(57)【要約】本発明は、Ｔｉｅ−２のリガンド結合領域を有するポリペプチド；結晶型のそのポリペプチド；その結晶型を用いてＴｉｅ−２の触媒領域の３次元構造を決定する方法に関する。本発明はさらに、Ｔｉｅ−２活性の阻害薬候補、例えばＴｉｅ−２触媒領域に対する天然基質の結合を阻害する化合物の設計および／または特定方法における、Ｔｉｅ−２触媒領域の３次元構造の、単独または阻害薬との複合体という両方の場合での使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｉｅ−２蛋白の触媒領域を有することを特徴とする結晶ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有する請求項１に記載の結晶ポリペプチド。
【請求項３】
結晶ポリペプチド−リガンド複合体であって、前記ポリペプチドがＴｉｅ−２蛋白の触媒領域を有することを特徴とする結晶ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４】
前記ポリペプチドが哺乳動物Ｔｉｅ−２の触媒領域を有する請求項３に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項５】
前記哺乳動物Ｔｉｅ−２がヒトＴｉｅ−２である請求項４に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項６】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸８０２〜１１２４を有する請求項５に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項７】
前記リガンドが下記式のものである請求項６に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【化１】
2004514405.tif 000010
【請求項８】
ａが約９６Å、ｂが約１１８Å、ｃが約７８Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項７に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項９】
前記リガンドが下記式のものである請求項６に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【化２】
2004514405.tif 000011
【請求項１０】
ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項９に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項１１】
前記リガンドが下記式のものである請求項６に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【化３】
2004514405.tif 000012
【請求項１２】
ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項１１に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項１３】
前記リガンドが下記式のものである請求項６に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【化４】
2004514405.tif 000013
【請求項１４】
ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項１３に記載の結晶ポリペプチド／リガンド複合体。
【請求項１５】
（ａ）Ｔｉｅ−２の前記触媒領域を有する第１のポリペプチドの結晶を得る段階；
（ｂ）前記結晶についてのＸ線回折データを得る段階；ならびに
（ｃ）Ｔｉｅ−２の前記触媒領域を有する第２のポリペプチドの原子座標および前記Ｘ線回折データを用いて前記結晶の結晶構造を解明する段階
を有するＴｉｅ−２蛋白の触媒領域を有する第１のポリペプチドの３次元構造の決定方法。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチドの結晶がリガンドと複合体形成した第１のポリペプチドを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のポリペプチドが哺乳動物Ｔｉｅ−２蛋白の触媒領域を有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが独立に、ヒトＴｉｅ−２蛋白の触媒領域を有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のポリペプチドが野生型ヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有し、前記第２のポリペプチドが野生型ヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１のポリペプチドが野生型ヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）Ｔｉｅ−２蛋白の触媒領域を有するポリペプチドの結晶の原子座標を得る段階；
（ｂ）前記原子座標を用いてＴｉｅ−２の活性サブ部位を規定する段階；ならびに
（ｃ）前記１以上の活性サブ部位に結合する化合物を特定する段階を有し、
前記活性サブ部位または部位に結合する前記化合物がＴｉｅ−２蛋白の阻害薬である、Ｔｉｅ−２蛋白の阻害薬である化合物の特定方法。
【請求項２２】
（ｄ）段階（ｃ）で特定された化合物のＴｉｅ−２を阻害する能力を評価する段階をさらに有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔｉｅ−２蛋白が哺乳動物蛋白である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔｉｅ−２蛋白がヒト蛋白である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔｉｅ−２蛋白が野生型ヒトＴｉｅ−２である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記結晶がさらに、前記触媒領域に結合したリガンドを有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸８０２〜１１２４を有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記リガンドが下記式のものである請求項２４に記載の方法。
【化５】
2004514405.tif 000014
【請求項２９】
前記結晶が、ａが約９６Å、ｂが約１１８Å、ｃが約７８Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドが下記式のものである請求項２４に記載の方法。
【化６】
2004514405.tif 000015
【請求項３１】
前記結晶が、ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リガンドが下記式のものである請求項２４に記載の方法。
【化７】
2004514405.tif 000016
【請求項３３】
前記結晶が、ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記リガンドが下記式のものである請求項２４に記載の方法。
【化８】
2004514405.tif 000017
【請求項３５】
前記結晶が、ａおよびｂが約８６．０Å、ｃが約１１２．０Å、α＝β＝γ＝９０°という単位格子パラメータを有する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔｉｅ−２蛋白の阻害薬候補である化合物の特定方法であって、前記Ｔｉｅ−２蛋白の触媒領域において１以上のサブ部位と相互作用する化合物を前記触媒領域を有するポリペプチドの結晶構造座標に基づいて設計する段階を有し、該化合物がＴｉｅ−２蛋白の阻害薬候補であると特定する、前記方法。
【請求項３７】
前記Ｔｉｅ−２蛋白が哺乳動物Ｔｉｅ−２蛋白である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔｉｅ−２蛋白がヒトＴｉｅ−２蛋白である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｔｉｅ−２蛋白が野生型ヒトＴｉｅ−２である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸８０２〜１１２４を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記結晶構造座標が図３に示したものである請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記結晶構造座標が図４に示したものである請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記結晶構造座標が図５に示したものである請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記結晶構造座標が図６に示したものである請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物がサブ部位１〜９のうちの１以上と相互作用する請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物がサブ部位１〜９のうちの２以上と相互作用する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がサブ部位１〜９のうちの３以上と相互作用する請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物が、サブ部位１およびサブ部位２を含むサブ部位集合と相互作用する請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２およびサブ部位３を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位４およびサブ部位５を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位７およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３、サブ部位７およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３、サブ部位７およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位４、サブ部位６およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３、サブ部位４、サブ部位６およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物が、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３、サブ部位４、サブ部位６およびサブ部位８を含むサブ部位セットと相互作用する請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｕ９０３と相互作用するよう配置された水素結合供与体；
（ｂ）ヒトＴｉｅ−２のＡｌａ９０５と相互作用するよう配置された水素結合受容体；
（ｃ）ヒトＴｉｅ−２のＡｌａ９０５と相互作用するよう配置された水素結合供与体；
（ｄ）ヒトＴｉｅ−２のＩｌｅ８３０、Ｖａｌ８３８、Ａｌａ８５３、Ｉｌｅ８８６、Ｉｌｅ９０２、Ｔｙｒ９０４、Ａｌａ９０５およびＬｅｕ９７１のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；
（ｅ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９１２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；
（ｆ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｎ９０９と相互作用するよう配置された水素結合供与体または水素結合受容体；
（ｇ）ヒトＴｉｅ−２のＶａｌ８３８、Ｌｙｓ８５５、Ｉｌｅ８８６、Ｉｌｅ９０２、Ｌｅｕ９７１およびＡｌａ９８１のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；
（ｈ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ８５５と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；
（ｉ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９８２と相互作用するよう配置された水素結合受容体；
（ｊ）ヒトＴｉｅ−２のＰｈｅ９８３と相互作用するよう配置された水素結合受容体；
（ｋ）ヒトＴｉｅ−２のＬｅｕ８７３、Ｌｅｕ８７６、Ｉｌｅ８８５、Ｉｌｅ８８６、Ｌｅｕ８８８、Ｌｅｕ９００、Ｉｌｅ９０２、Ａｌａ９８１およびＰｈｅ９８３のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；
（ｌ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９８２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；
（ｍ）ヒトＴｉｅ−２のＩｌｅ８８６と相互作用するよう配置された水素結合供与体；
（ｎ）ヒトＴｉｅ−２のＬｅｕ７６８と相互作用するよう配置された水素結合供与体；
（ｏ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｙ８３１と相互作用するよう配置された水素結合受容体；
（ｐ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｕ８３２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；
（ｑ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ８４０と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；
（ｒ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ９１６と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；
（ｓ）ヒトＴｉｅ−２のＡｒｇ９６８と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；
（ｔ）ヒトＴｉｅ−２のＡｒｇ９６８と相互作用するよう配置された水素結合供与体
のうちの２以上を有するＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６０】
（ｂ）および（ｄ）を有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６１】
（ｄ）、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１個を有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６２】
（ｄ）、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個を有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６３】
（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個をさらに有する請求項６２に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６４】
（ｇ）をさらに有する請求項６２に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６５】
（ｇ）をさらに有する請求項６３に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６６】
（ｋ）をさらに有する請求項６４に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６７】
（ｋ）をさらに有する請求項６５に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６８】
（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個をさらに有する請求項６２に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項６９】
（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個をさらに有する請求項６３に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７０】
（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個をさらに有する請求項６６に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７１】
（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個をさらに有する請求項６７に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７２】
前記阻害薬が、少なくとも約１ｍＭのＫｉを有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７３】
前記阻害薬が、少なくとも約１００μＭのＫｉを有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７４】
前記阻害薬が、少なくとも約１０μＭのＫｉを有する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７５】
前記阻害薬が選択的にＴｉｅ−２受容体に結合する請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬。
【請求項７６】
患者におけるＴｉｅ−２依存性状態の治療方法であって、該患者に治療上有効量の請求項５９に記載のＴｉｅ−２阻害薬を投与する段階を有する方法。
【請求項７７】
前記患者がヒトである請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔｉｅ−２依存性状態が過剰血管増殖を特徴とするものである請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｔｉｅ−２依存性状態が、増殖亢進障害、癌、心血管状態、眼球状態、フォンヒッペル−リンダウ病、類天疱瘡、乾癬、ページェット病、腎嚢胞、線維症、サルコイドーシス、肝硬変、甲状腺炎、オスラー−ウェーバー−ランジュ症、慢性炎症、関節滑膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍または敗血症である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記状態が、固形腫瘍、肉腫、線維肉腫、骨腫、メラノーマ、網膜芽腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、奇形癌、造血悪性腫瘍、悪性腹水症、カポジ肉腫、ホジキン病、リンパ腫、骨髄腫および白血病からなる群から選択される癌である請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記状態が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、虚血／再潅流損傷、慢性閉塞性肺疾患、血管閉塞、頸動脈閉塞疾患、クロウ−深瀬（ＰＯＥＭＳ）症候群、貧血、虚血、梗塞および血管漏出障害からなる群から選択される心血管状態である請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記状態が、眼球もしくは黄斑浮腫、眼球血管新生症、強膜炎、放射状角膜切除術、ブドウ膜炎、硝子体炎、近視、視窩、慢性網膜剥離、レーザー処置後合併症、結膜炎、シュタルガルト病、イールズ病、網膜症、黄斑変性および微小血管症からなる群から選択される眼球状態である請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記障害に、異常な内皮−内皮周囲相互作用が関与する請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
患者における受胎能力を低下させる方法であって、該患者に対して、治療上有効量の請求項５９のＴｉｅ−２阻害薬を投与する段階を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、２０００年３月２９日出願の米国暫定特許出願６０／１９２９２０号の恩恵を主張するものである。上記出願の全記載内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
（背景技術）
血管形成は、新たな血管が既存の血管からの内皮細胞による萌芽、分岐、増殖および細管形成によって形成される基本的プロセスである。健常なヒトでは、この血管新生はストリンジェントな制御下にあり、通常は胚発生、子宮内膜調節、泌乳および創傷修復の際にのみ生じる。しかしながら、慢性関節リウマチ、固形腫瘍、カポジ肉腫、眼球血管新生による失明、乾癬およびアテローム性動脈硬化などの多くの病的状態において、疾患進行は持続的な血管形成に依存する。薬物送達のための導管である血管は、身体において最も使いやすい組織の一つである。腫瘍血管の各内皮細胞は、１００〜１０００個の隣接する細胞を指示すると推定されている。しかし、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）刺激がないと、内皮細胞は通常は、３０００日に１回分裂するのみである。
