(57)【要約】本発明は、組織化学および細胞化学的な方法用の試薬分子による接近し易さのために細胞または組織を前処理する生物試料を細胞コンディショニングするための自動環境に使用する試薬を提供する。該試薬には、生物試料内の細胞および細胞構成物に分子が接近することを促進するために最適化された成分が含まれる。本発明は、有機溶媒に依存することなく組織化学または細胞化学的な手法で染色する生物試料を曝すことによって包埋媒体を除去またはエッチングするための自動環境において使用するための試薬も提供する。該試薬には生物試料から包埋媒体を除去またはエッチングするのを促進するために最適化された成分が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸緩衝液、エチレングリコール、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび界面活性剤を含む水性組成物。
【請求項２】
ほぼｐＨ４からほぼｐＨ９に緩衝化されている請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ほぼｐＨ６に緩衝化されている請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ほぼ１００ｍＭ以下のクエン酸緩衝液を含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ほぼ１０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ほぼ１０％未満のエチレングリコールを含む請求項１記載の組成物。
【請求項７】
ほぼ５％のエチレングリコールを含む請求項１記載の組成物。
【請求項８】
ほぼ１０ｍＭ以下のメタ重亜硫酸ナトリウムを含む請求項１記載の組成物。
【請求項９】
１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムを含む請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
ほぼ１０％以下のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
ほぼ０.３％のＳＤＳを含む請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
ほぼｐＨ６のほぼ１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ほぼ５％のエチレングリコール、ほぼ１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムおよびほぼ０.３％のＳＤＳを含む請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
緩衝液、グリコール、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび界面活性剤を含む水性組成物。
【請求項１４】
緩衝液がクエン酸緩衝液である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
緩衝液がほぼｐＨ６である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
グリコールがエチレングリコールである請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
緩衝液の濃度がほぼ１００ｍＭ以下であり、グリコールの濃度がほぼ１０％以下であり、メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度がほぼ１０ｍＭ以下であって、ＳＤＳの濃度がほぼ１０％以下である請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
緩衝液がほぼ１０ｍＭの濃度のクエン酸であって、組成物のｐＨがほぼ６である請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
グリコールがエチレングリコールであり、エチレングリコールの濃度がほぼ５％であり、メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度がほぼ１ｍＭであって、ＳＤＳの濃度がほぼ０.３％である請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
ほぼ５％のエチレングリコール、ほぼ１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムおよびほぼ０.３％の界面活性剤を含むほぼ１０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む水性組成物。
【請求項２１】
界面活性剤がＳＤＳである請求項２０記載の水性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、代理人ファイル番号98,541-Cの2000年11月22日に出願された米国特許出願番号09／721,096号の一部継続出願である、2001年3月7日に出願された米国特許出願番号09／800,689号の一部継続出願である。米国特許出願番号09／721,096号は、1999年9月3日に出願され、2000年3月16日にWO 00／14507として公開された国際特許出願PCT／US99／20353からの優先権の利益を主張する。ここで、国際特許出願PCT／US99／20353は、1998年9月3日に出願された米国仮特許出願番号60／099,018号；1999年2月26日に出願された米国特許出願番号09／259,240号；および1999年2月26日に出願され、1999年9月3日にWO 99／44030として公開されたPCT／US99／04181からの優先権の利益を主張する。2000年11月22日に出願された米国特許出願番号09／721,096号；1999年9月3日に出願され、2000年3月16日にWO 00／14507として公開された国際特許出願PCT／US99／20353；1998年9月3日に出願された米国仮特許出願番号60／099,018号；1999年2月26日に出願された米国特許出願番号09／259,240号および1999年2月26日に出願され、1999年9月2日にWO 99／44030として公開された国際特許出願PCT／US99／04181はすべて出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
本発明は、対応するターゲットに対する種々の分子の接近し易さを増大するように、および、一般的に、免疫組織化学（ＩＨＣ）、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または他の組織化学もしくは細胞化学的な操作をする前の自動機器上での生物試料の組織もしくは細胞の判読性を改善するように、細胞または組織をコンディショニングする溶液、方法および機器に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中に言及するすべての特許、特許出願および非特許文献または参考文献は、それらが矛盾しない限り出典明示して本明細書の一部とみなす。
罹患した器官から採取した組織試料または細胞試料の解釈に基づく疾患の診断は、過去数年間にわたって劇的に拡大している。伝統的な組織染色技術および免疫組織化学アッセイ、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションおよびイン・サイチュ・ポリメラーゼ連鎖反応のごときイン・サイチュ技術が、現在、ヒトにおける疾患状態を診断するのを補助するために用いられている。したがって、細胞の形態のみならず、細胞および組織内の特定の巨大分子の存在についても調べることができる種々の技術が存在する。
【０００４】
例えば、乳ガン、卵巣ガンおよび他のガン腫の診断は、ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ原腫瘍遺伝子またはそれから発現するタンパク質（群）の存在または不存在を同定するように設計された技術を用いることによって容易にすることができる。ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ原腫瘍遺伝子は、受容体チロシンキナーゼの上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属するメンバーである。ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ原腫瘍遺伝子の増幅および過剰発現は、乳ガンの約３０％、卵巣ガンおよび他のものの約２０％において見出される（Andrechek, E. R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, no. 7, pp. 3444-3449 (2000); Doherty, J. K.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp. 10869-10874 (1999); Oh, J. J.ら, Nucleic Acids Res., vol. 27, no. 20, pp. 4008-4017 (1999); Klapper, L. N.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp. 4995-5000 (1999);ならびに前記の各文献に見出される参考文献)。
【０００５】
これらの各技術は、アルデヒド（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドのごとき）、ホルマリン代替物、アルコール（エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール）のごとき化学物質で試料を固定し、または試料をパラフィン、セロイジン、寒天、ポリマー、樹脂、低温用媒体または種々のプラスチック包埋媒体（エポキシ樹脂およびアクリル酸のごとき）のごとき不活性物質中に包埋することが含まれ得る調製工程を試料の細胞または試料に行うことが必要である。凍結（冷凍組織切片）または極細の針を用いた吸引（穿刺吸引（ＦＮＡ））のごとき物理的操作を必要とする試料組織または細胞の調製もある。組織もしくは細胞試料またはその調製もしくは保存の方法にかかわらず、技術者の最終目標はデータを正確に解釈し得る、正確で、判読可能な、再現性のある結果を得ることである。正確で、判読可能な再現性のあるデータを得るための１の方法は、用いる技術にかかわりなく試験の結果を最適化するように組織または細胞を調製することである。免疫組織化学およびイン・サイチュ技術の場合には、これは特定のプローブ（例えば、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡほか）から得られるシグナルの量を増大させることを意味する。組織化学染色の場合には、それは染色の強度を増大させることまたは染色コントラストを増大させることを意味し得る。
【０００６】
保存しなければ、組織試料は、その宿主から取り出した後短期間のうちに診断におけるその使用が危うくなるように迅速に悪化する。１９８３年に、Ferdinand Blumは、組織を組織化学法に用いることができるようにそれを保存または固定するためにホルムアルデヒドを用い得ることを発見した。ホルムアルデヒドが組織を固定する正確なメカニズムは十分に確立されていないが、それにはそのメチレン架橋を介した同一タンパク質内の反応部位の架橋および異なるタンパク質間の反応部位の架橋が含まれる(Foxら, J. Histochem. Cytochem. 33: 845-853 (1985))。最近の事実は、カルシウムイオンも役割を演じていることを示唆している(Morganら, J. Path. 174: 301-307 (1994))。これらの架橋は、タンパク質の四次および三次構造に変化を生じるが、一次および二次構造は保存されるようである(Masonら, J. Histochem. Cytochem. 39: 225-229 (1991))。架橋反応が生じる範囲は、ホルマリンの濃度、ｐＨ、温度および固定の長さのごとき条件に依存する(Foxら, J. Histochem. Cytochem. 33: 845-853 (1985))。ガストリン、ソマトスタチンおよびα−１−アンチトリプシンのごとき幾つかの抗原はホルマリン固定後に検出し得るが、中間径フィラメントおよび白血球マーカーのごとき多くの抗原についてはホルマリン処理後の免疫検出が欠失または顕著に低下する(McNicolおよびRichmond, Histopathology 32: 97-103 (1998))。抗原の免疫反応性の喪失は、不連続である抗原エピトープ、すなわちエピトープの形成が隣接しないタンパク質配列の部分の集合に依存するアミノ酸配列において最も顕著である。
【０００７】
抗原賦活とは、架橋剤での組織の処理がその組織内に存在する抗原に誘導する構造変化を“元に戻す”試みをいう。抗原賦活の機構を説明しようとする幾つかの理論が存在する（例えば、ホルマリン固定によって形成される架橋の喪失または破壊）が、ホルマリンによるタンパク質構造の修飾は、高温加熱のごとき条件下で可逆的であることは明らかである。また、幾つかの因子が抗原賦活に影響することも明らかである：溶液中の加熱、ｐＨ、モル数および金属イオン (Shiら, J. Histochem. Cytochem. 45: 327-343 (1997))。
【０００８】
マイクロウェーブ加熱は、ホルマリン固定によってマスクされた抗原の賦活に対して最も重要な因子のようである。マイクロウェーブ加熱(１００±５℃)は、 一般的に抗原賦活免疫組織化学(AR-IHC)により良好な結果をもたらす。オートクレーブ処理(Ponsら, Appl. Immuraohistochem. 3: 265-267 (1995); Bankfalviら, J. Path. 174: 223-228 (1994));圧力処理（pressure cooking）(MillerおよびEstran, Appl. Imnaunohistochem. 3: 190-193 (1995); Nortonら, J. Path. 173: 371-379 (1994));ウォーターバス(Kawaiら, Path. Int. 44: 759-764 (1994));マイクロウェーブ・プラス・プラスチック圧力処理（microwaving plus plastic pressure cooking）(米国特許第5,244,787;; Pertschukら, J. Cell Biocherra. 19 (増補版): 134-137 (1994));および蒸気加熱(Pashaら, Lab. Invest. 72: 167A (1995); Taylorら, CAP Today 9: 16-22 (1995))のような異なる加熱方法がＩＨＣにおける抗原賦活について説明されている。
