(57)【要約】本発明は、可溶性形態ヒトＳＳＡＯ（セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ）、選択可能融合パートナー、シグナルペプチド；およびプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え構築物に関する。当該構築物は、ヒトＳＳＡＯの可溶性形態の生成のための方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）宿主細胞からの融合タンパク質の分泌を指令するシグナルペプチド、
（ｉｉ）ヒトセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）の可溶性形態、
（ｉｉｉ）ヒトＳＳＡＯの可溶性形態のダイマー化を、可能とする融合パートナー、および
（ｉｖ）該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態と該融合パートナーの間に位置するプロテアーゼ切断部位、
を含む、分泌される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態が、配列番号２のアミノ酸２９ないし７６３またはそのフラグメントを含む、請求項１の核酸。
【請求項３】
該融合タンパク質が、ベンジルアミンオキシダーゼ活性を有する、請求項２の核酸。
【請求項４】
該ヒトＳＳＡＯの可溶性形態が配列番号２のアミノ酸２９ないし７６３を含む、請求項２の核酸。
【請求項５】
該融合タンパク質がヒトＳＳＡＯの膜横断部分を欠く、請求項１の核酸。
【請求項６】
該融合タンパク質が配列番号２のアミノ酸６ないし２６を欠く、請求項１の核酸。
【請求項７】
該融合パートナーがヒトＳＳＡＯの可溶性形態のＮ末端部分に融合されている、請求項１の核酸。
【請求項８】
該融合パートナーがグルタチオンＳトランスフェラーゼまたはその機能的に同等の変異体である、請求項１の核酸。
【請求項９】
該融合パートナーがSchistosoma japonicumグルタチオンＳトランスフェラーゼの変異体であって、該変異体は他のアミノ酸残基によって置換された８５、１３８および１７８位の少なくとも１つのシステイン残基を有する、請求項８の核酸。
【請求項１０】
該融合パートナーが配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項８の核酸。
【請求項１１】
該シグナルペプチドがマウスＩｇＧ１重鎖シグナルペプチドである、請求項１の核酸。
【請求項１２】
該プロテアーゼ切断部位が３Ｃプロテアーゼ切断部位である、請求項１の核酸。
【請求項１３】
該３Ｃプロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）を含む、請求項１２の核酸。
【請求項１４】
該融合タンパク質が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項１５】
請求項１の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１４の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
組換えヒトＳＳＡＯの精製のための方法であって、
（ｉ）請求項１５の発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、
（ｉｉ）培養培地中で、かつ該発現ベクターによってコードされた融合タンパク質が、該培養培地に分泌される条件下で培養すること、
（ｉｉｉ）分泌された融合タンパク質を、融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドに結合させること、
（ｉｖ）該融合パートナーおよびヒトＳＳＡＯの可溶性形態を分離すること、および
（ｖ）ヒトＳＳＡＯの可溶性形態を回収すること
を含む方法。
【請求項１８】
融合パトナーに対してのアフィニティを有するリガンドがグルタチオンまたはその誘導体である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
該融合パートナーを、プロテアーゼ切断によってヒトＳＳＡＯの可溶性形態から分離する、請求項１７の方法。
【請求項２０】
該プロテアーゼがピコルナウイルス３Ｃプロテアーゼである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該プロテアーゼがライノウイルス３Ｃプロテアーゼである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
該プロテアーゼを融合パートナーに融合させて融合プロテアーゼ得る、請求項１９の方法。
【請求項２３】
該融合プロテアーゼが、ヒトＳＳＡＯの可溶性形態から、該融合プロテアーゼを該融合プロテアーゼに対してのアフィニティを有するリガンドに結合させることを含む方法によって分離される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
固定化された組換えヒトＳＳＡＯの製造のための方法であって、
（ｉ）細胞を請求項１５の発現ベクターでトランスフェクトすること、
（ｉｉ）該細胞を、培養培地中で、かつ該発現ベクターによってコードされる融合タンパク質を該培養培地中へ分泌させる条件下で培養すること、
（ｉｉｉ）該分泌された融合タンパク質を、融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドへ結合させ、これによって該融合タンパク質を固定化すること、
を含む方法。
【請求項２５】
請求項１の核酸によってコードされる融合タンパク質。
【請求項２６】
該融合タンパク質が、該融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンド上に固定化される、請求項２５の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）の可溶性形態、分泌可能融合パートナー、シグナルペプチドおよびプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体構築物に関する。本発明はヒトＳＳＡＯの可溶性形態の精製のための方法であって、当該組換え体構築物を利用する当該方法にも関する。
【０００２】
背景技術
セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）は、酵素の銅含有アミンオキシダーゼファミリーに属し（ＣｕＡＯ；ＥＣ．１．４．３．６）、そして真核および原核生物の両方に広く分布する（Buffoni, 1993）。この豊富な酵素の生理学的役割は、本質的に未知で、そして高アフィニティの内生基質はこれまで同定されず、しかしベンジルアミンは、人工的な高アフィニティ基質である（Buffoni, 1993; Callingham et al., 1995;Lyles, 1996, Hartmann and McIntire, 1997; Holt et al., 1998）。ヒトにおいて高ＳＳＡＯ活性は、血管平滑筋細胞に見出される（Lewinsohn 1984; Nakos and Gossrau, 1994; Yu et al., 1994; Lyles and Pino, 1998; Jaakkola et al., 1999）。ＳＳＡＯ活性はまた、非血管型の平滑筋細胞におよび内皮細胞に検出された（Lewinsohn, 1984; Castillo et al., 1998; Jaakkola et al., 1999）。小量のＳＳＡＯタンパク質はまた、組織結合形態と比較して類似特性を示す血液中に見出される（Yu and Zuo, 1993; Yu et al., 1994; Kurkijaervi et al, 1998）。
【０００３】
多くの研究は、血漿中のＳＳＡＯ活性が、いくつかのヒトの状態、例えば心不全、アテローム性動脈硬化症および糖尿病で上昇することを実証した（Lewinsohn, 1984; Boomsma et al., 1997; Ekblom. 1998; Boomsma et al., 1999; Meszaros et al., 1999）。酵素活性のこれらの変化に横たわる機構は、現在特徴付けられていない。内生アミンオキシダーゼによって生産される反応性アルデヒドおよび水素ペルオキシダーゼが、心臓血管疾患の進行の原因となりまたは寄与し得ること、および糖尿病におけるＳＳＡＯ活性の阻害が血管合併症を減少させ得ることを示唆した（Ekblom, 1998）。
【０００４】
