(57)【要約】本発明は、花ＧＡＢＡレベルのモジュレーションによる植物の稔性の変更方法を提供する。本発明の技術は、植物育種技術に用いることができる。本発明によって更に提供するのは、植物への候補モジュレーターの適用後の稔性への影響の識別による、ＧＡＢＡ代謝の候補モジュレーターまたはＧＡＢＡ類似体のスクリーニングのための検定である。該技術は、動物試験への変法を提供し且つ大規模な応用にしたがう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の稔性をモジュレーションする方法であって、該植物をＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体で処理することを含む方法。
【請求項２】
ＧＡＢＡ類似体が、フォルスコリン、ガバペンチン（gabapentin）およびプレガバリン（pregabalin）、４−cis−アミノクロトン酸、Ｎ−メチル−Ｅｘｏ−ＴＨＰＯ、テトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）、イミダゾール−４−酢酸、イソグバシン（Isoguvacine）、ムシモール（Muscimol）、バクロフェン（Baclofen）、cis−アミノクロトン酸（ＣＡＣＡ）および trans−アミノクロトン酸（ＴＡＴＡ）から成る群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物が雌雄同株植物である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物を処理することが、該植物の花の雄性部分を処理することを含む、雄性不稔植物を生じる方法として更に定義される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記モジュレーションすることが、前記植物を不稔性にすることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モジュレーションすることが、前記植物を自家不稔性にすることを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
植物が双子葉植物である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファおよび綿から成る群より選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
双子葉植物が、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
植物が単子葉植物である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワおよびサトウキビから成る群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
処理することが、植物の花を処理することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
処理することが、ＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体のオーバーザトップ（over the top）適用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
植物の稔性をモジュレーションする方法が、該植物をＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理することを含む方法。
【請求項１５】
ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤が、（Ｓ）−４−アミノ−５−フルオロペンタン酸、４−アミノ−２−（置換メチル）−２−ブテン酸、４−アミノ−５−フルオロペント−２−エン酸、γ−ビニルＧＡＢＡ［Ｄ，Ｌ−４−アミノヘクス−５−エン酸（ビガバトリン（Vigabatrin）（Ｒ））］およびバルプロエート（Valproate）から成る群より選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物が雌雄同株植物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物を処理することが、該植物の花の雄性部分を処理することを含む、雄性不稔植物を生じる方法として更に定義される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記モジュレーションすることが、前記植物を自家不稔性にすることを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
植物が双子葉植物である請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファおよび綿から成る群より選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
双子葉植物が、Arabidopsis thaliana である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
植物が単子葉植物である請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワおよびサトウキビから成る群より選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
処理することが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤を花に適用することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
処理することが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤のオーバーザトップ適用を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
増大したＧＡＢＡレベルによって自家不稔性にされた花を有する植物の稔性を回復する方法が、該植物をＧＡＢＡ阻害剤で処理することを含む方法。
【請求項２７】
ＧＡＢＡ阻害剤が、グバシン、（Ｒ）−ニペコチン酸、チアガビン（Tiagabine）、抗痙攣薬１−（２−（（（ジフェニルメチレン）アミノ）オキシ）エチル）−１，２，５，６−テトラヒドロピリジンカルボン酸塩酸塩、ＮＮＣ−７１１、ビククリン（Bicuculine）、ピトラゼピン（Pitrazepin）、ベンジルペニシリン、セクリニン、ファクロフェン（Phaclofen）、ＣＧＰ３５３４８、ピクロトキシン（Picrotoxin）、１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−イルおよびメチルホスフィン酸（methylphophinic acid）から成る群より選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
植物を、突然変異したＰＯＰ２遺伝子を含むと更に定義する請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
植物が、トランスジェニックアンチセンスＰＯＰ２遺伝子を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
植物が双子葉植物である請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
双子葉植物が、Arabidopsis thaliana である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファおよび綿から成る群より選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
植物が単子葉植物である請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワおよびサトウキビから成る群より選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
処理することが、ＧＡＢＡ阻害剤を花に適用することを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
処理することが、ＧＡＢＡ阻害剤のオーバーザトップ適用を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
植物育種の方法であって、
（ａ）第一植物および第二植物を入手し；
（ｂ）該第一植物をＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体で処理し；そして
（ｃ）該第一植物に該第二植物からの花粉を受粉することを含む方法。
【請求項３８】
受粉することが、自然受粉を生じさせることを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
受粉が、手動受粉を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
第一植物を、前記処理後に自家不稔性にする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ＧＡＢＡ類似体が、フォルスコリン、ガバペンチンおよびプレガバリン、４−cis−アミノクロトン酸、Ｎ−メチル−Ｅｘｏ−ＴＨＰＯ、テトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）、イミダゾール−４−酢酸、Isoguvacine、Muscimol、Baclofen、cis−アミノクロトン酸（ＣＡＣＡ）および trans−アミノクロトン酸（ＴＡＴＡ）から成る群より選択される請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
第一植物および第二植物が双子葉植物である請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
双子葉植物が、Arabidopsis thaliana 植物である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファおよび綿から成る群より選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
第一植物および第二植物が単子葉植物である請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワおよびサトウキビから成る群より選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
植物育種の方法であって、
（ａ）第一植物および第二植物を入手し；
（ｂ）該第一植物をＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理し；そして
（ｃ）該第一植物に該第二植物からの花粉を受粉することを含む方法。
【請求項４８】
受粉することが、自然受粉を生じさせることを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
受粉が、手動受粉を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
第一植物を、前記処理後に自家不稔性にする請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤が、（Ｓ）−４−アミノ−５−フルオロペンタン酸、４−アミノ−２−（置換メチル）−２−ブテン酸、４−アミノ−５−フルオロペント−２−エン酸、γ−ビニルＧＡＢＡ［Ｄ，Ｌ−４−アミノヘクス−５−エン酸（Vigabatrin（Ｒ））］および Valproate から成る群より選択される請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
第一植物および第二植物が双子葉植物である請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
双子葉植物が、Arabidopsis thaliana 植物である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
双子葉植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファおよび綿から成る群より選択される請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
