(57)【要約】本発明は、ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスに付随したレトロウイルス関連疾患の予防又は治療のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用に関する。好ましくは、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。本発明によれば、上記ガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせは、コリラギン及び／又はゲラニン及び他のエラギタンニン、であるか、又は、を含むことが好ましい。さらに好ましくは、上記ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓがＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスに付随したレトロウイルス関連疾患の予防又は治療のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用。
【請求項２】
ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスの複製の阻害のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用。
【請求項３】
ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスのウイルス侵入の阻害のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用。
【請求項４】
レトロウイルスがＨＩＶである、請求項１乃至３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項４記載の使用。
【請求項６】
抽出物が水抽出物、アルコール抽出物、水／アルコール抽出物、ヘキサン抽出物又はＣＯ２抽出物である、請求項１乃至３のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
アルコールがメタノール又はエタノールである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
画分が蛋白質画分か又はガロタンニン画分である、請求項１乃至５のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
ガロタンニンがコリラギンであるか又はガロタンニン画分がコリラギンを含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
ガロタンニンがゲラニンであるか又はガロタンニン画分がゲラニンを含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
ガロタンニンがエラグ酸であるか又はガロタンニン画分がエラグ酸を含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
ガロタンニンがブレビフォリンカルボキシル酸であるか又はガロタンニン画分がブレビフォリンカルボキシル酸を含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
ガロタンニンがコリラギン、ゲラニン、エラグ酸及びブレビフォリンカルボキシル酸とは異なるエラギタンニンであるか又はガロタンニン画分がコリラギン、ゲラニン、エラグ酸及びブレビフォリンカルボキシル酸とは異なるエラギタンニンを含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
ガロタンニン類の組み合わせ又はガロタンニン画分がコリラギン、ゲラニン、エラグ酸及びブレビフォリンカルボキシル酸及びコリラギンとゲラニンとは異なる任意のエラギタンニンの少なくとも２つを含む、請求項１乃至５及び８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
ガロタンニン類が０．１から９９．９％の濃度にて薬剤組成物中に製剤化される、請求項１乃至１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
抽出物又は画分が０．１から９９．９％の濃度にて薬剤組成物中に存在する、請求項１乃至１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓがＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓである、請求項１乃至１６のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスに付随したレトロウイルス関連疾患の予防及び／又は治療のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用に関する。好ましくは、上記レトロウイルスはヒト免疫疾患ウイルス（ＨＩＶ）である。本発明によれば、上記ガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせは、コリラギン及び／又はゲラニン及び／又は他のエラギタンニン、であるか、又は、を含む。さらに好ましいのは、上記ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓがＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓである。
【０００２】
レトロウイルスの感染は重度の病気を引き起こして、しばしばヒトの死をもたらし得る。ヒトに対して病原性のレトロウイルスは、ラウスザルコーマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶＩＩ）並びにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。特に、ＨＩＶは、その伝染性、その感染様式のため及び満足の行く治癒がこれまで証明されていないために、健康に関する公共機関の主要な関心事である。現在、ＨＩＶ感染患者の治療は高価なコンビネーション治療に依存しており、そして治療の推移が延期されたあとは、耐性ＨＩＶ株を生じるかもしれない。
