(57)【要約】非天然塩基を用いる分析について述べる。一実施形態では、本方法は、標的核酸を含有すると推測される試料を、核酸ポリメラーゼと、第１及び第２プライマーとに接触させ；試料中に標的核酸が存在する場合は、第１及び第２プライマーを用いてＰＣＲにより標的核酸を増幅し、二本鎖領域と、非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成し；標識と、一本鎖領域の非天然塩基に相補的な非天然塩基とを含むリポーターと試料を接触させ；リポーターの少なくとも一部を増幅産物の一本鎖領域にアニールし；アニーリング後、リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させ；かつ、少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。本発明は、試料中の標的核酸を検出するために使用する対応キットをも提供する。二者択一的に、リポーターをアニーリングしてから切断するのではなく、増幅産物中に組み込むことができる。
2004500850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程、
ａ）前記試料を、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程、
ｂ）前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ｉｉ）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程、
ｃ）前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程、
ｄ）前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程、
ｅ）アニーリング後、前記リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程、及び
ｆ）前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の前記標的核酸の存在と関連づける工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸ポリメラーゼが、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有し、かつ前記切断工程が、前記核酸ポリメラーゼで前記リポーターの少なくとも一部を切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、ＰＣＲによる前記標的核酸の増幅工程が、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅によって前記標的核酸を増幅する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅による前記標的核酸の増幅工程が、前記標的核酸と、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーとを、約９０℃〜１００℃と約５０℃〜６５℃の間で、各温度約１秒保持して循環させる工程を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
前記試料を前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程が、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを前記標的核酸にアニールする工程を含み、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸にアニールされるとき、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端間にゼロ〜５個の塩基のギャップを有することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項７】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域の前記非天然塩基が、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に隣接して位置することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項８】
前記リポーターが、（ｉ）前記一本鎖領域の少なくとも一部に相補的であり、かつ前記非天然塩基を含む第１領域と、（ｉｉ）前記非天然塩基に隣接した第２領域とを含み、該リポーターの該第２領域は、前記第２ヌクレオチドプライマーの前記第１領域に相補的でないことを特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記非天然塩基が、イソ−シトシン及びイソ−グアニンからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記リポーターの前記標識が、シグナル生成要素と、シグナルクエンチング要素とを含み、かつ前記切断工程が、前記リポーターの少なくとも一部で切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含み、この少なくとも１つのリポーター断片が、前記シグナル生成要素及び前記シグナルクエンチング要素の両方ではなく１つを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１１】
前記標識が、前記リポーターの５’末端に位置することを特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記シグナル生成要素が発蛍光団を含み、かつ前記シグナルクエンチング要素が蛍光クエンチャーを含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記リポーターの前記標識が、シグナル生成要素と、シグナル受取り要素とを含み、かつ前記切断工程が、前記リポーターの少なくとも一部で切断し、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程を含み、この少なくとも１つのリポーター断片が、前記シグナル生成要素及び前記シグナル受取り要素の両方ではなく１つを含むことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１４】
前記リポーターがオリゴヌクレオチドを含み、かつ前記アニーリング工程が、該リポーターの該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、少なくとも２個の非天然塩基を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記増幅工程が、前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって前記標的核酸を増幅し、増幅産物を生成する工程を含み、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記非天然塩基が、該非天然塩基を越える前記第１オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を実質的に妨げ、その結果前記一本鎖領域となることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、該第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に隣接して位置する少なくとも２個の非天然塩基を含み、かつ
前記増幅工程が、試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって前記標的核酸を増幅し、増幅産物を生成する工程を含み、前記核酸ポリメラーゼが、前記第１領域に最も近い、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域の非天然塩基の向かい側にヌクレオチドを間違って組み込むが、前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第１領域に次に近い非天然塩基の向かい側にはヌクレオチドを組み込まないことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１８】
前記アニーリング工程が、温度を下げて、前記増幅産物の前記一本鎖領域に前記リポーターの少なくとも一部をアニールする工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記関連づけ工程が、少なくとも１つのリポーター断片を検出する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記関連づけ工程が、前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離後に、前記増幅産物を検出する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
工程ａ）及びｃ）が、前記標的核酸の増幅前に行われる、請求項１の方法。
【請求項２２】
試料中の標的核酸を検出する方法であって、以下の工程、
ａ）前記試料を、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程、
ｂ）前記試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ｉｉ）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程、
ｃ）前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程、
ｄ）前記リポーターを、増幅産物中に、前記一本鎖領域の前記非天然塩基の向かい側に組み込む工程、及び
ｅ）前記リポーターの組込みを、前記試料中の前記標的核酸の存在と関連づける工程、
を含む方法。
【請求項２３】
前記試料をリポーターと接触させる工程が、標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的な非天然塩基のヌクレオチド三リン酸とを含むリポーターと前記試料を接触させる工程を含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記試料をリポーターと接触させる工程が、本質的に標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的な非天然塩基のヌクレオチド三リン酸とから成るリポーターと前記試料を接触させる工程を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記組込み工程が、前記リポーターを前記増幅産物中に、前記核酸ポリメラーゼを用いて前記一本鎖領域の前記非天然塩基の向かい側に組み込むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記組込み工程が、前記リポーターを前記増幅産物中に、リガーゼを用いて前記一本鎖領域の前記非天然塩基の向かい側に組み込むことを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記標識が発蛍光団を含む、請求項２２の方法。
【請求項２８】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、さらに標識を含み、かつ前記リポーター及び該第２オリゴヌクレオチドプライマーの該第２領域の標識が、シグナル生成／シグナルクエンチング対を含む、請求項２２の方法。
【請求項２９】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、さらに標識を含み、かつ前記リポーター及び該第２オリゴヌクレオチドプライマーの該第２領域の標識が、１対の発蛍光団を含み、該発蛍光団の一方の放射が、他方の発蛍光団の放射を刺激することを特徴とする請求項２２の方法。
【請求項３０】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、少なくとも１個の追加の塩基を含む、請求項２２の方法。
【請求項３１】
以下の成分、
ａ）核酸ポリメラーゼ、
ｂ）前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、
ｃ）第１領域と第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー、及び
ｄ）標識と、前記一本鎖領域の前記非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーター、
を含んでなるキット。
【請求項３２】
前記リポーターが、前記非天然塩基を含んでなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項３１のキット。
【請求項３３】
前記リポーターが、前記非天然塩基以外は、いずれの塩基も含まない、請求項３１のキット。
【請求項３４】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、さらに標識を含み、かつ前記リポーター及び該第２オリゴヌクレオチドプライマーの該第２領域の標識が、１対の発蛍光団を含み、該発蛍光団の一方の放射が、他方の発蛍光団の放射を刺激することを特徴とする請求項３１のキット。
【請求項３５】
前記第２オリゴヌクレオチドプライマーの前記第２領域が、さらに標識を含み、かつ前記リポーター及び該第２オリゴヌクレオチドプライマーの該第２領域の標識が、シグナル生成要素及びシグナルクエンチング要素を含む、請求項３１のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は、米国以外のすべての国々を指定して、米国民及び居住者であるＤａｖｉｄ Ｊ．Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｊａｍｅｓ Ｒ．Ｐｒｕｄｅｎｔ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｂ．Ｓｃｈｅｒｒｉｌｌ、Ｇｉｄｅｏｎ Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｋ．Ｇｒｅｎｉｅｒ、Ｃｒａｉｇ Ｓ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、及びＳｉｍｏｎａ ＪｕｒｃｚｋによってＰＣＴ出願として出願されている。
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡの特定セグメントの酵素的増幅方法である。ＰＣＲは、以下の基本工程の繰返しサイクルに基づいている：二本鎖ＤＮＡの変性、続くオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ鋳型へのアニーリング、及び核酸ポリメラーゼによるプライマー増幅（Ｍｕｌｌｉｓら及びＳａｉｋｉら，１９８５；及び米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号、これらの全開示は、参照によって本明細書に取り込まれる）。ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、該ＤＮＡの反対鎖をアニールするように設計され、かつ一方のプライマーの核酸ポリメラーゼ触媒増幅産物が他方のプライマー用鋳型鎖として働くことができるように位置づけられる。ＰＣＲ増幅プロセスの結果、その長さが該オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端によって規定される別々のＤＮＡ断片の指数関数的増加となる。
【０００３】
現在実施されているＰＣＲ法は、核酸配列を増幅する非常に強力な方法であるが、増幅される物質の検出には、ＰＣＲ産物をさらに操作しかつ引き続き処理して、標的ＤＮＡが存在するかどうかを決定する必要がある。新しい方法及び分析法を開発することが望ましい。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第５，２１０，０１５号は、標識化オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を検出する方法を教示している。この方法は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用い、アニールされた標識化オリゴヌクレオチドプローブを切断して、検出することができる。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第５，８４６，７１７号は、標的配列上に核酸切断構造を形成し、それから５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて部位特異的様式で該核酸切断構造を切断することによる標的核酸の検出方法を教示している。
参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第５，４３２，２７２号は、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の塩基対であるが、標準的なＡ：Ｔ又はＧ：Ｃ塩基対で観察されるパターンと異なる水素結合パターンを有する、非標準塩基を開示している。
【０００４】
発明の概要
本発明は、標的核酸の迅速な検出のための物質及び方法に関する。本発明の方法は、リポーターオリゴヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；及び第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。ここで、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１個の非天然塩基を含有する。
一実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸の検出方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。この方法は、前記試料を、核酸ポリメラーゼ、前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ｉｉ）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程；アニーリング後、前記リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程；及び前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【０００５】
別の実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸の検出方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。この方法は、前記試料を、核酸ポリメラーゼ、前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、前記第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲにより前記標的核酸を増幅し、（ｉ）二本鎖領域と（ｉｉ）前記非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターを、増幅産物中に、前記一本鎖領域の前記非天然塩基の向かい側に組み込む工程；及び前記リポーターの組込みを、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【０００６】
さらに別の実施形態では、本発明は、標的核酸の検出用キットを提供する。一実施形態では、本キットは、核酸ポリメラーゼ；前記標的核酸の第１部分に相補的な配列を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー；第１領域及び第２領域を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーであって、前記第１領域が前記標的核酸の第２部分に相補的な配列を含み、かつ前記第２領域が非天然塩基を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー；及び標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基とを含むリポーターを含む。任意に、本キットは、さらに本発明の方法を実施するための緩衝液及び試薬のような他の成分を含む。
本発明の方法は、種々のマス・スクリーニング法及び読み出しプラットフォームに組み込むことができる。
【０００７】
本発明は、以下の本発明の種々の実施形態に関する詳細な説明を添付図面と共に考慮するすることにより、さらに完全に理解することができる。
本発明は、種々の変形及び代替形態に適用できるが、そのうち特定のものが例として図面に示されており、かつ詳述される。しかし、記述される特定の実施形態に本発明を限定することを意図したものではないことを理解すべきである。反対に、本発明の精神及び範囲内にあるすべての変形、均等物、及び代替物を包含することを意図している。
【０００８】
発明の詳細な開示
本発明は、試料中の突然変異を検出、解析、又は試料中の標的核酸の量を定量するための方法及び物質に関する。本発明の方法は、一般的にＰＣＲの使用を含む。ＰＣＲは、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅でよい。本発明の方法は、リポーターオリゴヌクレオチド；核酸ポリメラーゼ；及び第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーを利用し、この第１及び第２プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、少なくとも１個の非天然塩基を含有する。固体支持体と共に使用する他の関連する分析方法は、２０００年１０月１４日に出願された米国特許仮出願番号６０／、タイトル“非天然塩基を用いる固体支持体分析システム及び方法”、代理人事件整理番号１３２３８．２ＵＳＰ１に記述されている。
【０００９】
本明細書で使用する場合、“核酸”は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は化学的バックボーンによって結合される塩基であって、該塩基が塩基対を形成するか又は相補的化学構造とハイブリダイズする能力を有する塩基として一般的に言及されるものの配列のようなポリマー分子を包含する。好適な非ヌクレオチドバックボーンとしては、例えばポリアミド及びポリモルフォリノバックボーンが挙げられる。用語“核酸”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド配列、及びその断片又は部分を包含する。核酸は、いずれの適切な、例えば天然源から単離された、組換え的に生産された、又は人工的に合成された形態でも供給され、一本鎖又は二本鎖でよく、かつセンス又はアンチセンス鎖を意味しうる。
【００１０】
用語“オリゴヌクレオチド”は、一般的に短い鎖（例えば、約１００ヌクレオチド長未満、典型的には長さ約６〜５０ヌクレオチド長）の核酸を指し、例えば、固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写、制限消化、流出転写等のような技術で現在利用可能な技法を用いて調製することができる。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは多くの因子によって決まり、順次該オリゴヌクレオチドの究極的な機能又は用途によって決まる。
“配列”は、ヌクレオチドの順序付けられた配置を意味する。
用語“試料”は、その最も広い意味で使用される。この用語は、標本又は培養（例えば、微生物培養）、並びに生物学的及び非生物学的試料を包含する。
【００１１】
本明細書で使用する場合、“標的”又は“標的核酸”は、試料中にあると推測され、かつ本発明の方法又はシステムで検出又は定量すべき核酸配列を含有する核酸を意味する。標的核酸は、分析手順の際に実際に分析される標的核酸配列を含有する。標的は、直接的又は間接的に分析することができる。少なくともいくつかの実施形態では、標的核酸が試料中に存在する場合、本発明の方法による増幅用鋳型として標的核酸が使用される。
【００１２】
本明細書で使用する場合、用語“相補的”又は“相補性”は、核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸のようなヌクレオチドの配列）を指して使用されるときは、塩基の対合規則によって関係づけられる配列を意味する。天然塩基については、塩基の対合規則は、ワトソンとクリックによって開発されたものである。本明細書で述べるような非天然塩基については、塩基の対合規則は、ワトソン−クリックの塩基の対合規則と同様な様式で、又は疎水的、エントロピー的、若しくはファンデルワールス力による水素結合の形成を含む。例として、配列“Ｔ−Ｇ−Ａ”では、相補的配列は“Ａ−Ｃ−Ｔ”である。相補性は、“部分的”でよく、該核酸の塩基のいくつかだけが、塩基の対合規則に適合する。代わりに、核酸間の“完全な”又は“全体的な”相補性もありうる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強さに影響する。
【００１３】
用語“ハイブリダイゼーション”は、相補的核酸の対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の会合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与するハイブリダイゼーション条件の厳密さ、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、及び核酸内のＧ：Ｃ比のような因子によって影響を受ける。
