(57)【要約】（１）フラボン配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化する（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し不溶性留分を除去する、そして、（３）可溶性フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し且つそれを含有する抽出物を形成するの工程からなる、適当なフラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料から濃縮フラボノイドアグリコン抽出物を生成する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程からなる、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料から濃縮フラボノイドアグリコン抽出物を生成することを特徴とした方法
（１）フラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を除去する、そして、
（３）可溶性フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、且つそれを含有する抽出物を形成する。
【請求項２】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ８．５〜１２．５に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項３】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ９〜１２に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項４】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ１１〜１２に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項５】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを少なくとも凡そ８．５に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項６】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを少なくとも凡そ９に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項７】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを少なくとも凡そ９．６に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項８】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ１１或いは１２に調整することにより溶解することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項９】
ｐＨの調整は、フラボノイドの分解を最小限度にするように反応量に対し最小量の炭酸ガス飽和処理を行うことを特徴とした請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨの調整は、アルカリを添加することにより行うことを特徴とした請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
アルカリは、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム或いはアンモニアガスであることを特徴とした請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程（２）に於ける不溶性留分は、沈殿、濾過及び遠心分離の何れか或いはこれらを組み合わせることにより除去されることを特徴とした請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ２〜６に調整することにより不溶性になすことを特徴とした請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
フラボノイドアグリコンはｐＨを凡そ２〜５．６に調整することにより不溶性になすことを特徴とした請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ２〜３．５に調整することにより不溶性になすことを特徴とした請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
フラボノイドアグリコンは、ｐＨを凡そ２、３．５、３．６、５．３或いは５．６に調整することにより不溶性になすことを特徴とした請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
工程（３）に於けるｐＨの調整は、酸を添加することにより行うことを特徴とした請求項１〜１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、硝酸、乳酸、酒石酸、クエン酸或いはプロピオン酸であることを特徴とした請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（３）に於ける不溶性留分は、沈殿、濾過、結晶化、共役結晶化及び遠心分離の何れか１つ或いはそれ以上によって分離することを特徴とした請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
工程（３）は、分離を促進するために塩を加える、反応混合物を蒸発脱水法或いは部分的凍結により濃縮する、及び又は分離促進を向上させるために反応混合物の温度を下げるの内、少なくとも１つからなることを特徴とした請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
フラボノイドは、カルコン、ジヒドロキシカルコン、オーロン、フラバノン、フラボン、ネオフラボノイド、フラボノール、ジハイドロキシフラボノール、プロアントシアニジン、フラバン、フラバン−３−オール、及びバイフラボノイド、これらのメトロキシル化及び異形体、アカセチン、アピゲニン、バイカレイン、カテキン、クリシン、クリソエリオール、ダチセチン、ジハイドロビネチン、ジハイドロカエンフェロール、ジオスメチン、カテキン、エピカテキン、エリオディシトール、フィゼチン、フスチン、ガラニン、ヘスペリチン、イソラムネチン、カエンフェロール、ルテオリン／ジギトフラボン、モリン、ミリセチン、ナリンゲニン、オロキシリンＡ、ポンシレチン、ケルセタゲチン、ケルセチン、ロビネチン、スカテラレイン、シリマリン基、シリビン、シリジアニン、シリグリスチン、スカルカプフラボン２、タンゲレチン、ブォゴニン、及びイソフラボンからなるグループから選択することを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項２２】
フラボノイドは、ゲニステイン、ダイゼイン、ホルモノネチン、バイオカニンＡ、バプテニン或いはプラテンセインであることを特徴とした請求項１記載の方法。
【請求項２３】
次の工程からなる、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する植物或いは植物原料から濃縮フラボノイドアグリコン抽出物を生成することを特徴とした方法
（１）フラボン配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を除去する、そして、
（３）可溶性フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、且つそれを含有する抽出物を形成する。
【請求項２４】
植物は、遺伝子的に性質が変えられていることを特徴とした請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
植物の部分は、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブ、アブラナ或いはカノラ由来の油製種子の塊、及びその他油料作物抽出物からなるグループから選択することを特徴とした請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２６】
植物は、大豆、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍなどのＣｉｃｅｒｓｐｐ）、白シナガワハギ（Ｍｅｌｉｏｔｕｓ ａｌｂａ）、ルサーン或いはアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、或いはツメクサ種などのマメ科の植物であることを特徴とした請求項２３〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