【０００３】
Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓの抽出物又はＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ由来の成分は当業界において抗ウイルス剤として記載されてきた。即ち、ＵＳ−Ａ　４，９３７，０７４（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．）は、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ｎｉｒｕｒｉの抽出物がＨＩＶのようなレトロウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）活性を阻害するかもしれないことを報告する。当該抽出物は、メタノール又は他の慣用の溶剤により植物全体を抽出することにより得てよい。Ｕｃｈｉｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０（１９９６），４１１−４１７は、ＨＩＶプロモーター活性の抑圧のためのタンニン酸の使用を記載する。Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ．６５（１９９９），４３−４６は、様々なエラギタンニン、例えばコリラギン及びゲラニンがＨＩＶの逆転写酵素に対して強い阻害作用を有することを記載する。Ｈｉｒａｙａｍａ，ＵＳ−Ａ　５，１５９，０６０は、レトロウイルスの逆転写酵素を阻害する硫酸化タンニンの使用を記載する。
【０００４】
上記の報告は全て野生型レトロウイルスのウイルスの伝染又はＲＴ−活性の阻害に依存する。そのようなウイルスは、ヌクレオシド性阻害剤又は非ヌクレオシド性阻害剤に通常は感受性である。そのような阻害剤又はそのような阻害剤の組み合わせによる治療の後、ＨＩＶが治療に対して耐性を発現するかもしれないことが観察された。一度上記ウイルスが上記阻害剤に対して耐性を示すと、現在の治療アプローチは通常失敗する。
【０００５】
従って、本発明の基礎となる技術上の問題は、ヌクレオシド性又は非ヌクレオシド性阻害剤に耐性なレトロウイルスによる感染を治療又は予防するための新規なアプローチを提供することであった。上記の技術上の問題に対する解決は、特許請求の範囲に特徴付けされる態様により提供される。
【０００６】
従って、本発明は、ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスに付随したレトロウイルス関連疾患の予防又は治療のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用に関する。
【０００７】
本発明は、ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスの複製の阻害のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用にも関する。
【０００８】
本発明は、さらに、ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスのウイルスの取り込みの阻害のための薬剤組成物の製造のための、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせの使用に関する。
【０００９】
本発明により製造された薬剤組成物は、薬学上受容可能な担体及び／又は希釈剤をさらに含んでよい。適切な薬学上の担体の例は当業界で良く知られており、リン酸緩衝塩溶液、水、エマルジョン、例えばオイル／水エマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等を含む。そのような担体を含む組成物は、よく知られた慣用の方法により製剤化することができる。これらの薬学組成物は適切な用量にて被験者に投与することができる。適切な組成物の投与は、異なる様式、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻内又は気管支内投与により、遂行してよい。用量の投与計画は施術する外科医及び臨床上の因子により決定されることになる。医学界においてよく知られるとおり、何れの一人の患者のための用量も多くの因子に依存しており、患者の大きさ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的な健康状態、及び同時に投与される他の薬剤を含む。局所用量は、例えば、１５０から１２００ｍｇの範囲であり得る；しかしながら、この例示範囲より下の用量又は越える用量は想像され、特に前記の因子を考慮する。一般には、薬剤組成物の通常の投与としての投与計画は１日あたり３から６ユニットの範囲であるべきである。進行は定期的な評価により監視することができる。上記組成物は局所又は全身投与であってよい。投与は通常経口であって、上記示された用量範囲である。非経口投与のための製造物は、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、及び注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液を含み、塩溶液及び緩衝化媒体を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル又は固定油を含む。静脈内媒体は、流体及び栄養性補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づく補充剤）等を含む。保存剤及び他の添加物は、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガス等であってもよい。用語「ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスに付随したレトロウイルス関連疾患」は、そのような阻害剤耐性レトロウイルスにより誘導されたか又は同時に付随する複数又は一つの疾患を意味する。例えば、上記複数又は一つの疾患状態は非耐性レトロウイルス株により誘導されて適切な処置により制御されたかもしれないが、耐性株が誘導されたかもしれない。以前に誘導されたかもしれない上記耐性レトロウイルスの病原性作用のため、上記複数又は一つの疾患状態が悪化したかもしれない。さらに、上記複数又は一つの疾患状態は耐性レトロウイルス、続く耐性レトロウイルスによる一次感染により誘導されたかもしれない。用語「耐性」は部分的な耐性も含み、典型的には少なくとも１０％の耐性であることに注目することが重要である。
