(57)【要約】【課題】ＣＤ８α＋免疫表現型を有するリンパ球性樹状突起細胞の提供。【解決手段】ＣＤ８α＋免疫表現型を有するリンパ球性樹状突起細胞（Lymphoid dendritic cell）は、人間造血母細胞（human hematopoietic stem cell）を、ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte macrophage−colony stimulating factor）を含む培地で培養した後、ＩＦＮ−γを含む培地で培養する方法により製造でき、上記リンパ球性樹状突起細胞は各種の免疫治療に有用である。
2004525634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間造血母細胞（hematopoietic stem cell）から分化され、ＣＤ８α＋の免疫表現型を有するリンパ球性樹状突起細胞。
【請求項２】
ＣＤ１ａ−，ＣＤ３−，ＣＤ４−，ＣＤ８α＋，ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４−，ＣＤ４０＋，ＣＤ５４＋，ＣＤ８０＋，ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＨＬＡ−Ｉ＋、及びＨＬＡ−ＩＩ＋の免疫表現型と有することを特徴とする請求項１記載のリンパ球性樹状突起細胞。
【請求項３】
インターリューキン−１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（IFN-γ）の生産誘導能を有する請求項１記載のリンパ球性樹状突起細胞。
【請求項４】
人間造血細胞を、ＧＭ−ＣＳＦを含む第１培地で培養し、更にＩＦＮ−γを添加した第２培地で培養する段階を含む、請求項１記載のリンパ球性樹状突起細胞の分化方法。
【請求項５】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γは、２〜４日毎に培地に添加し、ＧＭ−ＣＳＦは１−１０００ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γは１−１０００Ｕ／ｍｌの量で添加することを特徴とする請求項４記載のリンパ球性樹状突起細胞の分化方法。
【請求項６】
二番目の培養段階において、第２培地に０．０１〜１０μｇ／ｍｌのイオノマイシン（ionomycin）、リポポリサカライド（LPS）またはＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）を添加することを含むことを特徴とする請求項４記載のリンパ球性樹状突起細胞の分化方法。
【請求項７】
リンパ球性樹状突起細胞がＣＤ１ａ−，ＣＤ３−，ＣＤ４−，ＣＤ８α＋，ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４−，ＣＤ４０＋，ＣＤ５４＋，ＣＤ８０＋，ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＨＬＡ−Ｉ＋及びＨＬＡ−ＩＩ＋の免疫表現型を有することを特徴とする請求項４記載のリンパ球性樹状突起細胞の分化方法。
【請求項８】
リンパ球性樹状突起細胞がインターリューキン−１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（IFN-γ）の生産誘導能を有することを特徴とする請求項４記載のリンパ球性樹状突起細胞の分化方法。
【請求項９】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載の樹状突起細胞を有効量として含む免疫治療用の薬学組成物。
【請求項１０】
免疫治療が抗癌又は抗ビルース治療であることを特徴とする請求項９記載の薬学組成物。
【請求項１１】
疾病治療であって、請求項１ないし３のいずれか一項の有効量のリンパ球性樹状突起細胞を投与することを含む、哺乳動物における免疫−関連疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間造血母細胞（human hematopoietic stem cells）から分化されるリンパ球性樹状突起細胞（Lymphoid dendritic cells）、造血母細胞からリンパ球性樹状突起細胞を分化する方法、及び上記樹状突起細胞を有効成分とする免疫治療用の薬学的な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状突起細胞は、特定の抗原に対して多様な免疫反応を行うと共に、自家免疫反応に係るＴ−細胞を除くことにより、自家免疫反応を抑制する強力な抗原提示細胞（antigen presenting cell；APC）である。これらの樹状突起細胞の機能は、各々異なって分化された樹状突起細胞の下部集団（subset）の存在によると提案されている。
【０００３】
ネズミの樹状突起細胞は、解剖学上の位置、移植実験及び細胞表面の表現型に基づいて二つの亞類型、即ち、骨髄性及びリンパ球性樹状突起細胞に区分けされる。ＣＤ１１ｃ＋,  ＭＨＣＩＩ＋, ＣＤ４＋, ＣＤ８α−の細胞表面表現型を有する樹状突起細胞は、骨髄性前駆細胞（myeloid precursor cell）から分化誘導される骨髄性樹状突起細胞であり、逆にＣＤ１１ｃ＋，ＭＨＣＩＩ＋，ＣＤ４−，ＣＤ８α＋の細胞表面表現型を有する樹状突起細胞は、リンパ球性樹状突起細胞と呼ばれるが、胸腺（thymus）または脾臓（spleen）に存在する。