【０００３】
多くのポリペプチド増殖因子およびそれに関連する内皮細胞特異的受容体が発見されており、それらは主として内細胞増殖の刺激、分化および新血管の確立を行う。これらの増殖因子受容体には、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）Ｆｌｋ−１（マウス）、ＫＤＲ／ＶＥＧ−ＦＲ−２（ヒト）、Ｆｌｔ−ｌ／ＶＥＧＦＲ−１およびＦｌｔ−４／ＶＥＧＦＲ−３などがある。新血管形成を起こす受容体には、受容体チロシンキナーゼＴｉｅ−１およびＴｉｅ−２もある。
【０００４】
新血管発達の調節における役割からＴｉｅ−２は、持続的血管形成に依存する疾患の抑制を目的とする治療法における標的となり得る。Ｔｉｅ−２の生化学的アッセイの発達によって、化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングおよび基質構造に似る化合物についての試験実施によって主要なＴｉｅ−２阻害薬を特定する経路とともに、薬剤発見を進めることができるようになった。しかしながら、Ｔｉｅ−２受容体についての正確な３次元構造データがないため、今日に至るまで、合理的な構造に基づく設計はできるようになっていない。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチド、結晶型のそのポリペプチドおよびＴｉｅ−２の触媒領域への１以上の自然リガンドの結合についての可能な阻害薬を設計および／または特定する上での前記結晶型ポリペプチド由来の構造情報の使用に関する。
【０００６】
１実施形態において本発明は、ＴＩＥ−２の触媒領域を有し、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。別の実施形態において本発明は、結晶型のそのポリペプチドまたはリガンドと複合体化した前記ポリペプチドに関する。
【０００７】
別の実施形態において本発明は、Ｔｉｅ−２触媒領域を有する結晶ポリペプチドの３次元構造を決定する方法を提供する。１実施形態において当該方法は、（１）Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチドの結晶を得る段階；（２）前記結晶についてのＸ線回折データを得る段階；および（３）前記結晶の結晶構造を解く段階を有する。
【０００８】
前記方法には、前記ペプチドの結晶を得る前に、決定すべき３次元構造を有するポリペプチドを得る別の段階があっても良い。
【０００９】
別の実施形態において前記方法は、（１）Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチドの結晶を得る段階；（２）前記結晶についてのＸ線回折データを得る段階；および（３）前記Ｘ線回折データおよび第２のポリペプチドのＴｉｅ−２触媒領域についての原子座標を用いることで、前記結晶の結晶構造を解く段階を有する。前記方法には、前記ペプチドの結晶を得る前に、決定すべき３次元構造を有するポリペプチドを得る別の段階があっても良い。
【００１０】
本発明はさらに、Ｔｉｅ−２の触媒領域へのチロシンポリペプチドまたは蛋白またはＡＴＰなどの天然基質の結合を阻害することで、Ｔｉｅ−２の触媒活性を阻害する化合物を特定する方法に関する。そのような化合物は本明細書においては、「Ｔｉｅ−２阻害薬」と称する。当該方法は、（１）Ｔｉｅ−２の触媒領域の原子座標によって規定されるＴｉｅ−２の３次元構造を用いる段階；（２）前記３次元構造を用いて、阻害薬候補を設計または選択する段階；および（３）選択された化合物のＴｉｅ−２の触媒活性を阻害する能力を評価する段階を有する。前記方法は、段階２で設計または選択される化合物を合成することで、あるいは化合物ライブラリーからその化合物を得ることで、その化合物を提供する段階を有することもできる。さらに前記方法には、特定された化合物がＴｉｅ−２の触媒領域に結合する能力を評価する段階および／または特定された化合物のＴｉｅ−２の天然リガンドの結合を阻害する能力を評価する段階を有することができる。
【００１１】
別の実施形態において、Ｔｉｅ−２の触媒活性を阻害する化合物を特定する前記方法は、前記Ｔｉｅ−２触媒領域に存在するかそれに結合している場合に、前記化合物の１以上の官能基および／または部分が前記Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用する能力を測定する段階を有する。前記Ｔｉｅ−２触媒領域は、他の公知のチロシンキナーゼと比較して保存された相同配列によって規定される。前記化合物が所定数または１組のサブ部位と相互作用できる場合、あるいは望ましいまたは所定の範囲内の計算相互作用エネルギーを有する場合、その化合物はＴｉｅ−２阻害薬候補であると特定される。
【００１２】
本発明はさらに、Ｔｉｅ−２の触媒活性の阻害薬候補である化合物を設計する方法を提供する。この方法は、（１）Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用することができる１以上の官能基を特定する段階；ならびに（２）Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用する上で好適な配置で段階１で特定された官能基を与える足場を特定する段階を含む。前記特定された足場への前記特定された官能基または部分の結合によって生じる化合物は、Ｔｉｅ−２の阻害薬候補である。前記Ｔｉｅ−２触媒領域は、Ｔｉｅ−２触媒領域を有するポリペプチドの原子座標によって規定される。
【００１３】
さらに別の実施形態において本発明は、Ｔｉｅ−２の触媒活性を阻害し、Ｔｉｅ−２触媒領域に適合または結合する化合物を提供する。そのような化合物は代表的には、その化合物がＴｉｅ−２触媒領域に結合すると、その触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用する１以上の官能基を有する。Ｔｉｅ−２触媒領域は、他の公知のチロシンキナーゼと比較して保存された相同配列によって規定される。特定の実施態様においてＴｉｅ−２阻害薬は、本発明の方法によって特定または設計される化合物である。
【００１４】
本発明はさらに、患者におけるＴｉｅ−２介在状態を治療する方法を提供する。その方法は、本発明のＴｉｅ−２阻害薬、例えば、本発明の方法によってＴｉｅ−２阻害薬と特定された化合物またはＴｉｅ−２を阻害するよう設計された化合物などの、Ｔｉｅ−２の触媒活性を阻害する治療上もしくは予防上有効量の化合物を患者に投与する段階を有する。
【００１５】
本発明は、いくつかの利点を提供するものである。例えば本発明は、Ｔｉｅ−２蛋白のリガンド結合領域の第１の詳細な３次元構造を提供する。本明細書に記載の方法を用いて、高分離能で回折するＴｉｅ−２結晶の形成を可能にすることができる。それらの構造によって、Ｔｉｅ−２結合領域への結合を促進する特徴を有する分子構造の設計および／または特定が可能となることで、Ｔｉｅ−２阻害薬の合理的開発が可能となる。従って、本明細書に開示の構造を使用方法によって、少なくとも部分的にＴｉｅ−２活性が介在する状態の治療において有用となり得る化合物のより迅速な発見が可能となる。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトＴｉｅ−２のアミノ酸配列（配列番号１）を表す図である。
【００１７】
図２は、アミノ酸８０２からアミノ酸１１２４のヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有し、アミノ酸９６４に触媒不活性な点変異を有するアミノ酸配列（配列番号２）を表す図である。
【００１８】
図３Ａ〜３ＯＯは、配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【００１９】
図４Ａから４ＯＯは、配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【００２０】
図５Ａ〜５ＲＲは、配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【００２１】
図６Ａ〜６ＮＮは、配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【００２２】
図７は、原型キナーゼであるインシュリン受容体キナーゼの構造を示す図である。
【００２３】
図８は、Ｔｉｅ−２の触媒領域と相互作用するピロロピリミジン阻害薬（すなわち、阻害薬Ｉ）の領域を示す図である。
【００２４】
図９は、阻害薬Ｉに結合したＴｉｅ−２の触媒領域のモデルを示す図である。サブ部位は、異なった色で示してある。
【００２５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチドのＸ線結晶学的試験に関する。この試験から得られる原子座標は、触媒領域で適合することから、Ｔｉｅ−２の阻害薬候補となる化合物を特定する上で有用である。そのＴｉｅ−２阻害薬は、Ｔｉｅ−２活性によって調節されるかそれに依存する状態、例えば持続的血管形成に依存する状態を有する患者の治療方法において有用である。
【００２６】
蛋白キナーゼとしては少なくとも４００種類の酵素が特定されている。これらの酵素は、標的蛋白基質のリン酸化を触媒する。そのリン酸化は通常、ＡＴＰから蛋白基質へのリン酸基の転位反応である。リン酸が転位する標的基質における特異的構造は、チロシン、セリンまたはトレオニン残基である。それらのアミノ酸残基はリン酸転位における標的構造であることから、それらの蛋白キナーゼ酵素は通常、チロシンキナーゼまたはセリン／トレオニンキナーゼと称される。
【００２７】
チロシン、セリンおよびトレオニン残基でのリン酸化反応および対抗作用のホスファターゼ反応が、多様な細胞内信号に対する応答（代表的には細胞受容体が介在）、細胞機能の調節ならびに細胞プロセスの活性化または失活の基礎となる無数の細胞プロセスにおいて関与している。細胞内信号伝達には一連の蛋白キナーゼが関与しており、それらの細胞プロセスを行う上で必要である。それらのプロセスにおいて遍在することから蛋白キナーゼは、原形質膜の重要な部分として、または細胞質酵素として、あるいは多くの場合酵素複合体として核に局在しているものと見ることができる。多くの場合、それらの蛋白キナーゼは、細胞プロセスが細胞内のどこで何時起こるかを決定する酵素および構造蛋白複合体の必須要素である。
【００２８】
蛋白チロシンキナーゼ
蛋白チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、細胞蛋白における特定のチロシン残基のリン酸化を触媒する酵素である。これらの基質蛋白、多くの場合酵素自体のこの翻訳後修飾は、細胞の増殖、活性化または分化を調節する分子スイッチとして作用する（総覧については、シュレジンジャーらの報告（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｒｉｃｈ， １９９２， Ｎｅｕｒｏｎ ９： ３８３−３９１）参照）。良性および悪性の増殖性障害ならびに免疫系の不適切な活性化（例：自己免疫障害）、同種異系移植片拒絶反応および移植片対宿主病から生じる疾患などの多くの疾患状態において、ＰＴＫ活性の異常または過剰が認められている。さらに、ＫＤＲおよびＴｉｅ−２などの内皮細胞特異的受容体ＰＴＫは、血管形成プロセスに介在することから、不適切な血管形成（例：糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性による脈絡膜血管新生、乾癬、慢性関節リウマチ、未熟児網膜症、幼児性血管腫、乾癬およびアテローム性動脈硬化）が関与する他の疾患の進行支持に関与する。
【００２９】
チロシンキナーゼは、受容体型（細胞外領域、膜横断領域および細胞内領域を有する）または非受容体型（全て細胞内）であることができる。
【００３０】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）
ＲＴＫは、多様な生理活性を有する大きい膜横断受容体ファミリーを含む。現在のところ、少なくとも１９種類の異なるＲＴＫサブファミリーが特定されている。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーには、各種細胞型の成長および分化に必須の受容体が含まれる（Ｙａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７： ４３３−４７８， １９８８； Ｕｌｌｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｃｅｌｌ， ６１： ２４３−２５４， １９９０）。ＲＴＫの固有の機能は、リガンド結合時に活性化され、それによって受容体および複数の細胞基質のリン酸化と、それに続いて各種の細胞応答が生じる（Ｕｌｌｒｉｃｈ ＆ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， １９９０， Ｃｅｌｌ ６１： ２０３−２１２）。従って、受容体チロシンキナーゼ介在信号伝達は、特異的成長因子（リガンド）との細胞外相互作用によって開始し、代表的にはそれに受容体二量化、固有蛋白チロシンキナーゼ活性の刺激および受容体リン酸基転移が続く。それによって、結合部位が細胞内信号伝達分子に対して作られ、多様な細胞質信号伝達分子との複合体形成が生じて、それが適切な細胞応答を促進する（例：細胞分裂、分化、代謝効果、細胞外微小環境の変化）（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ， １９９２， Ｎｅｕｒｏｎ ９： １−２０参照）。
【００３１】
ＳＨ２８（ｓｒｃ相同−２）またはホスホチロシン結合（ＰＴＢ）領域を有する蛋白は、高親和性で活性化チロシンキナーゼ受容体およびそれらの基質に結合することで、細胞内に信号を伝達させる。これらのいずれの領域も、ホスホチロシンを認識する（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｃｅｌｌ ６９： ４１３−４２３； Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４： ２７７７−２７８５； Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２： ７６７−７７８； Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２： ６６８−６７８； Ｓｈｏｅｌｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． （１９９７）， １（２）， ２２７−２３４； ａｎｄ Ｃｏｗｂｕｒｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． （１９９７）， ７（６）， ８３５−８３８）。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を伴ういくつかの細胞内基質蛋白が特定されている。それらは、２つの主要群、すなわち（１）触媒領域を有する基質；ならびに（２）そのような領域を持たないが、アダプターとして作用し、触媒活性分子を伴う基質に分類することができる（Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２： ７６７−７７８）。受容体もしくは蛋白とＳＨ２もしくはＰＴＢ領域との間の相互作用の特異性は、リン酸化チロシン残基を直接取り囲むアミノ酸残基によって決まる。例えば、ＳＨ２領域と特定受容体上のホスホチロシン残基を囲むアミノ酸配列との間の結合親和力における差が、それの基質リン酸化プロファイルで認められる差と相関している（Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７２： ７６７−７７８）。観察から、各受容体チロシンキナーゼの機能は、それの発現パターンおよびリガンド利用性だけでなく、特定の受容体によって活性化される下流信号伝達経路の配列ならびにそれらの刺激のタイミングおよび期間によっても決まることが示唆されている。従ってリン酸化によって、特定の成長因子受容体ならびに分化因子受容体が招集する信号伝達経路の選択性を決定する重要な調節段階が提供される。
【００３２】
ＦＧＦＲ−１、ＰＤＧＦＲ、ＴＩＥ−２およびｃ−Ｍｅｔなどのいくつかの受容体チロシンキナーゼならびにそれに結合する増殖因子が、血管形成で何らかの役割を果たすことが示唆されている。ただしいくつかは間接的に血管形成を促進することができる（Ｍｕｓｔｏｎｅｎ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２９： ８９５−８９８， １９９５）。
【００３３】
Ｔｉｅ−２（ＴＥＫ）は、血管の分岐、萌芽、再建、成熟および安定性などの必須の血管由来プロセスに関与する内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼの最近発見されたファミリーの１構成員である。Ｔｉｅ−２は、作働薬リガンド（例：受容体自己リン酸化および信号伝達を刺激するアンギオポイエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）１（「Ａｎｇ１」））および拮抗薬リガンド（例：アンギオポイエチン２（「Ａｎｇ２」））の両方が特定されている最初の哺乳動物受容体チロシンキナーゼである。Ｔｉｅ−２およびそれのリガンドの発現のノックアウトおよびトランスジェニック操作は、Ｔｉｅ−２信号伝達の厳格な空間的・時間的制御が新血管の適切な発達において必須であることを示している。現在のモデルは、Ａｎｇ１リガンドによるＴｉｅ−２キナーゼの刺激が、新血管の分岐、萌芽および成長、ならびに血管の完全性維持および休止誘発において重要な内皮周囲支持細胞の招集および相互作用に直接関与することを示唆している。Ｔｉｅ−２のＡｎｇ１刺激の不在または血管退化部位で高レベルで産生されるＡｎｇ２によるＴｉｅ−２自己リン酸化の阻害は、特に成長／生存刺激がない場合に、血管構造および血管構造およびマトリクス接触の損失を生じることで、内皮細胞死を起こす可能性がある。しかしながら、最近少なくとも２種類の別のＴｉｅ−２リガンド（Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）が報告されており、各種作働性および拮抗性アンギオポイエチン類のヘテロオリゴマー化能力によるそれらの活性変化が示されていることから、状況はより複雑である。従って、抗血管形成の治療手法としてＴｉｅ−２リガンド−受容体相互作用を標的とすることはあまり好ましくなく、キナーゼ阻害戦略が好ましい。
【００３４】
Ｔｉｅ−２の可溶性細胞外領域（「ＥｘＴｅｋ」）は、乳房腫瘍異種移植片および肺転位モデルならびに腫瘍細胞介在眼球血管新生における腫瘍血管の確立を障害する作用を行うことができる。アデノウィルス感染によって、齧歯類におけるｍｇ／ｍＬレベルのＥｘＴｅｋのｉｎ ｖｉｖｏ産生を、７〜１０日間にわたり、有害副作用なく行うことができる。この結果は、正常な健常動物におけるＴｉｅ−２信号伝達経路の障害が十分に耐容され得ることを示唆している。それらのＥｘＴｅｋに対するＴｉｅ−２阻害応答は、リガンドの捕捉および／または全長Ｔｉｅ−２を有する非生産性ヘテロダイマーの生成の結果であり得よう。
【００３５】
最近、Ｔｉｅ−２発現の大幅な上昇が、ヒトの関節炎関節の血管滑液パンヌス内であり、不適切な血管新生における役割と一致していることが認められている。この知見は、Ｔｉｅ−２が慢性関節リウマチの進行において何らかの役割を果たすことを示唆している。構成的活性化型のＴｉｅ−２を産生する点変異が、ヒト静脈奇形障害に関連していることが特定されている。従ってＴｉｅ−２阻害薬は、そのような障害の治療ならびに不適切な血管新生の他の状況において有用である。
【００３６】
本明細書における実施例は、ヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチドの製造および結晶化について説明するものである。本明細書で使用される「触媒領域」という用語は、チロシン結合部位、金属イオン結合領域などのＡＴＰが結合する部位およびリン酸転位が起こる部位などのＡＴＰに結合する全てのキナーゼに共通の特異的モジュールを指す。Ｔｉｅ−２の場合に触媒領域は、配列番号１の約残基８２８〜約残基９８５のアミノ酸残基によって規定され、残基８２８〜８４０、８５３〜８５５、８７２、８７３、８７６、８７９、８８０、８８５〜８８８、９００、９０２〜９０９、９１２、９５４、９５５、９６０、９６４、９６８〜９７１および９８０〜９８５がその触媒領域に含まれる。
【００３７】
天然ヒトＴｉｅ−２（配列番号１）のアミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴで定義の方法に従う（Ｚｉｅｇｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８： ６６３ （１９９３））。実施例に記載のように、これら結晶のある種のものをＸ線結晶学検査によって調べ、そのペプチドにおける原子座標を得た。ある種の場合には、ポリペプチドが連結しなかった。すなわちリガンドと複合体形成しなかった。他の場合には、ポリペプチドがリガンドと複合体形成して、Ｔｉｅ−２触媒領域に結合したリガンドの原子座標も得られた。
【００３８】
Ｔｉｅ−２は、自己リン酸化および他の蛋白によるリン酸基転移を受ける。リン酸化状態は、検討すべき特に重要な翻訳後修飾である。配列番号１の残基８０２〜１１２４を有する野生型構築物（すなわち、Ｄ９６４Ｎ変異を持たない）を、単一リン酸化または複数リン酸化物として、発現系から単離した。ある単一リン酸化物は、Ｙ８９７またはＹ８９９のいずれかにリン酸基を有する。複数リン酸化物では、リン酸化は、蛋白上の多くのＹ残基の組み合わせによって生じ得る。２リン酸化物は、空間群Ｐ２（１）２（１）２（１）で結晶化し、単位格子サイズはａ＝５４．３２０Å、ｂ＝７５．８７２Å、ｃ＝７８．１４３Åおよびα＝β＝γ＝９０．０°であった。「空間群」という用語は、結晶の単位格子の対称要素の集合を指す業界用語である。他のリン酸化部位については、ジョーンズらの報告に記載されている（Ｊｏｎｅｓ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９９）， ２７４ （４３）： ３０８９６）。
