(57)【要約】本発明は、組み合わせられた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステムにおけるネステッドポリメラーゼ連鎖反応を通じた並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための一般的な方法、それとともにそれから派生する、たとえば点突然変異を決定するための、及びＤＮＡサブ領域（それらは特定の態様によれば未知であることができる）を配列決定するための改変に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ少なくとも３個のＰＣＲプライマーの、ｘ組のＰＣＲプライマーセット、Ｐ１１，Ｐ２１，Ｐ３１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ３２，Ｐ１３，Ｐ２３，Ｐ３３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘ，Ｐ３ｘ、を用いてネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うことによる組み合わせられた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステムにおける並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定方法であって、ここでｘは、自然数（正の整数）を表し、かつ、決定すべきＤＮＡ配列の数に相当し、そして、ｘ組のＰＣＲプライマーセットのそれぞれについて、
（ａ）　２個の外側ＰＣＲプライマーＰ１及びＰ２を、増幅されるべき標的ＤＮＡ配列の上流及び下流にあるＤＮＡサブ配列にそれらがハイブリダイズするように選択し、
（ｂ）　１個の内側ＰＣＲプライマーＰ３を、決定されるべき標的ＤＮＡ配列内にあるＤＮＡサブ配列にそれがハイブリダイズし、Ｐ３伸長生成物を形成することができるように選択し、そして、
（ｃ）　ｘ組の外側ＰＣＲプライマーＰ１１，Ｐ２１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ１３，Ｐ２３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘを、ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘに対して過剰に液相に存在させ、そして、
（ｄ）　ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘを、ｘ個の空間的に分離された定義された位置で固相に不可逆的に結合されて存在させて、ＤＮＡマイクロアレイを形成し、そして、
（ｅ）　決定を、ＤＮＡマイクロアレイの定義された位置でのＰ３伸長生成物の存在を確認することによって行う
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
並行増幅によって点突然変異を決定する方法であって、
（ａ）　請求項１記載の方法を用いて、決定されるべきｘ個の変異体のすべてが増幅されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　少なくともＰ３ｘ個のプライマーファミリーを用い、ここでプライマーファミリーの各個別メンバーＰ３ｘ−Ｎは、その３′末端のヌクレオチドに関して互いに他のメンバーと異なり、ここでＮは、異なるヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＴを記述し、増幅反応のアニーリング温度は、決定されるべき点突然変異に本質的に正確に相補的であるプライマーの存在を特徴とするＤＮＡマイクロアレイの定義された位置のみで所望の伸長生成物が形成されるように選択され、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）　点突然変異の決定を請求項１の工程（ｅ）にしたがって行う
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
並行増幅によってＤＮＡサブ領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）　請求項１記載の方法を用いて、決定されるべきｘ個の配列のすべてが増幅されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　少なくともＰ３ｘ個のプライマーファミリーを用い、ここでプライマーファミリーの各個別メンバーＰ３ｘ−Ｎ，・・・Ｐ３ｘ−Ｎｎは、その３′末端の１からｎ個のヌクレオチドに関して互いに他のメンバーと異なり、ここでＮは異なるヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＴを記述し、ｎは、決定されるべき配列の長さを示し、増幅反応のアニーリング温度は、決定されるべき配列に本質的に正確に相補的であるプライマーの存在を特徴とするＤＮＡマイクロアレイの定義された位置のみで所望の伸長生成物が形成されるように選択され、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）　決定されるべき配列の検出を請求項１の工程（ｅ）にしたがって行う
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
並行増幅によって未知のＤＮＡサブ領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）　請求項１記載の方法を用いて、決定されるべき配列のｎ個のヌクレオチドのすべての配列が確認されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　定義された長さｎを有し、順列のすべてにわたる１セットの内側プライマーＰ３を用い、ここでいくつかのプライマーが、それぞれの場合において決定されるべき配列の異なる領域に正確にハイブリダイズでき、定義された長さのその伸長生成物を形成でき、これらのプライマーのそれぞれ別個のものはＤＮＡマイクロアレイの異なる定義された位置に置かれており、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）　配列の決定を、工程（ｂ）において形成された伸長生成物を確認し、これらの決定された値をＤＮＡマイクロアレイの定義された位置に割り当て、必要であればコンピュータ支援の、コンビナトリアル解析の文脈において決定されるべき配列を蓄積することによって行い、ここで全体的な配列への個別のデータの実際の整列はそれぞれの重複配列領域を用いて行う
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
ｘ組の外側ＰＣＲプライマー、Ｐ１１，Ｐ２１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ１３，Ｐ２３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘが、ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘに対して１０２〜１０１２倍過剰、好ましくは１０４倍過剰で存在する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
２組の外側ＰＣＲプライマーＰ１及びＰ２の融解温度が、内側プライマーＰ３のそれと異なる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
固相が、金属表面、ＳｉＯ２を蒸着した金属表面、金属／半金属酸化物表面、ガラス表面、ポリマー表面、ナイロン膜又はニトロセルロース膜の中から選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
