(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ内のシトシンメチル化の検出方法に関する。【解決手段】ＤＮＡ内のシトシン−メチル化の検出方法であって、ａ）ゲノムＤＮＡプローブが濃度範囲０．１ｍｏｌ／ｌ及び６ｍｏｌ／ｌの間で重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素、二亜硫化物）の溶液でインキュベートされるものにおいて、変性試薬及び／又は溶剤ならびに少なくとも１種の遊離基捕捉剤が存在する作業ステップと、ｂ）処理ＤＮＡプローブが水又は水溶液で希釈される作業ステップと、ｃ）ＤＮＡプローブがポリメラーゼ反応で増幅される作業ステップと、ｄ）ステップａ）による処理によって配列がゲノムＤＮＡプローブに対してどの程度まで変化したかが検出され、かつゲノムＤＮＡプローブ内の少なくとも１個の座のメチル化状態を推論する作業ステップと、が実施される方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ内のシトシン−メチル化の検出方法であって、
ａ）ゲノムＤＮＡプローブが濃度範囲０．１ｍｏｌ／ｌ及び６ｍｏｌ／ｌの間で重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素、二亜硫化物）の溶液でインキュベートされるものにおいて、変性試薬及び／又は溶剤ならびに少なくとも１種の遊離基捕捉剤が存在する作業ステップと、
ｂ）処理ＤＮＡプローブが水又は水溶液で希釈される作業ステップと、
ｃ）ＤＮＡプローブがポリメラーゼ反応で増幅される作業ステップと、
ｄ）ステップａ）による処理によって配列がゲノムＤＮＡプローブに対してどの程度まで変化したかが検出され、かつゲノムＤＮＡプローブ内の少なくとも１個の座のメチル化状態を推論する作業ステップと、が実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
変性試薬及び／又は溶剤が次の化合物群又は化合物類の目録から選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法：
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及び置換誘導体、尿素又は誘導体、アセトニトリル、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ。
【請求項３】
遊離基捕捉剤が次の化合物群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法：
ジ−、トリヒドロキシベンゼン、緑茶エキス（ｇｒｅｅｎ　ｔｅａ　ｅｘｔｒａｃｔ）、ピクノゲノール（ｐｉｎｅ　ｂａｒｋ　ｅｘｔｒａｃｔ）、銀杏二葉エキス（ＥＧｂ７６１）、種々の果実エキス及び野菜エキスのフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオノーマライザ（Ｓｕｎ−Ｏ社）、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート酸）、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＱ、ヒドロキノン、ユビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、クルクミン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２ビスベータカルボキシエチル−ゲルマニウム−セスキオキシド、過酸化ジスムターゼ（ＳＯＤ）、過酸化カタラーゼ、アルファ−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルム溶解性）アルカロイド−エキス、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
３−ブロム−４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ジオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、
３，３−ビ−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３，５−ジブロム−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
３−ブロム−２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アントラキノン、
５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、
３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、
４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアントラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡプローブが処理前に熱的に変性されることを特徴とする、上記請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）が
ａ）請求項１による前処理ＤＮＡプローブに非特異的にハイブリッドし、そこからＰＣＲステップで１個以上の増幅体が生じる様々な配列の少なくとも１個のプライマー対によるＰＣＲ前増幅の部分ステップと、
ｂ）それぞれ請求項１による前処理ＤＮＡプローブ［（＋）鎖又は（−）鎖］の一部分と同じか又は相補的であり、被増幅ＤＮＡに特異的にハイブリッドする様々な配列のプライマーによる前増幅で形成された生成物のＰＣＲ増幅の部分ステップと、で実施されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
複数個のＤＮＡ部分の増幅が反応容器内で実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ポリメラーゼ反応のために耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されることを特徴とする、上記請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１のステップｃ）の前にＤＮＡの脱スルホン化が実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き
ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下に少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔で前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置に隣接する部分ステップと、
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有するオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、このヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップと、が実施されることを特徴とする、上記請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き
