣ５）および対応するＳＶ４０ラージＴ抗原形質転換誘導体で並行してＳｋｐ２プロモーター活性を測定した。ここでもまたＳｋｐ２プロモーター活性は正常細胞では低く、形質転換細胞株では極めて高かったが、このことはＳｋｐ２プロモーター活性と形質転換状態の連関の可能性を示唆している。
【００８０】
より詳しくは、ｐＧＬ３＃２としてサブクローニングされたプロモーター断片の活性を、ＭＥＦ（ネズミ胚繊維芽細胞）、Ｅ１Ａ＋ｒａｓ形質転換ＭＥＦ、ヒト肺繊維芽細胞ＭＲＣ５（またはＩＭＲ９０）およびＳＶ４０形質転換ＭＲＣ５（またはＩＭＲ９０）などの細胞株を１μｇのｐＧＬ３＃２１でトランスフェクトすることで評価した。非形質転換細胞のトランスフェクション効率を至適化するため、市販のＦＵＧＥＮＥ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の説明書に従って用いた。典型的には、細胞を２４ウェルディッシュで８０％密集まで増殖させた。ＦｕＧＥＮＥ（商標）６：ＤＮＡ比３：１（μｌ：μｇ）を用いて、トランスフェクション複合体を形成した。細胞株間でのトランスフェクション効率は、β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミド（０．１μｇ）を同時にトランスフェクトすることでノーマライズした。このように、ウェル当たりに試験プラスミド（ルシフェラーゼを発現）とノーマライズプラスミド（ｌａｃｚを発現）を４９：１の比率で含む全ＤＮＡ５００μｇを加えた。トランスフェクションは典型的には３回とした。
【００８１】
次に、トランスフェクション２４から４８時間後にトランスフェクト細胞株のルシフェラーゼ活性を測定した。要するに、細胞をトランスフェクション２４から４８時間後に回収し、０．１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．８、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＤＴＴ ０．５ ｍＭで溶解した。明澄な上清のルシフェラーゼおよびｌａｃｚ活性を化学発光によりアッセイした。Ｌａｃｚ活性は１，２−ジオキシエタン基質を化学発光レポーターアッセイ系（Ｇａｌａｃｔｏ−ＬｉｇｈｔＴＭ， Ｔｒｏｐｉｘ）で測定した。サンプルはＷｉｎｇｌｏｗソフトで作動するルミノメーター（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ ＬＢ９６Ｐ， ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）にて測定した。形質転換細胞と非形質転換細胞の間でノーマライズしたＳｋｐ２プロモーター活性の代表的な上昇は典型的には少なくとも５倍であった。
【００８２】
形質転換細胞におけるＳｋｐ２タンパク質の内在レベルは、ウエスタンブロット法を用いてアッセイした。全長Ｓｋｐ２に対して作製したポリクローナル抗体（Ｌｉｓｚｔｗａｎ ｅｔ ａｌ， （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ， １７： ３６８−３８３）を用いた。二次抗体としては、市販（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ抗体を用いた。また、増強化学発光（ＥＣＬ）検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた。
【００８３】
Ｓｋｐ２ ｍＲＮＡの内在レベルは、ノーザンブロット法または以下の特異的プライマー：５’ＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＧＧＧＧＡ３’（センス；配列番号１７）および５’ＧＣＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＴＧＡ３’（アンチセンス；配列番号１８）を用いるＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。Ｓｋｐ２ ｍＲＮＡが存在する場合には、長さ約９３２ヌクレオチドの核酸に相当する検出可能なバンドが見られた。Ｓｋｐ２ ｍＲＮＡにおいて３から８倍の上昇が形質転換細胞と非形質転換細胞の間で見られた。
