(57)【要約】本発明は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからの保護基の除去（すなわち、脱保護）のためのプロセスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、このようなプロセスにおける使用に適切な試薬、およびこのような試薬を簡便な使用の用意ができた様式で備えるキットを提供する。本発明のプロセスおよび試薬の使用によって、合成オリゴヌクレオチドを汚染する特定の不純物を生じる副反応は、最小化され得る。保護オリゴヌクレオチドを脱保護試薬と反応させることによってオリゴヌクレオチドの脱保護するための方法および試薬が提供され、ここで、この脱保護試薬は、活性メチレン化合物およびアミン試薬を含む。この活性メチレン化合物は、構造（ａ）を有し、ここで、置換基ＥＷＧは、求電子基であり、そしてＲは、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、複素環または求電子基である。
2004521628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを脱保護する方法であって、該方法は、保護オリゴヌクレオチドを脱保護試薬と反応させる工程を包含し、該脱保護試薬は、活性メチレン化合物およびアミン試薬を含み、ここで、該活性メチレン化合物は、以下の構造：
【化１】
2004521628.tif 000014
を有し、
ここで、ＥＷＧは、ニトロ、ケトン、エステル、カルボン酸、ニトリル、スルホン、スルホネート、スルホキシド、ホスフェート、ホスホネート、ニトロキシド、ニトロソ、トリフルオロメチル、ならびにニトロ、ケトン、エステル、カルボン酸、ニトリル、スルホン、スルホネート、スルホキシド、ホスフェート、ホスホネート、ニトロキシド、ニトロソおよびトリフルオロメチルの１以上によって置換されたアリール基から選択される、求電子基であり、そして
Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、複素環または求電子基から選択され、
該方法により、保護基が該オリゴヌクレオチドから除去される、方法。
【請求項２】
前記保護オリゴヌクレオチドが、連結を介して固体支持体に共有結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを切断する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、前記脱保護試薬との反応後に、前記固体支持体に共有結合したままである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記固体支持体が、高度に架橋されたポリスチレンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記固体支持体が、制御細孔ガラスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記固体支持体が、前記脱保護試薬を通過させる膜である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記固体支持体が、前記脱保護試薬を通過させるフリットである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記固体支持体が、平面的な非多孔性材料である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記材料が、ガラス、石英またはダイヤモンドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記材料が、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレンおよびポリエチレングリコールのグラフト、エチレンおよびアクリレートのコポリマー、またはエチレンおよびメタクリレートのコポリマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体が、入口および出口を有するカラム中に配置され、それによって、試薬が該カラムを通って流れ得る、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
複数の前記カラムをホルダ中に配置する工程、および複数のオリゴヌクレオチドを同時に脱保護する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホルダが、前記カラムのアレイを有するマイクロタイタープレートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記保護オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２−シアノエチルホスフェートヌクレオチド間連結を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記保護オリゴヌクレオチドが、核酸アナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸アナログが、ＬＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸アナログが、ＰＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸アナログが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記保護オリゴヌクレオチドが、標識に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が、蛍光色素、クエンチャー、ビオチン、移動度調節剤、小溝結合剤、ならびにＣ１〜Ｃ６アルキルアミンおよびＣ１〜Ｃ６アルキルチオールから選択されるリンカーからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記小溝結合剤が、ＣＤＰＩ−３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記蛍光色素が、フルオレセイン、ローダミンまたはシアニン色素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識が、ポリヌクレオチドの５’末端に結合している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識が、ポリヌクレオチドの３’末端に結合している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記脱保護試薬が、水をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記脱保護試薬が、アルコール溶媒をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルコール溶媒が、メタノールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルコール溶媒が、エタノールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルコール溶媒が、エチレングリコールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性メチレン化合物が、２，４−ペンタンジオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性メチレン化合物が、１，３−シクロヘキサンジオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性メチレン化合物が、アセト酢酸エチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性メチレン化合物が、マロノニトリルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性メチレン化合物が、マロン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記活性メチレン化合物が、ニトロメタンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記活性メチレン化合物が、マロンアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性メチレン化合物が、ジアルキルマロネートジエステルであり、ここで、該アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記脱保護試薬が、ジアルキルマロネートジエステル、水酸化アンモニウム水溶液およびアルコール溶媒の混合物を含み、ここで、該アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジメチルマロネートである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジエチルマロネートである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジ−ｎ−プロピルマロネートである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジイソプロピルマロネートである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記アミン試薬が、水酸化アンモニウム水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記アミン試薬が、メチルアミン水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記アミン試薬が、エチルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記アミン試薬が、イソプロピルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記アミン試薬が、ｎ−プロピルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記アミン試薬が、ｎ−ブチルアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記アミン試薬が、１，２−エチレンジアミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記アミン試薬が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）または１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記反応工程が、以下：
前記固体支持体に共有結合した前記保護オリゴヌクレオチドを、活性メチレン化合物および溶媒によって湿らせること、そして次いで
該保護オリゴヌクレオチドをアミン試薬で処理すること、
によってもたらされる、請求項２に記載の方法。
【請求項５３】
前記固体支持体が、入口および出口を有するカラム中に限定され、それによって試薬が該カラムを通って流れ得る、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
複数のカラムがホルダ中に構成され、それによって複数のオリゴヌクレオチドが同時に脱保護される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ホルダが、等間隔のカラムのマイクロタイターウェル構成である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５６】
前記保護オリゴヌクレオチドおよび前記アミン試薬が、密封可能な容器中に配置され、それによって該オリゴヌクレオチドが脱保護される工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記アミン試薬が、水酸化アンモニウム水溶液である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記アミン試薬が、アンモニア気体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記アミン試薬が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記溶媒が、アルコール、エーテル、アミド、アセトニトリル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記アルコールが、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールまたは１，２−エチレングリコールである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記エーテルが、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンまたは１，２−ジメトキシエタンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミドが、アセトアミド、ホルムアミド、ベンズアミドまたはジメチルホルムアミドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチド脱保護試薬であって、該オリゴヌクレオチド脱保護試薬は、活性メチレン化合物およびアミン試薬を含み、ここで、該活性メチレン化合物は、以下の構造：
【化２】
2004521628.tif 000015
を有し、
