(57)【要約】ヒト酸性線維芽細胞成長因子１５５（ｈａＦＧＦ１５５）の遺伝子が化学的合成により得られた。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のヌクレオチド配列は、文献に記載されたｈａＦＧＦ１５５のアミノ酸配列を基に推定した。合成されたｈａＦＧＦ１５５のアミノ酸配列は、文献に記載されたものとは異ならない。ｈａＦＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、すでに記載されているものとは異なっている。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子の化学的合成のために、エシェリヒア・コリ高発現タンパク質において、エシェリヒア・コリにより最も頻繁に使用されるコドンが使用された。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子を有するプラスミド（ｐｈａＦＧＦ１５５）を得て、エシェリヒア・コリを形質転換するために使用した。ｈａＦＧＦ１５４タンパク質の産生は、ラムダファージの溶菌性発生を遅延する条件下でプロデューサー株を培養することにより達成した。ｈａＦＧＦ１５４タンパク質がプロデューサー株細胞のラムダファージによる溶菌の結果として、可溶性条件の培地中に蓄積した。ｈａＦＧＦ１５４タンパク質は、培地に蓄積した可溶性タンパク質の２０％を占め、その生物学的活性を、新しい血管を作る（血管新生）能力により実証した。ＦＧＦ１５５タンパク質の第１位にあるイニシエーターメチオニン残基は、タンパク質合成の間に完全に除去され、ＦＧＦ１５４アミノ酸産生物を生じた。他の形態のｈａＦＧＦタンパク質を産生するためのファージ依存性方法の使用もまた、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質の産生方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された、生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドで、エシェリヒア・コリ株を形質転換すること、
形質転換された宿主細菌細胞に、溶菌遅延を媒介することができるバクテリオファージλを感染させること、および、
前記タンパク質の所望レベルの産生が達成されるまで溶菌を伴わずに、前記細胞の溶菌成長が誘導される培養条件下で前記エシェリヒア・コリ宿主細胞を培養し、前記タンパク質を可溶性で生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質として産生すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記バクテリオファージλは、温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度感受性突然変異がｃＩ８５７である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
培養工程前に、前記エシェリヒア・コリ宿主細胞を、前記バクテリオファージλの溶菌成長を防止する温度で生育させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記バクテリオファージλは、溶菌遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子中に突然変異を有するバクテリオファージλである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶菌遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子は、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択される遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーを産生するエシェリヒア・コリ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーが欠如するエシェリヒア・コリ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記感染バクテリオファージλが、約１〜約１００の範囲の感染多重度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記感染バクテリオファージλが、約１０〜約２５の範囲の感染多重度で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
エシェリヒア・コリ株のバクテリオファージ媒介溶菌遅延が、低感染多重度と比較してより高い感染多重度で遅延する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質が１５４個のアミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質が、配列番号８で記載される配列を有することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロモーターは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターであり、かつ、前記エシェリヒア・コリ株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することができるエシェリヒア・コリ株である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記誘導性プロモーターが、ｌａｃＵＶ５プロモーターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質が、１４６個のアミノ酸を含有するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質が、１４０個のアミノ酸を含有するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質が、１３４個のアミノ酸を含有するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号１に記載される配列を有する化学合成核酸。
【請求項２１】
生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質の産生方法であって、
ａ）温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλ株を保有するエシェリヒア・コリ細胞の第一の株を成育させること、
ｂ）前記エシェリヒア・コリ第一の株を溶菌させてバクテリオファージλを放出させることができる温度に調整すること、
ｃ）誘導性プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結された、前記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドで形質転換した、誘導物質の添加によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように誘導されうるエシェリヒア・コリ細胞の第二の株を提供すること、
ｄ）前記エシェリヒア・コリ細胞の第一の株から放出されたバクテリオファージλで、前記エシェリヒア・コリ細胞の第二の株を感染させること、および、
