(57)【要約】本発明は、ヒト対象のために個人的なライフスタイルのアドバイスプランを提供するコンピュータ援用方法であって、個人の遺伝子型について、1つ以上の遺伝子座に、ライフスタイルの危険因子と関係があるかもしれない対立遺伝子が存在するか否かを分析し、そして、遺伝子座にある個々の対立遺伝子の存在をライフスタイルの危険因子と関連付ける情報を含む第１のデータセットと存在する対立遺伝子を比較して、特定の対立遺伝子の存在に関係する危険因子を提供し、個人的なライフスタイルのアドバイスプランを作成する、上記方法に関する。このプランは、例えば食品の亜型の最低推奨量及び/又は最高推奨量を含み得る。
2004525448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象に対して個人的なライフスタイルのアドバイスプランを提供するコンピュータ援用方法であって、
（i）データ処理手段に、遺伝子座にある個々の対立遺伝子の存在をライフスタイルの危険因子と関連付ける情報を含む第１のデータセットを提供する工程、ここで、各遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子が疾患罹患性の増大または低減に関連することが分かっているものである、
（ii）データ処理手段に、前記危険因子の各々を少なくとも１つのライフスタイルの推奨にマッチさせる情報を含む第２のデータセットを提供する工程、
（iii）前記ヒト対象の第１のデータセットの遺伝子座のうちの１つ以上にある対立遺伝子を同定する第３のデータセットを入力する工程、
（iv）前記第１のデータセットを用いて前記ヒト対象の前記対立遺伝子に関連する危険因子を決定する工程、
（v）前記第２のデータセットを用いて工程（iv）で同定された各危険因子に基づいて少なくとも１つの適切なライフスタイルの推奨を決定する工程、ならびに
（vi）前記ライフスタイルの推奨に基づいて個人的なライフスタイルのアドバイスプランを作成する工程、
を含む上記方法。
【請求項２】
個人的なライフスタイルのアドバイスプランが食品の種類の最低推奨量及び/又は最高推奨量を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
顧客に報告書を届ける工程を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
プランがインターネットを介して届けられ且つユニークな識別コードを介してアクセス可能である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
プランが１つ以上のウェブページへのハイパーリンクを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第１のデータセットが、
（a）代謝第I段階における生体異物の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子、
（b）代謝第II段階における抱合反応に関与する酵素をコードする遺伝子、
（c）細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子、
（d）微量栄養素の不足に関係する遺伝子、
（e）アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（f）脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（g）凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、
（h）トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、
（i）金属中毒の罹患性に関係する酵素をコードする遺伝子、
（j）正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびに
（k）HLAクラス2分子をコードする遺伝子、
からなる群より選択される遺伝子の１つ以上の遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記第１のデータセットが、
（a）代謝第I段階における生体異物の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子、
（b）代謝第II段階における抱合反応に関与する酵素をコードする遺伝子、
（c）細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子、
（d）微量栄養素の不足に関係する遺伝子、
（e）アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（f）脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（g）凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、
（h）トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、
（i）金属中毒の罹患性に関連する酵素をコードする遺伝子、
（j）正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびに
（k）HLAクラス2分子をコードする遺伝子、
からなる群の各メンバーより選択される遺伝子の１つ以上の遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１のデータセットが、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ1、N-アセチルトランスフェラーゼ2、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼ2からなる群より選択される酵素をコードする遺伝子の１つ以上の遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記第１のデータセットが、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ1、N-アセチルトランスフェラーゼ2、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼ2をコードする遺伝子の各々の１つ以上の遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト対象のDNAサンプルの中のDNAの1つ以上の遺伝子座にある個々の対立遺伝子の存在を決定する工程、及び前記決定の結果を使用して工程（iii）で使用されるデータセットを構築する工程を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記個々の対立遺伝子の前記存在が、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドが、CYP1A1遺伝子、GSTμ遺伝子、GSTΠ遺伝子、GSTθ遺伝子、NAT1遺伝子、NAT2遺伝子、MnSOD遺伝子、MTHFR遺伝子及びALDH2遺伝子からなる群より選択される遺伝子のうちの１つに対して特異的なオリゴヌクレオチドから選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
複数のオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイであって、各オリゴヌクレオチドが、
（a）代謝第I段階における生体異物の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子、
（b）代謝第II段階における抱合反応に関与する酵素をコードする遺伝子、
（c）細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子、
（d）微量栄養素の不足に関連する遺伝子、
（e）アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（f）脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（g）凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、
（h）トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、
（i）金属中毒の罹患性に関連する酵素をコードする遺伝子、
（j）正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびに
（k）HLAクラス2分子をコードする遺伝子、
からなる群より選択される遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に特異的である、上記マイクロアレイ。
【請求項１４】
アレイが、（a）、（b）、（d）及び（e）より選択される遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に特異的なオリゴヌクレオチドを少なくとも含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが配列番号１〜８５及び配列番号２０５からなる群より選択される少なくとも40個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３記載のアレイ。
【請求項１６】
配列番号１〜８５及び配列番号２０５のオリゴヌクレオチドを含むアレイ。
【請求項１７】
複数のオリゴヌクレオチドを含む少なくとも5つのプライマー対で構成されるセットであって、各プライマー対は、
（a）代謝第I段階における生体異物の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子、
（b）代謝第II段階における抱合反応に関与する酵素をコードする遺伝子、
（c）細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子、
（d）微量栄養素の不足に関連する遺伝子、
（e）アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（f）脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（g）凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、
（h）トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、
（i）金属中毒の罹患性に関連する酵素をコードする遺伝子、
（j）正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびに
（k）HLAクラス2分子をコードする遺伝子、
からなる群より選択される遺伝子の中の多型を検出することができる、上記セット。
【請求項１８】
カテゴリー（a）〜（k）のうち少なくとも5つの中の遺伝子を検出することができるプライマー対を含む、請求項１７記載のセット。
【請求項１９】
セットが、配列番号ｎと配列番号（ｎ＋１）とで構成される少なくとも１つのプライマー対を含み、ｎが86〜98又は104〜162の偶数である、請求項１７又は請求項１８記載のセット。
【請求項２０】
個人の危険因子を食事的因子及び環境的因子にプロファイリングする方法であって、個人のDNAのサンプルを請求項１３〜１６記載のいずれか１つに記載のアレイ又は請求項１７〜１９記載のいずれか１つに記載のプライマー対のセットに接触させる工程、前記アレイもしくはプライマー対によって検出することができるその個体の中に存在する危険因子に関係のある遺伝子の対立遺伝子の存否を決定する工程、及び請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法を行う工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疾患の罹患性を評価する方法に関する。特に本発明は、食事及びライフスタイルの危険因子に関係のある疾患の罹患性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、外的要因によって主に影響を受ける疾患である。ヒト癌のうち80％もが、環境因子に曝露されることによって生じる。これらの外的要因への曝露は管理することができるため、癌の大半は予防することが可能であると考えられている（Giovannucci, 1999; Perera, 2000）。
【０００３】
ヒト腫瘍は、一連の突然変異によって正常な細胞の行動を支配する調節機構が失われ、最終的には十分な転移性（又は侵襲性）の可能性を持つ腫瘍が形成されることによって生じる（Smith, 1995）。全ての高等生物は、環境傷害（environmental insult）から（例えば摂取した植物毒素から）その身を守るために複雑な種類の機構を発達させた。最も重要な保護措置のうちの１つは、毒素（又は生体異物）の代謝により解毒を行い、最終的にその毒素を排出するものである（Smith, 1995）。残念なことに、代謝経路は必ずしも毒素を解毒するわけではない。実際に、多くの化学発癌物質は、これらの同じ代謝経路により活性化されて細胞の生体高分子と反応する。
【０００４】
