(57)【要約】本発明は酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける可溶性プロテイナーゼＫをコードする遺伝子の発現および培養培地への引き続く分泌方法に関する。さらに、異種発現されかつ分泌されたプロテイナーゼＫを精製する方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする配列の上流で、シグナルペプチドをコードする配列とリーディングフレームで融合されたプロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードし、かつ宿主細胞に対して適切なプロモーターの制御下にあるＤＮＡを含む、ベクターを用いた宿主細胞の形質転換、
ｂ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体の発現
ｃ）プロテイナーゼＫの分泌および自己触媒活性化
の工程を含む組換えプロテイナーゼＫを作製する方法であって、宿主細胞が酵母細胞であり、タンパク質が該発現宿主によって可溶性形態で発現されることに特徴を有する方法。
【請求項２】
宿主細胞がＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．の群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする遺伝子がベクターｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺαＡおよびｐＰＩＣ９Ｋのうちの１つにクローニングされる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がベクターｐＰＩＣＰＫ−１およびｐＰＩＣＰＫ−２のうちの１つで形質転換される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
プロテイナーゼＫの酵素原前駆体の発現がメタノールによって誘導される、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
タンパク質の分泌がシグナルペプチドのＮ末端融合により開始される、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
タンパク質の分泌がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子のシグナルペプチドのＮ末端融合により開始される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓがプロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＰＩＣＡαＡで形質転換され、該遺伝子がＡＯＸ１プロモーターの制御下にある、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
酵母の形質転換に適切である、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードするＤＮＡを含んでなるベクターであって、ここで、該ＤＮＡがコーディング配列の上流で適切なシグナルペプチドをコードする配列とリーディングフレームで融合され、コーディング遺伝子が宿主細胞に適切であるプロモーターの制御下にある、ベクター。
【請求項１１】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの形質転換に適切であることを特徴とする請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺαＡおよびｐＰＩＣ９Ｋの群より選択される、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする請求項１０または１１記載のＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項１３】
ｐＰＩＣＺαＡである請求項１０〜１２いずれか記載のベクター。
【請求項１４】
プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードするＤＮＡを含むベクターがｐＰＩＣＰＫ−１またはｐＰＩＣＰＫ−２である請求項１０〜１２いずれか記載のベクター。
【請求項１５】
酵母である、請求項１０〜１４いずれか記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．の群より選択される、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１５または１６記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、経済的に妥当な量で可溶性かつ活性な形態の組換えプロテイナーゼＫの製造方法に関する。
【０００２】
プロテイナーゼＫ（Ｅ．Ｃ．  ３．４．２１．６４、エンドペプチダーゼＫとしても公知）は、真菌Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒにより合成される細胞外エンドペプチダーゼである。これは典型的な触媒三連構造Ａｓｐ３９−Ｈｉｓ６９−Ｓｅｒ２２４を有するセリンプロテアーゼのクラスのメンバーである（Ｊａｎｙ，  Ｋ．Ｄ．ら、（１９８６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．１９９（２），  １３９−１４４）。２７９アミノ酸長のポリペプチド鎖の配列（Ｇｕｎｋｅｌ，  Ｆ．Ａ．およびＧａｓｓｅｎ，  Ｈ．Ｇ．  （１９８９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ：１７９  （１），  １８５−１９４）および三次元構造（Ｂｅｔｚｅｌ，  Ｃ．ら、（１９８８）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７８（１），  １５５−７１）が細菌性サブチリシンに高い相同性を有するので、プロテイナーゼＫはサブチリシンファミリーのメンバーとして分類される（Ｐａｈｌｅｒ，  Ａ．ら、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  Ｖｏｌ．  ３（６），  １３１１−１３１４；  Ｊａｎｙ，  Ｋ．Ｄ．およびＭａｙｅｒ，  Ｂ．  （１９８５），  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，  Ｖｏｌ．  ３６６（５），  ４８５−４９２）。プロテイナーゼＫは、天然のケラチンを加水分解する能力に基づき名付けられ、従って炭素および窒素の唯一の供給源としてのケラチン上で真菌が増殖することを可能にする（Ｅｂｅｌｉｎｇ，  Ｗ．ら、（１９７４）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ４７（１），  ９１−９７）。プロテイナーゼＫは、３０Ｕ／ｍｇより高い比活性を有し、従って既知のエンドペプチダーゼの中で最も活性なものの１つであり  （Ｂｅｔｚｅｌ，  Ｃ．ら、（１９８６）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  １９７（１−２），  １０５−１１０）、天然および変性タンパク質を非特異的に加水分解する。
