(57)【要約】望ましい薬剤応答に関連することが独立に確認されている１以上の遺伝子を有することによって被験薬剤に応答する素因を示している所定の試験患者群に被験薬剤を投与するヒト臨床薬剤試験の設計方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって臨床薬剤試験を実施する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって臨床薬剤試験を実施する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階であって、前記表現型が、前記薬剤試験で調べている薬剤に対して認められる応答または該応答の欠如である段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階であって、前記表現型が、前記薬剤試験で調べている薬剤に対して認められる応答または該応答の欠如である段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項３】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって臨床薬剤試験を実施する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階であって、前記表現型が、前記薬剤試験で調べている薬剤に対して認められる応答または該応答の欠如である段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者に関して薬剤介入の標的を確認する段階；
（ｄ）候補薬剤が見い出されるまで、前記標的に対する候補薬剤化合物をスクリーニングする段階；
（ｅ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｆ）段階（ｅ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｇ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｆ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって臨床薬剤試験を実施する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって新規な薬物療法を設計する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって、臨床的に類似の疾患表現型を有するが別個の遺伝子型を有する異なる患者用に個別の薬剤を開発する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項７】
患者群の薬理遺伝学的階層化によって、類似の遺伝子型を有するが、異なった診断基準に分類される臨床症状を示す異なる患者用に薬剤を開発する方法において、
（ａ）患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階；
（ｂ）前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階；
（ｃ）非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階；
（ｄ）段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階；ならびに
（ｅ）所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
前記表現型がアルツハイマー病の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記表現型が過敏性腸症候群の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記表現型が片頭痛の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記表現型が乾癬の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記表現型が非インシュリン依存型糖尿病の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表現型が喘息の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記表現型が慢性閉塞性肺疾患の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記表現型が双極性障害の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記表現型が抑鬱の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記表現型が１以上の形態の癲癇の診断である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記の第１または次回臨床薬剤試験の群を応答者群、非応答者群および部分応答者群に分けることができる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヌクレオチド配列データ、アミノ酸配列データ、タンパク質−タンパク質相互作用データ、臨床診断データまたは上記手順で得られる統計データを、電子的に読取可能な媒体に保存し、少なくとも２つの電子計算機器間で通信手段を介して通信する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト臨床薬剤試験の設計および実施における方法に関する。特に本発明は、薬理遺伝学データを用いるそのような方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
現在、新規医薬品のマーケティングには、候補医薬品の効力および安全性を示すために実施される大規模な臨床試験が必要である。いずれの臨床試験においても、その試験に登録された患者には、望まれる通りに候補薬剤に応答する患者、あるいはそれより弱く応答する患者、あるいは全く応答しない患者があるパーセントで認められる。さらに、可能性として３種類の有害副作用の結果、すなわち有害副作用なし、ある程度許容できる程度の有害副作用、ならびに許容できない有害副作用がある。現在得られるデータは、一部の応答者群または非応答者群の主要な部分が、認識される表現型を生じる複数の病因によるものであることを示唆している。そのような臨床試験時における各種医薬応答関連群の一塩基多型（ＳＮＰ）プロファイル作成は、疾患の多様な形態に寄与する遺伝子の位置を同定して、別の感受性標的を発見可能であることを示唆する。
【０００３】
ある特定の医薬品に対して応答する患者群に関する系統的研究は、反対の群に関する研究、すなわち最初に試験を行った医薬品に対して効力および許容できる安全性の結果を伴って応答しなかった患者小群についての系統的研究によって補足される。そのような部分的応答者または非応答者は、医薬品が上市されてからその機能を発揮する現行の試行錯誤システムによるのではなく、リアルタイムで確認することができると考えられる。現時点において医薬は、恩恵を受けない多くの患者および有害反応を生じる可能性のある多くの患者に対して広く販売されている。現時点では、製品ラベル表示で使用される一般的な警告以外、これらの患者からは使用に関する情報はほとんど得られない。
【０００４】
そこで当業界では、１）有害事象の可能性を低減し、２）治療応答が得られる可能性を高め、３）応答患者であるか非応答患者であるかを問わず、全ての先行データを利用することができる後に行われる臨床試験を容易に示唆する蓄積データを提供することで、対象となる患者群に利益を与えるような形でヒト薬剤試験を計画する方法が必要とされている。
【０００５】
発明の概要
要約すると本発明は、患者群の薬理遺伝学的階層化によって臨床薬剤試験を実施する方法において、患者群に対する第１の臨床薬剤試験を、前記薬剤試験が表現型と遺伝子型の間の関連を確認するように実施する段階（ａ）；前記臨床薬剤試験における前記患者群を応答者および非応答者の小群に分ける段階（ｂ）；非応答者患者群についての次回臨床薬剤試験を、前記次回薬剤試験が表現型と遺伝子型との間の次回関連を確認するように実施する段階（ｃ）；段階（ｃ）の患者群を次回応答者および次回非応答者患者群に分ける段階（ｄ）；ならびに所望に応じて多数回反復として段階（ｃ）および（ｄ）を繰り返す段階を有することを特徴とする方法である。