ａ）オリゴヌクレオチドの１セットが二重鎖の形成下に増幅ゲノムＤＮＡにハイブリッドされ、このオリゴヌクレオチドのセットが２種類の種からなり、かつ第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔でゲノムＤＮＡプローブ内の前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関して調査されるべき位置に隣接し、かつ第２種の第２オリゴヌクレオチドが標的分子の第２領域にハイブリッドされ、その結果第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端が個々のヌクレオチドの大きさ又は１０ヌクレオチドまでの隙間によって前記選択位置の箇所で第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドの３′末端から分離されている部分ステップと、
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有する第１種のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して最大でも第１種のオリゴヌクレオチドの３′末端と第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端との間にあるヌクレオチドの個数分だけ伸長され、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップと、
（ｃ）オリゴヌクレオチドがリガーゼの存在下にインキュベートされ、隣接するポリメラーゼ反応によって伸長された第１種のオリゴヌクレオチドと、第２種のオリゴヌクレオチドとが結合され、ここで伸長されたオリゴヌクレオチドの既存の３′ヒドロキシ機能を有する３′末端が直接第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するように、先行ステップで第１種のオリゴヌクレオチドの伸長が行われた場合、それによって連結生成物が得られる部分ステップと、が実施されることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
使用した第１種のオリゴヌクレオチド及び／又は使用した第２種のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、Ａ及びＣのみ又は塩基Ｔ、Ａ及びＧのいずれかを含有することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き
（ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列を有する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で一部又は全部前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置にハイブリッドされる部分ステップと、
（ｂ）オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３′末端であらかじめ塩基欠損対なしに被検位置にハイブリッドされる場合に、ポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップと、が実施されることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が検出のために検出可能の標識を有することを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
標識が放射性核種であることを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ヌクレオチドの標識が、質量分析計で検出可能である分離可能の質量標識であることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が全体で質量分析計で検出され、それによって前記生成物の質量により明確に特徴づけられることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物の各１個のフラグメントが質量分析計で検出されることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物のフラグメントが１個又は複数個のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる消化によって生成されることを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
質量分析計でのより良い検出性のために生成されたフラグメントが個々の正又は負の実効電荷を有することを特徴とする、請求項１８及び１９記載の方法。
【請求項２１】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を利用して、又は電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）を利用して検出され、かつ可視化されることを特徴とする、上記請求項１ないし２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
ゲノムＤＮＡがＤＮＡプローブから得られ、ＤＮＡの由来源が、例えば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液、パラフィン植込み組織、例えば眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織スライド及びそれら全ての可能な組合せを包含する、上記請求項１ないし２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
患者又は個体にとり不利な結果の診断及び／又は予測のための上記請求項１ないし２２のいずれか１項記載の方法の使用において、前記不利な結果が次のカテゴリ：望ましくない薬剤作用；癌罹患；ＣＮＳ機能不全、障害又は疾病；攻撃性症候群又は挙動障害；脳障害の臨床的、心理学的及び社会的な帰結；精神性障害及び人格性障害；老年痴呆及び／又は連想症候群；心臓血管病、機能不全及び障害；胃腸域の機能不全、障害又は疾病；呼吸系の機能不全、障害又は疾病；負傷、炎症、感染、免疫及び／又は予後；発育過程中の異常としての身体の機能不全、障害又は疾病；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾病；内分泌及び代謝機能不全、障害又は疾病；頭痛又は性的機能不全の少なくとも１つに属している方法の使用。
【請求項２４】
細胞型又は組織の区別又は細胞差異化の調査のための上記請求項１ないし２３のいずれか１項記載の方法の使用。
【請求項２５】
重亜硫酸塩を含有する試薬と、変性試薬又は溶剤と、増幅体の製造のための遊離基捕捉剤及びプライマーと、請求項１ないし２２のいずれか１項記載のアッセイの実施のための手引書とからなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ内のシトシンメチル化の検出方法に関する。
【０００２】
