(57)【要約】本発明はサンプルのウイルス力価を高める方法を提供する。本方法はウイルス粒子と結合してそれらを濃縮することがきる、レクチンおよび抗体などの特殊な結合成分を用いる。本発明はさらにサンプル、例えば血液からウイルス粒子を単離する方法を提供する。また、抗体または常磁性粒子を用いてウイルス粒子を特定の組織へターゲッティングする材料および方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス粒子を含んでなるサンプルのウイルス力価を高める方法であって、該サンプルを、ウイルス粒子と結合して複合体を形成し得る結合成分と接触させ、該複合体を濃縮することを含んでなる方法。
【請求項２】
該複合体が遠心分離により濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス力価を測定するステップをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルス粒子がレトロウイルス粒子である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該結合成分が粒状で稠密な支持体である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該粒状で稠密な支持体がパンソルビンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
複合体を捕捉し得る捕捉剤をさらに含んでなる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該捕捉剤が常磁性粒子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該結合成分がウイルス粒子と関連したタンパク質に対する抗体であり、該抗体が捕捉剤と結合した第二のカップリングパートナーとカップリングし得る第一のカップリングパートナーと結合している、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
該結合剤がウイルス粒子の表面のグリコシル化タンパク質と結合し得るレクチンであり、該レクチンが捕捉剤と会合した第二のカップリングパートナーと結合し得る第一のカップリングパートナーと会合している、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
レクチンがイソレクチンＢ４またはスクシニル−コンカナバリンＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該カップリングパートナーがビオチン／ビオシチン−アビジン／ストレプトアビジン、受容体−リガンド、および抗体−抗原からなる群から選択される、請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス力価を高めるために改変ウイルス粒子を含んでなるサンプルからのその捕捉を容易にするようウイルス粒子を改変する方法であって、ウイルスパッケージング細胞の表面にカップリングパートナーを組み込んで、パッケージング細胞に由来するウイルス粒子がそれらの表面にカップリングパートナーを提示するようにするステップを含んでなる、方法。
【請求項１４】
該カップリングパートナーがパッケージング細胞の表面のタンパク質に共有結合したビオチンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該ビオチンがスクシンイミドエステルを用いてタンパク質に共有結合されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス粒子の表面に組み込まれたカップリングパートナーと結合して複合体を形成し得る第二のカップリングパートナーを含んでなる捕捉剤を用いて該改変ウイルス粒子を濃縮し、さらに該複合体を濃縮するステップをさらに含んでなる、請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該複合体が医療に用いられる薬剤の製造に用いるために単離される、請求項１ないし１２および請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングに用いる、第一および第二のカップリングパートナーを介してともに結合したウイルス粒子および常磁性粒子を含んでなる複合体。
【請求項１９】
ｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングに用いる薬剤の製造に用いるための、請求項１８に記載の複合体の使用。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の体内組織へ請求項１８に記載の複合体をターゲッティングする方法であって、該複合体をヒトまたは動物の身体へ投与し、さらに磁場を用いて複合体を組織へ引き寄せるステップを含んでなる、方法。
【請求項２１】
該ウイルスがレトロウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ウイルスが標的組織での発現のための外来核酸配列を含んでなる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
組織のターゲッティングに用いる請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の方法によって製造され、該組織に特異的な抗体または抗体結合ドメイン（該抗体または抗体結合ドメインはウイルス粒子表面のカップリングパートナーを介して粒子と結合している）をさらに含んでなる、改変ウイルス粒子。
【請求項２４】
レトロウイルス粒子である、請求項２３に記載の改変ウイルス粒子。
【請求項２５】
サンプルからウイルスを単離する方法であって、
該サンプルを該ウイルスと特異的に結合し得る結合成分と接触させて、該ウイルスと結合成分に複合体を形成させ；
該複合体を該複合体を捕捉し得る捕捉剤と接触させ；さらに
該サンプルから該複合体および捕捉剤を単離する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２６】
該結合成分が捕捉剤と会合した第二のカップリングパートナーと結合し得る第一のカップリングパートナーと会合している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該カップリングパートナーはビオチンおよびストレプトアビジンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該結合成分が抗体であって、該捕捉剤が常磁性粒子である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
該複合体および捕捉剤が磁場を用いてサンプルから単離される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該捕捉剤が、固相支持体上にあり、そこにサンプルを通すと複合体および捕捉剤が固相支持体上に単離されて残る、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
結合成分がレクチンである、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
該サンプルが血液、尿、血清または精液である、請求項２５ないし３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
該ウイルスがＨＩＶである、請求項２５ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法を行うキットであって、
（ｉ）ウイルスに結合して複合体を形成し得る結合成分；および所望により、
（ｉｉ）カップリングパートナーを介して複合体を捕捉し得る捕捉剤
を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルス力価を高めることに関する材料および方法に関する。限定を意図するものではないが、本発明は特に、パッケージング細胞上清からのレトロウイルスの精製および濃縮を可能とする新規な方法に関する。本発明はまた、特異的組織のターゲッティング、病態の治療の分野での、またスクリーニングおよび診断のためのこれらの方法の適用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レトロウイルスを媒介とする遺伝子療法には、多数の感染性レトロウイルス粒子を放出するレトロウイルスパッケージング細胞および／またはレトロウイルス／標的細胞相互作用の効率を高める方法のいずれか（好ましくは双方）が必要である。レトロウイルスベクターの有効力価を至適化する努力は３つの戦略に焦点を当てる傾向にある。
【０００３】
１）レトロウイルスベクターＲＮＡのより効果的な発現およびパッケージングを考慮した新しいベクター構築物が設計されている１，２。これらはより多くのレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株の新たな作出と組み合わせたものであり３〜５、より広い標的細胞栄養性を有し３，５，６、かつ、遠心分離６またはヒト相補体５，６のいずれかによる不活性化に対してより耐性である。
【０００４】
２）最適なレトロウイルスベクター粒子産生のための培養条件およびレトロウイルス／標的細胞相互作用の効率が改良されている。レトロウイルス産生は感染性パッケージング細胞の相互の「やりとり（ピンポン）」７、重複感染８、３２℃での標的９またはパッケージング細胞の培養１０により、また、ある場合にはヒストンデアセチラーゼ阻害剤である酪酸ナトリウムの添加により増強され得る１１。ひとたび上清へ分泌されれば、標的細胞に感染するレトロウイルス粒子の確率は、ポリブレンおよび硫酸プロタミン１２，１３などのポリカチオンとともにインキュベートし、レトロウイルス粒子とリポソームまたはリポソーム脂質とを複合化し１４、培養上清を通し１５、それらの標的細胞を有するレトロウイルス粒子を低速で遠心分離する９，１０ことで高められる。標的細胞はまた、リン酸欠損培地１０でそれらを培養するか、またはフィブロネクチンおよびその末端切断型誘導体を添加することで感染感受性を高くすることができる１６。
【０００５】
３）上記の方法の多くは濃縮した、または精製したレトロウイルスと組み合わせることができる。レトロウイルス上清の分子量カットオフフィルター通過９，１７−２０、凍結乾燥９、およびリン酸カルシウムによる共沈殿２１の後に、レトロウイルス感染力を維持しつつ上清量が少なくなることが報告されている。しかし、かかる容量減は標的細胞への感染を阻害し得る２２、または標的細胞に有害であり得るその他の成分の濃縮が伴う可能性がある。このようなことが起こるのは、完全な感染性レトロウイルスの精製方法としての遠心分離の限界によるものであった。種々の形式の「従来法」は１８０００ｇで１６時間までの超遠心分離を含み２３、十分機能しているように見える。しかし、精製可能な上清の量は比較的少量で、感染性レトロウイルスの回収効率は低く、この方法は低力価のレトロウイルスでは良好に機能する２３。さらに文献で見られる他の変法では、時間をそのままにしての遠心分離速度の引き下げ２４−２６（３０００ｇ程度まで）、またはｇ力を高めての時間の短縮１９を用いる。しかし遠心分離には多くの魅力があり、実施が簡単で、感染阻害物質が同時に精製されることなく上清量を減らすことができる。遠心分離濃縮は非常に多くの潜在的利点を有することから、シュードタイプ・レトロウイルスベクター産生のためのパッケージング細胞は主要な懸念点としての遠心分離ストレスによる不活性化に対する耐性を持つように設計されてきた４，６。かかるＶＳＶ−Ｇ（水泡性口内炎ウイルスＧ）シュードタイプ・ベクターは５０，０００ｇで９０分間の処理を受けることができ６，２７、その結果２０００倍容積減でき、感染性ウイルスの回収は７０％を上回る６。
【０００６】
ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ以外のベクターに対して最適なレトロウイルス濃縮プロトコールがない状況では、より多くの上清を用いることで標的細胞に適用されるレトロウイルス粒子の数を簡単には増やせない。これは３７℃で５〜７時間というレトロウイルスベクターの半減期とその間にそれが細胞標的と接触するようになる確率の間のバランスによる。ブラウン運動だけによるレトロウイルス粒子の移動は一半減期に６００μｍを超えて移動するとは考えがたい２８。従って、１ｍｌの静置培養では９０％ものレトロウイルスが感染に利用できないことになる。標的細胞の利用度が限定されるため、利用可能な全てのレトロウイルスに効果的に相互作用させるのに十分多数の細胞を用いることができない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明者らはウイルス力価を高め、それにより感染に利用できるウイルス量を増やす方法が必要であることを認識している。例えば上記のレトロウイルスの例では、細胞に接触しそうにない９０％のレトロウイルスを十分利用するため、本発明者らはレトロウイルスと結合して複合体を形成し得る結合成分を利用する方法を設計した。次にこの複合体はパッケージング細胞上清から効率的に回収することができる。本発明者らは驚くべきことに、２００倍容積減するだけで力価を少なくとも１０００〜２０００倍高められる短時間低速遠心分離による回収を達成することができることを見出した。
【０００８】
従ってその最も一般的なものでは、本発明は、ウイルス粒子を含んでなるサンプルからウイルス力価を高める方法を提供し、該方法は該サンプルを、ウイルス粒子と結合して複合体を形成し得る結合成分と接触させ、該複合体を、例えばそのサンプルを遠心分離することによって濃縮し、さらに要すればウイルス力価を測定することを含んでなる。
このウイルス力価の上昇はサンプル中のウイルス量を増やすことにはならない。実際に、サンプル中の厳密なウイルス量は必ずしも知る必要はなく、本発明に関してはウイルス力価の上昇は標的細胞に感染するウイルスの量と見込みの両方の関数として考えなければならない。従ってかかる濃縮におけるウイルス力価の上昇は標的細胞の感染性によって決定することができる。
【０００９】
便宜のため、以下、レトロウイルスについて説明することで本発明およびその概要を示す。しかしながら当業者には、本発明がレトロウイルスシュードタイプ・パッケージング細胞系、例えばｖｓｖｇシュードタイプ・エンベロープを有するＭｏＭｕｌｖベクターをはじめとするあらゆるウイルスに適用することができることが明らかであろう。例えば、本発明者らは特に、ｓｓＲＮＡ、ポジティブセンス、非セグメント化ゲノム、包膜型、複製ウイルスにおけるＤＮＡステップを含むレトロウイルス科に注目している。レトロウイルス科のサブファミリーには、オンコウイルス亜科（すなわち、モロニーネズミ白血病ウイルス）、レンチウイルス亜科（すなわち、ＨＩＶおよびその他のレンチウイルスベクター）および泡沫状ウイルス亜科が含まれる。
【００１０】
しかし本発明はヘルペスウイルス科（ｄｓＤＮＡ型包膜ウイルス）などのその他のウイルス科にも適用でき、その例としては単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。  その他の科としてはアデノウイルス（ｄｓ型非包膜ウイルス）、例えばＡｄ．５に基づくものなどのアデノウイルスおよびアデノウイルスベクター；パポバウイルス科（ｄｓ型非包膜ウイルス）、例えばサル空泡ウイルス４０およびポリオーマウイルス；ピコルナウイルス科（ｓｓＲＮＡ＋センス、非包膜、非セグメント化ウイルス）、例えばエンテロウイルス、ポリオウイルス；ラブドウイルス科（ｓｓＲＮＡ、−ｖｅセンス、非セグメント化、包膜ウイルス）、例えば水泡性口内炎ウイルス；ポックスウイルス科（ｄｓＤＮＡ型非包膜ウイルス）、例えばポックスウイルス（天然痘）およびワクシニアが挙げられる。本発明が適用できるその他の科としては、アレナウイルス科、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、イリドウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パロウイルス科、レオウイルス科、トガウイルス科が挙げられる。このリストは網羅を意図したものではない。先にも述べたように、以下では便宜のためレンチウイルスをはじめとするレトロウイルスについて記載する。
