(57)【要約】本発明のある態様は、例えば固相粒子上に固定された末端サブユニットにサブユニットを付加させることにより形成するなど、固体支持体上でオリゴ糖を効率よく合成するための装置に関連する。ある実施態様では、本発明の装置は、例えば本願明細書に記載のように、オリゴ糖合成のコンビナトリアルな方法に用いられる。
2004507467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖の自動化固相合成用の装置であって、
１つ以上の不溶性樹脂ビーズを収容する反応容器と、
糖供与体溶液を収容する１つ以上の供与体容器と、
活性化試薬溶液を収容する１つ以上の活性化剤容器と、
デブロッキング試薬溶液を収容する１つ以上のデブロッキング容器と、
溶媒を収容する１つ以上の溶媒容器と、
前記糖供与体溶液と、前記活性化試薬溶液と、前記デブロッキング試薬溶液と、前記溶媒とを輸送することができる溶液輸送システムと、
前記溶液輸送システムを制御するコンピュータと、
を含む装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の不溶性樹脂ビーズが、有機リンカーを介して前記樹脂ビーズに連結されるグリコシル受容体を有する装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置で、さらに反応容器の温度を調節するための温度制御ユニットを含む装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置で、前記温度制御ユニットがコンピュータによって制御される装置。
【請求項５】
請求項３に記載の装置で、前記温度制御ユニットが反応容器の内部温度を測定する装置。
【請求項６】
請求項３に記載の装置で、前記反応容器が２つのキャビティを形成する二重壁構造であり、第１のキャビティはオリゴ糖の合成を収容し、第２のキャビティは前記温度制御ユニットの冷却剤を収容する、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置で、前記反応容器の二重壁構造がガラスからなる装置。
【請求項８】
請求項３に記載の装置で、前記温度制御ユニットが前記反応容器の温度を−８０Ｃ乃至＋６０Ｃに維持することができる装置。
【請求項９】
請求項３に記載の装置で、前記温度制御ユニットが前記反応容器の温度を−２５Ｃ乃至＋４０Ｃに維持することができる装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の供与体容器がグリコシルトリクロロアセトイミダートを含む溶液を収容する装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の供与体容器がリン酸グリコシルを含む溶液を収容する装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の活性化剤容器にルイス酸を含む溶液を収容する装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置で、前記１つ以上の活性化剤容器にシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容する装置。
【請求項１４】
請求項１２に記載の装置で、前記１つ以上の活性化剤容器にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容する装置。
【請求項１５】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上のデブロッキング容器にナトリウムメトキシドを含む溶液を収容する装置。
【請求項１６】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上のデブロッキング容器にヒドラジンを含む溶液を収容する装置。
【請求項１７】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の溶媒容器にジクロロメタンを含む溶液を収容する装置。
【請求項１８】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の溶媒容器にテトラヒドロフランを収容する装置。
【請求項１９】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の溶媒容器にメタノールを収容する装置。
【請求項２０】
請求項２に記載の装置で、前記１つ以上の供与体容器がグリコシルトリクロロアセトイミダートを含む溶液を収容し、前記１つ以上の活性化剤容器がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容し、前記１つ以上のデブロッキング容器がナトリウムメトキシドを含む溶液を収容し、第１の溶媒容器がジクロロメタンを収容し、第２の溶媒容器がメタノールを収容し、第３の溶媒容器がテトラヒドロフランを収容する装置。
【請求項２１】
請求項２に記載の装置で、前記１つ以上の供与体容器がリン酸グリコシルを含む溶液を収容し、前記１つ以上の活性化剤容器がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容し、前記１つ以上のデブロッキング容器がナトリウムメトキシドを含む溶液を収容し、第１の溶媒容器がジクロロメタンを収容し、第２の溶媒容器がメタノールを収容し、第３の溶媒容器がテトラヒドロフランを収容する装置。
【請求項２２】
請求項１に記載の装置で、さらにブロッキング試薬溶液を収容する１つ以上のブロッキング容器を含む装置。
【請求項２３】
請求項２２に記載の装置で、前記１つ以上のブロッキング容器がベンジルトリクロロアセトイミダートを含む溶液を収容する装置。
【請求項２４】
請求項２２に記載の装置で、前記１つ以上のブロッキング容器がカルボン酸を含む溶液を収容する装置。
【請求項２５】
請求項２４に記載の装置で、前記カルボン酸がレブリン酸である装置。
【請求項２６】
請求項２２に記載の装置で、さらに前記反応容器の温度を調節するための温度制御ユニットを含み、前記１つ以上の不溶性樹脂ビーズが有機リンカーを介して樹脂ビーズに連結されるグリコシル受容体を有する、装置。
【請求項２７】
請求項２６に記載の装置で、前記１つ以上のブロッキング容器がレブリン酸を含む溶液を収容し、前記１つ以上の供与体容器がリン酸グリコシル供与体を含む溶液を収容し、前記１つ以上の活性化剤容器がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容し、前記１つ以上のデブロッキング容器がヒドラジンを含む溶液を収容し、第１の溶媒容器がジクロロメタンを収容し、第２の溶媒容器がメタノールを収容し、第３の溶媒容器がテトラヒドロフランを収容し、第４の溶媒容器がピリジン及び酢酸を含む溶液を収容し、第５の溶媒容器が酢酸のテトラヒドロフラン０．２Ｍ溶液を収容する、装置。
【請求項２８】
請求項２６に記載の装置で、前記１つ以上のブロッキング容器がレブリン酸を含む溶液を収容し、第１の供与体容器がグリコシルトリクロロアセトイミダートを含む溶液を収容し、第２の供与体容器が第１のリン酸グリコシルを含む溶液を収容し、第３の供与体容器が第２のリン酸グリコシルを含む溶液を収容し、前記１つ以上の活性化剤容器がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容し、第１のデブロッキング容器がヒドラジンを含む溶液を収容し、第２のデブロッキング容器がナトリウムメトキシドを含む溶液を収容し、第１の溶媒容器がジクロロメタンを収容し、第２の溶媒容器がメタノールを収容し、第３の溶媒容器がテトラヒドロフランを収容し、第４の溶媒容器がピリジン及び酢酸を含む溶液を収容し、第５の溶媒容器が０．２Ｍの酢酸のテトラヒドロフラン溶液を収容する、装置。
【請求項２９】
請求項１に記載の装置で、前記１つ以上の不溶性樹脂ビーズがオクテンジオール官能基化樹脂からなる装置。
【請求項３０】
請求項２に記載の装置で、有機リンカーがリン酸グリコシルから成る装置。
【請求項３１】
グリコシル供与体と基質の間に炭素−ヘテロ原子結合を形成する方法であって、反応性アノマー位炭素を含むグリコシル供与体と、水素を有するヘテロ原子を含む基質と活性化試薬とを請求項１に記載の装置の反応容器中で溶液中で混合するステップを含み、前記活性化剤試薬が前記グリコシル供与体の前記反応性アノマー位炭素を活性化させ、それによって前記グリコシル供与体の前記アノマー位炭素と前記基質の前記へテロ原子の間に炭素−ヘテロ原子結合を含む生成物を形成する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が、リン酸グリコシルと、亜リン酸グリコシルと、グリコシルトリクロロアセトイミダートと、ハロゲン化グリコシルと、硫化グリコシルと、グリコシルスルホキシドと、ｎ−ペンテニルグリコシドと、１，２−無水グリコシドからなる群から選択される、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が、リン酸グリコシルと、グリコシルトリクロロアセトイミダートとからなる群から選択される、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法で、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が、酸素と、窒素と、硫黄とからなる群から選択される方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法で、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が、酸素と窒素からなる群から選択される、方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法で、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が酸素である、方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法で、前記活性化試薬がルイス酸である、方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法で、前記活性化試薬がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートである、方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の方法で、前記活性化試薬がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートである、方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が、リン酸グリコシルと、亜リン酸グリコシルと、グリコシルトリクロロアセトイミダートと、ハロゲン化グリコシルと、硫化グリコシルと、グリコシルスルホキシドと、ｎ−ペンテニルグリコシドと、１，２−無水グリコシドからなる群から選択され、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が酸素と、窒素と、硫黄からなる群から選択され、前記活性化試薬がルイス酸である、方法。
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が、リン酸グリコシル及びグリコシルトリクロロアセトイミダートからなる群から選択され、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が酸素と、窒素と、硫黄からなる群から選択され、前記活性化試薬がシリルトリフルオロメタンスルホナートである、方法。
【請求項４２】
請求項３１に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が、リン酸グリコシル及びグリコシルトリクロロアセトイミダートからなる群から選択され、前記基質の水素を有する前記へテロ原子が酸素と、窒素と、硫黄からなる群から選択され、前記活性化試薬がトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートである、方法。
【請求項４３】
請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の方法で、水素を有するヘテロ原子を含む前記基質が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結している、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法で、前記共有結合リンカーが−Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３−Ｏ−である、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法で、前記固体支持体が樹脂ビーズである、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法で、水素を有するヘテロ原子を含む前記基質が単糖と、オリゴ糖と、多糖と、糖複合体からなる群から選択される、方法。
【請求項４７】
請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、または４２に記載の方法で、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結されている、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法で、前記共有結合が−Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３−Ｏ−である、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法で、前記固体支持体が樹脂ビーズである、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法で、水素を有するヘテロ原子を含む前記基質が単糖、オリゴ糖、多糖、及び糖複合体からなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
請求項４３に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器を加圧または減圧して前記装置の前記反応容器から液相を除去するステップと、前記装置の前記反応容器に溶媒を加えるステップを含む、方法。
【請求項５２】
請求項４７に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器を加圧または減圧して前記装置の前記反応容器から液相を除去するステップと、前記装置の前記反応容器に溶媒を加えるステップを含む、方法。
【請求項５３】
請求項５１に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器を加圧または減圧して前記装置の前記反応容器から液相を除去するステップと、前記装置の前記反応容器に溶媒を加えるステップを含む、方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器を加圧または減圧して前記装置の前記反応容器から液相を除去するステップと、前記装置の前記反応容器に溶媒を加えるステップを含む、方法。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法で、さらに前記生成物を前記装置の前記反応容器中で脱保護試薬を含む溶液で処理し、前記生成物から保護基を除去して水素を有するヘテロ原子を含む第２の生成物を生成するステップを含み、前記第２の生成物を共有結合リンカーを介して固体支持体に連結する、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器中の溶液中で、反応性アノマー位炭素を含むグリコシル供与体と、水素を有するヘテロ原子を含む前記第２の生成物と、活性化試薬とを混合するステップを含み、前記活性化試薬が前記グリコシル供与体の前記反応性アノマー位炭素を活性化させて、それによって前記グリコシル供与体の前記アノマー位炭素と前記第２の生成物の前記へテロ原子との間に炭素−ヘテロ原子結合を含む第３の生成物を形成し、前記第３の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結される、方法。
【請求項５７】
