(57)【要約】本発明は潜在的に医薬品として有用な化合物の活性をインビボでスクリーニングする迅速な方法を提供する。本方法は、その中にレポーター遺伝子が生体親和性で半浸透性のカプセル化デバイス中に導入された標的細胞を増殖させる；対象の中に半浸透性のカプセル化デバイスを挿入させる；該対象へ潜在的に医薬品として活性な化合物を投与する；潜在的に医薬品として活性な化合物へインビボの曝露後に該対象から該カプセル化デバイスを除去する；および該レポーター遺伝子の発現を測定することにより該標的細胞の潜在的に医薬品として活性な化合物に対する反応を評価する、工程を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の医薬品活性をスクリーニングする方法であって、（ａ）その中にレポーター遺伝子が生体親和性で半浸透性のカプセル化デバイス中に導入された標的細胞を増殖させる；（ｂ）対象の中に半浸透性のカプセル化デバイスを挿入させる；（ｃ）該対象へ潜在的に医薬品として活性な化合物を投与する；（ｄ）該化合物へインビボの曝露後に該対象から該カプセル化デバイスを除去する；および（ｅ）該レポーター遺伝子の発現を測定することにより該標的細胞の該化合物に対する反応を評価する：工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、レポーター遺伝子は光−発生成分を生成しそして標的細胞の化合物に対する反応の評価を光−発生成分により発生される光の強度を測定することにより行う、方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子が生物発光成分を生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
半浸透性カプセル化デバイスが少なくとも５０，０００ダルトンの分子カットオフを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、標的細胞ががん性ならびに非がん性のヒト腫瘍細胞株；ヒト線維芽細胞；ヒト白血球；およびネズミ腫瘍細胞株からなる群から選択される、方法。
【請求項６】
標的細胞が腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、標的細胞が黒色腫細胞株、肺腫瘍細胞株、腎腫瘍細胞株、結腸腫瘍細胞株、前立腺腫瘍細胞株、卵巣腫瘍細胞株、乳腫瘍細胞株、中枢神経系腫瘍細胞株および白血病性細胞株からなる群から選択されるヒト腫瘍細胞株である、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、レポーター遺伝子が生理的異常に関連するタンパク質もしくは酵素の発現をまた制御するプロモーターを含有する、方法。
【請求項９】
該タンパク質もしくは該酵素が標的細胞により過大発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該タンパク質もしくは該酵素が標的細胞により過小発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコード化する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞がｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターに機能し得るように結合されているルシフェラーゼをコード化する遺伝子配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
標的細胞が飽和量のルシフェリンに曝露される後で評価される、請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコード化する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
レポーター遺伝子が構成的プロモーターを含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコード化する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的細胞が飽和量のルシフェリンに曝露される後で評価される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、動物において化合物の医薬品活性をスクリーニングする方法に向けられている。
【０００２】
腫瘍性増殖、特にがん性増殖、のような疾患状態に対する有効な処置への欲求は、潜在的化学療法剤をスクリーニングする素早くかつ信頼性のある方法への必要性を創出してきた。異なるタイプの腫瘍細胞株は種々の化学療法剤に対して異なって反応する傾向があり、種々の潜在的標的細胞および細胞株に対して一つの有望な薬剤をスクリーニングするために大多数の実験を必要とする。種々の細胞株を用いるインビトロのスクリーニングプロセスが潜在的化学療法剤をスクリーニングするために広く使用されているが、インビトロでの細胞の医薬品への曝露は高度に人工的であり、そして体内における薬剤の代謝的もしくは全身的変性を反映しない。加えて、疾患を引き起こす病理生理学的プロセスの理解における最近の進歩は、良く規定された標的への直接的な薬理学的介入（例えば、発現、もしくは酵素活性、またはシグナル形質導入分子／経路のモジュレーション）を可能にする。それ故に、生きた動物において潜在的医薬品候補のそれらの標的との相互作用を評価するであろう迅速なアッセイへの必要性がここにある。これらの“機械的”アッセイは“症候性”モデルを潜在的に取り替えることができるが、そこでは読み出しは疾病の進行であって、標的への化学療法的介入の効果ではない。
