(57)【要約】本発明は、ＬＳＧポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に前記ポリヌクレオチドを発現することによる、前記ポリペプチドを製造する方法、並びに前記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。本発明は、さらに、部分的に、研究、診断および臨床技術に関する用途のために、このようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストを利用するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは７４のポリヌクレオチドまたはそれらの変異体、
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは７４のポリヌクレオチドまたはそれらの変異体によって、発現されるポリペプチド、または、
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のアンチセンス配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド
を含む、ＬＳＧ。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４を含む、請求項１に記載のＬＳＧ。
【請求項３】
患者において肺癌の存在を診断するための方法であって、
（ａ）患者の細胞、組織または体液において、請求項１に記載のＬＳＧレベルを測定すること、および
（ｂ）測定したＬＳＧレベルと、正常ヒト対照由来の細胞、組織または体液におけるＬＳＧレベルとを比較すること
を含み、ここで、正常ヒト対照に対する該患者における測定したＬＳＧレベルの変化が肺癌の存在に関連する、前記方法。
【請求項４】
患者において肺癌の転移を診断するための方法であって、
（ａ）転移していることが知られていない肺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液の試料において、請求項１に記載のＬＳＧレベルを測定すること、および
（ｃ）測定したＬＳＧレベルと、正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＬＳＧレベルとを比較すること
を含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者における測定したＬＳＧレベルの増加が、転移している癌に関連する、前記方法。
【請求項５】
肺癌を有する患者において肺癌を病期分類するための方法であって、
（ａ）肺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液の試料において、請求項１に記載のＬＳＧのレベルを測定すること、および
（ｃ）測定したＬＳＧレベルと、正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＬＳＧレベルとを比較すること
を含み、ここで、正常ヒト対照に対する該患者における測定したＬＳＧレベルの増加が進行している癌に関連し、測定したＬＳＧレベルの減少が消退または寛解している癌に関連する、前記方法。
【請求項６】
転移の発生に関して、患者の肺癌をモニタリングするための方法であって、
（ａ）転移していることが知られていない肺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液における請求項１に記載のＬＳＧレベルを定期的に測定すること、および
（ｃ）定期的に測定したＬＳＧレベルと、正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＬＳＧレベルとを比較すること
を含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者における定期的に測定したＬＳＧレベルのいずれか１つの増加が、転移している癌に関連する、前記方法。
【請求項７】
患者における肺癌の病期の変化をモニタリングするための方法であって、
（ａ）肺癌を有する患者を同定すること、
（ｂ）該患者由来の細胞、組織または体液における請求項１に記載のＬＳＧレベルを定期的に測定すること；および
（ｃ）定期的に測定したＬＳＧレベルと、正常ヒト対照の細胞、組織または体液におけるＬＳＧレベルとを比較すること
を含み、ここで、正常ヒト対照に対する患者における定期的に測定したＬＳＧレベルのいずれか１つの増加が病期の進行している癌に関連し、減少が病期の消退または寛解している癌に関連する、前記方法。
【請求項８】
肺癌の画像化および処置における使用のための潜在的治療薬を同定する方法であって、化合物を、請求項１に記載のＬＳＧに結合する能力またはその発現を化合物の非存在下におけるＬＳＧに相対して減少させる能力についてスクリーニングすることを含み、ここで、ＬＳＧに結合する化合物の能力またはＬＳＧの発現を減少させる能力が、該化合物が肺癌の画像化および処置において有用であることを示す、前記方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＬＳＧによりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
ポリペプチドが、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項９に記載の抗体を患者に投与することを含む、患者における肺癌を画像化するための方法。
【請求項１２】
抗体が、常磁性イオンまたは放射性同位体で標識される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のＬＳＧの発現または活性を下方調節する化合物を患者に投与することを含む、患者における肺癌を処置するための方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のＬＳＧを発現する標的細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫応答が標的細胞に対して惹起されるように、免疫刺激量のＬＳＧポリペプチドをヒト患者に送達することを含む、前記方法。
【請求項１５】
ＬＳＧポリペプチドが、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のＬＳＧを含む、肺癌を処置するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序文
本出願は、その全体が本明細書に組込まれる２０００年８月２８日提出の米国仮出願第６０／２２８，３７８号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、正常のおよび腫瘍性の肺細胞に存在する、新たに同定された核酸およびポリペプチド（該核酸およびポリペプチドの断片、変異体並びに誘導体を含む）に関する。また本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体並びに本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。また本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、抗体、変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストを含む組成物並びにこれら組成物の使用のための方法に関する。これらの使用には、肺癌および肺における非癌性疾患状態の同定、診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置、並びに肺組織の同定、肺の胚発達および分化のモニタリングおよび改変、並びに本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの同定および／または設計を含む。使用はまた、遺伝子治療、形質転換動物および細胞の作出並びに処置および調査のために設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）肺組織の作出を含む。
【０００３】
発明の背景
過去１００年を通じて、現在、多くの国々では、肺癌が最も一般的な癌であるほどに、その発生率は着実に増加した。実際、肺癌は、アメリカで男性および女性の両方に対して、２番目に蔓延したタイプの癌で、両性の癌による死の最も一般的な原因である。肺癌死は、まず、タバコの喫煙の増加により、また、ヒ素、アスベスト、クロム酸塩、クロロメチルエーテル、ニッケル、多環式芳香族炭化水素および他の剤への暴露により、１９３０年以来、男性および女性の両方において１０倍増加した。スコット（Ｓｃｏｔｔ）、肺癌：診断と治療のガイド（Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、Ａｄｄｉｃｕｓ Ｂｏｏｋｓ （２０００）、およびアルベルグ（Ａｌｂｅｒｇ）ら（ケーン（Ｋａｎｅ）ら編）、肺癌の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）ｐｐ． １１−５２、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． （１９９８）参照。
【０００４】
肺癌は、肺から起こる原発性の腫瘍または腸や乳房などの別の器官から播種され二次性腫瘍に起因し得る。１ダースを超えるタイプの肺癌があるが、９０％以上は２つのカテゴリー：小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に分けられる。前記スコット参照。全ての肺癌の約２０〜２５％は、ＳＣＬＣであると特徴付けられ、一方、７０〜８０％は、ＮＳＣＬＣと診断される。同書（Ｉｄ）。まれなタイプの肺癌は、一般にアスベストへの暴露によって引き起こされ、肺の胸膜を冒す中皮腫である。肺癌は、通常、胸部Ｘ線、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャンによって、または、喀痰細胞診によって、診断されるか、スクリーニングされる。肺癌の診断は、通常、組織のバイオプシーによって確認される。同書。
【０００５】
ＳＣＬＣ腫瘍は、高度に転移性であり、急速に増殖する。患者がＳＣＬＣと診断された時までに、癌はリンパ節、副腎、肝臓、骨、脳および骨髄を含む身体の他の部分に既に広がっている。前記スコット；ファン・ホッテ（Ｖａｎ Ｈｏｕｔｔｅ）ら編、肺癌の治療における進歩および展望（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９９９）参照。疾患は、通常、手術が選択できない程度に広がっているので、現在の処置の選択は、化学療法に胸部照射を加えたものである。前記ファン・ホッテ参照。疾患の病期は、長期生存の主要な予測因子である。１つの肺および周囲のリンパ節を越えて広がった広範囲疾患を有する患者の５％未満しか２年以上生存しない。同書。しかしながら、未だ限定的な病期、すなわち、１つの肺を越えて広がっていないときに、疾患を診断し、処置すれば、５年生存率が、３〜４倍高くなる。同書。
【０００６】
ＮＳＣＬＣは、一般に、３つのタイプ：扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌に分類される。扁平上皮癌および腺癌の両方は、気道を裏打ちする細胞から発生する；しかしながら、腺癌は粘液を産生する杯細胞から発生する。大細胞肺癌は、顕微鏡学的に見たとき細胞が大きく、丸まって見えることからこのように名付けられ、一般的に、比較的未分化であると考えられる。イエスナー（Ｙｅｓｎｅｒ）、肺癌アトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ （１９９８）参照。
【０００７】
二次性肺癌は、身体の他所で発生し、肺へ広がった癌である。肺に転移する癌は、これに限定されないが、乳癌、メラノーマ、大腸癌およびホジキンリンパ腫を含む。二次性肺癌の処置は、由来する癌のソースに依存し得る。換言すれば、乳癌に由来する肺癌は、乳癌の処置に対しより反応性であり得、大腸癌に由来する肺癌は、大腸癌の処置に対し反応性であり得る。
【０００８】
癌の病期は、それがどの程度広がったかを示し、予後判定の重要な指標である。加えて、病期分類は、処置がしばしば癌の病期にしたがって決定されることから、重要である。ＳＣＬＣは、２つの病期：限定された疾患、即ち、１つの肺および近くのリンパ節にだけ見られる癌；および、広範囲疾患、即ち、胸部または身体の他の部分へと肺の外へ広がった癌に分けられる。ＳＣＬＣを有するほとんどの患者について、診断時には、疾患は、既にリンパ節または身体の他所に進行している。前記スコット参照。広がりがスキャン上に明らかでない場合であっても、いくつかの癌細胞は、広がっていき、血流またはリンパ系を介して移動しているようである。一般的に、放射線治療を伴なうまたは伴なわない化学治療が、しばしば好ましい処置である。最初に行なわれる初期スキャンおよび検査は、患者が処置に対して如何によく反応しているかを知るために、後に用いられる。
【０００９】
対照的に、非小細胞癌は、４つの病期に分けられ得る。病期Ｉは、リンパ節には癌はなく、高度に限局した癌である。病期ＩＩの癌は、冒された肺の頂部で、リンパ節へ広がっている。病期ＩＩＩの癌は、癌が始まった場所の近くへ広がっている。これは、胸壁、肺の被膜（胸膜）、胸部中央（縦隔）またはその他のリンパ節であり得る。病期ＩＶの癌は、身体の他の部分まで広がっている。病期Ｉ〜ＩＩＩの癌は、通常、化学治療を伴なうかまたは伴なわないで、手術によって処置される。病期ＩＶの癌は、通常、化学治療および／または苦痛緩和医療（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ ｃａｒｅ）で処置される。
【００１０】
多数の染色体および遺伝的異常が、肺癌において観察されてきた。ＮＳＣＬＣにおいて、染色体異常が３ｐ、９ｐ、１１ｐ、１５ｐおよび１７ｐ上に発見されており、染色体の欠損が、染色体７、１１、１３および１９上で見られた。スカリン（Ｓｋａｒｉｎ）編、肺癌の多様な処置（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． （２０００）；ジェミル（Ｇｅｍｍｉｌｌ）ら、前記ケーン中、ｐｐ． ４６５−５０２；ベイリー−ウイルソン（Ｂａｉｌｅｙ−Ｗｉｌｓｏｎ）ら、前記ケーン中、ｐｐ． ５３−９８参照。ＳＣＬＣにおいて、染色体異常は、１ｐ、３ｐ、５ｑ、６ｑ、８ｑ、１３ｑおよび１７ｐ上に発見されている。同書。加えて、染色体３ｐ短腕の欠損もまた、ＳＣＬＣ腫瘍の９０％より多く、ＮＳＣＬＣ腫瘍のおよそ５０％において見られた。同書。
【００１１】
多数の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子が、肺癌において関連付けられてきた。マブリー（Ｍａｂｒｙ）、前記ケーン中、ｐｐ． ３９１−４１２およびスクラファニ（Ｓｃｌａｆａｎｉ）ら、前記ケーン中、ｐｐ． ２９５−３１６参照。ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣの両方において、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子は、肺癌の５０％を超えて変異されている。前記イエスナー参照。他の腫瘍抑制遺伝子、染色体３ｐで見出されたＦＨＩＴは、タバコの喫煙によって変異されている。同書；前記スカリン。加えて、ＳＣＬＣの９５％より多くおよびＮＳＣＬＣの約２０〜６０％が、別の腫瘍抑制遺伝子である網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質を欠くか異常なもの、を有する。ｒａｓ癌遺伝子（特に、Ｋ−ｒａｓ）は、ＮＳＣＬＣ標本の２０〜３０％で変異されており、ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子は、病期２のＮＳＣＬＣの１８％および病期４のＮＳＣＬＣの６０％の標本において発現していた。前記ファン・ホッテ参照。染色体９の領域、具体的には、９ｐ２１の領域で見出された他の腫瘍抑制遺伝子は、多くの癌細胞で欠失しており、ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１５ＩＮＫ４Ｂを含む。前記ベイリー−ウイルソン；スクラファニら参照。これらの腫瘍抑制遺伝子は、肺癌の病原性に関連し得る。
【００１２】
さらに、多くの肺癌細胞は、肺癌細胞に自己分泌形態で作用し得る増殖因子を産生する。前記ケーン中、ジークフリード（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ）ら、ｐｐ． ３１７−３３６；前記ケーン中、ムーディ（Ｍｏｏｄｙ）、ｐｐ． ３３７−３７０および前記ケーン中、ヘスレー（Ｈｅａｓｌｅｙ）ら、ｐｐ． ３７１−３９０参照。ＳＣＬＣにおいて、多くの腫瘍細胞は、これら細胞の増殖性の増殖因子である、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）を産生する。前記スカリン参照。多くのＮＳＣＬＣ腫瘍は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターを発現し、ＥＧＦに反応して、ＮＳＣＬＣ細胞を増殖させる。インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）は、ＳＣＬＣ腫瘍の９５％超およびＮＳＣＬＣ腫瘍の８０％超において高められている；それは自己分泌性の増殖因子として機能する考えられる。同書。最後に、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｓｔｅｅｌ因子またはｋｉｔリガンドとしても知られている）およびｃ−Ｋｉｔ（ＳＣＦに対する前癌タンパク質チロシンキナーゼレセプター）の両方が、ＳＣＬＣにおいて高レベルで発現し、したがって、増殖を増大する自己分泌ループを形成し得る。同書。
【００１３】
大多数の肺癌の症例は、タバコの喫煙に起因するとされるが、大部分の喫煙者は肺癌を発生しない。疫学的な証拠は、肺癌への感受性がメンデル法則の様式で遺伝し、したがって、遺伝した遺伝要素を有しているであろうことを示唆している。前記ベイリー−ウイルソン。したがって、いくつかの遺伝子座での、ある対立遺伝子変異体が、肺癌への感受性に影響し得ると考えられる。同書。他の疾患に対する感受性と同様に、どの対立遺伝子の変異体が肺癌感受性に関係するか同定する１つの方法は、肺において高度に発現される遺伝子の対立形質の変異体に注目することである。
【００１４】
肺はまた、他の多数の消耗性の疾患（特に限定されないが、肺気腫、肺炎、嚢胞性繊維症および喘息）に感受性である。ストックリー（Ｓｔｏｃｋｌｅｙ）編、肺の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ）第Ｉ巻：肺気腫及び感染（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９９）（以下、ストックリーＩという）およびストックリー編、肺の分子生物学第ＩＩ巻：喘息および癌（Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９９）（以下、ストックリーＩＩという）参照。多くのこれらの障害の原因は、未だ十分に理解されておらず、あったとしても、これら非癌性肺障害の多数に良好な処置オプションはわずかしかない。したがって、種々の非癌性肺障害を理解し、これらの疾患の処置を同定する必要がある。
【００１５】
なお別の側面において、肺組織の発達および分化は、胚発生の間、重要である。肺および細気管支のものを含む気道の全ての上皮細胞は、胚性突起（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｏｕｔｐｏｕｃｈｉｎｇ）を裏打ちする原始的な内胚葉細胞に由来する。前記イエスナー参照。胚発生の間、多能性の（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）内胚葉幹細胞は、様々なタイプの専門化した細胞（吸入された粒子を移動させるための繊毛細胞、粘液を産生するための杯細胞、内分泌機能のためのクルチスキー（Ｋｕｌｃｈｉｔｓｋｙ’ｓ）細胞、ならびに界面活性タンパク質を分泌するためのクララ細胞およびＩＩ型肺胞上皮細胞（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ）を含む）へ分化する。同書。不適当な発達および分化は、生まれたとき肺が十分な界面活性物質を生産することができない幼児、特に未熟児において、呼吸器障害および苦痛を引き起こし得る。さらに、いくつかの肺癌細胞、特に小細胞癌は多能のようであり、小細胞癌、腺癌および扁平上皮癌を含む、多くの細胞型に自然に分化する可能性がある。同書。したがって、肺発達および分化についてのよりよい理解は、肺癌の開始および進行についての理解の促進を助けるだろう。
【００１６】
したがって、ヒトが肺癌を発症しやすいかを予見するための、肺癌を診断するための、該疾患の進行をモニターするための、肺癌を病期分類するための、肺癌が転移したかどうか決定するための、および肺癌を画像化するための、より感受性が高く、正確な方法に対する大きな必要性がある。さらに、肺癌のよりよい処置が必要とされる。さらに、肺気腫、肺炎、肺感染症、肺線維症、嚢胞性線維症および喘息などの非癌性肺障害を診断することおよび処置することに対する大きな必要性がある。また、法医学的な目的のためおよび特定の細胞または組織が肺特異的な特性を示すか否か決定するために肺組織を同定するのに用い得る、組成物およびそれらを用いる方法に対する必要性がある。
【００１７】
本発明において、方法は、肺特異的遺伝子（本明細書においてＬＳＧという）を介して肺癌を、検出、診断、モニタリング、病期分類、予後判定、画像化および処置するために提供される。本発明の目的のために、ＬＳＧは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列をそれぞれ含む遺伝子によって発現される未変性（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質を示す。「ＬＳＧ」によって、本明細書中、遺伝暗号の縮重による、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４に比較して、ヌクレオチド配列に変異を含むが、未だ同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも意味する。
【００１８】
典型的なＬＳＧポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３および８４に示される。代替的に、本明細書で用いられるＬＳＧによって意味するものは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされる未変性ｍＲＮＡ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のレベル、または配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のアンチセンス配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドのレベルである。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の記載により当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の記載および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示すものではあるが、例示のみを目的として描写されたものであることが理解されるべきである。以下の記載を読むことにより、そして本開示のその他の部分を読むことにより、開示された発明の精神および範囲内での各種変更および改良は当業者に容易に明らかになるだろう。
【００２０】
発明の概要
これらの目的、およびその他の目的に対し、本発明の目的は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドにより発現されるタンパク質、あるいは該タンパク質を発現するそれらの変異体；またはストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のアンチセンス配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、を含むＬＳＧを提供することである。典型的な本発明のＬＳＧポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４に示されている。
【００２１】
本発明の別の目的は、細胞、組織または体液中のＬＳＣレベルの変化を、正常ヒト対照の、好ましくは同一細胞、組織または体液型中のＬＳＧレベルと比較して分析することにより、肺癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの変化が肺癌に関連する方法を提供することである。
【００２２】
さらに、転移した肺癌を有することが疑われるヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＬＳＧについて分析し、かかる細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルを正常ヒト対照の、好ましくは同一細胞、組織または体液型中のＬＳＧレベルと比較することにより、転移をしたことが知られていない肺癌を有する患者における転移性肺癌を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの増加が、転移をした肺癌に関連する方法が提供される。
【００２３】
本発明はまた、肺癌を有するヒト患者を同定し、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料を分析し、かかる細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同一細胞、組織または体液型中のＬＳＧレベルと比較することにより、肺癌を有するヒトにおける肺癌を病期分類する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの増加が、消退または寛解している癌に関連する方法を提供する。
【００２４】
さらに、転移の発生について、肺癌を有するヒトの肺癌をモニタリングする方法が提供される。この方法は、転移していることが知られていないかかる癌を有する患者を同定することと、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＬＳＧについて定期的に分析することと、かかる細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同一細胞、組織または体液型中のＬＳＧレベルと比較することとを含み、この場合正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの増加が、転移した癌に関連している。
【００２５】
さらに、肺癌を有するヒトにおけるＬＳＧレベルを観察することにより、肺癌を有するヒトの肺癌の病期の変化をモニタリングする方法が提供される。この方法は、かかる癌を有するヒト患者を発見することと、かかる患者由来の細胞、組織または体液試料をＬＳＧについて定期的に分析することと、かかる細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルを、正常ヒト対照試料の、好ましくは同一細胞、組織または体液型中のＬＳＧレベルと比較することとを含み、この場合正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの増加が、進行している癌に関連し、ＬＳＧレベルの減少が、消退または寛解している癌に関連する。
【００２６】
さらに、肺癌の画像化および処置に使用するための、ＬＳＧを標的とする新たな治療薬を設計する方法を提供する。例えば、一態様では、ＬＳＧを標的とする抗体、またはかかる抗体の断片のような治療薬を用い、疾患もしくは症状を検出または診断することを目的とし、患者におけるＬＳＧの局在性を処置、検出または画像化することができる。この態様では、正常組織に比して検出される標識抗体量の増加が腫瘍転移または成長の指標となるであろう。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたはオムニクローナル（ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌ）であってもよく、あるいは分子生物学的技術により調製できる。本発明において、および本明細書全体にわたって用いられる場合、「抗体」という用語はまた、ＳＥＬＥＸと呼ばれ、当業者に既知であるインビトロ進化プロトコル（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に由来するようなアプタマーおよび一本鎖オリゴヌクレオチドを含むことを意味する。抗体は放射性同位体および常磁性金属を含むが、これらに限定されない各種の検出可能でかつ治療的標識体で標識することができる。ＬＳＧの濃度および／または活性を下げる小分子および抗体のような治療薬もまたＬＳＧの過剰発現を特徴とする疾患の処置に使用できる。かかる薬剤は本明細書中の教示に従い容易に同定できる。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴、利点および側面は、以下の説明から当業者に明らかになるだろう。しかしながら、以下の説明および具体的な実施例は、発明の好ましい態様を示しているが、例示のみを目的としていると理解されるべきである。以下の説明を読むこと、および本開示のその他部分を読むことから、開示の発明の精神および範囲内の各種変更および改良は当業者に容易に明らかになるだろう。
【００２８】
用語解説
以下の例示の説明は本明細書中、特に実施例中に頻繁に使用されるある種の用語の理解を助けるために提供される。説明は、便宜的に提供されるものであり、発明を限定するものではない。
【００２９】
「単離された」とは、その自然状態から「ヒトの手により」変えられること、すなわち自然界で生じる場合、それはその本来の環境から変更されたか、または取り出されたか、あるいはその両方を意味する。
【００３０】
その用語が本明細書中で使用されるように、例えば、生きている動物に、その自然な状態で自然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものではないが、その自然状態の共存物質から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離された」ものである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離されたという用語は、それが天然に存在する染色体および細胞から分離されていることを意味する。
【００３１】
単離の一部として、または単離に続いて、かかるポリヌクレオチドを、例えば、突然変異誘発、融合タンパク質を形成させること、および宿主内での増殖または発現のための、ＤＮＡのような他のポリヌクレオチドに結合することができる。単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドと結合させて、単離ポリヌクレオチドは、培養液または生体全体において、宿主細胞に導入することができる。培養液または生体全体において、宿主細胞へ導入する場合、その用語が本明細書中で用いられるように、かかるＤＮＡは、自然の形態または環境にないことから、単離されている。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、培地配合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、例えば細胞への導入用の溶液、化学または酵素反応のための組成物もしくは溶液のような組成物中に現れてもよく、例えばそれらは、自然に存在しない組成物ではなく、そこにまた本明細書中で用いられるような用語の意味での単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがとどまる。
【００３２】
