(57)【要約】本発明は酢テリア菌ＥＧＤ−ｅのゲノム配列およびヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、該生物のポリペプチド、特に表面または細胞包膜ポリペプチド、または種々の代謝サイクル、特にビタミンＢ１２生合成に関与するポリペプチドに関する。本発明はさらに、リステリア菌または関連種の同定を可能とする該配列の使用および種々の手段に関する。最後に本発明は、改変型リステリア菌株、および本発明の配列を用いた医薬組成物またはワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に相当する、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のヌクレオチド配列。
【請求項２】
下記ａ）〜ｆ）から選択される、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のヌクレオチド配列：
ａ）　配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）　高ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）　配列番号１と相補的なヌクレオチド配列、ａ）もしくはｂ）で定義されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、または、その対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、
ｄ）　配列番号１の代表的断片のヌクレオチド配列、または、ａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義されるヌクレオチド配列の代表的断片のヌクレオチド配列、
ｅ）　ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）　ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されるヌクレオチド配列の改変ヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号１由来の配列であって、配列番号１〜配列番号２８５４の配列のポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
下記ａ）〜ｆ）から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、ヌクレオチド配列：
ａ）　請求項３に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）　請求項３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）　高ストリンジェントな条件下で請求項３に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）　ａ）、ｂ）またはｃ）で定義される配列に対応する、相補的ヌクレオチド配列または相当するＲＮＡ配列、
ｅ）　ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される配列の代表的断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）　ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義される配列の改変ヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２〜配列番号２８５４の配列から選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
下記ａ）〜ｅ）から選択されるポリペプチドを含んでなる、ポリペプチド：
ａ）　請求項５および６のいずれかに記載のポリペプチド、
ｂ）　請求項５および６のいずれかに記載のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、
ｃ）　請求項５および６のいずれかに記載のポリペプチド、またはｂ）で定義されるポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸の断片、
ｄ）　請求項５および６のいずれかに記載のポリペプチド、またはｂ）もしくはｃ）で定義されるポリペプチドの、生物学的に活性な断片、
ｅ）　請求項５および６のいずれかに記載のポリペプチド、またはｂ）、ｃ）もしくはｄ）で定義されるポリペプチドの、改変ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項９】
アミノ酸生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
補因子、配合団および輸送体の生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
細胞包膜ポリペプチド、すなわちリステリア菌の表面に存在するポリペプチド、またはその断片（該ポリペプチドは好ましくは配列番号２〜配列番号４１である）をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
細胞機構に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
中枢中間体代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
エネルギー代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
脂肪酸およびリン脂質の代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
調節機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
複製プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】
転写プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２０】
翻訳プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２１】
タンパク質の輸送および結合プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２２】
非定型条件への適応に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】
医薬品および類似体感受性に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ビタミンＢ１２生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド（該ポリペプチドは好ましくは配列番号４２〜配列番号６４である）をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド配列。
【請求項２５】
トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２６】
リステリア菌に特異的なポリペプチド、またはその断片をコードする、請求項２〜４および８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
アミノ酸生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
補因子、配合団および輸送体の生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
細胞包膜ポリペプチド、すなわちリステリア菌の表面に存在するポリペプチド、またはその断片（該ポリペプチドは好ましくは配列番号２〜配列番号４１である）である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
細胞機構に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
中枢中間体代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
エネルギー代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
脂肪酸およびリン脂質の代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
調節機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
複製プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
転写プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
翻訳プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
タンパク質の輸送および結合プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
非定型条件への適応に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
医薬品および類似体感受性に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
ビタミンＢ１２生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド（該ポリペプチドは好ましくは配列番号４２〜配列番号６４である）、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
リステリア菌に特異的なポリペプチド、またはその断片である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、および／または請求項５〜７および２７〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチド配列であって、
記録媒体に記録されており、かつ、記録媒体の形式および性質がその配列の読み取り、解析および／または利用の助けとなるものである、ポリペプチド配列。
【請求項４６】
記録媒体がＣＤ−ＲＯＭ、コンピューターディスクまたはコンピューターサーバーである、請求項４５に記載のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載のヌクレオチドまたはポリペプチド配列がそこに記録されている、記録媒体。
【請求項４８】
リステリア菌近縁系統における遺伝子同定のためのヌクレオチドプライマーまたはプローブを選択するための、請求項４７に記載の媒体の使用。
【請求項４９】
リステリア菌近縁系統の遺伝子多形を調べるための、請求項４７に記載の媒体の使用。
【請求項５０】
他のゲノムを調べるための、特に他のゲノム由来の遺伝子の自動アノテーションのための、請求項４７に記載の媒体の使用。
【請求項５１】
配列が請求項２〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列から選択される、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列。
【請求項５２】
放射性化合物または非放射性化合物で標識される、請求項５１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５３】
支持体に共有結合または非共有結合により固定化される、請求項５１および５２のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項５４】
高密度フィルターまたはＤＮＡチップなどの支持体に固定化される、請求項５３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５５】
核酸配列を検出および／または同定するための、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５６】
請求項５５に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項５７】
チップ支持体に固定化された、リステリア菌以外の微生物のヌクレオチド配列もまた少なくとも１つ含む、請求項５６に記載のＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項５８】
他の微生物がリステリア菌関連微生物、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属の細菌およびリステリア菌の変異体から選択される、請求項５７に記載のＤＮＡチップまたはフィルター。
【請求項５９】
請求項５６に記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなる、リステリア菌種に属す種、または関連微生物に属す細菌を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項６０】
請求項５７および５８のいずれかに記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなる、微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項６１】
請求項５６〜５８のいずれか一項に記載のＤＮＡチップまたはフィルターを含んでなる、リステリア菌の少なくとも１つの遺伝子の発現を検出および／または定量するキットまたはパック。
【請求項６２】
請求項２〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、クローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６３】
請求項１１に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６４】
請求項１４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６５】
請求項９、１９または２０に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６６】
請求項１２に記載され、特に分泌機構に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６７】
請求項２４に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６８】
ストレス耐性および／またはストレス適応に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載のクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項６９】
請求項６２〜６８のいずれか一項に記載のベクターで形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項７０】
リステリア属に属す細菌である、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
リステリア菌種に属す細菌である、請求項７０に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の形質転換細胞を含んでなる、植物、またはヒト以外の動物。
【請求項７３】
請求項６２に記載のベクターで形質転換された細胞をそのポリペプチドを発現させる条件下で培養し、かつ、その組換えポリペプチドを回収することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法を用いて得られる、組換えポリペプチド。
【請求項７５】
請求項５〜７および２７〜４４のいずれか一項に記載の合成ポリペプチドを製造する方法であって、そのポリペプチドの化学合成を行う、方法。
【請求項７６】
請求項５〜２７、２７〜４４および７４のいずれか一項に記載のポリペプチド配列とヒトまたは動物で免疫応答を誘導し得るポリペプチド配列を少なくとも含んでなる、雑種ポリペプチド。
【請求項７７】
請求項７６に記載の雑種ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項７８】
請求項７７に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項７９】
請求項５〜７、２７〜４４、７４または７６のいずれか一項に記載のポリペプチドを特異的に認識し得る、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、その断片、またはキメラ抗体。
【請求項８０】
標識抗体である、請求項７９に記載の抗体。
【請求項８１】
