(57)【要約】エポチロン耐性セルラインが開示されている。本発明はまた、エポチロン耐性細胞に対し細胞傷害性であるかまたはエポチロンの化学センシタイザーまたは類似体である物質の同定方法を開示している。さらに本発明は、インビトロまたはインビボでのエポチロン耐性細胞の同定方法およびエポチロン耐性細胞の成長阻害方法を開示している。本発明はまた、エポチロン耐性細胞に特異的な抗体を開示している。また、開示されたエポチロン耐性セルラインを用いる微小管安定剤の同定方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌セルラインから誘導されたエポチロン耐性セルライン。
【請求項２】
セルラインが１０ｎＭのエポチロンＡに対して耐性を示す、請求項１記載のセルライン。
【請求項３】
セルラインが、２０ｎＭのエポチロンＡに対して耐性を示し、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０２として寄託されたＥＡ２０セルラインである、請求項１記載のセルライン。
【請求項４】
セルラインが、４０ｎＭのエポチロンＡに対して耐性を示し、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０８として寄託されたＥＡ４０セルラインである、請求項１記載のセルライン。
【請求項５】
セルラインが、６０ｎＭのエポチロンＡに対して耐性を示し、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０３として寄託されたＥＡ６０セルラインである、請求項１記載のセルライン。
【請求項６】
セルラインが、１５０ｎＭのエポチロンＡに対して耐性を示し、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０６として寄託されたＥＡ１５０セルラインである、請求項１記載のセルライン。
【請求項７】
ＫＢ−３１癌セルラインから誘導されたエポチロン耐性セルライン。
【請求項８】
セルラインが、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０５として寄託された癌セルラインＫＢ−３１／２９８である、請求項７記載のセルライン。
【請求項９】
セルラインが、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０４として寄託された癌セルラインＫＢ−３１／２９７である、請求項７記載のセルライン。
【請求項１０】
セルラインが、特許寄託指定ＰＴＡ−２７０７として寄託された癌セルラインＫＢ−３１／３１５である、請求項７記載のセルライン。
【請求項１１】
エポチロンと比較して、エポチロン耐性細胞に対し改善された細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、
ａ）エポチロン耐性細胞および感受性細胞を、試験すべき薬剤とインキュベーションし、
ｂ）エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして
ｃ）エポチロンと比べて低い耐性係数（耐性細胞についてのＩＣ５０値を親細胞についてのＩＣ５０値により除す）を示す薬剤を同定する
工程を包含する方法。
【請求項１２】
エポチロンと比べてエポチロン耐性細胞に対し選択的細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、
ａ）エポチロン耐性細胞および感受性細胞を試験すべき薬剤とインキュベーションし、
ｂ）エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして
ｃ）１より小さい耐性係数（耐性細胞についてのＩＣ５０値を親細胞についてのＩＣ５０値により除す）を示す薬剤を同定する
工程を包含する方法。
【請求項１３】
インビトロまたはインビボでエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、耐性細胞を請求項１１または１２記載の細胞傷害性薬剤の１種またはそれ以上と接触させる工程を含む方法。
【請求項１４】
エポチロンの化学センシタイザーである薬剤の同定方法であって、
ａ）試験すべき薬剤の存在および不存在下で、細胞が耐性を示すエポチロンとエポチロン耐性細胞をインキュベーションし、
ｂ）細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する
工程を包含し、その場合薬剤の不存在下でインキュベーションした培養物と比べて薬剤とインキュベーションした培養物の細胞傷害性が高いということが、その薬剤が化学センシタイザーであることを示すものである方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法にしたがって同定されたエポチロンの化学センシタイザー。
【請求項１６】
インビボまたはインビトロでエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、エポチロン耐性細胞を１種またはそれ以上のエポチロンおよび請求項１４記載の方法にしたがって同定された１種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させる工程を包含する方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞を含む、潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、
ａ）試験細胞および対応する正常細胞または腫瘍および非罹患組織、並びに対照エポチロン耐性細胞および親エポチロン−感受性細胞から全ｍＲＮＡを調製し、
ｂ）細胞または組織の全ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、
ｃ）ｃＤＮＡ標本の差次的遺伝子発現分析を遂行し、そして
ｄ）試験細胞または腫瘍対それらの対応する対照について観察された差次的発現パターンを、エポチロン耐性細胞対親エポチロン感受性細胞の場合と比較する工程を包含し、その場合、差次的遺伝子発現パターンが類似していることが、試験細胞が潜在的エポチロン耐性細胞であることを示唆するものである方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれかにおけるエポチロン耐性細胞に特異的な精製抗体。
【請求項１９】
医薬上許容される担体または希釈剤と共に請求項１８記載の１またはそれ以上の精製抗体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
エポチロン耐性セルラインの同定方法であって、
ａ）請求項１８記載の１またはそれ以上の抗体を標識し、
ｂ）試験細胞を１またはそれ以上の標識抗体に暴露し、そして
ｃ）前記細胞への１またはそれ以上の標識抗体の結合を測定する
工程を包含する方法。
【請求項２１】
エポチロン耐性セルラインの単離方法であって、
ａ）蛍光染料により請求項１８記載の１またはそれ以上の抗体を標識し、
ｂ）１またはそれ以上の蛍光標識抗体と細胞混合物をインキュベーションし、そして
ｃ）蛍光活性化細胞選別機の使用により１またはそれ以上の抗体により蛍光標識されたエポチロン耐性細胞を単離する
工程を包含する方法。
【請求項２２】
エポチロン耐性細胞を殺す方法であって、
ａ）毒性または治療活性を有する物質を請求項１８記載の１またはそれ以上の抗体に結合させ、
ｂ）細胞培養物（または患者）に１またはそれ以上の抗体を投与し、そして、
ｃ）エポチロン耐性細胞へ細胞傷害性薬剤をターゲッティングさせ、これらの細胞を選択的に殺す
ことを包含する方法。
【請求項２３】
インビボでのエポチロン耐性癌の診断方法であって、
ａ）請求項１８記載の１またはそれ以上の抗体を標識し、
ｂ）患者に１またはそれ以上の標識抗体を投与し、そして
ｃ）１またはそれ以上の標識抗体が結合している組織を同定する
ことを包含する方法。
【請求項２４】
癌の処置方法であって、処置を必要とする対象に請求項１８にしたがって同定された１またはそれ以上の抗体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
エポチロン類似体の同定方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項記載のエポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質と接触させ、そして
ｂ）試験物質に対する親セルラインの耐性と比較された試験物質に対するエポチロン耐性セルラインの耐性を測定する
工程を包含し、親セルラインと比べてエポチロン耐性セルラインの試験物質に対する耐性の方が大きいということが、試験物質がエポチロン類似体であることを示唆するものである方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法にしたがって同定されたエポチロン類似体。
【請求項２７】
潜在的微小管安定剤である化合物の同定方法であって、
ａ）試験すべき化合物とエポチロン依存的細胞をインキュベーションし（ただし、耐性細胞はエポチロン剥奪状態である）、そして
ｂ）依存的細胞の成長について検定する
工程を包含し、依存的細胞の成長が、化合物が潜在的微小管安定剤であることを示すものである方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法にしたがって同定された微小管安定剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、新たに同定されたエポチロンＡおよびエポチロンＢ耐性セルラインに関するものである。
【０００２】
発明の背景
多剤耐性とは、細胞がある種の細胞傷害性薬剤に対する耐性を獲得し、また構造的および機能的に関連の無い場合もある他の薬剤に対し獲得交差耐性を示すプロセスをいう。この点で化学療法薬に対する獲得耐性は、有効な癌治療にとっての重大な障害である。充分に特性確認された抗癌剤に対する耐性機序は、細胞から多様な細胞傷害性薬剤を流出させる原形質膜ＡＴＰ依存的ポンプである、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）および多剤関連タンパク質（ＭＲＰ）群のタンパク質の過剰発現を伴うが、必ずしも全ての多剤耐性細胞がこれらのタンパク質を過剰発現するわけではないことから、多剤耐性の非Ｐ−ｇｐ／ＭＲＰ仲介機序の存在が示されている。
【０００３】
エポチロン類、特にエポチロンＡおよびＢは、例えば式
【化１】
2004514433.tif 000002
［式中、Ｒは、水素（エポチロンＡ）またはメチル（エポチロンＢ）である］
を有する、新種の微小管安定化細胞傷害性薬剤（Ｇｅｒｔｈ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４９、５６０−３（１９９６）、またはＨｏｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、ＤＥ４１３８０４２参照）を代表する。
【０００４】
エポチロン類は、パクリタキセル（タキソール（登録商標））と同様、有糸分裂において細胞を抑止し、直接チューブリンおよび優先的には微小管に結合し、非有糸分裂細胞における細胞内微小管の束の形成を誘発し、超安定性チューブリンポリマーの形成を誘導する能力を有するマクロライドポリケチド類である。しかしながら、タキソール（登録商標）とは対照的に、エポチロンＡおよびＢは、それらがＰ−ｇｐ発現性多剤耐性癌セルラインに対する活性を保持している点で、Ｐ−ｇｐについての基質であるとは思われない。さらに、エポチロン仲介による微小管安定化は、内毒素シグナル伝達、すなわち癌治療においてタキソール（登録商標）の非血液学的作用を仲介すると考えられている作用を誘発することはない（Ｍｕｈｌａｒｄｔ，Ｐ．Ｆ．およびＳａｓｓｅ，Ｆ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：３３４４−３３４６参照）。
【０００５】
さらに、エポチロンは、タキソール（登録商標）より高い水溶性を示すため、処方するのにより適している。エポチロン類はＰ−ｇｐまたはＭＲＰ仲介多剤耐性を被らないため、それらは、他方でＰ−糖蛋白質排出ポンプの活性故に他の化学療法による治療に耐性を示す細胞の増殖を阻止し得る。細胞をエポチロンとインキュベーションすると、微小管の安定化、次いでアポトーシスが誘導される（Ｂｏｌｌａｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ，ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ＴＡＸＯＬ（Ｒ）−ｌｉｋｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５、２３２５−３３（１９９５）、および Ｂｏｌｌａｇ Ｄ．Ｍ．，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ６、８６７−７３（１９９７）参照）。さらに、見たところ微小管上の同一または立体的に近い結合部位を共有しているにもかかわらず、エポチロン類は、β−チューブリンイソ型に一突然変異をもつタキソール（登録商標）耐性卵巣癌セルラインに対して活性を示すことが示されている（Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）、２５３４−２５４１（１９９７）参照）。
【０００６】
