(57)【要約】突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子であって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする単離された哺乳類ＤＮＡ分子、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子であって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする単離された哺乳類ＤＮＡ分子、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログ。
【請求項２】
突然変異事象が、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型を生じることを特徴とする突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３】
受容体サブユニットがＧＡＢＡＡ受容体のサブユニットであることを特徴とする請求項１または２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項４】
サブユニットがγサブユニットであることを特徴とする請求項３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項５】
γサブユニットがγ２サブユニットであることを特徴とする請求項４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの細胞外領域をコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記突然変異事象がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする請求項６に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記突然変異事象がベンゾジアゼピン結合ドメインをコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項７に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項９】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの大細胞外ループをコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項８に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１０】
突然変異が点突然変異であることを特徴とする請求項５から９のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１１】
点突然変異が高度に保存されたアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換をもたらすことを特徴とする請求項１０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１２】
前記突然変異事象が成熟γ２サブユニットの４３番目の残基で高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項１１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１３】
前記突然変異事象がグルタミンによる高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項１２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの４７１位のＧからＡへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項１３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する請求項１４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項１６に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１８】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループに起こっていることを特徴とする請求項５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
前記突然変異事象が点突然変異であることを特徴とする請求項２０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの１３９４位のＣからＴへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項２１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２３】
前記突然変異事象がコードされた成熟γ２サブユニットタンパク質の３５１位での停止コドンの導入をもたらすことを特徴とする請求項２２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２４】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する請求項２３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２５】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項２０から２３のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２６】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項２５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２７】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２８】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２９】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットに起こることを特徴とする請求項３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３０】
前記突然変異事象が点突然変異であることを特徴とする請求項２９に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３１】
点突然変異がコードされた成熟タンパク質の１７２位でのアルギニン残基の置換をもたらすことを特徴とする請求項３０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３２】
アルギニン残基がシステイン残基により置換されることを特徴とする請求項３１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３３】
前記突然変異事象がδサブユニットの６５８位でのＣからＴへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項３２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列が配列番号３に記載されていることを特徴とする請求項３３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３５】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項３１から３３のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３６】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項３５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３７】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３８】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３９】
突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチドであって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする単離された哺乳類ポリペプチド、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログ。
【請求項４０】
突然変異事象が、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型を生じることを特徴とする突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４１】
受容体サブユニットがＧＡＢＡＡ受容体のサブユニットであることを特徴とする請求項３９または４０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４２】
サブユニットがγサブユニットであることを特徴とする請求項４１に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４３】
γサブユニットがγ２サブユニットであることを特徴とする請求項４２に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４４】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの細胞外領域で起こることを特徴とする請求項４３に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４５】
前記突然変異事象がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする請求項４４に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４６】
前記突然変異事象がベンゾジアゼピン結合ドメインで起こることを特徴とする請求項４５に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４７】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの大細胞外ループで起こることを特徴とする請求項４６に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４８】
前記突然変異事象が置換であることを特徴とする請求項４２から４７のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４９】
前記突然変異事象が成熟γ２サブユニットの４３番目の残基で高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項４８に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５０】
前記突然変異事象がグルタミンによる高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項４９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５１】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する請求項４９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５２】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項５０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５３】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項５２に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５６】
前記突然変異事象がγ２サブユニットタンパク質の第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループに起こっていることを特徴とする請求項４２に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５７】
前記突然変異事象が切断であることを特徴とする請求項５６に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５８】
欠失が成熟γ２サブユニットの３５１位からであることを特徴とする請求項５７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する請求項５８に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６０】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項５９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６１】
前記１または複数の突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項６０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６４】
サブユニットがＧＡＢＡＡδサブユニットであることを特徴とする請求項４１に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６５】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットの細胞外領域で起こることを特徴とする請求項６４に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６６】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットの大細胞外ループで起こることを特徴とする請求項６５に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６７】
前記突然変異事象が置換であることを特徴とする請求項６４から６６のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６８】
前記突然変異事象が成熟δサブユニットの１７２番目の残基でアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項６７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６９】
前記突然変異事象がシステインによるアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項４９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７０】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する請求項６９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７１】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項６５から７０のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７２】
前記１または複数の突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項７１に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７４】
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７５】
請求項３９から７４のいずれか一つに記載のサブユニットを含む集合したＧＡＢＡ受容体である単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７６】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって：
（１）請求項１から３８のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞をポリペプチド産生に有効な条件で培養する工程；および
（２）突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットを収集する工程
を含む方法。
【請求項７７】
突然変異型ＧＡＢＡサブユニットと他のＧＡＢＡサブユニットとを哺乳類ＧＡＢＡ受容体へと集合させ、そして集合した受容体を収集する工程をさらに含む請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項３９から７４のいずれか一つに記載のポリペプチドとは免疫反応するが、野生型ＧＡＢＡ受容体またはそのサブユニットとは免疫反応しない抗体。
【請求項７９】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ′）２およびＦａｂのような抗体断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項７８に記載の抗体。
【請求項８０】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、野生型ＧＡＢＡ受容体または受容体サブユニットおよび／または野生型ＧＡＢＡ受容体または受容体サブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子またはＧＡＢＡ受容体活性を置換するＧＡＢＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターまたはＧＡＢＡ受容体活性を回復する請求項７５に記載の突然変異型ＧＡＢＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターをかかる処置を必要としている患者に投与する工程を含む方法。
【請求項８１】
ジアゼパムによる増強が回復されることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
切断型ＧＡＢＡ受容体が細胞膜に組み込まれることによって受容体機能が回復することを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
対象の機能的受容体の活性が増大されることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
野生型ＧＡＢＡ受容体またはＧＡＢＡ受容体サブユニットが遺伝子治療法によって導入されることを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
野生型ＧＡＢＡＡγサブユニットまたはδサブユニットが導入されることを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における野生型ＧＡＢＡ受容体または受容体サブユニットおよび／または野生型ＧＡＢＡ受容体または受容体サブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子または野生型または請求項７５に記載の突然変異型ＧＡＢＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターの使用。
【請求項８７】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、請求項７５に記載の突然変異型ＧＡＢＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項８８】
選択的アンタゴニストまたはモジュレーターが抗体であることを特徴とする請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ′）２およびＦａｂのような抗体断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における請求項７５に記載の突然変異型ＧＡＢＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターの使用。
【請求項９１】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、請求項１から３８に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子のいずれか一つに相補的であるＤＮＡ分子をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項９２】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における請求項１から３８のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子に相補的であるＤＮＡ分子の使用。
【請求項９３】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための請求項１から３８のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子の使用。
【請求項９４】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断における請求項４０から７５のいずれか一つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項９５】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断における請求項７８または７９に記載の抗体の使用。
【請求項９６】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための方法であって：
（１）てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の疑いのある対象からＤＮＡを採取する工程；および
（２）前記ＤＮＡのＧＡＢＡ受容体のサブユニットのＤＮＡ配列と野生型ＧＡＢＡ受容体の対応するサブユニットのＤＮＡ配列とを比較する工程
を含む方法。
【請求項９７】
各ＤＮＡ断片は配列決定され、その配列が比較されることを特徴とする請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＤＮＡ断片は制限酵素分析に供されることを特徴とする請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
ＤＮＡ断片はＳＳＣＰ分析に供されることを特徴とする請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための方法であって：
（１）てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の疑いのある対象からＧＡＢＡ受容体を採取する工程；および
（２）前記受容体のサブユニットと野生型ＧＡＢＡ受容体の対応するサブユニットを比較する工程
を含む方法。
【請求項１０１】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項４０から７５のいずれか一つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０２】
ハイスループットスクリーニング技術が用いられることを特徴とする請求項１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
請求項１から３８のいずれか一つに記載の単離されたＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０４】
動物がラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類からなる群より選択される請求項１０３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０５】
動物がマウスである請求項１０４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０６】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項１０２から１０５のいずれか一つに記載の遺伝子改変非ヒト動物の使用。
【請求項１０７】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項１から３８のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞の使用。
【請求項１０８】
請求項１から３８のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項１０９】
請求項１から３８のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はてんかんに関係する突然変異に関する。
【０００２】
背景技術
てんかんは人口の約３％がその人生のある時期に冒される多様な脳障害の総称である（Ａｎｎｅｇｅｒｓ，１９９６）。てんかん発作は、中枢神経系のニューロン集団の異常発動によって起こる挙動の挿間的変化と定義することができる。これは様々な度合いの不随意筋収縮を引き起し、意識消失を起こすことも多い。てんかん症候群は、特徴的な症状、発作のタイプ、原因、発症年齢およびＥＥＧパターンに基づいて４０種類を超えるタイプに分類されている（国際抗てんかん連盟分類・用語委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｅａｇｕｅ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｐｉｌｅｐｓｙ），１９８９）。しかし、全ての症候群に共通するただ一つの特徴は、不定期かつ予測不可能な形で発作として発現するニューロン興奮性の持続的増加である。
【０００３】
てんかんの病因に対する遺伝子の寄与は患者の約４０％に存在すると見積もられている（Ｇａｒｄｉｎｅｒ，２０００）。てんかん発作は、最終的にニューロンの同期性を混乱させる数多くの分子的異常の終点であると考えられるので、てんかんの遺伝的根拠は雑多であると思われる。表現型の一部にてんかんが含まれるメンデル型遺伝病は２００を超える。これらの疾患では、発作は、脳構造または脳機能の乱れなどといった神経学的疾患が基礎にあることを示している。これに対し、てんかんがその患者における唯一の症状であるような「純粋な」てんかん症候群も数多く存在する。これらは特発性と呼ばれ、てんかんの全症例の約６０％を占める。
【０００４】
特発性てんかんはさらに部分型と全般型に細分されている。部分（焦点または局所）てんかん発作は限局的な皮質発射に起因するので、関与するのは一定の筋群だけであって、意識がなくなることはないだろう（Ｓｕｔｔｏｎ，１９９０）。しかし全般てんかんでは、ＥＥＧ発射が焦点を示さず、よって脳の全皮質下領域が関与する。全般てんかんがしばしば遺伝するという知見は理解できるが、脳内でおそらく構成的に発現される遺伝的欠損が部分発作を引き起す機序はよくわからない。
【０００５】
