(57)【要約】無血清昆虫細胞培養培地であって、維持される最大細胞密度及びこれらの細胞内での昆虫ウイルスの複製の改善を市販培地よりも低コストで提供する上記培地が記載される。スケールアップが容易で、保存期間の長いより安定したエマルジョンを製造する脂質エマルジョンの改良された調製法についても述べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地中で使用する液体エマルジョンの大規模製造法であって、
ａ）有機溶媒中で界面活性剤と脂質混合液を配合して、脂質相を生成すること、ここで前記脂質は脂肪酸、ステロール及び脂溶性ビタミンから本質的に成る群から選択する；
ｂ）前記脂質相を４０℃−７０℃の温度まで加熱し、液相を生成すること；及び前記脂質相に水相を添加し、安定な脂質ミクロエマルジョンを生成すること、ここで前記水相は水から成る、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記水相が乳化剤や界面活性剤を含まない、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
前記温度が５０℃−６０℃である、請求の範囲第１項から第２項までに記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶媒がｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール又は両者の混合物である、請求の範囲第１項から第３項までに記載の方法。
【請求項５】
前記脂溶性ビタミンが非アセチル化α−トコフェロールである、請求の範囲第１項から第３項までに記載の方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項に従って製造される脂質エマルジョン。
【請求項７】
改質基礎培地、ペプトン成分及び脂質成分を含む無血清培養培地であって、前記改質基礎培地が、
ａ）約０．１−６ｇ／ｌの前記改質基礎培地中総濃度を有する１種類以上の遊離アミノ酸；
ｂ）約０．２５−０．１ｇ／ｌの前記改質基礎培地中総濃度を有する１種類以上の遊離ビタミン。
【請求項８】
前記改質基礎培地がヒドロキシプロリンを含まない、請求の範囲第７項記載の無血清培養培地。
【請求項９】
前記改質基礎培地中の遊離アミノ酸対遊離ビタミン比が約１：０．０１−１：０．１の範囲である、請求の範囲第７−８項記載の無血清培養培地。
【請求項１０】
前記脂質成分が請求の範囲第１項に従って製造された脂質エマルジョンを含む、請求の範囲第７−９項記載の無血清培養培地。
【請求項１１】
配合脂質相及び水相を含む濃縮脂質エマルジョンであって、前記脂質相が界面活性剤と有機溶媒中の脂肪酸、ステロール及び脂溶性ビタミンから本質的に成る群から選択される脂質混合物とを含み、前記水相が水から本質的に成り、ここで前記脂質相対前記水相比が３：０．４−３：０．６で、さらにここで５０−６０℃の前記脂質相を周囲温度の前記水相と混合した時、前記濃縮脂質エマルジョンが自然に生じる、上記濃縮脂質エマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、発酵及び細胞培養に関し、また、さらに特に、細胞培養培地及びそれにおいて使用するための濃縮脂質エマルジョンに関する。
【０００２】
（背景技術）
ウイルス性殺虫剤、昆虫細胞系による組換え製品などの工業生産等、バイオテクノロジーにおける最近の多くの発展は、大規模なｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養を必要とし、さらにこれが、かなりの量の細胞培養培地を必要とする。不運なことに、通常細胞培養培地中に認められる血清及び血清アルブミンには問題があり、大規模タンク発酵にコストが高く、手が出せない可能性がある。先行技術でこれまでに記述された無血清代替物も、大量になるとコストがかかる。
【０００３】
大半の市販培地の主要な問題は、多量の血清成分（典型的には５−２０％）を培地に補充する必要があるという点であり、これは血清の高い値段及び入手が限られているために重大な制限因子になる。さらに、培地中の動物血清及び／又は血清アルブミンの使用も、血清中の未確認蛋白質の存在により生成物の精製の場で下流の工程作業を複雑にする可能性があり、また、動物のウイルスの汚染が深刻な安全性の問題を引き起こす可能性があるので、製造の見地から問題である。同様に、これらの材料に検出される未確認蛋白質は、小規模な実験作業に望ましくない変化も導入してしまう。さらに、血清自体の品質がロット毎に変動し、これは血清の変化毎に応じて、科学者や生産技術者が調査し解決しなければならない汚染リスクを導入する。
【０００４】
細胞培養培地での血清及び／又は血清アルブミンの使用の他の関連する問題は、大半の細胞培養作業の必須要件である脂質成分用担体としてのそれらの通常の役割に関する。培地への脂質の直接添加は、その低溶解度のために実用的でないので、粘質は水溶性リポ蛋白質の形態で血清成分とともに導入するのが典型的である。別法として、脂質をアルブミン成分に結合し、培地に添加することができる。しかし、これらの物質の使用に関して、上記の難点の下、血清もアルブミンも必要としない適切な脂質エマルジョンを提供するのが有利であると思われる。Ｂａｒｎｅｓら著、「ニューロン及びリンパ球様細胞の無血清培養法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌｓ）」、ｐ．１６９−８５（１９８４）中Ｉｓｃｏｖｅ、「無血清培地におけるリンパ球及び造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）」。慣用の昆虫無血清培地に必要な脂質を供給する技術でミクロエマルジョンが記述されている（Ｍａｏｉｅｌｌａら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１４０６（１９８８）が、これらの先行技術のエマルジョンは、高い製造コストや短期安定性を含めて、様々な理由で不十分であることが判明している。
【０００５】
そのため、必要なのは、かなりの低コストで細胞増殖に要求される必須の栄養上、生物学的及び生物物理的要求を提供する細胞増殖培地である。大規模タンク培養については、理想的な培養培地は、細胞増殖及び最大細胞密度に優れた性能を提供し、なおも比較的少数の低コストの成分からの調製が容易である。好ましくは、培地は、無血清であるべきである。生物学的に利用可能な形で重要な脂質を供給できるが、血清、血清アルブミン又は培養培地以外の蛋白などの脂質担体を要求しない濃縮脂質エマルジョンも必要である。
