(57)【要約】本発明は、ヒト白血病のインビボ・モデルの作成方法を提供する。該方法には：げっ歯動物に致死量に近い照射を施すことおよび有効な前処置量のヒト胎児臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣｓ）を注射することにより免疫欠損げっ歯動物を前処置すること；該げっ歯動物を約５〜１０日間維持すること；および移植に有効な量の一次ヒト白血病細胞を該げっ歯動物に注射すること；が含まれる。また、ヒト白血病のインビボおよびインビトロ・モデルも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血病のインビボ・モデルの作成方法であって、
ａ）げっ歯動物に致死量に近い照射を施すことおよび有効な前処置量のヒト胎児臍帯血由来の単核細胞を注射することにより免疫欠損げっ歯動物を前処置すること；
ｂ）約５〜１０日間、ステップａ）からのげっ歯動物を維持すること；
ｃ）移植に有効な量の一次ヒト白血病細胞をステップｂ）からのげっ歯動物に注射すること；
を含む方法。
【請求項２】
免疫欠損げっ歯動物が免疫欠損マウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫欠損マウスがＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
致死量に近い照射の適用が、約３５０ラドの全身ガンマ線照射でげっ歯動物を照射することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
移植に有効な量の一次ヒト白血病細胞が約１０６から約１０７細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一次ヒト白血病細胞がＴ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前処置に有効な量のヒト胎児臍帯血単核細胞が約１０６から約１０８細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
単核細胞が幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１により製造された、ヒト白血病のインビボ・モデル。
【請求項１１】
移植されたヒト白血病細胞を有する、免疫欠損げっ歯動物。
【請求項１２】
白血病開始細胞が白血病移植げっ歯動物において維持されている、請求項１１に記載のげっ歯動物。
【請求項１３】
マウスである、請求項１２のげっ歯動物。
【請求項１４】
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスである、請求項１３のマウス。
【請求項１５】
照射され、ヒト胎児臍帯血単核細胞を注射され、そして次いでヒト一次白血病細胞を注射された、請求項１１に記載のげっ歯動物。
【請求項１６】
移植された白血病細胞がげっ歯動物の骨髄および脾臓において見出される、請求項１１のげっ歯動物。
【請求項１７】
ヒト白血病のインビボ・モデルの作成方法であって、
ａ）げっ歯動物に致死量に近い照射を施すことおよび有効な前処置量の骨髄由来の幹細胞をげっ歯動物に注射することにより該免疫欠損げっ歯動物を前処置すること；
ｂ）約５〜１０日間、ステップａ）からのげっ歯動物を維持すること；
ｃ）移植に有効な量の一次ヒト白血病細胞をステップｂ）からのげっ歯動物に注射すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書中に報告されたいくつかの研究を援助するために使用された資金は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ ＤＫ４０２１８）により提供された。したがって、米国政府は本明細書中に開示された発明に関して一定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明の分野は白血病である。さらに特には、本発明はヒト白血病のインビボげっ歯動物モデルを含むヒト白血病のモデルに関する。
【０００３】
本発明の背景
Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）はＡＬＬの２０％までを占め（Ｋｅｒｓｅｙ ＪＨ．， Ｂｌｏｏｄ １９９７； ９０： ４２４３−４２５１）、ＡＬＬは子供において最もありふれたタイプの癌である。分子レベルでＴ−ＡＬＬの生物学をより理解することによって、白血病の特定の生物学的特徴を活用する選択的治療の開発が促進され、それによってこの疾患の外観が改善される。多くのＴ細胞起源の白血病細胞系が患者から確立されてきたけれども（Ｇｊｅｒｓｅｔ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９０； ５０： １０−１４； Ｓｍｉｔｈ ＳＤ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９７８； ５２： ７１２−７１８； Ｌａｎｇｅ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９８７； ７０： １９２−１９９； ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ ＳＤ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８４； ４４： ５６５７−５６６０）、患者からの白血病細胞の一次培養を維持することの困難さにより、該疾患の進行の研究が妨げられてきた。