【０００３】
潜在的化学療法剤をスクリーニングするインビボモデルがある。これらのモデルは、腫瘍細胞を実験動物の中に移植し、その動物を有望な化学療法剤で処置し、次いで動物をモニターして、腫瘍細胞に対する処置の効果を決定することを伴う。例示的なモデルとしては、（１）その中で生きた腫瘍細胞が外科的に移植されているかもしくは腫瘍細胞懸濁液が実験動物の皮膚下に注射されているところの皮下腫瘍モデル；（２）生きた腫瘍細胞が外科的に移植されているかもしくは腫瘍細胞懸濁液が腫瘍由来の器官（即ち、前立腺の中の前立腺腫瘍細胞、肺の中の肺腫瘍細胞もしくは、腫瘍細胞が実験動物の腎臓カプセル下に外科的に移植されている、腎下腫瘍モデル）の中に注射されている、正所性モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｄｅｌ）；（３）その中で腫瘍細胞が腹腔の中に注射されているところの腹膜モデル；または（４）その中で腫瘍細胞が実験動物の血管の中に直接注射されているところの転移モデルが挙げられる。次いで、移植腫瘍をモニターして、それが移植動物中で増殖していることを確認する。次いで、ここで得られる腫瘍性動物を使用して、潜在的化学療法剤をスクリーニングする。そのようなインビボモデルは労働集約型であり、そして大多数の試験動物および大量の試験化合物を必要とする。さらに、そのようなインビボモデルは、移植腫瘍が動物中で増殖するのに十分な時間を必要とする時間浪費型プロセスである。典型的には、インビボの試験結果を得ることに５〜６週間以上かかる。かくして、そこに化合物を迅速にスクリーニングするために利用できるインビボの試験方法の必要性が残っている。
【０００４】
概要
本発明は化合物の医薬品活性をスクリーニングする迅速な方法を提供する。本方法は、（ａ）その中にレポーター遺伝子が生体親和性で半浸透性のカプセル化デバイス中に導入された標的細胞を増殖させる；（ｂ）対象の中に半浸透性のカプセル化デバイスを挿入させる；（ｃ）該対象へ潜在的に医薬品として活性な化合物を投与する；（ｄ）潜在的に医薬品として活性な化合物へインビボの曝露後に該対象から該カプセル化デバイスを除去する；および（ｅ）該レポーター遺伝子の発現を測定することにより、該標的細胞の潜在的に医薬品として活性な化合物に対する反応を評価する、工程を包含する。
【０００５】
レポーター遺伝子は検出に適する任意の生成物をコード化し得る。好ましくはレポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼもしくは好ましくは緑色蛍光タンパク質および特にルシフェラーゼのような、インサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で検出を可能にするところの容易にアッセイされる生成物をコード化する。
【０００６】
望ましくは、光−発生成分、好ましくは生物発光成分、を生成するレポーター遺伝子を標的細胞の中に導入して、発光する能力のある標的細胞を生じさせる。次いで、標的細胞の潜在的に医薬品として活性な化合物に対する反応の評価を、光−発生成分により発生される光の強度を簡単に測定することにより、実施することができる。
【０００７】
第一の好ましい態様において、生物発光成分のための遺伝子配列は、生理的異常に関連するところのタンパク質もしくは酵素、例えば、生理的異常の結果として過小発現するか好ましくは過大発現するところのタンパク質もしくは酵素、の発現を制御するプロモーターに機能し得るように結合されている。この態様において、光−発生成分の発現レベルは生理的異常を予想する様にモジュレートされる。
【０００８】
第二の態様において、生物発光成分のための遺伝子配列は、構成的プロモーターに機能し得るように結合されていて、そして存在する光−発生成分の量は存在する標的細胞の数に比例する。かくして、スクリーニングされている化合物が細胞株において増殖の減少もしくは死を引き起こすならば、対照と比較して弱い光を放射する。
【０００９】
本方法は、従来のインビボスクリーニングモデルより高度に有利である。例えば、本方法を使用して、短いターンオーバー時間をもってインビボ有効度について抗腫瘍医薬品を試験することができる。結果を得るのに４〜５週間がかかり得る、従来の異種移植モデルと異なり、本方法は１０日未満で結果を生じさせることができる。特に、機械的レポーター遺伝子モデル、例えば、興味のある遺伝子がルシフェラーゼにより取り替えられて、光放射がこの遺伝子の発現への新医薬品候補の衝撃の尺度である事例、は４日未満で結果を生じさせることができる。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（化合物１）およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（化合物２）による静脈処置の２４時間後に無胸腺ヌードマウスから取り出した中空糸中のＨ１２９９Ｃ２による光放射のグラフ表示である。
【００１１】
詳細な説明