【００３９】
ヒトＴｉｅ−２の触媒不活性突然変異体（配列番号２）も結晶化した。その触媒不活性突然変異体は、野生型ヒトＴｉｅ−２ではアスパラギン酸である残基９６４がアスパラギンに置き換わっている以外、ヒトＴｉｅ−２の残基８０２〜１１２４と同じ配列を有していた。この置換によって、突然変異体は触媒不活性となった。配列番号２は、空間群Ｃ２２２（１）で結晶化し、その場合の単位格子サイズはａ＝７５．１９５Å、ｂ＝１１６．２８７Å、ｃ＝９５．０６０Åおよびα＝β＝γ＝９０．０°であった。
【００４０】
Ｘ線結晶学検査によって調べたＴｉｅ−２／リガンド複合体の４種類の結晶の原子座標を図３Ａ〜３ＯＯ、４Ａから４ＯＯ、５Ａ〜５ＲＲおよび６Ａ〜６ＮＮに示してある。「原子座標」（または「構造座標」）という用語は、Ｔｉｅ−２触媒領域分子を含む結晶ポリペプチドの原子（散乱中心）によるＸ線回折で得られたパターンに関する数式から誘導される数学的座標を指す。その回折データを用いて、結晶の繰り返し単位の電子密度マップを計算する。その電子密度マップを用いて、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確定する。原子座標を当業界で公知のように変換して、原子の相対的位置に影響を与えずに、異なる座標系とすることができる。
【００４１】
詳細には、以下に示す４種類の異なる阻害薬のうちの１種類と複合体形成した配列番号２について、４種類の高解像度結晶構造が得られた。
【００４２】
【化９】
2004514405.tif 000002
2004514405.tif 000003
【００４３】
ヒトＴｉｅ−２の触媒領域である配列番号２についてのＸ線結晶構造決定の結果は、以下の特徴を示した。
【００４４】
全体構造は、Ｎ末端葉部および相対的に若干大きいＣ末端葉部を有する認識可能なキナーゼ折畳部を持っていた。ＡＴＰ結合は、２個の葉部の境界部にあり、その領域で阻害薬が結合した。Ｎ末端葉部の主要な第２の構造要素は、５本鎖β−シートおよび長いα−ヘリックスであった。Ｃ末端葉部は主として、Ｎ末端葉部との境界部付近に短い２本鎖β−シートを有するα−ヘリックスの束であった。図７は、原型受容体チロシンキナーゼであるインシュリン受容体キナーゼを示してあり、公知のキナーゼに関連する構造的特徴を強調している。図９に示したＴｉｅ２の触媒領域の構造は、それと同様の特徴を有している。
【００４５】
蝶番領域は、Ｎ末端葉部とＣ末端葉部とを連結している。ＡＴＰ／阻害薬結合領域の一部を形成する蝶番の部分は、いくつかの水素結合相手を提供する。Ｅ９０３、Ａ９０５およびＰ９０６のカルボニル酸素原子ならびにＡ９０５、Ｈ９０７およびＧ９０８の骨格アミドプロトンが、ポケット内に入っていた。Ｌ９００、Ｉ９０２、Ｙ９０４およびＡ９０５の側鎖は、結合ポケットの大きさ、形状および性質を決定する上で役立つものであった。
【００４６】
プリン核結合領域は、蛋白のＮ末端葉部とＣ末端葉部が共同して、他のキナーゼ構造のＡＴＰのプリン環についての従来の位置である平坦で主として疎水性の結合領域を形成している領域であった。この領域に寄与する残基には、Ｉ８３０、Ａ８５３、Ｖ８３８、Ｉ８８６、Ｌ９７１およびＡ９８１などがあった。蝶番領域における残基の側鎖Ｉ９０２、Ｙ９０４およびＡ９０５も、この領域への疎水性特性に寄与していた。Ｉ８３０のカルボニル酸素およびＶ８３８のアミドプロトンも、この領域内で相互作用部位を提供していた。
【００４７】
公知のキナーゼ構造から類推して、ＡＴＰのリボース環は、延長糖ポケットと称されるＮ末端葉部におけるＧ８３１とＣ末端葉部におけるＮ９０９との間の領域を従来のように占有していよう。Ｇ８３１、Ｅ８３２およびＮ９０９の骨格アミドプロトン、Ｒ９６８のカルボニル酸素およびＥ８３２、Ｎ９０９およびＤ９１２の側鎖は、水素結合相手を提供していた。
【００４８】
公知のキナーゼ構造から類推して、ＡＴＰのγ−リン酸基は、残基Ｄ９６４（触媒不活性突然変異体におけるＮ９６４、配列番号２）の側鎖周囲の領域を占有していよう。Ｒ９６８の側鎖も、その領域に寄与する。支配的で利用可能な相互作用型は水素結合であり、非常に複雑な配位座が可能であった。
【００４９】
ヌクレオチド結合ループまたはグリシン豊富ループは、ＡＴＰ結合領域の正面部分を覆うＮ末端葉部における翼状のループであった。他の結合領域ではまだ記載されていない残基には、Ｄ８２８、Ｖ８２９、Ｇ８３３、Ｎ８３４、Ｆ８３５、Ｇ８３６、Ｑ８３７、Ｌ８３９およびＫ８４０などがあった。残基Ｉ８３０、Ｇ８３１、Ｅ８３２およびＶ８３８もこの構造要素の一部であったが、上記の他の結合領域にすでに含まれていた。このループは通常、非常に可撓性が高いと考えられており、ＡＴＰ結合領域の形状および大きさを変えることができる。カルボニル酸素原子、Ｎ８３４側鎖原子ならびにＧ８３３、Ｎ８３４およびＦ８３５の骨格アミドプロトンは、水素結合に利用可能である可能性があった。Ｄ８２８およびＫ８４０の側鎖原子は、イオン／水素結合相互作用に利用可能であった。Ｖ８２９、Ｉ８３０、Ｆ８３５およびＬ８３９の側鎖原子は、疎水性相互作用に寄与し得る。
【００５０】
早期活性化ループは、少なくとも１個の残基を有する長い可撓性のループであり、そのリン酸化が蛋白の活性化状態を決定すると考えられている。そのループは、ＡＴＰ結合部位で開始し、基質結合に相当する可能性が最も高い領域におけるＣ末端葉部で終了する。残基Ｆ９８３、Ｇ９８４およびＬ９８５は、ＡＴＰ結合部位の一部を形成しており、やはり活性化ループのＮ末端側にあった。Ｆ９８３およびＧ９８４のカルボニル酸素およびアミドプロトンならびにＬ９８５のアミドプロトンは水素結合に利用可能であり、Ｆ９８３およびＬ９８５の側鎖は、疎水性相互作用に寄与し得る。
【００５１】
公知のキナーゼと類似して、Ｋ８５５はキナーゼの触媒機序の一部である。アミノ基はイオン相互作用または水素結合相互作用に関与し得るものであり、メチレン基は疎水性相互作用に寄与し得る。その側鎖は非常に移動性が高い。
遠位疎水性ポケットは、埋め込まれた疎水性腔部を特徴とする。ＡＴＰ結合領域のこの部分は、公知のキナーゼ構造におけるＡＴＰ原子によっては占有されない。このポケットに寄与する残基には、Ｌ８７３、Ｌ８７６、Ｌ８７９、Ｉ８８５、Ｌ８８８、Ｙ９５４、Ｌ９５５、Ｆ９６０およびＩ９８０などがある。前述の領域からのＩ８８６、Ａ９８１およびＦ９８３も、その領域に対する疎水性相互作用に寄与する。さらに、この領域で利用可能な多くの骨格水素結合相手があった。それらの相手には、Ｉ８８６、Ｌ８７９およびＧ８８０のカルボニル酸素原子などがあった。α−Ｃヘリックスの明らかな破壊により、Ｅ８７２、Ｌ８７３およびＬ８７６のカルボニル酸素原子も利用可能である。残基Ｉ８８６およびＬ８８８の骨格アミドプロトンも、この領域で利用可能であった。
【００５２】
いくつかの残基がＡＴＰ／阻害薬結合部位に寄与していたが、規定可能なサブ領域の一部であるようには思われない。これらの残基は、Ｉ８５４、Ｅ８７２、Ｎ８８７、Ｉ９７０およびＩ９８０である。Ｅ８７２は多くの場合、公知のキナーゼ構造における触媒性リジンとのイオン性相互作用を形成する。Ｎ８８７は、遠位疎水性ポケットに寄与し得る。Ｉ８５４およびＩ９７０の側鎖は、ＡＴＰポケットの方向に向いていない。しかしながら、これら残基ならびにＩ９８０からのカルボニル酸素原子が、結合領域に向かって提供されていた。
【００５３】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の構造は、以下の特徴を有していた。
【００５４】
構造の最終解像度は、空間群Ｃ２２２１で２．８Åであり、残基８１８〜８５７、８６４〜９９５、１００１〜１１１６の骨格原子について決定された最終配位座を有していた。
【００５５】
阻害薬Ｉのピロロピリミジン環は蝶番領域における残基に対して水素結合を形成しており、プリン核領域と相互作用する。その阻害薬の核は、Ｅ９０３のカルボニル酸素に対する４−ＮＨ２置換基のアミノプロトンの形で水素結合供与体を提供していた。ピリミジン環の原子Ｎ３は、Ａ９０５の骨格Ｎ−Ｈからの水素結合を受容していた。この核の環系は、Ｃ末端葉部とＮ末端葉部の両方の残基に対して平面を提供していた。これらの領域における残基は、阻害薬の平面核を「挟持する」疎水性表面を提供する。この疎水性挟持領域に関与する残基には、Ｉ８３０、Ｖ８３８、Ｉ８６、Ｉ９０２およびＬ９７１などがある。阻害薬核の原子Ｎ１およびＮ７は、結合ポケットの溶媒露出口に向いていた。阻害薬の原子Ｃ６は、蛋白のＮ末端葉部のヌクレオチド結合ループの長軸に向いていた。
【００５６】
阻害薬ＩのＮ７シクロペンタン環は、溶媒の方向に向いていたが、依然蛋白腔部内にあった。この領域については、延長糖ポケットとして前述した。この領域は、主としてＩ８３０およびＬ９７１との疎水性相互作用を特徴としていた。Ｅ８３２のメチレン基も、このように寄与し得る。
【００５７】
ピロロピリミジン環のＣ５に結合したフェニル環は、プリン核領域からの残基、遠位疎水性ポケットおよび触媒性リジンＫ８５５からのメチレン基によって形成された主として疎水性の領域内にあった。疎水性接触は、残基Ｖ８３８、Ｉ８８６、Ｉ９０２、Ｌ９７１およびＡ９８１によるものであった。リジン８５５は非常に移動性が高いことから、ピロロピリミジン環に対してメタ位の塩素原子が水素結合を受けることも可能であった。
【００５８】
スルホンアミドリンカーは、Ｄ９８２のアミドプロトンと明瞭な水素結合を形成しており、Ｆ９８３のアミドプロトンと水素結合を形成することもできる。
【００５９】
末端フェニル環は、遠位疎水性ポケットにあった。一次接触は、Ｌ８７６、Ｉ８８６、Ｌ８８８およびＦ９８３によるものであった。
【００６０】
配列番号２／阻害薬ＩＩ、配列番号２／阻害薬ＩＩＩおよび配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の構造は、以下の特徴を有していた。
【００６１】
残基８１８〜８５７、８６４〜９９５、１００１〜１１１６は、解明された構造にモデル化されている。空間群Ｐ４２２１２が認められた。折畳部全体がなお、標準的なキナーゼ触媒領域折畳部にあり、配列番号２／阻害薬Ｉについて前述の結合領域がなおも関係している。
【００６２】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体における阻害薬ＩＩのピロロピリミジン核、Ｂ環、リンカーおよびＣ環は、阻害薬Ｉと同じように結合していた。さらに、Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は、延長糖ポケットを占有しており、Ｄ９１２と強力なイオン性相互作用を形成していた。
【００６３】
阻害薬ＩＩＩのピロロピリミジンは、複合体における配列番号２／阻害薬ＩＩＩにおいて、阻害薬Ｉと同じように結合していた。Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は、配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の場合と同様に、延長糖ポケットを占有しており、Ｄ９１２と強力なイオン性相互作用を形成していた。Ｂ環は、阻害薬Ｉと同じように結合していた。しかしながら、ハロゲン類（この場合はフッ素）とＫ８５５との間の水素結合がより明瞭であった。スルホンアミドリンカーのスルホニル酸素は、Ｄ９８３およびＦ９８３の骨格アミドプロトンに対して明瞭な２個の水素結合を形成していた。Ｃ環は、Ｌ８７６、Ｉ８８６、Ｌ８８８、Ｌ９００、Ｉ９０２およびＦ９８３由来の主要な相互作用を有する遠位疎水性ポケットを占有していた。
【００６４】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体における阻害薬ＩＶのピロロピリミジン核は、阻害薬Ｉと同じように結合していた。Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は、延長糖ポケットを占有し、配列番号２／阻害薬ＩＩの場合と同様に、Ｄ９１２と強力なイオン性相互作用を形成する。Ｂ環は、阻害薬Ｉと同じように結合する。しかしながら、阻害薬ＩＶにおいて可能な水素結合相手として働くハロゲン原子はない。リンカーの酸素原子は触媒性リジンＫ８５５からの水素結合を受容していた。阻害薬ＩＶのＣ環は、Ｌ８７６、Ｉ８８６、Ｉ９０２およびＦ９８３由来の主要な相互作用を有する遠位疎水性ポケットを占有していた。
【００６５】
Ｔｉｅ−２触媒領域の３次元構造の解析は、多くのサブ部位の存在を示しており、その各サブ部位は阻害薬の相補部位と相互作用することができる分子官能基を含む。Ｔｉｅ−２触媒領域のサブ部位１〜９を以下で定義する。各サブ部位に存在する化学部分の特性を以下にまとめてある。サブ部位は、それが相補的であるか、あるいは相互作用することができる化学部分の特性に従って、以下のように特徴付けられる。そのような部分には、水酸基、アミノ、エーテル、チオエーテル、カルボキシル、Ｐ＝Ｏおよびカルボニル基などの水素結合受容体；フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子などのハロゲン原子；ならびに３価リン原子、２価および４価硫黄原子、酸素原子および窒素原子を含む基などの少なくとも１つの孤立電子対を有するヘテロ原子などの他の基；水酸基、チオール、アミドプロトン、アミンプロトン、カルボン酸基および水素原子が結合する水素原子受容体の名称で挙げられるいずれかの基などの水素結合供与体；直鎖、分岐もしくは環状のアルキル基、エーテル基またはチオアルキル基などの疎水性基；直鎖、分岐もしくは環状のアルケニル基；直鎖、分岐もしくは環状のアルキニル基；単環式および多環式の芳香族炭化水素基ならびに単環式および多環式の芳香族ヒドロカルビル基ならびに単環式および多環式の複素環基もしくはヘテロアリール基などのアリール基；１級、２級、３級および４級アンモニウム基、イミダゾリウムおよび他のプロトン化ヘテロアルキルおよびヘテロアリール部分、置換および未置換のグアニジニウム基、スルホニウム基およびホスホニウム基などの正電荷を有する基；ならびにカルボン酸イオン、フェノレート、チオレート、スルホンアミド、スルファミン酸イオン、ボロン酸イオン、バナジウム酸イオン、スルホン酸イオン、スルフィン酸イオン、ホスフィン酸イオン、テトラゾレートおよび他のヘテロアリールアニオン、複素環Ｎ−オキサイドおよびリン酸基などの負電荷を有する基などがあり得る。特定の化学部分は、これらの基の１以上を含むことができる。
【００６６】
サブ部位１：蝶番領域
水素受容体：残基Ｅ９０３、Ａ９０５およびＰ９０６の骨格カルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００６７】
水素供与体：残基Ａ９０５、Ｈ９０７およびＧ９０８の骨格アミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００６８】
疎水性基：Ｌ９００、Ｉ９０２、Ｙ９０４およびＡ９０５の側鎖が疎水性基を提供する。
【００６９】
サブ部位２：プリン核結合領域
疎水性基：残基Ｉ８３０、Ａ８５３、Ｖ８３８、Ｉ８８６、Ｌ９７１、Ａ９８１および残基Ｉ９０２、Ｙ９０４およびＡ９０５の側鎖が疎水性基を提供する。
【００７０】
水素受容体：Ｉ８３０のカルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００７１】
水素供与体：Ｖ８３８のアミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００７２】
サブ部位３：延長糖ポケット
水素受容体：Ｒ９６８の骨格カルボニル酸素およびＥ８３２、Ｎ９０９およびＤ９１２の側鎖カルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００７３】
水素供与体：Ｇ８３１、Ｅ８３２およびＮ９０９の骨格アミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００７４】
サブ部位４：拡張γ−リン酸領域
水素結合基：残基Ｄ９６４（触媒的に不活性な突然変異体におけるＮ９６４）、Ｎ９６９およびＤ９８２が、プロトン供与体基およびプロトン受容体基の両方を提供する。
【００７５】
サブ部位５：ヌクレオチド結合ループ
水素受容体：残基Ｎ８３４の側鎖のカルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００７６】
水素供与体：残基Ｇ８３３、Ｎ８３４およびＦ８３５の骨格アミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００７７】
正電荷基：Ｋ８４０の側鎖が正電荷部位を提供する。
【００７８】
負電荷基：Ｄ８２８の側鎖が負電荷部位を提供する。
【００７９】
疎水性基：Ｖ８２９、Ｉ８３０、Ｆ８３５およびＬ８３９の側鎖が疎水性基を提供する。
【００８０】
サブ部位６：早期活性化ループ
水素受容体：残基Ｆ９８３およびＧ９８４の骨格カルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００８１】
水素供与体：残基Ｆ９８３、Ｇ９８４およびＬ９８５の骨格アミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００８２】
疎水性基：Ｆ９８３およびＬ９８５の側鎖が疎水性基を提供する。
【００８３】
サブ部位７：触媒性リジン
正電荷基：Ｋ８５５の側鎖が正電荷部位を提供する。
【００８４】
疎水性基：Ｋ８５５の側鎖のメチレン基が疎水性基を提供する。
【００８５】
サブ部位８：遠位疎水性ポケット
疎水性基：残基Ｌ８７３、Ｌ８７６、Ｌ８７９、Ｉ８８５、Ｌ８８８、Ｙ９５４、Ｌ９５５、Ｆ９６０、Ｉ９８０、Ｉ８８６、Ａ９８１およびＦ９８３が疎水性基を提供する。
【００８６】
水素受容体：残基Ｉ８８６、Ｌ８７９、Ｇ８８０、Ｅ８７２、Ｌ８７３およびＬ８７６の骨格カルボニル酸素がプロトン受容体を提供する。
【００８７】
水素供与体：残基Ｉ８８６およびＬ８８８の骨格アミドプロトンがプロトン供与体を提供する。
【００８８】
サブ部位９：ＡＴＰ結合部位に寄与するその他相互作用部位
水素受容体：残基Ｉ８５４、Ｉ９７０およびＩ９８０の骨格カルボニル酸素がＡＴＰ結合領域におけるプロトン受容体を提供する。
【００８９】
負電荷基：Ｅ８７２が、多くの場合で触媒性リジン残基Ｋ８５５とイオン性結合を形成する負電荷基を提供する。
【００９０】
図９は、阻害薬Ｉに結合したＴｉｅ−２の触媒領域のモデルを提供する。触媒領域のサブ部位１〜９はそれぞれ、下記のように異なる色で描いてある。すなわち、蝶番領域（暗青色）、プリン核（明青色）、延長糖ポケット（明紫色）、γ−リン酸領域（暗黄色）、ヌクレオチド結合ループ（赤）、早期活性化ループ（暗緑色）、触媒性リジン（明緑色）、遠位疎水性ポケット（暗紫色）およびその他相互作用部位（褐色）である。阻害薬は、明黄色で描いてある。
【００９１】
１実施形態において本発明は、Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチド、リガンドと複合体形成していても良い結晶型のそれらポリペプチド、ならびにＴｉｅ−２触媒領域の３次元構造を含む前記ポリペプチドの３次元構造を提供する。それらの３次元構造は、ポリペプチドのＸ線結晶学的試験から誘導される原子座標によって規定される。触媒領域は、未リン酸化、モノリン酸化または多リン酸化されていることができる。リン酸化は代表的には、チロシン残基で起こる。あるモノリン酸化体は、Ｙ８９７またはＹ８９９上にリン酸基を有する。
【００９２】
前記ポリペプチドは、酵母その他の単細胞生物、無脊椎動物または脊椎動物などのあらゆる生物種からのＴｉｅ−２の触媒領域を含むことができる。好ましくは前記ポリペプチドには、マウスＴｉｅ−２などの哺乳動物Ｔｉｅ−２の触媒領域がある。より好ましくは前記ポリペプチドには、ヒトＴｉｅ−２の触媒領域がある。本発明のポリペプチドにも、ヒトＴｉｅ−２またはマウスＴｉｅ−２の触媒領域の単一ヌクレオチド多形を有するポリペプチドがある。１実施形態において本発明のポリペプチドおよびそれの結晶型には、ヒトＴｉｅ−２またはマウスＴｉｅ−２の触媒領域と少なくとも８０％の同一性を有する配列がある。
【００９３】
２種類のアミノ酸配列の同一性パーセントを求めるには、それらの配列を至適な比較ができるように並べる（例えば、第１および第２のアミノ酸の一方もしくは両方にギャップを導入して至適な配置とすることができ、比較のために非相同（異なる）配列を無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のために配置される第１の配列の長さは、第２の配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。次に、相当するアミノ酸位置でのアミノ酸残基を比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列での相当する位置と同じアミノ酸残基によって占有されている場合、その分子はその位置において同一である。それら２種類の配列間の同一性パーセントは、ギャップ数を考慮した配列が共有する同一位置数、ならびに２種類の配列の至適配置を得るために導入する必要がある各ギャップの長さの関数である。
【００９４】
本発明はさらに、同一度は低いがアミノ酸配列によって本明細書に記載されているＴｉｅ−２ポリペプチドが行うものと同じ機能の１以上を行うには十分な相同性を有するポリペプチドを包含する。ポリペプチドについての相同性は、保存的アミノ酸置換によって決定される。そのような置換には、ポリペプチドにおけるある特定のアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で置換するものがある。保存的置換は、表現型的にサイレントである可能性が高い。保存的置換として代表的に認められるものには、例えば脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での相互の置き換え；ヒドロキシ残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換または芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ間の置き換えがある。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関する指針が、ボウイらの報告（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １３０６−１３１０ （１９９０））にある。