ｅ）タンパク質が産生され、前記エシェリヒア・コリ細胞の第二の株の溶菌時に培地中に放出されるように、前記誘導物質を含有する培地中で前記感染されたエシェリヒア・コリ細胞の第二の株をインキュベートし、前記タンパク質を可溶性で生物学的に活性なタンパク質として１００μｇ／ｍｌより高い濃度で産生させること、
を含む方法。
【請求項２２】
配列番号８で記載される配列を有するヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
発明の分野
本発明の分野は、組換え線維芽細胞成長因子タンパク質の産生方法および血管新生の促進におけるその使用に関する。
【０００２】
関連技術の説明
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、９つの構造的に関連したポリペプチドであり、これらは細胞の増殖、分化、および通常の発達の強力な制御因子である。これらはまた、腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および転移の病理プロセスに関与している（Ｇａｌｚｉｅ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （１９９７） ７５： ６６９−６８５）。これらは、広範な中胚葉および神経外胚葉由来細胞（内皮細胞を含む）に対して、強力な分裂促進因子および分化因子である。
【０００３】
ヘパリンプロテオグリカン、ヘパリン、またはヘパリン硫酸は、複数のＦＧＦ分子を複合体として同時に結合し、複合体はＦＧＦレセプターに提示される。ＦＧＦタンパク質は、それらのレセプターに結合し、結果としてタンパク質チロシンキナーゼが活性化する。これらのチロシンキナーゼのリン酸化は、新たなｍＲＮＡの転写を含む多くのシグナルを開始する。
【０００４】
２種の線維芽細胞成長因子、すなわち、塩基性および酸性線維芽細胞成長因子が、血管新生の強力な誘導物質として記載されている（Ｆｒｉｅｓｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： ９１９−９２５）。塩基性および酸性因子の両方の、血管形成の制御への関与、ならびに正常および異常血管新生への関与が示唆されている（Ｓｌａｖｉｎ， Ｊ． （１９９５） Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９ （５）： ４３１−４４４）。これらの因子は精製されており、アミノ酸配列が決定されて、ｃＤＮＡがクローニングおよび配列解析されている。
【０００５】
酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）は、胚性腎由来血管新生因子Ｉ、アストログリア成長因子Ｉ、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、網膜由来成長因子、ヘパリン結合性成長因子クラス１、内皮成長因子、眼由来成長因子ＩＩ、プロスタトロピン（ｐｒｏｓｔａｔｒｏｐｉｎ）、およびグリア成熟因子（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５： １５−２６）などの様々な名称で記載されている。また、クローニングされ、ヌクレオチド配列および染色体上の位置も、記載されている（Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３： ５４１−５４５）。
【０００６】
ａＦＧＦ遺伝子は染色体５に位置する。これは単一のコピーを有し、２つのイントロンで隔てられた３つのエキソンをコードする。４．８ｋｂのｍＲＮＡが１５５個のアミノ酸を持つ形態のａＦＧＦの合成を翻訳する。しかしながら、Ｎ−末端メチオニン残基がｉｎ  ｖｉｖｏで除去されて、１５４アミノ酸型が生じる。この１５４アミノ酸型ａＦＧＦは、１４０個または１３４個のアミノ酸からなる２種のａＦＧＦに切断される。ａＦＧＦタンパク質は、分子量１５，０００〜１７，０００Ｄのアニオン性分裂促進因子である。
【０００７】
ａＦＧＦタンパク質は、脳、網膜、骨基質、および骨肉腫で、見いだされている。これらの組織からは、１４０および１３４アミノ酸型しか得られていない。これらの切断ａＦＧＦは、ａＦＧＦの抽出または単離の間に特定のプロテアーゼにより生じた人工物（ａｒｔｉｆａｃｔ）であることが示唆されている（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５： １５−２６； Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６２ （３４）： １６６１２−１６６１７）。
【０００８】
ヘパリンがａＦＧＦタンパク質の生物学的活性を増強することが示唆されている（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２ （４６２４）： ６２３−６２５）。ａＦＧＦに結合したヘパリンが観察されている（Ｍａｃｉａｇ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５ （４６６５）： ９３２−９３５）。このヘパリン−結合特性は、効率的なアフィニティークロマトグラフィー法としてａＦＧＦタンパク質の精製に使用されてきた。ヘパリンはａＦＧＦの生物学的活性を増強させ、ａＦＧＦ−ヘパリン複合体の活性増強は数倍から１００倍まで様々である（Ｌｏｂｂ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５４： １−１４）。
【０００９】
発明の概要
一実施形態において、本発明は、生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質の産生方法であって、
プロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドで、エシェリヒア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株を形質転換する工程、
形質転換された細菌宿主細胞に、溶菌遅延を媒介することができるバクテリオファージλを感染させる工程、および、
上記タンパク質の所望レベルの産生が達成されるまで溶菌を伴わずに上記細胞の溶菌成長が誘導される培養条件下で、エシェリヒア・コリ宿主細胞を培養し、上記タンパク質を可溶性で生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質として産生する工程、
を含む方法に関する。
【００１０】
バクテリオファージλとして好ましくは、温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλが挙げられる。さらに好ましくは、温度感受性突然変異ｃＩ８５７を有するバクテリオファージλが挙げられる。
【００１１】
エシェリヒア・コリ宿主細胞は、培養工程前に、バクテリオファージλの溶菌成長を防止する温度で成育させたものが好ましい。
【００１２】
バクテリオファージλはまた、溶菌遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子中に突然変異を有するものが好ましい。溶菌遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子としては、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択される遺伝子がより好ましい。
【００１３】
エシェリヒア・コリ株としては、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーを産生するエシェリヒア・コリ株が好ましい。
【００１４】
エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーが欠如したものであってもよい。
