(57)【要約】ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称する減数分裂活性化ステロールの２つの受容体を同定した。
2004506446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号 １もしくは配列番号 ３中の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズする単離および／または精製したポリヌクレオチド分子であって、ａ） ＭＡＳレセプター〔即ち、３β−ヒドロキシ−４， ４−ジメチルコレスト−８， １４，２４−トリエン（本明細書中でＦＦ−ＭＡＳと称する）と結合する能力を有する蛋白質〕もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（即ち、ＦＦ−ＭＡＳと結合する能力を有する蛋白質）；またはｂ） ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）のリガンド結合ドメイン；をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがＲＮＡアンチセンス配列であるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡ配列であるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリヌクレオチドであって、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）の活性を提示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプター （ＦＦ‐ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号 １または配列番号 ３のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１２ ヌクレオチドのプローブであって、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）をコードする核酸とハイブリダイズする能力のあるプローブ。
【請求項８】
請求項７に記載のプローブであって、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）、或いはその対立遺伝子の変種および種の変種をコードする遺伝子と；特異的にハイブリダイズする能力のある配列番号 １もしくは配列番号 ３中の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むプローブ。
【請求項９】
請求項８に記載のプローブであって、鎖長において約４０ から 約６０ヌクレオチドを含むプローブ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のプローブであって、検出可能なシグナルを提供するために標識されているプローブ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のプローブであって、配列番号 １または配列番号 ３のヌクレオチドを含むプローブ。
【請求項１２】
配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、且つａ）ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）；またはｂ）ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）のリガンド結合ドメイン；をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡ配列が、配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、且つ ａ） ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）；またはｂ） ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）のリガンド結合ドメインまたは膜貫通性ドメイン；をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクションされた培養細胞株、酵母もしくはバクテリア。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞株、酵母またはバクテリアであって、内在性のＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）を発現していない細胞株、酵母またはバクテリア。
【請求項１６】
単離および／または精製された、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）、そのペプチド断片、またはその塩。
【請求項１７】
請求項１６に記載の単離および／または精製された蛋白質であって、配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列またはＦＦ−ＭＡＳと結合できる該アミノ酸配列の配列を含む、単離および／または精製された蛋白質。
【請求項１８】
ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）と特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離された抗体であって、前記抗体がモノクローナル抗体である単離された抗体。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の単離された抗体であって、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に対するＭＡＳの結合をブロックする単離された抗体。
【請求項２１】
請求項１９または２０に１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２２】
ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に対して親和性を有する化合物またはその塩の存在を検出する方法であって、工程 ａ） 前記化合物を、ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）、そのペプチド断片またはその塩に、接触させることと；並びに工程ｂ） ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に対する前記化合物の親和性を測定することと、を含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＭＡＳ アンタゴニストの存在を検出するための方法であって、工程ａ） ＭＡＳを含むＭＡＳアゴニスト存在下で、化合物を、種々の条件下で応答経路に連結するＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に、前記ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）および前記経路を介した関連する応答と前記化合物との結合を許容する十分な時間だけ暴露させることと；並びに工程ｂ） 前記ＭＡＳアゴニスト単独での前記応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）と前記化合物の結合から生じる前記応答経路の刺激の減少を検出し、それからＭＡＳ アンタゴニストの存在を決定することと；を含む方法。
【請求項２４】
請求項２２〜２３の何れか１項に記載のＭＡＳアゴニストの存在を検出するための方法であって、工程ａ） ＭＡＳアンタゴニスト存在下で、化合物を、種々の条件下で応答経路に連結するＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に、前記ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）および前記経路を介した関連する応答と前記化合物との結合を許容する十分な時間だけ暴露させることと、並びに 工程ｂ） 前記ＭＡＳアンタゴニスト単独での前記応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）と前記化合物との結合から生じる前記応答経路の刺激の増加を検出し、それからＭＡＳアゴニストの存在を決定することと；を含む方法。
【請求項２５】
ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳ シグナル伝達ペプチド （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に対して親和性を有する化合物またはその塩であって、この化合物または塩が請求項２０または２１に記載の方法により検出される化合物またはその塩。
【請求項２６】
配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳ シグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）を産生する方法であって、ａ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳ シグナル伝達蛋白質の発現をコードする配列番号 １または配列番号 ３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクションされた細胞、酵母もしくはバクテリアを成育することと、並びにｂ） 前記ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）を前記細胞から単離することと、を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）が、免疫親和性精製により単離される方法。
【請求項２８】
ＭＡＳレセプター （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）に対して親和性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするためのキットであって、前記ＭＡＳレセプター（ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）、そのペプチド断片またはその塩、を具備するキット。
【請求項２９】
配列番号 ２に示されるアミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合する、その類似体。
【請求項３０】
配列番号 ２に示されるアミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なるとの条件を満たすその類似体。
【請求項３１】
配列番号 ４に示されるアミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合する、その類似体。
【請求項３２】
配列番号 ４に示されるアミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なるとの条件を満たすその類似体。
【請求項３３】
配列番号 ６に示される部分アミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合する、その類似体。
【請求項３４】
配列番号 ６に示される部分アミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なるとの条件を満たすその類似体。
【請求項３５】
配列番号 ８に示される部分アミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、好ましくは １０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合する、その類似体。
【請求項３６】
配列番号 ８に示される部分アミノ酸配列を含むＭＡＳレセプター、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なるとの条件を満たすその類似体。
【請求項３７】
請求項２９〜３６の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターであって、該レセプターは、例えば結合アッセイでリガンドを検出するのに適切な緩衝液中に存在する可溶性の精製された蛋白質であるＭＡＳレセプター。
【請求項３８】
請求項２９〜３７の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターであって、可溶性の精製された蛋白質であり、例えば結合アッセイでリガンドを検出するのに適切な緩衝液中に存在し、且つ配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なるとの条件を満たすＭＡＳレセプター。
【請求項３９】
ＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターをコードするＤＮＡ配列、またはその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードするＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４０】
ＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターをコードするＤＮＡ配列；または配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なるとの条件を満たすその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードするＤＮＡ配列；を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４１】
配列番号 １ に示されるＤＮＡ配列もしくはその断片；または親和定数 １００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、その機能的類似体をコードするＤＮＡ配列；を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４２】
請求項４１に記載のＤＮＡ構築物であって、配列番号 １ に示されるＤＮＡ配列もしくはその断片；または親和定数 １００ μＭ未満、好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なるとの条件を満たすその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列；を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４３】
請求項３９〜４２の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物であって、配列番号 ５に示される部分ＤＮＡ配列；または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合する、その機能的類似体をコードするＤＮＡ配列；を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４４】
請求項３９〜４３の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物であって、配列番号 ５に示される部分ＤＮＡ配列；または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合し、且つ配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なるとの条件を満たすその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列；を含むＤＮＡ構築物。
【請求項４５】
ＤＮＡ構築物に関する請求項３９〜４４の何れか１項に記載の挿入されたＤＮＡ構築物を保持する組換え型発現ベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載の組換え型発現ベクターを含有する細胞。
【請求項４７】
細胞のゲノム内に統合されるＤＮＡ構築物に関する請求項３９〜４４の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物を含有する細胞。
【請求項４８】
請求項４６〜４７の何れか１項に記載の細胞であって、該細胞が真核細胞、特に昆虫または哺乳類細胞である細胞。
【請求項４９】
ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、ＦＦ　ＭＡＳ活性のアゴニストまたはアンタゴニスト）をスクリーニングする方法であって、ＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターを、ＦＦ−ＭＡＳのアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＦＦ−ＭＡＳまたは その類似体と、インキュベーションすることと；並びに前記ＭＡＳレセプターに対するＦＦ−ＭＡＳまたは前記類似体の結合の任意の効果を検出することと；を含む方法。
【請求項５０】
ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、ＦＦ‐ＭＡＳ活性のアゴニストもしくはアンタゴニスト）をスクリーニングする方法であって、ＦＦ−ＭＡＳまたは その類似体を、ＦＦ−ＭＡＳの活性のアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターと、インキュベーションすることと；並びに前記レセプターに対するＦＦ−ＭＡＳまたは前記類似体の結合の任意の効果を検出することと；を含む方法。
【請求項５１】
ＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターの使用であって、ＦＦ−ＭＡＳの活性のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするための使用。
【請求項５２】
ＤＮＡ構築物に関する請求項３９〜４４の何れか１項に記載のＤＮＡ構築物の使用であって、ＭＡＳレセプターに関する請求項２９〜３８の請求項の何れか１項に記載のＭＡＳレセプターの組織および／または器官に特異的な変種を単離するための使用。
【請求項５３】
請求項５２に記載に従って単離されたレセプターの使用であって、ＭＡＳアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしているポリヌクレオチド、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしている核酸とハイブリダイズするプローブ、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードしている配列を含むＤＮＡ構築物、ＤＮＡ配列がＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質をコードする培養細胞株、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する抗体、ＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ、およびＦＦ−ＭＡＳのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と親和性を有する化合物の存在を検出するための方法、に関する。
【０００２】
【発明の背景】
１９７８年に最初のＩＶＦ妊娠が実現されて以来、この処置は何千もの妊娠を成功させ、不妊カップルの研究および治療に関する多くの新規未研究領域を開拓してきた。なお、今日の不妊症治療様式を改善することに関して多くの要求がある。７カップル中で約１組が受精率低下（ｓｕｂ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）もしくは不妊症の問題を経験することが推定される。
【０００３】
ヒト卵母細胞のＩＶＦは、女性および男性の受精率低下の治療に通常使用されるようになった。標準のＩＶＦ治療は、女性患者の長期フェーズのホルモン刺激を含むものである。吸引された卵母細胞は、次にインビトロで受精され、そして培養される。この処理を最適化し、そして単純化するために絶え間ない努力が費やされた。それにもかかわらず、全体的な妊娠率は、現行の治療様式によって、約２０％を越えて顕著に増加しない。ＩＶＦ患者の大規模な欧州調査において、患者毎の１１．５の吸引した卵母細胞のうち７．２の卵母細胞が受精直前の減数分裂の再開（ｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ）を生じ、４．３の卵母細胞のみが受精し、２．２の卵母細胞のみが、受精とインビトロ培養の後に８細胞胚段階（８−ｃｅｌｌ ｅｍｂｒｙｏ ｓｔａｇｅ）に達したことが示された（ＥＳＨＲＥ， Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ， １９９７）。
【０００４】
現行の技術水準による胚の品質が非常に予測しがたいことから、妥当な成功のチャンスを得るためには２以上の胚が移送されなければならない。それ故、２〜３の胚（いくつかの国においては５胚まで）が移植されることが普通であり、これは患者および子供の双方に多大なる不便さとリスクとを伴う多胎妊娠（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ）という非常に重篤な副作用を伴う。更に、多子出産（双子、三つ子など）による多大な医療保障費は、ＩＶＦ費用全体を上回っていると推測されてきた。
【０００５】
従って、現行の治療法には、いくつかの不利な点がある。
【０００６】
更に、患者自身に注射する不快さと共に、体重増加、鼓脹（ｂｌｏａｔｉｎｇ）、吐き気（ｎａｕｓｅａ）、嘔吐（ｖｏｍｉｔｉｎｇ）、不安定情動（ｌａｂｉｌｅ ｍｏｏｄ）および他の持続する不快感などが、不利な点として報告されている。
【０００７】
ある種のステロール誘導体が減数分裂の制御に使用できることはＷＯ ９６／００２３５より既知である。かかるステロールの例は、４，４−ジメチル−５α−コレスタ−８，１４，２４−トリエン−３β−オル （以後、ＦＦ−ＭＡＳと称する）である。
【０００８】
このようなことから、現在ヒトのインビトロ成熟は、多大な関心と臨床的努力にもかかわらず高い確率で不成功に終わっていることが判明している。
【０００９】
効果的に減数分裂を制御する化合物を発見するための試行方法の１つは、関連するレセプターの使用である。
【００１０】
レセプターは、リガンド結合の際にシグナル伝達機能を実行する蛋白質性の高分子であると定義される。多くのレセプターは、細胞膜外層上に局在しており、他は細胞内に局在する。レセプターに結合する物質はリガンドと呼ばれ、この用語は、その対となるレセプターに関してのみ定義上の意味がある。「リガンド」という用語は、如何なる特定の分子サイズまたは他の構造上もしくは組成上の特性を意味するものではなく、この懸案となる物質は、標的分子に対してレセプターがリガンドの存在に関する情報を伝達するようにレセプターと結合、切断もしくは相互作用する能力がある物質を意味するものである。別に述べているように、特定のレセプターに結合する能力のある全ての物質がリガンドであるということではなく、全てのリガンドが特定のレセプターと結合する能力があるということである。レセプターは、イムノグロブリンのような物質を含まない。
【００１１】
レセプターは、様々に呼称される活性化もしくはシグナル伝達のプロセスにより機能すると信じられている。リガンドは、レセプター分子のコンホメーションが変化する様式でリガンド結合ドメインに結合する。このコンホメーション変化は、活性化と呼ばれ、細胞質部分において、レセプターの効果を修飾する。レセプター活性化により誘発された変化に共通するのは、レセプター酵素活性の変化もしくは発生である。
【００１２】
ｃＡＭＰ、ＩＰ３、キナーゼ、およびホスファターゼなどのシグナル伝達蛋白質は、全ての組織で遍在的に認められる蛋白質である。これらの蛋白質は、様々な経路により、リガンド／レセプター相互作用からの刺激を下流の細胞現象（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ）へと伝達（ｃａｓｃａｄｅ）し、典型的には酵素活性もしくは効果分子の機能状態を変化させる。
【００１３】
近年の製薬産業は、研究を、疾患もしくは傷害におけるレセプターの役割に焦点を合わせた研究、またレセプターと結合する能力のある薬（一般的には低分子量物質）の設計の研究に向けて適応してきた。この初期スクリーニングで同定された薬は、次にインビボもしくは組織外植片（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ）に対する活性を試験される。結果として、旧来の技術は、大規模スクリーニングに適合しない。標的レセプターを含有する組織サンプルもしくは分離した細胞（例えば、卵巣組織）は、取得にコストがかかり、限定量のみ存在するものであり、且つ機能的に生存可能な状態で維持することが困難である。更に、確実且つ再現よく候補薬を組織サンプルに投与することは時折困難なことである。組織培養における一次外植片を使用したスクリーニングアッセイは、組織サンプルで可能であるスケールよりも大きなスケールで実施される。しかしながら、生理的効果をアッセイすることはより困難であり、そしてアッセイは培養液もしくは培養条件などの多くの干渉の発生源からの干渉にさらされる。最後に、天然物から単離されたレセプターを使用したアッセイには、レセプターが天然の可変性に左右され、且つ適切な天然供給源が必ずしも利用可能ではないとの不利な点が存在する。本発明の課題の１つは、容易に再現可能で、単純なアッセイ系を提供することであり、これはリガンド結合だけでなく、作動的（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）もしくは拮抗的（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）のような結合の特性をも決定するために大規模スケールで実施できるものである。
【００１４】