２種のエポチロン耐性ヒト卵巣癌セルラインが以前文献において報告されているが（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７（６）：２９０４−２９０９（２０００））、本明細書に開示されているデータは、本発明セルラインが先に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型が異なることを示している。例えば、Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．により開示されたセルラインは、エポチロンＡおよびＢの両方に耐性を示し、本明細書に開示されているＥＡ１５０細胞は、タキソール（登録商標）およびエポチロンＢにごく僅かな耐性を呈すると思われる。同様に、Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．によるＥｐｏＡ８セルラインはエポチロン耐性を示すが、パクリタキセル耐性については制限されており、本明細書に開示されているＣ５／０およびＤ４／４０セルラインは両方ともパクリタキセルに対して完全な交差耐性を示す。さらに、本明細書に開示されているＤ４／４０セルラインは、薬剤耐性だけでなく薬剤依存性も示す。さらに、Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．により開示されたエポチロン耐性セルラインは、チューブリンポリマー化を誘導し、細胞成長を阻止するエポチロンの能力に影響する獲得βチューブリン突然変異を含むことが示された。本明細書に開示されているＣ５／０およびＤ４／４０セルラインは両方とも、ＨＭ４０チューブリンイソ型に単一の点突然変異（２７４位のトレオニンをプロリンにより置換）をもつ。突然変異部位はＥｐｏＡ８セルラインについて報告されたのと同一であり、突然変異（２７４位のトレオニンをイソロイシンにより置換）の性質は同一ではない。すなわち、類似突然変異は、本明細書に開示されているセルラインで見られる耐性機序に部分的に関与し得、本発明セルラインおよび Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．により報告されたセルライン間における表現型の差異は、依然として完全には特性確認されていないエポチロン耐性および付随的遺伝子型改変の作用機序が全耐性セルラインにおいて必ずしも同じではあり得ないことを示している。そのこと自体で、本発明のセルラインは、以前に報告されたエポチロン耐性細胞とは表現型および遺伝子型が異なるものと考えられる。
【０００７】
発明の要約
本発明の一態様は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは、１０ｎＭのエポチロンＡに耐性を示し、ＥＡ１０セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、２０ｎＭのエポチロンＡに耐性を示し、ＥＡ２０セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、４０ｎＭのエポチロンＡに耐性を示し、ＥＡ４０セルラインである。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは、６０ｎＭのエポチロンＡに耐性を示し、ＥＡ６０セルラインである。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、１５０ｎＭのエポチロンＡに耐性を示し、ＥＡ１５０セルラインである。
【０００８】
本発明の別の態様は、ＫＢ−３１癌セルラインのエポチロン耐性サブラインを提供する。一例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン２９７／Ｃ５／０である。別の例において、エポチロン耐性セルラインは、癌セルライン２９８／Ｄ４／４０である。さらに別の例において、エポチロン耐性セルラインは癌セルライン３１５／ｓｃ５．９である。
【０００９】
本発明の別の態様は、エポチロンと比べてエポチロン耐性細胞に対し改善された細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞を試験すべき薬剤とインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞について薬剤の細胞傷害性を測定し、そしてエポチロンと比べて低い耐性係数（耐性細胞についてのＩＣ５０値を親細胞についてのＩＣ５０値により除す）を示す薬剤を同定する工程を包含する方法である。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、エポチロンと比較してエポチロン耐性細胞に対する選択的細胞傷害性を示す薬剤の同定方法であって、エポチロン耐性細胞および感受性細胞と試験すべき薬剤をインキュベーションし、エポチロン耐性細胞および感受性細胞についての薬剤の細胞傷害性を測定し、そして１より小さい耐性係数（耐性細胞についてのＩＣ５０値を親細胞についてのＩＣ５０値により除す）を示す薬剤を同定する工程を包含する方法を提供する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞に対し選択的細胞傷害性を示す本明細書に開示された方法にしたがって同定された薬剤を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、エポチロン耐性細胞の成長をインビトロまたはインビボで選択的に阻害する方法であって、本明細書に開示された方法にしたがって同定された１種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と耐性細胞を接触させることを含む方法である。
【００１３】
本発明の別の態様は、エポチロン類の化学センシタイザーである薬剤の同定方法であって、試験すべき薬剤の存在および不存在下においてエポチロン耐性細胞を細胞が耐性を示すエポチロンとインキュベーションし、細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含する方法で、薬剤の不存在下でインキュベーションされた培養物の場合と比べて薬剤の存在下でインキュベーションされた培養物における細胞傷害性の方が高いということが、薬剤が化学センシタイザーであることを示すものである方法である。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に開示された方法にしたがって同定されたエポチロンの化学センシタイザーを提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、インビトロまたはインビボでのエポチロン耐性細胞の成長を阻止する方法であって、エポチロン耐性細胞を１種またはそれ以上のエポチロンおよび本明細書に開示された方法にしたがって同定された１種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させることを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、試験細胞から全ｍＲＮＡを調製し、試験細胞の全ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、慣用的方法により、例えばチップアレイ技術を用いてｃＤＮＡ標本の遺伝子発現分析を遂行し、そして試験細胞から誘導された発現パターンを、エポチロン耐性細胞について得られたパターンと比較する工程を包含する方法であり、その場合、類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性細胞であることを示唆している。この方法の延長として、慣用的方法、例えばチップアレイ技術を適用することによって、罹患組織または試験細胞を非罹患対照組織または細胞と比較することにより差次的遺伝子発現パターンが得られ、次いで親エポチロン感受性細胞とエポチロン耐性細胞との比較により得られたパターンと差次的発現遺伝子のパターンが比較され得る。類似した差次的遺伝子発現パターンは、罹患組織または試験細胞が潜在的にエポチロンに耐性を示すことを示唆し得る。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のエポチロン耐性細胞に特異的な精製抗体を提供する。さらに、本発明は、医薬上許容される担体または希釈剤と共に１種またはそれ以上のこれらの精製抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの同定方法であって、本明細書に開示された１またはそれ以上の抗体を標識し、１またはそれ以上の標識抗体に試験細胞を暴露し、そしてそれへの１またはそれ以上の標識抗体の結合を測定する工程を包含する方法を提供する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、エポチロン耐性セルラインの単離方法であって、本明細書に開示されている１またはそれ以上の抗体を蛍光染料で標識し、１またはそれ以上の蛍光標識抗体と細胞混合物をインキュベーションし、そして蛍光活性化細胞選別機の使用により１またはそれ以上の抗体で蛍光標識されたエポチロン耐性細胞を単離することを包含する方法を提供する。正常の非反応性細胞から抗体反応性エポチロン耐性細胞を分離する別の方法では、磁気ビーズと１またはそれ以上の請求の範囲に主張された抗体を共有結合的に結合させ、次いで磁気供給源を用いてそれらを固定し、未結合の非反応性細胞を洗浄することによりエポチロン耐性細胞を単離する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、エポチロン耐性細胞を殺す方法であって、細胞傷害性または治療活性を有する物質をエポチロン耐性細胞に特異的な１またはそれ以上の抗体に結合させ、細胞培養物（または患者）に１またはそれ以上の抗体を投与し、そしてエポチロン耐性細胞に細胞傷害性薬剤をターゲッティングしてこれらの細胞を選択的に殺すことを含む方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、インビボでのエポチロン耐性癌の診断方法であって、本明細書に開示された抗体の１またはそれ以上を標識し、１またはそれ以上の標識抗体を患者または患者組織標本に投与し、そして１またはそれ以上の抗体が結合している組織を同定することを含む方法を提供する。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、癌の治療方法であって、治療を必要とする対象にエポチロン耐性細胞に特異的な抗体の１またはそれ以上の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、エポチロンＡまたはＢの場合と類似した作用機序をもつ微小管結合性薬剤の同定方法であって、本発明のエポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質と接触させ、そして試験物質に対する親セルラインの耐性と比較された試験物質に対するエポチロン耐性セルラインの耐性を測定する工程を包含する方法を提供しており、親セルラインと比べてエポチロン耐性セルラインの試験物質に対する耐性の方が大きい場合、試験物質は、エポチロンＡまたはＢと類似した形でチューブリンと相互作用する微小管結合性薬剤であることが示唆される。この方法で同定された薬剤は、必ずしも限定されるわけではないが、エポチロン類似体を含み得る。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、上記で開示された方法にしたがって同定されたエポチロン類似体を含む微小管結合性薬剤を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、潜在的微小管安定剤である化合物の同定方法であって、エポチロン依存的細胞を試験化合物とインキュベーションし（この場合、耐性細胞はエポチロンが剥奪されている）、そして依存的細胞の成長について検定する工程を包含する方法を提供し、依存的細胞が成長する場合は、化合物が潜在的微小管安定剤であることを示している。本明細書で開示されている方法にしたがって同定された微小管安定剤もまた、本発明の一態様として本発明に包含される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍細胞を含む潜在的エポチロン耐性細胞の同定方法であって、慣用的分子生物学的技術を用いることにより、本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む細胞を同定する工程を包含する方法を提供する。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、ベータチューブリンの突然変異形態の翻訳を阻止、すなわち本明細書に開示されているエポチロン耐性細胞の特性を示す点突然変異を含む核酸の領域に対しアンチセンスである核酸を用いて腫瘍細胞におけるエポチロン耐性を阻止する方法を提供する。
【００２８】
発明の詳細な記載
以下、本開示全体を通じて使用されている略語を下記に列挙する。
Ｐ−ｇｐ＝Ｐ−糖蛋白質
ＭＤＲ＝多剤耐性
ＭＲＰ＝ＭＤＲ関連タンパク質
ＭＥＭ＝最少必須培地
ＭＴＳ＝３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩
ＰＭＳ＝フェナジンメトサルフェート
【００２９】
この発明は、概してエポチロンＡおよびエポチロンＢ耐性セルラインに関するものである。本発明の種々の態様は、エポチロン耐性の阻止および／または同定に関与する抗体および方法に関するものである。本発明の様々な態様は、以下の小節に記載されている。
【００３０】
Ｉ．エポチロン耐性セルライン
薬剤耐性セルラインの選択方法は当業界では公知であり、一般的に増加濃度の薬剤の存在下において細胞を培養および継代培養することを含む。生存している細胞コロニーを、さらに高濃度の薬剤の存在下で拡大させることにより、結局は細胞の個々の耐性セルラインおよびサブラインが生じる（例えば、Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１１７−１２６（１９８５）参照）。本明細書で使用されている薬剤に対する細胞の「耐性」の語は、細胞が、感受性細胞よりもさらに高濃度の薬剤に抵抗する能力をいう。すなわち、ある細胞のエポチロン耐性は、適切なエポチロン感受性細胞に対して測定される。例えば、薬剤に連続的に暴露されていた細胞のエポチロンＡ耐性は、薬剤耐性細胞が誘導された親感受性細胞に対して測定され得る。薬剤（例、エポチロンＡ）に対する細胞の耐性は、典型的には対照感受性細胞に対するＩＣ５０（細胞成長を５０％阻止するのに必要とされる薬剤の濃度）の増加として定量される。本明細書で使用されている「エポチロン耐性」の語は、エポチロンＡ、エポチロンＢまたはその両方に対する耐性をいう。
【００３１】
「エポチロン」の語は、エポチロンまたはエポチロン誘導体を全て包含する。好ましくは、「エポチロン」の語はエポチロンＡ、エポチロンＢ、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２５９２９に開示されたエポチロン誘導体、またはそれらの混合物を意味する。さらに好ましくは、その語は、その化学構造が上記で提供されているエポチロンＡおよびエポチロンＢを意味する。
【００３２】
本明細書で使用されている「試験細胞」は、エポチロン耐性である場合もそうではない場合もあり得る細胞をいう。
【００３３】
本明細書で開示されている幾つかのエポチロン耐性セルラインは、増加濃度のエポチロンＡの存在下におけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５セルラインの培養および継代培養から得られた。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５セルラインは、胸部腺癌セルラインであり、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア、アメリカ合衆国）から入手され得る。このセルラインは、１０％胎児牛血清、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補った最少必須培地（ＭＥＭ）を用いて単層で培養され、５．０％ＣＯ２中３７℃で維持され得る。培地および補給物質は全て、メリーランド、ロックビルのギブコ・ライフ・テクノロジーズから入手され得る。細胞は、約２０時間の倍加時間および約６０％の相対的平板効率を示す。
