(57)【要約】本発明は、部分的に、インビボでの循環Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体サブユニットの発現研究に基づく。１実施形態において、本発明は一般に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５アンタゴニストの新規な組み合わせ、ならびにそれらのアンタゴニストを投与することにより免疫応答を抑制する方法を特徴とする。いずれの場合にも、ＩＬ−１５分子またはＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）を標的とする第１の薬剤と、ＩＬ−２分子またはＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を標的とする第２の薬剤とを投与することによって、抑制が達成される。より一般的には、本発明は、患者に投与されたときまたはエキソビボで移植片に投与されたときに抗原反応性Ｔ細胞の数を低減する薬剤の、新規な組み合わせを特徴とする。たとえば、本発明は、それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤を含む組成物（たとえば、医薬として許容される組成物）を特徴とする。あるいは、組成物は少なくとも１種のＴ細胞死を促進する薬剤と、少なくとも１種のＴ細胞増殖を阻害する薬剤を含有することが可能である。Ｔ細胞死を促進する薬剤は、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）、受動的細胞死、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞障害）、またはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）を促進し得る。
2004525076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）を標的とする第１の薬剤と、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を標的とする第２の薬剤とを含む治療組成物。
【請求項２】
前記第１の薬剤が、ＩＬ−１５Ｒのサブユニットに結合する実質的に純粋な変異ＩＬ−１５ポリペプチドからなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項３】
前記サブユニットがＩＬ−１５Ｒαサブユニットである請求項２に記載の治療組成物。
【請求項４】
前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号２の１５６位に変異を有する請求項３に記載の治療組成物。
【請求項５】
前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドがさらに、配列番号２の１４９位に変異を有する請求項４に記載の治療組成物。
【請求項６】
配列番号２の１５６位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項４に記載の治療組成物。
【請求項７】
配列番号２の１４９位の前記変異が、グルタミンをアスパラギン酸に代える置換である請求項５に記載の治療組成物。
【請求項８】
前記変異ＩＬ−１５ポリペプチドが、配列番号２の１４９位および１５６位にグルタミンをアスパラギン酸に代える置換を有する請求項５に記載の治療組成物。
【請求項９】
前記第１の薬剤がさらに、ＩＬ−１５Ｒを有する細胞の除去をもたらす部分からなる請求項２に記載の治療組成物。
【請求項１０】
ＩＬ−１５Ｒを有する細胞を溶解する前記部分が、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である請求項９に記載の治療組成物。
【請求項１１】
前記第１の薬剤が、実質的に純粋な抗ＩＬ−１５Ｒ抗体からなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１２】
前記第２の薬剤が、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに特異的に結合する抗体からなる請求項１に記載の治療組成物。
【請求項１３】
患者において免疫応答を抑制する方法であって、ＩＬ−１５Ｒを標的とする第１の薬剤と、ＩＬ−２Ｒを標的とする第２の薬剤とを含む治療組成物を該患者に投与する工程からなる方法。
【請求項１４】
前記患者が、免疫疾患、特に自己免疫疾患を有するか、あるいは免疫疾患、特に自己免疫疾患を発症するおそれのある請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、およびベーチェット病からなるグループから選択されたリウマチ疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎およびグレーヴズ病からなるグループから選択された甲状腺の自己免疫疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、および脳脊髄炎からなるグループから選択された中枢神経系の自己免疫疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己免疫疾患が、尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー・アッシャー症候群、およびブラジル天疱瘡からなるグループから選択された種々の天疱瘡である請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己免疫疾患が、乾癬である請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が、炎症性腸疾患である請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有する請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、生物器官、組織、または細胞の移植を受けている請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、対宿主性移植片病を有する請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−１５に対する受容体を発現する細胞を除去する方法であって、ＩＬ−１５Ｒを標的とする第１の薬剤と、ＩＬ−２Ｒを標的とする第２の薬剤とを含む治療組成物に、該細胞を曝露する工程からなる方法。
【請求項２７】
前記細胞が、免疫系の細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、悪性細胞である請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
患者が請求項１に記載の治療組成物で治療可能な疾患または状態を有すると診断する方法であって、該患者から得た生体試料がＩＬ−１５および抗原性タグからなるポリペプチドによって結合している細胞を含有しているかどうかを判定する工程からなり、該結合の発生が、該細胞がインビボでＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤によって結合可能であり、それによりインビボで野生型ＩＬ−１５に応答して増殖を阻害可能であることを示唆している方法。
【請求項３０】
それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤を含む、医薬として許容される組成物。
【請求項３１】
Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤をさらに含む、請求項３０に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子、ＩＬ−１５受容体に拮抗する変異ＩＬ−１５分子、およびラパマイシンからなる請求項３１に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
Ｔ細胞死を促進する少なくとも１種の薬剤と、Ｔ細胞増殖を阻害する少なくとも１種の薬剤とを含む、医薬として許容される組成物。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞死が、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）、受動的細胞死、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞障害）、またはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）である請求項３２に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月１４日出願の米国特許出願第６０／２３２２５１号の利益を主張するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫学、移植拒絶、および免疫系に関連する疾患に関する。
（連邦政府支援研究）
本明細書に記載の研究は、部分的に国立衛生研究所（ＮＩＨ）の助成金によって支援されたものである。したがって、米国政府が本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（背景）
２種のインターロイキン、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、インビトロでのＴ細胞増殖の刺激に機能上重複している。しかしながら、インビボでの１次免疫活性化および免疫ホメオスタシスにおけるそれらの役割は明らかでない。インビボにおいて、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、異なる機能を有し、Ｔ細胞活性化の異なる側面を調節する可能性がある。たとえば、ＩＬ−２はアポトーシスに対して活性化Ｔ細胞を刺激する可能性があり（レナルド（Ｌｅｎａｒｄｏ）、Ｎａｔｕｒｅ３５３、８５８〜８６１ページ、１９９１年）、ＩＬ−１５は、細胞生存を支援する可能性がある（ドゥームズら（Ｄｏｏｍｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、２１４１〜２１５０ページ、１９９８年、ブルフォンら（Ｂｕｌｆｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３、１１２４〜１１２８ページ、１９９７年）。ＩＬ−１５はまた、インビボでメモリー型ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進すると考えられ、ＩＬ−２は、メモリー型ＣＤ８＋Ｔ細胞の持続的増殖を制限する（クら（Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８、６７５〜６７８ページ、２０００年）。さらに、ＩＬ−２欠損マウスの表現型は、リンパ増殖性および自己免疫性であり（ホラークら（Ｈｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４８、３５〜４４ページ、１９９５年）、ＩＬ−５欠損マウスは、幾分リンパ球減少性であり、ウイルス負荷に対する１次反応を開始できない（ケネディーら（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、７７１〜７８０ページ、２０００年、ロドルチェら（Ｌｏｄｏｌｃｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ９、６６９〜６７６ページ、１９９８年）。この著しい対立の分子的機序は依然として謎のままである。
【０００４】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５の機能性受容体は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５に対する結合特異性を定義する固有のα鎖と、共有のＩＬ−２受容体β，γ鎖とからなる。このγ鎖はまた、ＩＬ−４、ＩＬ−７、およびＩＬ−９受容体の重要なシグナル伝達成分である（スガムラら（Ｓｕｇａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４、１７９〜２０５ページ、１９９６年）。リンパ球画分において、これらの受容体サブユニットは、個々にまたは様々な組み合わせで発現し、異なる親和性および／または異なるシグナル伝達能力を有する受容体の形成をもたらし得る（スガムラら（Ｓｕｇａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、前掲）。たとえば、β鎖は、α鎖またはγ鎖のいずれかと結合して２量体構造を形成可能であり、あるいはα鎖およびγ鎖の両方と結合して３量体構造を形成可能である。同様に、γ鎖は、ＩＬ−２受容体またはＩＬ−１５受容体いずれかのβ鎖と相互作用し、およびβ鎖を介してα鎖と相互作用し得る。ＩＬ−２受容体α鎖とは対照的に、ＩＬ−１５受容体α鎖は単独で著しく高い親和性でＩＬ−１５と結合可能である（ギリら（Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、３６５４〜３６６３ページ、１９９５年）。しかしながら、ＩＬ−２受容体α鎖と同様に、この相互作用はシグナル伝達事象を誘発しないと考えられている。したがって、α、β、およびγサブユニットの３量化は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の両方に対する高親和性受容体の機能的完全性にとって必須である。
【０００５】
インビトロでの研究は、活性化Ｔ細胞がＩＬ−２受容体α鎖およびＩＬ−１５受容体α鎖の両方を発現し得ること（チェら（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２８１３〜２８１９ページ、１９９６年）、ならびにβおよびγ鎖が活性化Ｔ細胞によって構成的に発現すること（イシイら（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、１２７３〜１２７７ページ、１９９４年）が示されている。さらに、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は共に、インビボでの免疫活性化中に容易に検出される（リら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、８９０〜８９６ページ、１９９８年）。このように、インビボにおいて活性化Ｔ細胞がどのようにＩＬ−２、ＩＬ−１５、および他のγ鎖依存サイトカインを識別しているのかは不明である。
【０００６】
（概要）
本発明は、部分的に、インビボでの循環Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体サブユニットの発現研究に基づく。驚くべきことに、これらのサブユニットは、選択的に活性化Ｔ細胞応答をＩＬ−２またはＩＬ−１５に誘導し、それによってインビボでのＴ細胞応答を調節する。換言すれば（ＩＬ−２およびＩＬ−１５が重複しているという広く受け入れられている知識に反して）、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、インビボでのＴ細胞増殖の制御において異なる役割を果たす。特に、ＩＬ−１５はＴ細胞の分裂の開始に重要であり、ＩＬ−２はγｃ発現のダウンレギュレーションによってＴ細胞増殖を制御する。したがって１実施形態において、本発明は一般に、ＩＬ−２およびＩＬ−１５アンタゴニストの新規な組み合わせ、ならびにそれらのアンタゴニストを投与することにより免疫応答を抑制する方法を特徴とする。いずれの場合にも、ＩＬ−１５分子またはＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）に拮抗する第１の薬剤と、ＩＬ−２分子またはＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）に拮抗する第２の薬剤とを投与することによって抑制が達成される。別の実施形態において、本発明の組成物は（上述の薬剤の代わりに、または上述の薬剤に加えて）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）あるいはインターロイキン受容体（たとえば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５受容体）をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の発現を阻害する薬剤を含み得る。
【０００７】
より一般的には、本発明は、患者に投与されたときに抗原反応性Ｔ細胞の数を低減する薬剤の新規な組み合わせを特徴とする。たとえば、本発明は、それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤を含む組成物（たとえば、医薬として許容される組成物）を特徴とする。あるいは、この組成物は、Ｔ細胞死を促進する少なくとも１種の薬剤と、Ｔ細胞増殖を阻害する少なくとも１種の薬剤を含有することが可能である。Ｔ細胞死を促進する薬剤は、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）、受動的細胞死、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞障害）、またはＣＤＣ（補体依存性細胞障害）を促進することが可能である。
【０００８】
ＡＩＣＤを促進する薬剤には、ＩＬ−２および関連分子（たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃか、ＩＬ−２またはＩＬ−２受容体のアゴニストとして機能する他の分子（たとえば、ＩＬ−２受容体に特異的に結合し、その受容体の天然リガンドの結合を模倣する抗体））が含まれる。ＡＩＣＤを促進する他の薬剤は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である。受動的細胞死を促進する薬剤には、ＩＬ−１５に（ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体、または受容体の結合後に活性化される細胞内シグナル伝達経路の成分を標的にし、たとえば結合し、それによってその活性を阻害することにより）拮抗するか、またはＴ細胞生存に必要とされる他の因子（たとえば、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＯＸ−４リガンド、ＩＦＮ−β、４−１ＢＢ、またはＩＧＦ−Ｉ）に拮抗する薬剤が含まれる。別の実施形態において、本発明の組成剤は（上述の１種または複数の薬剤の代わりに、またはそれに加えて）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）あるいはインターロイキン受容体（たとえば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５受容体）をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の発現を阻害する薬剤を含み得る。
【０００９】
Ｔ細胞表面に結合し、かつＡＤＣＣまたはＣＤＣを活性化するＦｃ部分を含有する薬剤にＴ細胞を曝露することによって、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進することが可能である。より具体的には、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進する薬剤には、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−２、または変異ＩＬ−１５）およびＦｃ領域を含有する融合タンパク質（たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃ）、ならびにインターロイキン受容体（たとえば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５受容体）に結合する抗体または他のＦｃ含有タンパク質が含まれる。
【００１０】
