(57)【要約】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素に特異的に結合する、ピンクワタノミムシ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａからの２００ｋＤ受容体，ＢＴ−Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、クローン化、配列決定、および特性解明した。その最小毒素結合断片を同定した。当該ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡは、作物の成長および発生に影響するピンクワタノミムシおよび他の昆虫類中の受容体の分析、ならびに、可能性のある殺虫剤の細胞毒性および結合親和性のデサインアッセイを可能にする。本明細書に記載のクローンおよび他の方法は、天然および／または導入相同性受容体の操作、従って、標的宿主の生物、組織および／または細胞を特異的に破壊することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピンクワタノミムシ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ　ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａからの約２００ｋＤのＢＴ毒素受容体をコードする配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２のＢＴ毒素受容体配列をコードする、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１の配列を含んでなる、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記単離された核酸分子が、配列番号１の４００連続ヌクレオチドのプローブに該プローブの全長に亘り高度のストリージェンシーでハイブダイズできる、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記ＢＴ毒素受容体が、配列番号２の配列に少なくとも８５％相同である、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ＢＴ毒素受容体が、配列番号２の配列に少なくとも９０％相同である、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記ＢＴ毒素受容体が、配列番号２の配列に少なくとも９５％相同である、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記ＢＴ毒素受容体が、配列番号２の配列に少なくとも９８％相同である、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記配列が、原核生物系内での発現に最適化されたコドンである、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記配列が、真核生物系内での発現に最適化されたコドンである、請求項１の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項１から１０の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１３】
毒素類の細胞毒性のレベルおよび毒素類の作用の様式を査定するのに使用される、請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】
毒素類の細胞毒性のレベルおよび毒素類の作用の様式を査定するのに使用される、天然のＢＴ毒素受容体を含んでなる細胞。
【請求項１５】
請求項１１のベクターを含んでなるトランスジェニック生物。
【請求項１６】
配列番号２のアミノ酸（ａａ）５３４−５４４，ａａ２９１−３０４，ａａ６９７−７０５，ａａ６２２−６３２，ａａ８８６−８９５，ａａ７９１−８０３，ａａ１０５５−１０６６，ａａ１６２１−１６４２，ａａ１３２１−１３３１，ａａ１４５１−１４６１，ａａ１５１６−１５２５，ａａ１５７２−１５８２，ａａ１６７７−１７２９，およびａａ１２６９−１３６７から成る群より選択されるペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１７】
配列番号２に少なくとも８５％相同な配列を含んでなる、精製されたタンパク質。
【請求項１８】
前記配列が配列番号２に少なくとも９０％相同である、請求項１７の精製されたタンパク質。
【請求項１９】
前記配列が配列番号２に少なくとも９５％相同である、請求項１７の精製されたタンパク質。
【請求項２０】
前記配列が配列番号２に少なくとも９８％相同である、請求項１７の精製されたタンパク質。
【請求項２１】
前記配列が配列番号２である、請求項１７の精製されたタンパク質。
【請求項２２】
配列番号２のアミノ酸（ａａ）５３４−５４４；ａａ２９１−３０４；ａａ６９７−７０５；ａａ６２２−６３２；ａａ８８６−８９５；ａａ７９１−８０３；ａａ１０５５−１０６６；ａａ１６２１−１６４２；ａａ１３２１−１３３１；ａａ１４５１−１４６１；ａａ１５１６−１５２５；ａａ１５７２−１５８２；ａａ１６７７−１７２９；およびａａ１２６９−１３６７から成る群より選択される配列を含んでなる、精製されたペプチド。
【請求項２３】
配列番号２のａａ１２６９−１３６７を含む、請求項２２の精製されたペプチド。
【請求項２４】
配列番号２のａａ１６７７−１７２７からの少なくとも１７連続アミノ酸（ａａ）を含む、精製されたペプチド。
【請求項２５】
配列番号１のヌクレオチド３８０７−４１０１である第２配列のプローブに、前記プローブの全長に沿って高度のストリージェンシーでハイブリダイズできる第１配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２６】
請求項１９〜２１のペプチドをコードする配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項２７】
配列番号２で同定されるＢＴ−Ｒ２タンパク質のカルボキシル尾部内に存在する抗原に結合し、カイコまたはタバコスズメガＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｃｒｙ毒素受容体に結合しない、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｃｒｙ毒素受容体抗体。
【請求項２８】
配列番号２で同定されるＢＴ−Ｒ２タンパク質内に存在する抗原に結合し、カイコおよびタバコスズメガＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｃｒｙ毒素受容体にも結合する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｃｒｙ毒素受容体抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本特許出願は、１９９９年１０月２６日出願の先願同時係属米国暫定特許出願シリアル番号第６０／１６１５６４号からの優先権の恩典を請求し、その全開示を引用により本明細書に援用する。
発明の技術分野
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（ＢＴ）毒素に対する受容体に、従って該受容体に結合できる殺虫剤に、そして殺虫剤抵抗性の軽減に、関する。特に、当該発明は、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ　ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ，ピンクワタノミムシ、からの新規受容体および受容体エレメントについての組換えＤＮＡおよび発現系に関する。
【０００２】
発明の背景
当該発明の範囲を限定せずに、例として、綿害虫殺虫剤としてのＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素の使用に関連して、その背景を説明する。綿花の害虫類は、１９９８年全米でほぼ１０％も収穫を減らした。昆虫損害は、１７０万ベイル（綿の梱）以上も綿の全生産高を減少させ、約１２億２４００万ドルの経済損失をもたらした。特にワタノミムシ／メムシの組合せの一群は最も被害が大きく、２．７％の損失を与えた。ピンクワタノミムシＰｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ　ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ　Ｓａｕｎｄｅｒｓ（“ＰＢＷ”）は、綿花に甚大な被害を及ぼす鱗翅類の昆虫で、世界中で最も破壊的な綿花の害虫である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、殺虫性毒素類を含むパラ胞子結晶を形成するグラム陽性胞子形成細菌である（Ｂｕｌｌａら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８０）８：１４７−２０４；ＨｏｆｔｅおよびＷｈｉｔｅｌｅｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８９）５３：２４２）。毒素の作用は、感受性がある昆虫の中腸微柔毛の先端刷子縁（ＢＢＭＶ）上の特定の受容体への結合を介して媒介される。
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ処方物およびトランスジェニック植物を用いる綿害虫の生物的制御は、長年利用されており、急速に普及している。最近、ＢＴの毒素遺伝子をもつトランスジェニック綿植物が開発され、市販されている。そうしたトランスジェニック植物は、ピンクワタノミムシに対して高度の抵抗性を備えている（Ｓｃｈｎｅｐｆら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）６２：７７５）。しかし、害虫管理プログラムに何か新しい殺虫剤が導入されると、当該殺虫剤に抵抗性のある個体に向けての淘汰プロセスが間もなく開始する。ＢＴ毒素を発現するトランスジェニック作物の使用が増えるにつれて、昆虫抵抗性はさらに広がると予想される。数種の昆虫におけるＢＴ毒素に対する耐性の増加が複数の研究者により報告されており、一方、研究室の淘汰実験で、ＢＴ毒素処方物やトランスジェニック植物の使用が、ピンクワタノミムシに抵抗性の発生をもたらす可能性が明らかにされている（Ｂａｒｔｌｅｔｔら，Ｂｅｌｔｗｉｄｅ　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（１９９５）２：７６６）。
