(57)【要約】ゲノムＤＮＡのマイクロサテライト不安定性の分析で使用される方法およびキットが開示される。生物学的材料、例えば腫瘍に存在するＤＮＡのマイクロサテライト不安定性を検出するために使用できる方法およびキットもまた開示される。本発明の方法およびキットは、マイクロサテライト不安定性を伴なう疾患、例えばあるタイプの癌の検出または診断に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法：
（ａ）ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み；
（ｂ）前記少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルに由来する少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを多重増幅反応で前記プライマーを用いて同時増幅し、それによって増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに
（ｃ）前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。
【請求項２】
前記ゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである請求項１の方法。
【請求項３】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される２つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される３つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ａ）で提供される前記プライマーの少なくとも１つが、配列番号１−６８によって特定されるプライマー配列の群から選択される核酸配列を有する請求項１の方法。
【請求項５】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む請求項１の方法。
【請求項６】
前記少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅される請求項５の方法：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項７】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、蛍光によって標識された、各遺伝子座のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて工程（ｃ）で同時増幅される請求項１の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルが、１つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムＤＮＡサンプルおよび前記個体の腫瘍に由来する第二のゲノムＤＮＡサンプルを含む請求項１の方法であって、前記方法がさらに、第一のゲノムＤＮＡサンプルを同時増幅することにより生成された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを、第二のゲノムＤＮＡサンプルを同時増幅することにより生成された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズと比較することによってマイクロサテライト不安定性を検出することを含む請求項１の方法。
【請求項９】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項８の方法。
【請求項１０】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項８の方法。
【請求項１１】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項８の方法。
【請求項１２】
前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項１１の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含むゲノムＤＮＡにおけるマイクロサテライトの不安定性を検出する方法：
（ａ）ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み；
（ｂ）１つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムＤＮＡサンプルおよび前記個体の第二の生物学的材料に由来する第二のゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを、前記マイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて別個に多重増幅反応で同時増幅させ、それによって第一のサンプルから第一の増幅ＤＮＡフラグメントおよび第二のサンプルから第二の増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに
（ｃ）第一の増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを第二の増幅ＤＮＡフラグメントのサイズと比較し、第二のゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかの不安定性を検出する。
【請求項１４】
前記ゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される２つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される３つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項１３の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）で提供される前記プライマーの少なくとも１つが、配列番号１−６８によって特定されるプライマー配列群から選択される核酸配列を有する請求項１３の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）で提供される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーが蛍光によって標識される請求項１３の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む請求項１３の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅される請求項１８の方法：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項２０】
前記第二の生物学的材料サンプルが、腫瘍組織、播種細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿および他の体液から成る群から選択される請求項１３の方法。
【請求項２１】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項１３の方法。
【請求項２２】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項１３の方法。
【請求項２３】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項１３の方法。
【請求項２４】
前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項２３の方法。
【請求項２５】
以下を含む、ゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット：
ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。
【請求項２６】
前記ゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである請求項２５のキット。
【請求項２７】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される２つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される３つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項２５のキット。
【請求項２８】
前記少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む請求項２５のキット。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが以下から成る群から選択される請求項２８のキット：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項３０】
前記セットの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光によって標識される請求項２５のキット。
【請求項３１】
前記キットがさらに耐熱性ポリメラーゼを含む請求項２５のキット。
【請求項３２】
前記キットがさらに、正常非癌性生物学的材料から単離された第一のコントロールＤＮＡおよびミスマッチ修復遺伝子を欠く生物学的材料由来の第二のコントロールＤＮＡを含む請求項２５のキット。
【請求項３３】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を腫瘍の予後診断に用いることができる請求項２５のキット。
【請求項３４】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を家族性腫瘍素因の診断に用いることができる請求項２５のキット。
【請求項３５】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性が胃腸系および子宮内膜の腫瘍の徴候である請求項２５のキット。
【請求項３６】
前記マイクロサテライトの不安定性が大腸癌の徴候である請求項２５のキット。
【請求項３７】
以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法：
（ａ）ヒトゲノムＤＮＡの少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記セットは、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含み；
（ｂ）少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルに由来する少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを前記プライマーを用いて多重増幅反応で同時増幅させ、それによって増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに
（ｃ）前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。
【請求項３８】
前記少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅される請求項３７の方法：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項３９】
以下を含む、ゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット：
ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む、ヒトゲノムＤＮＡの少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが以下から成る群から選択される請求項３９のキット：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項４１】
以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法：
（ａ）少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅するためのプライマーを提供し；
（ｂ）少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルに由来する少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを前記プライマーを用いて多重増幅反応で同時増幅させ、それによって増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに
（ｃ）前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。
【請求項４２】
前記ゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される請求項４２の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが以下を含む少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットである請求項４２の方法：
ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１１、ＢＡＴ−４０およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される少なくとも２つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座；および
ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される少なくとも３つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座。
【請求項４６】
工程（ａ）で提供される前記プライマーの少なくとも１つが、配列番号１−６８によって特定されるプライマー配列の群から選択される核酸配列を有する請求項４２の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ１０Ｓ１４２６を含む請求項４２の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅される請求項４７の方法：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号７および配列番号８、