ここで、ＥＷＧは、ニトロ、ケトン、エステル、カルボン酸、ニトリル、スルホン、スルホネート、スルホキシド、ホスフェート、ホスホネート、ニトロキシド、ニトロソ、トリフルオロメチル、ならびにニトロ、ケトン、エステル、カルボン酸、ニトリル、スルホン、スルホネート、スルホキシド、ホスフェート、ホスホネート、ニトロキシド、ニトロソおよびトリフルオロメチルの１以上によって置換されたアリール基から選択される、求電子基であり、そしてＲは、水素、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、複素環または求電子基である、オリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項６５】
前記活性メチレン化合物がジアルキルマロネートジエステルであり、そして前記アミン試薬が水酸化アンモニウム水溶液である、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項６６】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジメチルマロネートである、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項６７】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジエチルマロネートである、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項６８】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジ−ｎ−プロピルマロネートである、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項６９】
前記ジアルキルマロネートジエステルが、ジイソプロピルマロネートである、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項７０】
前記活性メチレン化合物が、前記試薬の１〜１０容積％である、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項７１】
アルコール溶媒をさらに含む、請求項６５に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項７２】
前記アルコール溶媒が、前記試薬の１〜３０容積％である、請求項７１に記載のオリゴヌクレオチド脱保護試薬。
【請求項７３】
請求項６４に記載の脱保護試薬によって脱保護された、脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
前記脱保護オリゴヌクレオチドが、核酸アナログを含む、請求項７３に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７５】
前記核酸アナログが、ＬＮＡである、請求項７４に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
前記核酸アナログが、ＰＮＡである、請求項７４に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
前記核酸アナログが、２’−Ｏ−メチルＲＮＡである、請求項７４に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
前記保護オリゴヌクレオチドが、標識に共有結合している、請求項７３に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
前記標識が、蛍光色素、クエンチャー、ビオチン、移動度調節剤、小溝結合剤、ならびにＣ１〜Ｃ６アルキルアミンおよびＣ１〜Ｃ６アルキルチオールから選択されるリンカーから選択される、請求項７８に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
前記小溝結合剤が、ＣＤＰＩ−３である、請求項７９に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項８１】
前記蛍光色素が、フルオレセイン、ローダミンまたはシアニン色素である、請求項７９に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項８２】
前記標識が、ポリヌクレオチドの５’末端に結合している、請求項７８に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【請求項８３】
前記標識が、ポリヌクレオチドの３’末端に結合している、請求項７８に記載の脱保護オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、一般に、合成オリゴヌクレオチド化合物に関連する。より具体的には、本発明は、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断およびオリゴヌクレオチドの脱保護に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．発明の背景）
オリゴヌクレオチドは、多くの重要な分子生物学的実験、アッセイおよび情報収集操作（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、診断プローブ、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、およびゲノム配列決定）において基本的試薬である。固相支持体に対するモノマー単位の連続的な添加および共有結合によってオリゴヌクレオチドの合成を実施する利点は、高く評価されている。特に、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ法は、高度に最適化され、かつ全世界で採用されている（米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，９７３，６７９号）。毎年消費される、数百万のオリゴヌクレオチドの大部分は、ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーを使用する自動合成によって調製される（Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜６２；米国特許第４，４１５，７３２号）。
【０００３】
固相支持体上で化学反応を実施することには、いくつかの実際的な利点がある：（ｉ）過剰な試薬および可溶性の副産物が、単純な洗浄工程および濾過工程によって、容易に除去され、そして分離され得る、（ｉｉ）多くのオリゴヌクレオチドの並列作製を施行、操作、組織化することが容易になされる、そして（ｉｉｉ）反応が、操作の経済性および簡便性のためにスケールアップおよびスケールダウンされ得る。
【０００４】
多くの適用において、共有結合した標識を有するオリゴヌクレオチドが使用される。標識は、何らかの機能（例えば、親和性、検出、または他の物理学的特性）を分与し得る。オリゴヌクレオチド標識はまた、しばしば、反応性官能基を有しており、この反応性官能基は、副反応および改変を最小化するために、好ましくは保護され得る。
【０００５】
合成が完結した際に、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドと固相支持体との間の共有結合を化学的に切断することによって、この支持体から切出され、そして、全ての残りの保護基をこのヌクレオチドから脱保護される。切断および脱保護の工程は、共同的に作用され得、また同じ試薬を用いて実施され得る。あるいは、切断および脱保護は、異なった温度において、かつ、異なった試薬を使用して実施され得る。
【０００６】
代表的には、固相支持体からのオリゴヌクレオチド（２０ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌ）の切断は、約１〜３ｍｌの濃水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ；水中の約２８〜３０％のＮＨ３）を使用して、合成カラム中で、室温にて、実施される。このオリゴヌクレオチドの３’末端における代表的なエステル結合の切断は、これらの条件下にて、約１時間で完結する。このオリゴヌクレオチドと固相支持体との間の結合が切れようとする際に、水酸化アンモニウムはまた、ヌクレオチド間のホスフェートおよび核酸塩基保護基から２−シアノエチル基を除去しようとする。核酸塩基および保護基の型に依存して、このオリゴヌクレオチドの脱保護（保護基の除去）は、濃水酸化アンモニウムでの温度５５℃で約１〜８時間処理を必要とする、
あるいは、切断および脱保護は、無水アミン（米国特許第５，７５０，６７２号）、メチルアミン（米国特許第５，３４８，８６８号および同第５，５１８，６５１号）、ヒドラジンおよびエタノールアミン（Ｐｏｌｕｓｈｉｎ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２４、ｐ４９−５０；Ｐｏｌｕｓｈｉｎ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：６３９〜４５）を用いて実施され得る。
【０００７】
自動ＤＮＡ合成機における代表的な合成後の切断／脱保護ルーチン（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡのＭｏｄｅｌ  ３９２、Ｍｏｄｅｌ３９４、Ｍｏｄｅｌ  ３９４８）は、オリゴヌクレオチド合成が完結した後に合成カラムを介して濃水酸化アンモニウムを送達し、そして、より多くの水酸化アンモニウムの周期的な送達および容器中の溶出液の回収によって、これがこのカラム中に１時間留まることを可能にする。次いで、切断され、かつ部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを含む容器は、脱保護を完結するために加熱デバイスに移入され得る。あるいは、核酸塩基保護基は、完全な脱保護オリゴヌクレオチドを作製するためにさらなる加熱を必要としないほど十分に不安定であり得る。水酸化アンモニウムは、減圧下あるいは空気流または不活性ガス流の中で除去される。粗オリゴヌクレオチドは、疎水性カートリッジ精製（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、逆相ＨＰＬＣ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および析出が挙げられる種々の方法によって精製され得る。いくつの用途にとって、この粗オリゴヌクレオチドは、適切に機能するのに十分なほど純粋である。
【０００８】
この固相支持体からのオリゴヌクレオチドの切断の完結の後に、この残りの保護基を、６〜２４時間で、室温にて、または例えば、５５℃に昇温して水酸アンモニウム溶液中でインキュベーションすることにより、取り除く。あるいは、オリゴヌクレオチドは、気相中で、切断され得るか、そして／またはアンモニアまたは他のアミンで脱保護され、これによって、試薬ガスは、オリゴヌクレオチドと接触するようになり、その間にこの固相支持体に結合するか、その近傍にある（米国特許第５，５１４，７８９号；同第５，７３８，８２９号）。
【０００９】
任意の状況で使用される特定の切断および脱保護プロトコルは、核酸塩基、この核酸塩基間のリン、糖、５’末端または３’末端、ならびに任意の共有結合された標識上において使用される保護基によって、ほとんど決定される。合成のホスホジエステル法において使用される核酸塩基保護基の第１の生成セットとしては、アデノシンＡｂｚ、シトシンＣｂｚ、およびグアノシンＧｉｂｕ（Ｓｃｈａｌｌｅｒ（１９６３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，３８２１〜３８２７およびＢｕｃｈｉ（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２５１）として使用される、ベンゾイル（ｂｚ）保護基およびイソブチリル（ｉｂｕ）保護基が挙げられる。一般的に、チミジンＴは保護されない。
【００１０】
特定の副反応が切断および脱保護の反応の間に起こることが知られている。核酸塩基、ヌクレオチド間リン酸基、およびペンダントアミノ基の修飾は、特徴付けられている（Ｃｈａｎｇ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１２０５〜１２０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ（１９９９）Ｎｕｃｅｌｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１８：１１９９〜１２０１）。アクリロニトリルは、ヌクレオチド間リン酸基の脱保護によって放出され、核酸塩基、標識、または他の部位上に付加物を形成し得る（ＥＰ  １０２８１２４；ＷＯ００４６２３１；Ｅｒｉｔｊａ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：４１７１〜８２；Ｗｉｌｋ（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：７５１５〜２２）。他の不純物は特徴付けられていないが、オリゴヌクレオチドの不純物の純度を損なうことが知られており、そして効率の損失を引き起こす。保護基の脱保護が完結していない場合、オリゴヌクレオチドは、低い特異性または低い親和性にてハイブリダイズし、そして、ミスプライミングまたは突然変異誘発を導き得る。
【００１１】
オリゴヌクレオチドの切断および脱保護のための新規の試薬および方法が望まれる。特定の保護基は、修飾を生じるための、脱保護試薬、または自動合成機と適合性ではないかもしれない。特定の標識（例えば、伸長した結合体または反応性官能基を有する標識）は、切断工程および脱保護工程の間の標識またはオリゴヌクレオチドの修飾を生じ得る。副反応または副次的な修飾を最小化するか、またはそれを除去する試薬および方法が望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（ＩＩＩ．要旨）
本発明は、化学合成されたオリゴヌクレオチドから、保護基の除去、すなわち、脱保護のためのプロセスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、このようなプロセスにおける用途に適切な試薬、およびこのような試薬を、都合の良いすぐに使用できる様式で組み込むキットを提供する。本発明のこれらのプロセスおよび試薬を使用することによって、合成されたオリゴヌクレオチドを汚染する特定の不純物を生じる副反応が、最小化され得る。