本発明は化合物の医薬品活性をインビボで迅速に評価する試験方法を提供する。これに加えて、本方法を使用して、組織特異性および／もしくは化合物を含有する送達システムについて化合物を試験することができる。さらに、本方法を使用して、対象、例えば、好ましくは哺乳動物である、試験動物において試験化合物の全身性局在化および／もしくは化合物を含有する送達システムを検出することができる。
【００１２】
第一の好ましい態様において、本方法は、化合物の医薬品活性を評価するために、標的細胞、例えば、腫瘍性細胞、に関連するところの一つもしくはそれ以上の修飾レポーター遺伝子を使用する。標的細胞に関連するところのレポーター遺伝子により発現されるタンパク質もしくは酵素のレベルをモニターする従来の方法と異なり、本発明は、例えば、その発現レベルは生理的異常に依存するタンパク質もしくは酵素の発現をまた制御するプロモーターにその発現が機能し得るように結合されているところの光−発生成分により発生された光の強度をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で測定する。
【００１３】
かくして、本発明の第一の態様にしたがって、光−発生成分の発現、もしくはその欠損、は、標的細胞が化合物に暴露されるとき、興味のあるタンパク質もしくは酵素の発現に化合物が有するであろう作用を予測する。普通、興味のあるタンパク質もしくは酵素は、生理的異常の結果として過大発現されるか過小発現されると知られている。
【００１４】
光−発生成分の発現は、光−発生成分を発現する標的細胞により生じる光の強度に正確に相関するので、標的細胞による光−発生成分の発現は標的細胞により生成する光の強度を測定することにより簡単に評価される。同じプロモーターは興味のあるタンパク質もしくは酵素の両方および光−発生成分の発現を制御するので、光−発生成分の発現への化合物の作用はまた、細胞株において興味のあるタンパク質もしくは酵素の発現に化合物が有するらしい作用に相関する。
【００１５】
第二の態様において、細胞株の増殖を停止させるかモジュレートする試験化合物の能力が測定される。この第二の態様において、例えば、構成的プロモーターに機能し得るように結合されている生物発光分子を生成する遺伝子を含有するレポーター構成体を興味のある標的細胞の中に導入する。構成的プロモーターとは、そのようなプロモーターが標的細胞において構成的に活性であることを意味する。かくして、存在する生物発光分子の量、およびかくして発生される光の強度、は標的細胞の増殖に関係し、そして標的細胞の増殖、もしくはその欠損、は標的細胞により発生される光の強度を測定することにより評価される。
【００１６】
標的細胞は、種々の哺乳類の細胞株、特にヒトの細胞株、を含む、種々の細胞株から選択され得る。薬学的がん研究の分野においては、適当な細胞株の例としては、がん性ならびに非がん性のヒト腫瘍細胞株（例えば、黒色腫、肺腫瘍株、腎腫瘍株、結腸腫瘍株、前立腺腫瘍株、卵巣腫瘍株、乳腫瘍株、中枢神経系腫瘍株、白血病性細胞株、等）；ヒト線維芽細胞；ヒト白血球；およびネズミ腫瘍細胞株（例えば、ネズミ白血病）が挙げられる。
【００１７】
光−発生成分、特に生物発光分子、およびそれらの遺伝子配列は当分野において公知でありかつ市販で入手可能である。特に有用な光−発生成分としては、ルシフェラーゼファミリー（例えば、ホタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼおよびそれらの遺伝的に修飾された変異体）ならびに生物発光分子のエクオリンファミリーが挙げられる。他の有用な光−発生成分はまた公知であり、例えば、種々の蛍光タンパク質生物発光分子、例えば緑色蛍光タンパク質、は米国特許５，６２５，０４８および５，８０４，３８７に開示され、市販で入手可能である。
【００１８】
例えば生物発光分子をコード化するレポーター遺伝子のベクター構築体を、例えばトランスフェクションもしくは形質導入のような任意の公知方法により、腫瘍細胞株のような標的細胞の中に導入することができる。例えば、ルシフェラーゼのベクター構築体を、大抵の細菌を含む、種々の宿主細胞および多くの真核細胞をトランスフェクトする使用に適応させること（ｌｕｃ構築体）ができることは公知である。
【００１９】
次いで、生体親和性材料から作られている、半浸透性カプセル化デバイス中に標的細胞が置かれる。用語“生体親和性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）”は、材料自身もしくは生きた組織との組合せで異物反応もしくは線維症を生じないことを意味するようにここでは使用される。本発明の好ましい実施態様としては、半浸透性カプセル化デバイスは浸透性の中空糸または透析管であり、それは、例えば、ポリスルホン（ＰＳ）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース（ＣＡ−Ｅ）、けん化セルロースエステル（ＳＣＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、再生セルロース（ＲＣ）もしくはセルロースエステル（ＣＥ）から生産される。これらの中で特に適しているのは、ＰＶＤＦから生産される中空糸である。好ましくは、カプセル化デバイスは、挿入されるときに、対象動物の正常活動に干渉しないような寸法を有し、例えば、０．５〜５ｍｍもしくは０．５〜３ｍｍ、最も好ましくは約１ｍｍの内径を有する中空糸である。カプセル化デバイスは半浸透性であり、そして試験化合物ならびにデバイス中で増殖する細胞の成長および生存を持続させるために必要であるところの栄養剤および他の必要な成分のデバイスの内外からの拡散を可能にするようにデザインされている。好ましくは、半浸透性デバイスは、５０，０００ダルトンもしくはそれ以上、さらに好ましくは１００，０００ダルトンもしくはそれ以上、の分子量カットオフを有する材料から作られる。特に適する半浸透性デバイスは５０，０００ダルトン〜５００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する。
