(57)【要約】本発明は、繊維芽細胞成長因子ファミリーに属する新規ポリペプチド、それらペプチドをコードする核酸分子に関する。また、ここで提供されているのは、これらの核酸配列を含んでなるベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドへ結合する抗体、及び本発明のポリペプチドを生産する方法である。更には、肥満を治療する方法が提供されている。
2004500037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１又は約２３から約２１６の配列を含んでなるＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子。
【請求項２】
Ｆｉｇ．１（配列番号：１）のヌクレオチド位置約４６４又は約５３０から約１１１１の配列を含んでなる請求項１の単離された核酸。
【請求項３】
Ｆｉｇ．１（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含んでなる請求項１の単離された核酸分子。
【請求項４】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１又は約２３から約２１６の配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる請求項１の単離された核酸分子。
【請求項５】
（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を含むＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含んでなる請求項５の単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のコード化配列の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を含むＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項８】
（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列を含んでなる請求項７の単離された核酸分子。
【請求項９】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸１又は約２３から約２１６をコードする核酸配列の補体へハイブリダイゼーションするＤＮＡを含んでなるＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸１又は約２３から約２１６をコードする核酸が、Ｆｉｇ．１（配列番号：１）のヌクレオチド４６４又は約５３０から約１１１１を含む、請求項９の単離された核酸分子。
【請求項１１】
緊縮なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でハイブリダイゼーションが起こる、請求項９の単離された核酸分子。
【請求項１２】
（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の１又は約２３から約２１６のアミノ酸残基の配列と比較した場合に、少なくとも約８０％のポジティブ（陽性）をスコアするポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの補体を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１３】
少なくとも約２２ヌクレオチドを含んでなり、試験ＤＮＡ分子を（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基１又は約２３から約２１６を含んでなるＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と緊縮な条件下でハイブリダイゼーションすることで生成される単離された核酸分子、並びに試験ＤＮＡを分離すること。
【請求項１４】
（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有する、請求項１３の単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか１つの核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１６】
前記核酸分子がベクターで形質転換された宿主細胞によって認識コントロール配列に作用可能に結合している、請求項１５のベクター。
【請求項１７】
ＡＴＣＣへ受入番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託した核酸分子。
【請求項１８】
請求項１５のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞が大腸菌である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２１】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２２】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１８の宿主細胞を培養し、前記ＦＧＦ−１９ポリペプチドを細胞培養から回収することを含んでなる、前記ＦＧＦ−１９ポリペプチドを生産する工程。
【請求項２３】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１又は約２３から約２１６の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド。
【請求項２４】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基１又は約２３から約２１６を含んでなる請求項２３の単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド。
【請求項２５】
ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有する単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド。
【請求項２６】
ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したベクターのｃＤＮＡ挿入物によってコードされる、請求項２５の単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド。
【請求項２７】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の１又は約２３から約２１６のアミノ酸残基の配列と比較した場合に、少なくとも約８０％のポジティブ（陽性）をスコアする単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド。
【請求項２８】
Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基１又は約２３から約２１６の配列を含んでなる単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド、或いは抗−ＦＧＦ−１９抗体の結合部位を提供するのに十分なその断片。
【請求項２９】
（ｉ）緊縮な条件下で、試験ＤＮＡ分子を（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基１又は約２３から約２１６の配列を含んでなるＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体とハイブリダイゼーションさせること、（ｉｉ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下において試験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を培養すること、並びに（ｉｉｉ）細胞培養から前記ポリペプチドを回収することによって生産される単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記試験ＤＮＡが、（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有する、請求項２９の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
異種アミノ酸配列と融合したＦＧＦ−１９ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項３２】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタッグ配列である、請求項３１のキメラ分子。
【請求項３３】
前記異種アミノ酸配列がイムノグロブリンのＦｃ領域である、請求項３１のキメラ分子。
【請求項３４】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドへ特異的に結合する抗体。
【請求項３５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３４の抗体。
【請求項３６】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項３４の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が抗体断片である、請求項３４の抗体。
【請求項３８】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドに対するアゴニスト。
【請求項３９】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドに対するアンタゴニスト。
【請求項４０】
（ａ）ＦＧＦ−１９ポリペプチド、（ｂ）ＦＧＦ−１９ポリペプチドに対するアゴニスト、（ｃ）ＦＧＦ−１９ポリペプチドに対するアンタゴニスト、又は（ｄ）製薬的に許容可能な担体との混合物中の抗−ＦＧＦ−１９抗体を含んでなる組成物。
【請求項４１】
ａ）ＦＧＦ−１９の試料へ候補生物活性剤を添加し；及び
ｂ）前記ＦＧＦ−１９への前記候補剤の結合を測定し、この結合がＦＧＦ−１９へ結合することができる生物活性剤を示す、ことを含んでなるＦＧＦ−１９へ結合することができる生物活性剤をスクリーニングする方法。
【請求項４２】
ＦＧＦ−１９の活性を調節することができる生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＦＧＦ−１９の試料へ候補生物活性剤を添加し；及び
ｂ）ＦＧＦ−１９の生物学的活性の変化を測定することで、この変化が、ＦＧＦ−１９の生物学的活性を調節することができる生物活性剤を示す、段階を含んでなる前記方法。
【請求項４３】
前記生物活性が脂肪細胞のグルコース取り込みを低下させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物活性が脂肪細胞のレプチン放出を増加させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＦＧＦ−１９のレセプターを同定する方法であって、前記ＦＧＦ−１９が細胞膜物質上のレセプターと複合化し、そして前記レセプターをＦＧＦ−１９レセプターとして同定する、ＦＧＦ−１９を細胞膜物質を含んでなる組成物と混合することを含んでなる前記方法。
【請求項４６】
ＦＧＦ−１９が前記レセプターと結合する請求項４５の方法であって、更に前記ＦＧＦ−１９とレセプターを架橋する段階を含む前記方法。
【請求項４７】
前記組成物が細胞である、請求項４５の方法。
【請求項４８】
前記組成物が細胞膜抽出調製物である、請求項４５の方法。
【請求項４９】
脂肪細胞からのレプチン放出を誘導する方法であって、レプチン放出を誘導するのに効果的な量のＦＧＦ−１９を前記細胞へ投与することを含んでなる前記方法。
【請求項５０】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項４９の方法。
【請求項５２】
脂肪細胞のグルコース取り込みの減少を誘導する方法であって、グルコース取り込みの減少を誘導するのに効果的な量のＦＧＦ−１９を前記細胞へ投与することを含んでなる前記方法。
【請求項５３】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項５２の方法。
【請求項５５】
個体の肥満を治療する方法であって、前記肥満を治療するのに効果的な量のＦＧＦ−１９を含んでなる組成物を前記個体へ投与することを含んでなる前記方法。
【請求項５６】
前記肥満の治療法が、更に肥満に関連する症状の治療となる、請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項５５の方法。
【請求項５８】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項５５の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、更に製薬的に許容可能な担体を含む、請求項５５の方法。
【請求項６０】
前記ＦＧＦ−１９が、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
個体の全体重を減じる方法であって、前記個体へＦＧＦ−１９の有効量を投与することを含んでなる前記方法。
【請求項６２】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項６１の方法。
【請求項６４】
前記ＦＧＦ−１９を製薬的に許容可能な担体とともに投与する、請求項６１の方法。
【請求項６５】
全体重における前記減少が、前記個体の脂肪の減少を含む、請求項６１の方法。
【請求項６６】
前記ＦＧＦ−１９が、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
個体において、少なくとも１つのトリグリセリド及び遊離脂肪酸のレベルを減じる方法であって、前記個体へＦＧＦ−１９の有効量を投与することを含んでなる前記方法。
【請求項６８】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項６７の方法。
【請求項７０】
前記ＦＧＦ−１９を製薬的に許容可能な担体とともに投与する、請求項６７の方法。
【請求項７１】
前記ＦＧＦ−１９が、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
個体の代謝速度を高める方法であって、ＦＧＦ−１９の有効量を前記個体へ投与することを含んでなる前記方法。
【請求項７３】
前記ＦＧＦ−１９をタンパク質として投与する、請求項７２の方法。
【請求項７４】
前記ＦＧＦ−１９を核酸として投与する、請求項７２の方法。
【請求項７５】
前記ＦＧＦ−１９を製薬的に許容可能な担体とともに投与する、請求項７２の方法。
【請求項７６】
前記ＦＧＦ−１９が、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
ＦＧＦ−１９をコードする導入遺伝子を含むゲノムを含んでなる齧歯動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、ここにおいて繊維芽細胞成長因子−１９（ＦＧＦ−１９）ポリペプチドと命名された新規ポリペプチドの同定及び単離並びに組み換え型生産、肥満の治療的処置並びに肥満の処置に関連した治療的及び製薬的な特性を有する製薬的に活性な物質の生産のためにこのようなポリペプチドを利用した方法、組成物及びアッセイに関する。
【０００２】
（発明の背景）
肥満は、現代社会に広く蔓延し、社会的不名誉だけでなく、減少した寿命及び有害な生理的発達、生殖疾患例えば多嚢胞卵巣、感染症、静脈瘤、黒色表皮腫（黒色表皮肥厚症）、及び湿疹などの皮膚疾患、運動不耐性症、糖尿病 、インシュリン抵抗症、高血圧、高脂血症、胆石症、変形性関節症、整形外科的障害、血栓疾患、癌、及び心臓冠状動脈疾患を含む多くの医学的課題と関連がある。Ｒｉｓｓａｎｅｎら．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ３０１： ８３５−８３７（１９９０）。
【０００３】
肥満に対する現在の治療は、標準的な食事療法、低カロリーの食事、行動療法、食欲抑制剤、発熱薬剤、食事吸収阻害剤に関する薬物療法、顎配線、ウェストコード及び風船のような機械装置、及び手術を含む。Ｊｕｎｇ及びＣｈｏｎｇ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， ３５： １１−２０（１９９１）；Ｂｒａｙ， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， ５５： ５３８Ｓ−５４４Ｓ（１９９２）。タンパク質節約（タンパク質異化）修飾絶食が、思春期の減量において効果的であることが報告されている。Ｌｅｅら．， Ｃｌｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ．， ３１：２３４−２３６（４月 １９９２）。肥満の処置としてのカロリー制限は、貯蔵体タンパク質の異化を引き起こし、負のタンパク質バランスを起こす。従って、タンパク質補給食事療法は、カロリー制限下での窒素減少を少なくする手段として人気を得ている。このような食事療法では、単に中程度のタンパク質節約が生じるので、細い体容積を維持するためのより効果的な方法と貯蔵タンパク質が必要である。更には、このような療法が同じく体脂肪の減少の加速を引き起こすならば、肥満の処置は向上されううる。このような処置への種々の手段は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ及びＢｒａｙ， Ｍｅｄ． Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｎ． Ａｍｅｒ．， ７３： ２３７（１９８９）；Ｂｒａｙ， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ４９：３３（１９９１）で論じられているものを含む。
【０００４】
我々の社会における肥満の広範な蔓延、並びに上記で議論したような関連した深刻な結果を考慮すると、肥満者の体重を減じることに潜在的に有用ないずれの治療薬剤も、このような方々の健康にとって極めて有益な効果を有する。大きな副作用をともなわずに理想的な体重へ肥満患者の全体重を減じる薬剤のための技術が必要であり、それによって肥満患者が減量体重のレベルを維持することが支えられる。
従って、肥満患者の体重を正常で、理想的な体重へ戻すことに有用である治療法を示すことが所望されている。
更に、長期に渡って減量した体重を維持できる、肥満に対する治療法を示すことが所望されている。
また、肥満を予防すること、並びに一度治療が開始されると、例えば動脈硬化及び多嚢胞性卵巣症候群のような結果として、或いは二次的に肥満となる疾患の始まりを予防又は進展を止めることが望ましい。
そのような治療方法及び関連組成物をここで示す。また、ここで示されるのは、新規タンパク質及び核酸、そのモジュレーターのスクリーニングのための方法である。ここで示されている他の方法、治療方法及び組成物は、当業者にとって明かなものである。
【０００５】
（本発明の概要）
ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）は新規ポリペプチドをコードしているとして同定され、本出願で「繊維芽細胞成長因子−１９（ＦＧＦ−１９）」と命名された繊維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーに幾つかの配列同一性を有する。
一実施態様では、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を示す。
【０００６】
一側面では、単離された核酸分子は、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１又は約２３から約２１６を含む配列を有するＰＥＡＣＨポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
その他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸残基約１又は約２３から約２１６を含む配列を有するＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む。
【０００８】
その他の側面では、単離された核酸は、（ａ）Ｆｉｇ．１（配列番号：１）の約４６４又は約５３０から約１１１１を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
その他の側面では、単離された核酸分子は、（ａ）Ｆｉｇ．１（配列番号：１）の約４６４又は約５３０から約１１１１を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む。
【００１０】
更なる側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。このましい実施態様では、単離された核酸分子は、（ａ）（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチド、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む。
【００１１】
その他の側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したＤＮＡの全長ポリペプチドコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む。
【００１２】
その他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸１又は約２３から約２１６を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列の補体へハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む、下記に定義されているような活性ＦＧＦ−１９をコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、緊縮なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でハイブリダイゼーションが起こる。
更にその他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ．１（配列番号：１）の約ヌクレオチド４６４又は約５３０と約１１１１の間の核酸配列の補体へハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を含む、下記に定義されているような活性ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、緊縮なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でハイブリダイゼーションが起こる。
【００１３】
更なる側面では、本発明は、少なくとも約２２ヌクレオチドを有し、試験ＤＮＡ分子が（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の約１又は約２３から約２１６を含むアミノ酸残基の配列を有するＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する場合に、この試験ＤＮＡ分子を前記（ａ）又は前記（ｂ）と緊縮な条件下でハイブリダイゼーションさせることで生成される単離された核酸分子、並びに試験ＤＮＡの分離に関する。
【００１４】
その他の側面では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の残基約１又は約２３から２１６を含むアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも約８０％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８１％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８２％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８３％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８４％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８５％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８６％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８７％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８８％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８９％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９０％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９１％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９２％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９３％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９４％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９５％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９６％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９７％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９８％のポジティブ（陽性）、そして、あるいは少なくとも約９９％のポジティブ（陽性）をスコアするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の補体を含む単離された核酸に関する。
