(57)【要約】Ｇタンパク質共役レセプターに関連するポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書中に開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、およびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体、またはフラグメントもまた、開示される。本発明はさらに、これらの新規なヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つが関与する障害の、診断、処置、および予防のための、治療、診断、および研究の方法を開示する。本方法は、このような処置または予防または遅延が望ましい被験体に、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ抗体を、被験体のＮＯＶＸ関連障害を処置、予防、または遅延するのに十分な量で投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体における１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、但し、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、アミノ酸残基の１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択される、アミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体における１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、但し、該改変体は、該アミノ酸配列と、アミノ酸残基の１５％以下が異なる、改変体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される核酸配列とは単一のヌクレオチドが異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された因子。
【請求項６】
前記因子が、Ｇタンパク質共役レセプターリガンドである、請求項５に記載の単離された因子。
【請求項７】
単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体における１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、但し、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、アミノ酸残基の１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択される、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体における１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、但し、該改変体は、該アミノ酸配列と、アミノ酸残基の１５％以下が異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部、または該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする、核酸フラグメントであって、ここで、該改変体における１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、但し、該改変体は、該アミノ酸配列と、アミノ酸残基の１５％以下が異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の成分を含む核酸分子、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が、天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される核酸配列とは単一のヌクレオチドが異なる、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択されるヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチドが異なる、ヌクレオチド配列であって、但し、２０％以下のヌクレオチドが、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が、以下：
（ａ）前記アミノ酸配列をコードするコード配列とは１つ以上のヌクレオチド配列が異なる、コード配列を含む第１のヌクレオチド配列であって、但し、該第１のヌクレオチド配列における該コード配列の２０％以下のヌクレオチドが、該コード配列と異なる、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１のポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２のポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
前記核酸分子に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定する工程、
を包含し、
これによって、該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する、方法。
【請求項２１】
サンプル中の請求項７に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子と結合するプローブに接触させる工程；ならびに
（ｃ）該核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定する工程、
を包含し、
これによって、該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する、方法。
【請求項２２】
前記核酸分子の存在または量が、細胞または組織型に対するマーカーとして使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞または組織型が癌性である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記因子が、Ｇタンパク質共役レセプターリガンドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を該因子と接触させる工程；および
（ｃ）該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、
これによって、該ペプチドの発現または活性の変化が、該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節することを示す、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドの活性を調節するに十分な量で接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２９】
ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該処置または予防が所望である被験体に、請求項１に記載のポリペプチドを、該被験体における該ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記障害が、心筋症およびアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該処置または予防が所望である被験体に、請求項７に記載の核酸を、該被験体における該ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記障害が、心筋症およびアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該処置または予防が所望である被験体に、請求項１７に記載の抗体を、該被験体における該ＮＯＶＸに関連する障害を処置または予防するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記障害が糖尿病である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項７に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項１７に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４４】
１つ以上の容器中に請求項４１に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項４５】
１つ以上の容器中に請求項４２に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項４６】
１つ以上の容器中に請求項４３に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項４７】
第１の哺乳動物被験体において、請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルに関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の、該ポリペプチドの発現のレベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないか、または該疾患に罹患しにくいことが既知の第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程；
を包含し、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルの変化が、該疾患の存在または素因を示す、方法。
【請求項４８】
前記素因が癌の素因である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第１の哺乳動物被験体において、請求項７に記載の核酸分子の変化したレベルに関連する疾患の存在または素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の、該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）の該サンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないか、または該疾患に罹患しにくいことが既知の第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程；
を包含し、
ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸のレベルの変化が、該疾患の存在または素因を示す、方法。
【請求項５０】
前記素因が癌の素因である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
哺乳動物において病理状態を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、ポリペプチドを、該病理状態を軽減するに十分な量で投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその生物学的に活性なフラグメントである、方法。
【請求項５２】
哺乳動物において病理状態を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、請求項１７に記載の抗体を、該病理状態を軽減するに十分な量で投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
一般的に、ゲノムＤＮＡ配列によってコードされる新規なタンパク質およびそれらに類似したタンパク質（すなわち、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）に対して配列類似性を有する新規なタンパク質）、これらのタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸、ならびに本発明のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体に関する。
【０００２】
（発明の背景）
嗅覚レセプター（ＯＲ）は、多くの種におけるＧＰＣＲの非常に大きなサブファミリーとして同定されている。これらのレセプターは、いくつかの膜貫通ドメイン構造を多くの神経伝達物質およびホルモンレセプターと共有し、そして臭気シグナルのＧタンパク質媒介伝達の認識の基礎であるようである。以前に、異なる種においてクローニングされたＯＲ遺伝子は、それぞれのゲノムのランダムな位置由来であった。ヒトＯＲ遺伝子は、イントロンが少なく、そして４つの異なる遺伝子サブファミリーに属し、大きな配列可変性を示す。これらの遺伝子は、主に、嗅覚上皮において発現される。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規なポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド配列の発見に一部基づく。
【０００４】
従って、一つの局面において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、もしくは２３の配列、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を含む単離された核酸分子を提供する。この核酸は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。この核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、またはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
本明細書中に記載される核酸の一つ以上を含むベクター、および本明細書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
本発明はまた、上記核酸分子のいずれかを含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞に関する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、ＮＯＶＸ核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸によってコードされるＮＯＶＸポリペプチドのいずれか、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体）を含む。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【０００９】
なおさらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体であり得る。本発明はまた、ＮＯＶＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、上記核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドのエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００１０】
本発明はまた、上記薬学的組成物のいずれかを含むキットを含む。
【００１１】
本発明はさらに、ＮＯＶＸ核酸（例えば、ＮＯＶＸ核酸を含むベクター）を含む細胞を提供し、そしてこの核酸によってコードされるＮＯＶＸポリペプチドを発現するのに十分な条件下で細胞を培養することによってＮＯＶＸポリペプチドを産生するための方法を提供する。次いで、発現されたＮＯＶＸポリペプチドは、細胞から回収される。好ましくは、細胞は、ほとんどまたは全く内因性のＮＯＶＸポリペプチドを産生しない。細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００１２】
本発明はまた、サンプルをＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸に特異的に結合する化合物と接触させ、そして存在する場合、複合体形成を検出することによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸ核酸を同定する方法に関する。
【００１３】
本発明はさらに、ＮＯＶＸポリペプチドを化合物と接触させ、ＮＯＶＸポリペプチドの活性が改変されるか否かを決定することによって、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドを化合物と接触させ、その化合物が、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を改変するか、ＮＯＶＸポリペプチドに結合するか、またはＮＯＶＸポリペプチドをコードする核酸分子に結合するか否かを決定することによって同定されるＮＯＶＸポリペプチド活性を調節する化合物に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、被験体のＮＯＶＸ関連障害の存在またはこの障害の素因を測定する方法を提供する。この方法は、被験体からサンプルを提供する工程、およびこの被験体サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程を包含する。次いで、被験体サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量を、コントロールサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量と比較する。コントロールタンパク質サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量に対する被験体のタンパク質サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量における変化は、この被験体が、組織増殖関連状態を有することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、対等の個体（すなわち、年齢、性別、または他の一般的状態の類似する個体であって、組織増殖関連状態を有することが疑われていない個体）から取られる。あるいは、コントロールサンプルは、被験体が組織増殖関連障害を有すると疑われていないときのその被験体から取られ得る。いくつかの実施形態において、ＮＯＶＸは、ＮＯＶＸ抗体を使用して検出される。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、被験体のＮＯＶＸ関連障害の存在またはこの障害の素因を決定する方法を提供する。この方法は、核酸サンプル（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはその両方）を被験体から提供する工程、および被験体の核酸サンプル中のＮＯＶＸ核酸の量を測定する工程を包含する。次いで、被験体核酸中のＮＯＶＸ核酸サンプルの量を、コントロールサンプル中のＮＯＶＸ核酸の量と比較する。コントロールサンプル中のＮＯＶＸの量に対するサンプル中のＮＯＶＸ核酸の量における変化は、この被験体がＮＯＶＸ関連障害を有することを示す。
【００１７】
なおさらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸ関連障害を処置するか予防するかまたは遅延させる方法を提供する。本方法は、このような処置または予防または遅延が望ましい被験体に、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ抗体を、被験体のＮＯＶＸ関連障害を処置、予防、または遅延するのに十分な量で投与する工程を包含する。
【００１８】
また、ＮＯＶ１〜１２は、表５６に示される、ヒトＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）サブファミリーのタンパク質の嗅覚レセプター（ＯＲ）ファミリーのメンバーと相同性がある。従って、本発明に従うＮＯＶ１〜１２の核酸およびポリペプチド、抗体および関連化合物は、嗅覚損失の障害（例えば、外傷、ＨＩＶ疾患、新生物形成性増殖および神経学的障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病））における治療的適用および診断的適用において有用である。
【００１９】
他に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法または材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される（ｃｏｎｔｒｏｌ）。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであって限定することを意図しない。
【００２０】
本発明の他の特徴および他の利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
嗅覚レセプター（ＯＲ）は、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）の最も大きなファミリーであり、カテコールアミンレセプターおよびオプシンとともに、ＧＰＣＲの第１ファミリー（クラスＡ）に属する。ＯＲファミリーは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の系統発生スペクトルから哺乳動物にわたって１，０００を越えるメンバーを含む。ＯＲは、おそらく、多くのリガンドを分化させるために種内および種間の両方で必要な構造的多様性を独立して伸長する、プロトタイプのＧＰＣＲから数回現れた。個々の嗅覚感覚ニューロンは、単一または大部分いくつかのＯＲを発現することが予測される。全てのＯＲは、細胞外アミノ末端および細胞質カルボキシ末端を有する、３つの細胞外および３つの細胞質ループによって分離される７つのα−ヘリックスを含むと考えられる。ＯＲリガンド結合のポケットは、タンパク質の第２の膜貫通ドメインと第６の膜貫通ドメインとの間にあると期待される。哺乳動物ＯＲファミリー内の全体のアミノ酸配列同一性は、４５％〜＞８０％の範囲であり、アミノ酸レベルで互いに８０％より大きい同一性の遺伝子は、同じサブファミリーに属すると考えられる。
【００２２】
第１のＯＲが１９９１年にクローニングされてから、疾患および障害の間のそれらの作用機構および潜在的な調節不全における顕著な発展がなされた。いくつかのヒト疾患がＧＰＣＲ内のまれな変異から生じることが理解される。薬物発見手段が使用されて、ＯＲサブタイプの小さな構造的差異に基づいて高く特異的な化合物を作製し得、これは、現在、トランスジェニック動物またはノックアウト動物でＯＲレベルでのインビボ操作を用いて理解されている。さらに、ＯＲの細胞内相同性およびリガンド特異性に起因して、疾患または障害により失われた特定の嗅覚感覚ニューロンの再生が、基底細胞への個々のＯＲの導入によって可能である。さらに、新規な治療戦略は、いわゆるオーファン（ｏｒｐｈａｎ）レセプター（そのリガンドが発見されたままである）のさらなる研究によって解明され得る。
【００２３】
ＯＲタンパク質は、嗅覚リガンドに結合し、そしてＧタンパク質媒介細胞内シグナルを伝達し、潜在的な作用の生成を生じる。数百のＯＲ遺伝子のＤＮＡ配列の蓄積は、それらの構造、機能および進化的多様化に関連する特徴を予測する機会を提供する。Ｐｉｌｐｅｌ　Ｙら、Ｅｓｓａｙｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８８；３３：９３−１０４を参照のこと。ＯＲレパートリーは、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達を媒介する定常領域に結合する、複数の臭気物質の認識を確認する可変なリガンド結合部位を進化した。細胞の第２のメッセンジャーは、嗅覚物質特異的カチオンチャネルの直接的なゲーティングによって多様な臭気物質に対する応答の基礎になる。この状況は、細胞排除の機構を必要とし、これによってそれぞれの感覚ニューロンが１つのレセプター型のみで発現し、次いでこれは、軸索突出に影響する。従って、ＯＲレパートリーの「シナプスイメージ」は、中枢神経系の検出される嗅覚物質をコードする。
【００２４】
異なる嗅覚物質を区別する能力は、多数の異なる嗅覚物質レセプター（ＯＲ）に依存する。ＯＲは、鼻嗅覚感覚ニューロンによって発現され、そしてそれぞれのニューロンが、単一のＯＲ遺伝子の１つの対立遺伝子のみを発現する。鼻において、異なるセットのＯＲが、別個の空間的領域において発現される。同じＯＲ遺伝子を発現するニューロンは、同じ領域に存在する；しかし、この領域において、これらは、他のＯＲを発現するニューロンをランダムに散在する。細胞が発現のためのＯＲ遺伝子を選択する場合、それは特定の領域の遺伝子セットに制限され得るが、確立的機構により設定されるセットから選択され得る。ＯＲ遺伝子選択の提案されるモデルは、２つのクラス（遺伝子座依存的および遺伝子座独立的）に分けられる。遺伝子座依存的モデルは、ＯＲ遺伝子がゲノムにおいてクラスター化され、おそらく異なる領域の遺伝子セットのメンバーが異なる遺伝子座においてクラスター化することを仮定する。対照的に、遺伝子座独立的モデルは、ＯＲ遺伝子がクラスター化されることを必要としない。
ＯＲ遺伝子は、第７染色体の１１の異なる領域にマッピングされた。これらの遺伝子座は、大きな染色体ドメインの複製、続く広範囲な遺伝子複製および発散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）によって生じたことが明かなパラロガス染色体領域にある。同じ領域において発現されるＯＲ遺伝子は、多くの遺伝子座にマッピングすること；さらに、単一の遺伝子座が異なる領域において発現される遺伝子を含み得ることが研究によって示された。これらの発見は、ＯＲ遺伝子選択が遺伝子座独立的選択であるかまたは連続的な確立的選択を含む可能性を生じた。
【００２５】
Ｉｓｓｅｌ−ＴａｒｖｅｒおよびＲｉｎｅ（１９９６）は、イヌの嗅覚レセプター遺伝子ファミリーの４つのメンバーを特徴付けた。４つのサブファミリーが構成する遺伝子は、嗅覚上皮を排他的に発現した。パルスフィールドゲルのサザンブロットを使用する大きなＤＮＡフラグメントの分析は、サブファミリーのメンバーが一緒にクラスター化され、そしてサブファミリーのうちの２つが、イヌのゲノムに密接に連結した。２６種類のイヌにおける４つの嗅覚レセプター遺伝子サブファミリーの分析は、サブファミリー当たりの遺伝子の数が、嗅覚ハウンド、視覚ハウンドおよび愛玩種における嗅覚の鋭さに基づく差次的な選択にもかかわらず安定であったという証拠を提供した。Ｉｓｓｅｌ−ＴａｒｖｅｒおよびＲｉｎｅ（１９９７）は、哺乳動物進化の間の遺伝子ファミリーにおける変化を評価するため、およびイヌの遺伝子マップをヒトの遺伝子マップに連結し始めるために、イヌにおいて最初に同定された嗅覚レセプター遺伝子の４つのサブファミリーの比較的な研究を行った。これら４つのファミリーは、イヌの遺伝子においてＯＬＦ１、ＯＬＦ２、ＯＬＦ３、およびＯＬＦ４として示された。これら４つの遺伝子により表されるサブファミリーは、２〜２０遺伝子のサイズの範囲である。これらは、全てイヌの嗅覚上皮で発現されるが、イヌの肺、肝臓、卵巣、脾臓、精巣、または舌では検出可能には発現されなかった。ＯＬＦ１およびＯＬＦ２サブファミリーは、イヌのゲノムにおいてそしてヒトゲノムにおいても密接に連結する。最も小さなファミリーは、イヌのＯＬＦ１遺伝子によって表される。２４個の体細胞ハイブリッド株由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットに個々にハイブリダイズするイヌの遺伝子プローブを使用する。これらは、ヒトの相同なＯＬＦ１サブファミリーがヒトの第１１染色体にマッピングすることを示した。イヌのＯＬＦ２遺伝子に対して強い類似性を有するヒト遺伝子がまた第１１染色体にマッピングされる。イヌのＯＬＦ３にハイブリダイズしたヒトサブファミリーの両方のメンバーが、第７染色体上に位置付けられた。イヌＯＬＦ４プローブにハイブリダイズするヒト遺伝子がどの染色体にマッピングされるかを決定することは困難であった。このサブファミリーは、マウスおよびハムスターならびにヒトにおいて大きいので、げっ歯類バックグラウンドは、ヒト交差ハイブリダイゼーションバンドを大きく不明瞭にした。しかし、ヒト第１９染色体に対応するブロットのいくつかのヒト特異的なバンドを識別することは可能であった。これらは、１１ｑ１１にマッピングするＹＡＣへのハイブリダイゼーションによるヒトＯＬＦ１ホモログのマッピングを改良した。イヌにおいて、ＯＬＦ１およびＯＬＦ２サブファミリーは、互いに４５ｋｂ内である（Ｉｓｓｅｌ−ＴａｒｖｅｒおよびＲｉｎｅ（１９９６））。
【００２６】
Ｉｓｓｅｌ−ＴａｒｖｅｒおよびＲｉｎｅ（１９９７）は、ヒトＯＬＦ１およびＯＬＦ２ホモログが、同様に密接に連結されることを示す。ＹＡＣを研究することによって、Ｉｓｓｅｌ−ＴａｒｖｅｒおよびＲｉｎｅ（１９９７）は、ヒトＯＬＦ３ホモログが７ｑ３５をマッピングすることを見出した。第１９染色体特異的コスミドライブラリーは、イヌのＯＬＦ４遺伝子プローブでのハイブリダイゼーションによってスクリーニングされ、そして高いストリンジェンシーでさえプローブに強くハイブリダイズするクローンが、１９ｐ１３．１および１９ｐ１３．２に局在した。しかし、これらのクローンは、相同なヒトバンドの小さな画分と考えられた。Ｒｏｕｑｕｉｅｒら（１９９８）は、嗅覚レセプター遺伝子ファミリーのメンバーが、少しのヒト染色体を除く全てに分布することを示した。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション分析によって、これらは、ＯＲ配列がヒトゲノムの２５より多い場所に存在することを示した。それらの分布は、染色体アームの末端バンドに片よっていた。フローソートされた染色体を使用して、第１６染色体由来の８７ＯＲ配列を単離した。それらの配列の関係は、ＯＲファミリー発現の原因である染色体間および染色体内複製を示した。Ｒｏｕｑｕｉｅｒら（１９９８）は、ヒトゲノムが著しい数の機能不全性コピーを蓄積したことを決定した：これらの配列の７２％が、偽遺伝子であることを見出した。ＯＲＦ含有配列は、第７染色体、第１６染色体、および第１７染色体において優性である。