「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドを指す。多くの場合、この用語は一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指すが、とりわけ、同様に一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡも指すことができる。
【００３３】
一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成装置において実行されるもののような化学的方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、例えばインビトロ組換えＤＮＡ媒介技術において、ならびに細胞および生体でのＤＮＡ発現による、各種のその他の方法により作製することができる。
【００３４】
まず化学的に合成したＤＮＡは、典型的に、５’ホスフェートなしで得られる。かかるオリゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子形成に典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドの連結が望ましい場合には、キナーゼおよびＡＴＰを使用するような標準的技術によりホスフェートを付加することができる。
【００３５】
化学的に合成したオリゴヌクレオチドの３’末端は、遊離の水酸基を一般的に有しており、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼの存在下において、容易に別のオリゴヌクレオチドのような別のポリヌクレオチドの５’ホスフェートとホスホジエステル結合を形成するだろう。周知の様に、この反応は、望ましい場合、連結前に他のポリヌクレオチドの５’ホスフェートを除去することで選択的に阻止することができる。
【００３６】
ポリヌクレオチドは一般に、任意のポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ならびに修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡを包含する。したがって、例えば、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、あるいはより一般的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を表す。さらに、本明細書中で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を指す。かかる領域内の鎖は同一分子または異なる分子由来であってもよい。この領域には、１または２以上の分子全てを含んでもよいが、より一般的にはいくつかの分子の領域のみが含まれる。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドという用語にはまた、１または２以上の修飾塩基を含有する上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。すなわち、安定性またはその他の理由から修飾された主鎖を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中でその用語が意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの稀（ｕｎｕｓｕａｌ）な塩基あるいはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、２例のみ挙げたが、本明細書中でその用語が使用されているポリヌクレオチドである。
【００３８】
当業者に既知の有益な用途を提供する様々な修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされることが理解されるだろう。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドという用語には、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびにとりわけ単純および複雑な細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態が包含される。
【００３９】
ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、以下に記載の全てのポリペプチドを含む。ポリペプチドの基本構造は既知であり、当該分野の多くの教本およびその他の刊行物に記載されている。この情況では、本明細書中ではその用語は、ペプチド結合により直鎖状に相互に結合された２または３以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指すのに用いられる。本明細書中で用いる場合、その用語は一般には例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖型、および当該分野において一般にタンパク質と呼ばれる、多くの型がある長鎖型の両方を指す。ポリペプチドが２０種類の天然アミノ酸と一般に呼ばれる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多々あること、および末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が既定のポリペプチドにおいて、プロセシングやその他の翻訳後修飾のような自然のプロセスにより、または当該技術分野で既知の化学的修飾技術によって修飾されてもよいことが理解されるだろう。ポリペプチド中に自然に生ずる一般的修飾でさえ、あまりに多すぎて、本明細書中にその全体を列挙することはできないが、それらは基礎的テキスト、および詳細なモノグラフ、ならびに多くの研究文献に十分に記載されており、それらは当業者にとって既知である。
【００４０】
本発明のポリペプチド中に存在する既知の修飾は、代表的な少数のもの挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋形成、システイン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化を含む。
【００４１】
かかる修飾は当業者に既知であり、科学文献に詳細記載されている。グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化を含むがこれらに限定されない幾つかの特に一般的な修飾は、最も基本的なテキスト、例えばＰＲＯＴＥＩＮＳ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）に記載されている。例えば、ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）の中の、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ， １−１２、Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａａｃｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２）などの、多くの詳しいレビューが本件に利用できる。
【００４２】
本発明のポリペプチドは必ずしも全体が線状ではないということは理解されるであろう。むしろ、ポリペプチドはユビキチン化の結果により分枝されていてもよく、そして、それらは、一般に自然のプロセッシング現象を含む翻訳後の現象、および自然には起こらない人工的な操作によりもたらされる現象の結果として、分枝を伴った、または伴わない、環状であってもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳的自然プロセスにより、ならびに完全な合成的方法によっても合成され得る。
【００４３】
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のいかなる場所でも起こり得る。実際に、共有結合的修飾によるポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるいは両方の遮蔽は天然および合成ポリペプチドにおいて一般的であり、かかる修飾は、本発明のポリペプチド中にも同様に存在し得る。例えば、タンパク質分解プロセシング前に大腸菌で作られたポリペプチドのアミノ末端残基は、大部分が不変的にＮ−ホルミルメチオニンであろう。
【００４４】
ポリペプチド中に見られる修飾は、多くの場合それが作製される条件を反映するであろう。例えば、宿主内でクローンニングした遺伝子を発現することにより作製されたポリペプチドでは、修飾の性質および程度が、大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されるであろう。例えば、周知のように、グリコシル化は大腸菌などの細菌性宿主ではたいてい起こらない。したがって、グリコシル化が望まれる場合には、ポリペプチドはグリコシル化用宿主、一般には真核生物細胞で発現させるべきである。しばしば昆虫細胞は、哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を行なう。したがって、とりわけ自然なパターンのグリコシル化を有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために、昆虫細胞発現系が開発されている。他の修飾にも同様の考察が適用される。
【００４５】
同タイプの修飾が、所定のポリペプチド中の複数の部位において同一程度または様々な程度で存在し得ることが理解されるだろう。また所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含んでもよい。
一般に、本明細書中で使用される場合には、ポリペプチドという用語は、かかる全ての修飾、特に宿主細胞中においてポリヌクレオチドを発現させることにより合成されたポリペプチド中に存在する修飾を包含する。
本明細書中で用いられる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、それぞれ参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
【００４６】
変異体ポリヌクレオチドに関して、一般にその差は、参照ヌクレオチドと変異体ヌクレオチドの配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。したがって、変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）であり得る。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させないだろう。変化がこの型のサイレントな変化に限定される場合、変異体は参照と同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするだろう。あるいは、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもよい。かかるヌクレオチドの変化は、参照配列によりコードされるポリペプチド中にアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断を生じ得る。
【００４７】
変異体ポリペプチドに関して、一般にその差は、参照体と変異体の配列が全体としては極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限される。例えば、変異体ポリペプチドと参照ポリペプチドは、１または２以上の、置換、付加、欠失、融合および切断によりアミノ酸配列が異なってもよく、それらは、いかなる組合せで存在してもよい。
【００４８】
本明細書中で用いる受容体分子は、本発明のＬＳＧポリペプチドと特異的に結合または相互作用する分子を指し、好ましい古典的な受容体だけでなく、発明のポリペプチドと特異的に結合または相互作用するその他分子も包含する（それらはまたそれぞれ「結合分子」および「相互作用分子」、ならびに「ＬＳＧ結合または相互作用分子」とも呼ばれる）。本発明のポリペプチドと、受容体分子または結合分子または相互作用分子を含むかかる分子との結合は、本発明のポリペプチドに限定され得る（それは非常に高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドに高度に特異的であり得る（それは高度に好ましい）か、または本発明のポリペプチドを含むタンパク質のグループに高度に特異的であり得る（それは好ましい）か、あるいはその内の少なくとも１つが本発明のポリペプチドを含むタンパク質の複数のグループに特異的であり得る。
受容体はまた、本発明のポリペプチドに結合する、抗体および抗体由来試薬のように、非天然でもあってもよい。
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ以下に詳述するように、本明細書中でＬＳＧと称する、新規肺特異ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。
ポリヌクレオチド
本発明の一側面によれば、ＬＳＧポリペプチドをコードする単離ＬＳＧポリヌクレオチドが提供される。
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４に記載のポリヌクレオチド配列などの本明細書中に提供された情報を用いて、ＬＳＧをコードする本発明のポリヌクレオチドは、出発原料としてヒト腫瘍細胞由来のｍＲＮＡを用いたｃＤＮＡのクローニング法などの標準的クローニングおよびスクリーニング手法を用いて得てもよい。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、あるいは、例えば、クローニングにより得た、もしくは化学合成技術により、またはその組合せにより生産されたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であるか、またはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。
【００５１】
ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドのコード配列と同一であってもよい。またそれは、遺伝コードの冗長性（縮重）の結果として、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４によりコードされるのと同じポリペプチドをコードする、異なる配列を持つポリヌクレオチドであってもよい。
【００５２】
これらのポリペプチドをコードする、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４などの本発明のポリヌクレオチドは、それ自身成熟ポリペプチド用コード配列を含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、成熟ポリペプチド用コード配列およびプレタンパク質、またはプロタンパク質またはプレプロタンパク質配列などの、リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列などのさらなるコード配列含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、成熟ポリペプチドをコードする配列を、上記のさらなるコード配列を伴って、または伴わずに、追加の、非コード配列と一緒に含んでもよい。本発明のポリヌクレオチドに組込んでもよい追加の非コード配列の例は、例えば、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性の役割を果たす転写された非翻訳配列などのイントロン、ならびに非コード５’および３’配列、ならびに追加の機能を提供するようなアミノ酸をコードする、追加のコード配列を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
したがって、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドなどの、マーカー配列と融合してもよい。発明のこの側面のある好ましい実施例では、マーカー配列はとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）に提供されているタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８６： ８２１−８２４（１９８９））に記載されるように、例えばヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープである（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３７： ７６７ （１９８４））。
【００５４】
上記によれば、本明細書中で使用される「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする配列、特に配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４を含むポリヌクレオチドを包含する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３および８４に示される。この用語は、ポリペプチドをコードする単一連続領域または不連続領域（例えばイントロンにより中断された）を、さらにコードおよび／または非コード配列を含有してもよいさらなる領域とともに含むポリヌクレオチドを包含する。
【００５５】
本発明は、さらにＬＳＧポリペプチドの断片、類縁体および誘導体をコードする、本明細書中で上述したポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然の対立遺伝子変異体のような天然型変異体であってもよく、またはそれは天然に生ずることが知られていない変異体でもよい。かかる非天然型のポリヌクレオチド変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または生体に適用されるものを含む突然変異誘発技術により作製され得る。
【００５６】
これに関する変異体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加により上記ポリヌクレオチドとは異なる変異体である。置換、欠失または付加は、１または２以上のヌクレオチドを包含する。変異体はコードまたは非コード領域、あるいはその両方が変更され得る。コード域内の変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を生じてもよい。
【００５７】
これに関する本発明の特に好適な態様としては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４を含むＬＳＧポリヌクレオチドによってコードされたのと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらの変異体、類縁体、誘導体および断片、ならびに変異体、類縁体および誘導体の断片がある。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３および８４に示される。さらにこれに関して、特に好適なものは、ポリペプチドの変異体、類縁体、誘導体および断片、ならびに該断片の変異体、類縁体および誘導体をコードするＬＳＧポリヌクレオチドであって、その中で幾つか、少数の、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１個または０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されたものである。
【００５８】
これらの中で特に好ましいものは、ＬＳＧの特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加および欠失である。またこの点で特に好ましいものは、保存的な置換である。最も高度に好ましいのは、置換のない、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５９】
本発明のさらに好ましい態様は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドと少なくとも７０％同一であるＬＳＧポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドである。より好ましいのは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドと少なくとも８０％同一である領域を含むＬＳＧポリヌクレオチドである。
【００６０】
この点に関して、同前と少なくとも９０％同一であるＬＳＧポリヌクレオチドが特に好ましく、これらの特に好ましいＬＳＧポリヌクレオチドの中でも、少なくとも９５％であるものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％であるものの中でも、少なくとも９７％であるものが非常に好ましく、これらの中でも、少なくとも９８％および９９％であるものが特に非常に好ましく、少なくとも９９％であるものが最も好ましい。
【００６１】
さらに、この点に関して特に好適な態様は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによってコードされた成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６２】
本発明はさらに、上記ＬＳＧ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関しては、、本発明は特に、ストリンジェントな条件下において本明細書中で上述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる場合、 「ストリンジェントな条件」という用語は、少なくとも９５％、そして好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。
【００６３】
発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中でさらに記載するように、例えば本明細書記載の本発明のポリヌクレオチドは、ＬＳＧをコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、および、これらＬＳＧと高い配列類似性を有する他遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。かかるプローブは一般に、少なくとも１５塩基を含むだろう。好ましくは、かかるプローブは、少なくとも３０塩基を含み、少なくとも５０塩基を含んでもよい。
【００６４】
例えば、本発明のＬＳＧのコード領域は、既知のＤＮＡ配列から合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることにより単離してもよい。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、どのライブラリーの成員にプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特にポリヌクレオチドアッセイに関して、本明細書中にさら記載するように、ヒトの疾患に対する治療薬や診断薬発見のための研究用試薬および材料として用いられ得る。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質およびさらなるアミノまたはカルボキシル末端アミノ酸、あるいは成熟ポリペプチド内部のアミノ酸であるポリペプチド（例えば成熟形態が、１つよりも多いポリペプチド鎖を有する場合）をコードしてもよい。かかる配列は特に、前駆体からのタンパク質の成熟形態へのプロセシングの役割を果たしてもよく、タンパク質輸送を促進してもよく、タンパク質の半減期を延長または短縮してもよく、あるいはアッセイまたは生産に関するタンパク質の操作を容易にしてもよい。一般にインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）での場合に、さらなるアミノ酸は、細胞酵素により成熟タンパク質から加工される。
【００６７】
１または２以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を持つ前駆体タンパク質は、ポリペプチドの不活性体であり得る。プロ配列が取り除かれると、かかる不活性前駆体は一般に活性化される。活性化の前にプロ配列の幾らかまたは全てが取り除かれてもよい。一般に、かかる前駆体は、プロタンパク質と呼ばれる。
【００６８】
まとめると、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質にリーダー配列を加えたもの（プレタンパク質と称してもよい）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１または２以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはプロタンパク質の前駆体であり、ポリペプチドの活性な成熟形態を生ずるプロセシング工程中に一般には取り除かれる、１または２以上のプロ配列を有するプレプロタンパク質をコードし得る。
【００６９】
ポリペプチド
本発明はさらに、ＬＳＧポリペプチド、好ましくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。典型的には、ポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４に示される。本発明はまた、これらポリペプチドの断片、類縁体および誘導体にも関する。本発明のポリペプチドを参照する場合、「断片」、「誘導体」および「類縁体」という用語は、かかるポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。したがって、類縁体は、プロタンパク質部分の切断により活性化され、活性成熟ポリペプチドを産生することができるプロタンパク質を含む。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってもよい。ある好ましい態様では、それは組換えポリペプチドである。
【００７１】
本発明のポリペプチドの断片、誘導体、または類縁体は、（ｉ）１または２以上のアミノ酸残基が保存的あるいは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換され、かかる置換アミノ酸残基は遺伝的コードによりコードされるものであってもよく、またはそうでなくてもよいもの、（ｉｉ）１または２以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドに、リーダーまたは分泌配列あるいは成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質の精製に利用される配列などのさらなるアミノ酸が融合されているものであってもよい。かかる断片、誘導体および類縁体は、本明細書中の教示により、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換によって参照体から変化したものである。かかる置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様の特性を持つ別のアミノ酸により置換するものである。典型的に保存的置換とし捉えられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間でのあるものから別のものへの置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの相互置換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの置換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間の置換である。
【００７３】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは均一になるまで精製される。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（特に、成熟ポリペプチド）ならびに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと少なくとも７５％の類似性（好ましくは少なくとも７５％の同一性）、より好ましくは少なくとも９０％の類似性（好ましくは少なくとも９０％の同一性）、さらに好ましくは少なくとも９５％の類似性（好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。また一般に少なくとも３０個のアミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含むかかるポリペプチドの部分が包含される。典型的には、ポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４に示される。
【００７５】
当該技術分野において既知のとおり、２つのポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列を比較し、一方のポリペプチド配列のその保存的アミノ酸置換と第２のポリペプチドの置換とを比較することで決定される。
本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成により対応する完全長ポリペプチドを産生するために用いてもよい。したがって、断片は完全長ポリペプチド産生のための中間体として使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成するに使用してもよい。
【００７６】
断片
また本発明のこの側面の好ましい別態様としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの断片を含むポリペプチドがある。これに関しては、断片は上記ＬＳＧポリペプチド、およびそれらの変異体または誘導体のアミノ酸配列と部分的には完全に同一であるが、全てが同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７７】
かかる断片は、「遊離体（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であってもよく、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチドの一部でもなく、融合されていなくてもよく、またそれらが大型ポリペプチドの中に含まれてもよく、それらは、その大型ポリペプチドの一部または領域を形成する。大型ポリペプチド内に含まれる場合には、本明細書中に記載の断片は最も好ましくは単一の連続領域を形成する。しかしながら、複数の断片が単一の大型ポリペプチド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい態様は、宿主内での発現用に設計された前駆体ポリペプチド内に含まれ、ＬＳＧ断片のアミノ末端に融合された異種のプレおよびプロポリペプチド領域、および該断片のカルボキシル末端に融合されたさらなる領域を有する本発明のＬＳＧポリペプチドの断片に関する。したがって、本明細書中に意図する意味の一側面における断片は、ＬＳＧポリペプチドに由来する融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の１つの部分または複数の部分に関する。
【００７８】
本発明のポリペプチド断片の代表例として、約１５個〜約１３９個のアミノ酸を有する上記断片が挙げられ得る。この情況においては、「約」とは、特に引用される範囲、および一方の極値または両極値においていくつか、数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸だけ広い、または狭い範囲を含む。これに関して非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が５アミノ酸程度増減する範囲である。特に非常に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が３アミノ酸程度増減する範囲である。特に好ましいものは、引用範囲から一極値または両極値が１アミノ酸増減する範囲、または、付加または欠失のない引用範囲である。これに関して、すべてのうち最も非常に好ましいのは、約１５〜約４５アミノ酸からなる断片である。