【００１５】
特別な側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを有しないＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、或いはそのようなコード化核酸分子に対して相補的である単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の配列のアミノ酸残基約１からアミノ酸残基約２２を含むまで伸展するものとして試験的に同定された。しかし、シグナルペプチドのＣ末端の境界は変化するが、最も可能性があるのはここで最初に同定されたようなシグナルペプチドのＣ末端の境界の何れかの側のほぼ約５のアミノ酸に過ぎないことは知られており、ここで、シグナルペプチドのＣ末端の境界はこのようなタイプのアミノ酸配列エレメントを同定するための当該分野で日常的に使用されている基準に従って同定することができる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎ． １０：１−６ （１９９７）， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４６８３−４６９０ （１９８６）。更に、ある場合には、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全には一様ではなく、１つを越える分泌種を生じることもまた認識される。これらのポリペプチド、及びそれをコードするポリヌクレオチドは本発明によって考慮される。しかして、本出願の目的に対して、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示したＦＧＦ−１９ポリペプチドのシグナルペプチドは、アミノ酸１からＸまで延び、ここでＸは（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の１７〜２７及び下記に記載のこれの変異体である。従って、本発明によって包含されるＦＧＦ−１９ポリペプチドの成熟形態は、ＸがＦｉｇ．２（配列番号：２）の１７から２７の任意のアミノ酸である、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸Ｘから２１６を含んでなるもの、並びに下記に記載のようなこれの変異体を含む。
【００１６】
その他の実施態様は、例えばハイブリダイゼーションプローブとして、或いは、場合によっては抗−ＦＧＦ−１９抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードしうるＦＧＦ−１９ポリペプチドの、コード化断片としての用途が見出されうるコード化配列を含むＦＧＦ−１９ポリペプチド配列の断片に関する。そのような核酸断片は、通常少なくとも約２０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約３０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約４０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約５０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約６０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約７０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約８０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約９０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１１０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１２０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１３０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１４０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１５０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１６０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１７０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１８０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１９０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約２００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約２５０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約３００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約３５０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約４００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約４５０のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約５００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約６００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約７００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約８００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約９００のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約１０００のヌクレオチド長さであり、ここで、「約」は、その参照長さのプラスマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長さを意味する。好適な実施態様では、ヌクレオチド配列断片は、Ｆｉｇ．１（配列番号：１）に示すヌクレオチド配列の任意のコード化領域から派生する。いくつもの良く知られた配列アライメントプログラムを用いてＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の知られているヌクレオチド配列を一列に並べ、そしてどのＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによる常套的な方法によって、ＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規断片が決定できうることが知られている。このようなＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列のすべてが、ここで考慮され、過度の実験をせずに決定することができる。また、これらヌクレオチド分子断片によってコードされているＦＧＦ−１９ポリペプチド断片、好ましくは抗−ＦＧＦ−１９抗体のための結合部位を含むこれらＦＧＦ−１９ポリペプチド断片が考慮される。
【００１７】
その他の実施態様では、本発明は、ＦＧＦ−１９又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを提供する。ベクターは上述の単離された核酸分子の任意のものを含みうる。
また、このようなベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、バキュロウイルス感染昆虫細胞、又は酵母でありうる。ＦＧＦ−１９ポリペプチドを生産するための方法が更に提供され、これは、それぞれＦＧＦ−１９の発現に対して適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からＦＧＦ−１９をそれぞれ回収することを含んでなる。
その他の実施態様では、本発明は上述の単離された核酸配列の何れかによってコードされる単離ＦＧＦ−１９ポリペプチドを提供する。
特別な側面では、本発明は、単離された天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドを提供し、ある実施態様においては、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の残基約１又は約２３から約２１６のアミノ酸残基の配列を含む。
【００１８】
その他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の約１又は約２３から約２１６を含むアミノ酸残基の配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチドに関する。
【００１９】
更なる側面では、本発明は、ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチドに関する。好ましい実施態様では、単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチドは、ＡＴＣＣへ１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０（ＤＮＡ４９４３５−１２１９）で寄託したヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列を含む。
【００２０】
更なる実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の約１又は約２３から約２１６を含む残基のアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも約８０％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８１％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８２％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８３％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８４％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８５％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８６％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８７％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８８％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約８９％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９０％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９１％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９２％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９３％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９４％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９５％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９６％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９７％のポジティブ（陽性）、あるいは少なくとも約９８％のポジティブ（陽性）、そして、あるいは少なくとも約９９％のポジティブ（陽性）をスコアするアミノ酸配列を含む、単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチドに関する。
【００２１】
特別な側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを有しない単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチドを提供し、上述されたようにそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを製造するための方法もまたここに記載され、この方法は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの発現に適した条件下で適切にコードする核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養からＦＧＦ−１９ポリペプチドをそれぞれ回収することを含んでなる。
【００２２】
更なるその他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の約１又は約２３から約２１６を含むアミノ酸残基の配列を含む単離されたＦＧＦ−１９ポリペプチド、あるいは生物学的に活性又は抗−ＦＧＦ−１９抗体のための結合部位を提供するのに十分なその断片に関してであり、生物学的に活性な、又は抗−ＦＧＦ−１９抗体のための結合部位を提供するＦＧＦ−１９ポリペプチド断片の同定は、当該分野において良く知られている技術を用いて常套的な方法で達成することができうる。好ましくは、このＦＧＦ−１９断片は、肥満を治療的に処置する能力を含む、天然ＦＧＦ−１９ポリペプチドの定性的な生物活性を保持する。
【００２３】
また更なる側面では、本発明は、（ｉ）緊縮な条件下で試験ＤＮＡ分子を（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の約１又は約２３から約２１６を含むアミノ酸残基の配列を有するＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体とハイブリダイゼーションさせること、並びに試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する場合に、（ｉｉ）ポリペプチドの発現に適した条件下において試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養すること、並びに（ｉｉｉ）細胞培養からポリペプチドを回収することによって生産されるポリペプチドを提供する。
【００２４】
その他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したＦＧＦ−１９ポリペプチドを含んでナルキメラ分子を提供し、このＦＧＦ−１９ポリペプチドはすべてのＦＧＦ−１９ポリペプチド、上文に記載のしたその変異体又は断片を含む。このようなキメラ分子の例としては、イムノグロブリンのエピトープタッグ配列又はＦｃ領域と融合したＦＧＦ−１９ポリペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上文に記載されたＦＧＦー１９ポリペプチドと特異的に結合する下記において定義される任意の抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。
更にその他の実施態様では、本発明は、下記に定義される未変性のＦＧＦ−１９ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗−ＦＧＦ−１９抗体、あるいは小分子である。
【００２５】
更なる実施態様では、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドを候補分子に接触させ、前記ＦＧＦ−１９ポリペプチドにより媒介される生物活性をモニターすることにより、ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、このＦＧＦ−１９ポリペプチドは、未変性ＦＧＦ−１９ポリペプチドである。
また更なる実施態様では、本発明は、担体と組み合わせた、ＦＧＦ−１９ポリペプチド、又は上述したＦＧＦ−１９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、抗−ＦＧＦ−１９ポリペプチド抗体を含む組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容可能である。
【００２６】
本発明のその他の実施態様は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−ＦＧＦ−１９抗体に対して応答性のある症状の治療に有用な医薬の調製のためのＦＧＦ−１９ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＦＧＦ−１９抗体の用途に関する。
一実施態様では、ＦＧＦ−１９へ結合することができる生物学的薬剤をスクリーニングする方法が示されている。一側面では、この方法は、候補である生物学的薬剤をＦＧＦ−１９試料へ添加し、前記候補薬剤のＦＧＦ−１９への結合を測定することを含み、この結合は、生物学的薬剤がＦＧＦ−１９へ結合することができることを示す。
【００２７】
更にここで提供されているのは、ＦＧＦ−１９の活性を調節することができる生物学的薬剤をスクリーニングする方法である。一実施態様では、候補である生物学的薬剤をＦＧＦ−１９の試料へ添加し、ＦＧＦ−１９の生物学的活性の変化を測定する段階を含む方法が提供され、この変化は、生物学的薬剤がＦＧＦ−１９の活性を調節することができることを示す。一実施態様では、ＦＧＦ−１９活性は細胞のグルコースの取り込みを減少させた。その他の実施態様では、ＦＧＦ−１９活性は、グルコースの取り込みを減少させ、細胞からのレプチンの遊離を増加させる。好ましくは、この細胞は脂肪細胞である。更にその他の実施態様では、ＦＧＦ−１９活性は、脂質と炭水化物の酸化を増加させた。好ましくは、この細胞は肝臓又は筋肉細胞である。
【００２８】
更なるその他の実施態様では、本発明は、ＦＧＦ−１９のレセプターを同定する方法を提供する。好ましい実施態様では、この方法は、細胞膜上のレセプターと複合体を形成するＦＧＦ−１９を前記細胞膜を含む組成物と混合させ、前記レセプターがＦＧＦ−１９レセプターであることを同定することを含む。一実施様態では、この方法は、前記ＦＧＦ−１９とレセプターを架橋することを含む。細胞膜は、無傷の細胞又は細胞膜抽出調製物から得ることができる。
本発明の更なる側面としては、１つの方法は、細胞、好ましくは脂肪細胞から遊離するレプチンを含むために提供される。一実施態様としては、この方法は、レプチン遊離を誘導するのに有効な量のＦＧＦ−１９を細胞へ投与することを含む。
【００２９】
ここで提供される方法では、ＦＧＦ−１９は、ＦＧＦ−１９を発現する核酸又はタンパク質の形態として投与されうる。更に下記にて記述されるように、ＦＧＦ−１９は、輸液又は持続放出性製剤として投与してもよい。好ましくは、ＦＧＦ−１９は、製薬的に許容可能な担体として個別に投与される。
また、ここで提供されるのは、細胞、好ましくは脂肪細胞におけるグルコースの取り込みの減少を含むための方法である。一実施態様では、グルコース取り込みの減少を誘導するのに有効な量のＦＧＦ−１９を細胞へ投与することを含む。
【００３０】
さらに本発明のその他の側面では、肥満を個別に治療する方法が提供されている。一実施態様では、この方法は、肥満を治療するのに有効な量のＦＧＦ−１９を含んでなる組成物個別に投与することを含む。この方法では、心疾患のような、肥満に関連する症状が治療することができる。
また、ここで提供されるのは、ＦＧＦ−１９の有効量を個別に投与することを含んでなる、個体の総体重を減少させる方法である。好ましい実施態様では、各個体の体脂肪蓄積（脂肪）が減少する。
【００３１】
更には、個体の少なくとも１つのトリグリセリドと遊離脂肪酸のレベルを減少させるために、前記個体へＦＧＦ−１９の有効量を投与することを含んでなる、ある１つの方法がここで提供されるている。また、ここで提供されるのは、個体へＦＧＦ−１９の有効量を投与することを含んでなる、前記個体における代謝速度を高める方法である。
また、ここで提供されるのは、種々の条件と状況の下で、ＦＧＦ−１９の影響とそのモジュレーターを決定するための動物モデルである。一実施態様では、ＦＧＦ−１９をコードする導入遺伝子を含んでなるゲノムを含む動物、好ましくは齧歯動物が提供されている。
【００３２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＦＧＦ−１９ポリペプチド」、「ＦＧＦ−１９タンパク質」及び「ＦＧＦ−１９」という用語は、それぞれ天然配列ＦＧＦ−１９及びＦＧＦ−１９ポリペプチド変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え及び／又は合成方法によって調製してもよい。
【００３３】
「天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチド」は、天然由来のＦＧＦ−１９ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチド」という用語は、特に、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型）、天然に生じる変異体型（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びＦＧＦ−１９ポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。本発明の一実施態様では、天然配列ＦＧＦ−１９は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸１から２１６を含んでなる成熟又は全長天然配列ＦＧＦ−１９である。また、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に開示されているＦＧＦ−１９ポリペプチドが、アミノ酸位置１としてここで命名されたメチオニン残基で開始すると示されているが、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）のアミノ酸位置１から上流又は下流の何れかに位置するその他のメチオニン残基が、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられうることは、考えらるし可能である。
【００３４】
「ＦＧＦ−１９変異体」とは、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドの残基１又は約２３から２１６、（ｂ）ＸがＦｉｇ．２（配列番号：２）の１７から２７の任意のアミノ酸残基である、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドのＸから２１６、或いは（ｃ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する下記に定義する活性ＦＧＦ−１９ポリペプチドを意味する。このようなＦＧＦ−１９ポリペプチド変異体には、例えば、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）の配列の、１つ又は複数の内部ドメインと同じく、Ｎ末端及び／又はＣ末端において１つ又は複数のアミノ酸残基が付加、置換もしくは欠失されたＦＧＦ−１９ポリペプチドが含まれる。通常、ＦＧＦ−１９ポリペプチド変異体は、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドの残基１又は約２３から２１６、（ｂ）ＸがＦｉｇ．２（配列番号：２）の１７から２７の任意のアミノ酸残基である、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドのＸから２１６、或いは（ｃ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてあるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＦＧＦ−１９変異体ポリペプチドは、天然ＦＧＦ−１９ポリペプチド配列を包含しない。通常は、ＦＧＦ−１９変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３５】