上述のとおり、本発明の組成物は、Ｔ細胞死を促進する薬剤だけでなく、Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤も含み得る。Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤には、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン、および細胞増殖を防ぐために当該技術分野で知られ用いられている他の任意の薬剤（化学療法剤を含む）が含まれる。Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤の使用は特に、ＡＩＣＤを促進し、さらにＴ細胞増殖を刺激する薬剤との組み合わせにおいて特に有用である（たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃなど）。たとえば、本発明は、ＩＬ−２／Ｆｃ（たとえば、ＡＩＣＤ、およびＡＤＣＣまたはＣＤＣによる細胞溶解を促進する）、ＩＬ−１５アンタゴニスト（たとえば、ＩＬ−１５、Ｔ細胞生存に必要とされる因子に拮抗することによって、受動的細胞死を促進する）、ラパマイシン（Ｔ細胞増殖を阻害する）を含む医薬として許容される組成物を特徴とする。薬剤の他の組み合わせを含有する組成物を下に記載する。
【００１１】
特に２種以上の薬剤を用いるとき、それらは互いに物理的に分離している必要はない。ある薬剤は、主として１つの機能活性を有する単一実体であり得るが（たとえば、特異的にＩＬ−２またはＩＬ−１５に結合することによってＩＬ−２またはＩＬ−１５を標的とする抗体）、その薬剤はまた、少なくとも２つの機能活性を有する単一実体であることも可能である（たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃ、ｍＩＬ−１５／Ｆｃ、あるいは抗ＩＬ−２または抗ＩＬ−１５抗体。これらの分子において、インターロイキンはＡＩＣＤを媒介し、分子のＦｃ部分はＣＤＣおよびＡＤＣＣを媒介する）。したがって、（１）ＡＩＣＤを誘発する薬剤、（２）ＣＤＣを誘発する薬剤、および（３）細胞増殖を阻害する薬剤を含む組成物は、２種のみの活性成分を含んでもよい（たとえば、（１）ＡＩＣＤおよびＣＤＣを誘発するＩＬ−２／Ｆｃ分子、ならびに（２）細胞増殖を阻害するラパマイシン）。
【００１２】
本明細書に記載の組成物は、免疫抑制から利益を得るであろう患者の治療において有用である（たとえば、移植を受けた、または受ける予定の患者、免疫疾患、特に自己免疫疾患を有する患者、癌（たとえば、免疫系の癌）を有する患者、または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を罹患している患者）。ＧＶＨＤは、レシピエントでの抗原に対するドナー白血球の反応によって特徴づけられる。この反応は特に骨髄移植において問題となるが、臓器移植においても起こる。移植臓器に内在するドナー白血球は、常に共移植される。
【００１３】
本発明の組成物は複数の薬剤を含有し得るが、本発明の方法は、それらの薬剤が同時に投与される方法に限定されない。たとえば、患者は、ＩＬ−２アンタゴニストまたは該ＩＬ−２Ｒアンタゴニストを含有する組成物を投与する前に、ＩＬ−１５アンタゴニストまたは該ＩＬ−１５Ｒアンタゴニストを含有する組成物を投与することが可能である。同様に、患者は、ＩＬ−２アゴニストを含有する組成物を投与する前に、ラパマイシンを含有する組成物を投与することが可能である。さらに、本発明の組成物は（同時に、または連続的に適用）、患者に移植される前に器官または細胞移植片を処理するために用いることが可能である。本発明の薬剤、およびそれらを使用する方法は、以下にさらに記載する。
【００１４】
本発明において用いられる薬剤の多くは、有利な治療特性を有する。たとえば、ＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤は、変異ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５）ポリペプチドを含む融合タンパク質であり得る。この融合タンパク質の変異ＩＬ−１５部分はわずか少数の置換残基が野生型ＩＬ−１５と異なり得るので、これらの薬剤は免疫原性とはなる可能性は低い。さらに、ｍＩＬ−１５ポリペプチドは高親和性でＩＬ−１５Ｒαを結合し得るので、受容体に対して野生型ＩＬ−１５と有効に競合することが可能である。さらに本発明の薬剤は、補体や食細胞などの宿主免疫系の成分を活性化可能であり、これは最終的に、その薬剤が結合する受容体（たとえば、ＩＬ−２受容体）を有する細胞の除去（または枯渇）を媒介する。たとえば、本発明の薬剤は、標的化細胞の溶解またはファゴサイトーシスを媒介し得る。ＩＬ−１５受容体のアルファ・サブユニット（ＩＬ−１５Ｒα）は活性化または悪性免疫細胞によって発現されるが、休止免疫細胞によっては発現されないので、本発明の薬剤は、活性化された細胞（たとえば、抗原活性化Ｔ細胞）、または悪性となった細胞を特異的に標的とするために用いることが可能である。このように、Ｔ細胞は本発明の薬剤の好ましい標的であるが、本発明の組成物は、免疫障害の病因にかかわる他の細胞、たとえば免疫系の他の細胞、または組織の過増殖細胞などを標的とするためにも用い得る。
【００１５】
特に定義のない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を本明細書に援用する。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、図面、詳細な説明、および請求の範囲から明らかとなるであろう。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の材料および方法を用いることが可能であるが、好ましい材料および方法を以下に記載する。
【００１７】
（詳細な説明）
抗原またはマイトジェンがＴ細胞の活性化を誘発するとき、有効な免疫応答が開始する。Ｔ細胞活性化のプロセスにおいて、多くの細胞の変化が起こるが、これにはサイトカインおよびサイトカイン受容体の発現が含まれる。免疫応答にかかわるサイトカインの１種はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）であり、これはインビトロにおいてＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の増殖および分化を刺激するＴ細胞増殖因子である。インビボでは、これらの細胞型の増殖は免疫応答を増強する。免疫応答にかかわり本明細書に記載される他のサイトカインはＩＬ−２である。
【００１８】
本発明の組成物には、ＩＬ−１５またはその受容体を標的とする薬剤、およびＩＬ−２またはその受容体を標的とする薬剤、ならびに免疫応答（たとえば、体液性または細胞性免疫応答）を抑制するためにそれらの組成物を用いる方法が含まれる。いくつかの状況において、たとえば臓器移植、または免疫疾患、特に自己免疫疾患、または対宿主性移植片病の場合において、患者は免疫応答の抑制から利益を得る。他の状況、たとえば選択された免疫細胞が悪性または自己攻撃性となったとき、それらを積極的に破壊することは有益である。
【００１９】
本発明は、免疫応答を阻害する新規な方法の発見に基づく。阻害は、１種がＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒを標的とし、１種がＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒを標的とする、薬剤の組み合わせを投与することによって達成し得る（エキソビボでの移植片の処理を含む投与経路は、当該技術分野で知られており、以下にさらに記載する）。より一般的には、活性化Ｔ細胞死に至るシグナル伝達経路を活性化する（たとえば、ＡＩＣＤによって）、その生存に必要とされる因子の細胞を除去する（そのような除去に続いて死ぬ細胞は、受動的細胞死による死と呼ばれる）、または活性化細胞を免疫系の成分による細胞溶解の標的とする（このように死ぬ細胞は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣによる死と呼ばれる）ことによって、抗原反応性Ｔ細胞の数を低減することが可能である。したがって、本発明の組成物は、これらの目的の１つまたは複数を達成する（すなわち、認められている細胞死経路（たとえば、ＡＩＣＤ、受動的細胞死、ＡＤＣＣ、またはＣＤＣ）を経るＴ細胞死を促進する）薬剤を含む。Ｔ細胞死を促進する１種または複数の薬剤を含有することに加えて、本発明の組成物は、Ｔ細胞増殖を阻害する（たとえば抗原に応答して起こる）１種または複数の薬剤を含み得る。たとえば、本発明は、ＩＬ−２／Ｆｃ（たとえば、ＡＩＣＤ、およびＡＤＣＣまたはＣＤＣによる細胞溶解を促進する）、ｍＩＬ−１５／Ｆｃ（ＩＬ−１５に拮抗し（それによって受動的細胞死を促進）、ＡＣＤＤまたはＣＤＣによる細胞溶解を促進する）、およびラパマイシン（Ｔ細胞増殖を阻害する）を含む組成物（たとえば、医薬として許容される組成物、または器官または細胞培養に適用するために製剤されたもの）を特徴とする。
【００２０】
「薬剤」という用語は、治療薬として用いることが可能である本質的に任意の型の分子を包含するものである。野生型タンパク質と同一であっても、変異（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を含有してもよい抗体、融合タンパク質、および可溶性リガンドなどのタンパク質、およびそれらをコードする（またはそれらの「アンチセンス」である、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、またはそれらの受容体の成分（たとえば、サブユニット）をコードする核酸のアンチセンスであるオリゴヌクレオチド）核酸分子は、すべて「薬剤」である。本発明の薬剤は、全身に、局所的に、または細胞療法（すなわち、その患者に薬剤を発現する細胞を投与することによって、本発明の薬剤を患者に投与することが可能である）によって投与することが可能である。この細胞は、治療薬を発現する目的のためだけに患者に投与された細胞であり得る。この細胞はまた、細胞、組織、または臓器移植の細胞であり得る。たとえば、移植された細胞（たとえば、膵島細胞）、あるいは組織または器官内の細胞（たとえば、皮膚断片内、あるいは肝臓、腎臓、または心臓内の細胞）は、薬剤で処理し、エキソビボで薬剤をコードする核酸分子を用いて形質導入することが可能である（たとえば、移植前）。このようにして、移植された細胞は、それ自体の免疫抑制剤を産生する。たとえば、所望の表現型を有する細胞（たとえば、インスリン産生細胞）は、本発明の１種または複数の免疫抑制因子を産生する遺伝子を含むように修飾することが可能である。この移植された細胞、組織、または器官は、移植に先立って、または移植に続いて処理することが可能である。患者（または培養の細胞または器官）に薬剤を投与する方法は、当該技術分野の技術者に知られ、慣例的に用いられているが、以下にさらに記載する。
【００２１】
ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤
本発明の組成物は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５受容体を標的とする１種または複数の薬剤を含み得る。上述のとおり、単一の薬剤が複数の機能ドメインを有してもよい。ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒを標的にする薬剤には、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、またはそれらをコードする核酸に結合する（あるいはそれらと相互作用する）薬剤、ならびに活性化Ｔ細胞などの、ＩＬ−１５Ｒを有する細胞に結合し、その後破壊する薬剤が含まれる。したがって、免疫抑制の達成に有用な薬剤は、２つの機能部分、つまり薬剤の標的をＩＬ−１５Ｒを有する細胞とする標的化部分とＩＬ−１５Ｒを有する細胞の除去をもたらす標的細胞枯渇（たとえば、溶解）部分を有することが可能である。１実施形態において、標的化部分は、受容体を介して有効にシグナルを伝達することなくＩＬ−１５Ｒに結合する。たとえば、標的化部分は、変異ＩＬ−１５ポリペプチドを含むことが可能であり、標的細胞枯渇部分は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域を含むことが可能である。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、たとえばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または類似哺乳動物ＩｇＧなどから、あるいはＩｇＭ、たとえばヒトＩｇＭ、または類似哺乳動物ＩｇＭなどから誘導することができる。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。本発明は任意の特定の機構によって作用する薬剤に限定するものではないが、このＦｃ領域はＩＬ−１５Ｒを有する細胞の補体および食細胞主導の除去を媒介すると考えられる。
【００２２】
野生型ＩＬ−１５に類似の親和性でＩＬ−１５受容体複合体に結合するが、完全にはシグナル伝達を活性化しない変異ＩＬ−１５ポリペプチドがすでに産生されている。この変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドと有効に競合し、ＩＬ−１５シグナル伝達に応答して通常起こる１つまたは複数の事象、たとえば細胞増殖などを阻害し得る。本明細書では、「野生型ＩＬ−１５ポリペプチド」は、天然ＩＬ−１５（たとえば、図１に示す野生型ＩＬ−１５ポリペプチド）と同一のポリペプチドである。対照的に、「変異ＩＬ−１５ポリペプチド」は、野生型ＩＬ−１５と比較して少なくとも１つの変異を有し、野生型ＩＬ−１５によって通常促進される少なくとも１つのインビボまたはインビトロの活性を阻害するポリペプチドである。
【００２３】
本発明によって用いることが可能な変異ＩＬ−１５ポリペプチドは一般に、野生型ＩＬ−１５分子の１つまたは複数の活性の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも７０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％を遮断する。変異ＩＬ−１５ポリペプチドが野生型ＩＬ−１５活性を遮断する能力は、本明細書に記載のＢＡＦ−ＢＯ３細胞増殖アッセイ（ＩＬ−２Ｒβをコードする構築物で細胞をトランスフェクトした）を含む多くのアッセイによって評価可能である。さらに、本発明の変異ポリペプチドは、それらが示す野生型ＩＬ−１５との特定の同一性のパーセントによって定義可能である。２つのポリペプチド間の同一性パーセントを調査するとき、比較される配列の長さは、一般に少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも３５個のアミノ酸である。ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関して用いられる「同一性」という用語は、比較される２つのポリペプチドまたはＤＮＡ配列内のサブユニット（タンパク質のアミノ酸残基、またはＤＮＡ分子のヌクレオチド）間の同一性を指す。両方の分子のあるサブユニット位置を同一のモノマー・サブユニット（すなわち、同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド）が占めているとき、それらの分子はその位置において同一である。２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の１次関数である。したがって、アミノ酸長１００の参照ポリペプチドと５０％同一であるポリペプチドは、参照ポリペプチドのアミノ酸長５０部分と完全に同一であるアミノ酸５０個のポリペプチドであり得る。これはその全長にわたって参照ポリペプチドと５０％同一であるアミノ酸長１００のポリペプチドであってもよい。当然ながら、多くの他のポリペプチドが、同じ基準を満たすことになる。同一性は、典型的に、かつもっとも都合よく、ウィスコンシン大学バイオテクノロジー・センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ユニバーシティ・アベニュー１７１０、５３７０５）の遺伝子コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅなどの配列分析ソフトウェアをそのデフォルト・パラメータと共に用いて測定される。
【００２４】
本発明の変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９６％、９７％、９８％、または９９％）、野生型ＩＬ−１５と同一であり得る。変異は、アミノ酸残基の数または含量の変化からなる。たとえば、変異ＩＬ−１５は、野生型ＩＬ−１５より多いかまたは少ない数のアミノ酸残基を有することが可能である。あるいは、または上記に加えて、この変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み得る。変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、単一アミノ酸残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、たとえば１５６位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型ＩＬ−１５と異なり得る。同様に、変異ポリペプチドは、２つのアミノ酸残基、たとえば１５６位および１４９位の残基の付加、欠失、または置換のぶんだけ、野生型と異なり得る。たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、１５６位および１４９位の残基でグルタミンの代わりにアスパラギン酸を置換するぶんだけ（図２に示したとおり）、野生型ＩＬ−１５と異なり得る。標的化剤として有用な変異ポリペプチドは、野生型ＩＬ−１５と同様に、ＩＬ−１５Ｒの成分を認識し、結合する。１実施形態において、ＩＬ−１５の変異は、ＩＬ−２Ｒγ（ＩＬ−２受容体サブユニット）に結合すると考えられているサイトカインのカルボキシ末端ドメインである。別法として、または上記に加えて、変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβ（ＩＬ−２受容体βサブユニット）結合ドメイン内に１つまたは複数の変異を含み得る。
【００２５】
変異ＩＬ−１５ポリペプチドが、他の残基の代わりに１つのアミノ酸残基の置換を含む場合、その置換はこれに限定されないが保存的置換であることが可能であり、以下のグループ内の置換が含まれる。グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシンである。
【００２６】
ＩＬ−１５標的化ポリペプチド（たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチド）を用いる代わりに、またはそれを用いることに加えて、治療薬剤は抗体であることが可能である。たとえば、ＩＬ−１５は抗体によって標的とされ得る（すなわち、特異的に結合され得る）。同様に、ＩＬ−１５Ｒは、ＩＬ−１５Ｒの成分（たとえば、ＩＬ−１５Ｒαサブユニット）を結合する抗体の標的となり得る。ヒト化抗体を含む抗体をＩＬ−１５Ｒの成分に対して産生し得る方法は、当該技術分野でよく知られている。この抗体は、好ましくは、補体およびファゴサイトーシス、たとえばヒトＩｇＧ３およびＩｇＧ１（好ましくは後者）サブクラス、またはマウスＩｇＧ２ａサブクラスを活性化することができる。
【００２７】
本発明の方法はまた、（ａ）それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤、または（ｂ）Ｔ細胞死を促進する少なくとも１種の薬剤とＴ細胞増殖を阻害する少なくとも１種の薬剤、を含有する組成物を用いて行うことも可能である。Ｔ細胞死を促進する薬剤は、Ｔ細胞がその生存に必要とされる因子を枯渇したときに起こる受動的細胞死を促進することによって、Ｔ細胞死を促進し得る。ＩＬ−１５はそのような薬剤の１つである（他は以下に記載する）。したがって、ＩＬ−１５の能力を妨げ、生存因子として働く薬剤（たとえば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５受容体に特異的に結合する抗体）を、本発明の組成物に含み得る（たとえば、組成物は、ＡＩＣＤを促進する薬剤、受動態細胞死を促進する薬剤（たとえば、抗ＩＬ−１５抗体）、および任意選択でＴ細胞増殖を阻害する薬剤を含み得る）。
【００２８】
上述のとおり、免疫抑制を達成するのに有用な薬剤は、２つの機能部分、薬剤の標的をＩＬ−１５Ｒを有する細胞（直前に記載の変異ＩＬ−１５分子など）とする標的化部分、およびＩＬ−１５Ｒを有する細胞をたとえば溶解する、または他の方法で除去をもたらす標的細胞枯渇部分を含有し得る。したがって、この薬剤は、変異ＩＬ−１５ポリペプチド、および異種ポリペプチド、たとえば抗体のＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスのＦｃ領域などを含む、キメラポリペプチドであり得る。Ｆｃ領域は、補体結合およびＦｃ受容体結合を阻害する変異を含むことができ、あるいは標的細胞枯渇性（すなわち、補体を結合することによって、または抗体依存性補体溶解などの他の機序によって細胞を破壊することができる）であってよい。