【００３４】
本明細書に開示されているエポチロン耐性ＥＡ１０サブラインは、１０ｎＭのエポチロンＡ中、上記要領で親ＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌セルラインをインキュベーションすることから誘導される。本明細書で使用されている「サブライン」（または「サブクローン」）の語は、１種またはそれ以上のエポチロンに対するその耐性によって親セルラインから誘導されるセルラインをいう。本明細書でＥＡ２０、ＥＡ４０、ＥＡ６０およびＥＡ１５０と称されるエポチロン耐性セルラインは、各々２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭおよび１５０ｎＭのエポチロン中における上記の連続インキュベーションによりＥＡ１０セルラインから選択される。本発明は、他の濃度のエポチロンＡの存在下においてＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌セルラインの細胞を培養することにより選択され得る他のエポチロンＡ耐性セルラインを包含するものとする。エポチロンに対する細胞の比率耐性の増加は、耐性セルラインが誘導された親セルラインに対して評価され得る（例、耐性セルラインについてのエポチロンＡのＩＣ５０対親セルラインについてのエポチロンＡのＩＣ５０）。本発明のＥＡ２０、ＥＡ４０、ＥＡ６０およびＥＡ１５０エポチロン耐性セルラインは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、２０００年１１月２１日付でアメリカ合衆国２０１１０−２２０９バージニア、マナッサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、各々寄託番号ＰＴＡ−２７０２、ＰＴＡ−２７０８、ＰＴＡ−２７０３およびＰＴＡ−２７０６が割当てられた。
【００３５】
本発明の追加的エポチロン耐性セルラインは、ＫＢ−３１ヒト類表皮腫癌セルラインを培養および継代培養することにより選択された。ＫＢ−３１細胞は、上記で検討したＭＤＡ−ＭＢ−４３５セルラインと同様、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１７）から入手され得るＫＢ類表皮腫癌セルラインのサブクローンである。ヒト類表皮腫癌セルラインＫＢ−３１およびＫＢ−８５１１、すなわちＫＢ−３１細胞から誘導されたＰ−ｇｐ過剰発現性ＭＤＲセルラインは、当初ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート（バッファロー、ニューヨーク）の、ドクターＲ．Ｍ．Ｂａｋｅｒから入手されたもので（記載については、Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１１７−１２６（１９８５）および Ｆｏｊｏ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：３００２−３００７（１９８５）参照）、以前に報告された要領で培養されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：８５１−８５６（１９８９））。ＫＢ−８５１１セルラインは、受入番号ＤＳＭ ＡＣＣ２３４２としてドイチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（ＤＳＭＺ、マシェローダー・ベーク１ｂ、Ｄ−３８１２４ブラウンシュバイク、ドイツ国）において１９９８年２月２０日にブタペスト条約のもとで寄託された。出願者らはまた、ブダペスト条約のもと２０００年１１月２１日に本明細書で開示されている親ＫＢ−３１セルラインをＡＴＣＣに寄託した。このセルラインには、特許寄託指定番号ＰＴＡ−２７０１が与えられた。
【００３６】
ＫＢ−３１細胞は、５％胎児牛血清、Ｌ−グルタミン（１％ｖ／ｖ）、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）を補った最少必須培地アルファ（ＭＥＭアルファ）を用いて単層で培養され得、さらにストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）も加えられ得る（アニメド、バーゼル、スイス国）。細胞は約２２時間の倍加時間を示す。コルチシン処理によりＫＢ−３１セルラインから誘導されたＫＢ−８５１１は、ＫＢ−３１細胞と比較してコルチシンに対し約４０倍の相対耐性を示す。それらは、ＫＢ−３１細胞と同じ条件下で培養され得る。長期の組織培養中、高レベルのＰ−ｇｐ発現を維持するために、デメコルシン（５０ｎｇ／ｍｌ）をストック培養物の培地に加え得る（シグマ、セントルイス、ミズーリ）。ＫＢセルラインは当初口の表皮癌から誘導されると考えられていたが、イソ酵素分析、ヒーラマーカー染色体およびＤＮＡフィンガープリンティングは、親ＫＢセルラインがヒーラ細胞汚染故に確立された可能性があることを示している。ＫＢセルラインの特徴に関する追加的詳細および関連参考文献については、ＡＴＣＣウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見ることができる。
【００３７】
以下、実施例で詳細に説明されている通り、エポチロンＡおよびＢ耐性セルラインは、増加濃度の薬剤中でＫＢ−３１細胞を培養することにより誘導された。得られた２９８／Ｄ４／４０（ＫＢ−３１／２９８）、２９７／Ｃ５／０（ＫＢ−３１／２９７）および３１５／ｓｃ５．９（ＫＢ−３１／３１５）と称されるセルラインは、ブダペスト条約の規約に従い、２０００年１１月２１日付でＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＰＴＡ−２７０５、ＰＴＡ−２７０４、ＰＴＡ−２７０７が各々割当てられた。
【００３８】
本発明は、他濃度のエポチロンの存在下、ＫＢセルライン系統の細胞を培養することにより選別され得る他のエポチロン耐性セルラインを包含するものとする。
【００３９】
ＩＩ．抗体
本発明の別の態様は、本明細書に開示されたエポチロン耐性セルラインを用いて生産された抗体である。好ましくは、抗体は、本明細書に開示された１種またはそれ以上のセルラインに結合するが、（１）健康な組織には結合せず、および／または（２）親セルラインには結合しないモノクローナル抗体である。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化（すなわち、非抗原結合領域におけるアミノ酸配列が改変されたことにより、抗体がヒト抗体とより密接に似たものとなるが、依然としてその本来の結合能力を保持している抗体分子）、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより製造されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを包含し得るが、限定されるわけではない。上記抗体は、（１）耐性セルラインを同定するための診断ツールとして、および（２）エポチロン耐性癌に罹患した患者を処置するために、細胞傷害性または治療活性を有する物質にカップリングされた場合には治療剤として有用である。本明細書で使用されている「細胞傷害性または治療活性を有する物質」の語は、その作用が細胞を破壊し得る分子、例えば放射性同位元素、毒素（例、ジフテリア毒素またはリシン）または化学療法薬、並びにその作用が別の細胞を破壊し得る細胞、例えば細胞傷害性細胞をいう。「細胞傷害性細胞」の語は、例えばマクロファージ、好中球、好酸球、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞および大型顆粒リンパ球といった細胞を包含する。抗体は、細胞傷害性細胞におけるＦｃ受容体を通じて細胞傷害性細胞にカップリングされ得ると考えられる。エポチロン耐性細胞に結合する分子は、細胞傷害性または治療活性を有する物質に直接カップリングされ得るか（例、リシン結合モノクローナル抗体）またはかかる物質に間接的に連結され得る。例えば、腫瘍細胞および細胞傷害性細胞に架橋し得る二重特異性抗体が使用され得、それによって腫瘍細胞の溶解が容易になり得る。二重特異性抗体は、細胞傷害性細胞のＦｃ受容体に結合することにより腫瘍細胞および細胞傷害性細胞を架橋させ得る。
【００４０】
本発明は、本発明の抗体を用いてエポチロン耐性細胞を同定、単離および／または殺す方法、および（ｂ）エポチロン耐性癌処置用医薬の製造におけるかかる抗体の使用法、かかる抗体を医薬上許容される担体または希釈剤と組合わせるかまたはそれらを随伴して含む医薬組成物を包含する。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の不均一集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、様々な宿主、例えば限定するわけではないが、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトおよびその他を、生きている細胞、全細胞リゼイト、エポチロン耐性細胞からの部分精製リゼイトまたはエポチロン耐性細胞で優先的に発現されるタンパク質での注射により免疫化し得る。ラットおよびマウスは、モノクローナル抗体生産を伴う下流適用に好ましい宿主である。宿主の種により、様々なアジュバントが免疫応答を高めるのに使用され得る。上記アジュバントは、限定するわけではないが、フロイント（不完全または完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウムおよび表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、油エマルジョン、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）およびジニトロフェノールを包含する。ヒトで使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。（抗体生産方法および分析の概説については、例えば Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．および Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）参照）。
【００４２】
特定抗原に対する抗体の均一集団である、モノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインによる抗体分子の生産を誘導する技術により得られる。これらには、Ｋｏｈｌｅｒおよび Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、および米国特許第４３７６１１０号）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン・アール・リス、インコーポレイテッド、７７−９６頁）が含まれるが、限定されるわけではない。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに属し得る。この発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。高力価のｍＡｂがインビボで製造されることから、現時点では好ましい製造方法である。
【００４３】
さらに、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産を目的として開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２−４５４）が使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分では由来する動物種も異なる分子、例えばネズミｍＡｂに由来する可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン不変域を有する分子である。
【００４４】
別法として、一本鎖抗体の製造用を目的として報告された技術（米国特許第４９４６７７８号、Ｂｉｒｄ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３、および Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５４６）は、特異的発現遺伝子−一本鎖抗体を製造するように適合され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重および軽鎖フラグメントを連結することにより形成され、エポチロン耐性細胞に特異的な一本鎖抗体が製造される。特異性は関連しているが、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャッフリング法により生成され得る。（例、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８：１０１３４−１０１３７参照）。
【００４５】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の生産に有用な技術は、本明細書に開示されているポリペプチド、フラグメント、誘導体およびそれらの機能的均等内容物質に対する抗体を産生させるように適合化され得る。上記技術は、米国特許第５９３２４４８、５６９３７６２、５６９３７６１、５５８５０８９、５５３０１０１、５９１０７７１、５５６９８２５、５６２５１２６、５６３３４２５、５７８９６５０、５５４５５８０、５６６１０１６および５７７０４２９号に開示されている。
【００４６】
抗体はまた、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導することにより、または文献に開示された高特異結合性試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることにより製造され得る。（例、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７、および Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９参照）。
