(57)【要約】酵母において大量のタンパク質またはポリペプチドを産生するための方法を開示する。本方法は、ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはその機能的部分もしくは変異形を利用する。高収量で発現されるポリペプチドの例は、インスリンまたはインスリン類似体またはＧＬＰ１である。【選択図】図１
2004514450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母において異種の非細菌性ポリペチドまたはその中間体を作成するための方法であって、（ｉ）所望のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列を含む酵母株を前記ポリペプチドの発現に適した培養条件下で培養し、ここで、所望のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはその機能的部分もしくは変異形の転写制御下にあることと、（ｉｉ）所望のポリペプチドまたはその中間体を単離することとを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＣＩＴ１プロモーターは、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部からなる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ＣＩＴ１プロモーターは、配列番号：１の１０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＣＩＴ１プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記ＣＩＴ１プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜５３０のヌクレオチド配列の全部または一部からなる方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記発現されたポリペプチドは、培養培地から単離される方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記異種ポリペプチドは、インスリン前駆体である方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記異種ポリペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）である方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記異種ポリペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）Ａｒｇ３４である方法。
【請求項１０】
バッチ法である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非細菌性のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはＣＩＴ１プロモーターの機能的部分もしくは変異形とを含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、前記プロモーターは、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、前記プロモーターは、配列番号：１の１０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項１４】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、前記プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、前記プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜５３０のヌクレオチド配列の全部または一部からなるポリヌクレオチド構築物。
【請求項１６】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド構築物であって、さらに発現したペプチドを分泌するためのリーダー配列を含むポリヌクレオチド構築物。
【請求項１７】
（ａ）ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはその機能的部分もしくは変異形と、（ｂ）非細菌性ポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列と、（ｃ）適切なリーダー配列と、および（ｄ）可能な転写ターミネータ配列を適当な読み枠で含むベクター構築物。
【請求項１８】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物で形質転換された酵母細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターで形質転換された酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母において異種ポリペチドまたはその中間体、特に非細菌起源のポリペチドを産生するための方法に関する。また、本発明は、このような方法および形質転換された酵母細胞で使用するための、ＤＮＡ配列およびベクター構築物に関する。
【０００２】
【背景】
酵母は、所望のタンパク質またはポリペチドを産生するために広く使用されている生物である。酵母における外来タンパク質またはポリペチドの発現は、たとえばＥＰ １６３，５２９、ＵＳ ４，８７０，００８およびＵＳ ５，６１８，６７６に開示されている。
【０００３】
商業的に応用するには、発現されたポリペチドが高収量であることが重要である。プロモーターおよびいわゆる上流の活性化配列を含む種々の因子の多くは、発現収率に影響を与えるであろう。形質転換された宿主細胞において、天然遺伝子および外来遺伝子の両者の発現のために、宿主生物に対して同種のプロモーターを使用するときに、最高の結果が達成されることが一般に認められる。したがって、酵母で外来遺伝子を発現するためには、酵母遺伝子に関連したプロモーターが好ましいであろう。酵母で異種タンパク質を発現するために有用ないくつかのプロモーターは、既知である。最も一般的に使用される酵母プロモーターは、ＰＧＫ、ＴＰＩ、ＡＤＨ２、ＰＨ０５、ＭＦａ１およびＧＡＰプロモーターを含む。
【０００４】
しかし、改善された効率および大規模で使用するための制御される能力を有し、市販の製品において高レベルの発現収量が可能なさらなるプロモーターは、絶えず必要とされている。
【０００５】
【発明の要旨】
本発明は、酵母において異種の非細菌性ポリペチドを発現するための方法であって、酵母ＣＩＴ１遺伝子またはＣＩＴ１プロモーターの機能部分に結合した酵母プロモーターが異種遺伝子の発現のために使用される方法を提供する。