最近、ヒトＳＳＡＯのｃＤＮＡ配列が（Zhang and McIntire, 1996）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）であってリンパ細胞の、末梢リンパ節血管内皮細胞への結合を仲介することによってリンパ細胞再循環を知覚する（Smith et al., 1998;またＷＯ９８／５３０４９参照）ものと同一であることが見出された。ＳＳＡＯ／ＶＡＰ−１のｃＤＮＡ配列は、受託番号Ｕ３９４４７およびＮＭ  ００３７３４で寄託されている（配列番号１）。ＶＡＰ−１はまた、炎症性条件下で内皮細胞表面上で上方調節されることが見出された(Smith et al., 1998)。しかし、ＳＳＡＯの接着特性は、内皮細胞でのみ見出されたのみである。平滑筋細胞において、ＳＳＡＯはリンパ細胞の結合を支持しない（Jaakola et al., 1999）。ＤＮＡ配列分析、構造モデル化および実験データは、ヒトＳＳＡＯが、単一Ｎ末端膜横断(spanning)ドメインによって原形質膜にアンカー付けられている２つの９０−１００ｋＤａサブユニットからなるホモダイマー性糖タンパク質であることを示唆する（Morris et al., 1997; Smith et al., 1998; Salminen et al., 1998）。
【０００５】
組換え体哺乳動物ＳＳＡＯの精製、または天然起源からの、ほとんど均質の多量のヒトＳＳＡＯへの精製についてこれまで何ら報告は刊行されていない。１つの報告は、検出目的のための完全長ヒトＳＳＡＯのＮ末端へ融合されたＦＬＡＧペプチドの使用は記載したが、しかしヒトＳＳＡＯタンパク質の精製のためのその使用についての結果を提示されなかった(Smith et al., 1998)。モノクローナル抗体を使用して、小量のヒトＳＳＡＯを、イムノブロティングのために、血清および組織ホモジネートからイムノアフィニティ法で精製された(Smith et al., 1998; Kurkijaervi et al., 1998)。結果的に、有意な量のヒトＳＳＡＯの精製のための代替的方法の必要性がある。
【０００６】
Schistosoma japonicum由来のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、ホモダイマー細胞質性酵素であって、固定化コファクターグルタチオンを使用するアフィニティクロマトグラフィー、次いで還元性グルタチオン（ＧＳＨ）を使用する競合的溶出によって精製できるものである。この特異的相互作用の利益によって、E. coli細胞内発現のための遺伝子融合系が、Smithおよび共同研究者によって開発され（Smith & Johnson, 1998、またＷＯ８８／０９３７２参照）、ＧＳＴへ融合された組換え体タンパク質の検出および精製を容易化した。融合体パートナーとしてＧＳＴを使用することにともなう潜在的な欠点は、その表面上の遊離システインが、酸化的環境に曝露されたときに例えば融合される標的タンパク質上の遊離システインと架橋し得る可能性である。このリスクを最小化するため、そしてＧＳＴ融合タンパク質の分泌を可能とするため、ＧＳＴの突然変異体形態が最近開発され、これはホモダイマーを形成する能力および酵素活性の両方を保持する(Tudyka and Skerra, 1997)。ＧＳＴのホモダイマー化傾向を使用し、増加されたアビジチー効果のために、融合される標的タンパク質のダイマー化を喚起することができる(Tudyka and Skerra, 1997)。
【０００７】
文献に記載された代替的ホモダイマー性融合パートナーは、例えば免疫グロブリンのＦｃ領域（Hollenbaugh et al., 1992; Sakurai et al., 1998; Lo et al., 1998; Dwyer et al., 1999）およびロイシンジッパー、例えばＧＣＮ４（Rieker and Hu, 2000; Mueller et al., 2000）である。いくつかの種々のタンパク質が、種々の目的のため、例えばアビジチーを増加させるため（Dwyer et al., 1999; Muller et al., 2000)および途切れたＤＮＡ結合タンパク質の高アフィニティＤＮＡ結合を回復するために（Rieker and Hu, 2000）これらのホモダイマー性タンパク質ドメインに融合された。Ｆｃ融合タンパク質は、低ｐＨバッファーによる溶出に関係するタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーによって精製でき（Sakurai et al., 1998; Lo et al., 1998）、これは融合された標的タンパク質の活性を減少させ得る（Graeslund et al., 1997）。融合パートナーとしてＦｃを使用することに随伴するさらなる問題は、細胞生長のための血清の使用であって、これは分泌されたＦｃ融合物の検出および精製を複雑にし、なぜなら血清は多量の免疫グロブリンを含むからである（Skurai et al., 1998）。ロイシンジッパーＧＣＮ４は、E. coliにおいて発現されるタンパク質の融合パートナーとしてほとんど使用され（Mueller et al., 2000）、そしてアフィニティタグを融合し、精製を容易化しなければならない。
【０００８】
図面の簡単な説明
図１は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ  ＤＮＡ構築物の概略図である。ＧＳＴ融合パートナーにおける３つのシステインからセリンへの突然変異（GenBank受託番号Ｍ１４６５４を有する配列による残基８５、１３８および１７８）は、太字で示される。ボックスを付した配列は、３Ｃプロテアーゼの認識配列を示す。
図２は、ＳＳＡＯ精製プロセスの概観である。それぞれの精製工程について決定された特異的活性を示す。
図３は、ｐＭＢ８８７と命名されたＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターの該略図である。
【０００９】
発明の開示
本発明にしたがって、予測できないことに、可溶性ヒトＳＳＡＯが、可溶性ＳＳＡＯのダイマー化を可能とすることのできる融合パートナーを利用する精製系において、ミリグラム量で生産することができることが見出された。結果的に、第一側面では、本発明は融合タンパク質であって
（ｉ）ヒトＳＳＡＯの可溶性形態、
（ｉｉ）ＳＳＡＯのダイマー化を可能とする分泌可能融合パートナー、
（ｉｉｉ）宿主細胞からのポリペプチドの、培養培地への分泌を可能とするシグナルペプチド、および
（ｉｖ）ヒトＳＳＡＯ変異体および融合パートナーの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体構築物を提供する。
【００１０】
当業者に理解されるように、該組換え体構築物は所望により種々の長さのスペーサーアミノ酸配列をコードする１または２以上のヌクレオチド配列を含むことができる。そのようなスペーサー配列を使用し、融合タンパク質内のフレキシビリティーを増加させ、またはタンパク質ドメイン間のスペースを増加させ、その結果、隣接ドメインと独立に折り畳みが起こることができる。さらに、スペーサーは、導入された切断可能認識配列で切断するプロテアーゼの接近可能性を増加させるために有用であり得る。
【００１１】
ヒトＳＳＡＯの可溶性形態は、好ましくは、野生型ヒトＳＳＡＯの膜横断部分を欠く。ＳＳＡＯポリペプチドの膜横断部分は、当業界で知られ（Morris et al., 1997; Holt et al., 1998; Smith et al., 1998）、そして配列番号２のアミノ酸５ないし２７、特にアミノ酸６ないし２６に本質的に示す。
【００１２】
ヒトＳＳＡＯのアミノ酸配列は、膜横断部分を除き、配列番号２の２９位ないし７６３位を好ましくは含み、または本質的にそれからなる。しかし、当業者は、膜横断部分の一部が該ＳＳＡＯポリペプチドを、該ポリペプチドがなおもその本質的に可溶性の特性を維持しつつ、含み得ることを理解する。結果的に、ヒトＳＳＡＯのアミノ酸配列は、配列番号２の例えば２７ないし７６３位、または２８ないし７６３位を含み、ヒトＳＳＡＯの生物学的活性を実質的に有するそれらのフラグメントを含む。さらに、用語「ヒトＳＳＡＯポリペプチド」は、酵素的活性またはタンパク質相互作用（例えば接着機能）を保持した、または構造的研究を容易化するように設計された（例えば結晶化について改善された特性）、または構造／機能関連性の研究を容易化するように突然変異させた（これはまた不活性突然変異体を含む）、ヒトＳＳＡＯの突然変異体および天然に存在する変異体を含むことを意図する。
【００１３】
該融合パートナーを、ヒトＳＳＡＯポリペプチドのＣ末端またはＮ末端部分に融合することができる。該融合タンパク質は１より多い融合パートナー、例えばＳＳＡＯの、Ｎ末端に融合するもの、およびＣ末端に融合するものを含み得ることを認識する。追加的融合パートナーは、追加的アフィニティタグ、またはレポータータンパク質、例えば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）であり得る。