本明細書で使用する場合、“標識”は、検出可能な（好ましくは定量化できる）シグナルを与えることができ、かつ核酸又はタンパク質に結合できるいずれの原子又は分子をも意味する。標識は、比色、蛍光、電気泳動、電気化学的、分光学的、クロマトグラフ的、濃度測定、又はラジオグラフ法等のような技法によって検出可能なシグナルを与えることができる。標識は、それ自体検出可能なシグナルを生成しないが、別の標識と併用したときに検出可能なシグナルを生成又はクエンチできる分子でよい。例えば、標識は、クエンチャー−染料対のクエンチャーでよい。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語“熱安定性核酸ポリメラーゼ”は、ヌクレオシドの重合を触媒し、かつ例えば大腸菌由来のヌクレオチドポリメラーゼと比較した場合、相対的に熱に安定な酵素を意味する。一般的に、この酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、かつ鋳型に沿って５’方向に進行し、かつ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する場合、合成が終了するまで、介在するアニールされたオリゴヌクレオチドを加水分解して、介在するヌクレオチド塩基又はヌクレオチド断片を遊離させる。熱安定性酵素は、少なくとも約３７℃〜約４２℃、典型的には約５０℃〜約７５℃の範囲内の温度で活性を有する。代表的な熱安定性ポリメラーゼとしては、例えば、天然及び限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）を含むＴｈｅｒｍｕｓ種、及び限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａを含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ種の変性ポリメラーゼが挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語“ＤＮＡ多型性”は、ＤＮＡ中の特定部位に２つ以上の異なるヌクレオチド配列が存在することができ、かつ単数又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入のようないずれのヌクレオチド変化をも含む状態を意味する。これらヌクレオチド変化は、突然変異体又は多型性対立遺伝子変異体でありうる。本明細書で述べる方法の少なくともいくつかの実施形態は、単一塩基の突然変異、付加若しくは欠失によって引き起こされるβ−グロブリン遺伝病（いくつかのβ−サラセミア、鎌状細胞貧血、ヘモグロビンＣ病等）で生じるような核酸中の単一核酸の変化、及びα−サラセミア又はいくつかのβ−サラメニアに付随するような複数塩基の変化を検出することできる。さらに、本明細書の方法は、病気とは必ずしも関係ないが、単に、集団中の核酸の特定部位に２つ以上の異なるヌクレオチド配列（置換、欠失又は挿入されたヌクレオチド塩基対を有するかどうか）が、ヒトゲノムのＨＬＡ領域を有し、かつミトコンドリアＤＮＡのようなランダム多型性として存在できる状態を検出できる。
【００１６】
本発明は、試料中の標的核酸を検出するための方法及び物質を提供する。一実施形態では、方法は、標的核酸を含有すると推測される試料を、核酸ポリメラーゼと、第１及び第２プライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、該標的核酸を、前記第１及び第２プライマーを用いてＰＣＲによって増幅して、二本鎖領域と、少なくとも１つの非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基（又は複数の塩基）に相補的である非天然塩基（又は複数の塩基）とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターの少なくとも一部を、前記増幅産物の前記一本鎖領域にアニールする工程；アニーリング後、前記リポーターの少なくとも一部を切断して、少なくとも１つのリポーター断片を遊離させる工程；及び前記少なくとも１つのリポーター断片の遊離を、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【００１７】
別の実施形態では、方法は、標的核酸が含有すると推測される試料を、ポリメラーゼと、第１及び第２プライマーと接触させる工程；試料中に前記標的核酸が存在する場合、該標的核酸を、前記第１及び第２プライマーを用いてＰＣＲによよって増幅して、二本鎖領域と、少なくとも１つの非天然塩基を含む一本鎖領域とを有する増幅産物を生成する工程；前記試料を、標識と、前記一本鎖領域の非天然塩基に相補的である非天然塩基（又は複数の塩基）とを含むリポーターと接触させる工程；前記リポーターを前記増幅産物中に組み込む工程；及び前記リポーターの組込みを、前記試料中の標的核酸の存在と関連づける工程を含む。
【００１８】
本発明は、本明細書で述べる１種以上の方法を用いる試料中の標的核酸の検出で使用する対応キットをも包含する。
本発明は、所望により、いくつかの実施形態における洗浄又は分離（例えば、ゲル電気泳動法による）のような反応後処理を必要とせずに試料中の標的核酸を検出する能力を含め、多くの利点を提供することができる。さらに、いくつかの実施形態では、本方法は、１セットの反応条件で処理される１つの反応混合物中に全要素を添加することによって実施することができる。これは、順次、複数の反応工程及び試薬に付随する問題又は心配事を回避或いは低減できる。
【００１９】
一般的議論
さて、本発明の一実施形態について図１に示される概略図を参照しながら一般用語で説明する。図１Ａを参照すると、試料は、標的核酸１００を含有すると推測され、標的核酸１００は、第１部分１０２と、第２部分１０４を含む。示されるように、標的核酸１００は、鎖１００ａ及び１００ｂで構成される二本鎖分子である。
図１Ｂを参照すると、示されるように、第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８と試料を接触させる。第１プライマー１０６は、標的核酸１００の第１部分に相補的である。第２プライマー１０８は、第１領域１１０と第２領域１１２を含み、第１領域１１０は、標的核酸１００の第２部分１０４に相補的である配列を含む。第２プライマー１０８の第２領域１１２は、非天然塩基１１４を含む。第２領域１１２は、標的核酸１００に相補的でない。
【００２０】
第１及び第２プライマーに加え、試料をポリメラーゼにも接触させ、本明細書で述べるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。標的核酸１００が試料中に存在する場合、第１プライマー１０６の相補的部分及び第２プライマー１０８の相補的部分が、標準的な塩基の対合規則に従って標的核酸１００の対応する領域１０２及び１０４にアニールする。示されるように、プライマーが標的にアニールされるとき、第１プライマー１０６の３’末端ヌクレオチドは、図１Ｂ中１０７と示されるヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”によって、第２プライマー１０８の３’末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、鋳型核酸上の約ゼロ（０）〜約５個の塩基のギャップ１０７が、ＰＣＲプライマーの３’末端間に存在するように設計される。
【００２１】
図１Ｂに示されるように、ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅により、各プライマーの３’−ＯＨ末端から一本鎖が合成される。すなわち、図１Ｃに示されるように、第１プライマー１０６を用いて、標的核酸１００の鎖１００ａの少なくとも一部に相補的である鎖１２０ａが合成され、第２プライマー１０８を用いて、標的核酸１００の鎖１００ｂの少なくとも一部に相補的である鎖１２０ｂが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、増幅産物１２０を得ることができる。
図１Ｃに示されるように、増幅産物１２０は、二本鎖領域１２２と、一本鎖領域１２４を含む。この実施形態で示されるように、非天然塩基１１４は、二本鎖領域１２２に隣接する、一本鎖領域１２４中に位置する。一本鎖領域１２４は、１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００２２】
図１Ｄを参照すると、増幅産物１２０をリポーター１２６に接触させる。リポーター１２６は、標的核酸の増幅が起こる前、その間、又はその後に、反応に添加できると考えられる。リポーター１２６は、標識１２８、１３２及び増幅産物１２０の一本鎖領域１２４の非天然塩基１１４に相補的である非天然塩基１３０を含む。図１Ｄの実施形態では、リポーター１２６は、染料１２８とクエンチャー１３２を含む標識と、非天然塩基１３０を含む。リポーター１２６は、増幅産物１２０にアニールさせることができる。アニーリング後、図１Ｅに示されるように、リポーター１２６の少なくとも一部が切断され、染料１２８を含むリポーター断片１３４が生成される。リポーター断片１３４の遊離が、試料中の標的核酸の存在と関連づけられる。図示される場合では、リポーター断片の非クエンチド染料の存在が検出される。別の実施形態では、染料及びクエンチャーの位置が逆転され、切断時にリポーター断片がクエンチャーを持ち去る。
【００２３】
図８は、別の分析法を示しており、クエンチャー１３２は、リポーターの代わりに第２プライマー１０８に結合されている。クエンチャー１３２は、リポーター１２６の一部が切断され、染料１２８を含むリポーター断片１３４を生成するまで、リポーター１２６の染料１２８の蛍光をクエンチする。代替として、クエンチャーがリポーターに結合し、染料が第２プライマーに結合することもできる。本説明では、実施形態の図で共通する要素は同じ番号を付し、該要素について個々に説明する必要がない。
図９Ａ〜９Ｅ、１０Ａ〜１０Ｅ、１１Ａ〜１１Ｅ、及び１２Ａ〜１２Ｅは、図１Ａ〜１Ｅの分析と同様の多数の実施形態であり、Ｘ及びＹは、非標準塩基を表す。例えば、Ｘはイソ−シチジンを表し、Ｙはイソ−グアノシンを意味しうる。以下の記述は、図１Ａ〜１Ｅとこれら実施形態の分析との相異について説明する。その他の点では、同一の考察及び条件を適用できる。
【００２４】
図９Ａ〜９Ｅの分析では、第１及び第２プライマー１０６、１０８は、図９Ａに示されるように、二本鎖核酸１００と接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分１１０と、標的核酸に相補的でなく、通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分１１２とを有する。第２プライマー１０８は、第２部分１１２内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分１１０に隣接する非標準塩基１１４を有する。図９Ｂ及び９Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物１２０が合成される。増幅産物１２０は、二本鎖領域１２２と一本鎖領域１２４を有する。図９Ｃに示されるように、リポーター１２６は、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４と接触させられる。リポーターは、一本鎖領域１２４の非標準塩基１１４に相補的である非標準塩基１１９を含む。図９Ｄに示されるように、リポーター１２６は、一本鎖領域１２４にアニールする。リポーター１２６では、非標準塩基１１９に隣接する塩基１２７は、一本鎖領域の非標準塩基１１４に隣接する二本鎖領域の塩基１３１に相補的でありうるが、必ずしもそうでなくてもよい。図９Ｅに示されるように、塩基１２７がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片１３４が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部１２８を含有し、増幅産物１２０のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基１２７は、通常標識１２８を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２５】
図１０Ａ〜１０Ｅには別の実施形態が示される。この実施形態では、塩基１３１は、標的核酸に相補的である第２プライマー１０８の第１領域１１０の一部ではなく、代わりに塩基１３１は標的核酸配列に非相補的であり、かつ第２プライマー１０８の第に２領域１１２の一部である。その他の点では、この分析法の工程及び手順は、図９Ａ〜９Ｅの分析法と同一である。
【００２６】
別の実施形態では、図１１Ａに示されるように、第１及び第２プライマー１０６、１０８が、二本鎖標的核酸１００と接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分１１０と、標的核酸に相補的でなく、かつ通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分１１２を有する。第２プライマー１０８は、第２部分１１２内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分１１０に隣接する少なくとも２個の連続した非標準塩基１１４、１１７を有する。図１１Ｂ及び１１Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物１２０が合成される。増幅産物１２０は、二本鎖領域１２２と、一本鎖領域１２４を有する。任意に、非標準塩基１１４、１１７の最初の向かいに塩基１４１が誤って組み込まれる。図１１Ｃに示されるように、リポーター１２６は、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４と接触させられる。リポーターは、第２プライマーの非標準塩基に相補的である非標準塩基を含む。図１１Ｄに示されるように、リポーター１２６が一本鎖領域１２４にアニールする。図１１Ｅに示されるように、非標準塩基１２７がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片１３４が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部１２８を含有し、増幅産物１２０のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基１２７は、通常標識１２８を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２７】
さらに別の実施形態では、図１２Ａに示されるように、第１及び第２プライマー１０６、１０８が、二本鎖標的核酸１００に接触させられる。第２プライマーは、標的核酸の一部に相補的である第１部分１１０と、標的核酸に相補的でなく、かつ通常標的核酸にハイブリダイズしない第２部分１１２を有する。第２プライマー１０８は、第２部分１１２内で、かつ標的核酸にアニールする第２プライマーの第１部分１１０に隣接する２個の非標準塩基１１４、１１７を有する。図１２Ｂ及び１２Ｃに示されるように、第１及び第２プライマーを用いて、ＰＣＲにより、標的核酸の部分に相補的である増幅産物１２０が合成される。増幅産物１２０は、二本鎖領域１２２と、一本鎖領域１２４を有する。任意に、非標準塩基１１７の向かいにポリメラーゼによって誤って組み込まれた塩基１２１を含む。図１２Ｃに示されるように、リポーター１２６は、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４と接触させられる。リポーターは、第２プライマーの非標準塩基１１４に相補的である非標準塩基を含む。図１２Ｄに示されるように、リポーター１２６が一本鎖領域１２４にアニールする。リポーター１２６は、一本鎖領域の塩基１１４にアニールする非標準塩基１１９に結合された塩基１２７を含むが、塩基１２７は一本鎖領域の塩基１１７に相補的でない。図１２Ｅに示されるように、塩基１２７がポリメラーゼによって切断され、リポーター断片１３４が生成し、通常、発蛍光団又はクエンチャーのような標識又は標識の一部１２８を含有し、増幅産物１２０のリポーター断片の検出を可能にする。任意に、塩基１２７は、通常標識１２８を含むオリゴヌクレオチド配列で置換され、かつリポーターの残部から切断される。
【００２８】
図２には、本発明の別の実施形態が概略的に示される。図２Ａに示されるように、二本鎖標的核酸１００は、第１部分１０２及び第２部分１０４を含む。試料が、第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８に接触される。第１プライマー１０６は、標的核酸１００の第１部分１０２に相補的である。第２プライマー１０８は、標的核酸１００の第２部分１０４に相補的である第１領域１１０と、非天然塩基１１４を含み、かつ標的核酸１００に相補的でない第２領域１１４とを含む。
第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８に加え、試料はポリメラーゼ（図示せず）と接触させられ、ポリメラーゼ連鎖反応が行われる。図１に示される実施形態と同様に、標的核酸１００が試料中に存在する場合、第１プライマー１０６の相補性部分及び第２プライマー１０８の相補性部分が、標準的な塩基の対合規則に従い、標的核酸１００の対応する部分１０２、１０４にアニールする。図１に示される実施形態と同様に、プライマーがアニールされるとき、第１プライマー１０６の３’末端ヌクレオチドは、ヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”１０７によって第２プライマー１０８の３’末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、鋳型核酸上の約ゼロ（０）〜約５個の塩基のギャップが、ＰＣＲプライマーの３’末端間に存在するように設計される。
【００２９】
図２Ｂ及び２Ｃに示されるように、ポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅により、各プライマーの３’−ＯＨ末端から一本鎖１２０ａ、１２０ｂが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、図２Ｃに示される増幅産物１２０を得ることができる。
図２Ｃに示されるように、増幅産物１２０は、二本鎖領域１２２と、一本鎖領域１２４を含む。示されるように、一本鎖領域１２４は、第２プライマー１０８の非天然塩基１１４を含む。一本鎖領域１２４は単一の非天然塩基を含んで示されているが、本発明は、それに限定されず、一本鎖領域は１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００３０】
さて、図２Ｄを参照すると、増幅産物１２０がリポーター１５０に接触している。リポーター１５０は、ＰＣＲ増幅の前、その間又はその後に添加される。リポーター１５０は、図２Ｅに示されるように、標識１５４と、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４の非天然塩基１１４に相補的である非天然塩基１５２とを含む。リポーター１５０は、非天然塩基１１４の反対側の増幅産物中に組み込まれる。さらに詳細に後述するが、リポーター１５０の組込みは、例えば、ポリメラーゼ又はリガーゼのようないずれの適切な酵素を用いても達成することができる。試料中の標的核酸の存在は、増幅産物中のリポーターの存在と関連づけることによって決定される。図示した場合では、例えば、標的核酸の存在は、例えば蛍光若しくは他の可視化方法により標識１５４を検出することによって決定される。適切な検出及び可視化方法については、さらに詳細に後述する。
【００３１】
図１及び２の概略図は、本発明の構成要素の相対的な位置及び大きさを示すが、これらの提示は例示目的だけのためである。本明細書の議論から明かなように、第１プライマー及び第２プライマー、並びに標的核酸の第１部分及び第２部分の相対的な大きさは、特定の用途によって変わるだろう。さらに、標的核酸に沿う第１プライマー及び第２プライマーの相対的な位置は変化するだろう。また、本発明で用いる非天然塩基及び標識の位置も用途によって変わるだろう。
【００３２】
ポリメラーゼ
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅を利用して試料中の関心のある標的核酸を検出する方法及び物質を提供する。適切な核酸ポリメラーゼとしては、例えば、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的な核酸を組み込むことでオリゴヌクレオチドを伸長できるポリメラーゼが挙げられる。例えば、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼでよい。
ポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの成長末端の３’ヒドロキシル基と、ヌクレオチド三リン酸の５’リン酸基との間の結合の形成を触媒する。これらヌクレオチド三リン酸は、通常デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシチジン三リン酸（Ｃ）及びデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）から選択される。しかし、少なくともいくつかの実施形態では、本発明の方法で有用なポリメラーゼは、それらの非天然塩基のヌクレオチド三リン酸を用いて非天然塩基を組み込むこともできる。
【００３３】
ＰＣＲのような方法の際、鎖の変性に必要なかなり高い温度は、多くの核酸ポリメラーゼの不可逆的な不活性化をもたらしうるので、本発明で有用な核酸ポリメラーゼ酵素は、好ましくはＰＣＲのような方法の高温にさらされたときに反応を達成するのに十分なポリメラーゼ活性を保持する。好ましくは、本発明の方法に有用な核酸ポリメラーゼ酵素は、熱安定性核酸ポリメラーゼである。好適な熱安定性核酸ポリメラーゼとしては、限定するものではないが、好熱性生体由来の酵素が挙げられる。好適な熱安定性核酸ポリメラーゼを誘導できる好熱性生体の例としては、限定するものではないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ及びＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｂｕｓ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の種が挙げられる。核酸ポリメラーゼは、これら好熱性生体から直接精製できる。しかし、まず組換えＤＮＡ技法によって、該酵素をコードする遺伝子を多コピー発現ベクター中でクローン化し、そのベクターを、該酵素を発現可能な宿主細胞株中に挿入し、そのベクター含有宿主細胞を培養してから、該酵素を発現している宿主細胞株から核酸ポリメラーゼを抽出することによって、収率がかなり高い核酸ポリメラーゼを得ることができる。
【００３４】
多くの核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼ活性に加え、他の活性を有し；これら活性としては、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。５’−３’及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、本技術の当業者に公知である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、組み込まれた間違った塩基を除去することによって、新しく合成される鎖の精度を高める。対照的に、核酸ポリメラーゼ酵素中にしばしば存在する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、プライマーを含め、非保護５’末端を有する核酸を消化しうるので、特定用途では望ましくないことがある。従って、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が弱力化しているか、又は該活性が存在しない熱安定性核酸ポリメラーゼが、本発明の少なくともいくつかの実施形態で使用するために望ましい特性の酵素である。他の実施形態では、ポリメラーゼは、リポーターを切断し、かつ直接的又は間接的にシグナルが生成されるような標識断片を遊離させるのに十分な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有することが望ましい。
【００３５】
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の無い又は弱力化した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する適切な核酸ポリメラーゼは技術的に公知である。この目的を達成する核酸ポリメラーゼに修飾が導入された種々の核酸ポリメラーゼ酵素について記述されている。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を制御するタンパク質のドメインが除去されたホロ酵素のタンパク分解断片として生成されうる。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠乏している好適な核酸ポリメラーゼは商業的に入手可能なである。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠乏している商業的に入手可能なポリメラーゼの例としては、ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＳＴＯＦＦＥＬＴＭＤＮＡポリメラーゼ及びＫｌｅｎＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３６】
