(57)【要約】本発明は、突然変異されたＦＡＤプレセニリン−１（ＰＳ−１）遺伝子、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異の突然変異体タンパク質産物をコードする遺伝子を有する標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物ならびにその生殖による子孫、ならびに、突然変異されたＦＡＤ  ＰＳ−１遺伝子およびヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異の突然変異体タンパク質産物をコードする遺伝子を有する標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物ならびにその生殖による子孫、ならびに、アルツハイマー病の治療において有用な化合物の同定方法、およびアルツハイマー病の治療方法を提供する。
2004533802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレセニリン−１（ＰＳ−１遺伝子）のヒト突然変異、ヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）スウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ遺伝子を含んで成るヒトＦＡＤ突然変異についてヘテロ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
プレセニリン−１（ＰＳ−１遺伝子）のヒト突然変異、ヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）スウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ遺伝子を含んで成るヒトＦＡＤ突然変異についてホモ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ＰＳ−１遺伝子の前記突然変異がＰ２６４Ｌである、請求項１記載の哺乳動物。
【請求項４】
前記ＰＳ−１遺伝子の前記突然変異がＰ２６４Ｌである、請求項２記載の哺乳動物。
【請求項５】
前記哺乳動物がげっ歯類である、請求項１記載の哺乳動物。
【請求項６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項５記載の哺乳動物。
【請求項７】
前記哺乳動物がげっ歯類である、請求項２記載の哺乳動物。
【請求項８】
前記哺乳動物がマウスである、請求項７記載の哺乳動物。
【請求項９】
前記突然変異体ＰＳ−１遺伝子が発現される請求項１記載の哺乳動物の生殖による子孫。
【請求項１０】
前記突然変異体ＰＳ−１遺伝子が発現される請求項２記載の哺乳動物の生殖による子孫。
【請求項１１】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項１記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項１２】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項２記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項１３】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項９記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項１４】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項１０記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項１５】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）前記哺乳動物に化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項１記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項２０】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）前記哺乳動物に化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項２記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項２１】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）前記哺乳動物に化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項９記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項２２】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）前記哺乳動物に化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項１０記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項２３】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項１９記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項２８】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項２０記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項２９】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項２１記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項３０】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項２２記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項３１】
請求項１１記載の方法により同定される化合物。
【請求項３２】
請求項１２記載の方法により同定される化合物。
【請求項３３】
請求項１３記載の方法により同定される化合物。
【請求項３４】
請求項１４記載の方法により同定される化合物。
【請求項３５】
請求項１９記載の方法により同定される化合物。
【請求項３６】
請求項２０記載の方法により同定される化合物。
【請求項３７】
請求項２１記載の方法により同定される化合物。
【請求項３８】
請求項２２記載の方法により同定される化合物。
【請求項３９】
プレセニリン−１（ＰＳ−１遺伝子）のヒト突然変異およびスウェーデン型ＡＰＰ６９５についてのヒトトランスジェニックを含んで成るヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）突然変異についてヘテロ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【請求項４０】
プレセニリン−１（ＰＳ−１遺伝子）のヒト突然変異およびスウェーデン型ＡＰＰ６９５についてのヒトトランスジェニックを含んで成るヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）突然変異についてホモ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【請求項４１】
前記ＰＳ−１遺伝子の前記突然変異がＰ２６４Ｌである、請求項３９記載の哺乳動物。
【請求項４２】
前記ＰＳ−１遺伝子の前記突然変異がＰ２６４Ｌである、請求項４０記載の哺乳動物。
【請求項４３】
前記哺乳動物がげっ歯類である、請求項３９記載の哺乳動物。
【請求項４４】
前記哺乳動物がマウスである、請求項４３記載の哺乳動物。
【請求項４５】
前記哺乳動物がげっ歯類である、請求項４０記載の哺乳動物。
【請求項４６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項４５記載の哺乳動物。
【請求項４７】
前記突然変異体ＰＳ−１遺伝子が発現される請求項３９記載の哺乳動物の生殖による子孫。
【請求項４８】
前記突然変異体ＰＳ−１遺伝子が発現される請求項４０記載の哺乳動物の生殖による子孫。
【請求項４９】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項３９記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項５０】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４０記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項５１】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４７記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項５２】
Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力についての化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）前記哺乳動物に前記化合物を投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４８記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、前記Ａβペプチドのインビボのレベルを低下させる能力を有する化合物を指示する、前記方法。
【請求項５３】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）化合物を前記哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項３９記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項５８】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）化合物を前記哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４０記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項５９】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）化合物を前記哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４７記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項６０】
アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法であって、
ａ）化合物を前記哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定すること
の段階を含んで成り、請求項４８記載の哺乳動物からの組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少が、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する、前記方法。
【請求項６１】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
前記組織サンプルが、脳組織、非脳組織および体液よりなる群から選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項５７記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項６６】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項５８記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項６７】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項５９記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項６８】
有効なアルツハイマー病治療量の請求項６０記載の方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項６９】
請求項４９記載の方法により同定される化合物。
【請求項７０】
請求項５０記載の方法により同定される化合物。
【請求項７１】
請求項５１記載の方法により同定される化合物。
【請求項７２】
請求項５２記載の方法により同定される化合物。
【請求項７３】
請求項５７記載の方法により同定される化合物。
【請求項７４】
請求項５８記載の方法により同定される化合物。
【請求項７５】
請求項５９記載の方法により同定される化合物。
【請求項７６】
請求項６０記載の方法により同定される化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との関係）
本出願は一部継続出願であり、かつ、１９９７年８月２９日出願の仮出願番号第６０／０５７，０６９号明細書に対しＵ．Ｓ．Ｃ．第３５条§１１９（ｅ）項の下で優先権を主張する１９９８年３月１０日出願の米国特許出願第０９／０４１，１８５号明細書に対しＵ．Ｓ．Ｃ．第３５条§１２０の下で優先権を主張し、そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、非ヒト哺乳動物のプレセニリン１（ＰＳ−１）ＦＡＤ遺伝子中にヒト突然変異を含んで成る標的遺伝子組換え（ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）非ヒト哺乳動物、アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法、およびアルツハイマー病の治療方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、顕著な挙動変化および痴呆につながる、年齢に依存する神経変性性障害である。顕著な特徴の病態は、ニューロンおよびシナプスの相当の喪失の結果としての脳灰白質の萎縮、ならびにニューロン内神経原線維濃縮体および脳実質内の細胞外アミロイド斑の双方の形態のタンパク質沈着を包含する。加えて、ＡＤの脳の冒された領域は反応性の神経膠症を表し、これは脳損傷に対する応答であると思われる。ＡＤに罹りやすい集団からの生き残っているニューロンは、細胞骨格（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９６、２、８７１−８７５）、ゴルジ複合体（Ｓａｌｅｈｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９５、５４、７０４−７０９）およびエンドソーム−リソゾーム系（Ｃａｔａｌｄｏら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９５、１４、６７１−６８０）における変化により示されるところの代謝が危険にさらされていることの兆候を示す。
【０００４】
ＡＤ症例のおよそ１０ないし３０％が常染色体優性の様式で遺伝され、そして「家族性アルツハイマー病」もしくは「ＦＡＤ」と称される。遺伝的連鎖の研究は、ＦＡＤが不均質でありかつ症例の大多数は第１、１４、１９もしくは２１染色体上の遺伝子突然変異に関連づけられていることを示した（ＳｉｍａｎとＳｃｏｔｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９６、７、６０１−６０７に総説される）。重要なことには、これらの個体は、該突然変異が、関係した症候群よりはむしろ該疾患の発生と関連することを確認する、該疾患の古典的な症候的および病理学的特徴を発生することが示されている。第１４染色体上の遺伝子座がＦＡＤの有意の部分と関連し、そして、該遺伝子座での突然変異は、４６７アミノ酸のタンパク質をコードする「Ｓ１８２」もしくは「プレセニリン１」（ＰＳ−１）と命名される単一コピーの遺伝子に位置づけられている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７５、７５４−７６０；Ｃｌａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、１１、２１９−２２２）。第１染色体上に位置する緊密に関係した遺伝子「ＳＴＭ２」もしくは「プレセニリン２」（ＰＳ−２）は、ロシアのボルガ川流域からのドイツの家族の子孫を包含する２組のさらなるＦＡＤの一族に関連づけられている（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、９７３−９７７；Ｒｏｇａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７６、７７５−７７８）。ＰＳ−１およびＰＳ−２は全体で６７％のアミノ酸配列の相同性を共有し、また、一次構造分析は、それらが６ないし８つの膜貫通ドメインをもつ内在性膜タンパク質であることを示す（Ｓｌｕｎｔら、Ａｍｙｌｏｉｄ−Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９５、２、１８８−１９０；Ｄｏａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９６、１７、１０２３−１０３０）。プレセニリンの機能に関する情報の多くは、「ＳＥＬ−１２」（ｌｉｎ−１２／ｇｌｐ−１／Ｎｏｔｃｈファミリーにより媒介される細胞内シグナル伝達経路に参画すると思われる６ないし８膜貫通タンパク質）と命名されるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）中のプレセニリン相同物の同定から生じている（ＬｅｖｉｔａｎとＧｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７７、３５１−３５４）。ＰＳ−１およびＳＥＬ−１２タンパク質は４９％の配列の相同性を共有しかつ類似の膜配向性を有する。重要なことには、ヒトＰＳ−１およびＰＳ−２双方はＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）中の突然変異体のｓｅｌ−１２表現型をレスキューすることができ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達におけるプレセニリンの役割を示している（Ｌｅｖｉｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３、１４９４０−１４９４４）。
【０００５】
プレセニリンに関連づけられるＦＡＤは高度に浸透性であり、また、該疾患の攻撃的な性質は、該突然変異体タンパク質がＡＤの病態の発生経路に参画していることを示唆する。今日まで、７０を越えるＦＡＤ突然変異がＰＳ−１中で同定され、また、３種のＦＡＤ突然変異がＰＳ−２中で見出されている。ＦＡＤ突然変異の大部分は２種のプレセニリンタンパク質の間の保存された位置に存在し、それらが機能的もしくは構造的に重要なアミノ酸残基に影響を及ぼしていることを示唆する。興味深いことに、突然変異されたアミノ酸の多くはＳＥＬ−１２中でもまた保存されている。プレセニリン突然変異の２種以外の全部はミスセンス突然変異である。１種の例外はエキソン９を排除する異常なＲＮＡスプライシング事象をもたらし、内的に欠失された突然変異体タンパク質を創製する（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｕｒら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、１９９５、７、２９７−３０１；Ｓａｔｏら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、１、Ｓ９１−９４；およびＰｒｉｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、１０９０）。他者は、２種の欠失転写物（Δ４およびΔ４ｃｒｙｐｔｉｃ）ならびに１１３と１１４との間に挿入されたアミノ酸Ｔｈｒを伴う１種の完全長の転写物をもたらす（ＤｅＪｏｎｇｈｅら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、８、１５２９−１５４０）。後者の転写物はＡＤの病態生理学につながる。これらの後者の点は、該疾患の遺伝的優性と一緒に、プレセニリンの一族での疾患の病因が、正常のプレセニリンレベルの単純な喪失もしくは低下よりもむしろ新規かつ有害な機能を有する突然変異体のプレセニリンタンパク質の産生を必要とすることを論証している。該突然変異は、しかしながら、突然変異体のプレセニリンがｓｅｌ−１２表現型をレスキューもしくは完全にレスキューすることが可能でないため、正常のプレセニリンの機能を分断すると思われる（Ｌｅｖｉｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３、１４９４０−１４９４４）。