【００１４】
多数の種々の遺伝子融合システムおよび融合パートナーが記載された。そのようなシステムでは、相互作用の種々の型、例えば酵素−基質、細菌レセプター−血清タンパク質、ポリヒスチジン−金属イオン、および抗体−抗原が利用された（Uhlen et al., 1992）。アフィニティ精製のための種々の遺伝子融合システムは、当業界で知られる。そのようなシステムで使用される融合パートナーの例は（概説のために、例えばNilsson et al., 1997;またはSheibani, 1999）、スタフィロコッカスプロテインＡおよびその誘導体Ｚ；スタフィロコッカス性プロテインＡ由来のアルブミン結合タンパク質；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；ポリヒスチジンタグ；ビオチニル化アフィニティタグ（例えばBiotin Avi Tag）；E. coliマルトース結合タンパク質；セルロース結合ドメイン；ＦＬＡＧペプチド；およびStrep-タグを含む。代替的なシステムは、新規リガンドレセプターの生成のため、タンパク質骨格を使用して改変し得る（Skerra, 2000およびそこの引用参照）。これらの新規結合タンパク質、例えばアフィボディはそして、種々の応用のための融合パートナーとして有用であり得る（Nygren and Uhlen, 1997; Nord et al., 1997)。
【００１５】
本発明にしたがって、当該融合パートナーは、ＳＳＡＯのダイマー化を可能とするものとする。好適な融合パートナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であり、なぜならそのダイマー化する傾向のためであり、および精製処理が、固定化グルタチオン（例えばAmersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を含むクロマトグラフィー媒体を使用する温和な条件下で実施される可能性があるからである。加えて、ＧＳＴはその酵素活性によってまたはＧＳＴ特異的抗体またはグルタチオンの使用によって、商業的に利用可能なＧＳＴ検出システム（例えばAmersham Pharmacia Biotech)を使用して、簡便には検出することができる。該融合パートナーはまた、ダイマー化の保持された傾向を有する、かつアフィニティ精製を可能とする結合特性を有する、ＧＳＴの機能的に同等な変異体であり得る。当該融合パートナーは、より好ましくは、S. japonicum GST（GenBank受託番号Ｍ１４６５４；配列番号３および４）の変異体であって、宿主細胞からの分泌のために設計され、８５、１３８および１７８位の、１または2以上の、そのシステイン残基が他のアミノ酸残基（複数もある）で置換されたものである。最も好ましくは、当該変異体は、８５、１３８および１７８位のシステイン残基の全てがセリン残基で置換されたものである（Tudyka & Skerra, 1997および配列番号５参照）。
【００１６】
加えて、当該組換え体構築物は、当該融合タンパク質の、宿主細胞から培養培地ヘの分泌を可能とするＮ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものとする。真核細胞におけるヒトタンパク質、例えばＳＳＡＯの生産のために、ホモロガスシグナルペプチドが好ましい。ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＳＡＯ生産のために、例えばマウスＩｇＧ１重鎖シグナルペプチド（Kabat et al., 1991）を使用し得る。他の好適なシグナルペプチドが当業界で知られ、そして例えば前掲のKabat et alに記載される。
【００１７】
幾つかの方法は、化学的物質、例えばＣＮＢｒまたはヒドロキシルアミン、または酵素例えばエンテロキナーゼ、Ｘａ因子、トロンビン、ズブチリシンまたは他のプロテアーゼ（例えばNilsson et al. (1997)およびそこの引用参照）での処理に基づく融合タンパク質の部位特異的切断のため記載された。本発明にしたがって、当該融合パートナーは、簡便には、プロテアーゼ切断によってヒトＳＳＡＯから除去することができる。切断のために使用すべきプロテアーゼは例えば、ピコルナウイルス科由来の３Ｃプロテアーゼ、例えばライノウイルスまたはエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼ（Walker et al., 1994）であることができる。結果的に、好ましくはプロテアーゼ切断部位は、ピコルナウイルス科由来の３Ｃプロテアーゼ、例えばライノウイルスまたはエンテロウイルス３Ｃプロテアーゼのための切断部位であることができる。本発明の１つの例示的形態では、当該３Ｃプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）を含む。しかし、当業者は、他の好適な切断部位を同定することができ、例えばBlom et al. (1996)およびそこの引用参照。
【００１８】
本発明にしたがう組換え体構築物は、例えば図１に示すアミノ酸配列を本質的にコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、本発明に従う組換え体構築物を含む、標準的方法にしたがって調製した発現ベクターを提供する。そのような発現ベクターは、ｐＭＢ８８７と呼ばれる発現ベクターによって例示され、図3に示す。
【００１９】
さらなる側面では、本発明は、組換え体ヒトSSAOポリペプチドの精製の方法であって、
（ｉ）前に定義したように、本発明の発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、
（ｉｉ）当該細胞を、ベクターによって発現される融合タンパク質が細胞培地へ分泌されることを可能とする条件下で培養すること、
（ｉｉｉ）得られた融合タンパク質を、該融合パートナーに対してアフィニティを有するリガンドを含む培地へ結合させること、
（ｉｖ）当該融合パートナーおよび該ＳＳＡＯポリペプチドを分離すること、および
（ｖ）精製したヒトＳＳＡＯポリペプチドを回収すること
の工程を含む方法を提供する。
【００２０】
該融合パートナーは、融合タンパク質がなおアフィニティリガンドに付着されているとき、または該融合タンパク質が該アフィニティリガンドから開放されたときのいずれかのとき、ヒトＳＳＡＯ変異体から分離することができる。当該融合パートナーが、ＧＳＴである場合、該融合パートナーに対してのアフィニティを有する当該リガンドは好ましくは、グルタチオンまたはその誘導体である。あるいは、ＧＳＴ抗原処理された抗体をアフィニティリガンドとして使用し得る。
【００２１】
前記の様に、該融合パートナーを、例えばピコルナウイルス、例えばライノウイルス、３Ｃプロテアーゼでのプロテアーゼ切断によってヒトＳＳＡＯから分離することができる。当該プロテアーゼを、融合パートナーに融合し、それによって「融合プロテアーゼ」を得ることができる（Walker et al., 1994; Graeslund et al., 1997）。そのような融合パートナーは簡便には、ＳＳＡＯポリペプチドのために使用したのと同じ融合パートナー、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼであることができる。しかし、プロテアーゼのための他の好適な融合パートナー、例えばストレプトコッカス性プロテインＧ由来のアルブミン結合タンパク質は、当業界に既知であり、例えばGraeslund et al., 1997参照。当該融合プロテアーゼを、該融合プロテアーゼを当該融合パートナーに対してのアフィニティを有するリガンドを含む培地ヘ結合することを含む方法によって分離することができる。結果的に、該融合パートナーはＧＳＴであるとき、当該リガンドは好ましくはグルタチオン、またはその誘導体である。前記の様に、該融合パートナーに指向された抗体はまた、アフィニティリガンドとして使用し得る。商業的に利用可能なシステムは、PreScission Protease(Amersham Pharmacia Biotech,)であり、これはS. japonicum GSTおよびヒトライノウイルス３Cプロテアーゼからなる遺伝的に改変された融合タンパク質である。
【００２２】
ある種の適用のために、SSAOを固定化するのが有利であり得る。これは、例えばアフィニティタグ、たとえば前記のようなGSTによって達成し得る。融合タンパク質がアフィニティタグを介して固定化される場合の適用の例は、タンパク質リガンドの捕捉、タンパク質−タンパク質相互作用の分析、およびバイオリアクターにおける使用を含む（Nilsson et al., 1996; Nord et al., 1997; Shpigel et al., 1999）。しかし、タンパク質の固定化のための多くの代替的方法が記載され（例えばTischer and Kasche, 1999およびそこの引用参照）、それはまた、融合パートナーの除去後ＧＳＴ−ＳＳＡＯまたはＳＳＡＯの固定化、例えば共有結合および非共有吸着のために適用可能であり得る。加えて、ＳＳＡＯタンパク質はまた、ゾル−ゲルまたは人工的細胞、例えばリポソームにカプセル化し得る（例えばLiang et al., 2000およびそこの引用参照）。