【０００６】
本願で説明する種類の臨床試験は、磁気テープ、磁気ディスク、固体メモリーおよび記憶装置、光学式読取可能ディスクおよびそれらのいずれかの組み合わせなどの（これらに限定されるものではない）電子読取可能媒体に良好に保存される各種データを与えるものである。そのようなデータは、金属もしくは光ファイバー線などの通信手段を介して、あるいは無線電磁気周波数装置を介して良好に送信または通信される。さらにそのようなデータは、パーソナルコンピュータ、コンピュータワークステーション、コンピュータサーバー、メインフレームコンピュータ、スーパーコンピュータなどの少なくとも２つ以上の電子計算機器を介して良好に通信される。そのような通信は、そのような通信の送信者から指定の受信者にそのような通信を行う経路に関して電子的に指示を受けている複数のそのような機器を介して行うことができる。上記のようにして保存および通信可能なそのようなデータには、ヌクレオチド配列データ、アミノ酸配列データ、タンパク質−タンパク質相互作用データ、臨床診断データまたは上記の臨床試験で得られる統計データなどがあるが、これらに限定されるものではない。上記のそのような電子機器の使用は、特に商業的に使用される場合に、本願において特許請求する本願発明の別の実施形態である。
【０００７】
図面の簡単な説明
下記の図を用いて、本発明を説明する。
【０００８】
図１は、ＩＢＳ治療用のアロセトロン（ａｌｏｓｅｔｒｏｎ）の臨床試験に登録された女性患者から収集したデータに基づくグラフである。この試験群は、便秘のないＩＢＳ患者からなるものであった。被験者は、５ＨＴＴ遺伝子型に分けた。被験者２１９名中、７１名（３２．４％）が遺伝子型ｄｅｌ／ｄｅｌ（欠失／欠失、あるいは「１／１」とも称する）５ＨＴＴであり、７５名（３４．２％）が遺伝子型ｄｅｌ／ｉｎｓ（欠失／挿入、あるいは「１／２」とも称する）５ＨＴＴであり、７３名（３３．３％）が遺伝子型ｉｎｓ／ｉｎｓ（挿入／挿入、あるいは「２／２」とも称する）５ＨＴＴであった。図１には、５ＨＴＴ遺伝子型に分けた、アロセトロンまたはプラシーボのいずれかの投与に対して応答した被験者のパーセントを示してある。「応答」とは、１２週投与試験の６週の間でのＩＢＳ症状（腹痛および不快感）の緩和と定義した。被験者２１９名に、アロセトロン（被験者１０２名）または条件を一致させたプラシーボ（被験者１１７名）のいずれかを投与した。アロセトロン投与後に応答を示した患者の割合は、ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴで６８％（２１／３１）であり、ｄｅｌ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで６４％（２１／３３）であり、ｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで５８％（２２／３８）であった。プラシーボ投与後に応答を示した患者の割合は、ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴで５８％（２３／４０）であり、ｄｅｌ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで３８％（１６／４２）であり、ｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで３４％（１２／３５）であった。
【０００９】
図２は、５ＨＴＴ遺伝子型間で、便秘を報告したアロセトロン投与被験者のパーセントを比較するものである。アロセトロン投与被験者１０２名のうち、便秘を報告した被験者の割合は、ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴで１３％（４／３１）であり、ｄｅｌ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで３０％（１０／３３）であり、ｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴで２１％（８／３８）であった。
【００１０】
図３は、図１および２に示した情報を総合したものであり、アロセトロン投与被験者における便秘発生率およびＩＢＳ症状の緩和を経験した被験者のパーセントを５ＨＴＴ遺伝子型間で比較する図である。ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者では、ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者と比較した場合、好ましい治療応答の発生率が高く、ＩＢＳ症状緩和の発生率が高く、便秘発生率が低かった。
【００１１】
発明の説明
本発明の方法は、試験の各種相の実施方法および解釈方法ならびに試験実施の基礎となる技術についての説明を盛り込んだ、薬理遺伝学試験の実施に関する下記の説明によって最も良好に説明される。
【００１２】
５−ヒドロキシトリプタミン輸送体（５−ＨＴＴ）遺伝子における多型、ならびにそれに関連もしくは相関する表現型に関係する試験を行った。より詳細にはその試験は、消化管障害（例：過敏性腸症候群（ＩＢＳ））を有する被験者の医薬投与への応答に対するそのような多型の相関関係に関する。そのような試験はさらに、医薬活性に関する化合物のスクリーニング方法に関するものであった。これらの試験はさらに、やはり前記相関に基づいた、予測を目的とした被験者の遺伝子型決定方法に関するものである。
【００１３】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）のような病因未知の多くの消化管障害は、多因子障害であると考えられている。その障害の多くで、生化学的マーカーが認められておらず、診断は主として臨床症状の観察によって行われる。単一遺伝子メンデル性障害とは異なり、糖尿病、片頭痛および心血管疾患などの複雑な障害は多因子性である傾向があり、環境因子と１以上の感受性遺伝子との相互作用によって生じる。現在までのところ、連鎖試験および関連性試験のいずれによっても、ＩＢＳに対する個別の感受性遺伝子は同定されていない。
【００１４】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、腹痛および不快感ならびに排便習慣の変化を特徴とする一般的な消化管障害である。ＩＢＳは、便秘または下痢、あるいは便秘と下痢を交互に発生するという症状を特徴とし得るものである。現在、ＩＢＳに関する単一の病態生理学的マーカーまたは診断用マーカーはない。しかしながらＩＢＳについての各種診断基準はある（例：Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ． Ｉｎｔ． ２： ９２ （１９８９）； Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｊ． ２： ６５３ （１９７８）； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ ４５： １１４３ （１９９９））。
【００１５】
アロセトロン塩酸塩によるものなどの５−ヒドロキシトリプタミン受容体での拮抗作用が、下痢が主症状である過敏性腸症候群の治療において有用であることが明らかになっている。
【００１６】
アロセトロン塩酸塩（ＣＡＳ登録番号：ＣＡＳ−１２２８５２−６９−１；米国特許第５３６０８００号参照。その全開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる）は、５−ＨＴ３受容体アンタゴニストである。動物試験およびヒト試験の両方で、過敏性腸症候群の治療、特に下痢が主症状であるＩＢＳにおいて５−ＨＴ３受容体遮断が治療上有効であることが示されている（本明細書で引用の全ての米国特許の開示内容は、参照によってその全内容が本明細書に組み込まれる）。
【００１７】
