(57)【要約】本発明は、分離相間のタンパク質試料の移動を効率的に促進する方法を含む、多数の細胞タンパク質を分解し、かつ特徴決定することが可能な多相タンパク質分離法に関する。特に本発明は、タンパク質試料の分離、同定、および特徴決定のための自動化システムを提供する。従って、本発明は、多数のタンパク質を含有する試料の分析のための改善された方法を提供する。
2004500567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含むタンパク質の特徴決定法：
ａ）ｉ）複数のタンパク質を含有する試料と、
ｉｉ）第１の物理特性を基にタンパク質を分離する第１の分離装置と、
ｉｉｉ）第２の物理特性を基にタンパク質を分離する第２の分離装置と、
ｉｖ）質量分析装置とを提供する段階；
ｂ）該試料を該第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階；
ｃ）該第１の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、該第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；
ｄ）該第２の分離装置からの該第２の分離されたタンパク質試料を、該質量分析装置へ直接供給する段階；および
ｅ）該第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、該質量分析装置で質量スペクトル分析し、タンパク質質量を特徴決定する段階。
【請求項２】
試料が細胞溶解液を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の物理特性がタンパク質電荷である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第２の分離装置が逆相ＨＰＬＣ装置を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
逆相ＨＰＬＣが非多孔性逆相ＨＰＬＣを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
質量分析装置が、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ｄ）第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部において少なくとも第１の物理特性を提示する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
提示段階が、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部における第１および第２の物理特性の略図による表示を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第１および第２の特性が、ｐＩおよび疎水性を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
略図による表示が２次元タンパク質マップを含み、第１の物理特性が第１の軸上に表され、かつ該第２の物理特性が第２の軸上に表される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
略図による表示がさらに、該略図による表示において表されたタンパク質のタンパク質存在量を提示する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、略図による表示においてバンドとして表される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質存在量が、バンドの強度と相関する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
略図による表示が、第１のタンパク質を表している第１のバンドおよび第１のタンパク質のリン酸化型を表している第２のバンドの差異をもたらすような解像度を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
複数のタンパク質を含む試料が緩衝液をさらに含み、該複数のタンパク質が緩衝液中に可溶化され、かつ該緩衝液が第１および第２の分離装置に適合可能である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
緩衝液がさらに、質量分析装置に適合可能である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
緩衝液が、式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物を含有する、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物が、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドから選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
以下の（ａ）〜（ｂ）を備えるシステム：
ａ）第１の物理特性を基にタンパク質を分離する、第１の分離装置；および
ｂ）質量分析装置に直接連結された、非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置であり、該非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置により分離されたタンパク質が、処理が介入することなく、該質量分析装置へ直接供給される装置。
【請求項２２】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項２１記載のシステム。
【請求項２３】
液相の第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項２２記載のシステム。
【請求項２４】
質量分析装置がＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項２１記載のシステム。
【請求項２５】
第２の分離装置により分離されたタンパク質を検出する検出器をさらに備える、請求項２１記載のシステム。
【請求項２６】
タンパク質提示ソフトウェアを実行するために構成されたプロセッサをさらに備え、該タンパク質提示ソフトウェアが、検出されたタンパク質のデータ表示を生成する、請求項２５記載のシステム。
【請求項２７】
データ表示を提示するディスプレイをさらに含み、複数のタンパク質の少なくとも一部において、第１の物理特性、第２の物理特性、およびタンパク質存在量が表示される、請求項２６記載のシステム。
【請求項２８】
第１および第２の特性が、ｐＩおよび疎水性を含む、請求項２７記載のシステム。
【請求項２９】
データ表示が２次元タンパク質マップを含み、第１の物理特性が第１の軸上に表され、かつ第２の物理特性が第２の軸上に表される、請求項２７記載のシステム。
【請求項３０】
タンパク質が、データ表示においてバンドとして表される、請求項２７記載のシステム。
【請求項３１】
タンパク質存在量が、バンドの強度と相関する、請求項３０記載のシステム。
【請求項３２】
データ表示が、第１のタンパク質を表している第１のバンドおよび第１のタンパク質のリン酸化型を表している第２のバンドの差異をもたらすような解像度を有する、請求項３０記載のシステム。
【請求項３３】
以下の段階を含む、タンパク質の特徴決定法：
ａ）ｉ）複数のタンパク質を含有する試料と、
ｉｉ）第１の分離装置と、
ｉｉｉ）非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置と、
ｉｖ）質量分析装置とを提供する段階；
ｂ）該試料を該第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階であり、該第１の分離されたタンパク質試料が、複数の画分において該第１の分離装置から収集され、該画分の各々が個別のｐＨ範囲により定義される段階；ｃ）該画分の少なくともひとつからの該第１の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、該非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；および
ｄ）該第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、該質量分析装置で質量スペクトル分析し、タンパク質質量を特徴決定する段階。
【請求項３４】
第２の分離されたタンパク質試料が、タンパク質消化段階の介入を伴うことなく、質量分析装置へ直接供給される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
試料が細胞溶解液を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
第１の分離装置が電荷を基にタンパク質を分離する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
質量分析装置が、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
ｅ）第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部において少なくとも第１の物理特性を提示する段階をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
提示段階が、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部における第１および第２の物理特性の略図による表示を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
第１および第２の特性が、ｐＩおよび疎水性を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
略図による表示が２次元タンパク質マップを含み、第１の物理特性が第１の軸上に表され、かつ第２の物理特性が第２の軸上に表される、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
略図による表示がさらに、該略図による表示において表されたタンパク質のタンパク質存在量を提示する、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
複数のタンパク質を含む試料が緩衝液をさらに含み、該複数のタンパク質が緩衝液中に可溶化され、かつ該緩衝液が第１および第２の分離装置に適合可能である、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
緩衝液がさらに、質量分析装置に適合可能である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
緩衝液が、式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物を含有する、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物が、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドから選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
以下の（ａ）〜（ｅ）を備えるシステム：
ａ）第１の分離装置；
ｂ）該第１の分離装置から複数の画分においてタンパク質を溶離する緩衝液であり、該画分の各々が、個別のｐＨ範囲により定義される緩衝液；
ｃ）該複数の画分において分離されたタンパク質を受け取ることが可能な、第１の送達装置；
ｄ）該第１の送達装置からタンパク質を受け取るように構成された非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置；および
ｅ）該非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置からタンパク質を受け取るように構成された質量分析装置。
【請求項５０】
質量分析装置が、非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置からタンパク質を直接受け取るように構成される、請求項４９記載のシステム。
【請求項５１】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項４９記載のシステム。
【請求項５２】
液相の第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項５１記載のシステム。
【請求項５３】
質量分析装置が、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項４９記載のシステム。
【請求項５４】
非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置により分離されたタンパク質を検出する検出器をさらに備える、請求項４９記載のシステム。
【請求項５５】
タンパク質提示ソフトウェアを実行するために構成されたプロセッサをさらに備え、該タンパク質提示ソフトウェアが、検出されたタンパク質のデータ表示を生成する、請求項５４記載のシステム。
【請求項５６】
データ表示を提示するディスプレイをさらに含み、複数のタンパク質の少なくとも一部において、第１の物理特性、第２の物理特性、およびタンパク質存在量が表示される、請求項５５記載のシステム。
【請求項５７】
第１および第２の特性が、ｐＩおよび疎水性を含む、請求項５６記載のシステム。
【請求項５８】
データ表示が２次元タンパク質マップを含み、第１の物理特性が第１の軸上に表され、かつ第２の物理特性が第２の軸上に表される、請求項５６記載のシステム。
【請求項５９】
以下の（ａ）〜（ｅ）を備える自動化タンパク質特徴決定システム：
ａ）第１の分離装置；
ｂ）自動化試料取扱い機器；
ｃ）該第１の分離装置および該試料取扱い機器に動作可能であるように連結された、第２の分離装置であり、該第２の分離装置が、該第１の分離装置からのタンパク質を受け取るように構成された装置；
ｄ）該第２の分離装置および該試料取扱い機器に動作可能であるように連結された質量分析装置であって、該第２の分離装置からのタンパク質を受け取るように構成された質量分析装置；および
ｅ）該試料取扱い機器、該第１の分離装置、該第２の分離装置、および該質量分析装置を制御する、プロセッサ。
【請求項６０】
プロセッサが、コンピュータメモリーおよびコンピュータプロセッサを含む、請求項５９記載のシステム。
【請求項６１】
プロセッサが、質量分析装置により分析された、分離されたタンパク質のデータ表示を作成するように構成される、請求項５９記載のシステム。
【請求項６２】
自動化試料取扱い機器が、切換可能な、多チャンネルバルブを備える、請求項５９記載のシステム。
【請求項６３】
データ表示を提示するディスプレイをさらに含む、請求項６１記載のシステム。
【請求項６４】
データ表示が、タンパク質電荷を表す第１の次元を含む、請求項６１記載のシステム。
【請求項６５】
データ表示がさらに、タンパク質分子量を表す第２の次元を含む、請求項６４記載のシステム。
【請求項６６】
データ表示がさらに、タンパク質存在量を表す、請求項６５記載のシステム。
【請求項６７】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項５９記載のシステム。
【請求項６８】
液相の第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項６７記載のシステム。
【請求項６９】
第２の分離装置が非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置を含む、請求項５９記載のシステム。
【請求項７０】
質量分析装置が、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項５９記載のシステム。
【請求項７１】
質量分析装置が、非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置からタンパク質を直接受け取るように構成される、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
第１の分離装置により分離されたタンパク質を、第２の分離装置へのタンパク質送達の前に処理するよう構成された固相抽出装置をさらに備える、請求項５９記載のシステム。
【請求項７３】
以下の段階を含む、タンパク質分離の自動化方法：
ａ）ｉ）複数のタンパク質を含有する試料と、
ｉｉ）第１の物理特性を基にタンパク質を分離する第１の分離装置と、
ｉｉｉ）第２の物理特性を基にタンパク質を分離する第２の分離装置と、
ｉｖ）質量分析装置と、
ｖ）切換可能な、多チャンネルバルブを備える、自動化試料取扱い機器とを提供する段階；
ｂ）該試料を該第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階であって、該第１の分離されたタンパク質試料が、複数の画分で該第１の分離装置から収集され、かつ該画分の各々が、該第１の物理特性の個別の範囲により定義される段階；
ｃ）該第１の分離されたタンパク質試料を、該第２の分離装置へ、該自動化試料取扱い機器を用いて送達する段階；
ｄ）該第１の分離されたタンパク質試料を、該第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；
ｅ）該第２の分離されたタンパク質試料を、該質量分析装置へ、該自動化試料取扱い機器を用いて送達する段階；および
ｆ）該第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、該質量分析装置で質量スペクトル分析し、タンパク質質量を特徴決定する段階。
【請求項７４】
自動化試料取扱い機器、第１の分離装置、第２の分離装置、および質量分析装置に動作可能であるように連結された集中制御ネットワークをさらに備え、該集中制御ネットワークが、該自動化試料取扱い機器、該第１の分離装置、該第２の分離装置、および該質量分析装置を制御するように構成される、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
固相抽出装置を提供する段階をさらに含み、第１の分離された試料を第２の装置で処理する前に、該第１の分離された試料が該固相抽出装置で処理される、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
試料が細胞溶解液を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７７】
第１の物理特性がタンパク質電荷である、請求項７３記載の方法。
【請求項７８】
第１の分離装置が等電点電気泳動装置を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７９】
第１の分離装置が液相分離装置を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
第２の分離装置が逆相ＨＰＬＣ装置を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８１】
逆相ＨＰＬＣが非多孔性逆相ＨＰＬＣを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
質量分析装置が、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析装置を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８３】
ｇ）該第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部において少なくとも第１の物理特性を提示する段階をさらに含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８４】
提示段階が、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部における第１および第２の物理特性の略図による表示を含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
第１および第２の特性が、ｐＩおよび疎水性を含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
略図による表示が２次元タンパク質マップを含み、第１の物理特性が第１の軸上に表され、かつ第２の物理特性が第２の軸上に表される、請求項８４記載のシステム。
【請求項８７】
略図による表示がさらに、該略図による表示において表されたタンパク質のタンパク質存在量を提示する、請求項８４記載の方法。
【請求項８８】
複数のタンパク質を含む試料が緩衝液をさらに含み、該複数のタンパク質が緩衝液中に可溶化され、かつ該緩衝液が第１および第２の分離装置に適合可能である、請求項７３記載の方法。
【請求項８９】
緩衝液がさらに、質量分析装置に適合可能である、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
緩衝液が、式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物を含有する、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
式ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドの化合物が、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドから選択される、請求項９０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願明細書は、２０００年２月８日に出願された米国特許仮出願第６０／１８０，９１１号、２０００年１０月１０日に出願された第６０／２３９，３２５号、２０００年１０月１０日に出願された第６０／２３９，３２６号、および２００１年１月３日に出願された第６０／２５９，４４８号の優先的恩典を主張するものであり、各々、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
本発明は、その一部が、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の政府基金、基金第２−Ｒ０１ＧＭ４９５００−５号および米国国立科学財団（ＮＳＦ）の基金第ＤＢＩ−９９８７２２０号により実施された。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、分離相間のタンパク質試料の移動を効率的に促進する方法を含む、多数の細胞タンパク質を分解しかつ特徴決定することが可能な多相タンパク質分離法に関する。特に本発明は、タンパク質試料の分離、同定および特徴決定のための自動化システムを提供する。
【０００４】
発明の背景
ヒトゲノムを含む多くのゲノムの核酸配列が利用できるようになったので、この情報の価値を解釈する必要性が増している。核酸配列の利用可能性は遺伝子の推定および同定を可能にするが、これは、これらの遺伝子から産生されたタンパク質の発現パターンは説明してはいない。ゲノムは、タンパク質レベルの動的プロセスは説明していない。例えば、遺伝子の同一性および遺伝子発現のレベルは、細胞内の活性タンパク質の量を表していないだけではなく、遺伝子配列も、タンパク質の機能および活性に必須であるような翻訳後修飾を説明していない。従って、ゲノムプロジェクトに並行し、様々な細胞、組織、および種のプロテオーム（すなわち、限定された条件下でのゲノムの定量的タンパク質発現パターン）を理解する試みが始められている。プロテオーム研究は、薬物の発見および開発のための標的を同定すること、並びに診断情報（例えば腫瘍マーカー）を提供することを求めている。
【０００５】
研究の重要な領域は、細胞のタンパク質含量の研究である（すなわち、細胞において発現されたタンパク質の特性および量）。この分野は、多数のタンパク質を分離することができ、かつ非常に定量的に行うことができるために、タンパク質の発現または構造における変化を検出することができるような方法を必要としている。そのような細胞のタンパク質分離を実施するために一般に使用される方法は、２−Ｄ ＰＡＧＥである。この方法は、第１の次元においてｐＩを基に、および第２の次元においてタンパク質サイズを基に、数百のタンパク質を分解することが可能である。この方法で分離されたタンパク質は、一般に定量可能な染色法を用いて視認される。この結果は、タンパク質マップがｐＩおよびおおよその分子量を基にしている２次元画像である。コンピュータベースの画像解析技術を使用することにより、様々な細胞株において差異を伴って発現されたタンパク質を検索することができる。これらの方法を用い、細胞の形質転換および癌の進行のような状態、細胞加齢、環境傷害（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｎｓｕｌｔ）に対する細胞の反応、および薬剤に対する細胞の反応に連結したタンパク質発現の変化をモニタリングすることができる。タンパク質発現の変化が確定されたならば、次に更にそれらの同一性およびそれらが配列の変化または翻訳後修飾によりそれらの予想される構造から変化したかどうかを決定するために、標的タンパク質を更に分析することができる。