【００１１】
上記に定義した方法の後には、レトロウイルスを結合成分から分離するのが望ましい。しかし本発明者らは、上記の方法に使用でき、かつ、レトロウイルスに有効な感染力を維持させるためにレトロウイルスから必ずしも分離する必要がないいくつかの結合成分を確認した。これらは以下で本発明の個々の態様として論じる。
例えば本発明の第一の態様では、本発明者らは、安価で容易に入手できる粒状で稠密な支持体を用いる方法を設計した。パッケージング細胞上清中のレトロウイルスを過剰量の支持体と混合した場合、ウイルスの半減期内で静置培養の重力下で沈降させるに十分な濃度でレトロウイルス／支持体複合体を形成する。かかる複合体にもまた、要すればレトロウイルス濃縮液を作出するために短時間低速遠心分離を施すことができる。本発明者らはこの粒状で稠密な支持体を用いて、ウイルスが驚くべきことに感染力を維持し、その放出を助ける特別な処理を必要とせず、この無毒な支持体が最適なレトロウイルス／標的細胞相互作用を可能とするに十分な時間培養物中に保持されていてもよいということを見出した１４，２９。
【００１２】
従って本発明はサンプル中のレトロウイルス力価を高める方法であって、該方法は該サンプルに、該レトロウイルスと複合体を形成し得る稠密かつ粒状の支持体を加え、該サンプルを遠心分離して該複合体を濃縮し、さらに標的細胞の感染性によって求められる該レトロウイルスの濃度を測定することを含んでなる方法を提供する。
好ましくはこの稠密かつ粒状の支持体は、熱で殺し、ホルムアルデヒドで固定した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）であるパンソルビンであるが、サンソルビンなどのその他の支持体も使用できる。その他の細菌がパンソルビンやサンソルビンと同等の能力を有する場合もある。これは細菌の表面に存在するフィブロネクチン結合（ｆｎｂ）タンパク質に基づくものであると考えられ、ｆｎｂ型タンパク質は種々の細菌で発現し得る。このように、本明細書で示される教示をもとにすれば、他の好適な稠密かつ球状の支持体を決定することは当業者の能力の範囲内にある。
【００１３】
以下「詳細な説明」に詳しく説明するように、本発明者らは、ネズミ繊維芽細胞由来ＰＧ１３パッケージング細胞（Ｇｉｂｂｏｎ Ａｐｃ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ［ＧａＬｖ］エンベロープタンパク質シュードタイプ）から放出されたレトロウイルス粒子が感染性レトロウイルスとして効果的に濃縮できることを証明した。ＰＧ１３由来レトロウイルス粒子は、熱で殺し、ホルムアルデヒドで固定した黄色ブドウ球菌（パンソルビン）と自然に複合体を形成する。これらの複合体は遠心分離濃縮可能で、会合したレトロウイルス粒子は、それらの放出を助ける従来手段を必要とせずに標的細胞に感染する能力を保持する。
【００１４】
Ｋａｙｍａｎ Ｓ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． Ｍａｒ ９９， ｐ１８０２−１８０８）は、なかでも、レトロウイルス力価を高めることに関するものではないが、野生型ウイルスの上清を減じること（すなわち、ネガティブ濃縮）を目的としたパンソルビンの使用を記載している。しかし本発明とは対照的に著者らはウイルス（ＳＣ２５８）のｅｎｖ遺伝子に予め挿入しされたエピトープに対する抗体を用い、抗体のＦｃがパンソルビンのプロテインＡと結合することをもとに、これをウイルスおよびパンソルビンと混合したエピトープに対する抗体を用いている。著者らは、ポジティブ濃縮には感染性ウイルスを結合状態から回収する必要があること、また、抗体−抗原複合体を崩壊させるのに用いられる標準的な条件はレトロウイルスに致死的であることを述べている。これに対し、本発明者らは驚くべきことに、レトロウイルスとパンソルビンの複合体はレトロウイルスに感染力を維持させるのに破壊を必要としないことを証明した。このように、パンソルビンまたはその他の同様の粒状で稠密な支持体、例えばサンソルビンはウイルス力価の上昇を目的として使用でき、レトロウイルスとの間で形成された複合体のその後の破壊が避けられるので濃度または感染性に損失はない。
【００１５】
本発明者らは、感染力の保有と結びついた、観察されたこの結合が、パンソルビンに用いられた黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ Ｉ株の表面に存在し、最近クローニングされたフィブロネクチン結合タンパク質（ｆｎｂＡ３２およびｆｎｂＢ３３）によって説明することができると考えている。これらのタンパク質は、ＰＧ１３パッケージング細胞が基づくＮＩＨ ３Ｔ３細胞によって分泌されるネズミフィブロネクチンと相互作用し得る。次に上清中のフィブロネクチンをＰＧ１３由来レトロウイルス粒子と会合させることができる。従って、レトロウイルスはパンソルビンと直接的に相互作用をするのではなく、フィブロネクチンの介在によって会合するものと思われる。このフィブロネクチンの相互作用はレトロウイルス感染を阻害するのではなく促進することが分かっており、これがレトロウイルスがパンソルビンと複合化した場合に感染性を保持する理由を説明する。
この方法はＰＧ１３、ＰＡ３１７、およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２由来レトロウイルスに極めて有効であるが、それらの結果はＮＩＨ ３Ｔ３に基づくＧＰ＋Ｅ−８６およびヒトＨＴ１０８０に基づくＦＬＹＲＤ１８およびＡ１３パッケージング細胞などのその他のレトロウイルスではあまり奨励されるものではない。
【００１６】
従って本発明者らは、フィブロネクチンに対する抗体を用いることでレトロウイルスが上清から捕捉できるという前提をもとに、本発明の第二の態様としてのさらなる方法を設計した。このように本発明の第二の態様によれば、この結合成分はウイルスに関連したタンパク質に対する抗体または抗体結合ドメインである。この抗体はウイルスの表面に実際に存在するタンパク質に対するものであってもよいし、あるいはウイルスに関連したタンパク質、すなわちレトロウイルスに対して天然の結合親和性を有するタンパク質に対するものであってもよい。
【００１７】
抗体結合成分は稠密な支持体とは言えないので、静置培養の重力または短時間低速遠心分離によって形成された複合体を濃縮することはできない。従って本発明の第二の態様はまた、濃縮可能な、複合体捕捉用の捕捉剤の使用を提供する。かかる捕捉剤の例としては、磁石を用いて濃縮できる常磁性粒子（ＰＭＰ）（Ｐｒｏｍｅｇａ； その他Ｄｙｎａｌ， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃをはじめとする供給者）が挙げられる。非磁性ビーズも使用できるが、ただしそれらは少量、例えば１μｍのオーダーであり、低速遠心分離の影響を受けやすい。本明細書で示す例では、対象とする抗体はネズミフィブロネクチンに対するものであり、本発明者らはポリクローナルウサギ抗マウスフィブロネクチン抗体と結合させたストレプトアビジンコート常磁性粒子を用い、ネズミフィブロネクチンとの会合をもとに、ＰＧ１３由来粒子を磁気精製する。本発明者らは、これらの抗体がそれらのＦｃドメインを介してプロテインＡと結合し得ることを示した。プロテインＡはビオチンによってＰＭＰと結合してこの複合体を完成させてもよい。あるいは、ビオチニル化ポリクローナル抗体を用いてもよい。
【００１８】
従って本発明のこの第二の態様では、捕捉剤と会合した第一のカップリングパートナー、例えばストレプトアビジンと、抗体結合ドメインと会合した第二のカップリングパートナー、例えばビオチンを用いる必要がある。当業者ならば、本発明と組み合わせて使用できる他のカップリングパートナーを考案することができよう。
【００１９】
しかし本発明の第二の態様に従う方法はフィブロネクチンを分泌し、かつ、ウイルスを産生するネズミパッケージング細胞、例えばフィブロネクチン結合活性を有するレトロウイルスにしか適用できない。従ってより普遍的な方法論を提供するため本発明者らは、このアフィニティーキャプチャー戦略の有効範囲をその他のウイルスパッケージング細胞、例えば、ヒトＨＴ１０８０由来パッケージング細胞などのレトロウイルスパッケージング細胞へ拡張するレクチンに基づくアフィニティーキャプチャー戦略を用いるためにこの手法を採用した。これは、レトロウイルスエンベロープタンパク質がパッケージング細胞に特異的な基準でグリコシル化されていること、また、これらの細胞から放出されたレトロウイルスに対する表面修飾がこのことを反映するという知見に基づくものである。
【００２０】
従って本発明の第三の態様によれば、結合成分はウイルス、例えばレトロウイルスの表面のグリコシル化タンパク質と結合し得るレクチンである。本発明者らははじめて、レトロウイルスの表面タンパク質、例えばエンベロープタンパク質に対する翻訳後グリコシル化修飾が、感染性を維持するために結合成分から遊離させる必要なく本方法で使用できることを認識した。本発明のこの態様に関して以下に記載される例では、用いたレクチンは、バンデイラエ・シンプリシホリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）から単離したイソレクチンＢ４（ＢＳ−ＩＢ４）（ヒトには存在しないα−ガラクトシル基に結合）または主としてα−マンノース修飾物と結合するスクシニル−コンカナバリンＡである。グリコシル化部位と結合する当業者に公知の他のレクチン、例えばＰＨＡを使用してもよい。
【００２１】
本発明の第二の態様では、レクチン／レトロウイルス複合体を捕捉し、静置培養の重力によるか短時間低速遠心分離によるかのいずかで濃縮し得る捕捉剤が必要となる。ここでもこの捕捉剤は好ましくは常磁性粒子である。
【００２２】
本発明の第二および第三の両態様に関して、捕捉剤には、それらが複合体を捕捉し得る機構（例えば、抗体／レトロウイルスまたはレクチン／レトロウイルスなどのカップリングパートナー）が必要である。この機構はビオチン／ビオシチン−アビジン／ストレプトアビジン、受容体−リガンド、抗体−抗原などのカップリングパートナーによって提供され得る。従って複合体はカップリングパートナーの一方のメンバー、例えばビオチンをさらに含むように設計すればよく、捕捉剤はカップリングパートナーのもう一方のメンバー、例えばストレプトアビジンを含むように設計すればよい。このようにすれば、複合体および捕捉剤が接触した際にカップリングパートナーが結合し（ビオチン結合ストレプトアビジン）、それにより複合体と捕捉剤が結合する。
【００２３】
他の例もあり、例えば、本発明者らは抗体のＦｃ領域と結合するプロテインＡを用いる。従って、レトロウイルスの表面に存在するタンパク質に特異的であることによってレトロウイルスと結合する抗体を用いればよい。プロテインＡは捕捉剤（例えばストレプトアビジンコートＰＭＰ）に保持されるようにビオチニル化し、これを抗体／レトロウイルスと接触させればよい。抗体のＦｃ領域とプロテインＡはカップリングパートナーとして働き、抗体／レトロウイルス複合体と捕捉剤（ＰＭＰ）を接触させるよう働きをする。当業者ならば、プロテインＡの代わりにプロテインＧおよびプロテインＬを同じように使用できることが分かるであろう。
【００２４】
カップリングパートナー、例えばリガンドを使用する場合、それらをウイルス上清に導入する前にこれらを捕捉剤、例えばＰＭＰと結合させることが好ましい。このようにすれば、上清中のレトロウイルス複合体に対する捕捉剤／カップリングパートナーの比率を最適化することができる。
【００２５】
最後に本発明者らはあらゆるウイルス、好ましくは現在利用できる（さらにまだ開発されていない）レトロウイルスパッケージング細胞種に適用できる第四の戦略を検討した。レトロウイルスのこのようなパッケージング細胞特異的な翻訳後修飾に対する応答に加え、本発明者らはレトロウイルス表面に対して修飾を導入することを含むより先見性のあるアプローチを検討した。このアプローチではスクシンイミドエステル、例えばビオチンスクシンイミドエステルのタンパク質特異的共有結合活性を用いる。パッケージング細胞の表面タンパク質のビオチン修飾は、例えばストレプトアビジンＰＭＰによって効果的に捕捉される感染性レトロウイルスを生じる。
【００２６】
このように本発明者らは驚くべきことに、レトロウイルスの表面に結合成分を導入するためにカップリングパートナーを使用すればよいことを見出した。これは好ましくはパッケージング細胞の表面のタンパク質にビオチンを共有結合させ得るスクシンイミドエステル誘導体を用いることで達成される。これらのビオチニル化細胞に由来するレトロウイルスは例えば捕捉剤上のストレプトアビジンと親和性結合する。
【００２７】
このように本発明の第五の態様では、ウイルス粒子を改変して改変型ウイルス粒子を含んでなるサンプルからのその捕捉を容易にしてウイルス力価を高める方法が提供され、該方法はウイルスパッケージング細胞の表面にカップリングパートナーを組み込んで、パッケージング細胞に由来するウイルス粒子がそれらの表面にかかるカップリングパートナーを提示するようにするステップを含んでなる。
【００２８】
本発明の方法はパッケージング細胞上清からウイルスを濃縮して高力価とするだけでなく、本明細書に記載の結合相手を使用することからもたらされる他の利点も提供する。
例えば本発明者らは、レトロウイルスが感染性であるために結合表面から分離されなくてもよいことを見出した。さらに本発明者らは、捕捉剤／結合成分／ウイルス複合体が冷凍可能であることを見出した。解凍過程ではレトロウイルス活性の５０％までが失われるが、これは他の公知の方法よりもかなり優れている。さらに、本発明の方法に従うレトロウイルスの開始濃度は高いが少量であるために、濃縮していないウイルスに対して、極めて少量の凍結液、例えばＤＭＳＯしか用いない。ここのことはＤＭＳＯの毒性のために患者の治療においては極めて価値のあることである。
本発明者らはさらに、本発明に従って形成した複合体が疾病の治療に使用できるものと考えた。例えば、ＰＭＰ／レトロウイルス複合体はｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングに使用できる。適当なＰＭＰを用いれば、ＭＮＲを用いて必要な磁場の焦点を合わせることで特定の領域でそれらを分離させられる。
【００２９】
このように本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてウイルス、例えばレトロウイルスを組織へターゲッティングする薬剤の製造における、上記の方法に従って形成された複合体の使用を提供する。さらに本発明は、レトロウイルス複合体をヒトまたは動物（哺乳類）の体内へターゲッティングする方法を提供するが、該複合体はレトロウイルスおよび磁性粒子を含んでなり、該方法はヒトまたは動物身体に該複合体を投与し、磁場を用いて複合体を組織へ引き寄せることを含んでなる。
【００３０】
結合成分または捕捉剤に対するスペアの結合能を利用する組織ターゲッティングのさらなる方法も提供できる。例えばレトロウイルスの表面が本発明の第四の態様に従ってビオチンを有するように改変されていれば、ストレプトアビジンＰＭＰによって捕捉することができる。しかし本発明者らは、必ずしも全てのストレプトアビジンが結合しているわけではないことを見出した。このように、特定の組織抗原に対するビオチニル化抗体はまた、ストレプトアビジン−ビオチンカップリングパートナーを介してＰＭＰとも結合し得る。このように、抗体は特定の組織抗原と結合し、それにより結合したレトロウイルスを組織と接触させる。あるいは、プロテインＡを用いて、抗体のＦｃドメインと結合させてもよい。この組織抗原はターゲッティングのために選択された組織種に特異的ないずれかの公知の抗原であってよい。ある実施形態では、この組織抗原はレトロウイルスを特定の腫瘍と接触させる腫瘍抗原であってもよい。このレトロウイルスは遺伝子療法に用いる外来の核酸を有するようにさらに改変してもよい。この方法はレトロウイルスをターゲッティングされる組織種に応じて改変する必要はないという点で有利である。