前記遺伝子座がＤ１Ｓ５１８であるとき、配列番号４９および配列番号５０、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号１７および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号５６、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項４９】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む請求項４２の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、以下から成る群から選択される各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーを用いて同時増幅される請求項４９の方法：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項５１】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、蛍光によって標識された、各遺伝子座のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて工程（ｃ）で同時増幅される請求項４１の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルが、１つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来する第一のゲノムＤＮＡサンプルおよび前記個体の腫瘍に由来する第二のゲノムＤＮＡサンプルを含む請求項４１の方法であって、前記方法がさらに、第一のゲノムＤＮＡサンプルを同時増幅することにより生成された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを、第二のゲノムＤＮＡサンプルを同時増幅することにより生成された増幅ＤＮＡフラグメントのサイズと比較することによってマイクロサテライト不安定性を検出することを含む請求項４１の方法。
【請求項５３】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が腫瘍の予後診断に用いられる請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が家族性腫瘍素因の診断に用いられる請求項５２の方法。
【請求項５５】
前記マイクロサテライト不安定性の結果が、胃腸系および子宮内膜の癌性腫瘍の検出に用いられる請求項５２の方法。
【請求項５６】
前記癌性腫瘍が大腸癌に由来する腫瘍である請求項５５の方法。
【請求項５７】
以下を含むヒトゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座を分析することを目的とするキット：
１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む、ヒトゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。
【請求項５８】
前記２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される請求項５７のキット。
【請求項５９】
前記一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される請求項５７のキット。
【請求項６０】
前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが、少なくとも５つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される２つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、並びにＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１から成る群から選択される３つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む請求項５７のキット。
【請求項６１】
前記少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ１０Ｓ１４２６を含む請求項５７のキット。
【請求項６２】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが以下から成る群から選択される請求項６１のキット：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号７および配列番号８、
前記遺伝子座がＤ１Ｓ５１８であるとき、配列番号４９および配列番号５０、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号１７および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号５６、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項６３】
前記少なくとも２つのマイクロサテライト遺伝子座のセットが少なくとも９つのマイクロサテライト遺伝子座のセットであり、前記セットが、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８およびＤ１０Ｓ１４２６を含む請求項５７のキット。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが以下から成る群から選択される請求項６３のキット：
前記遺伝子座がＢＡＴ−２５であるとき、配列番号１および配列番号６０、
前記遺伝子座がＢＡＴ−２６であるとき、配列番号６１および配列番号６２、
前記遺伝子座がＭＯＮＯ−１５であるとき、配列番号６５および配列番号６６、
前記遺伝子座がＢＡＴ−４０であるとき、配列番号６７および配列番号６８、
前記遺伝子座がＤ３Ｓ２４３２であるとき、配列番号６３および配列番号５９、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ１８０８であるとき、配列番号５１および配列番号５２、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０７０であるとき、配列番号５３および配列番号５４、
前記遺伝子座がＤ７Ｓ３０４６であるとき、配列番号５５および配列番号６４、および
前記遺伝子座がＤ１０Ｓ１４２６であるとき、配列番号５７および配列番号５８。
【請求項６５】
前記セットの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座の各々のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが蛍光によって標識される請求項５７のキット。
【請求項６６】
前記キットがさらに耐熱性ポリメラーゼを含む請求項５７のキット。
【請求項６７】
前記キットがさらに、正常非癌性生物学的材料から単離された第一のコントロールＤＮＡおよびミスマッチ修復遺伝子を欠く生物学的材料由来の第二のコントロールＤＮＡを含む請求項５７のキット。
【請求項６８】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を腫瘍の予後診断に用いることができる請求項５７のキット。
【請求項６９】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性を家族性腫瘍素因の診断に用いることができる請求項５７のキット。
【請求項７０】
前記プライマーによって同時増幅されたマイクロサテライト遺伝子座セットの不安定性が胃腸系および子宮内膜の腫瘍の徴候である請求項５７のキット。
【請求項７１】
前記マイクロサテライトの不安定性が大腸癌の徴候である請求項７０のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国特許出願第０９／８４１３６６号（２００１年４月２４日出願）（前記は米国特許出願第０９／６６３０２０号（２０００年９月１５日出願）の部分継続出願である）に基づく優先権を主張する。
連邦政府支援研究開発に関する記述
本発明は、米国予防衛生研究所による政府の小企業における刷新的研究に対するグラント（US government Small Business Innovation Research Program Grant CA76834-02）を用いて達成された。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
技術分野
本発明は、単純な縦並びの繰返しを含むゲノムＤＮＡ領域（例えばマイクロサテライト遺伝子座）における不安定性の検出に関する。本発明は特に、腫瘍に由来する細胞、組織または体液から得られるゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座セットにおける不安定性の有無についての多重分析に関する。本発明はまた、癌および癌の素因の検出並びに診断にマイクロサテライトの不安定性の分析を使用することに関する。
【０００２】
背景技術
ゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座は、多様な応用（父子鑑定、法医学的検査並びに癌の検出および診断を含むが、ただしこれらに限定されない）のために分析されてきた。癌は、１つまたは２つ以上の腫瘍細胞タイプで不安定な特定のマイクロサテライト遺伝子座で不安定性が存在することによって検出または診断することができる。
マイクロサテライト遺伝子座は、長さが１塩基対から５塩基対の繰返し単位の単純な縦並びの繰返しを有するゲノム領域である。前記のようなマイクロサテライト遺伝子座がヒトゲノム全体に多数分散している。マイクロサテライト遺伝子座は最少の繰返し単位の長さにより分類される。例えば、長さが１塩基対から５塩基対の繰返し単位を有する遺伝子座は、それぞれ“一ヌクレオチド”、“二ヌクレオチド”、“三ヌクレオチド”、“四ヌクレオチド”および“五ヌクレオチド”繰返し遺伝子座と称される。
【０００３】
ほとんどの二倍体種（例えば哺乳類種）の正常なゲノムＤＮＡの各マイクロサテライト遺伝子座は、各遺伝子座について２つの対立遺伝子から成る。２つの対立遺伝子は長さが互いに同じでもまたは異なっていてもよく、それぞれ個々に変動することができる。マイクロサテライトの対立遺伝子は通常、個々の対立遺伝子およびその子孫において一定の長さで維持されるが、いくつかの腫瘍タイプではマイクロサテライトの長さに不安定性が観察されている（Aaltonen et al., 1993, Science 260:812-815; Thibodeau et al., 1993, Science 260:816-819; Peltomaki et al., 1993, Cancer Research 53:5853-5855; Ionov et al., 1993, Nature 363:558-561）。腫瘍におけるこのゲノム不安定性の状態（マイクロサテライト不安定性（以下では“ＭＳＩ”）と称される）は、遺伝性癌症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（以下では“ＨＮＰＣＣ”）の分子的特徴である。ＨＮＰＣＣのＭＳＩの原因は、機能不全のＤＮＳミスマッチ修復系であると考えられている。前記はＤＮＡ修復時に発生するエラーを取り消すことができない（Fishel et al., 1993, Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994, Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994, Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997, Nat. Genetics 17:271-2）。ＤＮＡ修復時に１つまたは２つ以上の繰返し単位の挿入または欠失がミスマッチの修復をもたらすことなく繰返し発生し、正常および腫瘍ＤＮＡサンプルから増幅されたマイクロサテライト遺伝子座で認められる長さの多形性として、対立遺伝子のサイズの比較によって検出することができる（Thibodeau et al., 1993, 上掲書）。
【０００４】
ＭＳＩは９０％を越えるＨＮＰＣＣで、さらに散発性大腸癌の１０−２０％で見出された（Liu et al., 1996, Nature Med. 2:169-174; Thibodeau et al., 1993, 上掲書; Ionov et al., 1993, Nature 363:558-561; Aaltonen et al., 1993, Science 260:812-816; Lothe et al., 1993, Cancer Res. 53:5849-5852）。しかしながら、ＭＳＩは大腸癌に限定されない。ＭＳＩはまた膵臓癌でも（Han et al., 1993, Cancer Res. 53:5087-5089）、胃癌でも（Peltomaki et al., 1993, Cancer Res. 53:5853-5855; Mironov et al., 1994, Cancer Res. 54:41-44; Rhyu et al., 1994, Oncogene 9:29-32; Chong et al., 1994, Cancer Res. 54:4595-4597）、前立腺癌でも（Gao et al., 1994, Oncogene 9:2999-3003）、子宮内膜癌でも（Risinger et al., 1993, Cancer Res. 53:5100-5103; Peltomaki et al., 1993, Cancer Res. 53:5853-5855）、さらに乳癌でも（Patel et al., 1994, Oncogene 9:3695-3700）検出された。
ＨＮＰＣＣの遺伝学的根拠は、いくつかのＤＮＡミスマッチ修復遺伝子（以下では“ＭＭＲ”）の１つにおける生殖細胞系列の突然変異であると考えられる（Leach et al., 1993 Cell 75:1215-1225; Fishel et al., 1993 Cell 75:1027-38; Leach et al., 1993 Cell 75:215-25; Bronner et al., 1994 Nature 368:258-61; Nicolaides et al., 1994 Nature 371:75-80; Miyaki et al., 1997 Nat. Genetics 17:271-2; Papadopoulos et al., 1994 Science 263:1625-1629）。ＨＮＰＣＣ患者では、５０−６０％が２つの修復遺伝子、ＭＳＨ２およびＭＬＨ１に遺伝性の突然変異を保有すると報告されている（Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074）。さらにまた、その腫瘍が高頻度ＭＳＩ（以下では“ＭＳＩ−Ｈ”）表現型を示すＨＮＰＣＣ症例の７０−１００％が、これら２つの遺伝子で生殖細胞系列の突然変異を有すると報告されている。ＨＮＰＣＣ患者ではＭＳＨ６、ＭＳＨ３、ＰＭＳ１およびＰＭＳ２遺伝子における生殖細胞系列突然変異はほとんど報告されておらず、これらのミスマッチ修復遺伝子における遺伝性突然変異はＨＮＰＣＣではマイナーな役割しか果たしていないことを示唆している（Peltomaki et al., 1997 Gastroenterology 113:1146-1158; Liu et al., 1996 Nat. Med. 2:169-174; Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074）。機能的な修復タンパク質がなければ、複製中に発生するエラーは修復されず、高率の突然変異を生じ、腫瘍発生の可能性が増す。
【０００５】