【００２９】
Ｆｃ領域は、天然源から単離する、組換えによって産生する、または合成することが可能である（本発明に用いられる任意のポリペプチドと同様）。たとえば、ＩｇＧのＣ末端ドメインと同種のＦｃ領域は、ＩｇＧをパパインで消化することによって産生可能である。ＩｇＧＦｃは、分子量約５０ｋＤａを有する。本発明のポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、または細胞を溶解する能力を維持しているより小さい部分を含み得る。さらに、全長Ｆｃ領域、またはフラグメント化Ｆｃ領域は、野生型分子の変種であり得る。すなわち、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼすかまたは及ぼさない変異を含有することが可能である。
【００３０】
本明細書では、インターロイキンまたはインターロイキン受容体を「標的とする」薬剤について言及される。薬剤が、インターロイキンまたはインターロイキン受容体の活性に影響を及ぼすような方法でインターロイキンまたはインターロイキン受容体に直接または間接的に結合するかまたは相互作用するときに、標的化が起こる。活性は、当該技術分野の技術者によって、通常の実験手法を用いて評価可能である。たとえば、シグナル伝達、あるいは受容体の結合に続いて起こる、または通常起こるであろう下流の他の生物事象の強度を評価可能である。インターロイキンまたはインターロイキン受容体を標的とする薬剤によって生じる活性は、そのように限定されないが、天然インターロイキンが天然インターロイキン受容体に結合するときに生じる活性と異なり得る。たとえば、その受容体が天然ＩＬ−２によって結合した場合に起こるものと実質的に同じ活性をその薬剤が生じる場合にも、ＩＬ−２受容体を標的とする薬剤は本発明の範囲に含まれる。ある薬剤が天然リガンドによって生じる活性と実質的に同じ、またはより高い活性を生じるとき、その薬剤は受容体アゴニストとみなし得る（薬剤と天然リガンドは同一条件下で検査される）。ある薬剤が天然リガンドによって生じる活性より低い活性を生じるとき、その薬剤は受容体のアンタゴニスト（その薬剤の主要な相互作用が受容体との相互作用である場合、たとえばｍＩＬ−１５）、またはインターロイキンのアンタゴニスト（その薬剤の主要な相互作用がインターロイキンとの相互作用である場合、たとえば抗ＩＬ−１５抗体）とみなし得る。ここでも、活性のレベルは、その薬剤および天然受容体（またはリガンド）を同一の条件下で試験することによって評価される。
【００３１】
本発明の薬剤と一部となり得るＦｃ領域は、「標的細胞枯渇性」、または「標的細胞非枯渇性」であり得る。非標的細胞枯渇性Ｆｃ領域は、典型的に、高親和性Ｆｃ受容体結合部位、およびＣ’１ｑ結合部位を欠いている。マウスＩｇＧＦｃの高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧＦｃの２３５位のＬｅｕ（ロイシン）残基を含む。したがって、マウスＦｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異または欠失することによって破壊され得る。たとえば、Ｌｅｕ２３５のＧｌｕ（グルタミン酸）による置換は、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体に結合する能力を阻害する。マウスＣ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ（リシン）３２０、およびＬｙｓ３２２残基を変異または欠失することによって、機能的に破壊され得る。たとえば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２のＡｌａ（アラニン）残基による置換によって、ＩｇＧ１Ｆｃは抗体依存性補体溶解を誘導することができなくなる。対照的に、標的細胞枯渇性ＩｇＧＦｃ領域は、高親和性Ｆｃ受容体結合部位、Ｃ’１ｑ結合部位を有する。高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧＦｃの２３５位のＬｅｕ（ロイシン）残基を含み、Ｃ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２残基を含む。標的細胞枯渇性ＩｇＧＦｃは、これらの部位において、野生型残基、または保存的アミノ酸置換を有する。標的細胞枯渇性ＩｇＧＦｃは、細胞を抗体依存性細胞性細胞障害、または補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）の細胞を標的にすることが可能である。ヒトＩｇＧの適切な変異も知られている（たとえば、モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ２、１１９〜１２４ページ、１９９４年、およびブレッケら（Ｂｒｅｋｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ２、１２５ページ、１９９４年を参照のこと）。
【００３２】
ＩＬ−１５Ｒを標的にする薬剤は、任意選択で抗原性タグ（たとえば、ＦＬＡＧ配列）に融合した変異ＩＬ−１５ポリペプチドが可能である。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載のとおり、ビオチン化高特異性抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される（さらに、ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年を参照のこと）。
【００３３】
さらに、可溶性ＩＬ−１５Ｒα鎖をアンタゴニストとして用いることが可能である。ＩＬ−１５受容体複合体はαβγサブユニットからなるが、α鎖は単独でＩＬ−１５に対して高親和性を示す。したがって、可溶性ＩＬ−１５Ｒα鎖はＩＬ−１５を結合し、ＩＬ−１５が細胞表面結合ＩＬ−１５Ｒ複合体に結合するのを妨げることになる。したがって、可溶性ＩＬ−１５Ｒα鎖は、受容体特異アンタゴニストとして作用し得る。
【００３４】
可溶性ＩＬ−１５Ｒα鎖の構築には、受容体陽性細胞、たとえば活性化Ｔ細胞または受容体発現細胞系など由来のＩＬ−１５Ｒα鎖の細胞外フラグメントをクローニングすること、任意選択でそれを分子タグ配列に融合することが含まれる。タグ配列は、たとえば、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、またはヒスチジンであり得る。この発現ベクター中の遺伝子構築物は、発現細胞系にトランスフェクトされ得る。発現細胞系によって産生されたタグ付き可溶性ＩＬ−１５Ｒα鎖は、そのタグ配列に特異的なｍＡｂを用いて精製される。さらに、ＩＬ−１５Ｒ細胞外ドメインは、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭサブタイプの、免疫グロブリンＦｃドメイン（たとえば、免疫グロブリンＧのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン）に結合（たとえば、ペプチド結合によって融合）可能である。そのような融合タンパク質は適切な細胞型において発現可能であり、その多くが当該技術分野の技術者に知られている。
【００３５】
ＩＬ−２またはＩＬ−２受容体を標的とする薬剤
免疫応答を阻害するために、上述のＩＬ−１５Ｒを有する細胞を標的とする薬剤を、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒを標的とする薬剤と共に投与することが可能である。他のものと「共に」投与される薬剤は、限定されないが、同時に、または同じ方法で投与できる（この注釈はＩＬ−２関連薬剤の議論において述べるが、本発明の組成物において組み合わせるいずれの薬剤または分子にも適用できる）。たとえば、ＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤は、ＩＬ−２Ｒを標的とする薬剤の前、または後に投与できる。同様に、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤はエキソビボで投与することができ（たとえば、移植が予定されている細胞、組織、または器官を処理するため）、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒを標的とする標的とする薬剤は、患者（たとえば、エキソビボでＩＬ−１５を標的とする薬剤によって処理された移植片を受けた患者）に、全身的に（たとえば、静脈内に）投与可能である。同様に、細胞増殖を阻害する薬剤とは異なる時間、または異なる方法で、ＡＩＣＤを促進する薬剤を投与することが可能である。したがって、本発明の方法において、本発明の組成物で組み合わせられるいずれの型の薬剤または分子も個別に投与可能である。
【００３６】
ＩＬ−２Ｒを阻害するために、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに結合し、拮抗する任意の薬剤を投与可能である。ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒを標的とする薬剤には、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに結合する薬剤、ならびに活性化Ｔ細胞などのＩＬ−２Ｒを有する細胞に結合し、その後それを破壊する薬剤が含まれる。ＩＬ−１５標的化に関連して上述したとおり、免疫抑制の達成に有用な薬剤は、薬剤の標的をＩＬ−２Ｒを有する細胞とする部分と、ＩＬ−２Ｒを有する細胞の除去をもたらす標的細胞枯渇（たとえば、溶解）部分とを有することが可能である。たとえば、この標的化部分は、受容体を介して有効にシグナルを伝達することなくＩＬ−２Ｒに結合可能である。Ｆｃ領域が含まれる場合、その領域は、上述したものと同じ免疫グロブリン分子から誘導可能である。
【００３７】
標的化薬剤、たとえばＩＬ−２／Ｆｃ薬剤など（たとえば、チェンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３、４０４１〜４０４８ページ、１９９９年を参照のこと）は、ＩＬ−２媒介ＩＬ−２Ｒシグナル伝達を妨げる薬剤、たとえばラパマイシンなどと共に投与可能である。細胞増殖を阻害する薬剤は、当該技術分野の技術者によく知られている（さらに以下に考察する）。ＩＬ−２Ｒ標的ポリペプチド（たとえば、ＩＬ−２ポリペプチド）を用いる代わりに、またはそれを用いる以外に、ＩＬ−１５アンタゴニストと併用される治療剤は、各々ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに拮抗する抗ＩＬ−２または抗ＩＬ−２Ｒ抗体（たとえば、ヒト化抗体）であることが可能である。
【００３８】
上に説明のとおり、本発明の方法（たとえば、免疫応答（たとえば、細胞免疫応答）を阻害する方法、移植片拒絶を阻害する方法、および癌を治療する方法）は、（ａ）それぞれがＴ細胞死を促進する２種以上の薬剤、または（ｂ）Ｔ細胞死を促進する少なくとも１種の薬剤とＴ細胞増殖を阻害する少なくとも１種の薬剤、を含有する組成物（たとえば、医薬として許容される組成物）を用いて行うことも可能である。Ｔ細胞死を促進する薬剤は、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）を促進することによってＴ細胞死を促進することが可能であり、そのような薬剤には、ＩＬ−２、およびＩＬ−２アゴニストとして機能する分子が含まれる。たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃ、ＩＬ−２受容体に結合し、それを介してシグナルを伝達する能力を維持しているＩＬ−２の変異体、およびＩＬ−２受容体に特異的に結合し、それに拮抗する抗体（たとえば、ＩＬ−２受容体のαサブユニットを特異的に結合する抗体）を、本発明の組成物に含み得る。ＡＩＣＤを促進する他の薬剤には、活性化Ｔ細胞においてＦａｓシグナル伝達カスケードを活性化することによってＴ細胞死を刺激するＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）、および生物学的に活性なその変異体が含まれる。
【００３９】
受動的細胞死を促進する薬剤
Ｔ細胞からその生存に必要とされる薬剤が枯渇したとき、受動的Ｔ細胞死が起こる。ＩＬ−１５に加えて、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＯＸ−４０リガンド、ＩＦＮβ、４−１ＢＢ、およびＩＧＦ−Ｉを含む因子が不可欠である（すなわち、これらの各因子が存在しないときＴ細胞は死ぬ。たとえば、ツら（Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５、１３３１〜１３３６ページ、２０００年、ツダら（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３６、３７〜５１ページ、２０００年、ベルトリーノら（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１、１２２５〜１２３８ページ、１９９９年、タカハシら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、５０３７〜５０４０ページ、１９９９年、ピリングら（Ｐｉｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９、１０４１〜１０５０ページ、１９９９年、チュら（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、１８９６〜１９０３ページ、１９９９年、およびワインバーグら（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０、４７１〜４８０ページ、１９９８年を参照のこと）。たとえば、１種または複数のそれらの因子に選択的に結合する、あるいは別の方法でそれらの因子のＴ細胞との通常生じる相互作用を妨げる薬剤にインビボまたは培養中で細胞を曝露することによって、Ｔ細胞から１種または複数のそれらの因子（ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−７など）を枯渇することが可能である（その枯渇の結果は受動的細胞死である）。
【００４０】
ＡＤＣＣまたはＣＤＣを促進する薬剤
ＡＤＣＣおよびＣＤＣは、Ｔ細胞表面に結合し、かつＡＤＣＣまたはＣＤＣを活性化する免疫グロブリン分子のＦｃ部分を含有する薬剤によって誘発され得る。そのような薬剤の例には、活性化免疫細胞に発現する細胞表面構造（たとえば、ＣＤ１５４などの細胞表面受容体、ＩＬ−２受容体、およびＩＬ−１５受容体）に結合する抗体が含まれる。さらに、活性化細胞の表面において受容体タンパク質に結合するリガンド／Ｆｃキメラ融合タンパク質を用いることが可能である（たとえば、ＩＬ−２／Ｆｃ、またはｍＩＬ−１５／Ｆｃ）。これらの例から、他の適切な薬剤は当該技術分野の技術者に明らかであろう。
【００４１】
細胞増殖を阻害する薬剤
細胞増殖を阻害する薬剤には、ラパマイシン（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン、および過増殖障害（癌など）の治療に有用であることが知られている他の任意の薬剤が含まれる。充分に特徴づけられている化学療法薬には、核酸代謝を阻害する薬剤が含まれる（プリンおよびピリミジン生合成阻害剤、ＲＮＡ合成阻害剤、およびＤＮＡ結合、ＤＮＡ修飾、または挿入剤など）。たとえば免疫応答を阻害するために用いられる組成物がさらに、ＡＩＣＤを促進するだけでなく、Ｔ細胞増殖を刺激するＩＬ−２／Ｆｃなどの薬剤を含有するとき、それらの薬剤は特に有用である。
【００４２】
細胞増殖を阻害する薬剤にはさらに、メトトレキサート（ＭＴＸ）およびピリメタミンなどの葉酸代謝拮抗剤；プリン代謝拮抗剤（６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、およびアザチオプリンなど）、ならびにシタラビン（ａｒａ−Ｃ）、５−アザシチジン、および５−フルオロウラシルなどのピリミジン・アンタゴニスト（これらの類は上述した）；アルキル化剤および他のＤＮＡ結合剤（たとえば、シクロホスファミド（ＣＰＡ）、ミトマイシンＣ、およびドキソルビシン（アドリアマイシン））；ビンカアルカロイド（たとえば、ビンクリスチン）；ならびにカルシニューリン阻害剤（たとえば、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、およびブレキナール（Ｂｒｅｑｕｉｎａｒ））が含まれる。
【００４３】
細胞増殖を阻害するために用いることが可能な他の薬剤には、細胞周期制御にかかわるタンパク質を直接妨げる薬剤（抗ＣＤＫ（細胞分裂キナーゼ）、または抗サイクリンなど）、あるいは細胞増殖細胞増殖チェックポイントに影響を及ぼすタンパク質（すべての増殖細胞は、前の工程が終わる前に細胞分裂周期（ＣＤＣ）の次の段階にはいるのを防ぐチェックポイントを細胞周期の異なる段階に有する）を直接妨げる薬剤が含まれる。チェックポイント制御に通じる経路は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成阻害剤（たとえば、Ｓ６キナーゼ、およびＰＩ−３キナーゼ阻害剤）を含む。細胞質分裂阻害剤も用いることが可能である。
【００４４】
免疫応答を阻害する薬剤のスクリーニング法
下の実施例に記載するインビトロアッセイにおける薬剤候補（たとえば、変異ＩＬ−１５またはＩＬ−２ポリペプチド）の試験に加えて、本明細書に記載の薬剤のどの特定の組み合わせが最も有効に免疫抑制をもたらすかを試験するために、以下の任意のインビボアッセイを用いることが可能である。たとえば、ＩＬ−２またはその受容体に拮抗する１種または複数の薬剤と組み合わせた、ＩＬ−１５Ｒを標的とする１種または複数の薬剤を、試験することが可能である。これらのインビボアッセイは、当該技術分野の技術者が本発明の薬剤の有効性をさらに試験することのできるいくつかの慣例的な方法を示すにすぎない。これらはＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびそれらの受容体を標的とする薬剤による治療を受けることのできる多様な病態に適切であるために、本明細書に含めるべく選択された。たとえば、これらのアッセイは、臓器移植、免疫疾患、特に自己免疫疾患、対宿主移植片病、および免疫系の癌（たとえば、Ｔ細胞が悪性となるときに生じる癌）に適切である。
【００４５】
移植の模範例
本発明の薬剤の組み合わせが免疫抑制を達成できるかどうかを判定するために、確立された移植の模範例においてその組み合わせを投与することが可能である（直接投与、遺伝子療法、または細胞療法のいずれかによる）。
【００４６】
本発明の薬剤、それらをコードする核酸分子（またはそれらとハイブリッド形成し、それによって阻害する）は、同種異系または異種皮膚移植、臓器移植、または細胞移植を動物に行う前に、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、またはイヌなどの任意の通常の実験動物に、標準的な手段によって、全身投与または局所投与可能である。同じ遺伝的背景を有するが、Ｈ−２遺伝子座がミスマッチであるＣ５７Ｂ１−１０、Ｂ１０．ＢＲ、およびＢ１０．ＡＫＭなどのマウス系統（ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、メイン州バーハーバー）は、種々の臓器移植の評価に適している。
【００４７】
心臓移植
宿主腹部の大血管にドナー心臓を吻合することによって心臓移植を行う方法は、オノら（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）によって最初に発表された（Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５７、２２５ページ、１９６９年、さらにコリーら（Ｃｏｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１６、３４３ページ、１９７３年を参照のこと）。この外科手術手法によって、ドナー心臓の大動脈を宿主の腹部大動脈に吻合し、さらに標準的な微小血管技術を用いて、ドナー心臓の肺動脈を隣接する大動脈に吻合する。心臓が適所に移植され、乳酸リンゲル液によって３７℃に加温されると、正常な洞調律が再開する。移植された心臓の機能は、腹壁を通して心室収縮を触診することによって多くの場合評価可能である。拒絶は心筋収縮の停止として定義される。本発明の薬剤（たとえば、変異ＩＬ−１５／Ｆｃと、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに結合しそれを阻害する抗体との組み合わせ、あるいは変異ＩＬ−１５／Ｆｃ、ＩＬ−２／Ｆｃ、およびラパマイシンの組み合わせ）は、これらの薬剤を投与された宿主が処理を受けていない宿主より長い期間ドナー心臓の移植を受容した場合、臓器拒絶の低減に有効であるとみなされる。