【００３１】
本発明者らはまた、本発明の方法がウイルスの標識または同定に使用できるものと考えている。例えば、上記の捕捉剤および／またはカップリングパートナーを用い、血液、血清、尿、唾液などの生体サンプルからウイルスを同定または単離するのに使用できる。ＨＩＶウイルスは血液サンプルから効率的に取り出すことができる。これにより高感度（約１００倍増強）のＨＩＶ試験が提供される。さらにかかる方法は生体サンプルを処理するのに用いられる他の技術と併用してもよい。例えば捕捉剤および／またはカップリングパートナーを用いて透析中の血清からウイルスを除去することができる。
【００３２】
このようにさらなる態様において本発明は、サンプル（例えば血液）からウイルスを単離または除去する方法を提供し、該方法は
（ａ）該サンプルを、ウイルスに特異的に結合し得る結合成分と接触させて、そのウイルスと結合成分に複合体を形成させ、
（ｂ）該複合体を、該複合体を捕捉し得る捕捉剤と接触させ、さらに
（ｃ）サンプルから該複合体および捕捉剤を単離または除去する
ステップを含んでなる。
【００３３】
上記のように、捕捉剤はビオチンおよびストレプトアビジンなどのカップリングパートナーを介して複合体を捕捉できる。捕捉剤がＰＭＰである場合、磁場を用いて捕捉されたその複合体とともにそこからそれを除去することができる。また捕捉剤は、ストレプトアビジンなどのカップリングパートナーでコーティングした固相支持体であってもよく、これにサンプルを通す。結合成分がビオチンなどのカップリングパートナーと会合している抗体またはレクチンである場合、それを固相支持体に結合させて、それによりサンプル、例えば血液、尿または血清から複合体を除去または単離する。
本明細書にはネズミおよびヒト双方由来のパッケージング細胞上清に適用した本発明の各態様に関する詳細な手順が記載されている。
【００３４】
本発明のさらなる態様としては、上記の方法に従ってパッキング細胞上清からレトロウイルス力価を高める方法を実施するためのキットまたはキットの使用が提供され、該キットはウイルスに結合し得る結合成分と所望により捕捉剤および／または上記のようなカップリングパートナーを含んでなる。該キットはまた便宜には本発明の方法を実施する説明書を含んでなる。本発明のキットの成分の例としては常磁性ビーズ、磁石、プロテインＡ−ビオチン複合体、抗ネズミフィブロネクチン抗体抗ヒトフィブロネクチン抗体、コンカナバリンＡ−ビオチン複合体、ＢＳＩ−Ｂ４−ビオチン複合体、ビオチンスクシンイミドエステルおよび洗浄バッファーがある。
【００３５】
以下、本発明の態様および実施形態を添付の図面を参照し、例として説明する。さらなる態様および実施形態は当業者ならば明らかであろう。本明細書に記載される全ての文書は参照により本明細書に組み入れる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
（本発明の第一の態様に関する詳細な説明）
ＰＧ１３上清のホルマリン固定した黄色ブドウ球菌（パンソルビン）とのインキュベーション
遺伝子療法を目的に、本発明者らは、ＧａＬｖ（Ｇｉｂｂｏｎ Ａｐｅ白血病ウイルス）エンベロープタンパク質を有するシュードタイプのネズミ繊維芽細胞由来ＰＧ１３パッケージング細胞を用いている３。軟寒天コロニーカウントアッセイを用いＫ５６２細胞で、ＭｏＭｕＬｖを基にしたベクター（ｐＷＺＬＩＬ２／Ｂ７Ｍ Ｆｕｓａｇｅｎｅ３０、ブラスチシジンＳ塩酸塩耐性を付与し、次にＩＬ−２／Ｂ７と呼ばれる）を産生するこれらの細胞の混合集団の力価を求めた。この混合集団から得られた力価（１．９５ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ）の代表的な例は図１で示すことができる（Ｔ＝０、対照）。この力価はこれまでのパッケージング細胞では実質的向上を示すが、発明者らの目的にはまだ十分でない。
【００３７】
従って本発明者らは、Ｇａｌｖシュードタイプ３１レトロウイルスおよび黄色ブドウ球菌３２，３３の双方がフィブロネクチンと接着することが知られていることから、比較的大型で稠密な細菌と会合したレトロウイルスが培養の重力下で沈降し、かつ、標的Ｋ５６２細胞に感染し得るレトロウイルスの局在濃縮を高め得るという仮説を試験することにした。細胞培養適合黄色ブドウ球菌の容易に入手できる供給源は、熱で殺し、ホルムアルデヒド固定してなおその表面上に機能的なプロテインＡを保持しており３４、従ってその他の表面発現タンパク質活性を保持し得るものである。
【００３８】
図１はパンソルビンとともにプレインキュベートしたＰＧ１３由来ＩＬ−２／Ｂ７レトロウイルス上清を用いた実験を示している。パンソルビンの不在下では、新たに採取した上清はＫ５６２細胞に対して１．９５ｘ１０４±４ｘ１０３／ｍｌの力価（ｃｆｕ／ｍｌ）を有する（Ｔ＝０、対照）。パンソルビンの不在下、４℃で２時間インキュベートした後（Ｔ＝２、対照）、ｃｆｕ／ｍｌは１．７５ｘ１０４±４ｘ１０３／ｍｌで変化しない。しかし、プレインキュベーション中にパンソルビンが存在すると、レトロウイルスのｃｆｕ／ｍｌ力価に用量依存的作用を示す。ＰＧ１３由来レトロウイルスベクターとともに２時間プレインキュベートしたパンソルビン２５μｌまででインキュベートした場合、Ｋ５６２細胞に対する有効力価（ｃｆｕ／ｍｌ）は３倍も上昇する。
【００３９】
感染性におけるパンソルビン／レトロウイルスプレインキュベーション時間の作用
２５μｌパンソルビン／５ｍｌレトロウイルス上清を用い、プレインキュベーションの最適な長さを検討した（図２）。約２時間のインキュベーション後にパンソルビンを媒介とする力価の上昇は平衡に達した（５．３ｘ１０４±９．５ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、一方、パンソルビンの不在下の対照力価（ｃｆｕ／ｍｌ）は一定のままであったが（Ｔ＝０、９ｘ１０３±１．１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ： ２時間８．３３ｘ１０３±１．７ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、４時間後には５．４ｘ１０３±１．１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌに低下する。次の実験では、通常、インキュベーション３時間、２５μｌパンソルビン／５ｍｌ上清を用いた。２５μｌパンソルビンを用い、図１の２時間後、力価（ｃｆｕ／ｍｌ）の上昇は３倍であり、図２の同じ条件下では７倍を上回ったことが分かる。これはその他の実験とも一致し（データは示されていない）、この種の実験の平均は約５倍のｃｆｕ／ｍｌ上昇である。
【００４０】
パンソルビンと複合化した後のレトロウイルスの低速遠心濃縮
図１および２に記載の実験を同量の上清で行ったが、実用的な方法とするにはスケールアップが必要である。重力のみの下でレトロウイルスのパンソルビン特異的な沈降により、低速遠心がパッケージング細胞上清からのレトロウイルスの濃縮および精製を可能とすることが示唆された。従って本発明者らは５０ｍｌレトロウイルス上清サンプルを２５０μｌパンソルビンとともにインキュベートし、レトロウイルスの濃縮を試みた。図３は典型的な実験を示す。
【００４１】
インキュベーション前の対照力価は図１および２の類似力価とほぼ同等であり（１．４ｘ１０４±７．５ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌ）、４℃で３時間のインキュベーション後にこれは７．２ｘ１０３±７．３ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌまで半分低下し、これがインキュベーション時間の妥当な上限であろうことを示している。再度パンソルビンによる３時間のインキュベーションを行ったところ、有効ｃｆｕ／ｍｌは１．４ｘ１０４から２．３ｘ１０５に（すなわち１６倍）高まる。このプロセスのこの部分の有効性は最適結合時間、レトロウイルス感染性の引き下げ、および容器に対するレトロウイルスまたはパンソルビンの非特異的結合の間の妥協点である。このことは、スケールアップ形式におけるわずか３時間のインキュベーション後ではなぜプレインキュベーションのみがより効果的なのかを説明する。ウイルスがパンソルビンと物理的に複合化することを証明するため、インキュベーション混合物から５ｍｌアリコートを取り出し、再び０．４５μｍフィルターで濾過し、すぐに力価を求めた。パンソルビンの不在下で３時間のインキュベーションの後、レトロウイルスを２回目の濾過をすることで力価は３８％低下する（７．２ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ［Ｔ＝３］から４．４ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ［２ｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ］）。同じ処理をパンソルビンとともにインキュベートしたサンプル（Ｐ）に対しても行ったところ、力価は９７％を超えて低下する（Ｐ：Ｐ Ｆｉｌｔｅｒ ２．３ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ：５．４ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）。このようにレトロウイルス力価の９７％以上が濾過単独により同時インキュベーションから除かれる可能性がある。
【００４２】
残りの４５ｍｌのパンソルビンレトロウイルス混合物を低速遠心分離、１回洗浄、および力価測定の前に新鮮培地２５０μｌに再懸濁（１８０倍容量減）したところｃｆｕ／ｍｌは１．１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ（Ｐｃｏｎｃ）となり、これは７．８ｘ１０３倍のｃｆｕ／ｍｌの上昇を表す。この濃縮物において検出された有効力価は対照上清のみと比較した場合に予測されるものより実質的に高いものである。この変則は、濃縮物を、パンソルビンとともにインキュベートして遠心分離を行わずに力価を求めた上清と比較した場合にはそれほど著しいものではないが（Ｐ ｃｏｎｃ， １．１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ：Ｐ， ２．３ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ）、なお、わずか１８０倍容量減したもので４７３倍の力価上昇を達成した。遠心分離サンプル（Ｐｄｅｐ）からの上層２５ｍｌの上清を用いて行った感染力価測定は、必ずしも全てのレトロウイルス感染性がパンソルビンとともにペレット化されているわけではなく、上清中になお２．７ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌの力価が残っていることを示す。このことはパンソルビンと結合しなかったレトロウイルス、または低速遠心分離下でペレット化しなかったパンソルビンと会合したレトロウイルスを表し得る。
【００４３】
対照として、パンソルビンの不在下で３時間インキュベートした後にもレトロウイルス上清の遠心分離を行った。目に見えないペレットを洗浄するステップなく、２５０μｌのスラリーに再懸濁し（Ｃｏｎｔ ｃｏｎｃ）たところ、１．６ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌという驚くほど高い力価が明らかとなり、対照と比べて１１５倍増強されたが、パンソルビン単独で達成されたものより＞６０倍低かった。２６００ｇで１０分というのは時間およびｇ力の両面で他のいずれの遠心分離プロトコールよりも著しく弱いものであるので、理論上、レトロウイルスの６８〜１２３％の間の回収率（対照としてのＴ＝０またはＴ＝３のいずれと比較するかによって異なる）はこれらの条件下では不可能なはずである。
【００４４】
Ｂ７−１３５の細胞外Ｉｇ様ドメインはレトロウイルスの表面に提示され３６，３７、パンソルビンプロテインＡと結合するかもしれないという可能性を排除するため、サンソルビン（プロテインＡ陰性黄色ブドウ球菌Ｗｏｏｄ ４６）を用い、並行して濃縮を行った。これらのレトロウイルスはサンソルビンを用いた場合でも１．１５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌまで濃縮できたが、これはパンソルビンで達成されたものより１０倍低い効率（遠心分離を行わないサンソルビンでも見られる）を示すが、遠心分離単独の場合よりもまだなお良好である。これはパンソルビン濃縮物のプロテインＡ成分が濃縮効果に主として寄与していることを示す。しかしながら、サンソルビン（Ｗｏｏｄ ４６）は通常検出できないレベル、またはＷｏｏｄ ４６がフィブロネクチンに対してより低い親和性を示すレベルでプロテインＡを発現するという可能性もある。
【００４５】
レトロウイルス濃縮は標的細胞に特異的なものではない
この作用はＫ５６２細胞だけに特異的なものではないことを証明するため、同じレトロウイルス調製物を用い、並行して他の２種のヒト骨髄細胞株ＮＢ４およびＵ９３７に感染させた。これらは図４にヒト接着上皮ＨｅＬａ細胞を感染させるのに用いた個々のレトロウイルス調製物とともに示されている。レトロウイルス上清の３時間インキュベーション対照の力価はＮＢ４細胞では極端に低く（４６±４０．４）、標準誤差も大きかったが、これは正味１００μｌの上清を細胞懸濁液１ｍｌ中に希釈したものを用いて測定したものであった。１８０倍容量を減らした後、有効力価は１．３ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌに上昇したが、これは２８２倍だけの力価上昇を示している。
【００４６】
Ｕ９３７細胞は正味１００μｌの上清を細胞懸濁液１ｍｌに希釈したものを用いても全く感染しなかったことから、Ｋ５６２細胞に対して７．２ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌの力価を有する同等のＰＧ１３由来上清（図３）はＮＢ４細胞では１５０倍低下し、Ｕ９３７細胞では０まで低下する。Ｕ９３７細胞の確実な感染は濃縮後に達成させるのみであり（Ｐ ｃｏｎｃ， １．３ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）、最初の力価が０であることから濃縮の有効性は評価できない。最後に、ＨｅＬａ細胞では、レトロウイルス上清の最初の力価４１０±４６は１６０倍濃縮後に４ｘ１０３倍を超えて上昇する（Ｐ ｃｏｎｃ， １．６５ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ）。ウイルスの最初の力価（Ｋ５６２、ＮＢ４およびＵ９３７の同じ日の同じウイルス調製物の場合）は大幅に異なるが、パンソルビンとともにインキュベーションおよび遠心分離することでいずれの場合にも力価が上昇する（ただし、ＮＢ４の場合には特に効果はなかった）。
【００４７】
レトロウイルス濃縮はベクター挿入部特異的なものではない