第一植物および第二植物が単子葉植物である請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
単子葉植物が、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワおよびサトウキビから成る群より選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
候補ＧＡＢＡ類似体についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験植物を入手し；
（ｂ）該試験植物を候補ＧＡＢＡ類似体で処理し；そして
（ｃ）該試験植物の稔性への該候補ＧＡＢＡ類似体の作用を検出する工程を含む方法。
【請求項５８】
検出することが、植物の稔性の減少を検出することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
試験植物が雌雄異株植物である請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
試験植物が雌雄同株植物である請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
処理することが、候補ＧＡＢＡ類似体を試験植物の花に適用することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験植物を入手し；
（ｂ）該試験植物を候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理し；そして
（ｃ）該試験植物の稔性への該候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤の作用を検出する工程を含む方法。
【請求項６３】
検出することが、植物の稔性の減少を検出することを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
試験植物が雌雄異株植物である請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
試験植物が雌雄同株植物である請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
処理することが、候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤を試験植物の花に適用することを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
処理することが、候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤を試験植物の上部に上から適用することを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
候補ＧＡＢＡ阻害剤についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）増大したＧＡＢＡレベルの結果として減少した稔性を示す試験植物を入手し；
（ｂ）該試験植物を候補ＧＡＢＡ阻害剤で処理し；そして
（ｃ）該試験植物の稔性への該候補ＧＡＢＡ阻害剤の作用を検出する工程を含む方法。
【請求項６９】
試験植物が、ＰＯＰ２遺伝子の突然変異を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
試験植物が、トランスジェニックＰＯＰ２遺伝子を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
試験植物が、アンチセンスＰＯＰ２遺伝子を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
検出することが、処理後の稔性の回復を検出することを含む請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２００１年６月２２日出願の米国予備特許出願第６０／３００，５１３号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書中に具体的に取り込まれる。米国政府は、米国エネルギー省による承認番号ＤＥ−ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２４０号によって、本出願に権利を有することができる。
【０００２】
Ｉ．発明の分野
本発明は、概して、植物の分子生物学および細胞生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、花ＧＡＢＡレベルのモジュレーションによって植物の稔性を変更することを含む方法および組成物に関する。
【０００３】
II．関連技術の説明
植物育種の目的は、単一の品種／雑種のいろいろな望ましい形質を組み合わせることである。育種技術は、植物の受粉方法を利用している。二つの一般的な受粉方法があり、一つの花からの花粉が同じ植物の同じまたは別の花に移される場合、植物は自家受粉する。花粉が別の植物の花から来ている場合、植物は他家受粉する（cross-pollinates）。受精様式の制御は、成功した植物育種スキームに決定的である。
【０００４】
植物育種技術の一つの使用は、ハイブリッド品種の開発である。これは、多数の重要な作物植物が雑種強勢を示すためであり、それによって、雑種植物は、一層活力のある成長を含めた増強された作物学的特性を示すので、農業経営者がそれらを成長させる。雑種作物は好適であるので、種子のハイブリッド品種の開発は、種子産業に重要である。
【０００５】
雑種作物の生産には、概して、自家受粉を防止する工程をとる必要がある。ハイブリッドトウモロコシ生産の場合、これは、典型的には、花粉発散前に、雄花生殖部分または穂を物理的に除去することによって達せされる。この技術は、有効であるが、きわめて労力を要する。更に、雄性および雌性双方の生殖器官がある個々の花を有する植物種の場合、これは、難しいまたは不可能でありうるので、概して、稔性を調節するための別のシステムが要求される。
【０００６】
自家受粉を制御するための別の手段は、遺伝的雄性不稔または自家不稔性の使用である。雄性不稔を与える多数の遺伝子は、例えば、米国特許第３，８６１，７０９号、米国特許第３，７１０，５１１号、米国特許第４，６５４，４６５号および米国特許第５，６２５，１３２号に記載されてきた。しかしながら、これら遺伝因子は、核であれ細胞質であれ、親系統で安定して維持するのが難しいことがありうる。細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）を用いる場合、ハイブリッド種子生産は、３種類の同系繁殖系統、すなわち、（１）ＣＭＳ細胞質を有する細胞質雄性不稔系統；（２）核遺伝子についてＣＭＳ系統と同質遺伝子である、正常細胞質を有する稔性同系繁殖体（「維持系統（maintainer line）」）；および（３）稔性回復遺伝子を有する、正常細胞質を有する別の稔性同系繁殖体（「回復（restorer）」系統）を必要とする。このＣＭＳ系統は、維持系統での受粉によって繁殖するが、ＣＭＳ細胞質は雌性親に由来しているので、子孫は全て雄性不稔である。したがって、雄性不稔系統の維持は、可能ではあるが、難しいし且つ労力を要することがありうる。更に、雄性不稔形質は、その植物に望ましくない特性を導入することがありうる。例えば、若干の細胞質雄性不稔因子は、真菌病原体への増加した感受性に関連していた。
【０００７】
いろいろな化学的殺配偶子剤も、受粉の制御のために記載されてきた。殺配偶子剤は、花粉の発生、成熟または放出に関与する過程または細胞に影響を与える。このような殺配偶子剤で処理された植物は、雄性不稔にされるが、典型的には、依然として雌性稔性である。化学的殺配偶子剤の使用は、例えば、米国特許第４，９３６，９０４号に記載されている。殺配偶子剤の使用は、ある場合には有益であると証明されており、それらはなお、広範な使用に採用されている。
【０００８】
先行技術は、植物稔性の調節に有用なシステムを提供してきたが、当該技術分野においては依然として、植物稔性を調節するための改良されたシステムが大いに要求されている。具体的には、費用のかかる植物の除雄または複雑な育種スキームへの必要条件を免れる自家不稔性を誘発するシステムが要求されている。このような新しいシステムの開発は、植物育種技術を改善し且つ農業分野における重要な進歩であると考えられる。
【０００９】
発明の要旨
一つの側面において、本発明は、植物の稔性をモジュレーションする方法であって、その植物を、ＧＡＢＡ代謝またはＧＡＢＡレベルの既知のまたは候補モジュレーターを含めたＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体で処理することを含む方法を提供する。この方法では、いずれかのＧＡＢＡ類似体、例えば、フォルスコリン、ガバペンチン（gabapentin）およびプレガバリン（pregabalin）、４−cis−アミノクロトン酸、Ｎ−メチル−Ｅｘｏ−ＴＨＰＯ、テトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）、イミダゾール−４−酢酸、イソグバシン（Isoguvacine）、ムシモール（Muscimol）、バクロフェン（Baclofen）、cis−アミノクロトン酸（ＣＡＣＡ）および trans−アミノクロトン酸（ＴＡＴＡ）から成る群より選択されるＧＡＢＡ類似体が用いられると考えられる。植物は、雌雄同株植物または雌雄異株植物でありうる。植物は、双子葉植物、例えば、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物でもありうる。植物は、単子葉植物、例えば、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物でもありうる。
【００１０】
この方法は、更に、本発明の若干の態様において、この植物を処理することが、この植物の花の雄性部分を処理することを含む、雄性不稔植物を生じる方法として定義されてよい。モジュレーションすることは、この植物を、自家不稔性を含めた不稔性にすることを含んでよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、ＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体のオーバーザトップ（over the top）適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は、植物の稔性をモジュレーションする方法であって、この植物をＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理することを含む方法を提供する。いずれか適当なＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤が用いられると考えられる。本発明の若干の態様において、この阻害剤は、（Ｓ）−４−アミノ−５−フルオロペンタン酸、４−アミノ−２−（置換メチル）−２−ブテン酸、４−アミノ−５−フルオロペント−２−エン酸、γ−ビニルＧＡＢＡ［Ｄ，Ｌ−４−アミノヘクス−５−エン酸（ビガバトリン（Vigabatrin）（Ｒ））］およびバルプロエート（Valproate）から成る群より選択される。植物は、雌雄同株植物または雌雄異株植物でありうる。植物は、双子葉植物、例えば、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物でもありうる。植物は、単子葉植物、例えば、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物でもありうる。
【００１２】
この方法は、更に、本発明の若干の態様において、この植物を処理することが、この植物の花の雄性部分を処理することを含む、雄性不稔植物を生じる方法として定義されてよい。モジュレーションすることは、この植物を、自家不稔性を含めた不稔性にすることを含んでよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、花へのＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１３】