【００９５】
配列の比較ならびに２種類の配列間の同一性パーセントおよび相同性の特定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１））。好ましい実施形態では、２種類のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ブロッサム（Ｂｌｏｓｓｏｍ）６２行列またはＰＡＭ２５０行列ならびに例えば１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４というギャップ加重および例えば１、２、３、４、５もしくは６という長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで２０００年３月２９日に入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマンら（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）： ４４４−４５３ （１９７０））のアルゴリズムを用いて求められる。さらに別の好ましい実施形態では、２種類のヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰ行列ならびに例えば４０、５０、６０、７０もしくは８０というギャップ加重および例えば１、２、３、４、５もしくは６という長さ加重を用い、ＧＣＧソフトウェアにおけるＧＡＰプログラムを用いて求める（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２ （１） ： ３８７ （１９８４））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで２０００年３月２９日に入手可能）。別の実施形態では、２種類のアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、例えばＰＡＭ１２０加重残基表、１２というギャップ長さペナルティーおよび４というギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたマイヤーズらのアルゴリズム（Ｅ． Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ （ＣＡＢＩＯＳ， ４： １１−１７ （１９８９））を用いて求める。
【００９６】
本発明の蛋白配列、例えばヒトＴｉｅ−２のアミノ酸８０２〜１１２４（配列番号１）をさらに、「照会配列」として用いて、データベースを参照した検索を行う、例えば他のファミリー構成員または関連配列を特定することができる。そのような検索は、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−１０ （１９９０））を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、例えばスコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて行って、本発明の蛋白と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ配置を得るのに、ギャップＢＬＡＳＴを文献記載の方法に従って用いることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ （１７）： ３３８９−３４０２ （１９９７））。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、個々のプログラム（例：ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで２０００年３月２９日に与えられた方法に従って用いることができる。
【００９７】
アミノ酸配列についての相同性は、ＮＣＢＩから入手可能なアドバンストＢｌａｓｔ検索（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ；アドバンストＢＬＡＳＴについては、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔ？Ｊｆｏｒｍ＝１（２０００年３月２９日）参照）によって設定されたパラメータで規定することができる。８５アミノ酸残基またはヌクレオチドより長い長さの参照分子について推奨されるそれらのデフォルトパラメータは、ギャップ存在コスト１１、残基ギャップ当たりコスト１、λ比０．８５と設定されている。ＢＬＡＳＴのバージョン２．０のさらに詳細な説明は、関連するウェブサイトページおよび文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））にある。　１実施形態において前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸８０２〜１１２４を有する。ポリペプチドはさらに、配列番号１のアミノ酸７９２〜１１２４、７８２〜１１２４、７７２〜１１２４、８１２〜１１２４、８２２〜１１２４、８３２〜１１２４、８０２〜１１１４、８０２〜１１０４または８０２〜１０９４を有することができる。別の実施形態においてポリペプチドは、９６４のアスパラギンアミノ酸がアスパラギン酸アミノ酸と置き換わっている配列番号２などのＴｉｅ−２の触媒的に不活性突然変異体であることができる（Ｄ９６４Ｎ突然変異体と称される）。他の触媒的に不活性な突然変異体には、９６４のアスパラギンアミノ酸のアラニン、セリン、トレオニンまたはグリシンによる置換などがある。
【００９８】
別の実施形態において結晶化する触媒領域は、天然配列からのアミノ酸の欠失を有することができる。例えば、結晶化に好適なポリペプチドには、配列番号１のアミノ酸９３４〜１１２４に融合した配列番号１のアミノ酸８０２〜９１８または他の関連する「キナーゼ挿入領域」欠失などがあり得る。
【００９９】
結晶ポリペプチドは好ましくは、Ｔｉｅ−２触媒領域に結合したリガンドをさらに有する。そのリガンドは好ましくは、小型（分子量約１５００未満）有機分子、例えば阻害薬Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶである。
【０１００】
１実施形態において本発明は、Ｔｉｅ−２蛋白の触媒領域を有する第１のポリペプチド３次元構造の決定方法に関する。その方法には、（１）第１のポリペプチドを有する結晶を得る段階；（２）前記結晶についてのＸ線回折データを得る段階；ならびに（３）前記Ｘ線回折データならびにＴｉｅ−２蛋白の触媒領域を有する第２のポリペプチドの原子座標を用いて、第１のポリペプチドの結晶構造を解明することで、第１のポリペプチドの３次元構造を決定する段階がある。第２のポリペプチドは、第１のポリペプチドと同じＴｉｅ−２触媒領域または異なるＴｉｅ−２触媒領域を有することができる。場合により、第１および第２のポリペプチドのいずれかまたは両方を、リガンドと複合体形成することができる。すなわち、第１のポリペプチドの結晶は、第１のポリペプチドとリガンドとの複合体を含むことができる。場合により、第２のポリペプチドの原子座標は、第２のポリペプチドに結合したリガンド分子の原子座標を含むことができる。第２のポリペプチドの原子座標は、例えば、第２のポリペプチドまたは第２のポリペプチドとリガンドの複合体を含む結晶のＸ線結晶学的解析によってすでに得られている。第２のポリペプチドの原子座標を用いて、例えば分子置換または同形置換などの当業界で公知の方法によって結晶構造を解明することができる。好ましくは第２のポリペプチドは、哺乳動物Ｔｉｅ−２、より好ましくはヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有する。例えば、使用可能な原子座標には、本明細書で提供される原子座標、好ましくは図３〜７で提供される原子座標がある。
【０１０１】
本発明はさらに、Ｔｉｅ−２阻害薬の候補である化合物を特定する方法を提供する。その方法は、（１）Ｔｉｅ−２の触媒領域を有するポリペプチドの結晶を得る段階；（２）前記結晶を用いるＸ線回折検査によって前記ポリペプチドの原子座標を得る段階；（３）前記原子座標を用いてＴｉｅ−２の前記触媒領域を規定する段階；ならびに（４）前記触媒領域に適合する化合物を特定する段階を有する。前記方法はさらに、段階４で特定された化合物を例えば化合物ライブラリーから得るか合成する段階ならびに特定された化合物のＴｉｅ−２酵素活性を阻害する能力を評価する段階を有することができる。
【０１０２】
前記ポリペプチドは好ましくは、哺乳動物Ｔｉｅ−２の触媒領域を有する。より好ましくは前記ポリペプチドは、ヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有する。好ましい実施形態において前記ポリペプチドは、上記で記載の本発明のポリペプチドである。
【０１０３】
前記ポリペプチドを、実施例に記載の方法などの当業界で公知の方法を用いて結晶化させて、Ｘ線回折検査に好適なポリペプチド結晶を得ることができる。結晶ポリペプチド／リガンド複合体は、得られた結晶ポリペプチドをリガンドを含む溶液に浸漬することで生成することができる。好ましくは、そのリガンド溶液は、ポリペプチドが不要である溶媒の溶液である。
【０１０４】
ポリペプチド（およびリガンド）の原子座標は、例えば当業界で公知の方法を用いるＸ線結晶学検査によって求めることができる。その結晶学検査から得られるデータを用いて、例えば、ポリペプチドおよび存在する場合はリガンドの原子の原子座標を得ることができる。当業界で公知のように、Ｘ線結晶構造の解明および精査によって、非水素原子の一部または全てについての座標を決定することができる。当業界で公知のように原子座標を用いて、Ｔｉｅ−２触媒領域の３次元構造を得ることができる。次にその構造を用いて、好ましくはコンピュータに基づく方法により、いずれか所定の化合物が触媒領域に適合する能力を評価することができる。
【０１０５】
化合物は、触媒領域に物理的に存在するのに好適な大きさおよび形状のものである場合、すなわち触媒領域に対して相補的であって、好ましくない立体的またはファン・デル・ワールズ相互作用がほとんどなく触媒領域に存在することができる形状を有する場合に、触媒領域に適合する。好ましくはその化合物には、触媒領域内の１以上のサブ部位と相互作用する１以上の官能基および／または部分がある。ポリペプチドの原子座標によって規定される触媒領域に化合物が適合する能力を評価する上での計算方法は当業界で公知であり、代表的な例を以下に示す。
【０１０６】
別の実施形態では、Ｔｉｅ−２の阻害薬候補の特定方法には、Ｔｉｅ−２触媒領域に存在する場合に、化合物の１以上の官能基および／または部分が、Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用する能力を求める段階がある。好ましくは、前記Ｔｉｅ−２触媒領域は、Ｔｉｅ−２触媒領域を有するポリペプチドの原子座標によって規定される。化合物が所定数または所定の組み合わせのサブ部位と相互作用できる場合、その化合物はＴｉｅ−２の阻害薬候補であると特定される。
【０１０７】
化合物の官能基または部分は、サブ部位内の１以上の相補的部分とエネルギー的に好ましいまたは安定な相互作用に関与する場合に、Ｔｉｅ−２触媒領域のサブ部位と「相互作用する」と言える。２種類の化学部分は、好適に配置された場合に、静電気的またはファン・デル・ワールズ相互作用などの引力相互作用または安定化相互作用に関与することができるのであれば「相補的」である。代表的には引力相互作用は、イオン−イオン（または塩架橋）、イオン−双極子、双極子−双極子、水素結合、ｐｉ−ｐｉまたは疎水性相互作用である。例えば、好適に配置された場合には塩架橋を形成できることから、負電荷部分と正電荷部分は相補的である。同様に、好適に配置された場合、水素結合供与体と水素結合受容体は相補的である。
【０１０８】
代表的には、被験化合物とＴｉｅ−２触媒領域との間の相互作用の評価は、原子座標によって規定される化合物と蛋白との可能な相互作用を、その化合物がその蛋白に結合する際の相互作用エネルギーを計算することで相互作用の強さに関して評価する、当業界で公知のものなどのコンピュータに基づく計算方法を用いることができる。その方法を用いる計算機化学者の見解で、所定の範囲内その他の計算相互作用エネルギーを有する化合物は、Ｔｉｅ−２阻害薬として最も高い可能性を有し、例えば化合物ライブラリーからまたは合成によって得ることができ、Ｔｉｅ−２阻害能力を評価することができる。所定の化合物の相互作用エネルギーは通常、その化合物が蛋白触媒領域内の１以上のサブ部位と相互作用する能力によって決まる。
【０１０９】
１実施形態において、前記方法で用いられる原子座標は、図３Ａ〜３ＯＯ、４Ａ〜４ＯＯ、５Ａ〜５ＲＲおよび６Ａ〜６ＮＮに示した原子座標である。理解すべき点として、図３〜６に示した座標は、例えば示される３次元構造にほとんど変化を与えることなく、当業界で公知の方法で、異なる座標系に変換することができる。
【０１１０】
ある場合には、化合物の一つの部分が２以上の個別の相互作用を介してサブ部位と相互作用することができる。化合物のある部分とサブ部位は、それらが相補的性質を有し、安定な相互作用を起こすのに十分な近位で、安定な方向に配置されている場合に相互作用することができる。化合物のその部分とサブ部位に関して可能な距離範囲は、当業界で公知であるように、相互作用の距離依存性によって決まる。例えば水素結合が生じるのは、水素原子を有する水素結合供与体原子と水素結合受容体原子とが約２．５Åおよび約３．５Åだけ離れている場合であるのが普通である。水素結合は、当業界では公知である（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ： Ｆｒｅｅｍａｎ （１９６０））。概して、化合物とＴｉｅ−２触媒領域との間の全体的相互作用または結合は、それらの個々の相互作用の数および強さによって決まる。
【０１１１】
被験化合物がＴｉｅ−２の触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用する能力は、被験化合物の官能基もしくは部分と上記のサブ部位１〜９などの特定の蛋白サブ部位における１以上のアミノ酸側鎖との間の相互作用をコンピュータ的に評価することで求めることができる。代表的には、好ましくは同時に重大な不安定化相互作用に関与することなく、所定数のサブ部位との安定化相互作用に関与することができる化合物は、Ｔｉｅ−２の阻害薬候補であると特定される。そのような化合物は、１以上のサブ部位、好ましくは２以上のサブ部位、より好ましくは３以上のサブ部位と相互作用する。
【０１１２】
本発明はさらに、Ｔｉｅ−２阻害薬候補である化合物の設計方法を提供する。その方法には、（１）Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位と相互作用することができる１以上の官能基を特定する段階；および（２）Ｔｉｅ−２触媒領域の１以上のサブ部位との相互作用に好適な方向で段階１で特定された１以上の官能基を提供する足場を特定する段階がある。特定された官能基または部分の特定された足場への結合によって生じる化合物は、Ｔｉｅ−２の阻害薬候補である。Ｔｉｅ−２触媒領域は通常、他の公知のチロシンキナーゼ、例えば図３Ａ〜３ＯＯ、４Ａ〜４ＯＯ、５Ａ〜５ＲＲおよび６Ａ〜６ＮＮに示した原子座標と比較した場合の保存相同配列によって規定される。
【０１１３】
当業界で公知の好適な方法を用いて、特定のサブ部位または特定のサブ部位集合と好ましく相互作用することができる化学部分、断片または官能基を特定することができる。その方法には、対話式分子グラフィックス；分子力学法；配座解析；エネルギー評価；ドッキング；データベース検索；ファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）モデル形成；デ・ノボ設計および特性推定などがあるが、これらに限定されるものではない。これらの方法を用いて、化学部分、断片または官能基を単一の阻害薬分子に組み立てることもできる。これらの同じ方法を用いて、所定の化学部分、断片または官能基が特定のサブ部位またはサブ部位集合と好ましい相互作用を行うことができるか否かを決定することもできる。
【０１１４】
１実施形態においてヒトＴｉｅ−２阻害薬候補の設計を、サブ部位１〜９を包含する触媒領域についての３次元形状および静電気的相補性を概括することから開始し、次に対話式分子モデル化法を当業者が用いて、モデル化された阻害薬候補の結合部位への適合の性質を視覚的に調べるようにすることができる。好適な視覚化プログラムには、ＩＮＳＩＧＨＴＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＲＡＳＭＯＬ（Ｒｏｇｅｒ Ｓａｙｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０： ３７４−３７６ （１９９５））、ＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１： ２８１−２８９ （１９９１））およびＭＩＤＡＳ（Ｆｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈｉｃｓ ６： １３−２７ （１９８８））などがある。
【０１１５】
本発明の別の実施形態は、標的蛋白部位に適合する候補について、既知の３次元構造の小分子のデータベースを走査することができるデータベース検索プログラムを用いる。好適なソフトウェアプログラムには、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、ＵＮＩＴＹ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、ＦＬＥＸＸ（Ｒａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６１ ： ４７０−４８９ （１９９６））、ＣＨＥＭ−３ＤＢＳ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ： Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ １６１ ： ２６９−２８８ （１９８２））およびＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ， ＣＡ）などがある。全ての相互作用の完全な評価が最初の検索時に必ず行われるので、検索で認められた分子が必ず主導的分子となるとは考えられない。むしろ、そのような候補がさらなる設計の枠組みとしてなって、適切な原子置換を行うことができる分子骨格を提供するものと予想される。当然のことながら、それらの分子の化学的コンプリメンタリー（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）を評価することができるが、足場、官能基、リンカーおよび／またはモノマーを変えて、酵素との静電気的、水素結合性および疎水性相互作用を最大とすることができると予想される。グッドフォード（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２８ ： ８４９−８５７ （１９８５））は、結合部位の分子表面上の各種化学基（プローブと称する）に対して高い親和性を有する領域を決定するためのコンピュータプログラムＧＲＩＤを作製している。従ってＧＲＩＤは、結合を促進すると考えられる公知のリガンドへの修飾を提案する手段を提供するものである。
【０１１６】
静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用、脱溶媒和効果、配座歪みまたは移動性、キレート形成ならびにリガンドおよび酵素の協同的相互作用および運動などの広範囲の因子がいずれも、その結合効果に影響を与えることから、生理活性阻害薬の設計を試みる上で考慮すべきである。
【０１１７】
阻害薬を特定するためのコンピュータ支援分子設計方法のさらに別の実施形態は、結合領域サブ部位に適合し、所定の足場に連結する断片を検索する段階を有する。その足場自体は、そのようにして特定することができる。そのような官能基およびモノマーの検索に好適なプログラムには、ＬＵＤＩ（Ｂｏｅｈｍ， Ｊ Ｃｏｍｐ． Ａｉｄ． Ｍｏｌ． Ｄｅｓ． ６ ： ６１−７８ （１９９２））、ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． ｉｎ″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ″， ｓｐｅｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｃｌｉｅｎｔ． Ｓｏｃ．， ７８ ： １８２−１９６ （１９８９））およびＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１ ： ２９−３４ （１９９１））などがある。
【０１１８】
対象ホスファターゼの阻害薬を特定するためのコンピュータ支援分子設計方法のさらに別の実施形態は、所望の構造および酵素の活性部位との静電気的相補性を示す小分子断片のアルゴリズム結合による阻害薬候補のデ・ノボ合成を含む。その方法は、Ｔｉｅ−２活性部位のモデルで繰り返し統合される小分子の大きいテンプレート集合を用いるものである。この作業に好適なプログラムには、ＧＲＯＷ（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１ ： ３１４−３２８ （１９９１））およびＳＰＲＯＵＴ（Ｇｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｏｍｐ． Ａｉｄ． Ｍｏｌ． Ｄｅｓ． ７ ： １２７ （１９９３））などがある。
【０１１９】
さらに別の実施形態において、阻害薬候補の好適性を、阻害薬集合についての結合親和性を等級分けすることができる経験評点関数を用いて求めることができる。そのような方法の例については、ミューゲ（Ｍｕｅｇｇｅ）の報告およびそこに引用の文献を参照する（Ｍｕｅｇｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍｉｎ． ４２ ： ７９１−８０４ （１９９９））。
【０１２０】