金属表面が、アルミニウム又は金でできており、金属／半金属酸化物表面が、Ａｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２でできており、ガラス表面が、石英ガラスでできており、ポリマー表面が、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート又はシクロオレフィンコポリマーでできている、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｘ組の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘが、ケイ素原子上に１，２又は３個の加水分解可能な原子又は基を有する二官能性シランを介して金属／半金属酸化物表面又はガラス表面に結合している、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
加水分解可能な原子又は基が、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ４−アシロキシ基又はアミノ基を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
二官能性シランの第二の官能基が、求核置換反応、求核付加反応、ディールス・アルダー反応又はラジカル置換反応に関与することができる、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
二官能性シランの第二の官能基が、反応性二重結合、ジエン基、ジエノフィル基、エポキシ、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、活性エステル、アミノ、ジスルフィド、チオール、アジリジン、アズラクトン、イソシアネート、イソチオシアネート又はアジド基、又は反応性脱離基を包含する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ｘ組の内側ＰＣＲプライマー、Ｐ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘが、ｘ個の空間的に分離された位置で固相に不可逆的に結合されている、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法を行うための固相ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１４】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼ、好適な緩衝剤物質、すべてのデオキシヌクレオチド三リン酸及びｘ組の外側ＰＣＲプライマーＰ１１，Ｐ２１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ１３，Ｐ２３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘのような、行うべき反応に必要な個別の又はすべての成分が、可逆的に脱水されて表面上に存在する、請求項１３記載の固相ＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１５】
さらに、加熱、冷却、温度制御、混合及び測定のための装置がマイクロアレイ上に組み込まれている「Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ」システムの形態の、請求項１３又は１４記載の固相ＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組み合わされた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステム（この種の固相マイクロアレイシステムは、実際にそこに固定化される生体分子（この場合、ＤＮＡ）にかかわらず、一般に「バイオチップ」とも呼ばれる）における、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ＝「ポリメラーゼ連鎖反応」ともいう）を通じた並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための一般的な方法に関する。分析されるべき試料中の特定の分析対象物の検出を既に可能にしているこの一般的な方法から出発して、本発明は、同様に、そこから派生した点突然変異及び対立遺伝子変異体の決定のための方法、ならびにＤＮＡサブ領域（実際、未知のＤＮＡサブ領域さえも）の配列を決定する方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
本説明の枠組みにおいては、「並行」という用語は、文脈に応じて２つの異なる意味で用いられる。第一に、たとえば、以下で述べる個別の配列モジュールの並行決定は、異なるプライマーの使用、すなわち複数の操作を通じて可能であり、第二に、本発明の方法に具体的に言及する場合、「並行」増幅は、本発明にしたがって記載されたＰ３プライマーによる液相及び固相の両方における核酸の同時の増幅を意味する。
【０００３】
プローブ、ＰＣＲプライマー又はプライマーという用語は、以下において、関与するオリゴヌクレオチドの機能に応じて用いられることになる。標的配列の特異的増幅のためのプライマーとして用いることができるオリゴヌクレオチドは、標的配列を検出するためのプローブとしても用いることができる。
【０００４】
固相マイクロアレイシステム、及び固体支持体上に固定化されたプローブへハイブリダイズさせ、その表面上での標識の局在を決定することによる標識（タグのついた）ＤＮＡ配列の解析の方法は、たとえばＥＰ０　３７３　２０３から公知である。
【０００５】
この種のＤＮＡマイクロアレイ解析のためには一連の個別の工程が必要である。したがって、試料中の核酸は、直接又はコピーの形態で標識されなければならず、あるいは、操作はマイクロアレイ上のコレクター核酸及び溶液中の第二の検出プローブを用いて行われる。同時に、生物学的な汚染の検出のような多くの適用が、たとえばＰＣＲを介した、試料配列の増幅を必要とする。次に、記録され、渡されることができる特異的な固定位置の信号を生成するために、（標識された）試料を、たとえば検出プローブを介して、マイクロアレイ上に結合されたプローブとハイブリダイズさせる。この手順は、多数の個別の反応工程を生じ、そのため、これらの解析が労力及びコスト集約的で、遅く、そのうえ誤りの起こりやすいものとなっている。
【０００６】
固体支持体又はチップの存在下でＰＣＲを行うこと（「チップ上ＰＣＲ」）は、それ自体既に公知である（Ｓｈｏｆｆｎｅｒ Ｍ．Ａ．， Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．， Ｈｖｉｃｈｉａ Ｇ．Ｅ．， Ｋｒｉｃｋａ Ｕ．， Ｗｉｌｄｉｎｇ Ｐ．：Ｃｈｉｐ ＰＣＲ Ｉ． Ｓｕｒｆａｃｅ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｓｉｌｉｃｏｎ−ｇｌａｓｓ ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ ＰＣＲ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９６ Ｊａｎ．１５；２４（２）：３７５−９； Ｃｈｅｎｇ Ｊ．， Ｓｈｏｆｆｎｅｒ Ｍ．Ａ．， Ｈｖｉｃｈｉａ Ｇ．Ｅ．， Ｋｒｉｃｋａ Ｕ．， Ｗｉｌｄｉｎｇ Ｐ： Ｃｈｉｐ ＰＣＲ ＩＩ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｓｉｌｉｃｏｎ−ｇｌａｓｓ ｃｈｉｐｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９６ Ｊａｎ． １５；２４（２）：３８０−５）。
【０００７】
「ネステッドＰＣＲ」と呼ばれるものの原理もまた公知である（参考：たとえば、Ｃ．Ｒ． Ｎｅｗｔｏｎ， Ａ． Ｇｒａｈａｍ：“ＰＣＲ”， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｏｘｆｏｒｄ １９９４，ｐ．５９及びここで引用する他の参考文献）。ネステッドＰＣＲは、２つのＰＣＲプライマー対を包含し、それらのうち、１つの対のメンバー（外側ＰＣＲプライマーとして知られる）が増幅されるべき標的ＤＮＡ配列のそれぞれ上流及び下流にハイブリダイズする。第二のプライマー対のメンバー（内側ＰＣＲプライマーとして知られる）は、第一のプライマー対の設計によって予め決定されるセクション内にハイブリダイズする。この技術の利点は、標的ＤＮＡ配列が優先的に増幅されるため、感度及び特異性が相当増大することにある。