【０００６】
２−Ｄ ＰＡＧＥは、依然タンパク質分析に広範に使用されているが、この方法には、労働集約的であり、時間がかかり、自動化が困難であり、かつ容易に再現できないことが多いという事実を含むいくつかの制限がある。加えて、特に差異を伴って発現実験において、定量は困難で動的範囲に限定されることが多い。更に、２−Ｄゲルは、細胞内のタンパク質画像を形成することができない一方で、質量決定はわずかに５〜１０％の精度であることが多く、かつこの方法は更なる分析のための質量分析とインターフェースすることが困難である。
【０００７】
別の２−Ｄ ＰＡＧＥの制限は、１個のゲルに負荷されるタンパク質の量が一般に２５０μｇ以下であることである。従って所定のスポット内のタンパク質の量は、更に分析を行うにはあまりにも少なすぎる。クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色されたゲルの検出限界は、１００ｎｇ／スポットであり、それ以上に、銀染色されたゲルについては検出限界は１０ｎｇである。更に、２−Ｄゲル中で単離されたタンパク質は、ゲル構造内部に包埋されており、かつ溶液中には遊離しておらず、その結果更なる分析のためのタンパク質の抽出を困難にしている。これらの制限のために、当技術分野は、効率的で、自動化され、かつ現在利用可能な技術よりも広範な解像能を有するタンパク質マップ作製法を必要としている。
【０００８】
発明の概要
本発明は、分離相間のタンパク質試料の移動を効率的に促進する方法を含む、多数の細胞タンパク質の分解および特徴決定が可能であるようなする多相タンパク質分離法に関する。特に、本発明は、タンパク質試料の分離、同定および特徴決定のための自動化システムを提供する。
【０００９】
例えば、本発明は、以下の段階を含むタンパク質を提示する方法を提供する：１）ｉ）複数のタンパク質を含有する試料、ｉｉ）第１の分離装置、およびｉｉｉ）第２の分離装置を提供する段階；２）試料を第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成し、ここで第１の分離されたタンパク質試料が、第１の分離装置から複数の画分で収集され、各画分が個別のｐＨ範囲により定義される（すなわち、各画分は、特定のｐＨ範囲内で、第１の分離装置から溶離されるタンパク質を含む）段階；第１の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；並びに、第２の分離されたタンパク質試料を質量分析法により分析し、２次元タンパク質マップを作製する段階。好ましい態様において、この２次元タンパク質マップは、タンパク質のｐＩ点を表している第１の次元を含む。更に別の好ましい態様において、この２次元タンパク質マップは更に、タンパク質の分子量を表している第２の次元を含む。
【００１０】
本発明は更に、下記を備えるシステムを提供する：第１の分離装置；複数の画分において第１の分離装置からのタンパク質の溶離が可能な緩衝液；各画分が個別のｐＨ範囲により定義された複数の画分に分離されたタンパク質を受け取ることが可能である、第１の送達装置；第２の分離装置が第１の送達装置からタンパク質を受け取るように構成されている、第２の分離装置；第２の分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能である、第２の送達装置；第２の送達装置からタンパク質を受け取るように構成された質量分析装置；並びに、該システムに連結されたプロセッサで、ここで該プロセッサは、質量分析装置により分析された分離されたタンパク質の２次元データ表示を作成することが可能である。好ましい態様において、このシステムは更に、データ表示の提示が可能な提示システムを備える。別の好ましい態様において、この２次元データ表示は、タンパク質のｐＩ点を表している第１の次元を含む一方で、更に別の好ましい態様において、この２次元データ表示は更に、タンパク質分子量を表す第２の次元を含む。
【００１１】
本発明は更に、以下の段階を含むタンパク質の提示法を提供する：ｉ）複数のタンパク質を含有する試料、ｉｉ）等電点分離装置、およびｉｉｉ）逆相ＨＰＬＣ分離装置を提供する段階；試料を等電点分離装置により処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階；該第１の分離されたタンパク質試料の該逆相ＨＰＬＣ分離装置により処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；並びに、第２の分離されたタンパク質試料を質量分析法（例えば、ＥＳＩ ｏａＴＯＦ／ＭＳ）により分析し、２次元タンパク質マップを作成する段階。好ましい態様において、等電点分離装置は、液相分離装置を含む。更に好ましい態様において、逆相ＨＰＬＣは、非多孔性逆相ＨＰＬＣを含む。一部の好ましい態様において、この方法は更に、２次元タンパク質マップにおいて少なくとも１種のタンパク質の特性を決定する段階を含む。例えば、一部の態様において、同定は、該２次元タンパク質マップの少なくとも一部を、対照タンパク質マップと比較する段階を含む。
【００１２】
一部の好ましい態様において、複数のタンパク質を含有する試料は、更に、緩衝液を含み、ここで複数のタンパク質は、緩衝液中に可溶化されており、かつこの緩衝液は前記２種の分離装置に適合する。更に別の好ましい態様において、緩衝液は更にＥＳＩ ｏａＴＯＦ／ＭＳに適合する。
【００１３】
本発明は更に、下記を備えるシステムを提供する：等電点分離装置；等電点分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能であるような第１の送達装置；逆相ＨＰＬＣ分離装置、ここでこのＨＰＬＣ分離装置は、第１の送達装置からタンパク質を受け取るよう構成されている；逆相ＨＰＬＣ分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能であるような第２の送達装置；および、第２の送達装置からタンパク質を受け取るように構成されたＥＳＩ ｏａ ＴＯＥ／ＭＳ装置。一部の態様において、このシステムは更に、該システムに接続されたプロセッサを備え、ここでこのプロセッサは、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ装置により分析された分離されたタンパク質のデータ表示を作成することが可能である。更に別の態様において、システムは更に、データ表示の提示が可能であるような提示システムを含む。好ましい態様において、この提示システムは、データ表示を２次元タンパク質マップとして提示することが可能である。特に好ましい態様において、この２次元タンパク質マップは、平面図タンパク質バンド形式において質量スペクトルを提示する。別の好ましい態様において、この２次元タンパク質マップは、タンパク質のリン酸化状態または他の小さい変動（例えば、メチル化、グリコシル化、リピド化、切断、アミノ酸置換などにおける差異）の間の区別を可能にする解像度を有する。好ましい態様において、等電点分離装置は、液相分離装置を含む。更に別の好ましい態様において、逆相ＨＰＬＣ装置は、非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置を含む。
【００１４】
本発明は更に、以下の段階を含むタンパク質を提示する方法を提供する：複数のタンパク質を含む試料、第１の分離装置、ここでこの第１の分離装置は第１の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）、および第２の分離装置、ここでこの第２の分離装置は液相分離装置でありかつここでこの第２の分離装置は第２の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）を提供する段階；試料を第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階；第１の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；並びに、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を、複数のタンパク質の少なくとも一部の第１および第２の物理特性が明らかにされるような条件下で提示する段階。一部の好ましい態様において、第１および第２の物理特性は、電荷、疎水性、および分子量を含むが、これらに限定されるものではない。一部の態様において、この提示は、２次元提示を生じるが、別の態様においては、提示は３次元（例えば、第３の物理特性の提示）または多次元である。
【００１５】
一部の態様において、複数のタンパク質を含む試料は更に、緩衝液を含み、ここで該複数のタンパク質は、この緩衝液中に可溶性であり、かつここでこの緩衝液は、第１および該第２の分離装置に適合することができる。一部の好ましい態様において、緩衝液は更に、質量分析法に適合することができる。一部の態様において、緩衝液は、式ｎ−オクチル（糖）ピラノシド（例えば、ｎ−オクチルＣ６−Ｃ１２グリコピラノシド、ここでＣ６−Ｃ１２グリコピラノシドは、６〜１２個の炭素の糖ピラノシドである）の化合物を含む。この糖成分は、いずれか特定の糖には限定されず、かつｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの化合物を含む。
【００１６】
一部の好ましい態様において、この試料は、細胞溶解液（例えば、動物、植物、および微生物由来の細胞；癌細胞；組織培養細胞；様々な発生または分化段階の細胞；胚細胞；組織；など）を含む。しかし、本発明は、細胞溶解液の使用には限定されない。例えばこの試料は、精製されたおよび一部精製されたタンパク質調製物を含むことができる。本発明は更に、タンパク質の性質には制限されない。例えばタンパク質は、タンパク質断片、ポリペプチド、修飾されたタンパク質（例えば、リピド化、グリコシル化、リン酸化など）、タンパク質複合体（例えば、タンパク質／タンパク質、タンパク質／核酸）、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、疎水性タンパク質、親水性タンパク質、膜タンパク質、細胞表面タンパク質、核タンパク質、転写因子、構造タンパク質、酵素、受容体などを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の一部の態様において、第１の分離装置は、液相分離装置を含む。しかし第１の分離装置は、液相装置に限定されるものではない。例えば、第１の分離装置は、ゲル−ベースであることができ、またはイオン排除、イオン交換、順相／逆相分配、サイズ排除、リガンド交換、液相／ゲル相等電点電気泳動、および吸着クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではないような方法から選択することができる。一部の好ましい態様において、第１の分離装置は、等電点電気泳動装置を含む。本発明の一部の態様において、第２の分離装置は、逆相ＨＰＬＣを含む。一部の好ましい態様において、逆相ＨＰＬＣは、非多孔性逆相ＨＰＬＣを含む。本発明のある態様は、液相でない（例えばゲル−相）ような第２の分離装置を利用することができる。
【００１８】
本発明の一部の態様において、この方法は更に、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも１種のタンパク質の同一性を決定する段階を含む。本発明はタンパク質の同一性を決定するいずれか特定の方法に限定されるものではないが、一部の態様において、この方法は、質量分析法により第２の分離されたタンパク質試料から少なくとも１種のタンパク質を分析することを含む。
【００１９】
本発明は更に、以下の段階を含むタンパク質の特徴決定法も提供する：ｉ）複数のタンパク質を含む試料、ｉｉ）第１の分離装置、ここでこの第１の分離装置は第１の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）、およびｉｉｉ）第２の分離装置、ここでこの第２の分離装置は液相分離装置でありかつここでこの第２の分離装置は第２の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）を提供する段階；試料を第１の分離装置で処理し、第１の分離されたタンパク質試料を作成する段階；第１の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；並びに、第２の分離されたタンパク質試料を、複数のタンパク質の少なくとも一部の第１および第２の物理特性が分析されるような条件下で特徴決定する段階。一部の態様において、特徴決定は、第２のタンパク質試料中の２種以上のタンパク質の第１の物理特性および第２の物理特性の定量を含む。別の好ましい態様において、特徴決定は、第２の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を質量分析法により分析する段階を含む。更に別の態様において、この特徴決定は、第２の分離されたタンパク質試料由来の少なくとも１種のタンパク質の同一性を、質量分析法により決定する段階を含む。
【００２０】
本発明は更に、以下の段階を含むタンパク質発現パターンを比較する方法を提供する：ｉ）複数のタンパク質を含む第１および第２の試料、ｉｉ）第１の分離装置、ここでこの第１の分離装置は第１の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）、およびｉｉｉ）第２の分離装置、ここでこの第２の分離装置は液相分離装置でありかつここでこの第２の分離装置は第２の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）を提供する段階；第１および第２の試料を第１の分離装置で処理し、第１および第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；第１および第２の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置で処理し、第３および第４の分離されたタンパク質試料を作成する段階；並びに、第３の分離されたタンパク質試料の第１および該第２の物理特性を、第４の分離されたタンパク質試料の第１および第２の物理特性と比較する段階。一部の態様において、第１および第２の試料は、段階ｂ）の前に単独の試料と一緒にされる（すなわち、試料は並行または順にというよりも一緒に試行される）。一部の態様において、第１の試料中のタンパク質の少なくとも一部は、第１の標識を含み、かつ第２の試料中のタンパク質の少なくとも一部は、第２の標識を含む。一部の態様において、この比較は、第３および第４の分離されたタンパク質試料の少なくとも一部を質量分析法により分析する段階を含む。
【００２１】
本発明は更に、下記を備えるシステムを提供する：第１の分離装置、ここでこの第１の分離装置は第１の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能である（すなわちそのために構成されている）；第１の分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能である（すなわちそのために構成されている）第１の送達装置；第２の分離装置、ここでこの第２の分離装置は、液相分離装置でありかつここでこの第２の分離装置は第２の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能であり（すなわちそのために構成されている）、かつこの第２の分離装置は、第１の送達装置からタンパク質を受け取ることが可能である（すなわちそのために構成された）；第２の分離装置により生成されたタンパク質を検出することが可能な（すなわちそのために構成された）、検出システム；検出システムに接続されたプロセッサ、ここでこのプロセッサは、第２の分離装置により生成されたタンパク質のデータ表示を行う；並びに、複数のタンパク質の少なくとも一部の第１および第２の物理特性が明らかにされるような条件下で、データ表示を提示することが可能な（すなわちそのために構成された）、提示システム。一部の態様において、このシステムは更に、第２の分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能な（すなわちそのために構成された）、第２の送達装置；並びに、第２の送達装置からタンパク質を受け取ることが可能な（すなわちそのために構成された）、質量分析装置を備える。
【００２２】
本発明は、更に以下の段階を含む方法を提供する：ｉ）複数のタンパク質を含む試料、ｉｉ）第１の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能な第１の分離装置；ｉｉｉ）第２の物理特性を基にタンパク質を分離することが可能な第２の分離装置；ｉｖ）質量を基にタンパク質を分離することが可能な質量分析装置；および、ｖ）自動化試料取扱い機器を提供する段階；並びに、試料を第１の分離装置で処理し、複数の画分で第１の分離装置から収集された第１の分離されたタンパク質試料を作成し、各画分は別個の物理特性により定義されるような段階；第１の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置へ、自動化試料取扱い機器を用いて移す段階；第１の分離されたタンパク質試料を第２の分離装置で処理し、第２の分離されたタンパク質試料を作成する段階；第２の分離されたタンパク質試料を質量分析装置へ、自動化試料取扱い機器を用い移す段階；並びに、第２の分離されたタンパク質試料を質量分析装置で分析し、３次元タンパク質マップを作成する段階。
【００２３】
一部の態様において、この方法は更に、自動化試料取扱い機器、第１の分離装置、第２の分離装置、および質量分析装置へ動作可能に連結された集中制御ネットワークを備える。一部の好ましい態様において、集中制御ネットワークは、自動化試料取扱い機器、第１の分離装置、第２の分離装置、および質量分析装置を制御するように構成されている。一部の態様において、集中制御ネットワークは、コンピュータメモリーおよびコンピュータプロセッサを備える。
【００２４】
一部の態様において、この方法は更に、固相抽出装置を備えている。一部の態様において、第１の分離された試料は、第２の装置で処理されるよう固相抽出装置で処理される。一部の態様において、自動化試料取扱い機器は、切換可能な、多チャンネルバルブを備える。
【００２５】
一部の態様において、複数のタンパク質を含有する試料は、更に緩衝液を含み、ここで複数のタンパク質は緩衝液中に可溶化され、かつここで緩衝液は第１の分離装置、第２の分離装置、および質量分析装置に適合している。一部の好ましい態様において、この緩衝液は、式ｎ−オクチル（糖）ピラノシドの化合物を含んでいる。本発明は、式ｎ−オクチル（糖）ピラノシドのいずれか特定の緩衝液に限定されふものではない。実際、様々な緩衝液が考案されており、これはｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むが、これらに限定されるものではない。一部の態様において、試料は細胞溶解液を含んでいる。
【００２６】
一部の態様において、第１の分離装置は、液相分離装置を含む。一部の態様において、液相分離装置はイオン交換分離装置である。一部の態様において、第２の分離装置は逆相ＨＰＬＣ分離装置を含む。一部の態様において、逆相ＨＰＬＣは、非多孔性逆相ＨＰＬＣを含む。
【００２７】
一部の態様においては、前述の第２の分離されたタンパク質試料の質量分析による分析の前に；第２の処理された試料が、第１の部分および第２の部分に分離され；並びに、第２の部分に酵素消化が施される。一部の態様において、質量分析段階は、第２の分離されたタンパク質試料のＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳによる分析を含む。本発明は、いずれか特定の質量分析技術に限定されるものではない。実際様々な質量分析技術が考案されており、これは、イオン捕獲型質量分析法、イオン捕獲／飛行時間型質量分析法、四重極およびトリプル四重極質量分析法、フーリエ変換（ＩＣＲ）質量分析法、および磁場型質量分析法を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
一部の態様において、３次元タンパク質マップは、タンパク質電荷を表している第１の次元、タンパク質疎水性を表している第２の次元、およびタンパク質質量を表している第３の次元を含む。一部の態様において、第２の複数のタンパク質を含む第２のタンパク質試料が分析されている。一部の態様において、３−Ｄタンパク質マップは、第１のタンパク質試料および第２のタンパク質試料の間のタンパク質発現パターンの比較を含む。
【００２９】
本発明は更に、下記を備えるシステムに動作可能なように連結された集中制御ネットワークを提供する：第１の分離装置；自動化試料取扱い機器；第１の分離装置および試料取扱い機器に動作可能なように連結された第２の分離装置、ここで第２の分離装置は、第１の分離装置からタンパク質を受け取るように構成されている；第２の分離装置および試料取扱い機器に動作可能なように連結された質量分析装置；ここで、質量分析装置は、第２の分離装置からタンパク質を受け取るように構成されており；および、ここで集中制御ネットワークは、試料取扱い機器、第１の分離装置、第２の分離装置を制御することが可能であり；並びに、質量分析装置。
【００３０】
一部の態様において、集中制御ネットワークは、コンピュータメモリーおよびコンピュータプロセッサを含む。一部の好ましい態様において、集中制御ネットワークは、質量分析装置により分析された分離されたタンパク質の３次元データ表示を作成することが可能である。一部の態様において、自動化試料取扱い機器は、切換可能な、多チャンネルバルブを備えている。
【００３１】
一部の態様において、このシステムは更に、３−Ｄデータ表示の提示が可能な提示システムを備えている。一部の態様において、３次元データ表示は、タンパク質電荷を表す第１の次元、タンパク質疎水性を表す第２の次元、およびタンパク質質量を表す第３の次元を含む。
【００３２】
一部の態様において、第１の分離装置は、液相分離装置を含む。一部の態様において、液相分離装置は、イオン交換分離装置である。一部の態様において、第２の分離装置は、逆相ＨＰＬＣ分離装置を含む。一部の態様において、逆相ＨＰＬＣ分離装置は、非多孔性逆相ＨＰＬＣ装置を含む。
【００３３】
発明の全般的説明
本発明は、分離相間のタンパク質試料の移動を効率的に促進するための方法を含む、多数の細胞タンパク質を分解することが可能な、多相タンパク質分離法に関する。本発明の方法は、タンパク質発現パターンを画像化しかつ比較するためのタンパク質プロファイルマップを提供する。本発明は、タンパク質プロファイルのスクリーニングのための従来の２−Ｄゲル分離法に代わるものを提供している。従来の２−Ｄ ＰＡＧＥの多くの制限は、その分離媒体としてのゲルの使用に起因している。本発明は、２−Ｄ ＰＡＧＥ技術に勝る顕著な利点をもたらす分離の為の代わりの媒体を提供する。例えば、一部の態様において、本発明は、２次元分離を使用し、ここで第２の次元の分離は、最終分離がゲル中で生じる２−Ｄ ＰＡＧＥ技術とは異なり、液相で生じるような方法を提供する。
【００３４】
本発明は、非常に効率的で、自動化し易く、かつ詳細な解像度を提供するようなタンパク質分離およびマッピングのためのシステムおよび方法を提供する。例えば、本発明の一部の方法において、タンパク質は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いそれらのｐＩに従い（例えば、ロトフォアにおいて）；非多孔性逆相ＨＰＬＣを用いそれらの疎水性に従い（ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ）；および、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳまたはその他の質量分析技術を用い質量に従い分離される。本発明は更に、分離装置（例えば、第１の相分離装置）からタンパク質を溶離するための新規技術を提供する。例えば、本発明のひとつの態様において、第１の次元で溶離されたタンパク質は、それらのｐＨに従い、各ｐＨ単位またはそれらの画分のいずれかで、一度に カラムから「剥離（ｐｅｅｌｅｄ ｏｆｆ）」される。一部の態様において、これらの集束された液体画分は次に、第２の次元においてそれらの疎水性およびサイズ（または他の所望の特性）に従い分離される。例えばＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣからの液体画分は、質量分析法（例えば、ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ）を用い直接オンラインで簡便に分析し、第３の次元を提供するようなそれらの分子量および相対的存在量を得ることができる。結果的に、仮想の２−Ｄタンパク質画像が作成され、かつ２Ｄゲル画像に類似している。