【０００６】
プレセニリンの発現プロフィルは概略のレベルで検査されているが、しかし、これまでは、これらの分析は疾患の病因の機構に関する情報をほとんど生じていない。プレセニリン１および２双方はＣＮＳおよび末梢組織中で広範に発現される。脳中では、発現はニューロンにより高められるが、しかし、ＡＤに罹りやすいおよび抵抗性双方の領域中で明らかである。細胞の局在化研究は、該タンパク質が主としてゴルジ複合体および小胞体中に蓄積するが、しかし発現レベルもしくは細胞以下の分布における有意の変化はＦＡＤ突然変異に帰されていないことを示している（Ｋｏｖａｃｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９６、２、２２４−２２９）。
【０００７】
プレセニリンタンパク質は２つの細胞内経路によりタンパク質分解的にプロセシングされる。通常の条件下では、完全長のタンパク質の非存在下で、３０ｋＤのＮ末端および２０ｋＤのＣ末端のタンパク質分解フラグメントの蓄積が起こる。このプロセシング経路は高度に調節されかつ比較的ゆっくりであると思われ、完全長のタンパク質のわずかな部分のみのターンオーバーを説明する。残存する部分はプロテアソームにより第二の経路で迅速に分解されると思われる（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９６、１７、１８１−１９０；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１１００６−１１０１０）。ＦＡＤに関連づけられるＰＳ−１変異体のタンパク質分解的代謝は異なると思われるが、しかし、病因論への該変化の関連性は知られていない（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、７５６−７６０）。
【０００８】
ＦＡＤにおける突然変異体のプレセニリンの１つの病理学的役割は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングおよびＡβペプチド（ＡＤの脳中の細胞外の神経炎斑の主要なタンパク質成分）の産生に対する影響に関係していると思われる。Ａβペプチドのより病原性の種であると考えられるより長い形態のＡβ（Ａβ４２）の上昇された血清濃度が、ＰＳ−１およびＰＳ−２突然変異を担持する患者で測定されている（Ｓｃｈｅｕｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９６、２、８６４−８７０）。加えて、ＰＳ−１突然変異を伴うＦＡＤの脳は大量のＡβ沈着物を有する（Ｌｅｍｅｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９６、２、１１４６−１１５０；Ｍａｎｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９６、４０、１４９−１５６；Ｇｏｍｅｚ−Ｉｓｌａら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９７、４１、８０９−８１３）。上昇されたレベルのＡβ１−４２は、突然変異体のＰＳ−１もしくはＰＳ−２でトランスフェクトされた細胞、および突然変異体のＰＳ−１を発現するマウスでもまた見出された（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９６、１７、１００５−１０１３；Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８３、７１０−７１３；Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、６７−７２；Ｍｕｒａｙａｍａら、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．、１９９９、２３、９０５−９１３；Ｍｕｒａｙａｍａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、２６５、６１−６３；Ｎａｋａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、１１、２５７７−２５８１）。それにより突然変異体のプレセニリンがＡＰＰのプロセシングに影響を及ぼす機構は知られていないが、しかし、これらの結果はＦＡＤの発症における増大されたＡβ４２産生の原因となる役割を支持する。重要なことに、突然変異体のプレセニリンが、ニューロンの機能不全および変性に直接もしくは間接的に関与する推定に基づく細胞内シグナル伝達および細胞死の経路のような、他のＡＤの病因となる過程に同様に影響することが可能である。
【０００９】
遺伝子的に工作された動物が、インビボでの特定の遺伝子産物の機能および疾患の表現型の発生におけるそれらの役割を検査するのに広範囲に使用されている。マウスの遺伝子工学は、最低２つの別個のアプローチ、すなわち（１）外因性の遺伝子が宿主ゲノム中に無作為に挿入されるトランスジェニックのアプローチ、および（２）特定の内因性のＤＮＡ配列もしくは遺伝子が部分的にもしくは完全に除去されるかまたは相同的組換えにより置き換えられる遺伝子ターゲッティングのアプローチに従って達成することができる。トランスジェニック生物体のトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）は、一般に、タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列およびタンパク質コーディング配列の発現を指図するプロモーターより構成される。トランスジェニック生物体は、全部の正常に発現される本来の遺伝子に加えてトランスジーンを発現する。他方、標的遺伝子組換え動物の標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ）は、２つの方法、すなわち（１）改変されたバージョンの標的遺伝子が発現される機能的形態、もしくは（２）標的遺伝子が分断されていて発現の喪失もしくは低下をもたらす非機能的もしくは「ヌル」の形態、の１つで改変することができる。標的遺伝子が単一コピーの遺伝子でありかつ動物が標的遺伝子座でホモ接合性である場合には、改変の型に依存して、動物は、標的遺伝子を発現しないか、もしくは正常な形態の非存在下でのみ改変されたバージョンの標的遺伝子を発現するかのいずれかである。
【００１０】
天然のおよび突然変異体の形態のプレセニリンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスが記述されている（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９６、１７、１００５−１０１３；Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８３、７１０−７１３；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９７、１９、９３９−９４５；Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、６７−７２；Ｃｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、５６０−５６４；およびＮａｋａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、１１、２５７７−２５８１）。ＰＳ−１中に突然変異を担持するマウスは上昇されたレベルのＡβ１−４２を有したとは言え、それらはＡＤの特徴となるＡβ沈着物を形成していないか、もしくは、ＡＤに関連する挙動上の欠陥を示していない。ニューロンの喪失が１グループにより記述されている（Ｃｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、５６０−５６４）。ＰＳ−１突然変異をもつトランスジェニックマウスを、スウェーデン型ＡＰＰ突然変異を担持するトランスジェニックマウスと交配した場合に、Ａβ沈着物の形成の顕著な促進が存在した（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９７、１９、９３９−９４５；Ｈｏｌｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９８、４、９７−１００；Ｌａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、２、６９５−６９７）。ＰＳ−１遺伝子の一方もしくは双方の機能的対立遺伝子を欠く標的遺伝子組換えＰＳ−１ヌルマウスもまた記述されている（Ｗｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３８７、２８８−２９２およびＳｈｅｎら、Ｃｅｌｌ、１９９７、８９、６２９−６３９）。双方のＰＳ−１対立遺伝子が分断されていてＰＳ−１発現の完全な喪失をもたらすマウスは生存可能でなく、そして生後まもなく死亡する。異常な表現型もしくはＡＰＰのプロセシングの変化は、２個のＰＳ−１対立遺伝子の一方のみを欠くマウスで報告されていないが、しかし、ＡＰＰプロセシングの阻害はＰＳ−１ヌルマウス由来のニューロンで見出される（ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、３８７−３９０）。
【００１１】
本出願において、ＡＤモデルを生成させる遺伝子ターゲッティングのアプローチ（Ｒｅａｕｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１、２３３８０−２３３８８（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））が記述される。１種のモデルはＡＰＰ遺伝子中のスウェーデン型ＦＡＤ突然変異および「ヒト化」マウスＡβ配列を使用する（米国特許第５，７７７，１９４号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））。このマウス（ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ）は、正常レベルのＡＰＰを産生し、ヒトＡβ１−４０およびＡβ１−４２を過剰産生したが、しかしＡβを沈着しなかった（Ｒｅａｕｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１、２３３８０−２３３８８）。ヒトＰＳ−１突然変異、とりわけＰ２６４Ｌ突然変異をマウスＰＳ−１遺伝子中に導入した。Ｐ２６４Ｌ突然変異はエキソン８中の突然変異のクラスター中の非保存的アミノ酸置換であり、４０歳代半ばないし５０歳代半ばでのＦＡＤの発症を引き起こす（Ｃａｍｐｉｏｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、４、２３７３−２３７７；Ｗａｓｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９５、１、８４８）。交配はＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌ二重標的遺伝子組換えマウスを生じさせた。これらのマウスはＡβ沈着を引き起こすのに十分な、上昇されたレベルのＡβ１−４２を有した。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ突然変異を担持するマウスは、スウェーデン型ＡＰＰ６９５を過剰発現するＴｇ２５７６マウス（Ｈｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６、２７４、９９−１０２；メイヨークリニック（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）、ミネソタ州ロチェスターから入手可能）ともまた交配した。本発明の明瞭な一利点は、ヘテロ接合性およびホモ接合性の標的遺伝子組換えマウスについてタンパク質の発現パターンの厳密さが維持されることである。なぜなら該発現は内因性プロモーター下であるからである。さらに、完全タンパク質（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）の発現レベルは変えられない。
【００１２】
（発明の要約）
本発明は、突然変異されたＦＡＤプレセニリン−１（ＰＳ−１）遺伝子、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異、およびヒト化Ａβ突然変異の突然変異体タンパク質産物をコードする遺伝子を含んで成る標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物、ならびにその生殖による（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ）子孫に関する。本発明はまた、突然変異されたＦＡＤプレセニリン−１（ＰＳ−１）遺伝子およびヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異の突然変異体タンパク質産物をコードする遺伝子を含んで成る標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物、ならびにその生殖による子孫にも関する。好ましくは、ＰＳ−１遺伝子はヒトＰ２６４Ｌ突然変異を含有するよう突然変異されている（Ｗａｓｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９５、１、８４８）。とりわけ、本発明は、プレセニリン１タンパク質をコードするマウスプレセニリン１遺伝子の一部が、ヒト突然変異、最も好ましくはＰ２６４Ｌ突然変異を含有するマウスプレセニリン１遺伝子をもたらすＤＮＡ配列で置き換えられているマウスに関する。なおより具体的には、マウスプレセニリン１遺伝子のコドン２６４の塩基配列がＣＣＧからＣＴＴ（ヒトのＰ２６４Ｌ突然変異を構成することが見出された塩基配列である）に変えられる。突然変異された遺伝子コドンはプレセニリン１のアミノ酸番号２６４でプロリンの代わりにロイシンをコードする。加えて、そしてなおより具体的には、マウスプレセニリン１遺伝子のコドン２６５中の１個のヌクレオチド塩基がアデノシンからグアノシンに変えられるが、しかしこの変化は発現されるタンパク質でアミノ酸変化をもたらさない。しかしながら、コドン２６４および２６５の組み合わせられた配列は、上述された最も好ましい変化の組み込み後に制限酵素ＡｆｌＩＩの制限酵素部位をもたらす。
【００１３】
従って、一態様において、本発明は、突然変異されたＦＡＤ遺伝子、好ましくは本来のプレセニリン１タンパク質をコードする配列の代わりにヒト突然変異、最も好ましくはＰ２６４Ｌ突然変異を含んで成るマウスプレセニリン１タンパク質をコードする配列を含んで成る標的突然変異体ＰＳ−１遺伝子についてホモ接合性の非ヒト哺乳動物および生殖による子孫を特徴とする。別の態様において、本発明は、突然変異されたマウスＦＡＤ遺伝子、好ましくは本来のプレセニリン１タンパク質をコードする配列の代わりにヒト突然変異、最も好ましくはＰ２６４Ｌ突然変異を含有するマウスプレセニリン１タンパク質をコードする配列を含んで成る標的ＰＳ−１遺伝子についてヘテロ接合性の非ヒト哺乳動物および生殖による子孫を特徴とする。
【００１４】
本発明はまた、ＰＳ−１遺伝子の突然変異およびヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性の哺乳動物またはその生殖による子孫、あるいは、ＰＳ−１遺伝子の突然変異、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性の哺乳動物ならびにその生殖による子孫に化合物を投与すること、ならびに該哺乳動物からの組織サンプル中のＡβ４２ペプチドの量を測定することを含んで成る、アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法にも向けられる。
【００１５】
本発明はまた、有効なアルツハイマー病治療量の上述された方法により同定された化合物を、アルツハイマー病を有することが疑われる個体に投与することを含んで成る、該個体の治療法方法にも向けられる。
【００１６】
本発明はまた、上述された方法のいずれかにより同定される化合物にも向けられる。
【００１７】
（詳細な記述）
本発明は、非ヒト哺乳動物の内因性（すなわち本来の）ゲノム中に、ヒト突然変異、最も好ましくはヒトＰ２６４Ｌ突然変異を含んで成るプレセニリン１遺伝子を含有する、標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物（およびこうした哺乳動物の生殖による子孫）に関する。非ヒト哺乳動物はまた、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異も含むことができる。非ヒト哺乳動物はまた、ヒトＰＳ−１突然変異に加えてヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異も含むことができる。最も好ましくは、標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物により通常産生されるプレセニリン１タンパク質の代わりに突然変異されたプレセニリン１タンパク質を産生する。ヒトＰ２６４Ｌ突然変異のようなヒト突然変異を含有するプレセニリン１遺伝子についてホモ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、突然変異されたプレセニリン１タンパク質を独占的に産生する。ヒトＰ２６４Ｌ突然変異のようなヒト突然変異を含有するプレセニリン１遺伝子についてヘテロ接合性の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、突然変異されたプレセニリン１タンパク質および本来のプレセニリン１タンパク質双方を産生する。好ましくは、本発明の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物はげっ歯類、そしてより具体的にはマウスである。
【００１８】
重要なことには、本発明の非ヒト哺乳動物はトランスジェニック技術と反対に遺伝子ターゲッティングにより生成されるため、該哺乳動物は、突然変異されたプレセニリン１タンパク質を、正常な内因性のプレセニリン１タンパク質の発現機構により独占的に産生する。有利には、また、トランスジェニックのアプローチ由来の発現と異なり、該プレセニリン１タンパク質は、正常なコピー数を有する遺伝子から、そして内因性のプレセニリン１遺伝子発現制御機構の制御下に発現される。結果として、本発明の非ヒト動物中のプレセニリン１タンパク質は、該野性型の非ヒト哺乳動物中の本来のプレセニリン１タンパク質と通常関連する同一の発生のタイミング、同一の組織特異性および同一の合成速度を伴い産生される。
【００１９】
本発明の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、ＡＤの病理学および徴候学においてヒト突然変異、好ましくはヒトＰ２６４Ｌ突然変異を含んで成るＰＳ−１の役割を解明するための道具もしくはモデルとして使用してよい。それらを、ヒト突然変異、好ましくはＰ２６４Ｌ突然変異がアミロイドタンパク質Ａβ４２の産生を増大させる様式を解明するのに使用してよい。本明細書で使用されるところの「増大させる」という用語は、前述の情況で使用される場合、本明細書に開示される非ヒト哺乳動物により産生されるＡβ４２のレベルが野性型対照に関して上昇されることを意味する。
【００２０】
本発明の非ヒト哺乳動物および生殖による子孫はまた、インビボの阻害剤についてスクリーニングするためのアッセイ系として、ならびに、脳組織、他の組織ならびに体液（例えば血液、血漿および脳脊髄液）中の過剰量のＡβペプチドの形成、存在および沈着を阻害するそれらの能力について推定の化合物の有効性および適合性を発見かつ試験するために使用してよく、前記方法は：（ａ）本来のＰＳ−１ペプチドをコードする配列の代わりにヒト突然変異、好ましくはＰ２６４Ｌ突然変異を含有するマウスＰＳ−１ペプチドをコードする配列を含んで成る、ヒト突然変異、好ましくはヒトＰ２６４Ｌ突然変異を含んで成る標的突然変異体ＰＳ−１遺伝子についてホモ接合性もしくはヘテロ接合性の非ヒト哺乳動物に前記化合物を投与すること、ならびに（ｂ）前記化合物の投与後適切な時間間隔で、前記非ヒト哺乳動物の脳組織、他の組織および体液（もしくはそれらの何らかの組合せ）中のＡβペプチドの量を測定すること、の段階を含んで成る。
