(57)【要約】本発明は、適度な阻害化合物を含む、ＨＣＶポリメラーゼプライマー−鋳型結合の阻害剤の同定を確実にするために全長未変性ＮＳ５ＢポリメラーゼよりＫmが高いＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いるＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤を同定する新規な方法を提供する。本方法は、低親和性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成されたポリメラーゼ産物の存在を測定する工程と、該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較する工程とを含み、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少がＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の潜在的阻害剤を同定する方法であって、
ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｂ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを、潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長とを測定する工程と、
ｄ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較する工程と
を含み、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少が、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が１０nＭより大きい、請求項１記載の方法。
【請求項３】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が６０nＭより大きい、請求項１記載の方法。
【請求項４】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が約１００nＭ以上である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が約２００nＭである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが、そのＮ末端に融合したヒスチジンタグをもつ未変性ＮＳ５Ｂポリぺプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号１で示される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号２で示される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号３で示される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号４で示される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該鋳型がポリアデニル酸鋳型を含み、該プライマーがＲＮＡオリゴウリジル酸プライマーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該プライマーが遊離5'Ｃ位でビオチニル化され、該リボヌクレオチド三リン酸が放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド三リン酸を含み、工程（ｃ）の該潜在的阻害剤の存在下と不在下のポリメラーゼ産物の量をシンチレーション近接分析(ＳＰＡ)によって測定し、よってシンチラントを含む複数のストレプトアビジン被覆ビーズが、ビオチニル化した該プライマー−鋳型と、形成されたビオチニル化ポリメラーゼ産物とを捕捉するために作用可能であるとともに、該ビーズの刺激時に、該ビーズから出された光の強さが放射能標識ポリメラーゼ産物の形成レベルに比例する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
インキュベートする該温度がほぼ室温である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
準備した該潜在的阻害剤の開始濃度が、低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値より小さいか又は同じである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
プライマー−鋳型に対するＫm値が１０nＭより大きい低親和性のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項１６】
プライマー−鋳型に対するＫm値が６０nＭより大きい低親和性のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項１７】
低親和性のＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が約１００nＭ以上である、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項１８】
低親和性のＮＳ５Ｂポリメラーゼの該プライマー−鋳型に対するＫm値が約２００nＭである、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項１９】
低親和性のＮＳ５Ｂポリメラーゼが、そのＮ末端に融合したヒスチジンタグをもつ未変性ＮＳ５Ｂポリぺプチドである、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項２０】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号１で示される配列を有する、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項２１】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号２で示される配列を有する、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項２２】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号３で示される配列を有する、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項２３】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号４で示される配列を有する、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【請求項２４】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を同定する方法であって、
ａ）プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｂ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを、潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長とを測定する工程と、
ｄ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較し、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少が、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示す工程と、
ｅ）ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｆ）該ＨＣＶ ＮＳ５ＢＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを、潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｇ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長とを測定する工程と、
ｈ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較し、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少が、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプライマー−鋳型結合阻害剤を示す工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の阻害剤としての試験化合物を同定するためのキットであって、
（ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを含む第１試薬と、
（ｂ）該プライマーが親和性タグ標識されている、該試験化合物の不在下に該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼによって結合することができる適切なプライマー−鋳型を含む第２試薬と、
（ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合し、続いて該プライマーが伸長するとき、よってポリメラーゼ産物を形成するときに放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド一リン酸として該プライマーに取り込むことができる複数の適切な放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド三リン酸を含む第３試薬と、
（ｄ）親和性タグ標識した該プライマー−鋳型と、形成された親和性タグ標識ポリメラーゼ産物とを捕捉するのに適した複数の受容体被覆固体支持体を含み、よって、測定時に該固体支持体から出されたシグナルの強さが放射能標識ポリメラーゼ産物の形成レベルに比例する第４試薬と
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２６】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤として試験化合物を同定するためのキットであって、
