(57)【要約】式（Ｉ）で示されるピリジル置換トリアゾール［式中、Ｒ１は、ハロ、−Ｏ−Ｃ１―６アルキル、−Ｓ−Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６ハロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、シアノ、フェニル、およびＣＯ２Ｒからなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基により置換されていてもよいナフチルまたはフェニルであり、ここで、Ｒは、水素またはＣ１―６アルキルであり、ｎは、０、１、２または３であるか；またはＲ１は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子３個までを含有していてもよく、ＮがさらにＣ１―６アルキルにより置換されていてもよい５〜７員芳香環または非芳香環と縮合しているフェニルであり；Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルコキシ、フェニル、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、ＮＨ−Ｃ１―６アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＮＨＲおよびＳＯ２ＮＨＲであり；Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つは、Ｎであり、残りは、ＮＲ３であり、ここで、Ｒ３は、水素、Ｃ１―６アルキル、Ｃ３―７シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）ｐＣＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ（ＯＲ６）２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、（ＣＨ２）ｐＮＨＣＯＲ７または（ＣＨ２）ｐＮＲ８Ｒ９であり；Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素またはＣ１―６アルキルであり；Ｒ６は、Ｃ１―６アルキルであり；Ｒ７は、Ｃ１―７アルキル、または置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリールＣ１―６アルキルもしくはヘテロアリールＣ１―６アルキルであり；Ｒ８およびＲ９は、独立して、水素、Ｃ１―６アルキル、アリールおよびアリールＣ１―６アルキルから選択され；ｐは、０〜４であり；ｑは、１〜４である］およびその塩および溶媒和物、ならびにそれらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、および医薬におけるそれらの使用が開示されている。
2004517069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004517069.tif 000026
［式中、Ｒ１は、ハロ、−Ｏ−Ｃ１―６アルキル、−Ｓ−Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６ハロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、シアノ、フェニル、およびＣＯ２Ｒからなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基により置換されていてもよいナフチルまたはフェニルであり、ここで、Ｒは、水素またはＣ１―６アルキルであり、ｎは、０、１、２または３であるか；またはＲ１は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子３個までを含有していてもよく、ＮがさらにＣ１―６アルキルにより置換されていてもよい５〜７員の芳香環または非芳香環と縮合しているフェニルであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルコキシ、フェニル、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、ＮＨ−Ｃ１―６アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＮＨＲおよびＳＯ２ＮＨＲであり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つは、Ｎであり、残りは、ＮＲ３であり、ここで、Ｒ３は、水素、Ｃ１―６アルキル、Ｃ３―７シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）ｐＣＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ（ＯＲ６）２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、（ＣＨ２）ｐＮＨＣＯＲ７または（ＣＨ２）ｐＮＲ８Ｒ９であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素またはＣ１―６アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１―６アルキルであり；
Ｒ７は、Ｃ１―７アルキル、または置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリールＣ１―６アルキルもしくはヘテロアリールＣ１―６アルキルであり；
Ｒ８およびＲ９は、独立して、水素、Ｃ１―６アルキル、アリールおよびアリールＣ１―６アルキルから選択され；
ｐは、０〜４であり；
ｑは、１〜４である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１がハロ、Ｃ１―６アルコキシ、Ｃ１―６アルキルチオ、およびフェニルから選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよいフェニルであるか；またはＲ１が、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子２個までを含有していてもよく、ＮがさらにＣ１―６アルキルにより置換されていてもよい５〜７員芳香環または非芳香環と縮合されているフェニルである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が４−メトキシフェニル、３−クロロフェニル、３−フルオロ−４−メトキシフェニルまたは３−クロロ−４−メトキシフェニルを表すか、またはＲ１がベンゾ［１，２，５］チアジアゾリル、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジル、ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル、ベンゾイミダゾリルまたはＣ１―６アルキルベンゾイミダゾリルを表す請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２がピリジル環の窒素原子に対してオルト位に位置する請求項１〜３いずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がメチルである請求項４記載の化合物。
【請求項６】
５−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール、
５−［２−エチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール、
６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン、
２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
１−メチル−６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−（２−エチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン、
６−（２−メチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン、
２−［５−（４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
２−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
２−［５−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、および
それらの医薬上許容される塩
から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩、および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
治療における請求項１〜６いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩または溶媒和物の使用。
【請求項９】
哺乳類におけるＡＬＫ５受容体により媒介される疾患の治療用薬物の製造における請求項１〜６いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
【請求項１０】
哺乳類におけるＴＧＦ−βシグナリング経路の阻害方法であって、かかる処置を必要とする哺乳類に治療上有効量の請求項１〜６いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項１１】
慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎疾患、うっ血性心不全、潰瘍、眼障害、角膜創傷、糖尿病性ネフロパシー、神経学的な機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜および皮下癒着、肺線維症および肝線維症を含むがそれらに限定されない線維症が主要成分であるいずれもの疾患、ならびに再狭窄から選択される疾患の治療方法であって、かかる治療を必要とする哺乳類に治療上有効量の請求項１〜６いずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項１２】
哺乳類におけるマトリックス形成の阻害方法であって、哺乳類に、治療上有効量の請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ」）−βシグナリング経路、特に、ＴＧＦ−βＩ型またはアクチビン様キナーゼ（「ＡＬＫ」）−５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害剤であるピリジル置換トリアゾール類、それらの製造方法、ならびに医薬における、特に、この経路により媒介される病態の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
ＴＧＦ−β１は、一群の１回膜貫通型セリン／トレオニンキナーゼ受容体を介してシグナリングする、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質およびミュラー抑制物質を包含する一群のサイトカインのファミリーのプロトタイプのメンバーである。これらの受容体は、Ｉ型またはアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体とＩＩ型受容体との２つに分類され得る。ＡＬＫ受容体は、ＡＬＫ受容体が（ａ）セリン／トレオニンに富む細胞内末端を欠いており、（ｂ）Ｉ型受容体間で非常に相同であるセリン／トレオニンキナーゼドメインを有しており、かつ、（ｃ）グリシン残基およびセリン残基に富む領域からなるＧＳドメインと称される共通の配列モチーフを共有するという点でＩＩ型受容体と区別される。ＧＳドメインは、細胞内キナーゼドメインのアミノ末端部にあり、ＩＩ型受容体による活性化にとって重大な意味をもつ。ＴＧＦ−βシグナリングがＡＬＫ受容体およびＩＩ型受容体の両方を必要とすることを示した研究がいくつかある。具体的には、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βの存在下にてＴＧＦ−βに対するＩ型受容体、ＡＬＫ５のＧＳドメインをリン酸化する。次いで、ＡＬＫ５は、２つのカルボキシ末端セリンで細胞質タンパク質ｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３をリン酸化する。リン酸化されたｓｍａｄタンパク質は、核中に移動し、細胞外マトリックスの産生に寄与する遺伝子を活性化する。したがって、本発明の好ましい化合物は、それらがＩ型受容体を阻害し、かくして、マトリックス産生を阻害するという点で選択的である。
【０００３】
ＴＧＦ−β１軸の活性化および細胞外マトリックスの増大は、慢性腎疾患および血管疾患の発生および進行への初期および持続的寄与因子である。ＢｏｒｄｅｒＷ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９４；３３１（１９），１２８６―９２。さらに、ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β１受容体ＡＬＫ５によるｓｍａｄ３リン酸化の作用を介して、硬化性沈着物の成分であるフィブロネクチンおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１の形成において役割を果たす。ＺｈａｎｇＹ．，ｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８；３９４（６６９６），９０９―１３；ＵｓｕｉＴ．，ｅｔａｌ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９８；３９（１１），１９８１―９。
【０００４】
腎臓および心臓血管系における進行性線維症は、罹患および死亡の主要原因であり、保健医療費への重大な寄与因子である。ＴＧＦ−β１は、多くの腎線維症性障害に関係付けられた。ＢｏｒｄｅｒＷ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９４；３３１（１９），１２８６―９２。ＴＧＦ−β１は、急性および慢性糸球体腎炎（ＹｏｓｈｉｏｋａＫ．，ｅｔａｌ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９３；６８（２），１５４―６３）、糖尿病性ネフロパシー（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔａｌ，１９９３，ＰＮＡＳ９０，１８１４―１８１８）、同種異系移植片拒絶反応、ＨＩＶネフロパシーおよびアンギオテンシン誘発性ネフロパシー（ＢｏｒｄｅｒＷ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９４；３３１（１９），１２８６―９２）において上昇する。これらの疾患において、ＴＧＦ−β１発現のレベルは、細胞外マトリックスの産生と一致する。３つの系の証明は、ＴＧＦ−β１とマトリックスの産生との間の因果関係を示唆している。第一に、正常な糸球体、糸球体間質細胞および非腎細胞は、インビトロにて外因性ＴＧＦ−β１により、細胞外マトリックスタンパク質を産生し、かつ、プロテアーゼ活性を阻害するように誘発され得る。第二に、ＴＧＦ−β１に対する中和抗体は腎炎のラットにおける細胞外マトリックスの蓄積を阻止し得る。第三に、ＴＧＦ−β１トランスジェニックマウスまたはＴＧＦ−β１遺伝子の正常なラットの腎臓へのインビボトランスフェクションは、急速に糸球体硬化症を発生させた。ＫｏｐｐＪ．Ｂ．，ｅｔａｌ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９６；７４（６），９９１―１００３。かくして、ＴＧＦ−β１活性の阻害は、慢性腎疾患における治療介入として指示される。
【０００５】
ＴＧＦ−β１およびその受容体は、損傷血管において増加し、バルーン血管形成術後の新生内膜形成において示される。ＳａｌｔｉｓＪ．，ｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６；２３（３），１９３―２００。加えて、ＴＧＦ−β１は、インビトロにおける平滑筋細胞（「ＳＭＣ」）移動の強力な刺激因子であり、動脈壁におけるＳＭＣの移動は、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の発生における寄与因子である。さらにまた、総コレステロールに対する内皮細胞産生物の多変量解析において、ＴＧＦ−β受容体ＡＬＫ５は、総コレステロールと相関関係にあった（Ｐ＜０．００１）。ＢｌａｎｎＡ．Ｄ．，ｅｔａｌ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９９６；１２０（１―２），２２１―６。さらにまた、ヒトアテローム性動脈硬化型病変由来のＳＭＣは、ＡＬＫ５／ＴＧＦ−βＩＩ型受容体比が増大する。ＴＧＦ−β１は、線維増殖性血管病変において過剰発現するので、受容体バリアント細胞は、ゆっくりであるが制御されない様式で増殖させられ、細胞外マトリックス成分を過剰産生する。ＭｃＣａｆｆｒｅｙＴ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｊｒ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９５；９６（６），２６６７―７５。ＴＧＦ−β１は、活性なマトリックス合成が生じるアテローム性動脈硬化型病変において非泡沫状マクロファージに免疫局在化され、これは、非泡沫状マクロファージがＴＧＦ−β依存性メカニズムを介するアテローム性動脈硬化型リモデリングにおけるマトリックス遺伝子発現のモジュレーションに関与し得ることを示唆している。したがって、ＴＧＦ−β１のＡＬＫ５に対する作用を阻害することは、また、アテローム性動脈硬化症および再狭窄においても指示される。
【０００６】
ＴＧＦ−βは、また、創傷修復においても指示される。ＴＧＦ−β１に対する中和抗体を数々のモデルにおいて使用して、ＴＧＦ−β１シグナリングの阻害が治癒過程の間の過剰な瘢痕形成を制限することにより損傷後の機能の回復において有益であることが示された。例えば、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２に対する中和抗体は、ラットにおいて単球およびマクロファージの数を減少させ、皮膚フィブロネクチンおよびコラーゲン沈着を減少させることにより、瘢痕形成を減少させ、新真皮の細胞構築を改善した（ＳｈａｈＭ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１９９５，１０８，９８５―１００２）。さらにまた、ＴＧＦ−β抗体は、また、ウサギにおける角膜創傷の治癒を改善し（Ｍｏｌｌｅｒ―ＰｅｄｅｒｓｅｎＴ．，Ｃｕｒｒ．ＥｙｅＲｅｓ．，１９９８，１７，７３６―７４７）、ラットにおける胃潰瘍の創傷治癒を促進する（ＥｒｎｓｔＨ．，Ｇｕｔ，１９９６，３９，１７２―１７５）。これらのデータは、ＴＧＦ−βの活性を制限することが多くの組織において有益であることを強く示唆しており、ＴＧＦ−βが慢性的に上昇するいずれもの疾患がｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３シグナリング経路を阻害することにより利益を得ることを示唆している。
【０００７】