二重盲検プラシーボ対照試験において、アロセトロン塩酸塩が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）患者において疼痛を軽減し、腸機能を改善することが示されている（Ｂａｒｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｊａｎ； １４ （１）： ２３−３４； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９９９ Ｎｏｖ； １３ （１１）： １１４９−２７； Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｉｌｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９９９ （Ｓｅｐｔ； １３ （９）： １１４９−５９， Ｍａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９９９ Ｍａｙ； １３ Ｓｕｐｐｌ ２： ７７−８２参照）。アロセトロンはさらに、カルチノイド性下痢の症状緩和のための治療薬として可能性を有することが示されている（Ｓａｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ １９９８ Ｍａｙ； ４２ （５）： ６２８−３４）。
【００１８】
５ＨＴ３、５ＨＴ４および５ＨＴ１ａ受容体などの５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）受容体が消化管で確認および特性決定されている。これらの受容体は、腸管運動性の調節だけでなく、内臓感覚経路にも関与している。各種５ＨＴ３アンタゴニスト（例：アロセトロン、グラニセトロン（ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）およびオンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ））が、ＩＢＳ治療向けに確認されている。この種の薬剤は、内臓の感受性を低下させ、遠位腸での運動活動性に対して阻害効果を有するように思われる。完全および部分的５ＨＴ４アゴニスト（例：ＨＴＦ９１９、テガセロド（ｔｅｇａｓｅｒｏｄ））は、便秘が主症状であるＩＢＳを改善するための治療薬となる可能性を有する（Ｆａｒｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １９９９ Ｏｃｔ； １３ （３）： ４６１−７１）。５ＨＴ４アンタゴニスト（ピボセロド（ｐｉｂｏｓｅｒｏｄ）、ＳＢ−２０７２６６Ａ）も、ＩＢＳ治療のために提案されている。
【００１９】
ヒト５ＨＴＴタンパク質は、染色体１７ｑ１２上に認められる単一の遺伝子（ＳＬＣ６Ａ４）によってコードされている（Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ２５４２ （１９９３）； Ｇｅｌｅｒｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ９５ ： ６７７ （１９９５）； Ｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ． ９１： ６７ （１９９３））。５ＨＴ輸送体はセロトニン作動性応答の強さおよび期間を調節する。５ＨＴＴコード配列に対して５′上流の転写制御領域における４４塩基対部分からなる挿入／欠失多型がすでに確認されている。この多型の欠失（または短い）対立遺伝子は、５ＨＴＴ遺伝子プロモーターの転写効率低下、遺伝子発現低下および５−ヒドロキシトリプタミン取り込み低下に関連している（Ｈｅｉｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ． １０２： ２４７ （１９９５）； Ｈｅｉｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ６６： ２６２１ （１９９６）； Ｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： １５２７ （１９９６））。さらに各種生化学的研究から、５ＨＴ取り込み機能が精神病において低下することが非常に多いことが示唆され、５ＨＴＴプロモーター多型による機能的５ＨＴＴ発現における変動が、感情障害における遺伝的感受性因子としての可能性があることが示唆されている（Ｃｏｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９６ Ｄｅｃ； １ （６）： ４５３−６０； Ｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６ Ｎｏｖ ２９； ２７４ （５２９２）： １５２７−３１； Ｆｕｒｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ １９９８ Ｆｅｂ ７； ８１ （１）： ５８−６３； Ｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｎｅｕｒｏｌ １９９９ Ｓｕｍｍｅｒ； １２ （２）： ４９−５２； Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９８ Ｍａｒ； ３ （２）： １７５−７）。
【００２０】
５−ヒドロキシトリプタミン輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子における多型が、医薬療法に対するＩＢＳ被験者の応答と相関を有することが確認されている（本願出願人らの同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４７５５；その全開示内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。より詳細には、５ＨＴＴ遺伝子の５′非コード領域における挿入／欠失多型が５ＨＴアンタゴニストによる治療に対するＩＢＳ患者の応答に関する予測因子であることが認められており、アロセトロンによる治療を行った場合に（５ＨＴＴ遺伝子の同一位置で別の多型を有する患者と比較して）、ＩＢＳ症状緩和の発生率が高く、副作用である便秘の発生率が低いＩＢＳ患者の遺伝的小集合が確認されている。
【００２１】
結果的にこれらの所見によって、消化管障害に対する５ＨＴアンタゴニスト治療に対して良好に応答する可能性が高い被験者を確認するための患者群スクリーニング方法が得られた。被験者については、ＩＢＳを有するものと事前に診断しておくことができるか、あるいはそのスクリーニングをＩＢＳ診断作業と併用することができる。
【００２２】
さらに別の態様は、５ＨＴリガンドによる治療に対する被験者の応答を予測する上での補助手段としての５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）リガンドで治療可能な消化管疾患を患う被験者のスクリーニング方法である。その方法は、被験者のＤＮＡサンプルを得る段階および５ヒドロキシトリプタミン輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子における多型対立遺伝子位置の遺伝子型を決定する段階を含んでなり、前記位置での異なる遺伝子型が、５ＨＴリガンド治療に対する表現型応答の異なる発生率に関連付けられている。サンプルで検出される遺伝子型は、被験者がその遺伝子型に関連する表現型応答を有する可能性が高いことを示す。
【００２３】
別の態様は、５ＨＴリガンド治療に対する被験者の応答を予測する上での補助手段として、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を有する被験者のスクリーニング方法である。この方法は、被験者のＤＮＡサンプルを得る段階および５ヒドロキシトリプタミン輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子における多型対立遺伝子位置の遺伝子型を決定する段階を含んでなり、前記位置での異なる遺伝子型が、５ＨＴリガンド治療に対する表現型応答の異なる発生率に関連付けられている。
【００２４】