生体サンプルにおいてリステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定する方法であって、
ａ）　生体サンプルを請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体と接触させ、
ｂ）　形成し得る抗原−抗体複合体を確認する
工程を含んでなる、方法。
【請求項８２】
リステリア菌株を請求項７９または８０に記載の抗体と接触させ、および
形成し得る抗原／抗体複合体を検出する
ことを含んでなる、リステリア菌の遺伝子の発現を検出する方法。
【請求項８３】
以下の要素：
ａ）　請求項７９および８０のいずれかに記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
ｂ）　所望により、免疫反応に好適な媒体を構成する試薬、
ｃ）　所望により、免疫反応によって生じた抗原−抗体複合体を確認する試薬を含んでなる、請求項８１または８２に記載の方法を行うキットまたはパック。
【請求項８４】
支持体、特にタンパク質チップに固定化される、請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体。
【請求項８５】
チップ支持体に固定化された、請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド、または請求項７９および８０のいずれかに記載の少なくとも１種の抗体を含む、タンパク質チップ。
【請求項８６】
チップ支持体に固定化された、リステリア菌以外の微生物の少なくとも１種のポリペプチド、またはリステリア菌以外の微生物の化合物に対する少なくとも１種の抗体もまた含む、請求項８５に記載のタンパク質チップ。
【請求項８７】
請求項８５および８６のいずれかに記載のタンパク質チップを含んでなる、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項８８】
請求項８６に記載のタンパク質チップを含んでなる、微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項８９】
請求項１〜４、８〜２６、５１〜５５および７７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を用いる、生体サンプルにおいてリステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定する方法。
【請求項９０】
ａ）　所望により、解析する生体サンプル由来のＤＮＡを単離するか、またはその生体サンプルのＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得、
ｂ）　請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のプライマーを用い、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物のＤＮＡを特異的に増幅させ、
ｃ）　その増幅産物を確認する
工程を含んでなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ａ）　請求項５１〜５５のいずれか一項に記載のヌクレオチドプローブを、そのプローブをリステリア菌種に属す細菌または関連微生物の核酸とハイブリダイズさせる条件下で、生体サンプル（ここで、この生体サンプルに含まれる核酸は、適当であれば、従前にハイブリダイゼーションしやすかったものである）と接触させ、
ｂ）　核酸プローブと生体サンプルの核酸との間で形成し得る雑種を確認する工程を含んでなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
ａ）　請求項５３に記載の支持体に固定化されたヌクレオチドプローブを、そのプローブをリステリア菌種に属す細菌または関連微生物の核酸とハイブリダイズさせる条件下で、生体サンプル（なお、このサンプルの核酸は、適当であれば、従前にハイブリダイゼーションしやすかったものである）と接触させ、
ｂ）　支持体に固定化されたヌクレオチドプローブと生体サンプルに含まれる核酸との間で形成し得る雑種を、適当であれば、プローブとハイブリダイズさせなかった生体サンプルの核酸を除去した後に、請求項５２に記載の標識ヌクレオチドプローブを接触させ、
ｃ）　工程ｂ）で形成した新しい雑種を確認する
工程を含んでなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
工程ａ）の前に、生体サンプルのＤＮＡ、または所望によりそのサンプルのＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡを、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のプライマーを用いて増幅させる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
以下の要素：
ａ）　請求項５１〜５５のいずれか一項に記載のヌクレオチドプローブ、
ｂ）　所望により、ハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）　所望により、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のプライマー、およびＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項９５】
以下の要素：
ａ）　捕捉プローブと呼ばれる、請求項５３に記載のヌクレオチドプローブ、
ｂ）　検出プローブと呼ばれる、請求項５２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ、
ｃ）　所望により、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のプライマー、およびＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項９６】
以下の要素：
ａ）　請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のプライマー、
ｂ）　所望により、ＤＮＡ増幅反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）　所望により、増幅断片の配列を確認する成分、より詳しくは請求項５１〜５５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパック。
【請求項９７】
プライマーおよび／またはプローブが、リステリア菌種に特異的な請求項２〜４、８〜２６、５１〜５５および７７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列から選択され、ポリペプチドが、リステリア菌種に特異的な請求項５〜７、２７〜４４および７４または７６のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択され、また、抗体が、リステリア菌種に特異的な請求項５〜７、２６〜４４、７４または７６のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択されるポリペプチドに対する、請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体から選択される、リステリア菌種に属す細菌を検出および／または同定する、請求項８１、８２および８９〜９３に記載の方法、または請求項８３、８７、８８および９４〜９６に記載のキットもしくはパック。
【請求項９８】
プライマーおよび／またはプローブが分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択され、ポリペプチドが分泌ポリペプチドから選択され、また、抗体が、リステリア菌の分泌または表面ポリペプチドに対する、請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体から選択される（該ポリペプチドは好ましくは配列番号２〜配列番号４１である）、請求項９７に記載の方法、またはキットもしくはパック。
【請求項９９】
請求項２〜４または８〜２６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のヌクレオチド配列における少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴する、リステリア菌株。
【請求項１００】
請求項１３に記載のヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株。
【請求項１０１】
請求項１４に記載のヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株。
【請求項１０２】
請求項９、１９または２０に記載のヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株。
【請求項１０３】
請求項１２に記載され、特に分泌機構に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株。
【請求項１０４】
ストレス耐性および／またはストレス適応に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株
【請求項１０５】
ビタミンＢ１２生合成に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列に突然変異を含む、請求項９９に記載のリステリア菌株。
【請求項１０６】
突然変異が遺伝子の不活性化をもたらす、請求項９９〜１０５のいずれか一項に記載のリステリア菌株。
【請求項１０７】
突然変異が遺伝子の過剰発現をもたらす、請求項９９〜１０５のいずれか一項に記載のリステリア菌株。
【請求項１０８】
対象となる化合物の生合成または生分解のための、請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の形質転換細胞、請求項９９〜１０７のいずれか一項に記載の株、および／または請求項７２に記載の動物の使用。
【請求項１０９】
請求項５〜７、２６〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の形質転換細胞、請求項９９〜１０７のいずれか一項に記載の株、および／または請求項７２に記載の動物を用いることを特徴とする、対象となる化合物の生合成または生分解法。
【請求項１１０】
対象となる化合物がビタミンＢ１２である、請求項１０８に記載の使用、または請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害、および／または真核細胞もしくは原核細胞における細胞複製を改変し得る、あるいは動物またはヒトにおいてリステリア菌または関連微生物の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化し得る有機または無機化合物を選択するための、請求項２〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の細胞、および／または請求項７２に記載の形質転換動物の使用。
【請求項１１２】
請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチドと結合し得るか、請求項２〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列と結合し得るか、または、請求項７９および８０のいずれかに記載の抗体を認識し得る、かつ／または遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害し得る、かつ／または真核細胞もしくは原核細胞における細胞複製を改変し得る、あるいは動物またはヒトにおいてリステリア菌の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化し得る化合物を選択する方法であって、
ａ）　該化合物を該ポリペプチドまたは該ヌクレオチド配列と、または請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の形質転換細胞と接触させ、かつ／または該化合物を請求項７２に記載の形質転換動物に投与し、
ｂ）　該化合物が該ポリペプチドまたは該ヌクレオチド配列と結合する能力、または遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害する能力、または細胞増殖もしくは複製を調整する能力、または該動物もしくはヒトにおいてリステリア菌もしくは関連微生物の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化する能力を測定する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１１３】
請求項１１２に記載の方法を用いて選択できる化合物。
【請求項１１４】
下記ａ）〜ｅ）から選択される化合物を含んでなる、医薬組成物：
ａ）　請求項２〜４および８〜２６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）　請求項５〜７、２７〜４４、７４および７６のいずれか一項に記載のポリペプチド、
ｃ）　請求項６２〜６８および７８のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ）　請求項７９または８０のいずれかに記載の抗体、
ｅ）　請求項１１３に記載の化合物。
【請求項１１５】
所望により医薬上許容されるビヒクルと組み合わせてもよい、請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
リステリア菌種に属す細菌または関連微生物の感染を予防または治療するための、請求項１１４および１１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
請求項５〜７、２７〜４４および７４のいずれか一項に記載の１以上のポリペプチド、および／または請求項７６に記載の１以上の雑種ポリペプチドを含んでなることを特徴とする、ワクチン組成物。
【請求項１１８】
ワクチン組成物を製造するための、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項１１９】
請求項６２〜６８および７８のいずれか一項に記載のベクター、および／または請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の細胞を含む、ワクチン組成物。
【請求項１２０】
リステリア菌種に属す細菌または関連微生物の感染を予防または治療するための、細胞性応答または体液性応答を誘導し得るワクチン組成物であって、請求項１１７および１１９のいずれかに記載の免疫組成物を、医薬上許容されるビヒクルおよび所望により１以上の好適な免疫アジュバントと組み合わせて含んでなる、組成物。
【請求項１２１】
ＤＮＡライブラリーが細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングされることを特徴とする、リステリア属の細菌のゲノムＤＮＡライブラリー。
【請求項１２２】
細菌がリステリア菌である、請求項１２１に記載のゲノムＤＮＡライブラリー。
【請求項１２３】
細菌がリステリア菌ＥＧＤ−ｅ株である、請求項１２１に記載のゲノムＤＮＡライブラリー。
【請求項１２４】
２０００年４月１１日にＣＮＣＭにＩ−２４３９として寄託されたＬＭ−細菌ライブラリーである、請求項１２２に記載のライブラリー。
【請求項１２５】
請求項１２１および１２４のいずれかに記載の少なくとも１つのライブラリーを用いることを特徴とする、あるリステリア株に存在していて別の株には存在しない、対象とするポリヌクレオチドを単離する方法。
【請求項１２６】
ａ）　リステリア起源の、ＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリー由来のクローンに含まれる少なくとも１種のポリペプチドを単離し、
ｂ）　リステリアの少なくとも１種のゲノムポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ（該リステリアは、工程ａ）のＢＡＣ　ＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた株とは異なる株に属す）か、または、
工程ａ）のＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリーを構築するのに用いたリステリアとは異なるリステリアのゲノムから作製したＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリー由来のクローンに含まれる少なくとも１種のポリヌクレオチド
を単離し、
ｃ）　工程ａ）のポリヌクレオチドと工程ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、