（ａ）プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを含む第１試薬と、
（ｂ）該プライマーがその５'Ｃ位でビオチニル化されている、該試験化合物の不在下に低親和性の該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼによって結合することができる適切なプライマー−鋳型を含む第２試薬と、
（ｃ）低親和性の該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合し、続いて該プライマーを伸長するとき、よってポリメラーゼ産物を形成するときに放射能標識[５,６3Ｈ]リボヌクレオチド一リン酸として該プライマーに取り込むことができる複数の適切な放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド三リン酸を含む第３試薬と、
（ｄ）ビオチニル化された該プライマー−鋳型と、形成されたビオチニル化ポリメラーゼ産物とを捕捉するのに適したシンチラントを含む複数のストレプトアビジン被覆ビーズを含み、よって、該ビーズの刺激時に該ビーズから出された光の強さが低親和性の該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼによる放射能標識ポリメラーゼ産物の形成レベルに比例し、よって、放射能標識ポリメラーゼ産物の低下がＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプライマー−鋳型結合阻害剤を示す第４試薬と
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２７】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の潜在的阻害剤を同定するスクリーニング分析であって、
ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｂ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを、潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いてリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該潜在的阻害剤の存在下と不在下に該プライマーに取り込まれるときの該プライマーの伸長を測定する工程と、
ｄ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較する工程と
を含み、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少が、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示すことを特徴とするスクリーニング分析。
【請求項２８】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号６で示される配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
低親和性の該ＮＳ５Ｂポリメラーゼが配列番号６で示される配列を有する、請求項１５記載のＮＳ５Ｂポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、ＲＮＡプライマー−鋳型に対する親和性の低いＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼより大きいＫmを有するＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼに関する。更に詳細には、本発明は、ＮＳ５Ｂ活性の阻害剤、特にＮＳ５Ｂプライマー−鋳型結合の阻害剤を同定するためのそのＮＳ５Ｂポリメラーゼの使用に関する。
【０００２】
背景
Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)は、世界中に広がった輸血後や市中感染非Ａ非Ｂ型肝炎の主な病因因子である。世界中で２億人を超える人々がウイルスに感染していると推定される。高い割合の保因者が慢性的に感染し、多くが慢性の肝臓疾患、いわゆる慢性Ｃ型肝炎に進行する。このグループは、肝硬変、肝細胞がん、又は死に至る末期肝臓疾患のような深刻な肝臓病の非常に危険な状態にある。
ＨＣＶがウイルスの持続を確立しかつ高い割合の慢性肝臓疾患を引き起こすメカニズムは、十分に解明されていない。ＨＣＶがどのようにホスト免疫系と相互作用し巧く切り抜けているかは不明である。更に、ＨＣＶ感染やＨＣＶ疾患に対して防御した細胞免疫応答と液素性免疫応答の役割もまだ確立されていない。
【０００３】
ＨＣＶはフラビウイルス科のエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスである。一本鎖ＨＣＶ ＲＮＡゲノムは、正の極性を有し、約３０１０アミノ酸の線状ポリタンパク質をコードしている、長さが約９６００ヌクレオチドの一つのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含んでいる。感染細胞においては、このポリタンパク質は細胞プロテアーゼとウイルスプロテアーゼによって多数の部位で切断され、構造タンパク質と非構造(ＮＳ)タンパク質を生成する。構造タンパク質(Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ２-p７)は、ウイルス粒子を構成するポリぺプチドを含んでいる（Hijikata et al., 1991; Grakoui et al., 1993(a))。非構造タンパク質(ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ)は、ＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製を触媒し調節する酵素又は副因子をコードしている(Hijikata et al., 1991)。成熟非構造タンパク質の生成は２つのウイルス的にコードされたプロテアーゼによって触媒される。第１のものは、ＮＳ３タンパク質のポリタンパク質からの放出を自己触媒するＮＳ２/３亜鉛依存性金属プロテアーゼである。放出されたＮＳ３はＮ末端セリンプロテアーゼドメインを含み(Grakoui et al., 1993(b); Hijikata et al., 1993)、ポリタンパク質からの残りの切断を触媒する。放出されたＮＳ４Ａタンパク質には少なくとも２つの役割がある。第一の役割は、ＮＳ３タンパク質と安定な複合体を形成し、ＮＳ３/ＮＳ４Ａ複合体の膜局在化を援助するものである(Kim et al., 1999)。第二の役割は、ＮＳ３プロテアーゼ活性の補因子として作用するものである。この膜関連複合体は、ポリタンパク質上の残りの部位の切断を触媒し、よってＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの放出を引き起こす(Bartenschlager et al., 1993; Grakoui et al., 1993(a); Hijikata et al., 1993; Love et al., 1996; Kwong et al.の総説, 1998)。ＮＳ３タンパク質のＣ末端セグメントもヌクレオシドトリホスファターゼとＲＮＡヘリカーゼ活性を含んでいる(Kim et al., 1995)。タンパク質ＮＳ４Ｂの機能は不明である。ＮＳ５Ａ、高リン酸化タンパク質は、種々のＨＣＶ遺伝子型のインターフェロン耐性に関与するらしい(Gale Jr. et al. 1997; Reed et al., 1997)。ＮＳ５Ｂは、ＨＣＶ複製に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲdＲp)である(Behrens et al., 1996)。
【０００４】
予想される抗ウイルス治療に適切な標的に関して、ＨＣＶゲノムのクローン化され特徴のある部分配列や完全配列が分析された。次の４種のウイルス酵素：(１)ＮＳ２/３プロテアーゼ；(２)ＮＳ３/４Ａプロテアーゼ複合体；(３)ＮＳ３ヘリカーゼ；(４)ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＮＳ５Ｂ ＲdＲp)が可能な標的である。他の核酸ポリメラーゼを連想させる構造を明らかにするためにＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結晶化した(Bressanelli et al. 1999; Ago et al. 1999; Lesburg et al. 1999)。
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、ＨＣＶ複製の阻害剤の探索において第一の標的である。ＮＳ５Ｂ活性を破壊する突然変異がチンパンジーモデルにおいてＲＮＡの感染能を破壊させることが最近証明された(Kolykhalov, 2000)。ウイルスＲＮＡ複製の開始工程はＮＳ５Ｂ(ＲdＲp)によるＲＮＡ鋳型の３'端を認識することであり、これは細胞タンパク質の援助とともに直接又は間接に起こることができる(Lai, 1998; Strauss et al., 1999)。次にＨＣＶポリメラーゼはこの鋳型を伸長させるとともに二本鎖ＲＮＡを形成するように進行する。それ故、ＨＣＶポリメラーゼの阻害剤は、ＲＮＡ複製中に２つの別々の工程、即ち、１）プライマー−鋳型結合工程と２）伸長工程で妨害し得る。
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性の種々の試験管内分析が開発された。一般に、標準反応混合液は、たいてい、緩衝液、塩、２価のカチオン、還元剤、又はヌクレオシド三リン酸又はＲＮＡ鋳型とプライマーからなる。ほとんどのこれらの分析は合成のホモポリマー/プライマーを利用している(Behrens et al., 1996; Yuan et al., 1997; Lohmann et al., 1997 & 1998; Yamashita et al., 1998; Ferrari et al., 1999; Oh et al., 1999; Ishii et al., 1999; Tomei et al., 2000; Johnson et al., 2000; Qin et al., 2001 & 2002; Hagedorn et al., 国際出願第97/12033号、米国特許第5,981,247号、Instituto di Ricerche di Biologia Moleculare P. Angeletti S.P.Aによる国際出願00/06529号, 国際出願第99/51781号, Viropharma Inc.による国際出願第00/13708号)。日本たばこ産業による国際出願第01/47883号には、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼに対する阻害活性を有する一連の化合物が報告され、ＨＣＶポリメラーゼ阻害活性を測定するための分析が報告されている。