なおもう一つの側面において、本発明は、増大したＧＡＢＡレベルによって自家不稔性にされた花を有する植物の稔性を回復する方法であって、この植物をＧＡＢＡ阻害剤で処理することを含む方法を提供する。潜在的には、いずれかのＧＡＢＡ阻害剤、例えば、グバシン、（Ｒ）−ニペコチン酸、チアガビン（Tiagabine）、抗痙攣薬１−（２−（（（ジフェニルメチレン）アミノ）オキシ）エチル）−１，２，５，６−テトラヒドロピリジンカルボン酸塩酸塩、（ＮＮＣ−７１１、ビククリン（Bicuculine）、ピトラゼピン（Pitrazepin）、ベンジルペニシリン、セクリニン、ファクロフェン（Phaclofen）、ＣＧＰ３５３４８、ピクロトキシン（Picrotoxin）、１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−イルおよびメチルホスフィン酸（methylphophinic acid）が、本発明で用いられると考えられる。用いられる植物は、突然変異したＰＯＰ２遺伝子を含むと更に定義することができる。植物は、トランスジェニックアンチセンスＰＯＰ２遺伝子を含んでいてもよく、ＲＮＡ介入（ＲＮＡｉ）の結果として減少したＰＯＰ２発現を有する植物が含まれる。植物は、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物を含めた双子葉植物のようないずれかの種からであってよい。植物は、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物を含めた単子葉植物であってもよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、花へのＧＡＢＡ阻害剤のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１４】
また更にもう一つの側面において、植物育種の方法であって、（ａ）第一植物および第二植物を入手し；（ｂ）その第一植物をＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体で処理し；そして（ｃ）この第一植物にその第二植物からの花粉を受粉することを含む方法を提供する。この受粉は、自然受粉を生じさせることを含めたまたは手動受粉によるいずれかの手段によって行うことができる。第一植物は、本発明の若干の態様において、この処理後に自家不稔性にされてよい。用いられると考えられるＧＡＢＡ類似体の例には、フォルスコリン、ガバペンチンおよびプレガバリン、４−cis−アミノクロトン酸、Ｎ−メチル−Ｅｘｏ−ＴＨＰＯ、テトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）、イミダゾール−４−酢酸、Isoguvacine、Muscimol、Baclofen、cis−アミノクロトン酸（ＣＡＣＡ）および trans−アミノクロトン酸（ＴＡＴＡ）が含まれる。これら植物は、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物を含めた双子葉植物種のようないずれかの種からであってよい。植物は、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物を含めた単子葉植物種からであってもよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、花へのＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ類似体のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１５】
また更にもう一つの側面において、本発明は、植物育種の方法であって、（ａ）第一植物および第二植物を入手し；（ｂ）その第一植物をＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理し；そして（ｃ）この第一植物にその第二植物からの花粉を受粉することを含む方法を提供する。この受粉は、自然受粉を生じさせることを含めたまたは手動受粉によるいずれかの手段によって行うことができる。第一植物は、本発明の若干の態様において、この処理後に自家不稔性にされてよい。用いられると考えられるＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤には、（Ｓ）−４−アミノ−５−フルオロペンタン酸、４−アミノ−２−（置換メチル）−２−ブテン酸、４−アミノ−５−フルオロペント−２−エン酸、γ−ビニルＧＡＢＡ［Ｄ，Ｌ−４−アミノヘクス−５−エン酸（Vigabatrin（Ｒ））］および Valproate が含まれる。これら植物は、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物を含めた双子葉植物種のようないずれかの種からであってよい。植物は、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物を含めた単子葉植物種からであってもよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１６】
また更にもう一つの側面において、本発明は、候補ＧＡＢＡ類似体についてスクリーニングする方法であって、（ａ）試験植物を入手し；（ｂ）その試験植物を候補ＧＡＢＡ類似体で処理し；そして（ｃ）その試験植物の稔性へのこの候補ＧＡＢＡ類似体の作用を検出する工程を含む方法を提供する。本発明の若干の態様において、検出することは、植物の稔性の減少を検出することを含む。この植物は、雌雄同株または雌雄異株の植物であってよいしまたはでなくてもよい。植物は、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物を含めた双子葉植物のようないずれかの種からであってよい。植物は、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物を含めた単子葉植物であってもよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、試験植物の花へのＧＡＢＡ類似体のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１７】
また更にもう一つの側面において、本発明は、候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤についてスクリーニングする方法であって、（ａ）試験植物を入手し；（ｂ）その試験植物を候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤で処理し；そして（ｃ）その試験植物の稔性へのこの候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤の作用を検出する工程を含む方法を提供する。本発明の若干の態様において、検出することは、植物の稔性の減少を検出することを含む。この植物は、雌雄同株または雌雄異株の植物であってよいしまたはでなくてもよい。植物は、Arabidopsis thaliana、タバコ、トマト、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、ニンジン、カリフラワー、ブロッコリ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファまたは綿植物を含めた双子葉植物のようないずれかの種からであってよい。植物は、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、イネ、芝草、オートムギ、オオムギ、モロコシ、アワまたはサトウキビ植物を含めた単子葉植物であってもよい。処理することは、一つまたはそれを超える花などのいずれかの植物部分を処理することを含んでよいし、しかも例えば、試験植物の花へのＧＡＢＡ類似体のオーバーザトップ適用によって植物全体を処理することを含んでよい。
【００１８】
また更にもう一つの側面において、本発明は、候補ＧＡＢＡ阻害剤についてスクリーニングする方法であって、（ａ）増大したＧＡＢＡレベルの結果として減少した稔性を示す試験植物を入手し；（ｂ）その試験植物を候補ＧＡＢＡ阻害剤で処理し；そして（ｃ）その試験植物の稔性へのこの候補ＧＡＢＡ阻害剤の作用を検出する工程を含む方法を提供する。本発明の一つの態様において、試験植物は、ＰＯＰ２遺伝子の突然変異を含む。もう一つの態様において、試験植物は、トランスジェニックＰＯＰ２遺伝子を含み、そしてアンチセンスまたはＲＮＡｉ技術によって減少したＰＯＰ２レベルを有していてもよい。検出することは、本発明の若干の態様において、処理後の稔性の回復を検出することを含む。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、植物の稔性の操作方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服する。本発明によって更に提供されるのは、植物稔性へのこのような作用を有する化合物の識別のための検定である。本発明の方法は、生殖組織中でのＧＡＢＡ蓄積が、植物に自家不稔性を引き起こすことがありうるという知見に関する。具体的には、本発明者による研究は、Ａ．thaliana ｐｏｐ２突然変異によって示される自家不稔表現型におけるＧＡＢＡ蓄積の役割を解明した。したがって、本発明によって植物生殖組織中のＧＡＢＡ蓄積を操作することにより、植物稔性を変更することができる。この方法で、自家受精を防止することができる。この技術は、有意の前進であり、潜在的に、自家受精の防止のための労力を要する手動技術への要求、または繁殖させるのが難しいことがありうるし且つ種々の有害な形質に関連していることがありうる核または細胞質の雄性不稔遺伝因子の使用が排除される。本発明により、自家不稔性は、生殖組織中のＧＡＢＡレベルを人為的に増加させることによって、例えば、ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ類似体またはＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤を投与することによって誘発することができる。
【００２０】
Ｉ．植物稔性におけるＧＡＢＡの役割の解明
従来の研究は、花粉管誘導の特異的欠損が、野生型と比較して３００倍の種子生産減少を示す Arabidopsis 突然変異体における自家不稔性の根拠を構成しているということを示した（Wilhelmi and Preuss, 1996）。従来、花粉管誘導は、この突然変異植物における唯一の明らかな欠損であったし；花粉管は、雌ずい細胞（胚珠の小皮子柄）に付着しなかったし且つ通常の標的である胚珠の珠孔の方向に成長する代わりに、子房中のいたるところでランダム方向に成長したということも分かった（Wilhelmi and Preuss, 1996；図１Ａおよび１Ｂ；および図２Ｂ、Ｃも参照されたい）。更に、この突然変異体は自家不稔性であり；雄性および雌性組織がこの突然変異を有する場合、誘導欠損だけが生じるということが確認された。その時点で、ｐｏｐ２−１およびｐｏｐ３−１と称される二つの遺伝子座が、稔性に必要であると考えられた（Wilhelmi and Preuss, 1996）。しかしながら、本発明者によって行われたその後の研究は、植物を不稔性にするには、ｐｏｐ２−１遺伝子座単独で充分であるということ、および近接して分離している胚致死突然変異が、稔性においてｐｏｐ３−１遺伝子座の誤った前の関連性を生じたということを示した。
【００２１】
Ａ．  ωアミノトランスフェラーゼとしてのＰＯＰ２の識別
ｐｏｐ２−１突然変異およびその地図位置は、従来、地図に基づくアプローチによってＰＯＰ２遺伝子をクローン化するのに用いられた（Laura Wilhelmi,Ph.D.thesis, University of Chicago および図３）。ｐｏｐ２−１突然変異系統中への形質転換で、そのクローン化された遺伝子は、稔性を回復することができた。タンパク質相同性研究に基づき、その時点では、ＰＯＰ２は、ビオチン生合成に関与するＤＡＰＡ（ジアミノペラルゴン酸）アミノトランスフェラーゼに最も高い相同性を有するアミノトランスフェラーゼをエンコードしているかもしれないということが示唆された（Laura Wilhelmi,Ph.D.thesis, University of Chicago および図３）。しかしながら、本発明者によって行われた最新のゲノム配列データベースを伴うその後のタンパク質配列分析は、そのＰＯＰ２タンパク質配列が、ωアミノトランスフェラーゼになお一層大きい相同性を有するということを示した（図４）。これら酵素は、β−アラニン、オルニチンおよびＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）などのωアミノ酸の生合成および異化に関与している。
【００２２】
Ｂ．  ｐｏｐ２不稔花におけるＧＡＢＡ蓄積