【００２０】
選択されたカプセル化デバイスを調製し標的細胞を装てんする。例えば、デバイス、例えばＰＶＤＦ中空糸、を７０％エタノールで洗い流して、７０％エタノール中、室温で約２４時間もしくはそれより長い期間培養することにより調製する。アルコールを無菌水の洗い流しで除去する。適切な調製後に、標的細胞を調製しデバイス中に置く。標的細胞は、デバイス中で細胞の増殖を維持するのに適切な細胞密度で調製される。この密度はそれぞれの細胞株について変動し、そしてそれぞれについて個別に設定されねばならない。一般則として、大抵の細胞は１〜１０×１０６個の細胞／ｍＬの培地で培養されるが、より高いもしくはより低い範囲を使用することができる。標的細胞を無菌注射筒へ移し、そしてデバイスの中にフィットする適切なゲージの注射針を用いてカプセル化デバイスを充てんする。次いで、カプセル化デバイスの端をシールする、例えば、熱シールするか外科用接着剤を使用して接着シールする。
【００２１】
充てんしたカプセル化デバイスを実験動物、例えば、マウス、ラットおよびイヌを含む哺乳動物、の中に挿入する。充てんしたデバイスをインビトロで培養して、挿入する前に、細胞培養を安定化させることができる。好ましくは、デバイスは腹腔内にもしくは皮下で挿入される。それぞれの実験動物は二つ以上の挿入物を有し、二つ以上の部位で挿入物を有することができる。数多くのデバイスを対象動物において種々の部位の中に、組織の特異性おおび動物に投与された医薬品的に活性な化合物をモニターできるように、挿入することが特に望ましい。生体親和性のカプセル化デバイスは動物の防御システムに干渉しないので、挿入したデバイスを宿主動物の中に長期間残留させることができる。
【００２２】
挿入後に、評価される化合物を実験動物に適切なレジメンの下で投与する。化合物が挿入した標的細胞と適切な期間相互作用するようにした後で、充てんしたカプセル化デバイスを動物から除去する。使用したレポーター遺伝子に依存して、標的細胞によるレポーター遺伝子の発現を、例えば発光を測定することにより、測定し、そして好ましくは、評価される化合物に曝露されなかった対照と比較する。
【００２３】
発現された光−発生成分の発光を、ＣＣＤカメラもしくはＩＶＩＳカメラを含む種々の手段により検出し、分析することができる。光−発生生物活性の映像をインビボで、即ち、動物の皮膚を通して映像を得て、処理することができるが、本発明にしたがうと、光放射を測定する前に動物からカプセル化デバイスを除去することがさらに望ましい。光放射のこのエクスビボ測定は、カプセル化デバイスをより簡単でさらに正確に処理して映像を得ることを可能にする。実際、中空糸中にカプセル化された生物学的実体により放射される光のエクスビボ測定は、特に、生物学的実体が、ＡＴＰ、酸素および／もしくは基質のような、光放射に必要な因子の飽和濃度に曝露されることを可能にすることにより、ならびにインビボでの光放射に影響するかも知れない他の因子の影響を減少させることにより、著しくさらに許容されるシグナル対ノイズ比を提供する。例えば、ルシフェラーゼを光−発生成分として利用するときには、インビボでデバイスを映像化する試みは、ルシフェリンが高濃度で有毒であるので、ルシフェリンの濃度を動物内で高強度の照度を得るのに十分なレベルまで増加させることができないという事実のために、許容できないほど低いシグナルをもたらす。
【００２４】
本方法を第一線のスクリーニングとして利用して、潜在的医薬品候補のインビボ有効度を試験することができる。本方法の主要な利点としては、短いターンオーバー時間（皮下異種移植モデルに比較して３〜８倍短い）、高いスループット（皮下異種移植モデルのときより４倍高い）、動物の必要数の大幅な減少、および４種の腫瘍を一つの動物中で試験する能力が挙げられる。広範な種類の臨床的に実証された作用機構を表す、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エトポシド、カンプトテシン、シスプラチンおよびマイトマイシンは、本方法により種々の腫瘍細胞株に試験されるとき、顕著な活性を生じることが見出されている。また、カプセル化デバイス中の腫瘍細胞は、全ての臨床的に適切な投与経路により、即ち、静脈的に、経口的におよび腹腔内的に、送達された抗腫瘍剤に反応したことが見出されている。
【００２５】
以下の実施例は本発明の態様を例示する。それらは本発明を説明することを意図し、これを限定するものではない。
【００２６】
実施例１