【０００３】
Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒ由来のプロテイナーゼＫは、その天然の宿主中ではプレプロタンパク質として翻訳される。プロテイナーゼＫをコードする遺伝子のｃＤＮＡの配列は、Ｇｕｎｋｅｌ，  Ｆ．Ａ．およびＧａｓｓｅｎ，  Ｈ．Ｇ．  （１９８９）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７９（１），  １８５−１９４により１９８９年に解読された。これによると、プレプロ−プロテイナーゼＫの遺伝子は、２つのエキソンからなり、１５アミノ酸長のシグナル配列、９０アミノ酸長のプロ配列および２７９アミノ酸長の成熟プロテイナーゼＫをコードする。６３ｂｐ  イントロンは、プロ配列の領域内に位置する。プレペプチドは、小胞体（ＥＲ）へのトランスロケーションの際に切り離される。現在、プロペプチドの切断により成熟プロテイナーゼＫを形成するための引き続くプロセシングについてはほとんど知られていない。
【０００４】
従って、成熟プロテイナーゼＫは２７９アミノ酸からなる。緻密な構造は、２つのジスルフィド架橋および２つの結合カルシウムイオンにより安定化される。これは、他のサブチリシンと比べてプロテイナーゼＫが、極度のｐＨ値、高温、カオトロピック物質および界面活性剤に対して相当に高い安定性を有する理由を説明する（Ｄｏｌａｓｈｋａ，  Ｐ．ら、（１９９２）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．  ４０（５），  ４６５−４７１）。プロテイナーゼＫは、高い熱安定性（６５℃まで、Ｂａｊｏｒａｔｈら、（１９８８），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７６，  ４４１−４４７）および広範なｐＨ範囲（ｐＨ  ７．５〜１２．０，  Ｅｂｅｌｉｎｇ，  Ｗ．ら、（１９７４）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ４７（１），  ９１−９７）により特徴づけられる。その活性は、尿素またはＳＤＳ等の変性物質の存在下で増大する（Ｈｉｌｚ，  Ｈ．ら、（１９７５）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ５６（１），  １０３−１０８；  Ｊａｎｙ，  Ｋ．Ｄ．およびＭａｙｅｒ，  Ｂ．  （１９８５）  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，  Ｖｏｌ．  ３６６（５），  ４８５−４９２）。
【０００５】
上記特性により、プロテイナーゼＫは非特異的タンパク質分解が必要されるバイオテクノロジー応用に特に重要となる。特定の例は、粗抽出物からの核酸単離（ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびＤＮＡ解析におけるサンプル調製である（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｄ．ら、（１９９５）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  Ｖｏｌ．  ４（６），  ３６８−３７０；  ＵＳ  ５，１８７，０８３；  ＵＳ  ５，３４６，９９９）。他の応用は、構造解明等のタンパク質解析の分野にある。
【０００６】
プロテイナーゼＫは、真菌Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒ（例えば、ＣＢＳ  ３４８．５５，  Ｍｅｒｃｋ  ２４２９号株またはＡＴＣＣ  ２２５６３株）の発酵により大量に商業的に得られる。しかし、このプロセスにおいて、プロテイナーゼＫの産生は、グルコースまたは遊離アミノ酸により抑制される。タンパク質−含有培地はまた、プロテアーゼの発現を誘導するので、唯一の窒素源としてＢＳＡ、粉ミルクまたはダイズ穀粉等のタンパク質を使用することが必要である。プロテアーゼの分泌は、増殖の定常期が達成されるとすぐに始まる（Ｅｂｅｌｉｎｇ，  Ｗ．ら、（１９７４）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ４７（１），  ９１−９７）。
【０００７】
Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒは、結果的に大規模の発酵に適さず、さらに遺伝的に操作することも困難であるため、他の宿主細胞において組換えプロテイナーゼＫを過剰発現させるために種々の試みがなされた。しかし、発現の欠如、不活性な封入体の形成または再天然化（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）に関する問題のためにこれらの実験において有意な活性は検出されなかった（Ｇｕｎｋｅｌ，  Ｆ．Ａ．およびＧａｓｓｅｎ，  Ｈ．Ｇ．  （１９８９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．１７９（１），  １８５−１９４；  Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９９６）  Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．３７９，  ９５−１０４）。
【０００８】
Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒは、培地に小量のプロテアーゼのみを分泌する緩徐に増殖する真菌である。これは、酵母と比べてより緩徐な細胞周期および発酵槽内で達成される光学密度がより低いという不利な点を有する。さらに、Ｔ．ａｌｂｕｍはまた、プロテイナーゼＫとは別に調製物を汚染しうる他のプロテーゼを産生することが知られている（Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９９１）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３，  ６６−７０）。
【０００９】
原理的には、大腸菌でプロテイナーゼＫを発現させることはできるが、これは、可溶性形態ではなく、そこから酵素が続いて所定の手段によって可溶化され、再天然化（ｒｅｎａｔｕｒｅ）されなければならない、いわゆる封入体で発現される。この方法の不利な点は、多量のタンパク質が可溶化および再天然化の間に失われることである。
【００１０】
従って、本発明の目的は、経済的に妥当な量の組換えプロテイナーゼＫの製造方法を提供することである。
【００１１】
驚くべきことに、組換えプロテイナーゼＫを、酵母において、自己触媒的に活性化されて活性プロテイナーゼＫを形成する可溶性形態の酵素原前駆体として発現させ、分泌させることができることが判明した。本発明の別の主題は、培地上清から活性プロテイナーゼＫの精製である。
【００１２】
従って、本発明は、
ａ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体のコード配列の上流で、シグナルペプチドをコードする配列とリーディングフレームで融合されているプロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードし、かつ宿主細胞に対して適切なプロモーターの制御下にあるＤＮＡを含むベクターでの宿主細胞の形質転換、
ｂ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体の発現、
ｃ）プロテイナーゼＫの分泌および自己触媒的活性化
ｄ）プロテイナーゼＫの単離および精製、
の工程を含み、宿主細胞が酵母細胞であり、タンパク質がこの発現宿主により可溶性形態で分泌されることを特徴とする組換えプロテイナーゼの製造方法に関する。
【００１３】
本発明の方法の特別な態様では、宿主細胞は、以下の群：Ｐｉｃｈｉａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等のＨａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ等のＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から選ばれる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが宿主細胞として使用されることが本発明において特に好ましい。
【００１４】
さらに、宿主細胞が酵素原前駆体をコードするＤＮＡで形質転換され、プロテイナーゼＫが培養培地への分泌のより後の時点、または直後に自己触媒的に活性化される場合本発明の方法に有利であることが判明した。
【００１５】
宿主細胞としてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用する場合、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする遺伝子は、好ましくは、以下のベクター：ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＧＡＰＺαＡおよびｐＰＩＣ９Ｋにクローンされる。この場合、ベクター：ｐＰＩＣＺαＡおよびｐＰＩＣ９Ｋが特に好ましい。本発明により、ベクターｐＰＩＣＺαＡが特に好ましい。上記ベクターは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【００１６】
さらに、本発明の組換えプロテイナーゼＫの製造方法では、プロテイナーゼＫまたはプロテイナーゼＫの酵素原前駆体の発現はメタノールにより誘導されることが好ましい（ｐＰＩＣベクター）。別の方法は、グリセルアルデヒドホスフェート（ｐＧＡＰベクター）により発現を誘導することである。
【００１７】
本発明の組換えプロテイナーゼＫの製造方法では、タンパク質の分泌は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子のシグナルペプチドのＮ−末端融合により開始される。これは、例えば、上記α標識ベクターがＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子のシグナルペプチドのヌクレオチド配列を有することを意味する。次いで、Ｎ−末端のシグナルペプチドおよび標的タンパク質からなる融合タンパク質は、翻訳の間に製造される。別の考えられうるシグナルペプチドは、プロテイナーゼの天然のシグナル配列である。
【００１８】
さらに、宿主細胞Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを、酵素原前駆体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＰＩＣＺαＡおよびｐＰＩＣ９Ｋで形質転換すること、および前記遺伝子が、ＡＯＸ１プロモーター、任意にＡＯＸ１ターミネーターの制御下にあることが組換えプロテイナーゼＫの製造に特に有利であることが判明した。
【００１９】
本発明はまた、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体のコード配列の上流で、適切なシグナルペプチドをコードする配列とリーディングフレームで融合されているプロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードするＤＮＡを含有するベクターに関し、ここで、コード遺伝子は宿主細胞に対して適切なプロモーターおよび任意に宿主細胞用のターミネーターの制御下にあり、このベクターはこの宿主細胞の形質転換に適切である。本発明によれば、宿主細胞は酵母である。
【００２０】