ポリメラーゼは、ＰＣＲの際に塩基を“間違って組み込む”ことがある。他言すれば、ポリメラーゼは、合成鎖上の３’位に、鋳型核酸鎖上の対をなすヌクレオチド（例えば、シトシン）と正準の水素塩基対を形成しないヌクレオチド（例えば、アデニン）を組み込みうる。ＰＣＲ条件を変えて、塩基の間違った組込みの発生を少なくすることができる。例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、清浄剤濃度、金属のタイプ、金属の濃度等のような反応条件を変えて、ポリメラーゼが鋳型鎖に相補的でない塩基を組み込むようなことを低減することができる。
単一のポリメラーゼを使用する代替として、本明細書で述べる方法のいくつかは、複数の酵素を使用して実施することができる。例えば、エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼのようなポリメラーゼ、及びエキソヌクレアーゼは、組み合わせて使用することができる。別の例は、エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼと熱安定性フラップエンドヌクレアーゼの使用である。さらに、ＲＮＡを試料として用いること、及び逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写できることがわかるだろう。転写は、ＰＣＲ増幅の前又は増幅時に起こりうる。
【００３７】
第１プライマー及び第２プライマー
本発明は、ポリメラーゼ、第１プライマー及び第２プライマーを含むＰＣＲを用いて標的核酸を検出する方法を提供する。図１、２及び９〜１２に示されるように、第１プライマー１０６は、標的核酸１００の第１部分１０２に相補的な配列を含む。第２プライマー１０８は、第１領域１１０及び第２領域１１２を含み、第１領域１１０は標的核酸の第２部分１０４に相補的な配列を含み、第２領域１１２は、少なくとも１個の非天然塩基を含む。第２領域は、一般的に標的核酸に相補的でない。
【００３８】
ＰＣＲ法では、プライマーは、増幅すべき標的核酸中に存在することが分かっている配列に相補的に設計される。通常、プライマーは、増幅すべき標的核酸配列に隣接する（かつその一部でありうる）配列に相補的であるように選択される。好ましくは、プライマーは、検出すべき標的核酸に隣接する配列に相補的であるように選択される。標的核酸の配列が分かれば、プライマーの配列は、まず検出すべき標的核酸の長さ又は大きさを決定し、標的核酸配列の５’及び３’末端に近いか、又は５’及び３’末端に近接している適切なフランキング配列を決定し、かつ標準的なワトソン−クリックの塩基の対合規則を用いて標的核酸のフランキング領域に相補的な核酸配列を決定してから、その決定したプライマー配列を合成することによって調製することができる。この調製法は、技術的に公知のいずれの適切な方法、例えば、適切な配列のクローニング及び制限及び直接化学合成によっても達成することができる。化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：９０によって記載されているホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８：１０９によって開示されているホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９に開示されているジエチルホスホラミデート法、及び米国特許第４，４５８，０６６号に開示されている固体担持法が挙げられる。これらはすべて参照によって本明細書に取り込まれる。
【００３９】
第１プライマー及び第２プライマーの標的核酸に対して十分に安定なハイブリッドを形成する能力は、いくつかの因子、例えば、プライマーと標的核酸との間で発現される相補性の程度によって決まる。典型的には、その標的に対して高度な相補性を有するオリゴヌクレオチドは、該標的と安定なハイブリッドを形成するだろう。
さらに、プライマーの長さは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズする温度に影響を及ぼす。一般に、より長いプライマーは、より短いプライマーよりも高温で標的核酸配列に対して十分に安定なハイブリッドを形成する。
さらに、プライマー中に高割合のＧ若しくはＣ又は特定の非天然塩基が存在すると、プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの安定性を高めることができる。この増加した安定性は、例えば、Ａ−Ｔ相互作用における２つの水素結合と比較した、Ｇ−Ｃ相互作用又は他の非天然塩基対相互作用における３つの水素結合の存在のためでありうる。
【００４０】
核酸二本鎖の安定性は、融解温度、つまり“Ｔｍ”によって評価又は表すことができる。特定条件下における特定の核酸二本鎖のＴｍは、該核酸二本鎖の集団の５０％が一本鎖核酸分子に溶解する温度である。特定の核酸二本鎖のＴｍは、いずれの適宜の方法によっても予測することができる。特定の核酸二本鎖のＴｍを決定する好適な方法としては、例えば、ソフトウェアプログラムが挙げられる。本発明の方法及びキットで使用するのに好適なプライマーは、該プライマーを含むオリゴヌクレオチド二本鎖の予想されたＴｍに基づいて予め決定することができる。
図１及び２に示されるように、第１プライマー及び第２プライマーが標的核酸にアニールされるとき、第１プライマー１０６の３’末端ヌクレオチドと第２プライマー１０８の３’末端ヌクレオチドとの間にギャップ１０７が存在する。ギャップ１０７は、標的核酸の多数のヌクレオチドを含む。ギャップは、ポリメラーゼが伸長鎖中に十分にヌクレオチドを組み込んで、一回りのＰＣＲ反応（例えば、一回りのアニーリング、伸長、変性）の際に、該ギャップを満たすことができることを条件として、いずれの数のヌクレオチドでもよい。典型的には、ポリメラーゼは、１秒当たり約３０〜約１００塩基を配置することができる。従って、プライマー間のギャップの最大長は、温度が、ポリメラーゼが活性であり、かつプライマーがアニールされる範囲内である一回りのＰＣＲでかかる時間量によって決まる。
【００４１】
標準的な熱サイクラーを用いるＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅では、ペルチエ冷却及び加熱の限界を考えると、温度変化は比較的遅い。標準的な熱サイクラーを用いる場合、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅反応条件が、ポリメラーゼが活性であり、かつプライマーがアニールされる温度範囲内である時間は、約１０〜約１５秒である。本発明の方法は、試料の温度を迅速に熱循環できる微量流体系を用いて遂行することができ、伸長時間はかなり短く、かつ温度変化がかなり速い。このような迅速な熱循環は、例えば、ＬａｂＣｈｉｐＴＭ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて達成できる。一実施形態では、第１及び第２オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸にアニールされるときに、ＰＣＲプライマーの３’末端間に、標的核酸上の約ゼロ（０）〜約５個の塩基のギャップが存在するように設計される。
【００４２】
非天然塩基
本発明で考えられるように、第２プライマーの第２領域は、通常少なくとも１個の非天然塩基を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれホスホジエステル結合によって結合されているデオキシリボース又はリボースを含むオリゴヌクレオチドである。各デオキシリボース又はリボースは、糖に結合された塩基を含む。天然に存在するＤＮＡ及びＲＮＡに組み込まれる塩基は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、及びウリジン（Ｕ）である。これら５個の塩基が“天然塩基”である。ワトソンとクリックによって考案された塩基の対合規則に従い、天然塩基はハイブリダイズしてプリン−ピリミジン塩基対を形成し、ＧはＣと対になり、ＡはＴ又はＵと対になる。これら対合規則は、オリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドとの特異的なハイブリダイゼーションを促進する。
【００４３】
これら天然塩基による塩基対の形成は、各塩基対の２個の塩基間の２又は３個の水素結合の生成によって促進される。各塩基は、２又は３個の水素結合供与体と水素結合受容体を含む。塩基対の水素結合は、一方の塩基上の少なくとも１個の水素結合供与体と、他方の塩基上の水素結合受容体との相互作用によって、それぞれ形成される。水素結合供与体は、例えば、少なくとも１個の水素に結合されているヘテロ原子（例えば、酸素又は窒素）を含む。水素結合受容体は、例えば、孤立電子対を有するヘテロ原子（例えば、酸素又は窒素）を含む。
天然塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵを、非水素結合部位における置換によって誘導して改変天然塩基を形成することができる。例えば、天然塩基は、反応性官能基（例えば、チオール、ヒドラジン、アルコール、アミン等）を塩基の非水素結合原子に結合することで支持体への付着に誘導することができる。他の可能な置換としては、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光性基、アルキル基（例えば、メチル又はエチル）等が挙げられる。
【００４４】
また、水素結合塩基対を形成する非天然塩基は、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号、及び第６，０３７，１２０号及び米国特許出願第０８／７７５，４０１号に記載されているように構成することができる。これらすべての開示は参照によって本明細書に取り込まれる。図３は、適切な塩基及びその対応する塩基対のいくつかの例を示す。これら塩基の特定の例は、塩基対の組合せ（ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ）に以下の塩基を含み：
【００４５】
【化１】
2004500850.tif 000003
【００４６】
【化２】
2004500850.tif 000004
【００４７】
式中、Ａは、高分子バックボーンの糖又は他の部分への結合点であり、Ｒは、Ｈ又は置換若しくは無置換アルキル基である。水素結合を利用する他の非天然塩基のみならず、塩基の非水素結合原子での官能基の組込みによる、上で特定した非天然塩基の変形を調製できることがわかるだろう。
【００４８】
これら非天然塩基対の水素結合は、天然塩基の場合と同様であり、非天然塩基と対になる水素結合受容体と水素結合供与体との間に、２又は３個の水素結合が形成される。天然塩基とこれら非天然塩基との相異の１つは、水素結合受容体と水素結合供与体の数及び位置である。例えば、シトシンは、供与体／受容体／受容体塩基で、受容体／供与体／供与体塩基であるグアニンと相補性である。参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第６，０３７，１２０号に示されように、ｉｓｏ−Ｃは受容体／受容体／供与体塩基であり、ｉｓｏ−Ｇは相補的な供与体／供与体／受容体塩基である。
【００４９】
オリゴヌクレオチドに使用される他の非天然塩基としては、例えば、両方とも参照によって本明細書に取り込まれる、Ｒｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，１６７１（１９９６）及びＭｃＭｉｎｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，１１５８５（１９９９）で議論されているナフタレン、フェナントレン、及びピレン誘導体が挙げられる。これら塩基は、安定化のために水素結合を利用しないが、代わりに疎水的又はファンデルワールス相互作用によって塩基対を形成する。
【００５０】
本発明に従い、非天然塩基を使用すると、試料中に存在する核酸配列の検出及び定量化を拡張可能である。例えば、非天然塩基は、核酸に伴う反応を触媒する多くの酵素によって認識されうる。ポリメラーゼは、伸長オリゴヌクレオチド鎖を重合し続けるために相補的なヌクレオチドを必要とするが、他の酵素は、相補的なヌクレオチドを必要としない。非天然塩基塩基が鋳型中に存在し、その相補的な非天然塩基が反応混合物中に存在しない場合、ポリメラーゼは、通常、該非天然塩基を通り過ぎて伸長プライマーを伸長しようと試みてエンストする（又は、十分量の時間が与えられた場合には、塩基を間違って組み込む）。しかし、リガーゼ、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ等のような、核酸に伴う反応を触媒する他の酵素は、非天然塩基を含む反応を触媒することができる。このような非天然塩基の特徴は、本発明に利用され、かつ本発明の範囲内である。
【００５１】
例えば、非天然塩基を用いて、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸配列を生成することができる。これは、ＰＣＲ反応を行い、試料中の標的核酸を検出することで達成することができ、該標的核酸は第１部分と第２部分を有し、この反応系は全４個の天然に存在するｄＮＴＰ’ｓ、標的核酸の第１部分に相補的な第１プライマー、第１領域と第２領域を有する第２プライマーを含み、該第１領域は標的核酸の第１部分に相補的であり、かつ該第２領域は標的核酸に非相補的である。第２プライマーの第２領域は非天然塩基を含む。標的核酸が存在する場合、第１プライマー及び第２プライマーの第１領域が該標的核酸にハイブリダイズする。数回のＰＣＲで、（ｉ）二本鎖領域及び（ｉｉ）一本鎖領域を含有する増幅産物が生成する。二本鎖領域は、ＰＣＲの際に第１及び第２プライマーの伸長によって形成される。一本鎖領域は１個以上の非天然塩基を含む。ポリメラーゼは、相補的な非天然塩基のヌクレオチド三リン酸の非存在下では非天然塩基を越えて重合により伸長産物を形成できないので、増幅産物の一本鎖領域が生じる。このように、非天然塩基が作用して、増幅産物の一本鎖領域を維持する。
【００５２】
上述したように、ポリメラーゼは、場合によっては、非天然塩基の反対の塩基を間違って組み込むことがある。この実施形態では、反応混合物が相補的な非天然塩基を含まないので、間違った組込みが起こる。従って、十分量の時間が与えられると、ポリメラーゼは、場合により、反応混合物の中に存在する、非天然塩基と反対の塩基を間違って組み込むことがある。
【００５３】
増幅
ＰＣＲの際、ポリメラーゼ酵素、第１プライマー及び第２プライマーを用いて本明細書で述べるような増幅産物を生成する。使用可能な１つのＰＣＲ法は改変ＰＣＲ、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅である。本明細書で使用する場合、用語“Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅”は、改変ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
伝統的なＰＣＲ法は以下の工程を含む：二本鎖核酸の変性、又は融解；プライマーのアニーリング；及びポリメラーゼによるプライマーの伸長。伸長されたプライマーを変性し、再び開始することにより、このサイクルが繰り返される。標的核酸のコピー数は、理論的には指数関数的に増加する。実際には、コピー数は、通常酵素が該サイクルの間に伸長できるより多くのプライマー鋳型が集積するプラトーに達するまで、各サイクルで倍加し；そして標的核酸の増加が線形になる。
【００５４】
Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔ増幅は、改変ポリメラーゼ連鎖反応であり、伸長工程のみならず、アニーリング及び融解工程が非常に短いか或いは除去される。本明細書で使用する場合、ＰＣＲの“工程”を指すとき、工程は、反応が所望の温度で、当該温度が実質的に変動せずに維持される時間である。例えば、典型的なＰＣＲの伸長工程は約３０秒〜約６０秒である。Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅の伸長工程は、通常、約０秒〜約２０秒の範囲である。好ましくは、伸長工程は約１秒以下である。好ましい実施形態では、伸長工程が除去される。典型的なＰＣＲのアニーリング及び融解工程の時間は、３０秒〜６０秒の範囲である。Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅のアニーリング及び融解工程は、通常約０秒〜約６０秒の範囲である。Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅では、アニーリング及び融解工程は、通常約２秒を超えず、好ましくは約１秒以下である。伸長工程が除去される場合、温度は、アニーリング温度と融解温度との間に中間の伸長工程を含まずに、アニーリング工程と融解工程の間で循環される。
【００５５】
さらに、どうやってアニーリング温度から融解温度に速く変えるかという限界は、伸長プライマー上への塩基の組込みにおけるポリメラーゼの効率と、プライマー間のギャップとプライマーの長さによって決まる組み込まなければならない塩基の数によって決まる。実施例では、Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅の例が示される。
試料中の核酸配列の存在を決定するために必要なＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅のサイクル数は、試料中の標的分子の数によって変化しうる。後述する一実施例では、１００個程度の標的核酸を検出するためには全部で３７サイクルで十分である。
【００５６】
増幅産物
例えば、図１、２、及び９〜１２に示されるように、ＰＣＲを用いて、二本鎖領域１２２と一本鎖領域１２４を含む増幅産物１２０が生成される。これらの図に示されるように、二本鎖領域１２２は、第１及び第２プライマー１０６及び１０８の伸長によって生じる。上述したように、一本鎖領域１２４は、本発明の第２プライマー内の非天然塩基の組込みから生じる。第２プライマー１０８の第２領域１１２は標的核酸１００に相補的でない。上述したように、非天然塩基はワトソンとクリックの塩基の対合規則に従って他の非天然塩基と結合を形成するので、非天然塩基の存在は増幅産物１２０内の一本鎖領域１２４としての第２領域を維持する。
これとは別の実施形態では、一本鎖領域１２４は、１個より多くの非天然塩基を含む。第２プライマー１０８の第２領域１１２に含まれる非天然塩基の数は、所望通りに選択することができる。
【００５７】
リポーター
本明細書で使用する場合、用語“リポーター”は、第２プライマーの第２部分に相補的であり、それゆえに二本鎖構造を形成する成分（例えば、オリゴヌクレオチド）を指す。例えば、図１、２、及び９〜１２に示されるような実施形態を参照すると、リポーターは、標識１２８、１３２（図２では１５４）と、一本鎖領域１２４の非天然塩基１１４に相補的である少なくとも１個の非天然塩基１３０（図２では１５２）とを含む。好ましくは、リポーターはポリメラーゼ連鎖反応の第１プライマー又は第２プライマーのどちらにも相補的でない。好ましくは、リポーターの３’末端は、“遮断”され、プライマー伸長産物中へのリポーターの組込みを阻害する。“遮断”は非相補性塩基を用いて、又は最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに、ビオチン若しくはリン酸基のような化学成分を付加することで達成することができ、選択する成分によっては、標識としても作用することで、二重に目的に役立ちうる。
【００５８】
本発明で有用なリポーターは１個より多くの非天然塩基を含むことができる。リポーターに含まれる非天然塩基の数は、使用者によって決めることができ、例えば、第２プライマーの第２領域の長さと塩基組成及び所望のハイブリダイゼーション条件とハイブリダイゼーション特異性のような因子よって決まるだろう。
リポーターのヌクレオチド含量は、通常第２プライマーの第２領域のヌクレオチド含量によって決定される。すなわち、リポーターの配列は、第２プライマーの第２領域の配列を決定し、かつワトソンとクリックによって開発された標準規則を用いて当該第２領域に対する補体を決定することで決められる。一実施形態では、例えば、第２プライマーの第２領域は単一の非天然塩基を含む。この実施形態では、リポーターは、好ましくは第２プライマーに含まれる非天然塩基に相補的な単一の非天然塩基を含む。同様に、１個より多くの非天然塩基が第２プライマーの第２領域に含まれる場合、第２領域の配列は、当該配列に対する補体を決定し、その結果によりリポーターが合成される。
【００５９】
第２プライマーの第２部分にハイブリダイズ可能な同一配列を有するリポーターは、第２プライマーの第２部分が、それら分析においても同じであることを条件として、種々の分析に使用することができる。他言すれば、“万能な”リポーターと第２プライマーの第２部分とを使用することができる。そして、第１部分が該標的核酸に特異的である第２プライマーの“万能な”第２部分を第２プライマーの一部に結合し或いは一部として合成することができる。これは、例えば、所望の標的核酸のために使用者の注文によって特製されるキットで使用することができる。
【００６０】
他の実施形態では、特定の分析において、それぞれ第２領域に異なった配列を有するいくつかの第２プライマーと、それぞれそのいくつかの異なった第２プライマーの１つの第２部分に相補的な配列を有するいくつかのリポーターとを使用することが有益である。このような分析では、各リポーターが異なった標識を有することが有利である。いくつかの実施形態では、リポーターを、その３’末端によって固体又は他の独特な支持体の別個の領域に結合させることができる。
リポーターの、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドに対して十分に安定なハイブリッドを形成する能力は、プライマーについて上述したような因子によって決まる。
【００６１】
これとは別の実施形態では、第２プライマーとリポーターが単一化合物である。この実施形態は図４に示される。図４Ａに示されるように、標的核酸１００は、第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８と接触している。この実施形態では、第２プライマーは以下を含む：第１領域１１０、第２領域１１２、リンカー１８０、リポーター１９０、及びクエンチャー１９６。この実施形態では、リンカー１８０が第２プライマー１０８をリポーター１９０と連結する。リポーター１９０は、染料１９２、非天然塩基１９４、及びクエンチャー１９６を含む。非天然塩基１９４は第２プライマー１０８の非天然塩基１１４に相補的である。図４Ｂに示されるように、第１領域１１０が標的核酸１００の第１部分１０２にアニールする。リンカー１８０は、一方のヌクレオチドの５’末端をもう一方のヌクレオチドの３’末端に結合させる化学的リンカーを含む。リンカー１８０は、図４Ｂに示されるように、リポーター１２６を折り返し、かつ第２プライマー１０２の第２領域１１２と塩基対を形成させる。一実施形態では、リンカー１８０は、リポーター１２６を第２領域１１２とハイブリダイズさせるのに十分な長さのヌクレオチドの配列を含む。好ましくは、この実施形態におけるリンカー１８０を含むヌクレオチドは、ヘアピンループ１８２を形成可能である。別の実施形態では、リポーター１２６が第２領域１１２にハイブリダイズする温度が、第１領域１１０が標的１００の第２部分１０４にハイブリダイズする温度より低い。
【００６２】
図４Ｃは、ＰＣＲ、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅の際にプライマー１０４及び１０６の伸長の結果生じる増幅産物２００を示す。増幅産物２００は、二本鎖領域２０２及び一本鎖領域２０４を含む。リポーター１９０が増幅産物の一本鎖領域２０４にアニールする。
図４Ｄに示されるように、リポーター１９０は、例えば、ポリメラーゼ又は他の適宜な酵素によって切断され、ひいてはリポーター断片１９８を遊離させる。遊離されたリポーター断片１９８は染料１９２を含む。ここで述べるように、クエンチャー１９６の近接による染料１９２の遊離によって、可視化されうる。いくつかの実施形態では、図４に示されるように、リポーター１２６が第２領域１１２にハイブリダイズされ、第１及び第２プライマー１０６、１０８が伸長する。これは、第１プライマー１０６が十分に伸長したときにポリメラーゼがリポーター断片１９８を切断するのを可能にし、かつＰＣＲプロセスの際に、リポーターの引き続き添加せずに、該分析の“リアルタイム”モニタリングを可能にする。しかし、第１及び第２プライマーの伸長時におけるリポーターの第２領域へのハイブリダイゼーションは必要な特徴ではない。リポーターの第２領域へのハイブリダイゼーションは、図１で示される分析について述べたのと同一様式で伸長後に起こりうる。
【００６３】
標識
本発明により、リポーターは標識を含む。ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的分析によって検出可能な成分を組み込むことによって標識化できる。標識をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに連結又は結合する方法は、使用する標識のタイプと、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド上の該標識の位置によって決まる。
本発明の用途に適する種々の標識、及びプローブ内にそれを封入する方法は技術的に公知であり、限定するものではないが、酵素基質、放射性原子、蛍光染料、発色団、化学発光標識、ＯＲＩ−ＴＡＧＴＭ（Ｉｇｅｎ）のような電気化学発光標識、特異的な結合パターンを有するリガンド、又はシグナルを増強し、変化させ、若しくは減少させるために相互作用しうる他のいずれの標識も挙げられる。熱サイクラー設備を用いてＰＣＲを実施し、この自動プロセスで必要な温度循環を存続するように標識を選択すべきであることが理解される。
本発明の方法の標識に好適な１つの放射性原子は、３２Ｐである。３２Ｐを核酸中に導入する方法は技術的に公知であり、例えば、キナーゼによる５’標識化、又はニックトランスレーションによるランダム挿入が挙げられる。
【００６４】
