(57)【要約】この発明は、病原性微生物（細菌又は真菌）によって引き起こされる感染の予防接種及び診断に有用な、病原性微生物由来免疫原性グリコペプチド、その選択方法及び調製方法に関する。グリコペプチドは、ａ１）  １４〜２５アミノ酸からなるグリコシル化Ｔエピトープから本質的になるグリコペプチド、そのうち少なくとも１つの中性アミノ酸は二糖又は三糖に結合し（グリコシド結合）、少なくとも１５％のアミノ酸はプロリンで、プロリンの１つは中性アミノ酸の位置に対して−１〜−４位に位置し、クラスＩＩ ＭＨＣ分子で示され、由来する天然のグリコペプチドでの免疫化で誘導される ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって特異的に同定されるが、同一の配列を有する非グリコシル化ペプチドでの免疫化で誘導されるＣＤ４＋ Ｔリンパ球によっては同定されず、かつそれらが同定されるＣＤ４＋ Ｔ リンパ球の増殖と該リンパ球によるサイトカインの分泌を誘導できるグリコペプチド、及びｂ１）  配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のグリコペプチドを除く、ａ１）に定義されるグリコペプチドの配列を含む１５〜３９アミノ酸の配列を有するグリコペプチドからなる群で選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ１）  少なくとも１つの中性アミノ酸は二糖又は三糖に結合し（グリコシド結合）、アミノ酸の少なくとも１５％はプロリンで、プロリンの１つは中性アミノ酸の位置に対して−１〜−４位に位置する、病原性微生物由来で、１４〜２５アミノ酸からなるグリコシル化Ｔエピトープから本質的になり、
−  クラスＩＩ ＭＨＣ分子で提示され、
−  由来する天然のグリコタンパク質での免疫化で誘導される ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって特異的に認識されるが、同一の配列を有する非グリコシル化ペプチドでの免疫化で誘導されるＣＤ４＋ Ｔリンパ球によっては認識されず、かつ
−  それらを認識するＣＤ４＋ Ｔ リンパ球の増殖と該リンパ球によるサイトカインの分泌を誘導できる
グリコペプチド、及び
ｂ１）  配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のグリコペプチドを除く、ａ１）に定義されるグリコペプチドの配列を含む１５〜３９アミノ酸の配列を有するグリコペプチド
からなる群から選択される免疫原性グリコペプチド。
【請求項２】
中性アミノ酸が、セリンとトレオニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性グリコペプチド。
【請求項３】
二糖又は三糖に結合した１〜７個のトレオニン残基を含むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のグリコペプチド。
【請求項４】
二糖又は三糖が、ヘキソースの二量体又は三量体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のグリコペプチド。
【請求項５】
ヘキソースがマンノースであることを特徴とする請求項４に記載のグリコペプチド。
【請求項６】
グリコシド結合が、α−（１，２）−結合であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載のグリコペプチド。
【請求項７】
病原性微生物が、タンパク質をＯ−グリコシル化できることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載のグリコペプチド。
【請求項８】
病原性微生物が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス又はカンジダ・アルビカンスであることを特徴とする請求項７に記載のグリコペプチド。
【請求項９】
エム．ツベルクローシス（Ｇｅｎｂａｎｋ 番号Ｘ８０２６８）のＡｐａタンパク質由来、又はエム．ツベルクローシス株Ｈ３７Ｒｖのゲノム配列の注釈に関し、Ｒｖ １７９６遺伝子によってエンコードされるＲｖ１７９６タンパク質由来であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載のグリコペプチド。
【請求項１０】
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が、Ａｐａタンパク質の配列の１〜３９位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１０、１８及び２７位のトレオニン残基の少なくとも１つがグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する、３９アミノ酸のグリコペプチド、
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）が、Ａｐａタンパク質の配列（Ｃ−末端配列）の２６１〜２８６位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１７位のトレオニン残基がグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する２６アミノ酸のグリコペプチド、及び
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がＲｖ １７９６ タンパク質の配列の１６９〜２０３位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の４、５、７、１３、１５、２３及び２５位のトレオニン残基の少なくとも１つがグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する３５アミノ酸のグリコペプチド
からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載のグリコペプチド。
【請求項１１】
−  グリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合したグリコシル化中性アミノ酸を溶液中に調製し、
−  グリコペプチドのペプチド配列を産生するのに必要なアミノ酸及び上記で得た中性アミノ酸を用いて、固体支持体上でグリコペプチドを合成し、かつ
−  固体支持体からグリコペプチドを切断する
工程からなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のグリコペプチドの合成方法。
【請求項１２】
中性アミノ酸が、セリン及びトレオニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グリコペプチドが、配列（Ｔは、２又は３個のグリコシド残基で官能化されたＯ−グリコシル化トレオニンを示し、かつＡｃはアセテート官能基を示す）：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
Ｈ２Ｎ−ＤＰＥＰＡＰＰＶＰＴＴＡＡＳＰＰＳＴＡＡＡＰＰＡＰＡＴＰＶＡＰＰＰＰＡＡＡＮＴ−ＣＯＮＨ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
ＡｃＮＨ−ＰＡＰＡＰＡＰＡＧＥＶＡＰＴＰＴＴＰＴＰＱＲＴＬＰＡ−ＣＯＯＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
ＡｃＮＨ−ＴＩＰＴＴＥＴＰＰＰＰＱＴＶＴＬＳＰＶＰＰＱＴＶＴＶＩＰＡＰＰＰＥＥＧ−ＣＯＮＨ２
を有する際、
ｉ）  ２又は３個のグリコシド残基で官能化されたＯ−グリコシル化トレオニンを溶液中に調製し、
ｉｉ）  これらの配列を製造するために必要なアミノ酸及び工程ｉ）で得たＯ−グリコシル化トレオニンを用いて、固体支持体上で、上記の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に相当するペプチドを合成し、
ｉｉｉ）  固体支持体からペプチドを切断し、かつ
ｉｖ）  化学合成により、ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＣ−末端にアミド官能性を、またペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＮ−末端にアセテート官能性を導入する
工程からなることを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
トレオニンによって担持されるグリコシド残基が、ヘキソース、好ましくはマンノースであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
マンノース残基で官能化されるトレオニンが、
ａ２）  式（Ｉ）及び（ＩＩ）
【化１】
2004520317.tif 000008
［式中、Ｐ１及びＰ２は、同一又は異なっていてもよく、ヒドロキシル官能性を保護する基を示し、かつＸは、臭素原子のような活性化官能性を示す］のマンノース誘導体の製造：
ｂ２）  ２つのマンノース残基からなり、式（ＩＩＩ）：
【化２】
2004520317.tif 000009
［式中、Ｐ１、Ｐ２及びＸは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して定義されるとおり］
に相当する活性化誘導体の生産をもたらす、式（Ｉ）の誘導体と式（ＩＩ）の誘導体との反応、次いで得られた化合物の活性化、
ｃ２）  任意に、３つのマンノース残基からなり、式（ＩＶ）：
【化３】
2004520317.tif 000010
［式中、Ｐ１、Ｐ２及びＸは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して定義されるとおり］
に相当する活性化誘導体の産生をもたらす、ａ２）に定義される式（Ｉ）のマンノース誘導体での式（ＩＩＩ）の化合物の反応、次いで得られた化合物の活性化、及び
ｄ２）  それぞれ式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）：
【化４】
2004520317.tif 000011
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は上記のとおり］
のグリコシル化トレオニンの生産をもたらす、式（ＩＩＩ）の化合物又は式（ＩＶ）の化合物の、式（Ｖ）：
【化５】
2004520317.tif 000012
［式中、Ｐ３は、第一級アミン官能性を保護する基を示し、かつＰ４はヒドロキシル官能性を保護する基を示す］
の適当に保護されたトレオニンとの縮合
工程を用いて調製されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも
ａ３）  二糖又は三糖に結合した少なくとも１つの中性アミノ酸及びプロリンの１つが中性アミノ酸の位置に対して−１〜−４位に位置する少なくとも１５％のプロリンを含む少なくとも１つの１４〜２５アミノ酸配列を、タンパク質のペプチド配列において、またそれから、検索し、選択し、
ｂ３）  請求項１１〜１５に記載の方法にしたがって、工程ａ３）で選択されるグリコペプチドを調製し、かつ
ｃ３）  抗原活性が、同一配列を有する対照のペプチドよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも３０倍大きいグリコペプチドを選択する
工程からなることを特徴とする、病原性微生物のタンパク質のペプチド配列を用いて免疫原性グリコペプチドを選択し、スクリーニングするための方法。
【請求項１７】
工程ａ３）に先立って、少なくとも１つの抗原性グリコタンパク質を予備選択する工程を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
中性アミノ酸が、セリンとトレオニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｃ３）で、グリコペプチドの抗原活性が、弱毒化病原性微生物又は病原性微生物の抗原画分で免疫化された動物のＣＤ４＋ Ｔリンパ球の活性を測定して評価されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１つに記載の方法を用いて得られることを特徴とするグリコペプチド。
【請求項２１】
免疫原性組成物もしくは免疫化組成物又は診断試薬の製造のための、請求項１〜１０もしくは２０のいずれか１つに記載のグリコペプチド又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のグリコペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのグリコペプチドの使用。
【請求項２２】
少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わさった、請求項１〜１０もしくは２０のいずれか１つに記載の少なくとも１つのグリコペプチドを含むことを特徴とする、体液性及び／又は細胞性免疫を誘導できる免疫原性組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤及び任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わさった、請求項１〜１０又は２０のいずれか１つに記載の少なくとも１つのグリコペプチドからなることを特徴とする、体液性及び／又は細胞性免疫を誘発し得る免疫化組成物。
【請求項２４】
グリコペプチドが、少なくとも１つのＢエピトープ、ＣＤ４＋型の１つのＴエピトープ又はＣＤ８＋型の１つのＴエピトープからなるタンパク質又はタンパク質フラグメントと組み合わさっていることを特徴とする、請求項２２又は請求項２３に記載の免疫原性組成物又は免疫化組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１０又は２０のいずれか１つに記載の１以上のグリコペプチドに対することを特徴とする抗体。
【請求項２６】
請求項１〜１０もしくは２０のいずれか１つに記載するグリコペプチド又は請求項２５に記載の抗体からなることを特徴とする診断試薬。
【請求項２７】
病原性微生物に感染している恐れのある患者由来の生物学的試料を請求項２６に記載の診断試薬と接触させ、生物学的試料複合体中に存在する抗体／微生物又は試料複合体に存在するグリコペプチド／抗体の形成を検出することからなることを特徴とする、病原性微生物での感染の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、病原性微生物のようなもの（細菌又は真菌）による免疫化及び感染診断に使用できる、病原性微生物由来の免疫原性グリコペプチド及びその選択ならびに製造方法に関する。
【０００２】
これらの感染を予防し、治療するために実行されている手段は、まず、感染をモニターし、治療できるスクリーニングと、次いで免疫化からなる。
ヒト医学で最も深刻な感染の一例としてエム．ツベルクローシスでの感染を挙げて、これらの手段を以降に例示する。具体的には、正常な免疫反応を有するエム．ツベルクローシスに感染した個体の５〜１０％が、深刻な疾患（結核）に進行する；この頻度は、免疫反応を欠いている個体（ＨＩＶ感染、免疫抑制剤での治療など）ではさらに高い。
【０００３】
診  断
現在利用可能な種々の技術には、以下が挙げられる：
−  結核を正確に診断するのに最も厳密な手段であるエム．ツベルクローシスの純粋培養物の生産。それは、肺結核症例の２／３を診断できる穏やかな高感度技術である。結果は、最低３〜４週間後にのみ、時には２ヶ月培養した後にのみ利用できる。標識した前駆体を用いる培養技術の使用はこれらの遅れを短縮できるが、にもかかわらず依然として相当な期間である。培養によるエム．ツベルクローシスのこの検出は、肺結核のためにすら時には入手しにくく、症例の約１／３が生物学的追認を受けない細菌含有試料を要する。時折り、この検査は、肺外形態の疾患に対する特殊な医学的介入（脳脊髄液の腰椎穿刺又はリンパ節バイオプシー）を要する。
【０００４】
−  分子遺伝学に基づく微生物学的技術（ＰＣＲ）は、細菌含有試料を得るという同一の要件に直面している。さらに、試料中にＰＣＲ反応阻害剤が存在するために、その由来を調節できず、時にこれらの技術を使用できない。技術は、一般的な実施には有効ではない。
−  現在、診断用途に適合した感度と特異性を有する血清学的診断法はない。
【０００５】
−  ツベルクリンに対する反応は、個体が感作され、エム．ツベルクローシスに感染しているか、又はＢＣＧで免疫化されていることを示す。ツベルクリンは、実際エム．ツベルクローシス抗原の混合物であり、したがって、エム．ツベルクローシスでの感染とＢＣＧでの免疫化とを識別することができない。というのは、ワクチン抗原とエム．ツベルクローシスとで交差反応が極めて多いからである。さらに、ツベルクリンに対するこの反応は、進行中の疾患である結核をエム．ツベルクローシスでの感染と識別することができない。
【０００６】
ワクチン
ＢＣＧでの免疫化は、一次感染（エム．ツベルクローシスの初期増殖）、特にこれらの細菌の二次転移を制御することができる。それは、おそらく現在利用できる有効な治療がない潜伏期の感染の発症を減じるのに寄与している。ＢＣＧは、特に副作用なく、結核に対して３０億人以上の個体を免疫化するために使用されている。ＢＣＧでの免疫化中、毒性が弱毒化されたこれらの細菌の局所増殖がある。細胞性免疫が、誘発される。それは、マイコバクテリアのタンパク質又は抗原に対する遅延型過敏症（ＨＳＲ）（ツベルクリンに対する反応）を引き起こし、エム．ツベルクローシスでの感染に対する耐性を増した。これらの２つの免疫反応（ＨＳＲ−型感作及び耐性増加）は、マイコバクテリア抗原と反応するＴリンパ球によって支持される。
【０００７】
ＢＣＧは、急性型感染（例えば子供の結核性脳膜炎）に対しても保護する。その有効性は、大人では多岐にわたる。ＢＣＧとツベルクローシス複合体に属さない他のマイコバクテリアとの交差反応性の存在、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシスのある免疫原性抗原のＢＣＧゲノムでの不在、又は感染中のこれらの抗原に対する異なる発現プロフィルは、多岐にわたるＢＣＧの有効性を説明し得る。
さらに、ＢＣＧは、毒性が弱毒化された生株である。したがって、それは、免疫抑制された個体、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染したことが確認された個体での使用を妨げる残留病原力を有している。
【０００８】
これらの感染により効果的に対抗するために、これらの感染の原因である病原性微生物に対して保護する抗原に基づいて、診断上の手段とワクチン、特に危険性のない「サブユニット」ワクチンを有することが賢明であろう。
強力な保護免疫反応を誘導できるこれらの病原性微生物の分子を見出すために、この意味において幾つかの研究が行われている。つまり、Ｊ． Ｈｅｓｓら（Ｃ．Ｒ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｉｓ， １９９９， ３２２： ９５３−９５８）は、結核に対するワクチンとして使用できる抗原が有すべき性質を概説している。その概説では、単一抗原よりむしろ予備選択した抗原の組み合わせを用いることが重要視されている。特に、種々の株に高度に保存される領域の存在、毒性株と弱毒性株の遺伝子発現プロフィルの相違、免疫反応のエフェクター細胞（Ｂ、ＣＤ４＋ Ｔ、ＣＤ８＋ Ｔ リンパ球）に関する反応性又は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の大多数のＨＬＡ分子へのこれらの抗原の結合能力などの基準に基づくこれらの抗原の選択が推奨されている。
【０００９】
これらの抗原の幾つかは、シー．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）のマンノタンパク質のような表面抗原形態（Ｂｕｕｒｍａｎら、ＰＮＡＳ， １９９８， ９５， ７６７０−７６７５）、又はエム．ツベルクローシスでの分泌抗原形態： ＭＰＴ５９ （３０ ｋＤａ）、８５Ａ （３２ ｋＤａ）、ＭＰＴ６４ （２３ ｋＤａ）、ｈｓｐ７１ （７１ ｋｆｌａ）、ＭＰＴ５１ （２４ ｋＤａ）、ＭＰＴ６３ （１６ ｋＤａ）及びＥＳＡＴ−６ （６ ｋＤａ） （Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９４， ６２， ２５３６−２５４４； Ｈｏｒｗｉｔｚら、ＰＮＡＳ， １９９５， ９２， １５３０−１５３４）のいずれかで存在する。これらのエム．ツベルクローシス抗原は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって優先的に認識されるので、免疫化組成物の潜在的な候補物としてすでに提案されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、上記； Ｈｏｒｗｉｔｚら、上記）。
【００１０】
また、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、かつ特異的ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって認識されるエピトープを含むペプチドをエム．ツベルクローシス抗原から単離することが提案されている； このようなエピトープは、特に２つのタンパク質について報告されている： ＥＳＡＴ−６ （Ｏｌｓｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０００， ３０， １７２４−１７３２）及びＭＰＴ−３９ （Ｍｕｓｔａｆａら、Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０００， ６８， ３９３３−３９４０）。