【０００６】
本発明は、遊離アミノ酸及びビタミン、従来の血清成分に代るペプトン成分及び脂質エマルジョン成分の新規配合品を含む改質基礎培地を含む低コスト無血清細胞培養培地の提供によって先行技術の問題を解決する。
【０００７】
大半の慣用の細胞培養培地の出発点は、典型的には、ビタミン、有機酸及び／又は適当な緩衝液と共に、水溶液中のアミノ酸、ミネラル、糖及び無機塩の既成混合物を含む塩基性基礎培地である。大半の慣用培地の場合、適切な動物の血清又は血清アルブミンを、脂質成分と共に、この塩基性基礎培地に添加し、細胞の生命、増殖及び生殖を維持するため、並びに、ウイルスの複製及び組換え体又はウイルス産物の発現のために必要とされる完全培地を製造する。
【０００８】
血清及び／又は血清アルブミンに伴うコストと諸問題の下、先行技術では、血清成分を別の蛋白代替物で代用する数件の試みがなされている。例えば、その開示を引用により本明細中に組み入れる、米国特許Ｎｏ．５，０２４，９４７は、１）慣用の基礎培地、２）脂質混合物及び３）ペプトン成分から成る無血清培地を開示しており、その場合、ペプトン成分中の加水分解した蛋白質生成物が血清又はアルブミン中に典型的に認められる蛋白質に代わることが意図されている。昆虫細胞の増殖を血清含有培地と同等の密度まで維持できるが、９４７特許は、高価な添加物（ヒドロキシプロリン及び有機酸など）を用いており、細胞増殖及びウイルス感染細胞密度を製造が経済的になるまで十分に高いレベルで維持しない。従って、培地の性能及び総コストの点で、依然として改善が必要である。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、他の高価な塩基性基礎培地添加物である、遊離アミノ酸を、対応してより多くの量のそれほど高価でないビタミン、糖、ペプトンで代用した時に、実質的に減少でき、又は全く使用しないことさえできることを発見した。この改質は、培地の性能を損なわずに実施できる。事実、本発明の無血清培地中で増殖した昆虫細胞は、’９４７特許で報告されたものの２倍の最大細胞密度を達成し、はるかに高い細胞密度での生殖ウイルス感染を支持する。従って、本発明の完全無血清培地は、先行技術で記述される無血清組成品と比較して、優れた結果を出しながら、追加コストの節約になる。
【００１０】
本発明は、また、上記無血清培地などの細胞培養培地の大規模調製で使用する細胞培養培地の脂質成分の新規生産法とそれによって生産した改良型脂質エマルジョンも提供する。引用によりその開示を本明細書に組み入れる米国特許Ｎｏ．５，３７２，９４３に記載されるものなどの先行技術は、エマルジョンを生産するには超音波処理又は渦巻き攪拌などの激しい攪拌を必要とする。対照的に、本発明は、自然に濃縮脂質エマルジョンを生成し、それによって、大量の液体の激しい攪拌に伴う高い製造コストを下げることができる選択的加熱段階を採用する。本発明の方法によれば、脂質成分のみを加熱し、周囲温度の少量の水を添加すると、エマルジョンが自然に生成する。生じるエマルジョンの液滴サイズを縮小するため、定速攪拌を使用できるのが有利である。
【００１１】
従って、本発明の脂質エマルジョンは、大量の液体の超音波処理や渦巻き攪拌が必要でないため、かなりのコストの節約を提供し、大規模培地生産を大幅に単純化する。請求の範囲に記載された方法に従って得られる改良型エマルジョンは、先行技術で生産されるエマルジョンに比較して優れた安定性を示す。本明細書中で開示したように、改良型エマルジョンは、少なくとも６ヶ月間程度の保存期間を有し、この期間中、生物学的活性を保持する。これらの脂質エマルジョンは、本発明の無血清培地と合わせて使用すると、有利であると考えられる。
【００１２】
本発明の改良型無血清培地の好ましい実施態様は、ペプトン成分、脂質成分及び保護成分を添加した改質基礎培地を含む。改質基礎培地は、追加成分と合わせて、細胞の生命、増殖及び生殖を維持するのに必要な基礎栄養素を提供する。
【００１３】
基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸、ビタミン、有機酸及び／又は緩衝液の栄養混合物を提供する。先行技術は、既成のレシピに基づく市販基礎培地の使用を述べており（例えば、米国特許Ｎｏ．５，０２４，９４７の第７−８Ｊ欄参照）、これは典型的には遊離アミノ酸、遊離有機酸及びビタミンの混合物を組み込む。「遊離アミノ酸」、「遊離有機酸」及び「遊離ビタミン」の語句は、本明細書中では、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙなどの多数の企業が市販している個々のアミノ酸、有機酸及びビタミンの精製品を指す。これらの遊離アミノ酸、有機酸及びビタミン調製品は、天然物から精製されたものであるか、又は、実質的に精製された形で大量生産されているもので、普通は、完全培地のペプトン成分に由来するアミノ酸及び／又はビタミンとは無関係に塩基性基礎培地に添加される。特に、遊離アミノ酸は、先行技術に記載される塩基性基礎培地の重要なコスト要素である。
【００１４】
先行技術と違って、本発明の基礎培地は、慣用の培地調製品と比較して、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリンなどの高コストの遊離アミノ酸の量を有意に減らすように改質されている。驚くべきことに、本発明者らは、例えばフマール酸、リンゴ酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸、ヒドロキシプロリン等の遊離有機酸のうち、最も高価なものの１つである、アミノ酸ヒドロキシプロリンを悪影響なしに培地から完全に排除できることを発見した。このアミノ酸の市販品は、２番目に高価な精製アミノ酸の５−６倍の価格であるのが典型的であるため、ヒドロキシプロリンの排除は、本発明が意図する遊離アミノ酸の総合的な削減と同様に、大規模生産に対してかなりのコストの節約になる。
【００１５】