【００２１】
本開示で使用されるところの以下の用語および句は以下の示される定義を有する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「Ａβペプチド」はＡβ４０もしくはＡβ４２またはそれらのフラグメントのいずれかを意味する。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「相同なアーム（ａｒｍ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、ターゲッティングベクター中の：（１）相同的組換えによるターゲッティングベクターの一部の標的遺伝子中への部位特異的組込みを提供するための十分な長さおよび相同性を有する；（２）標的遺伝子中に導入されるべき１個もしくはそれ以上の突然変異がその中にもしくはその間に配置される；ならびに（３）陽性の選択可能なマーカーに隣接する、ヌクレオチドＤＮＡ配列を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「相同的組換え」は、塩基対形成機構によるＤＮＡ分子内もしくは間の配列特異的部位（１個もしくは複数）でのＤＮＡセグメントの再配列を意味する。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「非ヒト哺乳動物のプレセニリン１（ＰＳ−１）ＦＡＤ遺伝子中のヒト突然変異」は、ヌクレオチド（１個もしくは複数）の対応する位置にヒトＰＳ−１遺伝子に対応するヌクレオチド（１個もしくは複数）を有する非ヒト哺乳動物をもたらす、非ヒト哺乳動物中のＰＳ−１遺伝子のいかなる突然変異も意味する。非ヒト哺乳動物のプレセニリン１（ＰＳ−１）ＦＡＤ遺伝子中のヒト突然変異は、限定されるものでないが、以下、すなわち、Ａ７９Ｖ、Ｖ８２Ｌ、Ｖ９６Ｆ、Ｙ１１５Ｃ、Ｅ１２０Ｄ、Ｅ１２０Ｋ、Ｍ１３９Ｉ、Ｍ１３９Ｔ、Ｍ１３９Ｖ、Ｉ１４３Ｆ、Ｉ１４３Ｔ、Ｍ１４６Ｉ、Ｍ１４６Ｌ（Ａ→Ｔ）、Ｈ１６３Ｙ、Ｇ２０９Ｖ、Ａ２３１Ｔ、Ａ２３１Ｖ、Ｍ２３３Ｔ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２５０Ｓ、Ａ２６０Ｖ、Ｌ２６２Ｆ、Ｃ２６３Ｒ、Ｐ２６４Ｌ、Ｐ２６７Ｓ、Ｒ２６９Ｈ、Ｒ２７８Ｔ、Ｅ２８０Ａ、Ｅ２８０Ｇ、Ａ２８５Ｖ、Ｅ３１８Ｇ、Ｇ３７８Ｅ、Ｇ３８４ＡおよびＬ３９２Ｖ（そのそれぞれはＣｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｍ１４６Ｌ（Ａ→Ｃ）（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０、Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８３、７１０−７１３、Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、６７−７２、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、７５６−７６０およびＬａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、２、６９５−６９７（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｍ１４６Ｖ（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０、Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６、３８３、７１０−７１３およびＧｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、１０１−１０６（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｈ１６３Ｒ（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０、Ｌａｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、２、６９５−６９７およびＣｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、５６０−５６４（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｉ２１３Ｔ（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０およびＮａｋａｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９、１１、２５７７−２５８１（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｌ２８６Ｖ（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０、Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、６７−７２およびＣｈｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、５６０−５６４（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ａ２６４Ｅ（Ｃｒｕｔｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、１８３−１９０、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、７５６−７６０およびＱｉａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９８、２０、６１１−６１７（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｙ１１５Ｈ（Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、６７−７２（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｔ１１６Ｎ（Ｒｏｍｅｒｏら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．、１９９９、１０、２２５５−２２６０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｐ１１７ＬおよびＬ１７１Ｐ（その双方はＳｔ．Ｇｅｏｒｇｅ  Ｈｙｓｌｏｐ、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．、２０００、４７、１８３−１９９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｅ１２３Ｌ（Ｙａｓｕｄａら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９、５６、６５−６９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｎ１３５Ｄ、Ｃ４１０Ｙ、Ａ４２６ＰおよびＰ４３６Ｓ（そのそれぞれはＨａｒｄｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７、２０、１５４−１５９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｍ１３９Ｋ（Ｄｕｍａｎｃｈｉｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９８、３５、６７２−６７３（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｔ１４７Ｉ、Ｗ１６５Ｃ、Ｌ１７３ＷおよびＳ３９０Ｉ（そのそれぞれはＣａｍｐｉｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、６５、６６４−６７０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｌ１６６Ｒ（Ｅｚｑｕｅｒｒａら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０００、５７、４８５−４８８（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｓ１６９ＬおよびＰ４３６Ｑ（そのそれぞれはＴａｄｄｅｉら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．、１９９８、９、３３３５−３３３９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｓ１６９Ｐ（Ｅｚｑｕｅｒｒａら、Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９、５２、５６６−５７０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｅ１８４Ｄ（Ｙａｓｕｄａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１９９７、２３２、２９−３２（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｇ２０９Ｒ（Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９９、１４、９０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｌ２１９Ｐ（Ｓｍｉｔｈら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．、１９９９、１０、５０３−５０７（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｍ２３３ＬおよびＡ４０９Ｔ（その双方はＡｌｄｕｄｏら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９９、１４、４３３−４３９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｅ２７３Ａ（Ｋａｍｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、��９９８、１６０、７６−８１（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｌ２８２Ｒ（Ａｌｄｕｄｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、２４０、１７４−１７６（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｇ３７８Ａ（Ｂｅｓａｎｃｏｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９８、１１、４８１（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｎ４０５Ｓ（Ｙａｓｕｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．、２０００、６８、２２０−２２３（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ａ４０９Ｔ（Ｓｕｇｉｙａｍａら、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．、１９９９、１４、９０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Ｌ４２４Ｒ（Ｋｏｗａｌｓｋａら、Ｆｏｌｉａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．、１９９９、３７、５７−６１（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Δエキソン９スプライスアクセプター部位欠失突然変異（Ｓ２９０Ｃを伴うＧ→Ｔ）（Ｈａｒｄｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７、２０、１５４−１５９およびＬｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９７、３、７５６−７６０（そのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Δエキソン９スプライスアクセプター部位欠失突然変異（Ｓ２９０Ｃを伴うＧ→Ａ）（Ｓａｔｏら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔ．Ｓｕｐｐ．、１９９８、１、Ｓ９１−９４（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Δエキソン９Ｆｉｎｎの４，５５５塩基対欠失（Ｐｒｉｈａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５、１０９０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；Δイントロン４スプライスドナーコンセンサス配列のＧ欠失（ＤｅＪｏｎｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、８、１５２９−１５４０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）；ならびに、５’プロモーター中の位置−４８のＣ→Ｔ突然変異、５’プロモーター中の位置−２８０のＣ→Ｇ突然変異、および５’プロモーター中の位置−２８１８のＡ→Ｇ突然変異（そのそれぞれはＴｈｅｕｎｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、２０００、９、３２５−３３１（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される）を挙げることができる。本出願はとりわけＰ２６４Ｌ突然変異を例示するとは言え、本発明の全部の局面は、上に引用されたそれぞれのかつすべてのヒト突然変異に適用されることができる。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ヒトＰ２６４Ｌ突然変異」は、以下、すなわち、プレセニリン１遺伝子のコドン２６４のヌクレオチド配列が、ＣＣＧから：ＣＴＴ；ＣＴＣ；ＣＴＡ；ＣＴＧ；ＴＴＡ；ＴＴＧよりなる群から選択される配列に変えられ；そして最も好ましくはＣＣＧからＣＴＴに変えられることを意味する。加えて、プレセニリン１遺伝子のコドン２６５のヌクレオチド配列は、場合によっては、しかし好ましくは、ＡＡＡからＡＡＧに変えられる。コドン２６４中の塩基配列の上述された最も好ましい変化はヒトＰ２６４Ｌ突然変異を構成する。コドン２６５の塩基配列の任意のしかし好ましい変化は、該遺伝子にＡｆｌＩＩ切断部位を付加する。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「標的（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子」もしくは「標的（ｔａｒｇｅｔｅｄ）遺伝子」は、その遺伝子がターゲッティングベクターを用いる相同的組換えにより改変されるべきである、細胞中の遺伝子を意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニックと反対に遺伝子ターゲッティングのアプローチを介して１種もしくはそれ以上の標的遺伝子を含んで成る非ヒト哺乳動物を意味する。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物」に関する「生殖による子孫」は、そのゲノムがその子孫の親（１匹もしくは複数）と同一の標的遺伝子組換え操作を包含する動物を意味する。例えば、そして制限でなく、ヒト突然変異を包含するための遺伝子ターゲッティング技術によりそのゲノムが操作されている哺乳動物がその後繁殖の目的上使用される場合は、その最初の哺乳動物（１匹もしくは複数）由来の全部のその後の世代は、こうしたその後の生殖による子孫のゲノム（１種もしくは複数）が元の哺乳動物のような標的遺伝子組換え操作を含んで成る限りは、「生殖による子孫」とみなされ；設計により、この定義は、こうした生殖による子孫にもまた存在してよい他のゲノム操作を除外せず、また、この定義は、こうした生殖による子孫が単に雄性と雌性の哺乳動物間の交雑技術によってのみ生じられることを必要としない。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「トランスジェニック非ヒト哺乳動物」は、外来の（「トランスジーン」）遺伝子配列が、非ヒト哺乳動物のゲノム中に無作為に挿入されておりそして従って（挿入されたトランスジーンがある遺伝子を分断させて従ってその発現を予防しない限り）全部の正常に発現される本来の遺伝子に加えて発現される、非ヒト哺乳動物を意味する。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「ターゲッティングベクター」もしくは「置換ベクター」は、相同なアーム、標的遺伝子中に組み込まれるべきヌクレオチド配列（相同なアーム内もしくはそれらの間に配置される）および１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカーを包含するＤＮＡ分子を意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「野性型対照動物」は、本明細書に開示されるところの標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物と同一種のかつそうでなければ比較可能な（例えば類似の齢）非標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を意味する。野性型対照動物は、特定の遺伝子型に関連する結果の評価における比較の基礎として使用することができる。
【００３３】
本発明の他の特徴および利点は、それらの好ましい態様の以下の記述および請求の範囲から明らかであろう。
【００３４】
本発明の標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物の調製における第一段階はＤＮＡターゲッティングベクターを調製することである。ターゲッティングベクターは、ヒト突然変異、好ましくはＰ２６４Ｌヒト突然変異を導入するように、相同的組換えを介して非ヒト哺乳動物の内因性のプレセニリン１遺伝子配列の一部を置き換えるように設計する。該ターゲッティングベクターを使用して、非ヒト哺乳動物細胞、例えば多能性マウス胚由来幹（「ＥＳ」）細胞をトランスフェクトする。この細胞中で、ターゲッティングベクターと標的遺伝子との間で相同的組換え（すなわち遺伝子ターゲッティング事象）が起こる。その後、該突然変異体細胞を使用して、（例えばマウス胚へのマウスＥＳ細胞の凝集により）無傷の非ヒト哺乳動物を生じさせて生殖系列キメラを生成させる。該生殖系列キメラを使用して、突然変異された標的遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を生じさせる。最後に、ヘテロ接合性の子孫の近親交配が、突然変異された標的遺伝子についてホモ接合性の非ヒト哺乳動物（例えばマウス）を生じる。
【００３５】
本発明の実務のためのターゲッティングベクターは、当該技術分野で既知の材料、情報および方法を使用して構築することができる。本発明で使用されるターゲッティングベクターの一般的記述が後に続く。
【００３６】
本発明での使用のためのターゲッティングベクターもしくは置換ベクターは、２つの不可欠の機能、すなわち（１）内因性のプレセニリン１標的遺伝子で特異的に（かつ安定に）組込むこと、ならびに（２）内因性のプレセニリン１遺伝子のエキソンの一部分を置き換えてそれによりヒト突然変異および該遺伝子中に新たな切断部位を導入する突然変異を導入すること、を有する。好ましい一態様において、Ｐ２６４Ｌ突然変異を導入するようにエキソン８の一部分を置き換える。それら２つの不可欠の機能はターゲッティングベクターの２つの基本的な構造的特徴に依存する。
【００３７】