【０００４】
白血病前駆細胞は白血病芽球ポピュレーションの維持および拡大に関係する（Ｕｃｋｕｎ ＦＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８８； １４０： ２１０３−２１１１； Ｕｃｋｕｎ ＦＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９０； ７６： １７２３−１７３３）。これらのクローン生成（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）芽球は、ＡＬＬ患者由来の骨髄または末梢血芽球細胞の容積の０．０５〜１．５％からなり（Ｕｃｋｕｎ ＦＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８８； １４０： ２１０３−２１１１； Ｔｏｕｗ Ｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９８６； ６８： １０８８−１０９４）、特定の増殖因子に応答して半固形培地中で増殖しコロニーを形成するそれらの能力に基づいて同定される（Ｔｏｕｗ Ｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９８６； ６８： １０８８−１０９４； Ｔｏｕｗ Ｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９８５； ６６： ５５６−５６１）。コロニー形成芽球細胞は、インビボＡＬＬ芽球前駆細胞のインビトロ対応物を表すと一般に考えられている（Ｕｃｋｕｎ ＦＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８８； １４０： ２１０３−２１１１）。これらのインビトロの研究にもかかわらず、白血病開始細胞（ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）は最近までインビボで明らかにされていなかった（Ｈｏｌｙｏａｋｅ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９９； ９４： ２０５６−２０６４； Ａｉｌｌｅｓ ＬＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７； ３： ７３０−７３７； ａｎｄ Ｔｅｒｐｓｔｒａ Ｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９６； ８７： ２１８７−２１９４）。
【０００５】
患者のサンプルから直接的にＮｏｎｏｂｅｓｅ Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｘ Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ （ＮＯＤ／ｓｃｉｄ） マウスのような免疫欠損げっ歯動物へとＴ−ＡＬＬ細胞を移植するための能力は、それ自体、ならびに該疾患の臨床的方針を予測し、残りの疾患を発見し、そして個別の治療的戦略を開発するのに独特の価値がある。Ｔ−ＡＬＬの丈夫なインビボ・マウス・モデルが利用できることにより、対応する白血病開始細胞の特徴づけならびに白血病に細胞の階層（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）の分類が促進されるであろう。致死量に近い照射を受けた免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスのヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣｓ）での前処置は、診断時に患者から採取した一次Ｔ−ＡＬＬ細胞のこれらのマウスにおける後の移植を容易にする。極めて詳しく言えば、本発明はヒト白血病移植の新規インビボ・モデルを提供する。データにより、移植のレベルが臍帯血ＭＮＣｓおよび注射されたＴ−ＡＬＬの両方の数に依存することが示される。さらに、データにより、白血病の播種（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）のパターンに関して、ならびに白血病移植マウスにおける白血病開始細胞の維持に関してヒトの病理学に対する該モデルの適合度が示される。該データにより、また、臍帯血前処置ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスがＴ−ＡＬＬ以外のヒト白血病の研究に適用可能であることの証拠が提供される。
【０００６】
本発明の要約
本発明は、ヒト白血病のインビボ・モデルの作成方法を提供する。該方法には：げっ歯動物に致死量に近い照射を施すことおよび有効な前処置量のヒト胎児臍帯血由来の単核細胞（ＭＮＣｓ）を注射することにより免疫欠損げっ歯動物を前処置すること；該げっ歯動物を３〜１２日間、好ましくは約５〜１０日間、さらに好ましくは約６〜９日間維持すること；移植に有効な量の一次ヒト白血病細胞を該げっ歯動物に注射すること；が含まれる。１つの実施態様において、臍帯血ＭＮＣｓは間葉系幹細胞を含むストローマ細胞である。
【０００７】
免疫欠損げっ歯動物は、好ましくは免疫欠損マウス、さらに好ましくはＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスである。マウスの前処置には、２つのステップが含まれる。第１に、マウスに、致死量に近いガンマ線を照射する。該照射は全身照射である。好適な致死量に近い照射量は、約２００〜約５００ラドである。さらに好ましくは、該照射量は約３００〜約４００ラド、いっそうさらに好ましくは約３５０ラドである。