さらに、本発明によれば、フマール酸、リンゴ酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸など、他の個々の有機酸の精製品は、高価でないチアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、パントテン酸、コリン、パラアミノ安息香酸、イノシトールのような高価でないビタミン、グルコースのような糖、ラクトアルブミン水解物（例えば、Ｅｄａｍｉｎ　Ｓ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（例えば、ＹｅａｓｔｏｌａｔｅＲ（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ））のような酵母エキス、Ｐａｎｍｅｄｅ（Ｐａｉｎｅｓ　＆　Ｂｙｒｎｅｓ，Ｌｔｄ．，英国）のような雄牛肝臓消化物、Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ、米国）のようなカゼイン消化物、トリプトースフォスフェートブイヨン、及び、多数の植物生成物水解物（例えば、コメ、小麦又は大豆からのＨｙ　Ｐｅｐ製品、Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のうちのいずれか、を大量に取り込むことによって細胞の接種密度を高めた場合、その配合品から削減するか、又は排除することができる。従って、好ましい実施態様では、本発明の無血清培地は、少量の遊離アミノ酸及びフマール酸、リンゴ酸、コハク酸及びα−ケトグルタル酸などの他の有機酸を含み、その場合、ペプトン成分添加前の塩基性基礎培地中の遊離アミノ酸総濃度は、塩基性基礎培地中に、好ましくは約０．１−６ｇ／ｌ、さらに好ましくは約０．５−５ｇ／ｌ、最も好ましくは約１−２ｇ／ｌの範囲である。比較すると、ＷｅｉｓｓらのＩＰＬ−４１培地（Ｗｅｉｓｓら、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　１７：４９５−５０２（１９８１））などの慣用の基礎培地は、総遊離アミノ酸濃度が約１３ｇ／ｌである。
【００１６】
細胞増殖をさらに改善し、遊離アミノ酸の削減を補うために、本発明の基礎培地は、慣用の先行技術における基礎培地に見られるものよりも有意に高い総遊離ビタミン濃度を採用している。市販の無血清昆虫細胞培地から利用できるビタミンの大部分は、ペプトン成分を経て、典型的には組織培養グレードの（ＴＣ）Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（又は他の酵母エキス）によって提供される。しかし、ＴＣ　Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅは、比較的高価なペプトンであり、実際には高濃度で細胞増殖を阻害する。そのため、本発明における塩基性基礎培地中での高めの濃度の遊離ビタミンの使用は、特に、少量の遊離ビタミンを添加するほうが同量のビタミンを含有するＴＣ　Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅを追加するよりも安価であるため、先行技術に優る著しい改善を示す。タンク発酵に要求される大量で培地を生産する時、これはかなりのコストの節約になる。従って、本発明による基礎培地中で、ペプトン成分添加前の塩基性基礎培地中の遊離ビタミンの総濃度は、好ましくは約０．０２−０．１ｇ／ｌ、さらに好ましくは約０．０４−０．０８ｇ／ｌ、最も好ましくは約０．０５−０．０７ｇ／ｌの範囲である。比較すると、ＷｅｉｓｓらのＩＰＬ−４１培地などの慣用の基礎培地配合品に見られるような遊離ビタミンの総濃度は、０．０２ｇ／ｌの規模である。
【００１７】
従って、本発明の基礎培地において、遊離アミノ酸対遊離ビタミン比は、約１：０．０１−１：０．１、通常には約１：０．０２−１：０．０８、さらに通常には約１：０．０３−１：０．０７、最も好ましくは約１：０．０３−１：０．０５の範囲になる。しかし、下記の実験部分で提示した増殖データが示すように、基礎培地の塩基性組成品へのこの有意な変化は、完全培地の性能に悪影響を与えない。
【００１８】
当然、個々のアミノ酸及びビタミンの相対濃度は、特定の細胞系の要求に応じて調整できる。例えば、グルタミンは、多くの昆虫細胞系に必須であるが、いくつかの細胞系は、グルタミンなしで増殖でき、前駆物質からそれを合成する場合もあることは、技術上周知である。Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．２２：５３３−３６（１９８７）参照。従って、企図される培地の用途に応じて、当業者は、各種の昆虫細胞系の周知の特徴に合わせるため、個々の遊離アミノ酸及びビタミンの濃度を容易に調整できる。
【００１９】
さらに、本発明の完全培地は、塩基性基礎培地中の遊離アミノ酸減少を補い、血清又はアルブミンの代用にもなるペプトン成分を含む。「ペプトン」という用語は、水解蛋白質生成物、典型的には酸又は酵素を使った自然蛋白質の部分加水分解によって生成され、平均分子量約５−３０ｋＤの混合蛋白質分解生成物の混合物を指すことを意図している。任意に、ペプトン成分を生成するために合わせる個々のペプトン分画は、限外濾過などで前精製し、培地中で増殖する昆虫細胞が発現する組換え産物の精製と使用を妨害する可能性のある残留プロテアーゼ、エンドトキシン又は他の高分子量生成物を除去する。
【００２０】
そのため、本発明において使用を計画しているペプトンは、本発明の培地から除外する血清、血清アルブミンなどによって供給される高分子量蛋白質から容易に識別できる。培地中の総ペプトン濃度は、採用する特定ペプトン分画、培養する細胞系の性質、用いるペプトンが細胞増殖に対し毒性又は阻害性を示すようになるレベルなどの多数の要因に左右され、各ペプトン分画の至適濃度は、経験的に決定される。一般に、本発明の完全無血清培地中の総ペプトン量は、約８−約３０ｇ／ｌ、さらに通常では約１２−約２４ｇ／ｌの範囲になる。
【００２１】
本発明における使用に適したペプトンは、市販されており、ラクトアルブミン水解物（例えば、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州、米国から得られるＥｄａｍｉｎ　Ｓ）、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（例えば、ＴＣ　Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ、米国）等の酵母エキス、Ｐａｎｍｅｄｅ（Ｐａｉｎｅｓ　＆　Ｂｙｒｎｅｓ，Ｌｔｄ．，英国）などの雄牛の肝臓消化物、Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ、米国）などのカゼイン消化物、トリプトースフォスフェートブイヨン及び多数の植物生成物水解物のいずれか（例えば、米、小麦又は大豆からのＨｙ　Ｐｅｐ製品、Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が含まれる。ペプトンの好ましい実施態様は、ＴＣ　Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、ラクトアルブミン水解物又は両者の配合物を含む。特に好ましく、典型的な実施態様では、ペプトン成分は、それぞれ、約６−１４ｇ／ｌ、さらに通常には約７−１３ｇ／ｌ、及び、好ましくは約８−１２ｇ／ｌの濃度のｙｅａｓｔｏｌａｔｅとラクトアルブミン水解物の混合物を含む。