【０００６】
その最も広範な側面において、本発明は、酵母において、異種の、非細菌性ポリペチドまたはその中間体を作成するための方法であって、（ｉ）所望のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列を含む酵母株を前記ポリペプチドの発現に適した培養条件下で培養し、ここで、所望のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはその機能的部分もしくは変異形の転写制御下にあることと、（ｉｉ）所望のポリペプチドまたはその中間体を単離することとを含む方法に関する。
【０００７】
本発明のもう一つの側面において、本発明は、非細菌性のポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列と、ＣＩＴ１酵母プロモーターまたはＣＩＴ１プロモーターの機能的部分もしくは変異形とを含むポリヌクレオチド構築物に関する。
【０００８】
さらなる側面において、本発明は、（ａ）酵母ＣＩＴ１プロモーターまたはその機能的部分もしくは変異形と、（ｂ）非細菌性ポリペチドまたはその中間体をコードするポリヌクレオチド配列と、（ｃ）適切なリーダー配列と、および（ｄ）可能な転写ターミネータ配列を適当な読み枠で含むベクター構築物に関する。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物または本発明のベクターで形質転換された酵母細胞に関する。
【００１０】
酵母プロモーターＣＩＴ１は、酵母クエン酸シンターゼ遺伝子ＣＩＴの発現に向けられる（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ （１９９４） ２５： １８５−１９５およびＲｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４） １３ （１）， １１９−１３１を参照）。ＣＩＴ１プロモーター配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｚ７１６１６の位置２４３４から位置３１５５の配列に相補的な配列に含まれる。
【００１１】
本発明のもう一つの態様において、ＣＩＴ１プロモーター配列は、配列番号：１に含まれ、典型的には配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部からなるであろう。本発明において使用されるプロモーター配列は、さらに配列番号：１の１０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなっていてもよい。さらなる態様において、プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜７２２のヌクレオチド配列の全部または一部からなっていてもよく、なおさらなる態様において、プロモーターは、配列番号：１の位置１５０〜５３０のヌクレオチド配列の全部または一部からなっていてもよい。
【００１２】
【詳細な記載】
「ＣＩＴ１」酵母プロモーターは、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ （１９９４） ２５： １８５−１９５） ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４） １３ （１） ： １１９−１３１によって開示された天然型または野生型の酵母プロモーター配列を意味する。天然のプロモーター配列の全ての部分が効率的な転写に必要でないことは、当業者に周知である。切除は、Ｎ末端の末端またはＣ末端の末端、またはＮ末端およびＣ末端の末端でなされてもよい。さらに、１つまたは複数のヌクレオチドは、プロモーター配列内で削除されることもできる。また、個々のヌクレオチドの小数は、その他のヌクレオチドに変化されてもよい（たとえば適切な制限位置を導入するため）。したがって、この意味で「ＣＩＴ１プロモーターの機能的部分または変異形」は、転写プロモーター活性が有害な影響を受けない限り、天然のＣＩＴ１プロモーター配列のこのような修飾された形態を包含する。プロモーター配列以外の他のすべてが同じであるような同様の構築物と比較して、少なくとも７５％の転写プロモーター活性を保持することが好ましいであろう。ＣＩＴ１プロモーターの機能的部分または変異形は、変化していないプロモーターの６５％未満、より典型的には少なくとも７０〜９５％未満の転写プロモーター活性を有するべきではない。
【００１３】
本発明に関して、ＣＩＴ１プロモーターの変異形は、プロモーター変異形が修飾されていない状態におけるその転写プロモーター活性の少なくとも６５％を保持している限り、配列番号：１から１つまたは複数の変異、欠失、置換、付加および／または修飾することによって得られるいずれの配列も含むであろう。
【００１４】
ＣＩＴ１プロモーターの機能的部分または変異形が、その変化していない形態の転写プロモーター活性の少なくとも６５％を保持しているどうかは、種々の方法によって、たとえばその発現が簡便な方法で検出可能であるレポーター遺伝子を使用することによって示すことができる。プロモーターおよびその変異形は、当業者に周知な上流活性化配列「ＵＡＳ」が先行していてもよい。
【００１５】
ＲＮＡポリメラーゼが転写開始配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写して転写終結配列で終結し、次いでｍＲＮＡがコード配列によってコードされたポリペチドに翻訳されるとき、コード配列は、プロモーターの「転写制御」下にある。
【００１６】
「適切な読み枠」とは、個々のポリヌクレオチド配列が、コード配列が酵母に認識されるプロモーターおよびターミネータ配列の転写制御下にあるような方法で使用可能な状態に結合されていることを意味する。
【００１７】
「酵母に認識される」プロモーターおよびターミネーター配列とは、酵母内で機能的な調節配列を意味する。
【００１８】
「パーセント配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列を整列してヌクレオチドとヌクレオチドを比較したときの、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を意味する。配列アランメントのための方法およびパーセント同一性の測定のための方法は、当業者に周知であり、たとえば、Ｓｍｉｔｈ Ｔ． Ｆ． ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｍ． Ｓ． （１９８１） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７： １９５−７を参照。
【００１９】