請求項５２に記載の方法で、さらに前記生成物を前記装置の前記反応容器中で反応性アノマー位炭素を含む第２の生成物を生成するための転換試薬を含む溶液で処理するステップを含み、前記第２の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結される、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法で、さらに前記装置の前記反応容器中の溶液中で、水素を有するヘテロ原子を含む基質と、反応性アノマー位炭素を含む前記第２の生成物と、活性化試薬を混合するステップを含み、前記活性化試薬が前記第２の生成物の前記反応性アノマー位炭素を活性化させて前記第２の生成物の前記アノマー位炭素と前記基質の前記へテロ原子との間に炭素−ヘテロ原子結合を含む第３の生成物を形成し、前記第３の生成物が共有リンカーを介して固体支持体に連結される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ポリペプチドやポリヌクレオチドなどバイオポリマー（生体高分子）は、通常、固相法によって合成される。固相法とは固体支持体上に固定したポリマー鎖に、ポリマーサブユニットを順次付加させていく方法である。この一般的な合成方法は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド用の市販合成装置で行うことができ、自動または半自動的にバイオポリマーを既定の配列に構築することができる。しかし、市販の合成装置ではオリゴ糖の合成を効率的に行うことができず、一般には市販の装置で合成した場合のオリゴ糖の収率は小さい。
【０００２】
グリコシル化反応は、有機化学の分野で完全に研究し尽くされた転換の１種である。一般に、グリコシル化は糖単位が２つ結合しているアセタールを形成する反応である。大半のグリコシル化剤の反応経路は同様である。アノマー位の置換基が脱離基として働き、求電子中間体を生成する。この中間体と水酸基を典型とする求核基が反応すると、グリコシド結合を形成する。この反応は、使用する脱離基、活性化試薬、及び用いた溶媒の性質に依って、多くの中間体を経て進行する。
【０００３】
信頼性が最も高いグリコシル供与体には、グリコシルトリクロロアセトイミダート、チオグリコシド、グリコシルスルホキシド、ハロゲン化グリコシル、亜リン酸グリコシル、ｎ−ペンテニルグリコシド及び１，２−無水糖などがある（図１参照）。グリコシル化剤の種類は豊富であるにもかかわらず、万能の供与体を用いるような方法はまだ見つかっていない。ペプチドやオリゴヌクレオチド合成とは反対に、単糖の構造には固有の違いがあるため、共通の供与体は普及しにくいだろう。むしろ、ある種のグリコシド結合を構築するには個別の供与体が用いられることになるだろう。
【０００４】
固相化学合成
液相のオリゴ糖合成は進行が遅い。それは、結合ステップと脱保護ステップを繰り返さなければならず、さらにその各ステップに精製を必要とするためである。精製の繰り返しを改善するために、固相技術が開発された。固相のオリゴ糖合成の場合、２つの方法が利用可能である（図２及び３参照）。供与体を固定する方法では、モノマー単位の非還元末端を介して、第一の糖をポリマーに結合させる（第２図）。その後、ポリマーに結合させた糖をグリコシル供与体に転換して、過剰の受容体及び活性化剤で処理する。生産的な結合によってポリマーに結合した二糖体が形成され、その一方で分解生成物は樹脂に結合したままとなる。オリゴ糖鎖を伸長するには、新たに付加させた糖単位をグリコシル供与体に転換し、上述のサイクルを繰り返す。供与体となる物質のほとんどは反応性が高いため、供与体固定法を用いると、ポリマーに結合した副生成物が生じる可能性が高くなる。
【０００５】
もう一つの方法が受容体固定戦略で、固相オリゴ糖合成に非常に有用であることがわかっている（図３）。この方法では、第一の糖をポリマーの還元末端に結合させる。糖についている固有の保護基を除去すると、受容体が結合したポリマーが完成する。反応性グリコシル化剤を溶液中で輸送し、生産的な結合によってポリマーに結合したオリゴ糖が形成され、その一方で供与体の分解によって生じた不必要な副生成物は流し落とすことができる。ポリマーに結合したオリゴ糖についている固有の保護基を除去すれば水酸基が新たに現れ、オリゴ糖鎖をさらに伸長することができる。
【０００６】
供与体固定法の利点はＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙらによって実証されているが、最も広く用いられ一般に実用的な、ポリマー支持体上でのオリゴ糖の合成方法は受容体固定戦略を採用している。総論はＰ．Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｓ．Ｊ． Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ３１ （１９９８）， ６８５を参照。反応を完了させるために過剰のグリコシル化剤溶液を使うことが可能となり、この方法は広く使われるようになった。上述のグリコシル化剤はすべて受容体固定法で用いられており、数々の成功を収めている。
【０００７】
最近はオリゴ糖の自動合成についての関心が高まりつつある。例えば、糖の構造と機能の関連性を調べる場合に、特定の位置に異なる残基を有したり、またはグリコシド結合のアノマー配置を変化させたオリゴ糖の混合物を生成することにいついてはしばしば関心が持たれている。別の例では、特定の受容体または抗体に対する高い結合親和性など、必要とされる活性を有するオリゴ糖の識別は、（ａ）ランダムな配列のオリゴ糖を大量に生成し、（ｂ）そのオリゴ糖をスクリーニングして必要な結合親和性を有する１種類以上のオリゴ糖を識別することによって、可能になると考えられる。
【０００８】
既存のオリゴ糖合成装置では、合成できるオリゴ糖の種類にも量にも限界がある。この限界のために、構造−機能の研究用にも、選択方法に利用するためにも、オリゴ糖の用途の可能性が限定されている。
【０００９】
発明の概要
本発明はオリゴ糖の自動固相合成のための装置及び方法を対象としており、その装置及び方法には、少なくとも１つの不溶性樹脂ビーズを収容する反応容器と、単糖供与体溶液を収容する供与体容器と、活性化試薬溶液を収容する活性化容器と、デブロッキング試薬溶液を収容するデブロッキング容器と、溶媒溶液を収容する溶媒容器と、不活性ガス圧下に保ちながら溶液を移動させることができる溶液輸送システムと、溶液輸送システムを制御するコンピュータとを利用することができる。不溶性樹脂ビーズはオクテンジオール官能基化樹脂から成っていてよい。
【００１０】
本発明の一の態様は、例えば固相粒子上に固定した末端サブユニットにサブユニットを付加させることによってオリゴ糖を形成するなど、固体支持体上でオリゴ糖を効率的に合成する装置に関する。ある実施態様では、本発明の装置は、例えば本願明細書に記載されているようなオリゴ糖を合成するコンビナトリアルな方法に用いられる。
【００１１】
本発明の別の態様では、反応容器に収容した不溶性の樹脂ビーズは、有機リンカーで樹脂ビーズに連結したグリコシル受容体を有してよい。有機リンカーはリン酸グリコシルから成っていてよい。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、オリゴ糖合成装置は反応容器の温度を調節する温度制御ユニットを有してよい。温度制御ユニットは、溶液制御システムを制御するコンピュータと同一のコンピュータで制御してよい。本発明のさらにさらなる態様では、反応容器は二重壁構造で２つのキャビティを形成してよく、第一のキャビティはオリゴ糖合成用で、第２のキャビティは温度制御ユニットの冷却剤を収容する。反応容器の二重壁構造はガラス製であってよい。
【００１３】
本発明の別の態様では、供与体容器はグリコシルトリクロロアセトイミダート及び／またはリン酸グリコシル溶液を収容してよい。
【００１４】
本発明の別の態様では、活性化容器はトリメチルシリルトリフルオロメタンスンホナートなどのルイス酸を収容してよい。
【００１５】
本発明のさらなる態様では、デブロッキング容器はナトリウムメトキシドのメタノール溶液を収容してよい。
【００１６】
本発明の別の態様では、溶媒容器はジクロロメタン、メタノール及び／またはＴＨＦを収容してよい。
【００１７】
本発明の別の態様では、この合成装置にはさらにブロッキング試薬溶液を収容するブロッキング容器が含まれてよい。ブロッキング容器には、例えばベンジルトリクロロアセトイミダート、またはカルボン酸を収容してよい。
【００１８】
ある実施態様では、本発明はグリコシル供与体と基質の間に炭素−へテロ原子結合を形成する方法であって、反応性アノマー位炭素を含むグリコシル供与体と、水素を有するヘテロ原子を含む基質と、活性化試薬とを本発明の装置の反応容器中の溶液中に混合するステップを含み、前記活性化試薬が前記グリコシル供与体の前記反応性アノマー位炭素を活性化させて、前記グリコシル供与体の前記アノマー位炭素と前記基質の前記へテロ原子の間に炭素−ヘテロ原子結合を構成する生成物を形成する方法に関する。反応性アノマー位炭素を含むグリコシル供与体は、リン酸グリコシルと、亜リン酸グリコシルと、グリコシルトリクロロアセトイミダートと、ハロゲン化グリコシルと、グリコシルスルフィドと、グリコシルスルホキシドと、ｎ−ペンテニルグリコシドと、１，２−無水グリコシドとからなる群から選択される。前記基質の水素を有するヘテロ原子は酸素と、窒素と、硫黄とからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の方法のある実施態様では、活性化試薬はルイス酸である。本発明の方法のある実施態様では、活性化試薬はシリルトリフルオロメタンスルホナートである。本発明の方法のある実施態様では、活性化試薬はトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートである。
【００２０】
本発明の方法のある実施態様では、水素を有するヘテロ原子からなる基質は共有結合リンカーを介して固体支持体に連結される。本発明の方法のある実施態様では、前記共有結合リンカーは−Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３−Ｏ−である。本発明の方法のある実施態様では、前記固体支持体は樹脂ビーズである。
【００２１】
本発明の方法のある実施態様は、反応性アノマー位炭素を含む前記グリコシル供与体は、共有結合リンカーを介して固体支持体に連結される。本発明の方法のある実施態様では、前記共有結合リンカーは−Ｏ−（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３−Ｏ−である。本発明の方法のある実施態様は、前記固体支持体の樹脂ビーズである。
【００２２】
本発明の方法のある実施態様では、水素を有するヘテロ原子を含む前記基質は、単糖、オリゴ糖、多糖、糖複合体からなる群から選択される。本発明の方法のある実施態様では、水素を有するヘテロ原子を含む前記基質は、単糖、オリゴ糖、多糖、糖複合体からなる群から選択される。
【００２３】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、前記装置の前記反応容器に正の圧力をかけるかまたは減圧して、前記装置の前記反応容器から液相を除去するステップと、前記装置の前記反応容器に溶媒を加えるステップを含む。
【００２４】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、前記装置の前記反応容器中で、前記生成物と脱保護試薬からなる溶液で処理し、それによって前記生成物から水素を有するヘテロ原子からなる第２の生成物を生成する保護基を除去するステップで、第２の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に結合するステップを含む。
【００２５】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、前記装置の前記反応容器中の溶液に、反応性アノマー位炭素を含むグリコシル供与体と、水素を有するヘテロ原子を含む第２の生成物と、活性化試薬とを混合するステップであって、前記活性化試薬が前記グリコシル供与体の前記反応性アノマー位炭素を活性化させることによって前記グリコシル供与体の前記アノマー位炭素と前記第２の生成物の前記ヘテロ原子との間に炭素−ヘテロ原子結合を構成する第３の生成物を形成し、前記第３の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結されるステップを含む。
【００２６】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、前記装置の前記反応容器中で、前記生成物を転換試薬を含む溶液で処理し、反応性アノマー位炭素を含む第２の生成物を生成するステップであって、前記第２の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に連結されるステップを含む。
【００２７】
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、前記装置の前記反応容器中の溶液に、水素を有するヘテロ原子を含む基質と、反応性アノマー位炭素を含む第２の生成物と、活性化試薬とを混合するステップであって、前記活性化試薬が前記第２の生成物の前記反応性アノマー位炭素を活性化して、それによって前記第２の生成物の前記アノマー位炭素と前記基質の前記へテロ原子の間に炭素−ヘテロ原子結合を含む第３の生成物を形成し、前記第３の生成物が共有結合リンカーを介して固体支持体に結合するステップを含む。
【００２８】
発明の詳細な説明
定義
便宜上、本願明細書、実施例、及び請求の範囲に用いる特定の用語をここに記載する。
本願明細書に用いられる「ヘテロ原子」という用語は、炭素または水素以外のいずれの元素である原子をも意味する。好ましいヘテロ原子は、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄及びセレンである。
【００２９】
「電子吸引基」という用語は当業に公知であり、置換基が隣接する原子から価電子を引きつける傾向、つまり、その置換基が隣接する電子と比較して電気的に陰性であることを意味する。電子吸引性はハメットシグマ（σ）定数で定量化することができる。この公知の定数は例えばＪ． Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９７７ ｅｄｉｔｉｏｎ） ｐｐ． ２５１−２５９など多くの参考文献に記載されている。ハメット定数は、一般に電子供与基の場合には陰性（ＮＨ２ではσ［Ｐ］ ＝ − ０．６６） 、電子吸引基の場合には陽性（ニトロ基ではσ［Ｐ］ ＝ ０．７８ ）であり、σ［Ｐ］はパラ置換を意味する。例示的な電子吸引基には、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、塩化物などがある。例示的な電子供与基にはアミノ、メトキシなどがある。
【００３０】
「アルキル」という用語は飽和脂肪族基のラジカルを意味し、直鎖アルキル基、分鎖アルキル基、環状アルキル（脂環式）基、アルキル置換環状アルキル基、及び環状アルキル置換アルキル基などがある。好ましい実施態様では、直鎖または分鎖アルキルは骨格に３０個以下の炭素原子を有し（例えば直鎖の場合Ｃ１乃至Ｃ３０、分鎖の場合Ｃ３乃至Ｃ３０）、さらに好ましくは２０個以下である。同様に、好ましい環状アルキルは環構造に３乃至１０個の炭素原子を有し、さらに好ましくは環構造に５，６または７個の炭素を有する。
【００３１】
本願明細書で用いられる「アラルキル」という用語は、アリール基（例えば芳香族基またはヘテロ芳香族基）で置換されたアルキル基を意味する。
【００３２】
「アルケニル」及び「アルキニル」は、長さと置換の可能性が上述のアルキルに類似しているが、それぞれ少なくとも一つの二重結合、または三重結合を有する不飽和脂肪族基を意味する。
【００３３】
本願明細書に用いられる「低アルキル」は、炭素数に他に指定がない限り上述の通りだが、その骨格構造に１乃至１０個の炭素を有する、さらに好ましくは６個の炭素原子を有するアルキル基である。同様に、「低アルケニル」及び「低アルキニル」は同様の鎖長を有する。好ましいアルキル基は低アルキルである。好ましい実施態様では、本願明細書においてアルキルと指定された置換基は低アルキルである。
【００３４】
本願明細書に用いられる「アリール」という用語は、０乃至４個のヘテロ原子を含んでよい５，６，及び７員環の単環芳香族基で、例えばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジンなどである。環構造にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリールヘテロ環」または「ヘテロ芳香族」とも呼ばれているかもしれない。芳香族環は、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクルリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、または−ＣＮなど、上述の置換基を有する環の１位置以上が置換されていてよい。「アリール」という用語には、２つ以上のサイクリック環を有し、２つ以上の炭素が隣り合う２つの環に共通（このような環は「融合環」である）である多環式環系で、少なくとも一つの環が芳香族で、例えばほかの環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／またはヘテロシクリルであってよい、多環式環系も含む。