ここに定義されるＦＧＦ−１９ポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら， ここでの目的ためには、％アミノ酸配列同一性値は下記に記載のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られ、このＡＬＩＧＮ−２プログラムに対する完全なソースコードは以下の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社により作成され、以下の表１に示されたソースコードは、米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９にユーザー資料と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社（サウス　サンフランシスコ，カリフォルニア）を通じて公的に利用できるし、あるいは以下の表１に提供されるソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００３６】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、以下の表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性を如何に計算するかを証明する。
【００３７】
特に断らない限り、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して上記に記載したようにして得られる。
しかし、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードして得るか、あるいは米国国立衛生研究所、ベゼスタ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００３８】
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００３９】
「ＦＧＦ−１９変異体ポリヌクレオチド」又は「ＦＧＦ−１９変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする核酸分子であり、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドの残基１又は約２３から２１６をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ．２（配列番号：２）の１７から２７の任意のアミノ酸残基である、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドのＸから２１６をコードする核酸配列、或いは（ｃ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片をコードする核酸配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。通常は、ＦＧＦ−１９変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドの残基１又は約２３から２１６をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ．２（配列番号：２）の１７から２７の任意のアミノ酸残基である、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すＦＧＦ−１９ポリペプチドのＸから２１６をコードする核酸配列、或いは（ｃ）Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列のその他の特異的に誘導された断片をコードする核酸配列の何れかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。ＦＧＦ−１９変異体ポリヌクレオチドは、天然ＦＧＦ−１９ヌクレオチド配列を含まない。
【００４０】
通常は、ＦＧＦ−１９変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００４１】
ここで同定されるＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＦＧＦ−１９ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら， ここでの目的ためには、％核酸配列同一性値は下記に記載のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られ、このＡＬＩＧＮ−２プログラムに対する完全なソースコードは以下の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社により作成され、以下の表１に示されたソースコードは、米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９にユーザー資料と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社（サウス　サンフランシスコ，カリフォルニア）を通じて公的に利用できるし、あるいは以下の表１に提供されるソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動しない。
【００４２】
ここでの目的ためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４及び５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００４３】
特に断らない限り、ここで使用される全ての％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して上記前に記載したようにして得られる。
しかし、％核酸配列同一性はまた、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。このＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードして得るか、あるいは米国国立衛生研究所、ベゼスタ、メリーランドから得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
核酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００４４】
他の実施態様では、ＦＧＦ−１９変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００４５】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施されたアミノ酸配列同一性比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有しているアミノ酸残基を含む。関心あるアミノ酸残基に対して陽性値がスコアされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基が好ましく置換（以下の表６に定義）されたものである。
【００４６】
この目的において、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する付与されたアミノ酸配列Ａのポジティブ％値（別に、付与されたアミノ酸配列Ａが、付与されたアミノ酸配列Ｂに対する、Ｂとの、又はＢに対抗する所定の％ポジティブを有するか、又はこれを含むものとしても呼称することができる）は、次の式：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
により算出され、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのプログラム整列において、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によりポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さとは等しくなく、Ｂに対するＡの％ポジティブは、Ａに対するＢの％ポジティブとは等しくないと認識されるであろう。
【００４７】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４８】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコード化する「単離された」核酸分子は、ＦＧＦ−１９−コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され、分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたＦＧＦ−１９−コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するＦＧＦ−１９−コード化核酸分子とは区別される。しかし、ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＦＧＦ−１９を通常発現する細胞に含まれるＦＧＦ−１９コード化核酸分子を含む。
【００４９】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００５０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００５１】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗ＦＧＦ−１９モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、及び多エピトープ特異性を持つ抗ＦＧＦ−１９抗体組成物、単鎖抗ＦＧＦ−１９抗体、及び抗ＦＧＦ−１９抗体の断片を包含する（下記を参照のこと）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。
【００５２】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （１９９５）を参照のこと。
【００５３】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【００５４】
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００５５】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＦＧＦ−１９ポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０の残基）を有する。
【００５６】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００５７】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＦＧＦ−１９ポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＦＧＦ−１９の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＦＧＦ−１９によって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＦＧＦ−１９が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＦＧＦ−１９が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。好ましい生物学的活性は、次の活性の何れか１つ又は複数を含む：個体の代謝（又は代謝速度）を増大させる、脂肪細胞のグルコース取り込みを減少させる、脂肪細胞からのレプチンの遊離を増大させる、個体のトリグリセリドを減少させる、そして個体の遊離脂肪酸を減少させる。ＦＧＦ−１９の幾つかの活性がＦＧＦ−１９によって直接的に誘導され、幾つかは間接的に誘導されるが、各々がＦＧＦ−１９の存在の結果であり、そうでなければ、ＦＧＦ−１９の非存在下ではそのような結果とならないことは、理解されている。
【００５８】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＦＧＦ−１９ポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＦＧＦ−１９ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＦＧＦ−１９ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＦＧＦ−１９ポリペプチドに通常付随する１つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００５９】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【００６０】
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６１】
「個体」とは、すべての対象であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
「肥満」は、体重（ｋｇ）をメートルで表した身長の２乗で割ることで計算する、哺乳動物の体重指数（ボディマスインデックス、ＢＭＩ）の少なくとも２５．９の状態に相当する。通常は、平均的な体重のヒトは、１９．９から２５．９未満のＢＭＩである。ここでの肥満とは、遺伝的又は環境的な原因であろうと、すべての原因に起因しうる。結果として肥満となりうる、又は肥満の原因となりうる疾患の例としては、食べ過ぎ及び過食症、多嚢胞性卵巣症候群、頭蓋咽頭腫、プラダー・ウィリー症候群、フレーリッヒ 症候群、ＩＩ型糖尿病、成長ホルモン欠乏患者、正常範囲内の低身長変異、ターナー症候群、並びに、例えば急性リンパ性白血病の子供など、代謝活性が低下や全無脂肪量のパーセントとしての安静時エネルギー消費量の低下を示す他の生理学的症状を含む。
【００６２】
「肥満に関連する症状」とは、感染症などの皮膚疾患に限定されないが、静脈瘤、黒色表皮腫、及び湿疹、運動不耐性、糖尿病、インシュリン抵抗性、高血圧、高脂血症、胆石症、変形性関節症、歯障害、血栓疾患、癌、及び冠状動脈性心臓病、特に個体における高トリグリセリド及び遊離脂肪酸に関連した心疾患などの、肥満の結果の又は肥満によって悪化する症状に相当する。
１つ又は複数の更なる治療薬剤との「組み合わせに」よる投与には、順序を問わない同時（共同の）及び連続投与が含まれる。
【００６３】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
【００６４】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７−１０６２ ［１９９５］）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００６５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００６６】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
【００６７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
【００６８】
「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ ９３／１１１６１； 及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により十分に記載されている。
【００６９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法（Ｌｏｗｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００７０】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【００７１】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ、その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【００７２】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えばＦＧＦ−１９ポリペプチド又はそれに対する抗体）の送達に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」は約５００ダルトン以下の分子量を有するものとここでは定義される。
【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
ＩＩ．　本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＦＧＦ−１９ポリペプチド
本発明は、本出願でＦＧＦ−１９と（またはＵＮＱ３３４とも）命名されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に特有のものであり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、簡単にするために、本明細書では、ＤＮＡ４９４３５−１２１９によりコード化されるタンパク質並びに上記のＦＧＦ−１９（しばしばＰＲＯ５３３とも称される）の定義に含まれるさらなる天然相同体と変異体は、それらの起源又は調製態様に関わらず、「ＦＧＦ−１９」と称する。
【００９５】
下記の実施例に開示するように、ＤＮＡ４９４３５−１２１９とここで命名されたｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。該クローンの実際のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンの配列決定を行うことにより当業者によって容易に決定され得る。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＦＧＦ−１９ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、その時点で入手可能な配列情報と最も良好に合致する特定可能な読み枠であるものを同定した。
【００９６】
上記にて照会したＡＬＩＧＮ−２配列アラインメントコンピュータープログラムを用いることで、全長天然配列ＦＧＦ−１９（Ｆｉｇ．２及び配列番号：２に示す）がＡＦ００７２６８＿１と特定のアミノ酸配列同一性を有することが見出されている。従って、本出願において開示されたＦＧＦ−１９ポリペプチドは、新規に同定された繊維芽細胞成長因子タンパク質ファミリーのメンバーであり、１つ又は複数の生物学的及び／又は免疫学的活性又はこのタンパク質ファミリーにとって典型的な特性を有しうると現在考えられている。
【００９７】
Ｂ．ＦＧＦ−１９変異体
ここに記載した全長天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドに加えて、ＦＧＦ−１９変異体も調製できると考えられる。ＦＧＦ−１９変異体は、ＦＧＦ−１９ ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＦＧＦ−１９ポリペプチドを合成することにより、調製できる。当業者であれば、グリコシル化部位の数又は位置を変えたりあるいは膜固着特性を変えるように、アミノ酸変化がＦＧＦ−１９の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
【００９８】
天然全長配列ＦＧＦ−１９又はここに記載したＦＧＦ−１９の様々なドメインにおける変異は、例えば米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の何れかを用いてなすことができる。変異は、天然配列ＦＧＦ−１９と比較してＦＧＦ−１９のアミノ酸配列が変化することになるＦＧＦ−１９をコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のＦＧＦ−１９の１つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。アミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されうるかの指針は、ＦＧＦ−１９の配列を、相同な既知のタンパク質分子のものと比較し、相同性の高い領域になされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学的性質を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定されうる。
【００９９】
ＦＧＦ−１９ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ末端又はＣ末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＦＧＦ−１９断片は、多くの一般的な技術の任意のものによって調製されうる。所望のペプチド断片は化学合成されてもよい。代替方法は、酵素での消化、例えば特定のアミノ酸残基によって定まる部位でタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによりＦＧＦ−１９断片を産生することを含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーに用いられる。好ましくは、ＦＧＦ−１９ポリペプチド断片は、Ｆｉｇ．２（配列番号：２）に示した天然ＦＧＦ−１９ポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１００】
特定の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換との表題で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と標記され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
【０１０１】
2004500037.tif 000024
【０１０２】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（６）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【０１０３】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して行わせることができる。部位特異的突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０：６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５ （１９８５）］、制限選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓら， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７：４１５ （１９８６）］又は他の周知の技術が、ＦＧＦ−１９変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
【０１０４】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。典型的には、アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９）］。アラニンもまた最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の両方に見いだされることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０：１ （１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【０１０５】
Ｃ．ＦＧＦ−１９の修飾
ＦＧＦ−１９の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つのタイプは、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＦＧＦ−１９の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性剤での誘導体化は、例えば、抗ＦＧＦ−１９抗体の精製方法及びその逆で用いるためにＦＧＦ−１９を水不溶性支持体マトリクスあるいは表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸エステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の試薬を含む。