酵素は、グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、アントシアナーゼ、ラムノジアスターゼ、ナリンジアナーゼ及びタカジアスターゼからなるグループから選択する何れか１つ或いはそれ以上であることを特徴とした請求項２３〜２６の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
酵素は外生であり、且つフラボノイド配糖体及び又はその共役体に添加されることを特徴とした請求項２３〜２７の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
複数の酵素が逐次的手段で使用されることを特徴とした請求項２３〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
次の工程からなる、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する植物原料から濃縮フラボノイドアグリコン抽出物を生成することを特徴とした方法
（１）内部に含まれるフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに転化するために適合される内部に含まれる少なくとも一つの酵素とを接触させるために植物原料の細胞構造を破壊し、それによりフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を分離する、そして
（３）フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、フラボノイドアグリコンを単離する。
【請求項３１】
細胞構造は、摩砕、破砕、パウンディング或いは圧ぺん、冷凍及び解凍、ヘミセルラーゼ或いはセルラーゼなどの酵素処理、超音波、乾燥、紫外線照射、押し出し及びシールのバッチ圧力施用を含む減圧或いは高圧の使用、酸化及びその他化学薬品にさらすこと、洗浄処理剤による処理或いは前述のものの組み合わせにより破壊することを特徴とした請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
植物原料は種子であり、フラボノイドアグリコンへのフラボノイド配糖体及びその共役体の転化をもたらすのに必要な内部酵素の生成を促進させるために前処理することを特徴とした請求項３０又は３１記載の方法。
【請求項３３】
前処理は、酵素の生成を促進するのに充分な長さの時間で種子を浸漬することを特徴とした請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
種子は、凡そ１０日或いはそれ以下の間浸漬することを特徴とした請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
種子は、凡そ０．５〜１０日間浸漬することを特徴とした請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料を以下に示す工程で処理する方法により生成したことを特徴とする濃縮フラボノイドアグリコン抽出物
（１）フラボン配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を除去する、そして、
（３）可溶性フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、且つそれを含有する抽出物を形成する。
【請求項３７】
フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する植物原料を以下に示す工程で処理する方法により生成したことを特徴とする濃縮フラボノイドアグリコン抽出物
（１）フラボン配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を除去する、そして、
（３）可溶性フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、且つそれを含有する抽出物を形成する。
【請求項３８】
フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する植物原料を以下に示す工程で処理する方法により生成したことを特徴とする濃縮フラボノイドアグリコン抽出物
（１）内部に含まれるフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに転化するために適合される内部に含まれる少なくとも一つの酵素とを接触させるために植物原料の細胞構造を破壊し、それによりフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに転化する
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を分離する、そして
（３）フラボノイドアグリコンを他と比べて不溶性にするためにＰＨを調整し、フラボノイドアグリコンを単離する。
【請求項３９】
植物原料は、大豆、ルピナス或いはクローバーなどのマメ科の植物から選択することを特徴とした請求項３７又は３８記載の濃縮フラボノイドアグリコン抽出物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料からフラボノイドアグリコンを抽出する方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は水溶媒を使用して植物原料から抽出する濃縮フラボノイドアグリコン抽出物の効果的な生成方法を提供するものである。
【０００２】
（背景技術）
フラボノイドは治療薬、抗菌剤及び抗酸化剤としてその使用を含む広範な適用を備えた植物化学の分野に属し、心臓病、アルツハイマー病、痴呆、ガンのような成人病を含む疾病や医学障害を治療したり予防したりできる。このフラボノイドの特徴や特性は科学文献の中で充分に立証されている。
【０００３】
「天然」の植物化学医薬品の需要は増大しており、世界人口の平均年齢が堅実に増加すると共に更に増大すると思われる。また、人口のより若い世代は病気を治療したり予防するための天然の代案により傾いている。更に、有機溶媒残留物がないような原料、特に工業的に合成され、そして製品のために環境への最小の負担で生産されるものの需要がかなりある。社会もまた、環境への影響がほとんどない生物分解性物質や製法の使用に重きを置いている。
【０００４】
フラボノイドは、植物ポリフェノールの下位集団で、基本１５炭素骨格からなる三員環構造である。植物フラボノイドアグリコン（即ち糖が結合していないフラボノイド）は種々の構造形状で見出されている。しかしながら、すべてがその基本核に１５個の炭素原子を持ち、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６の配置で配列され、３番目の環を形成してもしなくてもよい３番目の炭素元素によって結合される二員環である。
【０００５】
食餌や医薬品に於けるフラボノイドの重要な役割は、益々認められるようになっている。消費によって得られる利益を少なくともある程度招いているのは、赤ワイン、緑茶、エキストラバージンオリーブオイル、大豆製品、果物、野菜、種々の伝統的薬草茶やチンキ剤に於けるフラボノイドである。
【０００６】
有用性を充分に確立しているフラボノイドの１つはイソフラボンである。イソフラボンは特徴ある構造を有し、フラボノイドの特有の異性体類を形成する。イソフラボンへの関心は、イソフラボンが東アジア地域のいくつかの人口中に胸部衰弱性ガンの低い発生率をもたらす伝統的な東洋の食餌の要因となっているという提案を含めて広範囲である。
【０００７】
イソフラボンは他の植物群にも発現されるが、マメ科植物、詳しくはマメ科のパピリオンノイド（Ｐａｐｉｌｉｏｎｏｉｄｅａｅ）亜科に最も強く関係している。これには、クローバー、パルスビーンズ、大豆のような周知の飼料用作物、エンドウ、ハリエエニシダやエニシダのような灌木も含まれる。
【０００８】
人類や動物の健康に対するイソフラボンの利点に加え、最近では動物の飼料産業に於ける適用もなされている。そこでは、イソフラボンを補った餌が与えられたブタは、餌の摂取の増加はないが平均した毎日の重量増加を示している。ブタもまた、１日当たりの屠殺体筋肉及び高く見積もられる筋肉増分の割合を増加させた。
【０００９】
理想的な世界では、我々は、食物、食事や飲み物を注意して選択することにより充分な量の上記化合物を摂取できるであろうが、実際には、特に都会で働く者にとっては、しばしば不可能である。そのため、補助食品或いは治療法として簡便且つ効果的に使用されるフラボノイドに富んだ調合剤の必要性及び需要がある。
【００１０】