【００１１】
幾つかの観察が、発明者によって以前になされている（Ｒｏｍａｉｎら、 Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９３， ６１， ７４２−７５０； Ｒｏｍａｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９３， ９０： ５３２２−５３２６）：
−  生細菌のみが保護免疫を誘導でき、死菌細菌も保護なしに免疫反応を誘導する；
−  培養培地では、細菌の成長中に細菌によって放出され、生細菌で免疫化された動物の免疫系によって認識されるタンパク質は、これらが死菌細菌での免疫化後にあまり認識されないか、又は全く認識されないので、存在する。
【００１２】
選択についてこの二重の基準を用いて、２つの新たなタンパク質を精製した。Ａｐａ、又はＭＰＴ−３２ あるいは４５／４７ ｋＤａ 抗原複合体と命名されるエム．ツベルクローシスによって分泌されるタンパク質は、Ｒｖ １８６０遺伝子産物である（Ｌａｑｕｅｙｒｅｒｉｅら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． １９９５， ６３： ４００３−４０１０）。第二分子は、Ｒｖ １７９６遺伝子によってエンコードされる推定上のセリンプロテアーゼの内部ペプチドである。
抗原として天然のＡｐａタンパク質を用い、発明者らは、培養物にツベルクローシス群の細菌（エム．ツベルクローシス、エム．ボビス及びＢＣＧ）によって分泌されるタンパク質のわずか２％を示すこのタンパク質が、エム．ツベルクローシスに感染しているか、又はＢＣＧで免疫化された動物を由来とする特異的な ＣＤ４＋ Ｔ リンパ球によって極めて有効に認識される免疫優勢抗原であることを以前に示している（Ｒｏｍａｉｎら、 Ｉｎｆ． Ｉｍｍｕｎ．， １９９９， ６７， ５５６７−５５７２； Ｈｏｒｎ ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９９， ２７４， ３２０２３−３２０３０）。
【００１３】
これらの同一の研究において、発明者らは、Ａｐａのマンノシル化が、このタンパク質の抗原活性に必須であることも示した：
−  α−マンノシダーゼ又はトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）で天然のＡｐａを処理することによって、又はグリコシル化できない細菌（イー．コリ）でＡｐａを発現することによって得られるＡｐａの脱マンノシル化は、１００倍の抗原性損失を伴う。
−  エム．ツベルクローシスにって産生されるＡｐａとわずかに異なるマンノース組成を全体に有するマイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）によって産生されるグリコシル化Ａｐａは、約１０／１に低下する抗原活性を有する。
【００１４】
さらに、このエム．ツベルクローシスのＡｐａ分子は、ジマンノース（Ｔ１０及びＴ１８）、マンノース（Ｔ２７）、 マンノース、ジマンノース又はトリマンノース（Ｔ２７７）で、α−（１，２）型のグリコシド結合を介して４個のトレオニン残基（Ｔ１０、Ｔ１８、Ｔ２７ 及び Ｔ２７７）に結合した６〜９個のマンノース残基を含むことが報告されている（Ｄｏｂｏｓら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９６， １７８， ２４９８−２５０６）。モノ−、ジ−又はトリ−マンノースを含むこの糖類の構造は、酵母、特にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）由来のマンノタンパク質の構造に似ており、長いオリゴマンノース鎖を有するエフ．メニゴセプティカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）由来タンパク質の構造と異なることに留意すべきである。
【００１５】
脱マンノシル化後にみられるＡｐａ抗原性の損失は、この抗原の食作用とプロセシング、あるいは ＣＤ４＋ Ｔ リンパ球による後者の認識の低下に起因している可能性がある。具体的には、ヘキソースに特異的に結合するマクロファージ及び樹状細胞、特にシー．アルビカンス由来マンノタンパク質及びマイコバクテリア由来のリポアラビノマンナンのようなマンノリピドのマンノースレセプターは、ペプチド／クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体形態のこれらの細胞表面に存在する抗原の食作用とプロセシングで役割を果たしている（Ｓｔａｈｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９８， １０， ５０−５５）。また、（Ｎ−末端位のリジン残基についてマンノシル化された）マンノシル化ペプチドは、同一の配列を持つ非グリコシル化ペプチドよりも有効に樹状細胞によって食菌され、処理されることも分かっている（Ｔａｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７， ２７， ２４２６−２４３５）。
【００１６】
ニワトリのリソチームモデルでは、この抗原のＴエピトープを構成するペプチドのグリコシル化類似体であるペプチドが、このグリコシル化エピトープを特異的に認識するＣＤ４＋ Ｔリンパ球を誘導できることが示されている（Ｄｅｃｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９５， １５５， １０７４−１０７８）。しかし、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって特異的に認識されるグリコシル化Ｔエピトープは病原性微生物（細菌／真菌）由来の天然抗原で同定されないので、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によるこれらの病原性微生物由来抗原の認識におけるグリコシル化の重要性は依然として立証されべきものである。
さらに、これは、抗原のグリコシル化に関するエム．ツベルクローシスＡｐａと一般的な知見に関するデータであるにもかかわらず、免疫原性組成物又は免疫化組成物及び／又は診断試験において有効に使用できる、これらの病原性微生物のＯ−グリコシル化タンパク質由来抗原を製造する可能性は、現在のところない。
【００１７】
本質的に：
−  これらの微生物によって産生されるタンパク質のごく少量の％を示す活性タンパク質は、これらの病原性剤を大量に扱うため危険な方法を用いて、極めて低い収率で精製される、
−  異種発現系（グリコシル化できない真核細胞又は細菌）で産生されるタンパク質は、低い抗原活性を有する、
−  エム．スメグマティスのような同種の発現系で産生されるタンパク質は、許容される抗原活性を有するが、それらは複雑な方法を用いては不十分な量で産生される。
【００１８】
この結果、発明者らは、単独で又は他の剤と組み合わせて投与する際に、一方で免疫抑制された個体（生ワクチンの使用に関連した危険性の消失）を含む全ての個体に使用できるワクチンを構成でき、他方で診断目的で使用できる、保護体液性及び／又は細胞性免疫反応を誘導できる免疫優勢抗原を製造することを目的とした。
脱グリコシル化された天然タンパク質又はイー．コリで産生される組換えタンパク質に少なくとも等しく、さもなければ、より大きい抗原活性を示すグリコタンパク質を合成する病原性微生物（特にマイコバクテリア）由来のあるグリコペプチドが見出された。
また、これらのグリコペプチドを大量に製造するための実施しやすい手段を開発することが、本発明の目的である。
【００１９】
本発明の対象は、
ａ１）  少なくとも１つの中性アミノ酸は二糖又は三糖に結合し（グリコシド結合）、アミノ酸の少なくとも１５％はプロリンで、プロリンの１つは中性アミノ酸の位置に対して−１〜−４位に位置する、病原性微生物由来で、１４〜２５アミノ酸からなるグリコシル化Ｔエピトープから本質的になり、
−  クラスＩＩ ＭＨＣ分子で提示され、
−  由来する天然のグリコタンパク質での免疫化で誘導される ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって特異的に認識されるが、同一の配列を有する非グリコシル化ペプチドでの免疫化で誘導されるＣＤ４＋ Ｔリンパ球によっては認識されず、かつ
−  それらを認識するＣＤ４＋ Ｔ リンパ球の増殖と該リンパ球によるサイトカインの分泌を誘導できる
グリコペプチド、及び
ｂ１）  Ｄｏｂｏｓら（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９６， １７８， ２４９８−２５０６）によって記載されるＡｐａ由来の、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のグリコペプチドを除く、ａ１）に定義されるグリコペプチドの配列を含む１５〜３９アミノ酸の配列を有するグリコペプチド
からなる群から選択される免疫原性グリコペプチドである。
【００２０】
グリコシル化Ｔエピトープから本質的になるこれらのグリコペプチドは、このグリコシル化Ｔエピトープを介してＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって認識される。具体的には、ツベルクローシス群の生細菌での免疫化後、同一配列を有する非グリコシル化ペプチドに特異的なＴリンパ球よりもこれらのグリコペプチドに特異的なＴリンパ球がかなり多い。
有利には、グリコペプチドは、同一配列を有する対照のペプチドよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも３０倍大きい抗原活性を有する。
【００２１】
このグリペプチドは、以下の利点を有する：
−  保護細胞型免疫反応、あるいは体液性反応の誘導、及び免疫抑制個体における抗原としての潜在的な使用、
−  病原性微生物に特異的な多数のＴリンパ球によって認識されるための、従来の抗原（弱毒化生微生物の培養物、該培養物から調製される抗原混合物又は非グリコシル化ペプチド）に少なくとも等しく、さもなければより大きい抗原活性、
−  他の微生物、特に他の異型性マイコバクテリアとの交差反応性の問題を除き、免疫化と病原性微生物の診断の有効性を増すことができる、極めて狭い特異性；特に、より具体的には、病原性微生物に排他的に存在するそのオリゴ糖残基は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって認識されるＴエピトープの定義に必須な方法で寄与する； つまり、それらは、そのタンパク質の幾つかをＯ−グリコシル化できる病原性微生物（ツベルクローシス複合体細菌、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、カンジダ・アルビカンスなど）での免疫化及び感染を診断するのに特異的な抗原を構成する、