【００３５】
本発明の開発時に行われた実験は、これらの方法は、非常に多数のタンパク質の分離を可能にすることを明らかにした。これらのタンパク質の２−Ｄ画像は２−Ｄゲルのものと類似しているが、これは特定の細胞株由来の独特なパターンを観察することを目的として作成することができる。このタンパク質パターンは、相対的存在量情報、高い質量解像度並びに精度の高いｐＩおよび質量値を提供する。強度、質量およびｐＩ値が再現可能であるならば、異なる細胞、組織、または試料から得られる２−Ｄ画像を、関心のある点を確定するために定量的に比較することができるようなタンパク質の差異を伴って発現を試験することができる。更に、タンパク質が分離を通じて液相に存在するならば、一般に分析の自動化および速度が促進される。ＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳと略される本方法は、複雑なタンパク質混合物の分離および細胞タンパク質発現の高解像度の２−Ｄ画像の作成の実行可能な代替法であることが示されている。
【００３６】
本発明の一部の態様において、タンパク質は、イオン排除、イオン交換、順相／逆相分配、サイズ排除、リガンド交換、液相／ゲル相等電点電気泳動、および吸着クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない、非常に多数のタンパク質分離技術のいずれかを用い、第１の次元で分離される。本発明の一部の好ましい態様において、第１の次元は液相分離法である。第１の分離由来の試料を、第２の次元の分離を通過させる。本発明の好ましい態様において、第２の次元の分離は液相において行われる。その後第２の次元の分離由来の生成物が特徴決定される。例えば好ましい態様において、第２の分離段階の生成物は、第１および第２の分離段階（例えば、第１および第２の物理特性が、タンパク質の少なくとも一部について明らかにされるような条件下）において識別されたタンパク質の物理特性を基にした２−Ｄ形式で検出および提示される。これらの生成物は、生成物または生成物サブセットの質量および／または同一性を決定するために、例えば質量分析法により分析される。これらの態様において、３次元の特徴決定を適用することができる（すなわち、最初のふたつの分離段階の物理特性および質量分析データを基にして）。他のタンパク質処理段階は、この処理のいずれかの段階で行うことができることことが考案されている。
【００３７】
本発明の特定の態様において、これらの段階は、自動化システムにおいて組合わせられている。好ましい態様において、これらの各段階は自動化されている。例えば本発明は、タンパク質試料が該システムに適用されかつ使用者が発現マップの提示またはその他の望ましいデータ出力を受け取るために、動作可能な組合せで各分離要素および検出要素を含むようなシステムを提供する。自動化を達成するために、好ましい態様において、各段階の生成物は、引き続きのひとつまたは複数の段階と適合できなければならない。
【００３８】
本発明のある例証的な態様において、タンパク質は、ロトフォアの等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いそれらのｐＩに従い、並びにＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣを用いそれらの疎水性および分子量に従い、分離される。この組合わせた分離法は、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣと略される。質量分析法（ＭＳ）と組合せた場合、この技術は、３次元となり、かつ問題のタンパク質のｐＩおよび分子量を示すタンパク質マップの作成が可能になる。この情報は、更にタンパク質存在量も描いている画像にプロットすることができる。最終の結果は、ｐＩおよび分子量により分離されたタンパク質の複雑なパターンを示し、かつ相対的タンパク質存在量を指摘する、高解像度の画像である。この画像は、所定の細胞株または組織中のタンパク質が、病態、薬物療法、自然または誘導された分化、または環境条件によりいかに変化され得るかを決定するために使用することができる。この画像は、観察者が、画像中のいずれかのタンパク質のｐＩ、分子量、および存在量の変化を決定することを可能にする。ＭＳにインターフェースされた場合、いずれかの標的タンパク質の同一性も、酵素的消化およびペプチド質量マップ分析により得ることができる。加えて、この技術は、存在量の低いタンパク質が検出されるように、非常に高い負荷性（ｌｏａｄａｂｉｌｉｔｙ）（例えば、１ｇ）という利点を有する。
【００３９】
従来の２−Ｄ ＰＡＧＥ分離および提示技術において、第２の相分離は、ゲル（すなわち、液相ではない）において行われ、かつこれらのタンパク質は、分子量の差により分離されかつ検出される。対照的に本発明の一部の態様においては、第２の相分離は液相において行われる。本発明の第２の相分離技術の生成物は、更なる特徴決定および第２の相から作成されたデータの解釈に、はるかに良く適する。例えば本発明の一部の態様において、第２の相は、分離されたタンパク質生成物がピーク画分として容易に検出され、かつ第１および第２の分離段階の物理特性を基にしたコンピュータにより２次元において解釈および提示されるるようなＨＰＬＣを用いて実行される。液相であるＨＰＬＣ分離の生成物は、更なる検出段階（例えば、質量分析法）において容易に使用される。本発明の方法は、従来の２−Ｄ ＰＡＧＥと比べ、より多くの試料が分析されることを可能にし、より効率的であり、自動化を促進し、かつ２−Ｄ ＰＡＧＥでは検出されないようなタンパク質分析を可能にする。
【００４０】
例えば、ある例証的本発明の態様において、ヒトの赤白血病（ＨＥＬ）細胞のタンパク質プロファイルは、本発明の方法に加え比較の目的で従来のゲルベースの方法を用いて分析される。使用された各分離方法を表している２次元画像が、作成される。タンパク質は分離され、次に本発明のＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣおよび２−Ｄ ＰＡＧＥ法を用いて収集される。次にこれらのタンパク質は、酵素により消化され、かつペプチド質量マップがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより決定される（タンパク質がこの方法では明白には同定できない場合は、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ、ＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ、ＮＭＲ、ウェスタンブロット、エドマン配列分析および質量分析法を含むが、これらに限定されるものではないような多くの技術により更なる分析を行い、タンパク質の更なる分析を補助することができる［例えば、Ｙａｔｅｓ、Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、３３：１（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１３：１９０７（１９９９）；ＮｅｕｂａｎｅｒおよびＭａｎｎ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：２３５（１９９９）；Ｚｕｇａｒｏら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９：８６７（１９９８）；Ｉｍｍｌｅｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９：１０１５（１９９８）；Ｒｅｉｄら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９：９４６（１９９８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０３：１７３（１９９２）；Ｍａｔｓｕｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１８：４０９（１９９７）；ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１６：１７９１（１９９５）を参照］）。
【００４１】
一部の態様において、タンパク質を、ＳｗｉｓｓおよびＮＣＢＩｎｒタンパク質データベースに対してペプチド質量マップを検索するために、ＭＳ−Ｆｉｔを用い、暫定的に同定した。この作業は、有用な質量範囲を伴う非常に多数のタンパク質が、本発明の方法を用いて分離されたこと、およびこれらのタンパク質の２−Ｄ画像が、特定の細胞株に関連した独特なパターンを観察する目的で再現可能なように作成されたことを明らかにした。本発明の方法は、２−Ｄ ＰＡＧＥ技術により認められなかったタンパク質の検出を可能にした。タンパク質が分離を通じて液相中に存在する場合には、分析の自動化および速度も大きく促進される。
【００４２】
一部の態様において、本発明は、自動化タンパク質分離および特徴決定システムを提供する。このシステムは完全に一体化され、かつ多相、直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）分離法を転移および統合する。一部の態様において、情報は、自動化システムにより多次元タンパク質マップを作成するソフトウェアへ転移される。自動化は、増大した速度、効率、および試料回収を提供する一方で、可能性のある夾雑源および試料喪失を排除する。
【００４３】
従って、本発明の方法は、タンパク質発現プロファイルの画像の作成に加え、更なる分析のための個々のタンパク質の収集とって有利な技術であることが示されている。これらの能力は、分化経路に加え、癌（例えば、Ｈａｎａｓｈ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｃｈｒａｍｂａｃｈ， Ａ．編集、１−４４頁［１９９８］参照）、細胞加齢（例えば、Ｓｔｅｌｌｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７：１４４５［１９９５］参照）、環境傷害に対する細胞の反応（例えば、Ｗｅｌｓｈら、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、５５：１４１［１９９６］参照）、またはいくつかの薬物に対する細胞の反応のような特定の状態に連動しているタンパク質発現の変化をモニタリングすることを可能にしている。タンパク質発現において同定された顕著な変化があるならば、それらの同一性およびそれらが配列変化および翻訳後修飾によりそれらの予想される構造から変更されたかどうかを決定するために、更に対象となるタンパク質を分析することができる。
【００４４】
定義
本発明の理解の助けとなるように、多くの用語および語句を、以下のように定義する。
【００４５】
本明細書において使用される「多相タンパク質分離」という用語は、少なくとも２種の分離段階を含むタンパク質分離を意味する。一部の態様において、多相タンパク質分離は、タンパク質の異なる物理特性を基にタンパク質を分離する２種以上の分離段階を意味する（例えば、タンパク質電荷を基に分離する第１の段階およびタンパク質疎水性を基に分離する第２の段階）。
【００４６】
本明細書において使用される「タンパク質プロファイルマップ」という用語は、試料のタンパク質含量の表示を意味する。例えば、「タンパク質プロファイルマップ」は、所定の細胞において発現された総タンパク質の２次元提示を含む。一部の態様において、タンパク質プロファイルマップは更に、細胞における総タンパク質のサブセットも提示することができる。 タンパク質プロファイルマップは、２種以上の試料間で「タンパク質発現パターン」（例えば、試料中に発現されたタンパク質の量および特性）を比較するために使用することができる。このような比較は、例えば、一方の試料（例えば、癌細胞）には存在するが他方（例えば、正常組織）には存在しないようなタンパク質、もしくはある試料中において、他と比べ過剰発現または過小発現されたものの同定における使用を認める。
【００４７】
本明細書において使用される「物理特性を基にしたタンパク質分離を可能にする分離装置」という用語は、２種以上のタンパク質種を含む試料中に存在するタンパク質間の物理特性の差異を基に互いにタンパク質（例えば、少なくとも１種のタンパク質）の分離が可能であるような構築物またはシステムを意味する。例えば、様々なタンパク質分離カラムおよび構築物が考案されており、これはイオン排除、イオン交換、順相／逆相分配、サイズ排除、リガンド交換、液／ゲル相等電点電気泳動、および吸着クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない。これらおよび他の装置は、他の特性の中でもとりわけ、それらのサイズ、電荷、疎水性、およびリガンド結合親和力を基にタンパク質を互いに分離することが可能である。「液相」分離装置は、溶液に含まれたタンパク質試料を利用する分離装置であり、ここでタンパク質は分離時に液相中に可溶化されて残留し、かつ装置から収集された生成物（例えば、画分）は、液相中にある。これは、タンパク質が分離時にゲル相に侵入するゲル電気泳動装置とは対照的である。液相タンパク質は、ゲル相と比べタンパク質の回収／抽出に遙かに良く適する。 一部の態様において、液相タンパク質試料は、続く各段階において処理する前に試料を変更する必要を伴うことなく、多段階（例えば、複数の分離および特徴決定の段階）処理において使用することができる（例えば、タンパク質の回収／抽出および再溶解の必要なし）。
【００４８】
本明細書において使用される「タンパク質の提示」という用語は、タンパク質試料内のタンパク質の存在を説明するために使用される様々な技術を意味する。提示は、コンピュータディスプレイ表示上のタンパク質の可視化、図表、オートラジオグラフィーフィルム、一覧、表、チャートなどを含むが、これらに限定されるものではない。「第１および第２の物理特性が明らかにされる条件下でのタンパク質の提示」は、提示された各タンパク質の少なくとも２種の異なる物理特性が明らかにまたは検出可能にされるための、タンパク質（例えば、分離装置から得られたタンパク質、またはタンパク質のサブセット）の提示を意味する。例えばこのような提示は、各タンパク質の第１および第２の物理特性を説明する（例えば、定量する）欄を含む表、並びに各タンパク質が、ＸおよびＹ座標は、各々、第１および第２の物理特性により規定されるか、またはその逆であるようなＸ、Ｙ位置により表されているような２次元提示含むが、これらに限定されるものではない。このような提示は更に、追加の物理特性を含むような多次元提示（例えば、３次元提示）も含む。
【００４９】
本明細書において使用される「タンパク質試料の第１および第２の物理特性が分析されるような条件下での特徴決定」という用語は、２種以上のタンパク質の特徴決定を意味し、ここで２種の異なる物理特性が分析された（例えば、提示された、コンピュータ処理されたなど）各タンパク質に割り付けられており、かつ特徴決定の結果は、これらの２種の異なる物理特性を基にタンパク質を範疇化（すなわちグループ化および／または識別化）している。例えば、一部の態様において、２種のタンパク質は、等電点および疎水性を基に分離される。
【００５０】
本明細書において使用される「分離されたタンパク質試料の第１および第２の物理特性の比較」という用語は、各タンパク質試料内のタンパク質の２種の異なる物理特性を基にした、２種以上のタンパク質試料（または個別のタンパク質）の比較を意味する。このような比較は、２種の物理特性を基にした、試料中のタンパク質のグループ化、および２種の物理特性のただひとつを基にしたある種のグループの比較を含む（すなわち、グループ化は、他の物理特性の比較を組込んでいる）。
【００５１】
本明細書において使用される「分離装置から分離されたタンパク質を受け取ることが可能な送達装置」という用語は、タンパク質分離装置から１種以上の画分またはタンパク質試料を受け取り、かつそれらを別の装置（例えば、別のタンパク質分離装置、反応チャンバー、質量分析装置など）へ送達するようないずれかの装置（例えば、マイクロチューブ、トラフ、チャンバーなど）を意味する。
【００５２】
本明細書において使用される「タンパク質の検出が可能な検出システム」という用語は、タンパク質分離装置由来のタンパク質（例えば、分離装置から収集された１種以上の画分中のタンパク質）を検出するような、検出器、アッセイ、またはシステムのいずれかを意味する。このような検出システムは、タンパク質それ自身の特性（例えば、ＵＶスペクトル）を検出することができ、もしくは標識（例えば、蛍光標識）またはタンパク質に会合した他の検出可能なシグナルを検出することができる。検出システムは、タンパク質の検出された判定基準（例えば、吸光度、蛍光、ルミネセンスなど）を、電気的にまたは同様の方法（例えば、増倍型光電管または類似システムを通じて検出された）で処理し保存することができるシグナルへ変換する。
【００５３】
本明細書において使用される「装置と適合可能な緩衝液」および「質量分析法と適合可能な緩衝液」という用語は、このような装置（例えば、タンパク質分離装置）および技術において使用するのに適した緩衝液を意味する。緩衝液は、緩衝液が存在する場合に生じる反応が、装置または方法の意図された目的に一致する結果を生じる場合に適している。例えば、タンパク質分離装置と適合可能な緩衝液は、タンパク質を可溶化し、かつタンパク質が装置により分離されかつ収集されることを可能にする。質量分析法と適合可能な緩衝液は、タンパク質またはタンパク質断片を可溶化し、かつ質量分析後イオンの検出を可能にする緩衝液である。適当な緩衝液は、実質的にその意図された目的および結果を妨ぐように装置または方法と干渉することはない（すなわち、一部の干渉は許されることがある）。
【００５４】
本明細書において使用される「自動化試料取扱い機器」という用語は、自動化された方法またはシステム（例えば、自動化タンパク質特徴決定システム）の構成要素（例えば、分離装置）間で、試料（例えば、分離されたまたは分離されないタンパク質試料）の輸送が可能ないずれかの機器を意味する。自動化試料取扱い機器は、試料を輸送する物理的手段（例えば、多チャンネルバルブに連結されたチューブのマルチライン）を含むことができる。一部の態様において、自動化試料取扱い機器は、集中制御ネットワークへ接続されている。
【００５５】
本明細書において使用される「切換可能な多チャンネルバルブ」という用語は、自動化試料取扱い機器を通じて液の流れを方向付けるバルブを意味する。このバルブは、複数のチャンネルを有することが好ましい（例えば、２個以上、および好ましくは４個以上、およびより好ましくは６個以上）。加えて一部の態様において、個別のチャンネルへの流れは、オン／オフと「切換えることが可能」である。一部の態様において、バルブの切換は、集中制御システムにより制御される。切換可能な多チャンネルバルブは、複数の装置を１台の自動化試料取扱い機器へ接続することを可能にする。例えば、試料は、最初にシステムのひとつの装置（例えば、第１のクロマトグラフィー装置）を通じて方向付けられる。次に試料は、バルブの別のチャンネルを通じて、第２の装置（例えば、第２のクロマトグラフィー装置）へと方向付けられる。
【００５６】
本明細書において使用される「集中制御システム」または「集中制御ネットワーク」という用語は、複数の機器または装置（例えば、自動化試料取扱い機器および分離装置）に動作可能に連結された情報および装置の管理システム（例えば、コンピュータプロセッサおよびコンピュータメモリー）を意味する。好ましい態様において、集中制御ネットワークは、操作並びにネットワークに接続された機器および装置を制御するために構成される。例えば、一部の態様において、集中制御ネットワークは、複数のクロマトグラフィー装置の操作、装置間の試料の運搬、並びにデータの分析および表示を制御する。
【００５７】
本明細書において使用される「コンピュータメモリー」および「コンピュータ記憶装置」という用語は、コンピュータプロセッサにより読取り可能な保存媒体のいずれかを意味する。コンピュータメモリーの例は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、コンピュータチップ、ディジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、および磁気テープを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本明細書において使用される「コンピュータで読取り可能な媒体」という用語は、コンピュータプロセッサへの情報（例えば、データおよび指示）を保存しおよび提供するいずれかの装置またはシステムを意味する。コンピュータで読取り可能な媒体の例は、ＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスクドライブ、磁気テープおよびネットワーク上に媒体をストリーミングするサーバーを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本明細書において使用される「プロセッサ」および「中央演算処理装置」または「ＣＰＵ」という用語は、互換的に使用され、かつコンピュータメモリー（例えば、ＲＯＭまたは他のコンピュータメモリー）からのプログラムの読取りが可能であり、かつ該プログラムに従い段階のセットを実行するような装置を意味する。
【００６０】
本明細書において使用されるある装置から別の装置へのタンパク質試料の「直接供給」は、第１の装置から第２の装置への、処理段階を妨害することのないタンパク質の通過を意味する。例えば、タンパク質分離装置から質量分析装置へ直接供給されるタンパク質は、あらゆる妨害的消化段階を受けない（すなわち質量分析装置により受け取られたタンパク質は未消化のタンパク質である）。
【００６１】
本明細書において使用される「試料」という用語は、その最も広い意味で使用される。ある意味において、これは細胞溶解液を意味することができる。別の意味で、これは、生物学的および環境試料を含むいずれかの給源から得られる標本または培養物を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）から得られ、かつ体液、固形物、組織、および気体を包含している。生物学的試料は、血液産物（例えば、血漿および血清）、唾液、尿等を含み、かつ植物および微生物由来の物質を含んでいる。環境試料は、環境の物質、例えば表面材（ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｔｔｅｒ）、土壌、水、および工業的試料を含む。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６２】
発明の詳細な説明
本発明は多数の細胞タンパク質を分離する能力を有する新規の多次元分離法を提供する。以下の議論は４つの区分で提供される。（Ｉ）２相分離技術、（ＩＩ）改良型溶出技術、（ＩＩＩ）質量分析法技術および２−Ｄ提示システムおよび方法、ならびに（ＩＶ）迅速タンパク質特徴決定のための自動化３−Ｄ ＨＰＬＣ／ＭＣ法。
【００６３】
Ｉ）２相分離技術
第１の次元は第１の物理特性に基づいてタンパク質を分離する。例えば本発明のいくつかの態様では、タンパク質は第１の次元において等電点電気泳動法を用いてｐＩにより分離される（例えば、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、「生化学および分子生物学の実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」；Ｗｏｒｋ Ｔ Ｓ、Ｂｕｒｄｏｎ Ｒ Ｈ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、ｐ１０（１９８３）を参照のこと）。しかしながら、第１の次元はイオン排除、イオン交換、順相／逆相分離、サイズ排除、リガンド交換、液相／ゲル相等電点電気泳動法、および吸着クロマトグラフィーを含むが、それに限定されることはなく、多数の分離技術を活用してもよい。いくつかの態様（例えばいくつかの自動化態様）においては、分離段階の産物が第２の液相分離段階に直接導入されうるように、第１の次元が液相において実施されることが好ましい。
【００６４】