遺伝子分析が進歩し及びヒトゲノム計画から得られたヒトの遺伝子配列情報が入手可能となったおかげで、癌の罹患性の分析に、ゲノムレベルでの個人差という他の一面が加えられた。疾患をもたらし得る遺伝子と環境との相互作用の幾つかをはっきりさせるために、分子疫学が既に始まっている。分子疫学の最終的な目的は、個々人のために危険率の評価モデルを作り出すことであり、当該分野は既にヒト癌危険率における個人差に洞察を提供している（Shields, 2000）。分子疫学は、以下に挙げるヒト癌危険率の3つの大きな決定因子に注目している：遺伝性宿主罹患性因子（inherited host susceptibility factors）、発癌物質曝露の分子線量測定、及び発癌物質曝露の早期効果（early effect）のバイオマーカー。合衆国人口の代謝活性、解毒及びDNA修復の変異性（variability）は85〜500倍と高く、それに対応して癌危険率の変異性も高い（Hattis, 1986）。癌の潜伏期間を考慮すると、初期の段階で個々の危険率をバイオマーカーと関連付けることの重要性は明らかである。これらのバイオマーカーは、特定の環境と遺伝子との相互作用から癌に罹患するおそれのある集団又は個人を同定する手助けとなり得る。
【０００５】
癌の罹患性における個人差に貢献する要因を明らかにすることは、何年ものあいだ研究の主な焦点であった。発癌において環境要因の上記役割があるすると、候補遺伝子の幾つかは、発癌物質を活性化もしくは不活化させる生体異物代謝酵素をコードする遺伝子である。これらの酵素の発現レベルの変化により、発癌物質の活性化が活発になったり鈍くなったりする。癌の罹患性に貢献し得る他の遺伝的要因としては、DNA修復に関与する遺伝子、原癌遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期遺伝子、ならびに栄養、ホルモン状態、及び免疫応答の面で関与する遺伝子が挙げられる。ヒトゲノム計画で明らかになったデータにより、代謝系多型の組合せが高い癌危険率と益々つながりがあることを示す研究が行われた（Perena, 1997）。酵素活性のマーカーとしてDNA付加物の形成を測定した研究により、明らかに似たような環境に曝されている個人間でDNA損傷又はタンパク質付加物のレベルがかなり異なることが分かった（Bryant, 1987, Perena, 1992; Mooney, 1995）。観察されたこの変異性は、曝露の差又は実験環境の違いによっては説明できない、本質的な生物学的要因の組合せを反映している（Dickey, 1997）。事実、発癌物質への曝露が少なくても、その人が遺伝的に、代謝過程において発癌物質の活性化を促進する傾向があれば、それに比例して高い付加物レベルがもたらされる場合がある（Kato, 1995; Vineis, 1997）。
【０００６】
生体異物代謝酵素をコードする遺伝子座に複数の対立遺伝子が存在すると、様々な化学物質の発癌性効果に対する個々人の感受性は異なったものとなり得る。ヒトにおける代謝は、異なる2つの段階で起こる：代謝の第I段階（Phase I metabolism）は、ステロイド、脂肪酸又は（食事や煙などの外部からの）生体異物等の親油性（脂溶性）化合物に酸素原子又は窒素原子を付加するものであり、これによって第II段階の酵素によってこれらがN-アセチル化されたり又はグルタチオンに抱合されたりして（水溶性となり）、身体から排出されることができるようになっている。生体異物代謝酵素には以下のスーパーファミリーがある：シトクロムP450（第I段階）、GST(第II段階)及びNAT（第I段階及び第II段階）。これらは、環境傷害に適応する反応として進化したと考えられている。これらの酵素の活性における変化は、癌の罹患性の変化につながると予想されている（Hirvonen, 1999）。
【０００７】
しかし、生体異物の酵素による活性化は、癌発症の唯一のルートではない。疫学的研究結果は、栄養的要因もまたヒト癌の30％を越える割合で原因的な役割を果たしている可能性があることを示唆している。しかし、癌の発症における特定の食事的要因の正確な役割を定義することは、関係する変数が多いため難しい（Perera, 2000）。特定の食事的要因は、一日あたりに吸う煙草の本数といった単一の定量可能な変数として容易に測定されるわけではない。さらに、方法論、対照集団、発癌物質のタイプ、及び発癌物質への曝露量の違いにより、さらに複雑となる。
【０００８】
食事的要因と癌の罹患性との相互関係に関する研究の優先事項（priority）としては、個々の癌危険率に貢献する遺伝的要因の同定、果物や野菜に含まれる癌を予防する化学物質の同定、高温で肉を調理することにより生成される複素環式芳香族炭化水素及び多環式アミンの発癌物質的役割のより深い理解、ならびに高い癌危険率を伴う高カロリー摂取の役割のより深い理解が挙げられる（Perera, 2000）。
【０００９】
野菜及び果物の高い消費量は、癌危険率の低下と相関関係があり、癌に対する栄養的な効果についてのこの局面の研究により、正常な細胞の表現型の維持に関与する他の酵素及び微量栄養素が同定された（Giovannuci, 1999）。
【００１０】
合衆国人口の4分の1は果物及び野菜の摂取量が少なく、彼等は多くのタイプの癌（肺、喉頭、口腔、食道、胃、結腸直腸、膀胱、脾臓、子宮頚及び子宮癌）について、果物及び野菜の摂取量の最も多い4分の1の人口に比べておおよそ2倍の癌危険率を有する（Ames, 1999）。果物及び野菜は、葉酸塩及び抗酸化物質を多く含む。これらの摂取量が低いと、微量栄養素の不足につながる場合があり、これは、1本鎖及び2本鎖の切断もしくは酸化による障害又はその両方を引き起こすことにより、放射線損傷に似たDNA損傷を引き起こすことが分かった。DNA損傷活性と相関関係を有する微量栄養素としては、葉酸塩（又は葉酸）、鉄、亜鉛、及びビタミンB12、B6、C、Eが挙げられる（Ames, 1999）。
【００１１】
栄養的な効果と相関関係を有する癌のうち、大腸癌（結腸直腸新形成）は食事と最も強いつながりを有する。合衆国において、大腸癌は、4番目に最も一般的に起こりやすい癌であり、米国における癌による死亡の2番目に最も一般的な原因（新しい症例は130,000件、年間あたり50,000人が死亡）である（Potter, 1999）。WHOによると、結腸直腸癌は英国において癌による死亡の2番目に最も一般的な原因である（WHO、1997）。全世界の大腸癌は報告された新しい癌症例のうちの8.5％を占めており、先進諸国では発症率が最も高く、インドでは発症率が最も低い。大腸癌は男性及び女性においてほぼ同じ頻度で発生し、発生は、環境の変化に非常に敏感であると思われる。移民集団の発病率が受入れ国の発病率に近くなるのは非常に速く、しばしば最初の移民の世代でそうなる（Potter, 1999）。
【００１２】
大腸癌の危険因子としては、陽性の家族歴、肉類の消費、喫煙及びアルコール消費が挙げられる（Giovannuci, 1999）。野菜の消費、高い葉酸塩摂取量、非ステロイド系抗炎症薬の使用、ホルモン補充療法及び身体活動（physical activity）に関しては、逆の関係（即ち低い危険率）がある。肉類及びタバコの煙は発癌物質のもととなるが、野菜は葉酸塩及び抗酸化物質のもとであり、第II段階（解毒）酵素誘導能を有する（Taningher, 1999）。
【００１３】
生野菜、青物野菜及びアブラナ科の野菜を豊富に取り入れた食事は、大腸癌の危険率が低い。野菜及び穀物からの食物繊維を多く含む食事は、男性の結腸直腸腺腫危険率の2倍超の低下と関係づけられている。食事中の果物についてのデータは、現在のところ一貫していないが（WCRF、1997）、最近の報告（Eberhart, 2000）では、林檎の皮の中に含まれる、in vitroで腫瘍細胞系の成長を阻害する能力を有する植物化学物質の強力な抗酸化作用を測定した。したがって、将来的にはより明らかなつながりが定義される可能性がある。低い大腸癌危険率は、高い葉酸塩摂取量と関係があるが、特定の微量栄養素製剤又はビタミン補給剤よりも野菜を実際に摂取することが、最も一貫した低い危険率を有する（Potter, 1999）。
【００１４】
栄養と相関関係を有するとされている他の癌としては、前立腺癌及び乳癌が挙げられる。これらの悪性腫瘍は、食事及び栄養に関係する要因の組合せによって大きく影響を受ける。前立腺癌は、牛乳、乳製品、及び肉類の高い消費量と関係がある。これらの製品は、1,25(OH)2ビタミンD（細胞分化誘導媒介因子（cell differentiator）である）のレベルを低下させる。1,25(OH)2ビタミンDのレベルが低いと、細胞が最終分化を経て増殖し続けるのを防ぐことによって前立腺の発癌現象を促進し得る（Giovannucci, 1999）。乳癌、大腸癌及び前立腺癌は、経済的発展が遅れている国々において比較的稀であり、これらの国々では上部消化管の悪性腫瘍が極めて一般的である。上部消化管の癌は、様々な食品の習慣又は冷蔵以外の保存方法と関係があるとされている。例えば、口及び咽頭の癌は、世界中で6番目に最も一般的な癌であり、アルコール消費量、タバコ、塩蔵肉及び魚、燻製食品、焦げた肉、ならびに非常に熱い飲み物の摂取と関係があるとされている。このように、食事は、遺伝毒性化合物の直接の供給源であったり、又は慢性的な刺激もしくは炎症を引き起こし得る（Giovannucci, 1999）。
【００１５】
近年では、上記プロセス及び代謝の他の領域に関与する多くの遺伝子が、対立遺伝子の形で存在することが分かった。従って、ある集団、亜集団（subpopulation）、人種等は、幾つかの遺伝子の対立遺伝子のバリエーション（variation）と関係がある特定の疾患に対して高い又は低い罹患性を有する。何十年もの間、例えば食事、運動、喫煙、日光浴等に関する健康アドバイスは、政府、慈善団体、及び健康諮問組織（health advisory body）により発行されており、このようなアドバイスは、その集団全体を対象とするものか、又はせいぜい高齢者、子供、及び妊婦等のグループを対象とするもののみであった。従ってこのようなアドバイスは極めて一般的なものでしかなく、その性質ゆえに、個人の特定の遺伝子型を考慮することができない。さらに近年では、特定の食品や薬物などと医学的条件（しばしば健康を脅かす）との間のつながりについての研究結果が多くメディアに公表されている。疾患（例えば癌等）の罹患性又は心血管疾患の罹患性に貢献する要因は、集団によって及びその集団の個々人によって異なるので、個人のために、このような報告から彼又は彼女の特定の状況に適した有用なアドバイスを導き出すことはしばしば不可能である。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
個々人が自分自身の健康を守り管理することができるように、個人が、その人が健康な状態でいるために重要な危険因子について個人的に作成された情報及び疾患の危険率を低くするための個々人に合わせて作成されたアドバイスを持つことが必要である。
【００１７】
したがって、本発明は、ヒト対象に対して個人的なライフスタイルのアドバイスプランを提供するコンピュータ援用方法であって、
（i）データ処理手段に、遺伝子座にある個々の対立遺伝子の存在をライフスタイルの危険因子と関連付ける情報を含む第１のデータセットを提供する工程、ここで、各遺伝子座の少なくとも１つの対立遺伝子が疾患罹患性の増大または低減に関連することが分かっているものである、
（ii）データ処理手段に、前記危険因子の各々を少なくとも１つのライフスタイルの推奨にマッチさせる情報を含む第２のデータセットを提供する工程、
（iii）前記ヒト対象の第１のデータセットの遺伝子座のうちの１つ以上にある対立遺伝子を同定する第３のデータセットを入力する工程、
（iv）前記第１のデータセットを用いて前記ヒト対象の前記対立遺伝子に関連する危険因子を決定する工程、
（v）前記第２のデータセットを用いて工程（iv）で同定された各危険因子に基づいて少なくとも１つの適切なライフスタイルの推奨を決定する工程、ならびに
（vi）前記ライフスタイルの推奨に基づいて個人的なライフスタイルのアドバイスプランを作成する工程、
を含む上記方法を提供する。
【００１８】
ライフスタイルの危険因子とは、食事的要因、環境要因（例えば喫煙、環境化学物質又は日光等）への曝露に関係する危険因子を意味する。同様に、ライフスタイルの推奨とは、食事的要因及び環境要因（例えば喫煙、環境化学物質又は日光等）への曝露に関係する推奨に関するものと解釈すべきである。疾患の罹患性とは、アレルギー等の症状の罹患性を含むものと解釈すべきである。
【００１９】
このように、この方法により、個人の独特な遺伝子プロフィール及びそのプロフィールに関係のある疾患の罹患性に基づいて個人別のアドバイスを作成することが可能となる。顧客の遺伝子構成を個人別に評価することによって、特定の危険因子を同定し、食事及び他の健康についてのアドバイスを個人のニーズに合わせて作成することができる。好適な実施形態において、ライフスタイルのアドバイスは、食品タイプの最低推奨量又は最高推奨量を含む（量は0であってもよいことに留意されたい）。
【００２０】
また個人及び/又は個人の家族の性別や健康に関する情報も、特定の症状に関係する特定の多型又は多型のグループを調査すべきであるという指標を提供し得る。従ってこのような情報は、本発明の方法でスクリーニングしようとする多型の選択において使用することができる。
【００２１】
このような因子は、この方法の工程（v）における適切なライフスタイルの推奨の決定において使用することもできる。例えば、前立腺癌の罹患性を低下させることに関する推奨は女性には提示されず、子宮癌の罹患性に関する推奨は男性には提示されない。その顧客の年齢、アルコール消費量、及び現在の食事に関する情報等の他の因子を、工程（v）における適切なライフスタイルの推奨の決定に取り込んでもよい。