【００２２】
−  全体に非病原性（ａｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）であるための免疫抑制個体での使用、
−  大量での潜在的な生産、
−  進行中の用量とワクチンの有効性についてのより良い標準化、
−  貯蔵と使用の容易化。
グリコペプチドの有利な具体例によれば、中性アミノ酸は、セリンとトレオニンからなる群から選択される。
グリコペプチドのこの具体例の有利なアレンジによれば、それらは、二糖又は三糖に結合した１〜７個のトレオニン残基を含む。
グリコペプチドの別の有利な具体例によれば、二糖又は三糖は、ヘキソース、好ましくはマンノースの二量体又は三量体である。
【００２３】
グリコペプチドのさらに別の有利な具体例によれば、グリコシド結合はα−（１，２）結合である。
さらに別の有利な具体例によれば、グリコペプチドは、タンパク質をＯ−グリコシル化できる病原性微生物、好ましくはマイコバクテリウム・ツベルクローシス又はカンジダ・アルビカンス由来である。
この発明によれば、グリコペプチドは、好ましくは
−  エム．ツベルクローシス（Ｇｅｎｂａｎｋ 番号Ｘ８０２６８）のＡｐａタンパク質、又は
−  エム．ツベルクローシス株Ｈ３７Ｒｖ （Ｓａｎｇｅｒ ｂａｎｋ）のゲノム配列の注釈に関し、Ｒｖ １７９６遺伝子によってエンコードされるＲｖ１７９６タンパク質
に由来する。
【００２４】
好ましくは、グリコペプチドは、
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）が、Ａｐａタンパク質の配列の１〜３９位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１０、１８及び２７位のトレオニン残基の少なくとも１つがグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する、３９アミノ酸のグリコペプチド、
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）が、Ａｐａタンパク質の配列（Ｃ−末端配列）の２６１〜２８６位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１７位のトレオニン残基がグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する２６アミノ酸のグリコペプチド、及び
−  配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がＲｖ １７９６ タンパク質の配列の１６９〜２０３位から伸長する配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の４、５、７、１３、１５、２３及び２５位のトレオニン残基の少なくとも１つがグリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合する３５アミノ酸のグリコペプチド
からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の対象は、
−  グリコシド結合を介して二糖又は三糖に結合したグリコシル化中性アミノ酸を溶液中に調製し、
−  グリコペプチドのペプチド配列を産生するのに必要なアミノ酸及び上記で得たグリコシル化中性アミノ酸を用いて、固体支持体上でグリコペプチドを合成し、かつ
−  固体支持体からグリコペプチドを切断する
工程からなることを特徴とする、上記のグリコペプチドの合成方法でもある。
【００２６】
この方法の有利な具体例によれば、中性アミノ酸は、セリン及びトレオニンからなる群から選択される。
この具体例の有利なアレンジによれば、グリコペプチドが、配列（Ｔは、２又は３個のグリコシド残基で官能化されたＯ−グリコシル化トレオニンを示し、かつＡｃはアセテート官能基を示す）：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
Ｈ２Ｎ−ＤＰＥＰＡＰＰＶＰＴＴＡＡＳＰＰＳＴＡＡＡＰＰＡＰＡＴＰＶＡＰＰＰＰＡＡＡＮＴ−ＣＯＮＨ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
ＡｃＮＨ−ＰＡＰＡＰＡＰＡＧＥＶＡＰＴＰＴＴＰＴＰＱＲＴＬＰＡ−ＣＯＯＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
ＡｃＮＨ−ＴＩＰＴＴＥＴＰＰＰＰＱＴＶＴＬＳＰＶＰＰＱＴＶＴＶＩＰＡＰＰＰＥＥＧ−ＣＯＮＨ２
を有する際、
【００２７】
その方法は、
ｉ）  ２又は３個のグリコシド残基で官能化されたＯ−グリコシル化トレオニンを溶液中に調製し、
ｉｉ）  これらの配列を製造するために必要なアミノ酸及び工程ｉ）で得たＯ−グリコシル化トレオニンを用いて、固体支持体上で、上記の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に相当するペプチドを合成し、
ｉｉｉ）  固体支持体からペプチドを切断し、かつ
ｉｖ）  化学合成により、ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＣ−末端にアミド官能性を、またペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＮ−末端にアセテート官能性を導入する
工程からなる。
【００２８】
したがって、ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の合成は、そのあいだにグリコシル化アミノ酸が導入される従来の固相ペプチド合成に相当する。固相ペプチド合成の分野で知られているように、使用されるアミノ酸は適当に保護され、必要であれば、ペプチド配列に他のものが導入される前に活性化される。同様に、トレオニンによって担持されるグリコシド残基に存在するヒドロキシルは、ペプチド合成のあいだに適切に保護される必要がある。
いったんペプチド合成が行われると、ペプチドは、固体支持体から分離され、脱保護される。それらは、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００２９】
この具体例の有利なアレンジによれば、工程ｉ）で製造されるＯ−グリコシル化トレオニンによって担持されるグリコシド結合はヘキソース、好ましくはマンノースであり、マンノース残基は、有利にはα−（１，２）結合を介して互いに結合される。
【００３０】
このアレンジの有利な態様によれば、マンノース残基で官能化されるトレオニンは、以下のように製造される：
ａ２）  式（Ｉ）及び（ＩＩ）
【００３１】
【化６】
2004520317.tif 000002
［式中、Ｐ１及びＰ２は、同一又は異なっていてもよく、ヒドロキシル官能性を保護する基を示し、かつＸは、臭素原子のような活性化官能性を示す］のマンノース誘導体の製造：
ｂ２）  ２つのマンノース残基からなり、式（ＩＩＩ）：
【００３２】
【化７】
2004520317.tif 000003
［式中、Ｐ１、Ｐ２及びＸは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して定義されるとおり］
に相当する活性化誘導体の生産をもたらす、式（Ｉ）の誘導体と式（ＩＩ）の誘導体との反応、次いで得られた化合物の活性化、
【００３３】
ｃ２）  任意に、３つのマンノース残基からなり、式（ＩＶ）：
【００３４】
【化８】
2004520317.tif 000004
［式中、Ｐ１、Ｐ２及びＸは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関して定義されるとおり］
に相当する活性化誘導体の産生をもたらす、ａ２）に定義される式（Ｉ）のマンノース誘導体での式（ＩＩＩ）の化合物の反応、次いで得られた化合物の活性化、及び
ｄ２）  それぞれ式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）：
【００３５】
【化９】
2004520317.tif 000005
［式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は上記のとおり］
のグリコシル化トレオニンの生産をもたらす、式（ＩＩＩ）の化合物又は式（ＩＶ）の化合物の、式（Ｖ）：
【００３６】
【化１０】
2004520317.tif 000006
［式中、Ｐ３は、第一級アミン官能性を保護する基を示し、かつＰ４はヒドロキシル官能性を保護する基を示す］
の適当に保護されたトレオニンとの縮合。
【００３７】
保護基Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、研究Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｔ．Ｗ． ＧＲＥＥＮＥ 及びＰ．Ｇ．Ｍ． ＷＵＴＳ、第２版１９９１年、Ｊ． ＷＩＬＥＹ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）に記載される基から選択してもよい。例として、また非制限に、Ｐ１とＰ２はアセチル又はベンゾイル基を示してもよく、Ｐ３はＦｍｏｃ （９−フルオレニルメトキシカルボニル）基を示してもよく、かつＰ４はペンタフルオロフェニル基を示してもよい。
【００３８】
この発明の対象は、上記のように、本発明によるグリコペプチドを合成する方法に付随して有利に行ってもよい、病原性微生物のタンパク質のペプチド配列を用いて免疫原性グリコペプチドを選択し、スクリーニングするための方法であって、方法は、少なくとも
ａ３）  二糖又は三糖に結合した少なくとも１つの中性アミノ酸及びプロリンの１つが中性アミノ酸の位置に対して−１〜−４位に位置する少なくとも１５％のプロリンを含む少なくとも１つの１４〜２５アミノ酸配列を、タンパク質のペプチド配列において、またそれから、検索し、選択し、
ｂ３）  上記の合成法にしたがって、工程ａ３）で選択されるグリコペプチドを調製し、かつ
ｃ３）  抗原活性が、同一配列を有する対照のペプチドよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも３０倍大きいグリコペプチドを選択する
工程からなることを特徴とする。
【００３９】
このスクリーニング方法の有利な具体例によれば、工程ａ３）に先立って、少なくとも１つの抗原性グリコタンパク質を予備選択する工程が含まれる。
このスクリーニング方法の別の有利な具体例によれば、工程ｃ３）では、グリコペプチドの抗原活性は、弱毒化病原性微生物又は病原性微生物の抗原画分で免疫化された動物のＣＤ４＋ Ｔリンパ球の活性を測定して評価される。
