(57)【要約】水溶性ポリマーを使用して空気中の微生物を捕捉し閉じこめるための方法が開示される。水溶性ポリマーは、水又は生理学的希釈剤に直ぐに溶解でき、破壊されないで移送することができるように適切な機械的強度を有しており、水分を保持し、かつ微生物に付着する。無菌状態下での空気中の微生物を迅速にかつ高感度で検出するための方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のために空気中の微生物を捕捉し閉じこめる方法であって、
（ｃ）水溶性ポリマーを成型し；
（ｄ）上記水溶性ポリマーを空気中に存在している微生物にさらす、
工程を含んでなる方法。
【請求項２】
上記水溶性ポリマーが、移送されるのに十分な機械強度を持ち、水又は他の生理学的希釈剤に可溶性であり、水分を保持し、微生物に付着する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記水溶性ポリマーが、５００から５０００００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
水溶性ポリマーが、２０００から２５００００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する、請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
水溶性ポリマーが、１０００から１０００００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する、請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記水溶性ポリマーが、７０％から９０％の加水分解度を有する、請求項１ないし５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記水溶性ポリマーが、７５％から９０％の加水分解度を有する、請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記水溶性ポリマーが、８０％から８９％の加水分解度を有する、請求項１ないし５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記水溶性ポリマーが、１％から５０％の平衡含水量を有する、請求項１ないし８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記水溶性ポリマーが、２％から４０％の平衡含水量を有する、請求項１ないし８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記水溶性ポリマーが、４％から３０％の平衡含水量を有する、請求項１ないし８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記水溶性ポリマーが、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリル酸）ナリウム塩、ポリ（スチレンスルホン酸）、ポリアクリルアミド及びその混合物の群から選択される、請求項１ないし１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記水溶性ポリマーが、ポリ（ビニルアルコール）又はポリ（ビニルピロリドン）である、請求項１ないし１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
無菌環境の空気中の微生物の数を検出する方法であって、
（ａ）空気中に存在している上記微生物を水溶性ポリマーを用いて捕捉し閉じこめ；
（ｂ）上記水溶性ポリマーを希釈剤に溶解して溶液を生成し；
（ｃ）上記溶液から上記微生物を分離し；
（ｄ）上記微生物を、ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザー又はＤ−Ｃｏｕｎｔ（登録商標）アナライザーを用いて蛍光によって検出する、
工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
上記微生物が工程（ｃ）において濾過又は遠心分離によって分離される、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は水溶性ポリマーを使用して空気中の微生物を捕捉し閉じこめるための方法に関する。より詳細には、水溶性ポリマーは、生存及び非生存微生物を更なる分析のために維持する際にビヒクルとして使用することができる。無菌テストのために空気中に存在する微生物の数を提供するための迅速で高感度の方法もまた開示される。
【０００２】
（発明の背景）
ポリマーは、化学構造と重量を調節することによって合成ポリマーを形成するように適合化できる、天然に生じるか又はその化学的性質によって生じる反復化学単位鎖からなる。
合成ポリマーはモノマーの化学反応によって長いポリマー鎖が形成されることにより製造される。合成ポリマーの物理的性質に影響を及ぼす２つの主要な可変要因はモノマー反復単位の化学的性質とポリマーの分子量であり、これは正確に調節できる。しかして、より高分子量のポリマーはより高い機械強度を持つが溶液になると更に高い粘性を持つことが知られている。
【０００３】
ポリマー内の化学基の比を変化させることによって、ポリマーの物理的性質を特定の用途に適応させることができる。例えば、ポリマーの機械強度と溶解度をこのようにして調整することができる。
異なったタイプのポリマーを混合することによって、最終のコポリマーの特性が最適化された特性を示しうる。特定のポリマーの設計と合成によって、特定の機能に必要とされる正確な性質を持つ材料を生産することができる。例えば、特定の処理によって、ポリマー板（９０ｍｍ）の表面積を１平方メートルから１５００平方メートルに増加させることができる。この単一のプロセスは、ポリマーの物理的及び生物学的特性を増強して、環境の生物の回収のためのより効率的なメカニズムとする。
【０００４】
水溶性ポリマーは従来から知られており、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １３６： ｐ５３−７３ （１９９８）中に「Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｉ： Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」と題されてＰｒｏｋｏｐ等によって記載されている。これらのポリマーは、人工心臓、免疫隔離バリア、末期癌患者の苦痛管理用、膵臓ランゲルハンス島の保護等の、多くの用途を持っている。