【００１３】
第１の局面において、本発明は、保護されたオリゴヌクレオチドを脱保護剤と反応させることによって、オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法を提供し、ここで、この脱保護化試薬は、活性メチレン化合物およびアミン試薬を含む。
この活性メチレン化合物は、以下の構造：
【００１４】
【化３】
2004521628.tif 000003
を有する。
【００１５】
置換基ＥＷＧは、以下からなる群より選択される電子吸引基である：ニトロ基、ケトン基、エステル基、カルボン酸基、ニトリル基、スルホン基、スルホネート基、スルホキシド基、ホスフェート基、ホスホネート基、ニトロオキシド（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ）基、ニトロソ基、トリフルオロメチル基、ならびに１つ以上のニトロ基、ケトン基、エステル基、カルボン酸基、ニトリル基、スルホン基、スルホネート基、スルホキシド基、ホスフェート基、ホスホネート基、ニトロオキシド（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ）基、ニトロソ基およびトリフルオロメチル基により置換されたアリール基。この置換基Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ２０アリール基、複素環式基および電子吸引基から選択される。このアミン試薬は、水酸化アンモニウム水溶液、メチルアミン水溶液、またはＣ１−Ｃ６無水アルキルアミンであり得る。活性メチレン化合物およびアミン試薬に加えて、本発明の脱保護剤は、水またはアルコール溶媒を含み得る。保護基は、脱保護剤で処理することによって、オリゴヌクレオチドから除去される。
【００１６】
このオリゴヌクレオチドは、結合を介して、固相支持体に共有結合的に結合され得る。このオリゴヌクレオチドは、保護基が除去される前、その最中、またはその後のいずれかで、この固相支持体から切断され得る。この固相支持体は、有機ポリマーまたは無機物であり得る。この固相支持体は、脱保護試薬が通過することを可能にするメンブレンまたはフリットであり得る。
【００１７】
この固相支持体は、脱保護試薬が通過または流動するための注入開口部および排出開口部を有する、カラムまたは他の密閉物中に、封入され得る。このカラムは、多くのカラムのホルダーを含む種々の形式（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロタイタープレート形式）で配置される。ホルダー中の複数のオリゴヌクレオチドは、脱保護試薬について区別したかまたは無区別しない送達または脱保護試薬に対する曝露を介して、同時に、または別々に、脱保護され得る。
【００１８】
本発明の脱保護試薬によって脱保護され得るオリゴヌクレオチドは、核酸アナログを含む。オリゴヌクレオチドは、１以上の共有結合した標識（例えば、蛍光色素、クエンチャ−、ビオチン、移動性改変剤（ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、および小溝結合剤）を保持し得る。
【００１９】
第２の局面において、本発明は、初めに、活性メチレン化合物および溶媒を用いて、固相支持体に共有結合的に連結した保護されたオリゴヌクレオチドを湿らし、次いで、この保護したオリゴヌクレオチドをアミン試薬と反応させることによって、オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法を提供する。このアミン試薬は、液相にあっても、気相にあってもよく；含水性であっても、無水であってもよい（例えば、水酸化アンモニウム水溶液、アンモニアガスまたはＣ１〜Ｃ６アルキルアミン）。
【００２０】
第３の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチド脱保護試薬を含み、ここで、脱保護試薬は活性メチレン化合物およびアミン試薬を含む。この活性メチレン化合物は、以下の構造：
【００２１】
【化４】
2004521628.tif 000004
を有する。
【００２２】
置換基ＥＷＧは、以下からなる群より選択される電子吸引基である：ニトロ基、ケトン基、エステル基、カルボン酸基、ニトリル基、スルホン基、スルホネート基、スルホキシド基、ホスフェート基、ホスホネート基、ニトロオキシド（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ）基、ニトロソ基、トリフルオロメチル基、ならびに１つ以上のニトロ基、ケトン基、エステル基、カルボン酸基、ニトリル基、スルホン基、スルホネート基、スルホキシド基、ホスフェート基、ホスホネート基、ニトロオキシド（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ）基、ニトロソ基およびトリフルオロメチル基により置換されたアリール基。この置換基Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ６−Ｃ２０アリール基、複素環式基および電子吸引基から選択される。この活性メチレンは化合物は、脱保護試薬の１〜１０容量％であり得る。脱保護試薬は、試薬の１〜３０容量％であるアルコール溶媒を、さらに含み得る。
【００２３】
第４の局面において、本発明は、本発明の脱保護試薬によって脱保護された、脱保護オリゴヌクレオチドを含む。
【００２４】
（Ｖ．例示的実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態に対する詳細な言及が、ここで、なされ、これらの例が、添付の図面に例示される。本発明は、例示的実施形態と関連して記載されるが、これらの例示的実施形態は、本発明をこれらの実施形態に限定することを企図しないことが理解される。逆に、本発明は、全ての代替物、改変物、および等価物をに及ぶことが企図され、これらは、特許請求の範囲によって規定されるような本発明に包含され得る。
【００２５】
（Ｖ．１  定義）
別段規定されない限り、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される：
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）と対形成する際に、ワトソン−クリック水素結合を形成することができる窒素含有複素環式部分を意味する。代表的核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基である、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、ならびに天然存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン（米国特許第５，９１２，３４０号）、イノシン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎ）、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウライシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン，Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、フェノキサジン、７−デアザプリン、プソイドイソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリン、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号）、ならびにエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ．３８５−３９４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ）である。
【００２６】
「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に連結する核酸塩基からなる化合物を意味する。このリボースは、置換されても、置換されなくともよい。置換リボース糖としては、以下のリボースが挙げられるが、これらに限定されない：１以上の炭素原子（例えば、２’−炭素原子）が、１以上の同一であるかまたは異なった、−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲＲ基、またはハロゲン基で置換され、ここでＲの各々が独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ５〜Ｃ１４アリールから選択される、リボース。糖としては、以下が挙げられる：リボース、２’−デオキシリボース、２，３−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、２’−Ｃ−アルキル、２’−アルキルリボース、（例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’および３’−４’で連結した二環式糖改変体ならびに他で「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」二環式糖改変体（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）。２’位置および３’位置での修飾は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アルオロキシ（ａｌｌｙｌｏｘｙ）、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモを含む。核酸塩基が、プリン（例えば、ＡまたはＧ）であるとき、このリボース糖は、この核酸塩基のＮ９位に結合する。この核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、Ｔ、またはＵ）である場合、このペントース糖は、核酸塩基のＮ１位に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。
【００２７】
「ヌクレオチド」は、モノマー単位として、または核酸中の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドは、時折に「ＮＴＰ」として称され、または、特にリボース糖の構造的特徴を指し示すため、「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として示される。「ヌクレオチド５’トリホスフェート」とは、５’位にトリホスフェートエステルを有するヌクレオチドをいう。このトリホスフェートエステル基は、種々の酸素について硫黄置換を含み得る（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−トリホスフェート）。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そして、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合によって連結された、ヌクレオチドモノマーの１本鎖および２本鎖のポリマーを意味し、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはヌクレオチド間アナログ、および会合している対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、など）を含む。ポリヌクレオチドは、全体が、デオキシリボヌクレオチドから、全体がリボヌクレオチドから、または、それらのキメラ混合物からなり得る。ポリヌクレオチドは、塩基間ヌクレオチド、核酸塩基および糖アナログから構成され得る。ポリヌクレオチドは、サイズにおいて、代表的には、数個（例えば、５〜４０）のモノマー単位（これらが、しばしば、オリゴヌクレオチドと称される場合）から数千のモノマーヌクレオチド単位に及ぶ。別段指摘されない限り、いかなるポリヌクレオチドが表されている場合はいつでも、ヌクレオチドは、左側から右側へと、５’から３’への順序であることが理解され、ならびに、別段指摘されない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示すこと、「Ｃ」がデオキシシチジンを示すこと、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示すこと、そして「Ｔ」がデオキシチミジンを示すことが理解される。
【００２９】
「保護オリゴヌクレオチド」は、合成手段（例えば、固体支持体上での自動化された合成のホスホラミダイトヌクレオシド法）により調製された任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、これは、官能基上に１つ以上の保護基（例えば、核酸塩基の環外のアミン、ヌクレオチド間リン酸結合またはヒドロキシルもしくはアミノの５’末端）を含む。保護基の用語は、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９９）によって教示された一般的ストラテジーに従う。
【００３０】