【０００９】
マイクロウェーブ加熱を蒸留水中で行った場合には幾つかの抗原で満足のいく結果が得られているが、多くの抗原は加熱処理の間に緩衝液を使用する必要がある。十分な結果が狭いｐＨ範囲でしか達成されないような場合、抗原が特定のｐＨ要件を有する場合がある。現在のところ、大部分の抗原賦活溶液はほぼ６−８のｐＨで使用されているが、わずかにより塩基性の溶液がぎりぎり優れた結果を提供し得るという幾つかの指標が存在する(Shi,ら, J. Histochem. Cytocheni. 45: 327-343 (1997))。金属イオンを含む抗原賦活溶液の化学成分がマイクロウェーブ法において可能性のある補助因子として役割を果たしている可能性はあるが、現在まで、抗原賦活に必須かつ最良である単一の化学物質は全く同定されていない。
【００１０】
染色増強のために多くの溶液や方法が日常的に用いられている。それらには、限定されるものではないが、蒸留水、ＥＤＴＡ、尿素、Ｔｒｉｓ、グリシン、塩類溶液およびクエン酸緩衝液が含まれる。種々の洗剤（イオン性または非イオン性の界面活性剤）を含有する溶液も、（常温ないし１００℃を超える）広範囲の温度下で染色増強を促進し得る。
【００１１】
細胞の外部に存在し得る細胞表面分子に加えて、ＩＨＣ、ＩＳＨおよび他の免疫組織化学的および細胞化学的な操作において関心のある他の分子は細胞内、しばしば核のエンベロープに位置する。
【００１２】
これらの分子の幾つかは、ホルマリンのごとき固定剤(凝固または沈殿剤)に曝された場合に分子変換を受ける。したがって、これらの分子に関しては固定の影響を克服するのみならず、有機または無機の化合物と細胞との相互作用を促進するために細胞の浸透性を高めることが望ましい。
【００１３】
試験前に架橋剤に付すことができない組織試料もあるが、これらの組織に関しても改善された結果は重要である。細胞学的および組織学的試料を保存し、調製する種々の非−ホルマリン法が存在する。これらの方法の例には、限定されるものではないが：ａ) 血液スメア、サイトスピン（cytospins）TM、シンプレップス（ThinPreps）TM、タッチ・プレップス（touch preps）、セルライン、フィコール分離ほかがあり、多くの方法で日常的に保存されており、それらの方法には、限定されるものではないが、風乾、アルコール固定、スプレー固定剤およびスクロース／グリセリンのごとき保存培地が含まれる；ｂ）組織および細胞（固定化したものまたは非−固定化のもののいずれも）は凍結し、つづいて種々の安定化技術に付し得る。この安定化技術には、限定されるものではないが、保存、固定および乾燥が含まれる；ｃ）組織および細胞は多くの非−架橋性アルデヒド固定剤、アルデヒド非含有固定剤、アルコール性固定剤、酸化剤、重金属固定剤、有機酸および輸送培地中で安定化し得る、などが含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
試験の結果を改善するための１の方法は、所定の試料から得られるシグナルを増大させることである。一般的な感覚において、所定の分子のそのターゲットに対する接近し易さを増大させることによってシグナルの増大を得ることができる。細胞内に見出される抗原の場合では、細胞の透過性を増大させ、それによってより多数の分子が細胞に入ることができることによって細胞内のターゲットをより近づき易いものとし得る。それによって該分子がそのターゲットを“発見”する確率が上昇する。かかる透過性の増大は、ＩＳＨ、イン・サイチュＰＣＲ、ＩＨＣ、組織化学および細胞化学のごとき技術については特に重要である。
【００１５】
組織および細胞は、種々の不活性媒体（パラフィン、セロイジン、ＯＣＴＴＭ、寒天、プラスチック、アクリル酸ほか）に包埋して、将来分析するためのその保存を助ける。これらの不活性物質の多くは疎水性であって、組織学および細胞学的な適用に用いる試薬は大部分は親水性であり；したがって、試験する前に生物試料から不活性媒体を除去する必要があり得る。例えば、パラフィン包埋組織切片は、スライドをトルエン、キシレン、リモネンまたは他の好適な溶媒のごとき種々の有機溶媒に通すことによって組織切片からパラフィンを除去することによってその後の試験のために調製する。これらの有機溶媒は非常に揮発性が高く、特別な処理（例えば、脱パラフィン処理は換気フード中で行う）を必要とし、特別な廃棄を必要とすることを含む種々の問題を引起す。これらの有機溶媒を使用することは、分析費用を増大させ、試験する各組織試料に関連する危険に曝され、環境に対する重大な負の効果を有する。
【００１６】
現在のところ、自動様式でスライドを直接加熱することによって試料組織から不活性媒体を除去するのに利用できる技術は存在しない。また、現在、試料組織または細胞を一工程の自動染色プロセスでコンディショニングしつつ、試料組織から不活性媒体を除去することも不可能である。
【００１７】
本発明の方法によれば、ａ）有機溶媒を使用することなく包埋している媒体を自動的に除去することが可能となり、したがって細胞を染色に曝すことができ、それによって時間の短縮、費用の削減および安全性の担保が可能となり、ｂ）試料の細胞または組織から包埋している媒体を自動的に除去することなく、自動的に細胞をコンディショニングすることが可能となり、ｃ）細胞を曝し、細胞コンディショニングを行い、組織学的または細胞学的な標本の透過性を増大させることができる多段階自動プロセスが可能となり、それによって試料の判読性を増大させ、試験データの解釈を改善することができる。本発明の方法は、細胞学的および組織学的な染色技術と組合せて用いる大部分の組織学的および細胞学的な試料の染色性および判読性を改善するために用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、組織化学または細胞化学的なアッセイの間に生物試料中の分子の接近し易さを改善する、細胞または組織をコンディショニングするための溶液、方法および機器に関する。コンディショニングは、組織化学または細胞化学的なプロトコールのいずれの時点においても行い得る。
【００１９】
本発明は、さらに、有機溶媒を用いることなく包埋している媒体を除去することによって組織化学または細胞化学的な試験法において使用するために生物試料を曝すための自動方法に関する。
【００２０】
本発明は、組織化学的および細胞化学的な適用のために生物試料を同時に曝し、細胞コンディショニングするための自動方法にも関する。
【００２１】
本発明は、組織化学的および細胞化学的な染色法のために試薬分子が接近できるように細胞または組織を前処理する、生物試料を細胞コンディショニングするための自動環境において使用するための試薬、処方、水性組成物などを提供する。該試薬には、分子が生物試料内の細胞および細胞構成物に接近するのを促進するために最適化された成分が含まれる。本発明は、有機溶剤に依存することなく組織化学または細胞化学的手法において染色する生物試料を曝すことによって、包埋している媒体を除去またエッチング（etching）するための自動環境において使用するための試薬も提供する。試薬には、生物試料からの包埋している媒体の除去またはエッチングを促進するために最適化された成分が含まれる。
【００２２】
本発明の処方が有用となり得る１の具体例は、保存および支持のために生物試料が包埋されている不活性物質を除去することによって生物試料を曝すことに関する。好ましい具体例において、生物試料の１の側を加熱することによって生物試料からパラフィンまたは他の不活性物質を除去する。これは、包埋した生物試料が置かれた顕微鏡スライドを接触加熱することによって行い得る。包埋した生物試料から除去し得る他の不活性物質には、限定されるものではないが、寒天および低温媒体が含まれる。不活性な包埋媒体を除去するかまたは包埋媒体をエッチングするこのプロセスを、本明細書中で曝すまたは暴露という。
【００２３】
本発明の処方が有用となり得る好ましい方法において、スライドガラス上に載っているパラフィン包埋した生物試料を、最初に、加熱エレメントによって加熱する。該加熱エレメントは、試料スライドが乾燥し、パラフィンが融解するように、自動染色機器(両方とも出典明示して本明細書の一部とみなす、１９９７年１２月１９日に出願された米国特許出願08/995,052号および１９９８年２月２７日に出願された米国仮特許出願60/076,198号)内の生物試料（出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許出願第09／259,240号に開示されている温度プラットフォームのごとき）の１の側に熱を曝す。
【００２４】
加熱エレメント
（出典明示して本明細書の一部とみなす）米国特許出願09/259,240号で論じ、本明細書全体を通して同様の部分が同様の参照数字によって示されている図面に詳細に参照して、本発明による処方が有用である分子病理装置の斜視図を図１に示し、かかる装置は参照数字１０で示している。装置１０は、望ましい配列、時間および温度で、顕微鏡スライド上に載置された組織を自動的に染色するか、または核酸プローブ、抗体、および／または試薬で処理するように設計されている。ついで、かく染色または処理した組織切片は、患者の診断、予測または治療を選択する目的でスライドを判読する医師によって顕微鏡下で観察される。
【００２５】
本発明の処方が有用である装置の好ましい具体例において、装置１０は、ホスト・コンピュータ１４、好ましくはパーソナル・コンピュータ、モニター１６、キーボード１８、マウス２０、バルク流体容器２２、廃棄容器２３および関連する器具をも含むシステム１２（図２）の１のコンポーネントまたはモジュールとして機能する。さらなる染色モジュールまたは他の機器をシステム１２に加えて、サーバーとして機能するコンピュータ１４とネットワークを形成することもできる。また、これらの別々のコンポーネントの幾つかまたはすべてを装置１０に組入れて、それを独立型の機器とすることもできる。
【００２６】
装置１０ならびにシステム１２の好ましい構成は、一般的に、後記に開示するごとき新規な加熱システム、スライド支持体、バルク流体モジュール、体積アジャスト、およびスライド拭取りに関することを除いて、両方とも出典明示して本明細書の一部とみなす１９９７年１２月１９日に出願された米国特許出願08/995,052号ならびにVentana Medical Systems, Inc. (Tuscon, AZ)から入手可能であるVentana NexESの使用者ガイドに記載されている。明瞭にするために、本発明および本明細書の一部分とみなす参考文献の両方に見出されるこれらコンポーネントの詳細な説明は省略する。
【００２７】
簡単に説明すると、装置１０は標準的な顕微鏡スライドガラス上に載置した組織に化学試薬および生物試薬を自動的に適用するマイクロプロセッサー制御された染色機器である。放射状に配置されたスライドガラスを支持する回転式支持体（carousel）は、ステッピングモーターによって回転して、各スライドを一連の試薬分配器のうちの１の下に位置させる。装置１０は分配、洗浄、混合および加熱を制御して反応動力学を最適化する。コンピュータ制御のオートメーションにより、無人様式（walk-away manner）、すなわち手動の労力をほとんど使わないで装置１０を使用することができる。
【００２８】
より詳細には、装置１０は、上部セクション３２に取外し可能に載置または蝶番式に取り付けられた下部セクション３０から形成されるハウジングを含む。スライド回転式支持体３４は、軸Ａ−Ａの回りに回転するように下部セクション３０内に載置されている。より詳細に後記するごとく、複数の温度プラットフォーム５０が回転式支持体３４の周囲の回りに放射状に載置されており、その上に組織試料を含む標準的なスライドガラスを置くことができる。回転式支持体３４は好ましくはステンレススチールから構成されている。本明細書中に記載するごとく、各スライドの温度を種々のセンサーおよびマイクロプロセッサーによって個別に制御し得ることが本発明の鍵となる特徴である。また、洗浄分配ノズル３６、CoverslipTM分配ノズル３７、流体ナイフ３８、洗浄体積調整ノズル３９、バーコードリーダー・ミラー４０およびエアーボルテックスミキサー４２も装置１０の中に収容されており(図３)、それらの詳細は本明細書中に後に論じる。
【００２９】
上部セクション３２の上に回転可能に載置されているのは試薬回転式支持体２８である。分配器２６は、回転式支持体２８に結合するようになっている試薬トレイ２９に取外し可能に載置されている（図４）。試薬にはスライドに簡便に適用し得るいずれの化学的または生物学的物質も含まれ、核酸プローブまたはプライマー、ポリメラーゼ、一次および二次抗体、消化酵素、プレ固定剤、ポスト固定剤、ブロッキング剤、読出し化学物質、および対比染色剤が含まれる。試薬分配器２６には、好ましくはコンピュータによって同定するためにバーコードが標識されている（２９）。各スライドについて、単一の試薬を適用し、ついで温度制御された環境下で正確な時間インキュベートする。試薬の混合は、スライドの端部に沿って向けられた圧縮空気ジェット４２によって行い、したがって試薬を回転させる。適用にインキュベーションした後に、ノズル３６を用いてスライドから試薬を洗い流す。ついで、残存している洗浄緩衝液の体積を体積調整ノズル３９を用いて調整する。ついで、蒸発を阻害するためのカバースリップ（Coverslip）TM溶液をノズル３７を介してスライドに適用する。エアーナイフ３８はCoverslipTMのプールを分割し、つづいて次の試薬を加える。これらの工程は当該プロトコールが完了するまで回転式支持体が回転する場合に繰り返される。
【００３０】
ホストコンピュータ１４に加えて、装置１０は好ましくはそれ自体のマイクロプロセッサー４４を含んでおり、それにホストコンピュータ１４からの情報がダウンロードされる。詳細には、コンピュータは、“ラン・ルール（run rule)”と呼ばれる実行プログラムおよびセンサー・モニタリングおよび制御ロジックならびにプロトコールの温度パラメータの両方をマイクロプロセッサー４４にダウンロードする。Dallas Semiconductor, Dallas TXから販売されているモデル番号DS2251T 128Kはこのファンクションを実行し得るマイクロプロセッサーの一例である。
【００３１】