【００８４】
実施例３　Ｓｋｐ２プロモーターのＥ２Ｆ結合部位
可能性のあるＥ２Ｆ部位を含有する０．５ｋｂのプロモーター配列内の４領域のうち３領域に相当するオリゴヌクレオチドは、ゲルシフトアッセイにおいて特異的な様式で組換えＥ２Ｆに容易に結合する。Ｅ２Ｆを用いたゲルシフトアッセイはＫｒｅｋ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １５５７−１５６０の記載のように行うことができる。Ｅ２Ｆ部位変異体オリゴヌクレオチドはこれらのＤＮＡ結合シフトアッセイでは組換えＥ２Ｆと結合することができない。これらの結果は、Ｅ２ＦがＳｋｐ２プロモーターを直接活性化させる能力を持つことを示している。より詳しくは、可能性のあるＥ２Ｆ結合部位が豊富な４領域（図２）はＳｋｐ２プロモーターＳｍａ Ｉ断片で見られている。これらの可能性のあるＥ２Ｆ結合部位は、それらが「正規の」Ｅ２Ｆ結合部位（ＴＴＴＳＳＣＧＣ）のコア配列ＳＳＣＧＣ（ここで、ＳはＣまたはＧである）を含有することをもとに、あるいはＴＴＴＳＳＣＧＣ自体と密接に関連していることをもとに同定した。これらの結合部位は４つの個々の領域を包含し、それらの番号は最初のＳｐｅ Ｉプロモーター断片を表し、Ｓｍａ Ｉサブ断片はヌクレオチド２６５４番から３０１９番にわたっている。
【００８５】
便宜のため、以下のＥ２Ｆ結合部位の各々では一本鎖の配列だけを示している：
第一の領域の部位：
２６９３ＧＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡ２７０４（配列番号１９）：ゲルシフト分析ではバキュロウイルスで発現したＥ２Ｆ−１／ＤＰ１との結合は示さなかった。
【００８６】
第二の領域の部位：
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧ２８２４（配列番号２０）（下線はプロモーターの基本活性に寄与するＳｐ１結合部位である）。
これが２８０４ＡＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧ２８２４（配列番号２１）へ変異すると（第一の突然変異）、バキュロウイルスで発現したＥ２Ｆ−１／ＤＰ１を用いたゲルシフト分析における結合が無効となる。プロモーター活性は少なくとも２倍低下したが、Ｅ２Ｆ−１によっては活性化されなかった。
【００８７】
以下のその他の突然変異でも同じ結果が得られた：
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧ２８２４（配列番号２２）が
２８０４ＡＡＴＣＣＡＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＧ２８２４（配列番号２３）へ変異
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧ２８２４（配列番号２４）が
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＧ２８２４（配列番号２５）へ変異
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧ２８２４（配列番号２６）が
２８０４ＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＧ２８２４（配列番号２７）へ変異
【００８８】
第三の領域：
2004500887.tif 000002
下線の部分はＨｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６： １５１３−２３に記載のＥ２Ｆ（ａ）結合部位に同じである。この突然変異はＥ２Ｆ−１の結合を無効とした。プロモーター活性は約２倍低下し、Ｅ２Ｆ−１の抑制によって活性化された。
【００８９】
第三領域の詳細マッピングのためには以下のオリゴヌクレオチドを用いた：
2004500887.tif 000003
【００９０】
第四の領域：
２９９４ＡＧＴＴＣＧＣＧＧＧＴＣＣ３００６（配列番号３６）が
２９９４ＡＧＴＴＡＡＣＧＧＧＴＣＣ３００６（配列番号３７）へ変異
シグナルにおける有意な差は見られなかったが、このことはプロモーター活性がこの第四領域に対する突然変異によっては劇的な影響を受けなかったことを示している。これはＥ２Ｆ−１の活性化を無効にすることはなかった。