上記説明は、同一標識は、いくつかの異なる態様で働きうるので、種々の標識を明確なクラスに分類することを意図したものでないことを理解すべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、又は電子高密度試薬として貢献しうる。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせることができる。例えば、ヌクレオチドをビオチンで標識し、かつその存在を１２５Ｉで標識されたアビジンで検出することができる。他の変更及び可能性は、本技術の当業者には明かであり、本発明の範囲内で考えられる。
ある場合には、オリゴヌクレオチド上に標識の適切な間隔を維持して、オリゴヌクレオチドの加水分解時における標識の分離を許容するために正当な考慮を払って、単一のオリゴヌクレオチド上に２個の相互作用的標識を使用することが望ましい。同様に、例えば、リポーターと第２プライマーの第２領域のような異なるオリゴヌクレオチド上に２個の相互作用的標識を使用することが望ましい。この実施形態では、リポーターと第２領域は、相互にハイブリダイズするように設計される。この場合もやはり、ハイブリダイズ時にオリゴヌクレオチド間の標識の適当な間隔を維持することに考慮が払われる。
【００６５】
相互作用的標識対の１種は、クエンチャー−染料対である。好ましくは、クエンチャー−染料対は、発蛍光団とクエンチャーで構成される。好適な発蛍光団としては、例えば、フルオレッセイン、カスケードブルー、ヘキサクロロ−フルオレッセイン、テトラクロロフルオレッセイン、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−メトキシフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、テキサスレッド、エオシン、フルオレッセイン、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５，ｐ−エトキシフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸及び４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセンプロピオン酸が挙げられる。好適なクエンチャーとしては、例えば、Ｄａｂｃｙｌ、ＱＳＹ７ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）等が挙げられる。さらに、染料は、それらが別の染料の放射光線を吸収する場合、クエンチャーとしても使用できる。
【００６６】
標識は、非天然塩基を含むヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドに、種々の技法により直接又は間接的に結合させることができる。使用する標識の正確なタイプによって、標識はリポーターの５’又は３’末端に位置づけ、リポーターのヌクレオチド配列の内部に位置づけ、又はリポーターから伸長し、かつ種々の大きさ及び組成を有するスペーサーアームに結合させて、シグナルの相互作用を促すことができる。商業的に入手可能なホスホラミダイト試薬を用いて、例えば、リン酸結合の形成による５’塩基の５’ヒドロキシルにホスホラミダイト染料を結合させることによって、又は内部的に適切に保護されたホスホラミダイトを介して、各末端に官能基（例えば、チオール又は一級アミン）を含有するオリゴヌクレオチドを生成し、かつ例えば、参照によって本明細書に取り込まれるＰＣＲプロトコル：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されているプロトコルを用いてそれらを標識化することができる。
【００６７】
１種以上のスルフヒドリル、アミノ又はヒドロキシル成分を有する試薬を官能化するオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドリポーター配列中、通常５’末端に組み込む方法は、参照によって本明細書に取り込まれる米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。例えば、５’リン酸基はポリヌクレオチドキナーゼと［γ３２Ｐ］ＡＴＰを用いて放射性同位体として組み込み、リポーター基を与えることができる。ビオチンは、合成時に導入されたアミノチミジン残基を、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって、５’末端に付加することができる。
３’末端における標識は、例えば、ポリヌクレオチド末端トランスフェラーゼを利用して、例えば、コルジセピン、３５Ｓ−ｄＡＴＰ、及びビオチン化ｄＵＴＰのような所望成分を付加することができる。
【００６８】
オリゴヌクレオチド誘導体は標識としても利用できる。例えば、エテノ−ｄＡ及びエテノ−Ａは、リポーター中に組み込むことのできる公知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ−ｄＣは、リポーター合成に使用できる別の類似体である。このようなヌクレオチド誘導体を含有するリポーターは、ＰＣＲの際に核酸ポリメラーゼがプライマーを伸長するとき、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によって加水分解され、ずっと強い蛍光性のモノヌクレオチドを遊離しうる。
いくつかの実施形態では、標識化リポーターが第１及び第２標識を含み、第１標識はヌクレアーゼ感受性切断部位によって第２標識から分離されている。
【００６９】
リポーターの標識は、リポーターのいずれの適切な位置に位置づけることもできる。例えば、リポーターが１個より多くのヌクレオチドを含む場合、標識はリポーター配列のいずれの適切なヌクレオチドにも結合させることができる。標識は、リポーターの５’末端に位置づけ、非相補的配列によって標的核酸に相補的なリポーター配列から分離することができる。この実施形態では、増幅産物の非天然塩基に相補的な非天然塩基、及び第２プライマーの第２領域に非相補的な配列を含み、かつ該標識は第２領域に非相補的な配列内に位置づけられる。さらに、標識は、適切なスペーサー又は化学的リンカーを用いて、リポーターのヌクレオチドに間接的に結合させることができる。
【００７０】
別の実施形態では、標識化リポーターは、リポーター上又はリポーター上及び分析の第２構成要素（第２オリゴヌクレオチドのような）上に有効に位置づけられた１対の相互作用的シグナル生成標識を含み、この相互作用的シグナル生成標識が相互に十分に近接したときに検出可能なシグナルの生成をクエンチする。好ましくは、これら標識はヌクレアーゼ切断に感受性なリポーター内の部位によって分離され、それによって核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が、ヌクレアーゼ感受性部位でリポーターを切断することにより、第１の相互作用的シグナル生成標識を第２の相互作用的シグナル生成標識から分離させる。相互作用的シグナル生成成分の分離（例えば、該標識の一方を含有するリポーター断片を遊離させるためのリポーターの切断）の結果、検出可能なシグナルの生成となる。このような標識の例としては、染料／クエンチャー対又は２種の染料対（一方の染料の放射が第２染料による放射を刺激する）が挙げられる。
【００７１】
例示実施形態では、相互作用的シグナル生成対は、発蛍光団、例えばフルオレッセイン、５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テトラメチルローダミン等と、発蛍光団の蛍光放射をクエンチすることができるクエンチャー、例えば、ジメチルアミノアゾベンゼンアミノエキサル−３−アクリイニド（Ｄａｂｃｙｌ）とを含む。当業者は、特定の発蛍光団の放射をクエンチすることができる適切なクエンチャー成分を選択することができる。例示実施形態では、Ｄａｂｃｙｌクエンチャーが発蛍光団成分からの蛍光の放射を吸収する。発蛍光団−クエンチャー対については、参照によって本明細書に取り込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｎｏｎｉｓｏｔｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記述されている。
これとは別に、これら相互作用的シグナル生成標識は、第２プライマーの第２領域が少なくとも１個の非天然塩基と標識を含む場合の検出方法で使用することができる。この対の第２標識は、第２プライマーの非天然塩基に相補的な少なくとも１個の非天然塩基と、第２標識とを含むリポーターによって供給される。この実施形態は図６に示される。例えば、染料／クエンチャー対を使用すると、リポーターのハイブリダイゼーション又は増幅産物の組込みの結果、蛍光の減少となる。
【００７２】
これとは別に、２つの標識の近接は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は蛍光偏光によって検出することができる。ＦＲＥＴは２個の染料分子の電子励起状態間の距離依存性相互作用であり、光子の放射無しで、励起が供与体分子から受容体分子へ転移する。ＦＲＥＴの供与体／受容体染料対の例は、フルオレッセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳＴＭ／フルオレッセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＥＤＡＮＳＴＭ／Ｄａｂｃｙｌ、フルオレッセイン／フルオレッセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＢＯＤＩＰＹＴＭ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、及びフルオレッセイン／ＱＳＹ７ＴＭである。
【００７３】
アニーリング
リポーターは、検出方法の際適宜の時に試料に付加される。図１に示される実施形態では、ＰＣＲが十分な増幅産物１２０を生成した後、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４にリポーター１２６がアニールされる。この図解される実施形態では、リポーター１２６は、染料１２８、クエンチャー１３２、及び第２プライマー１０８の非天然塩基１１４に相補的な非天然塩基１３０を含む。リポーター１２６は、第２プライマー１０８の第２領域１１２に対応する配列にアニールする。ＰＣＲが十分な増幅産物１２０を生成した後に反応混合物にリポーター１２６を添加するか、又はＰＣＲ増幅の前に反応混合物にリポーター１２６を添加することができる。好ましくは、ＰＣＲ増幅の前にリポーター１２６が反応混合物に添加される。増幅後、好ましくは、リポーター／増幅産物の融解温度未満に温度を下げ、リポーターを増幅産物の一本鎖領域にアニーリングさせる。一実施形態では、リポーターの一本鎖オーバーハング領域へのアニーリング工程の際、反応温度は約４９℃以下である。アニーリングは、上述したような他のリポーター及び他のタイプの標識を用いる実施形態を含め、本発明の他の実施形態と同様に行われる。別の実施形態では、リポーター１２６は、第１及び第２プライマー１０６、１０８と増幅産物１２０の融解温度又はそれ以上の温度でアニールされる。この実施形態は、ＰＣＲ増幅産物の“リアルタイム”検出を行う場合に特に有用である。
【００７４】
切断
本発明の一実施形態では、リポーターが増幅産物にアニールした後、切断事象が起こって少なくとも１つのリポーター断片を遊離する。このリポーター断片の遊離は、後述するように、標的核酸の存在に関連づけられる。リポーターが増幅産物の一本鎖領域にアニールすると、これがリポーター／増幅産物複合体を形成し、複合体を切断してリポーター断片を遊離させる酵素によって認識されうる。この実施形態で使用するために考えられる酵素は、一般的に種々のリポーター／増幅産物複合体構造を認識することができる。例えば、リポーター１２６の５’末端部は、増幅産物の配列と重なることができ、一本鎖オーバーハング領域１６０を形成する（図１Ｄ参照）。
【００７５】
別の実施形態では、リポーター１２６はオーバーラップ領域を含まないで一本鎖オーバーハング領域を形成するが、リポーターが増幅産物にアニールされるときは（図５参照）、むしろリポーターはニック様構造を形成する。図５Ｄに示されるように、この実施形態では増幅産物中にニック様構造が形成される。一般的に、二本鎖ＤＮＡ中の“ニック”は、１本の鎖上の２個の隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合が存在しないことである。本明細書で使用する場合、用語“ニック様”構造は、リポーター１２６の５’末端ヌクレオチドと増幅産物の鎖１００ａの３’末端ヌクレオチドとの間にホスホジエステル結合が存在しない場合に形成される。二本鎖ＤＮＡの１本の鎖が新物質の再合成によって分解及び置換されうる開始点として、二本鎖ＤＮＡ中のニックを使用することができる、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのようないくつかの酵素がある。
【００７６】
この実施形態では、リポーター２１０は、増幅産物の非天然塩基１１４に相補的である非天然塩基２１６、染料２１２、及びクエンチャー２１４を含む。リポーター２１０が増幅産物の一本鎖部分にアニールする。従って、ニックは、非天然塩基２１６と増幅産物の隣接するヌクレオチドとの間に生成される。この実施形態では、ポリメラーゼは、リポーター／増幅産物複合体中に形成されたニック様構造を認識し、かつ当該ニック部位でリポーターを切断する。複合体の切断がリポーター断片１３４を遊離し、シグナルが検出される。
リポーター／増幅産物複合体によって形成される特定構造のいくつかは、いくらか詳細に議論されるが、他のリポーター／増幅産物複合体は、本明細書で述べるように切断を行うことで形成することができる。
【００７７】
図１Ｄに示される実施形態を参照すると、アニーリング後、リポーター１２６の５’末端１６０の部分は標的にアニールされず、一本鎖である。アニールされたリポーター断片を増幅産物から切断するためのポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性の能力が維持されることを条件として、塩基中のいずれの長さの一本鎖オーバーハング領域１６０も考えられることが分かる。図１Ｄで例示される実施形態では、検出のため、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を、アニールされたリポーター１２６の切断を可能にするのに十分な条件下で反応が続けられる。リポーター１２６の切断が切断断片１３４（標識又は標識の一部を含有する）を生成し、それが検出される（又は、代わりに残存リポーター／増幅産物複合体が検出され）、かつそれらは試料中における標的核酸の存在の指標である。少なくともいくつかの実施形態では、リポーター断片はモノ−、ジ−、及びより大きいヌクレオチド断片の混合物を含むことができる。
【００７８】
図１Ｅに示されるように、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が一本鎖領域１６０を切断し、リポーター断片１３４を遊離させる。この実施形態では、リポーター断片は染料１２８を含む。クエンチャー１３２を含む増幅産物からの染料１２８の遊離が染料の検出を可能にする。従って、リポーター断片の遊離は、リポーター断片がクエンチャーへの近接から遊離されるときに染料の検出を可能にする。これは、順次、リポーター断片の遊離と標的核酸の存在との関係を斟酌する。そうでなければ、染料とクエンチャーの配置が逆にされ、クエンチャーがリポーター断片と共に遊離され、リポーター／増幅産物上の染料が検出される。
【００７９】
組込み
さて、図２を参照すると、本発明の別の実施形態が示される。この実施形態では、第２プライマーの第２領域１２４が非天然塩基１２４を含む。非天然塩基１２４に相補的な非天然塩基１５２が、適切な酵素を用いて増幅産物中に組み込まれる。この実施形態では、リポーターの組込みが試料中の標的核酸の存在と関連づけられる。
図２に示されるように、本発明の方法はリポーター１５０；核酸ポリメラーゼ（図示せず）；第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８を利用する。ＰＣＲ反応混合物は、４個の天然に存在するヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）及び１個以上の非天然ヌクレオチド三リン酸（又は非天然ヌクレオチド三リン酸を含有するオリゴヌクレオチド）をもリポーター１５０として含有する。例示実施形態では、反応混合物中の１個以上の非天然ヌクレオチド三リン酸１５２が標識１５４を含む。ＰＣＲはＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅でよい。
【００８０】
第１プライマー１０６は、標的核酸１００の一部に相補的な配列を含み、かつ標的核酸１００の当該部分にハイブリダイズすることができる。第２プライマー１０８は第１領域１１０と第２領域１１２を有する。第１領域１１０は、標的核酸１００の一部に相補的な配列を含む。第２プライマー１０８の第２領域１１２は非天然塩基１１４を含み、この第２領域１１２は標的核酸１００に相補的でない。単一のヌクレオチドだけが第２領域１１２に図示されているが、第２領域はさらにヌクレオチドを含みうることが分かるだろう。好ましくは、非天然塩基１１４は、第２プライマー１０８の第１領域１１０と第２領域１１２との接合部に位置する。いくつかの実施形態では、第２オリゴヌクレオチドプライマーの第２領域１１２中に存在する非天然塩基１１４は、ｉｓｏ−Ｃ又はｉｓｏ−Ｇである。
【００８１】
第１プライマー１０６及び第２プライマー１０８に加え、試料はポリメラーゼに接触させられ（図示せず）、ポリメラーゼ連鎖反応が行われる。標的核酸１００が試料中に存在する場合、塩基の標準的な対合規則に従って、第１プライマー１０６の相補性部分と第２プライマー１０８の相補性部分１１０が、標的核酸１００の対応領域１０２、１０４にアニールする。図１に示される実施形態と同様に、プライマーが標的にアニールされるとき、第１プライマー１０６の３’末端ヌクレオチドは、ヌクレオチドの配列、つまり“ギャップ”によって、第２プライマー１０８の３’末端ヌクレオチドから分離される。好ましい実施形態では、第１及び第２プライマーは、鋳型核酸にアニールされるとき、ＰＣＲプライマーの３’末端間に、鋳型核酸上の約ゼロ（０）〜約５個の塩基のギャップが存在するように設計される。
【００８２】
図２Ｂ及び２Ｃに示されるように、ポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅によって、各プライマーの３’−ＯＨ末端から一本鎖１２０ａ、１２０ｂが合成される。ポリメラーゼ連鎖反応は所望のサイクル数続け、図２Ｃに示される増幅産物１２０を得ることができる。
図２Ｃに示されるように、増幅産物１２０は二本鎖領域１２２及び一本鎖領域１２４を含む。示されるように、一本鎖領域１２４は第２プライマー１０８の非天然塩基１１４を含む。一本鎖領域１２４は単一の非天然塩基を含んで示されているが、この領域は、１個より多くの非天然塩基を含むことができる。
【００８３】
さて、図２Ｄを参照すると、増幅産物１２０がリポーター１５０と接触させられる。リポーター１５０は標識１５４と非天然塩基１５２を含む。図２Ｅに示されるように、リポーター１５０は、増幅産物中非天然塩基１１４の反対側に組み込まれる。一実施形態では、リポーター１５０の非天然塩基１５２は、増幅産物１２０の一本鎖領域１２４の非天然塩基１１４に相補的なヌクレオチド三リン酸を含む。この実施形態では、ＰＣＲ反応は、４個の天然に存在するヌクレオチド三リン酸塩基（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に加え、標識された非天然ヌクレオチド三リン酸塩基の存在を含む。ＰＣＲ反応における非天然ヌクレオチド三リン酸塩基の濃度は、例えば、１μＭ〜１００μＭの範囲でよい。
【００８４】
リポーター１５０を増幅産物１２０中に組み込むための好適な酵素としては、例えば、ポリメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。伸長プライマー鎖中に天然ヌクレオチドを組み込むことができる多くのポリメラーゼを使用して、増幅産物中相補的な非天然塩基の向かい側に非天然塩基を組み込むこともできる。典型的には、クレノウ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、及びＢｓｔのようなクラスＡ ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ、Ｔｌｉ、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｔ４、及びＰｗｏのようなクラスＢポリメラーゼよりも非天然塩基をうまく組み込むことができる。ＨＩＶ−１のような逆転写酵素を使用しても、伸長プライマー中に、鋳型内のその相補性非天然塩基の向かい側に非天然塩基を組み込むことができる。この実施形態では、ポリメラーゼはヌクレアーゼ欠乏性であるか、又は低減されたヌクレアーゼ活性を有することができる。本発明を限定する意図ではないが、ヌクレアーゼ活性はいくつかのＰＣＲ反応を妨害することが分かっているので（Ｇｅｎｅ １１９２ １１２（１）：２９−３５及びＳｃｉｅｎｃｅ １９９３ ２６０（５１０９）：７７８−８３）、ヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼが、より強力であると考えられる。
【００８５】
試料中の標的核酸の存在は、増幅産物中のリポーターの存在と関連づけることによって決定される。適切な検出及び可視化方法を用いて標的核酸を検出する。例えば、例示の場合、標的核酸の存在は、例えば、蛍光又は他の可視化方法によって、標識１５４を検出することによって決定される。例えば、蛍光偏光を利用して、増幅産物中へのリポーターの組込みを検出することができる。
好ましくは、この実施形態では、洗浄工程又は分離工程は、リポーター１５０の増幅産物１２０中への組込み後、かつ検出前に行われる。この洗浄又は分離工程は、系から未結合リポーター１５０を除去するので、シグナルの検出は組み込まれたリポーターに依存する。当業者は、ゲル電気泳動法等によるサイズ分離等を含め、いずれの公知の洗浄又は分離工程も本発明と共に使用できることが容易にわかるだろう。代わりに、検出の方法として蛍光偏光を用いる場合、洗浄工程は必要ない。
【００８６】
この実施形態で使用するリポーター１５０は、少なくとも１個の非天然塩基１５２を含む。リポーターの非天然塩基は、好ましくは標識１５４を含む。リポーター１５０の非天然塩基１５２は、ＰＣＲ増幅の際、第２プライマー１０８の少なくとも１個の非天然塩基１１４の反対側にポリメラーゼによって増幅産物中に挿入される。
別の実施形態では、図６に示されるように、リポーター１７０は、第２プライマー１０８の非天然塩基１１４に相補的な非天然塩基１７２と、クエンチャー１２９とを含む。この実施形態では、第２プライマー１０８の非天然塩基１１４は染料１６２を含む。この実施形態では、リポーター１７０の組込みにより、クエンチャー１２９を染料１６２に近接させる。これは、順次、染料１６２のシグナル出力を減少させ、このシグナルの減少を検出し、標的核酸の存在と関連づけられる。好適な染料−クエンチャー対については上述した。これとは別に、染料−染料対を使用できる。標的核酸が存在する場合、ＰＣＲは、近接して２つの染料を配置する二重産物を生成し、標識の蛍光出力が変化する。この変化は、ベンチトップ蛍光プレートリーダーによって検出可能である。
この実施形態で用いるポリメラーゼは、ヌクレアーゼ活性を有し、又は低減したヌクレアーゼ活性を有し、又はヌクレアーゼ活性欠乏性でよい。好ましくは、このポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。
【００８７】
検出
リポーターオリゴヌクレオチド断片の検出と解析は、技術的に公知のいずれの方法によっても達成することができる。上記標識を含有する核酸の検出に多くの方法が利用できる。例えば、ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ接合体のようなアビジン接合体を利用する非放射性同位体検出法を用いて検出することができる。フルオレッセイン標識オリゴヌクレオチドは、フルオレッセイン−イメージャーを用いて検出することができる。
一実施形態では、さらに処理することなくＰＣＲ反応混合物内でリポーターオリゴヌクレオチドを検出することができる。例えば、切断されたオリゴヌクレオチドからのシグナルは、物理的分離の無い未切断オリゴヌクレオチドのシグナルから解明することができる。これは、例えば蛍光偏光解析によって達成することができ、蛍光分子の溶液中での大きさひいては回転速度の変化を検出することができる。
【００８８】
一実施形態では、標的が存在する場合、第１及び第２標識（例えば、染料／染料対）を近接して配置する二重産物が生成される。２つの標識が近接すると、リポーター分子標識の蛍光出力が変化する。この変化は、ほとんどのベンチトップ蛍光プレートリーダーで検出できる。これとは別に、標識対は近接したクエンチャー−標識対を含む。この実施形態では、リポーター分子標識の蛍光出力が変化し、この変化は検出可能である。この発明では、他の適切な検出方法が考えられる。