繰返しＤＮＡは特に複製時のエラーに敏感で、したがってミスマッチ修復系の機能不全はマイクロサテライト領域で広範囲の変化を生じる。機能的なミスマッチ修復系をもたない酵母細胞の研究によって、一ヌクレオチド、二ヌクレオチド、三ヌクレオチド、四ヌクレオチド、および五ヌクレオチド繰返しでそれぞれ２８００倍、２８４倍、５２倍および１９倍の突然変異率の増加が示された（Sia et al., 1997 Molecular and Cellular Biology 17:2851-2858）。ミスマッチ修復遺伝子の突然変異は腫瘍発生で直接的な役割を果たすとは考えられていないが、むしろＤＮＡ複製のエラーを持続させることによって作用を及ぼす。ミスマッチ修復欠損細胞は高い突然変異誘発率を有し、これらの変異が腫瘍誘発に関与する遺伝子で発生する場合、その結果は腫瘍の発生につながるであろう。ＭＳＩ陽性腫瘍は、増殖コントロール、アポトーシスおよびＤＮＡ修復に関与するいくつかの遺伝子（例えばＴＧＦＢＲＩＩ、ＢＡＸ、ＩＧＦＩＩＲ、ＴＣＦ４、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６）のコード領域の一ヌクレオチド繰返しにおいて体細胞性フレームシフト変異を保有することが見出された（Planck et al., 2000 Genes, Chromosomes & Cancer 29:33-39; Yamamoto et al., 1998 Cancer Research 58:997-1003; Grady et al., 1999 Cancer Research 59:320-324; Markowitz et al., 1995 Science 268:1336-1338; Parsons et al., 1995 Cancer Research 55:5548-5550）。変化がもっとも一般的である遺伝子座はＴＧＦＢＲＩＩで、この遺伝子座に関しては、９０％を越えるＭＳＩ−Ｈ大腸癌が、前記遺伝子座に存在する１０塩基ポリアデニン繰返しに変異を含むことが見出されている（Markowitz et al., 1995 Svience 268:1336-1338）。
【０００６】
ＭＳＩは、ミスマッチ修復遺伝子が関与するか否かに関わらずほぼ全てのＨＮＰＣＣで生じる。ＭＳＩはまた、腫瘍発生の初期に生じることが示された。前記２つの要素は、ＭＳＩ分析がＨＮＰＰＣ検出のための優れた診断検査になる一因を与えた。さらに、ＭＳＩ分析は有用なプレスクリーニング検査として機能し、更なる遺伝的検査を要する潜在的ＨＮＰＣＣ患者を特定することができる。散発性大腸癌のＭＳＩ分析もまた望ましい。なぜならばＭＳＩ出現は予後が良好であるか否かについて相関性を有するからである（Bertario et al., 1999 International J. Cancer 80:83-7）。
ＨＮＰＣＣの診断に関する長い間の問題の１つは、ＨＮＰＣＣ罹患者の大腸腫瘍の生検は散発性大腸癌と外観が病理学的に同じで、症状の診断を困難にしているということである。ＨＮＰＣＣの患者の予後判定、治療および追跡処置は異なっているので、より決定的な診断方法を見つけることは重要である。しかしながら、変異について既知のホットスポットをもたない大型の遺伝子である少なくとも５つの既知のＭＭＲ遺伝子が存在するために、ＨＮＰＣＣ患者における変異の検出は依然として困難である。直接的遺伝子配列決定は突然変異検出のためのもっとも正確な方法であるが、前記の方法は時間を要し高価でもある(Terdiman et al., 1999 The American Journal of Gastroenterology 94:23544-23560)。さらにまた、検出される多くの変異はミスマッチ修復タンパク質の機能に対して影響を及ぼさない無害な多形性であるので、高感度および特異性を配列決定単独で得ることは困難であろう。
マイクロサテライト遺伝子座のＤＮＡ分析は、特定の癌タイプの検出に使用される血液検査の開発を理論的に可能にする。腫瘍ＤＮＡは環境中に遊離され、特に多数の異なる癌タイプで血漿および血清中に高濃度で存在することが初期の研究によって示された（Leon et al., 1977 Cancer Res. 37:646-650; Stroun et al., 1989 Oncology 46:318-322）。それ以来、ポリメラーゼ連鎖反応（以下では“ＰＣＲ”）を用いて、いくつかの異なる腫瘍タイプから得られた血液中に放出されたＤＮＡがマイクロサテライトＤＮＡの分析によって検出されてきた（Hibi et al., 1998 Cancer Research 58:1405-1407; Chen et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:2297-2303; Kopreski et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:1961-1965; Fujiwara et al., 1999 Cancer Research 59:1567-1571; Chen et al., 1996 Nature Medicine 2:1033-1034; Goessl et al., 1998 Cancer Research 58:4728-4732; Miozzo et al., 1996 Cancer Research 56:2285-2288）。
【０００７】
担癌患者から得られた血液で検出された最初の腫瘍特異的配列は変異を有するＫ−ｒａｓ遺伝子であった（Vasioukhin et al., 1994 Br. J. Haematol. 86:774-779; Sorenson et al., 1994 Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 3:67-71; Sorenson et al., 2000Clinical Cancer Research 6: 2129-2137; Anker et al., 1997 Gastroenterology 112:1114-1120）。さらに最近になって頭部および頸部の扁平上皮癌（Nawroz et al., 1996 Nature Med. 2:1035-1037）および小細胞肺癌（Chen et al., 1996 Nature Med. 2:1033-1035）から得られた血漿および血清の可溶性腫瘍ＤＮＡでマイクロサテライトの不安定性が検出された。上記の検出は、多くの他の癌タイプに由来する循環腫瘍ＤＮＡのマイクロサテライトの不安定性についての研究を促した。Hibiらはマイクロサテライトマーカーを用い、大腸癌患者の血清ＤＮＡにおける遺伝的変化の存在について調べた（K. Hibi et al., 1998 Cancer Research 58:1405-1407）。Hibiらはまた、大腸癌患者の原発腫瘍の８０％がＭＳＩおよび／またはヘテロ接合性の消失（以下では“ＬＯＨ”）（以下で考察するまた別の突然変異型）を示すことを報告した。マイクロサテライト変異またはＬＯＨ変異は対を形成する血清ＤＮＡで検出されなかった。しかしながら、同一のＫ−ｒａｓ変異が対応する腫瘍および血清ＤＮＡで見出され、腫瘍ＤＮＡは前記血液中に存在することを示唆した（同書）。
【０００８】
循環腫瘍細胞および微小転移巣の検出もまた予後判定および治療に重要な関わりを有するであろう。播種された腫瘍細胞は非常に少数として存在するので、それら細胞は通常の免疫細胞学的検査では容易に検出することはできない（免疫細胞学的検査では、１００００から１０００００個の正常細胞中の１個の腫瘍細胞を検出できるだけである（Ghoussein et al., 1999 Clinical Cancer Research 5:1950-1960）。ＤＮＡまたはＲＮＡにおける腫瘍特異的異常のＰＣＲ増幅によるより感度の高い分子的技術は、眼にみえない（隠れた）腫瘍細胞の検出を極めて容易にした。１００万個の正常細胞中で１個の腫瘍細胞を日常的に検出することができるＰＣＲによる検査が、白血病、リンパ腫、メラノーマ、神経芽腫および種々のタイプの癌で循環腫瘍細胞および微小転移巣を特定するために考案された（同書）。
播種された腫瘍細胞を検出するほとんどの場合の標的はｍＲＮＡであった。しかしながら、ＤＮＡ標的がいくつか用いられ成功した（前記には上記で述べたように大腸癌のＫ−ｒａｓ変異が含まれる）。いくつかの腫瘍細胞タイプでマイクロサテライトの不安定性が存在することによって、前記不安定性により生じたこれら腫瘍特異的変異は隠れた腫瘍細胞のＰＣＲによる検出のための標的として機能することができるのではないかという可能性が生じた。
【０００９】
どのようにしてＭＳＩを正確に限定し正確に測定するかについては顕著な矛盾が存在する（Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257）。種々の腫瘍におけるＭＳＩの頻度に関する報告は極めて変動する。例えば、膀胱癌におけるＭＳＩの頻度について、別個の実験が３％から９５％の範囲のＭＳＩを報告している（Gonzalez-Zulueta et al., 1993 Cancer Research 53:28-30; Mao et al., 1996 PNAS 91:9871-9875）。ＭＳＩの範囲を限定することに関する１つの問題は、前記は腫瘍特異的でもあり、遺伝子座依存的でもあるということである（Boland et al., 上掲書）。したがって、単一の研究において特定の腫瘍タイプで観察されるＭＳＩの頻度は、分析される腫瘍の数、調べられる遺伝子座の数、腫瘍がＭＳＩを有するという判定の変更を与えるためにどれくらい多くの遺伝子座が必要であるのか、さらに個々の遺伝子座のどれを分析に含めるかによって左右されるであろう。これらの問題の解析に役立てるために、米国癌研究所がＭＳＩに関するワークショップのスポンサーになり、この分野を統一した（同書）。ワークショップの結果、５つのマイクロサテライトのセットがこの分野における将来の研究のためのリファレンスパネルとして提唱された。このパネルは２つの一ヌクレオチド遺伝子座ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、および３つの二ヌクレオチド遺伝子座Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１７Ｓ２５０を含む。
腫瘍サンプルのＭＳＩ分析における１つの固有の問題は、あるマーカーに対する正常な対立遺伝子の１つがＬＯＨのために失われており、他の新規なフラグメントが前記マーカーのために存在しない場合に生じる（同書）。前記の事例が真のＬＯＨを表しているのか、またはＭＳＩを表しているのかは容易には識別できない（ＭＳＩの場合、シフトされた対立遺伝子は残りの野生型対立遺伝子と一緒に移動している）。前記ＭＳＩに関するＮＣＩワークショップの推奨では、前記のような事例はＭＳＩと呼ばない。このタイプの問題を最少にする１つの方法は、大腸腫瘍で低頻度のＬＯＨを示す遺伝子座を用いることであろう。
【００１０】
疾患の治療および予後の決定に用いられる臨床診断アッセイでは、検査は高度に正確で（偽陰性が少ない）、さらに特異的（疑陽性率が低い）であることが要求される。情報量の多い多数のマイクロサテライト遺伝子座が特定され、ＭＳＩ検査用に推奨された（Boland et al. 1998上掲書）。しかしながら、もっとも情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座でさえ感度は１００％ではなく、特異性も１００％ではない。個々のマーカーを用いる感度の欠如を代償するために、マルチマーカーを用いて検出力を高めることができる。マルチマーカー分析に必要な労力の増加は、多重化によって相殺することができる。多重化は１本の試験管内で１組の遺伝子座の同時増幅および同時分析を可能にし、さらに完全な分析に必要なＤＮＡ総量をしばしば減少させることができる。与えられた任意の癌タイプのＭＳＩアッセイの特異性を高めるために、ＮＣＩワークショップで特定された５つの高度に情報量を有するマイクロサテライト遺伝子座パネル（上記を参照されたい）を改変し、同様に有用な他の遺伝子座と交換または付加することが推奨された（Boland et al. 1998, p.5250上掲書）。より大量の遺伝子座を増幅および分析することによって得られる情報量の増加は、検査結果の解釈における信頼性および正確さを高める。
【００１１】
多重ＭＳＩ分析によって正確さおよびＭＳＩ表現型の識別に関する問題は解決したが、複雑さが加わったことによって分析はより骨の折れるものとなろう。例えば、マイクロサテライト遺伝子座が多重形式で同時増幅および同時分析されるとき、データ解釈の容易さおよび正確さに影響を与える要因の重要性ははるかに大きくなる。正確なデータ解釈に影響を与える要因の１つは、ＰＣＲ時にマイクロサテライト遺伝子座で発生する吃音様断続生成物（スタッター、stutter）の量である（Bacher & Schumn, 1998 Profiles in DNA 2:3-6; Perucho, 1999 Cancer Research 59:249-256）。スタッター生成物は、ＰＣＲの過程で生成される小さなフラグメントで、主要な対立遺伝子とコアの繰返し単位の倍数分だけサイズが異なっている。マイクロサテライト遺伝子座で観察されるスタッターの量は、コアの繰返し単位の長さと反比例する傾向がある。したがって、スタッターは一繰返しおよび二繰返し遺伝子座でもっとも強く出現し、三ヌクレオチド、四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しで減少する（Bacher & Schumn, 1998上掲書）。多重化ではスタッターが少ない遺伝子座を使用することによって前記の問題を大きく減少させることができよう。しかしながら、パーセントスタッターは個々の繰り返し単位内でさえ大きく変動するので、遺伝子座の注意深い選択はスタッターの少ない遺伝子座の選択でもなお必要である（Micka et al., J. Forensic Sciences 44:1-15）。
【００１２】
マイクロサテライト多重系は、主に遺伝子型決定、マッピング実験、およびＤＮＡタイピングに用いるために開発された。これらの多重系は、多数のマイクロサテライト遺伝子座を一反応で同時に増幅させ、続いて得られた増幅対立遺伝子のサイズを検出するようにデザインされている。ＤＮＡタイピング分析の場合、多数のマイクロサテライト遺伝子座を使用することによって１つの遺伝子座での適合確率は劇的に高められる。適合確率はＤＮＡタイピングで用いられる一般的統計量で、任意に選択した個体と同じＤＮＡパターンを見つけるまでに検索しなければならない個体数の範囲を定める。例えば、４遺伝子座多重系（GenePrint（登録商標）CTTv Multiplex System, Promega）は、８遺伝子座多重系（GenePrint（登録商標）PowerPlex（登録商標）1.2 System, Promega）（これは２．７４ｘ１０8で適合確率１を有する）と比較して、アフリカ人−アメリカ人集団の２５２．４で適合確率１を有する（Proceedings:American Academy of Forensic Sciences (Feb. 9-14,1998), James W. Schumm et al., p.53, B88；（同書）Sandra D. Gibson et al., p.53, B89；（同書）Katherine Lazaruk et al., p.51, B83；R. Sparkes et al., 1996 Int. J. Legal. Med. 109:186-194）。市販ルートで入手可能な他のＤＮＡタイピング用多重系にはAmpFlSTRプロファイラー（登録商標）およびAmpFlSTRコファイラー（Cofiler）（登録商標）（AmpFlSTR Prifiler（登録商標）PCR Amplification Kit User7s Manual (1997), i-viiiおよび1-1から 1-10;およびAmpFlSTR Cofiler（登録商標）PCR Amplification Kit User Bulletin (1998), i-iiiおよび1-1から1-10,両文献ともPerkin-Elmer Corpにより刊行）が含まれる。ＤＮＡタイピング用多重系の他に、いくつかの多重マイクロサテライト系が疾患（例えば癌）の検出のために開発された。そのような系の１つ（“ＨＮＰＣＣマイクロサテライト不安定性検査”）はロシュダイアグノスチクス（Roche Diagnostics）によって開発され、前記検査では、５つのＭＳＩ遺伝子座（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ４３６、Ｄ１７Ｓ２５０およびＤ２Ｓ１２３）が同時増幅され分析される。また別の系、特にＭＳＩに対して高い感度および分析の容易さと正確さのためにスタッターが少ないさらに別の遺伝子座を含む系が必要とされている。