【０００８】
照射の直後に、正常ヒト対象由来の胎児臍帯血からの単核細胞をマウスに注射する。好ましい有効な数の単核細胞は、約１０６〜約１０８個の細胞である。さらに好ましくは、約１０〜２５ｘ１０６個の細胞が注射される。前処置の約１週間後に、生存能力のある一次ヒト白血病細胞をマウスに注射する。好適な数の一次白血病細胞は、約１０６〜約１０７個の細胞である。とりわけ好適な数の一次白血病細胞は、１〜５ｘ１０６個の細胞である。
【０００９】
関連する観点において、ヒト白血病のインビボ・モデルは骨髄由来のストローマ細胞を用いて上記のように製造され得る。骨髄のストローマ細胞は、間葉性の幹細胞を含む。本発明の方法において、前処置剤として任意の幹細胞、とりわけ間葉系幹細胞が使用され得る。本発明は、また、本発明の方法により製造されたヒト白血病のインビボ・モデルを提供する。
【００１０】
別の観点において、本発明はヒト白血病細胞を移植された免疫欠損げっ歯動物を提供する。好ましくは、免疫欠損げっ歯動物は免疫欠損マウスであり、さらに好ましくはＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスである。マウスを照射し、ヒト胎児臍帯血由来の単核細胞を注射し、次いでヒト一次白血病細胞を注射する。本発明の別の観点において、照射されたマウスに臍帯血または骨髄由来の間葉系幹細胞を注射し、次いでヒト一次白血病細胞を注射する。移植された白血病細胞は、マウスの骨髄または脾臓において見られる。
【００１１】
前処置されたげっ歯動物における白血病の有効な移植およびその後の拡大は、分子レベルで拡大に至るそしてそれを含むすべての事象を扱う生体ウインドウを提供する。前処置されたげっ歯動物における移植一次白血病細胞の播種は、ヒトの病理学に関する知見とよく似ている。一次細胞の移植レベルは、前処置された細胞（例えばＭＮＣｓ、幹細胞）の数の増加、および注射された一次白血病細胞の数の増加、の両方にしたがって増加する。
【００１２】
関連する実施態様において、本発明は抗がん剤のスクリーニング方法を提供する。特に、該スクリーニング方法は、抗白血病薬または剤をスクリーニングするために使用され得る。本方法は、推定されている抗白血病剤を本発明の動物モデルに投与するステップ、およびモデルにおける白血病の進行に対するその薬剤の効果をモニターするステップを含む。
【００１３】
図面の簡単な説明
本明細書の一部を構成する図面において、
図１はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの臍帯血前処置のため、および一次ヒト白血病の移植の分析のためのプロトコールを示す。
【００１４】
図２は一次Ｔ−ＡＬＬ細胞を注射された臍帯血前処置マウス由来の白血病移植骨髄および脾臓を示す。マウスを、骨髄（Ａ）および脾臓（Ｂ）におけるＴ−ＡＬＬのフローサイトメトリーにより分析した。各図において、点を付した（ｆｉｌｌｅｄ）ヒストグラム曲線は適用された実験のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対応し、そしてそれをイソタイプのコントロールｍＡｂに対応する点のない（ｏｐｅｎ）ヒストグラムに重ねる。実験のｍＡｂに関して陽性に染色された細胞のフラクションを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ３．２．１ソフトウエアを用いて、該曲線を差し引くことにより測定した。ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ７＋、およびＣＤ１９＋の百分率を各図において示す。
【００１５】
図３はあるシリーズの一次Ｔ−ＡＬＬドナーのマウス骨髄における一次Ｔ−ＡＬＬの移植を示す。Ｔ−ＡＬＬ移植レベルをＣＤ４５、ＣＤ７、およびＣＤ５の発現に基づいてフローサイトメトリーにより測定した。
【００１６】
図４は、マウスの骨髄および脾臓における移植のレベルが、臍帯血ＭＮＣｓの数およびＴ−ＡＬＬ細胞の数の両方に依存することを示す。（Ａ）において、２．５ｘ１０６個の一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の７日前に、示された数の臍帯血ＭＮＣｓをマウスに注射した；Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の６週間後に、マウスを分析のために屠殺した。（Ｂ）において、示された数の一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の７日前に、１０ｘ１０６個の臍帯血ＭＮＣｓをマウスに注射した；Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の６週間後に、マウスを分析のために屠殺した。移植された骨髄（□−□−□）および脾臓（・−・−・）におけるＴ−ＡＬＬの百分率を、それぞれの場合においてＣＤ７＋ＣＤ５＋細胞、一次ＴＡＬＬの表現型としてフローサイトメトリーにより測定した。
【００１７】