近年の方法論的開発により分子生物学においてよく研究されている観察レベルは、遺伝子自体と、この遺伝子のＲＮＡへの翻訳と、そこから生ずるタンパク質である。個体の発現の経過の中でいつ、どの遺伝子がスイッチを入れられ、特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性及び阻害がどのように制御されるかは、遺伝子もしくはゲノムのメチル化の規模と特性によって相関関係をつけることができる。その限りにおいて、病源体の状態が個々の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる。
【０００３】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡ内で最も頻繁に共有結合で修飾される塩基である。この塩基は、例えば転写の調節、遺伝子刷込み及び腫瘍形成においてある役割を果たしている。従って、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定が非常に重要である。ところが、５−メチルシトシン位置は、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対挙動を有するため、配列決定によって同定することができない。さらに、ＰＣＲ増幅において５−メチルシトシンを有する後成情報が完全に失われてしまう。
【０００４】
比較的新規の、この間に頻繁に適用されている５−メチルシトシン上のＤＮＡの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩の特異的反応に基づき、それに続くアルカリ性加水分解によって、ウラシルの塩基対挙動でチミジンに相当するウラシルに転換される。それに対し、５−メチルシトシンは前記条件下に修飾されない。それにより原初のＤＮＡは、原初にそのハイブリッド形成挙動によってシトシンから区別できないメチルシトシンが、今や「常法の」分子生物学の技術によって唯一残留するシトシンとして、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定によって検出できるように転換される。これらの技術は全て現在全面的に利用される塩基対に基づく。感受性に関する先行技術は、被検ＤＮＡをアガロース・マトリックス内に封じ込める方法によって定義され、それによりＤＮＡの拡散及び復元（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡにのみ反応する）を妨害し、全ての沈降ステップ及び洗浄ステップが迅速な透析に置換される（Ｏｌｅｋ，　Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．　１９９６，　２４，　５０６４−５０６６）。この方法によって個々の細胞を調査することができ、この方法の可能性が具体的に説明されている。確かに、従来個々の領域のみが約３０００塩基対長まで調査されているが、可能なメチル化解析の数千にわたる細胞の全体的な調査は不可能である。しかし、この方法も少ないサンプル量からなる非常に小さいフラグメントを確実に解析することができない。これはマトリックスによる拡散防止にも関わらず失われる。
【０００５】
５−メチルシトシンを検出する別の公知の可能性に関する概要は、次の概要論文から読み取ることができる：Ｒｅｉｎ，　Ｔ．，　ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，　Ｍ．　Ｌ．，　Ｚｏｒｂａｓ，　Ｈ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９８，　２６，　２２５５。
【０００６】
重亜硫酸塩技術は、従来幾つかの例外（例えばＺｅｃｈｎｉｇｋ，　Ｍ．ら、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎ．　１９９７，　５，　９４−９８）を除き研究の中でのみ使用されている。しかし、常に既知の遺伝子の短い特異的部分を重亜硫酸塩処理によって増幅し、完全に配列決定（Ｏｌｅｋ，　Ａ．及びＷａｌｔｅｒ，　Ｊ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９７，　１７，　２７５−２７６）するか、又は個々のシトシン位置を「プライマー伸長反応」（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｒｅａｋｔｉｏｎ）（Ｇｏｎｚａｌｇｏ，　Ｍ．　Ｌ．及びＪｏｎｅｓ，　Ｐ．　Ａ．，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９７，　２５，　２５２９−２５３１，　ＷＯ−Ｐａｔｅｎｔ  ９５００６６９）によって、又は酵素切断（Ｘｉｏｎｇ，  Ｚ．及びＬａｉｒｄ，  Ｐ．  Ｗ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７，  ２５，  ２５３２−２５３４）によって検出されている。特に、ハイブリッド形成による検出も記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ  ９９２８４９８）。
【０００７】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための重亜硫酸塩技術の適用を取り上げているその他の出版物は次のとおりである：Ｘｉｏｎｇ，  Ｚ．及びＬａｉｒｄ，  Ｐ．  Ｗ．  （１９９７），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５，  ２５３２；  Ｇｏｎｚａｌｇｏ，  Ｍ．  Ｌ．及びＪｏｎｅｓ，  Ｐ．  Ａ．  （１９９７），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５，  ２５２９；  Ｇｒｉｇｇ，  Ｓ．及びＣｌａｒｋ，  Ｓ．  （１９９４），  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １６，  ４３１；  Ｚｅｓｃｈｎｉｋ，  Ｍ．ら（１９９７），  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，  ３８７；  Ｔｅｉｌ，  Ｒ．ら（１９９４），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ６９５；  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｖ．ら（１９９５），  Ｇｅｎｅ  １５７，  ２６１；  ＷＯ  ９７４６７０５、ＷＯ  ９５１５３７３及びＷＯ  ４５５６０．
【０００８】
オリゴマー配列の製造における先行技術に関する展望は、１９９９年１月に発行された自然発生学特別号（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２１，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９）から、そこで引用されている文献及び低減された非特異的バックグラウンド信号によるオリゴヌクレオチドのような標的分子のための固体担体の製造方法に関する米国特許第５９９４０６５号から読み取ることができる。
【０００９】