ターゲッティングベクターの第一の基本的な構造的特徴は、内因性のプレセニリン１遺伝子の選択された領域もしくはプレセニリン１遺伝子に隣接する領域に相同である、「相同なアーム」として知られる一対の領域である。この相同性は、ターゲッティングベクターの少なくとも一部を染色体に組込ませて、相同的組換えによりプレセニリン１標的遺伝子の一部（もしくは全部）を置き換える。
【００３８】
一般に、相同的組換えは、塩基対形成の機構によるＤＮＡ分子内もしくは間の配列特異的部位（１個もしくは複数）でのＤＮＡセグメントの再配列である。本発明は、ときに「遺伝子ターゲッティング」として知られる相同的組換えの特定の一形態に関する。
【００３９】
ターゲッティングベクターの第二の基本的な構造的特徴は、標的遺伝子中に導入されるべき実際の塩基変化（突然変異（１個もしくは複数））よりなる。本発明において、例えば、エキソン８のコドン２６４中の塩基変化は、突然変異された遺伝子を発現させてタンパク質を作成した場合に、アミノ酸２６４のプロリンからロイシンへのアミノ酸変化をもたらした。上に列挙されたヒト突然変異のいずれかを哺乳動物ゲノム中に導入するために、他の塩基変化を所望のとおり作成することができる。プレセニリン１標的遺伝子に導入されるべき突然変異（１個もしくは複数）は「相同なアーム」内に配置する。
【００４０】
既に細胞中にある特定の遺伝子の構造に影響を及ぼす遺伝子ターゲッティングは、他の形態の安定な形質転換（形質転換された細胞中での発現のための外因性ＤＮＡの組込みが部位特異的でなく、そして従って形質転換された細胞中に既にあるいずれかの特定の遺伝子の構造に予想可能に影響を及ぼさない）と区別されるべきである。さらに、本発明の実務で好ましいターゲッティングベクターの型（例えば下に開示されるもの）を用いて、（「相同なアーム」と標的遺伝子との間で）ゲノムＤＮＡの相互交換が起こり、そしてベクター全体の染色体挿入が有利に回避される。
【００４１】
本特許開示の実施例は、それがヒトＰ２６４Ｌ突然変異もしくは上に引用された他のヒト突然変異のいずれかおよび付加的な切断部位を含有するマウスプレセリニン１タンパク質をコードするように、マウスプレセニリン１タンパク質をコードする配列を突然変異させるためのプレセニリン１遺伝子ターゲッティングベクターの構築（およびその使用）を示す。当業者は、相同的組換えの原理を使用して、同一の突然変異を導入するために多数の他のターゲッティングベクターを設計することができることを認識するであろう。こうした他のターゲッティングベクターを使用して生じられる標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は本発明の範囲内にある。ターゲッティングベクターの考慮の論考が後に続く。
【００４２】
置換配列に隣接する相同なアームの長さは、本発明の実務に対する有意の影響なしにかなり変動することができる。相同なアームは、ターゲッティングベクターの一方の鎖と、プレセニリン１標的遺伝子の遺伝子座のトランスフェクトされた細胞の染色体の一方の鎖との間の、有効なヘテロ二重鎖形成について十分な長さのものでなければならない。相同なアームの長さを増大させることは、ヘテロ二重鎖形成、そして従ってターゲッティング効率を促進する。しかしながら、付加的な相同的塩基対によって生じる漸増するターゲッティング効率はついに減少しそして標的ベクター構築における実務上の困難により相殺される（相同なアームは数千塩基対を越えるため）ことが認識されるであろう。各相同なアームの好ましい長さは５０ないし１０，０００塩基対である。
【００４３】
プレセニリン１標的遺伝子のどの領域（すなわちプレセニリン１標的遺伝子に隣接する染色体領域）がターゲッティングベクターの相同なアーム中に表されるかの選択においてかなりの許容範囲が存在する。基本的な束縛は、プレセニリン１標的遺伝子中の変えられるべき塩基対が相同なアームを構成する配列内に存しなければならないことである。相同なアームはプレセニリン１標的遺伝子内に存してよいが、しかし、それらがそうなることは必要ではなく、また、それらはプレセニリン１標的遺伝子に隣接してよい。
【００４４】
好ましくは、ターゲッティングベクターは相同なアームの間に陽性の選択マーカーを含むことができる。陽性の選択マーカーは標的遺伝子のイントロン内に配置されるべきであり、その結果、それはｍＲＮＡからスプライスされそして標的／マーカー融合タンパク質の発現を回避することができる。より好ましくは、ターゲッティングベクターは、２個の選択マーカー；相同なアームの間に配置された陽性の選択マーカーおよび相同なアームの外側に配置された陰性の選択マーカーを含むことができる。陰性の選択マーカーは、相同的組換えの代わりに無作為挿入によりゲノム中にターゲッティングベクターが組込まれているクローンを同定かつ除外する手段である。例示的な陽性の選択マーカーはネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびヒグロマイシンβホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例示的な陰性の選択マーカーは単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）チミジンキナーゼおよびジフテリアトキシン遺伝子である。
【００４５】
標的タンパク質の発現に対する潜在的な妨害を排除するために、陽性の選択マーカーは、バクテリオファージＰ１  ＤＮＡから単離された短いｌｏｘＰ組換え部位により隣接されることができる。標的遺伝子の遺伝子座の２個のｌｏｘＰ部位の間の組換えは、細胞へのｏｒｅ組換え酵素の導入により誘導することができる。これは陽性の選択マーカーの排除をもたらし、２個の短いｌｏｘＰ部位の一方のみを残す。（米国特許第４，９５９，３１７号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。突然変異されたプレセニリン１遺伝子のイントロン８からの陽性の選択可能なマーカーの削除をかように遂げることができる。
【００４６】
図１は、相同的組換えを使用して哺乳動物ゲノム中に突然変異を導入するための遺伝子ターゲッティングの一般的原理を具体的に説明する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、１９８９、５、７０−７６；ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、１０、７０５−７３０に総説される）。ゲノムＤＮＡの長さを、それを領域（図１ａ中で０〜５と番号づけられる）に組織化することにより最初に描く。図１において、数個の塩基対変化（１から１０まで）が領域３の周囲の細胞ＤＮＡに組み込まれることになっている。遺伝子ターゲッティングベクターを使用する相同的組換えを利用する。これらの変化を組み込むために使用される遺伝子ターゲッティングベクターの型を置換ベクターと命名する。
【００４７】
前に定義されたとおり、本明細書の「置換ベクター」は、１個もしくはそれ以上の選択可能なマーカー配列および選択可能なマーカーに隣接するＥＳ細胞のゲノムＤＮＡの２種の隣接する配列を包含するベクターを指す。これらの隣接する配列を「相同なアーム」と命名する。図１ｂにおいて、相同なアームは領域１−２および３−４により表される。ＥＳ細胞由来のＤＮＡ（同質遺伝子（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）ＤＮＡ）の使用が、標的配列との高効率の組換えを保証するのを助ける（ｔｅ  Ｒｉｅｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５１２８−５１３２）。相同なアームは、ベクター中で、ＥＳ細胞に対し毒性の薬物に対する耐性をコードするＤＮＡ配列（陽性の選択マーカー）のいずれかの側に配置される。別の非毒性の薬物に対する感受性をコードする遺伝子（陰性の選択マーカー）は相同な領域の外側に配置される。本発明で使用される置換ベクター中で、陽性の選択マーカーはｎｅｏｒ（ネオマイシン類似物Ｇ４１８に対する耐性をコードする遺伝子）であり、そして陰性の選択マーカーは単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）（ガンシクロビルに対する感受性をコードする）である。トランスフェクションを介してこの置換ベクターがＥＳ細胞に導入されかつそのＤＮＡがＥＳ細胞のＤＮＡとの相同的組換えを受ける場合、陽性の選択マーカーは、本実施例で領域２と３との間のゲノム中に挿入される（形質転換された細胞をＧ４１８に対し耐性にする）一方、陰性の選択マーカーは排除される（細胞をガンシクロビルに対し耐性にする）。従って、相同的組換えについて強化するために、トランスフェクトされたＥＳ細胞を、ｎｅｏｒ遺伝子の存在について選択するためのＧ４１８およびＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の非存在について選択するためのガンシクロビルを含有する培地中で成長させる。好ましくは、陽性の選択マーカーは、哺乳動物が別の哺乳動物と交配されれば、例えばｃｒｅ／ｌｏｘ技術を使用することにより分離される。
【００４８】
塩基対の変化（突然変異）が相同なアームの一方に導入される場合、これらの変化が相同的組換えの結果として細胞の遺伝子中に組み込まれることが可能である。突然変異が相同的組換えの結果として細胞ＤＮＡ中に組み込まれるかどうかは、変化を担持する相同なアーム中で交差事象が起こる場所に依存する。例えば、図１中のシナリオ「Ａ」により描かれるとおり、アーム中の交差は突然変異に対し近位で起こり、そして従ってそれらは細胞ＤＮＡ中に組み込まれない。シナリオ「Ｂ」においては、交差は突然変異の位置に対し遠位で起こり、そしてそれらは細胞ＤＮＡ中に組み込まれる。交差事象の位置は無作為であるため、突然変異を包含する相同的組換え事象の頻度は、それらが陽性の選択マーカーにより近く配置される場合に増大される。
【００４９】
上の方法により、当業者は、特定の塩基対の変化により隣接される目的の遺伝子中の予め選択された位置での選択可能なマーカーの組み込みを達成することができる。おそらく、当業者は、好ましくは、内因性の遺伝子発現を妨害しないように目的の遺伝子のイントロン内に組み込まれた選択可能なマーカーを有することを選ぶとみられる一方、目的のタンパク質産物中で所望の変化を作成するように、隣接するコーディング配列中に突然変異が包含されるとみられる（図１）、（Ａｓｋｅｗら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、１３、４１１５−４１２４、Ｆｉｅｒｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、８４６９−８４７３；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１９９３、２１、２６１３−２６１７、Ｇｕら、Ｃｅｌｌ、１９９３、７３、１１５５−１１６４およびＧｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６５、１０３−１０６）。
【００５０】
従って、上述された様式で、ヒトＰＳ−１突然変異を含んで成る標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を調製する。該哺乳動物は、ヘテロ接合性（１コピーのヒトＰＳ−１突然変異を含有する）もしくはホモ接合性（２コピーのヒトＰＳ−１突然変異を含有する）であることができる。好ましい一態様において、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋（ヘテロ接合性）もしくはＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌ（ホモ接合性）であるマウスを調製する。
【００５１】
上述されたヒトＰＳ−１突然変異を含んで成る標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物を、ＡＰＰ遺伝子中にスウェーデン型ＦＡＤ突然変異および「ヒト化」Ａβ配列を有する哺乳動物（例えばＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウス）と交配して、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌ、ＡＰＰＮＬｈ／＋×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌ、ＡＰＰＮＬｈ／＋×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋もしくはＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋と称される哺乳動物を生じさせることができる。加えて、上述されたヒトＰＳ−１突然変異を含んで成る標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物は、スウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異を有する哺乳動物（例えばＴｇ２５７６マウス）と交配することができる。しかしながら、こうした哺乳動物を交配する前に、ｃｒｅ／ｌｏｘ技術を使用して、ｎｅｏｒのような陽性の選択マーカーを除去することが好ましい。
【００５２】
本発明はまた、アルツハイマー病を治療するための化合物の同定方法にも向けられる。化合物は、ＰＳ−１遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性でありかつまたヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異も含有する哺乳動物またはその生殖による子孫、あるいはＰＳ−１遺伝子の突然変異、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性の哺乳動物ならびにその生殖による子孫に投与される。試験されるべきいかなる化合物も、限定されるものでないが静脈内、経口、脳中への直接注入などを挙げることができるいずれかの多様な経路により多様な量で投与することができる。限定されるものでないが脳組織、非脳組織および体液（例えば血液および血漿）を挙げることができる哺乳動物からの組織サンプルを得、そして該組織サンプル中のＡβペプチドの量を測定する。組織サンプル中のＡβペプチドの量の減少は、アルツハイマー病を治療するのに使用することができる化合物を指示する。
【００５３】
本発明はまた、アルツハイマー病を有することが疑われる個体の治療方法にも向けられる。アルツハイマー病を有することが疑われる個体は、医師により検査されそしてアルツハイマー病もしくはその症状を有すると診断されているいずれかのヒトである。ＰＳ−１遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性でありかつまたヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異も含有する哺乳動物またはその生殖による子孫、あるいはＰＳ−１遺伝子の突然変異、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性である哺乳動物ならびにその生殖による子孫に関して上述された方法により同定された化合物を、該個体の脳中のＡβペプチドの量を減少させるのに有効な量で該個体に投与する。Ａβペプチドの量を減少させるのに有効な量は、出発量として、ＰＳ−１遺伝子の突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性でありかつまたヒトスウェーデン型ＡＰＰ６９５突然変異も含有する哺乳動物またはその生殖による子孫を使用して、あるいは、ＰＳ−１遺伝子の突然変異、ヒトＦＡＤスウェーデン型突然変異およびヒト化Ａβ突然変異についてヘテロ接合性もしくはホモ接合性である哺乳動物またはその生殖による子孫を使用し、そして当業者に公知であるようにヒトでの使用について率に応じて増大する、該化合物の同定方法から決定することができる。有効なアルツハイマー病治療量は、アルツハイマー病の生理学的病態を測定可能に低下させる化合物の量、またはアルツハイマー病の身体的症状発現もしくは徴候を低下させる量である。当業者は、例えば、上述されたところの脳中のＡβペプチドの量を減少させる化合物の量で開始することができ、そして所望の効果および特定の個体で達成される効果に依存して、該量を率に応じて増大もしくは減少することができる。
【００５４】
本発明はまた、上述されたスクリーニング方法により同定される化合物にも向けられる。該化合物は、限定されるものでないが小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドもしくは核酸を挙げることができるいずれかの同定可能な化学物質もしくは分子であることができ、そしてこうした化合物は天然もしくは合成であることができる。
【００５５】
本明細書に開示される本発明をより効率よく理解することができるために、実施例を下に提供する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上でありかついかなる様式でも本発明に対する制限として解釈されるべきでないことが理解されるべきである。これらの実施例全体で、分子クローニング反応および他の標準的な組換えＤＮＡ技術は、別に示される場合を除き、商業的に入手可能な酵素を使用して、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）（下で「Ｍａｎｉａｔｉｓら」）に記述される方法に従って実施した。
【００５６】
【実施例】
例１：マウスＰＳ−１エキソン８領域のクローニング
マウスＰＳ−１ゲノムＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａで部分的に消化した１２９／ＳｖマウスＤＮＡから作製したバクテリオファージライブラリーから、Ｌａｍｂｄａ  ＤＡＳＨＴＭ  ＩＩのＢａｍＨＩサイト中にクローニングされた（Ｒｅａｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９５，  ２６７，  １８３１−１８３３、これは、引用することにより、その全体が本明細書に取り込まれる）。標準的な分子生物学技法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）を使用し、放射性標識した小さなＰＳ−１特異的ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションによって、およそ１．２×１０６個の組換えバクテリオファージが、ＰＳ−１配列の存在についてスクリーニングされた。この４７７塩基対のＰＳ−１プローブは、エキソン７の３’末端とエキソン１１の５’末端にそれぞれハイブリダイズするプライマーＲ８９２（ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＲ８８５（ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用したマウスゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９８７，  １５５，  ３３５−３５０）によって生成された（図２）。増幅されたフラグメントは、１．０％アガロースゲル上での電気泳動によって他の反応成分から分離され、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（商標） ＩＩ（Ｂｉｏ  １０１，  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて精製された。精製されたプローブＤＮＡは、キット製造業者によって供給される材料および方法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；  Ａｍａｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）を用いたランダムプライマー法によって、３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射性標識された。
【００５７】
このスクリーニングから、ＰＳ−１プローブにハイブリダイズする１３個のクローンが同定された。クローンは以下のように同定された：λＰＳ１−４、λＰＳ１−５、λＰＳ１−６、λＰＳ１−１０、λＰＳ１−１１、λＰＳ１−１７、λＰＳ１−１９、λＰＳ１−２０、λＰＳ１−２２、λＰＳ１−２４、λＰＳ１−２８、λＰＳ１−３１、およびλＰＳ１−３５。これらのクローンは限界希釈およびＰＳ−１プローブによるプラークハイブリダイゼーションによって精製された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００５８】