結腸がん細胞株（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ から入手可能なＰＣ−３Ｍ）を、構成的プロモーター（ｐＧＬ３ベクター；Ｐｒｏｍｅｇａ）の制御下でルシフェラーゼ用の遺伝子（ｌｕｃ遺伝子）を含有するベクターでトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞株を増殖させ、そして１０％熱−不活性化胎児ウシ血清（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で増大させる。挿入用の細胞増大をＴ−７５組織細胞フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）中で行う。全ての細胞培養をふ卵器中で、５％ＣＯ２を含有する加湿大気と共に３７℃で実施する。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて、細胞を７０〜９０％コンフルエンシーで収穫する。トリプシン化後に、細胞を培地中で望ましい濃度に希釈し、ふ卵器中３７℃で保つ。使用の２０分前に、細胞を２秒間渦巻き攪拌し、氷上に置く。カプセル化デバイスの中へ注射するための細胞懸濁液を１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で作成する。
【００２７】
トランスフェクトされた腫瘍細胞を半浸透性カプセル化デバイス、例えば、内径約１ｍｍを有する中空糸、の中に置いて、カプセル化デバイスを対象中に挿入する前に、デバイス中で増殖させる。例えば、１２μＬの上記の結腸がん細胞懸濁液をＰＶＤＦ中空糸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， Ｇａｒｄｅｎａ， ＣＡから入手可能で、内径１．０ｍｍおよび５００，０００分子量カットオフを有する）の中に置いて、開口部を熱シールして、シールした管を作成する。この管を１０％熱−不活性化胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中に置く。１０匹の非近交系無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡからの“Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲ”）を、０．９％食塩水で１：５に希釈した、１００ｍｇ／ｍＬケタミンおよび２０ｍｇ／ｍＬキシラジンの７：３混合液（ＭｃＧａｗ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）の０．２ｍＬを腹腔内投与することにより一度に麻酔する。両方の切開部位における皮膚をノバルサン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ， Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）で消毒する。首のうなじにおける皮膚中に外科鋏で切開後に、二つの管をそれを通して、１１ゲージの套管針（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を用いて動物のそれぞれの側の中に挿入する。一つの創傷クリップ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を使用して、皮膚を閉じる。腹腔内挿入のために、脾臓の丁度尾側に、背腹方向に、凡そ５ｍｍの切開を皮膚の中にする。この切開に続けて、脂肪組織の薄層を切開し、次いで今は露出した腹膜中に小さい切開（２ｍｍ）をする。それぞれの糸を挿入するには、それを穿孔の中に真直ぐに１／３を滑り込ませて、それぞれの糸の外端を動物の前部に向けて移動させ、そして糸を尾に向けて後方にずらせることが必要である。二つの皮膚ステープルを使用して、皮膚を閉じる。手術が終了すると、それぞれの動物は０．１ｍＬのブトルフェノール（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ， Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹから入手し、０．９％食塩水で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈する）の一回の皮下投与を受ける。動物は、それらのケージに帰る前に、ヒーティングパッドの上で麻酔から覚まさせる。
【００２８】
挿入デバイスをつけた動物に試験医薬化合物を投与する。化合物は、静脈、腹腔内、皮下、経口および／もしくは経皮の経路を含む種々の手段により、任意の回数で動物に投与される。処置された動物を実験室条件下に成長させて、システムを処理させ、化合物を体内に送達させる。化合物に挿入された標的細胞と相互作用するために十分な時間を持たせた後で、細胞により発現した光−発生成分により生成する光の強度を測定することにより、化合物の有効度をアクセスする。試験化合物が細胞に阻止効果を有するときには、光−発生成分の発現レベル、およびかくして光強度、は、デバイスを挿入されているが試験化合物を受け取っていなかった対照動物と比較して、減少される。逆に、試験化合物が細胞に促進効果を有するときには、光−発生成分の発現レベルは対照動物と比較して増加される。同様に、化合物が標的細胞とのいかなる相互作用も与えないかまたは試験動物の特定の部位もしくは組織に達しないときには、発光の強度は対照動物のそれと変わらない。
【００２９】
実施例２