図５は、白血病移植マウスにおけるＴ−ＡＬＬ白血病開始細胞の維持を示す。（Ａ）において、第１のマウスに、患者から採取した一次Ｔ−ＡＬＬ細胞を注射した。しかしながら、（Ｂ）において、第２のマウスに（Ａ）のマウスから回収した移植脾臓におけるＴ−ＡＬＬを注射した。特に、（Ａ）において、１．６ｘ１０６個の一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の９日前に、マウスに１０ｘ１０６個の臍帯血ＭＮＣｓを注射した；Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の７週間後に、マウスを分析のために屠殺した。（Ｂ）において、（Ａ）のマウスから回収された移植脾臓から得られた示された数のＴ−ＡＬＬ細胞の注射の８日前に、マウスに２５ｘ１０６個の臍帯血ＭＮＣｓを注射した；Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の５週間後に、マウスを分析のために屠殺した。移植された骨髄におけるＴ−ＡＬＬの百分率をＣＤ７＋ＣＤ５＋およびＣＤ７＋Ｖβ２＋細胞としてフローサイトメトリーにより測定した。ＣＤ７およびＴＣＲ Ｖβ２プロフィールを本図により示す。
【００１８】
図６は、臍帯血前処置マウスにおける一次小児Ｂ−ＡＬＬの移植を示す。特に、５ｘ１０６個の一次Ｂ−ＡＬＬ細胞の注射の９日前に、マウスに２５ｘ１０６個の臍帯血ＭＮＣｓを注射した。Ｂ−ＡＬＬ細胞の注射の６週間後に、マウスを分析のために屠殺した。骨髄（Ａ）および脾臓（Ｂ）における移植されたＢ−ＡＬＬの百分率をＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞としてフローサイトメトリーにより測定した。
【００１９】
本発明の詳細な説明
本発明は、ヒト白血病のインビボ動物モデルを含む白血病のモデルを提供する。インビボ・モデルでの使用に好適な動物は、げっ歯動物、さらに特にマウスである。該げっ歯動物は免疫欠損である。すなわち、該動物は損傷（ｉｎｓｕｌｔ）に対して免疫応答で対応する通常の能力を欠いている。多くの免疫欠損げっ歯動物モデルが当分野においてよく知られている。とりわけ好適な免疫欠損動物は、重症複合免疫欠損マウス（ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ）（ｓｃｉｄ ｍｏｕｓｅ）である。このようなｓｃｉｄマウスを取得する方法は当分野において周知である。本発明における使用にとりわけ好適なｓｃｉｄマウスは、Ｎｏｎｏｂｅｓｅ Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｘ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ （ＮＯＤ／ｓｃｉｄ） マウスである。
【００２０】
免疫欠損動物は、移植ヒト白血病細胞を含む。本明細書での使用において、「移植された（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ）」およびその文法的に等価な用語は、生命体全体を移動した、特定の組織にされた細胞を意味する。移植された白血病細胞は、動物モデルのいたるところで発見される。さらに特に、移植された白血病細胞は、肝臓（門脈および間葉領域）、腎臓（血管周囲および糸球体周辺間隙）、肺（実質組織）、胸腺、副腎および末梢血において見出される。最も多数の移植細胞が見出されるのは、造血組織、骨髄および脾臓においてである。
【００２１】
本発明にしたがう白血病のインビボ・モデルは、種々の用途を有する。１つには、該モデルは白血病発生の研究のために使用され得る。２つ目には、該モデルは、さまざまな処置の有効性を試験するためのビヒクルとして役立ち得る。３つ目には、該モデルは、推定される抗白血病治療剤をスクリーニングするためのビヒクルとして使用され得る。４つ目には、該モデルは診断／研究目的のために、患者の白血病細胞を継続的に拡大させるための手段として役立ち得る。ヒト白血病のインビボ動物モデルを作成する方法の詳細な記述は、本明細書に後記する。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（Ｓｃｈｕｌｔｚ ＬＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５； １５４： １８０−１９１）を、抗生物質が入っていない滅菌性 Ｍｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｏｒ ケージおよび通風性マウス・ラック（Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓｅａｆｏｒｄ， ＤＥ）中の Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 飼育器にて特定の病原体がいない環境下で飼育および維持した。いずれかの性（しかし、所定の実験にマッチさせた）別の５〜６週齢のマウスを、本研究において使用した。
【００２２】
ヘパリン処理した末梢血または骨髄サンプルを、プロトコール＃９４００ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐに登録された小児Ｔ−ＡＬＬを有する患者から採取した。同様のサンプルを、また、小児Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）または急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）を有する患者から採取した。１つの研究において、末梢血／骨髄からの単核細胞（ＭＮＣｓ）のフラクションを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）により単離した。Ｗｒｉｇｈｔ染色により測定されるように、リンパ芽球の量は一般的に＞９０％である。いくつかの場合において、白血病サンプルのＭＮＣｓを低温保存し、本研究における使用の前に液体窒素中で保存した。トリパンブルー染色排除により測定されるように、解凍後の生存率は一般的に８０％以上であった。胎児の臍帯血サンプルは、我々のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより認められている手順に従って、廃棄される予定の臍の緒から採取された。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離後、ＭＮＣｓを回収し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。臍帯血を、下記のように注射のために使用した。