【０００５】
従来技術における分析を行うために用いられる組換えＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ酵素は、優先的に生産され、大腸菌(E.coli)又はバキュロウイルス感染昆虫細胞(例えば、Ｓf9)から分離される。非タグ標識或いはタグ標識した全長ＨＣＶ ＮＳ５Ｂの発現により不溶性タンパク質が得られ、界面活性剤(例えば、トリトンＸ-１００、ＮＰ-４０及び/又はＣＨＡＰＳ)、塩又はグリセロールによる抽出が必要である(Behrens et al., 1996; Lohmann et al., 1997 & 1998; Oh et al., 1999; Ishii et al., 1999; Tomei et al, 2000; Johnson et al, 2000; Qin et al., 2001 & 2002)。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質は高度に保存されたＣ末端疎水性セグメントを有し、組換えクローンにおけるこのＣ末端部分の切断によって酵素の可溶性形態の発現と分離が可能になった(Yamashita et al., 1998; Ferrari et al., 1999; Tomei et al, 2000; Del Vecchio国際出願第99/29843号)。
ホモポリマーＲＮＡとの一般的な試験管内ポリメラーゼ反応におけるＮＳ５Ｂの活性には、プライマー−鋳型とリボヌクレオチド三リン酸とを含む複数の基質との相互作用が必要である。Ｋmのような定常状態の動力学的パラメータはプライマー−鋳型とリボヌクレオチド三リン酸の双方について求めることができる(Ferrari et al., 1999)。従来技術において開示された組換えＨＣＶポリメラーゼのプライマー−鋳型に対する親和性が高く(低Ｋm値)、阻害剤を同定するための分析における未変性ＮＳ５Ｂの使用は、未変性ＮＳ５Ｂのプライマー−鋳型に対する親和性が高いという点で同様に問題である。高親和性(低Ｋm)のポリメラーゼを阻害する試験化合物を同定するために、阻害剤がポリメラーゼ反応の基質と競合する阻害分析において試験化合物はプライマー−鋳型に対するＫmより低い濃度又はそれに近い濃度で存在することが重要である。
【０００６】
ＨＣＶ ＲＮＡゲノムによってコードされた未変性ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的阻害剤を同定するために組換えＨＣＶポリメラーゼ又は未変性ＨＣＶポリメラーゼを用いる既存のＨＣＶ ＮＳ５Ｂ分析は、ＲＮＡ結合又はリボヌクレオチド三リン酸取り込みの阻害剤を同定することができる。これらの基質と競合する阻害化合物の親和性は、プライマー−鋳型又はポリメラーゼのＮＴＰに匹敵しなければならない(又は高くなければならない)。化合物のライブラリーをスクリーニングするために従来技術のスクリーニング分析を用いると、親和性の高いものに対するプライマー−鋳型結合の競合阻害剤の同定が制限され、親和性の中程度又は低い阻害剤は同定しない。
新規で特異的な抗ＨＣＶ治療の開発は優先順位が高く、複製に不可欠なウイルス特異的機能は薬剤開発に最も魅力的な標的である。哺乳動物にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが存在しないことと、この酵素がウイルス複製に不可欠であるらしいことの事実は、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼが抗ＨＣＶ治療に理想的な標的であることを示している。
このように、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂプライマー−鋳型結合活性をモジュレート、特に阻害することができる、親和性の中程度又は低い試験化合物を同定するための感度が改善されかつ動的範囲の大きい方法の開発が依然として満たされず求められている。そのような化合物は、更に抗ＨＣＶ治療を薬化学的に最適化する理想的な出発点として役に立つ。
【０００７】
発明の要約
本発明は、ＨＣＶポリメラーゼプライマー−鋳型結合の阻害剤の同定を確実にするためにＫmが未変性ＮＳ５Ｂポリメラーゼより高いＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いるＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤の新規な同定方法を提供することにより従来技術の難点や欠点を減少させる。特に、本発明は、ＲＮＡ(プライマー−鋳型)に対するＫmが高い、よってＮＣＶ ＮＳ５Ｂ活性をモジュレートする(特に阻害する)ことができる試験化合物を同定するための感度が広範囲である組換えＨＣＶ ＮＳ５Ｂ構築物の設計に関する。
それ故、本発明の第１実施態様においては、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の潜在的阻害剤を同定する方法であって、
ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｂ）ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｃ）ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長を測定する工程と、
ｄ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較する工程と
を含み、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少がＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示す、前記方法が提供される。
【０００８】
本発明の第２実施態様においては、プライマー−鋳型に対する親和性の低いＮＳ５Ｂポリメラーゼ酵素が提供される。特に、本発明は、ポリ(Ａ)/オリゴ(Ｕ)に対するＫmが１０nＭより大きいＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。
本発明の第３実施態様においては、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の阻害剤としての試験化合物を同定するためのキットであって、
（ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを含む第１試薬と、
（ｂ）該プライマーがその５'Ｃ位に親和性タグ標識されている、該試験化合物の不在下に該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼによって結合することができる適切なプライマー−鋳型を含む第２試薬と、
（ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの結合時と続いての該プライマーの伸長時、よってポリメラーゼ産物の形成時に放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド一リン酸として該プライマーに取り込むことができる複数の適切な放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド三リン酸を含む第３試薬と、
（ｄ）親和性タグ標識した該プライマー−鋳型と、形成された親和性タグ標識ポリメラーゼ産物とを捕捉するのに適した複数の受容体被覆固体支持体を含み、よって、測定時に該固体支持体から出されたシグナルの強さが放射能標識ポリメラーゼ産物の形成レベルに比例する第４試薬と
を含む、前記キットが提供される。
【０００９】
第４実施態様においては、本発明は、未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的阻害剤を同定するとともに未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと工程(ａ)で潜在的阻害活性を有するものとして同定された試験化合物とを接触させ、よって未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性が阻害される方法の使用が包含される。
本発明の利点は、何倍も増加する。本発明は、化合物の大きなライブラリーについて行うのに簡単な分析を提供し、未変性ＮＳ５Ｂポリメラーゼを用いたように同定されない阻害剤を検出するための感度が改善された。重要なことに、この分析は、反応の主な基質の一方又は双方に対して競合的に作用し得る化合物が同定されるように未変性ＮＳ５ＢポリメラーゼよりＫmが大きいポリメラーゼＮＳ５Ｂ構築物を用いることの重要性を教示している。未変性ＮＳ５Ｂポリメラーゼよりプライマー−鋳型に対する親和性が低い(Ｋmが大きい)ポリメラーゼ構築物の使用は、化合物の大きなライブラリーをスクリーニングする際に潜在的阻害剤を同定するのに特に有効である。
本発明の他の目的、利点、特徴は、例示でありかつ本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない添付図面に関連する好適実施態様の下記の制限されない説明を読み取るときに明らかになる。
このように本発明を一般的に記載してきたが、ここで添付の図面を参照し、その好適実施態様の具体的な説明によって示される。
【００１０】
発明の詳細な説明
定義
特に定義しない限り、本明細書に用いられる科学技術用語と命名法は本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味をもつが本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきでない。
本明細書に記載されるアミノ酸残基は“Ｌ”異性体であることが好ましい。しかしながら、ポリぺプチドの所望の性質が保持されるならば、Ｌ-アミノ酸残基を“Ｄ”異性体の残基に置き換えることができる。