【００２７】
Ｔｒａｓｋら（１９９８）は、サブテロメアＤＮＡ複製を特徴付け、これは、ヒトゲノムの異常な領域、テロマーの可変性、複雑性および進化の歴史に見識を与えた。第１９染色体からクローン化されたＤＮＡを使用すると、これらは、異なる染色体によって共有されるＤＮＡ配列のブロックが、非常に大きく、高く類似し得ることを示した。これらの染色体は、ヒトが世界中に移動する前にこの配列を含んだと思われる。ヒトにおけるその多コピー分布と対照的に、このサブテロメアブロックは、チンパンジーおよびゴリラにおいて単一の遺伝子座に優先的にマッピングし、その部位は、ヒトゲノムのいずれの位置においても非オルソロガスである。嗅覚レセプター（ＯＲ）遺伝子ファミリーの３つの新たなメンバーは、この大きなセグメントのＤＮＡ内で複製することが見出され、これは、種々の集団由来の４５の関連しないヒト組織の各々に３ｑ、１５ｑおよび１９ｑに存在することが見出された。その配列から、この複製されたブロックにおけるＯＲの１つは、潜在的に機能的であるようである。この発見は、ＯＲファミリーの機能的多様性が、ヒトテロマーに近いＤＮＡの複製および染色体間再配置によって一部生成する可能性を生じた。
【００２８】
Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ（１９９９）は、脊椎動物における嗅覚レセプター（ＯＲ）遺伝子の分子生物学を概説した。ＢｕｃｋおよびＡｘｅｌ（１９９１）は、推定嗅覚レセプター遺伝子をコードするこの大きなファミリーの遺伝子を発見した。Ｚｈａｏら（１９９８）は、１つのＯＲ遺伝子が嗅覚に対するレセプターをコードするという機能的証拠を提供した。ＢｕｃｋおよびＡｘｅｌ（１９９１）によるラット由来のＯＲ遺伝子の単離は、３つの仮説に基づいた。第１に、ＯＲは、おそらく、特徴的に７回膜貫通タンパク質である、Ｇタンパク質結合レセプターである。第２に、ＯＲは、おそらく、広い異なる構造を有する莫大な数の化合物が脊椎動物嗅覚系によって検出され、そして区別され得るので、かなりのサイズの多遺伝子ファミリーのメンバーである。第３に、ＯＲは、おそらく、嗅覚感覚ニューロンにおいて選択的に発現される。Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら（１９９４）は、１７ｐ上のヒトＯＲ遺伝子のクラスターに注意を向けた。これには、第１のヒトＯＲ遺伝子ＯＲ１Ｄ２がＳｃｈｕｒｍａｎｓら（１９９３）によってマッピングされた。Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ（１９９９）に従って、１５０より多いヒトＯＲクローンの配列が報告された。
【００２９】
ヒトＯＲ遺伝子は、精巣ＯＲ遺伝子を除いて、偽遺伝子の高い頻度によって他の種の対応物とは顕著に異なる。研究によって、個々の嗅覚感覚ニューロンが小さなサブセットのＯＲレパートリーを発現することが示された。ラットおよびマウスにおいて、同じＯＲを発現するニューロンの軸索は、嗅球において規定された糸球上に集まる。
【００３０】
本発明は、一般的に、ゲノムＤＮＡ配列によってコードされる新規なタンパク質およびそれらに類似したタンパク質（すなわち、ＧＰＣＲに対して配列類似性を有する新規なタンパク質）、これらのタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸、ならびに本発明のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体に関する。新規な核酸配列およびそれらのポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表１は、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。実施例１は、新規な核酸がどのようの同定されたかについての記載を提供する。
【００３１】
【表１】
2004513610.tif 000002
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の用途および内容において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、先に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００３２】
例えば、ＮＯＶ１〜１２は、Ｇタンパク質媒介信号伝達を維持する際に重要なＧＰＣＲファミリーのタンパク質のメンバーと相同性がある。従って、本発明に従うＮＯＶ１の核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、Ｇタンパク質シグナル伝達によって特徴付けられる障害（例えば、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染、疼痛、癌、食欲不振、過食症、喘息、ならびにパーキンソン病）における治療的適用および診断的適用において有用である。
【００３３】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、本発明に特異的な抗体を産生するため、およびＮＯＶＸ活性またはＮＯＶＸ機能を阻害するかまたは高める分子をスクリーニングするための免疫原として使用され得る。
【００３４】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドのさらなる有用性は、本明細書中に開示される。
【００３５】
（ＮＯＶ１）
本発明に従うＮＯＶ１は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ１核酸は、ヒト第１１染色体において見出された。ＮＯＶ１核酸およびそのコードされるポリペプチドが、表２Ａに示される配列を含む。開示される核酸（配列番号１）は、９７８ヌクレオチドの長さであり、ヌクレオチド２１〜２３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド９５４〜９５６においてＴＡＡ終止コドンで終わるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
【００３６】
開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域に、表２Ａで下線を引き、開始コドンおよび終止コドンをボールド文字にする。代表的なＯＲＦは、推定分子量３４７９６．５ダルトン（Ｄａ）を有する３１１アミノ酸ポリペプチド（配列番号２）をコードする。ＮＯＶ１ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６４００の確実性で形質膜タンパク質および０．６８５０の確実性で小胞体膜タンパク質を推定する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、配列番号２の５５位と５６位との間におそらく切断部位が存在するシグナルペプチドの存在を示唆する。
【００３７】
【表２Ａ】
2004513610.tif 000003
ＮＯＶ１核酸は、表２Ｂに示されるように、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＭＵＳ１；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１２１９７９）に対する相同性（６７％同一）を有する。ＮＯＶ１ポリペプチドはまた、表２Ｃに示されるように、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＭＵＳ２；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＷＵ９３）由来の３１８アミノ酸残基と相同性を有する（６３％同一性、８０％類似性）。
【００３８】
【表２Ｂ】
2004513610.tif 000004
2004513610.tif 000005
【００３９】
【表２Ｃ】
2004513610.tif 000006
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
【００４０】
ＮＯＶ１発現は、ＴａｑＭａｎ分析によって分析される。結果を表４に示す。表１４Ｃは、ＮＯＶ１発現が、正常な組織と比較して、肺癌（小細胞）、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌および子宮癌において高いことを示す。
【００４１】
（ＮＯＶ２）
本発明に従うＮＯＶ２配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ２核酸は、ヒト第１１染色体において見出された。ＮＯＶ２核酸およびそのコードされるポリペプチドが、表３Ａに示される配列を含む。開示される核酸（配列番号３）は、９８３ヌクレオチドの長さであり、ヌクレオチド２１〜２３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド９６０〜９６２においてＴＡＡ終止コドンで終わるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域に、表３Ａで下線を引き、開始コドンおよび終止コドンをボールド文字にする。代表的なＯＲＦは、推定分子量３５０７７．８ダルトン（Ｄａ）を有する３１３アミノ酸ポリペプチド（配列番号４）をコードする。ＮＯＶ２ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６００の確実性で形質膜タンパク質を推定する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、ＮＯＶ２ポリペプチドがシグナルペプチドを有さないことを示唆する。
【００４２】
【表３Ａ】
2004513610.tif 000007
ＮＯＶ２核酸は、表３Ｂに示されるように、Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＧＡＬ１；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＣＨＫＨＢＢＲＥ／ａｃｃ：Ｌ１７４３２）と相同性（６３％同一性）を有する。ＮＯＶ２ポリペプチドは、表３Ｃに示されるように、Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ（ＧＡＬ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＹＨ５５）由来の３１９個のアミノ酸残基の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（５１％同一性、７０％類似性）を有する。ＮＯＶ２ポリペプチドはまた、表３Ｄに示されるように、Ｈｏｍｏ　ｓｐａｐｉｅｎｓ由来のＨＯＲ　５’ＢＥＴＡ３ポリペプチド（ＨＯＲ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ５Ｐ１）に対して相同性（４６％同一性、６７％類似性）を有する。
【００４３】
（表３Ｂ）
【００４４】
【表３Ｂ】
2004513610.tif 000008
（表３Ｃ）
【００４５】
【表３Ｃ】
2004513610.tif 000009
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００４６】
（表３Ｄ）
【００４７】
【表３Ｄ】
2004513610.tif 000010
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００４８】
ＮＯＶ２の嗅覚受容器様遺伝子の新規な１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）改変体に対するＤＮＡおよびタンパク質配列は、表３Ｅの通りである。新規なＳＮＰを同定および確認する方法は、実施例３に記載されている。
【００４９】
（表３Ｅ．ＳＮＰ）
１（ａ）．ＮＯＶ２ヌクレオチド配列の改変体１
８１位のＴ／Ｇ。
【００５０】
１（ｂ）．改変体１のヌクレオチド配列
【００５１】
【表３Ｅ】１５
2004513610.tif 000011
１（ｃ）．改変体１のタンパク質配列
【００５２】
【表３Ｆ】
2004513610.tif 000012
１（ｄ）．アミノ酸残基に対する改変体１の改変効果
なし。
【００５３】
２（ａ）．ＮＯＶ２ヌクレオチド配列の改変体２
１４９位のＣ／Ｇ。
【００５４】
２（ｂ）．改変体２のヌクレオチド配列
【００５５】
【表３Ｇ】
2004513610.tif 000013
２（ｃ）．改変体２のタンパク質配列
【００５６】
【表３Ｈ】
2004513610.tif 000014
２（ｄ）．アミノ酸残基に対する改変体２の改変効果
２６７位のＡｒｇ〜Ｇｌｙ。
【００５７】
３（ａ）．ＮＯＶ２の改変体３
２４５位のＧ／Ｃ。
【００５８】
３（ｂ）．改変体３のヌクレオチド配列
【００５９】
【表３Ｉ】
2004513610.tif 000015
３（ｃ）．改変体３のタンパク質配列
【００６０】
【表３Ｊ】
2004513610.tif 000016
３（ｄ）．改変体３の改変効果
２３５位のＧｌｎ〜Ｇｌｕ。
【００６１】
ＮＯＶ２の発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。結果を、実施例４（表１５Ｂ）に示される結果は、ＮＯＶ２の発現が、肺癌（小細胞）において、正常な組織と比較してより高いことを示す。
【００６２】
（ＮＯＶ３）
本発明に従うＮＯＶ３配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ３核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ３核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表４Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号５）は、９８０ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２５〜２７のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド９６４〜９６６のＴＡＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表４Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、予想分子量３５２５５．９Ｄａの３１３アミノ酸ポリペプチド（配列番号６）をコードする。ＮＯＶ３ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析により、０．６０００の確実性で形質膜タンパク質が予測される。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、ＮＯＶ３ポリペプチドがシグナルペプチドを有さないことが予想される。
【００６３】
（表４Ａ）
【００６４】
【表４Ａ】
2004513610.tif 000017
ＮＯＶ３核酸は、表４Ｂに示されるように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＧＰＣＲ；ｐａｔｎ；Ｔ５９２７４）と相同性（６１％同一性）を有する。ＮＯＶ３ポリペプチドは、表４Ｃに示されるように、Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ（ＧＡＬ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＹＨ５５）由来の３１９個のアミノ酸残基の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（５３％同一性、７２％類似性）を有する。Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来のＨＯＲ　５’ＢＥＴＡ３ポリペプチド（ＨＯＲ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ５Ｐ１）に対するさらなる相同性（４６％同一性、６９％類似性）をまた、表４Ｄに示されるように同定した。
【００６５】
（表４Ｂ）
【００６６】
【表４Ｂ】
2004513610.tif 000018
（表４Ｃ）
【００６７】
【表４Ｃ】
2004513610.tif 000019
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００６８】
（表４Ｄ）
【００６９】
【表４Ｄ】
2004513610.tif 000020
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００７０】
ＮＯＶ３の発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。この配列を、多くの組織中で穏やかに発現させ；この発現は、脳領域（特に、大脳皮質）においてわずかに高く、このことは、実施例４（表１６Ｂ）において示されるように、ニューロン由来の組織および細胞を同定するためのマーカーとしての有用性を示す。
【００７１】
（ＮＯＶ４）
本発明に従うＮＯＶ４配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ４核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ４核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表５Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号７）は、９５２ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６〜８のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド９４５〜９４７のＴＡＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表５Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、予想分子量３５０７７．８Ｄａの３１３アミノ酸ポリペプチド（配列番号８）をコードする。ＮＯＶ４ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６０００の確実性で原形質膜タンパク質を予想する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、ＮＯＶ４ポリペプチドはシグナルペプチドを有さないことが予測される。ＮＯＶ４核酸は、実施例２の方法に従ってクローニングされる。
【００７２】
（表５Ａ）
【００７３】
【表５Ａ】
2004513610.tif 000021
ＮＯＶ４核酸は、表５Ｂに示されるように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ嗅覚受容器ｍＲＮＡ（ＯＬＲ２；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＰＦＨ６ＯＲ／ａｃｃ：Ｘ８１４４５）と相同性（６４％同一性）を有する。ＮＯＶ４ポリペプチドは、表５Ｃに示されるように、Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ（ＧＡＬ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＹＨ５５）由来の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（５１％同一性、７０％類似性）を有する。この完全配列相同性（このタンパク質の全長配列を用いる、ＦＡＳＴＡアライメントによって定義される）は、４９．５１８％のアミノ酸同一性、および６０．４５０％のアミノ酸類似性である。さらに、このタンパク質は、以下のタンパク質ドメイン：アミノ酸残基３〜２２２に、７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって定義される場合）。
【００７４】
（表５Ｂ）
【００７５】
【表５Ｂ】
2004513610.tif 000022
（表５Ｃ）
【００７６】
【表５Ｃ】
2004513610.tif 000023
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００７７】
ＮＯＶ４の可能な新規なＳＮＰ改変体を、表５Ｄに示す。ＰＨＲＥＤスコアは、ＳＮＰ塩基対の質を示し、ここで、２３の最小スコアが許容可能である。新規なＳＮＰを同定および確認するための方法が、実施例３に記載されている。
【００７８】
（表５Ｄ）
【００７９】
【表５Ｄ】
2004513610.tif 000024
2004513610.tif 000025
2004513610.tif 000026
2004513610.tif 000027
ＮＯＶ４の発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。結果を、実施例４に示した。表１４Ｃは、ＮＯＶ１の発現が、肺癌（小細胞）、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌および子宮癌において、正常な組織と比較してより高いことを示す。ＧＰＣＲは、実施例４（表１６Ｂ）において示されるように単一エキソン遺伝子であるので、ＧＰＣＲに対して生成されるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーのセットは、対応する遺伝子領域を増幅するＧＰＣＲに対して産生した。この配列を、多くの組織において穏やかに発現させ；この発現は、脳（特に、大脳皮質）領域においてわずかに高く、このことは、ニューロン由来の組織および細胞を同定するためのマーカーとしての有用性を示す。
【００８０】
（ＮＯＶ５）
本発明に従うＮＯＶ５配列は、ＧＰＲＣファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ５核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ５核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表６Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号９）は、８８５ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２〜４のＧＧＧコドン（アミノ酸グリシンをコードするコドン）で開始し、そしてヌクレオチド８８１〜８８３のＴＡＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表６Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、２９３アミノ酸ポリペプチド（配列番号１０）をコードする。ＮＯＶ５ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６４００の確実性で原形質膜タンパク質を予想する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析により、シグナルペプチドの存在が示唆され、切断部位は、配列番号１０の３３位と３４位との間に存在する可能性が最も高い。
【００８１】
（表６Ａ）
【００８２】
【表６Ａ】
2004513610.tif 000028
ＮＯＶ５核酸配列（配列番号９）の逆相補体（配列番号４７）は、表６Ｂに示されるように、ヒト嗅覚受容器様ポリペプチドをコードする核酸（ＨＵＭ１；ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ受託番号１５０２０５７０８）と高い相同性（９８％の同一性）を有する。ＮＯＶ５ポリペプチドは、表６Ｃにおいて示されるように、Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ嗅覚受容器様タンパク質ＣＯＲ３’ＢＥＴＡ（ＧＡＬ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＹＨ５５）に対して相同性（５２％同一性、７２％類似性）を有することが見出された。
【００８３】
（表６Ｂ）
【００８４】
【表６Ｂ】
2004513610.tif 000029
（表６Ｃ）
【００８５】
【表６Ｃ】
2004513610.tif 000030
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００８６】
（ＮＯＶ６）
本発明に従うＮＯＶ６配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ６核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ６核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表７Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号１１）は、７９８ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２４〜２６のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド７８０〜７８２のＴＧＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表７Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、予想分子量２８３９９．４Ｄａの２５２アミノ酸ポリペプチド（配列番号１２）をコードする。ＮＯＶ６ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６４００の確実性で原形質膜タンパク質を予想する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析により、シグナルペプチドの存在が示唆され、切断部位は、配列番号１２の６１位と６２位との間に存在する可能性が最も高い。
【００８７】
（表７Ａ）
【００８８】
【表７Ａ】
2004513610.tif 000031
ＮＯＶ６核酸は、表７Ｂに示されるように、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＭＵＳ３；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１０２５３９）と相同性（６７％同一性）を有する。ＮＯＶ６ポリペプチドは、表７Ｃに示されるように、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＯＬＲ３；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｚ１Ｔ８）由来の２２３アミノ酸残基の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（５９％同一性、７４％類似性）を有する。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基１〜２３２に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって定義される場合）。
【００８９】
（表７Ｂ）
【００９０】
【表７Ｂ】
2004513610.tif 000032
（表７Ｃ）
【００９１】
【表７Ｃ】
2004513610.tif 000033
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００９２】
（ＮＯＶ７（ＡＣ０２６０３８＿Ｂ，ＣＧ５０３４１−０２））
本発明に従うＮＯＶ７配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ７核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ７核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表８Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号１３）は、９９５ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２１〜２３のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド９６６〜９６８のＴＡＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表８Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、予想分子量３４９３４．２Ｄａの３１５アミノ酸ポリペプチド（配列番号１４）をコードする。ＮＯＶ７ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、０．６０００の確実性で原形質膜タンパク質を予想する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析により、シグナルペプチドの存在が示唆され、切断部位は、配列番号１４の４６位と４７位との間に存在する可能性が最も高い。
【００９３】
（表８Ａ）
【００９４】
【表８Ａ】
2004513610.tif 000034