【００２３】
第２の研究において、臍の緒のＭＮＣｓを培地中に置き、そこで、間葉系幹細胞を含む細胞の接着層を観察した。ヒト臍帯血ＭＮＣｓを１０％ウシ胎児血清／ＲＰＭＩ １６４０培地中に１．５ｘ１０６細胞／ｍｌにて播き、培地を毎週変えながら２週間培養した。細胞のうちあるものは、培養プレートに接着した。これらの接着細胞は、骨芽細胞および含脂肪細胞を含むさまざまな細胞へと分化することができる間葉系幹細胞を含むことが評価および発見された。これらの間葉系幹細胞を、下記の前処置において単離および使用した。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの前処置のプロトコールおよび一次ヒト白血病の移植の分析を図１に概略する。白血病の移植の前に、マウスに１３７Ｃｓγ−照射器からの３５０ラドの全身照射をした。その直後に、０．２５ｍｌ滅菌ＰＢＳ中の１０〜２５ｘ１０６個の細胞を、尾静脈を通して注射した。６〜９日後、患者からの１〜５ｘ１０６個の生存力のある一次白血病細胞を０．２５ｍｌ ＰＢＳ中に懸濁させ、尾静脈を通して注射した。所定の実験に関しては、単一のドナーからの白血病細胞をすべてのマウスに使用した。実験マウスは、典型的に、２〜４の複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）として準備した。マウスを、播種した白血病により瀕死となるかまたは白血病細胞の注射の５〜７週間後に選択的に屠殺した。死体解剖を実施し、そして、マウスの組織における白血病細胞の負荷を、下記のようにフローサイトメトリーおよび細胞組織化学により測定した。
【００２４】
さまざまなマウス組織の全体的な試験を、屠殺直後の開腹後に行った。マウスからの複数の組織（肝臓、腎臓、肺、および脳を含む）を水緩衝性のジンク・ホルマリン（Ｚ−ｆｉｘ；Ａｎａｔｅｃｈ， Ｂａｔｔｌｅ Ｃｒｅｅｋ， ＭＩ）中で常法により固定し、脱水し、そしてパラフィン中に埋め込んだ。４μｍ組織切片を有するガラススライドを調製し、ヘマトキシリン／エオシンで染色した。マウスの骨髄を大腿骨および脛骨から回収した。単一細胞の懸濁液を、穏やかなピペッティングにより調製した。脾臓細胞を穏やかな解離により回収した。骨髄および脾臓細胞懸濁液中の赤血球細胞を、緩衝性塩化アンモニウムを用いて溶解させた。細胞の破片を、滅菌ナイロン細胞ろ過器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）でのろ過により除去した。マウス骨髄および脾臓からの単一細胞懸濁液のマルチ・パラメーター分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。２色免疫蛍光法を、ヒト白血病細胞を同定するために使用した。
【００２５】
フルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−またはフィコエリトリン（ＰＥ）−結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を、ＰＥ−結合抗 Ｖ β２（クローン ＭＰＢ２Ｄ５， Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）以外は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入した。ここに示された実験において使用されるｍＡｂｓには、ヒトＣＤ５（ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ２）、ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ１９（ＨＩＢ １９）、ＣＤ３３（ＷＭ５３）、およびＣＤ４５（ＨＩ３０）に対するものが含まれる。分析中に、赤血球細胞および破片を前角および９０°側方散乱に基づいて除去（ｇａｔｅ ｏｕｔ）した。各サンプルに関して少なくとも１５，０００イベントを集めた。イソタイプに適合するコントロールｍＡｂｓ［ＦＩＴＣ−またはＰＥ−結合ＩｇＧＩ（クローン ＭＯＰＣ０２１）］を使用して、分析に適したカーソル・セッティングを決定した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ３．２．１ ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、データを分析し、２次元プロットおよび１次元ヒストグラムにより表した。
【００２６】