本明細書に示されるすべてのアミノ酸残基配列は、IＵＰＡＣ-IＵＢ生化学命名委員会(１９７２)の推奨に従って通例左から右へアミノ末端からカルボキシ末端への向きに従うものである。
ヌクレオチド配列は、当該技術において一般に用いられIＵＰＡＣに従って１文字のヌクレオチド記号を用いて左から右へ５'→３'の向きに一本鎖によって示される。
遺伝子分離、分子クローニング、ベクター作製等の通例の方法は、当該技術において周知であり、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,; Ausubel et al., Current Protocols, Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.に纏められている。当業者は、これらの方法を用いて過度に実験することなく本明細書に記載されるプラスミドベクターを容易に再現することができる。この目的や他の目的に必要な種々の核酸配列、断片等は、市販で入手できるプラスミドの成分として容易に入手することができ、当該技術において周知でもあり、公に入手でき、発表された情報に基づいて容易に再現もできる。
【００１１】
本明細書に用いられる“親和性タグ”という用語は、リガンドを結合する物質を溶液から抽出するために“受容体”に対して強力な親和性が使用し得るリガンド(好ましくはプライマー−鋳型に結合する)を意味する。そのようなリガンドの例としては、ビオチン又はその誘導体、ヒスチジンポリぺプチド、アミローズ糖部分又は特異抗体によって認識しうる特定エピトープが挙げられる。そのような“親和性タグ”は、溶液としてプライマー−鋳型に結合することが好ましく、固体支持体に結合した適切な“受容体”部分によって捕捉される。
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチド又はその断片の“誘導体”は、タンパク質のアミノ酸配列を変動させることにより、例えば、タンパク質をコードしている核酸の操作により又はタンパク質自体を変化させることにより修飾したポリぺプチドを意味する。天然アミノ酸配列のそのような誘導体は、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換を含むことができ、もとのＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの必要な活性を変えてもよく変えなくてもよい。上述した本発明のＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチド又はタンパク質には、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチド由来でありかつＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの少なくとも１つの性質又は他の特性を保持する類似体、断片、誘導体又は変異体が含まれる。
“伸長”又は“拡張”という用語は、同じ意味で用いられ、適切なポリメラーゼによって行われるＤＮＡ又はＲＮＡの相補的鋳型で特定されたヌクレオチドの連続的な付加を意味する。本発明の具体的な関連においては、伸長又は拡張はＲＮＡ鋳型に対してフラビウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特にＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲdＲpによって行われる。
【００１２】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの“断片”又は“部分”は、鋳型への結合、プライミング、又は鋳型に沿った伸長のような機能の少なくとも１つを保持しつつ、十分な長さのアミノ酸残基又はアミノ酸が欠失したＮＳ５Ｂポリぺプチドの伸長部分を意味する。
“開始”という用語は、新成ＲＮＡ鎖の最初の５'位ヌクレオチドを組込むＲＮＡ合成の第１工程を意味する。この反応は、また“プライミング”とも言われる。
“ＮＳ５Ｂ”という用語は、同じ意味で用いられる“ＮＳ５Ｂタンパク質''、“ＮＳ５Ｂポリぺプチド''、“ＮＳ５Ｂポリメラーゼ”又はその組合わせと呼ばれるタンパク質をコードする領域を特定するウイルスゲノムの３' 端近くに位置するＨＣＶゲノムの一部を意味する。天然状態でのＮＳ５Ｂは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＲdＲp)として機能する。ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする核酸領域は、“ＮＳ５Ｂ遺伝子”と呼ぶこともできる。従って、“ＮＳ５Ｂ”という用語は、その用語が用いられる関係によっては、ＮＳ５Ｂポリぺプチドをコードする核酸、ＮＳ５Ｂ遺伝子又はＮＳ５Ｂポリぺプチド、又はそのいずれかの部分を意味することができる。ＮＳ５Ｂは、ＮＳ５Ｂ核酸配列又はＮＳ５Ｂポリぺプチドの自然対立遺伝子変異体、突然変異体、誘導体を更に意味することができる。ＮＳ５Ｂ核酸、ＮＳ５Ｂ遺伝子又はＮＳ５Ｂタンパク質は、適切な鋳型になお結合する機能的ポリメラーゼ、又は非機能的ポリメラーゼを意味する。
“プラスミド”という用語は、染色体外遺伝子要素を意味する。本明細書の出発プラスミドは、市販で入手でき、非制限条件で公にも入手でき、発表された手順に従って入手できるプラスミドから構築もできる。更に、記載されたものに等価なプラスミドも当該技術において既知であり、当業者に明らかである。
【００１３】
本明細書に用いられる“プライマー”という用語は、適当な環境に置かれた場合、鋳型依存性核酸合成の開始剤として機能的に作用することができる、生物系に由来する、制限酵素消化によって生成する、又は合成で作製される一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡを意味する。適切な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、条件、例えば、適切な温度とpＨと存在する場合、プライマーはその３'末端にポリメラーゼ又は類似の活性の作用によりヌクレオチドを付加してプライマー伸長(拡張)産物を得ることにより伸長(拡張)することができる。プライマーは長さが異なってもよく、具体的な条件や適用の要求に左右される。例えば、本発明の方法においては、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドプライマーは、長さが典型的には１〜２４ヌクレオチド以上である。プライマーは、所望の拡張産物の合成を開始するために、即ち、類似酵素の適切な近位にプライマーの３' ヒドロキシ部分を与えるのに十分な方法で所望の鋳型鎖とアニールすることができるように所望の鋳型に対して十分な相補性を有しなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な補体であることは必要ない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、他の相補的プライマーの５' 端に結合することができる。また、拡張産物の合成にプライマー−鋳型複合体を機能的に与えるためにプライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有するのであれば、非相補的塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に分散させることができる。
“ＲＮＡ合成”と“転写”という用語は、同じ意味で用いられ、鋳型開始部位を認識し結合する工程；第１相補的ヌクレオチドを組込むことにより開始する工程；新成ＲＮＡ鎖を伸長するために相補的ヌクレオチドを連続的に付加する工程のＲＮＡポリメラーゼによって用いられる個々の工程によって定義される。
【００１４】
“タグ"、“タグ配列”又は“タンパク質タグ”は、他の配列に付加したときに追加の効用を与え、特に検出又は分離においてその配列に有用な性質も与える化学部分、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はアミノ酸、ぺプチド又はタンパク質又は他の化学薬品を意味する。従って、例えば、ホモポリマー核酸配列又は捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列は、拡張産物又はハイブリダイズした産物の続いての分離を容易にするためにプライマー配列又はプローブ配列に付加することができる。タンパク質タグの場合には、キレート化金属クロマトグラフィーによるタンパク質分離を容易にするためにヒスチジン残基(例えば、４〜８連続的ヒスチジン残基)をタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に付加することができる。また、アフィニティクロマトグラフィー又はイムノアフィニティクロマトグラフィーのような方法によるタンパク質分離を容易にするために特異抗体分子又は他の分子(例えば、フラッグエピトープ、c-mycエピトープ、インフルエンザＡウイルス血球凝集素タンパク質のトランスメンブランエピトープ、プロテインＡ、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ等)と反応性のエピトープ又は決定基を示すアミノ酸配列、ぺプチド、タンパク質又は融合パートナーをタンパク質に付加することができる。化学タグ部分には、核酸又はタンパク質に付加することができかつアビジン又はストレプトアビジンの受容体部分等と相互作用することにより分離又は検出を容易にするビオチンのような分子が含まれる。他の多くのタグ部分が既知であり、熟練技術者によって予想することができ、本発明の範囲内に企図される。
“鋳型”という用語は、ポリメラーゼの基質の１つとして働くＤＮＡ、又は好ましくはＲＮＡのオリゴヌクレオチドを意味する。鋳型の配列は、転写中にポリメラーゼによって作製される反応に相補的である。
【００１５】
ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの異なる“変異体”は天然に存在する。これらの変異体は、タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の差を特徴とする対立遺伝子であってもよく、異なるＲＮＡプロセシング又は転写後修飾を含んでもよい。当業者は、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、付加又は置換を有する変異体を作製し得る。これらの変異体は、特に(ａ)１以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸で置換された変異体、(ｂ)１以上のアミノ酸がＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドに付加した変異体、(ｃ)１以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、(ｄ)ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドが、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等のＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドに有用な性質を与えることができる融合パートナー、タンパク質タグ又は他の化学部分のような他のぺプチド又はポリぺプチドと融合した変異体を含むことができる。本発明の他のＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドは、保存又は非保存位置にある種のアミノ酸残基に他の種の対応する残基を置き換えた変異体を含んでいる。他の実施態様においては、非保存位置のアミノ酸残基は連続的又は非連続的残基で置換されている。遺伝的(サプレッション、欠失、突然変異等)、化学的、酵素的手法を含むこれらの変異体を得る方法は、当業者に既知である。ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの生物学的性質のいずれかを保持するＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリぺプチドの誘導体を生じる代替的核酸プロセシング形態や代替的転写後修飾形態を含む対立遺伝子変異、類似体、断片、誘導体、変異体、修飾の程度まで、本発明の範囲内に包含される。
本明細書に用いられる“ベクター”という用語は、外因性ＤＮＡをホスト細胞へ導入するために用いられる核酸化合物を意味する。ベクターは、１以上のタンパク質分子をコードし得るヌクレオチド配列を含んでいる。天然状態での又は組換え操作を行ったプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージは、一般に用いられるベクターの例であり、結合した配列又は要素の複製を生成するように他の遺伝子配列又は要素(ＤＮＡ又はＲＮＡ)を結合することができる。
【００１６】
好適実施態様
本発明は、試験化合物の存在下と不在下にＨＣＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性を定量するための酵素、方法、分析、及びキットを提供する。
１−低親和性ＮＳ５Ｂポリメラーゼ分析
本発明の第１実施態様の第１態様によれば、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の潜在的阻害剤を同定する方法であって、
ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｂ）低親和性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｃ）その低親和性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長とを測定する工程と、
ｄ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較する工程と
を含み、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少がＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの潜在的プライマー−鋳型結合阻害剤を示す、前記方法が提供される。
【００１７】
第１実施態様の第２態様によれば、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を同定する方法であって、
本明細書に記載された工程ａ）〜ｄ）を行う工程と、
ｅ）未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、適切なプライマー−鋳型と、複数の適切なリボヌクレオチド三リン酸とを準備する工程と、
ｆ）該ＨＣＶ ＮＳ５ＢＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと該プライマー−鋳型とを工程(ｄ)で同定した潜在的阻害剤の存在下と不在下にインキュベートする工程と、
ｇ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合するときに形成されたポリメラーゼ産物の存在と、続いて該潜在的阻害剤の存在下と不在下にリボヌクレオチド一リン酸として１つ以上のリボヌクレオチド三リン酸が該プライマーへ取り込まれるときの該プライマーの伸長とを測定する工程と、
ｈ）該潜在的阻害剤の存在下と不在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量を比較し、該潜在的阻害剤の不在下に形成されたポリメラーゼ産物の量と比較した該潜在的阻害剤の存在下に形成された該ポリメラーゼ産物の量の減少がＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプライマー−鋳型結合阻害剤を示す工程と、
を含む、前記方法が提供される。
本発明に用いられるプライマー−鋳型は、本発明のポリメラーゼに結合する能力を有するものが含まれる。第１実施態様の好適態様においては、プライマー−鋳型はホモポリマープライマー−鋳型を含んでいる。好適態様においては、ホモポリマープライマーは１２ヌクレオチドＲＮＡオリゴウリジン酸(又はオリゴウリジン一リン酸)(オリゴ-Ｕ)プライマーを含み、鋳型は不均一な長さの相補的ポリアデニル酸(又はアデノシン一リン酸)(ポリＡ)鋳型を含んでいる。この実施態様の代替的態様においては、プライマーはＵ4、Ｕ6、Ｕ8、Ｕ10のような短い長さ、又はＵ14、Ｕ16、Ｕ18のような長い長さのオリゴウリジン酸を含んでいる。この実施態様の他の代替的態様においては、鋳型とプライマーとの間の比が異なるプライマー‐鋳型の異なる組合わせを用いることができる。本発明の他の代替的態様においては、プライマーは、試験化合物の存在下と不在下に形成されたポリメラーゼ産物の検出を援助するために遊離５'Ｃ位にビオチンのような親和性タグで修飾されている。
【００１８】
本発明に用いられるリボヌクレオチド三リン酸は、非標識のものと標識のものとが含まれる。この第１実施態様の好適態様においては、リボヌクレオチド三リン酸は放射能標識リボヌクレオチド三リン酸を含んでいる。好適態様においては、リボヌクレオチド三リン酸は、不均一な長さ(１０００〜１００００ヌクレオチド)の１２ヌクレオチドＲＮＡオリゴウリジン酸(又はオリゴウリジン一リン酸)(オリゴ-Ｕ)プライマーと相補的ポリアデニル酸(又はアデノシン一リン酸)(ポリＡ)鋳型を分析に用いる場合にＵＴＰ-[５,６3Ｈ]を含んでいる。
本発明のＮＳ５Ｂポリメラーゼに対して適切な選択性と活性を有する阻害剤は、本発明の方法とキットを用いて同定することができる。好適態様においては、潜在的阻害活性を有する試験化合物は、国際出願第02/04425号で以前に同定された化合物の種類を有する。本発明の好適態様においては、試験化合物はぺプチド、ランダムぺプチドライブラリの一部、コンビナトリアルケミストリ由来の分子ライブラリ、抗体、炭水化物、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はその一部、又は小有機分子又は小無機分子を含むことができるがこれらに限定されない。試験化合物は、内在性生理的化合物、又は天然化合物又は合成化合物であってもよい。試験化合物は、１以上のコンビナトリアルライブラリからの１以上の不連続の化合物であってもよい。そのようなライブラリは、多くの構造的に異なる分子化学種を含むことができる。コンビナトリアルライブラリは、リード化合物を同定するために又は以前に同定されたリード化合物を最適化するために使用し得る。“リード”化合物を本発明のスクリーニング法を用いて同定されるとすぐに、コンビナトリアルケミストリとコンピュータ法を最初のリード化合物を最適化するために使用し得る。最適化類似体/変異体は、最初のリード化合物を同定した同じスクリーニング法において又は未変性ＮＳ５Ｂポリメラーゼを用いた分析において試験することができる。そのようなライブラリは、コンビナトリアルケミストリの周知の方法で製造することができ、本方法によってスクリーニングすることができる。潜在的阻害剤は、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの生物学的機能を低下させることができる。好ましくは、潜在的阻害剤は、プライマー−鋳型に結合するポリメラーゼの能力を低下又は阻止する。
【００１９】
第１実施態様の好適態様は、反応物を室温で１.５時間インキュベートする。実施態様の代替的態様においては、インキュベーション時間と温度は上下することができ、異なる温度でのポリメラーゼの活性に左右される。
第１実施態様の好適態様においては、プライマー−鋳型とヌクレオチドの濃度は反応の阻害剤を検出する可能性を最大にするためにスクリーニング法ではＫmより低いか又はそれに近い。
第１実施態様の好適態様においては、スクリーニング法では化合物が溶液のままであることを確実にする適切な溶媒に溶解する。一好適態様においては、５％の最終ＤＭＳＯ濃度を有する分析緩衝液を用いる。この第１実施態様の代替的態様においては、試験化合物を当業者に既知の他の適切な溶媒に溶解する。他の代替的態様においては、共溶媒の必要を取り除くために試験化合物は分析緩衝液において十分に可溶性である。
第１実施態様の好適態様においては、本方法はマルチウェルプレート方式、例えば、９６ウェルプレート方式で行われる。標準の高スループットスクリーニング法は、通常は９６ウェル(８×１２)マイクロタイタプレートを用いる。典型的には、これらのプレートは、５００マイクロリットルまで処理し得る。３８４ウェルプレートと高い密度は、本発明の方法を小型化するために用いることができる。他の実施態様においては、キュベット、エッペンドルフ管等の他の試料方式を本発明において用いることができる。好適態様においては、本発明の分析法は完全に自動化され、プレートを移動させるロボットアームを組込んだ試薬を分配する液体ハンドラを有するロボットプラットフォームを含んでいる。
【００２０】