「ＰＯＴ」は、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「ＴＰＩ１」は、Ｓ．セレビジア（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
【００２０】
「インスリン前駆体」は、単鎖ポリペチドを意味し、これは、１つまたは複数の引き続いて起こる化学的および／または酵素的プロセスにより２本鎖ヒトインスリンに変換することができる。ヒトインスリンにおいて、単鎖インスリン前駆体は、正しく配置されたジスルフィド架橋（３つ）を含むであろう。
【００２１】
「リーダー」は、プレペプチド（シグナルペプチド）およびプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
「プロペプチド」は、培養培地中に分泌するために、発現したポリペチドが小胞体からゴルジ装置に向けられ、さらに分泌小胞に向けることができる機能があるポリペチド配列を意味する（すなわち、酵母細胞の細胞壁を越えて、または少なくとも細胞膜周辺腔の細胞膜を通過してポリペプチドを移出すること）。プロペプチドは、酵母α−因子プロペプチドであってもよく、ＵＳ ４，５４６，０８２および４，８７０，００８を参照する。あるいは、プロペプチドは、合成プロペプチド、すなわち天然に見出されないプロペプチドであってもよい。適切な合成プロペプチドは、ＵＳ ５，３９５，９２２；５，７９５，７４６；５，１６２，４９８およびＷＯ ９８／３２８６７において開示されたものである。プロペプチドは、好ましくはＣ末端の末端に、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列またはその機能的な類似体のいずれかなどのエンドペプチダーゼプロセシング配列を含んでいてもよい。
【００２３】
「シグナルペプチド」の用語は、タンパク質の前駆体型のＮ末端配列として存在するプレペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質を小胞体にトランスロケーションすることを容易にさせることである。シグナルペプチドは、通常このプロセスにおいて切断される。シグナルペプチドは、タンパク質を産生している酵母生物に対して異種または同種であってもよい。本発明のＤＮＡ構築物に使用される多くのシグナルペプチドは、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチドまたは機能的類似体のいずれかを含む（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＹＥＡＳＴ ６： １２７−１３７） ａｎｄ ｔｈｅ ａ−ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＭＦａ１ ｇｅｎｅ （Ｔｈｏｒｎｅｒ （１９８１） ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇＹ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ｐｐ １４３−１８０， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ）。
【００２４】
本明細書において使用されるものとして、「異種タンパク質またはポリペプチド」は、タンパク質配列の成熟した部分（すなわち、シグナルペプチド、リーダーペプチド、スペーサーペプチドなど）が、宿主細胞のものとは異なった種に由来するのものである。好ましくは、異種タンパク質またはポリペチドは、非細菌性のタンパク質またはポリペチドである。「非細菌性のタンパク質またはポリペプチド」は、細菌細胞に由来するタンパク質またはポリペチドではないことを意味する。
【００２５】
一連の態様において、異種ポリペチドは、インスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体である。インスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体は、１つまたは複数の引き続く化学物質および／または酵素法により、インスリンまたはインスリン類似体に転換することができる単鎖ポリペチドである。インスリンは、ヒトインスリンを含むが、これに限定されない。インスリン類似体は、天然のインスリン配列と比べて、Ａおよび／またはＢアミノ酸鎖において１つまたは複数の変異、置換、欠失および／または付加を有する。好ましくは、インスリン類似体は、１、２または３つのアミノ酸の欠失または置換を含む。「ＤｅｓＢ３０」または「Ｂ（１−２９）」は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠いているヒトインスリンＢ鎖配列を指す。Ａ（１−２１）は、天然のヒトインスリンＡ鎖を指す。「Ｍ１３」は、Ｂ（１−２９）が、短いペプチド架橋（ＡｌａＡｌａＬｙｓ）を介してＡ（１−２１）に結合された単鎖インスリン前駆体を指す。
【００２６】
もう一つの態様において、異種ポリペチドは、ＧＬＰ−１である。ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、とりわけＳｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２８ ７０４−７０７ （１９８５）によって与えられる。ＧＬＰ−１（７−３７）およびその類似体は、近年多くの注目を引きつけている。異種ポリペチドのその他の例は、ＧＬＰ−２およびグルカゴンであり、両方ともＮ末端位置にＨｉｓまたはＴｙｒを有し、且つ次の位置にＳｅｒ、Ａｌａ、またＧｌｙを有するペプチドであるＧＲＦ（成長ホルモン放出因子）ファミリーに属している（Ａｄｅｌｈｏｒｔｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９９４） ｐ ６２７５−６２７８を参照）。
【００２７】
「中間体」は、適切な化学的手段または物理的手段により、所望の最終産物に転換することができるポリペチドまたはタンパク質を意味する。
【００２８】
「連結ペプチド」または「Ｃ−ペプチド」は、単鎖プレプロインスリン様分子のＢ−Ｃ−Ａポリペチド配列の連結部分を意味する。特に、天然のインスリン鎖において、Ｃ−ペプチドは、Ｂ鎖の位置３０とＡ鎖の位置１を連結する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法により、合成的に調製されてもよく、たとえば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２： １８５９−１８６９によって記載されたホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３： ８０１−８０５によって記載された方法であってもよい。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、たとえば、自動ＤＮＡ合成装置において精製され、二重鎖にされ、合成ＤＮＡ構築物の形態にライゲーションされる。