【００９１】
実施例４　Ｓｋｐプロモーター−ルシフェラーゼプラスミドおよびＥ２Ｆ−１をコードするエフェクタープラスミドでの細胞の同時トランスフェクション
２９３細胞、ネズミ胚繊維芽細胞およびヒト肺繊維芽細胞をＳｋｐプロモーター−ルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ３＃２１（１μｇ）およびＥ２Ｆ−１またはその変異体をコードするエフェクタープラスミド（０．２μｇ）で同時トランスフェクトした（Ｋｒｅｋ ｅｔ ａｌ， （１９９５） Ｃｅｌｌ， ８３： １１４９−１１５８、およびＫｒｅｋ ｅｔ ａｌ， （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６２： １５５７−１５６０参照）。ＣＭＶプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを同時トランスフェクション実験の対照として用いた。Ｅ２Ｆ−１はＳｋｐ２プロモーターの優れたアクチベーターであると考えられた。ＤＮＡ結合または転写の活性化のいずれかに欠陥があるＥ２Ｆ−１変異体はＳｋｐ２プロモーター−ルシフェラーゼレポーターを活性化することができなかったことから、この活性化は特異的なものであった。Ｓｋｐ２プロモーターは、ｐＲＢ経路が破壊されている場合に過剰に活性化する調節エレメントである。
【００９２】
Ｅ２Ｆ結合部位を含有するその他のいくつかのプロモーターが同定されている。これまでに知られている各々の場合において（例えば、サイクリンＥ、サイクリンＡまたはＥ２Ｆ−１プロモーター）、プロモーター活性は細胞周期調節型であって、休止細胞では検出されないが、細胞がＧ１期を抜けてＳ期に入る際に高くなる（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｒ．Ａ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８５： ４５７−４５９）。
【００９３】
図１Ａ〜１Ｃでは、以下の転写因子結合または相互作用部位が確認される：Ｙｉ、Ａｐ１、Ａｐ２、Ｓｐ１、ＮＦｋＢ、ＹＹ１およびＭｙｂ。また、Ｓｍａ Ｉ制限部位も示されている。最初のＡＴＧコドンはＳｋｐ２構造遺伝子の推定開始部位であり、２番目のＡＴＧコドンは内部メチオニンをコードする。最初のＡＴＧコドンの下流の配列はＳｋｐ２構造遺伝子のエクソン１とエクソン２の開始部を包含する部分的コード配列である。
【００９４】
図２に示されているように、可能性のあるＥ２Ｆ結合部位を含む４領域がある。第一の領域はゲルシフトアッセイで、バキュロウイルスで発現したＥ２Ｆ１と物理的に相互作用しない。しかし上記に示されているように、第二、第三および第四の領域はゲルシフトアッセイでＥ２Ｆ１と結合することが示され、このことはプロモーター活性におけるこれら領域の役割の可能性を示している。さらに、第二および第三の領域の突然変異はプロモーター活性を低下させ、それと同時に後者の場合でＥ２Ｆの活性化を抑制し、プロモーター活性のレベルにおける第二および第三の領域の重要な役割ならびにＥ２Ｆに対する応答における第三の領域の重要な役割を支持している。Ｓｋｐ２プロモーターがＴＡＴＡボックスを持つことは明らかにされていない。
【００９５】
実施例５　Ｓｋｐ２プロモーターの活性は細胞周期中に変更されない
２つの実験を行った。まず内在するＳｋｐ２ ｍＲＮＡレベルを、上記のようにＲＴ−ＰＣＲによってＩＭＲ９０およびＭＥＦ細胞において細胞周期を通して測定した。細胞は血清飢餓により同調化した後、血清刺激した。試験したいずれの細胞でも、細胞周期を通してＳｋｐ２ ｍＲＮＡレベルに明らかな変動は見られなかった。
【００９６】
第二の実験では、クローニング断片ｐＧＬ３＃５、ｐＧＬ３＃１５、ｐＧＬ３＃２１およびｐＧＬ３＃２８のプロモーター活性を、ルシフェラーゼ活性のレベルを測定することで評価した。典型的には、ＲＥＦ５２細胞群をＳｋｐ２構築物（ｐＧＬ３＃５、ｐＧＬ３＃１５、ｐＧＬ３＃２１およびｐＧＬ３＃２８）の１つ１μｇでトランスフェクトし、血清飢餓状態とした後、血清を添加することで休止状態から脱するように刺激した。細胞は、０．１％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で７２時間インキュベートすることで血清飢餓（増殖停止）状態とした。最終濃度１０％となるまでＦＣＳを加えることで細胞を血清刺激し、刺激後から０ないし３６時間後に回収した。