【００１５】
感染バクテリオファージλは、約１〜約１００の範囲の感染多重度で提供されることが好ましく、約１０〜約２５の範囲の感染多重度で提供されることがより好ましい。
【００１６】
また、エシェリヒア・コリ株のバクテリオファージ媒介性溶菌遅延は、低感染多重度と比較してより高い感染多重度で遅延されることが好ましい。
【００１７】
生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質は、１５４個のアミノ酸を含むものが好ましい。ヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質は配列番号８で記載される配列を有するものがより好ましい。
【００１８】
プロモーターとしてはＴ７ポリメラーゼプロモーターが好ましく、エシェリヒア・コリ株としてはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を発現することができる株が好ましい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にあることが好ましい。誘導性プロモーターは、ｌａｃＵＶ５プロモーターであることがより好ましい。
【００１９】
生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質は、１４６個のアミノ酸を含むものであってもよい。
【００２０】
また、生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質は、１４０個のアミノ酸を含むものであってもよい。
【００２１】
さらに、生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質は、１３４個のアミノ酸を含むものであってもよい。
【００２２】
本発明は、好ましくは、生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質の産生方法であって、
ａ）温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλ株を保有するエシェリヒア・コリ細胞の第一の株を成育させる工程、
ｂ）エシェリヒア・コリの第一の株を溶菌させてバクテリオファージλを放出させることのできる温度に調整する工程、
ｃ）誘導性プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結された、上記生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドで形質転換した、誘導物質の添加によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように誘導されうるエシェリヒア・コリ細胞の第二の株を提供する工程、
ｄ）エシェリヒア・コリ細胞の第一の株から放出されたバクテリオファージλで、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株を感染させる工程、および、
ｅ）タンパク質が産生され、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株の溶菌時に培地中に放出されるように、誘導物質を含有する培地中で感染されたエシェリヒア・コリ細胞の第二の株をインキュベートし、上記タンパク質を、可溶性で生物学的に活性なヒト酸性線維芽細胞成長因子タンパク質として１００μｇ／ｍｌより高い濃度で産生する工程、
を含む方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１で記載される配列を有する化学合成核酸を包含する。
【００２４】
本発明および従来技術を上回って達成される利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を上記で説明した。もちろん、必ずしもすべてのこのような目的または利点が、本発明の任意の特定の実施形態によって達成され得るわけではないことが理解されるべきである。したがって、例えば本発明は、本明細書中に教示されたような一または複数の利点を達成するかまたは最適化する形で具体化または実行されるが、本明細書中に教示または示唆される他の目的または利点は必ずしも達成されるわけではないことが、当業者には認識されるであろう。
【００２５】
本発明のさらなる態様、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００２６】
次に、本発明のこれらの、またはその他の特徴を好ましい実施形態の図面を参照しながら説明するが、これらは本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【００２７】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
記載の実施形態は、本発明の好ましい実施形態を提示するが、本発明の思想を逸脱しない範囲で、当業者によって変更が行なわれることは、理解されるべきである。したがって本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるべきである。
【００２８】
ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、１５５個のアミノ酸残基を含有するタンパク質をコードする（配列番号１および２）。ｈａＦＧＦ１５５配列の第一番目のアミノ酸は、イニシエーターメチオニン残基であり、これは、通常の状態ではタンパク質合成の間に除去されて、１５４個のアミノ酸のＦＧＦタンパク質（配列番号８）をもたらす。しかしながら、組織サンプルからは２種の短いａＦＧＦの単離しかできていない。２種の単離されたＦＧＦは、１４０個および１３４個のアミノ酸残基を含有する。１４０個のアミノ酸を含有するａＦＧＦの形態は完全型とみられ、一方１３４個のアミノ酸を含有するａＦＧＦの形態は切断された型とみられる。１５５個または１５４個のアミノ酸を含有するａＦＧＦの組織サンプルからの抽出はこれまでできていない。短いアイソフォームが、細胞内プロセシングの通常の機能の結果生じるのか、またはａＦＧＦ抽出プロセス中の、特定のプロテアーゼによる単離過程の間に産生される人工物として生じるのかは知られていない。３種のａＦＧＦ形態のそれぞれについて単離したＤＮＡ組換え分子から産生されるタンパク質のウエスタンブロット分析は、１４０および１３４型の高い発現および１５４型の低い発現レベルを示した。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子の遺伝子は、１５４個のアミノ酸型のａＦＧＦタンパク質をコードするもので、化学合成される（配列番号１）。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のヌクレオチド配列は、ｈａＦＧＦ１５５アミノ酸配列（配列番号２）に基づいて推定された。この合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のアミノ酸配列は以前に報告されたもの、例えばＧｅｎＢａｎｋから得られる配列番号３のヒトａＦＧＦヌクレオチド配列の翻訳配列と異ならない。しかしながらｈａＦＧＦ遺伝子の好ましいヌクレオチド配列は、以前に報告されたものと異なる。本発明の好ましい実施形態では、ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、集中的に合成される細菌タンパク質について、エシェリヒア・コリにより最もよく用いられるコドンを用いて化学合成された。エシェリヒア・コリに関する好ましいコドン使用表は既知であり、利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｓｙｃｈｅ．ｕｔｈｃｔ．ｅｄｕ／ｓｈａｕｎ／Ｓｂｌａｃｋ／ｃｏｄｏｎｕｓｅ．ｈｔｍｌ参照）。ポリヌクレオチドの化学合成は、既知の方法論を使用することにより実行した（Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６４１９−６４３５）。