特発性全般てんかん（ＩＧＥ）は最もよく見られる遺伝性ヒトてんかん群である。現在ＩＧＥには大別して２つの群、すなわち古典的特発性全般てんかん（国際抗てんかん連盟分類・用語委員会，１９８９）と、新たに認識された熱性けいれんプラスをもつ全般てんかんの遺伝的症候群（ＧＥＦＳ＋）（ＳｃｈｅｆｆｅｒおよびＢｅｒｋｏｖｉｃ，１９９７；Ｓｉｎｇｈら，１９９９）とが知られている。古典的ＩＧＥは、小児欠神てんかん（ＣＡＥ）、若年欠神てんかん、若年ミオクロニーてんかんなど、臨床的に識別できるが重複する部分もある多くの亜症候群（ｓｕｂ−ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に分類される（国際抗てんかん連盟分類・用語委員会，１９８９；Ｒｏｇｅｒら，１９９２）。亜症候群は発症年齢および発作タイプのパターン（欠神、ミオクローヌスおよび強直−間代）によって同定される。一部の患者、特に強直−間代発作のみをもつ患者には、一般に認められた特定の亜症候群に適合しないものもある。これらを独立した症候群とみなしながらも、これらは神経生物学的連続体の一部である認識する論拠は、以前に提示されている（Ｂｅｒｋｏｖｉｃら，１９８７；１９９４；ＲｅｕｔｅｎｓおよびＢｅｒｋｏｖｉｃ，１９９５）。
【０００６】
ＧＥＦＳ＋を別個の一症候群であると認識することは、各罹患家系内に臨床的不均一性があることから、最初は難しかった。熱性けいれんプラス（ＦＳ＋）は、小児が３ヶ月〜６歳の年齢範囲以外で熱性けいれんを持つか、または熱性強直−間代発作を伴う亜症候群である。多くの家系構成員は、例えば欠神、ミオクロニー発作または脱力発作を伴うＦＳ＋などの稀な表現型を持ち、他の家系構成員はさらに重症な亜症候群、例えばミオクロニー失立てんかんなどを持つ。
【０００７】
古典的ＩＧＥの症例と、ほとんどのＧＥＦＳ＋症例は、単純なメンデル遺伝をしない。この遺伝的不均一性は、表現型の不均一性および不完全浸透と相まって、関与する遺伝子を同定しようとする試みを妨げてきた。にもかかわらず、主に単一遺伝子性の病因を示すまれな大家系を研究することにより、２つの形態のＩＧＥを引き起す４つの遺伝子が発見されている。良性家族性新生児けいれんでは、カリウムチャネル遺伝子中に突然変異ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が同定され（Ｃｈａｒｌｉｅｒら，１９９８；Ｓｉｎｇｈら，１９９８；Ｂｉｅｒｖｅｒｔら，１９９８）、ＧＥＦＳ＋では、ナトリウムチャネル遺伝子中に突然変異ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂが見いだされている（Ｗａｌｌａｃｅら，１９９８；２００１）。しかし、これらの遺伝子中の突然変異は全ＩＧＥ症例のごく一部の説明にしかならないことから、他の遺伝子の関与が示唆される。
【０００８】
欠神てんかんの齧歯類モデル研究およびヒト研究により、異常なＧＡＢＡ作動性活性の関与がしばしば示唆されてきた（Ｄｅｓｔｅｘｈｅ，１９９９；Ｖｅｒｇｎｅｓら，２０００；Ｆｅｕｃｈｔら，１９９９；Ｆｕｔａｔｓｕｇｉら，１９９８）。ＧＡＢＡ作動系の関与は、不安、躁うつ病、恐怖強迫症状、アルツハイマー病、精神分裂病、偏頭痛などの他の神経／心理学的障害（Ｓｉｂｉｌｌｅら，２０００；ＧｅｒｎｅｒおよびＨａｒｅ，１９８１；Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら，１９９８；Ｍｉｚｕｋａｍｉら，１９９８ａ；１９９８ｂ；Ｐｅａｒｌｓｏｎ，２０００；Ｌｉｍｍｒｏｔｈら，１９９６；ＭｉｔｓｉｋｏｓｔａｓおよびＳａｎｃｈｅｚ　ｄｅｌ　Ｒｉｏ，２００１）および肥満（Ｂｌａｓｉ，２０００）にも結びつけられている。
【０００９】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は中枢神経系にもっとも豊富に存在する抑制性神経伝達物質である。ＧＡＢＡ作動性抑制は、２種類の受容体、Ａ型およびＢ型によって媒介される。Ｂ型受容体はＧタンパク質共役受容体群の一つであり、二次メッセンジャーカスケードによって様々な抑制効果を媒介する。Ａ型受容体は迅速な抑制を媒介するリガンド作動性クロライドチャネルである。
【００１０】
全般発作の一部の遺伝的動物モデルには、Ａ型ＧＡＢＡ受容体（すなわちＧＡＢＡＡ受容体）レベルの低下が観察されているが、これらの神経化学的相違は発作感受性をもたらす特異的病変には結びつけられていない。これらの知見はＯｌｓｅｎら（１９９９）によって再検討されたが、これらの疾患モデルには、いずれも、ＧＡＢＡ受容体の特定のサブユニットの有無に関する概説が必要である。ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをコードする遺伝子は約１６種類あって、それらは類縁関係にある。これらは配列一致度に基づいてα、β、γ、δ、εおよびρサブユニットに分類され、６つのαサブユニット（α１、α２などと呼ばれる）、３つのβサブユニット、３つのγサブユニットおよび３つのρサブユニットがある。各ＧＡＢＡＡ受容体は５つのサブユニットからなり、各サブユニットは、少なくとも理論上は、上記のどのサブユニットからでも選択されうる。Ｏｌｓｅｎら（１９９９）は、例えばβ３サブユニット遺伝子が不活化（ノックアウト）されているマウスが、てんかんをその症状の一つとするヒト遺伝病アンゲルマン症候群の適切な動物モデルになることを示している。Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９９）は、ＧＡＢＡＡ受容体には多くの分子変異体があり、それらの変異体は異なる薬理学的性質を持つことを報告している。例えばＧＡＢＡＡ受容体γサブユニットは機能的受容体の形成には必要ないが、このサブユニットを省いてαおよびβサブユニットだけで受容体を発現させると、ベンゾジアゼピン類が無効になる。また、てんかんマウスが不安の徴候を示すこと、そしてベンゾジアゼピン類が抗不安薬であることにも注目すべきである。しかし、ヒトでの欠損性ＧＡＢＡ受容体の原因と考えられる突然変異については、どちらの論文も論じていない。
【００１１】
発明の開示
本発明は、その一側面として、突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子であって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする哺乳類ＤＮＡ分子、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じる。特に全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。
【００１２】
本発明の好ましい一形態では、単離された哺乳類ＤＮＡがコードする受容体はＧＡＢＡＡ受容体であり、そのサブユニットは典型的にはγサブユニットまたはδサブユニットである。
【００１３】
本発明は、一態様として、突然変異型ＧＡＢＡＡγ２サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡであって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象がＧＡＢＡＡγサブユニットの細胞外領域をコードするヌクレオチドに起こっており、前記突然変異事象がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする哺乳類ＤＮＡ、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００１４】
前記突然変異事象は、典型的には、ベンゾジアゼピン結合ドメインをコードするヌクレオチド、特にＧＡＢＡＡγサブユニットの大細胞外ループに起こる。前記突然変異事象は、典型的には、点突然変異である。
【００１５】
本発明の一形態では、突然変異がエキソン２にあり、この突然変異は、ＧＡＢＡＡ受容体の成熟γ２サブユニットの４３番目の残基（前駆体タンパク質の８２番目の残基）で、高度に保存されたアルギニンの（典型的にはグルタミン残基による）置換（Ｒ４３Ｑ）をもたらす。このＲ４３Ｑ突然変異は、配列番号１に示すように、ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニットの４７１位（ｃ２４５）のＧからＡへのヌクレオチド置換の結果として起こる。
【００１６】
理論に束縛されることは望まないが、この突然変異は前記レセプターへの内因性ベンゾジアゼピン様化合物（エンドゼピン類）の結合を阻害する働きをすると推測される。
【００１７】
また本発明は、さらなる一態様として、突然変異型ＧＡＢＡＡγ２サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡであって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が、上記タンパク質の第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループをコードするヌクレオチドに起こっている哺乳類ＤＮＡ、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００１８】
前記突然変異事象は、典型的には、点突然変異である。本発明の一形態では、突然変異がエキソン９にあり、この突然変異は、典型的には、成熟タンパク質の３５１位で、高度に保存されたグルタミン残基の停止コドンによる置換（Ｑ３５１Ｘ）をもたらす。このＱ３５１Ｘ突然変異は、配列番号２に示すように、ＧＡＢＡＡ受容体のγ２サブユニットの１３９４位（ｃ１１６８）におけるＣからＴへのヌクレオチド置換の結果として起こる。
【００１９】
前記突然変異は第４膜貫通ドメインを失った切断型タンパク質をもたらし、その結果、野生型受容体複合体に対してドミナントネガティブ効果を持つ非機能的ＧＡＢＡＡ受容体複合体の形成が起こる。
【００２０】
理論に束縛されることは望まないが、このドミナントネガティブ効果は、おそらく機能的ＧＡＢＡＡ受容体の密度の低下によるものと思われ、これはＧＡＢＡに対する抑制的応答を減少させることによって、ニューロンの興奮性の増加および発作をもたらす。
【００２１】
本発明は、さらなる一態様として、突然変異型ＧＡＢＡＡδサブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡであって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が大細胞外ドメインをコードするヌクレオチドに起こっている哺乳類ＤＮＡ、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００２２】
前記突然変異は、典型的には、点突然変異である。本発明の一形態では、上記突然変異により、成熟δサブユニットタンパク質の１７２位で、アルギニン残基（前駆体タンパク質の２２０番目の残基）のシステインによる置換（Ｒ１７２Ｃ）が起こる。このＲ１７２Ｃ突然変異は、配列番号３に示すように、ＧＡＢＡＡ受容体のδサブユニットにおけるＣからＴへのヌクレオチド置換（ｃ６５８）の結果として起こる。
【００２３】
理論に束縛されることは望まないが、この突然変異によってタンパク質にはシステイン残基が導入され、そのシステイン残基は、ジスルフィド結合形成に関して、野生型タンパク質においてジスルフィド結合形成を開始するシステイン残基と競合すると推測される。異常な結合の形成はタンパク質の正しい三次構造を乱し、よって受容体の機能を混乱させることになるだろう。
【００２４】
また本発明は、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっているＤＮＡ分子も包含する。かかるＤＮＡ分子はいずれも上記の突然変異を持つが、それ以外の点では機能的であるだろう。当業者にはよくわかるだろうが、かかる分子は配列番号１〜３に記載のＤＮＡ分子とは、かなり異なりうる。
【００２５】
本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野で認められた方法を用いて、様々な目的で操作することができる。これらの目的には、例えば遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現の改変などが含まれるが、これらに限るわけではない。遺伝子断片のＰＣＲ再構成および合成オリゴヌクレオチドの使用により、本発明のヌクレオチド配列を操作することができる。例えばオリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発法を使って、新しい制限部位を生成する突然変異をさらに導入したり、発現パターンを変化させたり、スプライス変異体を産生させたりすることができる。
【００２６】
遺伝コードは縮重しているので、自然界に存在する既知遺伝子のポリヌクレオチド配列とは最低限の類似性しか持たないものを含めて、数多くのポリヌクレオチド配列を作成することができる。したがって本発明は、考え得るコドン選択肢に基づいて組合わせを選択することによって作成することができるポリヌクレオチド配列の変異体を、考え得る限り全て包含する。これらの組合わせは、本発明のポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝コードに従って作成され、かかる変異体は全て具体的に開示されているとみなすべきである。
【００２７】
本発明のＤＮＡ分子にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型および混成ポリマー、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が包含され、当業者には理解されるであろうが、化学的または生化学的に修飾されていてもよいし、非天然ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基誘導体を含んでいてもよい。かかる修飾にはラベル、メチル化、インターカレーター、アルキル化剤、および修飾型結合が含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列とは実質的に異なるコドン使用頻度を持つヌクレオチド配列を作成すことが有利な場合もあるだろう。例えば、特定の原核宿主または真核宿主における当該ペプチドの発現速度が増加するように、その宿主が特定のコドンを利用する頻度に一致するコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させずにヌクレオチド配列を改変する他の理由としては、例えば、自然界に存在する突然変異型配列から産生される転写物よりも望ましい性質（例えば長い半減期）を持つＲＮＡ転写物の産生が挙げられる。
【００２８】
本発明は、もっぱら合成化学によって行われる本発明のＤＮＡ配列の製造も包含する。合成配列は、挿入されたコード配列の適切な宿主における転写および翻訳制御に必要な要素を含む発現ベクターおよび細胞系に挿入することができる。これらの要素には、調節配列、プロモーター、５′および３′非翻訳領域、ならびに本発明のポリペプチドをコードする配列の翻訳効率を向上させる特異的開始シグナル（ＡＴＧ開始コドンおよびコザック共通配列など）を含めることができる。開始コドンおよび上流調節配列を含む完全なコード配列が適当な発現ベクターに挿入される場合は、追加の制御シグナルは必要ないかもしれない。しかしコード配列またはその断片だけを挿入する場合は、上述のような外来の翻訳制御シグナルが、ベクターによって提供されるべきである。かかるシグナルは様々な起源を持つことができ、天然シグナルであっても合成シグナルであってもよい。使用する宿主細胞系に適したエンハンサーを含めることによって、発現効率を高めることができる（Ｓｃｈａｒｆら，１９９４）。
【００２９】
本発明は本明細書に記載する配列の相補鎖である核酸分子も包含する。
【００３０】
また本発明は、もう一つの側面として、配列番号１〜３のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子を提供する。
【００３１】
本発明は、さらにもう一つの側面として、配列番号１〜３のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列からなる単離されたＤＮＡ分子を提供する。
【００３２】
本発明によれば、精製されたポリペプチドまたはタンパク質を本発明のポリヌクレオチドまたはその変異体から製造することができる。これを行うために、宿主細胞を上述のＤＮＡ分子で形質転換することができる。典型的には、前記宿主細胞に、本発明のＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトする。様々な発現ベクター／宿主系を利用して、本発明のポリペプチドをコードする配列を包含させ、それを発現させることができる。これらの発現ベクター／宿主系には、例えばプラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系、マウスもしくは他の動物またはヒトの組織細胞系などがあるが、これらに限るわけではない。哺乳類細胞は、ワクシニアウイルス発現系を使ってタンパク質を発現させるためにも使用することができる。本発明は使用する宿主細胞またはベクターによって限定されない。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチド配列またはその変異体は、哺乳類系で組換えタンパク質を長期間にわたって製造することができるように、細胞株で安定に発現させることができる。本発明のポリペプチドをコードする配列は発現ベクターを使って細胞株に導入することができ、前記発現ベクターはウイルス複製起点および／または内因性発現要素ならびに選択可能マーカー遺伝子を同じベクター上または別個のベクター上に含むことができる。選択可能マーカーは選択剤に対する耐性を付与するものであり、その存在は、導入された配列をうまく発現させる細胞の増殖および回収を可能にする。安定形質転換細胞の耐性クローンは、その細胞タイプに適した組織培養技術を使って増殖させることができる。
【００３４】
また宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、または発現されたタンパク質を望ましい形にプロセシングするその能力を理由にして選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾には、例えばアセチル化、糖鎖付加、リン酸化およびアシル化などがあるが、これらに限るわけではない。「プレプロ」型タンパク質の翻訳後切断を、タンパク質のターゲティング、折りたたみおよび／または活性を指定するために使用することもできる。翻訳後活性に関して特殊な細胞機構および特徴的な機序を持っている様々な宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはＨｅＬａ細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手することができ、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが間違いなく起こるように、それらの細胞を選択することができる。
【００３５】
抗体産生などの目的で遺伝子のタンパク質産物が大量に必要な場合は、このタンパク質の高レベル発現を指示するベクター、例えばＴ５またはＴ７誘導性バクテリオファージプロモーターを含むベクターなどを使用することができる。本発明は、上記タンパク質の重要な機能ドメインを含む融合タンパク質の作製および単離における上記発現系の使用も包含する。これらの融合タンパク質は結合研究、構造研究および機能研究ならびに適当な抗体の作製に使用される。
【００３６】
タンパク質を融合タンパク質として発現させ精製するには、適当なｃＤＮＡ配列を、別のペプチド（例えばグルタチオンスクシニルトランスフェラーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに挿入する。融合タンパク質を原核細胞または真核細胞から発現させ、回収する。次に、融合タンパク質を、融合ベクター配列に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。次に、融合タンパク質の酵素的切断によって、所望のタンパク質を得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドの断片は、固相法を用いる直接ペプチド合成によって製造することもできる。自動合成はＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使って達成することができる。このタンパク質の様々な断片を個別に合成した後、それらを組み合わせて完全長分子を製造することができる。
【００３８】
本発明は、もう一つの側面として、突然変異型γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチドであって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とするポリペプチド、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じる。特に全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。
【００３９】
本発明の好ましい一形態では、上記ポリペプチドはＧＡＢＡＡ受容体の突然変異型γ２またはδサブユニットである。
【００４０】
本発明は、一態様として、点突然変異、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの細胞外領域に起こっている突然変異型ＧＡＢＡＡγ２サブユニットであって、前記突然変異がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする突然変異型ＧＡＢＡＡγ２サブユニット、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００４１】
前記突然変異は、典型的には、ベンゾジアゼピン結合ドメイン、特にＧＡＢＡＡγ２サブユニットの大細胞外ループにある。
【００４２】
前記突然変異は、典型的には、点突然変異である。
【００４３】
本発明の一形態では、上記突然変異事象が、γ２サブユニットタンパク質の大細胞外ドメイン中のベンゾジアゼピン結合部位で、アルギニン残基がグルタミン残基で置き換えられる置換である。この置換は、好ましくは、配列番号４（前駆体タンパク質配列を記載している）に示すように、Ｒ４３Ｑトランジションである。
【００４４】
本発明は、さらなる一態様として、点突然変異、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループに起こっている突然変異型ＧＡＢＡＡγ２サブユニット、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００４５】
本発明のさらなる一形態では、上記突然変異事象により、γ２サブユニットタンパク質の第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループにおいてグルタミン残基コドンが停止コドンによって置換される。この置換は、好ましくは、配列番号５（前駆体タンパク質配列を記載している）に示すように、Ｑ３５１Ｘトランジションである。
【００４６】
本発明は、さらにもう一つの態様として、点突然変異、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっている突然変異型ＧＡＢＡＡδサブユニット、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。
【００４７】
本発明のさらにもう一つ形態では、上記突然変異事象が、δサブユニットタンパク質の大細胞外ドメインにおいてアルギニン残基がシステイン残基に置き換わる置換である。この置換は、好ましくは、配列番号６（前駆体タンパク質配列を記載している）に示すように、Ｒ１７２Ｃトランジションである。
【００４８】
本発明の単離されたポリペプチドは、てんかんに関係する突然変異の他に、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の突然変異事象を起こしていてもよい。これらの突然変異は、典型的には、保存的置換である。
【００４９】
本発明は、さらにもう一つの側面として、配列番号４〜６のいずれか一つに記載の配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００５０】
本発明は、さらにもう一つの側面として、配列番号４〜６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【００５１】
本発明は、さらにもう一つの側面として、集合した哺乳類ＧＡＢＡ受容体である単離されたポリペプチド複合体であって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象がそのサブユニットに起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を、典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単離されたポリペプチド複合体、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。特に、全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。
【００５２】
本発明は、さらにもう一つの側面として、突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって、
（１）上記のＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチド産生に有効な条件で培養する工程、および
（２）突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットを収集する工程
を含む方法を提供する。
【００５３】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットは、野生型サブユニットまたはそれ自体突然変異型サブユニットである他のＧＡＢＡ受容体サブユニットと集合させることもでき、そうすることにより、集合したＧＡＢＡ受容体が得られる。
【００５４】
次に、実質的に精製されたタンパク質またはその断片を、さらなる生化学的解析に使用して、例えばタンパク質の結晶もしくは集合したＧＡＢＡ受容体の結晶のＸ線結晶解析または核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などにより、二次構造および三次構造を確立することができる。構造の決定により、ＧＡＢＡ受容体全体と相互作用する医薬もしくは特定のサブユニットタンパク質との相互作用を介してＧＡＢＡ受容体と相互作用する医薬、またはＧＡＢＡ受容体タンパク質全体の電荷配置もしくは他のタンパク質との電荷相互作用を変化させる医薬、または細胞におけるその機能を変化させる医薬の合理的設計が可能になる。
【００５５】
ＧＡＢＡ受容体サブユニットタンパク質中にてんかんに関与する突然変異が同定されたことで、ＧＡＢＡ受容体およびその関連サブユニットが、新たな用途、例えば正常型または突然変異型の遺伝子または遺伝子産物をスクリーニングしてその存在を検出するための様々なハイブリダイゼーションアッセイおよび免疫学的アッセイなどにも役立つようになることは理解されるだろう。
【００５６】
本発明の突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットの発現は、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型をもたらす。この表現型が他の症状および／または状態と共に現れる場合があることは理解されるだろう。したがって本発明により、例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害を処置するための治療方法が可能になる。また本発明により、例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害を診断する方法が可能になる。本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、ＧＡＢＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットのいずれか一つに突然変異を含み、前記突然変異が前記障害の原因となっている場合に、かかる処置を必要とする対象に、上述の野生型ＧＡＢＡ受容体ポリペプチドもしくは受容体サブユニットポリペプチド、またはＧＡＢＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、ＧＡＢＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットのいずれか一つに突然変異を含み、前記突然変異が例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害の原因となっている場合に、前記障害を処置するための医薬の製造におけるＧＡＢＡ受容体の選択的アゴニストまたはモジュレーターの使用を提供する。