【００２３】
アフィニティタグ、たとえばＧＳＴによる一つの利益は、例えば細胞ライセートから直接的に、しばしば１工程処理によって、指向化固定化を達成できることである。これは、活性結合部位のよい空間的配置接近可能であることおよび安定性の増加と言う結果となり得る(Saleemuddin, 1999; Turkova, 1999)。タンパク質の固定化のために使用されてきた代替的なアフィニティタグのアプローチの1例は、例えば、ビオチンリガーゼによって特異的にビオチニル化され、そしてビオチンおよびストレプトアビジンまたはアビジンの間の非常に強い相互作用（Ｋｄ〜１０−１５）を利用する融合パートナーとして使用できるペプチドおよびタンパク質（Nilsson et al., 1997）、および特異的にセルロースに結合するＣＢＤである（Linder et al., 1998; Tomme et al., 1998）。タンパク質の指向化固定化はまた、タンパク質を結合する固定化された抗体を使用することによって、またはタンパク質表面上に存在し得る炭水化物部分を介して達成し得る（Turkova, 1999）。
【００２４】
最近、エンドウ実生からのアミンオキシダーゼが、修飾されたカーボンペーストを使用して固定化され、生物発生性および合成アミンの定量のためのバイオセンサーを得られた（Wimmerova and Macholan, 1999）。同様に、組換え体ヒトＳＳＡＯを、バイオセンサーの構成のために固定化し、例えば、産業的有機性工程において使用され、そしてＳＳＡＯのための基質である、心臓血管毒素アリルアミンを検出し得る（Boor and Hysmith, 1987; Conklin et al., 1998）。固定化された場合、組換え体ＳＳＡＯは、膜アンカー型であるＳＳＡＯおよび、可溶性状態と異なり得るその特性を模倣し得ることを想起し得る。
【００２５】
結果的に、以下の例に示されるように、本発明は、酵素的活性を伴う高度に精製された可溶性組換え体ヒトＳＳＡＯの生産のための手法を提供する。例示された手法は、アフィニティ融合パートナーとして、宿主細胞からの輸送のために設計された（Tudyka and Skerra, 1997）、S. japonicumグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からの突然変異体の使用に関係する。融合タンパク質を、哺乳動物細胞から分泌させ、そしてグルタチオン−アフィニティクロマトグラフィーによって培養培地から直接的に精製し得る。特異的タンパク質分解および追加的グルタチオン−アフィニティクロマトグラフィー工程によって、該融合パートナーおよびプロテアーゼを除去し、それによって純粋な、可溶性且つ高度に活性の組み換え体ヒトＳＳＡＯタンパク質を、ミリグラム量で得た。発明者らの知識では、ヒトＳＳＡＯタンパク質の可溶性形態の、活性の組換え体が生産され、そしてほとんど均質に精製されたのはこれが最初である。
【００２６】
組換え体ヒトＳＳＡＯの生産のために開示された方法は、他の哺乳動物アミンオキシダーゼ、例えばヒト胎盤ジアミンオキシダーゼ(Zhang et al., 1995)およびヒト網膜特異的アミンオキシダーゼ（Imamura et al., 1998）、並びに他の分泌可能タンパク質にまた適用可能であることと信じる。開示の方法はまた、修飾の発見および同定、例えば活性部位コファクターの同定を、例えばコファクターを含有するペプチドの単離によって、または結晶構造決定によって容易化し得る。
【００２７】
以下の例において、ＳＳＡＯが活性かつ可溶性で、膜貫通（transmembrane）領域を欠くこと、およびＧＳＴをタンパク質分解的に除去することができることが示された。これらの発見は、ＳＳＡＯが膜貫通領域付近でのタンパク質分解性切断によって循環中に放出される（shedding）仮説である、Ｉ型およびＩＩ型膜タンパク質について一般的であるプロセスを支持する。例えば糖尿病において血漿中、上昇したＳＳＡＯ活性（Boomsma et al., 1999）はこうして、膜アンカー型であるＳＳＡＯを切断するプロテアーゼの増加したタンパク質分解活性の、または存在するプロテアーゼのための基質利用可能性を増加させる表面局在化の増加の結果であり得る。
【００２８】
特に定義しない限り、ここで使用するすべての技術的および具体的用語は、本発明の属する当業界での通常の技術を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。好適な方法および材料は以下に記載するが、ここに記載のものと類似または同等の方法および材料はまた、本発明の実施化または試験において使用できる。すべての刊行物、特許出願、特許およびここに言及する他の引用は、引用によりその全体をここに含める。矛盾がある場合には、定義も含めて本明細書の記載が優先する。加えて、材料、方法および例は、例示のみであり限定することを意図しない。本発明の他の特徴および有利性は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明かとなるであろう。
【００２９】
実験方法
大動脈ｃＤＮＡからのヒトＳＳＡＯ遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニング
２種のＰＣＲプライマーを、ヒト胎盤アミンオキシダーゼの公開されたｃＤＮＡ配列（GenBank受託番号Ｕ３９４４７; Zhang and McIntire, 1996）の助けによって設計した。５’プライマーＸＮＱＺ−１５（５’―CCG GAA TTC CAA CGC  GTC CAT GAA CCA GAA GAC AAT CCT CGT G―３’、配列番号７）を、ＡＴＧ開始コドンを含むＳＳＡＯコード配列の５’末端にハイブリダイズし、かつクローニングのための制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩとｍｌｕＩを含むように設計した。３’プライマーＸＮＱＺ−１７（５’―CCC CCA AGC TTG TCG ACT CAC TAG TTG TGA GAG AGA AGC CCC CCC―３’；配列番号８）を、本来の停止コドンＴＡＧ次いで追加的な停止コドンＴＧＡおよび、クローニングのための２つの制限酵素切断部位であるＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含む、３’末端にハイブリダイズするように設計した。ＰＣＲのためのテンプレートとして、０．５μｌのヒト大動脈およびヒト平滑筋細胞QUICK-Clone ｃDNA（１ｎｇ／μｌ、Clontech Laboratories, Palo Alto, CA)を試験した。以下の条件すなわち５０μｌの総体積中、２０ｐモルのそれぞれのプライマーＸＮＱＸ−１５およびＸＮＯＺ−１７、１μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）、１μｌのAdvantage cDNA cDNA Polymerase Mix(Clontech)、５μｌの１０ｘcDNA PCR反応バッファー（Clontech）をＰＣＲ反応のために使用した。増幅をPerkin-Elmer 2400サーモサイクラー(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)で実施した。ＰＣＲプログラムは、９４℃５分間の当初変性、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間および７２℃３分間の３５サイクル、次いで７２℃３分間での最終伸長からなる。ＴＡクローニングを次いで使用し、該ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ(Invitrogen, Carlsbad, CA)に挿入した。クローニングしたＰＣＲフラグメントを、色素ターミネーターサイクル配列決定についての標準的プロトコルにしたがって両方の方向で配列決定し、そしてＤＮＡ配列決定機ＡＭＩ３７７(Applied Biosystems, Foster City, CA)で分析した。
【００３０】
哺乳動物細胞におけるＳＳＡＯの発現のためのベクターの構築