【００４８】
皮膚移植
本発明の薬剤の種々の組み合わせの有効性は、皮膚移植後に評価することも可能である。齧歯動物に皮膚移植を行うために、ドナー動物を麻酔して、尾の一部から皮膚全層を除去する。レシピエント動物も麻酔し、剃毛側腹部から皮膚片を除去することによって移植床を準備する。一般に、皮膚片は約０．５×０．５ｃｍである。ドナーの皮膚を移植床に適合するように形成し、配置し、ガーゼで覆い、包帯をする。移植片は手術後６日から毎日検査することが可能であり、半数を超える移植上皮が生育不能に見えるとき、拒絶とみなされる。本発明の薬剤（たとえば、変異ＩＬ−１５／Ｆｃと、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒに結合しそれを阻害する抗体との組み合わせ、あるいは変異ＩＬ−１５／Ｆｃ、ＩＬ−２／Ｆｃ、およびラパマイシンの組み合わせ）は、これらの薬剤を投与された宿主が処理を受けていない宿主より長い期間ドナー皮膚の移植を受容した場合、皮膚移植拒絶の低減に有効であるとみなされる。
【００４９】
その結果がＩＬ−２／Ｆｃ、ｍＩＬ−１５／Ｆｃ、およびラパマイシンを含有する組成物の有用性を実証する、皮膚移植実験の典型的な例を、実施例（下記）で説明し、図１２に要約する。
【００５０】
膵島同種異系移植片モデル
ＤＢＡ／２Ｊ膵島細胞同種異系移植片は、ストレプトゾトシン（２２５ｍｇ／ｋｇ、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ミズーリ州セントルイス）の単回腹腔内注射によって糖尿病にした６〜８週齢のＢ６ＡＦ１マウスなどの齧歯動物に移植可能である。コントロールとして、同種同族膵島細胞移植片を、糖尿病マウスに移植可能である。膵島細胞の移植は、発表されたプロトコルに従って行うことが可能である（たとえば、ゴトウら（Ｇｏｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ４２、３８７ページ、１９８６年を参照のこと）。簡潔に述べれば、ドナー膵臓をコラゲナーゼＩＶ型（２ｍｇ／ｍｌ、ワーシントン・バイオケミカル社（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）、ニュージャージー州フリーホールド）と共にｉｎ  ｓｉｔｕで潅流する。３７℃、４０分の消化後、不連続Ｆｉｃｏｌｌ勾配で膵島を単離する。その後、膵島３００〜４００個を各レシピエントの腎皮膜下に移植する。同種異系移植片の機能は、連続血糖測定（Ａｃｃｕ−ＣｈｅｃｋＩＩＩ（商標）、ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ドイツ）によって追跡可能である。初期移植片機能は、移植後第３日の血糖値１１．１ｍｍｏｌ／ｌ未満と定義し、移植拒絶は、初期移植片機能の期間後１６．５ｍｍｏｌ／ｌを超える血糖値の上昇（それぞれ少なくとも連続２日）と定義する。
【００５１】
自己免疫疾患モデル
自己免疫疾患モデルは、インビボで本発明の薬剤の組み合わせを評価する他の手段を提供する。これらのモデルは当該技術分野の技術者に知られており、たとえばＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤を含む所与の薬剤組み合わせが、直接、遺伝子療法、または細胞療法によって供給されたとき特定の自己免疫疾患の治療において治療上有用であるかどうか判定するために用いることが可能である。
【００５２】
動物においてモデル化されている自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、および全身性エリテマドーデス（ＳＬＥ）などのリウマチ疾患、Ｉ型糖尿病、ならびに甲状腺、消化管、および中枢神経系の自己免疫疾患が含まれる。たとえば、ＳＬＥの動物モデルには、ＭＲＬマウス、ＢＸＳＢマウス、およびＮＺＢマウス、ならびにそれらのＦ１ハイブリッドが含まれる。これらの動物は、リウマチ疾患過程の特定の側面を研究するために交配することが可能であり、ＮＺＷマウスと交配させたとき、ＮＺＢ系統の子孫は重いループス糸球体腎炎を罹患する（ビールショースキーら（Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｕｎｉｖ．Ｏｔａｇｏ  Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．３７、９ページ、１９５９年、さらにポール（Ｐａｕｌ）編、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、レーブンプレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８９年を参照のこと）。同様に、ＮＢＺ×ＳＷＲ交配の子孫において、致死性腎炎へのシフトが認められる（データら（Ｄａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ２６３、４１２ページ、１９７６年）。ＳＮＦ１マウスにおける腎病変の組織所見は、充分に特徴づけられている（イーストコットら（Ｅａｓｔｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１、２２３２ページ、１９８３年、さらに上述の「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」を参照のこと）。したがって、ＩＬ−１５Ｒを標的とし、かつ、たとえばＩＬ−２Ｒを標的とする薬剤の投与が、ＳＬＥの動物モデルにおいて有効に免疫応答を抑制し得るのかどうかを判定するために、その動物の全身の健康状態、ならびに腎組織の組織所見を用いることが可能である。
【００５３】
ＳＬＥを発症するＭＲＬ系統マウスの１種、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒは、ヒトの慢性関節リウマチに類似の形態の関節炎を発症する（テオフィロポーラスら（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７、２６９ページ、１９８５年）。あるいは、フロイント完全アジュバント（全量１００μｌ）に１：１で混合したラットコラーゲンＩＩ型（２ｍｇ／ｍｌ）を尾の基部に注射することによって、齧歯動物に実験的関節炎を誘発可能である。関節炎は、免疫処理の２〜３週後に発症する。本発明の薬剤（ＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤、およびＩＬ−２Ｒを標的とする、または抗原活性化Ｔ細胞に結合し、不活性化する薬剤）をコードする核酸分子が免疫応答を抑制する能力は、核酸分子の標的をＴリンパ球とすることによって評価可能である。Ｔリンパ球を標的とする方法の１つは以下のとおりである。関節炎発現の２〜３日後に脾細胞懸濁液を調製し、コラーゲン（１００μｇ／ｍｌ）と共に４８時間インキュベートして、コラーゲン活性化Ｔ細胞の増殖を誘発する。この間に、対象となるポリペプチド薬剤をコードするベクターで形質導入する。コントロールとして、形質導入しない、または「空の」ベクターで形質導入した平行培養物を増殖させる。次いで、細胞を腹腔内に注射する（細胞５×１０７個／動物）。この処理の有効性は、チェルナヨフスキーら（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）によって記載されているとおり（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２、７３１〜７３５ページ、１９９５年）、その後の２週間、疾患の症状を追跡することによって評価する。コントロールと比較して症状が低度であれば、本発明の薬剤の組み合わせ、およびそれをコードする核酸分子が免疫抑制剤として機能し、したがって免疫疾患、特に自己免疫疾患の治療に有用であることを示している。
【００５４】
薬剤の様々な組み合わせがＩ型糖尿病において免疫応答を抑制する能力は、オタワのバイオ・ブリーディング・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）においてＷｉｓｔａｒラットの市販コロニーから発生させたＢＢラット系統で試験可能である。これらのラットは、ヒトＩ型糖尿病で起こるように、膵島細胞およびインスリンに対する自己抗体を自発的に発現する。あるいは、モデル系としてＮＯＤ（非肥満性糖尿病）マウスを用いることが可能である。同種異系のドナー膵島の移植後、ＮＯＤマウスにおいて血糖値が回復する実験の典型的な例を以下に説明し、図１１に要約する。これらの動物は、ＩＬ−２／Ｆｃ、ＩＬ−１５／Ｆｃ、およびラパマイシンの組み合わせで処理した。結果は移植の長期定着であった。
【００５５】
甲状腺の自己免疫疾患は、ニワトリにおいてモデル化されている。肥満系統（ＯＳ）ニワトリは、橋本病に類似の突発性自己免疫性甲状腺炎を一貫して発症する（コールら（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ１６０、１３５７ページ、１９６８年）。これらのトリの約１５％が、対応するヒトの自己免疫性甲状腺炎と同様に、胃の壁細胞に対する自己抗体を産生する。ＯＳニワトリにおけるこの疾患の発現は、任意の治療法の過程においてモニターすることができ、これには体の大きさ、脂肪蓄積、血清脂質、低温感受性、および不妊が含まれる。
【００５６】
中枢神経系（ＣＮＳ）における自己免疫疾患のモデルも、実験的に誘発可能である。麻痺に至るＣＮＳの炎症は、齧歯類および霊長類を含む多くの異なる実験動物においてアジュバントと共に脳または脊髄組織を単回注射することによって誘発可能である。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）と呼ばれるこのモデルは、Ｔ細胞に媒介される。同様に、実験的に誘発される重症筋無力症は、アジュバントと共にアセチルコリン受容体を単回注射することによって生じ得る（レノンら（Ｌｅｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２７４、２８３ページ、１９７６年）。
【００５７】
消化管の自己免疫疾患は、ＩＬ−２またはＩＬ−１０「ノックアウト」マウス、またはウシ血清アルブミンを含有する浣腸を受けたマウスにおいてモデル化可能である。
【００５８】
本発明の薬剤をコードする核酸分子
融合タンパク質であるもの（たとえば、変異ＩＬ−１５／ＦｃおよびＩＬ−２／Ｆｃ分子）を含む本発明のポリペプチド薬剤は、インビトロで適切な真核または原核発現系において核酸分子を発現し、次いでそのポリペプチド薬剤を精製することによって得られるだけでなく、核酸分子をコードする適切な遺伝子療法発現ベクターとして患者に投与することが可能である。さらに、核酸は、移植片の移植に先立って、その移植片の細胞に導入することが可能である。したがって、上述の薬剤をコードする核酸分子は、本発明の範囲内である。本発明のポリペプチドを、野生型ポリペプチドとの同一性の点から説明し得るのと同様に、それらをコードする核酸分子も必然的に、対応する野生型ポリペプチドをコードする核酸と一定の同一性を有することになる。たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型ＩＬ−１５をコードする核酸と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは８５％、もっとも好ましくは少なくとも９５％（たとえば、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一であり得る。核酸の場合、比較される配列の長さは一般に、少なくともヌクレオチド５０個、好ましくは少なくともヌクレオチド６０個、より好ましくは少なくともヌクレオチド７５個、もっとも好ましくはヌクレオチド１１０個である。
【００５９】
本発明の薬剤をコードする核酸分子は、天然配列、または天然に生じるものとは異なる配列であるが、遺伝コードの縮重の結果、同一のポリペプチドをコードする配列を含むことが可能である。これらの核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ、たとえばホスホアミダイトをベースとする合成によって生成したものなど）、あるいはこれらの型の核酸内のヌクレオチドの組み合わせまたは修飾からなる。さらに、この核酸分子は、２本鎖または１本鎖であり得る（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）。
【００６０】
本発明の核酸分子は、生体の天然ゲノムにおいて隣接する５’または３’コード配列から離れているため、「単離」と呼ばれる。したがって、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列の上流または下流に位置する非コード配列の一部または全体も含むことが可能である。分子生物学の分野の技術者は、核酸分子を単離する慣例的な手順を熟知している。たとえば、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって核酸分子を産生可能である。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）の場合、インビトロ転写によって分子を産生することが可能である。
【００６１】
本発明の単離核酸分子は、天然の状態ではそのような形で見出されない断片を含み得る。したがって、本発明は、核酸配列（たとえば、変異ＩＬ−１５をコードする配列）がベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス・ベクター）、あるいは異種細胞のゲノム（または天然の染色体位置以外の位置にある同種細胞のゲノム）に組み込まれているような組換え分子を包含する。
【００６２】
上述のとおり、本発明の薬剤は融合タンパク質であってもよい。上述の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の薬剤をコードする核酸分子は、「マーカー」または「リポーター」をコードする配列を含有可能である。マーカーまたはリポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ・コード）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。本発明の実施に関連した多くの標準的な手順と同様に、当該技術分野の技術者は、他の有用な試薬、たとえばマーカーまたはリポーターの機能を果たし得る他の配列を認識するであろう。
【００６３】
本発明の核酸分子は、哺乳動物の細胞など任意の生物細胞から得られた、または慣例的なクローニング法によって産生された本発明の薬剤（たとえば、ＩＬ−１５分子またはＩＬ−２分子）に変異体を導入することによって得ることが可能である。したがって、本発明の核酸は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコの核酸であり得る。好ましくは、核酸分子はヒトのものである。
【００６４】
上述の核酸分子は、たとえばそのベクターで形質導入された細胞にそれらの発現を誘導することのできるベクターに含有され得る。したがって、ポリペプチド薬剤に加えて、それらの薬剤をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、およびそれらのベクターでトランスフェクトされた細胞は、好ましい実施形態に含まれる。
【００６５】
本発明での使用に適したベクターには、細菌用のＴ７ベースのベクター（たとえば、ローゼンバーグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ５６、１２５ページ、１９８７年）、哺乳動物細胞用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（リー（Ｌｅｅ）およびネイサンズ（Ｎａｔｈａｎｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、３５２１ページ、１９８８年）、酵母発現系、たとえばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなど（たとえば、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド製の発現ベクターのＰＩＣＺファミリー）、および昆虫細胞用のバキュロウイルス由来ベクター（たとえば、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト製の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９）が含まれる。そのようなベクターの対象となるポリペプチドをコードする核酸挿入部は、たとえば発現を求める細胞型に基づいて選択されるプロモーターに機能的に結合させることが可能である。たとえば、Ｔ７プロモーターは細菌において用いることが可能であり、ポリヘドリン・プロモーターは昆虫細胞において用いることが可能であり、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネイン・プロモーターは哺乳動物細胞において用いることが可能である。さらに、高等真核生物の場合、組織特異および細胞特異プロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内の所与の組織または細胞型において核酸分子の発現を誘導することができるので、そのように呼ばれる。当該技術分野の技術者は、核酸の発現を誘導するために用いることのできる多数のプロモーターおよび他の調節因子を熟知している。
【００６６】
挿入された核酸分子の転写を促進する配列に加えて、ベクターは、複製起点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含むことが可能である。たとえば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子はそれが発現する細胞にＧ４１８耐性を付与し、それによってトランスフェクトされた細胞の表現型選択が可能となる。細胞の表現型選択を可能にする他の適切な選択マーカー遺伝子には、種々の蛍光タンパク質、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびその変異体が含まれる。当該技術分野の技術者は、所与の調節因子または選択マーカーが特定の実験での使用に適しているかどうか容易に判定可能である。
【００６７】
本発明に用いることが可能なウイルス・ベクターには、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびウシパピローマウイルス・ベクターが含まれる（たとえば、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編、「Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＣＳＨラボラトリー・プレス（ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと）。
【００６８】
本発明の薬剤をコードする核酸分子を含有し、インビトロでその核酸分子がコードされたタンパク質を発現する原核細胞または真核細胞も本発明の特徴である。本発明の細胞はトランスフェクトされた細胞であり、すなわち核酸分子、たとえば変異ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸分子が組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞である。そのような細胞の後代も、本発明の範囲内であるとみなされる。発現系の厳密な成分は重要でない。たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、大腸菌などの原核宿主において、あるいは昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ２１細胞）、または哺乳動物細胞（たとえば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、またはＨｅＬａ細胞）などの真核宿主において産生可能である。これらの細胞は、米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナサス）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系の選択においては、成分が互いに適合性であることのみが重要である。当該技術分野の技術者はそのような判別をすることができる。さらに、発現系の選択において手引きが必要である場合、オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９３年）、およびパウエルズら（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８５年、補遺１９８７年）を参照可能である。本発明の薬剤をコードする核酸分子を含有し、インビボでそのような核酸分子がコードされたタンパク質を発現する真核細胞も本発明の特徴である。