【００４０】
Ｔリンパ球の活性化は、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載されるような従来の免疫技術を用いて立証することができる。例として、リンパ球増殖アッセイ、活性化ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって合成されるサイトカイン（タンパク質又はｍＲＮＡ）のためのアッセイ（イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）又はＲＴ−ＰＣＲ型の重合鎖反応）、又はエム．ツベルクローシスの場合には、遅延型過敏症アッセイが挙げられる。
また、この発明は、上記のような選択及びスクリーニング方法を用いて得られるグリコペプチドを包含する。
【００４１】
また、この発明の対象は、免疫原性組成物もしくは免疫化組成物又は診断試薬の製造のための、本発明による少なくとも１つのグリコペプチド又は配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のグリコペプチドの使用である。
病原性微生物、特にエム．ツベルクローシスでの感染によって誘導される細胞性及び／又は体液性免疫を極めて特異的に検出する本発明によるグリコペプチドは、当業者にそれ自体知られており、細胞性免疫を検出できるいずれかの技術によって結核の診断に有利に用いることができる。例として、Ｔ−リンパ球増殖アッセイ及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球、特にγ−ＩＦＮに特異的なサイトカインのための免疫酵素アッセイが挙げられる。
【００４２】
また、本発明の対象は、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わさった、上記の少なくとも１つのグリコペプチドからなることを特徴とする、体液性及び／又は細胞性免疫を誘導できる免疫原性組成物である。
体液性又は細胞性免疫反応の設定でのＣＤ４＋ Ｔリンパ球とＣＤ８＋ Ｔ リンパ球つまりＢリンパ球との協同作用のために、本発明のグリコペプチドは、抗原に対する免疫化の有効性を増すために、いずれかの他の抗原用の輸送タンパク質（担体）として有利に用いることができる。この抗原／担体の組み合わせは、免疫化抗原に特異的なＢ及びＴリンパ球の選択と増幅を有利に容易にすることができる。
【００４３】
本発明の対象は、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤及び任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わさった、上記の少なくとも１つのグリコペプチドからなることを特徴とする、体液性及び／又は細胞性免疫を誘発し得る免疫化組成物である。
免疫原性組成物又は免疫化組成物の有利な具体例によれば、グリコペプチドは、少なくとも１つのＢエピトープ、ＣＤ４＋型の１つのＴエピトープ又はＣＤ８＋型の１つのＴエピトープからなるタンパク質又はタンパク質フラグメントと組み合わさっている。
【００４４】
本発明の目的のため、タンパク質の配列に対して、用語「Ｂエピトープ」、「ＣＤ４＋ 型Ｔエピトープ」及び「ＣＤ８＋ 型Ｔエピトープ」は、それぞれ抗体、ＣＤ４＋ リンパ球Ｔレセプター及びＣＤ８＋ リンパ球Ｔレセプターに結合し得るこの配列のフラグメントを意味することを意図する。
本発明の目的のため、表現「タンパク質とグリコペプチドの組み合わせ」は、いずれかの物理的手段又は化学的手段、例えばグリコペプチドの配列とタンパク質又はタンパク質フラグメントの配列との融合物の発現による混合と結合の双方を意味することを意図する。
用いられるアジュバントは、従来使用されるアジュバントである；有利には、それらは水酸化アルミニウムとスクアレンからなる群から選択される。
【００４５】
グリコペプチドは、ペプチドの免疫原性を増すことのできる、当業者にはそれ自体公知のいずれかの他の手段と任意に組み合わせてもよい。例として、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９９， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２９， ２７８８−２７９６により記載されるような分枝状多量体ペプチドを生産できる担体ペプチドへの結合が挙げられる。
本発明の対象は、本発明によるグリコペプチドの１以上に対することを特徴とする抗体でもある。
抗体の有利な具体例によれば、それらは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体から選択される。
【００４６】
本発明の対象は、本発明によるグリコペプチドと抗体からなる群から選択されることを特徴とする診断試薬でもある。
また、本発明の対象は、病原性微生物に感染している恐れのある患者由来の生物学的試料を上記の診断試薬（場合によって抗体又はグリコペプチド）と接触させ、生物学的試料複合体中に存在する抗体／微生物又は試料複合体に存在するグリコペプチド／抗体の形成を検出することからなることを特徴とする、病原性微生物での感染の検出方法である。
【００４７】
上記のアレンジに加えて、この発明は、この発明の具体例ならびに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう多くのアレンジをさらに含む：
−  図１は、遅延型過敏症アッセイを用いる、エム．ツベルクローシスから精製した天然のＡｐａの抗原活性測定を、α−マンノシダーゼによるＡｐａタンパク質の消化動態の関数として示す。結果は、時間の関数としてタンパク質ｍｇ当たりのツベルクリン単位で示す。
−  図２は、α−マンノシダーゼでのＡｐａタンパク質の消化動態の関数として、Ａｐａ分子のマンノース組成の質量分析を示す。Ａｐａタンパク質の各ピークに相当するマンノース残基数を示し、Ａｐａ消化産物の全体的な抗原活性を研究した種々の時間で示す。
【００４８】
−  図３は、遅延型過敏症アッセイを用いる、Ｒｖ １７９６タンパク質由来のＬｉｐと命名されるグリコペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の抗原活性測定を示す。エム．ツベルクローシス（ＰＰＤ）由来の標準的な精製タンパク質を０．１ｍｌ中０．２５μｇ用量で正の対照として用いる。Ｌｉｐペプチドを０．１ｍｌ中０．０２μｇ用量で用いる。α−マンノシダーゼ又はサブチリシンで処理したＬｉｐペプチドは、同一用量ではネガティブである。結果を紅斑反応直径により示す。
−  図４は、インビトロのリンパ球増殖アッセイを用いる Ｌｉｐペプチドの抗原活性を示す。Ｔリンパ球によるグリコシル化Ｌｉｐペプチド（天然 Ｌｉｐ）の認識を、脱グリコシル化ペプチド（Ｌｉｐ ＋ α−マンノシダーゼ）又は抗−Ｔ−リンパ球 ＣＤ４＋レセプター抗体と組み合わさったＬｉｐペプチド （Ｌｉｐ ＋ 抗Ｃｄ４）の認識と比較する。
【００４９】
−  図５は、遅延型過敏症アッセイを用いる、エム．ツベルクローシスから精製した天然のＡｐａ （天然Ａｐａ）又はイー．コリで産生される脱グリコシル化組換えＡｐａ （イー．コリｒＡｐａ）の抗原活性測定を、モルモットの免疫化の関数として示す。後者を、皮内注射される生ＢＣＧ又はサイトメガロウイルス初期プロモーターのコントロール下に位置するＡｐａのコード配列を含むプラスミドｐＡＧ８３１もしくはｐＡＧ８３２で予め免疫化した。プラスミドでのモルモットの免疫化は、遅延型過敏症反応によって発現され得る感作を生ずる。この反応を生ずるには２つの型の抗原は等価であるが、ＢＣＧでの免疫化後には、グリコシル化された天然のＡｐａのみが抗原性である。
【００５０】
−  図６は、α−（１，２）結合を介して結合する２又は３個のマンノース残基からなる単位の調製を示す、かつ
−  図７ （７ａ 及び７ｂ）は、２又は３個のマンノース単位で官能化されたトレオニンの調製を示す。
【００５１】
実施例１： Ａｐａタンパク質の抗原性におけるオリゴサッカライド残基数の重要性
１．  材料と方法
ａ）  α−マンノシダーゼでの消化によるＡｐａの制限された脱グリコシル化
上記のＨｏｒｎらによって記載されるプロトコルにしたがって、エム．ツベルクローシスの培養上清から精製した４５０μｇのＡｐａタンパク質を、４５０μｌ量の緩衝液Ａ （１００ ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯ−Ｎａ＋、２ ｍＭ ＺｎＣｌ２）に希釈する。
最初の時点で、７５μｌのＡｐａタンパク質溶液を除き、２５μｌの緩衝液Ａに希釈し、対照として凍結する。１ｍｇ／ｍｌ （３ＩＵ／ｍｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のα−マンノシダーゼ１２５μｌを３７５μｌのＡｐａ溶液に加え、５００μｌの反応容量を３７℃でインキュベートする。３０分、１時間、 ４時間、１６時間及び２４時間後、１００μｌの反応物を除き、−２０℃で凍結する。
【００５２】
ｂ）  消化産物の精製
１００μｌの試料を９０℃で２分加熱し、次いで 急冷し、真空下で乾燥させ、水中０．１％のトリフルオロ酢酸３００μｌ（溶液Ｂ）に再懸濁する。
Ａｐａ消化産物を、９０分で溶液Ｂ中の０〜９０％アセトニトリル勾配を用いて逆相クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でα−マンノシダーゼから分離する。Ａｐａを、５１．５％ ±０．５％のアセトニトリルに相当する時間ｔ ＝ ６８ 分でカラムから溶出する。Ａｐａに相当する画分を回収し、凍結乾燥し、水中５％のブタノール溶液（溶液Ｃ）に再懸濁し、次いで真空下で乾燥させる。精製した試料を次いで溶液Ｃ １００μｌに再懸濁する。
【００５３】
ｃ） Ａｐａ消化産物の生化学分析
各試料のオリゴサッカライド組成を、上記のＨｏｒｎらに記載される条件下で質量分析により分析する。
各試料中に存在するタンパク質の相対量を評価するために、２１０ ｎｍでの吸光度を測定する。
次いで、試料を乾燥し、その濃度を滴定緩衝液（緩衝液 Ｄ： ＰＢＳ、０．９％ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ８０）中で１ ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００５４】
ｄ）  遅延型過敏症アッセイにおける、α−マンノシダーゼでのＡｐａの制限された消化産物の抗原活性の生物学的滴定
２回の注射点で生ＢＣＧ ２ｍｇを皮内注射することによりあらかじめ３ヶ月免疫化したモルモットでの遅延型過敏症アッセイを用いて、抗原活性を測定する。
各試料を緩衝液Ｄで２ μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、この希釈液１００μｌ （０．２μｇ）を２頭のあらかじめ免疫化したモルモットのバッチに皮内注射する。