【００３０】
現在の好ましいＤＮＡ構築物を調製する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による。
【００３１】
また、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡおよび合成起源の混合物であってもよい。たとえば、リーダーペプチドをコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、ＡおよびＢ鎖をコードしているゲノムまたはｃＤＮＡ配列に結合されてもよく、その後、ＤＮＡ配列は、周知の手順に従って所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって部位を修飾されてもよく、または好ましくは、適切なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲにより、所望の配列を生じさせてもよい。
【００３２】
本発明は、酵母において複製することができ、所望のポリペチドをコードするポリヌクレオチド配列をもつベクターを包含する。組換えベクターは、独立して複製するベクター、すなわち、染色体外の存在物として存在するベクターであってもよく、その複製が染色体の複製から独立していてもよい（たとえば、プラスミド、細胞質因子、ミニクロモソームまたは人工クロモソーム）。ベクターは、自己複製を保証するためのいずれの手段を含んでいてもよい。酵母においてベクターを複製することが可能な配列の例は、酵母プラスミド２μＭ複製遺伝子ＲＥＰ １−３および複製開始点である。
【００３３】
あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノム中に組み込まれて、これが組み込まれたクロモソーム（ｓ）と共に複製されるものであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される総ＤＮＡもしくはトランスポゾンを共に含む単一のベクターまたはプラスミド、あるいは２以上のベクターまたはプラスミドを使用してもよい。ベクターは、直鎖状または閉環状のプラスミドであってもよく、好ましくは、宿主細胞のゲノム中にベクターを安定に組込むこと、またはゲノムから独立して細胞内でベクターを自律複製することを可能にするエレメントを含んでいてもよい。
【００３４】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞を容易に選択することができる１つまたは複数の選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーは、その産物が殺生物剤耐性もしくはウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを与える遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはリケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質抵抗性を与えるマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。酵母のための好ましい選択可能なマーカーは、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｐｅ）ＴＰＩ遺伝子である（Ｒｕｓｓｅｌｌ （１９８５） Ｇｅｎｅ ４０： １２５１３０）。
【００３５】
ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、使用可能な状態で本発明のプロモーター配列に連結されている。プロモーター配列は、上流のエンハンサ配列の後にあってもよい。
【００３６】
本発明は、酵母において複製されることができ、所望の産物または中間体をコードするポリヌクレオチド構築物をもつ組換え発現ベクターを包含する。組換え発現ベクターは、酵母生物において複製可能などのようなベクターであってもよい。ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、使用可能な状態で選択されたプロモーター配列に連結されているべきである。本発明のポリヌクレオチド構築物は、また、使用可能な状態で適切なターミネータ、たとえばＴＰＩターミネータ（Ａｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ４１９−４３４）に連結されていてもよい。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチド構築物 、プロモーターおよびターミネータをライゲーションするために、並びに酵母複製に必要な情報を含む適切な酵母ベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、それぞれ当業者にとって周知である。第一に、本発明の全てのＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を調製し、次に、適切な発現ベクターにこの断片を挿入することにより、または個々のエレメント（たとえばシグナル、リーダー、プロモーターおよび所望の産物）のための遺伝情報を含むＤＮＡ断片を順番に挿入した後でライゲーションすることにより、構築されてもよい。
【００３８】
本発明の方法において使用される酵母生物は、大量の本発明のインスリン前駆体およびインスリン前駆体類似体を培養において産生するいずれの適切な酵母生物であってもよい。適切な酵母生物の例は、酵母生物種サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、クルイベロミセス・ラクチ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロイワ・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジタ・ｓｐ．（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）、カンジタ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジタ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ）、ゲオトリクム・ｓｐ．（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）およびゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）から選択される株であってもよい。
【００３９】
