(57)【要約】本発明は、血漿と血清とからＲＮＡを抽出し、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ＲＴ−ＰＣＲを施し、そしてこれらをオリゴヌクレオチドチップ上で反応させることによって、ＨＣＶ遺伝子型を分析する方法を提供する。また、本発明は、１つのスライド上で４名のＨＣＶ遺伝子型を簡単で正確に分析することができる検査方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から１４までに記載の塩基配列を含んでいる複数のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項２】
前記各オリゴヌクレオチドプローブは、ＨＣＶ遺伝子型を決定するためのプローブであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、基材に固定されていることを特徴とする請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項４】
請求項１または２のプローブとターゲット遺伝子との結合を検出するのに用いられる配列番号１５から２０までに記載の１次または２次プライマー配列。
【請求項５】
前記２次プライマーのうち配列番号１８のアンチセンスプライマーは、ビオチンが付いていることを特徴とする請求項４に記載のプライマー配列。
【請求項６】
前記２次プライマーのうち配列番号１９のアンチセンスプライマーは、蛍光用プローブと相互作用することを特徴とする請求項４に記載のプライマー配列。
【請求項７】
前記蛍光用プローブである配列番号２０は、シアニンが付いていることを特徴とする請求項６に記載のプライマー配列。
【請求項８】
（ａ）血漿及び血清からＨＣＶ  ＲＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−１次ＰＣＲを施す段階と、
（ｃ）前記１次ＰＣＲの後、２次非対称ＰＣＲを施す段階と、
（ｄ）前記２次非対称ＰＣＲの副産物とプローブとを結合させる段階と、
（ｅ）前記の結合を確認する段階と、
を含むＨＣＶ遺伝子型の分析方法。
【請求項９】
前記（ｅ）の確認段階は、ビオチンと結合するAvidin-AP及びＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて確認するか、マイクロアレイスキャナーを用いて確認することを特徴とする請求項６に記載のＨＣＶ遺伝子型の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドチップ組成物及びその製造方法に関するものであり、より詳しくはＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の遺伝子型分析のためのオリゴヌクレオチドチップ（oligonucleotide chip）組成物及びその製造方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
一般に、Ｃ型肝炎ウィルス（Hepatitis C Virus；ＨＣＶ）は、肝炎の原因ウィルスであり、急性肝炎から慢性肝炎、肝硬変及び肝癌に進行する極めて危険な疾病を起こす要因として、主に輸血と体液によって感染される（Choo et al., Science 244, 359-362, 1989）。このウィルスは全世界的に約４億名くらい感染されていると推定されるが、ヨーロッパ、北米、日本等の先進国では全人口の０．２〜２％、南米、アジア等では２〜５％、またアフリカでは５％以上感染されており、韓国でも全人口の１．６％の８０万名くらいがＨＣＶに感染されていると推定される（Park et al., J. Viral Hepat. 2, 195-202, 1995）。このようにＨＣＶは人類の健康を脅威する非常に恐ろしいウィルスであり、Ｂ型肝炎ウィルス（Hepatitis B Virus；ＨＢＶ）とは異なり感染者の５０〜８５％が慢性肝炎に進行するほど予後が良くないウィルスであるにもかかわらず、ＲＮＡウィルスであるとの特性のため今まで適切な治療剤及びワクチンの開発はもちろん基礎的な研究さえ確立されていないのが実情である。しかし、分子生物学の発展に伴い診断方法が開発され輸血による感染の恐れから逃れることができるようになったが、まだ感染者の多くの感染経路が明らかでなく、感染の危険は相変わらず残っている状態である。
【０００３】