【００２２】
個人的な食事のアドバイスを含む報告書は、任意の適切な手段により（例えば手紙、ファックス、又はe-メール等の電子手段等により）顧客に届けることができる。あるいは、報告書は、一般郵便又は電子メールによりその顧客に通知された独特の識別子を用いることによってアクセスがその顧客に限定されているサービスプロバイダの保護されたウェブページ上に投函されてもよい。したがって報告書は、同定された特定の多型、疾患の予防及び/又は食事のアドバイスについての関連情報を提供する、その報告書の提供者のウェブサイトの他のドキュメント又は他のウェブサイトへの1つ以上のハイパーリンクを含むことができる。
【００２３】
このようなサイトは、報告書が顧客に最初に届けられた後に更新され新しいハイパーリンクをその報告書に加えることができるので、これらの情報及びアドバイスはいつでも更新することができるため、顧客はより長い期間、他の報告書を依頼する必要もなく、最新の個人的な健康及び食事のアドバイスにアクセスすることができる。
【００２４】
好ましくは、この方法は、罹患性と、疾患の危険率を最小にすると思われる手段とを広い視野で提供するために、様々な遺伝子座を調査するものである。個々の多型は、個人の癌危険率のバイオマーカーと考えられるが、異なるバイオマーカーも一緒に考慮した場合、大きな癌危険率が明らかとなる場合がある。例えば、CYP1A1活性と癌の罹患性との相関関係は、特定のタイプのCYP1A1多型の存在及びGSTM1多型の存在に応じて異なる。極端に活性のあるCYP1A1遺伝子（代謝第II段階の解毒活性を持たないヌル（null）GSTM1遺伝子型と組み合わさると第I段階のP450活性が高くなる）を有する個体は、癌発症の危険率が非常に高い（Taningher, 1999）。
【００２５】
ある特定の多型の存在は、１つの疾患の罹患性が高いことを示し且つ他の疾患の罹患性が低いことを示す場合がある。例えば、エポキシドヒドロラーゼ（CYP1A1及びCYP1A2により形成された毒性PAH代謝産物が、毒性の低いより高水溶性のtrans-ジヒドロジオール（trans-dihydrodiol）へと変換されるのを触媒する）をコードする遺伝子の1つの対立遺伝子は、アフラトキシンにより誘導される高い肝臓癌危険率と関連があるが、低い子宮癌危険率とも関係があることが最近になって発見された（Pluth, 200; Taningher, 1999）。
【００２６】
従って、最適な健康の維持について有意義なアドバイスを提供するために、他の多型に関係する危険因子を評価することが重要である。
【００２７】
多型を同定する対象となる好適な遺伝子としては、生体異物の解毒に関与する代謝第I段階の酵素をコードする遺伝子、さらなる解毒及び生体異物の排出に関与する代謝第II段階の酵素をコードする遺伝子、酸化的ストレスと闘う酵素をコードする遺伝子、微量栄養素の不足（例えば葉酸塩、B12又はB6の不足）に関連する遺伝子、アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、金属中毒の罹患性に関係する酵素をコードする遺伝子、正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびにHLAクラス2分子をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法は、対象者のDNAサンプルの中のDNAの1つ以上の遺伝子座にある個々の対立遺伝子の存在を測定する工程、及びその決定の結果を使用して工程（iii）で使用されるデータセットを構築する工程を含み得る。
【００２９】
個々の対立遺伝子の存否を決定する技法は当業者に公知である。これらの方法としては、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド（ASO）を用いたハイブリダイゼーション（Wallace, 1981; Ikuta, 1987; Nickerson, 1990, Varlaan-de Vries, 1986, Saiki, 1989及びZhang, 1991）、対立遺伝子特異的PCR（Newton 1989, Gibbs, 1989）、固相微小配列決定（minisequencing）（Syvanen, 1993）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（oligonucleotide ligation assay, OLA）（Wu, 1989, Barany, 1991; Abravaya, 1995）、蛍光5'ヌクレアーゼアッセイ（Holland, 1991 & 1992, Lee, 1998）、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第5,723,591号及び第5,801,155号、または制限酵素断片長多型アッセイ（RFLP）（Donis-Keller, 1987）等の技法が挙げられる。
【００３０】
好適な実施形態において、遺伝子座は、一般にTaqman（登録商標）アッセイと呼ばれる多型を検出するために使用される特殊タイプのPCR（蛍光レポーター分子、蛍光消去剤分子及び副溝結合化学物質を含むプローブが目的の領域にハイブリダイズされたのを、該蛍光分子の消光（quenching）の除去により得られた蛍光を検出することによって検出する）により評価される。詳細を以下に記載する。
【００３１】
他の実施形態において、遺伝子座は、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより評価される。この対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、固相表面に安定に結合させたオリゴヌクレオチドスポットのアレイとして並べられる。
【００３２】
本発明の方法での使用に適したこのアレイは、本発明のさらなる態様をなすものである。
【００３３】
同定すべき対立遺伝子についてサンプルを分析するために、目的の遺伝子を含むDNAの断片を増幅して、テストするのに十分な量の材料を作製してもよい。
【００３４】
本発明者らは、目的の遺伝子領域を増幅するための沢山の特異的プライマーセットを設計した。このようなプライマーは、独立した目的の特定領域を単離するためにペアで用いられる。従って、本発明のさらなる態様において、配列番号８６〜９９、１０４〜１６３より選択される配列を有するプライマーが提供される。他の態様において、配列番号ｎ（ｎは86〜98又は104〜162の偶数である）を有するプライマーと配列番号（ｎ＋１）を有するプライマーとを含むプライマー対が提供される。
【００３５】
ただし好ましくは、プライマーセットは、同じサンプルから沢山の多型を決定することができるように、沢山の領域を多重増幅（multiplex amplification）するために、他のプライマーセットと一緒に用いられる。従って、本発明の更なる態様において、配列番号８６〜１２１から選択される少なくとも5つ、より好ましくは10個、又は15個のプライマー対を含むプライマーセットが提供される。
【００３６】
発明の詳細な説明
データベースのための遺伝子多型の選択
遺伝子多型の正確な選択は、正確且つ有意義なアドバイスを提供するために重要である。このようなクラスの多型に限定されるわけではないが、本発明の好適な実施形態において、以下のクラスの遺伝子のうち１つ以上の多型についてのマーカーが使用される：
本発明の方法の第１のデータセットは、
（a）代謝の第I段階における生体異物の解毒に関与する酵素をコードする遺伝子、
（b）代謝の第II段階における抱合反応に関与する酵素をコードする遺伝子、
（c）細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子、
（d）微量栄養素の不足に関係する遺伝子、
（e）アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（f）脂質及び/又はコレステロールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子、
（g）凝固に関与する酵素をコードする遺伝子、
（h）トリプシン阻害因子をコードする遺伝子、
（i）金属中毒の罹患性に関係する酵素をコードする遺伝子、
（j）正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子、ならびに
（k）HLAクラス2分子をコードする遺伝子、
からなる群より選択される遺伝子の１つ以上の遺伝子座の２つ以上の対立遺伝子に関する情報を含み得る。
【００３７】
データセットは、好ましくは、上記カテゴリー（a）〜（k）からなる群より選択される遺伝子の少なくとも2つの遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む（例えばa+b、a+c、a+d、a+e、a+f、a+g、a+h、a+i、a+j、a+k、b+c、b+d、b+e等、c+d、c+e等、d+e、d+f等、e+f、e+g等、f+g、f+h等、g+h、g+i、g+k、h+i、h+k等）。データセットが少なくとも2つの遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む場合、これらの遺伝子座のうちの少なくとも１つがカテゴリー（d）のものであることが好ましい。これは、適度な細胞の成長及びDNA修復の維持において微量栄養素が中心的な役割を果たすため、及び微量栄養素の代謝もしくは利用障害が幾つかの異なる疾患と関連があるためである（Ames 1999; Perera, 2000; Potter, 2000）。より好ましくは、データセットは、上記カテゴリー（a）〜（k）からなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む。データセットが少なくとも3つの遺伝子座の対立遺伝子に関する情報を含む場合、これらの遺伝子座のうち少なくとも2つがカテゴリー（d）及び（e）のものであることが好ましい。これらのカテゴリーの両方に存在する多型に関する情報は特に有用である。これは、微量栄養素の代謝もしくは利用に関係する酵素の効率に対してアルコールの消費及び代謝が影響を及ぼすためである（Ulrich, 1999）。さらに好適な実施形態において、データセットが少なくとも3つの遺伝子座の対立遺伝子に関する情報を含む場合、これらの遺伝子座のうち少なくとも2つがカテゴリー（a）及び（b）のものであることが好ましい。これは、生体異物の代謝における第I段階の酵素と第II段階の酵素との密接な相互作用によるためである。さらにより好ましくは、データセットは、上記カテゴリー（a）〜（k）を含む群より選択される遺伝子のうち少なくとも4つの遺伝子座（例えばa+b+c+d、a+b+c+e、a+b+d+e、a+c+d+e、b+c+d+e等）の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む。データセットが少なくとも4つの遺伝子座の対立遺伝子に関する情報を含む場合、これらの遺伝子座のうち少なくとも3つがカテゴリー（
d）、（e）及び（f）のものであることが好ましい。これら3つのカテゴリーの中に存在する多型に関する情報は特に有用である。これは、アルコール代謝による悪影響を受けた微量栄養素の利用能の変化と脂質及びコレステロール代謝におけるアンバランスとが組み合わさって影響するので、これらの対立遺伝子の多型と冠状動脈疾患との間に強い相関関係があるためである。さらに、データベースが少なくとも5つの遺伝子座の対立遺伝子に関する情報を含む場合、これらの遺伝子座のうち少なくとも4つがカテゴリー（a）、（b）、（d）及び（e）のものであることが好ましい。これら4つのカテゴリーの中に存在する多型に関する情報は特に有用である。これは、微量栄養素の利用、アルコール代謝、生体異物の代謝の第I段階及び第II段階が組み合わさって、体内で生成される潜在的に有害な代謝産物のさらなる代謝及び排出に影響を及ぼすためである（Taningher, 1999; Ulrich, 1999）。同様に、データセットは、上記カテゴリー（a）〜（k）を含む群より選択される遺伝子の少なくとも5つ（例えばa、b、d、e及びf）、6つ、7つ、8つ、9つ又は10個の遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含み得る。
【００３８】