【００６９】
さらに、本発明の真核細胞は、細胞移植片、組織または臓器移植片の一部である細胞であり得る。そのような移植片は、ドナー生体から採取された初代細胞、あるいはレシピエント生体に移植される前にインビトロで培養、修飾、および／または選択された細胞（たとえば、幹細胞または前駆細胞を含む真核細胞系）からなり得る。レシピエント生体に移植後、細胞増殖が起こる可能性があるので、そのような細胞の子孫も本発明の範囲内である。細胞、組織、または臓器移植片の一部である細胞は、変異ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトし、その後、レシピエント生体に移植することが可能であり、そこで変異ＩＬ−１５ポリペプチドの発現が起こる。さらに、そのような細胞は、レシピエント生体への移植に先立って、選択手順、たとえば特定の細胞系統または細胞型の適用を可能にする１種または複数のさらなる核酸構築物を含有可能である。
【００７０】
発現したポリペプチドは、慣例的な生化学手順を用いて発現系から精製することが可能であり、以下に記載するように診断ツールとして、または治療薬剤として用いることが可能である。
【００７１】
ＩＬ−１５を標的とする薬剤は診断に有用である
ＩＬ−１５を標的とする薬剤は、本明細書に記載の薬剤の組み合わせで治療を行うことのできる疾患（たとえば、免疫疾患、特に自己免疫疾患）をある患者が有しているかどうかを判定するために用いることが可能である。この診断法は、たとえば免疫疾患、特に自己免疫疾患、または悪性免疫細胞として顕在する癌を有する疑いのある患者の組織試料を得て、その組織をＩＬ−１５Ｒを標的とする抗原タグ・ポリペプチドに曝露することによって実行可能である。この試料は、血液、尿、血清、または血漿試料などの任意の生体試料であってよい。さらにこの試料は、組織試料（たとえば、生検組織）、関節から得られた滲出液（たとえば、滑液）、腹腔から得られた滲出液（たとえば、腹水）、胸部から得られた滲出液（たとえば、胸膜液）、または中枢神経系から得られた滲出液（たとえば、脳脊髄液）であってよい。試料は、元は患者から得られた培養細胞（たとえば、末梢血単核細胞）からなることもできる。この試料は、ヒト患者などの哺乳動物から得ることが可能である。試料が、曝露した薬剤により結合されている細胞を含有する場合、インビボでその薬剤（たとえば、ＩＬ−１５Ｒを標的とする薬剤）によって結合され、それによりインビボで増殖を阻害されるかまたは破壊される可能性が高い。そのような試験の候補となる患者に表れる症状、および特定の一連の症状を与えられた試料となる関連組織は、当該技術分野の技術者によく知られている。
【００７２】
治療を施すことのできる患者
本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答（たとえば、細胞性免疫応答）に関連する、または関連するであろうＴ細胞の阻害、あるいは免疫障害の病因に関連する他の細胞（たとえば、単球、マクロファージ、および他の抗原提示細胞、たとえば樹状細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球など）の阻害、ならびに過増殖性細胞（たとえば、滑膜線維芽細胞（慢性関節リウマチで影響を受ける）、ケラチノサイト（乾癬で影響を受ける）、または皮膚線維芽細胞（全身性エリテマトーデスで影響を受ける）などの免疫障害に関連する組織に認められる）の破壊に有用である。これらの例に照らして、有効に標的とされ得る他の細胞型は当該技術分野の技術者に明らかとなるであろう。過増殖性細胞は、癌性細胞（たとえば、悪性Ｔ細胞）であってもよい。
【００７３】
したがって、本発明の組成物は、免疫疾患、特に自己免疫疾患を罹患している患者を治療するために用いることが可能であり、その疾患には、以下に限定されるわけではないが、（１）慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織病、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、またはベーチェット病などのリウマチ疾患、（２）Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、（３）橋本甲状腺炎、またはグレーヴズ病などの甲状腺の自己免疫疾患、（４）多発性硬化症、重症筋無力症、または脳脊髄炎などの中枢神経系の自己免疫疾患、（５）尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー・アッシャー症候群、またはブラジル天疱瘡などの種々の天疱瘡、（６）乾癬、または神経皮膚炎などの皮膚の疾患、および（７）炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎、またはクローン病）が含まれる。本発明の薬剤の組み合わせは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療に用いることも可能である。同様に、これらの薬剤を投与する方法は、合成材料または生物材料、あるいは両方の組み合わせの移植片を受けた患者の治療に用いることが可能である。そのような移植片は、臓器、組織、または細胞移植片、あるいは細胞を接種した合成移植片、たとえば血管細胞を接種した合成血管移植片であり得る。さらに、ＧＶＨＤを罹患している患者または血管損傷を受けた患者は、この方法から利益を得るであろう。
【００７４】
本発明は、ＩＬ−１５Ｒ（またはＩＬ−２受容体、あるいはＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＲとＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒとの組み合わせ）を標的とする薬剤の標的細胞枯渇性形態を包含するので、正常なＴ細胞を大量に破壊することなく、自己反応性または「移植片破壊性」免疫細胞を選択的に殺すことが可能である。したがって、本発明は、活性化、あるいは自己反応性または「移植片破壊性」免疫細胞、あるいは悪性細胞を含む、インビボでＩＬ−１５Ｒを発現する細胞を殺す方法を特徴とする。これらの方法は、ＩＬ−１５Ｒを標的とし、かつ補体系を活性化し、ＡＤＣＣ機序によって細胞を溶解、または野生型ＩＬ−１５受容体複合体を発現する細胞を殺す薬剤を含む薬剤の組み合わせを患者に投与することによって実施可能である。この方法は、ＩＬ−１５＋白血病、リンパ腫、または結腸癌などの他のＩＬ−１５＋悪性疾患を有する患者の治療に用いることが可能である。
【００７５】
使用製剤および投与経路
本発明の方法、およびそれを実施するために用いられる治療組成物は、「実質的に純粋な」薬剤を含有する。たとえば、薬剤がポリペプチドの場合、そのポリペプチドは、対象となるポリペプチド、たとえばＩＬ−１５Ｒを有する細胞に結合しそれを破壊するポリペプチドが、少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、薬剤（たとえば、ポリペプチド）は、対象となる薬剤が少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、もっとも好ましくは少なくとも９９重量％である。純度は、任意の適切な標準法、たとえば、カラム・クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などによって測定可能である。
【００７６】
本発明の方法において有用な薬剤は天然源から得ることが可能であるが、合成または他の方法で製造することも可能である（たとえば、ＩＬ−１５Ｒを有する細胞に結合し、破壊する薬剤は、組換え核酸分子の発現によって産生可能である）。真核生物由来、あるいは大腸菌または他の原核生物において合成されたポリペプチド、および化学的に合成されたポリペプチドは、それらの天然関連成分を実質的に含まない。ポリペプチドがキメラである場合、その薬剤の全部または一部をコードする配列（たとえば、変異ＩＬ−１５ポリペプチドをコードする配列、およびＩｇＧのＦｃ領域をコードする配列）を含有するハイブリッド核酸分子によってコードされ得る。本発明の薬剤（たとえば、ポリペプチド）は、細菌発現タンパク質の精製を促進するためにヘキサヒスチジン・タグに融合することが可能であり、または真核細胞に発現したタンパク質の精製を促進するためにヘマグルチニン・タグに融合することが可能である。
【００７７】
本発明の薬剤を製造するために必要な技術は当該技術分野で慣例であり、当該技術分野の技術者によって、過度な実験に頼ることなく実行可能である。たとえば、ＩＬ−１５の１つまたは複数のアミノ酸残基の置換からなる変異体は、１４９位および１５６位のグルタミン残基をアスパラギン酸残基に代えた変異ＩＬ−１５ポリペプチドを作製するために本明細書に記載したＰＣＲ利用変異誘発技術を用いて作製することが可能である。アミノ酸残基の欠失または付加（ＩＬ−１５ポリペプチド、または本明細書に記載した他の有用な任意のポリペプチド、たとえば共刺激を阻害する、または活性化Ｔ細胞に結合するポリペプチドに対して）からなる変異体も、標準的な組換え技術で製造可能である。治療的適用において、本発明の薬剤は、生理食塩水などの生理的に許容される担体と共に投与し得る。本発明の治療組成物はさらに、担体または賦形剤を含有することが可能であり、その多くが当該技術分野の技術者に知られている。使用可能な賦形剤には、緩衝液（たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（たとえば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが含まれる。本発明の薬剤は、対応する投与経路に従って、様々な形態で調剤可能である。たとえば、摂取または注射用に溶液を製造可能であり、摂取、吸入、または局所適用のためにゲルまたは粉剤を製造可能である。そのような製剤を製造する方法はよく知られており、たとえば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００７８】
投与経路も薬理学者および医師によく知られており、腹腔内、筋肉内、皮下、および静脈内投与を含む。さらなる経路には、頭蓋内（たとえば槽内または脳室内）、眼窩内、眼、嚢内、脊椎内、腹腔内、経粘膜、局所、皮下、および経口投与が含まれる。静脈内経路または動脈内経路は、ＩＬ−１５受容体を標的とする薬剤の投与に好ましいことが予期される。皮下組織はポリペプチドに安定な環境を提供し、ポリペプチドはそこからゆっくりと放出され得るので、皮下経路も頻繁に用いることができる。
【００７９】
細胞療法（遺伝子療法）の場合、細胞／組織／器官は、治療タンパク質が発現し、その後レシピエント生体内で移植細胞／組織／器官によって放出されるように、核酸組成物を用いて移植に先立ってインキュベーション、注入、または潅流によってトランスフェクトすることが可能である。同様に、細胞／組織／器官は、ドナー細胞／組織／器官に癒着性の移植片関連免疫細胞を除去するために、移植前に治療タンパク質を用いて潅流または単純なインキュベーションによって前処理を行うことが可能である（これは側面に過ぎず、おそらく臨床的意義はない）。細胞移植の場合、細胞は、植え込み法によって、または血管壁を経るカテーテルによる注射法を用いて投与できる。場合によって、細胞は脈管構造への放出によって投与することができ、その後、そこから血流によって分配され、かつ／または周囲組織に移動する（これは膵島細胞移植において行われ、そこで膵島細胞は門脈に放出され、その後、肝臓組織に移動する）。
【００８０】
患者に対する用量が、その患者の全身健康状態、性別、体重、体表面積、および年齢、ならびに投与される特定の化合物、投与時間および経路、同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因によって決まることは、医療分野においてよく知られている。本発明のポリペプチドの用量は変わり得るあるが、静脈内に投与されるとき、体重１ｋｇ当たり１マイクログラムから１０ｍｇの範囲、または血液量１ｌ当たり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲の用量で投与可能である。必要であれば、用量は１日１回または複数回投与することが可能であり、治療は長期間継続可能である。所与の適用例に対する正確な投与量の決定は、当該技術分野の技術者の能力範囲内である。
【００８１】
（実施例）
試薬
本明細書に記載の研究において、以下の試薬を用いた。組換え型ヒトＩＬ−２は、ホフマン・ラ・ロシュ社（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）（ニュージャージー州ナトレー）から得た。ラパマイシンは、ワイエス・アイエルスト社（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）（ニュージャージー州プリンストン）から得た。シクロスポリン−Ａ（ＣｓＡ）は、サンド社（Ｓａｎｄｏｚ）（ニュージャージー州イーストハノーバー）から得た。ＲＰＭＩ−１６４０、およびウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、バイオウイタッカー社（ＢｉｏＷｉｔｔａｋｅｒ）（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｇ４１８、およびストレプトアビジン−ＲＥＤ６７０は、ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（メリーランド州ゲイサースバーグ）から得た。デキサメタゾン、ＰＨＡ、リゾチーム、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、ＮａＣｌ、ＨＥＰＥＳ、およびＰＭＳＦは、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）から得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅは、ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（スウェーデン、ウプサラ）から得た。組換え型ヒトＩＬ−１５、および抗ヒトＩＬ−１５Ａｂは、ペプロテック社（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）（ニュージャージー州ロッキーヒル）から得た。抗ＦＬＡＧＡｂ、および抗ＦＬＡＧ親和性ビーズは、インターナショナル・バイオテクノロジー社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）（コネチカット州ニューへブン、コダック）から得た。ｐＲｃＣＭＶは、インビトロゲン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ゲニステインは、ＩＣＮバイオメディカルズ社（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）（カリフォルニア州アービン）から得た。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）は、ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）（イリノイ州ロックフォード）から得た。制限エンドンクレアーゼは、ニューイングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビバリー）から得た。［３Ｈ］ＴｄＲは、ニューイングランド・ヌクレア社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）（マサチューセッツ州ボストン）から得た。蛍光色素複合抗体ＣＤ２５−ＰＥ３、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ１２２−ＰＥ、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１−ＰＥ、またはＩｇＧ１−ＦＩＴＣは、ベクトン／ディッキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（カリフォルニア州サンノゼ）から得た。ＦＬＡＧペプチドは、ハーバード・メディカル・スクール（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）のペプチド合成施設（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で合成した。
【００８２】
ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質の産生
ヒトＩＬ−１５受容体発現の細胞パターンを研究するために、ＩＬ−１５融合タンパク質の発現に用いることが可能なプラスミドを構築した。このプラスミドは、アミノ酸１８個のＦＬＡＧ−ＨＭＫ配列に共有結合したＮ末端を有するＩＬ−１５ポリペプチド（ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５）をコードする。ＦＬＡＧ配列は、ビオチン化高特異性抗ＦＬＡＧ抗体によって認識され（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）、ＨＭＫ（心筋キナーゼ認識部位）配列は、放射性標識［３２Ｐ］の分子への導入を可能にする（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、上記、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）前掲）。
【００８３】
プラスミドＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５を構築するために、成熟ＩＬ−１５タンパク質をコードする３２２ｂｐ  ｃＤＮＡフラグメントを、合成オリゴヌクレオチド［センス５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号５、ＥｃｏＲＩ部位（下線）＋塩基１４５〜１６２）、アンチセンス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号５、ＢａｍＨＩ部位（下線）＋塩基４７２〜４８９）］を用いるＰＣＲによって増幅した。テンプレートＤＮＡは、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣから得た。このＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）に記載のとおり、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドに入れてクローニングした。ｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドのバックボーンは、ＦＬＡＧおよびＨＭＫ認識ペプチド配列をコードする配列をインフレームに含有する（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）。
【００８４】
ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質の発現および精製
ＩＬ−１５関連融合構築物ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５を、（ブラナーら（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１０１４ページ、１９９２年、ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９９２年）に記載のとおり、大腸菌ＢＬ−２１株に発現し、抗ＦＬＡＧ被覆ビーズを用いてアフィニティ精製した。この融合タンパク質を、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）で充分に洗浄した後、アフィニティ・カラムから溶出した。ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５を含有する溶出液を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）および０．１ＭＮａＣｌを含有する緩衝液に対して４℃で１８時間透析し、０．２μｍのメンブランで濾過し、−２０℃で保存した。
