(57)【要約】大豆モラセス由来の大豆イソフラボン濃縮物を、アセトンと水の混合物で抽出し、抽出液から不溶解固体を除去し、抽出液を冷却することによって、大豆サポニンをそこから沈降させ、沈降した大豆サポニンを抽出液から分離することを含む、大豆サポニンの回収方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆モラセス由来の大豆イソフラボン濃縮物をアセトンと水の混合物で抽出し、
上記抽出液から不溶解固体を除去し、
上記抽出液を冷却することによって大豆サポニンをそこから沈降させ、
沈降した大豆サポニンを上記抽出液から分離することを特徴とする大豆サポニンの回収方法。
【請求項２】
前記大豆イソフラボン濃縮物の抽出段階を高温で行なうことを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項３】
前記大豆イソフラボン濃縮物の抽出段階をアセトン還流下で行なうことを特徴とする請求項２に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項４】
前記冷却段階を約１０℃未満の温度で行なうことを特徴とする請求項３に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項５】
前期アセトンと水の混合物は、およそ、１部の水に対して、２．５ないし５部のアセトンを含むことを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項６】
前記混合物のｐＨは５．０より高いことを特徴とする請求項５に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項７】
前記混合物のｐＨは約６．５より高いことを特徴とする請求項６に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項８】
前記方法は、サポニンが除去された抽出液からアセトンを揮散させ、揮散した抽出液を冷却し、そこからイソフラボンを回収する追加段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項９】
前記大豆イソフラボン濃縮物は、大豆モラセスを典型的には高温で酸性とし、沈降物を回収することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１０】
前記冷却段階の温度が約−５〜５℃であることを特徴とする請求項４に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１１】
前記混合物は、１部の水に対して少なくとも２．５部のアセトンを含むことを特徴とする請求項５に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１２】
高温とは、常圧における約５６℃から、高圧における１５０℃までであることを特徴とする請求項２に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１３】
前記大豆サポニンは、少なくとも７０％の純度で回収されることを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１４】
揮散した抽出液を最初にヘキサンで抽出することを特徴とする請求項８に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１５】
不溶解固体を、アセトンと水の混合物で抽出し、追加の抽出液を得、上記追加の抽出液を冷却して、追加の大豆サポニンを沈降させ、これを抽出液から分離することを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１６】
前記方法は、逆流抽出システムを使用して行なうことを特徴とする請求項１５に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１７】
抽出液を得るために逆流抽出器を用いてアセトンと水の混合物で大豆モラセス由来の大豆イソフラボン濃縮物を抽出し、この抽出液を冷却することによって大豆サポニンをそこから沈降させ、この大豆サポニンを上記抽出液から分離することを特徴とする大豆サポニンの回収方法。
【請求項１８】
沈降した大豆サポニンをさらに再結晶により精製することを特徴とする請求項１に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項１９】
沈降した大豆サポニンは、水とアルコールの混合物から再結晶することを特徴とする請求項１８に記載の大豆サポニンの回収方法。
【請求項２０】
前記アルコールはエタノールであることを特徴とする請求項１９に記載の大豆サポニンの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
サポニンは、植物に広範に分布している配糖体である。各サポニンは、「サポゲニン」アグリコンに結合した１つ以上の糖部分からなる。糖部分は、グルコース、ガラクトース、またはペントースもしくはメチルペントースであり得、一方、サポゲニンはトリテルペンまたはステロイドであり得る。
【０００２】