従って、本発明はまた、上記に規定される組換えＤＮＡの１つまたはそれより多くのコピーを含有する組換えベクターに関する。ベクターは、好ましくは、タンパク質分泌のために宿主細胞用の強いプロモーターおよび宿主細胞に適したシグナルペプチドを有するプラスミドである。さらに、配列番号：２１に示されるプロペプチド（シグナル配列１〜１５（１５アミノ酸）；プロ配列１６〜１０４（９０アミノ酸）；成熟プロテイナーゼＫの配列１０６〜３８４（２７９アミノ酸））のＮ−末端にプレプロ−プロテイナーゼＫの天然のシグナルペプチドを融合することもできる。当業者が精通している発現ベクターの製造のための方法が使用され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。
【００２１】
本発明の別の主題は、上記に列挙されるベクターの１つで形質転換された宿主細胞であり、ここで宿主細胞は酵母である。宿主細胞は、好ましくは、以下の群：Ｐｉｃｈｉａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等のＨａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ等のＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種から選ばれる。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、宿主細胞として特に好ましい。特に、いくつかのベクター（各々１コピーのｐｐＫ遺伝子を有する）がゲノムに取り込まれる場合が好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は、プロテイナーゼＫを精製する方法に関する。プロテアーゼを精製するために、酵母細胞は精密濾過または遠心分離による最初の工程で除去される。得られた透明の溶液はプロテアーゼを含む。これに続いて、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等の陽イオン交換体に産物を結合させるために限外濾過により再緩衝化される。溶出後、限外濾過により再緩衝化され、ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＤＥＡＥ−Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ（Ｍｅｒｃｋ）等の陰イオン交換体に結合される。別の溶出の後、精製プロテアーゼは、限外濾過により安定な緩衝液系に移される（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  １９８２）。しかし、当業者は、先行技術の一部である他の精製方法を使用することができる。
【００２３】
本発明の方法は、驚くべきことに、酵素が、可溶性かつ活性な形態で異種宿主細胞により製造される組換えプロテイナーゼＫの調製を可能にする。プロテイナーゼＫの発現および培養培地への酵素の引き続く分泌は、特に有利である。なぜなら、これは、プロテイナーゼＫが宿主細胞のサイトゾルに強い毒性効果を発生することを妨げるからである。さらに、これは、サイトゾルの還元環境においては容易には生じ得ない２つのジスルフィド架橋の正確な形成を確実にするからである。従って、本発明の方法の重要な利点は、組換えプロテイナーゼＫの可溶性かつ活性な製造のためのアプローチを提供することである。本発明の宿主細胞の表面タンパク質が分泌されたプロテイナーゼＫによって加水分解されないことは非常に驚くべきことであり、説明がつかないことである。かかるプロテイナーゼＫによる表面タンパク質の予想される加水分解は、宿主細胞のライフサイクルに干渉しない。
【００２４】
均一であり、従って分析および診断適用に特に適切であるプロテイナーゼＫは、本発明の方法により得られる。本発明のプロテイナーゼＫの酵素原前駆体は、任意に、さらなるＮ−末端修飾および特に標的タンパク質の精製を容易にする配列（アフィニティータグ）を含みうる。さらに、酵素原前駆体は、翻訳の効率を増大させ、折りたたみ効率を増大させる配列、および／またはさらに、培養培地への標的タンパク質の分泌を生じる配列（天然のプレ配列および他のシグナルペプチド）を含みうる。
【００２５】
本発明の意味においてプロテイナーゼＫは、配列番号：１に示されるＧａｓｓｅｎら、（１９８９）  による配列ならびにＣｈ．  Ｂｅｔｚｅｌら、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０  （２００１），  ３０８０−３０８８）により開示されたアミノ酸配列のようなＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒに由来するプロテイナーゼＫの他のバリアント、特にプロテイナーゼＴ（Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９８９）  Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．  ８５（２），  ３２９−３３３；  Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９９６）  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ３７９，  ９５−１０４）  およびプロテイナーゼＲ（Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９９０）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ４（１０），  １７８９−１７９２；  ＵＳ５，２７８，０６２）、さらに組換え手段（例えば、ＷＯ  ９６／２８５５６に記載された）によって作製されたバリアントを意味する。配列番号：１は、プロ配列（１〜９０；９０アミノ酸）および成熟プロテイナーゼＫの配列（９１−３６８；２７９アミノ酸）を含む。Ｂｅｔｚｅｌらにより記載されたプロテイナーゼＫアミノ酸配列（Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ  ４０  （２００１），  ３０８０−３０８８）は、特に活性プロテアーゼの２０７位のセリン残基の代わりにアスパラギン酸を有する。
【００２６】