ＮＯＶ７核酸は、表８Ｂに示されるように、Ｐａｎ　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＰＡＮ１；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１０１７３０）と相同性（３８％同一性）を有する。ＮＯＶ７ポリペプチドは、表８Ｃに示されるように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ＯＬＲ３；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：ＣＡＢ６５７９９）由来の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（４９％同一性、６４％類似性）を有する。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基４０〜１４９に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって定義される場合）。
【００９５】
（表８Ｂ）
【００９６】
【表８Ｂ】
2004513610.tif 000035
（表８Ｃ）
【００９７】
【表８Ｃ】
2004513610.tif 000036
ここで、｜は、同一性を示し、そして＋は、類似性を示す。
【００９８】
ＮＯＶ７の１つ以上のコンセンサス位置を、表８Ｄに示されるようにＳＮＰとして同定した。「深さ」は、ＳＮＰの領域をカバーするクローンの数を示す。推定対立遺伝子頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ　Ａｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含む全てのクローンの画分である。記号「＞」は、「に変更される」を意味する。
【００９９】
（表８Ｄ）
【０１００】
【表８Ｄ】
2004513610.tif 000037
ＮＯＶ７の発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。結果を、実施例４、表１７Ｂ、１７Ｃおよび１７Ｅに示した。ＮＯＶ７の組織の発現（ＡＣ０２６０３８＿Ｂ）は、実施例４（表１７Ｂ）に示されるように多くの組織において全体にわたって低いレベルであった。最も高い発現が、精巣において見出される。従って、ＮＯＶ７（ＡＣ０２６０３８＿Ｂ）を、男性生殖細胞のマーカーとして使用し得、そして強力な標的としての受精能障害における治療用途を有し得る。ＮＯＶ７（ＡＣ０２６０３８＿Ｂ）は、実施例４（表１７Ｃ（パネル２Ｄ））において示されるように、ステロイドホルモン−卵巣癌、子宮癌および前立線癌に対して応答性の組織由来の腫瘍において、過剰発現する。従って、これは、細胞、特に、ステロイドホルモンに対して応答性の腫瘍細胞に対するマーカーである。これは、従って、異なる臨床結果に導くことが知られている、ホルモン応答性の腫瘍および非ホルモン応答性の腫瘍を識別するために使用さ得る。ＧＰＣＲであるタンパク質を使用して、腫瘍の増殖を調節し得る分子について候補治療剤（好ましくは、低分子治療剤およびヒトモノクローナル抗体）をスクリーニングし得る。ＮＯＶ７が活性化した好塩基球において発現されるので、表１７Ｃおよび１７Ｅ（パネル４Ｄ）における発現のパターンは、Ａｇ１２０１が感染において強力な役割を有し得ることを示す。好塩基球は、喘息およびアレルギー中の炎症の鍵となる細胞媒介物の一つである（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　２０００年７月２５日；４８（３）：２９６−８１．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｂｏｓｏｐｈｉｌｓ　ａｎｄ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌｓ：ｆｉｎｄｉｎｇ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎＲ１　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｏｌｉｖｅｒ　ＪＭ，Ｋｅｐｌｅｙ　ＣＬ，Ｏｒｔｅｇａ　Ｅ，Ｗｉｌｓｏｎ　ＢＳ．）。この分子は、これらの細胞を炎症部位に管外遊出させ、そして／またはこれらの細胞を活性化させるのに重要であり得る。Ａｇ１２０１に対する抗体治療剤は、好塩基球の活性化に起因する鼻腔および肺の炎症を阻害し、そして喘息、気腫、およびアレルギー性鼻炎の症状を効果的に減少または排除し得る。
【０１０１】
高い親和性のＩｇＥレセプター（Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩ）は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、じんま疹およびアナフィラキシーを含む、多くの急性および慢性のヒトアレルギー性反応において重要な役割を果たす。ヒトおよびげっ歯類において、このレセプターは、好塩基球およびマスト細胞において高いレベルで見出され、ＩｇＥおよび多価抗原によるその活性化は、Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩ依存性急性炎症の原因となる媒介物およびサイトカインを産生する。マスト細胞は、ペプチドに対して処理するためにＩｇＥ−Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩ複合体に結合した抗原を吸収し、そしてＴ細胞に対して提示することによって、持続性炎症応答にさらに寄与し得る。ヒトにおいて、Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩはまた、単球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）において、より低い密度で発現され、ここで、この同様の機能はまた、媒介物に対するシグナル伝達とサイトカイン産生および抗原提示との両方を含む。これらは、好塩基球およびマスト細胞においてＦｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩシグナル伝達カスケードの初期段階を規定すること、およびこれらの事象を阻害することに基づいてアレルギー性炎症を制御するための新規な経路を開発することに焦点を合わせて研究されている。抗原−刺激Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩシグナル伝達は、以下によって限定され得る：（１）Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩシグナル伝達を開始するＦｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩ関連タンパク質−チロシンキナーゼ（Ｌｙｎ）を隔離すること；（２）Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩシグナル伝達を伝播するタンパク質−チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）を排除すること；または（３）これを活性化すること；および（４）Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩと、同時発現されたレセプター（Ｆｃ　ｇａｍｍａ　ＲＩＩ）との間の阻害性の混信（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）を構築することによって限定され得、これはまた、Ｆｃｖａｒ　ｅｐｓｉｌｏｎ　ＲＩ媒介Ｓｙｋ活性をさらに限定する。これらの戦略は、アレルギー性炎症のための新規な治療のための基礎を形成し得る。
【０１０２】
（ＮＯＶ８）
本発明に従うＮＯＶ８配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ８核酸は、ヒト第１１染色体において見出される。ＮＯＶ８核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表９Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号１５）は、９６９ヌクレオチド長であり、そしてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２７〜２９のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド９５１〜９５３のＴＡＡ停止コドンで終わる。開始コドンから上流および末端コドンから下流の推定未翻訳領域は、表９Ａにおいて下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、予想分子量３３９６０．９Ｄａの３０８アミノ酸ポリペプチド（配列番号１６）をコードする。ＮＯＶ８ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析により、０．６４００の確実性で原形質膜タンパク質を予想する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、シグナルペプチドの存在が示唆され、切断部位は、配列番号１６の４１位と４２位との間に存在する可能性が最も高い。
【０１０３】
（表９Ａ）
【０１０４】
【表９Ａ】
2004513610.tif 000038
ＮＯＶ８核酸は、表９Ｂに示されるように、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＲＡＴ１；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｍ６４３７８）と相同性（７１％同一性）を有し、そしてＮＯＶ８核酸の逆相補体配列は、表９Ｃに示されるように、ヒト嗅覚受容器様ポリペプチドをコードする核酸（ＨＵＭ２；ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ信託番号８７７４０２６２）に対して高度の相同性（９７％同一性）を有する。ＮＯＶ８ポリペプチドは、表９Ｄに示されるように、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＯＬＲ４；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ９５００７）由来の嗅覚受容器様タンパク質と相同性（６８％同一性、７９％類似性）を有する。この完全配列相同性（タンパク質の全長配列を用いる、ＧＡＰアライメントによって定義される）は、６７％のアミノ酸同一性および７３％のアミノ酸類似性である。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基４１〜２９０に、７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって定義される場合）。
【０１０５】
【表９Ｂ】
2004513610.tif 000039
2004513610.tif 000040
【０１０６】
【表９Ｃ】
2004513610.tif 000041
【０１０７】
【表９Ｄ】
2004513610.tif 000042
ここで、｜は同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
【０１０８】
ＮＯＶ８発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。ＮＯＶ８核酸は、いくつかの腫瘍細胞株（卵巣癌腫ＯＶＣＡＲ−８および肺癌（非小細胞）ＨＯＰ−６２を含む）において発現される。このことは、実施例４において表１８Ｂに示されるように、腫瘍細胞（好ましくは、卵巣および肺の腫瘍）を同定するためのマーカーとしての有用性を示す。ＧＰＣＲとして、このタンパク質は、腫瘍増殖を調節し得る分子（好ましくは、低分子治療剤およびヒトモノクローナル抗体）をスクリーニングするために使用され得る。脂肪における発現は、ゲノムの夾雑によって汚染される。精巣における発現は、雄性生殖細胞を特異的に同定する有用性を示す。
【０１０９】
（ＮＯＶ９）
本発明に従うＮＯＶ９配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連したポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ９核酸は、ヒトの第１１染色体において見出される。ＮＯＶ９核酸およびそれによりコードされるポリペプチドは、表１０Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号１７）は、９３６ヌクレオチド長であり、そしてヌクレオチド５〜７位のＡＴＧ開始コドンで開始してヌクレオチド９２９〜９３１位のＴＡＡ停止コドンで終結するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。表１０Ａにおいて、開始コドンから上流の推定非翻訳領域および終結コドンから下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、３０８アミノ酸のポリペプチド（配列番号１８）をコードする。ＮＯＶ９ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、形質膜タンパク質を予測している（０．６４００の確実性）。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、シグナルペプチドの存在を示唆しており、切断部位は、配列番号１８における４１位と４２位との間に存在する可能性が最も高い。
【０１１０】
【表１０Ａ】
2004513610.tif 000043
ＮＯＶ９核酸は、表１０Ｂに示されているように、Ｇｏｒｉｌｌａ　ｇｏｒｉｌｌａ嗅覚受容器ｍＲＮＡ（ＧＯＲ１；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１７９７５６｜ａｃｃ：ＡＦ１７９７５６．１）に対して、高い程度の相同性（９８％同一性）を有する。ＮＯＶ９ポリペプチドは、表１０Ｃに示されているように、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の嗅覚受容器様（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ−ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質（ＯＬＲ５；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２３２６７）に対して、相同性（６８％同一性、７９％類似性）を有する。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基４１〜２９０に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定される場合）。
【０１１１】
【表１０Ｂ】
2004513610.tif 000044
ここで、｜は同一性を示す。
【０１１２】
【表１０Ｃ】
2004513610.tif 000045
ここで、｜は同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
【０１１３】
（ＮＯＶ１０）
本発明に従うＮＯＶ１０配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連したポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ１０核酸は、ヒトの第１１染色体において見出される。ＮＯＶ１０核酸およびそれによりコードされるポリペプチドは、表１１Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号１９）は、９７１ヌクレオチド長であり、そしてヌクレオチド１７〜１９位のＡＴＧ開始コドンで開始してヌクレオチド９５０〜９５２位のＴＧＡ停止コドンで終結するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。表１１Ａにおいて、開始コドンから上流の推定非翻訳領域および終結コドンから下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、３５１４７．４Ｄａの推定分子量を有する３１１アミノ酸のポリペプチド（配列番号２０）をコードする。ＮＯＶ１０ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、形質膜タンパク質を予測している（０．６０００の確実性）。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、シグナルペプチドの存在を示唆しており、切断部位は、配列番号２０における５９位と６０位との間に存在する可能性が最も高い。
【０１１４】
【表１１Ａ】
2004513610.tif 000046
ＮＯＶ１０核酸は、表１１Ｂに示されているように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＧＰＣＲ２；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＬ０９６７７０）に対して、相同性（６３％同一性）を有する。ＮＯＶ１０ポリペプチドは、表１１Ｃに示されているように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の嗅覚受容器様タンパク質（ＯＬＲ３；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：ＣＡＢ６５７９９）に対して、相同性（５１％同一性、６８％類似性）を有する。全体的な配列相同性は、５０．４９％のアミノ酸同一性および５７．３７％のアミノ酸類似性である。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基４７〜２９６に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定される場合）。
【０１１５】
【表１１Ｂ】
2004513610.tif 000047
【０１１６】
【表１１Ｃ】
2004513610.tif 000048
ここで、｜は同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
ＮＯＶ１０発現を、表１９Ｂに示されているように、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。
【０１１７】
（ＮＯＶ１１）
本発明に従うＮＯＶ１１配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連したポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ１１核酸は、ヒトの第１１染色体において見出される。ＮＯＶ１１核酸およびそれによりコードされるポリペプチドは、表１２Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号２１）は、１０１０ヌクレオチド長であり、そしてヌクレオチド３７〜３９位のＡＴＧ開始コドンで開始してヌクレオチド９８２〜９８４位のＴＡＡ停止コドンで終結するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。表１２Ａにおいて、開始コドンから上流の推定非翻訳領域および終結コドンから下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、３５６２０．１Ｄａの推定分子量を有する３１５アミノ酸のポリペプチド（配列番号２２）をコードする。ＮＯＶ１１ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、形質膜タンパク質を予測している（０．６０００の確実性）。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、可能性のある以下の２つの切断部位を有するシグナルペプチドの存在を示唆している：１つは、配列番号２２における４９位と５０位との間に存在し、そして１つは、配列番号２２における５９位と６０位との間に存在する。
【０１１８】
【表１２Ａ】
2004513610.tif 000049
ＮＯＶ１１核酸は、表１２Ｂに示されているように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＧＰＣＲ３；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０６５８６９）に対して、相同性（８８％同一性）を有する。ＮＯＶ１１ポリペプチドは、表１２Ｃに示されているように、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の臭気受容器（ｏｄｏｒａｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質（ＯＤＯＲ１；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｇ２６４６１８）に対して、相同性（６９％同一性、８１％類似性）を有する。全体的な配列相同性（このタンパク質の全長配列でのＧＡＰアラインメントにより規定される場合）は、４８％のアミノ酸同一性および５７％のアミノ酸類似性である。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基３９〜２８５に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定される場合）。
【０１１９】
【表１２Ｂ】
2004513610.tif 000050
2004513610.tif 000051
【０１２０】
【表１２Ｃ】
2004513610.tif 000052
ここで、｜は同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
【０１２１】
（ＮＯＶ１２）
本発明に従うＮＯＶ１２配列は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質に関連したポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ１２核酸は、ヒトの第１１染色体において見出される。ＮＯＶ１２核酸およびそれによりコードされるポリペプチドは、表１３Ａに示される配列を含む。開示された核酸（配列番号２３）は、９８８ヌクレオチド長であり、そしてヌクレオチド２３〜２５位のＡＴＧ開始コドンで開始してヌクレオチド９５９〜９６１位のＴＡＡ停止コドンで終結するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。表１３Ａにおいて、開始コドンから上流の推定非翻訳領域および終結コドンから下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンを太字にする。代表的なＯＲＦは、３５３５４．０Ｄａの推定分子量を有する３１２アミノ酸のポリペプチド（配列番号２４）をコードする。ＮＯＶ１２ポリペプチドのＰＳＯＲＴ分析は、形質膜タンパク質を予測している（０．６０００の確実性）。ＳＩＧＮＡＬＰ分析は、シグナルペプチドの存在を示唆しており、切断部位は、配列番号２４における３８位と３９位との間に存在する可能性が最も高い。
【０１２２】
【表１３Ａ】
2004513610.tif 000053
ＮＯＶ１２核酸配列（配列番号２３）の逆相補体（配列番号７５）は、表１３Ｂに示されているように、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＧＰＣＲ　ｍＲＮＡ（ＧＰＣＲ４；ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＬ０３１２５９）に対して、相同性（７３％同一性）を有する。ＮＯＶ１２ポリペプチドは、表１３Ｃに示されているように、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓの臭気受容器タンパク質（ＯＤＯＲ２；ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：ＢＡＡ８６１２５）に対して、相同性（４８％同一性、６０％類似性）を有する。全体的な配列相同性（このタンパク質の全長配列でのＧＡＰアラインメントにより規定される場合）は、４８％のアミノ酸同一性および５７％のアミノ酸類似性である。さらに、このタンパク質は、アミノ酸残基４１〜２８７に、７回膜貫通レセプタードメイン（ロドプシンファミリー）（ＩＰＲ０００２７６）を含む（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定される場合）。
【０１２３】
【表１３Ｂ】
2004513610.tif 000054
2004513610.tif 000055
【０１２４】
【表１３Ｃ】
2004513610.tif 000056
ここで、｜は同一性を示し、そして＋は類似性を示す。
【０１２５】
ＮＯＶ１２の新規なＳＮＰ改変体およびその対応するポリペプチドを、表１３Ｄに示す。新規なＳＮＰを同定する方法および確認する方法は、実施例３に記載される。
【０１２６】
【表１３Ｄ】
2004513610.tif 000057
2004513610.tif 000058
ＮＯＶ１２発現を、ＴａｑＭａｎ分析によって分析した。ＮＯＶ１２の発現は、実施例４において表２０Ｂ（パネル１．２）に示されるように、骨格筋において最高レベルを示し、そして脂肪組織においてより低い発現を示している。骨格筋における発現は、このＧＰＣＲが、エネルギー代謝、およびエネルギー源としての炭水化物または脂質のいずれかの調節に関与し得ることを示し得る。従って、ＮＯＶ１２は、糖尿病および／または肥満の処置における潜在的な低分子標的であり得る。
【０１２７】
ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２核酸によってコードされるポリペプチドを、表２１に示されるように、ＣＬＵＳＴＡＬＷ分析によって分析した。
【０１２８】
【表１３Ｅ】
2004513610.tif 000059
2004513610.tif 000060
ここで、＊は同一性を示し、：は強力な同一性を示し、そして．は弱い同一性を示す。ｒＯＲは、Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の嗅覚受容器様（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ−ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２３２６７）を示す。
【０１２９】
ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２は、ＧＰＣＲファミリーの新たなメンバーを表す。ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２は、ヒトの第１１染色体についてのマーカーとして使用され得る。ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２は、ＧＰＣＲタンパク質ファミリー内に含まれる遺伝子の発現における変化を決定するのに有用である。ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２は、ＧＰＣＲ関連タンパク質ファミリーのメンバーの発現における改変と関連付けられる障害の処置において有用な新しい診断組成物または治療組成物を提供することによって、当該分野における必要性を満たす。従って、ＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２の核酸およびタンパク質、ならびに本明細書中において同定される本発明の他の組成物は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連付けられる潜在的な治療的適用において有用であり得る。本発明について潜在的な治療的適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後判定マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、本明細書中に規定される組織および細胞型から構成される（しかし、これらに限定されない）すべての組織および細胞型のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０１３０】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下の処置を含む潜在的な治療的適用において有用である：感染（例えば、細菌感染、真菌感染、原生動物感染、およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染））、疼痛、癌（新生物、腺癌、リンパ腫、前立腺癌、および子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿貯留、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性および神経学的障害（不安、精神分裂病、大うつ病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）、および／または他の病状および障害。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして、使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＧＰＣＲ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは遺伝子治療において有用であり得、そしてＧＰＣＲ様タンパク質は、このＧＰＣＲ様タンパク質を必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。限定することのない例として、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置のための効力を有する：細菌感染、真菌感染、原生動物感染、およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物、腺癌、リンパ腫、前立腺癌、および子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿貯留、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性および神経学的障害（不安、精神分裂病、大うつ病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）、および／または他の病状および障害。ＧＰＣＲ様タンパク質をコードする新規な核酸、および本発明のＧＰＣＲ様タンパク質、またはそれらのフラグメントはさらに、診断的適用において有用であり得る。この診断的適用では、この核酸またはこのタンパク質の存在または量を評価する。これらの物質はさらに、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生において有用である。