ＴＧＦ−βは、また、腹膜癒着に関係付けられている（ＳａｅｄＧ．Ｍ．，ｅｔａｌ，ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，１９９９Ｎｏｖ―Ｄｅｃ，７（６），５０４―５１０）。したがって、ＡＬＫ５の阻害剤は、術後の腹膜および皮下の線維症性癒着の予防において有益である。
【０００８】
意外にも、この度、一群の２−ピリジル置換トリアゾール化合物がＡＬＫ５キナーゼの強力なかつ選択的な非ペプチド阻害剤として機能し、したがって、慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎疾患、うっ血性心不全、潰瘍、眼障害、角膜創傷、糖尿病性ネフロパシー、神経学的な機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜および皮下癒着、肺線維症および肝線維症を包含するがそれらに限定されない線維症が主要成分であるいずれもの疾患、ならびに再狭窄のようなＡＬＫ５キナーゼメカニズムにより媒介される種々の病態の治療および予防における有用性を有するという知見を得た。
【０００９】
本発明によると、式（Ｉ）：
【化１】
2004517069.tif 000003
［式中、Ｒ１は、ハロ、−Ｏ−Ｃ１―６アルキル、−Ｓ−Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６ハロアルキル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、シアノ、フェニル、およびＣＯ２Ｒからなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基により置換されていてもよいナフチルまたはフェニルであり、ここで、Ｒは、水素またはＣ１―６アルキルであり、ｎは、０、１、２または３であるか；またはＲ１は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子３個までを含有していてもよく、ＮがさらにＣ１―６アルキルにより置換されていてもよい５〜７員の芳香環または非芳香環と縮合しているフェニルであり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルコキシ、フェニル、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、ＮＨ−Ｃ１―６アルキル、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＮＨＲおよびＳＯ２ＮＨＲであり；
別法として、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１―６アルキル、Ｃ１―６アルコキシ、フェニル、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ、ＮＨ−Ｃ１―６アルキル、またはハロであり；
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３のうちの２つは、Ｎであり、残りは、ＮＲ３であり、ここで、Ｒ３は、水素、Ｃ１―６アルキル、Ｃ３―７シクロアルキル、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）ｐＣＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ（ＯＲ６）２、−（ＣＨ２）ｐＯＲ４、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＮ、−（ＣＨ２）ｑ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＮＨＲ４Ｒ５、−（ＣＨ２）ｐＮＨＣＯＲ７または−（ＣＨ２）ｐＮＲ８Ｒ９であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素またはＣ１―６アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１―６アルキルであり；
Ｒ７は、Ｃ１―７アルキル、または置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、アリールＣ１―６アルキルもしくはヘテロアリールＣ１―６アルキルであり；
Ｒ８およびＲ９は、独立して、水素、Ｃ１―６アルキル、アリールおよびアリールＣ１―６アルキルから選択され；
ｐは、０〜４であり；
ｑは、１〜４である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩が提供される。
【００１０】
式（Ｉ）で示される化合物のトリアゾール環において、二重結合は、２つの非置換窒素に対してのものであることが理解されるであろう。
【００１１】
好ましくは、Ｒ１は、置換されていてもよいナフチルまたはフェニルである。より好ましくは、Ｒ１は、ハロ、Ｃ１―６アルコキシ、Ｃ１―６アルキルチオ、およびフェニルから選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよいフェニルであるか；または、Ｒ１は、Ｎ、ＯおよびＳから独立して選択されるヘテロ原子２個までを含有していてもよく、ＮがさらにＣ１―６アルキルにより置換されていてもよい５〜７員の芳香環または非芳香環と縮合しているフェニルである。例えば、Ｒ１は、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾリル、ベンゾ［１，２，５］チアジアゾリル、キノキサリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、Ｃ１―６アルキルベンゾイミダゾリル、または［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジルを表す。別法としては、Ｒ１は、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾ［１，２，５］オキサジアゾリル、ベンゾ［１，２，５］チアジアゾリル、キノキサリニルまたはジヒドロベンゾフラニルを表す。好ましくは、Ｒ１は、４−メトキシフェニル、３−クロロフェニル、３−フルオロ−４−メトキシフェニルもしくは３−クロロ−４−メトキシフェニルを表すか、またはＲ１は、ベンゾ［１，２，５］チアジアゾリル、［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジル、ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル、ベンゾイミダゾリルもしくはＣ１―６アルキルベンゾイミダゾリルを表す。
【００１２】
好ましくは、Ｒ２は、ピリジル環の窒素に対してオルト位に位置しており、Ｒ２は、好ましくは、メチル基である。
【００１３】
本発明の特定の化合物としては、以下の化合物およびその医薬上許容される塩が挙げられる：
５−［５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール、
５−［２−エチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール、
６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５ａ］ピリジン、
２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
１−メチル−６−［５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール、
６−（２−エチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン、
６−（２−メチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン、
２−［５−（４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、
２−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン、および
２−［５−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン。
【００１４】
式（Ｉ）で示される化合物の適当な医薬上許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、および硝酸塩のような無機酸との塩、またはリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パルミチン酸塩、サリチル酸塩、およびステアリン酸塩のような有機酸との塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明の化合物は、水性溶媒および有機溶媒のような溶媒から結晶化または再結晶され得る。このような場合、溶媒和物が形成され得る。本発明は、その範囲内に、水和物を包含する化学量論的溶媒和物、および凍結乾燥のような処理により生成され得る可変量の水を含有する化合物を包含する。
【００１６】
式（Ｉ）で示されるある種の化合物は、ジアステレオ異性体、および、例えば、ラセミ混合物のようなあらゆる比率の異性体混合物などの光学異性体の形態で存在し得る。本発明は、かかる形態の全て、特に、純粋な異性体を包含する。異なる異性体を慣用的な方法により互いに分離または分割し得るか、または所定の異性体を慣用的な合成法により、または、立体特異的合成法もしくは不斉合成法により得ることができる。
【００１７】