完全なＳＳＡＯタンパク質の哺乳動物細胞における発現のためのベクターを、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ−ＳＳＡＯベクターからのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩフラグメントの、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega, Madison, WI）への挿入によって調製し、ベクターｐＭＢ８４３を得た。このベクターを、ヒトＳＳＡＯの残基２９−７６３に対応する領域のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した（Zhang and McIntire, 1996）。５’プライマー５’―GAG GAA GCT TTG TTC CAA GGT GGA GAT GGG GGT GAA―３’（配列番号９）を、３Ｃプロテアーゼ切断部位（以下参照）の一部についてのコドンおよび残基２９についてのコドンの上流のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を含むように合成した。３’プライマー５’―GCA TTC TAG TTG TGG TTT GTC―３’（配列番号１０）は、クローニングしたＳＳＡＯフラグメントの下流にアニーリングするｐＣＩ−ｎｅｏベクター特異的プライマーである。得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化しそしてプラスミドｐＥＴ３８ｂ（＋）(Novagen, Inc., Madison, WI)にクローニングし、同じ酵素で切断し、ｐＥＴ３８−ＳＳＡＯを得た。ＤＮＡ配列決定を、前記の様に実施し、クローニングしたＳＳＡＯフラグメントの予測された配列を確認した。
【００３１】
組換え体タンパク質のための分泌可能な酵素的に活性のダイマー化モジュールとして以前使用したS. japonicumからのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の突然変異形態（配列番号５）（Tudyka and Skerra, 1997）を、ＰＣＲ仲介突然変異誘発、そして以下に記載のようにフラグメントのアセンブリによって調製した。突然変異を実施し、S. japonicum GST(Lim et al., 1994; Tudyka and Slerra, 1997)の結晶構造中に表されたようなＧＳＴタンパク質表面付近に位置する３つのシステイン残基８５、１３８および１７８をセリン残基で置換し、酸化的環境ヘのＧＳＴ融合タンパク質の輸送後の、望ましくないジスルフィド形成を回避した（Tudyka and Skerra, 1997）。以下のＰＣＲプライマーを使用し、突然変異ＧＳＴを構築し、３Ｃプロテアーゼ切断部位の第一の部分（以下参照）並びにクローニングのための好適な制限酵素切断部位を導入した。加えて、該プライマーは、コントロール切断のため、およびライゲーションによってＰＣＲフラグメントをアセンブルする可能性のため、内部制限部位を導入する：ＲＯＥＬ−１（５’―GCC GGA ATT CGA CGC GTC CCC TAT ACT AGG TTA TTG G―３’；配列番号１１）は、クローニングのためのＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩを含み、そしてＧＳＴ（Ｍ１４６５４）のコドン２−８にアニーリングする；ＲＯＥＬ−２（５’―CTC TGC GCG CTC TTT TGG AGA ACC CAA CAT GTT GTG C―３’；配列番号１２）は、ＢｓｓＨＩＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−３（５’―GGT TCT CCA AAA GAG CGC GCA GAG ATT TCA ATG CTT GAA G―３’；配列番号１３）は、ＢｓｓＨＩＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−４（５’―ATG AGA TAA ACG GTC TTC GAA CAT TTT CAG CAT TTC―３’；配列番号１４）は、ＢｂｓＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−５（５’―GTT CGA AGA CCG TTT ATC TCA TAA AAC ATA TTT AAA TGG TGA TC―３’；配列番号１５）は、ＢｂｓＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−６（５’―AAA AGA AAC TAG TTT TGG GAA CGC ATC CAG GCA―３’；配列番号１６）は、ＳｐｅＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−７（５’―CCC AAA ACT AGT TTC TTT TAA AAA ACG TAT TGA AGC TAT C―３’；配列番号１７）は、ＳｐｅＩ部位を含む；ＲＯＥＬ−８（５’―ACC CAA GCT TCC TGA CTT TGT GAC TTT GGA GGA TGG TCG CCA CC―３’；配列番号１８）は、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩを含みＧＳＴ（Ｍ１４６５４）のコドン２１２−２１８にアニールする。ＲＯＥＬ−８はまた、部分的３Ｃプロテアーゼ切断部位の前にスペーサー−配列ＳＱＳＱのためのコドンを導入するであろう。ＧＳＴ遺伝子のオーバーラッピング部分を別個のＰＣＲ反応で、プライマー対ＲＯＥＬ−１／２、ＲＯＥＬ−３／４、ＲＯＥＬ−４／５およびＲＯＥＬ−７／８で、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−２(Amersham Pharmacia Biotech)をテンプレートとして使用して増幅する。これにより、完全な突然変異ＧＳＴ遺伝子を得、これら４種のＰＣＲフラグメントを混合すること、およびこれらをテンプレートとして、プライマーＲＯＥＬ−１およびＲＯＥＬ−８でのＰＣＲ反応において使用することによってアセンブルした。該ＰＣＲ反応を、Advantage cDNA PCR Kit(Clontech)を使用して実施した。次の工程では、ＧＳＴフラグメントをＲｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｐＵＣ１８（Amersham Pharmacia Biotech)の同じ部位にクローニングし、ｐＭＢ８０９を得た。ＤＮＡ配列決定を、前記の様に実施し、突然変異ＧＳＴフラグメントの予測された���列を確認した。ｐＭＢ８０９ベクターを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてＧＳＴフラグメントを単離し、そして同じ酵素で切断されたｐＥＴ３８−ＳＳＡＯベクター中のＳＳＡＯフラグメントの上流にクローニングした。この工程により、ＧＳＴとＳＳＡＯの間の（残基２９−７６３）ヒトライノウイルス１４およびコクサッキーウイルス（Miyashita et al., 1996; Wang et al., 1997)の、完全な３Ｃプロテアーゼ切断部位ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）の創出と言う結果となった（図１参照）。
【００３２】
ＧＳＴ−ＳＳＡＯフラグメントを、ベクターｐＭＢ５６５のＭｌｕＩとＳａｌＩ部位にクローニングし、ここにマウスＩｇＧ重鎖の突然変異シグナル配列（図１）を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Promega)の多重リンカー中にクローニングする。得られたＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターを、ｐＭＢ８８７と命名する（図３）。
【００３３】
安定クローンのトランスフェクションおよび選択
３種の２５ｃｍ２Ｔフラスコに約４ｘ１０５ヒト胚腎臓２９３細胞（HEK293細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３, Rockville, MD）を播種した。細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補足したDulbeccoの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む増殖培地で５０％までコフルエントに増殖させた。このＦＢＳを５６℃３０分間熱不活性化し次いで、増殖培地成分と混合した。発現ベクターｐＭＢ８８７を次いで、製造者の推奨にしたがってLipofectAMINEを使用して（Life Technologies, Frederick, MD）リポソーム仲介トランスフェクションによって細胞に導入した。４８時間の増殖後、安定的にトランスフェクトした細胞の選択のために、培地を１ｍｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇ４１８）で補足した増殖培地に、全てのフラスコで培地を交換した。約２週間後、抵抗性細胞が出現し、そしてコフルエントに増殖させた。３つのＴフラスコからの細胞をプールし（クローンの混合物）、そして１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補足した増殖培地中に希釈し、そして１５ｃｍペトリ皿に播種した。個別のコロニーが２週間後に出現し、そしてＧＳＴ−ＳＳＡＯ生産の次の分析のために個別に拡張させるべくつまみ出した。拡張したクローンからの、収集した培地中のＧＳＴタンパク質の検出を、ＧＳＴ  ９６ウェル検出モジュール（Amersham Pharmacia Biotech)を使用して実施した。７この陽性クローンを選択および凍結した。