その医療用用途に加えて、ポリマー材料はまた試験管、サンプルウェル、ピペット先端、使い捨てピペット等々のような多くの必需品において研究室でまた使用されている。
【０００５】
例えば、米国特許第５５０１９５４号に記載されているように、様々なポリマーが、核の形態を保持しながら細胞中のＤＮＡを検出する方法において固体支持体として使用されている。この方法では、ＤＮＡはポリマーメンブレンフィルター上に付着させられ、蛍光標識されたサンプルと共にインキュベートされ、標識プローブを使用して検出される。使用されるポリマーメンブレンはポリカーボネート、フッ化ポリビニリデン、ポリスルホン、ナイロン、セルロースエステル、ニトロセルロース及びテフロン（登録商標）（ＰＴＦＥ）から製造されている。この特許に記載されているポリマーメンブレンは、この方法に対しての必要条件の一つが、ポリマーメンブレンが一連の処理と洗浄にわたって細胞材料を保持し、無傷のまま残さなければならないことから、水不溶性ポリマーである。
【０００６】
ＥＰ５４６０３２は、ポリマーの分散水溶液と混合し、混合物をコヒーレントフィルムに塗布することによって、分子、ポリマー又は微生物を固定する方法を記載している。形成されたメンブレンは水不溶性であり、乾燥した状態で保存され得る。
微生物の分析は多くの異なった領域、例えば食品の製造、飲み水、医薬製造における製薬的用途、化粧品分析、電子産業及び医療用途の分析において重要である。
様々な微生物の試験のためのサンプルは一般に例えば綿棒を用いて捕集され、分析のために研究室に送られる。分析プロセスでは、サンプルを先ず培養することが必要となる。
【０００７】
あるいは、バイオセンサーを用いる微生物の分析のための迅速な方法がまた従来から知られている。例えば、ＷＯ９９３１４８６は、金属が被覆されたポリマーフィルムと、分析物に特異的に結合する受容材料がその上にある被覆金属上にパターン化されたレセプター層が印刷されているバイオセンサーを開示している。バイオセンサーに付着した微生物の量はレーザの照射時に回折像を介して測定されている。
他のタイプのバイオセンサーがＷＯ９８２７４７に開示されており、それは、金属が被覆されたポリマーフィルムと、そのフィルム上に印刷された、分析物に対して特異的な受容材料をその上に持つ自己組織化単層膜を有する。自己組織化単層膜はあるパターンに印刷され、その結果、バイオセンサーが分析物に結合すると、バイオセンサーが透過光を回折させてパターンを形成する。
バイオセンサーは環境中の様々な微生物を検出することができるけれども、回折像の測定はしばしば精度が悪く、不正確で、感度に欠けることが理解されなければならない。
【０００８】
更に、多くの微生物学の分野において、活性な微生物の数の決定は全数のカウントよりも重要である。残念ながら、これまでの培養法では実際に生存している微生物の割合が過小評価され、全ての微生物粒子を示す総数によりこの割合が過大評価されると広く認識されている。
サンプル中に存在する微生物の正確な数を得ることに伴う問題に加えて、成長培地での培養技術は時間がかかり、結果を得るのに一般に約１８時間から２０日を要することもまた知られている。常套的な成長培地の使用は非特異的で自然であり、よって変動があり制御できない。
微生物を採取した後にそれを培養する必要性を解消する一方法がＥＰ０８１６５１３Ａ１に記載されている。この文献は、微生物を含んでいるかもしれない表面に微生物を捕集するための感圧式接着シートを使用することを開示している。接着シートは水溶性ポリマーと微生物の通過を許容しない水透過性膜から主として構成された接着層のラミネートからなる。よって、ＥＰ０８１６５１３Ａ１は、少なくとも２層の接着シートを互いに接合させることを必要とし、その一方の層がサンプリング後のプロセスで微生物を捕捉するように作用する。
【０００９】
更に、感圧式接着シートを用いての微生物のサンプリングには、微生物の蓄積がシート上に達成されるように試験対象の表面に接着層を接触させることが必要である。よって、接着層又は水中に存在する発色剤を用いて微生物の視覚による観察は達成されるが、この方法はあまり感度がよいものではない。
ＥＰ０８１６５１３Ａ１では、微生物をサンプリングする、少なくとも２つのラミネート層を必要とするその装置、及び／又は微生物を検出するその方法が、非常に高い検出感度が要求される空気サンプルの無菌テストに使用できることは開示も示唆もされていない。
確かに、無菌環境の特有の管理と制御が医薬、製剤の加工及びある場合には医療機器において必要とされていることは従来からよく知られている。無菌製品の多くの部分は無菌処理プロセスによって製造されているが、それはこのプロセスがプロセスの流れからの微生物の排除と充填時に微生物が容器に入ることを防止するものであるからである。無菌処理プロセスは一般にクリーンルームで行われ、クリーンルームは常に注意深く監視される。
【００１０】
製薬産業での無菌状態の使用に加えて、電子産業もまた電子部品、コンピュータチップ、コンピュータ部品等々の製造のためにクリーンルームを使用し監視している。
環境監視についてのこれら２種の産業における差異は、電子産業では、非生存微生物又は粒子状物質が一般に測定され、生存粒子状物質又は微生物の数にはあまり重点が置かれていないことである。これに対して、製薬産業では生存微生物の点により大きな関心がある。
無菌状態を監視する一方法は全粒子状物質数を確認することである。この方法は環境の微生物量に関しての情報は提供しない。粒子状物質カウンターの基本的な限界は、それらが０．５μｍ以上の粒子だけを測定することである。空気によって運ばれる粒子は遊離して浮かんでいるか単一の細胞ではなく、１０μｍから２０μｍの粒子と結合していることがよくあり、よって微生物をカウントしないで粒子状物質だけをカウントする試験は落胆させられるものである。
【００１１】
クリーンルームは特定の基準に合致しなければならないことは従来から知られている。実際、連邦の基準には含まれていないが、時間当たりの換気及び速度の規定は通例である。しかして、例えば無菌処理環境のクラス１０００００のルームは時間当たり最少２０の換気を行うように設計される一方、クラス１００のクリーンルームは時間当たり１００を越える換気を行う。汚染物を希釈して除去することによって、多量の空気が無菌生産中に空気によって運ばれる汚染を低減する可能性がある。
異なったグレードのクリーンルームに対して満たされなければならない所定の空気清浄度ガイドラインが存在する。しかして、例えばクラス１００では、全てのデータ地点の移動平均が空気１立方メートル当たり１コロニー形成単位（ｃｆｕ）未満でなければならず、採られた全てのサンプルの少なくとも８５％がゼロでなければならない。クラス１００００のクリーンルームでは、採られた全てのサンプルの少なくとも６５％がゼロでなければならず、クラス１０００００では、サンプルの少なくとも５０％がゼロでなければならない。よって、これらの値は安全な環境監視を提供するためには非常に重要である。