【００７９】
本発明の特に好ましい断片としては、ＬＳＧポリペプチドの切断突然変異体がある。切断突然変異体としては、アミノ末端を含む連続残基（すなわち連続領域、部分、または一部）またはカルボキシル末端を含む連続残基の欠失、あるいは二重切断突然変異体の場合には、一方がアミノ末端を含み、もう一方がカルボキシル末端を含む２つの連続残基の欠失を除く、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するＬＳＧポリペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が挙げられる。本明細書記載のサイズ範囲を有する断片もまた、切断断片の好ましい態様であり、一般には断片の中で特に好ましい。
【００８０】
また本発明のこの側面において好ましいのは、本発明のＬＳＧポリペプチドの構造的または機能的特質によって特徴付けられる断片である。これに関する本発明の好ましい態様としては、本発明のＬＳＧポリペプチドのアルファへリックスおよびアルファへリックス形成領域（「アルファ領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、回転（ｔｕｒｎ）および回転形成（ｔｕｒｎ−ｆｏｒｍｉｎｇ）領域（「回転領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指数（ｈｉｇｈ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）領域を含む断片が挙げられる。
【００８１】
上記のタイプの領域は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列の分析によって定法により同定される。好ましい領域は、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）アルファ領域、ベータ領域、回転領域およびコイル領域、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）アルファ領域、ベータ領域および回転領域、カイト−ドリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）親水性領域および疎水性領域、アイゼンベルク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）アルファおよびベータ両親媒性領域、カルプルス−シュルツ（Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ）フレキシブル領域、エミニ（Ｅｍｉｎｉ）表面形成領域およびジャムセン−ウォルフ（Ｊａｍｓｅｎ−Ｗｏｌｆ）高抗原性指数領域を含む。
【００８２】
これに関して非常に好ましい断片としては、上記特徴の幾つかのような複数の構造的特徴を組合せるＬＳＧの領域を含む断片である。この点に関し、ＬＳＧポリペプチドの選択された残基により規定される領域は、その全てが回転領域、親水性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性指数領域に高度に特徴的なアミノ酸構成により特徴付けられており、特に非常に好ましい領域である。かかる領域は、大型ポリペプチド内に含まれてもよく、または上記のような本発明の好ましい断片そのものでもよい。この項で用いられる「約」という用語は、断片に関して一般的に記載した上記の意味を有することが理解されるであろう。
【００８３】
さらに好ましい領域は、ＬＳＧポリペプチドの活性を媒介する領域である。これに関する最も非常に好ましいものは、同様の活性または改良された活性を有するか、あるいは望ましくない活性が低減された断片を含む、ＬＳＧポリペプチドの化学的、生物学的、またはその他の活性を有する断片である。これに関して非常に好ましいのは、関連ポリペプチドの活性領域と配列または位置について、あるいは配列および位置の両方について相同的であり、肺特異結合タンパク質を含む断片である。これら観点において特に好ましい断片としては、上記の切断突然変異体である。
【００８４】
本発明はまた、上記断片をコードするポリヌクレオチド、断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするもの、および、該断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに関することが理解されるであろう。これらの観点において、好ましいポリヌクレオチドは上記の好ましい断片に対応するものである。
【００８５】
融合タンパク質
本発明の１つの態様において、本発明のＬＳＧポリペプチドは、好ましくは他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は様々な用途に用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドをＨｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメインおよびマルトース結合タンパク質に融合すると精製が容易になる（ＥＰ Ａ ３９４，８２７、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ，Ｎａｔｕｒｅ ３３１： ８４−８６ （１９８８）も参照）。同様にＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３およびアルブミンへの融合は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での半減期を延長する。本発明のポリペプチドに融合された核局在シグナルは、特定の細胞内局在性についてタンパク質を標的にすることができ、一方共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは融合タンパク質の活性を増加または低下させることができる。融合タンパク質はまた１つより多い機能を持つキメラ分子を作り出すこともできる。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質に比べ、融合タンパク質の溶解度および／または安定性を高めることができる。これら上記の全てのタイプの融合タンパク質は、よく知られた手順にしたがって作製することができる。
【００８６】
例えば、ＬＳＧポリペプチドを、以下の手順を介してＩｇＧ分子に融合することができる。簡単に述べると、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、配列の５’および３’末端におよぶプライマーを用い、ＰＣＲ増幅する。これらプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物発現ベクターへのクローニングを容易にするために好都合な制限酵素部位を有する。例えば、ｐＣ４（アクセッション番号２０９６４６）を用いる場合、ヒトＦｃ部分はＢａｍＨＩクローニング部位に連結できる。この手順では、３’ＢａｍＨＩ部位は破壊されなければならない。次に、ヒトＦｃ部分を含むベクターはＢａｍＨＩにより再度制限処理され、これによりベクターは直線化され、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドがこのＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは終止コドンなしにクローニングされることが好ましい。さもなければ融合タンパク質は産生されない。
【００８７】
天然に存在するシグナル配列を用いて分泌タンパク質を産生する場合には、ｐＣ４は第２シグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在するシグナル配列を使用しない場合には、ベクターは異種シグナル配列を含むように改変することができる（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１参照）。
【００８８】
診断アッセイ
本発明はまた、ヒト患者のＬＳＧレベルと、正常ヒト対照でのＬＳＧレベルとを比較することにより、癌を検出、診断、モニタリング、病期分類、および予後判定する定量的および定性的両方の診断アッセイならびに方法に関する。本発明に関して、ＬＳＧレベルが意味するものは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子により発現される未変性タンパク質である。これらのポリヌクレオチドによってコードされる典型的なポリペプチドは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３および８４に示される。
【００８９】
本明細書中で「ＬＳＧ」とはまた、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４と比較した場合にヌクレオチド配列に変化を含むが、依然として同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。検出される未変性タンパク質は、完全体、分解産物、分子複合体または化学的修飾体であってもよい。あるいは、本明細書中で用いられる場合、ＬＳＧが意味するものは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列によりコードされる未変性ｍＲＮＡ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のレベル、またはストリンジェントな条件下において配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のアンチセンス配列にハイブリダイズが可能なポリヌクレオチドのレベルである。
【００９０】
かかるレベルは、好ましくは、正常および異常レベルの決定を含む、細胞、組織および／または体液の少なくとも１つについて測定される。したがって、例えば正常対照体液、細胞、または組織試料に比較したＬＳＧタンパク質の過剰発現を診断するための本発明による診断アッセイは、肺癌の存在の診断に使用され得る。
【００９１】
本発明のすべての方法は、ＬＳＧと同様に、任意に他の癌マーカーのレベルを決定することを含んでもよい。ＬＳＧの以外の本発明に有用な他の癌マーカーは、試験される癌に依存しており、当業者に既知である。
【００９２】
本発明は、好ましくは同種類の正常ヒト対照由来の細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルと比較した、細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルの変化を分析することにより、肺癌の存在を診断する方法であって、正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧレベルの増加が、肺癌の存在に関連する方法を提供する。
【００９３】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて、試験される患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常ヒト対照の好ましくは同一細胞、組織または体液中により、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００９４】
本発明はまた、転移の発生に関して、いまだ転移していない肺癌を有する患者において、転移性肺癌を診断する方法も提供する。本発明の方法では、転移した肺癌を持つと疑われる（しかしそれまでに転移していることは知られていない）ヒト癌患者が同定される。このことは当業者に既知の各種手段により達成される。
【００９５】
本発明では、細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルの存在を決定することは、特に転移をしていない肺癌と転移をしている肺癌とを区別するのに有用である。従来技術は、転移をしている肺癌と転移をしていない肺癌とを区別することが難しく、適切な処置の選択はかかる知識に依存することが多い。
【００９６】
本発明では、かかる細胞、組織または体液において測定される癌マーカーレベルはＬＳＧであり、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーがまさに血清中のＬＳＧである場合、このレベルは好ましくは、正常ヒト対照の血清中のＬＳＧレベルと比較される。正常ヒト対照に対する患者におけるＬＳＧの増加は、転移を有する肺癌に関連する。
【００９７】
本発明を限定するものではないが、典型的に、定量的診断アッセイにおいて試験またはモニターされる患者における癌が転移していることを示す陽性結果は、ＬＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または体液レベルが、正常患者の好ましくは同一細胞、組織または体液中よりも、少なくとも２倍高く、最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。
【００９８】
本明細書中で用いる正常ヒト対照は、癌を有しないヒト患者および／または患者由来の非癌性試料を含み、転移を診断またはモニタリングする方法では、正常ヒト対照はまた、好ましくは、信頼性の高い方法により転移していない肺癌を有することが決定されているヒト患者由来の試料を含んでもよい。
【００９９】
病期分類
本発明はまた、ヒト患者における肺癌を病期分類する方法も提供する。この方法は、かかる癌を持つヒト患者を同定すること、およびかかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＬＳＧについて分析することを含む。次に、患者において決定されたＬＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルと比較し、ここで、正常ヒト対照に対するヒト患者のＬＳＧレベルの増加が進行している癌に関連し、ＬＳＧレベルの低下（それでも真の正常レベルよりは高い）が、消退または寛解している癌に関連する。
【０１００】
モニタリング
さらにかかる癌を持つヒト患者において、転移の発生に関して肺癌をモニタリングする方法を提供する。この方法は、転移がしていることが知られていない、かかる癌を持つヒト患者を同定すること、かかる患者由来の細胞、組織または体液を定期的にＬＳＧレベルについて分析すること、およびヒト患者において決定されたＬＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルと比較することを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者のＬＳＧレベルの増加が、転移している癌に関連する。この方法では、正常ヒト対照試料にはまた、以前の患者試料も含まれ得る。
【０１０１】
さらに本発明により提供されるのは、肺癌の病期の変化を、かかる癌を有するヒト患者においてモニタリングする方法である。該方法は、かかる癌を有するヒト患者を同定すること、かかるヒト患者由来の細胞、組織または体液をＬＳＧについて定期的に分析すること、およびヒト患者において決定されたＬＳＧレベルを、正常ヒト対照の好ましくは同種類の細胞、組織または体液中のＬＳＧレベルと比較することを含み、ここで正常ヒト対照に対するヒト患者におけるＬＳＧレベルの増加が、病期が進行している癌に関連し、ＬＳＧレベルの減少が、病期が後退しているかまたは寛解している癌に関連する。この方法において、正常ヒト対照試料には、以前の患者試料も含まれる得る。
【０１０２】
転移の発生に関しての患者のモニタリングは定期的であり、好ましくは４半期ごとに実施される。しかしながら、これは、癌、特定患者および癌の病期に依存して、より高頻度で、またはより低頻度で実施されてもよい。
【０１０３】
予後判定試験および臨床試験モニタリング
本明細書中に記載の方法はさらに、ＬＳＧレベル増加に関連した疾患または障害を発症する対象、またはその危険性を有する対象を同定するための予後判定アッセイとしても利用できる。本発明は、試験試料をヒト患者より得て、ＬＳＧを検出する方法を提供する。正常ヒト対照に比べ高レベルのＬＳＧの存在は、ヒト患者が癌、特に肺癌を発症する危険性があるという診断である。
【０１０４】
本発明のＬＳＧの発現または活性を低下させる治療薬の有効性は、臨床試験中における、または、ヒト細胞におけるものなどのインビトロスクリーニングアッセイにおける、ヒト患者のＬＳＧの発現レベルを分析することによりモニタリングすることもできる。このようにして、遺伝子発現パターンは、ヒト患者、場合によっては細胞の、試験される薬剤に対する生理学的応答を示すマーカーとして利用できる。
【０１０５】
遺伝子病変および突然変異の検出
本発明の方法はまた、ＬＳＧにおける遺伝子病変、または突然変異の検出にも使用することができ、これにより遺伝子病変を持つヒトが肺癌に対する危険性を有するか、または肺癌を有するかどうかを決定することができる。遺伝子病変は例えば、本発明のＬＳＧからの１または２以上のヌクレオチドの欠失および／または付加および／または置換の存在、ＬＳＧの染色体再配列、ＬＳＧの異常修飾（例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン）、ＬＳＧのｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、ＬＳＧの対立遺伝子の欠損、および／またはＬＳＧタンパク質の不適切な翻訳後修飾の存在を確認することにより検出することができる。本発明のＬＳＧにおけるかかる病変を検出する方法は、当業者に既知である。
【０１０６】
例えば、１つの態様においては、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドに対応する遺伝子の変化は、所定の表現型（疾患など）を示す全集団または個々の患者からのＲＮＡの単離によって決定される。次に、当該技術分野において既知のプロトコルを用いて、これらのＲＮＡ試料からｃＤＮＡが生成される。これらの技法を詳述した多くの実験室マニュアルの代表例である、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照。次いで、ｃＤＮＡを、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４における対象となる領域の周辺のプライマーを用いて、ＰＣＲ用の鋳型として使用する。
【０１０７】
ＰＣＲ条件は、典型的には、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ７０６ （１９９１）に記載される緩衝溶液を用いて、９５℃での３０秒間、５２〜５８℃での６０〜１２０秒、および７０℃での６０〜１２０秒の３５サイクルから構成される。ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端において標識したプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を配列決定する。選択エクソンのイントロン−エクソン境界もまた決定され、ゲノムＰＣＲ産物を分析して、結果を確認する。次に、突然変異が疑われるＰＣＲ産物をクローニングして、配列決定して、直接シーケンシングの結果を確認する。Ｈｏｌｔｏｎ Ｔ． Ａ． ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ， Ｍ． Ｗ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９： １１５６ （１９９１）に記載されるように、ＰＣＲ産物をＴ尾状（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクターにクローニングし、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて配列決定する。病気に冒されていない個体に存在しない突然変異により、病気に冒された個体を同定する。
【０１０８】
ゲノム再配列もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化を決定する方法として観察できる。この方法では、ゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸塩（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）でニックトランスレーションし、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５： ７３−９９ （１９９１）に記載されるように、ＦＩＳＨを実施する。標識プローブを用いたハイブリダイゼーションは、対応するゲノム座への特異的ハイブリダイゼーションのための、大過剰のヒトＤＮＡを用いて行なわれる。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムで染色体を対比染色し、ＣおよびＲバンドの組合せを生じさせる。正確なマッピングのための整列画像（ａｌｉｇｎｅｄ ｉｍａｇｅ）は、冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）および可変励起波長フィルターを併合したトリプルバンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）を用いて得られる（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ．， ８： ７５ （１９９１））。画像収集、分析および染色体分画長測定は、ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌプログラムシステム（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）を用いて行なう。プローブによりハイブリダイズされるゲノム領域の染色体変化は、挿入、欠失および転座として同定される。これらの変化は、関連疾患用診断マーカーとして用いられる。
【０１０９】
アッセイ技術
患者由来の試料における、本発明のＬＳＧなどの遺伝子の発現レベル（タンパク質レベルを含む）を決定するのに使用可能なアッセイ技術は、当業者に既知である。かかるアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびプロテオミクスアプローチ、二次元ゲル電気泳動法（２Ｄ電気泳動）およびマススペクトロメトリーまたはタンパク質相互作用プロファイリングのような非ゲルベースのアプローチが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、ＥＬＩＳＡは生物学的液体中の遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡアッセイはまず、販売元から容易に入手できない場合には、ＬＳＧに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらにＬＳＧに特異的に結合するレポーター抗体が一般には調製される。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射性、蛍光または酵素試薬、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素あるいはアルカリホスファターゼに結合される。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡを行なうには、ＬＳＧに特異的な抗体を、抗体を結合する固体支持体、例えばポリスチレンディッシュ上でインキュベートする。次に、ディッシュの上のフリーなタンパク質結合部位をウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより覆う。次に、分析する試料をこのディッシュ中でインキュベートし、その間にＬＳＧはポリスチレンディッシュに結合した特異抗体に結合する。未結合試料は緩衝液により洗い流される。ＬＳＧに対し特異的であり、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能試薬に結合しているレポーター抗体をディッシュに載せ、その結果レポーター抗体はＬＳＧに結合している任意のモノクローナル抗体に結合する。次に、未結合のレポーター抗体を洗い流す。次に、比色基質を含むペルオキシダーゼ活性用試薬をディッシュに添加する。ＬＳＧ抗体に結合した固定化ペルオキシダーゼが着色反応産物を生ずる。所定時間中に発色した色の量は、試料中に存在するＬＳＧタンパク質の量に比例する。定量的な結果は典型的に、標準曲線を参照することで得られる。
【０１１２】
競合アッセイもまた使用されるが、この場合ＬＳＧに特異的な抗体は、固体支持体に結合され、標識ＬＳＧおよび宿主由来の試料を固体支持体の上を通過させる。固体支持体に結合した検出される標識量を試料中のＬＳＧ量に相関させることができる。
【０１１３】
また、本発明のＬＳＧの核酸配列の全て、または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、核酸法を、肺癌に関するマーカーとしてのＬＳＧのｍＲＮＡの検出に使用することもできる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）は、各種悪性腫瘍の診断およびモニタリングのための悪性細胞の検出に使用できる。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、数千の他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物中において特異的なｍＲＮＡ集団の存在を検出するのに使用可能な強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲでは、ｍＲＮＡ種はまず、酵素、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にｃＤＮＡは標準的ＰＣＲ反応で増幅される。したがって、ＲＴ−ＰＣＲは増幅により、単一のｍＲＮＡ種の存在を示すことができる。したがって、ｍＲＮＡがそれを産生する細胞に非常に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、特定のタイプの細胞の存在を同定することができる。
【０１１４】
固体支持体上に配列された（すなわちグリッディング）クローンまたまオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、その遺伝子の発現の検出、およびその発現レベルの定量の両方に使用できる。このアプローチでは、ＬＳＧ遺伝子をコードするｃＤＮＡは、基材上に固定される。この基材はガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むが、これらに限定されない任意の適切なタイプであり得る。ＬＳＧ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部がこの基材に結合され、次にＲＮＡまたはＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーであり得る、当該組織から単離された分析体とインキュベートされる。基材に結合したＤＮＡと分析体との間のハイブリダイゼーションは、分析体の放射性標識または蛍光標識、またはハイブリッドを検出するために設計した二次分子を含むが、これらに限定されない複数の手段により検出および定量することができる。遺伝子発現レベルの定量は、分析体からのシグナル強度を既知の標準物質から決定されたシグナル強度と比較することで行なうことができる。標準物質は標的遺伝子のインビトロ転写により得ることができ、その収量を定量し、次にその物質を使って標準曲線を作成する。
【０１１５】
プロテオミクスアプローチのうち、２Ｄ電気泳動法が当業者に既知の技術である。血清などの試料からの個別のタンパク質の単離は、通常ポリアクリルアミドゲル上において、タンパク質を異なる特性により順次分離することで達成される。まずタンパク質は、電流を用い大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均一に作用し、その結果小型のタンパク質ほど大型のタンパク質に比べゲル上を遠くへ移動する。第二の次元は、第一の次元に対し垂直方向に電流を作用させ、タンパク質の大きさに基づいてではなく、各タンパク質の持つ特異的電荷により分離する。異なる配列を持つ２つのタンパク質は、大きさと電荷の両方に基づいて同一であることはないので、２Ｄ分離の結果は、各タンパク質が特有のスポットを占有する方形のゲルとなる。このスポットの化学的または抗体プローブによる分析、あるいは続くタンパク質のマイクロシークエンシングにより、試料中の所定のタンパク質の相対量を明らかにすること、および該タンパク質を同定することができる。
【０１１６】
上記試験は、患者より得たホモジネートまたは可溶化組織などの、各種細胞、体液および／または組織抽出物由来の試料について行なうことができる。組織抽出物は、組織生検および剖検材料から常法により得られる。本発明に有用な体液には、血液、尿、唾液またはそれらの任意の他の体分泌物または派生物が含まれる。血液とは、全血、血漿、血清または血液の任意の派生物を含むことを意味している。
【０１１７】
ＬＳＧのインビトロターゲティング／肺癌治療
このＬＳＧの同定はまた、癌、特に肺癌の画像化および処置のための新規治療物質の合理的設計において有用である。例えば、一側面では、ＬＳＧに特異的に結合する抗体を産生し、肺癌を患うことが疑われる患者にインビボで使用することができる。ＬＳＧを特異的に結合する抗体は、診断および／または治療目的で肺癌が疑われる患者に注射することができる。したがって、本発明の別の側面は、ヒト患者に対し有効量の抗体を投与することにより、かかる治療を必要としている患者の肺癌の発症を防止し、治療するための方法に関する。
【０１１８】
「有効量」とは、腫瘍上に発現した標的抗原に結合し、外科的除去のための腫瘍の退縮または腫瘍の消失をもたらすのに必要な抗体量または濃度を意味する。過剰発現されたＬＳＧへの抗体の結合は、かかるＬＳＧを発現する癌細胞に死をもたらすと考えられる。インビボ診断および処置のための抗体の調製および使用は、当該技術分野で既知である。例えば、インジウム−１１１で標識された抗体−キレーターは、癌胎児抗原発現腫瘍のラジオイムノシンチグラフィイメージングでの使用について記載されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。特に、これらの抗体−キレーターは、再発性結腸直腸癌が疑われる患者における腫瘍検出に使用されている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴画像化における使用のための、標識として常磁性イオンを有する抗体も記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ． Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２： ３３９−３４２）。
【０１１９】
ＬＳＧに対する抗体は、同様に使用することができる。ＬＳＧを特異的に結合する標識抗体は、患者の疾患状態の診断または病期分類を目的として、肺癌が疑われる患者に注射することができる。使用される標識は、使用する画像化様式に応じ選択されるであろう。例えば、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１３１などの放射性標識体が平面スキャンまたは単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に使用できる。フッ素−１９などの陽電子放射標識は、陽電子放射断層撮影法に使用できる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンは、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）に使用できる。正常組織の画像化と比べた標識の存在から、癌の播種を決定することができる。器官または組織内の標識量からはまた、その器官または組織中の癌の有無を決定できる。