不動化ＤＮＡ配列の走査のために、多くは蛍光標識プローブが使用されている。蛍光標識に特に好適なのは、各プローブの５′ＯＨにＣｙ３及びＣｙ５色素の簡単な取り込みである。ハイブリッドプローブの蛍光の検出は、例えば共焦点顕微鏡を介して行われる。色素Ｃｙ３及びＣｙ５は、その他の多くの色素と並んで商業的に入手することができる。
【００１０】
マトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子を解析するための非常に高性能の開発である（Ｋａｒａｓ，  Ｍ．及びＨｉｌｌｅｎｋａｍｐ，  Ｆ．  （１９８８），  Ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓｅｓ  ｅｘｅｅｄｉｎｇ  １００００  ｄａｌｔｏｎｓ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６０：  ２２９９−２３０１）。解析体が吸光マトリックス内へ埋め込まれる。短レーザーパルスによってマトリックスが蒸発され、解析体分子がこのようにフラグメント化されずに気相中へ輸送される。マトリックス分子との衝突によって、解析体のイオン化が達成される。印加した電圧が無磁界の飛行管内へイオンを加速する。前記イオンの質量が異なるために、イオンが様々な強さで加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンよりも速く検出器に到達する。
【００１１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光学は、ペプチド類とタンパク質類の解析に非常に良く適している。核酸の解析は多少困難である（Ｇｕｔ，  Ｉ．  Ｇ．及びＢｅｃｋ，  Ｓ．  （１９９５），  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  １：  １４７−１５７）。核酸の場合は、感受性がペプチドよりも約１００倍悪くなり、フラグメントサイズの増加とともに過度に減少する。多量に負に帯電したバックボーンを有する核酸の場合、マトリックスによるイオン化プロセスは本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光学の場合、マトリックスの選択が顕著に重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着については、非常に微細な結晶化を生じる幾つかの非常に高性能のマトリックス類が見い出されている。ＤＮＡの場合は、確かにこの間に幾つかの興味をひくマトリックス類が存在するが、それによって感受性の差異は縮小されなかった。この感受性の差異は、ＤＮＡがペプチドに類似するように、前記ＤＮＡが化学的に修飾されることによって縮小させることができる。通常のバックボーンのリン酸塩がチオリン酸塩と置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル置換化学によって中性電荷のＤＮＡに転換することができる（Ｇｕｔ，  Ｉ．  Ｇ．及びＢｅｃｋ，  Ｓ．  （１９９５），  Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｎｅｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：  １３６７−１３７３）。この修飾ＤＮＡへの「電荷標識」（ｃｈａｒｇｅ  ｔａｇｓ）のカップリングは、総量がペプチドの場合で見い出されるものと同じ量分の感受性の向上で生じる。ｃｈａｒｇｅ  ｔａｇｇｉｎｇ  のもう１つの長所は、非修飾基質の検出を非常に困難にする不純物に対する解析の安定性が向上することである。
【００１２】
ゲノムＤＮＡは、細胞−、組織−又はその他の実験プローブのＤＮＡから標準方法で得られる。この標準方法は、「フリッチ及びマニアティス編、分子クローニング：実験マニュアル、１９８９年」（Ｆｒｉｔｓｃｈ  ｕｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｄｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８９）のような参考文献に見い出される。
【００１３】
尿素は、ゲノムＤＮＡ内の５−メチルシトシンの配列決定前の重亜硫酸塩処理の効率を改善する（Ｐａｕｌｉｎ  Ｒ，  Ｇｒｉｇｇ  ＧＷ，  Ｄａｖｅｙ  ＭＷ，  Ｐｉｐｅｒ  ＡＡ，  （１９９８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：  ５００９−５０１０）。
【００１４】
従って、本発明の課題は、先行技術の欠点を克服するＤＮＡ内のシトシン−メチル化の検出方法を提供することである。
【００１５】
この課題は、ＤＮＡ内のシトシン−メチル化の検出方法が提供されるものにおいて、次の作業ステップが実施されることによって解決される：
ａ）ゲノムＤＮＡプローブが濃度範囲０．１ｍｏｌ／ｌ及び６ｍｏｌ／ｌの間で重亜硫酸塩（＝亜硫酸水素、二亜硫化物）の溶液でインキュベートされるものにおいて、変性試薬及び／又は溶剤ならびに少なくとも１種の遊離基捕捉剤が存在する作業ステップ。
ｂ）処理ＤＮＡプローブが水又は水溶液で希釈される作業ステップ。
ｃ）ＤＮＡプローブがポリメラーゼ反応で増幅される作業ステップ。
ｄ）ステップａ）による処理によって配列がゲノムＤＮＡプローブに対してどの程度まで変化したかが検出され、かつゲノムＤＮＡプローブ内の少なくとも１個の座のメチル化状態を推論する作業ステップ。
【００１６】
本発明にしたがって、この場合に変性試薬及び／又は溶剤が次の化合物群又は化合物類の目録から選択されていることが有利である：
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及び置換誘導体、尿素又は誘導体、アセトニトリル、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ。
【００１７】
さらに、この場合に遊離基捕捉剤が次の化合物群から選択されていることが有利である：
ジ−、トリヒドロキシベンゼン、緑茶エキス（ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｘｔｒａｃｔ）、ピクノゲノール（ｐｉｎｅ  ｂａｒｋ  ｅｘｔｒａｃｔ）、銀杏二葉エキス（ＥＧｂ７６１）、種々の果実エキス及び野菜エキスのフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオノーマライザ（Ｓｕｎ−Ｏ社）、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート酸）、トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＱ、ヒドロキノン、ウビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、クルクミン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２ビスベータカルボキシエチル−ゲルマニウム−セスキオキシド、過酸化ジスムターゼ（ＳＯＤ）、過酸化カタラーゼ、アルファ−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルム溶解性）アルカロイド−エキス、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