ヒト肺がん細胞株、Ｈ１２９９、をｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ＡＴＴＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手して、１０％熱−不活性化胎児ウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養する。凡そ８０％コンフルエンシーで収穫した細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷冷ＰＢＳ中で２×１０７個の細胞／ｍＬの濃度で懸濁させる。１０μｇのｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１ルシフェラーゼプラスミドおよびＮｅｏｔｅｔＲ選択マーカーとのトランスフェクションのために細胞懸濁液０．５ｍＬを使用する。トランスフェクションは０．３Ｖおよび５００Ｆにおけるエレクトロポレーションにより実施される。次いで、細胞を０．４ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を含有する上記培地中で平板培養する。一つのコロニーを選択し、１個の細胞／ウェルに希釈し、そして単一のクローンを増大させて、Ｈ１２９９Ｃ２と呼ぶｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーター−ルシフェラーゼ安定細胞株を作成する。細胞株を試験して、マイコプラズマ汚染（Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）およびマウス抗体生成（ＭＡ ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）について陰性であることを見る。
【００３０】
挿入のために、Ｈ１２９９Ｃ２細胞株を、１０％熱−不活性化胎児ウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で細胞培養ふ卵器中、５％ＣＯ２を含有する加湿大気と共に３７℃で増殖させかつ増大させる。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて、細胞を７０〜９０％コンフルエンシーで収穫する。トリプシン化後に、細胞を上記培地で１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に希釈し、２秒間渦巻き攪拌し、中空糸への注射まで氷上に置く。
【００３１】
ＰＶＤＦ中空糸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ， Ｇａｒｄｅｎａ， ＣＡ）を、使用前最低７２時間７０％エタノール中に浸漬する。中空糸のその後全ての取扱いは、無菌手順を用いてラミナーフローフードの中で行う。個々の中空糸を受け皿から取り出して、２０−ゲージの注射針をつけた２０ｍＬ注射筒を使用して、支持面上で氷冷培地３〜４ｍＬで洗い流す。次いで、Ｈ１２９９Ｃ２細胞懸濁液を、２０−ゲージの注射針をつけた３ｍＬ注射筒を使用して、中空糸の中にゆっくりと注射する。引き続いて、糸の両端を平坦な持針器を用いてシールし、細菌学的インシネレーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）中で加熱する。１１３℃にセットした中空糸熱シーリング機械（ｍｏｄｅｌ ＦＳ−２ Ｍａｒｋ １， Ｏｕｔｓｏｕｒｃｅ ２０００， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）を用いて、次いで、全長の中空糸を１．５ｃｍのマイクロカプセルの中にシールする（以後“ファイバー”と呼ぶ）が、それぞれのファイバーは約１２μＬ（１２，０００個の細胞）の細胞懸濁液を含有する。次いで、ファイバーを６ウェルプレート（培地５ｍＬを含有するウェル当り１２本のファイバー）の中に置いて、プレートをふ卵器中３７℃で一夜培養した。
【００３２】
上述のように調製されたファイバーを含有するプレートをラミナーフローフードの中でヒーティングパッドの上に置く。１０匹の非近交系無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡからの“Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲ”）を、０．９％食塩水で１：５に希釈した、１００ｍｇ／ｍＬケタミンおよび２０ｍｇ／ｍＬキシラジンの７：３混合液（ＭｃＧａｗ Ｉｎｃ．， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）の０．２ｍＬを腹腔内投与することにより一度に麻酔する。切開部位における皮膚をノバルサン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ， Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹ）で消毒する。首のうなじにおける皮膚中に外科鋏で切開後に、一つのファイバーをそれを通して、１１ゲージの套管針（Ｐｏｐｐｅｒ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を用いて挿入する。一つの創傷クリップ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を使用して、皮膚を閉じる。手術が終了すると、それぞれの動物は０．１ｍＬのブトルフェノール（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ， Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＮＹから入手し、０．９％食塩水で０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈する）の一回の皮下投与を受ける。動物をそれらのケージに帰す前に、ヒーティングパッドの上で麻酔から覚まさせる。