ＨＣＶは、１９８９年Chooらによりチンパンジーの血漿から得たｎｏｎ−Ａ、ｎｏｎ−Ｂ（ＮＡＮＢ）型肝炎のウィルスから明らかになった、５０nm程度の大きさで約９５００個の塩基と３０００個余りのアミノ酸よりなるpositive-single strand linear ＲＮＡウィルスである。このＨＣＶ遺伝子の基本構造はcore、nucleocapsid及びenvelope glycoproteinのような３つの構造たんぱく質と、helicase、viral protease、RNA-dependent RNA polymerase、transcriptase及びregulatory peptideのような６つの非構造たんぱく質を生成するＯＲＦ（open reading frame）からなる（Chou et al., Jpn. J. Med. Sci. Biol. 4, 147-157, 1991）。ＯＲＦの両端には5’-untranslated region（５’ＵＴＲ）と３’ＵＴＲとが存在するが、５’ＵＴＲは約３４０ｂｐとしてＨＣＶ遺伝子において最も良好に保存されている部位であって、stem-loop構造となっている（Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 1711-1715, 1991）。
【０００４】
ＨＣＶは突然変異率が高くて１年に（１．４４〜１．９２）×１０−３ｂｐ程度の塩基置換が起こるが、ＨＣＶ遺伝子のうち５’ＵＴＲとcapsidが最も保存がよくＥ１とＥ２から変異が最も多く現れる（Ogata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 3392-3396, 1991）。このためＨＣＶは非常に高い遺伝子多型性を示しておるが、現在まで大別して６個の型に分けられ、それに属する亜型も数種から数十種まで分布している（Simmonds et al., J. Gen. Virol. 74, 2391-2399, 1993; Cha et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 7144-7148, 1992）。今までこれら型を分類するにおいて標準化した方法がなく研究者ごとに相異なる命名法を使っておるが、現在はSimmondsらが提案した分類法が最も広く使われている。この分類法は遺伝子型に数字（１、２、３等）を付け、亜型にアルファベット文字（ａ、ｂ、ｃ等）を付ける方法である。この分類法によると、ＨＣＶは遺伝子型の間には３１〜３５％の差があり、亜型間には２０〜２３％の差を示しており、同じ亜型の内でも１〜１０％の差を示している（Simmonds et al., J. Gen. Virol. 74, 661-668, 1993）。
【０００５】
ＨＣＶ遺伝子型の分析はＨＣＶ感染の確認、感染経路、及びＩＦＮ−αの治療効果を予測する等に利用されている（Hino et al., J. Med. Virol. 42, 299-305, 1994）。また、地域と民族によって異なる分布を示しているため（Greene et al., J. Gen. Virol. 76, 211-215, 1995）、分布度調査及びワクチンの開発にも利用されている。現在ＨＣＶを治療するのに最も普遍的な抗ウィルス治療剤はＩＦＮ−αであるが、大体治療者の５０％以上が効果を示し、２５％程度のみ肝の作用が正常に戻り血清内のＨＣＶが消えるといわれる。なお、ＩＦＮ−αの治療効果とＨＣＶ型との関連性が報告されているが、遺伝子型１ａ、２、３及び５では治療効果に優れるが、１ｂ及び４では効果が落ちるといわれる（Yoshioka et al., Hepatology 16, 293-299, 1992）。また、１ｂと４とは慢性肝炎への転換が早い反面、１ａと２ａとは症状の好転が遥かに良いといわれる（Lopez-Labrador et al., J. Hepatol. 27, 959-965, 1997）。
【０００６】
一般に、ＨＣＶ遺伝子型を分析するには次のような方法が使われている。第一は、ＨＣＶ遺伝子型に特異性を持つＰＣＲプライマーを用いるＳＳＰ−ＰＣＲである。これはcoreで多様な遺伝子型に特異なＰＣＲプライマーを組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを実施するものである。これはＲＴ−ＰＣＲの後すぐ結果を得ることができるとの長所があるが、プライマーの認識部位に突然変異が発生したり新しい型に対しては決めることができないという短所がある。このため変異の多いＨＣＶ遺伝子型の分析には好ましくない方法である。第二は、５’ＵＴＲ部位をＲＴ−ＰＣＲにて増幅し制限酵素を用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法であるが（Park et al., J. Med. Microbiol. 47, 1998）、簡単で容易に結果を得ることができるとの長所がある反面、用いる制限酵素が変異部分を認識することができなければ分析できないという短所がある。