【００３０】
一方で、ｈａＦＧＦ遺伝子の他の既知の形態、すなわち１５４、１４６、１４０、および１３４アイソフォーム、およびそれらの任意の突然変異体、誘導体、類縁体、またはフラグメントなどを含む、当業者に既知の他の形態のｈａＦＧＦタンパク質をコードする、動物組織から単離されたＤＮＡが本発明の実施において当業者により使用され得る。ヒトａＦＧＦタンパク質は、血管新生を刺激するための方法において使用され得る。請求項に記載の方法により産生されたヒトａＦＧＦはまた、適当な薬剤キャリアとともに組成物に使用され得る。そのようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、水、デキストロース、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、Ｔｉｓｓｕｃａｌ（登録商標） （Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｄｕａｒｔｅ， ＣＡ）のようなフィブリン糊（ｆｉｂｒｉｎｇｌｕｅ）がキャリアとして使用される。
【００３１】
図１は、本発明者により合成されたｈａＦＧＦ１５５遺伝子の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ＧｅｎＢａｎｋから得られたヒト酸性線維芽細胞成長因子の配列（配列番号３）を図１の化学合成配列と比較した。比較結果を図２において示す。８０コドンに違いが認められた。
【００３２】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物体により認識され、ｈａＦＧＦ核酸と作動可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、作動可能に連結される特定の核酸配列、たとえばｈａＦＧＦ核酸配列などの転写および翻訳を制御する、構造遺伝子（一般に１００〜１０００塩基対）の開始コドンに対して上流（５’）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは、典型的には２つの種類、すなわち誘導性および構成性プロモーターに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化に、例えば栄養素の存在または非存在に、あるいは温度の変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの高レベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、原核生物宿主細胞により認識される多数のプロモーターが既知である。これらのプロモーターは、供給源（ｓｏｕｒｃｅ）ＤＮＡからプロモーターを制限酵素で除去して、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ｈａＦＧＦコード遺伝子に作動可能に結合される。
【００３３】
当業者に知られたプロモーターとして、β−ラクタマーゼ−乳糖プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９７８） Ｎａｔｕｒｅ ２７５： ６１５； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９７９） ２８１： ５４４）、アルカリホスファターゼ−トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８： ４０５７； Ｅｐ３６， ７７６）が挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが適している。最も好適なプロモーターは、Ｔ７プロモーターシステムである。適当な制限部位を導入するために、適当なリンカーまたはアダプターを使用して、それらをｈａＦＧＦ  ＤＮＡに連結する方法が当業者に知られている。プロモーターはまた、より高い発現レベルを達成するために直列で使用してもよい。
【００３４】
かなり多数の原核生物宿主細胞が、本明細書中に記載されるベクター中にクローニングされたｈａＦＧＦ遺伝子の発現に適している。好適な原核生物宿主として、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌（例えば、エシェリヒア属などの腸内細菌科）が挙げられる。最も好適な原核生物宿主はエシェリヒア・コリである。
【００３５】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外の要素として、または染色体中へ組み込まれて、複製され得るようにＤＮＡを生物体へ導入することを意味する。原核生物細胞の形質転換は、ＣａＣｌ２での処理または電気穿孔法のような当業者に周知の方法を使用して行われる。
【００３６】
バクテリオファージに感染している産生細胞の重要な利点は、ファージが、細菌宿主細胞中でのすべての高分子合成の顕著な再配列を引き起こす点である。細菌遺伝子の転写を非作動にすることにより、ファージは標的遺伝子の転写を増大し、その結果として、所望の産物の産出を増大し得る。
【００３７】
本発明の超産生系の一実施形態では、細菌溶菌を遅延するアンバー突然変異（例えばＱ−およびＲ−突然変異）を有するファージλが、ファージλにおけるアンバー突然変異の補正を担うサプレッサーを欠如したＳｕ°と呼ばれるエシェリヒア・コリ株中に提供される。エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ°）株を得るために、Ｓｕ°クローンが野生型Ｓｕ＋集団から選択される。好ましくは選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が、ファージＤＮＡ中に挿入される。
【００３８】
エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ０）株、例えばエシェリヒア・コリＫ８０２の選択は、ファージλｃＩ８５７Ｎａｍ７Ｎａｍ５３ｂｌａ  ｔｅｔ（以後、λｂｌａＮ’と呼ぶ）を用いて実行された。エシェリヒア・コリＣ６００株（λｂｌａＮ’）は、ファージの供給源として役目を果たした。このファージは、リプレッサー遺伝子（ｃＩ８５７）中にｔｓ突然変異を保有する、単一部位（ＥｃｏＲＩ）ベクター中のＥｃｏＲＩ部位にプラスミドｐＣＶ１１（ｂｌａ  ｔｅｔ）を挿入することにより得られた。次に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えにより、２つのアンバー突然変異がファージＮ遺伝子中に導入された。
【００３９】
ファージλクリア（ｃｌｅａｒ）を用いて、非溶原性に関してクローンが試験された。ファージλｂｌａＮ’のほかに、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を用いて、サプレッサーに関して検査した。
【００４０】