【００２２】
本発明の無血清培地は、さらに、有機溶媒に溶解した脂質エマルジョン成分を含んでいてもよい。先行技術は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８保護剤の１０％水溶液中に脂質溶液を乳化するために、高エネルギーインプット渦巻き攪拌法を使ったこれらの添加物の組み合わせを教示している（例えば、’９４３特許、第６、１１、２１−３１欄）。しかし、不運なことに、この方法は、実施が困難で、１，０００Ｌ−１０，０００Ｌのレベルでの製造に使用するための大量のエマルジョンを調製するためにスケールアップできない。本発明は、脂質ミクロエマルジョンを生成する低コストでスケールアップが容易な配合品及び方法を提供することによってこれらの問題を解決する。これにより作られるエマルジョンは、先行技術のエマルジョンよりも安定で、保存期間が長い。
【００２３】
本発明に従って、本発明の脂質エマルジョンは、先行技術で記述されたものに若干の変更を加えて、脂肪酸、ステロイド、脂溶性ビタミン及び有機溶媒の混合物を含む。本発明の脂質エマルジョンでは、脂肪酸は、脂肪酸アルキルエステル、さらに好ましくはポリ不飽和脂肪酸メチルエステルなどのポリ不飽和脂肪酸アルキルエステルを含む。脂肪酸エステルは、Ｃ１２−Ｃ２２、好ましくはＣ１３−Ｃ１９の鎖長を有する。アルキル成分は、Ｃ１−Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）であり、その場合、メチルが最も好ましい。特に好ましいポリ不飽和脂肪酸メチルエステル混合物は、魚肝油、さらに好ましくはビタミンＡも含有するタラ肝油によって提供される。配合品は、タラ肝油の代わりに純粋オレイン酸脂肪酸メチルエステルを使用することによっても簡素化できる。ステロイドは、好ましくは、ラノステロール、スチグマステロール、シトステロール及びコレステロール、また、特に好ましい実施態様ではコレステロールなどのステロールであり、一方、脂溶性ビタミンは、フィロキノン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、カルシフェロール（ビタミンＤ）、レチノール（ビタミンＡ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）及び非アセチル化型α−トコフェロールから成る群から選択するが、その場合、非アセチル化型α−トコフェロール（ビタミンＥ）が最も好ましい。さらに、先行技術には使用のために様々なアルコール（Ｃ１−Ｃ６アクロール）が記述されているが、本発明の脂質エマルジョンの優先される有機溶媒は、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール又は両者の混合物で、その場合、ｎ−プロパノールが最も好ましい。
【００２４】
ポリ不飽和脂肪酸アルキルエステルの混合物、好ましくはタラの肝油などのメチルアルキルエステルが、完全培地中１ｍｇ／ｌ−５０ｍｇ／ｌの最終濃度で存在するのが好ましい；ステロイド、好ましくはステロール、最も好ましくはコレステロールは、２ｍｇ／ｌ−７ｍｇ／ｌの濃度で、脂溶性ビタミン、好ましくは非アセチル化α−トコフェロールは、０．５ｍｇ／ｌ−４ｍｇ／ｌの濃度であるのが好ましく、アルコール、好ましくはｎ−プロパノールは、０．００１％−０．０１％、さらに好ましくは０．００２％−０．００５％、最も好ましくは０．００２５％−０．００３５％の濃度であるのが好ましい。無毒で、細胞増殖を阻害しない有機溶媒の最終濃度は、増殖させる細胞のタイプ、選択する溶媒、等に応じて選択する。
【００２５】
一般に、水相と混合し、その結果脂質ミクロエマルジョンを生成する前に、上記添加物と組合わせることによって生じる脂質相には、界面活性剤が含まれる。好ましくは、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、通常フォスフォリピド又は非イオン性ポリマー界面活性剤、通常ポリソルベートであり、そして好ましくはポリソルベート２０又はポリソルベート８０（ツイーン８０として市販、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，米国）になる。
【００２６】
本発明の方法に従って、上記脂質をプロパノールに添加し、無水脂質相に達するまで定速で攪拌しながら４０−７０℃、好ましくは５０−６０℃の温度まで加熱する。その後、１回分以上の少量の水を脂質相に、やはり定速で攪拌しながら添加し、その混合物を室温まで冷却する。エマルジョンは、一般に自然に生じるが、通常、滅菌濾過できるように、液滴サイズを縮小することが必要である。脂質相対水相比は、容積換算で約３：０．４−３：０．６の範囲である。約３：０．５（ｖ／ｖ）の比率が好ましい。液相を維持するため、必要に応じてさらに有機溶媒を添加できる。次に、長期保存を容易にするため、大量の水又は１％Ｐｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を、定速で攪拌しながら、濃縮エマルジョンにゆっくりと添加する。
【００２７】
重要なこととして、また、先行技術（’９４３特許、第６−８欄）が教示していることとは反対に、本発明は、水相中に高濃度保護剤又は他の乳化剤が存在すると、実際に脂質ミクロエマルジョンを脱安定化し、基礎培地添加まで保存できる期間を著しく短縮することを確認している。そのため、典型的には保存期間がわずか数日で、使用直前に注文又は調製しなければならない先行技術の市販脂質エマルジョンの重大な問題を、本発明の方法と配合品が解決する。本発明の優先実施態様に従って、水性成分に添加する乳化剤の濃度は、約２％以下、さらに好ましくは約１％以下、最も好ましくは脂質エマルジョンの水性成分に追加乳化剤を添加しないことである。総培地中でのこれらの化合物の有益効果は、それらを別個に完全培地に添加することによって得ることができ、エマルジョン成分中でそれらが引き起こす安定性の問題を回避できる。
【００２８】