第三は、５’ＵＴＲ部位をＲＴ−ＰＣＲにて増幅し遺伝子型に特異なオリゴヌクレオチドプローブが付いているフィルタと交雑反応をさせるものである。これはプローブの種類によって正確な結果が得られるが、フィルタを用いることから、数多くのプローブを固定するに限界があり、１つのフィルタにて一人しか分析できないので多くの検体を処理・分析するにおいて多くの時間と労働力が要る。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は上記の方法の問題点を解決し、上記の必要性から成されたものであり、本発明の目的はＣ型肝炎ウィルスの遺伝子型を分析するための改善された組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の組成物を用いて改善されたＨＣＶ遺伝子型の分析方法を提供することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明は配列番号１から１４までの塩基配列を含んでいる複数のオリゴヌクレオチドプローブ組成物を提供する。
【０００９】
本発明の各オリゴヌクレオチドプローブは、ＨＣＶ遺伝子型を決定するためのプローブであり、上記のオリゴヌクレオチドプローブは基材に固定されていることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、上記のプローブとターゲット遺伝子との結合を検出するのに用いられる配列番号１５から２０までに記載の１次または２次プライマー配列を提供する。
【００１１】
上記の２次プライマーのうち配列番号１８のアンチセンスプライマーは、ビオチンが付いていることを特徴とし、上記の２次プライマーのうち配列番号１９のアンチセンスプライマーは、蛍光用プローブである配列番号２０と相互作用することを特徴とし、上記蛍光用プローブは望ましくはシアニンが付いていることを特徴とする。
【００１２】
さらに、本発明は、血漿及び血清からＨＣＶ  ＲＮＡを抽出する段階と、抽出したＲＡＮを用いてＲＴ−１次ＰＣＲを施す段階と、上記１次ＰＣＲの後、２次非対称ＰＣＲを施す段階と、上記２次非対称ＰＣＲの副産物とプローブとを結合させる段階と、上記の結合を確認する段階とを含むＨＣＶ遺伝子型の分析方法を提供する。
【００１３】
上記確認段階は、ビオチンと結合するStreptavidin-Alkaline phosphatase及びNitroblue tetrazolium chloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて確認するか、マイクロアレイスキャナーを用いて確認することを特徴とする。
【００１４】
本発明では、最近開発されたＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて１つのスライド上で４名の検体を同時に分析することができるＨＣＶオリゴヌクレオチドチップを開発した。これは過去に開発されたオリゴヌクレオチドチップをさらに向上させたものである。すなわち、ＨＣＶ遺伝子型を決定するためにＨＣＶ  ５’ＵＴＲにおいて６個の型、１１個の亜型及び５３個の種に特異的に反応する１４個のオリゴヌクレオチドを設け、これらを１つのアルデヒドガラススライドの上に４個のセットで集積した。ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して増幅させたＨＣＶ遺伝子をＰＣＲ副産物と、スライドに集積したオリゴヌクレオチドプローブとを交雑反応させた。これを発色反応法または蛍光反応法を用いて反応が生じたプローブを分析することによって、ＨＣＶに対する６個の遺伝子型と１１個の遺伝子亜型を区分した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、非限定的な実施例に基づいて本発明を詳しく説明する。
実施例１：ＨＣＶプライマーの合成及び塩基配列
ＲＴ−ＰＣＲに用いたＨＣＶ  ＰＣＲプライマーは、表１に示されているような５’ＵＴＲで６個型に共通して反応することができる部位を分析して使用した。
２次非対称ＰＣＲに用いるアンチセンスプライマーは、確認方法によって２つに分けた。第一に、交雑反応をさせて発色反応にて確認するためのものとしてはビオチンを付けた。第二に、交雑反応をさせ蛍光反応にて確認するためのものとしてはシアニンを使用した。人為的に２次ＰＣＲ用のアンチセンスプライマーの５’端に２５ｂｐ塩基（ＳＰ６）を追加して合成し、この部位に相補的なシアニンと結合された塩基を合成した。ここで使用したプライマーはMolecular cloning ３版（SambrookとRusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, U.S.A., 2001）の10.42に記述のオリゴヌクレオチド合成と同じ方法を使用してドイツのMWG-biotech社に依頼して合成した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