第２の次元は第２の物理特性（すなわち第１の物理特性とは異なる特性）に基づいてタンパク質を分離し、好ましくは液相（例えば液相サイズ排除）において実施される。例えば本発明のいくつかの態様においては、タンパク質は第２の次元において非多孔性逆相ＨＰＬＣを用いて疎水性により分離される（例えばＬｉａｎｇら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１０：１２１９（１９９６）；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、９：１５４６（１９９５）；Ｏｐｉｔｅｃｋら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５８：３４４（１９９８）；Ｎｉｓｓｏｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１１：６１０（１９９７）；Ｃｈｅｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１２：１９９４（１９９８）；Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９）；Ｃｈｏｎｇら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１３：１８０８（１９９９）を参照のこと）。本方法により、その疎水性および分子量にしたがってタンパク質を例外的に迅速および再現性高く高精度で分離される。これらの逆相（ＲＰ）分離において使用される非多孔性（ＮＰ）シリカ充填物質は、解析時間を３分の１にも減少させること、ならびに、多孔率およびより大きなタンパク質の低い回収率に関連する問題を解消する。ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣカラムの負荷能力がそうであるように、分離効率は球形粒子の小さな直径のために高いまま維持される。しかしながら、第２の次元は如何なる多数の分離技術も活用してよい。例えばある態様では、１−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥレーンゲルが使用される。第２の次元を液相において実施することは、分離されたタンパク質の効率的な解析を容易にし、産物が付加的な解析段階に直接導入されることを可能にする（例えば直接質量分析法解析）。
【００６５】
本発明の特定の態様においては、２番目のゲルベースのサイズ分離よりはむしろ２つの分離段階において使用される２つの物理特性に基づいているが、２−Ｄ ＰＡＧＥ画像に類似したタンパク質パターンを生成するために、第２分離段階から得られたタンパク質がソフトウェアを用いてマッピングされる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ． Ｐａｒｕｓ博士、ミシガン大学、化学部門、９３０ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州 ４８１０９−１０５５）。いくつかの態様では、ＲＰ ＨＰＬＣピークはＨＰＬＣから溶出されるピークの強度にしたがって、２−Ｄ画像において異なる強度のバンドとして表される。いくつかの態様では、ピークは液相におけるＨＰＬＣ分離の溶出物として収集される。
【００６６】
いくつかの態様では、第２の次元から収集されたタンパク質は、タンパク質分解酵素、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳＦｉｔデータベース検索を用いて同定された。ヒト赤白血病細胞溶解液を用いた実施例においては、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣを用いて、３．２〜９．５ ｐＩ範囲において約７００個のバンドが分離され、１２ｋＤａから７５ｋＤａの分子量範囲で３８個の異なるタンパク質が同定された。同一のヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞株溶解液の２−Ｄゲル分離と比較して、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣは低分子量および塩基性タンパク質の分離を改良した。加えて、タンパク質は分離を通して液相に残存し、それゆえ全過程を自動化し、ハイスループットで適用可能となる。
【００６７】
特定の好ましい態様は以下に詳細に記載される。これらの記載された実施例は本発明の範囲を限定することを意図しない。例えば、実施例はヒト組織および試料を用いて記載されているが、本発明の方法および装置は、植物および微生物由来の試料を含む任意の所望のタンパク質試料を使用することができる。
【００６８】
Ａ．ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ法
以下の記載は、本発明の方法にしたがって、等電点電気泳動法（第１の次元）およびＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離（第２の次元）を実施するための特定の好ましい態様を提供する。
【００６９】
１．ＩＥＦ分離
溶解緩衝液を用いてタンパク質は細胞から抽出される。効率的な処理を容易にするためには、各段階の産物を次の段階に直接使用することを可能にするために、この溶解緩衝液は下流の分離および解析段階（例えば、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と互換性がなければならない。そのような緩衝液は処理の自動化において重要な局面である。したがって、好ましい緩衝液は２つの基準を満たさなければならない：（１）タンパク質を可溶化する；および（２）分離／解析法の各段階と互換性がある。本発明を以下に記載する特定の方法構成において使用するために適切な緩衝液を提供するが、当業者はタンパク質試料を緩衝液中に可溶化することにより、任意の特定の構成のための緩衝液の適切性を決定することができる。緩衝液に対してタンパク質が可溶性である場合、試料は所望の特定の分離および検出法の構成を通して処理される。所望の構成の最終段階が検出可能な情報（例えばイオンは質量分析解析において検出される）を生ずる場合、陽性の結果が得られる。または、方法の各段階の産物は、所望の産物の存在を決定するため（例えば、タンパク質が分離段階から溶出されるかを決定するため）解析されうる。
【００７０】
溶解緩衝液を用いてタンパク質を抽出した後、タンパク質は第１の次元で最初に分離される。この段階の目的は、その後のＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣおよび質量分析段階と互換性がある液体画分中でタンパク質が単離されることである。これらの態様においては、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧＩ、シグマ）を緩衝液中で使用する。ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドが、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣおよびその後の質量分析解析の両者と互換性がある、少数の界面活性剤の一つである。製剤ｎ−オクチル（糖）ピラノシドの界面活性剤は、これらの態様において用途が見出されたと考えられる。利用される溶解緩衝液は、６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１．０％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１０ｍＭジチオエリトリトール、および２．５％（ｗ／ｖ）担体両性電解質（３．５１〜１０ ｐＩ）であった。抽出後、上清のタンパク質溶液は、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）によりそのｐＩにしたがってタンパク質を分離することが可能な装置に負荷される。ここでは、タンパク質は、再びＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣと互換性があるべきである泳動緩衝液中で可溶化される。適切な泳動緩衝液は、６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、０．５％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１０ｍＭジチオエリトリトール、および２．５％（ｗ／ｖ）担体両性電解質（３．５〜１０ ｐＩ）であった。
【００７１】
この段階に使用してもよい３種の例示的な装置を下記に示す。
【００７２】
ａ）ロトフォア（Ｒｏｔｏｆｏｒ）
本装置（バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ））は、タンパク質をそのｐＩにしたがって液相中で分離する（例えば、Ａｙａｌａら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ６９：１１（１９９８）参照）。この装置により、高いタンパク質負荷、および実施に４〜６時間しか必要とされない迅速な分離が可能となる。タンパク質は５時間のＩＥＦ分離後、液体画分で回収される。これらの液体画分は、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣによりすぐに解析することができる。この装置は１ｇまでのタンパク質を負荷することができる。
【００７３】
ｂ）全ゲル溶出剤を用いた担体両性電解質ベースのスラブゲルＩＥＦ分離
タンパク質溶液がスラブゲルに負荷される場合に、タンパク質は同一のｐＩのタンパク質を含む一連のゲル幅のバンドに分離される。これらのタンパク質は、その後、全ゲル溶出剤（ＷＧＥ、バイオラッド）を用いて回収される。その後タンパク質は、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣによりすぐに解析することができる液体画分中で単離される。この種のゲルは、２０ｍｇまでのタンパク質を負荷することができる。
【００７４】
ｃ）全ゲル溶出剤を用いたＩＰＧスラブゲルＩＥＦ分離
ここでタンパク質は、イモービリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）ｐＩ勾配スラブゲルに負荷され、同一のｐＩのタンパク質を含む一連のゲル幅のバンドに分離される。これらのタンパク質は、ＷＧＥを用いてＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣによりすぐに解析することができる液体画分中に電気的に溶出される。ＩＰＧゲルは少なくとも６０ｍｇのタンパク質を負荷することができる。
【００７５】
２．ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣによるタンパク質分離
大量のｐＩ集束型タンパク質（ｐＩ−ｆｏｃｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む液体画分を獲得し、第２の次元分離を非多孔性ＲＰ ＨＰＬＣで行う。本発明の多相分離を容易にするために、本発明では別のＲＰ ＨＰＬＣ互換性界面活性剤（例えばｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）と非多孔性ＲＰ充填物質（Ｅｉｃｈｒｏｍ）を活用する新規の組み合わせを提供する。この界面活性剤はまた、低分子量のために質量分析法とも互換性がある。２−Ｄタンパク質分離を行うためにＩＥＦ後に第２の次元分離として、これらの型のタンパク質分離用ＲＰ ＨＰＬＣカラムを使用することは、本発明の新規の特徴である。それらに含まれる非多孔性充填は、最適なタンパク質回収および迅速で効率的な分離を提供するため、これらのカラムはこの作業によく適している。ＲＰ ＨＰＬＣと互換性がありながらタンパク質溶解度を増加させるいくつかの界面活性剤が現在までに言及されてきたが、この目的のために使用されうる多くの他の異なる低分子量非イオン性界面活性剤が存在することは注意すべきである。ＲＰ ＨＰＬＣが第２の次元として機能することを可能にするいくつかの重要な特性は以下のとおりである：これらの界面活性剤は（他の多くの界面活性剤とは異なり）ＲＰ ＨＰＬＣ、およびその後の質量分析解析ともまた互換性があるため、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドまたはｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等の非イオン性低分子量界面活性剤を、移動層は低いレベルで含むべきであり；カラムは高温（約６０℃）に保持されるべきであり；且つ多孔性充填に関連するタンパク質回収の問題を除去するためにカラムは非多孔性シリカを用いて充填されるべきである。
【００７６】
３．質量分析法によるタンパク質の検出および同定
本発明のいくつかの態様においては、第２の分離段階の産物は質量分析法を用いてさらに特徴決定される。例えば、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離から溶出されるタンパク質は、分子量および同一性を決定するために質量分析法により解析される。この目的のために、分離から溶出されるタンパク質は同時に解析され、分子量および同一性を決定することができる。溶出した画分はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ（ＬＣＴ、マイクロマス）（米国特許第６，００２，１２７号を参照）のいずれかを用いて、分子量を決定することができる。残りの溶出物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはＥＳＩ ｏａ ＴＯＦのいずれかにより、タンパク質消化およびペプチド質量マップフィンガープリント解析を介してタンパク質の同一性を決定するために使用される。分子量２−Ｄタンパク質マップは、分子量全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ’ｓ）をＵＶクロマトグラムと相関させること、および関連する様々な遅延時間を計算することにより適切な消化フィンガープリントに適合される。ＵＶクロマトグラムは消化フィンガープリント画分番号を用いて自動的に標識される。得られた分子量および消化質量フィンガープリントデータは、その後ＭＳＦｉｔ（ＵＣＳＦ）等のウエッブベースのプログラムによりタンパク質同一性を検索するために使用することができる。
【００７７】
４．自動化
先に記載された段階の全ては、例えば、あるひとつの別個の装置に自動化される。例示的な態様においては、第１の次元はロトフォアにより実施され、回収された液体画分は、適切なチューブを経由して直接第２の次元の非多孔性ＲＰ ＨＰＬＣ装置に適用される。第２の次元の分離由来の産物は、適切なコンピュータハードウェアおよびソフトウェアを用いてスキャニングされ、データが解釈され、および２−Ｄ表示として示される。または、第２の次元の画分由来の産物は、適切なマイクロチューブを通じて、質量分析解析用に調製するために試料を適切な酵素で処理する場である質量分析前反応室に輸送される。試料はその後、質量分析法により解析され、得られたデータは処理者に受け取られ、解釈される。出力データは、タンパク質同一性、タンパク質質量、タンパク質消化物に由来するペプチドの質量、任意の検出された物理特性（例えば、大きさ、電荷、疎水性等）に基づいたタンパク質の次元表示およびその他を含むが、それらに限定されることはない任意の数の望ましい解析を表す。好ましい態様では、タンパク質は装置の分離および解析ユニットの各々と互換性がある緩衝液中に可溶化される。本発明の自動化システムを用いることにより、２−Ｄゲルに使用されている同様の自動化システム技術よりも１桁安いタンパク質解析システムが提供される（例えば、ＦｉｇｅｙｓおよにＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． １２１：７（１９９９）；Ｙａｔｅｓ、Ｊ． Ｍａｓｓ． Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、３３：１（１９９８）およびＰｉｎｔｏら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１８１（２０００））。
【００７８】
５．ソフトウェアおよびデータ提示
上記に列挙された技術により生成されたデータは、従来の２−Ｄゲル画像に類似した２−Ｄ画像として提示されてもよい。いくつかの態様では、クロマトグラム、ＴＩＣまたは統合およびデコンボリューションされた質量スペクトルがＡＳＣＩＩ形式に変換され、その後ピークが白色の背景に対して濃色のバンドとして提示されるような２５６段階のグレースケールを用いて垂直にプロットされる。スケールはまた、カラー形式でも可能であると思われる。この方法により生成される画像は、ｐＩ、疎水性、分子量、および分離されたタンパク質の相対的存在量に関する情報を提供する。したがって、その画像は、ｐＩ、疎水性、分子量、および相対的存在量に関して、細胞タンパク質プロファイルにおける興味深い変化をつきとめるために使用可能なタンパク質パターンを提示する。当然ながら、画像を特定の領域のより詳細な拡大図を示すために調節することができ、または、より少ないタンパク質のより明らかな画像が示されるように、豊富なタンパク質シグナルを飽和することができる。この情報を、疾患状態、薬学的治療、および環境条件の影響を評価するために使用することができる。画像は自動的にデジタル化されるため、画像を容易に保存することができ、問題の細胞のタンパク質プロファイルを解析するために使用することができる。画像に基づくタンパク質バンドはペプチド質量フィンガープリントおよびＭｓＦｉｔ検索結果等のバンドの解析を通して得られた他の実験結果にハイパーリンクさせることができる。したがって、詳細な質量スペクトル、データ解析、および相補性実験（例えば免疫アフィニティーおよびペプチド配列決定）を含む、与えられた２−Ｄ画像に関して獲得された全ての情報に、元々の画像からアクセス可能である。
【００７９】
先に列挙された技術により生成されたデータはまた、単純な読み出しとして提示されてもよい。例えば、２個またはそれ以上の試料が比較される場合に（下記のＪ節を参照）、提示されるデータは試料間の相違または類似性を詳述してもよい（例えば、試料間で同一性または量が異なるタンパク質のみを列挙する等）。この点において、試料間（例えば対照試料および実験試料）の相違が特定の条件（例えば癌細胞、毒素暴露等）を示す場合は、読取りは単純にその条件の存在または同一性を示してもよい。ある態様において、読取りは、特定のタンパク質の存在を単純に＋／−、または解析される特定の条件に関連する発現パターンを表示する。
【００８０】
６．ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣの稼動
図１に示されるＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣの画像は、ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞株由来の全細胞タンパク質溶解液における２次元分離のデジタル提示である。この画像は２−Ｄゲルを用いて得られる可能性のあるパターン認識およびタンパク質プロファイリングと同一の利点を提供するように設計されている。水平および垂直の次元はそれぞれ、等電点およびタンパク質疎水性に関する。ロトフォアを用いて実施される等電点電気泳動法段階は、ｐＨ３．２から９．５の範囲の２０個のタンパク質画分を生じた。これらの画分はその後、ＨＰＬＣによる分離およびＵＶ吸光度（２１４ｎｍ）による検出のために非多孔性逆相カラムに注入された。得られたクロマトグラムはＡＳＣＩＩ形式に変換され、その後ピークが白色の背景に対して濃色のバンドとして提示されるような２５６段階のグレースケールを用いて垂直にプロットされた。タンパク質プロファイルは、図２に示された拡大特性を用いて、および／または特定のロトフォア画分を選択し、図２の左図に示されたようにＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣクロマトグラムを観察することにより、より詳細に調べることができる。拡大およびクロマトグラム画像の特性は、元々の画像中では観察不可能でありうるバンドパターンの詳細を観察する方法を提供する（図１参照）。加えて、２５６段階のグレースケール提示は限界があるため、図１の面積１、２および３のバンド強度は存在量が少ないタンパク質をより良く示すために３倍で再スケールされた。いくつかの存在量の多いタンパク質バンドはいくつかの領域の低強度のバンドを検出不可能にしてしまう可能性があるため、このようにすることは好ましかった。図１においては、各個別のクロマトグラムの全ピーク面積は、元々のロトフォア画分に見出されたタンパク質の相対的存在量を反映するようにスケーリングされた（図３参照）。したがって、異なるクロマトグラムのバンド強度は直接的に比較することができ、それゆえ細胞溶解液中の相対タンパク質量の正しい画像が提供される。ロトフォア画分カラムの幅は、その推定ｐＨ範囲を表すように調節された。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣにより観察されたタンパク質の分子量は１２ｋＤａから７５ｋＤａの範囲であった。図４に示されるような典型的なＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離は１０．５分内に３５個のピークを生じた。全２０画分から観察することができる全ピーク数は約７００個と推定される。
【００８１】
上記の実験で使用された勾配時間（ｔＧ）は非常に短く、より長い勾配を用いることによりピーク能力が有意に増加することが期待される。これは、２つの分離が勾配時間１０．５分（図５Ａ参照）および２１分（図５Ｂ参照）を用いて実施されたロトフォア画分１７を用いて示される。ｔＧ＝１０．５分を用いて、平均ピーク幅は０．１４分であり、したがってピーク能力は７５であった。ｔＧ＝２１分を用いて、平均ピーク幅は０．２３分であり、したがってピーク能力は９１であった。実際に分離されたピーク数は５１個であった。ｔＧ＝２１分のより長い分離時間を用いると、観察されるピーク数は７００個から１０００個に増加するはずである。しかしながら、質量分析検出を使用する時は、より長い勾配時間を用いることなく、同数のピークを最終的に分離するために十分な分解能を得なければならないことに留意すべきである。
【００８２】
これらのピークの代表的な試料中のタンパク質は、従来の方法である酵素消化、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳペプチド質量分析、およびＭＳＦｉｔデータベース検索を用いて同定された。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ画像の拡大により、観察者が全体の画像中から観察可能なものよりもより多くのバンドを知覚可能になる。加えて、図２に示されるように、観察者は特定のバンド形式クロマトグラムを選択してもよく、画像の左のウインドウにある従来のピーク形式クロマトグラムを観察してもよい。これにより、観察者がバンド形式クロマトグラムにおいては観察不可能でありうる部分的に分離されたピークを見出すためにピーク形式クロマトグラムを使用することが可能となる。５個の標準タンパク質のバンドが最も左の欄に示されており、この質量範囲は１４．２ｋＤａから６７ｋＤａまでである。ＲＰ ＨＰＬＣはタンパク質を疎水性により分離するので、これらの標準は従来の１−Ｄゲルにおけるような分子量マーカーではない。むしろ、それらは観察される可能性のあるタンパク質分子量の範囲を示すために使用される。より多くのタンパク質が下記の表１に示されるように同定されたが、１０個の異なるタンパク質が画像上で標識されている。特定のタンパク質または特定のタンパク質クラスが検出されることが望ましい本発明のいくつかの態様においては、開始時のタンパク質試料は選択的に標識されてもよい。タンパク質が分離段階を経た後に、タンパク質の検出を選択標識を含むものに限定することができる。
【００８３】
Ｂ．２−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥによるタンパク質分離