【０００８】
しかし、この技術は、たとえば、ＰＣＲのために必要な試薬を一緒にピペッティングすることによってさえ導入されうる種類の汚染物質に対し、非常に感受性である。さらに、ネステッドＰＣＲの場合には、空間的及び／又は時間的に分離された増幅が起こること、すなわち、たとえば第一のアンプリコンが希釈されなければならないこと、又は外側プライマーの少なくとも１つが除去されなければならないこと、のいずれかが必要である。一般に、希釈法が用いられ、その場合、もとのマトリックスの濃度及び外側プライマー（以下、それぞれＰ１及びＰ２と呼ぶ）の少なくとも１つの濃度は大きく低減される。第一の増幅後にピペットによって添加することは原理的には可能であるが、これには、「ネステッドＰＣＲ」に通常内在する利点（上記を参照）が達成され得ない危険性が付随する。そのうえ、当業者は、混合物中に３つ全部のプライマーが同時に存在する場合、さらなる感度及び特異性の増大は達成できず、この理由のため、本当の意味でそれをネステッドＰＣＲと呼ぶことがもはやできないこと（たとえばＷＯ９６／２６２９１参照）を知っている。この理由のため、ＷＯ９０／１１３６９、ＷＯ９６／３１６２２、ＷＯ９３／２１３３９及びＷＯ９８／２８４３８は、増幅サイクルが空間的及び／又は時間的に分離されて起こる方法を記載している。
【０００９】
ＰＣＲ試薬を予め混合し、適切に安定化する試みも、特にＰＣＲ反応の実施を簡便化するためになされていた。しかし、技術水準においては、意図されている反応の反応物質が、反応が単に試料の溶液、好ましくは水性溶液を添加することによって開始されうるようにして、マイクロアレイ配置上に直接、脱水された形態で提供される、という趣旨で記載されていない。
【００１０】
核酸分析を行うために試薬を凍結乾燥又は乾燥するための種々の異なる技術は、技術水準において記載されている。したがって、反応のために必要な成分（それらの中には核酸もある）のすべてを有する半球（へミスフェア）の調製は、米国特許第５，５６５，３１８号に記載されている。同様な技術は、ＦＲ２，６７４，２５３号、ＥＰ０，２９８，６６９号、ＥＰ０，７２６，３１０号、ＧＢ２，３３３，３５８号、ＷＯ９４／１７１０６、ＷＯ９８／００５３０、米国特許第５，２５０，４２９号及びＥＰ０，３８３，５６９号の出願に記載されている。
【００１１】
このような試薬球（スフェア）の利用に関する重要な核酸技術のすべては、特許出願ＷＯ９６／３２４９７に具体的な用語で記載されている。さらに、シークエンシング反応のための乾燥試薬がプレート（おそらくは微量滴定プレート）上で使用される装置又は装備は、特許出願ＷＯ９４／１６１０７において言及されている。これらの試薬が上に存在し、試薬の放出後に微量滴定プレートのくぼみの中で反応が進行しうるようなやり方で「８のストリップ（８’ｓ ｓｔｒｉｐｓ）」として知られているもの又は微量滴定プレートの上につけることができる、コームの形態の固体支持体は、特許出願ＷＯ９６／１７０８３に記載されている。
【００１２】
互いに空間的に分離されたスポット（「スポッツ」）の形態での個別のＰＣＲ試薬の適用又は顕微鏡スライドの形態の固相上のある領域上での適用は、特許出願ＷＯ９３／１４２２３に記載されている。乾燥標識（タギング）物質の可逆的結合及び再水和後のプローブの標識もまた記載されている。しかし、この場合、プローブ又はプローブ核酸自体は、明白に固体支持体に可逆的に結合されて存在する。
【００１３】
技術水準において記載されたこれらの技術のいずれもが、システムの固相上に直接検出可能に形成され、したがってそこに共有結合した伸長生成物を評価することによって、所望の結果が、（望ましい場合にはリアルタイムにおいてさえ）高スループット率及び再現性を有する非常に特異的な形で生成され、種々の適用領域に渡すことができる、結合された液相／固相ＰＣＲシステムにおける並行増幅を可能にしていない。
【００１４】
本発明の目的は、技術水準に存在する欠点を排除し、簡便で、誤りなしに操作することができ、感度及び特異性に関していかなる妥協もする必要がない、ＤＮＡ配列の増幅及び分析のための好ましく価格設定された方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、この課題はそれぞれが少なくとも３つのＰＣＲプライマーのｘ組のＰＣＲプライマーセットＰ１１，Ｐ２１，Ｐ３１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ３２，Ｐ１３，Ｐ２３，Ｐ３３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘ，Ｐ３ｘ（ここで、ｘは自然数（正の整数）を表し、決定されるべきＤＮＡ配列の数に相当する）を用いてネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うことによる組み合わせられた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステムにおける並行増幅による、ＤＮＡ配列の特異的決定のための一般的に適用可能な方法によって解決され、ここで、このｘ組のＰＣＲプライマーセットの各々について、
（ａ）　２個の外側ＰＣＲプライマーＰ１及びＰ２を、増幅されるべき標的ＤＮＡ配列の上流及び下流にあるＤＮＡサブ配列にそれらがハイブリダイズするように選択し、
（ｂ）　１個の内側ＰＣＲプライマーＰ３を、決定されるべき標的ＤＮＡ配列内にあるＤＮＡサブ配列にそれがハイブリダイズし、Ｐ３伸長生成物を形成することができるように選択し、そして、
（ｃ）　ｘ組の外側ＰＣＲプライマーＰ１１，Ｐ２１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ１３，Ｐ２３，・・・Ｐ１ｘ、Ｐ２ｘを、ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘに対して過剰に液相に存在させ、そして、
（ｄ）　ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘを、ｘ個の空間的に分離された定義された位置で固相に不可逆的に結合されて存在させて、ＤＮＡマイクロアレイを形成し、そして、
（ｅ）　決定を、ＤＮＡマイクロアレイの定義された位置でのＰ３伸長生成物の存在を確認することによって行う。
【００１６】
なかでも、以下に記載される利点は、本発明の方法を用いて達成されうる。ネステッドＰＣＲ反応は、固相ＤＮＡマイクロアレイ上で直接、並行して進行する。液相における従来のネステッドＰＣＲを行う場合に通常必要な、外側プライマーＰ１及びＰ２を用いる最初のＰＣＲ後の反応バッチの希釈及び最調整は、もはや不要である。分析全体を行うために、ここに記載する方法の使用者は、たった一つの付加的な操作工程を行う必要がある。すなわち、その者が行うために残されているすべては、試料核酸及びＰＣＲ試薬（ＰＣＲ緩衝液中のＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオチド三リン酸）をピペットによって添加することであり、ただし、これらの試薬は好ましい態様の固体支持体上に脱水された形態において完全に又は部分的に既に提供されていないことを条件とする。これは、労力のコスト及び汚染の危険性の両方を有意に低減させ、誤りの機会も明確に低減させる。
【００１７】
したがって、標準的ＰＣＲの感度を、特に非常に少量の標的ＤＮＡしか分析のために利用できない適用の文脈において、達成することは重要である。さらに、典型的な複数の適用の場合において要求される並行して起こる種々の反応工程についての特異性を保証することは、偽陽性及び偽陰性の検出事象を排除するために非常に本質的である。
【００１８】