【００１２】
スリット対寒天サンプラー、シーブインパクター、遠心サンプラー、サーフェスエアーシステムサンプラー及びジェラチンフィルターサンプラーのような、空気によって運ばれる生存微生物を採取する多くの方法が従来から知られている。これらのサンプラーの全てはサンプリングユニットを通して空気を引き込むか押し出すポンプ、モータ又は真空を必要とする。これらの「アクティブな」サンプリング装置を使用するのは、必要な空間を占有することから、クリーンルームにスペース上の制限がある場合には都合が悪い。更に、これらの装置は、また、機器のサイズと位置あるいは装置がサンプリング媒体又はフィルター中に空気を強制的に移送する方式の結果として方向のある空気流を乱すおそれがあることから、安全な無菌状態に対しては危険である。
「アクティブではない」サンプリング装置の他のタイプは沈降プレートである。沈降プレートは長い期間にわたって空気環境を定性的に評価するための簡単で安価な方法である。落下プレートはペトリ皿に配された寒天からなり、アクティブなサンプリング装置の使用が困難である重要な領域で有用である。実際、沈降プレートは、４ないし５時間さらされると、アクティブなサンプリング装置で観察されるものと同様な検出の限界をもたらしうる。
【００１３】
しかしながら、これらの方法の多くでは、微生物を捕捉するための媒体として寒天が使用されており、寒天の不足並びに製品変動性のために寒天に代わる適切な代替物が探索されていることが知られている。
更に、滅菌状態下での微生物の監視はいまだ完全ではないことが従来からよく知られている。サンプリング感度の変動と検出の限界はサンプリング方法自体の固有の特性に帰するばかりでなく、培地の変動、インキュベーション温度、サンプルの取り扱い及びサンプルの偶発的な汚染にも帰する。
更に、クリーンルームの微生物の評価は定量的な評価ではない方法を用いてなされている。それどころか、使用される方法はせいぜい半定量的と定義できる。実際、多くの方法は、非定型的に高レベルの微生物汚染の存在を測定するのに適しているに過ぎず、その精度と正確さは非常に乏しいものである。
【００１４】
従って、空気サンプルの迅速な分析方法ばかりでなく、特に無菌テスト領域において、より高い精度でこの分析を達成するための手段を提供することが微生物の環境分析の分野で必要とされている。
しかして、従来技術に伴う問題を解消することが本発明の目的である。
空気中の微生物を捕捉し閉じ込めるために水溶性ポリマーを使用することが本発明の目的である。
空気サンプルの無菌分析のための高感度の手段を提供することが本発明の他の目的である。
移送できるように十分な機械強度を持ち、水又は他の生理学的希釈剤に可溶性で、生存微生物を生存状態に維持しながらある程度まで水分を保持し、空気中の微生物を捕捉することができるポリマーを提供することが本発明の他の目的である。
未知の空気サンプル中の微生物を迅速に検出するための方法を提供することが本発明の更に他の目的である。
【００１５】
微生物を更に成長させることを必要としない、未知の空気サンプル中の微生物の検出方法を提供することが本発明の更なる目的である。
成長培地を用いるという変動し制御できないシステムを避ける方法を提供することが本発明の他の目的である。
これらの目的と他の目的は、発明の概要、好適な実施態様の説明及び特許請求の範囲において実証される本発明によって達成される。
【００１６】
（本発明の概要）
本発明は、分析のために空気中の微生物を捕捉し閉じこめる方法であって、
（ｃ）水溶性ポリマーを成型し；
（ｄ）上記水溶性ポリマーを空気中に存在している微生物にさらす、
工程を含んでなる方法に関する。
本発明の他の側面では、無菌環境における空気中の微生物の数を検出し、１個までカウントする方法であって、
（ａ）空気中に存在している上記微生物を水溶性ポリマーを用いて捕捉し閉じこめ；
（ｂ）上記水溶性ポリマーを希釈剤に溶解させて、溶液を生成し；
（ｃ）上記溶液から上記微生物を分離し；
（ｄ）上記微生物を、ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザー又はＤ−Ｃｏｕｎｔ（登録商標）アナライザーを用いて蛍光によって検出する、
工程を含んでなる方法が提供される。
【００１７】
（発明の好適な実施態様の詳細な説明）
ここで使用される場合、「微生物」という用語は、藻類、細菌、真菌類（酵母、カビ及びカビ胞子）（苔癬を含む）、リケッチア、原虫、花粉、寄生虫、ダニ、ウイルス及びウイルス様物質（ｓｕｂｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ）を包含する。
ここで使用される場合、「細菌」という用語は、胞子形成細菌を包含し、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ビブリオ・フェータス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｅｔｕｓ）、鼠咬症スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｉｎｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｉ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、淋菌（Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ）等々、並びに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、チモテ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）、ソンネ（赤痢）菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、ザイモモナスｓｐ（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｓｐ）、エドワードシエラ・イクタルリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｉｃｔａｌｕｒｉ）等々を含む。
ここで使用される場合、「水溶性ポリマー」という用語は、ポリマーが水及び／又は生理学的希釈剤に可溶性であり、ポリマーを移送できるように十分な機械強度を持ち、ある程度まで水分を保持し、微生物に付着することを意味する。
【００１８】
「生存微生物」とは、微生物が適切な条件下で生存することができることを意味する。
「適切な条件」とは、微生物が乾燥せず、又はストレスを受けないことを意味する。