本発明の材料と方法は、種々の供給源（種々のタイプの組織、細胞および体液を含む）から得られるヒトゲノムＤＮＡの特定のマイクロサテライト遺伝子座の多重分析で使用するようにデザインされている。本発明は従来の技術を凌ぐ顕著な改善を示し、ＭＳＩ遺伝子座の識別力、正確さの増加、並びにＭＳＩ分析と前記遺伝子座の変異に関係する疾患（例えば癌）診断の処理量の増加をもたらす。
【００１３】
発明の要約
本発明は、マイクロサテライト遺伝子座またはマイクロサテライト遺伝子座セットの増幅および分析のための方法およびキットを提供する。本発明はまた、腫瘍組織または癌細胞に由来するヒトゲノムＤＮＡの多数のマイクロサテライト遺伝子座を同時増幅することによって、個体の癌を検出するための方法およびキットを提供する。
ある特徴では、本発明は以下の工程を含むマイクロサテライト遺伝子座を分析する方法を提供する：（ａ）ゲノムＤＮＡの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを１本の試験管で同時増幅するためのプライマーを提供し、ここで前記遺伝子座セットは少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含み；（ｂ）ゲノムＤＮＡサンプルに由来する少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座の前記セットを多重増幅反応で前記プライマーを用いて同時増幅し、それによって増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに（ｃ）前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。
別の特徴では、本発明は、少なくとも２つの別個のゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅する方法を提供する。ここで第一のサンプルは１つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来し、第二のサンプルは前記個体の第二の生物学的材料に由来する。前記少なくとも２つのヒトゲノムＤＮＡサンプルは、少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットに存在する各遺伝子座のためのプライマーを用いて、別個の多重増幅反応で同時増幅される。前記２つの多重反応から得られた増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを互いに比較し、第二のヒトゲノムＤＮＡサンプルの前記少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のいずれかにおける不安定性を検出する。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択されるヒトゲノムＤＮＡの少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を分析する方法である。前記のＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を分析する方法は以下の工程を含む：（ａ）少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の少なくとも１つのプライマーを提供し；（ｂ）ヒト対象者個体の生物学的材料に由来するゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を前記少なくとも１つのプライマーを用いて増幅し、それによって増幅ＤＮＡフラグメントを生成し；さらに（ｃ）前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。好ましくは、前記増幅ＤＮＡフラグメントは、ヒト集団の該当遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子のサイズと前記増幅ＤＮＡフラグメントのサイズとを比較することによって、前記少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座のマイクロサテライトの不安定性を検出するために分析される。また別には、前記方法を用いて、１つの個体の正常な非癌性生物学的材料に由来するヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を増幅し、さらにマイクロサテライトの不安定性は、得られた増幅ＤＮＡフラグメントを工程（ｂ）で得られたものと比較することによって検出される。
【００１５】
本発明のまた別の実施態様は、対象者個体から単離されたＤＮＡのマイクロサテライトの不安定性を検出する、以下を含むキットである：１つの一ヌクレオチド遺伝子座および２つの四ヌクレオチド遺伝子座を含む少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを同時増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを容れた単一容器。
上記に簡単に記載した本発明の方法およびキットの種々の実施態様は、腫瘍細胞または癌細胞のＭＳＩの検出で使用するために特に適している。特に、本発明の方法およびキットを用いて、ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５から成る群から選択される少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、または、生物学的材料（例えば組織または体液、好ましくは腫瘍または癌性細胞に由来するＤＮＡを含むか、または含むと思われる生物学的材料）に由来する少なくとも１つのゲノムＤＮＡサンプルの、１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を含む少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットを増幅させることができる。単形態性または準単形態性遺伝子座（例えばＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５）の場合、該当遺伝子座の標準的パターンを有する集団の任意の個体に由来する正常なＤＮＡを増幅することによって作製されたパターンと前記の生成パターンとを比較することができる。しかしながら、陽性結果がＭＳＩではなく生殖細胞系列の変異を反映しているのではないことを担保するために、前記腫瘍ＤＮＡを得た個体と同じ個体の正常組織に由来するＤＮＡを使用するのが好ましい。
【００１６】
前記方法およびキットはまた、個体の正常組織から得たＤＮＡの多重増幅の結果を同じ個体の他の生物学的材料から得たＤＮＡの多重増幅の結果と比較するために用いることができる。本発明の方法のこの固有の実施態様を使用し、正常細胞との比較によって腫瘍細胞のＭＳＩを検出することについては図１で説明されている。特に図１は四ヌクレオチド繰返し（ＧＡＴＡ）を示し、前記はポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）でプライマー対（“プライマーＡ”および“プライマーＢ”）によって増幅される。続いて毛細管電気泳動を用いて増幅された対立遺伝子をサイズによって分離し、分画された増幅対立遺伝子をジーンスキャン（GeneScan（登録商標））ソフトによって作図する。正常ＤＮＡから得られた増幅ＤＮＡの図表には２つの対立遺伝子および小さなスタッターのピークのみが出現するが、一方、増幅された腫瘍ＤＮＡの図表には２つの対立遺伝子の他に３つのＭＳＩピークが出現していることに留意されたい。
本発明の特徴の利点およびより完全な評価は、以下の図面、好ましい実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を吟味することによって得られるであろう。図面は説明と例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定しようとするものではないことは明瞭に理解されよう。
【００１７】
発明の開示
Ａ．定義
以下の定義は、本発明の記載および限定に用いられる以下の用語の範囲および細部の明瞭で一貫した理解の提供を容易にしようとするものである。
本明細書で用いられるように、“対立遺伝子”は、特定の染色体上の位置（遺伝子座）に存在する遺伝子またはＤＮＡ配列のいくつかの選択可能形態の１つを指す。各常染色体の遺伝子座で、個体は２つの対立遺伝子（１つは父親から１つは母親から遺伝する）を有する。
本明細書で用いられるように、“増幅する”とは、核酸（例えばゲノムＤＮＡ）のある特定の遺伝子座から多数のコピーが生成される過程を指す。増幅は、以下を含む多数の公知の手段のいずれかを用いて実施できる（ただしこれらに限定されない）：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（R.K. Saiki et al., 1985 Science 230:1350-1354）、転写利用増幅（D.Y. Kwoh & T.J. Kwoh, American Biotechnology Laboratory, October, 1990）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）（G.T. Walker et al., 1992 Proc Natl. Acad. Sci., USA 89:392-396）。
本明細書で用いられるように、“同時増幅”は、同じ容器内の単一の増幅反応で２つまたは３つ以上の遺伝子座から多数のコピーが生成される過程を指す。
【００１８】
本明細書で用いられるように、“ＤＮＡ多形性”は、ある遺伝子座について集団内に２つまたは３つ以上の対立遺伝子が存在することをいう。本明細書で用いられるように、“遺伝子座”は、個々の遺伝子またはＤＮＡ配列の位置を特定する固有の染色体上の位置をいう。本明細書で用いられるように、“遺伝子座特異的プライマー”は、指定の遺伝子座または前記遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子に対して相補的な鎖の一部分と特異的にハイブリダイズし、さらに当該増幅方法で用いられる条件下では他のＤＮＡ配列と効率的にハイブリダイズしないプライマーをいう。
本明細書で用いられるように、“ヘテロ接合性の消失”（以下では“ＬＯＨ”）とは、個体が生まれつきヘテロ接合体であるマーカーについてアッセイすることによって検出される、ある染色体上の対立遺伝子の消失を指す。特に、ＬＯＨは、一人の特定の対象者から得た２つの異なるゲノムＤＮＡサンプル（１つのサンプルは正常な生物学的材料に由来し、他方は腫瘍または前癌状態の組織に由来する）の増幅で観察することができる。正常な生物学的材料に由来するＤＮＡは２つの異なる長さの対立遺伝子を生成し、腫瘍サンプルは増幅される同じ遺伝子座の２つの長さの対立遺伝子のうち１つのみを生成する場合は、前記腫瘍はＬＯＨを示している。
【００１９】
本明細書で用いられるように、“マイクロサテライト遺伝子座”とは、１つから７つ、より好ましくは１つから５つ、非常に好ましくは１つから４つの塩基対の長さを有する短い繰返し配列エレメントを含むゲノムＤＮＡの領域を指す。マイクロサテライト遺伝子座の中で少なくとも１回繰り返される各配列は、本明細書では“繰返し単位”と称される。各マイクロサテライト遺伝子座は好ましくは少なくとも７つの繰返し単位、より好ましくは少なくとも１０個の繰返し単位、さらに非常に好ましくは少なくとも２０個の繰返し単位を含む。
本明細書で用いられる“マイクロサテライト不安定性”（以下では“ＭＳＩ”）は、ある対象者の一定の組織、細胞または体液から得られたゲノムＤＮＡの対立遺伝子の長さがマイクロサテライト遺伝子座で変化する遺伝的不安定性の様式をいう。具体的には、ＭＳＩは個々の対象者から得られた２つの異なるゲノムＤＮＡサンプル（例えば健康な組織と癌性組織）の増幅に際して観察することができる（この場合、正常サンプルは１つまたは２つの長さが異なる増幅された対立遺伝子を生じ、腫瘍サンプルでは、増幅された対立遺伝子の少なくとも１つは前記遺伝子座のＤＮＡを含む正常サンプルの増幅対立遺伝子とは長さが異なる）。ＭＳＩは一般には、マイクロサテライト遺伝子座で少なくとも１つの繰返し単位が挿入または欠失した結果として生じる。
【００２０】
本明細書で用いられるように、“ＭＳＩ−Ｈ”は、高頻度のＭＳＩをもつ腫瘍を分類するために用いられる用語である。５つのマイクロサテライト遺伝子座（例えば米国立癌研究所の１９９８年のＨＮＰＣＣに関するワークショップでＨＮＰＣＣの検出に使用するために選択された５つのマイクロサテライト遺伝子座）を分析したとき、前記遺伝子座の少なくとも２つが不安定性を示すとき腫瘍はＭＳＩ−Ｈと分類される（Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257）。６つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を分析した場合、腫瘍に由来するゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも３０％が不安定であることが判明したとき、前記腫瘍はＭＳＩ−Ｈと分類される。
本明細書で用いられるように、“ＭＳＩ−Ｌ”は、低頻度のＭＳＩをもつ腫瘍を分類するために用いられる用語である。５つのマイクロサテライト遺伝子座（例えば米国立癌研究所の１９９８年のＨＮＰＣＣに関するワークショップでＨＮＰＣＣの検出に使用するために選択された５つのマイクロサテライト遺伝子座）を分析したとき、前記遺伝子座の１つだけが不安定性を示すとき腫瘍はＭＳＩ−Ｌと分類される。６つ以上のマイクロサテライト遺伝子座を分析した場合、腫瘍に由来するゲノムＤＮＡのマイクロサテライト遺伝子座の３０％未満が不安定であることが判明したとき、前記腫瘍はＭＳＩ−Ｌと分類される。ＭＳＩ−Ｌの腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈの腫瘍とは潜在的に異なる分子的病因を有する別個のミューテーターの表現型であると考えられる（Thibodeau, 1998; Wu et al., 1999 Am. J. Hum. Genetics 65:1291-1298）。正確にＭＳＩ−ＨとＭＳＩ−Ｌ表現型を区別するためには、６つ以上のマイクロサテライトマーカーを分析するように推奨されている（Boland 1998 上掲書；Frazer et al., 1999 Oncology Research 6:497-505）。
【００２１】
本明細書で用いられるように、“ＭＳＳ”は、マイクロサテライトが安定である（いずれのマイクロサテライト遺伝子座も不安定性を示さない）腫瘍を指す。ＭＳＩ−ＬとＭＳＳとの区別もまた、５つよりはるかに多い数のマーカーを用いたときにのみ達成できる。米国立癌研究所は、前記の目的のため、および上記のＭＳＩ−ＨとＭＳＩ−Ｌとを明瞭に区別する目的のためにはさらに別の１９個の一ヌクレオチドおよび二ヌクレオチド繰返し遺伝子座を使用することを推奨した（Boland, 1998上掲書）。
本明細書で用いられるように“ＭＳＩ−Ｌ／Ｓ”は、ＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳのいずれかであると分類された全てのものを指す。
本明細書で用いられるように“マイクロサテライトマーカー”は、マイクロサテライト繰返しおよび前記繰返し領域に接する核酸配列を含むゲノムＤＮＡのフラグメントを指す。
本明細書で用いられるように“単形態性”とは、ただ１つの対立遺伝子パターンが集団の全メンバーの正常なゲノムＤＮＡに存在することが判明したゲノムＤＮＡの遺伝子座を指す。