どのωアミノ酸がＰＯＰ２の基質であると考えられるか決定するために、野生型および突然変異体の花における個々の遊離アミノ酸の濃度を決定した。この分析結果を表１に与える。理解されるように、ＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１花において、野生型花と比較して約１００倍高いことが判明した。β−アラニンの濃度も、野生型花に相対してｐｏｐ２−１花において僅かに高かった（約５倍）。この実験を２回繰り返して（全３回）、平均および標準偏差を生じた（表１）。誤差限界の範囲内で、野生型花とｐｏｐ２−１花との間に２倍を超える変動を示したアミノ酸は他になかった。遺伝子分析は、ｐｏｐ２−１突然変異が、ＰＯＰ２遺伝子の機能の損失を引き起こすということを示した。したがって、ｐｏｐ２−１花におけるＧＡＢＡレベルの有意の増加は、ＰＯＰ２の通常の機能がＧＡＢＡ異化にあるということを示唆している。ＧＡＢＡ側路と称される、ＧＡＢＡを含む生化学的経路は、以前に、他の生物で解明された（例えば、Shelp et al., 1999；図５を参照されたい）。この経路において、グルタミン酸はＧＡＢＡに変換され、次にこれが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼによってコハク酸セミアルデヒドに分解される。次に、コハク酸セミアルデヒドは、４−ヒドロキシ酪酸に変換される、またはコハク酸に変換された後、ＫＲＥＢ’ｓ回路に入る。トランスアミナーゼへの配列相同性およびｐｏｐ２−１突然変異体におけるＧＡＢＡ蓄積に基づいて（図７および表１）、ＰＯＰ２は、Arabidopsis のＧＡＢＡトランスアミナーゼをエンコードしているということが結論づけられた。
【００２３】
ｐｏｐ２−１花におけるＧＡＢＡレベルの有意の増加は、野生型ＰＯＰ２が、ＧＡＢＡからアミノ基を除去することによって機能すると考えられるということを示している。生化学的検定は、ＧＡＢＡトランスアミナーゼが、ピルビン酸かまたはα−ケトグルタル酸にアミノ基を移動させるということを示している。どちらの活性も、植物を含めた多数の種に存在するが（Shelp et al, 1999）、α−ケトグルタル酸クラスだけが、系統発生分析において包含を確信するのに充分に特性決定されてきた。ＰＯＰ２とβ−アラニンピルビン酸トランスアミナーゼとの間の有意の相同性は、ＰＯＰ２が、ピルビン酸をアミノ受容体として利用すると考えられるということを示唆している。
【００２４】
【表１】
2004534542.tif 000002
【００２５】
野生型およびｐｏｐ２−１突然変異体からの全花抽出物のマススペクトロメトリー分析とカップリングしたガスクロマトグラフィーは、コハク酸レベルが未変化のままであるということを示した（表２）。同様に、４−ヒドロキシブタン酸レベルも、野生型および突然変異体の花抽出物において未変化であった（表２）。更に、コハク酸セミアルデヒドは、ＧＡＢＡ側路の他に、チロシンおよびビタミンＢ６の代謝経路において中間体として生じるということが知られている（www.genome.ad.jp/dbget-bin/www_bget?cpd:C00232）。総合して、これら結果は、ｐｏｐ２植物の不稔性が、下流の欠失よりもむしろ、ＧＡＢＡレベルの増加の結果であるということを示している。
【００２６】
【表２】
2004534542.tif 000003
【００２７】
Ｃ．  増加したＧＡＢＡレベルは減少した稔性と相関する
野生型 Arabidopsis 植物は、それらの花序茎において限られた分枝を示す。対照的に、ｐｏｐ２−１不稔植物は、多数の不稔植物に典型的である広範な分枝を有する。ｐｏｐ２−１の場合、第二枝の角果（果実）は、第一枝のものより多い種子を有する（図６Ｂ）。稔性におけるこの相違も、第一枝および第二枝の花におけるＧＡＢＡレベルと相関したかどうか調べるために、これら二つのタイプの枝から別々に単離される花から、全アミノ酸を定量した。図６Ａに示されるように、ＧＡＢＡレベルは、野生型植物の第一および第二枝花において同じままであることが判明した。ｐｏｐ２−１の場合、第一枝花と比較して増加した稔性を示した第二枝花において、ＧＡＢＡレベルの有意の減少が判明した。他のアミノ酸全ての濃度は、ｐｏｐ２−１の第一および第二枝花において同じままであった。これら結果は、増加したＧＡＢＡレベルが、減少した稔性と相関するということを示した。
【００２８】
ＧＡＢＡレベルと稔性との間の関係を確かめるために、更に別の植物を、ＰＯＰ２遺伝子中の突然変異について単離した。更に二つの突然変異系統を、ｐｏｐ２遺伝子中への転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の挿入について識別した（Krysan et al., 1999）。ｐｏｐ２−１の場合を一緒にした、これら二つの対立遺伝子における花ＧＡＢＡレベルおよび稔性の比較は、逆相関を示し、花粉管成長が、増加するＧＡＢＡとともに一層ランダムになることが示唆された（図９）。これら結果は、神経芽細胞の移動パターンに依存するＧＡＢＡ濃度に似ている。すなわち、ＧＡＢＡは、ｆＭ濃度で適切な移動を支配するが、μＭレベルでランダムな運動性を刺激する（Barker et al, 1998）。ＧＡＢＡは、哺乳動物神経系において活動電位を引き起こし、そして更に、小脳細胞の生長を促進するケモトロフィック因子（chemotrophic factor）として役立つ神経伝達物質である。ＰＯＰ２の機能の解明は、ＧＡＢＡが、極性のある細胞誘導を植物界でも動物界でも促進するという証拠を与える。その発見は、花粉管誘導におけるＧＡＢＡレセプターおよび下流のシグナリング分子の役割を特性決定する機会を与える。更に、それら結果は、哺乳動物神経系におけるＧＡＢＡのケモトロフィック役割（chemotrophic role）のモデルとして花粉管成長を利用する可能性を示す。例えば、ＧＡＢＡアゴニストおよびアンタゴニストは、動物実験を実施する前にまたは代わりに、植物で試験されると考えられる。
【００２９】
Ｄ．  ＧＡＢＡの局在化
ＧＡＢＡ蓄積の機能的有意性を更に理解するために、更に別の研究を行って、ＧＡＢＡレベルが野生型に相対して有意に増加したｐｏｐ２−１植物の器官を識別した。全アミノ酸を、野生型およびｐｏｐ２−１植物の葉、花粉および胚珠から単離した。これら抽出物を含有するドットブロットを、ＧＡＢＡまたはグルタミン酸に対して上昇した抗体でプローブした。図８に示されるように、ｐｏｐ２−１葉におけるＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１胚珠または花粉で見出されるレベルよりも低かったが、野生型葉におけるレベルよりは高かった。それらＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１花粉および胚珠において、該当する野生型器官と比較して一層高かった。雄性（花粉）および雌性（胚珠）組織で認められる増加した蓄積は、ｐｏｐ２−１花の自家不稔表現型と一致する。野生型花粉管は、ｐｏｐ２雌ずいにおいて胚珠を首尾良く受精させ、そしてｐｏｐ２突然変異体花粉管は、野生型雌ずいにおいて受精するので、不稔性は、雄性組織と雌性組織との間の相互作用を伴うことがありうる。したがって、ＧＡＢＡでの不稔性の誘発には、最初に、ある与えられた標的種の限界レベルを連続的に決定することが望まれることがありうる。
【００３０】
花粉管誘導におけるＧＡＢＡの役割について手がかりを得るために、ＧＡＢＡの細胞特異的局在化を雌ずい内で行った。受粉した野生型またはｐｏｐ２−１の雌ずいの薄い切片を作成し、そして抗ＧＡＢＡ抗体でプローブした。上記のＧＡＢＡ定量化およびドットブロットの結果と一致して、ｐｏｐ２−１雌ずいは、野生型雌ずいに相対して増加したＧＡＢＡ蓄積を示した（図１０）。これら研究に用いられた雌ずいは、受粉していたので、それらを通った花粉管と、受精した胚珠を含有した。花粉管が胚珠へ行く経路に何からの特異的ＧＡＢＡ局在化が存在するかどうか調べるために、未受粉の雌ずいで類似した研究を行っている。
【００３１】
ｐｏｐ２−１胚珠において増大したＧＡＢＡは、通常はＧＡＢＡを蓄積する細胞の増加によってまたは異所性蓄積によって生じると考えられる。これら可能性を区別するために、ＧＡＢＡを、野生型および突然変異体の雌ずい部分に免疫局在化して（immunolocalized）、ｐｏｐ２突然変異体が誘導欠損を示したそれら部位に集中させた（図１Ｂ、Ｃ）。胚珠は、小皮子柄によって隔膜表面に付く（図１Ａ）。内胚珠皮および外胚珠皮は、卵を含めた胚嚢細胞を包み；花粉管は、隔膜に沿って成長し、小皮子柄を上り、珠皮の間の珠孔に入り、その後精子を放出することによって卵を標的とする（図１Ａ）。隔膜および小皮子柄に相対して、野生型胚珠は、珠孔に最も近い内珠皮細胞にＧＡＢＡ蓄積の焦点を有したが（図１Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊ（それぞれ、ｎ＝４８、５６、７８、１２３））；珠皮細胞のこの亜集団は、以前には、花粉管誘導を支配するのに関連していなかった。ｐｏｐ２−１の場合、そのＧＡＢＡパターンは、野生型に似ていたが、隔膜および小皮子柄および胚珠のいたるところできわめて増大した（図１Ｇ、Ｋ；それぞれ、ｎ＝６６、８７）。ｐｏｐ２花粉管は、小皮子柄細胞へのランダム成長および欠陥付着、珠皮表面上の不適当な成長、および珠孔を越えた移動を示し（Wilhelmi and Preuss, 1996）；これら部位は全て、以上に高レベルのＧＡＢＡによって顕著である。ＧＡＢＡのこれら増加は、ｐｏｐ２花粉管を不適当な位置に引きつけて、不稔性を引き起こすことができる。
【００３２】
II．不稔性の誘発および利用
本発明により、ＧＡＢＡレベルの操作を用いて、植物の稔性を変更することができる。例えば、本発明は、自家不稔性植物の生産誘発システムを提供することによって先行技術の欠点を克服する。具体的には、本発明は、植物に自家不稔表現型を人為的に誘発するための生殖組織中のＧＡＢＡレベルの操作を可能にする。或いは、本発明は、稔性へのＧＡＢＡの作用を人為的に減少させることによって、例えば、ＧＡＢＡ阻害剤の適用によって、増大したレベルのＧＡＢＡで植物の稔性を回復する方法を提供する。
【００３３】
本発明の重要な用途は、植物育種である。例えば、植物花におけるＧＡＢＡレベルの増大は、植物に自家不稔性を誘発するのに用いられ、それによって、植物の異系交雑を容易にすることができる。この技術は、労力を要する植物の除雄への要求、または維持するのが難しいまたは関連している遺伝的不稔システムの使用を、有害な形質を伴うことなく免れる。
【００３４】
植物を効率よく異系交雑する能力は、植物育種手順に重要である。植物は、ヘテロ接合性でありうるしまたはホモ接合性でありうる。ある遺伝子座に同じ対立遺伝子が存在する場合、その遺伝子座にホモ接合性があるといわれる。それらが異なる場合、ヘテロ接合性があるといわれる。完全な同系繁殖植物の場合、ヘテロ接合性状態への強い選択または自然突然変異がなければ、本質的に全ての遺伝子座がホモ接合性である。ある植物において、ホモ接合性遺伝子座はその植物に有害であり、低下した活力および／または不充分な成長をもたらすことがありうるので、農業経営者による同系繁殖植物の直接的使用は、あまり好適でないことがありうる。例えば、トウモロコシは「雑種強勢」を示し、したがって、農業経営者がそれを雑種として成長させる。すなわち、概して、ハイブリッドトウモロコシは、同系繁殖体が示すより大きい活力を示すであろう。したがって、雑種の生産は、繁殖業者および栽培者にとってきわめて興味深いであろう。更に、作物の新品種は、典型的には、出発系統間で最初に雑種交雑を行うことによって生じる。したがって、慎重な受粉管理は、植物育種に不可欠である。しかしながら、ヒトの介入がなければ、多数の植物は自家受粉して、育種過程を予測不能にするであろう。
【００３５】
雑種生産のためには、雄性および雌性の親は、典型的には、いろいろなヘテロティック（heterotic）バックグラウンドに由来する異なった選りすぐりの同系繁殖体である。次に、両親の植物を栽培し、開花時期まで成長させる。次に、雑種生産のためには、交雑受粉が起こるべきである。しかしながら、上に示されたように、多数の植物は自然に自家受粉するであろうし、通常は、雑種生産のためにヒト介入を必要とする。一般的には、これは、自家受精を防止するために、花粉発散時期の前に、除雄、例えば、植物の雄性生殖部分の除去を必要とする。しかしながら、除雄は、時間と労力を要する。或いは、核または細胞質の雄性不稔遺伝因子を用いることができる。しかしながら、これら形質の導入は、その形質を選りすぐりの生殖質中に労力を要して戻し交雑することがありうるし、親系統における不稔形質の繁殖は、複雑な育種スキームを必要とすることがありうるし、そしてこれら不稔形質は、連鎖した有害な形質に関連していることがありうる。しかしながら、本発明によれば、生殖組織中のＧＡＢＡレベルを人為的に増加させることによって、例えば、ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ類似体またはＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤を投与することによって、この工程を置き換えることができる。
【００３６】