【０００４】
ネズミのＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞は、ＩＬ−１２類似ＮＫ細胞（殺傷細胞）及びＴ細胞との反応によりＩＦＮ−γを分泌させるとの報告があった（TOSHIAKI et al., BRIEF EFINITIVE REPORT，１８９（１２），１９８１−１９８６（１９９９））。また、ネズミのランゲルハンス細胞（LANGERHANS CELL）のような骨髄性樹状突起細胞をＣＤ８α―ネズミに注射した際、リンパ節（lymph node）へ移動してＣＤ８α＋樹状突起細胞に分化し、この細胞がＩＦＮ−γを生産すると報告されたことがある（MIRIAM ET AL., BLOOD，９６（５），１８６５−１８７２（２０００））。
【０００５】
このようなリンパ球性樹状突起細胞は、免疫寛容（tolerance）を引起すだけではなく、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γを生産することにより、ヘルパーＴ細胞タイプI（T helper cell type I）の反応を活性化する、多様な細菌を含む抗原に対する強力な免疫ＡＰＣｓとして作用する。
【０００６】
樹状突起細胞は、実際に動物の全ての組織に存在するが、その量が極めて少ないため、生体組織を通じては十分な量を取得し難い。
【０００７】
従って、ＨＳＣｓまたは単球（monocyte）から例えば、顆粒球−大食細胞のコロニー刺激因子（GM−CSF）、インターロイキン−４(ＩＬ-４)、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor−alpha；TNF−α）及び幹細胞因子（stem cell factor； SCF）などのサイトカインを用いて多量の樹状突起細胞を製造するための多くの研究がなされてきた。ＧＭ−ＣＳＦを用いて作った樹状突起細胞の免疫表現型は、ＣＤ１ａ＋，ＣＤ４＋，ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ４０＋，ＣＤ５４＋，ＣＤ８０＋，ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ＋，ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋，ＣＤ３−，ＣＤ８−及びＣＤ１４−である（Williams et al., Int. Rev. Cytol., １５３：４１２，１９９４； Santiago-Schwarz et al., Nature, ３６０：２５８，１９９３； Rosenzwajg et al., Blood, ８７：５３５，１９９６）。
【０００８】
しかし、人間におけるＣＤ８α＋の免疫表現型の樹状突起細胞は、まだその存在さえ確認されていないだけでなく、造血母細胞からの分化についても研究されたことがない。
【非特許文献１】
TOSHIAKI et al.,BRIEF EFINITIVE REPORT,189(12),1981-1986(1999)
【非特許文献２】
MIRIAM ET AL.,BLOOD,96(5),1865-1872(2000)
【非特許文献３】
Williams et al.,Int.Rev.Cytol.,153:412,1994
【非特許文献４】
Santiago-Schwarz et al., Nature, 360:258,1993; Rosenzwajg et al., Blood,87:535,1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、人間造血細胞から分化されたＣＤ８α＋の免疫表現型を有するリンパ球性樹状突起細胞を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、人間造血母細胞からリンパ球性の樹状突起細胞を分化させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、リンパ球性樹状突起細胞を含む免疫治療用の薬学的な組成物を提供することである。
【００１２】
更に、本発明のまた他の目的は、哺乳動物から免疫−関連疾病を治療する方法に係るものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、造血母細胞（hematopoietic stem cell）から分化され、ＣＤ８α＋の免疫表現型を有するリンパ球性樹状突起細胞を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために、ＧＭ−ＣＳＦを含有する一番目の培養培地、及びＩＦＮ−γを含有する二番目の培地で順次に人間造血母細胞を培養することを含むリンパ球性樹状突起細胞の分化方法を提供する。
【００１５】
更に、本発明の他の目的を達成するために、治療学的における有効量の樹状突起細胞を含む免疫治療用の薬学的な組成物を提供する。
【００１６】
更に、本発明のまた他の目的を達成するために、疾病治療において有効量のリンパ球性樹状突起細胞を投与することを含む、哺乳動物における免疫−関連疾患の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞は、ＣＤ１ａ−，ＣＤ３−，ＣＤ４−，ＣＤ８＋，ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４−，ＣＤ４０＋，ＣＤ５４＋，ＣＤ８０＋，ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，  ＨＬＡ−Ｉ＋及びＨＬＡ−ＩＩ＋の免疫表現型を有する。
