(57)【要約】本発明は、例えば代用血管として使用されるポリマーのような、特に外科でプロテーゼ材料として使用されるポリマーの表面にペプチドを結合させるための触媒としてのルテニウムおよびオスミウム錯体の使用に関するものである。
2004506084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スペーサーアームをポリマーに結合させる段階を有する活性化ポリマーの製造方法であって、該方法がメタロセン型化合物の存在下に行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
スペーサーアームをポリマーに結合させる段階を有する活性化ポリマーの製造方法であって、反応をメタロセン型化合物の存在下に行うことを特徴とする方法。
【請求項３】
メタロセン型化合物を用いて反応を触媒する方法であって、該反応がスペーサーアームをポリマーに結合させる段階を有することを特徴とす
る方法。
【請求項４】
メタロセン型化合物を用いて反応を触媒する方法であって、該反応がスペーサーアームをポリマーに結合させることからなることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記メタロセン型化合物が、下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）Ｌ２（Ｈａｌ）　　　　　（Ｉ）
［式中、Ｃｐは、未置換であるかあるいはハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル−Ｃ６−１０アリール、Ｃ２−６アルケニル−Ｃ６−１０アリール、−ＮＲ１Ｒ２から選択される１以上の置換基によって置換されているシクロペンタジエニル配位子であり、この場合Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素ならびにＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され（式中Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキル基である）；
Ｍはルテニウムもしくはオスミウムであり；
Ｈａｌはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素であり；
基Ｌは同一でも異なっていてもよく、Ｃ１−６アルキル基、ＣＯおよびＰＲ３から選択され、この場合少なくとも１個のＬがＰＲ３であり；
基Ｒは同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素、Ｃ１−６アルキル基およびアリール基Ａｒから選択され、そのアリール基はＣ６−１０アリール基またはヘテロアリール基であり、そのヘテロアリール基は、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有する５員環もしくは６員環であり、且つこの場合各Ｒは、未置換であるかあるいは同一でも異なっていてもよい１以上の置換基によって置換されており、その各置換基はハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ，−ＮＲ１Ｒ２から選択される（式中Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素ならびにＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され、Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキルである）；］
または下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）２　　　　　　　（ＩＩ）
［式中、Ｍは上記で定義の通りであり、基Ｃｐは同一でも異なっていてもよく、上記で定義の通りである］
のいずれかである請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記メタロセン型化合物が、Ｃｐが未置換シクロペンタジエニル基であり、基ＬがいずれもＰＲ３基であり、そのＰＲ３基は同一でも異なっていてもよく、且つそれぞれ式ＰＲ′３、ＰＲ′２Ａｒ、ＰＲ′Ａｒ２またはＰＡｒ３によって表され、この場合基Ｒ′は同一でも異なっていてもよく、且つそれぞれＣ１−６アルキル基であり、各Ａｒは同一でも異なっていてもよく、フェニル、ナフチルまたはピリジル基を表し、各Ｒ′およびＡｒは未置換であるかあるいはハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ，−ＮＲ１Ｒ２から選択される１以上の置換基によって置換されている（式中Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素ならびにＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され、Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキル基である）式（Ｉ）の化合物である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ａｒがフェニルであり、Ｒ′がメチルである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記メタロセン型化合物がＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーがポリテトラフルオロエチレン、ダクロンまたはポリ（カーボネート−尿素）ウレタンである請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーがプロテーゼの形態にある請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化ポリマーからプロテーゼを形成する段階をさらに有する請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化ポリマーをライニング物質と反応させてライニングされたポリマーを製造する段階をさらに有する請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ライニング物質がペプチドを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが抗凝固性ペプチドおよび／または増殖促進ペプチドおよび／または走化性ペプチドである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ライニング物質が種細胞を含むことで、前記活性化ポリマーが種細胞のライニングで播種される請求項１２ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ライニングされたポリマーを、前記活性化ポリマーと反応させる前に、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと反応させる請求項１２ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ライニングされたポリマーからプロテーゼを形成する段階をさらに有する請求項１２ないし１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテーゼが代用血管である請求項１０ないし１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記代用血管が、ポリ（カーボネート−尿素）ウレタン移植体である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれかに記載の方法によって得ることができる活性化ポリマー、ライニングされたポリマーまたはプロテーゼ。
【請求項２１】
請求項１ないし１９のいずれかに記載の方法によって得られた活性化ポリマー、ライニングされたポリマーまたはプロテーゼ。
【請求項２２】
身体の一部分の置換を必要とするヒトまたは動物患者を処置する方法であって、前記身体の一部分を、請求項２０または２１に記載のプロテーゼで置換する段階を有する方法。
【請求項２３】
スペーサーアームをプロテーゼとしての使用に好適なポリマーに結合させる際の、請求項１ないし８のいずれかに記載のメタロセン型化合物を含む触媒の使用。
【請求項２４】
身体の一部分の置換用のプロテーゼの製造における、請求項１ないし８のいずれかに記載のメタロセン型化合物、スペーサーアームおよび、プロテーゼとしての使用に好適なポリマー、の使用。
【請求項２５】
スペース基Ｐ２１／ｎを有する請求項１ないし８のいずれかに記載のメタロセン型化合物。
【請求項２６】
図１に示した構造を有し、また結合長さ：
Ｒｕ（１）−Ｐ（２）＝２．３２０２Å
Ｒｕ（１）−Ｐ（１）＝２．３２１２Å
Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝２．４５１０Å
Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１．８４１７Å
を有し、さらに結合角：
Ｃｌ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２１．５０°
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｐ（１）＝１０１．５７°
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝９０．２４°
Ｐ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝９１．７０°
Ｐ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２１．５１°
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２２．３３°
（この場合Ｃ（０）はシクロペンタジエニル環の重心を表す）を有するＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌ。
【請求項２７】
下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）（ＰＲ３）２Ｈａｌ　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、Ｍ、Ｃｐ、ＰＲ３およびＨａｌは請求項５ないし８のいずれかで定義の通りであり、基ＰＲ３は同一でも異なっていてもよい］または請求項２５もしくは２６に記載の化合物の製造方法であって、１．８〜２．５モル部のＰＲ３を０．８〜１．５モル部のＲｕ（Ｈａｌ）３および０．８〜１．５モル部のシクロペンタジエンと脱水ジエチルエーテル中で反応させる段階を有する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法によって得ることができる請求項２６に記載の化合物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法によって得られた請求項２６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えば代用血管として使用されるポリマーなどのような、好ましくは特に外科においてプロテーゼ（人工器官）材料として使用されるポリマーの表面にペプチドを結合させるための触媒としてのルテニウムおよびオスミウム錯体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