致死量に近い照射をされた免疫欠損ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスをヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣｓ）で前処置することにより、Ｔ−ＡＬＬを有する患者から得られた一次白血病細胞のこれらのマウスへのその後の移植が促進される。図１において概略を示したように、このモデルにおいて、患者から得られた一次白血病細胞の注射の約１週間前に、照射されたＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにヒト臍帯血ＭＮＣｓを注射する。次いで、マウスを約６週間後に屠殺し、白血病細胞の移植レベルを測定する。フローサイトメトリーにより評価されるように、Ｔ−ＡＬＬ移植マウスの骨髄および脾臓の典型的なプロフィールを図２に示す。ＣＤ４５の発現は、総合的な造血細胞移植を示す。ＣＤ７は、移植されたヒトＴ−ＡＬＬにより発現される。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統の移植されたヒト細胞を示す。この実験に関して、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋移植Ｔ−ＡＬＬ細胞は、図２において示された対応するヒストグラムにより示されるように、骨髄の約８３％および脾臓の６８％を含む。特に、Ｔ−ＡＬＬ移植細胞においては非常に少数のＣＤ１９＋細胞（骨髄において約２％および脾臓において４％）が存在し、このことは、Ｔ−ＡＬＬの拡大が移植臍帯血ＭＮＣｓから分化する通常のＣＤ１９＋細胞の拡大を追い越すことを示唆している（Ｖｏｒｍｏｏｒ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９４； ８３： ２４８９−２４９７； Ｈｏｇａｎ ＣＪ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９７； ９０； ８５−９６； Ｋｏｌｌｍａｎｎ ＴＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９４； ９１： ８０３２−８０３６； Ｙｕ Ｊ．， Ｉ Ｆｏｒｍｏｓ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９９６； ９５： ２８１−２９３； ａｎｄ Ｐｆｌｕｍｉｏ Ｆ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １９９６； ８８： ３７３１−３７４０）。ある場合において、移植された細胞が注射された一次Ｔ−ＡＬＬ由来であることのさらなる確認は、ＴＣＲ Ｖβ遺伝子利用分析により実施される。同様の結果が間葉系幹細胞を用いる研究から得られ、このことにより、ヒト白血病細胞の移植が促進されていることが示される。
【００２７】
本研究により、また、ある範囲の注射されたＴ−ＡＬＬ細胞数にわたって、シリーズの一次Ｔ−ＡＬＬドナーのためのマウス骨髄におけるＴ−ＡＬＬ移植のレベルの特徴が表される（図３）。これらの研究において、８つの異なる一次Ｔ−ＡＬＬドナーを使用した。マウスの骨髄における効率的な移植は、典型的に、臍帯血で処置されたマウスへの１〜５ｘ１０６個の一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の注射の６週間後に観察される（図３）。次いで、本研究は、マウスの骨髄および脾臓における６週間での移植のレベルが臍帯血ＭＮＣｓの数および注射された一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の数に依存するかどうかの問題を扱う（図４）。図４において、同一のＴ−ＡＬＬドナーであるが臍帯血のドナーは異なる２つの実験が行われた。図４Ａにおいて、６週間でのマウスの骨髄および脾臓におけるＴ−ＡＬＬ移植レベルが前処置に使用された臍帯血細胞の数に依存することが明らかである。同様に、図４Ｂから、６週間での骨髄および脾臓におけるＴ−ＡＬＬ移植レベルが、注射された一次Ｔ−ＡＬＬ細胞の数に依存することが明らかである。
【００２８】
Ｔ−ＡＬＬ転移の研究および対応する治療的介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）のための本マウス・モデルの適当な利用を扱うために、Ｔ−ＡＬＬの播種のプロフィールを、移植された臍帯血前処置マウスにおいて測定した。肝臓において、門脈および間葉領域で白血病細胞の著しい湿潤が存在する。腎臓において、ヒト白血病細胞は血管周囲および糸球体周辺間隙に凝集する。肺において、白血病細胞は実質組織内で検出された。移植されたＴ−ＡＬＬ細胞は、また、マウスの胸腺、副腎、および末梢血に播種した。
【００２９】
白血病の発生における中心的役割のために、われわれのモデルのシステムにおいて白血病開始細胞が白血病移植マウス内で維持されるか否かを測定すること、例えばインビボにおけるＴ−ＡＬＬの拡大の経路を研究することはかなり重要である。この問題を扱うために、患者から採取された一次Ｔ−ＡＬＬを注射されたマウスの移植脾臓から回収されたＴ−ＡＬＬが、第２の臍帯血前処置マウスへの移植で白血病を繰り返すか否かを測定した。この研究のために、Ｔ細胞受容体β鎖可変領域２（ＴＣＲ Ｖβ２）を発現している一次Ｔ−ＡＬＬを使用した。この方法において、移植されたＴ−ＡＬＬはＣＤ７＋Ｖβ２＋細胞として独自に同定され得る。この実験の結果は、マウスの骨髄に関する図５において示される。
【００３０】
前処置されたマウスに患者から得られた一次Ｔ−ＡＬＬ細胞を注射すると、骨髄において高レベルの移植が起こり、これはＴ−ＡＬＬの注射の７週間後に測定された（図５Ａ）。特に、骨髄における細胞の９２％がＣＤ７を発現し、８９％がＶβ２を発現し、このことは骨髄細胞の約９０％を含むＣＤ７＋Ｖβ２＋サブセットの存在と矛盾していなかった。同一のマウスにおいて、ＣＤ７＋Ｖβ２＋細胞（Ｔ−ＡＬＬ）は脾臓細胞の約９２％を占めていた。移植された脾臓中のＴ−ＡＬＬ細胞は臍帯血で前処置された第２のマウスに注射するために使用された（図５Ｂ）。