ＢＴ毒素処方物または当該毒素遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、抵抗性のまたは耐性の昆虫株の出現を促す恐れがあるという関心が、ＢＴ毒素タンパク質とそれらのそれぞれの昆虫受容体との間の相互作用についての理解を深めるための探究を、経済的に相当重要な問題にすることになった。
【０００３】
米国特許第５６９３４９１号で、本発明者らは、タバコスズメガ、Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ（Ｍ．Ｓｅｘｔａ）の幼虫からＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素受容体ＢＴ−Ｒ１の精製およびｃＤＮＡクローニングを開示した。最近、二つのＢＴ毒素受容体が、カイコ，Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから同定、精製およびクローン化されている（Ｎａｇａｍａｔｓｕら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６２：７２７）。
これまでのところ、この分野では、主要な綿害虫、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａのＢＴ毒素受容体の構造と機能に関する構造情報は得られていない。さらに、当該発明者らが知る限り、ＢＴ受容体上のＢＴ毒素についてのコンセンサス結合ドメインをコードする最小結合断片は、まだ同定されていない。該最小結合断片の単離は、Ｐ．ｇｏｐｓｓｙｐｉｅｌｌａのように世界中で経済的に重要な他の昆虫類から、重要でありながらまた特性解明されていないＢＴ毒素受容体のクローニングおよび構造特性把握を可能にするであろう。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、本明細書でＣｒｙ毒素受容体と記す、新規ＢＴ結晶毒素受容体の単離および発現についての情報および材料を提供する。大体において、当該発明は、本明細書ではＢＴ−Ｒ２と記す、新規鱗翅類ＢＴ毒素受容体の構造および機能の特性把握を提供する。
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素に特異的に結合するピンクワタノミムシからの代替糖タンパク質受容体をコードするｃＤＮＡをクローン化し、配列決定し、特性を解明した。当該ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡは、ピンクワタノミムシおよび作物の成長や発生に影響する他の昆虫や生物における受容体の分析を、ならびに、細胞毒性および可能性のある殺虫剤の結合親和性についての検定のデザインを、可能にする。本明細書に記載のクローンおよび他の方法は、天然の、および／または、導入相同の受容体の操作、従って、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒素に抵抗性のある昆虫を含む、標的宿主の生物、組織および／または細胞を特異的に破壊することを可能にする。
当該発明は、ピンクワタノミムシ、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａのＣｒｙ１Ａ毒素に対する２００ｋＤ受容体をコードする、精製およびクローン化ｃＤＮＡを、さらに提供する。本発明の長所は、ＢＴ毒素受容体上の毒素結合ドメインをコードする最小結合断片の同定である。本発明のもう一つの長所は、現在未詳のＢＴ受容体のクローニングおよび構造特性解明についての方法論の提供である。さらに、本発明は、毒素抵抗性の出現と戦う際に使用するための、有効な毒素結合受容体の同定およびデザインのための方法および材料を提供する。また、本発明は、毒素受容体を発現するトランスジェニック生物を作製するのに使用してもよい。
【０００５】
現在好ましい典型的実施態様の詳細な説明
本発明は、当該発明の好ましい実施態様が示されている、添付図面を以下に参照しながら、ここでさらに十分に説明される。しかし、本発明は、多くの異なる形で具体化が可能で、本明細書に示された実施態様に限定されると解釈するべきでなく；むしろ、本開示が完全無欠になるように、そして当該発明の範囲を当業者に十分伝えるように、これらの実施態様は提供されるものである。
略語および定義
本明細書を通じ下記の略語を使用する：ｂｐ−塩基対；ＢＴ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓまたはＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；ＢＴ−ＲＸ−Ｘ型のＢＴ毒素受容体；ＢＢＭＶ−膜小胞の刷子縁；ｃＤＮＡ−相補的ＤＮＡ；Ｃｒｙ毒素−ＢＴのパラ胞子結晶毒素；ＩＥＦ−免疫電気泳動；ｋｂ−キロベースまたはキロ塩基対；ｋＤ−キロダルトン；Ｋｄ−解離定数；ＬＣ５０−５０％死亡率をもたらす致死濃度；ＰＢＷ−ピンクワタノミムシ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａまたはＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ；ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ端の急速増幅；ＲＴ−逆転写酵素；ＳＷ−カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉまたはＢ．ｍｏｒｉ）；ＴＨＷ−タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａまたはＭ．ｓｅｘｔａ）；およびＵＴＲ−非翻訳領域。
【０００６】
用語“Ｘ％相同”は、Ｔ．Ａ．ＴａｔｕｓｏｖａおよびＴ．Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ  ＬＥＴＴ．１７４：２４７−２５０に記載されているブラスト（ＢＬＡＳＴ）相同性整列により、および下記のパラメーターを用いて、決定される、二つの核酸またはタンパク質の配列がどの程度同一かを、指す：プログラム（ｂｌａｓｔｎ）または（ｂｌａｓｔｐ）が適正；マトリックス（ＯＢＬＯＳＵＭ６２）；マッチに対するリオード（１）；ミスマッチに対するペナルティー（−２）；オープンギャップ（５）およびエクステンションギャップ（２）ペナルティー；ギャップＸ−ドロップオフ（５０）；エクスペクト（１０）；ワードサイズ（１１）；フィルター（オフ）。これらのパラメーターを用いる二配列整列プログラムに基づくウェブの例は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌで見られる。
それ故、当該発明は、本発明の配列に高度に似ている核酸およびタンパク質配列を含み、また本明細書に記載の配列に８０、８５、９０、９５および９８％類似性の配列を含む。
【０００７】
当該発明はまた、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから単離または合成的に調製できる核酸配列、および本明細書の下記に記載されている核酸配列に由来する４００ヌクレオチドプローブの全長に高度のストリンジェンシーの下にハイブリダイズする核酸配列を含む。高度のストリンジェンシーとは、６０℃の温度で０．２Ｘ  ＳＳＣの最終洗浄を含むと定義される。計算では：
Ｅｆｆ  Ｔｍ  ＝  ８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ホルムアミド）
これらの条件で、５０％ＧＣをもつ遺伝子の許容ミスマッチ比率は、約１２％と推定される。
本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列を、便宜を計って以下に表示する。
【０００８】
【表１】
2004500055.tif 000002
【０００９】
【表２】
2004500055.tif 000003
【００１０】
さらに特に、本明細書に記載の研究は、新規Ｃｒｙ毒素受容体の同定、クローニング、および特性把握を標的とした。一つの実施態様は、以下“ＰＢＷ”と記す、ピンクワタノミムシ、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａの従来未同定のＣｒｙ毒素受容体の特性把握および単離を指向した。
ＰＢＷのＣｒｙ毒素受容体を同定および単離するために、五つの異なるＣｒｙタンパク質（Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１Ａｂ，Ｃｒｙ１Ａｃ，Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１１Ａ）について、新生児ＰＢＷ幼虫に対する毒性を測定した。鱗翅類特異的毒素（Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃ）は、ＰＢＷ幼虫に高い毒性を示し、ＬＣ５０は２５−４５ｎｇ／ｃｍ３昆虫餌料の範囲であったが、一方、甲虫類特異的（Ｃｒｙ３Ａ）または双翅類特異的（Ｃｒｙ１１Ａ）毒素は、２０００ｎｇ／ｃｍ３まで何らの検出可能な毒性を示さないことが、明らかにされた（図３）。
【００１１】
三つの鱗翅類特異的Ｃｒｙ１Ａ毒素（Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃ）の、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａのＢＢＭＶへの結合を詳細に解明した。リガンドブロット実験は、１２０ｋＤのタンパク質類がＣｒｙ１Ａｃ毒素にのみ結合するのに対し、２００ｋＤタンパク質がＣｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃ毒素に結合することを、示した。１２０ｋＤタンパク質は熱ショックタンパク質であることが今ではわかっているが、Ｃｒｙ毒素作用へのその関係は不明である。