図１の画像はＨＥＬ細胞タンパク質溶解液のＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離を示し、図６の画像は同一のＨＥＬ細胞株溶解液２−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥ分離のクーマシーブルー（ＣＢＢ）染色を示す。このゲルのｐＩ範囲はロトフォア分離に用いられたのと同じであり、分子量範囲は８ｋＤａから１４０ｋＤａである。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離に関しては、単離タンパク質の代表的な試料が、酵素消化、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、およびＭＳＦｉｔ法を用いて同定された（例えばＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０３：１７３（１９９２）参照）。本研究の標的タンパク質の質量範囲（１０ｋＤａ〜７０ｋＤａ）に関しては、約１８８個のタンパク質スポットがＣＢＢ染色ゲル上で観察され、ＣＢＢ染色ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）ブロットから３５５個、および銀染色ゲルから６５２個が、バイオ画像２Ｄ分析器（ＢｉｏＩｍａｇｅ ２Ｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ）第６．１版ソフトウェア（ゲノミックソリューション（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））を用いて推測されたように観察された。２−Ｄゲル分離の総スポット能力は２１００と推定される。ゲルから同定されたタンパク質は画像上に標識され、下記の表２にも示される。ＨＥＬ細胞タンパク質の別の２−Ｄゲル分離画像はＳｗｉｓｓ−２ＤＰＡＧＥデータベースを介して観察することができる（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ；Ｓａｎｃｂｅｚら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １６：１１３１（１９９５）参照）。加えて、１９個のタンパク質エントリーが示されるＨＥＬ細胞の最新のタンパク質リストを見ることもできる（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔ−ｃｈ２ｄ−ｔａｂｌｅ．ｐｌ）。
【００８４】
【表１】ＨＥＬ細胞ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離から同定された３８個のタンパク質
2004500567.tif 000003
＊トリプシンでのみ標識されたタンパク質は全て、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｅ）では消化されなかった。
【００８５】
【表２】ＨＥＬ細胞ＣＢＢ ２−Ｄゲルから同定された９個のタンパク質
2004500567.tif 000004
【００８６】
Ｃ．ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ対２−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：タンパク質負荷および定量
各分離法は多数の単離タンパク質を生成する分離の直交機構に基づいている。タンパク質プロファイルを、単離タンパク質の相対的存在量ならびにそのパターンに関して比較してもよい。しかし、本発明の液相法の負荷能力はゲル相の能力を大きくしのいでいることが示される。
【００８７】
銀染色によるゲル法の検出限界は約１〜１０ｎｇである。クーマシーブルー染色は１００ｎｇのタンパク質を検出することができ、スポットのタンパク質量は２．５桁の範囲にわたって定量することができる。本発明の方法の特定の態様において使用される標準タンパク質のＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣに関しては、ＵＶ検出器による検出限界は１０ｎｇである。ピーク中のタンパク質は１０ｎｇから２０μｇまでの範囲で定量可能であり、３．１桁となる。ＨＰＬＣピークの定量は面積を求めるためにピークを統合することを含む。ゲルに関しては、スポットを最初にデジタル化し、その後、対象となる各スポットの統合された光学密度を決定するためにこの画像を解析しなければならない。ＨＰＬＣを利用する本発明の態様において、ＵＶ検出器の感度は銀染色と同程度であり、そして定量はより単純である。銀染色ゲルおよびＨＰＬＣ ＵＶピーク検出両方の検出限界は質量依存性である。ゲルに関しては、分解能および感度はタンパク質の分子量に比例する。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣに関しては、分解能および感度はタンパク質の分子量に逆比例する。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣは塩基性領域のタンパク質および５０ｋＤａ未満のタンパク質でよりよく実施される一方、ゲルは酸性タンパク質および５０ｋＤａを超えるタンパク質に関して改善された結果を提供するようである（例えば図１および図６参照）。これらの結果は、ゲルおよびＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣの各々が、タンパク質含量に関して重要な情報を提供する場合に、これら２つの技術の相補的な性質を示す。
【００８８】
本発明の方法を用いたある実験において、２３．５ｍｇのタンパク質がロトフォアに負荷され、５時間のＩＥＦ分離時間後、２ｍＬから４ｍＬの範囲の画分をポリプロピレンマイクロチューブに回収した。各画分のタンパク質量は、０．２５ｍｇから１．０５ｍｇの範囲であった。各画分のタンパク質量を合計すると、全体で１０．２ｍｇのタンパク質がロトフォアから回収された。この量は、チオ尿素を添加することならびにロトフォア緩衝液中の非イオン性界面活性剤の量を現行の０．１％レベルよりも増加させることにより、増加させることができる。対照的に図６の２−Ｄゲルに負荷されたタンパク質の量は２００μｇであった。多くの疎水性タンパク質が分離の過程で失われることは知られているが（Ｈｅｒｂｅｒｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：６６０（１９９９））、実際にゲルに負荷されたタンパク質の量に対して相対的に、実際にゲルを通りぬけ、スポットに集中されるタンパク質の量は定量されなかった。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣに関して、最初に負荷されるタンパク質は１ｇであってもよいが、理論的にゲルに負荷してもよいタンパク質の量は５μｇから２５０μｇまでの範囲である。図１に示される分離を生ずるために実際に使用されたタンパク質の量は、最初にロトフォアに負荷された量のわずか一部分である。１０．２ｍｇのタンパク質がロトフォアから回収されたが、図１の画像は実際には全体で１〜２ｍｇのタンパク質の分離を表している。現在使用されているＨＰＬＣカラムの負荷は、ピーク能力が影響を受ける可能性はあるが、増加させることが可能であると考えられる。または、分離効率を損失することなく、より高い負荷能力を可能にするには、より小さなカラムと連続して、より大きなカラムを使用することが可能であると思われる（例えば、Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９）参照）。
【００８９】
２−Ｄゲルは細胞溶解液の最初の１回の負荷から２次元の分離を提供する。同一ゲル上の異なるスポットの強度は、元々の溶解液中のタンパク質の相対的存在量を表している。しかしながら、本発明のＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ法においては、２−Ｄ ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ画像におけるバンド強度が各ロトフォア画分からＨＰＬＣに負荷されたタンパク質の量に依存するように、ＩＥＦおよびＨＰＬＣ分離用にタンパク質が負荷される。各ロトフォア画分の物質量は異なっているため、各クロマトグラムの総面積は各ロトフォア画分から回収された総タンパク質量を表すようにスケール化された（図３参照）。結果として、タンパク質バンド強度は、ロトフォア画分内および異なる画分間の両方において比較することができる。
【００９０】
本発明のいくつかの態様において、２−Ｄゲル技術がＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣと共に使用される。特定のタンパク質をさらに特徴決定することが望ましい態様において、ゲルは、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣを用いて獲得された画分が１つまたは複数の所望のタンパク質を有することを示す情報を提供することができる。
【００９１】
Ｄ．等電点電気泳動法：液相対ゲル相
液相ＩＥＦの主たる懸念は、溶液中でのタンパク質の拡散のために、ゲル中のように効果的にタンパク質が等電点電気泳動されないことである。α−エノラーゼの場合には、液相およびゲル相の画像を比較すると、両方の場合に、広いｐＩ範囲にわたってかなりのタンパク質の拡散が生じているように見られる。この範囲は、液相およびゲル相の両者においてｐＩ ６．５からｐＩ ９．５に渡っている。βアクチン等のより酸性のタンパク質においては、対応するゲル分離されたタンパク質よりも、液相においてタンパク質がｐＩの次元により拡散しているようである。両方法により対象となるタンパク質のｐＩの合理的に正確な評価が提供される。表１に関しては、ロトフォア画分のｐＨが増加するにつれて、一般的にはその中に同定されたタンパク質のｐＩの増加も見られる。画分３のｐＨは４．２と計測され、この画分から同定されたタンパク質のｐＩは４．０９から５．７であった。画分９のｐＨは５．８と計測され、この画分から同定されたタンパク質のｐＩは５．２９から６．４５であった。画分１６のｐＨは７．２と計測され、そこに見出されたタンパク質のｐＩは７．０１から８．９３の範囲であった。従ってｐＩの正確性は＋／−０．６５から１．７３ ｐＩ単位である。これは担体両性電解質ベースのゲルと同等である。特定のタンパク質のｐＩはカルバミル化および酸化等の人工修飾、ならびにリン酸化および糖付加等の翻訳後修飾のために大きく変化しうることを忘れてはならない。
【００９２】
Ｅ．２次元液体分離
図４、画分１６は単離タンパク質の定量の例として使用されてもよい。画分１６に関しては、注入された量は１６０μＬであった。これは、タンパク質の濃度が２０１．４μｇ／ｍＬであった場合には、その時負荷されたタンパク質の量は３２．２μｇであったことを意味する。クロマトグラムはマイクロカルオリジン（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎ）ソフトウェアを用いて統合され、総面積は９７．７８と決定された。ピーク１６Ｅおよび１６Ｊの面積はそれぞれ３．６８および５．４１であった。ピーク面積を総面積で割ることにより、ピークにより提示されるタンパク質の割合が得られる。したがって、１００％のタンパク質回収を仮定するならば、１６中のＰＰＩＡＳＥ（１６Ｅ、ｔＲ＝５．６８）の量は（０．０３７６＊３２．２μｇ）１．２１μｇであり、α−エノラーゼ（１６Ｊ、ｔＲ＝７．４５）の量は（０．０５５３＊３２．３μｇ）１．７８μｇであった。ピーク面積は、タンパク質のアミド結合に対する２１４ｎｍの吸光度により生成され、そのため、それによりタンパク質の型に関わらずピーク中のタンパク質の量を良好に測定することを可能となる低い選択性を提供すると考えられる。
【００９３】
図４は、所定のピーク中のタンパク質の量を推定するために、どのようにクロマトグラムの連続的統合を使用することができるかを示す。ピーク面積線は、観察者が対象となるピークの幅に渡って生じている、垂直の質量軸の変化を測定することができ、質量単位に単純に変換される。細胞溶解液中の最初のタンパク質濃度および溶解された細胞数が既知である場合、異なる細胞溶解液中の定量的比較を実施することができる。この比較は、いくつかの疾患状態または薬学的治療のために生じるタンパク質発現レベルの変化を調べるために重要である。ゲル作業においては、異なる試料中のタンパク質の定量のために使用される技術は、発現レベルが一定であると考えられている標準タンパク質に対して、対象となるスポットの統合された光学密度を正規化することである。このようにしてスポット強度の任意の実験変動を補正することができる。この同一の方法が、発現レベルの変化が定量的に観察されるように、対象となるタンパク質の信頼性の高い定量を可能にするＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ画像に適用される。
【００９４】
これらの実験は１００％のタンパク質回収率を仮定している。実際の回収率（％）および溶出時間への依存を決定することが可能である。典型的なタンパク質回収率はＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣにおいて７０％から９５％の範囲であることが示されており（Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９））、そのためより可能性の高い回収率（％）である８０％では、画分１６中のＰＰＩＡＳＥおよびα−エノラーゼの量は各々１．０μｇおよび１．４２μｇと推定されるであろう。
【００９５】
Ｆ．ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ対１−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥのロトフォア画分解析
ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣは非常に効率的なタンパク質分離を提供し（Ｃｈｅｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１２：１９９４（１９９８）；Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９）；Ｃｈｏｎｇら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１３：１８０８（１９９９）を参照のこと）、注入、データ処理、およびタンパク質収集の見地においてゲルと比較してずっと自動化しやすい方法である。加えて、本発明により提供されるＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離は、１４時間を必要とする１−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥによる同等の分離よりも７０倍早い。上記の実験において、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ法は、１−Ｄゲルがわずか２６バンドしか生成しないところで、３５バンドを生成するより高い分解能を有している。図７に示されるように、２つの方法の直接比較は、類似した分子量範囲に渡り、１−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥのものよりもＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣバンドがよりずっと狭いことを明らかにしている。また分子量が減少するにつれて、１−Ｄゲルバンド幅が大きく増加することも明らかである。ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣにおいては、より低分子量のタンパク質が改善された分解能および感度を示すという逆の傾向が生じる。画像の上部領域にはほとんどバンドがないので、この画像はＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離がより大きなタンパク質においてはうまくいかないことを示しているようである。しかし、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣの垂直次元はタンパク質分子量ではなく、むしろタンパク質疎水性であることを思い起こすことが重要であるように、これは事実ではない。画像の半分より少し上にある比較的疎水性のタンパク質であるウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）の溶出が観察されることにより、これは証明される。
【００９６】
Ｇ．既知の標的タンパク質に対する溶出時間の予測
２−Ｄゲルの利点の１つはゲルの垂直座標がタンパク質の分子量を＋／−１０％の誤差をもって推定するために使用してもよいことである。従って、対象となるタンパク質の位置は、タンパク質がゲルから同定される前に推定することができる。本発明の方法における溶出時間をタンパク質質量と関連付ける試みにおいて、ｌｏｇ（ＭＷｔ）／タンパク質極性比に対する溶出時のアセトニトリルパーセント（％Ｂ）プロットの線形適合が生成された。極性比（ＰＲ）はタンパク質中の全アミノ酸数で極性アミノ酸の数を割ったものであり、分子量はｋＤａである。このプロットに用いられたタンパク質は、表１に由来する６個のタンパク質のサンプリング（ＨＳＰ６０、β−アクチン、ＴＩＭ、α−エノラーゼ、ＰＰＩＡＳＥ、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸）ならびに、図１に列記されている４つの標準であった。得られた方程式（方程式１：％Ｂ／１００＝０．０７９８０５＊（ｌｏｇＭＷｔ）／ＰＲ＋０．０７７６８６（Ｒ＝０．９６７７、ＳＤ＝０．０１４７２２、Ｎ＝７））は標的タンパク質の溶出時間を予測するために使用される。ＨＳＰ６０、β−アクチン、およびα−エノラーゼに関しては、実験的溶出時間は各々１０．２８、１０．１５および７．２５であった。予測溶出時間は１０．２０、１０．１３および９．７８であった。ＨＳＰ６０およびβ−アクチンの場合では予測がうまく機能しているが、α−エノラーゼに関しては予測はそれほどよくない。正確ではないが、この予測は、分子量および疎水性が既知である特定の標的タンパク質がより容易に発見されることができるように、タンパク質がいつ溶出されるかに関して実際いくつかの考え方を提供する。
【００９７】
Ｈ．酵素消化、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、およびＭＳＦｉｔデータベース検索によるタンパク質同定
ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離由来のバンドの代表的サンプリングから同定されたタンパク質は表１に列記されている。ロトフォア画分１２由来の約８０個のタンパク質のサンプリングは消化され、それらのペプチド質量マップをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより獲得することに成功した。これら８０個のうち、３８個の異なるタンパク質が同定された。これらの場合において、全てのタンパク質が利用可能なデータベース中に存在するわけではないため、およそ５０％の検出タンパク質が同定されることが期待される。類似の結果がＨＥＬ細胞試料の２−Ｄゲルから解析されたタンパク質に対して観察された。現在のＳｗｉｓｓ−２ＤＰＡＧＥの表はＨＥＬ細胞に関して１９個のタンパク質エントリーを列記する。これら１９個のタンパク質のうち、５個がＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離から同定された。ゲルにおいて、これら同一の５個のタンパク質がまた同定された。
【００９８】
一般的に、ゲルＭＳＦｉｔの結果は液相の結果よりも良好なようである。これは、第２の次元を泳動する前に、ゲルタンパク質が各々ＤＴＥおよびヨードアセトアミドを用いて還元およびアルキル化されたという事実に起因する可能性がある。この段階は全てのジスルフィド結合が破壊され、最適のタンパク質分解が生産されることを確実にするために役立つと思われる。したがって、この誘導体化段階は、ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣに先立ってまたは細胞溶解の間に、還元およびアルキル化を実施することにより、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ法に追加することが可能である。それにも関わらず、いくつかの例において、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣの消化は、網羅性および品質において、ゲル由来の消化をしのぐものである。これは、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ法およびゲル法経由で単離されたα−エノラーゼに関してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの直接比較を示す、図８中に示される。これらの質量スペクトルは最初に外部的にキャリブレーションされ、その質量プロファイルを使用して、質量精度４００ｐｐｍでＳｗｉｓｓタンパク質データベースが検索された。これらの検索は、ゲルおよび液体タンパク質消化の両方に関してα−エノラーゼに強いヒットを与えた。各質量スペクトルはその後、最初に外部的にキャリブレーションされたマッチから、マッチしたペプチドピークを用いて内部的に再キャリブレーションされた。新しいピーク表を、その後、同じＳｗｉｓｓタンパク質データベースを２００ｐｐｍの質量精度で検索するために使用した。図８はゲルからの消化に比べて液体からの消化が改善されていることを明らかに示す。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ質量スペクトルは６０％のタンパク質配列に一致し、一方ゲルに由来する質量スペクトルは４９％一致する。４７ｋＤａタンパク質の配列で６０％の一致を達成することはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析においては普通ではなく、ゲル消化に対して有意に改善されたことが示されている。本発明はいかなる特定の機構に限定されることもないが、配列網羅性の上昇は、タンパク質が液相で消化され、相対的に純度が高いという事実による可能性があり、これはペプチドがゲル断片内に包埋されるために損失することがないためである。Ｔ１６３〜１７９にマッチするピークにおけるメチオニン酸化レベルを観察すると、ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣにより単離されたタンパク質がゲル由来のものよりも、より酸化されていないことが明らかである。
【００９９】
ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣクロマトグラムの多くは基底線から完全には分離されないいくつかのピークを含む。部分的に分離されたタンパク質も依然として効果的にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を用いて同定することができるので、これを問題とする必要はない。ロトフォア画分３においては１０．１５分および１０．２５分にピークがある（表１参照）。これらのピークは基底線上にわずか５０％しか分離されておらず、１０．１５分の溶出ピークがβ−アクチンであり、１０．２５分の溶出ピークがＨＳＰ６０であることは依然として明白である。これらのタンパク質に対する予測溶出時間がそれぞれ１０．１３および１０．２０分であることには注意されたい。タンパク質は部分的に分離されたピークからも同定可能であるため、より急速な勾配を用いた迅速な分離が可能である。バンドパターンの再現性は、異なるロトフォア画分から観察されるように、特定のタンパク質に対する保持時間を見ることで決定することができる。β−アクチンは画分３および画分９の両方において１０．１５分で溶出される。α−エノラーゼは画分１２、１６および２０においてそれぞれ７．２５、７．４５および７．３９分に溶出される。そしてＨＳＡ６０は画分３および画分４においてそれぞれ１０．２８および１０．２５分に溶出される。＋／−０．１分の保持時間の変動から、明らかに、これらの分離は泳動間で非常に再現性が高い。
【０１００】
したがって、本発明の方法は、多数のタンパク質の再現性の高い分離に関して有利な方法を提供することが示された。ヒト赤白血病細胞溶解液の実施例において、本方法は、急速勾配を用いて７００個のバンドを、およびより長い勾配を用いて１，０００個のバンドを分解する能力を有する。これらのバンドの画分を解析した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳＦｉｔデータベース検索により３８個の異なるタンパク質が試験的に同定された。これは現在までに２−Ｄゲルから同定されている１９個の異なるタンパク質によく匹敵する。ヒト赤白血病細胞溶解液中に見出されたいくつかのタンパク質：α−エノラーゼ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９：８１８（１９９８）およびＭｏｈａｍｍａｄら、Ｅｎｚ． Ｐｒｏｔ．、４８：３７（１９９４））、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｂｉｎｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２８３２（１９９７）およびＳｉｒｏｖｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４３２：１５９（１９９９））、ＮＰＭ（Ｒｅｄｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８７：８８２（１９９６））、ＣＲＫＬ（ｔｅｎ Ｈｏｅｖｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２４６９（１９９３））および熱ショックタンパク質（ＨＳ２７）（Ｆｕｑｕａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４９：４１２６（１９８９））を含むが、これらは様々な型の癌に関連付けられている。ＮＰＭおよびＣＲＫＬが白血病に特異的に関連付けられている。