【００３５】
ｏｒｔｈｏ、ｍｅｔｈａ、及びｐａｒａという用語は、それぞれ、１，２−、１，３−、及び１，４−二置換ベンゼンを意味する。例えば、１，２−ジメチルベンゼンとｏｒｔｈｏ−ジメチルベンゼンという名称は同義である。
【００３６】
「ヘテロシクリル」または「ヘテロシクリル基」という用語は、３乃至１０員環構造を意味し、さらに好ましくは３乃至７員環を意味し、その環構造には１乃至４個のヘテロ原子が含まれる。複素環は多環であってもよい。ヘテロシクリル基には、例えばチオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンなどのラクタム、スルタム、及びスルトンなどが含まれる。複素環は上述のような例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、及び−ＣＮなどの置換基で１位置以上が置換されていてもよい。
【００３７】
「ポリシクリル」または「多環式基」という用語は、２つ以上の環（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／またはヘテロシクリル）で、例えばその環が「融合環」であるような２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通の２つ以上の環を意味する。隣接していない原子がつながっている環は、「架橋」環と呼ばれる。多環の各環は、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル部分または芳香族部分またはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、及び−ＣＮなどの上述の置換基で置換されていてよい。
【００３８】
本願明細書に用いる「ニトロ」という用語は−ＮＯ２を意味し、「ハロゲン」は−Ｆ， −Ｃｌ， −Ｂｒ または −Ｉを意味し、「スルフヒドリル」は−ＳＨを意味し、「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味し、「スルホニル」は−ＳＯ２−を意味する。
【００３９】
「アミン」及び「アミノ」という用語は当業に公知で、例えば一般式
【化１】
2004507467.tif 000003
で表すことができ、ここでＲ９、Ｒ１０、Ｒ’１０がそれぞれ原子価の法則に従った独立の基である部分である、非置換及び置換アミンの両方を意味する。
【００４０】
「アシルアミノ」という用語は当業に公知で、一般式
【化２】
2004507467.tif 000004
で表すことができ、ここでＲ９は上に定義された通り、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニルまたは−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８で、ｍ及びＲ８は上に定義された部分を意味する。
【００４１】
「アミド」という用語はアミノ置換カルボニルとして当業に公知で、一般式
【化３】
2004507467.tif 000005
で表すことができ、ここで Ｒ９、Ｒ１０は上に定義された部分を含む。このアミドの好ましい実施態様には、不安定である可能性もあるイミドは含まれない。
【００４２】
「アルキルチオ」という用語は、上述のように、硫黄ラジカルが結合したアルキル基を意味する。好ましい実施態様では、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル及び−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８のうちの１つで、ここでｍ及びＲ８は上に定義された通りである。代表的なアルキルチオ基にはメチルチオ、及びエチルチオなどが含まれる。
【００４３】
「カルボニル」という用語は当業に公知で、一般式
【化４】
2004507467.tif 000006
で表すことができる部分などが含まれ、ここでＸは結合であるかまたは酸素または硫黄を表し、Ｒ１１は水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８または薬学的に許容な塩を表し、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８ここでｍ及びＲ８は上に定義された通りである。Ｘが酸素で、Ｒ１１またはＲ’１１が水素でない場合、この式は「エステル」を表す。Ｘが酸素で、Ｒ１１が上に定義されたとおりである場合、この部分は本願明細書ではカルボキシル基を示し、特にＲ１１が水素である場合はこの式は「カルボン酸」を表す。Ｘが酸素でＲ’１１が水素である場合、この式は「ホルマート（ギ酸エステル）」を表す。一般に、上式の酸素原子が硫黄に置換される場合、この式は「チオールカルボニル」基 を表す。Ｘが硫黄でＲ１１またはＲ’１１が水素でない場合、この式は「チオールエステル」を表す。Ｘが硫黄でＲ１１が水素である場合、この式は「チオールカルボン酸」を表す。Ｘが硫黄でＲ’１１が水素である場合、この式は「チオールギ酸エステル」を表す。一方で、Ｘが結合でＲ１１が水素ではない場合、上式は「ケトン」基である。Ｘが結合でＲ１１が水素である場合、上式は「アルデヒド」基である。
【００４４】
本願明細書に記載の「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は、上述の通りの酸素ラジカルが結合しているアルキル基を意味する。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシなどが含まれる。「エーテル」は２つの炭化水素の間を酸素が共有結合で連結しているものである。従って、アルキルをエーテルにするアルキル置換基はアルコキシルであるかまたはアルコキシルと同様のものであり、例えば−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８の一つで表すことができ、ここでｍ及びＲ８は上述の通りである。
【００４５】
「スルホナート」という用語は当業に公知で、一般式
【化５】
2004507467.tif 000007
で表すことができる部分を含み、ここでＲ４１は電子対、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである。
【００４６】
トリフリル、トシル、メシル、及びノナフリルは当業に公知で、それぞれ、トリフルオロメタンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、メタンスルホニル基、及びノナフルオロブタンスルホニル基を意味する。トリフラート、トシラート、メシラート及びノナフラートは当業に公知で、トリフルオロメタンスルホナートエステル、ｐ−トルエンスルホナートエステル、メタンスルホナートエステル、及びノナフルオロブタンスルホナートエステル官能基及び前記基を有する分子を意味する。
【００４７】
Ｍｅ， Ｅｔ， Ｐｈ， Ｔｆ， Ｎｆ， Ｔｓ， Ｍｓ という略語は、それぞれ、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル及びメタンスルホニルである。さらに包括的な当業の有機化学者が使用する略称の一覧表は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの各巻の第１号に掲載されており、この一覧表は通常、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓという題名の表に掲載されている。前記一覧表に含まれる略称及び当業の有機化学者が用いるすべての略称は、その内容を本願明細書に引用したものとする。
【００４８】
「スルファート（硫酸エステル）」という用語は当業に公知で、一般式
【化６】
2004507467.tif 000008
で表すことができる部分を含み、ここでＲ４１は上に定義されたとおりである。
【００４９】
「スルホニルアミノ」という用語は当業に公知で、一般式
【化７】
2004507467.tif 000009
で表すことができる部分を含む。
【００５０】
「スルファモイル」という用語は当業に公知で、一般式
【化８】
2004507467.tif 000010
で表すことができる部分を含む。
【００５１】
本願明細書に記載の「スルホニル」という用語は、一般式
【化９】
2004507467.tif 000011
で表すことができる部分を含み、ここでＲ４４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールからなる群から選択される。
【００５２】
本願明細書に記載の「スルホキシド」という用語は、一般式
【化１０】
2004507467.tif 000012
で表すことができる部分を含み、ここでＲ４４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アラルキル、またはアリールからなる群から選択される。
【００５３】
「セレノアルキル」は置換セレノ基が結合しているアルキル基を意味する。アルキル上で置換してもよい例示的な「セレノエーテル」は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル及び−Ｓｅ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ７のうちの一つから選択され、ここでｍ及びＲ７は上に定義されたとおりである。
【００５４】
同様の置換をアルケニル基及びアルキニル基に行い、例えばアミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、カルボニル置換アルケニル、またはアルキニルを生成することができる。
【００５５】
本願明細書に記載の通り、例えばアルキル、ｍ、ｎなどの各表現が構造の中に１回以上現れた場合のその表現の定義は、当該構造の別の位置におけるその表現の定義とは独立であることを意図する。
【００５６】
「置換」または「〜で置換された」という文言には、このような置換は置換原子及び置換基の許容される原子価に従っており、置換によって、例えば転位、環化、脱離などの自然発生的な転換が生じないような安定な化合物が生成される、という暗黙の条件が含まれる。
【００５７】
本願明細書に記載の「置換された」という用語は、有機化合物のすべての置換可能な基を含むことを意図する。広義の態様では、この置換可能な基には、有機化合物の非環状および環状置換基、分鎖及び非分鎖置換基、炭素環式及び複素環式置換基、芳香族及び非芳香族置換基が含まれる。具体的な置換基には、例えば上述の置換基が含まれる。適切な有機化合物にとってこの置換可能な基は１つまたは複数あってよく、同一であるかまたは異なっていてよい。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は水素置換基及び／または本願明細書に記載の有機化合物の置換可能な基でヘテロ原子の原子価の条件を満たす置換基のいずれかを有してもよい。本発明は、有機化合物の置換可能な基によって、いかなる形でも制限されないことを意図する。
【００５８】
本願明細書に記載の「保護基」という用語は、反応性の官能基となりうる基を不必要な化学転換から保護する一時的な置換基を意味する。このような保護基の例には、カルボン酸、アルコールのシリルエーテル、及びアルデヒドのアセタールとケトンのケタールがそれぞれ含まれる。保護基化学の分野については総説が書かれている（Ｇｒｅｅｎｅ， Ｔ．Ｗ．； Ｗｕｔｓ， Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．； Ｗｉｌｅｙ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。
【００５９】
本発明のある化合物は、特定の幾何学的または立体異性的形状であってもよい。本発明は、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−及びＳ−鏡像異性体、ジアスレテオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、及びその他のそれらの混合物など、本願発明の範囲内に含まれる化合物すべてを包含する。アルキル基などの置換基に非対称な炭素原子が追加されてもよい。このような異性体すべて及びそれらの混合物は本願発明に含まれることを意図する。
【００６０】
例えば本願発明の化合物のある鏡像異性体が必要である場合、非対称合成またはキラル補助剤を用いた誘導によって調製し、得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を解離して目的の純粋な鏡像異性体を得てもよい。また、分子がアミノなど塩基性官能基、またはカルボキシルなどの酸性官能基を有する場合、ジアステレオマー塩を適切な光学活性の酸または塩基で形成し、得られたジアステレオマーを当業に公知の分別結晶法またはクロマトグラフィーによる方法で分割して、純粋な鏡像異性体を回収する。
【００６１】
包含される上述の化合物の等価物には、別の形で上述の化合物に一致する化合物と、一般的特性が同一である（例えば鎮痛薬として機能するなどの）化合物で、置換基に、シグマ受容体に結合する化合物の有効性に有害な影響を及ぼさない１つ以上の単純なバリエーションがある化合物が含まれる。一般に、本発明の化合物は、例えば後述の一般反応スキームに記載される方法か、またはそれを改良した方法によって、容易に入手可能な開始材料、試薬及び従来の合成手順を用いて調製することができる。このような反応の場合、公知であるが本願明細書に記載されていない変形法を用いることも可能である。
【００６２】
本発明の目的のために、化学元素はＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ６７ｔｈ Ｅｄ．， １９８６−８７の裏表紙にある元素周期表にしたがって識別する。さらに本発明の目的のために、「炭化水素」という用語は少なくとも１つの水素と１つの炭素原子を有する許容しうる化合物すべてを含むことを意図する。広義の態様では、許容しうる炭化水素には、置換または非置換であってよい非環状および環状有機化合物、分鎖及び非分鎖有機化合物、炭素環式及び複素環式有機化合物、芳香族及び非芳香族有機化合物が含まれる。
【００６３】
コンビナトリアルライブラリ
本発明の反応は薬学的、農芸化学的もしくはその他の生物学的もしくは医学関連の活性、または材料関連の特質のスクリーニングのための化合物のコンビナトリアルライブラリの作製に直ちに役立つ。本発明の目的のためのコンビナトリアルライブラリは、必要な特性を選別するために一緒にスクリーニングされてよい化学関連化合物の混合物で、前記ライブラリは溶液中にあるか、固体支持体に共有結合していてよい。多種類の関連化合物を１反応で調製できれば、必要なスクリーニングの段階数を大きく減少させ単純化する。適切な生物学的、薬学的、農芸化学的または物理学的特性を選別するスクリーニングは、従来の方法で行ってよい。
【００６４】
ライブラリの多様性は、多様なレベルにおいて作製してすることができる。例えば、コンビナトリアル法で用いる基質アリール基は、例えば環構造に関する多様性など、核となるアリール部分に関して多様化することができ、及び／またはその他の置換基を変化させることもできる。
【００６５】
有機低分子のコンビナトリアルライブラリの作製には、当業に様々な技術がある。例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １４：８３、Ａｆｆｙｍａｘ 米国特許第 ５，３５９，１１５号及び５，３６２，８９９号、Ｅｌｌｍａｎ 米国特許第５，２８８，５１４号、Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ公報 ＷＯ ９４／０８０５１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＪＡＣＳ １１６：２６６１、Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＪＡＣＳ １１５：２５２、ＰＣＴ公報 ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９３／０９６６８ 、ＷＯ９１／０７０８７、及びＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２）を参照のこと。したがって、約１６から１，０００，０００種以上のダイバーソマーからなる多様なライブラリを合成することができ、特定の活性または特性についてスクリーニングすることができる。