【００１０】
用語「ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルス及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤耐性レトロウイルスのウイルスの取り込み」は、その標的細胞へのレトロウイルスの侵入を意味する。レトロウイルスは、少なくとも３つの連続する工程からなるプロセスによりその標的細胞に侵入することが示された。第一工程は、その標的細胞の表面上の分子へのレトロウイルスの結合を含む。ＨＩＶは、例えば、ウイルス糖蛋白質ｇｐ４１とｇｐ１２０を通してその標的細胞に結合する。後続の工程において、ウイルスは、標的細胞へのウイルス粒子のエンドサイトーシスを含む機構により標的細胞に取り込まれる。次の工程において、ウイルスは、コートをとられ、そしてそのＲＮＡ遺伝物質及びウイルスのコードする逆転写酵素が細胞質に放出される。逆転写酵素は、ＲＮＡ遺伝物質をＤＮＡプロウイルスに転写することによりレトロウイルスの複製サイクルを開始させ、そして次にプロウイルスは標的細胞のゲノムに組込まれる。レトロウイルスのための標的細胞は、細胞表面分子を通してレトロウイルスを結合することができる細胞である。例えば、上記標的細胞はＨＩＶ−１の場合、ＣＤ４陽性細胞である。
【００１１】
本発明によれば、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓの抽出物は、ＣＤ４　Ｔ−細胞の感染の阻害により、ヌクレオシド性阻害剤及び／又は非ヌクレオシド性阻害剤に対して耐性のレトロウイルスの複製を有効に阻害することがわかった。さらに、ウイルス複製に加えて、標的細胞により取り込まれたウイルスも顕著に阻害された。驚くことに、上記抽出物、画分及びガロタンニンは、いくつかのＮＲＴＩ（ヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤）株、いくつかのＮＮＲＴＩ（非ヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤）株及び一つのＨＩＶ−２株に対して、有効であることがわかったか、又は野生型ＨＩＶ−１株に比較して、より有効であったことから、並はずれの広い防御能力を証明する。有利なことに、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物またはその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせは、レトロウイルスのライフサイクルの少なくとも２つの鍵となる工程、即ちインビトロにおいて取り込みと逆転写を同時に阻害することができる。
【００１２】
発明の使用の一つの好ましい態様において、上記レトロウイルスはＨＩＶ、ラウスザルコーマウイルス又はＨＴＬＶ　Ｉ又はＩＩである。
ＨＩＶはＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２であってよい。特に好ましいのは、上記ＨＩＶ−がＨＩＶ−１であることである。
【００１３】
Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物は当業界でよく知られた慣用の方法に従い調製してよい；例えば、Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ　ｃｉｔ．Ｈｉｒａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔを参照。好ましくは、上記抽出物は、水抽出物、アルコール抽出物、水−アルコール抽出物、ヘキサン抽出物又はＣＯ２抽出物である。
【００１４】
さらに好ましくは、活性成分として用いられるＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓの化合物が抽出工程の間に破壊されないことである。そのような抽出プロセスは、当業界公知であり、引用により上で本明細書に言及された。
【００１５】
もっとも好ましくは、上記アルコールがメタノール又はエタノールである。
本発明によれば、上記画分は蛋白質画分か又はガロタンニン画分であることがさらに好ましい。蛋白質画分は慣用のプロトコルに従い調製してもよい。ガロタンニン画分を得るための適切なプロトコルも当業界にてよく知られている；例えば、Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔを参照。例えば、１００ｇの新たに粉末化した薬剤を１０００ｍｌの蒸留水中で２時間回転フラスコ中で加熱してよい。冷却後、溶液はコットンウールを通して濾過する。固形堆積物は同時に２回５００ｍｌメタノールと共に加熱して、次に冷却後にデカントする。化合されたメタノール抽出物は、次に回転エバポレーター中で乾燥させる。乾燥堆積物を２００ｍｌの蒸留水に再懸濁して、３分間超音波処理に供する。そうして得られた懸濁液を３回１００ｍｌのジクロロメタンにより抽出してよい。化合されたジクロロメタン相を次に１００ｍｌの蒸留水により抽出する。水相を化合して、液体の約半分を回転エバポレーターに残して、このプロセスの生成物を次に凍結乾燥させる。得られたガロタンニン画分の典型量は１０．５ｇである。
【００１６】
本発明によれば、上記ガロタンニンがコリラギンであるか、又は上記ガロタンニン画分がコリラギンを含むことがさらに好ましい。
また、上記ガロタンニンがゲラニンであるか、又は上記ガロタンニン画分がゲラニンを含むことも好ましい。
【００１７】
さらに好ましいのは、上記ガロタンニンがエラグ酸であるか、又は上記ガロタンニン画分がエラグ酸を含む。