知られているように、ファージλＮ’突然変異体は宿主細胞を溶菌できず、非常に不安定なプラスミドの形態で細胞中に存在する。宿主細胞がサプレッサーを含有する場合、アンバー突然変異の表現型は補正され、Ｎタンパク質が合成されて、溶菌能を有するファージが発生し得る。λＮ’により感染されたＳｕ＋およびＳｕ０細胞の生存能力におけるこの差は、エシェリヒア・コリＳｕ＋細胞集団から自発的に出現するＳｕ０復帰細胞を選択するための基礎として用いられる。細胞中にアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性マーカーを導入する挿入プラスミドを有するファージλを用いて、非溶菌性Ｓｕ０細胞が突然変異体を隠蔽しないようにした。ファージはまた、細胞溶菌を起こすこのようなファージの溶菌性発生を可能にするリプレッサー遺伝子中にｔｓ突然変異も含有する。
【００４１】
ファージλｂｌａＮ’で感染させ、４３℃で成育させた後、Ｓｕ＋培養物がアンピシリンおよびテトラサイクリンを補充された培地に接種された場合、プラスミドの形態でファージλｂｌａＮ’を含有する単一な、サプレッサー非含有細胞がプレート上で発生するはずである。ファージから細胞を救済して、親培養のＳｕ０誘導株を得る。本方法は、いくつかの段階に細分することができる。
【００４２】
１．ファージλｂｌａＮ’による培養物の感染
培養エシェリヒア・コリＳｕ＋を、激しく攪拌しながら３７℃で、マルトースを含有するＭ９培地上で、１〜２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。５〜１０個の粒子／細胞の多重度でファージλｂｌａＮ’を用いて細胞を感染させ、２０℃で２０分間インキュベートした。この条件下では、感染多重度は約１００％であり、大量のＳｕ＋細胞のほかに、ファージは単一Ｓｕ０細胞にも感染する。
【００４３】
２．マーカーファージを含有するサプレッサー非含有細胞の選択
感染後、１２γ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０γ／ｍｌのアンピシリンを補充した寒天培地上で細胞を平板培養し、４３℃で成育させた。２４時間で、単一コロニーが発生し、これを、抗生物質を有する寒天培地上で再度平板培養し、３７℃で成育させた。
【００４４】
３．ファージλｂｌａＮ’からの選定クローンの救済
エシェリヒア・コリＳｕ０細胞中のファージλＮ’は、非常に不安定なプラスミドの形態であるため、ファージから救済するために、抗生物質を含有しない選定用寒天培地上で選定クローンを平板培養し、３７℃で成育させた。抗生物質を含有しない培地上での一次の継代においてファージを失った細胞の数は、合計で１２〜３５％になった。このような細胞の選定は、抗生物質耐性の欠失およびファージλクリアに対する感受性の獲得をモニタリングすることにより実行した。
【００４５】
４．リプレッサーに関する細胞の検定
アンバー突然変異を有するファージλの、救済クローンの芝地上にプラークを形成する能力を調べた。親エシェリヒア・コリＳｕ＋株の同系サプレッサー非含有誘導体は、その上にファージλｂｌａＮ’がプラークを形成せず、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４が１〜３×１０５ＰＦＵ／ｍｌのプラークを産生し、遺伝子ＱおよびＲ中に突然変異を有さないファージλｃＩ８５７が１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌのプラークを産生するクローンである。
【００４６】
この方法を用いて、エシェリヒア・コリＫ８０２Ｓｕ＋のＳｕ０復帰細胞を得た。感染時点での細胞数およびそれらの中のＳｕ０復帰細胞の数に基づくと、サプレッサー非含有細胞の発生頻度は３×１０−７であった。
【００４７】
好ましい実施形態では、目的遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）にクローン化される。好適な遺伝子としては、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、およびヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型およびヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。代替的実施形態では、目的遺伝子は、適切なプロモーターの制御下で細菌プラスミドおよびλファージ中にクローン化され得る。もっとも好ましい実施形態では、化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）にクローン化される。
【００４８】
Ｔ７プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってのみ認識され、エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメラーゼにより認識されない。得られたｈａＦＧＦ遺伝子を有するプラスミドでエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。この株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質はエシェリヒア・コリ細胞に対して有毒であるので、必要な場合にのみＴ７ＲＮＡポリメラーゼ合成を誘導するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導可能ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。ｌａｃプロモーターの誘導は、栄養培地にＩＰＴＧを添加することにより実行される。ｈａＦＧＦタンパク質を得るために、ｈａＦＧＦ遺伝子を有する組換え体プラスミドを含有する産生株は、集中的曝気の条件下で、２０〜４０℃の温度で１ｍｌ中に５×１０７〜５×１０９の細胞密度に培養される。次にそれは、０．１〜１００個のファージ体／細胞の多重度で、ｔｓ突然変異ｃＩリプレッサー遺伝子を有するラムダファージにより感染され、インキュベーションが２０〜３７℃で２〜１４時間継続される。ファージと同時に、ＩＰＴＧが１ｍＭの濃度で導入される。
【００４９】
ｈａＦＧＦタンパク質の産生は、ラムダファージの溶菌性発生を遅くする条件下で、産生株を培養することにより達成された。そのような条件として、培養の温度低下、ならびにＱおよびＲ遺伝子のような後期ラムダファージ遺伝子におけるアンバー突然変異の使用が挙げられる。
【００５０】
ｈａＦＧＦタンパク質は、ラムダファージによる産生株細胞溶菌の結果として、可溶性タンパク質として培地中に蓄積された。各ｈａＦＧＦタンパク質の産生量は、培地中に蓄積した可溶性タンパク質の２０％を占めた。破砕屑を、遠心分離により培地から除去した。次いで、ｈａＦＧＦは、以下の手法（これは適当な精製手法の例である）により夾雑可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製された。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、イムノアフィニティー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、よびゲル濾過による精製が挙げられる。ｈａＦＧＦ組換えタンパク質は、Ｃ１８ＨＰＬＣカラムを使用して精製してもよい。別の実施形態において、精製ｈａＦＧＦを得るためにｈａＦＧＦ組換えタンパク質をヘパリンセファロースに適用してもよい。次いで、精製ｈａＦＧＦは、自動アミノ末端配列分析に１５サイクルかけられた。この分析は、ＦＧＦ１５５の第１位にあるイニシエーターメチオニンの全てが合成の間に除去されてしまい、結果として１５４個のアミノ酸を含有するＦＧＦ分子を生成することを示した。上記分析の２〜１４サイクルで検出されたアミノ酸は、ＦＧＦ１５５の位置２〜１４のアミノ酸に等しかった。
【００５１】
精製ｈａＦＧＦ組換えタンパク質の生物学的活性は、新しい血管を作る（血管新生）能力により実証された。アッセイには、ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）のモデルを使用した新血管の形成におけるｈａＦＧＦの影響の研究により行った。