【００１８】
ＣＤ８α＋リンパ球性細胞は、人間造血母細胞をＧＭ−ＣＳＦ(granulocyte macrophage-colony stimulating factor)を含有する培地で適切な期間、例えば３〜９日間培養し、ＩＦＮ−γを含有する二番目の培地で３〜９日間培養することにより製造できる。
【００１９】
本発明の過程において、ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−γを２〜４日、好ましくは３日間に１回ずつ培地に添加し、ＧＭ−ＣＳＦは１〜１，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０〜２００ｎｇ／ｍｌを添加し、ＩＦＮ−γは１〜１，０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００Ｕ／ｍｌの量で添加することが好ましい。
【００２０】
成熟したＤＣｓの分化を促進するために、二番目の培地にイオノマイシン（ionomycin）、リポポリサカライド（LPS）またはＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）を０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌの濃度で、二番目の段階における培養の最後部分に添加し、二番目の培養が済むまで、１日中培養することが好ましい。
【００２１】
本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞は、優れたインターロイキン−１２及びＩＦＮ−γの生産能力、及びＴ細胞の増殖を刺激する活性を示し、ヘルパーＴ細胞の活性化及びＣＴＬ（cytotoxic T lymphocyte）の活性化を通じる強力な細胞性免疫反応を誘導できる。
【００２２】
本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞は、免疫関連疾患に対する免疫治療用の薬学組成物の活性成分として用いられる。本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞を用いることにより治療できる免疫関連疾患は、悪性疾患、結核感染、ＨＩＶ感染及び自家免疫疾患などを含むが、これらに限られない。
【００２３】
免疫関連疾患の予防や治療用の薬学的な組成物は、通常の方法により、本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞を薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と混合するか、薬学的に許容可能な希釈剤で希釈させることにより製造できる。適合した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、水、及び鉱質オイルが含まれる。剤形としては、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、柔化剤、保存剤などを更に含んでもよい。本発明に係る薬学組成物は、哺乳類へ投与された後、活性成分が速やかに、持続的に、又は遅延放出されるように剤形化することができ、滅菌された注射溶液が好ましい。
【００２４】
従って、本発明においては、更に疾患治療が求められる対象へＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞を有効量で投与することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患を治療する方法を提供する。
【００２５】
本発明のＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞は、通常の免疫治療方法により患者へ投与されることができる。具体的に患者から自家細胞を取得して培養し、免疫学的な増強効果を有するＤＣｓを取得し、これを標的抗原として感作（pulse）させる。この過程において、樹状突起細胞の免疫増強力を高めるために、ＤＣｓを放射線照射や紫外線照射で弱めた癌細胞の存在下で、細胞毒性物質又は繰り返し的な冷凍−解凍の過程を用いて死滅させた癌細胞の分解物（lysate）の在下で感作させることもできる。その他の方法では、癌細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質又はペプチドが樹状突起細胞の感作のための抗原として用いられる。このように、特定抗原で感作された樹状突起細胞を患者に直接注射するか、又は上記樹状突起細胞により活性化されたＴ細胞を患者に注射することもできる。また、治療効果を増強させるために、ＤＣｓをＩＬ−２と共に注射することが好ましい。
【００２６】
本発明の細胞組成物は、硬皮（transdermal）、皮下、静脈又は筋肉注入などを含む各種の経路を通じて投与されることができる。
【００２７】
ＣＤ８α＋リンパ球性樹状突起細胞の通常の単位投与量は、１×１０７〜１×１０９個の細胞数であることが好ましく、６ヶ月間に１週や一ヶ月ごとに投与できる。しかし、実際の投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の年齢、性別、及び体重などの色々な関連因子に鑑みて決定しなければならず、上記投与量は本発明の範囲を限定しない。