本明細書で用いられるように“ヌクレオチド”はＤＮＡ分子の塩基単位を指し、これは、１つのホスファチジル骨格単位および４塩基（アデニン（“Ａ”）、チミン（“Ｔ”）、グアニン（“Ｇ”）およびシトシン（“Ｃ”））のうちの１つを含む。
【００２２】
本明細書で用いられるように“ポリメラーゼ連鎖反応”または“ＰＣＲ”は、変性、プライマーによるアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長の繰返しにより標的ＤＮＡ配列のコピー数を約１０6倍またはそれ以上増幅する技術を指す。核酸を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応の工程は、米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号（前記両文献は参照により本明細書に含まれる）に含まれる。
本明細書で用いられるように“プライマー”とは、その３’末端がＤＮＡポリメラーゼ酵素による重合反応部位として機能できるように、標的ＤＮＡの遺伝子座を含む一方の鎖とハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントを指す。
本明細書で用いられるように“プライマー対”とは、標的ＤＮＡの対向する鎖と増幅されるべきヌクレオチド配列に接する標的ＤＮＡの領域でハイブリダイズする一対のプライマーを指す。
本明細書で用いられるように“プライマー部位”とは、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で用いられるように“準単形態性”とは、ただ１つの対立遺伝子パターンがある集団のほぼ全てのメンバーの正常なゲノムＤＮＡで存在することが判明しているゲノムＤＮＡの遺伝子座を指す。
本明細書で用いられるように“スタッター”とは、マイクロサテライト遺伝子座の増幅後に認められる小さなフラグメントを指し、主たるフラグメントまたは対立遺伝子よりも小さい１つまたは２つ以上の繰返し単位の長さを有する。前記は、増幅過程でＤＮＡポリメラーゼのすべり現象により生じると考えられている（Levinson & Gutman, 1987 Molecular Biology Evolution 4:203; Schlotterer & Tautz, 1992 Nucleic Acids Research 20:211）
【００２３】
Ｂ．増幅または同時増幅させる遺伝子座の選択
本明細書で例示および考察される本発明の実施態様の各々で増幅または同時増幅される少なくとも１つのＭＳＩ遺伝子座は一ヌクレオチド繰返し遺伝子座である。前記のような遺伝子座は、機能不全のＤＮＡミスマッチ修復系を有する腫瘍で非常に変化し易いことが示され（Parsons, 1995上掲書）、そのような遺伝子座の有用性が特に癌および機能不全ＤＮＡミスマッチ修復系が関与する他の疾患の検出で高められた。ある研究者グループは、ただ１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座（ＢＡＴ−２６）を増幅および分析することによって、１６０の腫瘍サンプルのうち１５９で（９９．４％の精度）ＭＳＩ−Ｈ状態を正しく確認することができたと報告した（Hoang et al., 1997 Cancer Research 57:300-303）。
いくつかの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座（ＢＡＴ−２６を含む）はまた、準単形態性を有することが確認された。単形態性または準単形態性は、正常／腫瘍対合サンプルの比較をより簡単にする。なぜならば、正常サンプルのＰＣＲ生成物は一般に全て同じサイズで、腫瘍サンプルのいずれの変化も容易に特定できるからである。
【００２４】
ゲノムＤＮＡ分析で一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を使用することの主要な欠点は、前記のような遺伝子座のいずれの増幅も、種々の長さを有する大量の異質なＤＮＡ増幅フラグメント（“スタッター”生成物）を増幅反応中に生じるということである。そのような人工産物は、はるかに長い繰返し単位を有する遺伝子座の増幅生成物ではより低い度合いで存在する。繰返し単位の長さと異質な増幅フラグメントの存在との関係の説明には図２を参照されたい。図２は、五ヌクレオチドから一ヌクレオチド繰返し遺伝子座まで繰り返し単位の長さが減少するにつれて人工産物のスタッターが増加することを示している。
一ヌクレオチド遺伝子座が単形態性または準単形態性である場合は、しかしながら対立遺伝子のサイズシフトを容易に検出することができ、たとえ重度にスタッターが存在したとしてもＭＳＩは顕示される。遺伝子座が準単形態性であるときは、サイズシフトの検出は、マイクロサテライト不安定性が示されると考えられる個体の生物学的材料（例えば腫瘍組織または体液）から得られるゲノムＤＮＡの増幅対立遺伝子を、１つの集団の対応する遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子のサイズと比較することによって実施できる。この特質によって、単一の標準対立遺伝子または標準対立遺伝子パネルのパターンを用いて個々の結果を分析し、個体の一定のゲノムＤＮＡにおけるマイクロサテライト不安定性の検出のために前記個体から採取しなければならないサンプル量を最小限にすることができる。
【００２５】
本発明の方法でまたは本発明のキットを用いて増幅されるマイクロサテライト遺伝子座の少なくとも１つは、好ましくは一ヌクレオチド繰返し遺伝子座、より好ましくは準単形態性一ヌクレオチド繰返し遺伝子座である。本発明の方法およびキットで使用するために選択される前記一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、好ましくは癌性生物学的材料では不安定であるが、正常な生物学的材料では不安定ではない。ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６およびＢＡＴ−４０は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌の特徴を有する大腸腫瘍でＭＳＩの識別に有用な一ヌクレオチド繰返し遺伝子座として認定された（Zhou et al., 1998 Genes, Chromosomes & Cancer 21:101-107; Boland et al., 1998 Cancer Research 58:5248-5257; Dietmaier et al., 1997 Cancer Research 57:4749-4756; Hoang et al., 1997 Cancer Research 57:300-303）。２つのまた別の遺伝子座（本明細書ではＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５と認定）は、コンピュータ化公開配列情報データベース（GenBank）の検索により特定され、前記のような遺伝子座として上記で確認されたとおりの好ましい特徴を有することが判明した。本発明での使用に適した一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の検索および特定は実施例２で説明される。同様な技術を用いて、本発明の方法およびキットで使用するために適した他の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座を特定することができる。
【００２６】
本発明の方法にしたがって、または本発明のキットを用いて増幅または同時増幅される一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、好ましくは準単形態性であり、与えられた用途について対象組織タイプで不安定性を示す。ＭＯＮＯ−１１およびＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−２５並びに特にＢＡＴ−２６はいずれも準単形態性であり、いくつかの癌性腫瘍組織で不安定性を示す。４つの準単形態性一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は全て、本発明の方法およびキットで特に有用であることが判明した。ＢＡＴ−４０はまた、いくつかの癌性腫瘍組織におけるその不安定性のために本発明の方法およびキットで有用であることが判明した。しかしながら、ＢＡＴ−４０は準単形態性遺伝子座ではない。本発明の方法では、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つの一ヌクレオチド繰返しマイクロサテライト遺伝子座が増幅または同時増幅される。
少なくとも１つの一ヌクレオチド繰返し遺伝子座および少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、本発明の方法およびキットに関する少なくともいくつかの実施態様にしたがって同時増幅され分析される。四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、より短い繰り返し単位を有するマイクロサテライト遺伝子座、特に一ヌクレオチドおよび二ヌクレオチド繰返し遺伝子座と比較して、増幅されたときに本質的に人工産物のスタッターをほとんど生じない（例えば図２を参照されたい）。前記のような人工産物は、シフトした対立遺伝子が第二の対立遺伝子のスタッターの位置に生じた場合にはＭＳＩと区別することは困難であろう。したがって、解釈についての懸念、およびデータの解釈を可能にするために準単形態性の必要性は存在しない（前記は一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の場合である）。実際、１つの集団内で高度に多形性である四ヌクレオチド繰返し遺伝子座さえも、個々の対象者内では前記が安定であることを条件に使用することができる。そのような遺伝子座はＤＮＡタイピングで一般的に用いられる。
【００２７】
本発明のいずれかの方法またはいずれかのキットを用いて増幅されるいずれの遺伝子座についても、好ましくは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、問題の生物学的材料タイプを除いて個体のＤＮＡで安定であることを基準に選択される。本発明の方法およびキットで用いられる好ましい四ヌクレオチド繰返し遺伝子座には以下が含まれる：ＦＧＡ、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ１Ｓ５４７、Ｄ１Ｓ１６７７、Ｄ２Ｓ１７９０、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ５Ｓ２８４９、Ｄ６Ｓ１０５３、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ９Ｓ２１６９、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ１０Ｓ２４７０、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１７Ｓ１２９４、Ｄ１７Ｓ１２９９およびＤ１８Ｓ５１。
上記で述べた同じ好ましい基準をもつまた別の一ヌクレオチドまたは四ヌクレオチドが、上記で述べた少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットと一緒に好ましくは同時増幅される。しかしながら、一ヌクレオチド繰返しまたは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座を前記の少なくとも３つのマイクロサテライト遺伝子座のセットに包含し、本発明の方法にしたがいまたは本発明のキットを用いて同時増幅し、分析することもまた意図される。
本発明の方法にしたがって、または本発明のキットを用いて増幅される遺伝子座および遺伝子座のセットを選択する好ましい方法は下記でさらに考察される。しかしながら、本発明の方法および材料がいったん開示されたら、本発明の方法およびキットで使用される遺伝子座、プライマー対および増幅技術を選択するさらに別の方法も当業者には容易に理解されることとなろう。そのような方法は全て添付の請求の範囲内に包含される。
【００２８】
Ｃ．更なる遺伝子座のスクリーニング
本発明の方法またはキットを疾患の治療および予後判定用の臨床診断アッセイに用いようとするときは、前記は高度に正確（偽陰性が少ない）および特異的（疑陽性率が低い）な結果を生じるようにデザインする必要がある。情報量の多い遺伝子座は好ましくはスクリーニングによって、より好ましくは徹底したスクリーニングによって特定される（実施例１および２参照）。しかしながら、もっとも情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座でさえも感度は１００％ではなく、特異性も１００％ではない。
特定の疾患（例えば癌性腫瘍）に密接に関連する組織でＭＳＩを検出する場合の個々のマーカーの能力は、多数のマーカーを多重化することによって顕著に高められる。より多くの遺伝子座を増幅し分析することによって得られる情報の増加は、検査結果の解釈における信頼性および正確さを高める結果をもたらす。疾患（例えば癌）の検出または診断で必要な感度を得るために、５つまたは６つ以上の非常に情報量の多いマイクロサテライト遺伝子座を分析することが推奨された（Boland, 1998 Cancer Research 58:5248-5257）。マイクロサテライト遺伝子座の多重化は、多数の遺伝子座全ての同時増幅および分析を可能にし、一方、しばしば制限される増幅に必要なＤＮＡ量を減少させることによってＭＳＩの分析をさらに簡易化する。
【００２９】
ＭＳＩ測定におけるまた別の一般的な問題は、ごく少しの割合（＜３０％）のマイクロサテライトマーカーが腫瘍で変化する中間型ＭＳＩ表現型の出現に関する（Boland, 1998上掲書）。これらの低ＭＳＩ腫瘍は、ＭＳＩ−Ｈ腫瘍とは潜在的に異なる分子的病因を有する別個のミューテーターの表現型を示していると考えられる（Thibodeau et al., 1993 Science 260:816-8; Wu et al., 1999 Am. J. Hum. Genetics 65:1291-1298; Kolodner et al., 1999 Cancer Research 59:5068-5074; Wijnen et al., 1999 Nature Genetics 23:142-144）。しかしながら、ＭＳＩ−ＬとＭＳＩ−Ｈとが本当に異なるのか否かは明らかではない。診断のためには、ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳ腫瘍は一般的には１つの安定な表現型クラスであると考えられる。ＭＳＩ−ＨとＭＳＩ−Ｌ表現型とを正確に区別するために、多数のマイクロサテライトマーカーを分析することが推奨されている（Boland, 1998; Frazer, 1999上掲書）。
多重増幅反応で遺伝子座を同時増幅し分析しようとするときは、データ解釈の容易さおよび正確さを含むさらに別の事柄も考慮することが必要である。正確なデータ解釈に影響を与える主要な要因の１つはＰＣＲ中にマイクロサテライト遺伝子座で発生するスタッターの量である。四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、それらは二ヌクレオチドのようなより短い繰返しタイプよりも顕著に少ないスタッターを生じる（図２）という理由から、本発明の方法および本発明のキットにより分析されるＭＳＩ多重化物に包含させるために選択された。しかしながら、％スタッターは個々の繰返しタイプ内でさえ顕著に変動する（図４）ので、遺伝子座を注意深く選択することはなお必要である。一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、疾患を含む問題の生物学的材料で高率の不安定性を示すので個体分析およびＭＳＩ多重化物に含めるために選択された。