レトロウイルスの濃縮は他の細胞標的にも有効である（様々であるが）ことが示されたので、本発明者らはパンソルビンとのレトロウイルスコンジュゲーションがレトロウイルスベクター（すなわちＢ７−１）中の特定の挿入部に限られた作用であるのか、それともＰＧ１３から放出されたその他のレトロウイルスベクターにも適用できるのかを調べることにした。本発明者らは、ｐＷＺＬＩＬ２／Ｂ７Ｍ Ｆｕｓａｇｅｎｅ３０と同じレトロウイルスベクタースピン（ｐＷＺＬｂｌａｓｔ３８）であるが別の挿入部を伴ったものを検討することに研究を拡張した。このベクターはシグナルペプチドを伴わない末端切断型遺伝子をコードし、ＲａＲＴ（末端切断型レチノイン酸受容体α）と呼ばれる。図５はこのＰＧ１３産生細胞の混合集団が同じ様式で濃縮可能なレトロウイルスを放出することを示している。濾過直後のＫ５６２細胞に対する力価測定は、１．２５ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ（ＩＬ−２／Ｂ７のほぼ１０倍高い）の力価を示した。パンソルビンを媒介とする遠心分離濃縮は２００倍の容量減の後にこの力価を７．７ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ（Ｐ ｃｏｎｃ， ６３３３倍の上昇）まで高めた。対照レトロウイルス遠心分離濃縮（および洗浄）は力価に５０倍の上昇（６．６ｘ１０６±８．６ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ）、容量では２００倍の減少を示した（データはプロットされていない）。
【００４８】
同じ濃縮レトロウイルス調製物はまた、ＮＢ４細胞に感染させるのに用いた場合には力価の上昇は限られた値を示す（８７５倍）（Ｔ＝０： ５．６ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ， Ｐ ｃｏｎｃ ４．９ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌ）。この場合のＵ９３７に対するこのウイルス上清の開始力価は９．４ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌであり、これはＰ ｃｏｎｃでは４．６５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌに上昇した（４９００倍）。開始力価３．３５ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌのＨｅＬａ細胞は約２５００倍というあまり著しいとはいえない力価上昇を示す。
【００４９】
レトロウイルス濃縮はＰＧ１３に特異的なものではない
パンソルビンを媒介とする濃縮はＰＧ１３から放出された種々のベクターでも機能し、Ｋ５６２標的細胞に特異的なものではない。他の現行のパッケージング細胞株および種々の挿入部の検討を限られたものではあるが表１に示す。ＰＧ１３パッケージング細胞は最も効果的に濃縮されるものと思われる（この場合、２００倍容量減で３５００倍）。しかし、これはＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２３９（２００倍濃縮に対してノーマライズしたところ１５００倍の力価上昇）およびＰＡ３１７４０（２００倍濃縮に対してノーマライズしたところ６００倍の力価上昇）の場合と密接に関連している。ネズミ繊維芽細胞由来パッケージング細胞は、パンソルビンを媒介とする濃縮が極めて効果的でないヒト肉腫細胞由来ＦＬＹ５パッケージング細胞とは完全に異なる様式で応答しているものと思われる。ＧＰ＋Ｅ−８６４１細胞はエコトロピックであってネズミ標的細胞でしか試験できないことから、ヒト細胞に感染するものとの比較は不適当であるが、これらの細胞に由来するレトロウイルスはあまり効果的には濃縮されない。
【００５０】
不溶性の稠密基質としてのパンソルビンの使用は、かかる粒子が高密で供給された場合、感染性レトロウイルスの寿命内で相対的に低い力価のレトロウイルス上清と相互作用し得るという原理の証明となる。図１では、レトロウイルス上清をパンソルビンとともに同時インキュベートするとレトロウイルスの有効力価（ｃｆｕ／ｍｌ）を高めることができることを示している。この相互作用の時間経過の研究（図２）は、最初の相互作用は非常に急速であるが、６０分以上インキュベートした後に良好な結果に達することを示している。本発明者らはこれらの結果をレトロウイルスがパンソルビンと複合化するようになることを示し、次にその一部が静置培養の重力下で沈降し、標的細胞と会合したレトロウイルスの局部濃度を引き上げるこができるものと解釈している。また、一晩のインキュベーションにもかかわらずＫ５６２細胞をパンソルビンに曝すことは有害でないようである。パンソルビンは感染の促進というよりも上清中に存在し得るいくつかの阻害因子をキレートしていたということができる８，２２。しかし、本発明者らは非感染ＰＧ１３産生細胞からの上清の添加が標準的な感染プロトコールにおいてレトロウイルスの有効力価を阻害せず（データは示されていない）、また、レトロウイルス／パンソルビン同時インキュベートの濾過はパンソルビンと分離したｃｆｕ活性を示したことから、この説明はありそうにないものと考えた。また、レトロウイルスはそれが感染性となるのにパンソルビンから解離する必要はないこと、あるいは３７℃で一晩培養するだけでその放出を促進するに十分であることも明らかである。しかし、複合体の形成を媒介するためにパンソルビンおよび抗レトロウイルスエンベロープ抗体を用いるその他の手法における場合とは異なり、この場合にはレトロウイルスの感染性は妥当なものであると考えられる４２。
【００５１】
図１および２に示されているデータを用い、パンソルビン量および同時インキュベーション時間の妥当な選択肢を選択し、スケールアップ実験および遠心分離濃縮の双方に用いた。パンソルビン／レトロウイルス相互作用は２６００ｇでの２回の遠心分離、力価測定に先立つ新鮮培地中に比較的激しく再懸濁させる本発明者らのプロトコールに十分な強さである。容量減少と静置培養の重力を媒介とする感染性の向上の組合せは、Ｋ５６２でアッセイした力価における上昇を容量減少だけによって期待されるものを遙かに上回るということに対する１つの説明となり得る。また、いくつかの標的細胞がその近傍にレトロウイルスを保持できるパンソルビンに対して親和性を有し得る可能性もある。図３は機構はなんであれ、有効力価が１８０倍のみの容量減で７５００倍まで上昇し得ることを示している。さらに驚くべきことに、パンソルビンの不在下での上清の遠心分離もまた効率はずっと低いが力価を上昇させることができた。このことはＰＧ１３由来レトロウイルスが培養物中の未知の因子と複合化して架橋し、遠心分離可能な沈殿の濃縮をもたらし得ることを示す。
【００５２】
図３の枯渇実験（Ｐｄｅｐ）は鮮明ではなかったが、本発明者らはこれらの速度でパンソルビンは完全にペレット化されないことを示すために上清の活性を説明する。複合化したレトロウイルスを０．４５μｍフィルターを通して、濾過前のものから９０％も力価を引き下げた（Ｐ：Ｐ Ｆｉｌｔｅｒ）場合のサンプルで、より鮮明な画像が得られた。しかしながらここでもまた、力価は０にまでは下がらず、このことは利用できるレトロウイルスの多くがパンソルビンと結合しないままである（最適なプロトコールであっても）こと、あるいはこの濾過が結合したレトロウイルスがパンソルビンから解離するのに十分なものであることを示している。
【００５３】
濃縮プロトコールの陰性対照（理想的にはレトロウイルス結合活性を持たないパンソルビン）がなければ、パンソルビンに対するプロテインＡの活性は完全には差し引くことができない。
サンソルビンによる並行実験では、この効果はかなり複雑であり、サンソルビンはそのプロテインＡ陽性相手よりもずっと効果が小さいが、それはなお事実上有望な結果を示すものである。サンソルビン（Ｗｏｏｄ ４６株）はプロテインＡだけを欠くＣｏｗａｎ Ｉ（パンソルビン）の遺伝子操作亜系ではなく、完全に異なる株であり、従ってこれらの細胞では全く異なる細胞表面タンパク質も欠損している可能性がある。分泌性変異型黄色ブドウ球菌株から精製されたビオチニル化プロテインＡと複合化したストレプトアビジン結合常磁性ビーズによる濃縮を再現する試みは、低いレトロウイルス結合活性しか示さず（データは示されていない）、これはリガンドとしてのプロテインＡの差し引きの助けとなり得る。
【００５４】
この濃縮法の適用がどの程度幅広いものか調べるため、本発明者らはＫ５６２がこの種の方法で特有の標的細胞であるかどうかを調べることにした。図４は接着性ＨｅＬａ細胞がＫ５６２細胞よりも程度は低いが同様に応答することを実質的に明らかに示している。Ｕ９３７細胞のＩＬ−２／Ｂ７レトロウイルス感染が低力価であることはまた、これらの細胞では濃縮率の評価ができないことを意味する。
【００５５】
濃縮ウイルスの細胞株感染能は細胞特異的なものではないが、パンソルビンに対するレトロウイルスの親和性がＩＬ−２／Ｂ７挿入部に独特なものであるかどうかを調べることは重要であった。従って本発明者らはｐＷＺＬｂｌａｓｔ中のＲａＲＴ挿入部など、他のベクターを用いたプロトコールを繰り返し行った。図５に詳細に示す結果は、レトロウイルスベクター濃縮能がある特定の挿入部／ベクター構築物に特異的なものではないことを示している。しかし、この場合、Ｕ９３７標的細胞がＮＢ４細胞よりも感染に対して受容性が高いことは注目に値する。これはＵ９３７細胞に毒性があるＩＬ−２の発現などといった挿入作用によるものであると考えられるが、本発明者らは５００００Ｕ／ｍｌといった高濃度でヒトＩＬ−２を一度に加えた３種類の懸濁細胞で、軟寒天クローニング効率には何ら阻害を示すことができなかった。ＩＬ−２の存在下または不在下でＵ９３７、Ｋ５６２およびＮＢ４のクローニング効率はそれぞれ７８％、４３％および１０％であった（細胞は２００細胞／ディッシュでプレーティング、データは示されていない）。このように外から加えたＩＬ−２はこれらの細胞に対して毒性はないが、ｄｅ ｎｏｖｏ細胞内ＩＬ−２の存在がこれらの細胞に対して異なる毒性があるかどうかを調べるためには調節型の発現ベクターが必要となる。
【００５６】
パンソルビン遠心分離による濃縮は通常上清サンプル５０ｍｌで行い、このプロトコールのスケールアップは主としてこの系に投入できる上清の量に依存する。５０ｍｌ遠沈管を用いて１０分毎に上清４００ｍｌを遠心分離できれば、何リットルという上清からのウイルスの産生は比較的簡単なものとなる。この研究は当初は低力価のウイルスに伴う問題に応じて行われたものであるが、高力価の出発材料ではどうなるかを検討するのも注目に値することである。パンソルビンは１０％（ｗ／ｖ）懸濁液として購入されるが、粒子数の見積もりは血球計算盤で計測することで求められ、その濃度は１ｘ１０１０から１ｘ１０１１／ｍｌの間であることを示す。このように上清５０ｍｌ（パンソルビン２５０μｌ）の濃縮のための標準プロトコールは１．２５ｘ１０１０粒子前後を用い、各粒子が１個の感染性レトロウイルス粒子としか結合できないとしても、これは５０ｍｌ上清中１．２５ｘ１０１０レトロウイルス粒子のパンソルビン保持能を与える。おそらくこの方法は本発明者らが研究してきたものよりも高力価の産生細胞で同等以上の効率であり得る。上清が１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌのレトロウイルスを含むとすれば、通常濃度のパンソルビン（２．５ｘ１０８／ｍｌ）と混合した場合、各レトロウイルスは隣のものと平均１００μｍと離れることになり、パンソルビン粒子とは平均１６μｍしか離れない。このように、レトロウイルスはパンソルビン粒子の近傍に到達するまでに１０〜２０μｍ移動することだけを必要とすることから、上清のレトロウイルス含量を高めたり低くしたりすると（ただし、パンソルビンの保持能以下）、レトロウイルスがパンソルビン粒子と接触する確率に若干の変化が生じる。レトロウイルスはパンソルビンと結合した場合には標的細胞に感染できないと予測されたが、実際には、３７℃にて標的細胞で希釈した場合には逆反応が起こって培地中へ徐々にレトロウイルスが放出される可能性がある。しかし本発明者らは、レトロウイルスは標的細胞に感染しつつ、パンソルビンと複合化されたままであると考えている。
【００５７】
結合機構に関する明確なデータはないが、本発明者らはウイルスがパンソルビンと結合しているものと確信しており、そうでなければ図３（ＰおよびＰ Ｆｉｌｅｔｅｒ）に示されているように同時インキュベートした上清の濾過は力価を引き下げないであろう。
【００５８】
本発明の第一の態様は、濃縮手順が至適化されたＰＧ１３細胞に作用することが本明細書で示されている。しかしＫ５６２細胞をターゲッティングするために同様のプロトコールを用いる場合、本発明者らはまた、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２３９およびＰＡ３１７４０（マウスパッケージング細胞、両栄養性ネズミ白血病ウイルスエンベロープ）に対してはパンソルビン単独で十分機能し、２００倍の容量減に対してノーマライズした場合、それぞれ１５００倍および６００倍の力価上昇であった。さらにこの方法は、ＦＬＹＡ１３５（ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞、両栄養性ネズミ白血病ウイルスエンベロープ）、ＦＬＹＲＤ１８５（ＲＤ１１４ネコ内在ウイルスエンベロープを有するＨＴ１０８０）などのその他のパッケージング細胞株でも行われている。さらに本発明者らは、エクトロピックパッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６４１（Ｍｏ−ＭＵＬＶ ｅｎｖ）由来のレトロウイルスをネズミ３２Ｄｐ２１０４３骨髄細胞に対して力価測定した場合、２００倍の容量減でパンソルビンが１５０倍濃縮できたことを見出した（これはＫ５６２細胞に対するＦＬＹＡ１３を有する株の効率である）。
【００５９】
本発明者らはレトロウイルスとパンソルビンとの結合がフィブロネクチン媒介物によって媒介され得ると考えている。少なくとも２つの細菌遺伝子のタンパク質産物が特殊な膜結合フィブロネクチン結合タンパク質（ｆｎｂＡ３２およびｆｎｂＢ３３）であろうと思われ、これら両者は黄色ブドウ球菌（Ｃｏｗａｎ Ｉ株ではないが）からクローニングされたものである。しかしＣｏｗａｎ Ｉのフィブロネクチン結合能は短い組換えｆｎｂＢペプチドの外からの適用によって阻害され得る３３（ｆｎｂＡは試験されていない）。Ｗｏｏｄ ４６株はこのように直接試験されてはいないが、フィブロネクチンまたはラミニンいずれかの存在下でのＣｏｗａｎ Ｉの凝集能はＷｏｏｄ ４６には実質的にはないものと証明されている４４。また、これらの両株はフィブロネクチンをコーティングした組織培養プラスチック器具に同じように接着するが４４、このことはＷｏｏｄ ４６がｆｎｂＡまたはｆｎｂＢのいずれかに、しかしおそらくは両方ではない、に欠陥があることを示しているということも注目に値することである。また、パッケージング細胞株ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ＰＡ３１７およびＰＧ１３に由来するレトロウイルスは全てヒトフィブロネクチンの組換え断片（ＣＨ−２９６１６，３１、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）としても知られる）と結合することも報告されている。従って、ＮＩＨ３Ｔ３由来パッケージング細胞４５から産生されたフィブロネクチンおよびレトロウイルスは培養の過程でフィブロネクチンと結合するようになり、かかるフィブロネクチン／レトロウイルス複合体は次にｆｎｂＡまたはｆｎｂＢを介してパンソルビンと結合し得る。ほとんどのパッケージング細胞からのフィブロネクチンの発現レベルはレトロウイルス力価の測定における制限因子となるはずであり、そうでなければＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ処理後に増強は見られない。このように、ネズミパッケージング細胞はフィブロネクチンの分泌に関して公式に試験されたことはないが、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞はＦＬＹＡ１３およびＦＬＹＲＤ１８のコアで、正常ヒト二倍体繊維芽細胞との０．３％の会合に比べてフィブロネクチンとしての全タンパク質の０．００４％しか発現せず４６、ＦＬＹＲＤ１８エンベロープはフィブロネクチンと結合さえしない４７。ＦＬＹＡ１３細胞もＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２およびＰＡ３１７の双方と同じｅｎｖタンパク質を用いているものの、濃縮アッセイはむしろ十分には行えない。パンソルビン／フィブロネクチン／レトロウイルス複合体はまた、フィブロネクチンの細胞結合ドメインは標的細胞と架橋し得る１６という点でＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎと同じように感染を促進することができ、それらが発現するＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の大部分は不活性であることからこれはＮＢ４細胞ではあまり有効ではない可能性がある４８。