【００５５】
動物の種々のバッチは以下のとおりである：
・バッチ１：  緩衝液Ｄ １００μｌを投与した負の対照
・バッチ２：    Ａｐａ ｔ＝０
・バッチ３：    Ａｐａ ｔ＝３０分
・バッチ４：    Ａｐａ ｔ＝１時間
・バッチ５：    Ａｐａ ｔ＝４時間
・バッチ６：    Ａｐａ ｔ＝１６時間
・バッチ７：    Ａｐａ ｔ＝２４時間
・バッチ８：    正の対照（１０ツベルクリン単位（ＴＵ）に相当するマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＰＰＤ）由来の標準的な精製タンパク質０．２５μｇ）
注射から２４時間後、紅斑反応直径の平均を、種々の動物バッチについて測定し、試料のツベルクリン力価をＰＰＤ標準に対して測定する。
【００５６】
２．  結果
結果を図１と２に示す。
α−マンノシダーゼでの消化動態の関数としてＡｐａの抗原活性分析（図１）は、Ａｐａの抗原活性が、α−マンノシダーゼでの消化中に徐々に失われることを示している：１時間で ６６％、４時間で８６％及び長い消化には９７〜９９％。
種々の消化時間で得た生成物のマンノース組成の分析（図２）は、
・  天然のＡｐａ分子が、６〜８マンノース残基を有し、かつ
・  ３〜６マンノース残基が依然としてあるＡｐａ分子は、その抗原活性の８６％を失うことを示している。
【００５７】
Ａｐａのオリゴマンノース組成は、ジマンノース（Ｔ１０及びＴ１８）、マンノース（Ｔ２７）、マンノース、ジマノース又はトリマンノース （Ｔ２７７）、上記のＤｏｂｏｓらのとおりであることが分かっている。さらに、α−マンノシダーゼは、エキソマンノシダーゼである。
その結果、結果は、
・  Ａｐａの４オリゴマンノース鎖の１又は２個の末端マンノースの損失は、抗原活性の劇的な損失をもたらし、かつ
・  Ａｐａの抗原性は、グリコシル化トレオニン残基の１以上に対するジマンノース又はトリマンノースの存在に関連している
ことを示している。
【００５８】
実施例２： エム．ツベルクローシスのＬｉｐグリコペプチドの立証
材料と方法
ａ）  グリコペプチドの精製
ａ１）  粗物質の調製
マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｈ３７Ｒｖ）株の細菌を、Ｓａｕｔｏｎ合成培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ， Ｈ． Ｃａｓｓａｇｎｅ， １９６１， Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ編集、２巻、２４２頁）で２０日間培養する。１０，０００ Ｄａより大きい分子量分子のみを保持するように、培地に分泌された分子を限外ろ過膜（ＰＭ１０， ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮し、次いで凍結乾燥する。約１０ ｇの凍結乾燥物が、培養培地６０Ｌについて得られる。
【００５９】
ａ２）  分子ろ過（工程１）
調製用カラムを、Ｓｕｐ７５ プレップグレードマトリクス （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で充填する。この５０×７５０ ｍｍのカラムを、１ ｍｌ／ｍｉｎの流速でリン酸緩衝液（５０ ｍＭ Ｎａ２／Ｋ ＰＯ４， ｐＨ ７．１； １００ ｍＭ ＮａＣｌ； ４％ブタノール）で平衡化する。上記の粗物質を、１００ｍｌ当たり１０ｇの最終濃度で平衡化緩衝液に溶解し、４時間４３，０００ ｇで遠心分離し、次いで０．２２μｍのろ紙で濾過して清澄にする。１３ ｍｌを注入し、２８０ ｎｍでの吸光度を介して検出される種々の画分をＰＭ１０膜上で濃縮し、次いで凍結乾燥する。
溶出画分７００〜８００ ｍｌは極めて抗原性である：遅延型過敏症は、生ＢＣＧで免疫化したモルモットで認められる； この画分は、他方、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは比較的不活性である。
【００６０】
ａ３）  イオン交換（工程２）
２４×２５０ ｍｍのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ調製用カラム（１５μｍ）を、８ ｂａｒの最大圧を用いて流速５ ｍｌ／ｍｉｎで２０ ｍＭ ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８．４％ ブタノール緩衝液で平衡化する。当初の緩衝液１０ｍｌに溶解した上記の画分５００ｍｇを注入した後、同一緩衝液で０〜１５０ｍＭの直線状のＮａＣｌ勾配を適用する。溶出した画分を２８０ ｎｍの吸光度で検出し、ＰＭ１０膜で濃縮し、次いで凍結乾燥する。
４０〜７５ ｍＭ ＮａＣｌで溶出された画分は、極めて抗原性である；遅延型過敏症が生ＢＣＧで免疫化されたモルモットで認められる； この画分は、他方、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットで比較的不活性である。
【００６１】
ａ４）  Ｃ８カラムでの逆相（工程３）
４．６×１００ ｍｍのＰｈａｒｍａｃｉａ ＲＰＣカラム（逆相カラム） Ｒｅｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣを、流速１ ｍｌ／ｍｉｎで２０ ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯ−ＮＨ４＋ 緩衝液、ｐＨ ６．５を用いて平衡化する。０〜９０％の非直線状アセトニトリル勾配を、緩衝液２ｍｌ中の上記画分１０ｍｇをカラムに注入した後に適用する。溶出した画分を２８０ ｎｍで検出し、次いで凍結乾燥前に４０℃で真空下に濃縮する。
アセトニトリル濃度１８〜２２％の溶出画分は、生ＢＣＧワクチンで免疫化したモルモットでの遅延型過敏症を顕在化する点で極めて抗原性であり、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは比較的不活性である。
【００６２】
ａ５）  Ｃ１８カラムでの逆相（工程４）
Ｃ１８逆相マイクロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）カラム（Ｂｒｏｗｌｅｃ ｌａｂ． １×２５０ ｍｍ）を、２０ ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯ−ＮＨ４＋ 緩衝液、ｐＨ ６．５を用いて１ ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化する。０〜９０％の非直線アセトニトリル勾配を、カラムに上記の画分を注入した後、適用する。
２２０ ｎｍでのみ検出された画分を約１１％濃度のアセトニトリルで溶出する。この画分（３ ｍｇ）は、生細菌で免疫化したモルモットでの遅延型過敏症反応の顕在化に極めて活性で、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは比較的不活性である。
【００６３】
ｂ）  精製グリコペプチドの生化学的分析
最終精製工程で得た画分を、製造者の指示に従って改変エドマン技術 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ）を用いてシークエンスした。
各試料の組成を、上記のＨｏｒｎらによって記載される条件下で質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 分光計）により分析する。
ｃ）  α−マンノシダーゼでのグリコペプチドの消化
上記の精製グリコペプチド９μｇを６５μｇの１００ ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯ−Ｎａ＋緩衝液、ｐＨ ５に溶解し、次いで、３μｌの１ ｍｇ／ｍｌ α−マンノシダーゼ溶液（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ）、つまり９０ ｍＵのα−マンノシダーゼを加える。全てを消化するように反応を２４時間３７℃でインキュベートし、次いで得られた生成物を真空下で乾燥する。
【００６４】
ｄ）  ペプチドのサブチリジンでの消化
上記の精製グリコペプチド６９０ ｎｇを、５μの１００ ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ ８に溶解し、次いで１μｌの１００μｇ／ｍｌ サブチリジン溶液、つまり約１００ ｎｇを加える。反応を２４時間３７℃でインキュベートし、次いで反応生成物を真空下で乾燥させ、滴定緩衝液（緩衝液Ｄ）に溶解する。
ｅ）  遅延型過敏症アッセイを用いるグリコペプチドの抗原活性の生物学的滴定
未消化又はα−マンノシダーゼもしくはサブチリジンで消化した上記の精製グリコペプチド０．０２μｇを、実施例１に記載のプロトコルにしたがってあらかじめ免疫化したモルモットのバッチに注射する。結果を、紅斑反応直径の値で示す。対照は、１０ＴＵに相当する０．２５μｇのＰＰＤからなる。
ｆ）  インビトロのリンパ球増殖アッセイを用いるグリコペプチドの抗原活性測定
アッセイの条件は、上記のＨｏｒｎらの記載する条件である。
【００６５】
２．  結果
ａ） Ｌｉｐ グリコペプチドの精製及び生化学的分析
精製グリコペプチドについて行った質量測定は、測定が１６２質量単位値異なると、マンノースでおそらくグリコシル化される複雑な分子の存在を示す。α−マンノシダーゼで処理したペプチドの質量に相当する６９５１ Ｄａの質量は、これらの分子の最少質量としてみなされる。
精製グリコペプチドのＮ−末端配列は、主要配列 ＴＩＰＴＴ．．． と少数配列ＩＰＴＴＥ．．．の存在を示している。
これらの結果は、配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がエム．ツベルクローシスの Ｒｖ１７９６遺伝子によってエンコードされるタンパク質由来ペプチドのＮ−末端フラグメントの配列であり、Ｓａｎｇｅｒ ｂａｎｋのエム．ツベルクローシス株Ｈ３７Ｒｖのゲノム配列の注釈に関し、該タンパク質の１６９〜２３９位に伸長している、Ｌｉｐと称されるマンノシル化グリコペプチドに適合している。
【００６６】
ｂ）  遅延型過敏症アッセイを用いるＬｉｐグリコペプチドの抗原活性測定
グリコペプチドは、生細菌で免疫化したモルモットの遅延型過敏症反応の顕在化に極めて活性であり、他方、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは比較的不活性である。
グリコペプチドの抗原活性は、精製工程中に増す：
−  工程１：  得られた画分は、生ＢＣＧで免疫化したモルモットで１８０，０００ ＴＵ／ｍｇ及び熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットで１０，０００ ＴＵ／ｍｇの活性を有する。