この時点で、ミクロエマルジョンを基礎培地に直接添加し、完全培地と共に滅菌濾過、あるいは、単独で滅菌濾過し、少なくとも１ヶ月間、また、通常６ヶ月まで冷蔵庫保存できる。この方法は、特別な装置を用いずに必要な量までスケールアップでき、容易に実施でき、長い保存期間、製造目的の培地の配合コスト削減に必要な全特徴を有するエマルジョンを生じるという長所がある。
【００２９】
例えば、攪拌及び／又はスパージされた細胞培養物中の細胞損傷を防ぐ助けになる保護成分など、様々な目的で本発明の完全無血清培地に別の添加物を加えることができる。保護成分は、好ましくはプロピレンオキサイド及びエチレンオキサイドのブロックコポリマー（ポリオキシプロピレンポリオキシエチレン縮合物）、さらに好ましくはＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から入手できるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８及びＦ８８などのＰｌｕｒｉｎｉｃポリオールを含む。保護成分としての使用に適した他の材料には、ヒドロキシエチルデンプン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストランサルフェート、ポリビニルピロリドン、フィコール、アルギン酸及びポリプロピレングリコールがある。上記のように、本発明の方法に従って、保護成分は、好ましくは、先行技術で提言されるように脂質成分と配合するよりもむしろ、完全培地に別個に添加する。
【００３０】
本発明の培地は、水溶性添加物、例えば、グルコース取り込みを高めるインシュリン、イオン輸送のためのトランスフェリン、セレンなどの微量元素、過酸化保護剤としてのカタラーゼ、脂質前駆物質としてのエタノールアミン、テストステロンなどのステロイドホルモン、トリヨードチロニンなどの甲状腺ホルモン、ハイポキサンチンやチミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジンなどの核酸前駆物質、並びに、細胞培養用の普通の血清補充培地又は無血清培地中に含有される他の栄養素を含むことができる。
【００３１】
培養培地を調製する方法は重要でない。培地は、例えば、全添加成分及び添加剤を初めにそれぞれ適当な濃度で水に溶解した後、減圧下でメンブランフィルターで溶液を濾過することによって調製し、滅菌培養培地を得ることができる。上記のように、組換え又はウイルス産物の発現のために昆虫細胞を増殖させる時、培地のペプトン成分は、前濾過に続いて、後の精製を促進するために、収集しなければならない組換え又はウイルス産物よりも小さいものであるように選択した分子量切り捨て点を有する膜を使った限外濾過などによって前精製するのが好ましい。
【００３２】
本発明の培地で細胞を培養する方法も重要でない。細胞は、普通の培養培地の条件とほぼ同一の条件下で、本発明の培地で培養する。一般に、本発明の無血清培地で増殖した細胞は、選択した特定の細胞系に適した温度範囲と条件下で培養する。例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、好ましくはＳｆ９細胞は、約２０℃−約２８℃の温度範囲で培養し、その場合、培養培地のｐＨは、好ましくは約６−約７、さらに好ましくは約６．２−約６．４の範囲に維持する。ある場合、十分に通気した条件、即ち、攪拌及び／又はスパージ培養物中で細胞を増殖させるのが有利なことがある。例、国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３７５６参照，国際公開Ｎｏ．ＷＯ９１／００３４１として公開、その開示は、これによってそのまま組み入れられている。
【００３３】
一般に、血清、アルブミン又は蛋白性脂質担体又は非蛋白性脂質担体を採用する培地で昆虫、特にＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの細胞の増殖に成功すれば、血清又は蛋白性脂質担体をペプトンで代用し、脂質ミクロエマルジョンを提供する本発明の培地中で、任意に他の必要なホルモン及び増殖因子と合わせて、細胞を増殖できる。例えば、様々な市販昆虫細胞培養物用培地があり、それらは、例えば、トリプトースブイヨンを含まないＴＣ１０［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから販売；Ｇａｒｄｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔ．Ｐａｔｈｏｌ，２５：３６３（１９７５）参照］、ＧｒａｃｅのＡｎｔｈｅｒａｅａ培地［Ｖａｕｇｈｎら、ＴＣＡ  Ｍａｎｕａｌ，３（１）（１９７６）；Ｙｕｎｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５５：１５６５−１５６６（１９６７）］、ＭａｒｋｓのＭｅｄｉｕｍ  Ｍ２０［Ｖａｕｇｈｎら、ＴＣＡ  Ｍａｎｕａｌ、３（１）（１９７６）；Ｍａｒｋｓ、Ｉｎ  Ｋｒｕｓｅら（編）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１５３−１５６（１９７３）］、ＧｏｏｄｗｉｎのＩＰＬ−５２培地［Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，１１：３６９−３７８（１９７５）］、ＧｏｏｄｗｉｎのＩＰＬ培地［Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｉｎ  Ｋｕｒｓｔａｋら（編）、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ（１９８０）］、ＧｏｏｄｗｉｎのＩＰＬ−７６ペプトン培地［Ｇｏｏｄｗｉｎら、同上；Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、１４：４８５−４９４（１９７８）］、ＨｉｎｋのＴＮＭＦＨ培地（改訂）［Ｈｉｎｋ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２２６：４６６−４６７（１９７０）］、Ｈａｎｓｅｎの培地Ｓ−３０１［Ｈａｎｓｅｎ、Ｉｎ  Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ（編）、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．７５−９９（１９７６）］；Ｖａｕｇｈｎら、ＴＣＡ  Ｍａｎｕａｌ、３（１）（１９７６）］及び上述のＩＰＬ−４１培地［Ｗｅｉｓｓら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１７（６）；４９５−５０２（１９８１）］などの前記市販基礎培地である。