【００９７】
血清刺激後、様々な時点（６〜１０時間間隔で０〜４０時間）でルシフェラーゼ活性を評価した。ここでもまた、細胞周期を通してルシフェラーゼ活性に変動は見られなかった。これに対し、同じ実験で、サイクリンＡプロモーターは予測されたように細胞周期的に発現した。Ｓｋｐ２プロモーター活性は、他の公知のＥ２Ｆにより調節されるいずれのプロモーターとも全く対照的に、細胞周期中に調節されず、むしろＳｋｐ２プロモーター活性は細胞の状態、すなわち、形質転換されているかされていないかによって異なる。従ってＳｋｐ２プロモーターは腫瘍細胞選択的な導入遺伝子の発現に十分適している。
【００９８】
実施例６　Ｓｋｐ２に基づくアデノウイルスベクターの構築
アデノウイルスベクターは５型ヒトアデノウイルスに由来し、ウイルス領域Ｅ１のヌクレオチド５５４番から３３２８番（Ａｄ５配列からナンバリング）の間を欠失させることで複製欠陥型となる。さらに、Ｅ３ウイルス領域のヌクレオチド２８５９２番から３０４７０番の間が欠失している。
【００９９】
ウイルスＥ１領域を以下の特徴を持つトランスジェニック領域で置換した：
（ｉ）　ネズミＳｋｐ２プロモーター配列（すなわち、断片図２および図４に示されている３６６ｂｐのＳｍａ Ｉ断片）、または対照としての市販のベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手したＣＭＶプロモーター；
（ｉｉ）　対象ｃＤＮＡ（例えば、ＥＧＦＰ， ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター由来， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；ルシフェラーゼ， ｐＧＬ３基本ベクター由来， Ｐｒｏｍｅｇａ；またはヒトＥ２Ｆ−１， Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： ７２４５−７２５０）； および
（ｉｉｉ）　ＳＶ４０由来のポリアデニル化シグナル（サルウイルス４０ゲノムのヌクレオチド２７５２番から２５３４番）。
【０１００】
従ってアデノウイルスベクターのトランスジェニック領域はアデノウイルスＩＴＲ配列によってフランキングされている。当業者には、Ｓｋｐ２プロモーターを含むその他種々のベクターを容易に設計できるということが明らかであろう。
【０１０１】
組換えウイルスはＨａｒｄｙ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７１： １８４２−１８４９によって記載されている系を用いてＣＲＥ８細胞にて作製した。第一段階は各アデノウイルスのいわゆる「導入ベクター」の構築であった。用いた各導入ベクターは公開されている親ベクターｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ， （１９９７），上記）に由来するものであった。
【０１０２】
ＡｄＣＭＶＥＧＦＰの導入ベクター
ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩクローニング部位でフランキングされたＥＧＦＰ ｃＤＮＡ断片をｐＡｄｌｏｘに方向を指定してサブクローニングした。このプラスミドをｐＦＭＩ４と呼ぶ。（５’ＩＴＲ＝逆方向反復領域の後にＣＭＶプロモーターの上流の残余Ｌｏｘ Ｐ部位（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，上記参照）がある。）
【０１０３】
ＡｄＳｋｐ２ＥＧＦＰの導入ベクター
ｐＦＭＩ４をＳｐｅ ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して連結し、ｐＦＭＩ６を得た。このプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＳｍａ Ｉで消化し、Ｓｋｐ２プロモーター断片を挿入した。このプラスミドをｐＦＭＩ７と呼んだ。（５’ＩＴＲの後にＳｋｐ２プロモーターの上流の残余Ｌｏｘ Ｐ部位（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ，上記参照）がある。）