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉからの１７５ｋＤカドヘリン様Ｃｒｙ１Ａａ結合タンパク質の場合、１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ａａ結合は、非標識Ｃｒｙ１Ａａの存在により排除されたが、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａａリガンドブロットにより確認された約１１０ｋＤの別のバンドは、検出できる程度の競合を証明することはできなかった。したがって、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａは、Ｍ．ｓｅｘｔａおよびＢ．ｍｏｒｉのように、少なくとも一つのＣｒｙ１Ａ毒素に対して高親和性および低親和性の両結合タンパク質を含み、ＰＢＷからの前記２００ｋＤａタンパク質は、鱗翅類特異的Ｃｒｙ１Ａ毒素に対する共通の結合タンパク質であることが、明らかになった。
【００１２】
ピンクワタノミムシの中腸ＢＢＭＶとのＣｒｙ１Ａ毒素相互作用の詳細な機構を明らかにした。それぞれＣｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃに対して、相同競合検定から計算した平衡解離定数（Ｋｄ）（図３Ａおよび３Ｂ）は、１６．５，１２．４および１２．８ｎＭおよび結合部位の濃度は３．７，３．６および８．６ｐｍｏｌ／ｍｇである。三つのＣｒｙ１Ａ毒素に対するヒル係数は、ＢＢＭＶ結合タンパク質について０．６と０．８の間であり（図３Ａ）、ＢＢＭＶ中の結合部位に対するそれらの毒素の結合には負の協同性があることを示している。Ｃｒｙ１Ａ毒素類のＢＢＭＶタンパク質への結合は、特異的で可飽和性である。４６０μｇのＢＢＭＶタンパク質の飽和に必要な毒素量は次の順序であった：Ｃｒｙ１Ａｃ＞Ｃｒｙ１Ａａ＞Ｃｒｙ１Ａｂ。
抗Ｃｒｙ１Ａｂ抗血清とのＢＢＭＶタンパク質類の免疫沈澱および１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂ毒素とのその後のリガンドブロッティングも、該毒素の約２００ｋＤタンパク質への結合を示した。その２００ｋＤタンパク質は、二次元（２Ｄ）ゲル分析により示されたように単一タンパク質である（データは示してない）。等電点（ｐＩ）４．３をもつＭ．ｓｅｘｔａからの２１０ｋＤ結合タンパク質とＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ｐＩ  ４．１）からの２００ｋＤ結合タンパク質との比較から、両タンパク質はほぼ同じ等電点をもつことが明らかになった。２００ｋＤ  ＰＢＷタンパク質は、Ｍ．ｓｅｘｔａ  ＢＴ−Ｒ１２１０ｋＤタンパク質に対するポリクローナル抗血清と多少の交差反応性をもつことがわかった。  ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２遺伝子をクローン化するため、二つの受容体，タバコスズメガ（“ＴＨＷ”）ＢＴ−Ｒ１およびカイコ（“ＳＷ“）ＢＴ−Ｒ１７５、のものの間の保存性アミノ酸配列に基づき、十分に縮重のプライマーをデザインした。該プライマー位置は、毒素結合に不可欠な細胞外ドメイン中の領域をコードすると、本発明者らにより考えられた配列を、含むか除くかするようにデザインされたが、本明細書では以下、該配列は”リード（ＲＥＡＤ）”サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列と記す。また以下、該ＤＮＡ配列のこの結合断片は、“サイン”領域と記すこととする。
【００１３】
三つのクローン、ＰＢＷ−４２１（ａａ１３６７−１４９６），ＰＢＷ−８６６（ａａ１２１０−１４９６）およびＰＢＷ−１３７３（ａａ１２１０−１６７５）が得られたが、それらは、ＴＨＷ  ＢＴ−Ｒ１およびＳＷ  ＢＴ−Ｒ１７５の両者に、約５０％ヌクレオチドおよび約６０％アミノ酸配列類似性をもつ。前記４２１塩基対および８６６塩基対クローンは、それぞれ約２１および３２ｋＤのタンパク質をコードする。発現された両タンパク質は、ＴＨＷ  ＢＴ−Ｒ１ポリクローナル抗血清と交差反応したが、２１ｋＤタンパク質ではなく、３２ｋＤタンパク質の方は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素と特異的に、高い親和性で結合することが示された。その推定Ｋｄ値は約１７ｎＭで、ＢＢＭＶについて得られたＫｄ値と同様である。同様に、ＰＢＷ−８６６クローンからの内部断片は、毒素に結合しなかったが、ＢＴ−Ｒ１抗体と交差反応をした。このデータは、抗ＢＴ−Ｒ１抗体による認識は、機能性毒素受容体を規定するには不十分なことを、証明している。  完全長受容体をコードするｃＤＮＡ配列を得るために、５´および３´ＲＡＣＥ反応を用いてＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２受容体の５´および３´端をまず得て、次いで５´および３´ＵＴＲからの遺伝子特異的プライマーを用いて完全長受容体ｃＤＮＡのクローニングを行った。その完全長ｃＤＮＡクローン（配列番号１）には、１７２９個アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号２）があり、１９４ｋＤの推定分子量および２−Ｄゲル分析により測定された値と同様な４．１の計算ｐＩ値をもつ。
【００１４】
当該タンパク質は三つのドメインから成る：すなわち、細胞外、膜貫通および細胞質ドメインである。該タンパク質配列は二つの疎水性領域を含み、一つはアミノ末端にあり、シグナルペプチドの特徴をもち、もう一つはＣＯＯＨ末端付近（アミノ酸１５７５−１６００）で、膜貫通ドメインを形成するらしい。細胞外ドメインは、１２のカドヘリン様モチーフに加えて、二つのロイシンジッパーモチーフを含む膜近位領域を、含む。Ｎ結合糖鎖形成のための１１のコンセンサス部位が細胞外領域に存在し、それが、天然タンパク質と計算された質量との見掛けの分子量の差を説明すると思われる。
上述の結果に基づき、受容体配列における、あるいは毒素結合親和性における、あるいは受容体発現における、変動が、異なるレベルの毒素感受性または抵抗性をもたらすことは、当業者には明らかであろう。さらに、本発明の受容体は、技術分野で周知の方法によりトランスジェニック生物の作出に使うことが可能である。
【００１５】
ＢＴ毒素の作用様式を調べるために、いくつかの理由から、哺乳動物異種細胞培養系を選んだ。第一に、ＢＴ  Ｃｒｙ１Ａ毒素類は、これまでに調べられた何れの哺乳類細胞系にも毒作用を示さない。この特徴は、ほとんどの入手可能な昆虫細胞系が、毒素に対してさまざまな程度の感受性性を示すのと、対照的である（Ｋｗａら，１９９８）。第二に、哺乳類細胞の使用により、当該受容体が、昆虫細胞系中の何らの会合タンパク質と無関係に、毒性を媒介するかどうかを決定できることになる。
哺乳類ＣＯＳ−７細胞へ導入されると、当該クローン化ｃＤＮＡは、ＢＴ−Ｒ１抗血清を用いるウェスタンブロット分析により検出されるＢＴ−Ｒ２を発現した。発現された受容体は、細胞表面にディスプレイされ、Ｍ．ｓｅｘｔａ  ＢＴ−Ｒ１に対して高めたポリクローナル抗体で検出された。これらの結果は、ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡにより発現されたタンパク質が、該昆虫中腸に見られる天然タンパク質と同様であることを、示唆している。
ＢＴ毒素類に対する受容体でトランスフェクトしたＣＯＳ−７哺乳類細胞を、Ｃｒｙ１Ａ毒素の細胞毒性を査定するモデル系として使用する可能性について、裁定した。該表面受容体は、Ｃｒｙ１Ａｂ抗体を用いる免疫蛍光標識法により検出されたＣｒｙ１Ａｂ毒素に、明らかに結合できた（データは示してない）。これらの結果は、当該受容体の結合部位がその未変性のコンホメーションをとっていることを示す。有意義にも、当該細胞をＢＴ−Ｒ１抗血清とインキュベートしたところ、メタノール固定されたトランスフェクトＣＯＳ−７細胞中に、強く標識された小胞が観察された（データは示してない）。この観察は、該細胞のエンドサイトーシス／エキソサイトーシス経路で通常形成する小胞がＢＴ−Ｒ２タンパク質を含むことを、示している。加えて、この結果は、該受容体が、当該昆虫中腸でのその本来の対応物のように、細胞表面で発現されるだけでなく、細胞によって正常にリサイクルされることも、示している。
【００１６】
Ｃｒｙ１Ａｂ毒素で処理されたトランスフェクトＣＯＳ−７細胞を、時間を変えて顕微鏡観察したところ、顕著な細胞病理学的パターンが証明された。蛍光顕微鏡下で観察された細胞病理学的変化は、形質膜の破壊、細胞膨張、細胞の分解および斃死を含んでいた。それらの徴候は、０．６μｇ／ｍｌ  Ｃｒｙ１Ａｂ、２時間の存在下で得られた。それに対して、ベクターだけをトランスフェクトし、その後毒素で処理した細胞については、細胞病理学的な影響は全く現れなかった。明らかに、表面受容体への毒素の結合と細胞への毒性との間には、明瞭な相関関係がある。
ＢＴの調製物に中毒した後の、Ｍ．ｓｅｘｔａおよび他の鱗翅類幼虫の中腸細胞の細胞学的外観および超微細構造は、複数の研究者によって詳しく報告されている（Ｂｒａｖｏら，１９９２）。Ｍ．ｓｅｘｔａ中腸に関する組織病理学的研究は、中腸上皮細胞（円柱細胞）へのＣｒｙ１Ａの病理学的挙動を証明した（Ｍｉｄｈｏｅら，１９９９）。これらの研究者は、中腸の上皮細胞が、ＢＴ毒素の摂取後間もなく、膨張するのを明らかにした。ついに、それらの上皮細胞は破裂し、その細胞質内容物を中腸内腔へ放出した。
中毒したトランスフェクトＣＯＳ−７細胞についての本観察は、これらの報告と完全に一致し、両系において毒が同様に作用することを証明している。さらに、該ＢＴ毒素受容体のトランスフェクト分子を発現する細胞ならびに該受容体の天然型を発現する細胞は、細胞毒性のレベルおよび毒素の作用様式の査定に使用可能なことが、当業者には自明のはずである。
【００１７】
鱗翅類の昆虫は、サイズが１６０から２２０ｋＤの範囲の、Ｃｒｙ１Ａ毒素類に対する高分子量結合タンパク質を、一般に発現する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｒａｍｉｒｅｚ  １９９４；Ｖａｄｌａｍｕｄｉら，１９９３；Ｏｄｄｏｕら，１９９３；Ｎａｇａｍａｔｓｕら，１９９８ａ；Ｉｈａｒａら，１９９８）。これらのタンパク質の二つは、２００ｋＤピンクワタノミムシ受容体の他に、クローン化され、配列決定された：すなわち、Ｍ．ｓｅｘｔａからのＢＴ−Ｒ１２１０ｋＤカドヘリン関連受容体（Ｖａｄｌａｍｕｄｉら，１９９５）およびＢ．ｍｏｒｉからの１７５ｋＤカドヘリン関連受容体（Ｎａｇａｍａｔｓｕら，１９９８ａ）である。興味深いことに、これら二つのタンパク質は、両者間で６０−７０％同一性および８０％類似性をもつ。
Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａは、少なくとも一つのＣｒｙ１Ａ毒素、Ｃｒｙ１Ａｃに対する高親和性および低親和性結合タンパク質を発現する。その高親和性受容体は、大きな分子量のカドヘリン関連タンパク質である。最も重要な保存領域の一つはサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列と思われる。該サイン配列は配列（ＲＥＡＤ）を含むが、それは、毒素結合部位の二つのアルギニンに結合する二つの負に荷電したアミノ酸の存在により、毒結合に関与すると考えられている。裏付ける証拠は、前記サイン配列を含むクローンＰＢＷ−８６６，およびサイン配列を含まないＰＢＷ−４２１についての免疫ブロット分析から、得られる。該最小結合断片をさらに規定するため、短小化ペプチド類について、毒素を結合するそれらの能力をテストした（図４）。当該最小結合断片は、“ＲＥＡＤ”サイン配列を含み、アミノ酸１２６９番から１３６７番で構成する。
本明細書に提供される情報は、ピンクワタノミムシの毒素受容体の分子生物学を理解する上で、また野外におけるより長期の持続性、より高い毒性、および抵抗性発生の妨害についての有効な毒素を操作するためにも、必要である。この情報は、他の経済的に重要な作物害虫におけるＣｒｙ毒素受容体相互作用の理解を助けるはずである。
【００１８】
【実施例】
実施例１　精製された毒素類の特異性
組換えプロトキシン類Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１Ａｂ，およびＣｒｙ１Ａｃ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ，オハイオ州大）を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ−１０３から調製し、Ｌｅｅら　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：３１１５による記載にほぼ従いトリプシン処理した。さらに、その可溶性トリプシン処理６０ｋＤ毒素類を、ＨＲ−５／５Ｍｏｎｏ−Ｑ陰イオン交換カラム（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡＴＭ）上で、ＦＰＬＣ塩化ナトリウム塩濃度勾配精製に付した後、定量、１２５Ｉ標識し、そしてバイオアッセイに使用した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのＣｒｙ３Ａ結晶タンパク質を、３．３Ｍ臭化ナトリウム中で可溶化し、パパインで処理し、そして得られた６７ｋＤ毒素を、Ｌｉら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５３：８１５の方法により精製した。６５ｋＤ  Ｃｒｙ１１Ａ毒素は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓからＣｈｉｌｃｏｔｔら  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ（１９８８）１３４：１５５１により記載されているように可溶化により単離し、さらに陰イオン交換ＦＰＬＣにより精製した。すべての毒素タンパク質定量は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，画分Ｖ）を標準品として、バイシンコニン酸法（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＴＭ）を用いて実施した。
【００１９】
ピンクワタノミムシは、ＵＳＤＡ  ＰＩＮＫ  ＢＯＬＬＷＯＲＭ  ＲＥＡＲＩＮＧ  ＦＡＣＩＬＩＴＹＴＭ（ＰＢＷＲＦ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）から入手した。人工飼料は、ＳＯＵＴＨＬＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  ＩＮＣ．ＴＭ，Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＡＲから入手した。該飼料は、沸騰水中で再構成し、５５℃に冷却した。各Ｃｒｙ毒素は、温液体飼料中で完全に混合し、バイオアッセイ用カップは２０ｍｌの飼料で充たした。冷却および乾燥後、１０匹の新生幼虫を各カップにいれ、カップは直ちに蓋をした。Ｗａｔｓｏｎら，Ｂｅｌｔｗｉｄｅ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，Ｔｅｎｎ．（１９９５）の方法を用い、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａの１齢幼虫に対するトリプシン活性化毒素類の毒性を測定した。通常、各用量につき、６カップの４複製を調製した。カップは３０℃で２１日間インキュベートしたが、これは、正常なＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａの９５％以上が蛹化に達するのに必要な期間である。２１日が終ったところで、飼料カップを調べ、各カップ中の幼虫の数、および蛹と成虫の数とを記録した。
新生Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ幼虫を用いてテストした精製Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１Ａｂ，Ｃｒｙ１Ａｃ，Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ２Ａの比毒性を、図３Ｂに示す。３種のＣｒｙ１Ａ毒素はすべて毒性が高く、ＬＣ５０値は２５−４５ｎｇ／ｃｍ３人工飼料当り、の範囲であった。Ｃｒｙ３Ａ（鞘翅類すなわち甲虫類に有毒とされる）およびＣｒｙＩＩＡ（双翅類、特に蚊に有毒とされる）は、テストした最高濃度（２０００ｎｇ／ｃｍ３）でもＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ幼虫に毒性を示さなかった。
【００２０】
実施例２　ＢＴ−Ｒ２受容体の特性解明
４齢初期幼虫を１時間氷上に置き、それらの幼虫から中腸を外科的に取出した。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒら，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７）８６Ａ：３０，の示差マグネシウム沈澱法により、プロテアーゼインヒビター類（５ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、アンチパイン、アプロトニン、ロイペプチン、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、および５ｍＭベンザミジン）の存在下で、中腸組織からＢＢＭＶを調製した。最終ペレットは、プロテアーゼインヒビター類を含むＡ緩衝液（３００ｍＭ　マニトール，５ｍＭ　ＥＧＴＡ，および１７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）中に再懸濁し、液体窒素中で瞬間凍結し、−８５℃で貯蔵した。
【００２１】
Ｃｒｙ毒素類は、クロラミンＴ法（ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９４：４９５，１２５Ｉ−Ｎａ（ＮＥＮ  ＤＵＰＯＮＴＴＭ）による）を用いて、１２５Ｉ標識した。１０μｇの毒素を、２５μｌのクロラミンＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を含む１００μｌのＮａＨＰＯ４緩衝液（０．５Ｍ，ｐＨ７．４）中で、５μｌの１２５Ｉ−Ｎａ（０．５ｍＣｉ）と混合した。反応混合物は２３℃で２０−２５秒間撹拌し、そして５０μｌのＮａ２Ｓ２０５（４．４ｍｇ／ｍｌ）を添加して反応を停止させた。遊離のヨウ素は、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＰＢＳで平衡化したＥＸＣＥＬＬＵＬＯＳＥＴＭ脱塩カラム（ＰＩＥＲＣＥＴＭ）上のゲル濾過により、除去した。
【００２２】
毒素結合アッセイ
同種および異種両競合阻害結合アッセイを、ＫｅｅｔｏｎおよびＢｕｌｌａ（１９９７）による記載のように実施した。全量２５μｇのＢＢＭＶを、次第に濃度を上げた（０−１０００ｎＭ）適当な非標識同種毒素（Ｃｒｙ１Ａｃ）または異種毒素（Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１Ａｂ，Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１１Ａ）の存在下で、１．２ｎＭ１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素とインキュベートした。インキュベーションは、１００μｌの結合緩衝液（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ）中、２５℃で３０分間行った。放射線標識および非標識毒素類を、ＢＢＭＶに加える前に、混合した。非結合の毒素は、ＢＢＭＶ結合毒素から、１４，０００ｘｇで１０分間の遠心分離により分離した。結合毒素を含むペレットは、氷冷結合緩衝液中で緩い渦撹拌により３回洗い、最終ペレット中の放射能をＢＥＣＫＭＡＮ ＧＡＭＭＡ  ５５００ＴＭカウンターを用いて測定した。結合データは、ＰＲＩＳＭＴＭプログラム（ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＩＮＣ．ＴＭ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）により分析した。
【００２３】
１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素のＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａへの競合阻害結合は、次第に濃度を増加させた非標識Ｃｒｙ１Ａｃ，Ｃｒｙ１Ａｂ，Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１１Ａ毒素類の存在下で実行した。同種競合結合アッセイは、ヨウ素化Ｃｒｙ１Ａ毒素および各種濃度の対応非標識毒素で実施した。標識毒素の結合部位濃度（Ｂｍａｘ）および解離定数（Ｋｄ）は、３回の別個の実験から計算した。平衡結合パラメーター類は、データをＰＲＩＳＭＴＭコンピュータープログラムで分析することにより推定した。