【００３０】
ＬＯＨ発生率は、本発明の方法またはキットで増幅および分析されるＭＳＩ選択のまた別の因子である。ＬＯＨは、マイクロサテライトマーカーに対する新規な他のフラグメントが存在しないとき、ＭＳＩを示す前記マーカーで正常な対立遺伝子が失われたと誤った認識をもたらす。具体的には、これが真のＬＯＨであるか、シフトされた対立遺伝子は残りの野生型と一緒に移動するＭＳＩであるかは容易には識別できない。上記で述べた問題を最小限にするために、本発明の方法およびキットで使用するために選択されるマイクロサテライトマーカーは、好ましくは低頻度ＬＯＨ、好ましくは約２０％を超えないＬＯＨ、より好ましくは約１４％を越えないＬＯＨ、さらに好ましくは約３％を越えないＬＯＨを示す。
マイクロサテライトマーカーが上記で述べた必要な属性（すなわち高い感度、高い特異性、低いスタッター、低いＬＯＨ）を全て保有することは比較的稀なことである。診断検査で用いることができるＭＳＩ分析系のための敷居は若干高く、扱いにくいサンプルから得られる少量のＤＮＡを用いて、１つのアッセイで多数の遺伝子座から強固で再現性があり、さらにＭＳＩ−Ｌ表現型とＭＳＩ−Ｈ表現型とを区別できる結果が要求される。本発明で使用するために好ましいものとして上記で特定された具体的な好ましい一ヌクレオチドおよび四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は全て、上記で説明したとおり、診断分析での使用に適したＭＳＩ遺伝子座の基準の各々に合致することが判明した。
本発明の好ましい多重分析方法およびキットを用いて増幅されるＭＳＩ遺伝子座の特に２つの主要なタイプに対するさらに別の遺伝子座選択基準は以下で述べる。
【００３１】
Ｄ．プライマーのデザイン
１つまたは２つ以上のマイクロサテライト遺伝子座のためのプローブは本発明の方法およびキットに関する各実施態様で提供される。各遺伝子座について少なくとも１つのプライマー、より好ましくは各遺伝子座について少なくとも２つのプライマーが提供される（後者の少なくとも２つのプライマーは遺伝子座に接するプライマー対の形態を有する）。プライマーが多重増幅反応で用いられる場合は、多数の同時増幅遺伝子から増幅される遺伝子はサイズがオーバーラップしないか、またはサイズがオーバーラップする場合は前記オーバーラップする対立遺伝子を識別できるような態様で標識した増幅対立遺伝子が生成されるプライマーおよび増幅条件を選択するのが好ましい。
本発明の方法にしたがって好ましくは同時増幅される個々の遺伝子座の増幅に適したプライマーは下記の実施例４の表９に提示されている。９つの遺伝子座（すなわちＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８およびＤ７Ｓ１８０８）を含む好ましいある多重化物で使用される適切なプライマーは実施例６の表１１に記載されている。９つの遺伝子座（すなわちＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＭＯＮＯ−１５、ＢＡＴ−４０およびＤ７Ｓ１８０８）を含むより好ましい多重化物での使用に適したプライマーは実施例８の表１３に記載されている。前記および他の多重化物をデザインするための手引きは下記で提供される。同じ遺伝子座または本発明の範囲内に含まれる他の遺伝子座セットの増幅に適した他のプライマーも当業者には決定できよう。
【００３２】
Ｅ．ＭＳＩ多重化物のデザインおよび試験
本発明のマイクロサテライト遺伝子座の多重分析方法は、適切な遺伝子座セット、プライマーおよび増幅プロトコルを選択し、多数の同時増幅遺伝子座から増幅された対立遺伝子を生成することを含む。前記生成される増幅対立遺伝子は好ましくはサイズがオーバーラップせず、より好ましくは、それらは、別個の遺伝子座に由来するサイズがオーバーラップする対立遺伝子を識別することが可能な態様で標識される。遺伝子座の組み合わせは、上記２つの理由のいずれかのために、または、組み合わせた場合１つまたは２つ以上の遺伝子座が適切な生成物を生じないか、または真の対立遺伝子を示さないフラグメントがこの反応で生成されるという理由のために拒絶することができる。
以下の因子は、好ましくはどの遺伝子座を本発明の多重化物に含めるかを決定する際に考慮される。マイクロサテライト多重化物を効果的にデザインするために、各遺伝子座の対立遺伝子のサイズレンジが決定される。前記情報を用いて全ての別個の遺伝子座間で対立遺伝子の分離が促進される。なぜならば、オーバーラップはいずれも、別の遺伝子座の不安定性として不適切な認定を下すある遺伝子座に由来する対立遺伝子を生じる可能性があるためである。
【００３３】
偽一ヌクレオチド（non-mononucleotide）繰返し遺伝子座によって出現するスタッターの量もまた好ましくは考慮される。なぜならば、遺伝子座によって示されるスタッターの量はデータ解釈の容易さおよび正確さの主要な因子であるからである。各偽一ヌクレオチド繰返し遺伝子座に対して存在するスタッターレベルは集団調査を実施して決定するのが好ましい。上記で特記したように、四ヌクレオチド繰返しマーカーでは、二ヌクレオチドのようなより短い繰返しタイプよりスタッターが顕著に少なく、したがってＭＳＩ分析で正確にスコアを付与することができる。（図２および３）（Bacher & Schumm, 1988 Profiles in DNA 2(2):3-6）。少ないスタッターを生じることが判明している種類のマイクロサテライト遺伝子座（例えば四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座）でさえも、％スタッターは繰返しタイプ内で顕著に変動する可能性があることに留意されたい（図３、また図２も参照されたい）（Micka et al., 1999上掲書）。
少なくとも１つの一ヌクレオチドおよび少なくとも２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座が、本発明の方法にしたがいまたは本発明のキットを用いて同時増幅されるＭＳＩ遺伝子座多重化物に含まれるが、さらに別の一ヌクレオチドおよび／または四ヌクレオチド繰返し遺伝子座を前記多重化物中に含ませることができる。同じ基準または上記で述べた基準に類似する基準に合致する一ヌクレオチドまたは四ヌクレオチド繰返し遺伝子座以外のマイクロサテライト遺伝子座を多重化物に含めることもまた意図される。
【００３４】
本発明にしたがって分析される多重化物は好ましくは少なくとも３つのＭＳＩ遺伝子座のセットを含む。より好ましくは、前記は、少なくとも５つのＭＳＩ遺伝子座のセット、さらに好ましくは少なくとも９つのＭＳＩ遺伝子座のセットを含む。前記多重化物が少なくとも９つの遺伝子座のセットであるとき、好ましくは前記多重化物は少なくとも以下の遺伝子座のセットであり（ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ１Ｓ５１８およびＤ７Ｓ１８０８）、さらに好ましくは以下の遺伝子座のセットである（ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ３Ｓ２４３２、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１５およびＤ７Ｓ１８０８）。最初の多重化物で使用するために適したプライマーのリストは下記の実施例６の表１１に提示されている。第二のより好ましい多重化物で使用するために適したプライマーのリストは下記の実施例８の表１３に提示されている。
他の因子、例えば材料と方法の都合のよい組み合わせを考慮することもまた意図されている。そのような追加される因子の決定は、本明細書に開示した選択方法および手引きにしたがうか、または当業者に公知の技術を用いて決定できる。具体的には、同じ技術または実質的に同様な技術を用い、下記に記載した好ましいＭＳＩ遺伝子座およびＭＳＩ遺伝子座のセットを特定してプライマー対配列を選択し、さらにプライマーの濃度を調節して含まれる遺伝子座の全てが増幅される平衡を特定することができる。換言すれば、いったん本発明の方法および材料が開示されれば、本発明の方法およびキットで使用される遺伝子座、プライマー対増幅技術を選択する種々の方法を当業者は容易に想起することができよう。そのような方法は全て本発明の範囲内に含まれる。
【００３５】
Ｆ．ゲノムＤＮＡの供給源
本発明の方法にしたがって同時増幅されるゲノムＤＮＡは、対象個体、好ましくは哺乳類、より好ましくはイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、サルまたはヒト、さらに好ましくはヒトまたはマウス、極めて好ましくはヒトから得られる生物学的材料に由来する。前記生物学的材料は、任意の組織、細胞、またはゲノムＤＮＡを含む前記対象者から得られる生物学的液体であろう。前記生物学的材料は、好ましくは腫瘍組織、播種細胞、糞便、血液細胞、血漿、血清、リンパ節、尿および他の体液から成る群から選択される。
前記生物学的材料は、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された組織サンプルの形態（本明細書では“ＰＥＴ”）であってもよい。生検から得られる組織サンプルは一般的に長期保存のためにＰＥＴとして保存される。ホルマリンは組織サンプル内で架橋を形成し、前記は破壊が困難で時にはＤＮＡ収量の低下をもたらす。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルに付随するまた別の問題は、より長いフラグメントの増幅はしばしば問題が多いということである。そのようなサンプルから得られるＤＮＡが多重増幅反応で用いられるときは、ピークの高さの顕著な低下がフラグメントサイズの増加にしたがって認められる。本発明のマイクロサテライト分析方法およびキットは、好ましくはＰＥＴ組織サンプルから得られるＤＮＡの増幅および分析のためにデザインされる。（本発明の方法を用いた前記のようなサンプルの増幅の説明については実施例７を参照されたい。）
本発明の方法またはキットを腫瘍の分析または検出に用いるときは、分析するゲノムＤＮＡの少なくとも１つのサンプルは腫瘍に由来する。単形態性または準単形態性遺伝子座（例えばＭＯＮＯ−１１またはＭＯＮＯ−１５）を増幅させるときは、生成された増幅対立遺伝子のサイズは普遍的集団の対応する遺伝子座でもっとも一般的に観察される対立遺伝子サイズと比較される。好ましくは本発明の方法およびキットは、同じ個体から得られた少なくとも２つの異なるＤＮＡサンプルを増幅させることによって腫瘍を診断または検出するために用いられる（前記では２つのサンプルのうち１つは正常な非癌性の生物学的材料に由来する）。
本発明をさらに以下の実施例によって説明する。本実施例は本発明の範囲を制限するものと解されるべきではない。
【００３６】
実施例１
ＭＳＩの頻度についてのマイクロサテライトマーカーのスクリーニング
本実施例では、ＭＳＩを検出するために、腫瘍から単離したＤＮＡのマイクロサテライトマーカーを正常組織または細胞から単離したＤＮＡのマイクロサテライトマーカーと比較した。具体的には、マイクロサテライト遺伝子座を正常／腫瘍ＤＮＡサンプル対から増幅し遺伝子型を決定した。正常サンプルでは認められない１つまたは２つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプルに存在する場合は、スコアをＭＳＩ陽性とした。二ヌクレオチド、四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しマイクロサテライトマーカーを変化の頻度について分析し、ＭＳＩに対する個々のマーカーの相対的感度を決定した。本実施例で用いた具体的な方法についての詳細な情報は以下で提供される。
組織およびＤＮＡの単離：適合する３９人の患者の正常組織（血液）および新形成組織サンプルをヒト組織共同ネットワーク（Cooperative Human Tissue Network, 以下では“ＣＨＴＮ”）（Ohio State University, Columbus, OH）から入手した。外科的切除の後で、組織サンプルを液体窒素で凍結して−７０℃で保存した。血液サンプルは真空試験管を用いて静脈穿刺によって採集した。血液および固形腫瘍のＤＮＡ抽出は標準的フェノール／クロロホルム法（Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor, New York）にしたがうか、またはＱＩＡアンプ血液組織キット（QIAamp Blood and Tissue Kit, QIAGEN, Santa Clarita, CA）を用い製造元のプロトコルにしたがって実施した。
【００３７】
ＰＣＲおよびマイクロサテライト分析：２７５のマイクロサテライト遺伝子座から得た蛍光標識プライマーを用いて正常／腫瘍サンプル対から鋳型ＤＮＡを増幅した。リサーチジネティクスＣＨＬＣ／ウェーバーヒトスクリーニングセット（Weber Human Screening Set）バージョン９．０の２４５の四ヌクレオチド繰返しマーカーを評価した（Research Genetics, Huntsville, AL）。四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返しマーカーのためのまた別のプライマーセットをプロメガ社（Promega Corporation, Madison, WI）から入手した（パワープレックス（PowerPlex（登録商標））１６システムはＤ３Ｓ１３５８、ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ペンタＥ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＣＳＦ１ＰＯ、ペンタＤ、ｖＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、ＴＰＯＸおよびＦＧＡ遺伝子座を含む）。五ヌクレオチド繰返しマーカーＴＰ５３、ペンタＡ、ペンタＢ、ペンタＣ、ペンタＤ、ペンタＥ、ペンタＦおよびペンタＧは、公開データベースから得た配列データを用いた注文合成であった（Promega Corporation, Madison, WI）。比較のために包含させた二ヌクレオチドマーカー（Ｄ８Ｓ２５４、ＮＭ２３、Ｄ１８Ｓ３５、Ｄ５Ｓ３４６、ＴＰ５３−ｄｉ、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ１Ｓ２８８３、Ｄ３Ｓ１６１１、Ｄ７Ｓ５０１）はＰＥバイオシステム社（現在はアプライドバイオシステムグループ（Applied Biosystems Group（Foster City, CA）として事業を続行）から入手した。
【００３８】
リサーチジネティクスのヒトスクリーニングセットバージョン９．０のマーカーを１０μＬのＰＣＲ反応物中で２．５ｎｇのＤＮＡを用いて以下に記載したように多重反応させ、スクリーニングを実施した。他の遺伝子座は２５μＬのＰＣＲ反応物中で１ｎｇのＤＮＡを用いて以下に記載したように単一反応体として評価した。全てのマーカーは、下記で別に指示しないかぎり、パーキンエルマー（Perkin-Elmer（登録商標））ジーンアンプ（GeneAmp）ＰＣＲシステム９６００サーマルサイクラーを用い同じ条件下でＰＣＲ増幅させた。パワープレックス（PowerPlex（登録商標））１６システム（Technical Manual #TMD012, Promega Corporation, Madison, WI）から得たマイクロサテライトマーカーおよびマイクロサテライトＲＥＲアッセイシステム（PE Biosystems発行の製品文献を参照されたい、non Applied Biosystems, Foster City, CA）の二ヌクレオチド繰返しマーカーは製造元のプロトコルにしたがって分析した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