さらに好ましいのは、上記ガロタンニンがブレビフォリンカルボキシル酸（ｂｒｅｖｉｆｏｌｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）であるか、又は上記ガロタンニン画分がブレビフォリンカルボキシル酸を含む。
【００１８】
本発明によれば、さらに好ましくは、上記ガロタンニンが別のエラギタンニンであるか、又は上記ガロタンニン画分がエラギタンニンを含む。さらなるエラギタンニンの例は、チェブラグ酸（ｃｈｅｂｕｌａｇｉｃ ａｃｉｄ）、エレオカープシン（ｅｌａｅｏｃａｒｐｕｓｉｎ）、マロツシニン（ｍａｌｌｏｔｕｓｉｎｉｎ）、フィランツシン（ｐｈｙｌｌａｎｔｕｓｉｉｎ）及び１−ガロイル−３，５−ヘキサヒドロジフェノイル−４−０−ブレビフォリンカルボキシル−β−Ｄ−グルコピラノースである。
【００１９】
発明の使用の別の好ましい態様においては、上記ガロタンニン又は上記ガロタンニン画分の組み合わせは、コリラギン、ゲラニン、エラグ酸及びブレビフォリンカルボキシル酸及び任意に別のエラギタンニンを少なくとも２つ、例えば３つ、４つ又は５つ含む。コリラギン、ゲラニン、エラグ酸及びブレビフォリンカルボキシル酸及び任意の別のエラギタンニンの相対量は、薬剤組成物中で変更してよい。コリラギンとゲラニンを含む少なくとも３つの異なるエラギタンニンが上記薬剤組成物に存在することが好ましい。
【００２０】
本発明の使用の別の好ましい態様において、上記ガロタンニンは、０．１から９９．９％、好ましくは１から９５％の最終濃度にて上記薬剤組成物中に製剤化させる。これは、経口投与に関して特に真実と思う。
【００２１】
上記抽出物又は上記画分が０．１から９９．９％、好ましくは１から９５％の最終濃度にて上記薬剤組成物中に存在することも好ましい。これは、経口投与に関して特に真実と思う。
【００２２】
Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓが異なるＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ種に属するかもしれない場合（全ては本発明に包含される）、上記ＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓはＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓであることが好ましい。
【００２３】
本発明は、ヌクレオシド性又は非ヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤に耐性のレトロウイルスを病原とするか又は付随する疾患により冒された患者を治療する方法にも関し、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせを上記患者に適量投与することを含む。好ましくは、上記レトロウイルスがＨＩＶ、より好ましくはＨＩＶ−１である。また、上記ガロタンニンがコリラギン又はゲラニン又は別のエラギタンニン又はそれらの組み合わせであることも好ましい。本発明の治療方法のさらに好ましい態様は、発明の使用に関連して論じられ、そして等しく適用可能である。
【００２４】
最後に、本発明は、レトロウイルスがヌクレオシド性又は非ヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤に耐性である場合のレトロウイルスの複製を阻害する方法に関し、Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物又はその画分又はガロタンニン又はガロタンニン類の組み合わせを、上記レトロウイルスに感染した患者に適量投与することを含む。本発明の阻害方法のさらに好ましい態様は、発明の使用に関連して論じられ、そして等しく適用可能である。
【００２５】
多数の文書が明細書を通じて引用される。これらの文書の開示内容はその全体を引用により本明細書に取り込む。
実施例は発明を例示する。
実施例１
感染アッセイにおけるＰ．ａｍａｒｕｓからのガロタンニンの抗ＨＩＶ−１活性　ＨＩＶ（ＨＸ１０，Ｒａｔｎｅｒ　Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８７；ＡＩＤＳ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３，５７−６又はＨＢＩＯ，受託番号１５６５４、Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ　３１３，２７７−２８４）を、ＭＴ４細胞系の条件化培養液体から調製した（Ｍｉｙｏｓｈｉ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８２），Ｇａｎｎ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　ｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２８：２１９；Ｐａｕｗｅｌｓ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１６：１７１）。上記培養液体は、低速遠心分離（９００ｘｇ）により細胞を透明にし、そして等量の子ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を−８０℃保存前に加えた。Ｐ．ａｍａｒｕｓのガロタンニン抽出物及び精製されたガロタンニンコリラギン及びゲラニンによるウイルス感染の阻害は、ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌリポーター細胞系を用いて評価した（Ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（ＭＡＧＩ）ｃｅｌｌｓ，Ｋｉｍｐｔｏｎ　Ｊ，Ｅｍｅｒｍａｎ　Ｍ．（１９８２），Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６６（４）：２２３２−２２３９）。簡単に言えば、１．５　ｘ　１０４のＭＡＧＩ細胞／ウエルを４８ウエル培養プレートにプレートし、そして一晩成育させた。