【００５８】
本発明の一側面として、突然変異がγ２サブユニットのベンゾジアゼピン結合部位に起こっている場合に、適切なアゴニストまたはモジュレーターは、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体におけるＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を回復させることができるだろう。
【００５９】
本発明のもう一つの側面として、適切なアゴニストまたはモジュレーターは、受容体機能が回復するように、切断型γ２サブユニットを含むＧＡＢＡＡ受容体が細胞膜に効率よく組み込まれることを可能にするものであってもよい。
【００６０】
あるいは、残りの機能的受容体におけるＧＡＢＡに対する応答を増大させることができる適切なアゴニストまたはモジュレーターを選択してもよい。
【００６１】
適当なＧＡＢＡ受容体サブユニットに相当するタンパク質またはペプチドは、対応する突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットを含む細胞または対応するＧＡＢＡ受容体サブユニットを欠いている細胞に供給することができる。ＧＡＢＡ受容体サブユニットタンパク質は上述のように製造して、例えばマイクロインジェクション法によって、またはもう一つの例としてリポソームを利用して、細胞に導入することができる。能動的にまたは拡散によって細胞に取り込まれる分子もあるだろう。てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置においては、適当なＧＡＢＡ受容体サブユニット活性を持つタンパク質またはペプチドを、そのようなサブユニットが不足している細胞に供給することにより、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の部分的逆転が起こるはずである。
【００６２】
治療にはＧＡＢＡ受容体サブユニット活性を持つ他の分子（例えば薬物または有機化合物）も使用することができる。
【００６３】
実質的に精製されたＧＡＢＡ受容体サブユニット（典型的にはＧＡＢＡＡγまたはδサブユニット）と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を投与してもよい。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、望ましい純度を持つ適当なＧＡＢＡ受容体サブユニットまたはその活性断片もしくは変異体を、許容できる周知の担体、賦形剤または安定剤と混合することによって製造される。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で無毒性であり、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのノニオン界面活性剤などが挙げられる。
【００６５】
適当なＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子またはその断片を遺伝子治療法に使用して、突然変異型遺伝子を発現させているがその遺伝子産物が非機能的であるような人々における遺伝子の発現レベルを増大させてもよい。
【００６６】
もう一つの選択肢として、適当なＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子またはその断片を、細胞への取込みが可能でありかつ有効な機能を与えるのに十分なタンパク質をコードすることが可能な形で、罹患細胞に送達してもよい。あるいは、一部の突然変異体では、その遺伝子中に第２の突然変異を持つ相同な遺伝子をさらに１コピー導入することによって疾患を予防したり、突然変異を変化させて、または別の遺伝子を使って、負の効果を遮断したりすることもできる。
【００６７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、ＧＡＢＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターおよび／または上述の単離されたＤＮＡ分子または野生型ＧＡＢＡ受容体もしくはＧＡＢＡ受容体サブユニットを投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における、ＧＡＢＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターおよび／または上述の単離されたＤＮＡ分子または野生型ＧＡＢＡ受容体もしくはＧＡＢＡ受容体サブユニットの使用を提供する。
【００６９】
適当なＧＡＢＡ受容体サブユニットまたはその断片もしくは誘導体を発現させる能力を持つベクターは、典型的には、当該遺伝子が細胞によって発現され染色体外にとどまるように対象に投与されるか、または理想的には、細胞中に存在する内因性突然変異型遺伝子と組換えを起こすように細胞中に導入されるだろう。これには遺伝子突然変異を補正するために二重組換え事象が必要である。これらの方法で遺伝子を導入するためのベクターは当技術分野では知られており、適切なベクターはどれを使用してもよい。
【００７０】
遺伝子治療に適したベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクター、例えばトリ、ネズミおよびヒト由来の形質導入レトロウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、パポバウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスなどが含まれる。
【００７１】
遺伝子治療は一般に認められている方法で行われるだろう（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，１９９１；Ｃｕｌｖｅｒ，１９９６）。発現制御要素に連結された１コピーの適当なＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子を含み、かつ細胞内で複製する能力を持つベクターを作製する。もう一つの選択肢として、ベクターは複製欠損性で、複製および遺伝子治療での使用にはヘルパー細胞を必要としてもよい。次にそのベクターを患者に注射する。遺伝子が標的細胞のゲノムに永続的に組み込まれない場合は、処置を繰り返す必要があるかもしれない。
【００７２】
非ウイルス感染法によるインビトロ遺伝子導入も使用することができる。これらの方法にはＤＮＡの直接注入、リン酸カルシウム存在下での裸のＤＮＡの取込み、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合またはリポソーム送達などがある。遺伝子導入は、ヒト人工染色体の一部としての送達または受容体を介した遺伝子導入によって達成することもできる。これには、特定の細胞表面受容体に結合してエンドサイトーシスおよび哺乳類細胞内へのＤＮＡの導入を誘導するターゲティング分子にＤＮＡを連結する必要がある。このような技術の一つでは、ポリ−Ｌ−リジンを利用して、アシアロ糖タンパク質をＤＮＡに連結する。リソソームを破壊し、よってＤＮＡが分解されるのを避け、ＤＮＡが核に移動できるように、この複合体にはアデノウイルスも添加する。これらの粒子を静脈内に注入した結果、肝細胞への遺伝子導入が達成されている。
【００７３】
ＤＮＡを脳に直接ターゲティングする遺伝子導入技術は好ましい。例えば、ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット感受性対立遺伝子を保有する患者は、彼らの脳前駆細胞の一部または全部が、必要とされる適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの機能的正常コピーを少なくとも新たに１コピーは受取ることができるように、遺伝子送達法によって処置される。処置された患者は、感受性対立遺伝子が正常対立遺伝子の存在によって相殺されているという事実により、疾患リスクが低下しているはずである。
【００７４】
本発明、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、ＧＡＢＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットに突然変異を含み、前記突然変異が前記障害の原因となっている場合に、かかる処置を必要とする対象に、ＧＡＢＡ受容体または受容体サブユニットの選択的アンタゴニストまたはモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。
【００７５】
本発明は、さらにもう一つの側面として、ＧＡＢＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットに突然変異を含み、前記突然変異がてんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の原因となっている場合に、前記障害を処置するための医薬の製造におけるＧＡＢＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターの使用を提供する。
【００７６】
当技術分野で周知の方法により、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を使って、上記疾患の原因となっている突然変異型受容体に特異的な抗体を産生させるか、または薬剤ライブラリーをスクリーニングして突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する薬剤を同定することができる。
【００７７】
一側面として、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する抗体は、アンタゴニストまたはモジュレーターとして直接的に使用するか、または突然変異型ＧＡＢＡ受容体を発現させる細胞もしくは組織に薬剤を運ぶターゲティング機構もしくは送達機構として間接的に使用することができる。
【００７８】
本発明は、さらにもう一つの側面として、上述のポリペプチドとは免疫反応するが、野生型ＧＡＢＡ受容体またはそのサブユニットとは免疫反応しない抗体を提供する。
【００７９】
特に、受容体を構成するサブユニットに上述した障害の原因となる突然変異を含む集合したＧＡＢＡ受容体に対する抗体を提供する。当業者には理解されるであろうが、かかる抗体には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および一本鎖抗体などを含めることができるが、これらに限るわけではない。
【００８０】
抗体を産生させるために、上記のポリペプチドまたはその断片もしくはオリゴペプチドであって免疫原性を持つものを注射することによって、例えばウサギ、ラット、ヤギ、マウス、ヒトなどといった種々の宿主を免疫化することができる。免疫応答を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。アジュバントには、例えばフロインドアジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質があるが、これらに限るわけではない。ヒトに使用されるアジュバントには、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）などがある。
【００８１】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体に対する抗体を誘導するために使用されるオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を持つことが好ましい。また、これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であって、小さい天然分子の全アミノ酸配列を含むことが好ましい。ＧＡＢＡＡ受容体アミノ酸の短いストレッチを別のタンパク質（例えばＫＬＨ）のアミノ酸ストレッチに融合し、そのキメラ分子に対する抗体を産生させてもよい。
【００８２】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体に対するモノクローナル抗体は、培養連続継代性細胞系による抗体分子の産生に対応した任意の技術を使って製造することができる。これらの技術には、例えばハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術などがあるが、これらに限るわけではない（例えばＫｏｈｌｅｒら，１９７５；Ｋｏｚｂｏｒら，１９８５；Ｃｏｔｅら，１９８３；Ｃｏｌｅら，１９８４を参照されたい）。
【００８３】
抗体は、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導するか、文献に開示されているように免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって作製することもできる（例えばＯｒｌａｎｄｉら，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら，１９９１）。
【００８４】
ＧＡＢＡ受容体に対する特異的結合部位を含む抗体断片も生成させることができる。例えばそのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成するＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２断片のジスルフィド橋を還元することによって生成するＦａｂ断片などがある。もう一つの選択肢として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるようにしてもよい（例えばＨｕｓｅら，１９８９を参照されたい）。
【００８５】
望ましい特異性を持つ抗体を同定するためのスクリーニングには、種々の免疫アッセイを使用することができる。確定された特異性を持つポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する競合結合アッセイまたは免疫放射線アッセイのプロトコールは、当技術分野では数多く知られている。そのような免疫アッセイでは通例、ＧＡＢＡ受容体とその特異的抗体との複合体形成が測定される。２つの非干渉ＧＡＢＡ受容体エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル免疫測定法は好ましいが、競合結合アッセイも使用することができる。
【００８６】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、上述したＤＮＡ分子のいずれか一つの相補鎖（アンチセンス）である単離されたＤＮＡ分子であって、かつ突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ分子を投与することを含む方法を提供する。
【００８７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における、本発明のＤＮＡ分子の相補鎖である単離されたＤＮＡ分子であってかつ突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ分子の使用を提供する。
【００８８】
かかる処置を必要とする対象には、典型的には、ＧＡＢＡ受容体を構成するサブユニットをコードするポリヌクレオチドの相補鎖を発現させるベクターを投与することができる。アンチセンス法には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入、およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを含む様々なアプローチを使用することができる。細胞または組織にベクターを導入するために利用できる方法は数多くあり、それらはインビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用に同様に適している。エクスビボ治療法の場合は、患者から採取した幹細胞にベクターを導入し、それをクローン増殖させ、自家移植によって同じ患者に戻すことができる。トランスフェクション、リポソーム注射、またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達は、当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる（例えばＧｏｌｄｍａｎら，１９９７を参照されたい）。
【００８９】
さらなる態様として、本発明のアゴニスト、タンパク質、アンタゴニスト、モジュレーター、抗体、相補配列またはベクターはいずれも、他の適当な治療薬と組み合わせて投与することができる。当業者は、通常の薬学的原理に従って、適当な薬剤の選択を行うことができる。治療薬の併用は相乗的に作用して、上述した様々な障害の処置または予防をもたらしうる。このようにして、各薬剤の投与量の減らしても治療効力を得ることができ、よって有害な副作用の可能性を減らすことができる。
【００９０】
本発明のさらにもう一つの側面によれば、特に精製された突然変異型ＧＡＢＡ受容体ポリペプチドおよびそれらを発現させる細胞は、種々の技術による候補薬剤のスクリーニングに有用である。てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置に役立つ治療薬が本発明のポリペプチドに対しておそらく結合親和性を示すことは理解されるだろう。このような技術としては、例えば組換えポリペプチドで安定に形質転換されていて当該ポリペプチドまたは断片を発現させる真核または原核宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイに利用することが挙げられるが、これに限るわけではない。結合アッセイでは、特定のＧＡＢＡ受容体サブユニットポリペプチドまたは断片と被験薬剤との複合体の形成が測定されるか、または被験薬剤が特定のＧＡＢＡ受容体サブユニットポリペプチドもしくは断片と既知のリガンドとの複合体の形成を妨害する程度が測定されるだろう。
【００９１】
もう一つの薬物スクリーニング技術では、突然変異型ＧＡＢＡ受容体ポリペプチドに対して適切な結合親和性を持つ化合物のハイスループットスクリーニングを行うことができる（国際公開第８４／０３５６４号パンフレット参照）。この技術では、多数の小ペプチド試験化合物を固体基板上で合成し、ＧＡＢＡ受容体ポリペプチド結合と洗浄とによってアッセイすることができる。この場合、結合したＧＡＢＡ受容体ポリペプチドは、当技術分野で周知の方法によって検出される。この技術の変形として、本発明の精製ポリペプチドをプレートに直接コーティングして、相互作用する試験化合物を同定することもできる。
【００９２】
本発明では、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する能力を持つ中和抗体が突然変異型ＧＡＢＡ受容体への結合に関して試験化合物と競合するような競合薬物スクリーニングアッセイの使用も考えられる。このようにして、抗体を使って、突然変異型ＧＡＢＡ受容体の１または複数の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。
【００９３】
本発明は、形質転換細胞、トランスフェクトもしくは注入卵母細胞またはトランスジェニック動物内で、本発明のポリペプチドを使って化合物をスクリーニングするのに、とりわけ有用である。突然変異ＧＡＢＡ受容体を含む培養細胞またはトランスジェニック動物に特定の薬物を添加または投与し、受容体の電流に対する効果を、野生型ＧＡＢＡ受容体を含む細胞または動物の電流と比較する。電流をより正常なレベルに変化させる薬物候補は、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置または予防に役立つ。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、コンビナトリアルライブラリー技術を利用して開発される化合物のスクリーニングにも使用することができる。これにより、ポリペプチドの活性を調節する能力について、多種多様な物質を調べることが可能になる。ペプチドライブラリーの使用は好ましく（国際公開第９７／０２０４８号パンフレット参照）、そのようなライブラリーとそれらの使用法は当技術分野では知られている。
【００９５】
ポリペプチド機能のモジュレーターであると同定される物質は本質的にペプチドであっても、非ペプチドであってもよい。多くのインビボでの薬学的応用には、非ペプチド「小分子」が好ましいことが多い。また、その物質のミミックまたはミメティックを医薬用に設計することもできる。既知の医薬活性化合物（「リード」化合物）に基づくミメティックの設計は、新薬を開発するための一般的アプローチである。元の活性化合物の合成が困難であるか、その合成に多大なコストがかかる場合、または不適切な投与方法をもたらす場合には、この方法が望ましいことが多い。ミメティックの設計では、元の活性化合物のうち標的とする特性の決定に重要な部分を同定する。これらの部分またはその化合物の活性領域を構成する残基は、ファーマコフォアと呼ばれる。ファーマコフォア構造が見つかったら、Ｘ線回折データおよびＮＭＲを含む一連の情報源から得たデータを使って、そのファーマコフォア構造を、その物理的性質に従ってモデル化する。次に、テンプレート分子を選択する。このテンプレート分子には、ファーマコフォアを模倣する化学基を付加することができる。選択は、ミメティックの合成が容易になるように、薬理学的におそらく許容できるように、インビボで分解しないように、そしてリード化合物の生物学的活性を保つように行うことができる。さらなる最適化または修飾を行って、インビボ試験または臨床試験に有用な１または複数の最終ミメティックを選択することができる。
【００９６】
標的特異的な抗体を単離して、その結晶構造を解くこともできる。原理的には、このアプローチによってファーマコフォアを得ることができ、得られたファーマコフォアに基づいて上述のように薬物設計を行うことができる。機能的薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）を作製することによって、タンパク質の結晶構造解析を全く避けることもできるだろう。抗Ｉｄの結合部位は、鏡像の鏡像として、元の受容体の類似体であると予想される。もしそうなら、化学的または生物学的に作製したペプチドバンクからペプチドを単離するために、その抗Ｉｄを使用することができるだろう。
【００９７】
上述の治療方法はいずれも、そのような治療を必要としている、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、そして最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を含む任意の対象に適用することができる。
【００９８】
ＧＡＢＡ受容体サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断に使用することができ、またそれゆえに本発明では、これらの障害に対する素因の診断に、本発明のＤＮＡ分子を使用することが考えられる。
【００９９】
本発明のもう一つの態様では、診断目的で使用することができるポリヌクレオチドとして、例えばオリゴヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡ、ならびに相補ＲＮＡおよびＤＮＡ分子が挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、生物学的試料中の遺伝子発現を検出および定量するために使用することができる。診断に使用されるゲノムＤＮＡは体細胞、例えば血中、組織生検、外科標本、または剖検材料中に存在する体細胞などから得ることができる。ＤＮＡを単離して特定の配列の検出に直接使用してもよいし、分析に先だってＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅してもよい。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも、ＰＣＲ増幅を行ってまたはＰＣＲ増幅を行わずに使用することができる。特定の核酸配列を検出するには、特異的オリゴヌクレオチドを使ったハイブリダイゼーション、制限酵素消化および制限酵素マッピング、ＰＣＲマッピング、ＲＮアーゼ保護、および他の様々な方法を使用することができる。例えばＧＡＢＡ受容体サブユニットから得られる増幅産物の直接ヌクレオチド配列決定を使用することができる。試料アンプリコンの配列を野生型アンプリコンの配列と比較して、ヌクレオチドの相違の有無を決定する。
【０１００】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断における上記ポリペプチドの使用を提供する。
【０１０１】
ＧＡＢＡ受容体を構成するタンパク質に基づいて診断アッセイを行う場合は、様々なアプローチが考えられる。例えば診断は、ＧＡＢＡ受容体を形成する正常タンパク質と突然変異型タンパク質の電気泳動移動度の差をモニターすることによって達成することができる。このようなアプローチは、電荷置換が存在する突然変異体の同定、または挿入、欠失もしくは置換によって、結果として生じたタンパク質の電気泳動移動度に、著しい変化が起こっている突然変異体の同定には、特に役立つだろう。また診断は、正常タンパク質と突然変異型タンパク質とのタンパク質分解による切断パターンの相違もしくは様々なアミノ酸残基のモル比の相違に基づいて行うか、または遺伝子産物の機能の変化を実証する機能アッセイによって行うこともできる。
【０１０２】
もう一つの側面として、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する抗体を、てんかんの診断に使用するか、または完全なＧＡＢＡ受容体もしくはＧＡＢＡ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーターもしくは阻害剤で処置される患者をモニターするためのアッセイに使用することもできる。診断用途に有用な抗体は、治療薬に関する上記の説明と同様にして製造することができる。ＧＡＢＡ受容体に関する診断アッセイとしては、例えば抗体とラベルとを利用してヒト体液中または細胞もしくは組織の抽出物中の突然変異型ＧＡＢＡ受容体を検出する方法などが挙げられる。抗体は修飾を施してまたは修飾を施さずに使用することができ、レポーター分子の共有結合または非共有結合によって標識することができる。
【０１０３】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体の存在を測定するためのプロトコールは、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳなど、当技術分野では種々知られており、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を診断するための基礎になる。突然変異型受容体の発現は、哺乳類試験対象（好ましくはヒト）から採取した体液または細胞抽出物を、その受容体に対する抗体と、複合体の形成に適した条件で混合することによって実証される。複合体形成量は様々な方法、好ましくは測光手段によって定量することができる。突然変異型受容体に特異的な抗体は、前記突然変異型受容体を発現させる個体にしか結合せず、野生型受容体だけを発現させる個体（すなわち正常な個体）には結合しないだろう。これがこの疾患を診断するための基礎となる。
【０１０４】
ある個体が障害を持つと診断されたら、有効な処置を開始することができる。これらの処置としては、例えば突然変異型受容体に対する選択的モジュレーターまたは突然変異型受容体に対するアンタゴニスト（上述の抗体または突然変異型相補鎖など）の投与を挙げることができる。これらに代わる処置としては、例えば受容体機能が正常なレベルまで回復するように突然変異型受容体に対する選択的アゴニストまたはモジュレーターを投与すること、または野生型受容体の導入（特に上述の遺伝子治療法による導入）などが挙げられる。典型的には、適当な完全長ＧＡＢＡ受容体サブユニットまたはその誘導体または断片を発現させる能力を持つベクターを投与することができる。