３−ブロム−４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ジオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、３，３−ビ−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３，５−ジブロム−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
３−ブロム−２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アントラキノン、
５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、
３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、
４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアントラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
【００１８】
本発明にしたがって、この場合にゲノムＤＮＡプローブが処理前に熱的に変性されることが有利である。
【００１９】
特に、本発明にしたがって、ステップｃ）が、
ａ）請求項１による前処理ＤＮＡプローブに非特異的にハイブリッドし、そこからＰＣＲステップで１個以上の増幅体が生じる様々な配列の少なくとも１個のプライマー対によるＰＣＲ前増幅の部分ステップと、
ｂ）それぞれ請求項１による前処理ＤＮＡプローブ［（＋）鎖又は（−）鎖］の一部分と同じか又は逆相補的であり、被増幅ＤＮＡに特異的にハイブリッドする様々な配列のプライマーによる前増幅で形成された生成物のＰＣＲ増幅の部分ステップとで実施されることが有利である。
【００２０】
さらに、本発明にしたがって、複数個のＤＮＡ部分の増幅が反応容器内で実施されることが有利である。
【００２１】
さらに、本発明にしたがって、ポリメラーゼ反応のために耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用されることが有利である。
【００２２】
特に、本発明にしたがって、本発明による方法のステップｃ）の前にＤＮＡの脱スルホン化が実施されることが有利である。
【００２３】
また、前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き次の部分ステップが実施されることが有利である：
【００２４】
ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下に少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔で前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置に隣接する部分ステップ。
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有するオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、このヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
【００２５】
本発明にしたがって、前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き次の部分ステップが実施されることが有利である：
ａ）オリゴヌクレオチドの１セットが二重鎖の形成下に増幅ゲノムＤＮＡにハイブリッドされ、このオリゴヌクレオチドのセットが２種類の種からなり、かつ第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔でゲノムＤＮＡプローブ内の前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関して調査されるべき位置に隣接し、かつ第２種の第２オリゴヌクレオチドが標的分子の第２領域にハイブリッドされ、その結果第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端が個々のヌクレオチドの大きさ又は１０ヌクレオチドまでの隙間によって前記選択位置の箇所で第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドの３′末端から分離されている部分ステップ。
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有する第１種のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して最大でも第１種のオリゴヌクレオチドの３′末端と第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端との間にあるヌクレオチドの個数分だけ伸長され、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
（ｃ）オリゴヌクレオチドがリガーゼの存在下にインキュベートされ、隣接するポリメラーゼ反応によって伸長された第１種のオリゴヌクレオチドと、第２種のオリゴヌクレオチドとが結合され、それによって、ここで伸長されたオリゴヌクレオチドの既存の３′ヒドロキシ機能を有する３′末端が直接第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するように、先行ステップで第１種のオリゴヌクレオチドの伸長が行われた場合に連結生成物が得られる部分ステップ。
【００２６】
この場合、本発明にしたがって、使用した第１種のオリゴヌクレオチド及び／又は使用した第２種のオリゴヌクレオチドが塩基Ｔ、Ａ及びＣのみ又は塩基Ｔ、Ａ及びＧのいずれかを含有することが特に有利である。
【００２７】
さらに、本発明にしたがって、前処理ＤＮＡの検出のためにＰＣＲ生成物がオリゴヌクレオチド配列上でハイブリッドされ、それに続き次の部分ステップが実施されることが有利である：
（ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列を有する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で一部又は全部前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置にハイブリッドされる部分ステップ。
（ｂ）オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３′末端であらかじめ塩基欠損対なしに被検位置にハイブリッドされる場合に、ポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
【００２８】
また、本発明にしたがって、ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が検出のために検出可能の標識を有することも有利である。この場合、標識が蛍光標識であり及び／又は標識が放射性核種であることが特に有利である。この場合、ヌクレオチドの標識が、質量分析計で検出可能である分離可能の質量標識であることが特に有利である。
【００２９】