【表２】
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【００４１】
【表３】
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【００４２】
ＰＣＲ生成物（リサーチジネティクスのマーカーは最初に１ＸのゴールドスターＰＣＲ緩衝液で１：４に希釈）の１μＬをインターナルレーンスタンダード（Promega Corporation, Madison, WI）１μＬおよび脱イオン化ホルムアミド２４μＬと混合した。サンプルを９５℃で３分間変性させ、ただちに氷上で３分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ジネティックアナライザーを用い、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがって以下の設定で実施した：注入時間５秒、注入電圧１５ｋＶ、泳動１５ｋＶ、泳動温度６０℃および泳動時間２８分。
【００４３】
アッセイの説明：正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のサイズの特定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザー（Applied Biosystems）の適切な電気泳動図を精査し、各遺伝子座について主要なピークを決定することによって実施した。正常なサンプルでは、個体が個々のマーカーについてホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかに応じて、１つまたは２つのピークまたは対立遺伝子が各遺伝子座について存在する。正常および腫瘍対に対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルで見出されない１つまたは２つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプルに存在する場合は、スコアをＭＳＩ陽性とした。
評価されるサンプル間でさらにマーカー間で広い範囲の変化の頻度が観察された。ＭＳＩに関するＮＣＩワークショップで推奨されたガイドライン（Boland et al., 1998）にそって変化の頻度を基準にサンプルを２つの群に分けた。３０−４０％を越えるマーカーが腫瘍サンプルで変化を示すサンプルをＭＳＩ−Ｈと分類し、さらに３０−４０％未満の場合をＭＳＩ−Ｌと分類した。変化を示さないサンプルをマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）と分類した。このＭＳＩ表現型の定義を基準にして、９つのサンプルがＭＳＩ−Ｈに分類され、残りの３０サンプルがＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳのいずれかに分類された。
四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座は、上記のスクリーニングを実施した遺伝子座でもっとも少量のスタッターを示した。四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチド繰返し遺伝子座で認められた％スタッターの結果について図４を参照されたい。四ヌクレオチド繰返しマーカーはまた、ＭＳＩ−Ｈ群で０〜１００％の範囲で変化の頻度が変動した（図５）。一般に五ヌクレオチドマーカーは低レベルのＭＳＩを示した（図６）。ＣＨＴＮサンプルでＭＳＩに対して高い感度（ＭＳＩ−ＨサンプルでＭＳＩは８８％を越える）および高い特異性（ＭＳＩ−ＬおよびＭＳＳサンプルについてはＭＳＩは８％未満）を示すマイクロサテライトマーカーを選択し、メーヨークリニック（Mayo Clinic, Rochester, MN）から得られたまた別の２０個の正常／腫瘍大腸癌サンプルとともにさらに評価した（実施例５参照）。
【００４４】
実施例２
一ヌクレオチド繰返し遺伝子座の特定と性状決定
ＭＳＩ表現型の決定で一ヌクレオチド繰返し遺伝子座は非常に情報量が多いという特性のために、我々はまた、ヒトゲノムのポリ（Ａ）領域をＭＳＩアッセイの新規な供給源として吟味した。これを実施するために、（Ａ）30（Ｎ）30配列についてＧｅｎＢａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）からＢＬＡＳＴＮ（Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:402-410）検索を用いて一ヌクレオチド繰返しを特定した。（Ｎ）30配列を付け加えたのは、頻繁なｍＲＮＡヒットを排除し、さらにフランキング配列をＰＣＲのためのプライマーのデザインに利用することができるようにするためであった。次にフランキングプライマーを３３のＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列のためにオリゴプライマー分析ソフト（バージョン６．０）（National Bioscience, Inc., Plymouth, MN）を用いてデザインし、ポリ（Ａ）繰返しを含む領域を増幅した。遺伝子座の評価は、９つのＭＳＩ−Ｈおよび３０のＭＳＳ大腸癌サンプルおよび対応する正常ＤＮＡサンプルを用いて実施した。
【００４５】
新規な遺伝子座で２つの特徴についてスクリーニングした。第一にＭＳＩ−Ｈ群で検出でき、ＭＳＳ群で検出できない遺伝子座についてスクリーニングした。第二に、単形態性またはほぼ単形態性（準単形態性）であることを基準にして遺伝子座を選別した。新規な遺伝子座の単形態性は、５つの人種群（アフリカ系アメリカ人、アジア系アメリカ人、白人系アメリカ人、ラテンアメリカ系アメリカ人、インド系アメリカ人）から得られた９６サンプルの遺伝子型を決定することによって決定した。３３の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座のスクリーニングによって４つの新規な一ヌクレオチド繰返し遺伝子座が明らかにされた（ＭＯＮＯ−３、ＭＯＮＯ−１１、ＭＯＮＯ−１５およびＭＯＮＯ−１９）。これらはＭＳＩに対して高い感度を示し（表４および図７）、さらに比較的ホモ接合性で単形態性であった（表５）。前記の各遺伝子座で検出されたホモ接合性および単形態性の度合いは表５に示されている。
【００４６】
【表４】
2004533241.tif 000005
【００４７】
【表５】
2004533241.tif 000006
【００４８】
実施例３
集団調査
集団調査を実施した。前記調査では、上記の実施例１および２で説明した実験で多重化の候補として選択した好ましいマイクロサテライト遺伝子座を用い、アフリカ系アメリカ人の個体から得られた９３のサンプルの遺伝子型を決定した（使用した増幅条件については下記の表６および上記の表３を参照されたい）。本実験で増幅および分析した遺伝子座のリストについては下記の表７を参照されたい。さらに、プールしたヒト多様化ＤＮＡサンプルおよびコントロールＣＥＰＨＤＮＡ１３３１−１および１３３１−２（Coriell Cell Repository, Camden, NJ）をスクリーニング集団に加えた。アフリカ系アメリカ人のサンプルは、全ての人種群で見出された最大の遺伝的多様性を含むので用いた。
２２の異なるマイクロサテライトマーカーを含む９６のサンプルのスクリーニングを促進するために、選択されるマーカーは３つを含む小さな群で多重化した。多重化プライマーセットを用いて、下記に述べる条件下で個体のサンプルＤＮＡを増幅させた。
【００４９】
【表６】
2004533241.tif 000007
【００５０】
集団調査の結果は表７にまとめられている。各対立遺伝子座に対する最少および最大の対立遺伝子のサイズは対立遺伝子サイズのレンジを決定することによって特定した。パーセントスタッターを計算するために、スタッターバンドのピークの高さを真の対立遺伝子によって生成されたピークの高さで割り、続いて１００倍した。最少および最大スタッター値を各遺伝子座について計算するとともに、２０の任意のサンプルの値をまとめた平均パーセントスタッターを算出した。
【００５１】
【表７】
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【００５２】
実施例４
ＭＳＩ多重化デザイン
ＭＳＩに対して高い感度を示し、さらに最少のスタッターおよび最少のＬＯＨ発生率を有する多重化ＭＳＩアッセイを開発するために、下記表８に挙げた基準を用いて上記の実施例で特定した遺伝子座をＭＳＩ分析で使用可能な候補として特定した。
【００５３】
【表８】
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【００５４】
下記表９に挙げた遺伝子座が、上記表８に挙げた明細に合致する遺伝子座として特定された。
【００５５】
【表９】
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【００５６】
実施例５
ミスマッチ修復遺伝子の分析
多重ＭＳＩアッセイの開発で用いられるＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルのＭＳＩの主要な原因を決定するために、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２遺伝子のタンパク質発現レベルを調べた。８つのＭＳＩ−Ｈサンプルに由来するパラフィン包埋組織の免疫組織化学的分析を文献（Thibodeau et al., Cancer Research 58:1713-1718）に記載されたように実施した。ＭＬＨ１およびＭＳＨ２におけるタンパク質発現の欠如は高レベルのＭＳＩを示す腫瘍サンプルで予想され、前記は機能不全のミスマッチ修復系を示唆する。
ＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルに対する免疫組織化学的アッセイの結果は表１０に示されている。表１０のタンパク質発現の欄における“ＮＤ”は何も検出されなかったことを示していることに留意されたい。
【００５７】
【表１０】
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【００５８】
実施例６
ＭＳＩ多重アッセイの開発および実証
本発明の方法にしたがって分析される多重化物のデザインで使用する最良の遺伝子座が決定されたら、多重ＰＣＲに付随する問題および遺伝子座間の不適合を克服する必要がある。これは、注意深いプライマーのデザインおよび徹底的な試行錯誤によって単一ＰＣＲ条件セットを用いて同時増幅できる遺伝子座を見つけることを必要とした。遭遇する問題には以下が含まれる：（１）多数のオリゴがただ１つのＰＣＲ反応で混合されたときに生じるプライマー−プライマー相互反応；（２）個々の遺伝子座における配列の束縛によるプライマーデザインの制限（例えばＤＮＡ配列によって許容されるアンプリコンの最少サイズ、プライマーの最適以下の％ＧＣ、均一なＰＣＲ条件下で全てのプライマーに対してＴｍのバランスをとることの困難さ、プライマーの非特異的増幅、ヘアピン形成および自己ダイマー形成を最小限にするために望ましい温度プロフィルをもつプライマーを見出すことの困難さ、ヒトゲノムの他の繰返し配列に対する相同性）、および（３）２５０ｂｐの限定サイズ範囲内で９つの遺伝子座の全ての分離を可能にする多重デザイン。
実施例１から５に記載した３００に近いマイクロサテライトマーカーの徹底的な評価をもとにして、好ましいＭＳＩ多重アッセイのために９つの遺伝子座を選択した（表１１）。３つの遺伝子座は一ヌクレオチド繰返し（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６およびＭＯＮＯ−１５）で、６つは四ヌクレオチド繰返し（Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３１、Ｄ１０Ｓ１４２６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ１８０８）であった。前記の遺伝子座は腫瘍サンプルでＭＳＩを特定するために優れたマーカーセットであることが判明した。前記９遺伝子座多重化物を用いた、２９のＭＳＩ−Ｈおよび３０のＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳ大腸癌サンプルについてのＭＳＩ分析の結果は図８に要約されている。
【００５９】
上記の９つの遺伝子座を含むＭＳＩ多重化物を用いて得られた結果の典型的な例は図９に示されている。画像は、選択した９つ全てのマイクロサテライト遺伝子座を同時に増幅し、続いてＰＣＲ生成物をＡＢＩ３１０ＣＥで分離して得られた。９つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の一本の毛細管（またはゲルレーン）での分離は、遺伝子座のサイズがオーバーラップしないように前記多重化物をデザインするか、または異なる蛍光染料の使用によって達成された。異なる多重遺伝子座に対するサイズレンジは、下記に記載するプロトコルにしたがい、記載のＭＳＩ多重化物を用いてアフリカ系アメリカ人の個体から得られた９３のサンプルの遺伝子型を決定することによって求めた。さらに、プールしたヒト多種ＤＮＡサンプルおよびコントロールＣＥＰＨＤＮＡ１３３１−１および１３３１−２（ＣＯＲＩＥＬＬ細胞集積所）もスクリーニング集団に含めた。アフリカ系アメリカ人のサンプルは、全ての人種群の中でそれらが最も大きな遺伝的多様性を含むことが判明したので用いられた。
【００６０】
【表１１】
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【００６１】
ＭＳＩ多重アッセイのためのプロトコル：同じ個体から得た正常組織および腫瘍組織に由来する鋳型ＤＮＡを、ＱＩＡアンプ血液組織キット（QIAamp Blood and Tissue Kit, QIAFEN, Santa Clarita, CA）を用い製造元のプロトコルにしたがって精製した。２５μＬの反応容積中の２ナノグラムの鋳型ＤＮＡを下記表１２に記載したプロトコルを用い、上記の表３に示した反復プロフィルに従って増幅した。
【００６２】
【表１２】
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【００６３】
１μＬのＰＣＲ生成物を１μＬのインターナルレーンスタンダード（Promega Corporation, Madison, WI）および２４μＬの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを９５℃で３分加熱して変性させ、直ちに氷上で３分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザーで、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがい下記の設定により実施した：
泳動モジュール：  ＧＳＳＴＲＰＯＰ４（フィルターセットＡ）
注入時間：        ４秒
注入電圧：        １５ｋＶ
泳動電圧：        １５ｋＶ
泳動温度：        ６０℃
泳動時間：        ２４分
正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。正常サンプルでは、個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、各遺伝子に対して１つもしくは２つのピークまたは対立遺伝子が存在した。正常および腫瘍対に対する対立遺伝子のパターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルでは見出されない１つまたは２つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプルに存在する場合はＭＳＩを陽性とした。ＭＳＩ分析のためにデザインした多重化物を用いて得られた結果の典型的な例は、大腸癌については図１０および１１に、胃癌については図１２に示されている。