【００３４】
Cell Factory中のＧＳＴ−ＳＳＡＯの生産
クローン番号１０を拡張させ、そして５％ＦＢＳ（熱不活性化）、２ｍＭのＬグルタミンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補足したＤＭＥＭを含む増殖培地中で培養し、そして使用して、１５００ｍｌの増殖培地を含む６３２０ｃｍ２のNunc Cell Factory(Nalge Nunc Int., Naperville, IL)に播種し、３７℃で増殖させた。４日の増殖後、細胞はコフルエントになり、そして培地を収集した。新しい増殖培地（１５００ｍｌ）と減少した量のＦＢＳ（２％）を次いで、同じCell Factory中の細胞に添加し、次いで３日後に調質した培地を収集した。この処理を１回反復し、１つのCell Factoryから４．５リットルまでの総量の収集した培地を得た。収集した培地を遠心分離しそして−７０℃で貯蔵した。
【００３５】
調質した細胞培地の濃縮
２つのCell Factory（９．４リットル）からの凍結した調質した培地を、３０℃のウォーターバス中で融解した。材料を、Centramate超ろ過装置(Pall Filtron, Northborough, MA）を使用して、Omega膜（MWCO(Molecular-Weight Cut-Off)10000)を経由してポンプし、６００ｍｌの体積を達成した。濃縮水を０．６５μｍのプレフィルター（Sartorius, Goettingen, Germany）を備えた、０．４５μｍフィルターであるSartobran Pを経由してろ過した。管系中の残りの濾液を、２５０ｍｌのリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ）によって置換し、８５０ｍｌのろ過サンプルを得た。
【００３６】
ＧＳＴ−ＳＳＡＯの精製および切断
ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質を、１０カラム体積のＰＢＳで平衡させた、８ｍｌのグルタチオン−セファロース４Fast Flow（１０ｍｇまでのGST／ｍｌゲルを結合する、Amersham Pharmacia Biotech）を充填したHR10/10カラム（Amersham Pharmacia Biotech)においてグルタチオンアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ろ過した材料（８５０ｍｌ）を、室温で終夜０．９ｍｌ／分で負荷した。フロースルー材料を、分析のために収集し、そして−２０℃で貯蔵した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、結合したタンパク質を溶出緩衝液で溶出させた（２０ｍＭのＧＳＨ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２）。
【００３７】
溶出液をヘリウムを散布した切断可能緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５℃）で平衡させたHiPrep Desalt 26/10カラム（Amersham Pharmacia Biotech)に負荷し、そしてタンパク質ピークを収集した。切断を、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５ｍＭまでおよび３８０単位のPreScissionプロテアーゼ（Amersham Pharmacia Biotech)を添加することによって開始させた。PreScission ProteaseはＧＳＴおよびヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼからなる遺伝的に改変された融合タンパク質であり、そしてその認識配列のＧｌｎ（Ｑ）およびＧｌｙ（Ｇ）残基の間を特異的に切断する。
【００３８】
該切断混合物を、５℃でインキュベートした。６３時間のインキュベーション後、この材料を、切断緩衝液で平衡させたグルタチオン−セファロースカラムに前記の様に負荷した。貫流液（３６ｍｌ）を収集し、そして５℃で約１週間開管中で貯蔵した。サンプルをとりだし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元性）によって分析した。カラムに捕捉したタンパク質を、分析のために溶出緩衝液で溶出させた。収集したタンパク質サンプルを、緩衝液交換および濃縮のために、JumboSep装置（MWCO 30000, Pall Filtron)に適用した。遠心分離および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液での希釈の５サイクルを実施した。サンプルを種々の分析のためにとった。緩衝液交換および濃縮された材料（４．２ｍｌ）を次いで、−７０℃で貯蔵した。
【００３９】
タンパク質分析
ＳＳＡＯの精製およびサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サンプルを、勾配性ゲル４−２０％または４−１２％（Novex, Copenhage,Denmark）において、２−メルカプトエタノールの存在下または不存在下で電気泳動し、そしてタンパク質をクマシー染色（PhastGel Blue R, Amersham Pharmacia Biotech）によって可視化した。タンパク質濃度を、製造者の指示にしたがって、標準としてウシ血清アルブミンにより、９６ウェルプレートにおけるCoomassie Plus proteinアッセイ試薬キット（Pierce, Rockford, IL）で決定した。
【００４０】
サイズ排除クロマトグラフィーを、SMART System(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、Superdex 200 PC 3.2/30カラム(Amersham Pharmacia Biotech)において実施した。カラムを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのｎａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファーで室温で平衡化させた。注入容量は、１０μｌであり、そしてサンプルを、０．１ｍｌ／分の流速で溶出させた。カラムキャリブレーション分子量マーカーのため、Gel Filtration HMW Calibration Kit(Amersham Pharmacia Bioech)からの、Blue Dextran 2000(〜２０００ｋＤａ）、チログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋＤａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）およびアルドラーゼ（１５８ｋＤａ）を使用した。
【００４１】
Ｎ末端配列決定を、精製ＧＳＴ−ＳＳＡＯおよびＳＳＡＯについて、HP 1090 PTH分析器（Hewlett Packaed, Palo Alto, CA）に結合されたHP G1000Aタンパク質シーケンサーを使用する反復されたエドマン分解によって実施した。ＧＳＴ−ＳＳＡＯサンプルを脱塩し、分析前にグルタチオンを除去した。ＳＳＡＯを、切断後のグルタチオン−セファロースカラムのフロースルーより取得した。
【００４２】