特に、ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が全体で質量分析計で検出され、それによって前記生成物の質量により明確に特徴づけられることも有利である。本発明にしたがって、ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物の各１個のフラグメントが質量分析計で検出されることも有利である。
【００３０】
本発明による方法は、ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物のフラグメントが１個又は複数個のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる消化によって生成されることを特徴とすることも有利である。
【００３１】
さらに、質量分析計でのより良い検出性のために生成されたフラグメントが個々の正又は負の実効電荷を有することが有利である。
【００３２】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物がマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を利用して、又は電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）を利用して検出され、かつ可視化されることが申し分なく特に有利である。
【００３３】
本発明による方法は、ゲノムＤＮＡがＤＮＡプローブから得られ、ＤＮＡの由来源が、例えば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液、パラフィン植込み組織、例えば眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織スライド及びそれら全ての可能な組合せを包含することも有利である。
【００３４】
本発明のもう１個の目的は、患者又は個体にとり不利な結果の診断及び／又は予測のための本発明による方法の使用において、前記不利な結果が次のカテゴリ：望ましくない薬剤作用；癌罹患；ＣＮＳ機能不全、障害又は疾病；攻撃性症候群又は挙動障害；脳障害の臨床的、心理学的及び社会的な帰結；精神性障害及び人格性障害；老年痴呆及び／又は連想症候群；心臓血管病、機能不全及び障害；胃腸域の機能不全、障害又は疾病；呼吸系の機能不全、障害又は疾病；負傷、炎症、感染、免疫及び／又は予後；発育過程中の異常としての身体の機能不全、障害又は疾病；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾病；内分泌及び代謝機能不全、障害又は疾病；頭痛又は性的機能不全の少なくとも１つに属している方法の使用である。
【００３５】
また、本発明の目的は、細胞型又は組織の区別又は細胞差異化の調査のための本発明による方法の使用である。
【００３６】
最後に、本発明のもう１つの目的は、重亜硫酸塩を含有する試薬と、変性試薬又は溶剤と、増幅体の製造のための遊離基捕捉剤及びプライマーと、本発明による方法によるアッセイの実施のための手引書とからなるキットである。
【００３７】
本発明は、ピペット測定ステップのみを含むメチルシトシンの自動化可能の検出方法を提供する。それによって、既存の方法の効率が処理の簡便性、品質、コスト及び特にスループットに関して改善される。
【００３８】
ゲノムＤＮＡプローブ内のメチルシトシンの自動化可能の検出方法を記載する。
【００３９】
被解析ゲノムＤＮＡは、有利にはゲノムＤＮＡがＤＮＡの常法の由来源、例えば細胞株、血液、痰、便、尿、脳脊髄液、パラフィン植込み組織、例えば眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房又は肝臓の組織、組織スライド及びそれら全ての可能な組合せから得られる。
【００４０】
この方法の第１ステップで、使用したＤＮＡが有利には重亜硫酸塩（＝二亜流化物、亜流酸水素）により、塩基対挙動に関して様々な塩基が発生し、他方、５位メチル化シトシンが変化しないで残るように、塩基の５位にメチル化しない全てのシトシンが変化されるように処理される。
【００４１】
ゲノムＤＮＡプローブは、特に有利には処理前に熱的に変性される。
【００４２】
反応のために濃度範囲０．１ｍｏｌ／ｌ及び６ｍｏｌ／ｌの間で重亜硫酸塩が使用される場合、非メチル化シトシン塩基に付加が行われる。本発明による方法の場合は、特に変性試薬又は溶剤ならびに遊離基捕捉剤が存在しなければならない。
【００４３】
この場合、変性試薬又は溶剤として有利には次の化合物群又は化合物類が対象となる。
【００４４】
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及び置換誘導体、尿素又は誘導体、アセトニトリル、第１級アルコール、第２級アルコール、第３級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯ又はＴＨＦ。
【００４５】
遊離基捕捉剤として、目録１に列挙した化合物群又はその誘導体群が好ましく適している。それに続きアルカリ性加水分解が次にウラシル内の非メチル化シトシン−ヌクレオベースの転換を生ぜしめる。
【００４６】
第２方法ステップで、処理ＤＮＡプローブが水又は水溶液で希釈される。有利には、それに続きアルカリ性ｐＨ値でＤＮＡの脱スルホン化（１０−３０分、９０−１００℃）が実施される。
【００４７】
この方法の第３ステップで、ＤＮＡプローブがポリメラーゼ連鎖反応、有利には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで増幅される。複数個のＤＮＡ部分の増幅は、好ましくは反応容器の中で行われる。
【００４８】
この方法ステップは、好ましくは２部分ステップで実施される。これは前処理ＤＮＡプローブを非特異的にハイブリッドし、そこからＰＣＲステップで１個以上の増幅体を得る様々な塩基配列の少なくとも１個のプライマー対を用いるＰＣＲ前増幅によって開始される。その後、前増幅で形成された生成物のＰＣＲ増幅が様々な塩基配列のプライマーによって実施され、これがそれぞれ前処理ＤＮＡプローブ［（＋）鎖又は（−）鎖］の部分と同じか又は逆相補的であり、被増幅ＤＮＡを特異的にハイブリッドする。
【００４９】
この場合、前記のような前増幅がしばしばＰＣＲ反応としてではなく、耐熱性ポリメラーゼを必要としないプライマー伸長反応として実施されることは明確である。
【００５０】
最後の方法ステップで、配列が重亜硫酸塩を含有する試薬による処理によってゲノムＤＮＡプローブに対してどの程度まで変化したかが検出され、ゲノムＤＮＡプローブ内の少なくとも１個の座のメチル化状態が推論される。
【００５１】
検出のためにＰＣＲ生成物が特に有利にはオリゴヌクレオチド配列上にハイブリッドされる。
【００５２】
この方法の有利な変形態様において、オリゴヌクレオチド配列上のハイブリッド後に次の部分ステップが実施される：
ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下に少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔で前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置に隣接する部分ステップ。
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有するオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、このヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