第１実施態様の好適態様に従って、本方法は均質（“混合と測定”)方法であることが好ましい。即ち、ポリメラーゼ反応産物を定量する測定可能なシグナルを生成するために用いられる試薬は、インキュベーション時間の終わりにポリメラーゼ反応混合物に直接添加する。更に好ましくは、基質は、遊離５'Ｃ位にビオチンで修飾した１２ヌクレオチドＲＮＡオリゴウリジン酸(又はオリゴウリジン一リン酸)(オリゴ−Ｕ)プライマー；不均一な長さ(１００〜１００００ヌクレオチド)の相補的ポリアデニル酸(又はアデノシン一リン酸)(ポリＡ)鋳型を含み、オリゴ−Ｕプライマーから伸長した鎖へのＵＭＰ−[５,６3Ｈ]の取り込みとしてポリメラーゼ活性を測定する。3Ｈ標識反応生成物は、ストレプトアビジン(アマーシャム−ファーマシア、バイオテック、ＵＳＡ)で被覆したシンチレーション接近分析(ＳＰＡ)ビーズで捕捉し、当該技術において周知である手順に従ってトップカウントにより定量する。試験化合物の異なる濃度における結果に基づいて、標準濃度−阻害％曲線をプロットし、分析して試験化合物のIＣ50を求める。第１実施態様の代替的態様においては、反応混合液のアリコートを個々の反応時間(典型的には１５〜９０分間の範囲にある)で取り出し、反応速度分析の液体シンチレーション計数により結合放射能を定量した。
【００２１】
２−低親和性ＮＳ５Ｂポリメラーゼ
第２実施態様の好適実施態様においては、ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、未変性ＮＳ５Ｂのアミノ末端部分に融合したヘキサヒスチジンタグを含んでいる。好適実施態様においては、適切親和性ポリメラーゼのプライマー−鋳型に対するＫmは１０nＭ以上である。他の実施態様においては、低親和性ポリメラーゼは、プライマー−鋳型に対するＫm値が約２０nＭ以上、好ましくは６０nＭ以上、更に好ましくは１００nＭ、最も好ましくは２００nＭであるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを包含している。本発明の第２実施態様によれば、本発明に用いられるポリメラーゼは、全長未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(配列番号５)に相対してプライマー鋳型に対する親和性が低いものである。本発明の実施態様の好適態様においては、低親和性ポリメラーゼは組換えＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ構築物を包含している。好適実施態様においては、構築物はＮ末端ヘキサヒスチジンタグ全長ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ(ＨＴ-ＮＳ５Ｂ；配列番号１又はＨＴ-ＮＳＡ５Ｂ；配列番号６)を含んでいる。他の好適実施態様においては、構築物は、Ｃ末端２１アミノ酸がなくＮ末端ヘキサヒスチジン又はＣ末端ヘキサヒスチジンタグをもつ成熟ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ(ＨＴ-ＮＳ５ＢΔ２１ＣとＮＳ５ＢΔ２１Ｃ-ＨＴ；配列番号２と配列番号３)の可溶形態を含んでいる。他の実施態様においては、ポリメラーゼは成熟ＮＳ５Ｂ上に通常見られるＣ末端５７アミノ酸がなくＣ末端ヘキサヒスチジンタグをもつ成熟ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ(ＮＳ５ＢΔ５７-ＨＴ；配列番号４)の可溶形態を含んでいる。
【００２２】
３−キット
本発明の第３実施態様によれば、ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼと適切なプライマー−鋳型との間の結合の潜在的阻害剤としての試験化合物を同定するためのキットであって、
（ａ）該プライマー−鋳型に対する親和性が全長未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼに相対して低いＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを含む第１試薬と、
（ｂ）プライマーが５'Ｃ位にビオチニル化されている、該試験化合物の不在下に該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼによって結合することができる適切なプライマー−鋳型を含む第２試薬と、
（ｃ）該ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの結合時と続いての該プライマーの伸長時、よってポリメラーゼ産物の形成時に、放射能標識リボヌクレオチド一リン酸として該プライマーに取り込むことができる複数の適切な放射能標識[5,６3Ｈ]リボヌクレオチド三リン酸を含む第３試薬と、
（ｄ）そのビオチニル化したプライマー−鋳型と、形成されたビオチニル化ポリメラーゼ産物とを捕捉するのに適したシンチラントを含む複数のストレプトアビジン被覆ビーズを含み、よって、ビーズの刺激時に該ビーズから出された光の強さが放射能標識ポリメラーゼ産物の形成レベルに比例する第４試薬と
を含む、前記キットが提供される。
低親和性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼ、適切なプライマー−鋳型、親和性タグ、適切な放射能標識リボヌクレオチド三リン酸、受容体被覆固体支持体の好適態様を個々に示す。
【００２３】
４−ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害
本発明の第４実施態様によれば、未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害する方法であって、
（ａ）本明細書に記載される方法によって未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤を同定する工程と、
（ｂ）該未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと工程(ａ)とを接触させ、これにより該未変性ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性が阻害される工程と
を含む、前記方法が提供される。
本発明の好適実施態様の詳細を次の実施例において更に説明するが、添付の特許請求の範囲について制限するものでないことは理解される。
【００２４】
実施例１
ＮＳ５Ｂポリメラーゼ酵素の精製
ＨＴ-ＮＳ５Ｂ：組換えバキュロウイルス構築物(ＢacＨＴa５Ｂ)から感染したＳf-２１昆虫細胞中のヘキサヒスチジンタグ前駆体としてＮＳ５Ｂポリメラーゼを作製した。このベクターは、全長ＨＣＶ ＮＳ５Ｂに結合したＮ末端ヘキサヒスチジンタグをコードしている(ＨＴ-ＮＳ５Ｂと呼ばれる；配列番号１)。要するに、ＢacＨＴa５Ｂ感染Ｓf-２１細胞沈降物を溶解緩衝液(２５mＭトリスpＨ７.５、１mＭ ＥＤＴＡ、５mＭ ＭgＣl2、２mＭβ-メルカプトエタノール、５００mＭ ＮaＣl、５０％グリセロール、０.１％ ＮＰ-４０、０.０５％トリトンＸ-１００とプロテアーゼインヒビターの反応混液)に再懸濁し、ダウンスホモジナイズし、ＤＮaselで処理し、音波処理し、それから遠心分離で澄明にする(１０５ ０００×ｇ、４５mim.、４℃)。得られた上清を３容量の緩衝液Ａ(２５mＭトリス pＨ７.５、２mＭβ-メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１０mＭイミダゾール、５００mＭ ＮaＣl、０.１％ＮＰ-４０、０.０５％トリトンＸ-１００とプロテアーゼインヒビターの反応混液)で希釈し、Ｎi-ＮＴＡキレート化樹脂(キアゲン)に加えた。ＨＴ-ＮＳ５Ｂタンパク質を緩衝液Ａに直線(１０〜５００mＭ)のイミダゾール勾配で溶離し、その後、緩衝液Ｂ(２０mＭトリスpＨ７.５、２０％グリセロール、２mＭβ-メルカプトエタノール、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１％ ＮＰ-４０、０.０５％トリトンＸ-１００)で希釈してＮaＣl濃度を３００mＭに下げた。ＨＴ-ＮＳ５ＢをＤＥＡＥセファロースカラムに加えて核酸を除去し、フロースルー物を緩衝液Ｂで２倍に希釈して続いてのＨiトラップヘパリンクロマトグラフィーのためにＮaＣl濃度を１５０mＭに下げた。精製ＨＴ-ＮＳ５Ｂを２００〜１０００mＭ ＮaＣl勾配でＨiトラップヘパリンカラムから溶離し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００２５】
ＨＴ-ＮＳ５ＢΔ２１又はＮＳ５ＢΔ２１-ＨＴ：組換えＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、成熟ＮＳ５Ｂに通常見られるＣ末端２１アミノ酸のない変異体の発現により可溶性形態で作製し得る。我々は、これをいわゆるＮＳ５ＢΔ２１のＮ末端ヘキサヒスチジンを含むもの(ＨＴ-ＮＳ５ＢΔ２１と呼ぶ；配列番号２)とＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含むもの(ＮＳ５ＢΔ２１-ＨＴと呼ぶ；配列番号３)に表現した。Ｅ.coli株ＪＭ１０９(ＤＥ３)中のpＥＴベクターからのこれらの遺伝子の発現を０.４mＭ ＩＰＴＧで２４℃において３時間誘導する。細胞を取り出し、溶解緩衝液(トリス-ＨＣl pＨ７.５、１０％グリセロール、１mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ 2-メルカプトエタノール、５００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＰＭＳＦ、１μg/mlアンチペイン、１μg/mlペプスタチンＡ、１μg/mlロイペプチン)にマイクロフルイタイザで溶解した。溶解物を３０ ０００ｇ遠心分離で澄明にし、その後、イミダゾールで最終濃度１０mＭまで補足する。次に、溶解物を予め緩衝液Ｃ(２５mＭトリス-ＨＣl pＨ７.５、１０％グリセロール、１mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ 2-メルカプトエタノール、５００mＭ ＮaＣl、１０mＭイミダゾール、プロテアーゼインヒビター)で平衡にした金属キレート化樹脂(Ｎi-ＮＴＡ；キアゲン)に装填し、徹底的に洗浄し、その後、緩衝液Ｃ中の１０〜５００mＭイミダゾール勾配を用いてタンパク質を溶離する。ＨisタグＮＳ５ＢΔ２１を含有するピーク画分をプールし、緩衝液Ｄ(２０mＭトリス-ＨＣl pＨ７.５、１０％グリセロール、５mＭ ＤＴＴ)で希釈してＮaＣl濃度を３００mＭに下げ、ＤＥＡＥセファロースカラムに加えて核酸を除去する。ＤＥＡＥセファロースカラムからのフロースルー物を緩衝液Ｄで希釈してＮaＣl濃度を２００mＭに下げ、それからヘパリンセファロースカラムに加える。ＨisタグＮＳ５Ｂを緩衝液Ｄ中の２００mＭ〜１Ｍ ＮaＣl勾配でヘパリンセファロースから溶離する。ＨisタグＮＳ５Ｂを含有するピーク画分をプールし、緩衝液Ｄで希釈して２００mＭの最終ＮaＣlを得、リソースＳカラムに装填する。濃縮ＨisタグＮＳ５ＢをリソースＳから溶離し、３００mＭ ＮaＣlを含有する緩衝液Ｄ中でスーパデックス２００によりサイズ分画する。ピーク画分は、非常に純粋なＨisタグＮＳ５Ｂを含み、使用するまで−８０℃で貯蔵する。