【０１０４】
ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１の導入ベクター
ｐＦＭＩ７をＮｃｏＩで消化し、クレノウで処理して平滑末端とした。Ｅ２Ｆ−１ ｃＤＮＡ を平滑末端化ＢａｍＨＩ−クレノウ処理したインサートとして挿入し、ｐＦＭＩ８を得た。
【０１０５】
ＡｄＳｋｐ２ルシフェラーゼの導入ベクター
ｐＦＭＩ７をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ部位でフランキングされたルシフェラーゼｃＤＮＡ断片と連結した。
【０１０６】
ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１／ＥＧＦＰ（融合タンパク質）の導入ベクター
停止コドンを除いたＥ２Ｆ−１コード配列を有し、２つのＮｃｏＩ部位によってフランキングされた断片をＰＣＲにより作出し、ＮｃｏＩで線状化したｐＦＭＩ６へサブクローニングした。
【０１０７】
Ｃｒｅ８細胞における相同組換えによる組換えアデノウイルスの作製のため、導入ベクターをＳｆｉＩで線状化し、Ψ５（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ， （１９９７），上記）と呼ばれるヘルパー親アデノウイルスから精製したウイルスＤＮＡとともにＣｒｅ８細胞へ同時トランスフェクトした。
【０１０８】
組換えアデノウイルスの力価を全粒子に関して、またはプラーク形成単位に関して求めた。典型的な実験では、細胞株ＩＭＲ９０およびＩＭＲ９０−ＳＶ４０またはＨＭＥＣ、ならびに乳癌細胞株および細胞（ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＳＫ−ＢＲ３細胞）を、同じ粒子数（２Ｘ１０３から５Ｘ１０４粒子／細胞の範囲）のＡｄＳｋｐ２ＥＧＦＰかＡｄＣＭＶＥＧＦＰのいずれかで感染させた。感染２４〜３０時間後、細胞を蛍光顕微鏡で生きているかどうか調べるか、またはＥＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析に用いた。
【０１０９】
蛍光顕微鏡は形質転換および乳癌細胞で強いＥＧＦＰ発現を示した。シグナル強度は非形質転換細胞の方が弱く、乳房一次上皮細胞（ＨＭＥＣ）で特に弱かった。
【０１１０】
ＦＡＣＳ分析は、ＥＧＦＰ発現強度がその対応する一次細胞または非形質転換細胞に比べて形質転換細胞および乳癌細胞で約１０倍高かったことを示した。
【０１１１】
頭頚部腫瘍由来の腫瘍細胞株をはじめとする他の細胞種で、それらの対応する一次正常細胞に比べた場合にも同様の結果が見られた。また、ヌードマウスの実験でも、生検サンプルを採ってヌードマウスに注入した場合にも同様の結果が見られた。このような場合にもなお、かかる実験には腎臓癌細胞（ＡＣＨＮ細胞、ＣＡＫＩ−１細胞、７８６−０細胞またはＡ４９８細胞）およびそれらの一次対応物（例えば、ＲＰ−ＴＥＣ）が用いられる。
【０１１２】
実施例７　皮下腫瘍を有するヌードマウスへのアデノウイルスベクターの投与
腫瘍性細胞（例えば、腎臓癌細胞株）をヌードマウスの側腹部に注射する。腫瘍はマウス内で約１０ｍｍの大きさになるまで増殖させる。ＡＤＳｋｐ２ＥＧＦＰをマウスに注射する。腫瘍組織および周囲の正常組織に由来する切片でＥＧＦＰの発現をモニタリングする。さらに、いずれの腫瘍も含まないＡｄＳｋｐ２ＥＧＦＰまたはＡｄＣＭＶＥＧＦＰをヌードマウスの側腹部または静脈に注射して、これらの条件下でＥＧＦＰの発現を評価する。ＥＧＦＰ発現は腫瘍では容易に得られるが、このことはＳｋｐ２プロモーターがマウスで増殖した腫瘍でレポーター遺伝子ＥＧＦＰの高レベルの発現を与え得ることを示す。
【０１１３】
実施例８　 ＳＢＢＲ３細胞におけるＳｋｐ２プロモーター活性に対するＥ２Ｆ１の作用