ｄ）　工程ｂ）のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション複合体を形成しなかった、工程ａ）のポリヌクレオチドを選択し、
ｅ）　選択したポリヌクレオチドを同定する
工程を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
リステリア属の細菌のゲノムライブラリー。
【請求項１２８】
細菌がリステリア菌である、請求項１２７に記載のゲノムライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ゲノム配列、および細胞包膜、分泌もしくは特異的ポリペプチド、または代謝、複製プロセスもしくは発病に関与するポリペプチドなどのリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、さらにその配列を含むベクター、ならびにこれらのベクターで形質転換された細胞または動物に関する。さらに、本発明はこれらの核酸またはポリペプチドを検出する方法、およびリステリア菌感染を診断するキットに関する。本発明は、そのヌクレオチド配列またはそのポリペプチドを用いる細菌感染を調整し得る化合物を選択するための方法および対象となる分子の生合成または生分解方法にも向けられる。最後に、本発明は細菌感染、特にリステリア菌感染を予防および／または治療するための、医薬組成物、特にワクチン組成物を含んでなる。
【０００２】
背景技術
リステリア菌は通性細胞内病原体である。これはますます重大な公衆衛生問題を提起し、欧州食品産業にかなりの経済的な衝撃を与えている食物を介する感染、リステリア症（ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｉｓ）の病因となる病原体である。リステリア症は最も致命的な食品媒介性感染である（死亡率約３０％）。リステリア菌は３つの関門：小腸関門、脳血液関門および胎盤関門を越えて侵入し得る特異な特性を有している。リステリア菌の臨床症状としては、髄膜炎、髄膜脳炎、流産および敗血症が挙げられる。この感染は日和見感染症であり、妊婦、乳幼児、高齢者および免疫抑制患者、特にＡＩＤＳ患者で発症しやすい。この疾患は健康な人にも感染することは明らかであり、汚染された食品により甚大な数の流行病をもたらす。リステリア菌は獣医学分野でも重要であり、ヒツジ属（ヒツジ）およびウシ属のメンバーにはかなりの危険性がある。リステリア菌は特にストレスまたは極限条件耐性であり、食物の安全性の問題だけではなく環境の安全性の問題にも配慮してその存在を調べることが重要である。
【０００３】
リステリア菌ゲノムの物理的マップおよび予備的遺伝子マップをＬＯ２８株で確立した。しかしながら、さしあたり完成された遺伝子マップを入手することはできない。この細菌のゲノムは環状であり、約３０００キロベースを含んでいる。このＧＣ含量は約３８％である。毒性因子の研究により、毒性におけるその機能が明確に確認されている大部分の遺伝子を含有する場合に限り、その遺伝子座が病原性細胞群であると考えられる１５ｋｂの遺伝子座の同定が可能になった。この遺伝子座に加え、他のいくつかの遺伝子、特に侵入および運動遺伝子ならびにムレインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シグマ因子、他をコードする遺伝子もまた同定されてきた。
【０００４】
リステリア菌タンパク質の重要なファミリーは表面タンパク質ファミリーである。進化プロセスによりグラム陽性菌における数多くの特異な機構の開発がなされてきた。これによりそれらはそれらの表面にタンパク質を固定化できる。これらの種々の細胞壁タンパク質の機能は極めて多様である。しかしながら、共有結合によりグラム陽性病原菌に付着した多くのタンパク質は感染した宿主内部での病原菌の生存に重要なものと見られている。リステリア菌では、真核生物細胞に浸透する能力が表面および／または分泌タンパク質、インターナリンのファミリーと関連があった。これまでに、インターナリンファミリーの９種のメンバーが同定された（ＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ、ＩｎｌＣ、ＩｎｌＣ２、ＩｎｌＤ、ＩｎｌＥ、ＩｎｌＦ、ＩｎｌＧおよびＩｎｌＨ）。それらはＬＰｘＴＧモチーフのＴ−Ｇ結合のタンパク質分解による切断、およびトレオニンのカルボキシル基とペプチドグリカンの遊離アミノ基との共有結合などにより細胞壁にアンカーされると考えられている。最近の研究ではインターナリンには２つのクラス：細胞壁と結合する高分子タンパク質（＞５０ｋＤａ）群、および分泌される比較的低分子のタンパク質（＜３０ｋＤａ）群があることがわかってきた。これらの２つのクラスは類似した、極めて相同なＬＲＲモチーフ、さらにＬＲＲフランキング領域、ならびにＮ末端シグナルペプチド配列を有している。低分子のインターナリン（ｓ−ｉｎｌ）はＢ反復領域または細胞壁へアンカーされる配列がないために分泌される。
【０００５】
リステリア菌の研究では、この生物の種々の代謝経路に関する理解を深めるためには新しいアプローチ、特に遺伝子アプローチが必要である。
【０００６】
よって、本発明の１つの目的は２０００年４月１１日にＣＮＣＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］にＩ−２４４０として寄託されたリステリア菌ＥＧＤ−ｅゲノムおよびそのゲノムに含まれる全ての遺伝子の完全配列を開示することである。
【０００７】
実際には、この生物のゲノム情報により、種々の遺伝子、同様に種々のタンパク質、種々の代謝経路間の相互作用をさらに明確に定義することが可能になる。実際には、単離された配列の開示とは異なり、生物の完全ゲノム配列が全体を構成しており、これから増殖および機能するためにこの生物が必要とする全ての情報を直接得ることができる。
【０００８】
従って本発明は、配列番号１に相当することを特徴とする、リステリア菌のヌクレオチド配列に関する。
【０００９】
本発明はまた、下記ａ）〜ｆ）から選択される、リステリア菌のヌクレオチド配列に関する：
ａ）　配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）　高ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｃ）　配列番号１と相補的なヌクレオチド配列、ａ）もしくはｂ）で定義されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、または、その対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、
ｄ）　配列番号１の代表的断片のヌクレオチド配列、または、ａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義されるヌクレオチド配列の代表的断片のヌクレオチド配列、
ｅ）　ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される配列を含んでなるヌクレオチド配列、および
ｆ）　ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義されるヌクレオチド配列の改変ヌクレオチド配列。
【００１０】
より詳しくは本発明の主題はまた、配列番号１由来の配列であって、配列番号２〜配列番号２８５４の配列のポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする、好ましくは配列番号２〜配列番号４１の配列のリステリア菌の細胞包膜ポリペプチドもしくはリステリア菌の表面に存在するポリペプチドをコードする、あるいは配列番号４２〜配列番号６４の配列のビタミンＢ１２生合成に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列でもある。
【００１１】
より一般には本発明はまた、配列番号１に由来し、かつ、配列番号１から単離され得る、リステリア菌のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。
【００１２】
さらに、下記ａ）〜ｆ）から選択されるヌクレオチド配列も本発明の主題である：
ａ）　配列番号２〜配列番号２８５４の配列から選択される、好ましくは配列番号２〜配列番号４１または配列番号４２〜配列番号６４の配列のポリペプチドから選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｂ）　配列番号２〜配列番号２８５４の配列から選択される、好ましくは配列番号２〜配列番号４１または配列番号４２〜配列番号６４の配列のポリペプチドから選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）　高ストリンジェントな条件下で、配列番号２〜配列番号２８５４の配列から選択される、好ましくは配列番号２〜配列番号４１または配列番号４２〜配列番号６４の配列のポリペプチドから選択される、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
ｄ）　ａ）、ｂ）またはｃ）で定義される配列に対応する相補的ヌクレオチド配列または相当するＲＮＡ配列、
ｅ）　ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される配列の代表的断片のヌクレオチド配列、および
ｆ）　ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）で定義される配列の改変ヌクレオチド配列
【００１３】
本明細書での記載に同様に用いられる「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」とは、改変または改変されていないヌクレオチドの適切な系列をいうものであり、異常なヌクレオチドを含むまたは含んでいない、かつ二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびそのＤＮＡの転写産物に等しく相当する核酸のある断片またはある領域を定義することを可能にするものである。よって、本発明の核酸配列はＰＮＡ（ペプチド核酸）なども包含する。
【００１４】
本発明はそれらの自然染色体環境、すなわち自然状態に、あるヌクレオチド配列に関するものでないものと解される。それらは単離および／または精製された配列である、すなわち、例えば複製によって直接または間接的に獲得されたものものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。化学合成により得られた核酸も包含する。
【００１５】
本発明の目的は、２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性％」を最良のアラインメント後に得られる、比較配列間の同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合％で示すことであり、この割合％は単に統計上のものであり、２配列間の差異はランダムにかつそれら全体に散在している。「最良のアラインメント」または「最適なアラインメント」とは、以下のように測定される同一性％が最も高いアラインメントをいうものである。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較はこれらの配列を最適な状態にアラインメントした後にそれらを比較することで慣例的に行われる。この比較はセグメントまたは「比較ウィンドウ」で行い、配列類似性を有する局所領域を同定、比較する。比較配列の最適アラインメントは手作業ではなく、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ の局所相同性アルゴリズム（１９８１， Ａｄ． Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ の局所相同性アルゴリズム（１９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ の類似性検索方法（１９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４）、これらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ　Ｐ、ＢＬＡＳＴ　Ｎ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって得ることができる。最適アラインメントを得るためには、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムをＢＬＯＳＵＭ　６２　マトリックスで使用する。ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスを使用してもよい。
【００１６】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性％は、最適な状態にアラインメントされたこれら２配列を比較して測定する。ここで比較しようとする核酸またはアミノ酸配列は、これら２配列間の最適アラインメント用参照配列に対し、付加または欠失を含んでなる。同一性％は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２配列間で同一である同一位置数を測定し、この同一位置数を比較した全位置数で割り、これら２配列間の同一性％を得るために得られた結果に１００を掛けて算出する。
【００１７】
「参照配列との最適アラインメント後に、少なくとも８０％、好ましくは８５％〜９０％、さらに好ましくは９５％または９８％の同一性を有する核酸配列」とは、参照核酸配列に対し、特に局部型の、特に欠失、末端切断、伸長、キメラ融合および／または置換などのある改変を有しており、かつ、この核酸配列が参照核酸配列との最適アラインメント後に、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す核酸配列をいうものである。好ましくはそれらはその相補的配列が参照配列と特異的にハイブリダイズし得る配列である。好ましくは特異的または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２配列の一方の配列と、もう一方のものと相補的な配列との最適アラインメント後に、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を保証するものである。
【００１８】
高ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、２つの相補的ＤＮＡ断片間のハイブリダイゼーションが維持できる温度およびイオン強度条件を選択するのに重要である。実例として、上記ポリヌクレオチド断片を定義する目的でのハイブリダイゼーション工程における高ストリンジェントな条件は有利には以下の通りである。
【００１９】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを２工程：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中において４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）本質的には、プローブ長に合わせた温度（すなわち、プローブ長＞１００ヌクレオチドの場合は４２℃）で２０時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳでの２０℃で２０分間の２回洗浄、さらに０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでの２０℃で２０分間１回洗浄で行う。プローブ長＞１００ヌクレオチドの場合には、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでの６０℃で３０分間最終洗浄を行う。当業者ならば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）の開示に従って、定義される長さのポリヌクレオチド用の上記高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件をそれより長いまたは短いオリゴヌクレオチド用に調整することができる。
【００２０】
また、「本発明の配列の代表的断片」とは、その由来となる配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、３００および４５０個の連続するヌクレオチドをいうものである。
【００２１】
「代表的断片」とは、以下で定義される生物学的に活性なポリペプチド断片をコードする核酸配列を特に意味するものである。
【００２２】
「代表的断片」とは、遺伝子間配列、特に調節シグナル（プロモーター、ターミネーターまたはエンハンサー）を有するヌクレオチド配列を意味するものでもある。
【００２３】