他のモデル化法を本発明に従って用いることができ、それには例えばコーエンら（Ｃｏｈｅｎ）の報告（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３ ： ８８３−８９４ （１９９４））；ナビア（Ｎａｖｉａ）らの報告（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ ： ２０２−２１０ （１９９２））；ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）らの報告（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３２ ： ２５１０−２５１３ （１９８９））；アッペルト（Ａｐｐｅｌｔ）らの報告（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３４ ： １９２５−１９３４ （１９９１））；およびイーリック（Ｅａｌｉｃｋ）らの報告 （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ ： １１５４０−１１５４４ （１９９１））に記載のものがある。
【０１２１】
次に、前記の方法のいずれかによってＴｉｅ−２の阻害薬候補と特定された化合物を、例えば合成または化合物ライブラリーから得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｉｅ−２を阻害する能力を評価することができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、当業界で公知の方法に従い、例えばＴｉｅ−２の基質存在下で被験化合物とＴｉｅ−２を溶液で接触させることで行うことができる。基質変換の速度を、被験化合物存在下で求め、被験化合物非存在下での速度と比較することができる。Ｔｉｅ−２生理活性についての好適なアッセイは、実施例４に記載してある。
【０１２２】
本発明の方法によって特定または設計される阻害薬は、競争的阻害薬、非拮抗的阻害薬または非競争的阻害薬であることができる。「競争的」阻害薬とは、ＡＴＰと同じＴｉｅ−２領域内で完全または部分的に結合することによってＴｉｅ−２の活性部位に関してＡＴＰと直接競合することで、Ｔｉｅ−２の活性を阻害するものである。「非拮抗的」阻害薬は、ＡＴＰとは異なる酵素領域に結合することでＴｉｅ−２を阻害する。そのような阻害薬は、すでにＡＴＰと結合しているＴｉｅ−２に結合し、遊離酵素に結合するものではない。「非競争的」阻害薬とは、Ｔｉｅ−２の遊離型またはＡＴＰ結合型のいずれかに結合することができるものである。一部の例において阻害薬は、複数の基質の結合を妨害することで酵素の触媒活性を阻害することができる（例：ＡＴＰおよびチロシン基質）。それは、複数の基質結合部位を完全または部分的に閉塞することによって、あるいはアロステリック的または配座的に基質への親和性を低下させるか産生物放出を遮断する部位を占有することによって行うことができる。
【０１２３】
別の実施形態において本発明は、Ｔｉｅ−２の触媒領域に結合することができるＴｉｅ−２阻害薬およびそれの使用方法、例えば、Ｔｉｅ−２の少なくとも１種類の生理活性の阻害薬であることが特定されている化合物または上記の方法によってＴｉｅ−２の少なくとも１種類の生理活性を阻害するよう設計された化合物を提供する。例えば本発明には、Ｔｉｅ−２サブ部位１〜９のうちの１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上と相互作用する化合物が含まれる。
【０１２４】
１実施形態において本発明のＴｉｅ−２阻害薬は、Ｔｉｅ−２触媒領域に存在する場合に、サブ部位１、サブ部位２および場合によって少なくとも１つの他のサブ部位と相互作用するよう配置された１以上の部分を有する。例えば、サブ部位１と相互作用することができる官能基は、水素結合供与体、水素結合受容体または疎水性部分であることができる。サブ部位２と相互作用することができる官能基は、疎水性基、水素結合供与体または水素結合受容体であることができる。
【０１２５】
別の実施形態において本発明のＴｉｅ−２阻害薬は、サブ部位１、２および３と、そして場合により１以上の別のサブ部位と相互作用するよう配置された官能基を有する。
【０１２６】
本発明のＴｉｅ−２阻害薬はさらに、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位８と、そして場合により１以上の別のサブ部位と相互作用するよう配置された官能基を有する化合物を含む。別の実施形態において前記阻害薬は、サブ部位１、サブ部位２、サブ部位３、サブ部位８と、そして場合により１以上の別のサブ部位と相互作用するよう配置された官能基を有する。
【０１２７】
他の実施形態において本発明のＴｉｅ−２阻害薬は、各群が１以上の別のサブ部位を含んでいても良い下記のサブ部位群、すなわちサブ部位１、４および５；サブ部位１、２、７および８；サブ部位１、２、３、７および８；サブ部位１、２、３、７および８；サブ部位１、２、４、６および８；サブ部位１、２、３、４、６および８；サブ部位１、２、３、４、６および８の群と相互作用するよう配置された官能基を有する化合物を含む。
【０１２８】
前記阻害薬化合物のある部分は、図３〜６で提供される原子座標によって規定されるＴｉｅ−２触媒領域内にあると、その部分が所定のサブ部位内の適切なアミノ酸側鎖に近位で、その側鎖に対して適切に配向している場合に、そのサブ部位と「相互作用するよう配置」されている。
【０１２９】
上記のサブ部位の説明で示したように、サブ部位１〜９のうちのいくつかは、２種類以上の部分と相互作用することができる。以下に挙げた各サブ部位について、阻害薬候補が有する好ましい種類の相互作用性部分を示してある。
【０１３０】
サブ部位１：水素結合供与体（Ｅ９０３）および水素結合受容体（Ａ９０５）。
【０１３１】
サブ部位２：疎水性、好ましくは芳香族部分（Ｉ８３０、Ｖ８３８、Ｉ８８６、Ｉ９０２およびＬ９７１）。
【０１３２】
サブ部位３：疎水性、好ましくはアルキル部分（Ｉ８３０およびＬ９７１）および正電荷部分（Ｄ９１２）。
【０１３３】
サブ部位４：水素受容体部分（Ｄ９８２およびＦ９３８）。
【０１３４】
サブ部位８：疎水性、好ましくは芳香族部分（Ｌ８７６、Ｉ８８６、Ｌ８８８およびＦ９８３）。
【０１３５】
本発明の好ましいＴｉｅ−２阻害薬はＴｉｅ−２酵素活性を阻害し、Ｋｉ値は少なくとも約１ｍＭ、好ましくは少なくとも約１００μＭ、より好ましくは少なくとも約１０μＭである。別の実施形態ではＴｉｅ−２阻害薬は、インシュリン受容体またはＣｓｋ、ＫＤＲ、ｌｃｋもしくはｚａｐなどの他のチロシンキナーゼ受容体より、Ｔｉｅ−２受容体に選択的に結合する。好ましい実施形態では前記阻害薬は、インシュリン受容体またはＣｓｋと比較して、Ｔｉｅ−２受容体に関して０．１倍以下のＫｉを有する。より好ましい実施形態において阻害薬は、インシュリン受容体またはＣｓｋと比較して、Ｔｉｅ−２受容体に関して０．０１倍以下のＫｉを有する。最も好ましい実施形態において阻害薬は、インシュリン受容体またはＣｓｋと比較して、Ｔｉｅ−２受容体に関して０．００１倍以下のＫｉを有する。
【０１３６】
好ましい実施形態において本発明のＴｉｅ−２阻害薬は、Ｔｉｅ−２触媒領域に存在またはそれに結合している場合に、（ａ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｕ９０３と相互作用するよう配置された水素結合供与体；（ｂ）ヒトＴｉｅ−２のＡｌａ９０５と相互作用するよう配置された水素結合受容体；（ｃ）ヒトＴｉｅ−２のＡｌａ９０５と相互作用するよう配置された水素結合供与体；（ｄ）ヒトＴｉｅ−２のＩｌｅ８３０、Ｖａｌ８３８、Ａｌａ８５３、Ｉｌｅ８８６、Ｉｌｅ９０２、Ｔｙｒ９０４、Ａｌａ９０５およびＬｅｕ９７１のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；（ｅ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９１２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；（ｆ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｎ９０９と相互作用するよう配置された水素結合供与体または水素結合受容体；（ｇ）ヒトＴｉｅ−２のＶａｌ８３８、Ｌｙｓ８５５、Ｉｌｅ８８６、Ｉｌｅ９０２、Ｌｅｕ９７１およびＡｌａ９８１のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；（ｈ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ８５５と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；（ｉ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９８２と相互作用するよう配置された水素結合受容体；（ｊ）ヒトＴｉｅ−２のＰｈｅ９８３と相互作用するよう配置された水素結合受容体；（ｋ）ヒトＴｉｅ−２のＬｅｕ８７３、Ｌｅｕ８７６、Ｉｌｅ８８５、Ｉｌｅ８８６、Ｌｅｕ８８８、Ｌｅｕ９００、Ｉｌｅ９０２、Ａｌａ９８１およびＰｈｅ９８３のうちの１以上と相互作用するよう配置された疎水性部分；（ｌ）ヒトＴｉｅ−２のＡｓｐ９８２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；（ｍ）ヒトＴｉｅ−２のＩｌｅ８８６と相互作用するよう配置された水素結合供与体；（ｎ）ヒトＴｉｅ−２のＬｅｕ７６８と相互作用するよう配置された水素結合供与体；（ｏ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｙ８３１と相互作用するよう配置された水素結合受容体；（ｐ）ヒトＴｉｅ−２のＧｌｕ８３２と相互作用するよう配置された水素結合供与体または正電荷官能基；（ｑ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ８４０と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；（ｒ）ヒトＴｉｅ−２のＬｙｓ９１６と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；（ｓ）ヒトＴｉｅ−２のＡｒｇ９６８と相互作用するよう配置された水素結合受容体または負電荷官能基；（ｔ）ヒトＴｉｅ−２のＡｒｇ９６８と相互作用するよう配置された水素結合供与体のうちの２以上を有する。
【０１３７】
好ましい実施形態において本発明のＴｉｅ−２阻害薬は、（ｂ）および（ｄ）；（ｄ）ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも１個；（ｄ）ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個、および（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個；（ｄ）および（ｇ）、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）、（ｇ）、そして（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個、ならびに（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個；（ｄ）、（ｇ）、（ｋ）、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）、（ｇ）、（ｋ）、そして（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）、そして（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個、（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個、ならびに（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個；（ｄ）、（ｇ）、（ｋ）、そして（ｉ）および（ｊ）のうちの少なくとも１個、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個；（ｄ）、（ｇ）、（ｋ）、そして（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも１個、ならびに（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２個を有する。
【０１３８】
本発明の好ましいＴｉｅ−２阻害薬は、Ｔｉｅ−２サブ部位と相互作用する部分および／または官能基が直接または介在部分を介して結合した分子足場または骨組みを有する。足場は例えば、ペプチドまたはペプチド様足場、単環式、二環式もしくは三環式部分などの環状または多環部分であることができ、１以上のヒドロカルボニルまたは複素環を有することができる。分子足場は、Ｔｉｅ−２の適切な残基との相互作用に適した配置または配向で結合した相互作用性部分を提供する。
【０１３９】
阻害薬Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶなどのピロロピリミジンが好ましいＴｉｅ−２阻害薬である。ピロロピリミジンの合成方法は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ　９９／２１５６０に記載されており、その出願の内容は参照によって全体が本明細書に組み込まれる。１実施形態において本発明の阻害薬は、下記構造式Ｖによって表されるピロロピリミジンおよびそれの製薬上許容される塩を含まない。
【０１４０】
【化１０】
2004514405.tif 000004
式中、
環Ａは、置換もしくは未置換脂肪族基、ハロゲン、置換もしくは未置換芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族基、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換アラルキル、置換もしくは未置換ヘテロアラルキル、シアノ、ニトロ、−ＮＲ４Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）２Ｈ、−ＯＨ、置換もしくは未置換アルコキシカルボニル、−Ｃ（Ｏ）２−ハロアルキル、置換もしくは未置換アルキルチオエーテル、置換もしくは未置換アルキルスルホキシド、置換もしくは未置換アルキルスルホン、置換もしくは未置換アリールチオエーテル、置換もしくは未置換アリールスルホキシド、置換もしくは未置換アリールスルホン、置換もしくは未置換アルキルカルボニル、−Ｃ（Ｏ）−ハロアルキル、置換もしくは未置換脂肪族エーテル、置換もしくは未置換芳香族エーテル、カルボキサミド、テトラゾリル、トリフルオロメチルスルホンアミド、トリフルオロメチルカルボニルアミノ、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換アルキルアミド、置換もしくは未置換アリールアミド、−ＮＲ９５Ｃ（Ｏ）Ｒ９５、置換もしくは未置換スチリルおよび置換もしくは未置換アラルキルアミドからなる群から選択される１以上の置換基で置換されていても良い６員芳香環または５員もしくは６員ヘテロ芳香環であり；Ｒ９５は脂肪族基もしくは芳香族基であり；
Ｌは、−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｓ（Ｏ）２−；−Ｎ（Ｒ）−；−Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＯＲ）−；−Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）−；−Ｎ（ＳＯ２Ｒ）；−ＣＨ２Ｏ−；−ＣＨ２−；−ＣＨ２Ｎ（Ｒ）−；−ＣＨ（ＮＲ）−；−ＣＨ２Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ））−；−ＣＨ２Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＯＲ）−；−ＣＨ２Ｎ（ＳＯ２Ｒ）−；−ＣＨ（ＮＨＲ）−；−ＣＨ（ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ）−；−ＣＨ（ＮＨＳＯ２Ｒ）−；−ＣＨ（ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ）−；−ＣＨ（ＯＣ（Ｏ）Ｒ）−；−ＣＨ（ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−；−Ｃ（＝ＮＯＲ）−；−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ（ＯＲ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２−；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）−；Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｓ（Ｏ）−；Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｓ（Ｏ）２−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−；−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−；−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｃ（Ｏ）−；−ＳＯＮ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）−；−ＳＯ２Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）−；−Ｎ（Ｒ）ＳＯＮ（Ｒ）−；Ｎ（Ｒ）ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ）Ｐ（ＯＲ′）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ）Ｐ（ＯＲ′）−；−Ｎ（Ｒ）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ′）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ′）−；−Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｐ（ＯＲ′）Ｏ−；−Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｐ（ＯＲ′）−；−Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ′）Ｏ−または−Ｎ（Ｃ（Ｏ）Ｒ）Ｐ（ＯＲ′）−であり；ＲおよびＲ′はそれぞれ独立に、−Ｈ、アシル基、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族基または置換もしくは未置換シクロアルキル基であり；あるいは
Ｌは、−ＲｂＮ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２−、−ＲｂＮ（Ｒ）Ｐ（Ｏ）−または−ＲｂＮ（Ｒ）Ｐ（Ｏ）Ｏ−であり；Ｒｂは、それが結合しているスルホンアミド、ホスフィンアミドまたはホスホンアミド基と一体となった場合に、環Ａに縮合した５員もしくは６員環を形成しているアルキレン基であり；あるいは
Ｌは、下記構造式：
【０１４１】
【化１１】
2004514405.tif 000005
のいずれかによって表され；
ホスフィンアミドまたはホスホンアミドと一体となったＲ８５は、５員、６員もしくは７員の芳香族、ヘテロ芳香族もしくはヘテロシクロアルキル環系であり；
Ｒ１は、置換脂肪族基、置換シクロアルキル、置換ビシクロアルキル、置換シクロアルケニル、置換されていても良い芳香族基、置換されていても良いヘテロ芳香族基、置換されていても良いヘテロアラルキル、置換されていても良いヘテロシクロアルキル、置換されていても良いヘテロビシクロアルキル、置換されていても良いアルキルアミド（ａｍｉｎｄｏ）および置換されていても良いアリールアミド、置換されていても良いＳ（Ｏ）２−アルキルまたは置換されていても良い−Ｓ（Ｏ）２−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキルまたは置換されていても良い−Ｃ（Ｏ）−アルキルであり；ただし、Ｒ１が脂肪族基またはシクロアルキル基である場合にＲ１は、水酸基および低級アルキルエーテルからなる群から選択される１以上の置換基によって専ら置換されているわけではなく；前記ヘテロシクロアルキルは２−フェニル−１，３−ジオキサン−５−イルではなく；脂肪族基は、１以上の脂肪族基によって専ら置換されているわけではなく；１以上の置換基が、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族、置換もしくは未置換アラルキル、置換もしくは未置換ヘテロアラルキル、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換芳香族エーテル、置換もしくは未置換脂肪族エーテル、置換もしくは未置換アルコキシカルボニル、置換もしくは未置換アルキルカルボニル、置換もしくは未置換アリールカルボニル、置換もしくは未置換ヘテロアリールカルボニル、置換もしくは未置換アリールオキシカルボニル、−ＯＨ、置換もしくは未置換アミノカルボニル、オキシム、置換もしくは未置換アザビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、オキソ、アルデヒド、置換もしくは未置換アルキルスルホンアミド基、置換もしくは未置換アリールスルホンアミド基、置換もしくは未置換ビシクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロビシクロアルキル、シアノ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ウレイド、チオウレイドおよび−Ｂ−Ｅからなる群から選択され；