別の実施形態では、さらに処理した後にリポーターが検出される。オリゴヌクレオチドを分離するのに有用な技術的に公知の多くの技法のいずれを用いても反応からリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離できると考えられる。例えば、固相抽出によって反応混合物からリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離することができる。電気泳動法又は電気泳動法以外の方法でリポーターオリゴヌクレオチド断片を分離することができる。例えば、ビオチン−標識オリゴヌクレオチドは、常磁性若しくは磁性ビーズ、又はアビジン（若しくはストレプトアビジン）で被覆された粒子を用いて反応混合物から分離することができる。この様式では、ビオチン化オリゴヌクレオチド／アビジン−磁性ビーズ複合体は、該複合体を磁場にさらすことによって、混合物中の他の成分から物理的に分離されうる。一実施形態では、リポーターオリゴヌクレオチド断片は、質量分析法によって解析される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、熱循環時に蛍光を読み取ることのできる機器上で増幅が行われ、かつ検出される場合、非特異性ＰＣＲ産物から意図したＰＣＲ産物を区別することができる。鋳型核酸の量が制限されている場合、意図した産物以外の増幅産物が形成されうる。これは、第２プライマー１０８が、それ自体又は第１プライマー１０６と共にプライマー二量体に合体されるプライマー二量体形成のためである。プライマー二量体形成の際、２つのプライマーの３’末端がハイブリダイズし、かつ核酸ポリメラーゼにより、関与する各プライマーの５’末端まで伸長される。これが、次の一回りの増幅でこの非特異的産物をさらに指数関数的に生じさせるのに関与するプライマーの形成時の完全基質である基質を生じさせる。従って、プライマー二量体の最初の形成は、それが非常に珍しい事象である場合でさえ、特に鋳型核酸が制限され或いは不在のとき、増幅プロセスが二量体産物を該反応に打ち勝たせることができるので、有利な相互作用である必要はない。第２オリゴヌクレオチドプライマー１０６がこの産物中に組み込まれるとき、標識された非標準塩基１７０は、第２プライマー１０６の非標準塩基１１４に対して直交に配置される。この結果、リポーターの標識１２９と第２プライマーの１６２との間に相互作用をもたらし、図６Ｅに示されるような意図した産物１２０の形成におけるのと同一の蛍光出力の変化を与えるだろう。プライマー二量体産物は、通常意図した産物より長さが短く、それゆえより低い融解温度を有する。図６Ｅに示されるように標識は二本鎖を越えて近接に保持されるので、２本の鎖を分離する事象は、標識の相互作用を破壊するだろう。反応産物を含有する反応の温度をプライマー二量体の二本鎖ＤＮＡｓのＴｍより高く上昇させると、意図した産物は、該産物のＤＮＡ二本鎖を融解し、かつ標識の相互作用を破壊して蛍光の測定可能な変化を与えるだろう。増幅及びシグナル生成後、徐々に反応温度を上げながら蛍光の変化を測定することによって、意図した産物のＴｍ及び非特異的産物のＴｍを決定することができる。
【００９０】
入れ子状ＰＣＲ
本発明の方法を用いて入れ子状ＰＣＲを行うことができる。例として、第１、第２、及び第３プライマー（又はそれより多い）を用いて入れ子状ＰＣＲを行うことができる。第２プライマーは、標的配列に相補的な第１領域と、リポーターオリゴヌクレオチドに相補的な第２領域を有する。第１及び第３プライマーは、第２プライマーより高温で標的にハイブリダイズすることができる。変性及びアニーリング温度間の循環が第１及び第３プライマーを標的核酸にアニールさせるが、第２プライマーはアニールさせない、数回のＰＣＲサイクルが行われた後、第１増幅産物が生成されうる。その後、ＰＣＲアニーリング温度を下げて、第２プライマーの第１領域を第１増幅産物にハイブリダイズさせることができる。この下げたアニーリング温度での数サイクルのＰＣＲにより、第１及び第２プライマー間の第２増幅産物が生成する。温度を下げて、リポーターオリゴヌクレオチドの第２プライマーの第２領域へのハイブリダイゼーションを可能にする。
【００９１】
ＤＮＡ多型性の検出における使用
本発明の方法は、核酸配列の配列変異を検出するのに有用である。本明細書で使用する場合、用語“配列変異”は、２核酸間の核酸配列の相異を指す。例えば、野生型遺伝子とこの遺伝子の突然変異体は、単一塩基の置換若しくは欠失又は１個以上のヌクレオチド挿入の存在によって、配列が変化しうる。これら２つの遺伝子の型は、相互に配列が変わると言われている。配列変異の一例は、ＤＮＡ多型性である。図７に示される実施形態では、単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）の検出が例示されており、ＰＣＲを用い、蛍光プレートリーダー上にＰＣＲ反応プレートを配置すること以外はさらに試料の操作を必要としない。対立遺伝子特異性標識を含む対立遺伝子特異性リポーター又はプライマーが使用される。例えば、２つの対立遺伝子系は、異なった色の標識を有する対立遺伝子特異性リポーター又はプライマーを含んでよい。試料中の当該対立遺伝子の存在を指標するどちらかの色の存在及び当該両方の対立遺伝子を指標する２色の組合せの存在が試料中にある。
【００９２】
この実施形態では、プライマーは以下のように単一のヌクレオチド多型性を検出するように設計される。好ましくは、使用するプライマーの１つは対立遺伝子特異性プライマーを含む。好ましくは、プライマーの１つは非天然塩基を含む。一実施形態では、これら両特徴が単一のプライマーによって与えられる。代わりに、対立遺伝子特異性プライマーは、非天然塩基を含むプライマーとは別個のプライマーである。
本明細書で使用する場合、用語“対立遺伝子特異性プライマー”は、ＳＮＰを含有すると推測される領域内の標的核酸に完全に相補的であるプライマーを意味する。
【００９３】
ＳＮＰ対立遺伝子を区別するために使用可能な対立遺伝子特異性ＰＣＲプライマーは、関心のある多型性塩基が該プライマーの３’末端に位置するように、各対立遺伝子に相補的に設計される。高レベルの対立遺伝子の区別は、その３’末端で標的ＤＮＡの３’末端、すなわち、プライマーが特異的でない対応する対立遺伝子とヌクレオチドのミスマッチがあるプライマーを伸長するポリメラーゼの能力の制限によって部分的に達成される。さらに、対立遺伝子の区別は、対立遺伝子特異性プライマー内の他の位置にミスマッチを配置することで達成することができる。一般に、対立遺伝子特異的な位置は、ミスマッチがあるとポリメラーゼがプライマーを有効に伸長できないという条件で、プライマー内のどこでもよい。好ましくは、対立遺伝子ミスマッチが、選択されたＰＣＲ条件では異なった対立遺伝子の標的核酸配列への対立遺伝子特異性プライマーのハイブリダイゼーションを十分に不安定にするようにプライマーが選択される。一実施形態では、対立遺伝子特異的な位置は、プライマーの３’末端から約５塩基以内である。例えば、対立遺伝子特異的な位置は、プライマーの３’末端塩基でよい。プライマー中の対立遺伝子特異的な位置のこれら交代性の位置を用いて、以下の２つの主な方法で選択的な増幅を達成することができる：１）プライマーのＴｍを下げ、ポリメラーゼの熱循環の際に鋳型ＤＮＡ上でプライマーがハイブリダイズして伸長しないようにすることにより、又は２）ポリメラーゼが伸長しないであろう不都合なプライマー／鋳型構造を創造することによる。特異性の向上は、伸長停止時間、及びアニーリングと融解の停止時間が短いか、又は存在しないＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅を利用することによって達成される。このような一実施形態では、反応は約９０〜１００℃と約５０〜６５℃との間で迅速に循環され、各温度で最大約１秒保持され、それによってポリメラーゼにミスマッチのプライマーを伸長する時間をほとんど残さない。例示した実施形態では、反応は約９５℃と約５８℃の間で循環され、各温度で最大約１秒保持される。この迅速な循環は、最短の可能なＰＣＲ産物を生成することで、一般的に、ＰＣＲプライマーの３’塩基間の鋳型核酸上の約ゼロ（０）〜約５塩基のギャップを残すことによって可能にされる。好ましくは、プライマーは、可能な最短配列及び約５５〜６０℃のＴｍを有するように設計される。ゲノムＤＮＡ試料に関するＳＮＰ解析を含む一実施形態では、３０個程度の標的分子を検出するには、総計約３７サイクルで十分だった。
【００９４】
図７には対立遺伝子特異的分析法の１例が示される。本明細書で議論される他の分析法を使用し、又は対立遺伝子特異的分析のために改変できることが分かるだろう。図７Ａを参照すると、試料は標的核酸１００を含有すると推測され、該標的核酸１００は、第１部分１０２と第２部分１０４を含む。示されるように、標的核酸１００は、鎖１００ａと１００ｂで構成される二本鎖分子である。
図７Ｂを参照すると、示されるように、試料が２つ以上の対立遺伝子特異性第１プライマー１０６ａ、１０６ｂと、第２プライマー１０８と接触させられる。一方の対立遺伝子特異性第１プライマー１０６ａは標的核酸１００の第１部分１０２に相補的である。他方の対立遺伝子特異性プライマー１０６ｂは、標的核酸１００の第１部分１０２に完全には相補的でない。第２プライマー１０８は、第１領域１１０と第２領域１１２を含み、第１領域１１０は標的核酸１００の第２部分１０４に相補的な配列を含む。第２プライマー１０８の第２領域１１２は、非天然塩基１１４を含む。第２領域１１２は、標的核酸１００に相補的でない。
【００９５】
第１プライマー及び第２プライマーに加え、試料はポリメラーゼとも接触させられ、本明細書で述べるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される。試料中に標的核酸１００が存在する場合、対立遺伝子特異性第１プライマー１０６ａの相補性部分及び第２プライマー１０８の相補性部分が、塩基の標準的な対合規則に従って標的核酸１００の対応する領域１０２及び１０４にアニールする。
図７Ｂに示されるように、ポリメラーゼを用い、ＰＣＲ、つまりＦａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅により、各プライマー１０６ａ、１０８の３’−ＯＨ末端から一本鎖が合成される。すなわち、対立遺伝子特異性第１プライマー１０６ａを用い、標的核酸１００の鎖１００ａの少なくとも一部に相補的な鎖１２０ａが合成され、第２プライマー１０８を用い、標的核酸１００の鎖１００ｂの少なくとも一部に相補的な鎖１２０ｂが合成される。対立遺伝子特異性第１プライマー１０６ｂは、標的核酸１００に完全には相補的でないので、実質的に伸長しない。ポリメラーゼ連鎖反応を所望のサイクル数進め、図７Ｃに示される増幅産物１２０を得ることができる。そして、図１に示される分析で述べたように分析を進める。
【００９６】
キット
本発明の方法で使用する試薬を診断キットに詰めることができる。診断キットは、標識化リポーター、第１プライマー、及び第２プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ポリメラーゼによって伸長オリゴヌクレオチド中に組み込むことができる非天然塩基を含む。一実施形態では、この非天然塩基は標識される。オリゴヌクレオチドと非天然塩基が標識されない場合、特異的な標識試薬もキットに含めることができる。キットは、他の適宜の梱包試薬及び増幅に必要な物質、例えば、緩衝液、ｄＴＮＰｓ、重合酵素、及び検出解析のために、例えば、酵素及び固相抽出用溶媒を含むこともできる。
本発明の方法に有用な試薬は、溶液で貯蔵することができ、又は凍結乾燥することができる。凍結乾燥する場合、試薬のいくつか又はすべては、再構成後簡単に使用するため微量定量プレートウェル内に直ちに貯蔵することができる。凍結乾燥試薬の技術的に公知のいずれの方法も、本発明の方法で有用な試薬を乾かして調製するのに適すると考えられる。
【００９７】
本明細書で参照又は引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、及び刊行物は、その全体がこの明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲まで、参照によって本明細書に取り込まれる。
以下は、本発明を実施する手順を説明する実施例である。これら実施例は、限定するものと考えるべきでない。特に言及しない限り、すべてのパーセンテージは質量についてであり、すべての溶媒混合割合は体積についてである。
【００９８】
実施例
実施例１
プライマー設計
核酸成分の配列中に示される記号は以下の通りである：Ａ＝デオキシアデニレート；Ｔ＝デオキシチミジレート；Ｃ＝デオキシシチジレート；Ｇ＝デオキシグアニレート；Ｘ＝デオキシ−イソ−シトシン（ｄ−ｉｓｏＣ）；Ｙ＝デオキシ−イソ−グアニン（ｄ−ｉｓｏＧ）；Ｐ＝標的核酸中の多型性ヌクレオチドに相補的な第１プライマーのヌクレオチド；Ｂ＝核酸ポリメラーゼと、リポーターの伸長を遮断するために機能する３’末端へのビオチンＴＥＧＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の付加によるリポーター核酸の３’修飾；Ｑ＝５’−ジメトキシトリチルオキシ−５−［（Ｎ−４’−カルボキシ−４（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−アミノヘキシル−３−アクリルイミド］−２’−デオキシウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ｄａｂｃｙｌ ｄＴ；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の付加によってリポーター中に組み込まれるシグナルクエンチング要素（５’−５−［（Ｎ−４’−カルボキシ−４（ジメチルアミノ）−アゾベンゼン）−アミノヘキシル−３−アクリルイミド］−２’−デオキシウリジン（Ｄａｂｃｙｌ ｄＴ；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）；ＦＡＭ＝シグナル生成要素（６−カルボキシフルオレッセイン（６−ＦＡＭ）；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。下線は、鋳型に相補的でない核酸成分の部分を示す。
【００９９】
核酸成分の設計は、以下のように示される。
【０１００】
2004500850.tif 000005
【０１０１】
第１プライマーは、約６０℃のＴｍを有するように設計される。第２プライマーは、約６１℃のＴｍを有するように設計される。Ｔｍは、参照によって本明細書に取り込まれるＰｅｙｒｅｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，３４６８−７７（１９９９）を含め、種々の公知技術によって推定することができる。
ハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである。
【０１０２】
2004500850.tif 000006
【０１０３】
３’Ｇは、ＴａｑポリメラーゼのＧミスマッチを広げる傾向のため、対立遺伝子特異性プライマーの設計では避けた。
第２プライマーの第１領域、つまり３’末端は、標的核酸の第２部分、つまり下流領域に相補的だった。標的核酸上の第２プライマーの位置は、ギャップ、つまり第１及び第２プライマーの３’末端間にある標的核酸の領域を与え、０〜約５ヌクレオチドでありうる。第２プライマーの合成では、第２プライマーの第２領域内のイソ−シトシンヌクレオチド組込みは、標準的なＤＮＡ合成条件を用いて行った。
【０１０４】
実施例２
対立遺伝子特異性ＰＣＲ
蛍光に基づいたＰＣＲ反応では、以下の核酸成分を使用した。
【０１０５】
2004500850.tif 000007
【０１０６】
個々に２０μｌのＰＣＲ反応量に対するＰＣＲ反応中の成分の作用濃度（１Ｘ）は以下に示される。
【０１０７】
2004500850.tif 000008
【０１０８】
氷上で各成分を解凍し、一緒に穏やかに混合した。１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液を調製し、１００ｍＭ トリスｐＨ８．０、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌの分解したニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−３１５９）、４００ｍＭの酢酸カリウム、及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２で構成された。マスターミックス及び対立遺伝子特異性ミックスは、下記の割合で試薬を添加して調製した。
【０１０９】
2004500850.tif 000009
【０１１０】
反応の最終体積は２０μＬだった。マスターミックスと第１プライマーを合わせて１５μＬに５μＬの標的核酸を添加した。標的核酸の量は、最終利用者のニーズに応じてマスターミックスに添加する水の量を調整することで増減できる。５μＬは、多チャネルピペッターで供給するのに便利な量である、対立遺伝子特異性ミックスは、以下に示されるように調製した。
【０１１１】
2004500850.tif 000010
【０１１２】
以下のように分析プレートを調製した：１５μＬの対立遺伝子特異性ミックス（上述したような）を９６−ウェル分析プレートに等分した。（対立遺伝子特異性ミックスは、分析で使用される各特異性第１プライマーについて調製かつ実験することができる）。標的核酸試料を、対立遺伝子特異性ミックスを含有する各ウェルに体積５μＬで繰返し添加した。特定数のウェルを対照として取っておいた：各対立遺伝子特異性ミックスについてネガティブ対照（標的核酸無し）を実験すべきである。標的核酸の添加後、２０μＬの鉱油で反応を覆い、分析プレートをＤＮＡ熱サイクラーに移した。この手順の実際の時間は、多チャネルピペッターの使用により非常に短縮された。
分析プレートの熱循環パラメーターは以下に示される。
【０１１３】
2004500850.tif 000011
【０１１４】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートをＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダーに移し、プレートの上部から読み取るように装置をセットした。プレートリーダーのパラメーターは次の通りである：４８５±１０ｎｍに励起フィルター設定；５３０±１２．５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲインを５０に設定。そして、試料を読み取った。
表１は、対立遺伝子特異性プライマーを用いて得られた示度を示す。
【０１１５】
表１
2004500850.tif 000012
　　ＲＦＵ＝相対蛍光単位
【０１１６】
実施例３
ＳＮＰ検出における“Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ”増幅と標準ＰＣＲとの比較
この実施例は、標的レベルの大きさを３桁にわたって変えることにり、“Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ”増幅と伝統的なＰＣＲ循環パラメーターとの間の対立遺伝子の区別の相対的なレベルを示す。Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ増幅は、プライマーの変性及びアニーリング温度間の循環を含み、これら温度は非常に短時間で停止する。
【０１１７】
以下の核酸成分を用いた。
【０１１８】
2004500850.tif 000013
【０１１９】
鋳型核酸濃度は、アトモル範囲にあった。個々の２０μＬのＰＣＲ反応量に対するＰＣＲ反応における成分の作用濃度（１Ｘ）は、以下に示される。
【０１２０】
2004500850.tif 000014
【０１２１】
ＰＣＲ反応は、実施例２で述べたのと同一手順で調製した。
“ｆａｓｔ ｓｈｏｔ”ＰＣＲでは、以下のＰＣＲパラメーターを用いた。
【０１２２】
2004500850.tif 000015
【０１２３】
伝統的なＰＣＲでは、以下のＰＣＲパラメーターを用いた。
【０１２４】
2004500850.tif 000016
【０１２５】
ＡｍｐｌｉｔａｑＴＭＧｏｌｄは、５’→３’エキソヌクレアーゼポジティブＴａｑポリメラーゼであり、ＡｍｐｌｉｔａｑＴＭＳｔｏｆｆｅｌは、５’→３’エキソヌクレアーゼ欠乏性Ｔａｑポリメラーゼである。
表２に示されるデータは、標的核酸レベルの大きさを３桁にわたって変えることによる“Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ”増幅と伝統的なＰＣＲ循環パラメーターとの間の対立遺伝子の区別の相対的なレベルを示す。特異的反応（Ｃ−プライマー／Ｇ−標的、及びＡ−プライマー／Ｔ−標的）と、ミスマッチ反応（Ｃ−プライマー／Ｔ−標的、及びＡ−プライマー／Ｇ−標的）のバンド強度の比較により、対立遺伝子区別のレベルを決定することができる。表２は、これら実験で見られた区別のレベルを要約している。
【０１２６】
表２
2004500850.tif 000017
【０１２７】
この結果に示されるように、特定の３’ミスマッチは、核酸ポリメラーゼによって容易に拡大される。この場合、伝統的なＰＣＲパラメーターでは、ＡｍｐｌｉｔａｑＴＭＧｏｌｄを含有する５’→３’エキソヌクレアーゼ及び５’→３’エキソヌクレアーゼ欠乏性ＡｍｐｌｉｔａｑＴＭＳｔｏｆｆｅｌＤＮＡポリメラーゼの両者で、Ｃ／Ｔミスマッチが、Ａ／Ｇミスマッチよりずっと多く拡大する。“Ｆａｓｔ−ｓｈｏｔＴＭ”増幅を利用することで、どちらかの酵素を用いて両対立遺伝子間の１：１０００レベルの区別が達成される。
【０１２８】
実施例４
ＰＣＲ及びリポーターアニーリング
蛍光に基づいたＰＣＲ反応には、以下の核酸を使用した。
【０１２９】
2004500850.tif 000018
【０１３０】
２μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中の２ｆＭの合成鋳型対照、及び２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０を用いた。
次の反応の反応成分は、以下に示される。
【０１３１】
2004500850.tif 000019
　ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭ５Ｕ／μｌは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから得た。
【０１３２】
試薬を解凍し、穏やかに混合して２つのマスターミックスを調製した。一方のマスターミックス（Ａ）は、第２プライマーＡとリポーターＡを含んでいた。他方のマスターミックス（Ｂ）は、第２プライマーＢとリポーターＢを含んでいた。以下のようにマスターミックスを調製した。
【０１３３】
2004500850.tif 000020
【０１３４】
反応の最終体積は２０μｌだった。マスターミックスと第１プライマーを合わせて１５μＬに５μｌの標的核酸を添加した。標的核酸の量は、マスターミックスに添加する水の量を調整することで、最終利用者のニーズに応じて増減できる。
分析プレートは次にように調製した：１５μｌのマスターミックスを９６−ウェル分析プレートのウェルに等分した（Ｌｏｗ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＭｕｌｔｉｐｌａｔｅＴＭ９６ウェル；ＭＪ Ｒｅｓｅａｃｈ，ＭＬＬ−９６０１）。標的核酸試料を、マスターミックスを含有するウェルに体積５μｌで繰返し添加した。いくつかのウェルには、ネガティブ対照として、標的核酸ではなく５μｌの水を添加した。標的核酸又はネガティブ対照の添加後、２０μＬの鉱油Ｍｉｎｅｒａｌ Ｏｉｌ（明白色油；Ｓｉｇｍａ，Ｍ−３５１６）で反応を覆い、分析プレートをＤＮＡ熱サイクラーに移した。
【０１３５】
分析プレートの熱循環パラメーターは以下に示される。
【０１３６】
2004500850.tif 000021
【０１３７】
追加の対照として、試料のいくつかはＰＣＲ熱循環に供しなかった。
ＰＣＲ循環反応後、蛍光シグナルの放射について分析プレートを調べた。分析プレートをＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダーに移し、プレートの上部から読み取るように装置をセットした。プレートリーダーのパラメーターは次の通りである：４８５±１０ｎｍに励起フィルター設定；５３０±１２．５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲインを５０に設定。そして、試料を読み取った。対照としてＰＣＲ増幅前の蛍光シグナルの放射についても分析プレートを調べた。
引き続き試料を１０％未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で追跡し、次に臭化エチジウム染色を行い、増幅産物の存在を検出かつ分析プレートから得られた蛍光示度を確認した。
標的核酸鋳型の蛍光検出の結果は、表３に示される。増幅産物は、ＰＡＧＥ後の臭化エチジウムによっても検出された。表３では、（−）は、鋳型又は熱循環プロセスの非存在を示し、（＋）は存在を示す。表３中の数は、相対蛍光単位を示す（ＲＦＵｓ）。
【０１３８】
表３
2004500850.tif 000022
【０１３９】
表３に示されるように、いくつかの第２プライマー及びリポーターは、試料中に存在する標的核酸配列の存在の検出にうまく使用できる。マスターミックスＡ中の第２プライマー／リポーターの組合せは、マスターミックスＢ中の第２プライマー／リポーター組合せより強いシグナルを生成した。（シグナル強度のいくらかの差を斟酌し、マスターミックスＡは、マスターミックスＢよりも多くのＰＣＲ産物を含むことも分かるだろう。）シグナル強度の差は、より低温で大きいようである。しかし、マスターミックスＢ中の第２プライマーとリポーターは、すべての保持温度でバックグラウンドを超えるシグナルを生成したので、標的核酸配列の検出及び定量には十分だった。
【０１４０】
ＰＣＲ産物は、ＰＡＧＥ及び臭化エチジウムによる染色か或いはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）５９５ ＦｌｕｏｒｏｉｍａｇｅｒＴＭによるフルオレッセイン蛍光の走査によって分離した。マスターミックスＡとマスターミックスＢの両反応について、鋳型含有反応に対応するレーンでＰＡＧＥ後の臭化エチジウム染色によって増幅産物が検出された（＋）。核酸鋳型を含有しない反応に対応するレーンでは、増幅産物は見られなかった（−）。これら結果は、上記分析で検出された蛍光シグナルの増加が、試料中の標的核酸配列の存在がによることを確証した。
【０１４１】
マスターミックスＡの第２プライマー／リポーターの組合せと、マスターミックスＢの第２プライマー／リポーターの組合せとの間のシグナル強度の差は、反応時の非天然塩基、ｉｓｏＣの分解が原因のようだった。非天然塩基、ｉｓｏＣは、トリス緩衝液含有溶液のような求核物質含有溶液中では、高温で分解する傾向がある。しかし、上で提示した結果は、ｉｓｏＣがトリス緩衝液中、高温で使用するのに適することを示している。