【０１０１】
ある例示的な実験において同定されたタンパク質は１２ｋＤａから７５ｋＤａまでの範囲（しかし、本発明によりより広い範囲が考えられる）に渡る。この範囲は、タンパク質プロファイリング、同定、およびいくつかの疾患状態または細胞処理との相関を含む、現在の研究において対象となるタンパク質の多くを含む可能性がある。２−Ｄゲルと明確に対照的に、この方法は自動化によく適合している。ＥＳＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ等の質量分析法を、タンパク質およびタンパク質消化物全体を検出するために適用することが可能である。最も重要なことは、本発明の方法は従来の２−Ｄゲルに対して別の２−Ｄタンパク質マップを提供し、より低分子量のタンパク質およびより塩基性のタンパク質に関する結果を改善するようである。液相２−Ｄ分離の主な利点は、最終産物が液相中の精製されたタンパク質であることである。また最初に負荷するタンパク質はゲルの５０倍とすることが可能であり、１回のＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離により単離されうる標的タンパク質の量は、２−Ｄゲル分離から獲得可能なものより５０倍大きい可能性を有する。加えて、研究者がｐＩが既知である特定のタンパク質に興味を有する場合には、対象となる画分のみが２次元目の分離を介して解析される必要があるため、この方法を２４時間未満で標的タンパク質を単離および同定するために使用してもよい。ゲルを基にした方法は同一の結果を達成するのに３日を必要とすると思われる。
【０１０２】
Ｉ．新規腫瘍抗原の同定
免疫原性を有する腫瘍タンパク質を同定することに対して相当な興味が存在する。腫瘍抗原に対する自己抗体および抗原そのものは、患者血清および他の生物学的液体においてアッセイが可能である２つの癌マーカーを表している。ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＭＳは癌患者の体液性応答を惹起する腫瘍タンパク質を同定するために実行された。癌患者血清に特異的に反応するタンパク質の同定がこの方法を用いて証明された。腫瘍細胞株由来の可溶化されたタンパク質がＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＭＳに供される。ｐＩ範囲に基づいて定義される個々の画分は同時にＨＰＬＣならびに１次元電気泳動に供される。癌患者由来の血清を１次元電気泳動画分のウエスタンブロットにより反応させる。肺癌患者由来血清と特異的に反応し、対照由来のものとは反応しない１つのバンドはアネキシンＩＩおよびアルドケト還元酵素の両者を含むことが見出された。この画分に含まれるタンパク質をＨＰＬＣによってさらにサブ分画することができることにより、アネキシンＩＩが肺癌患者において体液性応答を惹起する腫瘍タンパク質として同定された。
【０１０３】
Ｊ．比較解析
先の記載から明らかなように、本発明の方法は２個またはそれ以上の試料間のタンパク質プロファイルを比較する機会を提供する（例えば、癌細胞と対照細胞、未分化細胞と分化細胞、処理細胞と未処理細胞）。本発明のある１つの態様では、比較すべき２つの試料が平行して泳動される。各試料から生成されたデータは試料間のタンパク質発現の差異を決定するために比較される。任意の特定の細胞型に関するプロファイルが、将来の未知試料の同一性を決定するための標準として使用されてもよい。加えて、発現パターンにおいて対象となる１つまたは複数のタンパク質をさらに特徴決定してもよい（例えば、その同一性を決定するために）。別の態様では試料由来のタンパク質が同時に泳動される。これらの態様においては、各試料由来のタンパク質は別々に標識され、その結果、解析段階において、各試料由来のタンパク質発現パターンは区別され、提示される。選択標識の使用はまた、望ましい場合には全タンパク質集団の亜集団を解析するために使用することができる。
【０１０４】
先の記載から明らかであるように、本発明の方法および構成はタンパク質発現パターンを解析するための改良法を提供する一連の新規特性を提供する。例えば、本発明は、２次元液相タンパク質マップを作製するために、結果として液相画分中のｐＩ集束タンパク質を生じるＩＥＦと非多孔性ＲＰ ＨＰＬＣを組み合わせる方法を提供する。そのような方法で生成されるデータは、従来のサイド画面のピーク形式ではなく、トップ画面のタンパク質バンド形式にクロマトグラムを提示する、１つの２−Ｄ画像において異なるｐＩ ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣクロマトグラムの集合を見るような、新規および有用性の高い形式で提示されてもよい。図２に示されるようにサイド画面のピーク形式は左に示され、トップ画面のバンド形式は右に示される。本発明はまた、多段階の分離および検出段階を活用する自動化システムと互換性がある界面活性剤も提供する。
【０１０５】
本発明はまた、酵素消化を用いたＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣにより分離されたタンパク質の同定、および結果として生じるペプチド質量フィンガープリントの質量分析法解析を含む、付加的な特徴決定段階を提供する。タンパク質の分子量を決定するために、ＨＰＬＣからの溶出物をＭＡＬＤＩプレート（パーセプティブ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ））上にオフラインで収集するか、または直交抽出飛行時間法を用いたオンライン解析のいずれかによりタンパク質を検出してもよい。そのような方法により生成されたデータは、元々のＵＶ吸光度クロマトグラムと事実上同一であると考えられる全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を生成するために、ＭＡＬＤＩまたはＬＣＴにより生成されたタンパク質分子量由来のデータを用いるなどして新規および有用性の高い形式で提示されてもよい。これらのクロマトグラムのシグナルは吸光度ではなく、ｐＩ集束タンパク質の特定の群のＨＰＬＣ溶出物から生成されるイオンの数に基づいていると考えられる。これらのクロマトグラムは上述したように、同一の２−Ｄトップ画面バンド形式にプロットされる。これらの方法により、ｐＩ集束タンパク質の各集合体の完全な質量スペクトルを提示するために生成された各ＴＩＣを、完全に統合およびデコンボリューションすることが可能となる。その方法はまた、垂直次元がタンパク質分子量であり、そして水平次元がタンパク質ｐＩである１つの２−Ｄ画像中に全ての統合されたＴＩＣを提示することを可能にする。タンパク質量スペクトルは、それらを上から見た場合にはバンドとして現れる。したがってこの画像はまた定量的な情報（ＬＣＴの場合）を含み、それゆえ存在するタンパク質の量に依存してバンドの強度が変化すると考えられる。
【０１０６】
タンパク質質量マッピングのための液相法は、タンパク質の同一性を同時に決定するためにタンパク質が消化され、ペプチド質量マップが解析されるように、タンパク質画分の集合をマイクロチューブ中に収集することも可能にするであろう。レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出スキームは、全体の感度を３桁増加させるためにこの方法と共に使用される。ゲルに背景蛍光が存在しないと思われることから、液相ＬＩＦ検出器はゲル中よりもより高感度の蛍光検出を提供する。このＬＩＦ検出法は下記のものを含むが、それらに限定されることはない、多数の方法において使用可能である：
（１）各々異なる蛍光色素で以前に染色された等量の２つの細胞溶解液を組み合わせて、その後、二重蛍光検出器を使用して、２つの異なる細胞溶解液由来の同一のタンパク質を同時に検出する段階；
（２）他の全てのタンパク質を見ることなく解析の間を通じて標的化されうるように、細胞溶解液中の特定の標的タンパク質を標識するために蛍光タグを有する抗体を使用する。
【０１０７】
本発明の方法および装置は、特定の細胞、組織またはその他の完全な特徴決定を行うために他の分析技術と結合するための効率的なシステムも提供する。例えば、本発明の方法は、試料中に存在する遺伝子、遺伝子の発現レベル、および試料に関連するタンパク質の存在（例えば活性タンパク質）の完全な理解を提供するために、遺伝子プロファイリング技術（例えば、遺伝子チップまたはハイブリダイゼーションを基礎とする核酸診断）と組み合わせて使用されてもよい。
【０１０８】
ＩＩ）等電点クロマトグラフィーを用いた改良型溶出技術
上記の様に、本発明は、それに引き続いて質量分析法によるオンライン質量マッピングが行われる（例えば以下に詳述されるようにＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳを用いて）全細胞溶解液からの２−カラム２−Ｄタンパク質分離を備える新規の液体クロマトグラフィー法を提供する。例えば最初のＬＣ次元で等電点（ｐＩ）に基づいてタンパク質が分離されるので、それは３−Ｄのタンパク質解析システムである。
【０１０９】
本発明はさらに分離装置（例えば第１相分離装置）からタンパク質を溶出する新規技術を提供する。例えばこの技術のある１つの態様においては、第１の次元から溶出されたタンパク質が、１ｐＨ単位またはその画分のいずれかでｐＨにしたがって一時にカラムから「剥離」される等電点クロマトグラフィー（ＣＦ）と称する。これらの集束された液体画分はその後、疎水性および大きさ（または他の所望の特性）にしたがって２次元時に分離される。例えばＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ由来の液体画分は、その分子量および相対的存在量を獲得するために３次元目を提供する質量分析計（例えばＥＳＩ−ｏａＴＯＦ）を用いて直接オンラインで簡単に解析されうる。結果として、仮想的な２−Ｄタンパク質画像が生成され、それは２−Ｄゲル画像に類似している。さらにこの２−Ｄタンパク質画像はｐＩ、疎水性、分子量、および相対的存在量等の重大な情報を含む。この「タンパク質剥離（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅｅｌｉｎｇ）」２−Ｄ ＬＣ−ＭＳ法は、例えば正常および疾患全細胞溶解液間のタンパク質発現を研究するための、実際的には２−Ｄゲルに代替的なものである。この全システムは迅速なプロテオーム解析用に完全に自動化され、および単一のユニットに統合され、２−Ｄゲルを用いた自動化技術と比較してより正確でコストの安い自動化技術を提供する。
【０１１０】
本発明の等電点クロマトグラフィー技術の例示的な態様が実施例７に提供される。これらの実験から得られたデータは図１４〜１６に示される。図１４はＭＣＦ−１０Ａ全細胞溶解液（ｐＨ７〜４）のＣＦプロファイルを示している。画分１から３はさらにＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳを用いて解析された（以下に詳細に記載する）。図１５Ａ〜Ｃは、以下に記載の図１４の３つの画分におけるＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＴＩＣ（全イオンカウント）プロファイルを示す：（Ａ）画分１（ｐＨ ６．７５〜６．５５）、（Ｂ）画分２（ｐＨ ５．５０〜５．２５）および（Ｃ）画分３（ｐＨ ５．２０〜４．９０）。ＴＩＣプロファイルをＭａｘＥｎｔ１ソフトウェア（以下に詳細に記載する）を用いて統合およびデコンボリューションすることにより、図１６に示されるように全３画分の質量スペクトルが２−Ｄ形式で提示される。図１６は、垂直カラムが分子量であり、水平次元がタンパク質ｐＩ点である１つの２−Ｄタンパク質マップ中の統合されたＴＩＣを示す。このマップはまた、存在するタンパク質の量に依存してバンドの強度が変化する（灰色の色合い）ことによる、相対的存在量の情報を含む。
【０１１１】
ＣＦ−ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳにより生成されたデータを、従来の２−Ｄゲル画像に非常に類似した２−Ｄマップまたは２−Ｄ画像として提示することができる。例えばいくつかの態様においては、クロマトグラム、ＴＩＣ、統合およびデコンボリューションされた質量スペクトルは、垂直方向にプロットされる前にＡＳＣＩＩ形式に変換され、２５６段階のグレースケールを用いて、そのピークが白色の背景に対して濃色のバンドとして提示される。このスケールは多様なカラー形式でも役立つ。したがって、この２−Ｄマップは分離されたタンパク質の相対的存在量ならびにｐＩ、疎水性、分子量に関する重要な情報を提供する。このマップは、その中にある全てのバンドのより詳細な画像を得るために、特定の対象となる領域を拡大することにより調節されうる。この２−Ｄマップから集められる全ての情報は、疾患状態、薬学的治療、または環境変化による細胞系中のタンパク質発現を調べるために使用されうる。画像は自動的にデジタル化されるため、それは容易に保存され、且つバンドを他の実験結果または関連データにハイパーリンクすることができる。結果として、全ての情報を元々の画像から利用することが可能である。
【０１１２】
本発明の分離、解析、および提示法に等電点クロマトグラフィーを使用することは以前には利用可能ではなかった多くの重要な利点を提供する。例えば、等電点クロマトグラフィーを第２の分離相（例えばＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）および質量分析法解析と組み合わせることにより、２−Ｄゲルに類似した２−Ｄ液相タンパク質マップが作製される。好ましい態様においては、これは、例えばＣＦからの画分をＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣに移送するために切換えバルブを用いて、２個または複数のＬＣユニット間でオンラインで（すなわち自動化された様式で）両方のクロマトグラフィー技術が実施されることによる、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。タンパク質は１ｐＨ単位またはその画分のいずれかでｐＨにしたがって一時にＣＦカラムから「剥離」される。この「剥離」特性により、それぞれのｐＩ領域におけるタンパク質バンドをさらに集束することが可能になる。従って、各ｐＩバンドのタンパク質濃度は溶出中に高められる。上記の方法に関して、処理の各段階と互換性がある緩衝液を使用してもよい。例えば、いくつかの態様においては、試料調製およびＣＦ分離は、ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳと互換性がある塩酸グアニジンおよび非イオン性界面活性剤（例えばｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド）の使用を伴う。
【０１１３】
ＩＩＩ）質量分析法解析および２−Ｄ提示システムおよび方法
本発明のいくつかの好ましい態様においては、詳細で、且つ有益な２−Ｄタンパク質マップを作製するのを容易にするために、質量分析法により分離されたタンパク質が解析される。本発明は、そのような解析に使用される質量分析技術の特性により限定されることはない。例えば、本発明の使用法を見出している技術は、イオントラップ質量分析法、イオントラップ／飛行時間質量分析法、四重極および三重極質量分析法、フーリエ変換（ＩＣＲ）質量分析法、および扇形磁場質量分析法を含むが、それらに限定されることはない。質量分析法解析および２−Ｄタンパク質提示の以下の記述は、ＥＳＩおよびＴＯＦ質量分析法を用いて説明される。当業者はそのような方法に他の質量分析法技術が適用可能であることを認めると思われる。
【０１１４】
本発明のいくつかの態様では、正確なタンパク質分離マップを提供するために、２次元タンパク質分離に続いてＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析法が使用される。例えば、本発明のある１つの態様においては、タンパク質はヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞由来のタンパク質が解析された。ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞株はミシガン大学の小児科から取得された。ＨＥＬ細胞は実施例１に記載されている方法にしたがって培養された。第１の次元の分離においては準備段階の規模のロトフォア（バイオラッド）が使用された。この実験においては２０ｍｇのタンパク質が負荷された。タンパク質は、本明細書の別の場所に記載されているロトフォア法を若干改良して、５時間に渡る等電点電気泳動法を用いて分離された。分離温度は１０℃であり、分離緩衝液は０．５％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）（シグマ）、６Ｍ尿素（ＩＣＮ）、２Ｍチオ尿素（ＩＣＮ）、２％βメルカプトエタノール（バイオラッド）、および２．５％バイオライト両性電解質、ｐＨ３．５〜１０（バイオラッド）を含んでいた。
【０１１５】
ロトフォア（ロトフォア精製システム、バイオラッド）を泳動するために使用される操作は、バイオラッドのマニュアルに記載されている標準操作の改良版であった。開始電力、電圧、および電流は、それぞれ、１２Ｗ、４００Ｖ、および３６ｍＡであった。終了電力、電圧および電流は、それぞれ、１２Ｗ、１０００Ｖおよび５ｍＡであった。ロトフォアに含まれている２０個の画分は、隔壁を突き抜けている２０個の針のアレイにプラスティックチューブで接着された別々のバイアルに真空ソースを用いて同時に収集された。ロトフォア画分をポリプロピレンマイクロ遠心チューブに４００μＬ容量で分注し、所望の更なる解析のために−８０℃で保存した。画分のｐＨはｐＨ試験紙（タイプＣＦ、ワットマン）を用いて決定された。ロトフォア由来の画分をブラッドフォードアッセイ法を用いて定量化した（例えば、Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７２：１０９９（２０００））を参照）。
【０１１６】
ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣに関しては、１．５μｍ Ｃ１８（ＯＤＳＩ）非多孔性シリカビーズ（アイクロム（Ｅｉｃｈｒｏｍ）テクノロジー）を含む分析用（３．０＊３３ｍｍ）ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣカラム上で１分間に０．４ｍＬの流量で分離を実施した。３ｍｍカラムの使用は、溶媒吸着を減少させると共に、ＬＣＴを使用して十分以上の感度を提供した。カラムはカラム加温器（チンバーライン（Ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ）、ボールダー、コロラド州）中に設置され、６５℃に維持された。分離は水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ、０．３％ギ酸）勾配を用いて実施された。使用された勾配プロファイルは以下のとおりである：（１）１分間に０〜２０％アセトニトリル（溶媒Ｂ）；（２）２分間に２０〜３０％のＢ；（３）８分間に３０〜５４％のＢ；（４）１分間に５４〜６５％のＢ；（５）１分間に６５〜１００％のＢ；（６）３分間に１００％のＢ；（７）１分間に１００〜５％のＢ。このプロファイルの効果的な開始時間は、１分間の滞留時間のために、勾配に入ってから１分間のときであった。アセトニトリルは９９．９３＋％のＨＰＬＣグレード（シグマ）であり、ＴＦＡは１ｍＬの密封型ガラスアンプル（シグマ）に由来し、ギ酸はＡＣＳグレードであった（シグマ）。使用された非イオン性界面活性剤は、ｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＧ）（シグマ）であった。使用されたＨＰＬＣ装置はベックマンモデル１２７ｓ／１６６であり、ピークは市販されているＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ（ＬＣＴ、マイクロマス、マンチェスター、英国）を用いてオンラインで検出された。好ましい態様では、ＲＰ ＨＰＬＣおよびＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳの段階と互換性がある界面活性剤（例えばｎ−オクチル（糖）ピラノシド処方の界面活性剤等）が分離および検出段階に渡って使用された。
【０１１７】
ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ分析は、リフレクトロン（Ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）、０．５メートル飛行チューブおよび二重マイクロチャネル平面検出器を備えたマイクロマスＬＣＴを用いて実施された。その機器は質量分解能５０００（ＦＷＨＭ）のタンパク質質量スペクトルを生成した。ＨＰＬＣカラム溶出物の流量は１：１の比率でＥＳＩステンレススチールキャピラリーに分割され、質量分析計には０．２ｍＬ／分の流量を残した。ソース温度は１５０℃に保持され、脱溶媒和温度は４００℃であり、噴霧装置ガス（Ｎ２）は最大流量の５０％に保持され、脱溶媒和ガスは６００Ｌ／分で保持された。キャピラリー電圧は＋２５００Ｖに保持され、試料コーン電圧は＋４５Ｖに保持された。抽出コーンは＋３Ｖに保持された。ＲＦ電圧は、第一の六重極が正ＤＣオフセット＋７Ｖにバイアスされ、第二の六重極が負ＤＣオフセット−２Ｖにバイアスされて、１０００Ｖにセットされた。検出器電圧は２９００Ｖに保持された。データは最大質量／電荷範囲５０００で獲得され、プッシャーサイクル時間は９０μｓとなった。データはＥＣＰに１Ｈｚのスピードで保存され、その後このデータ収集コンピュータからメインデータ解析コンピュータへ、データファイルおよびＴＩＣを生成するために転送された。
【０１１８】
質量スペクトルを解析するために使用されるソフトウェアはＭａｘＥｎｔ（第１版）ソフトウェアおよびＭａｓｓ Ｌｙｎｘ第３．４版（マイクロマス）であった。典型的なデコンボリューションは広範な標的質量範囲、１ダルトンの分解能、０．７５Ｄａピーク幅、および６０％ピーク高値を用いて実施された。特定のＴＩＣ由来の全てのデコンボリューションされた質量スペクトルは互いに加算され、各ＴＩＣに対して１つの質量スペクトルを生じた。各ロトフォア画分のＴＩＣ質量スペクトルはその後、２Ｄマッピングソフトウェアに入力された（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ． Ｐａｒｕｓ博士、ミシガン大学化学科、９３０Ｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅ． Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州 ４８１０９−１０５５より入手可能である）。
【０１１９】
図９の２−Ｄ画像は垂直次元にタンパク質分子量を、そして水平次元にタンパク質ｐＩを示す。個々のタンパク質はグレースケール画像内のバンドとして提示される。タンパク質同一性は、上述のＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ分離法およびＭｓＦｉｔデータベース検索を用いた消化解析を介して以前に同定された全てのタンパク質の仮想マップに重ね合わせられることにより、この画像にマッチされる。
【０１２０】
実験的質量値は典型的には、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースに記録されている値の１０００分の１から１０００分の３以内であった。ｐＩは以下に示すように強度プロファイルを用いて０．０１から０．５ ｐＩ単位以内であると推定された。各垂直レーンは、バンド形式において、その特定のロトフォア画分のＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ解析由来のＬＣＴ質量スペクトル検出を介して観察された全てのタンパク質を表す。ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ分離は各ロトフォア画分につき１７〜６０μｇのタンパク質について実施された。画像内のバンドはソース分子量ピークの強度にしたがって、グレースケール強度が変化する。この画像は、より量の多いタンパク質のシグナルを仮想的に飽和させることにより、強度次元が拡大された。拡大率は２７倍、すなわち５３６１５／２０００（最大強度／拡大強度）である。強度は少なくとも３桁の線形動的範囲を有する。いくつかの同一のタンパク質パターンを、液相分離およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ由来の２Ｄゲル画像（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｃｂｒ．ｎｒｃ．ｃａ／ｃｈ２ｄｏｔｈｅｒｇｉｆｓ／ｐｕｂｌｉ／ｅｌｃ．ｇｉｆ）の両者において見ることができる。２Ｄゲル画像において同定された１９個のタンパク質のうち５個はまた、液相分離でも見出された。これらの画像を比較する場合には、質量スケールが液相分離においては直線状であり、ゲル相分離では対数であることは肝に命じなければならない。