同様に、意味ある臨床的診断は、大抵は不活性型のリガンド（例えば、試験検体においてリガンドの活性を変化もしくは排除しさえもする、酵素的もしくは他の処理工程に供試されたリガンド）の干渉がない状況下での生物学的に活性なリガンドのアッセイに依存する。免疫アッセイ法は、試験サンプル中のリガンドの測定に広く使用される。しかしながら、リガンドの活性型と不活性型とを区別できる抗体を同定することは大抵は非常に困難である。レセプターは、分析物の結合試薬として抗体に代えて頻繁に使用されている。しかしながら、必ずしもレセプターと結合する全ての物質が、レセプター活性を誘導する（即ち、生物学的に活性）能力があるわけではない。本発明の課題の１つは、それらのレセプターによるシグナル伝達を誘導もしくは阻害することにおいて、活性を有する臨床試験サンプルにおいて、リガンドを同定する方法を提供することである。
【００１５】
リガンドから細胞現象への刺激の伝達において、細胞質蛋白質は、レセプターもしくはシグナル伝達分子として作用できる。様々なレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質のタイプは、異なる経路（例えば、低分子Ｇ蛋白質、カルシウム流入、ホスファターゼ、およびリパーゼ）を利用し、それらの全ては酵素活性もしくは遺伝子転写の変化を生じる。
【００１６】
減数分裂活性化ステロール（以後はＭＡＳと称する）は、卵胞液（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）および雄ウシ精巣組織（ｂｕｌｌ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ）において、最初に同定された活性シグナル伝達分子を構成するものである。前記ステロールは、減数分裂プロセスの強力なアクチベータとしてＢｙｓｋｏｖ １９９５ および Ｇｒｏｎｄａｈｌ 等 （Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５８ （１９９８）， １２９７ 以下参照） により記載され、またＷＯ ９６／００２３５， ９６／２７６５８， ９７／００８８４，９８／２８３２３，９８／５４９６５ および ９８／５５４９８において、より具体的にはそれらの請求項１に記載される。ＭＡＳステロールの減数分裂の効果を直接的もしくは間接的に伝達する如何なるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質も、これまで記載されていない。本発明の前に、推定上のＭＡＳ レセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質の性質を有するものの存在は、以前は同定されていなかったが、その存在は示唆されていた〔例えば、 Ｇｒｏｎｄａｈｌ等 （Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ６２ （２０００）， ７７５ 以下参照） によって〕。
【００１７】
２０００年９月２９日にクローン ＮＴ２ＲＭ２００１６３２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、アクセッション番号ＡＫ０２２５５４として公表され、そして２００１年５月１０日にクローンＮＴ２ＲＰ２０００４４８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列がアクセッション番号ＡＫ０２７５３５として提出された。それらのクローンに関して、如何なる有用性もしくは作用も言及されていなかった。
【００１８】
単離および精製されたＭＡＳレセプター もしくは ＭＡＳシグナル伝達蛋白質に関して、同様に他のレセプターから独立したＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現できる系に関して多大なる必要性が存在する。細胞および組織におけるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の存在を特異的に同定することは更に望ましいだろう、それにより時間を浪費し、複雑で、且つ非特異的な機能的薬理学アッセイを避けることができる。抗不妊症もしくは避妊薬（ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ｄｒｕｇ）の使用に関して、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に特異的な新規のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを選別し、開発することも望ましいことであろうが、現在のところは可能とはなっていない。実に驚くべきことに、本発明は、これら及び他の関連する必要性を達成させるものである。
【００１９】
【発明の概要】
今回、本発明は、減数分裂作用性ステロール（ＭＡＳ、ｍｅｉｏｔｉｃ ａｃｔｉｎｇ ｓｔｅｒｏｌｓ ）のレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質のヌクレオチド配列を提供する。本発明は、単離され、実質的に純粋なＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質およびそれらの断片を提供する。それらのレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質は、３β−ヒドロキシ−４， ４−ジメチルコレスト−８， １４，２４−トリエン（以後はＦＦ−ＭＡＳと称する）により誘導される配偶子成熟プロセスに関与することが示され、インビトロで培養されたマウス卵母細胞において、リガンド活性化に際して特異的に誘導される卵核胞崩壊（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ、以後はＧＶＢと称する）を特異的に誘導する。このようなことから、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＦＦ−ＭＡＳへの結合に際してシグナル伝達機能を実行する蛋白質性の高分子であると定義される。要約すれば、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＦＦ−ＭＡＳに結合する。別の言い方をすると、ＭＡＳシグナル伝達蛋白質はＭＡＳ結合蛋白質であると明示することができる。
【００２０】
ＭＡＳレセプターは、ＦＦ−ＭＡＳもしくは他の内在性の減数分裂活性化ステロール〔例えば、 ３ β−ヒドロキシコレスト−８， １４−ジエン；３β−ヒドロキシ−４， ４ジメチルコレスト−８， ２４−ジエン；および ３β−ヒドロキシコレスト−８， ２４−ジエン、或いはそれらの代謝物（リガンドとして）〕と相互作用する点において、同一の機能的特長を有する蛋白質 ＳＡＭ１ａ もしくは ＳＡＭ１ｂに関連する任意の蛋白質である。機能的特長には、卵母細胞における結合、レセプター 活性化、および続く卵核胞崩壊（ＧＶＢ）が含まれる。ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂのアミノ酸配列は、以下の配列番号 ２および配列番号 ４に記載される。
【００２１】
ＭＡＳレセプターは、男性および女性に使用できる受精促進性（ｐｒｏｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）および受精阻害性（ａｎｔｉｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）の化合物を発見するために使用できる。
【００２２】
単離もしくは精製された形態でかかるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を供給して、本発明は抗血清および／またはモノクローナル抗体の形態のＭＡＳ レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質に対する抗体をも提供する。
【００２３】
別の側面において、本発明は、組換えによる手段によって、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質およびそのポリペプチドもしくはその断片を産生する能力を提供する。発現されたＭＡＳレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質または断片は、生来の（ｎａｔｉｖｅ ）レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の生物学的活性を有していても、有していなくてもよい。結果的に、単離および精製されたポリヌクレオチドが記載され、それはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質およびその断片をコードするものであり、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡ（ｃＤＮＡなどの）もしくはＲＮＡの形態で存在してもよい。それらの配列に基づいたプローブは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする遺伝子およびそれらの関連遺伝子をハイブリダイズさせて同定するために使用し得る。前記プローブは、完全長ｃＤＮＡまたは１４から２５ ヌクレオチドと同程度に小さいか、またより多くの場合には約４０ から 約５０以上のヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
関連する態様において、本発明は、転写プロモータ、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質または断片をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーターを含むＤＮＡ構築物に関係しており、各々はレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の発現に関して操作可能な状態で相互に関連している。発現させるために前記構築物は、少なくとも１つのシグナル配列をも含んでいてもよい。更に、大規模生産のために発現したレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を、例えば免疫親和性精製などにより細胞から分離してもよい。
【００２５】
ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現する細胞またはバクテリアは、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が媒介する細胞の代謝を変化させる化合物の同定にも使用し得る。化合物は、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質との結合に関して、および／またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が媒介する宿主細胞の代謝の変化への効果に関して選別されてもよい。ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、リガンド／レセプター相互作用もしくはリガンド／シグナル伝達蛋白質相互作用上の効果に関して、精製されたレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはその結合断片を使用した無細胞系においても選別され得る、または代謝変化を評価する能力をも提供するミセルなどの再構成系を使用した無細胞系においても選別され得る。
【００２６】
更に別の態様において、本発明は、生物学的サンプルにおける哺乳類 ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の存在を決定し得る診断の方法に関する。例えば、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、免疫複合体形成を助長する条件下でサンプルとインキュベーションされ、そして該複合体が検出されるが、これは典型的には酵素、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｒ）、粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）、または二次標識抗体などの標識手段により検出される。従って、前記手段は、検査されるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質に関する卵巣または精巣組織を含む組織の免疫化学染色に使用される。
【００２７】
蛋白質レベルでの配列類似性およびステロール結合ドメインの共通の存在に基づくと、本発明のレセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質は、最近　Ｊ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ． ４０ （１９９９）， ２２０４に公開されたオキシ・ステロール結合蛋白質（以後はＯＳＰＢと称する）の新規のスーパーファミリーに属するといえる。何れの性（ｇｅｎｄｅｒ）の配偶子成熟または如何なる減数分裂プロセスにおけるどのような機能も、このＯＳＰＢファミリーに帰属するとされたことはない。
【００２８】