【００２４】
ラジオリガンド　ブロッティング
２００μｇのＢＢＭＶタンパク質を、ＦｒａｎｃｉｓおよびＢｕｌｌａ（１９９７）による記載のように、可溶化し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転移した。ブロットは、５％脱脂ドライミルクパウダー、５％グリセロール、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０，および０．０２５％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．９％塩化ナトリウム）により、２５℃で２時間遮断した。遮断緩衝液を除き、膜は、非標識毒素の存在または不在のいずれかで、２　ｘ　１０５ｃｐｍ／ｍｌ（１−１．２５ｎＭ）１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａ毒素類を含む等容量の新しい遮断緩衝液中、２５℃で２時間インキュベートした。最後に、膜は、新しい遮断緩衝液で各１０分間３回洗い、ＴＢＳで１回すすぎ、乾燥し、−８０℃でＫｏｄａｋ  Ｘ線フィルムに露出した。
２００および１２０ｋＤタンパク質への結合の特異性を明らかにするため、ＰＢＷ  ＢＢＭＶタンパク質類のブロットを、次第に濃度を増加させた非標識Ｃｒｙ１Ａｃ毒素の存在下で、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素とインキュベートした。
【００２５】
Ｃｒｙ１Ａｂ結合タンパク質の免疫沈澱
免疫沈澱は、Ｖａｄｌａｍｕｄｉら（１９９３）に従って実行した。２５μｌのＣｒｙ１Ａｂ抗血清を、洗浄緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０，６ｍＭ　ＥＤＴＡ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび２５０ｍＭ塩化ナトリウム）中で平衡化した１ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂへ加え、４℃で１時間混合した。該ブロットを洗浄緩衝液で３回洗った後、７００μｇのＣｒｙ１Ａｂ毒素を加え、該混合物を４℃でさらに１時間インキュベートｌし、洗浄緩衝液で３回再び洗浄した。ピンクワタノミムシＢＢＭＶタンパク質類（６ｍｇ）を、１％ＮＰ−４０およびプロテアーゼインヒビター類（１０μｇ／ｍｌペプスタチン、アンチパイン、アプロトニンおよびロイペプチン；５ｍＭヨードアセタミド；および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を含む洗浄緩衝液中で可溶化した。非可溶化タンパク質は遠心分離により除去した。可溶化されたタンパク質は、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、１ｍｌのＣｒｙ１Ａｂ毒素へ結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズへ添加し、そしてその試料を４℃で１時間ゆっくり撹拌した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズは、遠心分離し、０．２５％ＮＰ−４０および０．０２％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液で４回洗浄した。その毒素結合タンパク質複合体は、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）試料緩衝液中で加熱して解離させ、そして該結合タンパク質類は、クーマシー染色し、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１ＡｂによるリガンドブロッティングとＣｒｙ１Ａｂ抗血清を用いるウェスタンブロットにより検出した。
【００２６】
ピンクワタノミムシＣｒｙ１Ａ受容体の免疫検出
免疫沈澱したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ＰＢＳ緩衝液中５％脱脂ドライミルクで遮断し、１０μｇ／ｍｌのＣｒｙ１Ａｂを含む同じ遮断緩衝液中、４℃で一晩インキュベートした。非結合毒素はＰＢＳで洗浄した。６０ｋＤ　Ｃｒｙ１Ａｂ毒素に対して家兎で高めた抗体を、１：１０００に希釈し、前記膜に２５℃で２時間ハイブリダイズさせ、次いでそのブロットをＰＢＳで洗浄した。ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗家兎ＩｇＧをＴＢＳ遮断緩衝液中１：３０００に希釈し、膜に２時間ハイブリダイズさせた。次に、膜をＰＢＳで徹底的に洗浄した。結合毒素の可視化は、ｔｈｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）ウェスタンブロット検出法（ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）を用いて達成した。
【００２７】
サザンブロット分析
Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａまたはＭ．ｓｅｘｔａからの４０μｇのＰｖｕＨ消化ゲノムＤＮＡを、０．８％１Ｘ　ＴＢＥアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜（ＢＩＯ−ＲＡＤＴＭ，ＺＥＴＡ−ＰＲＯＢＥ  ＧＴＴＭ）上へブロットした。分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に従って行った。該フィルターは、ＢＴ−Ｒ１ｃＤＮＡの３２Ｐ標識ランダムプライムドＣ末端（ＨｉｎｃＨ断片，０．５ｋｂ）とハイブリダイズした。フィルターハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬，１Ｍ塩化ナトリウム，２％ＳＤＳ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で２１時間行った。該フィルターは、２Ｘ  ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳで，次に１Ｘ  ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳで，次に０．５Ｘ  ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，次いで４番目に０．２５Ｘ  ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳで洗浄した。各洗浄は４２℃３０分間である。最後に、該フィルターを２Ｘ  ＳＳＣですすぎ、Ｋｏｄａｋ  Ｘ線フィルムにー８５℃で露出した。
【００２８】
タンパク質の電気泳動溶出
電気泳動は、７．５％アクリルアミド（ｐＨ８．０）を用いる、厚さ１．５ｍｍのポリアクリルアミド　スラブ　ゲル中で実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質は、４Ｍ酢酸ナトリウム溶液で透明なバンドとして明らかにした。それらのタンパク質は、かみそりの刃を用いて切り取った。ゲル片中のタンパク質は、５０％（ｖ／ｖ）メタノール溶液中１５分間固定し、０．１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）および２％　２−メルカプトエタノール中、さらに１５分間２回平衡化した。１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを加えた上記緩衝液中での当該ゲル片の平衡化は、上記のように実施した。平衡化したゲル片は、ＳＤＳ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１９０ｍＭグリシンおよび０．１％ＳＤＳ）を含む最少量の該緩衝液とともに、透析チューブヘ挿入した。電気溶出は、実質的にＦｉｎｄｌａｙ（１９９０）による記載のように行った。水平ｆｌａｔ−ｂｅｄ−ｍｉｎｉ−ｇｅｌ電気泳動装置（ＢＩＯ−ＲＡＤＴＭ）を、５０Ｖ、１２時間、４℃の電気溶出に使用した。緩衝液は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９０ｍＭグリシンおよび０．１％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）である。電気泳動の終りに、電極の極性を３０秒間変え、透析チューブへのタンパク質の吸着を防いだ。透析チューブ内の緩衝液を集め、チューブは最少容量の緩衝液で３回洗浄した。ＳＤＳを透析で除き、タンパク質はＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０ミクロ濃縮器（ＡＭＩＣＯＮ）を用いて濃縮した。
【００２９】
二次元ゲル電気泳動
二次元ゲル電気泳動は、Ｏ´Ｆａｒｒｅｌｌ（１９７５）の方法に従って実施した。等電点電気泳動は、２．０ｍｍ（内径）ガラス管中で２．０％アンホライン（ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ）（ｐＨ３．５−１０；ＬＫＢ／ＰＨＡＲＭＡＣＩＡＴＭ）を用い、９６００ｖｏｌｔ−ｈｒで行った。緩衝液｀Ｏ中で１０分間平衡化後、チューブゲルを、８％アクリルアミド（ｐＨ８．０）スラブゲル（１４  ｘ  １４  ｃｍ）の先端のスタッキングゲルに当てた。ＳＤＳスラブゲル電気泳動は、１２．５ｍＡで４時間行った。電気泳動後、一つのゲルはクーマシーブルーで染色し、その他のゲルはＰＶＤＦペーパー上へ２００ｍＡで一晩トランスブロットした（Ｖａｄｌａｍｕｄｉら，１９９３）。ＰＶＤＦペーパーは、パウダードミルク溶液で遮断し、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃまたは１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂとインキュベートし、−８５℃でＸ線フィルムに露出した。
【００３０】
ＢＴ−Ｒ２をコードするｃＤＮＡの同定および回収