「捕捉する」とは、微生物が水溶性ポリマーによって環境から隔離されることを意味する。
「閉じこめる」とは、微生物が水溶性ポリマーに付着するかあるいは水溶性ポリマーによって捕捉等されることを意味する。
「環境（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」とは、それらが空気、物理的物体、表面等々かどうかに拘わらず、周囲（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｓ）を意味する。
ここで使用される場合、「ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）」及び「ＣｈｅｍＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）」という用語は相互に交換可能に使用され、同じ機器である。その機器は合衆国においては「ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）」と呼ばれ、欧州では「ＣｈｅｍＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）」と呼ばれることは従来からはよく知られている。
【００１９】
より特定的には、本発明は、水溶性ポリマーを使用して空気中に存在している微生物を捕捉し閉じこめる方法に関する。好ましくは、本発明は、例えば無菌状態が維持されなければならないクリーンルームに存在する微生物の環境分析を含む。微生物を捕捉し閉じこめた後、微生物は更なる分析のために実験室に更に移送されうる。
捕捉され閉じこめられる微生物は生存微生物、非生存微生物及びそれらの混合物でありうる。本発明の好適な実施態様では、水溶性ポリマーを使用して、空気中の生存微生物が捕捉され閉じこめられる。ついで生存微生物は移送され分析にかけられる。
【００２０】
微生物を水溶性ポリマー上に捕集したあと、微生物はＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）又はＤ−Ｃｏｕｎｔ（登録商標）アナライザーを使用して分析される。これらの特定のアナライザーの使用によって、サンプルの受け取りからおよそ９０分以内に微生物のカウントが得られ、ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザーを用いて空気中に存在する微生物の有無から微生物１個まで測定することができる。このタイプの分析の感度はクリーンルームのような無菌処理プロセス中に存在しうる微生物を管理するためには極めて重要である。更に、分析の前に微生物を培養する必要はなく、よって時間と費用を節約できる。
【００２１】
本発明において使用される水溶性ポリマーは環境分析に適合化されなければならず、明確に定まり再現性のある物理的性質をもって調製されなければならない。更に、本発明において使用される水溶性ポリマーは水及び／又は生理学的希釈剤に直ぐに溶解できなければならず、破壊されないで移送できるように適切な機械強度を持っていなければならず、捕捉され閉じこめられた微生物が分析時に生存しているようにある程度まで水分を保持し、また空気中の微生物に付着しなければならない。
水溶性ポリマーは十分な微生物の捕捉のために大なる表面積の形態を持ち、非毒性で、良好な皮膜形成性又は成型性、加工性、溶解後の濾過性を持ち、望まれるならば非殺菌性で、好ましくは滅菌性であるのが好ましい。
【００２２】
本発明において使用される水溶性ポリマーは天然でも合成でもよい。天然ポリマーが使用される場合、上述の特定の特性を達成するように、例えばポリマーグラフト化又は酸化によって改変することができる。構造的に明確に定まった水溶性ポリマーを、微生物を捕捉し閉じこめるプロセスで使用することが好ましい。
本発明において使用されるポリマーは水溶性ホモポリマー、水溶性コポリマー、一を越えるホモポリマー／コポリマーの混合物、多孔性ポリマー等々でありうる。これらのポリマーは上述の特定の性質を生じるように設計し合成することが可能である。
【００２３】
より詳細には、本発明の水溶性ポリマーは、その機械強度によって特徴付けられる；つまり、それらは破壊されることなく移送可能であり、よって、５００から５０００００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２０００から２５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１０００から１０００００ｇ／ｍｏｌの範囲内にある特定の分子量を有する。
更に、水溶性ポリマーは、水及び／又は他の生理学的希釈剤に可溶性でなければならず、この特性は、分子量と、適用可能な場合には、加水分解度とに依存する。この溶解性の基準によって包含される特定の分子量は上述のとおりである。加水分解度に関しては、適用される場合には、本発明の水溶性ポリマーは、７０％から９０％、好ましくは７５％から９０％、最も好ましくは８０から８９％の加水分解度を有する。
【００２４】
更に、本発明の水溶性ポリマーは、ある程度まで水分を保持しなければならない。この特性は、これらのポリマーを成型し空気乾燥させた時の平衡含水量によって測定できる。より詳細には、平衡含水量は１ｗ／ｗ％から５０ｗ／ｗ％、より好ましくは２ｗ／ｗ％から４０ｗ／ｗ％、最も好ましくは４ｗ／ｗ％から３０ｗ／ｗ％でなければならない。
機械強度、親水性及び水分保持性という上記の性質によって、本発明の水溶性ポリマーは実施例において実証されるように微生物に付着する。よって、空気中に存在する微生物を本発明で特定した水溶性ポリマーを用いて容易に捕捉し閉じこめることができる。
【００２５】
好適な実施態様では、本発明において使用されるポリマーは次の性質をまた有しうる：
（１）ポリマー粉末は雰囲気温度で適当な希釈剤に直ぐに溶解しなければならない；
（２）それらは皮膜形成又は成型性を有していなければならず、均一なフィルムとして又はモールドに成型できる；
（３）それらは良好な機械的性質を持ち、理想的にはそれらが注入された容器から破壊しないで容易に取り外されなければならない；
（４）ポリマーフィルム、モールド、ビーズ又はミクロスフィアは合理的な時間スケールで雰囲気温度で水に完全に溶解しなければならない；
（５）ポリマーフィルム、モールド、ビーズ又はミクロスフィアは溶解して、メンブレンを通して濾過可能である透明で均質な溶液を水で形成しなければならない；
（６）障害となるポリマー残留物が濾過後にメンブレン上に残ってはならない；
（７）ポリマーは非殺菌性でなければならない；
（８）ポリマーフィルム、モールド、ビーズ又はミクロスフィアは微生物に対して付着性でなければならない；