【配列の簡単な説明】
配列番号１および配列番号３は、２つのマウス　ＭＡＳ レセプターまたはシグナル伝達ペプチド（それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ １ｂと称する）のｃＤＮＡのヌクレオチドであり、それぞれ配列番号２および配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有している。配列番号５および配列番号７は、２つのヒト　ＭＡＳ レセプターまたはシグナル伝達ペプチド（それぞれＳＡＭ１ａ および ＳＡＭ １ｂと称する）のｃＤＮＡのヌクレオチドであり、それぞれ配列番号６および配列番号 ８に記載されたアミノ酸配列を有している。配列番号９から１４は、実施例５中で言及されたヌクレオチドである。
【００２９】
【好適な態様の記載】
本発明は、単離したＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を提供することによる、ＭＡＳレセプター／リガンド相互作用またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質／リガンド相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する手段を提示するものである。「ＭＡＳレセプター」という用語は、天然のＭＡＳレセプター、または天然のＭＡＳレセプターに固有の多くの構造的および機能的特長を共有するレセプターの何れかに由来する任意の蛋白質を意味する。かかるレセプターは、類似の機能を有する蛋白質を産するように天然のレセプターの領域が削除もしくは置換された際に生じ得る。相同配列、対立遺伝子多型、および自然突然変異体（ｎａｔｕｒａｌ ｍｕｔａｎｔｓ）；誘導された点（ｐｏｉｎｔ）、欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、および挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）突然変異体；或いは、発現した変種（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ）；天然のＭＡＳレセプターをコードする核酸と高もしくは低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる蛋白質；天然の物質から回収された蛋白質；並びにＭＡＳレセプター蛋白質に対する抗血清により回収された密接に関連する蛋白質；も含まれる。同様に、このことはＭＡＳシグナル伝達蛋白質においても適用される。
【００３０】
ＭＡＳレセプター「リガンド」は、ＭＡＳレセプターのリガンド結合ドメイン、ＭＡＳレセプター 類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）、またはキメラＭＡＳレセプターにより結合される能力を有する分子を意味し、このことは米国特許明細書番号 ４，８５９，６０９（本明細書中に引用により援用される）に一般的に記載される。前記分子は化学的に合成し得る、または天然に生じたものであってもよい。リガンドは、アゴニストおよびアンタゴニストにグループ分けできる。アゴニストは、レセプターへのそれらの結合が細胞内の応答経路を誘導する分子である。アンタゴニストは、レセプターへのそれらの結合が細胞内の応答経路をブロックする分子である。
【００３１】
「単離された」ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、哺乳類卵母細胞などのその生来の環境以外に存在するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を言及することを意味しており、例えば、本明細書中で以下に定義されるような実質的に純粋なＭＡＳレセプターを含んでいる。より一般的には、「単離された」は、細胞もしくは他の系の異種構成物としてＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を含むことを意味する。例えば、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた細胞により発現され、該細胞から分離され、そして他の選択されたレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を含有するミセルに添加される。いくつかの事例において、ＭＡＳレセプターという用語は、ＭＡＳレセプターおよびＭＡＳシグナル伝達蛋白質の双方の範囲におよぶ用語である。
【００３２】
精製されたＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、少なくとも５０％、好ましくは 少なくとも８０％、より好ましくは 少なくとも９０％ （ｗ／ｗ）の純度を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を意味する。
【００３３】
ヒト ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ １ｂは、それぞれクローンＮＴ２ＲＰ２０００４４８およびＮＴ２ＲＭ２００１６３２である。
【００３４】
本発明のＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を定義する同様の方式は、様々なＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のアミノ酸配列間の類似性によるものであり、配列番号２のアミノ酸配列と比較した際には少なくとも約９０％、好ましくは約９５％である。アミノ酸配列類似性の別の表現は、ホモロジーである。ヌクレオチド レベルでの様々なＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のヌクレオチド間の類似性は、配列番号１のヌクレオチドと比較した際に少なくとも約８０％、好ましくは約９０％である。
【００３５】
「高ストリンジェンシー」条件という用語は、標識プローブ、即ち、配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、数％、 好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満（もし存在するのであれば）のミスマッチ塩基を含有する試験されるポリヌクレオチド配列と、高い特異性でハイブリダイズする条件を意味する。高ストリンジェンシー ハイブリダイゼーション条件は、例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、１９８９（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。
【００３６】
２００塩基以上のポリヌクレオチドの形態のプローブの場合、高ストリンジェンシー ハイブリダイゼーションは、プローブと、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む膜を、６ｘ ＳＳＣ、１０％ デキストラン硫酸、１ ％ ＳＤＳ、５ｘ デンハルト、５０ μｇ／ｍｌ サケ ＤＮＡ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），および２ ｘ １０６ ｃｐｍ／ｍｌ の放射標識プローブを含有する緩衝液中でインキュベーションすることにより達成される。インキュベーションは、６８ ℃で振盪または回転し、少なくとも２時間、典型的には一晩である。そして膜を、２ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳ 中４２ ℃で３０分間洗浄し、次に２ｘ ＳＳＣ， ０．１ ％ ＳＤＳ中で６８℃で３０分間洗浄し、そして０．２ ｘ ＳＳＣ， ０．１ ％ ＳＤＳ中で６８℃で洗浄し、そして最後に０．１ ｘ ＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳ中で６８℃で３０分間洗浄する。膜をＸ線フィルムに暴露する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド プローブ（長さ２５〜２００塩基）の場合、高ストリンジェンシー ハイブリダイゼーションは、 ６ｘ ＳＳＣ， ０．０５ Ｍ リン酸ナトリウム （ｐＨ ６，８）， １ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８，０）， ５ｘ デンハルト 溶液， １００ μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ， １００ ｍｇ／ｍｌ デキストラン硫酸，および１８０ μＭの放射標識 オリゴヌクレオチド （５ｘ１０５ から １．５ｘ１０６ ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を含有する溶液中で実行される。前記ハイブリダイゼーション温度は、プローブの長さに依存して変化する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等（上記、１１章）は、高ストリンジェンシー ハイブリダイゼーションを生じる条件をいかに計算して、実験的に検証するかを記載している。ハイブリダイゼーションはＴｍより５〜１０ ℃低い温度で、およびハイブリダイゼーション後の洗浄はＴｍの５℃低い温度で実施され、 Ｔｍ は、次のように計算される、
Ｔｍ ＝ ８１．５−１６．６ （Ｌｏｇ１０ ［Ｎａ＋］） ＋０．４１ （％ Ｇ＋Ｃ）− （６００／Ｎ）（式中のＮ ＝ 鎖長）。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、振盪または回転して一晩実施される。そして膜を２ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳで室温、１５分間で２回洗浄し、そして０．２ｘ ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ でプローブのＴｍの５℃低い温度で６０分間洗浄する。膜をＸ線フィルムに暴露する。
【００３９】
ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の親和定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を決定する手段の１つは、以下の実施例３に記載した試験によるものである。特定のＭＡＳレセプターにＦＦ−ＭＡＳが結合するかどうかを決定する手段の１つは、以下の実施例４に記載される試験によるものである。以下の実施例３に記載される試験は、特定の 蛋白質がＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質であるかどうか、或いは他の言葉で表現すると、特定の蛋白質が本願の特許請求の範囲の請求項において特定されるＳＡＭ１ａの類似体であるかどうかを決定することに使用できる。このような背景において、用語「類似体」は、天然の変種（他の動物種、例えば、 ヒト， サル， マウスまたはラットにおいて発現されるものを含む）であって、ＭＡＳレセプターまたは「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」（即ち、前記変種をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾した生来のＭＡＳレセプターに由来するポリペプチド）の天然の変種を示すことを意図しており、前記変種は生来のアミノ酸配列のＣ−および Ｎ−末端の何れか若しくはその双方における１以上のアミノ酸の付加；生来のアミノ酸配列における１以上の部位での１以上のアミノ酸の置換；生来の配列の何れか若しくはその双方の末端での、または生来の配列内の１以上の部位での、１以上のアミノ酸の削除；或いは 生来の配列における１以上のアミノ酸の挿入；を生じている。
【００４０】
別の側面において、本発明は、ＭＡＳ レセプター／リガンド相互作用もしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質／リガンド相互作用を制御する手段を提供するものである。このような手段によって治療的および／または予防的にＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質またはそのリガンド（ＦＦ−ＭＡＳなどの）に直接的または間接的に関連する疾患を治療するものである。本発明のレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を取得することにより、アゴニストまたはアンタゴニストを同定でき、それらはリガンドと、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質との相互作用をそれぞれ刺激または阻害するものである。アゴニストまたはアンタゴニストの何れかによって、レセプターまたはシグナル伝達蛋白質を発現する細胞の代謝および反応性が制御される。このような様式で不妊症を治療するための、または避妊法の新規原理を達成するための減数分裂を制御する手段を提供する。
【００４１】