【００５２】
本発明のさらに詳細な説明を以下に提示する。記載された実施形態は本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の思想を逸脱しない範囲で当業者によって変更が行なわれることが理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるべきである。
【００５３】
実施例１  ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１５４の産生
ヒト酸性線維芽細胞成長因子をコードする化学合成ｈａＦＧＦ１５５（１５５個のアミノ酸）遺伝子（配列番号１）を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ（図３）により、培養エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）を形質転換した。培養ＢＬ２１（ＤＥ３）は、細菌ゲノム中に誘導可能ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下で化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを産生した。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介される細胞中のＴ７ポリメラーゼの出現後にのみ、開始する。
【００５４】
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを有する培養エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を、２×１０８細胞／ｍｌの密度になるまで成育させた。次に、約１０ファージ体／１細菌細胞の多重度で、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００５５】
ＬＢ培地中、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させたエシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物から、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製した。溶原性培養物を４３℃に温めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げ、６０〜７０分経過した後、細菌細胞を溶菌させると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００５６】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベーションした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ｈａＦＧＦ１５４を得た。
【００５７】
変性条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ｈａＦＧＦ１５４を含有する培地を分析し、クーマシーブルーで染色した。ｈａＦＧＦ１５４タンパク質を含有する培地の電気泳動写真は、図４において精製ｈａＦＧＦタンパク質と比較されている。レーン１は、組換えｈａＦＧＦ１５４（２２５ｍｇＦＧＦ−１／ｌ）を含有する未精製培地を示す。レーン２は、ヘパリン−セファロースカラム精製組換え体ｈａＦＧＦ１５４を示す。レーン３は、ＨＰＬＣ−Ｃ１８カラム精製ｈａＦＧＦ−１５４を示す。左端の印のないレーンは、分子量標準マーカーを含有する。全体としての精製収率は、約６５％であった。生物学的活性を２種類の異なるアッセイ、３Ｔ３細胞増殖アッセイおよびラット後肢血管新生アッセイ（示さず）により測定した。生物学的活性はＳｉｇｍａ−Ｃｈｅｍ社から得られるＦＧＦ−１と等しい効力を持っていた。ニワトリ胚漿尿膜を使用したアッセイを以下の実施例７に示す。
【００５８】
ファージ感染培養細胞におけるｈａＦＧＦ１５４タンパク質産生は、全細胞性タンパク質の約２０％であった。ｈａＦＧＦ１５４の分子量は、濃度計Ｉｍａｇｅ  ＭａｓｔｅｒＶＤＳにより測定した場合、１７，９０８ダルトンであった（データは示さず）。ＦＧＦ１５４のＮ末端配列分析は、第１位にアラニン残基を示し、イニシエーターメチオニンは検出されなかった。
【００５９】
実施例２  ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型をコードする化学合成遺伝子（図６：配列番号４）を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ（図５）により、培養エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号５で示される。培養ＢＬ２１（ＤＥ３）は、細菌ゲノム中に誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介される細胞中でのＴ７ポリメラーゼの出現後にのみ、開始する。
【００６０】
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、約１０ファージ体／１細菌細胞の多重度で、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を細胞に感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６１】
ＬＢ培地中、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させたエシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製した。溶原性培養物を４３℃に温めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分経過した後、細菌細胞を溶菌させると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６２】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベーションした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１３４アミノ酸型を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型を得た。
【００６３】
実施例３  ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型（図８：１４０個のアミノ酸）をコードする化学合成遺伝子（配列番号６）を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ（図７）により、培養エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）を形質転換した。対応するタンパク質は、配列番号７として示される。培養ＢＬ２１（ＤＥ３）は、細菌ゲノム中に誘導可能ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介される、細胞中でのＴ７ポリメラーゼの出現後にのみ、開始する。
【００６４】