ここで図５に転じると、スライド加熱システム４８のブロック図が示されている。該システムには、一般的に、スライドを加熱し、その温度をモニターするために回転式支持体３４に放射状に載置された約２０の温度プラットフォーム、ならびにセンサーをモニターし、ヒーターを制御するスライド回転式支持体に載置された制御電子部品プリント回路基板５２も含まれる。制御電子部品５２は回転式のスライド回転式支持体３４の下に載置されている。情報および電力は、固定された機器プラットフォームから、スリップリング・アセンブリー５６を介して回転式支持体に移送される。この情報には、後記するごとく電子部品５２を制御するために（コンピュータ１４からダウンロードされた後に）マイクロプロセッサー４４から通信された、スライド（上部および下部）を加熱するために必要な温度パラメータが含まれる。実行している間にスライドの温度がプログラムされた下限を下回ると判断された場合には、温度プラットフォームがスライドを加熱する。同様にして、スライドの温度が上限を上回ることが判明した場合には、加熱を中止する。ヒーター当たり約８ワットを提供する十分な容量を有する電源は、適当な温度上昇速度（a/k/a"ランプアップ"）と合致するように配されている。
【００３２】
同様にして、別の具体例においては、スライドの冷却は後に記載するごとく同様にして制御し得る。１の別の具体例において、スライドの下方に冷却プラットフォームが載置される。冷却プラットフォームは、ペルチエ型熱変換器を含むことができる。別の具体例において、スライドの迅速な冷却が特定の適用のために必要な場合には、（図示していない）ファンのごとき冷却デバイスを任意に配し得る。冷却デバイスはすべてのプラットフォームに対して常温の空気を変化させ、室内空気の温度の低下を補償するために低下させてはならないスライドに対応するヒーターを必要とする。本明細書に記載するスライド加熱システムは、伝導加熱を使用し、スライドを個々に加熱する。該システムはより正確なスライド上の温度を提供し、スライド毎に温度設定することができる。
【００３３】
スライドの加熱
典型的に、生物試料はスライド（スライドガラスのごとき）の上面に載置する。ついで、スライドを、当該スライドの底面が温度プラットフォーム５０と接触するように温度プラットフォーム上に載置する。先に論じたごとく、温度プラットフォーム５０は伝導を介して、スライドの底部分を加熱する。生物試料を加熱した後に、流体（気体または液体としての）によってスライドから不活性物質を除去し得る。 例えば、不活性物質は脱イオン水および界面活性剤で濯ぎ得る。本発明に有用な界面活性剤には、限定されるものではないが、Chemphos TC-227S (Chemron Corp.)、Colawet DOSS70 (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70E (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70PG (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、ESI-TERGETM 320 (CCP/Atofina, Kansas City, MO)、Geropon T-77 (Rhodia, Inc.)、Geropon AS-200 (Rhodia, Inc.)、Hostapon KCG (Clarient Corp.)、Monafax 057 (Uniquema/ICI Surfactants)などが含まれる。好ましくは、界面活性剤はChemphos TC-227SまたはHostapon KCGである。より好ましくは、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
【００３４】
本発明の脱パラフィン法は、先行技術で行われたものとは顕著に異なる。先行技術の方法には: (１)有機溶剤を用いてパラフィンを溶解すること、または(２)熱および溶解剤を手動で用いてパラフィンを溶解することが含まれる。それに対して、本発明の１の態様において、脱パラフィンにはパラフィンを溶解する化学反応が含まれない。詳細には、試料上に置く液体はパラフィンを溶媒和しない。その代わりに、本発明の方法には、組織からパラフィンを融解させ、それを流体で洗い流すことが含まれる。１の具体例において、包埋試料上に置く流体は、パラフィンと混和するものでも混合できるものでもない。この一例は、パラフィンと混和しない水である。また、水は液体パラフィンよりも大きな密度を有する。パラフィンは、融解した場合、スライドの上面を濯ぎ得るように流体の頂部まで浮き、融解したパラフィンを濯ぎ流すことができる。
【００３５】
本発明のもう１の方法において、パラフィン包埋生物試料は、顕微鏡スライドガラス上に載置し、その顕微鏡スライドを加熱エレメント上に載置する。試薬は生物試料スライドの上に置き、ついで生物試料スライドを不活性物質を融解させ得る高温に曝し、その後に、不活性物質を流体（気体または液体として）によってスライドから除去し得る。
【００３６】
本発明の好ましい具体例において、包埋生物試料の加熱と組合せて試薬を用いる。好適な試薬には、限定されるものではないが、脱イオン水、クエン酸緩衝液(pH 6.0-8.0)、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(pH 6-10)、リン酸緩衝液(pH 6.0-8.0)、SSC緩衝液、APK WashTM、酸性の緩衝液または溶液(pH 1-6.9)、塩基性の緩衝液または溶液(pH 7.1-14)、鉱油、Norpar、キャノーラ油およびPAG油が含まれる。これらの各試薬は、Triton X-100、Tween、Brij、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムのごときイオン性または非イオン性の界面活性剤も含み得る。本発明において有用な他の界面活性剤には、限定されるものではないが、Chemphos TC-227S (Chemron Corp.)、Colawet DOSS70 (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70E (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70PG (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、ESI-TERGETM 320 (CCP/Atofina, Kansas City, MO)、Geropon T-77 (Rhodia, Inc.)、Geropon AS-200 (Rhodia, Inc.)、Hostapon KCG (Clarient Corp.)、Monafax 057 (Uniquema/ICI Surfactants)などが含まれる。好ましくは、界面活性剤はChemphos TC-227SまたはHostapon KCGである。より好ましくは、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
【００３７】
本発明の方法において、加熱エレメントの温度は不活性物質の融点を超える温度まで上昇させる。例えば、純粋なパラフィンの融点はMerck indexにおいて５０−５７℃と掲載されている。したがって、本発明の方法においては、温度は生物試料を包埋しているパラフィンの融点を超える。本発明の好ましい方法において、温度は５０℃なし約１３０℃を超えて上昇させる。
【００３８】
本発明の方法において、不活性物質を融解させるのに必要な時間は、用いる温度および包埋物質により変化するであろう。典型的には、自動システムにおいては、マイクロプロセッサーのごときプロセッサーをメモリーと結合して用いる。パラフィンを融解させるのに必要な時間および温度は、メモリーに含まれるテーブル内に含まれている。
【００３９】
パラフィン包埋生物試料は、５分ないし６０分間の範囲で高温に付する。本発明の方法に用いる加熱エレメントは、生物試料を載置する表面と加熱エレメントとの間に十分な接触が維持されることを必要とする。
【００４０】
図６に参照すると、そこにはスライドから包埋媒体を除去する１の具体例のフローチャートが示されている。ブロック６０に示すごとく、フライドの表面を振盪する。１の具体例において、ボルテックスエアミキサー４２を使いてスライドの表面上の生物試料を攪拌する。ブロック６２に示すごとく、スライドの温度を所定の温度まで上昇させる。１の具体例において、スライドの温度は温度プラットフォーム５０を使用して加熱することによって上昇させる。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション(ＩＳＨ)の一例として、最初の加熱工程で、スライドを６５℃に１６分間加熱し、ついで７５℃に２分間加熱する。免疫組織化学(ＩＨＣ)の例においては、最初の加熱工程で、温度プラットフォームの温度を７５℃にほぼ４分間上昇させる。この最初の加熱工程は、必ずしも包埋媒体を除去するために必要なものではなく、 (1) 生物試料とスライドの表面との間のいずれの水分をも除去するため；および（２）包埋している媒体を融解し始めるために（パラフィンの融点は先に論じたように５０−５７℃である）行うものである。
【００４１】
包埋媒体は試料の外側に存在し（すなわち、試料を覆っている）、組織中に注入されてもいる。この最初の加熱を行う場合には、包埋媒体を組織から排出（pool away）し得る。詳細には、スライドはスライド角度で存在する（完全に水平ではない）ため、試料が落ち着くよりも低位のスライド上の点に包埋媒体は徐々に溜まり得る。別の態様において、スライドは最初の加熱工程の後に流体（液体または気体のいずれか）で濯いで、溜まっている包埋媒体を除去し得る。例えば、脱イオン水のごとき流体を用いて、包埋媒体をスライドから濯ぎ得る。
【００４２】
ブロック６４に示すごとく、水性流体をスライドに適用する。流体が生物試料全体を覆うようであれば、いずれの水性流体でも許容し得る。先に論じたごとく、水性流体の例には、脱イオン水、クエン酸緩衝液(pH 6.0−8.0)、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(pH 6-10)、リン酸緩衝液(pH 6.0-8.0)、ＳＳＣ緩衝液、APK WashTM、酸性の緩衝液または溶液(pH 1-6.9)、塩基性の緩衝液または溶液(pH 7.1-14)、鉱油、Norpar、キャノーラ油およびPAG油が含まれる。さらに、水性流体には、Triton X-100、Tween、Brij、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムのごときイオン性または非イオン性の界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤は水性流体の表面張力を低下させ、スライドの表面に水性流体をより良好に広がらせる。１の具体例において、水性流体は約０.１％のTriton X−100を含む脱イオン水を含む。本発明に有用な他の界面活性剤には、限定されるものではないが、Chemphos TC-227S (Chemron Corp.)、Colawet DOSS70 (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70E (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70PG (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、ESI-TERGETM 320 (CCP/Atofina, Kansas City, MO)、Geropon T-77 (Rhodia, Inc.)、Geropon AS-200 (Rhodia, Inc.)、Hostapon KCG (Clarient Corp.)、Monafax 057 (Uniquema/ICI Surfactants)などが含まれる。好ましくは、界面活性剤はChemphos TC-227SまたはHostapon KCGである。より好ましくは、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
【００４３】
スライドに適用する前に流体が微生物を含んでいないように、抗微生物剤として作用する、さらなる成分を添加することができる。１の具体例において、流体には、９９重量％以上の水含量が含まれる(すなわち、流体は９９−１００％の水からなる)。包埋物質を除去するための流体として水を用いることは好ましくなく、慣用的には包埋物質を除去するために有機溶剤のごときものが使用されている。水は、典型的な包埋物質であるパラフィンと全く非混和性である。それに対して、トルエン、キシレン、リモネンのごとき有機溶剤はパラフィンと混和性であり、したがって脱パラフィンに好適と考えられる。
【００４４】
さらに、水性流体は、包埋媒体が水性流体の表面に浮くことができ、かつ、スライド上の生物試料が完全に乾燥しないように十分な量および十分な時間（加熱による水性流体の蒸発を考慮して）適用すべきである。１の具体例において、水性流体は、最初の適用で１ｍＬの水性流体を生物試料上に適用し、２分後に水性流体の２回目の適用を行うことを含む、順次に適用する。２回目の適用は、ほぼ５ｍＬないし１ｍＬの水性流体とし得る。流体は、スライドの上方に直接的に位置が定められたノズルを用いることによってスライドに適用し得る。このように、スライド上に滴下する流体の量は制御し得る。さらに、流体包埋物質（パラフィンのごとき）が低表面張力を有するようにもできるため、スライド上に流体の流れを適用してもスライドの上面に十分な量の流体を残さないようにすることもできる。したがって、流体を包埋試料に滴下するためにノズルを使用することは好ましい。それによって、より多量の流体がスライドの上面に残るからである。さらに考慮しなければならないことは、包埋媒体の融点よりも高温に生物試料の温度を維持することである。パラフィンの例においては、融点はほぼ５０−５７℃である。好ましい具体例において、試料を７５℃に加熱する。しかしながら、水性流体は加熱されないため、水性流体をスライドに適用すると生物試料の温度を一時的にほぼ６０−６５℃まで低下させ、これはなおパラフィンの融点よりも高温である。したがって、試料を加熱する温度の選択は、スライドに流体を添加してもスライドの温度を包埋媒体の融点未満に低下させないように十分に高温とすべきである。また、スライドに適用する流体は、スライド上の試料の温度を低下させないように、適用する前に加熱することもできる。
【００４５】
ブロック６６では、蒸発阻害剤を適用する。好ましい態様において、LIQUID COVERSLIPTM (LCSTM)を適用する。その後に、ブロック６８に示すごとく、スライドを加熱するためにシステムを所定の時間待機させる。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション(ＩＳＨ)においては、スライドを加熱する時間の一例は７５℃にて６分間である。免疫組織化学（ＩＨＣ）の例においては、インキュベートする時間は７５℃にて８分間である。１の具体例において、後に論じるごとく、スライドの温度を工程７６まで最初の加熱の間一定のままにしておく。したがって、スライド用のヒーターは加熱の最初の工程の間はオンにし、スライドから包埋媒体を濯ぐ後まで同じ温度のままにしておく。また、ヒーターの設定温度は、最初の加熱の時点から包埋媒体をスライドから濯ぐ後まで調整し得る。