【００４７】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂフラグメントがあるが、これらに限定はされない。別法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することにより（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定が可能となり得る。
【００４８】
本発明は、当業者が本発明セルラインに結合する二重特異性抗体およびテトラマー抗体複合体を製造することを可能にする。二重特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することにより製造され得る。ハイブリッドハイブリドーマは、当業界で公知の手順、例えばＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８６）８３：１４５３および Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（１９８６）７：２４１に開示された手順を用いて製造され得る。一般に、ハイブリッドハイブリドーマは、本発明のセルラインに結合し得る第一モノクローナル抗体を生産する第一セルラインおよび検出可能な物質、または毒性または治療活性を有する物質に結合し得る第二モノクローナル抗体を生産する第二セルラインを融合することにより形成される。二重特異性抗体はまた、Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：６２８および Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１６：３５４で以前に報告された手順を用いる化学的手段を用いて構築され得る。テトラマー抗体複合体は、当業者によく知られた方法、例えば米国特許第４８６８１０９号に記載された教示内容にしたがって製造され得る。
【００４９】
様々なイムノアッセイが、所望の特異性を有し、交差反応性が最小限である抗体を同定するためのスクリーニングに使用され得る。特異性が確立されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる競争的結合または免疫放射線検定法用の多様なプロトコルは、当業界ではよく知られている。上記イムノアッセイは、典型的には、エポチロン耐性細胞で優先的に発現されるエポチロン耐性細胞またはタンパク質およびその特異抗体間の複合体形成の測定を含む。
【００５０】
抗体結合親和力は、ラジオイムノアッセイ技術と連係的なスキャッチャード分析を含む慣用的方法により測定され得る。
【００５１】
検出を容易にするために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであって、その若干の変形が存在しており、それらも全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき標本を結合分子と接触した状態にする。適切なインキュベーション期間後、充分な時間をかけて抗体―抗原二元複合体を形成させ得る。この時点において、次いで検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した第二抗体を加え、インキュベーションし、抗体‐抗原‐標識抗体の三元複合体を形成させ得るのに充分な時間をかける。未反応物質があれば洗浄し、そしてシグナルの観察により抗原の存在を測定するか、または既知量の抗原を含有する対照標本と比較することにより定量し得る。フォワードアッセイに関する変形は、標本および抗体の両方を結合抗体へ同時に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき標本を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法を包含する。これらの技術は当業者には熟知されており、小さな変化を加え得ることは容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチアッセイ」は、基本的２サイト技術に対する変形を全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体がエポチロン耐性細胞特異的抗体であることである。
【００５２】
このタイプの検定法において最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素イムノアッセイの場合、通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により、酵素を第二抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な種々のライゲーション技術が存在し、それらは当業者にはよく知られている。常用されている酵素には、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートと使用するのに適しており、ペルオキシダーゼコンジュゲートの場合、１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンを一般的に使用する。また蛍光性基質を使用することも可能であり、それらは上記の色素原基質よりも蛍光性生成物を生じる。次いで、適切な基質を含有する溶液を抗体‐エポチロン耐性細胞特異抗原‐標識抗体の三元複合体に加える。この基質は第二抗体に結合した酵素と反応して定性的可視シグナルを与え、それを通常分光光度計によってさらに定量することにより、血清標本中に存在するエポチロン耐性細胞特異的抗原の量の評価が行われ得る。
【００５３】
Ｃ５／０およびＤ４／４０細胞、試験セルラインで同定された特定単一ヌクレオチド突然変異の存在可能性についてプローブするため、患者の腫瘍または血清標本は、当業界の分子生物学者に周知の突然変異検出技術により分析され得る。これらの技術には、ＳＳＯ（配列特異的オリゴヌクレオチドの使用）、ＰＡＳＡ（特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅）、固相ミニシーケンシング（小規模配列決定法）、マルチプレックス固相蛍光プライマー伸長法、ＯＬＡ（デュアルカラー・オリゴヌクレオチドライゲーション検定法）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）およびＵＨＧ（普遍的ヘテロ二本鎖ジェネレーター）分析が包含され得る（これらの方法の概要については、Ｌａｎｄｇｒｅｎ（１９９６）“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ＩＳＢＮ０１９８５７７９５８参照）。
【００５４】
別法として、蛍光性化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、それらの結合能力を改変することなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線での照明により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子における興奮状態を誘導した後、特徴的なより長い波長の光を放射する。放射は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特有の色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は、両方とも当業界では充分に確立されており、特に本発明方法には好ましい。しかしながら、他の受容体分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子も使用され得る。如何に要求された用途に適うよう手順を変更するかは当業者には容易に想到できることである。
【００５５】
本発明の追加的態様は、医薬上許容される担体と連係させた、本明細書で検討されている治療効果のいずれかを目的とする、医薬組成物の投与に関するものである。上記医薬組成物は、エポチロン耐性細胞抗原に対する抗体を含み得るが、それらに限定はされない。上記組成物は、単独または少なくとも１種の他の薬剤、例えば安定性化合物と組合わせて投与され得、その場合、無菌の生体適合性医薬用担体、例えば限定するわけではないが食塩水、緩衝食塩水、デキストロースおよび水中で投与され得る。上記組成物は、患者に単独でまたは他の薬剤、例えば他の化学療法薬、薬剤またはホルモン剤と組合わせて投与され得る。
【００５６】
本明細書で使用されている「他の化学療法薬」の語は、特に腫瘍疾患の処置で使用されるかまたは使用され得る化学療法薬をいい、例えば以下の種類から誘導された化学療法薬がある：
（Ａ）アルキル化剤、好ましくは架橋化学療法薬、好ましくはビス−アルキル化剤、
（Ｂ）抗腫瘍抗生物質、好ましくはドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、ルベックス（登録商標））、
（Ｃ）代謝拮抗物質、
（Ｄ）植物アルカロイド類、
（Ｅ）ホルモン剤およびアンタゴニスト、
（Ｆ）生物応答修飾因子、好ましくはリンホカイン類またはインターフェロン類、（Ｇ）プロテインチロシンキナーゼおよび／またはセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤、
（Ｈ）アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体、
（Ｉ）微小管安定剤／または不安定剤、または
（Ｊ）多種多様な薬剤またはその他または未知の作用機序をもつ薬剤。
【００５７】
本発明に包含される医薬組成物は、限定されるわけではないが、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段を含むかなり多数の経路により投与され得る。
【００５８】
有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、医薬上使用され得る製剤への活性化合物の加工処理を容易にする賦形剤および補助物質を含む医薬上許容される担体または希釈剤を含み得る。「医薬上許容される担体または希釈剤」の語は、充填剤（フィラー）、例えば糖類、例えば乳糖、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、および結合剤、例えばトウモロコシ、小麦、イネまたはジャガイモ澱粉を用いる例えば澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、および／または所望ならば、崩壊剤、例えば上述の澱粉、同じくカルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを包含するが、これらに限定はされない。賦形剤は、特に流動性調節剤および滑沢剤、例えば珪酸、タルク、ステアリン酸またはその塩類、例えばステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、および／またはポリエチレングリコールである。糖剤コアには、適切な、所望により腸溶のコーティングが施され、その場合、特に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、または適切な有機溶媒中のコーティング溶液、または腸溶コーティングを製造する場合、適切なセルロース調製物、例えばエチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートの溶液が使用される。カプセルは、ゼラチンでできた乾燥充填カプセル並びにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセリンまたはソルビトールでできた軟カプセルである。乾燥充填カプセルは、顆粒形態の有効成分を例えば充填剤、例えば乳糖、結合剤、例えば澱粉、および／または流動促進剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウムと共に、および所望の場合安定剤と共に含有し得る。軟カプセルでは、有効成分は、好ましくは適切な油性賦形剤、例えば脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコール類に溶解または懸濁されており、また、安定剤および／または抗菌剤も添加され得る。染料または色素は、識別目的または異なる用量の有効成分を区別するため、錠剤または糖剤コーティングまたはカプセルケーシングに添加され得る。
【００５９】
本明細書で使用されている「治療有効量」は、毒性または治療活性を有する物質に結合されたとき、徴候または病状を改善し得る、例えば腫瘍細胞の死を誘発し得る有効成分の量、例えば本明細書で開示されたエポチロン耐性セルラインに対して産生される抗体の量をいう。治療効率および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的医薬手順により決定され得、例えばＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）およびＬＤ５０（集団の５０％における致死量）である。毒性および治療作用間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表され得る。高い治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物試験から得られたデータは、ヒトに用いられる用量範囲の処方で使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくはＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんどまたは全く伴わない。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変動する。
【００６０】
いずれの化合物についても、治療有効量は、最初、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタを用いる動物モデルにおいて評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのに使用され得る。次いで、上記情報は、ヒトの場合に有用な用量および投与経路を決定するのに使用され得る。
【００６１】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関連した因子に照らして、現場の医師により決定される。用量および投与を調節することにより、活性部分のレベルを充分なものにし、または所望の効果を維持させる。考慮され得る因子には、病状の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ（複数も可）、反応感受性、および治療に対する耐性／応答がある。長時間作用性の医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により、３〜４日ごと、毎週、または２週間ごとに１回、または３週間ごとに１回投与され得る。