Holtおよび共同研究者（Holt et al., 1997）によって記載されたモノアミンオキシダーゼのためのスペクトロフォトメトリックアッセイを使用し、種々の精製工程からのサンプル中のアミンオキシダーゼ活性を決定した。アッセイを、SPECTRAmax 250マイクロプレートスペクトロフォトメーター(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)において３７℃でインキュベートされた９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。０．２のリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）中に、１ｍＭのバニリン酸(Sigma, St. Louis, MO)、５００μＭの４−アミノアンチピリン(Sigma)、および４Ｕｍｌ−１のペルオキシダーゼ（ホースラディッシュ由来のＶＩ型、Sigma)を含む試薬ミックスを調製し、同じ日にアッセイを実施し、使用まで５℃で保持した。反応を、５０μｌのサンプル、５０μｌの試薬ミックスおよび２００μｌのリン酸カリウムバッファーであって７５０μＭのベンジルアミンヒドロクロリド（Sigma)を有するまたは有しないものを混合することによって開始させ、そして３反復で実施した。ブランク参照値を取得するため、ウェルを、サンプルの代わりにバッファーを加えて分析した。吸光度の変化を、１０−４０分にわたり４９０ｎｍで追跡した。標準曲線を、Ｈ２Ｏ２のストック溶液の、１０ｎｍ／ウェルないし１２０ｎｍｏｌ／ウェルの範囲の、リン酸カリウムバッファー中による希釈によって調製した。阻害実験を実施したとき、サンプルを、ベンジルアミン溶液の添加の前に、３７℃で３０分間３００μＭのセミカルバジド中でインキュベーションした。
【００４３】
発明をここで、以下の実施例を参照することで説明する。これらは発明を例示することのみ意図し、そしてとにかく発明の範囲の限定として考察すべきではない。
【００４４】
実施例
実施例１：ＳＳＡＯ  ｃＤＮＡのクローニング、
ＰＣＲ戦略を、ヒト大動脈由来のヒトＳＳＡＯの遺伝子を増幅するために使用した。該ＰＣＲプライマーを、ヒト胎盤アミンオキシダーゼ遺伝子に隣接する配列（Zhang and mcIntire, 1996）を含ませ、かつ種々の発現ベクターへのクローニングのための制限酵素切断部位を含むよう設計した。〜２３００ｂｐのＰＣＲ生成物をクローニングし、そして引き続くＤＮＡ配列決定は、該クローニングしたＰＣＲ産物が、ヒト胎盤アミンオキシダーゼ配列（Zhang and McIntire, 1996）に、および肺ｃＤＮＡからクローニングされたＶＡＰ−１配列（Smith et al., 1998)に同一であることを示した。
【００４５】
実施例２；膜に結合したＳＳＡＯの精製（比較例）
組換えＳＳＡＯタンパク質を生産するための試みは、ヒトＳＳＡＰタンパク質の完全コード配列がクローンニングされているｐＭＢ８４３を使用して、活性ＳＳＡＯがヒト肺腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞中で生産され得ることを示した。活性タンパク質が、可溶化剤を使用する抽出後見出されたが、マイクログラム量のみのタンパク質が部分的に精製された。
【００４６】
実施例３：ＳＳＡＯの可溶性形態の発現のための遺伝子構築物の理論的解釈および設計
代替的な戦略を、哺乳動物細胞における非膜結合性ＳＳＡＯの生産のため開発した。精製および検出を、推定膜横断ペプチドを含むＮ末端領域を、固有ダイマー化傾向を有するアフィニティ融合パートナーで置換することによって実施した。該戦略はまた、培養培地へ該融合パートナーを分泌することができるための分泌可能アフィニティ融合パートナーの使用に関係した。S. japonicumグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の突然変異性変異体を選択した。この突然変異体ＧＳＴは、その活性並びにダイマー化する傾向を有し、そして分泌のため最適化された（Tudyka and Skerra, 1997）。
【００４７】
精製ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質からのＳＳＡＯの放出を可能とするように、プロテアーゼ切断部位を設計した。予測されたアミノ酸配列のスキャンによって、３つのグリシン残基によって隣接された２８位のアルギニンが明かとなった。いくつかのヒトプロテアーゼは、塩基性残基の後で切断し（Carter, 1990; Hooper et al., 1997）、およびグリシン残基の短いストレッチは、プロテアーゼヘの感受性を高めることが示唆された（Carter, 1990）。加えて、多くの膜アンカータンパク質の細胞外領域の、血流へのタンパク質分解的放出（shedding）は、その膜の近くで起こる（Hooper et al., 1997）。２９位のグリシン残基はしたがって、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の精製後、部位特異的タンパク質分解のために好適な基質へ連結するように選択した。こうして、Ｐ１’位のグリシンを有する、かつ高い特異性を有する基質を切断できるプロテアーゼが望まれた。いくつかの商業的プロテアーゼは、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼおよび３Ｃプロテアーゼのようなこれら２つの特性を有して存在する(Nilsson et al., 1997)。切断後プロテアーゼを容易に捕捉する能力は、考えられる別の因子であり、ＧＳＴへ融合された商業的に入手可能な３Ｃプロテアーゼの選択へとつながった。該３Ｃプロテアーゼ切断部位ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）(Miyashita et al., 1996; Wang et al., 1997)を、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合構築物に導入した（図１）。
【００４８】
ＧＳＴ−ＳＳＡＯフラグメントを、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の、培養培地への分泌を達成するためのシグナル配列とともにインフレームでクローニングした。マウス抗体の重鎖由来のシグナル配列を使用した（図１参照）。最終的な構築物（配列番号１９および２０）は、こうして、抗体シグナルペプチド、１８アミノ酸スペーサー領域、突然変異性ＧＳＴタンパク質、３Ｃプロテアーゼのための基質配列およびヒト大動脈ｃＤＮＡからクローニングされたヒトＳＳＡＯタンパク質の残基２９−７６３を含む融合タンパク質をコードした（図１）。非修飾ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の計算された分子量は、１１２ｋＤａである。
【００４９】
実施例４：ＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの調質された培地上での当初の分析
ＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターｐＭＢ８８７で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の小規模の培養からの調質培地におけるベンジルアミンオキシダーゼ活性は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯが培養培地中に分泌されたことを示した。更なる分析は、グルタチオン−セファロースビーズを使用して、調質培地から直接的に小量のＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質を精製し得ること（データ示さず）、そして精製された剤濾うはベンジルアミンオキシダーゼ活性を有することが、示された。興味深いことに、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質が、グルタチオン−セファロースビーズ上に固定化されたとき、活性であることが見出された。調質培地中のＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の量は、ビーズ上に捕捉されたタンパク質の量の評価によって、〜１ｍｇ／Ｌであると計算された。
【００５０】
実施例５：ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の分取精製および部位特異的切断