Ｂは、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換芳香族、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族、アルキレン、アミノアルキル、アルキレンカルボニル（ｃａｒｂｎｏｎｙｌ）またはアミノアルキルカルボニルであり；
Ｅは、置換もしくは未置換アザシクロアルキル、置換もしくは未置換アザシクロアルキルカルボニル、置換もしくは未置換アザシクロアルキルスルホニル、置換もしくは未置換アザシクロアルキルアルキル、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールカルボニル、置換もしくは未置換ヘテロアリールスルホニル、置換もしくは未置換ヘテロアラルキル、置換もしくは未置換アルキルスルホンアミド、置換もしくは未置換アリールスルホンアミド、置換もしくは未置換ビシクロアルキル、置換もしくは未置換ウレイド、置換もしくは未置換チオウレイドまたは置換もしくは未置換アリールであり；
Ｒ２は、−Ｈ、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換シクロアルキル、ハロゲン、−ＯＨ、シアノ、置換もしくは未置換芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換アラルキル、置換もしくは未置換ヘテロアラルキル、−ＮＲ４Ｒ５または−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ３は、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アルケニル基、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換芳香族基、置換もしくは未置換ヘテロ芳香族基または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルであり；
ただしＲ３が置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アルケニル基である場合は、Ｌは−ＳＮ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｓ−、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＮ（Ｒ′）−、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ′）−またはＮ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ′）−であり；
ただし、Ｌが−Ｏ−、−ＣＨ２ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−または−ＮＲＣ（Ｏ）であり、Ｒ３がアザシクロアルキルまたはアザヘテロアリールである場合には、ｊは０であり；
ただし、Ｌが−Ｏ−であり、Ｒ３がフェニルである場合には、ｊは０であり；　Ｒ４、Ｒ５および窒素原子が一体となって、３、４、５、６もしくは７員の置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロビシクロアルキルまたは置換もしくは未置換ヘテロ芳香族を形成しており；あるいは
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、−Ｈ、アザビシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換アルキル基またはＹ−Ｚであり；
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｐ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、（ＣＨ２）ｐＯ−、−（ＣＨ２）ｐＮＨ−、−（ＣＨ２）ｐＳ−、−（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）−および−（ＣＨ２）ｐＳ（Ｏ）２−からなる群から選択され；
ｐは０〜６の整数であり；
Ｚは、−Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールまたは置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基であり；
ｊは０〜６の整数である。
【０１４２】
本明細書で使用する場合に芳香族基には、炭素環系（例：フェニルおよびシンナミル）および縮合多環式芳香環系（例：ナフチルおよび１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）などがある。芳香族基は本明細書においては、アリール基とも称される。
【０１４３】
本明細書で使用されるヘテロ芳香族基には、ヘテロアリール環系（例：チエニル、ピリジル、ピラゾール、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、インダゾリル、フラン類、ピロール類、イミダゾール類、ピラゾール類、トリアゾール類、ピリミジン類、ピラジン類、チアゾール類、イソオキサゾール類、イソチアゾール類、テトラゾール類またはオキサジアゾール類）および炭素環系芳香環、炭素環系非芳香環またはヘテロアリール環が１以上の他のヘテロアリール環と縮合しているヘテロアリール環系（例：ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンズイミダゾール、インドール、テトラヒドロインドール、アザインドール、インダゾール、キノリン、イミダゾピリジン、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）ならびにそれらのＮ−オキサイド類などがある。
【０１４４】
本明細書で使用される場合にアラルキル基は、炭素原子数１〜約６の脂肪族基によってある化合物に連結された芳香族置換基である。
【０１４５】
本明細書で使用される場合にヘテロアラルキル基は、炭素原子数１〜約６の脂肪族基によってある化合物に連結されたヘテロ芳香族置換基である。
【０１４６】
本明細書で使用される場合にヘテロシクロアルキル基は、原子３〜８個を有し、窒素、酸素または硫黄などの少なくとも１個のヘテロ原子を有する非芳香環系である。
【０１４７】
本明細書で使用される場合にアシル基は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｘＲｚ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（Ｏ）Ｒｘであり；ＲｘおよびＲｚはそれぞれ独立に、−Ｈ、置換もしくは未置換脂肪族基または置換もしくは未置換芳香族基である。
【０１４８】
本明細書で使用される場合に脂肪族基は、完全に飽和しているか、１以上の不飽和単位を有する直鎖、分岐または環状のＣ１〜Ｃ８炭化水素を含むものである。「低級アルキル基」とは、炭素原子数１〜６の飽和脂肪族基である。
【０１４９】
Ｔｉｅ−２の触媒的に不活性な突然変異体に結合した阻害薬Ｉ（配列については図２、原子座標については図３を参照する）は、空間群Ｃ２２２１で結晶化した。Ｘ線結晶学的構造から、以下の相互作用が明らかになった。
【０１５０】
阻害薬Ｉのピロロピリミジン環は、蝶番領域における残基に対する水素結合を形成し、プリン核領域と相互作用する。その阻害薬の核は、Ｅ９０３のカルボニル酸素に対する４−ＮＨ２置換基のアミノプロトンの形で水素結合供与体を提供する。ピリミジン環の原子Ｎ３は、Ａ９０５の足場Ｎ−Ｈからの水素結合を受容する。核の環系は、Ｃ末端葉部およびＮ末端葉部の両方の残基に対して平面を提供する。これらの領域における残基は、阻害薬の平面核を「挟持する」疎水性表面を提供する。この疎水性挟持領域に関与する残基には、Ｉ８３０、Ｖ８３８、Ｉ８６、Ｉ９０２およびＬ９７１などがある。核の原子Ｎ１およびＮ７は、結合ポケットの溶媒露出口に向いている。原子Ｃ６は、蛋白のＮ末端葉部のヌクレオチド結合ループの長軸に向いている。
【０１５１】
Ｎ７シクロペンタン環は、溶媒の方を向いているが、依然蛋白腔部内にある。その領域については、他のキナーゼ構造で認められるＡＴＰのリボース環の結合形態後に、延長糖ポケットとして前述してある。この領域は、主としてＩ８３０およびＬ９７１との疎水性相互作用を特徴とする。Ｅ８３２のメチレン基も、この形に寄与し得る。
【０１５２】
ピロロピリミジン環のＣ５に結合したフェニル環は、主としてプリン核領域からの残基、遠位疎水性ポケットおよび触媒性リジンＫ８５５からのメチレン基によって形成された疎水性領域にある。
【０１５３】
疎水性接触は、残基Ｖ８３８、Ｉ８８６、Ｉ９０２、Ｌ９７１およびＡ９８１によるものである。リジン８５５は非常に移動性が高いことから、ピロロピリミジン環に対してメタ位のＣ１原子が水素結合を受容していることも可能である。
【０１５４】
スルホンアミドリンカーは、Ｄ９８２のアミドプロトンと明瞭な水素結合を形成し、Ｆ９８３のアミドプロトンに対する水素結合を形成することもできる。
【０１５５】
末端フェニル環（標識環Ｃ）は、遠位疎水性ポケットにある。主要な接触は、Ｌ８７６、Ｉ８８６、Ｌ８８８およびＦ９８３によるものである。
【０１５６】
Ｔｉｅ−２の触媒的に不活性な突然変異体に結合した阻害薬ＩＩ（配列については図２参照、原子座標については図４参照）は、空間群Ｐ４２２１２で結晶化した。Ｘ線結晶学的構造から、以下の別の相互作用が明らかになった。
【０１５７】
ピロロピリミジン核、Ｂ環、リンカーおよびＣ環は阻害薬と同じように結合する。Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は、延長糖ポケットを占有し、Ｄ９１２との強力なイオン性相互作用を形成する。
【０１５８】
Ｔｉｅ−２の触媒的に不活性な突然変異体に結合した阻害薬ＩＩＩ（配列については図２参照、原子座標については図４参照）は、空間群Ｐ４２２１２で結晶化した。Ｘ線結晶学的構造から、以下の別の相互作用が明らかになった。
【０１５９】
ピロロピリミジン核は、阻害薬Ｉと同じように結合する。Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は延長糖ポケットを占有し、Ｔｉｅ−２／阻害薬ＩＩの場合のように、Ｄ９１２と強力なイオン性相互作用を形成する。Ｂ環は、阻害薬Ｉと同じようにに結合する。しかしながら、ハロゲン、この場合にはフッ素原子とＫ８５５との間の水素結合の方が明瞭である。リンカーは、Ｄ９８３およびＦ９８３の足場アミドプロトンに対して明瞭な２つの水素結合を形成する。Ｃ環は遠位疎水性ポケットを占有し、主要な相互作用はＬ８７６、Ｉ８８６、Ｌ８８８、Ｌ９００、Ｉ９０２およびＦ９８３からのものである。
【０１６０】
Ｔｉｅ−２の触媒的に不活性な突然変異体に結合した阻害薬ＩＶ（配列については図２、原子座標については図４参照）は、空間群Ｐ４２２１２で結晶化した。Ｘ線結晶学的構造から、以下の別の相互作用が明らかになった。
【０１６１】
ピロロピリミジン核は、阻害薬Ｉと同じように結合する。Ｎ−７シクロヘキシルＮ−メチルピペラジニル基は延長糖ポケットを占有し、Ｔｉｅ−２／阻害薬ＩＩの場合と同様にＤ９１２と強力なイオン性相互作用を形成する。Ｂ環は阻害薬Ｉと同じように結合する。しかしながら、可能な水素結合相手として働く塩素原子はない。この場合のリンカーは酸素原子であり、それは触媒性リジンＫ８５５から水素結合を受容する。Ｃ環は遠位疎水性ポケットを占有し、主要な相互作用はＬ８７６、Ｉ８８６、Ｉ９０２およびＦ９８３からのものである。
【０１６２】
１実施形態において本発明は、患者におけるＴｉｅ−２依存性状態の治療方法に関するものである。その方法は、治療上有効量の前記のＴｉｅ−２阻害薬を患者に投与する段階を有する。患者はいずれの動物であることもでき、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１６３】
「Ｔｉｅ−２依存性状態」とは、Ｔｉｅ−２の触媒活性が疾患もしくは状態の進行において何らかの役割を果たす疾患または医学的状態である。例えば、１実施形態においてその状態は、過剰血管増殖を特徴とする。Ｔｉｅ−２阻害薬は、血管形成依存性障害、ならびに異常な内皮−内皮周辺相互作用が関与する障害（例：再狭窄）の治療において有用である。
【０１６４】
Ｔｉｅ−２依存性状態には、増殖亢進障害、癌、心血管状態、眼球状態、フォンヒッペル−リンダウ病、類天疱瘡、乾癬、ページェット病、腎嚢胞、線維症、サルコイドーシス、肝硬変、甲状腺炎、オスラー−ウェーバー−ランジュ症、慢性炎症、関節滑膜炎、炎症性腸疾患、クローン病、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍および敗血症などがある。さらに、Ｔｉｅ−２阻害薬を用いて、患者における生殖能を低下させることができる。
【０１６５】
好ましい治療方法は、癌が固形腫瘍、肉腫、線維肉腫、骨腫、メラノーマ、網膜芽腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、奇形癌、造血悪性腫瘍、悪性腹水症、カポジ肉腫、ホジキン病、リンパ腫、骨髄腫または白血病であるものである。
【０１６６】
別の好ましい治療方法は、心血管状態、アテローム性動脈硬化、再狭窄、虚血／再潅流損傷、慢性閉塞性肺疾患、血管閉塞、頸動脈閉塞疾患、クロウ−深瀬（ＰＯＥＭＳ）症候群、貧血、虚血、梗塞、血管漏出障害であるものである。
【０１６７】
さらに別の好ましい治療方法は、前記眼球状態が、眼球もしくは黄斑浮腫、眼球血管新生症、強膜炎、放射状角膜切除術、ブドウ膜炎、硝子体炎（ｖｉｔｒｉｔｉｓ）、近視、視窩、慢性網膜剥離、レーザー処置後合併症、結膜炎、シュタルガルト病、イールズ（Ｅａｌｅｓ）病、網膜症、黄斑変性または微小血管症であるものである。
【０１６８】
Ｔｉｅ−２阻害薬はさらに、血管形成または血管発生を促進する方法で用いることができる。さらにＴｉｅ−２阻害薬は、プロ血管形成性増殖因子とともに投与することができる。
【０１６９】
治療上有効量とは、その用語を本明細書で使用する場合、疾患の進行もしくは症状の部分的または完全阻害を起こす量である。そのような量は、例えば患者の大きさおよび性別、治療対象の状態、症状の重度および求める結果によって決まり、当業者が決定することができる。
【０１７０】
本発明の化合物は場合により、例えばＴｉｅ−２が介在する状態の症状を治療および／または緩和する上で知られている１以上の別の薬剤または療法との併用で投与することができる。その別の薬剤は、本発明の化合物と同時に投与することができるか、あるいは順次投与することができる。例えばＴｉｅ−２阻害薬は、当業界で公知の別の抗癌剤との併用で投与することができる。同時投与可能な別の療法には、例えば放射線療法、紫外線照射、温熱療法、レーザー照射、標的放射性核種および中性子衝撃などがあると考えられる。
【０１７１】
本発明はさらに、１以上の上記のＴｉｅ−２阻害薬を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療上（または予防上）有効量の１以上の上記のＴｉｅ−２結合阻害薬と製薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む。好適な製薬上許容される担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。担体および組成物は無菌であることができる。製剤は、投与形態に適合するものでなければならない。
【０１７２】
好適な製薬上許容される担体には、水、塩溶液（例：ＮａＣｌ）、アルコール類、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール類、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、乳糖、アミロースもしくはデンプンなどの炭水化物、シクロデキストリン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル類、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどがあるが、これらに限定されるものではない。医薬製剤は無菌であることができ、所望に応じて、例えば活性化合物と有害な反応を起こさない潤滑剤、保存剤、安定剤、湿展剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩類、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質などの補助剤と混合することができる。
【０１７３】
所望に応じて組成物は、少量の湿展剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、液剤、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤または粉剤であることができる。組成物は、トリグリセリド類などの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として製剤することができる。経口製剤には、医薬用のマニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリジノン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含有させることができる。
【０１７４】
組成物は、ヒトへの静脈投与用に用いられる医薬組成物として、常法に従って製剤することができる。代表的には、静脈投与用の製剤は無菌等張性緩衝水溶液である。必要な場合に組成物には、可溶化剤および局所麻酔剤を含有させて、注射部位での疼痛を緩和することもできる。成分は、単位製剤、例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密封容器に入った乾燥凍結粉末または水を含まない濃縮物として、別個または互いに混合して供給される。組成物を注入によって投与すべき場合には、それを無菌の医薬用水、生理食塩水またはブドウ糖／水を含む注入瓶で配布することができる。組成物を注射によって投与する場合、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、投与前に成分を混合できるようにすることができる。
【０１７５】
本発明の医薬組成物は、Ｔｉｅ−２阻害薬化合物の放出を制御することで、持続性もしくは徐放性組成物を提供する薬剤を含むこともできる。
【０１７６】
Ｔｉｅ−２阻害薬は、従来の無毒性で生理的に許容される担体もしくは媒体を含む製剤で、皮下投与、静脈投与、非経口投与、腹腔内投与、経皮投与、筋肉投与、眼内投与、局所投与、経腸（例えば、経口）投与、直腸投与、経鼻投与、口腔投与、舌下投与、経膣投与、吸入噴霧投与、薬剤ポンプ投与または埋込貯留物を介した投与することができる。好ましい投与方法は、経口投与によるものである。それを投与する形（例：シロップ、エリキシル剤、カプセル、錠剤、液剤、発泡剤、乳濁液、ゲル、ゾル）は部分的に、それを投与する経路によって決まる。例えば、粘膜（例：口粘膜、直腸、眼球粘膜、腸粘膜、気管支粘膜）投与の場合、点鼻剤、エアロゾル、吸入剤、噴霧剤、点眼剤または坐剤を用いることができる。本発明の化合物および薬剤は、鎮痛剤、抗炎症剤、麻酔剤およびＴｉｅ−２依存性状態の１以上の症状または原因を抑制することができる他の薬剤などの他の生理活性薬剤とともに投与することができる。
【０１７７】
具体的な実施形態では、治療が必要な限定された領域に、本発明の薬剤を局所投与することが望ましい場合がある。それは例えば、手術時の局所注入、局所塗布、経皮貼付剤により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、あるいは埋込物によって行うことができ（それらに限定されるものではない）、前記の埋込物は、例えばシラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）の膜もしくは繊維などの膜のような多孔性材料、非多孔性材料またはゼラチン状材料製である。例えば前記薬剤は、関節に注射することができる。
【０１７８】
実施例
実施例１：蛋白精製
ＴＥＶプロテアーゼ開裂ペプチドを含む（Ｈｉｓ）６Ｔｉｅ−２　８０２〜１１２４、Ｄ９６４Ｎを、ＳＦ−９細胞のバキュロウィルス感染によって組換え的に発現させた。細胞を、２０ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ８．０、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１ｍＭ　ＡＤＰ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２および完全プロテアーゼ阻害薬、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ）からのＥＤＴＡを含まないカクテルを含む緩衝液中で溶解させた。リガンドＡＤＰ／Ｍｇ＋＋は、その後の全ての精製段階の緩衝液中で、その濃度に維持した。細胞溶解物を遠心し、上清を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．３Ｍ　ＮａＣｌ中で平衡状態としておいたＮｉ＋＋キレーティングセファロースカラムに加えた。Ｔｉｅ−２を、１００ｍＭイミダゾールとの競合によって溶離した。溶出（Ｈｉｓ）６Ｔｉｅ−２をＴｅｖプロテアーゼで消化させ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＤＴＴに対して透析した。透析サンプルを遠心して沈殿蛋白を除去し、Ｔｉｅ−２をモノＱ（ＭｏｎｏＱ）アニオン交換カラムに結合させ、０．０２５から０．２Ｍ　ＮａＣｌの直線的２０カラム容量勾配で溶離した。代表的には、早期溶出分画の後期溶出分画に対する単分散度における差を、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて検出することができた。サンプル純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、天然ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳ総質量分析を用いて評価した。同様のＤＬＳ特性を有する分画を蓄積し、−８０℃での限外濾過を用いて２ｍｇ／ｍＬより大きい濃度まで濃縮した。限外濾過サンプルを、下記の結晶学的実験で用いた。表Ｉに、結晶化に好適な条件範囲を挙げてある。
【０１７９】
実施例２