−  工程２：  得られた画分は、生ＢＣＧで免疫化したモルモットでは９００，０００ ＴＵ／ｍｇ及び熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは３０，０００ ＴＵ／ｍｇの活性を有する。
−  工程３：  精製画分は、生ＢＣＧで免疫化したモルモットでは１，０００，０００ ＴＵ／ｍｇより大きく、熱不活化ＢＣＧで免疫化したモルモットでは３０，０００ ＴＵ／ｍｇ未満の活性を有する。
【００６７】
図３に示す結果は、
−  ３７℃で２４時間のα−マンノシダーゼの作用は、９５％より高い抗原活性の損失を引き起こす： 脱グリコシル化後、画分は、１，０００，０００ ＴＵ／ｍｇの活性から３０，０００ ＴＵ／ｍｇ未満の活性に低下した、
−  サブチリジンの作用は、抗原活性を廃する、及び
−  等量のタンパク質で、Ｌｉｐグリコペプチドは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ＰＰＤ）由来の標準的な精製タンパク質より少なくとも１０倍活性が高い、ことを示している。
【００６８】
ｃ）  インビトロのリンパ球増殖アッセイを用いるＬｉｐグリコペプチドの抗原活性測定
図４に示す結果は、Ｔ−リンパ球増殖がペプチド濃度に依存していることを示している。この増殖は、Ｔリンパ球がＣＤ４分子に対する抗体で処理される際、又はグリコペプチドがα−マンノースで処理される際、重要ではない。
【００６９】
実施例３： Ａｐａタンパク質をエンコードする裸のＤＮＡでの免疫化による、Ｔエピトープの定義におけるＡｐａのオリゴサッカライド残基の役割の立証
１．  材料と方法
ａ） Ａｐａタンパク質をエンコードする配列を含むプラスミドの構築
サイトメガロウイルス初期プロモーター配列を含むプラスミド ｐＳ６５Ｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｐＥＩで切断し、クレノウ酵素で修復し、次いで連結してプラスミドｐＡＧ８００を得る。
プラスミドｐＡＧ８００を酵素ＡｐａＩで切断して、それ自体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド１２Ｍ４８ （５’ ＣＡＡＣＧＴＴＧＧＧＣＣ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と連結し、プラスミドｐＡＧ８０２を得る。
【００７０】
シグナル配列を欠くＡｐａのコード配列を含む８７５塩基対のフラグメントを、オリゴヌクレオチド２２Ｍ４２ （５’ ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＴＡＧＣＣＧ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と３３Ｍ４４ （５’ ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＣＧ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を用いて、プラスミドｐＬＡ３４−２ （Ｌａｑｕｅｙｒｅｒｉｅ， １９９５， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６３， ４００３−４０１０）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。
オリゴヌクレオチド３３Ｍ４４を、コザック型のコンセンサス翻訳開始部位を含むように合成した（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９８７， １５， ８１２５−８１４８）。ＰＣＲで得たフラグメントをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断し、ＢｇＩＩＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＡＧ８０２に挿入し、プラスミドｐＡＧ８０３を得る。これらの操作中、オリゴヌクレオチド配列５’ ＣＡＡＣＧＴＴＧＧＧＣＣ ３’が失われる； Ｐｓｐ１０４６ ＩＳＳと称されるこの配列は、配列ＩＬ−１２ｐ４０ ＩＳＳ と同様に、免疫反応を増す免疫刺激配列であると考えられる（Ｌｉｐｆｏｒｄ ＧＢら、１９９７， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２７， ３４２０−３４２６）。
【００７１】
Ｐｓｐ１０４６ ＩＳＳ配列を、オリゴヌクレオチド２５Ｍ４６ （５’ ＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２５Ｍ４５ （５’ ＧＡＴＣＣＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）をクローニングすることによってプラスミドｐＡＧ８０３のＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＡＧ８３１を得る。
ＩＬ−１２ｐ４０ ＩＳＳ配列を、オリゴヌクレオチド２４Ｍ６４ （５’ ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣＴ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２４Ｍ６３ （５’ ＡＧＣＧＣＴＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣ ３’； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）をクローニングすることによって、プラスミドｐＡＧ８０３のＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＡＧ８３２を得る。
【００７２】
エシェリキア・コリ株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを形質転換後、上記のプラスミドを、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培養培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９）で増幅する。細菌溶解物をＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ （１％）で処理することによりエンドトキシンを除く先の工程の後、プラスミドＤＮＡを製造者の指示に従ってＭａｘｉＰｒｅｐ ＱＩＡ フィルターカラム（ＱＩＡＧＥＮ）で精製する。
【００７３】
ｂ）  プラスミドｐＡＧ８３１とｐＡＧ８３２でのモルモットの免疫化
わき腹に２回皮内注射することにより、上記のように調製し、精製したプラスミドｐＡＧ８３１又は ｐＡＧ８３２のＤＮＡ ５０μｇで体重３００〜４００ｇのモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）を免疫化する。
対照は、実施例１又は実施例２に記載される条件下で生ＢＣＧで免疫化したモルモットの群からなる。
【００７４】
ｃ）  遅延型過敏症アッセイを用いる、裸のＤＮＡで免疫化したモルモットにおける真核細胞により産生されるＡｐａタンパク質の抗原活性測定
免疫化から１〜２ヶ月後に、遅延型過敏症反応を、天然のＡｐａタンパク質又はエシェリキア・コリの形質転換株で産生される組換えＡｐａタンパク質に対して測定し、タンパク質を上記のＨｏｒｎらに記載されるプロトコルにしたがって精製する。
天然のＡｐａ及び組換えＡｐａを、滴定緩衝液（緩衝液Ｄ） １００μｌ中０．２μｇ用量で皮内注射する。抗原活性を、実施例２に記載されるように測定する。
【００７５】
２．  結果
図５に示す結果は以下のとおりである：
・  真核プロモーターの制御下でＡｐａのコード配列を含むプラスミドｐＡＧ８３１又はｐＡＧ８３２で免疫化したモルモットは、天然のＡｐａタンパク質に対する免疫反応（抗原とまとめられる際には、遅延型過敏症アッセイ又はインビトロＴ−リンパ球増殖アッセイを用いて測定できる抗体及びＣＤ４＋ 型のＴ−反応）を多くの場合に生ずる。天然のＡｐａ抗原に相当する動物では、酵素経路を介して脱グリコシル化される抗原又はイー．コリ由来の非グリコシル化組換え抗原に対するＣＤ４＋ Ｔ リンパ球の反応は、グリコシル化天然抗原で見られる反応と同一の強度である。
・  他方、生ＢＣＧで免疫化したモルモットは、天然のＡｐａに対してのみ遅延型過敏症反応を示す。これらの動物は、上記のようにイー．コリで産生される非グリコシル化組換えＡｐａに対し、反応を生じないか、又はかなり低下した反応を生ずる。
【００７６】
これらの結果は、以下のことを示している：
１）   Ａｐａをエンコードする裸のＤＮＡで免疫化した動物で認められる結果は、マクロファージ又は樹状細胞によるＡｐａタンパク質の食菌及び提示能力が、天然又は組換えの（非グリコシル化）Ａｐａタンパク質と同一であることを示している、
２）  生ＢＣＧで免疫化した動物で認められる結果と上記の結果の組み合わせは、脱グリコシル化Ａｐａタンパク質に対する反応の不在は、マクロファージ又は樹状細胞によるその提示能力の低下ではなく、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球による認識不在に起因していることを示している。その結果、エム．ツベルクローシス又は生ＢＣＧによって産生されるような、天然型のＡｐａ又はＬｉｐタンパク質の側鎖のオリゴマンノース残基は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球によって認識されるＴエピトープの構成で役割を果たしている。
【００７７】
実施例４：グリコシル化ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の調製
１）  グリコシル化シントン１５、１６及び１９の調製
ペプチド合成の前に、グリコシル化シントン、つまり２又は３個のマンノース残基で官能化したトレオニンを調製する。
・  化合物５及び８の調製（図６）
化合物５及び８の調製は、それぞれＨ． ＦＲＡＮＺＹＫら（Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １， １９９５， ２８８３−２８９８）及びＲ．Ｋ． ＮＥＳＳら（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ， １９５０， ７２， ２２００−２２０５）に記載されている。