【０１０５】
もう１つの治療補助方法として、実質的に精製されたＧＡＢＡ受容体またはＧＡＢＡ受容体サブユニットポリペプチドと医薬的に許容できる担体とを、上述のように投与してもよい。
【０１０６】
さらなる態様として、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列のいずれかに由来するオリゴヌクレオチド、またはそれ以上に長い断片を、マイクロアレイにプローブとして使用することもできる。マイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために使用することができ、また遺伝子変異体、突然変異および多型を同定するためにも使用することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、障害の遺伝的根拠の理解、障害の診断、ならびに治療薬の開発およびその活性のモニタリングに使用することができる。マイクロアレイは、当技術分野で知られる方法を使って製造、使用および解析することができる（例えばＳｃｈｅｎａら，１９９６；Ｈｅｌｌｅｒら，１９９７を参照されたい）。
【０１０７】
本発明によれば、本発明のＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子改変（ノックアウト、ノックインおよびトランスジェニック）非ヒト動物モデルを作出することもできる。これらの動物は、疾患の機序をＧＡＢＡ受容体との関連で研究するためのＧＡＢＡ受容体機能の研究、候補医薬化合物のスクリーニング、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を発現させる外植哺乳類細胞培養物の作製、および可能性のある治療的介入の評価に役立つ。
【０１０８】
本発明の動物モデルでの使用に適した動物種としては、例えばラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限るわけではない。マウスやラットは飼育が比較的容易であり、寿命が短いので、初期の研究には遺伝子改変マウスおよびラットが極めて望ましい。研究によっては、トランスジェニック酵母またはトランスジェニック無脊椎動物が好適であるかもしれない。なぜならこれらは迅速なスクリーニングが可能であり、取り扱いがはるかに容易だからである。長期の研究には、ヒトに類似していることから非ヒト霊長類が望ましいだろう。
【０１０９】
突然変異型ＧＡＢＡ受容体の動物モデルの作出には、いくつかの方法を使用することができる。そのような方法としては、例えば相同動物遺伝子における特異的突然変異の生成、相同組換えによる野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化動物遺伝子の挿入、野生型もしくは突然変異型プロモーター配列または人工プロモーター配列を用いたゲノムコンストラクトまたはミニ遺伝子ｃＤＮＡコンストラクトとしての（単一または多重）突然変異型ヒト遺伝子の挿入、または相同組換えによる内因性遺伝子の人工改変断片の挿入などが挙げられる。改変には、突然変異停止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠失、またはＣｒｅリコンビナーゼなどの酵素によって認識される組換え配列（ｌｏｘ　ｐ部位）の包含などがある。
【０１１０】
好ましいトランスジェニックマウスを作出するために、標準的な卵母細胞マイクロインジェクション技術または胚性幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロインジェクションによって、特定のＧＡＢＡ受容体サブユニットの突然変異型をマウス生殖系列に挿入することができる。もう一つの選択肢として、内因性ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合には、胚性幹細胞を使った相同組換えを適用することもできる。
【０１１１】
卵母細胞注入の場合は、１コピーまたは複数コピーの突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子を、受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入することができる。次に、この卵母細胞を偽妊娠養母に再移植する。次に、生産マウスを、特定のヒトサブユニット遺伝子配列の存在に関する尾ＤＮＡまたは他の組織由来のＤＮＡの分析により、組み込まれた遺伝子についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたは他の染色体ＤＮＡ断片として注入された完全なゲノム配列であるか、天然プロモーターまたは異種プロモーターを持つ完全なｃＤＮＡであるか、またはコード領域および最適な発現に必要であることがわかった他の配列を全て含むミニ遺伝子であることができる。
【０１１２】
本発明のさらにもう一つの側面によれば、特定ＧＡＢＡ受容体サブユニットのヒト突然変異、特に本発明によって開示されるヒト突然変異が同定された結果として作出される動物モデルから得られる神経学的材料を、マイクロアレイ実験に使用することができる。これらの実験は、てんかん脳組織における特定ＧＡＢＡ受容体サブユニットまたは全脳ライブラリー由来の任意のｃＤＮＡクローンの発現レベルを、正常な対照脳組織と比較して同定するために行うことができる。上記２つの組織間に認められるＧＡＢＡ受容体サブユニットをはじめとする遺伝子の発現レベルの変動は、それらの遺伝子が、動物モデル中に存在する元のＧＡＢＡ受容体突然変異の原因または結果として、てんかん過程に関与することを示す。マイクロアレイは当技術分野で知られた方法によって製造、使用および解析することができる（例えばＳｃｈｅｎａら，１９９６；Ｈｅｌｌｅｒら，１９９７）。
【０１１３】
本発明は、さらにもう一つの側面として、候補医薬化合物をスクリーニングするための上記遺伝子改変非ヒト動物の使用を提供する。
【０１１４】
本明細書では多数の従来技術刊行物を参照するが、このような参照を行なったからといって、これらの文書のいずれかがオーストラリアまたは他の国において、当技術分野に共通する一般知識の一部であると容認するわけではないことは、明らかに理解されるだろう。
【０１１５】
本明細書および本願特許請求の範囲の全体を通して、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈上別段の必要がない限り、非排他的な意味で使用される。
【０１１６】
図面の簡単な説明
一例として、下記の実施例および添付の図面を参照して、本発明の好ましい形態を説明する。
図１は、小児欠神てんかんおよび熱性けいれんを持つ４世代家系である家系１の家系図。遺伝子型別を行なっていない非罹患ブランチは省いた。疾患関連ハプロタイプを四角の枠で囲む。Ｒ４３Ｑ突然変異の存在をｍで示す。疾患ハプロタイプに関係する二点ｌｏｄスコアも示す。
図２は、同じく特発性全般てんかんが存在する家系２の家系図。この図はこの家系内に存在する臨床的不均一性を示している。Ｑ３５１Ｘ突然変異が同定された発端者は乳児重症ミオクロニーてんかんだった。Ｑ３５１Ｘ突然変異は発端者の兄弟および母にも同定されたが、この両名は熱性けいれんに分類された。
図３は、家系１のＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）遺伝子中に存在するｃ２４５Ｇ→Ａ突然変異の位置を示す図。ａ：この配列トレースはＧＡＢＲＧ２のエキソン２の一部を示している。上側は突然変異型配列を表し、下側は野生型を表す。上の矢印はヌクレオチド塩基変化の位置を示している。ＧＡＢＲＧ２タンパク質における突然変異の位置を下の矢印で示す。ｂ：ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットタンパク質と他のリガンド作動性受容体サブユニットとの整列。保存されたアルギニン（Ｒ）残基を四角の枠で囲んである。
図４は、家系２におけるＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）遺伝子中の突然変異の位置を示す図。この配列トレースは遺伝子のエキソン９の一部を表し、上側はＣ→Ｔ変異を示している。この変異の結果、ＣＡＡ（グルタミン）からＴＡＡ（停止コドン）へのコドン変化が起こる。下側の配列トレースは野生型ＧＡＢＲＧ２遺伝子の配列を表す。
図５は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞におけるＧＡＢＲＧ２およびＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）の電気生理学的解析を表す図。ａ：ＧＡＢＲＧ２のＲ４３Ｑ突然変異は、ＧＡＢＡ電流のジアゼパムによる増強を消失させる。ＧＡＢＡ（１μＭ）およびジアゼパム（Ｄｉａｚ；１μＭ）に対する野生型ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２：ＧＡＢＲＧ２（α１β２γ２）チャネル（ｉ）および突然変異型ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２：ＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）［α１β２γ２（Ｒ４３Ｑ）］チャネル（ｉｉ）の応答。ジアゼパムは、突然変異型チャネルでは小さな有意でない減少が認められた（１０％±６％；平均±ＳＥＭ；ｎ＝１７）のに対し、野生型では電流を有意に（Ｐ＜０．０１）増加させた（３０２±３３％；平均±ＳＥＭ；ｎ＝２０）。ｂ：Ｚｎ２＋感受性の低下が示すＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）の機能的発現。野生型（α１β２γ２）チャネル（ｉ）および突然変異型［α１β２γ２（Ｒ４３Ｑ）］チャネル（ｉｉ）からのＧＡＢＡ活性化電流のＺｎ２＋（１０μＭ）感受性の比較。どちらの場合も、Ｚｎ２＋の存在下で起こるＧＡＢＡ電流の抑制は部分的に過ぎなかった（野生型、３７±２％；突然変異型、４０±５％）。これはＧＡＢＲＧ２の機能的発現を示す（それぞれｎ＝９）。ＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２（α１β２）のみの同時発現（ｉｉｉ）では、ＧＡＢＡ（１００μＭ）活性化電流は、Ｚｎ２＋（１０μＭ）によってほとんど完全に消失した（８９±７％、ｎ＝８）。
図６は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞における野生型ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）およびＧＡＢＲＧ２（Ｑ３５１Ｘ）突然変異体の電気生理学的解析の結果を要約した図。突然変異型ＧＡＢＲＧ２受容体の発現はＧＡＢＡに対する応答を消失させることから、この変異体はドミナントネガティブ効果を持つことが示唆される。突然変異型（Ｑ３５１Ｘ）および野生型ＧＡＢＲＧ２受容体を発現させる卵母細胞ならびにＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２を発現させる対照でのＧＡＢＡ応答（電流強度としてμＡの単位で測定）の比較を示す。切断型受容体が機能しなかったとすると、電流強度はＡ１／Ｂ２含有受容体の場合と同様になるだろう。しかし切断型ＧＡＢＲＧ２を組み込んだ受容体は全ての電流を消失させたことから、これはドミナントネガティブ効果を持つことが示唆される。
【０１１７】
発明実施の形態
実施例１：罹患家族の臨床診断
この研究では３つの家系に属する患者を扱い、全ての参加被験者からインフォームドコンセントを得た。図１に家系図を示す第１の家系は英国に起源を持ち、４世代にわたる１９２人に関する情報が得られた。生存する家族はほとんどがオーストラリアのビクトリア州に居住していた。発作歴がある２９人のうち、７人は小児欠神てんかん（ＣＡＥ）が持ち、そのうちの６人は事前に熱性けいれん（ＦＳ）を起こしていた。別の１２人は典型的ＦＳを持ち、別の３人は熱性けいれんプラス（ＦＳ＋）の延長された表現型を持っていた。残り７人の罹患者のうち、１人はさらに重症な全般けいれん表現型（ミオクロニー失立てんかん）を持ち、１人は側頭葉てんかんを持ち、５人は未分類てんかんを持っていた。発作をもたない別の２人は、脳波（ＥＥＧ）に全般性棘波発射があった。ＦＳの平均発症年齢は１３ヶ月、ＣＡＥの平均発症年齢は３年だった。家系図から世代依存的浸透度の可能性が示唆される。これはおそらく２つの要因、すなわち両系（ｂｉｌｉｎｅａｌ）遺伝と、老人の場合は幼児期の確かな病歴が得られないこととによるのだろう。
【０１１８】
図２に家系図を示す第２の家系には熱性けいれんプラスをもつ全般てんかん（ＧＥＦＳ＋またはＦＳ＋）があり、この家系は乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）に罹った発端者を介して確認された。父母両系にてんかんの家族歴があり、父側には８人、母側には３人の罹患者がいた。母、その兄弟およびその娘はＦＳを持っていたと考えられた。ＳＭＥＩを持つ発端者は生後３ヶ月で焦点ＦＳを発症し、続いて複数の発作タイプが発生し、顕著なミオクローヌスと軽度の知的障害とを伴った。発端者のＥＥＧは光感受性を伴う全般性多棘波を示した。発端者の３人の兄弟のうち２人は罹患者であり、１人はＦＳを、また１人はモノクロニー失立てんかん（ＭＡＥ）を持っていた。ＭＡＥを持つ少年は生後２ヶ月でミオクロニーおよび欠神発作を起こした。全般強直−間代発作は４歳時に始まった。彼のＥＥＧは光感受性を伴う全般性多棘波を示した。彼も軽度の知的障害を持っていた。父側では６人がＦＳを持ち、２人がＦＳおよびてんかんを持っていた。図２に記載するこの家系の家系図は、上に臨床的に説明した家系２の個体の全てを示しているわけではない。
【０１１９】
第３の家系は熱性けいれんプラスをもつ全般てんかん（ＧＥＦＳ＋またはＦＳ＋）を持っていた。この家系の多くの家族はまだ臨床的に特徴づけられていない。発端者および発端者と一卵性双生児の関係にある兄弟はＧＥＦＳ＋を持っている。
【０１２０】
発作を持つ２３人を含む家系１の家族４７人、罹患者６人を含む家系２の家族１４人、および家系３の一卵性双生児である両少年およびその母から、ＤＮＡ抽出用に血液を採取した。ＤＮＡ抽出法には、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用するか、またはＷｙｍａｎおよびＷｈｉｔｅ（１９８０）の方法を適合させて使用した。
【０１２１】
実施例２：遺伝子型別および連鎖解析
家系１から採取したＤＮＡ試料の自動遺伝子型別はオーストラリアン・ゲノム・リサーチ・ファシリティ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって行なわれた。１０ｃＭの平均遺伝距離に広がる４００マーカーのゲノムワイドスキャンを行なった。連鎖解析では、熱性けいれん（ＦＳ）、熱性けいれんプラス（ＦＳ＋）または小児欠神てんかん（ＣＡＥ）を持つ全ての個体を罹患者とみなした。未分類てんかんまたは異常脳波を持つ個体は罹患状態未知とした。ｌｏｄスコアはＦＡＳＴＬＩＮＫ　ｖ４．０Ｐ（ＬａｔｈｒｏｐおよびＬａｌｏｕｅｌ，１９８４）を使って決定した。二点ｌｏｄスコアは、常染色体優性遺伝、浸透度７５％、疾患対立遺伝子頻度０．０００１および均等なマーカー対立遺伝子頻度を仮定して計算した。
【０１２２】
さらに、第５染色体のマイクロサテライトマーカーを、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（１９９５）が先に記述しているように、手作業で遺伝子型別した。簡単に述べると、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使って、１００ｎｇのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲ条件は、９４℃で１分、６０℃で１．５分および７２℃で１．５分を１０サイクルの後、９４℃で１分、５５℃で１．５分および７２℃で１．５分を２５サイクルとした。ＰＣＲ反応の最後に、９４℃で１０分間の最終伸長ステップを行なった。産物を５％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、−７０℃で１〜３日間の露出によるオートラジオグラフィーで可視化した。
【０１２３】
ゲノムスクリーニングの結果、第５染色体上に、先に罹患者（ＣＡＥ、ＦＳまたはＦＳ＋）と分類した個体と共に分離する連鎖マーカー（Ｄ５Ｓ４２２）が明らかになった（θ＝０．０でｌｏｄスコアは６．０６）。疾患対立遺伝子とマーカーＤ５Ｓ２１１２およびＤ５Ｓ２０４０との組換えにより、変異遺伝子は、染色体５ｑ３２−ｑ３３上の９．３ｃＭの領域内に置かれた（図１）。ＥＥＧ異常のみを持つ家族（ＩＶ−８および結婚によって家系に入ったＩＩＩ−１９）は両名とも疾患関連突然遺伝子を持たない。発作は持っているがＣＡＥまたはＦＳを持つことは知られていない３人の個体（ＩＩ−１３、ＩＩＩ−６、ＩＩＩ−８）からＤＮＡを入手することができた。個体ＩＩＩ−８は未分類てんかんを持つが、その息子はＦＳを持ち、彼女はＤ５Ｓ４２２の疾患関連対立遺伝子を保有している。個体ＩＩ−１３は成人として側頭葉てんかんを持ち、上記対立遺伝子を保有するが、彼女の両親は死亡しているので、彼女が小児期にＦＳを起こしたかどうかはわからなかった。同様に、突然変異型対立遺伝子を持つ世代ＩＩの４人の非罹患者（ＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−６、ＩＩ−７）および検査を受けていない絶対保因者（ＩＩ−９）に熱性けいれんが報告されていないのは、これらの老人では小児期の確かな病歴が得られないためだろう。未分類発作障害を持つ（そして罹患者とは定義しなかった）個体ＩＩＩ−６は、検査を受けた個体のなかでは突然変異型対立遺伝子を持たないのに発作をもつ唯一の個体だった。この集団における罹患率が高いことを考えると、彼女は表現型模写であると思われる。
【０１２４】
ヒトゲノムマップ ’９９（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）を検索したところ、Ｄ５Ｓ４２２の近くに位置し、よっててんかん関連突然変異の候補遺伝子であると考えられる４つのＧＡＢＡＡ受容体サブユニットα１（ＧＡＢＲＡ１）、α６（ＧＡＢＲＡ６）、β２（ＧＡＢＲＢ２）およびγ２（ＧＡＢＲＧ２）のクラスターが見つかった。ＧＡＢＲＧ２ヌクレオチド配列のインシリコデータベース解析により、遺伝子のゲノム構造を決定することができた（表１）。これにより、イントロン配列中に各エキソンをまたぐプライマーを設計することが容易になった。その結果、ＧＡＢＲＧ２遺伝子の９つのエキソンのそれぞれを家系構成員のゲノムＤＮＡから増幅することが可能になり、それにより、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析法で各エキソンを突然変異についてスクリーニングすることが可能になった。
【０１２５】
実施例３：家系１におけるＧＡＢＲＧ２の突然変異解析
疾患原因突然変異を同定するために、家系１の個体に対してＧＡＢＲＧ２エキソンのＳＳＣＰ解析を行い、続いてＳＳＣＰバンドシフトの配列決定を行なった。家系１の解析に使用したプライマーを表２に示す。これらのプライマーの配列を配列番号７〜２４に示す。
【０１２６】
エキソン特異的プライマーを使ったＰＣＲ反応は、６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．５μＭ　ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、０．１７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１５μｇ／ｍｌの各プライマー、２００μＣｉ／ｍｌの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、および１０μｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応は、９４℃で６０秒、６０℃で９０秒および７２℃で９０秒を１０サイクルした後、９４℃で６０秒、５５℃で９０秒および７２℃で９０秒を２５サイクルすることによって行なった。次に、７２℃で１０分間の最終伸長反応を行なった。次に、終了したＰＣＲ反応液を等体積のホルムアミドローディング緩衝液（９６％ホルムアミド、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール）と混合し、９５℃に５分間加熱した後、氷で急冷した。次に、各試料３μｌを、５％グリセロールおよび０．６×ＴＢＥを含む３７．５％ＭＤＥＴＭゲルにのせた。ゲルを室温にて７００ボルトで２０時間泳動し、Ｘ線フィルムに−７０℃で露出した。
【０１２７】
次に、高次構造変化を示すＰＣＲ産物を配列決定した。これにはまず、適当な個体からアンプリコンを再増幅した後、ＱｉａＱｕｉｃｋ　ＰＣＲプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の方法に基づいて使用することによって、配列決定用ＰＣＲ増幅テンプレートの精製を行なった。精製ＧＡＢＲＧ２アンプリコンの配列決定に使用したプライマーは、最初の増幅ステップに使用したものと同じである。各配列決定反応には、２５ｎｇのプライマーと１００ｎｇの精製ＰＣＲテンプレートとを使用した。全ての配列決定反応にＢｉｇＤｙｅシークエンシングキット（ＡＢＩ）を製造者の説明書に従って使用した。産物をＡＢＩ３７７シークエンサーにかけ、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを使って解析した。
【０１２８】
この家系におけるエキソン２のＳＳＣＰ解析および配列決定により、ＧＡＢＲＧ２遺伝子の４７１位におけるＧ→Ａヌクレオチド置換（ｃ２４５Ｇ→Ａ）が明らかになった（図３ａ）。ｃ２４５Ｇ→Ａ突然変異は、成熟ＧＡＢＲＧ２タンパク質の４３番目の残基または前駆体タンパク質の８２番目の残基にあたる高度に保存されたアルギニンアミノ酸をグルタミンに変える（それぞれＲ４３ＱおよびＲ８２Ｑ）。アミノ酸残基番号は以下の説明では成熟タンパク質に基づくことにする。Ｒ４３Ｑ変化は、疾患関連対立遺伝子を保有する全ての家系構成員に検出されたが、正常集団から得た１４０の対照染色体には検出されなかった。また、この部位での配列保存は、他の多くのヒトおよび動物ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットならびに他のリガンド作動性受容体サブユニットに認められた（図３ｂ）。これは、この残基が機能的に重要であることを示す情況証拠になる。
【０１２９】
実施例４：家系２におけるＧＡＢＲＧ２の突然変異解析
疾患原因突然変異を同定するために、家系２の個体に対してＧＡＢＲＧ２エキソンのＳＳＣＰ解析を行った後、ＳＳＣＰバンドシフトの配列決定を行なった。家系２の解析に使用したプライマーを表３に示す。これらのプライマーの配列を配列番号７〜１７、１９〜２４および２５〜２９に示す。
【０１３０】
この家系の解析では、ＳＳＣＰに使用するプライマーの５′末端をＨＥＸで標識した。代表的なＰＣＲ反応は、３０ｎｇの患者ＤＮＡを使って、１０μｌの総液量で行なった。ＰＣＲ反応液は全て６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．５μＭ　ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０％ＤＭＳＯ、０．１７ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５μｇ／ｍｌの各プライマー、および１００Ｕ／ｍｌのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を１０サイクルした後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒を２５サイクルすることによって行なった。次に、７２℃で１０分間の最終伸長反応を行なった。
【０１３１】
終了したＰＣＲ反応液に、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１２．５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含む２０μｌのローディング色素を加え、それを、２％のグリセロールを含む架橋比３５：１（アクリルアミド：ビスアクリルアミド）の非変性４％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲル厚は１００μｍ、幅１６８ｍｍ、長さ１６０ｍｍとした。ゲルを２２℃にて１２００ボルトおよび約２０ｍＡで泳動し、ＧｅｌＳｃａｎ　２０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（オーストラリア））で製造者の説明書に従って解析した。
【０１３２】
次に、高次構造変化を示すＰＣＲ産物を家系１について説明したように配列決定した。ただし、ＳＳＣＰ変化が認められた特定エキソンの再増幅に使用したプライマーには、５′ＨＥＸラベルを含めなかった。再増幅したエキソンは、ＱｉａＱｕｉｃｋ　ＰＣＲプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の方法に基づいて使用することによって精製した。精製したＧＡＢＲＧ２アンプリコンの配列決定に使用したプライマーは、最初の再増幅ステップに使用したものと同じである。各配列決定反応には、２５ｎｇのプライマーと１００ｎｇの精製ＰＣＲテンプレートとを使用した。全ての配列決定反応にＢｉｇＤｙｅシークエンシングキット（ＡＢＩ）を製造者の説明書に従って使用した。産物をＡＢＩ３７７シークエンサーにかけ、ＥｄｉｔＶｉｅｗプログラムを使って解析した。
【０１３３】
この家系におけるエキソン９のＳＳＣＰ解析により、発端者にバンドシフトが同定された。この変異体を配列決定したところ、ＣからＴへのヌクレオチド変化がＧＡＢＲＧ２遺伝子のエキソン９内の１３９４位に認められた（ｃ１１６８Ｃ→Ｔ）（図４）。同じヌクレオチド置換は発端者の兄弟と母親にも認められた。ｃ１１６８Ｃ→Ｔ突然変異は、成熟ＧＡＢＲＧ２タンパク質の３５１番目の残基にあたる高度に保存されたグルタミンアミノ酸を停止コドンに変え（Ｑ３５１Ｘ）、第４膜貫通ドメインを失った切断型タンパク質をもたらす。Ｑ３５１Ｘ突然変異は、ＳＳＣＰスクリーニング中に試験した他の試料には認められなかった。ＧＡＢＲＧ２タンパク質の第４膜貫通ドメインの喪失は、受容体複合体の機能および／または集合に重大な問題を引き起すのではないかと考えられる。
【０１３４】
実施例５：家系３におけるＧＡＢＲＤの突然変異解析
本発明が明らかにしたようにＧＡＢＲＧ２遺伝子はてんかんに関係しているので、他のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの突然変異解析を開始した。疾患原因突然変異を同定するために、家系３の個体に対してＧＡＢＲＤエキソンのＳＳＣＰ解析を行ない、続いてＳＳＣＰバンドシフトの配列決定を行なった。家系３の解析に使用したプライマーを表４に示す。これらのプライマーの配列を配列番号３０〜４９に示す。エキソン１のＳＳＣＰ解析は、このエキソンをまたぐゲノム配列を入手できないので、完了していない。
【０１３５】
上述した家系２の解析と同様に、家系３におけるＧＡＢＲＤ遺伝子の解析に使用したプライマーは、その５′末端をＨＥＸで標識した。ＰＣＲ条件は家系２の解析について上述した条件と同じとした。ＳＳＣＰ変化が認められたエキソンを上述のように配列決定して、この変化の根拠を同定した。
【０１３６】
この家系におけるＧＡＢＲＤのＳＳＣＰ解析により、発端者にバンドシフトが同定された。この変異体を配列決定したところ、ＣからＴへのヌクレオチド変異が、ＧＡＢＲＤ遺伝子内のｃ６５８位に認められた。このヌクレオチド変化により、アルギニンアミノ酸はシステイン残基に置き換わることになる。この突然変異は、発端者と一卵性双生児の関係にある兄弟および彼らの母親にも認められたが、正常集団から得た１９２の対照染色体には認められなかった。
【０１３７】
実施例６：ＧＡＢＲＧ２突然変異の機能的意義