【００６２】
特定用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般的に当業界の実践者にとって入手可能なものである。当業者であれば、ヌクレオチドについてはタンパク質またはそれらの阻害剤の場合とは異なる処方物を使用するはずである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬処方物は、例えば米国特許５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９および６０５１５６１号に記載されている。他の化学療法薬（複数も可）との組み合わせの場合、他の化学療法薬（複数も可）は、市販されており、当業者に周知の標準的処方物で使用される。
【００６３】
処方および投与技術に関するさらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マーアック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルベニア）の最新版で見ることができる。
【００６４】
ＩＩＩ．本発明方法
本発明の一態様は、上記で開示された抗体を用いて、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞を同定し、単離し、および／または殺す方法に関するものである。例えば、検出方法は、試験細胞を、本明細書に開示されたエポチロン耐性細胞の内側または優先的には同細胞上で発現されたタンパク質に指向した抗体と接触させることを含み得る。この方法では、抗体を検出可能な物質で標識する。上記の検出可能な物質には、インビトロまたはエクスビボまたはインビボの腫瘍標本中においてエポチロン耐性腫瘍細胞を同定するのに使用され得る蛍光マーカー、酵素または放射性マーカーがある。エポチロン耐性腫瘍細胞は、エポチロン耐性について試験すべき腫瘍細胞と本発明抗体をインキュベーションすることにより同定され得る。エポチロン耐性特異抗体により認識される抗原が細胞の内側で発現されることが知られている場合、抗体投与前に細胞を透過性にするかまたは固定しなければならない。腫瘍細胞への抗体の結合は、エポチロン耐性細胞の内側または同細胞上で発現されたタンパク質が腫瘍細胞に存在していることを示している。腫瘍細胞への抗体結合レベルは、正常対照細胞への抗体結合レベルと比較され得、そして正常細胞と比べて腫瘍細胞への抗体結合が増加していることが、エポチロン耐性の指標として使用され得る。細胞（例、試験すべき腫瘍細胞または正常対照細胞）への抗体の結合は、抗体を標識している検出可能物質を検出することにより測定される。検出可能物質は抗体へ直接カップリングされ得るか、または別法として、検出可能物質は抗体と結合し得る別の分子にカップリングされ得る。例えば、第一抗体に指向した第二抗体の場合、第二抗体が検出可能物質にカップリングされている。
【００６５】
エポチロン耐性腫瘍細胞は、インビトロまたはインビボの腫瘍標本から検出され得る。例えば、患者から摘出された腫瘍組織は、腫瘍標本として使用され得る。標本は、即座に使用されるかまたは後で使用するため−２０℃未満の温度で冷凍貯蔵され得る。顕微鏡スライド上の腫瘍薄片は、標準的免疫組織化学技術を用いて抗体と、または標準的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術により核酸と反応し得る。さらに、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液が得られる場合、腫瘍細胞を抗体と反応させ、フローサイトメトリーにより分析し得る。別法として、エポチロン耐性腫瘍細胞は、腫瘍をもつ対象からインビボで検出され得る。標識抗体は対象に導入され得、腫瘍に結合した抗体が検出され得る。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的造影技術により検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【００６６】
エポチロン耐性腫瘍の同定に有用な試薬、例えば本発明抗体は、診断用キット中に組込まれ得る。このキットは、標本と比較される標準物質を含み得る。多様な試薬が適切な容器中でキットに内包され得、キットは、容器用ホルダーおよび使用説明書を含み得る。
【００６７】
患者からの腫瘍薄片または血漿は、上記突然変異検出技術に基いて設計された分子プローブを用いるかまたは他の慣用的方法にしたがって分析され得る。さらに、本明細書で開示されているエポチロンＡ耐性細胞に特有な点突然変異を含む核酸の領域に指向したアンチセンス核酸が、当業者に熟知されている分子生物学的技術を用いて作製され得ると予想される。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する論文については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｅｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ（遺伝分析用分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１（１）巻（１９８６）を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞においてエポチロン耐性を付与するタンパク質をコード化する核酸（例、ｍＲＮＡ）の発現を阻害する方法で使用され得る。このタンパク質の発現の減少は、アンチセンス核酸が導入された細胞のエポチロン耐性を阻害または除去する手段として使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養中のエポチロン耐性細胞に加えることにより、耐性が阻害された細胞が作製され得る。インビトロで上記細胞は、可能性のある治療剤を試験するのに使用され得る。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子療法で使用することにより、対象においてエポチロン耐性癌を除去または阻止し得ることが予想される。これは、インビボでの核酸の慣用的送達技術を用いて行われ得る。当業者には公知であるアンチセンス核酸を含有する医薬化合物および処方物の使用および投与に関して多くの参考文献が存在する。（例えば、米国特許第６１２４１３３、６０９６５４３および６１１７８４８号参照）。
【００６８】
さらに本発明は、腫瘍細胞を含むエポチロン耐性細胞の同定方法であって、ｃＤＮＡマイクロアレイまたは他の慣用的方法を用いることにより、試験細胞、エポチロン耐性標本および対応するレファレンス標本（非罹患組織対照組織およびエポチロン感受性細胞）の全ｍＲＮＡプールから調製されたｃＤＮＡの差次的遺伝子発現分析を遂行する工程を伴う方法を提供する。潜在的エポチロン耐性細胞の同定は、試験細胞および本発明エポチロン耐性セルライン対それらの対応する対照における差次的発現遺伝子の類似パターンを得ることに基いている。差次的遺伝子発現は、慣用的方法を用いてインビトロまたはインビボ供給源からの細胞標本から単離されたＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを用いて遂行され得る。全およびメッセンジャーＲＮＡ調製物、ノーザン分析および差次的遺伝子発現分析は、当業界で公知の方法のいずれかにしたがって遂行され得る。
【００６９】
同様に、プロテオーム解析（細胞性タンパク質の２−Ｄゲル電気泳動）を遂行することにより、耐性関連タンパク質パターン（フィンガープリント）が同定され得る。具体的には、エポチロン耐性および感受性親細胞をプロテオーム技術で分析することにより、エポチロン耐性細胞に伴う差次的タンパク質発現パターンが同定され得る。すなわち、細胞からのタンパク質抽出物は、慣用的方法にしたがって二次元ゲル電気泳動（一次元等電点電気泳動および二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分解され得る。次いで、発現されたタンパク質は、銀染色または他の慣用的タンパク質染色方法により可視化され、２種のセルライン間でパターンが比較され得る。耐性セルラインの典型的な特徴である差次的タンパク質発現パターンは、他の推定的エポチロン耐性細胞を同定できる可能性をもつ「フィンガープリント」として使用され得る。
【００７０】
さらに本発明は、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類の化学センシタイザー」の語は、耐性細胞に対する治療剤の効力を高め、および／または治療剤についての細胞の耐性を減少させ得る物質をいう。例えば、ベラパミルは、Ｐ−ｇｐ−仲介多剤耐性の化学センシタイザーである。ベラパミルの存在下では、多剤耐性細胞はアントラサイクリン類の細胞傷害性作用に対する感受性が高くなる。本発明のセルラインは、エポチロン類の化学センシタイザーである物質の同定方法において特に有用である。これは、試験すべき薬剤の存在および不存在下において細胞が耐性を示すエポチロンとエポチロン耐性細胞をインキュベーションし、そして細胞についてのエポチロンの細胞傷害性を測定する工程を包含し得、薬剤の不存在下でインキュベーションした培養物と比べて薬剤とインキュベーションした培養物の細胞傷害性の方が高い場合、その薬剤は化学センシタイザーであることが判る。細胞傷害性は、当業者に公知の方法、例えば比色分析システム、例えばＣＥＬＬＴＩＴＥＲ９６（登録商標）ＡＱＵＥＯＵＳアッセイ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）を用いて測定され得る。
【００７１】
本発明はまた、エポチロン類似体の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「エポチロン類似体」の語は、エポチロン様特性を有する合成または天然化合物をいう。この語は、微小管安定剤を包含し得るが、限定するわけではない。ここで予測される通り、本発明のセルラインは、エポチロン類についてのセルラインの耐性を部分的に克服し得るエポチロン類似体を同定するのに使用され得る。例えば、エポチロン耐性セルラインおよび対応する親セルラインを増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで耐性セルラインについて測定されたＩＣ５０値を親セルラインについて測定された同値で除すことにより、相対耐性係数が決定され得る。耐性係数が低い（レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンと比べて）試験化合物は、興味の対象である潜在的類似体を構成する。例えば、２９７／Ｃ５／０細胞および親ＫＢ−３１細胞を増加濃度の試験物質とインキュベーションし、次いで２９７／Ｃ５／０について測定されたＩＣ５０値をＫＢ−３１細胞について測定された同値で除すことにより相対耐性係数が測定され得る。耐性係数が低い（レファレンスとして同検定法に含まれるエポチロンＡと比べて）試験化合物は、潜在的ヒットを構成する。さらに、本明細書で開示されている２９８／Ｄ４／４０セルライン（エポチロン耐性であり、エポチロン依存性でもある）による実験は、エポチロンの場合と類似した作用機構をもつ化合物の同定に有用である。例えば、慣用的方法を用いることにより、エポチロンＡと類似した作用機序をもつ薬剤を同定する方法として、これらの細胞の増殖を支える薬剤についての様々なライブラリーがスクリーニングされ得る。
【００７２】
本発明はまた、エポチロン耐性細胞に対して選択的細胞傷害性を示す物質の同定方法を提供する。本明細書で使用されている「細胞傷害性薬剤」の語は、細胞増殖を阻害し、細胞死を誘導する、抗癌剤を含む化合物をいう。この方法は、標準的方法を用いて、本明細書で開示されている耐性セルラインを試験すべき物質とインキュベーションし、耐性セルラインについての物質の細胞傷害性を測定し、それを親セルラインの場合と比較することを含み得る。エポチロン耐性セルラインを優先的に殺す化合物、すなわち成長阻害についてのＩＣ５０が耐性細胞の方が対応する親細胞化合物の場合よりも低い化合物がヒットとなる。これについての一例は、２９７／Ｃ５／０および２９８／Ｄ４／４０細胞におけるビンクリスチンおよびデメコルシンである。
【００７３】
本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーは、エポチロン耐性セルラインの成長を阻害する方法において特に有用である。細胞傷害性薬剤およびエポチロン類の化学センシタイザーを用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、エポチロン耐性細胞を１種またはそれ以上のエポチロンおよび１種またはそれ以上の化学センシタイザーと接触させる。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤を用いるエポチロン耐性セルラインの成長阻害方法では、耐性細胞を１種またはそれ以上の細胞傷害性薬剤と接触させる。「接触させる」の語は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ投与を包含するものとする。本発明方法にしたがって同定された細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーはまた、エポチロン耐性腫瘍を患う対象における（すなわち、エポチロン類が天然または獲得耐性故にもともとまたはもはや有効な治療剤ではない状況における）治療有用性を有し得る。上記細胞傷害性薬剤および化学センシタイザーの適切な医薬組成物、投与方法および用量は、当業者にとっては明白なものであり、上記で検討されたものを含む慣用的方法にしたがって遂行され得る。
【００７４】
本発明を実践する場合、他に指示がなければ、当業者にとって遂行可能な細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの慣用的技術が使用される。これらの技術は最近の文献で詳細に開示されており、具体的にはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈおよび Ｍａｎｉａｔｉｓ編、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”第２版、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（アカデミック・プレス、インコーポレイテッド）、および Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８７）を参照。