酵母細胞の形質転換は、たとえば、プロトプラストを形成した後、それ自体既知の方法で形質転換することによって行われてもよい。細胞を培養するために使用される培地は、産業的規模で酵母生物を培養するために適したどのような従来の培地であってもよい。典型的発酵槽の設計および操作は、Ｂａｉｌｅｙ ＆ Ｏｌｌｉｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ， ｐ６２０−２６， Ｓｅｃ． ｅｄ． １９８６， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ＩＳＢＮ ０−０７−００３２１２−２Ａに記載されている。培養は、バッチ式培養法（すなわち、植菌前に全ての成分が添加される）として、発酵の間に栄養制御剤が添加される流加培養法として、またはＡｉｂａ， Ｈｕｍｐｈｅｙ ａｎｄ Ｍｉｌｌｉｓ ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎ． Ｙ．， １９６５に記載されているように、完全培地のフィードが連続して発酵槽に与えられて、等量の培地が発酵槽から除去されることを意味する連続培養として行われてもよい。一つの態様において、培養は、バッチ式培養法（すなわち、最初の、限定された量の栄養素を含む閉ざされた培養システム）として行われる。
【００４０】
「産業的または商業的規模」は、１０ｍ３より大きい製造規模、好ましくは１０〜５００ｍ３の間、より好ましくは、５０から２００ｍ３の間、より好ましくは、８０〜１８０ｍ３の間を意味する。
【００４１】
発現された産物は、遠心または濾過によって培地から酵母細胞を分離し、塩（たとえば、硫酸アンモニウム）を用いて、もしくはイオン交換クロマトグラフィにより、上澄またはろ液のタンパク質成分を沈殿させた後、種々のクロマトグラフィ方法（たとえば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィなど）によって精製することにより、媒介物から酵母細胞を分離することを含む従来の手順によって回収されるてもよい。
【００４２】
培地に分泌して回収した後、単離したポリペチドは、種々のインビトロにおける手順、たとえば予想されるＮ末端伸張配列および／または発現されて分泌された産物中のその他の不必要な配列の除去を行ってもよい。したがって、米国特許番号５，３９５，９２２およびヨーロッパ特許番号７６５，３９５Ａ（両特許は、参照により本願明細書に詳細に援用される）に記載されているように、所望のポリペチド、たとえばインスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体は、Ｎ末端アミノ酸残基伸張を伴って発現されてもよい。Ｎ末端伸張は、末端伸張がＬｙｓ残基で切断されるように、塩基性アミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ）に特異的なタンパク分解性の酵素により、回収されたインスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体から除去されてもよい。このようなタンパク分解性の酵素の例は、トリプシンまたはアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼである。インスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体が連結ペプチドを含む場合、このような連結ペプチドは、トリプシンもしくはトリプシン様の酵素またはアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼにより、インビトロにおける酵素変換によって切断されるであろう。米特許明細書番号４，３４３，８９８または４，９１６，２１２に記載されているように、インスリン前駆体またはインスリン前駆体類似体が発現されて単鎖前駆体が分泌された場合であって、Ｂ２９アミノ酸残基が、ペプチド結合またはＡｌａＡｌａＬｙｓ配列（Ｍ１３）などの連結ペプチドによりＡ１アミノ酸残基と結合されている場合、インスリン前駆体は、Ｌ−スレオニンエステルの存在下でトリプシンまたはアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼによる酵素転換の後、塩基または酸加水分解によるインスリンまたはインスリン類似体のスレオニンエステルの転換によって、インスリンに転換される。
【００４３】
本発明は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されるが、いかなる形であれ本発明の範囲および請求の範囲を限定することは意図されない。添付された図は、本明細書および本発明の一部に組み込まれるものとものと考えられる。引用した全ての文献は、そこに記載された全てが、参照により本願明細書に詳細に援用される。
【００４４】
【実施例】
一般的な手順：
プラスミドおよびＤＮＡ
全ての発現プラスミドは、ＷＯ ＥＰ １７１ １４２において記載したものと同様のＣ−ＰＯＴ型であり、これは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプラスミド選別および安定化の目的で、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）ｗｏ含むことを特徴とする。プラスミドは、さらに、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースリン酸イソメラーゼターミネーターを含む。
【００４５】
酵母株および形質転換
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ６６３（ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３ ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ＋）またはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＥ１７１９（ＭＡＴａ／ＭＡＴα Δｙａｐ３：：ＵＲＡ３／Δｙａｐ３：：ｕｒａ３ ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３ Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２ ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ＵＲＡ３／ＵＲＡ３）を形質転換のための宿主に使用した。株ＭＴ６６３は、出願ＷＯ ９２／１１３７８に関連して、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｉｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託されており、寄託番号ＤＳＭ ６２７８を与えられた。株ＭＥ１７１９は、ＷＯ ９８／０１５３５において記載されている。ＭＴ６３３およびＭＴ１７１９の形質転換は、それぞれＷＯ ９７／２２７０６およびＷＯ ９８／０１５３５に記載したとおりに行った。