除雄後、ハイブリダイゼーションおよび受精が起こる。植物は、自然かまたは機械的技法によって交雑させることができる。花粉が、重力、風、受粉を媒介する昆虫または動物、または花の雄性生殖部分からその花のレセプター部分への他の天然ベクターによって運ばれる場合、自然受粉が起こる。トウモロコシなどの雌雄同株作物の場合、雄花および雌花部分は、同一植物の異なった場所に位置している。雌雄異株植物の場合、別々の雄性植物および雌性植物が存在する。
【００３７】
人為的に支配される受粉は、手または他の手動技術によって行うことができる。不稔性を誘発するための植物の処理は、個々の植物で、または親植物の畑全体のオーバーザトップ処理によって行うことができる。一般的には、雄性親（花粉ドナー）として用いられる植物と、雌性親（花粉レシピエント）として用いられる植物が存在するであろう。この場合、雌性親は、典型的には、その処理によって雄性不稔にされ、そして異系交雑された子孫は、その雌性親から得られるであろう。適当な雄性親は、雄性生殖組織に関して稔性（雄性稔性）であろうが、雌性不稔であってよいしまたはでなくてよい。
【００３８】
雌性植物を雄性不稔にする処理後、植物を成長させ、そして自然または手動の交雑受粉が起こる。雌性親植物の誘発された雄性不稔の結果として、雌性親からの花粉は予め不稔にされているので、雄性親植物からの花粉が全て、受粉に利用可能である。当然ながら、このハイブリダイゼーション手順の際、これら親品種は、好ましくは、他の植物から隔離されるように成長させて、外来源からの花粉の何等かの偶発的混入を最小限にするまたは防止する。これら隔離技術は、充分に当業者の技術の範囲内である。
【００３９】
本発明の一つの態様において、生産される種子は、Ｆ１雑種植物に成長させることができる第一代種子であり、この第一および第二親植物は、同系繁殖植物である。もう一つの態様において、第一および第二親植物の一方または両方が雑種でありうる。ある同系繁殖植物を、別の異なった同系繁殖植物と交雑する場合、第一代（Ｆ１）雑種植物に成長することができる種子が生じる。このＦ１種子、それから成長するＦ１雑種植物、およびそのＦ１雑種植物の種子は、本発明の側面である。Ｆ１雑種を生産する方法の目的は、相互作用して新しいまたは改良された形質（表現型特性）を生じる新しい遺伝子組合せを生じるように、植物の遺伝子補体を操作することである。Ｆ１雑種を生産する方法は、典型的には、一つまたはそれを超える同系繁殖植物の生産および交雑で開始する。好ましい態様において、交雑は、
（ａ）第一および第二親植物の種子を植え；
（ｂ）その第一および第二親植物の種子を栽培しまたは成長させ；
（ｃ）第一植物上の少なくとも一つの花のＧＡＢＡレベルを増加させるために、ＧＡＢＡ代謝のモジュレーターで、少なくとも第一植物を処理し；そして
（ｄ）処理された花に、第二親植物からの花粉を交雑受粉する工程を含む。
【００４０】
両親植物は、成熟するまで成長し続けさせてよいし、またはそれら雄性列は、開花完了後に破壊されてよい。したがって、若干の態様において、この技術には、次に、（ｅ）交雑受粉によって得られた種子を採取する工程が含まれてよい。概して、雌性親植物からの種子だけを採取して、異系交雑された種子を得る。集められた種子は、農業経営者に販売され、加工されまたは更に別の育種プログラムで用いられうる有益な市販製品である。
【００４１】
III．植物のＧＡＢＡをモジュレーションすること
本発明の一つの態様において、若干の既知のまたは候補のＧＡＢＡ代謝モジュレーターまたはＧＡＢＡを、植物または植物部分に適用することができる。本発明の一つの態様において、この植物部分は、雄性および／または雌性部分を含めた花である。いずれか適当な方法を、その適用に用いることができる。例えば、ＧＡＢＡ阻害剤、ＧＡＢＡ類似体およびＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤、更には、いずれかのその組合せを含めたＧＡＢＡ代謝モジュレーターを、水溶液または粉末溶液中で植物に適用することができる。処理は、単一の植物またはその部分、ある選択された植物集合、植物列、植物集団または植物の畑全体へのそのモジュレーターのオーバーザトップ適用によることができる。処理は、概して、稔性の変更が望まれる植物に、または候補のＧＡＢＡ代謝モジュレーターまたはＧＡＢＡ類似体の識別について本明細書中に与えられる検定で用いられる植物で行われるにすぎないであろう。例えば、植物中の有効なＧＡＢＡレベルを増大させることができる候補化合物は、試験植物への候補化合物の適用での自家不稔表現型の誘発によって識別することができる。このような候補は、ＧＡＢＡの異化を阻害することによってＧＡＢＡレベルを増大させることができるし、またはＧＡＢＡ合成を刺激することによってそのようにすることができる。或いは、このような化合物は、ＧＡＢＡと同様の生理学的自家不稔活性を引き起こすＧＡＢＡ類似体であってよい。
【００４２】
本発明の技術は、大規模に行うことができる。例えば、候補ＧＡＢＡ代謝モジュレーターの検定は、選択された試験植物の集団を候補化合物で処理後、自家受粉後に子孫を生じるその植物の能力へのこの処理の作用を決定することによって行うことができる。潜在的には、いずれの植物も検定に用いられると考えられるが、Ａ．thaliana は、小さいサイズおよび成熟までの短い成長期間を含めたその使用の便利さゆえに、この目的に特に有用な一つの生物である。Ａ．thaliana の自家不稔性は、伸長した種子さや（角果）の顕著な不存在によって容易に識別可能である。稔性の更に別の証明は、角果を開き、種子の減少または不存在を目で見て確かめることによって行われる。より大規模な分析については、植物群を採取し、種子さやを機械的手段によって開き、そして種子を植物破片から分離後に集めることができる。植物材料１グラム当たりの種子収量は、それら種子を秤量することによって容易に決定される。
【００４３】
ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ類似体またはＧＡＢＡ代謝モジュレーターを含有する組成物を、植物への適用のために具体的に製剤化することが望まれることがありうるということは、当業者によって理解されるであろう。このような組成物は、当業者に知られているであろう。このような製剤中に包含されることが望まれうる成分の具体的なタイプは、例えば、米国特許第６，２４２，３８２号に記載されており、この開示はそのまま本明細書中に参照により具体的に取り込まれる。本発明によるＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ類似体またはＧＡＢＡ代謝モジュレーターと一緒に包含するための成分のタイプの若干の例を、下に挙げるが、当業者は、このリストが非制限であり且つ単に例示の目的のためのものであるということを理解するであろう。
【００４４】
ＧＡＢＡモジュレーターまたは類似体と一緒に包含されて植物に適用されることが望まれることがありうる一つの成分は、界面活性剤である。界面活性剤として適当なものには、芳香族スルホン酸、例えば、リグノ−、フェノール−、ナフタレン−およびジブチルナフタレンスルホン酸の、およびアリールスルホネート、アルキルエーテル、ラウリルエーテル、硫酸脂肪アルコールおよび硫酸脂肪アルコールグリコールエーテルの脂肪酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩；スルホン化ナフタレンおよびその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合物；ナフタレンまたはナフタレンスルホン酸とフェノールおよびホルムアルデヒドとの縮合物；フェノールまたはフェノールスルホン酸とホルムアルデヒドとの縮合物；フェノールとホルムアルデヒドおよび亜硫酸ナトリウムとの縮合物；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル；エトキシル化イソオクチル−、オクチル−またはノニルフェノール；トリブチルフェニルポリグリコールエーテル；アルキルアリールポリエーテルアルコール；イソトリデシルアルコール；エトキシル化ヒマシ油；エトキシル化トリアリールフェノール；リン酸化トリアリールフェノールエトキシラートの塩；ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート；ソルビトールエステル；リグニン−亜硫酸廃液；またはメチルセルロース；またはこれらの混合物が含まれる。界面活性剤使用の場合の慣例は、固体混合物の全重量に基づいて約０．５〜２５重量％を包含することである。
【００４５】
ＧＡＢＡモジュレーターたまは類似体は、植物への適用のための固体混合物中に含まれてもよい。このような場合、活性化合物と一緒に一つまたはそれを超える担体材料を包含することが望まれることがありうる。担体の例には、シリカ、シリカゲル、シリケート、タルク、カオリン、アタクレー（attaclay）、石灰石、白亜、黄土、クレー、ドロマイト、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウムなどの鉱土；粉砕合成材料；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、チオ尿素および尿素などの化学肥料；穀物粉、樹皮粉、木粉および堅果殻粉などの植物由来製品；セルロース粉末；アタパルジャイト；モンモリロナイト；雲母；蛭石；合成シリカおよび合成ケイ酸カルシウム；またはこれらの混合物が含まれる。
【００４６】
溶液には、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、二リン酸水素アンモニウム、一リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素アンモニウムナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウムまたはカルバミン酸アンモニウムなどの水溶性化合物または塩が含まれてよい。
【００４７】
他の典型的な成分には、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、部分水素化ポリ酢酸ビニル、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマーおよびポリ酢酸ビニルまたはこれらの混合物などの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、タルクまたはポリエチレングリコール、またはこれらの混合物などの滑沢剤；シリコーンエマルジョン、長鎖アルコール、リン酸エステル、アセチレンジオール、脂肪酸または有機フッ素化合物などの消泡剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、トリニトリロ三酢酸の塩またはポリリン酸の塩、またはこれらの混合物などの錯化剤が含まれる。
【００４８】
植物への適用のために本発明によって用いられると考えられる既知のＧＡＢＡ阻害剤の例には、グバシン、（Ｒ）−ニペコチン酸、Tiagabine、抗痙攣薬１−（２−（（（ジフェニルメチレン）アミノ）オキシ）エチル）−１，２，５，６−テトラヒドロピリジンカルボン酸塩酸塩、ＮＮＣ−７１１、Bicuculine、Pitrazepin、ベンジルペニシリン、セクリニン、Phaclofen、ＣＧＰ３５３４８、Picrotoxin、１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−イルおよびメチルホスフィン酸（methylphophinic acid）が含まれる（例えば、Krogsgaard-Larsen et al., 2000; Iversen, 2000; および Gerasimov et al., 2000 を参照されたい）。
【００４９】
本発明によって用いられると考えられる既知のＧＡＢＡ類似体の例には、フォルスコリン、ガバペンチンおよびプレガバリン、４−cis−アミノクロトン酸、Ｎ−メチル−Ｅｘｏ−ＴＨＰＯ、テトラヒドロイソキサゾロピリジン（ＴＨＩＰ）、イミダゾール−４−酢酸、Isoguvacine、Muscimol、Baclofen、cis−アミノクロトン酸（ＣＡＣＡ）および trans−アミノクロトン酸（ＴＡＴＡ）が含まれる（例えば、Jefferson, 2001; Devlin, 2001; Schousboe, 2000; および Potschka et al., 2000 を参照されたい）。
【００５０】
本発明によって用いられると考えられる既知のＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤の例には、（Ｓ）−４−アミノ−５−フルオロペンタン酸、４−アミノ−２−（置換メチル）−２−ブテン酸、４−アミノ−５−フルオロペント−２−エン酸、γ−ビニルＧＡＢＡ［Ｄ，Ｌ−４−アミノヘクス−５−エン酸（Vigabatrin（登録商標））］および Valproate が含まれる（例えば、Silverman et al., 1983; Silverman, 1986; Silverman, 1986; Johannessen, 2000; および Gerasimov et al., 2000 を参照されたい）。