実施例２：ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出、逆転写−１次ＰＣＲ及び２次ＰＣＲ反応
１）ＨＣＶ  ＲＮＡ抽出バッファ（１ml中 DEPC-DW 860 ul, Taq 10X buffer 100 ul, 1M DTT 20 ul, 10% NP40 20 ul）５ulと血漿または血清１０ulとを混合した。
２）ＰＣＲ機器の温度を９２℃に設定した状態で、混合した血清の入っているチューブを２分間加熱した後、用意しておいた氷にすぐ入れた。
３）５〜１０秒間遠心分離した。
４）表２の条件にて逆転写反応及び１次ＰＣＲ反応を、GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler（Perkin Elmer Cetus, U.S.A.）で連続的に施した。
５）１次ＰＣＲ産物２ulを使って、表３の条件にて２次非対称ＰＣＲ反応を施した。
６）２次非対称ＰＣＲが終わった産物５ulにゲルローディングバッファ（0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400）１ulを入れ、１μｇ/ml ethidium bromide（ＥｔＢｒ）を含有したアガロースゲルで電気泳動した後、ＵＶ transilluminatorが付着されたImage analyzer（Vilber Lourmat, France）にて２３６ｂｐまたは２６１ｂｐのバンドを確認した
【００１８】
【表２】
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【００１９】
【表３】
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【００２０】
実施例３：ＨＣＶオリゴヌクレオチドチップの製作のためのプローブ合成及び塩基配列
アルデヒドガラスの上に、共有結合のためにすべてのプローブの５’端にアミノリンクを付け、交雑反応の際反応しやすくするために１０〜２０個のオリゴ（ｄＴ）を付着した後、表５のような塩基配列を付けて合成した。すなわち、「アミノリンク−オリゴ（ｄＴ）１０−２０−プローブ塩基配列」の順にして、ドイツのMWG-biotech社に依頼して合成した。このとき決定したＨＣＶ遺伝子型の塩基配列は、表４に示されているように、６個型の総５３種のＨＣＶ遺伝子を分析して決定した。
【００２１】
【表４】
2004525643.tif 000006
【００２２】
表５に示した塩基配列のうち、真ん中に大文字で示した塩基が最も重要な部分であり、これを中心にして約１５ｂｐないし２５ｂｐのサイズとして、６２℃を前後にしてＴｍ値を設定して合成した。
【００２３】
【表５】
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【００２４】
実施例４：ＨＣＶオリゴヌクレオチドチップの製作
１）オリゴヌクレオチドチップを製作するために、Telechem社のスーパーアルデヒドガラススライドを使用した。１００pmoleのアミノ基が付いているプローブと、同量のＤＭＳＯと混合してスライドの上に固定させ、０．２％のＳＤＳで５分間２回洗ってから蒸留水で５分間２回洗った。そして、９５℃に加熱された蒸留水で２分間１回洗った後、室温で蒸留水で１回洗った。
２）ソディウムボロハイドライド（1.3g NaBH4, 375ml PBS, 125ml 100% EtOH）に５分間反応させた後、０．２％ＳＤＳで１分間３回洗い、蒸留水で１分間１回洗ってから室温で乾燥させた。
３）４個の検体を分離して分析するために、Sigma社のcoverwell perfusion chamber（４つのチャンバー）を付けて分離した。このように完成したＨＣＶオリゴヌクレオチドチップを使用する前まで室温の暗い所で保管した。
【００２５】
実施例５：ＨＣＶ  ＰＣＲ産物との結合反応
１）プレハイブリダイゼイションバッファ（1% BSA, 5X SSC, 0.1% SDS）２０〜２００ulをオリゴヌクレオチドが結合されたスライドの上に滴下して、４２℃で３０〜６０分間反応させた。蒸留水で５回洗い、イソプロパノルでリンスして室温で乾燥させ、さらに８０℃で２時間乾燥させた。