用語「核酸アナログ」は、１つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含み、そして核酸に関連した質および特徴（例えば、ワトソン／クリック、ウォッブル（ｗｏｂｂｌｅ）およびフォッグスティーン塩基対合（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）ならびに他の配列認識効果）のいくつかを有する核酸のアナログをいう。核酸アナログは、改変された核酸塩基部分、改変された糖部分、および／または改変された核間結合を有し得る（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ（１９９１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３−２９）。改変は標識を含む。核酸アナログの１つの種類（例えば、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル、およびメチルホスホネートオリゴヌクレオチド）は、核間部分が天然に存在するように改変され、そして中性ｐＨまたは中性ｐＨ付近で荷電されず、ここで、非結合酸素原子の１つは、中性の置換基（例えば、−ＮＲ２、−ＯＲ、−Ｒ）によって置換される。核酸アナログの別の種類は、糖および核間部分が荷電していない中性のアミド骨格（例えば、モルホリノ−カルバメートおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）で置換されている。ＰＮＡの形態は、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミド骨格ポリマーである（Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９１）。ＰＮＡ配列を説明するときはいつでも、アミノ末端は左側に、そしてカルボキシル末端は右側であることが理解される。
【００３１】
「脱保護試薬」は、液体状態または気体状態の任意の試薬または処方物を意味し、これは、化学反応によって保護されたオリゴヌクレオチドから保護基を除去するか、あるいは固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断する。
【００３２】
「固体支持体」は、任意の粒子、ビーズまたはオリゴヌクレオチドの合成が生じる表面を意味する。
【００３３】
「活性メチレン化合物」は、炭素に結合し、かつ基底状態（代表的には、約６〜２０のｐＫａを有する）下で除去し得る酸性プロトンを有する任意の有機試薬を意味する。
【００３４】
用語「切断する」および「切断」は、固体支持体にオリゴヌクレオチドを結合する共有結合を破壊することをいう。
【００３５】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドに結合し得る任意の部分を意味し、そして以下に対して機能する：（ｉ）検出シグナルの提供；（ｉｉ）第１の標識または第２の標識（例えば、ＦＲＥＴ）によって提供される検出シグナルを調節するために第２の標識との相互作用（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションの安定化（すなわち、二重鎖の形成）；（ｉｖ）モビリティーへの影響（例えば、電荷、疎水性、形状、または他の物理学的パラメーターによる電気泳動移動度または細胞浸透性）、あるいは（ｖ）捕捉部分の提供（例えば、親和性、抗体／抗原またはイオン錯化）。
【００３６】
用語「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）、リンカー（ＬＩＮＫＥＲ）および結合（ｌｉｎｋａｇｅ）は、交換可能に使用され、そして共有結合、あるいは原子の鎖（共有結合するか、あるいは標識をポリヌクレオチドに、一方の標識を別の標識に、または固体支持体をポリヌクレオチドもしくはヌクレオチドに結合される）を含む化学的部分を意味する。
【００３７】
「結合部分」は、化学的反応基、置換基または共有結合もしくは結合を形成するために、別の分子と反応し得る部分（例えば、求核または求電子）を意味する。
【００３８】
「置換（される）」とは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子、官能基または部分で置換される分子をいう。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ２であり、一方置換窒素は−ＮＨＣＨ３である。例示的な置換基は、ハロ（例えば、フッ素および塩素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族，複素環、水溶性基および結合部分）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「アルキル」は、飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖、分枝または環式の炭化水素ラジカル（親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一炭素原子から１つの水素原子の除去によって誘導される）を意味する。代表的なアルキル基は、１〜１２の飽和および／または不飽和の炭素（メチル、エチル、プロピル、ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない）からなる。
【００４０】
「アルコキシ」は、−ＯＲを意味し、ここで、Ｒは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである。
【００４１】
「アルキルジイル」は、飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖または環式の１〜２０個の炭素原子の炭化水素ラジカル（親アルカン、アルケンまたはアルキンの、同一または異なる２つの炭素原子から２つの水素原子の除去によって誘導される２つの一価のラジカル中心を有する）を意味する。代表的なアルキルジイル基としては、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルイジル、１，４−ブチルジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
「アリール」は、親芳香環系の単一炭素原子から１つの水素原子の除去によって誘導される６〜２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。代表的なアリール基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されたラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
「アリールジニル」は、共役共鳴電子系および親アリール化合物の異なる２つの炭素原子から２つの水素原子の除去によって誘導される少なくとも２つの一価のラジカル中心を有する、６〜２０個の不飽和の環式または多環式炭化水素を意味する。
【００４４】
「複素環」は、環に、少なくとも１つの非炭素原子を有する任意の環系を意味する。
【００４５】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」および「置換アリールジイル」は、それぞれアルキル、アルキルジイル、アリールおよびアリールジイルを意味し、ここで、１つ以上の水素原子は、互いに独立して、別の置換基と置換される。代表的な置換基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：−Ｘ、−Ｒ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−＋ＮＲ３、−Ｎ＝ＮＲ２、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ２＋、−Ｎ３、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＣＯ２−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ２、ここで、各Ｘは、独立して、ハロゲンであり、そして各Ｒは、独立して−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１４アリール、複素環、あるいは結合基。
【００４６】
「核間アナログ」は、以下のようなオリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナログを意味する：（ｉ）アルキルホスホネート（例えば、Ｃｌ〜Ｃ４アルキルホスホネート、特に、メチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホラミダイト；（ｉｉｉ）アルキルホスホトリエステル（例えば、Ｃｌ〜Ｃ４アルキルホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオネート；および（ｖ）ホスホロジチオエート。核間アナログはまた、非ホスフェートアナログを含み、ここで、この糖／リン酸サブユニットは、骨格構造を含む非リン酸によって置換される。非リン酸オリゴヌクレオチドアナログの１つの型は、一般にＰＮＡと称される、２−アミノエチルグリシン単位のようなアミド結合を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００）。
【００４７】
「水溶性基」は、水溶液中の本発明の化合物の溶解度を増加させる置換基を意味する。例示的な水溶性基としては、四級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、ポリエステル、ポリヒロドキシルおよびボロネートが挙げられるが、これらに限定されない。
「アレイ」は、固体支持体上または管のアライメント内に存在するオリゴヌクレオチドの予め決定された空間的アライメントを意味する。
【００４８】
（Ｖ．２  オリゴヌクレオチド合成）
本発明の試薬および方法によって切断され、そして脱保護されるオリゴヌクレオチドは、以下を用いるホスホラミダイト法によって固体支持体上で合成され得る（米国特許番号第４，４１５，７３２号および同第４，９７３，６７９号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１）：（１）３’ホスホラミダイトヌクレオシド、Ｉ（２）支持体、例えば、シリカ、制御された有孔のガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（米国特許番号第４，４５８，０６６号）およびポリスチレン（米国特許番号第５，０４７，５２４号および同第５，２６２，５３０号）、ならびに（３）自動化合成機（Ｍｏｄｅｌｓ  ３９２，３９４，３９４８，３９００  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。他の支持体材料としてはポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタアクリレートポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはこれらのコポリマーおよび移植片が挙げられる。
【００４９】
概して、ホスホラミダイト法の合成は、効率的でかつ迅速な結合および出発ヌクレオチドモノマーの安定性の理由から、好ましい。この方法は、オリゴヌクレオチド鎖が固体支持体上で成長するために、最も一般的には、３’側から５’側方向において、３’末端ヌクレオシドが結合による合成開始では固体支持体に結合されるために、モノマー（例えば、構造Ｉ）の環状付加を伴う。この結合としては、代表的に、塩基変動性の官能基（例えば、スクシネート、ジグリコレート、オキサレートまたはヒドロキノン−ジアセテート（Ｐｏｎ（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３６２９−３５））が挙げられ、そしてアンモニア、アミン、カーボネート、水酸化物および他の試薬によって切断される。３’ホスホラミダイトヌクレオシドモノマー単位は、市販されており、そして一般構造Ｉ：
【００５０】
【化５】
2004521628.tif 000005
を共有し、ここで、Ｒ１は、保護基または置換基（例えば、２−シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリールおよび置換アリール）であり、；Ｒ２およびＲ３は、アミン置換基（例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキルおよびアリール）であり、；Ｒ４は、環外の窒素保護基（例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、フタロイル（米国特許番号第５，９３６，０７７号）、２−（４−ニトロ−フェニル）エチル、ペント−４−エノイル、ジメチルホルムアミジン（ｄｍｆ）、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンであり；そしてＲ５は、酸不安定保護基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、４−メトキシトリトル（ＭＭＴ）、ピクイル（ｐｉｘｙｌ）、トリチルおよびトリアルキルシリル）である。あるいは、オリゴヌクレオチドは、５’側から３’側方向に合成され得れ、ここで、５’側はホスホラミダイトヌクレオシドモノマー（例えば、５’にホスホラミダイト基）を有し、そして３’側は保護基を有する（Ｗａｇｎｅｒ（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６：１６５７−６０）。
【００５１】
本発明の試薬および方法を用いる切断および脱保護は、固体支持体へのより不安定な結合およびより不安定な保護基を用いてオリゴヌクレオチド上で実行され得る。より不安定な核酸塩基保護基は、市販されている（例えば、フェノキシアセチル型：ＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ（Ｓｉｎｈａ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：１３−２３；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＰＡＣホスホラミダイトＴＭ（米国特許番号第４，９８０，４６０号；Ｓｃｈｕｌｈｏｆ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３９７−４１６；Ｓｃｈｕｌｈｏｆ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３１９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ならびにホルムアミジンおよびアセトアミジン（ＭｃＢｒｉｄｅ（１９８６）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：２０４０−４８；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：８０３１−３６；Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １２：１０３３−４６）。これらの不安定な保護基は、最初の生成セットよりも有意に速く脱保護される。例えば、このセット（ＡｂＺ、ＣｂＺ、Ｇｄｍｆ、Ｔ（ＦａｓｔｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅＴＭ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））は、完全な脱保護のために濃水酸化アンモニウム中で、６５℃でたった１時間だけを必要とする。