【００２６】
ＮＳ５ＢΔ５７-ＨＴ：組換えＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、成熟ＮＳ５Ｂに通常見られるＣ末端２１アミノ酸のない変異体の発現により可溶性形態で作製し得る。我々は、これをいわゆるＮＳ５ＢΔ５７-ＨＴのＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含むもの(ＮＳ５ＢΔ２１-ＨＴと呼ぶ；配列番号４)に表現した。Ｅ.coli株ＪＭ１０９(ＤＥ３)中のpＥＴベクターからのこれらの遺伝子の発現を０.４mＭ ＩＰＴＧで２４℃において３時間誘導する。細胞を取り出し、溶解緩衝液(トリス-ＨＣl pＨ７.５、１０％グリセロール、１mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ 2-メルカプトエタノール、５００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＰＭＳＦ、１μg/mlアンチペイン、１μg/mlペプスタチンＡ、１μg/mlロイペプチン)にマイクロフルイタイザで溶解した。溶解物を２０ ０００ｇ遠心分離で澄明にし、その後、イミダゾールで最終濃度１５mＭまで補足する。次に、溶解物を予め緩衝液Ｅ(トリス-ＨＣl pＨ７.５、１０％グリセロール、１mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ 2-メルカプトエタノール、５００mＭ ＮaＣl、１５mＭイミダゾール、プロテアーゼインヒビター)で平衡にした金属キレート化樹脂(Ｎi-ＮＴＡ；キアゲン)に装填し、徹底的に洗浄し、その後、緩衝液Ｅ中の１０〜５００mＭイミダゾール勾配を用いてタンパク質を溶離する。ＨisタグＮＳ５ＢΔ２１を含有するピーク画分をプールし、緩衝液Ｆ(２５mＭ ＮaＰＯ4 pＨ７.５、１０％グリセロール、２mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１μg/mlのプロテアーゼインヒビター反応混液、０.１mＭ ＰＭＳＦ)で希釈してＮaＣl濃度を３００mＭに下げ、ＤＥＡＥセファロースカラムに加えて核酸を除去する。ＤＥＡＥセファロースカラムからのフロースルー物を緩衝液Ｆで希釈してＮaＣl濃度を２００mＭに下げ、それからヘパリンセファロースカラムに加える。ＨＴ-ＮＳ５Ｂを緩衝液Ｆ中２００mＭ〜１Ｍ ＮaＣl勾配でヘパリンセファロースから溶離する。ＮＳ５Ｂを含有するピーク画分をプールし、緩衝液Ｇ(２５mＭ ＮaＰＯ4 pＨ７.５、１０％グリセロール、２mＭ ＤＴＴ)で希釈して１４０mＭの最終ＮaＣlを得、１４０mＭを含有する緩衝液Ｇ中で平衡にしたＱセファロースカラムに装填する。Ｑセファロースカラムからのフロースルー物を集め、５Ｍ ＮaＣlで最終濃度３００mＭ ＮaＣlに調整する。次に、フロースルー物に溶離したＮＳ５Ｂを遠心コンセントレータで濃縮し、使用するまで−８０℃で貯蔵する。
【００２７】
全長未変性ＮＳ５Ｂ(配列番号５)：これを上記ＨＴ-ＮＳ５Ｂに記載されたように組換えバキュロウイルスからヒスチジンタグ前駆体(ＮＴ-ＮＳＡ５Ｂ；配列番号６)として作製する。この前駆体は、ＮＳ３/４ＡプロテアーゼによるＮＳ５Ｂのアミノ末端の異種配列の除去を可能にするＮＳ３プロテアーゼのＮＳ５Ａ-ＮＳ５Ｂ切断部位を含む。ＮＳ３/４Ａプロテアーゼは、成熟ＮＳ５Ｂを生成するためにＮＳ５Ａ-５Ｂを切断し、同量の緩衝液Ｉ(５０mＭ ＮaＰＯ4 pＨ７.８、１０％グリセロール、０.３Ｍ ＮaＣl、０.１％n-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド)で希釈した緩衝液Ｈ(２０mＭトリスpＨ７.５、２０％グリセロール、２mＭβ-メルカプトエタノール、１mＭ ＥＤＴＡ、０.１５％n-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド)中１：５０：１.２５モル比のＮＳ３プロテアーゼ：４Ａ補因子ぺプチド：ＨＴ-ＮＳＡ５Ｂ前駆体を用いる。反応を室温で４５分間行い、続いて４℃で５時間インキュベートする。Ｈisタグ５ＡをＮＳ３触媒除去した後、反応混合液を１０mＭイミダゾールで補足し、Ｎi-ＮＴＡ樹脂とバッチ混合して切断Ｈisタグテール部と非切断ＨＴ-ＮＳ５Ｂタンパク質を結合する。樹脂を遠心分離で沈降させ、上清(ＮＳ５Ｂと呼ばれる成熟ＮＳ５Ｂ画分；配列番号５)を上記のようにＨiトラップヘパリンクロマトグラフィー処理してＮＳ３プロテアーゼをＮＳ５Ｂ ＲdＲpから分離する。ヘパリンクロマトグラフィーで分画したＮＳ５Ｂを８００mＭ ＮaＣlを含有する緩衝液Ｈ中で分取用スーパローズ-１２ゲルろ過カラムに加えて非常に純粋なＮＳ５Ｂを回収する。
【００２８】
実施例２
未変性ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性の阻害
国際出願第０２/０４４２５号に述べられている化合物より選ばれるような化合物についてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(ＮＳ５Ｂ)に対する阻害活性を次の分析に従って試験した。
基質は下記の通りである。
遊離５'Ｃ位にビオチンで修飾した１２ヌクレオチドＲＮＡオリゴウリジン酸(又はオリゴウリジン一リン酸)(オリゴ-Ｕ)プライマー、
不均一な長さ(１００〜１００００ヌクレオチド)の相補的ポリアデニル酸(又はアデノシン一リン酸)(ポリＡ)鋳型、
ＵＴＰ-[５,６3Ｈ]。
ポリメラーゼ活性は、オリゴ-Ｕプライマーから伸長した鎖へのＵＭＰ-[５,６3Ｈ]の取り込みとして測定した。3Ｈ標識反応産物をストレプトアビジン(アマシャム-ファルマシアバイオテック、ＵＳＡ)で被覆したＳＰＡビーズで捕捉し、当該技術において周知である手順に従ってトップカウントにより定量した。
すべての溶液をＤＥＰＣ処理ＭilliＱ水(２mlのＤＥＰＣを１リットルのＭilliＱ水に添加する。混合液を激しく振盪してＤＥＰＤを溶解し、次に１２１℃で３０分間オートクレーブにかけた。)から調製した。
酵素：全長ＨＣＶ ＨＴ-ＮＳ５Ｂ(配列番号１)を上記実施例１に記載されたＮ末端ヘキサヒスチジン融合タンパク質として精製した。酵素を貯蔵緩衝液中で−２０℃で貯蔵し得る。これらの条件下、少なくとも６ヶ月間活性を維持することがわかった。
基質：ビオチニル化オリゴ-Ｕ12プライマー、ポリ(Ａ)鋳型、ＵＴＰ-[５,６3Ｈ]を水に溶解した。この溶液は−８０℃に貯蔵し得る。
2004520839.tif 000002
試験化合物反応混液：分析直前に試験化合物を１５％ＤＭＳＯを含有する分析緩衝液に溶解した。
基質反応混液：分析直前に、基質を下記の濃度に分析緩衝液に混ぜた。
【００２９】
【表１】
2004520839.tif 000003
【００３０】
酵素反応混液：分析直前に、ＲＮＡポリメラーゼ(ＮＳ５Ｂ)反応混液を下記の濃度に分析緩衝液中で調製した。
【００３１】
【表２】
2004520839.tif 000004
【００３２】
プロトコール：
下記の成分を連続して添加することによりＭicrofluor(登録商標)白色“Ｕ”下部プレート(Ｄynatech(登録商標)#7105)において分析反応を行った。
２０μlの試験化合物反応混液；
２０μlの基質反応混液；
２０μlの酵素反応混液
(分析中の最終[ＮＳ５Ｂ]＝１０nＭ；分析中の最終[n-ドデシルマルトシド]＝０.３３％；分析中の最終ＤＭＳＯ＝５％)。
反応液を室温で１.５時間インキュベートした。ＳＴＯＰ溶液(２０μl；０.５Ｍ ＥＤＴＡ、１５０ng/μl tＲＮＡ)、続いて３０μlのストレプトアビジン被覆ＰＶＴビーズ(２０mＭトリス-ＨＣl、pＨ７.５、２５mＭ ＫＣl、０.０２５％ＮaＮ3中８mg/ml)を添加した。次に、プレートを３０分間振盪した。ＣsＣl溶液を添加(７５μl、５Ｍ)してＣsＣl濃度を１.２Ｍにした。次に、混合液を１時間放置した。次に、ビーズを次のプロトコールを用いたヒューレットパッカードトップカウント(登録商標)機器により計数した。
データ方式：カウント/分
シンチレータ：liq/plast
エネルギー範囲：低
効率方式：ノーマル
領域：０〜５０
カウントの遅れ：５分
カウント時間：１分
予想結果：６０００cpm/ウェル
２００cpm/ウェル酵素対照なし
１０種類の異なる濃度の試験化合物の結果に基づいて、標準濃度-阻害％曲線をプロットし、分析して試験化合物のIＣ50を求めた。いくつかの化合物について、２つの点からIＣ50を測った。
【００３３】
実施例３
ＨＴ-ＮＳ５Ｂによるポリメラーゼ活性に対するプライマーの長さの影響の評価
ＮＳ５Ｂポリメラーゼに対する最適ホモポリマープライマー-鋳型を調べる実験を従来技術において行った。鋳型とプライマー間の異なる割合のほかに基質の異なる組合わせを試験した。ポリＧ/オリゴＣとポリＵ/オリゴＡは酵素によって効率よく用いられなかった(Lohmann et al., 1997; Oh et al., 1999; Johnson et al, 2000)が、ポリＣ/オリゴＧとポリＡ/オリゴＵは効率よい鋳型/プライマーであった(Lohmann et al., 1997; Lohmann et al., 1998; Ferrari et al., 1999; Oh et al., 1999; Ishii et al., 1999; Tomei et al, 2000; Johnson et al, 2000)ことは以前に知られている。オリゴプライマーの異なる長さは、ポリメラーゼ反応に用いられている(通常は１２〜２０量体)。
ＨＴ-ＮＳ５Ｂ酵素活性に対するプライマーの長さの影響をオリゴＵ4、Ｕ6、Ｕ8、Ｕ10、Ｕ12、Ｕ14、Ｕ16、Ｕ18(ジェンセットＳＡ、パリ、フランス)を用いて実験した。それぞれの濃度を２６０nmにおけるＯＤ吸収により求め、次に分析において５００nＭの最終濃度の各オリゴを得るために調整した。ポリ(Ａ)は２０μg/μlの最終濃度で維持した。反応におけるこれらの他の試薬の条件は、実施例４においてＫm定量プロトコールに記載された条件と同じであった。分析に用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂ酵素とＵＴＰの最終濃度は、それぞれ１５nＭと１μＭであった。反応の速度について異なるオリゴを求め、Ｕ12を用いた標準反応と比較した。結果を図１に示す。図１に示されるように、ヌクレオチド取り込みの最大速度をＵ12により得た。Ｕ12より短い又は長いオリゴで再構成された反応は低速度の取り込みを示した。