【００６６】
ある例示的な実施態様では、置換ダイバーソマーのライブラリはＳｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ 公報 ＷＯ ９４／０８０５１に記載の技術に適合させた主反応を用いて合成することができ、例えば基質のある１つの位置にある加水分解可能なまたは光分解可能な基によって、ポリマービーズに結合させることなどができる。Ｓｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．の技術によると、ライブラリを合成するのは１セットのビーズ上で、各ビーズにはそのビーズ上にある特定のダイバーソマーを識別するための１セットのタグが含まれている。酵素阻害物質を見つけるのに特に適しているある実施態様では、そのビーズを透過膜の表面上にまき散らし、ビーズリンカーを溶解してダイバーソマーをビーズから遊離させることができる。各ビーズから遊離したダイバーソマーは、膜を透過して拡散し、アッセイゾーンに到達して、酵素アッセイと相互作用を生じるだろう。数々のコンビナトリアル的手法については、以下に詳述する。
【００６７】
Ａ．　直接的な特徴付け
コンビナトリアルケミストリの分野では、例えばフェムトモル未満の量の化合物を特徴づけることができる質量分析法（ＭＳ）等の技術の感度を利用し、コンビナトリアルライブラリから選択された化合物の化学的構成を直接決定するのが主流になりつつある。例えば、ライブラリが不溶性支持マトリックス上にある場合、初めに離散的な集団をなす化合物が支持体から遊離して、ＭＳで特徴づけることができる。ほかの実施態様では、特に化合物をマトリックスに連結するために不安定な結合が最初に使用される場合、化合物をマトリックスから遊離させるためにＭＳ試料調製技術の一部としてＭＡＬＤＩなどのＭＳ技術を使うこともできる。例えば、ライブラリから選択されたビーズをＭＡＬＤＩの段階で照射してダイバーソマーをマトリックスから遊離させ、そのダイバーソマーをイオン化してＭＳ分析することも可能である。
【００６８】
Ｂ）マルチピン合成
本方法のライブラリはマルチピンライブラリの形式を取ることができる。簡単に説明すると、Ｇｅｙｓｅｎら（Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＰＮＡＳ ８１：３９９８−４００２） が導入した方法で、マイクロタイタープレートのフォーマットにポリアクリル酸をすりつけたポリエチレンピンを並べ、そのピン上で並行合成することによって化合物ライブラリを作製する方法である。Ｇｅｙｓｅｎの技術を使うと、マルチピン法を使って１週間に何千種もの化合物を合成しスクリーニングすることができ、連結させた化合物は多くのアッセイに再利用することもできる。適切なリンカー部分をピンに付け、合成後に化合物を支持体から切り離し、純度の評価やさらなる評価に用いることもできる（ｃ．ｆ．， Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３１：５８１１−５８１４、Ｖａｌｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７：１６８−１７７、Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３２：６１６３−６１６６）。
【００６９】
Ｃ）ディバイド−カップル−リコンバイン（ｄｉｖｉｄｅ−ｃｏｕｐｌｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ）
さらに別の実施態様では、ディバイド−カップル−リコンバイン戦略を用いて１セットのビーズ上に多様な化合物ライブラリを提供することができる（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ （１９８５） ＰＮＡＳ ８２：５１３１−５１３５、及び 米国特許第 ４，６３１，２１１号、５，４４０，０１６号、５，４８０，９７１号を参照）。簡単に説明すると、その名が示すとおり、ライブラリに縮重が導入されている各合成ステップでは、ライブラリの特定の位置において、付加される置換基の種類と等しい数のグループにビーズを分割（ｄｉｖｉｄｅ）し、異なる置換基をそれぞれ別々の反応で結合（ｃｏｕｐｌｅ）させ、そのビーズを次の繰り返しのために１つのプールに合わせ戻す（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ）。
【００７０】
ある実施態様では、ディバイド−カップル−リコンバイン戦略は、「ティーバッグ」法と呼ばれる類似の方法を用いて行うこともできる。これは最初にＨｏｕｇｈｔｅｎが開発した方法で、化合物の合成は孔の空いたポリプロピレンのバッグの中に密封された樹脂上で行われる（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８２：５１３１−５１３５）。そのバッグを適切な反応液中に入れて化合物が付いている樹脂に置換基を結合させるが、樹脂の洗浄や脱保護などの通常のステップはすべて、１つの容器中で同時に行う。合成が終わると、各バッグには１つの化合物が入っている。
【００７１】
Ｄ）光誘導、空間指定可能並行化学合成によるコンビナトリアルライブラリ
空間指定可能合成とは、合成基質上の位置によって化合物の特性が決まるコンビナトリアル合成のスキームである。ある実施態様では、固体支持体上の特定の位置への化学試薬の付加を制御することによって、コンビナトリアルプロセスを行う（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ａｎｎｕ Ｒｅｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２６：２７１−２８０； Ｆｏｄｏｒ， Ｓ．Ｐ．Ａ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７； Ｐｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，１４３，８５４； Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：１９−２６）。光リソグラフィの空間分解能によって小型化が可能である。この技術は光感受性保護基を用いた保護／脱保護反応を用いて行うことができる。
【００７２】
この技術の重要な点は、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３−１２５１に解説されている。合成基質は、光感受性ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）保護アミノリンカーまたはその他の光感受性リンカーの共有結合によって結合できるように調製する。合成支持体の特定の領域を結合用に選択的に活性化するために、光を使う。光で光感受性保護基を除去（脱保護）すると、選択した領域が活性化される。活性化後、光感受性保護基をアミノ末端にそれぞれ有する最初の１セットのアミノ酸類似体が表面全体に露出される。結合は、前の段階で光が指定した領域のみに生じる。反応を止め、プレートを洗浄し、第二のマスクを通してその基質に再び光を照射し、第二の保護ビルディングブロックとの反応のために異なる領域を活性化させる。マスクのパターンと反応物質の順序が生成物とその位置を決定する。このプロセスには光リソグラフィを利用するため、合成できる化合物の数が適切な分解能で指定可能な合成部位の数のみに制限される。各化合物の位置は正確にわかっており、ほかの分子との相互作用を直接評価することができる。
光誘導化学合成では、生成物は照射のパターンと反応物質の付加の順序に依存する。リソグラフィのパターンを変化させることによって、様々なテスト化合物のセットを同時に数多く合成することができ、この特性が数多くの様々なマスキング戦略を作り出している。
【００７３】
Ｅ）　コード化したコンビナトリアルライブラリ
さらに別の実施態様では、本願方法はコード化タギングシステムによって提供された化合物ライブラリを利用する。コンビナトリアルライブラリからの活性化合物の識別における最近の改善点には、特定のビーズの反応ステップとそのビーズに付いていると推測される構造を固有にコードするタグを用いる化学指標システムを利用している。理論上は、この方法はファージディスプレイライブラリを模倣しており、活性は発現したペプチドに由来しているが、活性ペプチドの構造は対応するゲノムＤＮＡ配列から推測する。合成コンビナトリアルライブラリをコードするために、最初はＤＮＡをコードとして利用した。コード化にはほかに様々な方法が報告されており、配列決定可能なバイオオリゴマー（例えばオリゴヌクレオチド及びペプチド）を用いたコード法、及び配列決定可能ではないタグを加えた二進法コード法などがある。
【００７４】
１）配列決定可能なバイオオリゴマーを用いたタギング
オリゴヌクレオチドを用いてコンビナトリアル合成ライブラリをコードする原理は１９９２年に報告されており（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：５３８１−５３８３）、その翌年にはこのようなライブラリの例が報告された（Ｎｅｅｄｌｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰＮＡＳ ９０：１０７００−１０７０４）。特定のジヌクレオチド（それぞれＴＡ、ＴＣ、ＣＴ、ＡＴ、ＴＴ、ＣＡ及びＡＣ）でコードされているＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ 及び Ｔｈｒ（３文字アミノ酸コード）のすべての組み合わせからなる７７（＝８２３，５４３）種のペプチドのコンビナトリアルライブラリを、固体支持体上でのペプチド及びオリゴヌクレオチド合成を交互に行って調製する。この作業では、ビーズをオリゴ糖合成用の保護ＯＨ基とペプチド合成用のＮＨ２基を生成するための試薬に同時にプレインキュベートさせて、ビーズのアミン結合官能性をペプチド合成用かオリゴヌクレオチド合成用のいずれかに区別した（ここでは１：２０の比率）。完了後、各タグはコードを有する６９塩基、１４ユニットから成った。ビーズ結合ライブラリを蛍光標識した抗体とインキュベートし、強力な蛍光を発する結合抗体を有するビーズを蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）で収集した。ＤＮＡタグをＰＣＲで増幅して配列を決定し、予想されたペプチドを合成した。このような手法の後で、化合物ライブラリを本願方法に用いることも可能で、タグのオリゴヌクレオチド配列が特定のビーズが経た一連のコンビナトリアル反応を同定し、ビーズ上の化合物を識別する。
【００７５】
オリゴヌクレオチドタグを利用すると、きわめて高感度のタグ分析が可能になる。そうであっても、この方法は、タグとライブラリメンバーの共合成を交互に行うのに必要な保護基のオルトゴナルセットを慎重に選択しなければならない。さらに、タグの化学不安定性、特にホスファート（リン酸エステル）と糖のアノマー位結合のために、非オリゴマーライブラリの合成に用いることができる試薬と条件の選択を制限されている。好ましい実施態様では、このライブラリは、アッセイ用のテスト化合物ライブラリメンバーを選択的に切断することが可能なリンカーを利用する。
【００７６】
コンビナトリアルライブラリにはタギング分子としてペプチドも利用されている。２つの例示的な方法が当業で報告されており、どちらもコード用とリガンド用のストランドが交互に取り付けられた固相への分枝リンカーを用いている。１つ目の方法（Ｋｅｒｒ ＪＭ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１５：２５２９−２５３１） では、コード用ストランドに酸感受性保護を用い、化合物ストランドには塩基感受性保護を用いることで合成のオルトゴナリティを達成した。
【００７７】
代替的な方法（Ｎｉｋｏｌａｉｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ ６：１６１−１７０）では、分枝リンカーを用い、コードユニットとテスト化合物を両方とも樹脂上の同一の官能基に結合させることができる。ある実施態様では、切断可能なリンカーを、切断するとコードと化合物の両方を有する分子を遊離するように、分枝点とビーズの間に配置することができる（Ｐｔｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３２：３８９１−３８９４） 。別の実施態様では、解離可能なリンカーを、テスト化合物を選択的にビーズから分離してコードを残すように配置することができる。この最後の構造体は特に貴重で、なぜならコード基の妨害なくテスト化合物をスクリーニングすることができるからである。ペプチドライブラリメンバーとそれに対応するタグの独立した解離及び配列決定の当業における例で、ペプチドの構造をタグから正確に予測できることが確認されている。
【００７８】
２）　配列決定可能ではない（ｎｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅａｂｌｅ）タギング：二進法コード化　テスト化合物ライブラリをコード化する代替的な方法は、配列決定可能ではない電子含有（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｃ）タギング分子のセットを二進法コードとして用いる （Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰＮＡＳ ９０：１０９２２−１０９２６）。例示的なタグはハロ芳香族アルキルエーテルで、電子捕捉ガスクロマトグラフィ（ＥＣＧＣ）でフェムトモル未満のレベルでトリメチルシリルエーテルとして検出することができる。アルキル鎖の長さと芳香族ハロゲン化物置換基の性質や位置を変化させると、このようなタグを４０種類以上合成することが可能で、原理的には２４０（１０１２超）種の分子をコードすることができる。最初の報告（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， 同上） では、タグが光解離性ｏ−ニトロベンジルリンカーを介して結合したのは、ペプチドライブラリの利用可能なアミン基の約１％だった。この方法は、ペプチド様またはその他のアミン含有分子のコンビナトリアルライブラリを調製する場合には便利である。しかし、さらに多様性に富んだシステムが開発されており、どのようなコンビナトリアルライブラリも基本的にはコードすることができる。ここでは、その化合物は光解離性リンカーを介して固体支持体に結合しており、タグはカルベン挿入によるカテコールエーテルリンカーを介してビーズマトリックスに結合している（Ｎｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５９：４７２３−４７２４）。このオルトゴナル結合戦略では、アッセイのために溶液中で選択的にライブラリメンバーを切り離し、引き続いてタグセットの酸化分離後にＥＣＧＣによってデコードすることができる。
【００７９】
当業のアミド結合ライブラリのいくつかは、アミン基に結合させた電子含有タグを用いた二進法コード化を用いているが、ビーズマトリックスにこれらのタグを直接結合させると、コード化コンビナトリアルライブラリで調製することができる構造の多様性がはるかに増える。このように結合させると、タグとそのリンカーはビーズマトリックス自体とほぼ同じ程度に反応性がなくなる。電子含有タグを固相に直接結合させた２つの二進法コード化したコンビナトリアルライブラリが報告されており（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ＰＮＡＳ ９２：６０２７−６０３１）、本化合物ライブラリの作製法の指針となっている。いずれのライブラリも、ライブラリのメンバーを光感受性リンカーで固体支持体に結合させるオルトゴナルな結合ストラテジを用いて作製されており、タグは強力な酸化によってのみ解離できるリンカーで結合されていた。ライブラリメンバーは部分的に固体支持体から繰り返し光溶離することができ、ライブラリメンバーを多くのアッセイに用いることができる。連続的な光溶離は超ハイスループット反復スクリーニング戦略をも可能にする。まず、複数のビーズを９６穴マイクロ対タープレートに置く。２番目に化合物を部分的に切り離し、アッセイプレートに移す。３番目に金属結合アッセイによって活性ウエルを識別する。４番目に対応するビーズを新しいマイクロ対タープレートに１列に並べ直す。５番目に１種類の活性化合物を識別する。６番目に構造をデコードする。