本発明の方法の効率を最適化するため、非天然塩基、ｉｓｏＣを使用する場合は、ホットスタート活性化を必要としないポリメラーゼと、事実上非求核性である緩衝液を使用すべきである。
【０１４２】
実施例５
乾燥プレート調製
本発明の方法に必要な試薬のいくらか又はすべては、貯蔵に便利かつ使用しやすいように乾燥することができる。例えば、４０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１単位／反応のＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭポリメラーゼ、後述するような糖、及び８μＭリポーターを含有するマスターミックスとして反応を設定することができる。マスターミックスを９６ウェル微量定量プレートのウェル内に等分し、ＳＰＥＥＤＶＡＣＴＭ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）内で４５〜５０分間（加熱せず）乾燥する。乾燥後、１ ＤＥＳＰＩＡＫＴＭ（Ｔｒｏｃｋｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する真空バッグ内に置かれたＭＩＣＲＯＳＥＡＬ ＡＴＭフィルム（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でプレートを覆い、バッグをアルゴンで充填し、ＦＯＯＤ ＳＡＶＥＲＴＭ（Ｔｉｌｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で封鎖することができる。種々の糖（マンノース、ラフィノース、スクロース、及びトレハロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を種々の濃度（１質量％、２質量％、５質量％、及び１０質量％）で使用することができる。
【０１４３】
反応ミックスは、核酸標的、第１プライマー、第２プライマー、及び任意にリポーターを含有する水中で再構成することができる。そして、反応ミックスをＰＣＲに供することができる。
このように、乾燥した試薬は、容易に再構成し、かつＰＣＲでうまく使用することができる。このような凍結乾燥試薬は長期間室温で貯蔵することができる。試薬のいくつか又はすべては、乾燥することができる。本発明の所定の方法で必要な凍結乾燥試薬のいくつか又はすべては、再構成後の使用のため微量定量プレートのウェル内に貯蔵することができる。
【０１４４】
実施例６
非天然塩基のＰＣＲ組込みを含む分析
以下の実施例は、第２プライマーの標識近傍の位置におけるＤＮＡ二重鎖を横切るヌクレオチド三リン酸の部位特異性組込み（ＳＳＩ）による第２プライマー上の標識のシグナルをクエンチすることによるＰＣＲ産物の集積を監視する方法を説明する。標識化ヌクレオチド三リン酸は、ＰＣＲ伸長の際、伸長している第１プライマー中に組み込まれる。標識化ヌクレオチド三リン酸の標識は、第２プライマー上の標識をクエンチすることができる。代わりに、第２プライマーの標識（供与体染料）とリポーターの標識（受容体染料）との間に蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を観察することができる。ＰＣＲ産物の検出は、供与体染料を励起し、かつ組み込まれた受容体染料の放射を読み取ることによって観察できる。
【０１４５】
ＰＣＲ反応には、以下の核酸成分を使用した。
【０１４６】
2004500850.tif 000023
【０１４７】
“ｃ３”は、プロピルスペーサーを示し、第１プライマーの合成の際にヌクレオチドの代わりに化学的に導入された。第１プライマーの合成で用いるホスホラミダイトは、３−Ｏ−ジメチルトリチル−プロピル−１−［２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（スペーサーホスホラミダイトＣ３；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）だった。任意に、ヌクレオチド修飾を含め、同一のヌクレオチド配列を含有するが、プロピルスペーサーを欠いたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の第１プライマー用の代用物として使用することができる。
【０１４８】
これら系の設計では、標識化ヌクレオチド三リン酸が第２プライマーＡ又はＢの標識近傍の塩基に相補的であることが好ましい。標識される天然に存在するヌクレオチド塩基を使用する場合、第２プライマーＡ又はＢの標識近傍の該相補性塩基を組み込む能力は、限定された場合のみに可能である。これは、すべての４つの天然に存在するヌクレオチド塩基は、おそらく他の位置で組み込まれるからである。例えば、ｉｓｏＧ及びｉｓｏＣのような標識化非天然塩基を使用することによって、標識化非天然塩基は、相補的な非天然塩基の向かい側だけに組み込まれ、第２プライマーＡ又はＢの標識近傍に配置されるうる。
【０１４９】
標識された非天然塩基及び天然に存在するヌクレオチド三リン酸を使用する系は、試料中に存在する標的核酸（鋳型）の量を検出又は定量する分析において、クエンチャー染料（ＱＳＹ７ＴＭ）で標識された天然に存在するヌクレオチド（ｄＴＴＰ）を利用する。この実施例では、標識された天然に存在するヌクレオチドが、ＰＣＲ伸長の際、第２プライマーＡの標識（ＦＡＭ）の向かい側、かつ近傍の位置で第１プライマー中に組み込まれた。試料中に存在する標的核酸（鋳型）の量を検出又は定量するための分析において、クエンチャー染料（ＱＳＹ７ＴＭ）で標識された非天然塩基、ｉｓｏＧ（ｄＧｉｓｏＴＰ）を使用する系も実施することができる。この実施例では、標識された天然に存在するヌクレオチドが、ＰＣＲ伸長の際、ｉｓｏＣ（Ｘ）の向かい側、第２プライマーＢの標識（ＦＡＢ）の近傍の位置で、第１プライマー中に組み込まれた。ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ及びＱＳＹ７ＴＭｄＧｉｓｏＴＰの化学構造は以下に示される。
【０１５０】
【化３】
2004500850.tif 000024
【０１５１】
【化４】
2004500850.tif 000025
【０１５２】
ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲにおける部位特異的組込みによる蛍光クエンチングを示した。ＰＣＲ条件：２５μｌの反応量中、０．２μＭの第１プライマー、０．２μＭの第２プライマーＡ、０．４ｐＭの鋳型核酸、５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、１０ｍＭトリスｐＨ８、０．１％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００、０．１μｇ／μｌ分解ニシン精子ＤＮＡ、４０ｍＭ ＫＡｃ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１単位のＫｌｅｎｔａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔ／Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び０又は３．９ｕＭ ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ。
ＰＣＲ条件は、以下に示される。
【０１５３】
2004500850.tif 000026
【０１５４】
反応は、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ励起／５３０ｎｍ放射）による蛍光について、又はゲル電気泳動法によって解析した。７０℃で６秒の保持時間を使用して、正確な蛍光示度を得た。結果は、表４に示される。
ＰＣＲ反応は、ＴｙｐｏｏｎＴＭ蛍光スキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて６ＦＡＭについて走査した１０％未変性ポリアクリルアミドゲルに基づいて解明した。産物バンドに含まれ相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）は、（＋）ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ反応では１，３２５，６４４であり、（−）ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ反応では４１，４６２，９４５だった。ポリアクリルアミドゲルは、臭化エチジウム（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０μｇ／ｍｌ）で染色もした。臭化エチジウム染色からの産物バンドの定量化は、（＋）ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ反応では２１，９９３ＲＦＵ’ｓ、（−）ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ反応では２５，５３７ＲＦＵ’ｓを示した。
【０１５５】
表４は、３５サイクルのＰＣＲの前後でＰＣＲ反応ウェル内で読み取られた正味のＲＦＵ’ｓを示す。
【０１５６】
表４
2004500850.tif 000027
【０１５７】
これらの結果は、標識化ヌクレオチド三リン酸（ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ）が、ＰＣＲの際に第２プライマーのフルオレッセイン標識（ＦＡＭ）の向かい側で二重鎖中に組み込まれるとき、蛍光強度が２７倍減少することを示す。
この実施例の核酸成分を用いて、部位特異的組込み（ＳＳＩ）によるＰＣＲ産物の集積の“リアルタイム”モニタリングをも実証した。
【０１５８】
ＰＣＲ条件は以下の通りだった：１５μｌの反応量中、０．２μＭの第１プライマー、０．２μＭの第２プライマーＡ、０．３３ｐＭの鋳型、５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、１０ｍＭトリスｐＨ８、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１μｇ／μｌ分解ニシン精子ＤＮＡ、４０ｍＭ ＫＡｃ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１単位のＫｌｅｎｔａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔ／Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び０又は３ｕＭ ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ。
【０１５９】
ＰＣＲ条件：
2004500850.tif 000028
（＊Ｘ＝６，１１，１６，２１，２６，３１，又は３６）
【０１６０】
反応は、ＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）による蛍光について（４８５ｎｍ励起／５３０ｎｍ放射）、又はゲル電気泳動法によって解析した。図１４に結果を示す。
図１４は、相対蛍光対ＰＣＲサイクル数を示す。ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ含有反応もゲル電気泳動法で調べた（１０％未変性ポリアクリルアミドゲルについて５μｌ）。臭化エチジウム（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０μｇ／ｍｌ）によるゲルの染色は、予想された産物の集積を示した。ＱＳＹ７ＴＭｄＴＴＰ含有反応の蛍光は、ゲル解析で示されたＰＣＲ産物の状況及び集積と一致する。これら結果は、標的濃度に対するクエンチングに相関するＰＣＲの回数は、試料中に存在する標的の量を数量化できることをも示した。例えば、存在する標的が多いほど、クエンチングが速く起こるだろう。
【０１６１】
上述の実施例では、正確な蛍光測定のために７０℃で６秒の保持時間を用いた。このような保持時間は、プライマー間のギャップを越え、かつプライマーを越えて組み込まれる不可欠な数の塩基については必要ない。蛍光が測定されない場合、７０℃での保持時間は必要ない。蛍光示度、又は他の適切な測定値を得るために保持時間が必要な場合、保持温度は、第１プライマーが標的配列に効率的にハイブリダイズできる温度より高い温度が好ましい。一実施形態では、保持温度は、第１プライマーの融解温度より１０℃以上高い。
【０１６２】
実施例７
標識化非天然塩基の合成
本発明の方法及びキットに好適な標識化非天然塩基は種々の方法で製造することができる。標識化−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸の２種の合成スキームが提供される：方法Ａは図１５に示され、方法Ａの化合物（化合物１〜８、８ａ〜８ｄを含む）はセクションＡで述べられ；方法Ｂは図１６に示され、方法Ｂの化合物（化合物９〜１８）はセクションＢで述べられる。
【０１６３】
セクションＡ
方法Ａによる標識化−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸の合成に関与する以下の化学反応のため、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＤＥＡＥセルロース、ω−アミノブチルアガロースゲル及びトリブチルアンモニウムピロリン酸はＳｉｇｍａから購入し；ビオチン２−ニトロフェニルエステル、６−カルボキシフルオレッセイン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び６−カルボキシテトラメチルローダミン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドはＢｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入し；ＱＳＹ７ＴＭ ＮヒドロキシスクシンイミドエステルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入し；他の全化学薬品はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．又はＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入し、さらに精製せずに使用した。溶媒は、４Å分子ふるい上で乾燥した。反応は、乾燥アルゴン下、オーブン−ドライガラスシステム内で行った。“エバポレーション”は、膜ポンプによる揮発性溶媒の除去を指す。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（２３０〜４２５メッシュ）で行った。
【０１６４】
６−（６−アミノヘキシル）−アミノ−２−クロロプリン ２’−デオキシ−３’，５’−ジ−トルイルリボシド２：
ＤＭＦ（１００ｍｌ）に溶解した２，６−ジクロロ−２’−デオキシ−３’，５’−ジトルイルリボシド１（１当量， ５ｍｍｏｌ，２．７０５ｇ）を、室温で、２００ｍｌ ＤＭＦ中ヘキサメチレンジアミン（２０当量， １００ｍｍｏｌ， １１．６０ｇ）の撹拌溶液に４０分かけて添加した。溶液を５０℃で２．５時間撹拌してから室温に冷まし、濃縮して残留物を抽出した（水／酢酸エチル）。有機層を水で洗浄し（５×５０ｍｌ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒をエバポレートしてフォームとして２．６７３ｇ（４．３０８ｍｍｏｌ， ８６％）の生成物２を得た。
【０１６５】
６−（６−アミノヘキシル）−アミノ−２−クロロプリン２’−デオキシリボシド３：
上で得られた化合物２（４．３０８ｍｍｏｌ，２．６７３ｇ）を２０ｍｌメタノールに溶解し、０℃にてアンモニアで飽和させ、封管に入れた。それを８０℃で１時間加熱し、０℃に冷却した。管を開け、溶媒を膜ポンプ真空下でエバポレートした。残留物をエーテル／ヘキサンで３回処理し、得られた粉末を真空中乾燥し、さらに精製せずに次工程で使用した。
【０１６６】
６−（６−アミノヘキシル）−アミノ−２−フェノキシプリン２’−デオキシリボシド４：
上で得られた化合物３（最大４．３０８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、ベンジルアルコール（４３ｍｌ）中のＮａＨ溶液（１２当量，５１．６９ｍｍｏｌ，鉱油に６０％分散の２．０６８ｇ）を添加した。それを１００℃で２時間撹拌し、室温に冷却した。酢酸を添加（１２当量）して反応混合物を中和した。その結果の溶液をＣｅｌｉｔｅＴＭ上でろ過し、ろ液をエバポレートし、得られた残留物をさらに精製せずに次工程で使用した。
【０１６７】
６−（６−トリフルオロアセチルアミドヘキシル）−アミノ−２−フェノキシプリン２’−デオキシリボシド５：
上で得られた生成物をメタノール（３０ｍｌ）／トリフルオロ酢酸エチル（３０ｍｌ）の混合物に溶解し、室温で２４時間撹拌した。溶媒及び過剰のトリフルオロ酢酸エチルをエバポレーションで除去し、残留物をクロロホルム中１．５％メタノール、そしてクロロホルム中１７．５メタノールの一段階勾配を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：６２６ｍｇ（１．１３４ｍｍｏｌ，３段階で２６％）。
【０１６８】
６−（６−トリフルオロアセチルアミドヘキシル）−アミノ−３−フェノキシプリン２’−デオキシリボシド５’−三リン酸６：
１，２，４−トリアゾール（４．５当量，０．５８５ｍｍｏｌ，４０ｍｇ）を０．５ｍｌのアセトニトリル／４．５当量のトリエチルアミン（０．５８５ｍｍｏｌ，０．０８１ｍｌ）の混合物に溶解し、そのフラスコを氷浴内に入れた。オキシ塩化リン（１．５当量，０．１９５ｍｍｏｌ，０．０１８ｍｌ）を添加し、それを室温で３０分間撹拌した。それをろ過し、固体を最小量のアセトニトリルで洗浄し、ろ液を化合物５（１当量，０．１３ｍｍｏｌ，７２ｍｇ）に添加した。をれを３０分間室温で撹拌してからＤＭＦ（２ｍｌ）中トリブチルアンモニウムピロリン酸（８９ｍｇ）の溶液を添加し、１９時間撹拌を続けた。そして、水（１ｍｌ）を添加して残存トリアゾリド基を加水分解した。３０分間撹拌後、反応混合物を真空中３０℃で濃縮し、０．０５Ｍ〜０．５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配を用いてＤＥＡＥセルロース上のカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を０．４〜０．５Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを３０℃でエバポレートし、さらに使用した。
【０１６９】
Ｎ６−（６−アミノヘキシル）−２’−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸７：
上で得られた化合物をメタノールと共にエバポレートし、メタノール（５ｍｌ）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０質量％，１０ｍｇ）及びＨＣＯＯＮＨ４（６３ｍｇ）を添加し、還流下４５分間撹拌した。それを室温に冷却し、触媒からろ過し、かつ触媒を熱水で洗浄し、その混合ろ液を真空中で濃縮した。残留物を２８％水酸化アンモニウム水溶液（３ｍｌ）に溶解し、室温で３時間撹拌し、真空中濃縮し、０．０５Ｍ〜０．５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配を用いてＤＥＡＥセルロース上のカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を０．３〜０．４Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションをエバポレートし、さらに使用した。
【０１７０】
Ｎ６−（６−Ｔａｍｒａ−アミドヘキシル）−２’−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸８ａ：
化合物７（そのトリエチルアンモニウム塩として約１ｍｇ）を０．２ｍｌの０．１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液に溶解し、ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解した６−カルボキシテトラメチルローダミンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１０ｍｇ）を添加した。それを３５℃で３時間撹拌してからω−アミノブチルアガロースを添加して過剰のＴａｍｒａＴＭを結合させ、さらに１時間撹拌し、反応混合物をＤＥＡＥセルロースカラムに装填し、０．０５Ｍ〜０．５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配で溶離した。生成物を０．４Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを３０℃でエバポレートした。
化合物８ｂ及び８ｄは、６−カルボキシテトラメチルローダミンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの代わりに、それぞれ、６−カルボキシフルオレッセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＱＳＹ７ＴＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、化合物８ａと同様に調製される。
【０１７１】
Ｎ６−（６−ビオチニルアミドヘキシル）−２’−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸８ｃ：
化合物７（そのトリエチルアンモニウム塩として約１ｍｇ）を０．２ｍｌの水に溶解し、ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解したビオチン２−ニトロフェニルエステル（１０ｍｇ）を添加した。溶液は明黄色に変わった。それを３５℃で１時間撹拌し、ω−アミノブチルアガロースを添加して過剰のビオチンを結合させ、さらに１時間撹拌し、反応混合物をＤＥＡＥセルロースカラムに装填し、０．０５Ｍ〜０．５Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液の勾配で溶離した。生成物を０．４Ｍの緩衝液濃度で溶離した。生成物含有フラクションを３０℃でエバポレートした。
【０１７２】
セクションＢ
方法Ａによる標識化−デオキシイソグアノシン５’−三リン酸の合成に関与する以下の化学反応のため、トリブチルアンモニウムピロリン酸はＳｉｇｍａから購入し；ビオチンＮヒドロキシスクシンイミドエステルはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し；ＱＳＹ７ＴＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＤａｂｃｙｌ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入し；他の全化学薬品はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．又はＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入し、さらに精製せずに使用した。溶媒は、４Å分子ふるい上で乾燥した。反応は、乾燥アルゴン下、オーブン−ドライガラス製品内で行った。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（２３０〜４２５メッシュ）で行った。
以下の略語を使用した：Ａｃ２Ｏ（無水酢酸）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＡＰ（４，４’−ジメチルアミノピリジン）；ＤＭＴ（４，４’−ジメトキシトリチル）；Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）；ＭｅＣＮ（アセトニトリル）；ＭｅＯＨ（メチルアルコール）；Ｔｏｌ（ｐ−トルイル）。
【０１７３】
１−（ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチル）−ヘキサメチレンジアミン（９）
ヘキサメチレンジアミン（１０当量，３７５ｍｍｏｌ，４３．５ｇ）を２回ピリジンから共エバポレートし、１００ｍｌのピリジンに溶解した。ＤＭＡＰ（０．１当量，３．７５ｍｍｏｌ，４５７ｍｇ）を添加し、反応フラスコを氷浴内に置いた。１００ｍｌピリジンに溶解したＤＭＴ−クロライド（１当量，３７．５ｍｍｏｌ，１２．６９ｇ）を２時間かけて滴下添加した。それを室温で４時間撹拌し、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）を添加し、反応混合物を濃縮し、残存残留物を水性ＮａＨＣＯ３／酢酸エチルで抽出した。有機層を２回ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥し、溶媒をエバポレートした。得られた生成物をさらに精製せずに次工程で使用した。
収量：１４．８９５ｇ（６５．６３４ｍｍｏｌ，９５％）粘着性油。
【０１７４】
２−クロロ−６−（６−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルアミノヘキシル）−アミノプリン−２’−デオキシ−３’，５’−ジトルイルリボシド（１０）
化合物９（１．３当量，３１．９１６ｍｍｏｌ，１３．３４ｇ）をＤＭＦと共に共エバポレートし、１００ｍｌのＤＭＦに溶解した。１００ｍｌのＤＭＦに溶解したジイソプロピルエチルアミン（３．９当量，９５．７４８ｍｍｏｌ，１６．６５ｍｌ）及び化合物１（１当量，２４．５５１ｍｍｏｌ，１３．２８２ｇ）を添加し、室温で３時間撹拌した。それを濃縮し、残留物を水性ＮａＨＣＯ３／酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートした。残留物をエーテルと共に２回こね、固体生成物を得、さらに真空中で乾燥後さらに精製せずに使用した。