（９）好ましくは、ポリマーは１２０℃まで熱的に安定、すなわちオートクレーブ条件で安定か、放射線に対して不活性でなければならない；
（１０）ポリマーは水分を保持しなければならない；
（１１）ポリマーは滅菌時に化学的に架橋して不溶性ゲルを形成することがあってはならない。
【００２６】
本発明において使用することができるポリマーの例は多孔性又は水溶性合成ポリマーでありうる。多孔性ポリマーは、例えば、Ｙａｎｇ及びＺｈａｎｇ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １１４， ｐ１４５−１５５ （１９９６）の方法を使用して調製することができる。水溶性合成ポリマーには、限定されるものではないが、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）ナリウム塩（ＰＡＭＰＳＡ）、ポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳＳ）、ポリアクリルアミド、アガロース、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）（ＰＨＥＡ）等々が含まれる。
２種のコポリマー又は一を越えるホモポリマー／コポリマーの混合物をまた用いることができる。ポリマーはポリマーの様々な性質を所望されるように変更し又はあつらえることもまたでき；つまり、例えば機械強度、水溶解特性、微生物保持品質、水分保持品質及びその組み合わせを増加又は減少させることができる。
【００２７】
本発明の最も好適な実施態様では、水溶性ポリマーとして、１０００から２５０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは５０００から１０００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは７５００ｇ／ｍｏｌから２５０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；５０００から５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１００００から１０００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは２００００から７５０００ｇ／ｍｏｌのポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）；５００から１０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１０００から５００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは２０００から１００００ｇ／ｍｏｌのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）；２０００から２５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは５０００から１０００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１００００から５００００ｇ／ｍｏｌのポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）；１０００から２５００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは２０００から１０００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは５０００から５００００ｇ／ｍｏｌのポリ（アクリル酸）−ナトリウム塩（ＰＡＭＰＳＡ）；及び５００から５０００００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１０００から５００００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１５００から１００００ｇ／ｍｏｌのポリアクリルアミドを使用するのが好ましい。
【００２８】
本発明の最も好ましい実施態様では、１００００から１０００００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量と８０％から９０％の範囲の加水分解度を持つポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を用いるのが好ましい。
ポリマーは、フィルム、スワブ、プレート、ファイバー、ディスク、接触板、ミクロスフィア、ビーズ等々の形態に成形できる。ポリマーの形状は重要ではなく、空気のサンプリングが必要とされる環境に適応させることができる。これらの形状の全ては多孔性又は非多孔性ポリマーを用いて適合させることができる。
【００２９】
水溶性ポリマーが平らな物体、例えばフィルム、プレート又はディスクの形態に成形される場合、ポリマーの厚みは５０μｍと５ｍｍの間の範囲で変わりうる。５０μｍから１ｍｍの範囲の厚みを持つのが好ましい。
ミクロスフィア又はビーズが望ましい場合は、従来から知られている押出方法又はエマルション／懸濁液の方法を使用することができる。例えば、ミクロスフィアは、Ｔｈａｎｏｏ等， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５， １６（１９９３）の方法によって調製することができる。
ミクロスフィアのサイズは捕捉し閉じこめる必要がある微生物の量に依存して変動しうる。サイズは５０ｎｍから３ｍｍ、より好ましくは１μｍから１ｍｍ、最も好ましくは２５０μｍから５００μｍの範囲とできる。
【００３０】
水溶性ポリマーは従来から知られている方法に従って溶液から成型することができる。例えば、ポリマー粉末は、望まれる場合は、希釈剤に溶解され滅菌されうる。
一般に水溶性ポリマーを溶解させるために使用される希釈剤は一般に細菌を含まない水である。しかしながら、リン酸緩衝生理食塩水、蒸留水、脱イオン水、ＷＦＩ水、滅菌水及びそれらの混合物をまた使用することができる。必要ならば、ポリマー溶液のｐＨは希酢酸又は水酸化ナトリウムを用いて所望のｐＨ、例えば中性ｐＨに調整することができる。
【００３１】
滅菌が望ましい場合、水溶性ポリマーがその水溶解性、機械強度を保持し、乾燥せず、その捕捉及び閉じこめ能を維持して、微生物が水溶性バイオポリマー中で生存するかぎり、如何なる滅菌法でも用いることができる。より特定的には、ポリマーは、オートクレーブ（１２１℃で１５分）を用いて、ガンマ線照射（１０Ｋグレイから３０Ｋグレイ、好ましくは２０Ｋグレイの線量）により、あるいはエチレンオキシド処理を利用して、殺菌することができる。