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖを有する培養エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、約１０ファージ体／１細菌細胞の多重度で、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４により細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６５】
ＬＢ培地中、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させたエシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物から、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製した。溶原性培養物を４３℃に温めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌させると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６６】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベーションした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４０アミノ酸型を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型を得た。
【００６７】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４０は、ニワトリ膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００６８】
実施例４  ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中で誘導可能ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介される、細胞中でのＴ７ポリメラーゼの出現後にのみ、開始する。
【００６９】
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、約１０ファージ体／１細菌細胞の多重度で、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００７０】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分経過した後、細菌細胞を溶菌に付すと、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００７１】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベーションした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４６アミノ酸タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに添加して、精製ヒトｈａＦＧＦ１４６アミノ酸型を得た。
【００７２】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４６は、ニワトリ膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００７３】
実施例５  ｈａＦＧＦの精製
ｈａＦＧＦを含有する培地を、１倍量の０．０４ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で希釈し、０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化させたヘパリン−セファロースカラムに添加した。流速を８０ｍｌ／時間に調整した。ｈａＦＧＦタンパク質を含有する培地の添加後、カラムを０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。次にカラムを、０．６ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．３で洗浄した。溶出は１．５ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５を用いて実行した。全工程を４℃で実行した。
【００７４】
実施例６  ファージ依存的方法により産生した組換えタンパク質のゲル分析
ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、およびヒトａＦＧＦ１５４アミノ酸型を含有する培地を、変性条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、クーマシーブルーで染色した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、およびヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型を含有する培地の電気泳動写真を、図９において、分子量標準と比較した。レーン２は、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型を含有する３０μｌの培地を示す。レーン３は、組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する３０μｌの培地を示す。レーン５は、組換えＦＧＦ１５４タンパク質を含有する３０μｌの培地を示す。レーン１は、それぞれ２μｇの分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。上から、分子量標準は９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０，０００；２０，１００；および１４，４００である。
【００７５】
混合物中のヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、およびヒトａＦＧＦ１５４アミノ酸型の量の定量を、ポリアクリルアミドゲル上の染色タンパク質バンドを濃度計Ｉｍａｇｅ  ＭａｓｔｅｒＶＤＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で走査することにより行った。ファージ感染培養物中における組換えタンパク質の産生は、全細胞性タンパク質の約２０％であった。
【００７６】
精製組換えヒトａＦＧＦ１３４、ｈａＦＧＦ１４０、ｈａＦＧＦ１４６、およびｈａＦＧＦ１５４タンパク質を含有する電気泳動写真を、分子量標準と比較した（図１０）。レーン２は、５μｇの精製ａＦＧＦ１３４タンパク質を示す。レーン３は、５μｇの精製ヒトａＦＧＦ１４０を示す。レーン４は、５μｇの精製ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型を示す。ファージ感染培養におけるヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生量は、全細胞性タンパク質の約２０％であった。レーン６は、５μｇのｈａＦＧＦ１５４タンパク質を示す。レーン１および８は、それぞれ２μｇの分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。
【００７７】
実施例７  ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）中の血管新生に及ぼすＦＧＦ作用の試験方法