【００４６】
加熱の間、包埋媒体は水性流体の頂部に浮く。好ましい具体例において、スライドに適用した流体は包埋媒体よりも大きな密度を有する。特異的な例において、流体は大部分が水からなり（例えば、９９％以上が）、包埋媒体はパラフィンである。油ベースの生成物としてのパラフィンは、水よりも小さい密度を有する。したがって、パラフィンは融解した後に水の頂部に上昇する。
【００４７】
ついで、ブロック７０に示すごとく、スライドを濯ぎ、水性流体中で包埋媒体を持ち去る。好ましい具体例において、スライドをカバーしたのと同じ型の水性流体を用いてスライドを濯ぐ。また、濯ぎは、一定量の水性流体を生物試料上に残す。その後、ブロック７２に示すごとく、水性流体をさらにスライドに適用する。別の具体例において、スライドを濯ぐことにより、さらに水性流体を適用する必要がないように、スライド上に十分量の水性流体を残すこともできる。
【００４８】
ブロック７４においては、蒸発阻害剤を適用し、これは好ましい具体例においてLiquid CoverslipTM (LCSTM)である。その後、ブロック７６に示すごとくスライドの温度を低下させる。好ましい具体例において、これは温度プラットフォーム５０によって加える熱を減少または除去することによって行う。さらに、好ましい具体例において、スライドの温度を４２℃の所定温度まで低下させる。この所定の温度は、処理する場合に、すべてのスライドが知られている温度となる（変動し得る常温になるのに対して）ように選択する。その後、ブロック７８に示すごとく、装置を所定時間待機させる。
【００４９】
本発明のもう１の具体例は、その中で生物試料が保存および支持のために包埋されている不活性物質を除去することなく生物試料を曝すことに関する。本発明の好ましい具体例において、生物試料は、包埋した生物試料が置かれている顕微鏡スライドを接触加熱する（contact heating）ことによって試験に対する準備が整う。包埋生物試料から除去されない他の不活性物質には、限定されるものではないが、プラスチックまたはセロイジン製の包埋媒体および／または他のポリマーおよび樹脂が含まれる。
【００５０】
本発明の好ましい方法において、スライドガラス上に載っている包埋した生物試料を最初に加熱エレメントによって加熱する。加熱エレメントは、試料スライドが乾燥するように、自動染色機器(米国特許出願08/995,052および60/076,198号)内の米国特許出願09/259,240号に開示されている温度プラットフォーム５０を使用するごときによって、生物試料の一方の側に熱を曝す。
【００５１】
本発明のもう１の方法において、包埋生物試料を顕微鏡スライドガラス上に置き、その顕微鏡スライドを一方の側で加熱する（例えば、該スライドを温度プラットフォーム上に置くことによって）。ついで、試薬を生物試料スライドに置き、試薬を含む生物試料を特定の温度（常温から１００℃を超える温度の範囲）まで、特定の時間（２分から１２時間の範囲）加熱する。これにより、不活性包埋物質の表面のエッチングが起り、その後に、流体（気体または液体としての）によってエッチング試薬を除去し得る。先に論じたごとく、時間の長さおよび特定の温度はメモリーに保存し得る。
【００５２】
本発明の好ましい方法において、試薬は、包埋生物試料を加熱することと組合せるかまたは組合せないで用いる。好適な試薬には、限定されるものではないが、脱イオン水、クエン酸緩衝液(pH 6.0-8.0)、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(pH 6-10)、リン酸緩衝液(pH 6.0-8.0)、SSC緩衝液、APK WashTM、酸性の緩衝液または溶液(pH 1-6.9)、塩基性の緩衝液または溶液(pH7.1-14)、鉱油、Norpar、キャノーラ油およびPAG油が含まれる。これらの各試薬は、イオン性または非イオン性の界面活性剤も含むことができ、それらには、限定されるものではないが、Chemphos TC-227S (Chemron Corp.)、Colawet DOSS70 (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70E (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN)、Colawet DOSS70PG (Colonial Chemical, Inc., South Pittsburg, TN), ESI-TERGETM 320 (CCP/Atofina, Kansas City, MO)、Geropon T-77 (Rhodia, Inc.)、Geropon AS-200 (Rhodia, Inc.)、Hostapon KCG (Clarient Corp.)、Monafax 057 (Uniquema/ICI Surfactants)などが含まれる。好ましくは、界面活性剤はChemphos TC-227SまたはHostapon KCGである。より好ましくは、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
【００５３】
本発明の方法においては、加熱エレメントの温度は包埋生物試料を乾燥またはエッチングするのに適当なレベルに設定する。例えば、エッチングは、常温から３７℃の範囲の温度にて、メタノール−水酸化ナトリウム（ナトリウムメトキシド）の塩基性溶液を用いて行い得る。
【００５４】
本発明の方法においては、不活性物質をエッチングするのに要する時間は使用する温度および包埋物質（プラスチックまたはセロイジン製の包埋媒体および／または他のポリマーおよび樹脂ほか）により変化するであろう。本発明の好ましい方法においては、包埋生物試料を２分から１２時間の範囲で適当な温度に付する。本発明の方法に使用する加熱エレメントは、生物試料をその上に置く表面と当該加熱エレメントとの間に十分な接触が維持される必要がある。
【００５５】
本発明の好ましい具体例には、生物試料から不活性包埋物質を除去またはエッチングするのと同時の、その後のまたはそれとは独立した、細胞コンディショニングの自動方法も含まれる。適当な（有機または無機）の試薬中で生物試料を加熱することが、細胞中のターゲット分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、色素または他の小分子ほか）に対する試薬の接近し易さを改善することが判明した。分子ターゲットに対する試薬（有機または無機）の接近し易さを改善するこの方法を、本明細書中では細胞コンディショニングという。
【００５６】
本発明の１の方法において、細胞コンディショニングは前記したごとく生物試料を曝している間に行う。本発明のこの方法においては、生物試料を顕微鏡スライド上に置き、自動染色機器（米国特許出願08/995,052および60／076,198)内で顕微鏡スライドを一方の側で加熱する（例えば、スライドを温度プラットフォーム上に置くことによって）。試薬は生物試料の上に置き、加熱エレメントの温度は上昇させても、上昇させなくてもよい。生物試料は、不活性物質を融解またはエッチングすることができ、後に組織化学または細胞化学技術を用いて染色すべき生物試料を細胞コンディショニングすることができるような適当な時間、適当な温度に曝す。
【００５７】
図７ａ−ｂに参照すると、そこには細胞試料を曝して細胞コンディショニングを行い得る１の具体例のフローチャートが示されている。ブロック８０に示すごとく、細胞コンディショニングを適用するか否かを決定する。必要なプロセシングに依存して、種々の細胞コンディショニングを適用し得る。ブロック８２に示すごとく、スライドは水性流体で濯ぐ。生物試料全体を覆うようであればいずれの水性流体も許容し得る。好ましい具体例において、Triton X-100TMを含む脱イオン水を使用する。その後、ブロック８４に示すごとく、蒸発阻害剤をスライドに適用する。好ましい具体例においては、Liquid CoverslipTMを適用する。その後、ブロック８６に示すごとく、スライドの温度を所定値に変化させる。好ましい具体例において、ヒーターはスライドを４２℃に加熱する。この最初の加熱は、すべてのスライドが所定の温度で細胞コンディショニングが開始することを確実ならしめるために行い；さもなければ、スライドの温度が常温によって決まる場合にはスライドの温度が分からないかもしれない。
【００５８】
ついで、ブロック８８に示すごとく、蒸発阻害剤を適用する。その後、ブロック９０に示すごとく、スライドの温度を所定の温度まで上昇させる。これが細胞コンディショニングを行う温度である。好ましい具体例において、ヒーターの温度は１００℃に設定する。その後、ブロック９２に示すごとく細胞コンディショナーを適用し、ブロック９４に示すごとく蒸発阻害剤を適用する。本明細書中で論じるごとく、多数の細胞コンディショナーを適用し得る。
【００５９】
どの程度試料を軽度／重度に固定するかによって、必要な細胞コンディショニングの量が決まる。試料を軽度に固定する場合には、温和な細胞コンディショニングが推奨される。同様にして、試料を中度ないし重度（拡大して）に固定する場合には、各々、適度ないし重度の細胞コンディショニングが推奨される。不適当な細胞コンディショニングは、試料のプロセシングに対して有害な結果を及ぼし得る。好ましい具体例において、温和／中度／重度の細胞コンディショニングは、各々、３０／６０／９０分である。さらに、細胞コンディショナーは、細胞を適当にコンディショニングし、試料が完全に乾燥するのを避けるために、プロセシング内で所定の増分で適用する。図７ａに示すごとく、ブロック９６に示した細胞コンディショナーおよびＬＣＳTMの適用を繰り返す回数を決定する。この変数を“ループ  カウンター”と呼ぶ。図７ｂのブロック９８に示すごとく、“ループ  カウンター”を０に設定する。（ブロック１００に示すごとく）ループを入力し、（ブロック１０２に示すごとく）システムを所定の時間待機させる。好ましい具体例において、所定の時間は６分間である。（ブロック１０４に示すごとく）細胞コンディショナーを適用し、（ブロック１０６に示すごとく）蒸発阻害剤を適用する。ついで、ブロック１０８に示すごとく、ループ  カウンターを増分する。好ましい具体例において、ループを実行する回数は温和／中度／重度の細胞コンディショニングに対して５／１０／１５である。その後、ブロック１１０に示すごとく、スライドの温度を低下させる。好ましい具体例において、ヒーターの温度は４２℃まで低下させる。また、ヒーターを切り、スライドの温度を常温まで戻すこともできる。その後、ブロック１１２に示すごとくスライドを濯ぐ。
【００６０】
細胞コンディショニングに用いる試薬は、包埋生物試料を曝すためのものと同一のものとし得る。例えば、ＤＮＡターゲットについては、細胞コンディショニング溶液はＥＤＴＡの溶液とし；通常温度設定を９５℃にて２−９０分間の範囲とし得る。タンパク質ターゲットについては、細胞コンディショニング溶液はホウ酸緩衝液の溶液とし；通常温度設定を１００℃を超える温度にて２−９０分間の範囲とし得る。ＲＮＡターゲットについては、細胞コンディショニング溶液をＳＳＣの溶液とし；通常温度設定を７５℃にて２−９０分間の範囲とし得る。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色のごとき組織化学的反応については、細胞コンディショニング溶液を処理した脱イオン水とし：通常温度を６０−８０℃にて２−９０分間の範囲とし得る。可能な試薬の部分的なリストは、Analytical Morphology, Gu編, Eaton Publishing Co. (1997), pp. 1-40に見ることができる。溶液は一般的に、公知のモル濃度、ｐＨおよび組成のものとすべきである。好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および／またはエチレングリコールをコンディショニング溶液に添加する。さらに、金属イオンまたは他の物質をこれらの試薬に添加して、細胞コンディショニングの効果を高め得る。
【００６１】
本発明のもう１の方法において、細胞コンディショニングは前記したごとく生物試料を曝した後に行う。本発明のこの方法においては、生物試料を顕微鏡スライドガラス上に置き、自動染色機器(米国特許出願08/995,052および60/076,198号)内で顕微鏡スライドを一方の側で加熱する（例えば、スライドを温度プラットフォーム上に置くことによって）。この方法（その１の具体例を図６に示す）においては、スライドガラス上に置いた包埋生物試料を、最初に、試料スライドが乾燥し、包埋物質が融解またはエッチングされ、流体を適用することによって除去されるように、自動染色機器内の加熱エレメントによって加熱する。生物試料を曝した後に、生物試料の細胞コンディショニングが行えて、その後に組織化学的または細胞化学的な技術を使用して染色し得るようにするために、適当な試薬を適用する。
【００６２】
細胞コンディショニングに使用する試薬は、包埋生物試料を曝すためのものと同一のものとし得る。例えば、ＤＮＡターゲットについては、細胞コンディショニング溶液をＳＳＣの溶液とし；通常温度設定を９５℃にて２−９０分間の範囲とし得る。タンパク質ターゲットについては、細胞コンディショニング溶液をリン酸緩衝液の溶液とし；通常温度設定を１００℃を超える温度にて２−９０分間の範囲とし得る。ＲＮＡターゲットについては、細胞コンディショニング溶液をＳＳＣの溶液とし；通常温度設定を７５℃にて２−９０分間の範囲の時間とし得る。トリクローム染色のごとき組織化学的反応については、細胞コンディショニング溶液をBouins液とし；通常温度を６０−８０℃の範囲にて２−３０分間の範囲とし得る。
【００６３】
本発明のなおもう１の方法において、細胞コンディショニングは生物試料を曝すことなく行う。本発明のこの方法においては、生物試料を顕微鏡スライドガラス上に置き、顕微鏡スライドを自動染色機器内の加熱エレメント上に置く。試薬を生物試料上に置き、加熱エレメントの温度は上昇させても、上昇させなくてもよい。生物試料の細胞コンディショニングは、組織化学的または細胞化学的な技術を用いて、染色する前に行う。
【００６４】
細胞コンディショニングに使用する試薬は、包埋生物試料を曝すためのものと同一のものとし得る。例えば、ＤＮＡターゲットについては、細胞コンディショニング溶液をクエン酸ナトリウムの溶液とし；通常温度設定を９０℃にて２−９０分間の範囲とし得る。タンパク質ターゲットについては、細胞コンディショニング溶液を尿素の溶液とし；通常温度設定を１００℃を超える温度にて２−９０分間の範囲とし得る。全細胞については、細胞コンディショニング溶液はメタノールの溶液とし；通常温度設定を常温にて４−１０分間の範囲とし得る。抗酸菌（ＡＦＢ）染色のごとき組織化学的反応については、細胞コンディショニング溶液をラッカセイ油とし；通常温度を６０−７０℃にて３０−６０分間の範囲とし得る。