したがって、以下に詳述するように、これらの要求の組み合わせを約束するために、操作が少なくとも３つのプライマーを用いて行われ、それによって検出プライマーＰ３のみが固相又は検出表面に結合し、全体の混合物中に存在するアンプリコンの重要な選択を確保することが示唆され、それが、必要とされる高い特異性を全く可能にする唯一のことである。さらに、この態様は、従来の方法と比較して顕著に特異性を増大させるが、液相中に存在する外側プライマーＰ１及びＰ２が固相に結合した検出プライマーＰ３に関して過剰に存在することにおいて達成される。言い換えれば、検出の特異性は、固相結合ＰＣＲに参加することができる核酸配列のみが混合物中に同様に存在する外側プライマーを通じてそれ自身予め「資格がある」ものであることにおいて確保される。まず第一に、これは、最小量の標的ＤＮＡでさえ、充分に増幅され、したがって、検出に利用可能であることを確保する。第二に、プライマーＰ１／Ｐ２及びＰ３の間の濃度差、及び増幅可能なＤＮＡ標的についての固相結合検出プライマーの、液相ＰＣＲに対して不利な条件におかれた達成能は、驚くべきほどに、本質的に目的の標的配列について予め選択された核酸のみが検出に参加しうることを確保する。
【００１９】
したがって、組み合わされた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステムにおけるネステッドＰＣＲを通じた並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための本発明の方法は、従来のＰＣＲ、すなわち、液相において行われるものと同じ感度を有し、同時に、ハイブリダイゼーションアッセイ及びプライマー伸長アッセイよりも高い特異性を有する。この理由は、プライマー／試料ＤＮＡ／ポリメラーゼシステムに内在する増幅に関する特異性が、固体支持体上に固定化された（そして、そのためプローブとしても機能する）内側プライマー及びアンプリコン間の特異的相互作用によってさらに顕著に強化されるからである。したがって、全体的な結果は、たとえば５′−エキソヌクレアーゼアッセイ（たとえばＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ技術）の結果よりも優れている。
【００２０】
これらの利点は、たとえば微量滴定プレート固相ＰＣＲ（Ｎｕｎｃ、たとえばＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋ（商標）参照）又は「Ｂｒｉｄｇｅ（商標）ＰＣＲ」（Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，たとえばＷＯ９８／３６０９４及びＷＯ９６／０４４０４参照）のような単純な固相プライマー伸長アッセイを用いては達成することができない。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、固定位置の内側ＰＣＲプライマー（これはプローブとしても作用する）の結果として、多数の異なる配列、特性又は特徴を並行して調べるために、標識（タギング）試薬を用いて（たとえば標識ヌクレオチドを用いて）マイクロアレイ上で操作を行うことが可能である。
【００２２】
しかし、たとえば光学的又は他の物理的方法を用いることによる、タギングなしの検出は等しく可能であり、すなわち、本発明の方法は、標識ヌクレオチドなしでさえ実施することができ、反応生成物を測定することができる。
【００２３】
ここで、技術水準の従来のハイブリダイゼーション法（この場合、固体支持体表面上での非特異的質量の増大が問題を呈する）と比較して、本発明の方法は、表面上での非特異的質量の増大を、高温の利用によって大幅に低減させることができ、それによって固相プライマーＰ３に対する特異的伸長生成物の共有結合が必要な特異性のほとんど排他的な決定を確保するという利点を有する。
【００２４】
位置的に特異的な質量増大の測定は、たとえば物理的方法によって起こることができる。たとえば、反射インデックスの位置的に特異的な変化、電気的抵抗及び／又は電気伝導性の位置的に特異的な変化、光学密度の位置的に特異的な変化、又は位置的に特異的な偏光効果などを測定することができる。
【００２５】
基本的には、本発明の一般的な方法は、広い範囲の領域の適用に適しており、それによって一方では分析すべき試料中の特定の分析対象物の純粋に診断的な検出と、他方ではゲノミックス及び／又はプロテオミクスにおける対応する問題の文脈における配列データ又は機能的関係についての情報を決定するためのその方法の複合体由来改変とを区別することができる。しかし、この区別は、説明のためのみのものであり、本発明の方法の基本的に開放的な適用可能性をいかなる意味においても制限すべきではない。
【００２６】
したがって、特定の態様によれば、本発明の一般的な方法は、そこから派生した方法、特に並行増幅によって点突然変異を決定するための方法であって、
（ａ）　上記で定義した本発明の方法を用いて、決定されるべきｘ個の変異体のすべてが増幅されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　少なくともＰ３ｘ個のプライマーファミリーを用い、ここでプライマーファミリーの各個別メンバーＰ３ｘ−Ｎはその３′末端のヌクレオチドに関して互いに他のメンバーと異なり、ここでＮは異なるヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＴを記載し、増幅反応のアニーリング温度は、決定されるべき点突然変異に本質的に正確に相補的であるプライマーの存在を特徴とするＤＮＡマイクロアレイの定義された位置のみで所望の伸長生成物が形成されるように選択し、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）点突然変異の決定を上記で定義した本発明の方法の工程（ｅ）にしたがって行う
ことを特徴とする方法を含む。
【００２７】
ここで、「本質的に正確に相補的なプライマー」という記述は、ハイブリダイズされ、かつ、ＤＮＡポリメラーゼによってマトリックスとして認められるプライマー（「鋳型」）が伸長されること、すなわち、規則として３′末端の領域におけるヌクレオチドのすべてがマトリックス（鋳型）に相補的であること、を意味する。
【００２８】
さらに、本発明の一般的な方法は、並行増幅によるＤＮＡサブ領域の配列の決定のための、そこから派生した方法であって、
（ａ）　上記で定義した本発明の方法を用いて、決定されるべきｘ個の配列のすべてが増幅されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　少なくともＰ３ｘ個のプライマーファミリーを用い、ここでプライマーファミリーの各個別メンバーＰ３ｘ−Ｎ，・・・Ｐ３ｘ−Ｎｎはその３′末端の１からｎ個のヌクレオチドに関して互いに他のメンバーと異なり、ここでＮは異なるヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ及びＴを記載し、ｎは決定されるべき配列の長さを示し、増幅反応のアニーリング温度は、決定されるべき配列に本質的に正確に相補的であるプライマーの存在を特徴とするＤＮＡマイクロアレイの定義された位置のみで所望の伸長生成物が形成されるように選択し、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）　決定されるべき配列の検出を上記で定義した本発明の方法の工程（ｅ）にしたがって行う
ことを特徴とする方法を含む。
【００２９】
本発明の一般的な方法の最初の２つの派生した改変の適用の領域は、全く異なることができるが、決定は、本質的に同じようにして行う。ＤＮＡサブ領域の配列を決定するための派生法における意図は、単なる末端３′ヌクレオチド以上のものを決定することであるが、公知のマイクロアレイの設計及び個々の反応領域の決定されるべき配列の第一、第二、第三・・・及びｎ番目の位置に相当するフィールドへのグループ分けの結果として、ＤＮＡサブ領域の決定は、各フィールドについて得られたデータの連続的な読み取りによって行う。言い換えれば、アレイの設定に基づいて、決定されるべき第一の塩基が検出されるフィールドは、最初に評価され、この第一のフィールドからの結果を知って、決定されるべき配列の第二の位置の塩基の決定が行われる、等々である。好ましくは、あるフィールの各試験は、最大の測定された信号強度を記録し割り当てることによって行う。もちろん、フィールドの測定値は、並行の方式で行うこともできる。更なる参照は、図３の文脈において行われる。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、一般的な方法は、並行増幅によって未知のＤＮＡサブ領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）　上記で定義した本発明の一般的な方法を用いて、決定されるべき配列のｎ個のヌクレオチドのすべての配列が確認されるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ここで、