ＧＡＢＡＡ受容体機能に対するＧＡＢＲＧ２突然変異の効果を調べるために、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞の電気生理学的解析を行なった。ヒトＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＲＢ２およびＧＡＢＲＧ２サブユニットをコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ））を使って、ｃ２４５Ｇ→Ａ突然変異およびｃ１１６８Ｃ→Ｔ突然変異をヒトＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＲＧ２に個別に導入した。ｃ２４５Ｇ→Ａ突然変異の組込みには配列番号５０に示すオリゴヌクレオチド（５′　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＣ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＣ　３′）を使用し、ｃ１１６８Ｃ→Ｔ突然変異の組込みには配列番号５１に示すオリゴヌクレオチド（５′　ＧＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＴＧＣ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＧＣＧ　３′）を使用した。突然変異誘発の成功は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。野生型ｃＤＮＡおよび突然変異型ｃＤＮＡを線状化し、ゲル精製し、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ・メッセージ・マシン（Ｍｅｓｓａｇｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）インビトロＲＮＡ合成キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使って、ｃＲＮＡを作製した。ｃＲＮＡの試料を変性アガロースゲルで泳動して、それらが正しいサイズを持ち、分解していないことを確かめた。マイクロインジェクションによって、ＧＡＢＡＡサブユニットに相当する約２５ｎｇのｃＲＮＡを、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ステージＶまたはＶＩ）に導入した。二元複合体（ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２）ではなく三元複合体（ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２：ＧＡＢＲＧ２）の構築を促進するために、１０倍モル過剰の野生型および突然変異型ＧＡＢＲＧ２を使用した。次に、卵母細胞をＯＲ２緩衝液（８２．５ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に２％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したもの、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に保存し、１８℃で３〜５日間インキュベートすることによって、受容体を十分に発現させた。二電極電圧クランプ（ＡｘｏＣｌａｍｐ　２Ｂ，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使って卵母細胞からの電流を記録し、−８０ｍＶの保持電位で記録を行なった。電極には３Ｍ　ＫＣｌを充填した。電極の抵抗値は１〜２ＭΩだった。卵母細胞にＮＤ９６溶液（９６ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ　ＢａＣｌ２および５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を持続的に灌流した。γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア））を槽灌流によって適用した。
【０１３８】
ｃ２４５Ｇ→Ａ（Ｒ４３Ｑ）突然変異：
図５に示すように、ＧＡＢＲＧ２またはＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）を発現させる卵母細胞では、ＧＡＢＡに対するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞の電気生理学的応答を識別できないことがわかった。しかし、アルギニン４３は２つの高親和性ベンゾジアゼピン結合ドメインのうちの最初の方に位置するので（Ｋｕｃｋｅｎら，２０００）、この突然変異はＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）電流のジアゼパムによる増強を変化させるかもしれないと予想された。追加の実験により、野生型チャネルではジアゼパムは電流を有意に増強したが（３０３±３３％；平均±ＳＥＭ；ｎ＝２０）（Ｐ＜０．０１）、ＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）を含む受容体を発現させる卵母細胞ではジアゼパムによる増強が完全に消失して、電流にわずかな減少が認められた（１０±６％；平均±ＳＥＭ；ｎ＝１７；図５ａ　ｉｉ）。ＧＡＢＲＧ２およびＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）ｃＲＮＡの５０：５０混合物を注入した卵母細胞ではジアゼパムによる中間的な増強（１２９±３０％、ｎ＝８）が認められたので、これらの知見から、Ｒ４３ＱはＧＡＢＡ受容体に対するベンゾジアゼピン類の作用を消失させることが示唆される。
【０１３９】
これに代わるもう一つの説明として、ＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）突然変異が、ＧＡＢＲＧ２サブユニットとＧＡＢＡ受容体との不適正な集合を引き起すことが考えられる。ベンゾジアゼピン感受性にとってＧＡＢＲＧ２の発現は絶対的必要条件であり（ＳｉｇｅｌおよびＢｕｈｒ，１９９７）、ＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２だけの発現によって生じるＧＡＢＡ活性化電流はベンゾジアゼピン類によって増強されないことが明らかにされている。このベンゾジアゼピン感受性の欠失は、この研究中にＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）突然変異で得られた結果と定性的に似ているので、本発明者らは、ＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２だけの発現によって生じる電流がＺｎ２＋に対して高い感受性を持つのに対して、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＲＢ２およびＧＡＢＲＧ２サブユニットが正しく集合することによって生じる電流はかなり低感度であること（Ｄｒａｇｕｈｎら，１９９０）に基づいて、上記２つの可能性を識別することにした。追加の実験によって、Ｚｎ２＋はＧＡＢＲＧ２発現卵母細胞にもＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）発現卵母細胞にも同じ効果を示すことがわかった。これは突然変異型サブユニットの発現と集合を表す（図５ｂ　ｉおよびｉｉ）。ＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）サブユニットが集合に関与しないのであれば、Ｚｎ２＋感受性はＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２だけでみられるものと似ていただろう。しかしこれが事実に反することは明らかである。なぜならＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２だけを発現させる卵母細胞ではＧＡＢＡ活性化電流がＺｎ２＋によって完全に消失したからである（図５ｂ　ｉｉｉ）。したがって突然変異型サブユニットは発現されて、ＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２と共に集合し、さらにこの突然変異はＺｎ２＋感受性に影響を及ぼさない。よってＧＡＢＲＧ２のＲ４３Ｑ突然変異の機能上の帰結は、ＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失させることである。
【０１４０】
理論に束縛されることは望まないが、Ｒ４３Ｑ突然変異によって起こるベンゾジアゼピン感受性の喪失から、天然のベンゾジアゼピン受容体リガンドと推定される物質（エンドゼピン類）は熱性けいれんの予防および欠神の予防に生理学的役割を持っているかもしれないことが示唆される。あるいは、ＧＡＢＲＧ２中のＲ４３Ｑ突然変異はインビボではＧＡＢＡＡ受容体機能をさらに別の形で変化させるのかもしれない。この突然変異がどのようにして熱性けいれんの年齢依存的発現および温度感受性、ＣＡＥの年齢依存的発現を引き起すかは説明がつかないが、それはＧＡＢＡＡのまたは関連するニューロンネットワーク中の他の受容体の発育段階に応じた差次的発現および温度依存的動態に関係しているのかもしれない（Ｂｒｏｏｋｓ−ＫａｙａｌおよびＰｒｉｔｃｈｅｔｔ，１９９３）。
【０１４１】
ｃ１１６８Ｃ→Ｔ（Ｑ３５１Ｘ）突然変異：
１：１：１０（ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２：ＧＡＢＲＧ２（Ｑ３５１Ｘ））のｃＲＮＡ注入比を用いたところ、ＧＡＢＡに対する電流応答は観察されなかった。しかし、野生型ＧＡＢＲＧ２を上記の比で組み込んだ対照群は、強い電流応答を与えた。また、１：１：１０（ＧＡＢＲＡ１：ＧＡＢＲＢ２：水）の注入比での発現は、ＧＡＢＡに対する電流応答を与えた。切断型受容体複合体は、ＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＡ２受容体複合体の場合のような電流強度を誘起しなかったので、突然変異型ＧＡＢＲＧ２受容体の発現はドミナントネガティブ効果を持つ（図６）。
【０１４２】
これらの実験の結果は、ＧＡＢＲＧ２（Ｑ３５１Ｘ）サブユニットがＧＡＢＲＡ１およびＧＡＢＲＢ２サブユニットと共に集合して非機能的な受容体複合体を作ることを示している。受容体の不活化について考えられる２つの機構は、非機能的な受容体は正しく集合できるものの、細胞膜には分泌されるがＧＡＢＡに応答できないという機構、または細胞膜表面にうまく輸送されることができず、よって小胞体（ＥＲ）の内腔にとどまっているという機構である。（ここに開示した本発明の突然変異体の場合と同様に）膜貫通アンカーが失われると、複合体はＥＲに閉じ込められてしまうので、切断型受容体に関する先の研究は、後者の説明を裏付けている。
【０１４３】
したがって、ＧＡＢＲＧ２（Ｑ３５１Ｘ）サブユニットを含むＧＡＢＡＡ受容体複合体は集合した突然変異型受容体複合体に対してドミナントネガティブ効果を持つが、これはおそらく、機能的ＧＡＢＡＡ受容体の密度の低下が、ＧＡＢＡに対する抑制的応答を減少させ、よってニューロンの興奮性の増加および発作を引き起すためだろう。
【０１４４】
実施例７：ＧＡＢＡＡ受容体および受容体サブユニットの解析
以下の方法を使ってＧＡＢＡＡ受容体および受容体サブユニットの構造および機能を決定する。
【０１４５】
分子生物学的研究
ＧＡＢＡＡ受容体が全体としてまたは個々のサブユニットを介して既知タンパク質および未知タンパク質結合する能力を調べることができる。機能的パートナーの発見および同定には、酵母ツーハイブッドシステムなどの方法を利用する。酵母ツーハイブリッドシステムを支えている原理は、多くの真核転写活性化因子は、酵母のものを含めて、２つの分離したモジューラードメインからなっていることである。第１のモジュラードメインは、特異的プロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメインであり、第２のモジュラードメインは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体に、ＤＮＡ結合部位の下流にある遺伝子を転写するように指示する活性化ドメインである。どちらのドメインも単独では転写を活性化することができないので、転写の活性化には両方のドメインが必要である。酵母ツーハイブリッド法では、興味ある遺伝子またはその一部（ベイト（ＢＡＩＴ））を、それがＤＮＡ結合ドメインを持つペプチドへの融合物として発現されるようにクローニングする。第２の遺伝子または遺伝子群、例えばｃＤＮＡライブラリーに由来する遺伝子（ターゲット（ＴＡＲＧＥＴ））は、それが活性化ドメインへの融合物として発現されるようにクローニングする。興味あるタンパク質がその結合パートナーと相互作用すると、ＤＮＡ結合ペプチドは活性化ドメインに接触することになり、レポーター遺伝子の転写が開始される。第１のレポーター遺伝子によって、相互作用するタンパク質を含む酵母細胞が選択される（このレポーターは通常、選択培地での増殖に必要な栄養遺伝子である）。第２のレポーターは確認のために使用され、相互作用タンパク質に応答して発現されるが、これは通常、増殖には必要とされない。
【０１４６】
ＧＡＢＡＡレポーター相互作用遺伝子およびタンパク質の性質も研究することができるので、これらパートナーは創薬の標的になりうる。
【０１４７】
構造研究
ＧＡＢＡＡ受容体組換えタンパク質を細菌、酵母、昆虫細胞および／または哺乳類細胞で産生させて、それらを結晶構造解析およびＮＭＲ研究に使用することができる。タンパク質の分子モデリングと併せて、構造に基づく薬物設計を容易にすることができる。
【０１４８】
実施例８：ＧＡＢＡＡ受容体またはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットに対するポリクローナル抗体の作製
小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋）およびミオクロニーてんかんを持つ個体におけるＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＲＧ２サブユニット中の突然変異が同定され、よってその受容体のてんかんへの関与が確認されたら、突然変異型タンパク質を選択的に結合し、正常タンパク質と区別するために、抗体を作製することができる。突然変異を起こしたエピトープに特異的な抗体は、薬剤で処理した細胞を選別して薬剤の治療ポテンシャルを評価するための細胞培養アッセイに、とりわけ有用である。
【０１４９】
ポリクローナル抗体を製造するために、特定のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットアミノ酸配列に相同な短いペプチドを設計することができる。このようなペプチドは典型的には１０〜１５アミノ酸長である。これらのペプチドは、他の受容体サブユニットに対するホモロジーが最も領域に設計すべきであり、また、モノクローナル抗体産生などのさらに後続の実験での種間相互作用を避けるために、マウスオルソログに対しても低いホモロジーを持つべきである。次に、合成ペプチドは、ＰＩＥＲＣＥＴＭキット（ＰＩＥＲＣＥ）などの市販のキットと共に提供される標準的プロトコールを用いて、ビオチン（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン）に結合させることができる。次に、ビオチン化ペプチドに、溶解状態でアビジンとの複合体を形成させ、３週間の間隔で抗原を４回投与（各投与につき２００μｇ）することによって、各ペプチド複合体につき２匹のウサギを免疫化する。初回投与分はフロインドの完全アジュバントと混合し、２回目以降の投与分はフロインドの免疫アジュバントと混合する。免疫化が完了した後、ウサギから試験採血し、元のペプチドの段階希釈液を使ったドットブロット法によって血清の反応性をアッセイする。ウサギが免疫前血清と比較して有意な反応性を示したら、そのウサギを屠殺し、以降の実験のために免疫血清を分離することができるように、血液を集める。
【０１５０】
この手順を繰り返して野生型の受容体サブユニットに対する抗体を作製する。これらの抗体は、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットに対する抗体と共に、様々な組織における突然変異型の存在および相対レベルを検出するために使用される。
【０１５１】
実施例９：ＧＡＢＡＡ受容体またはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットに特異的なモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は以下の方法で作製することができる。無傷のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットタンパク質またはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットペプチド（野生型または突然変異型）を含む免疫原を、フロインドのアジュバントと混合して、マウスに注射する。各マウスには１０〜１００μｇの免疫原を４回注射する。４回目の注射後にマウスから採取した血液試料を、上記免疫原に対する抗体の存在について調べる。免疫マウスを屠殺し、脾臓を摘出し、単細胞浮遊液を調製する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）。これらの脾細胞をリンパ球の供給源とし、そのリンパ球を永久増殖性の骨髄腫パートナー細胞と融合する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。細胞を９６穴プレートに２×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、個々のウェルを増殖に関して調べる。次に、これらのウェルを、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより、野生型または突然変異型サブユニットターゲットタンパク質を使って、ＧＡＢＡ受容体サブユニット特異抗体の存在について試験する。陽性ウェルの細胞を増殖させ、サブクローニングして、モノクローナル性を樹立し、確認する。望ましい特異性を持つクローンをマウスで腹水として拡大、増殖させた後、プロテインＡセファロースを使ったアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはこれらの技術の変形および併用によって精製を行う。
【０１５２】
産業上の利用可能性
本発明は、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断および処置を可能にするものである。特に本発明は、全般てんかんの診断および処置、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの診断および処置を可能にするものである。
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
【表４】
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【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】小児欠神てんかんおよび熱性けいれんを持つ４世代家系である家系１の家系図である。
【図２】同じく特発性全般てんかんが存在する家系２の家系図である。
【図３】家系１のＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）遺伝子中に存在するｃ２４５Ｇ→Ａ突然変異の位置を示す図である。
【図４】家系２におけるＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）遺伝子中の突然変異の位置を示す図である。
【図５】アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞におけるＧＡＢＲＧ２およびＧＡＢＲＧ２（Ｒ４３Ｑ）の電気生理学的解析を表す図である。
【図６】アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞における野生型ＧＡＢＡＡ受容体γ２サブユニット（ＧＡＢＲＧ２）およびＧＡＢＲＧ２（Ｑ３５１Ｘ）突然変異体の電気生理学的解析の結果を要約した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月8日(2002.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子であって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする単離された哺乳類ＤＮＡ分子、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログ。
【請求項２】
突然変異事象が、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型を生じることを特徴とする突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３】
サブユニットがＧＡＢＡＡγサブユニットであることを特徴とする請求項２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項４】
γサブユニットがγ２サブユニットであることを特徴とする請求項３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの細胞外領域をコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記突然変異事象がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする請求項５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記突然変異事象がベンゾジアゼピン結合ドメインをコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項６に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの大細胞外ループをコードするヌクレオチドに起こることを特徴とする請求項７に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項９】
突然変異が点突然変異であることを特徴とする請求項４から８のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１０】
点突然変異が高度に保存されたアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置換をもたらすことを特徴とする請求項９に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１１】
前記突然変異事象が成熟γ２サブユニットの４３番目の残基で高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項１０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１２】
前記突然変異事象がグルタミンによる高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項１１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１３】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの４７１位のＧからＡへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項１２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する請求項１３に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項１５に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１８】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項１９】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡγ２サブユニットの第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループに起こっていることを特徴とする請求項４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２０】
前記突然変異事象が点突然変異であることを特徴とする請求項１９に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの１３９４位のＣからＴへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項２０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記突然変異事象がコードされた成熟γ２サブユニットタンパク質の３５１位での停止コドンの導入をもたらすことを特徴とする請求項２１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２３】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する請求項２２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２４】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項１９から２２のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２５】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項２４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２６】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２７】
配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２８】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットに起こることを特徴とする請求項２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項２９】
前記突然変異事象が点突然変異であることを特徴とする請求項２８に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３０】
点突然変異がコードされた成熟タンパク質の１７２位でのアルギニン残基の置換をもたらすことを特徴とする請求項２９に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３１】
アルギニン残基がシステイン残基により置換されることを特徴とする請求項３０に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３２】
前記突然変異事象がδサブユニットの６５８位でのＣからＴへのヌクレオチド置換であることを特徴とする請求項３１に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３３】
ヌクレオチド配列が配列番号３に記載されていることを特徴とする請求項３２に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３４】
点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項３０から３２のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３５】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的アミノ酸置換をもたらす点突然変異であることを特徴とする請求項３４に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３６】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３７】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる単離された哺乳類ＤＮＡ分子。