その代表的断片としては、ＯＲＦ配列と呼ばれるオープンリーディングフレーム（オープンリーディングフレーム用ＯＲＦ）に相当し、一般には開始コドンと停止コドンの間、または２つの停止コドン間に存在し、かつ、好ましくは、例えば、限定されるものではないが、後述するＯＲＦ配列などの少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するものが好ましい。
【００２４】
本明細書にて後述するＯＲＦヌクレオチド配列のナンバーリングはそのＯＲＦによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列のナンバーリングと対応している。
【００２５】
本発明の代表的断片は、例えばＰＣＲなどの特異的増幅により、または本発明のヌクレオチド配列の好適な制限酵素での消化後に得られる。この方法については特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の研究報告に記載されている。その代表的断片はそれらがあまり長くない場合には当業者には十分に公知な方法による化学合成によっても得ることができる。
【００２６】
本発明の配列を含む配列、または代表的断片としては、本発明の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を示す配列で天然で構成された配列もまた包含される。
【００２７】
「改変ヌクレオチド配列」とは、当業者には十分に公知な技術による変異誘発で得られ、かつ改変、好ましくは正常配列に対し最大１０％改変されたヌクレオチド、例えばポリペプチド発現のための調節および／またはプロモーター配列における変異を含んでなり、特に発現レベルおよび／またはそのポリペプチドの活性の改変をもたらすいずれかのヌクレオチド配列を意味するものである。
【００２８】
「改変ヌクレオチド配列」とは、以下で記載する改変ポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配列もまた意味するものである。
【００２９】
本発明の代表的断片はプローブまたはプライマーであり、これらを核酸配列の検出、同定、アッセイまたは増幅方法に用いることができる。
【００３０】
本発明の目的に対し、プローブまたはプライマーは、例えば１２塩基〜数ｋｂ、特に１５塩基〜数百塩基、好ましくは１５〜５０または１００塩基を含んでなり、かつ標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成させる所与の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有する、一本鎖核酸断片または変性二本鎖断片として定義される。
【００３１】
本発明のプローブまたはプライマーを、当業者には十分に公知な方法を用いて放射性または非放射性化合物で直接または間接的に標識し、検出可能および／または定量可能なシグナルを得てもよい。
【００３２】
本発明の非標識ポリヌクレオチド配列をそのままプローブまたはプライマーとして用いてもよい。
【００３３】
一般には配列を標識し、数多くの用途に使用できる配列を得る。本発明のプライマーまたはプローブは放射性エレメントまたは非放射性エレメントで標識する。
【００３４】
用いられる放射性同位元素としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈまたは１２５Ｉが挙げられる。非放射性物質はビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジオキシゲニンなどのリガンド、ハプテン、色素および放射線ルミネセンス、化学ルミネセンス、生物ルミネセンス、蛍光またはリン光剤のような発光剤から選択される。
【００３５】
よって、本発明のポリヌクレオチドを、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応技術）を利用する方法でのプライマーおよび／またはプローブとして用いてもよい（Ｒｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この技術には増幅しなけらばならない断片を構成するオリゴヌクレオチドプライマー対の選択が必要である。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に記載の技術が挙げられる。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動後、またはゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法の後に増幅断片を同定し、その後、配列決定することができる。増幅特異性はプライマーとして本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、マトリックスとしてこれらの配列または誘導された増幅生成物を含むプラスミドを用いて制御することができる。増幅ヌクレオチド断片をハイブリダイゼーション反応の試薬として用い、その増幅ヌクレオチド断片の配列に相補的な配列により生体サンプル中の標的核酸の存在を確認してもよい。
【００３６】
本発明は本発明のプライマーを用いる増幅により得られる核酸にも向けられる。
【００３７】
ＰＣＲ（ＰＣＲ様）代替技術として標的核酸を増幅する別の技術を本発明のヌクレオチド配列のプライマー対を用いて利用することも有利である。「ＰＣＲ様」とは、核酸配列の直接または間接的な複製を行う、または標識系を増幅する全ての方法をいうものであり、これらの技術はもちろん十分に公知なものであり、一般にそれらはポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を伴い、起源サンプルがＲＮＡである場合には、事前に逆転写が行われる方法をいう。現在では、この増幅に向けた数多くの方法がある。例えば、ＳＤＡ（鎖置換増幅）法（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０： １６９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， １１７３）により報告されたＴＡＳ（転写に基づく増幅系）法、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， １８７４）により報告された３ＳＲ（自律的配列複製）法、Ｋｉｅｖｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３５， ２７３）により報告されたＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）法、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１， １０７７）により報告されたＬＣＲ（リガーゼ鎖反応）法、Ｓｅｇｅｖ（１９９２， Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｃ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ， １９７−２０５）により報告されたＲＣＲ（修復鎖反応）法、Ｄｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９， １４２）により報告されたＣＰＲ（サイクリングプローブ反応）法またはＭｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １７１， ２８１）により報告されたＱ−β−レプリカーゼ増幅法などである。これらの技術のいくつかのものはその後改良されている。
【００３８】
検出する標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、本発明のプライマーを用いる増幅反応を行う前に、または本発明のプローブを用いる検出方法を行う前に逆転写酵素タイプの酵素を用いて、生体サンプルに含まれるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得ることが有利である。次いで、得られたｃＤＮＡは本発明の増幅または検出方法で用いるプライマーまたはプローブの標的をつとめる。
【００３９】
プローブハイブリダイゼーション法は多くの方法で行うことができる（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６９， １−２５）。最も一般的な方法は種々の組織の細胞または培養細胞から抽出した核酸を支持体（ニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレンなど）に固定化し、明確に定義された条件下で、固定化された標的核酸をプローブとともにインキュベートすることからなる。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、形成された雑種分子を好適な方法（放射能、蛍光またはプローブと結合した酵素の活性を測定）を用いて検出する。
【００４０】
本発明の核酸プローブの別の具体例によれば、後者を捕捉プローブとして用いてもよい。この場合、「捕捉プローブ」と呼ばれるプローブを支持体に固定化し、それを用いて特異的ハイブリダイゼーションにより調べる生体サンプルから得られた標的核酸を捕捉する。次いで、容易に検出可能なエレメントで標識した「検出プローブ」と呼ばれる第２のプローブを用いて標的核酸を検出する。
【００４１】
ここで、有利な核酸断片としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションにより、その対応する産物の発現を確実に阻害する構造を有するオリゴヌクレオチドが特に挙げられる。また、その対応する産物の発現調節に関与するタンパク質と相互に作用することによりこの発現の阻害または活性化のいずれかをもたらすセンスオリゴヌクレオチドについても記載する。
【００４２】
好ましくは本発明のプローブまたはプライマーは支持体に共有結合または非共有結合により固定化される。特に、支持体は本発明の対象でもあるＤＮＡチップまたは高密度フィルターであってよい。
【００４３】
「ＤＮＡチップ」または「高密度フィルター」とは、ＤＮＡ配列を結合させる支持体をいうものであり、その地理的位置によってこれらの配列各々の位置を正確に示すことができる。これらのチップまたはフィルターは、主にそれらのサイズ、支持体材料、あるいはそれに結合させるＤＮＡ配列数が異なっている。
【００４４】
第１の発明のプローブまたはプライマーは種々の作製方法を用いて固相支持体、特にＤＮＡチップに結合させることができる。特に、光化学アドレッシングまたはインクジェットによりｉｎ ｓｉｔｕ合成を行う。もう１つの方法としては、ｅｘ ｓｉｔｕ合成を行い、プローブを機械的もしくは電子アドレッシングによりまたはインクジェットによりＤＮＡチップ支持体に結合させることからなる。これらの種々の方法は当業者には十分に公知なものである。
【００４５】
従って、本発明のヌクレオチド配列（プローブまたはプライマー）によって特異的な核酸配列を検出または増幅することが可能になる。特に、プローブをＤＮＡチップまたは高密度フィルターに結合させるとこれらのその配列の検出は容易である。
【００４６】
ＤＮＡチップまたは高密度フィルターを使用することで、実際にはリステリア菌ＥＧＤ−ｅ近いゲノム配列を有する生物における遺伝子発現の同定が可能になる。
【００４７】
本発明で提供される、この生物における全遺伝子の同定により追加されたリステリア菌ＥＧＤ−ｅのゲノム配列がこれらのＤＮＡチップまたはフィルターを構築するための基礎となっている。
【００４８】
これらのフィルターまたはチップの製造は遺伝子の５’および３’末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成することからなっている。これらのオリゴヌクレオチドは本発明で開示するゲノム配列およびそのアノテーションを用いて選択される。ＤＮＡの対応する部位にあるこれらのオリゴヌクレオチドを対合する温度は各オリゴヌクレオチドでほぼ同じでなければならない。これにより、高度に自動化された環境において好適なＰＣＲ条件を用いる各遺伝子に対応するＤＮＡ断片の製造が可能になる。次いで、増幅断片をガラス、シリコンまたは合成ポリマー製のフィルターまたは支持体に固定化し、これらの媒体をハイブリダイゼーションに用いる。
【００４９】
かかるフィルターおよび／またはチップならびに対応するアノテーションゲノム配列の有用性から、これらの相補的ＤＮＡを作製し、それらをフィルターまたはチップに固定化されたＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによりリステリア菌関連の大きな微生物群または全ての遺伝子の発現の調査が可能になる。さらに、フィルターおよび／またはチップで、これらの生物のＤＮＡを作製し、それをフィルターまたはチップに固定化されたＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより株または種の多様性の調査が可能になる。
【００５０】
種々の株または種のゲノム配列間の差異がハイブリダイゼーション強度に大きな影響を与え、結果として結果の解釈に影響する。そのため、調査しようとする株の正確な遺伝子配列を得ることが必要である。以下で詳細に記載する、ゲノムのランダム断片の配列を同定し、本発明で開示するリステリア菌ＥＧＤ−ｅの完全ゲノム配列に従ってそれらを構成することを含む遺伝子の検出方法が非常に有用である。
【００５１】
本発明のヌクレオチド配列をＤＮＡチップに用いて変異解析を行ってもよい。この解析は本発明のヌクレオチド配列の各塩基を解析し得るチップを構成することに基づいている。この目的には、ＤＮＡチップでの微量配列決定技術を特に用いる。調べる変異ヌクレオチドの直前直後の位置で、解析する配列マトリックスとハイブリダイズする固定化プライマーを伸長させることにより変異を検出する。解析する配列の一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡマトリックスを、ＰＣＲなどの技術により増幅された産物を用いて慣例法により製造することが有利である。次いで、このようにして得た一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡマトリックスを、それらを固定化プライマーと特異的にハイブリダイズさせる条件下でＤＮＡチップに結合させる。熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴｔｈまたはＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは変異部位の位置にあるヌクレオチドに相補的な標識ヌクレオチド類似体を加えて固定化プライマーの３’末端を特異的に伸長させる。例えば、蛍光ジデオキシリボヌクレオチドの存在下で熱サイクルを行う。試験条件を、特に使用チップ、固定化されるプライマー、使用ポリメラーゼおよび選択した標識系に適合させる。プローブハイブリダイゼーションに基づく技術に対し、微量配列決定法の利点はＤＮＡチップに用いた同じ反応条件下で全ての変異ヌクレオチドを最大限の識別力で同定できることであり、それによってルーチンおよび工業的変異多重検出での識別力および特異性が最大のものとなる。
【００５２】
よって、高密度フィルターおよび／またはＤＮＡチップを使用することで、工業的に重要な生物、特に種々の条件下で増殖させたリステリア菌の遺伝子調節に関する新しい情報を得ることができる。また、それによって数多くの工業用途に用いられる株のゲノム間の差異を迅速に同定することも可能となる
【００５３】
さらに、ＤＮＡチップまたはフィルターは微生物の測定、検出および／または同定に非常に有利な手段でもある。よって、そのチップ支持体に固定化された、リステリア菌以外の微生物のヌクレオチド配列もまた少なくとも１つ含む本発明のＤＮＡチップが好ましい。好ましくは選択される微生物がリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｅｎｕｓ）の細菌（以後、リステリア菌関連微生物とよぶ）またはリステリア菌ＥＧＤ−ｅの変異体から選択される。
【００５４】
本発明のＤＮＡチップまたはフィルターは微生物、特に本発明の対象でもあるリステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するあるキットまたはパックの非常に有用なエレメントである。
【００５５】
さらに、リステリア菌に特異的なプローブまたはプライマーを含む本発明のＤＮＡチップまたはフィルターもまたリステリア菌種（または関連微生物）の遺伝子発現を検出および／または定量するキットまたはパックの非常に有利なエレメントである。
【００５６】