フラボノイドを抽出する先行技術には、一般に、以下の問題点がある。即ち、（１）有毒試薬の使用を含んでいる（２）過度の多角的な抽出を必要とする（３）配糖体状でのフラボノイド（フラボノイド配糖体）の抽出を含んでいる（４）消費時間が掛かりすぎる（５）引火性の有機溶媒を多量に使用する。
【００１１】
本発明は、これら先行技術の欠点を克服し、また先行技術の方法に比べて高い生成率でフラボノイドを単離する簡便な方法を提供することを目的とする。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、次の工程からなる、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料から濃縮フラボノイドアグリコンを生成する方法を提供する。
（１）フラボン配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに酵素的に転化し、
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を除去し、そして、
（３）可溶性フラボノイドアグリコンを不溶性にするためにＰＨを調整して、それを含有する抽出物を形成する。
【００１３】
本発明に係る「フラボノイド」は次の構造式、或いはその二量体、三量体、或いは重合体を有する植物ポリフェノールである。
【００１４】
【構造式１】
2004500374.tif 000002
【００１５】
本発明に係る特定のフラボノイドは、カルコン、ジヒドロキシカルコン、オーロン、フラバノン、フラボン、ネオフラボノイド、カテキン、フラボノール、ジハイドロキシフラボノール、プロアントシアニジン、フラバン、フラバン−３−オール、及びバイフラボノイド、これらのメトロキシル化したもの、及び共役体やアシル共役体のような異性体を含むもの、更に詳しくは、アカセチン、アピゲニン、バイカレイン、クリシン、クリソエリオール、ダチセチン、ジハイドロビネチン、ジハイドロカエンフェロール、ジオスメチン、カテキン、エピカテキン、エリオディシトール、フィゼチン、フスチン、ガラニン、ヘスペリチン、イソラムネチン、カエンフェロール、ルテオリン／ジギトフラボン、モリン、ミリセチン、ナリンゲニン、オロキシリンＡ、ポンシレチン、ケルセタゲチン、ケルセチン、ロビネチン、スカテラレイン、シリマリン基、シリビン、シリジアニン、シリグリスチン、スカルカプフラボン２、タンゲレチン、ブォゴニン、及び次の構造式を有するゲニステイン、ダイゼイン、ホルモノネチン、バイオカニンＡ、バプテニン及びプラテンセインのようなイソフラボンを含む。
【００１６】
【構造式２】
2004500374.tif 000003
【００１７】
出発原料は多様化しても良く、好ましくはフラボノイド配糖体及び又はその共役体を含む植物、その部分、或いはその調整品からなる。詳しくは、植物原料としては、葉、花弁、萼片、花、葉柄、新芽、根、茎、種子、鞘、塊茎、樹皮、形成層、材木、菌こぶ、果実、野菜、ハーブ、バクテリア、藻、シダ、樹液、樹脂、ブドウ、リンゴ、タマネギやアボカドなどの皮、柑橘類の皮、果物の外皮を含む皮、リンゴ、ワインの絞りかす、穀粒の外皮、藁、干し草、オリーブやアブラナ或いはカノラ由来の油製種子のかたまり、及びその他油料作物抽出物が挙げられる。出発原料はまた、変型バクテリア、藻類或いは菌類、ＧＭ作物やその一部及び生成物などの有機体を遺伝子的に変異させてもよい。
【００１８】
ある特定種類の出発原料は浸漬され、種子を発芽させるのであり、マメ科種子のような種子を発芽させられるのである。マメ科種子に於いて、大豆は別として、乾燥種子にイソフラボノイドは本質的に含有されないが、新芽を浸漬して発育させると一定割合のイソフラボンが発現し、乾燥種子の重量を基礎として抽出及び産出でイソフラボン割合が著しく増加することがわかっている。この増加は少なくとも葉の新芽が出て第一葉が大きく開く段階まで続くようである。
【００１９】
また、種子発育とフラボノイド合成は温度に影響されるのであり、好ましくは種子発育とイソフラボン生成は凡そ２３℃〜２８℃で行われる。一般的に、収量は、成長への温度の公知効果により初期の種子に対して高温（上限まで）でより多くなり、同時期の種子に対して低温でより少なくなると認識されている。
【００２０】
本出願人は、既に、予め発芽させた大豆が濃縮フラボノイド生成物を生成するための出発原料として使われることを見出している。この際、大豆は乾燥種子中に重要な割合のイソフラボノイド配糖体を含有している。しかしながら、配糖体をアグリコンに転化するのに必要な酵素を生成するために、浸漬と成育が行われなければならない。この際、大豆は、内生の酵素を活性化させ且つ本発明により得られる抽出物内のイソフラボノイド割合を増加させるために、少なくとも約室温（２５℃）で１日間浸漬させるのが好ましい。アグリコンを生成するために必要な酵素の割合は種皮下に於ける根の発育と一致する。１粒の種子当たりの抽出物や収量に於けるイソフラボノイドのより良い割合の着手は、再び温度に依存するものとなる。
【００２１】
このような種子や新芽の抽出は、蛋白質含量５０％〜６０％或いはそれ以上の（イソ）フラボノイド濃縮蛋白質抽出物として記載されるものを生産することができる。これらの濃縮蛋白質凝縮物は蛋白質割合を上げるために水溶性炭水化物などで洗うことにより（イソ）フラボノイド蛋白質を含む分離物に転化される。収量は成長種子や新芽を粉砕する際の精密さを増すことにより、より一層向上させることができるのであり、これは出発原料が強靱なときに特に好ましい。
【００２２】
本発明に係る植物は、フラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する如何なる植物であっても良いが、好ましくは、大豆、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍのようなＣｉｃｅｒ ｓｐｐ）、白シナガワハギ（Ｍｅｌｉｏｔｕｓ ａｌｂａ）、ルサーン或いはアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、或いはツメクサ種のようなマメ科の植物である。また、異なる植物を組み合わせて出発原料を構成してもよい。
【００２３】
フラボノイド配糖体及び又はその共役体は完全に転化されるのが好ましい。しかしながら、実際には、出発原料中のフラボノイド配糖体及び又はその共役体の一部はフラボノイドアグリコンに転化されないようである。明確には、転化の割合が高ければ高いほど、抽出過程で元に戻るフラボノイドアグリコンが多くなるのである。いずれにせよ本発明の方法で行われる転化割合は、過程の必須産出を含む操作パラメーターによって決定されるものとなる。
【００２４】
フラボノイド配糖体を転化するために使用される酵素は変化に富んでおり、例えば、グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、アントシアナーゼ、ラムノジアスターゼ、ナリンジアナーゼ或いはタカジアスターゼからなるグループに由来する酵素のようにグリコシド結合を加水分解する能力を備えた酵素を含んでもよい。
【００２５】
その他の酵素は、グルコース（糖）部分と共役部分（例えばアシル基）間のフラボノイド配糖体共役体の結合を加水分解するのに適した酵素を含んでおり、例えば、イソフラボン−７−Ｏ−グリコシド−６−マロネートマロニルエステラーゼ（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ ７−Ｏ −ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ−６” ｍａｌｏｎａｔｅ ｍａｌｏｎｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）や適切な植物に見られる同等の酵素などがある。
【００２６】