【請求項３８】
突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチドであって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする単離された哺乳類ポリペプチド、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログ。
【請求項３９】
突然変異事象が、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型を生じることを特徴とする突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４０】
サブユニットがＧＡＢＡＡγサブユニットであることを特徴とする請求項３９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４１】
γサブユニットがγ２サブユニットであることを特徴とする請求項４０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４２】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの細胞外領域で起こることを特徴とする請求項４１に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４３】
前記突然変異事象がＧＡＢＡ応答のジアゼパムによる増強を消失または減少させることを特徴とする請求項４２に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４４】
前記突然変異事象がベンゾジアゼピン結合ドメインで起こることを特徴とする請求項４３に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４５】
前記突然変異事象がγ２サブユニットの大細胞外ループで起こることを特徴とする請求項４４に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４６】
前記突然変異事象が置換であることを特徴とする請求項４０から４５のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４７】
前記突然変異事象が成熟γ２サブユニットの４３番目の残基で高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項４６に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４８】
前記突然変異事象がグルタミンによる高度に保存されたアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項４７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する請求項４７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５０】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項４８に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５１】
前記１または複数の追加突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項５０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５４】
前記突然変異事象がγ２サブユニットタンパク質の第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間の大細胞質ループに起こっていることを特徴とする請求項４０に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５５】
前記突然変異事象が切断であることを特徴とする請求項５４に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５６】
欠失が成熟γ２サブユニットの３５１位からであることを特徴とする請求項５５に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５７】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する請求項５６に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５８】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項５７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項５９】
前記１または複数の突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項５８に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６０】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６２】
サブユニットがＧＡＢＡＡδサブユニットであることを特徴とする請求項３９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６３】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットの細胞外領域で起こることを特徴とする請求項６２に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６４】
前記突然変異事象がＧＡＢＡＡδサブユニットの大細胞外ループで起こることを特徴とする請求項６３に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６５】
前記突然変異事象が置換であることを特徴とする請求項６２から６４のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６６】
前記突然変異事象が成熟δサブユニットの１７２番目の残基でアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項６５に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６７】
前記突然変異事象がシステインによるアルギニンの置換をもたらすことを特徴とする請求項６６に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６８】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する請求項６７に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項６９】
置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される１または複数の追加突然変異事象が起こっていることを特徴とする請求項６３から６７のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７０】
前記１または複数の突然変異事象が保存的置換であることを特徴とする請求項６９に記載の単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７３】
請求項３８から７２のいずれか一つに記載のサブユニットを含む集合したＧＡＢＡＡ受容体である単離された哺乳類ポリペプチド。
【請求項７４】
突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって：
（１）請求項１から３７のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞をポリペプチド産生に有効な条件で培養する工程；および
（２）突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットを収集する工程
を含む方法。
【請求項７５】
突然変異型ＧＡＢＡＡサブユニットと他のＧＡＢＡＡサブユニットとを哺乳類ＧＡＢＡＡ受容体へと集合させ、そして集合した受容体を収集する工程をさらに含む請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項３８から７２のいずれか一つに記載のポリペプチドとは免疫反応するが、野生型ＧＡＢＡＡ受容体またはそのサブユニットとは免疫反応しない抗体。
【請求項７７】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ′）２およびＦａｂのような抗体断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、野生型ＧＡＢＡＡ受容体または受容体サブユニットおよび／または野生型ＧＡＢＡＡ受容体または受容体サブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子またはＧＡＢＡＡ受容体活性を置換するＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターまたはＧＡＢＡＡ受容体活性を回復する請求項７３に記載の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターをかかる処置を必要としている患者に投与する工程を含む方法。
【請求項７９】
ジアゼパムによる増強が回復されることを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
切断型ＧＡＢＡＡ受容体が細胞膜に組み込まれることによって受容体機能が回復することを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
対象の機能的受容体の活性が増大されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
野生型ＧＡＢＡ受容体またはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットが遺伝子治療法によって導入されることを特徴とする請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
野生型ＧＡＢＡＡγサブユニットまたはδサブユニットが導入されることを特徴とする請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における野生型ＧＡＢＡＡ受容体または受容体サブユニットおよび／または野生型ＧＡＢＡＡ受容体または受容体サブユニットをコードする単離されたＤＮＡ分子または野生型または請求項７３に記載の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストまたはモジュレーターの使用。
【請求項８５】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、請求項７３に記載の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項８６】
選択的アンタゴニストまたはモジュレーターが抗体であることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体およびＦ（ａｂ′）２およびＦａｂのような抗体断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における請求項７３に記載の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターの使用。
【請求項８９】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、請求項１から３７に記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子のいずれか一つに相補的であるＤＮＡ分子をかかる処置を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項９０】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における請求項１から３７のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子に相補的であるＤＮＡ分子の使用。
【請求項９１】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための請求項１から３７のいずれか一つに記載の単離された哺乳類ＤＮＡ分子の使用。
【請求項９２】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断における請求項３８から７３のいずれか一つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項９３】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断における請求項７６または７７に記載の抗体の使用。
【請求項９４】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための方法であって：
（１）てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の疑いのある対象からＤＮＡを採取する工程；および
（２）前記ＤＮＡのＧＡＢＡＡ受容体のサブユニットのＤＮＡ配列と野生型ＧＡＢＡＡ受容体の対応するサブユニットのＤＮＡ配列とを比較する工程
を含む方法。
【請求項９５】
各ＤＮＡ断片は配列決定され、その配列が比較されることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＤＮＡ断片は制限酵素分析に供されることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
ＤＮＡ断片はＳＳＣＰ分析に供されることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断のための方法であって：
（１）てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の疑いのある対象からＧＡＢＡＡ受容体を採取する工程；および
（２）前記受容体のサブユニットと野生型ＧＡＢＡ受容体の対応するサブユニットを比較する工程
を含む方法。
【請求項９９】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項３８から７３のいずれか一つに記載のポリペプチドの使用。
【請求項１００】
ハイスループットスクリーニング技術が用いられることを特徴とする請求項９９に記載の使用。
【請求項１０１】
請求項１から３７のいずれか一つに記載の単離されたＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０２】
動物がラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類からなる群より選択される請求項１０１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０３】
動物がマウスである請求項１０２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０４】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項１００から１０３のいずれか一つに記載の遺伝子改変非ヒト動物の使用。
【請求項１０５】
候補医薬化合物のスクリーニングにおける請求項１から３７のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞の使用。
【請求項１０６】
請求項１から３７のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項１０７】
請求項１から３７のいずれか一つに記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は中枢神経系にもっとも豊富に存在する抑制性神経伝達物質である。ＧＡＢＡ作動性抑制は、２種類の受容体、Ａ型およびＢ型によって媒介される。Ｂ型受容体はＧタンパク質共役受容体群の一つであり、二次メッセンジャーカスケードによって様々な抑制効果を媒介する。Ａ型受容体は迅速な抑制を媒介するリガンド作動性クロライドチャネルである。文脈が他のものを要求しない限り、以後「ＧＡＢＡＡ受容体」という呼称はＡ型受容体の呼称として解釈される。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
発明の開示
本発明は、その一側面として、突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットをコードする単離された哺乳類ＤＮＡ分子であって、点突然変異、欠失、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とする哺乳類ＤＮＡ分子、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じる。特に全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の好ましい一形態では、単離された哺乳類ＤＮＡはＧＡＢＡＡγサブユニットまたはδサブユニットをコードする。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明は、もう一つの側面として、突然変異型γ−アミノ酪酸Ａ型（ＧＡＢＡＡ）受容体サブユニットである単離された哺乳類ポリペプチドであって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象が起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡ受容体の機能を混乱させることを特徴とするポリペプチド、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じる。特に全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本発明は、さらにもう一つの側面として、集合した哺乳類ＧＡＢＡＡ受容体である単離されたポリペプチド複合体であって、置換、欠失、切断、挿入および再配列からなる群より選択される突然変異事象がそのサブユニットに起こっており、前記突然変異事象が集合したＧＡＢＡＡ受容体の機能を、典型的には、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型が生じるように混乱させることを特徴とする単離されたポリペプチド複合体、またはそれ以外は機能的なその断片もしくはホモログを提供する。特に、全般てんかんの表現型、より具体的には、小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）および／またはミオクロニーてんかんの表現型が生じる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明は、さらにもう一つの側面として、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットであるポリペプチドを製造する方法であって、
（１）上記のＤＮＡ分子を含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチド産生に有効な条件で培養する工程、および
（２）突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットを収集する工程
を含む方法を提供する。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットは、野生型サブユニットまたはそれ自体突然変異型サブユニットである他のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットと集合させることもでき、そうすることにより、集合したＧＡＢＡＡ受容体が得られる。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
次に、実質的に精製されたタンパク質またはその断片を、さらなる生化学的解析に使用して、例えばタンパク質の結晶もしくは集合したＧＡＢＡ受容体の結晶のＸ線結晶解析または核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などにより、二次構造および三次構造を確立することができる。構造の決定により、ＧＡＢＡＡ受容体全体と相互作用する医薬もしくは特定のサブユニットタンパク質との相互作用を介してＧＡＢＡ受容体と相互作用する医薬、またはＧＡＢＡ受容体タンパク質全体の電荷配置もしくは他のタンパク質との電荷相互作用を変化させる医薬、または細胞におけるその機能を変化させる医薬の合理的設計が可能になる。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットタンパク質中にてんかんに関与する突然変異が同定されたことで、ＧＡＢＡＡ受容体およびその関連サブユニットが、新たな用途、例えば正常型または突然変異型の遺伝子または遺伝子産物をスクリーニングしてその存在を検出するための様々なハイブリダイゼーションアッセイおよび免疫学的アッセイなどにも役立つようになることは理解されるだろう。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本発明の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの発現は、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の表現型をもたらす。この表現型が他の症状および／または状態と共に現れる場合があることは理解されるだろう。したがって本発明により、例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害を処置するための治療方法が可能になる。また本発明により、例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害を診断する方法が可能になる。
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、ＧＡＢＡＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットのいずれか一つに突然変異を含み、前記突然変異が前記障害の原因となっている場合に、かかる処置を必要とする対象に、上述の野生型ＧＡＢＡＡ受容体ポリペプチドもしくは受容体サブユニットポリペプチド、またはＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、ＧＡＢＡＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットのいずれか一つに突然変異を含み、前記突然変異が例えばてんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満など（ただしこれらに限定されない）の障害の原因となっている場合に、前記障害を処置するための医薬の製造におけるＧＡＢＡＡ受容体の選択的アゴニストまたはモジュレーターの使用を提供する。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニットに相当するタンパク質またはペプチドは、対応する突然変異型ＧＡＢＡ受容体サブユニットを含む細胞または対応するＧＡＢＡ受容体サブユニットを欠いている細胞に供給することができる。ＧＡＢＡＡ容体サブユニットタンパク質は上述のように製造して、例えばマイクロインジェクション法によって、またはもう一つの例としてリポソームを利用して、細胞に導入することができる。能動的にまたは拡散によって細胞に取り込まれる分子もあるだろう。てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置においては、適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニット活性を持つタンパク質またはペプチドを、そのようなサブユニットが不足している細胞に供給することにより、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の部分的逆転が起こるはずである。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
治療にはＧＡＢＡＡ受容体サブユニット活性を持つ他の分子（例えば薬物または有機化合物）も使用することができる。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
実質的に精製されたＧＡＢＡＡ受容体サブユニット（典型的にはＧＡＢＡＡγまたはδサブユニット）と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物を投与してもよい。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明の医薬組成物は、望ましい純度を持つ適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニットまたはその活性断片もしくは変異体を、許容できる周知の担体、賦形剤または安定剤と混合することによって製造される。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で無毒性であり、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのノニオン界面活性剤などが挙げられる。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子またはその断片を遺伝子治療法に使用して、突然変異型遺伝子を発現させているがその遺伝子産物が非機能的であるような人々における遺伝子の発現レベルを増大させてもよい。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
もう一つの選択肢として、適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子またはその断片を、細胞への取込みが可能でありかつ有効な機能を与えるのに十分なタンパク質をコードすることが可能な形で、罹患細胞に送達してもよい。あるいは、一部の突然変異体では、その遺伝子中に第２の突然変異を持つ相同な遺伝子をさらに１コピー導入することによって疾患を予防したり、突然変異を変化させて、または別の遺伝子を使って、負の効果を遮断したりすることもできる。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、ＧＡＢＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターおよび／または上述の単離されたＤＮＡ分子または野生型ＧＡＢＡＡ受容体もしくはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットを投与することを含む方法を提供する。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における、ＧＡＢＡＡ受容体のアゴニストもしくはモジュレーターおよび／または上述の単離されたＤＮＡ分子または野生型ＧＡＢＡ受容体もしくはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの使用を提供する。