【００３４】
本発明の培地は、細胞増殖だけでなく、インターフェロン、リンフォカイン及び抗体などの有用な生理活性物質の製造にも使用可能である。バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を経て昆虫細胞に発現していた異種蛋白は、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｂａｎｂｕｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、２２：３１９−３２９（１９８５）に概略が述べられている。しかし、本開示から利益を受ける当業者は、本発明に従って、多くの他の組換え蛋白を動物、植物及び／又は微生物細胞によって生産できる、と分かるだろう。典型的な組換え蛋白は、限定されるものではないが、コロニー刺激因子［例えば、とりわけＪｏｎｇ及び短形ＣＳＦ−１又はＭ−ＣＳＦ、６−ＣＦＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びインターロイキン−３］、修飾プロウロキナーゼ又はウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、ＴＰＡ−ウロキナーゼハイブリッド、ホールリシン毒素、リシンＡ鎖、リシンＡ含有産物、並びに、インターフェロンα、β及びγ及びそのハイブリッド）、インターロイキン、腫瘍壊死因子、エリスロポレチン及び他の造血増殖因子、ヒト成長ホルモン、並びに、ブタ、ウシなどの成長ホルモン、上皮増殖因子、インシュリン、Ｂ型肝炎ワクチン、単純ヘルペスウイルス糖蛋白ワクチン、スーパーオキサイドジスムターゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、心房ナトリウム利尿因子、ネコ白血病ウイルスワクチン、例えば、ｇｐ７０ポリペプチド、抗体分子の軽及び重鎖、ヒマ（Ｒｉｃｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニン（ＲＣＡ）などのレクチン、ジフテリア毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのエクソトキシン、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａの毒性蛋白（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−ｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫蛋白、例えばＣＡＴなどの多数の酵素、並びに、多数の他のハイブリッド蛋白である。
【００３５】
ここで述べる典型的実施態様は、昆虫細胞培養での使用にさらに具体的に適合させているが、本発明は、請求の範囲の特徴を有する培地はほとんどいかなる細胞型にも有利に使用できることと考えている。細胞は、動物、微生物又は植物由来のものであることができる。動物細胞の場合、脊椎動物でも、無脊椎動物であることができる。好ましくは、細胞は、組換え、ウイルス及び／又は天然産物を生産できるものである。典型的な脊椎動物細胞は、哺乳類細胞、例えば、リンパ球、線維芽細胞、上皮細胞、卵巣細胞、その形質転換細胞、各種新生物細胞及びそれに由来するハイブリドーマである。さらに具体的な哺乳類細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＵＭＣＬやＣ５１８０４などのＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）−形質転換ヒトリンパ芽球細胞系、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫由来Ｎａｍａｌｗａ細胞、マウスリンパ球様細胞由来骨髄腫ＳＰＩ細胞、ＨＥＬ及びＩＭＲ−９０などのヒト線維芽球細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３  Ｈｅｐ−２及びＫＢなどのヒト腫瘍由来上皮細胞、ヒト初代培養細胞、ラット吉田肉腫細胞、ヒト線維芽球細胞ＢＨＫ−２１、マウス線維芽球細胞３Ｔ３、マウスリンパ腫細胞ＹＡＣ−１、抗ＬＰＳ  ＩｇＭを産生する安定細胞系Ｄ−２３４−４−２７−８などのヒト／マウスハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ  ８５９８）、及び１９８１年１１月３０日出願の米国特許Ｓｅｒ．Ｎｏ．３２５，９６９に記載されるように、ヒト線維芽球インターフェロンに対するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマである。
【００３６】
典型的な無脊椎動物細胞は、昆虫細胞、好ましくは、それぞれ、野生型ウイルスもしくは組換えバキュロウイルス感染時、ウイルス又は組換え産物を産生できる細胞、また、血清、アルブミン、別種の蛋白及び／又は他の脂質担体を含有する培地中で増殖、生殖し、組換え及び／又はウイルス産物を発現することが立証されている細胞である。前記昆虫細胞系は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（カイコガ）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ（マイマイガ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサギンウワバ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（タバコガ）及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）である。［一般に、Ｇｒａｎａｄｏｓら（ｅｄ）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ  １９８６）；Ｖａｕｇｈｎ，Ａｄｖ．Ｃｅｌｌ，Ｃｕｌｔ．，Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ（ｅｄ）、Ｉｎｖｅｒｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｐｐｌｉｃｓ．，ｐ．２９５（１９７６）；及びＶａｕｇｈｎ，Ｉｎ，Ｂａｒｉｇｏｚｚｉ（ｅｄ）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｃｏｌｌｑ．Ｉｎｖｅｒｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，（２ｎｄ，Ｔｒｅｍｅｚｚｏ，１９６７），ｐ．１１９（１９６８）参照］