【００５２】
本発明は、結合を通して任意の固体支持体に共有結合されるオリゴヌクレオチド上で実施され得る。この固体支持体は、オリゴヌクレオチドが結合または合成され得る任意の配置、容積またはスケールにおいて、任意の材料であり得る。代表的な固体支持体としては、ビーズまたは高度に架橋結合したポリスチレンの粒子（米国特許第５，０４７，５２４号；同第５，２６２，５３０号）、あるいは制御された有孔性ガラスが挙げられる。空間的に、固体支持体は、平均直径約１〜１００μｍであり得、そして単分散または広範な大きさおよび形状であり得る。これらのビースまたは粒子は、注入開口部および排出開口部を有するカラム内に封入され得る。ホスホラミダイトの合成法を実行するための試薬は、自動化合成機上に取り付けたカラムに流入され得る。あるいは、固体支持体は、多孔性膜、フィルター、フリットまたは他の流入デバイス、または類似する試薬の流れを実行する流入形状であり得る。
【００５３】
あるいは、固体支持体は、不浸透性、剛体有機ポリマー（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリカーボネート、およびそれらのコポリマー）であり得る。なお別の固体支持体は、非多孔性の平面材料（例えば、ガラス、石英またはダイヤモンド（ＥＰ  １０６３２８６））であり得る。適切な材料としてはまた、金属（例えば、アルミニウム、金、白金、銀、銅などまたはそれらの合金）が挙げられる。これらの金属は、固体ブロックまたは表面（層を含む）であり得る。これらの金属は、スライド、薄板、平面、またはディスクの形状（ＷＯ  ０１／０１１４２）において、少なくとも１つの実質的に平面を有し得る。１つの実施形態において、ガラスのようなブロック材料は、金属層または薄膜（例えば、金、銀、銅または白金）でコートされる。金属薄膜の堆積は、電子ビームエバポレーションのような方法によって実施され得る。この金属層は、オリゴヌクレオチドが結合される反応性官能基で誘導体化される。例えば、金層は、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端へのジスルフィド結合で誘導体化され得る。
【００５４】
無機固体支持体（例えば、ガラス、制御された有孔性ガラス、シリカゲル）は、代表的にシラン試薬（例えば、アミノアルキル−トリアルコキシシランまたはメルカプトアルキル−トリアルコキシシラン、これらはそれぞれアミノ官能基およびチオール官能基を生じる）で誘導体化され得る。次いで、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド合成のための出発ヌクレオシド、または一般的な支持試薬は、アミノまたはチオールで誘導体化される固体支持体に共有結合される。
【００５５】
オリゴヌクレオチドが合成または結合され得る固体支持体表面のアレイは、並行様式または経時的な形式において、本発明の方法および試薬を用いる切断または脱保護を実行し得る。アレイに関する保護したオリゴヌクレオチドの１つまたはサブセットは、マスキング、標的化した試薬の送達、または試薬への曝露に指向させる他の手段によって選択的に切断され、そして脱保護され得る（Ｆｏｄｏｒ，米国特許第５，４４５，９３４号）。
（Ｖ．３  オリゴヌクレオチドの切断方法および脱保護方法）
合成が完成する際、固体支持体結合オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと固体支持体との間の共有結合の化学的切断により支持体から除去され、オリゴヌクレオチドから残存する全ての保護基（核塩基からのＰおよびヌクレオチド間結合からのシアノエチルを含む）を除去するために脱タンパク質化される。切断および脱保護の工程は、Ｐがアミド型保護基であり、そしてリンカーがエステル（構造ＩＩ）の場合、同一の試薬（例えば、濃水酸化アンモニウム）を用いて同時発生し、そして実行され得る。あるいは、切断および脱保護の工程は、「直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）」試薬を用いて、個々に実行され得る。例えば、リンカーがジスルフィドである場合、核酸塩基Ｐおよびリン酸保護基は、水酸化アンモニウムを用いて保護したオリゴヌクレオチドから除去され得、そして脱保護したオリゴヌクレオチドは、固体支持体に結合されたままである。対照的に、同一の保護したオリゴヌクレオチドは、ジチオスレイトールのようなジスルフィド選択的切断試薬を用いて、そのインタクトな保護基で個体支持体から切断され得る。切断および脱保護の正味の結果は、保護したオリゴヌクレオチドＩＩおよび切断および脱保護したオリゴヌクレオチドＩＩＩの構造：
【００５６】
【化６】
2004521628.tif 000006
によって例示され得る。
【００５７】
本発明の１つの実施形態において、保護したオリゴヌクレオチドの３’末端は、構造ＩＩ（５〜約１００のヌクレオチドのうち２つのヌクレオチドを示す）によって示される。これらの核酸塩基は、塩基不安定な保護基Ｐで保護されている。例示的なセットは、ＡｂＺ、ＧｉｂＵ、ＣｂＺおよびＴである。核間リン酸基は、２−シアノエチル、メチルまたはいくつかの他の保護基によって保護され得る。３’末端は、構造ＩＩにおいて、結合（ｌｉｎｋａｇｅ）、リンカーによって固体支持体Ｓに結合される。結合としては、塩基不安定な官能基（例えば、エステル、カルバメートまたはホスフェート）が挙げられる（ＥＰ  ８３９  ８２９）。代表的な３’のエステルは、スクシネート、ジグリコレート、オキサレートまたはヒドロキノン−ジアセテートである。合成後、保護したオリゴヌクレオチドは、本発明の脱保護試薬と反応され、核酸塩基保護基であるＰおよび核間ホスフェート保護基である２−シアノエチルの除去をもたらす。同時にか、または個々に、３’末端結合は、固体支持体からオリゴヌクレオチドを分離するために切断され、最終的に切断および脱保護したオリゴヌクレオチド（構造ＩＩＩによって示される）を生じる。
【００５８】
別の実施形態において、結合は、切断されないように（すなわち、合成および脱保護の工程の間の切断に耐性であるように）選択される。切断されない結合は、官能基の不活性型（例えば、アミド、アルキル、ホスフェートまたはエーテルの官能基）を含み得る。切断されない結合を用いて合成したオリゴヌクレオチドは、本発明の試薬および方法によって脱保護され得、そして固体支持体形状（例えば、バイオチップ、ＤＮＡチップまたはアレイ）で使用され得る。この固体支持体形状には、多くの脱保護されたオリゴヌクレオチドが固体基板上に固定される。従って、オリゴヌクレオチドに結合した剛体またはマトリクスの固体支持体は、既知の配置に、および相補的核酸または他の試薬、光、レーザー、電流または検出装置によってアドレス可能に配列され得る。
【００５９】
別の実施形態において、固体支持体への連結は、選択的に切断可能（すなわち、合成および脱保護工程の間は切断に対して抵抗性であるが、他の試薬または条件により切断可能）であるよう選択される。固体支持体への連結は、Ｃ−ＳｉまたはＯ−Ｓｉ結合を含む場合に選択的に切断可能であり得、フッ化物陰イオン試薬（フッ化テトラブチルアンモニウムまたはフッ化水素トリエチルアンモニウム）を用いて実施される。連結は、ジスルフィド−Ｓ−Ｓ−官能基を含む場合に選択的に切断可能であり得、ジチオトレイトールまたは他のジスルフィド切断試薬によって切断され得る。連結は、オルト−ニトロベンジル基を含む場合に選択的に切断可能であり得、光分解条件下で切断される。
【００６０】
本発明の驚くべきであり、予想されなかった局面は、活性メチレン試薬およびアミン試薬を含む脱保護試薬がオリゴヌクレオチドの切断および脱保護に有効であり、役立つことである。本発明の新規の脱保護試薬および方法は、オリゴヌクレオチド（それらの共有結合した標識を含む）の汚染および改変を引き起こす望まない副反応を最小限に抑え得る。アミン試薬は、求核試薬として作用して保護基を置換し、そして活性メチレン化合物は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド上の任意の標識を改変するようさらに反応し得る特定の中間体と反応するかまたはそれらを不活性にするように作用する。他の機構が起こり得、そして他の利益が、本発明の脱保護試薬の使用から生じ得る。
【００６１】
１つの実施形態において、アミン試薬および活性メチレン化合物は、一緒に混合されて、保護されたオリゴヌクレオチドの保護基を除去するために適用され得る脱保護試薬を提供する（実施例１〜３）。この反応は、室温または上昇した温度で実施され得る。保護されたオリゴヌクレオチドが連結を通して固体支持体に共有結合されている場合、保護基を除去するプロセスは、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去と同時に起こり得る。切断後、切断されたオリゴヌクレオチドは、フリットもしくはメンブレンを通した濾過またはデカンテーションにより固体支持体から分離され得る。切断されたオリゴヌクレオチドはさらに、上昇した温度の下でかまたは保護基の除去を補助する他の試薬の添加により脱保護され得る。脱保護が完了した場合、脱保護されたオリゴヌクレオチドは、従来の周知の手段（例えば、エバポレーション、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、または疎水性カートリッジ手順）により脱保護試薬から分離され得る。脱保護試薬中の１つ以上の化合物は、気体流または真空下でのエバポレーションにより除去されるように十分に揮発性であり得る。
【００６２】
アミン試薬は、液体処方物中にてかまたは気体状態で使用され得る（Ｂｏａｌ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３１１５−１７）。特定のアミンは、室温および圧力にて気体であり（例えば、アンモニア（ｂｐ＝−３３℃））、そしてオリゴヌクレオチド保護基を除去し、切断を実行するのに有効である（Ｋｅｍｐｅ、米国特許第５，５１４，７８９号）。保護されたオリゴヌクレオチドは、密閉された、加圧された空間、容器、またはボンベ中でアンモニア気体と接触され得る。アンモニアは、加圧された容器から気体として導管を通して送達され得る（Ｋｅｍｐｅ、米国特許第５，７３８，８２９号）かまたは保護されたオリゴヌクレオチドもまた含む密閉された空間内で水酸化アンモニウム水溶液から生成され得る。後者の実施形態において、アンモニア気体またはアンモニアおよび水の蒸気は、開放された容器の包囲された空間（例えば、フラスコの皿）における水酸化アンモニウム水溶液の内包により生成され得る。試薬の気体状態は、包囲された空間内の温度が上昇することにより、濃度において増加する（実施例６）。
【００６３】
別の実施形態において、活性メチレン化合物は、アミン試薬の前にかまたはアミン試薬を含む混合物中にて保護されたオリゴヌクレオチドと接触し得る。１つの実施形態において、活性メチレン化合物および溶媒は混合され、保護されたオリゴヌクレオチドが共有結合されている固体支持体を湿らすために使用される。十分な量の混合物が、固体支持体を覆うかまたはその表面を湿らすために（例えば、フロースルー容器（例えば、カラム）において）送達される（実施例６）。アミン試薬は、固体支持体付近に送達され、十分な量の活性メチレン試薬が保持されることを確実にする。従って、活性メチレン試薬の副作用抑制利益は、試薬の連続的な送達により実現される。
【００６４】
（Ｖ４．オリゴヌクレオチドの切断および脱保護のための試薬）
オリゴヌクレオチドは、活性メチレン化合物およびアミン試薬を含む本発明の新規試薬により切断および／または脱保護され得る。活性メチレン化合物は、塩基性条件下（代表的には、約６〜２０のｐＫａ）で除去可能な炭素に結合した酸性プロトンを保有する有機試薬を含む。活性メチレン化合物は、脱保護試薬の１〜１０体積％を構成し得る。活性メチレン化合物は、以下の構造：
【００６５】
【化７】
2004521628.tif 000007
により表される。ここで、炭素基の酸性度は、電子求引基（ＥＷＧ）により増加される。酸性炭素上の他の置換基（Ｒ）は、第２または第３の電子求引基、水素、アルキル、アリール、またはｐＫａ＝約６〜２０の範囲でプロトンを酸性にする任意の官能基であり得る。電子求引基としては、ニトロ、ケトン、エステル、カルボン酸、ニトリル、スルホン、スルホネート、スルホキシド、ホスフェート、ホスホネート、ニトロキシド、ニトロソ、およびトリフルオロメチルが挙げられる。電子求引基としてはまた、１つ以上のニトロ基、ケトン基、エステル基、カルボン酸基、ニトリル基、スルホン基、スルホネート基、スルホキシド基、ホスフェート基、ホスホネート基、ニトロキシド基、ニトロソ基、およびトリフルオロメチル基で置換されたアリール基が挙げられる。活性メチレン化合物の有用なクラスとしては、以下が挙げられる：（ｉ）１，３ケト−エステル（例えば、エチルアセトアセテート）；（ｉｉ）１，３ジケトン（例えば、２，４−ペンタンジオンおよびシクロヘキサンジオン）、（ｉｉｉ）マロネート誘導体（例えば、マロノニトリル、マロン酸、マロンアミド、およびジアルキルマロネートジエステル）。ジアルキルマロネートジエステルとしては、ジメチルマロネート、ジエチルマロネート（ＤＥＭ）、ジ−ｎ−プロピルマロネート、およびジイソプロピルマロネートが挙げられる。
【００６６】