従って、本発明は、リガンド／ＭＡＳレセプターもしくはリガンド／ＭＡＳシグナル伝達蛋白質相互作用により媒介される現象のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング処理を提供する。かかるスクリーニングアッセイは、広く多様な形式を採用できるものであり、リガンドの側にある程度依存して、レセプターまたはシグナル伝達蛋白質相互作用が標的とされるものである。例えば、かかるアッセイは、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と結合する化合物を同定するために設計し得るものであり、それによってレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の相互作用をブロックまたは阻害し、それによってレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質とリガンドとの相互作用をブロックまたは阻害する。他のアッセイは、リガンドを代替できる化合物（従って、ＭＡＳレセプター媒介の、またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質媒介の細胞内経路を刺激できる）を同定するため設計される。更に他のアッセイは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質とＦＦ−ＭＡＳとの会合を阻害または促進し、これによりＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質リガンドに関する細胞応答を左右する化合物を同定するために使用できる。
【００４２】
１つの機能的なスクリーニングアッセイにおいて、受精活性化現象の開始が、例えばＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするｍＲＮＡを注射した卵においてモニターされる。そして次に適切なリガンドと共に、または別々に、スクリーニングする選択化合物に暴露される。一般的な事柄は Ｋｌｉｎｅ 等〔 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１ （１９８８）， ４６４−４６７、本明細書中に引用により援用される〕を参照のこと。
【００４３】
前記スクリーニング処理は、例えばレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合し、そしてリガンドとの相互作用に実質的に影響する抗体などの試薬を同定するために使用できる。前記抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルであってもよく、精製した抗血清もしくはモノクローナル抗体またはそれらの混合物などの抗血清もしくは単一特異的抗体の形態である。例えば、インビボ診断もしくはイメージングのための組成物の構成物としてヒトに投与するために、前記抗体は、好ましくは免疫原性を最小化するため実質的にヒトであり、実質的に純粋な形態で存在する。実質的にヒトとは、一般的にヒトにおいて免疫原性を最小化するため少なくとも約７０％ヒト抗体配列、好ましくは少なくとも約８０％ヒト、最も好ましくは 少なくとも約９０〜９５％以上のヒト抗体配列を含有することを意味する。
【００４４】
ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と結合する抗体は、様々な手段で産生し得る。非ヒト抗血清もしくはモノクローナル抗体〔例えば、マウス、ウサギ類（ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）、馬（ｅｑｕｉｎｅ）など〕の生産は公知であり、例えばレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質分子またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質分子の目的の一部分を含む調製物（リガンド結合に寄与するドメインもしくはドメイン群など）で動物を免疫することで達成し得る。モノクローナル抗体の産生のために、免疫動物から得られた抗体産生細胞が、不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｅｄ）され、選別されるか、或いはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と結合する抗体の産生について最初に選別され、そして不死化される。ヒト ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生は通常の方法では困難であろうことから、実質的ヒト分子を産生するために非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）２もしくは超可変領域）を、ヒト定常領域（Ｆｃ）またはフレームワーク領域に、組換えＤＮＡ技術によって移行することが望ましいだろう。かかる方法は当該技術分野において既知であり、例えば米国特許明細書番号 ４，８１６，３９７，およびヨーロッパ特許公開番号１７３，４９４および２３９，４００に記載されており、これらの文献は引用によって本明細書内に援用される。或いは、ヒト Ｂ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりヒトレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質と特異的に結合するヒト モノクローナル抗体またはその部分をコードするＤＮＡ配列を単離でき、この処理はＨｕｓｅ等〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６ （１９８９）， １２７５−１２８１、本明細書内に引用により援用される〕により要約された一般的なプロトコールに従って実施することができ、そして望ましい特異性を有する抗体（もしくは結合断片）をコードする配列をクローニングおよび増幅する。
【００４５】
他の態様において、本発明は、インビトロでレセプターまたはシグナル伝達蛋白質を発現する細胞により実施するスクリーニングアッセイを提供する。例えば、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれらの選択部分をコードするＤＮＡは、当該技術において既知の処理（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， １９８９を参照のこと、この文献は本明細書中に引用により援用される）を使用して樹立細胞株（例えば、ＢＨＫおよびＣＨＯなどの哺乳類細胞株）にトランスフェクションされる。そしてレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質が培養細胞により発現され、細胞において適切なリガンド（ＦＦ−ＭＡＳまたは他のＭＡＳ化合物など）と別々または一緒に選択された薬剤が、その望まれる効果に関して選別される。レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれらの部分をコードしている配列を増幅するために用いられる核酸配列を増幅する手段は、米国特許明細書番号 ４，６８３，１９５および４，６８３，２０２（本明細書中に引用により援用される）に記載されている。
【００４６】
更に別の側面において、本発明により提供されるスクリーニングアッセイは、ＭＡＳレセプター蛋白質もしくはシグナル伝達蛋白質をコードする、または前記レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の選択部分（例えば、リガンドと結合する）をコードするヌクレオチド配列を含有する生殖細胞および体細胞を有するトランスジェニック哺乳類に関する。なお更なる一側面において、本発明により提供されるスクリーニングアッセイは、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするヌクレオチド配列が特定のＭＡＳシグナル伝達機能の表現型上の欠損を呈するノックアウト動物を産するために分子ターゲティングされるトランスジェニック哺乳類に関する。好ましくは、分子ノックアウトは、生殖組織（卵巣または精巣）に組織特異的であり、発生において時間的に制御される〔従って、誘導可能（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）である〕。例えば、ヒト ＭＡＳレセプターをコードする配列を非ヒト 哺乳類胚、或いはノックアウトに導入し得るいくつかの手段が存在し、それらのいくつかは、例えば米国特許明細書番号 ４，７３６，８６６、Ｊａｅｎｉｓｃｈ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １４６８−１４７４ （１９８８） 〕および Ｗｅｓｔｐｈａｌ 等〔 Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５： １８１−１９６ （１９８９）〕に記載され、これら文献は本明細書中に引用により援用される。そして動物細胞は、前記レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を発現し、従って選択したアゴニストもしくはアンタゴニストを試験および選別するための便利なモデルとして使用できる。
【００４７】
別の側面において、本発明は診断方法および組成物に関連する。ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質分子およびそれらに対する抗体を備える手段によって、多様な診断アッセイが提供される。例えば、抗体（ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対するモノクローナル抗体を含む）によって、検査を行う特定個体中の選択された細胞もしくは組織または培養物におけるレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の存在および／または濃度を決定し得る。これらのアッセイは、例えば男性不妊症、女性不妊症などの疾患の診断および／または治療に使用できる、または双方の性別における避妊法の手段に使用できる。
【００４８】
多くのタイプの免疫アッセイが、利用可能であり、当業者に既知であり、これには、例えば競争的アッセイ、サンドイッチアッセイなどがあり、例えば、米国特許明細書番号 ４，６４２，２８５； ４，３７６，１１０； ４，０１６，０４３； ３，８７９，２６２； ３，８５２，１５７； ３，８５０，７５２； ３，８３９，１５３； ３，７９１，９３２； 並びに Ｈａｒｌｏｗ および Ｌａｎｅ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８８）〕などに一般に記載されており、各々は本明細書中に引用により援用される。１つのアッセイ形式において、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、標識抗体を使用することによって、好ましくは脳組織、例えば卵巣もしくは精巣組織、卵母細胞調製物、または精液サンプルと反応するモノクローナル抗体を使用することによって、そしてそれらへの特異的な結合を決定することによって同定および／または定量され、前記アッセイは典型的には免疫複合体形成を促進する条件下で実行される。非標識一次抗体は、レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質を検出する一次抗体と反応する標識と組み合わせて使用できる。例えば、一次抗体は、一次抗体を特異的に検出するために作成された標識二次抗体により間接的に検出されてもよい。或いは、抗ＭＡＳレセプター抗体またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質抗体は、直接標識できる。広範囲の多様な標識が用いられ、それには放射性核種、粒子（例えば、金、フェリチン、磁気粒子、赤血球）、蛍光団（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｒｅｓ）、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、およびリガンド（特にハプテン）などがある。
【００４９】
ＭＡＳレセプター ＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＲＮＡは、ＭＡＳレセプター ＲＮＡまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 ＲＮＡを標的とする標識合成オリゴヌクレオチド プローブによるハイブリダゼーション処理により細胞中で直接検出し得る。また、ポリメラーゼ連鎖反応 （Ｓａｉｋｉ 等、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９ （１９８８）， ４８７，および米国特許明細書番号 ４，６８３，１９５， 各々の文献は本明細書中に引用により援用される）をＤＮＡ配列を増幅するために使用でき、これは次にアガロースゲル上のそれらの特徴的サイズ、ＭＡＳレセプター ＤＮＡもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 ＤＮＡ またはオリゴヌクレオチド プローブを使用したそれらのゲルのサザンブロット、或いは類似プローブを使用したドットプロットを元に検出される。前記プローブは、約１４ ヌクレオチドから約２５以上のヌクレオチド、好ましくは４０ から ６０ ヌクレオチドを含んでもよく、そしていくつかの事例においてはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の大部分またはｃＤＮＡ全体が使用されてもよい。前記プローブは、酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光団、化学発光体、および常磁性体粒子などの検出可能なシグナルで標識される。ハイブリダイゼーションに関連する高ストリンジェンシーは、適切な温度および塩濃度を使用して取得される。