さらに別の態様は、消化管障害を有する被験者の遺伝子小群間での測定可能な表現型効果における変動に関して５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）リガンドをスクリーニングする方法である。この方法は、消化管障害を患う被験者の群に５ＨＴリガンドを投与する段階、ならびにその各被験者からＤＮＡサンプルを得る段階を含んでなる。そのＤＮＡサンプルは、５ヒドロキシトリプタミン輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子の多型対立遺伝子に関する遺伝子型であり、前記多型対立遺伝子遺伝子型と被験者群における表現型応答の発生との間の相関を確認する。（別の遺伝子型を有する被験者での発生率と比較して）所望の治療応答または副作用発生率の上昇または低下と関連づけられる遺伝子型の検出は、その消化管障害治療におけるリガンドの有効性が遺伝子小群間で変動することを示すものである。
【００２５】
遺伝子サンプルは、ＩＢＳ治療に関するアロセトロンの臨床試験に登録された被験者から得た。その遺伝子サンプルについて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、５−ヒドロキシトリプタミン輸送体遺伝子（５ＨＴＴ遺伝子）の５′非コード領域における挿入／欠失多型についてスクリーニングを行った。対立遺伝子に「ｄｅｌ」（欠失）または「ｉｎｓ」（挿入）と標識して、３種類の可能な遺伝子型が得られた（ｄｅｌ／ｄｅｌ、ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ）。挿入多型（対立遺伝子「ｉｎｓ」）は以下の配列番号２を有していた。
【００２６】
【化１】
2004513609.tif 000002
説明：
ＰＣＲプライマー配列には下線を施してある。
非コード配列は、小文字で示してある。
多型塩基は太字で示してある。
塩基の番号割り付けは、示した配列に関するものである。
多型番号割り付けは、遺伝子ｃＤＮＡ配列に関するものである。
【００２７】
「ｄｅｌ」対立遺伝子は、５ＨＴＴ遺伝子の５′非翻訳領域における約４４塩基対の欠失を表す。転写調節領域におけるこの欠失は、５ＨＴ再取り込みの低下に関連し、従って５ＨＴ基底レベル上昇に関連するものであった。従って、ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型により、転写効率の低下、５ＨＴＴ産生低下および基礎５ＨＴ再取り込み低減（ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ遺伝子型との比較）を生じるものと仮定される。ｄｅｌ／ｄｅｌ、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ遺伝子型は、被験者においてほぼ均等に分布していた。被験者２１９名中、７１名がｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴであり、７５名がｄｅｌ／ｉｎｓ ５ＨＴＴであり、７３名がｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴであった。
【００２８】
ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型は、５ＨＴ３アンタゴニスト治療の効果としてのＩＢＳ症状緩和発生率の上昇および便秘頻度の低下に関連していることから、５ＨＴ３アンタゴニスト治療に対する好ましい治療応答発生率の上昇（同じ５ＨＴ３アンタゴニスト治療を受けたｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ遺伝子型を有する被験者と比較）に関連していることがさらに確認された。
【００２９】
これら３種類の５ＨＴＴ遺伝子型のそれぞれで、ＩＢＳ症状の緩和において、アロセトロンの方がプラシーボより有効であった（図１）。しかしながら、ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型群（欠失多型に関して同型接合）では、アロセトロンおよびプラシーボの両方についてのＩＢＳ症状緩和発生率が、他の５ＨＴＴ遺伝子型と比較して高くなった（図１）。ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型を有する被験者も、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴ遺伝子型群と比較して、便秘発生率の低下を示した（図２）。図３には、ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者が、ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者と比較した場合に、ＩＢＳ症状緩和発生率が高く、アロセトロン誘発副作用である便秘発生率が低く、好ましい治療応答発生率上昇を示したことが示されている。
【００３０】
従って、５ＨＴリガンドで治療可能な消化管障害を患う被験者を遺伝子的にスクリーニングして、そのような治療に対する被験者の応答を予測する上で役立てることができる。スクリーニングには、被験者からＤＮＡのサンプルを得る段階、ならびに５ヒドロキシトリプタミン輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子における所定の多型位置での遺伝子型（多型対立遺伝子の有無）を確認する段階があり、その位置での異なる遺伝子型は、５ＨＴリガンド治療に対する表現型応答の異なる発生率と事前に関連付けられている。従って特定の遺伝子型の存在は、その個別の被験者が関連する表現型を示す可能性が高いことを示すものである。遺伝子型によって絶対的な予測ができることは希である。すなわち、ある特定の遺伝子型を有する群が特定の表現型について高い発生率を示す場合、その遺伝子型を有する全ての個体がその表現型を示すとは限らない。しかしながら当業者には、本明細書に記載の方法による被験者の遺伝型決定が、被験者が５ＨＴリガンド治療に対して有する応答を予測する上で役立ち、従って治療決定において役立つことは明らかであろう。
【００３１】
本明細書で使用する場合に「所定のゲノム座での多型対立遺伝子に関する被験者（またはＤＮＡサンプル）の遺伝子型決定」または「多型対立遺伝子位置での遺伝子型決定」とは、どの形の対立遺伝子が被験者（またはサンプル）に存在するかを検出することを意味する。当業界で公知であるように、ある個体は特定の対立遺伝子に関して異型接合または同型接合であることができる。マイクロサテライトマーカーの場合のように、２種類より多い対立遺伝子型が存在することができる。従って、３種類より多い遺伝子型が存在する可能性がある。
【００３２】
本明細書で使用する場合、多型対立遺伝子の遺伝子型決定に基づいた特定の表現型応答「に対する素因を有する」被験者は、その多型対立遺伝子で異なる遺伝子型を有する個体より、その表現型を示す可能性が高い。表現型応答が２対立遺伝子多型に基づいたものである場合、その応答は３種類の可能な遺伝子型間で異なる場合がある（例えば５ＨＴＴの場合、ｄｅｌ／ｄｅｌ、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ）。
【００３３】
本明細書で使用する場合、ある群の「遺伝的小集合」は、特定の遺伝子型を有するその群の構成員からなる。２対立遺伝子多型の場合、群は３つの小集合、すなわち対立遺伝子１に関して同型接合、異型接合および対立遺伝子２に関して同型接合に分けることが可能である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「５ＨＴリガンドで治療可能な」消化管障害とは、５ＨＴリガンドの投与（適切な医薬製剤で、しかも治療上有効な量で）が、許容されない副作用を起こすことなく、症状を軽減または緩和することが示されているものである。そのような治療有効性は、典型的には、医薬製剤に関する規制当局（例：ＦＤＡ、ＥＭＥＡ）の承認または論文審査を受けた医学雑誌での臨床試験結果の発表によってわかる。そのような化合物の治療上有効量は、例えば用量−応答試験を用いて、当業者が容易に決定することができる。本明細書で使用する場合、「５ＨＴリガンド」は５ＨＴ受容体のアンタゴニストおよびアゴニストを含むものであり、それには部分的アゴニストおよび５ＨＴＴと相互作用する薬剤（例：選択的セロトニン再取り込み阻害薬、ＳＳＲＩ類）などがある。５ＨＴリガンドは、５ＨＴ３および５ＨＴ４受容体などの５ＨＴ受容体のあらゆるサブタイプに結合することができる。そのリガンドは、特定の受容体サブタイプに対して特異的であることができる。
【００３５】