活性メチレン化合物の濃度の効果を、０％、０．１％、１％、および３％のジエチルマロネートを含有する４つのエタノール性アンモニア（１５％エタノール：濃ＮＨ４ＯＨ）試薬を用いて調査した（実施例２ａ〜２ｄ）。４つの試薬各々を用いて蛍光色素、消光部分、および小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）で標識されたオリゴヌクレオチドの一部を切断および脱保護した（実施例３）。逆相ＨＰＬＣによる分析は、活性メチレン化合物を含まない試薬（０％  ＤＥＭ）における有意な混入による汚染を示した。０．１％  ＤＥＭの存在により、この汚染の大部分が消滅した。１％および３％の存在は、本質的に全ての後で溶出する汚染を消滅させた。
【００６７】
活性メチレン化合物が溶媒に溶解され、そしてアミン試薬処理の前に、保護されたオリゴヌクレオチドが共有結合された固体支持体を湿らすために使用される１つの実施形態において、溶媒は、アルコール、エーテル、アミド、アセトニトリル、ジクロロメタン、またはジメチルスルホキシドから選択され得る。アルコール溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、または１，２−エチレングリコールが挙げられる。エーテル溶媒としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、または１，２−ジメトキシエタンが挙げられる。アミド溶媒としては、アセトアミド、ホルムアミド、ベンズアミド、またはジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００６８】
アミン試薬は、気体状態において使用されるか、または固体支持体上のオリゴヌクレオチドを処理するための溶液として水に溶解され得る。アミン試薬の組成は、保護されたオリゴヌクレオチドと反応して保護基を除去する第一級アミン基、第二級アミン基、または第三級アミン基を有する任意の試薬を含む。従って、アミン試薬としては、以下が挙げら
れる：（ｉ）アンモニア（ＮＨ３）ガス；（ｉｉ）水または水とアルコール溶媒との混合物中に水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）として溶解されたアンモニア；（ｉｉｉ）アルキルアミン、Ｒ２ＮＨ、およびＲＮＨ２（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルである）；（ｉｖ）アルキルジアミンおよびアリールジアミン、Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ２０アルキルジイルまたはＣ６〜Ｃ２０アリールジイルである）；（ｖ）ホルムアミジン（例えば、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）および１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン（ＤＢＮ））。
【００６９】
アルコール溶媒としては、メタノール、エタノール、エチレングリコール、イソプロパノール、および試薬の溶解、固体支持体の加湿、反応速度の増加、または副反応の最小化を補助する他のヒドロキシル含有試薬が挙げられる。アルコール溶媒は、脱保護試薬の１〜３０体積％を構成し得る。
【００７０】
アミン試薬は、密閉系または密閉環境においてオリゴヌクレオチドを有する溶液から生成された気体状態でオリゴヌクレオチドと接触され得る。例えば、固体支持体に結合された保護されたオリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウム溶液の開放容器をさらに含む容器中に密閉され得る。この容器は、シールされ得るか、または大気に対して開放され得る。シールされる場合、この容器は、ボンベ装置の様式で加熱され得る。従って、アンモニア蒸気は、オリゴヌクレオチドと接触し得、そして保護基を除去し得る。あるいは、アミン試薬は、オリゴヌクレオチドを含むカラムまたは容器を通されるかまたはそれらに送達され得る。例えば、アミン試薬は、自動合成機に導入され、そしてプログラムされた試薬送達の一部としてカラムに送達され得、カラムの入口および出口開放部を通過して流れ得る。活性メチレン試薬は、アミン試薬の前に、またはアミン試薬との混合物として、オリゴヌクレオチドを含む容器に送達され得る。
【００７１】
オリゴヌクレオチドが合成される１つ以上のカラムは、本発明の脱保護方法が実行され得るホルダー装置（例えば、マイクロタイターウェルトレイ）に配置さえ得るかまたはホルダー装置に移され得る。ホルダーは、脱保護試薬もまた配置または送達される、密閉可能な容器中に囲まれ得る。例えば、カラムの固体支持体上に保護されたオリゴヌクレオチドを含むホルダーは、ステンレス綱圧力容器においてシールされ得る。脱保護試薬は、シールの前に容器中に配置され得るか、または導管を通して容器中に送達され得る。この一般的な様式において、複数の（例えば、数個の、または数百の）オリゴヌクレオチドは、同時に切断および脱保護され得る。あるいは、カラムの１つより多いホルダーは、この容器中にシールされ得る。また、ホルダーは、手動での介入またはプログラムされたロボット手段によって、連続的に導入および処理され得る。
【００７２】
（Ｖ．５  標識されたオリゴヌクレオチド）
本発明の新規試薬および方法により切断および脱保護されるオリゴヌクレオチドは、標識試薬と結合され、「標識」され得る。このような結合体は、ＤＮＡ配列決定用プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチド連結プローブ、二重標識５’−エキソヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎＴＭ）プローブ、電気泳動用サイズスタンダード（すなわち、「レーンスタンダード」または「レーンマーカー」）などとしての有用性を見出し得る（米国特許第４，７５７，１４１号；Ａｄｎｒｕｓ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐｐ．３９−５４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｐｐ．４０−５５、６４３−７１；Ｍｕｌｌａｈ（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１）。
【００７３】
特定の標識は、蛍光、化学発光、または電気化学的発光による標識されたオリゴヌクレオチドの検出のためにシグナルを提供する（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ｐｐ．３−２８）。オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な蛍光色素として、フルオレセイン、ローダミン（米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，００８，３７９；同第６，１９１，２７８号）、エネルギー移動色素（米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号）およびシアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９）が挙げられる。フルオレセイン色素の例として、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ、米国特許第５，１１８，９３４号）が挙げられる。蛍光は、大部分が、多くの連結実験および用途（例えば、オリゴヌクレオチド連結アッセイおよび他のインビトロでのＤＮＡプローブに基づく診断試験）の好ましい検出方法として放射活性にとって代わる。
【００７４】
標識の別のクラスとして、蛍光消光剤が挙げられる。消光剤の発光スペクトルは、近接する分子内蛍光色素または分子間蛍光色素と重複し、その結果、蛍光色素の蛍光は、蛍光共鳴エネルギー移動「ＦＲＥＴ」の現象によって実質的に消去されるかまたは消光される（Ｃｌｅｇｇ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３−３８８）。本発明におけるＦＲＥＴの例は、オリゴヌクレオチドが蛍光色素および蛍光消光剤で標識される場合である。特定の消光剤として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群より選択されるローダミン色素；（ｉｉ）ジアゾ化合物（例えば、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ（Ｍａｔａｙｏｓｈｉ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９５４−５８；Ｔｙａｇｉ、ＷＯ９５／１３３９９）、Ｆａｓｔ  Ｂｌａｃｋ（Ｎａｒｄｏｎｅ、米国特許第６，１１７，９８６号）；（ｉｉｉ）シアニン色素（Ｌｅｅ、米国特許第６，０８０，８６８）、および（ｉｖ）他の発色団（例えば、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物など）。
【００７５】
エネルギー移動色素は、オリゴヌクレオチド標識の別の型である。エネルギー移動色素標識として、アクセプター色素に連結されたドナー色素が挙げられる（米国特許第５，８００，９９６）。第１の波長の光（例えば、レーザー由来）は、ドナー色素（例えば、ＦＡＭ）によって吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素によって吸収される励起エネルギーを発する。アクセプター色素は、第２の長波長の蛍光を発する。エネルギー移動標識のドナー色素およびアクセプター色素は、ドナー色素（例えば、ＦＡＭ）の４’または５’位とアクセプター色素の５−カルボキシ基または６−カルボキシ基を連結する連結により結合され得る。他の剛性または非剛性の連結が有用であり得る。
【００７６】
金属ポルフィリン錯体（例えば、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネート（Ｓｔａｎｔｏｎ、ＷＯ８８／０４７７７）および化学発光化合物（例えば、１，２−ジオキセタン化学発光部分（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、米国特許第４，９３１，２２３号）は、有用なオリゴヌクレオチド標識の他の例である。
【００７７】
標識（本明細書中で、ハイブリダイゼーション安定化部分と呼ばれる）の別のクラスとして、小溝結合剤（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．およびＧａｉｔ，Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐ３３７−４６）、インターカレート剤、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミン）、および架橋した官能基が挙げられるがこれらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対形成の安定性（すなわち、親和性）またはハイブリダイゼーション速度（二重鎖の高温溶解温度（Ｔｍ）により例示される）を増加させ得る。ハイブリダイゼーション安定化部分はまた、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列（得られる二重鎖は、１つ以上のワトソン／クリックの塩基対形成の不一致を含む）との間のＴｍにおける大きな差違により示される、塩基対形成の特異性を増加させ得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．およびＧａｉｔ，Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１５〜８１）。ハイブリダイゼーションの特異性および親和性を増強する標識（例えば、小溝結合剤および親和性リガンド標識）が望ましい。ビオチンおよびジゴキシゲニンは、オリゴヌクレオチドの捕捉および単離のための有用な親和性リガンド標識である。小溝結合剤としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＣＤＰＩ１〜３（米国特許第６，０８４，１０２号；ＷＯ９６／３２４９６；Ｋｕｔｙａｖｉｎ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：６５５−６１）、ネトロプシン、およびジスタマイシンが挙げられる。他の有用な標識としては、電気泳動移動度変更剤（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、アミノ酸、ペプチド、および酵素が挙げられる。
【００７８】
標識されたオリゴヌクレオチドは、以下の式ＩＶ：
【００７９】
【化８】
2004521628.tif 000008
を有し得る。ここで、オリゴヌクレオチドは、２〜１０００ヌクレオチドを含む。標識は、保護形態または非保護形態の蛍光色素であり、代表的なクラスの標識であり、これには、エネルギー移動色素が挙げられる。Ｂは任意の核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）である。Ｌは連結（例えば、プロパルギルアミン（米国特許第５，０４７，５１９号；同第５，７７０，７１６号；同第５，８２１，３５６号；同第５，９４８，６４８号））である。Ｒ６はＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、保護されたヒドロキシル、トリアルキルシリルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２である。Ｒ７は、Ｈ、ホスフェート、インターヌクレオチドホスホジエステル（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、またはインターヌクレオチドアナログ（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇ）である。Ｒ８は、Ｈ、ホスフェート、インターヌクレオチドホスホジエステル、またはインターヌクレオチドアナログである。この実施形態において、核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＩＶは、核酸塩基を通して結合された複数の標識を保有し得る。核酸塩基標識オリゴヌクレオチドＩＶは、（ｉ）自動合成機によるヌクレオシドホスホルアミダイト試薬のカップリングまたは（ｉｉ）標識試薬の合成後カップリングにより形成され得る。５’末端に標識されたオリゴヌクレオチドは、以下の構造Ｖ：