【００８０】
固相オリゴ糖合成の自動化
自動合成による確定したペプチド及び核酸配列の実現は、これらの分子が関与する様々な分野の研究に重大な影響を与えた。ＰＣＲなどの重要な技術は、短いＤＮＡ鎖の確実な合成方法がルーチン化した後で可能になった。糖鎖生物学の分野は、複雑なオリゴ糖の合成が困難なために難航している。複雑な糖複合体に関与する現象に関心がある研究者らが、必要な分子の調製のために自動合成に頼ることができるのが理想的である。
【００８１】
ある一般的な応用例では、本願発明の装置は、オリゴ糖の構造−機能分析用に用いることができるオリゴ糖またはその混合物を生成するために用いる。例えば、対象のオリゴ糖は、抗原性オリゴ糖、タンパク質−糖質認識イベント、または抗生オリゴ糖であってよい。一般に、例えば構造−機能研究において、１つ以上の特定の残基位置にある様々な糖置換基のうちの１つの活性への作用を決定することが望ましい。別の一般的な応用例では、この装置は、抗体などの既知のレセプタへの結合活性など、望ましい活性を有するオリゴ糖を選択するためのランダム配列オリゴ糖の生成に用いる。
【００８２】
固相オリゴ糖合成の開発における進展のほとんどが最近達成されている一方で、固相オリゴ糖合成の自動化への試みはまだ報告されたことがない。固体支持体上にオリゴ糖を合成する本願発明者らの試みが成功したため、本願発明者らは合成装置で糖質を組み立てはじめた。本願発明者らは完全に自動化した方法で５糖を８．５時間で合成し、総収率は７５％だった。特注の反応容器を取り付けたＡＢＩ３９３Ｂペプチド合成装置に、マンノーストリクロロアセトイミダート供与体、活性化剤（ＴＭＳＯＴｆ）、及びデブロッキング溶液としてナトリウムメトキシドのメタノール溶液を入れた。塩化メチレン、ＴＨＦ、及びメタノールを洗浄溶媒として用い、すべての試薬を不活性ガス雰囲気下に置いた。樹脂に対して５当量の供与体と触媒量の活性物質を送り出すように結合サイクルをプログラムし、その後２０分間放置した。洗浄ステップの後、グリコシル化を繰り返して高収率を確保した。洗浄後、２０分間の脱保護を行い、次の受容体部位を露出させた。このプロトコルを繰り返し、望ましい５糖を優れた各ステップの結合収率（＞９８％）と純度で生成した。完全に自動化した５００分間の合成によって調製された支持体に結合した粗五糖のＨＭＱＣスペクトルを、溶液中で調製した純粋な標準五糖ｎ−ペンテニルグリコシドの溶液ＨＭＱＣスペクトルと比較する。図１７を参照のこと。ＨＲ−ＭＡＳスペクトルの線幅はポリマーであるために広がっているが、望ましい生成物が１０段階の合成ステップの後に得られた主な化合物として観測されていることをきわめて強力に示している。本願発明者らは、生物学的に重要なより大きなオリゴ糖を合成するために、ほかのグリコシル供与体を様々な支持体とより短い結合プロトコルに組み合わせて用いる場合を評価しはじめた。
【００８３】
オリゴ糖の自動化固相合成用のプロトコル
固体支持体上の反応は特に自動化に適している。予備研究で本願発明者らは、溶媒及び試薬輸送に適合させたペプチド合成装置でトリマンノシドを総収率９１％で合成した。
【００８４】
固相リンカー
どの固相合成戦略にも重要な要素は、第一の糖と固体支持体を結合する適切なリンカー基の選択である（表１）。固相有機合成用のリンカーの総説はＦ． Ｇｕｉｌｌｉｅｒ， Ｄ． Ｏｒａｉｎ， Ｍ． Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， １００ （２０００）， ２０９１ を参照のこと。このリンカーはグリコシル化条件と脱保護条件に対して不活性でなければならない。同様に重要なのは、合成の終了時において高収率に切断しなければならない点である。ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成に用いられるものと同様の酸及び塩基不安定性リンカーを、オリゴ糖合成用に改良した。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
シリルエーテルは一般に、供与体結合パラダイム下でモノマーをポリマー支持体に結合させるためによく用いられる。ジイソプロピルフェニルシリルエーテル１などのリンカーは、軽度に酸性な条件と強塩基条件に対して安定で、グリコシルトリクロロアセトイミダート、グリカル、フッ化グリコシル、及びグリコキシルスルホキシドが用いられる場合には有用であることがわかっている。フッ化物ソースで処理してポリマー支持体から遊離させ、最初の結合点が保護されていない遊離オリゴ糖を得る。オリゴ糖合成において一時的な保護基としてシリルエーテルを用いることが多いため、残存する水酸基を区別する場合にはシリルリンカーの組み込みは非常に困難である場合が多い。
【００８７】
リンカーとしてシリルエーテルを用いることを避けて、シリル保護基を一時的に用いることができるようにするために、光感受性リンカーの１種が開発された。Ｕ． Ｚｅｈａｖｉ， Ａ． Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ９５ （１９７３）， ５６７３； Ｒ． Ｒｏｄｅｂａｕｇｈ， Ｂ． Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ， Ｈ．Ｍ． Ｇｅｙｓｅｎ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３８ （１９９７）， ７６５３ 。２などの光感受性リンカーには、ｏ−ニトロベンジルエーテル基を使用することが多い。この官能基は様々な条件に安定であるが、ポリマー支持体からの解離は速度が遅く収率もばらつくことが多い。それにもかかわらず、光感受性リンカーは、合成をデザインする際に有用である別のオルトゴナリティを提供する。
【００８８】
オリゴ糖合成に固有のリンカー戦略には、チオグリコシドを介した第一の糖のポリマー支持体への結合が含まれる。上述のように、チオグリコシドは酸に対して適度に安定で、塩基条件下では不活性である。３などのチオグリコシドを、アルコールまたは水存在下でＮ−ブロモスクシンイミドまたはＨｇ（Ｏ２ＣＣＦ３）２などの親硫試薬を加えてポリマー支持体から解離させると、それぞれアセタールまたはヘミアセタール生成物を得る。このリンカーの明らかな限界は、チオグリコシド供与体との不適合と酸性活性剤での処理に対して安定性が制限されている点である。また、アノマーが混在する可能性があり、還元末端で解離が生ずるためにアノマーの比率を制御するのは困難である。
【００８９】
最近、解離方法にオレフィン複分解を用いた４と同様のリンカーが開発された。オレフィンリンカーは酸性及び塩基性反応条件に安定で、二重結合が最終解離のハンドルとして働く。この選択肢は魅力的である。それはリンカーの官能性が通常用いられる結合及び脱保護条件下で不活性であり、最終解離ステップが数多くの保護基に適合しているためである。重要なことに、この解離生成物にはオレフィンが含まれるため、さらに官能基を操作することが可能になる。
【００９０】
液相オリゴ糖合成と同様に、現在利用されている様々な固相技術の中で特に際立ったグリコシル化法やリンカー戦略は一つもない。リンカー戦略が多いということは、合成法を計画する際に役立つ柔軟性を提供する。新規のリンカー及び解離戦略を開発すれば、固相方法を用いて様々な複雑な糖質を合成することができるであろうことが予想される。
【００９１】
カップリングサイクル
本願発明者らが開発した固相の結合条件は、自動化したオリゴ糖の合成に用いられている。数多くのグリコシル化反応を室温で行うことができ、そのグリコシル化反応には完全に可溶で室温における長期の保存に安定な試薬を用いる。まず初めに、本願発明者らはグリコシルトリクロロアセトイミダート供与体を単糖ビルディングブロックとして用いた。それは、室温でこのユニットを結合させることができるからである。エステル及びシリル保護基を一時的なマスキング基として用いた。それは、除去率が高く迅速だからである。
【００９２】
本願発明者らが調製したへプタマンノシドを、結合サイクルの最初のテスト配列として用いた。モニタを行わなかったため、結合と脱保護の完了を確実に行う必要があった。典型的な結合サイクルでは、グリコシル供与体と活性剤ＴＭＳＯＴｆを５当量ずつ樹脂に輸送した。１時間後、樹脂を洗浄して、結合ステップを繰り返した。樹脂の洗浄と数段階の洗浄後、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液を樹脂に加え、１時間反応させた。さらなる洗浄ステップの後に次の結合サイクルを開始した。合成の完了後、樹脂をエチレンで交差複分解してｎ−ペンテニルグリコシド型のオリゴ糖最終生成物を除去した。自動化合成の成果は分析用ＨＰＬＣで評価し、生成物の量と副生成物（主に欠失配列）の総量とを比較した。
【００９３】
キャッピングステップの導入
１糖単位（ｎ−１）だけを欠失している欠失配列は、必要な生成物から分離することが最も難しく、いずれかの配列の結合サイクル中に生じた不完全な結合ステップが原因で生じる。１つのサイクル中に結合に失敗したオリゴ糖鎖は、その後の伸長ステップの間にうまくグリコシル化することもある。従って、合成の終了時に難しい精製問題が存在することもある。欠陥のある配列の伸長を避けるために、結合サイクルにキャッピングステップ（つまりブロッキングステップ）を含むことができる。各結合が完了するごとに、反応性が高いブロッキング基を用いて遊離ヒドロキシ受容体をキャップすることができる。例えば、ベンジルトリクロロアセトイミダートをキャッピング試薬として（ＴＭＳＯＴｆで活性化して）用い、グリコシル化しなかった位置にベンジルエーテルを生成し、合成の間反応しないようにさせることができる。（ｎ−１）−欠失配列を最小限に留めるために、この単純なキャッピングステップを用いて、オリゴ糖の最終生成物の精製を大幅に簡略化することが期待されている。
【００９４】
オリゴ糖の自動化固相合成
分子レベルの情報の伝達は生命活動の主要なプロセスで、そのプロセスは細胞システムの３つの主要な反復生体高分子であるタンパク質、核酸、及び糖質に主に依存している（図４参照）。生物学におけるタンパク質と核酸の重要性が長い間評価されていたのに対し、天然のオリゴ糖と糖複合体の理解はまだ緒についたばかりである。Ｒ． Ａ． Ｄｗｅｋ， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９６， ６８３ （１９９６）。細胞表面糖複合体はシグナル伝達経路及び細胞認識プロセスに関与しており、数多くの病状に関与すると考えられている。Ｓ． Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２， ２５７ （１９８９）。
【００９５】
急速に成長しつつある分子糖鎖生物学の分野の大きな問題点は、構造が確定している純粋な糖質と糖複合体の不足である。このような生分子は、自然状態では低濃度で微小不均一な形態で見られることが多く、識別や分離が非常に困難である。従って、詳細な生物物理学や生化学の研究に必要な明確なオリゴ糖を十分に入手できるかどうかは、効率的な合成方法にかかっている。オリゴ糖合成は大きく進歩しているが、複雑な糖質の作製には時間がかかり、少数の専門研究施設でしか行われていない。Ｇ． Ｊ． Ｂｏｏｎｓ， Ｅｄ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｂｌａｃｋｉｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９８）。
【００９６】
歴史的に、構造が確定している複雑な糖質を入手するのは非常に困難であった。最近の固相合成法の発達によって、複雑なオリゴ糖の作製は多少簡単になったが、望ましい構造を得るにはまだ高度な専門技術が必要である。本願明細書では、固相合成装置による数種類のオリゴ糖の自動化化学合成法を説明する。リン酸グリコシルビルディングブロックと新規のオクテンジオール官能化樹脂を用いて、分枝１２糖を合成した。目的のオリゴ糖は固体支持体から解離させて簡単に得ることができた。これにより、オリゴペプチドやオリゴヌクレオチドの作製とほぼ同様に、専門家以外でも複雑なオリゴ糖を作製することが可能になった。
【００９７】
最終的には、オリゴ糖合成の一般的で自動化された方法によって、専門家以外でも目的の構造体を迅速に調製することが可能になるだろう。オリゴヌクレオチド（Ｍ． Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０， ２８１ （１９８５））及びオリゴペプチド（Ｅ． Ａｔｈｅｒｔｏｎ， Ｒ． Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８９）） は、現在では固相戦略を用いた自動化合成装置で効率的に日常的に調製されている。ペプチド及びヌクレオチド合成装置が生体高分子の生化学に与えた重大な影響を考えれば、自動化オリゴ糖合成装置が糖鎖生物学の分野に与える影響は容易に想像できるだろう。
【００９８】
自動化オリゴ糖合成
本願発明者らは初めて自動化した固相オリゴ糖合成装置を開発した。固相パラダイムは特に合成プロセスの自動化に役立つ。グリコシル化と脱保護の反復性を、容易に結合サイクルに組み込むことができる。反応を完了させるために過剰量の試薬を用い、一方で、樹脂を洗浄（溶媒を使用）して可溶性の不純物をすべて除去する。糖を固体支持体から離脱させた後に必要な精製ステップは１つだけである。
【００９９】
固相合成の利点に配慮しつつ、本願発明者らは自動化オリゴ糖合成装置の開発のためにいくつかの主要な点について考慮した。それはａ）支持体に結合している伸長する糖鎖の還元または非還元末端のいずれかを用いた全体的な合成戦略のデザイン（Ｙ． Ｉｔｏ， Ｓ． Ｍａｎａｂｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２， ７０１ （１９９８）を参照）と、ｂ）合成中の反応条件すべてに不活性だが必要時に効率的に解離させることができるポリマーとリンカーの選択と、ｃ）標的オリゴ糖の複雑さに見合った保護基戦略と、ｄ）立体特異的及び高収率のグリコシル化反応と、ｅ）温度が可変な条件下で反復的な化学操作を行うことができる装置、である。
さらに、グリコシル化反応は湿度に敏感であるため、連続的に不活性ガス雰囲気下に維持することができるシステムが必要である。さらに、多くのグリコシル化反応は低温で行わなければならないため、冷却剤を循環することができる２つめのキャビティに囲まれたガラス製の反応容器を使用してもよい。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートなどの活性化剤を触媒として用いるには、これらの試薬を正確に計量し輸送する必要がある。
【０１００】
新規の装置をデザインするよりも、本願発明者らは自動化ペプチド合成に用いられる既存の装置を作りなおすことにした。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．社製のモデル４３３Ａペプチド合成装置を本願発明者らの目的のために改造した。糖質合成に用いるために、市販のペプチド合成装置を数カ所改造する必要があった。この装置に数本の試薬ボトルを取り付けた。それらは洗浄用試薬のボトルとグリコシル化反応及び脱保護用試薬のボトルである。供与体種を入れた小型カートリッジを、合成前に合成装置に手作業で取り付けることができる。操作者が介入することなく全ステップの操作が行えるようにサイクルをプログラムした。全試薬及び供与体種の反応容器への輸送と、容器内の収容物の混合は、装置が制御した。
【０１０１】
図５を参照すると、本発明に従って作製された自動化オリゴ糖合成装置２００のある実施態様が描かれている。この自動化オリゴ糖合成装置２００は、反応容器２１０と、単糖供与体溶液を収容する２つの供与体容器２２０ａ−ｂと、活性化試薬溶液を収容する活性化剤容器２３０と、デブロッキング試薬溶液を収容するデブロッキング容器２４０と、ブロッキング試薬溶液を収容するブロッキング容器２５０と、溶媒溶液を収容する３つの溶媒容器２６０ａ−ｃと、溶液輸送システム２７０と、反応容器２１０の温度を調節する（すなわち反応容器２１０の温度を望ましい温度に維持する）温度制御ユニット２９０と、溶液輸送システム２７０と温度制御ユニット２９０を自動的に制御するようにあらかじめプログラムすることができるコンピュータ２８０と、からなる。
【０１０２】