【００６５】
本発明には、アルデヒドで固定されておらず、またパラフィンのごときマトリックス中にも包埋されていない、穿刺吸引細胞診(FNA)スメア、接触標本、Ficoll、CytospinsR、Thins PrepsR、子宮頸−膣パップスメア、血液または体液フィルムほかのごとき細胞化学的標本の細胞コンディショニングも含まれる。多くの場合はメタノールまたはエタノールのごときアルコール中に固定するが、ヘアスプレーまたは他のエアゾール固定剤を噴霧して乾燥させる場合もあり、また、数ある中でカーボワックスおよび（有機または無機）Saccomanno試薬を含み得る細胞化学固定剤中に入れる場合もある。細胞はスライドに遠心分離するかまたは濾過するか、または直接スライドガラスに接触させて塗り付ける場合があり（PAP's）、あるいはスライドに対して直接適用する(接触標本（touch preps）)。
【００６６】
“生物試料”なる語には、限定されるものではないが、標準的な顕微鏡スライドガラス上に置き得るいずれの収集細胞（遊離細胞または組織中の細胞）も含まれ、限定されるものではないが、器官の切片、ガン切片、体液、スメア、凍結切片、血液、細胞学的標本、微生物、組織配列およびセルラインが含まれる。
【００６７】
“色素”なる語には、限定されるものではないが、生物試料中のターゲット化した分子に適用した場合に、該分子を検鏡下で検出し得るようにするいずれの生物学基または化学基も含まれる。色素には、限定されるものではないが、検出可能な核酸プローブ、抗体、および組み合わさってまたはそれ自体で（明視野または蛍光によって）発色する最終生成物を生じる他の試薬が含まれる。
【００６８】
曝すまたは脱パラフィン（すなわち、脱パラフィンの方法）に対して本明細書中で用いる“試薬”、“緩衝液”、“添加剤”、“成分”および“溶液”なる語には、 以下の成分または成分群が含まれ得、それらは別段指摘しない限りすべてSigma Chemicalから入手可能である：脱イオン水、約０.１％のTriton X-100を含む脱イオン水、ｐＨ６.１付近の１０ｍＭのリン酸、約０.１％のTriton X-100を含むｐＨ６.１付近の１０ｍＭのリン酸、ｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.１％のTriton X-100、２×ＳＳＣ、１０ｍＭの塩化トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン（すなわち、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）を含むｐＨ８.２付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.１％のTriton X-100を含むｐＨ８.２付近の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌが含まれる。本発明の範囲の当業者であれば、前記に掲載した成分または成分群の濃度を、曝すまたは脱パラフィンする試薬、緩衝液、添加剤または溶液の特徴を変化させることなく変化し得ることを認識するであろう。
【００６９】
細胞コンディショニングに対して本明細書中で用いる“試薬”、“緩衝液”、“添加剤”、“成分”、“溶液”および“細胞コンディショナー”なる語には以下の成分または成分群が含まれ、これらは別段指摘しない限りすべてSigma Chemicalから入手可能である: ｐＨ６付近の５ｍＭのクエン酸、約０.５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｐＨ６付近の５ｍＭのクエン酸、ｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６付近の２０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳを含むｐＨ６付近の２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６付近の５０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳを含むｐＨ６付近の５０ｍＭのクエン酸、ｐＨ８付近の１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、  約０.０７５％のＳＤＳを含むｐＨ８付近の１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の１０ｍＭのＥＤＴＡ、 約０.０７５％のＳＤＳを含むｐＨ８付近の１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の２０ｍＭのＥＤＴＡ、約０.０７５％のＳＤＳを含むｐＨ８付近の２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の５０ｍＭのＥＤＴＡ、約０.０７５％のＳＤＳを含むｐＨ８付近の５０ｍＭのＥＤＴＡ、約０.５％のＳＤＳおよび約１％のエチレングリコールを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳおよび約５％のエチレングリコールを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳおよび約１０％のエチレングリコールを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.０７５％のＳＤＳおよび約１％のエチレングリコールを含むｐＨ８付近の１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.０７５％のＳＤＳおよび約５％のエチレングリコールを含むｐＨ８付近の１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.０７５％のＳＤＳおよび約１０％のエチレングリコールを含むｐＨ８付近の１ｍＭのＥＤＴＡ、約ｐＨ９のリン酸/クエン酸/ＥＤＴＡ、約１０ｍＭの尿素を含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約１ｍＭの尿素を含むｐＨ６.２付近の１０ｍＭのクエン酸、約１.４ｍＭのＭｇＣｌ２および約０.１％のＳＤＳを含むｐＨ７付近の１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム with 約１.４ｍＭのＭｇＣｌ２および約０．１％のＳＤＳを含むｐＨ７.９９付近の１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ８付近の１０ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ、約２０％のホルムアミドを含むｐＨ８付近の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、約５％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.１％のTriton X-100および約２０％のホルムアミドを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、５×ＳＳＣおよび約２.５％のクロンドロイチンＡを含むｐＨ７付近の１０ｍＭのクエン酸、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、約０.１％のTriton X-100および約２０％のホルムアミドを含むｐＨ８.２付近の１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、約２０％のグリセリンを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約０.１％のTriton X-100および約１０ｍＭのグリシンを含むｐＨ６付近の１０ｍＭのクエン酸、約１ｍＭのクエン酸および約０.２５％のＳＤＳを含むｐＨ７.８付近の１ｍＭのＥＤＴＡ、Norpar/鉱油(高温カバーシップ)、PAG-100油、約２％のＳＤＳを含む６付近ないし６.２付近のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸、約１％のＳＤＳを含む６付近ないし６.２付近のｐＨ��有する１０ｍＭのクエン酸、約０.５％のＳＤＳを含む６付近ないし６.２付近のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸、約０.２５％のＳＤＳを含む６付近ないし６.２付近のｐＨを有する１０ｍＭのクエン酸、約２％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約１％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.５％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.２５％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.１％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.０７５％のＳＤＳを含む７.５付近ないし８付近のｐＨを有する１ｍＭのＥＤＴＡ、約０.２５％のＳＤＳを含むｐＨ８付近の０.５ｍＭのＥＤＴＡ、約０.５％のＳＤＳを含む９.６付近のｐＨの１０ｍＭのＥＤＴＡが含まれる。
【００７０】
本発明が属する技術分野の当業者であれば、前掲の成分または成分群の濃度または濃度群は、細胞コンディショニング用の試薬、緩衝液、添加剤または溶液の特徴を変化させることなく、変化させ得ることを認識するであろう。
【００７１】
本発明の好ましい具体例は、１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、７.５ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ(二ナトリウム塩)、０.０５％のProClinTM 300 (Supelco, Inc., Bellefonte, PA)を含むｐＨ８.５の塩基性処方である。意図する他の具体例には、Ｔｒｉｓ塩基濃度が約５ｍＭないし約２０ｍＭの範囲の塩基性処方、ホウ酸濃度が約５ｍＭないし約４０ｍＭの範囲の塩基性処方、ＥＤＴＡ濃度が約０.５ｍＭないし約２ｍＭの範囲の塩基性処方、またはｐＨ７付近ないしｐＨ９付近のｐＨ範囲にある塩基性処方が含まれる。意図する温度範囲は、９５℃付近ないし１００℃付近である。限定することを意図するものではないが、Ｔｒｉｓ塩基またはＥＤＴＡの濃度が前記に特定した範囲を超えて変化する場合には顕著な差異が示されず、ホウ酸の濃度が２０ｍＭまたは４０ｍＭの代わりに１０ｍＭの場合に顕著に良好な結果が得られ、ホウ酸の濃度が５ｍＭの代わりに１０ｍＭの場合に僅かに良好な結果が得られ、コンディショニングは８付近ないし８.６付近のｐＨで最適であることは注意すべきである。１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０.５％のBrij 35と、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.５％のBrij 35とを比較すると、両方の試薬とも１００℃にて最も強いコンディショニングを示し、９５℃では顕著に弱いコンディショニングを示した。
【００７２】
意図する他の具体例には、限定されるものではないが、クエン酸緩衝液（クエン酸三ナトリウム二水和物およびクエン酸一水和物の組み合わせ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、２０ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋４０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋１０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋５ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋７.５ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋５％のエチレングリコール、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋５％のエチレングリコール、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０.１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋５％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋５％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋１０％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１０％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋５％のホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋５％のホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋１０％のホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１０％のホルムアミド、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０.５％のBrij 35、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.５％のBrij 35，１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０.１％のBrij 35、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.１％のBrij 35、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋０.５％のTriton X-100、１０ｍＭのＴｒｉｓ＋２０ｍＭのホウ酸＋０.５％のTriton X-100が含まれる。
【００７３】