【００２８】
本発明に係る薬学的な組成物を用いる免疫治療法は、患者の造血母細胞から分離された樹状突起細胞を用いるため、免疫拒否反応を起さないだけでなく、患者の体内へ注入された樹状突起細胞が持続的にサイトカインを生産するという長所を持つ。
【００２９】
上記薬学組成物は、Ｔ細胞増殖を刺激して特定の抗原による疾病に対して、強力な細胞性免疫反応を引起すことができ、抗癌、及び抗ビールスの治療にも効果的に適用できる。
【００３０】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
【００３１】
また、特別な言及がない限り、下記実施例において、個体と固定混合物、液体と液体、及び液体と個体に対する下記百分率は、各々重量／重量、体積／体積、及び重量／体積に基づいたものである。
【実施例１】
【００３２】
＜造血母細胞抽出、及び樹状突起細胞の生成＞
末梢造血母細胞（peripheral blood stem cells，PBSCs）を集めるために、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF, Lenograstim, chugai, Co., Tokyo, Japan）を多様な腫瘍疾患を有する１０人の患者（乳房癌、白血病及びリンパ腫患者）らに３００μｇ／日の量で皮下注射した。注射してから４日目にＣｏｂｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ(Cobe BCT, Inc., CO)細胞分離機を用いる単核球分班術（leukapheresis）により末梢造血母細胞を抽出した。フィコール・ハイパック（Ficoll-hypaque；Histopaque, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA）を用いた密度勾配遠心分離法（density gradient centrifugation）により得られた上記造血母細胞から単核細胞（mononuclear cell）を分離した後、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ，Sigma Chemical）で２回洗浄した。５％牛血清アルブミン（bovine serum albumin；ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝溶液から３０μｍナイロンメッシュ網で単核細胞を濾過した。
【００３３】
これらの単核細胞を集め、ＦｃＲブロッキング（blocking）試薬を添加してから、４℃で３０分間ＣＤ３４単一クローン抗体（QBend-１０mouse IgG１，Miltenyi reagent A２）と反応させ、ＰＢＳで洗浄してメッシュを通過させた後、勾配免疫磁場分離法（high gradient immunomagnetic separation，HGIS； MidiMACS，Miltenyi biotech，USA）を行い、ＣＤ３４＋細胞を分離した。このＣＤ３４＋造血母細胞１×１０５／ｍｌを５％人間血清アルブミン（human serum albumin）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Sigma）、１００Ｕ／ｍｌのＬ−グルタミン（Sigma）を含有するＸ−ＶＩＶＯ２０培地（Biowhittaker，Walkersville，MD，USA）で、最初１週間は、３日ごとに５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Leucogen, LG Chemical Co., Korea）を加え、次の１週間は２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ(Intermax-γ, LG Chemical Co., Korea)を３日間に１回ずつ加えながら２週間培養した。２週の培養期間のうち、最後日の一日前、即ち１３日目には１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（ionomycin，Sigma）を加えて一日中培養することにより、分化増殖された細胞を成熟させた。
【００３４】
図１から分かるように、培養された樹状突起細胞は、複数の突起を有する比較的に豊富な細胞質を有する。これらの細胞は、初期培養期間の間、群集を成して増殖しながら、フラスコの表面に付着して育つ途中、２週目にＩＦＮ−γを投与すると、各々の細胞として離れて増殖し始める。また、走査電子顕微鏡（scanning electron microscope）及び透過電子顕微鏡（transmission electron microscope）で観察した結果、核が一方へずれており、細胞表面に多数の突起が存在し、豊富な細胞質と細胞質内に多くの顆粒を有することが確認できる。
【００３５】
一方、培養時間に伴う細胞数の増加を調べるため、１週及び２週間の培養液を各々１ｍｌ取って血算盤（hemocytometer）で細胞数を測定した。
【００３６】
その結果、図２に示したように、培養期間の間、特にＩＦＮ−γを添加した後、総細胞数が継続的に増加することが分かった。最後の培養日の１４日目には、細胞数が約３０×１０５／ｍｌであり、培養初期に比べて平均３０倍以上の増加を示した。
【実施例２】
【００３７】
＜分化されたＤＣｓの免疫表現型の調査＞