【０１２０】
インビボの方法で使用可能な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびオムニクローナル抗体、ならびに分子生物学的技術により調製される抗体が含まれる。抗体断片およびアプタマー、ならびにＳＥＬＥＸと呼ばれる、当業者に既知のインビトロ進化プロトコルより得た一本鎖オリゴヌクレオチドも利用できる。
【０１２１】
スクリーニングアッセイ
本発明はまた、ＬＳＧタンパク質に結合するか、またはＬＳＧタンパク質の発現あるいは活性に対する調節効果を持つモジュレータを同定するための方法を提供する。ＬＳＧタンパク質の発現または活性を低下させるモジュレータは、肺癌の処置に有用であると考えられる。かかるスクリーニングアッセイは、当業者に既知であり、細胞ベースアッセイおよび無細胞アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
コンピュータ画像化によりＬＳＧの領域に特異的に結合することが推測される小分子もまた、肺癌の画像化および処置での使用のために、設計、合成、および試験することができる。さらに、分子ライブラリーを、本発明で同定されたＬＳＧに対する分子の結合能力について評価することにより、潜在的な抗癌剤をスクリーニングすることができる。ライブラリーにおいてＬＳＧに結合できるものとして同定された分子は、肺癌の処置における使用を目的としたさらなる評価のための重要な候補体である。好ましい態様では、これら分子は、細胞中のＬＳＧ発現および／または活性を下方調節するだろう。
【０１２３】
養子免疫治療およびワクチン
癌の養子免疫治療は、細胞が、定着した腫瘍の消退を直接または間接的に媒介することを目的として、抗腫瘍応答性を持つ免疫細胞を、担腫瘍宿主に投与する治療的アプローチである。リンパ球、特にＴリンパ球の輸血は、この治療分類に入るものであり、国立癌研究所（ＮＣＩ）の研究者等は、末梢血リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、皮下リンパ節の生検材料由来のＴ細胞培養物の自己輸血を複数のヒト癌患者の処置に使用している（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， 米国特許第４，６９０，９１４号、１９８７年９月１日発行； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９８８、Ｎ． Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９： １６７６−１６８０）。
【０１２４】
本発明は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）の非共役複合体ありまたはなしで、抗原性ＬＳＧ分子に対し感作されたマクロファージを用いた、原発性および転移性肺癌の防止および／または処置のための養子免疫治療の組成物および方法に関する。ＬＳＧの抗原性または免疫原性は、ＬＳＧタンパク質またはその断片の抗体を産生する能力、またはナイーブなエフェクター細胞を教育する能力（エフェクター細胞は、次に抗原（またはエピトープ）発現標的細胞を溶解する）から容易に確認できる。
【０１２５】
癌細胞は、定義によれば、異常であり、正常組織には存在しないので、免疫系により外来物質として認識されるべきタンパク質を含む。しかしながら、免疫系はしばしばこの異常に気づかず腫瘍の攻撃をしないようである。癌細胞により産生される外来性ＬＳＧは、それらの存在を示すのに使用できる。ＬＳＧは腫瘍抗原と呼ばれる短い断片に分解され、細胞表面に提示される。これらの腫瘍抗原はクラスＩおよびクラスＩＩの２つの型が存在するＭＨＣと呼ばれる分子により、細胞表面に保持または提示される。ＭＨＣクラスＩ分子と会合する腫瘍抗原は、細胞障害性Ｔ細胞によって認識されるが、一方抗原−ＭＨＣクラスＩＩ複合体はヘルパー細胞と呼ばれる第２のＴ細胞サブセットにより認識される。これらの細胞はサイトカインを分泌し、これが腫瘍の増殖を遅らせるか、または停止させ、別の型の白血球、Ｂ細胞が腫瘍細胞に対する抗体を作るのを助ける。
【０１２６】
養子免疫治療では、Ｔ細胞またはその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍特異的ＬＳＧ抗原を用いて、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で刺激される。次に、刺激された細胞は、患者に再注入され、そこでそれらは癌細胞を攻撃する。研究から、細胞障害性およびヘルパーＴ細胞の両方を使用すると、いずれか一方のサブセットのみを使用した場合に比べはるかに効果的であることが示されている。さらに、ＬＳＧ抗原は、米国特許第５，９８５，２７０号に記載されているように、熱ショックタンパク質と複合体を形成し、ＡＰＣを刺激し得る。
【０１２７】
ＡＰＣは、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の抗原提示細胞から選択でき、好ましくはマクロファージである。細胞がその個体に対して自己のものである好ましい使用では、養子移植のための免疫細胞のドナー選択の問題を回避するために、リンパ球、マクロファージ、またはその他のＡＰＣ等の自己の免疫細胞が用いられる。自己の免疫細胞の使用により回避できる他の問題は、処置が効を奏さない場合は致死的となる移植片対宿主病である。
【０１２８】
遺伝子治療を用いた養子免疫治療では、ＬＳＧのＤＮＡを従来の遺伝子治療と同様にしてエフェクター細胞内に導入することができる。これによりエフェクター細胞が抗原性タンパク質を産生するように操作されると、腫瘍細胞に対するこれら細胞の細胞障害性が高められ、結果として養子免疫治療が改善される。
本発明のＬＳＧ抗原はまた、肺癌ワクチン構成成分としても有用である。ワクチンは、免疫刺激量のＬＳＧ抗原を含む。免疫刺激量とは、肺癌の改善または処置を目的としてレシピエント内に所望の免疫応答を惹起することができる抗原量を表す。有効量は、当業者に既知の標準的方法により経験的に決定され得る。
【０１２９】
ＬＳＧ抗原は、所望の型の免疫応答、例えば抗体および／または細胞媒介性の応答を誘発するために設計された多くのワクチン配合物のいずれか一つとして提供され得る。かかる配合物は、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第５，５８５，１０３号に記載されている配合物を含むが、これに限定されるものではない。免疫応答を刺激するのに使用される本発明のワクチン配合物はまた、薬学的に許容され得るアジュバントも含むことができる。
【０１３０】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。
【０１３１】
宿主細胞は、ＬＳＧポリヌクレオチドを組み込み、本発明のＬＳＧポリペプチドを発現するように遺伝的に操作することができる。例えば、ＬＳＧポリヌクレオチドは、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）および形質転換の周知技術を用いて、宿主細胞内に導入され得る。ＬＳＧポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチドとともに導入されてもよい。かかる他のポリヌクレオチドは、単独で導入されてもよく、共導入されてもよく、または本発明のＬＳＧポリヌクレオチドと結合して導入されてもよい。
【０１３２】
例えば、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドは、例えば哺乳動物細胞における、コトランスフェクションおよび選択に関する標準的技術を用いて、選択可能マーカーをコードする他の分離したポリヌクレオチドとともに、宿主細胞内にトランスフェクトされてもよい。この場合、ポリヌクレオチドは一般に、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれるであろう。
【０１３３】
あるいは、ＬＳＧポリヌクレオチドは、宿主内での増殖用の選択可能マーカーを含むベクターに結合されてもよい。ベクター構築物は、上記技術により宿主細胞内に導入されてもよい。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物中に、または荷電脂質との複合体中に、ＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーションもまた宿主内へのＬＳＧポリヌクレオチド導入に利用され得る。ベクターがウイルスの場合には、それはインビトロでパッケージングされてもよく、またはパッケージング細胞内に導入され、パッケージングされたウイルスが細胞内に形質導入されてもよい。当業者により日常的に行なわれている、よく知られた広範な技術が、本発明のこの側面にしたがってＬＳＧポリヌクレオチドを作製し、およびＬＳＧポリヌクレオチドを細胞内に導入するのに好適である。かかる技術は、本明細書中に既述したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．などの参考文献に十分に概説されている。
【０１３４】
本発明で用いてもよいベクターは、例えばプラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡウイルスベクターを含む。かかるベクターは、細胞内へのＤＮＡおよびＲＮＡ導入に関する既知の技術により、細胞内にポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして導入され得る。ベクターは、ファージおよびウイルスベクターの場合、好ましくは、感染および形質導入に関する既知の技術によりパッケージされたウイルス、またはキャプシド形成されたウイルスとして細胞内に導入され得る。ウイルスベクターは、複製性または複製欠損性であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に、補完宿主細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）内でのみ生ずる。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現のための好ましいベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主細胞での発現に効果的なシス作用性の制御領域を含むベクターを包含するが、これに限定されない。適切なトランス作用性因子は、宿主により供給されるか、補完ベクター（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）により供給されるか、または宿主導入時にベクター自体により供給される。
【０１３６】
これに関して、ある好ましい態様において、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみの発現、もしくは誘発性および細胞特異的発現の両方であり得る。誘発性ベクターのうち特に好ましいのは、温度および栄養添加物といった操作が容易である環境因子により発現が誘発できるベクターである。原核生物および真核生物宿主での使用のための構成的および誘発的発現ベクターを含めた本発明のこの態様に適切な各種ベクターが既知であり、当業者により常法として使用されている。
【０１３７】
操作された宿主細胞は、通常の栄養培地中で培養でき、培地はとりわけプロモーターを活性化すること、形質転換体を選択すること、または遺伝子を増幅することに関して適切なように改良してもよい。発現のために選択された宿主細胞に従来使用されている温度、ｐＨ等の培養条件は、一般的に本発明のＬＳＧポリペプチドの発現に適切であろう。
【０１３８】
本発明のＬＳＧポリペプチドの発現には非常に多様な発現ベクターが使用可能である。かかるベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクターを含む。ベクターは、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、ならびに、それらの組合せ、例えば、コスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的要素に由来するものなどに由来してもよい。これらは全て本発明のこの側面による発現に使用され得る。一般に、宿主内でポリペプチドを発現させるためのポリヌクレオチドの維持、増殖、または発現に適切な任意のベクターをこれに関する発現に使用してもよい。
【０１３９】
適切なＤＮＡ配列は、各種既知の、かつ日常的な技術のいずれかによりベクター内に挿入され得る。一般に発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１または２以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使い制限断片を一つに結合させることで、発現ベクターに結合される。この目的に使用できる制限および結合の手法は当業者にとって既知かつ常法である。この観点に適切な手法、および別の方法を用い発現ベクターを構築する手法は、当業者にとって既知かつ常法であり、本明細書の他所に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に詳細記載されている。
【０１４０】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写に対するプロモーターを含む適切な発現制御配列に作動可能に連結されている。代表的なプロモーターとしては、よく知られた少数のプロモーターを挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターがある。本発明のこの側面での使用に適切である多くの記載外のプロモーターが既知であり、本発明での議論および実施例に例示される様式によって当業者により容易に使用され得ることが理解されるだろう。
【０１４１】
一般に発現構築体物は転写の開始および終止に関する部位、および転写領域内には翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写体のコード部分は、開始部位に翻訳を開始するＡＵＧを、そして翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含む。
さらに、構築物は、発現を制御しかつ発現をもたらす制御領域を含んでもよい。一般には、多くの一般的に実施されている手法によれば、かかる領域は、とりわけリプレッサー結合部位やエンハンサーのように、転写を制御することで作動するであろう。
【０１４２】
増殖および発現用のベクターは、一般には選択マーカーを含むだろう。かかるマーカーはまた増幅にも適切であり、あるいはベクターはこの目的のためのさらなるマーカーを含んでもよい。これに関しては、、好ましくは発現ベクターは１または２以上の選択マーカー遺伝子を含み、形質転換した宿主細胞の選択に関する表現型の特徴を提供する。好ましいマーカーは、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素あるいはネオマイシン耐性を、大腸菌やその他の細菌の培養についてテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０１４３】
本明細書の他所に記載されている適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター、およびその他の適切な制御配列を含むベクターは、その中での所望のポリペプチドの発現に適切である各種既知の技術を用い、適切な宿主内に導入され得る。適切な宿主の代表例は、大腸菌、放線菌およびネズミチフス菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ショウジョウバエのＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）のｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボーズ黒色腫細胞などの動物細胞、ならびに植物細胞を含む。非常に多様な発現構築物のための宿主がよく知られており、当業者は本開示により、本発明のこの側面にしたがって、ＬＳＧポリペプチドの発現に適した宿主を容易に選択することができるだろう。
【０１４４】
より具体的には本発明はまた、発現構築物などの、１または２以上の上記配列を含む組換え構築物も包含する。構築物には、本発明のかかるＬＳＧ配列が挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターが含まれる。配列は順方向、または逆方向に挿入され得る。これに関するある好ましい態様では、構築物は、例えばプロモーターなどの、配列に作動可能に連結された制御配列をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明での使用に適切なベクターが多く市販されている。
【０１４５】
以下に、市販のベクターを例示する。細菌での使用にとりわけ好ましいベクターは、Ｑｉａｇｅｎより入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５である。とりわけ好ましい真核細胞ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、およびＰｈａｒｍａｃｉａより入手可能なｐＳＫＶ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。これらベクターは、本発明のこの側面での使用に関し、当業者が利用可能な多くの市販されている既知のベクターから例示することのみを目的とし掲載されている。本開示を読むことにより、宿主内での、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖および／または発現に適切な任意のその他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの側面に使用できることが当業者に理解されるであろう。
【０１４６】
プロモーター領域は、候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含み得る断片を導入するための、１または２以上の部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写単位などの、プロモーター領域を欠くレポーター転写単位を含むベクターを用いて、任意の所望の遺伝子より選択することができる。周知のように、ｃａｔ遺伝子の上流にある制限部位において、プロモーターを含む断片をベクターに導入すると、標準的なＣＡＴアッセイにより検出することができるＣＡＴ活性が発生する。この目的に適切なベクターは既知であり、容易に入手できる。かかる２種類のベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。すなわち、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターには、既知、かつ容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポーター遺伝子を使用した上記技術により容易に得ることができるプロモーターも含まれる。
【０１４７】
とりわけ知られている、本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩとｌａｃＺおよびプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーター、およびｔｒｐプロモーターである。本観点に適切な、とりわけ知られている真核生物プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のものなどの、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターである。
【０１４８】
宿主細胞での発現に適切であるベクターおよびプロモーターを選択することは既知の手法であり、発現ベクターの構築、宿主内へのベクターの導入および宿主での発現に必要な技術は、当該技術分野で日常の技術である。
本発明はまた、上記構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は哺乳動物細胞などの高等真核生物細胞、または酵母細胞などの下等真核生物細胞である。あるいは、宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞である。
【０１４９】
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法により行なうことができる。かかる方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， （１９８６）などの多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
宿主細胞内の構築物は従来の様式で用いられ、組換え配列にコードされる遺伝子産物を産生できる。あるいは、本発明のＬＳＧポリペプチドは従来のペプチド合成装置により合成的に作製することができる。
【０１５０】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系は、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを利用することで、かかるタンパク質の産生に利用することができる。原核生物および真核生物宿主とともに使用することに適したクローニングおよび発現ベクターは、本明細書の他所で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載されている。
【０１５１】
一般に、組換え発現ベクターは複製起点、下流の構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子由来プロモーター、およびベクターへの暴露後にベクター含有細胞を単離できるようにする選択マーカーを含むだろう。特に適切なプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、および熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。選択マーカーは、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐｌ遺伝子を含む。
【０１５２】
高等真核生物による本発明のＬＳＧポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することで増強することができる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性要素であり、通常約１０〜３００塩基対（ｂｐ）であり、所定の宿主細胞タイプにおいてプロモーターの転写活性を高める。エンハンサーの例は、ｂｐ１００〜２７０にある複製起点の後方に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【０１５３】
本発明のＬＳＧポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、標準的技術を用いることで、発現のためのプロモーターと作動可能に連結されるようにベクター内に挿入される。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結合部位に対し適切に５’側に位置するように配置される。リボソーム結合部位は発現されるべきポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’側になる。一般に、通常ＡＵＧである１つの開始コドンから開始し、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧの間に位置するような他のオープンリーディングフレームは存在しない。また一般に、ポリペプチドの末端には翻訳停止コドンがあり、さらに転写領域の３’末端に適切に配置されたポリアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在するだろう。
【０１５４】
小胞体内腔内、細胞周辺腔、または細胞外環境に翻訳タンパク質を分泌するために、発現ポリペプチド中に適切な分泌シグナルを組み込んでもよい。シグナルはポリペプチドに対し同種でも、あるいは異種シグナルでもよい。
【０１５５】
ポリペプチドは融合タンパク質などの修飾形態として発現されてもよく、分泌シグナルだけでなくさらなる異種機能領域を含んでもよい。すなわち、例えば精製中、あるいはその後の取り扱いや保存中、宿主細胞内における安定性および持久性を改善するために、さらなるアミノ酸領域、特には荷電アミノ酸をポリペプチドのＮ末端に付加してもよい。精製を容易にするためにポリペプチドに領域を付加してもよい。かかる領域は、ポリペプチドの最終調製前に取り除かれるだろう。分泌または排出を起こさせるために、あるいは安定性を向上させ、とりわけ精製を容易にするために、ポリペプチドにペプチド部分を加えることは、当該分野において一般的であり、日常的な技術である。
【０１５６】
本発明によるＬＳＧポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適切な原核動物宿主は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やネズミサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の様々な種はこれに関する適切な宿主である。さらに、当業者に既知のその他の多くの宿主も、これに関して使用できるだろう。
【０１５７】
代表的であるが、非限定的な例としては、細菌での応用に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび既知のクローニングベクターであるｐＢＲ３２２の遺伝要素を含む市販プラスミド由来の細菌性の複製起点を含むことができる。かかる市販ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と合わせられる。適切な宿主株を形質転換し、宿主株を選択したプロモーターが誘発可能な適切な細胞密度まで増殖させた後に、適切な手段でそれを誘発し（例えば温度変化、または化学的誘発物質への暴露）、細胞はさらなる期間培養される。
【０１５８】
次に、細胞は一般には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊され、そして得られた粗製抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来の方法により破壊することができ、かかる方法は当業者に既知である。
【０１５９】
同様に、発現には様々な哺乳動物細胞培養系が使用できる。典型的な哺乳動物発現系は、Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２３： １７５ （１９８１）に記載されている、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系である。適合するベクターを発現させることができるその他の哺乳動物細胞系は、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらに発現に必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含むだろう。これに関するある好ましい態様では、ＳＶ４０スプライス部位に由来するＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化部位がこれらのタイプの必須非転写遺伝要素として利用される。
【０１６０】
ＬＳＧポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法により組換え細胞培養物より回収および精製され得る。最も好ましくは、精製には高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が用いられる。単離または精製中にポリペプチドが変性させられた場合には、活性立体構造を再生するためにタンパク質のリフォールディングに関する既知の技術が利用され得る。
【０１６１】
本発明のＬＳＧポリペプチドは、天然精製産物、化学合成産物、および例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物を含む原核生物または真核生物宿主から組換え技術により生産された産物を含む。組換え体の産生手法に用いた宿主に応じて、本発明のＬＳＧポリペプチドはグリコシル化されてもよく、あるいはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のＬＳＧポリペプチドはさらに幾つかの例では宿主媒介性プロセスの結果としての初期修飾メチオニン残基を含んでもよい。
【０１６２】
ＬＳＧポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本発明によれば、各種用途、特にＬＳＧの化学的および生物学的な特性を利用する用途に使用され得る。さらなる用途は、細胞、組織および生物体の障害の診断および処置に関する。本発明のこれらの側面は、以下の議論によってさらに説明される。
【０１６３】
ポリヌクレオチドアッセイ
上記においていくらか詳細に述べたとおり、本発明はまた、例えば診断薬としての相補的ポリヌクレオチドを検出することを目的としたＬＳＧポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連したＬＳＧの突然変異体の検出は、ＬＳＧの過少発現、過剰発現または発現の変化の結果生ずる疾患または疾患に対する感受性、例えば遺伝性肺癌に対する感受性の診断に追加されまたは診断を決定することができる診断ツールを提供するだろう。
【０１６４】
ヒトＬＳＧ遺伝子に突然変異を有する個体は、各種技術によりＤＮＡレベルで検出されるだろう。診断用の核酸は、患者細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料から得られる。ゲノムＤＮＡは検出に直接用いてもよく、または分析前にＰＣＲを使い酵素的に増幅してもよい（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ、３２４： １６３−１６６（１９８６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に使用される。例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または７４のＬＳＧポリヌクレオチドに相補的なＰＣＲプライマーは、ＬＳＧ発現および突然変異の同定および分析に使用できる。例えば欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ変化により検出できる。点突然変異は、増幅ＤＮＡを放射線標識したＬＳＧ  ＲＮＡに、または代替的に、放射線標識したＬＳＧアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることで同定できる。完全一致配列は、ＲＮａｓｅＡ消化または融解温度の差により、不一致二本鎖と識別することができる。
【０１６５】
参照遺伝子と突然変異を有する遺伝子との配列の差はまた、直接ＤＮＡ配列分析からも示される。さらにクローンニングしたＤＮＡ断片をプローブとして使用して、特定のＤＮＡ断片を検出してもよい。かかる方法の感度は、ＰＣＲまたはその他の増幅法を適切に利用することで大きく高めることができる。例えば、配列分析用プライマーは、変法ＰＣＲにより作成された二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子とともに用いられる。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いた従来の方法、または蛍光タグを用いた自動配列決定方法によって実施される。
【０１６６】
ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝子検査は、変性剤が存在する、または存在しないゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することで達成され得る。小配列の欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動法により視覚化することができる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別されるが、その場合、異なるＤＮＡ断片の移動度はそれらの特異的融解温度または部分融解温度にしたがってゲル中の異なる点で遅くなる（例えば、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １２４２ （１９８５）参照）。
【０１６７】
特異的位置における配列の変化はまた、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的切断法（例えばＣｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８５： ４３９７−４４０１ （１９８５））などのヌクレアーゼ保護アッセイによっても明らかとなり得る。
したがって、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列分析または制限酵素の使用（例えば制限酵素長多型（「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングといった方法により達成できる。従来型のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列分析法に加えて、突然変異は、インサイチュ分析によっても検出できる。
【０１６８】
染色体アッセイ
本発明のＬＳＧ配列はさらに、染色体同定にも有用である。染色体上の特定部位を同定することが求められており、実際の配列データに基づいた（反復多型）少数の染色体マーキング試薬が、現在染色体位置をマーキングするために利用できる。本発明の各ＬＳＧ配列は、個々のヒト染色体上の特定位置に特異的に標的化され、それとハイブリダイズすることができる。したがって、ＬＳＧは、配列を疾患関連遺伝子と相関させる上での重要な第１段階である、ＤＮＡの染色体へのマッピングに用いることができる。
【０１６９】
これに関するある好ましい態様では、本明細書中に開示されたｃＤＮＡは本発明のＬＳＧのゲノムＤＮＡをクローニングするのに用いられる。これは、各種既知の技術と、一般に市販されているライブラリーを用いて達成できる。このゲノムＤＮＡは、その目的のための既知の技術を使用したインサイチュ染色体マッピングに用いられる。
幾つかの例では、配列は、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）をｃＤＮＡから調製することで、染色体にマッピングできる。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用することで、ゲノムＤＮＡ中の１つより多いエクソンにおよばず、従って増幅工程を複雑にするプライマーが迅速に選択される。次にこれらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いられる。プライマーに対応したヒト遺伝子を含むハイブリッドだけが増幅断片を生ずる。
【０１７０】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定ＤＮＡを特定の染色体に割りふる迅速な手法である。同一オリゴヌクレオチドプライマーとともに本発明を使用すれば、特定の染色体または大型のゲノムクローンのプールに由来する断片のパネルを使用し、同様にサブローカリゼーションを行なうことができる。その染色体へのマッピングに同様に使用できるその他のマッピング戦略は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フロー選別染色体によるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのハイブリダイゼーションによる前選別を含む。
【０１７１】
展開した中期染色体へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は５０または６０ｂｐといった短いｃＤＮＡで用いることができる。この技術は、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ： Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８））によって記載されている。
いったん配列を染色体位置に正確にマッピングできれば、染色体における配列の物理的位置と遺伝地図データとを関連付けることができる。かかるデータは、例えばジョン・ホプキンス（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ）大学、ウエルチ（Ｗｅｌｃｈ）医学図書館よりオンラインで入手可能なＶ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ， ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ ＩＮ ＭＡＮに見いだされる。次に、連鎖分析（物理的に近接する遺伝子の随伴遺伝）により、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連性が同定される。
【０１７２】
次に、病気に罹った個体と罹っていない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差を決定する必要がある。もし変異が病気にかかった個体の一部または全部に観察されるが、いずれの正常個体にも観察されない場合、その変異はおそらく病気の原因物質である可能性がある。
現時点の物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の解像度では、疾患関連染色体領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０ないし５００の潜在的原因遺伝子のうちの１個であろう。（これは１メガ塩基マッピングの解像度、および２０ｋｂあたり１つの遺伝子と仮定）。
【０１７３】
ポリペプチドアッセイ
上記でいくらか詳細に記載したとおり、本発明はまた、正常および異常レベルの決定を含む、細胞および組織、および例えば血液や尿などの生物学的液体中のＬＳＧポリペプチドのレベルを検出する定量および診断アッセイなどの診断アッセイに関する。したがって、例えば正常組織試料と比較したＬＳＧポリペプチドの過剰発現または過少発現を検出する本発明による診断アッセイは、例えば新生物の存在の検出に用いられる。宿主由来試料中の、本発明のＬＳＧポリペプチドなどのタンパク質のレベルの決定に使用できるアッセイ技術は、当業者に既知である。かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。とりわけＥＬＩＳＡが好ましい場合が多い。
【０１７４】
例えば、抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、試料中、好ましくは生物試料中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで、特異抗体により被覆する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり、本明細書記載の方法により産生される。ウェルへのポリペプチドの非特異的結合が低減するように、ウェルをブロッキングする。次に、被覆したウェルを、ＬＳＧポリペプチドを含有する試料とともに、室温にて２時間より長い時間インキュベートする。好ましくは、試料の連続希釈物を用いて、結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄して、未結合のポリペプチドを除去する。次に、２５〜４００ｎｇの濃度の特異抗体−アルカリホスファターゼ複合体５０μｌを添加して、室温にて２時間インキュベートする。再びプレートを脱イオン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の複合体を除去する。
【０１７５】
次に、各ウェルに、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＰＰ）基質溶液（７５μｌ）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。マイクロタイタープレートリーダーにより、反応を測定する。対照試料の連続希釈物を用いて、標準曲線を作成し、Ｘ軸上にポリペプチド濃度を（対数目盛）、Ｙ軸上に蛍光または吸光度（均等目盛）をプロットする。標準曲線を用いて、試料中のＬＳＧポリペプチド濃度を内挿する。
【０１７６】
抗体
上記でいくらか詳細に記載したとおり、ＬＳＧポリペプチド、それらの断片またはその他の誘導体、もしくはその類縁体、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生ずるための免疫原として使用できる。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまたキメラ、単鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も含む。かかる抗体および断片の産生のための、当該技術分野で既知の様々な手法が使用できる。
【０１７７】
抗体産生のための多様な方法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２に記載されている。
例えば、本発明のＬＳＧポリペプチドを発現する細胞を動物に投与して、ポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘発することができる。好ましい方法では、分泌タンパク質調製物を調製し、それを天然の夾雑物を実質的に含まないように精製する。次に、より高い特異的活性を有するポリクローナル抗血清を産生するために、この調製物を動物に導入する。得られた抗体は、ポリペプチド自体と結合するだろう。このようにすれば、ＬＳＧポリペプチドの断片のみをコードする配列でも、これを用いて全未変性ポリペプチドに結合する抗体を生成することができる。次にかかる抗体を用いてそのＬＳＧポリペプチドを発現している組織から、ＬＳＧポリペプチドを単離できる。
【０１７８】
あるいは、モノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の製造技術の例は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７ （１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２（１９８３））および（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ ． ｐｇ．７７−９６ （１９８５））を含むが、これらに限定されない。ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術は、ヒトモノクローナル抗体の製造に有用である。
【０１７９】
ハイブリドーマ技術は、Ｋｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ５１１ （１９７６））、Ｋｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： ２９２ （１９７６））およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ． Ｙ．， ｐｐ． ５６３−６８１ （１９８１））にも記載されている。一般に、かかる手法は、ＬＳＧポリペプチド、またはより好ましくは分泌ＬＳＧペプチド発現細胞で、動物（好ましくは、マウス）を免疫することを包含する。かかる細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養されてもよいが、１０％のウシ胎児血清（約５６℃にて不活化）添加、ならびに非必須アミノ酸約１０ｇ／ｌ、ペニシリン約１，０００Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン約１００μｇ／ｍｌ添加、アール変法イーグル培地において細胞を培養することが好ましい。かかるマウスの脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞系と融合させる。
【０１８０】
本発明によれば、いかなる適切な骨髄腫細胞系を用いてもよいが、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞系（ｐａｒｅｎｔ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）（ＳＰ２０）を用いることが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地において選択的に保持され、続いてＷａｎｄｓ ｅｔ ａｌ． （Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０： ２２５−２３２ （１９８１））に記載されたように、限界希釈によりクローニングされる。次に、かかる選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチドを結合することが可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
【０１８１】
あるいは、ポリペプチドに結合することが可能なさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いた二段階手法にて産生することができる。かかる方法は、抗体自身が抗原であるという事実を利用するものであり、したがって、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法にしたがって、タンパク質特異抗体を用いて、動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、かかる動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、タンパク質特異抗体に結合する能力が、ポリペプチドにより阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。かかる抗体は、タンパク質特異抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、それを用いて、動物を免疫し、さらなるタンパク質特異抗体の形成を誘発することができる。
【０１８２】
単鎖抗体の生成に関し記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体の生成に適用することができる。さらにトランスジェニックマウス、ならびに他の非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他の断片を、本明細書に開示する方法にしたがって用いてもよいことが理解されるであろう。かかる断片は、典型的に、（Ｆａｂ断片を産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するための）ペプシンなどの酵素を用いて、タンパク質分解性切断により産生される。あるいは、分泌タンパク質結合断片は、組換えＤＮＡ技術の適用により、または合成化学により産生され得る。
【０１８３】
ヒトにおける抗体のインビボ使用に関して、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。かかる抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝構築物を用いて産生することができる。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である（レビューとして、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： １２０２ （１９８５）、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４： ２１４ （１９８６）、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８１６，５６７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７１４９６、Ｍｏｒｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７３４９４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８６０１５３３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８７０２６７１、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３ （１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８ （１９８５）を参照）。
【０１８４】
上記抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または精製のために、固体支持体に抗体を結合させることで、本発明のＬＳＧポリペプチドを発現しているクローンを単離または同定すること、またはＬＳＧポリペプチドを精製することに使用され得る。上記でさらに詳細に述べられているとおり、ＬＳＧに特異的な抗体はまた、癌に苦しむ患者において、腫瘍、特に肺の癌の画像化に用いてもよい。かかる抗体はまた、ＬＳＧを発現する標的腫瘍に対し治療的に用いてもよい。
【０１８５】
同定された本発明のＬＳＧの好ましい典型的な抗原性エピトープを以下に示す。用いた抗原性インデックス（ＡＩ ａｖｇ）は、ジェームソン−ウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）である。いくつかの態様において、ＬＳＧのこれらの領域に対する抗体を惹起するのが好ましい。
【表１】
2004520814.tif 000002
【０１８６】
【表２】
2004520814.tif 000003
【０１８７】
ＬＳＧ結合分子およびアッセイ
本発明はまた、受容体分子などのＬＳＧを結合する分子の同定に関する方法も提供する。受容体タンパク質などの、ＬＳＧを結合するタンパク質をコードする遺伝子は、当業者に既知の様々な方法によって同定できる。例は、リガンドパニング法（Ｌｉｇａｎｄ ｐａｎｎｉｎｇ）およびＦＡＣＳソーティングを含むが、これらに限定されない。かかる方法は、例えばＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５（１９９１）などの多くの研究用マニュアルに記載されている。
【０１８８】
発現クローニングは、この目的にも用いることができる。そのためには、本発明のＬＳＧに反応する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製する。このＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリーをプールに分ける。次に、このプールを本発明のＬＳＧに反応しない細胞に個別にトランスフェクトする。次に、トランスフェクトした細胞を標識ＬＳＧに暴露する。ＬＳＧポリペプチドは、放射性ヨウ素化法、または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位を含めること（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）などの標準的方法を含むが、これらに限定されない多様な既知の技術により標識できる。暴露後、細胞は固定され、標識ＬＳＧの結合が決定される。これら手法はガラススライド上で好都合に実行される。標識ＬＳＧを含むプールが、ＬＳＧ結合細胞が産生したｃＤＮＡを含むとして同定される。次に、これらの陽性体からサブプールが調製され、上記と同様に宿主細胞内にトランスフェクトされ、スクリーニングされる。サブプールプロセスとスクリーニングプロセスを繰り返すことで、受容体分子などの結合分子候補をコードする１または２以上の単一クローンを単離することができる。
【０１８９】
あるいは標識リガンドは、受容体分子などの、それを結合する分子を発現する細胞から調製された、膜あるいは膜抽出物などの細胞抽出物にフォトアフィニティー結合することができる。架橋した物質はポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）により分析され、Ｘ線フィルムに感光させられる。リガンド−受容体を含む標識複合体は切り出され、ペプチド断片に分解され、タンパク質マイクロシーケンシングにかけることができる。マイクロシーケンシングより得たアミノ酸配列を使用することで、候補受容体分子をコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのユニークまたは縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。
本発明のポリペプチドはまた、受容体分子などのＬＳＧ結合分子の、細胞内または無細胞調製物中でのＬＳＧ結合能の評価に使用できる。
【０１９０】
アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子
本発明はまた、細胞においてＬＳＧの作用を高める、または阻止するような化合物をスクリーニングする方法も提供する。本明細書中で用いられる「化合物」は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体、ならびに細胞におけるＬＳＧの作用を高めるまたは作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）または阻止するまたは拮抗する潜在力を有する、任意の他の候補分子を包含するとされる。本明細書中で用いる場合、アゴニストは、ＬＳＧの天然の生物学的機能を増加させるか、またはＬＳＧに類似の様式で機能する化合物であり、一方アンタゴニストは、本明細書で用いる場合、かかる機能を低下させるまたは排除する化合物である。アゴニストおよび／またはアンタゴニストについてスクリーニングするための多様な既知の方法を、ＬＳＧアゴニストまたはアンタゴニストの同定に用いるために適合させることができる。
【０１９１】
例えば、膜などの細胞コンパートメント、または膜調製物などのそれらの調製物は、ＬＳＧにより調節されるシグナリングまたは制御経路の分子などの、ＬＳＧを結合する分子を発現する細胞から調製され得る。この調製物は、ＬＳＧアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下において、標識ＬＳＧとインキュベートされる。化合物の結合分子を結合する能力は、標識リガンドの減少した結合となって現れる。自由に結合する化合物、すなわちＬＳＧ結合分子の結合において、ＬＳＧの効果を誘発しない分子が最も良好なアンタゴニストであろう。十分に結合し、ＬＳＧと同一または密接に関係した効果を惹起する化合物はアゴニストである。潜在的アゴニストよびアンタゴニストのＬＳＧ類似の効果は、例えば候補分子を細胞または適切な細胞調製物と相互作用させた後に、セカンドメッセンジャーシステムの活性を決定すること、およびその効果をＬＳＧの効果、あるいはＬＳＧと同一の効果を惹起する分子の効果と比較することで測定され得る。この観点に関して有用であり得るセカンドメッセンジャーシステムは、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセンジャーシステムを含むが、これらに限定されない。
【０１９２】
ＬＳＧアンタゴニストに関するアッセイの別の例は、競合阻害アッセイに適切な条件の下においてＬＳＧならびに潜在的アンタゴニストを、膜結合ＬＳＧ受容体分子または組換えＬＳＧ受容体分子とを組合せる競合アッセイである。ＬＳＧは、受容体分子に結合したＬＳＧ分子の数を正確に決定し、潜在的アンタゴニストの有効性を評価できるように、例えば放射能で標識することができる。
【０１９３】
潜在的アンタゴニストは、本発明のＬＳＧポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または無力化する小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を含む。潜在的アンタゴニストはまた、小有機分子、ペプチド、ＬＳＧ誘発活性を誘発することなく、受容体分子などの結合分子上の同一部位に結合し、それによりＬＳＧを結合から排除することによりＬＳＧの作用を阻害する、密接に関連するタンパク質または抗体などのポリペプチドであってもよい。
【０１９４】
潜在的アンタゴニストは、ＬＳＧポリペプチドの結合部位に結合し、これを占有することで受容体分子などの細胞結合分子への結合を阻害し、その結果正常な生物学的活性が阻害される小分子を含む。小分子の例としては、小有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
他の潜在的アンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じ、あるいは三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するのに使用できる。アンチセンス技術は、例えばＯｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， ５６： ５６０ （１９９１）； ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＳ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ ＯＦ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （１９８８）の中で論じられている。三重らせん形成は、例えばＬｅｅｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ４５６ （１９８８）、およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３６０ （１９９１）の中で論じられている。該方法はポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば本発明の成熟型ＬＳＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用され得る。
【０１９６】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写物に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計されており、それによりＬＳＧポリペプチドの転写ならびに生成を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＬＳＧポリペプチドへの翻訳を阻止する。また上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現され、ＬＳＧの産生を阻害するように細胞内に送達されることもできる。
【０１９７】
組成物
本発明はまた、ＬＳＧポリヌクレオチドまたはＬＳＧポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストを含む組成物に関する。
例えば、本発明のＬＳＧポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、細胞、組織または生体への使用のための非無菌的または無菌的な１または２以上の担体、例えば対象への投与に適切な薬学的担体と併用されてもよい。かかる組成物は、例えば媒体添加物または治療的な有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。かかる担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せを含んでもよいが、これらに限定されない。配合物は投与様式に適していなければならない。
【０１９８】
本発明の組成物は、個々の患者の臨床状態（特に、ポリペプチドまたは他の化合物単独での処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および開業医に既知の他の要素を考慮して、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に沿った様式で、処方されて、投薬される。したがって、本明細書の目的に関する「有効量」は、かかる考慮により決定される。
【０１９９】
一般的な提案として、１回用量あたり非経口的に投与される分泌ポリペプチドの薬学的総有効量は、約１μｇ／ｋｇ（患者の体重）／日〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）／日の範囲であろうが、上述するように、これは治療上の判断に左右されるであろう。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトに関して最も好ましくは、ホルモンに関して約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与えられる場合、ポリペプチドまたは他の化合物は、典型的に、１日あたり１〜４回の注射により、または連続皮下注入により（例えば、ミニポンプを用いて）、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０ｍｇ／ｋｇ／時の用量速度にて投与される。点滴バッグ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｂａｇ）溶液もまた、用いてもよい。変化を観察するのに必要な処置の期間、および処置後に応答が生じる間隔は、所望の効果に依存して変わるようである。
【０２００】
本発明の分泌タンパク質を含有する薬学的組成物は、経口的に、経直腸的に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（パウダー、軟膏、ジェル、滴薬または経皮パッチによるものなど）、口腔に、または口腔もしくは鼻スプレーとして、投与される。「薬学的に許容し得る担体」は、無毒性の固形、半固形または液体賦形剤、希釈剤、カプセル用材料または任意のタイプの配合助剤を指す。本明細書で使用する「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内注射ならびに注入を含む投与様式を指す。
【０２０１】
ポリペプチドまたは他の化合物はまた、持続放出系により適切に投与される。持続放出性組成物の適切な例としては、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２： ５４７−５５６ （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５： １６７−２７７ （１９８１）、およびＲ． Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２： ９８−１０５ （１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が挙げられる。
【０２０２】
持続放出性組成物はまた、リポソームエントラップポリペプチドを包含する。ポリペプチドまたは他の化合物を含有するリポソームは、既知の方法により調製される（Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ３６８８−３６９２ （１９８５）、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４０３０−４０３４ （１９８０）、ＥＰ ５２３２２、ＥＰ ３６６７６、ＥＰ ８８０４６、ＥＰ １４３９４９、ＥＰ １４２６４１、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ １０２３２４）。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、そこでの脂質含量は、約３０ｍｏｌパーセントのコレステロールよりも高く、選択比率は、最適な治療に関して調節される。