【００６０】
本発明者らは４種の異なるバッチのパンソルビン、２バッチのサンソルビン、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製の同等のパンソルビン１バッチを用いた。パンソルビンの濃縮能には２〜４倍のバッチ間変動が見られ（濃縮後の力価では２０００〜７５００倍上昇）、常にサンソルビンより有効であることが分かり、またＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品よりも常に良好である。第一の着眼点として、このようなバッチ間変動は問題であると考えられる。しかし、Ｃｏｗａｎ Ｉの製造法はプロテインＡをもとにして至適化および品質管理されているが、ｆｎｂについてはなされていない。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製品の低い活性は２６００ｇでそれがどこまで十分にペレット化されるかに関わるものと思われるので、より良好な遠心分離を目的に至適化することでその活性は改良できる。
【００６１】
本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では明らかな適用性を有するが、治療適用性については、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入細胞でさえ高濃度のパンソルビンの存在下で時間を費やさなければならないので議論の余地があると考えられる。毒性因子は感染過程でパンソルビンをこすと考えられ、これらはｉｎ ｖｉｖｏで細胞ワクチンと接着するようになれば有毒となる可能性がある。しかし、この可能性は当技術分野の他の著者により棄却されている。にもかかわらず、ヒト用途ではパンソルビンのプロテインＡ成分だけが認可されている（自己免疫性血小板減少性紫斑（ＩＴＰＰ）の管理）５０。さらにウイルスにより誘導されるラット悪性腫瘍における有望な結果５１の後、プロテインＡのみを用いる患者血漿の体外吸着は、抗腫瘍免疫応答を阻害すると考えられる抗体複合体の除去に基づく転移性乳癌５２，５３、カポジ肉腫５３、および結腸癌５３の臨床試験の段階に達した５２，５３。しかしながら、レトロウイルスの役割の証拠がより強要され、ウイルス血症の軽減が循環しているレトロウイルス／抗体複合体に依存している他の悪性腫瘍の治療におけるＣｏｗａｎ ＩのプロテインＡおよびｆｎｂの相対的寄与について推測することは興味をそそられるものである５４，５５。
【００６２】
パンソルビンの作用はレトロウイルスと粒状支持体との間の相互作用がレトロウイルスの半減期内で起こり得ることを示す。これにより本発明者らはレトロウイルスベクターの濃縮のための簡便な方法を開発することができた。しかしながら本発明のさらなる態様はより臨床実施の助けとなり、広範なパッケージング細胞株に適用できると考えられる試薬を用いる改良である。
【００６３】
本発明の第一の態様に関する材料および方法
細胞株
ヒト（ＮＢ４、Ｕ９３７、Ｋ５６２）およびマウス（３２Ｄｐ２１０４３）骨髄細胞株およびＨｅＬａ上皮細胞は通常ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン（全てＳｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）で増殖させた。懸濁細胞は１ｘ１０５から１ｘ１０６／ｍｌの間で維持したが、ＨｅＬａ細胞はトリプシン処理により継代し、７ｘ１０６／９０ｍｍ以下の組織培養ディッシュで維持した。
マウス胚繊維芽細胞由来ＧＰ＋ｅｎｖＥ−８６４１、ＰＧ１３ ＧａＬｖシュードタイプ３（ＣＲＬ−１０６８６、ＡＴＣＣから入取）、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＰＡ３１７およびヒト肉腫由来ＦＬＹＡ１３およびＦＬＹＲＤ１８パッケージング細胞は通常、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン中で培養した。細胞は９０ｍｍ組織培養ディッシュで維持し、トリプシン処理により継代し、５ｘ１０５から７ｘ１０６／９０ｍｍ組織培養ディッシュの間で維持した。
【００６４】
試薬
パンソルビン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ５０７８５８）（熱で殺してホルマリン固定した黄色ブドウ球菌（Ｃｏｗａｎ Ｉ）の１０％（ｗ／ｖ）懸濁液）、高細胞表面密度のプロテインＡを有する１μｍ粒子を４℃で保存し、４〜６週間後に更新した。サンソルビン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ５５７６０１）（熱で殺してホルマリン固定した黄色ブドウ球菌（Ｗｏｏｄ ４６）の１０％（ｗ／ｖ）懸濁液）、細胞表面プロテインＡを含まない１μｍ粒子を４℃で保存し、４〜６週間後に更新した。不溶性プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｐ−７１５５）細胞懸濁液約１０％（湿重／ｖｏｌ）の不活性Ｃｏｗａｎ株の黄色ブドウ球菌を４℃で保存し、４〜６週間後に更新した。プロテインＡ−ビオチン標識物（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｐ−２１６５）をプロテインＡ分泌黄色ブドウ球菌株の培地（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．０、−２０℃で保存）から精製した。ブラスチシジンＳ塩酸塩（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ， ＵＫ， １５０４７７）は濾過除菌し、−２０℃で５ｍｇ／ｍｌ水溶液で保存した。ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｐ−８８３３）は濾過除菌し、−２０℃で５ｍｇ／ｍｌ水溶液で保存した。Ａｇａｒ Ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＵＳＡ， ０１４２−１７−０）。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｈ−９２６８）水で８ｍｇ／ｍｌとし、−２０℃で濾過除菌保存した。ストレプトアビジンマグネスフェア常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ， Ｚ５４８２）ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ（５ｘ１０８粒子／ｍｌ）の１μｍ径常磁性粒子は４℃で保存した。
【００６５】
産生細胞の作製および培養
ＰＧ１３、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２およびＰＡ３１７パッケージング細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６／９０ｍｍディッシュでプレーティングし、４時間後に培地を吸引し、４μｇ／ｍｌポリブレンを含有するＧＰ＋Ｅ−８６上清を濾過したもの（０．４５ｍＭ）１０ｍｌと置き換えた。これらリン酸カルシウムでトランスフェクトしたＧＰ＋Ｅ−８６混合細胞集団はｐＷＺＬＩＬ−２／Ｂ７３０またはｐＷＺＬＲａＲＴレトロウイルスベクター（ブラスチシジンＳ耐性を付与する）またはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏベクター（ピューロマイシン耐性を付与する）を産生した。２４時間後にこの感染を繰り返し、細胞をさらに４８時間培養し、適当であれば４週間１０μｇ／ｍｌブラスチシジンＳまたは５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で細胞を選択し、耐性細胞の混合集団を低温保存した。
ＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３パッケージング細胞を７．５ｘ１０５／９０ｍｍディッシュで開始し、一晩培養した後に培地を吸引し、８μｇ／ｍｌポリブレンを含有するＧＰ１３．ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏ上清を濾過したもの（０．４５μｍ）１０ｍｌと置き換えた。７２時間後に培地を吸引し、５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する新鮮培地と置き換えた。細胞をさらに７日間培養し、この時点で対照培養物は全て死滅しており、生存しているものの混合集団を低温保存した。
【００６６】
レトロウイルスの作製
ＰＧ１３、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ＰＡ３１７およびＧＰ＋Ｅ−８６産生細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６／９０ｍｍディッシュでプレーティングし、７２時間後に培地を置き換え、２４時間後、培地を吸引し、０．４５μｍフィルターで濾過し、さらなる処理のために採取した。ＦＬＹＡ１３およびＦＬＹＲＤ１８細胞を２ｘ１０６／９０ｍｍディッシュでプレーティングし、４８および７２時間後に培地を更新し、全９６時間後に培地を吸引し、０．４５μｍフィルターで濾過し、さらなる処理のために採取した。
【００６７】
黄色ブドウ球菌の調製
パンソルビン、サンソルビン、または不溶性プロテインＡをＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで１：２０希釈し、４℃で１８時間保存した。必要な量を遠心分離し（２６００ｇ、２０分、４℃）、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで所望の濃度に再懸濁した。
【００６８】
パンソルビン／サンソルビン：レトロウイルス複合体の調製および濃縮
示された量のパンソルビン／サンソルビンを滅菌ポリプロピレン管の所望の量のレトロウイルス上清に加え、一定の運動の下（Ｓｔｕａｅｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＲＴ１ ｔｉｌｔｉｎｇ ｒｏｌｌｅｒ ｍｉｘｅｒ）、４℃で混合物をインキュベートした。示された時点で混合物をそのままｃｆｕ／ｍｌ力価測定を行うか、遠心分離濃縮を行った。濃縮については４５または５０ｍｌの混合物を遠心分離し（２６００ｇ， １０分， ４℃）、上清を廃棄し、ペレットを１０ｍｌの冷ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、上記のように再び遠心分離した。上清を注ぎ出し、これらの試験管を６０秒間逆さにして保存して排水し、ペレットを約２５０μｌの冷ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。ペレットの再懸濁は塊を形成しやすいので困難であり（特にパンソルビン）、最終量の２５０μｌは５０％が塊およびスラリーで５０％が新鮮培地からなる傾向にある。要すれば混合物に１５０ｇでパルスをかけ（効率的な回収のため）、氷上で保存するため、またｃｆｕ／ｍｌ力価の測定のためにポリプロピレン低温バイアルに取り出してもよい。
【００６９】
ｃｆｕ／ｍｌ力価の測定
Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＮＢ４および３２Ｄｐ２１０細胞の懸濁液をカウントし、４．４μｇ／ｍｌのポリブレンを含むＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中４ｘ１０５ｍｌに調整した。次にこれらの細胞を１ｍｌアリコートで２４ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２で１〜３時間インキュベートした。レトロウイルス調製物をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで連続１：１０希釈を行い、１００μｌを３つのウェルに加えてよく混合した。１８〜２４時間後、細胞０．９ｍｌを３．８ｍｌのＲＰＭＩ＋２４％ＦＣＳ＋１．３ｍＭピルビン酸ナトリウムと混合し、３７℃で維持した後、オートクレーブにかけて６０℃で維持した５％ｗ／ｖ Ｎｏｂｌｅ Ａｇａｒ水溶液（最終濃度０．３％）０．３ｍｌを加えた。次に細胞を６０ｍｍ組織培養ディッシュにプレーティングし、寒天を固化させた後、３７℃／５％ＣＯ２下に置いた。さらに１８〜２４時間後、さらに２０μｇ／ｍｌブラスチシジンＳか１０μｇ／ｍｌピューロマイシンのいずれかを含有するＲＰＭＩ＋２０％ＦＣＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム５ｍｌを注意深く加え、それぞれ１０および５μｇ／ｍｌの軟寒天選択濃度とした。これらのディッシュをさらに２〜３週間培養に戻し、その後、軟寒天コロニー数を求めた。濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）はディッシュ／ウェル当たりのコロニー数に希釈率を掛けて算出した。全てのｃｆｕ／ｍｌ測定で倍数希釈を用いたが、大抵の場合正確にカウントするには少なすぎたり多すぎたりして（すなわち３００／６０ｍｍディッシュを超える）有益な情報は得られない。
【００７０】
接着性ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、カウントしてＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中１ｘ１０５／ｍｌに調整した後、２４ウェル細胞培養プレートに０．５ｍｌアリコートでプレーティングした。１８時間インキュベーションした後（３７℃／５％ＣＯ２）、感染１〜３時間前にポリブレンを含有するさらに０．５ｍｌの培地を加えて最終濃度４．４μｇ／ｍｌとした。
レトロウイルスにＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで連続１：１０希釈を行い、適当な希釈の１００μｌアリコートを３回加え、標的細胞と混合した。４８時間感染させた後、培地を１０μｇ／ｍｌブラスチシジンＳを含有する新鮮培地に置き換えた。培地は２週間の間３〜４日ごとに更新し、その後吸引し、プレートを２ｍｌクーマシーブルー染色液（４５％メタノール：１０％酢酸中５．３５％ｗｔ／ｖｏｌ）で染色し、水道水で洗浄し、コロニーをカウントして力価を測定した。
【００７１】
本発明の第二、第三、第四の態様に関する詳細な説明
フィブロネクチンと会合したＰＧ１３由来レトロウイルスの常磁性粒子を媒介とする濃縮