【００７５】
この明細書で述べられている出版物、特許および特許出願は全て、この発明が関係する技術分野の専門家の技能レベルを示すものである。
【００７６】
上記で概説された本発明は、以下の実施例によりさらに理解し易くなるはずであり、これらは本発明のある態様の説明を目的としているに過ぎず、いかなる意味にせよ本発明を制限する意図はないものとする。
【００７７】
実験
以下の原材料および方法を用いて実施例１〜６を行う：
エポチロン耐性細胞の選択
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を播種（１プレートにつき１×１０６細胞）し、３７℃および５．０％ＣＯ２で１０％胎児牛血清を補った薬剤不含有ＭＥＭにおいて密集度約８０％まで成長させる。次いで、細胞の成長を、頻繁に培地を変えながら５週間にわたって１０ｎｍのエポチロンＡ（ノバルチス・アクチエン・ゲゼルシャフト、バーゼル、スイス国）含有培地で続行させる。個々の耐性コロニーを単離し、慣用的方法にしたがって１２ウェル、６ウェル、２５ｃｍおよび７５ｃｍプレートで連続的に発展させる。次いで、耐性細胞（創始細胞）を高濃度のエポチロン中でインキュベーションすることにより、より高度の耐性セルラインを得る。
【００７８】
成長阻害検定法
成長阻害は慣用的方法を用いて分析され得、例えばＭＴＳ検定法（プロメガ、ウィスコンシン）が使用され得る。この検定法では、１ウェルにつき約４０００細胞を、１０％胎児牛血清を補ったＭＥＭ中の９６ウェルプレートに播種し、５．０％ＣＯ２中３７℃でインキュベーションする。２４時間後、薬剤の希釈液（使用される濃度範囲は１ｎＭおよび１０００ｎＭ間である）を加え、さらに７２時間細胞を薬剤とインキュベーションさせる。次いで、ＰＭＳと混合したＭＴＳ試薬（製造会社の使用説明書によると、ＭＴＳ：ＰＭＳ ２０：１）を加え、慣用的方法にしたがってサーモマックスのマイクロプレート読取りシステム（モレキュラー・ディバイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア）を用いて吸光度を定量する。２４時間薬剤無しで成長させた細胞を成長対照として用いて薬剤濃度を測定することにより、細胞成長の５０％阻害（ＩＣ５０）が得られた。１プレートで１薬剤につき６検定を遂行する。
【００７９】
ウエスタンイムノブロッティング
当業界で公知の技術にしたがって原形質膜タンパク質を抽出する（例えば、Ｇｅｏｒｇｅｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４８：４７９−４８４、Ａｒｃｈｉａｎｌ−Ｍａｔｈｅｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２：６０３−６１０参照）。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜（ミリポア、マサチューセッツ）に移し、Ｍｏｎｋｓ，Ａ ｅｔ ａｌ．，ＪＮＣＩ、８３：７５７−７６６（１９９１）にしたがってＰ−ｇｐおよびＭＲＰに対するモノクローナル抗体でプローブした。
【００８０】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロッティング
慣用的方法（例えば、化合物および方法体系は、カリフォルニアのキアゲンにより市販されている）にしたがって、全ＲＮＡおよびポリＡ ＲＮＡを様々なセルラインから単離する。ポリＡ ＲＮＡの標識およびマイクロアレイチップのハイブリダイゼーションを購入する（インサイト・ファーマシューティカルズ、パロアルト、カリフォルニア）。慣用的方法にしたがってノーザン・ブロッティングを行い、１０μｇの全ＲＮＡを１％アガロースゲルにおいて電気泳動させ、ナイロン膜に移し、ＥＳＴクローン（ゲノム・システムズ、インコーポレイテッド、セントルイス、ミズーリ）から合成された３３Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせる。ノーザンブロットシグナルが検出され、慣用的方法にしたがいホスホイメージング技術を用いてこれらを定量する。フルオレサミン標識ヌクレオチドＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを含むｃＤＮＡプローブは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズから入手される。
【００８１】
細胞周期分析
慣用的方法にしたがって、細胞を、１０％胎児牛血清を補ったＭＥＭ中１×１０６細胞の密度で１０ｃｍ２組織培養皿に播種し、５．０％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベーションし、薬剤（２×ＩＣ５０濃度）に２４時間暴露し、トリプシン処理により採取し、遠心分離により集め、１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄する。冷７０％エタノールに再懸濁し、５ｍｌのＰＢＳで再洗浄し、ＰＩ溶液（７０μｌのよう化プロピジウム、３８ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ）に再懸濁することにより、細胞を固定する。３７℃で３０分間、ＰＩ溶液中でインキュベーション後、細胞を慣用的方法論にしたがってフローサイトメトリーにより分析する（装置およびソフトウェアはカリフォルニアのベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメトリー・システムズにより市販されている）。
【００８２】
実施例１
エポチロンＡ耐性セルラインの生成
上記方法にしたがって、親ＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌セルラインのエポチロンＡ耐性サブクローンを確立する。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５胸部腺癌細胞を、５週間３７℃で５％ＣＯ２下１０ｎＭのエポチロンＡの存在下において１０％胎児牛血清を補ったＭＥＭ中でインキュベーションする。細胞の大多数は死ぬが、生残っているクローンを選択し、１０ｎＭのエポチロンＡを含む培地中でさらに拡大させる。１２耐性コロニーのうち一つが充分に拡大し、ここでこれをＥＡ１０セルラインと命名する。１０ｎＭエポチロンＡ含有培地中でＥＡ１０細胞を維持する。さらに高濃度のエポチロンＡでのＥＡ１０細胞（創始細胞）の連続培養により、追加的な、より耐性の高いセルラインが得られる。２０ｎＭ（ＥＡ２０）、４０ｎＭ（ＥＡ４０）、６０ｎＭ（ＥＡ６０）または１５０ｎＭ（ＥＡ１５０）エポチロンＡに耐性を示すセルラインをこの要領で単離する。
【００８３】
実施例２
エポチロンＡ耐性細胞は、エポチロンＡ誘導Ｇ２／Ｍブロックを克服する
エポチロンＡ耐性および親ＭＤＡ−ＭＢ−４３５エポチロンＡ感受性細胞の細胞周期分布パターンを、標準ＦＡＣＳ分析法により比較する。データは、２０ｎＭエポチロンＡの存在下で２４時間培養されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のほとんどにおける細胞分裂過程が、細胞周期のＧ２／Ｍ期で遮断されていることを示す。対照的に、６０ｎＭエポチロンＡ中で２４時間培養されたＥＡ６０細胞の大集団は、Ｇ２／Ｍ期ブロックを克服し、Ｇ１およびＳ期に再び入る。すなわち、エポチロンＡ耐性細胞集団のかなりの部分は、通常エポチロンＡ感受性細胞の細胞周期で起こるＧ２／Ｍブロックを克服すると思われる。
【００８４】
実施例３
エポチロンＡ耐性細胞において可能性のある２種の耐性機序
ＭＴＳ検定法を用いて、５０％のＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＥＡ１０、ＥＡ２０、ＥＡ４０、ＥＡ６０およびＥＡ１５０細胞の成長阻害に必要とされる薬剤の濃度（ＩＣ５０）を測定する。表１で示されている通り、ＥＡ１０およびＥＡ２０細胞におけるエポチロンＡのＩＣ５０は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞よりもそれぞれ５倍および７倍増加している。興味深いことに、エポチロンＡのＩＣ５０は、ＥＡ２０およびＥＡ４０細胞において本質的に同じであるが、ＥＡ４０細胞は、ＥＡ２０細胞の選択に使用されるエポチロンＡの２倍濃度で選択される。しかしながら、ＥＡ６０およびＥＡ１５０細胞においてエポチロンＡのＩＣ５０の１５倍および＞１００倍増加がそれぞれ観察される。さらに、エポチロンＡに対する耐性が増加しているのとは対照的に、ＥＡ４０およびＥＡ１５０細胞は等しくタキソール（登録商標）に対し耐性を示す。すなわち、エポチロンＡ耐性の少なくとも２種の機序が存在し得る可能性があり、低い方の耐性機序はタキソール（登録商標）に対し交差耐性であり、そして高い方はエポチロンＡ特異的耐性機序である。
【００８５】
表１
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＥＡ１０、ＥＡ２０、ＥＡ４０、ＥＡ６０およびＥＡ１５０細胞で比較されたエポチロンＡ（ＥｐｏＡ）、エポチロンＢ（ＥｐｏＢ）およびタキソール（登録商標）のＩＣ５０値
【表１】
2004514433.tif 000003
【００８６】
実施例４
Ｐ−ｇｐまたはＭＲＰは、エポチロンＡに対する耐性を仲介しない
Ｐ−ｇｐおよび／またはＭＲＰ発現レベルを、ウエスタンイムノブロッティングによりエポチロンＡ感受性および耐性細胞において分析する。データは、多剤耐性ＭＤＡ／Ｔ０．３細胞およびアドリアマイシン耐性ＨＬ６０細胞がそれぞれＰ−ｇｐおよびＭＲＰを発現するが、Ｐ−ｇｐもＭＲＰも感受性ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞または耐性ＥＡ１０もしくはＥＡ２０細胞からは検出されないことを示している。
【００８７】
本明細書に開示されているエポチロンＡ耐性細胞がＰ−ｇｐ基質であるタキソール（登録商標）に対して呈する交差耐性は限られているため、エポチロン耐性はウエスタンブロッティングにより検出され得ないほど低いレベルのＰ−ｇｐにより仲介される可能性が存在する。それなりに、エポチロン耐性細胞は、Ｐ−ｇｐ阻害剤により除去され得る他のＰ−ｇｐ基質に対しある程度の交差耐性を有する。この可能性を調べるため、ＭＴＳ検定法を用いて、Ｐ−ｇｐ基質、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびビンブラスチンの細胞傷害性をエポチロンＡ耐性細胞に対して測定する。表２で示されている通り、親ＭＤＡ−ＭＢ−４３５セルラインおよびエポチロンＡ耐性ＥＡ４０セルラインは、３種の細胞傷害性薬剤全てに等しく感受性を示す。ＥＡ２０および耐性ＭＤＡ／Ｔ０．３細胞を［３’−デスオキシ−３’−オキソ−ＭｅＢｍｔ］１−［Ｖａｌ］２−シクロスポリン（ＰＳＣ−８３３、米国特許第５５２５５９０号に開示されているＰ−ｇｐ阻害剤）の存在下においてタキソール（登録商標）またはエポチロンＡとインキュベーションすると、タキソール（登録商標）に対するＭＤＡ／Ｔ０．３細胞の耐性は除去されるが、エポチロンＡに対するＥＡ２の耐性に対する効果は全く観察されない。
【００８８】
ＭＤＡ／Ｔ０．３は、タキソール（登録商標）へのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の暴露を増強することにより選択されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のクローン性サブラインである。ＭＤＡ／Ｔ０．３細胞は、高レベルのＰ−糖蛋白質を発現し、様々な化学的および機能的に関連の無い化合物に対し耐性を示す。ＭＤＡ／Ｔ０．３細胞は、Ｐ−糖蛋白質排除剤ＰＳＣ−８３３での処理により多様な細胞傷害性薬剤に感作され得る。
【００８９】
これらのデータを考え合わせると、Ｐ−ｇｐまたはＭＲＰはエポチロン耐性を仲介せず、これらの薬剤排出タンパク質はこれらの細胞でアップレギュレーションされないことが示されている。
【００９０】
表２
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ／Ｔ０．３およびＥＡ４０細胞で比較した様々なＰ−ｇｐ基質のＩＣ５０
【表２】
2004514433.tif 000004
【００９１】
実施例５
エポチロン耐性細胞の特徴である差次的遺伝子発現
高密度ｃＤＮＡマイクロアレイを含む慣用的方法を用いて、エポチロン耐性細胞に特有な差次的遺伝子発現が検査され得る。例えば、ＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＥＡ２０、ＥＡ４０およびＥＡ１５０細胞から単離し、これらを用いてフルオレサミン標識ヌクレオチドｃｙｅ３−ｄＵＴＰまたはｃｙｅ５−ｄＵＴＰを組込むｃＤＮＡプローブを製造した。ガラスチップ（インサイト・ファーマシューティカルズ、カリフォルニアにより市販されている）上における７５００の非重複遺伝子特異的ｃＤＮＡ配列のマイクロアレイを、試験標本としてＥＡ２０、ＥＡ４０またはＥＡ１５０細胞および対照としてＭＤＡ−ＭＢ−４３５からの全ＲＮＡプールの蛍光標識ｃＤＮＡ発現産物と同時にハイブリダイズさせる（標識およびハイブリダイゼーションは、カリフォルニア、パロアルトのインサイト・ファーマシューティカルズにより行なわれた）。各ハイブリダイゼーションについて、試験および対照を異なる蛍光標識で標識し、各ｃＤＮＡスポットについて、各プールにおけるその発現産物の相対量を、当業界で公知の方法にしたがってそのスポットで発生された純（ネット）蛍光シグナルにより測定する（例えば、Ｓｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０参照）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＥＡ１５０細胞からのｃＤＮＡとハイブリダイズしたチップ（ただし、各ｃＤＮＡプールは異なる染料で標識されている）からは、幾つかの差次的発現遺伝子が生じる。遺伝子発現データの分析は、プロプライエタリ（知的所有権をもつ）ソフトウェアを用いて行われるが、慣用的方法体系も使用され得る。デュプリケイト実験の比較は、３倍未満での差次的発現遺伝子のレベルにおける揺らぎを示している（データは示さず）。３倍を越えて差次的発現された遺伝子についてさらなる分析を行った。マイクロアレイ結果を確証するため、差次的発現遺伝子のサブセットを慣用的方法にしたがってノーザンブロッティングにより分析し、分析された遺伝子のサブセットの差次的発現を確認する。
【００９２】