【０１３１】
（ＮＯＶＸ核酸）
本発明の核酸は、ＮＯＶＸのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能である。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードする。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体の形態もしくはプロタンパク質の産物に関連する。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、限定することのない例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、本明細書中で記載されるオープンリーディングフレームによってコードされる、ポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。産物「成熟」形態は、重ねて、限定することのない例として、遺伝子産物が産生される細胞内で発生し得る１以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に導くこのようなプロセシング工程の例としては、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされる、Ｎ−末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク分解性切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ−末端メチオニンである）を有する、前駆体のポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ−末端メチオニンの除去後に残った残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎを有する前駆体のポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が切断される）は、残った残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断事象以外の翻訳後改変の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、限定することのない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質は、これらのプロセスの１つのみの作用またはそれらの任意の組み合わせから生じ得る。
【０１３３】
ＮＯＶＸ核酸としては、とりわけ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３で提供される配列の核酸またはそれらのフラグメントである。さらに、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の変異体核酸または改変体核酸あるいはそれらのフラグメントを含み、これらの任意の塩基は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示される対応する塩基から変更され得るが、依然としてＮＯＶＸ様の活性および生理学的機能の少なくとも１つを維持するタンパク質をコードする。本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の核酸配列の相補体（それらのフラグメント、誘導体、アナログおよびそれらのホモログを含む）をさらに含む。本発明は、構造が化学的改変を含む、核酸または核酸フラグメントあるいはそれらの相補体をさらに含む。
【０１３４】
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子に関する。また、ＮＯＶＸをコードする核酸（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメントおよびＮＯＶＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するためのフラグメントも含まれる。本明細書において使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して産生されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１３５】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほども大きな長さの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長い長さのプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【０１３６】
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合には他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないものであり得るか、または化学的に合成される場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１３７】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらの任意のヌクレオチド配列の相補体は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３の核酸配列の全部または一部を使用して、ＮＯＶＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載される）を用いて単離され得る。
【０１３８】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを用い、そして適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され得、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を用いることにより調製され得る。
【０１３９】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では、１００ｎｔより短い長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、もしくは２３に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成する。
【０１４１】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介し得るか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じない、他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１４２】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の核酸配列の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＮＯＶＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）の配列として規定され、そして全長より短い配列のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する（しかし、同一ではない）構造を有するが、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。
【０１４３】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、その誘導体またはアナログが修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列に比較した場合（この整列化は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸が、ストリンジェントの条件下、中程度にストリンジェントの条件下、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラムは、デフォルト設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）であり、これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を使用する。
【０１４４】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子改変体および変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列には、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まれない。相同な核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、およびＮＯＶＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同なアミノ酸配列は、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１４５】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログおよび他の哺乳動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計される、プローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上連続する、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の天然に存在する変異体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１４６】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、プローブはさらに、このプローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０１４７】
「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、用量依存性を伴うかまたは伴わずに、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、必要に応じて、ＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態おいて、ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含む。
【０１４８】
（ＮＯＶＸ改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。それにより、これらの核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＮＯＶＸタンパク質（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のポリペプチド）と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１４９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは哺乳動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動性を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＮＯＶＸの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸ内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０１５０】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ヒトｃＤＮＡまたはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＮＯＶＸ　ｃＤＮＡは、ヒトの膜結合ＮＯＶＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜結合ヒトＮＯＶＸ　ｃＤＮＡは、可溶性ヒトＮＯＶＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。
【０１５１】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチド長である。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【０１５２】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって得られ得る。
【０１５３】
本明細書中で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０１５４】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、これらの条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％　ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションに、０．２×ＳＳＣ、０．０１％　ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄が続く。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１５５】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中、５５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、３７℃での１回以上の洗浄である。使用され得る他の中程度のストリンジェンシーの条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１５６】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％　ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中、４０℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ中、５０℃での１回以上の洗浄である。使用され得る他の低いストリンジェンシーの条件は、当該分野で周知である（例えば、交差種（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１５７】
（保存的変異）
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列への変異によって変化を導入し、それによって、ＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、そのコードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし得ることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の配列においてなされ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＮＯＶＸの野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。
【０１５８】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含むＮＯＶＸタンパク質をコードする、核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４のアミノ酸配列に少なくとも約７５％の相同性であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４に少なくとも約８０％相同性であり、より好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４に少なくとも約９０％、約９５％、約９８％相同性であり、そして最も好ましくは、少なくとも約９９％相同性である。
【０１５９】
タンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、そのコードされるタンパク質に導入される。
【０１６０】
変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定の非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸ中の推定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の変異誘発に続いて、そのコードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１６１】
１つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（１）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変異ＮＯＶＸタンパク質とＮＯＶＸのレセプターとの間の複合体形成；（３）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質（例えば、アビジンタンパク質）またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（４）ＮＯＶＸタンパク質を結合する能力；あるいは（５）抗ＮＯＶＸタンパク質抗体を特異的に結合する能力。
【０１６２】
（アンチセンスＮＯＶＸ核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のヌクレオチド配列またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的であるか（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的である）またはｍＲＮＡ配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＮＯＶＸコード鎖、またはその一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３のＮＯＶＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供される。
【０１６３】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４に対応する、ヒトＮＯＶＸのタンパク質コード領域）をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０１６４】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３）を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１６５】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、以下の小節にさらに記載されように、その挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１６６】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果、それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたはそれに結合し、それによって、このタンパク質の発現を、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであり得るか、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝（ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで、全身的に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０１６７】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：３２７〜３３０）を含み得る。
【０１６８】
このような改変としては、非制限的な例として、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために少なくとも一部で実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１６９】
（ＮＯＶＸリボザイムおよびＰＮＡ部分）
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対する相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ　ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１７０】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸの調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１７１】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でのＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ　９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０１７２】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節（例えば、転写または翻訳の停止の誘導または複製の阻害による）のためのアンチセンス薬剤または抗遺伝子剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、遺伝子における一塩基対変異の分析（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）による）において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合に、人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列決定およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用され得る。
【０１７３】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞の取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を合わせ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。そのようなキメラは、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供しながら、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向を考慮して選択される、適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：３３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖が、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有する、キメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ　５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１７４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤など）に結合され得る。
【０１７５】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に提供される、ＮＯＶＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に示される対応する残基から変化され得るが、そのＮＯＶＸ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、この変異体タンパク質または改変体タンパク質において、２０％までまたはそれ以上の残基がそのように変化され得る。いくつかの実施形態において、本発明に従うＮＯＶＸポリペプチドは、成熟ポリペプチドである。
【０１７６】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保存するＮＯＶＸ様改変体としては、その配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸により置換され、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む、任意の改変体が含まれる。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０１７７】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質が、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代替法として、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【０１７８】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」とは、その調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生された細胞の細胞性成分から、このＮＯＶＸタンパク質が分離されている、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾燥重量で）の非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは、約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおより好ましくは、約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは、約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、これらはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、そして最も好ましくは、約５％未満を示す。
【０１７９】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、ＮＯＶＸタンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されている、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾燥重量で）の化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質、より好ましくは、約２０％未満の化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおより好ましくは、約１０％未満の化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、そして最も好ましくは、約５％未満の化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０１８０】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。
【０１８１】