式（Ｉ）で示される化合物は、医薬組成物において使用しようとするものであるので、それらは、各々、好ましくは、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも純度６０％、より適当には、少なくとも純度７５％、好ましくは、少なくとも純度８５％、特に、少なくとも純度９８％（％は、重量対重量に基づく）で提供されることが容易に理解されるであろう。当該化合物の不純物を含む調製物は、医薬組成物において使用される純粋な形態を調製するのに使用され得る；当該化合物のこれらのあまり純粋ではない調製物は、式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される誘導体を少なくとも１％、より適当には、少なくとも５％、好ましくは、１０〜５９％含有すべきである。
【００１８】
本明細書で使用される用語「Ｃ１―６アルキル」および「Ｃ１―７アルキル」は、それら自体についてであっても、またはＣ１―６アルコキシのような大きな基の一部としてであっても、鎖長が限定されない限り、各々、炭素原子１〜６個および１〜７個の直鎖または分枝鎖の基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
Ｃ１―６ハロアルキル基は、１個またはそれ以上のハロ原子を含有し得、特定のＣ１―６ハロアルキル基としては、ＣＦ３が挙げられる。
【００２０】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、本明細書において互換性をもって、塩素原子、フッ素原子、ヨウ素原子および臭素原子に由来する基を意味するように使用される。
【００２１】
用語「シクロアルキル」は、本明細書において、環状基、好ましくは、炭素３〜７個の環状基を意味するように使用され、シクロプロピル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
用語「アリール」は、本明細書において、二環系または三環系を包含し得る５員〜１４員の置換または非置換芳香環または芳香環系を意味するように使用され、フェニル、ナフチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
用語「ＡＬＫ５阻害剤」は、本明細書において、ｐ３８またはＩＩ型受容体よりも優先的にＡＬＫ５受容体を選択的に阻害する、ｓｍａｄ６およびｓｍａｄ７のような阻害性ｓｍａｄ以外の化合物を意味するように使用される。
【００２４】
用語「ＡＬＫ５媒介病態」は、本明細書において、ＡＬＫ５により媒介（またはモジュレート）されるいずれもの病態、例えば、ＴＧＦ−１βシグナリング経路におけるｓｍａｄ２／３のリン酸化の阻害によりモジュレートされる疾患を意味するように使用される。
【００２５】
用語「潰瘍」は、本明細書において、糖尿病性潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍を包含するように使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
式（Ｉ）で示される化合物は、公知または市販の出発物質から技術的に認知されている手順により製造され得る。出発物質が商業的供給源から入手不可能である場合、それらの合成法は本明細書に記載されているか、または、それらは、当該技術分野で知れている手順により製造され得る。
【００２７】
具体的には、式（Ｉ）で示される化合物は、スキーム１に例示するように製造され得る。
【００２８】
ヨウ化銅（Ｉ）の存在下、パラジウム触媒を使用して臭化アリールをトリメチルシリルアセチレンとカップリングさせる。次いで、該トリメチルシリル基を、炭酸カリウムを用いて塩基性条件下にて除去し、遮蔽されていない末端アセチレンを、パラジウム触媒を介して置換ブロモピリジンとカップリングさせる。二置換アセチレンをトリメチルシリルアジドで処理してトリアゾールを得、これを、炭酸カリウムの存在下、適当なアルキル化剤Ｌ−Ｒ３（ここで、Ｌは、離脱基、例えば、Ｉである）でアルキル化することができる。得られた異性体をクロマトグラフィー法により分離することができる。
【００２９】
【化２】
2004517069.tif 000004
【００３０】
【化３】
2004517069.tif 000005
【００３１】
別法として、二置換アセチレン中間体は、適当な１−アリール−２−ピリジルエタノンをＨｕｅｎｉｇ塩基およびトリフルオロメタンスルホン酸無水物で処理することにより製造され得る。１−アリール−２−ピリジルエタノンは、ＷＯ００／６１５７６に記載されている手順に従って製造され得る。
【００３２】
式（Ｉ）で示される化合物の合成の間、中間化合物における不安定な官能基、例えば、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノ基は保護され得る。種々の不安定な官能基の保護方法および得られた保護誘導体の開裂方法は、例えば、ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅａｎｄＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，（Ｗｉｌｅｙ―Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１）において包括的に検討されている。
【００３３】
式（Ｉ）で示される化合物の製造については、以下の実施例において詳細に記載される。
【００３４】
式（Ｉ）で示される化合物は、個々に、または、式（Ｉ）で示される化合物を少なくとも２種類、例えば、５〜１，０００種類、より好ましくは、１０〜１００種類含む化合物ライブラリーとして製造され得る。式（Ｉ）で示される化合物のライブラリーは、当業者に知られている手順によるコンビナトリアル「スプリット・アンド・ミックス」法または液相化学もしくは固相化学のいずれかを使用するマルチプル・パラレル合成法により製造され得る。
【００３５】
かくして、本発明のさらなる態様によると、式（Ｉ）で示される少なくとも２種類の化合物またはそれらの医薬上許容される塩を含む化合物ライブラリーが提供される。
【００３６】
本発明の別の態様において、治療における式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用が提供される。
【００３７】
本発明のさらなる態様によると、哺乳類におけるＡＬＫ５受容体により媒介される疾患の治療用薬物の製造における式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の使用が提供される。
【００３８】
ＡＬＫ５媒介病態としては、慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎疾患、うっ血性心不全、潰瘍、眼障害、角膜創傷、糖尿病性ネフロパシー、神経学的な機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜および皮下癒着、肺線維症および肝線維症を含むがそれらに限定されない線維症が主要成分であるいずれもの疾患、ならびに再狭窄が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
用語「治療」は、予防的処置または治療的処置のいずれも意味する。
【００４０】
本発明のさらなる態様によると、哺乳類におけるＴＧＦ−βシグナリング経路の阻害方法、例えば、Ｉ型またはアクチビン様キナーゼＡＬＫ５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害方法が提供される。
【００４１】
本発明のさらなる態様によると、ＴＧＦ−βシグナリング経路の阻害、例えば、Ｉ型またはアクチビン様キナーゼＡＬＫ５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害による哺乳類におけるマトリックス形態の阻害方法が提供される。
【００４２】
式（Ｉ）で示される医薬上有効な化合物およびその医薬上許容される塩は、当該技術分野において周知の慣用的な手順に従って、式（Ｉ）で示される化合物と標準的な医薬担体または希釈剤とを合わせることにより調製される慣用の投与剤形で投与され得る。これらの手順は、所望の製剤に適当なように、成分を混合すること、造粒すること、および圧縮することまたは溶解することを含む。
【００４３】
本発明のさらなる態様によると、式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩、および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、いずれの経路による投与のためにも処方され得、ヒトを包含する哺乳類への経口投与、局所投与、または非経口投与に適した剤形のものが挙げられる。
【００４５】
当該組成物は、いずれの経路による投与のためにも処方され得る。当該組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジ剤、クリーム剤、または経口もしくは滅菌非経口液剤または懸濁剤のような液体製剤の剤形であり得る。
【００４６】
本発明の局所処方物は、例えば、軟膏剤、クリーム剤またはローション剤、眼軟膏剤および点眼剤または点耳剤、含浸包帯剤、ならびにエアゾール剤として提供され得、保存剤、薬物浸透を補助するための溶媒、ならびに軟膏剤およびクリーム剤における皮膚軟化剤のような適当な慣用の添加剤を含有し得る。
【００４７】
当該処方物は、また、クリームまたは軟膏基剤およびローション剤のためのエタノールまたはオレイルアルコールのような適合する慣用の担体を含有し得る。かかる担体は、処方物の約１％から約９８％まで存在し得る。より通常は、それらは、処方物の約８０％までを構成する。
【００４８】