ＰＧ１３由来レトロウイルスがパッケージング細胞上清中のフィブロネクチンと実際に会合しているかどうかを調べるため、本発明者らはＰＭＰと結合したネズミフィブロネクチンに対するポリクローナル抗体を用いた。これまでに記載の軟寒天コロニー形成アッセイ５６を用いてアッセイした際のこれらの粒子の感染性ＰＧ１３レトロウイルスを捕捉する能力は図７に詳しく示されている。濃縮しない場合、ヒト骨髄Ｋ５６２細胞に対する最初の力価（ｃｆｕ／ｍｌ）は１．４ｘ１０５±９ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ（対照）であり、これをプロテインＡ−ビオチン結合ＰＭＰ（ＰＡＢ）とともに上清量１２５倍減まで濃縮したところ、この力価は１．６ｘ１０７±３．４ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌまで１００倍を超えて高まった。しかし、プロテインＡ−ビオチンを介してＰＭＰと結合したポリクローナルウサギ抗マウスフィブロネクチン抗体（プロテインＡ抗体ビオチン：ＰＡＡＢ）はその力価を４ｘ１０８±９．５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌまで高め、同じ１２５倍の容量減で２８００倍の上昇を示す。配向特異的抗体固定を生じる抗体プロテインＡ−ビオチンの組合せは、プロテインＡ−ビオチン単独より２５倍効果が高い。しかし、プロテインＡ−ビオチン単独の効率はフィブロネクチンかレトロウイルスかのいずれかに対するプロテインＡの親和性が限定されていることを示唆するものではない。
【００７２】
ネズミフィブロネクチンに対する抗体はネズミフィブロネクチン由来パッケージング細胞由来の感染性レトロウイルスをレトロウイルス上清から捕捉することを可能とする。わずか１２５倍の容量減で２０００〜３０００倍のオーダーでレトロウイルスに力価上昇をもたらす。捕捉されたレトロウイルス集団の総感染力（ｃｆｕ／ｍｌ）は対照上清のほぼ２０倍である。このことはブラウン運動のみというようりむしろＰＭＰの重力を媒介とする沈降によってウイルスの細胞への送達の上昇１５、またはＰＭＰ捕捉後のレトロウイルスの感染性の向上を反映している。磁気濃縮後のレトロウイルス／ＰＭＰ混合物からの上清を用いる枯渇実験ではまた、上清からのレトロウイルス力価の９０数％の低下が示されている。このデータはＰＧ１３パッケージング細胞がネズミフィブロネクチンを上清中へ分泌し、レトロウイルス粒子の大部分がそれと会合しているか、あるいはフィブロネクチンの不在下のレトロウイルスには感染力がないかのいずれかであることを確信させるものである。
【００７３】
この方法の効率は、レトロウイルスとフィブロネクチンとの結合およびフィブロネクチンと標的細胞との結合を担う両エピトープがこれらの条件下で抗体によって立体障害を受けていないということを示している。
【００７４】
このプロトコールは５ｍｌのレトロウイルス上清を濃縮するのに全部で１．２５ｘ１０９ＰＭＰを用いるが、ＰＭＰの数を減らしたさらなる実験では、ＰＭＰの集塊形成によって根拠付けられるようにさらなる架橋が生じた。低濃度のプロテインＡ−ビオチンおよび抗体を用いた他の試みでもまた、レトロウイルス濃縮の効率はよる低いものであった。
【００７５】
レクチン／ＰＭＰを媒介とするレトロウイルス粒子捕捉
ネズミパッケージング細胞から放出されたレトロウイルス粒子はヒト血清による不活性化に極めて感受性が高く、用いたパッケージング細胞およびエンベロープタンパク質の双方に依存するものと思われる５７。この感受性の大部分はネズミパッケージング細胞によって放出されたレトロウイルス粒子のエンベロープタンパク質に対する末端Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ修飾によるものである。このネズミ酵素のヒトホモログは祖先から獲得した突然変異を有し、ヒト細胞で顕現する（α１−３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に低下をきたす５８，６０。ヒト血清で見られるＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ修飾に対する高レベルの抗体は、ネズミパッケージング細胞に由来するレトロウイルスベクターがｉｎ ｖｉｖｏで急速に不活性化されることを確実なものとする５７。ＰＧ１３由来レトロウイルスにおけるＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ修飾の存在は、ＰＧ１３レトロウイルスを捕捉する第二の方法論を与える。図８はＧａｌ（α１−３）Ｇａｌ結合イソレクチンＢ４（ＢＳＩ−Ｂ４）６１または主としてより偏在性のα−マンノース修飾と結合するコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）６２のいずれかと結合したＰＭＰを用いた濃縮効率を示している。これらの２種のＰＭＰ結合レクチンのいずれかを用いると、対照力価４ｘ１０８±５．５ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌは、上清量を１２５倍減じた後、ビオチン−ＢＳＩ−Ｂ４では７ｘ１０８±６．４ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌ（１７００倍）、またはビオチン−ＣｏｎＡでは５．４ｘ１０８±５ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌ（１３００倍）まで高めることができる。ＰＭＰ単独による濃縮は４倍の上昇（１．６ｘ１０６±４ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ）をもたらしたが、このことはレトロウイルス濃縮がストレプトアビジンではなくむしろレクチンに依存していたことを証明している。この方法論はフィブロネクチンと結合できないレトロウイルスベクターに有効であり得ることからより幅広く適用できよう４７。この場合、レトロウイルスはＰＭＰと密接に会合し、かつ、本発明の第二の態様のようにフィブロネクチンのような大きな中間体タンパク質によって捕捉されないので感染性を維持するということは驚くべきことである。このことは本質的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１による感染を阻害することが知られている６３レクチンの１つであるＣｏｎＡについてもその通りであるが、これはその独自の受容体利用を反映する特殊なケースであるかもしれない６４。同様のＣｏｎＡ捕捉法は実際に、ＰＧ１３由来ベクターで見られた上昇とは著しく対照的に、ＨＩＶ−１の感染力価を引き下げた（９５％を超える低下）６５ことも注目に値する。しかしながら、レクチンは、フィブロネクチンと類似の様式で媒介として働く上清中のタンパク質と結合するのであって、レトロウイルス自体と直接結合するのではないという可能性もある。
【００７６】
ヒトＨＴ１０８０由来パッケージング細胞に適用したレクチン／ＰＭＰを媒介とする磁気濃縮
このレクチン法はまたＦＬＹＡ１３およびＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルスに対しても試験されており５，６６、それに関して本発明者らはこれまでに有効な方法を設計することができなかった。図９はＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３由来レトロウイルスのレクチン／ＰＭＰを媒介とする濃縮を示している。ＦＬＹＲＤ１８細胞の力価は３．５ｘ１０４±１．１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ（対照）であり、ＣｏｎＡを媒介とする濃縮はこれを１．２ｘ１０７±３．６ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌに高めた（１２５倍）。このような３４２倍の上昇はＰＧ１３で達成できる１３００倍より遙かに小さいものであり、ＦＬＹＲＤ１８レトロウイルスのＣｏｎＡ／ＰＭＰを媒介とする濃縮は通常、ＰＧ１３から得られたものより５倍低い効率である。ＢＳＩ−Ｂ４／ＰＭＰ濃縮物の力価は対照より６倍高いだけで（２．２ｘ１０５±６．４ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ）、ヒト細胞に最少量のα−ガラクトシル基が存在することが確実である。ＦＬＹＡ１３細胞の力価は６．２ｘ１０±５．７ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌ（対照）であり、これはＣｏｎＡ／ＰＭＰを媒介として１２５倍に減量した後、２．３ｘ１０６±２ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌまで３６９倍高まる。ここでもまた、ＢＳＩ−Ｂ４はヒト由来パッケージング細胞から放出されたレトロウイルスを捕捉する上で効果がなかった。ＦＬＹ由来のレトロウイルスはＰＧ１３由来のものよりも効果は小さいものの、レクチンを媒介とする濃縮はＨＴ１０８０（ＦＬＹ）由来レトロウイルス系に対してはなお、これまでに記載された最も有効なものである５。
【００７７】
ビオチンスクシンイミドエステル／ＰＭＰを媒介とするＰＧ１３レトロウイルス粒子捕捉
本発明の第二の態様（抗体を媒介とする）および本発明の第二の態様（レクチンを媒介とする）は現在までのところ、遺伝子治療に使用される全ての包膜レトロウイルスパッケージング細胞株に対して普遍的に利用可能または有効なものではない。従って、本発明者らは本発明の第四の、レトロウイルスのＰＭＰを媒介とする濃縮に関しておそらくは最も強力な態様を設計した。標識パッケージング細胞６７、６８に対する方法論を用いて、ＰＧ１３パッケージング細胞を、ビオチンをパッケージング細胞の表面のタンパク質と共有結合させるスクシンイミドエステル誘導体で標識した。図１０ａはビオチン化したパッケージング細胞に由来するレトロウイルスのＰＭＰを媒介とする濃縮の結果を示している。濃縮を行わない場合の、パッケージング細胞のビオチン化（ＢＳＥ）または担体単独（ＤＭＳＯ）処理による力価への効果はない（対照： ４．６ｘ１０５±１．５ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ、ＤＭＳＯ： ４．２ｘ１０５±２．６ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ、ＢＳＥ： ４．２ｘ１０５±３．６ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ）。ビオチン化を行わない場合（ＤＭＳＯ担体単独での細胞の処理）、ＰＭＰ単独ではレトロウイルスを捕捉することができない （ＤＭＳＯ濃度： ４．６ｘ１０５±１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ）。
【００７８】
ビオチニル化パッケージング細胞はＰＭＰのストレプトアビジンと親和的に結合するレトロウイルスを放出し、わずか１２５倍の容量減でも力価は１．８ｘ１０９±１．８ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌまでの濃縮（４２００倍増強）を達成し、ＰＧ１３に対して最も有効な方法であると思われる。さらに、容量を減じた上清の力価は６．４ｘ１０４／ｍｌ±１．４ｘ１０４／ｍｌまでの低下を示し、これは対照力価の８０％を越える低下となる。図１０ｂは標識２４時間後にアビジン−ＦＩＴＣで検出可能な表面改変程度を示すＦＡＣＳプロフィールを示している。ＤＭＳＯ単独で処理し、アビジン−ＦＩＴＣ（ＤＭＳＯ＋Ａｖ−ＦＩＴＣ）で染色した対照細胞の蛍光性と、２４時間前にビオチン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理し、アビジン−ＦＩＴＣ（ＢＳＥ＋Ａｖ−ＦＩＴＣ）で染色した細胞のものとの比較によりプロフィールの詳細を示す。培養２４時間後でさえも２ｌｏｇを越える蛍光性のシフトがある。ビオチニル化反応はパッケージング細胞に対して毒性はなく、アミノ酸リジン側鎖のＮＨ２末端を標的にするものと考えられている。懸濁細胞のビオチン化を扱う先の試験では、タンパク質ターンオーバーの結果として表面改変部がかなり急速にエンドサイトーシスされることを示唆する。そのため、ほとんどのビオチン化タンパク質が上清に放出されない。出芽プロセスでのレトロウイルスｇａｇおよびｐｏｌとの結合の前にパッケージング細胞の表面に存在するエンベロープタンパク質がビオチン化される。このように、ビオチン標識したレトロウイルスはかかるビオチン化パッケージング細胞から放出され得る。その他の細胞の表面タンパク質はレトロウイルスコート上にそれらのビオチン化誘導体として提示され得るため、ｅｎｖタンパク質をビオチン化する必要はない。さらに、後にレトロウイルスと結合することとなるパッケージング細胞に由来するタンパク質をビオチン化の最初の標的としてもよい。レトロウイルスの表面には３００個のエンベロープ分子があると予測されることから、ビオチン化プロセスの効率は捕捉にとって大きな問題ではない。ビオチン／ストレプトアビジン相互作用の強度がとても強いため、レトロウイルスを捕捉するにはたった１個のビオチンがＰＭＰと接触することで十分であろう。
【００７９】
効率的なビオチンスクシンイミドエステル／ＰＭＰを媒介とするＦＬＹＲＤ１８およびＡ１３捕捉
コンカナバリンＡを媒介とするＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３捕捉では予想したほどの良い結果は得られなかった。本発明者らは、ビオチンＳＥ捕捉によってレトロウイルスがこれらのパッケージング細胞から効率的に捕捉されるかどうかを調べることにした。図１１はＦＬＹＲＤ１８（図１１）およびＦＬＹＡ１３（図１１）におけるビオチンを媒介とする磁気濃縮の効率を調べる試験の結果を示している。開始力価への担体単独およびビオチン改変の影響をさらに試験し、ＦＬＹＲＤ１８（図１１）では対照力価（４．６ｘ１０４±８．７ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）と、ＤＭＳＯ担体（４．７ｘ１０４±１．２ｘ１０４ｃｆｕ／ｍｌ）、またはビオチン改変（５．４ｘ１０４±３ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ）のものとに違いはなかった。細胞を担体（ＤＭＳＯ）単独で処理した場合、１２５倍の容量減によってレトロウイルスの濃縮はなされなかった、ＤＭＳＯ濃度： ４．３ｘ１０４±７ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ。ＦＬＹＲＤ１８のビオチン化の結果、１２５倍の容量減によって開始物質の２０００倍を越える１ｘ１０８±１．８ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃縮力価を得た。これはＰＧ１３のものに近い効率を示すものであった。また、本発明の第４の態様によってＦＬＹＡ１３細胞も効率的に濃縮されることも調べられた。
【００８０】
対照および濃縮ＰＧ１３由来レトロウイルスの冷凍／融解安定性
レトロウイルス調製物は、独立して行われる必要な安全性試験のため、予め調製しておく必要がある。そのため、濃縮が冷凍後の感染性の維持に関連してどのような意味合いをもっているのかを調べることが重要である。図１２から、レトロウイルス濃縮物が冷凍した対照上清よりも実際は安定していることが分かる。対照はそれぞれ、１回目の冷凍融解によってそれらの力価は８０％を越える低下を示し、２回目の後には９４％を越える低下を示す。濃縮物の場合、活性のほとんどが１回目の融解によって失われる（６０％まで）が、後に感染性がさらに失われることはほとんどない。よって、ＰＧ１３由来濃縮物は未処理の上清よりも有効に保存することができる（ＣｏｎＡおよびＢＳ−ＩＢ４の場合−２０℃で６週間を越える）。以下で記載するように、濃縮物を、３容量の１０％ＤＭＳＯの添加によって得た７．５％ＤＭＳＯ、２０％ＦＣＳの最終濃度で冷凍した （よって、融解した濃縮物の力価についてはこの希釈を考慮に入れて調整した）。濃縮物を滴定するためには多くの希釈物が必要であり、ＤＭＳＯの影響を問題にするものではないため、融解後のレトロウイルス調製物をさらに洗浄するＰＭＰ磁気濃縮装置を使用することもできる。しかし、融解レトロウイルスの１０倍希釈でさえ、重大なＤＭＳＯ混入をなお含むため、対照上清の冷凍はＤＭＳＯ存在下での冷凍に従わない。