【００３４】
実施例４
ＮＳ５Ｂポリメラーゼの異なる構築物の反応速度分析
従来技術に報告された試験管内組換えＨＣＶポリメラーゼによる分析は異なる鋳型とプライマー、切断型とタグ標識の異なるポリメラーゼ構築物を用いる。この多基質系で定常状態速度論を行うことは複雑であることから、酵素学実験はプライマー−鋳型とＮＴＰ双方の著しく異なるＫm値を報告している。ほとんどのこれらの実験は、反応に含まれるヌクレオチド三リン酸のＫm定量に向けられた。プライマー−鋳型としてポリＣ/オリゴＧを用いたＧＴＰについて報告されたＫmは、行われた実験によって異なる。０.２μＭ〜５２μＭの値(Tomei et al, 2000; Lohmann et al., 1998; Ferrari et al., 1999)が得られた。ポリＡ/オリゴＵにおいては、ＵＴＰに対するＫmも異なる。５μＭ〜２２μＭ間の値(Tomei et al, 2000; Johnson et al, 2000; Lohmann et al., 1998)が得れた。プライマー−鋳型に対するＫmの定量に関して、ポリＣ/オリゴＧとＨＣＶポリメラーゼ間に高親和性値が報告された(Ｋm３０nＭ)(Ferrari et al., 1999)。
複数の基質とのポリメラーゼ反応においては、反応は連続順序：まずポリメラーゼがプライマー−鋳型に結合して二成分複合体を形成し、次に、ヌクレオチドを結合して触媒的にコンピテントな三成分複合体を形成する。
一方の基質の動力学的パラメータを求めるために、酵素はもう一方の基質によって飽和されなければならない。各基質の増加濃度の初速度を求めた。データを処理し、速度論ソフトウェア(ＧraＦit Ｅrithacus Ｓoftware)で分析した。プライマー−鋳型(ポリＡ/オリゴＵ12)に対するＫmを測るために、分析にはポリＡ/オリゴＵ12の増加濃度(１０nＭ〜１０００nＭ)の存在下に飽和量のＵＴＰ(２５〜５０μＭ)を用いた。
同様に、ＵＴＰに対するＫmの定量においては、増加濃度のＵＴＰの存在下に飽和量のプライマー−鋳型を用いた(４００〜１０００nＭ)。
【００３５】
我々は、実施例１に記載された親和性タグやＣ末端切断のような特徴を組込んだ種々の精製ＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼを調べ、異なるＮＳ５Ｂ変異体の活性を確認した。ホモポリマーＲＮＡとの一般的な試験管内ポリメラーゼ反応におけるＮＳ５Ｂの活性には、プライマー−鋳型とリボヌクレオチド三リン酸を含む複数の基質との相互作用が必要である。Ｋmのような定常状態の動力学的パラメータは、プライマー−鋳型とリボヌクレオチド三リン酸の基質の双方について求めることができる(Ferrari et al., 1999)。
ポリメラーゼ反応は、１０mＭトリス pＨ７.５、１mＭ ＥＤＴＡ、５mＭ ＭgＣl2、０.１７単位/μl ＲＮasin、０.３３％ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、３％グリセロール、０.０１％Igepal、３０mＭ ＮaＣl中で行った。ポリ(Ａ)/オリゴＵ12に対する異なる酵素構築物のＫmの定量においては、分析におけるプライマーの最終濃度は１０nＭ〜１０００nＭ(プライマー−鋳型比率１０はすべての濃度で維持した)の範囲であり、最終ＵＴＰ濃度は２５又は５０μＭ(０.０８〜０.２μＣi/μlを含有する)であった。反応の引き金となるＵＴＰを付加する前にプライマー−鋳型とポリメラーゼを混合した。８μlのアリコートを特定の時間(１５〜９０分間の範囲にある)で除去し、ＤＥ８１ろ紙ディスクにスポットし、完全に乾燥した。次に、ディスクを１Ｍリン酸ナトリウムpＨ７で３回１０分間洗浄してから水と８５％エタノールですすいだ。次に、結合放射能を５mlのオプチフェイズ‘ＨiＳafe'２中で液体シンチレーション計数により定量した。ポリ(Ａ)/オリゴＵ12の各濃度での初速度を求めた。データを処理し、速度論ソフトウェア(ＧraＦit Ｅrithacus Ｓoftware)で分析してポリ(Ａ)/オリゴＵのＫmを得た。飽和量のポリ(Ａ)/オリゴＵ12(４００nＭ〜１０００nＭ)の存在下のＵＴＰに対するＫmを求めるために同じ手順をあてはめた。
異なるＮＳ５Ｂポリメラーゼ構築物(ＮＳ５Ｂ、ＨＴ-ＮＳ５Ｂ、ＨＴ-ＮＳ５ＢΔ２１Ｃ、ＮＳ５ＢΔ２１Ｃ-ＨＴ、ＮＳ５ＢΔ５７-ＨＴ)を上記実施例１に記載されたように作製し精製した。これらの酵素構築物に対するＵＴＰとポリＡ/オリゴＵ双方のＫm値を求めた。下記表Ｉに示した結果は、ポリメラーゼ構築物によってＵＴＰに対するＫmが０.８μＭ〜８μＭに変動することを示している。しかしながら、プライマー−鋳型に対するＫmは異なるポリメラーゼ構築物の間で約３０倍だけ変動し、７nＭ〜２００nＭの範囲にあった。
表１：ＮＳ５Ｂポリメラーゼの異なる構築物の反応速度分析
【００３６】
【表３】
2004520839.tif 000005
【００３７】
実施例５
試験化合物に対するＫiの定量と阻害機序の決定
ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤の種類は、本発明の方法を用いた国際出願第０２/０４４２５号において以前に同定した。この種類の阻害剤から代表的な化合物による阻害機序を求めるために、２組の反応を行った。
第１組においては、異なるプライマー−鋳型の反応速度と阻害剤濃度を調べることによりＨＴ-ＮＳ５Ｂ(実施例１参照)ポリメラーゼ反応を行った。プライマー−鋳型の濃度は、２５〜１０００nＭの範囲にあり、所定濃度のＵＴＰは２５μＭ(０.２μＣi33Ｐ-ＵＴＰ/μlまで含有する)であった。分析に用いた酵素濃度は５nＭであり、阻害剤の濃度はIＣ50が０.２５〜４倍の範囲にあった。これらのインキュベーションの各々について、反応の速度を決まった時間にアリコートを取り出し、ＤＥ８１フィルタディスク上に転写し、完全に乾燥した。次に、ディスクを１Ｍリン酸ナトリウムpＨ７で３回１０分間洗浄し、水と８５％エタノール中ですすいだ。次に５mlのオプチフェイズ‘ＨiＳafe'２中で液体シンチレーション計数により結合した放射能を定量した。実施例４に記載されたようにデータを処理した。
第２組の実験においては、反応の速度を異なるＵＴＰと阻害剤濃度においてモニタした。プライマー−鋳型濃度は一定(約２５０nＭ)であり、ＵＴＰ濃度は０.２５μＭ〜５０又は１００μＭ(０.０２〜０.２μＣi33Ｐ-ＵＴＰ/μl)の範囲にあり、阻害剤濃度はIＣ50値が０.２５〜４倍の範囲にあり、酵素濃度は１０〜２５nＭであった。
次に動力学的結果を、阻害機序の決定と阻害定数(競合阻害部分としてＫiと非競合阻害部分としてＫi')の定量を可能にするコーニッシュ・ボーデン(1974)の方法に従ってプロットした。これらのグラフの例を図２と図３に示す。主要な競合成分においては、プライマー−鋳型に対して混合阻害機序が観察された(ｘ軸より上でのディクソンプロットの交差とｘ軸より下でのコーニッシュ−ボーデンプロットの交差)。対照的に、ディクソンプロットとコーニッシュ−ボーデンプロットがｘ軸上で交差するように、ＵＴＰの明らかな非競合阻害を得た。
【００３８】
実施例６
異なるポリメラーゼ構築物により得られたIＣ50値の変化
実施例５における試験化合物と同じ種類の化合物から一連の30種の関連化合物のIＣ50値を、実施例１に記載されたＮＳ５Ｂポリメラーゼの５種類の異なる構築物により求めた。これらの実験の結果を下記表２に示す。
表２：ポリメラーゼ構築物に対するIＣ50値の定量
【００３９】
【表４】
2004520839.tif 000006
【００４０】
実施例５に詳述されるように、この種類の阻害剤は、プライマー-鋳型と競合することがわかった(実施例５で求めたように阻害機序とＫiとＫi'値によって証明された)。この系の阻害剤のIＣ50を調べた。プライマー−鋳型に対する種々のＮＳ５Ｂ構築物の異なるＫmに基づいて、この系の阻害剤のIＣ50は種々のＮＳ５Ｂ構築物と異なることが予想された。表２は、実験結果を纏めたものである。実施例１に用いられるＨＴ-ＮＳ５Ｂ酵素は、基準値(１に基準化)とみなされ、この系の化合物のIＣ50の増加はＨＴ-ＮＳ５ＢΔ２１酵素による４.２倍から全長未変性による１２８倍まで変動した。IＣ50値の劇的な増加は、全長未変性ＮＳ５Ｂと結合するプライマー−鋳型の阻害剤のスクリーニングが適度に強力な化合物の同定を著しく損なったことを意味している。
文献、特許、特許出願はすべて、個々の文献、特許又は特許出願の記載が個々に本願明細書に含まれていることを意味するのと同じ程度まで本願明細書に含まれるものとする。
【００４１】
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【００４２】
本発明の好適実施態様を本明細書に記載してきたが、本発明の真意又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】オリゴＵ4、Ｕ6、Ｕ8、Ｕ10、Ｕ12、Ｕ14、Ｕ16、Ｕ18を用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂ酵素活性に対するプライマーの長さの影響を示すグラフである。
【図２】図２Ａはジオキサンプロットを用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂの代表的な試験化合物によるプライマー−鋳型に対する阻害様式と阻害定数(Ｋi)の定量を示す図であり、図２Ｂはコーニッシュ-ボーデンプロットを用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂの代表的な化合物によるプライマー−鋳型に対する阻害様式と阻害定数(Ｋi)の定量を示す図である。
【図３】図３Ａはジオキサンプロットを用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂの代表的な試験化合物によるＵＴＰに対する阻害様式と阻害定数(Ｋi)の定量を示す図であり、図３Ｂはコーニッシュ-ボーデンプロットを用いたＨＴ-ＮＳ５Ｂの代表的な化合物によるプライマー−鋳型に対する阻害様式と阻害定数(Ｋi)の定量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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