２）発色反応法では、ビオチンが結合されたＨＣＶ  ＰＣＲ産物を９５℃で３分間変性させた後、ハイブリダイゼイション溶液（4X SSC, 0.3% SDS）と１：３の割合で混合した。蛍光反応法では、ＳＰ６が結合されたＨＣＶ  ＰＣＲ産物を９５℃で３分間変性させた後、同量のシアニン−プローブ及びハイブリダイゼイション溶液（6X SSC, 0.5% SDS）と混合した。
３）５０〜２００ulのハイブリダイゼイションバッファをスライド上のチャンバーに満たし、チャンバーを覆って６３℃で１〜３時間反応させた。
４）1X SSC, 0.2% SDSにて室温で５〜１０分間洗い、0.1X SSC, 0.2% SDSにて６３℃で５〜１０分間洗って、さらに0.1X SSCで５〜１０分間洗った後、室温で乾燥させた。
【００２６】
５）結果の確認
Ａ．発色反応法（ビオチン法）；Blocking buffer ３０〜１２０ulにて室温で３０分間反応させ、３０〜１２０ulの１／２０００に希釈されたStreptavidin-Alkaline phosphataseと３０分間反応させた。１／５０に希釈された４０〜１６０ulのNitroblue tetrazolium chloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate（ＮＢＴ／ＰＣＩＰ）にて、室温の暗い所で１時間反応させた後、用心深く蒸留水で洗った。発色反応が現れることを見てＨＣＶ遺伝子型を分析した。
Ｂ．蛍光反応法（シアニン法）；スキャナー（GenePiX4000, Axon instruments, U.S.A.）を使用して蛍光を示すＨＣＶ遺伝子型を分析した。
このように、ＨＣＶ遺伝子型を分析するのにＨＣＶ  ５’ＵＴＲをＰＣＲにて増幅し、型により異なって現れる塩基を分析する方法を使用した。この５’ＵＴＲからＨＣＶ遺伝子型を分析したのは、５’ＵＴＲ内の塩基変化が特定の部位に限られているためプライマーの選択に容易で、突然変異や新しい型に対してもＲＴ−ＰＣＲを施すことができるからである（Okamoto et al., Jpn. J. Exp. Med. 60, 215-222, 1990）。また、５’ＵＴＲでの結果がcore、ＮＳ３、及びＮＳ５の結果と同一であるため５’ＵＴＲが主に用いられており（Karachristos et al., J. Med. Microbiol. 42, 367-371, 1995）、本発明でも５’ＵＴＲを用いてＨＣＶ遺伝子型を分析した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明ではＨＣＶ  ５’ＵＴＲの遺伝子を分析して遺伝子型を診断するオリゴヌクレオチドチップを開発した。このオリゴヌクレオチドチップは従来のチップが持っている短所を克服・補完する。すなわち、従来のプローブ２つを修正し２つを追加することによって、１ｃと２ｃとがさらに確認できることになり、４ａと５ａとに当たって分析がより明確になった。これを用いたＨＣＶ遺伝子型の分析はＨＣＶ感染の確認、感染経路、及び ＩＦＮ−αの治療効果を予測する等に利用されうる。また、遺伝子型の分布を参考にして地域と民族に最適なＨＣＶワクチン開発にも用いられ得、ＨＣＶに関連した慢性肝炎、肝硬化、及び肝癌を研究するにも助かる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）オリゴヌクレオチドチップ全体のスライド形態を示す写真である。すなわち、１つのスライドにて４名のＨＣＶ遺伝子型を同時に分析するために、示されている数字のように４個の部屋からなっている。このスライドの上に、表５に示したようにＨＣＶ遺伝子型を区分する１２個のプローブを２重に固定し、陽性及び陰性コントロールに用いられる２個のプローブは４重にして、総３２個のプローブを固定した。そして、この上に、coverwell perfusion chamber（Sigma Cat♯ Z37916-6, U.S.A.）を付けてＨＣＶオリゴヌクレオチドチップを製作した。
【図２】図２は、ＨＣＶオリゴヌクレオチドチップのＨＣＶ１ｂタイプに関する発色反応結果の写真であり、図１のようなスライド形態の４個の部屋のうち１個の部屋で生じた反応を拡大して示したものである。この写真は、韓国人に最も多く発生するＨＣＶ１ｂタイプであって、１４個のプローブのうち表５の「反応ＨＣＶ型」に示されているように、プローブ１と２で同時に反応が生じたものである。また、プローブ１３は陽性（Positive）コントロールとしてすべての反応で現れるようにし、プローブ１４は陰性（Negative）コントロールとしていずれの反応でも現れないようにすることによって、実験の正確度を確認することができる。そして、それぞれ２個の同じ点を示したのは正確を期するために同じプローブを２個ずつ固定したものであり、プローブ１３及び１４は陽性・陰性コントロール及び位置確認のため最上及び最下にそれぞれ２個ずつ２回固定しておいた。