水溶性ポリマー溶液はポリエステルメンブレンを通して濾過して、水溶性ポリマー溶液を清浄にすることができる。一般に、０．３μｍから０．６μｍ、好ましくは０．４μｍから０．５μｍ、より好ましくは０．４５μｍのメンブレンが使用される。
滅菌後、希釈された水溶性ポリマーはついで上述のようにして適当な形状に成形され、雰囲気温度で又は層流フュームフード内で溶液を蒸発させることによって成型される。
【００３２】
一般に、成型の間の水溶性ポリマーの濃度は約１重量％から２０重量％、好ましくは１重量％から１２重量％、より好ましくは５重量％から１０重量％の範囲である。２種のポリマー又は一を越えるホモポリマー／コポリマーの混合物を用いる場合、同じ最終濃度が使用される。例えば、１％のポリ（ビニルアルコール）と４重量％のポリ（ビニルピロリドン）のコポリマー混合物を使用することができる。
典型的な手順では、一定分量の水溶性ポリマーを成型することができる。例えば、５ｍｌの１０％ポリマー溶液をペトリ皿に加えることができ、水溶性ポリマーを成型するために層流フード中で室温で水を蒸発させる。
【００３３】
水溶性ポリマーは好ましくはクリーンでダストのない条件下で調製され成型されなければならない。
「一般には」空気の監視のために、水溶性ポリマーは、９０ｍｍから１５０ｍｍの直径、より好ましくは５０ｍｍから１３０ｍｍの直径のサイズを持つペトリ皿で成型される。一般には、表面上の微生物の監視のような他の環境への応用の場合よりも、空気のサンプリングにおいてより多量のポリマーが必要となる。
ポリマーを成型後、水溶性ポリマーは空気にさらされ、そこに微生物が捕捉され閉じこめられる。サンプルは好ましくは従来から知られた方法によって無菌状態下で収集される。
【００３４】
例えば、特定の環境又はルームにおける微生物の量を測定することが望まれる場合、成型された水溶性ポリマーは、１から１０時間、好ましくは１．５から８時間、より好ましくは２から４時間の間、その環境又はルームに放置されうる。水溶性ポリマーはトラップとして作用し、ポリマー中に微生物を閉じこめる。
あるいは、水溶性ポリマーは適当なフレームに取り付け、通気坑の前に吊すことができる。
未知のサンプルを水溶性ポリマー上に配し、又は捕捉し閉じこめた後、未知のサンプルを含む水溶性ポリマーは、ペプトン及び０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（登録商標）又はＷＦＩ水、無菌水、殺菌水、リン酸緩衝生理食塩水等々のような希釈剤中に再懸濁される。
【００３５】
捕捉された微生物は遠心分離又は濾過によって回収することができる。好適な実施態様では、濾過工程が使用される。再懸濁されたポリマー溶液は０．１ミクロンから５ミクロンの間、好ましくは０．２ミクロンから４．５ミクロン、最も好ましくは０．４ミクロンのメンブレンを通して濾過することができる。
再懸濁されたポリマー中の微生物の数量はＤ−Ｃｏｕｎｔ（登録商標）アナライザー（シェミュネックス）を用いて、あるいは出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５６６３０５７号に記載されたＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザー（シェミュネックス）を用いて決定される。これらの２種のアナライザーを用いると、サンプル中に存在する微生物の数を９０分以内で分析することができ、分析前に微生物を成長させることを必要としない。アナライザーは双方とも分析にレーザ光線を用いる細胞数測定器である。
【００３６】
この好適な実施態様では、微生物を含む再懸濁されたポリマー溶液はＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）を用いて分析することができる。ついで、サンプルは０．４ミクロンの多孔性メンブレンを通して濾過される。
表面に保持されている微生物は、Ｄ−Ｃｏｕｎｔ（登録商標）アナライザー又はＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザーのためにサンプル中に標識溶液を直接加えることによって標識される。サンプルの濾過後に濾過メンブレンの表面に保持される微生物は、蛍光マーカー又は蛍光を発する任意の薬品を使用して標識される。
本発明において使用することができる蛍光標識は、限定されるものではないが、ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖのようなフルオレッセイン誘導体に基づく蛍光染料を含むが、他の種類の蛍光マーカー、例えばカスケードブルー、ルシファーイエロー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、アクリジンオレンジ等々も含む。
【００３７】
この好ましい実施態様では、ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖが使用され、微生物を保持するメンブレンを、次のようにして調製されたＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖ溶液に接触させる：
１００μｌのＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖを１０ｍｌの濾過した（０．２２μｍ）ＣｈｅｍＳｏｌ標識バッファーに加えた。溶液を完全に混合した。
ＷＯ９８／５５８６１に記載されたプロトコールに従って、メンブレンを蛍光染料と共にインキュベートした後、メンブレンをＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザーで分析する。分析後、アナライザーによって検出した蛍光事象の量はサンプル中の微生物数に相関する。
【００３８】
本発明とその利点を更に説明するために、次の特定の実施例を示すが、これらは例証のためだけのものであり決して限定するものではないものと理解される。
【００３９】
（実施例）
実施例１−ポリマーの調製
ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）フィルムの調製
１００００ｇ／ｍｏｌの平均分子量と８０％の加水分解度を有するポリ（ビニルアルコール）（ＣＡＳ番号９００２−８９−５）５ｇを室温で撹拌しながら水（１００ｃｍ３）に溶解させた。十分に溶解したところで、この溶液をついでオートクレーブした。２０ｍｌのその溶液を滅菌したプラスチック製ペトリ皿に加えた。ついで、層流ヒュームフード中で雰囲気温度で水を蒸発させることによってフィルムを空気中で成型した。フィルム成型体の生じる時間は、層流の空気流の条件に依存し、約１０時間であった。上述の手順で測定したフィルム中の平衡含水量は約６重量％であった。