各クローンから、ＤＮＡがＣｓＣｌ勾配上で精製したバクテリオファージ粒子から調製された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。それから、クローニングされたインサートの各々について、ＦＬＡＳＨＴＭ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標） Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、制限酵素地図が作成された。この方法によって作成された典型的な制限酵素地図が、図３に具体的に示されている。この制限酵素マッピングの方法は、最初に１０μｇのバクテリオファージＤＮＡを、標準的な制限酵素消化条件を用いて、制限酵素ＮｏｔＩで完全に消化することを含む（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。．ＮｏｔＩは、インサートの一方の末端に付けられているＴ３バクテリオファージ・プロモーターと、他方の末端に付けられているＴ７バクテリオファージ・プロモーターを分離するために、ベクターＤＮＡ中のすべてのクローンを、クローニングされたインサートの両方の末端で切断する。ＮｏｔＩで消化されたＤＮＡはそれから、一例としては、３７℃で８４μｌの反応体積中、限定的な量の酵素（０．２ｕｎｉｔｓ／μｇ  ＤＮＡ）を使用して、酵素ＥｃｏＲＩで部分的に消化される。３分後、１２分後および４０分後に一定量（２６μｌ）が取り除かれ、消化反応は１μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加によって停止された。３つすべての時点からのＤＮＡが０．７％アガロースゲル上で分離され、エチジウムブロマイド染色によって可視化され、それから、毛細管移動によってＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（商標）メンブレン（ＮＥＮ（商標） Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）へと移された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）。このメンブレンは、キット製造業者によって供給された試薬と方法を用いて、Ｔ３プロモーターに特異的なアルカリホスファターゼ標識オリゴヌクレオチド（ＦＬＡＳＨＴＭキットに同梱）によってハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、メンブレンは洗浄され、化学発光生成基質によって現像され、それから、暗所で約６０分間、Ｘ線フィルムに露光された。
【００５９】
このオリゴヌクレオチドプローブは、インサートの１つの末端を効果的に標識する。Ｘ線フィルム上でバンドの位置を決定し、それらが対応するＤＮＡの大きさを計算することによって、インサートのＴ３末端に対するＥｃｏＲＩ部位の位置を決定することが可能であった（図３）。これらの結果はそれから、インサートのＴ７末端に対するＥｃｏＲＩ部位の位置を決定するために、メンブレンからプローブをはぎ取り、Ｔ７特異的オリゴヌクレオチドを再ハイブリダイズさせることによって、補足されることができた。このプロセスは酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて繰り返された。重複した異なるクローンの制限酵素地図を比較することによって、合成地図が組立てられた。単離された１３個の最初のクローンから、６個の独立したクローンが同定された（図２）。
【００６０】
エキソン８は、６つの異なるラムダ・ゲノムクローンの各々の完全な消化産物にエキソン特異的プローブをハイブリダイズさせることによって、制限酵素地図上で位置付けられた。初めに、６つの異なるクローンの各々からの３μｇのＤＮＡが、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって完全に消化された。消化されたＤＮＡは０．８％アガロースゲル上で分解され、エチジウムブロマイド染色によって可視化され、毛細管移動によってＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（商標）メンブレンへと移された。このメンブレンはそれから、マウスＰＳ１エキソン８由来の配列に特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブによって、ハイブリダイズされた。このプローブは、エキソン８の５’末端と３’末端にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドＦＥＸ８（ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  Ｇ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＲＥＸ８（ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を用いたＰＣＲによって作製された。ハイブリダイゼーション後、メンブレンは洗浄され、Ｘ線フィルムに露光された（図４）。この実験は、すべてのクローンがエキソン８プローブにハイブリダイズする２．５ｋｂのフラグメントを含むことを明らかにした。この情報を各ラムダクローンについての制限酵素地図データと組み合わせることによって、エキソン８が地図上で同定された（要約地図上の位置１１．５から１４、図２）。
【００６１】
同様な手順が、エキソン７特異的プローブを使用し、制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを利用して、我々の合成地図上でのエキソン７の位置を同定するために用いられた。エキソン７特異的プローブは、ＰＣＲプライマーＦ８９２（ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＧＡＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とＰＳ１−１（ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  Ｇ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いて作製された。エキソン７はλＰＳ１−２２を除き、すべてのクローンの２ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに限局化され、これはエキソン７が要約地図上の位置７．０と９．０の間に位置するという決定を可能とした（図２）。
【００６２】
また、エキソン特異的プローブは、さらなる制限酵素を用いたさらなる制限地図情報を得るためにも使用された。たとえば、λＰＳ１−２２をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル上で分離し、Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（商標）メンブレンへと移し、エキソン８特異的プローブでプロービングすると、７００ｂｐのフラグメントが同定された。この情報は、他のバクテリオファージ・クローンからの情報と組み合わされると、合成地図上の位置１１．７へのＢａｍＨＩの配置を可能とした（図２）。この過程は制限酵素ＸｈｏＩについて繰り返された。
【００６３】
また、他のヒト変異を含むさらなるベクターを調製するための、マウスＰＳ−１遺伝子のさらなる領域のクローニングも、望むとおりに、成し遂げられうる。
例２：置換ベクターの作製
要約地図（図２）上で位置７．０から１１．７に位置する４．７ｋｂのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（２つの内部ＸｂａＩフラグメントをも含む）が、必要な変異を含んだ５’アームとして選ばれ、３’アームとしては、要約地図（図２）上で位置１１．７から１５．８に位置する４．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（内部ＥｃｏＲＩ部位をも含む）が選ばれた。これらのフラグメントは、上述のものと同じ一般構造を有する置換ベクター（ｐＰＳ１−８−ＴＶ、図５）を生成するために、初めに単離され、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ）中にクローニングされ、それから、ｎｅｏｒ遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子およびリンカー配列を含むｐＰＮＴＩｏｘ２プラスミド（下に記述）中にさらにサブクローニングされた。
【００６４】
（ａ）  中間プラスミドｐＰＮＴｌｏｘ２の作製
ｐＰＳ１−８−ＴＶは、初めにｎｅｏｒカセットの両側に２つのオリゴヌクレオチド・リンカーを挿入し、ｐＰＮＴＩｏｘ２（図６）と呼ばれる中間体を作製することにより、ｐＰＮＴ（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １９９１，  ６５，  １１５３−１１６３；  ＭＩＴのＲｉｃｈａｒｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ博士から取得）から作製された。二本鎖の７９塩基対の５’リンカーは、３’末端で重複する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、それから、残りの一本鎖領域をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントによって充填することにより、作製された。オリゴヌクレオチドＰＮＴ  Ｎｏｔ（ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）とＰＮＴ  Ｘｈｏ（ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＧＣ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）（各１５０ｎｇ）が、５ＵのＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼバッファーおよび、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む３０μｌの反応混合液中で結合された。３７℃で１時間インキューベートした後、リンカーの各末端の制限酵素部位を解放するために、この反応混合液の一部（５μｌ）が、制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで同時に消化された。さらに、２００ｎｇのｐＰＮＴがＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化された。消化されたプラスミドは、０．８％アガロースゲル上で分離され、ゲルから精製され、標準的な方法に従って、仔ウシ腸管ホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。一定量（６６ｎｇ）の二重に消化されたリンカーは、二重に消化されてホスファターゼで処理されたｐＰＮＴ  ＤＮＡに連結された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。コンピテントＷＭ  １１００大腸菌（Ｄｏｗｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９８８，１６，  ６１２７−６１４５）のＤＮＡ形質転換後、プラスミドＤＮＡがアンピシリン耐性菌から単離され（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８１，１１４，  １９３−１９７）、制限酵素解析によって分析された。適切な組換えプラスミドはＳａｌＩ、ＨｐａＩおよびＮｓｉＩ部位（リンカー中に存在）を獲得したものとして同定されると同時に、出発プラスミドのＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位をまだ保持していた。７９ｂｐのリンカー配列を持つ１つのそのような組換えプラスミドが同定され、ｐＸＮ−４（図６）と呼ばれた。
【００６５】
同様なアプローチが、ｐＸＮ−４のＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位の間に３’リンカーを挿入するために使用された。リンカーを合成するために用いられたオリゴヌクレオチドは、ＰＮＴ  Ｘｂａ（ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＴＡＴ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＰＮＴ  Ｂａｍ（ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＴ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）であった。この場合、ｐＸＮ−４と二本鎖リンカーＤＮＡがＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化された。精製されたフラグメントはＤＮＡ連結反応によってつながれ、コンピテントＷＭ１１００バクテリア中に形質転換された。プラスミドＤＮＡはＸｂａＩとＢａｍＨＩによって消化され、３２Ｐ−ｄＣＴＰとＫｌｅｎｏｗポリメラーゼによって末端標識され、８％アクリルアミドゲル上で分離された（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。ゲルは乾燥され、Ｘ線フィルムに露光された。適切な組換えクローンは、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ二重消化によって遊離される４０塩基対のバンドの存在によって同定された。その結果生じたプラスミドは“ｐＰＮＴＩｏｘ２”（図６）と名付けられた。
【００６６】
挿入されたリンカーの配列を確かめるために、両方のリンカーを含んでいるフラグメントが、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲｌを用いてｐＰＮＴＩｏｘ２から単離され、ヌクレオチド配列決定により従い易いベクターであるｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋中にクローニングされた。リンカーの同一性は、Ｔ３およびＴ７シークエンシング・プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を用いて、直接的なヌクレオチド配列決定（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９７７，  ７４，  ５４６３−５４６７）によって確かめられた。
【００６７】
（ｂ）  相同アームのサブクローニング。
【００６８】
相同な３’アームとｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異生成のために用いられるフラグメントを含むＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（要約地図上の位置１１．５から１５．９、図２）は、初めに、３０μｌのファージＤＮＡをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化されたＤＮＡを０．８アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色でＤＮＡを可視化し、それから、ゲルから４．４ｋｂのフラグメントを切り出すことによって、λＰＳ１−２２から単離された。ＤＮＡはＧｅｎｅＣｌｅａｎ（商標）  ＩＩ（Ｂｉｏ  １０１  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使ってゲルから精製された。同時に１μｇのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋がＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化され、同じ手順によってその後精製された。約４００ｎｇの精製されたラムダＤＮＡと１００ｎｇの精製されたプラスミドＤＮＡが、１０μｌの連結反応において結合された。コンピテントＷＭ  １００大腸菌の形質転換後、プラスミドＤＮＡがアンピシリン耐性菌から単離され、その結果生じたプラスミドを確認するために、制限酵素解析によって分析された（図７）。この場合、形質転換されたバクテリアからのプラスミドＤＮＡは、プラスミドＤＮＡが４．４ｋｂのＰＳ−１フラグメントを獲得したかどうか決定するために、初めにＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩでそれを消化することによって分析された。このプラスミドは“ｐＰＳ  Ｉ−ＸＨ１６”と名付けられた。
【００６９】
同様な手順が、ｐＰＳ１−ＸＨ１６から２００ｂｐのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、それをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋内にサブクローニングするために使用された。その結果生じたプラスミドは“ｐＰＳｌ−ＸＢ１”と名付けられた（図８）。
【００７０】
相同な５’アーム中のフラグメントの１つ（要約地図上の位置７．０から１１．２の４．２ｋｂのＸｂａＩフラグメント；  図２）が同様に、λＰＳ１−６からｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋内にサブクローニングされ、“ｐＰＳ１−Ｘ１５”（図９）と名付けられた。このインサートは２つの方向のどちらででもプラスミド内に配置され得たため、プラスミドＤＮＡは酵素ＥｃｏＲＩでそれを消化することによって、さらにスクリーニングされた。このようにして、クローンｐＰＳ１−Ｘ１５は５’末端がＴ３プロモーターに最も近くなる方向でＰＳ−１インサートを有し、その一方、ｐＰＳ１−Ｘ２においては５’末端がＴ７プロモーターに隣接しているということが決定された（図９）。
【００７１】
５’アーム中の３００ｂｐのＸｂａＩフラグメント（要約地図上の位置１１．２から１１．５；  図２）もまた、同様にしてλＰＳ１−２０からｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋にクローニングされ、ｐＰＳ１−Ｘ３１９（図１０）と名付けられた。この場合、ＸｂａＩフラグメントの方向は、続く制限酵素マッピングによって決定されなかった。
【００７２】
（ｃ）  相同アームの制限酵素マッピング。
【００７３】
さらなる制限酵素マッピングが、ｐＰＳ１−Ｘ３１５およびｐＰＳ１−Ｘ２に対して実行された。一例としては、２つのプラスミドの各々が酵素ＨｉｎｃＩＩで消化され、アガロースゲル上で分離され、エチジウムブロマイドで可視化された。ＨｉｎｃＩＩ部位がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ（商標）  ＳＫ＋プラスミドバックボーン中、インサートの位置と比較してＴ７プロモーターに近いマルチクローニングサイト領域内に存在することが知られているため、２つの消化されたサンプルの各々において、フラグメントの大きさを決定することにより、４．２  ＰＳ−１フラグメントにおけるＨｉｎｃＩＩ部位の位置を決定することが可能であった（図１１）。
【００７４】
４．２ｋｂのＰＳ−１フラグメント中に１回もしくは２回生じる制限酵素部位の位置は、上記の方法によって決定された。与えられた酵素の部位が２つより多く存在した場合は、２つのプラスミドの各々を、問題の酵素のほかにあいまいさを解決することのできる部位を切断する別の酵素によっても二重に消化することにより、相対位置を決定することが必要となった。多くの場合、２回より多く切断する酵素は、このようにして解決されず、単に４．２ｋｂのＰＳ−１フラグメント中に複数の部位を有するとして記載された。この領域を特徴づけるために用いられた他の酵素のリストは、ＡｃｃＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＮｓｉＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩを含むが、これに限定されない。これらのデータの要約は図１２に具体的に示されている。同じ手順はｐＰＳ１−ＸＨ１６の制限酵素地図を作製するために用いられた（図１２）。
【００７５】
（ｄ）  相同な３’アームの突然変異生成。
【００７６】