本発明のＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つ（例えば、ＴＳＲモジュール）を含み得る。さらに、このタンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分が、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１８２】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、以下に詳細に議論されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に実質的に相同であり、そして天然の対立遺伝子改変または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１８３】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列化される（例えば、ギャップが、配列間の最適な整列のために、その比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０１８４】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ　１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１８５】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を導き、この一致した位置の数を比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてその結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを導くことによって、算出される。本明細書中で使用される場合、用語「実質的な同一性」は、そのポリヌクレオチドが、比較領域にわたって参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性、そしてしばしば、９０〜９５％の配列同一性、より通常には、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残基パーセント」は、その比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較し、同一のアミノ酸および保存的アミノ酸置換が上記のように両方の配列において存在する位置の数を決定して、その一致した位置の数を導き、この一致した位置の数を比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてその結果を１００で乗算して陽性残基パーセントを導くことによって、算出される。
【０１８６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質の全てまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１８７】
例えば、１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに連結されたＮＯＶＸポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、ＮＯＶＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０１８８】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸの精製を容易にし得る。
【０１８９】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、１つ以上のドメインを含むＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に含まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上のＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによって、ＮＯＶＸ媒介シグナル伝達をインビボで抑制し得る。１つの非限定的な例においては、意図される本発明のＮＯＶＸリガンドは、ＮＯＶＸレセプターである。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸの同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害（例えば、癌）の両方の処置、および細胞生存の調節（例えば、促進または阻害）、ならびに急性および慢性炎症性障害および過形成創傷治癒（例えば、過形成性瘢痕およびケロイド）に、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として、ＮＯＶＸリガンドを精製するため、およびＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイにおいて、使用され得る。
【０１９０】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、粘着末端の充填（適切な場合）、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的突出を生じるアンカープライマーを用いて実施し得る、次いで、この突出を、アニールおよび再増幅し、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、その融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１９１】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびＮＯＶＸアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体、例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の活性１つ以上を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流メンバーまたは上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して少ない副作用を被験体において有する。
【０１９２】
ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニスト活性またはＮＯＶＸタンパク質アンタゴニスト活性について、ＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとしてか、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１１：４７７を参照のこと）。
【０１９３】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーを、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１回だけニック形成が生じる条件下にて、ヌクレアーゼで処理すること、その二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するようにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより、生成し得る。この方法により、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０１９４】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技法が当該分野で公知である。このような技法を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で発現させることを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法である反復型（ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ）アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７−３３１）。
【０１９５】
（ＮＯＶＸ抗体）
ＮＯＶＸタンパク質に対する抗体、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、ヒト由来の抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関連し、これらは分子内に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスもまた、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中で抗体に対する言及は、ヒト抗体種のすべてのこのようなクラス、サブクラスおよび型に対する言及を含む。
【０１９６】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原、またはその一部もしくはフラグメントとして役立つことが意図され得、そしてさらに、免疫原として使用されて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長タンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４において示されるアミノ酸配列）の少なくとも６アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを含み、その結果このペプチドに対して惹起された抗体は、その全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと、特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、そのペプチド表面上に遺伝子座するタンパク質の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【０１９７】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸタンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか、そしてそれ故、抗体産生を標的とするために有用な表面残基をコードするようであるかを示す。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、当該分野で周知の任意の方法（例えば、フーリエ変換を用いるかまたは用いない、Ｋｙｔｅ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む）により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２（この各々が全体として、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提供される。
【０１９８】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０１９９】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｍｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ，およびＬａｎｅ　Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０２００】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、またはこれらの誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。免疫学的応答を増加させるために使用される種々のアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０２０１】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、またはあるいは、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０２０２】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、唯一の軽鎖遺伝子産物および唯一の重鎖遺伝子産物からなる唯一の分子種の抗体分子からなる抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団のすべての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、その抗体への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０２０３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、その免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得る、リンパ球を誘発する。あるいは、そのリンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０２０４】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は、脾細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常は、形質転換された哺乳動物細胞（特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞）である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を好ましくは含む、適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【０２０５】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である、不死化細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０２０６】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０２０７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準方法によって増殖させ得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０２０８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０２０９】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列に代えてヒトの重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコード配列で置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の配列を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに代えて置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに代えて置換され得、キメラ二価抗体を生じ得る。
【０２１０】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトの免疫応答を引き起こさないヒトへの投与に適する。抗体のヒト化形態は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、ヒト抗体の対応する配列に代えてげっ歯類ＣＤＲまたはげっ歯類ＣＤＲ配列で置換することによって、達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメイン、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。これらの領域内で、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして骨格領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の骨格領域に対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部を最適に含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０２１１】
（ヒト抗体）
十分にヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の配列の本質的に全体がヒト遺伝子から本質的に生じる抗体分子に、関する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「十分にヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）によって調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０２１２】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体産生が観察され、このことはすべての点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６１１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ　３６８、８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ　３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３　６５−９３（１９９５））。
【０２１３】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体でなく十分にヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非ヒト宿主における免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子は、能力を失っており、そしてヒトの重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、その改変の完全よりも少ない相補体を含む中間トランスジェニック動物を交雑することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるように、ＸｅｎｏｍｏｕｓＴＭと呼ばれる。この動物は、十分にヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原による免疫後に、動物から直接（例えば、ポリクローナル抗体の調製）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０２１４】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に記載される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座由来のＪセグメント遺伝子を欠失して、遺伝子座の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成、および選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによってもたらされる欠失を防ぐ工程；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚性幹細胞から作製する工程。
【０２１５】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞融合する工程。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０２１６】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関する方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０２１７】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、技術が、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法が、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについて所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０２１８】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、モノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体）である。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０２１９】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる１０個の抗体分子の可能な混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１　ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０２２０】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む）である。この融合物中の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０２２１】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大にするように操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖についての同一または同様のサイズの補償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０２２２】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、近接するジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸塩ナトリウムの存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＢＮ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＢＮ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンを用いる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量のもう１つのＦａｂ’−ＴＢＮ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定のための薬剤として使用され得る。
【０２２３】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的に結合され得て二重特異的抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、十分にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロでの化学的結合に供され、二重特異的抗体を形成した。このように形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発し得る。
【０２２４】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製しそして単離するための、種々の技術もまた記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間を対にできないリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインが、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０２２５】
２つより多い結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２２６】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このエピトープのうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームが、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（Ｆｃ　Ｒ）（例えば、Ｆｃ　ＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ　ＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃ　ＲＩＩＩ（ＣＤ１６））のような白血球上の標的化分子に結合するアームと、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を指向するために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームとを、保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０２２７】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ　０３０８９）提案されてきた。この抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって、構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が、挙げられる。
【０２２８】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし得る。このように作製されるホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーション能力および／または増加した補体媒介細胞殺傷、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１１９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２６５６（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は、二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの能力を有し得るように、操作され得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０２２９】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体））に結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
【０２３０】
このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓｅｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２３１】
抗体と細胞傷害性因子との結合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート　ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。Ｃ１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０２３２】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して未結合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性薬剤にその後結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０２３３】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター（好ましくは発現ベクター）に関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがこのウイルスのゲノムに連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞中で自発的に複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用され得る。なぜなら、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるからである。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、他の形態の発現ベクターを含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０２３４】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含むこと意味し、この調節配列は、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてか、またはこのベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０２３５】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは、当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０２３６】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、さらにＧｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０２３７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２３８】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０２３９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中で、タンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２４０】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０２４１】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２４２】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２４３】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ、１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９．ＥＭＢＯ　Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３．Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８３．Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。