【００５３】
この方法のもう１つの有利な変形態様において、オリゴヌクレオチド配列上にハイブリッド後に次の部分ステップが実施される：
ａ）オリゴヌクレオチドの１セットが二重鎖の形成下に増幅ゲノムＤＮＡにハイブリッドされ、このオリゴヌクレオチドのセットが２種類の種からなり、かつ第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で直接的に又は１０塩基までの間隔でゲノムＤＮＡプローブ内の前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関して調査されるべき位置に隣接し、かつ第２種の第２オリゴヌクレオチドが標的分子の第２領域にハイブリッドされ、その結果第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端が個々のヌクレオチドの大きさ又は１０ヌクレオチドまでの隙間によって前記選択位置の箇所で第１種のハイブリッド化オリゴヌクレオチドの３′末端から分離されている部分ステップ。
（ｂ）ｎヌクレオチドの既知の配列を有する第１種のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼを利用して最大でも第１種のオリゴヌクレオチドの３′末端と第２種のオリゴヌクレオチドの５′末端との間にあるヌクレオチドの個数分だけ伸長され、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
（ｃ）オリゴヌクレオチドがリガーゼの存在下にインキュベートされ、隣接するポリメラーゼ反応によって伸長された第１種のオリゴヌクレオチドと、第２種のオリゴヌクレオチドとが結合され、ここで伸長されたオリゴヌクレオチドの既存の３′ヒドロキシ機能を有する３′末端が直接第２種の有利にはホスホル化して存在するオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するように、先行ステップで第１種のオリゴヌクレオチドの伸長が行われた場合、それによって連結生成物が得られる部分ステップ。
【００５４】
使用した第１種のオリゴヌクレオチド及び／又は使用した第２種のオリゴヌクレオチドが特に有利には塩基Ｔ、Ａ及びＣのみ又は塩基Ｔ、Ａ及びＧのいずれかを含有する。
【００５５】
この方法のさらに有利な変形態様において、オリゴヌクレオチド配列上のハイブリッド後に次の部分ステップが実施される：
（ａ）増幅ゲノムＤＮＡが二重鎖の形成下にｎヌクレオチドの既知の配列を有する少なくとも１個のオリゴヌクレオチドにハイブリッドされ、前記ハイブリッド化オリゴヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３′末端で一部又は全部前記オリゴヌクレオチドのメチル化に関してゲノムＤＮＡプローブ内で調査されるべき位置にハイブリッドされる部分ステップ。
（ｂ）オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３′末端であらかじめ塩基欠損対なしに被検位置にハイブリッドされる場合に、ポリメラーゼを利用して少なくともヌクレオチド１個分だけ伸長され、少なくとも１個のヌクレオチドが検出可能の標識を有し、前記伸長がゲノムＤＮＡプローブ内の各シトシンのメチル化状態に依存する部分ステップ。
【００５６】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が検出のために特に有利には検出可能の標識を有する。
【００５７】
好ましくは、ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物の標識が蛍光標識、放射性核種又は質量分析計で検出される分離可能の質量標識である。
【００５８】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が好ましくは全体で質量分析計で検出することができ、それによって前記生成物の質量により明確に特徴づけられる。
【００５９】
特に、有利にはＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物の各１個のフラグメントが質量分析計で検出される。
【００６０】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物のフラグメントが、有利には１個又は複数個のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによる消化によって生成される。
【００６１】
質量分析計でのより良い検出性のために、生成されたフラグメントが特に有利には個々の正又は負の実効電荷を有する。
【００６２】
ＰＣＲ生成物及び／又は伸長生成物及び／又は連結生成物が、好ましくはマトリックス介助レーザー脱着／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を利用して、又は電子スプレー質量分析法（ＥＳＩ）を利用して検出され、かつ可視化される。
【００６３】
本方法は、有利には患者又は個体にとり不利な結果の診断及び／又は予測のために使用され、前記不利な結果が次のカテゴリ：望ましくない薬剤作用；癌罹患；ＣＮＳ機能不全、障害又は疾病；攻撃性症候群又は挙動障害；脳障害の臨床的、心理学的及び社会的な帰結；精神性障害及び人格性障害；老年痴呆及び／又は連想症候群；心臓血管病、機能不全及び障害；胃腸域の機能不全、障害又は疾病；呼吸系の機能不全、障害又は疾病；負傷、炎症、感染、免疫及び／又は予後；発育過程中の異常としての身体の機能不全、障害又は疾病；皮膚、筋肉、結合組織又は骨の機能不全、障害又は疾病；内分泌及び代謝機能不全、障害又は疾病；頭痛又は性的機能不全の少なくとも１つに属している。
【００６４】
さらに、この新規の方法は、特に有利には細胞型、組織の区別又は細胞差異化の調査に利用される。
【００６５】
さらに、本発明の目的は、重亜硫酸塩を含有する試薬と、変性試薬又は溶剤と、目録１記載の遊離基捕捉剤、増幅体の製造のためのプライマーと、アッセイの実施のための手引書とを含むキットである。
【００６６】
目録１：
ジ−、トリヒドロキシベンゼン、緑茶エキス（ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｘｔｒａｃｔ）、ピクノゲノール（ｐｉｎｅ  ｂａｒｋ  ｅｘｔｒａｃｔ）、銀杏二葉エキス（ＥＧｂ７６１）、種々の果実エキス及び野菜エキスのフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオノーマライザ（Ｓｕｎ−Ｏ社）、
ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート酸）、
トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＱ、ヒドロキノン、ウビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、クルクミン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２ビスベータカルボキシエチル−ゲルマニウム−セスキオキシド、過酸化ジスムターゼ（ＳＯＤ）、過酸化カタラーゼ、アルファ−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルム溶解性）アルカロイド−エキス、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