このような酵素は購入したり、或いはブタの肝臓のような動物、ツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐｐ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ｓｐｐ）、メリロート（Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ ｓｐｐ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓｐｐ）、ツバキ（茶）（Ｃａｍｅｌｌｉａ（Ｔｈｅａ） ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、サクラの種（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｐ）、（例えばアーモンド（Ｐ． ａｍｙｇｄａｕｌｓ）、カストルビーン（Ｐ． ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、甘果桜桃（Ｐ． ａｖｉｕｍ）、アンズの種（Ｐ． ａｒｍｅｎｉａｃａ））、プルヌスフランギュラ（Ｒｈａｍｎｕｓ ｆｒａｎｇｕｌａ）、及びプルヌスヒエ（Ｒｈａｍｎｕｓ ｕｔｉｌｉｓ）のような植物、こうじかび（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）或いはこうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）を含むアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）のような菌類、ハリエンジェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）、根球菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ）のような菌類、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｏｅｎｏｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍのような細菌、或いはＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｓｐｐのような腸内細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ及びＣａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｉｍｍａのような酵母菌を含む当業者にとって明白な根源から入手できる。
【００２７】
本発明はまた、遺伝子変形（遺伝子処理）有機体から得られた酵素のような遺伝子処理酵素の使用にまで及ぶ。この際、遺伝子操作を行えば、不充分な量の酵素或いは不充分な働きの酵素を生成するものとなる植物や微生物も利用できる。また、遺伝子工学は酵素の働きなどのような特性を向上させるために使用することができる。このように遺伝子処理された生成物は全て、本発明に於いて使用することができる。
【００２８】
環境に応じて、フラボノイドアグリコンへのフラボノイド配糖体或いはその共役体の酵素的転化は、必要な転化を行うために同時或いは連続して複数の酵素を使用してもよい。この分野に於ける周知技術は、過程や出発原料の必要条件に少なくとも基づいた酵素的転化の性質を決定することができる。
【００２９】
例えば、フラボノイドアグリコンへのフラボノイド配糖体及び又はその共役体の転化は、連続した或いは同時に行われる複数の酵素処理を必要としてもよい。この際、フラボノイド配糖体及び又はその共役体をフラボノイドアグリコンに転化する前の複合物或いはこの複合物の中間体に転化させてもよい。中間体に転化するための必要条件や使用する特定酵素は当業者にとって明白なものである。例えば、ナリンギン（配糖体）は先ずアルファルファモノシダーゼを使ってプルニン（中間配糖体）に転化され、それからフラボノイドアグリコンにはβグルコシダーゼを使ってグルコースの加水分解部分によりナリンゲニンを形成するものとなる。
【００３０】
フラボノイド配糖体は、フラボノイドアグリコンへの酵素的転化に先立ち、一つ以上の糖質残基或いはその一部を除去するために前処理されるものとなる。この際、フラボノイド配糖体は、部分的に転化したフラボノイド配糖体を生成するために、幾つかの糖質残基或いはサッカリド単位のような糖質残基の一部を加水分解するように処理してもよい。ここに、一つ以上の糖質残基は、少なくとも１つの糖質残基をフラボノイド配糖体に残す強酸を使用する加水分解により、フラボノイド配糖体から取り除かれる。
【００３１】
その他の変量は、一定の抽出過程及び更に詳しくは酵素的転化から最適な成果を達成するように調整する必要があろう。最適な転化をもたらすための変量の調整や条件の特定の組み合わせは、当業者にとって明白である。このような変量としては、温度、含水量、及びその他の溶質或いは酵素安定剤の添加がある。
【００３２】
出発原料がフラボノイド配糖体及び又はその共役体及び酵素を含有する比較的傷のない細胞構造を備えた植物原料である場合、フラボノイド配糖体及び又はその共役体は、一般的に、フラボノイドアグリコンに転化するために適合される酵素により細胞内分離される。この状態で、酵素とフラボノイド配糖体及び又はその共役体とは、少なくとも植物原料の細胞構造を破裂させることにより接触するものとなる。
【００３３】
よって、本発明は次の工程からなるフラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する植物原料から濃縮フラボノイドアグリコンを生成する方法を提供するものである。
（１）内部のフラボノイド配糖体或いはその共役体とこれらをフラボノイドアグリコンに転化するために適合される少なくとも一つの酵素とを接触させるために植物原料の細胞構造を壊し、それによりフラボノイド配糖体或いはその共役体をフラボノイドアグリコンに転化し、
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を分離し、そして、
（３）フラボノイドアグリコンを不溶性にするためにＰＨを調整してフラボノイドアグリコンを単離する。
【００３４】
少なくとも細胞構造を壊す処理としては、細胞を裂き、変化させるなど当業者にとって明白なものが挙げられる。即ち、摩砕、破砕、パウンディング、圧ぺん、冷凍、解凍、ヘミセルラーゼ或いはセルラーゼのような酵素処理、超音波、乾燥、紫外線照射、押し出し及びシールのバッチ圧力施用からなる減圧或いは高圧の使用、微生物消化或いはエンシレージ化、酸化剤或いは他の化学薬品にさらす、洗浄処理剤などの処理或いはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３５】
破壊過程で使われた成分が残りの過程の妨げになるようであれば、さらに先の過程に先だって反応混合物から除去されるべきである。
【００３６】
また、本発明方法により生成した抽出物は、重要なフラボノイド濃度をより上げるために更に処理を行ってもよい。この際、付加的浄化プロトコルとしては、アルコール洗脱などが行われる。この際、本発明の抽出物をアルコール（例えばメタノール、エタノール或いは水性アルコール）浸出にさらして溶媒を蒸発させると、２〜６倍のフラボノイドアグリコンというかなりの濃度の濃縮物が得られることがわかっている。
【００３７】
上記した如く、酵素とフラボノイド配糖体及び又はその共役体は、両者ともに出発原料内に含まれる。しかしながら、出発原料は、必要な転化を行うには不充分な量の酵素を備えるか或いは酵素を全く持っていないフラボノイド配糖体及び又はその共役体からなるものでもよい。この場合、本発明の方法では、フラボノイド配糖体及び又はその共役体をフラボノイドアグリコンに転化するために酵素を適合して添加してもよい。
【００３８】
よって、本発明は次の工程からなるフラボノイド配糖体及び又はその共役体を含有する出発原料からフラボノイドアグリコンを抽出する方法を提供する。
（１）フラボノイド配糖体及び又はその共役体をフラボノイドアグコンに転化するために適合される酵素を出発原料に添加することによりフラボノイド配糖体及び又はその共役体をフラボノイドアグコンに転化し、
（２）フラボノイドアグリコンを溶解するためにＰＨを調整し、不溶性留分を分離し、そして、
（３）フラボノイドアグリコンを不溶性にするためにＰＨを調整してフラボノイドアグリコンを単離する。
【００３９】
フラボノイドアグリコンは生成されるとすぐに、重合したりその他の好ましくない変換を起こさないように保護される必要がある。例えば、ポリフェノールオキシダーゼ活性は、フラボノイドアグリコンの重合を防ぐために、制限されたり除去されなければならない。これは、物理的手段例えば熱により、或いは化学手段例えば亜硫酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、シアン化水素酸、一酸化炭素、蛋白質消化酵素により、及び又は酸素を排除する方法の使用、例えば二酸化炭素や窒素の被膜を供給したり真空吸引により成し遂げられる。最後の方法では、ポリフェノールオキシダーゼ活性が因習的に永久に除去されるか或いはフラボノイドアグリコンがポリフェノールオキシダーゼ酵素を含有する液体や固体から分離されてしまうまで、酸素の排除が続行される。
【００４０】
ｐＨはフラボノイドアグリコンを溶解させるために調整される。よって、ｐＨは少なくとも凡そ８．５、好ましくは少なくとも９．６、１１或いは１２若しくは凡そ９．６〜１２に調整される。しかしながら、ｐＨ調整の所要特定水準は、少なくとも抽出している特定フラボノイドアグリコンに応じて変化するものとなる。
【００４１】
本発明方法に於けるアルカリ抽出結果の効率は、ｐＨがイソフラボノイドが事実上１００％（９９．９％）電離している状態のｐＨ値以上に上げられると（ｐＨ＝ｐＫａ＋３ｐＨ或いは凡そ１０．２の時）、このｐＨ値ではイソフラボノイドアグリコンは完全な水溶性であるが、抽出収量は増加するという予期しないものである。ｐＨ１２〜１２．５でイソフラボノイドの分解を引き起こすと予想されるｐＨ値でも抽出は引き続き拡大している。
【００４２】