【００５１】
潜在的には、植物壊死を引き起こさないいずれかの量のＧＡＢＡ代謝モジュレーターを、本発明で適用することができる。このようなレベルは、類似した環境条件下においてそれ以外の場合には成長する植物集団のメンバーへの混合物の連続適用によって決定されるであろう。これら適用の結果としての植物生育能力への作用は、成長する植物組織についての壊死区域の目視識別によって確かめることができる。
【００５２】
VI．ＧＡＢＡ代謝モジュレーターおよびＧＡＢＡ類似体を識別する検定
本発明の一つの重要な側面は、ＧＡＢＡ代謝モジュレーターおよびＧＡＢＡ類似体の識別のための新しい検定を含む。例えば、本発明は、増加した花ＧＡＢＡレベルが、新しいＧＡＢＡ類似体またはＧＡＢＡ代謝モジュレーターの識別のための自家不育に関連しているという知見の利用を可能にする検定を提供する。本発明により、大多数のＧＡＢＡ類似体は、植物花への連続適用後、実際のＧＡＢＡ類似体の場合の自家不稔表現型の識別を行うことにより、スクリーニングされると考えられる。同様に、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの候補阻害剤は、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの阻害が、増加したＧＡＢＡレベルを生じると考えられるのと同様に、スクリーニングされると考えられる。或いは、ＧＡＢＡ阻害剤は、既存の増加したＧＡＢＡレベルを有する植物を、候補ＧＡＢＡ阻害剤で処理後、自家稔性の回復についてスクリーニングすることにより、スクリーニングされると考えられる。
【００５３】
新しい検定は、動物試験に代わるものを提供するという点で重要である。これら検定も、自然の生化学的過程においてＧＡＢＡが果たしている主要な役割を考慮すると、有意である。例えば、ＧＡＢＡは、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）における主要な抑制神経伝達物質である（概説については、Enna, 1983; Schwartz, 1988 を参照されたい）。ＧＡＢＡ神経伝達物質の減少は、てんかんを含めたいろいろな神経障害の病因に関連していた（Krogsgaard-Larsen et al., 2000; Rebak et al., 1979）。したがって、新規なＧＡＢＡ代謝モジュレーターの識別は、いろいろな医学的状態を処置する新しい手段を提供することができる。
【００５４】
Ｖ．植物
本明細書中で用いられる「植物」という用語は、いずれかのタイプの植物を意味する。本発明者は、本発明によって用いることができる若干の植物の典型的な説明を下に与えている。しかしながら、他のタイプの植物が当業者に知られるであろうし且つ本発明で用いられると考えられるので、このリストは、単に例示の目的で与えられており、制限するものではない。
【００５５】
農業で利用される植物の一般的なクラスは、アーティチョーク、コールラビ、キバナスズシロ、リーキ、アスパラガス、レタス（例えば、頭花、葉、タチチシャ）、体菜、マランガ（malanga）、ブロッコリ、メロン（例えば、マスクメロン、スイカ、クレンショー、ハネーデュー、カンタループ）、芽キャベツ、キャベツ、カルドニ（cardoni）、ニンジン、白菜（napa）、カリフラワー、オクラ、タマネギ、セロリ、パセリ、ヒヨコマメ、パースニップ、チコリ、ハクサイ（Chinese cabbage）、コショウ、コラード、ジャガイモ、キュウリ植物（マロー、キュウリ）、カボチャ、ウリ科、ハツカダイコン、乾球タマネギ、カブカンラン、ナス、バラモンジン、キクヂシャ、シャロット、エンダイブ、ニンニク、ホウレンソウ、グリーンオニオン（green onions）、カボチャ属、青野菜、ビート（テンサイおよび飼料ビート）、サツマイモ、フダンソウ、セイヨウワサビ、トマト、ケール、カブおよびスパイス類を含めた野菜作物である。
【００５６】
しばしば商業的に利用されている植物の他のタイプには、リンゴ、アンズ、サクランボ、ネクタリン、モモ、セイヨウナシ、プラム、プルーン、マルメロ、アーモンド、クリ、ハシバミ、ペカン、ピスタチオ、クルミ、カンキツ類、ブルーベリー、ボイゼンベリー、クランベリー、アカスグリ、ローガンベリー、キイチゴ、イチゴ、クロイチゴ、ブドウ、アボカド、バナナ、キーウィ、カキ、ザクロ、パイナップル、トロピカルフルーツ、ポルネ（pornes）、メロン、マンゴー、パパイヤおよびレイシなどの果実およびブドウ作物が含まれる。
【００５７】
最も広範囲に栽培される植物の多くは、マツヨイグサ、メドーフォーム（meadow foam）、トウモロコシ（飼料用、スイートコーン、ポップコーン）、ホップ、ホホバ、ラッカセイ、イネ、ベニバナ、小穀類（オオムギ、オートムギ、ライムギ、コムギ等）、モロコシ、タバコ、カポック、マメ科植物（マメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、油脂植物（セイヨウアブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココヤシ、ヒマ、カカオ豆、アメリカホドイモ）、繊維植物（綿、アマ、アサ、ジュート）、クスノキ科（肉桂、樟脳）などの畑作植物、またはコーヒー、サトウキビ、茶および天然ゴム植物などの植物である。
【００５８】
経済的に重要な別の植物群は、観賞植物である。一般的に栽培される観賞植物の例には、アルストレメリア（alstroemeria）（例えば、アルステメリア・ブラジリエンシス（Alstoemeria brasiliensis））、アスター、アザレア（例えば、ツツジ属（Rhododendron sp.））、ベゴニア（例えば、シュウカイドウ属（Begonia sp.））、ホタルブクロ、ブーゲンビレア、サボテン（例えば、カクタシエ・シュルムベルゲラ・ツルンカタ（Cactaceae schlumbergera truncata））、ツバキ、カーネーション（例えば、ディアンタス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus））、キク（例えば、キク属（Chrysanthemum sp.））、クレマチス（例えば、ハンショウヅル属（Crematis sp.））、ケイトウ、オダマキ、シクラメン（例えば、シクラメン属（Cyclamen sp.））、ラッパズイセン（例えば、スイセン属（Narcissus sp.））、偽シプレス（false cypress）、フリージア（例えば、フリージア・レフラクタ（Freesia refracta））、ゼラニウム、ガーベラ、グラジオラス（例えば、グラジオラス属（Gradiolus sp.））、ホリー、ハイビスカス（例えば、ハイビスカス・ロササネンシス（Hibiscus rosasanensis））、アジサイ（例えば、マクロフィラ・ハイドランジア（Macrophylla hydrangea））、ビャクシン、ユリ（例えば、ユリ属（Lilium sp.））、モクレン、ミニローズ（miniroses）、ラン（例えば、ラン科（Orchidaceae）の科メンバー）、ペチュニア（例えば、ペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida））、ポインセチア（例えば、ショウジョウボク（Euphorbia pulcherima））、サクラソウ、ツツジ、バラ（例えば、バラ属（Rosa sp.））、キンギョソウ（例えば、キンギョソウ属（Antirrhinum sp.））、低木類、森林などの樹木（広葉樹、および針葉樹などの常緑樹）およびチューリップ（例えば、チューリップ属（Tulipa sp.））が含まれる。
【００５９】
VI．定義
本明細書中で用いられる「対立遺伝子」という用語は、一つまたはそれを超える代わりの遺伝子形態のいずれかを意味し、これら対立遺伝子は全て、一つの形質または特徴に関する。二倍体の細胞または生物において、ある与えられた遺伝子の二つの対立遺伝子は、１対の相同染色体上に該当する遺伝子座を占有する。
【００６０】
本明細書中で用いられる「交雑受粉」という用語は、異なった植物からの二つの配偶子の合体による受精を意味する。
本明細書中で用いられる「花」という用語は、植物の雄性および雌性両方の生殖器官を意味する。若干の植物が、別々の雄花および雌花を、単一の植物上に（例えば、雌雄同株植物）かまたは別々の植物上に（雌雄異株植物）有するということ、および本明細書中で用いられる「花」という用語が、雄花および雌花双方を包含するということは、当業者に理解されるであろう。
【００６１】
本明細書中で用いられる「ＧＡＢＡ類似体」という用語は、このＧＡＢＡ類似体で処理された植物において自家稔性の減少を引き起こすいずれかの化学物質または他の物質を意味する。この物質は、同じ官能基を有するＧＡＢＡに化学的に類似していることができるし、または構造は異なってよいが、植物内のＧＡＢＡ標的に作用して、自家稔性の増加を引き起こすことができる。このような類似体を論じるのにしばしば用いられる別の名称は、「アゴニスト」である。
【００６２】
本明細書中で用いられる「候補ＧＡＢＡ類似体」という用語は、ＧＡＢＡ類似体である性状を有することができるいずれかの化合物を意味する。
本明細書中で用いられる「ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤」という用語は、通常は、アミノ基をＧＡＢＡから受容体に移動させるように、またはアミノドナーから受容体上に移動させることによってＧＡＢＡを形成するように作用する酵素（例えば、トランスアミナーゼ）の活性を阻害することができる化学物質または他の物質を意味する。
【００６３】
本明細書中で用いられる「候補ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤」という用語は、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ阻害剤である性状を有することができるいずれかの化合物を意味する。
【００６４】
本明細書中で用いられる「ＧＡＢＡ阻害剤」という用語は、ＧＡＢＡの天然の活性に対抗するように作用するいずれかの化学物質または他の物質を意味する。阻害剤は、ＧＡＢＡに化学的に似ていてよいし、または構造が異なっていてよい。これら阻害剤は、標的に結合することでＧＡＢＡに競合的に干渉することによって作用してよいし、または植物中へのＧＡＢＡの取込みを阻害することによって作用してよい。このような阻害剤を論じるのにしばしば用いられる別の名称は、「アンタゴニスト」である。
【００６５】
本明細書中で用いられる「候補ＧＡＢＡ阻害剤」という用語は、ＧＡＢＡ阻害剤である性状を有することができるいずれかの化合物を意味する。
本明細書中で用いられる「ＧＡＢＡ代謝モジュレーター」という用語は、生物の細胞または組織のＧＡＢＡレベルを増加させるまたは減少させることができる化合物を意味する。
【００６６】
本明細書中で用いられる「雌雄同株」という用語は、同一植物上に別々の雄花および雌花を有する植物を意味する。トウモロコシ（Zea mays）は、例えば、主軸の上部に雄花の穂、およびそれより下に雌花の群（雌穂または穂軸）を有する。雌雄異株植物は、別々の植物上に雄花および雌花を有する。
【００６７】
本明細書中で用いられる「表現型」という用語は、細胞または生物の検出可能な特徴であって、遺伝子発現の徴候である特徴を意味する。
本明細書中で用いられる「ＰＯＰ２」は、GenBank 受託番号ＡＦ３５１１２５の核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に該当する植物遺伝子座を意味する。
【００６８】
本明細書中で用いられる「自家不稔」という用語は、生育可能な子孫を生じるように自家受精することができない、または実質的に減少した自家受粉能力を示す植物を意味する。実質的に減少した自家受精レベルは、典型的には、少なくとも５０％であるが、しばしば、６０％、７０％、８０％、９０％などまたは１００％もの、なお一層高いレベルの種子収率の減少を意味するであろう。
【００６９】
本明細書中で用いられる「自家受粉」という用語は、同一植物の葯から柱頭への花粉の移動を意味する。
本明細書中で用いられる「導入遺伝子」という用語は、形質転換によって植物のゲノム中に導入された遺伝子配列を意味する。
【００７０】
VII．実施例