冠動脈および末梢血管の疾患の形でのアテローム性動脈硬化性血管疾患は、米国および欧州の両方において最大の死因となっている。冒された血管を治療するための外科的な決め手は、自己静脈もしくは動脈のバイパス移植などである。しかしながら、多くの患者において十分な自己静脈がない。従って、プロテーゼ代用血管が必要とされる。
【０００３】
現在、プロテーゼ代用血管および他の外科プロテーゼとして、いくつかの材料が使用可能である。それには、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびダクロンなどがある。これら２種類の材料は剛性であり、移植体として使用すると、融着部で伸展性不一致を生じる。ＰＴＦＥまたはダクロン移植体の一次開存率は、４〜５年目で２０〜３０％である。代用血管として使用可能な別の材料は、ポリ（カーボネート−尿素）ウレタン（ＣＰＵ）である。この材料は、比較的弾性が高いことから、それが模倣する血管との類似性が高いという長所を有する。従ってＣＰＵ移植体は、身体において自然の血管と同様に挙動するという意味において伸展性移植体である。特にその材料は、取り付けられる部位が撓む場合に、ＰＴＦＥまたはダクロン移植体より容易に撓む。
【０００４】
多くの人が、伸展性を、心血管プロテーゼを動脈系に適合させる上で必要な非常に重要な属性であると考えている。従って、特に膝より下の動脈バイパスなどの低血流状況での直径の小さい移植体の臨床的性能の向上に向けては、伸展性材料の開発が重要な段階であると考えられる。現在使用される移植体が伸展性を得るには全体的な外側への膨張に依存することから、長期伸展性を得ることは掴みどころのない目標であった。しかしながら、末梢血管の内側への増殖が外側への膨張を妨害することから、比較的短期間経過後に伸展性は失われる。
【０００５】
しかしながら、ＣＰＵ系の移植体は異なる機構によって伸展性を得る。外側への膨張を必要とすることなく壁圧縮の機構によって、容量増加が行われる。相対的に剛性の材料ではなく伸展性のＣＰＵを用いることで、移植体の開存率が高くなることが認められている（Ｓｅｉｆａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ Ｇｒａｆｔｓ， １９９９ Ｒ． Ｇ． Ｌａｎｄｅｓ）。
【０００６】
しかしながら、これら材料を単独で移植体に使用するには問題がある。血液がその移植体を通って流れるに連れて、血小板などの粒子が移植体表面に付着する傾向があったり、血液が凝固する可能性があり、それは特に吻合部領域、特に遠位吻合部で起こり、移植体の管腔表面に沿っても起こる。それによって、血管の内径が狭くなり（狭窄）、それは血流がほとんどない直径の小さい（例えば５ｍｍ以下）移植体に関して特に問題となる。影響を受ける主要な領域は、移植体の下流端が血管と出会う遠位吻合部である。それは主に、正常な血管の天然のライニングである内皮細胞による被覆がないことが原因である。内皮は、正常な血流を促進する抗凝固物質および血小板活性化物質を放出する能力を有する。
【０００７】
この問題に対処するため、手術前および手術中の両方での移植体への内皮細胞播種が試みられている。大まかに言えば播種は、患者の脂肪組織または静脈から内皮細胞を抽出し、それを用いて移植体の内側をコーティングすることで、自然の内皮に似せることによって行われる。このように行う移植体の播種は、開存率を高めることが明らかになっているが、播種された細胞は移植体表面、特にＰＴＦＥ表面にはほとんど付着しない。実際、細胞を移植体管腔上に直接播種した場合、血流への曝露後に付着した状態で残るのは細胞のうちのわずか１〜１４％である。
【０００８】
従って、内皮播種において非常に重要な点は、血管を通る血流によって生じる剪断応力に播種された細胞が抵抗する能力である。血流の脈動的性質によって、移植体表面にしっかり付着していない場合には、細胞が一掃される可能性が特に高くなる。例えばＰＴＦＥのように内皮播種がより困難である場合、剪断応力の影響は致命的である。ただしそれは、いずれの移植体材料を用いる場合でも非常に重要である。
【０００９】
従って、細胞を移植体に結合させる信頼性の高い方法が必要とされる。理想的な結合方法において必要な条件は、温和な条件および水系媒体のみの使用、ならびに全ての重要な移植体ポリマーへの利用可能性である。さらにその方法では、毒性材料が関与したり、滅菌が妨害されることがあってはならない。最も望ましい方法はさらに、大量生産に容易にスケールアップできることである。細胞の移植体への結合はこれまで、水溶性フィブロネクチンなどの接着性残留物で移植体管腔表面をコーティングすることで促進されていた。しかしながら、そのような接着性残留物は、血流に曝露された場合に、内皮細胞と一緒に非常に容易に洗い流される。別の方法が、移植体を形成するポリマーに化学的なスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）を結合させ、そのあと細胞をそのスペーサーアームに結合させる方法である。
【００１０】
スペーサーアームの移植体への結合はこれまで、セリウム（セリウムＩＶ）イオン化学を用いて行われていた。この種の方法では、酸化剤としてセリウムイオンを使用し、移植体材料への酸素吹き込みと、それによる酸素ラジカルの発生を行う。しかしながら、酸素ラジカルの存在が、ポリマー移植体材料の構造を変えることが明らかになっている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で、ヒドロキシルラジカルが酸化分解を生じさせ、それが応力亀裂ならびに移植体、特にポリ（エーテル）ウレタン製の移植体において完全な不良をもたらす場合が多いことが明らかになっている。
【００１１】
外科的用途の場合、移植体の物理的および化学的特性における変動の許容される範囲は小さく、酸素ラジカルによって生じる変化は移植体の不良を生じるには十分である。実際、結合方法にセリウムイオン化学を用いる場合、許容できない程度に多数で、移植体の不良が生じることが明らかになっている。さらに、ＣＰＵなどの伸展性ポリマーを用いる場合、セリウムイオンおよび酸素ラジカルが関与する反応段階によって、ポリウレタン類は脆くなり、それによってそのような材料を用いる利点がなくなり、伸展性が大幅に低下する。この方法の別の欠点は、セリウムイオンがヒトに対して有毒であるという点である。従って、それらの使用は医学的場面では非常に望ましくない。
【００１２】
従って、スペーサーアームをポリマー移植体材料に結合させる有効な方法を提供し、しかも移植体材料の構造に対する損傷を回避する新たな結合方法が必要とされる。また、毒性を避けるために結合方法でセリウムイオンの使用を完全に回避するのも望ましいことである。
【００１３】
発明の概要
驚くべきことに本発明者らは、例えば触媒コンバーターや非線形光学および半導体の領域などの医学以外の分野での使用のみがこれまで知られていたある種の触媒を、プロテーゼ、特に代用血管において使用されるものなどのポリマー材料へのスペーサーアームの取り付けに使用できることを見い出した。それらの触媒は、シクロペンタジエニル配位子を有するルテニウムまたはオスミウム系錯体である。そのような化合物は、電子移動型反応を促進する。本発明者らは、この種の化学を、プロテーゼ、特に代用血管などの外科用デバイスで使用されるポリマー材料へのスペーサーアームの結合での使用に適用させることが可能であることを見い出した。
【００１４】
従って本発明は、スペーサーアームを移植体材料に取り付けさせることができる全く新しい方法を提供する。セリウムイオンおよび酸素ラジカルの使用は完全に回避される。従って、酸素ラジカルによって生じる移植体材料に対する構造的変化が回避され、移植体の開存率が高くなる。これは移植体材料としてＣＰＵを用いる場合に特に有利である。というのは、ルテニウムもしくはオスミウム錯体を使用しての反応中に構造が実質的に変化を受けず、有利な伸展特性が維持されるからである。さらに、本発明の方法によって、ある程度の架橋がカーボネート構造に生じ、その結果材料の安定性を高め、従って実質的に非分解性とすることができる。
【００１５】
しかしながらその方法は、他の移植体材料に適用可能である。さらに、本発明の方法は比較的安価であり、温和な条件を用い、水系媒体中で行うことができる。それはさらに、セリウムイオンの使用によって生じる毒性の問題をも回避するものである。
【００１６】
温和な水系条件を用いることで、移植体表面に固有の親水性が生じる。それが今度は、表面タンパク質吸着および細胞付着を大幅に減少させる不活性基材表面を提供する。スペーサーアームの長さおよび３次元可動性は、その部分構造が細胞受容体および生理的受容体と直接相互作用することを可能とすることから、この潜在親水性は、付着する分子の必要な生物活性を維持する上でも役立つ。
【００１７】
この新たな結合方法を用いて得られる代用血管は、口径が小さい、中等度および大きい動脈を置換するのに用いることができ、末梢血管手術および冠動脈バイパス手術に好適であるという点で有利である。そのような移植体は、管腔表面の血栓形成性が低いことから、改善された合成血流路を提供する。
【００１８】
この研究を行う上で本発明者らは、本発明において有用な特定の触媒を合成した。化学式Ｒｕ（Ｃｐ）（ＰＰｈ３）２Ｃｌ（Ｃｐは、未置換シクロペンタジエニル配位子を表す）を有するこの錯体は、新規な結晶構造を有することが認められている。それの構造は、この化合物に対してこれまでに知られていないスペース基を有するという点で新規である。本発明のこの態様の錯体はまた、新規な合成経路によって製造された。この方法が錯体の新規な構造をもたらしたと思われる。従ってその新規な方法は、本発明の錯体のものと同等のスペース基を有する他の錯体の製造に適用可能である。
【００１９】
従って本発明は、以下のものを提供する。
【００２０】
スペーサーアームをポリマーに結合させる段階を有する活性化ポリマーの製造方法であって、メタロセン型化合物の存在下に行われることを特徴とする方法。
【００２１】
メタロセン型化合物を用いて反応を触媒する方法であって、その反応がスペーサーアームをポリマーに結合させる段階を有することを特徴とする方法。
【００２２】
前記メタロセン型化合物が、下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）Ｌ２（Ｈａｌ）　　　　　（Ｉ）
［式中、Ｃｐは、未置換であるかあるいはハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル−Ｃ６−１０アリール、Ｃ２−６アルケニル−Ｃ６−１０アリール、−ＮＲ１Ｒ２から選択される１以上の置換基によって置換されているシクロペンタジエニル配位子であり、この場合Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素ならびにＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され（式中Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキル基である）；
Ｍはルテニウムもしくはオスミウムであり；
Ｈａｌはフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素であり；