全ＲＮＡを、ＰＢＷの４齢幼虫の中腸組織から、グアニジニウムチオシアネート法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｋｉら　Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２：１５６）により、調製した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを、ＰＯＬＹＡＴＲＡＣＴ　ＭＲＮＡ　ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭＴＭ（ＰＲＯＭＥＧＡＴＭ）で単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）およびランダムヘキサマープライマー類および逆転写酵素を用い、標準的な方式に従って合成し、所望のｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の鋳型として用いた。縮重オリゴヌクレオチドプライマー類は、Ｍ．ｓｅｘｔａ  ＢＴ−Ｒ１およびＢ．ｍｏｒｉ  ＢＴ−Ｒ１７５間の保存性アミノ酸に基づきデザインした。そうしたプライマー類は、ＰＢＷ ＢＴ−Ｒ２の部分断片のクローン化に使用した。
【００３１】
ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２のクローニングのために、Ｍ．ｓｅｘｔａ  ＢＴ−Ｒ１およびＢ．ｍｏｒｉ  ＢＴ−Ｒ１７５の間の膜近位ドメイン保存配列中の配列由来の完全縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを採用した。ＢＴ−Ｒ−１４８６Ｄに対するプライマーＢＴ−Ｒ−１３５５ＵおよびＢＴ−Ｒ−１２０９Ｕを、ＰＢＷ  ｃＤＮＡに適用し、４２１ｋｂおよび８６６ｋｂ断片を増幅した。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロース上で分離し、ゲル精製して、ＴＡクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中へクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶ∝Ｆ中へ形質転換した。正しい挿入断片の存在と同一性は、ＥｃｏＲ１消化およびＤＮＡ塩基配列決定で確認した。ＰＢＷ−８６６クローンは、クローンＰＢＷ−４２１中に見られるヌクレオチド配列を含むことがわかった。さらに、１６５７Ｄに対するプライマー１２０９Ｕを用いて、膜近位ドメインおよび細胞質ドメインの大部分を表す１３７３ｋｂ断片（ＰＢＷ−１３７３）をクローン化した。クローンＰＢＷ−２８７（ａａ１３４６−１４３８）は、８６６ｋｂクローンからの２８７ｋｂ内部断片で、遺伝子特異的プライマーＰ５およびＰ６を用いてクローン化した。
【００３２】
該部分クローン類から得た配列に基づき、センスおよびアンチセンスプライマーを用いて、５´および３´ＲＡＣＥシステムにより、当該製造会社の説明書（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬＴＭ）に従って、ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２クローンの３´および５´端をクローン化した。該５´端は、キット中にあるＡＢＲＩＤＧＥＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＰＲＩＭＥＲＴＭ（ＡＵＡＰＴＭ）に対する遺伝子特異的アンチセンスプライマーＧＳＰ１，ＧＳＰ２およびＧＳＰ３を用いて、増幅した。３´端は、ＡＵＡＰＴＭに対する遺伝子プライマーＧＳＰ４を用いて増幅した。予測サイズのＰＣＲ産物を単離し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中へサブクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＩＮＶ∝Ｆ中へ形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣＯＳ７細胞中での組換えタンパク質発現のため、ＲＴ−ＰＣＲクローンまたは完全長ＰＢＷ−ＢＴ−Ｒ２クローンのコード配列を、ｐＥＴ３０またはｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中へ再クローン化し、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ（ＮＯＶＡＧＥＮＴＭ）またはＣＯＳ７哺乳類細胞中へ形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養は、１ｍＭ終濃度のＩＰＴＧを用い３時間誘導した。
【００３３】
完全長ＰＢＷ ＢＴ−Ｒ２（〜５．５ｋｂ；配列は図１配列番号１を参照されたい）を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中へ結合し、ＤＮＡ塩基配列決定により確認した。その推定ポリペプチドの分子量は１９４ｋＤで、ｐＩは４．１である。該受容体は１７２９個アミノ酸のオープンリーディングフレームをもつ（図２）（配列番号２）。該アミノ酸配列は、２３アミノ酸残基の推定シグナルペプチド、２７残基の膜貫通ドメイン（ａａ  １５７８−１６０５）および１２４残基細胞質ドメインを含む。さらに、該アミノ酸配列は、１２の推定カドヘリンモチーフ、１１の推定Ｎ−糖鎖形成部位およびアミノ酸１５４１−１５６２と１５７８−１６００に二つのロイシンジッパーモチーフを含む。最小毒素結合断片はアミノ酸１２６９から１３６７である（図４）。
【００３４】
該タンパク質相同性を、既出の定義のところで記載のように、ＢＬＡＳＴＰにより分析すると、ＧｅｎＢａｎｋ非冗長（ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｎｔ（ｎｒ））データベース中の最も近いパラログは、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＪＥ０１２８にあるＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ受容体で、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ  ＝  １０３４／１７０８（６０％），Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ  ＝  １２６６／１７０８（７３％），Ｇａｐｓ  ＝  ３５／１７０８（２％）である。次に近い種は、Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＢ３３７５８．１のＭａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａで、Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ  ＝  ８７１／１５４０（５６％），Ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ  ＝  １１０１／１５４０（７０％），Ｇａｐｓ  ＝  ２２／１５４０（１％）である。該ヌクレオチド配列は有意な相同性を示さなかった。
【００３５】
これら３種間のペプチド相同性は図５Ａ−Ｃに示し、完全に保存されている残基は箱囲いしてある。ＳＢＷ配列のペプチド断片を使って、特異的または非特異的抗体の作製が可能である。通常、抗体を作出するには少なくとも１７アミノ酸ペプチド断片が使われるが、もっと小さなペプチドでも、抗原性があり、独特であるために十分複雑なこともある。特に、ＰＢＷ配列のカルボキシル尾部（ａａ１６７７−末端）は、この種に独特で、ＰＢＷ独特の抗体を作製するのに使用可能である。抗原として有用と思われる典型的なペプチド（図５、配列番号２についての番号で）を、以下に示す：
【００３６】
【表３】
2004500055.tif 000004
【００３７】
発現ＢＴ−Ｒ２タンパク質の免疫検出
誘導性ＢＬ２１　（ＤＥ３）　ＬｙｓＳ細菌培養からの細胞溶解物を電気泳動に付し、ＰＶＤＦ膜に移した。フィルターは、１０μｇ／ｍｌのＣｒｙ１Ａｂ毒素を含む５０ｍｌの遮断緩衝液中４℃で遮断した。非結合毒素はＰＢＳにより除去した。ＴＨＷに対する家兎一次抗体はＰＢＳにより除去した。細胞外ドメインＴＨＷ　ＢＴ−Ｒに対するまたはＦＰＬＣ精製Ｃｒｙ１Ａｂに対する家兎一次抗体は、５０ｍｌ　ＴＢＳ遮断緩衝液で１：１０００に希釈した。フィルターは、抗血清と２時間インキュベートし、遮断緩衝液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗家兎ＩｇＧを１：２０００に希釈し、２７℃で２時間フィルターとともにインキュベートして、そして高度化学発光（ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ））検出システム（ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）で現像させた。
【００３８】
ＢＴ−Ｒ２の哺乳類発現
哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中へクローン化したＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡを、ＫｅｅｔｏｎおよびＢｕｌｌａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）６３：３４１９により記載の方法に従って、哺乳類細胞（ＣＯＳ−７  ＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）中で発現させた。ＣＯＳ−７細胞（４  ｘ  １０４／ウエル）を、２４ウエル・プレート中に置いた１２ｍｍカバースリップ上で、１０％加熱不活性化胎児牛血清（ＦＢＳ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、増殖させた。
【００３９】