本発明の意味においてプロ−プロテイナーゼＫは、特にＮ末端が配列番号：１のそのプロ配列に連結されたプロテイナーゼＫを意味する。プロテイナーゼＫに緊密に関連するサブチリシンＥおよびそのバリアントの場合、プロ配列が活性プロテアーゼの折りたたみおよび形成において重要な影響を有する（Ｉｋｅｍｕｒａ，  Ｈ．ら、（１９８７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６２  （１６），  ７８５９−７８６４）。特に、プロ配列が分子内シャペロンとして作用することが推定される（Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｍ．  （１９９１）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｖｏｌ．  ４５，  ３１４−３２１）。折りたたみの後、プロペプチドを自己触媒的に切断することにより成熟サブチリシンプロテアーゼを形成するようにプロセスされる（Ｉｋｅｍｕｒａ，  Ｈ．およびＩｎｏｕｙｅ，  Ｍ．  （１９８８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２６３（２６），  １２９５９−１２９６３）。このプロセスは、サブチリシンＥ  （Ｓａｍａｌ，  Ｂ．Ｂ．ら、（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．  ８５（２），  ３２９−３３３；  Ｖｏｌｋｏｖ，  Ａ．およびＪｏｒｄａｎ，  Ｆ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ２６２，  ５９５−５９９）、サブチリシンＢＰＮ´  （Ｅｄｅｒ，  Ｊ．ら、（１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．  ３２，  １８−２６）、パパイン  （Ｖｅｒｎｅｔ，  Ｔ．ら、（１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２６６（３２），  ２１４５１−２１４５７）  およびサーモリジン  （Ｍａｒｉｅ−Ｃｌａｉｒｅ，  Ｃ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２７３（１０），  ５６９７−５７０１）  の場合に起こる。
【００２７】
通常は疎水性であるプロ配列の所定のコア領域のみが、シャペロン機能に必要であるようである。なぜなら、広範な領域の変異が活性に影響を有さないからである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｔ．  およびＩｎｏｕｙｅ，  Ｍ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ２２６，  ９３１−９３３）。さらに、プロペプチドが種々のサブチリシンバリアント間で交換されうることが知られている。従って、例えば、サブチリシンＢＰＮ´はまた、サブチリシンＥのプロ配列を認識する（Ｈｕ，Ｚ．ら、（１９９６）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２７１  （７），  ３３７５−３３８４）。
【００２８】
従って、本発明は、９０個のアミノ酸長の配列番号：１のプロ配列、ならびに折りたたみを容易にする他のバリアントに関する。また、成熟プロテアーゼＫの折りたたみのために外来的に付加され、かつ上述の機能を有するプロペプチドに関する。
【００２９】
従って、本発の方法の重要な利点は、組換えプロテイナーゼＫが、可溶性かつ活性形態で発現宿主により培養培地に分泌されることである。さらに、本発明の方法に使用される発現宿主は、非常に活性で非特異的なプロテアーゼによって損傷も障害もされず、すなわち、詳細には問題をともなうことなく増殖し続け、細胞溶解の増大は観察されない。さらに、本発明の発現宿主は、Ｔｒａｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍと比べて扱いが容易であり、より高い増殖速度により特徴づけられる。
【実施例１】
【００３０】
遺伝子合成
シグナル配列をもたず、かつイントロンをもたないＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌｉｍｂｅｒ  由来の成熟プロテイナーゼＫの遺伝子を遺伝子合成により作製した。３６８アミノ酸長のＧｕｎｋｅｌおよびＧａｓｓｅｎ，  １９８９の配列（天然のシグナルペプチドを含まない）を鋳型として使用した。大腸菌および酵母における発現のためのコドン最適化核酸配列を、アミノ酸配列を再翻訳することにより得た。このアミノ酸配列を配列番号：１に示し、ヌクレオチド配列を配列番号：２に示す。
【００３１】
遺伝子合成のため、遺伝子を、代替配列内においてセンスおよびリバースの相補的対鎖オリゴヌクレオチドの１８個のフラグメントに分割した（配列番号：３〜２０）。少なくとも１５ｂｐの領域を、各場合において隣接するオリゴヌクレオチドと重複する５’末端および３’末端に付着させた。引き続く発現ベクター内へのクローニングのために制限エンドヌクレアーゼの認識部位をコード領域の外側の合成遺伝子の５’末端および３’末端に付着させた。ＥｃｏＲＩ切断部位を含有する配列番号：３に示すオリゴヌクレオチドを、プロプロテイナーゼＫ遺伝子をクローニングするための５’プライマーとして使用した。配列番号：２０は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を含有する３’プライマーを示す。３’プライマーは、翻訳の終結を確実にするための天然停止コドンの後ろにさらなる停止コドンを含む。
【００３２】
このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応により互いに連結し、得られた遺伝子を増幅した。このために、遺伝子をまず、それぞれ６個のオリゴヌクレオチドの３個のフラグメントに分割し、この３個のフラグメントを第２のＰＣＲサイクルにて互いに連結した。
【００３３】
フラグメント１は配列番号：３〜８に示すオリゴヌクレオチドから構成され、フラグメント２は配列番号：９〜１４に示すオリゴヌクレオチドから構成され、フラグメント３は配列番号：１５〜２０に示すオリゴヌクレオチドから構成される。
【００３４】
以下のＰＣＲパラメータを適用した。
ＰＣＲ反応１（３個のフラグメントの作製）
2004517643.tif 000002
【００３５】
ＰＣＲ反応２（遺伝子全体を形成するためのフラグメントの連結）
2004517643.tif 000003
【００３６】
ターミナルプライマーの添加
2004517643.tif 000004
【実施例２】
【００３７】
遺伝子合成による合成プロテイナーゼＫフラグメントのクローニング