次の日、細胞を、１００μｌ中の７０μｌのＨＩＶ−１ストックと共に、１０μｇ／ｍｌ，５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ又は１．２５μｇ／ｍｌの濃度のガロタンニン抽出物又はコリラギン又はゲラニン又はＰＢＳの存在下で２時間湿潤雰囲気にてインキュベートした。次に、薬剤を含むか又は含まない２００μｌの培地を加えて、細胞を２日間インキュベートした。感染した細胞は、ＨＩＶ感染の結果として内在β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の５−ブロモ−４−クロロ−３−イノリル−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）の染色により検出した。細胞をＰＢＳ中の０．２％グルタルアルデヒド及び１％のフォルムアルデヒドとの５分間のインキュベーションにより固定化した。固定化された細胞をＰＢＳにより２回洗浄して、染色溶液（４ｍＭ　Ｋ−フェリシアニド、４ｍＭ　Ｋ−フェロシアニド、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｘ−ｇａｌ）を３０分間３７℃において重層した。青い細胞の数を顕微鏡観察により数えた（詳細に関しては、Ｋｉｍｐｔｏｎ　Ｊ，Ｅｍｅｒｍａｎ　Ｍ．（１９９２）．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６６（４）：２２３２−９を参照）。抗ウイルス活性は抽出物を伴う場合と伴わない場合の青く染まった細胞の比率から計算し、そしてパーセント阻害として表した。試験は３通り実施した。感染の阻害を表１に示す。表１から認識され得るとおり、ガロタンニンは用量依存性様式にてＨＩＶ−１の複製を阻害する。
【００２６】
【表１】
2004513092.tif 000002
実施例２
Ｐ．ａｍａｒｕｓのガロタンニンを用いたインビトロでのＨＩＶ−１逆転写酵素の阻害
Ｐ．ａｍａｒｕｓのガロタンニンコリラギン及びゲラニンの組換えＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）に対する阻害効果を市販のＲＴアッセイ（Ｓｃｒｅｅｎ　ＲＴＡ，Ｒｅｔｒｏ−Ｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，ドイツ）により測定したが、逆転写酵素の測定値としてＤＮＡ中のビオチン化ヌクレオチドの取り込みを利用する。組換えＴＲＨ試薬（５ｍＵ）を１０μｇ／ｍｌ，５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ又は１．２５μｇ／ｍｌの濃度のコリラギン又はゲラニン又はＰＢＳと共に２時間インキュベートし、そしてＲＴ活性を製造者のプロトコルに従い測定した。組換えＨＩＶ−１　ＲＴのＰ．ａｍａｒｕｓガロタンニンによる阻害を、図１にてグラフにより表す。図１から、阻害がゲラニンに関して＞８０％及びコリラギンに関して＞３５％の点である１０μｇ／ｍｌまで、阻害の増加はガロタンニンの濃度増加に伴って直線であることが観察され得る。
実施例３
感染アッセイにおけるゲラニンの抗ＨＩＶ−１活性
実施例１に記載されたＨＩＶ−１ウイルスストックを用いて、ＣＤ４＋リンパ性細胞（ＭＴ４）の感染に対するＰ．ａｍａｒｕｓのゲラニンの阻害効果を評価した。５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を、ＭＴ４細胞の感染により、ウイルスストックの連続希釈及び続く細胞液体中のウイルス性ｐ２４含有量の定量（ＨＩＶ−１　ｐ２４コアプロフィールＥＬＩＳＡ，ＮＥＮ，Ｚａｖｅｎｔｅｍ，ベルギー）と共に、測定した。ＭＴ４細胞は計算上１００　ＴＣＩＤ５０にて５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ，１．２５μｇ／ｍｌ，０．６３μｇ／ｍｌ又は０．３１μｇ／ｍｌの濃度のＰ．ａｍａｒｕｓの精製されたゲラニン存在下で感染させた。ゲラニンはそれらの濃度において無害であることが以前に確定していた。ＭＴ４標的細胞を７日間ウイルス及び阻害剤の存在下でインキュベートし、そして新鮮な培地（薬剤を含む）を一日おきに加えた。感染は細胞液体中のｐ２４の含有量の定量により監視した。検出可能なｐ２４含有量（参照用阻害剤及び非感染陰性対照に比較して）のないサンプルを、感染から完全に防御されたものとした。さもなくば、液体中のｐ２４の含有量は防御に対して負に相関した。各実験は３通りに実施した。図２は、２つの独立の試験の結果をグラフにより描写する（平均、エラーバーは標準偏差を反映する）。図２から、増加するゲラニン濃度が増加した阻害をもたらし、完全な阻害が１．２５μｇ／ｍｌであることが観察され得る。
実施例４
感染アッセイにおけるＲＴ阻害剤耐性ＨＩＶ−１株に対する抗ＨＩＶ−１活性
本質的には、実施例３に記載されたのと同じ実験を用いて、ヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株に対するゲラニンの阻害効果を測定した。ＡＲＰ１４５と呼ばれる株（Ｔｉｓｄａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９０（１２）：５６５３−５６５６）をＮＩＢＳＣ（ＭＲＣ）から得て、３ＴＣ／ＦＴＣ耐性により表現型上の特性決定をした。ＭＴ４細胞に、計算上１００　ＴＣＩＤ５０のＨＸ１０又はＡＲＰ１４５いずれかを、５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ，１．２５μｇ／ｍｌ及び０．６３μｇ／ｍｌの濃度のＰ．ａｍａｒｕｓの精製されたゲラニン存在下で、感染させた。耐性株及び野生型親株（ＨＸ１０）の阻害は図３においてグラフにより表す。ゲラニンによる野生型又はＮＲＴＩ耐性株の阻害に顕著な差異は観察されなかった。
実施例５
感染アッセイにおけるＲＴ阻害剤耐性ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対するＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓ抽出物の抗ＨＩＶ−１活性