サポニンは洗浄特性を示し、水中油滴型エマルションを形成し、水に溶かすと多量の泡状物または石鹸泡を生じる。「サポニン」という名称は、「石鹸」にあたるラテン語の「ｓａｐｏ」に由来する。サポニン含有植物、特にシャボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｌｉｓ）、カスミソウ（Ｃｈｌｏｒｏｇａｌｕｍ  ｐｏｍｅｒｉｄｉａｎｕｍ）、セッケンボク（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）、およびムクロジ（Ｓａｐｉｎｄｕｓ  ｍｕｋｕｒｏｓｓｉ）は、何世紀もの間、石鹸として使用されてきている。
【０００３】
サポニンは、ソフトドリンク、冷凍炭酸飲料、カクテル・ミックス、および消火器の起泡剤として使用されている。その洗浄特性により、シャンプー、洗顔料、および種々の美容組成物に使用されている。サポニンには、抗微生物特性および抗真菌特性、並びに、栄養補給利点および薬理的利点もある。
【０００４】
サポニンを乾燥植物物質から抽出および単離する伝統的な方法は、種々のアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール）または水−アルコール混合物を用いた抽出からなる。非極性有機溶媒（すなわち石油エーテルまたはヘキサン）を使用した脱脂段階は、抽出段階前に実施しても、まさに抽出時に実施してもよい。その後、大量のアセトンまたはエーテルの導入により粗サポニンを沈降させる。Ｋ．ＨｏｓｔｅｔｔｍａｎｎおよびＡ．Ｍａｒｓｔｏｎ、サポニン、ケンブリッジ大学出版（１９９５）、１４３〜１４５頁。
【０００５】
透析、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの、タンパク質精製に使用する困難な方法が、サポニンのさらなる精製に使用されることが多い。Ｐ．Ａ．Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｓ．Ｚ．Ｄｚｉｅｄｚｉｃ、およびＭ．Ｗ．Ｋｅａｒｓｌｅｙ、「サポゲニンの高速液体クロマトグラフィーによる、大豆およびいくつかの市販の大豆製品のサポニン含量」、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．１９８６、３７、６９４〜６９８。
【０００６】
大豆種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）は、約０．５重量％のサポニンを含む。Ｐ．Ａ．Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｓ．Ｚ．Ｄｚｉｅｄｚｉｃ、およびＭ．Ｗ．Ｋｅａｒｓｌｅｙ、「サポゲニンの高速液体クロマトグラフィーによる、大豆および大豆市販大豆製品のサポニン含量」Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ、１９８６、３７、６９４〜６９８。２０世紀初期以来、大豆サポニンは調査対象であった。これらの化合物は、種々の糖およびアセチル部分の付いたトリテルペノイド骨格からなる。現在の共通した見解は、大豆サポゲノールＡ、ＢおよびＥは真のアグリコンであるが、大豆サポゲノールＣ、ＤおよびＥは、その単離工程中に起こる加水分解の人工物であるというものである。対応するグリコシドは、それぞれ、いわゆる「Ａ群サポニン」、「Ｂ群サポニン」および「Ｅ群サポニン」である。
【０００７】
大豆サポニンは、抗変異原性特性を示し、このために癌予防に有望な薬剤である。Ｍ．Ｊ．Ｐｌｅｗａら、「単一細胞電気泳動およびフローサイトメトリーを使用して、市販大豆製品から抗変異原を同定」、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４０２（１９９８）、２１１〜２１８およびＬｉ  Ｂａｉｘｉａｎｇ、「大豆サポニンの抗変異機構に関する研究」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、（２０００）、２６４〜２６５。さらに、Ｂ群大豆サポニンは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のインビトロでの複製に対して顕著な抑制作用を示している。Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａら、Ｎ．Ａｉｄｓ、３、１０（１９８９）、６６５〜６６８。大豆サポニンの化学構造は、既知の抗ウイルス剤であるグリシルリチン化合物のものと非常に類似しており、大豆サポニンは、抗ウイルス医薬化合物合成の構築ブロックとして有望である。
【０００８】
非常に大量の大豆を培養し加工するにも関わらず、現時点では、大豆サポニンは、単離および精製が困難なため、商業上、主要な商品ではない。
【０００９】
ヘキサン脱脂大豆粕を、エタノールと水の混合物（典型的には７５重量％エタノール）からなる溶媒で高温で抽出することにより広く製造されている主な商品は、大豆タンパク質濃縮物および大豆タンパク質単離物である。この抽出の目的は、レシチン、糖、および複合炭水化物をタンパク質から分離することである。エタノールを分画蒸留により回収すると、糖（主にスクロース、ラフィノース、およびスタキオース）および他の炭水化物の水溶液（イソフラボンおよびサポニンも含む）が残る。この物質は、この業界では「大豆可溶性物質」または「大豆モラセス」として知られている。
【００１０】