ＰＣＲ混合物をアガロースゲルに負荷し、約１１３０ｂｐのＰＣＲフラグメントをアガロースゲル（Ｂｉｏ  １０１，  Ｉｎｃ．  ＣＡ  ＵＳＡ  製のＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ）から単離した。フラグメントを１時間３７℃で、ＥｃｏＲＩ  および  ＨｉｎｄＩＩＩ  制限エンドヌクレアーゼ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて切断した。同時に、ｐＵＣ１８  プラスミド（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を１時間３７℃で、ＥｃｏＲＩ  およびＨｉｎｄＩＩＩ  制限エンドヌクレアーゼで切断し、混合物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２６３５ｂｐベクターフラグメントを単離した。続いて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用い、ＰＣＲフラグメントおよびベクターフラグメントを互いにライゲートした。このために、１μｌ（２０ｎｇ）のベクターフラグメントおよび３μｌ（１００ｎｇ）のＰＣＲフラグメント、１μｌ  １０×リガーゼバッファー（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９、Ｂ．２７）、１μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、４μｌ滅菌再蒸留Ｈ２Ｏをピペッティングし、注意深く混合し、１６℃で一晩インキュベートした。
【００３８】
クローニングした遺伝子を、両鎖の制限解析および多重配列決定により検査した。
【実施例３】
【００３９】
ベクター構築
始めに、合成遺伝子をｐＵＣプラスミドから再び単離しなければならない。この目的のため、始めに、１μｇのプラスミドＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）と共にインキュベートし、続いて、制限エンドヌクレアーゼを２０分間６５℃に加熱することで不活化した。その後、得られたＤＮＡオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を、製造業者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）に従ってＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填し、次いで、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを１０分間７５℃にて不活化した。最後に、上記ｐＵＣプラスミドのベクターフラグメント（ここでは線形である）を、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切断し、この反応混合物を１％アガロースゲルに適用し、フラグメントを電流（１００Ｖ／１５０ｍＡ）を印可することによりサイズに従って分離した。プロ−プロテイナーゼＫの遺伝子（ｐｐｋ遺伝子）を含む約１１２０ｂｐのフラグメントをアガロースゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｑｉａｇｅｎ）から単離した。
【００４０】
ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切断し、制限エンドヌクレアーゼを２０分間６５℃にインキュベーション混合物を加熱することで不活化した。その後、得られたＤＮＡオーバーハングを、製造業者の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）に従ってＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填し、次いで、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを１０分間７５℃にて不活化した。最後に、ｐＰＩＣＺαＡのベクターフラグメント（ここでは線形である）を、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切断し、この反応混合物を１％アガロースゲルに適用し、フラグメントを電流（１００Ｖ／１５０ｍＡ）を印加することによりサイズに従って分離した。約３５５０ｂｐのベクターフラグメントをアガロースゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｑｉａｇｅｎ）から単離した。
【００４１】
この様式で得られたフラグメントを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９）によって互いにライゲートした。このベクターにおいて、ｐｐｋ遺伝子は、ＡＯＸ−１プロモーター（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のアルコールオキシダーゼ１のプロモーター、メタノールで誘導可能）の制御下にあり、このクローニングストラテジーを用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子のシグナルペプチドの後ろに正しいリーディングフレームでクローニングした。次いで、この様式で挿入した遺伝子フラグメントを、制限解析および配列決定によりエラーのない配列に対して試験した。プロ−プロテイナーゼＫをコードするｐｐｋ遺伝子を含む得られた発現ベクターを、ｐＰＩＣＰＫ−１と命名した（図１参照）。
【００４２】
続いて、ｐｐｋ遺伝子をまた、ｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。この目的のため、ベクターｐＰＩＣＰＫ−１を、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切断し、制限混合物由来のフラグメントを、１％アガロースゲル内でサイズに従って分離し、ＡＯＸ−１プロモーター領域の３´部分、α因子のシグナルペプチドの配列およびｐｐｋ遺伝子を含む約１９６０ｂｐのフラグメントをゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｑｉａｇｅｎ）から単離した。同時に、ベクターｐＰＩＣ９Ｋを、製造業者の使用説明書に従って制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で切断し、制限混合物由来のフラグメントを、１％アガロースゲル内でサイズに従って分離し、約８４５０ｂｐのフラグメントをゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／Ｑｉａｇｅｎ）から単離した。