【００３１】
Ｔ−ＡＬＬの注射の５週間後のこの第２のレシピエント・マウスの分析により、白血病の再現、すなわち骨髄細胞の５８％がＣＤ７を発現し、５２％がＴＣＲ Ｖβ２を発現していること（このことは、骨髄細胞の約５２％がＣＤ７＋Ｖβ２＋表現型を有することと矛盾しない。）が示された。この第２のレシピエント・マウスにおいて、脾臓（ＣＤ７＋Ｖβ２＋細胞）におけるＴ−ＡＬＬ移植のレベルは６８％であった。これらの結果により、白血病移植マウスにおいて白血病開始細胞の維持が存在することが明らかに示される。
【００３２】
該モデル系はＴ−ＡＬＬの研究および関連する治療戦略の前臨床試験を促進するために最初開発されたが、それが他の白血病のインビボ研究に適用可能であるか否かを測定することに関心がもたれていた。この目的で、臍帯血前処置マウスに一次小児Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞を注射し、そして、マウスの骨髄および脾臓におけるＢ−ＡＬＬの移植のレベルをＢ−ＡＬＬの注射の３９日後に測定した（図６）。マウスの骨髄細胞の約９０％が、移植されたＢ−ＡＬＬが期待される均一なＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ヒト表現型を発現した（図６Ｂ）。予備的研究により、臍帯血前処置マウスは急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）のインビボにおける研究にも適用可能であることが示唆されている。この研究において、１６％の骨髄における白血病の移植および１％の脾臓における移植が、その１１日前にＡＭＬを注射された前処置ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスで観察された。
【００３３】
インビトロでの臍帯血または間葉系幹細胞による白血病コロニーの形成の促進
白血病移植に対する促進活性の性質を特徴付けるため、白血病クローン生成細胞のコロニー形成を、臍帯血または臍帯血由来間葉系幹細胞で処置した培地の存在下でインビトロにて試験した。インビトロ白血病コロニー・アッセイは、ＩＬ−２のような増殖因子に応答して増殖してコロニーを形成する白血病クローン生成細胞の能力に基づいている。これらの白血病“前駆”細胞は、白血病芽球ポピュレーションの維持および拡大に関与している。
【００３４】
患者から得られそしてメチルセルロース中の１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）で培養された一次Ｔ−ＡＬＬの白血病コロニーの形成は、ＭＮＣｓまたは幹細胞前処置培地の添加により、用量依存的に有意に促進された。Ｔ−ＡＬＬコロニー形成の促進は、処置された培地の不存在下で観察されるものと比べて実質的に増加している処置された培地中に存在する因子により、４倍に増加する。顕微鏡で分析すると、処置された培地に加えられたサンプルにおけるコロニーのサイズには広い範囲が存在する。培養内のコロニーを個々に取り出し、類似の大きさのコロニーにプールし、そして白血病細胞の数を計数した。臍帯血で処置された培地が入った培養内の個々のコロニーあたりの細胞の数は、２５０および２８５ｘ１０２／コロニーの範囲であることが見出され、それに対して、処置された培地の不存在下では１００細胞未満／コロニーが観察された。したがって、培養内の臍帯血前処置培地の添加による爆発的なサイズの増加は、数倍から１００倍以上のオーダーであった。
【００３５】
臍帯血がインビトロで白血球コロニー形成を促進する因子（複数を含む）をインビトロで構成的に発現することをさらに確認するために、２重層寒天アッセイを白血病のサンプルに関して行った。下側の寒天層内の照射された臍帯血から分泌されたある“分散可能な因子（複数を含む）”は、有意に、外因性のＩＬ−２およびＰＭＡの非存在下で上側の層における白血病コロニーの定着効率を上昇させた。予想されたように、１４日での白血病コロニーの数は、下側の寒天層の照射された臍帯血ＭＮＣｓの数と上側の寒天層に加えたＴ−ＡＬＬ細胞の数の両方に依存する。照射された臍帯血のみが培養された場合にコロニーが存在しないことにより、上側の層のコロニーはＴ−ＡＬＬ調製物に由来することが示される。
【００３６】
白血病コロニーのこれらのインビトロの研究は、白血病細胞の増殖がおそらくＭＮＣｓまたは幹細胞処置培地の添加により刺激されることを示している。本アッセイにおける個々のコロニーから回収される細胞が白血病起源に由来するものであって単なる患者からの通常のＴ細胞ではないことを確認するために、１人の患者の一次Ｔ−ＡＬＬの典型的でない表面表現型を利用した。この患者から得られた一次Ｔ−ＡＬＬ白血病サンプルの表現型分析により、これらの細胞がＣＤ７＋（９９％）、ＣＤ３４＋（９８％）、ＣＤ４５＋（２％）であり、Ｂ細胞および単球マーカーには陰性であることが判明した。白血病細胞は予想通りＣＤ７を発現していたが、それらは変則的にＣＤ４５を発現しておらず、一律にＣＤ３４を発現していた。したがって、この異常型の表現型により、正常なＴ細胞と該患者のＴ−ＡＬＬとの明白な区別が可能となる。
【００３７】
この一次白血病サンプルを用いて、臍帯血処置培地を添加した白血病コロニー形成アッセイが行われた。臍帯血処置培地はこの患者からのＭＮＣｓの白血病コロニーの形成を予想の３倍以上大幅に増大させることが判明した。１４日目に、白血病コロニーを個々に取り出した。約１．４ｘ１０６個の細胞を回収し、そしてこれらの細胞をフローサイトメトリー分析のためにプールした。大部分の細胞は、独特にＣＤ４５−ＣＤ７＋）、ＣＤ４５−ＣＤ３４＋）、およびＣＤ７＋ＣＤ３４＋であった。まとめると、この結果は表面表現型ＣＤ４５−ＣＤ７＋ＣＤ３４＋を有するインビトロ培養物からの約９０％の回収細胞と矛盾せず、この患者の一次白血病の異常型表現型と同一である。この分析により、臍帯血からの処置培地はＴ−ＡＬＬを有する患者からの一次白血病細胞のインビトロでの増殖というよりもむしろ、患者から得られた一次Ｔ−ＡＬＬサンプル内の正常Ｔ細胞を単に刺激するだけであるという主張が支持される。