【００８０】
【化９】
2004521628.tif 000009
を有する。ここで、ＸはＯ、ＮＨ、またはＳであり；Ｒ６はＨ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；Ｒ７は、Ｈ、ホスフェート、インターヌクレオチドホスホジエステル、またはインターヌクレオチドアナログであり；そしてＬは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルジイル、Ｃ６〜Ｃ２０アリールジイル、または１００個までのエチレンオキシ単位のポリエチレンオキシである。
【００８１】
種々の標識は、オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合され得る。標識を保有するかまたは合成後反応により標識され得る官能性を保有する固体支持体は、オリゴヌクレオチド合成のための固体支持体として使用され得る（米国特許第５，１４１，８１３号；同第５，２３１，１９１号；同第５，４０１，８３７号；同第５，７３６，６２６号）。このアプローチにより、標識または官能性は、オリゴヌクレオチドの合成の間、存在する。切断および脱保護の間、標識または官能性は、オリゴヌクレオチドに対して共有結合されたままである。３’末端で標識されたオリゴヌクレオチドは、以下の構造ＶＩ：
【００８２】
【化１０】
2004521628.tif 000010
を有し得る。
【００８３】
式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ中の結合Ｌは、標識（ＬＡＢＥＬ）上の任意の部位にて結合され得る。
【００８４】
標識化は、公知の標識、結合、連結基、標準試薬および反応条件、ならびに分析方法および精製方法を用いる、多数の公知の技術のいずれか１つを使用して、達成され得る。一般に、この標識およびオリゴヌクレオチドに連結する結合は、（ｉ）ハイブリダイゼーションを阻害するべきでも、（ｉｉ）酵素活性を阻害するべきでも、（ｉｉｉ）標識の特性（例えば、色素の蛍光をクエンチまたは漂白する特性）に悪影響を与えるべきでもない。オリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、ヌクレオチド間結合、および５’末端および３’末端を含む部位にて標識され得る。オリゴヌクレオチドは、これらの部位のいずれかで、反応性アミノ基、チオール基、スルフィド基、ジスルフィド基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基を有するように官能基化され得る。核酸塩基標識部位としては、一般に、プリンまたはデアザプリンの７−デアザ位またはＣ−８位、およびピリミジンのＣ−５位が挙げられる。この標識と核酸塩基との間の結合は、アセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合であり得る。代表的に、この標識上のカルボキシル基は、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）を形成することによって活性化され、そしてアルキニルアミノ誘導体化核酸塩基またはアルケニルアミノ誘導体化核酸塩基上のアミノ基と反応される。標識は、５’末端にて（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’  ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９〜５４）、自動化プロトコルの一部として、蛍光色素および他の標識（これらは、ホスホラミダイト試薬として官能基化されている）とともに、最も簡便でかつ効果的に導入される。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端の両方にて標識され得る。各末端は、１つ以上の標識を有し得る。例えば、実施例１〜４は、５’末端の蛍光色素および２つの標識、３’末端のクエンチャーＱおよび副溝結合剤ＣＤＰＩ３を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
合成オリゴヌクレオチドを標識するための第一の方法において、求核性官能基（例えば、第一級脂肪族アミン）が、オリゴヌクレオチド上の標識結合部位（例えば、５’末端）にて導入される。自動化した固体支持体合成が完了した後、このオリゴヌクレオチドは、支持体から切断され、そして全ての保護基が取り除かれる。この求核性オリゴヌクレオチドは、求電子性部分（例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）））を含む過剰な標識試薬と、均一な溶液条件下で反応される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１；Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’  ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４）。標識されたオリゴヌクレオチドＩＶ、ＶまたはＶＩは、色素の反応性結合基形態（例えば、ＮＨＳ）を、アミノ、チオールまたは他の求核試薬で官能基化されたオリゴヌクレオチドと反応させることによって形成され得る（米国特許第４，７５７，１４１号）。
【００８７】
第二の方法において、標識は、例えば、支持体試薬としてか（米国特許第５，７３６，６２６号および同第５，１４１，８１３号）または非ヌクレオシドホスホラミダイト試薬として、自動化合成の間かまたは自動化合成の前に、オリゴヌクレオチドに直接取り込まれる。特定の蛍光色素および他の標識は、５’標識化のためのホスホラミダイト試薬として官能基化されている（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９９−１００）。
【００８８】
ポリヌクレオチドは、電気泳動移動の速度に影響を及ぼす部分（すなわち、移動度改変標識（ｍｏｂｉｌｉｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｌａｂｅｌ））で標識され得る。移動度改変標識としては、ポリエチレンオキシ単位である−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−が挙げられ、ここで、ｎは、１〜１００であり得る（米国特許第５，６２４，８００号）。このポリエチレンオキシ単位は、リン酸基で散在され得る。別々の既知のサイズのポリエチレンオキシの標識で特異的に標識されるポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数とは実質的に無関係に、電気泳動による分離が可能である。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドが、スペクトルによって分解可能な色素標識および移動度改変標識の存在によって、識別され得る。色素標識と移動度改変標識との両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド構成要素のライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によって、酵素学的に形成され得る。
【００８９】
本発明は、特に、複数の標識および異なる標識を有するポリヌクレオチドを切断および脱保護するのに十分に適している。
【００９０】
（Ｖ．６  実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによって、さらに明らかになる。これらの実施例は、本発明を純粋に例示し、本発明の範囲をいかなる様式においても制限しないことが意図される。
【００９１】
（実施例１）
オリゴヌクレオチドＴ８−Ｑ−ＣＤＰＩ３：
５’ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号１）
を、Ｍｏｄｅｌ  ３９４８  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。８サイクルのホスホラミダイト化学を、クエンチャー標識Ｑおよび副溝結合剤標識ＣＤＰＩ３を含む１２μｍｏｌｅ／ｇｍの結合部で充填した１６ｍｇ（２００ｎｍｏｌｅ）の高架橋ポリスチレンビーズ支持体を含むカラム中で、チミジン３’ホスホラミダイトを用いて行った。このクエンチャー標識Ｑは、以下の構造を有する：
【００９２】
【化１１】
2004521628.tif 000011
ここで、Ｘは、結合のための結合部位である。この副溝結合剤標識ＣＤＰＩ３は、以下の構造を有する：
【００９３】
【化１２】
2004521628.tif 000012
ここで、Ｘは、結合のための結合部位である。
【００９４】
この支持体を、２つの部分に分けた。第一の部分を、１５％のエタノールアンモニア（１５：８５  ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）で、５５℃にて２時間処理し、切断および脱保護した。第二の部分を、１５％のエタノールアンモニアに溶解した３％マロン酸ジエチル（ＤＥＭ）（３：１５：８２  ｖ／ｖ／ｖ  ＤＥＭ：ＥｔＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）で、５５℃にて２時間処理した。
【００９５】
冷却した後、各部分からのアリコートを、逆相ＨＰＬＣによって分析した。この吸着剤は、Ｃ−１８ポリスチレン／ジビニルベンゼンの２〜５μｍの粒子であった。この移動相は、約ｐＨ７のＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）中のアセトニトリル勾配であった。（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＷＡＶＥ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。他の移動相、条件、およびＨＰＬＣ機器もまた、本発明の方法および試薬によって切断および脱保護されるオリゴヌクレオチドを分析するのに有用である。主な生成物ピークおよび主な（第一の）後期溶出汚染物質を、各アリコートから分離および単離した。ＤＥＭを用いずに切断および脱保護された、第一部分からの後期溶出汚染物質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）によって分析し、３４８５．５［Ｍ＋２６］の質量単位の質量を有することを見出した。この質量は、さらなるビニル基修飾（−ＣＨ２＝ＣＨ２）と一致する。各部分からのＨＰＬＣの主なピークを、予測されるような、３４５９．４１質量単位（ポジティブモード）での強い分子イオンピークからＴ８−Ｑ−ＣＤＰＩ３に割り当てた。
【００９６】
（実施例２）
オリゴヌクレオチドＴ１５−Ｑ−ＣＤＰＩ３：
５’ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号２）
を、Ｍｏｄｅｌ  ３９４８  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。１５サイクルのホスホラミダイト化学を、クエンチャー標識Ｑおよび副溝結合剤標識ＣＤＰＩ３を含む１２μｍｏｌｅ／ｇｍの結合部で充填した１６ｍｇ（２００ｎｍｏｌｅ）の高架橋ポリスチレンビーズ支持体を含むカラム中で、チミジン３’ホスホラミダイトを用いて行った。この支持体を、２つの部分に分けた。第一の部分を、１５％のエタノールアンモニア（１５：８５  ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）で、５５℃にて２時間処理し、切断および脱保護を有効にした。第二の部分を、１５％のエタノールアンモニアに溶解した３％マロン酸ジエチル（ＤＥＭ）（３：１５：８２  ｖ／ｖ／ｖ  ＤＥＭ：ＥｔＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）で、５５℃にて２時間処理した。冷却した後、各部分からのアリコートを、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＤＥＭを用いずに切断および脱保護された部分は、６．１分で溶出するたった２６．５％の所望生成物を含有する複合体生成混合物を示す（図１ａ）。この生成混合物には、有意な（５０％）後期溶出不純物が混入した。３％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、改善された純度（６．１分で溶出する７６．８％の所望の生成物、および低下したレベルの後期溶出不純物）を示す（図１ｂ）。
【００９７】
（実施例３）
５’末端にて、蛍光色素（Ｆ＝６−カルボキシフルオレセイン）で標識され、３’末端にて、クエンチャー部分（Ｑ）および副溝結合剤（ＣＤＰＩ３）で標識されたオリゴヌクレオチド：
５’Ｆ−ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号３）
５’Ｆ−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号４）
を、Ｍｏｄｅｌ  ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。ホスホラミダイト化学を、クエンチャー標識Ｑおよび副溝結合剤標識ＣＤＰＩ３を含む１２μｍｏｌｅ／ｇｍの結合部で充填した１６ｍｇ（２００ｎｍｏｌｅ）の高架橋ポリスチレンビーズ支持体を含むカラム中で、ヌクレオシド３’ホスホラミダイト（Ａｂｚ、Ｇｄｍｆ、ＣｂｚおよびＴを含む）を用いて行った。
【００９８】
各合成の後、この支持体を、４つの部分に分けた。各部分を、１５％エタノールアンモニア（１５：８５  ｖ／ｖ  ＥｔＯＨ：濃ＮＨ４ＯＨ）中、０％、０．１％、１％または３％のマロン酸ジエチル（ＤＥＭ）を含有する試薬で、６５℃にて２時間処理し、切断および脱保護した。
【００９９】