【００８１】
ＰＭＰ／レトロウイルス複合体はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける感染局在化に使用できる
現在では、実質的に「感染性、常磁性、レトロウイルスベクター粒子」であるものを製造することができる。これらは磁気によって所望の感染位置に引き寄せることができる。図１３ではｉｎ ｖｉｔｒｏ磁気局在化の一例を示し、この方法論の原理を例示している。磁気シートから切断し、ＨｅＬａ細胞の密集に至らない培地の下部に置かれた図中の付形物（ｄ）によって、レトロウイルスを引き寄せかつ保持し、磁性物質（ｃ）の存在によってのみ指図される部分に主として感染させることができる。本明細書において使用される特定の設計は、このターゲッティングが撹拌中のディッシュにおけるレトロウイルスベクターをボルテックスする渦流体力学の結果ではないことを示すことを意図している。さらに、この試験では感染が磁場の連続した存在下で起こり得ること、レトロウイルスが培養中に常磁性粒子により捕捉されることが分かる。この磁気シーティングは弱いが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるレトロウイルス感染に対しては極めて有効である。しかし、有効なｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングは三次元の問題であり、より強力な磁場が必要である。ｉｎ ｖｉｖｏ環境では、接近可能な部位で小型永久磁石が使用でき、ｅｘ ｖｉｖｏ発生した電磁界を１つの特定部位に同時に集中させる。全てのターゲッティングにおいて、ターゲッティングされていない部位の感染抑制が主要な問題であり、このため記載したもののようなレトロウイルスベクターの可逆的不活性化は画期的かつ優れた開発（２８）である。可逆的に不活性化されたレトロウイルスベクターの特異的組織、器官への局在化および転移、その後の感染の局在的再活性化によってさらなるレベルの洗練がｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングに加えられるであろう。
【００８２】
要するに、ストレプトアビジンＰＭＰ技術とリガンドの好適な選択によりＰＧ１３およびＦＬＹパッケージング細胞双方に由来するレトロウイルスを捕捉する。この研究は３種類のパッケージング細胞型と２種類の標的細胞系の試験にすぎず、標的細胞型とレトロウイルスによる受容体の使用の両方に依存した好ましい捕捉方法が存在すると思われるため、各標的細胞型のさらなる最適化によって濃縮物の感染性がさらに増強すると考えられる。例えば、コンカナバリンＡはα−マンノース改変受容体を介して侵入するレトロウイルスに対する最善の選択ではないと考えられよう（２５−２７）。また、ＰＭＰに対するスペアビオチン結合能力を用いてさらなるタンパク質を結合し、リガンドでしか達成し得ない程度のターゲッティング（３１−３４）、またはレトロウイルス包膜遺伝子の単鎖Ｆｖ改変（３５−３８）を導入してもよい。本発明者らは、リガンドと感染製剤とを個体の遺伝子改変なく結合させることにより、レトロウイルスターゲッティングにおけるより高い順応性が加わり、シュードタイピング（３１、３３、３７）および標的細胞特異的パッケージング細胞設計（３２、３４、３５、３８）両方に関する必要条件がなくなることを十分に理解している。また、さらなるリガンドの不在下では常磁性レトロウイルスベクターがその他の同一細胞内にある小細胞群に向けたｉｎ ｖｉｖｏ感染ターゲッティングの有望な方法であることも注目に値する。
【００８３】
レトロウイルス／ＰＭＰ比を最適化する改変に関するＰＭＰ／レトロウイルス技術はポリカチオンエンハンサー依存性（３９）を軽減し、さらにキャプチャーカレントレンチウイルスベクター構築物（４０）を、ＰＭＰ濃縮物として適用して磁場により必要な部位に保持、またはその部位に向けてｉｎ ｖｉｖｏレトロウイルス感染の可能性を高める。
【００８４】
材料および方法
細胞株
ヒト骨髄懸濁液（Ｋ５６２）およびＨｅＬａ接着性上皮細胞は通常、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン（全てＳｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）で増殖させた。懸濁細胞を１ｘ１０５ないし１ｘ１０５／ｍｌ間で維持し、トリプシン処理によりＨｅＬａ細胞を継代し、７ｘ１０６未満／９０ｍｍ組織培養ディッシュで維持した。
ＰＧ１３ ＧａＬｖ シュードタイプパッケージング細胞３（ＣＲＬ−１０６８６、ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡから入手）は通常、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンで培養させた。細胞を９０ｍｍ組織培養ディッシュで維持し、トリプシン処理により継代し、５ｘ１０５ないし７ｘ１０６／９０ｍｍ組織培養ディッシュ間で維持した。
【００８５】
試薬
ストレプトアビジンマグネスフェア常磁性粒子、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ（５ｘ１０８粒子／ｍｌ）の１μｍ径常磁性粒子、４℃で保存。ポリクローナルＩウサギ抗マウスフィブロネクチン、ＰＢＳ中１０．８ｍｇ／ｍｌ、４℃で保存（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， ４４７０−４３３９）。プロテインＡ分泌Ｓ． ａｕｒｅｕｓ株の培養物から精製したプロテインＡ−ビオチン標識（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｐ−２１６５） （ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ ＰＨ ８．０、−２０℃で保存）。スクシニル−コンカナバリンＡ、ビオチン標識（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｌ０７６７）、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ ＰＨ ８．０、−２０℃で保存。Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ＳｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａのイソレクチンＢ４、ＢＳ−Ｉビオチン標識（ＢＳ−ＩＢ４）、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ ＰＨ ８．０、−２０℃で保存（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｌ２１４０）。カプロン酸ビオチンアミド  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｂ２６４３）、ＤＭＳＯで３６６ｍＭまで再構成、−２０℃で保存。以後ＢＳＥと記す。アビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ａ−２９０１）、−２０℃で保存、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ ＰＨ ８．０まで再構成。ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ， Ｐ−８８３３）、濾過滅菌、水中５ｍｇ／ｍｌ、−２０℃で保存。
【００８６】
産生細胞の生成および培養
ＰＧ１３パッケージング細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６／９０ｍｍディッシュにプレーティングした。４時間後、培地を吸引し、４μｇ／ｍｌポリブレンを含有する濾過した（０．４５μｍ）ＧＰ＋Ｅ−８６上清１０ｍｌと置き換えた。これらのリン酸カルシウムでトランスフェクトしたＧＰ＋Ｅ−８６混合細胞集団はピューロマイシン耐性を与えるｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏベクターを産生した。この感染を２４時間後に繰り返し、それらの細胞をさらに４８時間培養し、５μｇ／ｍｌピューロマイシン含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで細胞を４週間選抜し、耐性細胞の混合集団を低温保存した。
ＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３パッケージング細胞を７．５ｘ１０５／９０ｍｍディッシュで開始し、一晩培養した後、培地を吸引し、８μｇ／ｍｌポリブレンを含有する濾過した（０．４５μｍ）ＰＧ１３．ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏ上清１０ｍｌと置き換えた。７２時間後、培地を吸引し、５ｍｇ／ｍｌピューロマイシン含有新鮮培地と置き換えた。細胞をさらに７日間培養した。この時点で全ての対照培養物が死滅し、生存物の混合集団が低温保存できた。
【００８７】
レトロウイルスの作製
ＰＧ１３産生細胞をトリプシン処理し、１ｘ１０６／９０ｍｍディッシュにプレーティングし、７２時間後に培地を更新した。２４時間後に培地を吸引し、０．４５μｍフィルターで濾過し、さらなる処理に用いた。ＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３を２ｘ１０６／９０ｍｍディッシュにプレーティングし、４８および７２時間後に培地を吸引し、新しいものと取り換えた。さらに２４時間後、能力のないレトロウイルスを含有する培地を吸引し、０．４５μｍフィルターで濾過し、さらなる処理に用いた。
【００８８】
ビオチン標識レトロウイルスの作製
細胞を、実質的には接着性細胞６７、６８の改変に関する上記のように、ビオチン化した。要するに、７２時間培養した後、培地を完全に吸引し、０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２および０．４８ｍＭ ＭｇＣｌ２をさらに添加したＰＢＳ ＰＨ ８．０で洗浄し、新たに希釈したＢｉｏｔｉｎＳＥ（ＰＢＳ ＰＨ ８．０中５００μＭ＋Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）１０ｍｌと置き換えた。細胞を室温で３０分間インキュベートし、この後、試薬を完全に吸引し、新鮮増殖培地と置き換え、さらに細胞を戻して３℃で培養した。さらに３ないし４時間後、再び培地を新しいものと取り換え、細胞を戻して１８時間培養し、この後、レトロウイルス上清を吸引した。全ての場合において、同時に担体単独（ＤＭＳＯ）で標識した対照も処理した。
【００８９】
免疫蛍光検査法
ビオチン化パッケージング細胞を一晩培養した。レトロウイルスを回収した後、細胞をヴェルセンの存在下で丁寧にピペッティングして培地から除去し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに入れた。総数１ｘ１０６の細胞を１００μｌのＨＢＳＳ＋１％ＦＣＳ中、１０μｇ／ｍｌアビジン−ＦＩＴＣ有りまたは無しで標識した。細胞を室温でインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。
【００９０】
常磁性粒子の調製
５ｍｌのレトロウイルス上清に対し、２．５ｍｌの常磁性粒子（ＰＭＰ）（５ｘ１０８／ｍｌ）を１５ｍｌポリプロピレンチューブに入れ、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−６磁気粒子濃縮装置に適用し、上清を吸引し、さらにＰＭＰを１ｍｌの濾過滅菌ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡに再懸濁し、滅菌１，５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。次いで、ＰＭＰをＤｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｅ磁気粒子濃縮装置に適用し、上清を吸引し、さらにＰＭＰを０．４ｍｌの濾過滅菌ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＭＰＣ−Ｅに適用し、上清を吸引した。
抗体結合に関しては、ＰＭＰを５０μｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡおよび５０μｌの２ｍｇ／ｍｌプロテインＡ−ビオチンに再懸濁した。室温で３０分間インキュベートした後、ＰＭＰをＭＰＣ−Ｅを用いてＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、２５０ｍｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中５ｍｇ／ｍｌポリクローナルＩｇウサギ抗マウスフィブロネクチンに再懸濁した。
【００９１】
レクチン結合に関しては、ＰＭＰを１００μｌの１ｍｇ／ｍｌビオチンスクシニル−コンカナバリンＡ、１００μｌの５００μｇ／ｍｌビオチン標識イソレクチンＢ４（ＢＳ−ＩＢ４）のいずれかに再懸濁した。ビオチンスクシンイミドエステル濃縮および対照非結合ＰＭＰに関しては、ＰＭＰを１００μｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡに再懸濁した。
室温で３０分間インキュベート（定期的に撹拌しながら）した後、全てのＰＭＰ複合体をＭＰＣ−Ｅを用いて５００μｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。最終洗浄後、ＰＭＰを所望の容量のレトロウイルス上清に再懸濁した。
【００９２】
ＰＭＰの調製および濃縮： レトロウイルス複合体
通常１．２５ｘ１０９で調整したＰＭＰを滅菌ポリプロピレンチューブに入った５ｍｌのレトロウイルス上清に再懸濁し、混合物を定速運動 （Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＲＴ１ ｔｉｌｔｉｎｇ ｒｏｌｌｅｒ ｍｉｘｅｒ）下、４℃でインキュベートした。２．５時間後に混合物をＤｙｎａｌ ＭＰＣ−６に適用し、上清を吸引し、さらにＰＭＰを１ｍｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡまたはＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳのいずれかに再懸濁した（レクチン濃縮）。次いで、ＰＭＰをＭＰＣ−Ｅを用いてさらに３回洗浄し、ＰＭＰを最小量のＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。１．２５ｘ１０９のＰＭＰの充填量を２０μｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、最終容量を４０μｌとする（５ｍｌ： ４０μｌ、１２５倍容量）。後にこれをさらに処理する。
【００９３】
ｃｆｕ／ｍｌ力価の測定