【０１２１】
３−Ｄ液体分離法により単離されたタンパク質のｐＩは、ある範囲のｐＩ画分にわたる特定のタンパク質ピークの強度を観察することにより推定可能である。タンパク質は拡散および塩基性陰極ドリフトのために２〜６ ｐＩ画分のいずれかに広がる可能性があるため、自身のｐＩに最も近い画分に最も存在量が多いはずである。これは図１０の拡大画像で観察することができる（また、図１３の拡大画像も参照のこと）。このアプローチを用いてα−エノラーゼのｐＩは７．０（データベース値７．０１）と推定され、グリセルアルデヒド−３−ＰＯ４デヒドロゲナーゼのｐＩ値は８．０（データベース値８．５７）と推定される。この酸性シフトはリン酸化または糖付加等の翻訳後修飾によるものである可能性がある。
【０１２２】
タンパク質分子量は、最初の全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）由来の１０〜６０秒のデータのいずれかを組み合わせることにより獲得された多価電荷タンパク質傘質量スペクトルをＭａｘＥｎｔデコンボリューションすることにより決定された。図１１Ａにベータおよびガンマアクチンの傘が示され、各アクチン型は電荷状態により標識される。図１１Ｂは、得られたアクチンの分子量質量スペクトルを示し、ここでは２つの型のアクチンが分離されている。アクチンスポットが常にベータおよびガンマアクチンの共移動を提示するゲル画像とは異なり、２つの型のアクチンが互いに明確に分離されていることに注意されたい。本発明の液相法の有用な特性は、観察者に特定のタンパク質の各型の相対レベルを記録することを可能にする、高分解能質量スペクトルの定量能力である。結果として、特定のタンパク質のリン酸化および非リン酸化型の相対的存在量を決定することができると考えられる。加えて、例えばリン酸化等の翻訳後修飾は、８０Ｄａのいくつかの整数倍の間隔を求めて、データを検索することにより発見することができる。
【０１２３】
図１２はロトフォア画分の統合された分子量質量スペクトルの１つである従来型ピーク画面形式を示す。全てのタンパク質はデコンボリューションされ、その後１つの質量スペクトルに一緒に加算された。この質量スペクトルにおいて観察された４４個の固有のタンパク質分子量が存在する。本明細書中で解析された全１５個のロトフォア画分中に同様の数の固有の質量が存在すると仮定し、画分間の縦方向の拡散を説明すると、ｐＩ ４．１からｐＩ ８．７５の間の画像に約２２０個の固有のタンパク質質量が存在すると推定される。１５個のみが本研究で解析されたが、ロトフォアは２０個の画分を生ずるので、全ロトフォア画分を完全に解析すると約３００個の固有の質量が観察されることになる。上記の実験で獲得されない低レベルのタンパク質は、改良型ＨＰＬＣ勾配、５３ｍｍ長カラム、およびより詳細なＭａｘＥｎｔ解析を用いて獲得することができる。そのような方法を用いて、固有の質量の数は約７５０になると考えられる。
【０１２４】
上記の実験に示されるように、ヒト赤白血病細胞溶解液のＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ分離に由来する２Ｄタンパク質画像は、タンパク質の高い質量分解能および高い精度の画像化を提供する。質量分解能は、質量では小さな差異しか有さない同一のタンパク質の画像が非常に異なる型を示すことを可能にする。５０００Ｄａの質量分解能を用いると、５００００Ｄａタンパク質を５００１０Ｄａタンパク質から分離することが可能である。明らかに、タンパク質全体の単一のリン酸化をこのレベルの分解能で観察することができる。２−Ｄ画像間の定量比較は、既知量の標準タンパク質を用いて試料をスパイキングし、そして目当てとなるタンパク質を介して画像を正規化することにより達成することができる。したがって、観察者は異なる試料のタンパク質プロファイルの有意な量の変化を検出することができる。その差異は、その後、より詳細な解析のために標的化することができる。例えば、画像上のタンパク質バンドは、ペプチド質量フィンガープリントおよびＭＳＦｉｔ検索結果等のバンド解析を介して獲得された他の実験結果にハイパーリンクすることが可能である。したがって、特定の２−Ｄ画像に関して獲得された、詳細な質量スペクトル、データ解析、および相補性実験（免疫アフィニティー、ペプチド配列決定）を含む全情報は元々の画像を介してアクセス可能である。
【０１２５】
いくつかの疾患状態または薬学的治療のために存在量が変化したタンパク質を同定し、且つ特徴決定することにより、薬学的物質に対する薬剤標的ならびに疾患状態の生物マーカーを同定し、そして特定の生物学的試料（例えば、候補薬剤に暴露されたまたは暴露されていない組織試料）中でそのようなマーカーの存在または変化をモニターすることができる。実際、薬学的物質のスクリーニングおよび診断技術は、細胞（例えば実験細胞および対照細胞）をロボットを用いて、培養し、処理し、溶解し、溶解液が本発明の自動化分離および解析システムに供されるような、本発明のシステムおよび方法を用いて自動化されうる。
【０１２６】
上記から明らかであるように、本発明の方法およびシステムはタンパク質発現パターンを解析するための改良法を提供する一連の新規特性を提供する。例えば、本発明は、２−Ｄゲルのそれに類似した２次元液相タンパク質マップを作製するために、得られた液相画分中にｐＩ集束タンパク質を生じるＩＥＦを非多孔性ＲＰ ＨＰＬＣおよびＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせる方法を提供する。これらの方法により、酵素消化を用いたＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ、および得られたペプチド質量フィンガープリントの質量分析法解析により分離された、タンパク質の同定が可能となり、且つこのデータを、全タンパク質３−Ｄ分離法を介して発見されたタンパク質のｐＩおよび分子と関連付けることが可能となる。本発明のいくつかの改良型提示態様においては、従来の横画面ピーク形式ではなく、トップ画面タンパク質バンド形式で質量スペクトルを提示する１つの２−Ｄ画像中で、異なるＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳクロマトグラムの集合を見ることができる。その方法はまた、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳを用いたコンピュータ（例えばオンライン）解析を用いて、ＨＰＬＣからの溶出物を解析することにより、タンパク質の検出およびその分子量の決定を可能にする。
【０１２７】
ＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ法はまた、ｐＩ集束タンパク質の各集合の完全な質量スペクトルを提示するために生成された各ＴＩＣを完全に統合およびデコンボリューションすることを可能にする。その方法はまた、垂直次元がタンパク質分子量であり、そして水平次元がタンパク質ｐＩである１つの２−Ｄ画像中に、全ての統合されたＴＩＣを提示することも可能にする。そのような提示ではタンパク質量スペクトルは、それらが上から見られたようなバンドとして現れる。したがってこの画像はまた、存在するタンパク質の量に依存してバンドの強度が変化する相対的存在量情報を含むと考えられる。その方法とともに液相分離技術を使用することによって、タンパク質の同一性を同時に決定するためにタンパク質が消化され、そしてペプチド質量マップが解析されるように、マイクロチューブまたは９６ウェルプレートにタンパク質画分を収集することが可能となる。
【０１２８】
ＩＶ）迅速タンパク質特徴決定のための自動化３−Ｄ ＨＰＬＣ／ＭＣ法
いくつかの態様においては、本発明は複数の物理特性に基づいてタンパク質試料を分離および同定するための自動化システムを提供する。したがって、いくつかの態様においては前節に記載されたタンパク質分離および解析技術は単一の統合されたオンラインシステムに自動化される。タンパク質試料は第１相および直交第２相で分離され、その後、質量分析解析が実施される。好ましい態様においては、全段階は自動化試料取扱い機器および集中制御ネットワークを介して、自動化および調和される。
【０１２９】
したがっていくつかの態様においては、全分離および特徴決定処理は１つの集中制御ネットワークを介して制御される。ネットワークは自動化過程に使用される全ての器具およびソフトウェアと統合される。いくつかの好ましい態様においては、集中制御ネットワークはコンピュータシステムを含む。集中制御ネットワークの使用は、分離および特徴決定処理全体が、１人の操作者により１つのコンピュータ端末から制御されることを可能にする。ネットワークは適切な分離相に試料を移送する。ネットワークはその後、タンパク質情報の解析ソフトウェアへの移送を制御する。解析ソフトウェアはネットワークに統合され、そして使用者により必要とされる情報に基づいて、カスタマイズされた報告書を生成するためにプログラムされうる。
【０１３０】
Ａ．タンパク質分離
上記の通り、本発明は２相におけるタンパク質試料の分離法を提供する。好ましい態様においては、方法は直交的であり、したがって２次元マップの生成を可能にする。いくつかの好ましい態様においては、本発明はさらに２相の分離自動化方法を提供する。
【０１３１】
１．第１相における分離
本発明の自動化分離法を、いかなる適切なタンパク質試料に対して使用してもよい。先に議論したように、いくつかの態様においては、試料は製剤ｎ−オクチル（糖）ピラノシド化合物（例えば、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよび−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むが、それらに限定されることはない）を含む緩衝液中に可溶化される。
【０１３２】
自動化分離処理の第１の次元は第１の物理特性に基づいてタンパク質を分離する。例えば本発明のいくつかの態様では、タンパク質は電荷で分離される（例えばイオン交換クロマトグラフィー）。いくつかの好ましい態様においては、陽イオン交換クロマトグラフィーが正の電荷タンパク質を分離するために使用され、そして陰イオン交換クロマトグラフィーが負の電荷タンパク質を分離するために使用される。しかしながら、第１の次元は、イオン排除、等電点電気泳動法、順相／逆相分離、サイズ排除、リガンド交換、液相／ゲル相等電点電気泳動法、および吸着クロマトグラフィーを含むがそれらには限定されることはない、任意の数の分離技術を活用してもよい。
【０１３３】
いくつかの好ましい態様においては、最初の分離相は液相で実施される。いくつかの態様においては、第１相はイオン交換である。そのような態様においては、２次分離相に先立って試料が脱塩されることが好ましい。いくつかの態様においては、脱塩は自動化固相抽出（ＳＰＥ）システム上で実施される。いくつかの態様においては、イオン交換および脱塩は同一の自動化ＳＰＥシステム上で実施される。他の態様においては、イオン交換はカラム上で実施され、そして溶出物は自動化ＳＰＥシステムに移動される。
【０１３４】
いくつかの態様においては、タンパク質が少量存在する場合、解析に十分な量を獲得するために複数回ＳＰＥカラム上に試料を負荷することができる。したがって、本発明は、低レベルで発現するタンパク質を同定することを可能にするための付加された利点を有する。
【０１３５】
２．自動化試料取扱い
前節で記載されたように、好ましい態様において、試料は自動化試料取扱いシステムを用いて処理される。本発明は、任意の１つの自動化試料取扱いシステムに限定されない。しかしながら、いくつかの好ましい態様においては、オンライン自動化ＳＰＥシステムが使用される（例えば、プロスペクト自動化ＳＰＥシステム、スパークオーランド機器（Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｎ）、オランダを含むが、それに限定されることはない）。オンラインＳＰＥの利点は、ＬＣ移動相によるＳＰＥカートリッジから第２相（例えばＬＣシステム）への直接溶出である。したがって、いくつかの煩雑な取扱いシステムは取り除かれ、オンラインＳＰＥをより効率的にし、格別の解析結果が提供される。オンラインＳＰＥの格別の解析能力は、分析物の収集、蒸発、再構築および注入に由来し、それゆえいくつかの主要なエラー原因を除く。加えて、オンライン溶出は、抽出カートリッジ由来の精製された分析物を１００％ＬＣ（例えばＨＰＬＣ）に移送する。これはコストの低減ならびに最大の精度および感度を提供し、したがって溶媒、ガラス器具、および労働時間を節約する。加えて、試料およびＳＰＥカートリッジは、試料追跡を容易にし、そして光および空気から試料を保護する、完全な閉鎖系で処理される。それはまた操作者を危険な試料または溶媒からも保護する。さらに、操作が少ないことは失敗がほとんどないことを意味し、ＳＰＥの高圧溶媒制御はその処理をカートリッジ逆圧とは無縁なものとしている。
【０１３６】
３．第２相での分離
いくつかの好ましい態様においては、第１の分離相に続いて、分離段階の産物が直接、第２の液相分離段階に導入される。第２の次元はタンパク質を第２の物理特性（すなわち、第１の物理特性とは異なる特性）に基づいて分離され、そして好ましくは液相で実施される（例えば液相サイズ排除）。例えば、本発明のいくつかの態様においては、タンパク質は非多孔性逆相ＨＰＬＣを用いて疎水性により分離される（例えばＬｉａｎｇら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１０：１２１９（１９９６）；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、９：１５４６（１９９５）；Ｏｐｉｔｅｃｋら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５８：３４４（１９９８）；Ｎｉｓｓｏｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１１：６１０（１９９７）；Ｃｈｅｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１２：１９９４（１９９８）；Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９）；Ｃｈｏｎｇら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１３：１８０８（１９９９）を参照のこと）。
【０１３７】
本方法は、その疎水性および分子量にしたがってタンパク質を例外的に迅速および再現性高く高精度で分離することを備える。これらの逆相（ＲＰ）分離において使用される非多孔性（ＮＰ）シリカ充填物質は、分析時間を３分の１に減少させることならびに、多孔率およびより大きなタンパク質の低い回収率に関連する問題を除去する。
【０１３８】
好ましい態様においては、本発明で使用されている自動化オンライン試料取扱いシステムは完全に第２の分離相を第１の分離段階と統合する。試料は第１相（例えば、イオン交換）から脱塩（例えばＳＰＥ）を介して第２相（例えばＮＰ−ＲＰ ＨＰＬＣ）に直接流れ込む。好ましい態様（例えば、プロスペクトシステムを利用するもの）においては、ＨＰＬＣカラムは自動化試料取扱いシステムに統合される。例えば、バルブ切替えが抽出カートリッジをＨＰＬＣシステムに持ち込むために使用される、複数のバルブシステムが使用されうる。いくつかの態様においては、感度および分解能を改善するために、試料を１回より多く（例えば２回）第２相分離段階（例えば、ＮＰ−ＲＰ ＨＰＬＣ）に通過させる。例えば、いくつかの態様においては、２つの異なるＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣカラムがタンデムに利用される。タンパク質分離の自動化は、取扱いを通して生じる可能性のある試料損失および潜在的な汚染を減少させ、ならびに効率および速度を増加させる。
【０１３９】
Ｂ．質量分析法によるタンパク質の同定
第１相および第２相の試料分離に続いて、自動化試料取扱いシステムは試料を質量分析法段階へ移送する。本発明はいかなる単一の質量分析法技術にも限定されるものではない。実施多様な技術が考えられる。例えば、本発明の使用法を見出している技術は、イオントラップ質量分析法、イオントラップ／飛行時間質量分析法、四重極および三重極質量分析法、フーリエ変換（ＩＣＲ）質量分析法、および扇形磁場質量分析法を含むが、それらに限定されることはない。好ましい態様においては、ＭＳ解析は自動化され、オンラインで実施される。いくつかの態様では、第２分離相からの溶出物は２つの画分に分離される。溶出物の画分はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ（ＬＣＴ、マイクロマス）（例えば米国特許第６，００２，１２７号を参照）のいずれかを用いて分子量を決定するために使用される。残りの溶出物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳまたはＥＳＩ ｏａ ＴＯＦのいずれかを用いて、タンパク質消化およびペプチド質量マップフィンガープリント解析を介してタンパク質の同一性を決定するために使用される。分子量２Ｄタンパク質マップは、分子量全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）をＵＶクロマトグラムと相関させ、および関連する様々な遅延時間を計算することにより、適切な消化フィンガープリントに適合される。ＵＶクロマトグラムは消化フィンガープリント画分番号を用いて自動的に標識される。得られた分子量および消化質量フィンガープリントデータはその後ＭＳＦｉｔ（ＵＣＳＦ）のようなウエッブベースのプログラムを介してタンパク質同一性を検索するために使用することができる。
【０１４０】
タンパク質を同定し、且つ特徴決定するための本発明の自動化分離処理により生成される３−Ｄマップの使用に関する詳細な考察は、上記の節に提供されている。いくつかの態様においては、第１の次元が、第１の物理特性（例えば電荷または等電点）を表し、第２の次元が第２の物理特性（例えば疎水性または分子量）を表し、そして第３次元が試料中に存在するタンパク質の分子量および相対的存在量を表す、３−Ｄマップを本発明は提供する。いくつかの態様では、３−Ｄタンパク質マップ由来のデータは、タンパク質の同一性を決定するためにタンパク質データベースを検索するために使用される。
【０１４１】
本発明のいくつかの態様では、試料解析は集中制御ネットワークを用いて自動化および統合化される。例えば質量分析法データは３−Ｄタンパク質マップ生成のためのソフトウェアを含む統合型コンピュータシステムに移送される。統合型コンピュータシステムはまたデータベース検索を行い、そして報告書を作成する能力を有する。報告書は特定の用途にカスタマイズされた様式で操作者に提供される。例えば、ある実験が溶液中の未知の成分を同定するために設計されている場合に、報告書は３−Ｄマップの成分を特定のタンパク質として同定する。逆に実験が２つの試料間のタンパク質発現プロファイルを比較するように設計されている場合には、報告書は１つの試料中に存在し、別の方には存在しないか、または２つの試料間に異なる頻度で存在するタンパク質を同定することができる。
【０１４２】
Ｃ．自動化タンパク質分離および特徴決定の実施
説明的な実施例８は、自動化オンラインプロスペクトシステムが電荷および疎水性に基づいてタンパク質試料を分離するために使用される、本発明のある特定の態様を記載する。シベリア永久凍土全細胞溶解液を最初に、ミニＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラムを用いて分離した。ミニＱカラム溶出物のグラフを図１７に示す。陰イオン交換カラム勾配由来の画分（１分ごと）は自動化プロスペクトシステムを用いて第２段階に直接注入された。プロスペクトはその後、画分を１０ Ｃ４ ＳＰＥカートリッジに捕捉した。各カートリッジを、残存塩を取り除くために逆相ＨＰＬＣ開始緩衝液を用いて洗浄した。プロスペクトシステムはＨＰＬＣおよびＳＰＥ段階と多バルブ切替えシステムを統合する。洗浄段階に続いて、ＳＰＥカートリッジからの溶出物が直接ＮＰ−ＲＰ ＨＰＬＣカラムに移送された。
【０１４３】
画分はタンデムカラム法を用いて分離された。勾配がＨＰＬＣカラムに適用された。ＨＰＬＣカラムはその後、最初の緩衝液に切り替えられ、そして平衡化された。最初の勾配からの溶出物を、その後２番目の（異なる）ＨＰＬＣカラムに通過させる。２番目のタンデムカラムの使用は分解能および感度を増加させる。この段階は、ＳＰＥカートリッジ（各々が１つの陰イオン交換画分を表す）の各々に対して繰り返される。
【０１４４】
ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣによる分離に続いて、分子量および存在量を決定するために、タンパク質画分をＭＳによりオンラインで解析した。カラムからの溶出物は２つの画分に分離された。１つの画分はＭＳの前に酵素的に消化された。消化および非消化の両方の試料がＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ ＴＩＣ（全イオンカウント）質量分析法により解析された。全イオンカウントプロファイルは図１８Ａおよび図１８Ｂに示される。
【０１４５】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されることはない。
【０１４６】
実施例１
ＨＥＬ細胞試料調製
ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞株はミシガン大学の小児科から取得された。ＨＥＬ細胞は４ｍＭグルタミン、２ｍＭピルビン酸、１０％ウシ胎児血清（ギブコ）、ペニシリン（１ｍＬにつき１００単位）、ストレプトマイシン（１ｍＬにつき１００単位）、および２５０ｍｇハイグロマイシン（シグマ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ）中で培養された（７％ＣＯ２、３７℃）。ＨＥＬ細胞ペレットは滅菌ＰＢＳ中で洗浄され、その後−８０℃で保存された。細胞ペレットはその後、０．１％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＧ）（シグマ）および８Ｍ尿素（シグマ）中に再懸濁され、細胞破壊およびタンパク質可溶化の効果を得るために２分間ボルテックスされた。全細胞タンパク質溶出物はロトフォア緩衝液を用いてその後５５ｍＬに希釈され、そしてロトフォア分離チャンバー（バイオラッド）に導入された。
【０１４７】
実施例２
１−ＤゲルおよびＳＤＳ ＰＡＧＥ分離
ロトフォア分離により、別々のｐＩ範囲に分離されたＨＥＬ細胞タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけの分子量にしたがって分離された。この処理は完了するまで約１４時間を要する。ロトフォア画分の試料を、等量の試料緩衝液（１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、１％ジチオスレイトール、およびブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス（ｐＨ６．８））に懸濁し、５分間煮沸した。その後、これらを１０％アクリルアミドゲル上に負荷した。試料は、色素先端がゲルの反対側末端に到着するまで４０ボルトで電気泳動された。分離されたタンパク質を銀染色により可視化した。ゲルは５％氷酢酸を含む５０％エタノール中で一晩固定され、その後５％氷酢酸を含む２５％エタノール、５％氷酢酸、および１％氷酢酸中で連続的に洗浄された（各段階２時間）。ゲルは０．２％硝酸銀を用いて２５分間含浸され、０．４％ホルムアルデヒドを含む３％炭酸ナトリウム中で１０分間現像された。発色現像は１％氷酢酸を用いてゲルを含浸して終了させて、その後、ゲルをデジタル化した。
【０１４８】
実施例３
２−Ｄ ＰＡＧＥ
ＨＥＬ細胞からタンパク質抽出物を調製するために、回収された細胞ペレットは、８Ｍ尿素、２％ＮＰ−４０、２％担体両性電解質（ｐＨ３．５から１０）、２％βメルカプトエタノール、および１０ｍＭ ＰＭＳＦからなる３倍量の可溶化緩衝液を添加することにより、溶解され、その後、細胞抽出物を含む緩衝液をマイクロ遠心チューブに移送し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４９】