経口投与用錠剤およびカプセル剤は、単位投与剤形であり得、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤化用滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン；またはラウリル硫酸ナトリウムのような許容される湿潤剤などの慣用的な賦形剤を含有し得る。該錠剤は、通常の製薬プラクティスにおける周知の方法に従って被覆され得る。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の剤形であり得るか、または、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元するための乾燥製剤として提供され得る。かかる液体製剤は、懸濁化剤、例えば、ソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用脂肪、乳化剤、例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアカシア；（食用油を含み得る）非水性ビヒクル、例えば、扁桃油、グリセリンのような油性エステル、プロピレングリコール、またはエチルアルコール；保存剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸、および所望により、慣用のフレーバーまたは着色剤などの慣用の添加剤を含有し得る。
【００４９】
坐剤は、慣用の坐剤基剤、例えば、カカオ脂または他のグリセリドを含有するであろう。
【００５０】
非経口投与については、流動性単位投与剤形は、当該化合物および無菌ビヒクル（水が好ましい）を使用して調製される。当該化合物は、ビヒクルおよび使用濃度に依存して、ビヒクルに懸濁または溶解され得る。液剤の調製において、当該化合物を注射用精製水に溶解し、濾過滅菌した後、適当なバイアルまたはアンプルに充填し、密封することができる。
【００５１】
有利には、局所麻酔薬、保存剤および緩衝化剤のような薬剤をビヒクルに溶解することができる。安定性を増強するために、当該組成物をバイアルに充填した後、冷凍し、水分を真空除去することができる。次いで、凍結乾燥粉末をバイアル中に密封し、使用前に、添付の注射用精製水バイアルを供給して液剤に戻すことができる。非経口懸濁剤は、当該化合物を溶解するのではなくビヒクルに懸濁させること、および滅菌を濾過により行うことができないこと以外は、実質的に同様に調製される。当該化合物は、無菌ビヒクルに懸濁させる前に酸化エチレンに曝露させることにより滅菌され得る。有利には、当該組成物に界面活性剤または湿潤剤を含有させて当該化合物の均一な分布を促進することができる。
【００５２】
当該組成物は、投与方法に依存して、活性物質を０．１重量％、好ましくは、１０〜６０重量％含有し得る。当該組成物が投与単位を含む場合、各単位は、好ましくは、活性成分５０〜５００ｍｇを含有するであろう。成人の治療に使用される投与量は、投与経路および投与回数に依存して、好ましくは、１日あたり１００〜３０００ｍｇの範囲、例えば、１日あたり１５００ｍｇであろう。かかる投与量は、１日あたり１．５〜５０ｍｇ／ｋｇに相当する。適当には、投与量は、１日あたり５〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００５３】
式（Ｉ）で示される化合物の個々の投与の最適な量および間隔が、処置される状態の性質および程度、投与形態、投与経路および投与部位、ならびに処置される個々の哺乳類により決定されるであろうということ、ならびに、かかる最適値が慣用的な技法により決定され得ることは当業者に認識されるであろう。最適な治療単位、例えば、所定の日数の間、１日あたりに投与される式（Ｉ）で示される化合物の投与回数を当業者が慣用の治療単位決定試験を使用して確かめることができることは、当業者により理解されるであろう。
【００５４】
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される誘導体を上記投与範囲で投与する場合、毒物学的効果は示されない。
【００５５】
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典明示により本明細書の一部とする。
【００５６】
以下の実施例は、単に例示的なものであり、如何なる場合も本発明の範囲を限定しようとするものではない。当該実施例において、マススペクトルは、化学的イオン化技法（ＣＩ）を用いてＨｉｔａｃｈｉＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＲＭＵ−６Ｅを使用して、または、エレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化技法を用いてＭｉｃｒｏｍａｓｓＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ装置を使用して行った。
【００５７】
略語
ＣＨ２Ｃｌ２−ジクロロメタン
ＤＭＦ−ジメチルホルムアミド
Ｅｔ３Ｎ−トリエチルアミン
ＥｔＯＡｃ−酢酸エチル
ＨＣｌ−塩酸
ＭｅＯＨ−メタノール
ＭｇＳＯ４−硫酸マグネシウム
Ｎａ２ＳＯ４−硫酸ナトリウム
ＴＨＦ−テトラヒドロフラン
ＴＭＳ−トリメチルシリル
ＴＭＥＤＡ−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン
【００５８】
実施例
実施例１：  ５−［５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール
【化４】
2004517069.tif 000006
５−（６−メチル−ピリジン−２−イルエチニル）−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール（３００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、それにトリメチルシリルアジド（４１５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物をアルゴン下にて１３０℃で還流させながら一夜加熱した。ＤＭＦを減圧除去した。残留物を酢酸エチルと水との間で分配した。酢酸エチル層を集め、乾燥させ、減圧濃縮した。標記化合物をＳＣＸカラムに付してメタノール性アンモニアで溶離して精製した（２６５ｍｇ、７５％）；１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．６２（３Ｈ，ｓ）、７．３２−７．４４（３Ｈ，マルチプレット）、７．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）、ＮＨは観察されなかった；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：２９５（ＭＨ＋）。
【００５９】
実施例２：  ５−［２−エチル−５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］−チアジアゾール
【化５】
2004517069.tif 000007
５−［５−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール（１２０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（８５ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）およびヨードエタン（４９μＬ、０．６１ｍｍｏｌ）で処理した。該反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、減圧下にて蒸発乾固させた。残留物を水と酢酸エチルとの間で分配させた。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下にて蒸発乾固させた。溶離液として酢酸エチルを使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより標記化合物を単離した（４０ｍｇ、３０％）；１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．６９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ）、２．５６（３Ｈ，ｓ）、４．６１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．５１（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：３２３（ＭＨ＋）。
【００６０】
実施例３：  ６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５ａ］ピリジン
【化６】
2004517069.tif 000008
６−エチニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジンから製造例４に従って製造した６−（６−メチルピリジン−２−イルエチニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン（２００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）をアルゴン下にて無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解した。これにトリメチルシリルアセチレンアジド（０．４ｍｌ、０．３４ｇ、３ｍｍｏｌ、３．５当量）を添加し、該溶液を１３０℃で１６時間還流した。溶媒を除去した後、残留物を水（３０ｍｌ）に溶解し、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水および食塩水（各々、２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去した。粗製生成物を、２ｍｌのＳＣＸ酸イオン交換カラムを使用することにより精製し、これをジクロロメタンで溶離し、次いで、ジクロロメタン：メタノール（１：１）で溶離し、最後に、メタノール中３％アンモニア（２０ｍｌ）で溶離して塩基性生成物を取り出し、橙色の固体生成物を得た（２５ｍｇ、１０％）。最小量のメタノールに該固体を溶解し、エーテル中１ＭＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈し、溶媒を除去することによりこの化合物の塩酸塩を調製して橙色の固体を得た；１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．６１（１Ｈ，ｂ．ｓ）、８．４０（１Ｈ，ｓ）、８．０４（１Ｈ，ｄ）、７．８０（１Ｈ，ｄ）、７．６６（２Ｈ，ｍ）、７．２０（１Ｈ，ｄ）、２．６１（３Ｈ，ｓ）、Ｎｈは観察されなかった；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２７６［Ｍ−Ｈ］―、２７８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００６１】