大豆モラセスを高温で、典型的にはｐＨ２．５〜４．５へと酸性にすることにより、イソフラボンおよびサポニンに富んだ固体が沈降する。これらの固体を、遠心分離またはろ過により取り出し、その後、乾燥させると、適切な有機溶媒（すなわちメタノール、エタノール、アセトン等）での抽出により大豆イソフラボンを回収するための市販供給原料として役立つ。米国特許第５，９１９，９２１号。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明の主題は、大豆由来の物質から高純度の大豆サポニンを回収し、一方で、副産物である大豆イソフラボンの経済的な回収手段も提供するための費用効率の高い方法として、種々の濃度および温度のアセトン／水混合物を使用する。
【００１２】
サポニンは特徴的には、アセトンに不溶性であるが、アセトンと水の混合物では、高温でサポニンを溶かすことができる。この目的におけるアセトンと水の比は、およそ、１部の水に対し、２．５〜５．０部のアセトンの範囲であり得、所望により重量基準にして約４：１である。かなりアセトンの濃度が高い場合、サポニンの抽出効率は不必要に減少し、かなり水の濃度が高い場合、回収されるサポニンの品質は低下することがあり、望ましくない混入物質（主にオリゴ糖）が溶液中に生じ、回収されるサポニンの純度は低下する。従って、より高濃度のアセトンまたは水を使用できるが、効率的ではないかもしれない。
【００１３】
サポニンを抽出するために、供給原料を最適アセトン／水混合物中でアセトン還流温度（常圧で５６℃、または高圧でより高い温度）で消化し、サポニンを溶液中に移行させる。混合物のｐＨは、サポニンが溶液中に移行するに十分な程高いものであるべきである。この目的では、ｐＨは少なくとも５．０、好ましくは６．５またはそれ以上を使用することが望ましい。不溶解固体は、遠心分離、ろ過または静置し、５０℃より高い温度に維持しつつデカントすることにより除去する。その後、溶けたサポニンを含む濃縮液またはろ液を１０℃未満の温度まで（好ましくは−５〜５℃）冷却すると、溶けた大豆サポニンが沈降し、遠心分離、ろ過または静置、そしてデカントにより除去できる。従来技術で大豆サポニンからの分離が困難であることが判明している大豆イソフラボンは溶液中に留まり、濃縮液、ろ液、またはデカントした上清液中に取り出され、これから次に分画蒸留によりアセトンを除去し、得られた水性瓶画分を冷やし、イソフラボンを不溶性として、ろ過、遠心分離、または静置およびデカントにより回収できるようにすることにより回収できる。
【００１４】
供給原料とアセトン／水混合物の比率は変更できる。供給原料とアセトン／水混合物の容量比約１：１０を使用した、イソフラボンの抽出効率は、典型的には非常に高く、９０％を超えることが多い。しかしながら、これらのパラメータを用いてのサポニン抽出効率はかなり低く（典型的には２０〜４０％）。しかしながら、サポニンの純度は極めて高い。これらの条件下での効率的なサポニン回収は、最適アセトン／水の溶媒を用いた２回以上の連続的抽出、あるいは、当業者には明白な逆流抽出法に再度かけることが必要であろう。
【００１５】
冷やした湿潤アセトン抽出液のろ過、遠心分離または静置そしてデカントにより回収したサポニンの純度は、典型的には７０％を超えている。それらを適切な溶媒に溶かし、ろ過し、結晶化することにより容易にさらに精製できる。我々は、７０％エタノール／３０％水からなる溶媒を、１重量部のサポニンに対して１０〜１５重量部の溶媒という比で使用して、素晴らしい結果を得たが、当業者は、他のアルコールと水の混合物も効果的であることを認識しているだろう。混合物を７０℃またはそれ以上に加熱し、サポニンを溶かし、この温度でろ過し、不溶性不純物を除去し、２５℃以下までゆっくりと冷却すると、９５％を超える純度のサポニンが結晶化し、回収される。クロマトグラフィー技法に再度かけることなく、この純度の大豆サポニンを得られることは、これまで報告されていない。
【００１６】
実施例１
大豆モラセス由来の市販の大豆イソフラボン濃縮物１，０００ｇ（以下の組成：５．０％イソフラボン、１０．１６％サポニン、３５％全炭水化物、７％レシチン、２％脂肪、３３％タンパク質、５％灰、５％水分：を持つ粉末である、インディアナ州フォートウェーン所在セントラル・ソヤ・カンパニーの「プレバステイン（Ｐｒｅｖａｓｔｅｉｎ）」）を、激しく攪拌している９，４５０ｇのアセトンと２，３５０ｇの水の混合物に加えた。混合物をアセトン還流温度（５６℃）まで９０分間加熱し、その後、５０℃を超過した温度を維持しつつ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗でろ過した。
【００１７】
非濁琥珀色液体のろ液を５℃まで冷やすと、オフホワイトの沈降物が溶液から析出した。これらの固体を、１０℃未満の温度を維持しつつ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗で真空ろ過することにより取り出した。
【００１８】
ろ過ケークを最小量の純アセトンで洗浄し、真空で５０℃で乾燥すると、ＨＰＬＣによると８６％を超過した純度のアイボリー色の固体２４．０ｇ（すなわち全サポニン含量）が得られ、これは回収率２０．３％に相当する。分析により、この物質に含まれるイソフラボンの量は、０．２重量％を超過しないことも判明した。この段階の冷ろ液のＨＰＬＣ分析により、溶解サポニンの濃度は僅か０．０６重量％であることが判明した。
【００１９】
サポニンの単離後、ろ液に含まれるアセトンを、常圧で分画蒸留により揮散し、再使用するために回収した。その後、揮散したろ液を、６０℃で３０分間、激しく攪拌しながら、５００ｇのヘキサンで抽出して、レシチンおよび脂肪を除去した。攪拌を止めて、混合物を層分離し；上（有機）層を除去し、下（水）層を１０℃未満まで冷やし、ここで大豆イソフラボンが沈降し、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗で真空ろ過により取り出した。ろ過ケークを真空で５０℃で乾燥し、ＨＰＬＣによると純度７２％の大豆イソフラボン５３．５ｇ（すなわち全イソフラボン含量）が得られ、これは供給原料に含まれるイソフラボンの７７％を回収することに相当する。