【００５０】
レセプターもしくはシグナル伝達蛋白質またはそれに対する抗体の存在の検出において、本発明の課題のレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質との共に使用するキットも提供される。従って、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体などの単一特異的抗体、またはレセプターもしくはシグナル伝達蛋白質の組成物が提供され、これらは通常はコンテナ中に凍結乾燥状態で存在するものである。そして単独か或いは例えばアンチ抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、標識、遺伝子プローブ、ポリメラーゼ連鎖反応プライマおよびポリメラーゼなどの付加的な試薬と共に梱包される状態の何れかの形態で提供される。
【００５１】
なおより具体的には、本発明は、 単離および／または精製したポリヌクレオチド分子に関し、該ポリヌクレオチド分子は配列番号 １または配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、且つこのポリヌクレオチドは、 ａ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、またはｂ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインをコードする。このポリヌクレオチドは、ＲＮＡアンチセンス配列 またはｃＤＮＡ配列であってもよい。このポリヌクレオチドは、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 活性を提示するポリペプチドをコードしてもよい。このポリヌクレオチドは、 配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質 （ＦＦ−ＭＡＳと結合できる）をコードし得る。前記ポリヌクレオチドは、配列番号 １または配列番号 ３のヌクレオチドを有してもよい。
【００５２】
更に、 本発明は、少なくとも１２ ヌクレオチドのプローブに関し、該プローブはＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする核酸とハイブリダイズする能力がある。このプローブは、配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、或いはその対立遺伝子バリアントおよび種バリアントを含んでいてもよい。これらはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズする能力を有している。このプローブは、長さで約４０ から 約６０ のヌクレオチドを含んでもよい。
【００５３】
このプローブは、検出可能なシグナルを提供するために標識されていてもよい。このプローブは、配列番号 １または配列番号 ３のヌクレオチドを含んでもよい。
【００５４】
更に、 本発明は、ａ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、またはｂ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列であって、配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡ構築物に関する。このＤＮＡ構築物は、配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有してもよい。
【００５５】
更に、 本発明は、配列番号 １もしくは配列番号 ３の２５以上連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、高ストリンジェンシーでハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、このＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で形質転換もしくはトランスフェクトされた培養した酵母またはバクテリアに関し、このＤＮＡ配列は ａ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質；またはｂ） ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のリガンド結合ドメインまたは膜貫通ドメイン；をコードする。この細胞株、酵母またはバクテリアは、内在性のＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を発現しなくてもよい。
【００５６】
本発明に従ってＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩を、単離および／または精製し得る。単離および／または精製した蛋白質（ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質）は、配列番号 ２または配列番号 ４のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５７】
更に、 本発明は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と特異的に結合する単離した抗体に関する。この単離した抗体において、該抗体はモノクローナル抗体であってもよい。この単離した抗体は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質とＭＡＳの結合をブロックし得る。
【００５８】
更に、 本発明は、本明細書中で言及したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【００５９】
更に、 本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対して親和性を有する化合物またはその塩の存在を検出するための方法であって、工程ａ） 前記化合物と、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩とを接触させることと；および工程ｂ） 前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する該化合物の親和性を測定することと、を含む方法に関する。このＭＡＳ アンタゴニストの存在を検出するための方法は、工程ａ） ＭＡＳ （ＦＦ−ＭＡＳ）を含むＭＡＳ アゴニストの存在下で、化合物を、種々の条件下において応答経路にカップルするＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質および前記経路を介した関連する応答に対する前記化合物の結合を許容する十分な時間暴露することと、並びに工程ｂ） ＭＡＳ アゴニスト単独による応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と前記化合物との結合から生じる応答経路の刺激における減少を検出し、この結果からＭＡＳ アンタゴニストの存在を決定することと、を含んでいてもよい。更に、ＭＡＳ アゴニストの存在を検出するための方法は、工程ａ） ＭＡＳ アンタゴニスト存在下で、化合物を、種々の条件下において応答経路にカップルするＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質および前記経路を介した関連する応答に対する前記化合物の結合を許容する十分な時間暴露することと、並びに工程ｂ） ＭＡＳ アンタゴニスト単独による応答経路の刺激と比較して、前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質と前記化合物との結合から生じる応答経路の刺激の増加を検出し、この結果からＭＡＳ アゴニストの存在を決定することと、を含んでいてもよい。
【００６０】
更に、 本発明は、ＭＡＳレセプター もしくはＭＡＳ シグナル伝達ペプチドに対して親和性を有する化合物またはその塩に関するものであり、この化合物もしくは塩は、本明細書中に記載される方法により検出される。
【００６１】
更に、 本発明は、配列番号 ２もしくは配列番号 ４のアミノ酸配列を有するＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を産生するための方法に関し、この方法はａ） 前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の発現をコードする配列番号 １または配列番号 ３ のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物で、形質転換またはトランスフェクションされた細胞、酵母もしくはバクテリアを生育させることと、並びにｂ）前記ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質を、前記細胞から単離することと、を含んでいてもよい。この方法において、前記ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、免疫親和性精製によって、単離し得る。
【００６２】
更に、 本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対して親和性を有する化合物またはその塩をスクリーニングするためのキットに関し、このキットはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質、そのペプチド断片またはその塩を含む。
【００６３】
或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ２に示されるアミノ酸、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含むものであると定義し得る。配列番号 ２に示されるアミノ酸、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６および８のアミノ酸と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ４に示されるアミノ酸、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいてもよい。配列番号 ４に示されるアミノ酸配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６に示される部分アミノ酸配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体を含んでいてもよい。配列番号 ６に示される部分アミノ酸配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。或いは、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ８に示される部分アミノ酸配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいてもよい。配列番号 ８に示される部分アミノ酸配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその類似体、を含んでいるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。本発明によるＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、リガンドを検出する（例えば、結合アッセイによって、）のに適切な緩衝液中に存在する可溶性の精製された蛋白質であってもよい。リガンドを検出する（例えば、結合アッセイによって）のに適切な緩衝液中に存在する可溶性の精製された蛋白質であるＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質は、配列番号 ６および８のアミノ酸配列と異なっていてもよい。
【００６４】