また、収量は、ｐＨが完全電離（ｐＫａ＋３）させる値以上に上げられるので増加するのではなく、むしろ塩基触媒酸化の割合が増加するために減少するものと予想される。ゲニステインとバイオチャニンＡは凡そ７．２のｐＫａ値を持つことが知られている。この場合には、酸性沈殿物のｐＨを変化させる観察結果に相当し、一旦ゲニステイン、バイオチャニンＡとイソフラボノイドアグリコンが完全に（９９＋％）荷電されなければ、収量に於ける変化は、陽子イオン濃度中に１０００倍変動値を超えて確認されることはない。
【００４３】
フラボノイドアグリコンを溶解するためのｐＨ調整は、液体或いは固体状の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、若しくはアンモニアガスなどのアルカリを添加するような当業者にとって自明な各種方法で行われるものとなる。ｐＨは可溶化されるフラボノイドアグリコンの割合を一定に保つために変えられる。不溶性のままの植物原料は、フラボノイドアグリコンを液層中へ完全に抽出するために更に処理してもよい。このような処理として、不溶性植物原料の洗浄、濯ぎ、散水が挙げられる。
【００４４】
フラボノイドアグリコンを充分に溶解させるとすぐに、不溶性留分は、可溶性と不溶性留分を分離する当業者にとって自明な方法を単独或いは組み合わせることにより除去される。このような方法として、沈降、濾過、及び遠心分離が挙げられる。本発明の目的に於ける「不溶性留分の分離」という表現及びその言い換えは、不溶性留分の一部の除去を意味するものであり、更に詳しくは遠心分離或いはその他の自明な方法により成し遂げられる大部分の不溶性留分の除去を含むものである。
【００４５】
好ましくは、アルカリ抽出は、フラボノイドの分解を避けるために反応量に対し最小量の炭酸ガス飽和で処理される。この際、驚いたことに、アルカリ抽出中、反応量に対する炭酸ガス飽和を最小限にすると、収量がかなり増加するということがわかった。炭酸ガス飽和は、アルカリ抽出中、サンプルの攪拌阻止に制限しないで、拡散、激しい攪拌、その他液体サンプルと空気との混合などの各種方法で最小限にするようにしてもよい。或いは、炭酸ガス飽和を防止するために、アルカリ抽出を、窒素、アルゴン、或いはアルカリ溶液に混合された化合物を吸収する酸素のような、酸素を減らした或いは酸素のない大気下で行ってもよい。
【００４６】
次いでｐＨはフラボノイドアグリコンを不溶性にするために調整される。よって、ｐＨは凡そ２、３或いは２〜６、好ましくは３．５、３．６、５．３、５．６のような凡そ３〜５に調整される。しかしながら、ｐＨの所要特定水準は、少なくとも抽出している特定フラボノイドアグリコンに応じて変化するものとなる。本方法のこの段階に於ける最適なｐＨは、通常技術を備えた人がフラボノイドアグリコンに最適なｐＨを決定するために経験的試験を行って決定してもよい。
【００４７】
フラボノイドアグリコンを不溶性にするためのｐＨ調整は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、或いはプロピオン酸等の酸、これらは液体、固体、気体の何れの形態でもよい、を加えるなどの当業者にとって自明な各種方法で行われるものとなる。ｐＨは不溶性になるフラボノイドアグリコンの割合を一定にするように変えられる。必要であれば、ｐＨ調整は、反応物の混合及びフラボノイドアグリコンの殆ど完全な酸性化を通して確実にするために攪拌して行われる。可溶性留分は、フラボノイドアグリコンを不溶性層に完全に移行させるために更に処理してもよい。
【００４８】
フラボノイドアグリコンは懸濁物質或いは沈殿物として充分に分離されると、その不溶性留分は可溶性及び不溶性留分に分離するための当業者にとって明白な決まり切った方法の何れか単独或いは組み合わせにより除去されるものとなる。このような方法として、沈殿、濾過、晶化、共同晶化や遠心分離などが挙げられる。また分離を補助するために温度を下げたり反応容量を冷却してもよい。
【００４９】
分離はまた、有機溶媒の使用、選択薄膜濾過や、薄層クロマトグラフィー、液クロマトグラフィー、高圧液クロマトグラフィーからなるクロマトグラフィーのような他の従来技術により行ってもよい。反応混合物の酸性水溶性或いは水溶性有機調整物もまた、活性炭に吸着させることにより精製したり純化してもよい。
【００５０】
更なる精製法は、沈殿物を酸抽出段階から適切な溶媒中へ溶解させ、次いで１以上の非フラボノイド成分が不溶性となって沈殿するように溶液を加減するのである。この適正な方法は例えば、沈殿物をエタノール中に溶解させ、次いでアセトンを加えることによって加減するのであり、幾らかの溶解糖類、サポニンや蛋白質が多かれ少なかれある程度沈殿するものと思われる。残留溶液を蒸発させて濃縮抽出物を回収させることができるが、溶液を更に処理するようにしてもよい。
【００５１】
抽出のために出発原料として植物原料を使う際の起こり得るやっかいな問題は、抽出中に不必要な植物蛋白質が共沈することである。フラボノイドアグリコンを分離するために抽出中に操作した種々の条件では、フラボノイドアグリコンは他の植物蛋白質から充分に分離されないことがある。これにより、出発原料或いは抽出工程中に実施する付加処理工程は、共沈に結びつく問題を少なくとも減らすために向けられるものとなる。
【００５２】
よって、本発明は更に、本発明方法に於けるフラボノイドアグリコンの抽出を不当に妨害しないように不必要な蛋白質を改変する処理からなっている。このような処理には、（１）アルカリ化工程後の可溶性層中に於ける不必要な蛋白質の割合を減少させる（２）酸性化工程後の可溶性層中に於ける不必要な蛋白質或いは蛋白原料の割合を増加させる処理が含まれる。
【００５３】
上記処理は多様であり、当業者にとって明白なものも含まれる。本発明に含まれる処理には、加熱、例えばタンニン或いはベントナイトとの化学処理、酵素処理或いはアルカリｐＨ調整前の出発植物原料若しくは不必要な蛋白質が重要な可溶性フラボノイドアグリコンから分離される不溶性形態になるのを確実にするためのアルカリ抽出工程に起因する反応混合物の放電などが含まれる。更なる方法として、アルカリ抽出工程に起因する反応混合物を蛋白質吸収物質を詰めたカラムに通してもよい。
【００５４】
或いは、酸抽出工程に起因する反応混合物を、不必要な蛋白質が酸性媒体に可溶形態に転化されるペプシン、パパインのようなプロティナーゼで処理してもよい。ゲル濾過クロマトグラフィーもまた、ゲル濾過或いは大きな蛋白質を透過させないでフラボノイド分子を透過させる程度の小孔を備えたゲル濾過薄膜フィルタを含めて使用される。他の生物学的方法もまた、微生物を消化したり吸収する蛋白質を備えた発酵を含めて使用される。破砕原料の生牧草埋蔵化もまた抽出プロトコルを助けるものとなる。
【００５５】
上記した本発明方法によれば、イソフラボノイドのようなフラボノイドを高い収量で得ることができる。例えば、収量は、抽出に有機溶媒を使用する以外は同等の工程を実施する方法より少なくとも凡そ２５％以上多く、好ましくは発表された収量より少なくとも５０％以上、更に好ましくは少なくとも６７％以上である。
【００５６】
（発明を実施するための最良の形態）
特に指示しない限り、（１）以下実施例中、アルカリ抽出による布フィルタは抽出に使用する溶液と同等のｐＨ溶液で２度濯いだ、（２）以下実施例中、全てのアルカリ抽出は最小限の炭酸ガス飽和及び次の一般的な方法に従って実施した（ａ）植物原料を大量の水、通常少なくとも２倍から４倍量の水で拡散する（ｂ）懸濁液に初めに少量の濃縮水酸化ナトリウム溶液（凡そ５ｍｌ）を加える（ｃ）その後選択したｐＨに近づくにつれて水酸化ナトリウム水溶液を滴下する（ｄ）水酸化ナトリウムを懸濁液（最小限の炭酸ガス飽和）と充分に混合して混合物が安定したｐＨ値になるまで時間をかける（ｄ）所望のｐＨに達した後、更に２〜３分後にその値をチェックし、見出される値にずれがある場合ｐＨを調整する、そして（３）実施例中、言及される全てのフラボノイド収量を薄層クロマトグラフィー或いはＵＶスペクトルグラフィック法を用いて決定した。
【００５７】
（実施例１Ａ）
１９９９年の冬を越し西オーストラリア州の南西部で成育した地下茎クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ Ｌ）の葉凡そ１ｋｇのサンプルを１０月初旬に収集し、２０℃で１日そして５℃で１０間貯蔵した。この貯蔵原料の内凡そ５ｋｇの葉を切り取ってプラスチックの袋に保存した。
【００５８】
２５ｇのクローバーの葉を酸洗浄した湿った白砂５０ｇと混合し、乳鉢と乳棒で３．５分間すりつぶした。すりつぶした葉と砂の原料を密封プラスチック袋に１０分間入れておき、そして凡そ６２℃で２０分間熱処理した。
【００５９】
翌日、熱処理した原料をビーカーに移し、２００ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌しながら５Ｍ濃度の水酸化ナトリウム液を滴下し、ｐＨ９．６の懸濁液になるまでｐＨをあげた。この懸濁液を３重層にした良質のガーゼに通してきめの粗い繊維状物質を除去し、ガーゼを透過した軟泥のような物質は２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することで除去した。