培養ＨＥＬ細胞の抽出物は、以下に記載するようにいくつかの変更をすることにより、Ｃｈｅｎら（Ｃｈｅｎら、Ｒａｐ． Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．、１３：１９０７（１９９９）により以前記載されたように２次元に分離された。可溶化緩衝液中での細胞溶解に引き続いて、約２．５ｘ１０６個細胞由来の細胞溶解液が等電点電気泳動法ゲルに適用された。等電点電気泳動法はｐＨ３．５から１０の担体両性電解質（バイオラッド）を用いて、７００Ｖで１６時間、続いて１０００Ｖでさらに２時間実施した。１次元チューブゲルは、ともに室温で２ｍｇ／ｍＬのジチオエリトリトール（ＤＴＥ）溶液に１０分間浸され、それから２０ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド（シグマ）溶液に１０分間浸された。１次元チューブゲルは、２次元試料緩衝液（１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、１％ジチオスエリトリトール、およびブロモフェノールブルーを含む、１２５ｍＭトリス（ｐＨ６．８））中で平衡化された後、２次元ゲルを含むカセット上に負荷された。２次元目の分離に関しては、１１．５％から１４％のアクリルアミド勾配が使用され、試料は、色素先端がゲルの反対側末端に到着するまで電気泳動された。分離されたタンパク質をイモービリン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ）−Ｐ ＰＶＤＦ膜に転写した。いくつかのゲル中のタンパク質パターンは銀染色またはクーマシーブルー染色により、そしてイモービリン−Ｐ膜に関しては膜のクーマシーブルー染色により可視化された。
【０１５０】
実施例４
ロトフォア等電点電気泳動法
第１の次元の分離においては準備段階の規模のロトフォアが使用された。この装置はタンパク質を、そのｐＩにしたがって液相で分離し、全緩衝液容量５５ｍＬで、１ｇまでのタンパク質を負荷する能力を有する。または、より少量のタンパク質の解析には、容量を小さくしたミニロトフォアを使用することが可能である。これらのタンパク質は、分離温度が１０℃であり、そして分離緩衝液は０．１％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＧ）（シグマ）、８Ｍ尿素（ＩＣＮ）、２％βメルカプトエタノール（バイオラッド）、および２．５％バイオライト両性電解質、ｐＨ３．５〜１０（バイオラッド）を含む、等電点電気泳動法を用いて５時間に渡って分離された。ロトフォア（ロトフォア精製システム、バイオラッド）を泳動するために使用される操作は、バイオラッドのマニュアルに記載されている標準操作の本明細書での改良版であった。ロトフォアに含まれている２０個の画分は、隔壁を突き抜けている２０個の針のアレイにプラスティックチューブで接着された別々のバイアルに真空ソースを用いて同時に収集された。ロトフォア画分をポリプロピレンマイクロ遠心チューブに４００μＬ容量で分注し、必要であれば所望の更なる解析のために−８０℃で保存することができた。ゲル法の利点は更なる使用のために、ゲル中で４℃にて安定にタンパク質を保存できる能力である。各画分のタンパク質濃度はブラッドフォード法を基にしたタンパク質アッセイ法を用いて定量された。画分のｐＨはｐＨ試験紙（タイプＣＦ、ワットマン）を用いて決定された。
【０１５１】
実施例５
ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ
１．５μｍ Ｃ１８（ＯＤＳＩ）非多孔性シリカビーズ（ミクラサイエンティフィック社（Ｍｉｃｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を含む分析用（４．６＊１４ｍｍ）ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣカラム上で１．０ｍＬ／分の流速で分離が実施された。カラムはチンバーラインカラム加温器中に設置され、６５℃に維持された。分離は、水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ、０．０５％ＯＧ）勾配を用いて実施された。使用された勾配プロファイルは以下のとおりである：（１）２分間に０〜２５％アセトニトリル（溶媒Ｂ）；（２）２分間に２５〜３５％のＢ；（３）５分間に３５〜４５％のＢ；（４）１分間に４５〜６５％のＢ；（５）１分間に６５〜１００％のＢ；（６）３分間に１００％のＢ；（７）１分間に１００〜５％のＢ。このプロファイルの開始点は、１分間の滞留時間のために、勾配に入ってから１分間のときであった。アセトニトリルは９９．９３＋％のＨＰＬＣグレード（シグマ）であり、ＴＦＡは１ｍＬの密封型ガラスアンプル（シグマ）のものであった。使用された非イオン性界面活性剤はｎ−オクチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＧ）（シグマ）であった。使用されたＨＰＬＣ機器はベックマンモデル１２７ｓ／１６６であった。ピークは１５μＬの分析用フローセル中で２１４ｎｍの出力光吸収により検出された。
【０１５２】
ＭＷタンパク質マーカーとして、ならびに保持時間、分子量、および疎水性との相関をみるための標準タンパク質（シグマ）は、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、炭酸脱水素酵素（２９ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、リゾチーム（１４．４ｋＤａ）、トリプシン阻害因子（２０ｋＤａ）、およびα−ラクトアルブミン（１４．２ｋＤａ）であった。
【０１５３】
実施例６
ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ単離タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析は、遅延抽出技術、１メートル飛行チューブ、および高電流検出器を備えたパーセプティブボイジャーバイオスペクトロメトリーワークステーション（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）上で実施された。Ｎ２レーザーはレーザー脱離およびイオン化のための３３７ｎｍの光を提供する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳはＤａｉら（Ｄａｉら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７１：１０８７（１９９９））２層乾燥滴法（ｔｗｏ ｌａｙｅｒ ｄｒｉｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）の改良型（本明細書で記載されている）を用いたタンパク質消化物由来のペプチド質量を決定するために使用された。ＭＡＬＤＩマトリックス、α−シアノ−４−ヒドロキシル−ケイ皮酸（α−ＣＨＣＡ）（シグマ化学社、セントルイス、ミズーリ州、米国）がアセトン飽和溶液（１％ＴＦＡ）中で調製された。この溶液は同じアセトン溶液（１％ＴＦＡ）で８倍に希釈され、そしてその後、試料液滴に１：２の比率（ｖ：ｖ）で添加された。混合された液滴は、分子量解析のためにＭＡＬＤＩ ＴＯＦ機器に導入するに先立ち、ＭＡＬＤＩプレート上で風乾された。
【０１５４】
タンパク質は、５０％エタノール中で０．８％ＯＧの２０μＬを含む１．５ｍＬポリプロピレンマイクロチューブに収集された。酵素消化物の調製において、アセトニトリルがスピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）を用いて４５℃で３０分間除去された。２００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３（ＩＣＮ）／１ｍＭ β−メルカプトエタノールの溶液が、その後、チューブの残液に１〜２の比率で添加され、結果約に約１５０μＬの全容量を有する５０〜１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液を生じた。引き続いて、０．２５μｇの酵素がこの溶液に添加され、その後、混合物がボルテックスされ、３７℃の保温室に２４時間設置された。使用された酵素は、アルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側にて切断するトリプシン（プロメガ、ＴＰＣＫ処理済）、またはグルタミン酸残基のカルボキシ側を５０〜１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液中で切断するＧｌｕ−Ｃ（プロメガ）のいずれかであった。
【０１５５】
消化溶液は典型的には容量で１００μＬであり、この溶液の３０〜５０μＬが、２μＬのＣ１８樹脂ビーズを有するジップチップ（Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓ）（ミリポア）を用いて、脱塩され、最終容量５μＬまで濃縮された。精製されたペプチド溶液はその後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析のためにＭＡＬＤＩプレート上にスポットするために使用された。全てのスペクトルは１２８回平均で取得され、そしてアンジオテンシンＩ、ＡＣＴＨ（１−１７）、ＡＣＴＨ（１８−３９）およびＡＣＴＨ（７−３８）を含むパーセプティブ標準ペプチド混合物（パーセプティブバイオシステム）を用いて内部的および外部的にキャリブレーションされた。
【０１５６】
これらの消化物はその後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析およびＭＳＦｉｔデータベース検索（Ｗａｌｌら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、７１：３８９４（１９９９）によりタンパク質を同定する際の助けとして使用された。ペプチド質量マップは、ＳｗｉｓｓおよびＮＣＢＩｎｒタンパク質データベースに対して、２ヶ所の切れ損ないを許容するＭＳＦｉｔを用いて検索された。分子量は５ｋＤａから７０ｋＤａ、およびｐＩは全ｐＩ範囲に渡った。外部的にキャリブレーションされたペプチド質量は４００ｐｐｍの質量精度で検索され、そして内部的にキャリブレーションされたペプチド質量は２００ｐｐｍの質量精度で検索された。
【０１５７】
実施例７
等電点クロマトグラフィー
本発明の等電点クロマトグラフィー技術のある１つの例示的な態様においては、タンパク質は化学溶解処理を用いて細胞から抽出された。溶解緩衝液は６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよび５０ｍＭトリスからなる。細胞は激しくボルテックスされ、−２０℃にて一晩放置された。それらは引き続いて１７，０００回転で２０分間遠心された。上清が細胞破壊片から除去され、そしてさらに任意の粒子を除去するために高速で再度遠心された。最良の再現性を有するデータのためには、溶解物は４８時間以内に最良に使用される。このＣＦのための緩衝液は（Ａ）イミダゾール−ＨＡＣ、０．１％塩酸グアニジン、０．０５％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ７．２；および（Ｂ）ポリバッファー７４（１：１０希釈）、０．１％塩酸グアニジン、０．０５％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ４である。この実施例のＣＦカラムは、室温で１ｍＬ／分の流速のＭｏｎｏ Ｐ ＨＲ ５／２０（アマシャムファルマシア、ウプサラ、スェーデン）である。注入に先立ち、負荷時間２０分で、溶解物が緩衝液Ａを用いて平衡化される。このＣＦカラムの試料負荷能力はタンパク質１０ｍｇである。ｐＨ勾配はこれもアマシャムファルマシアからのｐＨフローセルメーターを用いてモニターされる一方、分離プロファイルは２８０ｎｍでモニターされる。
【０１５８】
ｐＨ勾配の上限ｐＨ範囲（この場合は７）を定義するために、ＣＦカラムは緩衝液Ａを用いて平衡化された。２番目の「集束」緩衝液Ｂは、その後等電点（ｐＩ）の順番で、溶出結合タンパク質に適用される。緩衝液ＢのｐＨは４であり、ｐＨ勾配の下限を定義する。溶出緩衝液Ｂがイオン交換器の緩衝官能基を滴定するので、ｐＨ勾配が形成される。
【０１５９】
ＣＦからのｐＩ集束液体画分はＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて第２の次元で解析される。非多孔性ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（アイクロムテクノロジー、ダリエン、イリノイ州、米国）は、２−Ｄゲルに匹敵する能力を有する２−Ｄタンパク質マップを獲得するために、ＣＦ後の第２直交分離次元として使用される。これらのカラムは、高いタンパク質回収率、速度および効率のために、タンパク質分離において格別である。最適なタンパク質分離を達成するために、カラムは高温（例えば６０℃）に保たれるべきである。この高温はまた選択性を改善する。分解能ならびに選択性もまた、複数のＮＰカラムを連続して使用することにより増強することができる。例えばＯＤＳ１、２および３等の非多孔性シリカビーズ（アイクロムテクノロジー）を充填されたＲＰ−ＨＰＬＣカラムはこれらのタスクによく適合する。
【０１６０】
ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分離から溶出されたタンパク質は、分子量、同一性、および相対的存在量を決定するためにＭＳにより直接的に解析することができる。この例において、溶出されたタンパク質は、ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳ（ＬＣＴ、マイクロマス、マンチェスター、英国）により同時に計測される。分割バルブからの溶出タンパク質の他の部分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＥＳＩ−ＱＩＴ−ｒｅＴＯＦ ＭＳ、またはＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＭＳ（ＬＣＴ）を用いてペプチドマップを獲得するために、酵素消化用の画分収集器を用いて収集することができる。タンパク質の分子量、ｐＩ、およびペプチドマップ等の情報はその後ＭＳ−Ｆｉｔ（例えばｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）等のウェブベースのタンパク質データベースプログラムに組み入れられる。
【０１６１】
実施例８
自動化３−Ｄ ＩＥ ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ｏａ ＴＯＦ ＭＳ
この実施例は、電荷、疎水性および質量に基づくタンパク質分離および同定のための自動化システムを記述する。タンパク質試料はイオン交換（ＩＥ）カラムを用いて電荷に基づいて分離される。タンパク質画分はその後、自動化プロスペクトシステムを用いて脱塩のための固相抽出（ＳＰＥ）カラムに捕捉される。プロスペクトシステムはその後、タンパク質画分を非多孔性逆相ＨＰＬＣカラム（ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ）に移送される。試料はその後、ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ質量分析法を用いて同定される。
【０１６２】
Ａ．ＳＰＥによるタンパク質分離および捕捉
試料２３−９−２５のシベリア永久凍土全細胞溶解液（ミシガン州立大学、微生物生態学のＪｉｍ Ｔｉｅｎｄｊｅから取得した）は化学溶解処理を用いて溶解された。溶解緩衝液は６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、および５０ｍＭトリスを含んでいた。細胞は激しくボルテックスされ、そして０℃にて一晩放置された。その後細胞を１７，０００回転で２０分間遠心した。上清を細胞物質から除去し、その後、ＩＥのための平衡化緩衝液（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５％ＭｅＯＨ、０．１％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ｐＨ８）と１：１に混合された。試料はその後ミニＱ陰イオン交換カラム（アマシャムファルマシア、ウプサラ、スェーデン）に２７℃、１ｍｌ／分の流速で注入された。平衡化緩衝液がカラムに３分間通され、続いて緩衝液Ｂ（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５％ＭｅＯＨ、０．１％ ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）の０％〜１００％の勾配で１５分間実施された。ミニＱカラム溶出物のグラフは図１７に示される。
【０１６３】
画分１（１分毎）は各々、ＩＥからの溶出物を１０ Ｃ４ ＳＰＥカートリッジに通すことにより、別々の固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ上に収集される。プロスペクトオンライン自動化ＳＰＥシステム（スパークオーランド機器、オランダ）はＳＰＥ、ＨＰＬＣおよびＭＳ相で利用された。
【０１６４】
Ｂ．ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣによるタンパク質精製および分離
ＲＰ解析用の最初の移動相緩衝液は、緩衝液Ａ（水を溶媒とした０．１％ＴＦＡ）中で５％の緩衝液Ｂ（ＡＣＮを溶媒とした０．１％ＴＦＡ）であった。この溶液は陰イオン交換移動相由来の全ての残存塩が除去されるまで、ＳＰＥカートリッジに通された。ＳＰＥカートリッジからの溶出物は次に、プロスペクトシステムにより直接２番目の直交分離相用のＨＰＬＣに通された。
【０１６５】
非多孔性ＲＰカラム（アイクロムテクノロジー、ダリエン、イリノイ州）が第２の分離相として使用された。タンデムカラム法が活用された。ＯＤＳＩＩＩＥおよびＯＤＳＩ ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣカラム（アイクロムテクノロジー、ダリエン、イリノイ州）は１．５μｍのＣ１８（ＯＤＳＩ）非多孔性シリカビーズを含んでいた。カラム次元は４．６＊３３ｍｍ（ＯＤＳＩＩＩＥ）および４．６＊１４ｍｍ（ＯＤＳＩ）であった。カラムは選択性を改善するために６０℃に維持された。５０００ｐｓｉ圧での０．５ｍＬ／分の流速が維持された。カラムに負荷し、初期緩衝液で平衡化し、勾配を開始した。緩衝液Ｂ（ＡＣＮを溶媒とした０．１％ＴＦＡ）の勾配が以下のように実施された：５％Ｂで１．５分間；２分間で５％Ｂから２０％Ｂ；５分間で２０％Ｂから３５％Ｂ；１５分間で３５％Ｂから６０％Ｂ；５分間で６０％Ｂから１００％Ｂ。最初のＨＰＬＣカラム（ＯＤＳＩ）からの溶出物は２番目のＨＰＬＣカラム（ＯＤＳＩＩＩＥ）に移動された。
【０１６６】
勾配にしたがって、安定した基底線が実現されるまでは、初期の移動相緩衝液がＲＰカラムを通された。ＨＰＬＣ段階は各ＳＰＥカラムに関して繰り返された（その各々が陰イオン交換カラムからの１分間の画分を含んでいた）。
【０１６７】
Ｃ．質量分析法によるタンパク質同定
ＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣによる分離に続いて、タンパク質画分が、その分子量および存在量を決定するためにＭＳを用いてオンラインで解析された。試料はＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ ＴＩＣ（全イオンカウント）質量分析法により解析された。質量分析法条件は以下の通りであった：キャピラリー２９００Ｖ、試料コーン４５Ｖ、抽出コーン３Ｖ、ＲＦレンズ１０００Ｖ、脱溶液温度３５０℃、およびソース温度１２０℃。
【０１６８】
ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ ＴＩＣ解析の結果は図１８Ａおよび図１８Ｂに示される。図１８ＡはミニＱカラムの３〜４から収集された画分の全イオンプロファイルを示す。図１８Ｂは７〜８分から収集された画分の全イオンプロファイルを示す。
【０１６９】
上記の明細書において言及された全ての刊行物および特許は本明細書に参照として組み入れられる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な変更および変動は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであると思われる。本発明は特定の好ましい態様と関連付けられて記載されているが、主張されているような発明は過度にそのような特定の態様に限定されるべきではない。実際に、当業者に明白な発明を実施するための記載された様式の様々な変更は、特許請求の範囲内であると意図されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のひとつの態様において、ヒト赤白血病細胞溶解液タンパク質の等電点電気泳動非多孔性逆相ＨＰＬＣ（ＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ）分離を用いる２−Ｄタンパク質提示の例を示す。
【図２】図１に示した提示の一部の拡大図（ｐＩ＝４．２〜７．２およびｔＲ＝６．０〜９．０）（右側パネルはバンドパターンを示す）および連結したＨＰＬＣデータの対応する例（左側パネルはピークを示す）を示す。
【図３】本発明のひとつの態様における、ロトフォア画分の定量を示す。
【図４】本発明のひとつの態様における、ＨＥＬ細胞溶解液のロトフォア画分のＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、本発明のひとつの態様における、ＨＥＬ細胞溶解液のロトフォア画分の短側（５Ａ）および長側（５Ｂ）のＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ分離勾配時間を示す。
【図６】ＨＥＬ細胞溶解液タンパク質のクマーシーブルー染色した２−Ｄ ＰＡＧＥ分離の例を示す。
【図７】本発明の特定の態様における、いくつかのロトフォア画分のＩＥＦ−ＮＰ ＲＰ ＨＰＬＣ（左側４レーン）と、１−Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥ（右側４レーン）の直接並記した比較を示す。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＩＥＦ−ＮＦ ＲＰ ＨＰＬＣ（８Ａ）および２−Ｄ ＰＡＧＥ（８Ｂ）により単離されたα−エノラーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳトリプシン処理により生じたペプチド質量マップを示す。
【図９】ヒト赤白血病細胞溶解液タンパク質の等電点電気泳動−非多孔性ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ（ＩＥＦ−ＮＰＳ ＲＰ ＨＰＬＣ−ＥＳＩ ｏａ ＴＯＦ／ＭＳ）分離における２Ｄタンパク質画像を示す。
【図１０】図９の３５ｋＤａ〜５２ｋＤａ質量範囲の２Ｄタンパク質画像の拡大を示す。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＭａｘＥｎｔデコンボリューションした分子量質量スペクトルのアクチンの多価電荷された傘（ａｃｔｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｕｍｂｒｅｌｌａ）を示す。βおよびγアクチンについての傘を図１１Ａに示し、各々、荷電状態で標識されたアクチン型に由来している。図１１Ｂは、アクチンの２型が分離されているようなアクチンについて得られた分子量質量スペクトルを示す。
【図１２】従来のピーク形式で示されたロトフォア画分から組み合わせたタンパク質分子量質量スペクトルを示す。
【図１３】図９の５ｋＤａ〜４０ｋＤａの質量範囲の２Ｄタンパク質画像の拡大を示す。
【図１４】ＭＣＦ−１ＯＡ全細胞溶解液の等電点クロマトグラフィーのプロファイルを示す。
【図１５】図１５Ａ、Ｂ、およびＣは、図１４で同定された３種の試料画分のＮＰ−ＲＰ−ＨＰＣＬ−ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＴＩＣ（総イオン数）プロファイルを示す。
【図１６】ＭａｘＥｎｔ１ソフトウェアで生成された、図１５の３種の試料画分の積分され、かつデコンボリューションされたＴＩＣプロファイルを示す。
【図１７】試料２３−９−２５のＳｉｂｅｒｉａｎ Ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔ全細胞溶解液の陰イオン交換のプロファイルを示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、 図１７の２個の画分のＮＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ｏａＴＯＦ ＴＩＣプロファイルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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