（ｂ）　定義された長さｎを有し、順列のすべてにわたる１セットの内側プライマーＰ３を用い、ここでいくつかのプライマーが、それぞれの場合において、決定されるべき配列の異なる領域に正確にハイブリダイズでき、定義された長さのその伸長生成物を形成でき、これらのプライマーのそれぞれ別個のものはＤＮＡマイクロアレイの異なる定義された位置に置かれており、
（ｃ）　いかなる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性ももたないＤＮＡポリメラーゼを増幅に用い、そして、
（ｄ）　配列の決定を、工程（ｂ）において形成された伸長生成物を確認し、これらの決定された値をＤＮＡマイクロアレイの定義された位置に割り当て、必要であればコンピュータ支援の、コンビナトリアル解析の文脈において決定されるべき配列を蓄積することによって行い、ここで全体的な配列への個別のデータの実際の整列はそれぞれの重複配列領域を用いて行う
ことを特徴とする方法をも含む。
【００３１】
あるいは、コンセンサスＰＣＲは、ＰＣＲアダプターの連結を介して行うこともできる。これは、ｃＤＮＡ配列の「プール」から出発する署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシングを達成する（これは増幅のオンライン観察の場合には定量的に行うこともできる）。この種のシークエンシング方法（ＭＰＳＳ＝「大量並行署名付シークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」）は、最近記載され（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１８， Ｊｕｎｅ ２０００， ｐ．６３０−３４）、本明細書に開示された技術的な教示が考慮に入れられれば、はるかに簡便な方法で行うことができる。この目的のために、本発明の方法は、アッセイの前に、単にｃＤＮＡ生成、制限消化及びアダプター連結を必要とする。これに対して、ＭＰＳＳは、ｃＤＮＡの製造、制限消化、その後の「ビーズ」へのハイブリダイゼーション、「ビーズ」の「ＦＡＣＳ」ソーティング（ＦＡＣＳ＝蛍光活性化細胞ソーター）、及び連結及び制限消化の工程の反復を必要とする。
【００３２】
配列決定のための基本的な工程は、「ハイブリダイゼーションによるシークエンシング」技術に関する一般的な文献（参考：たとえばＥＰ０，３７３，２０３）から当業者に公知である。さらに、記載された方法を説明するための図４及び５が参照される。
【００３３】
この方法の別の態様によれば、配列の決定は、工程（ｂ）において形成された伸長生成物のそれぞれの長さを確認し、確認された値をＤＮＡマイクロアレイの定義された位置に割り当てることによって行う。
【００３４】
別の好ましい態様によれば、上述の方法は、少なくとも９ヌクレオチドを有するプライマーによって、未知の配列から始まる、署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシング及び定量のためにも用いることができる。
【００３５】
この目的のために、未知の配列は、制限酵素で切断され、アダプタープライマーが連結され、連結生成物が残りのＤＮＡから分離され、たとえばノナマーのプライマーを用いて、チップ上で、チップ上に増幅される。たとえば、完全な細菌のＲＮＡ「プール」のｃＤＮＡが決定される。アンプリコンは、好ましくは１８〜２５ｂｐ（塩基対）を含む。固相プライマーは、すべて９ヌクレオチドの長さであり、その配列が異なる。固相上には２６２１４４種の異なるプライマー変異体が存在する。標準的ＰＣＲ条件がここでも用いられるが、ノナマーでの固相増幅が優先されるためには、１０〜２０サイクル後、アニーリング温度は３０〜５０℃に下げられる。正確に相補的なプライマーのみが伸長される。染色後、得られるパターンは、通常のデータベースとの比較によって配列の決定を可能にする。
【００３６】
したがって、「ＳＡＧＥ」法の生成物の配列決定が可能になる（Ｖｅｒｃｕｌｅｅｃｕ Ｖ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５， Ｖｏｌ．２７０， ｐ．４８４−８７； Ｎｅｉｌｓｏｎ， Ｌ． ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０００， Ｖｏｌ．６３， ｐ．１３−２４）。ｃＤＮＡの最初の量は、オンライン検出によって決定することができる。
【００３７】
さらに、本発明は、本発明の方法を行うための固相ＤＮＡマイクロアレイにも関し、その上にはｘ個の内側プライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３・・・Ｐ３ｘがｎ個の空間的に分離された位置で固相に不可逆的に結合されている。
【００３８】
並行増幅によってＤＮＡサブ領域の配列を決定するための本発明の方法の結果として、当業界のシークエンシング方法の欠点、中でも特にこの種の方法論の基本的な直線性によってもたらされる低い感度、を排除することが可能である。
【００３９】
たとえば、「サイクルシークエンシング」として知られているものの場合、液相中でたった一つの増幅のみが起こり、シークエンシング生成物の分離が必要な結果となり、誤りの機会を含み、労働集約的である。
【００４０】
一方、「ミニシークエンシング」（Ｓａｎｇｅｒのジデオキシシークエンシング技術による）として知られるものの場合、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰｓ）のみが用いられ、そのため直線的な増幅のみが起こるので、大量の用いるべき「鋳型」又はマトリックスが必要である。
【００４１】
本発明の方法と比較して、例として記載した両方のシークエンシング技術は、決定されるべきマトリックス（鋳型）の同時の、すなわち並行した増幅が不可能であるという欠点を有する。
【００４２】
さらに、本発明の方法は、アンプリコン全体というよりむしろ配列決定されるべき全アンプリコンの関連領域のみが特異的な方式で配列決定されることが可能であるということにおいて、特に（たとえばＥＰ０，３７３，２０３に記載されたような）「ハイブリダイゼーションによるシークエンシング」技術のような公知の方法から区別される。さらに、この方法は、アンプリコンのいくつかの内部領域の配列の同時の決定を可能にする。
【００４３】
ハイブリダイゼーションによって、又はＡＲＭＳ技術（「増幅無反応性突然変異システム（Ａｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」）の使用によって、（たとえばＰ． Ｓｃｈｅｉｎｅｒｔ： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｉｏｎｓ； ＢｉｏＴｅｃ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ， ５／６／１９９８参照）ＳＮＰ（「一塩基多型」）を決定するためには、問題の配列を知らなくてはならない。さらに、「偽プライミング（Ｆａｕｌｔｙ Ｐｒｉｍｉｎｇ）」と呼ばれるものは認識されない。複数の操作（いくつかの異なるプライマーを用いることによる並行した実施）は、同じ長さの伸長生成物の生成のため、不可能であり、したがって、別個の混合物が必須である。
【００４４】
それに対し、特に、並行増幅によって点突然変異を決定するための本発明の方法は、以下のような利点を有する。
【００４５】