“１０ｘＳＳＣ”なる語は、１リットル溶液を作成するために必要な場合には脱イオン水、、８７.６６ｇのＮａＣｌ、４４.１２ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物を含む、適当にはＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ７.０に調整された１０モル濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムの溶液をいう。０.５ｍｌのＰｒｏＣｌｉｎ  ３００を保存剤として添加する。いずれの濃度（ｘモル）で調製したすべてのリン酸緩衝液に関して、（１）Ｋ
２ＨＰＯ４またはＮａＨＰＯ４を用いるＨＰＯ４-2、および（２）ＫＨ２ＰＯ４またはＮ
ａＨ２ＰＯ４を用いるＨ２ＰＯ４-のｘモル溶液を調製する。
【００７４】
細胞コンディショナーのもう１の好ましい態様は（細胞コンディショニング溶液２またはＣＣ２）、約ｐＨ６の約１０ｍＭのクエン酸緩衝液、約５％のエチレングリコール、約１ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウム（MorphosaveTM, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ ;米国特許第5,432,056号)および約０.３％のドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を含む。クエン酸の濃度は約５ｍＭないし約５０ｍＭの範囲とし得る。緩衝液のｐＨは約４ないし約８の範囲とし得る。エチレングリコールの濃度は、約１％ないし約１０％の範囲とし得る。メタ重亜硫酸ナトリウムの濃度は、約０.１ｍＭないし約１０ｍＭ、好ましくは約０.５ｍＭないし約１.５ｍＭの範囲とし得る。ＳＤＳの濃度は、約０.１％ないし約１％、好ましくは約０.２５％ないし約０.５％の範囲とし得る。
【００７５】
以下に記載する実施例は本発明を説明する目的で示すものであって、如何なる場合においても本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の意図または視野を逸脱することなく下記のものの変形を成し得ることを理解するであろう。すべての特許、特許出願および他の刊行物は出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００７６】
実施例
実施例１  Ｈ＆Ｅで染色した生物試料を用いた自動“暴露”および“細胞コンディショニング”の例
パラフィンに包埋している乳房、胃、脳、扁桃および腎臓を含む生物試料を、以下の手法に従って曝した：前記に参照した生物試料を含有するスライドを自動機器(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ)に入れ、以下に記載する暴露プロトコールに付した。一般的に、パラフィン包埋生物試料を含有するスライドを６５℃にて６分間加熱乾燥し、ついで以下のもののいずれかで濯ぐ:各々０.１％のTriton X-100を含有する１)１×クエン酸緩衝液、２)脱イオン水、３)１０ｍＭのリン酸緩衝液(pH=6.3)、または４)１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液(pH=7.4)。
【００７７】
暴露プロトコール１
1. 2分間インキュベートする
2. スライドを濯ぐ
3. スライドの体積を調整し、LIQUID COVERSLIPLIQUID COVERSLIPTMを適用する
4. 6分間インキュベートする
5. スライドを濯ぐ
6. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
7. 温度を65.0℃に上昇させる
8. スライドを濯ぐ
9. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
10. 4分間インキュベートする
11. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
12. 4分間インキュベートする
13. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
14. 4分間インキュベートする
15. スライドを濯ぐ
16. 温度を42.0℃まで低下させる
17. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
18. 4分間インキュベートする
19. スライドを濯ぐ
20. 温度を42.0℃まで低下させる
21. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
22. 4分間インキュベートする
23. スライドを濯ぐ
【００７８】
自動暴露後に、生物試料をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。スライドをヘマトキシリン１(Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI)中に１.５分間入れ、ついで脱イオン水の流水で１分間濯いだ。ついで、スライドを酸アルコール清澄薬 (Richard Allen Scientific)に１分間入れ、脱イオン水の流水で１分間濯いだ。
【００７９】
ついで、スライドをアンモニア−青色化試薬中に１分間入れ(Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI)、うちで脱イオン水の流水で１分間濯ぐ。ついで、スライドを９５％のエタノール中で濯ぎ、ついで２.５％のエオジンＹ(Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI)に２.５分間入れる。生物試料を１００％のエタノール浴に１分間曝すことによってスライドを脱水する。このプロセスを３回繰返し、つづいて生物試料をキシレン浴に２分間、２回曝す。脱水工程の後に、生物試料をカバーガラスで覆った。
【００８０】
対照生物試料は、伝統的な溶媒ベースの脱パラフィン技術によって脱パラフィンした。顕微鏡スライド上に置き、パラフィン中に保存したパラフィン-包埋生物試料を、キシレン浴に５分間完全に浸漬した。生物試料を含有するスライドを２番目のキシレン浴中に５分間入れた。第２のキシレン浴を取り除いた後に、スライドを１００％のエタノール浴中に３分間入れた。ついで、スライドを第２の１００％エタノール浴に３分間入れ、ついで、９０％エタノール溶液に２分間入れた。ついで、スライドを８０％エタノールに１分間入れ、つづいて蒸留水中に１ないし３分間完全に浸漬した。脱パラフィン後に、前記したごとく生物試料をヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【００８１】
溶媒技術および自動加熱技術によって脱パラフィンした生物試料を、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色した後に比較した。
【００８２】
すべてのセットのスライド上の形状が許容され、実質的に同等であった。自動加熱法によって暴露した扁桃および脳の生物試料は、標準的な溶媒技術によって脱パラフィンした生物試料よりもより強調されたヘマトキシリン染色を示した。
【００８３】
実施例２
“細胞コンディショニング”と同時に行う生物試料の自動“暴露”
ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した腎臓および扁桃の生物試料を実施例１に記載したプロトコールに従って暴露した。自動的に曝した後に、生物試料を免疫組織化学染色に使用するために自動DAB染色のプロトコールに付す。ＤＡＢ染色のプロトコールを以下に記載する:
ＤＡＢプロトコール
1. 2分間インキュベートする
2. スライドを濯ぐ
3. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
4. スライドを濯ぐ
5. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
6.スライドを濯ぐ
7. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
8. 1滴の阻害剤を適用する
9. 4分間インキュベートする
10. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
11. 1滴の一次抗体を適用する
12. 32分間インキュベートする
13. スライドの体積を調整し、LCSを適用する
14. 1滴のビオチニル標識Igを適用する
15. 8分間インキュベートする
16. スライドを濯ぐ
17. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
18. 1滴のアビジン-HRPOを適用する
19. 8分間インキュベートする
20. スライドを濯ぐ
21. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
22. 1滴のDABおよび1滴のDAB H202を適用する
23. 8分間インキュベートする
24. スライドを濯ぐ
25. スライドの体積を調整し、LIQUID COVERSLIPTMを適用する
26. １滴の銅を適用する
27. 4分間インキュベートする
28. スライドを濯ぐ
【００８４】
腎臓生物試料に用いた一次抗体は抗-ＣＤ１５(Ventana Medical Systems, Inc. Tucson, AZ, カタログ番号250-2504）であった。扁桃生物試料に用いた一次抗体は抗-ＣＤ４５ＲＯ(Ventana Medical Systems, Inc. Tucson, AZ, カタログ番号250-2563)であった。用いたＤＡＢ染色キットはVentana Medical Systems, Inc. Tucson, AZ, カタログ番号250-001から得た。
【００８５】
対照生物試料は、実施例１に記載した伝統的な溶媒ベースの脱パラフィン技術によって脱パラフィンした。脱パラフィンした後に、生物試料を１.５Ｌの１×クエン酸緩衝液を含有する圧力調理器(Model ＃62104 Nordic Ware, Minneapolis, MN)に入れた。ついで、その圧力調理器を密閉し、マイクロウェーブ・オーブン(Model ＃；MQS0836E, Matsushita, Franklin Park, IL)に入れた。そのマイクロウェーブ・オーブンを“高温”に設定して、試料をほぼ３０分間マイクロウェーブ加熱に付した。マイクロウェーブ処理した後に、ついでその試料を固く締めた蓋を有する圧力調理器中で３０分間“養生（cured）”した。生物試料を養生した後に、１×クエン酸緩衝液中に２分間入れた。ついで、生物試料をクエン酸緩衝液から取り出し、スライドの末端をブロッティングして過剰なクエン酸緩衝液を除去した。ブロッティングした後に、スライドを自動機器に入れ、前記したごとく免疫組織化学的に染色した。
【００８６】
溶媒技術ならびに自動暴露および同時細胞コンディショニングによって脱パラフィンした生物試料を、免疫組織化的染色後に比較した。すべてのセットのスライドの形態および染色は許容し得るものであって、実質的に同等であった。
【００８７】
実施例３
二段階自動“暴露”および“細胞コンディショニング”
パラフィン中に保存され、ホルムアルデヒドで処理した扁桃および乳房の生物試料を以下のプロトコールによって処理した：
暴露および細胞コンディショニングのプロトコール
1. 2分間インキュベートする
2. サーモフォイルの温度を65.0℃まで上昇させる
3. 6分間インキュベートする
4. スライドを濯ぎ、LCSTMを適用する
5. 6分間インキュベートする
6. スライドを濯ぎ、LCSTMを適用する
7. サーモフォイルの温度を100.0℃まで上昇させる
8. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
9. スライドを濯ぐ
10. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
11. 4分間インキュベートする
12. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
13. 4分間インキュベートする
14. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
15. 4分間インキュベートする
16. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
17. 4分間インキュベートする
18. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
19. 4分間インキュベートする
20. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
21. 4分間インキュベートする
22. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
23. 4分間インキュベートする
24. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
25. 4分間インキュベートする
26. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
27. 4分間インキュベートする
28. スライドを濯ぐ
29. 温度を42.0℃まで降下させる
30. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する 31.4分間インキュベートする
32. スライドを濯ぐ
33. 温度を20.0℃まで降下させる
34. スライドの体積を調整し、LCSTMを適用する
35. 4分間インキュベートする
36. スライドを濯ぐ
【００８８】
プロトコールに使用した緩衝液は、２０％のホルムアミドまたは０.１％のTritonのいずれかを含むＳＳＣ緩衝液であった。生物試料を前記のプロトコールに付した後に、実施例２の免疫組織化学染色に用いたＤＡＢパラフィンのプロトコールを適用した。
【００８９】
扁桃生物試料を一次抗体としての抗-Ｋｉ６７で処理した。乳房試料を一次抗体としての抗−エストロゲン受容体(6F11)または抗−プロゲステロン受容体で処理した。すべての一次抗体はVentanaを通して入手可能である。
【００９０】