【０１０６】
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， サン フランシスコ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１０７】
本発明の範囲に含まれるＦＧＦ−１９ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」は、この目的に対しては、天然配列ＦＧＦ−１９に見いだされる１つ又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＦＧＦ−１９に存在していない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味することが意図されている。さらに、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【０１０８】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１つ又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＦＧＦ−１９（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＦＧＦ−１９アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＦＧＦ−１９ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に公開された国際公開８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ．２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
【０１０９】
ＦＧＦ−１９ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８：１３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
ＦＧＦ−１９の共有結合的修飾の他の型は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
また、本発明のＦＧＦ−１９は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＦＧＦ−１９を含むキメラ分子を生成するように修飾されてもよい。
【０１１０】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＦＧＦ−１９との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＦＧＦ−１９のアミノ末端又はカルボキシル末端に位置する。このようなＦＧＦ−１９のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＦＧＦ−１９を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は当該分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６ （１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０ （１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７ （１９９０）］を含む。
【０１１１】
別の実施態様では、キメラ分子はＦＧＦ−１９の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも一つの可変領域に代えてＦＧＦ−１９ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【０１１２】
Ｄ．ＦＧＦ−１９の調製
以下の説明は、主として、ＦＧＦ−１９核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＦＧＦ−１９を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＦＧＦ−１９を調製することもできると考えられる。例えば、ＦＧＦ−１９配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成法によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， サン フランシスコ， カリフォルニア （１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４ （１９６３）参照］。手動の技術又は自動によるインビトロタンパク質合成法を実施してもよい。自動合成法は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスターシティー， カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施することができる。ＦＧＦ−１９の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＦＧＦ−１９を生産してもよい。
【０１１３】
１．ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡの単離
ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡは、ＦＧＦ−１９ ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＦＧＦ−１９ ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＦＧＦ−１９−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、関心ある遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＦＧＦ−１９に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＦＧＦ−１９をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）］。
【０１１４】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
【０１１５】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【０１１６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＦＧＦ−１９生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋら， 上掲に見出すことができる。
【０１１７】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗら， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５ （１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【０１１８】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシリリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｒｔ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５　（ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１１９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＦＧＦ−１９コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス　セレビシエは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス ポンベ （Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］；１９８５年５月２日公開のＥＰ １３９，３８３）；クルベロミセス ホスツ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばケー・ラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４（２）： ７３７−７４２ ［１９８３］）、ケー・フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、ケー・ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、ケー・ウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、ケー・ワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、ケー・ドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、ケー・テモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケー・マルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日公開のＷＯ ９１／００３５７）；及びコウジ菌、例えばアスペルギルス ニダランス（Ｂａｌｌａｎｃｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ ［１９８３］； Ｔｉｌｂｕｒｎら， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ ［１９８３］； Ｙｅｌｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びクロカビ（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ ［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
【０１２０】
グリコシル化ＦＧＦ−１９の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。多くの特異的な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ　Ｇ２，ＨＢ ８０６５）； 及びマウス乳房腫瘍細胞 （ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＴＣ　ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【０１２１】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＦＧＦ−１９をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【０１２２】
ＦＧＦ−１９は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＦＧＦ−１９−コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１２３】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択性マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１２４】
哺乳動物細胞の適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＦＧＦ−１９−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ らにより， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｍａｎら， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）］。
【０１２５】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＦＧＦ−１９−コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］を含む。細菌系で用いるプロモータもまたＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９７８）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【０１２６】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＦＧＦ−１９転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ　２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０１２７】
より高等の真核生物による所望のＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作用要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＦＧＦ−１９コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【０１２８】
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＦＧＦ−１９をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＦＧＦ−１９の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉら， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【０１２９】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１３０】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＦＧＦ−１９ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１３１】
５．ポリペプチドの精製
ＦＧＦ−１９の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＦＧＦ−１９の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【０１３２】
ＦＧＦ−１９を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＦＧＦ−１９のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２ （１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＦＧＦ−１９の性質に依存する。
【０１３３】
Ｅ．ＦＧＦ−１９の用途
ＦＧＦ−１９をコードするヌクレオチド配列（又はそれらの補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＦＧＦ−１９核酸も、ここに記載される組換え技術によるＦＧＦ−１９ポリペプチドの調製に有用であろう。
【０１３４】
全長天然配列ＦＧＦ−１９遺伝子（配列番号：１）又はその一部は、全長ＦＧＦ−１９ｃＤＮＡの単離又はＦｉｇ．１（配列番号：１）に示したＦＧＦ−１９配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＦＧＦ−１９の天然に生じる変異体又は他の種からのＦＧＦ−１９をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に配列番号：１のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＦＧＦ−１９のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＦＧＦ−１９遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＦＧＦ−１９遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１３５】
本出願で開示する任意のＥＳＴ配列はプローブとして、ここに記載した方法で用いることができる。
ＦＧＦ−１９核酸の他の有用な断片は、標的ＦＧＦ−１９ｍＲＮＡ（センス）又はＦＧＦ−１９ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＦＧＦ−１９ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８： ２６５９： １９８８）及び ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ９５８， １９８８）に記載されている。
【０１３６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＧＦ−１９タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、ＷＯ ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１３７】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−（Ｌ−リジン）に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【０１３８】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４−媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ ９０／１３６４１参照）を含む。
【０１３９】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【０１４０】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＦＧＦ−１９コード配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＦＧＦ−１９をコードするヌクレオチド配列は、そのＦＧＦ−１９をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１４１】
ＦＧＦ−１９のコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＦＧＦ−１９がレセプターである場合）、ＦＧＦ−１９は、結合性相互作用に係る他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＦＧＦ−１９は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＦＧＦ−１９又はＦＧＦ−１９のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施することができる。
【０１４２】
また、ＦＧＦ−１９又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、ＦＧＦ−１９をコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＦＧＦ−１９をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＦＧＦ−１９導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＦＧＦ−１９コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【０１４３】
あるいは、ＦＧＦ−１９の非ヒト相同体は、動物の胚性幹細胞に導入されたＦＧＦ−１９をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＦＧＦ−１９をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＦＧＦ−１９をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＦＧＦ−１９「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＦＧＦ−１９をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＦＧＦ−１９をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＦＧＦ−１９をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Ｌｉら， Ｃｅｌｌ， ６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１４４】
また、ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ４１４３−４１４６ ［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１４５】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である（Ｄｚａｕら， Ｔｒｅｎｄｓ， ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ２０５−２１０［１９９３］）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ４４２９−４４３２ （１９８７）； 及びＷａｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ３４１０−３４１４ （１９９０）によって記述されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， ８０８−８１３ （１９９２）を参照のこと。
【０１４６】
ここに記載したＦＧＦ−１９ポリペプチドはまた、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＦＧＦ−１９核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＦＧＦ−１９ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＦＧＦ−１９ポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＦＧＦ−１９核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１４７】
ここに記載したＦＧＦ−１９ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＦＧＦ−１９ポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このＦＧＦ−１９生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ，Ａ． Ｅｄ．， （１９８０））、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４８】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉら， 編， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ｐｐ． ４２−９６のＭｏｒｄｅｎｔｉ， Ｊ． 及びＣｈａｐｐｅｌｌ， Ｗ． 「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」に記載された原理に従って実施できる。
【０１４９】
ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
【０１５０】
ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はモジュレーターの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＦＧＦ−１９ポリペプチド又はモジュレーターの持続放出が望まれる場合、ＦＧＦ−１９ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２： ７９５−７９９ （１９９６）； Ｙａｓｕｄａ， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｔｈｅｒ．， ２７： １２２１−１２２３ （１９９３）； Ｈｏｒａら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： ７５５−７５８ （１９９０）； Ｃｌｅｌａｎｄ， 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｏｗｅｌｌ 及び Ｎｅｗｍａｎ編， （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５）， ｐ． ４３９−４６２； ＷＯ ９７／０３６９２，ＷＯ ９６／４００７２，ＷＯ ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１５１】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ， 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」： Ｍ． Ｃｈａｓｉｎ及び Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ （編）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）， ｐｐ． １−４１。
【０１５２】
ここで提供されているＦＧＦ−１９を含んでなる治療的薬剤及び組成物は、様々に応用することができる。これら応用には、肥満又は肥満に関連した症状を有する個体の治療が含まれる。一側面では、ＦＧＦ−１９は、この症状を治療するのに有効な量のＦＧＦ−１９を必要とする個体へ投与される。好ましくは、この症状とは、次のうちの少なくとも１つが治療されることを必要とする：代謝の増大、体重の減少、体脂肪の減少、トリグリセリドの減少、遊離脂肪酸の減少、脂肪細胞からのグルコース放出の増加及び／又は脂肪細胞からのレプチン放出の増加。これらパラメーターの各々は、標準的な方法、例えば、酸素消費量を測定して代謝速度を決定するによって、体重計を用いて体重を測定する，そして大きさを測定して脂肪を割り出すことで測定することができる。更には、トリグリセリド、遊離脂肪酸、グルコース及びレプチンの存在と量を、標準的な方法で決定することができる。これら各々のパラメーターは、下記の特定の実施例において例示されている。
【０１５３】
ＦＧＦ−１９及びＦＧＦ−１９を含んでなる組成物は、インビボにて好んで用いられる。しかし、下記に記載のように、前出にて記載のＦＧＦ−１９のモジュレーターをスクリーニングするための方法のように、投与はインビトロで可能である。とはいえ、動物モデル及び患者からの試料を用いて、ＦＧＦ−１９のモジュレーターもまた同定することができることが理解されている。
【０１５４】
本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドを模倣又は増大させる（アゴニスト）、又はＦＧＦ−１９ポリペプチドの効果を予防又は阻害する（アンタゴニスト）を同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。ここでは、アゴニスト及びアンタゴニストはモジュレーターに相当する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＦＧＦ−１９ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
【０１５５】
このアッセイは、この分野で知られた技術である、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＦＧＦ−１９ポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０１５６】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＦＧＦ−１９ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＦＧＦ−１９ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１５７】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＦＧＦ−１９ポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者ら（Ｆｉｅｌｄｓ及びＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ９５７８−９５８２ （１９９１））に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ５７８９−５７９３ （１９９１）に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１５８】
ここで同定されたＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【０１５９】
アンタゴニストをアッセイするために、ＦＧＦ−１９ポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＦＧＦ−１９ポリペプチド存在下での関心ある活性を阻害する化合物の能力が化合物がＦＧＦ−１９ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＦＧＦ−１９ポリペプチド及び膜結合ＦＧＦ−１９ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、放射性等で標識でき、レセプターに結合したＦＧＦ−１９ポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．， １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＦＧＦ−１９ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリーがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＦＧＦ−１９ポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＦＧＦ−１９ポリペプチドに暴露する。ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１６０】
レセプター同定の代替的方法として、標識ＦＧＦ−１９ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＦＧＦ−１９ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
【０１６１】
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＦＧＦ−１９ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＦＧＦ−１９ポリペプチドの作用を競合的に阻害するＦＧＦ−１９ポリペプチドの変異形態であってもよい。
競合的結合アッセイを実施するここでの一実施態様では、ＦＧＦレセプター４又はＦＧＦ−１９に対する抗体を競合物として用いる。
【０１６２】
他の潜在的なＦＧＦ−１９ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＦＧＦ−１９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌ， Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： ４５６ （１９８８）； Ｄｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参照）、それによりＦＧＦ−１９ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＦＧＦ−１９ポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６： ５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ： ボーカラトーン， フロリダ， １９８８））。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に送達され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１６３】
潜在的アンタゴニストは、ＦＧＦ−１９ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＦＧＦ−１９ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
【０１６４】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１， 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの１つ又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１６５】
ここで提供されているすべてのアッセイは、幅広い種々の候補生物活性剤をスクリーニングすることに用いることができる。ここで用いられている「候補生物活性剤」、「候補薬剤」又は「候補薬」、又はここで用いられている文法的に同等の用語は、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチド、プリン類似体などの細胞活性表現型、又は核酸配列及びタンパク質配列の双方を含むＦＧＦ−１９配列の発現の何れかを直接的又は間接的に変化させることができる生物活性剤のために試験されるすべての分子を表す。
【０１６６】
候補薬剤は、主として有機分子であるが、多くの化学物質を包含し、好ましくは１００を越え、約２，５００ダルトン（ｄ）より小さい分子量を有する小有機化合物である。小分子は、ここで更に、５０ｄと２０００ｄの間の分子量を有すると定義される。その他の実施態様では、小分子は１５００より小さい、又は１２００より小さい、又は１０００より小さい、又は７５０より小さい、又は５００ｄより小さい分子量を有する。一実施態様では、ここで用いられる小分子は、約１００から２００ｄの分子量を有する。候補薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基を含み、特には水素結合、そして主には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシ又はカルボキシ基を含む。候補薬剤は、１つ又は複数の上記の官能基で置換された環状炭素又はヘテロ環状構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造を頻繁に含む。また、候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はその組み合わせの中に見出される。特に好まれるのはペプチドである。
【０１６７】
候補薬剤は、合成又は天然化合物のライブラリを含む幅広い種々のソースから得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、幅広い種々の化合物及び生物分子のランダム及び直接合成のための多くの手段を利用することができる。あるいは、細菌、糸状菌、植物及び動物抽出物のライブラリを利用することができるか、又は容易に作製することができる。更には、通常の化学的、物理的及び生化学的手段によって、天然又は合成的に作製されたライブラリ及び化合物を容易に修飾できる。構造類似体を作製するために、既知の薬理学的な薬剤にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの直接又はランダム化学修飾を施してもよい。
【０１６８】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤はタンパク質である。ここで「タンパク質」によってとは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合的に結合しているアミノ酸を意味する。このタンパク質は、天然発生アミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造で構成されうる。従って、ここで用いられる「アミノ酸」、又は「ペプチド残基」とは、天然発生及び合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは、本発明の目的のアミノ酸であると考えられている。また、「アミノ酸」は、プロリン及びヒドロキシプロリンのようなイミノ酸残基を含む。その側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置の何れかである。好ましい実施態様では、このアミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配置である。非天然発生側鎖が用いられる場合には、非アミノ酸置換基が、例えばインビボでの分解を防いだり、遅くしたりすることに用いられてもよい。
【０１６９】
好ましい実施態様では、候補生物活性薬剤は、天然発生タンパク質又は天然発生タンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダム又は直接消化物を用いてもよい。この方法では、原核生物及び真核生物タンパク質のライブラリは、本発明の方法でのスクリーニングのために作製される。特に、この実施態様で好まれるのは、細菌、糸状菌、ウイルス、及び哺乳動物タンパク質のライブラリであり、後者は好まれており、そしてヒトタンパク質が特に好まれている。
【０１７０】
好ましい実施様態では、候補生物活性剤は、約５から約３０アミノ酸のペプチドで、約５から約２０アミノ酸が好まれ、そして約７から約１５が特に好まれる。このペプチドは、上記で概説したように、ランダムペプチド、又は「偏向」ランダムペプチドで、天然発生タンパク質の消化物でありうる。「ランダム化」又はここで文法的に同等な表現によって、各核酸及びペプチドは、基本的に、各々ランダムヌクレオチド及びアミノ酸で構成されていると言われている。一般的に、これらランダムペプチド（又は核酸、下記にて記載）は化学的に合成されることから、それらは、任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置へ取り入れうる。この合成工程は、ランダム化タンパク質又は核酸を生成し、配列の長さにわたってすべて又は殆どの可能性ある組み合わせの形成を許容するために設計することができ、故にランダム化候補生物活性タンパク質性剤のライブラリを形成する。
【０１７１】
１つの実施態様では、すべての位置において配列優先又は一定さをともなわずに、ライブラリは完全にランダム化される。好ましい実施態様では、ライブラリは偏っている。すなわち、配列内のある位置は、一定に保たれているか、限られたメンバーの可能性から選択されるかの何れかである。例えば、好ましい実施態様では、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体構造的に偏った（小さい又は大きいのどちらか）残基の明確な種類において、核酸結合ドメインの作成、システインの作成、架橋結合のため、ＳＨ−３ドメインのプロリン、セリン、スレオニン、チロシン又はヒスチジンのリン酸化部位など、又はプリンに対するなどのために、ヌクレオチド又はアミノ酸残基はランダム化されている。
【０１７２】
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は核酸である。「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又はここでの文法的に同等の表現によって、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合的にともに結合していると意味される。本発明の核酸は、概してリン酸ジエステル結合を含んでいるが、下記に概説するように、幾つかの場合は、代替バックボーンを有しうる核酸類似体が含まれ、この代替バックボーンは、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）： １９２５（１９９３）及びその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｏｒｇ． ３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら， Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８０５（１９８４）， Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０（１９８８）；及びＰａｕｗｅｌｓら．， Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１４３７（１９９１）；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕら．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１： ２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルフォスフォアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照のこと）、及びペプチド核酸バックボーン及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら．， Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７（１９９６）、すべて参考文献によって取り入れている）を含んでなる。他の類似核酸は、ポジティブ（陽性）バックボーン（Ｄｅｎｐｃｙら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６０２７（１９９５）；非イオンバックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３： １５９７（１９９４）；第２章及び３章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｅｄ． Ｙ．Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ 及びＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７：７４３（１９９６））並びに非リボゾームバックボーンを含み、それらは米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、及び第６及び７章、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０， ”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｅｄ． Ｙ．Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ及びＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載のものを含む。１つ又は複数の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７９）。幾つかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ， Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２， １９９７ ３５ページに記載されている。この結果、これら参考文献のすべてが、参考文献によって明らかに取り入れられている。リボース−リン酸バックボーンの修飾は、標識のような付加的物質の付加を容易にするためか、または生理的環境下におけるそのような分子の安定性と半減期を増すためにに施されるであろう。更には、天然発生核酸と類似体の混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、及び天然発生核酸と類似体の混合物を作製してもよい。この核酸は、仕様としては、一本鎖又は二本鎖でもよく、或いは二本鎖又は一本鎖配列の双方の部分を含んでもよい。この核酸が任意のデオキシリボ−及びリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、及びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む任意の塩基の組み合わせを含む場合には、この核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの双方、ＲＮＡ又はハイブリッドでもよい。
【０１７３】
タンパク質に関する上記の一般的な記述のように、核酸候補生物活性剤は、天然発生核酸、ランダム核酸、又は「偏向」ランダム核酸でよい。例えば、タンパク質に関して上記にて概説しているように、原核生物又は真核生物ゲノムの消化物を用いてもよい。
好ましい実施態様では、候補生物活性剤は、有機化学的物質であり、その幅広い多くのものを文献から得ることが可能である。
上記にて概説した好ましい実施例では、個々の遺伝子と遺伝子の産物（タンパク質）についてスクリーニングをおこなってもよい。好ましい実施態様では、遺伝子又はタンパク質は、特定の組織と関連した別々に発現した遺伝子であり、よって条件はこれら組織に関連しているとして、下記の実施例に記載されているように同定された。従って、一実施態様では、スクリーニングは、ＦＧＦ−１９へ結合することができる候補薬剤を最初に見出すように設計され、次いで、候補薬剤のＦＧＦ−１９活性を調節する能力を評価するアッセイに、これら薬剤は用いられうる。従って、当該分野において認識されているように、実行しうる異なった数多くの方法がある。
【０１７４】
ＦＧＦ−１９の活性を調節する薬剤のスクリーニングも実行される。好ましい実施態様では、ＦＧＦ−１９の活性を調節することができる生物活性剤のスクリーニングの方法は、ＦＧＦ−１９の試料へ候補生物活性剤を添加し、ＦＧＦ−１９の生物学的活性の変化を測定する段階を含む。「ＦＧＦ−１９の活性を調節すること」は、活性の増加、活性の低下、又は存在する活性の型や種類の変化を含む。従って、この実施態様では、候補薬剤は、ＦＧＦ−１９へ結合するはずであるし（これは、必修でなくてもよいが）、そしてここで定義されるＦＧＦ−１９の生物学的又は生化学的活性を変化するはずである。この方法は、上記にて全般的に概説したインビトロスクリーニング法、及びＦＧＦ−１９の存在、発現、分布、活性、量での変化に関する細胞のインビボスクリーニング法の両方を含む。
【０１７５】
従って、この実施態様では、これらの方法は、試料と候補生物活性剤を組み合わせること、並びにＦＧＦ−１９活性への効果を評価することを含む。「ＦＧＦ−１９タンパク質活性」又はここでの文法的に同等の用語によって、上記に記載した、少なくともＦＧＦ−１９タンパク質の生物学的活性が表される。
好ましい実施態様では、ＦＧＦ−１９タンパク質の活性が上昇する；その他の好ましい実施態様では、ＦＧＦ−１９タンパク質の活性が低下する。従って、アンタゴニストである生物活性剤は、ある実施態様で好まれ、アゴニストである生物活性剤は、他の実施態様で好まれうる。
本発明の一側面では、ＦＧＦ−１９に対する薬剤候補物質の効果を評価することで、ＦＧＦ−１９配列を含む細胞は薬剤スクリーニングアッセイで用いられる。細胞型は、正常細胞、腫瘍細胞、及び脂肪細胞を含む。
【０１７６】
グルコース取り込み、レプチン放出、新陳代謝、トリグリセリド及び遊離脂肪酸レベル、体重及び体脂肪の変化ようなＦＧＦ−１９活性を評価する方法は、当該分野で知られており、下記の実施例において例示されている。
好ましい実施態様では、上記の定義のように、この方法は、ＦＧＦ−１９を含む細胞へ候補生物活性剤を添加することを含む。好ましい細胞型は、殆どすべての細胞を含む。これらの細胞は、好ましくは組み換え体であるが、ＦＧＦ−１９タンパク質をコードする核酸を含む。好ましい実施態様では、候補薬剤のライブラリは、多数の細胞で試験される。
【０１７７】
一側面では、このアッセイは、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法剤を含む薬理学的薬剤、放射線、発癌物質、又は他の細胞（すなわち、細胞間接触）などの生理学的シグナルへの存在下又は非存在下での、又は先だっての又は後での曝露で評価される。その他の実施例では、測定は、細胞周期プロセスの異なった段階で確定される。
また、ここで提供されるＦＧＦ−１９配列は、診断方法で用いることができる。ＦＧＦ−１９の過剰発現は異常に高い代謝速度を示し、発現抑制は肥満の傾向を示す。更には、変異又は機能失調のＦＧＦ−１９に関して、患者からの試料を分析してもよい。一般的には、そのような方法は、患者からの試料を比較すること、及びＦＧＦ−１９の発現をコントロールのそれと比較することを含む。
【０１７８】
Ｆ．抗ＦＧＦ−１９抗体
本発明は抗ＦＧＦ−１９抗体を更に提供する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【０１７９】
１．ポリクローナル抗体