公知の５ＨＴ関連化合物には、５ＨＴ３アンタゴニスト類（例：オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン（ｔｒｏｐｉｓｅｔｒｏｎ）、ドラセトロン（ｄｏｌａｓｅｔｒｏｎ）、ミルタザピン（ｍｉｒｔａｚａｐｉｎｅ）、イタセトロン（ｉｔａｓｅｔｒｏｎ）、パンコプリド（ｐａｎｃｏｐｒｉｄｅ）、ザトセトロン（ｚａｔｏｓｅｔｒｏｎ）、アザセトロン（ａｚａｓｅｔｒｏｎ）、クリアンセトロン（ｃｌｉａｎｓｅｔｒｏｎ）、ＹＭ−１４４（山之内）およびＲＳ１７０１７（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））などがある。
【００３６】
５ＨＴ４アゴニストも公知であり、テガセロド、プルカロプリド（ｐｒｕｃａｌｏｐｒｉｄｅ）、ノルシサプリド（ｎｏｒｃｉｓａｐｒｉｄｅ）およびＹ−３４９５９として知られる４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ−Ｎ−（１−置換ピペリジン−４−イル）ベンズアミド（吉富製薬）ならびにブスピロンなどがある。便秘を主症状とするＩＢＳの治療への５ＨＴ４アゴニストの使用が提案されている。５ＨＴ４アンタゴニストには、ピボセロド（ｐｉｂｏｓｅｒｏｄ：スミスクライン・ビーチャム（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ））などがある。
【００３７】
二重５ＨＴ３および５ＨＴ４アゴニストには、レンザプリド（ｒｅｎｚａｐｒｉｄｅ；スミスクライン・ビーチャム）およびＥ３６２０（エーザイ）などがある。５ＨＴ１ａアゴニストも知られており、ＬＹ３１５５３５（イーライ・リリー（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ））がある。
【００３８】
選択的セロトニン再取り込み阻害薬には、フルオキセチンなどがある。
【００３９】
本明細書で使用する場合に「副作用」とは、治療用化合物投与に対する望ましくない応答、すなわち治療対象の疾患の症状または原因を改善する方向ではない効果である。副作用は、軽微な不都合からより重大な事象まで幅広い。
【００４０】
本発明の方法によれば、５ＨＴリガンド活性を有する化合物について、消化管障害のある被験者の遺伝子小群間でのその効果の変動をスクリーニングすることができる。そのような方法では、５ＨＴ介在消化管障害を患う被験者群へのその化合物の投与、その被験者からのＤＮＡサンプルの取得（化合物投与の前または後のいずれかで行うことができる）、５ＨＴＴ遺伝子における多型対立遺伝子位置の遺伝子型決定、ならびに被験者の遺伝子型と治療に対する表現型応答（好ましい応答および好ましくない応答の両方）との関連づけを行う。その多型対立遺伝子位置で別の遺伝子型を有する被験者における発生率と比較して、望ましい治療応答の発生率上昇（または望ましくない副作用の発生率低下）と相関を有する遺伝子型は、そのような消化管障害治療における化合物の有効性が遺伝子小群間で変動することを示す。
【００４１】
言い換えれば、その方法を用いて、公知の５ＨＴＴ多型対立遺伝子と５ＨＴリガンド治療に対する消化管障害を有する（ＩＢＳなど）被験者の応答との相関を確認することができる。対象となる疾患を有する被験者の群を、特定の多型対立遺伝子についての遺伝子型に従って階層化し、治療薬に対する被験者の応答を評価し（予報的または後見的に）、遺伝子型間で比較する。治療薬に対する応答には、望ましい治療応答（例：徴候または症状の緩和）および望ましくない副作用の一方または両方があり得る。このようにして、治療効力発生率上昇（または低下）または特定の副作用の発生率上昇（または低下）に関連する遺伝子型を確認することができる。応答の上昇または低下は、他の遺伝子型または群全体と比較したものである。その相対的上昇または低下が認められたら、応答者および非応答者を確認し、別個の小群に割り当てることができる。非応答者は、治療効力発生率に関して所定の程度の低下を示す被験者、恐らくは治療効力を全く示さない被験者となる。あるいは、非応答者を、比較的良性の副作用から生命を脅かす可能性のある副作用にわたる対象の副作用について所定の程度の発生率上昇を示す被験者として分類することができる。
【００４２】
多型は、機能的影響を有する場合と有しない場合とがある、ヒトゲノム内での変異配列である。それらの変異型は、遺伝病の分析および診断、法医学研究、進化研究および個体群研究などの遺伝子研究のあらゆる面で用いることができる。典型的には、連鎖試験および関連性試験という２種類の遺伝解析が行われる。
【００４３】
連鎖試験は、遺伝子の機能に関して事前の知見や仮定がない場合に遺伝子マップ情報を提供するものである。連鎖試験では、ＤＮＡ多型を用いて、対立遺伝子共有頻度が、染色体位置が疾患対立遺伝子の位置に近いマーカー（多型）では相対的に高いと予想して、疾患に冒された血族間で同一の染色体領域を確認する。連鎖領域の物理的クローニングにより、候補疾患遺伝子を含むと考えられるＤＮＡ配列が絞り込まれる。連鎖解析は疾患遺伝子座を特定の染色体または染色体領域に位置決定するものであるが、遺伝子を調べるＤＮＡ領域は広いのが普通であり、数百万塩基対程度のものである。
【００４４】
連鎖とは対照的に、関連性は、ある群における多型および疾患表現型の共存を示すものである。関連性試験は、多型マーカーが機能（疾患）を起こす変異型に非常に近い位置にある場合に、マーカーと疾患表現型との間で起こる現象である連鎖不均衡に基づくものである。そのマーカーと病原性変異型が非常に近位にあることから、ある群においてそれを分けるには、多くの世代の組換えが必要である。従ってそれらは、予想頻度より高い頻度で同じ染色体に共存する傾向がある。マーカー（多型）は、その頻度がある表現型群において別の表現型群での頻度と比較してかなり高い場合、特定の表現型に関連していると言われる。概して、マーカーが機能的に多型の位置に近いほど、その関連性が強い。
【００４５】
関連性試験は、連鎖領域を詳細にマッピングし、連鎖解析が困難な遺伝子座をマッピングし、未知の素因遺伝子座をマッピングする機会を提供する。互いに連鎖不均衡である多型は、広い領域にわたって離れている場合がある。連鎖不均衡が、１ ｋｂという小さい領域や５００ ｋｂという大きい領域で報告されている。遺伝子全体での多型が互いに連鎖不均衡であって、ゲノム構造全体−イントロン、エキソン、プロモーターおよび転写調節領域、ならびに３′および５′非翻訳領域を調べることが有用となる場合がある。機能性多型と連鎖不均衡であるマーカーは、その多型を対象の表現型と関連づける試験の基礎として用いることができる。
【００４６】
５ＨＴＴ遺伝子における多型は、ＩＢＳの薬物治療に対する被験者の応答において何らかの役割を果たすことから、５ＨＴ輸送体（５ＨＴＴ）遺伝子の遺伝子型決定（直接またはその発現産物を介して）が、５ＨＴＴ遺伝子型間で変動する測定可能な効果を有する治療用化合物を同定する上で有用である。測定すべき効果は、当業者には明らかなように、特定の消化管状態、治療用化合物および患者群によって決まる。測定可能な効果には、病気の徴候もしくは症状の緩和または変化、あるいは化合物投与に関係する副作用の発生があり得る。測定は、客観的または主観的（例えば、患者自身の報告によるもの）であることができる。５ＨＴＴ遺伝子型と治療応答との関連は、個々の被験者が５ＨＴリガンド治療に対して特定の様式で応答する確率を決定する方法を提供する。遺伝子型決定においては、通常測定される特性は、遺伝子における多型またはその発現産物によって影響され得るものである。本明細書で使用する場合、多型という用語には、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入／欠失多型、マイクロサテライト多型ならびにミニサテライト（ＶＮＴＲ）多型などがある。
【００４７】
多型の検出方法