【００４６】
酵母発現
上記の通りのプラスミドを含む酵母株をＹＰＤ培地で培養した（Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｃ． ＆ Ｆｉｎｋ， Ｇ． Ｒ．， Ｅｄｓ．， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）。それぞれの株２−４について、個々の５ｍｌの培養液を３０℃において７２時間、最終ＯＤ６００約１５〜２０に振とうした。遠心後、定量分析のために上澄を除去し、この方法によって分泌された異種産物の濃度を測定した。ＧＬＰ−１については、出願中の特許出願ＤＫ ＰＡ ２００１ ０１１４１において記載したようにＨＰＬＣで解析した。インスリン前駆体については、Ｓｎｅｌ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ２４ （１９８７） ３２９−３３２に記載した方法によって解析した。Ｓｆ−ＩＢＰについては、インスリン結合実験は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ａ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （２０００） １６９４８ １６９５３に記載したように行った。ＡＭＭＥＰについては、タンパク質分解活性のためのアッセイを次のように行った：伸張ＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓ（配列番号：２）を有するＭ１３前駆体（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １７０： １０７−１１２，１９９６に記載した）をｙＫＶ３３３またはｙＥＡ２８４由来の上清と共にオーバーナイトでインキューベートした。次いで、上記の通りにＨＰＬＣにより、ＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ−Ｌｙｓ（配列番号：２）が延長されたＭ１３または単一のＮ末端Ｌｙｓ残基（ＡＭＭＥＰ切断によって生じる産物）を有するＭ１３について上澄みを解析した。ＬｙｓＭｌ３／ＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＬｙｓ（配列番号：２）−ＭＩ３の比をＡＭＭＥＰ発現レベルの基準として使用した。
【００４７】
表１において、多くのインスリン前駆体、ＧＬＰ−１（７−３７）Ｌｙｓ３４Ａｒｇ類似体、並びにＣＩＴ１プロモーターを用いて得られたＳｆ−ＩＢＰおよびＡＭＭＥＰの発現量は、ＣＩＴ１プロモーターの代わりにＴＰ１１プロモーターを使用した対応する構築物で得られたレベルのパーセンテージとして与えた。
【００４８】
実施例１
ＣＩＴ１プロモーターの発現制御下でインスリン前駆体Ｍ１３をコードする発現ベクターの構築。
【００４９】
図１は、ｐＭＴ７４２と呼ばれる酵母プラスミドを示す（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ７３，１９８８，９９． １１３−１２０）。プラスミドは、転写−プロモーター（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲｌ断片に位置する）とＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩ遺伝子の転写−ターミネーターの間のプラスミド中に挿入されたＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片を含む発現カセットを含有する。
【００５０】
プラスミドｐＭＴ７４２において、ＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片は、ＭＦａ１ プレ−プロリーダー、二塩基プロセシング・エンドペプチダーゼＫＥＸ２のためのＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位および単鎖ミニインスリン前駆体Ｍ１３からなる融合産物をコードする。ＴＰＩ遺伝子由来のプロモーターがＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＩＴ１遺伝子由来のプロモーターによって置換されたプラスミドを構築するために、標準的な分子生物学的技術（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ， Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）を使用して、以下の工程を行った。
【００５１】
ＣＩＴ１プロモーターを含む７２２ｂｐ ＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドＥ１０２（５’−ＴＡＴ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＴＴ ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＣＡ ＡＴＧ ＡＴＴ Ｃ−３’）（配列番号：３）およびＥ１０３（５’−ＴＡＴ ＣＧＣ ＴＧＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＴ ＡＡＡ ＴＡＧ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＴＧＴ−３’）（配列番号：４）を使用して、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ゲノムＤＮＡ（株ＭＴ６６３由来）から増幅した。Ｅ１０２は、ＳａｌＩ制限部位を導入するように設計し、Ｅ１０３は、ＥｃｏＲｌ制限部位を導入するように設計した。これにより、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲｌで消化した後、ＣＩＴ１プロモーターをＳａｌＩ−ＥｃｏＲｌ断片としてクローン化することができる。
【００５２】