【００６０】
次いで、分離溶液のｐＨを５．３に調整した。ｐＨ５．３の混合物を４８時間凡そ１℃に保ち、それから最終容量が凡そ１００ｍｌになるように溶液を部分的に凍結させ、形成された氷を分離して濃縮し、残存溶液と沈殿物を濾紙で濾過した。
【００６１】
濾紙及び濾紙に保持された沈殿物を４０℃で乾燥し、イソフラボン含量をＭ．ＦｒａｎｃｉｓとＡ．Ｊ．Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎの方法（「地下茎クローバーのイソフラボン含量に於ける変種変異、及び顕微技術による判断」Ｃ．Ｍ．ＦｒａｎｃｉｓとＡ．Ｊ．Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ、農芸研究のオーストラリアジャーナル、第１６巻、第５５７頁〜６４頁、１９６５年）を幾分変えて、即ち全く骨の折れない型で測定した。
【００６２】
濾紙上に保持された物質の重量は、４枚の濾紙の重量を測定してその平均重量を計算し、そしてこの平均重量を実験で用いた濾紙と保持物質の測定重量から引いて計算した。
【００６３】
（結果）
濾紙上に保持された物質の重量は０．３５ｇ。乾燥濾過した沈殿物中のイソフラボンの割合はゲニステイン２６．１ｇ／１００ｇ、バイオチャニンＡ８．５ｇ／１００ｇ、フォルムオノネチン２．１ｇ／１００ｇ、ダイゼインは検出されなかった。２５ｇのクローバーの葉からのイソフラボンの計算抽出量は０．１２８ｇであった。
【００６４】
（実施例１Ｂ）
１９９９年の冬を越し西オーストラリア州の南西部で成育したトリッカラ品種の地下茎クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ Ｌ）の葉凡そ１ｋｇのサンプルを１０月初旬に収集し、２０℃で１日、５℃で１０日間貯蔵した。
【００６５】
上記貯蔵原料の凡そ５ｋｇの葉を切り取ってプラスチックの袋に保存した。２５ｇのクローバーの葉を酸洗浄して湿った白砂５０ｇと混合し、乳鉢と乳棒で３．５分間すりつぶした。すりつぶした葉と砂の原料を密封プラスチック袋に１０分間入れておき、凡そ６２℃で２０分間熱処理した。
【００６６】
翌日、熱処理した原料をビーカーに移し、２００ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌しながら５Ｍ濃度の水酸化ナトリウム液を滴下し、ｐＨ１２．０の懸濁液になるまでｐＨをあげた。この懸濁液を３重層にした良質のガーゼに通してきめの粗い繊維状物質を除去した。
【００６７】
次いで、分離した溶液及び懸濁液のｐＨを５．６に調整した。ｐＨ５．６の混合物を４８時間凡そ１℃に保ち、それから最終容量が凡そ１００ｍｌになるように溶液及び懸濁液を部分的に凍結させ、そして形成された氷を分離して濃縮し、残存溶液と沈殿物を濾紙で濾過した。濾紙と保持された沈殿物を４０℃で乾燥させ、イソフラボン含量を実施例１Ａと同様に測定した。
【００６８】
濾紙上に保持された物質の重量は、４枚の濾紙の重量を測定してその平均重量を計算し、そしてこの平均重量を実験で用いた濾紙と保持物質の測定重量から引いて計算した。
【００６９】
（結果）
濾紙上に保持された物質の重量は１．１ｇ。乾燥濾過した沈殿物中のイソフラボンの割合はゲニステイン７．３ｇ／１００ｇ、バイオチャニンＡ２．４ｇ／１００ｇ、フォルムオノネチン０．５５ｇ／１００ｇ、ダイゼインは検出されなかった。２５ｇのクローバーの葉からのイソフラボンの計算抽出量は０．１２８ｇであった。
【００７０】
（実施例１Ｃ）
１９９９年の冬を越し西オーストラリア州の南西部で成育したトリッカラ品種の地下茎クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ Ｌ）の葉凡そ１ｋｇのサンプルを１０月初旬に収集し、２０℃で１日、５℃で１０日間貯蔵した。この貯蔵原料の凡そ５ｋｇの葉を切り取ってプラスチックの袋に保存した。
【００７１】
２６ｇのクローバーの葉を酸洗浄して湿った白砂５２ｇと混合し、乳鉢と乳棒で３．５分間すりつぶした。すりつぶした葉と砂原料を密封プラスチック袋に１０分間入れておき、凡そ６２℃で２０分間熱処理した。
【００７２】
翌日、熱処理した原料をビーカーに移し、２００ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌しながら５Ｍ濃度の水酸化ナトリウム液を滴下し、ｐＨ１２．０の懸濁液になるまでｐＨをあげた。この懸濁液を３重層にした良質のガーゼに通してきめの粗い繊維状物質を除去した。次いで、分離した溶液と懸濁液のｐＨを３．５に調整した。ｐＨ３．５の混合物を４８時間凡そ１℃に保ち、それから最終容量が凡そ１００ｍｌとなるように溶液と懸濁液を部分的に凍結させ、そして形成された氷を分離して濃縮し、残存溶液と沈殿物を濾紙で濾過した。濾紙と保持された沈殿物を４０℃で乾燥させ、イソフラボン含量を実施例１Ａと同様に測定した。
【００７３】
濾紙上に保持された物質の重量は、４枚の濾紙の重量を測定してその平均重量を計算し、そしてこの平均重量を実験で用いた濾紙と保持物質の測定重量から引いて計算した。
【００７４】
（結果）
濾紙上に保持された物質の重量は１．０９ｇ。乾燥濾過した沈殿物中のイソフラボンの割合はゲニステイン１１．１ｇ／１００ｇ、バイオチャニンＡ３．８ｇ／１００ｇ、フォルムオノネチン０．８５ｇ／１００ｇ、ダイゼインは検出されなかった。２６ｇのクローバーの葉からのイソフラボンの計算抽出量は０．１７１ｇであった。
【００７５】
比較例として、アルカリ抽出生成物にガラス濾過を介して付加濾過工程を行うことを除き、同じプロトコル及び同等の出発原料を使用した。収量は、濾紙に保持された物質の重量が０．４１５ｇ、ゲニステイン６．３ｇ／１００ｇ、バイオチャニンＡ１．２５ｇ／１００ｇ、フォルムオノネチン０．４０ｇ／１００ｇであった。２６ｇのクローバーの葉からのイソフラボンの計算抽出量は０．０３３ｇであった。
【００７６】
（実施例１Ｄ）
１９９９年の冬を越し西オーストラリア州の南西部で成育したトリッカラ品種の地下茎クローバー（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ Ｌ）の葉凡そ１ｋｇのサンプルを１０月初旬に収集し、２０℃で１日、５℃で１０日間貯蔵した。この貯蔵原料の凡そ５ｋｇの葉を切り取ってプラスチックの袋に保存した。
【００７７】
２６ｇのクローバーの葉を酸洗浄して湿った白砂５２ｇと混合し、乳鉢と乳棒で３．５分間すりつぶした。すりつぶした葉と砂の原料を密封プラスチック袋に１０分間移しておき、凡そ６２℃で２０分間熱処理した。
【００７８】
翌日、熱処理した原料をビーカーに移し、１５０ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌しながら５Ｍ濃度の水酸化ナトリウム液を滴下し、ｐＨ１１．０の懸濁液になるまでｐＨをあげた。この懸濁液を３重層にした良質のガーゼに通してきめの粗い繊維状物質を除去した。アルカリクローバー懸濁液に生ずるスラッジ部分を沈殿させ、懸濁物質を残したままの液体を他のビーカーに注いで分離した。
【００７９】
次いで、分離した溶液及び懸濁液のｐＨを３．６に調整した。ｐＨ３．６の混合物を４８時間凡そ１℃に保ち、それから最終容量が凡そ１００ｍｌになるように溶液及び懸濁液を部分的に凍結させ、そして形成された氷を分離して濃縮し、残存溶液と沈殿物を濾紙で濾過した。濾紙と保持された沈殿物を４０℃で乾燥させ、イソフラボン含量を実施例１Ａと同様に測定した。
【００８０】
濾紙上に保持された物質の重量は、４枚の濾紙の重量を測定してその平均重量を計算し、そしてこの平均重量を実験で用いた濾紙と保持物質の測定重量から引いて計算した。
【００８１】
（結果）
濾紙上に保持された物質の重量は１．２５ｇ。乾燥濾過した沈殿物中のイソフラボンの割合は、ゲニステイン１５．５ｇ／１００ｇ、バイオチャニンＡ５．２ｇ／１００ｇ、フォルムオノネチン１．３０ｇ／１００ｇ、ダイゼインは検出されなかった。２６ｇのクローバーの葉からのイソフラボンの計算抽出量は０．１２５ｇであった。
【００８２】
実施例１Ａ〜１Ｄに於ける沈殿物中のイソフラボンの割合は、それぞれゲニステイン１０，１０，１０，１０対バイオチャニンＡ３．２，３．３，３．４，３．４対フォルムオノネチン０．８，０．８，０．８，０．８である。よって、電離平衡が大変類似しており、おそらく３つ全てに共有される７位のフェノールＯＨ基が必然的に含まれることを示している。
【００８３】
（実施例１Ｅ）
地下茎クローバーの葉を、凡そ５℃で１ヶ月間貯蔵しておいた野外育ちの遅咲き（開花過ぎている）テリッカとラリザを混合した地下茎クローバー植物から切り取った。着生の葉柄長さは１〜１．５ｃｍであった。
【００８４】