【００４３】
続いて、この様式で得られたフラグメントを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９）によって互いにライゲートした。このベクターにおいて、ｐｐｋ遺伝子はまた、ＡＯＸ−１プロモーター（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のアルコールオキシダーゼ１に対するプロモーター、メタノールで誘導可能）の制御下にある。ベクターｐＰＩＣ９Ｋは、ベクターｐＰＩＣＺαＡとは選択マーカーおよびＡＯＸ１座へのｐＰＩＣＺαＡの組み込みが固定されるのに対し、当業者には公知である形質転換前のベクター線形化に依存してＰｉｃｈｉａゲノムへのベクターの組み込みについて可能性が３つあることにより異なっている。次いで、挿入した遺伝子フラグメントを、制限解析および配列決定によりエラーのない配列に対して試験した。
【００４４】
プロ−プロテイナーゼＫをコードするｐｐｋ遺伝子を含む得られた発現ベクターを、ｐＰＩＣＰＫ−２と命名した（図２参照）。
【実施例４】
【００４５】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｐＰＩＣＰＫ−１の形質転換
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｘ−３３にｐＰＩＣＰＫ−１を引き続くゲノムへの組み込みで形質転換するために、始めに、ベクターをＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で線形化した。形質転換をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用するエレクトロポレーションによって実施した。
【００４６】
この目的のため、５ｍｌのＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型株のコロニーを接種し、振盪しながら３０℃にて一晩インキュベートした。一晩培養物を、続いて２００ｍｌの新鮮なＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）に１：２０００で再接種し、ＯＤ６００が１．３〜１．５に到達するまで振盪しながら３０℃にて一晩インキュベートした。細胞を遠心分離（１５００×ｇ／５分）し、ペレットを２００ｍｌ氷冷滅菌水（０℃）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離（１５００×ｇ／５分）し、１００ｍｌ氷冷滅菌水（０℃）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、１０ｍｌ氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、０．５ｍｌ氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。この様式で得られた細胞を氷上で保存し、形質転換のために速やかに使用した。
【００４７】
約１μｌの線形化ｐＰＩＣＰＫ−１ベクターＤＮＡを８０μｌの細胞に添加し、全混合物を氷冷（０℃）エレクトロポレーションキュベットに移し、さらに５分間氷上でインキュベートした。続いて、キュベットをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、形質転換を１ｋＶ、１ｋΩおよび２５μＦで実施した。エレクトロポレーション後、１ｍｌの１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）を混合物に添加し、続いて、１００〜１５０μｌを１００μｌ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＹＰＤＳ寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）にプレーティングした。続いて、プレートを３０℃にて２〜４日間インキュベートした。
【００４８】
最小デキストロースグリッドプレート（ｍｉｎｉｍａｌ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｇｒｉｄ  ｐｌａｔｅ）にコロニーを接種し、このコロニーをさらに分析した。
【００４９】
成長したコロニーを選び取り、２０μｌ滅菌水に再懸濁し、１７．５Ｕのリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で溶菌し（１時間、３７℃）、ｐｐｋ発現カセットの正確な統合についてＰＣＲにより直接試験した。
【００５０】
次いで、形質転換の間にゲノムへ完全な発現カセットを統合したクローンを、発現実験に使用した。
【実施例５】
【００５１】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｐＰＩＣＰＫ−２の形質転換
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５におけるｐＰＩＣＰＫ−２をゲノムへの引き続く組み込みで形質転換するために、始めに、ベクターをバリアントＩに対してＰｍｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で線形化して、ＡＯＸ−１遺伝子座にそれを組み込み、バリアントＩＩに対してＳａｌＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で線形化して、Ｈｉｓ４遺伝子座にそれを組み込んだ。形質転換をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用するエレクトロポレーションによって実施した。
【００５２】