実際に、遺伝子発現の制御は１個以上の新しい遺伝子を発現させるか、または細胞に既に存在する遺伝子の発現を改変するかのいずれかによって株の増殖および収量を最大のものとするための重大なポイントとなっている。本発明はリステリア菌で自然に活性な、遺伝子発現可能な全ての配列を提供するものである。従って、それによりリステリア菌で発現される全ての配列が同定できることになる。さらに、それによってその発現が所与の機構に従う遺伝子を位置決定する手段が提供される。これを行うために、リステリア菌のいくつかまたは全ての遺伝子のＤＮＡを本発明のプライマーを用いて増幅し、次いで、例えばガラスもしくはナイロンなどの支持体またはＤＮＡチップに結合させ、これらの遺伝子の発現プロフィールを追跡できる手段を構築する。この手段はコード配列を含む支持体からなり、これを細胞で発現されるメッセンジャーＲＮＡに現れる標識分子混合物（特に本発明の標識プローブ）とのハイブリダイゼーション用マトリックスとして用いる。その後、この試験を異なる回数で繰り返し、好適な処理によりこれらのデータ全てを合わせることで、これらの遺伝子全ての発現プロフィールを得る。また、所与の調節機構に従う配列の情報を利用して、少し異なる様式ではあるが同じ調節機構に従う他の配列を指向される方法、例えば相同性により検索することもできる。さらに、プローブとして用いられるセグメントの上流に存在する各制御配列を単離し、リポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質））などの好適な手段を用いてその活性を調べることができる。次いで、これらの単離配列をその最大限の発現を求めて対象となる配列の代謝工学により改変し、構成することができる。
【００５７】
当業者であれば、本発明で提供されるゲノム配列を用いて、リステリア菌における遺伝子転写を調節するタンパク質をコードする遺伝子を同定することができる。さらに、表Ｉではリステリア菌ゲノム（配列番号１）で同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（そのゲノム上のそれらの位置とそれらのものと考えられる推定機能を挙げている）の一覧を示している。しかしながら、かかる一覧表は、細胞においていくつかの役割を有するように構成されたタンパク質に限定されるものではない。
【００５８】
これらの遺伝子の構造および完全性を改変することで、これらのレギュレーターに対する標的であるプロモーターによって制御される標的遺伝子の発現を改変することができる。よって、当業者は所望の用途に好適なレギュレーターと、さらに対象となる遺伝子の発現を最大にすることが可能な標的を選択する。ＤＮＡチップなどの上記手段の使用によって、その調節がある遺伝子の不活性化によって改変される全ての遺伝子の正確な位置を示すこともできる。従って、少数のわずかな差異しかない同じタイプの調節に相当する１組の制御配列を選択することができる。次いで、これらの配列を用いて対象となる遺伝子の発現を制御してもよい。
【００５９】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列、好ましくは配列番号１の配列の代表的断片によりコードされる、および表１に記載したＯＲＦ配列に相当するポリペプチドにも関する。特に、配列番号２〜配列番号２８５４の配列、好ましくは配列番号２〜配列番号４１の配列および配列番号４２〜配列番号６４のポリペプチドから選択されること特徴とする、リステリア菌のポリペプチドもまた本発明の対象である。
【００６０】
本発明はまた、下記ａ）〜ｅ）から選択されるポリペプチドを含んでなるポリペプチドを含む：
ａ）本発明のポリペプチド、
ｂ）本発明のポリペプチドと少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すポリペプチド、
ｃ）本発明のポリペプチド、またはｂ）で定義されるポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸の断片、
ｄ）本発明のポリペプチド、またはｂ）もしくはｃ）で定義されるポリペプチドの生物学的に活性なポリペプチド断片、
ｅ）本発明のポリペプチド、またはｂ）、ｃ）もしくはｄ）で定義されるポリペプチドの改変ポリペプチド。
【００６１】
上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も本発明の主題である。
【００６２】
本明細書において「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」および「タンパク質」は相互に使用できる。
【００６３】
本発明は天然形態にあるポリペプチドに関するものでない、すなわちそれらはそれらの天然環境では得られないが、天然供給源からの精製によりそれらを単離するまたは得る、または遺伝子組換えまたは化学合成によりそれらを得ることができ、その結果、それらは以下に記載するような異常なアミノ酸を含んでなるものと理解すべきである。
【００６４】
「別のものとある割合％の同一性を有するポリペプチド」とは、「相同ポリペプチド」とも記載されるが、天然のポリペプチドに対し、ある改変、特に少なくとも１個のアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断、伸長、キメラ形成および／または変異を有するポリペプチドまたは翻訳後修飾を受けたポリペプチドをいうものである。相同ポリペプチドとしては、そのアミノ酸配列が本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の相同性を示すものが好ましい。置換の場合、１個以上の連続または非連続アミノ酸が「等価な」アミノ酸で置き換えられる。「等価なアミノ酸」とは、本明細書ではその対応するペプチドの生物学的活性を実質的に改変することなく基本構造のアミノ酸の１つと置換可能であり、後に定義されるいずれかのアミノ酸をいうものである。
【００６５】
これらの等価なアミノ酸は、それらが置き換わるアミノ酸との構造的相同性、または構成されるべき種々のポリペプチドの生物学的活性の比較アッセイの結果のいずれかに基づいて決定される。
【００６６】
例示として、その対応する改変ポリペプチドの生物学的活性に大きな改変をもたらすことなく行われる置換の可能性を挙げる。例えば、ロイシンをバリンまたはイソロイシンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、グルタミンをアスパラギンに、アルギニンをリジンに、置き換えることができるが、同じ条件下で逆置換も当然考えられる。
【００６７】
相同ポリペプチドはこれまでに定義した相同または同一ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに相当する。このため、本発明の定義において、相同ポリペプチドは、リステリア菌に存在することがある、変異ポリペプチドまたは異種間または同一種内変化に相当するポリペプチド、特に、少なくとも１個のアミノ酸残基の末端切断、置換、欠失および／または付加に相当するポリペプチド、を含んでなる。
【００６８】
２つのポリペプチド間の同一性％を２つの核酸配列間の場合と同様に算出されると考えられる。よって、２つのポリペプチド間の同一性％は、これら２配列の最適アラインメント後に最大相同性のウィンドウで算出する。最大相同性のウィンドウを定義するために核酸配列の場合と同じアルゴリズムを使用することができる。
【００６９】
「本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片」とは、特に、以下で定義するような、本発明のポリペプチドの生物学的特徴の少なくとも１つを有するポリペプチド断片、具体的には通常、例えば：
酵素（代謝）活性または有機もしくは無機化合物の生合成または生分解に関与する活性、
構造的活性（細胞包膜、シャペロン分子、リボソーム）、
輸送活性（エネルギー輸送、イオン輸送）、もしくはタンパク質分泌における活性、
複製、増幅、調製、転写、翻訳または成熟、特にＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の成熟プロセスにおける活性
などの活性、部分活性でさえ示し得るポリペプチド断片をいう。
【００７０】
「本発明のポリペプチド断片」とは、少なくとも５個、好ましくは１０、１５、２５、５０、１００および１５０個のアミノ酸を含んでなるポリペプチドをいう。
【００７１】
ポリペプチド断片はリステリア菌株に自然に存在する単離または精製断片、またはトリプシンまたはキモトリプシンなどのタンパク質分解酵素または化学試薬（臭化シアン、ＣＮＢｒ）でのそのポリペプチドの切断、またはそのポリペプチドを高酸性環境（例えば、ｐＨ＝２．５）に置くことにより得られる断片に相当する。ポリペプチド断片は化学合成によっても、その断片を発現させる核酸を含み、好適な調節および／または発現エレメントの制御下に置かれた本発明の発現ベクターで形質転換した宿主を用いても作製できる。
【００７２】
本発明のポリペプチドの「改変ポリペプチド」とは、以下で記載する遺伝子組換えまたは化学合成によって得られるものであり、正常配列に対し少なくとも１つの改変、好ましくは正常配列に対し最大１０％の改変されたアミノ酸を有するポリペプチドをいうものである。これらの改変は、特に活性の特異性または効果に必要な、または本発明のポリペプチドの構造コンホーメーション、電荷または疎水性を担うアミノ酸に含まれる。よって、活性が同等、高いもしくは低い、または特異性が同等、狭いもしくは幅広いポリペプチドを作製することができる。改変ポリペプチドとしては、５個までのアミノ酸が改変、ＮもしくはＣ末端で末端切断、または欠失もしくは付加されたポリペプチドが挙げられる。
【００７３】
示すように、ポリペプチド改変の目的は、特に：
有機もしくは無機化合物の生合成または生分解方法においてそれを使用させる、
複製、増幅、転写の修復および制御、翻訳または成熟、特にＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の成熟方法においてそれを使用させる、
その改良された分泌をさせる、
その溶解性、またはその活性の効果もしくは特異性を調整する、またはそうでなければその精製を容易にする
ことである。
【００７４】
化学合成には異常なアミノ酸または非ペプチド結合を使用できるという利点もある。よって、異常なアミノ酸、例えばＤ型のもの、または特に硫黄含有形態のアミノ酸類似体を用いることが有利である。
【００７５】
本発明はリステリア菌ＥＧＤ−ｅゲノムのヌクレオチド配列とあるポリペプチド配列もまた提供するものである。当業者なら、公知の方法および好適なソフトウェアを用いて別のＯＲＦを同定することができる。
【００７６】
リステリア菌のゲノム配列で同定された遺伝子としては、ビタミンＢ１２生合成に関与する遺伝子が特に挙げられる（配列番号４２〜配列番号６４）。この細菌はこのビタミンを自然合成できるため、それらの合成を誘導する遺伝子の情報から当業者はこれらの遺伝子の発現を最大限にするまたはこのビタミンの生成を増大する目的でそれらを改変することができる。よって、本発明の対象は配列番号４２〜配列番号６４に相当する遺伝子を含む宿主細胞を開始基質とともに提供し、ビタミンＢ１２の生成に好適な条件下で培養し、かつそのビタミンを回収することを特徴とする、ビタミンＢ１２の製造方法でもある。宿主細胞は好ましくは細菌細胞、さらに好ましくはバチルスまたはリステリア属の細菌である。本発明の核酸もしくはポリペプチド配列を用いるビタミンＢ１２製造方法、本発明の宿主細胞、または本発明の動物もしくは植物もまた本発明の対象である。
【００７７】
一般に配列表の配列または対応するそれらのコード核酸配列は、当業者ならば、以下に挙げられる活性種別の各々に関する下記表１の配列の各々について認められる最も可能性の高い推定機能を用いて決定することができる。
【００７８】
このように、また好ましくは、本発明は、ビタミンＢ１２生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。それは好ましくは配列番号４２〜配列番号６４のポリペプチド配列である。
【００７９】
好ましくは、本発明は、細胞包膜ポリペプチドもしくはリステリア菌表面のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。それは好ましくは配列番号２〜配列番号４１のポリペプチド配列である。
【００８０】
好ましくは、本発明は、アミノ酸生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８１】
好ましくは、本発明は、補因子、配合団および輸送体の生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８２】
好ましくは、本発明は、細胞機構に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８３】
好ましくは、本発明は、中枢中間体代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８４】
好ましくは、本発明は、エネルギー代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８５】
好ましくは、本発明は、脂肪酸およびリン脂質の代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８６】
好ましくは、本発明は、ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８７】
好ましくは、本発明は、調節機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８８】
好ましくは、本発明は、複製プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００８９】
好ましくは、本発明は、転写プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９０】
好ましくは、本発明は、翻訳プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９１】
好ましくは、本発明は、タンパク質の輸送および結合プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９２】
好ましくは、本発明は、非定型条件への適応に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９３】
好ましくは、本発明は、医薬品および類似体感受性に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９４】
好ましくは、本発明は、トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９５】
好ましくは、本発明は、リステリア菌に特異的なポリペプチド、またはその断片をコードすることを特徴とする、本発明のヌクレオチド配列に関する。
【００９６】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、ビタミンＢ１２生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。それは好ましくは配列番号４２〜配列番号６４の配列のポリペプチドである。
【００９７】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、細胞包膜ポリペプチドもしくはリステリア菌の表面ポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。それは好ましくは配列番号２〜配列番号４１の配列のポリペプチドである。