１０ｇを凡そ７０秒間粉砕し、５分後、原料を保存するためにメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加えた、最終濃度は葉重量の１．２％であった。植物原料は抽出まで冷凍貯蔵し、個々のサンプルを水と混合しｐＨを選択値に調整した。２時間後、これらを布濾過し、濾過した固体物質を２度濯いだ。一方濾液はｐＨ２に調整して２０℃で１晩貯蔵した後、濾紙で濾過し、濾過物質を暖気乾燥させた。
【００８５】
（結果）
結果を下記表１に示す。
【００８６】
【表１】
2004500374.tif 000004
【００８７】
（実施例１Ｆ）
実施例１Ｅと同様の葉原料を、ｐＨ１０或いはｐＨ１２で抽出する前に４０分間５８〜６４℃で加熱する工程を実施例１Ｅに付け加えて同様に処理した。
【００８８】
（結果）
結果を下記表２に示す。
【００８９】
【表２】
2004500374.tif 000005
【００９０】
（実施例１Ｇ）
丁度開花し始めたトレー成育の遅咲きトリッカラ地下茎クローバー植物から地下茎クローバーの葉を切り取った。葉柄に対する葉状部の割合は７７．５％〜２２．５％であった。
【００９１】
１１ｇの葉４バッチを準備し、各バッチを約４ｇの純粋なケイ砂と一緒に乳鉢と乳棒で９０秒間すりつぶした。それから凡そ３．５分間後に、原料を保存するためにメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（最終濃度はクローバー重量の０．２％）を添加し、各バッチを個々のプラスチック袋に入れて温浴で５８〜６３℃の間で４０分間加熱した。
【００９２】
翌日個々のバッチを一体にして、脱イオン水（約３００ｍｌ）を加え、ｐＨ１２で凡そ２０分間抽出した後、布で粗濾過した。濾過した固体物質は２度濯がれ、アルカリ溶液は７７．５ｍｌずつに４等分して、それぞれ３分間半遠心分離した。個々の遠心分離溶液をｐＨ２．０、３．０、４．０及び５．０に調整した後、１晩貯蔵し翌日濾紙で濾過した。濾過物質を暖気乾燥した。
【００９３】
（結果）
結果を下記表３に示す。
【００９４】
【表３】
2004500374.tif 000006
【００９５】
（実施例１Ｈ）
地下茎クローバーの葉を凡そ５℃で３日間貯蔵しておいた野外育ちの遅咲き（開花過ぎている）トリッカとラリザを混合した地下茎クローバー植物から切り取った。
【００９６】
１１ｇを凡そ９０秒間粉砕し、５分後に水と混合し、混合物のｐＨをｐＨ１０に調整し、種々の時間経過後、布濾過した。濾過した固体物質は２度濯ぎ、濾液はｐＨ２に調整して２０℃で１晩貯蔵した後、濾紙で濾過し、濾過物質を暖気乾燥させた。
【００９７】
（結果）
結果を下記表４に示す。
【００９８】
【表４】
2004500374.tif 000007
【００９９】
（実施例１Ｉ）
地下茎クローバーの葉を凡そ５℃で１６日間貯蔵しておいた野外育ちの遅咲き（開花過ぎている）トリッカとラリザを混合した地下茎クローバー植物から切り取った。
【０１００】
１０ｇを凡そ７０秒間粉砕し、５分後に原料を保存するためにメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加え、最終濃度を葉重量の０〜２．０％にした。植物原料を抽出する前に室温で５日間貯蔵し、個々のサンプルを水と混合し、そのｐＨを１．５時間１０に調整してから布で濾過した。濾過した固体物質は２度濯ぎ、濾液はｐＨ２に調整して２０℃で１晩貯蔵した後、濾紙で濾過し、濾過物質を暖気乾燥させた。
【０１０１】
（結果）
結果を下記表５に示す。
【０１０２】
【表５】
2004500374.tif 000008
【０１０３】
（実施例１Ｊ）
地下茎クローバーの葉を凡そ５℃で２５日間貯蔵しておいた野外育ちの遅咲き（開花過ぎている）トリッカとラリザを混合した地下茎クローバー植物から切り取った。
【０１０４】
１６ｇを凡そ９０秒間粉砕し、５分後に原料を保存するためにメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加え、最終濃度を葉重量の０．２〜１．２％にした。原料を５９〜６４℃で４０分間加熱した。サンプルを水と混合し、ｐＨを１．５時間１２に調整してから布で濾過した。濾過した固体物質は２度濯ぎ、濾液は遠心分離してｐＨ２に調整して２０℃で１晩貯蔵した後、濾紙で濾過し、濾過物質を暖気乾燥させた。
【０１０５】
（結果）
０．２％のメタ重亜硫酸ナトリウムで保存した１６ｇの葉状部から、０．５０２ｇの乾燥沈殿物を得た。イソフラボン含量は約２４．０ｇ／１００ｇ、或いは葉原料の約０．７６ｇ／１００ｇ、或いは乾燥重量の４．１％であった。
【０１０６】
１．２％のメタ重亜硫酸ナトリウムで保存した１６ｇの葉状部から、０．７１０ｇの乾燥沈殿物を得た。イソフラボン含量は約２４．０ｇ／１００ｇ、或いは葉原料の約１．０７ｇ／１００ｇ、或いは乾燥重量の５．６６％であった。
【０１０７】
（実施例１Ｋ）
地下茎クローバーの葉を凡そ５℃で２５日間貯蔵しておいた野外育ちの遅咲き（開花過ぎている）トリッカとラリザを混合した地下茎クローバー植物から切り取った。
【０１０８】
１６ｇを凡そ９０秒間粉砕し、５分後に原料を保存するためにメタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加え、最終濃度を葉重量の１．２％とした。サンプルを水と混合し、ｐＨを１．５時間１０に調整してから布で濾過した。濾過した固体物質は２度濯ぎ、濾液はｐＨ２に調整して２０℃で１晩貯蔵した後、濾紙で濾過し、濾過物質を暖気乾燥させた。
【０１０９】
（結果）
ｐＨ１０で抽出した１６ｇの葉から、１．１０ｇの乾燥沈殿物を得た。イソフラボン含量は約１２．６ｇ／１００ｇ、或いは葉原料の約０．８６ｇ／１００ｇ、或いは乾燥重量の４．５７％であった。
【０１１０】
（実施例２Ａ）
（１）ビターホワイトイタリアンルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）を１日水道水に浸し、その間２度水を取り替えた。ルピナスは凡そ２５℃の室温で発芽し、１０日目に根が充分に発育し、第１葉が子葉の開いた半分の間から現れる段階で発芽したルピナス５６ｇを乳鉢と乳棒で砂と一緒にすりつぶした。
（２）ゲニステイン配糖体の加水分解を行うために、（１）の粉砕物質を時間を変えて放置した（１６分から５時間：下記参照）。
（３）加水分解した粉砕物質を水で凡そ３００ｍｌにして混合懸濁溶液を形成し、ｐＨ値をｐＨ１２に調整し、設定時間の間３０℃でｐＨ１１．９〜１２．０の間で維持した（下記参照）。
（４）（３）の混合物を布で濾過し、クレメンツモデルＢ万能遠心分離器で約６００〜１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（５）（４）の濾液をｐＨ２に調整し、酸性溶液を沈殿物が沈殿するように１晩放置して、濾過し乾燥させた。
【０１１１】
（結果）
結果を下記表６に示す。
【０１１２】
【表６】
2004500374.tif 000009
【０１１３】
化合乾燥沈殿物は、乾燥重量に対し、５９％の蛋白質、４．２％のソーダ灰、及び１７．８％のヘキサン抽出物を備え、凡そ６％の水分を含有すると測定された。
【０１１４】
（実施例２Ｂ）
ルピナスアルバス種子を２４時間浸漬し、それから種々の時間（２３時間、４日及び５日）放置した後、粉砕して１〜１．５時間放置してからｐＨ１０．５で１．２５時間かけて粗ペーストを抽出した。得られた混合物を布で濾過して沈殿物を除去し、それからｐＨ３．５に酸性化して貯蔵した後、濾紙で濾過して酸性沈殿物を単離した。
【０１１５】
（結果）
抽出の結果は下記表７に示す。
【０１１６】
【表７】
2004500374.tif 000010
【０１１７】
（実施例２Ｃ）
ホワイトイタリアンルピナスを１時間のエアー休止２回（凡そ８時間と２０時間目）を行って２４時間浸漬し、その後期間を変えて（１２時間〜９日）１２時間毎に凡そ１時間浸漬した。それから、浸漬した種子を少量の砂と一緒に乳鉢と乳棒で約１０分間粉砕し、時間を変えて（６５分〜１４５分）密封ビーカーに貯蔵してｐＨ１０〜１２で抽出し、２重層の布で粗濾過し、酸性化（ｐＨ２〜３．５）して１晩貯蔵した後濾紙で濾過した。
【０１１８】
（結果）
結果を下記表８に示す。
【０１１９】
【表８】
2004500374.tif 000011
【０１２０】
（実施例２Ｄ）
Ｇｕｎｇｕｒｒｕ品種の細長葉ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｏｆｏｌｉｕｓ）平均重量０．１５ｇを、数回水を換えながら水道水に１日間浸漬し、それから時間の長さを変えて（４〜８日）凡そ２５℃の室温で発芽させた。
【０１２１】
全ての種子を少量の砂と一緒に乳鉢と乳棒で約５分間粉砕し、時間の長さを変えて（６５〜８８分）密封ビーカーに貯蔵してｐＨ１２で６０〜９０分間抽出し、２重層の布で粗濾過し、ｐＨ３．５に酸性化して１晩貯蔵した後濾紙で濾過した。
【０１２２】
（結果）
結果を下記表９に示す。
【０１２３】
【表９】
2004500374.tif 000012
【０１２４】
（実施例３Ａ）