更に、 本発明は、本明細書中に記載されるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードしているＤＮＡ配列、またはその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードしているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物に関する。前記ＤＮＡ構築物は、本明細書中で定義されるＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質をコードしているＤＮＡ配列またはその機能的類似体（ＦＦ−ＭＡＳと結合する）をコードするＤＮＡ配列を含み、配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。本発明のＤＮＡ構築物は、配列番号 １に示されるＤＮＡ配列またはその断片、或いは親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいてもよい。配列番号 １に示されるＤＮＡ配列もしくはその断片、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいる本ＤＮＡ構築物は、配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。本発明によるＤＮＡ構築物は、配列番号 ５に示される部分ＤＮＡ配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいてもよい。配列番号 ５に示される部分ＤＮＡ配列、または親和定数 １００ μＭ未満、 好ましくは１０ μＭ未満でＦＦ−ＭＡＳと結合するその機能的類似体をコードするＤＮＡ配列、を含んでいる本ＤＮＡ構築物は、配列番号 ５および７のヌクレオチドと異なっていてもよい。
【００６５】
更に、 本発明は、ＤＮＡ構築物に対して本願の特許請求の範囲に先に記載された請求項の何れか１項による挿入されたＤＮＡ構築物を保有する組換え型発現ベクターに関する。
【００６６】
更に、 本発明は、本明細書中で定義される組換え型発現ベクターを含有する細胞に関する。この細胞は、そのゲノム内に統合されるＤＮＡ構築物（本明細書中で定義される）を含有していてもよい。この細胞は、真核細胞、特に昆虫または哺乳類細胞であってもよい。
【００６７】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、 ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストもしくはアンタゴニスト）をスクリーニングする方法に関する。該方法は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中で定義される）を、ＦＦ−ＭＡＳのアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＦＦ−ＭＡＳ、または その類似体と、インキュベーションすることと；並びにＦＦ−ＭＡＳ、またはＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対する類似体の結合の任意の効果を検出することと、を含んでいる。或いは、ＭＡＳレセプターに対するリガンド（即ち、ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストまたはアンタゴニスト）のスクリーニング方法は、ＦＦ−ＭＡＳまたは その類似体を、ＦＦ−ＭＡＳの活性のアゴニストまたはアンタゴニストであると推測される物質と、そして次にＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中に記載される）と、インキュベーションすることと；並びに前記レセプターとＦＦ−ＭＡＳまたは前記類似体の結合の任意の効果を検出することと；を含んでいてもよい。
【００６８】
更に、 本発明は、ＦＦ−ＭＡＳ活性のアゴニストまたはアンタゴニストに関するスクリーニングのための、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中で定義される）の使用に関する。
【００６９】
更に、 本発明は、ＭＡＳレセプターもしくはＭＡＳシグナル伝達蛋白質の組織および／または器官特異的な変種を単離するためのＤＮＡ構築物（本明細書中で定義される）の使用に関する。
【００７０】
更に、本発明は、ＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質（本明細書中に記載のとおりに単離される）の使用に関する。
【００７１】
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、本発明を限定するように理解されるものではない。
【００７２】
【実施例】
＜実施例１＞
《マウス卵母細胞へのホスホロチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｎａｔｅ）オリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション》
２つのアンチセンス オリゴヌクレオチド（２０ ヌクレオチド）をマイクロインジェクションに利用した：本明細書中でそれぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂと称するｃＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡのコザック配列（ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に対して相補的な５’−ＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴ−３’および ５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴＣＧ−３’、その双方が以下に示されるそれぞれ配列番号 １および配列番号 ３において定義される。コントロール実験において、対応するセンス・オリゴヌクレオチドがマイクロインジェクションされた：それぞれＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂのｍＲＮＡに対して、５’−ＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’および ５’−ＣＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣ− ＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’。ＳＡＭ１ａ アンチセンスは、ＳＡＭ１ ｂ アンチセンスと共にコインジェクションされ、ストック溶液〔１．２５ μｇ／μｌの各ヌクレオチドを１０ ％ ヒト血清アルブミン （以後ＨＳＡと称する）＋５ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ 値 ： ７．５）中に含む〕から使用された。ＳＡＭ１ａセンスは、ＳＡＭ１ｂセンスと共にコインジェクションされ、ストック溶液〔１．２５ μｇ／μｌの各ヌクレオチドを１０ ％ ＨＳＡ＋５ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ 値 ： ７．５）中に含む〕から使用された。倒立型顕微鏡のステージ上の３５ｍｍペトリ皿中のミネラルオイル下のアルファ−ＭＥＭ（０．８％ ＨＳＡおよび３ ｍＭ ヒポキサンチンを添加した）の液滴中にロードされた個々の 卵核胞 （ＧＶ）−ステージ 卵母細胞の細胞質中に、約１２ ｐｇ の各オリゴヌクレオチド （１０ ｐｌ）をインジェクションした。前記卵母細胞を、Ｇｒｎｄａｈｌ 等、１９９８〔Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５８ （１９９８）， １２９７ 以下参照〕に記載のように卵胞刺激ホルモン（以後ＦＳＨと称する）で４８時間プライミングした２１−２４日齢マウスの卵巣から得た。卵母細胞を保持ピペット（１２０ μｍ外径および２０ μｍ 内径）上に吸い込み、そしてインジェクションピペット （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ） をプレッシャーマイクロインジェクター （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合させた。ピペットホルダーを、モータつきのマイクロマニピュレーター（Ｌｕｉｇｓ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｒａｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上に備え付けた圧電ポジショニングシステム〔ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｕｒｌｅｉｇｈ， ＮＹ， ＵＳＡ）〕に取り付けた。インジェクションピペットを、透明帯（ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｄｉｃａ）に対し押し込み、そして圧電パルスを与え、 インジェクションピペットを ２０ μｍ 前方に移動した。この移動の間にピペットは、透明帯および卵細胞膜（ｏｏｌｅｍａ）を貫通し、そして卵母細胞細胞質中に約１０ μｌの容量を放出するため若干の圧力パルスを適用した。ヒポキサンチン含有培地への１０ μＭ ＦＦ−ＭＡＳの添加により惹起される減数分裂の再開前に、インジェクションした卵母細胞を、ＣＯ２インキュベータ中に３７℃で２０時間静置した。ＦＦ−ＭＡＳの効果は、更なるインキュベーションの２４時���後、卵割胞崩壊 （以後ＧＶＢＤと称する）した卵母細胞の数として評価された。アンチセンス オリゴヌクレオチドのインジェクションに続く２０時間の培養期間の理論的根拠は、ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ 蛋白質をコードするｍＲＮＡの分解を可能とするためである。結果として、ＭＡＳ レセプター蛋白質またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質のレベルが卵母細胞内で減少する際に、ＭＡＳ応答が鈍くなる（１００％ から ５０％、下記の表を参照）。
【００７３】
【表１】
2004506446.tif 000003
表１に示したように、コントロール（即ち、センスをインジェクションした卵母細胞および非インジェクション卵母細胞）と比較して、アンチセンスをインジェクションした卵母細胞において、ＧＶＢＤは５０％近く阻害された。この結果は、アンチセンス・プローブによるＳＡＭ１ ａおよびＳＡＭ１ ｂをコードするｍＲＮＡの選択的阻害を示している。更に、これらの結果は、ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ 蛋白質のＭＡＳ シグナル伝達への関与が重要であること、またこれらの分子のデノボ蛋白質合成の機能的ノックアウトが卵母細胞でのＭＡＳシグナルを部分的に中断することからこの重要さが明らかであることを示している。
【００７４】
ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂは、卵母細胞のＭＡＳ シグナル伝達に関して相補的な機能を保持する同一遺伝子に由来する２つの密接に関連する蛋白質である。
【００７５】
＜実施例２＞
《ＦＦ−ＭＡＳ 結合アッセイ：》
１０ μｌ の非標識ＦＦ−ＭＡＳ 〔６．６％エタノール （ＥｔＯＨ）中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ ｎＭ〕 を、１０μｌの２００ ｎＭ　３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ 〔約１２．８ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液 （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ； １．５ ｍＭ ＥＤＴＡ； １０％ グリセリン ； １．０ ｍＭ ３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ−１−プロパンスルホネート （以後ＣＨＡＰＳと称する、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）； １ ％ ＢＳＡ （ウシ血清アルブミン）中に溶解〕と混合した。１０ μｇのＳＡＭ１ ｂ 蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに溶解した）を、４０μｌの最終容量になるように添加した。非特異的結合（Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）を３０ μＭ 非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定し、全体結合（ｔｏｔａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）を６．６％ ＥｔＯＨを含有するアッセイ緩衝液を添加することにより決定した。インキュベーションを４℃で２時間実行した。２％ Ｃａｂ−ｏｓｉｌ Ｍ−５ （Ｆｌｕｋａのシリカゲル）および０．２％ デキストラン Ｔ７０（シグマ）を含有する２５０ μｌ 氷冷アッセイ緩衝液を各チュウブに添加し、混合して、若干回転させた。Ｃａｂ−ｏｓｉｌ Ｍ−５の添加の約５分後、チュウブを５分間１４０００ ｒｐｍ （ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離した。２００μｌの上清を、マイクロシンチチュウブ（ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−ｔｕｂｅ）に移し、そして３．５ ｍｌ アトムライト〔ａｔｏｍｌｉｇｈｔ （Ｐａｃｋａｒｄ）〕を添加した。チュウブを液体シンチレーションカウンタ中で測定した。得られた結果を図１に示す。「ＩＣ−５０」は、結合３Ｈ　ＦＦ−ＭＡＳの５０％を置換する非標識ＦＦ−ＭＡＳの濃度である。