【００６４】
実施例７
ＭＳＩ多重化物を用いたＰＥＴサンプルＤＮＡの増幅
上記実施例６で特定した多重化物のマイクロサテライト遺伝子座を、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル由来のＤＮＡを増幅させるその能力について調べた。ＤＮＡはＰＥＴブロックから切り出した３つの１０ミクロン切片から、ＱＩＡアンプ組織キット（QIAamp Tissue Kit; Qiagen, Sanra Clarita, CA）を用い、以下の改変を加えながら製造元の指示にしたがって抽出した。７０℃に予備加熱した１００μＬのＱＩＡＧＥＮＡＥ緩衝液をカラムに加え、５分インキュベートして遠心分離し、続いて第二の溶出のためにカラムに再適用した。精製ＤＮＡ溶液１００μＬのうちの２μＬをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。実施例６で述べた９つの遺伝子座を多重化したプライマーセットを用いてＰＥＴサンプルのＤＮＡを増幅させた。得られた結果は、ＭＳＩ多重化物は、通常的に用いられるが扱いにくいＰＥＴサンプルに由来するＤＮＡを増幅させることができることを示した（図１３）。
【００６５】
実施例８
第二のＭＳＩ多重系の構成
第二のＭＳＩ多重アッセイ系での分析のために、９つの遺伝子座を含む第二のセットを特定した。前記遺伝子座は、大腸腫瘍サンプルでＭＳＩを決定するために上記の実施例４で特定した周知の遺伝子座のセットのうちの８つおよびさらに別の一ヌクレオチド繰返し遺伝子座（ＢＡＴ−４０）に由来する。多重遺伝子座のデザインは、１本の毛細管またはゲルレーンの中で遺伝子座のサイズがオーバーラップしないものであるか、または分離させたときオーバーラップが生じる場合は異なる染料を用いて標識することができるものであった。経験的に決定した最適な実験条件を用いて、数百人の健常な個体で多重マイクロサテライト分析を実施した。
ＭＳＩ多重アッセイのために選択した９遺伝子座のセットおよび各遺伝子座について関連する識別データは下記の表１３に示されている。
【００６６】
【表１３】
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【００６７】
第二のＭＳＩ多重化物の遺伝子座の４つ（ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−４０およびＭＯＮＯ−１５）は一ヌクレオチド繰返しで、５つ（Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ１０Ｓ１４２６）は四ヌクレオチド繰返しである。表１３は、第二のＭＳＩ多重化物中の各遺伝子座の増幅に用いられるプライマー対、各プライマー対による各遺伝子座の増幅で生成されるフラグメントのおよそのサイズレンジを示している。表１３に示したプライマー配列は、第二のＭＳＩ多重化物中の各遺伝子座の増幅に特に適切なものとして選択された。
表１３に示した９つの遺伝子座を含む多重化物およびプライマー対を用いて３６のＭＳＩ−Ｈ大腸癌および３０のＭＳＳ大腸癌に対するＭＳＩの分析の結果は、下記表１４および図１４に表されている。図１４は、調べた２つのタイプのサンプル（すなわちＭＳＩ−ＨおよびＭＳＳ）の各々で、多重化物の各遺伝子座で測定されたパーセントＭＳＩを示す棒グラフである。実施例６で認定した多重化物のさらに別の遺伝子座（すなわちＤ１Ｓ５１８）もまた本発明のアッセイに含めた。
【００６８】
【表１４】
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【００６９】
表１４および図１４にまとめたアッセイの結果は、ＢＡＴ−４０の増幅は、Ｄ１Ｓ５１８よりもＭＳＩ−ＨとＭＳＳサンプルとをより明瞭に識別することを示した。第二のＭＳＩ増幅系を用いて増幅された９つ全ての遺伝子座は非常に高い効率で検出された。
【００７０】
実施例９
ＭＳＩ多重系による分析
アフリカ系アメリカ人の各個体に由来する９３のサンプル、プールしたヒト多種ＤＮＡ並びに細胞株１３３１−１および１３３１−２（Coriel Cell Repository, Camdem, NJ）由来のコントロールＤＮＡを実施例８に記載した多重９遺伝子座系を用いて調べた。選択した９つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の同時増幅、それに続くＡＢＩ３１０ＣＥでの生成物の分離によって、予想された全ての生成物が下記に示すように得られた。
【００７１】
【表１５】
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【００７２】
【表１６】
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【００７３】
１μＬのＰＣＲ生成物を１μＬのインターナルレーンスタンダード（ＤＧ２６１１、Promega Corporation, Madison, WI）および２４μＬの脱イオン化ホルムアミドと混合した。サンプルを９５℃で３分加熱して変性させ、直ちに氷上で３分冷却した。増幅フラグメントの分離および検出は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザーで、ユーザーマニュアルで推奨されている標準的プロトコルにしたがい下記の設定により実施した：
泳動モジュール：  ＧＳＳＴＲＰＯＰ４（フィルターセットＡ）
注入時間：        ４秒
注入電圧：        １５ｋＶ
泳動電圧：        １５ｋＶ
泳動温度：        ６０℃
泳動時間：        ２４分
正常な対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。これらの結果は図１５に示されている。個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、正常サンプルの各遺伝子に対して１つもしくは２つのピークまたは対立遺伝子が存在した。
【００７４】
実施例１０
ＭＳＩ多重系による患者サンプルの分析
同じ個体に由来する正常および腫瘍組織対の対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を、上記の実施例８に記載した多重遺伝子座を用いて調べた。選択した９つ全てのマイクロサテライト遺伝子座の同時増幅とそれに続くＡＢＩ３１０ＣＥでの生成物の分離によって全ての予想された生成物が得られた。
患者サンプルの多重ＭＳＩアッセイおよび反復プロフィルのためのプロトコルは、正確に上記の実施例のとおりに実施した。正常な対立遺伝子および腫瘍の対立遺伝子のアンプリコンサイズの特定は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ジネティックアナライザーから得られた電気泳動図を調べ、各遺伝子座について優勢なピークを決定することによって達成された。
組織対の試験の典型的な結果は図１６に示されている。個々のマーカーについて個体がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかにしたがい、正常サンプルの各遺伝子に対して１つまたは２つの対立遺伝子が存在した。正常および腫瘍のサンプル対に対する対立遺伝子パターンまたは遺伝子型を比較し、同じ個体の正常サンプルには見出されない１つまたは２つ以上の異なる対立遺伝子が腫瘍ＤＮＡサンプルに存在する場合は、ＭＳＩ陽性とした。
本発明をこれまで具体的に説明してきたが、当業者には、これまでに記載されたもので実施することができる変更、付加および省略を含む種々の改変が明らかであろう。したがって、これら改変もまた本発明に包含され、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に合法的に一致するもっとも広い解釈によってのみ範囲を制限される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】マイクロサテライト不安定性分析を示す。図では、同じゲノムＤＮＡの２つの対立遺伝子上の四ヌクレオチド遺伝子座にアニールさせたプライマー対が示され、正常組織と腫瘍組織に由来するＤＮＡの四ヌクレオチド遺伝子座の増幅生成物の毛細管電気泳動の結果がプロットされている。腫瘍組織の増幅ＤＮＡの図表にはＭＳＩのピークが示されている。
【図２】観察されるスタッターの量に対するマイクロサテライト繰返し単位の長さの影響を示す。図には、ゲノムＤＮＡの２つの異なる対立遺伝子上の四ヌクレオチド遺伝子座にアニールさせたプライマー対の略図、並びに種々の個体から得られたヒトゲノムＤＮＡの増幅された一、二、三、四および五ヌクレオチド繰返し遺伝子座の蛍光スキャンおよび図表のセットが含まれている（前記増幅された遺伝子座はゲルまたは毛細管電気泳動によって分画された）。
【図３】低スタッター四ヌクレオチド繰返し遺伝子座は高スタッター二ヌクレオチド繰返し遺伝子座よりも解釈が容易であることを示す。図は、正常および腫瘍組織に由来する２つの異なるＤＮＡサンプルセットの２つの四ヌクレオチド繰返し遺伝子座および２つの二ヌクレオチド繰返し遺伝子座の増幅生成物を毛細管電気泳動した結果をプロットしたものである。
【図４】選択した四ヌクレオチドおよび五ヌクレオチドでのスタッター量の変動を示す。図では１３の異なる四ヌクレオチド繰返し遺伝子座および５つの異なる五ヌクレオチド繰返し遺伝子座で観察されるパーセントスタッターの変動がプロットされている。四角は平均パーセントスタッターを示し棒線は各遺伝子座で観察されるスタッターの範囲を表している。
【図５】マイクロサテライト不安定性の頻度に対する四ヌクレオチド繰返しマーカーのスクリーニングの結果を示す。図では、総数２７３のマーカーで与えられたパーセントＭＳＩを示すマイクロサテライト遺伝子座の数がプロットされている。例えば、ほぼ１５の遺伝子座が調べたＭＳＩ−Ｈ腫瘍サンプルの１００％で変化を示した。
【図６】マイクロサテライト不安定性の頻度に対する五ヌクレオチド繰返しマーカーのスクリーニングの結果を示す。図では、９つのＭＳＩ−Ｈ腫瘍のセットおよび３０のＭＳＳ腫瘍のセットで、８つの異なる四ヌクレオチド繰返し遺伝子座の各々について観察されたパーセントＭＳＩがプロットされている。
【図７】ＭＯＮＯ−１５マーカーを用いたマイクロサテライト不安定性分析を示す。図は、４人の異なる個体に由来する４つの異なる正常／腫瘍サンプル対から得られたＤＮＡのＭＯＮＯ−１５遺伝子座の増幅生成物を毛細管電気泳動して得られた図表である。
【図８】９遺伝子座のＭＳＩ多重化物を用いて得られた５９の大腸癌サンプルのパーセントＭＳＩを示す。図では、下記実施例６で述べた９つの遺伝子座を含むＭＳＩ多重化物（すなわち、Ｄ１Ｓ５１８、Ｄ３Ｓ２４３２、Ｄ７Ｓ１８０８、Ｄ７Ｓ３０４６、Ｄ７Ｓ９０７０、Ｄ１０Ｓ１４２６、ＢＡＴ−２５、ＢＡＴ−２６およびＭＯＮＯ−１５）を用いて５９の大腸癌サンプル（２９のＭＳＩ−Ｈおよび３０のＭＳＩ−ＬまたはＭＳＳサンプル）で観察されたパーセントＭＳＩがプロットされている。
【図９】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いた蛍光多重マイクロサテライトアッセイを示す。図は、図８で使用した９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いて得られた正常な非癌性ヒトゲノムの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図１０】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いた大腸癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図８で使用した９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いて得られた正常サンプルおよび大腸腫瘍サンプル由来ＤＮＡの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図１１】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いた大腸癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示し、図１０と同じタイプの図表であるが、異なる個体に由来する正常／大腸癌ＤＮＡ対の異なるサンプルを用いて作成された。
【図１２】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いた胃癌サンプルでのマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図８で述べた９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いて得られた正常／胃癌サンプル対由来ＤＮＡの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図１３】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いたパラフィン包埋組織のマイクロサテライト分析を示す。図は、図８で述べた９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いて得られたパラフィン包埋組織由来ＤＮＡの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図１４】１０の異なるマイクロサテライト遺伝子座における大腸癌サンプルでのパーセントＭＳＩを示す。図は、実施例８で述べたＭＳＩ多重化物に含まれる９つの遺伝子座（すなわち、ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０７０、Ｄ７Ｓ３０４６、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１５、Ｄ７Ｓ１８０８、ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６およびＤ３Ｓ２４３２）およびＤ１Ｓ５１８を用いて６６の大腸癌サンプル（３６のＭＳＩ−Ｈおよび３０のＭＳＩ安定またはＭＳＩ−Ｌサンプル）で観察されたパーセントＭＳＩの棒グラフである。
【図１５】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いた蛍光多重マイクロサテライト分析を示す。図は、以下のような蛍光染料標識プライマーで標識した実施例８で述べたＭＳＩ多重化物を用いた正常非癌性ヒトゲノムＤＮＡの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。ＢＡＴ−２６、Ｄ７Ｓ３０７０およびＤ７Ｓ３０４６に対するプライマーはフルオレセインで標識し、ＢＡＴ−４０、ＭＯＮＯ−１５およびＤ７Ｓ１８０８に対するプライマーはＪＯＥで標識し、ＢＡＴ−２５、Ｄ１０Ｓ１４２６およびＤ３Ｓ２４３２に対するプライマーはＴＭＲで標識した。
【図１６】９遺伝子座ＭＳＩ多重化物を用いたマイクロサテライト不安定性の検出を示す。図は、図１５で使用した同じ９遺伝子座ＭＳＩ多重化物および標識プライマーを用いて正常／大腸腫瘍サンプル対由来ＤＮＡの多重増幅生成物の毛細管電気泳動により作成された図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533241.tif 000120
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533241.tif 000121
【国際調査報告】
2004533241.tif 000122
2004533241.tif 000123
2004533241.tif 000124