基Ｌは同一でも異なっていてもよく、Ｃ１−６アルキル基、ＣＯおよびＰＲ３から選択され、この場合少なくとも１個のＬがＰＲ３であり；
基Ｒは同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素、Ｃ１−６アルキル基およびアリール基Ａｒから選択され、そのアリール基はＣ６−１０アリール基またはヘテロアリール基であり、そのヘテロアリール基は、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を有する５員環もしくは６員環であり、且つこの場合各Ｒは、未置換であるかあるいは、同一でも異なっていてもよい１以上の置換基によって置換されており、その各置換基はハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ，−ＮＲ１Ｒ２から選択され、この式中Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素ならびにＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され、式中Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキル基である；］
または下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）２　　　　　　　（ＩＩ）
［式中、Ｍは上記で定義の通りであり、基Ｃｐは同一でも異なっていてもよく、上記で定義の通りである］
のいずれかである上記で定義の２種類の方法のいずれかの方法。
【００２３】
上記の方法のいずれかによって得ることができる活性化ポリマー、ライニングされたポリマーまたはプロテーゼ。
【００２４】
上記の方法のいずれかによって得られた活性化ポリマー、ライニングされたポリマーまたはプロテーゼ。
【００２５】
身体の一部分の置換を必要とするヒトまたは動物患者を処置する方法であって、前記身体の一部分を、上記で定義の方法のいずれかによって得られたまたは得ることができるプロテーゼで置換する段階を有する方法。
【００２６】
プロテーゼとしての使用に好適なポリマーへのスペーサーアームの結合における、上記で定義のメタロセン型化合物を含む触媒の使用。
【００２７】
身体の一部分の置換用のプロテーゼの製造における、上記で定義のメタロセン型化合物、スペーサーアームおよび、プロテーゼとしての使用に好適なポリマー、の使用。
【００２８】
スペース基Ｐ２１／ｎを有する上記で定義の式（Ｉ）の化合物。
【００２９】
図１に示した構造を有し、また結合長さ：
Ｒｕ（１）−Ｐ（２）＝２．３２０２Å
Ｒｕ（１）−Ｐ（１）＝２．３２１２Å
Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝２．４５１０Å
Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１．８４１７Å
を有し、さらに結合角：
Ｃｌ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２１．５０ｏ
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｐ（１）＝１０１．５７ｏ
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝９０．２４ｏ
Ｐ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃｌ（１）＝９１．７０ｏ
Ｐ（１）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２１．５１ｏ
Ｐ（２）−Ｒｕ（１）−Ｃ（０）＝１２２．３３ｏ
（この場合Ｃ（０）はシクロペンタジエニル環の重心を表す）を有するＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌ。
【００３０】
下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）（ＰＲ３）２Ｈａｌ　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、Ｍ、Ｃｐ、ＰＲ３およびＨａｌは上記で定義の通りであり、基ＰＲ３は同一でも異なっていてもよい］または上記で定義のＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）Ｃｌの製造方法であって、１．８〜２．５モル部のＰＲ３を０．８〜１．５モル部のＲｕ（Ｈａｌ）３および０．８〜１．５モル部のシクロペンタジエンと脱水ジエチルエーテル中で反応させる段階を有する方法。
【００３１】
前記の方法によって得ることができる、上記で定義の構造を有するＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌ。
【００３２】
前記の方法によって得られた、上記で定義の構造を有するＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌ。
【００３３】
図面の簡単な説明
図１は、錯体Ｒｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌの構造を表す図である。
【００３４】
図２は、活性化ポリマーのライニングおよび本発明のライニングされたポリマーの試験で使用される流動循環路を表す図である。
【００３５】
図３ａ、ｂおよびｃは、ＲＧＤおよびヘパリンでコーティングされた移植体のＥＳＥＭ分析を示す図である（ａ、倍率５５倍；ｂ、倍率２２０倍；ｃ、倍率３５００倍）。
【００３６】
図４ａおよびｂは、ヘパリンならびにヘパリン／ＲＧＤコーティングした移植体のＴＭＡ分析を示す図である。
【００３７】
図５ａ、ｂ、ｃおよびｄは、ヘパリン／ＲＧＤコーティングした移植体のＤＭＡ分析を示す図である。
【００３８】
発明の説明
ルテニウムおよびオスミウム錯体
ルテニウムおよびオスミウムシクロペンタジエニル錯体は、各種の合成触媒法において有効であることが知られている。例えばトロストら（Ｔｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ）は、アルケンを付加反応させて不飽和ケトンを生成するための触媒としてのそのような錯体の使用について記載している（１９９７， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９： ８３６−８３７）。これら錯体はさらに、触媒コンバーター、半導体および非線形光学などの分野でも用いられる（Ｌｏｎｇ； Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３４： ２１−３８）。これら錯体の触媒としての活性は、金属ドナーと有機アクセプターとの間の効率的な電荷移動機構によるものであると考えられている。
【００３９】
この種の錯体はかなり注目されており、現在（ｉ）アルデヒドアセタール（Ｇｒｏｔｊａｈｎ， ＤＢ． Ｅｔ ａｌ． Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ． １９９６； １５： ｐｐ． ２８６０−２８６２）またはアレニリデン配位子からのカルベン錯体の生成；（ｉｉ）配位ケトホスフィンからのＣ−およびＯ−結合エノレートの形成（Ｒａｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ， Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ． １９９６； １５： ｐｐ． ２８５２−２８５４）；（ｉｉｉ）中性ビニリデン錯体の反応性（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７： ｐｐ． ７２９１−７２９２およびＯｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ； １９９６； １５： ｐｐ． ４０７５−４０７７）；（ｉｖ）アミノアレニリデン錯体の合成（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ； １９９６； ｐｐ． １００９− １０１０）；カチオン性ビニリデン−エン−イン前駆体のシクロ芳香族化（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｉｎｎ； Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９５； １１７： ｐｐ． ８０４５−８０４６）および脱プロトン化ビニリデン錯体のシクロプロパン化（Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６； １１８： ｐｐ． ６４３３−６４４４）の分野で研究が行われている。しかしながら、医学分野でのそれらの使用についてはこれまで報告されていない。
【００４０】
本発明者らは、例えばルテニウムまたはオスミウムシクロペンタジエニル化合物などのメタロセン型化合物が本発明の方法における触媒として有用であることを見出した。メタロセン型化合物は、遷移金属および１、２もしくはそれ以上置換または未置換のシクロペンタジエン配位子を有する化合物である。本発明での使用に好ましいメタロセン化合物は、下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）Ｌ２（Ｈａｌ）　　　　　（Ｉ）
［式中、Ｃｐ、Ｍ、ＬおよびＨａｌは上記で定義の通りである］、または下記式の化合物：
Ｍ（Ｃｐ）２　　　　　　　（ＩＩ）
［式中、ＭおよびＣｐは上記で定義の通りである］である。本発明での使用に特に好ましい化合物は、下記式のものである。
Ｍ（Ｃｐ）（ＰＲ３）２Ｈａｌ　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、Ｍ、Ｃｐ、ＲおよびＨａｌは上記で定義の通りである］。
【００４１】
本明細書で使用される場合、Ｃ１−６アルキル基は代表的には、炭素原子１〜６個を有する（分岐または環状の場合は３個以上）直鎖もしくは分岐もしくは環状のアルキル基または部分構造であり、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルがある。アルキル基は未置換であるか、あるいは、例えばハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ１および−ＣＯＯＲ１から選択され、この場合Ｒ１は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。
【００４２】
Ｃ６−１０アリール基は代表的には、フェニル基またはナフチル基であり、好ましくはフェニル基である。アリール基は未置換であるか、あるいは、例えばハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ１および−ＣＯＯＲ１から選択され、この場合Ｒ１は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。
【００４３】