実施例４：  ２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン
【化７】
2004517069.tif 000009
実施例３の手順に従って、２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルエチニル）−６−メチルピリジンから製造した。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．５６（２Ｈ，ｍ）、７．４２（１Ｈ，ｓ）、７．３９（１Ｈ，ｄｄ）、７．１２（１Ｈ，ｄ）、６．８２（１Ｈ，ｄ）、４．６３（２Ｈ，ｔ）、３．２５（２Ｈ，ｔ）、２．６０（３Ｈ，ｓ）、ＮＨは観察されなかった；ｍ／ｚ：２７７．１［Ｍ−Ｈ］―、２７９［Ｍ＋Ｈ］＋
【００６２】
実施例５：  ２−［５−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチル−ピリジン
【化８】
2004517069.tif 000010
２−（２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルエチニル）−６−メチルピリジン（製造例９の手順に従って、１−（２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノンから製造した）（０．８３０ｇ、３．３０ｍｍｏｌ、１．０当量）の室温での乾燥ＤＭＦ７ｍｌ中撹拌溶液にアジドトリメチルシラン（１．３５ｍｌ、１．１４ｇ、９．９０ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加した。該溶液をアルゴン下にて６５℃で合計５日間加熱し、３日後にさらにアジドトリメチルシラン１ｍｌを添加した。該反応混合物を冷却し、減圧下にて蒸留することによりＤＭＦを除去した。残留物を水とＥｔＯＡｃとの間で分配し、層を分取した。有機相を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４にて乾燥させた。油状物に濃縮し、次いで、シリカ上にてフラッシュカラムクロマトグラフィーに付してＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：Ｅｔ３Ｎ（９５：４：１）で溶離して、濃い油状物として標記化合物０．６４９ｇ（６７％）を得た。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ：７．５７（１Ｈ，ｔ）、７．４４（１Ｈ，ｄ）、７．２７（２Ｈ，ｍ）、７．１５（１Ｈ，ｔ）、６．８９（１Ｈ，ｄ）、４．３２−４．２５（４Ｈ，ｍ）、２．５９（３Ｈ，ｓ）、ＮＨは観察されなかった；ｍ／ｚ［ＥＳＭＳ］：２９５．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００６３】
実施例６：  １−メチル−６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール
【化９】
2004517069.tif 000011
実施例３の手順に従って、１−メチル−６−（６−メチル−ピリジン−２−イル−エチニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールから製造した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ）、７．５３（２Ｈ，ｍ）、７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．８３（３Ｈ，ｓ）、２．５９（３Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：２９１（ＭＨ＋）。
【００６４】
実施例７：  ６−（２−エチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン
【化１０】
2004517069.tif 000012
実施例２の手順に従って、６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジンから製造した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．７２（１Ｈ，ｓ）、８．３７（１Ｈ，ｓ）、８．０７（１Ｈ，ｄ）、７．７５（１Ｈ，ｄ）、７．６７（２Ｈ，ｍ）、７．１８（１Ｈ，ｔ）、４．５９（２Ｈ，ｑ）、２．６０、（３Ｈ，ｓ）、１．６８（３Ｈ，ｔ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：３０６．３［Ｍ＋Ｈ］＋
【００６５】
実施例８：  ６−（２−メチル−５−（６−メチルピリジン−２−イル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン
【化１１】
2004517069.tif 000013
アルキル化剤としてヨードメタンを使用して、実施例２の手順に従って、６−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジンから製造した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．７１（１Ｈ，ｓ）、８．３７（１Ｈ，ｓ）、８．０５（１Ｈ，ｄｄ）、７．７５（１Ｈ，ｄ）、７．６７（２Ｈ，ｍ）、７．１８（１Ｈ，ｄｄ）、４．３２（３Ｈ，ｓ）、２．６１（３Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２９２．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００６６】
実施例９：  ２−［５−（４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン
【化１２】
2004517069.tif 000014
実施例３の手順に従って、２−（４−メトキシフェニルエチニル）−６−メチルピリジンから製造した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．８４（１Ｈ，ｔ）、７．５０（２Ｈ，ｍ）、７．３０（１Ｈ，ｄ）、６．９５（２Ｈ，ｍ）、３．８５（３Ｈ，ｓ）、２．７９（３Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２６７．２［Ｍ＋Ｈ＋］、２６５．１［Ｍ−Ｈ＋］
【００６７】
実施例１１：  ２−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン
【化１３】
2004517069.tif 000015
実施例３の手順に従って、２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニルエチニル）−６−メチルピリジン（３００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１当量）から製造した。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．５５（２Ｈ，ｍ）、７．４６（２Ｈ，ｍ）、７．１５（１Ｈ，ｄ）、６．９９（１Ｈ，ｔ）、３．９４（３Ｈ，ｓ）、２．５９（３Ｈ，ｓ）、ＮＨは観察されなかった。
【００６８】
実施例１２：  ２−［５−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−６−メチルピリジン
【化１４】
2004517069.tif 000016
実施例３の手順に従って、２−（３−クロロ−４−メトキシフェニルエチニル）−６−メチルピリジンから製造した。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９２（１Ｈ，ｔ）、７．６３（１Ｈ，ｄ）、７．５４（２Ｈ，ｍ）、７．３０（１Ｈ，ｄ）、６．９４（１Ｈ，ｄ）、３．９５（３Ｈ，ｓ）、２．７５（３Ｈ，ｓ）、ＮＨは観察されなかった。
【００６９】
製造例１：  ５−ブロモ−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール
【化１５】
2004517069.tif 000017
４−ブロモ−ベンゼン−１，２−ジアミン（１７ｇ、９１ｍｍｏｌ）に塩化チオニル（２００ｍｌ）を添加した。該反応混合物にＤＭＦ１滴を添加した。該反応混合物をアルゴン下にて８０℃で一夜還流させながら加熱した。該反応混合物を室温に冷却し、大きいビーカーに入れた氷に滴下し、固体重炭酸ナトリウムで中和した。該混合物を酢酸エチルと水との間で分配させた。酢酸エチル層を回収し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧除去した。シリカゲルカラムクロマトグフラィーに付して９０％酢酸エチル／１０％メタノールで溶離して標記化合物を単離した（１２ｇ、６２％）；１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９，２Ｈｚ）、７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）、８．１６（１Ｈ，ｓ）。