【図３】図３は、ＨＣＶオリゴヌクレオチドチップのＨＣＶ１ｂタイプに関する蛍光反応結果の写真であり、プローブとの反応は図２と同様である。相違点は、ＰＣＲ及び交雑反応時に蛍光用プライマー及びプローブを用い、結果の解析時にスキャナー（GenePiX4000, Axon instruments, U.S.A.）を用いてＨＣＶ遺伝子型を分析したことにある。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月12日(2002.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から１４までに記載の塩基配列を含んでいる複数のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、各々ＨＣＶ遺伝子型を決定するためのプローブであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドプローブは基材に固定されていることを特徴とする請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ組成物。
【請求項４】
テストサンプル内のＨＣＶ遺伝子型を分析する方法において、
前記サンプルに対し２段階のＰＣＲを施し、
２次非対称ＰＣＲ段階が、配列番号１７に記載のフォワードプライマーと、配列番号１９に記載のリバースプライマーと、配列番号２０に記載の蛍光用プローブとを用い、前記２次非対称ＰＣＲの産物を請求項１のプローブに結合させる段階と、
前記結合産物を検査する段階と、を含むＨＣＶ遺伝子型の分析方法。
【請求項５】
前記蛍光用プローブは、シアニンを含むことを特徴とする請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
前記検査する段階は、前記結合産物をマイクロアレイスキャナーにより視覚化する段階を含むことを特徴とする請求項４に記載の分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）血漿及び血清からＨＣＶ  ＲＮＡを分離する段階と、（ｂ）分離したＲＮＡを鋳型として用い、配列番号１５に記載のフォワードプライマー及び配列番号１６に記載のリバースプライマーとを用いて１次ＲＴ−ＰＣＲを施す段階と、（ｃ）上記１次ＰＣＲの後、配列番号１７に記載のフォワードプライマーと、配列番号１９に記載のリバースプライマーと、配列番号２０に記載の蛍光用プローブとを用いて２次非対称ＰＣＲを施す段階と、（ｄ）上記２次非対称ＰＣＲの産物と請求項１のプローブとを結合させる段階と、（ｅ）上記結合産物を検査する段階とを含むＨＣＶ遺伝子型の分析方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
上記本発明のＨＣＶ遺伝子型の分析方法において、結合結果は、ビオチンと結合するStreptavidin-Alkaline phosphatase 及びNitroblue tetrazolium chloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate （ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて、あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて視覚化される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明では、最近開発されたＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて１つのスライド上で４名の検体を同時に分析することができるＨＣＶオリゴヌクレオチドチップを開発した。これは過去に開発されたオリゴヌクレオチドチップをさらに向上させたものである。すなわち、ＨＣＶ遺伝子型を決定するためにＨＣＶ  ５' ＵＴＲにおいて６個の型、１１個の亜型及び５３個の種に特異的に反応する１４個のオリゴヌクレオチドを設け、これらを１つのアルデヒドガラススライドの上に４個のセットで集積した。ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して増幅させたＨＣＶ遺伝子をＰＣＲ副産物と、スライドに集積したオリゴヌクレオチドプローブとを交雑反応させた。これを発色反応法または蛍光反応法を用いて反応が生じたプローブを分析することによって、ＨＣＶに対する６個の遺伝子型と１１個の遺伝子亜型を区分した。
【国際調査報告】
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