確認されるべき３′塩基の配列は、既知である必要がない（しかし、既知であることができる）。さらに、（Ｓａｎｇｅｒのジデオキシシークエンシング技術の場合のような）いかなる終止剤をも用いる必要がなく、個別の異なるＳＮＰを区別して特徴づける個別の配列モジュールの並行の決定、すなわち複数の操作が可能である。
【００４６】
指数関数的増幅の助けを借りて、最小量のマトリックス（鋳型）（１コピーで充分）でシークエンシングを行うので、感度が非常に高い。
【００４７】
さらに、本発明の有利な、及び／又は好ましい態様は、従属する請求項の対象である。
【００４８】
本発明は、態様の例に基づいて、図面に示す説明を参照することによって、制限なしに、以下に詳細に記載される。
【００４９】
並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための本発明の方法の有利な形状においては、ｘ個の外側ＰＣＲプライマーＰ１１，Ｐ２１，Ｐ１２，Ｐ２２，Ｐ１３，Ｐ２３，・・・Ｐ１ｘ，Ｐ２ｘは、ｘ個の内側ＰＣＲプライマーＰ３１，Ｐ３２，Ｐ３３，・・・Ｐ３ｘに関して、１０２〜１０１２倍過剰で、たとえば１０４倍過剰で存在する。その結果として、最初はＰＣＲは液相においてより広い範囲で起こる。しかし、アンプリコン濃度が増大するにつれて、ＰＣＲは、固相表面上でますます多く起こり、そこではそれはネステッドＰＣＲに相当する。
【００５０】
並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための本発明の方法の更に有利な態様においては、２つの外側ＰＣＲプライマーＰ１及びＰ２の融解温度（Ｔｍ）は、内側プライマーＰ３のそれとは異なる。たとえば、外側ＰＣＲプライマーは内側ＰＣＲプライマーよりも高い融解温度を有する。そうすると、反応の経過は、最初に、上昇した温度で外側ＰＣＲプライマーのみが結合又は「アニール」し、伸長されるように調整することができる。適当な回数のＰＣＲサイクルの後、温度を、次に、内側ＰＣＲプライマーもその「鋳型」に結合でき、決定に必要な伸長生成物が形成されるように低下させる。
【００５１】
種々の固相プライマーＰ３間の融解温度もまた異なることができる。したがって、増幅がＤＮＡマイクロアレイの特定の定義された位置のみで起こるように反応を制御することが可能である。所望の場合、増幅プロフィールを調製することによって、たとえば塩基の組成、ＧＣ含量及び長さのような固相プライマーの異なる特性を考慮することが可能である。
【００５２】
並行増幅によるＤＮＡ配列の決定のための本発明の方法において、固相又は固体支持体は、何ら特別な制限の対象ではなく、たとえば金属（たとえばアルミニウム又は金）表面、ＳｉＯ２を蒸着した金属表面、金属／半金属酸化物（たとえばＡｌ２Ｏ３又はＳｉＯ２）表面、ガラス表面、たとえばフィルム形態、ナイロン膜又はニトロセルロース膜のポリマー表面、から選択することができる。しかし、基本的に「半固体」又はゲル様支持体もまた好適であることは、当業者には明らかである。唯一の重要な要因は、検出反応の位置的な固定化及び／又は空間的な局在化が可能であることである。
【００５３】
たとえば、本発明によって好ましい好適なゲル様支持体は、従来の固体支持体上にそれ自体公知の重合開始剤を固定化し、その上に相当するモノマーを次に重合させて、「ポリマーブラシ」として知られているものを形成させることによって調製することができる。最初に、これらのモノマーは、それを介して「ポリマーブラシ」を互いに架橋することが可能になる官能基を有することができ、第二に、それらは、その目的がプローブ分子、たとえばオリゴヌクレオチド又は抗体を固定化することである官能基（リンカー基）を有することができる。水相においては、固体支持体表面上の「ポリマーブラシ」の層は、ゲル様の方式で膨張する。「ポリマーブラシ」で、二官能性分子（「リンカー」）から作られる従来の自己編成単層（「自己会合性単層（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）」、「ＳＡＭｓ」）を用いる場合よりも支持体表面上にかなり高いグラフト密度を達成することが可能である。試料又はプローブ分子に関するカップリング密度もまた、かなり高い。「ポリマーブラシ」技術の詳細は、ＷＯ００／４３５３９に記載されており、それをここで迅速に参照する。
【００５４】
ガラスの使用は、ガラスがその孔の中に標的ＤＮＡが拡散し得、結果としてその相当するプローブをよりゆっくり見出す多孔質の表面を有さないので、好ましい。さらに、ガラスは、機械的に丈夫であり、温度に抵抗性であり、激しい洗浄条件に対して感受性が低く、低い内在性蛍光を有する。すべてのタイプ及び種類のガラスが好適であり、たとえば石英ガラスがある。
ポリマー表面は、たとえばポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（アクリルガラス又はＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ）又はシクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣｓ）からなることができる。たとえば、好適なＣＯＣは、「Ｔｏｐａｚ」という商品名でＴｉｃｏｎａから入手することができる。
【００５５】
外側及び内側プライマー又はプローブの正確な配列は、実際の分析的な問題にしたがって当業者によって選択される。たとえば、それは、検出又は区別されるべき微生物に対して特異的なＤＮＡ配列にハイブリダイズする配列を含むことができる。たとえば、生物特異的配列は、配列データベース比較（必要であれば「アラインメント」）によって確認することができる。基本的には、プローブとして一般にＤＮＡ又は核酸に何ら制限はない。それらの公知の利点のため、ＤＮＡ−ＰＮＡ（ペプチド−核酸）ハイブリッド又はキメラを使用することも可能である。改変された核酸（たとえばｄＩ、ｄＩ−ビオチン、ｄＵ、ｄＵ−ビオチン）もまた使用することができる。
【００５６】
本発明によれば、固体支持体の表面への、スペーサー有り又は無しでの生体分子の直接又は間接固定化は、共有結合によって起こり、たとえばオリゴヌクレオチドのインシチュ合成ならびにそれぞれの長さに無関係の先に合成されたヌクレオチド配列のグラフティング及びプローブ及び／又はプライマーとして作用する核酸の実際の性質に等しく影響する。
【００５７】
たとえば、ガラス支持体を、たとえばガラス表面にカップリングすべきハロシラン基（たとえばクロロシラン基）又はアルコキシシラン基を有する、二官能性分子（「リンカー」として知られている）の溶液に浸漬することができる。
【００５８】
使用することができる二官能性シランは、何ら特別な制限の対象ではない。ケイ素原子上に１、２、又は３個の加水分解可能な原子又は基を有するシランのすべてが考慮の対象となり、たとえばハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アシロキシ又はアミノ基が挙げられる。
【００５９】
具体的な用語では、たとえば、イソシアノプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランをガラス支持体上に適用することができる。
【００６０】
二官能性シランの第二の官能基もまた、いかなる制限の対象でもなく、固定化されるべきプローブ分子（たとえば核酸）又は試料に応じて選択される。例としては、求核置換反応、求核付加反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応又はラジカル置換反応が可能な反応性基が挙げられる。実際の例は、反応性二重結合、ジエン基、ジエノフィル基、エポキシ、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、活性エステル、アミノ、ジスルフィド、チオール、アジリジン、アズラクトン、イソシアネート、イソチオシアネート及びアジド基及び反応性脱離基である。
【００６１】
多数の試料又はプライマー／プローブ分子を複数の支持体表面にカップリングするための、これらの、及びその他の二官能性リンカーは、特に生物学的起源のものも含め、当業者には周知であり、たとえばＧ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６が参照される。