ＣＯＳ−７細胞は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ  ＰＬＵＳ  ＲＥＡＧＥＮＴＴＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬＴＭ）を用いて、該構築物でトランスフェクトした。細胞は、１０％ＣＯ２の湿気の多い雰囲気で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、３７℃２日間インキュベートした。ＢＴ−Ｒ２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＢＴ−Ｒ１または抗Ｃｒｙ１Ａｂ抗血清によるイムノブロッティングによりモニターした。表面発現は、抗ＢＴ−Ｒ１抗体による免疫蛍光顕微鏡法により、検出した。トランスフェクトされた細胞へのＢＴ毒素の影響は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素の存在または不在下で、当該細胞を２または４時間インキュベートし、そして抗ＢＴ−Ｒ１または抗Ｃｒｙ１Ａｂ抗体の何れかを用い、免疫蛍光顕微鏡により形態的変化をモニターすることにより、証明した。細胞死が明らかに証明される（示してない）。
【００４０】
免疫蛍光顕微鏡法
ＣＯＳ−７細胞を、２４ウエル・プレート中１２ｍｍガラスカバースリップ上で、増殖させた。細胞を固定し、冷メタノール（−２０℃）または４％パラホルムアルデヒド中、２７℃で１５分間浸透化した。カバースリップを、ＰＢＳで３回すすぎ、次いでＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１５分間遮断した。細胞は、一次抗体と２７℃で３０分間インキュベートし、次いで上記のようにすすぎと遮断を行った。同じインキュベーションおよび洗浄処置を二次抗体に適用した。抗体はＴＲＩＴＣヤギ抗家兎ＩｇＧで検出した。カバースリップをＦＬＵＲＯＭＯＵＮＴ ＧＴＭに装着し、エピ蛍光照明および４０Ｘ  アポクロマートレンズを備えたＯＬＹＭＰＵＳＴＭ顕微鏡で観察した。写真撮影はＯＬＹＭＰＵＳ  ＳＰＯＴＴＭカメラで行った。
【００４１】
ウェスタンブロット分析
トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞を、冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１０μＭロイペプチン）中で細胞溶解し、氷冷下１０分間再懸濁した。次いで、４Ｘ　試料緩衝液を当該細胞に添加し、９５℃で５分間加熱した。溶解物は７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動に付し、タンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦフィルターに移し、遮断し、そして抗ＢＴ−Ｒ１または抗Ｃｒｙ１Ａｂ抗体とインキュベートした。
【００４２】
結果：１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａ結合タンパク質の同定
Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａのＢＢＭＶタンパク質類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると、分子サイズが２０５ｋＤ以上から２５ｋＤ以下までの範囲にあった（データは示してない）。１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃをリガンドブロットに使用して、どのＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ  ＢＢＭＶタンパク質がそれぞれの毒素に結合するかを同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ膜に移され、放射能標識された各毒素と個別にインキュベートされた。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａａ，１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂおよび１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃは、約２００ｋＤのタンパク質に結合した（データは示してない）。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃは約１２０ｋＤにあるタンパク質バンドにも結合した。Ｃｒｙ１ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂはいずれも、１２０ｋＤタンパク質には結合しなかった。３種の毒素すべての結合パターンは、還元および非還元いずれの条件でも、同じであった（データは示してない）。
【００４３】
結果：競合阻害結合アッセイ
１２５Ｉ−標識Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃを、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ  ＢＢＭＶとの結合アッセイに使用した。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素のＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａへの競合結合は、次第に濃度を増加させた非標識Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１Ａｂ，Ｃｒｙ１Ａｃ，Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１１Ａ毒素類の存在下で行った。Ｃｒｙ１Ａｃ結合の５０％阻害は、１０ｎＭの非標識Ｃｒｙ１Ａｃ，１００ｎＭの非標識Ｃｒｙ１Ａａおよび１００ｎＭの非標識Ｃｒｙ１Ａｂで観察された。１０００ｎＭの濃度で、非標識Ｃｒｙ１Ａｃ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａａは、ヨウ素化Ｃｒｙ１Ａｃの結合をそれぞれ９５、８２および８０％減少させた（データは示してない）。Ｃｒｙ３ＡおよびＣｒｙ１１Ａ毒素はいずれも，Ｃｒｙ１Ａｃ毒素結合部位に競合しなかった。
【００４４】
同種競合結合アッセイはヨウ素化Ｃｒｙ１Ａ毒素で実施し、さまざまな濃度の対応非標識毒素Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１ＡｃはＢＢＷタンパク質に対し高い結合親和性を示した（データは示してない）。Ｃｒｙ１Ａ毒素類の結合の５０％阻害は、対応する非標識毒素の約１０ｎＭの濃度で観察された。これらのデータは、それらの３種の毒素のそれぞれが、高い親和性で特異的に結合することを、示している。各毒素の結合部位濃度Ｂｍａｘおよび解離定数Ｋｄは、ＧＲＡＰＨＡＤコンピュータープログラムでデータを分析することにより、３回の別々の同種競合阻害実験から計算した（表１）。Ｋｄ値はすべて同様で低ｎＭ範囲にあったが、Ｃｒｙ１Ａｃに対するＢｍａｘはＣｒｙ１ＡａまたはＣｒｙ１Ａｂより高かった。Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃに対するヒル係数は、それぞれ０．６５，０．６５および０．７７で、ＢＢＭＶタンパク質に対する毒素類について負の結合協力性を示していた。Ｃｒｙ１ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂの両者についての非線形回帰分析に基づき、単一結合部位モデルが示された。重要なことだが、Ｃｒｙ１Ａｃについてのデータは、高および低親和性結合部位をもつ、二結合部位モデルが最も合致していた。
【００４５】
結果：リガンドブロットにおける１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素結合の特異性
Ｃｒｙ１Ａｃ毒素について予測された推定“二結合部位”モデルを顧慮して、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ　ＢＢＭＶタンパク質のラジオリガンドブロットを、次第に濃度を上げた非標識Ｃｒｙ１Ａｃ毒素の存在下で、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｃ毒素を用いて行った。これらのブロットのオートラジオグラフィーは、２００ｋＤバンドの強度に顕著な減少を明らかにした（データは示してない）。実際、１０ｎＭのＣｒｙ１Ａｃ毒素濃度でそれは検出できなかった。しかし、１２０ｋＤバンドの場合、１０００ｎＭのＣｒｙ１Ａｃ濃度でも、バンド強度に実質的な減少はなかった（データは示してない）。飽和結合アッセイでは、一定量の各３種の１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａ毒素を次第に濃度を上げたＢＢＭＶとインキュベーションしたところ、いずれの場合も結合は飽和レベルに達したが、Ｃｒｙ１Ａｃ結合のレベルはＣｒｙ１ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂのものより相当高いことがわかった。４００μｇ／ｍｌのＢＢＭＶでの最大飽和結合は、Ｃｒｙ１Ａａ，Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃについてそれぞれ０．３５，０．０５および１．５ｎｇで、Ｃｒｙ１Ａｂに比べてＣｒｙ１Ａｃ結合には約３０倍の、またＣｒｙ１Ａａに比べてＣｒｙ１Ａｃの方が４倍高いことを表している（データは示してない）。
【００４６】
結果：Ｃｒｙ１Ａｂ結合タンパク質の免疫沈澱
免疫沈澱実験を、前記３種の毒素のうち最も高い結合親和性をもつＣｒｙ１Ａｂを用いて行ったが、それは、該毒素の２００ｋＤタンパク質への結合の特異性をさらに調べるためである。ＢＢＭＶタンパク質を１％ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０ＴＭ中で可溶化し、抗毒素ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと免疫沈澱させた。結合した物質の混合物を、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液中で可溶化した。電気泳動とゲルのクーマシーブルーでの染色から、約２００ｋＤａのタンパク質が明かとなり、２００ｋＤ毒素結合タンパク質の選択的沈澱が証明された。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂでのラジオリガンドブロティングは、約２００ｋＤａのバンドを示し（データは示してない）、前のリガンドブロット実験で確認されたのと同じ結合タンパク質の沈澱を表していた。加えて、Ｃｒｙ１Ａｂおよび抗Ｃｒｙ１Ａｂポリクローナル抗血清を用いた、免疫沈澱タンパク質のウェスタンブロット（データは示してない）は、ラジオリガンドブロットの結果を裏付けた（データは示してない）。６０および５２ｋＤａの低分子量バンドは、それぞれＣｒｙ１Ａｂ毒素およびＩｇＧの重鎖に相当する。