合計３塩基対の変更がＰＣＲ戦略を用いてエキソン８領域に導入された（変更の要約については、図１３参照）。Ｐ２６４Ｌ変異とＡｆｌＩＩ部位が導入された。１０ｎｇのｐＰＳ１−ＸＢ１が２つのＰＣＲ反応の各々に含められた。最初の反応は、プライマーＥＸＰＬ２（ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＣＧＴ  ＡＴＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＴ７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を含んだ。これは、エキソン８の３’末端とクローンＰＳ１−ＸＢ１を包含した２２０ｂｐのバンドを生成した。また、このフラグメントはＰ２６４Ｌ変異と、Ｐ２６４Ｌ変異の一環としてもたらされた新たなＡｆｌＩＩ部位も含んだ。
【００７７】
第二のＰＣＲ反応は、プライマーＥＸＰＬ１（ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、およびＴ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を使用した。これは、エキソン８の５’末端とクローンＰＳ１−ＸＢ  １を包含した１３７ｂｐのフラグメントを生成した。また、このフラグメントはＰ２６４Ｌ変異とＡｆｌＩＩ部位も含んだ（図１４）。
【００７８】
最初の反応の産物は、ＭａｇｉｃＴＭ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を使用して精製され、その末端の制限酵素部位を解放するためにＢａｍＨＩとＡｆｌＩＩで消化された。同じように、第二の反応の産物が精製され、ＡｆｌＩＩとＸｂａＩで消化された。これらの２つのフラグメントならびに、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋は、一緒に連結され、ＨＢ１０１コンピテント大腸菌細胞中に形質転換された。アンピシリン耐性のコロニーからＤＮＡが単離され、分析された。２つのＰＣＲフラグメントがそれらのＡｆｌＩＩ部位で共に連結され、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋のＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位に挿入された組換えプラスミドを保持しているクローンは、ｐＰＳ１−ＸＢ８５（図１４）と呼ばれた。変異生成したエキソン８の配列を確認するため、Ｔ３およびＴ７シークエンシング・プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，  ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ）およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を用いて、直接的なヌクレオチド配列決定（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９７７，  ７４，  ５４６３−５４６７）が行われた。
【００７９】
相同な５’アームは、いくつかのクローニング段階を通して、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋中に組み立てられた。最初に、ｐＰＳ１−ＸＢ１５は１つのＸｂａＩ部位だけが切断されるように、ＸｂａＩで部分的に消化された。その結果生じたＤＮＡはそれから、ＢａｍＨＩで消化され、ゲルで精製された（図１５）。
【００８０】
ｐＰＳ１−ＸＢ８５中の変異を導入されたインサートは、それをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、その結果生じた変異したインサートをゲルで精製することにより、放出された。２００ｂｐのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが直鎖状化されたｐＰＳ１−Ｘ１５に連結され、組換えプラスミドはＡｆｌＩＩ消化によって、インサートの適切な方向性に関してスクリーニングされた。正しい方向を持つプラスミドは１．９ｋｂと５．８ｋｂのフラグメントを生じた。このプラスミドは“ｐＰＳ１−２０６”と名付けられた。
【００８１】
変異を導入した２００ｂｐのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの５’側に、小さな３００ｂｐのＸｂａＩフラグメントを挿入するため、ｐＰＳ１−２０６は、部分的なＸｂａＩ消化によって直鎖状化された（図１６）。ｐＰＳ１−Ｘ３１９からのＸｂａＩフラグメントが単離され、直鎖状化されたｐＰＳ１−２０６  ＤＮＡ内にクローニングされた。３００ｂｐのＸｂａＩフラグメントの方向は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射性標識ターミネーター・サイクルシークエンシング・キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）を用いて、ＥＸ８ＰＬ１プライマーにより、組換えクローンおよびλＰＳ１−２０をシークエンシングすることによって決定された。ＸｂａＩ部位を越えてλＰＳ１−２０と配列同一性を共有した１つのプラスミドクローンが、適切な方向で挿入された３００ｂｐのＸｂａＩフラグメントを有していた。組み立てられた５’アームを含むこのプラスミドは、“ｐＰＳ１−５’３６０”と名付けられた（図１６）。
【００８２】
（ｅ）  ターゲティングベクターｐＰＳ−１−８−ＴＶの組み立て。
【００８３】
プラスミドｐＰＮＴｌｏｘ２は、相同な３’アームを受け入れるために、最初にプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、直鎖状のプラスミドをゲルで分離することによって調製された（図１７）。並行して、ｐＰＳ１−ＸＨ１６をＥｃｏＲＩによって部分的に消化し、直鎖状形態を単離することによって、３’アームが調製された。このフラグメントはそれからＢａｍＨＩで消化され、４．１ｂｐのフラグメントがゲルによって分離された。３’アームがｐＰＮＴｌｏｘ２に連結された。その結果生じたプラスミドは“ｐＰＮＴ３’４１３”と名付けられた。
【００８４】
５’アームは、最終的なｐＰＳＩ−８−ＴＶプラスミドを与えるために、ｐＰＮＴ３’４１３に挿入された。５’アームは最初にＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化することによって、プラスミドＤＮＡから遊離させられた。並行して、ＮｏｔＩとＳａｌＩで二重に消化することによって、ｐＰＮＴ３’４１３が調製された。２つのＤＮＡのフラグメントは連結され、コンピテントＷＭ  １１００大腸菌細胞に形質転換された（図１８）。
【００８５】
他のヒト変異を含めるために、さらなるベクターが上記方法において調製されうる。
例３：ＥＳ細胞におけるマウスＰＳ−１遺伝子の突然変異生成
（ａ）  細胞。
【００８６】
１２９／Ｓｖ×１２９／Ｓｖ−ＣＰ  ＦＩハイブリッドマウスから誘導され（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０，  ８４２４−８４２９）、Ｊａｎｅｔ  Ｒｏｓｓａｎｔ博士（Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）から得られたＲ１系統のＥＳ細胞が使用された。これらの細胞は、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；  Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｌｏｇａｎ，  Ｕｔａｈ；  ｃａｔ．  ＃  Ａ−１１１５；  Ｌｏｔ  ＃  １１１５２１５４）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ２５−０２５−Ｌ１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ２５−００５−Ｌ１）、１０−６Ｍ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ２１９８５−０２３）、１ｍＭナトリウム・ピルベート（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ２５−０００−Ｌ１）、１×濃度のペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ３０−００１−Ｌ１）および１０００Ｕ／ｍｌの白血病阻止因子（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  １３２７５−０２９）を補充した、ダルベッコの修正によるイーグル培地を含むＥＳ細胞培地（Ｌ−グルタミンおよび４５００ｍｇ／Ｌのグルコースを含む；  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｒｎｄｏｎ，  ＶＡ）中で培養された。細胞は０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ９３９１）溶液で簡単に処理された組織培養プラスチック上で培養された。
【００８７】
培養は４８時間ごとに、もしくは細胞が約８０％のコンフルエントとなった時に継代された。継代については、細胞は最初にリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）で洗浄され、それからトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない０．０５％トリプシンと０．０２％  ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液）で処理された。細胞のすべてが懸濁された後、トリプシン消化は組織培養培地の添加によって止められた。細胞は遠心によって回収され、５ｍｌの組織培養培地中に再懸濁され、１ｍｌ量の細胞懸濁液が同じ大きさの新しいプレートを開始するために使用された。
【００８８】
（ｂ）  ＥＳ細胞のＤＮＡトランスフェクション。
【００８９】
ｐＰＳ１−８−ＴＶ  ＤＮＡ（４００μｇ）は１ｍｌの反応体積中、ＮｏｔＩでそれを消化することにより、エレクトロポレーションの準備がなされた。ＤＮＡはそれから、エタノールの添加によって沈殿され、７０％エタノールで洗浄され、５００μｌの滅菌水中に再懸濁された。
【００９０】
ＮｏｔＩで直鎖状化されたｐＰＳ１−８−ＴＶ  ＤＮＡは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いて、ＥＳ細胞中に電気穿孔された。１０個のエレクトロポレーション・キュベットの各々において、ＥＳ細胞培養培地中に懸濁された２．５×１０６個の細胞に４０μｇのＤＮＡが電気穿孔された。エレクトロポレーションの条件は、通常６．０〜６．１秒の間の範囲の時定数をもたらす２５０Ｖ、５００μＦであった。エレクトロポレーションの後、細胞はエレクトロポレーション・キュベット中、室温で２０分間インキューベートされた。すべての電気穿孔された細胞はそれからプールされ、１０個のゼラチン化プレート上に等しく分配された。２４時間後、プレートは吸引され、新鮮なＥＳ細胞培地が加えられた。その翌日、９枚のプレートの培地は１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）と０．２μＭのガンシクロビル（Ｓｙｎｔｅｘ）を補充したＥＳ細胞培地と交換された一方、１枚のプレートは１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８のみを補充した培地を入れられた。さらに８日後、結果として生じた個々のＥＳ細胞コロニーはプレートから摘み取られ、Ｗｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ  ３３−６１  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｖｏｌ．  １２６，１９９３，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．  Ｌ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄによって記述されているようにして、２４穴プレートのウェル中において個々に増殖された。Ｇ４１８とガンシクロビルを補充したプレート上で増殖したコロニーの数と、Ｇ４１８の補充のみで増殖した数の比較は、ネガティブセレクションの効率を決定するために使用された。
【００９１】
（ｃ）  ＥＳ細胞形質転換体の分析。
【００９２】
２４穴プレートの各ウェル中の細胞培養が約８０％のコンフルエントになった場合、それは洗浄され、細胞は２滴のトリプシン−ＥＤＴＡを散布された。トリプシン処理は１ｍｌのＥＳ細胞培地の添加によって止められた。この懸濁液のうちの一定量（０．５ｍｌ）が、別個の２４穴プレートの２つのウェルの各々に移された。細胞がコンフルエント近くまで増殖した後、プレートの１つは細胞株の低温保存のために使用され、一方、もう１つはクローンの各々のためのＤＮＡの供給源として使用された。
【００９３】
低温保存では、２４穴プレート中の細胞は最初に、プレートを氷上に置くことによって冷やされた。培地はそれから、１０％  ＤＭＳＯおよび２５％  ＦＢＳを補充した新鮮なＥＳ細胞培地と交換され、プレートは、スタイロフォームの箱中でプレートを断熱して、−７０℃のフリーザーにそれを入れることによって、約０．５℃／ｍｉｎで冷却された。
【００９４】
他のプレート上のクローンからＤＮＡを単離するために、各ウェル中の培地は５００μｌの消化バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）と交換された。３７℃で一晩のインキュベーション後、５００μｌのイソプロパノールが各ウェルに加えられ、プレートは軌道振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）上で１５分間撹拌された。上清は吸引され、５００μｌの７０％エタノールと交換され、プレートはさらに１５分間振盪された。ＤＮＡ沈殿物はウェルから摘出され、５０μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解された。
【００９５】
マウスＰＳ−１遺伝子の突然変異生成に関する一次分析は、ＡｐａＩで消化したＥＳ細胞ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション・スクリーニングを含んだ。この分析のためのプローブは、相同な３’アームの外側の我々のクローニングしたＰＳ−１領域の３’末端から誘導された（図１９ｄ）。それは最初に、λＰＳ１−６（図２）の３’末端に対応する６ｋｂのＸｂａＩフラグメントを単離し、それをＸｂａＩで消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＩＢ＋中にサブクローニングすることによって調製された。ｐＰＳ１−Ｘ６と呼ばれるこのサブクローンのＸｈｏＩ（内部の部位）とＨｉｎｄＩＩＩ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）  ＳＫ＋ポリリンカー由来）によるさらなる消化は１０００ｂｐのプローブを生じた。
【００９６】
サザンハイブリダイゼーション・スクリーニングについては、各ＥＳ細胞クローンＤＮＡの一定量（１０ｕｌ）がＡｐａＩで消化され、０．８％アガロースゲル上で分離され、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ（商標）メンブレンに移された。プローブはランダムプライミング法によって３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識され、５８℃で一晩メンブレンにハイブリダイズさせられた（Ｃｈｕｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｄ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ，  １９８４，  ８１，  １９９１−１９９５）。ＰＳ−１遺伝子がうまく相同遺伝子組換えを経たＥＳ細胞株は、このアッセイにより９および１５ｋｂのＡｐａＩフラグメントを生じる（図１９）。これは、相同遺伝子組換えが都合よく、新たなＡｐａＩ部位をｎｅｏｒカセットが取り込まれる領域に導入するからである。１５ｋｂのバンドはＰＳ−１の変更のない細胞コピーをあらわす一方、９ｋｂのバンドは新たなＡｐａＩ部位がより短いフラグメントをもたらすＰＳ−１コピーから誘導される。この最初のスクリーニングにおいて分析された２６０の細胞株のうち８つの細胞株が、潜在的なターゲティング成功細胞株として同定された。
【００９７】
一次スクリーニングによって推定上の相同組換え体として評価されたすべての細胞株はそれから、λＰＳ１−２０に由来する５．５ｋｂの５’  ＸｂａＩフラグメントから単離された５００ｂｐのＫｐｎＩ−ＡｐａＩフラグメントを用いて、ＳｃａＩ消化ＥＳ細胞ＤＮＡに対し、さらにスクリーニングされた。この場合、正常なＰＳ−１遺伝子は１３．８ｋｂのフラグメントを生じ、変異体ＰＳ−１遺伝子は１０．５ｋｂのフラグメントを生じた（図１９ｅ）。このスクリーニングによって調べられた８つの細胞株のうち４つが、その５’末端で相同遺伝子組換えを受けたことが示された。
【００９８】
両方のスクリーニングによって相同遺伝子組換えを経たと確認された細胞株は、（前述の２つのスクリーニングの１つのみに陽性の結果を与える相同挿入に対して）真に相同遺伝子組換えを経たものとみなされた。しかし、このアームに含められた変異は、５’アームが組換えを起こす際にどこで交叉が生じるかに依存して、適切な相同組換えの結果として、細胞ＤＮＡ内に取り込まれることも、取り込まれないこともある（図１）。したがって、Ｐ２６４Ｌ変異の結果として生じる新たなＡｆｌＩＩ部位を検出することを目的とする、さらなるサザンハイブリダイゼーション・スクリーニングが実施された。このためには、ｐＰＳ１−Ｘ１５から単離された１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントが、ＡｆｌＩＩで消化されたＤＮＡに対するプローブとして利用された。変更のないＰＳ−１遺伝子は、６．７ｋｂのバンドを生じた（図１９ｆ）。適切な相同遺伝子組換えは起こったが、計画された突然変異を欠いているＰＳ−１遺伝子は８．７ｋｂのバンドを生じる一方、計画された突然変異の含有物は２．２ｋｂのバンドを生じる。調査した４つの真の相同組換え細胞株のうち、４つすべてが計画された突然変異の近くに新たなＡｆｌＩＩ部位を取り込んだことが示された。
【００９９】
ここに記述された突然変異を導入された形のＰＳ−１遺伝子は、ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌと名付けられ、それに対して、正常なＰＳ−１遺伝子はＰＳＩ＋と名付けられた。１コピーのＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌを保持している４つのＥＳ細胞株はＰＳ１−８７、ＰＳ１−１７５、ＰＳ１−１７６およびＰＳ１−２４３と呼ばれた。これらの株のうち３つが解凍され、細胞数が拡大され、ＰＳ−１変異マウスを樹立するために用いられた。
【０１００】
他のヒト突然変異を含めるために、マウスＰＳ−１遺伝子のさらなる突然変異生成が、上記方法においてＥＳ細胞において実施されうる。
例４：ＰＳ−１変異マウスの樹立
ＰＳ−１変異ＥＳ細胞は、変異ＥＳ細胞をＥ２．５胚へ凝集させ、凝集した胚を偽妊娠した雌に移すことによりキメラマウスを作製するために用いられた（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９３，  ３６５，  ８７−８９）。平均して１０〜１５細胞である凝集塊を生成するための限定的なトリプシン処理によって、ＥＳ細胞が凝集のために調製された。Ｅ２．５胚は、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８６，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記述されているようにして、卵管フラッシング（ｏｖｉｄｕｃｔ  ｆｌｕｓｈｉｎｇ）によって、過排卵したＣＤ−１雌マウスから回収された。透明帯は酸性のタイロード液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を使って、胚から取り除かれた。凝集ウェルは、平滑な金属器具（かがり針）を組織培養プラスチック内に押し込むことによって作製された。胚はそれから、ミネラルオイル下の小滴（約２０μｌ）のＭ１６倍地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）中、およそ１０〜１５個のＥＳ細胞の凝集塊と一緒にウェル中に置かれた。一晩のインキュベーション（３７℃、湿度１００％、空気中５％のＣＯ２）後、凝集胚は偽妊娠雌の子宮角に移された（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６、前出）。