【００７０】
製造例２：  ５−トリメチルシラニルエチニルベンゾ［１，２，５］チアジアゾール
【化１６】
2004517069.tif 000018
５−ブロモ−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール（１０ｇ、８０ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴンで１０分間脱ガスし、次いで、ヨウ化銅（１．５３ｇ、８ｍｍｏｌ）およびビス−トリフェニルホスフィン−パラジウム−ジクロリド（１．１２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。シリンジを介してＴＭＳ−アセチレン（１２．７５ｍｌ）を添加し、次いで、ジイソプロピルアミンを２０分間にわたって滴下した。該反応混合物を周囲温度で一夜撹拌した。ＴＨＦを減圧除去した。得られた茶色の油状物に酢酸エチルを添加し、該混合物をセライトで濾過した。残渣を酢酸エチルと水との間で分配した。溶離液として石油エーテルを使用してカラムクロマトグラフィーにより標記化合物を単離した（９ｇ、４９％）；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：２３１．１（ＭＨ＋）、ｍ／ｚ（ＡＰＩ―）：２３３．１（Ｍ）。
【００７１】
製造例３：  ５−エチニル−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール
【化１７】
2004517069.tif 000019
５−トリメチルシラニルエチニル−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール（９ｇ）のメタノール（２００ｍｌ）中撹拌溶液に炭酸カリウム（１６ｇ）を添加した。周囲温度で１時間撹拌した後、該反応混合物を濾過し、蒸発乾固させた。残留物を酢酸エチルと水との間で分配させた。酢酸エチル層を回収し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下にて蒸発乾固させて標記化合物（６ｇ、９６％）を得た；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：１６０（Ｍ＋）。
【００７２】
製造例４：  ５−（６−メチル−ピリジン−２−イルエチニル）−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール
【化１８】
2004517069.tif 000020
５−エチニル−ベンゾ［１，２，５］チアジアゾール（６ｇ、３８ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−６−メチル−ピリジン（１３ｇ、７６ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（０．７ｇ、３．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）、ＴＭＥＤＡ（１００ｍｌ）に溶解した。該混合物をアルゴンで１０分間脱ガスし、次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を添加した。該反応を５０℃で５時間加熱した。溶媒を減圧除去した。残留物を酢酸エチル／水間で分配させた。有機層を乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶離液として石油エーテル／酢酸エチル（３：１）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより標記化合物を単離した（５．２ｇ、５５％）；１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．６１（３Ｈ，ｓ）、７．３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７３Ｈｚ）、７．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）、７．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）、８．２５（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ（ＡＰＩ＋）：２５２（ＭＨ＋）。
【００７３】
製造例５：  Ｎ´−（５−ブロモ−２−アミノピリジン）−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジン
【化１９】
2004517069.tif 000021
アルゴン下、５−ブロモ−２−アミノピリジン（９．８ｇ、５６．６ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）および乾燥ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（２０ｍｌ）に溶解した。該溶液を１３０℃で１６時間還流し、冷却し、溶媒を除去した。得られた残留物を精製せずに次工程において使用した；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２２８．０／２３０．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００７４】
製造例６：  ６−ブロモ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン
【化２０】
2004517069.tif 000022
アルゴン下にてＮ´−（５−ブロモ−２−アミノピリジン）−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジン（１６．２ｇ、約５６．６ｍｍｏｌ、１当量）をメタノール（９０ｍｌ）およびピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。これにヒドロキシルアミン−Ｏ−スルホン酸（７．３ｇ、７５．２ｍｍｏｌ、１．３当量）を撹拌しながら添加して紫色の懸濁液を得た。これを室温にし、１６時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物を炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）に懸濁し、酢酸エチル（２×２００ｍｌ）で抽出した。次いで、有機層を水および食塩水（各々、１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去した。シリカ上にてフラッシュクロマトグラフィーに付して、４０−６０℃石油エーテル：酢酸エチル（２：１）から４０−６０℃石油エーテル：酢酸エチル（１：１）までの勾配溶媒系で溶離することにより精製して、薄黄色固体として生成物を得た（５ｇ、４４．６％）；１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．７７（１Ｈ，ｓ）、８．３４（１Ｈ，ｓ）、７．６９（１Ｈ，ｄ）、７．６５（１Ｈ，ｄ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：１９８．０／２００．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００７５】
製造例７：  ２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−カルボン酸メトキシメチルアミド
【化２１】
2004517069.tif 000023
アルゴン下にて、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−カルボン酸（５ｇ、３０ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解した。これに塩化オキサリル（３．４ｍｌ、４．９５ｇ、３９ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加し、次いで、ＤＭＦ数滴を滴下することにより多量のガスが発泡した。これを３時間撹拌した後、ガス発生が止み、白っぽい溶液が得られた。これにＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン・塩酸塩（４．１ｇ、４２ｍｍｏｌ、１．４当量）を添加し、次いで、トリエチルアミン（１２．５７ｍｌ、９．１１ｇ、９０ｍｍｏｌ、３当量）を滴下し、多量の白色固体が形成された（Ｅｔ３ＮＨＣｌ）。該溶液を一夜撹拌した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（１５０ｍｌ）で抽出した。水性層をジクロロメタン（５０ｍｌ）で抽出し、有機層を合わせた。有機層を水および食塩水（各々、１００ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去した。粗製残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーに付して４０−６０℃石油エーテル：酢酸エチル（３：１）で溶離することにより精製して、オフホワイト色の固体を得た（４．５ｇ、７２％）。１ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．６１（１Ｈ，ｄ）、７．５６（１Ｈ，ｄｄ）、６．７９（１Ｈ，ｄ）、４．６２（２Ｈ，ｔ）、３．５７（３Ｈ，ｓ）、３．４９（３Ｈ，ｓ）、３．２４（２Ｈ，ｔ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２０８．１［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７６】