培養された樹状突起細胞の免疫表現型を調べるため、１×１０５細胞をＣＤ１ａ，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８α，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ１４，ＣＤ８０，ＣＤ８３，ＣＤ８６，ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ（ＡＢＣ），ａｎｄ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＤＲ）に対する特異性を有し、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocynante）またはＰＥ（phycoerythrin）で標識された単一抗体を５％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含む緩衝溶液で１５分間暗室で処理してから、これをＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析器（flow cytometry；FACScan，Becton Dickinson）で分析した。
【００３８】
上記分析結果を図３Ａ、及び３Ｂに示したが、培養７日目の免疫表現型は、ＣＤ１ａ，ＣＤ１１ｃだけでなく、ＣＤ４０，ＣＤ５４，ＣＤ８０，ＣＤ８６，ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ及びＩＩに対しても陽性を示すが、成熟した樹状突起細胞の表現型であるＣＤ８３＋は弱く示された。イオノマイシンの添加は、ＣＤ１ａ及びＣＤ１４を陰性に切り換え、ＣＤ８３＋の表現型を有する細胞数が増加した。また、図４Ａ、及び４Ｂから分かるように、ＣＤ８αは陽性表現型を示す反面、これらの細胞は、ＣＤ３及びＣＤ４の陰性表現型を示した。
【００３９】
これらの結果から、人間造血母細胞から分化された樹状突起細胞は、ＣＤ１ａ−，ＣＤ３−，ＣＤ４−，ＣＤ８α＋，ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１４−，ＣＤ４０＋，ＣＤ５４＋，ＣＤ８０＋，  ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＨＬＡ−Ｉ＋，ＨＬＡ−ＩＩ＋の表現型を示し、特にＣＤ８α＋を強く示すことが分かる。
【実施例３】
【００４０】
＜ＣＤ８α＋ＤＣｓの抗原貪食能力の確認＞
分化されたＤＣｓが抗原貪食（phagocytosis）能力を有するかを確認するために、２×１０５ＤＣｓを牛胎児血清（FBS）は用いなく、ＦＩＴＣが標識されたテキストラン（dextran-FITC，Sigma）と３７℃で１時間混合培養した後、フローサイトメトリー分析器（flow cytometry）で分析して細胞内へ貪食されたテキストランの量を測定した。
【００４１】
図５Ｂ及び５Ｃから分かるように、ＣＤ８α＋ＣＤｓは活発な貪食作用を示し、特に培養１４日目の貪食作用が更に極大化した。４℃での対照実験は、観察された本発明におけるＣＤ８α＋ＣＤｓの貪食作用が、測定条件により創出された架空なものではなく、実在することを示す。
【実施例４】
【００４２】
＜ＣＤ８α樹状突起細胞のリンパ球の増殖誘導能力調査＞
リンパ球性樹状突起細胞がリンパ球の増殖を刺激できるかを調べるため、次のように同種異系（allogenic）の混合リンパ球反応（Mixed Lymphocyte Reaction；MLR ）を行った。
【００４３】
フィコール−ハイパック (Ficoll-Hypaque；Histopaque; Sigma Chemical, USA)を用いた密度勾配遠心分離法（density gradient centrifugation）により正常人の血液から末梢単核細胞（MNCs）を分離しＰＢＳで洗浄した。取得された３×１０８のＭＮＣを人間Ｔ細胞濃縮カラム（human T cell enrichment column，R & D, USA）で室温で１０分間培養した後、ＰＢＳでＴ−細胞を抽出した。次いで、γ線（３０Gy）で照射されたＤＣｓ及びＴ細胞{効果細胞（effector cell）：反応細胞（responder cell）}の比率を１：１，１：１０，  １：１０２，１：１０３及び１：１０４に変化させながらマイクロプレートに３倍数入れて３７℃で３日間培養した。ここに２０μｌのＢｒｄＵ（５-bromo-２’-deoxyuridine）を添加して２４時間更に培養した。ホルムアルデヒドを添加して３０分間室温で反応させて固定した後、プレートに１００μｌの抗−ＢｒｄＵ溶液を入れて室温で９０分間反応させた。次いで、上記プレートをＰＢＳで洗浄してから、発色基質を入れて３０分間反応させた。これに１ＮのＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた後、ＥＬＩＳＡプレート測定器（ Molecular device, USA）を用いて４５０ｎｍ波長での吸光度を測定した。
【００４４】
図６の結果から分かるように、効果細胞：反応細胞の比率が１：１０４である際に、Ｔ細胞の著しい増殖が観察され、これはリンパ球性樹状突起細胞がＴリンパ球の増殖を刺激する機能を持っていることを示す。
【実施例５】
【００４５】
＜リンパ球性樹状突起細胞のサイトカイン分泌能力＞
細胞のサイトカイン分泌能をＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbant assay）を行って測定した。