【００８５】
ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒαサブユニットに結合する
精製したＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質が細胞表面ＩＬ−１５受容体と相互作用するかどうか判定するために試験した。上述のとおり、［３２Ｐ］−ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５を、マイトジェンＰＨＡで活性化したＰＢＭＣの培養物に添加した。相互作用タンパク質を互いに永続的に結合させるために、化学架橋剤スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を添加した。細胞を洗浄、溶解、遠心分離し、洗浄剤可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質のオートラジオグラフィは、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５（１５ｋＤａ）とヒトＩＬ−１５Ｒαサブユニット（６０〜６５ｋＤａ）とを合わせた分子量に相当する７５〜８０ｋＤａの単一のバンドを示した。このバンドがＩＬ−１５Ｒαサブユニットと同一であることは、モル過剰量のｈＩＬ−１５の存在下で行った架橋実験によって確認した。この条件下で、放射性標識１５ｋＤａのバンドは検出できなかった。このように、［３２Ｐ］−ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質の確認によって、マイトジェン活性化ＰＢＭＣの表面に発現した６０〜６５ｋＤａＩＬ−１５Ｒαサブユニットへの部位特異結合が認められる。
【００８６】
ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５はＩＬ−２Ｒβの発現を必要とする生物活性増殖因子である
次の一連の実験において、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質が生物活性増殖因子として機能し得るのかどうかを判定するために試験した。ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣは、［３Ｈ］−ＴｄＲ取り込みアッセイによって検出されるとおり、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５またはヒト組換え型ＩＬ−２に応答して増殖する。ＩＬ−１５配列を欠損するＦＬＡＧペプチドは細胞増殖を刺激しない。ＩＬ−２と同様に、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒβサブユニットを発現するＩＬ−２Ｒγ＋ＢＡＦ−ＢＯ３細胞トランスフェクタントの増殖を刺激する。しかしながら、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質は、ＩＬ−２Ｒβ鎖配列を欠損するベクターでトランスフェクトした親ＢＡＦ−ＢＯ３細胞の増殖を刺激しない。このように、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５は、細胞増殖を刺激するために、標的細胞上にＩＬ−２Ｒβ鎖の発現を必要とする生物活性増殖因子である。
【００８７】
マイトジェン活性化ＰＢＭＣはＩＬ−１５αサブユニットを発現するが、休止ＰＢＭＣは発現しない
ヒトＰＢＭＣ上のＩＬ−１５結合部位の発現を細胞蛍光分析によって検出するために、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体、およびストレプトアビジン−ＲＥＤ６７０を用いた。試験を行ったＰＢＭＣは、新しく単離した細胞、またはＰＨＡ活性化細胞であった。これらの細胞を洗浄し、培地のみ、またはＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５共に、続いて抗ＦＬＡＧビオチン化抗体、およびストレプトアビジン−ＲＥＤ６７０と共にインキュベートした。この染色細胞を、フロー・サイトメトリによって分析した。ＰＨＡで活性化したＰＢＭＣはＩＬ−１５Ｒαタンパク質を発現したが、休止ＰＢＭＣは発現しなかった。上述の架橋実験の結果と一致して、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５のＰＨＡ活性化ＰＢＭＣへの結合は、モル過剰のｒＩＬ−１５によって遮断され、したがってＩＬ−１５結合部位に対するＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５結合の特異性を実証する。活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は共に、ＩＬ−１５α鎖を発現する。活性化誘発ＩＬ−１５Ｒα鎖は、ＣＤ１４＋（単球／マクロファージ）細胞、およびＣＤ１６＋（ナチュラルキラー）細胞においても検出された。
【００８８】
ＩＬ−２ＲαおよびＩＬ−２ＲβサブユニットはＩＬ−１５結合に必要とされない
ＩＬ−２Ｒαサブユニットに対して、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５タンパク質および抗ＣＤ２５Ｍａｂで染色したＰＨＡ活性化ＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析は、ＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−２Ｒαサブユニットの両方を発現する細胞集団と、いずれかのサブユニットを発現するが両方は発現しない細胞集団とを明らかにする。ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５に結合しないＩＬ−２Ｒα＋細胞が存在する。１日だけＰＨＡで刺激したほぼすべてのＰＢＭＣが、ＩＬ−１５ＲαまたはＩＬ−２Ｒβ鎖を発現するが、両方のタンパク質は発現しない。対照的に、ＰＨＡ刺激の３日後には、ＩＬ−１５Ｒα＋、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞（ダブル・ポジティブ）のはるかに大きな集団、ＩＬ−１５Ｒα＋、ＩＬ−２Ｒβ−細胞（シングル・ポジティブ）のはるかに小さな集団が認められた。興味深いことに、ＩＬ−１５に結合できないＩＬ−２Ｒβ＋細胞が存在する。したがって、ＩＬ−２Ｒβ鎖の発現は、ＩＬ−１５結合に充分でない。
【００８９】
すべてを考慮すると、これらのデータは、ＩＬ−１５がＩＬ−１５Ｒα＋、ＩＬ−２Ｒα−、およびＩＬ−２Ｒβ−細胞に結合し得ることを示している。ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５ＲαサブユニットでトランスフェクトしたＩＬ−２Ｒα−、β−細胞との相互作用を調べた実験によっても同様の結果が得られた（アンダーソンら（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、２９８６２ページ、１９９５年、ギリら（Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、３６５４ページ、１９９５年）。ＩＬ−１５Ｒαサブユニット発現に必要であることに加えて、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγサブユニットは、細胞をＩＬ−１５誘発増殖に対して感受性にするために必要とされる。
【００９０】
要約すると、上に示した実験は（ｉ）ＩＬ−１５Ｒαサブユニットが、活性化マクロファージ、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞によって迅速に発現されること、ならびに（ｉｉ）ＩＬ−１５Ｒαサブユニットの誘発は、デキサメタゾンによって遮断されるがＣｓＡまたはラパマイシンでは遮断されないこと、を実証した。さらに、これらの実験は、ＩＬ−１５ＲαサブユニットがＩＬ−１５結合に必要かつ充分であり、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５融合タンパク質がＩＬ−１５受容体の研究に極めて有用なツールであることを確認した。
【００９１】
ＩＬ−２ＲβサブユニットはＩＬ−２およびＩＬ−１５両方のシグナル伝達に重要である
活性化Ｔ細胞の生存能力の低下、それによる活性化Ｔ細胞の枯渇は、加速性アテローム性動脈硬化症、同種異系移植片の拒絶、ある種の白血病、および他の免疫媒介病変の原因であるリンフォカインおよびマイトジェンの産生を低減する方法を提供する。さらに、ＩＬ−１５によって活性化されたシグナル伝達経路の遮断も、加速性アテローム性動脈硬化症、同種異系移植片の拒絶、ある種の白血病、および他の免疫媒介病変の原因であるリンフォカインおよびマイトジェンの産生を低減する方法を提供する。Ｔ細胞は活性化されたとき、増殖し、その細胞表面にインターロイキンに対する受容体を発現する。さらに活性化Ｔ細胞は、少なくとも３種のリンフォカイン、すなわちガンマインターフェロン、Ｂ細胞分化因子ＩＩ、およびＩＬ−３を放出する。これらのリンフォカインは、同種異系移植片拒絶のような種々の望ましくない事象を生じ得る。対照的に、休止Ｔ細胞および長期記憶Ｔ細胞はリンフォカイン受容体を発現しない。この受容体発現の差異は、休止細胞に干渉することなく、活性化免疫細胞を標的にする手段を提供する。ＩＬ−１５Ｒのいくつかのサブユニットを認識するように設計された分子は、活性化単球／マクロファージ、ならびに活性化Ｔ細胞を認識し、これらの細胞を選択的に阻害または破壊するために用いることが可能である。ＩＬ−１５Ｒサブユニットに結合するが、ＩＬ−１５活性を持たないＩＬ−１５誘導体は、真のＩＬ−１５の結合を遮断し、および／または取り込みを遮断するため、本発明の方法において有用である。下記の変異ＩＬ−１５分子は、そのような誘導体の実施例を提供する。
【００９２】
ＩＬ−１５Ｒを標的とする変異ＩＬ−１５ポリペプチド
変異ＩＬ−１５の遺伝子構築物
２重変異（Ｑ１４９Ｄ、Ｑ１５６Ｄ）を有するヒトＩＬ−１５タンパク質を、ＩＬ−２Ｒγサブユニットに対する結合に重要な推定部位を標的とするように設計した。１４９位および１５６位の極性であるが電荷は持たないグルタミン残基を、ＰＣＲ補助変異誘発を利用して、アスパラギン酸の産生残基に変異させた。ＩＬ−１５の２重変異体をコードするｃＤＮＡを、合成センス・オリゴヌクレオチド［５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡ−３’（配列番号  ）、ＥｃｏＲＩ部位（下線のヘキサマー）＋塩基１４５〜１６２］、および合成アンチセンスオリゴヌクレオチド［５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＴ−ＡＴＧＴＡＣＡＡＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’（配列番号  ）、ＢａｍＨＩ部位（下線へ基サマー）＋塩基４７２〜４８９、変異塩基は一重下線で示す］を用いるＰＣＲによって増幅した。テンプレートは、ヒトＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドであった。記載のとおり、増幅したフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＲＩで消化したｐＡＲ（ＤＲＩ）５９／６０プラスミドにクローニングした（ルクレールら（ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、８１４５ページ、１９８９年）。１５６位残基における変異の存在はＳａｌＩを用いた消化によって確認され、この変異は新たなＳａｌＩ制限部位を導入する。さらに、変異を標準的な技術に従って、ＤＮＡシークエンシングによって実証した。ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５野生型タンパク質に関して上述したとおり、ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５（Ｑ１４９Ｄ、Ｑ１５６Ｄ）２重変異タンパク質を産生し、精製して、シークエンシングによって確認した。
【００９３】
同じ方法を用いて、１４９位または１５６位のいずれかに、単一のアミノ酸置換を含む変異体を調製した。前述のとおり、これらの位置（１４９および１５６）は、４８個のアミノ酸シグナル配列を欠損する成熟ＩＬ−１５ポリペプチドでは、それぞれ１０１位および１０８位に対応する。
【００９４】
同様に、この方法は、１４９位または１５６位のグルタミン残基の代わりに任意のアミノ酸を組み込むために、または１４９位および／または１５６位以外の位置にアミノ酸置換を導入するために用いることが可能である。
【００９５】
ＩＬ−１５関連タンパク質の存在下におけるＢＡＦ−ＢＯ３細胞の増殖
この２重変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、用量依存的にＢＡＦ−ＢＯ３の増殖を阻害する可能性があり、２重変異ＩＬ−１５を３０μｌ（約５０μｇ／ｍｌ）添加した場合、同じ濃度の２重変異ＩＬ−１５を２０μｌ添加した場合に比べて、より完全に増殖を阻害した。
【００９６】
ＰＨＡ刺激ヒトＰＢＭＣの増殖
ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５の２重変異ポリペプチドが、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣを結合する能力を以下のように実証した。ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを洗浄し、培地のみ、またはＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５  ２重変異体と共にインキュベートした。次いで、細胞を抗ＦＬＡＧビオチン化抗体と共にインキュベートし、ストレプトアビジンＲＥＤ６７０複合体で染色した。染色した細胞を、フロー・サイトメトリで分析した。
【００９７】
野生型ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５で染色した白血病細胞系のＦＡＣＳ分析  上述と類似の一連の実験において、野生型ＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５ポリペプチドが白血病細胞を結合する能力を示した。処理した細胞は、白血病細胞系ＭＯＬＴ−１４、ＹＴ、ＨｕＴ−１０２、およびベス・イスラエル病院（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（マサチューセッツ州ボストン）において現在確立されており、２Ａおよび２Ｂと称する細胞系から得た。培養細胞を洗浄し、培地のみ、またはＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５野生型ポリペプチドを含有する培地と共にインキュベートした。次いで、細胞をビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体と共にインキュベートし、ストレプトアビジンＲＥＤ６７０複合体で染色した。染色した細胞を、フロー・サイトメトリで分析した。
【００９８】
さらなる変異ＩＬ−１５キメラポリペプチドの遺伝子構築
抗原性タグを有する変異ＩＬ−１５を提供するＦＬＡＧ−ＨＭＫ−ＩＬ−１５キメラに加えて、他の多くのポリペプチドを、ＩＬ−１５またはＩＬ−２の任意の変異体に結合させることが可能である。たとえば、変異ＩＬ−１５またはＩＬ−２を、以下の方法に従って、抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃフラグメントに結合させることが可能である。
【００９９】
変異ＩＬ−１５／Ｆｃの遺伝子構築
Ｆｃγ２ａに対するｃＤＮＡは、逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ、ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ニューヨーク州グランドアイランド）、および合成オリゴ−ｄＴ（１２〜１８）オリゴヌクレオチド（ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））によって、標準的な技術を用い、ＩｇＧ２ａ分泌ハイブリドーマから抽出されたｍＲＮＡから産生することが可能である。この変異ＩＬ−１５ｃＤＮＡを、ＩＬ−１５特異合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって、プラスミド・テンプレートから増幅可能である。
【０１００】
この５’オリゴヌクレオチドは、独自のＮｏｔＩ制限部位４０ヌクレオチド５’を翻訳開始コドンに挿入するように設計され、一方３’オリゴヌクレオチドは、終止コドンを除去し、さらに変異ＩＬ−１５／Ｆｃ接合部において独自のＢａｍＨＩ部位の作製を容易にするために、Ｃ末端セリン残基コドンをＡＧＣからＴＣＧに修飾する。Ｆｃγ２ａドメインｃＤＮＡの増幅に用いられる合成オリゴヌクレオチドは、ヒンジの最初のコドンにわたる独自のＢａｍＨＩ部位を作製し、さらに独自のＸｂａＩ部位３’を終止コドンに導入するためにヒンジの最初のコドンをＧｌｕからＡｓｐに変える。
【０１０１】
Ｆｃフラグメントは、標的細胞非枯渇性であるように、すなわち補体系を活性化できないように修飾可能である。標的細胞非枯渇性変異ＩＬ−１５構築物（ｍＩＬ−１５／Ｆｃ）を製造するために、オリゴヌクレオチド部位誘導変異誘発を用いて、Ｃ’１ｑ結合モチーフ、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、Ｌｙｓ３２２をＡｌａ残基で置き換える。同様に、Ｌｅｕ２３５をＧｌｕで置き換えて、ＦｃγＲＩ結合部位を不活化する。独自のＢａｍＨＩ部位における正確な翻訳リーディング・フレーム内のサイトカインとＦｃ’’成分とのライゲーションにより、全体で１３個のシステイン残基を有するアミノ酸４１１個の単一ポリペプチド（アミノ酸１８個のＩＬ−１５シグナル・ペプチドを含む）をコードする１２３６塩基対のオープン・リーディング・フレームが生じる。成熟分泌ホモダイマーＩＬ−１５／Ｆｃは、全体で８個までの分子内ジスルフィド結合および３個の重鎖間ジスルフィド結合と、グリコシル化を除き約８５ｋＤａの分子量を有すると予測される。
【０１０２】
ｍＩＬ−１５受容体Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製
ｍＩＬ−１５／Ｆｃの適切な遺伝子構築は、融合遺伝子をＮｏｔＩ−ＸｂａＩカセットとして真核発現プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングした後に、ＤＮＡ配列分析をすることによって確認可能である。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびＧ４１８による選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を有する。ｍＩＬ−１５／Ｆｃ融合遺伝子を有するプラスミドを、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、米国菌株保存機関から入手可能）にエレクトロポレーション（１．５ｋＶ／３μＦ／０．４ｃｍ／ＰＢＳ）によってトランスフェクトし、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ギブコ−ＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））１．５ｍｇ／ｍｌを含有する血清を含まないＵｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（バイオウイタッカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．）メリーランド州ウォーカーズビル）中で選択する。サブクローニングの後、ＥＬＩＳＡ（ファーミンジェン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）カリフォルニア州サンディエゴ）によってＩＬ−１５の上清をスクリーニングすることによって、高レベルの融合タンパク質を産生するクローンを選択する。ｍＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を、タンパク質Ａセファロース・アフィニティ・クロマトグラフィー、それに続くＰＢＳによる透析、および０．２２μｍの濾過滅菌によって、培養上清液から精製する。精製したタンパク質は、使用まで−２０℃で保存可能である。