【０１０１】
子孫へのＥＳ細胞の寄与は、色素性の外被色の出現によって評価された。陽性のマウスはキメラ創始者（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｏｕｎｄｅｒ）と呼ばれる。ＥＳ細胞による生殖系列への寄与は、キメラ創始者とＣＤ−１雌の間のかけ合せからの、色のついた子孫の出現によって評価された。
例５：キメラ
胚凝集に使われた３つのＰＳ−１変異ＥＳ細胞株のうち、１つが生殖系列キメラを生じた：
【０１０２】
【表１】
2004533802.tif 000003
【０１０３】
生殖系列キメラはそれから、ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌを保持しているマウスの系統を樹立するために用いられた。色のついた子孫中の変異ＰＳ−１対立遺伝子の存在は、例１に記載されたものと実質的に同じ手順の後に続き、ｎｅｏｒカセットを検出することを目的とするＰＣＲ戦略を使用して決定された。ＰＣＲプライマーは以下のとおりであった：ｎｅｏ２８（ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＣ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；およびｎｅｏ４４５（ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＣＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。ゲノムＤＮＡは尾部試料から調製された（Ｈｏｇａｎ，  １９８６、前出）。４匹の色のついた子孫のうち、１匹の雌マウスがＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌについてヘテロ接合性（ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／＋）であった。すなわち、このマウスは、前述のＰＣＲ戦略に基づき、ｎｅｏｒカセットについて陽性であった。同様にＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌについてヘテロ接合性である以降の世代の子孫は、この雌を野生型の雄とかけ合わせることによって開発された。
【０１０４】
ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌについてヘテロ接合性（ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／＋）であるマウスは、ＰＣＲに基づく方法を使用して遺伝形質を決定された。マウスＰＳ−１の野生型対立遺伝子の存在は、以下のプライマーを使って評価された：Ｘ８Ｆ（ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＡＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）およびＸ８Ｒ（ＴＴＡ  ＣＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。これらのプライマーによる評価は１４２ｂｐのフラグメントを生じる（データは省略）。変異対立遺伝子の存在はプライマーｎｅｏ２８およびｎｅｏ４４５を使って評価され、これは４１７ｂｐのフラグメントを生じる。よって、変異についてヘテロ接合性であるマウスは、両方のバンドを生じる；変異についてホモ接合性であるマウスは４１７ｂｐのバンドのみを生じる；そして、野生型対立遺伝子についてホモ接合性であるマウスは１４２ｂｐのバンドのみを生じる。組織サンプルは動物の尾部から得られ、例１のＰＣＲ手順がそのような評価のために利用された。
【０１０５】
ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ対立遺伝子についてホモ接合体であるマウス（すなわちＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／ｎＰ２６４Ｌ）は、ヘテロ接合体のマウス（ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／＋）を、ヒト化したＡＰＰ遺伝子についてホモ接合体であるマウス（ＰＣＴ公開番号Ｗ０９６／３４０９７において開示、１９９６年１０月３１日公開；これは引用することにより本明細書に完全に取り込まれている）と交雑することによって作製された。その結果生じる世代の子孫（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）はそれから、ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、かつ、ヒト化されたＡＰＰ遺伝子についても共にヘテロ接合性であることが決定された（データは省略）；これらの世代の子孫はそれから、交雑に使用され、その結果生じる子孫がＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌについてホモ接合性であり、同様にヒト化ＡＰＰ遺伝子についてヘテロ接合性であることが（上に概説されたＰＣＲ手順を使用して）決定された（この同腹仔からの世代の子孫は、ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ対立遺伝子についてヘテロ接合性／ヒト化ＡＰＰ遺伝子についてホモ接合性；ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ対立遺伝子についてヘテロ接合性／ヒト化ＡＰＰ遺伝子についてヘテロ接合性であるものも見出された――この同腹仔から得られた子供の数が限られていたため、二重ホモ接合体は見つからなかった）。以降の交配はＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／ｎＰ２６４Ｌ×ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスを生じた。
【０１０６】
ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ対立遺伝子についてホモ接合性のマウスはまた、ヘテロ接合性のマウス（ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／＋）の交雑によっても生成された。１セットの交配で、６匹のホモ接合体が２７匹の子孫の中に見つかり、これは、ヘテロ接合体のかけ合せから予想される２５％のホモ接合体の回収率の範囲内によくおさまる。
【０１０７】
したがって、また、上に開示されたさまざまな交配アプローチに基づき、この動物の実質的に正常な生存度と胎生期生残は明らかである。
例６：ＰＧＫ−ｎｅｏカセットの切出し
ＣｒｅリコンビナーゼをコードしているｐＢＳ１８５プラスミドＤＮＡ（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ＢｉｏＬ，１９９０，  ２，  ４４１−４４９、引用することにより本明細書にその全体が取り込まれている）が、前核注入（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって、ＰＳ−１ｎＰ２６１Ｌ／＋×ＣＤ−１のかけ合わせから生成された１細胞胚内へ導入された。プラスミドは環状であったため、ゲノムへのＤＮＡの組込みは非常に低い発生頻度を有していた。Ｃｒｅリコンビナーゼを生成するＤＮＡの一過性発現は、初期胚においてＰＧＫ−ｎｅｏカセットを切り出した。注入された胚は偽妊娠の雌へと移された。ＰＧＫ−ｎｅｏカセットの切り出しは、子孫の遺伝形質を決定することによって確かめられた。これらのマウスはＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋と名付けられ、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスを生成するためにかけ合わせられた。
【０１０８】
ネオマイシン選択可能マーカーはＰＳ−１遺伝子の転写を減少させたため、Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現後に起きる隣接するｌｏｘＰ部位での遺伝子組換えによって、ＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子が切除された。ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／＋×ＣＤ−１のかけ合せによって作製された１細胞胚（ｎ  ＝  １５４）は、ｐＢＳ１８５のプラスミドＤＮＡを注入され、偽妊娠の雌に移植された。ＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子の喪失は、例５に記述されているように、Ｘ８ＦおよびＸ８Ｒプライマーのペアを使ったＰＣＲによって、２１９塩基対フラグメントとして、子孫において評価された。ネオマイシン選択可能マーカーが切除された変異ＰＳ−１対立遺伝子は、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌと名付けられた。１匹の創始者マウスにおいて切り出しがうまく生じ、ヘテロ接合性（ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋）およびホモ接合性（ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌ）のマウスの系統が生成された。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスは、Ｐ２６４Ｌ変異がＡβの生成および沈着に与える影響をさらに研究するために、Ｔｇ２５７６マウスおよびＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスとかけ合わせられた。
例７：ノザンおよびウェスタンブロット
生後２〜６ヶ月のＰＳ−１＋／＋、ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／ｎＰ２６４ＬおよびＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスが、ＰＳ−１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを評価するために用いられた。ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，  Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，  ＴＸ）中での均質化によって、トータルＲＮＡが脳の半分から抽出された。メッセンジャーＲＮＡはＯｌｉｇｏｔｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）によって選別された。等体積のｍＲＮＡがローディングバッファー（ＮｏｒｔｈｅｒｎＭＡＸ−Ｇｌｙ，  Ａｍｂｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）と混合され、５０℃に３０分間加熱され、０．７％アガロースゲル上で分離され、ナイロンメンブレンへ移された。ＰＳ−１  ｍＲＮＡは、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）中にクローニングされたヒトＰＳ−１の３’末端（ヌクレオチド１０８３〜１４２８）をあらわす３２Ｐ−ｄＵＴＰ標識リボプローブにより検出された。同じブロットは規準化のためにＧＡＰＤＨプローブ（Ａｍｂｉｏｎ）をハイブリダイズさせられた。ｍＲＮＡを可視化するために、メンブレンは蛍光スクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に感光され、Ｓｔｏｒｍ  ８４０  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒでスキャンされ、濃度測定がＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によって実施された。
【０１０９】
脳の半分が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、０．２５％デオキシコレート、０．２５％  ＮＰ−４０、およびプロテアーゼインヒビター（５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチン）を含む２．５ｍｌのバッファー中で均質化された（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  １９９７，  ３，  ７５６−７６０）。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）によって決定された。全脳ライセートは還元的なローディングバッファーと混合され、３７℃で４５分間熱せられた。各サンプルの総タンパク質５０μｇが、ＮｕＰＡＧＥ  １０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）上での電気泳動によって分離され、ニトロセルロースへ移された。メンブレンは０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０および５％脱脂粉乳を含むＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中、４℃で一晩ブロッキングされた。ＰＳ−１は同じ溶液で希釈されたウサギポリクローナル抗体によって検出された。Ｃ末端フラグメントは、抗体Ｂ１７．２により１：２０００の希釈で検出された（Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２，  ３５９０−３５９８）。Ｂ１７．２はヒトＰＳ−１の親水性ループドメインにあるアミノ酸残基３００〜３１５（ＥＧＤＰＥＡＱＲＲＶＳＫＮＳＫＹ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）に対して作製された。Ｎ末端フラグメントは１：５００希釈のＣＰ１６０により検出された。ＣＰ１６０は、ｐＱＥ−９プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてバクテリア内で発現させた、６×ヒスチジンタグを付加したヒトＰＳ−１のＮ末端フラグメント（アミノ酸１〜８０）を用いて作製された。合成ＰＳ−１  Ｎ末端フラグメントは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って精製された。ペプチドはウサギへの注射のために、アクリルアミドゲルから切り出された。ＣＰ１６０のＩｇＧ画分はアフィニティー精製され、ブロッティングに使用された。一次抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）により検出された。ブロットは化学発光試薬（ＬｕｍｉＧＬＯ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と反応され、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＩＬ）に感光された。フィルムはスキャンされ、濃度測定がＲＦＬＰ２．１ソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ，  Ｆａｉｒｆａｘ，  ＶＡ）で実施された。
【０１１０】
ノザンブロット解析はＰＳ−１  ｍＲＮＡについて３．１ｋｂのバンドを示した。ＰＳ−１  ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して、ローディングの差に関して規準化された。ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／ｎＰ２６４Ｌマウス中のＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子の存在は、野生型レベルの２０％であるＰＳ−１  ｍＲＮＡレベルをもたらした（データは省略）。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウス中のｍＲＮＡレベルは、ＰＳ−１＋／＋マウスの１００％であった（データは省略）。このように、ＰＧＫ−ｎｅｏカセットの除去はＰＳ−１  ｍＲＮＡレベルを正常なレベルに戻した。
【０１１１】
ウエスタンブロッティングは、３つすべての遺伝子型において、抗体ＣＰ１６０を使用した場合には約３０ｋＤａのＮ末端ＰＳ−１フラグメントを示し、抗体Ｂ  １７．２を使用した場合には約２０ｋＤａのＣ末端ＰＳ−１フラグメントを示した。抗原をあらかじめ吸収させたＣＰ１６０によるブロッティングは、約３０ｋＤａのＮ末端バンドを排除した（データは省略）。Ｃ末端ＰＳ−１フラグメントに対するＢ１７．２の特異性は、以前に示されている（Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２，  ３５９０−３５９８）。ＰＳ−１ｎＰ２６４Ｌ／ｎＰ２６４ＬマウスにおいてはＰＳ−１  ｍＲＮＡレベルが減少していたため、ＰＳ−１タンパク質のレベルもまた正常なレベルの約１５〜２０％にまで減少していた（データは省略）。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおける変異ＰＳ−１の正常なｍＲＮＡ発現にもかかわらず、ＰＳ−１タンパク質レベルは約５０％に減少していた（データは省略）。Ｎ末端およびＣ末端の両フラグメントは同様な程度に減少していた。これらのデータは、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異が翻訳、完全長ＰＳ−１タンパク質のプロセッシング、あるいは切断されたフラグメントの安定性に対する影響のいずれかを介して、ＰＳ−１タンパク質レベルに影響することを示している。報告は、ＰＳ−１のいくつかのＦＡＤ変異による、Ｎ末端フラグメントのさまざまな減少および／もしくはホロタンパク質の蓄積を記述した（Ｍｅｒｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９６，  ３８９，  ２９７−３０３；  Ｍｕｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９７，  ２２９，  ６１−６４；  Ｌｅｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ，  １９９７，  ４１，  ７４２−７５３；  Ｍｕｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．，  １９９９，  ２３，  ９０５−９１３；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９９，  ２６０，  １２１−１２４）。対照的に、ＦＡＤ患者において、トランスフェクションを行った細胞において、およびトランスジェニックマウスもしくは遺伝子ターゲティングしたマウスにおいて、種々のＰＳ−１  ＦＡＤ変異がフラグメント形成の減少を引き起こさないことが見出された（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，  １９９７，  ８，  １７１７−１７２１；  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，  １９９７，  ３，  ７５６−７６０；  Ｐｏｄｌｉｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ｄｉｓ．，１９９７，  ３，  ３２５−３３７；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，１９９９，  ５，  １０１−１０６；  Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｍｅｄ，  １９９９，  ５，  ５４２−５５４；  Ｖａｎｄｅｒｈｏｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９９，  ２７４，  １８３−１８６；  Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９６，１７，  １００５−１０１３；  Ｄｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９６，  ３８３，  ７１０−７１３；  Ｃｉｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，１９９７，  ３，  ６７−７２；  Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９９，１１，  ２５７７−２５８１）。トランスフェクトしたＰＣ１２細胞における、Ｐ２６４Ｌ変異によるＮ末端フラグメント減少のレベルは、野生型ＰＳ−１の値の約３５〜４０％であり（Ｍｕｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏ−Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．，  １９９９，  ２３，  ９０５−９１３）、ＰＳ−１＋／＋マウスとの比較でＰＳ１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいて見られた減少の程度と一致した。