次の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために包含される。次の実施例に開示される技術は、本発明の実施において充分に機能すると本発明者によって発見された技術であり、したがって、その実施に好ましい方法を構成すると考えられうるということが、当業者に理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、多数の変更が、発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様で行うことができるし且つ同様のまたは類似の結果を得ることもできるということを理解するはずである。より詳しくは、化学的にも生理学的にも関係している若干の薬剤は、本明細書中に記載の薬剤の代わりに置き換えることができ、同じまたは類似の結果が達せられると考えられるということが明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似した代替物および修正は全て、請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００７１】
実施例１
花粉管誘導の欠損は不稔を引き起こす
花粉管誘導の特異的欠損は、野生型と比較して３００倍の種子生産減少を示した Arabidopsis 突然変異体の不稔性についての根拠として以前に決定された（Wilhelmi and Preuss, 1996）。花粉管誘導は、この突然変異植物における唯一の明らかな欠損であったし；花粉管は、雌ずい細胞（胚珠の小皮子柄）に付着しなかったし且つ通常の標的である胚珠の珠孔の方向に成長する代わりに、子房中のいたるところでランダム方向に成長したということも分かった（Wilhelmi and Preuss, 1996、図１も参照されたい）。更に、この突然変異体は自家不稔性であり；雄性および雌性組織がこの突然変異を有する場合、誘導欠損だけが生じるということが確認された。
【００７２】
ｐｏｐ２−１およびｐｏｐ３−１と称される二つの遺伝子座は、以前は、稔性に必要であると考えられた（Wilhelmi and Preuss, 1996）。ｐｏｐ２−１は、染色体３にマッピングされており（図３）、ｐｏｐ３−１は、染色体５にマッピングされた。しかしながら、本発明者によるその後の研究は、植物を不稔性にするには、ｐｏｐ２−１遺伝子座単独で充分であったということ、および接近して分離している胚致死突然変異が、稔性においてｐｏｐ３−１遺伝子座の誤った関連性を生じたということを示した。
【００７３】
ｐｏｐ２−１欠損を識別後（Laura Wilhelmi,Ph.D.thesis, University of Chicago）、ｐｏｐ２突然変異部位でＤＮＡ配列を増幅したＰＣＲプライマーを作成した。引き続き、そのＰＣＲ産物を制限酵素で処理して、突然変異体および野生型の対立遺伝子を明白に区別させた（Laura Wilhelmi,Ph.D.thesis, University of Chicago, 2000）。この方法を用いて、分離しているｐｏｐ２およびｐｏｐ３の対立遺伝子を有する植物の遺伝子型の再評価を行って、これら遺伝子間の複雑な遺伝子相互作用を明らかにした。
【００７４】
野生型（Columbia 生態型）ｘ不稔性突然変異体（Landsberg 生態型）交雑による１１０の不稔性Ｆ２子孫におけるＤＮＡ多型の分離は、多型性マーカーにそれぞれ４．８ｃＭおよび６ｃＭで連鎖した二つの遺伝子座ｐｏｐ２およびｐｏｐ３に予め関連していた。ＰＯＰ２をクローニング後、ｐｏｐ２−１ｄＣＡＰＳマーカーを設計し、そして不稔性への完全な連鎖（５１７植物）、更には、胚致死（ｅｍｂ）損傷への強い連鎖（４．５ｃＭ）を確認した。意外にも、このｅｍｂ突然変異を欠いた希少なｐｏｐ２／ＰＯＰ２植物は、３：１の比率の稔性：不稔性の子孫を生じ（１１４４：３４０，Ｐ＜０．０１；χ２検定）、単一の遺伝子形質が示唆された。したがって、ｐｏｐ３について以前に観察された偏りは、ｅｍｂまたは他の損傷を有する植物の適応度の回復によって生じていたかもしれない。更に別の証拠が、ｐｏｐ２−１が不稔性に充分であることを示している。（１）ＰＯＰ３に一層近接して連鎖した（２ｃＭの範囲内）分子マーカーの分析は、ｐｏｐ３突然変異を欠いた不稔性ｐｏｐ２／ｐｏｐ２植物を決定した（７／全１１０植物）、（２）ｐｏｐ２／ｐｏｐ２、ＥＭＢ／ＥＭＢ植物の野生型への戻し交雑は、３：１の比率の稔性：不稔性のＦ２植物を生じた（１６７０：５０７，Ｐ＜０．０１；χ２検定）、（３）ＰＯＰ２導入遺伝子のコピーは、ｐｏｐ２−１稔性を回復した、そして（４）他のｐｏｐ２対立遺伝子も、不稔性欠損を引き起こす。
【００７５】
Ａ．  ωアミノトランスフェラーゼとしてのＰＯＰ２の識別
ｐｏｐ２−１突然変異は、従来、地図に基づくアプローチによってＰＯＰ２遺伝子をクローン化するのに用いられた（Laura Wilhelmi,Ph.D.thesis, University of Chicago および図３）。ｐｏｐ２−１突然変異系統中への形質転換で、そのクローン化された遺伝子は、稔性を回復することができた。タンパク質相同性研究に基づき、その時点では、ＰＯＰ２は、ビオチン生合成に関与するＤＡＰＡ（ジアミノペラルゴン酸）アミノトランスフェラーゼに最も高い相同性を有するアミノトランスフェラーゼをエンコードしているかもしれないということが示唆された。しかしながら、本発明者によって行われた最新のゲノム配列データベースを伴うその後のタンパク質配列分析は、そのＰＯＰ２タンパク質配列が、ωアミノトランスフェラーゼになお一層大きい相同性を有するということを示した（図４）。図４に示されるように、この分析プログラムは、ＰＯＰ２が、ＤＡＰＡの種類よりもβ−アラニンアミノトランスフェラーゼに近縁であるということを示した。ωアミノトランスフェラーゼは、β−アラニン、オルニチンおよびＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）などのωアミノ酸の生合成および異化に関与している。
【００７６】
これら結果は、クラスIIIωアミノトランスフェラーゼに有意の（Ｐ＜１ｘ１０−９３）類似性を示した。このクラスのアミノトランスフェラーゼは、保存されたモチーフを有するラージファミリーを構成している。系統発生分析は、ＰＯＰ２が、シュードモナス属（Pseudomonas）β−アラニンピルビン酸アミノトランスフェラーゼに最も類似しているということを示した。このデータベースは、トマトおよびコショウのＰＯＰ２に近縁のものを含有して、この酵素が、植物の中で広く保存されているということが示唆される。この Pseudomonas アミノトランスフェラーゼは、β−アラニン、オルニチンおよびＧＡＢＡが含まれるアミノ酸の群であるωアミノ酸を認識するという点が異例である。
【００７７】
Ｂ．  ｐｏｐ２不稔花におけるＧＡＢＡ蓄積
どのωアミノ酸がＰＯＰ２の基質であると考えられるか決定するために、野生型および突然変異体の花における個々の遊離アミノ酸の濃度を、Molecular Structure Facility, University of California, Davis の商業的に入手可能なサービスを用いて決定した。このの分析には、０．１〜１グラムの組織を液体窒素中で圧潰し、２．５ｍｌのメタノール（６２５μｌ）、クロロホルム（１．５ｍｌ）および水（３７５μｌ）中に抽出した。この試料を遠心分離して、相を分離し、上相を集め、窒素ガス下で乾燥させた。乾燥した材料を水中に再懸濁させ、分析用に送った。次に、これら試料抽出物を、Beckman Amino Acid Analyzer（Beckman Instruments）で分析した。
【００７８】
分析の結果を表１に与える。理解されるように、ＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１花において、野生型花と比較して１００倍高かった。β−アラニンの濃度も、野生型花に相対してｐｏｐ２−１花において僅かに高かった（５倍）。この実験を２回繰り返して、平均および標準偏差を生じた（表１）。誤差限界の範囲内で、野生型花とｐｏｐ２−１花との間に２倍を超える変動を示したアミノ酸は他になかった。遺伝子分析は、ｐｏｐ２−１突然変異が、ＰＯＰ２遺伝子の機能の損失を引き起こすということを示した。したがって、ｐｏｐ２−１花におけるＧＡＢＡレベルの有意の増加は、ＰＯＰ２の通常の機能がＧＡＢＡ異化にあるということを示唆している。ＧＡＢＡ側路と称される、ＧＡＢＡを含む生化学的経路は、以前に、他の生物で解明された（例えば、Shelp et al., 1999；図５を参照されたい）。この経路において、グルタミン酸はＧＡＢＡに変換され、次にこれが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼによってコハク酸セミアルデヒドに分解される。次に、コハク酸セミアルデヒドは、４−ヒドロキシ酪酸に変換される、またはコハク酸に変換された後、ＫＲＥＢ’ｓ回路に入る。トランスアミナーゼへの配列相同性およびｐｏｐ２−１突然変異体におけるＧＡＢＡ蓄積に基づいて（表１）、ＰＯＰ２は、Arabidopsis のＧＡＢＡトランスアミナーゼをエンコードしているということが結論づけられた（図６）。
【００７９】
Ｃ．  増加したＧＡＢＡレベルは減少した稔性と相関する
野生型 Arabidopsis 植物は、それらの花序茎において限られた分枝を示す。対照的に、ｐｏｐ２−１不稔植物は、多数の不稔植物に典型的である広範な分枝を有する。ｐｏｐ２−１の場合、第二枝の角果（果実）は、第一枝のものより多い種子を有する（図６Ｂ）。稔性におけるこの相違も、第一枝および第二枝の花におけるＧＡＢＡレベルと相関したかどうか調べるために、これら二つのタイプの枝から別々に単離される花から、全アミノ酸を定量した。アミノ酸分析は、上記のように、University of California, Davis より商業的に入手可能なサービスを用いて行った。第一枝は、若い Arabidopsis 植物の葉のロゼットより生じる最初の花序である。第二枝は、その最初の花序より遅れて生じ、しかも最初の花序の上にある分裂組織で始まる枝である。これら枝の稔性は、発育している角果を開き且つ種子数を計数することによって測定した。図６Ａに示されるように、ＧＡＢＡレベルは、野生型植物の第一および第二枝花において同じままであることが判明した。ｐｏｐ２−１の場合、第一枝花と比較して増加した稔性を示した第二枝花において、ＧＡＢＡレベルの有意の減少が判明した。他のアミノ酸全ての濃度は、ｐｏｐ２−１の第一および第二枝花において同じままであった。これら結果は、増加したＧＡＢＡレベルが、減少した稔性と相関するということを示した。
【００８０】
ＧＡＢＡレベルと稔性との間の関係を確かめるために、更に別の植物を、ＰＯＰ２遺伝子中の突然変異について単離した。ＰＯＰ２遺伝子に該当するＰＣＲプライマーを用いて、University of Madison, Madison, WI にある商業施設（www.biotech.wisc.edu/Arabidopsis/ を参照されたい）を用いて、Ｔ−ＤＮＡ挿入を含有する植物のライブラリーをスクリーニングした。ＰＣＲ産物を、ＰＯＰ２遺伝子に該当する一つのプライマーと、Ｔ−ＤＮＡに該当するもう一つのプライマーで増幅させた。Ｔ−ＤＮＡ突然変異体のプールからのゲノムＤＮＡを増幅させ、そしてＰＣＲ産物を生じた（したがって、ＰＯＰ２遺伝子の近くにＴ−ＤＮＡインサートを有した）プールを、サザンハイブリダイゼーションにより、ＰＯＰ２遺伝子をプローブとして用いて検出した。サブプールの引き続きのスクリーニングも、Madison 施設で行った。ＰＯＰ２の近くに挿入を有する植物の小プールを識別した後、個々の植物を成長させ、ＰＣＲに用いた。これらＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定は、挿入されたＴ−ＤＮＡの部位を示した。更に二つの突然変異系統を、ｐｏｐ２遺伝子中への転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の挿入について識別した（Krysan et al., 1999）。これら系統の内の二つ（ｐｏｐ２−２およびｐｏｐ２−３）から単離された花は、野生型花に相対するＧＡＢＡレベルの増加を示した（図７）。興味深いことに、これら二つの系統における増加は、ｐｏｐ２−１花の場合より少なかった。
【００８１】
試料が等しく加えられたことを示すために、二重ドットブロットを、グルタミン酸に対して上昇した抗体でプローブしたが、それらは、これら系統の中で類似した変化を示さなかった（図７）。ドットブロットは、花からの抽出物をニトロセルロースフィルター上にスポットすることによって行った。この抽出物を作るには、０．１〜１グラムの組織を液体窒素中で圧潰し、２．５ｍｌのメタノール（６２５μｌ）、クロロホルム（１．５ｍｌ）および水（３７５μｌ）中に抽出した。この試料を遠心分離して、相を分離し、上相を集め、窒素ガス下で乾燥させた。乾燥した材料を水中に再懸濁させた。懸濁した材料を、２．５％グルタルアルデヒド中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に室温で少なくとも１２時間結合させた。その懸濁液を、濃厚物としてかまたは連続希釈で、ニトロセルロースフィルター上にスポットした。
【００８２】