供与体容器２２０ａ−ｂは、グリコシルトリクロロアセトイミダートまたはリン酸グリコシルなど、適切なグリコシル供与体溶液であればいずれも収容することができる。活性化剤容器２３０は適切な活性化試薬溶液であればいずれも入れることができる。一般に、ルイス酸は導電性でオリゴ糖を形成すなわち合成することが示されており、適切な活性化剤として使用することができる。従って、活性化剤容器２３０はシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容するか、またはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナートを含む溶液を収容することができる。デブロッキング容器２４０には、ナトリウムメトキシドまたはヒドラジンを含む溶液など、適切なデブロッキング試薬溶液であればいずれも入れることができる。ブロッキング容器２５０には、ベンジルトリクロロアセトイミダートまたはカルボン酸を含む溶液など、適切なブロッキング試薬溶液であればいずれも収容することができる。このような適切なカルボン酸の１つにはレブリン酸がある。複数の溶媒容器２６０ａ−ｃには、とりわけジクロロメタン、ＴＨＦ、及びメタノールなどの適切な溶媒溶液であればいずれも収容することができる。
【０１０３】
溶液輸送システム２７０は供与体溶液と活性化溶液とデブロッキング溶液とブロッキング溶液と溶媒溶液をそれぞれの容器から反応容器２１０へ輸送できなければならない。特定のグリコシル化反応が湿度に敏感であるため、溶液輸送システム２７０も装置２００の試薬を不活性ガス雰囲気下に維持できる、すなわち試薬を加圧下に維持できなければならない。当業者は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．社製モデル４３３Ａペプチド合成装置など、このような溶液輸送システム２７０が市販されており容易に入手可能であることを理解するであろう。米国特許第５，１８６，８９８号に記載の溶液輸送システムも、本発明に従ったオリゴ糖合成に適切であると考えられるシステムである。
【０１０４】
コンピュータ２８０は、溶液輸送システム２７０及び温度制御ユニット２９０の動作を制御する適切なコンピューティング装置であればいずれであってもよく、例えばパーソナルコンピュータまたはワークステーションであってよい。コンピュータ２８０は、溶液輸送システム２７０の動作を自動的に制御するようにあらかじめプログラムすることができ、結合、洗浄、保護／キャッピング（すなわちブロッキング）及び脱保護の特定のプロトコル用のサイクルをコンピュータ２８０にあらかじめプログラムすることができる。このように、オリゴ糖の自動化固相合成を制御し実現することができる。さらに、コンピュータ２８０は溶液輸送システム２７０と別々の装置であってもよく、またはコンピュータ２８０は溶液輸送システム２７０と統合されていてもよい。コンピュータ２８０と溶液輸送システム２７０が別々の装置である場合、この２つの装置をつなぐ通信ポート／ケーブルまたはＩＲデータリンクなど適切なデータ通信パスが必要である。同様に、反応容器２１０の自動温度制御が必要な場合は、コンピュータ２８０に必要な温度プロトコルをあらかじめプログラムして温度制御ユニット２９０の動作を制御できる。温度制御ユニット２９０の自動制御をコンピュータ２８０で行う場合、コンピュータ２８０は温度制御ユニット２９０とデータ通信ができなければならない。
【０１０５】
温度制御ユニット２９０は、反応容器２１０の温度を必要な温度に制御及び維持することができる適切な装置であればいずれであってもよい。Ｊｕｌａｂｏ ＵＳＡ Ｉｎｃ．社（ペンシルバニア州アレンタウン）から入手できるいくつかの外部冷蔵循環器を、許容しうる温度制御ユニット２９０として使用することもできる。多様な種類のオリゴ糖の自動化固相合成を行うには、温度制御ユニット２９０は、反応容器２１０の温度を設定温度−２５℃乃至＋４０℃、好ましくは設定温度−８０℃乃至＋６０℃に維持することができなければならない。温度制御ユニット２９０の冷却剤は、反応容器２１０を取り巻きインプット及びアウトプットパスウェイで温度制御ユニット２９０に接続することができるスリーブ（示さず）を通して反応容器２１０のまわりを循環させることができる。または、反応容器２１０は二重壁構造で、二重壁構造の外部キャビティには温度制御ユニット２９０の冷却剤を収容することができる。反応容器２１０の温度は、温度制御ユニット２９０を必要な温度にあらかじめプログラムして、例えば５分間ほどのあらかじめ決められた「寒冷浸透」時間の間、反応容器２１０の周囲に冷却剤を循環させて確立することができる。または、温度制御ユニット２９０は、反応容器２１０の壁面に取り付けられた温度センサーを有し、実際の反応容器２１０のキャビティ、つまりオリゴ糖の自動化合成が行われているキャビティ内の温度測定をリアルタイムで行うことができる。したがって、温度センサーは温度制御ユニット２９０にデータをフィードバックすることができ、それにより反応容器２１０の実際の温度をさらに適切に維持することができる。
【０１０６】
図７を参照すると、本発明に従って作製された二重壁冷却反応容器２１０（断面図を示す）のある実施態様が描かれている。反応容器２１０の二重壁構造は、２つのキャビティを形成する。第１のキャビティ２１０ａではオリゴ糖の合成を行い、第２のキャビティ２１０ｂは温度制御ユニット２９０の冷却剤を収容する。温度制御ユニット２９０の冷却剤は、導管２９１及び２９２を通って第２のキャビティ２１０ｂを循環する。導管２９１及び２９２は、例えばゴム引きした材料、または金属材料など、適切な材料であればいずれからできていてもよい。導管２９１及び２９２は、二重壁反応容器２１０の外面にある２つの開口部に機械的なクランプ、テープ、粘結剤、エポキシ系接着剤などで固定することができる。二重壁冷却反応容器２１０は、ガラス製、またはその他の例えばチタンなど適切な材料であればいずれからできていてもよい。
【０１０７】
様々な溶液が溶液輸送システム２７０を通ってキャビティ２１０ａに導入される（図５）。同様に、これらの溶液は、溶液輸送システム２７０が作動して、追加の溶液を導入するか圧縮された不活性ガスを導入することで、キャビティ２１０ａから排出する（排出物として収集する）ことができる。合成装置を稼働させる前に、不溶性樹脂ビーズ２１４を反応容器２１０のキャビティ２１０ａに入れることができる。樹脂ビーズ２１４はオクテンジオール官能基化樹脂から成っていてよく、さらに有機リンカー（示さず）によって樹脂ビーズ２１４に連結するためのグリコシル受容体を有してもよい。有機リンカーはリン酸グリコシルから成っていてよい。溶液は孔の空いたガラスフリット２１６を通ってキャビティ２１０ａから出ることができる。ガラスフリット２１６は溶液を通すことはできるが、樹脂ビーズ２１４とさらに重要なそのビーズ上で形成されたオリゴ糖を反応容器２１０のキャビティ２１０ａ内に保持することができる。
【０１０８】
【実施例】
ここまでは本発明を一般化して説明してきたが、以下の例を参照することでさらに容易に理解することができるだろう。なお、以下の例は本発明の特定の態様及び実施態様を説明する目的のためだけに含まれており、本発明を限定するものではない。
【０１０９】
例１
自動化した固相オリゴ糖合成−−一般実験手順
一般方法
ここで使用したすべての化学薬品は試薬級で、特に記載のない限りそのまま使用した。洗浄サイクルで使用したジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社から購入し（ＨＰＬＣ級）、さらに精製することなく用いた。試薬の調製に用いたジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ社（ＣｙｃｌｅｔａｉｎｅｒＴＭ）から購入し、使用前に中性アルミナカラムに通した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はＪ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ社（ＣｙｃｌｅｔａｉｎｅｒＴＭ）から購入し、使用前に中性アルミナカラムに通した。ピリジンは使用前に水素化カルシウムで還流して蒸留した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（ＴＭＳＯＴｆ）はＡｃｒｏｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。ナトリウムメトキシド（２５％ ｗ／ｖ メタノール溶液）、氷酢酸（ＡｃＯＨ）及び酢酸ヒドラジン（９８％）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。分析用薄層クロマトグラフィはＥ． Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）で行った。化合物の可視化は、プレートを硫酸セリウム−モリブデン酸アンモニウム溶液に浸してから加熱して行った。液体カラムクロマトグラフィは、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ社製２３０乃至４００メッシュ（孔径６０Å）シリカゲルで、指定の溶媒を強制流動させて行った。Ｈ ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ社製ＶＸＲ−５００分光器（５００ ＭＨｚ）で測定し、ＣＨＣｌ３（７．２７ ｐｐｍ）に対するｐｐｍで報告する。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）の単位で報告する。Ｃ ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ社製ＶＸＲ−５００分光器（１２５ ＭＨｚ）で測定し、内部標準のＣＤＣｌ３（７７．２３ ｐｐｍ）に対するδで報告する。ポリマーに結合した化合物は以下の条件を用いてＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲで分析した。すべてのスペクトルはＢｒｕｋｅｒ社製４ｍｍ ＣＣＡ ＨＲ−ＭＡＳ プローブを取り付けたＢｒｕｋｅｒ社製ＤＲＸ−６００分光器を６００ＭＨｚ（Ｈ）において操作して測定した。サンプル（０．４５−０．５５ ｍｍｏｌ ｇ−１を１０ ｍｇ）をセラミックローターの中に入れて、３０乃至１００μＬのＣＤＣｌ３に懸濁させ、磁気角３．０ＫＨｚで回転させた。１Ｄ−ＮＭＲ解析は１Ｄスピンエコー、３２スキャン、緩和時間２秒、総実験時間３分で行った。ＴＯＣＳＹデータは、ｍｌｅｖｔｐパルスシーケンス、混合時間８０ミリ秒、緩和時間１秒、１６スキャン／ＦＩＤ、４００ＦＩＤ、２０４８ポイント／ＦＩＤ、総実験時間２．２時間 で得られた。ＨＭＱＣ実験はｉｎｖｂｔｐパルスシーケンス（ＢＩＲＤシーケンスのＨＭＱＣ）、緩和時間１．３秒、９６スキャン／ＦＩＤ、２５６ＦＩＤ、２０４８ポイント／ＦＩＤ、総実験時間１３．５時間で行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 質量分光は、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製 Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ １０２で、以下の条件で行った。マトリックス溶液の１μｌアリコート（１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）のＴＨＦ溶液）をサンプルホルダーにスポットし、乾燥させた。さらにオリゴ糖溶液の１μｌアリコートをそのマトリックス上に一緒にスポットし、乾燥させて、陽イオンモードで分析した。ＨＰＬＣ分析は分析���（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（Ｒ） ６０ Å、４ μｍ、３．６ ｘ １５０ ｍｍ）及び分取シリカカラム（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ（Ｒ） ６０ Å、６ μｍ、７．８ ｘ ３００ ｍｍ）を用いてＷａｔｅｒｓ Ｍｏｄｅｌ ６００Ｅ Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ 輸送システムで行った。
【０１１０】
一般手順Ａ　α−（１→２）マンノシド の自動合成：
オクテンジオール官能基化樹脂１（２５ μｍｏｌ、８３ ｍｇ、０．３０ ｍｍｏｌ／ｇ 装填時）を反応容器に装填し、オリゴ糖合成装置に挿入した。ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）及びＴＭＳＯＴｆ（０．５当量、１ｍＬ、０．０１２５Ｍ ＴＭＳＯＴｆのＣＨ２Ｃｌ２溶液）で輸送した供与体２（１０ 当量、０．２５ ｍｍｏｌ、１６０ ｍｇ） を用いて、その樹脂をグリコシル化した。懸濁液の混合は３０分間行った（ボルテックス１０秒、放置５０秒）。その樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（各６ ｘ ４ ｍＬ） で洗浄し、二度目のグリコシル化を行った。２回のグリコシル化の終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（各６ ｘ ４ ｍＬ）及び１：９ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ （各４ ｘ ４ ｍＬ） で洗浄した。アセチルエステルの脱保護は、グリコシル化樹脂をナトリウムメトキシド（１０当量、０．５ ｍＬ、０．５ Ｍ ＮａＯＭｅ のＭｅＯＨ溶液）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液で３０分間処理して行った。その樹脂を１：９ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ （各１ ｘ ４ ｍＬ）で洗浄し、二度目の脱保護条件下に３０分間おいた。可溶性不純物の除去のために、１：９ ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ （各４ ｘ ４ ｍＬ）、０．２ Ｍ ＡｃＯＨのＴＨＦ溶液 （各４ ｘ ４ ｍＬ）， ＴＨＦ （各４ ｘ ４ ｍＬ）、及びＣＨ２Ｃｌ２ （各６ ｘ ４ ｍＬ） で洗浄した。脱保護したポリマーに結合したＣ２−ＯＨ α−マンノシドの伸長は、上述のグリコシル化／脱保護プロトコルを繰り返して行った。末端のグリコシドは脱保護しなかったため、解離した生成物のＮＭＲ分析が容易だった。
【０１１１】
一般手順Ｂ　ポリマー支持体からのオリゴ糖の解離
グリコシル化樹脂（２５μｍｏｌ）を５酸化リンで１２時間減圧乾燥し、１０ｍＬフラスコに移した。そのフラスコをエチレンでパージして、グラブ触媒（ビス（トリシクロへキシルホスフィン）ベンジルイジンルテニウム（ＩＶ）ジクロリド４．１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、２０ｍｏｌ％）を加えた。この反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１気圧のエチレン下で３６時間撹拌した。トリエチルアミン（１１１ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ、１６０当量）及びトリスヒドロキシメチルホスフィン（５０ ｍｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ， ８０ 当量）を加え、得られた溶液を室温で１時間撹拌した。Ｈ． Ｄ． Ｍａｙｎａｒｄ， Ｒ． Ｈ． Ｇｒｕｂｂｓ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， ４１３７ （１９９９） 。薄黄色の反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水（３ ｘ ２５ ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ ｘ ２５ ｍＬ）及び食塩水（３ ｘ ２５ ｍＬ）で洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（３ ｘ ２５ ｍＬ）で抽出し、有機混合物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過及び濃縮した。得られたオリゴ糖をシリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィまたは高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で精製した。
【０１１２】
ペンタマンノシド３
一般手順Ａに従って調製した。５量体３のＨ−ＮＭＲスペクトルは、あらかじめ合成した標準試料とすべての点において同一であった。Ｒ． Ｂ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｏ． Ｊ． Ｐｌａｎｔｅ， Ｌ． Ｇ． Ｍｅｌｅａｎ， Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ １， １８１１ （１９９９）。樹脂に結合した５量体のＨＲ−ＭＡＳスペクトルをＨＭＱＣ及びＴＯＣＳＹ法で記録した。その記録は以下に含まれる。ＨＲ−ＭＡＳ ＴＯＣＳＹスペクトル（４．８乃至５．５ｐｐｍ）に５つすべての特徴的なアノマー位プロトン共鳴が認められた。その中にはＨＭＱＣスペクトルの２つのアノマー位プロトンと重なるものがあった。