【００３３】
ファイバーの挿入の２４時間後に、動物を、両方ともヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、化合物１もしくは２（それらの作成については下記参照）の単回静脈投与により処置する。静脈投与のために、化合物を注射用水（ビークル）中５％デキストロース中の溶液として処方する。
【００３４】
投与の２４時間後に、全ての動物を屠殺し、その後にファイバーを取り出して、０．２５ｍｇ／ｍＬのＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）を入れた培地２．５ｍＬを含有する６ウェルプレート（一つのファイバー／ウェル）の中に置く。培養の１５分後に、ＨａｍａｍａｔｓｕＣＣＤカメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）を用いて光放射を記録する。引き続いてＬｉｖｉｎｇｉｍａｇｅ［登録商標］ｖ．２．１０ソフトウェアー（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）を用いて、映像の光出力を分析する。
【００３５】
記載された結果は、ヒストン脱アセチル化の阻害はｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターの活性化を、およびかくしてｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１腫瘍サプレッサ―タンパク質を、もたらすことを示す。この実施例では、レポーター遺伝子が使用され、そこではｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１遺伝子はホタルルシフェラーゼ遺伝子に取り替えられて、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１プロモーターの活性化はルシフェラーゼを生成する。化合物１もしくは２を投与された動物から取り出されたファイバーからの光放射の記録（図１参照）により判断すると、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はインビボにおいてレポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）の統計的に有意な（ｐ＜０．０１、片側（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントｔ検定）かつ再現性のある発現を引き起こす。
【００３６】
化合物１の作成：
ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）中、３−（４−｛［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチルアミノ］−メチル｝フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペノン酸メチルエステル（１２．６ｇ、３７．７ミリモル）、（２−ブロモエトキシ）−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン（１２．８ｇ、５３．６ミリモル）および（ｉ−Ｐｒ）２ＮＥｔ（７．４２ｇ、５７．４ミリモル）の溶液を５０℃で加熱する。８時間後に、混合液をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏで分配する。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発する。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーに供して、３−［４−（｛［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ｝−メチル）−フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペノン酸メチルエステル（１３．１ｇ）を生成する。メタノール（ＭｅＯＨ）（１００ｍＬ）中、ＫＯＨ（１２．９ｇ、８７％、０．２モル）の溶液をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中、ＨＯＮＨ２・ＨＣｌ（１３．９ｇ、０．２モル）の溶液に加えると、沈澱が生じる。１５分後に、混合液をろ過し、ろ過ケーキをＭｅＯＨで洗浄し、ろ液を減圧下に凡そ７５ｍＬに蒸発する。混合液をろ過し、容積をＭｅＯＨで１００ｍＬに調整する。ここで得られる２Ｍ  ＨＯＮＨ２溶液はＮ２下に−２０℃で２週間まで保存される。