【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
適当なＧＡＢＡＡ受容体サブユニットまたはその断片もしくは誘導体を発現させる能力を持つベクターは、典型的には、当該遺伝子が細胞によって発現され染色体外にとどまるように対象に投与されるか、または理想的には、細胞中に存在する内因性突然変異型遺伝子と組換えを起こすように細胞中に導入されるだろう。これには遺伝子突然変異を補正するために二重組換え事象が必要である。これらの方法で遺伝子を導入するためのベクターは当技術分野では知られており、適切なベクターはどれを使用してもよい。


【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、ＧＡＢＡＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットに突然変異を含み、前記突然変異が前記障害の原因となっている場合に、かかる処置を必要とする対象に、ＧＡＢＡＡ受容体または受容体サブユニットの選択的アンタゴニストまたはモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。


【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本発明は、さらにもう一つの側面として、ＧＡＢＡＡ受容体がその受容体を構成するサブユニットに突然変異を含み、前記突然変異がてんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の原因となっている場合に、前記障害を処置するための医薬の製造におけるＧＡＢＡＡ受容体の選択的アンタゴニストまたはモジュレーターの使用を提供する。


【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
当技術分野で周知の方法により、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体を使って、上記疾患の原因となっている突然変異型受容体に特異的な抗体を産生させるか、または薬剤ライブラリーをスクリーニングして突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する薬剤を同定することができる。