遺伝子発現における大規模で非特異的な変化がエポチロンＡ耐性細胞の選択中に生じなかったことを確かめるために、３倍より大きく変化している遺伝子の比率を算出する。チップ上に配列された７５００の遺伝子のうち、４０００スポットからシグナルが検出され、発現が変化しているのは僅か１．８％に過ぎない。同数の遺伝子が、ＥＡ４０およびＥＡ１５０細胞において差次的に発現されている。
【００９３】
特異的にエポチロン耐性細胞において差次的に発現されている遺伝子をさらに区別するため、マイクロアレイチップは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５親セルラインおよびタキソール（登録商標）の存在下で選択された多剤耐性ＭＤＡ／Ｔ０．３セルラインから合成されたｃＤＮＡによりプローブされ得る。ＭＤＡ／Ｔ０．３またはＥＡ１５０細胞で差次的に発現された遺伝子の比較により、両セルラインでアップレギュレーションまたは抑制された遺伝子が同定され得る。発現がＥＡ１５０細胞で変化した遺伝子のうちの僅かなパーセンテージのみがＭＤＡ／Ｔ０．３細胞でも変化した。すなわち、マイクロアレイヒットの大部分はエポチロンＡ耐性細胞に特異的である。
【００９４】
マイクロアレイに存在するＥＳＴ配列によりＮＣＢＩデータベースを検索すると、エポチロンＡ耐性セルラインでアップレギュレーションされた遺伝子が５０％を越える割合で既知インターフェロン誘導性タンパク質をコード化することが示されている。これらのアップレギュレーション遺伝子の大部分は、組織適合性ＩＩ類タンパク質（ＨＬＡＩＩ）をコード化する。興味深いことに、若干のアップレギュレーションされた遺伝子の発現はエポチロンＡ耐性の増加と共に変化し、ＨＬＡＩＩタンパク質を含む。
【００９５】
非インターフェロン誘導性アップレギュレーション遺伝子のほとんどは、細胞表面タンパク質または細胞内シグナル伝達性タンパク質をコード化する（表３）。少数のアップレギュレーション遺伝子はまた、微小管関連または細胞骨格タンパク質、薬剤代謝性酵素またはストレスタンパク質としても同定された。
【００９６】
表３
生化学的機能または発現部位によるＥＡ１５０細胞でアップレギュレーションされた遺伝子の分類
【表３】
2004514433.tif 000005
【００９７】
本明細書に開示されているエポチロンＡ耐性細胞、特にＥＡ１５０セルラインの場合に特有な遺伝子発現パターンを用いることにより、エポチロン耐性であり得る腫瘍細胞を含む細胞が同定され得る。例えば、ｃＤＮＡを試験細胞から入手し、これらの細胞の遺伝子発現について慣用的方法にしたがって特性検定し得る。本明細書で主張されているエポチロンＡ耐性細胞の場合（例、ＥＡ１５０セルライン）と類似した発現パターンは、試験細胞が潜在的にエポチロン耐性であることを示している。
【００９８】
以下の原材料および方法を用いて実施例６〜１３を遂行する。
エポチロンＡおよびＢは、バイオモレキュラー・プロダクション・ユニット、ノヴァリティス・アクチエン・ゲゼルシャフトにより粘液細菌ソランギウム・セルロスム（Ｓｏｒｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）を醗酵させ、次いで精製することにより得られる（例、Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９９４２６０２）。パクリタキセルはカルビオケム（ラジョラ、カリフォルニア）から入手される。ディスコデルモリドは、Ｓ．Ｐｏｍｐｏｎｉ（ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィック・インスティテュート、フォートピアス、フロリダ）から得られるが、米国特許５０１００９９記載の要領でも入手され得る。ヴィンブラスチンサルフェート（ヴェルベ（登録商標））は、イーライ・リリー（インディアナポリス、インディアナ）から購入され、デメコルシンおよび５−フルオロウラシルはシグマ（セントルイス、ミズーリ）から購入される。パラプラチンは、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ（プリンストン、ニュージャージー）から入手される。
【００９９】
エポチロン耐性細胞の選択
ヒトＫＢ−３１（薬剤感受性）およびＫＢ−８５１１（多剤耐性、Ｐ−ｇｐ（Ｐ−糖蛋白質）過剰発現性）類表皮腫癌細胞は、ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュート（バッファロー、ニューヨーク、アメリカ合衆国）のドクターＲ．Ｍ．Ｂａｋｅｒから得られ（ＡＴＣＣを通じても得られる）、前記にしたがって培養される（Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５７：１０４（１９８４））。簡単に述べると、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２および８０％相対湿度雰囲気中３７℃で完全ＭＥＭ−アルファ培地（５％胎児牛血清および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミンを補った最少必須培地−アルファ）により細胞を培養する。
【０１００】
ＫＢ−３１類表皮腫癌細胞を、１０ｃｍ皿１枚につき０．５×１０６細胞で播種し、１．７ｎＭエポチロンＡの存在下、完全ＭＥＭ−アルファ培地中で３日間インキュベーションする。５ｎＭのエポチロンＡの存在下でさらに３日間インキュベーション後、細胞を継代培養（分裂比１：１０）し、５ｎＭのエポチロンＡの存在下で拡大させる。次いで、段階的（２倍）増加濃度のエポチロンＡへの断続的暴露により、生残っている細胞を選別する。この過程中における幾つかの段階で、単一細胞コロニーを機械的な力により１０ｃｍ皿から除去し、２４ウェル皿、２５ｃｍおよび７５ｃｍフラスコで拡大させる。皿に残っているコロニーをプールし、２倍高濃度のエポチロンＡの存在下で再播種し、上記と同様個々のコロニーを拡大させる。この選別手順によりＥｐｏＡ３２０−８０Ｃと呼ばれるサブラインが得られ、これをまず３２０ｎＭエポチロンＡ（他の培地交換／継代培養ごとに含まれる）の断続的存在下で選別し、それに続いて８０ｎＭエポチロンＡ（培地交換／継代培養ごとに含まれる）中での連続成長に適合化させる。このサブラインは、エポチロンＡの存在に部分的に依存していることが判った。しかしながら、薬剤の不存在下で成長したＥｐｏＡ３２０−８０Ｃのサブライン（おそらく代償的突然変異を伴うと思われる）を単離することも可能であり、これをＥｐｏＡ３２０／ＮＤと命名した。サブラインのクローン性を確認するため、それらを追加ラウンドの継代培養にかけることにより、ＥｐｏＡ３２０−８０ＣおよびＥｐｏＡ３２０／ＮＤからそれぞれ誘導される、２９８／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０ラインが得られた。２９８／Ｄ４／４０の最適成長は４０ｎＭエポチロンＡの存在下で行なわれ、２９７／Ｃ５／０はエポチロンＡの不存在下で成長する。同様のスキームを用いて、エポチロンＢの存在下で成長するＫＢ−３１細胞を選別する（出発濃度０．６ｎＭ）。３１５／ｓｃ５．９と称される耐性度が最高であるサブクローンを最初２．０ｎＭエポチロンＢの存在中で維持し、次いでエポチロンＢの不存在下での成長に適合化させた。
【０１０１】
インビトロ細胞成長阻害検定
基本的には報告された要領（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４３：８５１（１９８９））で抗増殖検定法を遂行する。簡単に述べると、細胞を１．５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種し、一晩のインキュベーションにより接着させる。化合物を１日目に連続希釈で加える。次いで、プレートをさらに３日間インキュベーションした後、慣用的方法にしたがって、細胞を３．３％ｖ／ｖグルタルアルデヒドにより固定し、水で洗浄し、０．０５％ｗ／ｖメチレンブルーで染色する。洗浄後、染料を３％ＨＣｌで溶離し、製造会社の使用説明書にしたがってスペクトラマックス・プラス（モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア）により光学密度を６６５ｎｍで測定する。式（処理ＯＤ−出発ＯＤ）／（対照ＯＤ−出発ＯＤ）×１００を用いたＳｏｆｔＰｒｏ２．６．１プログラム（モレキュラー・デヴァイシーズ、サニーヴェール、カリフォルニア）を用いて数学曲線の当てはめによりＩＣ５０値を測定する。ＩＣ５０は、インキュベーション期間の最後における純細胞成長の５０％阻害に至らしめる薬剤濃度として定義される。セルライン２９８／Ｄ４／４０によるＩＣ５０測定は、４０ｎＭのエポチロンＡの存在下で遂行される。
【０１０２】
細胞ベースおよび細胞不含有チューブリンポリマー化検定法
それぞれ無傷および溶解細胞における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合の薬剤誘発による変化は、基本的には報告された要領（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７５：５７−６３（１９９８））で評価される。簡単に述べると、細胞薬剤効果を評価するため、２×１０５細胞を２４ウェルプレート１枚につき最大６ウェルまで１ｍｌの容量で播種する。３７℃で１８〜２４時間インキュベーションして細胞を付着させた後、試験物質を細胞培養培地に加えて所望の濃度を達成し、次いで３７℃で２時間細胞のインキュベーションを行う。最終賦形剤濃度は１％である。次いで、一度に１プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を欠く室温リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ／Ｏ）１ｍｌで２回洗浄する。残存するＰＢＳ／Ｏを注意深く除去した後、１００μｌの室温低張性溶解緩衝液Ａ（ＨＬＢ／Ａ：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭのＭｇ２Ｃｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのペファブロック、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５％のノニデットＰ−４０）を加え、プレートをアルミホイルで包むことにより、光に誘導されたチューブリンポリマー化によるアーチファクトを最小限にする。３７℃で正確に５分間インキュベーション後、細胞を削り取って採取し、室温のエッペンドルフ管に移す。採取したウェルを１００μｌの室温ＨＬＢ／Ａで１回洗浄し、対応する初回標本とプールする。管を５秒間渦状に混合して細胞溶解を促した後、１２０００×ｇの卓上遠心分離器中室温で１０分間遠心分離することにより、非ポリマー化チューブリン（上清）から微小管（ペレット）を分離する。次いで、上清を注意深く新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。同時に、沈澱物質を、２００μｌの室温再懸濁緩衝液（ＲＳＢ：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５ｍＭのＭｇ２Ｃｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのペファブロック、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．５％のノニデットＰ−４０）に再懸濁する。３０秒間ソニケーター水浴中にエッペンドルフ管を置くことにより、ペレットの可溶化を助ける。次いで、上清および可溶化されたペレット標本に、９５℃で５分間加熱した６×標本ローディング緩衝液（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ２２７、６８０−６８５）を補足し、下記要領により１０％分解／５％濃縮用ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。
【０１０３】
細胞不含有系における非ポリマー化およびポリマー化チューブリン間の割合に対する薬剤効果を評価するため、細胞を薬剤添加時に溶解し、以下の要領で処理する。上記と同様に、細胞を播種し、１８〜２４時間インキュベーションする。次いで、一度に１プレートを減光した組織培養フードに移し、細胞を１ｍｌの室温ＰＢＳ／Ｏで２回洗浄する。残存するＰＢＳ／Ｏを注意深く除去した後、所望の濃度の試験物質を含有する２００μｌの室温ＨＬＢ／Ａを細胞に加える。最終賦形剤濃度は１％である。プレートをアルミホイルで包み、３７℃で５分間インキュベーションする。次いで、リゼイトをエッペンドルフ管に移し、５秒間ボルテックスした後、１２０００×ｇの卓上遠心分離器中室温で３０秒間遠心分離にかける。標本のさらなる処理は上記と同様に遂行される。
【０１０４】
粗細胞下分画
本質的には報告された要領（Ｂｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３９０２−９０９（１９８９））で粗細胞下分画を行うことにより、細胞質ゾルおよび膜（「顆粒」）細胞構成成分を分離する。簡単に述べると、１×１０６細胞を１０ｃｍ皿に播種し、密集成長の７０〜８０％に達するまで３７℃でインキュベーションする。氷へ移した後、培地を吸引除去し、細胞を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ／Ｏで２回洗浄する。残存する洗浄緩衝液を注意深く除去した後、細胞を５００μｌの低張性溶解緩衝液Ｂ（ＨＬＢ／Ｂ：２５ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのβ−グリセロホスフェート、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４）中で採取し、エッペンドルフ管へ移し、氷上に置く。溶液の泡立ちを回避する、ブランソン振動器２５０（５０％デューティーサイクル、パワー出力設定６）を用いて細胞を１０バーストで音波処理にかける。次いで、音波処理した細胞リゼイトを、４℃に予冷しておいた卓上遠心分離器中１２’００×ｇで１５分間遠心分離する。次いで、上清（＝細胞質ゾル）を新たなエッペンドルフ管に移し、さらなる処理時まで氷上で貯蔵する。その間、残存するペレット標本を注意深く１ｍｌのＨＬＢ／Ｂですすぐ。２５０μｌのトリトン溶解緩衝液（ＴＬＢ：ＨＬＢ／Ｂ、１％トリトンＸ−１００を補充）を加えた後、上記と同様に標本を音波処理し、遠心分離にかける。次いで、生じた上清（＝膜）を新たなエッペンドルフ管に移す。タンパク質含有量を測定（ＢＣＡキット、ピアス、ロックフォード、イリノイ）後、等タンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７％分解／５％濃縮用ポリアクリルアミドゲル）により分解し、下記要領で抗原を免疫ブロッティングにより検出する。