ニワトリ胚のモデルに及ぼす血管新生の試験方法（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８２：６４０９−６４１３）を適用して、ｈａＦＧＦ１５５、１４６および１４０組換えタンパク質の血管新生に与える作用を、精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子と比較して決定した。精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子は、インターロイキンと相同の配列を有する強力な血管新生性血管内皮細胞分裂促進因子である。
【００７８】
３日齢ニワトリ胚の殻をエチルアルコールで滅菌した。ピンセットを用いて殻および殻下被膜を気室から除去し、３５ｍｍペトリ皿の底で卵を覆った。胚を３７℃で５〜６日間インキュベートした。この期間の終了時に、胚を検査し、ＣＡＭの十分に発達した血管を有する卵を実験用に選択した。
【００７９】
ＦＧＦを含有するゲルを沈着させた円形濾紙を、ゲルを血管側に向けて卵ＣＡＭ上に載せて、３７℃でさらに３日間、サーモスタット中でインキュベートした。ゲルは以下の方法で調製した：試験量のＦＧＦをイーグル培地（溶液１）３０μｌ中に溶解し、次に、３０μｌのイーグル培地中に、１０μｇのヘパリンを溶解し、２％のアガロースを添加した（溶液２）。次に溶液１および２を等量ずつ混合し、得られた混合物を、直径１２ｍｍの円形濾紙上に６０μｌずつ沈着させた。
【００８０】
４日目に、円形濾紙を取り除いた。濃化牛乳（乳脂肪１０％）を約１ｍｌまたはそれ以下の量でＣＡＭ下に注入した。結果は、ＣＡＭ血管が容易に観察される白色バックグラウンドであった。
【００８１】
実験結果を、コンピューターを接続したビデオカメラで記録した。ＦＧＦの影響下での新規のＣＡＭ血管の形成を、血管成長の性質および方向、それらの量および質（大、中、小）、吻合の存在または非存在等のパラメーターについて評価した。これらのデータを、ＦＧＦに曝露されなかった対照試料と比較した。図１１は、本明細書中に記載したファージ依存的組換え方法により産生され、ヘパリンセファロース上で精製されたＦＧＦ１５４で処理した後の発生１４日目のニワトリ胚血管を示す。
【００８２】
図１１Ａは、組換えＦＧＦ１５４タンパク質の添加と血管新生との間の相関を示す。１μｇのＦＧＦ１５４の添加後４日目において、血管は主として小さく、放射状成長を示している（図１１Ａ）。ＦＧＦ１５４の量を３μｇに増加させた結果、対応して血管の大きさが増加した（データは示さず）。中型血管が放射状成長を伴って観測された。さらに添加するＦＧＦ１５４を４μｇに増加させた結果、添加４日後に大型、中型、および小型の血管が発達する（示さず）。未処理の対照を図１１Ｂに示す。
【００８３】
本発明の思想から逸脱せずに多数のならびに種々の変更がなされ得る、と当業者には理解されよう。したがって、本発明の実施の形態は例証のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するように意図されないことは明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】エシェリヒア・コリ高発現タンパク質中に見出されるコドンによって天然体に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１５５個のアミノ酸）の化学合成ヌクレオチド配列 （配列番号１）、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号２）を示す図。
【図２】化学合成ｈａＦＧＦ１５５コドンにおいてなされた改変を示す図。ＦＧＦｆｒＨＵＭＥＣＧＦＢは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から得られた配列（配列番号３）である。ＨａＦＧＦ  １５５は、本発明の化学合成配列（配列番号１）である。
【図３】化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を含有するｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ構築物を示す図。
【図４】組換えｈａＦＧＦ１５４（配列番号８）を含有する培地の精製を示す図。電気泳動写真において：レーン１：組換えｈａＦＧＦ１５５（２２５ｍｇＦＧＦ−１／ｌ）を含有する未精製培地；レーン２：ヘパリン−セファロースカラム精製組換えｈａＦＧＦ１５４；レーン３：ＨＰＬＣ  Ｃ−１８カラムによるｈａＦＧＦ１５４の精製である。左端の印のないレーンは、分子量マーカーを含有する。
【図５】化学合成ｈａＦＧＦ１３４遺伝子（配列番号４）を含有するｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ構築物を示す図。
【図６】エシェリヒア・コリ高発現タンパク質中に見出されるコドンによって天然体に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１３４個のアミノ酸）の化学合成ヌクレオチド配列 （配列番号４）、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号５）を示す図。
【図７】化学合成ｈａＦＧＦ１４０遺伝子（配列番号６）を含有するｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ構築物を示す図。
【図８】エシェリヒア・コリ高発現タンパク質中に見出されるコドンによって天然体に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１４０個のアミノ酸）の化学合成ヌクレオチド配列 （配列番号６）、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号７）を示す図。
【図９】本明細書中に記載したファージ依存的方法により産生されたタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図。レーン１：分子量標準、各々２μｇの標準；レーン２：組換えＦＧＦ１３４タンパク質を含有する４０μｌの培地；レーン３：組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する４０μｌの培地；レーン４：組換えインターフェロンα２Ｂを含有する４０μｌの培地；レーン５：組換えＦＧＦ１５４タンパク質を含有する４０μｌの培地；レーン６：組換えヒト成長ホルモンを含有する４０μｌの培地；レーン７：組換えメチオニンアミノペプチダーゼを含有する４０μｌの培地；レーン８：エシェリヒア・コリのＢ−ガラクトシダーゼを含有する４０μｌの培地。
【図１０】請求の範囲に記載された発明に従って精製された組換えタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図。レーン１：分子量標準；レーン２：５μｇの精製ＦＧＦ１３４タンパク質；レーン３：５μｇの精製ＦＧＦ１４０タンパク質；レーン４：５μｇの精製ＦＧＦ１４６タンパク質；レーン５：５μｇの精製インターフェロンα２Ｂタンパク質；レーン６：５μｇの精製ＦＧＦ１５４タンパク質；レーン７：５μｇの精製メチオニンアミノペプチダーゼタンパク質；レーン８：分子量標準。
【図１１】ＦＧＦ処理後の発生第１４日目におけるニワトリ胚ＣＡＭ血管を示す図。１５４アミノ酸型ｈａＦＧＦタンパク質の添加後第４日目におけるニワトリのタマゴのＣＡＭ血管新生を示す。倍率３倍。図１１Ａは、１μｇの１５４アミノ酸型ｈａＦＧＦタンパク質の効果を示す。添加した血管は主に小さく、放射状の成長を示す。図１１Ｂは、対照サンプルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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