３−ブロム−４−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ジオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、３，３−ビ−［２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロム−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３，５−ジブロム−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
２−ブロム−３−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アントラキノン、
３−ブロム−２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アントラキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アントラキノン、
５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、
３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、
４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−クロル−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル）−安息香酸、
メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−安息香酸塩、
４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアントラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアントラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３−ブロム−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
２−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、
【００６７】
次の例が本発明を説明する。
【００６８】
例：
自動化された重亜硫酸塩反応の実施。
【００６９】
本例において、抑制エンドヌクレアーゼを用いて製造者の指示にしたがって処理したゲノムＤＮＡプローブの第ＶＩＩＩ遺伝子因子内のシトシンのメチル化状態の検出方法の適用を説明する。この方法は、交叉汚染を除外する交換可能のピペット測定先端部用に４つの独立した垂直移動式アダプトを備えた自動ピペット測定システム（ＭＷＧ  ＲｏｂｏＳｅｑ  ４２０４）の使用に基づく。このピペット測定システムは、±２μｌ以下の誤差を有する１００μｌのピペット測定を可能にする。自動ピペット測定システムの作業パレットは、ピペット測定先端部用の６架台と、８ピペット測定位置のうち２つが冷却できる前記８ピペット測定位置と、冷却式試薬架台と、１０微量滴定パレット用の積層システムと、ピペット測定先端部監視ステーションと、アダプタからピペット測定先端部の分離用の装置とを装備している。自動ピペット測定システムは、シリアルインタフェースを介してコンピュータと接続されており、この方法の適用に必要な全てのピペット測定ステップの自由プログラミングを可能にするソフトウエアプログラムを介して制御される。
【００７０】
第１方法ステップで、手動でＤＮＡプローブの部分標本が微量滴定プレートの自由選択可能の９６位置に滴定される。微量滴定プレートがそれに続きエッペンドルフ  パターンサイクラーの使用下に前処理ＤＮＡプローブの変性のために９６℃に加熱される。次に微量滴定プレートを自動ピペット測定システム内へ移す。ＤＮＡを含む全ての位置で、プログラム制御されて順次試薬架台から変性試薬（ジオキサン）、ナトリウムヒドロゲンサルファイト溶液３．３モルの部分標本及び遊離基捕捉剤溶液の部分標本が使用した変性試薬内に加えてピペット測定される。それに続き、微量滴定プレートがエッペンドルフ  パターンサイクラー内でＤＮＡプローブ内にナトリウムヒドロゲンサルファイトの作用下に全ての非メチル化シトシン残基が重亜硫酸塩付加物に転換されるまでインキュベートされる。
【００７１】
重亜硫酸塩処理後、微量滴定プレートをサーモサイクラーから自動ピペット測定システム内へ移す。同じ型式の第２微量滴定プレートを前置きする。チャンバの第１微量滴定プレート上と同等の位置に重亜硫酸塩処理ＤＮＡプローブを含む全てのチャンバ内に、初めに塩基性トリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ９．５）を移し入れ、それに続き重亜流酸塩処理ＤＮＡの部分標本を第２微量滴定プレートの対応する位置へ移し入れる。塩基性溶液内で非メチル化シトシン残基の重亜流酸塩付加物がウラシル残基に転換される。
【００７２】
重亜硫酸塩処理ＤＮＡの鎖（本例ではセンス鎖）の標的とした増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。第１型（ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  Ａ（ＳＥＱ−ＩＤ：１）及びＴＡＡ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  Ａ（ＳＥＱ−ＩＤ：２））のプライマー対が使用されており、これは成功を収めた重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖の特異的増幅を可能にするが、ＤＮＡ鎖の非メチル化シトシン残基がウラシル残基に転換されず、又は不完全に転換された前記ＤＮＡ鎖の特異的増幅は可能にしない。ＰＣＲ反応のために、自動ピペット測定システムで同じ型式の第３微量滴定プレートが前置きされる。チャンバの第１微量滴定プレート上と同等の位置に重亜硫酸塩処理ＤＮＡプローブを含む全てのチャンバ内で、初めにＰＣＲバッファ、ＤＮＡポリメラーゼ及び第１型のプライマーを含む原液の部分標本が自動的にピペット測定される。その後、自動的に第２微量滴定プレートの各位置から希釈した重亜硫酸塩処理ＤＮＡの部分標本が、前記部分標本がＰＣＲ反応の実施のためにサイクラー内へ移される前に、対応する第３微量滴定プレートの位置へ移される。ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動と、それに続き臭化エチジウムによる着色とによって同定される（図１）。図１は、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅したゲル図である（左図：分子量マーカー、右：ＰＣＲ生成物）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅したゲル図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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