【００４７】
結果：結合タンパク質の精製
２００ｋＤバンドが一つ以上のタンパク質を含むかどうかを明らかにするため、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから当該バンドを切り出し、電気溶出、透析、そして濃縮を行った。濃縮タンパク質を、ｐＨ範囲３．５−１０にわたって二次元ゲル電気泳動により分析した。該タンパク質は、４．５±０．２の推定ｐＩおよび２００ｋＤａの見掛け分子量をもつ一つのスポットとして移動した。精製された２００ｋＤタンパク質は、シッフ試薬で染色したところ（データは示してない）、結合タンパク質は糖鎖形成していることが明らかになった。１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂを結合した２００ｋＤ  ＩＥＦスポット（データは示してない）は、他の免疫沈澱研究の結果を確証している。
【００４８】
サザンブロット分析
Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ中にＣｒｙ１Ａ受容体の存在を検出するために、両昆虫からのゲノムＤＮＡを、クローン化ＴＨＷ　ＢＴ−Ｒ１ｃＤＮＡおよびその５０７−ｂｐ最小結合断片に対して、ハイブリッド形成させた。それら二つのプローブは、Ｍ．ｓｅｘｔａゲノムＤＮＡのＰｖｕＨ断片に強く結合した（データは示してない）。しかし、該最小結合プローブを用いた場合には、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ  ＤＮＡに弱いハイブリッド形成があり、完全長ＢＴ−Ｒ１プローブでは全く認められなかった（データは示してない）。これらの結果は、Ｍ．ｓｅｘｔａからの最小結合断片が、該完全長ＢＴ−Ｒ１受容体に対するより、ずっとＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ中のＣｒｙ１Ａ結合受容体に、有意レベルのヌクレオチド類似性を共有することを、示唆している。
【００４９】
結果：ＢＴ−Ｒ１抗体を用いる未変性およびクローン化ＰＳＷ　ＢＴ−Ｒ２の免疫検出
クローン化ＰＢＷ断片のＴＨＷ　ＢＴ−Ｒ１に対する近縁性および毒素を結合するその能力を確かめるため、それを、ｐＥＴ３０発現ベクター中へサブクローン化した。未変性ＰＢＷ  ＢＢＭＶタンパク質およびクローンＰＢＷ−２８７，−４２１および−８６６から発現されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ移し、抗ＢＴ−Ｒ１血清またはＣｒｙ１Ａｂ毒素と、次いで該毒素に対する抗血清と、インキュベートした。その結果、ＢＢＭＶは、ＴＨＷ  ＢＴ−Ｒ１抗血清と相互作用する２００ｋＤタンパク質を含むことが明らかになった（データは示してない）。さらに、それぞれ約１５、２１および３２ｋＤのタンパク質を発現するクローンＰＢＷ−２８７，−４２１および−８６６も、ＢＴ−Ｒ１抗血清と交差反応した。しかし、３２ｋＤクローンだけが毒素に結合するタンパク質で、２１ｋＤタンパク質については検出できる結合は全く観察されなかった（データは示してない）。これらの結果は、ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２のＴＨＷ  ＢＴ−Ｒ１への配列近縁性を確認し、３２ｋＤタンパク質が該受容体の毒素結合部位を含むことを証明している。
【００５０】
結果：クローン化受容体への毒素結合の特異性
該受容体断片（ＰＢＷ−８６６）への毒素結合の特異性および親和性を、競合リガンドブロット分析を用いて決定した。発現された３２ｋＤタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に移し、次第に濃度を上げた非標識Ｃｒｙ１Ａｂ毒素の不在または存在下で、１２５Ｉ−Ｃｒｙ１Ａｂとインキュベートした。オートラジオグラフィーは、３２ｋＤバンドの強度が、５００ｎＭ非標識Ｃｒｙ１Ａｂ毒素の存在下で、検出不能のレベルまで、顕著に減少することを、明らかにした（データは示してない）。結合した１２５Ｉ−毒素はガンマカウンターで定量し、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＩＭＡＧＥＲＴＭ分析システムを用いて、発現断片への毒素の結合親和性を計算した。該毒素の結合親和性（〜１７ｎＭ）は、ＢＢＭＶについての計算値（表１）と同様であった。これらの結果は、Ｃｒｙ１Ａｂが、ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２８６６に高い親和性で特異的に結合することを、証明している。他の短小化断片もテストし、そして最小結合断片はアミノ酸１２６９から１３６７までで構成すると、決定した。
【００５１】
結果：ＣＯＳ−７細胞中でのＰＢＷ　ＢＴ−Ｒ２の発現
ＰＢＷ　ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中へサブクローン化し、ＣＯＳ−７細胞中へトランスフェクトした。ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素を結合できる膜タンパク質として、発現された。過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から分離された膜を、可溶化し、電気泳動に付し、そしてＣｒｙ１Ａｂ毒素およびその抗血清で、またはＢＴ−Ｒ１抗血清で直接、免疫ブロットした。発現された２２０ｋＤ受容体は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素を結合し、ＢＴ−Ｒ１抗血清と交差反応した。ベクターをトランスフェクトされた細胞への相互作用は、全く観察されなかった。
【００５２】
細胞表面上へのＢＴ−Ｒ２受容体の発現は、当該細胞をメタノールまたはパラホルムアルデヒド中で固定し、そしてまず抗ＢＴ−Ｒ１血清と、次いでＴＲＩＴＣ  ＩｇＧ二次抗体とインキュベートすることにより、示された。トランスフェクトされた細胞は、細胞表面へのＢＴ−Ｒ１抗体の結合により、表面が輝いており、ＰＢＥ  ＢＴ−Ｒ２受容体が細胞表面で発現されることを、明らかに示した。
【００５３】
その表面発現ＰＢＷ受容体は、毒素を結合し、当該細胞を殺す。トランスフェクトされた細胞は、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素と２または４時間インキュベートし、洗浄し、固定して、そしてまず抗Ｃｒｙ１Ａｂ抗血清と、次いでＴＲＩＴＣ ＩｇＧ二次抗体とインキュベートした。免疫蛍光顕微鏡により示されるように、ＢＴ−Ｒ２発現ＣＯＳ−７細胞は該毒素を結合したが、ベクターのみでトランスフェクトされた細胞は毒素の表面結合を全く示さなかった。ＰＢＷ  ＢＴ−Ｒ２を発現する細胞を、毒素と２または４時間インキュベートすると、細胞の本来の姿の消失、細胞質の消失、形質膜の完全な分解、および細胞死を含む顕著な形態的変化を示した。
【００５４】
既に引用したものおよび以下の参考文献は、本明細書で援用され、当該発明公開を支援するために使用される。
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【００５５】
本発明は、例証的な実施態様を参考にしながら記載しきたが、この記載は、限定的な意味に解釈されることを意図するものではない。例証的実施態様のさまざまな修飾および組合せ、ならびに当該発明の他の実施態様は、当該記載を参照すれば、当業者には自明であろう。従って、添付の特許請求の範囲は、そうした修飾および強化を包括することを、意図している。
【図面の簡単な説明】
本発明の方法および装置のさらに完全な理解は、添付図面とともに、以下の詳細な説明を参照することにより、得られると思われるが、そこで：
【図１】図１Ａ−Ｂは、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａからのＢＴ−Ｒ２タンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａからのＢＴ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号２）を示す。矢印は、推定カドヘリンドメインＣＲ１−ＣＲ１２の開始部位を示す、ＳＩＧ  ＝  シグナル配列（二重下線）。ＰＤ  ＝  膜近位ドメイン；ＣＹＴ  ＝  細胞質領域。膜貫通領域は下線と太字で示す。ロイシンジッパーモチーフＬＺは下線を付す。Ｎ残基は推定Ｎ−糖鎖形成部位を表す。最小結合断片ＭＢＦ（アミノ酸ａａ１２６９−１３６７）も二重下線を付す。
【図３】図３Ａは、中腸上皮細胞から調製したＰ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ幼虫の刷子縁膜小胞上へのＣｒｙ１Ａ毒素の結合結果を示すグラフである。
図３Ｂは、Ｐ．ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ幼虫およびＢＢＭＶへのＣｒｙ１Ａ毒素の毒性結果を示すグラフである。
【図４】図４は、短小化体（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）ＰＢＷ−１２１０−１４３９，ＰＢＷ−１２６９−１４３９，ＰＢＷ−１３６７−１４９６，およびＰＢＷ−１２１０−１３６７（最小結合断片）を含む、ピンクワタノミムシ（ＰＢＷ）ＢＴ−Ｒ２ｃＤＮＡｓの構造の地図である。各クローンから発現されたタンパク質のＣｒｙ１Ａ毒素への結合は、結合の場合（＋）、非結合の場合（−）により同定された。
【図５】図５Ａ−Ｃは、カイコ（上）、タバコスズメガ（中）、ピンクワタノミムシ（下）Ｃｒｙ毒素受容体の整列の図解である。完全に保存されている残基は、箱で囲ってある。
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500055.tif 000065
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