例８：Ａβ４０特異的および４２特異的なＥＬＩＳＡ
沈着傾向を示す（ｐｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｎｇ）二重遺伝子ターゲティングマウス（１〜６ヶ月のＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウス、５ヶ月のＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウス、および１〜２ヶ月のＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウス）および、２〜４ヶ月の沈着傾向を示すＴｇ２５７６マウス（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，  ２７４，  ９９−１０２）からの脳の半分が、ドライアイス上で凍結され、−７０℃で保存された。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスとかけ合わせた、沈着傾向を示すＴｇ２５７６マウス（２〜４ヶ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１＋／＋マウス、２ヵ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウス、および１ヵ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウス）からの脳の半分が同様にしてさらに調製された。脳の半分は４ｍｌの０．２％ジエチルアミンおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で均質化され、１００，０００×ｇで遠心分離された。上清は２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌによってｐＨ  ８に中和され、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）によりタンパク質濃度が分析され、５％胎性クローン血清（ｆｅｔａｌ  ｃｌｏｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）と１％脱脂粉乳のＴＢＳ溶液で１：１希釈された。Ａβ４２特異的ＥＬＩＳＡは、以前に記述されたようにして実施された（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９８，  １８，  １７４３−１７５２）。Ａβ４０特異的ＥＬＩＳＡは修正されて（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９８，  １８，  １７４３−１７５２）、捕捉抗体が６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ，  Ｎａｐａ，  ＣＡ）となり、検出抗体がＡβ４０に選択的となるようにされた（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）。ＥＬＩＳＡシグナルは、Ａβ４０もしくは４２（Ｂａｃｈｅｍ，  Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，  ＰＡ）を用いて生成された標準曲線に基づき、総抽出タンパク質１ミリグラムあたりのＡβのナノグラム数として報告された。
【０１１２】
表２はＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異がＡβ沈着の出現前に、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスの脳におけるＡβ４０およびＡβ４２のレベルに与える影響を示す。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異はＡβ４０レベルに対して有意な影響を持たなかった。１コピーのＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異はＡβ４２をわずかに上昇させたが、変異の影響はＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１＋／＋マウスと比較して、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいてのみ有意であった。Ａβ４２レベルにおけるこの増加は、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１＋／＋およびＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスと比較して、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４ＬマウスにおけるＡβ４０に対するＡβ４２の比に有意な上昇を引き起こした。Ｔｇ２５７６マウスはＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスよりも著しく多いＡβ４０およびＡβ４２を有していたが、Ａβ４２／４０比はＴｇ２５７６とＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１＋／＋マウスにおいて同様であった。
【０１１３】
表３は、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異がＡβ沈着の出現前に、Ｔｇ２５７６マウスの脳におけるＡβ４０およびＡβ４２レベルに対して与える影響を示している。ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異はＡβ４０レベルに対して有意な影響を持たなかった。１コピーのＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異はＡβ４２をわずかに上昇させたが、変異の影響はＴｇ２５７６×ＰＳ−１＋／＋マウスと比較して、Ｔｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいてのみ有意であった。このＡβ４２レベルの増加は、Ｔｇ２５７６×ＰＳ−１＋／＋マウスと比較してＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいて、Ａβ４０に対するＡβ４２の比率に有意な上昇を引き起こした。このように、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異がＡβレベルに与える影響はＴｇ２５７６とＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスについて同様であった。
【０１１４】
【表２】
2004533802.tif 000004
【０１１５】
【表３】
2004533802.tif 000005
【０１１６】
例９：免疫組織化学および組織学
ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスが生後１２ヵ月目に調べられた。生後３、６、９、１２、１５および１８ヵ月のＰＳ−１＋／＋、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋もしくはＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４ＬであるＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスが評価された。調べられたさらなるマウスはＴｇ２５７６であり、ＰＳ−１＋／＋、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋もしくはＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌで、生後１、２、４、６、９、１２、１５および１８ヵ月であった。Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスへのかけ合わせによって維持された他のＴｇ２５７６マウスもまた、生後６、９、１２、１５、１８および２１ヶ月目に調べられた。マウスはリンガー溶液を灌流され、脳が取り除かれ、二等分された。各脳の半分は７０％エタノールと１５０ｍＭ  ＮａＣｌに４８時間浸され、パラフィンが包埋され、矢状面で１０μｍに切片化された。１６切片のセットが２００μｍの間隔で取られ、免疫組織化学によってＡβの沈着を示すために染色された。使用された抗体は、ヒトＡβのアミノ酸１〜２８に対して作製されたウサギポリクローナル抗体の１１５３（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９４，  ６０，  ６０７６１９）とモノクローナル抗体４Ｇ８および６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ）であった。切片は４Ｇ８の場合は８０％の蟻酸で前処理され、１１５３および６Ｅ１０の場合は前処理を行わず、そして、１：１，０００希釈で一次抗体と共に一晩反応させられた。抗体はビオチン化された二次抗体（１：１００）を用いて複合体化され、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  ＣＡ）を用いて連結され、ニッケル増強３，３’−ジアミノベンンジデンを用いて可視化された。非トランスジェニックマウス、およびあらかじめ吸収された一次抗血清が染色の対照として役立った。切片のさらなるセットは、チオフラビンＳを用いて染色され、蛍光顕微鏡で調べられた。
【０１１７】
ＣａｓｔＧｒｉｄシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，  Ｄｅｍｎａｒｋ）を使用し、１１５３抗体で染色された１セットの１６切片において、新皮質におけるプラーク量（ｐｌａｑｕｅ  ｌｏａｄ）が定量された。新皮質の体積とＡβ沈着によって占められる新皮質のパーセント体積は、点計数（ｐｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）（Ｗｅｉｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９）  Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｖｏｌ．  １：  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ，  ４１５  ｐｐ．  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）によって、立体解析学的に決定された。代表的な結果が表４に示されている。
【０１１８】
表４．生後６ヶ月の新皮質におけるＡβプラーク量（％体積含有率）
2004533802.tif 000006
細胞外のＡβ沈着は、ＰＳ−１＋／＋のものと比較して、ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋もしくはＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４ＬのＴｇ２５７６マウスにおいては著しく加速されていた。Ｔｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスにおいては、Ａβ沈着は生後２ヵ月では認められなかったが、生後４ヵ月では存在していた。Ｔｇ２５７６  ｘ  ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスでは、Ａβ沈着は生後１ヵ月では存在しなかったが、生後２ヵ月では存在していた。Ｔｇ２５７６×ＰＳ−１＋／＋マウスは生後６ヵ月までＡβ沈着を示さず、その量は、Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬバックグラウンドで維持された生後６ヵ月のＴｇ２５７６マウスにおいて見られるそれに相当した。１１５３抗体で可視化されたＡβプラーク量は、より高齢のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋およびＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスの新皮質において、劇的に増加していた（データは省略）。生後４ヶ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスおよび生後２ヶ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスは、４Ｇ８もしくはチオフラビンＳで染色される多数の沈着を有しており、これは最早期の沈着が緻密な原線維アミロイドを含むことを示している。
【０１１９】
Ｔｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいて見られる沈着の加速に加えて、もう一つの差異は沈着の領域分布であった。生後６ヵ月のＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウス、生後９ヵ月のＴｇ２５７６×ｐＳ−１Ｐ２６１Ｌ／＋マウスおよび生後１８ヵ月のＴｇ２５７６（Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬバックグラウンド）マウスを比較すると、沈着の密度は、終脳構造において類似していた（データは省略）。しかし、Ｔｇ２５７６×ｐＳ−１Ｐ２６１Ｌ／ＰＩ６１Ｌマウスの皮質下構造では、Ａβ沈着の量がＴｇ２５７６×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋およびＴｇ２５７６マウスにおけるよりも、非常に多くなっていた（データは省略）。
【０１２０】
ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈマウスにおけるＡβ沈着は、生後２２ヵ月まで評価された。沈着の証拠は発見されなかった。同様に、マウスＡＰＰについて野生型であるＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいて、生後１２ヶ月で、沈着は見つからなかった。極めて稀なＡβ沈着が、１１５３抗体およびチオフラビンＳの両方を用いて、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／＋マウスの皮質において生後１２ヶ月に認められた。生後１８ヵ月では、これらのマウスにおけるＡβ沈着は、より多数で、より大きかった。
【０１２１】
２コピーのＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ変異は、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４ＬマウスにおけるＡβ４２の増加をもたらし（表２）、早い年齢でのＡβ沈着をもたらした。ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスでは、Ａβ沈着は、生後３ヵ月では見つからなかったが、６ヵ月では存在していた。沈着は、ＡＰＰＮＬｈ／ＮＬｈ×ＰＳ−１Ｐ２６４Ｌ／Ｐ２６４Ｌマウスにおいて、加齢とともに増加した。
【０１２２】
本文書において引用もしくは記述された各特許、特許出願、および出版物の開示は、この結果、引用することにより、それらの全体において、本明細書に取り込まれている。
【０１２３】
ここに記述されたものに加えて、前の記述から本発明のさまざまな修正が当業者にとって明らとなるであろう。そのような修正はまた、添付特許請求の範囲の範囲内におさまることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、遺伝子ターゲッティングの一般的原理を具体的に説明する図解である。
【図２】
発明にかかる、フラッシュ［Ｆｌａｓｈ］（商標）非放射活性遺伝子マッピングキットを使用して調製された、一組のマウスＰＳ−１ゲノムクローン地図である。制限エンドヌクレアーゼの文字略語は以下のとおりである：Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｘｈ、ＸｈｏＩ。
【図３】
発明にかかる、フラッシュ［Ｆｌａｓｈ］（商標）制限マッピング法を具体的に説明するのに使用される代表的制限地図である。
【図４】
発明にかかる、ＰＳ−１の制限地図上にエキソン７および８を位置づけるための戦略を具体的に説明する図である。
【図５】
発明にかかる、ＰＳ−１のエキソン８とｐＰＳ１−８−ＴＶ置換ベクターとの間の関係を具体的に説明する一対の遺伝子地図である。制限エンドヌクレアーゼの文字略語は以下のとおりである：Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｘｈ、ＸｈｏＩ、Ｎ、ＮｏｔＩ。
【図６】
発明にかかる、プラスミドｐＰＮＴＩｏｘ２の構築を具体的に説明する図解である。
【図７】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−ＸＨ１６の構築を具体的に説明する図解である。
【図８】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−ＸＢ１の構築を具体的に説明する図解である。
【図９】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−Ｘ１５およびｐＰＳ１−Ｘ２の構築を具体的に説明する図解である。
【図１０】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−Ｘ３１９の構築を具体的に説明する図解である。
【図１１】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−Ｘ１５およびｐＰＳ１−Ｘ２からの相同な５’アームの制限マッピングを具体的に説明する図解である。
【図１２】
発明にかかる、ＰＳ１の相同な３’および５’アームについての一対の制限地図である。
【図１３】
発明にかかる、本発明のＰ２６４Ｌ突然変異およびＡｆｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の付加を遂げるための塩基変化を具体的に説明するＰＳ−１のエキソン８の部分的配列である。
【図１４】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−ＸＢ８５の構築を具体的に説明する図解である。
【図１５】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−２０６の構築を具体的に説明する図解である。
【図１６】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−３６０の構築を具体的に説明する図解である。
【図１７】
発明にかかる、プラスミドｐＰＮＴ３’４１３の構築を具体的に説明する図解である。
【図１８】
発明にかかる、プラスミドｐＰＳ１−８−ＴＶの構築を具体的に説明する図解である。
【図１９】
発明にかかる、マウスＰＳ１内の相同的組換えを検出するための戦略を具体的に説明する図解である。制限エンドヌクレアーゼの文字略語は以下のとおりである：Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｘ、ＸｂａＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ａ、ＡｐａＩ；Ａｆ、ＡｆｌＩＩ；Ｓｃ、ＳｃａＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；およびＨｃ、ＨｉｎｃＩＩ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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