【０２４４】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２４５】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は、その次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０２４６】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ヒト、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２４７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０２４８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０２４９】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０２５０】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入されている、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物（ここで外因性のＮＯＶＸ配列がそれらのゲノムに導入されている）または相同組換え動物（ここで内因性のＮＯＶＸ配列が変更されている）を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、およびＮＯＶＸタンパク質の活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【０２５１】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）導入、そしてこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３を含む配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトＮＯＶＸ　ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。介在配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向するために、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物と交配され得る。
【０２５２】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＮＯＶＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０２５３】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計され得る（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら，１９８７．Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、胚幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、この導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら，１９９２．Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【０２５４】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，１９８７．ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ　１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、出産させた。それらの生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物の全ての細胞に、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相同組換えＤＮＡを含む動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ，１９９１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０２５５】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２５６】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルから出し、そしてＧ０期に入らせ得る。次いで、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物由来の、除核された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構築された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フォスター動物から産生された子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０２５７】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で「活性化合物」といわれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性物質である、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。何らかの従来の媒体または薬剤がこの活性化合物と不適合性である範囲を除いて、組成物におけるその使用は、意図される。補足的な活性化合物はまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０２５８】
本明細書中に開示された抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。この抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法によって調製される（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号において記載される）。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０２５９】
特に有用であるリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いた逆層エバポレーションによって生成され得る。リポソームは、規定された孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生じる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のようにジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合体化され得る。化学治療剤（例えば、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）は、必要に応じてリポソーム内に含まれ得る。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮的（すなわち、局所的）、粘膜を越えて、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。
【０２６１】
注射可能な使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（ここで、水溶性）または水性分散液および滅菌の注射可能な溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０２６２】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質あるいは抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中に、必要な場合、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および予め滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２６３】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（スイッシュ）（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２６４】
吸入による投与について、この化合物は、適切なプロペラント（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２６５】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知であるように軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２６６】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０２６７】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２６８】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のために単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０２６９】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが含まれ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２７０】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書中で開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与され得る。このような組成物を調製する際に関する原理および考慮、ならびに成分の選択の際の手引きは、例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ　Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ　Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ　Ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４）、１９９１、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに提供される。抗原性タンパク質が、細胞内にあり、そして完全な抗体が、インヒビターとして使用される場合、内在化抗体が、好ましい。しかし、リポソームはまた、抗体または抗体フラグメントを細胞に送達するために使用され得る。抗体フラグメントが、使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが、好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を維持するペプチド分子が設計され得る。このようなペプチドは、化学的に合成され得、そして／または組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、処置される特定の適応性について、必要なに応じて１より多くの活性化合物を含み得、好ましくは、互いに悪影響を与えない補完的活性を有する化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞障害性剤、サイトカイン、化学療法剤または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量で組み合わせて適切に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合化によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）で、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいてトラップされ得る。
【０２７１】
インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌されなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０２７２】
徐放性調製物が、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ　ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注入可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超えて分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。
【０２７３】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書とともに、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０２７４】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質を発現するために（例えば、遺伝子治療適用の際に宿主細胞における組み換え発現ベクターを介して）使用され、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおける）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的病変を検出し得、かつ以下にさらに記載されるようなＮＯＶＸ活性を調節し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生またはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少しているかもしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴づけられる障害を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離し、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸ活性は、増殖および分化、抗体産生、および腫瘍増殖を含む。
【０２７５】
本発明は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤および上記される処置のためのそれらの使用に関する。
【０２７６】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質発現またはＮＯＶＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または候補薬剤、あるいは試験化合物または試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【０２７７】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーとしては、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス付け可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Ｌａｍ，１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１２：１４５を参照のこと。
【０２７８】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０２７９】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０２８０】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ、１９９３．Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において示され得る。
【０２８１】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２８２】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子とＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２８３】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２８４】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して優先的に、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２８５】
さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合を決定するための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより達成され得る。例えば、適切な基質に対するこの標的分子の触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２８６】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０２８７】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用にかなう。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例としては、例えば、以下の非イオン性界面活性剤が挙げられる：ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２８８】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多くの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着していない標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２８９】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕獲され得る。このような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記の方法に加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２９０】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２９１】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３．Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において「ベイトタンパク質」として使用されて、ＮＯＶＸに結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流エレメントまたは下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与するようである。
【０２９２】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは、非常に近くにされている。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０２９３】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２９４】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば（限定ではない）、これらの配列を使用して、（ｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉ）生物学的サンプルの法医学的同定を助け得る。これらの適用のうちのいくつかは、以下の節において記載される。
【０２９５】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列は、わずかな生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２９６】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分の塩基ごとに実際のＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、この配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、このＤＮＡを配列決定し得る。
【０２９７】
このように調製された、個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、独特の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体からおよび組織からこのような同定配列を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの一部分を独特に表す。対立遺伝子バリエーションは、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子バリエーションは、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子バリエーションの大部分は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２９８】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して、個体からのＤＮＡが同定の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、より少ない配列が必要とされる。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体同定を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは各々が、１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３における配列）が使用される場合、ポジティブな個体同定に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２９９】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）に関して決定し、これによって、個体が、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいはＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した障害を発症する危険性があるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。ＮＯＶＸの異常発現活性に関連した障害としては、例えば、異常な細胞増殖、細胞分化および細胞移動によって特徴付けられる障害（例えば、癌、新脈管形成、アテローム性動脈硬化症および肥満）、神経学的障害（例えば、発作、ペンドレッド症候群、多発性硬化症およびアルツハイマー病）、ケラチノサイト欠損症（例えば、病変性乾癬皮膚）、虚血性障害（例えば、糖尿病性網膜症）、肝臓障害（例えば、肝硬変）ならびに膵臓障害（例えば、急性膵炎）が挙げられる。
【０３００】
本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置し得る。
【０３０１】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定し、これによって、その個体についての適切な治療的薬剤または予防的薬剤（本明細書において「薬理ゲノム学」とよばれる）を選択するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基づいた、個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０３０２】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０３０３】
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０３０４】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１もしくは２３の核酸またはその一部分（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長で、かつ、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチドである））であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書中に記載される。
【０３０５】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための１つの薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質と結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。本発明のタンパク質に対する抗体は、タンパク質の局在化および／または定量に関連して、当該分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、タンパク質に対する抗体または抗原結合ドメインを含むその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、薬理学的に活性な化合物として利用される。
【０３０６】
本発明のタンパク質に特異的な抗体は、標準技術（例えば、免疫親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、タンパク質を単離するために用いられ得る。このような抗体は、細胞からの天然のタンパク質抗原の精製および宿主細胞において発現される組換え的に産生された抗原の精製を容易にし得る。さらに、抗原タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、このような抗体を用いて（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）抗原タンパク質を検出し得る。このタンパク質に対する抗体は、例えば、所定の処置レジメンの効力を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３０７】
抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する、組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物学的サンプル中のＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０３０８】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０３０９】