ＳＫＢ３細胞にＡｄ−Ｓｋｐ２−ＥＧＦＰおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｅ２Ｆ１またはＡｄ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼを、各ウイルス１０４粒子／細胞にて同時感染させた。２０時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳによりＥＧＦＰ発現を分析した。Ｅ２Ｆ１の異所発現は、ＥＧＦＰ発現の上昇によって証明されるようにＳｋｐ２プロモーター活性を上昇させる。対照ウイルスＡｄ−ＣＭＶ−ルシフェラーゼで同時感染を行った場合にはこの作用は見られない。
【０１１４】
同様の作用がＭＥＦ細胞でも見られた。要するに、１回継代したＥ２Ｆ−１−／−ＭＥＦを２４ウェルプレートにて、Ｅ２Ｆ−１を発現するエフェクタープラスミド３４０ｎｇの存在または不在下で、ルシフェラーゼを発現する試験Ｓｋｐ２プロモータープラスミド（ｐＧＬ３＃５またはｐＧＬ３＃２１）１．７μｇでトランスフェクトした（対照としてはｐＢＳＫによる同時トランスフェクションを含んだ）。ノーマライゼーションのためにＬａｃＺ発現プラスミド（１００ｎｇ）を含めた。トランスフェクション２４時間後に細胞を回収し、相対値（ルシフェラーゼ／ｌａｃＺ）を求めた。両Ｓｋｐ２プロモーター構築物とも高い相対発現を示し、ｐＧＬ３＃２１はｐＧＬ３＃５よりも高い活性を示した。Ｅ２Ｆ−１プロモーターでは低レベルで、また、ｐＧＬ３＃５およびｐＧＬ３＃２１の両者では遙かに高いレベルでプロモーター活性のＥ２Ｆ−１誘導が見られた（それぞれＥ２Ｆ−１プロモーターより５倍および１０倍高い）。
【０１１５】
実施例９　アポトーシス誘導遺伝子の発現を駆動するためにＳｋｐ２プロモーターを用いるアデノウイルスベクターの構築
Ｓｋｐ２プロモーターに基づくウイルスベクターの特殊な特性は、アポトーシス遺伝子、特にＥ２Ｆ−１の発現のために理想的なものとなる。Ｓｋｐ２プロモーターの下流にＥ２Ｆ−１ ｃＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを構築する。このベクターはＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１と呼ばれる。調節を受けないＥ２Ｆ−１発現はｐ５３依存性の、およびｐ５３非依存性のアポトーシスの双方を誘導することが分かっているのことからＥ２Ｆ−１を用いる。一時トランスフェクション実験では、Ｅ２Ｆ−１はＳｋｐ２プロモーターの有効なアクチベーターとして働く（図８参照）。この組換えアデノウイルスベクターの作用を組織培養細胞、次いでマウスで増殖させた腫瘍について評価する。
【０１１６】
細胞増殖およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖に対する、Ｓｋｐ２プロモーターにより駆動されるＥ２Ｆ−１発現と電離放射線の組合せを検討する。まず、指数増殖中のＩＭＲ９０およびＩＭＲ９０ＳＶ４０Ｔａｇ形質転換細胞にＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１またはＡｄＳｋｐ２ＥＧＦＰを感染させ、Ｅ２Ｆ−１およびＥＧＦＰのタンパク質発現をウエスタンブロット法によって評価する。ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１感染細胞の増殖速度およびアポトーシス指数を求め、ＡｄＳｋｐ２ＥＧＦＰ感染細胞と比較する。見られた作用がＥ２Ｆ−１依存性かどうかを評価するため、対照としてＥ２Ｆ−１変異誘導体を含む組換えアデノウイルス、特にＥ２Ｆ−１のＤＮＡ結合欠陥種を含める。
【０１１７】
正常細胞および形質転換細胞は、ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１に対する応答に違いがある。ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１は電離放射線に対する形質転換細胞の応答性を変化させる。
【０１１８】
細胞死に必要な電離放射線の最小線量を求める。また、頭頚部癌細胞株のパネルも試験する。これらの細胞はｐ５３の状態ならびにそれらの放射線感受性に関して特性決定することができる。形質転換細胞および腫瘍細胞ではＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１の有意なプロアポトーシス作用が見られる。
【０１１９】