【００３８】
このことと矛盾することなく、照射された臍帯血により支持された上側の層内の該患者からの細胞が白血病の起源であって、単なる患者の血液からの正常なＴ細胞ではないことがフローサイトメトリーによりさらに示された。特に、寒天アッセイの上側の層からの約８０％の回収細胞は、ＣＤ４５−ＣＤ７＋表現型であり、この患者からの非典型的表現型の一次Ｔ−ＡＬＬと類似していることが示された。
【００３９】
臍帯血処置培地における促進活性は、５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出したｐＨ７．５のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、および２００〜３００ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンで溶出した小麦胚凝集素アフィニティー・カラムに結合し、したがって、酸性の糖タンパク質（複数を含む）に対応する。強力な免疫制御サイトカインであるサイトカインＩＬ−１５は、また、抗原特異的Ｔ細胞およびリンフォカイン活性化キラー細胞の活性を促進することができるＴ細胞増殖因子である。１０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１５は一次白血病のコロニーの形成を約８０％促進し、中和抗ＩＬ−１５抗体（１００ｎｇ／ｍｌまで）は本アッセイにおいて白血病コロニー形成のＩＬ−１５誘導促進を完全に阻害するのに十分であることが示された。対照的に、中和抗体（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の同様の投与は、本アッセイにおいて臍帯血処置培地の添加に帰することができる促進には影響しなかった。
【００４０】
これらの結果により、ＩＬ−１５は臍帯血処置培地において白血病促進活性がないことが示される。このことと矛盾することなく、ＥＬＩＳＡによる測定によって、臍帯血処置培地の我々の調製物（総計２２調製物）は無視できる量のＩＬ−１５（＜０．０３ｎｇ／ｍｌ）のみを含み；そしてこの量はＩＬ−１５の生物学的活性のＥＤ５０（すなわち３ｎｇ／ｍｌ）の１００分の１未満である、ことが示された。
【００４１】
メチルセルロース培養を用いるインビトロ白血病コロニー・アッセイには１００ユニット／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（ＩＬ−２受容体のインデューサー）の添加が含まれるので、臍帯血処置培地による白血病コロニーの形成の促進は、ＩＬ−２またはＩＬ−２受容体における単なる増加によるわけではなさそうである。このことと矛盾することなく、ＥＬＩＳＡによって測定される臍帯血処置培地中のＩＬ−２の量は、培養物中に加えられた外因性ＩＬ−２と比較して最小（４つの異なる調製物に関して約４．３±３．９ユニット／ｍｌ）であることが判明した。さらに、抗ＩＬ−２受容体ｍＡｂｓ（ＩＬ−２Ｒαに関してはＭ−Ａ２５１、ＩＬ−２Ｒβに関しては３Ｄ７、およびＩＬ−２Ｒγに関してはＡＧ１８４）を用いるフローサイトメトリー分析により、臍帯血処置培地単独ではＩＬ−２受容体の発現に効果がないことが示される。
【００４２】
ヒトの骨髄由来の単核細胞を、臍帯血ＭＮＣｓに関して上記したように培養した。間葉系幹細胞を含む接着層を、上記のインビトロおよびインビボ研究の両方において使用されたように単離した。骨髄由来の幹細胞は、ヒト白血病のインビボ・モデルにおける有効な前処置剤であり、そしてインビトロで白血病コロニー形成を促進することが判明した。
【００４３】
上記したように、本発明の動物モデルはヒト白血病の適当なモデルである。したがって、該モデルは多様な有用性を有する。このような使用の１つは、推定される抗癌剤（例えば抗白血病剤）のスクリーニングである。このような推定される薬剤は該動物モデルに投与され、そして白血病の経時的経過が追跡される。薬剤は任意のプロトコールにしたがって投与され得る。さらに、該薬剤は一次白血病の注射前または後のいずれかに投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの臍帯血前処置のため、および一次ヒト白血病の移植の分析のためのプロトコールを示す。
【図２】図２は一次Ｔ−ＡＬＬ細胞を注射された臍帯血前処置マウス由来の白血病移植骨髄および脾臓を示す。
【図３】図３はあるシリーズの一次Ｔ−ＡＬＬドナーのマウス骨髄における一次Ｔ−ＡＬＬの移植を示す。Ｔ−ＡＬＬ移植レベルをＣＤ４５、ＣＤ７、およびＣＤ５の発現に基づいてフローサイトメトリーにより測定した。
【図４】図４は、マウスの骨髄および脾臓における移植のレベルが、臍帯血ＭＮＣｓの数およびＴ−ＡＬＬ細胞の数の両方に依存することを示す。
【図５】図５は、白血病移植マウスにおけるＴ−ＡＬＬ白血病開始細胞の維持を示す。
【図６】図６は、臍帯血前処置マウスにおける一次小児Ｂ−ＡＬＬの移植を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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