このフィルターを、遮断用緩衝液（Tris Saline 緩衝液（２０ｍＭ Tris，１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ Tween ２０，ｐＨ７．５）中５％脱脂粉乳）中において室温で３０分間インキュベート後、同緩衝液中であるが、グルタミン酸またはＧＡＢＡに対する抗体（それぞれ、Sigma カタログ＃Ｇ２９８２および＃Ａ２０５２）の添加を伴って、室温で１時間インキュベートした。これら抗体は、製造者が勧めるように希釈した（濃厚原液より１：１０００希釈）。次に、フィルターを、Tris Saline 緩衝液中において室温で３回洗浄した。洗浄後、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したウサギ抗マウスＩｇＧ，Piece, カタログ＃３１４５０）を１：５０００で加え、Tris Saline 緩衝液中において室温で３０分間インキュベートした。結合した抗体の検出は、ＥＣＬキット（Amersham Life Science, カタログ＃１０５９２４３および＃１０５９２５０）を用いて、製造者の取扱説明書にしたがって行った。得られた化学発光シグナルを、Ｘ線フィルム上で検出した。
【００８３】
Ｄ．  ＧＡＢＡの局在化
ＧＡＢＡ蓄積の機能的有意性を更に理解するために、更に別の研究を行って、ＧＡＢＡレベルが野生型に相対して有意に増加したｐｏｐ２−１植物の器官を識別した。全アミノ酸を、野生型およびｐｏｐ２−１植物の葉、花粉および胚珠から単離した。これら抽出物を含有するドットブロットを、ＧＡＢＡまたはグルタミン酸に対して上昇した抗体でプローブした（上を参照されたい）。図８に示されるように、ｐｏｐ２−１葉におけるＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１胚珠または花粉で見出されるレベルよりも低かったが、野生型葉におけるレベルよりは高かった。それらＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１花粉および胚珠において、該当する野生型器官と比較して一層高かった。雄性（花粉）および雌性（胚珠）組織で認められる増加した蓄積は、ｐｏｐ２−１花の自家不稔表現型と一致する。
【００８４】
花粉管誘導におけるＧＡＢＡの役割を更に理解するために、ＧＡＢＡの細胞特異的局在化を雌ずい内で行った。受粉した野生型またはｐｏｐ２−１の雌ずいの薄い切片を作成し、そして抗ＧＡＢＡ抗体でプローブした（図１および図１０）。雌ずいを受粉させ、リン酸緩衝化生理食塩水ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸カリウム，１４５ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ８．０）中の２．５％グルタルアルデヒド（Polysciences）、４％ホルムアルデヒド（Fisher）中で固定した。固定された試料を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そして一連のエタノール（５０％、７０％、８５％、９５％および１００％）中において室温でインキュベートした。各々のインキュベーションを１５分間行い、１回繰り返した。試料を、室温の１００％エタノール中で各１５分間３回洗浄し、ブタノール：エタノール（５０％：５０％，容量：容量）中で１５分間１回洗浄し、そして１００％ブタノール中で各２時間２回洗浄した。試料を、溶融パラフィン（Fisher）中において５５℃で４８時間浸潤させ；新たなパラフィンを加え、更に２４時間のインキュベーションを５５℃で行った。
【００８５】
重合後、１０μｍ切片を、Spencer-Lens Co.（Buffalo, NY）ウルトラミクロトームで切り取り、抗ＧＡＢＡ抗体でプローブした。その場での抗体染色は、植物組織を遮断用緩衝液（ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミン）に室温で３０分間、次に、同緩衝液中であるが、ＧＡＢＡに対する抗体（Sigma カタログ＃Ａ２０５２）の添加を伴って、４℃で一晩暴露することによって行った。これら抗体は、濃厚原液より１：１００に希釈した。次に、組織を、ＰＢＳ中において室温で３回洗浄した。洗浄後、二次抗体（１ｎｍ金粒子に結合したウサギ抗マウスＩｇＧ，Amersham Life Science, カタログ＃ＲＰＮ４７１）を１：２００で加え、ＰＢＳ中において室温で３０分間インキュベートした。結合した抗体の検出は、ＩｎｔｅｎＳＥＴＭＭ銀増強キット（Amersham Life Science, カタログ＃ＲＰＮ４９１）を用いて、製造者の取扱説明書にしたがって行った。得られた染色を、光学顕微鏡で観察した。
【００８６】
初めの方に記載されたＧＡＢＡ定量化およびドットブロットの結果と一致して、ｐｏｐ２−１雌ずいは、野生型雌ずいに相対して増加したＧＡＢＡ蓄積を示した（図１０）。これら実験に用いられた雌ずいは、受粉していたので、それらを通った花粉管と、受精した胚珠を含有した。花粉管が胚珠へ行く経路に何からの特異的ＧＡＢＡ局在化が存在するかどうか調べるために、未受粉の雌ずいで類似した研究を行っている。
【００８７】
本明細書中に開示され且つ請求の範囲に記載された組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度の実験を伴うことなく製造し且つ実行することができる。本発明の組成物および方法を、好ましい態様によって記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および方法に、および方法の工程または工程の順序に変更を行うことができるということは、当業者に明らかであろう。より詳しくは、化学的にも生理学的にも関係している若干の薬剤は、本明細書中に記載の薬剤の代わりに置き換えることができるし、同じまたは類似の結果が達せられると考えられるということが明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似した代替物および修正は全て、請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【００８８】
参考文献
次の参考文献は、それらが、典型的な手続き上のまたは他の詳細を本明細書中に示されたものに補足して与える程度に、本明細書中に参照により具体的に取り込まれる。
【００８９】
ＷＯ００６１７６３号
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
次の図は、本明細書の一部分を成し、本発明の若干の側面を更に示すために包含される。本発明は、本明細書中に与えられる具体的な態様の詳細な説明と組み合わせた一つまたはそれを超えるこれら図面の参照によって、より良く理解することができる。
【図１Ａ−Ｂ】ｐｏｐ２突然変異体の花粉管誘導欠損。花粉管は、通常の標的である胚珠の珠孔方向への成長の代わりに、子房中のいたるところでランダム方向の成長を示す（Wilhelmi and Preuss, 1996）。
【図２】胚珠中のＧＡＢＡ局在化。（図２Ａ〜２Ｂ）図示された（中実管、図２Ａ）または走査型電子顕微鏡で認められる（図２Ｂ、以前に Wilhelmi and Preuss, 1996 に示されたような）野生型胚珠での花粉管成長の最終段階；管は、隔膜（ｓ）から出て、珠柄（ｆ）を上り、珠孔（ｍ）に入る。（図２Ｃ）ｐｏｐ２−１胚珠での異常な花粉管成長の走査型電子顕微鏡写真（Wilhelmi and Preuss, 1996）。（図２Ｄ〜２Ｋ）野生型の胚珠（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｉ、２Ｊ）およびｐｏｐ２−１胚珠（図２Ｇ、２Ｋ）の断面；横および交差断面は、それぞれ、ＤおよびＨに図示されるように調製した。抗ＧＡＢＡ局在化は、銀（図２Ｅ、２Ｉ）またはＴＲＩＴＣ（図２Ｆ〜２Ｇ、２Ｊ〜２Ｋ）で検出した。多量のＧＡＢＡを、珠孔（矢じり形）を取り囲む内珠皮細胞の亜集団（矢印）で検出した；増大したＧＡＢＡは、ｐｏｐ２−１胚珠のいたるところで見られた（図２Ｇ、２Ｋ）。
【図３】ｐｏｐ２−１の染色体３へのマッピング。ＤＮＡ多型を用いて、ＰＯＰ２遺伝子の遺伝子地図位置を、Arabidopsis の染色体３に規定した。追加の遺伝子マーカーを、必要に応じて識別したが、これらは、ＤＮＡ配列地図上に遺伝子を小間隔で配置するのに用いた。
【図４Ａ−４Ｂ】ＰＯＰ２タンパク質配列の系統樹。（図４Ａ）Megalign 分析ソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ，Madison, WI）によって決定されるクラスIIIトランスアミナーゼの系統発生関係。各々のタンパク質について、Genbank 受託番号を示し、アミノ酸基質を括弧内に示している。ＰＯＰ２は、単一コピー Arabidopsis 遺伝子であり、イネ、トウガラシ（Capsicum）（コショウ）およびトマトに存在する未知の部分についての遺伝子と近縁関係にある。（図４Ｂ）ＧＡＢＡトランスアミナーゼの保存されたピリドキサールリン酸補因子結合部位（＊）に隣接したタンパク質配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw）およびボックスシェーディングソフトウェア（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）を用いて整列させた。ダッシュ記号は、整列を最大限にするのに導入されたギャップを示し；大部分の配列の同一のまたは同様の残基を影付きにしている（それぞれ、黒および灰色）。このＰＯＰ２タンパク質は、ピリドキサールリン酸補因子への予想される高度に保存された結合部位を有するクラスIIIトランスアミナーゼである（ＢＬＡＳＴ  Ｐ＜１ｘ１０−１１）。
【図５】ＧＡＢＡ側路を含む生化学的経路（Shelp et al., 1999）。この経路において、グルタミン酸はＧＡＢＡに変換され、次にこれが、ＧＡＢＡトランスアミナーゼによってコハク酸セミアルデヒドに分解される。次に、コハク酸セミアルデヒドは、４−ヒドロキシ酪酸に変換される、またはコハク酸に変換された後、ＫＲＥＢ’ｓ回路に入る。
【図６Ａ−Ｂ】（図６Ａ）第一および第二花序からの花のＧＡＢＡレベル。認められるように、ＧＡＢＡレベルは、野生型植物の第一および第二花序の花で同じままであったが、ｐｏｐ２−１の花では、第一花序と第二花序との間に有意の差があった。（図６Ｂ）第一および第二花序の角果中の種子計数。ｐｏｐ２−１の場合、第二枝の角果は、第一枝の角果より多い種子を有する。
【図７Ａ−Ｂ】（図７Ａ）ｐｏｐ２−１突然変異体のＧＡＢＡ蓄積。二つの追加のＰＯＰ２突然変異系統（ｐｏｐ２−２およびｐｏｐ２−３）より単離された花も、野生型花に相対するＧＡＢＡレベルの増加を示した。興味深いことに、これら二つの系統の増加は、ｐｏｐ２−１花の場合より少なかった。（図７Ｂ）試料が等しく加えられたことを示す対照。二重ドットブロットは、グルタミン酸に対して上昇した抗体でプローブしたが、突然変異系統の中でＧＡＢＡの場合と同様の変化を示さなかった。
【図８Ａ−Ｂ】（図８Ａ）ＧＡＢＡに対して上昇した抗体でプローブされた、野生型およびｐｏｐ２−１植物の葉、花粉および胚珠から単離された全アミノ酸を含有するドットブロット。ｐｏｐ２−１葉のＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１胚珠または花粉で見出されるレベルよりも低かったが、野生型葉のレベルよりは高かった。それらＧＡＢＡレベルは、ｐｏｐ２−１花粉および胚珠において、該当する野生型器官と比較して一層高かった。雄性（花粉）および雌性（胚珠）組織で認められる増加した蓄積は、ｐｏｐ２−１花の自家不稔表現型と一致する。（図８Ｂ）グルタミン酸に対して上昇した抗体でプローブされた、野生型およびｐｏｐ２−１植物の葉、花粉および胚珠から単離された全アミノ酸を含有する対照ドットブロット。
【図９】ＰＯＰ２組織中のＧＡＢＡレベル。花ＧＡＢＡ濃度と種子生産との間の相関（相関係数Ｒ２＝０．９８）。データは、５個の花（ＧＡＢＡ）または６個の果実（種子収量）の試料サイズを各々有する三重測定値から得られる平均である（±標準誤差）。３個のｐｏｐ２突然変異体での花ＧＡＢＡおよび稔性のレベルの比較は、逆相関を示し、花粉管成長が、増加するＧＡＢＡとともに一層ランダムになることが示唆された。
【図１０】雌ずい内で行ったＧＡＢＡの細胞特異的局在化。受粉した野生型またはｐｏｐ２−１の雌ずいの薄い切片を作成し、そして抗ＧＡＢＡ抗体でプローブした。ＧＡＢＡ定量化およびドットブロットの結果と一致して、ｐｏｐ２−１雌ずいは、野生型雌ずいに相対して増加したＧＡＢＡ蓄積を示した。
【図９】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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