冷却した後、各部分からのアリコートを、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＤＥＭを用いずに切断および脱保護した部分は、それぞれ、配列番号３および配列番号４について、６．５分で溶出するたった２１．８％の所望生成物（図２ａ）、および６．４分で溶出するたった３２．７％の所望生成物（図３ａ）を含有する、複合体生成混合物を示す。この生成混合物には、有意な（５０％）後期溶出不純物が混入した。０．１％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、改善された純度（それぞれ、配列番号３および配列番号４について、６５．８％（図２ｂ）および６４．４％（図３ｂ）、ならびに低下したレベルの後期溶出不純物）を示す。１％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、それぞれ、配列番号３および配列番号４について、さらに改善された純度（７６．７％（図２ｃ）および７６．７％（図３ｃ））を示す。３％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、それぞれ、配列番号３および配列番号４について、さらに改善された純度（７９．５％（図２ｄ）および７７．５％（図３ｄ））を示す。
【０１００】
蛍光色素６−カルボキシフルオレセイン（Ｆ）は、以下の構造を有する：
【０１０１】
【化１３】
2004521628.tif 000013
ここで、Ｘは、結合のための結合部位である。
【０１０２】
（実施例４）
実施例３の手順に従って、１３ｎｔのオリゴヌクレオチド：
５’Ｆ−ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号５）
を合成し、その支持体を、２つの部分に分けた。一方の部分を、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨのみ、および１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨ中、３％  ＤＥＭで切断および脱保護した。各部分からのアリコートを、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＤＥＭを用いずに切断および脱保護した部分は、６．１分で溶出するたった２６％の所望生成物を含有する、複合体生成混合物示す（図４ａ）。この生成混合物には、有意な後期溶出汚染物質が混入した。３％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、改善された純度（６．１分で溶出する６７％の所望生成物、および低下したレベルの後期溶出不純物）を示す（図４ｂ）。
【０１０３】
（実施例５）
液相切断／脱保護：
４８までのオリゴヌクレオチドのセットを、Ｍｏｄｅｌ  ３９４８  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成した。各オリゴヌクレオチドを、約２０ｍｇの３’ヌクレオシド、ＯｎｅＳｔｅｐＴＭ合成／精製カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ａｎｄｒｕｓ，米国特許第５，９３５，５２７号および同第６，１７５，００６号；Ｂａｉｅｒ（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：２９８−３０３）中の高架橋ポリスチレンに対して、５０〜１００ｎｍｏｌｅスケールにて、合成した。オリゴヌクレオチドは、１５〜５０ｎｔまたはそれより長くてもよい。オリゴヌクレオチドは、標識されなくても、蛍光色素またはハイブリダイゼーション安定化部分のような標識で標識されてもよい。アセトニトリル中に溶解し、プロトン供給源アクチベータとしてテトラゾールまたはテトラゾールアナログ（例えば、５−エチルチオテトラゾール）を有する増大オリゴヌクレオチドの５’末端に結合した、３’ホスホラミダイトヌクレオシドのＦａｓｔＰｈｏｒａｍｉｄｉｔｅＴＭセット（Ａｂｚ、Ｇｄｍｆ、ＣｂｚおよびＴ）を用いて、合成を行った。合成をプログラム化して、酸脱トリチル化（ａｃｉｄｉｃ  ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）によって、オリゴヌクレオチドの５’末端から５’ＤＭＴ基を取り除き得るか、または脱トリチル化の最終工程を省くことによって、この５’ＤＭＴ基をインタクトなままにし得る。３つのオリゴヌクレオチドのセットが、合成流体送達ヘッドの下で、合成段階を完了した場合、３つのカラムのセットは、切断／脱保護送達ヘッドの下で回転する。本発明の脱保護試薬（例えば、濃水酸化アンモニウムと活性化メチレン化合物との、０．５ｍｌ〜１．５ｍｌの混合物）を、このカラムに送達し得る。この活性化メチレン化合物は、試薬の１〜１０容量％であり得る。この脱保護試薬は、１〜３０容量％のアルコール溶媒をさらに含有し得る。この脱保護試薬は、数分間〜１時間、周囲温度またはそれより高い温度で、カラム中に静置され得るかまたはこのカラムを通して循環され得る。それによって、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から切断され、そして約６５℃にて約１〜２時間加熱された封入チュービングまで送達され、脱保護（すなわち、核酸塩基およびヌクレオチド間保護基の除去）が完了し得る。
【０１０４】
５’ＤＭＴ基がインタクトなままである場合、この脱保護されたオリゴヌクレオチドを含有する溶液を、このオリゴヌクレオチドが合成されるＯｎｅＳｔｅｐカラム中のポリスチレンでの吸収によるトリチル選択的疎水性相互作用によって精製し得る。吸収（充填）の後、このカラムを、不純物の洗い流し、オリゴヌクレオチドの脱トリチル化、および脱保護され、精製され、そして脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドの溶出をもたらすように試薬で処理した。
【０１０５】
（実施例６）
気相切断／脱保護：
４８オリゴヌクレオチドのセットを、Ｍｏｄｅｌ  ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）による単回の予めプログラムした実行によって合成した。各オリゴヌクレオチドを、入口開口部および出口開口部を備えるカラム中、約１０ｍｇのポリスチレン支持体によって、２００ｎｍｏｌｅスケールにて合成した。このオリゴヌクレオチドは、１５ｎｔ長〜３０ｎｔ長のサイズ範囲であった。４８オリゴヌクレオチドの合成が完了した後、アセトニトリル溶液中の２００μｌの１％  ＤＥＭを、各カラムに送達した。アルゴンガスを、この開口部を通して約３０秒間流して、ほとんどの溶液を排出させた。次いで、このカラムを、ホルダー（例えば、９６ウェルマイクロタイター形式）に移した。このホルダーを、約１ガロンの内部容量を有する、封鎖可能なステンレス鋼の圧力容器に配置した。このようなホルダーを４つまで、並行切断操作および脱保護操作のために、この容器内に配置し得る。このホルダーを、容器の底面から約１インチの位置に取り付けたメッシュスクリーン上に配置した。約４５０ｍｌの冷却した濃水酸化アンモニウム溶液を、この容器の底面床にかまたはこの容器の底面床上に据えた（メッシュスクリーンの下部）浅いパン内に加えた。このカラムまたはホルダーは、水酸化アンモニウム溶液と直接的には接触しなかった。この容器を封鎖し、６５℃まで約２時間加熱した。この加熱期間中に内部で生じる圧力は、約４５ｐｓｉであった。この容器を、冷却し、通風し、そして開いた。
【０１０６】
カラムを含むホルダーを容器から取り除き、デバイス内に置き、それによって、真空を適用して、カラムの入口開口部を通して液体および空気を引き抜き得る。各カラムに、２５０μｌの水を送達し、そして排出するために流し出した。切断および脱保護されたオリゴヌクレオチドを、２５０μｌの２０％（標識されたオリゴヌクレオチドについて５０％）のアセトニトリル含有水を各カラムに送達し、このカラムの出口開口部の下部に取り付けられた容器内に溶出液を収集することによって、溶出した。あるいは、液状試薬（すなわち、洗浄水または溶離溶液）を、遠心分離によってカラムを通して押出し得、ここで、ホルダーは、遠心分離中に回転する。溶出したオリゴヌクレオチドを、減圧下で乾燥して水性媒体中に再懸濁するか、さらに希釈するか、または実験のアリコートに直接使用し得る。
【０１０７】
（実施例７）
実施例３の手順に従って、２５ｎｔオリゴヌクレオチド：
５’Ｈ２Ｎ−（ＰＥＯ）２−ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  Ｃ３’（配列番号６）
を、Ｃポリスチレン支持体上で合成した。最終のＡホスホラミダイトが結合した後、２つのＰＥＯ（ペンタエチレンオキシ；−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５−）リンカーを、ＰＥＯホスホラミダイトとして、続いてＡｍｉｎｏｌｉｎｋ  ＴＦＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ホスホラミダイトとして結合し、２つのＰＥＯ結合を有する５’アミノを得た（Ｖｉｎａｙａｋ，ＷＯ  ００／５０４３２；Ａｎｄｒｕｓ，ＷＯ  ９８／３９３５３）。この支持体を、２つの部分に分けた。一方の部分を、ＮＨ４ＯＨのみで切断および脱保護した。他方の部分を、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨ中１％  ＤＥＭで切断および脱保護した。各部分からのアリコートを、逆相ＨＰＬＣによって分析した。ＮＨ４ＯＨのみで切断および脱保護された部分は、６．５分で溶出するたった２５．８％の所望生成物を含有する複合体生成混合物を示す（図５ａ）。この生成混合物には、有意な後期溶出汚染物質が混入した。１％  ＤＥＭで切断および脱保護された部分は、改善された純度（６．５分で溶出する４８．９％の所望生成物、ならびに低下したレベルの初期溶出汚染物質および後期溶出汚染物質）を示す（図５ｂ）。
【０１０８】
本明細書中で参照される全ての刊行物、特許および特許出願は、参考として、各個々の刊行物、特許または特許出願が詳細かつ個々に参考として援用されることが示されるような程度まで、本明細書中で援用される。
【０１０９】
わずかな実施形態のみが上記に詳細に記載されているが、化学分野の当業者は、多くの変更がこれらの教示から逸脱することなくこれらの実施形態において可能であることを明確に理解する。このような全ての変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】図１Ａは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨのみで切断され、脱保護されたＴ１５−Ｑ−ＣＤＯＰＩ３の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨ中の３％ジエチルマロネート（ＤＥＭ）を用いて切断され、脱保護されたＴ１５−Ｑ−ＣＤＯＰＩ３の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび０％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび０．１％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび１％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび３％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号３）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび０％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号４）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび０．１％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号４）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび１％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号４）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨおよび３％ＤＥＭで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号４）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨのみで切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号５）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨ中の３％ジエチルマロネート（ＤＥＭ）で切断し、そして脱保護した、５’Ｆ−ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  Ｃ−Ｑ−ＣＤＰＩ３３’（配列番号５）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、濃ＮＨ４ＯＨのみで切断し、そして脱保護した、５’Ｈ２Ｎ−（ＰＥＯ）２−ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  Ｃ３’（配列番号６）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１５％エタノール：ＮＨ４ＯＨ中の１％ジエチルマロネート（ＤＥＭ）で切断し、そして脱保護した、５’Ｈ２Ｎ−（ＰＥＯ）２−ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  Ｃ３’（配列番号６）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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