【０１０３】
融合タンパク質の大きさおよびアイソタイプ特異性を評価するために、還元条件下（ＤＴＴあり）および非還元条件下（ＤＴＴなし）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、モノクローナルまたはポリクローナル抗ｍＩＬ−１５または抗Ｆｃγ１次抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行うことが可能である。変異ＩＬ−１５／Ｆｃの機能活性は、上述の標準的なＴ細胞増殖アッセイによって評価可能である。以下のｍＡｂはファーミンジェン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。ＰＥ抗マウスＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα鎖、ＩｇＧ１、ＰＣ６１）、ラット抗マウスＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒβ鎖、ＩｇＧ２ｂ、ＴＭ−ｂ１）、ラット抗マウスＣＤ１３２（ＩＬ−２Ｒγｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＴＵＧｍ２）、ハムスター抗マウスＣＤ３（ＩｇＧ、１４５−２Ｃ１１）、ハムスター抗マウスＣＤ２８（ＩｇＧ、３７．５１）、ＰＥ抗マウスＣＤ６２Ｌ（ＩｇＧ２ａ、ＭＥＬ１４）、ＰＥハムスター抗マウスＢｃｌ−２複合体（ＩｇＧ、３Ｆ１１）、ＰＥ抗マウスＩＬ−２複合体（ＩｇＧ２ｂ、ＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＰＥアネキシンＶ、ビオチン化抗ラットＩｇＧ２ｂ、ＰＥストレプトアビジン、ＰＥ−ＣｙＣｈｒｏｍｅ、およびＰＥアイソタイプ・コントロールｍＡｂ複合体である。ビオチン化マウス抗ＦＬＡＧｍＡｂ、およびラットＩｇＧ１コントロールｍＡｂは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス）から得た。Ｂ細胞ハイブリドーマ分泌ラット抗マウスＣＤ２５ｍＡｂ（ＴＩＢ２２２、ＩｇＧ１）は、米国菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から得た。細胞は、血清を含まないＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ培地（バイオウイタッカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、メリーランド州ウォーカーズビル）で増殖し、培養上清中のｍＡｂをタンパク質Ｇカラムで精製した。
【０１０４】
インビボでのＩＬ−２およびＩＬ−１５の発現研究
組換え型ヒトＩＬ−２およびＩＬ−１５を、Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。ＩＬ−１５−ＦＬＡＧおよびＩＬ−１５変異体／Ｆｃ融合タンパク質を構築し、発現し、以前に報告されているとおり試験した（チェら（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２８１３〜２８１９ページ、１９９６年、キムら（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、５７４２〜５７４８ページ、１９９８年）。前に報告されているとおり、ラット抗マウスγｃｍＡｂ（４Ｇ３／３Ｅ１２、ＩｇＧ２ｂ）を用いた（リら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、１１９３〜１１９９ページ、２０００年）。
【０１０５】
リンパ球を以下のように、蛍光色素５−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）、オレゴン州ポートランド）で標識した。脾臓および末梢リンパ節をドナー・マウスから採取し、単一細胞懸濁液をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で調製した。赤血球を低浸透圧ショックによって溶解した。細胞を１×１０７／ｍｌでＨＢＳＳに再懸濁し、ウェルズら（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００、３１７３〜３１８３ページ、１９９７年）によって記載のとおり、ＣＦＳＥで標識した。
【０１０６】
ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をインビボで活性化するために、ＤＢＡ／２マウスを、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  Ｅｘａｃｔｏｒ（カナタ社（Ｋａｎａｔａ）カナダ、オンタリオ州）を用いて照射（１０００ｒａｄ）した。次いで、それぞれのマウスに、０．５ｍｌＨＢＳＳ中４から６×１０７のＣＦＳＥ標識細胞を尾の静脈から投与した。３日後、宿主マウスを殺し、脾臓および末梢リンパ節を別々に採取した。細胞表面染色およびＦＡＣＳ分析のために、単一細胞懸濁液を調製した。
【０１０７】
いくつかの実験において、照射宿主マウスを、抗ＣＤ２５ｍＡｂまたは抗γｃｍＡｂで処理した（ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内注射後から３日間、腹腔内に１ｍｇ／日）。インビボでの細胞分裂を、ＣＦＳＥ標識細胞の注射後、第３日に判定した。ＩＬ−１５変異体／Ｆｃ融合タンパク質の処理は、標識細胞の静脈内注射後から３日間、腹腔内に１．５μｇ／日であった。
【０１０８】
照射同種異系宿主内のインビボ活性化ＣＦＳＥ標識細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体サブユニットの発現のために染色した。ＩＬ−２受容体α鎖の発現を検出するために、細胞（２×１０６）を氷上で３０分間、ＰＥ抗マウスＣＤ２５ｍＡｂで染色し、洗浄して、０．５％ＢＳＡを含有する１ｍｌＰＢＳに再懸濁した。ＩＬ−２Ｒβおよびγｃの発現を検出するために、細胞を氷上で３０分間、ラット抗マウスβ鎖（ＩｇＧ２ｂ）またはγｃｍＡｂ（ＩｇＧ２ｂ）と共にインキュベートし、その後、ビオチン化抗ラットＩｇＧ２ｂと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、さらに２０分間、ＰＥストレプトアビジンで染色した。細胞を洗浄し、分析のために、ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡに再懸濁した。ＩＬ−１５Ｒα鎖の発現を検出するために、細胞をそのα鎖と結合するＩＬ−１５−ＦＬＡＧ融合タンパク質と共にインキュベートし（チェら（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２８１３〜２８１９ページ、１９９６年）、次いでビオチン化マウス抗ＦＬＡＧｍＡｂで染色した。次いで細胞を洗浄し、ＰＥストレプトアビジンで染色した。各実験において、アイソタイプ対応コントロールｍＡｂを、コントロールとして含めた。すべての試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州マウンテンビュー）を備えたＦＡＣＳｏｒｔを用いて分析した。データを集め、ＣＦＳＥ＋細胞にゲーティングすることによって分析した。すべての分裂ＣＦＳＥ＋細胞は、ＣＤ３の発現によって定義されるとおりＴ細胞であった。各試料に関して、少なくとも１０００００事象を回収した。
【０１０９】
インビボでの分裂Ｔ細胞のアポトーシスを、以下のとおり分析した。ＣＦＳＥ標識リンパ球を、上述のとおり照射同種異系宿主内インビボで刺激した。３日後、細胞を宿主脾臓および末梢リンパ節から採取し、標識緩衝液中、氷上で１５分間、ＰＥアネキシンＶ複合体で染色した。細胞のＣＦＳＥプロファイルに基づいて細胞分裂を同定し、識別される各細胞分裂におけるアポトーシス細胞死をアネキシンＶ染色によって分析した。
【０１１０】
さらに細胞を、細胞内ＩＬ−２およびＢｃｌ−２サイトカイン発現に対して染色した。３日間インビボで活性化させたＣＦＳＥ標識細胞を、宿主脾臓およびリンパ節から採取した。細胞をインビトロで４時間、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で再刺激し、培養の最後の２時間にＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ファーミンジェン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））を添加した。細胞を固定して、４℃で１０分間、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ファーミンジェン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））で浸透化し、次いでＰＥ抗マウスＩＬ−２ｍＡｂ複合体で染色し、さらにアイソタイプ対応コントロールｍＡｂをコントロールとして用いた。Ｂｃｌ−２染色のために、細胞を固定して、１０分間、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで浸透化し、３０分間、ＰＥ抗Ｂｃｌ−２ｍＡｂ複合体またはアイソタイプ・コントロールＡｂで染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１１１】
細胞選別およびインビボ再刺激を以下のように行った。標識細胞の静脈内注射の３日後、照射同種異系宿主からＣＦＳＥ標識細胞を調製した。インビボでの細胞増殖を、ＣＦＳＥプロファイルの分析によって同定した。第２細胞分裂を選択し、ゲーティングして、２０００事象／秒でＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）ソータ（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて選別した。選別した細胞を、１０％ＦＣＳならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０５／ｍｌで再懸濁し、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）被覆プレートに、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）と共に平板培養した。３日後、細胞を回収し、ＰＥ抗マウスＣＤ２５複合体およびアイソタイプ・コントロールＡｂで染色した。細胞増殖およびＩＬ−２受容体α鎖発現を、ＦＡＣＳによって分析した。
【０１１２】
細胞選別およびインビトロ増殖アッセイを以下のように行った。標識細胞の静脈内注射の３日後、照射同種異系宿主からＣＦＳＥ標識細胞を調製し、その細胞のＣＦＳＥプロファイルの分析によって、インビボでの細胞増殖を同定した。第２細胞分裂を選択し、ゲーティングして、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）を用いて選別した。細胞（１×１０４／ｍｌ）を、１０％ＦＣＳならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシン添加のＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、４８時間、ＩＬ−２（４０μ／ｍｌから５００μ／ｍｌ）またはＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞を１ｍＣｉ３Ｈ−ＴｄＲ（アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、マサチューセッツ州ボストン）で１６時間パルスし、３Ｈ−ＴｄＲ取り込みをシンチレーション・カウンティング（ベックマン・インスツルメント社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、メリーランド州コロンビア）によって求めた。
【０１１３】
上述の試薬および技術は、いくつかの発見の基礎を提供した。第１に、ＣＦＳＥ標識Ｂ６ＡＦ１（Ｈ−２ｂ／ｄ．ｋ）同種異系リンパ球は、同系コントロールと対照的に（リら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ５、１２９８〜１３０２ページ、１９９９年）、照射ＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）宿主内で活発に増殖した。宿主脾臓から回収したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の約２０％が、養子免疫伝達から３日以内に細胞周期にはいり、７から８巡の個別の細胞分裂が明らかに同定された（図３Ａ）。驚いたことに、高親和性のＩＬ−２受容体シグナル伝達に必要とされるＩＬ−２受容体α鎖は、最初の５回の分裂の間に検出できなかった。すなわち、この受容体サブユニットは、５回の細胞分裂後にのみ発現される。対照的に、ＩＬ−２受容体のβサブユニットは、すべての分裂Ｔ細胞によって構成的に発現され、その発現レベルは細胞が分裂を続けるにつれて次第に上昇した。インビボにおけるγｃ発現のパターンは、α鎖およびβ鎖と著しく異なっていた（図３Ａ）。非分裂Ｔ細胞（０分裂）は、非常に低いレベルのγ鎖を発現した（＜１０％）。細胞周期にはいった後、γ鎖は分裂Ｔ細胞から非常に高いレベルで発現された。連続する各細胞分裂の後、発現レベルは上昇を続けた。しかしながら、５回の細胞分裂後、γ鎖の発現は急激にダウンレギュレーションされ、６回の細胞分裂後にはほぼ基底レベルにまで達した（図３Ａ）。
【０１１４】
末梢リンパ節から採取されたＣＦＳＥ標識細胞もＩＬ−２受容体の３種のサブユニットに関して極めて類似するパターンを示したので、ＩＬ−２受容体サブユニットの差異的な発現は、宿主脾臓における活性化Ｔ細胞のサブセットの選択的蓄積によるものではない。
【０１１５】
第２に、インビボでのＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の刺激は、ＩＬ−２受容体の３種すべてのサブユニットに一様な発現をもたらした（図３Ｂ）。これは、インビボでのＩＬ−２受容体発現の調節がインビトロとは異なることを示唆している。ＩＬ−２受容体α鎖は、セレクチンに類似の挙動で、インビボでのタンパク分解分割に感受性であることが知られている（ヘマーら（Ｈｅｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９、５５〜６４ページ、１９９５年）。インビボでの分裂Ｔ細胞によるＬ−セレクチン発現の染色は、Ｌ−セレクチンが最初の５回の細胞分裂の間に高レベルで発現されることを示し（図３Ｃ）、最初の５回の細胞分裂の間にＩＬ−２受容体α鎖の発現を検出できなかったのは、急速なタンパク分解分割によるものではないことを示唆した。最初の５回の細胞分裂のＴ細胞がＩＬ−２受容体α鎖を発現し得るのかどうかを判定するために、ＩＬ−２受容体α鎖を発現しなかった第２細胞分裂にあるＴ細胞を選別し、インビトロにおいて３日間、固定化抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で刺激した。これらの選別されたＴ細胞はインビトロでの再刺激において分裂を続け、すべての分裂Ｔ細胞はＩＬ−２受容体α鎖を発現した。明らかに、インビボおよびインビトロにおけるＩＬ−２受容体α鎖の発現の調節は異なっている。
【０１１６】
ＩＬ−１５の受容体も重要なシグナル伝達成分として、最初の５回の細胞分裂の間に高レベルに発現するＩＬ−２受容体βおよびγ鎖を用いるので（タガヤら（Ｔａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４、３２９〜３３６ページ、１９９６年）、初期細胞分裂の間、ＩＬ−１５に対する応答性を付与するＩＬ−１５受容体α鎖を細胞が発現するかどうかを本出願人らは調べた。主要な染色試薬としてＩＬ−１５−ＦＬＡＧ融合タンパク質を適用することによって、（チェら（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、２８１３〜２８１９ページ、１９９６年）、細胞分裂数にかかわらず、分裂Ｔ細胞において、たとえ低レベルであってもＩＬ−１５受容体α鎖が明らかに検出可能であることが実証された（図４Ａ）。ＩＬ−２受容体のα鎖は、インビボにおいてすべての分裂Ｔ細胞で検出されなかった。したがって、最初の５回の細胞分裂の間、α鎖がＩＬ−１５受容体に対して選択的に発現するが、ＩＬ−２受容体に対して発現しないことは、共通β鎖およびγ鎖の発現と共に、インビボにおける初期細胞分裂がＩＬ−１５依存性であり、ＩＬ−２依存性ではないらしいことを示唆している。
【０１１７】
この仮説を試験するために、インビボの分裂Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生を評価した。細胞内ＩＬ−２染色は、ＩＬ−２が５回を超えて分裂した細胞によってのみ高レベルに発現されることを示した。飽和用量の細胞溶解性抗ＣＤ２５ｍＡｂによる宿主マウスの処理は、最初の５回の細胞分裂を阻害できず（コントロールＡｂ処理マウスと比較）、第１および第５分裂の分裂細胞は抗ＣＤ２５処理マウスとコントロール・マウスにおいて著しく類似していた。さらに、インビボの第２細胞分裂にあるＴ細胞を選別して、ＩＬ−２またはＩＬ−１５の存在下インビトロで培養し、細胞増殖を３Ｈ−ＴｄＲの取り込みによって分析した。培養中に５００μ／ｍｌという高用量で投与されたＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖を支持できなかった。対照的に、ＩＬ−１５は活発な細胞増殖を刺激した（図４Ｂ）。
【０１１８】
インビボでのＩＬ−２発現のパターンは、ＩＬ−２受容体αおよびβ鎖のアップレギュレーション、および際立って減少する共通γ鎖の発現と密接に関連している（図５Ａ）。これは、ＩＬ−２がインビボにおいてγ鎖の発現を調節することを示唆している。この可能性を試験するために、ＩＬ−２欠損マウスおよび野生型コントロール・マウス由来のＴ細胞において、γ鎖の発現を検査した。ＩＬ−２欠損マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型コントロールに比べて、細胞表面で非常に高いレベルでガンマ鎖を発現した（図５Ｂ）。抗ＣＤ２５による宿主マウスの処理は、インビボの分裂Ｔ細胞においてγ鎖のダウンレギュレーションを阻害したが、この処理はＩＬ−２受容体β鎖の発現に影響を及ぼさなかった（図５Ｃ）。
【０１１９】
γ鎖は、知られているすべてのＴ細胞増殖因子にとって決定的に重要なシグナル伝達要素であり、γ鎖シグナルは細胞生存に必須であって、細胞生存は少なくとも部分的にはＢｃｌ−２ファミリー抗アポトーシスタンパク質の持続発現によって達成される（ナカジマら（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５、１８９〜１９５ページ、１９９７年）。インビボでの５回の細胞分裂後のγ鎖発現の減少がクローン増殖を調節するのかどうか判定するために、宿主からの回収後、ＣＦＳＥ標識細胞をＰＲアネキシンＶで染色し、分裂Ｔ細胞のアポトーシス細胞死をインビボで分析した。４回の細胞分裂後に、急激な細胞死が生じた。非分裂細胞（０分裂）は、＜１０％のアネキシンＶ陽性細胞を有した。しかしながら、第６細胞分裂後は、〜４０％の細胞がアネキシンＶ陽性であった。Ｆａｓ変異ＭＲＬ−ｌｐｒマウスのＴ細胞もインビボにおいて類似のアポトーシス細胞死パターンを有するので、この種の細胞死はＦａｓ依存性ではない（リら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３、２５００〜２５０７ページ、１９９９年）。Ｂｃｌ−２発現の染色は、Ｂｃｌ−２染色の平均チャネル蛍光強度は、４回の細胞分裂後に著しく減少した（図５Ｅ）。したがって、γ鎖ダウンレギュレーションにおけるシグナル伝達事象は、持続的なＢｃｌ−２発現を支持できない可能性があり、細胞はアポトーシス細胞死を受けやすくなる（ナカジマら（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５、１８９〜１９５ページ、１９９７年）。
【０１２０】