ヘテロアリール基は代表的には、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個、２個、３個またはそれ以上のヘテロ原子を有する５員環または６員環である。ヘテロアリール基の代表例には、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピラゾリジニル、ピロリルおよびピラゾリル基などがあり、最も好ましいヘテロアリール基はピリジルである。ヘテロアリール基は未置換であるか、あるいは、例えばハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ１および−ＣＯＯＲ１から選択され、この場合Ｒ１は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。
【００４４】
Ｃ２−６アルケニル基は、直鎖、または分岐もしくは環状（３個以上の炭素が存在する場合）であり、代表的にはエテニル、プロペニルまたはブテニル基である。アルケニル基は未置換であるか、あるいは、例えばハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ１および−ＣＯＯＲ１から選択され、この場合Ｒ１は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。
【００４５】
Ｃ１−６アルコキシ基は直鎖、または分岐もしくは環状（３個以上の炭素が存在する場合）であり、代表的にはメトキシ、エトキシ、プロポキシまたはブトキシ基である。アルコキシ基は未置換であるか、あるいは、例えばハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ１および−ＣＯＯＲ１から選択され、この場合Ｒ１は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。
【００４６】
ハロゲンは代表的には、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。
【００４７】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物において、金属Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、好ましくはルテニウムである。Ｍは代表的には、（Ｉ）酸化状態にある。
【００４８】
代表的にはＣｐは、未置換または、１以上、例えば２個の置換基で置換されたシクロペンタジエニル基である。シクロペンタジエニル基は好ましくは、未置換であるかメチル基で置換されており、より好ましくはそれは未置換である。
【００４９】
シクロペンタジエニル基は、η１またはη５結合を介して、好ましくはη５結合を介して金属に結合されていてよい。
【００５０】
代表的には式（Ｉ）の化合物において、Ｈａｌは塩素または臭素であり、好ましくは塩素である。
【００５１】
代表的には基ＬはいずれもＰＲ３によって表され、その基ＰＲ３は同一でも異なっていてもよく、式ＰＲ′３、ＰＲ′２Ａｒ、ＰＲ′Ａｒ２またはＰＡｒ３によって表され、各Ｒ′は同一でも異なっていてもよく、Ｃ１−６アルキル基を表し、各Ａｒは同一でも異なっていてもよく、フェニル、ナフチルまたはピリジル基を表し、各Ｒ′およびＡｒは未置換であるかあるいは、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ１Ｒ２（この場合Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていてもよく、水素およびＣ１−６アルキル基、−ＣＯＲ３および−ＣＯＯＲ３から選択され、Ｒ３は水素またはＣ１−６アルキル基である）から選択される１以上の置換基で置換されている。基Ｒ′およびＡｒは好ましくは未置換であるか、ハロゲン、ヒドロキシ、メチル、エチルもしくはメトキシ基で置換されている。
【００５２】
好ましくは、式ＰＲ′３、ＰＲ′２Ａｒ、ＰＲ′Ａｒ２およびＰＡｒ３における基Ｒ′およびＡｒは、それぞれメチル基およびフェニル基によって表される。最も好ましい基ＰＲ３はＰＰｈ３である。
【００５３】
最も好ましい式（Ｉ）の化合物は、Ｒｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌである。
【００５４】
上記のルテニウムおよびオスミウムシクロペンタジエニル錯体は、当業界で公知の方法によって製造することができる。例えばＭ（Ｈａｌ）３を、配位子Ｌとともに未置換もしくは置換シクロペンタジエンと組み合わせて、式（Ｉ）の化合物を製造することができる。好適な方法には、ブルースらの報告（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ， Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． １９７７， ３０： ｐｐ． １６０１−１６０４およびＪ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ． １９８１： ｐｐ． １３９８−１４０８）に記載のものなどがある。式（ＩＩ）の化合物は、Ｍ（Ｈａｌ）３を２当量の置換もしくは未置換のシクロペンタジエンと組み合わせることで製造することができる。
【００５５】
活性化ポリマーの製造
本発明の方法は、プロテーゼとしての使用に好適なあらゆるポリマーに適用することができる。それはまた、例えばバイパス管などのヘパリン処理を必要とするカテーテルまたは他の外科用デバイスに適用することもできる。好ましいポリマーは、プロテーゼとしての使用に好適なものであり、特にはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ダクロンおよびポリ（カーボネート−尿素）ウレタン（ＣＰＵ）などの代用血管としての使用に好適なものである。ＰＴＦＥおよびダクロンはよく知られた材料であり、現在代用血管用に市販されており、いずれも剛性で伸展性のない材料である。ＣＰＵは伸展性材料であることから、代用血管の製造には好ましい。ＣＰＵの製造方法は、ＥＰ−Ａ−０２８６２２０に記載されている。本発明の方法で使用可能な別のポリマーには、ポリカーボネートウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ナイロン（非晶質）、ポリテレフタル酸エステル、天然ゴム、エチレンビニルアセテート、スチレンブタジエンゴム、フルオロエラストマー類、ポリクロロプレン、ポリヘキセン、アクリロニトリル−ブタジエン、エチレンビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、シリコーンゴムコポリ（ｃｏｐｏｌ）、ポリイソプレン、シリコーンゴムおよびブチルゴムなどがある。
【００５６】
この活性化法は、いかなる形のポリマーを用いても行うことができる。具体的にはそのポリマーは、平坦なシートまたは管であり得、あるいはプロテーゼ、カテーテルその他のデバイスの形に前成形され得る。
【００５７】
当業界で公知のいずれのスペーサーアームも、本発明の目的に対して用いることができる。好適なスペーサーアームについては、バンフォードらの報告（Ｂａｍｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９２； １０： ｐｐ． ２４３ − ２６１）およびそれに引用の参考文献に記載されており、それらは参照によって本明細書に組み込まれる。好適なスペーサーアームの例には、含窒素化合物、ペプチドおよびアルコールなどがある。含窒素化合物の例としては、アミン類（例えば１級、２級および３級アミン）、４級アンモニウム化合物類およびアミド類などがある。特に好ましい含窒素化合物は、Ｎ−（３−アミノプロピル）−メタクリルアミド塩酸塩（ＡＭＰＡ）、６−アミノヘキサン酸およびアクリルアミドである。ペプチドの例としては、短鎖ないし中鎖のペプチド配列があり、例えばグリシル残基、ペンタグリシン、ジ−β−アラニン、プリマキン−ペプチド類およびＧｌｙ−βＡｌａ−βＡｌａである。アルコールの例としては、ポリエチレングリコールおよびビス（アミノヘキサニオール）がある。
【００５８】
スペーサーアームに結合させる部分構造が増殖因子である場合、スペーサーアームは好ましくは剛性構造を有する。比較的可撓性が低いため、移植体への増殖因子の結合に用いるには、アクリルアミドが特に好ましいスペーサーアームである。
【００５９】
この結合方法は、適宜にポリマーを前処理し、次にその適宜に前処理したポリマーを触媒およびスペーサーアームと不活性条件下、代表的には窒素雰囲気下で反応させることで行われる。代表的にはその反応は蒸留水中、好ましくは３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、より好ましくは３７℃で行う。その反応は好ましくは、７以下、例えば５〜７または６〜７のｐＨで行う。ｐＨの調節には、酸、例えば硝酸などの一般的な無機酸を用いることができる。
【００６０】
使用される触媒は上述したように、１以上のメタロセン型化合物、好ましくは１以上のルテニウムもしくはオスミウム錯体を含む。
【００６１】
望ましくはその活性化反応は、抱合剤の存在下に行って、反応中に形成されるゲルの量を減らし、生成するゲルの除去を促進させる。このゲルは、スペーサーアーム間の架橋反応の生成物であると考えられる。当業界で公知のあらゆる抱合剤を用いることができる。例えば、アンモニウム塩を用いることができる。好ましい抱合剤は、１，１−ジメチル−１−（３−メタクリルアミドプロピル）−１−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（ＳＰＥ）である。
【００６２】
前記前処理段階は好ましくは、表面活性化剤を用いて行う。当業界で公知のあらゆる表面活性化剤を用いることができ、例えば４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）がある。前処理を行う温度は、好ましくは１０〜９０℃、より好ましくは２５〜７５℃、最も好ましくは５０℃である。
【００６３】
活性化反応の結果はスペーサーアームが結合したポリマーであり、それは以下において「活性化ポリマー」と称する。
【００６４】
本発明の活性化ポリマーは、外科用デバイスの形状、例えばプロテーゼに成形してもよい。あるいは、活性化ポリマーには、外科用デバイスの形状、例えばプロテーゼに成形する前に、ライニング物質でライニングを施すことができる。
【００６５】
ライニングされたポリマーの製造
本発明はまた、プロテーゼの形態を取ってもよい活性化ポリマーをライニング物質と反応させる段階を有する、ライニングされたポリマーの製造方法を提供する。好適なライニング物質には、細胞またはペプチド、例えば抗凝固性ペプチド、増殖促進ペプチドまたは走化性ペプチドなどがあり、特に抗凝固性ペプチドまたは増殖促進ペプチド、特にはヘパリンおよび／またはＲＤＧ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）がある。
【００６６】
本発明で使用することができる細胞には、内皮細胞および微小血管細胞などがあり、好ましくは内皮細胞である。好適な細胞の例には、動物内皮細胞などの動物細胞、あるいはヒト静脈、代表的には伏在静脈または臍帯静脈から、またはヒト脂肪組織から回収した細胞などがある。細胞の回収は、ジャッフェらの報告（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９７３； ５２： ２７４５−５６）に記載の方法などの標準的な方法を用いて行う。そのような細胞の代用血管内表面への播種は、全内皮の増殖を促進することが知られている。これは、移植体の表面に付着する粒子に対する自然の防御を提供し、開存率を高めるものである。代表的には使用される細胞は、患者自身の組織由来として、拒絶反応を回避する。