抗ＦＧＦ−１９抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、１つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１８０】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ＦＧＦ−１９抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する１つ又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１８１】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＦＧＦ−１９に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１８２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１８３】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；上掲のＭｏｒｒｉｓｏｎら］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１８４】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１８５】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗ＦＧＦ−１９抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
【０１８６】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１８７】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Ｃｏｌｅら， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１） ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇら， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
【０１８８】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＦＧＦ−１９に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９ （１９９１）に開示されている。
【０１８９】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１９０】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１９１】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５） は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１９２】
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５ （１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１９３】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
【０１９４】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＦＧＦ−１９ポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアームは、特定のＦＧＦ−１９ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＦＧＦ−１９ポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＦＧＦ−１９結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はＦＧＦ−１９ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１９５】
５．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／２００３７３；ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１９６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）を参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）を参照。
【０１９７】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされた抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１９８】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）にコンジュゲートされてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１９９】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎら， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【０２００】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＦＧＦ−１９ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
【０２０１】
ＦＧＦ−１９ポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７８８９−７８９３ （１９９３）参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つを越える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２０２】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅに開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２０３】
持続放出性製剤を調製してもよい。持続放出性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２０４】
Ｇ．抗ＦＧＦ−１９抗体の用途
本発明の抗ＦＧＦ−１９抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ＦＧＦ−１９抗体は、ＦＧＦ−１９の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８７） ｐｐ． １４７−１５８］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位をコンジュゲートさせるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはＨｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， １４４：９４５ （１９６２）；Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： １０１４ （１９７４）；Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ４０：２１９ （１９８１） ；及びＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．， ３０：４０７ （１９８２）に記載された方法が含まれる。
【０２０５】
また、抗ＦＧＦ−１９抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＦＧＦ−１９のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＦＧＦ−１９に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＦＧＦ−１９を含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＦＧＦ−１９以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＦＧＦ−１９を抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示目的でのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０２０６】
実施例
実施例において言及されている市販の試薬は、特段の指示がない限り製造者の説明に従って使用された。以下の実施例及び本明細書全体を通じてＡＴＣＣ登録番号により同定される細胞出所は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）， マナサス， バージニアである。
【０２０７】
実施例１
ヒトＦＧＦ−１９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＳＴ配列登録番号ＡＦ００７２６８、マウス線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１５）は種々の公的なＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｄａｙｈｏｆｆ等）を検索するために用いられた。検索は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：４６０−４８０ （１９９６））を利用し、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳に対する比較により行われた 。検索の結果、ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ　ＡＡ２２０９９４がヒットし、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ　ＮＴ２の神経前駆体９３７２３０として同定されていた。また、ＡＡ２２０９９４の配列は、ここではＤＮＡ４７４１２として言及されている。
【０２０８】
ＤＮＡ４７４１２配列に基づき、１）目的の配列を含むｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより同定するために、及び２）ＦＧＦ−１９に対する全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドが合成された。通常、正方向及び逆方向のＰＣＲプライマーは２０から３０ヌクレオチドの範囲内で、しばしば、約１００から１０００ｂｐの長さのＰＣＲ産物を産生するように設計される。場合によって、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐ以上であるとき、さらにオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー由来のＤＮＡは、ＡｕｓｕｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、上掲に従い、ＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲ増幅によりスクリーニングされる。その後、陽性ライブラリーは、プローブオリゴヌクレオチド及び一対のプライマーペアーを用いて、目的の遺伝子をコードするクローンを単離するために使用された。
【０２０９】
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）が合成された：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＴＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡ−３’
（配列番号：３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＧＴＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡ−３’
（配列番号：４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、以下に示されるヌクレオチド配列を持つＤＮＡ４７４１２から構築された。
ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＧＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＴＡ−３’
（配列番号：５）
【０２１０】
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児網膜組織から単離された。ｃＤＮＡクローンを単離するために使用されるｃＤＮＡライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ，サンディエゴ， カリフォルニアからのような市販の試薬を使用し、標準的な方法によって構築された。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩサイトを含むオリゴｄＴから伸長させ、平滑末端にて半リン酸化されたＳａｌＩアダプターと連結し、ＮｏｔＩにて切断後ゲル電気泳動にて適当なサイズに分離し、ベクターに特有のＸｈｏＩサイト及びＮｏｔＩサイトを利用し、決まった方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤなど；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩサイトを含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３：１２７８−１２８０ （１９９１）を参照のこと）にクローン化した。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ＦＧＦ−１９ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列（ここでは、ＤＮＡ４９４３５−１２１９（Ｆｉｇ１、配列番号：１）と命名されている）、及びＦＧＦ−１９ポリペプチドに対する誘導体のタンパク質配列を示した。
【０２１１】
上述のように同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置４６４−４６６に見かけの翻訳開始部位、及びヌクレオチド位置１１１２−１１１４に停止シグナルを持つ単一の読み枠を含んでいた（配列番号：１）。予想されるポリペプチド前駆体は、２１６アミノ酸長で、およそ２４，００３ダルトンの計算上の分子量、及びおよそ６．９９の推定されるｐＩをもつ。Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示される全長ＦＧＦ−１９配列の解析により、Ｆｉｇ２に示されるように様々な重要なポリペプチドドメインの存在が証明されたが、これらの重要なポリペプチドドメインを示す位置は、上述のごとく、おおよそのものである 。染色体マッピングにより、ＦＧＦ−１９コード化核酸は、ヒトの染色体１１ｑ１３．１中バンドｑ１３．１にマップされることが明らかとなっている。クローンＤＮＡ４９４３５−１２１９は、１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣに寄託されており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０が割り当てられている。
Ｆｉｇ２に示される全長配列（配列番号：２）のＡＬＩＧＮ−２配列整列解析を用いた、Ｄａｙｈｏｆｆデーターベース（バージョン３５．４５Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ３５）の解析により、ＦＧＦ−１９アミノ酸配列と以下に示すＤａｙｈｏｆｆ配列との間の配列同一性が証明された：ＡＦ００７２６８＿１， Ｓ５４４０７， Ｐ＿Ｗ５２５９６， ＦＧＦ２＿ＸＥＮＬＡ， Ｐ＿Ｗ５３７９３， ＡＢ００２０９７＿１， Ｐ＿Ｒ２７９６６， ＨＳＵ６７９１８＿１， Ｓ２３５９５， 及びＰ＿Ｒ７０８２４。
【０２１２】
実施例２
ハイブリダイゼーションプローブとしてのＦＧＦ−１９の使用
以下の方法では、ＦＧＦ−１９をコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用について記述する。
全長又は成熟ＦＧＦ−１９のコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーに存在するホモログＤＮＡ（自然に生じるＦＧＦ−１９変異体をコードするようなもの）をスクリーニングするためのプローブとして用いられる。
いずれか一方のライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮性条件下にて実施される。フィルターに対する放射標識されたＦＧＦ−１９由来のプローブのハイブリダイゼーションは、５０％　ホルムアミド、５ｘ　ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、０．１％　ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘ デンハード溶液、及び１０％　硫酸デキストラン中で、４２℃、２０時間行われた。フィルターの洗浄は、０．１ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中、４２℃にて実施される。
その後、全長天然配列ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡと所望の配列同一性をもつＤＮＡは、当該技術分野において既知の標準的技術を使用して同定し得る。
【０２１３】
実施例３
大腸菌中でのＦＧＦ−１９の発現
本実施例は、大腸菌での組換体の発現によるＦＧＦ−１９の非グリコシル化形態の調製を示す。
ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡ配列は、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには、選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位が含まれるべきである。種々の発現ベクターが用いられる。適当なベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９７７）参照のこと）などである。ベクターは制限酵素で切断し、脱リン酸化する。次いで、このＰＣＲで増幅された配列を、ベクターへライゲーションする。好ましくは、ベクターには、抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＦＧＦ−１９コード化領域、ラムダ転写停止部位、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列が含まれる。
【０２１４】
その後、ライゲーション混合物は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲中に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換させるのに使用される。形質転換体は、ＬＢプレート上での生育能により同定され、抗生物質耐性コロニーが選択される。プラスミドＤＮＡは単離され、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定により配列確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢ培地のような液体培養液中で一晩増殖させることが可能である。この一晩かけて培養した産物は、引き続き、大規模培養に植菌するために使用されてもよい。その後、細胞は所望の吸光度になるまで増殖させ、その間に発現プロモーターが始動される。
さらに数時間細胞を培養した後、細胞は遠心により回収することができる。遠心により得られた細胞沈殿物は、当該技術分野において既知の種々の試薬を用いて可溶化することができ、その後、可溶化されたＦＧＦ−１９タンパク質は、当該タンパク質との強固な結合を可能にする条件下にて金属キレートカラムを用い、精製することができる。
【０２１５】
ＦＧＦ−１９は、以下の方法に従い、ポリｈｉｓタグ形態で、大腸菌中で発現される。ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡは、まず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅される。プライマーには選択される発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び有効かつ信頼性のある翻訳開始部位、金属カラムによる迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク切断的除去を提供する他の有用な配列が含まれている。その後、ＰＣＲで増幅され、ポリｈｉｓでタグ化された配列は、発現ベクターに連結され株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））由来の大腸菌宿主を形質転換するのに使用される。形質転換体は、最初に、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で、Ｏ．Ｄ．６００に到達するまで３０℃で３−５時間振盪しながら増殖させる。培養物は５０−１００倍にＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ，１．０７ｇのＫＣｌ，５．３６ｇのディフコ　イーストエキストラクト，５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ　ｈｙｃａｓｅ　ＳＦを５００ｍＬの水の溶解し、さらに、１１０ｍＭ　ＭＰＯＳ，ｐＨ７．３，０．５５％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び７ｍＭ　ＭｇＳＯ４になるように添加する）中にて希釈し、おおよそ、２０−３０時間、３０℃にて振盪させながら増殖させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を検証するために試験サンプルをとり、全培養物は細胞を沈殿させるために遠心する。細胞沈殿は、精製及び巻き戻しまで凍結させる。
【０２１６】
０．５から１Ｌの発酵槽からの大腸菌のペースト（６−１０ｇペレット）を１０倍量（Ｗ／Ｖ）の７Ｍ　グアニジン，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８のバッファーに再懸濁させる。固体の亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを、各々、最終濃度０．１Ｍ及び０．０２Ｍになるように添加し、溶液は一晩、４℃にて撹拌される。このステップの結果、全てのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質が得られる。溶液は、ベックマンの超遠心機にて４０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心される。上清は３−５倍容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍ　グアニジン，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）で希釈され、夾雑物を除くため、０．２２μフィルターを通してろ過される。浄化された抽出液を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍＬのキアゲンＮｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにかける。カラムは、５０ｍＭ　イミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ），ｐＨ７．４を含む別途のバッファーにより洗浄される。タンパク質は２５０ｍＭ　イミダゾールを含むバッファーにて溶出される。所望のタンパク質を含む画分がプールされ４℃にて保存される。タンパク質濃度は、タンパクのアミノ酸配列に基づく計算上の吸光係数を用いて吸光度２８０ｎｍにより見積もられる。
【０２１７】