【００３７】
さらに、本発明の培地中で増殖できる昆虫細胞は、好ましくは、バキュロウイルス発現ベクター系又は他の野生型ウイルスの宿主になることができる（昆虫網）のいずれかの目に由来するが、好ましくは、Ｄｉｐｔｅｒａ（ハエ）目又はＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ（チョウ）目に由来する。昆虫約３００種が核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）疾患を有する、と報告されおり、その大半（２４３種）がＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａから単離された。［Ｗｅｉｓｓら、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（バキュロウイルスの大規模増殖のための細胞培養法）、Ｇｒａｎａｄｏｓら（ｅｄ）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ中：Ｖｏｌ．ＩＩ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐｐ．６３−８７、ｐ．６４（１９８６）］以下の昆虫に由来する昆虫細胞系が典型的である：Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ好ましくはＣＰ−１２８細胞系；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（好ましくはＴＮ−３６８細胞系）；Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（好ましくはＳｆ９細胞系）；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ；Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｄｏｔｓｕｇａｔａ；Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ  ｓｅｒｔｉｆｅｒ；Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ；Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｅｕｃａｌｙｐｔｉ；Ｇｎｏｒｉｍｏｓｃｈｅｍａ  ｏｐｅｒｃｕｌｌｅｌａ；Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ；Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ；Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ；Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｏｒｅｉ；Ａｇｒｏｔｉｓ  ｃ−ｎｉｔｒｕｍ、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ、Ａｇｏｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｍａｌｉｎｅｌｌｕｓ、Ｃｏｌｉａｓ  ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍｅｔａｌｉｓ、Ａｐａｎｔｅｌｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｃｅｌｕｓ、Ａｒｃｔｉａ  ｃａｊａ及びＬｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ。好ましい昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及び、特に好ましいのは、Ｓｆ９細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）である。ＩＰＬ−Ｓｆ２１ＡＥ  ＩＩＩなどの他のＳ．Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系が、Ｖａｕｇｈｎら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１３：２１３−２１７（１９７７）に記載されている。
【００３８】
本発明の培地中で培養する好ましい昆虫細胞は、ピコルナウイルス、パルボウイルス、エントモポックスウイルス、バキュロウイルス及びラブドウイルスなど、多数の昆虫病原ウイルスの生殖に適しており、そのうち、バキュロウイルス群からの核多面体病ウイルス（ＮＰＶ）及び顆粒病ウイルス（ＧＶ）が好ましい。さらに好ましいのは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｓｐｐ．、Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｓｐｐ．及びＬｙｍａｎｔｒｉａ  ｓｐｐ．からのもののような、ＮＰＶウィルスである。さらに好ましいのは、バキュロウイルス株Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ  ＮＰＶ、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｏｎｅｌｌａ  ＮＰＶ及び、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、３０：８２８−８３８（１９７９）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：３１１−３１９（１９８０）；及びＳｍｉｔｈら、Ｖｉｒｏｌ．８９：５１７−５２７（１９７８）によって特徴付けられ、記述されたＥ２、Ｒ９、Ｓ１、Ｍ３などのＡｃＮＰＶのプラーク精製株である。
【００３９】
（実験）
以下の例は、本発明のいくつかの好ましい実施態様及び本発明の面を説明するが、その範囲を制限することを意図するものではない。
【００４０】