【００６２】
ナイロン膜については、たとえば５′末端にオリゴ−（ｄＴ）テールを有するオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。オリゴ−（ｄＴ）テールのチミン塩基は、ＵＶ照射によってナイロン膜の一級アミンに共有結合で結合される。
【００６３】
並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための本発明の方法の好ましい態様においては、この方法の実施に必要なＰＣＲ試薬及び／又は成分のすべて又は個別のメンバーは、使用される固相ＤＮＡマイクロアレイ上に存在し、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ）、好適な緩衝剤物質及びすべてのデオキシヌクレオシド三リン酸及びｘ個の外側プライマーが、その表面上に安定に可逆的に脱水されている。
【００６４】
任意の所望のＰＣＲ試薬、たとえば通常の市販されているものを用いることができる。固体支持体への適用は、たとえばピペッティングによって従来の方法にしたがって行う。脱水、たとえば空気中、真空中又は乾燥キャビネット中、デシケーター中での慣用的な乾燥剤上での乾燥又は凍結乾燥（フリーズドライ法）は、その後に行う。凍結乾燥は、特に迅速で穏和な脱水方法を包含するので、好ましい。最終濃度は、定義された容量の液体中での再水和後に、特に濃度及びｐＨのような必要な反応パラメーターが得られるように、より濃縮された形態でＰＣＲ試薬を適用することによって調整することができる。
【００６５】
適用は、空間的に分離された方式で行うこともできる。
【００６６】
ＰＣＲ試薬は、長期間、たとえば少なくとも６ヵ月、冷蔵なしで固体支持体上で安定である。
【００６７】
好適には、内側プライマーは、前もって（すなわちＰＣＲ試薬を適用及び脱水する前に）固体支持体の表面に既に共有結合によって結合されているか、固定化されている。
【００６８】
使用においては、分析すべき試料中におそらく存在する可能性がある試料核酸を水性溶液中で添加し、ＰＣＲ試薬の再水和をもたらし、分析的出発物質の設計によって予測された「鋳型」相補的配列が存在した場合、さらなる試薬の添加の必要なしに固体支持体上で増幅が進行する。
【００６９】
好ましい態様によれば、分析／検出は、固相ＤＮＡマイクロアレイ上に伸長生成物として共有結合によって形成される標識された（タグのついた）ＤＮＡ配列の助けを借りて、たとえばＥＰ　０，３７３，２０３によって公知のように、表面上の標識の局在化を決定することによって行う。
【００７０】
たとえば、蛍光色素を標識としてアンプリコン中に取り込むことができ、その蛍光発光を次に検出又は測定する。標識の取り込みは固定位置方式で起こるので、標識反応は、必要であればリアルタイムでも検出及び／又は観察することができる。
【００７１】
標識及び検出技術は、何ら特別な制限の対象ではない。たとえば、放射能又は蛍光によって標識されたヌクレオチドを使用することが可能である。これに関して、蛍光標識は、放射性物質を用いて作業する場合のような特別の保護的注意を何ら適用する必要がないという利点を有する。ハイブリダイゼーションの検出は、次に、たとえば共焦点レーザー走査顕微鏡術によって行うことができる。
【００７２】
さらなる可能性は、ジゴキシゲニン標識の特異的プローブ（オリゴヌクレオチド）の使用である。この場合、ハイブリダイゼーションの検出は、たとえばその後の抗体及び色反応によって、たとえばポリ又はモノクローナルジゴキシゲニン抗体（たとえばアルカリホスファターゼとコンジュゲート化されたもの）を用いて、行うことができる。アルカリホスファターゼは、たとえばニトロブルー−テトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）を、青色色素物を形成するように変換する。
【００７３】
さらなる態様において、本発明の方法のひとつを実行するために示唆される固相ＤＮＡマイクロアレイは、「Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ」システムとして公知のものの形態で存在し、ここでは、反応物の混合及び温度調節に必要なすべての装置が、必要であればそれらのすべて又はいくつかの装置についての制御ユニットも含め、マイクロアレイに構築されている。この種のシステムは、本発明における使用に基本的に好適であり、たとえばＫｏｅｈｌｅｒら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｏｒｗｅｌｔ， Ｎｏ．２（２０００）， ｐｐ．５ｆｆ「Ｃｈｉｐ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ」に記載されており、本発明の知識を有する当業者によって不当な対価無しに容易に設計し操作することができる。あるいは、必要なプロセスパラメーターの制御は、たとえばコンピュータ機器において、完全に又は部分的に外部的に行うこともできる。
【００７４】
簡単に要約すると、組み合わされた液相／固相ＤＮＡマイクロアレイシステムにおけるネステッドＰＣＲを通した並行増幅によるＤＮＡ配列の特異的決定のための本発明の一般的な方法、及びある種の領域の適用のために改変されたその派生法は、ＰＣＲの感度、マイクロアレイ分析の並行性、及びプライマー／「鋳型」／ポリメラーゼ系の特異性を、マイクロアレイへの安定な脱水された試薬の付着の利点と一緒にする。
【００７５】
本発明を、以下の実施例に基づいて及び添付の図面の参照によって、以下において詳細に説明する。しかし、実施例の目的は単に本発明の特定の個別の態様を説明することであり、それらは一般的な発明的アイディアの制限として解釈されるべきではないという事実に対して明白に注意を喚起する。実際の態様例の多数の改変及び最適化を、当業者は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義された本発明の保護範囲を逸脱することなく行うことができる。
【００７６】
【発明の実施の形態】
【実施例】
実施例１
図１：既知の配列の特異的検出。この図の上半分は、増幅中のプロセスを模式的に示し、下半分は検出の時の状況を示す。少なくとも１つの溶液プライマー対（Ｐ１及びＰ２）及び少なくとも１つの固相プライマー（Ｐ３）が存在する。Ｐ３は、Ｐ１及びＰ２によって増幅されるアンプリコン内にその結合領域を有する。９０〜９５℃での変性は各サイクル後に行い、これは極端な洗浄工程（ストリッピング）に相当するので、共有結合によって結合した反応生成物のみが、反応完了後に固相上に残る（図１下を参照）。その他のすべての反応生成物は、上清中に存在し、検出中に無視される。
【００７７】
本実施例は、分析されるべき食品試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅに特徴的な既知の配列の存在の特異的検出に関する。試料物質の調製は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅの検出に特異的に関するＤＩＮインストラクション１０１３５にしたがって行う。
【００７８】
試料ＤＮＡは、１００μｌの水性溶液中に溶解されており、活性化されたガラスのマイクロアレイ上にピペッティングされ、そこにはその他のすべての試薬が凍結乾燥された形態で既に存在し、それによって、固相に共有結合されているＰ３プライマー以外のすべての成分が可逆的に固定化される。
【００７９】
試料溶液の添加の結果として、凍結乾燥された成分は、再水和され、その後の反応の進行のために以下の濃度で利用可能である。プライマーＰ１及びＰ２は、それぞれ１００ｎＭ及び６００ｎＭの濃度で存在し、プライマーＰ３は５０ｐＭの濃度を有する。通常のＰＣＲ標準緩衝液成分である、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２及びそれぞれ２００μＭの濃度の３種のヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰは、８．３のｐＨを有する水性試料溶液中に存在する。この系のｄＴＴＰ濃度は７５μＭであり、ビオチン−ｄＵＴＰのそれは５０μＭである。この系はまた、６．４単位のＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）−Ｇｏｌｄ， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）をも含む。