多型対立遺伝子は、典型的には、当業者には公知のいずれか好適な技術を用いて、被験者からのポリヌクレオチドまたはタンパク質における多型配列の存在を直接確認することで検出される。そのようなポリヌクレオチドは典型的には、ゲノムＤＮＡ、あるいは個体からのゲノム材料を用いて得られたライブラリー（例：ｃＤＮＡライブラリー）におけるものなどの前記ポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドである。本発明の方法の実施に先だって行うポリヌクレオチドまたはタンパク質の処理について、以下でさらに説明する。典型的には多型の存在は、個体のポリヌクレオチドもしくはタンパク質を多型についての特異的結合剤と接触させる段階および前記結合剤が前記ポリヌクレオチドもしくはタンパク質と結合するか否かを決定する段階を有し、前記結合が多型が存在することを示すものである方法で決定される。前記結合剤は、前記多型の片側または両側の隣接ヌクレオチドおよびアミノ酸、例えば全部でまたは片側での少なくとも２個、５個、１０個、１５個またはそれ以上の隣接ヌクレオチドまたはアミノ酸にも結合することができる。１実施形態においてその結合剤は、多型位置に隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸に結合することで、相当する野生型配列に結合することができる。ただし結合形態は、多型ポリヌクレオチドもしくはタンパク質の結合とは異なっており、その相違は検出可能である（例えば、それは下記で説明する配列特異的ＰＣＲで起こり得る）。
【００４８】
ポリヌクレオチドにおいて多型の存在が確認される場合、それは２本鎖の形で検出される場合もあるが、典型的には１本鎖の形で検出される。
【００４９】
結合剤は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１５、２０、３０またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド（１本鎖または２本鎖）であることができる。結合剤は、ワトソンクリック塩基対合に関与することができる単位（プリン類またはピリミジン類など）を含む構造的に類似するポリヌクレオチド分子であることができる。結合剤は、典型的には少なくとも１０アミノ酸、例えば少なくとも２０、３０、５０、１００アミノ酸の長さを有するタンパク質であることができる。結合剤は抗体であることができる（多型と結合することができる抗体などの断片を含む）。
【００５０】
この方法で使用されるポリヌクレオチド剤は、配列特異的な様式で（例えば、ワトソンクリック塩基対合に従ったハイブリダイゼーション）、対象となる多型および隣接配列に結合することから、多型および隣接領域の配列に対して完全または部分的に相補的である配列を有するのが普通である。
【００５１】
従って、ある検出方法では、結合剤をプローブとして用いる。プローブは標識することができるか、あるいは間接的に標識可能なものとすることができる。標識の検出を用いて、個体のポリヌクレオチドまたはタンパク質における（従って、それに結合した）プローブの存在を検出することができる。ポリヌクレオチドもしくはタンパク質へのプローブの結合を用いて、プローブまたはポリヌクレオチドもしくはタンパク質を固定化することができる（従って、それをある組成物または溶液から分離することができる）。
【００５２】
別の検出方法では、個体のポリヌクレオチドもしくはタンパク質を固体支持体上に固定化し、プローブと接触させる。次に、固体支持体に固定化された（多型への結合を介した）プローブの存在を、プローブ上の標識を検出することで直接、あるいはプローブに結合する部分とプローブとを接触させることで間接的に検出する。ポリヌクレオチド多型の検出の場合、固体支持体は通常、ニトロセルロースまたはナイロン製である。タンパク質多型の場合にその方法は、当業者には公知の技術であるＥＬＩＳＡ系に基づいたものとすることができる。
【００５３】
検出方法は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いるオリゴヌクレオチド連結アッセイに基づいたものとすることができる。それらのプローブは、多型を含むポリヌクレオチド上の隣接領域に結合することで、（結合後に）適切なリガーゼ酵素によって、その２つのプローブを連結することができる。しかしながら、この２つのプローブは、多型を含むポリヌクレオチドのみに結合することから（連結が可能なように）、連結生成物の検出を用いて、多型の存在を確認することができる。
【００５４】
別の検出方法では、プローブをヘテロ２本鎖分析に基づく系を用いて多型を検出する。そのような系では、プローブが多型を含むポリヌクレオチド配列に結合すると、それは多型が起こる位置でヘテロ２本鎖を形成する（すなわち、それは２本鎖構造を形成しない）。そのようなヘテロ２本鎖構造は、１本鎖もしくは２本鎖特異的な酵素を用いることで検出することができる。典型的には、前記プローブはＲＮＡプローブであり、使用する酵素はヘテロ２本鎖領域を開裂させるＲＮＡｓｅ Ｈである。これにより、開裂産物の検出によって多型を検出できるようになる。
【００５５】
ある検出方法は、文献記載の（例えば、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３： ２６８−７１ （１９９４）およびＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ４３９７−４４０１ （１９９８））蛍光化学開裂不一致分析に基づいたものとすることができる。
【００５６】
１実施形態において前記ポリヌクレオチド剤は、それが多型を含むポリヌクレオチドと結合する場合にのみＰＣＲ反応におけるプライマーとして作用することができる（すなわち、配列または対立遺伝子特異的ＰＣＲ系）。従ってＰＣＲ産物は、個体のポリヌクレオチドに多型が存在する場合にのみ産生される。従って、ＰＣＲ産物の検出によって、多型の存在を確認することができる。好ましくは、多型に対して相補的であるプライマーの領域は、そのプライマーの３′末端またはその末端付近にある。この系の１実施形態において、ポリヌクレオチド剤は野生型配列に結合するが、ＰＣＲ反応におけるプライマーとしては作用しない。
【００５７】
検出は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）に基づく系を用いて行うことができる。それは、ポリヌクレオチドにおける多型の存在が、制限酵素によって認識される制限部位を形成または破壊する場合に用いることができる。従って、そのような多型でポリヌクレオチドを処理すると、相当する野生型配列と比較して、異なる産物が産生される。そこで、特定の制限消化産物の存在を検出することにより、多型の存在を確認することができる。
【００５８】
あるいは、多型の存在を、多型の存在がゲル電気泳動時のポリヌクレオチドもしくはタンパク質の移動度に対して生じる変化に基づいて決定することができる。ポリヌクレオチドの場合、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）分析を用いることができる。それは相当する野生型ポリヌクレオチドと比較して、変性ゲルでの１本鎖ポリヌクレオチドの移動度を測定するものであり、移動度における差の検出が多型の存在を示す。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は同様の系であり、変性勾配を有するゲルを用いてポリヌクレオチドについて電気泳動を行い、相当する野生型ポリヌクレオチドと比較した移動度における差が多型の存在を示すものである。
【００５９】
多型の存在は、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ検出系などの蛍光色素と消光剤に基づくＰＣＲアッセイを用いて確認することができる。すなわちこのアッセイは、多型周辺および多型を含む配列を有する対立遺伝子特異的プライマーを用いるものである。その特異的プライマーは、５′末端で蛍光色素により、３′末端で消光剤により、そして、プライマーに対するヌクレオチドの付加を防止する３′リン酸基により標識する。通常、色素の蛍光は、同じプライマーに存在する消光剤によって消光される。対立遺伝子特異的プライマーは、多型のいずれかの対立遺伝子５′にハイブリダイズすることができる第２のプライマーと併用する。
【００６０】
上記のアッセイでは、多型を含む対立遺伝子が存在する場合、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、特異的プライマーに到達するまで、非特異的プライマーにヌクレオチドを付加する。次にそれは、エンドヌクレアーゼ活性によって、特異的プライマーからポリヌクレオチド、蛍光色素および消光剤を放出する。従って蛍光色素はもはや消光剤の近位にはなく、蛍光を発する。多型を含まない対立遺伝子存在下では、特異的プライマーとテンプレートとの間の不対合がＴａｑのエンドヌクレアーゼ活性を阻害し、消光剤から蛍光色素は放出されない。従って、放出される蛍光を測定することで、多型の有無を確認することができる。