【００７６】
＜実施例３＞
《特定のポリヌクレオチドがＭＡＳレセプター またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質である蛋白質をコードするかどうかを決定するアッセイ：》
１０ μｌの非標識ＦＦ−ＭＡＳ （６．６％ ＥｔＯＨ中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ ｎＭ）が、１０ μｌの２００ ｎＭ　３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ〔約１２．８ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液 （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ； １．５ ｍＭ ＥＤＴＡ； １０％ グリセリン； １．０ ｍＭ ＣＨＡＰＳ； １％ ＢＳＡ）中に溶解〕と混合される。試験される１０ μｇの特定の蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに希釈される）は、最終容量の４０μｌとなるように添加される。非特異的結合は、３０ μＭ 非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定され、全体結合が６．６ ％ ＥｔＯＨを含有する１０ μｌ アッセイ緩衝液 を添加することにより決定される。インキュベーションが、４℃で２時間実行される。２５０ μｌの氷冷アッセイ緩衝液（２ ％ Ｃａｂ−ｏｓｉｌ Ｍ−５および０．２ ％ デキストランを含有する）が、各チュウブに添加され、混合され、そして若干回転される。Ｃａｂ−ｏｓｉｌ Ｍ−５添加の約５分後、チュウブは５分間、１４０００ ｒｐｍ （ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ） で遠心分離される。２００ μｌの上清が、マイクロシンチチュウブに移され、そして３．５ ｍｌ アトムライトが添加される。チュウブは、液体シンチレーションカウンタ中で測定される。もし３Ｈ　ＦＦ−ＭＡＳ結合が非標識ＦＦ−ＭＡＳにより置換されるならば、試験した蛋白質はＭＡＳレセプターまたはＭＡＳシグナル伝達蛋白質である。
【００７７】
＜実施例４＞
《特定の化合物がリガンドであるかどうかを決定するアッセイ ：》
試験される１０ μｌの化合物（６．６％ ＥｔＯＨ中に１，３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００ ｎＭ）が、１０ μｌの２００ ｎＭ　３Ｈ−標識ＦＦ−ＭＡＳ 〔約１２．８ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アッセイ緩衝液 （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ； １．５ ｍＭ ＥＤＴＡ； １０％ グリセリン ； １．０ ｍＭ ＣＨＡＰＳ； １％ ＢＳＡ中に溶解）〕と混合される。１０ μｇのＳＡＭ１ ａ 蛋白質（アッセイ緩衝液中に新たに希釈される）が、最終容量の４０μｌとなるように添加される。非特異的結合が３０ μＭ 非標識ＦＦ−ＭＡＳの存在下で測定され、全体結合が６．６％ ＥｔＯＨを含有する１０ μｌ アッセイ緩衝液の添加により決定される。インキュベーションは、４℃で２時間実行される。２５０ μｌの氷冷アッセイ緩衝液（２ ％ Ｃａｂ−ｏｓｉｌおよび０．２ ％ デキストランを含有する）が、各チュウブに添加され、混合され、そして若干回転される。Ｃａｂ−ｏｓｉｌ添加の約５分後、チュウブは５分間、１４０００ ｒｐｍ （ミニフュージ、ｍｉｎｉｆｕｇｅ） で遠心分離される。２００ μｌの上清が、マイクロシンチチュウブに移され、そして３．５ ｍｌ アトムライトが添加される。チュウブは液体シンチレーションカウンタ中で測定される。もし化合物が特異的ＦＦ−ＭＡＳ結合を置換できるならば、それはＭＡＳレセプターに対する、またはＭＡＳシグナル伝達蛋白質に対するリガンドである。
【００７８】
＜実施例５＞
《ＳＡＭ１のクローニング》
ｃＤＮＡ ライブラリーを、２４日齢マウスの１０，０００ 卵母細胞から分離したｍＲＮＡから調製した。前記ｃＤＮＡ ライブラリーを、ｐＳＰＯＲＴ プラスミド・ベクター （ライフテクノロジー）中に構築した。クローンをアトランダムにとり、そして部分的にシークエンスし、配列をフレッド／フラップ　プログラム（ｐｈｒｅｄ／ｐｈｒａｐ ｐｒｏｇｒａｍｓ）を使用して組み立てた。シークエンスした数千クローン中から、２つの配列による１配列アセンブリーがヒトのオキシ・ステロール結合蛋白質（Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と２１ ％ アミノ酸同一性を示した。最長のクローン ＭＯＣＹ２８６４が完全にシークエンスされ、データベース中で如何なる同一もしくはオルソロガスである遺伝子も発見できなかった。この新規遺伝子はＳＡＭ１と命名された。ＳＡＭ１　ｃＤＮＡの５’端の増幅は、卵母細胞ライブラリ上でｐＳＰＯＲＴに特異的なプライマ ＃１７６９５９ （配列番号 ９） およびＳＡＭ１に特異的なプライマ ＃１９８２４１ （配列番号 １０）を使用したＰＣＲによって実行された。この結果は、２つの異なる５’端を有するｃＤＮＡの存在を示し、これらはＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ ｂと命名された。完全長ＰＣＲ増幅を、ＳＡＭ１ ａに関してプライマ ＃１９９７７２ （配列番号 １１）および＃１９８２３９ （配列番号 １２） 、並びにＳＡＭ１ ｂに関して＃２０１７９０ （配列番号 １３）および＃１９８２３９ （配列番号 １２） を使用してマウス卵母細胞ライブラリー上で実行した。それぞれＮｈｅｌおよびＮｏｔｌの認識部位が、前記プライマに導入された。ＳＡＭ１ ａおよびＳＡＭｂ　ｃＤＮＡｓを、ＮｈｅｌおよびＮｏｔｌ 制限酵素で消化し、そして ｐｃＤＮＡ３．１＋ （インビトロジェン）中にクローン化した。
【００７９】
Ｃ端ヒスチジンストレッチ（ニッケルカラムに対する親和性から精製に使用された）に融合したＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂ 蛋白質を発現させるＤＮＡ構築物を、以下のように作出した。ＳＡＭ１ ａおよびＳＡＭ１ ｂ　ｃＤＮＡを、それぞれプライマ ＃１９９７７２ （配列番号 １１）および＃２１１４６５ （配列番号 １４）並びにプライマ ＃２０１７９０ （配列番号 １３）および＃２１１４６５ （配列番号 １４）を使用してＰＣＲ増幅した。それぞれＮｈｅｌおよびＸｍａｌの認識部位を、前記プライマに導入した。そして、ＰＣＲ産物を、制限酵素 ＮｈｅｌおよびＸｍａｌを用いてｐＢｌｕｅＢａｃ４， ５Ｖ５ＨＩＳ （インビトロジェン） 内にクローン化した。そして、この中間構築物を、ＳｍａｌおよびＢｓｔＢｌにより消化し、ＤＮＡ ポリメラーゼ１のクレノー断片を使用してフィルインさせ、そして再ライゲーションした。これらの構築物は、「ｐＢｌｕｅＢａｃ４， ５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１ａ」および「ｐＢｌｕｅＢａｃ４， ５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１ｂ」と命名された。
【００８０】
《Ｓｆ９ 細胞におけるＳＡＭ１発現》
ＳＡＭ１ａ−ＨＩＳおよびＳＡＭ１ｂ−ＨＩＳ 蛋白質を、「Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ トランスフェクション　キット」マニュアル（インビトロジェン）にしたがって組換え型バキュロウイルスを使用してＳｆ９ 細胞中で発現した。
【００８１】
Ｓｆ９ 昆虫細胞を感染させるために、 ０．５ μｇ　Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ　ＤＮＡおよび組換え型トランスファープラスミド 「ｐＢｌｕｅＢａｃ４， ５Ｖ５ＨＩＳ中のＳＡＭ１」（４ μｇ）を、１ ｍｌ グレースの昆虫培養液（Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉａ）および２０ μｌのインセクチンプラスリポソーム（ｌｎｓｅｃｔｉｎ−Ｐｌｕｓ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）で１５分間インキュベーションし、そして混合液を６０ｍｍ培養皿内で２ｘ１０６　Ｓｆ９ 細胞に添加した。細胞を２７℃で揺動して９６時間放置した。ビラ（Ｖｉｒａ）を単離して、プラークアッセイを実行した。推測上の組換え型プラークを選別し、 Ｐ−１ ウイルスストックを作出した。組換え型ウイルスクローンのＰＣＲ分析を行い、そして陽性クローンから高タイターのウイルスストックを調製した。大規模にＳＡＭ１ ａおよびＳＡＭ１ ｂを発現させるため、 ５００ ｍｌ　Ｓｆ９ 細胞（２，０ ｘ １０６ 細胞／ｍｌ） を、それぞれＳＡＭ１ ａおよびＳＡＭ１ ｂに関して２５ ｍｌ ウイルス （１，８ ｘ １０８ プラーク形成単位／ｍｌ）または６０ ｍｌ ウイルス （６ ｘ １０７　ｐｆｕ／ｍｌ）で感染させた。インキュベーションの７０時間後、細胞を遠心分離で沈殿させ、蛋白質を精製した。
【００８２】
【化１】
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＜実施例６＞
《ＳＡＭ１ａおよびＳＡＭ１ｂの精製》
ＨＩＳ−ＳＡＭ１ａおよびＨＩＳ−ＳＡＭ１ｂの精製を、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）のマニュアル（ＱｌＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ　第４版）にしたがって実行した。
【００８３】
簡単に説明すると、 ＳＦ９ 昆虫細胞（バキュロウイルス 発現ベクター内に６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ａまたは６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ｂの構築物を含有する）の細胞培養物を遠心分離し、沈殿物を、溶解緩衝液 （５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ３００ ｍＭ ＮａＣＩ， １０ ｍＭ イミダゾール， ｐＨ ８）およびリゾチームを添加し、溶解物を遠心分離で清澄化した後に氷上で６ ｘ １０秒間ソニケーションして溶解させた。清澄化した溶解物を、 Ｎｉ−ＮＴＡ アガロース（キアゲン）の５０％スラリーと穏和な撹拌条件下でインキュベーションし（６ｘＨｉｓ−ＳＡＭ１ａと結合させるために）、２回洗浄（５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ３００ ｍＭ ＮａＣｌ， ２０ ｍＭ イミダゾール， ｐＨ ８） し、高濃度のイミダゾール （５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ３００ ｍＭ ＮａＣｌ， ２５０ ｍＭ イミダゾール， ｐＨ ８）で溶出した。精製した蛋白質の収量および純度を、クマシー（ブリリアントブルー、シグマ）染色した。ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル （ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｇｅｌ， インビトロジェン）上で分析した。
【００８４】
【化２−１】
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【００８５】
【化２−２】
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【化３】
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【００８６】
【化４−１】
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【００８７】
【化４−２】
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【化５】
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［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＡＭ１ｂからの３Ｈ−標識　ＦＦ−ＭＡＳの置換を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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