１つの実施形態において、この方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０３１０】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物または薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＮＯＶＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内にパッケージングされ得る。このキットはさらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０３１１】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現もしくは異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現もしくは活性に関連した障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。このような障害としては、例えば、異所性の細胞増殖、細胞分化および細胞移動により特徴付けられる障害（例えば、癌、新脈管形成、アテローム性動脈硬化症および肥満症）、神経学的障害（例えば、発作、ペンドレッド症候群、多発性硬化症およびアルツハイマー病）、ケラチノサイト欠損症（例えば、病変性乾癬皮膚）、虚血性障害（例えば、糖尿病性網膜症）、肝臓障害（例えば、肝硬変）、および膵臓障害（例えば、急性膵炎）が挙げられる。
【０３１２】
あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患もしくは障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を同定するための方法を提供する。この方法では、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現もしくは異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断特徴である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０３１３】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害について薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。この方法では、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての診断特徴である）。
【０３１４】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える変更またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠損、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において公知の、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞（例えば、頬粘膜細胞が挙げられる）を含む任意の生物学的サンプルが使用され得る。
【０３１５】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ　９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用することが所望され得ることが予想される。
【０３１６】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７を参照のこと）；Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０３１７】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特定の変異の存在についてスコア付けし得る。
【０３１８】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝的変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、１９９６．Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら、１９９６．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作製することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である、並行プローブセットから構成される。
【０３１９】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ、１９７７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ　７４：５４６３によって開発された技術に基づく配列決定反応が挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら、１９９５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８を参照のこと）。これらの自動化配列決定手順には、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、１９９６．Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら、１９９３．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０３２０】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら、１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在する一本鎖領域）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼを用いて処理して、そのミスマッチ領域を酵素的に消化し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルで大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、１９９２．Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０３２１】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕら、１９９４．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコールなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０３２２】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ、１９９２．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと。サンプルおよびコントロールのＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１塩基の変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、（ＤＮＡよりもむしろ）二次構造が配列中の変化に対してより感受性であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら、１９９１．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０３２３】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、そのＤＮＡが完全には変性しないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０３２４】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る。例えば、Ｓａｉｋｉら、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０３２５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差示的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら、１９８９．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは１つのプライマーの最も３’末端で目的の変異を保有し得、ここで、適切な条件下でミスマッチはポリメラーゼ伸長を妨害または減少させ得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ、１９９３．Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）。さらに、変異領域に新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために所望され得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、１９９２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０３２６】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子に関与する疾患または疾病の症状または家族歴を示す患者を診断するための臨床的設定において便利に使用され得る。
【０３２７】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０３２８】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、異常な細胞増殖、分化および移動により特徴付けられる障害（例えば、癌、新血管形成、アテローム硬化症および肥満）、神経学的障害（例えば、発作、ペンドレッド症候群、多発性硬化症およびアルツハイマー病）、ケラチノサイト欠損（例えば、損傷性乾癬の皮膚）、虚血性障害（例えば、糖尿病性網膜症）、肝臓障害（例えば、肝硬変）、ならびに膵臓障害（例えば、急性膵炎）を処置（予防的または治療的に）するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０３２９】
薬理ゲノム学は、罹患された人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０３３０】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０３３１】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０３３２】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、増殖または免疫障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０３３３】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０３３４】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加することが（すなわち、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少すること（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）が望ましくあり得る。
【０３３５】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。異常なＮＯＶＸ発現に関連する障害には、例えば、異常な細胞増殖、分化および移動により特徴付けられる障害（例えば、癌、新血管形成、アテローム硬化症および肥満）、神経学的障害（例えば、発作、ペンドレッド症候群、多発性硬化症およびアルツハイマー病）、ケラチノサイト欠損（例えば、損傷性乾癬の皮膚）、虚血性障害（例えば、糖尿病性網膜症）、肝臓障害（例えば、肝硬変）、ならびに膵臓障害（例えば、急性膵炎）が挙げられる。これらの治療方法は、以下により詳細に記載される。
【０３３６】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０３３７】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０３３８】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３３９】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小区分において、さらに議論される。
【０３４０】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３４１】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が免疫不全疾患（例えば、ＡＩＤＳ）を有する場合である。
【０３４２】
本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体を含む）は、治療剤として使用され得る。このような薬剤は、一般的に、被験体における疾患および病理を処置または予防するために使用される。抗体調製物（好ましくは、その標的抗原について高い特異性および高い親和性を有するもの）は、被験体に対して投与され、そして一般的に、その標的との結合に起因して効果を有する。このような効果は、所定の抗体分子と問題の標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存して、２つの種類のうちの１つであり得る。第１の例では、抗体の投与は、標的とそれが天然に結合する内因性リガンドとの結合を抑止または阻害し得る。この場合、抗体は、標的に結合し、そして天然に存在するリガンドの結合部位をマスクし、ここでそのリガンドは、エフェクター分子として働く。従って、レセプターは、シグナル伝達経路を媒介する。そのリガンドは、シグナル伝達の原因である。
【０３４３】
あるいは、その効果は、標的分子上のエフェクター結合部位への結合によって、抗体が生理学的結果を誘発するものであり得る。この場合、標的（存在し得ないかまたは疾患もしくは病理を欠損し得る内因性リガンドを有するレセプター）が、代理のエフェクターリガンドとして抗体を結合して、レセプターによって、レセプターに基づくシグナル伝達事象を開始する。
【０３４４】
治療的に有効な量の本発明の抗体は、治療目的を達成するために必要とされる量を一般的にいう。上記のように、これは、いくつかの場合において標的の機能を妨害し、そして他の場合において生理学的応答を促進する、抗体とその標的抗原の間の結合相互作用であり得る。投与されるために必要とされる量は、その特異的抗原についての抗体の結合親和性にさらに依存し、そしてまた、その量は、投与される抗体が、その抗体が投与される自由な体積の他の被験体から枯渇される速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的有効用量の一般的な範囲は、非限定的な量として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的な投薬の頻度は、例えば、毎日２回〜１週間に１回の範囲であり得る。
【０３４５】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３４６】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３４７】
本発明はさらに、以下の実施例において記載され、この実施例は、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
【０３４８】
（実施例）
（実施例１：本発明の核酸を同定する方法）
新規な核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋによって利用可能にされたＧｅｎｏｍｉｃ　Ｄａｉｌｙ　Ｆｉｌｅｓに対して実行したＧＰＣＲまたはホモログに対するＣｕｒａ　ＧｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列ファイルを使用するか、または個々の配列センターからダウンロードしたファイルからのＴＢｌａｓｔＮによって同定した。同定した。エキソンをホモロジーによって予測し、イントロン／エキソンの境界を標準の遺伝学的法則を利用して決定した。エキソンはさらに、選択されて、複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ＴＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索ならびにいくつかの場合、ＧｅｎｅＳｃａｎＴＭおよびＧｒａｉｌを用いた類似性決定の手段によってさらに精錬した。遺伝子配列をさらに規定し完全にするために利用可能な場合、公開されたデータベースおよび権利化されたデータベースの両方から示された配列をまた加えた。次いで、この配列を手動で明らかな不一致について修正し、それによって全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０３４９】
（実施例２：ＮＯＶ４（ＡＣ０２０５９７＿ＦＧ）核酸をクローニングする方法）
ＮＯＶ４（ＡＣ０２０５９７＿ＦＧ）の配列を、インシリコ（ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ）での配列の予測によって、ｃＤＮＡフラグメントの実験室でのクローニングによって誘導した。全長ＤＮＡ配列、またはその配列の一部、またはその両方のいずれかを網羅するｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコ予測は、ＣｕｒａＧｅｎが権利を有する配列データベースまたは公的なヒト配列のデータベースにおいて利用可能であり、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくらかの部分のいずれかが提供される配列に基づく。
【０３５０】
研究室クローニングを、以下に要約される方法の１つ以上を使用して実行した：
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、種々のヒトサンプルより誘導する。このサンプルは、複数の組織型、正常および疾患状態、生理的状態、および異なるドナー由来の発生学的状態を表す。サンプルを、組織全体、初代細胞または組織培養初代細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学薬剤（例えば、増殖因子、ケモカイン、またはステロイド）で処理し得た。次いで、誘導されたｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎが権利を有するＳｅａＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して配列決定した。配列の追跡（ｔｒａｃｅ）を、手動で評価し、そして適切な場合、訂正のために編集した。すべてのサンプルからのｃＤＮＡ配列を一緒に集めて、ときどき公的なヒト配列を含め、バイオインフォマティックプログラムを使用して各アセンブリについてコンセンサス配列を作製する。各アセンブリをＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含める。配列を、アセンブリについての成分として含め、このとき、別の成分との同一性の程度は、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった。各アセンブリは遺伝子またはその部分を表し、そして改変体（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列改変体を形成するスプライシング）の情報を含む。
【０３５１】
エキソン連結：ＡＣ０２０５９７＿ＦＧ配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした：
５’ＡＡＴＣＡＴＧＴＣＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＧ３’（配列番号８７）および
５’ＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＴＴＧＣ３’（配列番号８８）
プライマーを、推定ｃＤＮＡの５’末端および３’末端で設計し、以下の組織に由来する発現したヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。
【０３５２】
複数のクローンを配列決定し、そしてこれらのフラグメントを一緒に集め、ときどき公的なヒト配列を含め、バイオインフォマティックプログラムを使用して各アセンブリについてコンセンサス配列を作製する。各アセンブリをＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含める。配列を、アセンブリについての成分として含め、このとき、別の成分との同一性の程度は、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった。各アセンブリは遺伝子またはその部分を表し、そして改変体（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列改変体を形成するスプライシング）の情報を含む。
【０３５３】
物理的クローン：オープンリーディングフレーム全体を網羅するエキソン連結によって誘導したＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ２．１ベクターにクローニングして、クローンＡＣ０２０５９７＿ＦＧ．６９９００３．Ｊ５　ＦＬＣ　ＥＬを提供した。
【０３５４】
（実施例３：新規ＳＮＰの同定および確認の方法）
（Ｓｅｑ　ＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術）：ｃＤＮＡは、異なるドナー由来の多様な組織型、正常状態および疾患状態、生理学的状態、および発生状態を表す種々のヒトサンプルに由来した。サンプルを組織全体、細胞株（初代細胞また組織の培養された初代細胞および細胞株）として得た。細胞および細胞株は、生物学的因子または化学的因子（例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイド）遺伝子発現の調節するを用いて処置され得る。次いで、このように誘導されるｃＤＮＡは、ＣｕｒａＧｅｎ所有のＳｅｑ　ＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術を利用して配列決定された。配列トレースを手動で評価し、必要に応じて収集したものについて編集した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列をバイオインフォマティックスプログラムを用いてこれら自身および公開されるＥＳＴについて集めて、Ｓｅｑ　ＣａｌｌｉｎｇＴＭアセンブリのＣｕｒａＧｅｎヒトＳｅｑ　ＣａｌｌｉｎｇＴＭデータベースを生成した。各アセンブリは、１つ以上の重複するｃＤＮＡ配列を含み、これらは、１つ以上のヒトサンプルに由来する。アセンブリの別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であった場合、フラグメントおよびＥＳＴは、アセンブリの成分として含まれた。各アセンブリは、遺伝子および／またはその改変体（例えば、スプライシングされた形態ならびに／または一塩基多型（ＳＮＰ）およびこれらの組み合せ）を示し得る。
【０３５５】
改変体の配列は、本出願に含まれる。改変体の配列は、ＳＮＰを含み得る。いくつかの場合において、ＳＮＰは、「ｃＳＮＰ」として規定され得、これは、ＳＮＰを含む核酸配列がｃＤＮＡとして生じることを示す。ＳＮＰは、いくつかの経路で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位において、１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換に起因し得る。このような置換は，転移または転換のいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子に関してヌクレオチドの欠損または挿入により生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子においての特定のヌクレオチドについてギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置の遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。ＳＮＰを含むコドンが、遺伝コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントであり得る。遺伝子領域の外側に生じるＳＮＰ、または遺伝子内のイントロン中に生じるＳＮＰは、タンパク質の任意のアミノ酸配列における変化を生じないが、発現パターン（例えば、一過性の発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現の調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性）の変化の調節の変化を生じ得る。
【０３５６】
（新規ＳＮＰ同定の方法）：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎ所有のＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズム利用して配列アセンブリを分析することによって同定される。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準で、アセンブリにおける改変を同定する：ＳＮＰは、アライメントの両端上の１０塩基対以内においては分析されない；ウィンドウサイズ（表示においての塩基数）は、１０である；ウィンドウ中の許容されるミスマッチの数は、２である；最小のＳＮＰ塩基の質（ｂａｓｅ　ｑｕａｌｉｔｙ）（ＰＨＲＥＤスコア）は、２３である；ＳＮＰを記録する最少の変化の数は、２／アセンブリ位置である。ＳＮＰＴｏｏｌは、アセンブリを分析し、そしてＳＮＰの位置を示し、アセンブリ中の個々の変異配列、この所定の位置でのアセンブリの深度、アセンブリ対立遺伝子の推定頻度およびＳＮＰ配列の変化に関する。次いで配列トレースを選択し、手動のバリデーションのための表示に導く。このコンセンサスアセンブリ配列は、変異配列変化と共にＣｕｒａＴｏｏｌに取りこまれて、ＳＮＰ配列変異から生じる潜在的なアミノ酸配列を同定する。次いで、包括的なＳＮＰデータ分析をＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースに出力する。
【０３５７】
（新規ＳＮＰ確認の方法）：ＳＮＰをＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇとして公知の検査方法を用いて確認する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇについてのプロトコールの詳細は、以下に見出し得る：Ａｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｂｙ　Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　Ｐｙｒｏｐｈｏｓｈａｔｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（２０００）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｃｈ　１０、第８巻、８月号　１２４９〜１２６５。
【０３５８】
簡潔には、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型決定のリアルタイムプライマー伸長工程である。このプロトコールは、ゲノムＤＮＡサンプル由来の二重鎖、ビオチン化ＰＣＲ産物を用い、これらをストレプトアビジンビーズに結合する。次いで、これらのビーズを変性して、単鎖結合ＤＮＡを生じる。関節的なピロリン酸（ＰＰｉ）（これは、ＤＮＡ鎖伸展時で各ｄＮＴＰから放出される）生物発光アッセイに基づく技術を利用してＳＮＰを特徴付ける。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ媒介の塩基取り込みの後に、ＰＰｉは、放出されて、アデノシン５′−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）と共にＡＴＰスルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）に対する基質として用いられて、これは、ＡＴＰの形成を生じる。引き続いて、ＡＴＰは、ルシフェラーゼ作用によるルシフェリンの酸化誘導体への変換を達成する。続く光の出力は、約４塩基までの添加された塩基の数に比例する。この方法の進行を可能にするため、過剰ｄＮＴＰをアピラーゼで分解し、アピラーゼはまた、はじめの反応混合物中にも存在して、その結果、配列決定の間にｄＮＴＰのみがテンプレートに加わる。この工程は、十分に自動化され、９６ウェル形態に適用され、大規模のＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングを可能にする。
【０３５９】