製造例８：  １−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン
【化２２】
2004517069.tif 000024
アルゴン下にて２，６−ジメチルピリジン（１．２４ｍｌ、１．１４ｇ、１０．６２ｍｍｏｌ、１．１当量）をＴＨＦ（４０ｍｌ）に溶解し、−３０℃に冷却した。これにｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、４．２５ｍｌ、１０．６２ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下することにより暗赤色溶液が形成された。これを−３０℃で１時間撹拌した。アルゴン下にて２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−カルボン酸メトキシメチルアミド（２．０ｇ、９．６５ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、−３０℃に冷却した。これに上記冷アニオン溶液を、カニューレ針を介して少量に分けて添加した。得られたピンク色の溶液を−３０℃で２０分間撹拌した後、ゆっくりと室温に加温し、一夜撹拌した。溶媒を除去し、残留物を塩化アンモニウム飽和水溶液（１００ｍｌ）に溶解し、次いで、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水および食塩水（各々、１００ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４にて乾燥させ、溶媒を除去した。該粗製物をフラッシュカラムクロマトグラフィーに付して４０−６０℃石油エーテル：酢酸エチル（１：１）で溶離することにより精製して、蛍光性黄色生成物を得た（１．３ｇ、５３％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９５（１Ｈ，ｓ）、７．９２（１Ｈ，ｄ）、７．６６（１Ｈ，ｍ）、７．０８（１Ｈ，ｄ）、７．０２（１Ｈ，ｄ）、６．７９（１Ｈ，ｄ）、４．６３（２Ｈ，ｔ）、４．４（２Ｈ，ｓ）、３．２４（２Ｈ，ｔ）、２．５４（３Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２５２．１［Ｍ−Ｈ］―、２５４．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７７】
製造例９：  ２−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルエチニル）−６−メチルピリジン
【化２３】
2004517069.tif 000025
アルゴン下にて１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−２−（６−メチルピリジン−２−イル）エタノン（２００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（１．５ｍｌ）に溶解した。これにＨｕｅｎｉｇ塩基（０．７ｍｌ、０．５ｇ、３．９ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、次いで、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．１６ｍｌ、０．２７ｇ、０．９５ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴下した。これにより茶色の溶液が形成され、これを一夜撹拌した。該反応化合物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液（５ｍｌ）で抽出し、水性層をジクロロメタン（５ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、水および食塩水（各々、５ｍｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去した。粗製残留物を４０−６０℃石油エーテル：酢酸エチル（３：１）にてカラム処理して薄黄色固体を得た（１６０ｍｇ、８０％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．５４（１Ｈ，ｔ）、７．４３（１Ｈ，ｓ）、７．３９（１Ｈ，ｄｄ）、７．３７（１Ｈ，ｄ）、７．０７（１Ｈ，ｄ）、６．７５（１Ｈ，ｄ）、４．６０（２Ｈ，ｔ）、３．２１（２Ｈ，ｔ）、２．５８（３Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ［ＡＰＣＩＭＳ］：２３６．２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７８】
生物学的データ
本発明の化合物の生物学的活性は、以下のアッセイを使用して評価され得る。
【００７９】
ｓｍａｄ３のＡＬＫ５キナーゼリン酸化の評価方法
コーティング緩衝液１００μｌあたりグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ｓｍａｄ３融合タンパク質１５０ｎｇを含有する０．１モルの重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．６）１００μｌをピペットで加えることによりベーシックなＦｌａｓｈ−Ｐｌａｔｅｓ（エヌイーエヌ・ライフ・サイエンシズ（ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ））をコーティングした。プレートにカバーをし、室温で１０〜２４時間インキュベートした。次いで、該プレートをコーティング緩衝液（０．１モルの重炭酸ナトリウム）２００μｌで２回洗浄し、２〜４時間風乾させた。
リン酸化反応について、各ウェルに、５０ｍｍｏｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）；５ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２；１ｍｍｏｌのＣａＣｌ２；１ｍｍｏｌのジチオトレイトール；１００μｍｏｌのグアノシン・トリリン酸塩；０．５μＣｉ／ウェルのガンマ３３Ｐ−アデノシン・トリリン酸塩（エヌイーエヌ・ライフ・サイエンシズ）および４００ｎｇのＡＬＫ５のキナーゼドメインのＮ末端でのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの融合タンパク質（ＧＳＴ−ＡＬＫ５）を含有する９０μｌを供給した。ＧＳＴ−ＡＬＫ５を添加せずにバックグラウンドカウントを測定した。種々の化合物の存在下にて酵素の活性を測定することによりＡＬＫ５の阻害剤を評価した。プレートを３０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、該アッセイ緩衝液を吸引により除去し、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水中１０ｍｍｏｌの冷ピロリン酸ナトリウムの２００μｌで３回洗浄した。最後の洗液を吸引し、ブロットされたプレートを乾燥させた。次いで、プレートをＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔにて計数した。
【００８０】
マトリックスマーカーの阻害：ウェスタンブロットプロトコール
以下のとおり、酵素アッセイにおける活性を確認するデータを得た：
フラスコ中にて細胞をほぼ集密するまで増殖させ、一夜飢餓させ、ＴＧＦ−ベータおよび化合物で処理した。氷冷リン酸緩衝生理食塩水で処理した後、細胞を２４時間または４８時間洗浄し、次いで、該プレートに２Ｘローディング緩衝液５００μｌを加え、細胞をスクレープし、微量遠心管にて集めた。（２Ｘローディング緩衝液：１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、４％ドデシル硫酸ナトリウム、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール、５％ベータ−メルカプト−エタノール）。管中にて細胞を溶解し、ボルテックスした。試料を１０分間沸騰させた。試料２０μｌを７．５％ポリアクリルアミドゲル（ビオラド（ＢｉｏＲａｄ））上に加え、電気泳動にかけた。
【００８１】
ゲル中のサイズ分画タンパク質をセミドライブロッティングによりニトロセルロース膜に移動させた。膜を４℃にてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の５％粉ミルクで一夜ブロックした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、膜を一次抗体と一緒に室温で４時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、膜を二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベートした。最後に、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）からのＥＣＬ検出キットを用いてシグナルを可視化した。
【００８２】
本発明の化合物は、一般に、０．０００１〜１０μＭの範囲のＩＣ５０値を有するＡＬＫ５受容体モジュレーター活性を示す。
【国際公開パンフレット】
2004517069.tif 000027
2004517069.tif 000028
2004517069.tif 000029
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2004517069.tif 000051
【国際調査報告】
2004517069.tif 000052
2004517069.tif 000053
2004517069.tif 000054