対照生物試料は、実施例１に記載したごとく、伝統的な溶媒ベースの脱パラフィン技術によって脱パラフィンした。脱パラフィン後に、その生物試料を１.５Ｌの１×クエン酸緩衝液を含有する圧力調理器(Model ＃;62104 Nordic Ware, Minneapolis, MN)に入れた。ついで、圧力調理器を密閉し、マイクロウェーブ・オーブン(Model ＃;MQS0836E, Matsushita, Franklin Park, IL)に入れた。マイクロウェーブ・オーブンを“高温”に設定して、試料をほぼ３０分間マイクロウェーブ加熱に付した。マイクロウェーブ処理後に、その試料をついで、固く締めた蓋を有する圧力調理器中で３０分間“養生”した。養生した後に、その生物試料を１×クエン酸緩衝液に２分間入れた。ついで、生物試料をクエン酸緩衝液から取り出し、スライドの端部をブロッティングして、過剰量のクエン酸緩衝液を除去した。ブロッティング後に、そのスライドを自動機器に入れ、前記したごとく免疫組織化学的に染色した。
【００９１】
溶媒技術および自動加熱技術によって脱パラフィンした生物試料を、免疫組織化学染色後に比較した。すべてのセットのスライド上の形態は許容し得るものであって、実質的に同等であった。すぺてのセットのスライド上のKi67での染色は同等であった。ER (6F11)およびPR (1A6)染色は自動細胞コンディショニングを用いた場合よりも僅かに弱く、これはプロセスが働くがさらなる開発および最適化が必要であることを示している。
【００９２】
実施例４
イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション用の非パラフィン包埋セルライン(Thin PrepsTM)の自動細胞コンディショニング
Cytyk調製物溶液(ロット番号; 01139Q)中に保存したHela (ATCC ロット番号; 980427H)、Caski (ATCC ロット番号; 980416C)および(ATCC ロット番号; 980416S)セルラインを、Cytyk 2000機器を用いて顕微鏡スライド上に沈殿させた。沈殿後に、スライドをアルコールに入れて、DiscoverlyR In-Situ染色モジュール (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ)上で使用するまで水分を維持した。スライドを機器に負荷し、２０×ＳＳＣ(Ventana P/N 650-012)から作製した２×ＳＳＣで濡らした。スライドは、現在Depar 30といわれている細胞コンディショニング・プロトコールを通し、そこでスライドを２×ＳＳＣで濯ぎ、スライドの温度をほぼ３０分間９５℃まで上昇させた。ついで、スライドを３７℃まで冷却し、イン・サイチュ実験に前にAPK  WashRで濯いだ。
【００９３】
プロトコールBlue Swap ISHを用いて、セルラインをHPV 16/18 (Enzo HPV 16/18 Bio Probe カタログ番号32874)について染色した。プローブを適用する前に、セルラインをProtease 2 (Ventana P/N 250-2019)で酵素的に消化する。 プローブを適用した後に、該プローブおよび生物試料を９５℃にて８分間同時に変性させた。非特異的に結合したプローブを５５℃にて２×ＳＳＣのストリンジェンシー洗浄でもって洗い流した。ついで、プローブをストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出する。
【００９４】
染色した後に、セルラインを２回繰り返す９５％エタノールへの１分間暴露および１００％エタノールへの１分間暴露で脱水した。エタノールの後に、スライドを２回キシレンに３分間暴露した。脱水後に、スライドにカバーガラスを被せた。
【００９５】
コンディショニング後の染色されたセルラインは許容し得る形態、弱い染色を示し、これらのスライドに高いバックグラウンドが存在し、プロセスをより開発する必要があることを示していた。
Depar 30プロトコール
湿潤負荷スライド
1. 適用を省略し、２分間インキュベートする
2. スライドを濯ぐ(2XSSC緩衝液) (スライドを65℃に温める)
3. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
4. 適用を省略し、6分間インキュベートする
5. スライドを濯ぐ(2XSSC緩衝液) (スライドを95℃に温める)
6. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
7. スライドを濯ぐ
8. 体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
9. 適用を省略し、4分間インキュベートする
10. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
11. 適用を省略し、4分間インキュベートする
12. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
13. 適用を省略し、4分間インキュベートする
14. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
15. 適用を省略し、4分間インキュベートする
16. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
17. 適用を省略し、4分間インキュベートする
18. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
19. 適用を省略し、4分間インキュベートする
20. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
21. 適用を省略し、4分間インキュベートする
22. スライドを濯ぐ(2XSSC緩衝液) (スライドを37℃に温める)
23. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
24. 適用を省略し、4分間インキュベートする
25. スライドを濯ぐ(APK Wash)
26. スライド体積を調整し、ついでLCSTMを適用する
【００９６】
実施例５
シングルコピーＤＮＡ検出用の自動“暴露”および“細胞コンディショニング”
両方ともRaymond Tubbs博士、Cleveland, Clinic Pathology Dept.、Cleveland Ohioに寛大に提供いただいたホルマリン固定し、パラフィン包埋したセルラインCaski (R96-1050A)およびSiha (R96-96-C2)を含むスライドを、Ventanaターゲットスライド上で染色した。スライドを機器に乾燥負荷し、スライド温度を６５℃まで上昇させた。
【００９７】
Depar 30プロトコールを行い、そこでスライドを６５℃にある間に２×ＳＳＣ緩衝液で濯ぎ、ついで、温度を約４０分間９５℃まで上昇させた。ついで、スライドを３７℃まで冷却し、APK洗浄液で濯いだ。この時点で、以下のイン・サイチュ・プロトコールを行った:
【００９８】
イン・サイチュ・プロトコール：Tubbs 1
(Ventana APK Washをすべての濯ぎ工程に用いた)
プロテアーゼ消化: プロテアーゼ２、３７℃にて４分
阻害剤工程: ＤＡＢキットからのVentana阻害剤、37℃にて32分
プローブ: Enzo HPV Bio Probe 16/18
対照プローブ: Enzo HPV Bio Probe 6/11
変性: 95℃、8分
ハイブリダイゼーション: 37℃、64分
2回のストリンジェンシー洗浄2XSSC、60℃、8分、各々
3回目のストリンジェンシー洗浄2XSSC、37℃、4分
プローブ検出: ストレプトアビジンHRPO (Dako GenPoint カタログ番号K0620)
増幅: ビオチニルチラミド(Dako GenPointカタログ番号K0620)
検出: ストレプトアビジンHRPO (Dako GenPoint カタログ番号K0620)または
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ  (Vector 番号SA5100)
発色体DAB (Dako Gen Point  カタログ番号K0620)またはVentana NBT/BCIP (Kit P/N250-060)または
Ventanaナフトール/Fast Red (キット P/N250-030)
【００９９】
実施例６
非パラフィン包埋試料用の自動“細胞コンディショニング”
実施例２に記載したのと同様のＤＡＢ染色用のプロトコールをこの実施例において用いた。
これらの抗体に対する細胞コンディショニング工程は、セルラインのThinPreps を作製するためにCytyk 20000機器を用いた後に行った。ThinPrepsRは、Ventana ES機器、NexES機器および手動方法(Cytyk, Inc.)で、ER、PgR、Ki67、P53に対する抗体を用いて染色した。スライドの二重の群をNexESイン・サイチュ・モジュール上で染色することにより、細胞コンディショニング工程を自動で行うことができる。
前記した例はCytylc機器およびThinPrepsRの染色に特異的であるが、経験では細胞学的調製物を作製するその様式に限定されない。
【０１００】
実施例７
凍結試料の“細胞コンディショニング”
各ブロックから６の切片を切除することによって凍結扁桃ブロックを調製し、試料を顕微鏡スライド上に置いた。各ブロックからの４のスライドをDiscoveryイン・サイチュ・モジュール上に置き、プロトコールDepar 10を入力した。
【０１０１】
スライドを６５℃にて６分間乾熱し、ついで０.１ＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８）で濯いだ。濯いだ後に、そのスライドを６５℃にて２０分間インキュベートした。ついで、スライドを３７℃まで冷却し、APK洗浄液で濯いだ。各ブロックからの２のスライドを対照として処理しないままにした。各ブロックからのDepar 10処理した２の処理スライドおよび１の未処理スライドを、実施例１に記載したごとくH & Eにつき染色した。各ブロックからの２の処理したスライドおよび各ブロックからの１の未処理をLCAについて染色する。実験結果: H & Eおよび抗体染色に関して、処理および未処理スライド間に染色の差は存在しなかった。
【０１０２】
実施例８
免疫組織化学用の自動“暴露”および“細胞コンディショニング”
下記のプロトコールおよびフローチャートに従って、種々の抗体をNexES Plus (Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ)自動化環境下でアッセイした：
プロトコール:
(1) *****EZ Prepを選択する*****
(2) *****一定時間の工程を開始する*****
(3) 脱パラフィンを選択した場合
(4) スライドを75℃に温め、4分間インキュベートする
(5) 体積を調整する
(6) LCSTMを適用する
(7) 8分間インキュベートする
(8) スライドを濯ぐ
(9) 体積を調整する
(10) LCSTMを適用する
(11) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(12) 細胞コンディショニングを選択した場合
(13) コンディショナー#1を選択した場合
(14) スライドを濯ぐ
(15) スライド体積を調整する
(16) LCSTMを適用する
(17) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(18) 細胞コンディショニングカバーガラスを適用する
(19) スライドを100℃に温め、2分間インキュベートする
(20) 細胞コンディショナー#1を適用する
(21) LCSTMを適用する
(22) 標準を選択した場合
(23) 6分間インキュベートする
(24) 細胞コンディショナー#1を適用する
(25) LCSTMを適用する
(26) (21)-(23)を9回繰り返す
(27) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(28) 温和を選択した場合
(29) 6分間インキュベートする
(30) 細胞コンディショナー#1を適用する
(31) LCSTMを適用する
(32) (27)-(29)を4回繰り返す
(33) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(34) 延長を選択した場合
(35) 6分間インキュベートする
(36) 細胞コンディショナー#1を適用する
(37) LCSTMを適用する
(38) (33)-(35)を14回繰り返す
(39) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(40) コンディショナー#1を選択しなかった場合
(41) コンディショナー#2を選択した場合
(42) スライドを濯ぐ
(43) スライド体積を調整する
(44) LCSTMを適用する
(45) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(46) 細胞コンディショニングカバーガラスを適用する
(47) スライドを100℃に温め、2分間インキュベートする
(48) 細胞コンディショナー#2を適用する
(49) LCSTMを適用する
(50) 標準を選択した場合
(51) 6分間インキュベートする
(52) 細胞コンディショナー#1を適用する
(53) LCSTMを適用する
(54) (49)-(51)を9回繰り返す
(55) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(56) 温和を選択した場合
(57) 6分間インキュベートする
(58) 細胞コンディショナー#1を適用する
(59) LCSTMを適用する
(60) (55)-(57)を4回繰り返す
(61) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(62) 延長を選択した場合
(63) 6分間インキュベートする
(64) 細胞コンディショナー#1を適用する
(65) LCSTMを適用する
(66) (61)-(63)を14回繰り返す
(67) スライドを42℃に温め、2分間インキュベートする
(68) スライドを濯ぐ
(69) スライド体積を調整する
(70) LCSTMを適用する
(71) ディスポーザブル・スライド・ヒーター
(72) 反応緩衝液を選択する
【０１０３】
表Ｉは、本明細書中に記載した自動脱パラフィンおよび細胞コンディショニングを用いてNexES Plus (BENCHMARKTM IHCとしても知られている)に対して行った自動免疫組織化学アッセイの結果を要約している。自動免疫組織化学アッセイからのスライドを、NexES機器上の手動脱パラフィン／細胞コンディショニングを用いて調製したスライドと比較した。特異的抗体を３回調製した。ネガティブ対照スライドは単一のものを調製した。両方のアッセイからのスライドを当該技術分野の熟練者によって分析し、具体的な染色強度および非特異的バックグラウンド染色強度についてレートを割当てた。NexES Plus完全自動アッセイからのすべてのスライドのレートは、具体的な染色強度および非特異的なバックグラウンド強度の両方において、手動で脱パラフィンし、細胞コンディショニングしたNexESスライドのレートを超えていた。スライドを分析し、２の独立した当業者によってレーティングし、平均染色強度を決定した。表１中で“適格組織”と記した欄は、それに用いた抗体を標準化するために用いた標準対照組織を表す。標準化された抗体には４.０のレートを与えている。“平均染色強度”と記した欄に示され得るごとく、自動脱パラフィン／細胞コンディショニングしたスライドの大部分がこれらの結果と一致するかまたはそれを超えた。