好ましくは、データセットは、上記カテゴリー（a）〜（k）を含む群の各メンバーより選択される遺伝子の1つ以上の遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む。好適な実施形態において、第１のデータセットは、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ1、N-アセチルトランスフェラーゼ2、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ（manganese superoxide dismutase）、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及びアルコールデヒドロゲナーゼ2酵素の各々をコードする遺伝子の遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む。より好適な実施形態において、第１のデータセットはさらに、エポキシドヒドロラーゼ（EH）、NADPH-キノンレダクターゼ（NQ01）、パラキソノアーゼ（paraxonaoase, PON1）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、アルコールデヒドロゲナーゼ1、アルコールデヒドロゲナーゼ3、コレステロールエステル輸送タンパク質、アポリポタンパク質A IV、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質C III、アンギオテンシン、VII因子、プロトロンビン20210、β-フィブリノーゲン、ヘム-オキシゲナーゼ-1、α-抗トリプシン、SPINK1、Δ-アミノレブリン酸デヒドラターゼ、インターロイキン1、インターロイキン1、ビタミンD受容体、B1キニン受容体、シスタチオニン-β-シンターゼ、メチオニンシンターゼ（B12 MS）、5-HT輸送体、トランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）、L-myc、HLAクラス2分子、T-リンパ球関連抗原4（CTLA-4）、インターロイキン4、インターロイキン3、インターロイキン6、IgA、及び/又はガラクトース代謝遺伝子GALTのうち1つ以上（好ましくは各々）をコードする遺伝子の遺伝子座の2つ以上の対立遺伝子に関する情報を含む。
【００３９】
（a）代謝の第I段階における生体異物の解毒及び（b）代謝の第II段階における抱合反応に関与する遺伝子をコードする遺伝子
生体異物は、例えば焦げた赤身肉の中に見られるような、潜在的に毒性のある化合物である。肉（特に高温で中までよく焼いた肉）の消費は、高い癌危険率と関係がある（Sinha, 1999）。このように肉を調理すると、複素環式アミン（HCA）、ニトロソアミン（NA）及び多環式芳香族炭化水素（PAH）（これらは動物の体内で公知の発癌性作用を有する）が産生される（Hirvonen, 1999; Layton, 1995）。
【００４０】
生体異物の解毒は、ヒト体内において2段階で起こる。
【００４１】
代謝の第I段階は、ステロイド、脂肪酸、（食事や煙などの外部からの）生体異物等の親油性（脂溶性）化合物に酸素原子又は窒素原子を付加するものであり、これにより、第II段階酵素によってこれらが抱合されて（水溶性となり）、身体から排出されることができるようになる（Hirvonen, 1999）。これらの遺伝子の中に癌危険率と相関関係を有する遺伝子多型を有する人は、焦げた食品、燻製の魚、中まで火を通した赤肉（焼いたものまたは揚げたもの）の消費を避けるべきである（Sinha, 1999）。またこのような人は、代謝の第I段階の生成物がより効率よく除去されるように、代謝の第II段階を促進することが知られている食品の消費を増やすべきである。
【００４２】
本発明において多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（a）の遺伝子の具体的な例としては、CYP1A1、CYP1A2、CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP11B2等のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（CYP）をコードする遺伝子、NAT1等のN-アセチルトランスフェラーゼ1をコードする遺伝子、NAT2等のN-アセチルトランスフェラーゼ2をコードする遺伝子、エポキシドヒドロラーゼ（EH）をコードする遺伝子、NADPH-キノンレダクターゼ（NQ01）をコードする遺伝子、パラキソノアーゼ（paraxonaoase, PON1）をコードする遺伝子、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４３】
CYPは、シトクロムP450モノオキシゲナーゼとも呼ばれる（遺伝子はCYPと呼ばれ、酵素はP450と呼ばれる）。P450酵素は、基質中への酸素原子の挿入を触媒する広い基質活性を有するスーパーファミリーに属する。
【００４４】
この反応は、分子（前発癌物質）をDNA反応性求電子性発癌物質へと変換することができる（Hirvonen, 1999; Smith, 1995）。シトクロムP450をコードする遺伝子（CYPファミリーの遺伝子）の中の多型は、癌やCADの罹患性の変化、及び様々な薬剤の代謝の変化に関係がある（Poolsup, 2000; Miki, 1999; Cramer, 2000; Marchand, 1999; Sinha, 1997）。
【００４５】
CYP1A1は、多環式芳香族炭化水素（PAH）を代謝するP450酵素をコードする。CYP1A1遺伝子は多型性であり、PAHにより誘導されることが可能である。これは、PAHに曝露されるとこの酵素の発現が増加することを意味する（MacLeod, 1997）。CYP1A1は、染色体15q22-q24上に位置する（Smith, 1995）。この遺伝子は、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、口腔癌、胃癌及び肺癌との関連性が指摘されていた（Perera, 2000; Garte, 1998）。その遺伝子産物であるP450酵素は、該酵素が代謝する物質（agent）に曝露されることによって誘導され得るため、発癌物質のもととなる可能性のあるもの（中まで火の通った赤肉等）の高レベル消費は、その酵素の産生量を増加させて、発癌物質の生成を促進することになる（Mooney, 1996; Perera, 2000; Alexandrie, A.K. 2000）。CYP1A1遺伝子の多型を研究したところ、酵素活性においてかなりの差があり、この差に応じてその酵素の既知の基質に曝露した後の癌危険率に差があることが判明した（Alexandrie, 2000; Rojas, 2000; Garte, 2000）。A4889G置換（すなわち5'-3'鎖の4889位のアデニン残基がグアニン残基により置換されている）を含むIle-Val多型I及びT6235C置換を含むCYP1A1*C多型はいずれも、PAHに曝露した後は野生型遺伝子と比べて高いレベルで誘導され、癌危険率の大きな増加との関連が示唆されていた（Taningher, 1999; Garte, 1998; Kawajiri, 1996; MacLeod, S., 1997; Smith, 1995）。
【００４６】
最近のAmerican Review紙によると、白人人口のおよそ10％は、癌危険率に関係のある多型性を保有している（Sheilds, 2000）。CYP1A2、CYP2C、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP11B2をコードする遺伝子の多型性は、癌の罹患性及び薬物感受性の変化と関係がある（Poolsup, 2000; Miki, 1999; Cramer, 2000; Marchand, 1999; Sinha, 1997）。
【００４７】
またNAT1（N-アセチルトランスフェラーゼ1）及びNAT2（N-アセチルトランスフェラーゼ2）も、PAH及び複素環式アミン（HAA）を活性化する。これらの酵素は、N-アセチル化、O-アセチル化、及びN,O-アセチル化を触媒する。O-アセチル化反応は、DNAに結合することができる化学発癌物質を形成する可能性があり、最も危険性が高いと考えられている。P450に酸素が挿入されると、化合物上でN-アセチル化反応が生じ得る。これにより、その化合物は水溶性が高くなり、排出される。この活性のおかげで、NAT遺伝子はしばしば第I段階及び第II段階両方のタイプの酵素とみなされる。癌との関連性を記載している文献は、これらの酵素の活性化作用に焦点をあてているので、これらの酵素は第I段階についての節にしか記載されていない。ヒト体内には3つの別個のN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子があり、そのうち2つ（NAT1及びNAT2）は活性遺伝子であり、1つ（NATP）は偽遺伝子である。偽遺伝子は同じ配列を持つが、明確な機能及びプロモーターエレメントを持たず、細胞内で発現されない（すなわち、この遺伝子からRNAに転写され、アミノ酸へと翻訳されてタンパク質/酵素を生成することがない）（Perera, 2000）。NAT1及びNAT2遺伝子は、8番染色体の8p21.3-21.1に位置しており、いずれの遺伝子も870bp長であり、これはいずれも290アミノ酸長のタンパク質をコードする。これらの遺伝子は多型性が高く、疫学的研究からは、癌との関連性に関して相反する情報がしばしば得られた。これらの遺伝子は、地理的及び人種的な違いを示し、その酵素活性は異なる組織もしくは器官の中で大きく異なる。現在までに知られているNAT1の多型はおよそ20種あるが、以下のリストは癌との関連性が判明した多型のみを挙げている（Hein, 2000a）。現在の学名及び多型のリストは以下のウェブサイトに保存されている。
http://www.louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.html.
【００４８】
NAT1及びNAT2両方の疫学的研究の多くは、酵素活性を測定する表現型アッセイを用いたものであり、アセチル化の速い人（rapid acetylator）とアセチル化の遅い人（slow acetylator）とがいることを発見し、アセチル化の速い人は大腸癌の危険率が高いことが分かった（Perera, 2000）。しかし、これらの結果を後に分析したところ、アセチル化の速い/遅いは、アセチル化のために選択された基質に応じて大きく異なり得ることが分かった（Hein, 2000a）。最近の研究は、遺伝子配列データを用いて、より正確にアセチル化活性及び癌危険率を多型にマッチさせた（Hein, 2000b）。これらの遺伝子は、サイズは同じであるが、異なる基質に作用する。例えば、カフェインはNAT2の基質であるがNAT1の基質とはならない。
【００４９】
NAT1は結腸内でNAT2よりも高いレベルで発現されるので、NAT1は結腸内の活性化されたHAAまたはPAHの局在化活性と関係があるものと思われる（Brockton, 2000; Perera, 2000）。T1088A及びC1095A置換を含み且つ速いアセチル代謝表現型を有する多型NAT*10は、高い大腸癌危険率及び結腸組織内における高レベルのDNA付加物（すなわち癌につながりうるDNA損傷）との関連性が一貫して指摘されてきた（Perera, 2000;Ilett, 1987）。NAT1*11多型は、喫煙する女性又は中まで火の通った赤肉を消費する女性における乳癌の危険率との関連性が指摘されている（Zheng, 1999）。しかし、この表現型はよく理解されておらず、したがって、このマーカーは速いもしくは遅いアセチル代謝表現型として分類することはできない（Doll, 1997）。NAT1*11多型の以下の2つの対立遺伝子が公知である：C(-344)T、A(-40)T、G445A、G459A、T640G、C1095A置換及びΔ9:1065-1090欠失を含むNAT1*11A多型；ならびにC(-344)T、A(-40)T、G445A、G459A、T640G置換及びΔ9:1065-1090欠失を含むNAT1*11B多型。NAT1*11多型について言及するときは、NAT1*11A又はNAT1*11B多型も指すものと理解されたい。
【００５０】
一方NAT1*14は、酵素活性を殆ど又は全く持たず（Brockton, 2000）、高い肺癌危険率との関連性が指摘されている（Bouchardy, C., 1998）。NAT1*14多型の以下の2つの対立遺伝子が公知である：G560A、T1088A及びC1095A置換を含むNAT1*14A多型；ならびにG560A置換を含むNAT1*14B多型。NAT1*14多型について言及するとき、文脈において特に断らない限り、NAT1*14A又はNAT1*14B多型についても言及しているものと理解すべきである。NAT1*14多型は、NAT1*11多型と制限酵素部位を共有し、文献中に報告された相反する結果の幾つかは、使用したアッセイ（制限断片長多型アッセイ（RFLP））がこれらの多型を区別することができなかったことによるものと考えられる（Hein, 2000a）。本発明で使用するのに適したオリゴヌクレオチドアッセイは、全ての多型を区別することができるので、RFLP手法に比べてより正確である。
【００５１】
NAT2は主に肝臓内で発現されるが、他の器官における癌の発生率との関連性が指摘されている（Hein, 2000b）。T481C及びT341C置換を含むNAT2*5A、C282T及びG590A置換を含むNAT2*6A、G857A置換を含むNAT2*7Aは、低いアセチル化活性を有し（Hein, 2000b）、膀胱癌の危険率との関連性が指摘されている（Taningher, 1999; Lee, 1998）。NAT2*4は、正常な（即ち野生型の）配列と考えられる。NAT2*4は、速いアセチル化活性を有し、幾つかの研究において、特にNAT1*10多型と組み合わせて（Bell, 1995）、高い癌危険率との関連性が指摘されている（Hein, 2000b; Gil, 1998に概説が記載されている）。少なくとも１つのNAT2*4対立遺伝子を有するNAT2の速い/即時アセチル代謝表現型は、中まで火が通った赤肉を消費した女性における乳癌との関連性が示唆されている（Dietz, 1999）。白人人口のおよそ55％が、癌に関連のあるNAT1多型を保有している（Shields, 2000）。
【００５２】
エポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子の多型性は、癌及び慢性の閉塞性肺疾患と関係がある（Pluth, 200; Miki, 1999）。NADPH-キノンレダクターゼをコードする遺伝子の多型性は、癌の罹患性の変化と関係がある（Nakajima, 2000）。パラキソノアーゼ（paraxonoase）をコードする遺伝子における多型性は、癌及びCADの罹患性の変化と関係がある（MacKness, 2000）。ミエロペルオキシダーゼをコードする遺伝子の多型性は、CADの罹患性の変化と関係がある（Schabath, 2000）。
【００５３】
本発明において多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（b）の遺伝子の具体的な例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（例えばGSTM1、GSTP1、GSTT1）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００５４】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼは、求電子性化合物が体内から排出されるように、該化合物とグルタチオンとの反応を触媒する。これらの酵素は、広範且つ重複する基質特異性を有するスーパーファミリーに属する。グルタチオン-S-トランスフェラーゼは、化学毒素及び発癌物質に対する主要な防御経路を提供し、環境傷害に適応する反応として進化したと考えられているので、それらの広い基質特異性を説明している（Hirvonen, 1999）。以下の4つのファミリーメンバーがある：α、μ、θ及びπ（A、M、T及びPとも表される）。各ファミリーの中で多型が同定されている（Perera, 2000）。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ活性の低い人は、上記のような高温で調理した肉を避け、果物及び野菜の消費量を増やすべきである。ブロッコリ等のアブラナ科の野菜及び葫や玉葱等のアリウム科のメンバーは、これらの酵素の強力な誘導因子であることが分かっており、これらは、体内からの毒性物質の排出を促進することが期待されている（Cotton, 2000; Giovannucci, 1999）。
【００５５】
GSTμは、以下の3つの対立遺伝子を有する：ヌル；野生型であると考えられている（a）；及びC534G置換を含む（b）（対立遺伝子(a)と(b)との間には機能的な差はない）。GSTμ亜型は、上記4つのタイプのうち最も高い活性を有し、肝臓内に主に存在する（Hirvonen, 1999）。人口のうちの約半分は、この遺伝子を完全に欠失しており、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌および口腔癌の危険率はそれに対応している（Shields, 2000；Perera, 2000）。肺癌及び膀胱癌全体のうち17％はGSTM1ヌル遺伝子型に原因を帰すものと推定されている（Hirvonen, 1999）。GSTM1ヌル遺伝子型と活性の高いCYP1A1多型との組合せは、幾つかの研究において、非常に高い癌危険率との関連性が指摘されていた（Rojas, 2000；Shields, 2000）。GSTM1遺伝子は、染色体1p13.3上に位置する（Cotton, 2000）。
【００５６】
GSTπ遺伝子は、染色体11q13上に位置する。この亜型は、沢山の発癌性化合物を代謝することが知られており、肺の中に最も豊富に存在する亜型である（Hirvonen, 1999）。これまでに、2つの単一のヌクレオチド多型（A313G置換を含むGSTP1*B及びC341T置換を含むGSTP1*C）が癌との関連性が指摘されている。これらの多型遺伝子の酵素は野生型に比べて活性が低く、これに対応して膀胱癌、精巣癌、喉頭癌及び肺癌の危険率が高くなっている（Harries, 1997；Matthias, 1998；Ryberg, 1997）。
【００５７】
GSTθ遺伝子は染色体22q11.2上にあり、白人人口の約20％において欠失している。この酵素は、様々な組織（赤血球細胞、肝臓及び肺を含む）の中に見られる（Potter, 1999）。この欠失は、肺癌、喉頭癌及び膀胱癌の高い危険率と関係がある（Hirvonen, 1999）。GSTM1対立遺伝子及びGSTT1対立遺伝子の両方が欠失している人は癌を発症する危険率が非常に高いと考えられているが、GSTM1ヌル遺伝子型との関連性は現在研究中である（Potter, 1999）。
【００５８】
細胞が酸化的ストレスと闘うのを助ける酵素をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（c）の遺伝子の具体的な例としては、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子（MnSOD又はSOD2遺伝子）が挙げられる。
【００５９】
マンガン・スーパーオキシドジスムターゼは、フリーラジカル又はフリーラジカルスカベンジャーを破壊する酵素である。この遺伝子は、染色体6q25.3上に位置するが、この酵素は、細胞のミトコンドリアの中に見られる。現在までに、2つの多型（T175C置換を含むIle58Thr対立遺伝子及びT(-28)C置換を含むVal(-9)Ala対立遺伝子）が癌と関連性があるとされている。閉経前の女性を調べたところ、Val(-9)Ala多型を有する人では乳癌の危険率は4倍高く、このグループにおける一番高い危険率は、果物及び野菜の消費量が少ない女性に見られることが分かった（Ambrosone, 1999）。この多型は、アミノ酸鎖のシグナル配列の中に起こる。このシグナル配列は、この酵素が細胞のミトコンドリアの中に確実に輸送されるようにするので、この多型はミトコンドリアに送達される酵素の量を少なくすると考えられる（Ambrosone, 1999）。ミトコンドリアは一般に、細胞のワークホース（workhorse）（エネルギー生成反応が起こる場所）と呼ばれる。これは、多くの酸化反応が起こる部位であるため、多くのフリーラジカルがここで生成される。この酵素の活性が低い人には、抗酸化性サプリメントを取り、果物及び野菜の消費量を増やすようアドバイスするべきである（Giovannucci, 1999;Perera, 2000）。
【００６０】
葉酸塩、ビタミンB12又はビタミンB6等の微量栄養素欠損症に関係する遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（d）の遺伝子の具体的な例としては、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（MTHFR）活性をコードする遺伝子が挙げられる。
【００６１】
5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼは、DNA前駆体の葉酸塩依存性メチル化において活性である。この酵素の活性が低いと、DNAへのウラシル（チミンの代わり）の導入が増加する（Ames, 1999）。MTHFR遺伝子は多型性であり、大腸癌、成人性急性リンパ性白血病及び乳幼児の白血病との関連性が指摘されている（Ames, 1999; Perera, 2000; Potter, 2000）。その野生型対立遺伝子及び多型対立遺伝子はいずれも、疾患との関連性が指摘されている（それぞれ食事中の葉酸塩のレベルに依存する）。白人人口の約35％はこの遺伝子座に遺伝子多型を有し、それに対応した大腸癌の危険性を有する（Shields, 2000）。この遺伝子座における多型としては、C677T又はA1298C置換を有する多型が挙げられる。MTHFR活性を持たない人に対する食事の推奨としては、葉酸塩を含むサプリメントを摂取し、果物及び野菜の消費量をふやすことが含まれる（Ames, 1999）。低レベルのビタミンB12及びB6は、低いMTHFR活性及び高い癌危険率と関連づけられていたので、そのような人は、これらのビタミンの摂取量をふやすべきである。B12は主に肉に含まれ、B6は全粒粉（whole grains）、穀類、バナナ及びレバーに含まれる（Ames, 1999）。アルコールは葉酸塩の代謝に悪影響を及ぼし、A1298C多型を有する人に対して最も深刻な影響を及ぼす（Ulrich, 1999）。これらの人には、アルコールを避けるようにアドバイスすべきである。
【００６２】
アルコールの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（e）の遺伝子の具体的な例としては、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例えばALDH2遺伝子、ALDH1遺伝子及びALDH3遺伝子）が挙げられる。
【００６３】
アルコールデヒドロゲナーゼ2（ALDH2）は、エタノール利用の第2ステップに関与する。この酵素の活性の低下は、強力なDNA付加物形成因子（potent DNA adduct former）であるアセトアルデヒドの蓄積につながる（Bosron, 1986）。現在までに1つの多型（ALDH2*2多型）が同定されている。ALDH2*2多型は、G1156A置換を含み、食道/咽頭癌、胃癌、肺癌、及び大腸癌と関連性がある（IARC, 1998; Yokoyama, 1998）。この多型を有する人へのアドバイスは、アルコールを避けることである。ALDH1及びALDH 3の多型は、癌及びパーキンソン病の高い罹患性と関係がある。
【００６４】
脂質及び/又はコレステロール代謝に関与する酵素をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（f）の遺伝子の具体的な例としては、以下の遺伝子が挙げられる：コレステロールエステル輸送タンパク質をコードする遺伝子（例えばCETP遺伝子等）であって、その遺伝子の多型性が冠状動脈疾患（CAD）の罹患性の変化と関係があるもの（Raknew, 2000; Ordovas, 2000）；アポリポタンパク質A, IV（ApoA-IV）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が冠状動脈疾患（CAD）の罹患性の変化と関係があるもの（Wallace, 2000; Heilbronn, 2000）；アポリポタンパク質E（ApoE）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が、CAD及びアルツハイマー病の罹患性の変化と関係があるもの（Corbo, 1999; Bullido, 2000）；又はアポリポタンパク質C,III（ApoC-III）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCAD、高血圧症、及びインスリン抵抗性の罹患性の変化と関係があるもの（Salas, 1998）。
【００６５】
凝固機構に関与する酵素をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（g）の遺伝子の具体的な例としては、以下の遺伝子が挙げられる：アンギオテンシン（AGT-1）及びアンギオテンシン変換酵素（ACE）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が高血圧症の罹患性の変化と関係のあるもの（Brand 2000; de Padua Mansur, 2000）；VII因子をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCADの罹患性の変化と関係のあるもの（Donati, 2000; Di Castelnuovo, 2000）；プロトロンビン20210をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が静脈血栓症の罹患性の変化と関係のあるもの（Vicente, 1999）；β-フィブリノーゲンコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCADの罹患性の変化と関係のあるもの（Humphries, 1999）；又はヘム-オキシゲナーゼ-1をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が肺気腫の罹患性の変化と関係のあるもの（Yamada, 2000）。
【００６６】
トリプシン阻害因子をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（h）の遺伝子の具体的な例としては、以下の遺伝子が挙げられる：α-抗トリプシンをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が慢性閉塞性肺疾患（COPD）の罹患性の変化と関係のあるもの（Miki, 1999）；またはセリンプロテアーゼ阻害因子であるKazal 1型（SPINK）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が膵臓炎の罹患性の変化と関係のあるもの（Pfutzer, 2000）。
【００６７】
金属毒への感受性に関係のある酵素をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（i）の遺伝子の具体的な例としては、Δ-アミノアミノレブリン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が鉛毒への感受性の変化と関係のあるものが挙げられる（Costa, 2000）。