【００６１】
別の多型検出方法では、多型領域を含むポリヌクレオチドを、その多型を含む領域について配列決定して、多型の存在を確認する。
【００６２】
従って、当業界で公知であるように、本発明の方法においては、下記のいずれかの技術を用いることができる。
【００６３】
＊一般：ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定。
【００６４】
＊走査：ＰＴＴ（蛋白切断法）、ＳＳＣＰ（１本鎖配座分析）、ＤＧＧＥ（変性勾配ゲル電気泳動）、ＴＧＧＥ（温度勾配ゲル電気泳動）、クリーバーゼ（Ｃｌｅａｖａｓｅ）、ヘテロ２本鎖分析、ＣＭＣ（化学的不一致開裂）、酵素不一致開裂。
【００６５】
＊ハイブリダイゼーションに基づくもの：固相ハイブリダイゼーション（ドットブロット、ＭＡＳＤＡ、逆ドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ（チップ））；液相ハイブリダイゼーション（Ｔａｑｍａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）。
【００６６】
＊延長に基づくもの：ＡＲＭＳ（増幅不応性突然変異系）、ＡＬＥＸ（増幅不応性突然変異系直線延長）ＳＢＣＥ（単一塩基鎖延長）。
【００６７】
＊組み込みに基づくもの：ミニ配列決定、ＡＰＥＸ（アレイプライマー延長）。
【００６８】
＊制限酵素に基づくもの：ＲＦＬＰ（制限断片長多型）。
【００６９】
＊連結に基づくもの：ＯＬＡ（オリゴヌクレオチド延長アッセイ）。
【００７０】
＊その他：インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００７１】
試験キット
本願において特許請求の範囲に係る発明の別の実施形態は、予測（患者ケア）試験または試験キットに基づいたものである。この予測試験は、消化管疾患治療における遺伝子型と５ＨＴリガンドに対する表現型応答との間の所定の関連性に基づいたＩＢＳの疾患管理において役立つ製品および／またはサービスであることができると考えられる。そのような試験は、下記の２種類の異なる形式を取ることができると考えられる。
【００７２】
所定の多型の存在についてＤＮＡまたはＲＮＡを分析する分子試験。適切な試験キットは、１以上の下記の試薬または装置を有することができる。すなわち、薬剤の多型への結合を検出する手段、ポリヌクレオチドで作用することができる酵素（典型的にはポリメラーゼまたは制限酵素）、酵素試薬に好適なバッファー、多型に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマー、陽性もしくは陰性対照（または両方）、ゲル電気泳動装置およびサンプルからＤＮＡを単離する手段である。その製造物は、現在の最新技術によって報告されているチップ技術の一つを利用することができる。試験キットには、特定の多型もしくは遺伝子型とＩＢＳを有する被験者が５ＨＴリガンドによる療法に対して好ましく応答する可能性との間の相関について記載した印刷された説明書または機械で読取可能な説明書が含まれるものと考えられる。
【００７３】
所定の多型の存在を示唆するタンパク質または代謝物などの被験者身体由来の材料を分析する生化学試験。適切な試験キットは、所定の多型領域（または多型に隣接する特定領域）に特異的に結合する分子、アプタマー、ペプチドもしくは抗体（抗体断片を含む）、あるいは本明細書で定義の結合剤を有するものと考えられる。前記製造物はさらに、１以上の別の試薬または装置（当業界で公知のもの）を含むことができる。試験キットにはさらに、特定の多型もしくは遺伝子型と、ＩＢＳを有する被験者が５ＨＴリガンドによる療法に対して好ましく応答する可能性との間の相関について記載した、印刷された説明書または機械で読取可能な説明書が含まれるものと考えられる。
【００７４】
どのような形態であれ、そのような試験キットを有することで、非常に多様な患者の所在からの表現型データの収集が促進される。応答者群および非応答者群の同定を容易にするために、試験キット結果を遺伝子型分析のための集中記憶装置に送ることができる。
【００７５】
本実施例では、ＩＢＳと診断された被験者または５ＨＴリガンドによって治療可能な別の消化管障害と診断された被験者をスクリーニングして、その被験者が５ＨＴリガンド、詳細には５ＨＴ３アンタゴニスト、より詳細にはアロセトロンによる治療に対して特定の形で応答する確率を求める方法について説明する。被験者は哺乳動物、好ましくはヒトである。その方法は、予め、特定の所望の治療結果の低いまたは高い発生率（他の遺伝子型を有する被験者での発生率と比較して）と関連付けられた、あるいは望ましくない副作用の高いまたは低い発生率（他の遺伝子型を有する被験者での発生率と比較して）と関連付けられた５ＨＴＴ遺伝子における多型について被験者をスクリーニングする段階、次に前記被験者を応答者、部分応答者または非応答者に分類する段階を有する。
【００７６】
５ＨＴリガンドを有する被験者の治療は、治療を必要とする被験者に対して有効量の前記医薬を投与する段階を有する。薬剤の用量は、製薬業界で公知かつ許容される方法に従って決定され、当業者が決定することができる。アロセトロンについての好適な用量範囲および血漿中濃度は、米国特許第５３６０８００号（その全開示内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）の開示にある。
【００７７】
実施例２：５ＨＴＴ遺伝子における挿入／欠失多型のアッセイ
ＩＢＳ治療に関するアロセトロンの臨床試験に登録したヒト女性被験者２１９名から遺伝子サンプルを得た。当業界で公知のＰＣＲ技術を用いて、５−ヒドロキシトリプタミン輸送体遺伝子（５ＨＴＴ遺伝子）で、挿入／欠失遺伝子マーカーのアッセイを行った。対立遺伝子に「ｄｅｌ」（欠失）または「ｉｎｓ」（挿入）と標識して、３種類の可能な遺伝子型が得られた（ｄｅｌ／ｄｅｌ、ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ）。
【００７８】
挿入／欠失マーカーは、５ＨＴＴ遺伝子の５′非翻訳領域にあった。欠失多型（対立遺伝子「ｄｅｌ」）は配列番号１を有しており、挿入多型（対立遺伝子「ｉｎｓ」）は配列番号２を有していた（挿入は太字で示した）。
【００７９】
【化２】
2004513609.tif 000003
【００８０】
【化３】
2004513609.tif 000004
【００８１】
欠失部分は、配列番号２のヌクレオチド１６１〜２０４を有していた。ＰＣＲプライマー配列には下線を施してある。
【００８２】
この５ＨＴＴ遺伝子型は均等に分布していた。５ＨＴＴマーカーについて遺伝子型決定した被験者２１９名中、７１名（３２．４％）がｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴであり、７５名（３４．２％）がｄｅｌ／ｉｎｓ ５ＨＴＴであり、７３名（３３．３％）がｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴであった。
【００８３】
「ｄｅｌ」対立遺伝子は、５ＨＴＴ遺伝子における５′非翻訳領域での約４４塩基対の欠失を表す。ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型により、転写効率が低下し、５ＨＴＴ産生が低下し、基礎５ＨＴ再取り込みが低下する（ｄｅｌ／ｉｎｓまたはｉｎｓ／ｉｎｓ遺伝子型と比較して）。
【００８４】
実施例３：遺伝子型と表現型の相関
臨床試験設定でのアロセトロンに対する被験者の応答を検討し、遺伝子型との相関を調べた。二重盲検プラシーボ対照臨床試験で、被験者に１２週にわたって、アロセトロンまたはプラシーボのいずれかを投与した。アロセトロンに対する好ましい応答は、被験者が１２週試験の６週の間に、ＩＢＳ症状の緩和を報告した場合とした。便秘を含む他の各種効果の発生率も記録した。
【００８５】
臨床試験におけるアロセトロン投与に対する被験者の応答は、遺伝子型に従って階層化した。
【００８６】