【００４０】
ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）フィルムの調製
４４０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するポリ（ビニルピロリドン）（ＣＡＳ番号９００３−３９０８）５ｇを室温で撹拌しながら水（１００ｃｍ３）に溶解させた。十分に溶解したところで、この溶液を０．４５ミクロンフィルターに通して濾過した。１％の溶液を滅菌したプラスチック製ペトリ皿に加えた。ついで、層流ヒュームフード中で室温で水を蒸発させることによってフィルムを空気中で成型した。フィルム成型体の生じる時間は約１６時間であった。
【００４１】
実施例２−ポリマーの含水量と物理的性質
５％から１０％まで、つまり１００ｍｌ水中５ｇから１０ｇのポリマーまで変動する濃度範囲で水溶液からフィルムを成型した。５ｍｌの１０％ポリマー溶液を小さなペトリ皿に加え、水を室温と雰囲気圧で蒸発させた。ペトリ皿から無傷でフィルムを取り外し、フィルムの機械的性質を、水溶性ポリマーが溶解するのにかかった時間並びに濾過時間を測定することによって、評価した。
しかして、フィルムを純水（２０℃、５０ｍｌ）に再び溶解させ、溶解にかかった時間を記録した。
濾過試験は、ぞれぞれ０．２ミクロンと０．４ミクロンの孔径を有する二種の異なった濾過メンブレンを使用して、標準的な条件（４００ｍｂａｒ）下、１、２及び５％の３通りの異なった濃度で全ての水溶性ポリマー（５０ｍｌ溶液）について実施した。
水分保持性を決定するのに重要であると考えられたため、成型フィルムの幾つかについて含水量を平衡化した。フィルムは、水に希釈し、層流フュームフードで乾燥させた後、サンプルを一定重量になるまで放置するという通常の方法によって、空気中で成型した。ついで、サンプルを、再びサンプルが一定重量になるまで１００℃の真空オーブンで乾燥させた。これらの測定によって、二つの一定重量の間の質量差から平衡含水量を算定することができ、それは水の質量に等しい、つまり質量−乾燥重量である。
【００４２】
実施例３−細胞毒性実験
上記のポリマー溶液、つまりＰＶＡ又はＰＶＰを、５０ｍｌの予め濾過されたペプトン（１ｇ／リットル）及び０．１％トゥイーン８０（登録商標）中に再懸濁させた。約１０から１０３個の次の微生物を別個のチューブの再懸濁ポリマー溶液に加えた。
大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、枯草菌、鵞口瘡カンジダ及びクロコウジカビ
ついで１０ｍｌの各ポリマー／微生物を、シェミュネックスによって開発されＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）として市販されている「ＴＣＶ」及び「Ｆｕｎｇｉ」のプロトコールを用いてＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）使用して分析した。
より詳細には、これらのプロトコールは一般に以下に記載するが、当業者であれば、従うことができるより詳細なバージョンが、出典明示によりここに取り込まれるＷＯ９８／５５８６１に記載されていると理解するであろう。以下に述べる試薬の全ては、フランスのメゾン−アルフォールにその国際本部を置くシェミュネックスから公に入手できる。
【００４３】
細菌、細菌胞子及び酵母の検出
ＣＳＥ／２対比染色
針を取り付けたシリンジ（２０ｍｌ）を用いて、ＣＳＥ／２ボトルキャップに孔をあけ、ＣＳＥ／２（１サンプル当たり１ｍｌ）を吸引した。０．２μｍのＡｕｔｏｔｏｐユニットフィルターをシリンジに取付け、１ｍｌのこの対比染色物を濾過漏斗中に分配した。真空タップを開放し、ＣＳＥ／２をフィルターに通した。完了したところで（メンブレンの表面には液体は残っていないがメンブレンは湿ったままでなければならない）真空タップを閉じた。ついで真空を開放した。
【００４４】
サンプルの予備標識
標識パッドの支持体を所定位置に配してサンプルキャリアを準備した。包装から標識パッドを取り出した後、６００μｌのＣｈｅｍＳｏｌ Ａ４（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を標識パッド上に付着させた。
サンプルメンブレンを標識パッドまで移して、メンブレンの同じ面がフィルターのように標識パッドに確実に接触するようにした。
標識パッドとメンブレンを６０分±５分の間、３７℃±３℃にてインキュベートした。
【００４５】
サンプルの標識
予備標識段階の後、Ｃｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンを、ＷＯ９８／５５８６１に記載されたプロトコールに従って６００μｌの標識溶液に前もって浸し３０℃で３０分間インキュベートした新しい標識パッドに移した。
【００４６】
ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）分析
標識段階後に、標識されたＣｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンをＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）機器に導入した。機器にメンブレンを導入した後、４分で分析を実施した。
標識パッドからの標識されたＣｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンをサポートパッド上に移した。ペトリ皿に保護されたメンブレンホルダーをＣｈｅｍＳｃａｎ機器に移した。ソフトウェアを用いてスキャンを開始した。メンブレンホルダーの準備後に４分で分析を実施した。
【００４７】
菌類プロトコールは以下の通りである：
Ｆｕｎｇｉ−酵母及びカビの検出
ＣＳＥ／５対比染色
針を取り付けたシリンジ（２０ｍｌ）を用いて、ＣＳＥ／５ボトルキャップに孔をあけ、ＣＳＥ／５（１サンプル当たり１ｍｌ）を吸引した。０．２μｍのＡｕｔｏｔｏｐユニットフィルターをシリンジに取付け、１ｍｌを濾過漏斗中に分配した。
真空タップを開放し、ＣＳＥ／５をフィルターに通した。完了したところで（メンブレンの表面には液体は残っていないがメンブレンは湿ったままでなければならない）真空タップを閉じた。ついで真空を開放した。
【００４８】
サンプルの予備標識
包装から標識パッドを取り出した後、６００μｌのＣｈｅｍＳｏｌ Ａ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を標識パッド上に付着させた。サンプルメンブレンを標識パッドまで移して、メンブレンの同じ面がフィルターのように標識パッドに確実に接触するようにした。