【００６８】
正常な細胞の代謝及び成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー（j）の遺伝子の具体的な例としては、以下の遺伝子が挙げられる：ビタミンD受容体をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が骨粗鬆症、結核症、グレーヴズ病、COPD及び早発性歯周疾患の罹患性の変化と関係のあるもの（Ban, 2000;Wilkinson, 2000; Gelder, 2000; Miki, 1999; Hennig, 1999）；B1キニン受容体（B1R）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が腎臓病の罹患性の変化と関係のあるもの（Zychma, 1999）；シスタチオニン-β-シンターゼをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCADの罹患性の変化と関係のあるもの（Tsai, 1999）；メチオニンシンターゼ（B12 MS）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCADの罹患性の変化と関係のあるもの（Tsai, 1999）；5-HT輸送体をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が神経障害、アルツハイマー病、精神分裂症、セロトニン経路の他の障害の罹患性の変化と関係のあるもの（Oliveira, 1999）；腫瘍壊死因子受容体2（TNFR2）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCADの罹患性の変化と関係のあるもの（Fernandez-Real, 2000）；ガラクトース代謝遺伝子GALTをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が子宮癌の罹患性の変化と関係のあるもの（Cramer, 2000）；トランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCAD及び癌の罹患性の変化と関係のあるもの（Yokota, 2000）；ならびにL-mycをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCAD（特に喫煙に対する耐性に関係のあるもの）及び癌の罹患性の変化と関係のあるもの（Togo, 2000）。
【００６９】
免疫学的罹患性と関係のあるタンパク質をコードする遺伝子
本発明で多型に関する情報を使用し得る対象となるカテゴリー(k)の遺伝子の具体的な例としては、以下の遺伝子が挙げられる：HLAクラス2分子をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が子宮頚癌及びヒト乳頭腫ウイルス（HPV）感染症の罹患性の変化と関係のあるもの（Maciag, 2000）；T-リンパ球関連抗原4（CTLA-4）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が肝臓病の罹患性の変化と関係のあるもの（Argawal, 2000）；インターロイキン1（IL-1）をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が心臓血管疾患及び歯周疾患の罹患性の変化と関係のあるもの（Macaiag, 2000；Nakajima, 2000）； IL-4をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がアトピー及び喘息の罹患性の変化と関係のあるもの（Rosa-Rosa, 1999）；IL3をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がアトピー及び喘息の罹患性の変化と関係のあるもの（Rosa-Rosa, 1999）；IL6をコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性が骨粗鬆症の罹患性の変化と関係のあるもの；ならびにIgAをコードする遺伝子であって、その遺伝子の多型性がCOPDの罹患性の変化と関係のあるもの（Miki, 1999）。
【００７０】
多型の検出
上記の通り、本発明の方法は、本発明の方法で用いられるデータセットを構築するためにヒト対象のDNAサンプルを分析する工程を含む。
【００７１】
サンプルのテスト
組織サンプルの収集
本発明の方法又はアレイを用いた分析用のDNAは、任意の適切なクライアント又は患者の細胞サンプルから単離することができる。便宜上、DNAは、頬（頬側）細胞から単離するのが好ましい。これにより、クライアントによって簡単且つ無痛の細胞収集が可能となり、液体サンプルの郵送に伴う問題もなく、遺伝子テストの供給者にサンプルを郵送することができるという便利な点を有する。
【００７２】
細胞は、プラスチック製もしくは紙製のマトリックス「ブラシ」を備えた使い捨ての掻き取りデバイス（例えばC.E.P.Swab（商品名）:Life Technologies Ltd., UK等）を用いて口の内側から単離してもよい。内側の頬をやさしくこすって細胞をマトリックス上に載せると、約2000個の細胞が得られる（Aron, 1994）。次に、ペーパーブラシを完全に乾かし、ハンドルから外して遠心分離管の中に入れ、クライアント又は患者によって遺伝子テストの施術者に郵送することができる。
【００７３】
サンプルからのDNAの単離
従来手法を用いて、細胞サンプルからDNAを単離することができる。例えばDNAをフィルタ、カラムマトリックス、又は磁気ビーズ上に固定することができる。Qiagen QIAampキット（Quiagen, Crawley, UK）等の多くの市販キットを用いることができる。簡単に説明すると、細胞サンプルを遠心分離管の中に入れ、プロテイナーゼKと合わせて混合し、インキュベートさせて細胞を溶解させる。次にエタノールを加え、ライゼートをQIAampスピンカラムに移し、数回洗浄した後にカラムからDNAを溶出させる。
【００７４】
使用した特定の方法により単離されたDNAの量を定量して、十分なDNAがアッセイで利用可能かどうかを確かめ、PCR増幅に望ましいDNAの濃度を得るのに必要な希釈倍率を決定する。例えば、所望の標的DNA濃度は、10ng〜50ngであってもよい。この範囲外のDNA濃度は、個々の対立遺伝子のPCR増幅には逆効果となって、多型決定工程の感度及び選択性に悪影響をもたらす場合がある。
【００７５】
サンプルから得たDNAの量は、任意の好適な技法を用いて決定することができる。このような技法は当業者には周知であり、UV（Maniatis, 1982）もしくは蛍光ベースの方法が挙げられる。UV法は、ヌクレオチド、RNA、EDTA及びフェノール等の汚染分子による吸光度の干渉が問題となり、この技法のダイナミックレンジ及び感度は蛍光法のものほどは良くないので、蛍光法が好ましい。PicoGreen dsDNA Quantification（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）等の蛍光ベースのキットが市販されている。
【００７６】
プライマー
サンプルをテストする前に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を用いて、米国特許第4,683,202号及び第4,683,195号に記載されているように、サンプル中の核酸を選択的に増幅することができる。
【００７７】
本発明で使用される好適なプライマーは、18〜23ヌクレオチド長であり、内部の相同性またはプライマー同士の相同性を持たない。
【００７８】
さらに、目的の領域の増幅及び特異性を確かめるために、約150塩基長が増幅されるように目的の領域のどちらかの側にハイブリダイズさせるためにペアの2つのプライマーが好ましくは選択されるが、これより短いもしくは長い断片の増幅を用いても良い。理想的には、多型の部位は、増幅した領域の中央又はその近くである方がよい。
【００７９】
表１は、特にTaqman（登録商標）アッセイを本発明の方法で用いる場合に本発明で使用することができるプライマー対の好適な例を記載している。これらのプライマーは、その遺伝子標的、ならびに各遺伝子標的に対してTaqman（登録商標）アッセイで用いられる野生型プローブ及び多型性プローブの好適な例と一緒に記載されている。
【００８０】
表２は、本発明で用いることができるプライマー対の好適な例を、その遺伝子標的及びこれらのプライマーを用いて単離された（これらのプライマーが増幅する）断片のサイズと一緒に記載している。
【００８１】
これらのプライマー及びプライマー対は、本発明のさらなる態様をなす。したがって本発明は、配列番号８６〜９９、配列番号１０４〜１６３より選択される配列を有するプライマーを提供する。他の態様において、配列番号ｎ（ｎは８６〜９８又は１０４〜１６２の偶数である）を有するプライマーと配列番号（ｎ＋１）を有するプライマーとを含むプライマー対が提供される。
【００８２】
本発明の好適な実施形態において、例えばDNAアレイ法を用いて複数の多型の存在を測定できるようにするために、多数の配列の多重増幅が想定される。したがって、同じ反応で使用されるプライマー対は、好ましくは、自己ハイブリダイゼーション（self hybridisation）または他のプライマーとのハイブリダイゼーションを防ぐために、位置、融解温度の類似性、内部安定性、及び、内部相同性もしくはプライマー同士の相同性の不在、及び各プライマーが安定なヘアピンループ構造を形成する性質の不在によって選択される。このように、一緒に同時に増幅されるプライマー対のセットは、好ましくは、一緒に同時に効率良く増幅することができるように、ほぼ同じ熱プロフィールを有することができる。これは、ほぼ同じ長さ及び同じG/C含量のプライマー対のグループとすることによって達成し得る。
【００８３】
したがって、本発明のさらなる態様において、配列番号８６〜１２１から選択される少なくとも5つ、より好ましくは10個、又は15個のプライマー対を含むプライマーセットが提供される。
【００８４】
表１
2004525448.tif 000003
2004525448.tif 000004
2004525448.tif 000005
表２：プライマー対の例
2004525448.tif 000006
2004525448.tif 000007
DNAのサンプル（好ましくは目的の領域が増幅されたもの）を得たら、個々の多型を同定することができる。これらの多型についてのマーカーを同定するには、同じ遺伝子の対立遺伝子形態（ヌクレオチド置換、又は例えばGSTM1及びGSTT1遺伝子等の幾つかの遺伝子の場合はその遺伝子全体の欠失により、異なるもの）を区別して検出する。既知のヌクレオチド差を検出する方法は、当業者に周知である。このような方法としては、以下の方法（ただしこれらに限定されない）が挙げられる：
-対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）を用いたハイブリダイゼーション（Wallace, 1981; Ikuta, 1987; Nickerson, 1990, Varlaan, 1986, Saiki, 1989及びZhang, 1991）；
-対立遺伝子特異的PCR（Newton 1989, Gibbs, 1989）；
-固相微小配列決定（Syvanen 1983）；
-オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Wu, 1989, Barany, 1991; Abravaya, 1995）；
-蛍光5'ヌクレアーゼアッセイ（Holland, 1991 & 1992, Lee, 1998,米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、第5,723,591号及び第5,801,155号）；
-制限酵素断片長多型アッセイ（RFLP）（Donis-Keller, 1987）。
【００８５】
好適な実施形態において、遺伝子座は、多型を検出するために使用される特殊タイプのPCR（一般にTaqman（登録商標）アッセイと呼ばれる）をAB7700器具（Applied Biosystems, Warrington, UK）を用いて行うことにより評価される。この方法では、その多型を含む目的の領域にハイブリダイズするプローブを合成する。このプローブは以下の3つの修飾を含む：蛍光レポーター分子、蛍光消光分子、及びゲノムDNA鎖への結合を促進する副溝結合性の化学物質。このプローブはDNAのどちらかの鎖に結合される。例えば、コード鎖に結合する場合、Taqポリメラーゼ酵素が5'側上流プライマーからDNAを合成し始めるとき、このポリメラーゼはこのプローブに出会って、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を用いて１つずつこのプローブから塩基を除去し始める。蛍光レポーター分子に結合した塩基が除去されてしまうと、この蛍光分子は消光分子によって消光されなくなり、この分子は蛍光発光し始める。このタイプの反応は、マッチしたゲノム配列にプローブが完全にハイブリダイズしたときのみ起こり得る。増幅サイクルが連続的に起こると（即ちさらに多くのプローブ及びプライマーが反応混合物中のDNAに結合すると）、蛍光の量は増え、陽性の結果が検出される。ゲノムDNAがプローブに完全にマッチする配列を持たない場合、蛍光シグナルは検出されない。