【００２０】
「使用済固体」（すなわち、最初に抽出し、ろ過により熱アセトン／水混合物から取り出した供給原料）を、激しく攪拌している９，４５０ｇのアセトンと２，３５０ｇの水の混合物に加えた。混合物をアセトン還流温度（５６℃）まで９０分間加熱し、その後、５０℃を超過する温度を維持しつつＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗でろ過した。
【００２１】
非濁琥珀色液体のろ液を５℃まで冷やすと、オフホワイトの沈降物が溶液から析出した。これらの固体を、１０℃未満の温度を維持しつつ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗で真空ろ過することにより取り出した。
【００２２】
ろ過ケークを最小量の純アセトンで洗浄し、真空で５０℃で乾燥すると、ＨＰＬＣによると純度８８％のアイボリー色の固体２２．８ｇ（すなわち全サポニン含量）が得られ、これは、初回抽出後に留まったサポニンのさらに２９．４％が回収され、すなわち、２回の連続抽出後に出発物質に最初に存在したサポニンの計４６％が回収されたことに相当する。ＨＰＬＣ分析により、この物質に含まれるイソフラボンの量は、０．０８重量％を超過しないことが判明した。ここでも、この段階の冷ろ液のＨＰＬＣ分析により、溶解サポニン濃度は僅か０．０６重量％であることが判明した。
【００２３】
実施例２
大豆モラセス由来の市販の大豆イソフラボン濃縮物１，０００ｇ（以下の組成：９．０％イソフラボン、８．１％サポニン、６％可溶性食物繊維、６％非複合糖、６％オリゴ糖、７％レシチン、１％脂肪、１８％タンパク質、４％灰、８％水分をもつ粉末である、イスラエルのアシドード所在ソルバー・プラント・エクストラクツの「ソルゲン（Ｓｏｌｇｅｎ）１０」）を、激しく攪拌している９，４５０ｇのアセトンと２，３５０ｇの水の混合物に加えた。このスラリーのｐＨは３．１であり、サポニンを溶液に移行するにはあまりにも酸性が強いので、９４ｇの５０重量％の水酸化ナトリウム水溶液をゆっくりと加えて、ｐＨを６．５にした。この混合物をアセトン還流温度（５６℃）まで９０分間加熱し、その後、５０℃以上の温度を維持しつつ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗でろ過した。
【００２４】
非濁琥珀色液体のろ液を５℃まで冷やすと、オフホワイトの沈降物が溶液から析出した。これらの固体を、１０℃未満の温度を維持しつつ、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ４ろ紙を通してブフナー漏斗で真空ろ過することにより取り出した。ろ過ケークを、最小量の冷アセトンで洗浄し、真空で５０℃で乾燥すると、ＨＰＬＣによると純度７１％の明黄褐色固体４４ｇ（すなわち全サポニン含量）（供給原料の容積の４．４％、これは含有サポニンの回収％に相当する）が得られ、これは３８．５％の回収率に相当する。この物質のイソフラボン含量は、０．４重量％を超えなかった。ＨＰＬＣによるこの冷ろ液の分析により、溶解したサポニン含量は０．１４％であることが判明し、これは１４．９ｇ含有に相当する。
【００２５】
サポニン単離後、ろ液に含まれるアセトンを分画蒸留により常圧で揮散させ、再使用するために回収した。その後、揮散したろ液を、５００ｇのヘキサンを用いて、６０℃で３０分間激しく攪拌しながら抽出し、レシチンおよび脂肪を除去した。攪拌を止めて、混合物を層分離し；上（有機）層を除去し、１，０００ｍｌの水を下（水）層に加えて、その粘度を低下させた。その後、この溶液を１０℃未満に冷やすと、大豆イソフラボンが沈降した。混合物を一晩放置した後、上清液をデカントし、沈降物を５０℃で真空で乾燥すると、ＨＰＬＣによると純度４４％の大豆イソフラボン１３４ｇ（すなわち全イソフラボン含量）が得られ、これは、供給原料に含まれるイソフラボンの６６％が回収されたことに相当する。
【００２６】
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載したが、特許請求の範囲に定義したような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、数々の修飾が可能である。
【国際公開パンフレット】
2004517875.tif 000002
2004517875.tif 000003
2004517875.tif 000004
2004517875.tif 000005
2004517875.tif 000006
2004517875.tif 000007
2004517875.tif 000008
2004517875.tif 000009
2004517875.tif 000010
2004517875.tif 000011
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517875.tif 000012
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517875.tif 000013
【国際調査報告】
2004517875.tif 000014
2004517875.tif 000015
2004517875.tif 000016