【０１１３】
へプタマンノシド４
一般手順Ａに従って調製した。７量体４のスペクトルデータはあらかじめ合成した標準試料とすべての点において同一だった。Ｒ． Ｂ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｏ． Ｊ． Ｐｌａｎｔｅ， Ｌ． Ｇ． Ｍｅｌｅａｎ， Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ １， １８１１ （１９９９）。へプタマンノシド合成物を分取ＨＰＬＣ精製して得られた純粋４のＨ−ＮＭＲは以下に含まれる。
【０１１４】
（グラフ１）
2004507467.tif 000014
樹脂から解離後のへプタマンノシド４合成の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝１ｍＬ／分、２０→３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２０分）：７．８分＝へプタマンノシド４、６．２分＝６量体、５．４分＝５量体。
【０１１５】
デカマンノシド５
一般手順Ａに従って調製した。１０量体を分取ＨＰＬＣで精製し、Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで特徴付けした。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４．９乃至５．４ｐｐｍ）における特徴的なアノマー位共鳴によって、１０量体構造を確認した。アセテートの共鳴（２．１ ｐｐｍ）とｎ−ペンテニル共鳴（５．７ｐｐｍ）がそれぞれ１つずつと質量分光データ（計算値Ｍ＋＋Ｎａ（４４７３．６）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢ、ＴＨＦ）Ｍ＋＋Ｎａ（４４７４．０））から、１０量体５を明らかに同定した。
【０１１６】
（グラフ２）
2004507467.tif 000015
樹脂から解離後のデカマンノシド５合成の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝１ｍＬ／分、２０→２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２０分）：５．７分＝デカマンノシド５、５．０分＝９量体、４．４分＝８量体。
【０１１７】
一般手順Ｃ　フィトアレキシン誘導因子 β−グルカンオリゴ糖の自動化合成
オクテンジオール官能基化樹脂１（２５μｍｏｌ、８３ ｍｇ、０．３０ ｍｍｏｌ／ｇ装填時）を、冷却ジャケットを取り付けた反応容器に装填し、改良型ＡＢＩ−４３３Ａペプチド合成装置に導入した。供与体８または９（５当量、０．１２５ ｍｍｏｌ、それぞれ９０ ｍｇ及び１４６ｍｇ） をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）及びＴＭＳＯＴｆ（５当量、１ｍＬ、０．１２５Ｍ ＴＭＳＯＴｆのＣＨ２Ｃｌ２溶液）で−１５℃で輸送し、それを用いてその樹脂をグリコシル化した。この懸濁液を１５分間混合した（ボルテックスで１０秒、放置５０秒）。この樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（各６ ｘ ４ｍＬ）で洗浄し、２度目のグリコシル化を行った。２回のグリコシル化を終了してから、その樹脂を１：９ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ （各４ ｘ ４ ｍＬ）、ＴＨＦ（４ ｘ ４ ｍＬ）及びピリジン：酢酸（３：２、３ ｘ ４ ｍＬ）で洗浄し、１５℃に温めた。レブリノイルエステルの脱保護はグリコシル化した樹脂を酢酸ヒドラジン（４０当量、４ｍＬ、０．２５Ｍ Ｎ２Ｈ４−ＨＯＡｃのピリジン：酢酸３：２溶液）で１５分間処理して行った。その樹脂を２回目の脱保護条件に１５分間置いた。可溶性不純物の除去は、ピリジン：酢酸（３：２、３ ｘ ４ ｍＬ）、０．２Ｍ ＡｃＯＨのＴＨＦ溶液（４ ｘ ４ ｍＬ）、ＴＨＦ（各４ ｘ ４ ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（各６ ｘ ４ｍＬ）で洗浄して行った。脱保護したポリマーに結合したＣ６−ＯＨ β−グルコシドの伸長は、供与体８及び９を交互に用いて上述のグリコシル化／脱保護プロトコルを繰り返して行った。末端のグリコシドは脱保護されていなかったため、一般手順Ｂを用いて遊離させた生成物のＮＭＲ分析を容易にした。
【０１１８】
フィトアレキシン誘導因子 ６糖１０
一般手順Ｃに従って調製した。６量体を分取ＨＰＣＬで精製し、１Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで特徴付けした。特徴的なｔ−ブチル（１．２ｐｐｍ）、ｎ−ペンテニル（５．７ ｐｐｍ）及びレブリノイル（２．２、２．５、２．７）の共鳴と質量分光データ（計算値Ｍ＋＋Ｎａ（２７７６．８）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢ、ＴＨＦ）の観測値Ｍ＋＋Ｎａ（２７７８．０））から、６量体１０を明らかに同定した。
【０１１９】
（グラフ３）
2004507467.tif 000016
樹脂から解離後のヘキサマンノシド１０合成の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝１ｍＬ／分、１７％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：４．７５分＝６量体
【０１２０】
フィトアレキシン誘導因子　１２糖７
一般手順Ｃに従って調製した。１２量体を分取ＨＰＣＬで精製し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで特徴付けした。特徴的なｔ−ブチル（１．２ｐｐｍ）、ｎ−ペンテニル（５．７ ｐｐｍ）及びレブリノイル（２．２、２．５、２．７）の共鳴と質量分光データ（計算値Ｍ＋＋Ｎａ（５３４５．５）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＤＨＢ、ＴＨＦ）Ｍ＋＋Ｎａ（５３４６．２））から、１２量体７を明らかに同定した。
【０１２１】
（グラフ４）
2004507467.tif 000017
樹脂から解離後のＰＥ １２糖７合成の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝１ｍＬ／分、２０→２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：６．７分＝１２量体。
【０１２２】
例２
改良型ペプチド合成装置を用いて、自動化固相オリゴ糖合成装置に関与する変数の系統的な研究を行った。本願発明者らは固相オリゴ糖合成の「受容体結合」戦略を選択した。Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５， ２１４９ （１９６３）。この方法では、反応性グリコシル化剤は溶液で輸送されるが、その一方で求核受容体の水酸基が固体支持体上に露出している。生成的な結合イベントで支持体に結合したオリゴ糖を得、可溶性副生成物をフィルターを通して単純に洗浄してそれを精製する。新しく形成された糖ユニットについている一時的な保護基を除去して別の水酸基を露出させ、再び結合サイクルを続ける。
【０１２３】
生物学的に重要なα−マンノシドの合成は重要な研究の焦点であり、効率的な自動化サイクルを設立するためにこれらの分子（スキーム１、３乃至５）を選択した。トリクロロアセトイミダート供与体２を供与体ビルディングブロックとして選択した。それは、数グラムのスケールで調製でき、室温で活性化できるからである。Ｊ． Ｒａｄｅｍａｎｎ， Ｒ． Ｒ． Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２， ３９８９ （１９９７） 及びその参考文献を参照のこと。２の活性化はルイス酸のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート（ＴＭＳＯＴｆ）を用いて酸性条件下で行った。アセチルエステル保護基の除去はナトリウムメトキシドを用いて塩基性条件下で行った。
【０１２４】
（スキーム１）
2004507467.tif 000018
【０１２５】
酸性及び塩基性反応条件をカップリングサイクルに用いることを可能にするために、ポリマー支持体とリンカーの適合性を調べた。Ｒ． Ｂ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｏ． Ｊ． Ｐｌａｎｔｅ， Ｌ． Ｇ． Ｍｅｌｅａｎ， Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ １， １８１１ （１９９９）。様々な市販のポリマー支持体を調べた。メリフィールド樹脂（１％橋かけポリスチレン）及びポリスチレンベースのＡｒｇｏｐｏｒｅＴＭはカップリングサイクルの間中、優れた性質を示した。本願発明者らの以前の研究は、オレフィンリンカー１はカップリングサイクルの条件に安定だが、合成の最終段階でオレフィン架橋複分解によって固体支持体から解離させることも容易であるということを示した。試薬の濃度及び量と反応時間を変化させることによって、本願発明者らは表２に示すサイクルに到達した。表２の条件をオクテンジオール官能基化１％橋欠けポリスチレンに適用し、ペンタマンノシド３の合成を１４時間で行った（スキーム１）。
【０１２６】
【表２】
2004507467.tif 000019
【０１２７】
樹脂に結合したオリゴ糖を分析する能力は、固相合成法の開発を成功させるために不可欠である。Ｂ． Ｙａｎ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３１， ６２１ （１９９８）。樹脂結合５量体６の２次元核磁気共鳴分析を高分解能磁気核スピン（ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲ）技術（図８参照）を用いて行った。ＮＭＲスペクトルを分析したところ、９７と１０３ ｐｐｍの間に特徴的なアノマー位シグナルが現れた。さらに等核ＴＯＣＳＹ ＨＲ−ＭＡＳ分析によって、５つの固有のアノマー位プロトンが存在することを確認した。６の樹脂上ＴＯＣＳＹ分析については次の例を参照のこと。以前の実験の通り、樹脂結合サンプルのスペクトルに若干の線幅の広がりが見られた。Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｘ． Ｂｅｅｂｅ， Ｇ． Ｄ． Ｓｕｋｅｎｉｃｋ， Ｓ． Ｐｏｃｈａｐｓｋｙ， Ｓ． Ｊ． Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３６， ４９１ （１９９７）。全体的に、ポリマー結合５量体のＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲデータは、溶液中で調製した標準５量体試料と明らかに一致した。精製なしの９ステップの合成後でも樹脂に結合した５糖６の純度は優れていたため、本願発明者らはさらに大きな構造体の合成に挑戦することにした。７量体４と１０量体５の平均収率は１ステップにつき９０乃至９５％だった。単量体１ユニットにつき３時間と反応時間が短かったため、４の合成は２０時間で完了し、総収率は４２％だった。比較のために、へプタマンノシド４を手作業で固体支持体上で合成したところ、１４日間かかり、総収率は９％だった。
【０１２８】
例３
【０１２９】
自動化α−マンノシド構築が成功したので、さらに複雑な目標構造体として完全に保護したフィトアレキシン誘導因子（ＰＥ）β−グルカン７を選択した（図９参照）。Ａ． Ｄａｒｖｉｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２， １８１ （１９９２）。真菌性βグルカンオリゴ糖の存在下では、ダイズ植物から抗生物質フィトアレキシンが放出される。宿主のダイズ植物中のＰＥβ−グルカンによって開始される応答は、植物の中で最も研究されている防御機序である。これらのオリゴ糖はこれまでに溶液中と固体支持体上で合成されており、本願発明者らの自動化作業において優れたベンチマークとして用いることができると予想した。Ｐ． Ｆｕｇｅｄｉ， Ｗ． Ｂｉｒｂｅｒｇ， Ｐ． Ｊ． Ｇａｒｅｇｇ， Å． Ｐｉｌｏｔｔｉ， Ｃａｒｂ． Ｒｅｓ． １６４， ２９７ （１９８７）； ａｎｄ Ｋ． Ｃ． Ｎｉｃｏｌａｏｕ， Ｎ． Ｗｉｎｓｉｓｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｐａｓｔｏｒ， Ｆ． ＤｅＲｏｏｓｅ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１９， ４４９ （１９９７） 及びそれらの参考文献参照。
【０１３０】
分枝β（１→３）／β（１→６） ＰＥ構造体の合成のため、２種類の異なるリン酸グリコシド供与体８及び９の使用を想定した。最近本願発明者らは、グリカールの前駆体から容易に調製できる有用なグリコシル化剤としてリン酸グリコシドを導入した。Ｏ． Ｊ． Ｐｌａｎｔｅ， Ｒ． Ｂ． Ａｎｄｒａｄｅ， Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ． １， ２１１ （１９９９）。保護基を戦略的に検討した結果、レブリノイルエステルを６−Ｏ一時的保護基及び２−Ｏ−ピバロイル基として用いて、グリコシル化反応のβ選択性を完全にした。レブリノイルエステルの脱保護は、ヒドラジンのピリジン／酢酸溶液で行い、リン酸ビルディングブロックはＴＭＳＯＴｆで活性化した。
【０１３１】
ペプチド及び核酸合成とは異なり、オリゴ糖化学に関与する多くの操作は室温では行わない。液相研究から、多くの供与体と同様に、リン酸グリコシルを使用する際にも、最良の結果を得るためには低温にする必要があることがわかった。Ｄ． Ｋａｈｎｅ， Ｓ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｙ． Ｃｈｅｎｇ， Ｄ． Ｖａｎ Ｅｎｇｅｒ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１， ６８１１ （１９８９）。この要求に応えるために、本願発明者らは温度制御した反応容器を設計した。この容器のまわりは、市販の冷却装置に容易に取り付けることができる冷却ジャケットで囲まれている。リン酸供与体８を用いたモデル反応では、自動化サイクルで変化可能な温度を容易に組み込むことができることを実証した。
【０１３２】
カップリング及び脱保護条件はリン酸グリコシルとレブリノイルエステルを使用するために調節した。その結果得られたサイクルを表３に示す。リン酸供与体８の−１５℃での活性化に必要な反応時間は、トリクロロアセトイミダート２に必要な時間よりも短かった。レブリン酸塩は＋１５℃で脱保護し、要した反応時間は１５分間のみで、一般にアセチルエステルの解離に要する時間よりも短かった。ポリマンノシド３−５の合成の時と同様に、２度のグリコシル化と２度の脱保護が行われた。これらの改善点を自動化サイクルに組み込んだ結果、高収率、高純度のモデルβ（１→６） ３糖が得られた。
【０１３３】
【表３】
2004507467.tif 000020
【０１３４】
表３の自動化サイクルを用いて、さらに複雑なＰＥオリゴ糖をリン酸ビルディングブロックを交互に使いながら合成した（スキーム２）。分枝６糖１０の構築は１０時間で完了し、ＨＰＬＣ分析で判定したところ８０％を超える収率を得た。また、本願発明者らは同一のサイクルを用いて１２糖７を１７時間で調製し、５０％を超える収率を得た。特に、液相において合成しなければならないリン酸ビルディングブロックは２つしかなく、この大きさの構造体の組み立てに通常要する手作業を大幅に減少させた。このように自動化によって物質を好都合に生成できる点は、多糖合成の従来の方法をしのぐ大きな改善点である。
【０１３５】
（スキーム２）
2004507467.tif 000021
【０１３６】
例４
複合型３糖
アノマートリクロロアセトイミダート供与体及びリン酸グリコシル供与体の活性化及び結合の手順と共にアセチルエステル及びレブリノイルエステルの脱保護の手順を開発した後、本願発明者らは自らの自動化化学のすべての態様を用いた合成法をデザインした。目標構造体として３種類の別々のモノマーユニットからなる３糖２４を選択し、様々な供与体と一時的な保護基を組み込むための合成法を考案した（スキーム５）。この３糖モチーフを有するグリカンはＧａｌ−β−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃ−β−（１→２）−Ｍａｎ 結合の存在のために合成が困難である。
【０１３７】