【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
一側面として、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体を特異的に結合する抗体は、アンタゴニストまたはモジュレーターとして直接的に使用するか、または突然変異型ＧＡＢＡ受容体を発現させる細胞もしくは組織に薬剤を運ぶターゲティング機構もしくは送達機構として間接的に使用することができる。


【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
本発明は、さらにもう一つの側面として、上述のポリペプチドとは免疫反応するが、野生型ＧＡＢＡＡ受容体またはそのサブユニットとは免疫反応しない抗体を提供する。


【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
特に、受容体を構成するサブユニットに上述した障害の原因となる突然変異を含む集合したＧＡＢＡＡ受容体に対する抗体を提供する。当業者には理解されるであろうが、かかる抗体には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および一本鎖抗体などを含めることができるが、これらに限るわけではない。


【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体に対するモノクローナル抗体は、培養連続継代性細胞系による抗体分子の産生に対応した任意の技術を使って製造することができる。これらの技術には、例えばハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術などがあるが、これらに限るわけではない（例えばＫｏｈｌｅｒら，１９７５；Ｋｏｚｂｏｒら，１９８５；Ｃｏｔｅら，１９８３；Ｃｏｌｅら，１９８４を参照されたい）。


【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
ＧＡＢＡＡ受容体に対する特異的結合部位を含む抗体断片も生成させることができる。例えばそのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成するＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２断片のジスルフィド橋を還元することによって生成するＦａｂ断片などがある。もう一つの選択肢として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるようにしてもよい（例えばＨｕｓｅら，１９８９を参照されたい）。


【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
望ましい特異性を持つ抗体を同定するためのスクリーニングには、種々の免疫アッセイを使用することができる。確定された特異性を持つポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する競合結合アッセイまたは免疫放射線アッセイのプロトコールは、当技術分野では数多く知られている。そのような免疫アッセイでは通例、ＧＡＢＡＡ受容体とその特異的抗体との複合体形成が測定される。２つの非干渉ＧＡＢＡＡ受容体エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル免疫測定法は好ましいが、競合結合アッセイも使用することができる。


【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、上述したＤＮＡ分子のいずれか一つの相補鎖（アンチセンス）である単離されたＤＮＡ分子であって、かつ突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ分子を投与することを含む方法を提供する。


【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本発明は、さらにもう一つの側面として、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を処置するための医薬の製造における、本発明のＤＮＡ分子の相補鎖である単離されたＤＮＡ分子であってかつ突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡ分子の使用を提供する。


【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
かかる処置を必要とする対象には、典型的には、ＧＡＢＡＡ受容体を構成するサブユニットをコードするポリヌクレオチドの相補鎖を発現させるベクターを投与することができる。アンチセンス法には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入、およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを含む様々なアプローチを使用することができる。細胞または組織にベクターを導入するために利用できる方法は数多くあり、それらはインビボ、インビトロおよびエクスビボでの使用に同様に適している。エクスビボ治療法の場合は、患者から採取した幹細胞にベクターを導入し、それをクローン増殖させ、自家移植によって同じ患者に戻すことができる。トランスフェクション、リポソーム注射、またはポリカチオン性アミノポリマーによる送達は、当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる（例えばＧｏｌｄｍａｎら，１９９７を参照されたい）。


【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
本発明のさらにもう一つの側面によれば、特に精製された突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体ポリペプチドおよびそれらを発現させる細胞は、種々の技術による候補薬剤のスクリーニングに有用である。てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置に役立つ治療薬が本発明のポリペプチドに対しておそらく結合親和性を示すことは理解されるだろう。このような技術としては、例えば組換えポリペプチドで安定に形質転換されていて当該ポリペプチドまたは断片を発現させる真核または原核宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイに利用することが挙げられるが、これに限るわけではない。結合アッセイでは、特定のＧＡＢＡ受容体サブユニットポリペプチドまたは断片と被験薬剤との複合体の形成が測定されるか、または被験薬剤が特定のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットポリペプチドもしくは断片と既知のリガンドとの複合体の形成を妨害する程度が測定されるだろう。


【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
もう一つの薬物スクリーニング技術では、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体ポリペプチドに対して適切な結合親和性を持つ化合物のハイスループットスクリーニングを行うことができる（国際公開第８４／０３５６４号パンフレット参照）。この技術では、多数の小ペプチド試験化合物を固体基板上で合成し、ＧＡＢＡＡ受容体ポリペプチド結合と洗浄とによってアッセイすることができる。この場合、結合したＧＡＢＡＡ受容体ポリペプチドは、当技術分野で周知の方法によって検出される。この技術の変形として、本発明の精製ポリペプチドをプレートに直接コーティングして、相互作用する試験化合物を同定することもできる。


【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
本発明では、突然変異型ＧＡＢＡ受容体を特異的に結合する能力を持つ中和抗体が突然変異型ＧＡＢＡ受容体への結合に関して試験化合物と競合するような競合薬物スクリーニングアッセイの使用も考えられる。このようにして、抗体を使って、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体の１または複数の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出することができる。


【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明は、形質転換細胞、トランスフェクトもしくは注入卵母細胞またはトランスジェニック動物内で、本発明のポリペプチドを使って化合物をスクリーニングするのに、とりわけ有用である。突然変異ＧＡＢＡＡ受容体を含む培養細胞またはトランスジェニック動物に特定の薬物を添加または投与し、受容体の電流に対する効果を、野生型ＧＡＢＡＡ受容体を含む細胞または動物の電流と比較する。電流をより正常なレベルに変化させる薬物候補は、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の処置または予防に役立つ。


【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、てんかん（特に小児欠神てんかん、熱性けいれん（ＦＳ＋を含む）およびミオクロニーてんかん）および／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満の診断に使用することができ、またそれゆえに本発明では、これらの障害に対する素因の診断に、本発明のＤＮＡ分子を使用することが考えられる。


【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
ＧＡＢＡＡ受容体を構成するタンパク質に基づいて診断アッセイを行う場合は、様々なアプローチが考えられる。例えば診断は、ＧＡＢＡＡ受容体を形成する正常タンパク質と突然変異型タンパク質の電気泳動移動度の差をモニターすることによって達成することができる。このようなアプローチは、電荷置換が存在する突然変異体の同定、または挿入、欠失もしくは置換によって、結果として生じたタンパク質の電気泳動移動度に、著しい変化が起こっている突然変異体の同定には、特に役立つだろう。また診断は、正常タンパク質と突然変異型タンパク質とのタンパク質分解による切断パターンの相違もしくは様々なアミノ酸残基のモル比の相違に基づいて行うか、または遺伝子産物の機能の変化を実証する機能アッセイによって行うこともできる。


【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
もう一つの側面として、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体を特異的に結合する抗体を、てんかんの診断に使用するか、または完全なＧＡＢＡＡ受容体もしくはＧＡＢＡＡ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーターもしくは阻害剤で処置される患者をモニターするためのアッセイに使用することもできる。診断用途に有用な抗体は、治療薬に関する上記の説明と同様にして製造することができる。ＧＡＢＡＡ受容体に関する診断アッセイとしては、例えば抗体とラベルとを利用してヒト体液中または細胞もしくは組織の抽出物中の突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体を検出する方法などが挙げられる。抗体は修飾を施してまたは修飾を施さずに使用することができ、レポーター分子の共有結合または非共有結合によって標識することができる。


【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体の存在を測定するためのプロトコールは、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳなど、当技術分野では種々知られており、てんかんおよび／または不安および／または躁うつ病および／または恐怖強迫症状および／またはアルツハイマー病および／または精神分裂病および／または偏頭痛および／または肥満を診断するための基礎になる。突然変異型受容体の発現は、哺乳類試験対象（好ましくはヒト）から採取した体液または細胞抽出物を、その受容体に対する抗体と、複合体の形成に適した条件で混合することによって実証される。複合体形成量は様々な方法、好ましくは測光手段によって定量することができる。突然変異型受容体に特異的な抗体は、前記突然変異型受容体を発現させる個体にしか結合せず、野生型受容体だけを発現させる個体（すなわち正常な個体）には結合しないだろう。これがこの疾患を診断するための基礎となる。


【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
ある個体が障害を持つと診断されたら、有効な処置を開始することができる。これらの処置としては、例えば突然変異型受容体に対する選択的モジュレーターまたは突然変異型受容体に対するアンタゴニスト（上述の抗体または突然変異型相補鎖など）の投与を挙げることができる。これらに代わる処置としては、例えば受容体機能が正常なレベルまで回復するように突然変異型受容体に対する選択的アゴニストまたはモジュレーターを投与すること、または野生型受容体の導入（特に上述の遺伝子治療法による導入）などが挙げられる。典型的には、適当な完全長ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットまたはその誘導体または断片を発現させる能力を持つベクターを投与することができる。


【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
もう１つの治療補助方法として、実質的に精製されたＧＡＢＡＡ受容体またはＧＡＢＡＡ受容体サブユニットポリペプチドと医薬的に許容できる担体とを、上述のように投与してもよい。


【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
本発明によれば、本発明のＤＮＡ分子で形質転換された遺伝子改変（ノックアウト、ノックインおよびトランスジェニック）非ヒト動物モデルを作出することもできる。これらの動物は、疾患の機序をＧＡＢＡ受容体との関連で研究するためのＧＡＢＡ受容体機能の研究、候補医薬化合物のスクリーニング、突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体を発現させる外植哺乳類細胞培養物の作製、および可能性のある治療的介入の評価に役立つ。


【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
好ましいトランスジェニックマウスを作出するために、標準的な卵母細胞マイクロインジェクション技術または胚性幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロインジェクションによって、特定のＧＡＢＡＡ受容体サブユニットの突然変異型をマウス生殖系列に挿入することができる。もう一つの選択肢として、内因性ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子を不活化または置換することが望ましい場合には、胚性幹細胞を使った相同組換えを適用することもできる。


【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
卵母細胞注入の場合は、１コピーまたは複数コピーの突然変異型ＧＡＢＡＡ受容体サブユニット遺伝子を、受精直後のマウス卵母細胞の前核に挿入することができる。次に、この卵母細胞を偽妊娠養母に再移植する。次に、生産マウスを、特定のヒトサブユニット遺伝子配列の存在に関する尾ＤＮＡまたは他の組織由来のＤＮＡの分析により、組み込まれた遺伝子についてスクリーニングすることができる。導入遺伝子は、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたは他の染色体ＤＮＡ断片として注入された完全なゲノム配列であるか、天然プロモーターまたは異種プロモーターを持つ完全なｃＤＮＡであるか、またはコード領域および最適な発現に必要であることがわかった他の配列を全て含むミニ遺伝子であることができる。


【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
本発明のさらにもう一つの側面によれば、特定ＧＡＢＡＡ受容体サブユニットのヒト突然変異、特に本発明によって開示されるヒト突然変異が同定された結果として作出される動物モデルから得られる神経学的材料を、マイクロアレイ実験に使用することができる。これらの実験は、てんかん脳組織における特定ＧＡＢＡ受容体サブユニットまたは全脳ライブラリー由来の任意のｃＤＮＡクローンの発現レベルを、正常な対照脳組織と比較して同定するために行うことができる。上記２つの組織間に認められるＧＡＢＡＡ受容体サブユニットをはじめとする遺伝子の発現レベルの変動は、それらの遺伝子が、動物モデル中に存在する元のＧＡＢＡＡ受容体突然変異の原因または結果として、てんかん過程に関与することを示す。マイクロアレイは当技術分野で知られた方法によって製造、使用および解析することができる（例えばＳｃｈｅｎａら，１９９６；Ｈｅｌｌｅｒら，１９９７）。




【国際調査報告】
2004500126.tif 000113
2004500126.tif 000114