平均乾燥重量０．１６ｇ（天火乾燥０．１５ｇ）の大豆種子を最初から７時間後の１時間のエアー休止を含め１１時間浸漬した。排水して４５分間放置した後、種子に砂を加えて乳鉢と乳棒で約５分間よくすりつぶし、水分を損失しないように密封したビーカー内に凡そ２５℃の室温で貯蔵した。
【０１２５】
８０分後、粗ペーストは、濾過前にｐＨ１２に調整したアルカリ溶液で２．５時間浸出させ、次いで濾液をｐＨ２．０に調整した。酸性化溶液を約２０℃で１晩放置した後、濾紙で濾過して乾燥させた。それから重量部分をアルコールで浸出させ、イソフラボン溶液の割合をチェックした。
【０１２６】
（結果）
１００個の種子から７．２７ｇの乾燥沈殿物を得た、メタノール浸出可能な１００ｇ当たり約０．１５ｇのイソフラボン、概算でイソフラボン７０ｍｇ／乾燥種子１００ｇであった。
【０１２７】
（実施例３Ｂ）
大豆種子を１時間のエアー休止を２回設けて（凡そ８時間目と２０時間目）２４時間浸漬し、それからその後１２時間毎に凡そ１時間浸漬した。種子を乳鉢と乳棒で少量の砂と５〜１０分間粉砕し、時間を変えて密封ビーカー内に貯蔵してアルカリ溶液で抽出し、２重層の布で粗濾過し、酸性化して１晩貯蔵した後濾紙で濾過した。
【０１２８】
（結果）
種子を２４時間浸漬し、粉砕して８０分間放置する前に５時間そのままにし、ｐＨ１２で２時間アルカリ抽出してからｐＨ３．５に酸性化した。収量は以下の通りである。
１００個の種子から７．３８７ｇの乾燥沈殿物を得た。１００ｇ当たり約０．１５ｇのイソフラボン、概算で乾燥種子に対し７３ｍｇ／１００ｇであった。
【０１２９】
２４時間浸漬しその後１．５日間保持した種子は、長さが２〜３ｍｍある種皮の直ぐ下に見える最初の段階であった。粉砕し１１０分放置した後、粗ペーストをｐＨ１２で１４０分間アルカリ抽出した。布で濾過した後、濾過液を等量に分けて、ｐＨ３．５及びｐＨ４．５に夫々れ酸性化した。収量は以下の通りである。
ｐＨ３．５のものは、１００ｇ当たり約０．２０ｇのイソフラボン、概算で乾燥種子に対し１１８ｍｇ／１００ｇの乾燥沈殿物４．３０ｇを得た。
ｐＨ４．５のものは、１００ｇ当たり約０．２３ｇのイソフラボン、概算で乾燥種子に対し１４４ｍｇ／１００ｇの乾燥沈殿物４．８４ｇを得た。
【０１３０】
２４時間浸漬した後４日間保存した種子は、子葉が種皮から丁度現れる段階であった。子葉は根に対して下方へ折れ曲がり少しだけ開いていた。種子をつぶし、乳鉢と乳棒で加えた砂と一緒に約５分間よくすりつぶし、それから凡そ２５℃の室温で水分喪失しないように密封したビーカー内に貯蔵した。１４０分後、粗ペーストを濾過する前にｐＨ１２に調整したアルカリ溶液で１５０分間浸出し、次いで濾液をｐＨ３．５に調整した。酸性化溶液を約２０℃で１晩放置した後、濾紙で濾過して乾燥した。重量部分をアルコールで浸出した、その際のイソフラボンの収量は以下の通りである。
６０個の種子から１００ｇ当たり約０．３３６ｇのイソフラボン、乾燥種子に対し凡そ２２３ｍｇ／１００ｇの乾燥沈殿物６．１７ｇを得た。メタノール浸出濃度は１．２５ｇ／１００ｇであった。
【０１３１】
他のバッチの大豆種子を２時間浸漬して１．５時間保持した後、少量の砂と乳鉢と乳棒で１０分間粉砕し、覆われたビーカー内に２時間貯蔵し、ｐＨ１２のアルカリ溶液で２時間抽出した後、布濾過して濯ぎ、ｐＨ３．５に酸性化して１晩貯蔵した後、濾紙で濾過して乾燥した。
１００個の種子から１００ｇ当たり約０．２０ｇのイソフラボン、乾燥種子に対し凡そ８０ｍｇ／１００ｇの乾燥沈殿物５．８８ｇを得た。
【０１３２】
（実施例４）
８ｇのペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）植物の葉を乳鉢と乳棒で砂及び少量の水を加えて一緒に１．５分間すりつぶし、得られた葉ペーストをエリオシトリン（エリオディチオール−７−ラミノサイド配糖体（ｅｒｉｄｉｃｔｙｏｌ−７−ｒｈａｍｉｎｏｓｉｄｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅ））の加水分解を行うために１３分間そのままにした。
【０１３３】
葉ペーストを凡そ１５０ｍｌの混合溶液−懸濁液に調節し、ｐＨを１２．０に調整し、ｐＨをｐＨ１１．８〜１２．０の間に９０分間維持した。この後、ｐＨ２．０に調整する前に混合物を布で濾過した。酸性化溶液を１晩放置して沈殿物を析出させた後、翌日濾紙で濾過し乾燥させた。
【０１３４】
（結果）
乾燥沈殿物の重量は０．３７２ｇであった。エチルアルコール浸出エリディチオールは乾燥沈殿物に対し１００ｇ当たり凡そ２．５ｇと測定された。これはペパーミントの葉原料に対し１００ｇ当たり凡そ１１８ｍｇの算出割合となる。
【０１３５】
市販用に供給されている長さ凡そ２．５ｃｍの根を有するが発芽した葉が表面に見えない状態のカブリ（Ｋａｂｕｌｉ）亜型浸漬ヒヨコマメをスパーマーケットで購入し、凡そ５℃の冷蔵庫で貯蔵し、いろんな時間でバッチを浸漬し、適当な発芽段階まで更に発育させた。これらは種子を取り出し、つぶし、砂を加えて乳鉢と乳棒で約１０分間よくすりつぶし、それから凡そ２５〜２８℃の室温で水分損失しないように密封ビーカー内で貯蔵した。少なくとも１．２５〜３時間後に、粗ペーストをｐＨ１２に調整したアルカリ溶液で少なくとも１時間浸出させて濾過し、次いで濾液をｐＨ３．５に調整した。
【０１３６】
酸性化溶液を約２０℃で１晩沈殿させた後、濾紙で濾過し、乾燥させた。次いで重量部分をアルコールで浸出し、イソフラボン溶液割合を調べた。
【０１３７】
（結果）
購入後全く浸漬していないサンプル、葉の新芽は見えないが根が種子から現れる際、曲がった部分からの測定値が２．６ｃｍまでの段階の種子を冷蔵庫に貯蔵した。この種子６０個から１００ｇ当たり約０．０８ｇのイソフラボンを含有する乾燥沈殿物９．１５ｇを得た。メタノール浸出濃度は０．６ｇ／１００ｇであった。
【０１３８】
葉の新芽は見えないが４．４ｃｍにまで根が伸びている種子を用い、この種子６０個から１００ｇ当たり約０．３９ｇのイソフラボンを含有する８．９４ｇの乾燥沈殿物を得た。メタノール浸出濃度は３．０ｇ／１００ｇであった。
【０１３９】
葉の新芽が完全に発芽した段階の種子を用い、この種子４０個から１００ｇ当たり約０．３６ｇのイソフラボンを含有する６．１７ｇの乾燥沈殿物を得た。メタノール浸出濃度は２．２ｇ／１００ｇであった。
【０１４０】
発芽子葉が間に大きな切れ目を備えて分離し、そして新芽が１．２ｃｍまで伸び、根が５ｃｍ或いはそれ以上伸びているがヒヨコマメの根に側根がない段階の種子を用い、この種子６７個から１００ｇ当たり約０．４１ｇのイソフラボンを含有する８．０８ｇの乾燥沈殿物を得た。メタノール浸出濃度は２．４ｇ／１００ｇであった。
【０１４１】
子葉が完全に開いた段階、即ち新芽が２．５ｃｍまで発芽し、根が側根を１．４ｃｍの長さまで伸ばした状態で６．７ｃｍまで伸びている種子を用い、この種子６１個から１００ｇ当たり約０．６７ｇのイソフラボンを含有する８．４１ｇの乾燥沈殿物を得た。
【０１４２】
葉の新芽が完全に発芽した段階に到達した種子のバッチを特別工程、即ち、つぶし一定時間放置した後、４０分間６０℃まで加熱し濾過後ｐＨ２．０に酸性化する前に遠心分離する工程により処理した。この種子５０個から１００ｇ当たり約０．７５ｇのイソフラボンを含有する２．６１ｇの乾燥沈殿物を得た。
【０１４３】
上記実施例に於いて、アルカリｐＨ抽出効果は、単に植物原料に負の電荷を増加させ、さらに負電荷にイオン化したイソフラボノイドアグリコンを負イオン−負イオン反発作用によって溶液内に浸出させるヒドロキシイオンによるものではないと気づくことが重要である。この場合、植物原料を長い間ｐＨを上げた状態のままにすると、溶液内に流出するイソフラボノイドの量が増加してしまうという結果になる。しかし、浸出量は実際には時間に依存せず、即ち、ｐＨ１０で浸出する際の浸出時間を５分から１時間に増やしても収量は殆ど変わらないが、ｐＨの変化には素早く応答するものとなり、クローバーの葉原料をｐＨ９．５で抽出して布濾過し、布濾過した固体をｐＨ９．５よりむしろｐＨ１２の溶液で濯ぐと、約２，３分の操作で２７％の収量を増加させるものとなった。
【０１４４】
ｐＨを上げることはアグリコンを水溶性にするだけでなく、植物原料の物理的性質−目下の構造の利用によるむしろ物理的でない包括−を変えることにより、或いは化学的環境のある様相を変更する、例えば付着物中にフラボノイドを保持させる平衡を変えることにより、アグリコンを溶液中に流出させることができると推測される。後者の機構は従来の有機溶媒抽出に於けるよりもアルカリ抽出での収量がかなり多いことからも説明できる。
【０１４５】
明細書中、特に制限しない限り、「〜よりなる」或いはその変形「〜よりなる（三人称単数）」「〜よりなっている」は一定の完全体或いは完全体のグループを含有することを意味するのであり、何か他の完全体或いは完全体のグループを除外することを意味するものではない。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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