タンパク質は、次のような構成物で構成される新しく調製された巻戻しバッファー中で、サンプルをゆっくりと希釈することにより巻き戻される；２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．６，０．３Ｍ　ＮａＣｌ，２．５Ｍ　尿素，５ｍＭ　システイン，２０ｍＭ　グリシン，及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ。巻戻し容積は、最終的なタンパク質濃度が５０から１００ｍｇ／ｍｌの間になるように選択される。巻戻し溶液は、４℃にて１２−３６時間穏やかに撹拌される。巻戻し反応は、ＴＦＡを最終濃度０．４％（ｐＨおよそ３）になるように添加することにより停止される。タンパク質の更なる精製の前に、容積は０．２２μフィルターを通してろ過され、アセトニトリルが最終濃度２−１０％になるように添加される。巻き戻されたタンパク質は、アセトニトリル濃度勾配が１０から８０％である、０．１％　ＴＦＡの溶出バッファーを用いて、ＰｏｒｏｓＲ１／Ｈ逆相カラムにてクロマトされる。Ａ２８０の吸収をもつ画分のアリコットがＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析され、均一な巻戻しタンパク質を含む画分がプールされる。通常、適切にも巻き戻されたほとんどのタンパク質は、逆相レジンとの相互作用から遮蔽される疎水性内部を有する最もコンパクトなもののため、これらの種のタンパク質は最も低いアセトニトリル濃度にて溶出される。凝縮体は、通常、高いアセトニトリル濃度にて溶出される。望ましい形態から誤って巻き戻されたタンパク質の形態を分離することに加え、逆相のステップは、サンプルからエンドトキシンをも除去する。
所望の巻戻されたＦＧＦ−１９ポリペプチドを含む画分はプールされ、アセトニトリルはタンパク質溶液に直接、窒素を穏やかに吹き付けることにより除去される。タンパク質は、透析又は製剤化バッファーで平衡化されたＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）レジンを用いたゲルろ過、及び滅菌的にろ過されることにより、０．１４Ｍ　塩化ナトリウム，及び４％　マンニトールを含む２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ６．８中に製剤化される。
【０２１８】
実施例４
哺乳類細胞におけるＦＧＦ−１９の発現
本実施例は、哺乳類細胞における組換体発現によりＦＧＦ−１９の潜在的にグリコシル化された形態の調製を示す。
ベクター、ｐＲＫ５（欧州特許第３０７，２４７号、１９８９年３月１５日発行を参照のこと）は、発現ベクターとして用いた。 随意に、ＦＧＦ−１９ＤＮＡは、ＦＧＦ−１９ＤＮＡの挿入を可能にするように選択された酵素により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲中で記載されているような連結方法を用いて、ｐＲＫ５に連結される。その結果得られるベクターはｐＲＫ５−ＦＧＦ−１９と呼ばれる。
一の実施態様において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２３９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１５７３）は、ウシ胎児血清及び、任意に栄養素構成成分及び／又は抗生物質を添加されたＤＭＥＭなどの培養液中、組織培養プレート中でコンフルエントになるまで生育させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＦＧＦ−１９ＤＮＡは、ＶＡ　ＲＮＡ遺伝子（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２））をコードする約１μｇのＤＮＡと混合され、５００μｌの１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．２２７Ｍ　ＣａＣｌ２， に溶解させる。この混合物に対し、５００μｌの５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５），２８０ｍＭ　ＮａＣｌ，１．５ｍＭ　ＮａＰＯ４ を一滴ずつ添加し、２５℃で１０分間、沈殿を形成させる。培養液は、アスピレーターで除去し、２０％グリセロールを含む２ｍｌのＰＢＳを３０秒間添加する。２９３細胞は、無血清培地で洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を約５日間培養する。
【０２１９】
おおよそ、形質移入２４時間後、培養液を除去し、培養液（のみ）、又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養液で置換する。培養１２時間後、条件培地を回収し、スピンフィルターにて濃縮し、１５％ＳＤＳゲルで泳動する。泳動後ゲルを乾燥させ、 ＦＧＦ−１９ポリペプチドの存在を示すように選択された時間、フィルムを露光させる。軽質移入された細胞を含む培地は、さらに培養され（無血清培地中）、培養液は選択されたバイオアッセイで試験される。
それに代わる技術により、ＦＧＦ−１９はＳｏｍｐａｒｙｒａｃら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， １２：７５７５（１９８１）により記述された硫酸デキストラン法を用い、２９３細胞へ一過的に導入されてもよい。２９３細胞はスピナーフラスコ中で最大密度になるように生育させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＦＧＦ−１９ＤＮＡが添加される。まず、細胞は遠心によりスピナーフラスコから濃縮され、ＰＢＳにて洗浄される。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物は、４時間、細胞ペレット上でインキュベートされる。細胞は、９０秒間２０％グリセロールで処理し、組織培養液で洗浄し、組織培養液、５μｇ／ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコへ再び移される。約５日後、条件培地は、遠心され細胞及び細胞片を除去するためにろ過される。その後、発現されたＦＧＦ−１９を含むサンプルは、濃縮され、透析及び／又はカラムクロマトグラフィーのような選択されたいずれかの方法により精製され得る。
【０２２０】
他の実施態様において、ＦＧＦ−１９はＣＨＯ細胞中にて発現され得る。ｐＲＫ５−ＦＧＦ−１９は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥデキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞へ形質移入され得る。上述したように、細胞培養物はインキュベートされ、培地は、培養液（のみ）又は３５Ｓ−メチオニンのような放射標識物を含む培養液に置換される。ＦＧＦ−１９ポリペプチドの存在を定量後、培養液は無血清培地で置換される。好ましくは、培養は約６日間行われ、その後条件培地を回収する。発現されたＦＧＦ−１９を含む培養液は、いずれか選択された方法により濃縮され、精製される。
また、エピトープタグ化されたＦＧＦ−１９は、宿主ＣＨＯ細胞中でも発現される。ＦＧＦ−１９は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングされる。サブクローン化されたインサートは、ポリｈｉｓタグのような選択されたエピトープタグと共にフレームが合うように、バキュロウイルスの発現ベクターへ融合されるようにＰＣＲを行うことも可能である。ポリｈｉｓタグＦＧＦ−１９インサートは、安定クローンの選択のためにＤＨＦＲのような選択マーカーを含むＳＶ４０作動性ベクターへサブクローニングすることができる。最終的に、ＣＨＯ細胞は、ＳＶ４０作動性ベクターで形質移入されること（上述のように）が可能である。上述のように、発現を確認するために標識化することを行ってもよい。その後、発現されたポリタグ化ＦＧＦ−１９を含む培養液は、濃縮することも可能であり、Ｎｉ２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーのような、いずれか選択された方法で精製される。
【０２２１】
また、ＦＧＦ−１９はＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で一過的発現方法により発現してもよく、ＣＨＯ細胞中で、他の安定発現法によってもよい。
ＣＨＯ細胞中での安定発現は、以下の方法を用いて実施される。タンパク質は、ＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現され、この場合、各タンパク質の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）に対するコード化配列は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合され、及び又は、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態である。
ＰＣＲ増幅の後、各ＤＮＡは、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）中に記載の標準的な技術を用いてＣＨＯ発現ベクターへサブクローン化される。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの簡便なシャトリング（入替え）を可能にするために、目的のＤＮＡの５’及び３’と適合する制限酵素部位をもつように構築される。ＣＨＯ細胞で発現に用いられるベクターは、Ｌｕｃａｓら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：９ （１７７４−１７７９ （１９９６））中に記載されているように使用され、目的のｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現を誘起するために、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用する。
【０２２２】
所望のプラスミドＤＮＡ１２μｇを、市販の形質移入試薬、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）又はＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、およそ１０，０００，０００のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、Ｌｕｃａｓら， 上掲中で記載されているように生育される。およそ３ｘ１０−７細胞が、その後の増殖及び後述の産生に使用するため、アンプル中に凍結される。　プラスミドＤＮＡを含むアンプルは、水浴中に静置し、ボルテックスを行うことにより解凍される。内容物は、ピペッティングにより１０ｍｌの培養液を含む遠心用チューブに移され、５分間、１０００ｒｐｍで遠心される。上清はアスピレーターで除去され、細胞は１０ｍｌの選択培地（０．２μｍでフィルターろ過された５％ウシ胎児血清を含し、０．２μｍフィルターでろ過されたＰＳ２０）に再懸濁される。その後、細胞は、９０ｍｌの選択培地を含む１００ｍＬのスピナーへ分取される。１−２日後、細胞は、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たされた２５０ｍＬのスピナーへ移され、３７℃で培養される。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、及び２０００ｍＬのスピナーに３ｘ１０５細胞／ｍｌになるように播種される。細胞培養液は、遠心により新しい培地と交換し産生培地へ再懸濁させる。適切ないずれかのＣＨＯ培地が用いられが、１９９２年６月１６日発行の米国特許第５，１２２，４６９号中に記載の産生培地が実際には使用された。３Ｌの産生スピナーに１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種される。０日目、細胞数、ｐＨが決定される。１日目、スピナーからサンプリングされ、ろ過された空気の散布が開始される。２日目、スピナーからサンプリングされ、温度が３３℃へ変更され、５００ｇ／Ｌのグルコース３０ｍＬ及び１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサン　エマルジョン、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、０，６ｍｌが加えられる。生産の過程を通じて、ｐＨは必ず７．２付近を保つように調整される。１０日後、又は生存率が７０％以下に落ち込むまで、細胞培養物は、遠心及び０．２２μｍのフィルターを通してろ過することにより回収される。ろ過産物は、４℃で保存されるか、即時に精製用のカラムに通されるかのいずれかとなる。
【０２２３】
ポリ−Ｈｉｓタグ化構築物に関しては、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してタンパク質の精製が行われる。精製の前に、イミダゾールが５ｍＭの濃度になるように条件培地に添加される。条件培地は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ及び５ｍＭ　イミダゾールを含む２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化された６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／ｍｉｎの流速で送り込まれる。カラムに添加後、カラムはさらに平衡化バッファーで洗浄され、タンパク質は０．２５Ｍ　イミダゾールを含む平衡化バッファーで溶出される。続いて、高度に精製されたタンパク質は、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，０．１４Ｍ　ＮａＣｌ及び４％　マンニトール，ｐＨ６．８を含む保存用バッファーへ、２５ｍｌＧ２５Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで脱塩され、−８０℃で保存される。
【０２２４】
イムノアドヘシン（Ｆｃ−包含）構築物は、以下のように条件培地から精製される。条件培地は２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化された５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）へ送り込まれる。カラムに添加後、カラムは１００ｍＭ　クエン酸，ｐＨ３．５で溶出される前に平衡化バッファーで大規模に洗浄される。溶出されたタンパク質は、２７５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ９を含むチューブへ１ｍｌ画分を回収することにより、即座に中和される。高度に精製されたタンパク質は、次いで、ポリ−Ｈｉｓタグ化タンパク質に関して上述されているように保存用バッファー中で脱塩される。均一性は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及びエドマン分解法によるＮ末端アミノ酸配列決定により評価される。
【０２２５】
実施例５
酵母におけるＦＧＦ−１９の発現
以下に示す方法は、酵母における組換体ＦＧＦ−１９細胞の発現について記述したものである。
まず最初に、酵母の発現ベクターが、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＦＧＦ−１９の細胞内生産又は分泌のために構築される。分泌のために、ＦＧＦ−１９をコードするＤＮＡは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然のＦＧＦ−１９シグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチド、又は、例えば、酵母α−因子若しくはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及びリンカー配列（必要ならば）をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミド中へクローン化することができる。
【０２２６】
その後、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞は上述の発現プラスミドで形質転換することができ、選択された発酵培地で培養できる。形質転換された酵母の上清は、１０％のトリクロロ酢酸で沈殿化することにより分析することが可能で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマジーブルーによるゲルの染色が行われる。
次いで、組換体ＦＧＦ−１９を単離し、発酵培地から遠心にて酵母細胞を除くことにより精製することができ、その後、選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮する。ＦＧＦ−１９を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィーレジンを用いて、さらに精製される。
【０２２７】
実施例６
バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＦＧＦ−１９の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるＦＧＦ−１９の発現について記述したものである。
ＦＧＦ−１９をコードする配列は、バキュロウィルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流と融合される。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及びイムノグロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域に類似の）を含む。種々のプラスミドが用いられるが、市販のｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のようなプラスミド由来のプラスミドが含まれる。大まかには、ＦＧＦ−１９をコードする配列、又は膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のようなＦＧＦ−１９のコード配列のうち所望の部分、又はタンパク質が細胞外タンパクの場合は成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーによりＰＣＲ法で増幅される。５’プライマーは隣接する制限酵素部位（選択された）を含んでいてもよい。その後、増幅産物は、選択された制限酵素により切断され、発現ベクターにサブクローニングされる。
【０２２８】
組換体バキュロウィルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏ Ｇｏｌｄ（商品名）ウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１７１１）にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されている）を用いて共形質転換により産生される。２８℃にて４−５日培養後、放出されたウィルスは回収され、さらに増幅させるため利用される。ウィルス及びタンパク質発現は、上述のようにＯ’Ｒｅｉｌｌｅｙら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）の方法により行われる。
【０２２９】
発現されたポリ−ｈｉｓタグ化ＦＧＦ−１９は、例えば、以下のようにＮｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）において記載されているように、組換体ウィルスを感染させたＳｆ９細胞から調製される。大まかには、Ｓｆ９細胞は洗浄され、超音波処理バッファー（２５ｍＬ　Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ；１０％　グリセロール；０．１％　ＮＰ−４０；０．４Ｍ　ＫＣｌ）中に再懸濁され、氷上にて２０秒間２度超音波処理される。超音波処理された産物は、遠心にて夾雑物が除かれ、その上清はローディングバッファー（５０ｍＭ　リン酸、３００ｍＭ　ＮａＣｌ，１０％　グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈され、０．４５μｍのフィルターでろ過される。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販されている）は、総容積５ｍＬで調製され、２５ｍＬの水で洗浄され、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡化される。ろ過された細胞抽出物液は、１分間に０．５ｍＬの流速でカラムに添加される。カラムは、ベースラインのＡ２８０になるまでローディングバッファーで洗浄され、その時点で分取が開始される。次に、カラムは第二の洗浄バッファー（５０ｍＭ　リン酸；３００ｍＭ　ＮａＣｌ，１０％　グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄され、非特異的に結合したタンパク質を溶出させる。Ａ２８０がベースラインにまで再度到達した後に、カラムは、第二のバッファー中０から５００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により展開される。１ｍＬずつ分取され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はＮｉ２＋−ＮＴＡ結合アルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）によるウェスタンブロットにより解析される。溶出されたＨｉｓ１０タグ化ＦＧＦ−１９を含む画分がプールされローディングバッファーに対して透析される。
あるいは、ＩｇＧタグ化（又はＦｃタグ化）ＦＧＦ−１９の精製は、既知のクロマトグラフィー技術、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを用いることにより行うことができる。
【０２３０】
実施例７
ＦＧＦ−１９と結合する抗体の調製
本実施例は、ＦＧＦ−１９と特異的に結合するモノクローナル抗体の調製について示すものである。
モノクローナル抗体を産生するための技術は、当該技術の分野において周知であり、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、上掲中に記載されている。用いられる免疫原には、精製されたＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−１９を含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換体ＦＧＦ−１９を発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、過度の実験を行うことなく、当業者により行われ得るものである。
【０２３１】
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスが、完全フロイトアジュバント中でエマルジョン化されたＦＧＦ−１９免疫原で免疫され、１−１００μｇの量で皮下又は腹腔内に注射される。あるいは、免疫源はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ハミルトン， モンタナ）中でエマルジョン化され、動物の後足のパッド部分に注射される。その後、免疫されたマウスは、１０から１２日後に選択したアジュバント中でエマルジョン化された追加の免疫原により追加免疫される。その後、数週間の後、マウスはさらに免疫注射により追加免疫される。血清サンプルは、抗ＦＧＦ−１９抗体を検出するためにエライザアッセイによりテストのために定期的にマウスから眼窩球出血により採取される。
【０２３２】
適当な抗体価が検出された後、抗体に対し「陽性」の動物は最終的にＦＧＦ−１９の静脈注射によりインジェクトされる。３から４日後、マウスは処理され、脾臓細胞が回収される。脾臓細胞は、ＡＴＣＣ，Ｎｏ．ＣＲＬ１５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたマウスミエローマ細胞株と融合される（３５％ポリエチレングリコールを使用）。融合細胞は、その後、非融合細胞、ミエローマ同士のハイブリッド、脾臓細胞同士のハイブリッドの生育を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングされ得るようなハイブリドーマを産生する。
【０２３３】
ハイブリドーマ細胞は、ＦＧＦ−１９に対する反応性に関し、エライザによりスクリーニングされることになる。ＦＧＦ−１９に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」のハイブリドーマ細胞の同定は、当該技術の範囲内のことである。
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗ＦＧＦ−１９モノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、同系のＢａｌｂ／ｃマウスへ腹腔内にインジェクトされる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコ又はローラーボトル中で生育させることが可能である。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿を用いたのち、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行うことができる。あるいは、プロテインＡ又はプロテインＧに対する抗体の結合性に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
【０２３４】