クローン化を容易にするために、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＰＩプロモーターを含むｐＭＴ７４２のＡｐａｌ−ＥｃｏＲｌを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｉｌ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＡｐａｌ−ＥｃｏＲｌベクター断片にサブクローン化した。生じたプラスミドｐＥＡ２２２をＳａｌＩおよびＥｃｏＲｌで消化して、ベクター断片をＣＩＴ１プロモーターを含むＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片にライゲーションした。生じたプラスミドｐＳｕｒｆ／ＣＩＴをＮｃｏｌおよびＥｃｏＲｌで消化して、ＣＩＴ１プロモーターを含むＤＮＡ断片を、ｐＭＴ７４２由来のＮｃｏｌ／Ｘｂａｌベクター断片およびＥｃｏＲｌ／Ｘｂａｌ断片にライゲーションして、最終的なプラスミドｐＥＡ２６８を生じた。
【００５３】
発現プラスミドを大腸菌内で増殖させ、アンピシリンの存在下で培養して、標準技術な技術を使用して単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか（１９８９））。プラスミドＤＮＡは、適切な制限ヌクレアーゼ（たとえば、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、Ｘｂａｌ）によってインサートを調べ、適切なＣＩＴ１プロモーター配列を含むことを配列解析によって示した。
【００５４】
プラスミドｐＥＡ２６８は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ６６３に形質転換された。プラスミドｐＥＡ２６８を有する酵母形質転換体は、ＹＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）アガー（２％）プレート上で炭素源としてグルコースを利用することによって選択し、生じた株をｙＥＡ２６８と名付けた。コントロール株ＭＴ７４２は、ｐＭＴ７４２で形質転換したＭＴ６３３である。
【００５５】
実施例２
ＣＩＴ１プロモーターの発現制御下でＮ末端伸長インスリン前駆体Ｍ１３をコードする発現ベクターの構築。
【００５６】
プラスミドｐＡＫ７２９（ＷＯ ９７／２２７０６に記載）由来の発現カセットを含むＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ ＤＮＡ断片は、シグナルペプチドの後に合成リーダー、二塩基プロセシング・エンドペプチダーゼＫＥＸ２のためのＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位、スペーサーおよびプロセシング部位（ＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＰｒｏＬｙｓ）（配列番号：５）並びに単鎖ミニ−インスリン前駆体Ｍ１３から成る融合産物をコードする。この断片をｐＥＡ２６８由来のＮｃｏＩ／ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＣＩＴ１プロモーターを含む）にライゲーションして、最終的にプラスミドｐＥＡ２７４を生じた。プラスミドを大腸菌で増殖して、単離し、実施例１の通りに正確なインサートを調べた。プラスミドｐＡＫ７２９およびｐＥＡ２７４をＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ６６３に形質転換し、実施例１の通りに形質転換体を選択した。生じた酵母株は、それぞれｙＡＫ７２９およびｙＥＡ２７４と名付けた。
【００５７】
実施例３
ＣＩＴ１プロモーターの発現制御下にＮ末端伸長インスリン前駆体（Ｂ（１−２９）（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｖｓ−Ａ（１−２１）））をコードする発現ベクターの構築。
【００５８】
出願中の特許出願ＤＫ ＰＡ ２００１−００５４７は、シグナルペプチドの後に合成リーダー、二塩基プロセシング・エンドペプチダーゼＫＥＸ２のためのＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位、スペーサーおよびプロセシング部位（ＧｌｕＧｌｕＧｌｙ−ＧｌｕＧｌｕＰｒｏＬｙｓ）（配列番号：６）並びにインスリン前駆体Ｂ（１−２９）−ＡｓｐＰｒｏＬｙｓ−Ａ（１−２１）から成る融合産物の発現を開示している。この融合産物をコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片を、ｐＥＡ２６８由来のＮｃｏＩ／ＸｂａｌおよびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＣＩＴ１プロモーターを含むこと）にライゲーションした。生じたプラスミドを大腸菌内で増殖し、単離して実施例１に記載の通りに正確なインサートを調べて、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＥ１７１９を形質転換した。形質転換体は、実施例１に記載したとおりに選択した。コントロールと比較した収率を表１に示す。
【００５９】
実施例４
Ｎ末端伸張を伴うＧＬＰ−１（７−３７）Ａｒｇ３４の発現。
【００６０】
出願中の特許出願ＤＫ ＰＡ ２００１ ０１１４１は、ＭＦα１プレプロリーダー、二塩基プロセシング・エンドペプチダーゼＫＥＸ２のためのＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位、スペーサーおよびプロセシング部位ＧｌｕＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｙｓ（配列番号：７）、並びに位置３４のＬｙｓがＡｒｇで置換されたＧＬＰ−１類似体を含む融合産物の発現を開示している。融合産物をコードするＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ ＤＮＡ断片を、ｐＥＡ２６８由来のＡｐａＩ／ＸｂａＩおよびＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＣＩＴ１プロモーターを含む）にライゲーションした。生じたプラスミドを大腸菌内で増殖し、実施例１に記載の通りに単離して正確なインサートを調べ、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＥ１７１９に形質転換した。形質転換体を実施例１に記載の通りに選択した。
【００６１】
実施例５
ＴＰＩまたはＣＩＴ１プロモーターを含むＳｆ−ＩＢＰタンパク質の発現ベクターの構築。
【００６２】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒａ（ヨトウムシ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）インスリン様ペプチド結合タンパク質は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ａ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ （２０００） １６９４８−１６９５３に開示されており、該遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＦ２３６６４１寄託されている。