【０１７５】
２−ベンジルオキシ−６−（６−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルアミノヘキシル）−アミノプリン−２’−デオキシリボシド（１１）
化合物１０（１当量，１９．２３ｍｍｏｌ，１７．７４ｇ）をＤＭＦ（２５ｍｌ）に溶解し、ベンジルアルコール（１２８ｍＬ）中のＮａＨ（１０当量，１９２．３ｍｍｏｌ， 鉱油中に分散の７．６９ｇ）溶液に添加した。反応混合物を加熱してから（１２０℃，６時間）室温で（１５時間）撹拌後、ＣｅｌｉｔｅＴＭ上でろ過し、ろ液をエバポレートし、残留物を抽出し（酢酸エチル／水）、有機層を洗浄（ＮａＨＣＯ３−溶液）、乾燥し、溶媒を除去し、残留物をエーテル／ヘキサン１：１０と共に５回こねた。ＴＬＣ：ＣＨＣｌ３／１０％ＭｅＯＨ ＲＦ＝０．２６。
収量：１０．２８０ｇ（１３．５６２ｍｍｏｌ，２段階で７０．５％）フォーム。
【０１７６】
２−ベンジルオキシ−６−（６−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルアミノヘキシル）−アミノプリン−２’−デオキシ−５’−Ｏ−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルリボシド（１２）
化合物１１（１４．７３８８ｍｍｏｌ，１１．１７２ｇ）をピリミジンで共エバポレートし、１５０ｍｌのピリジンに溶解し、ＤＭＡＰ（０．２５当量，３．６８４７ｍｍｏｌ，４５０ｍｇ）を添加した。フラスコを氷浴内に置き、ＤＭＴＣ１（１．５当量，２２．１０８ｍｍｏｌ，７．８４８ｇ）を２時間かけてゆっくり添加した。それを室温で２２時間撹拌してからＭｅＯＨ（１ｍｌ）を添加し、反応混合物を濃縮し、残留物を抽出した（クロロホルム／水性ＮａＨＣＯ３）。有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートし、残留物をエーテル／ヘキサン１：１と共ににこねて過剰のＤＭＴを除去し、不溶性の固体生成物を乾燥し、精製せずにさらに使用した。
収量：１４．８９０ｇ（１４．０４７ｍｍｏｌ，９５％）明褐色フォーム。
【０１７７】
２−ベンジルオキシ−６−（６−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルアミノヘキシル）−アミノプリン−３’−Ｏ−アセチル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−ｐ，ｐ’−ジメトキシトリチルリボシド（１３）
化合物１２（１４．０４７ｍｍｏｌ，１４．８９ｇ）をピリミジンで共エバポレートし、２００ｍｌのピリジンに溶解し、ＤＭＡＰ（０．２５当量，３．５１１７ｍｍｏｌ，４２８ｍｇ）、ＥＴ３Ｎ（５当量，７０．２３５ｍｍｏｌ，９．７ｍｌ）及びＡｃ２Ｏ（２．５当量，３５．１１７５ｍｍｏｌ，３．５８２ｇ）を添加した。それを室温で４．５時間撹拌してからＭｅＯＨ（２ｍｌ）を添加し、反応混合物を濃縮し、残留物を抽出した（酢酸エチル／水性ＮａＨＣＯ３）。有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートし、残留物を、酢酸エチル／ヘキサン／ＥＴ３Ｎ ３０：６０：１、それから６５：３５：３の一段階勾配を用いてカラムクロマトグラフィーで精製した。収量：５．９３ｇ（５．３８５ｍｍｏｌ，３８％）黄色フォーム。
【０１７８】
２−ベンジルオキシ−６−（６−アミノヘキシル）−アミノプリン−３’−Ｏ−アセチル−２’−デオキシリボシド（１４）
化合物１４（２．４７１ｍｍｏｌ，２．７２３ｇ）を５０ｍｌのアセトニトリル／２ｍｌの水に溶解し、Ｃｅ（ＣＨ４）２（ＮＯ３）３（０．３当量，０．７４ｍｍｏｌ，４０６ｍｇ）を添加した。それを４５分間還流し、さらに０．１５当量のＣｅ（ＣＨ４）２（ＮＯ３）３（０．３７ｍｍｏｌ，２０５ｍｇ）を添加し、１時間還流を続けた。それをエバポレートし、残留物をエーテルと共にこねてＤＭＴを除去し、不溶性生成物を乾燥し、さらに精製せずにさらに使用した。
【０１７９】
２−ベンジルオキシ−６−（６−トリフルオロアセトアミドヘキシル）−アミノプリン−３’−Ｏ−アセチル−２’−デオキシリボシド（１５）
上で得られた化合物１４（最大５．３８５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＭｅＯＨ／５０ｍｌのトリフルオロ酢酸エチル／５ｍｌのＥｔ２Ｎに溶解し、反応混合物を室温で２１．５時間撹拌した。ＴＬＣ（クロロホルム／１７．５％ＭｅＯＨ）：ＲＦ＝０．７２）は完全な転換を示した。それをエバポレートし、残留物を抽出し（食塩水／酢酸エチル）、有機層を乾燥し、溶媒をエバポレートして残留物をクロロホルム／１．５％ＭｅＯＨ、それから１７．５％ＭｅＯＨの一段階勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：２．８０ｇ（４．７１４ｍｍｏｌ，８７％）フォーム。
【０１８０】
２−ベンジルオキシ−６−（６−トリフルオロアセトアミドヘキシル）−アミノプリン−３’−Ｏ−アセチル−５’−トリホスホリル−２’−デオキシリボシド（１６）
イミダゾール（６１当量，３０６ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ，再結晶）をアセトニトリル（３．６ｍＬ）に溶解し、冷却した（０℃）。ＰＯＣｌ３（１９当量，０．１２８ｍＬ）及びトリエチルアミン（６１当量，０．６３３ｍＬ）を添加し、混合物を撹拌後（０℃，０．５時間）一部（０．３０９ｍＬ）を化合物１５（１当量，０．０７４ｍｍｏｌ，４４ｍｇ）に添加した。この混合物を撹拌後（室温，０．５時間）、トリブチルアンモニウムピロリン酸（２当量，０．１６ｍｍｏｌ，７３ｍｇ）を含有するＤＭＦ（１．５ｍＬ）を添加した。２４時間後に反応をクエンチし（２ｍＬ，１０％ＮＨ４ＣＯＯ）、凍結乾燥した。生成物を２０％ＭｅＣＮ及び（ＮＨ４）２ＣＯ３／２０％ＭｅＣＮの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃＴＭＳＡＸ−１０；Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって精製した。集めた生成物を繰返し凍結乾燥し、過剰の塩を除去した。収量０．００７ｍｍｏｌ（１０％）、白色固体。
【０１８１】
６−（６−アミノヘキシル）−アミノプリン−５’−トリホスホリル−２’−デオキシリボシド（７）
化合物１６（０．００７ｍｍｏｌ）をメタノール（２．５ｍＬ）に溶解後、Ｐｄ／Ｃ（１０％，５ｍｇ）及びＮＨ４ＣＯＯ（０．０５ｍｍｏｌ，３１ｍｇ）を添加した。懸濁液を還流後（１時間）触媒をろ過して除き、溶媒をエバポレートした。残留物を２８％水酸化アンモニウムで処理後（１．５ｍＬ，３時間，室温）反応生成物を乾燥し、２０％ＭｅＣＮ及び（ＮＨ４）２ＣＯ３／２０％ＭｅＣＮの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃＴＭＳＡＸ−１０；Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって精製した。集めた生成物を繰返し凍結乾燥し、過剰の塩を除去した。収量０．００６３ｍｍｏｌ（９０％）、白色固体。
【０１８２】
６−（６−ビオチニルアミドヘキシル）−アミノプリン−５’−トリホスホリル−２’−デオキシリボシド（８ｃ）、６−（６−ｄａｂｃｙｌアミドヘキシル）−アミノプリン−５’−トリホスホリル−２’−デオキシリボシド（１７ａ）、６−（６−ＱＳＹ７ＴＭアミドヘキシル）−アミノプリン−５’−トリホスホリル−２’−デオキシリボシド（１７ｂ）
Ｈ２Ｏ中（４０μＬ）化合物７（０．８８μｍｏｌ，トリエチルアンモニウム塩）に、ホウ酸ナトリウム（１０．５μＬ，１Ｍ，ｐＨ８．５）を添加し、次いでビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｄａｂｃｙｌ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はＱＳＹ７ＴＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２．６μｍｏｌ，３当量）を含有するＤＭＦ（２１６ｍＬ）を添加した。反応を進行後（３時間，５５℃）、それを２０％ＭｅＣＮで希釈し、生成物を、２０％ＭｅＣＮ及び（ＮＨ４）２ＣＯ３／２０％ＭｅＣＮの勾配を用いてアニオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃＴＭＳＡＸ−１０；Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって精製した。収率５０〜８０％。
【０１８３】
実施例８
蛍光−クエンチング非標準デオキシ−ヌクレオチド三リン酸の部位特異的組込みの“リアルタイム”モニタリング。
ＰＣＲ反応の循環の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ＰＣＲ反応は、第１及び第２プライマーを含み、第２プライマーは、その５’末端に発蛍光団結合ヌクレオチド（ＦＡＭ−ｄＴ）を含む。鋳型核酸の増幅の際、蛍光クエンチング化合物（Ｄａｂｃｙ又はＱＳＹ７ＴＭ）に結合している標準のヌクレオシド三リン酸（反応Ａ；ｄＴＴＰ）又はｉｓｏＧヌクレオシド三リン酸（反応Ｂ；ｄＧｉｓｏＴＰ）が、第２プライマーの発蛍光団−結合ヌクレオシドに（ＦＡＭ−ｄＴ）［向かい側かつ隣接して］組み込まれ、ＰＣＲ反応における蛍光シグナルが減少する。
【０１８４】
この実施例では、以下の核酸をＰＣＲ反応に使用した。
【０１８５】
2004500850.tif 000029
【０１８６】
“ｃ３”は、プロピルスペーサーを示し、第１プライマーの合成時にヌクレオチドの代わりに化学的に導入された。第１プライマーの合成で用いたホスホラミダイトは、３−Ｏ−ジメチルトリチル−プロピル−１−［２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトだった（スペーサーホスホラミダイトＣ３；Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。任意に、ヌクレオチド修飾を含め、同一のヌクレオチド配列を含有するが、プロピルスペーサーを欠いているオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の第１プライマーの代用物として使用できる。
【０１８７】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０１８８】
2004500850.tif 000030
上記成分を調製した。
【０１８９】
第２プライマーＡ、第２プライマーＢ、ｄＴＴＰ、ＤａｂｃｙｌｄＴＴＰ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、ＤａｂｃｙｌＧｉｓｏＴＰ及びＱＳＹ７ＴＭｄＧｉｓｏＴＰは、以下のＰＣＲ反応で可変成分だった。これら成分を、以下に示されるように、ＰＣＲ反応Ａ〜Ｊに下記濃度で添加した。
【０１９０】
2004500850.tif 000031
【０１９１】
反応は、最終体積２５μＬに調製した。反応混合物を２５μＬのＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ管（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）に充填した。ＰＣＲ管を微小遠心分離機内で６秒間回転させ、反応チャンバー内に液体を引いた。ＰＣＲ反応を含む管をＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）内に置き、全ＰＣＲ反応の間、蛍光を絶え間なく監視した。
【０１９２】
熱循環パラメーター：
2004500850.tif 000032
＊２〜４１循環の３工程時に、Ｓｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭのオプティクスを活性化し、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０１９３】
４１サイクルのＰＣＲ増幅後、蛍光モニタリングオプティクスにて毎秒０．２℃の割合でＰＣＲ管内の温度を６０℃から９５℃に上昇させることによって、ＰＣＲ反応産物を融解曲線解析に供した。
ＰＣＲ反応Ａ、Ｂ、及びＣからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングが図１７Ａに示され、これらＰＣＲ産物の融解曲線解析が図１７Ａに示される。これら結果は、それぞれ、発蛍光団−結合標準ヌクレオシド含有第２プライマー又は非標準ヌクレオシド含有第２プライマーと組み合わせてクエンチング化合物−結合標準ヌクレオシド三リン酸又はクエンチング化合物−結合ｉｓｏＧヌクレオシド三リン酸を含む試料内でＰＣＲ反応の蛍光がクエンチされることを示している。融解曲線データは、発蛍光団−結合核酸鎖をクエンチング化合物−結合核鎖から分離することで反応産物内の蛍光が復元されることを示している。
ＰＣＲ反応Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングは、図１８Ａに示される。ＰＣＲ反応Ｈ、Ｉ、及びＪからのＰＣＲ反応産物の蛍光クエンチングは、図１８Ｂに示される。
【０１９４】
実施例９
ゲノムＤＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びゲノムＤＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅時に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ＰＣＲ反応は、第１プライマーと、２個の非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−Ｇ及びｉｓｏ−Ｃ）を含有する第２プライマーとを含み；プライマーはハイブリダイズしてマウスゲノムＤＮＡの領域を増幅するように設計した。ＰＣＲ反応は、非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−Ｇ）を含有するリポーター核酸、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチド（Ｄａｂｃｙｌ ｄＴ）、及び該リポーターの５’塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）をも含んでいた。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含有するリポーター核酸からの核酸ポリメラーゼ活性による発蛍光団の切断をもたらしうる。
【０１９５】
この実施例では、以下の核酸をＰＣＲ反応で使用した。
【０１９６】
2004500850.tif 000033
【０１９７】
マウスゲノムＤＮＡは、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得、１ｍＭ ＭＯＰＳｐＨ７．５、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ中に希釈した。鋳型Ａでは、マウス株Ａ／ＪゲノムＤＮＡを連続的に濃度５ｎｇ／μｌ、２．５ｎｇ／μｌ、１．２５ｎｇ／μｌ、０．６３ｎｇ／μｌ、０．３１ｎｇ／μｌ、及び０．１６ｎｇ／μｌに希釈した。鋳型Ｂでは、マウス株Ｃ５７ＢＬ／６ＪゲノムＤＮＡを連続的に濃度２０ｎｇ／μｌ、２ｎｇ／μｌ、０．２ｎｇ／μｌ、２０ｐｇ／μｌ、２ｐｇ／μｌ、及び０．２ｐｇ／μｌに希釈した。ゲノムＤＮＡ希釈シリーズを５分間煮沸し、氷上に５分間置き、−２０℃で貯蔵した。
【０１９８】
マウスゲノム中の特定の標的核酸配列のＰＣＲ増幅及び検出用にプライマーを合成した。最初の標的核酸配列は、Ａ／ＪマウスゲノムＤＮＡ、座Ｌ１１３１６、染色体３−９．６７９Ｐ（設計Ａ）を用いてこの手順の実行可能性を評価するために選択した。さらなるゲノムＤＮＡ定量化のために選択した標的配列は、マウス株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、座Ｒ７５３７８、染色体１０−４１．５Ｆ（設計Ｂ）だった。第１プライマーＡ及び第１プライマーＢは、６０．０〜６３．０℃のＴｍを有するように設計される。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、６１．０〜６３．０℃のＴｍを有するように設計される。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＯｌｉｇｏ ４．０ＴＭソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、全プライマーを二次構造形成について評価した。
【０１９９】
この実施例の全ＰＣＲ反応には、以下の成分（基本ＰＣＲ成分）が指示濃度で存在した。
【０２００】
2004500850.tif 000034
【０２０１】
上記成分を含有する（第１プライマーＡ及び第２プライマーＡと共に）マスターミックスＡは、２５μＬの最終反応量に対して１．０４Ｘ濃度で調製した。
上記成分を含有する（第１プライマーＢ及び第２プライマーＢと共に）マスターミックスＢは、２５μＬの最終反応量に対して１．２５Ｘ濃度で調製した。
設計Ａ反応混合物は、５ｎｇ／μＬ、２．５ｎｇ／μＬ、１．２５ｎｇ／μＬ、０．６３ｎｇ／μＬ、０．３１ｎｇ／μＬ、及び０．１６ｎｇ／μＬの各Ａ／Ｊゲノム標的ＤＮＡ希釈１μＬを、２４μＬのＰＣＲ Ａマスターミックスを含有する２５μＬのＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭＰＣＲ管に添加することによって作製した。管を微小遠心分離機内で６秒間回転させ、液体を反応チャンバー内に引いた。個々のＰＣＲ管は、それぞれ核酸標的数１５００、７５０、３７５、１８８、９４、及び４７ハプロイド当量に相当する５ｎｇ、２．５ｎｇ、１．２５ｎｇ、６３０ｐｇ、３０ｐｇ、及び１６０ｐｇのＡ／Ｊゲノム標的ＤＮＡを含んでいた。
【０２０２】
設計Ｂ反応混合物は、２０ｎｇ／μＬ、２ｎｇ／μＬ、０．２ｎｇ／μＬ、２０ｐｇ／μＬ、及び２ｐｇ／μＬの各Ｃ５７ＢＬ／６Ｊゲノム標的ＤＮＡ希釈５μＬを、２０μＬのＰＣＲマスターミックスＢを含有する熱循環プレートウェル又は各リアルタイム熱サイクラー特有の管に添加することによって作製した。個々のＰＣＲ管又はウェルは、それぞれ核酸標的数３０，０００標的、３，０００標的、３００標的、３０標的、及び３標的に相当する１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、及び１０ｐｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊゲノム標的ＤＮＡを含んでいた。反応を微量定量プレート内で行うときは、試料量の蒸発を防ぐため熱循環の前に１５μＬの鉱油オーバレイを各ウェルに添加した。
【０２０３】
設計Ａ反応混合物をＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ内に置き、次の条件下で循環させた。
【０２０４】
2004500850.tif 000035
＊サイクル＃１７〜５１の２工程時に、動的プロットを生成するため、リアルタイムＰＣＲ熱サイクラーのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
これら反応の蛍光示度は、図１９に示される。
【０２０５】
設計Ｂ反応混合物を、下記のリアルタイムＰＣＲ熱サイクラー内に個々別々に置き：
１）Ｓｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ２５μＬ管（Ｃｅｐｈｅｉｄ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いるＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｃｅｐｈｅｉｄ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）
２）Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ管（Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いるＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
３）９６−ウェル微量定量プレート（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いるｉＣｙｃｌｅｒＴＭ（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）
４）ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ光学９６−ウェル反応プレートウェル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
かつ以下の条件下で循環させた。
【０２０６】
2004500850.tif 000036
＊２〜４１循環の３工程時に、Ｓｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭのオプティクスを活性化し、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０２０７】
閾値サイクル（Ｃｔ）及び分散の相関関係（Ｃｖ）法によって、蛍光の読取り情報を解析した。閾値サイクルは、システムが、対数−線形期の際にＰＣＲ産物の指数関数的成長に伴うシグナルの増加を検出し始める時である。対数−線形期の傾斜は増幅効率の反映であり、真正な増幅は該傾斜の屈折点、すなわち対数−線形期が始まる時の成長曲線上の点で示される。この点は、成長曲線に沿った変化の最大割合をも表す。核酸定量化はＣｔに関連し、核酸の初期量が多いほどＣｔ値は低い。Ｃｔは、どのベースライン活性より上、かつ指数関数的増加期以内に置かれるべきである。
【０２０８】
実施例１０
ＲＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びＲＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ヒトβ−アクチンｍＲＮＡの検出及び定量化のためにＤＮＡプライマーを合成した。ｃＤＮＡ／第１プライマーがヒトβ−アクチンｍＲＮＡの５’領域上の配列にハイブリダイズし、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を開始する。ｃＤＮＡ／第１プライマーと、２個の非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−Ｃ及びｉｓｏ−Ｇ）を含む第２プライマーとを、鋳型としてｃＤＮＡを用いるヒトβ−アクチン配列の増幅に用いた。ＰＣＲ反応はリポーター核酸をも含み、これは非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−Ｇ）、蛍光クエンチング化合物−結合ヌクレオチド（Ｄａｂｃｙｌ ｄＴ）、及び該リポーターの５’塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）を含有する。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物にリポーター核酸をアニーリングすると、核酸ポリメラーゼ活性による蛍光クエンチング化合物に結合したリポーター核酸からの発蛍光団の切断が起こる。
【０２０９】
この実施例の逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応に以下の核酸を使用した。
【０２１０】
2004500850.tif 000037
【０２１１】
単一ドナー由来の全ヒト心臓ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得た。ＲＮＡ試料は、５ｍＭビス−トリス−プロパンｐＨ８．９、０．１ｍＭ ＥＴＤＡ、１００ｎｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１００ｎｇ／ｍｌの剪断されたニシン精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で構成される緩衝液に２０ｎｇ／μｌ、２ｎｇ／μｌ、２００ｐｇ／μｌ、２０ｐｇ／μｌ、２ｐｇ／μｌ及び０．２ ｐｇ／μｌに希釈した。
【０２１２】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０２１３】
2004500850.tif 000038
【０２１４】
表Ｘに示される試薬を含有するＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、２５μＬの最終反応量のためにヌクレアーゼの無いＨ２Ｏを用いて１．２５Ｘ濃度で調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、２０μＬの１．２５Ｘ ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを２５μＬのＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭＰＣＲ管にそれぞれ希釈したＲＮＡ試料５μＬに添加することによって調製した。そして、管を微小遠心分離機内で６秒間回転させて反応チャンバー内に液体を引いた。
【０２１５】
遠心分離後、すぐに反応混合物をＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭに入れ、下記の条件下で循環させた。
【０２１６】
2004500850.tif 000039
＊サイクル＃３〜５２の２工程時に、動的プロットを生成するため、リアルタイムＰＣＲ熱サイクラーのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。結果は、図２０に示される。
【０２１７】
実施例１１
標識化非標準塩基の部位特異的組込みによるＲＮＡのリアルタイム定量化