【００９８】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、アミノ酸生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【００９９】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、補因子、配合団および輸送体の生合成に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１００】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、細胞機構に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０１】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、中枢中間体代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０２】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、エネルギー代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０３】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、脂肪酸およびリン脂質の代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０４】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、ヌクレオチド、プリン、ピリミジンまたはヌクレオシドの代謝に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０５】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、調節機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０６】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、複製プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０７】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、転写プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０８】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、翻訳プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１０９】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、タンパク質の輸送および結合プロセスに関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１０】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、非定型条件への適応に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１１】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、医薬品および類似体感受性に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１２】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、トランスポゾンに関連する機能に関与するリステリア菌のポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１３】
もう１つの態様では、本発明の主題は好ましくは、リステリア菌に特異的なポリペプチド、またはその断片であることを特徴とする、本発明のポリペプチドである。
【０１１４】
しかしながら、生存生物は完全体であるため、完全体として扱う必要があることに注意することが重要である。よって、いずれもの生物が、その特性を開発しかつそれを示すことを可能にするには、種々の代謝経路間の相互作用が必要である。従って、上記の分類は限定されるものではなく、２つの異なる代謝経路に関与する可能性のある遺伝子と考えるべきである。
【０１１５】
また、本発明の対象はその配列が記録媒体に記録され、その形式および性質がその配列の読み取り、解析および／または利用の助けとなる、本発明のヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド配列である。これらの媒体は本発明から抽出されるその他の情報、特に既に公知の配列との類似性、ならびに／または他の微生物のヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチド配列に関する情報を収容して得られた結果の比較解析および／または利用の助けともなる。
【０１１６】
これらのその記録媒体としては、特に磁気、光学、電気またはハイブリッド媒体などのコンピューター読み取り可能媒体、特にコンピューターディスク、ＣＤ−ＲＯＭおよびコンピューターサーバーが挙げられる。かかる記録媒体もまた本発明の対象である。
【０１１７】
情報を提供する本発明の記録媒体は、リステリア菌またはこの生物の近縁系統における遺伝子同定のためのヌクレオチドプライマーまたはプローブを選択するのに非常に有用である。同様に、これらの媒体によってリステリア菌ｅｇｂゲノムのヌクレオチド配列だけでなくその配列のゲノム構成までも提供される場合には、リステリア菌近縁系統の遺伝子多形を、特に共線領域を同定することにより調べるためのこれらの媒体の使用が非常に有用である。よって、本発明の記録媒体の使用もまた本発明の対象である。
【０１１８】
種々の配列間の相同性解析は、実際には上記のＢｌａｓｔプログラムまたはＧＣＧパッケージのプログラムなどの配列比較プログラムを用いて行うことが有利である。
【０１１９】
本発明は本発明のヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターにも向けられている。特に、細胞包膜もしくは表面ポリペプチド、または細胞機構、特に分泌、中枢中間体代謝、特に糖生成、エネルギー代謝およびビタミンＢ１２生合成、転写および翻訳およびポリペプチド合成プロセスに関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が好ましい。
【０１２０】
本発明のベクターは、好ましくは所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌をさせるエレメントを含んでなる。
【０１２１】
また、ベクターはプロモーター、翻訳開始および決定シグナル、さらに転写調節に好適な領域を含んでなる。それは宿主細胞において安定した状態で維持される必要がある。それは所望により翻訳されたタンパク質の分泌を示す特定のシグナルを含み得るものである。これらの種々のエレメントは用いる細胞性宿主に応じて当業者により選択され、最適なものとされる。この結果、本発明のヌクレオチド配列をベクターに挿入し、これを選択された宿主で自己複製させてもよいし、またはこれが選択された宿主に組み込むベクターであってもよい。
【０１２２】
かかるベクターを当業者によって一般に用いられる方法により調製し、得られたクローンをリポフェクション、エレクトロポレーション、熱衝撃または化学的方法などの標準法を用いて好適な宿主に導入してもよい。
【０１２３】
本発明のベクターは、例えばプラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させる目的で宿主細胞を形質転換するのに有用である。
【０１２４】
本発明はまた本発明によるベクターで形質転換された宿主細胞も包含する。
【０１２５】
細胞性宿主は原核生物または真核生物系、例えば細菌細胞だけでなく、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳類細胞から選択される。昆虫細胞または植物細胞もまた使用される。好ましい本発明の宿主細胞は、特に原核生物細胞、好ましくはリステリア属、リステリア菌種またはリステリア菌種関連微生物に属す細菌である。本発明は本発明の形質転換細胞を含んでなるヒト以外の動物にも関する。本発明の形質転換細胞を本発明の組換えポリペプチドの製造方法に用いることができる。本発明のベクターおよび／または本発明のベクターで形質転換された細胞を使用することを特徴とする組換え形態の本発明のポリペプチドを製造する方法は、その方法自体が本発明に含められる。好ましくは、本発明のベクターで形質転換された細胞をそのポリペプチドを発現させる条件下で培養し、かつ、その組換えポリペプチドを回収する。本発明の宿主細胞を食品組成物の製造に用いてもよく、その方法自体が本発明の対象である。
【０１２６】
記載したように、細胞性宿主は原核生物または真核生物系から選択される。特に、かかる原核生物または真核生物系の分泌を助ける本発明のヌクレオチド配列を同定することができる。そのため、かかる配列を有する本発明のベクターを分泌させようとする組換えタンパク質の製造に使用することが有利である。結果として、対象となる組換えタンパク質が宿主細胞内部ではなく細胞培養物上清に存在することからそれらの精製は容易である。
【０１２７】
本発明のポリペプチドは化学合成によっても製造できる。かかる製造方法もまた本発明の対象である。当業者であれば、化学合成法、例えば固相を用いる技術（特にＳｔｅｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， １１１， ２ｎｄ ｅｄ． （１９８４）を参照）または断片縮合または通常の液相合成による部分固相を用いる技術については周知である。化学合成により得られたポリペプチドは対応する異常アミノ酸を含む可能性があり、これも本発明に含められる。
【０１２８】
また、本発明は少なくとも１つの本発明のポリペプチドまたはその断片とヒトまたは動物で免疫応答を誘導し得るポリペプチド配列を有する雑種ポリペプチドにも関する。
【０１２９】
有利には、細胞性応答または体液性応答を誘導し得る抗原決定基である。
【０１３０】
かかる抗原決定基はマルチプルエピトープに対する抗体の合成を誘導し得る免疫組成物を得るために用いる糖付加形態の本発明のポリペプチドまたはその断片を含んでなる。
【０１３１】
これらの分子は本発明のポリペプチドまたはその断片を有する分子部分と所望により免疫成分、特にジフテリア毒、破傷風毒、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（特許ＦＲ ７９ ２１８１１）、小児麻痺ウイルスのＶＰＩ抗原、またはいずれかの他のウイルスもしくは細菌抗原もしくは毒素のエピトープと組み合わせてなる。
【０１３２】
本発明の雑種分子の合成方法には、所望のポリペプチド配列をコードする雑種ヌクレオチド配列を構築する遺伝子工学において用いられる方法も含まれる。例えば、Ｍｉｎｔｏｎにより１９８４年に報告された融合タンパク質をコードする遺伝子を得る技術を参照するとよい。
【０１３３】
その雑種ヌクレオチド配列を発現させることで得られる組換えポリペプチドであることを特徴とする、雑種ポリペプチドをコードするその雑種ヌクレオチド配列および本発明の雑種ポリペプチドもまた本発明の一部である。
【０１３４】
本発明はその雑種ヌクレオチド配列の１つを含むことを特徴とするベクターもまた含む。そのベクターで形質転換された宿主細胞、その形質転換細胞の１つを含むトランスジェニック動物およびそのベクター、その形質転換細胞および／またはそのトランスジェニック動物を用いて組換えポリペプチドを製造する方法もまた当然、本発明の一部である。
【０１３５】
本発明のポリペプチドと免疫ポリペプチドとの結合は化学的または生物学的に行われる。よって、本発明によれば、１以上の結合エレメント、特にアミノ酸を導入し、本発明のポリペプチドと免疫刺激ポリペプチドとの結合、すなわち本発明のポリペプチドのＮまたはＣ末端で起こり得る免疫刺激抗原共有結合を容易にすることが可能である。この結合の二官能価試薬はこの結合を行うために選択された末端の関数として決定され、この結合技術は当業者には十分に公知のものである。
【０１３６】
ペプチド結合から誘導される複合体を遺伝子組換えによって製造してもよい。雑種ペプチド（複合体）は実際には組換えＤＮＡ技術によって抗原、免疫原またはハプテンペプチドをコードする配列を本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に挿入または付加することで製造される。遺伝子組換えにより雑種ペプチドを製造するこれらの技術は当業者には十分に公知のものである（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ， １９９６， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６０， ５１２−５３８を参照）。
【０１３７】
好ましくは免疫ポリペプチドがトキソイド、特にジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド、ストレプトコッカス誘導タンパク質（ヒト血清アルブミン結合タンパク質など）、ＯＭＰＡ膜タンパク質および外層膜タンパク質複合体、外層膜小胞または熱衝撃タンパク質を含有するペプチド群から選択される。
【０１３８】
本発明の雑種ポリペプチドは本発明のポリペプチドを特異的に認識し得るモノクローナルまたはポリクローナル抗体を得るのに非常に有用である。実際には、本発明の雑種ポリペプチドは免疫分子と結合した本発明のポリペプチドに対する免疫応答を増強させる。本発明のポリペプチドを認識するかかるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、その断片、またはキメラ抗体もまた本発明の対象である。
【０１３９】
特異的なモノクローナル抗体はＫｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５）によって報告されたハイブリドーマ培養の慣例法により得てもよい。
【０１４０】
本発明の抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。これは免疫複合体または検出および／もしくは定量可能なシグナルを得るために標識された抗体の形であってもよい。
【０１４１】
このように本発明の抗体は、生体サンプルにおいてリステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定する方法であって、以下の工程：
ａ）生体サンプルを本発明の抗体と接触させ、
ｂ）形成し得る抗原−抗体複合体を確認する
ことを含んでなることを特徴とする方法で使用できる。
【０１４２】
本発明の抗体をリステリア菌株または関連微生物の遺伝子発現の検出に用いることもできる。詳しくは、リステリア菌株または関連微生物を本発明の抗体と接触させるた後に形成される抗原−抗体複合体の存在を介して、その発現産物に特異的な抗体によって認識される遺伝子の発現産物の存在を検出することができる。用いる細菌株を「調製」、すなわち遠心分離し、溶解し、さらに免疫反応に好適な媒体を構成する好適な試薬に入れておいた。特に、還元条件の存在または不在下で細菌株溶解液のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後に行われるウェスタンブロットに類似した遺伝子の発現を検出する方法が好ましい。ポリアクリルアミドゲルでタンパク質が移動および分離した後、そのタンパク質を好適なメンブラン（例えば、ナイロン製）に移し、タンパク質または対象となるポリペプチドの存在をそのメンブランを本発明の抗体と接触させることで検出する。
【０１４３】
このように、本発明はまた、記載の方法（リステリア属または関連微生物の発現を検出する、またはリステリア菌種に属する細菌または関連微生物に属す細菌を検出および／または同定する）を行うキットまたはパックであって、
以下の要素：
ａ）本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
ｂ）所望により、免疫反応に好適な媒体を構成する試薬、
ｃ）所望により、免疫反応によって生じた抗原−抗体複合体を確認する試薬
を含んでなるキットまたはパックを含む。
【０１４４】
本発明のポリペプチドおよび抗体を支持体、特にタンパク質チップに固定化することが有利である。かかるタンパク質チップもまた本発明の対象であり、リステリア菌以外の微生物のポリペプチドまたはリステリア菌以外の微生物の化合物に対する抗体もまた少なくとも１つ含んでもよい。
【０１４５】
本発明のタンパク質を含むタンパク質チップまたは高密度フィルターを本発明のＤＮＡチップと同様に構築することができる。実際にはタンパク質チップに直接結合したポリペプチドの合成を行う、またはｅｘ ｓｉｔｕ合成後に合成したポリペプチドをそのチップに結合させる工程を行うことができる。かなり大きなタンパク質を支持体に結合させたい場合には後者の方法が好ましく、このタンパク質を遺伝子工学により製造することが有利である。しかしながら、そのチップ支持体にペプチドだけを結合させたい場合にはそのペプチドを直接ｉｎ ｓｉｔｕ合成する方がより有利である。
【０１４６】
本発明のタンパク質チップを、リステリア菌種または微生物関連の細菌を検出および／または同定するキットまたはパックにおいて、またはより一般的には微生物を検出および／または同定するキットまたはパックにおいて使用することが有利である。本発明のポリペプチドをＤＮＡチップに結合させる場合、試験サンプル中の抗体の存在が調べられるが、本発明の抗体をタンパク質チップ支持体へ結合させた場合にはその抗体が特異性を示すタンパク質の同定がなされる。
【０１４７】
好ましくは本発明の抗体をタンパク質チップ支持体へ結合させ、リステリア菌または関連微生物に特異的なその対応する抗原の存在を検出する。
【０１４８】
上記のタンパク質チップを、遺伝子産物を検出し、その遺伝子の発現プロフィールを確立するために本発明のＤＮＡチップとともに用いてもよい。
【０１４９】
本発明のタンパク質チップは所与の微生物の種々のタンパク質間の相互作用を調査するプロテオミック試験にも非常に有用である。簡潔には、生物の種々のタンパク質の代表的ペプチドを支持体に結合させる。その支持体を標識タンパク質と接触させ、所望によりすすぎ工程を行い、その後、その標識タンパク質とそのタンパク質と結合したペプチドとの相互作用を確認する。
【０１５０】
このように、本発明のポリペプチド配列を含むタンパク質チップおよび本発明の抗体は、それらがキットまたはパックに含まれることから本発明の対象である。
【０１５１】