標識パッドとメンブレンを３時間±５分の間、３０℃±３℃にてインキュベートした。
【００４９】
サンプルの標識
予備標識段階の後、Ｃｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンを、ＷＯ９８／５５８６１に記載されたプロトコールに従って６００μｌの標識溶液に前もって浸し３７℃±３℃で１時間インキュベートした新しい標識パッドに移した。
標識段階のための新鮮な標識パッドを準備した。ＣｈｅｍＰｒｅｐ Ｓの標識パッド上にその標識パッドを配した。６００μｌの標識溶液を標識パッド上に配した。
Ｃｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンを新しい標識パッドに移した。
ついで標識パッドとメンブレンを、サンプルキャリアでＣｈｅｍＰｒｅｐ Ｓまで移し、最少１時間の間３７℃±３℃でインキュベートし、インキュベーションを完了させた。
【００５０】
ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）分析
標識段階後に、標識されたＣｈｅｍｆｉｌｔｅｒメンブレンをＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）機器に導入した。機器にメンブレンを導入した後、４分で分析を実施した。
ポリマーと接触していなかった微生物のみを用いるコントロールもまた上述のようにして分析した。結果を以下の表１に示す。
【００５１】
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上記の表１において、回収率はＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）の結果とプレートのカウントの間の比である。
【００５２】
実施例４−更なる細胞毒性実験
ポリマーの調製を実施例２に従って実施した。微生物を分析前に１５分間ポリマーに接触させたことを除いて、実施例３と同じ手順を実施した。この実験の結果は表２にまとめる。
【００５３】
2004514430.tif 000003
この結果から分かるように、回収率は１００％よりも大きく、コントロールと非常に類似している。
【００５４】
実施例５−空気中の微生物の測定
この実験において、空気中の微生物の数を測定した。ＰＶＡポリマーを実施例２におけるようにして調製し、分析の前、それぞれ３０分と３時間３０分、実験室に放置した。分析を実施例３に記載したようにして実施した。表３はこの実験の結果を与える。
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【００５５】
実施例６−更なるポリマーの試験
ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸ナトリウム塩）（ＰＡＭＰＳＡ）、ポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）及びポリアクリルアミドを実施例２に従って調製し、実施例１の手順に従って成型した。細胞毒性実験は実施例３及び４のようにしてなされる。微生物の数は実施例５に従って分析される。同様な結果が、これらの特定のポリマーを使用して得られる。
【００５６】
実施例７−クリーンルームで測定した微生物
この実験では、空気中の微生物数がクラス１００のクリーンルームで測定される。ポリマーは実施例２のようにして調製し、９０ｍｍの直径のペトリ皿で成型した。ついで成型した水溶性ポリマーを、操業状態中、空気ダクトのそばに配し、分析前４時間放置した。分析を実施例３に記載したようにして実施した。
このサンプルには微生物が存在していないので、クリーンルームは、この特定の管理された環境下で空気清浄度の基準に合致していることが確認された。
【００５７】
実施例８−オレンジアクリジンを用いた微生物の総数の検出：ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）を用いた生存及び死細胞のカウント
上記のポリマー溶液、つまりＰＶＡ又はＰＶＰを実施例２におけるようにして調製し、９０ｍｍ直径のペトリ皿に入れた。
生存及び死滅微生物の混合物（５０ｘ５０）の約１０から１０３個の微生物を成型した水溶性ポリマーの表面に配した。
ついで、プレートからポリマーフィルムを取り除き、実施例２に記載したようにして純水に再溶解させた。
微生物を含むポリマー溶液を、０．４μｍのＣｈｅｍｉｆｉｌｔｅｒメンブレンに、このメンブレンを次の標識プロトコールで更に処理する前に、通して濾過した：
・生存微生物の数は、先の実施例に記載したＴＶＣプロトコールに従って生存マーカー（ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ）及びＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザーを用いて定義される、
・微生物の全細胞総数（生存及び死滅）は、次のプロトコールを使用して決定される：０．８ｍｌのオレンジアクリジン溶液をＣｈｅｍｉｆｉｌｔｅｒメンブレンの表面に配し室温で２分間インキュベートした。ついで、標識された細胞の数を、一般的な落射蛍光顕微鏡でのメンブレンのマニュアルでの観察によって得た。
その結果は、ＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）アナライザーによって決定された生存細胞の数と死滅細胞の予想数と実験的に決定された総数の値との間の完全な一致を示している。
【００５８】
本発明は様々な好適な実施態様によって説明されたが、当業者であれば、その範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、省略及び変形を行うことができると理解するであろう。従って、本発明の範囲は、均等の範囲を含む、特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．４μｍの多孔性メンブレン（ＣＢ０４）を使用するポリ（ビニルアルコール）ポリマー（ＰＶＡ）（Ｋ３０）の濃度に対しての濾過時間の変動を示すグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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2004514430.tif 000033
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514430.tif 000034
【国際調査報告】
2004514430.tif 000035
2004514430.tif 000036
2004514430.tif 000037