次いで、３−［４−（｛［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ｝−メチル）−フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペノン酸メチルエステル（６．５０ミリモル）を２Ｍ  ＨＯＮＨ２のＭｅＯＨ溶液（３０ｍＬ、６０ミリモル）に加え、引き続きＭｅＯＨ（５ｍＬ）中、ＫＯＨ（４２０ｍｇ、６．５ミリモル）の溶液を加える。２時間後に、ドライアイスを反応液に加え、混合液を蒸発乾固する。残渣を熱いＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中に溶解し、冷却し、−２０℃で一夜保存する。ここで得られる懸濁液をろ過し、固体を氷冷ＭｅＯＨで洗浄し、減圧下で乾燥すると、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）−エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ｝−メチル）−フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペンアミドを生成する。次いで、ヒドロキサム酸（５．０ｇ、１３．３ミリモル）を９５％トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ（５９ｍＬ）中に溶解し、４０〜５０℃で４時間加熱する。混合液を蒸発し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製して、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドをトリフルオロ酢酸塩（ｍ／ｚ ３８０ ［ＭＨ＋］）を生成し、これを次いで遊離塩基に変換することができる。
【００３７】
化合物２の作成：
乾燥テトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）中、ＬｉＡｌＨ４（１７ｇ、４４５ミリモル）の懸濁液を０℃に冷却し、２−メチルインドール−３−グリオキシルアミド（３０ｇ、１４８ミリモル）を３０分にわたり小分けして加える。混合液を室温で３０分攪拌し、次いで還流下に３時間保持する。反応液を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（１７ｍＬ）、１５％ＮａＯＨ（水溶液、１７ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５１ｍＬ）で処理する。混合液をＭｇＳＯ４で処理し、ろ過し、ろ液を蒸発して、２−メチルトリプタミンを得て、それをＭｅＯＨ中に溶解する。４−ホルミルケイ皮酸メチル（１６．９ｇ、８８．８ミリモル）をこの溶液に加え、引き続きＮａＢＨ３ＣＮ（８．４ｇ）および酢酸（１当量）を加える。１時間後に、反応液をＮａＨＣＯ３（水溶液）で希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、蒸発する。残渣をクロマトグラフィーにより精製して、３−（４−｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチルアミノ］−メチル｝フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペノン酸メチルエステルを得る。このエステルをＭｅＯＨ中に溶解し、１．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（１〜１．５当量）を加え、引き続きジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）を加える。ここで得られる沈澱をろ過し、固体をＥｔ２Ｏで洗浄し、完全に乾燥すると、３−（４−｛［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチルアミノ］−メチル｝フェニル）−（２Ｅ）−２−プロペノン酸メチルエステル塩酸塩を得る。このメチルエステル塩酸塩（１４．９ｇ、３８．６ミリモル）およびＨＯＮＨ２（５０％水溶液、２４．０ｍＬ、約３９１．２ミリモル）の氷冷溶液に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（水溶液、８５ｍＬ）を加える。６時間後に、この氷冷溶液をＨ２ＯおよびＮＨ４Ｃｌ（水溶液、０．８６Ｍ、１００ｍＬ）で希釈する。ここで得られる沈澱をろ過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、乾燥して、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ｍ／ｚ ３５０ ［ＭＨ＋］）を得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（化合物１）およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（化合物２）による静脈処置の２４時間後に無胸腺ヌードマウスから取り出した中空糸中のＨ１２９９Ｃ２による光放射のグラフ表示である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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