【００６７】
ライニング物質として使用可能な抗凝固性ペプチドの例としては、アポリポ蛋白Ｂ−１００およびＫＲＡＤ−１４ペプチドなどの当業界で公知の抗凝固性ペプチドなどがある。ＫＲＡＤ−１４ペプチドは、アポリポ蛋白Ｂ−１００由来であり、下記式を有する。
【００６８】
Ｚ１−Ｋ−Ａ−Ｑ−Ｘ１−Ｋ−Ｋ−Ｎ−Ｋ−Ｈ−Ｒ−Ｈ−Ｓ−Ｘ２−Ｔ−Ｚ２
式中、
Ｘ１は、ＳまたはＹを表し；
Ｘ２は、ＴまたはＩを表し；
Ｚ１は、ペプチドのＮ末端または１〜４７アミノ酸を表し；
Ｚ２は、ペプチドのＣ末端、末端アミド基または１〜７７アミノ酸を表す。この式ではペプチド配列は、標準的な１文字コードによって表される。
【００６９】
このペプチドがトロンビン活性化においてプロトロンビナーゼ複合体（因子Ｘａおよび因子Ｖ）に対する阻害効果を有することが、当業界で示唆されている。ＫＲＡＤ−１４ペプチドはまた、トロンボプラスチンの表面で活性化因子ＶＩＩを防止する能力も有する。さらにＫＲＡＤ−１４ペプチドは、恐らくはトロンビン活性化防止のために、トロンビンによる血小板の活性化に影響するように思われる。しかしながら、血小板活性化に対するＫＲＡＤ−１４ペプチドの直接効果は排除することができない。
【００７０】
１以上の内部欠失、挿入または置換を有し、実質的にアポリポ蛋白Ｂ−１００と同等の抗凝固特性を保持しているＫＲＡＤ−１４ペプチドの変異体、ならびにＫＲＡＤ−１４ペプチドまたはそれの変異体の塩も、本発明の抗凝固性ペプチドとしての使用に好適である。
【００７１】
アポリポ蛋白Ｂ−１００内には、アミノ酸３３００〜３４００の領域で、ＫＲＡＤ９８およびＫＲＡＤ−１４（アミノ酸３１２１〜３２１７）を含むドメインが、もう１つの正電荷配列と構造的に密接に関連していることも、当業界では公知である。より具体的には正電荷配列は、アポリポ蛋白Ｂ−１００のアミノ酸３３５９〜３３６７の配列であるＲＬＴＲＫＲＧＬＫＬＡＴであると考えられている。従ってこの配列は、ＫＲＡＤ−１４のペプチドの活性を増大することができると考えられる。
【００７２】
従って本発明の方法では、抗凝固剤として、ＫＲＡＤ−１４と、アポリポ蛋白Ｂ−１００のアミノ酸３３００〜３４００を有する第２のペプチドまたはその配列の一部もしくは変形体との組み合わせを用いることが可能である。この２種類のペプチドは、いずれの方法ででも物理的に結合させることができる。例えば、第２のペプチドを、ペプチド結合により結合されたＫＲＡＤ−１４ペプチドのＮ末端またはＣ末端延長としてつけることができ、あるいは何らかの他の方法、例えばシステイン−システインジスルフィド結合のような１以上の共有結合によってそれをつけることもできる。その結合は、当業界で公知の手段によって行うことができる。ＫＲＡＤ−１４ペプチドならびにこのペプチドの組み合わせ、そしてそれの抗凝固剤としての使用に関するさらなる詳細な説明は、ＷＯ９７／４３３１１にある。
【００７３】
上記のような抗凝固性ペプチドによるポリマーのライニングは、そのようなポリマーから形成されたプロテーゼを患者に挿入すると、抗凝固効果が直ちに起こるという利点を有する。これは播種細胞によるポリマーのライニングとは対照的である。なぜなら、播種の際にポリマー表面に付着する比較的少ない内皮細胞から全内皮層が生成するにはある程度の時間を要するからである。
【００７４】
ライニング物質としての使用に好適な増殖促進ペプチドの例としては、内皮層の増殖を促進する当業界で公知のペプチドなどがある。代表的な増殖促進ペプチドは、ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ；例えばモーリらの報告（Ｍｏｈｒｉ， Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， １９９５， １６： ｐ． ２６３）に記載のようなフィブロネクチン断片１３７１〜１３８２および；１３７７〜１３８８；例えばウッズらの報告（Ｗｏｏｄｓ， Ａ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ， １９９３； ４： ｐ． ６０５）に記載のフィブロネクチン接着促進ペプチド；例えばハバースティックらの報告（Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋ， ＤＭ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ； １９８５； ６６： ｐ． ９４６）に記載のＧＬＹ−ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ；である。
【００７５】
好適な走化性ペプチドの例としては、それが結合される表面、代用血管の場合、移植体の管腔に内皮細胞を引きつけるものなどがある。Ｎ−ホルミルペプチドはこの目的に適している。というのは、細胞の移動を化学誘引物質源に走化させる化学誘引物質を分泌するからである。フィブロネクチン断片および関連ペプチドも用いることができる。これらのタンパク質は、内皮細胞の移植体管腔への付着、さらには他の細胞への付着を促進する。それらはまた、血塊形成を安定化させる上で役立つ。走化性タンパク質についての詳細は、フリールらの報告などにある（Ｆｒｅｅｒ Ｒ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． １９７９； Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｘｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ； Ｇｒｏｓｓ， Ｅ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｍ．， ｅｄｓ．： ７４９ ａｎｄ Ｐｒｏｃｔｅｒ， ＲＡ ； Ｒｅｖ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９８７； ９： ｐ． ３１７）。
【００７６】
ライニングされたポリマーの製造方法においては、２種類以上のライニング物質を用いることが好ましい。つまり、２種類の異なる播種細胞を用いることができるか、あるいは、より好ましくは、ライニング物質は種細胞およびペプチドの両方を含む。例えば、ライニング物質は種細胞および抗凝固性ペプチドを含むことができる。これは、内皮層自体がまだ完全に形成されていない間でも、ペプチドにより直ちに抗凝固効果が提供されるという利点を有する。あるいは、ライニング物質は種細胞および増殖促進ペプチドを含むことができる。この場合、播種された細胞からの内皮形成は、増殖促進ペプチドの存在によって促進される。好ましいライニング物質は、種細胞、抗凝固性ペプチドおよび増殖促進ペプチドを含む。
【００７７】
ポリマーにライニング物質をライニングする方法は、当業界で公知の方法によって行うことができる。代表的には、ライニング物質を好適な媒体に懸濁させる。細胞がライニング物質中に存在する場合、それをジラらの報告（Ｚｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １９９０； １２： ｐｐ． １８０−９）に記載のものなどの標準的な培養法によって培養することができる。その場合、ライニング物質を懸濁させる媒体は代表的には、組織培地である。組織培地中の細胞の濃度は、好ましくは１〜５０×１０５個／ｃｍ２、好ましくは２〜２４×１０５個／ｃｍ２、より好ましくは２〜１６×１０５個／ｃｍ２である。使用可能な他の好適な培地には、オートクレーブ処理および濾過して無菌性を確保した全血または蒸留・脱イオン水がある。培地中のペプチド濃度は、好ましくは１ｎｇ〜１００μｇ／培地ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ〜１μｇ／培地ｍＬの範囲である。
【００７８】
このあとライニング物質は適宜官能化され得る。これは、スペーサーアームがうまく結合できる条件を与える準備段階である。これがこのあとライニング物質がひとたびスペーサーアームに共有結合的に連結されるやそれの安定化につながる。この段階を行う上で好適な薬剤には、カルボジイミド類などがある。カルボジイミドは、未置換であるか１または２ヶ所の位置で置換されていてもよい。好適な置換基の例としては、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、ヒドロキシ基、ハロゲンならびにアミノ、モノ（Ｃ１−６アルキル）アミノおよびジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基などがある。これら置換基の各アルキル基およびアルケニル基は、未置換であるか１以上のさらなる置換基でいずれかの位置で置換されていてもよい。好適なさらなる置換基には、ヒドロキシ基、ハロゲンならびにアミノ、モノ（Ｃ１−６アルキル）アミノおよびジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基などがあり、好ましくはアミノ、モノ（Ｃ１−６アルキル）アミノおよびジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基である。
【００７９】
官能化を行う上で好ましい薬剤には、Ｃ１−６アルキル基、アミノ（Ｃ１−６アルキル）基、Ｃ１−６アルキルアミノ（Ｃ１−６アルキル）基およびジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ（Ｃ１−６アルキル）基から選択される１個もしくは２個の基で置換されたカルボジイミドなどがある。特に好ましい薬剤には、１−（Ｃ１−６アルキル）−３−アミノ（Ｃ１−６アルキル）カルボジイミド、１−（Ｃ１−６アルキル）−３−（Ｃ１−６アルキル）アミノ（Ｃ１−６アルキル）カルボジイミドおよび１−（Ｃ１−６アルキル）−３−ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ（Ｃ１−６アルキル）カルボジイミドなどがある。特に好ましい薬剤は、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である。
【００８０】
次に、溶解または懸濁している官能化されていてもよいライニング物質を含む培地を、活性化ポリマーと接触させる。典型的には、培地を活性化ポリマーの入ったチャンバに挿入して、０．１〜１０時間、好ましくは０．５〜６時間インキュベートするか、あるいは培地を０．０５〜１０時間、好ましくは０．５〜６時間にわたって、活性化ポリマー上にポンプで注ぐ。ポリマーが管状ポリマーである場合、それをインキュベーション中あるいはポンプ送り中に回転してポリマーのより均一なライニングを得てもよい。インキュベーションまたはポンプ送りの手順を１回以上繰り返して、細胞の播種効率またはペプチドによる表面の被覆を良くすることができる。この方法は好ましくは、３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、より好ましくは３７℃の温度で行う。細胞がライニング物質中に存在する場合、その方法を約３７℃で行うことが特に重要である。
【００８１】
ライニング物質のポリマーへの付着を促進するため、例えばインキュベーションまたはポンプ送り工程の前またはその最中、ポリマーに静電荷を印加するか、あるいは０．５テスラ・ヘルムホルツコイルを用いることができる。
【００８２】