下記の実験の開示では、以下の略語が当てはまる：ｅｑ（等量）；Ｍ（モラー）；μＭ（マイクロモラー）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；ＥＣ（℃）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）
【００４１】
下記の個々の材料は、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入したＴＣ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、ＤＦ５５７７−０８を除いて、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉから購入した。
【００４２】
例１
無血清培地の調製
ＥＭ０２８と表示した本発明の無血清培地の具体的な実施態様は、表１に挙げる添加物及び量を使って調製した：
【００４３】
2004500889.tif 000002
【００４４】
脂質エマルジョンは、以下の例２に述べた通りに調製した。脂質濃縮物は、下記の表２から表４に挙げた成分及び量で調製した。濃縮物及び粉末成分は、上記の表１の順に、８００ｍｌの水に添加した。その後、最終混合液のｐＨは、６．３に調整し、容積を１Ｌとした。
【００４５】
2004500889.tif 000003
2004500889.tif 000004
2004500889.tif 000005
【００４６】
グルタミンを除くアミノ酸は、下記の表５に従って調製した：
【００４７】
2004500889.tif 000006
【００４８】
チロシンを除く上記アミノ酸は、表５に示す順に９００ｍｌの水に添加する。個々のアミノ酸が、妥当な時間内に溶解しなければ、ｐＨが１．７になるまで、６Ｎ　ＨＣｌを添加できる。他のアミノ酸全部を添加した後、チロシンを５０ｍｌの水に溶解し、先の混合物にゆっくりと添加する。その後、最終容積を調整し、１Ｌとする。
【００４９】
例２
脂質エマルジョンの調製
2004500889.tif 000007
【００５０】
界面活性剤と脂質添加物を大型ガラスビーカーに入れ、穏やかに約５０−６０℃になるまで加熱した。固体が融解し、液相ができるまで、混合液をマグネティック攪拌棒で連続して攪拌した。加熱と混合を続けながら、０．５ｍｌの水をゆっくりと添加した後、プロパノール１．３ｍｌを添加した。混合液を室温まで冷却し、次に、別にプロパノール１．７ｍｌを混合しながら添加し、液相を得た。その後、水８．３ｍｌ又は水中１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８を混合しながら滴下した。攪拌速度を高め、水０．８ｍｌ又は１％　Ｐｌｕｒｏｎｉｃを添加した。混合液を、攪拌しながら、１５分間穏やかに加熱し（温度は４０℃以下に保った）、水又は１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃを添加し、容積を１．０Ｌとした。後から使用する目的でエマルジョンを保存するため、エマルジョンを滅菌濾過し、冷蔵庫保存した。
【００５１】
例３
脂質エマルジョンの長期安定性
表７は、本特許で述べる手順を使って生産した脂質エマルジョンの長期安定性を示す。３種類の異なるロットのＥＭ２８培地中で増殖したＳｆ９細胞の達成した最大細胞密度とＡｃＭＮＰＶ　ＰＩＢ産生を提示する。ロット１０及び１１は、タラ肝油脂肪酸メチルエステルか純粋オレイン酸脂肪酸メチルエステルをそれぞれ含有する７ヶ月前に調製した脂質エマルジョンで調製した。その他の溶液は、すべて、新たに調製された。ロット１２は、新たに調製した溶液及び脂質エマルジョンを使って調製した（脂質エマルジョンは、タラ肝油脂肪酸メチルエステルを含有した）。ウイルスの産生については、培養物を細胞１．８ｘ１０６ヶ／ｍｌの密度で感染させた。
【００５２】
2004500889.tif 000008
【００５３】
例４
ＰＩＢｓの産生
表８は、市販無血清昆虫培地（Ｅｘｃｅｌｌ　４０１、ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ、Ｌａｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）又は脂質ミクロエマルジョンを含有する場合と含有しない場合のＥＭ０２８培地中で増殖したＳｆ９細胞によるＡｃＭＮＰＶバキュロウイルス多面閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）の産生を示す。細胞は、震盪フラスコ中細胞２．４　ｘ　１０６ケ／ｍｌの密度で感染させた。
【００５４】
2004500889.tif 000009
【００５５】
本発明の低コスト無血清培地中で増殖された細胞が、先行技術無血清培地配合品について記述したものよりも優れた細胞密度を達成できることは、上記結果から明らかである（図１）。本発明の培地は、低コストで高密度細胞培地中でのバキュロウィルスの生産的複製も維持する。さらに、例３は、本発明に従って生産した脂質エマルジョンの優れた安定性を実証している。
【００５６】
本明細書で言及する全公報及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを表す。全公報及び特許出願は、個々の公報及び特許出願が、それぞれ、具体的に、個別に、引用により組み入れるように指示された場合と同じ程度に引用により本明細書中に組み入れている。
【００５７】
上記の発明は、理解を明白にするために図解と例によって、幾分詳細に説明されているが、添付した特許請求の範囲内である程度の変更及び改変を行うことができる。例えば、表１−６に示す個々の成分の相対量は、特定の当該細胞系の特定ニーズに従って、当業者が改変でき、そのニーズは、当業者に周知であり、容易に入手できるものである。一般に、上記の表１−６で説明した特定量は、約５０％まで、さらに好ましくは約２０％まで変更できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
典型的な市販無血清昆虫培地での増殖と比較したＥＭ０２８低コスト無血清培地でのＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　Ｓｆ−９細胞の増殖を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500889.tif 000036
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