ＰＣＲ反応の循環及びＲＮＡ試料からの核酸鋳型の増幅の際に、ＰＣＲ反応の蛍光のモニタリングを行った。ヒトβ−アクチンｍＲＮＡの検出及び定量化のためにＤＮＡプライマーを合成した。ｃＤＮＡ／第１プライマーがヒトβ−アクチンｍＲＮＡの５’領域上の配列にハイブリダイズし、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成を開始する。ｃＤＮＡ／第１プライマーと、リポーターの５’塩基（Ｔ）に結合した発蛍光団（６ＦＡＭ）及び５’の最後から２番目の非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−ｄＣ）を含有する第２プライマーとを、鋳型としてｃＤＮＡを用いるヒトβ−アクチン配列の増幅に用いた。鋳型核酸の増幅時、発蛍光団クエンチング化合物−結合非標準ヌクレオシド三リン酸（Ｄａｂｃｙｌ−ｄ−ｉｓｏＧＴＰ）がＰＣＲ反応に存在し、発蛍光団−結合５’−ヌクレオチド（ＦＡＭ−ｄＴ）に隣接し、かつＰＣＲ反応の蛍光シグナルを減少させる第２プライマーの非標準ヌクレオチド（ｉｓｏ−ｄＣ）の向かい側に組み込まれた。
【０２１８】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
【０２１９】
2004500850.tif 000040
【０２２０】
単一ドナー由来の全ヒト心臓ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得た。ＲＮＡ試料は、５ｍＭビス−トリス−プロパンｐＨ８．９、０．１ｍＭ ＥＴＤＡ、１００ｎｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１００ｎｇ／ｍＬの剪断されたニシン精子ＤＮＡで構成される緩衝液中、２０ｎｇ／μＬ、２ｎｇ／μＬ、２００ｐｇ／μＬ、２０ｐｇ／μＬ、２ｐｇ／μＬ及び０．２ｐｇ／μＬに希釈した。
【０２２１】
全ＰＣＲ反応で、以下の成分（基本ＰＣＲ反応成分）が指示濃度で存在した。
【０２２２】
2004500850.tif 000041
【０２２３】
ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、２５μＬの最終反応量のためにヌクレアーゼの無いＨ２Ｏを用いて１．２５Ｘ濃度で調製した。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合物は、２０μＬの１．２５Ｘ ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、２５μＬのＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ２５μＬ管（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にそれぞれ希釈したＲＮＡ試料５μＬに添加することによって調製した。そして、管を微小遠心分離機内で６秒間回転させて反応チャンバー内に液体を引いた。
【０２２４】
遠心分離後、すぐに反応混合物をＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）内に入れ、下記の条件下で循環させた。
【０２２５】
2004500850.tif 000042
＊サイクル＃２３〜５２の３工程時に、図２１に示されるような動的プロットを生成するため、Ｓｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭのオプティクスを活性化してＦＡＭ−生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。
【０２２６】
実施例１２
多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ
多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行い、種々のマウス株由来の単一ヌクレオチド多型性マウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６の配列を決定した。この実施例では、多重ＰＣＲ反応は、標的核酸上の下流の非多型性配列にハイブリダイズする共通の第１プライマーと、２つの上流第２プライマー、すなわち第２プライマーＡ及び第２プライマーＢとを含み、各第２プライマーは対立遺伝子特異的であり、特異性は、異なる３’ヌクレオチドによって決まる。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、標的核酸ハイブリダイゼーションには寄与しないが、それぞれリポーターＡ及びリポーターＢのハイブリダイゼーションを許容する、異なる５’領域をも有していた。リポーター核酸は、それぞれ５’の最後の２番目の非標準ヌクレオチド及び発蛍光団クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含み、かつそれぞれ５’ヌクレオチドに結合した異なる発蛍光団（ＦＡＭ又はＨＥＸ）を有する５’ヌクレオチドを含んでいた。異なる発蛍光団は、励起により異なる波長の光を放射した。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、核酸ポリメラーゼ活性によるクエンチング化合物−結合リポーター核酸からの発蛍光団（単数又は複数）の切断を引き起こしうる。対立遺伝子特異性核酸標的の優勢の結果、切断されたリポーターからの発蛍光団の特有の蛍光放射となる。
【０２２７】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
【０２２８】
2004500850.tif 000043
2004500850.tif 000044
±＝近交系。＊＊＝Ｆ１ハイブリッド系。
マウスｇＤＮＡ試料は、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。すべてのｇＤＮＡ試料は、１ｍＭ ＭＯＰＳｐＨ７．５、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ中、２ｎｇ／μＬに希釈した。
【０２２９】
2004500850.tif 000045
【０２３０】
上記成分を含有するマスターミックスは、１０μＬの最終反応量のために２Ｘ濃度で調製した。５μＬのマスターミックスを分析プレートの個々のウェルに等分し、個々のウェルに５μＬの標的ＤＮＡｓ（１０ｎｇ）を添加した。ポジティブ対照（完全適合鋳型）及びネガティブ対照（不適合鋳型又は鋳型無し）用にＰＣＲ反応を調製した。鋳型核酸の添加後、各ウェルを１５μＬの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。ＰＣＲ反応を行う前に、分析プレートを蛍光シグナルの強度について走査し、５３０及び５８０ｎｍにベースライン蛍光を設置した。
【０２３１】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２３２】
2004500850.tif 000046
【０２３３】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートを、プレートの上部から読むように設定された装置を有するＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。プレートリーダーのパラメーターは以下の通り：（６ＦＡＭ蛍光検出）４８５±１０ｎｍに励起フィルター設定；５３０±１２．５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン５０に設定、（ＨＥＸ蛍光検出）５３０±１２．５ｎｍに励起フィルター設定；５８０±２５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン５０に設定。
【０２３４】
実施例１３
因子Ｖ遺伝子型の多重ＰＣＲ解析
多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行い、ヒトゲノムＤＮＡの因子Ｖ遺伝子における対立遺伝子特異的ヌクレオチド変異を決定した。この実施例で用いた手順は、実施例１２で用いた手順と同様である。
【０２３５】
2004500850.tif 000047
【０２３６】
合成因子Ｖ標的は、自動ＤＮＡ解析によって調製した。因子Ｖ標的を含むヒトゲノムＤＮＡは、Ｃｏｒｎｅｌｌ／ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞貯蔵所（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から得た。全ｇＤＮＡ試料は、１ｍＭ ＭＯＰＳｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ内せ１又は５ｎｇ／μＬに希釈し、５分間煮沸してからＰＣＲ前に氷上に置いた。合成標的は、連続的に、１ｍＭトリスｐＨ８．０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）及び０．１μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、１又は１０ｆＭに希釈した。
【０２３７】
2004500850.tif 000048
【０２３８】
上記成分を含有するマスターミックスは、１０μＬの最終反応量のために２Ｘ濃度で調製した。５μＬのマスターミックスを分析プレート（Ｌｏｗ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＭｕｌｔｉｐｌａｔｅＴＭ，９６ウェル；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の個々のウェルに等分し、個々のウェルに５μＬの標的ＤＮＡｓを添加した。５又は５０ｚｍｏｌ（約３０００又は３０，０００分子）の突然変異、野生型、又は異型接合的合成標的をウェルに添加した。５又は２５ｎｇの異型接合的、又は野生型ヒトゲノムＤＮＡをウェルに添加した。対照として標的ＤＮＡを含有しないウェルを用いた。鋳型核酸の添加後、各ウェルを１５μＬの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。ＰＣＲ反応を行う前に、分析プレートを蛍光シグナルの強度について走査し、５３０ｎｍ及び５８０ｎｍにベースライン蛍光を設置した。
【０２３９】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２４０】
2004500850.tif 000049
【０２４１】
ＰＣＲ循環反応後、分析プレートを蛍光シグナルの放射について調べた。分析プレートを、プレートの上部から読むように設定された装置を有するＣｙｔｏｆｌｕｏｒＴＭ４０００蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。プレートリーダーのパラメーターは以下の通り：（６ＦＡＭ蛍光検出）４８５±１０ｎｍに励起フィルター設定；５３０±１２．５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン５０に設定、（ＨＥＸ蛍光検出）５３０±１２．５ｎｍに励起フィルター設定；５８０±２５ｎｍに放射フィルター設定、かつＰＭＴゲイン５０に設定。行われる各多重ＰＣＲ反応について、それぞれＹ及びＸ軸に示されるＨＥＸ及びＦＡＭ蛍光の相対蛍光単位（ＲＦＵｓ）が合わせて図２２に示される。
【０２４２】
実施例１４
エキソヌクレアーゼ欠乏性核酸ポリメラーゼ及び切断剤としてＦｌａｐエンドヌクレアーゼを用いる多重リアルタイム対立遺伝子特異的ＰＣＲ
種々のマウス株由来のゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６内の単一ヌクレオチド多型の配列に対し、多重蛍光に基づいたＰＣＲ反応を行った。この実施例では、多重ＰＣＲ反応は、標的核酸上の下流の非多型性配列にハイブリダイズする共通の第１プライマーと、２つの上流第２プライマー、すなわち第２プライマーＡ及び第２プライマーＢとを含み、各第２プライマーは対立遺伝子特異的であり、特異性は、異なる３’ヌクレオチドによって決まる。第２プライマーＡ及び第２プライマーＢは、標的核酸ハイブリダイゼーションには寄与しないが、それぞれリポーターＡ及びリポーターＢのハイブリダイゼーションを許容する、異なる５’領域をも有していた。リポーター核酸は、それぞれ５’の最後の２番目の非標準ヌクレオチド及び発蛍光団クエンチング化合物−結合ヌクレオチドを含むが、５’ヌクレオチドに結合した異なる発蛍光団（ＦＡＭ又はＨＥＸ）を有する５’ヌクレオチドを含んでいた。異なる発蛍光団は、励起により異なる波長の光を放射した。非標準ヌクレオチドの対合を含む増幅産物へのリポーター核酸のアニーリングが、フラップエンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）酵素活性によるクエンチング化合物−結合リポーター核酸からの発蛍光団（単数又は複数）の切断を引き起こしうる。対立遺伝子特異性核酸標的の優勢の結果、切断されたリポーターからの発蛍光団の特有の蛍光放射となる。
【０２４３】
この実施例では、以下の核酸をＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。
【０２４４】
2004500850.tif 000050
±＝近交系。＊＊＝Ｆ１ハイブリッド系。
マウスｇＤＮＡ試料は、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。すべてのｇＤＮＡ試料は、１ｍＭ ＭＯＰＳｐＨ７．５、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ中、２０ｎｇ／μＬに希釈し、９５℃に５分間加熱し、氷上で急冷した。
【０２４５】
2004500850.tif 000051
【０２４６】
Ｍｊａ ＦＥＮ−１は、参照によって本明細書に取り込まれるＨｏｓｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３：２７１５４−６１に記載されている方法を修正した方法に従って発現させ、かつ精製した。Ｍｊａ ＦＥＮ−１配列を含むＧｅｎＢａｎｋ受入番号はＵ６７５８５である。Ｍｊａ ＦＥＮ−１は、米国特許第５，８４３，６６９号、及びＢｕｌｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）２７３：１０５８−１０７３に記載されており、両者とも参照によって本明細書に取り込まれる。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦＥＮ−１遺伝子を含有するプラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に形質転換し、最終濃度０．４ｍＭまでイソプロピルチオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加により、対数期にタンパク質過剰発現を誘発した。さらに２時間の成長後細胞を３０００Ｘｇでペレット化し、緩衝液１（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．５（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ），１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），１０ｍＭ イミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））に再懸濁させ、簡単に超音波処理し、７５℃で４５分間加熱して可溶化してから氷上で０℃に急冷した。この手順は、細胞を可溶化し、混入している中温性の自然の大腸菌タンパク質の大部分を沈殿させた。生成溶液を２５，０００Ｘｇで遠心分離し、緩衝液１で予め平衡させたＴＡＬＯＮＴＭ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と上清を合わせ、重力流カラム内に装填し、緩衝液１で広範に洗浄した。１００ｍＭ、２００ｍＭ、３５０ｍＭ及び５００ｍＭの段階的なイミダゾール勾配を含むように調整した緩衝液１を用いてＦＥＮ−１を溶離した。ＦＥＮ−１含有フラクションを収集し、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に対して広範に透析した。透析した原料を５０％グリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、０．５％ＴｗｅｅｎＴＭ２０（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、及び０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＴＭＰ−４０（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に調整した。
【０２４７】
上記成分を含有するマスターミックスを１．５Ｘ以上の最終濃度に調製した。これらミックスの１５μｌを分析プレートの個々のウェルに等分し、標的ＤＮＡｓ（１００ｎｇ）５μＬを個々のウェルに添加して吸引によって混合した。ポジティブ対照（完全適合鋳型）、ネガティブ対照（不適合鋳型又は鋳型無し）、及び異種接合性試料（適合及び不適合鋳型）用にＰＣＲ反応を調製した。鋳型核酸添加後、各ウェルを２０μＬの鉱油で覆い、簡単に遠心分離した。
分析プレートをｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移し、下記のパラメーターを用いて循環させた。シグナル検出に使用したフィルター設定は以下の通り：（６ＦＡＭ）−励起フィルター４９０±１０ｎｍ、放射フィルター５３０±１５ｎｍ；（ＨＥＸ）励起フィルター５３０±１５ｎｍ、放射フィルター５７５±１０ｎｍ。
【０２４８】
以下のＰＣＲパラメーターを使用した。
【０２４９】
2004500850.tif 000052
＊サイクル＃２７〜４２の２工程時に、動的プロットを生成するためｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱＴＭリアルタイムＰＣＲ検出システムのオプティクスを活性化してＦＡＭ及びＨＥＸ生成蛍光を読み、ＰＣＲ反応管内の蛍光の測定を可能にした。結果は、図２３Ａ〜Ｂに示される。
【０２５０】
実施例１５
蛍光クエンチドＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析及び蛍光クエンチドＰＣＲ増幅産物
クエンチング化合物を有するＳＳＩによってクエンチされた発蛍光団を含有するＰＣＲ反応産物の融解曲線解析を用いてクエンチャー組込みプライマー／二量体の存在を調べることができる。クエンチャー組込みプライマー／二量体は、通常クエンチャー組込みＰＣＲ産物より低温で融解する。融解曲線解析は、クエンチャー組込みプライマー／二量体と、ＰＣＲ増幅後の産物として両者が存在する場合はクエンチャー組込みＰＣＲ産物との融点における蛍光の増加を示すことができる。
【０２５１】
実施例１１からのＰＣＲ増幅産物をＳｍａｒｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いる融解曲線解析に供した。毎秒０．１℃の割合でＰＣＲ反応産物の温度を徐々に上昇させながら蛍光の変化を監視した。意図した産物（クエンチャー組込みＰＣＲ産物）のＴｍ及び非特異的産物（クエンチャー組込みプライマー／二量体）のＴｍが図２５に示される。出発量１ｐｇのＲＮＡ鋳型を含むＲＴ−ＰＣＲ反応についての融解解析は、約７１℃のＴｍを有する有意量の非特異的産物及び約７９℃のＴｍを有する意図した産物を示した。１００ｎｇのＲＮＡ鋳型を含む反応についての融解解析は、７９℃のＴｍを有する意図した産物の形成のみを示した。一端意図した産物のＴｍが分かると、意図した産物によって生成されるシグナルを特異的に観察するために、非特異的産物のＴｍより高い温度、及び意図した産物のＴｍ未満の温度で、反応の蛍光測定を行うことによって観察することが有用である考えられる。融解曲線解析の結果は、図２４に示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
１Ａ〜１Ｅは、本発明の一実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図２】
２Ａ〜２Ｅは、本発明の第２実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図３】
多数の非天然塩基の化学構造を示し、式中、Ａは高分子バックボーンへの付着点であり、ＸはＮ又はＣ−Ｚであり、ＹはＮ又はＣ−Ｈであり、かつＺはＨ、置換若しくは無置換アルキル基、又はハロゲンである。
【図４】
４Ａ〜４Ｄは、本発明の第３実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図５】
５Ａ〜５Ｅは、本発明の第４実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図６】
６Ａ〜６Ｅは、本発明の第５実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図７】
７Ａ〜７Ｅは、本発明の第６実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図８】
８Ａ〜８Ｅは、本発明の第７実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図９】
９Ａ〜９Ｅは、本発明の第８実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１０】
１０Ａ〜１０Ｅは、本発明の第９実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１１】
１１Ａ〜１１Ｅは、本発明の第１０実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１２】
１２Ａ〜１２Ｅは、本発明の第１１実施形態の分析方法を概略的に図解する。
【図１３】
ＰＣＲ混合物に特異的な対立遺伝子と鋳型試料を含有する分析プレートを調製するための一般的な手順を概略的に図解する。
【図１４】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングを示すグラフであり、Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１５】
方法Ａによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１６】
方法Ｂによる標識化非天然塩基の調製の合成スキームを概略的に図解する。
【図１７Ａ】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１７Ｂ】
図１７ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１８Ａ】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによるＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの“リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図１８Ｂ】
図１８ＡのＰＣＲ増幅産物の融解曲線解析を示すグラフであり；Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１９】
ゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２０】
種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光の増加の “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２１】
ＰＣＲ増幅産物中へのクエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅するＰＣＲ反応における蛍光のクエンチングの “リアルタイム”モニタリングを示すグラフであり；Ｙ軸に相対蛍光単位（ＲＦＵ’ｓ）が示され、Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示される。
【図２２】
野生型、突然変異体、及び異型接合性因子Ｖ ＤＮＡ標的の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵｓが示され、Ｘ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２３Ａ】
種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＨＥＸ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２３Ｂ】
種々のマウス株由来ゲノムＤＮＡのマウスＳＴＳ配列２７．ＭＭＨＡＰ２５ＦＬＡ６における多型性の多重ＰＣＲ解析による総合結果を示すグラフであり；Ｘ軸にＰＣＲサイクル数が示され、Ｙ軸にＦＡＭ蛍光ＲＦＵｓが示される。
【図２４】
クエンチング化合物の部位特異的組込みによる種々の量の逆転写ＲＮＡを増幅する反応によるＰＣＲ産物の融解曲線解析であり；Ｙ軸に経時的な蛍光の変化が示され、Ｘ軸に融解温度が示される。
【図１３】
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【図１４】
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【図１７Ａ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004500850.tif 000190
2004500850.tif 000191
2004500850.tif 000192
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