【００６３】
オリゴヌクレオチドは、アミノ酸配列ＥＥＡＥＰＫを有するＮ末端伸張を備えたＳｆ−ＩＢＰのアミノ酸２３〜２６５をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅できるようにデザインした。ＰＣＲおよびオーバーラップＰＣＲの組合せを使用した後、標準的な方法（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７７： ６１−６８，１９８９， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）によって単離およびクローン化して、ＳＰ−リーダー−ＫＲ−Ｅｘｔ−Ｓｆ−ＩＢＰをコードする発現カセットを含む発現ベクターｐＥＡ２６３を得た。発現カセットを含むプラスミドｐＥＡ２６３由来のＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ断片を、ｐＥＡ２６８由来のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩおよびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＣＩＴ１プロモーターを含む）にライゲーションし、最終的なプラスミドｐＥＡ２８６を生じた。
【００６４】
プラスミドを大腸菌内で増殖し、実施例１に記載の通りに単離して正確なインサートを調べた。プラスミドｐＥＡ２６３およびｐＥＡ２８６により、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ６６３を形質転換して、形質転換体を実施例１に記載の通りに選択した。生じた酵母株は、それぞれｙＥＡ２６３およびｙＥＡ２８６と名付けた。
【００６５】
実施例６
ＡＭＭＥＰの発現ベクターの構築。
【００６６】
ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）エンドメタロプレプチダーゼ（ｅｎｄｏｍｅｔａｌｌｏｐｒｅｐｔｉｄａｓｅ）の遺伝子は、Ｖａｄ， Ｋ ａｎｄ Ｔｈｉｍ， Ｌ．によってクローン化されており、ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＡＪ２３８７１８に寄託されている。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチドは、完全なコード配列がＰＣＲ増幅されるようにデザインした。単離した後、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、完全なＡＭＭＥＰコード配列を含むＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ ＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩベクター断片およびＴＰＩプロモーター（ｐＭＴ７４２由来の両方とも）を含むＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片にライゲーションして、最終的なプラスミドｐＫＶ３３３を生じた。
【００６７】
ＡＭＭＥＰのための発現カセットを含むプラスミドｐＫＶ３３３由来のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を、ｐＥＡ２６８由来のＮｃｏＩ／ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＣＩＴ１プロモーターを含む）にライゲーションして最終的なプラスミドｐＥＡ２８４を生じた。
【００６８】
プラスミドを大腸菌内で増殖し、実施例１に記載の通りに単離して正確なインサートを調べた。プラスミドｐＫＶ３３３およびｐＥＡ２８４によりＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＴ６６３を形質転換して、形質転換体を実施例１に記載の通りに選択した。生じた酵母株は、それぞれｙＫＶ３３３およびｙＥＡ２８４と名付けた。
【００６９】
表１は、ＴＰＩプロモーターと比較してＣＩＴ１プロモーターを使用することによる収率の増加を示す。ＣＩＴ１プロモーターの使用では、発現して分泌された産物が５０〜３４０％以上に増加されたことが、表より明らかである。
【００７０】
表１
【００７１】
【表１】
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［配列表］
2004514450.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｐＭＴ７４２（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ７３，１９８８，９９．１１３−１２０）と呼ばれる酵母プラスミドの例を示す。プラスミドは、該プラスミド内の転写−プロモーター（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片に位置する）とＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＩ遺伝子の転写−ターミネータとの間に挿入されたＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を含む発現カセットを含む。
【図２】
図２は、実施例１において記載したＣＩＴ１プロモーターを含む７２２ヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。配列の上には、オリゴヌクレオチドＥ１０２およびＥ１０３によって挿入されたヌクレオチドの変化を示す。下線を引いた配列は、これらの変化によって挿入された制限位置を示す。該ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｚ７１６１６の位置２４３４〜位置３１５５の相補的配列と一致する。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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2004514450.tif 000029
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【国際調査報告】
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2004514450.tif 000032
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