本発明は本発明のヌクレオチド配列を用いる、生体サンプルにおいてリステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定する方法も包含する。
【０１５２】
本発明において、「生体サンプル」とは、生存生物から採取したサンプル（特に、哺乳類から採取した血液、組織、器官またはその他のサンプル）、または生体材料、すなわちＤＮＡを含むサンプルを示すことは理解されるであろう。よって、生体サンプルには細菌を含む食品組成物（例えば、チーズ、乳製品）、さらに酵母を含む食品組成物（ビール、パン）他が含まれる。
【０１５３】
本発明のヌクレオチド配列を用いる検出および／または同定方法は本来、多くのものがある。
以下の工程：
ａ）所望により、解析する生体サンプル由来のＤＮＡを単離するか、またはその生体サンプルのＲＮＡ由来のｃＤＮＡを得、
ｂ）本発明の少なくとも１種のプライマーを用い、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物のＤＮＡを特異的に増幅させ、
ｃ）その増幅産物を確認する
ことを含んでなる方法が好ましい。
【０１５４】
この方法は特にポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの特異的増幅に基づくものである。
【０１５５】
以下の工程：
ａ）本発明のヌクレオチドプローブを、そのプローブをリステリア菌種に属す細菌または関連微生物の核酸とハイブリダイズさせる条件下で、生体サンプル（なお、この生体サンプルに含まれる核酸は、適当であれば、従前にハイブリダイゼーションしやすかったものである）と接触させ、
ｂ）核酸プローブと生体サンプルのＤＮＡとの間で形成し得る雑種を確認することを含んでなる方法が好ましい。
【０１５６】
かかる方法は対象とする生体サンプルに含まれるＤＮＡの存在を検出することに限定すべきでなく、該サンプルに含まれるＲＮＡを検出するのにも使用できる。この方法は特にサザンブロッティングおよびノーザンブロッティングを包含する。
【０１５７】
本発明のもう１つの好ましい方法は、以下の工程：
ａ）本発明の支持体に固定化されたヌクレオチドプローブを、そのプローブをリステリア菌種に属す細菌または関連微生物の核酸とハイブリダイズさせる条件下で、生体サンプル（なお、このサンプルの核酸は、適当であれば、従前にハイブリダイゼーションしやすかったものである）と接触させ、
ｂ）支持体に固定化されたヌクレオチドプローブと生体サンプルに含まれる核酸との間で形成し得る雑種を、適当であれば、プローブとハイブリダイズさせなかった生体サンプルのＤＮＡを除去した後に、本発明の標識ヌクレオチドプローブを接触させ、
ｃ）工程ｂ）で形成した新しい雑種を確認する
ことを含んでなる。
【０１５８】
この方法は本発明のＤＮＡチップとともに用いるのが有利であり、該チップの表面に存在するプローブとハイブリダイズする核酸を探し、標識プローブを用いて検出する。この方法は本発明のプライマーを用い、ＤＮＡまたは所望により逆転写によって得られる相補的ＤＮＡを増幅する前工程と組み合わせて行うのが有利である。
【０１５９】
このように本発明はまた、以下の要素：
ａ）本発明のヌクレオチドプローブ、
ｂ）所望により、ハイブリダイゼーション反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）所望により、本発明の少なくとも１種のプライマー、およびＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパックを包含する。
【０１６０】
同様に、本発明はまた、以下の要素：
ａ）捕捉プローブと呼ばれる、本発明のヌクレオチドプローブ、
ｂ）検出プローブと呼ばれる、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ、
ｃ）所望により、本発明の少なくとも１種のプライマー、およびＤＮＡ増幅反応に必要な試薬
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパックを包含する。
【０１６１】
最後に、以下の要素：
ａ）本発明の少なくとも１種のプライマー、
ｂ）所望により、ＤＮＡ増幅反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）所望により、増幅断片の配列を確認する成分、より詳しくは本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
を含んでなることを特徴とする、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物を検出および／または同定するキットまたはパックも本発明の主題である。
【０１６２】
好ましくは、本発明の方法および／またはキットもしくはパックに用いられる本発明の該プライマーおよび／またはプローブおよび／またはポリペプチドおよび／または抗体はリステリア菌種に特異的なプライマーおよび／またはプローブおよび／またはポリペプチドおよび／または抗体から選択される。好ましくは、これらの要素は、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、分泌ポリペプチドから、またはリステリア菌の分泌ポリペプチドに対する抗体から選択される。
【０１６３】
本発明のヌクレオチド配列、特にＯＲＦ配列、またはその調節エレメント（特にプロモーター）に１以上の突然変異を含むリステリア菌、および／または関連微生物の株も本発明の主題である。
【０１６４】
本発明によれば、細胞機構、特に分泌、中枢中間体代謝、エネルギー代謝、ならびにアミノ酸合成、転写・翻訳、およびポリペプチド合成のプロセスに関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に１以上の突然変異を有するリステリア菌株が好ましい。
【０１６５】
該突然変異はこの遺伝子の不活性化をもたらし、特にそれらが該遺伝子の調節エレメントにある場合にはこの遺伝子の過剰発現をもたらす。
【０１６６】
本発明はまた、遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害、および／または真核細胞もしくは原核細胞における細胞複製を改変し得る、あるいはリステリア菌またはそれに関連する微生物の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化し得る有機または無機化合物を選択するための、本発明のヌクレオチド配列、本発明のポリペプチド、本発明の抗体、本発明の細胞、および／または本発明の形質転換動物の使用に関する。
【０１６７】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片と結合し得るか、本発明のヌクレオチド配列と結合し得るか、または本発明の抗体を認識し得る、かつ／または遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害し得る、かつ／または真核細胞もしくは原核細胞における細胞の増殖もしくは複製を改変し得る、あるいは動物またはヒトにおいてリステリア菌もしくはそれに関連する微生物の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化し得る化合物を選択する方法であって、
以下の工程：
ａ）該化合物を該ポリペプチドまたは該ヌクレオチド配列と、または請本発明の形質転換細胞と接触させ、かつ／または該化合物を本発明の形質転換動物に投与し、
ｂ）該化合物が該ポリペプチドまたは該ヌクレオチド配列と結合する能力、または遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害する能力、または細胞増殖もしくは複製を調整する能力、または該形質転換動物においてリステリア菌もしくはそれに関連する微生物の感染に関連した病状を誘導、阻害または悪化する能力を測定する
ことを含んでなる方法も含む。
【０１６８】
本発明の形質転換細胞および／または動物をモデルとし、リステリア菌により誘導または悪化した病状の原因である、または例えば、生殖器、眼、または全身疾患、特にリンパ系疾患などのこれらの病状を予防および／または治療する化合物を調査、同定および／または選択する方法において使用することが有利である。特に、本発明のベクターとの形質転換で、例えばその感染能力が増強または阻害される、または感染により通常誘導または悪化する病状を調整することのできる形質転換宿主細胞、とりわけリステリア属の細菌を使用して病状が明らかに顕れている動物を感染させる。例えば、形質転換リステリア菌に感染させたこれらの非形質転換動物を調査モデルとする。同様に、本発明の形質転換動物をリステリア菌が原因の病気を予防または治療し得る化合物を選択する方法において使用する。形質転換細胞および／または形質転換動物を使用するこの方法もまた本発明の一部である。
【０１６９】
選択される化合物はポリペプチドまたは炭水化物などの有機化合物、またはいずれか他の周知の有機もしくは無機化合物、または分子モデリング技術により開発された、または化学もしくは生化学合成により得られた新規な化合物である。これらの技術は当業者であれば周知のものである。
【０１７０】
この選択された化合物を、リステリア菌またはいずれか他の関連微生物の細胞増殖および／または複製を調整するために、およびこれら微生物による感染を制御するために使用する。また、この本発明の化合物をいずれかの真核生物または原核生物細胞、特に腫瘍細胞および感染微生物の細胞増殖および／または複製を調整するためにも使用し、その化合物がそれに対して活性であることを確認する。その調整を決定する方法は当業者には十分に周知のものである。
【０１７１】
「微生物の増殖を調整し得る化合物」とは、その微生物の発生、増殖、増殖率および／または生存能力を干渉、改変、制限および／また低減し得るいずれかの化合物をいうものである。
【０１７２】
この調整は、例えばタンパク質と結合することでその生物学的活性を阻害または増強し得る、または微生物の外層膜表面タンパク質と結合してその微生物の宿主細胞への侵入を防ぐ、またはその微生物に対する感染生物の免疫系の作用を促進し得る薬剤を用いて行う。また、この調整を、微生物のＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列と結合して、例えばその生物学的または構造的活性がその微生物の増殖または繁殖に必要であるペプチドの発現を阻害し得る薬剤を用いて行ってもよい。
【０１７３】
本発明における「関連微生物」とは、本発明の化合物によりその遺伝子発現を調整、調節、誘導もしくは阻害し得る、またはその細胞増殖もしくは複製もまた調整し得るいずれかの微生物をいうものである。また、本発明における「関連微生物」とは、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドを含んでなるいずれかの微生物をいうものである。これらの微生物が本発明のものと同一または相同であるポリペプチドまたはヌクレオチド配列を含んでなる場合もある。本発明の検出および／または同定方法またはキットを用いて検出および／または同定し、またそれは本発明の化合物の標的として機能する。
【０１７４】
本発明は、本発明の選択方法を用いて選択される化合物に関する。
【０１７５】
本発明はまた、以下の化合物：
ａ）本発明のヌクレオチド配列、
ｂ）本発明のポリペプチド、
ｃ）本発明のベクター、
ｄ）本発明の抗体、および
ｅ）本発明の選択方法を用いて選択される化合物
から選択される化合物を、所望により医薬上許容されるビヒクルと組み合わせて含んでなる医薬組成物に関する。
【０１７６】
「有効量」とは本発明の化合物もしくは抗体またはポリペプチドの、リステリア菌または関連微生物の増殖を調整するのに十分な量を表すものとする。
【０１７７】
本発明はまた、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物の感染症を予防または治療する、本発明の医薬組成物に関する。
【０１７８】
本発明はまた、本発明の１以上のポリペプチド、および／または本発明の１以上の雑種ポリペプチドを含んでなることを特徴とする、免疫および／またはワクチン組成物に向けられる。
【０１７９】
本発明はまた、ワクチン組成物を製造するための、本発明の形質転換細胞の使用を含んでなる。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、本発明のベクター、および／または本発明の形質転換細胞を含むことを特徴とする、ワクチン組成物に向けられる。
【０１８１】
本発明はまた、リステリア菌種に属す細菌または関連微生物の感染を予防または治療するための、本発明のワクチン組成物に関する。
【０１８２】
好ましくはリステリア菌または関連微生物感染症の予防および／または治療を意図した本発明の免疫および／またはワクチン組成物は、リステリア菌の細胞包膜のポリペプチドまたはその断片、対応するタンパク質またはその断片を含んでなる、免疫および／またはワクチン組成物から選択される。ヌクレオチド配列を含んでなるワクチン組成物は好ましくはまた、リステリア細胞包膜のポリペプチドまたはその断片、対応するタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドも含んでなる。
【０１８３】
これらの好ましい免疫および／またはワクチン組成物のうち、その配列がこの機能グループに同定され、従前に一覧化されているヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から選択されるポリペプチドもしくはその断片、またはヌクレオチド配列もしくはその断片を含んでなるものが好ましい。
【０１８４】
本発明の免疫組成物の一部となる本発明のポリペプチドまたはその断片は、例えばその増殖またはインターロイキンの分泌を起こす、また該ポリペプチドに対する抗体の産生をもたらすＴ細胞を刺激する該ポリペプチドの能力など、当業者に公知の技術を用いて選択できる。
【０１８５】
ヒトで用いる用量に匹敵する用量重のワクチン組成物を投与するマウスでは、抗体反応は、通常の技術に従い、血清サンプルを採取した後、血清中の存在する抗体とワクチン組成物の抗原の間での複合体の形成を調べることで試験する。
【０１８６】
本発明によれば、該ワクチン組成物は医薬上許容されるビヒクル、および適当であれば１以上の好適な免疫アジュバントと組み合わせるのが好ましい。
【０１８７】
現在、多種のワクチンが感染症からヒトを保護するのに利用できる：弱毒生菌微生物（ウシ結核菌（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）−結核のＢＣＧ）、不活性化微生物（フルウイルス）、無細胞抽出液（百日咳の百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、組換えタンパク質（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）および多糖類（肺炎球菌）。合成ペプチドから製造されたワクチンまたは異種抗原を発現する遺伝子組換え微生物から製造されたワクチンは試験中である。もっと最近では、免疫防御抗原をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡが代替のワクチン法として提案されている。この種のワクチンは、ｉｎ ｖｉｖｏでは複製せず、かつ、免疫タンパク質をだけをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドに由来する特定のプラスミドで形質転換されている。動物は裸のプラスミドＤＮＡを筋肉に単に注入することにより免疫化されてきた。この技術はｉｎ ｓｉｔｕにおける免疫タンパク質の発現、および細胞型（ＣＴＬ）および体液型（抗体）の免疫応答をもたらす。この免疫応答の二重の誘導は裸のＤＮＡによるワクチン技術の主な利点の１つである。
【０１８８】
ヌクレオチド配列または配列が挿入されているベクターを含んでなるワクチン組成物は特に国際出願ＷＯ９９／１１０９２および国際出願ＷＯ９５／１１３０７にも記載されている。
【０１８９】
本発明のワクチン組成物を構成するヌクレオチド配列は、このポリペプチドの細胞への透過またはその細胞核への輸送を促進する化合物に連結された後に宿主に注入すればよい。得られた複合体は、国際出願ＷＯ９４／２７２３８（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に記載のように、高分子微粒子に封入してもよい。
【０１９０】
本発明のワクチン組成物のもう１つの態様によれば、ヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡをＤＥＡＥ−デキストランと、核タンパク質と、もしくは脂質と複合体を形成させるか、またはリポソームに封入するか、あるいは細胞へのトランスフェクション助けるゲルの形に導入する。本発明のポリペプチドまたはベクターはまたバッファー溶液に懸濁させてもよいし、あるいはリポソームと結合させてもよい。
【０１９１】