スペーサーアームへのライニング物質の結合は、スペーサーアームが規則的配向でポリマーに結合している場合に最も効率良く行うことができる。望ましくは、ライニング物質の細胞またはペプチドのポリマーへの結合の場合、スペーサーアームを正しく配置しなければならない。ＰＴＦＥまたはダクロンなどの剛性ポリマーを用いる場合、スペーサーアームの結合はかなり均一である。しかしながら、ＣＰＵなどの伸展性ポリマーの場合、ポリマーへの結合時におけるスペーサーアームの配向ははるかに規則性が低く、ライニング物質を結合させることが特に難しくなる。スペーサーアームに結合するライニング物質の割合は概して低いことから、その問題に対処することが特に望ましい。
【００８３】
それを行うことができる一つの方法は、活性化ポリマーの管腔表面へのヒドロゲルの塗布によるものである。溶液の場合、スペーサーアームは正しい配向をとりやすく、ライニング物質が結合するのを可能とすることが、これまでに明らかになっている。例えばライニング物質を活性化ポリマーに加えた後でのポリマーへのヒドロゲルの塗布によって、活性化ポリマー上のスペーサーアーム周囲に局所的な溶液状の水系環境が生じ、それの均一配向が促進される。その結果、結合するライニング物質粒子の割合が高くなる。
【００８４】
ライニング活性化ポリマーのさらなる処理
ポリマーは、プロテーゼあるいは、例えばバイパス手術用のカテーテルもしくは管などの他のデバイスの形態とすることができる。あるいは、活性化段階後または活性化段階とライニング段階の両方の後に、活性化またはライニングされたポリマーを適当なデバイスに成形することができる。プロテーゼその他のデバイスの成形は、当業界で公知の方法によって行うことができる。例えば、エドワーズらの報告（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔ． Ａｐｐ． １９９５； １０： ｐｐ． １７１−１８７）に記載の方法を用いることができる。
【００８５】
代表的には、本発明の活性化およびライニングされたポリマーを用いて、代用血管、心臓弁、ステント、神経損傷改善のための手術で用いられる導管および整形外科関節置換物などのプロテーゼを形成する。好ましいプロテーゼは代用血管である。
【００８６】
本発明の活性化およびライニングされたポリマーは、プロテーゼ以外の外科用デバイスでの使用においても想到され得る。例を挙げると、カテーテル、バイパス手術中に血液を通すプラスチック管、ならびに、Ｘ線診断法で使用されるＩｎなどの標識物質の注入に用いられる管などのヘパリン処理する必要があるデバイスなどがある。本発明の活性化ポリマーをそのような形で用いる場合、ライニング物質は代表的にはヘパリンである。
【００８７】
本発明のライニングされたポリマーは、プロテーゼの形態の場合、身体の一部分の置換を必要とするヒトもしくは動物患者の治療に用いることができ、その方法は、その身体の一部分を本発明のプロテーゼで置換する段階を有する。この方法は、プロテーゼ手術の分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。例えば、プロテーゼが代用血管である場合、移植体を自然の血管に端部と端部、端部と側部あるいは側部と側部で吻合させ得る。吻合は代表的には、縫合糸を用いて行う。しかしながら、縫合糸を用いると、移植体がＣＰＵなどの伸展性ポリマーから形成されていたとしても、吻合部は通常は剛性である。吻合部は狭窄が最も起こりやすい部位であることから、吻合部、特に遠位吻合部での伸展性を維持することが特に重要である。従って、クリップの使用またはレーザー法などの別法が開発されている。これらの方法の利点は、吻合部での移植体の伸展性がある程度保持されるという点である。
【００８８】
ルテニウム錯体の新規な構造
本発明を成し遂げる際に本発明者らは、公知の化合物Ｒｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌについて新たな結晶構造を見出した。この化合物が最初に報告されたのは、ギルバートらによるものであり（Ｇｉｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ａ． １９６９： ｐｐ． １７４９−１７５３）、ブルースらの報告（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｓｔ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． １９７７； ３０： ｐｐ． １６０２−１６０４）に記載の簡単な経路によって合成可能である。この経路では、トリフェニルホスフィンのエタノール溶液へのエタノール性三塩化ルテニウムおよびシクロペンタジエンの急速な順次添加を行う。
【００８９】
以前に製造された化合物の構造は、Ｐ１／ｎスペース基（ａ＝１４．４９３（８）、ｂ＝１１．３１５（４）、ｃ＝１１．７４５（４）Å、α＝６９．９９（３）、β＝８４．６７（４）、γ＝６２．２７（３）；Ｚ＝２；Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｄａｌｔｏｎ． Ｔｒａｎｓ． １９８１： ｐｐ． １３９８−１４０８）を有する三斜晶系である。
【００９０】
本発明者らは、同じ化学式を有するが、異なる結晶構造を有する化合物を製造した。この新規化合物の基本構造を図１に示してあり、結合長さおよび結合角は上記で定義している。この新規化合物は、これまでに知られている化合物と同形であるが、新たな空間群Ｐ２１／ｎを有する。シクロペンタジエニル配位子が、η５配位でルテニウム原子に結合している。この新たな構造におけるルテニウム原子についての幾何形状は、シクロペンタジエニル配位子が効率良く三つの配位座を取っている歪んだ八面体であると考えることができる。あるいは、その幾何形状は、シクロペンタジエニル配位子（Ｃ（Ｏ））の垂直軸が単一配位座を占有しているとする、歪んだ四面体であると考えることができる。
【００９１】
この錯体の新規な構造は、本発明の合成方法を用いて得ることができる。その合成方法を用いて、本発明の活性化ポリマーの製造方法において使用される式（Ｉ）の化合物などの他のルテニウムおよびオスミウム錯体を得ることもできる。この経路によって、本発明の新規化合物と同じ構造を有するさらなる錯体を得ることができる。従って、新規な結晶構造を有するさらなる化合物が想到される。
【００９２】
本発明の合成方法を用いて、下記式の化合物を製造することができる。
Ｍ（Ｃｐ）（ＰＲ３）２Ｈａｌ　　　　　（ＩＩＩ）
［式中、Ｍ、Ｃｐ、ＰＲ３およびＨａｌは上記で定義の通りであり、基ＰＲ３は同一でも異なっていてもよい。］この方法は、脱水ジエチルエーテル中、１．８〜２．５、好ましくは１．９〜２．３、より好ましくは２．０モル部のＰＲ３を、０．８〜１．５、好ましくは０．９〜１．３、より好ましくは１．０モル部のＭ（Ｈａｌ）３および０．８〜１．５、好ましくは０．９〜１．３、より好ましくは１．０モル部のシクロペンタジエンと反応させることで行われる。脱水ジエチルエーテル中で反応を行うことで、錯体が結晶化時に転位して前記新規な構造となることが見い出された。
【００９３】
この反応は好ましくは、例えば窒素雰囲気などの不活性条件下で行う。代表的には、ＰＲ３を脱水ジエチルエーテル中に溶解または懸濁させ、好ましくは濾過しておいた同じ溶媒中のＭ（Ｈａｌ）３の溶液に加える。同じ溶媒中の置換もしくは未置換シクロペンタジエンの溶液を、ＰＲ３と同時またはより好ましくは１〜３０分後、好ましくは５〜１５分後、より好ましくは１０分後に加える。シクロペンタジエンは好ましくは、使用前に蒸留したばかりのものとする。この反応は好ましくは、室温より高い温度、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃で行う。この方法を用いて式ＲｕＣｐ（ＰＰｈ３）２Ｃｌの化合物を製造する場合、使用される試薬はＲｕＣｌ３、ＰＰｈ３および未置換シクロペンタジエンである。
【００９４】
製造された錯体の結晶を得るためには、得られた溶液を溶媒留去して乾固させ、残留物をクロロホルム、塩化メチレン、メタノール、エタノールもしくは酢酸エチルなど（好ましくはクロロホルム）の極性溶媒に溶かし、その溶液に非極性溶媒をゆっくり拡散させることで結晶化を行う。好適な非極性溶媒には、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ヘキサンおよび石油など（好ましくはヘキサン）がある。
【００９５】
得られる結晶の構造は、粉末回折方法によるＸ線結晶解析などの標準法を用いて、あるいはより正確な最小２乗法による精緻化を用いて決定することができる。
【００９６】
【実施例】
以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明する。
【００９７】
実施例１：Ｃ４１Ｈ３５ＣｌＰ２Ｒｕ・Ｃ２Ｈ４Ｏの合成
別段の断りがない限り、以下の手順は、従来のシュレンク（Ｓｃｈｌｅｎｋ）および真空法に従って、乾燥窒素下で行う。この手順で使用した試薬はいずれも、アナラー（Ａｎａｌａｒ）または化学的に純粋なグレードであり、溶媒はいずれも適切な乾燥剤を入れて蒸留し使用前に脱酸素した。
【００９８】
三塩化ルテニウム水和物の脱水ジエチルエーテル溶液を濾過したものを、還流ジエチルエーテル中に懸濁させた２倍モル当量の撹拌トリフェニルホスフィンに加えた。１０分間還流後、蒸留したばかりのシクロペンタジエンのジエチルエーテル溶液を加えた。このあと、混合物を撹拌しながら、褐色から橙−赤色への完全な色変化が認められるまでさらに３時間還流した。溶液を溶媒留去して乾固させ、残留物をシュレンク管中でクロロホルムに溶かした。そのクロロホルム溶液にヘキサンをゆっくり拡散させることで（数日の期間をかけて）、橙−赤色の柱状晶を得た。溶液をシュレンク管から取り出し、得られた結晶を収率９０％で回収した。
【００９９】
結晶の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラム（ＣＤＣｌ３中）は、約４ｐ．ｐ．ｍ．（σ）にＣ５Ｈ５プロトンの鋭い１重線と約７ｐ．ｐ．ｍ．に芳香族プロトンの多重線を有する。塩化メチレン中での３１Ｐ−ＮＭＲスペクトラムは、２つのトリフェニルホスフィン配位子が等価であることを示す３９ｐｐｍの１本の鋭いシグナルを示した。このシグナルは、−８０〜３５℃の温度範囲内で変化しなかった。ＫＢｒペレットを用いてＩＲスペクトラムを得たところ、ν（Ｒｕ−Ｃｌ）２８１ｍ、２７６ｍｃｍ−１が得られた。ＦＤ法を用いる質量分析によって、化合物の分子式を確認した（Ｍ＋７２６）。
【０１００】
得られた錯体の構造を、エンラフ−ノニウス（Ｅｎｒａｆ−Ｎｏｎｉｕｓ）ＣＡＤ−４円形回折計を用いたＸ線回折データ収集によって決定した。データ収集条件は以下の通りであった。
2004506084.tif 000003
【０１０１】
以下の結晶データを得た：
2004506084.tif 000004
【０１０２】
実施例２：ＣＰＵの活性化
活性化を行うポリ（カーボネート−尿素）ウレタン（ＣＰＵ）を、５０℃に維持した蒸留水に挿入することで、活性化ＣＰＵポリマーを製造した。４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）を加え、混合物を４５分間撹拌した。そのあとポリマーを新鮮な蒸留水で５回洗浄した。
【０１０３】