【０１０５】
免疫ブロッティング
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に移し、ウサギ抗Ｐ−ｇｐ抗体（ＰＣ０３、希釈率１：１００）（カルビオケム、サンディエゴ、カリフォルニア）またはマウス抗ベータ−チューブリン（ｔｕｂ２．１、希釈率１：１０００）（シグマ、セントルイス、ミズーリ）および対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（希釈率１：１００００）（アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）でプローブする。製造会社の使用説明書（ＥＣＬ）（アマーシャム、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）にしたがって強化された化学発光方法を用いて免疫複合体を検出する。
【０１０６】
実施例６
エポチロン耐性セルラインの生成
エポチロン耐性セルライン、ＥｐｏＡ３２０−８０Ｃ、ＥｐｏＡ３２０／ＮＤ、２９８／Ｄ４／４０、２９７／Ｃ５／０および３１５／ｓｃ５．９を上記で開示されている要領で生成させる。具体的には、ＫＢ−３１細胞の増殖を、３．２ｎＭのエポチロンＡの存在下で半最大阻害する。段階的増加濃度のエポチロンＡと断続的スケジュールでＫＢ−３１類表皮腫癌細胞をインキュベーションすると、顕著に高い濃度のエポチロンＡの存在下でも成長し得る細胞の出現が誘発される。すなわち、ＥｐｏＡ−３２０細胞は、３日間薬剤不在断続期間をもって週１回投与されると、３２０ｎＭのエポチロンＡの存在下でも成長した。サブクローン、２９８／Ｄ４／４０を、週２回（すなわち、培地交換ごとに）投与された４０ｎＭエポチロンＡの存在下で成長するように適合化させる。興味深いことに、これらの細胞は、親細胞において５０％の細胞成長低下に至らしめる濃度の１０倍を越える濃度のエポチロンＡの存在下でも生残るだけでなく、さらに最適な成長についてもこの薬剤量に依存的であることが見出された。さらに、２９８／Ｄ４／４０細胞からエポチロンＡが剥奪されているとき、それらは細胞周期のＧ２／Ｍ期で成長を停止し、結局はアポトーシスにより死ぬ。興味深いことに、２種の他の微小管安定剤である、エポチロンＢおよびパクリタキセルは、このセルラインの成長を維持する場合にエポチロンＡの代わりに用いられ得る（類似した薬剤依存的表現型は、既にＥｐｏＡ−３２０−８０Ｃ細胞について言及されている）。これは、２９８／Ｄ４／４０細胞が、他の微小管安定剤により補足され得る形でそのチューブリンの機能性に欠陥を生じさせる突然変異を獲得したことを示唆している。すなわち、このセルラインは薬剤スクリーンで使用され得、その場合微小管安定機構を伴う可能性がある化合物は、エポチロンＡ剥奪２９８／Ｄ４／４０細胞の成長を維持することによって同定され得る（下記参照）。それにもかかわらず、エポチロンＡの不存在下で長期間インキュベーションすると、エポチロンＡに対しまだ部分的に耐性を示すが、２９８／Ｄ４／４０の薬剤依存的表現型を喪失したサブラインを単離することができ、これは代償的突然変異に起因すると予測される。このセルラインのサブクローン、２９７／Ｃ５／０は、さらなる分析に使用される。
【０１０７】
エポチロンＡをエポチロンＢまたはパクリタキセル（タキソール（登録商標））と置き換えてもエポチロンＡ耐性／依存的セルライン２９８／Ｄ４／４０の成長が維持され得るという事実は、このセルラインを薬剤スクリーンに使用しても、エポチロンＡの場合と類似した作用機序を有する化合物が同定され得ることを示している。それを行うために、２９８／Ｄ４／４０細胞（予めエポチロンＡが剥奪されている）を増加濃度の試験化合物とインキュベーションした後、慣用的方法にしたがって３日間のインキュベーション期間の最後に細胞数が測定され得る。可能性のあるヒットは、この検定法における陽性対照として含まれ得るエポチロンＡ（またはパクリタキセル）と同様に２９８／Ｄ４／４０細胞の成長を維持するものである。
【０１０８】
実施例７
２９８／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０細胞の薬剤耐性プロフィール
第１セットの分析において、２９８／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０の薬剤耐性プロフィールを測定する（表１参照）。両エポチロンＡ選択セルラインは、部分的または完全にエポチロンＢおよびパクリタキセルに対して交差耐性を示すが、興味深いことに別の微小管安定剤であるディスコデルモリドには交差耐性を示さない。他方、２９８／Ｄ４／４０および、程度は劣るにせよ２９７／Ｃ５／０は、微小管不安定剤ビンブラスチンおよびデメコルシンに対し高感受性であると思われる。いずれのセルラインとも標準細胞傷害性薬剤ドキソルビシン、５−フルオロウラシルまたはパラプラチンに交差耐性を示さない（２９８／Ｄ４／４０について示されたパラプラチンに対する耐性のごく僅かな増加を除く）。対照的に、Ｐ−糖蛋白質過剰発現性ＫＢ−８５１１細胞は、パクリタキセル、ビンブラスチン、デメコルシンおよびドキソルビシンに耐性を示すため、古典的多剤耐性プロフィールを呈する。これらを考え合わせると、２９２／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０について観察される耐性プロフィールは、古典的な多剤耐性の場合とは区別される。
【０１０９】
表４　エポチロン選択ＫＢ−３１サブラインの交差耐性プロフィール
【表４】
2004514433.tif 000006
【０１１０】
以下の方法にしたがって表４のデータを集める。細胞（１×１０３）を９６ウェルプレートに播種し、２４時間付着させる。次いで、化合物を２倍連続希釈として加え、インキュベーションをさらに７２時間続行する。実験開始時および終了時の細胞数を、慣用的方法にしたがって細胞性タンパク質マス（塊）のメチレンブルー染色により推定する。賦形剤処理細胞の実質マス増加を１００％成長として設定する。ＩＣ５０は、対照と比較した半最大成長阻害に至らしめる薬剤濃度として測定される。耐性セルラインで測定されたＩＣ５０を親ＫＢ−３１細胞で測定された同値で除すことにより、特定薬剤についての耐性係数（ＲＦ）を計算する。データを別々の３実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として表すが、例外はｎａ＝適用不可能（ｎ＜３）である。Ｐ−糖蛋白質を過剰発現するコルチシン選択ＫＢ−３１細胞は、古典的多剤耐性表現型についてのレファレンスとしての役割を果たした。
【０１１１】
エポチロンＢの存在下で選択されるＫＢ−３１サブライン３１５／ｓｃ５．９は、エポチロンＢに対して３．１倍耐性、およびエポチロンＡ、パクリタキセルおよびドキソルビシンに対し下限に近い交差耐性を示した。２９８／Ｄ４／４０と同様に、３１５／ｓｃ５．９は、微小管不安定剤ビンクリスチンおよびデメコルシン、並びに非微小管ターゲッティング薬剤、５−フルオロウラシルに対してやや高感受性である。エポチロンＡ選択クローン２９２／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０の場合と比べてこのクローンについて達成された顕著に低い全般的耐性レベルは不確かであるが、選ばれた選択スケジュール（段階的な２倍濃度増加）の結果であり得る。
【０１１２】
実施例８
Ｐ−ｇｐは、３１５／ｓｃ５．９、２９８／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０細胞ではエポチロン耐性を仲介しない。
エポチロン耐性がＰ−糖蛋白質を必然的に伴うわけではないことを確認するために、膜タンパク質について濃厚化した細胞リゼイトを、イムノブロッティングによりＰ−糖蛋白質の存在について評価する。具体的には、細胞（２×１０６）を１５ｃｍ皿において播種し、密集成長の７０〜８０％まで成長させる。細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により粗細胞下分画にかける。顆粒画分（原形質膜で濃厚化）を構成するペレットを、常用のデタージェント緩衝液に再懸濁する。等タンパク質量（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、そしてＥＣＬシステムを用い、市販の抗体（ｍｄｒ−１（Ｐ−糖蛋白質）（Ａｂ−１）、カルビオケム−ノヴァケム、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いてＰ−糖蛋白質を検出する。コルチシン選択ＫＢ−８５１１細胞（Ｐ−糖蛋白質を過剰発現する）の顆粒画分は、陽性対照としての役割を果たす。
【０１１３】
結果は、親ＫＢ−３１細胞と同様、Ｐ−ｇｐ発現が３１５／ｓｃ５．９、２９８／Ｄ４／４０および２９７／Ｃ５／０細胞からは全く検出され得ないことを示している。対照的に、コルチシンでの選択によりＫＢ−３１細胞から誘導される（Ａｋｉｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ．１１：１１７−１２６（１９８５））、「古典的」多剤耐性ＫＢ−８５１１細胞は、Ｐ−糖蛋白質を過剰発現する。エポチロンＡおよびＢがＫＢ−８５１１細胞に対して完全な活性を保持しているという事実（表４参照）と考え合わせると、これらの観察結果は、エポチロン耐性がＰ−糖蛋白質を伴うわけではないことを強く示唆しているだけでなく、これらの薬剤により細胞を反復暴露しても、この薬剤排出ポンプは誘導されないことも示唆している。
【０１１４】
実施例９
２９８／Ｄ４／４０または２９７／Ｃ５／０細胞におけるチューブリンポリマー化
特定薬剤の細胞蓄積の減少または代謝的不活化の増加に至る機序以外に、標的遺伝子における改変も観察されることが多い。すなわち、我々は、エポチロンＡに暴露されたとき、２９８／Ｄ４／４０または２９７／Ｃ５／０細胞が有するチューブリンポリマー化ポテンシャルが減少するか否かを試験した。具体的には、ＫＢ−３１、２９７／Ｃ５／０および２９８／Ｄ４／４０細胞（２×１０５）を６ウェルプレートで別々に播種し、２４時間付着させる。細胞を、０、１、１０、１００または１０００ｎＭ濃度のエポチロンＡまたは賦形剤（０．１％ＤＭＳＯ）と２時間インキュベーションする。次いで、処理細胞を低張性溶解緩衝液中で採取し、上記と同様遠心分離により可溶性チューブリン（上清に存在）を微小管ポリマー（ペレットに存在）から分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって上清タンパク質の画分を分離した後、β−チューブリン特異的抗体ＴＵＢ２．１（シグマ、セントルイス、ミズーリ）およびＥＣＬシステムを製造会社の使用説明書にしたがって用いることによりブロットされたタンパク質を免疫検出することによって、非ポリマー化チューブリンの量を評価する。
【０１１５】
結果は、増加濃度のエポチロンＡと親ＫＢ−３１細胞のインキュベーションにより、これらの細胞におけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少が誘導され、ポリマー化微小管のプールにおける付随的増加を伴うこと（データは示さず）を示している。興味深いことに、非ポリマー化チューブリンの減少をまねくエポチロンＡの濃度は、成長阻害についてのＩＣ５０と類似した範囲に含まれる（表４参照）。対照的に、２９７／Ｃ５／０細胞で非ポリマー化チューブリン画分を減少させるのに要求される薬剤濃度は顕著に高く、２９８／Ｄ４／４０細胞は、試験された用量範囲（すなわち、１０００ｎＭ以下）でのエポチロンＡ仲介チューブリンポリマー化に対し完全に不応性である。しかしながら、エポチロンＡ仲介チューブリンポリマー化の減少が、薬剤摂取の減少またはチューブリン機能性の真性欠陥に起因するかは、この実験からは明らかにされなかった。この問題と取り組むため、エポチロンＡとのインキュベーション前に細胞を溶解する。具体的には、ＫＢ−３１、２９７／Ｃ５／０および２９８／Ｄ４／４０細胞（２×１０５）を別々に６ウェルプレートに播種し、２４時間付着させる。次いで、０、１、１０または１００μＭエポチロンＡ含有低張性緩衝液で細胞を溶解する。賦形剤（ＤＭＳＯ）濃度は１％であった。３７℃で５分間インキュベーション後、標本を遠心分離にかけて、ポリマー化チューブリンから可溶性物質を分離し、上記と同様に非ポリマー化チューブリンのレベルをウエスタンブロッティングにより評価する。
【０１１６】
結果は、増加濃度のエポチロンＡが、ＫＢ−３１細胞リゼイトにおけるチューブリンの非ポリマー化プールの用量依存的減少をまねくことを示している。２９７／Ｃ５／０細胞についての用量応答曲線は高濃度にシフトし、２９８／Ｄ４／４０におけるチューブリンプールはまた、非ポリマー化チューブリンのレベルでのエポチロンＡ仲介変化に対し完全に不応性である。また、この細胞不含有検定フォーマットで効果を発揮するのに必要とされるエポチロンＡの濃度は、細胞ベースの検定法の場合に観察される濃度より数桁大きいことは注目に値する。これは、エポチロン類（およびパクリタキセル）が細胞内側で数百倍蓄積するという初期の観察結果と一致している。これらの結果を考え合わせると、２９７／Ｃ５／０および２９８／Ｄ４／４０細胞が、直接的または間接的にそれらのチューブリン機能性を改変する一突然変異または幾つかの突然変異を獲得したことが示唆されている。
【０１１７】
ＨＭ４０β−チューブリンイソ型のヌクレオチド配列決定は、親ＫＢ−３１と比較したときに２９７／Ｃ５／０および２９８／Ｄ４／４０細胞に存在する単一塩基突然変異の存在を明らかにした。すなわち、ヌクレオチド８２０、コドン２７４における第１ヌクレオチドは、ＡからＣに改変された。改変されたコドン（ＡＣＣ→ＣＣＣ）により、トレオニンからプロリンへの非同類アミノ酸変化（Ｔｈｒ２７４Ｐｒｏ）が生じた。標準的分子生物学的方法を使用する。簡単に述べると、全コーディング配列を包含するオーバーラップフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより全ＲＮＡから増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ビッグダイ（商標）ターミネーターサイクル配列決定キット（ＰＥバイオシステムズ）を用いて自動式サイクルＰＣＲにより配列決定する。使用した４種のイソ型特異的プライマーセットは以前に報告されている（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２７）：１７１１８−１７１２５（１９９７））。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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