この目的のため、５ｍｌのＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５野生型株のコロニーを接種し、振盪しながら３０℃にて一晩インキュベートした。一晩培養物を、続いて２００ｍｌの新鮮なＹＰＤ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）に１：２０００で再接種し、ＯＤ６００が１．３〜１．５に到達するまで振盪しながら３０℃にて一晩インキュベートした。細胞を遠心分離（１５００×ｇ／５分）し、ペレットを２００ｍｌ氷冷滅菌水（０℃）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離（１５００×ｇ／５分）し、１００ｍｌ氷冷滅菌水（０℃）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、１０ｍｌ氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、０．５ｍｌ氷冷（０℃）１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）に再懸濁した。この様式で得られた細胞を氷上で保存し、形質転換のために速やかに使用した。
【００５３】
約１μｌの線形化ｐＰＩＣＰＫ−２ベクターＤＮＡを８０μｌの細胞に添加し、全混合物を氷冷（０℃）エレクトロポレーションキュベットに移動し、さらに５分間氷上でインキュベートした。続いて、キュベットをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）に移動し、形質転換を１ｋＶ、１ｋΩおよび２５μＦで実施した。エレクトロポレーション後、１ｍｌの１Ｍソルビトール（ＩＣＮ）を混合物に添加し、続いて、ヒスチジンを含まないＭＭＳ寒天プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う最小培地）に１００〜１５０μｌをプレーティングした。続いて、プレートを３０℃にて２〜４日間インキュベートした。変異（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）によりＨｉｓ４遺伝子を欠損するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５のクローンは、機能的Ｈｉｓ４遺伝子を挿入により有するベクターｐＰＩＣＰＫ−２を組み込んだ場合、これらのプレート上でのみ成長し得、従ってヒスチジン生合成における欠損を補い得る。
【００５４】
最小デキストロースグリッドプレートにコロニーを接種し、このコロニーをさらに分析した。成長したコロニーを選び取り、２０μｌ滅菌水に再懸濁し、１７．５Ｕのリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）で溶菌し（１時間、３７℃）、ｐｐｋ発現カセットの正確な組み込みについてＰＣＲにより直接試験した。
【００５５】
次いで、形質転換の間にゲノムへ完全な発現カセットを統合したクローンを、発現実験に使用した。
【実施例６】
【００５６】
プロテイナーゼＫの発現
１０ｍｌのＢＭＧＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）に陽性コロニーを接種し、振盪しながら３０℃にて一晩インキュベートした。続いて、６００ｎｍでの光学密度を測定し、１０ｍｌのＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）にＯＤ６００＝１になるように接種した。ＢＭＭＹ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログに従う）は、ＡＯＸ１プロモーターを介してプロテイナーゼＫの発現を誘導するメタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｖ）を含有する。
【００５７】
振盪フラスコを振盪しながら３０℃にてインキュベートし、サンプルを２４時間ごとに採取し、ＯＤ６００を測定し、プロテイナーゼＫの発現について活性試験を実施し、各回０．５％メタノール（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｂ．Ｖ）をさらなる誘導のために再供給（ｒｅｆｅｄ）した。発現実験を１６８時間行った。
【実施例７】
【００５８】
分泌された組換えプロテイナーゼＫの活性試験
組換えプロテイナーゼＫの活性試験のためには、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ  ＩＤ番号１０２３８２）、ＤＭＳＯ（Ｍｅｒｃｋ  ＩＤ番号１０９６７８）、基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＩＤ番号０７１６７６６）およびＴｒｉｓ塩（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＩＤ番号０１５３２６５）が必要である。
【００５９】
溶液の組成は以下のとおりである：
【００６０】
溶液１：５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−塩；１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２  ｐＨ８．２
溶液２：１２５ｍｇ  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ溶解１ｍｌ  ＤＭＳＯ
細胞を遠心分離（５分１０００ｒｐｍ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  卓上遠心機）し、上清を溶液１に１：５００で希釈した。
【００６１】
２ｍｌの溶液１を、キュベットにピペットで移し、０．０２ｍｌの溶液２を添加した。両溶液を混合し、２５℃の反応温度にてインキュベートした。反応を、０．０５ｍｌの上記の希釈上清を添加し再混合することで開始し、４０５ｎｍでの吸光度における変化を測定し、直線領域におけるΔＡ／分を測定した。次いで、以下の式を計算に使用した：
【００６２】
【数１】
2004517643.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、発現プラスミドｐＰＩＣＰＫ−１の図である。開始ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたプロテイナーゼＫの酵素原プロフォームをコードする配列。
【図２】図２は、発現プラスミドｐＰＩＣＰＫ−２の図である。開始ベクターｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされたプロテイナーゼＫの酵素原プロフォームをコードする配列。
【図１】
2004517643.tif 000006
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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