Ｉ．２リン酸化Ｔｉｅ−２　８０２〜１１２４
Ａ．結晶化条件
Ｔｉｅ−２　８０２〜１１２４（２ＰＯ４）蛋白を、蒸気拡散法を用いて着（ｓｉｔｔｉｎｇ）滴形態または懸滴形態で結晶化させた。蛋白濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、ウェル溶液は１０％ＰＥＧ６０００；０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；５％ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）であった。液滴は、等容量の蛋白および５００μＭ阻害薬を含むウェル溶液を用いて設定した。結晶は常法により、約１週間かけて０．４ｍｍ×０．１ｍｍ×０．０１ｍｍまで成長させた。結晶は空間群Ｐ２（１）２（１）２（１）のものであり、単位格子サイズはａ＝５４．３２０Å、ｂ＝７５．８７２Å、ｃ＝７８．１４３Åおよびα＝β＝γ＝９０．０°であった。表Ｉに、結晶化に好適な条件範囲を挙げてある。
【０１８０】
Ｂ．データ収集
リガンド結合結晶についてのデータは、Ｒ−ＡｘｉｓＩＩリン画像プレート検出器を搭載した５０ｋＶ　１５０ｍＡで動作するリガク（Ｒｉｇａｋｕ）ＲＵ３００回転陽極発生機で収集した。Ｘ線は長い鏡によって単色光化し、０．００６７μｍニッケルフィルターでフィルター処理した。データは、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて処理および換算した（Ｍｉｎｏｒ， Ｗ．， １９９３）。データは３．５Åの解像度で収集した。
【０１８１】
Ｃ．データ処理
ＣＣＰ４パッケージソフト（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ ４ １９９４）（ｔｏｍｔｚ、ｔｒｕｎｃ、ｃａｄおよびｅｃａｌｃ）中のプログラムを用いて、分子置換に関するフォーマットおよび処理を行った。分子置換プログラムＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ， Ｊ． １９９４）を用いて、初期モデルを用いたデータ設定について位相を見いだすことに成功した。初期モデルは、ポリアラニンに対して切り取ったＦＧＦＲキナーゼ領域の炭素末端部分（残基 ５６６〜５７５および５９２〜６７２）（ＰＤＢ受付番号１ＦＧＫ）からなるものであった。より完全なモデル（残基４６４〜４８５、４９１〜５００、５０５〜５７５および５９２〜７６２）を用いた第２ラウンドのＡＭＯＲＥも行って、位相調整溶液を特定した。
【０１８２】
Ｄ．モデルの至適化
グラフィックプログラムＯ、バージョン６．２．１（Ｊｏｎｅｓ， Ａ．， １９９７； Ｋｅｙｗｅｇｔ Ｇ． Ｊ．， １９９５）を用い、交互に手動再構成を行うＣＮＳ （Ｂｒｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９８）を用いる最小二乗最小化を数ラウンド繰り返して、１．０シグマのレベルで描かれる係数２ｆｏ−ｆｃで各ラウンド後に得られる電子密度マップとモデルを比較しながら、そのモデルの改良を行った。
【０１８３】
ＩＩ．Ｔｉｅ−２（Ｄ９６４Ｎ）８０２〜１１２４（配列番号２）
Ａ．結晶化条件
精製Ｔｉｅ−２（Ｄ９６４Ｎ）８０２〜１１２４蛋白を、蒸気拡散法を用いて着滴形態で結晶化させた。蛋白濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであり、ウェル溶液は１．０〜１．５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ　ＭＥＳ、ｐＨ６．５、５％ジオキサン（１，４−ジオキサン）であった。液滴は、等容量の蛋白および１００〜３００μＭ阻害薬を含むウェル溶液を用いて設定した。結晶は常法により、約２〜３日で０．３ｍｍ×０．０５ｍｍ×０．０１ｍｍまで成長させた。Ｔｉｅ−２／阻害薬Ｉの結晶は空間群Ｃ２２２（１）のものであり、単位格子サイズはａ＝７５．１９５Å、ｂ＝１１６．２８７Å、ｃ＝９５．０６０Åおよびα＝β＝γ＝−９０．０°であった。Ｔｉｅ−２／阻害薬ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ複合体の結晶は空間群Ｐ４２２１２のものであり、単位格子サイズはａ＝ｂ＝８６．０Å、ｃ＝１１２．０Åおよびα＝β＝γ＝−９０．０°であった。
【０１８４】
Ｂ．データ収集
阻害薬Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶと複合体形成したリガンド結合結晶（Ｔｉｅ−２（Ｄ９６４Ｎ）８０２〜１１２４）についてのデータは、ブランデイス（Ｂｒａｎｄｅｉｓ）Ｂ４、ＣＣＤ検出器を搭載したブルックハベン・ナショナル・ラボラトリー（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ｕｐｔｏｎ， ＮＹ）でビームラインＸ２５で収集した。Ｔｉｅ−２／阻害薬Ｉ複合体についてのデータは、２．０Å解像度に対して可視のより高い解像度反射を用い、完全に２．７５Å解像度に対して収集した。
【０１８５】
Ｃ．データ処理
ＣＣＰ４パッケージソフト（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ ４ １９９４）（ｔｏｍｔｚ、ｔｒｕｎｃ、ｃａｄおよびｅｃａｌｃ）中のプログラムを用いて、分子置換に関するフォーマットおよび処理を行った。分子置換プログラムＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ， Ｊ． １９９４）を用いて、初期モデルを用いたデータ設定について位相を見いだすことに成功した。初期モデルは、ＦＧＦＲキナーゼ領域の保存部分（Ｔｉｅ２残基番号８１８〜８３０、８４１〜８４２、８５０〜８５７、８６６〜８９０、９００〜９１６、９３５〜９８１、１００１〜１０９３）からなるものであった。そのモデル、ほとんどの場合ポリアラニンを、５種類のチロシンキナーゼ構造（ＩＲＫ、ＨＣＫ、ＳＲＣ、ＦＧＦＲおよびＬＣＫ）の重なりで異なるループ領域に切った。さらにこのモデルには、ＦＧＦＲモデルで同一の側鎖が認められた位置に、それらの側鎖残基のみがあった。
【０１８６】
Ｄ．モデルの至適化
グラフィックプログラムＯ、バージョン６．２（Ｊｏｎｅｓ， Ａ．， １９９７； Ｋｅｙｗｅｇｔ Ｇ． Ｊ．， １９９５）を用い、交互に手動再構成を行うＣＮＳ （Ｂｒｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９８）を用いる最小二乗最小化を数ラウンド行って、２種類の電子密度マップ、すなわち１．０シグマのレベルで描かれる係数２ｆｏ−ｆｃで得られた一方のマップならびに１．５シグマのレベルで描かれる係数２ｆｏ−ｆｃで得られた他方のマップとモデルを比較しながら、そのモデルの改良を繰り返し行った。
【０１８７】
Ｅ．阻害薬の合体
阻害薬 Ｉは活性部位に結合しているのが認められた。それは最初に、電子密度マップを肉眼で調べ、阻害薬の歪み角を調節することで、手動でＯに合体させた。パラメータおよびトポロジーファイルは、Ｘ−ｕｔｉｌプログラムｘｐｌｏ２ｄ（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ Ｇ． Ｊ． ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｔ． Ａ． １９９７）を用いるＣＮＳに関して得て、若干の変更を加えて、阻害薬における塩素を適切にモデル化した。
【０１８８】
ＩＩＩ．Ｔｉｅ−２（Ｄ９６４Ｎ）８０２〜１１２４（配列番号２）
Ａ．結晶化条件
蛋白（構築物Ｔｉｅ−２Ｄ９６４Ｎ）を、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＡＤＰおよび５ｍＭ　ＤＴＴを含む緩衝液中に入ったものとして得た。蛋白濃度は、クマシー・プラス（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ）アッセイ、標準としてのＢＳＡを用いて測定したところ、約２．３ｍｇ／ｍＬであった。
【０１８９】
阻害薬ＩＩＩをＤＭＳＯに溶かして、５０ｍＭ原液を得た。原液を、最終阻害薬濃度２ｍＭとなるように蛋白溶液に加えた。結晶化条件を、室温および４℃で、ハンプトンスクリーン（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ）のクリスタルスクリーン（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｃｒｅｅｎ）、クリスタルスクリーン２、メンブファク（Ｍｅｍｂｆａｃ）、ナトリクス（Ｎａｔｒｉｘ）およびＰＥＧ／イオンスクリーンを用いてスクリーニングした。結晶は、沈殿緩衝液：２０％ＰＥＧ３３５０、０，２Ｍトリ−リチウム・シトラートｐＨ８，１（０，２Ｍ ｔｒｉ−Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔ ｐＨ ８，１）（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ ＰＥＧ／ｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ， Ｎｒ． ４５）着滴または懸滴：貯液槽中の緩衝液７５０μＬを用い、代表的には蛋白１μＬ〜２μＬおよび貯液槽液１μＬ〜２μＬを混合した液滴で成長させた。
【０１９０】
下記の添加物（液滴に対して１０体積％）を加えても、結晶が生成した。
【０１９１】
【表１】
2004514405.tif 000006
【０１９２】
Ｂ．データ収集
データは、ＤＥＳＹ、ハンブルグにおけるマックス−プランク−ソサイアティ（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｓｏｃｉｅｔｙ）のビームラインＢＷ６で測定した。
【０１９３】
結晶は１００Ｋまで衝撃冷却した。冷凍緩衝液は、結晶化緩衝液と２０〜３０％グリセリンを混合したものであった。Δφ＝０．２５°を有する２１３フレームを、結晶検出器距離１２０ｍｍおよび波長１．０７２Åで、ＭＡＲ　ＣＣＤ検出器を用いて収集した。
【０１９４】
結晶は、単位格子サイズａ＝ｂ＝８６．０Åおよびｃ＝１１２．０Åを有する正方晶空間群のものであった。異なる結晶の格子サイズには変動がある（ａおよびｂの場合、８５〜８７Å、ｃの場合９７〜１１３）。消光は、分子置換によって特定された空間群Ｐ４２２１２を示している。
【０１９５】
表ＩＩ：Ｔｉｅ−２／阻害薬複合体の結晶化条件
【０１９６】
【表２】
2004514405.tif 000007
2004514405.tif 000008
2004514405.tif 000009
【０１９７】
参考文献
Ｂｒｕｎｇｅｒ， Ａ． Ｔ．， Ａｄａｍｓ， Ｐ． Ｄ．， Ｃｌｏｒｅ， Ｇ． Ｍ．， ＤｅＬａｎｏ， Ｗ． Ｌ． Ｇｒｏｓ， Ｐ． Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｒ． Ｗ．， Ｊｉａｎｇ， Ｊ−Ｓ．， Ｋｕｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ．， Ｎｉｇｅｌｓ， Ｍ．， Ｐａｎｎｕ， Ｎ． Ｓ．， Ｒｅａｄ， Ｒ． Ｊ．， Ｒｉｃｅ， Ｌ． Ｍ．， Ｓｉｍｏｎｓｏｎ， Ｔ．， ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ， Ｇ． Ｌ．． （１９９８） Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．， Ｄ５４， ９０５−９２１．
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ ４ （１９９４） Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ ： Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓ． ｔ Ｄ５０， ７６０−７６３．
Ｊｏｎｅｓ， Ａ． Ｔ ａｎｄ Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ， Ｍ． （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７７， １７３−２０８．
Ｋｌｅｙｗｅｇｔ Ｇ． Ｊ． ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｔ． Ａ． （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７７， ５２５−５４５．
Ｋｌｅｙｗｅｇｔ Ｇ． Ｊ．， （１９９５） ＥＳＦ／ＣＣＰ４ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ３１， ４５−５０．
Ｍｉｎｏｒ， Ｗ． ＸＤＩＳＰＬＡＹＦ ｐｒｏｇｒａｍ， Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （１９９３）．
Ｎａｖａｚａ， Ｊ． （１９９４） Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ａ５０， １５７−１６３．
実施例３：Ｔｉｅ−２阻害薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験
前記蛋白キナーゼ阻害における化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力は、以下に詳細に説明する手順によって求めることができる。
【０１９８】
化合物の効力は、対照と比較した被験化合物による外因性基質（例：合成ペプチド（Ｚ． Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． ３７３ ： ５３６−５３９）のリン酸化阻害量によって求めることができる。
【０１９９】
ヒトＴｉｅ−２キナーゼの製造および精製
ヒトＴｉｅ−２細胞内領域のコード配列（ａａ７７５〜１１２４）を、鋳型としてのヒト胎盤から単離したｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって形成した。Ｎ末端にポリ−Ｈｉｓ６配列を導入し、その構築物をＸｂａ１およびＮｏｔ１部位でトランスフェクションベクターｐＶＬ１９３９にクローニングした。バキュロゴールド・トランスフェクション（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いる同時トランスフェクションによって、組換えＢＶを形成した。組換えＢＶをプラーク精製し、ウェスタン分析によって特定した。蛋白産生用に、ＳＦ−９昆虫細胞を２×１０６／ｍＬにてＳＦ−９００−ＩＩ培地で増殖させ、ＭＯＩ　０．５で感染させた。スクリーニングに用いられるＨｉｓ標識キナーゼの精製は、ＫＤＲについて記載のものと同様に行った。
【０２００】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ入手源
ＥＧＦＲはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入し（カタログ番号Ｅ−３６４１；５００単位／５０リットル）、ＥＧＦリガンドはオンコジーン・リサーチ・プロダクツ／カルバイオケム（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手した（カタログ番号ＰＦ０１１−１００）。
【０２０１】
ＰＴＫのための酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、チロシンキナーゼ活性の存在を検出し、測定した。ＥＬＩＳＡは、例えばボラーらの著作（Ｖｏｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８０，″Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，″Ｉｎ ： Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｄ ｅｄ．， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ， ｐｐ ３５９−３７１ Ａｍ． Ｓｏｃ． ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ．）に記載の公知のプロトコールに従って実施した。
【０２０２】
開示のプロトコールには、特定のＰＴＫに関する活性の測定用に変更を加えた。例えば、ＥＬＩＳＡ実験を実施する上で好ましいプロトコールを以下に示す。受容体ＰＴＫファミリーの他の構成員ならびに非受容体チロシンキナーゼについての化合物の活性を測定するためのこれらプロトコールにおける変更は、当業者の能力の範囲内である。阻害薬選択性の測定に関しては、汎用ＰＴＫ基質（例：ポリ（Ｇｌｕ４Ｔｙｒ）のランダムコポリマー、ＭＷ２００００〜５００００）を、アッセイにおける見かけのＫｍの約２倍の濃度のＡＴＰ（代表的には５μＭ）とともに用いた。
【０２０３】
以下の手順を用いて、本発明の化合物のＴｉｅ−２チロシンキナーゼ活性に対する阻害効果のアッセイを行った。
【０２０４】
緩衝液および溶液： ＰＧＴＰｏｌｙ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１。
【０２０５】
粉末を−２０℃で保存する。粉末を、５０ｍｇ／ｍＬ溶液となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かす。小分けサンプル１ｍＬずつを−２０℃で保存する。平板を作る際には、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＰＢＳで２５０ｇ／ｍＬまで希釈する。
【０２０６】
反応緩衝液：１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４ｍＭ　ＭｎＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２％ＢＳＡ、２００Ｍ　ＮａＶＯ４、ｐＨ７．１０。
【０２０７】
ＡＴＰ：１００ｍＭの小分けサンプルを−２０℃で保存する。水で２０μＭまで希釈する。
【０２０８】
洗浄緩衝液：０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ。
【０２０９】
抗体希釈緩衝液：０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液。
【０２１０】
ＴＭＢ基質：使用直前にＴＭＢ基質と過酸化物溶液を９：１で混合するか、あるいはネオゲン（Ｎｅｏｇｅｎ）からのＫ−Ｂｌｕｅ基質を用いる。
【０２１１】
停止溶液：１Ｍリン酸。
【０２１２】
手順１．平板準備
ＰＧＴ原液（５０ｍｇ／ｍＬ、冷凍）をＰＢＳで希釈して、２５０μｇ／ｍＬとする。コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の調整平底高アフィニティーＥＬＩＳＡ平板（コーニング＃２５８０５−９６）のウェル当たり１２５μＬを加える。ＰＢＳ　１２５μＬをブランクウェルに加える。密閉テープで覆い、３７℃で終夜インキュベートする。洗浄緩衝液２５０μＬで１回洗浄し、３７℃の乾燥インキュベータで約２時間乾燥する。コーティングされた平板を、用時まで４℃の密封袋中で保存する。
【０２１３】
２．チロシンキナーゼ反応：
−２０％ ＤＭＳＯ水溶液中にて４倍濃度の阻害薬溶液を調製する。
【０２１４】
−反応緩衝液を調製する。
【０２１５】
−酵素溶液を調製して、所望の単位が５０μＬ中に含まれるようにする。例えばＫＤＲの場合には、１ｎｇ／Ｌとして、反応においてウェル当たり総量が５０ｎｇとなるようにする。氷上で保存する。
【０２１６】
−４倍ＡＴＰ溶液を、１００ｍＭ原液水溶液から２０μＭとする。氷上で保存する。
【０２１７】
−ウェル当たり酵素溶液５０μＬを加える（代表的には、キナーゼの比活性に応じて、酵素５〜５０ｎｇ／ウェル）。
【０２１８】
−４倍阻害薬２５μＬを加える。
【０２１９】
−阻害薬アッセイ用に４倍ＡＴＰ２５μＬを加える。
【０２２０】
−室温で１０分間インキュベートする。
【０２２１】
−ウェル当たり０．０５Ｎ　ＨＣｌを５０μＬ加えることで反応停止する。
【０２２２】
−平板を洗浄する。
【０２２３】
＊＊反応における最終濃度：ＡＴＰ　５μＭ、ＤＭＳＯ　５％。
【０２２４】
３．抗体結合
−２段階希釈によって（１００倍、次に２００倍）、ＰＹ２０−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）抗体（ホスホチロシン抗体）の小分けサンプル１ｍｇ／ｍＬを、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で５０ｎｇ／ｍＬに希釈する。
【０２２５】
−ウェル当たりＡｂ　１００μＬを加える。室温で１時間インキュベートする。４℃で１時間インキュベートする。
【０２２６】
−４倍平板を洗浄する。
【０２２７】
４．発色反応
−ＴＭＢ基質を調製し、ウェル当たり１００μＬを加える。
【０２２８】
−０．６に達するまで、６５０ｎｍでＯＤをモニタリングする。
【０２２９】
−１Ｍリン酸で停止する。平板読読取装置上で振盪する。
【０２３０】
−４５０ｎｍでただちにＯＤを読み取る。
【０２３１】
至適なインキュベーション時間および酵素反応条件は、酵素調製物によって若干変動するものであり、各ロットについて経験的に決定する。
【０２３２】
実施例４：Ｔｉｅ−２阻害薬の効力を測定するための細胞アッセイ
以下の細胞アッセイを用いて、Ｔｉｅ−２阻害薬の効力を測定することができる。
【０２３３】
「ＮＩＨ−３Ｔ３／ｈＴＥＫ細胞系
全長Ｔｉｅ−２ｃＤＮＡを含むレトロウィルス発現ベクターであるＬＮＣＸ６　ｈ−ＴＥＫは、ケビン・ピータース博士（Ｄｒ． Ｋｅｖｉｎ Ｐｅｔｅｒｓ）から提供を受けた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍形成性下位系統を、リン酸カルシウム沈殿法により、ＬＮＣＸ６　ｈ−ＴＥＫ１０ｉｇでトランスフェクションし、４００ｉｇ／ｍＬのネオマイシンで選択する。個々のクローンを単離し、ウェスタンブロッティングによってＴｉｅ−２蛋白の有無を分析した。Ｔｉｅ−２の最大発現は、クローン番号６７で認められた。アンギオポイエチン１メッセージの発現がＰＣＲを用いて示されており、自己分泌ループがバナジウム酸の存在で明らかである。