（スキーム５）
2004507467.tif 000022
【０１３８】
供与体１１、２２、及び２３を使用するために必要な活性化及び脱保護条件を考慮して、本願発明者らは適切なカップリングサイクルを考案した（表４）。表４に概説した順序に従って、３糖２４の合成を１％橋欠けポリスチレン支持体上で行った（スキーム５）。１０時間のカップリングサイクルの後、３糖２４を支持体から切り離しＨＰＬＣで分析したところ、総収量６０％の２４を得た。これはすべての自動化プロトコルを１つの結合サイクルに組み込んだ初めての例であったことから、本願発明者らにとってこの結果は励みになった。さらに、レブリン酸エステルをフタロイルアミン保護基の存在下で脱保護できたことによって、ほかの手順にも一般的に応用できるオルトゴナルな保護基戦略を提供できた。本願発明者らの自動化プロトコルのために開発された各程度のオルトゴナリティが速度と効率を向上させ、ますます数多くの複雑な糖類の調製が可能になるだろうと考えられる。
【０１３９】
【表４】
2004507467.tif 000023
【０１４０】
まとめると、本願発明者らは、オリゴ糖に生物学的に関連する合成を完全に自動化して固体支持体上で成功したことを報告する。グリコシル化／脱保護サイクルを開発し、α（１→２）マンノシドの１０量体の合成に利用した。２種類のフィトアレキシン誘導因子β−グルカンである、６糖１０及び１２糖７を、リン酸グリコシルを用いて迅速に構築した。本願発明者らは、この技術は専門家以外の者に必要以上の困難を伴わない迅速かつ確実なオリゴ糖の合成を提供できるものと考えている。糖合成に関与する煩雑な手作業がなくなることで、生化学研究用の合成物質が入手しやすくなるだろう。確定した構造体を機械から容易に入手できるようになれば、糖鎖生物学の分野に大きな影響を与え、天然のオリゴ糖及び糖複合体の重要性を完全に理解することができる日が来るかもしれない。
【０１４１】
例５
ビルディングブロック８及び９の合成及び特徴付け
【０１４２】
（スキームＩ）
2004507467.tif 000024
【０１４３】
ジブチル３，４ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−レブリノイル−２−Ｏ−ピバロイル−β −Ｄ− グルコピラノシルホスファート ８の合成
【０１４４】
３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−レブリノイル−Ｄ−アラビノ−ｈｅｘ−１−エニトール （２．１２ ｇ， ５．０ ｍｍｏｌ） をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に溶解し、０℃に冷却した。ジメチルジオキシランのアセトン０．０８Ｍ溶液（７５ｍＬ、６．０ ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を１５分間撹拌した。溶媒を窒素通気下で除去し、まだ残っている残留物を減圧下で１５分間０℃で乾燥させた後、ＣＨ２Ｃｌ２ ２０ｍＬを加えた。この溶液を１５分間かけて−７８℃に冷却してから、リン酸ジブチル（１．０４ｍＬ、５．２５ ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下して加えた。加え終わったら、その反応混合物を０℃まで温めて、ＤＭＡＰ（２．４４ ｇ、２０．０ ｍｍｏｌ） 及び塩化ピバロイル（１．２３ ｍＬ、１０．０ ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を１時間かけて室温まで温めた。溶媒を減圧除去し、残留物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した結果、無色油状の８を３．２９ｇ（９０％）得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ） δ ７．３４ − ７．２４ （ｍ， １０Ｈ）， ５．２３ （ａｐｐ ｔ， Ｊ ＝ ７．６， ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１４ （ａｐｐ ｔ， Ｊ ＝ ７．９， ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８１ − ４．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７２ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７ （ｄ， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３９ （ｄ， Ｊ ＝ １１．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．０， １２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６７ − ３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７６ − ２．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５７ − ２．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９ （ｓ， ３Ｈ）， １．６７ − １．６０ （ｍ， ４Ｈ）， １．４１ − １．３５ （ｍ， ４Ｈ）， １．２０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９６ − ０．９０ （ｍ， ６Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ） δ ２０６．４， １７７．０， １７２．５， １３７．９， １３７．５， １２８．７， １２８．６， １２８．４， １２８．３， １２８．２， １２８．０， １２７．５， ９６．６， ９６．６， ８２．９， ７５．３， ７５．２， ７３．８， ７２．９， ６８．２， ６８．２， ６８．０， ６８．０， ６２．７， ３９．０， ３８．０， ３２．３， ３２．３， ３２．３， ３２．２， ３０．０， ２７．９， ２７．３， １８．８， １８．８， １３．８， １３．７； ３１Ｐ ＮＭＲ （１２０ ＭＨｚ） δ −１．６６。
【０１４５】
ジブチル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→３）−４−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−レブリノイル−２−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−グルコピラノシルホスファート９の合成
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１？３）−４−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−レブリノイル−Ｄ−アラビノ−ｈｅｘ−１−エニトール （１．００ ｇ， １．１４ ｍｍｏｌ） をＣＨ２Ｃｌ２ （５ ｍＬ） に溶解し、０℃に冷却した。０．０８ Ｍ のジメチルジオキシランのアセトン溶液（２５ ｍＬ， １．７７ ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を１５分間撹拌した。溶媒をＮ２通気下で除去し、まだ残っている残留物を減圧下で１５分間０℃で乾燥させた後、ＣＨ２Ｃｌ２を２０ ｍＬ加えた。その溶液を１５分間かけて−７８℃まで冷却し、リン酸ジブチルを５分間かけて滴下して加えた。加え終わってから、その反応混合物を０℃まで温め、ＤＭＡＰ （０．５７ ｇ， ４．７２ ｍｍｏｌ） 及び塩化ピバロイル （０．２９ ｍＬ， ２．３６ ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を１時間かけて室温まで温めた。その溶媒を減圧下で除去し、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィで精製して、無色油状の９を９５０ ｍｇ （７０％） 得た。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ） δ７．３２ − ７．２４ （ｍ， ２５Ｈ）， ５．２２ （ａｐｐ ｔ， Ｊ ＝ ７．９， ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１４ （ａｐｐ ｔ， Ｊ ＝ ６．４， ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９３ （ｄ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８１ （ｄ， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７４ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６４ − ４．５４ （ｍ， ３Ｈ）， ４．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．３８ − ４．３６ （ｍ， １Ｈ）， ４．２３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．３， １１．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１８ − ４．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０７ − ３．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．８０ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．６４ − ３．５４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．２０ （ｓ， ３Ｈ）， １．６３ − １．６１ （ｍ， ４Ｈ）， １．４０ − １．３５ （ｍ， ４Ｈ）， １．２３ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９５ − ０．９０ （ｍ， ６Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１２５ ＭＨｚ） δ ２０６．５， １７６．６， １７２．５， １７１．４， １３８．６， １３８．５， １３８．１， １２９．０， １２８．９， １２８．８， １２８．６， １２８．５， １２８．５， １２８．３， １２８．３， １２８．１， １２８．０， １２７．７， １２７．７， １２７．６， １０３．５， ９６．５， ９６．５， ８４．８， ８２．６， ９．２， ７８．２， ７５．９， ７５．４， ７５．２， ７５．１， ７５．０， ７３．８， ７３．６， ７３．６， ７３．２， ７３．１， ６９．３， ６８．３， ６８．２， ６８．０， ６７．９， ６２．９， ６０．６， ３９．０， ３８．０， ３２．３， ３２．３， ３２．３， ３０．０， ２７．９， ２７．５， ２７．４， ２７．３， ２１．３， １８．８， １８．８， １４．４， １３．８， １３．８； ３１Ｐ ＮＭＲ （１２０ ＭＨｚ） δ −２．３３．
【０１４６】
例６
リン酸グリコシル化の最適温度の評価
【０１４７】
（スキームＩＩ）
2004507467.tif 000025
【０１４８】
室温におけるホスファート８を用いた３量体合成のＨＰＬＣデータ（スキームＩＩ）：
（グラフ５）
2004507467.tif 000026
樹脂から解離後の、室温におけるトリグリコシド合成体の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝ １ ｍＬ／分， ２０→３０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン （２０ 分）： ５分 ＝ ３量体。
【０１４９】
−１５℃におけるホスファート８を用いた３量体合成のＨＰＬＣデータ（スキームＩＩ）：
（グラフ６）
2004507467.tif 000027
樹脂から解離後の、−１５℃におけるトリグリコシド合成体の分析ＨＰＬＣクロマトグラム。流速＝ １ ｍＬ／分， ２０→３０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン （２０ 分）： ５分 ＝ ３量体。
【０１５０】
本願明細書への引用
ここに引用したすべての特許及び公報は、その内容を本願明細書に引用によって援用する。
【０１５１】
等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、ここに説明した本発明の特定の実施例の等価物を数多く認識し、又は確認できることであろう。このような等価物は、上述の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
通常用いられる特定のグリコシル化剤を示す。
【図２】
供与体を固相に結合させた糖質合成を一般的に示す。
【図３】
受容体を固相に結合させた糖質合成を一般的に示す。
【図４】
シグナル伝達プロセスを担う繰り返し生体オリゴマーの主な種類を示す。
【図５】
本発明による自動化オリゴ糖合成装置のある実施態様を示す。
【図６】
本発明による自動化オリゴ糖合成装置の別の実施態様を示す。
【図７】
本発明による二重壁冷却反応容器のある実施態様を示す。
【図８】
樹脂結合と液相の５糖の２次元ＮＭＲスペクトルの比較を示す。
【図９】
本発明の装置を用いて合成した完全に保護されたフィトアレキシン誘導因子（ＰＥ）β−グルカンを示す。
【図１０】
オリゴ糖の自動化固相合成の概要を示す。
【図１１】
リン酸グリコシルを用いたオリゴ糖の自動化合成におけるステップの概要を示す。
【図１２】
リン酸グリコシルを用いた固体支持体上のオリゴ糖合成のサイクルを示す。
【図１３】
リン酸グリコシルを用いた６糖の合成に用いる自動化合成サイクルを示す。
【図１４】
本発明の装置を用いて合成した６糖のＨＰＬＣデータを示す。
【図１５】
オリゴマンノシドの自動化合成におけるステップの概要を示す。
【図１６】
本発明の方法及び装置を用いて合成したオリゴ糖、及びオリゴ糖を合成するために用いた結合サイクルを示す。
【図１７】
本発明の装置を用いた場合と溶液中の両方において合成したオリゴ糖のＨＲ−ＭＡＳ ＨＭＱＣデータを示す。
【図１８】
本発明の装置を用いて合成したへプタマンノシドのＨＰＬＣデータを示す。
【図１９】
トリクロロアセトイミダートグリコシル供与体を用いたデカマンノシドの自動化合成を示す。
【図２０】
リーシュマニアキャップ４糖の自動化合成を示す。
【図２１】
ＧｌｃＡ ３糖の自動化合成を示す。
【図２２】
ポリグルコサミンの自動化合成を示す。
【図１】
2004507467.tif 000028
【図２】
2004507467.tif 000029
【図３】
2004507467.tif 000030
【図４】
2004507467.tif 000031
【図５】
2004507467.tif 000032
【図６】
2004507467.tif 000033
【図７】
2004507467.tif 000034
【図８】
2004507467.tif 000035
【図９】
2004507467.tif 000036
【図１０】
2004507467.tif 000037
【図１１】
2004507467.tif 000038
【図１２】
2004507467.tif 000039
【図１３】
2004507467.tif 000040
【図１４】
2004507467.tif 000041
【図１５】
2004507467.tif 000042
【図１６】
2004507467.tif 000043
【図１７】
2004507467.tif 000044
【図１８】
2004507467.tif 000045
【図１９】
2004507467.tif 000046
【図２０】
2004507467.tif 000047
【図２１】
2004507467.tif 000048
【図２２】
2004507467.tif 000049
【国際公開パンフレット】
2004507467.tif 000050
2004507467.tif 000051
2004507467.tif 000052
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507467.tif 000131
【国際調査報告】
2004507467.tif 000132
2004507467.tif 000133
2004507467.tif 000134