【０２０３】
非経口投与に関して、一態様では、ポリペプチドまたは他の化合物は、一般的に所望の純度にて、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で、薬学的に許容し得る担体、すなわち、使用する投与量および濃度にてレシピエントに無毒性であり、配合物の他の成分と併用可能（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であるものと混合することにより配合される。
例えば、配合物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドまたは他の化合物にとって有害であると知られている他の化合物を含まない。
【０２０４】
一般に、配合物は、液体の担体または微細固体の担体、あるいはその両方と、均一かつ緊密にポリペプチドまたは他の化合物を接触させることにより調製される。次に、必要な場合には、生成物を所望の配合物に成形する。好ましくは、担体は、非経口担体、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。かかる担体媒質の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびブドウ糖溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性媒質、ならびにリポソームもまた、本発明に有用である。担体は適切に、等張性および化学的安定性を高める物質などの、少量の添加剤を含有する。かかる物質は、用いる投与量および濃度にて、レシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、および他の炭化水素、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの対イオン、および／またはポリソルベート、ポロクサマー、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２０５】
ペプチドまたは他の化合物は、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨにて、かかるビヒクル中で配合される。先述の賦形剤、担体または安定剤のうちのあるものの使用は、結果としてポリペプチド塩または他の化合物の塩の形成を生じる結果となろうことは理解されるであろう。
【０２０６】
治療用投与のために使用されるべきポリペプチドはいずれも無菌であべきである。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を通した濾過により容易に達成される。治療用ポリペプチド組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により突き刺すことが可能なストッパーを有する点滴溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０２０７】
ポリペプチドは通常、単用量または複数用量容器（例えば、密封アンプルまたはバイアル）中に、水溶液として、または再構成用凍結乾燥配合物として、保管されるであろう。凍結乾燥配合物の例として、１０ｍｌバイアルを滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌで充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、注射用静菌水を用いて、凍結乾燥ポリペプチドを再構成することにより調製される。
【０２０８】
キット
本発明はさらに、本発明の上記組成物の１または２以上の成分が充填された１または２以上の容器を含む、薬学的パックおよびキットに関する。１または２以上のかかる容器には、医薬品または生物製品の製造、使用または販売を管轄する政府機関が定めた形式で書かれた、該機関による、ヒトへの投与に関する製品の製造、使用または販売の承認を示す通知を添付することができる。
【０２０９】
投与
本発明のＬＳＧポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはその他の化合物、好ましくはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、単独または治療化合物などのその他の化合物とともに使用してもよい。
薬学的組成物は、例えばとりわけ局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内または皮内経路による投与を含む効果的かつ便宜的な方法で投与され得る。
【０２１０】
薬学的組成物は一般に、特定の１または２以上の適応症の処置あるいは予防に有効な量で投与される。一般には、組成物は少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇの量で投与される。しかしながら、最適投与量は、適応症、その重症度、投与経路、合併症状等を考慮しながら、各処置の様式および適応症に関する標準的方法により決定されるだろう。
【０２１１】
個体においてＬＳＧポリペプチドの標準または正常発現レベルの減少により引き起こされる症状は、好ましくは分泌形態にある、本発明のＬＳＧポリペプチド、またはそのアゴニストを投与することにより処置できることが理解されるであろう。したがって、本発明はまた、ＬＳＧポリペプチドレベルの増加を必要とする個体を処置する方法であって、かかる個体においてＬＳＧポリペプチドの活性レベルを増加させるためのＬＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストの量を含む薬学的組成物を、かかる個体に投与することを含む方法を提供する。例えば、減少したＬＳＧポリペプチドレベルを有する患者は、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇのＬＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストを６日間連続で受けてもよい。好ましくは、ＬＳＧポリペプチドが投与される場合、それは好ましくは分泌形態においてである。
【０２１２】
本発明の組成物はまた、ＬＳＧポリペプチドの増大したレベルを処置するために投与することもできる。例えば、アンチセンス技術を、本発明のＬＳＧポリペプチドの産生を抑制するために用いることができる。この技術は、癌などの様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態のもののレベルを減少させる方法の一例である。異常に増加したポリペプチドレベルを有すると診断された患者に、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋｇ／日にて、２１日間、アンチセンスポリヌクレオチドを静脈内に投与することができる。この処置が十分に耐えられた場合、処置は７日の休止期間後に繰り返される。また、ＬＳＧポリペプチドのアンタゴニストを含む組成物を、患者におけるＬＳＧレベルを減少させるために投与することもできる。
【０２１３】
遺伝子治療
ＬＳＧポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、しばしば「遺伝子治療」と称される治療様式において、かかるポリペプチドをインビボで発現させることにより、本発明により使用されてもよい。
したがって、例えば、患者由来の細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドにより操作されてもよく、次に操作された細胞を、ポリペプチドにより処置されるべき患者に提供することができる。例えば、細胞は本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで操作することができる。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、本発明でのそれらの使用は本発明中の教示より明らかになるだろう。
【０２１４】
同様に細胞は、当分野既知の方法によりインビボでのポリペプチド発現のためインビボで操作され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、上述したとおり、複製欠損レトロウイルスベクターでの発現のために操作され得る。次に、レトロウイルス発現構築物が単離され、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞内に、そのパッケージング細胞が次に所望遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するように導入され得る。これらの産生細胞は、インビボで細胞を操作し、インビボにおいてポリペプチドを発現させることを目的として、患者に投与され得る。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらおよびその他の方法は、本発明の教示より当業者に明らかになるはずである。
【０２１５】
本明細書中で上述したレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスより得られる。
【０２１６】
かかるベクターは、ポリペプチドを発現させるための１または２以上のプロモーターを含むだろう。好適なプロモーターの選択は、本明細書の教示から当業者に明らかとなるだろう。しかしながら、使用され得る適切なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７： ９８０−９９０ （１９８９）記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびベータアクチンプロモーターなどの真核生物細胞性プロモーターを含むが、これらに限定されない。使用され得るその他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
用いられ得るさらなるプロモーターは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーターなどの誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、ベータアクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーターを含む。プロモーターは、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する未変性プロモーターでもよい。
【０２１８】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、好適なプロモーターの制御下に置かれ得る。
１つの態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、プロデューサー細胞系を形成するパッケージング細胞系の誘導に使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＭｉｌｌｅｒ， Ａ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １： ５−１４ （１９９０）記載のＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
ベクターは、当該技術分野に既知の任意の手段によりパッケージング細胞内に導入される。かかる手段としては、エレクトポレーション、リポソームの利用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム内にカプセル封入されるか、または脂質に結合された後に宿主に投与されてもよい。プロデューサー細胞系は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生するだろう。次に、かかるレトロウイルスベクター粒子を利用して、真核生物細胞にインビトロまたはインビボにおいて形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するだろう。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２０】
典型的な遺伝子治療の一方法は、ＬＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを発現することが可能な線維芽細胞を、患者に移植することを伴う。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により対象から得られる。得られた組織を組織培養培地に置き、小片に分離する。組織の小片を組織培養フラスコの湿った表面上へ載せ、各フラスコにおいて約１０片を載せる。フラスコを上下ひっくり返し、きつく閉めて、室温で一晩放置する。室温にて２４時間後、フラスコをひっくり返し、組織片をフラスコの底に固定させたままで、新鮮な培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン加）を添加する。次に、フラスコを３７℃にて約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、続いて数日毎に取り換える。さらに２週間の培養の後、線維芽細胞の単層が現れる。
【０２２１】
単層をトリプシン処理し、大きなフラスコへはがし取る。モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列に隣接したｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ， Ｐ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ， ７： ２１９−２５ （１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理する。アガロースゲル上で線状ベクターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。本発明のＬＳＧポリペプチドまたはそのアゴニストもしくはアンタゴニストをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端配列に相当するＰＣＲプライマー用いて増幅することができる。好ましくは、５’プライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含有し、３’プライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状主鎖ならびに増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、一緒に添加する。
【０２２２】
得られた混合物を、２つの断片の連結に適した条件下において保持する。次に、連結混合物を用いて、バクテリアＨＢ  １０１を形質転換した後、ベクターが適切に挿入された所定の遺伝子を有することを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上に蒔く。両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％の仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、コンフルエント密度に、組織培養で増殖させる。次に、遺伝子を含有するＭＳＶベクターを培地に添加し、パケージング細胞にベクターで形質導入する。すると、パッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染ウイルス粒子を生産する（パッケージング細胞は、今度はプロデューサー細胞と称される）。
【０２２３】
形質導入したプロデューサー細胞に、新鮮な培地を添加し、続いて、コンフルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから、培地を採取する。ミリポアフィルターを通して感染ウイルス粒子を含有する使用済培地を濾過し、剥離したプロデューサー細胞を除去し、続いてこの培地を用いて、線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから、培地を除去し、プロデューサー細胞からの培地とすばやく入れ換える。この培地を除去し、新鮮な培地と入れ換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞は感染し、選択は必要ない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。線維芽細胞がいったん効果的に感染したら、線維芽細胞を分析して、タンパク質が産生されるかどうかを決定する。次に、操作した線維芽細胞を、単独で、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアビーズ上においてコンフルエントまで増殖させた後に、宿主に移植する。
【０２２４】
あるいは、ＬＳＧに関連する障害、疾患および症状を処置するために、インビボ遺伝子治療方法を用いることもできる。遺伝子治療方法は、ポリペプチドの発現を増加または減少させるための、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。
【０２２５】
例えば、本発明のＬＳＧポリヌクレオチドまたは、それに対するアゴニストもしくはアンタゴニストをコードする核酸配列は、プロモーターまたは標的組織によって、ポリペプチド発現に必要な任意の他の遺伝要素に作動可能に連結されてもよい。かかる遺伝子治療ならびに送達技術および方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ ９０／１１０９２、ＷＯ ９８／１１７７９、米国特許第５，６９３，６２２号、第５，７０５，１５１号、第５，５８０，８５９号、Ｔａｂａｔａ Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５ （３）： ４７０−４７９、Ｃｈａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ３５（６）： ５１７−５２２、Ｗｏｌｆｆ Ｊ． Ａ． （１９９７） Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ． ７ （５）： ３１４−３１８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３ （５）： ４０５−４１１， Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４ （１２）： ３２８１−３２９０（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ポリヌクレオチド構築物は、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質腔への注射などの、動物細胞へ注入可能な物質を送達するいかなる方法により送達されてもよい。ポリヌクレオチド構築物は、薬学的に許容し得る液体または水性担体中で送達することができる。
【０２２６】
「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、細胞への侵入を補佐、促進または助長するよう作用する、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム配合物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含むいかなる送達ビヒクルも含まない配列を指す。しかしながら、ポリヌクレオチドはまた、当業者に既知の方法により調製され得るリポソーム配合物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２： １２６−１３９、およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８５ （１）： １−７に教示されているもの）にて送達されてもよい。
【０２２７】
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれない構築物であり、またそれらは、複製が可能な配列を含有しないであろう。当業者に既知のいかなる強力なプロモーターも、ＤＮＡ発現を促進するために使用することができる。他の遺伝子治療技術と異なり、標的細胞へ裸の核酸配列を導入することの１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究により、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、最大６ヶ月の期間、所望のポリペプチドの産生を提供することができることがわかった。
【０２２８】
ポリヌクレオチド構築物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む、動物内組織の間質腔へ送達され得る。組織の間質腔は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ多糖マトリックス、管または房の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、または筋細胞を覆う結合組織内もしくは骨小腔中にある同様のマトリックスを含む。循環系の血漿およびリンパ管のリンパ液により占有される腔も同様である。
【０２２９】
筋組織の間質腔への送達が好ましい。ポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射により利便性よく送達され得る。送達および発現は、未分化またはあまり完全には分化していない細胞、例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞などにおいて達成され得るが、それらは、好ましくは、分化した永続性の非分裂細胞に送達され、そこで発現される。インビボの筋細胞は特に、ポリヌクレオチドを取り込み、発現するそれらの能力に優れている。
【０２３０】
裸のポリヌクレオチド注射に関して、有効投与量のＤＮＡまたはＲＮＡは、約０．０５μｇ／体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であろう。好ましくは、投与量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであろう。当然のことながら、当業者が理解するように、この投与量は、注射の組織部位により変化するであろう。適切かつ有効な投与量の核酸配列は、当業者により容易に決定することができ、それは、処置する症状および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間質腔への注射の非経口経路によるものである。しかしながら、特に肺もしくは気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達用のエアロゾル配合物の吸入などの、他の非経口経路もまた使用してもよい。さらに、裸のポリヌクレオチド構築物は、血管形成中に、当該手順で使用されるカテーテルにより、動脈へ送達することができる。
【０２３１】
筋肉中に注射されたポリヌクレオチドのインビボでの用量反応効果は以下のように決定される。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生のための適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論にしたがって調製する。鋳型ＤＮＡは、環状または線状のいずれであってもよく、それは裸のＤＮＡとして用いられるか、あるいはリポソームと複合体を形成する。次に、マウスの四頭筋に、様々な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０２３２】
５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、２．５％アベルチン０．３ｍｌの腹腔内注射により麻酔する。腹側大腿上に１．５ｃｍの切開を施し、四頭筋を直接見えるようにする。筋肉の膝への遠位付着部位から約０．５ｃｍかつ約０．２ｃｍの深さで、１分にわたり、２７ゲージ針を通じて、１ｃｃの注射器内の担体０．１ｍｌ中の鋳型ＤＮＡを注射する。将来の位置確認のために注入部位上に縫合糸を設置し、皮膚をステンレス製クリップで閉じる。
【０２３３】
適切なインキュベーション時間後（例えば、７日）、四頭筋全体を切除することにより、筋肉摘出物を調製する。個々の四頭筋のすべての５番目の１５μｍ断面を、タンパク質発現のために組織化学的に染色する。タンパク質発現に関するタイムコースは、種々のマウス由来の四頭筋が異なる時間にて採取されることを除いて、同様の様式にて行なわれ得る。注射後の筋肉中のＤＮＡの永続性は、注射したマウスおよび対照マウスから全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後に、サザンブロット分析により確定されてもよい。
マウスでの上記実験の結果を用いて、裸のＤＮＡを用いた、ヒトおよび他の動物における適切な投与量および他の治療パラメータを外挿することができる。
【０２３４】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明のＬＳＧポリペプチドはまた、非ヒトトランスジェニック動物にて発現させることもでできる。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小型ブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーが含まれるが、これらに限定されないあらゆる種の非ヒト動物を用いて、トランスジェニック動物を生み出してもよい。当該技術分野で既知の任意の技法を用いて、動物に導入遺伝子（すなわち、本発明のポリペプチド）を導入して、トランスジェニック動物の創始系統を生産してもよい。
【０２３５】
かかる技法としては、前核（ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ）マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４０： ６９１−６９８ （１９９４）、Ｃａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １１：１２６３−１２７０ （１９９３）、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） ９： ８３０−８３４ （１９９１）； およびＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））、生殖系列（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２： ６１４８−６１５２ （１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６： ３１３−３２１ （１９８９））、細胞または胚へのエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３： １８０３−１８１４ （１９８３））、遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １７４５ （１９９３）を参照）、胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への幹細胞の移し戻し、および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７： ７１７−７２３ （１９８９））が挙げられるが、これらに限定されない。かかる技法のレビューとして、Ｇｏｒｄｏｎ， ”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ”， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５： １７１−２２９ （１９８９）を参照されたい（それは、参照により全体が本明細書に援用される）。
【０２３６】
当該技術分野において既知のいかなる技法、例えば、静止状態へ誘導された培養胚細胞、胎児細胞または成人細胞からの核の、脱核卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０： ６４−６６ （１９６６）， Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８５： ８１０８１３ （１９９７））を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含有するトランスジェニッククローンを生産してもよい。
【０２３７】
本発明は、すべての動物細胞において導入遺伝子を持つトランスジェニック動物、ならびに、すべてではないが幾つかの細胞において導入遺伝子を持つ動物、すなわちモザイク動物またはキメラ動物を提供する。導入遺伝子は、単一導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム、もしくは頭−尾タンデム）のような多重コピーとして、組み込まれてもよい。導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．の教示（Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６２３２−６２３６ （１９９２））にしたがって、特定の細胞タイプに選択的に導入されて、そこで活性化されてもよい。かかる細胞タイプ特異的な活性化に必要な調節遺伝子は、所定の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０２３８】
ポリヌクレオチド導入遺伝子が内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望ましい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡潔に述べると、かかる技法を利用する場合、内因性遺伝子に相同的な幾つかのヌクレオチド配列を含有するベクターを、内因性遺伝子のヌクレオチド配列へ、染色体配列との相同組換えにより組み込み、その機能を崩壊させる目的で設計する。導入遺伝子はまた、特定の細胞タイプへ選択的に導入されてもよく、したがって、例えばＧｕ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５： １０３−１０６ （１９９４））の教示にしたがって、その細胞タイプのみで内因性遺伝子を不活性化させる。かかる細胞タイプに特異的な不活性化に必要な調節配列は、所定の特定細胞タイプに依存し、それは当業者には明らかであろう。
【０２３９】
トランスジェニック動物がいったん創出されれば、組換え遺伝子の発現は、標準的な技法を利用してアッセイされ得る。初期スクリーニングは、導入遺伝子の組み込みが起ったことを確認すべく動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技法により達成され得る。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られた組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない技法を用いて評価してもよい。トランスジェニック遺伝子発現組織の試料はまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて、免疫細胞化学的に、または免疫組織化学的に評価してもよい。
【０２４０】
創始動物がいったん生産されれば、それらを、繁殖、同系交配、異系交配、または交雑させて、特定の動物コロニーを生産してもよい。かかる繁殖戦略の例としては、別個の系統を樹立するために、１つよりも多い組み込み部位を有する創始動物を異系交配すること、各導入遺伝子の付加的発現の効果が理由で、高いレベルで導入遺伝子を発現する複合遺伝子導入をもたらすために、別個の系統を同系交配させること、発現を増大させ、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすために、所定の組み込み部位に関してホモ接合性の動物を生産するために、ヘテロ接合性のトランスジェニック動物を交雑させること、複合へテロ接合性またはホモ接合性系統を生産するために、別個のホモ接合性系統を交雑させること、および当該実験モデルに適切な明瞭なバックグラウンドに導入遺伝子を配置させるために繁殖させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のＬＳＧポリペプチドの生物機能を説明し、ＬＳＧの異常発現に関連した症状および／または障害を研究し、かかるＬＳＧ関連症状および／または疾患を回復するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これに限定されない用途を有する。