実施例８
特異的な抗体を用いたＦＧＦ−１９ポリペプチドの精製
天然又は組換体ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、タンパク質精製の分野において様々な標準的な技術により精製される。例えば、ｐｒｏ−ＦＧＦ−１９ポリペプチド、成熟ＦＧＦ−１９ポリペプチド、又はｐｒｅ−ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、目的のＦＧＦ−１９ポリペプチドに対して特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。通常、イムノアフィニティーカラムは活性化されたクロマトグラフィー用の樹脂に抗ＦＧＦ−１９ポリペプチドを共有結合的にカップリングさせることにより構築される。
【０２３５】
ポリクローナルイムノグロブリンは、免疫された血清から硫安沈殿法、又は固定化プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ニュージャージー）による精製のいずれかの方法により調整される。同様に、モノクローナル抗体はマウス腹水液から硫安沈殿又は固定化プロテインＡによるクロマトグラフィーにより精製される。部分精製されたイムノグロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフィー用樹脂に共有結合的に結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂はブロッキングされ、生じた樹脂は製造者の指示に従い洗浄される。
【０２３６】
このようなイムノアフィニティーカラムは、可溶性形態のＦＧＦ−１９ポリペプチドを含む細胞から画分を調製することによりＦＧＦ−１９の精製に用いられる。本精製法は、細胞全体の可溶化又は界面活性剤の添加による分画遠心法により得られる細胞成分分画の可溶化、又は当該技術分野において周知のその他の方法により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶性ＦＧＦ−１９ポリペプチドは、細胞が生育する培地中に有効量分泌される。
可溶性ＦＧＦ−１９ポリペプチドを含む調製物は、イムノアフィニティーカラムに通され、カラムはＦＧＦ−１９ポリペプチドの優先的な吸収を可能にする条件下にて洗浄される（例えば、界面活性剤の存在下、高イオン強度のバッファー中）。その後、カラムは抗体／ＦＧＦ−１９ポリペプチドの結合を壊すような条件下にて溶出され（例えば、およそｐＨ２−３の低ｐＨバッファー、又は尿素又はチオシアン酸イオンのようなカオトロピック因子の高濃度下）、ＦＧＦ−１９ポリペプチドが回収される。
【０２３７】
実施例９
薬物スクリーニング
本発明は、特に、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はその結合フラグメントを用い、様々な薬物スクリーニングのいずれかの技術において有用である。そのような試験において用いたＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントは、液体に可溶状態であるか、固体状の支持体に添付されているか、細胞表面上に出現されているか、細胞内に局在している。ある薬物スクリーニング方法においては、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントを発現する組換体核酸で、安定に形質転換された真核又は原核宿主細胞が利用される。薬物は、そのような形質転換された細胞に対し、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。このような細胞は、生きた状態又は固定化形態であり、標準的な結合アッセイに対し使用され得る。例えば、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントと、試験される薬物との間の複合体形成を測定する。あるいは、試験される薬物によって引き起こされるＦＧＦ−１９ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの複合体形成の減少を調べることができる。
【０２３８】
従って、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド関連疾病又は疾患に影響を及ぼし得る薬剤又は他のいずれかの薬物についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そのような薬物をＦＧＦ−１９ポリペプチド又はそのフラグメントに接触させることを含み、（Ｉ）薬物とＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメント間の複合体の存在、又は（ｉｉ）ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントと細胞との複合体の存在を、当該技術分野において周知な方法によりアッセイすることを含む。このような競合結合アッセイにおいて、典型的には、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントは標識される。適当なインキュベーションの後、遊離型のＦＧＦ−１９ポリペプチド又はフラグメントは結合型で存在するものと分離され、遊離型又は非複合体型の標識の量は、特定の薬物がＦＧＦ−１９ポリペプチドに結合し、ＦＧＦ−１９ポリペプチド／細胞の複合体を阻害する特定の薬物の能力の測定値である。
【０２３９】
薬物スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドと適切な結合親和性を持つ化合物に対するハイスループットのスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に発行の国際公開第８４／０３５６４号において詳細に記載されている。簡単に述べると、大量の異なる小ペプチド試験化合物は、プラスチックピン、又は何らかの表面のような固体基質上で合成される。ＦＧＦ−１９ポリペプチドに適用されるとき、ペプチド試験化合物はＦＧＦ−１９ポリペプチドと反応し、洗浄される。結合されたＦＧＦ−１９ポリペプチドは、当該分野において周知の方法により検出される。また、精製されたＦＧＦ−１９ポリペプチドは、上述の薬物スクリーニング技術において使用するためにプレート上に直接コートされ得る。さらに、非中和抗体はペプチドを捕獲し、固体支持体上に固定化するために用いられる。
また、本発明は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドと結合し得る中和抗体が、試験化合物とＦＧＦ−１９ポリペプチド又はそのフラグメントとの結合に対し競合するような、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用においても考慮される。このように、抗体は、ＦＧＦ−１９ポリペプチドと１つ又は複数の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を検出するために使用され得る。
【０２４０】
実施例１０
合理的な薬物デザイン
合理的な薬物デザインのゴールは、目的物（即ち、ＦＧＦ−１９ポリペプチド）の生物学的な活性ポリペプチドの構造的類似体、又はそれらが結合する小分子、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害因子などの構造的類似体を作り出すことである。これらの例の幾つかは、より活性が高く、安定なＦＧＦ−１９ポリペプチドの形態である薬物、又はインヴィボにおいてＦＧＦ−１９ポリペプチドの機能を促進し又は妨害する薬物を創り出すために使用され得る（Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：１９−２１（１９９１））。
１つのアプローチにおいて、ＦＧＦ−１９ポリペプチド又はＦＧＦ−１９ポリペプチド−阻害因子複合体の三次元構造がＸ線結晶解析により、コンピューターモデリングにより、又は最も典型的には、これら２つのアプローチを組み合わせることによって決定される。ＦＧＦ−１９ポリペプチドの形態と電荷は、分子の構造を明らかにし、分子の活性部位を決定するために確認されなくてはならない。時には、ＦＧＦ−１９ポリペプチドに関する有用な情報は、相同なタンパク質の構造に基づくモデリングにより得られることもある。双方の場合において、関連する構造上の情報は、ＦＧＦ−１９ポリペプチド用類似体分子をデザインするために使用されたり、有効な阻害因子を同定するために使用される。合理的な薬物デザインの有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１：７７９６−７８０１ （１９９２）中に示されるように、活性又は安定性を向上させる分子を含み、また、Ａｔｈａｕｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１３：７４２−７４６ （１９９３）中に示されるように、天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する。
【０２４１】
また、上述の如く、機能的アッセイにより選択された標的特異的抗体を単離し、その結晶構造を解析することも可能である。このアプローチは、原理的には、あとに続く薬物デザインが基礎となし得る薬の核となる物を産み出す。機能的、薬理学的に活性のある抗体に対する抗イディオタイプ抗体を産生することにより、全体としてタンパク質結晶学を迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプ抗体の結合部位は、オリジナルのレセプターの類似体であることが予測される。抗イディオタイプ抗体は、化学的又は生物学的に産生されたペプチドの貯蔵所からペプチドを同定し、単離するために使用することが可能であろう。そして、単離されたペプチドは薬の核として作用するであろう。
当該発明のおかげで、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を実施するために、十分量のＦＧＦ−１９ポリペプチドが、入手可能となる。さらに、ここで提供されるＦＧＦ−１９ポリペプチドアミノ酸配列に関する知見は、Ｘ線結晶解析の代わりに、又はＸ線結晶解析に加えてコンピューターモデリング技術を用いる者に対して、手引きを提供するであろう。
【０２４２】
実施例１１
ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスにおける、体重、レプチンレベル、摂食、尿産生、酸素消費、及びトリグリセリド及び遊離脂肪酸レベルの調査
ここで開示されたように、ＦＧＦ−１９は、線維芽細胞成長因子関連分泌タンパク質の成長因子ファミリーとして新規に同定された。ここにおいて、ＦＧＦ−１９はＦＧＦレセプター４と相互作用することで特徴づけられているが、分裂促進因子としては作用しないようである。本タンパク質の機能をさらに調べるために、ヒトＦＧＦ−１９を発現する遺伝子組換えマウスが作製された。
特に、ヒトＦＧＦ−１９をコードするｃＤＮＡがミオシン軽鎖に対するプロモーターを含むプラスミド中へクローン化された。このプロモーターは、移入遺伝子の筋肉特異的な転写に対し十分に機能する。スプライシングのアクセプター及びドナーも、発現レベルを上昇させるために、ＦＧＦ−１９ｃＤＮＡの５’側に含まれており、転写レベルを上昇させ、転写終結サイトを提供するために、ポリＡ付加シグナルを持つスプライシングのドナー及びアクセプターが、ＦＧＦ−１９ｃＤＮＡの３’側に含まれていた。
【０２４３】
ＭＬＣプロモーター、５’スプライシングアクセプター及びドナー部位、ＦＧＦ−１９ｃＤＮＡ、３’スプライシングアクセプター及びドナー部位、及び転写終結部位を包含するＤＮＡ（導入遺伝子）は、適当な制限酵素部位を用い、アガロースゲル上でのサイズ分画により精製された。精製されたＤＮＡは、受精したマウスの一つの前核中へインジェクトされ、遺伝子組換えマウスが産み出され、下記に記載されているように同定された（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ；Ｔｉｍ Ｓｔｅｗａｒｔ；Ｉｎ Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｐｐ５６５−５９８；１９９７ Ｅｄｓ Ｍ Ｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐ Ｂｅｒｇ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ；Ｓａｕｓａｌｉｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。以下に議論されている水の摂取、摂食、尿産生、ヘマトクリット値の測定のためマウスは、６週齢であった。レプチン、トリグリセリド、及び遊離脂肪酸の測定は、８週齢のマウスであった。
【０２４４】
以下に考察された結果が示すように、これらのマウスは、摂食の増加、及び酸素消費効率により証明される代謝効率の増加を示す。摂食の増加にもかかわらず、これらのマウスの体重は、遺伝子組換えを行っていない同腹仔の体重に有意に足りなかった。この体重の減少は、ヒト及び齧歯類の脂肪組織質量と密接に関連し、遺伝子組換えマウスにおいて減少するレプチンによる肥満症の減少の結果のようである。このことを更に裏付けることとして、遺伝子組換えマウスは、鼻部と尻部間の長さを測定することにより評価すると、通常の直線的な成長をする。これらのマウスは、体温、体格（骨の長さ）及び血液学的値に関しては正常である。摂食の増加に付帯的に起こりがちなこととして、遺伝子組換えマウスは尿産生量を増加させた。組換えマウスは、それほど多くの水分摂取を行っているようでもなく、通常のヘマトクリット値による測定した結果、脱水状態でもないので、尿産生の増加は、増加した食餌の代謝に由来するようである。ＦＧＦ−１９は筋肉質量及び長骨形成のいずれかに変化を与えることなく、肥満症を減少させるので、ＦＧＦ−１９は、肥満症及びそれと関連した状態における効果的な治療手段であることが示される。
【０２４５】
さらに特記するに、ＭＬＣ−ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスは、異なる絶食及び摂食の条件で種々の時間において体重が測定された。特に、メスのＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウス及び非遺伝子組換え同腹仔のグループは、無制限の摂食の間、６時間と２４時間の絶食後、及び２４時間の絶食終了後２４時間目の６週齢において体重が測定され。Ｆｉｇ３Ａに示されるように、全ての条件下においてＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウス（黒塗り棒）は、野生型、つまり非遺伝子組換え同腹仔（斜線棒）より体重は少なかった。
Ｆｉｇ３Ｂは、Ｆｉｇ３Ａにおいて示されたマウスと同じグループの血清で、レプチンに対してアッセイされた結果を示す。ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスにおけるレプチンの減少は、肥満症の軽減による体重の減少（Ｆｉｇ３Ａ）と一致する。
６週齢の遺伝子組換えマウスが、摂食（Ｆｉｇ４Ａ）、水分摂取（Ｆｉｇ４Ｂ）、尿産生（Ｆｉｇ４Ｃ）及びヘマトクリット値（Ｆｉｇ４Ｄ）に関し観察された。結果に見られるように、ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウス（黒塗り棒）は、野生型の同腹仔に比べより多くの食餌を消費するが、より多く水分を摂取することはない。水分消費量において変化はないが、遺伝子組換えマウスはより多くの尿を産生する（Ｆｉｇ４Ｃ）。尿産生の増加に拘わらず、遺伝子組換えマウスは通常のヘマトクリット値により証明されるように（Ｆｉｇ４Ｄ）脱水状態ではないようである。
【０２４６】
食餌消費の増加（Ｆｉｇ４）に伴う体重の減少（Ｆｉｇ３）は、代謝効率の増加により説明される。代謝効率は酸素消費量を測定することにより決定された。Ｆｉｇ５に示されるように、ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスは、２４時間の絶食及び２４時間の絶食終了後２４時間の後の両低カロリー周期の間、代謝速度を増大させていた。肥満症及びトリグリセリド、遊離脂肪酸の上昇は、心血管性疾患の対する危険因子である。ＦＧＦ−１９は心血管性疾患（肥満症（Ｆｉｇ３））に対する危険因子の一つを減少させるので、ＦＧＦ−１９は他の危険因子も低下させるのかどうか調査された。Ｆｉｇ６に見られるように、ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスにおいて、トリグリセリドのレベル及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）も低減される。
【０２４７】
実施例１２
ＦＧＦ−１９の注入により摂食の増加及び酸素消費量の増加が生じる。
ＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスにおいて観察される効果は、ＦＧＦ−１９タンパク質により引き起こされるということを確認するために、非遺伝子組換えＦｖＢマウスの集団に、浸透圧により作動する移植ポンプにより供給される組換体ＦＧＦ−１９（１ｍｇ／ｋｇ／日、静注）が注入された。Ｆｉｇ７Ａ−Ｂに示されるように、組換体ヒトＦＧＦ−１９の投与は、坦体のみ注入されたマウスに比し、摂食量の増加を引き起こす。さらに、ＦＧＦ−１９の注入により、酸素消費量により測定される代謝効率の増加が生じる。
【０２４８】
実施例１３
ＦＧＦ−１９は、グルコースの摂取を減少させ、脂肪細胞からのレプチンの放出を増加させる。
ＦＧＦ−１９が代謝を変化させるメカニズムをさらに調べるために、組換体ヒトＦＧＦ−１９がラット脂肪細胞の初代培養に添加され、グルコースの摂取量及び細胞からのレプチンの放出が測定された。Ｆｉｇ８Ａ−Ｂに示されるように、Ｆｉｇ１９はラット脂肪細胞の初代培養からのレプチンの放出を増加させ、初代培養へのグルコースの摂取を減少させる。
【０２４９】
実施例１４
高脂肪食餌を摂取したＦＧＦ−１９遺伝子組換えマウスにおける糖耐性及び脂肪パッド重量の調査
通常、高脂肪食のマウス（及びヒト）は、体重が増加し肥満症になるであろうし、糖非耐性又は糖尿病になるであろう。ＦＧＦ−１９を投与することが、肥満症と遺伝子組換えマウス及びそれらの非遺伝子組換えマウス（年齢、性が一致した）の糖耐性の同齢集団に影響をあたえるかどうか調べるために、基本的には、Ｒｅｂｕｆｆｅ−Ｓｃｒｉｖｅら， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｖｏｌ ４２， Ｎｏ１１ １９９３ ｐｐ１４０５−１４０９ 及びＳｕｒｗｉｔら，Ｖｏｌ４４， Ｎｏ５ １９５５ ｐｐ６４５−６５１　に記載されており、ナトリウム含量がＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ． Ｃａｔａｌｏ ｎｏ．Ｄ１２３３０Ｎにより調製される通常の固形試料に関して基準化された点において変更を加えた方法で、同腹仔を高脂肪食状態にした。
【０２５０】
１０週間後、正常なマウス試料または高脂肪食餌によるマウス（メスの遺伝子組換えマウスとそれらの同腹仔である非遺伝子組換えマウス）に対して、糖耐性テストが行われた。従って、各マウスは腹腔内に、体重ｋｇあたり１．０ｍｇのグルコースがインジェクトされ、血中に存在するグルコース濃度は次のインジェクションまでのインターバルにおいて測定された。Ｆｉｇ１０のグラフは、マウスにおけるグルコースレベルを表し、高脂肪食餌を与えられていたメスの非遺伝子組換えマウスの８／９が糖尿病（２時間のグルコースレベルが２００ｍｇ／ｄｌ以上で；（Ｗｏｒｌｄ ｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｖｏｌ ３；Ｅｄ Ｋｒａｌｌ， Ｌ．Ｐ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ））と認められ、一方、同一の食餌を与えられた遺伝子組換えマウスの０／５が糖尿病であると思われることを示す。
６又は１０週間食餌を与えられた後、高脂肪食餌が与えられたオスのマウスが処理され、蓄積脂肪に特異的な体重を測定することにより肥満症が決定された。Ｆｉｇ９に示されるように、高脂肪食を与えられていた遺伝子組換えマウスは、非遺伝子組換え同腹仔に比較して著しく脂肪は少なかった。
【０２５１】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ ユニバーシティー ブルバード， マナサス， バージニア， ２０１１０−２２０９ アメリカ合衆国（ＡＴＣＣ）に寄託した：
材料　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣ寄託番号　　　　 寄託日
ＤＮＡ４９４３５−１２１９　　２０９４８０　　　１９９７年１１月２１日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
【０２５２】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ．１】天然配列ＦＧＦ−１９をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド４６４−１１１１）を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示し、そのヌクレオチド配列（配列番号：１）は、ここで「ＤＮＡ４９４３５−１２１９」と命名されるクローンである。また、太字及び下線部で示されているのは、各々開始及び終止コドンの位置である。
【Ｆｉｇ．２】配列番号：１のコード化配列より由来する天然配列ＦＧＦ−１９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。また、示されているのは、種々の他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置である。
【Ｆｉｇ．３Ａ及び３Ｂ】ＭＬＣ−ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウスが、トランスジェニックではない同腹子より低い体重であり（Ｆｉｇ．３Ａ）、低いレベルの循環レプチンを有することを示す（Ｆｉｇ．３Ｂ）棒グラフである。Ｆｉｇ．３Ａは、６週齢の自由摂食間（一番左）、６及び２４時間の絶食後、及び２４時間の絶食が終了して２４時間後（最も右）における、ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウス（無地棒）及びトランスジェニックではない（野生型）同腹子（点線棒）の体重を示す。Ｆｉｇ．３Ｂは、レプチンのアッセイにおける、Ｆｉｇ．３Ａに示した同じグループのマウスの血清を示す。
【Ｆｉｇ．４Ａ−４Ｄ】摂食及び尿生産が増加したが、正常なヘマトクリットを有することを示す棒グラフ。マウスのグループは、自由摂食の間及び２４時間の絶食が終了後の２４時間（Ｆｉｇ．４Ａ）、水分摂取（Ｆｉｇ．４Ｂ）、尿放出（Ｆｉｇ．４Ｃ）及びヘマトクリットの間に、ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウスは摂食をモニターされ、各グラフのＦＧＦ−１９トランスジェニックマウスの結果は無地の黒棒、並びに野生型の結果は点線棒で示されている。
【Ｆｉｇ．５】ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウスでは、酸素消費量速度が増加していることを示す棒グラフ。２４時間の絶食及び２４時間の絶食が終了後の２４時間が後に続く、両光サイクル（暗又は明）間のＦＧＦ−１９トランスジェニックマウス（無地の黒棒）及び野生型マウス（点線棒）の酸素消費を示す。
【Ｆｉｇ．６Ａ及び６Ｂ】ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウス（無地の黒棒）では、野生型マウス（点線棒）に対してトリグリセリド（Ｆｉｇ．６Ａ）及び遊離脂肪酸（Ｆｉｇ．６Ｂ）が減少していることを示す棒線グラフ。
【Ｆｉｇ．７Ａ及び７Ｂ】ＦＧＦ−１９（点線棒）を欠く媒介物を注入したマウスに対して、トランスジェニックでないマウスへＦＧＦ−１９（無地の黒棒）を注入することが、摂食量（Ｆｉｇ．７Ａ）の増加及び酸素消費量（Ｆｉｇ．７Ｂ）の増加につながることを示す棒グラフであり、「ｎ」は夜、そして「ｄ」は昼を示す。
【Ｆｉｇ．８Ａ及び８Ｂ】ＦＧＦ−１９が脂肪細胞からのレプチン放出を増加させ（Ｆｉｇ．８Ａ）、脂肪細胞によるグルコース取り込みを減少させる（Ｆｉｇ．８Ｂ）ことを示す棒グラフ。
【Ｆｉｇ．９】長期に渡り、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えたＦＧＦ−１９トランスジェニックマウス（斜線棒）又は野生型マウス（無地の黒棒）の脂肪体重量を示す棒グラフであり、左から始まる水平棒に沿って、精巣上体（ＨＦＤ Ｅｐ）及び腎周囲をともなう後腹膜（ＨＦＤ ＲＰ／ＰＲ）の６週、そして精巣上体及び腎周囲をともなう後腹膜の１０週において結果が示されている。
【Ｆｉｇ．１０】長期に渡る、ＦＧＦ−１９トランスジェニックマウス（斜線棒）又は野生型マウス（無地の黒棒）のグルコース耐性を示す棒グラフ（両方ともに高脂肪食を１０週間）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004500037.tif 000180