（実施例４．種々の細胞および組織におけるＮＯＶ１〜ＮＯＶ１２の定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常および病理由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含むマイクロタイタープレートを使用して、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ　ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を使用して、評価した。ＲＴＱ　ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍにおいて実行した。サンプルの種々のコレクションをパネル上で組み立て、そしてパネル１（正常な供給源および癌の供給源由来の、細胞および細胞株を含む）、パネル２（正常な供給源および癌の供給源からの組織由来（特に、外科サンプル由来）のサンプルを含む）、パネル３（広範な種々の癌の供給源由来のサンプルを含む）、およびパネル４（正常な細胞および炎症状態に関連する細胞由来の、細胞および細胞株を含む）と称する。
【０３６０】
第１に、ＲＮＡサンプルを、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨのような構成的に発現した遺伝子に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたは約１ｎｇポリＡ＋）を、製造業者のプロトコールに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）およびランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれカタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、別個のプレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、対数スケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルが、蛍光の閾値レベル超えるサイクル）として記録し、所与のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、相対発現パーセントを、このＲＮＡの差の逆数をとって１００を掛けることにより得る。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られたＣＴの平均値は、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従ってこのサンプルと比較して希釈した。
【０３６１】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに変換し、製造業者の指示に従って、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ用のヴァージョンＩ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイに対して設計した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴｍは、プライマーＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズ７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、未反応の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認するために、マススペクトルによって評価した。正方向プライマーおよび逆方向プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの最終濃度は、２００ｎＭであった。
【０３６２】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローンに特異的なプローブおよび標的プローブで多重化された別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００の１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比））、０．２５Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素を含む）を用いて設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで以下の増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。
【０３６３】
パネル１の結果において、以下の省略形が使用される：
ｃａ．＝癌腫、
＊＝転移から確立された、
ｍｅｔ＝転移、
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞改変体、
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ　＝非小、
ｓｑｕａｍ＝扁平（ｓｑｕａｍｏｕｓ）、
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水、
ｇｌｉｏ＝神経膠腫、
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽腫。
【０３６４】
（パネル２）
パネル２に対するプレートは、一般に、２つのコントロールウェルおよび９４の試験サンプルを含み、この試験サンプルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との守秘の共同作業において働いている外科医によって獲得された、ヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡからなる。これらの組織は、ヒト悪性疾患由来であり、そして多くの悪性疾患組織が示される場合には、腫瘍にすぐ隣接した非癌性組織から得られる「整合した縁（ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらは限定された正常な隣接組織であり、以下の結果において「ＮＡＴ」と記されている。腫瘍組織および「整合した縁」を、２人の独立した病理学者が評価する（外科病理学者および再度ＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者による）。この分析は、腫瘍分化の悪性度分類の、全体の組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分のサンプルが、その患者の臨床状態に関する情報を提供するもとの外科病理学報告を含む。これらの整合した縁を、手術のゾーンを囲む（すなわち、すぐ近位の）組織（表ＲＲにおいて「ＮＡＴ」と記され、正常な隣接組織を表す）から採取する。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡのサンプルを、高齢者または突然死の被災者（事故など）において実施した剖検由来の種々のヒト組織から得た。これらの組織を、疾患がないことを確認し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の市販の供給源から購入した。
【０３６５】
全てのサンプルからのＲＮＡ完全性を、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ染色強度比を指針として使用する（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）アガロースゲル電気泳動の目視評価、および分解生成物を示す低分子量のＲＮＡの非存在によって、品質管理する。逆転写酵素の非存在下で、単一のエキソンのスパンにわたって増幅するよう設計されたプローブおよびプライマーのセットを使用して実施されるＲＴＱ　ＰＣＲ反応によって、サンプルをゲノムＤＮＡ夾雑に対して管理する。
【０３６６】
（パネル４）
パネル４は、９６ウェルプレート上のサンプル（２つのコントロールウェル、９４の試験サンプル）を含み、これらのサンプルは、種々のヒト細胞株または炎症状態に関連する組織から単離された、ＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）からなる。コントロールの正常組織（例えば、結腸および肺）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）由来、ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の全ＲＮＡを使用した。肝硬変症患者からの肝臓組織、および狼瘡患者からの腎臓由来の全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を罹患すると診断された患者からのＲＮＡ調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０３６７】
神経膠星状細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞を全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによって供給されるこれらの細胞型のための培地中で増殖させた。これらの初代の細胞型を、示されるように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて、６時間および／または１２〜１４時間活性化させた。以下のサイトカインを使用した；約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓからの基本培地（０．１％の血清を含む）中での培養によって、種々の時間にわたって時々飢餓させた。
【０３６８】
単核細胞を、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から、Ｆｉｃｏｌｌを用いて調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにインターロイキン２中での４〜６日間の培養によって、これらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγおよび５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合において、単核細胞を、４〜５日間、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（植物性赤血球凝集素）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウマイトジェン）を含むＤＭＥＭ　５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。サンプルを、ＲＮＡ調製のために、２４時間、４８時間および７２時間において採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応物）サンプルを、２人のドナーから採取し、Ｆｉｃｏｌｌを使用して単核細胞を単離し、そしてこの単離した単核細胞を、１：１で、約２×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で混合することによって得た。このＭＬＲを培養し、そしてサンプルを、ＲＮＡ調製のために、１〜７日の範囲の種々の時点で採取した。
【０３６９】
単球を、ＣＤ１４　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ　ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを使用して、製造業者の指示に従って、単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ　５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−４中で５〜７日間培養することによって、樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＡＢ　Ｈｕｍａｎ　ＳｅｒｕｍまたはＭＣＳＦ中約５０ｎｇ／ｍｌで、単球を５〜７日間培養することによって、調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）を用いて６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌで抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０３７０】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞もまた、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６　Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ、陽性ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを使用して、製造業者の指示に従って、単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９細胞の単核細胞を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９　Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズおよび＋ｖｅ選択を用いて枯渇することによって、単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用して、ＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４リンパ球を単離し、残りの細胞はＣＤ４５ＲＡ　ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ　ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ　ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）に入れ、そして１０６細胞／ｍｌで、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ　６ウェル組織培養プレート上にプレートした。６時間後および２４時間後、これらの細胞を、ＲＮＡ調製のために採取した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、この単離したＣＤ８リンパ球を、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコーティングされたプレート上で４日間活性化させ、次いで、これらの細胞を採取し、そしてＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで、増殖させたＣＤ８細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間再度活性化させ、そして前記のように増殖させた。ＲＮＡを、２回目の活性化の６時間後および２４時間後、ならびに２回目の増殖培養の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で４〜６日間培養し、その後、ＲＮＡを調製した。
【０３７１】
Ｂ細胞を得るために、扁桃を、ＮＤＲＩから入手した。この扁桃を滅菌解剖鋏で切断し、次いでふるいに通した。次いで、扁桃細胞を遠心分離により沈殿させ、そしてＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。これらの細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌのＰＷＭまたは約１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を使用した。細胞を、ＲＮＡ調製のために、２４時間、４８時間および７２時間において採取した。
【０３７２】
一次および二次のＴｈ１／Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌ　ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ　Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ４（１μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｔｈ１に指向し、一方でＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を使用して、Ｔｈ２に指向し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を使用して、Ｔｒ１に指向した。４〜５日後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球をＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。これに続いて、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球を、アポトーシスを防止するために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）を添加したことを除いて上記のように、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインを用いて５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再度、ＩＬ−２とともに４〜７日間増殖させた。活性化したＴｈ１およびＴｈ２リンパ球を、最大３サイクルこの様式で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８　ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化に続いて６時間後および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での２回目および３回目の増殖培養まで４日間、一次および二次Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０３７３】
以下の白血球細胞株を、ＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞をさらに、０．１ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ中５×１０５細胞／ｍｌで８日間培養することによって分化した（３日ごとに培地を交換し、そして細胞濃度を５×ｌ０５細胞／ｍｌに調整した）。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（ＡＴＣＣにより推奨されるように）を、５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して、使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２もまた、ＡＴＣＣから入手した。これらの両方を、ＤＭＥＭ　５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方でＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインで６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１３および２５ｎｇ／ｍｌ　ＩＦＮγ。
【０３７４】
これらの細胞株および血球に対して、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を使用して約１０７細胞／ｍｌを溶解することによって、調製した。簡単に言えば、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後に、これらのチューブをＳｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４ローターで１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。水相を除去し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ　Ｔｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿したＲＮＡを、Ｓｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４ローターでの９，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により沈殿させ、そして７０％エタノール中で洗浄した。このペレットを、ＲＮＡｓｅを含まない３００μｌの水および３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ　ＤＴＴに再溶解し、７μｌのＲＮＡｓｉｎおよび８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。このチューブを３７℃で３０分間インキュベートして、夾雑ゲノムＤＮＡを除去し、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の１００％エタノールで再沈殿させた。このＲＮＡを遠心分離により沈殿させ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水に入れた。ＲＮＡを、−８０℃で保存した。
【０３７５】
（Ａ．　ＮＯＶ１（ＡＣ０２０５９７＿Ｅ））
遺伝子ＡＣ０２０５９７＿Ｅの発現を、表１４Ａに記載のプライマー−プローブセットＡｇ６０７を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１４Ｂおよび１４Ｃに示す。
【０３７６】
【表１４Ａ】
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【０３７７】
【表１４Ｂ】
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2004513610.tif 000063
2004513610.tif 000064
【０３７８】
【表１４Ｃ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。これをさらに、各パネルのゲノムコントロールウェルにおける発現によって確認する。パネル２において得られたデータは、ＲＴ酵素の非存在下、従っていずれのｃＤＮＡ産生もない条件で、ゲノムＤＮＡを増幅し得るプローブ／プライマーセットを作動することで明らかとなるように、パネル２に存在するゲノム汚染によって汚染される。結論は、分析されたパネル１．２および２において配列が検出できないほどかなり低い発現を有するということである。
【０３７９】
（Ｂ．ＮＯＶ２（ＡＣ０２０５９７＿Ｆ））
遺伝子ＡＣ０２０５９７＿Ｆの発現を、表１５Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ６０８を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１５Ｂに示す。
【０３８０】
【表１５Ａ】
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表１５Ｂ．パネル１および４を用いたプライマー−プローブセットＡｇ６０８のＲＴＱ−ＰＣＲ
【０３８１】
【表１５Ｂ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。パネル１．１におけるこの遺伝子の発現は、検出できないほど低い。肺癌の１つのサンプルにおける発現は、高いＣｔ値に起因して信頼できない。パネル１４の大腸炎サンプルにおけるこの遺伝子の発現は、ゲノム汚染に基因する。
【０３８２】
（Ｃ．ＮＯＶ３（ＡＣ０２０５９７＿Ｇ））
遺伝子ＡＣ０２０５９７＿Ｇの発現を、表１６Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ６０９を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１６Ｂに示す。
【０３８３】
【表１６Ａ】
2004513610.tif 000072
【０３８４】
【表１６Ｂ】
2004513610.tif 000073
ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。
【０３８５】
（Ｄ．ＮＯＶ７（ＡＣ０２６０３８＿Ｂ、ＣＧ５０３４１−０２）
遺伝子ＡＣ０２６０３８＿Ｂの発現を、表１７Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１２０１を用いて評価した。パネル１についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１７Ｂに示し、パネル２および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１７Ｃに示す。
【０３８６】
遺伝子ＣＧ５０３４１−０２の発現を、表１７Ｄに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１１７５を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１７Ｅに示す。
【０３８７】
【表１７Ａ】
2004513610.tif 000074
【０３８８】
【表１７Ｂ】
2004513610.tif 000075
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【０３８９】
【表１７Ｃ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。これをさらに、各パネルのゲノムコントロールウェルにおける発現によって確認する。
【０３９０】
【表１７Ｄ】
2004513610.tif 000081
【０３９１】
【表１７Ｅ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。これをさらに、各パネルのゲノムコントロールウェルにおける発現によって確認する。パネル１．２における発現は、脂肪における高い発現からも明らかなように、ゲノム汚染によって汚染される。精巣および癌細胞株における発現は、検出できないほど低い（高いＣｔ値において生じる）。
【０３９２】
（Ｅ．ＮＯＶ８（ＧＭ＿８７７４０２６２＿Ａ）
遺伝子ＧＭ＿８７７４０２６２＿Ａの発現を、表１８Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１１７６を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１８Ｂに示す。
【０３９３】
【表１８Ａ】
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表１８Ｂ．パネル１および４においてプライマー−プローブセットＡｇ１１７６を使用したＧＭ＿８７７４０２６２＿ＡのＲＴＱ−ＰＣＲ発現分析
【０３９４】
【表１８Ｂ】
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（Ｆ．ＮＯＶ１０（ＧＭ＿３３２０２５９７＿Ａ））
遺伝子ＧＭ＿３３２０２５９７＿Ａの発現を、表１９Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１１７３を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表１９Ｂに示す。
【０３９５】
【表１９Ａ】
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【０３９６】
【表１９Ｂ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。これをさらに、各パネルのゲノムコントロールウェルにおける発現によって確認する。パネル１．２の脂肪における発現は、ゲノムＤＮＡコントロールと比較することによって示されるように、ゲノム汚染によって汚染される。パネル４ＤにおけるＡｇ１１７３の組織特異的発現は、一貫性がなく、従って炎症および免疫疾患のための分析の使用に対して影響を受けやすい。
【０３９７】
（Ｇ．ＮＯＶ１２（ｎｈ３４１ｂ０７＿Ａ）
遺伝子ｎｈ３４１ｂ０７＿Ａの発現を、表２０Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１１７７を用いて評価した。パネル１および４についてのＲＴＱ−ＰＣＲランの結果を、表２０Ｂに示す。
【０３９８】
【表２０Ａ】
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【０３９９】
【表２０Ｂ】
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ＧＰＣＲが単一エキソン遺伝子のため、ＧＰＣＲに対して生じるＲＴＱ−ＰＣＲプローブ／プライマーセットは、対応するゲノム領域を増幅する。これをさらに、各パネルのゲノムコントロールウェルにおける発現によって確認する。パネル４Ｄにおける遺伝子ｎｈ３４１ｂ０７＿Ａの発現レベルは、低くかつ非特異的である。
【０４００】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は例示であって、本発明の範囲を限定することを意図するのではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により規定される。他の局面、利点および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内にある。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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