【０２４２】
ノックアウト動物
内因性の遺伝子発現はまた、標的（ｔａｒｇｅｔｅｄ）相同組換えを用いて、遺伝子および／もしくはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより低減することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ２３０−２３４ （１９８５）、Ｔｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ５１： ５０３５１２ （１９８７）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５： ３１３−３２１ （１９８９）を参照。それらはそれぞれ、その全体が、参照により本明細書に援用される）。例えば、内因性ＬＳＧポリヌクレオチド配列（遺伝子のコード領域または調節領域）に相同的なＤＮＡに隣接した突然変異体である本発明の非機能性ＬＳＧポリヌクレオチド（または完全に非関連のＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いて、あるいは用いずに使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトすることができる。別の態様では、当該技術分野にて既知の技法を用いて、所定の遺伝子を含有するが、発現はしない細胞におけるノックアウトを生成する。
【０２４３】
標的相同組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、結果として標的遺伝子の不活性化を招く。かかるアプローチは、研究および農業の分野に特に適しており、そこで胚性幹細胞の改変を用いて、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を発生させることができる（例えば、上述のＴｈｏｍａｓ ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９を参照）。組換えＤＮＡ構築物が、当業者には明らかであろう適切なウイルスベクターを用いて、インビボにおいて、必要とされる部位に直接的に投与されるか、または標的にされるという条件で、このアプローチはまた、ヒトにおける使用にルーチンで適合され得る。
【０２４４】
本発明のさらなる態様では、本発明のＬＳＧポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞、あるいは本発明のＬＳＧポリペプチドを発現しないように遺伝子操作された（例えば、ノックアウト）細胞を、インビボにおいて患者に投与する。かかる細胞は、患者、またはＭＨＣ適合ドナーから得てもよく、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えば、リンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞を含むことができるが、これらに限定されない。細胞は、組換えＤＮＡ技法を用いて、インビトロにおいて遺伝子操作され、細胞に本発明のポリペプチドのコード配列を導入するか、あるいは例えば形質導入（ウイルスベクター、好ましくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを用いて）またはプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むが、これらに限定されないトランスフェクション手法により、本発明のポリペプチドに関するコード配列および／または内因性調節配列を崩壊させる。
【０２４５】
本発明のＬＳＧポリペプチドのコード配列は、強力な構成もしくは誘導プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの制御下に置くことにより、本発明のＬＳＧポリペプチドの発現、好ましくは分泌を達成することができる。本発明のＬＳＧポリペプチドを発現、好ましくは分泌する操作細胞を全身的に、例えば、循環にて、または腹腔内にて患者に導入することができる。
【０２４６】
あるいは、細胞をマトリックス中に組み込み、体内へ移植することができ、例えば、遺伝子操作した線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植することができ、または、遺伝子操作した内皮細胞は、リンパ管または血管移植片の一部として移植することができる（例えば、各々その全体が参照により本明細書に組込まれる米国特許第５，３９９，３４９号、および米国特許第５，４６０，９５９号を参照）。
【０２４７】
投与されるべき細胞が非自系または非ＭＨＣ適合細胞である場合、それらは、導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を防ぐ既知の技法を用いて、投与され得る。例えば、細胞は、じかに接している細胞外環境との構成成分の交換が可能であるものの、導入細胞が宿主免疫系により認識されることが不可能なカプセル化形態で導入されてもよい。
【０２４８】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のＬＳＧポリペプチドの生物機能を説明し、異常なＬＳＧの発現に関連した症状および／または障害を研究し、かかるＬＳＧ関連症状および／または疾患を改善するのに効果的な化合物をスクリーニングするのに有用な動物モデル系を含むが、これらに限定されない用途を有する。
【０２４９】
以下に、本発明をさらに示すために、限定的でない例を提供する。
【０２５０】
例
以下の例は、別途詳細に記載されていない限り、当業者に周知であり日常的に行なわれる標準的な手法を用いて行なわれた。以下の例の日常的な分子生物学の手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）などの標準的な実験室マニュアルに記載されているように行ない得る。
【０２５１】
マイクロアレイ分析の序論と背景
ｃＤＮＡマイクロアレイは、ガラス顕微鏡スライド上の順序付けられたアレイ（ａｒｒａｙ）における区別可能な多数のｃＤＮＡの高速自動化プリント（ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｒｏｂｏｔｉｃ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）によって製造される。２つの複合試料において、配列の相対量を測定するのに用いられる（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ， １９９５； Ｓｈａｌｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９６）。
【０２５２】
マイクロアレイ法において、ｍＲＮＡは、対象となる組織、腫瘍または対照（正常組織または正常隣接組織）から単離される。癌組織または対照由来のｍＲＮＡ（２００〜６００ｎｇ）を逆転写し、それぞれ、蛍光ヌクレオチドＣｙ５（赤）またはＣｙ３（緑）を組込んだ。蛍光的に標識したｃＤＮＡの２つの集団をともに混合し、同時に、ガラススライド上、２ｃｍ×２ｃｍの面積におよそ１０，０００のｃＤＮＡエレメントを有するマイクロアレイへハイブリダイズした（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｒｖｉｃｅ： Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ， ＵＳＡ）。ハイブリダイゼーションの後、スライドを共焦点走査型レーザー顕微鏡でスキャンした。
【０２５３】
スキャンした画像は、アレイ上の各スポットに対して、強度および局部的なバックグランドの測定をもたらすために用いられる（ＧＥＭｔｏｏｌｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。１つのＥＳＴを示す各スポットについて、標準化されたＣｙ５／Ｃｙ３強度の比は、対照に相対する１つの組織中の遺伝子発現の定量（この場合、癌組織対正常組織または正常隣接組織での発現）をもたらす。例えば、３０００の癌−Ｃｙ５強度および１０００の正常−Ｃｙ３強度を示す遺伝子は、癌組織において、３倍多く発現している。高度な分析ソフトウェアは、データからの、遺伝子発現のパターンのソートおよび解読に用いられる（Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｔｒｅｅｖｉｅｗ ｐｒｏｇｒａｍｓ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； Ｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９８； Ａｌｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ， ２０００）。しかしながら、インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）の再現性研究によれば、検出可能な差異ある発現のレベルは、およそ±１．７４であると計算されている。したがって、癌と正常の間の観察された比が１．８以上である要素はいずれも差異ある発現であるとみなされる。
【０２５４】
参照文献
１． Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．， Ｄ． Ｓｈａｌｏｎ， Ｒ．Ｗ． Ｄａｖｉｓ， ａｎｄ Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ． １９９５． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｃＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４６７−４７０．
２． Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．， Ｓ．Ｊ． Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ． １９９６． Ａ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６： ６３９−６４５．
３． Ｅｉｓｅｎ， Ｍ．Ｂ．， Ｐ．Ｔ． Ｓｐｅｌｌｍａｎ， Ｐ．Ｏ． Ｂｒｏｗｎ， ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ． １９９８． ”Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ”． ＰＮＡＳ ９５： １４８６３−１４８６８．
４． Ａｌｉｚａｄｅｈ， Ａ．Ａ．， ｅｔ ａｌ， ２０００． ”Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．” Ｎａｔｕｒｅ， ４０３： ５０３−５１１．５． ＧＥＭ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ． Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．
【０２５５】
肺ディアデクサス（ｄｉａＤｅｘｕｓ）マイクロアレイ候補
以下は、本明細書中、肺特異的遺伝子またはＬＳＧとも呼んでいる、肺癌に対する「ディアデクサスマイクロアレイ候補」配列のリストである。
【表３】
2004520814.tif 000004
【０２５６】
例１
配列１
Ｌｎｇ１２８
遺伝子ＩＤ  ９７９０５７
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１２８の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な気管（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表４】
2004520814.tif 000005
【０２５７】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１２８のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺（３５．６３）において非常に高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２５８】
表２  無名数は、６９ペアの対応試料および１つの卵巣正常試料および１つの卵巣癌試料におけるＬｎｇ１２８の発現の相対レベルである。値は全て、正常な気管（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表５】
2004520814.tif 000006
【０２５９】
【表６】
2004520814.tif 000007
【０２６０】
【表７】
2004520814.tif 000008
【０２６１】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１２８のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２１個の肺癌組織（肺試料＃１、２、４、５、７、９、１０、１２、１３、１４、１７、１９、２１、２３、２４、２５、２７、２８、３０、３１および３５）が、それぞれの正常隣接に比べ、Ｌｎｇ１２８を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の５５％で癌組織における過剰発現が認められた（全３８個の肺対応試料のうち２１個）。
【０２６２】
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１２８は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２６３】
ノーザン分析
２つの転写物  〜２．２ｋｂおよび〜４．２ｋｂ
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣ （配列番号２１）
逆方向プライマー
ＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡ （配列番号２２）
プローブ
ＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧ （配列番号２３）
【０２６４】
例２
配列２
Ｌｎｇ１２９
遺伝子ＩＤ ３４７８４２
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１２９の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表８】
2004520814.tif 000009
【０２６５】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１２９のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２６６】
表２  無名数は、６７ペアの対応試料および１つの卵巣正常試料および１つの卵巣癌試料におけるＬｎｇ１２９の発現の相対レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表９】
2004520814.tif 000010
【０２６７】
【表１０】
2004520814.tif 000011
【０２６８】
【表１１】
2004520814.tif 000012
【０２６９】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１２９のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２３個の肺癌組織（肺試料＃２、４、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３７および３８）が、それぞれの正常隣接に比べ、Ｌｎｇ１２８を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の６１％で癌組織における過剰発現が認められた（全３８個の肺対応試料のうち２３個）。
【０２７０】
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１２９は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２７１】
ノーザン分析
２つの転写物  〜６．５ｋｂおよび〜９ｋｂ
Ｌｎｇ１２９に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）データベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＧＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴ （配列番号２４）
逆方向プライマー
ＧＣＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡ （配列番号２５）
プローブ
ＡＧＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＴＡＴＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＴＴＣＣ （配列番号２６）
【０２７２】
例３
配列３
Ｌｎｇ１１２
遺伝子ＩＤ ９８３４３９
表１  無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１１２の発現の相対的レベルである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表１２】
2004520814.tif 000013
【０２７３】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１１２のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、肺において唯一検出可能であることを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２７４】
表２  無名数は、４９ペアの対応試料におけるＬｎｇ１１２の発現の相対レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表１３】
2004520814.tif 000014
【０２７５】
【表１４】
2004520814.tif 000015
【０２７６】
対応試料の分析において、１つの子宮癌試料を除いて、唯一の検出は肺試料においてであり、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、４個の肺癌組織（肺試料＃２、６、１４および２６）が、３２個の癌対応ペアにおいて、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１１２を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の１２．５％で癌組織における過剰発現が認められた（全３２個の肺対応試料）。
【０２７７】
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。結果は、Ｌｎｇ１１２が、全３２個の試験した肺癌組織において、そのそれぞれの正常隣接に比べ、差別的に発現することを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１１２は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２７８】
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣ （配列番号２７）
逆方向プライマー
ＣＡＧＡＧＣＣＣＴＴＣＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＣ （配列番号２８）
プローブ
ＴＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＡ （配列番号２９）
【０２７９】
例４
配列４
Ｌｎｇ１１４
遺伝子ＩＤ ２３６５８２
表１  無名数は、１２の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１１４の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な精巣（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表１５】
2004520814.tif 000016
【０２８０】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１１４のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、肺（６０２．５８）において最も高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２８１】
表２  無名数は、７８ペアの対応試料および１つの正常卵巣試料および２つの血液試料におけるＬｎｇ１１４の発現の相対レベルである。値は全て、正常な精巣（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表１６】
2004520814.tif 000017
【０２８２】
【表１７】
2004520814.tif 000018
【０２８３】
【表１８】
2004520814.tif 000019
【０２８４】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１１４のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１１個の肺癌組織（肺試料＃１、２、７、１０、１１、１２、１５、１６、２６、２８および３２）が、３５個の癌対応ペアにおける、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１１４を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の３１％で癌組織における過剰発現が認められた（全３５個の原発癌の肺対応試料）。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の３１％におけるｍＲＮＡの過剰発現によって、Ｌｎｇ１１４は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２８５】
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣ （配列番号３０）
逆方向プライマー
ＣＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣ （配列番号３１）
プローブ
ＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧ （配列番号３２）
【０２８６】
例５
配列５
Ｌｎｇ１１８
遺伝子ＩＤ ２１０９９５
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１１８の発現の相対的レベルである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表１９】
2004520814.tif 000020
【０２８７】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１１８のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２８８】
表２  無名数は、３６ペアの対応試料におけるＬｎｇ１１８の発現の相対レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表２０】
2004520814.tif 000021
【０２８９】
【表２１】
2004520814.tif 000022
【０２９０】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１１８のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１７個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１１８を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１１８は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２９１】
Ｌｎｇ１１８に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧ （配列番号３３）
逆方向プライマー
ＴＣＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＴ （配列番号３４）
プローブ
ＣＧＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＡＣＴ （配列番号３５）
【０２９２】
例６
配列６
Ｌｎｇ１２１
遺伝子ＩＤ ２０８９９４
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１２１の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な気管（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表２２】
2004520814.tif 000023
【０２９３】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１２１のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２９４】
表２  無名数は、２０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１２１の発現の相対レベルである。値は全て、正常な気管（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表２３】
2004520814.tif 000024
【０２９５】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１２１のより高い発現が、肺組織に対して高度の組織特異性を示す肺試料において検出された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１２個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１２１を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１２１は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０２９６】
Ｌｎｇ１２１に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴ （配列番号３６）
逆方向プライマー
ＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＧＣＡＣＡＴＡＧ （配列番号３７）
プローブ
ＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＴＡＡＧ （配列番号３８）
【０２９７】
例７
配列７
Ｌｎｇ１２４
遺伝子ＩＤ １０６６４９８
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１２４の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表２４】
2004520814.tif 000025
【０２９８】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１２４のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において唯一検出可能であることを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０２９９】
表２  無名数は、４０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１２４の発現の相対レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表２５】
2004520814.tif 000026
【０３００】
【表２６】
2004520814.tif 000027
【０３０１】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１２４の発現が肺試料において（１つの甲状腺癌試料を除き）唯一検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１９個全ての肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１２４を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した全ての肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１２４は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３０２】
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴ （配列番号３９）
逆方向プライマー
ＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣ （配列番号４０）
プローブ
ＣＴＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＡＧＧＣ （配列番号４１）
【０３０３】
例８
配列８
Ｌｎｇ１２６
遺伝子ＩＤ ２８７０１６
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１２６の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な胸腺（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表２７】
2004520814.tif 000028
【０３０４】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１２６のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、副腎および卵巣を除いて、肺において相対的に高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３０５】
表２  無名数は、２０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１２６の発現の相対レベルである。値は全て、正常な胸腺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表２８】
2004520814.tif 000029