有利には、かかるワクチンは１９９６年にＴａｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．またはＨｕｙｇｅｎ ｅｔ ａｌにより記載された方法に従い、または国際出願ＷＯ９５／１１３０７においてＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．により記載された技術に従って製造する。
【０１９２】
かかるワクチンはまた、ヒトまたは動物での発現のための調節エレメントの制御下に置いた本発明のベクターを含有する組成物の形態で製造してもよい。対象となるポリペプチド抗原のｉｎ ｖｉｖｏ発現のためのベクターとしては、例えばプラスミドｐｃＤＮＡ３またはプラスミドｐｃＤＮＡ１／ｎｅｏが使用でき、両者ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）製である。かかるワクチンは組換えベクターの他、生理食塩水、例えば塩化ナトリウム溶液を含んでなるのが有利である。
【０１９３】
「医薬上許容されるビヒクル」とは、医薬組成物またはワクチン組成物中に含まれ、いずれの副反応も起こさず、かつ、例えば有効化合物の投与を助ける、生物内でその寿命を長くする、かつ／またはその有効性を高める、溶液においてその溶解度を高める、あるいはその保存を向上させる、化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの医薬上許容されるビヒクルは周知であり、選択された有効化合物の性質および投与方法に応じて当業者が調節する。
【０１９４】
ワクチン製剤については、例えば水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミルのペプチド誘導体のあるものなどムラミルペプチド系の代表的なもの、細菌溶解液、またはフレンドの不完全アジュバントといった当業者に公知の好適な免疫アジュバントを含んでもよい。
【０１９５】
好ましくは、これらの化合物は全身投与、特に静脈、筋肉内、皮内または皮下、あるいは経口投与される。より詳しくは、本発明のポリペプチドを含んでなるワクチン組成物は数回皮内または皮下投与して、経時的に拡散させる。
【０１９６】
これらの化合物の最適な投与法、用量および医薬形態は一般に、例えば患者の年齢もしくは体重、患者の健康状態の重篤度、注目される治療許容および副作用など、患者にとっての好適な治療を確立することを考慮に入れた基準に従って定めることができる。
【０１９７】
本発明は、リステリア菌によって引き起こされる、または悪化する生殖器疾患を治療または予防するための、本発明の組成物の使用を含んでなる。
【０１９８】
最後に、本発明は、リステリア菌の存在によって引き起こされる、または悪化する疾患を治療または予防するための、本発明の組成物の使用を含んでなる。
【０１９９】
最後に、本発明は、リステリア菌の存在によって引き起こされる、または悪化する全身性疾患、特にリンパ系の疾患を治療または予防するための、本発明の組成物の使用を含んでなる。
【０２００】
さらに、本発明の主題はまた、リステリア属、好ましくはリステリア菌、好まＥＧＤ−ｅ株の細菌のゲノムＤＮＡライブラリーでもあり、該ＤＮＡライブラリーは細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングされている。かかるゲノムＤＮＡライブラリーはリステリアゲノムの著しく大きな挿入、特に５０〜２００ｋｂの間の長さの挿入を含む。
【０２０１】
コスミド系に比べてＢＡＣ系を用いる利点の１つは、形質転換細胞当たりに用いられるプラスミドが１コピー、または最大でも２コピーだけであり、これによりＤＮＡ断片間の組換えの可能性が小さくなり、より重要なことには、細菌にクローニングされた遺伝子の致死的な過剰発現の危険性がなくなるということである。しかし、ＢＡＣが１コピーで存在するということは、その配列に対して十分なＤＮＡを得るのに大量の培養物からプラスミドを抽出しなければならないことを意味する。さらに、クローンがＢＡＣライブラリーで維持される安定性および忠実度は、種々のリステリア株間のゲノムの違いの同定、および種々の株間で見られる表現型のバリエーションを司るこれらの遺伝子の違いの同定を見込んだものである。
【０２０２】
本発明で記載されるゲノムＤＮＡライブラリー、特に２０００年４月１１日にＣＮＣＭ［Ｎａｔｕｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］にＩ−２４３９として寄託されたＬＭ＿ｂａｃｌｉｍライブラリーは事実上リステリア菌ゲノムを覆うものである。しかし、大腸菌の致死性の問題のためにある領域がこのライブラリーにクローニングできなかったとしても、これらの領域は当業者により、コンティグをなす種々のクローンの末端の配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて容易に増幅および同定することができる。
【０２０３】
本発明はまた、あるリステリア株に存在するが別の株には存在しない、対象とするポリヌクレオチドを単離する方法に関し、それはリステリアゲノムを含むＢＡＣに基づく少なくとも１つのＤＮＡライブラリーとして用いる。対象とするポリヌクレオチドを単離する本発明の方法は以下の工程：
ａ）リステリア起源の、ＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリー由来のクローンに含まれる少なくとも１種のポリペプチドを単離し、
ｂ）リステリアの少なくとも１種のゲノムポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡ（該リステリアは、工程ａ）のＢＡＣ　ＤＮＡライブラリーを構築するのに用いた株とは異なる株に属す）か、または、
工程ａ）のＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリーを構築するのに用いたリステリアとは異なるリステリアのゲノムから作製したＢＡＣに基づくＤＮＡライブラリー由来のクローンに含まれる少なくとも１種のポリヌクレオチド
を単離し、
ｃ）工程ａ）のポリヌクレオチドと工程ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、
ｄ）工程ｂ）のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション複合体を形成しなかった、工程ａ）のポリヌクレオチドを選択し、
ｅ）選択したポリヌクレオチドを同定する
ことを含んでなる。
【０２０４】
工程ａ）のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの組換えＢＡＣクローンを好適な制限酵素で消化し、所望によりそれから得られたポリヌクレオチド挿入を増幅することで製造できる。
【０２０５】
このように本発明の方法は、当業者がリステリア属の種々の株または種の間、例えば病原株とそれらの非病原性の等価物の間のゲノム比較研究を行えるものである。
【０２０６】
特に、これらの株間の多形性の領域を検討および決定することができる。
【０２０７】
【実施例】
例１：　リステリア菌ＤＮＡのＢＡＣライブラリーの作製
平均重量８０ｍｇのリステリア菌染色体ＤＮＡ含有ブロックを当業者には公知な方法を用いてアガロースゲルで調製した。それらを５００ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０溶液に保存しておいた。
【０２０８】
８ブロックを用いてライブラリーを構築する。これらのアガロースブロックをＴＥ／ＰＭＳＦ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ　ＥＤＴＡ；１００μＭ　ＰＭＳＦ）で氷上で３０分間、２回洗浄する。次いで、アガロースブロックをＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で氷上で３０分間、２回洗浄する。各アガロースブロックを８つにスライスし、１６スライスを１本の試験管に一緒に入れる。次いで、それらのブロックをプレインキュベーション溶液（２０μＭ　スペルミジン、５ｍＭ　ＤＴＴ、１×制限バッファー）中、氷上で４０分間インキュベートする。プレインキュベーションバッファーを１回交換し、さらに４０分間インキュベートする。
【０２０９】
消化バッファー（２ｍＭ　スペルミジン、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、０．０２μｇ　ＢＳＡ、０．５×制限バッファー）中、４℃で３０分間、制限酵素を加えないで部分消化を行い、その後、試験管当たり０．１、０．２５、０．４または０．５単位のＥｃｏＲＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を３７℃で２時間加える。消化バッファーを２００μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡに置き換え、試験管を氷上におくことで部分消化を停止させる。
【０２１０】
次いで、アガロースブロックを０．５×ＴＢＥバッファーを含有する１％ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　アガロース（ＦＭＣ）ゲルに置く。その後、パルスフィールドゲル電気泳動を以下の条件で行う：
開始パルス時間：９０秒、
最終パルス時間：９０秒、
６Ｖ／ｃｍ、
角度：１２０°、
ゲル化時間：１６時間、１２℃。
【０２１１】
５０および２００ｋｂ間の領域をゲルから切り出し、３つの部分（５０〜１００ｋｂ、１００〜１５０ｋｂ、１５０〜２００ｋｂ）に分ける。クローニング用ゲルは臭化エチジウムで染色してはならない。
【０２１２】
これらのアガロースブロックを０．５×ＴＢＥバッファーを含有する新たな１％ＳｅａＫｅｍ　ＧＴＧ　アガロース（ＦＭＣ）ゲルに置く。さらなるパルスフィールドゲル電気泳動を以下の条件で行う：
開始パルス時間：５秒、
最終パルス時間：５秒、
４Ｖ／ｃｍ、
角度：１２０°、
ゲル化時間：１５時間、１２℃。
【０２１３】
ＤＮＡを臭化エチジウム染色せずに、再度、５０および２００ｋｂ間の領域をゲルから切り出し、３つの部分（５０〜１００ｋｂ、１００〜１５０ｋｂ、１５０〜２００ｋｂ）に分ける。
【０２１４】
アガロース切片を、各約１００ｍｇの小部分に切り分ける。
【０２１５】
アガロースを６７℃で１０分間インキュベートし、次いで４２℃まで冷却し、１μｌのβ−アガロース（ＦＭＣ、１Ｕ／μｌ）を加える。混合物を４２℃で３０分間インキュベートし、アガロースの消化完了後、６７℃で１０分間インキュベートし、次いで氷上でインキュベートしすることでβ−アガロースを変性させる。
【０２１６】
ＥｃｏＲＩで消化し、リン酸化した１５０ｎｇのＤＮＡベクター（ＣＩＰ， Ｒｏｃｈｅ）を用いてＢＡＣライブラリーを構築する。ベクターｐＢｅｌａＢＡＣ−Ｋａｎ（Ｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９８， ２５８， ５６２−７０）を用いて上記ライブラリーを構築する。そのために、１５０ｎｇの上記ベクターを１５０ｎｇのＤＮＡ挿入物とともに５単位のリガーゼ（ＵＳＢ１単位／μｌ）を含有する連結バッファー×１中、１２℃で１６時間でインキュベートする。
【０２１７】
連結バッファーは製造業者推奨のバッファーである。
【０２１８】
５μｌの連結反応物を４０μｌのＤＨ１０Ｂ電気反応性細胞に加えて形質転換を行い、エレクトロポレーションをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈエレクトロポレーターにて以下の条件で行う：
３３０μＦ、４ｋΩ、直流電圧：低抵抗値Ω、印加速度：高速、１．５ｍｍエレクトロポレーションキュベット。
【０２１９】
１ｍｍのＳＯＣ培地を細胞に加え、これを３７℃で４５分間インキュベートする。次いで、細胞を３０ｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび４０μｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌも含有するＬＢ寒天含有ディッシュで培養する。青色の細胞に対し、白色の組換え細胞を選択し、このようにして得られたクローン各々に対して制限マップを作製することでＢＡＣライブラリーを同定する。
【０２２０】
例２：　リステリア菌ゲノム配列のアノテーションおよび解析
バイオインフォマティクスはゲノム解析の３段階：ランダム配列決定法を用いて得られた挿入物のショットガン追跡調査、ゲノム配列解決段階、アノテーションにおいて主要な役割を果たしている。本願発明者はこれらの３つの要件を満たし得る完全なソフトウェアパッケージ：ＧＭＰ−Ｔｏｏｌ−ｂｏｘ（ＧＭＰＴＢ）を開発した。
【０２２１】
ショットガン追跡調査：
ランダム配列決定処理中、ＧＭＰＴＢが結果ファイル（Ｐｈｒａｐフォーマット）または構成に必要な特性（コンティグ数、配列数、他）から抽出し、それらを表として表示する。この表を用いてこの方法の進行を示し、構成プログラムを迅速に確認できるグラフを作成することができる。重要なことは、ＧＭＰＴＢでは構成結果の比較ができ、さらに新旧コンティグ（融合、形成など）の関係を説明するＨＴＭＬページが作成されるということである
【０２２２】
配列解決段階：
ＧＭＰＴＢでは種々の戦略を用いてコンティグ間の結合を推定する。ＧＭＰＴＢは特に、末端配列の位置および方向に基づき、結合し得る全てのクローンを検索する。これが間違った構成を示す場合もある。ＧＭＰＴＢはまたゲノム比較に基づき、コンティグ末端と他のゲノム配列との類似性（ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで）を検索することにより、結合を推定することもできる。
【０２２３】
アノテーション：
ＧＭＰＴＢは最終段階でアノテーションが開始できる、実際に、ＧＭＰＴＢは構成時に各オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対し個別のタンパク質ファイル（ＩＰＦ）を作成する。これらは下記の３カテゴリーのフィールドを含む特定の形式のテキストファイルである：
【０２２４】
−　最小フィールドにはＩＤ番号、バージョン数、位置および配列が収容される。出力されたヌクレオチド配列は、第１の停止コドン前に５００付加塩基、さらに第２の停止コドン後に２００付加塩基を含むオープンリーディングフレーム配列に相当する。
【０２２５】
−　自動フィールドには異なるプログラムによりＩＰＦに加えられた結果が収容される。それはＤＮＡ配列（リボソーム結合部位、プロモーターまたはターミネーター、コーディング能力などの検索）および推定タンパク質配列（相同性、ドメインなど）に関するものである。
【０２２６】
−　入力フィールドには使用者によって加えられた結果およびコメントが収容される。新規構成後、ＧＭＰＴＢは全てのＯＲＦを抽出し、これまでの構成で誘導されたＩＰＦ配列に従って新規ＩＰＦを作成する。ＧＭＰＴＢは各構成後の新規自動解析に唯一用いることができる改変ＩＰＦを認識する。
【０２２７】
この方法論の特異性は、その配列が改変されない限り、ＩＰＦのアノテーションが構成段階とは独立していることである。ＩＰＦはＳｙｂａｓｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａｂａｎｋ（ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ系）と接続しており、ウェブサーバーを介してアクセス可能である。それらはゲノム解析段階で多くの発明者らにより改変およびアノテーションが可能である。
【０２２８】
生体材料の寄託
以下の生物：
リステリア菌株ＥＧＤ−ｅ、番号Ｉ−２４４０；
リステリアＤＮＡのＢＡＣライブラリー（１４５クローン）、ＬＭ−ｂａｃｌｉｂ、番号Ｉ−２４３９
をブダペスト条約の規定に従い、２０００年４月１１日、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＣＮＣＭ） ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５， Ｆｒａｎｃｅに寄託した。
【０２２９】
ＢＡＣライブラリー（Ｉ−２４３９）を大腸菌株ＤＨ１０Ｂで作製し（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８７， ４６４５， １９９０）、ＥｃｏＲＩ酵素でリステリア菌ＤＮＡを部分消化した後、ベクターｐＢｅｌａＢＡＣ−Ｋａｎ（Ｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９８， ２５８， ５６２−７０）で構築した。
【０２３０】
【表１】
2004507217.tif 000002
2004507217.tif 000003
2004507217.tif 000004
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
2004507217.tif 000072
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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