これらの結果は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５シグナル伝達の遮断が、インビボにおいてＴ細胞発現に異なる影響を及ぼすであろうことを示唆している。この可能性をさらに調査するために、ＩＬ−２欠損マウス（Ｈ−２ｂ）由来のＣＦＳＥ標識リンパ球を、照射ＤＢＡ／２宿主（Ｈ−２ｄ）に注射し、３日後にインビボにおいて細胞分裂を分析して、野性株コントロール・マウスと比較した。ＩＬ−２欠損マウスのＴ細胞は、インビボで分裂および増殖を続けた。約３０％のＣＦＳＥ標識細胞が細胞周期にはいり、コントロールに比べて、細胞の大多数が５回を超えて分裂した。
【０１２１】
ＩＬ−１５受容体特異アンタゴニストとして作用する（キムら（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、５７４２〜５７４８ページ、１９９８年）ＩＬ−１５変異体／Ｆｃで処理した宿主マウスは、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖頻度が著しく減少し、ＣＦＳＥ標識細胞の圧倒的多数が処理マウスにおいて細胞周期にはいることができなかった。さらに、ＩＬ−２およびＩＬ−１５受容体の共有シグナル伝達成分、共通γ鎖に対する遮断ｍＡｂで処理した宿主マウスも、インビボにおけるＴ細胞分裂を著しく阻害した。したがって、ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、インビボにおいてＴ細胞発現の異なる側面を調節し、これらのインターロイキンのアンタゴニストの投与は上述のとおり免疫応答を抑制し得る。
【０１２２】
これらの結果はまた、γ鎖のダウンレギュレーションがＴ細胞活性化および細胞周期進行、ならびにＩＬ−２シグナル伝達を必要とすることを実証した。明らかに、インビボにおけるγ鎖のダウンレギュレーションは、ＩＬ−２産生、および高親和性ＩＬ−２受容体発現と密接に関連している。ＩＬ−２の不在下、γ鎖は極めて高レベルで発現し、ＩＬ−２受容体の遮断は、循環Ｔ細胞におけるインビボγ鎖ダウンレギュレーションを阻害する。このように、これらの研究は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５がインビボにおいて初期Ｔ細胞活性化の異なる側面を調節するということの新規な証拠を提供する。インビトロ研究に基づく従来の考えおよび結論に反して、ＩＬ−１５はインビボのＴ細胞分裂開始において重要な増殖因子であり、インビボでのＩＬ−２の特異な役割は、循環Ｔ細胞におけるγ鎖発現を調節することによってクローン性増殖の規模を制御することである。
【０１２３】
これらの結果は上述の臨床適用例を支持する。腫瘍免疫およびＡＩＤＳにおいて外因性ＩＬ−２とのＴ細胞応答を高めようとする試みは、早期Ｔ細胞死を促進する可能性があり、耐性誘導および自己免疫においてＩＬ−２を遮断する療法は、望ましくないＴ細胞増殖を誘発する可能性がある。さらに、ＩＬ−１５およびＩＬ−２の段階的かつ複合的標的化は、Ｔ細胞依存性細胞変性状態においてＴ細胞活性を遮断する重要な方法を示す。
【０１２４】
溶解性ＩＬ−２／ＦｃはＩＬ−２Ｒを有する細胞を溶解し、ＦｃＲＩに結合する
Ｔ細胞系の細胞（ＣＴＬＬ−２細胞、１０６）を１００ｍＣｉ５１Ｃｒで標識し、ＩＬ−２／Ｆｃの溶解性形態およびラット低毒性補体（Ｃ’）、ＩＬ−２／Ｆｃの非溶解性形態およびＣ’、マウス免疫グロブリンおよびＣ’（陰性コントロール）、またはＣ’単独（０．５μｇ／ｍｌ、陰性コントロール）と共にインキュベートした。同じ細胞の別のグループを、洗浄剤（１％ＮＰ４０）で処理した（陽性コントロール）。細胞溶解は、５１Ｃｒ放出によって測定した。洗浄剤存在下で認められた溶解の程度を１００％溶解と表す。上述した処理に続く特異的細胞溶解を、以下の式に従って算出した。特異的細胞溶解％＝［（実験から得たｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）／（全放出ｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）×１００％］。図６に示す結果は、細胞溶解性ＩＬ−２／ＦｃはＩＬ−２Ｒを有するＣＴＬＬ−２細胞を溶解するが、非溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは溶解しないという結論を支持している。
【０１２５】
溶解性および非溶解性ＩＬ−２／Ｆｃが、ＦｃＲＩトランスフェクトＣＨＯ細胞上でＦｃ受容体を結合する能力を評価するために（マウスＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、およびＩＬ−２Ｒ陰性）、ＦｃＲＩトランスフェクタントをＰＢＳ、ｍＩｇＧ２ａ、溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ、または非溶解性ＩＬ−２／Ｆｃであらかじめインキュベートした。洗浄後、蛍光ヤギ抗マウスＦｃ複合体を用いて、ＦＡＣＳ分析のために細胞を染色した。図７に示したとおり、細胞溶解性ＩＬ−２／ＦｃはＦｃＲＩを結合し得るが、溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは結合できない。
【０１２６】
溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは養子移植モデルにおいて糖尿病の予防に有効である
ＩＬ−２／Ｆｃの２種の異なる変異体を作製した。ＣＤＣおよびＣＤＣＣを媒介する第１の変異体はマウスＩｇＧ２ａ由来のＦｃ末端を含有し（ＩＬ−２／Ｆｃ）、ＣＤＣまたはＣＤＣＣを活性化しない第２の変異体はＦｃ部分による点変異であった（ＩＬ−２／Ｆｃ−／−）。ＩＬ−２／Ｆｃは、ＩＬ−２Ｒを有する細胞（マウスＣＴＬＬ−２Ｔ細胞系など）においてＣＤＣを媒介し、ＦｃＲＩに結合するが、ＩＬ−２／Ｆｃ−／−は媒介、結合しない（図６および７）。さらに、溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子は、ＮＯＤ養子移植モデルにおいて糖尿病の発症を予防するであろうが、その分子の非溶解性形態（ＩＬ−２／Ｆｃ−／−）は無効である（図１３）。この動物モデルにおいて、単分散脾細胞をＡＣＫ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（バイオウイタッカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、メリーランド州ウォーカーズビル）で処理することによって赤血球を枯渇させた。次いで、非糖尿病の８から１２週齢の照射（７００ｒａｄ）ＮＯＤ雄レシピエントに、急性糖尿病の雌ＮＯＤマウス（高血糖＜２週）由来の脾臓白血球２×１０７を注射した。血糖値（ＢＧＬ）を週ごとに試験し、ＢＧＬが任意の単回の測定で１６．５ｍｍｏｌ／ｌを超えたとき、または３日連続で１３．８ｍｍｏｌ／ｌを超えたとき、糖尿病と診断した。図１３に示したとおり、動物の大部分は、処理を中止した後も、糖尿病を発症しないままであった。
【０１２７】
上述のとおり、本明細書に示したアッセイおよび動物モデルは、治療有効性に関して本発明の薬剤の種々の組み合わせを試験するために用いることが可能である。
【０１２８】
ラパマイシンはインビボ対宿主性移植片モデルにおいてＴ細胞増殖を阻害するが、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを阻害しない
インビボ対宿主性移植片モデル（上述のとおり）において、ＩＬ−２／Ｆｃおよびラパマイシンの存在下、宿主反応性Ｔ細胞の運命を分析した。図８に示したとおり、ラパマイシンはＩＬ−２／Ｆｃの存在下であっても、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害するが、機能性ＩＬ−２Ｒの発現を許容する。アネキシンＶ染色によって明らかなように、抗原活性化宿主反応性Ｔ細胞は、ＩＬ−２／Ｆｃおよびラパマイシンの存在下アポトーシスを受ける（図１０）。
【０１２９】
本発明の組成物は膵島および皮膚同種異系移植片の長期生存を可能にする
急性糖尿病ＮＯＤレシピエントに移植された同種異系膵島の拒絶、またはＮＯＤマウスに移植された皮膚移植片の拒絶を防ぐために、Ｔ細胞死を促進し、Ｔ細胞増殖を阻害する薬剤の組み合わせを用いた。図１１および１２に示したとおり、溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ、ｍｕｔＩＬ−１５／Ｆｃ、およびラパマイシンの組み合わせは、移植片拒絶の予防に有効（かつ、試験を行った他の処理より有効である）であることが証明された。移植片の生存および移植片の機能は観察期間を通じて持続し、大部分の移植片は治療停止後も生存した。この劇的な効果は、用いた薬剤の組み合わせ（Ｔ細胞死を促進する薬剤、ならびにＴ細胞増殖を阻害する薬剤）によるものであると考えられる。
【０１３０】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
野生型ＩＬ−１５核酸配列（配列番号１）と、予想されるアミノ酸配列（配列番号２）とを表示する図である。
【図２】
変異ＩＬ−１５核酸配列（配列番号３）と、予想されるアミノ酸配列（配列番号４）とを表示する図である。１４９位でグルタミンをコードする野生型コドンＣＡＧ、および１５６位でグルタミンをコードする野生型コドンＣＡＡが、いずれもアスパラギン酸をコードするＧＡＣに変更されている（これらの位置（１４９および１５６）はそれぞれ、４８個のアミノ酸シグナル配列を欠損する成熟ＩＬ−１５ポリペプチドの１０１位および１０８位に相当する。
【図３Ａ】
ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）注射３日後、宿主脾臓での分裂Ｔ細胞によるＩＬ−２受容体α、β、およびγｃ鎖の発現を示す一連のプロットである。６回の実験の代表的なデータを示す。
【図３Ｂ】
インビトロでの分裂Ｔ細胞によるＩＬ−２受容体α、β、およびγ鎖の発現を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞リンパ球を、３日間インビトロで抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。細胞分裂およびＩＬ−２受容体サブユニットの発現を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析した。
【図３Ｃ】
インビボでの分裂Ｔ細胞によるＬ−セレクチンの発現を示すプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内注射３日後、宿主マウスのリンパ節から細胞を採取し、ＰＥ−抗ＣＤ６２ＬｍＡｂで染色した。アイソタイプ・コントロールｍＡｂで染色した細胞に基づいて、四分区間を設定した。
【図３Ｄ】
インビボでの分裂Ｔ細胞間におけるＩＬ−２受容体α鎖の発現の差異を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞を３日間インビボで刺激した後、第２細胞分裂にある細胞を選別した。選別した細胞を、３日間インビトロで抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて再刺激した。細胞分裂、およびＩＬ−２受容体α鎖の発現を、ＦＡＣＳによって分析した。
【図４Ａ】
ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内注射３日後、インビボでの分裂Ｔ細胞によるＩＬ−１５受容体α鎖の発現を示す一連のプロットである。細胞をＩＬ−１５−ＦＬＡＧ融合タンパク質で染色し、続いてビオチン化抗ＦＬＡＧｍＡｂおよびＰＥ−ストレプトアビジンで染色した。ＩＬ−１５−ＦＬＡＧ不在下で染色した細胞をコントロールとして含めた。
【図４Ｂ】
インビトロのＩＬ−２およびＩＬ−１５に対するインビボでの分裂Ｔ細胞の異なる応答を示す棒グラフである。ＣＦＳＥ標識リンパ球を３日間インビボで刺激し、ＣＦＳＥプロファイルを検査することによって細胞分裂を分析した。第２細胞分裂にあるＴ細胞を選別し、細胞（１×１０４）を、２日間ＩＬ−２またはＩＬ−１５を用いてインビトロで培養した。細胞増殖を、３Ｈ−ＴｄＲ取り込みによって求めた。結果は、３重検定の平均ＣＰＭ±ＳＤで表す。
【図４Ｃ】
インビボでのＴ細胞分裂に対する抗ＣＤ２５処理の効果を示す１対のグラフである。ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内注射の直前３日間、宿主マウスに１ｍｇ／日で腹腔内（ｉ．ｐ．）に抗ＣＤ２５ｍＡｂを与えた。アイソトープ・コントロールｍＡｂで処理したマウス（ｒａｔＩｇＧ１）をコントロールとして含めた。
【図５Ａ】
インビボでの分裂Ｔ細胞の細胞内ＩＬ−２染色を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞を、３日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）の存在下、インビトロで４時間ＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激した。次いで細胞を固定、浸透し、ＩＬ−２産生に関して染色した。アイソトープ・コントロールｍＡｂで染色した細胞をコントロールとして含めた。
【図５Ｂ】
ＩＬ−２欠損マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞によるγｃの発現を示す１対のグラフである。ＩＬ−２欠損マウス、および野生型コントロール・マウスの脾臓細胞を、ＰＥ−抗マウスＣＤ４ｍＡｂ、およびＦＩＴＣ−抗マウスＩＬ−２受容体γｃｍＡｂで染色した。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるγｃの発現をＦＡＣＳによって分析した。
【図５Ｃ】
インビボでの分裂Ｔ細胞によるγｃ発現に対する抗ＣＤ２５処理の効果を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞の静脈内注射の直前３日間、宿主マウスに１ｍｇ／日（ｉ．ｐ．）で抗ＣＤ２５ｍＡｂを与えた。インビボでの分裂Ｔ細胞におけるＩＬ−２受容体βおよびγ鎖の発現を、第３日（すなわちＣＦＳＥ標識細胞注射の３日後）に求めた。アイソトープ・コントロールｍＡｂで処理したマウス（ｒａｔＩｇＧ１）をコントロールとして含めた。
【図５Ｄ】
インビボでの分裂Ｔ細胞のアポトーシス細胞死を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞を、３日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、ＰＥ−アネキシンＶで染色した。細胞分裂およびアポトーシス細胞死をＦＡＣＳによって分析した。
【図５Ｅ】
インビボでの分裂Ｔ細胞による細胞内Ｂｃｌ−２発現を示す一連のプロットである。ＣＦＳＥ標識細胞を、３日間インビボで刺激した。宿主脾臓から細胞を採り、ＰＥ−抗マウスＢｅｌ−２ｍＡｂ、またはアイソトープ・コントロールｍＡｂで染色した。細胞分裂、およびＢｃｌ−２の発現をＦＡＣＳによって分析した。
【図６】
種々の薬剤による処理後に細胞死を評価した（ＣＴＬＬ−２細胞からのアイソトープ５１Ｃｒの放出によって評価、Ｘ軸参照）実験の結果を示す棒グラフである。ＮＰ４０は洗浄剤、ＩＬ−２／ＦｃはＩｇＧ分子（この分子は細胞溶解性である）のＦｃ領域とＩＬ−２を有する融合タンパク質、Ｃ’はラット補体、ＩＬ−２／ＦＣ−／−は、非細胞溶解性ＩＬ−２含有融合タンパク質であり、ｍＩｇはマウス免疫グロブリンである。細胞溶解性ＩＬ−２／ＦｃはＩＬ−２Ｒを有するＣＴＬＬ−２細胞を溶解し、非細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは溶解しないという結論をこの研究は支持している。
【図７】
一連のヒストグラフである。ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、左上）、マウス免疫グロブリン（ｍＩｇＧ２ａ、右上）、非細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子（ＩＬ−２／ＦＣ−／−、左下）、および細胞溶解性ＩＬ−２含有融合タンパク質（ＩＬ−２／Ｆｃ、右下）に曝露した後、その細胞におけるＦｃＲＩの蛍光強度を測定した。各ヒストグラフにおいて、ＦｃＲＩ／ＣＨＯの蛍光強度に対して細胞数をプロットする。細胞溶解性ＩＬ−２／ＦｃはＦｃＲＩに結合し、非細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは結合しないという結論をこの研究は支持している。
【図８】
インビボにおけるＣＤ４＋（左側）およびＣＤ８＋（右側）Ｔ細胞の増殖性反応を示す１連の８つのプロットである。細胞をＣＦＳＥで標識し、細胞溶解性分子（ＩＬ−２／Ｆｃ）、細胞増殖剤（ラパマイシン（Ｒａｐ））、または２種の薬剤の組み合わせを用いて、３日間インビボで刺激した。陰性コントロールとして、１群の動物は処理しなかった。ＩＬ−２／ＦＣを、ＣＦＳＥプロファイルによって分析した。ラパマイシンはＩＬ−２増殖シグナル伝達を阻害するという結論をこの研究は支持している。
【図９】
ＣＦＳＥ標識リンパ球を３日間インビボで刺激した実験から得られた一連の４つのプロットである。分裂Ｔ細胞でのＩＬ−２Ｒα鎖の発現を、非処理（左上）、ラパマイシン単独（Ｒａｐ、右上）、ＩＬ−２／Ｆｃ単独（左下）、またはラパマイシンとＩＬ−２／Ｆｃとの組み合わせ（Ｒａｐ＋ＩＬ−２／Ｆｃ、右下）を与えられた動物においてＦＡＣＳによって評価した。ラパマイシンおよびＩＬ−２／Ｆｃによる処理は、インビボにおいて、初期Ｔ細胞増殖中にＩＬ−２Ｒのαサブユニットの発現を促進するという結論をこの研究は支持している。
【図１０】
ＣＦＳＥ標識リンパ球を３日間インビボで刺激し、ＦＡＣＳによって分析したときに得られた１対のプロットである。分裂Ｔ細胞（ＣＤ４＋）でのアネキシンＶの発現を、非処理（左図）、ラパマイシンおよびＩＬ−２／Ｆｃ（Ｒａｐ＋ＩＬ−２／Ｆｃ、右図）を与えられた動物において評価した。ラパマイシンおよびＩＬ−２／Ｆｃによる処理は、インビボにおいて、初期Ｔ細胞増殖中にＣＤ４＋細胞のアポトーシスを促進するという結論をこの研究は支持している。
【図１１】
自己免疫非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスに生存する膵島同種異系移植片を試験した実験の結果を示す表である。移植片を、初期同種異系移植片機能（この列に示したパーセントは、同種異系移植片が機能したマウスのパーセントを表す（機能は血中ｇｌｕｏｃｏｓｅ濃度を監視することにより評価した））、および機能性移植片の平均生存時間（ＭＳＴ）に関して評価した。ｎ＝試験動物数である。処理は、「処理」という見出しの下に示す（さらに表に添付の凡例、および下の説明を参照のこと）。ここに示された結果は、ラパマイシン、ＩＬ−２／Ｆｃ、およびｍＩＬ−１５／Ｆｃの組み合わせによる処理が、膵島同種異系移植片の長期生存をもたらすという結論を支持している。
【図１２】
ＮＯＤマウスにおいて皮膚同種異系移植片の生存を試験した実験の結果を示す表である。移植片を、機能性移植片の平均生存時間（ＭＳＴ）に関して評価した。ｎ＝試験動物数である。処理は、「処理」という見出しの下に示す（さらに表に添付の凡例、および下の説明を参照のこと）。ここに示された結果は、ラパマイシン、ＩＬ−２／Ｆｃ、およびｍＩＬ−１５／Ｆｃの組み合わせによる処理が、皮膚同種異系移植片の長期生存をもたらすという結論を支持している。
【図１３】
細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子、マウス免疫グロブリン（ｍＩｇ）、および非細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃ分子による処理に続く期間にわたって、糖尿病が認められないままであった動物の％をプロットする線グラフである。細胞溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは自己免疫を遮断したが、溶解性ＩＬ−２／Ｆｃは遮断しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004525076.tif 000106
【国際調査報告】
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2004525076.tif 000108
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2004525076.tif 000111
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