本質的には、実施例１に記載されたのと同じ実験を用いて、実施例７に記載されたとおりに調製したＰｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ抽出物のＨＩＶ−２株（ＲＯＤ，Ｃｌａｖｅｌ　Ｆ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：３４３；Ｇｕｙａｄｅｒ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ　３２６：６６２）及びヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株（ＡＲＰ１４５）に対する阻害効果を測定した。ＭＡＧＩ細胞に７０μｌの対応するウイルスストックを、５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ，１．２５μｇ／ｍｌ及び０．６３μｇ／ｍｌの濃度の上記抽出物の存在下で、感染させた（リン酸緩衝塩溶液中）。ＨＩＶ−２株、ＮＲＴＩ耐性株及び野生型親株（ＨＸ１０）の阻害を、図４においてグラフにより表す。上記抽出物による、ＨＩＶ−２又はＮＲＴＩ耐性ＨＩＶ−１株のＨＩＶ−１野生型株との比較における阻害の低下は観察されなかった。対照的に、ＨＩＶ−２の阻害は増強された。さらにもっと増強されたのはＮＲＴＩ耐性株の阻害であった。
実施例６
Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓ抽出物を用いたＨＩＶ−１逆転写酵素のインビトロにおける阻害
Ｐ．ａｍａｒｕｓ抽出物（実施例７）の組換えＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）に対する阻害効果を、本質的には実施例２に記載されたのと同じ方法により測定した。しかしながら、この実験においては、別のＲＴアッセイを用いた（逆転写酵素アッセイ、非放射性、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）。組換えＲＴ−試薬（２．５ｍＵ）を１０μｇ／ｍｌ，５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ又は１．２５μｇ／ｍｌの濃度の上記抽出物又はＰＢＳと共に１時間インキュベートし、そしてＲＴ活性を製造者のプロトコルに従い測定した。抽出物による組換えＨＩＶ−１　ＲＴの阻害を図５においてグラフにより表す。図５から、組換えＨＩＶ−１　ＲＴに対する阻害が用量依存性であることが観察できる。１０μｇ／ｍｌの抽出物濃度において、阻害は完全であった（＞９８％）。
実施例７
Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓ抽出物の調製
完全な未切断の乾燥した葉を、１から３時間、３０−４０℃において、エタノール５０％（ｖ／ｖ）の薬剤溶剤比１：１０（＋／−３）にて鋼製の容器の中で抽出した。薬剤の残余を分離して、次に、１から３部の水により洗浄した。エタノール溶出物と上記の水を混合した。次に、クエン酸１水素２ナトリウム（１−３％　ｍ／ｍ）を加え、そして上記液体を次に膜で濾過した。粉末化されたＳｔｅｒｃｕｌｉａ（エタノール／水に予め溶解）を上記抽出物液体に加えた（０．５−５％　ｍ／ｍ最終濃度）。液体を減圧下で（約３００ｍｂａｒを２０ｍｂａｒに低下）蒸発させた後に、２０−４０％乾燥質量（ｍ／ｍ）の乾燥物質含有量に到達するまで蒸発温度を３０から６０℃（＋／−５℃）にした。次に、均質な懸濁液が生じるまで、柔らかい抽出物をマルトデキストリン（２８−３９％　ｍ／ｍ）と混合した。当該混合物を、８０−１２０℃の温度及び２０−４０秒間、微生物の汚染の軽減のためにショートヒーティングユニットを通して加工した。当該混合物を、水の含有量が５％未満になるまで徹底して乾燥させた。乾燥のプロセスの間、乾燥ユニットの外部温度は９０℃を超えなかった（＋／−５％）（＝「生成物温度（ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｅｍｐ．）」）。シリカ（０．５−３％　ｍ／ｍ）を、乾燥プロセスの間及び乾燥プロセスの後に加えた。乾燥生成物を混合して、次にふるいにかけた。
実施例８：Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ　ａｍａｒｕｓ由来の化合物の精製
１．単離手法
ブレビフォリンカルボキシル酸の単離のための出発物質は、実施例７に記載された抽出物であった。
【００２７】
乾燥抽出物を５０％水性エタノールに溶解して、遠心分離することにより、不溶性の物質及び微粉（ｆｉｎｅｓ）を除去した。透明な上清をＳｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ２０カラムに適用して、２０％水性メタノール中で稼働させた。カラムクロマトグラフからの精製された画分Ｘを回転エバポレーター中で濃縮して、凍結乾燥させた。
２．同定手法
精製された化合物Ｘは、ＵＶ分光分析機及び１３Ｃ−ＮＭＲにより確認した。ＵＶの主ピークは、文献データに完全に一致して、２７８、３５０及び３６２ｎｍにおいてであった（Ｍ．Ａ．Ｎａｗｗａｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６（３），７９３−７９８，１９９４）。我々のＮＭＲデータは、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙに記載されたブレビフォリンカルボキシル酸の１３Ｃ原子の存在及び構造を証明した（上記参照）。抽出物をＨＰＬＣ分析に供した（図６）。追加の証拠は、教授Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄａ，岡山大学、日本からのブレビフォリンカルボキシル酸の真正サンプルを用いたオリジナルのＨＰＬＣフィンガープリントをスパイクすることにより提供された（図７参照）。
３．要約
Ｐｈ．ａｍａｒｕｓのガロタンニンサンプルから別の主要なガロタンニン化合物を単離したところ、ブレビフォリンカルボキシル酸として同定された。この化合物はゲラニンの分解産物として得ることができる、。