市販の過アセチル化マンノース１ （つまり、１，２，３，４，５−ペンタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノース）を、Ａ． ＬＥＶＥＮＥら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９３１， ９０， ８９−９８）によって記載されるように、酢酸中の臭化水素の作用によりアノマー位で臭素化する。活性化中間体２を、２，６−ジメチルピリジン／メタノール混合物でオルソエステル３に環化する。１０％水性トリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物中で０℃での酸加水分解によるオルソエステルの位置選択的な開環は、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノース（５）を生じる。位置異性体４も単離される。
【００７８】
市販のマンノース６は、ピリジン中の塩化ベンゾイルの作用により７に過ベンゾイル化される。後者は、酢酸中の臭化水素の作用により８に活性化される。しかし、このプロトコルと以下の方法では、臭化水素の作用による以外の活性化方法、例えば当業者に公知の方法を用いてもよい。
・  二糖１０及び１２の調製（図７ａ）
化合物１０及び１２の調製は、それぞれＡ． ＪＡＮＳＳＯＮら（Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １， １９９２， １６９９−１７０７）及びＨ． ＦＲＡＮＺＹＫら（同節）に記載されている。化合物２及び５は、ジクロロメタン中でトリフルオロメタンスルホネート銀（又はいずれかの他の縮合反応プロモーター）の存在下で縮合され、過アセチル化二糖９を生じ、次いで酢酸中の臭化水素の作用により臭素化前駆体に活性化する。同一のプロトコルによれば、化合物５及び８は、縮合されて化合物１１を生じ、それ自体１２に活性化される。
【００７９】
・  三糖１８の調製（図７ａ）
活性化二糖１２を、ジクロロメタン中のトリフルオロメタンスルホネート銀の存在下で単糖アクセプター５に縮合し、過アセチル化三糖１７を生じ、次いでこれを酢酸中の臭化水素の作用により臭素化前駆体１８に活性化する。
・  ２つのマンノース単位を有するシントン１５ならびに１６、及び３つのマンノース単位を有するシントン１９の調製（図７ｂ）
Ｉ． ＳＣＨＯＮら（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， １９８６， ３０３−３０５）に記載されるように、第一級アミン官能基がＦｍｏｃ基で保護されている市販のトレオニン１３の酸官能性を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）の存在下でペンタフルオロフェノール（ｐｆｐ）の作用によりエステルの形態で阻害し、アクセプター前駆体１４を生じる。
【００８０】
シントン１５及び１６の調製は、それぞれＡ． ＪＡＮＳＳＯＮら（同節）及びＨ． ＦＲＡＮＺＹＫら（同節）により記載されている。ジクロロメタン中のトリフルオロメタンスルホネート銀の存在下で行なわれる活性化二糖１０及び１２との化合物１４の縮合は、それぞれシントン１５及び１６を生じる。同じプロトコルによれば、化合物１４と活性三糖１８との縮合は、シントン１９を生じる。
【００８１】
２）  グリコシル化ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 及び ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の調製
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いて固相で合成される。ペプチド合成は、所望の配列を生産する一方、ペンタフルオロフェノールの活性化エステルの形態のグリコシル化シントン（シントン１５、１６及び１９）を挿入するために必要なアミノ酸を用いて自動合成機行われる。
使用されるシントンに応じて、２つのマンノース残基で官能化（ペプチド合成中のシントン１５及び／又は１６の挿入）されるトレオニンからなるペプチド又は３つのマンノース残基で官能化（ペプチド合成中のシントン１９の挿入）されるトレオニンからなるペプチド又は２つのマンノースで官能化されるトレオニンと３つのマンノース残基で官能化（ペプチド合成中のシントン１９及び１５及び／又は１６の挿入）されるトレオニンの双方を含むペプチドのいずれかが得られる。
【００８２】
合成の最後に、トリフルオロ酢酸を用いて固体支持体からペプチドを切断し、種々のアミノ酸及びマンノースのヒドロキシル官能性を脱保護した後、ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製する。その構造を、当業者に公知の技術、例えば質量分析及びアミノ酸分析を用いて制御する。
次に、当業者に公知の有機化学技術を用いる化学合成により、アミド官能性（ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＣ−末端位）ならびにアセテート官能性（ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のＮ−末端位）を導入する。
【００８３】
実施例５： イー．コリで産生されるＡｐａペプチドでの免疫化による、Ｔエピトープの定義におけるＡｐａのオリゴサッカライド残基の役割の立証
１）  材料と方法
当業者に周知のイー．コリにおける組換えタンパク質のクローニング、発現及び精製の従来技術（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡＵＳＵＢＥＬ， ２０００， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ， Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， ＵＳＡ）に記載されるプロトコル参照）にしたがって、Ａｐａの２５０〜２８０位に相当するペプチドをボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のサイクラーゼのフラグメントとの融合体の形態でイー．コリで産生した。
体重３００〜４００ｇの５頭のＨａｒｔｌｅｙモルモットの３群を、アジュバント溶液０．１ｍｌ中のこの精製Ａｐａペプチド２０μｇを用いて、１ヶ月空けて２回皮内注射し、免疫化した。
【００８４】
実施例１に記載される条件下で生ＢＣＧで予め４ヶ月間免疫化した４頭のモルモット３群を、対照として用いる。
免疫化から１〜２ヶ月後、遅延過敏症反応を、天然のＡｐａタンパク質、イー．コリで産生される組換えＡｐａタンパク質及び実施例１に記載されるようにして調製された脱グリコシル化Ａｐａタンパク質に関して、実施例３に定義する条件下で測定した。
【００８５】
２）  結果
Ａｐａ融合ペプチド又は生ＢＣＧで免疫化したモルモットの遅延過敏症反応を、天然のＡｐａタンパク質、イー．コリで産生される組換えＡｐａタンパク質及び脱グリコシル化Ａｐａタンパク質に関して測定した。紅斑反応の直径（ｍｍ）で表された結果を、以下の表１に示す：
【００８６】
【表１】
2004520317.tif 000007
【００８７】
上記の表１に示すように、生ＢＣＧで免疫化したモルモットで見られる遅延過敏症反応は、天然のＡｐａ分子の注射後に著しい。反応は、化学的に脱グリコシル化した分子又はイー．コリで産生される分子の注射後に極めて弱いか、あるいはない。他方、ボルデテラ・ペルツシスのサイクラーゼフラグメントとＡｐａ分子の内部フラグメントとの融合に相当する組換え分子で免疫化したモルモットについては、感作は、天然分子又は脱グリコシル化分子に対して同一である。
【００８８】
これらの結果は、Ａｐａ分子のグリコシル化Ｔエピトープが、生細菌で免疫化されたモルモットによって選択的に認識されることを示している。また、結果は、モルモットによる脱グリコシル化分子の認識の不在又は低下は、これらの分子の低下した固有の抗原性に伴わないことを示している。
上記から明らかであるように、この発明は、より具体的に記載したにすぎないその実施方法、調製及び適用にいかなる方法でも制限されない； 逆に、本発明は、本発明の概要又は範囲を逸脱しない限り当業者に起こりうる全ての変形を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、遅延型過敏症アッセイを用いる、エム．ツベルクローシスから精製した天然のＡｐａの抗原活性測定を、α−マンノシダーゼによるＡｐａタンパク質の消化動態の関数として示す。結果は、時間の関数としてタンパク質ｍｇ当たりのツベルクリン単位で示す。
【図２】
図２は、α−マンノシダーゼでのＡｐａタンパク質の消化動態の関数として、Ａｐａ分子のマンノース組成の質量分析を示す。Ａｐａタンパク質の各ピークに相当するマンノース残基数を示し、Ａｐａ消化産物の全体的な抗原活性を研究した種々の時間で示す。
【図３】
図３は、遅延型過敏症アッセイを用いる、Ｒｖ １７９６タンパク質由来のＬｉｐと命名されるグリコペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の抗原活性測定を示す。エム．ツベルクローシス（ＰＰＤ）由来の標準的な精製タンパク質を０．１ｍｌ中０．２５μｇ用量で正の対照として用いる。Ｌｉｐペプチドを０．１ｍｌ中０．０２μｇ用量で用いる。α−マンノシダーゼ又はサブチリシンで処理したＬｉｐペプチドは、同一用量ではネガティブである。結果を紅斑反応直径により示す。
【図４】
図４は、インビトロのリンパ球増殖アッセイを用いる Ｌｉｐペプチドの抗原活性を示す。Ｔリンパ球によるグリコシル化Ｌｉｐペプチド（天然 Ｌｉｐ）の認識を、脱グリコシル化ペプチド（Ｌｉｐ ＋ α−マンノシダーゼ）又は抗−Ｔ−リンパ球 ＣＤ４＋レセプター抗体と組み合わさったＬｉｐペプチド （Ｌｉｐ ＋ 抗Ｃｄ４）の認識と比較する。
【図５】
図５は、遅延型過敏症アッセイを用いる、エム．ツベルクローシスから精製した天然のＡｐａ （天然Ａｐａ）又はイー．コリで産生される脱グリコシル化組換えＡｐａ （イー．コリｒＡｐａ）の抗原活性測定を、モルモットの免疫化の関数として示す。後者を、皮内注射される生ＢＣＧ又はサイトメガロウイルス初期プロモーターのコントロール下に位置するＡｐａのコード配列を含むプラスミドｐＡＧ８３１もしくはｐＡＧ８３２で予め免疫化した。プラスミドでのモルモットの免疫化は、遅延型過敏症反応によって発現され得る感作を生ずる。この反応を生ずるには２つの型の抗原は等価であるが、ＢＣＧでの免疫化後には、グリコシル化された天然のＡｐａのみが抗原性である。
【図６】
図６は、α−（１，２）結合を介して結合する２又は３個のマンノース残基からなる単位の調製を示す。
【図７】
図７ （７ａ 及び７ｂ）は、２又は３個のマンノース単位で官能化されたトレオニンの調製を示す。
【図１】
2004520317.tif 000013
【図２．１】
2004520317.tif 000014
【図２．２】
2004520317.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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