３種類の５ＨＴＴ遺伝子型のそれぞれで、緩和発生において、アロセトロンはプラシーボより有効であった（図１）。しかしながら、ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型群（欠失多型に関して同型接合）では、ＩＢＳ症状緩和発生率の上昇が認められた（他の５ＨＴＴ遺伝子型と比較して上昇）（図１）。アロセトロンによるＩＢＳ症状の緩和は、ｄｅｌ／ｄｅｌ被験者の６８％（２１／３１）、ｄｅｌ／ｉｎｓ被験者の６４％（２１／３３）、およびｉｎｓ／ｉｎｓ被験者の５８％（２２／３８）で得られた。
【００８７】
臨床試験でのアロセトロン投与時の便秘発生を、遺伝子型に従って階層化した。ｄｅｌ／ｄｅｌ遺伝子型を有するアロセトロン投与被験者は、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴ遺伝子型群と比較して、低い便秘発生率を示した（図２）。便秘は、アロセトロン投与を受けた被験者群（ｎ＝１０２）全体の２１％で報告された。ｄｅｌ／ｄｅｌ被験者（ｎ＝３１）では４名（１３％）が便秘を報告し、ｄｅｌ／ｉｎｓ被験者（ｎ＝３３）では１０名（３０％）が便秘を報告し、ｉｎｓ／ｉｎｓ被験者（ｎ＝３８）では８名（２１％）が便秘を報告した（図２）。
【００８８】
ｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者は、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨＴＴ遺伝子型を有する被験者と比較した場合、好ましい治療応答の発生率が高く、ＩＢＳ症状緩和の発生率が高く、便秘発生率が低かった（図３）。そこでｄｅｌ／ｄｅｌ ５ＨＴＴ遺伝子型は応答者群と見なすことができ、ｄｅｌ／ｉｎｓおよびｉｎｓ／ｉｎｓ ５ＨｔＴＴ遺伝子型群は限定的応答者または非応答者と見なすことができる。
【００８９】
実施例４：５ＨＴＴ多型についての個体の遺伝子型決定
消化管疾患を有する被験者の群からＤＮＡサンプルを得て、標準法（自動抽出またはキット形式の使用）を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。被験者の遺伝子型および用いるいずれかの対照個体について、ＰＣＲアッセイ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ、Ｔａｑｍａｎ対立遺伝子識別アッセイまたは当業界で公知の他のいずれかの好適な方法を用いて、５ＨＴＴ遺伝子配列内の多型を確認する。
【００９０】
十分な物理的大きさを有する増幅産生物（例：複数塩基の挿入／欠失多型）に特定の多型が存在する場合、簡単なサイズ識別アッセイを用いて、個体における遺伝子型を決定することができる。この場合、２種類のプライマーを用いて、多型位置周囲の領域における対象遺伝子を特異的に増幅する。ＰＣＲ増幅を行って、有する遺伝子型（挿入または欠失）に応じて長さが異なる産生物を得る。ゲル電気泳動を行う場合、大きさの異なる産生物を分離し、肉眼観察できるようにし、特定の遺伝子型を直接確認する。
【００９１】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型）アッセイを当業界で公知の方法に従って用いて、多型を検出することもできる。各多型位置に関して、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイでは２種類の遺伝子特異的プライマーを用いて、対象の多型位置周囲のゲノムＤＮＡの断片にアニールさせ、その断片を特異的に増幅させる。ＰＣＲ増幅後、特異的制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて、生成したＰＣＲ産物を消化させる。アッセイに用いる酵素は、多型の存在下／非存在下にＰＣＲ産物に結合し、それを開裂させて、多型位置に存在する特定の塩基を確認する上で役立つ断片を生成するのに必要とする、その特異的認識配列に従って選択される。制限酵素による開裂後、ゲル電気泳動を用いて、生成した断片を分離し、肉眼観察できるようにする。
【００９２】
当業界で公知のＴａｑｍａｎアッセイを用いて多型を同定することもできる。各多型位置に関して、対立遺伝子識別アッセイでは、５′末端で異なる蛍光色素によって標識されているが、３′末端では共通の消光剤で標識されている２種類の対立遺伝子特異的プローブを用いる。いずれのプローブも３′リン酸基を有することから、Ｔａｑポリメラーゼはそれにヌクレオチドを付加することができない。多型位置を含む配列を有する対立遺伝子特異的プローブは、その位置での配列のみで異なることになる（これは必ずしも正しいとは限らない。対立遺伝子特異的プローブは、互いに対して移動して、長さや組成において同一でなくなる場合がある。しかしながら、それらが同じＤＮＡ領域を含む場合、対象とする多型位置は別としてそれらは同一である）。対立遺伝子特異的プローブは、適切な位置に対する不一致を生じることなくハイブリダイズを行うことができるだけである。
【００９３】
対立遺伝子特異的プローブは２種類のプライマーと併用するが、そのプライマーの一方は２種類の特異的プローブのテンプレート５′にハイブリダイズし、他方は２種類のプローブのテンプレート３′にハイブリダイズする。特異的プローブの一方に相当する対立遺伝子が存在する場合、特異的プローブはテンプレートに完全にハイブリダイズする。次に、５′プライマーを延長するＴａｑポリメラーゼが、特異的プローブからヌクレオチドを除去して、蛍光色素と消光剤の両方を放出する。それによって、消光剤のごく近位での色素からの蛍光増加がなくなる。
【００９４】
対立遺伝子特異的プローブが他の対立遺伝子にハイブリダイズする場合、多型位置での不一致がＴａｑの５′→３′エンドヌクレアーゼ活性を阻害することから、蛍光色素放出が防止される。
【００９５】
ＡＢＩ７７００配列検出システムを用いて、ＰＣＲ反応管中で直接、熱サイクルＰＣＲ終了時の各特異的色素からの蛍光増加を測定する。次に、反応からの情報を解析する。個体が特定の対立遺伝子に関して同型接合である場合、その特異的プローブからの色素に相当する蛍光のみが放出されるが、個体が異型接合の場合は両方の色素が蛍光を発する。
【００９６】
次に個体の遺伝子型について、５ＨＴリガンド治療に対する表現型応答との相関を調べる。遺伝子小群間で変動する応答を、応答者、部分応答者または非応答者のいずれかとして確認する。本発明の方法では、非応答者群が確認されたら、その群に、診療所で認められるような疾患の基礎原因である異なった生化学的経路を有する、１以上の異なるタンパク質を発現している異なった遺伝子が存在することが仮定される。 従って、非応答者群が次なる臨床試験で注目されるようになり、その試験では、最初の試験で投与された薬剤に応答しなかったその群での疾患経路の一部であると考えられる、１以上の標的と相互作用することが明らかになっている候補薬剤を投与する。第１の薬剤試験で候補薬剤に対して応答しなかった群全体で、第２の候補薬剤が好ましい応答を誘発することが第２の試験で示された場合、最初に試験を開始した患者の群全体が、その疾患の臨床的確定（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に関して、安全かつ有効な薬物療法の恩恵を受けることは明らかである。多くの場合、そのような臨床試験が２回より多く反復され、それは疾患の臨床的確定を発現する同数の別の遺伝子型があることを反映するものと考えられる。例えば、非インシュリン依存型糖尿病として分類される疾患を発現する６種類もの異なる遺伝子型があり得る。従って、本発明の方法を中心として、あらゆる数の臨床試験を行うことができる。すなわち、非応答者の群を生じる反復では、その非応答者群は、臨床試験のそれ以前の反復で調べた薬剤とは別の薬剤によって治療可能な異なる遺伝子型を有する可能性がある全く新しい患者群を代表するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＩＢＳ治療用のアロセトロン（ａｌｏｓｅｔｒｏｎ）の臨床試験に登録された女性患者から収集したデータに基づくグラフである。
【図２】
５ＨＴＴ遺伝子型間で、便秘を報告したアロセトロン投与被験者パーセントを比較するグラフである。
【図３】
図１および２に示した情報を総合したものであり、アロセトロン投与被験者における便秘発生率およびＩＢＳ症状の緩和を経験した被験者のパーセントを５ＨＴＴ遺伝子型間で比較する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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