ヌードマウスに移植された皮下腫瘍でもＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１の同様のプロアポトーシス作用が見られる。Ｓｋｐ２プロモーターによって駆動されたＥ２Ｆ−１の発現は少なくとも部分的に腫瘍の増殖を阻害するのに十分なものであり、腫瘍は小さくなる。ＡｄＳｋｐ２Ｅ２Ｆ−１を注入した腫瘍は、対照を注入した腫瘍とは対照的に、低線量の電離放射線に応答して退縮する。従ってこれまでに可能であったものよりも低い線量の放射線を用いて治療効果を達成することができる。腫瘍退縮が見られるが、これはアポトーシスの増加によるものである。
【０１２０】
本明細書に記載の種々の実験は、癌療法としてのＳｋｐ２プロモーターに基づくウイルスベクターの有用性を示す。
【０１２１】
実施例１０　チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現を駆動するためにＳｋｐ２プロモーターを用いるアデノウイルスベクターの構築
Ｅ２Ｆ−１の代わりにＴＫ ｃＤＮＡを用いて実施例９のアデノウイルスベクターを構築する。ガンシクロビルの静注と組み合わせて投与する場合、アデノウイルスベクターＡＤＳｋｐ２ＴＫは適当な対照と比べた場合に腫瘍サイズの低下をもたらす。放射線療法と組み合わせると、低線量の放射線で腫瘍退縮が起こるのが分かる。
【０１２２】
実施例１１　Ｓｋｐ２プロモーターを用いるスクリーニングアッセイ
実施例６のアデノウイルスベクター（ＡｄＳｋｐ２−ＥＧＦＰ）を用いてＳＫＢＲ乳癌細胞を感染させ（１０４ウイルス粒子／細胞）、それらの細胞をＥｒｂＢ２、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋまたはｃｄｋ２の阻害剤で処理する。種々の阻害剤を例えばマイクロモルからミリモルの範囲で試験すればよい。１２時間後、細胞を回収し、ＥＧＦＰの発現をＦＡＣＳにより分析する。ｃｄｋ２阻害剤（α−ｃｄｋ２、１０ｍＭ）では、ＥＧＦＰ発現に著しい低下がもたらされる（対照レベルの５％未満）。
【０１２３】
この作用の腫瘍特異性はＳＫＢＲ細胞に対照ベクター、例えばＣＭＶプロモーターを含有する実施例６のアデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶ−ＥＧＦＰ）（１０４ウイルス粒子／細胞）を感染させることで求めることができる。これらの対照細胞を上記のように阻害剤で処理する。ｃｄｋ２阻害剤はＣＭＶプロモーター構築物からのＥＧＦＰの発現に作用せず、このことはＳＫＰ２およびＣＭＶプロモーターからの応答の差異を示す。
【０１２４】
この実施例はＳＫＰ２プロモーターの制御下で乳癌細胞およびＥＧＦＰを用いるスクリーニング法を示すが、当業者にはその他の好適な細胞または細胞株、ならびにＳＫＰ２プロモーター活性を検出するその他の手段（種々のレポーター遺伝子またはＳＫＰ２自体の使用など）も使用できることが明らかであろう。試験化合物は特定の特性を持つように選択することもできるし、あるいは化学化合物、天然化合物またはその他の化合物のライブラリーとして提供してもよい。
【０１２５】
本明細書に記載の全ての参照文献ならびに先行出願ＧＢ００１５７１．８（２０００年６月２３日出願）は出典明示によりその各々が個々に述べられている場合と同じく本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ】Ｓｋｐ２プロモーターを含む直鎖ＤＮＡ断片の３７２０ｂｐの配列を示す（配列番号１）。
【図２】図１Ｃの２６５３〜３０２４ｂｐのＤＮＡ配列を示し、Ｓｋｐ２プロモーターの特定の領域を同定する（配列番号２）。
【図３】ネズミＳｋｐ２の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）のマップを示す。
【図４】Ｓｋｐ２プロモーターの領域を含むｐＧＬ３プラスミドのマップを示す。
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2004500887.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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