【０３０６】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１２６のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１４個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１２６を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１２６は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３０７】
Ｌｎｇ１２６に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＧＧＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＴＣＡ （配列番号４２）
逆方向プライマー
ＧＧＣＧＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴ （配列番号４３）
プローブ
ＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＡＣＡＴ （配列番号４４）
【０３０８】
例９
配列９
Ｌｎｇ１３６
遺伝子ＩＤ １０７１７
ｄｄｘ肺コード ＳＱＬｎｇ００１
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１３６の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表２９】
2004520814.tif 000030
【０３０９】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１３６のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
表２  無名数は、６０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１３６の発現の相対レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表３０】
2004520814.tif 000031
【０３１０】
【表３１】
2004520814.tif 000032
【０３１１】
【表３２】
2004520814.tif 000033
【０３１２】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１３６のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２９個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１３６を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１３６は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３１３】
Ｌｎｇ１３６に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＴＣＣＧＴＧＧＣＴＣＧＴＧＣＴＴ （配列番号４５）
逆方向プライマー
ＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＴＴＧＴ （配列番号４６）
【０３１４】
例１０
配列１０
Ｌｎｇ１４３
遺伝子ＩＤ ２４９４５
ｄｄｘ肺コード ＳＱＬｎｇ００６
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１４３の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な膵臓（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表３３】
2004520814.tif 000034
【０３１５】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１４３のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において非常に高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３１６】
表２  無名数は、７８ペアの対応試料、２つの血液試料および２つの正常卵巣試料におけるＬｎｇ１４３の発現の相対レベルである。値は全て、正常な膵臓（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表３４】
2004520814.tif 000035
【０３１７】
【表３５】
2004520814.tif 000036
【０３１８】
【表３６】
2004520814.tif 000037
０＝陰性
【０３１９】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１４３のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、３８個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１４３を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１４３は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３２０】
Ｌｎｇ１４３に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＴＧＴ （配列番号４７）
逆方向プライマー
ＧＣＡＣＣＡＣＴＴＡＡＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡ （配列番号４８）
プローブ
ＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴ （配列番号４９）
【０３２１】
例１１
配列１１
Ｌｎｇ１４４
遺伝子ＩＤ ５２０１７
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ００７
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１４４の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な子宮（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表３７】
2004520814.tif 000038
【０３２２】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１４４のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３２３】
表２  無名数は、３０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１４４の発現の相対レベルである。値は全て、正常な子宮（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表３８】
2004520814.tif 000039
【０３２４】
【表３９】
2004520814.tif 000040
【０３２５】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１４４のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２０個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１４４を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１４４は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３２６】
Ｌｎｇ１４４に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡ （配列番号５０）
逆方向プライマー
ＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴ （配列番号５１）
プローブ
ＴＴＴＴＧＡＧＧＧＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＴ （配列番号５２）
【０３２７】
例１２
配列１２
Ｌｎｇ１３８
遺伝子ＩＤ ４６０２５４
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ１１０
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１３８の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表４０】
2004520814.tif 000041
【０３２８】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１３８のｍＲＮＡの発現が、他の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３２９】
表２  無名数は、５０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１３８の発現の相対レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表４１】
2004520814.tif 000042
【０３３０】
【表４２】
2004520814.tif 000043
【０３３１】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１３８のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２７個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１３８を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１３８は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３３２】
Ｌｎｇ１３８に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＣＴＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＧＣＴＣＴ （配列番号５３）
逆方向プライマー
ＴＴＧＧＧＴＡＧＴＡＴＣＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧ （配列番号５４）
プローブ
ＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣ （配列番号５５）
【０３３３】
例１３
配列１３
Ｌｎｇ１３７
遺伝子ＩＤ １７９０９０
ｄｄｘ肺コード ＳＱＬｎｇ０１２
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１３７の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表４３】
2004520814.tif 000044
【０３３４】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１３７のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において相対的に高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３３５】
表２  無名数は、７０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１３７の発現の相対レベルである。値は全て、正常な脾臓（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表４４】
2004520814.tif 000045
【０３３６】
【表４５】
2004520814.tif 000046
【０３３７】
【表４６】
2004520814.tif 000047
【０３３８】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１３７のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、３８個の癌対応ペアにおいて、３１個の肺癌組織（肺試料＃２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３３、３４、３５、３６および３７）が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１３７を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の８２％で癌組織における過剰発現が認められた（全３８個の肺対応試料）。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の８２％におけるｍＲＮＡの過剰発現によって、Ｌｎｇ１３７は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３３９】
ノーザン分析
１つの転写物  〜３．４ｋｂ
Ｌｎｇ１３７に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＴＣＧＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＣＧ （配列番号５６）
逆方向プライマー
ＴＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＴ （配列番号５７）
プローブ
ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＡ （配列番号５８）
【０３４０】
例１４
配列１４
Ｌｎｇ１４２
遺伝子ＩＤ ６３４８
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ００４
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１４２の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表４７】
2004520814.tif 000048
【０３４１】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１４２のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３４２】
表２  無名数は、２０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１４２の発現の相対レベルである。値は全て、正常な肺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表４８】
2004520814.tif 000049
【０３４３】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１４２のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１０個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１４２を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１４２は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３４４】
Ｌｎｇ１４２に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＡＧＧＴＣＴＴＧＴＡＧＧＧＡ （配列番号５９）
逆方向プライマー
ＣＡＡＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡ （配列番号６０）
プローブ
ＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧ （配列番号６１）
【０３４５】
例１５
配列１５
Ｌｎｇ１４０
遺伝子ＩＤ ９４６９４
ｄｄｘ肺コード ＳＱＬｎｇ００５
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１４０の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な乳腺（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表４９】
2004520814.tif 000050
【０３４６】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１４０のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において非常に高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３４７】
表２  無名数は、７８ペアの対応試料、２つの血液試料、１つの正常卵巣試料および１つの癌性卵巣試料におけるＬｎｇ１４０の発現の相対レベルである。値は全て、正常な乳腺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表５０】
2004520814.tif 000051
【０３４８】
【表５１】
2004520814.tif 000052
【０３４９】
【表５２】
2004520814.tif 000053
０＝陰性
【０３５０】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１４０のより高い発現レベルが肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、３８個の癌対応ペアにおいて、２０個の肺癌組織（肺試料＃１、３、６、８、９、１２、１３、１６、２０、２２、２４〜２７、２９〜３２、３４および３８）が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１４０を過剰発現していることを示す。試験した肺対応試料の５３％で癌組織における過剰発現が認められた（全３８個の肺対応試料）。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料の５３％におけるｍＲＮＡの過剰発現によって、Ｌｎｇ１４０は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３５１】
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＣＡＡＣＡ （配列番号６２）
逆方向プライマー
ＡＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡ （配列番号６３）
プローブ
ＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡ （配列番号６４）
【０３５２】
例１６
配列１６
Ｌｎｇ１５１
遺伝子ＩＤ １４５８１２
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ００８
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１５１の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な胸腺（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表５３】
2004520814.tif 000054
【０３５３】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１５１のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３５４】
表２  無名数は、２０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１５１の発現の相対レベルである。値は全て、正常な胸腺（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表５４】
2004520814.tif 000055
【０３５５】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１５１のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１０個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１５１を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１５１は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３５６】
Ｌｎｇ１５１に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＴＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＣ （配列番号６５）
逆方向プライマー
ＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣ （配列番号６６）
プローブ
ＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡ （配列番号６７）
【０３５７】
例１７
配列１７
Ｌｎｇ１５０
遺伝子ＩＤ １０７１３
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ００２
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１５０の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な精巣（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表５５】
2004520814.tif 000056
【０３５８】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１５０のｍＲＮＡの発現が、肺において検出され、副腎、子宮頸、大腸、食道、心臓、肝臓、乳腺、筋肉、卵巣、膵臓、直腸、小腸、脾臓、胃および胸腺において、検出できないことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３５９】
表２  無名数は、４０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１５０の発現の相対レベルである。値は全て、正常な精巣（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表５６】
2004520814.tif 000057
【０３６０】
【表５７】
2004520814.tif 000058
【０３６１】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１５０のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する相対的に高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、１８個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１５０を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１５０は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３６２】
Ｌｎｇ１５０に対するＤＮＡ配列
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＡＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣ （配列番号６８）
逆方向プライマー
ＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＴＡ （配列番号６９）
プローブ
ＴＧＴＧＣＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＡ （配列番号７０）
【０３６３】
例１８
配列１８
Ｌｎｇ１４１
遺伝子ＩＤ ２０１５２
ｄｄｘ肺コード ＳＱｌｎｇ００３
表１  無名数は、２４の正常な異なる組織におけるＬｎｇ１４１の発現の相対的レベルである。値は全て、正常な脳（キャリブレーター）と比較する。これらのＲＮＡ試料は、商業的に利用可能なプールであり、種々の個体由来の特定組織の試料をプールすることに起源する。
【表５８】
2004520814.tif 000059
【０３６４】
表１の発現の相対レベルは、Ｌｎｇ１４１のｍＲＮＡの発現が、他の大部分の分析した正常組織に比べて、肺において高いことを示している。
表１の無名数は、種々の個体由来の特定組織の試料のプールを分析して得たものである。それらは、表２の単一個体の組織試料から得られたＲＮＡに起源する無名数とは比較できない。
【０３６５】
表２  無名数は、５０ペアの対応試料におけるＬｎｇ１４１の発現の相対レベルである。値は全て、正常な脳（キャリブレーター）と比較する。対応ペアは、特定組織に対する癌試料由来のｍＲＮＡおよび同じ個体由来の同じ組織に対する正常隣接試料由来のｍＲＮＡによって形成される。
【表５９】
2004520814.tif 000060
【０３６６】
【表６０】
2004520814.tif 000061
【０３６７】
対応試料の分析において、Ｌｎｇ１４１のより高い発現が肺試料において検出され、肺組織に対する相対的に高度の組織特異性が示された。これらの結果は、正常プール試料で得られた組織特異性の結果（表１）を確認するものである。
さらに、本発明者らは、癌試料および同じ個体由来の同質遺伝的な正常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルを比較した。この比較によって、癌の病期に対する特異性の指標（例えば、正常隣接に比べ癌試料においてｍＲＮＡ発現のより高いレベル）が提供される。表２は、２７個の肺癌組織が、それぞれの正常隣接組織に比べ、Ｌｎｇ１４１を差別的に発現していることを示す。
結局、高レベルの組織特異性に加え、試験した肺対応試料におけるｍＲＮＡの差別的発現によって、Ｌｎｇ１４１は、肺癌の診断、モニタリング、病期分類、画像化および処置のための良好なマーカーになると考えられる。
【０３６８】
Ｌｎｇ１４１に対するＤＮＡ配列
配列は、インサイトデータベースより入手可能。
ＱＰＣＲ発現分析のために用いたプライマー
順方向プライマー
ＡＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡ （配列番号７１）
逆方向プライマー
ＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＴＡＣ （配列番号７２）
プローブ
ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＡＧＡＧＧＴＴＣＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧ （配列番号７３）
【国際公開パンフレット】
2004520814.tif 000062
2004520814.tif 000063
2004520814.tif 000064
2004520814.tif 000065
2004520814.tif 000066
2004520814.tif 000067
2004520814.tif 000068
2004520814.tif 000069
2004520814.tif 000070
2004520814.tif 000071
2004520814.tif 000072
2004520814.tif 000073
2004520814.tif 000074
2004520814.tif 000075
2004520814.tif 000076
2004520814.tif 000077
2004520814.tif 000078
2004520814.tif 000079
2004520814.tif 000080
2004520814.tif 000081
2004520814.tif 000082
2004520814.tif 000083
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2004520814.tif 000090
2004520814.tif 000091
2004520814.tif 000092
2004520814.tif 000093
2004520814.tif 000094
2004520814.tif 000095
2004520814.tif 000096
2004520814.tif 000097
2004520814.tif 000098
2004520814.tif 000099
2004520814.tif 000100
2004520814.tif 000101
2004520814.tif 000102
2004520814.tif 000103
2004520814.tif 000104
2004520814.tif 000105
2004520814.tif 000106
2004520814.tif 000107
2004520814.tif 000108
2004520814.tif 000109
2004520814.tif 000110
2004520814.tif 000111
2004520814.tif 000112
2004520814.tif 000113
2004520814.tif 000114
2004520814.tif 000115
2004520814.tif 000116
2004520814.tif 000117
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2004520814.tif 000121
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2004520814.tif 000131
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2004520814.tif 000135
2004520814.tif 000136
2004520814.tif 000137
2004520814.tif 000138
2004520814.tif 000139
2004520814.tif 000140
2004520814.tif 000141
2004520814.tif 000142
2004520814.tif 000143
2004520814.tif 000144
2004520814.tif 000145
2004520814.tif 000146
2004520814.tif 000147
2004520814.tif 000148
2004520814.tif 000149
2004520814.tif 000150
2004520814.tif 000151
2004520814.tif 000152
2004520814.tif 000153
2004520814.tif 000154
2004520814.tif 000155
2004520814.tif 000156
2004520814.tif 000157
2004520814.tif 000158
2004520814.tif 000159
2004520814.tif 000160
2004520814.tif 000161
2004520814.tif 000162
2004520814.tif 000163
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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