【００８０】
反応は、１０分間ポリメラーゼを活性化することによって開始させ、当面は６５℃のアニーリング温度及び当面は９４℃の変性温度で５０サイクル進行させ、ここでＰＴＣ　２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いる各サイクルは、以下のインキュベーション時間を含む：９４℃で４５秒、６５℃で６０秒及び７２℃で１２０秒。
【００８１】
反応後、共有結合した生成物に取り込まれたビオチンをストレプトアビジン−蛍光色素コンジュゲートによって公知の方法で染色し、検出手順に運ぶ。
【００８２】
実施例２
図２：アロタイプ決定。プライマーファミリーによる３′末端ヌクレオチドの同一性の特異的決定。図の上半分は、増幅中のプロセスを模式的に示し、下半分は検出の時の状況を示す。
【００８３】
コンセンサスＰＣＲを実施例１に述べた反応条件下で行う（参照：たとえば、Ｐ． Ｗｏｒｄｓｗｏｒｔｈ，”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ａｎｔｉｇｅｎｓ： ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９９１ Ｊｕｌｙ； ２９（１−２）： ３７−９）が、ここで、全部で２７０ヌクレオチドを含むＤＲ遺伝子（ＨＬＡクラスＩＩ）のエクソンＩＩの３００の変異体のすべてを増幅する。内部的に結合する固相プライマーＰ３は、１８〜２７ヌクレオチドの長さを有し、全部で２５０ファミリーのメンバーであり、この数字は、ヘテロ接合性の存在下であっても反復性を介して１つのゲノタイプの不明瞭でない同定を可能にするために必要であり、ここでプライマーファミリーの各個別メンバーはその３′末端のヌクレオチドに関して互いに他のメンバーと異なる（図２参照）。
【００８４】
存在するプライマーの本質的に同一の長さのため、増幅反応のアニーリング温度は６５℃であり、そのため、選択した条件下で、所望の伸長生成物は、決定されるべき変異体配列に本質的に正確に相補的であるプライマーの存在によって特徴付けられるＤＮＡマイクロアレイの定義された位置でのみ優先的に形成される。
【００８５】
実施例１にしたがった検出の後、得られた蛍光パターンを種々の異なる対立遺伝子の個別の配列に基づいて予測されるべき信号パターン順列と比較する。各場合において比較によって発見された一致は、試験されるべきゲノタイプ変異体の明瞭な同定を可能にする。
【００８６】
実施例３
図３：「配列タグ獲得」：プライマーファミリーによる既知のプライマー配列で開始する特異的署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシング。図の上半分は、増幅中の事象を模式的に示し、下半分は検出の時の状況を示す。図１及び２とは対照的に、固相上での副反応は、明確性のために上半分においては示していない。
【００８７】
コンセンサスＰＣＲを実施例２におけるように行う。この場合、未知の細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡを増幅する。この場合、アンプリコンは約１２００ｂｐ（塩基対）の長さを有する。しかし、意図は、可変性すなわち非保存領域中の内部領域の６ヌクレオチドのみを配列決定することである。この未知の配列セクションは、保存領域から出発して決定される。各場合において異なり、保存領域から出発する、３′末端の最後の塩基のみによる、固相プライマーファミリーがこの目的のために用いられ、全部で４６（これは４０９６変異体に等しい）が生じる（参照：図３）。アニーリング温度及びプライマーの全部の長さは、必要な特異性に一致する（実施例２を参照されたい）。実施例２に述べたように、プライマーは、１８〜２７ヌクレオチドの長さを有する。
【００８８】
検出は実施例２に先に記載したように行う。
【００８９】
得られたデータの評価は、マイクロアレイ設計に基づいて行う。その設計によって予め決められた、フィールド（これは決定されるべき配列の第一、第二、第三、第四、第五、及び第六位に相当する）中への個別の反応領域のグループ分けの結果として、６ヌクレオチドを含むＤＮＡサブ領域の決定を、各フィールドについて得られたデータの連続的な読み取りによって行う。言い換えれば、そのアレイ設計に基づいて、決定されるべき最初の塩基が検出されるフィールドは、最初に評価され、この最初のフィールドからの結果を知って、決定されるべき配列の第二の位置の塩基の決定が行われる、などである。好ましくは、フィールドの各試験は、最大の測定された信号強度を記録し、割り当てることによって行う。もちろん、フィールドの測定は、並行の方式で行うこともできる。さらなる参照は図３の文脈においてなされる。
【００９０】
実施例４
図４：プライマーヘキサマーによる未知の配列から出発する署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシング。図の上半分は、増幅中の事象を模式的に示し、下半分は、検出の時の状況を示す。図１及び２とは対照的に、固相上での副反応は、明確性の理由のため、上半分においては示していない。
【００９１】
未知の配列を、インバースＰＣＲ後に特異的プライマーによって増幅する。インバースＰＣＲは、当業界で公知である（参照：たとえば、Ｃ．Ｒ． Ｎｅｗｔｏｎ， Ａ． Ｇｒａｈａｍ：“ＰＣＲ”， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｏｘｆｏｒｄ １９９４， ｐｐ．１２０ ｆｆ．及びここで引用されたその他の文献）。この場合、トウモロコシ粒（種子）ゲノム中に組み込まれた移入遺伝子構築物の「ボーダー」配列を決定する。アンプリコンは、５００ｂｐ（塩基対）を含む。固相プライマーＰ３は、すべて６ヌクレオチドの長さであり、その配列が異なる。チップ上には４０９６の異なる固相プライマー変異体が存在する。１０００コピーのトウモロコシＤＮＡを使用する。標準ＰＣＲ条件をここでも使用する（上記を参照）。しかし、ヘキサマーを用いる固相増幅を優先させるため、アニーリング温度はサイクル２０の後に３０℃に下げる。
【００９２】
その後、配列の決定は、特異的に形成された伸長生成物を確認すること、ＤＮＡマイクロアレイの定義された位置へのこれらの決定された値の割り当て、及びコンビナトリアル分析の文脈における決定されるべき配列の蓄積（必要であればコンピュータ支援されたもの）によって行い、それによって全体的な配列への個別のデータの実際のアラインメントをそれぞれの重複する配列領域を用いて行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】
既知の配列の特異的な検出。
【図２】
プライマーファミリーによる３′末端ヌクレオチドの同一性の特異的決定によるアロタイプ決定。
【図３】
「配列タグ獲得（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）」として知られるもの、すなわち、プライマーファミリーによる既知のプライマー配列から出発する特異的署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシング。
【図４】
プライマーヘキサマーによる未知の配列から出発する署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシング。
【図５】
連続配列シリーズを生成するための図４による署名つき（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）シークエンシングによって得られた個別の結果の照合。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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