Ｋ５６２細胞の懸濁液をカウントし、４．４μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中４ｘ１０５／ｍｌに調整した。次いで、細胞を１ｍｌアリコートで２４ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２で１ないし３時間インキュベートした。レトロウイルス調製物をＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで１：１０で連続希釈し、１００μｌを３つのウェルに加え、完全に混合した。１８ないし２４後、０．９ｍｌの細胞を３．８ｍｌのＲＰＭＩ＋２４％ＦＣＳ＋１．３ｍＭピルビン酸ナトリウムと混合し、３７℃で維持し、その後、さらなる０． ３ｍｌのオートクレーブ処理した５％寒天（６０℃で維持）（最終濃度０．３％）を加えた。次いで、細胞を６０ｍｍ組織培養ディッシュにプレーティングし、寒天を移植した後、３７℃／５％ＣＯ２で培養した。さらに４８時間後、さらなる５ｍｌのＲＰＭＩ＋２０％ＦＣＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（全て１０μｇ／ｍｌピューロマイシン含有）を慎重に加え、５μｇ／ｍｌピューロマイシンの軟寒天選択濃度とした。ディッシュを戻し、さらに２ないし３週間培養し、その後、軟寒天コロニー数を測定した。濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）はディッシュ／ウェル当たりのコロニー数に希釈率を掛けて算出した。全てのｃｆｕ／ｍｌ測定で、倍数希釈を用いたが、大抵の場合正確にカウントするには少なすぎたり多すぎたりして（すなわち３００／６０ｍｍディッシュを超える）有益な情報は得られない。
【００９４】
接着性ＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、カウントし、１ｘ１０５／ｍｌに調整し（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳまたは要すればＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）、次いで、０．５ｍｌアリコートで２４ウェル細胞培養プレートにプレーティングした。１８時間インキュベート（３７℃／５％ＣＯ２）した後、感染１ないし３時間前にさらに０．５ｍｌのポリブレン含有培地を加え、最終濃度を４．４ｍｇ／ｍｌとした。
レトロウイルスをＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで１：１０連続希釈し、３つの１００μｌアリコートの好適な希釈物を標的細胞に加え、さらに混合した。感染４８時間後、培地を５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する新鮮培地と置き換えた。培地を２週間３ないし４日毎に取り換え、この後これを吸引し、このプレートを２ｍｌクーマシーブルー染色液（４５％メタノール： １０％酢酸中５．３５％重量／容量）で染色し、水道水で洗浄、コロニーをカウントし、力価を求めた。
【００９５】
レトロウイルス調製物の冷凍および融解
対照非濃縮レトロウイルスを２ないし５ｍｌアリコートずつ−２０℃において冷凍した。濃縮ＰＭＰ捕捉レトロウイルスを３容量の標準冷凍混合物（１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＣＳ、最終ＤＭＳＯ濃度： ７．５％）を加えることで冷凍し、−２０℃においた。レトロウイルス調製物を可能な限り急速に融解し、１アリコートを試験用に取り分け、残りのものを−２０℃に戻した。
【００９６】
レトロウイルス感染の磁気増強
ＨｅＬａ細胞を２ｘ１０５細胞／９０ｍｍディッシュにプレーティングし、３７℃で一晩培養した。感染前に必要な磁気付形物（Ｂｉｓｉｆｌｅｘ ＩＩシートから切断）を培養ディッシュの下側にテープで貼り、さらに培地を４μｇ／ｍｌポリブレンに調整し、２ないし４時間後、ビオチン化ＰＧ１３由来レトロウイルスを充填した７．５ｘ１０６磁気粒子を５ｍｌの新鮮培地に加えた。その後、培養物を室温で３０分間撹拌し（４０サイクル／分）（Ｔｈｅ Ｂｅｌｌｙ Ｄａｎｃｅｒ， Ｓｔｏｖａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ， Ｇｒｅｅｎｂｏｒｏ， ＮＣ， ＵＳＡ）、その後、この培養物を３７℃においた。２４時間後、磁石を取り出し、培地を交換し、培養物を３７℃に戻した。全４８時間の感染の後に培地を５μｇ／ｍｌピューロマイシンに調整し、毎日培地を交換した後（薬剤選択を維持）、培養物をクーマシーブルー染色液（４５％メタノール：１０％酢酸中５．３５％ｗｔ／ｖｏｌ）で培養物を染色した（選択を開始して７２時間後）。
【００９７】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】増加量のパンソルビンとともにレトロウイルス上清をプレインキュベートすると有効力価が高まる。ホルマリンで固定した黄色ブドウ球菌とともにインキュベートした後、ＰＧ１３由来レトロウイルス（ＩＬ−２／Ｂ７）上清のｃｆｕ／ｍｌを測定した。レトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（Ｔ＝０、対照）、パンソルビンの不在下（Ｔ＝２、対照）または指定量のパンソルビンとともに４℃で２時間インキュベートし、その後、この混合物の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図２】パンソルビン／レトロウイルスプレインキュベーションの時間は有効力価に比例的上昇をもたらす。ＰＧ１３由来レトロウイルス（ＩＬ−２／Ｂ７）上清の５ｍｌアリコートをパンソルビンの不在下、または２５μｌパンソルビンとともにインキュベートし、その混合物の希釈系を用いて示された時点でＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図３】ＰＧ１３由来レトロウイルスベクター（ＩＬ−２／Ｂ７）上清／パンソルビン複合体の遠心分離濃縮。レトロウイルス上清を回収し、サンプルを採取し、Ｋ５６２細胞の感染を媒介するため（Ｔ＝０）、連続希釈を行った。次に上清全体を５０ｍｌアリコートに分け、なにも加えずに（Ｔ＝３）、２５０μｌパンソルビン単独（Ｐ）または２５０μｌサンソルビン（Ｓ）のいずれかとともに４℃で３時間インキュベートした。次にＴ＝３、ＰおよびＳからのサンプルの希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。さらに、Ｔ＝３およびＰの５ｍｌアリコートに０．４５μＭ濾過を施し、感染に用いた（２ｎｄ ＦｉｌｔｅｒおよびＰ Ｆｉｌｔｅｒ）。次に全てのサンプルを遠心分離濃縮し、力価測定用にＴ＝３およびＰから上清を吸引した（Ｃｏｎｔ ＤｅｐおよびＰｄｅｐ）。Ｔ＝３の残りの上清をよく混合し（ペレットを再懸濁させるように）、力価測定に用いた（ＣｏｎｔＣｏｎｃ）。残りのパンソルビンおよびサンソルビンサンプルペレットを１０ｍｌ新鮮培地に再懸濁し、再度遠心分離し、最少量の培地（最初の量の１８０倍減）に再懸濁し、感染に用いた（ＰｃｏｎｃおよびＳｃｏｎｃ）。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図４】パンソルビンを媒介とするレトロウイルス力価上昇はＫ５６２細胞だけに有効なわけではない。ＰＧ１３ ＩＬ−２／Ｂ７由来のレトロウイルス上清を回収し、５０ｍｌアリコートに分け、なにも加えずに（Ｔ＝３）、２５０μｌパンソルビン（Ｐ）とともに４℃でインキュベートした。３時間後、全ての条件からのサンプルを用いてＮＢ４、Ｕ９３７およびＨｅＬａ細胞に感染させた（Ｔ＝３）。残りの量の各パンソルビン／レトロウイルスサンプルを記載のように遠心分離濃縮し、再び感染に用いてＮＢ４、Ｕ９３７およびＨｅＬａ細胞に感染させた（Ｐｃｏｎｃ）。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図５】パンソルビンはベクターインサートとは独立にレトロウイルスと複合化する。ＰＧ１３ ＲａＲＴに由来するレトロウイルス上清を回収し、それを用いてすぐにＫ５６２、ＮＢ４、Ｕ９３７およびＨｅＬａ細胞に感染させた（Ｔ＝０）。残りの５０ｍｌ上清をパンソルビン（Ｐ）の存在下、４℃にて３時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを遠心濃縮し、感染に用いた（Ｐｃｏｎｃ）。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図６】パンソルビンを媒介とする濃縮効率はパッケージング細胞種によって異なる。ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２ＩＬ−２／Ｂ７、ＰＡ３１７ＩＬ−２／Ｂ７、ＦＬＹＲＤ１８ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏ、ＦＬＹＡ１３ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏおよびＧＰ＋Ｅ−８６ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏから得たレトロウイルス上清を回収し、すぐにヒトＫ５６２またはネズミ３２Ｄｐ２１０骨髄細胞のいずれかで力価を求めた（対照）。残りのサンプルを５０ｍｌ（ＦＬＹＲＤ１８、ＦＬＹＡ１３およびＧＰ＋Ｅ−８６）または１０ｍｌ（ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２およびＰＡ３１７）アリコートに分け、２５０μｌまたは５０μｌいずれかのパンソルビンとともに４℃でインキュベートした。３時間後、サンプルを上記のように遠心濃縮し、これを用いて再び標的細胞に感染させた（パンソルビン濃縮物）。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図７】フィブロネクチン会合型ＰＧ１３由来レトロウイルスの常磁性粒子を媒介とする濃縮。ＰＧ１３由来レトロウイルス（ｐＢｅｂｅ．ｐｕｒｏ）上清のｃｆｕ／ｍｌを常磁性粒子（ＰＭＰ）とのインキュベーションの前後で測定した。レトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（対照）、２．５ｘ１０９ストレプトアビジン・マグネスフェア（プロテインＡ−ビオチン単独またはプロテインＡ−ビオチンおよびポリクローナルＩｇウサギ抗マウスフィブロネクチンとともにプレインキュベーションしたもの）とともに４℃で２時間インキュベートした。上記のように磁気濃縮および洗浄した後、混合物の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図８】レクチン／ＰＭＰを媒介とするＰＧ１３レトロウイルス粒子の捕捉および濃縮。ＰＧ１３由来レトロウイルス（ｐＢｅｂｅ．ｐｕｒｏ）上清のｃｆｕ／ｍｌを常磁性粒子（ＰＭＰ）とのインキュベーションの前後で測定した。レトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（対照）、２．５ｘ１０９ストレプトアビジン・マグネスフェア（ビオチニル化レクチンイソレクチンＢ４（ＢＳＩ−Ｂ４）またはビオチニル化レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のいずれかとともにプレインキュベーションしたもの）とともに４℃で２時間インキュベートした。上記のように磁気濃縮および洗浄した後、混合物の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図９】レクチン／ＰＭＰを媒介とするＦＬＹＲＤ１８およびＡ１３レトロウイルス粒子の捕捉および濃縮。ＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３由来レトロウイルス（ｐＢｅｂｅ．ｐｕｒｏ）上清のｃｆｕ／ｍｌを常磁性粒子（ＰＭＰ）とのインキュベーションの前後で測定した。レトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（対照）、２．５ｘ１０９ストレプトアビジン・マグネスフェア（ビオチニル化レクチンイソレクチンＢ４（ＢＳＩ−Ｂ４）またはビオチニル化レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のいずれかとともにプレインキュベーションしたもの）とともに４℃で２時間インキュベートした。上記のように磁気濃縮および洗浄した後、混合物の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図１０ａ】ビオチンスクシンイミドエステル／ＰＭＰを媒介とするＰＧ１３レトロウイルス粒子の捕捉および濃縮。ＰＧ１３由来レトロウイルス（ｐＢｅｂｅ．ｐｕｒｏ）上清のｃｆｕ／ｍｌを常磁性粒子（ＰＭＰ）とのインキュベーションの前後で測定した。非処理の、ＤＭＳＯインキュベートした、またはビオチンスクシンイミドエステル標識したパッケージング細胞からのレトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（対照、ＤＭＳＯ、ビオチンＳＥ）、あるいはＤＭＳＯインキュベートした、またはビオチン標識したパッケージング細胞からの上清を２．５ｘ１０９ストレプトアビジン・マグネスフェアとともに４℃で２時間インキュベートした。上記のように磁気濃縮および洗浄した後、混合物（ＤＭＳＯｃｏｎｃ、ビオチンＳＥｃｏｎｃ）の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図１０ｂ】ビオチン標識パッケージング細胞のフローサイトメトリー分析。ＰＧ１３細胞を上記のようにビオチニル化し、３７℃で一晩インキュベートした。レトロウイルス処理のため上清を回収した後、上記のように細胞を下層から取り出し、１ｘ１０６細胞をアビジンＦＩＴＣで標識した。この２つのプロフィールは担体単独（ＤＭＳＯ、実線）とともにインキュベートした細胞、アビジン−ＦＩＴＣ標識の前に２４時間ビオチニル化したもの（ビオチンＳＥ、点線）を表す。担体対照の平均蛍光指数（ＭＦＩ）は６．５であり、ビオチニル化細胞のそれは２０００である。
【図１１】ビオチンスクシンイミドエステル／ＰＭＰを媒介とするＦＬＹＲＤ１８およびＡ１３レトロウイルス粒子の捕捉および濃縮。ＦＬＹＲＤ１８およびＦＬＹＡ１３由来レトロウイルス（ｐＢｅｂｅ．ｐｕｒｏ）上清のｃｆｕ／ｍｌを常磁性粒子（ＰＭＰ）とのインキュベーションの前後で測定した。非処理の、ＤＭＳＯインキュベートした、またはビオチンスクシンイミドエステル標識したパッケージング細胞からのレトロウイルス上清の５ｍｌアリコートをすぐに力価を求めるか（対照、ＤＭＳＯ、ビオチンＳＥ）、あるいはＤＭＳＯインキュベートした、またはビオチンＳＥ標識したパッケージング細胞からの上清を２．５ｘ１０９ストレプトアビジン・マグネスフェアとともに４℃で２時間インキュベートした。上記のように磁気濃縮および洗浄した後、混合物（ＤＭＳＯｃｏｎｃ、ビオチンＳＥｃｏｎｃ）の希釈系を用いてＫ５６２細胞に感染させた。各値は３回のコロニーカウントの平均値と標準誤差を示す。
【図１２】凍結および解凍調製物を示す。対照の非濃縮レトロウイルスの２〜５ｍｌアリコートを−２０℃に置くことで凍結させる。レトロウイルスを捕捉した濃縮ＰＭＰを、３容量の標準凍結混合物（１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＣＳ、最終ＤＭＳＯ濃度：７．５％）を添加して−２０℃に置くことで凍結させた。レトロウイルス調製物をできるだけ早く解凍し、試験用に一アリコートを除き、残りを−２０℃に戻した。
【図１３】磁場を媒介とするＨｅＬａ細胞のレトロウイルス感染の局在化。プレートａ）は非感染培養物のピューロマイシン選択の毒性作用を示す。プレートｂ）は磁気ターゲッティングの不在下での一様な感染拡散を示す。プレートｃ）はレトロウイルス感染の結果として薬剤耐性細胞の生存のパターンによって根拠づけられる培養の特定領域に向けた標的細胞の有効な指示感染を示す。プレートｄ）は局在感染を指示するのに用いられる元の磁性鋳型を示し、ターゲッティングされた感染がどれだけ密接に元の鋳型の形状を反映するかということを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500831.tif 000098
【国際調査報告】
2004500831.tif 000099
2004500831.tif 000100
2004500831.tif 000101