【００４６】
抗ヒトＩＬ−１２及び抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Pharmingen）を０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ３溶液に最終濃度２μｇ／ｍｌとなるように希釈させた後、取得した溶液５０μｌをＥＬＩＳＡプレート（corning）に分けて４℃で２４時間培養した。５％ＦＢＳを含むＰＢＳで各プレートを３時間遮った後、５０μｌの検体と７日、１３日及び１４日目の各培養液５０μｌを添加して４時間反応させた。
【００４７】
ビオチン（biotin）で標識された検出抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で添加して３時間反応させた。次いで、プレートを洗浄し、ストレプトアビジンと結合された畑わさびパーオキシダーゼ（streptavidin-horseradish peroxidase）を１：２０００に希釈した溶液で１時間処理し、更に洗浄してからＥＬＩＳＡプレート測定器（Molecular device，USA）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００４８】
図７Ａ及び７Ｂの結果から分かるように、生産されたサイトカインの量は１３日まで極めて少ない量に留まり、イオノマイシンを添加してからは、水準が高くなった。
【００４９】
本発明を上記具体的な実施例と関連して述べたが、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の範囲内において、当該分野における当業者が多様に変形、及び変化可能であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】（Ａ）人間造血母細胞から分化されたリンパ球性樹状突起細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】（Ｂ）人間造血母細胞から分化されたリンパ球性樹状突起細胞の走査電子顕微鏡写真である。
【図１Ｃ】（Ｃ）人間造血母細胞から分化されたリンパ球性樹状突起細胞の透過電子顕微鏡写真である。
【図２】培養時間経過に伴う樹状突起細胞の量の変化を示す図面である。
【図３】リンパ球性樹状突起細胞の免疫表現型を示すヒストグラムである（Ａ：７日間培養した後の細胞；Ｂ：１４日間培養した後の細胞；ｘ軸：細胞個体の頻度；ｙ軸：蛍光の強度；オープンヒストグラム（open histogram）：陰性対照群；及び満たされたヒストグラム（filled histogram）：細胞表面抗原に対する陽性細胞群）。
【図４Ａ】リンパ球性樹状突起細胞の免疫表現型を示すヒストグラムである（Ａ：ＣＤ３とＣＤ４のみを染色したもの）
【図４Ｂ】リンパ球性樹状突起細胞の免疫表現型を示すヒストグラムである（Ｂ：ＣＤ３とＣＤ８ａのみを染色したもの）。
【図５Ａ】ＦＩＴＣで標識されたデキストラン（dextran−ＦＩＴＣ）を貪食する能力（Ａ：対照群；オープンヒストグラム（open histogram）；陰性対照群；及び満たされたヒストグラム（filled histogram）：ＦＩＴＣで標識されたデキストランを貪食する細胞群）。
【図５Ｂ】ＦＩＴＣで標識されたデキストラン（dextran−ＦＩＴＣ）を貪食する能力（Ｂ：一週間培養した後の細胞群；オープンヒストグラム（open histogram）；陰性対照群；及び満たされたヒストグラム（filled histogram）：ＦＩＴＣで標識されたデキストランを貪食する細胞群）。
【図５Ｃ】ＦＩＴＣで標識されたデキストラン（dextran−ＦＩＴＣ）を貪食する能力（Ｃ：二週間培養した後の細胞群；オープンヒストグラム（open histogram）；陰性対照群；及び満たされたヒストグラム（filled histogram）：ＦＩＴＣで標識されたデキストランを貪食する細胞群）。
【図６】Ｔ−細胞分化刺激能（黒菱形: 一週間培養した後の細胞群、及び黒四角：二週間培養した後の細胞群）；
【図７Ａ】人間造血母細胞から分化された樹状突起細胞がサイトカインを分泌するか確認するために、インターロイキン−１２（interleukin−１２；ＩＬ−１２）（Ａ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）結果を示すグラフである。  １：一週間ＧＭ−ＣＳＦで培養した後、生産された蛋白質の量  ２：一週間ＧＭ−ＣＳＦで、以後一週間ＩＦＮ−γで培養した後、生産された蛋白質の量  ３：一週間ＧＭ−ＣＳＦで、以後一週間ＩＦＮ−γで培養し、最後に一日中イオノマイシンで培養して生産された蛋白質の量
【図７Ｂ】人間造血母細胞から分化された樹状突起細胞がサイトカインを分泌するか確認するために、ＩＦＮ−γ（Ｂ）に対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）結果を示すグラフである。  １：一週間ＧＭ−ＣＳＦで培養した後、生産された蛋白質の量  ２：一週間ＧＭ−ＣＳＦで、以後一週間ＩＦＮ−γで培養した後、生産された蛋白質の量  ３：一週間ＧＭ−ＣＳＦで、以後一週間ＩＦＮ−γで培養し、最後に一日中イオノマイシンで培養して生産された蛋白質の量
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004525634.tif 000040
【国際調査報告】
2004525634.tif 000041