アフィニティ精製に基づく手法の概略は、図２に示す。精製の結果は、表１にまとめる。１つの選択されたクローンは拡張し、そしてCell Factriesで生長し、より多量の、精製のためのＧＳＴ−ＳＳＡＯを生成した。収集した調質された培地を濃縮およびろ過し、グルタチオン−セファロースカラム上に負荷するための時間を減少させた。次いで、グルタチオン−アフィニティクロマトグラフィーを、濃縮およびろ過した調質された培地からＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質を精製するため適用した。カラム上に捕捉されたタンパク質を、２０ｍＭ  ＧＳＨで溶出させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件で分析した。これは、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質が高純度を有すること、および単一の工程で培養培地中の多量の他のタンパク質から単離し得ることを示した。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質は、分子量マーカの１１６ｋＤａタンパク質とのレベルで移動した。全８．８ｍｇのタンパク質を、グルタチオン−セファロースカラムから回収した。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の特異的活性は、３４３ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１であると決定された。興味深いことに、特異的活性は、還元剤ＧＳＨを除去するバッファー交換工程によって、ほとんど２倍であった（６３４ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１）。
【００５１】
グルタチオンアフィニティ精製されたＧＳＴ−ＳＳＡＯを、ＧＳＴ−３Ｃプロテアーゼ融合タンパク質（４６ｋＤａ）で切断し、ＳＳＡＯからＧＳＴ融合パートナーを除去した。分析的実験は、切断がゆっくりだが正確であり、観察可能な副産物がないことを示唆した。さらに、完全な切断が、〜４８時間インキュベーション後に取得され得る。切断混合物をグルタチオンセファロースカラムに通過させ、除去されたＧＳＴ融合パートナーおよびＧＳＴ−３Ｃプロテアーゼを捕捉した。フロースルー材料を収集し、そして還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、これは〜９７ｋＤａの分子量の予測されたＳＳＡＯ産物のみを示した。捕捉された材料をまた分析し、これはＧＳＴ融合パートナー（〜２８ｋＤａ）およびＧＳＴ−３Ｃプロテアーゼのみを示した。これは、完全な切断が起こったこと、およびすべてのＧＳＴ含有タンパク質が、グルタチオン−セファロースカラム上に捕捉されたことを示した。またすべてのＳＳＡＯタンパク質がカラムを経由して通過したことを示した。なぜなら、ＳＳＡＯタンパク質が溶出された材料中に見出されなかったからである。
【００５２】
精製ＳＳＡＯタンパク質の特異的活性は、５２２ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１であると決定された。これは切断前に決定された特異的活性よりも小さかった。ＤＴＴを使用して、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の切断中の３Ｃプロテアーゼ活性を確保したから、我々は、切断バッファーがＳＳＡＯホモダイマー中の可能なジスルフィド架橋に影響したかいなか見るため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元性）を作成した（Kurkijaervi et al., 1998; Smith et al., 1998; Salminen et al., 1998）。推定されたＳＳＡＯモノマー（〜９７ｋＤａ）のみが、みられ得る（データ示さず）。しかし、ＳＳＡＯタンパク質は、５℃での貯蔵中に、〜１７０ｋＤａのサイズにトランスフォームし（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した）、このことは、１またはいくつかのジスルフィドが形成されたことを示した。切断バッファーを、透析ろ過（diafiltration）によって除去し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、該ＳＳＡＯタンパク質がなお明らかにダイマー性であり、分子量が〜１７０ｋＤａであることを示した。全部で３．６ｍｇの組換えＳＳＡＯを、８０９ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１の特異的活性を有する９，４リットルの調質培地から取得した。プロセスの全体収率は、決定されたベンジルアミンオキシダーゼ活性に基づいて２２％であった。
【００５３】
興味深いことに、ＧＳＴ融合パートナーは、ＳＳＡＯタンパク質のベンジルアミンオキシダーゼ活性に顕著には影響がなかった。バッファー交換工程後の精製ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の特異的活性は、６３４ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１と決定された。ＧＳＴ融合パートナーの除去後、ＳＳＡＯの特異的活性は、８０９ｎｍｏｌ・分−１・ｍｇ−１と決定された。しかし、ＧＳＴ融合パートナーの分子質量は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質の〜２５％であり、そしてＧＳＴの除去後の特異的活性の増加は、同じ範囲であった。これは、該融合タンパク質を酵素特性把握のために使用する可能性を開く。さらに、アフィニティ融合パートナー、例えばＧＳＴを使用して、固体支持体上に有向の態様で組換えタンパク質を結合または固定化し、例えばタンパク質−タンパク質相互作用および酵素特性把握を研究することができる(Nilsson et al., 1997)。ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質は、それをグルタチオン−セファロースビーズに結合させたとき、実際に活性であった。
【００５４】
実施例６；精製されたＳＳＡＯタンパク質の当初の特性把握
ゲルろ過実験を実施し、非変性条件下でのＳＳＡＯタンパク質のサイズを分析した。非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調査したとき、ダイマー性タンパク質として移動したＳＳＡＯタンパク質材料からのサンプルを、キャリブレーションした分析的Superdex 200カラム上に負荷した。ＳＳＡＯタンパク質は、１．２９ｍｌで溶出し、これはわずかにカタラーゼ（２３２ｋＤａ）より早く、これは１．３５ｍｌで溶出した。
【００５５】
精製ＳＳＡＯタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定は、ＧＳＴ−３Ｃプロテアーゼが、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質（図１）中の３Ｃプロテアーゼ基質配列ＥＡＬＦＱＧ（配列番号６）を特異的に切断することを示した。２９アミノ酸を決定し、そして予測されたＳＳＡＯアミノ酸配列（配列番号２）中の残基数２９−５８に正確に対応した。Ｎ末端配列決定をまた、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ融合タンパク質について実施し、これは、シグナルペプチドが、予測されたとおり保有されたことを示した。
【００５６】
最後に、精製ＳＳＡＯタンパク質は、予測されたようにセミカルバジドによる阻害に感受性であることが見出された。０．１ｍＭのセミカルバジドの存在下、９５％より多いベンジルアミンオキシダーゼ活性が阻害された。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
引用文献
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
【表５】
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【００６２】
【表６】
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【００６３】
【表７】
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【００６４】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ＧＳＴ−ＳＳＡＯ  ＤＮＡ構築物の概略図である。ＧＳＴ融合パートナーにおける３つのシステインからセリンへの突然変異（GenBank受託番号Ｍ１４６５４を有する配列による残基８５、１３８および１７８）は、太字で示される。ボックスを付した配列は、３Ｃプロテアーゼの認識配列を示す。
【図２】図２は、ＳＳＡＯ精製プロセスの概観である。それぞれの精製工程について決定された特異的活性を示す。
【図３】図３は、ｐＭＢ８８７と命名されたＧＳＴ−ＳＳＡＯ発現ベクターの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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