【０１０４】
【表１】
2004525366.tif 000002
【０１０５】
【表２】
2004525366.tif 000003
【０１０６】
【表３】
2004525366.tif 000004
【０１０７】
表１（前掲）に示した一次抗体(Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ)をアルファベット順に以下に記載する:
【０１０８】
抗−bol-2 :
クローンbcl-2/100/D5は、アポトーシスのインヒビターであるｂｃｌ−２を検出するために使用したモノクローナル抗体である。この抗体は反応性および新生生物の小胞体増殖を識別するための補助となり得る。対照：扁桃 (VMSI # 760-2693)
【０１０９】
抗−C-erbB-2 (HER2/neu) :
クローンCB11はc-erb-B2に対するモノクローナル抗体であり、それは細胞膜に局在し、時としてある種の新生生物細胞の細胞質に局在していることもある(VMSI # 760-2994)
【０１１０】
抗−CD15 :
クローンMMAは顆粒球系統および／またはReed-Sternberg分化の細胞の同定の補助として用いるモノクローナル抗体である。対照: ホジキンのリンパ腫(VMSI # 760-2504)
【０１１１】
抗−CD20 :
クローンL26はＢリンパ球の系統の細胞を同定を補助するために用いるモノクローナル抗体である。対照: 扁桃(VMSI # 760-2531/760-2137)
【０１１２】
抗−CD43 :
クローンL60は、正常な顆粒球およびＴリンパ球の原形質膜に局在する抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。対照:扁桃(VMSI # 760-2511)
【０１１３】
抗−CD45RA :
クローンX148は、正常なＢリンパ球および一部のＴリンパ球の原形質膜に局在する抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。対照：扁桃 (VMSI # 76-2510)
【０１１４】
抗−CD45RO :
クローンA6はＴ系統の細胞および一部のＢ細胞の原形質膜に結合するモノクローナル抗体である。対照:扁桃(VMSI # 760-2563)
【０１１５】
抗−CEA :
クローンTF-3H8-1は、粘膜の上皮細胞の原形質膜および細胞質領域に局在する抗原に特異的に結合する。対照:小腸カルシノーマ (VMSI # 760-2507/760-2141)
【０１１６】
抗−クロモグラニン:
クローンLK2H10は、正常および新生生物の神経内分泌細胞の分泌顆粒に局在するクロモグラニンタンパク質に結合するモノクローナル抗体である。対照：膵臓 (VMSI # 760-2519/760-2140)
【０１１７】
抗−デスミン:
クローンDE-R-11は、筋細胞系統の細胞の同定に用いるモノクローナル抗体である。デスミンは成熟平滑筋、横紋筋および心筋に見出される中間径フィラメントである。対照: 精管 (VMSI # 760-2513)
【０１１８】
抗−EGFR :
クローン31G7は種々の細胞上に存在する貫膜糖タンパク質に対して指向される。(VMSI # 760-2548)
【０１１９】
抗−EMA :
クローンMc5は、上皮系統の同定において補助するために用いるモノクローナル抗体である。EMAは散乱した組織球リンパ球からの大細胞再生カルシノーマ再生大細胞とよく分化しているかほとんど分化していないリンパ腫の両方を識別することができる価値を有する。対照:カルシノーマ(VMSI # 760-2508)
【０１２０】
抗−ER :
クローン6F11は、エストロゲン受容体の存在を検出するために用いるモノクローナル抗体である(VMSI # 760-2596/760-2132)。
クローンCC4-5も、エストロゲン受容体の存在を検出するために用いるモノクローナル抗体である(VMSI # 760-2546/760-2138)
【０１２１】
抗−GFAP :
GFAPポリクローナル抗体は、大部分のヒトの星状細胞および上衣細胞の細胞質に存在するGFAPに対して指向されたポリクローナル抗体である。この試薬を用いて膠の系統の細胞の同定を補助することができる。対照:脳 (VMSI # 760-2516)
【０１２２】
抗−カッパ:
カッパ鎖はＢ細胞系統の細胞によって発現されている。個々の細胞によって産生される免疫グロブリン分子がリンパ球細胞による軽鎖の産生は、単一の軽鎖クラスのみを含むように遺伝子的に制限されている。このクローン制限を用いてＢ−細胞および血漿細胞集団のポリクローナルまたはモノクローナルの性質を示し得る。対照：形質細胞腫(VMSI # 760-2514)
【０１２３】
抗−ケラチン:
クローン5D3は、ヒト表皮性ケラチンに対して生起したモノクローナル抗体である。この抗体を用いて、上皮系統の細胞の同定を補助し得る。この抗体はサイトケラチン８および１８と反応する。対照：カルシノーマ (VMSI # 760-2501)
クローンAE1はヒト上皮ケラチンに対して生起されたモノクローナル抗体である。この抗体を用いて、乳管上皮系統の細胞を同定を補助し得る。AE1がサイトケラチン１０、１３、１４、１５および１９と反応する。対照: 肝臓(VMSI # 760-2521)
【０１２４】
抗−パン・ケラチン:
パンケラチンは上皮系統の細胞の同定を補助するのに用いるモノクローナル抗体クローンAE1/AE3/PCK26のカクテルである。この抗体カクテルは９、１１および１２を除くすべてのサイトケラチンと反応する。対照：皮膚 (VMSI # 760
2595/760-2135)
【０１２５】
抗−Ki67:
クローンMM1は、活動細胞周期(Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期)を通して存在するが、休止（Ｇ０期）の細胞には存在しない細胞増殖と関連する核抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。この試薬は増殖する細胞の同定を補助するのに用い得る対照:扁桃 (VMSI # 760-2520)
【０１２６】
抗−ラムダ:
ラムダ軽鎖は、Ｂ−細胞系統の細胞によって発現されている。リンパ系細胞によって産生される軽鎖は、個々の細胞によって産生される免疫グロブリン分子が単一の軽鎖クラスのみを含むように遺伝子的に制限されている。このクローン拘束はＢ-細胞および形質細胞集団のポリクローナルおよびモノクローナル性を示す補助となり得る。対照:形質細胞腫 (VMSI # 760-2515)
【０１２７】
抗−LCA:
クローンRP2/18は、リンパ球下垂（lymphocytic descent）の細胞の同定を補助するのに用い得る。この抗体は、単球／組織球および多形核球（polymorph）に対する変化する反応性を有する、主にリンパ球の原形質膜および細胞質縁部に局在する抗原に特異的に結合する。対照: リンパ腫 (VMSI # 760-2505/760-2136)
【０１２８】
抗−メラノソーム:
クローンHMB45モノクローナル抗体は、メラノサイト系統の細胞の同定を補助するのに用い得る。それは異常なメラノサイトおよびメラノーマ細胞において発現されている抗原と反応する。対照:メラノーマ (VMSI # 760-2518/760-2139)
【０１２９】
抗−筋肉アクチン:
クローンHUC1-1は、単球下垂（myocytic descent）の細胞の同定を補助するのに用いるモノクローナル抗体である。筋肉アクチンは横紋筋、平滑筋および心筋系統の細胞において発現されている。対照: 回腸 (VMSI # 760-2502)
【０１３０】
抗−NSE:
クローンBBS/NC/VI-H14は、ニューロン、神経内分泌細胞、内分泌腫瘍、カルチノイドおよびメルケル細胞ガンの細胞質において発現し得る抗原と反応するモノクローナル抗体である。対照: 膵臓(VMSI # 76-2517)
【０１３１】
抗−p53 :
クローンBp-53-11は、ｐ５３タンパク質に対して指向されたモノクローナル抗体である。この試薬は、新生生物細胞集団において異常に増殖する細胞の同定を補助するのに用い得る。対照：癌腫 (VMSI # 760-2540)
【０１３２】
抗−PCNA:
クローンPC10は種々の細胞集団における増殖細胞の同定を補助するのに使用し得るモノクローナル抗体である。PCNA抗原はＧ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期のすべての増殖細胞において発現している。対照：扁桃 (VMSI # 760-2503)
【０１３３】
抗−PSA :
PSAポリクローナル抗体は前立腺上皮細胞の細胞質で発現している分泌タンパク質と反応するポリクローナル抗体である。対照：前立腺 (VMSI # 760-2506)
【０１３４】
抗−PSAP :
クローンPASE/4LJは、前立腺系統の細胞の同定を補助するのに用い得るモノクローナル抗体である。PSAPは正常な前立腺上皮細胞の細胞質領域に局在する抗原に特異的に結合する。対照：前立腺 (VMSI # 760-2509)
【０１３５】
抗−PR :
クローン1A6は、ヒト組織のプロゲステロン受容体の同定を補助するのに用いるモノクローナル抗体である。(VMSI # 760-2547/760-2133)
【０１３６】
抗−S 100 :
S100ポリクローナル抗体は正常および異常な神経内分泌下垂（neuro-endocrine descent)の細胞の同定を補助するのに用いるポリクローナル抗体である。対照：皮膚 (VMSI # 760-2523/760-2133)
【０１３７】
抗−ビメンチン:
クローン3B4は間充織起源の細胞の同定を補助するのに用いる。対照：精管 (VMSI # 760-2512/760-2134)
【０１３８】
ネガティブ対照:
ポリクローナル抗体の品質制御工程の一部分としての、ネガティブ組織対照に適用したポリクローナル血清。(VMSI # 760-1023)
ネガティブ対照Ｉｇ：
クローンMOPC-21はモノクローナル抗体の品質制御工程の一部分としてネガティブ組織対照に適用する。(VMSI # 760-2014)
【０１３９】
実施例９
免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）またはイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に対する“暴露”を伴うまたは伴わない自動“細胞コンディショニング”
ＣＣＳ溶液は、c-erb2/HER-2/neu遺伝子またはそれから発現されたタンパク質（群）を検出するために設計された試薬(例えば、INFORMTM; HER-2/neu DNA 試験, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ; PATHWAYTM HER-2/neu (CB11) タンパク質試験, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ;ほか)と共に、自動免疫組織化学、免疫細胞化学またはイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションの機器（例えば、BenchMark ISH, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ; BenchMarkTM IHC, Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ;ほか)で用い得る。
【０１４０】
ＩＳＨアッセイについては、ＣＣ２溶液を、好ましくはＣＣ２溶液を組織に約９０℃にて約１０分間適用して脱パラフィンした後であってＤＮＡプローブを適用する前の自動前処理工程において用い得る。ＣＣ２溶液と加熱処理とを組合せることによって、ゲノムＤＮＡをｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡプローブとの結合に好適なより良好なものとすることができる。
【０１４１】
ＩＨＣアッセイについては、ＣＣ２溶液は、好ましくは脱パラフィン後の自動細胞コンディショニングにおいて、ＣＣ２溶液を組織に約９５℃にて約３０分間適用して用い得る。ＣＣ２溶液と高温とを組合せることによって、ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質 (抗原またはエピトープ）を抗−ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  抗体との結合により好適とし得る。
【０１４２】
これらは、ＣＣ２溶液を好ましくは用いる代表的な事情である。ＣＣ２溶液は、考慮しているターゲット化ＤＮＡまたはタンパク質分子の存在または不存在を検出するために設計された多くの他のアッセイ、技術、プロトコールまたは手法においても有用である。
【０１４３】
前記の詳細な説明から、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく多くの変化および修飾を本発明の態様に作成し得ることは理解されるであろう。本発明のこの真の意図および範囲は、前記の発明の詳細な説明に鑑みて解釈されるべき添付した請求の範囲によって決まる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、スライドフードオープンおよび回転式支持体のドアを除去して示す、本発明の処方を用い得る機器の斜視図を示す。
【図２】図２は、それらと共に作動するコンピュータおよび他の機器と組合せて示す本発明の処方を用い得る機器の斜視図を示す。
【図３】図３は、本発明の処方を用い得る機器の分解組立図を示す。
【図４】図４は、試薬分配器と一緒に示す本発明の処方を用い得る機器の斜視図を示す。
【図５】図５は、本発明の処方を用い得る機器の加熱システムのブロック図を示す。
【図６】図６は、スライドから包埋媒体を除去するための１の具体例のフローチャートを示す。
【図７ａ−ｂ】図７ａ−ｂは細胞コンディショニングの１の具体例のフローチャートを示す。
【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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