【００８６】
特にTaqman（登録商標）アッセイを、使用し得るプライマーと一緒に本発明の方法で使用する場合、本発明で使用し得るオリゴヌクレオチドプローブの例を挙げることができる。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、本発明の他の態様をなす。
【００８７】
したがって、本発明のさらなる態様において、配列番号１６４〜２０２より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、配列番号１６４〜２０２を含む群より選択される少なくとも5つ、10個、20個、30個、40個、50個、60個又は70個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセットを提供する。
【００８８】
アレイ
本発明の好適な実施形態において、特定の多型の存在を決定するために、オリゴヌクレオチドアレイ（好ましくはマイクロアレイ）を用いて対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行うのが便利である。
【００８９】
このようなマイクロアレイにより、例えば、小さく区切られた場所（マイクロスポット）に及び/又は固相支持体もしくは診断用チップ上にアレイ状に固定された核酸配列等の結合剤を用いて、アッセイの小型化が可能になる。これらのアプローチは、（特に蛍光標識した試薬を用いると）高い感度を示し、テストされる個体からは非常に少量の生物学的サンプルしか必要とせず、様々な別個のアッセイを同時に行うことができるため、特に価値がある。この利点は、1つのサンプルを用いて1つ以上の遺伝子の多種の多型を区別するアッセイを行えるので、有用である。この小型化技術を可能にする技法の例は、国際特許出願公開第WO84/01031号、第WO88/1058号、第WO89/01157号、第WO93/8472号、第WO95/18376号、第WO95/18377号、第WO95/24649号、及びEP-A-0373203号に記載されており、これらは本明細書中に参考として組み込まれる。
【００９０】
DNAマイクロアレイは、多型を検出するために適切な識別を行うことが分かった。Yershov, 1996；Cheung, 1999及びSchena 1999は、この技法の原理について記載している。簡単に説明すると、DNAマイクロアレイは、特定の標的多型とハイブリダイズするよう選択されたオリゴヌクレオチドを用いて作製することができる。ロボットによって、これらのオリゴヌクレオチドを、スライドガラスの所定の位置に、例えば所定のX、Yデカルト座標に載せて固定させてもよい。PCR産物（例えば蛍光標識したRNA又はDNA）をDNAマイクロアレイ上に導入し、サンプルRNA又はDNAがオリゴヌクレオチドの相補配列に配列特異的に結合し、そして結合しなかった物質を洗い流すことができるように、ハイブリダイゼーション反応を行う。従って遺伝子標的多型は、アレイ上で相補的オリゴヌクレオチドに結合してシグナルを発するこれらの能力によって検出することができる。特異的オリゴヌクレオチドプローブについての蛍光シグナルが無ければ、そのクライアントは対応する多型を持たないことを示す。もちろんこの方法は、蛍光標識の使用には限定されず、当分野で周知の他の好適な標識を用いることができる。各座標の蛍光は、各蛍光シグナルを特定のオリゴヌクレオチドと関連付けるために適当な自動検出装置を用いて読み取ることができる。
【００９１】
このアレイで用いられるオリゴヌクレオチドは、その多型の部位を網羅し、且つ各オリゴヌクレオチドが、その配列の中の中央位置に以下に挙げる塩基のうちの１つを含むように選択することができる：
-リーディング鎖の中の目的の位置に野生型又は通常の塩基；
-尾部（非コード）鎖の中の目的の位置に野生型又は通常の塩基；
-リーディング鎖の中の目的の位置に異なる塩基；
-尾部鎖の中の目的の位置に異なる相補的塩基。
【００９２】
この方法で使用されるアレイは、本発明の他の独立した態様をなす。本発明のアレイは、各オリゴヌクレオチドが上記カテゴリー（a）〜（k）を含む群より選択される遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に特異的である、2つ以上のオリゴヌクレオチドからなるセットを含む。
【００９３】
好ましくはこのアレイは、上記（a）〜（k）のうち少なくとも2つの異なるカテゴリー（例を以下に列挙）の個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々特異的である複数のオリゴヌクレオチドを含む：例えばa+b（即ちカテゴリー（a）の第1の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に特異的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド及びカテゴリー（b）の第2の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に特異的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド）、a+c、a+d、a+e、a+f、a+g、a+h、a+i、a+j、a+k、b+c、b+d、b+e等、c+d、c+e等、d+e、d+f等、e+f、e+g等、f+g、f+h等、g+h、g+i、g+k、h+i、h+k。アレイが2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む場合、これらのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つがカテゴリー（d）の遺伝子の多型の配列に特異的なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これは、適度な細胞の成長及びDNA修復の維持において微量栄養素が中心的な役割を果たすこと、ならびに微量栄養素の代謝もしくは利用障害が幾つかの異なるタイプの疾患と関連があることによるものである（Ames 1999; Perera, 2000; Potter, 2000）。より好ましくは、アレイは、上記（a）〜（k）のうち少なくとも3つの異なるカテゴリー（例を以下に列挙）の個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々が特異的である複数のオリゴヌクレオチドを含む：例えばa+b+c、a+b+d、a+b+e、a+b+f、a+b+g、a+b+h、a+b+i、a+b+j、a+b+k、a+c+d、a+c+e等、a+d+e等、b+c+d等、c+d+e等、d+e+f等、及びこれらのカテゴリーの他の全ての組合せ。該アレイが3つ以上のオリゴヌクレオチドを含む場合、これらのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも2つがカテゴリー（d）及び（e）の遺伝子の多型の配列に特異的なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これら両方のカテゴリーの中に存在する多型に関する情報は、微量栄養素の代謝及び利用に関係する酵素の効率に対してアルコールの消費及び代謝が影響を及ぼすため、特に有用である（Ulrich, 1999）。さらに好適な実施形態において、該アレイが3つ以上のオリゴヌクレオチドを含む場合、これらのオリゴヌクレオチドのうち少なくとも2つがカテゴリー（a）及び（b）の遺伝子の多型の配列に特異的なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これは、生体異物の代謝の第I段階の酵素と第II段階の酵素との密接な相互作用によるためである。さらにより好ましくは、該アレイは、上記（a）〜（k）のうち少なくとも4つ（例えばa+b+c+d、a+b+c+e、a+b+d+e、a+c+d+e、b+c+d+e等）の異なるカテゴリーの個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々が特異的である複数のオリゴヌクレオチドを含む。アレイが4つ以上のオリゴヌクレオチドを含む場合、これらのオリゴヌクレオチドのうち少なくとも3つがカテゴリー（d）、（e）及び（f）の遺伝子の多型の配列に特異的なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これら3つのカテゴリーの中に存在する多型に関する情報は、アルコール代謝により悪影響を受けた微量栄養素の利用能の変化と脂質及びコレステロール代謝におけるアンバランスとが組み合わさって影響するせいで、これらの対立遺伝子の多型が冠状動脈疾患と強く相関するため、特に有用である。アレイが5つ以上のオリゴヌクレオチドを含む場合、これらのオリゴヌクレオチドのうち少なくとも4つが、カテゴリー（a）、（b）、（d）及び（e）の遺伝子の多型の配列に特異的なオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これら4つのカテゴリーの中に存在する多型に関する情報は、微量栄養素の利用、アルコール代謝、生体異物の代謝の第I段階及び第II段階が組み合わさって、体内で生成される潜在的に有害な代謝産物のさらなる代謝及び排出に影響を及ぼすため、特に有用である（Taningher, 1999; Ulrich, 1999）。同様に、アレイは、上記（a）〜（k）のうちの少なくとも5つ（例えばa、b、d、e及びf）、6つ、7つ、8つ、9つ又は10個の異なるカテゴリーの個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々が特異的である複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００９４】
最も好ましくは、アレイは、上記カテゴリー（a）〜（k）の各々の個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々が特異的である複数のオリゴヌクレオチドを含む。
【００９５】
１つの好適な実施形態において、アレイは、シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ1、N-アセチルトランスフェラーゼ2、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及びアルコールデヒドロゲナーゼ2酵素をコードする遺伝子を含む群の各メンバーを含む個々の遺伝子の1つ以上の多型を含む配列に各々特異的な複数のオリゴヌクレオチドを含む。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ1、N-アセチルトランスフェラーゼ2、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マンガン・スーパーオキシドジスムターゼ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及びアルコールデヒドロゲナーゼ2酵素の各々をコードする遺伝子の遺伝子座。より好適な実施形態において、アレイはさらに、エポキシドヒドロラーゼ（EH）、NADPH-キノンレダクターゼ（NQ01）、パラキソノアーゼ（paraxonaoase, PON1）、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、アルコールデヒドロゲナーゼ1、アルコールデヒドロゲナーゼ3、コレステロールエステル輸送タンパク質、アポリポタンパク質A IV、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質C III、アンギオテンシン、VII因子、プロトロンビン20210、β-フィブリノーゲン、ヘム-オキシゲナーゼ-1、α-抗トリプシン、SPINK1、Δ-アミノレブリン酸デヒドラターゼ、インターロイキン1、インターロイキン1、ビタミンD受容体、B1キニン受容体、シスタチオニン-β-シンターゼ、メチオニンシンターゼ（B12 MS）、5-HT輸送体、トランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）、L-myc、HLAクラス2分子、T-リンパ球関連抗原4（CTLA-4）、インターロイキン4、インターロイキン3、インターロイキン6、IgA、及び/又はガラクトース代謝遺伝子GALTのうち1つ以上（好ましくは各々）をコードする遺伝子の遺伝子座の1つ以上の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含む。
【００９６】
好適なアレイにおいて、アレイの中のオリゴヌクレオチドは、表３（右欄には好適なオリゴヌクレオチドを、及び左欄にはサンプルDNAの適当な断片を増幅するために用いたプライマーセットを記載）に記載された配列番号１〜配列番号８５を含む群より選択される少なくとも5つ、10個、20個、30個、40個、50個、60個又は70個のオリゴヌクレオチドを含む。
【００９７】
好適な実施形態において、アレイは、配列番号１〜８５のオリゴヌクレオチドの全てを含む。
【００９８】
表３
2004525448.tif 000008
2004525448.tif 000009
2004525448.tif 000010
2004525448.tif 000011
2004525448.tif 000012
2004525448.tif 000013