【０２３４】
細胞Ｔｉｅ−２アッセイ
Ｔｉｅ−２細胞自己リン酸化を、ＮＩＨ−３Ｔ３／ｈＴＥＫ（ｈＴＥＫ）細胞系を用いて測定した。細胞を９６ウェルプレートに終夜接種した。培地を除去し、細胞を阻害薬で２０分間、ホスファターゼ阻害薬ＮａＶＯ３（２ｍＭ）でさらに１５分間処理した。細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、溶解物を特異的ａ−Ｔｉｅ−２モノクローナル抗体（ＫＰ３３、ケビン・ピータース博士提供）を用いて免疫沈殿させ、免疫沈殿蛋白についてＳＤＳ　ＰＡＧＥを行った。次に、Ｔｉｅ２蛋白でのホスホチロシンレベルを、ウェスタンブロットでのａ−ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって求めた。フィルムを走査し、未処理対照と比較した阻害％を測定した。」
【０２３５】
均等物
以上、本発明について詳細に示し、本発明の好ましい実施形態を参照しながら説明したが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、形式および詳細についての各種変更を行うことが可能であることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトＴｉｅ−２のアミノ酸配列（配列番号１）を表す図である。
【図２】
アミノ酸８０２からアミノ酸１１２４のヒトＴｉｅ−２の触媒領域を有し、アミノ酸９６４に触媒不活性な点変異を有するアミノ酸配列（配列番号２）を表す図である。
【図３Ａ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｂ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｃ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｄ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｅ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｆ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｇ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｈ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｉ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｊ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｋ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｌ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｍ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｎ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｏ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｐ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｑ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｒ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｓ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｔ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｕ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｖ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｗ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｘ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｙ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３Ｚ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＡＡ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＢＢ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＣＣ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＤＤ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＥＥ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＦＦ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＧＧ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＨＨ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＩＩ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＪＪ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＫＫ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＬＬ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＭＭ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＮＮ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図３ＯＯ】
配列番号２／阻害薬Ｉ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ａ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｂ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｃ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｄ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｅ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｆ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｇ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｈ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｉ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｊ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｋ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｌ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｍ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｎ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｏ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｐ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｑ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｒ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｓ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｔ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｕ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｖ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｗ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｘ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｙ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４Ｚ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＡＡ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＢＢ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＣＣ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＤＤ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＥＥ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＦＦ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＧＧ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＨＨ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＩＩ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＪＪ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＫＫ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＬＬ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＭＭ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＮＮ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図４ＯＯ】
配列番号２／阻害薬ＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ａ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｂ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｃ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｄ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｅ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｆ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｇ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｈ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｉ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｊ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｋ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｌ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｍ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｎ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｏ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｐ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｑ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｒ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｓ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｔ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｕ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｖ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｗ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｘ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｙ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５Ｚ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＡＡ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＢＢ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＣＣ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＤＤ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＥＥ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＦＦ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＧＧ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＨＨ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＩＩ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＪＪ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＫＫ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＬＬ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＭＭ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＮＮ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＯＯ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＰＰ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＱＱ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図５ＲＲ】
配列番号２／阻害薬ＩＩＩ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ａ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｂ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｃ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｄ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｅ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｆ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｇ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｈ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｉ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｊ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｋ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｌ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｍ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｎ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｏ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｐ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｑ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｒ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｓ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｔ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｕ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｖ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｗ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｘ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｙ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６Ｚ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＡＡ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＢＢ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＣＣ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＤＤ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＥＥ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＦＦ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＧＧ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＨＨ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＩＩ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＪＪ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＫＫ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＬＬ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＭＭ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図６ＮＮ】
配列番号２／阻害薬ＩＶ複合体の原子座標を示す図である。
【図７】
原型キナーゼであるインシュリン受容体キナーゼの構造を示す図である。
【図８】
Ｔｉｅ−２の触媒領域と相互作用するピロロピリミジン阻害薬（すなわち、阻害薬Ｉ）の領域を示す図である。
【図９】
阻害薬Ｉに結合したＴｉｅ−２の触媒領域のモデルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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