（１，１−ジメチル−１−（３−メタクリルアミドプロピル）−１−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（ＳＰＥ）、硝酸、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリレート塩酸塩（ＡＭＰＡ）およびＲｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌの混合物をこのあとポリマーに加え、反応を窒素下にて３７℃で４時間継続した。さらに４５分後、ポリマーを新鮮な蒸留水で５回洗浄して、活性化ポリマーを得た。
【０１０４】
実施例３：ペプチド／細胞によるライニング
本発明の活性化ポリマーは、図２に図示し、後述の実施例５でさらに詳細に説明する流動循環系を用いて、ペプチドおよび細胞でライニングすることができる。この流動循環系は、ギジセアンドリアの報告（Ｇｕｉｄｉｃｅａｎｄｒｅａ， Ｊ Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ， ２０００， ３： ｐｐ． １６−２４）にも記載されている。この流動循環系には、流体貯留部および速度可変電磁気遠心ポンプ（Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃｕｓ）ＶＳＥＣＰがあり、そのポンプは可撓性プラスチック２および位置１に置かれた活性化ポリマーを通って系に流体をポンプ循環させる。この流体は、培養液およびペプチドを含み、この循環路を２時間ポンプ循環される。次に、この系を蒸留水で洗浄し、乾燥させる。
【０１０５】
細胞を活性化ポリマーの表面に注入し、３０分間静置してインキュベートして、ライニングされたポリマーを得た。
【０１０６】
実施例４：ヘパリンによるライニング
蒸留水１リットル中のヘパリン５〜１０ｇを、反応容器に加えた。１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．２５〜０．５０ｇを十分な量のＨＣｌとともに加えて、ｐＨを４．５〜６．５とした。反応を１時間続けた。
【０１０７】
実施例２に従って活性化しておいたＣＰＵ移植体の小片を、図２ならびに実施例３および５で示した流動循環系で、その溶液にて６時間潅流培養した。そして、最初に蒸留水で、次に０．０１Ｎ　ＮａＯＨ溶液で潅流を続けることで、ライニングされた移植体を洗浄した。
【０１０８】
最後に、移植体をＣＯ２インキュベータ中で乾燥し、滅菌した。
【０１０９】
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
本発明のライニングされたポリマーからなるプロテーゼについて、図２に図示した特別に設計された流動循環系に血液を循環させることでｉｎ ｖｉｔｒｏで調べる。このモデル系によって、身体の血液循環系内での血流動力学的な力が正確にシミュレーションされる。この系には、循環する血液を空気９５％およびＣＯ２５％で酸素処理するマキシマ（Ｍａｘｉｍａ）中空繊維酸素処理器（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）ＭＨＦＯを取り付けてある。ｐＨ、ｐＯ２およびｐＣＯ２を、自動血中ガス、電解質およびヘマトクリット分析装置（ＢＧ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて一定間隔でモニタリングし、補正をしかるべく行って生理的な値を一定とする。
【０１１０】
アナログ−デジタル変換器ＡＤＣを取付けた流動波形コンディショナーＦＷＣを前記流動系に用いて、所望の波形のパルスを発生させる。血液が移植体を通って流れる時に、各種の測定を行うことができる。具体的には、身体の血管で見られる剪断応力条件を正確に模倣するシステムを用いて、核医療画像処理システム（ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）ＮＭＩＰに連結されたガンマカメラ、δ−カメラを用いて、Ｉｎ標識内皮細胞のライニングされたポリマー上での保持を測定する。移植体１を収容する循環系の区間をカメラの上に置き、流動循環系の運転中に一定間隔で画像を取得する。別の実験で自然漏出現象を測定し、考慮に入れる。そうして、細胞付着を時間に関して計算することができる。
【０１１１】
播種細胞の代謝および増殖に対する脈動流の影響も測定する。それは、８時間にわたって流動循環系で潅流培養させておいたライニングされたポリマーの内皮細胞被覆を、流動循環系での試験を行っていない同じライニングされたポリマーの対照と比較することで行う。
【０１１２】
同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を、本発明のライニングされたポリマーを有する心臓弁および他のプロテーゼ、ならびに、カニューレおよび管などの非プロテーゼ外科用デバイスに対して想到することができる。
【０１１３】
実施例６：ライニングされたポリマーの分析
ライニングされたポリマー移植体材料を、ミオリンク（Ｍｙｏｌｉｎｋ；商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ ａｎｄ ＣａｒｄｉｏＴｅｃｈ Ｌｔｄ， Ｗｒｅｘｈａｍ ＵＫ）のサンプルを活性化することで調製した。自然移植体を実施例２に従って活性化し、活性化ポリマーを標準法に従って、ヘパリンまたはヘパリンとＲＧＤの混合物でライニングする。ＲＧＤは、細胞接着および付着を促進することが明らかになっている配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有するペプチドである。
【０１１４】
ライニングされたポリマーについて、図２に示した流動循環系を用いて試験を行った。以下の表（１）は、流動データをまとめたものである。各ライニングされたポリマーを、１０時間潅流培養してから、下記の方法を用いて調べた。
【０１１５】
表１：血流動力学的パラメータのまとめ。データは平均±標準偏差として示してある。
【表１】
2004506084.tif 000005
結合の評価：用いた方法の説明
１．Ｘ線光電子スペクトル測定（ＸＰＳ）
ＸＰＳ試験用のサンプル準備
ライニングされたポリマーの小片３個を、両面接着テープの小片を用いてホルダーに固定した。電気的に接地した９０％透過ニッケルメッシュ格子をサンプル表面の数ｍｍ上方に設置して、静電荷補償を援助した。
【０１１６】
狭ビーム光源ＸＰＳ：方法および装置
基底圧４×１０−７Ｐａ（３×１０−９）ｔｏｒｒで動作するサーフェース・サイエンス・インスツルメンツ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ； ＳＳＩ）Ｍ−プローブスペクトル装置（Ｍ−Ｐｒｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて、ＸＰＳ測定を行った。装置のエネルギースケールを、それぞれ８３．９８および９３２．６７ｅＶのＡｕ（４ｆ７／２）およびＣｕ（２ｐ３／２）ピークを用いて検量する。その装置では、透過は結合エネルギーに依存しない。それは、新鮮なＰＴＦＥ（テフロン）サンプルについての予側フッ素：炭素比２：１（６６．６原子％：３３．４原子％）を測定することで容易に確認される。
【０１１７】
Ｘ線スポット径１０００μｍ×４００μｍおよび約−１８０Ｗのパワーを用い、単色ＡｌＫαＸ線（１４８６．６ｅＶ）でサンプルを照射した。測定スペクトラムを１５０ｅＶの透過エネルギーで記録し、それから表面化学組成を求めた。さらに、特定の高解像度スペクトラムを、２５ｅＶ（解像１）または５０ｅＶ（解像２）の透過エネルギーで記録し、それからこれら元素の化学状態を確認した。
【０１１８】
サンプル表面の約１ｍｍ上方に配置した電気的に接地した９０％透過ニッケルメッシュスクリーンを用い、フラッドガン（ｆｌｏｏｄ ｇｕｎ）電流約０．１ｍＡで約４〜９ｅＶの電子ビームを用いて、電気絶縁試料についての電荷補償を行った。
【０１１９】
分析に用いた標準電子放出（ｔａｋｅ ｏｆｆ）角度は、３〜５ｎｍの範囲にある最大分析深さを与える３５°である。
【０１２０】
結合後のポリマーの分解の評価
２．環境走査型電子顕微鏡測定（ＥＳＥＭ）
ＥＳＥＭ顕微鏡写真を、移植体の長手方向に１．５ｍｍ間隔で撮った。デジタル顕微鏡写真について、移植体材料の割れ目、絡み合い、亀裂および表面擦過などのＥＳＣを示す特徴についての「ブラインド」検査を行った。
【０１２１】
３．ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）
９０１０型溶媒送液システムおよび９０６５型ポリクロム（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍ；登録商標）ＵＶダイオードアレーを有するバリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＤＳ−６５１ ＬＣスターシステム（ＬＣ Ｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、クロマトグラムを得た。使用した溶媒は、４０℃で流量１ｍＬ／分のテトラヒドロフランとした。孔径５００、１０４および１０５ÅのＰＬ−Ｇｅｌ（登録商標）（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの架橋ポリスチレンカラムを用いた。
【０１２２】
４．熱分析法
ａ）示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＤＳＣ−５０を用いてＤＳＣを行った。−１５０℃〜１５０℃の付属冷却装置を取付けて熱流束ＤＳＣ−５０を操作して、冷媒として液体窒素を用いて２０℃／分の加熱速度における各材料についての温度記録図を得た。サンプルと基準の間の温度差は、その２つの材料間の熱流量（炉からの）における差に比例していた。熱流束ＤＳＣ−５０は、一定速度の加熱、冷却および等温保持温度形式でのサンプルの発熱および吸熱反応ならびに熱容量を測定する。これは、熱変化の直接的尺度を提供する。それは、物理的変化、典型的には溶融、相転移およびガラス転移によって生じる熱容量変化から生じるものである。サンプル（５０ｍｇ）を密封したアルミニウムサンプル皿に入れた。生分解したサンプルの屈熱性変移（ｔｈｅｒｍｏ−ｔｒｏｐｉｃ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）に関連する温度およびエンタルピー、特にセル定数の正確さを高めるため、全てのＤＳＣ実験は、インジウム標準を用いて較正した熱量計で行った。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、熱容量におけるステップ的上昇の中間点（１／２Δｃｐ）とした。熱容量は、標準サファイア（Ａｌ２Ｏ３）サンプルについて調べることで較正した。
【０１２３】
ｂ）熱機械分析（ＴＭＡ）
ＴＭＡは、島津ＴＭＡ−５０を用いて行った。ＴＭＡシステムを−１２０℃〜２８０℃の温度範囲で操作し、５０ｇ負荷下および直線的加熱下での生分解したサンプルの変形を測定した。サンプル（５０ｍｇ）を密封アルミニウムサンプル皿に入れた。
【０１２４】
ｃ）動的機械熱分析（ＤＭＡ）
ＤＭＡは、レオメトリック・サイエンティフィック（Ｒｈｅｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ＤＭＴＡ ＩＩＩを用いて行った。ＤＭＡは、温度範囲−１５０℃〜１５０℃にわたっての温度、周波数および応力の関数として、機械的挙動を定量的に測定するものである。それは、特に動的機械的環境下でのｔａｎΔ値（ダンピング）において顕著な最大値を生じるガラス転移温度（Ｔｇ）を測定する上で感度の高い方法である。ＤＭＴＡ ＩＩＩによって、周波数１ＨｚおよびＦ＝０．１Ｎで１５ｍ〜１５ｍの歪み範囲における曲げ、剪断、引っ張りおよび圧縮に関するデータを得た。サンプル（５０ｍｇ）を密封アルミニウムサンプル皿に入れた。