2004525448.tif 000014
アドバイス決定ツリー構造図（Advice decision tree）
遺伝子多型分析の結果を用い、第１のデータセットを用いて、サンプルのドナーの遺伝子プロフィールを疾患の罹患性と関連付けることができる。この遺伝子プロフィールは、特定の多型と関係する相対的な疾患の罹患性及びこれらの相互作用についての詳細を提供する。次に、データセット１を用いて同定された危険因子を、データセット２の食事及び他のライフスタイルの推奨とマッチさせて、サンプルのドナーの遺伝子プロフィールに個々人に合ったライフスタイルのアドバイスプランを作成することができる。このようなアドバイスを作成するのに使用することができるデータセット１及び２の例を図１に示す。
【００９９】
具体的な罹患性に合わせて適当なアドバイスを作成することができるように、好ましくはランキングシステムを使用して、癌及び/又は他の症状の危険率に対する特定の多型の罹患性の程度を示す指標を提供する。ランキングシステムは、クライアントのサンプルの中の対立遺伝子がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるか（即ち二倍体核の中に存在する対立遺伝子が同じものであるか異なるものであるか）を考慮するよう設計することができる。使用される5つのカテゴリーを以下にまとめる。
【０１００】
（i）罹患性が低い：対立遺伝子が罹患性を低下させることが判明した場合。
【０１０１】
（ii）罹患性は普通である：対立遺伝子が癌又は疾患の危険率の通常の罹患性を有することが判明した場合。これは一般に、ホモ接合性野生型対立遺伝子又は同様の機能を有することが判明した多型である。
【０１０２】
（iii）罹患性がやや高い：野生型の対立遺伝子（すなわち普通の罹患性）及び特定の癌もしくは疾患に対する罹患性を高めることが分かっている多型の対立遺伝子を含むヘテロ接合性遺伝子型が存在する場合。
【０１０３】
（iv）罹患性が高い：その多型を含むホモ接合性遺伝子型が、癌罹患性の高い危険率を伴って存在する場合。
【０１０４】
（v）罹患性がさらに高い：2つ以上の異なる遺伝子標的の影響が組み合わさることにより、特定の癌もしくは疾患についてさらに高い罹患性が観察された場合。
【０１０５】
データセット１を用いて、同定された各多型に罹患性を割り当て、データセット2から同定された各罹患性に対応するライフスタイルの推奨を割り当ててもよい。例えば、ある人がNAT1*10多型を有することが分かった場合、決定ツリー構造図は、結腸癌の罹患性が高いことを示す。次に、結腸癌の危険率を最小限におさえるのに適した推奨を作成する。例えばこの推奨は、高い危険率に関係のある特定の食品を避け、このような癌の予防効果と関係のある他の食品の消費を増やす、というものであってもよい。推奨を全部まとめてそのサンプルのドナーに個人的に合ったライフスタイルのアドバイスプランを作成することができる。決定ツリー構造図は好ましくは、互いに積極的に相互作用して各々個別に関係する危険因子から期待されるものよりも高い罹患率を生み出す多型及び/もしくは罹患性、ならびに/又は、互いに負の方向に相互作用して各々個別に関係する罹患性を低下させる多型及び/もしくは罹患性の特定の組合せが分かるように、アレンジされる。このような組合せが同定された場合、作成されるアドバイスはそれに応じて調整することができる。例えば、NAT2*4とNAT1*10多型との組合せは、高い癌危険率との関連性が指摘されている（Bell, 1995）。従って、対象者のDNAからこのような多型の組合せが同定された場合、それに関連する非常に高い癌罹患性が割り当てられ、アドバイスは、（例えば焦げた食品の消費を減らす又は無くすことにより）生体異物の消費を減らす必要性を強調するように調整される。
【０１０６】
アドバイスを作成する際、その人及び/又はその人の家族の性別や健康状態、年齢、アルコール消費量、ならびに現存の食事に関する情報等の他の要因を、適当なライフスタイルの推奨の決定において使用することができる。
【０１０７】
実験
実施例１：DNAサンプルの調製
Qiagen QIAampキットを用いてその製造業者の指示に従って（Qiagen, Crawley, UK）、ブラシで得た頬側細胞サンプルからDNAを調製する。簡単にまとめると、再テストが必要な場合、ブラシを半分にカットして、その片方を密閉管の中で室温にて保存する。ブラシのもう片方を微量遠心分離管の中に入れる。400μl PBSを加え、ブラシを室温にて45分間再加水する。次に、Quiagen溶解用緩衝液及びプロテイナーゼKを加え、中身を混合し、56℃にて15分間インキュベートさせて、細胞を溶解させる。エタノールを加え、溶解物をQIAampスピンカラムに移し、数回洗浄してそこからDNAを溶出する。
【０１０８】
実施例２：DNAの定量
十分なDNAが単離されたことをチェックするために、PicoGreen dsDNA定量キット（Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA）を用いて定量工程を行う。
【０１０９】
要約すると、90μlのTEが入った微量遠心分離管の中にアリコート10μlを移すことによって、クライアントのDNAサンプルを調製する。十分なPicoGreen dsDNA定量試薬100μlを加え、よく混ぜて、平らな穴底を有する黒い96穴プレートの中に移す。次にプレートを暗所で5分間インキュベートした後、蛍光の読取りを行う。クライアントのサンプル中に存在するDNAの量は、DNA標準物を用いて作成した検量線から推定することにより決定する。
【０１１０】
続くPCR工程では、全量5〜50ngのDNAを用いる。再テストが必要であれば、残っているクライアントのDNAサンプルを-20℃にて保存する。
【０１１１】
実施例３：MTHFR A1298C多型を同定するためのTaqman（登録商標）アッセイ
改変型反応混合物（modified reaction mixture）は、Taqポリメラーゼ（1.25unit/μl）、最適化PCR緩衝液、dTNP（各200μM）、2mM MgCl2及びプライマー対（配列番号１６０及び１６１）、ならびに多型プローブ（配列番号２００）を含む。
【０１１２】
反応混合物をまず50℃にて10分間インキュベートした後、95℃にて5分間インキュベートし、そして55℃〜60℃で1分間のアニーリング及び95℃にて30秒間の変性を40サイクル繰り返す。サイクル中及び操作終了時の両方で、放出されたプローブのレポーター分子の蛍光を、AB7700サーモサイクラーの一体型CCD検出システムにより測定する。操作過程の間中、蛍光シグナルが増大していれば、陽性結果を示す。
【０１１３】
次に同じプライマー対及び野生型プローブ（配列番号１９９）を用いてアッセイを繰り返す。サンプルが多型についてホモ接合性である場合、野生型プローブでは蛍光シグナルは見られない。しかし、サンプルが多型についてヘテロ接合性である場合、野生型プローブでも蛍光シグナルが見られる。ホモ接合性野生型から単一のレポーターが得られる場合は、ホモ接合性多型サンプル及びヘテロ接合性多型サンプルがX/Y軸上にプロットされ、ホモ接合性対立遺伝子は、各レポーターに対してこれらの軸の両端に密集し、ヘテロ接合性対立遺伝子は中央領域に密集する。
【０１１４】
実施例４：多数の多型を同定するための多型同定用DNAアレイ法
a)PCR増幅
PCR反応混合物は、Taqポリメラーゼ（1.25unit/反応）、最適化PCR緩衝液、dNTP's（それぞれ200μM）、適当な濃度（1〜4mM）のMgCl2、7つの断片を増幅するための各プライマー（配列番号１〜８、１７〜６３）40pmol、及びサンプルDNAを含む。
【０１１５】
反応混合物をまず95℃にて1分間インキュベートした後、MWG TC9600サーモサイクラー（MWG-Biotech-AG Ltd, Milton Keynes, UK）で、以下のPCRに45サイクル実施した：
50℃にて1分間のアニーリング；
73℃にて1分間の重合；
95℃にて30秒間の変性。
【０１１６】
さらに50℃にて1分間アニーリング工程を行ったあと、73℃にて7分間最終重合工程を行う。
【０１１７】
MWG TC9600サーモサイクラーではなく、例えばApplied Biosystems 9700サーモサイクラー（Applied Biosystems, Warrington, UK）等の他のサーモサイクラーを用いても良い。
【０１１８】
標的遺伝子の増幅を行ったあと、2％アガロースゲル又は3.5％NuSieveアガロースゲルを用いた電気泳動分離により、産物の生成をチェックする。
【０１１９】
次に、Qiagen QIAquick PCR精製キット（Qiagen, Crawley, UK）を用いてPCR増幅産物を精製し、dNTP、プライマー、及び酵素をPCR産物から除去する。PCR産物をQIAquickスピンカラムに層状に載せ、バキュームでPCR産物を他の反応産物から分離し、緩衝液中でDNAを溶出する。
【０１２０】
b)RNA転写及びPCR産物の蛍光標識
次に、RNAの伸長鎖に取り込むための蛍光標識したUTPと一緒にT3及びT7RNAポリメラーゼを用いてDNAをRNAに転写する。反応混合物は以下の物質を含む：反応緩衝液20μl（5X）、500μM ATP、CTP、GTP、蛍光UTP（Amersham Ltd, UK）；DEPC処理したdH2O；T3 RNAポリメラーゼ1unit又はT7 RNAポリメラーゼ1unit（Promega Ltd., Southampton, UK）；Rnasinリボヌクレアーゼ阻害因子1unit及びPCRで得たDNA（全量の1/3、dH2O中10μl）。
【０１２１】
この混合物を37℃にて1時間インキュベートする。次に、混合物をDNAアーゼで処理して、新しく合成された蛍光RNAだけが残るようにDNAを除去する。次にRNAを沈殿させ、微量遠心分離にかけ、アレイ上でハイブリダイゼーションを行うために緩衝液中に再懸濁させる。
【０１２２】
c)多型分析
次に、DNAマイクロアレイを用いてサンプルの増幅断片（sample amplified fragment）をテストする。
【０１２３】
使用されるDNAマイクロアレイは、オリゴヌクレオチド（配列番号１〜８５）を含む。これらのオリゴヌクレオチドを、ロボットによりスライドガラスに載せ、固定化させる。蛍光標識した増幅DNAをこのDNAマイクロアレイに導入し、ハイブリダイゼーション反応を行って、サンプル中の任意の相補配列に結合させ、未結合の物質を洗い流す。結合したサンプルの存在は、スキャナを用いて検出される。特定のオリゴヌクレオチドプローブの蛍光シグナルが無ければ、そのクライアントがこれに対応する多型を持たないことを示す。
【０１２４】
実施例５：G560A多型を同定するためのDNAアレイ法
PCR反応混合物は、Taqポリメラーゼ（1.25unit/反応）、最適化PCR緩衝液、dNTP's（それぞれ200μM）、適当な濃度（1〜4mM）のMgCl2、及び断片を増幅するための各プライマー（配列番号８８、８９）40pmolを含む。使用する方法は、実施例４に詳細が記載された方法と同じものであり、アレイはオリゴヌクレオチド（配列番号１７、１８、１９及び２０）を含む。
【０１２５】
結合したサンプルの存在は、上記のようにスキャナを用いて検出する。蛍光性の高いスポットは、配列番号１９及び２０のオリゴヌクレオチドに対応する位置で検出される。配列番号１７及び１８に対応するスポットではシグナルは見られず、サンプルが野生型対立遺伝子についてヘテロ接合性ではないことを示している。
【０１２６】
実施例６：レポートの作成
個々の対立遺伝子の存在を危険因子と関連付ける第１のデータセット及び危険因子をライフスタイルのアドバイスと関連付ける第２のデータセットを含むコンピュータにマイクロアレイ又はTaqman（登録商標）分析の結果を入力する。特定の多型の存在を同定し、同定された多型に基づいてライフスタイルの推奨を提供するレポートを作成する。このような決定プロセスの例を図２に示す。
【０１２７】
DNAのサンプルをスクリーニングし、同定された対立遺伝子をデータセット3としてデータ処理装置に入力する。各対立遺伝子をデータセット１のライフスタイルの危険因子とマッチさせる（例えばNAT1*10対立遺伝子の存在及びGSTM1対立遺伝子の不在による高い大腸癌罹患性等）。次に、同定された危険因子をデータセット2の1つ以上のライフスタイルの推奨とマッチさせる（例えば、「赤肉、焦げた食品、燻製の肉及び魚を避け、喫煙をすぐやめる」（第I段階酵素により潜在的に毒性のある副産物の生成及びその活性の増大を回避するため）、ならびに「玉葱や葫などのアリウム科の野菜及びブロッコリ等のアブラナ科（brassaicae）の野菜の消費を増やす」（GSTP1やGSTT1等の存在する第II段階酵素の活性を高めるため、及び代謝の第I段階の毒性副産物の排出を促すため）等）。次にこれを、データ処理装置に入力された他の因子（例えば年齢、性別及び現在の食事）についてチェックし、その結果に応じて推奨を訂正した後、その対立遺伝子に適した最終的な推奨を作成する。次に、ライフスタイルの推奨を整理して分かり易い個人的なライフスタイルのアドバイスプランを作成する。
【０１２８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】本発明の実施形態において使用することができるデータベース１及びデータベース２の例を表す。
【図２】本発明の実施形態を表す流図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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