【００２８】
ここではＰｈ．ａｍａｒｕｓの４つの主要化合物を同定した：
−　ゲラニン（７）
−　コリラギン（５）
−　エラグ酸
−　ブレビフォリンカルボキシル酸（４ａ）
実施例９
ＨＩＶ−２株及び感染アッセイにおけるＲＴ阻害剤耐性ＨＩＶ−１株の選択に対するゲラニンの抗ＨＩＶ−１活性
本質的には、実施例１に記載されたのと同じ実験を用いて、ＨＩＶ−２（ｒｏｄ）株及びヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株（ＡＲＰ１４１，ＡＲＰ１４５及びＡＲＰ１４６）並びに非ヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株（ＡＲＰ１０１０，ＡＲＰ１０１１及びＡＲＰ１０１４）の選択に対するゲラニンの阻害効果を判定した。２．５μｇ／ｍｌ，１．２５μｇ／ｍｌ及び０．６３μｇ／ｍｌの濃度のゲラニンの存在下で、ＭＡＧＩ細胞に７０μｌの対応するウイルスストックを感染させた。ＨＩＶ−２株、ＲＴ耐性株及び野生型親株（ＨＸ１０）のＥＣ５０値を計算して、表２に掲載する。ＨＩＶ−２又はＲＴ耐性ＨＩＶ−１株の、ＨＩＶ−１野生型株との比較における、ゲラニンによる阻害において、ＥＣ５０値の顕著な差異は観察されなかった。
【００２９】
【表２】
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実施例１０
ゲラニンによるウイルス取り込みの阻害
ゲラニンによるウイルスの取り込みの阻害を、最近記載されたアッセイ（Ｓａｐｈｉｒｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１８：６７７１−６７８５）にわずかな修飾を加えて用いて監視した。簡単に言えば、ＭＡＧＩ細胞を予め４℃において６０分間インキュベートし（２００μｌ）、ウイルス及び阻害剤（１００μｌの容量）を加え、細胞を３０分間４℃においてインキュベートし、そして最後に３７℃に２時間シフトさせた。次に、細胞を５００μｌのＰＢＳで５回洗浄することにより、未結合のウイルスを除去し、５分間トリプシン処理することにより、５００μｌのＰＢＳを用いて、全ての付着したが内部に入らなかったウイルスを再び洗浄し、そして最後に０．５％のＮＰ−４０を含む１００μｌのＰＢＳにより溶解した。細胞溶解物のＨＩＶ−１　ｐ２４含有量をｐ２４サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＮＥＮ）を用いて測定した。１００μｇ／ｍｌの濃度の硫酸ヘパリン（Ｈｅｐ−Ｓ）及びα−ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０モノクローナル抗体（最終希釈１：４０）を対照として使用した。ゲラニンを１０μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ及び０．６２５μｇ／ｍｌの最終濃度にて野生型ＨＩＶ−１の取り込みの妨害に関して試験し、結果を図８に描写する。観察され得るとおり、ウイルスの内在化は用量依存性様式によりゲラニンによりブロックされた。
実施例１１
ＣＭＩ−１１１とも呼ばれるＰ．ａｍａｒｕｓの抽出物（実施例７）の感染アッセイにおけるＲＴ阻害剤耐性ＨＩＶ−１株の選択に対する抗ＨＩＶ−１活性
本質的には、実施例１に記載されたのと同じ実験を用いて、追加のヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株（ＡＲＰ１４１及びＡＲＰ１４６）並びに非ヌクレオシド性ＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）耐性ＨＩＶ−１株（ＡＲＰ１０１０，ＡＲＰ１０１１及びＡＲＰ１０１４）の選択に対するＰ．ａｍａｒｕｓ抽出物の阻害効果を判定した。１０μｇ／ｍｌ，５μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ，１．２５μｇ／ｍｌ及び０．６３μｇ／ｍｌの濃度のＰ．ａｍａｒｕｓ抽出物の存在下で、ＭＡＧＩ細胞に７０μｌの対応するウイルスストックを感染させた。ＨＩＶ−２株、ＲＴ耐性株及び野生型親株（ＨＸ１０）のＥＣ５０値を計算して、表３に掲載する。ＨＩＶ−２又はＲＴ耐性ＨＩＶ−１株の、ＨＩＶ−１野生型株との比較における、ＣＭＩ−１１１による阻害において、ＥＣ５０値の顕著な差異は観察されなかった。対照的に、ＨＩＶ−２の阻害は増強された。もっとさらに増強されたのは、ＲＴ耐性株の阻害であった。
【００３０】
【表３】
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実施例１２
Ｐ．ａｍａｒｕｓ沈殿によるウイルスの取り込みの阻害
Ｐ．ａｍａｒｕｓ沈殿ＣＭＩ−１１１（実施例７）によるウイルス侵入の阻害を、本質的には実施例１０に記載されたとおりに測定した。ＣＭＩ−１１１を１０μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ及び０．６２５μｇ／ｍｌの最終濃度にて野生型ＨＩＶ−１の取り込みの妨害に関して試験し、結果を図９に描写する。観察され得るとおり、ウイルスの内在化は用量依存性様式によりＣＭＩ−１１１によりブロックされた。
実施例１３
ゲラニンによるＣＤ４へのＨＩＶ−１　ｇｐ１２０の結合の阻害
ウイルスエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０の、その細胞受容体ＣＤ４への結合の、ゲラニンによる阻害を、固定化された組換えＣＤ４及び組換えＨＩＶ−１　ｇｐ１２０を用いてＥＬＩＳＡ様アッセイフォーマットにおいて監視した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇ／ウエル　ＣＤ４（０．１Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．５）により、１２時間、４℃においてコートした。プレートは５回２００μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ，０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）により洗浄し、そして２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ，０．１％ゲランチン）により１時間ブロックした。ウエルを１００ｎｇの組換えｇｐ１２０及び試験サンプルの希釈物（１０％最終濃度、ブロッキングバッファー中）と１時間インキュベートし、そして５回洗浄した。ウエルをさらに１００μｌのマウス抗−１２０−Ｖ３モノクローナル抗体と、１時間、３７℃においてインキュベートし、５回洗浄し、そして１００μｌの抗−マウスＨＲＰ−配合モノクローナル抗体と、１時間、３７℃においてインキュベートし、そして１０回洗浄した。最後に、ウエルを１００μｌの基質（ＯＰＤ）と、１５分間インキュベートし、反応を１００μｌの１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４により停止し、そしてプレートをＥＬＩＳＡリーダーにより読んだ（４９２ｎｍ）。ゲラニンを最終濃度１０μｇ／ｍｌ，３．３３μｇ／ｍｌ，１．１１μｇ／ｍｌ，０．３７μｇ／ｍｌ，１．１２３μｇ／ｍｌ及び０．０４１μｇ／ｍｌにおいて２通り試験した。この典型的実験の結果を図１０に描写する。観察され得るとおり、ｇｐ１２０のＣＤ４への結合はゲラニンにより用量依存性様式にて阻害された。０．４８±０．０５μｇ／ｍｌの平均ＩＣ５０値は３つの別個の実験から計算した。
実施例１４
Ｐ．ａｍａｒｕｓ抽出物によるＨＩＶ−１　ｇｐ１２０のＣＤ４への結合の阻害　ウイルスエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０の、その細胞受容体ＣＤ４への結合の、Ｐ．ａｍａｒｕｓ抽出物による阻害を、本質的には実施例１３に記載されたとおりに測定した。Ｐ．ａｍａｒｕｓ抽出物を最終濃度３０μｇ／ｍｌ，１０μｇ／ｍｌ，３．３３μｇ／ｍｌ，１．１１μｇ／ｍｌ，０．３７μｇ／ｍｌ及び１．１２３μｇ／ｍｌ及び０．０４１μｇ／ｍｌにおいて２通り試験した。この典型的実験の結果を図１１に描写する。観察され得るとおり、ｇｐ１２０のＣＤ４への結合はＣＭＩ−１１１により用量依存性様式にて阻害された。２．６５±０．４４μｇ／ｍｌの平均ＩＣ５０値は３つの別個の実験から計算した。
【００３１】
図面は示す：
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：Ｐ．ａｍａｒｕｓから精製したコリラギン及びゲラニンの濃度の函数として（μｇ／ｍｌ）（横座票）、インビトロにて測定されたヒト免疫不全ウイルスタイプ１逆転写酵素のパーセント阻害（縦座標）をグラフにより表す。
【図２】
図２：Ｐ．ａｍａｒｕｓから精製したゲラニンの濃度の函数として（μｇ／ｍｌ）（横座票）、インビトロにて測定されたＭＴ４細胞内のヒト免疫不全ウイルスタイプ１の複製のパーセント阻害（縦座標）をグラフにより表す。
【図３】
図３：Ｐ．ａｍａｒｕｓから精製したゲラニンの濃度の函数として（μｇ／ｍｌ）（横座票）、インビトロにて測定されたＭＴ４細胞内のヒト免疫不全ウイルスタイプ１の野生型ＨＸ１０及びヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤耐性変種ＡＲＰ１４５の複製のパーセント阻害（縦座標）をグラフにより表す。
【図４】
図４：Ｐ．ａｍａｒｕｓ　ＣＭＩ−１１１抽出物（実施例７）の濃度の函数として（μｇ／ｍｌ）（横座票）、インビトロにて測定されたＨｅＬａ　ＣＤ４＋リポーター細胞系内のヒト免疫不全ウイルスタイプ１の野生型ＨＸ１０及びヌクレオシド性逆転写酵素阻害剤耐性変種ＡＲＰ１４５、及び野生型ヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２子孫）の複製のパーセント阻害（縦座標）をグラフにより表す。
【図５】
図５：Ｐ．ａｍａｒｕｓ　ＣＭＩ　１１１抽出物（実施例７）の濃度の函数として（μｇ／ｍｌ）（横座票）、インビトロにて測定されたヒト免疫不全ウイルスタイプ１の逆転写酵素のパーセント阻害（縦座標）をグラフにより表す。
【図６】
図６：Ｐｈ．ａｍａｒｕｓの乾燥抽出物のＨＰＬＣフィンガープリントである。
【図７】
図７：Ｐｈ．ａｍａｒｕｓの乾燥抽出物＋ブレビフォリンカルボキシル酸（４ａ）のＨＰＬＣフィンガープリントである。
【図８】
図８：異なる濃度の（μｇ／ｍｌ）ゲラニン存在下（横座票）でインビトロにて測定されたＨＩＶ−１に感染したＨｅＬａ　ＣＤ４＋リポーター細胞系中の細胞内ＨＩＶ−１　ｐ２４濃度のパーセント低下（ウイルスの内在化の阻害）（縦座標）をグラフにより表す。１００μｇ／ｍｌの濃度の硫酸ヘパリン（Ｈｅｐ−Ｓ）に関して、及びα−ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０モノクローナル抗体（最終希釈１：４０）に関してのパーセント低下も描写される。
【図９】
図９：異なる濃度の（μｇ／ｍｌ）ＣＭＩ−１１１存在下（横座票）でインビトロにて測定されたＨＩＶ−１に感染したＨｅＬａ　ＣＤ４＋リポーター細胞系中の細胞内ＨＩＶ−１　ｐ２４濃度のパーセント低下（ウイルスの内在化の阻害）（縦座標）をグラフにより表す。１００μｇ／ｍｌの濃度の硫酸ヘパリン（Ｈｅｐ−Ｓ）に関して、及びα−ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０モノクローナル抗体（最終希釈１：４０）に関してのパーセント低下も描写される。
【図１０】
図１０：異なる濃度の（μｇ／ｍｌ）ゲラニン存在下（横座票）でインビトロにて測定された、固定化ＣＤ４へのＨＩＶ−１　ｇｐ１２０の結合のパーセント低下（ウイルス受容体結合の阻害）（縦座標）をグラフにより表す。
【図１１】
図１１：異なる濃度の（μｇ／ｍｌ）ＣＭＩ−１１１存在下（横座票）でインビトロにて測定された、固定化ＣＤ４へのＨＩＶ−１　ｇｐ１２０の結合のパーセント低下（ウイルス受容体結合の阻害）（縦座標）をグラフにより表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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