【０１２５】
５．結合後品質管理
寸法特性：すなわち内径；壁厚および肉眼検査、に対する影響（もしあれば）の測定は、ＩＳＯ標準操作手順に従って行った。移植体の内径は、較正されたテーパ型ゲージを用いて測定した。その較正は、国際標準機構認定基準：８．５−ＩＳＯ／ＤＳ７１９８／４０／に従い行った。移植体の壁厚の測定は定荷重ゲージを用いて、国際標準機構認定基準８．７−ＩＳＯ／ＤＳ７１９８に従い行い、肉眼評価は白色光背後照明を用いて、国際標準機構認定基準８．１−ＩＳＯ／ＤＳ７１９８に従い行った。
【０１２６】
半径方向引張り強度（ＲＴＳ）：インストロン（Ｉｎｓｔｒｏｎ）張力試験機１０１１で、標準操作手順に従い半径方向引張り試験を行った。試験片は１２±０．５ｍｍとし、スプリットピンアセンブリーにネジ込み、ＡＳＴＭ １７０８法および国際標準機構認定基準ＩＳＯ ５２７を用いて、ジョー分離が５０ｍｍ／分であるインストロン装置に装着した。展伸およびピーク荷重を記録し、破壊時荷重を以下の式から計算した。
単位長さ当たりの荷重＝最大荷重／２×サンプル長さ。
【０１２７】
これによって、応力−歪み曲線を得た。
【０１２８】
結果
ＸＰＳによるヘパリン結合ＣＰＵの内表面および外表面の特性決定
表２：表面化学組成（数値は原子％である）
【表２】
2004506084.tif 000006
表３：炭素１ｓスペクトラムのまとめ（数値は総炭素濃度の％単位である）
【表３】
2004506084.tif 000007
表４：窒素スペクトラムのまとめ（数値は総窒素濃度の％単位である）
【表４】
2004506084.tif 000008
表５：硫黄スペクトラムのまとめ（数値は総硫黄濃度の％単位である）
【表５】
2004506084.tif 000009
表面組成
ヘパリンコートミオリンク移植体のＸＰＳ分析によって、下記の化学種を確認する。
【０１２９】
１．ヘパリン：ヘパリン濃度を、ＸＰＳによって直接測定することができる。
【０１３０】
２．４級窒素：恐らくスペーサー基から発生。
【０１３１】
３．カーバメート：ポリ（カーボネート−尿素）ウレタンから発生。
【０１３２】
４．カーボネート：ポリ（カーボネート−尿素）ウレタンから発生。
【０１３３】
５．ケイ素：コーティング前のミオリンク移植体製造の押出段階時に潤滑剤として使用したシリコーン（ＰＤＭＳ）から発生。
【０１３４】
表６：ヘパリン表面濃度
【表６】
2004506084.tif 000010
【０１３５】
ヘパリン表面濃度は、純粋なヘパリンサンプルを基準として、コート表面上の硫黄パーセントによって定量する。
【０１３６】
内表面
表１１の結果は、ヘパリン表面濃度が表面の４％〜１０％の範囲であることを示している。
【０１３７】
外表面
表１１の結果は、ヘパリン表面濃度が表面の２％未満〜６％の範囲であることを示している。
【０１３８】
ヘパリン生物活性および硫黄結合エネルギー
ヘパリン中の硫黄の２つの化学状態を、Ｘ線モノクロメーターを有する装置を用いるＸＰＳで、４種類のスピン分裂状態に解像することができる。Ｓ２ｐ３／２状態の結合エネルギーについては、コーティングの生物活性に影響を与えるヘパリンのイオン−共有結合の程度に関して以前に研究されており、共有結合の方がイオン結合より生物活性が高い。検出した硫黄の状態は以下の通りであった。
表７：硫黄スペクトラムのまとめ
【表７】
2004506084.tif 000011
【０１３９】
これらの比は、ミオリンク移植体上のスペーサー基に結合したヘパリンが共有結合していることを示している。その結合についてのさらなる別の証拠を、基準データと比較したヘパリンスルホンアミド基窒素から確認することができる。
【０１４０】
窒素結合エネルギー
ヘパリン鎖上のスルホンアミド基における窒素のＸＰＳピーク結合エネルギーから、ヘパリンのスペーサー基への結合の性質に関する情報を得ることができる。結合エネルギーの比較を表８に示してある。
【０１４１】
表８：ヘパリンスルホンアミド窒素スペクトラムのまとめ
【表８】
2004506084.tif 000012
【０１４２】
ミオリンクコーティングに対するヘパリンの結合エネルギーは、好ましい共有結合コーティングに相対的に近く、（非活性）イオン結合コーティングからは遠い。ミオリンクへのヘパリンの結合エネルギー値は、それの生物活性（ヘパリン１単位当たり）が、以前に研究されている共有結合ヘパリンのものより高いことを示している可能性がある。
【０１４３】
結果のまとめ
・ヘパリンコートミオリンク移植体の内管腔における全分析箇所で、ヘパリンが検出された。
【０１４４】
・ヘパリン分布は分析箇所間で均一であった。ヘパリン濃度は、内管腔で４〜１０％の範囲であり、その値を以前に分析されている他のコーティングにおけるヘパリン濃度３０％と比較することができる。濃度がやや低いのは、生理的ｉｎ ｖｉｔｒｏ循環系で潅流培養されたサンプルによるものである。
【０１４５】
・コーティング処理後のＣＰＵ構造に、ＸＰＳによって分解は検出できなかった。
【０１４６】
・単位ヘパリン当たりのヘパリン生物活性は、以前に研究された共有結合ヘパリンより良好ではないとしても、それと同等であると期待されるものと考えられる。
【０１４７】
・中間体製造工程によって、最終ヘパリンコート製品に低レベルで残留するシリコーン（ＰＤＭＳ）が生じた。これらのサンプルにおいて、結合方法自体から存在するルテニウムなどの重金属は、ＸＰＳによって検出できなかった。
【０１４８】
ヘパリン／ＲＧＤコートＣＰＵ材料のＸＰＳによる特性決定
表９：表面化学組成（数値は原子％である）
【表９】
2004506084.tif 000013
表１０：炭素１ｓスペクトラムのまとめ（数値は総炭素濃度の％単位である）
【表１０】
2004506084.tif 000014
表１１：窒素スペクトラムのまとめ（数値は総窒素濃度の％単位である）
【表１１】
2004506084.tif 000015
表１２：硫黄スペクトラムのまとめ（数値は総硫黄濃度の％単位である）
【表１２】
2004506084.tif 000016
【０１４９】
ヘパリンＲＧＤ移植体の内管腔におけるヘパリンの存在は、下記の要素によって確認される。
【０１５０】
１．ヘパリンおよび、ＲＧＤなどの存在する他の成分から予想される窒素、炭素および酸素とともに、全ての分析箇所で硫黄が検出される。
【０１５１】
２．全ての分析箇所で２種類の状態、すなわちＮＳＯ３およびＯＳＯ３で硫黄が存在する。ＸＰＳによって検出されるＯＳＯ３の一部は、スルホネートなどの他のＯＳＯ３含有化学種から発生する可能性があるが、ＮＳＯ３シグナルは専ら表面にグラフトされたヘパリンから発生するものである。
【０１５２】
３．窒素は、ヘパリンコートＲＧＤ表面で４種類の状態で検出される。その４種類の状態のうちの３種類は、以前に分析したヘパリンコート表面でも認められた（上記の分析参照）。
【０１５３】
４．Ｃ−Ｏ状態と、かなり少ないがＯ−Ｃ−Ｏ状態の両方の炭素が、分析した全ての表面で検出された。
【０１５４】
全４種類の特徴は、ヘパリン−ＲＧＤコート移植体のサンプル上で分析した全ての内管腔表面にヘパリンが存在することを裏付けるものである。得られたスペクトラムから、ポリマー表面、この場合オリンクがポリマー表面が結合形成工程中に変性を受けるとは思われないことは明瞭である。
【０１５５】
ＲＧＤアミノ酸配列の存在が、結合エネルギー３９９ｅＶでこのサンプルにおいて検出される窒素の新たな状態によるＸＰＳスペクトラムに示される。それは、ヘパリンおよびミオリンク構造のいずれにも存在しない、ＲＧＤの２級アミン状態であると提案される。
【０１５６】
ＲＧＤ濃度は高く、各箇所でヘパリン濃度と直接相関している。
【０１５７】
結合後のポリマーの分解の評価
ＥＳＥＭ分析
低倍率および高倍率での、ＲＧＤおよびヘパリンでコートされた移植体のＥＳＥＭ分析により、結合後分解の証拠がないことが示されている（ａ：倍率５５倍、ｂ：倍率２２０倍、ｃ：倍率３５００倍で測定した図３ａ、ｂ、ｃ）。これは、ＥＳＣの一般的な特性である孔食やエッチングが肉眼で観察されなかったことで確認された。
【０１５８】
ＤＳＣ
分解を示すガラス転移温度や吸熱における変化は示されなかった。
【０１５９】
ＴＭＡ
図４ａ、ｂは、自然ＣＰＵと同様に、−１００〜５０℃にピークがないことで明らかなように、分解がないことを示した。以前のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ分解試験で、カーボネート結合が分解した場合には、多数の大きな且つ急峻なピークがその領域で認められることが明らかになっている。
【０１６０】
ＤＭＡ
図５ａ、ｂ、ｃ、ｄは上記のように、βピークが存在しないことで、分解を示す証拠がないことを示した。実際に、ＣＰＵ材料がヘパリンまたはヘパリンおよびＲＧＤによって架橋されるのに従い、それは実際にやや剛性を増し、固有エネルギーの不一致を低減して内部構造を安定化し、その結果分解しにくくする。
【０１６１】
品質管理
品質管理では、代用血管（ポリマー）の内径が５ｍｍ±０．１ｍｍに留まり、壁厚が０．９ｍｍ±０．０５ｍｍに留まりまた目視にて欠陥がないことからその内径が変化しておらず、寸法および外観が通常のバッチ合格限度内（ｎ＝６）に留まることが示された。
【０１６２】
インストロン引張り試験機１０１１で標準操作手順に従い、結合後ポリマー移植体に関して半径方向引張り強度の評価を行ったところ、１．４８Ｎ／ｍｍに留まったことから、サンプル（ｎ＝６）がバッチ許容範囲（１Ｎ／ｍｍより大きいこと）内に留まることが示された。
【０１６３】
ＧＰＣ分析
ＧＰＣ分析では、対照（ｍｗ９８５００、ｍｎ４５３００、ｄ２．１７）および被験サンプル（ｍｗ１０４０００、ｍｎ４１６００、ｄ２．４９５）の間に有意差がないことが示された。
【０１６４】
実施例７：ｉｎ ｖｉｖｏ試験
本発明のライニングされたポリマーからなるプロテーゼについてさらに、それを公知の技術によって、例えばバイパスその他の手術を行うことによって外科被験体の中に挿入し、そしてそのパフォーマンスをモニタリングし、適宜に所定の期間後にそれを摘出および分析することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでテストすることができる。被験体は最初の場合にはマウスその他のヒト以外の哺乳動物被験体とする場合が多いが、ヒト患者での臨床試験も想到することができる。
【０１６５】
同様のｉｎ ｖｉｖｏ試験が、本発明のライニングされたポリマーを有する心臓弁および他のプロテーゼ、ならびにカニューレおよび管などの非プロテーゼ外科用デバイスについて想到され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
錯体Ｒｕ（シクロペンタジエニル）（ＰＰｈ３）２Ｃｌの構造を表す図である。
【図２】
活性化ポリマーのライニングおよび本発明のライニングされたポリマーの試験で使用される流動循環路を表す図である。
【図３】
ＲＧＤおよびヘパリンでコーティングされた移植体のＥＳＥＭ分析を示す図である。
【図４】
ヘパリンならびにヘパリン／ＲＧＤコーティングした移植体のＴＭＡ分析を示す図である。
【図５】
ヘパリン／ＲＧＤコーティングした移植体のＤＭＡ分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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