(57)【要約】本発明は、内生Ｂ７分子がそのリガンドと結合するのを遮断する可溶性ＣＴＬＡ４分子を対象に投与することによる、リウマチ疾患を処置するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７分子と結合する可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量を対象に投与する、リウマチ疾患の処置方法。
【請求項２】
コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤、シクロスポリン、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とする生物薬剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラからなる群の中から選ばれる免疫抑制剤の有効量をさらに投与する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、Ｂ７分子がＴ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合するのを阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、Ｔ細胞／Ｂ７陽性細胞の相互作用を妨害する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図２３に示す＋１０４位のロイシンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位の変異を含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図１８に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンまでのＬ１０４ＥＩｇである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図１８に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンまでのＬ１０４ＥＩｇである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図２３に示す＋１０４位のロイシンがグルタミン酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位における第１の変異、および
ａ．図２３に示す＋２９位のアラニンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋２９位、
ｂ．図２３に示す＋１０５位のグリシンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０５位、
ｃ．図２３に示す＋２５位のセリンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋２５位、または
ｄ．図２３に示す＋３０位のスレオニンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋３０位、
における第２の変異を含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、
ａ．図１９に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、
ｂ．図２０に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、
ｃ．図２１に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ、または
ｄ．図２２に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ、である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、
ａ．図１９に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、
ｂ．図２０に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、
ｃ．図２１に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ、または
ｄ．図２２に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わるＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ、である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがＡＴＣＣ ＰＴＡ−２１０４と命名されるＤＮＡ配列によってコードされている、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、
ａ．図２３に示す＋１０４位のロイシンがグルタミン酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位、
ｂ．図２３に示す＋２９位のアラニンがチロシンと置換しているＣＴＬＡ４の＋２９位、および
ｃ．図２３に示す＋２５位のセリンが他のアミノ酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋２５位、における変異を含有している、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｂ７分子と結合する可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量を対象に投与する、リウマチ疾患を処置するための方法であって、可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図２３に示す＋１０４位のロイシンがグルタミン酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位における変異および図２３に示す＋２９位のアラニンがチロシンと置換しているＣＴＬＡ４の＋２９位における変異を含有している方法。
【請求項１４】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子がＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
リウマチ疾患が慢性関節リウマチである、請求項１または１３記載の方法。
【請求項１８】
関節腫脹、痛み、圧痛、朝のこわばり、構造的障害、血清Ｃ反応性タンパク質レベルの上昇、可溶性ＩＬ−２ｒレベルの上昇、可溶性ＩＣＡＭ−１レベルの上昇、可溶性Ｅ−セレクチンレベルの上昇、および赤血球凝集率の上昇からなる群から選ばれるリウマチ疾患に付随する症状を緩解する方法であって、請求項１または１３記載の方法によってリウマチ疾患に罹患した対象を処置する方法。
【請求項１９】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を局所的にまたは全身に投与する、請求項１または１３記載の方法。
【請求項２０】
投与が、静脈内、筋肉内、皮下、移植可能ポンプ、連続注入、遺伝子治療、リポソームおよび経口投与からなる群から選ばれる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量が約０．５−１００ｍｇ／ｋｇ体重（対象）である、請求項１または１３記載の方法。
【請求項２２】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重（対象）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量が２ｍｇ／ｋｇ体重（対象）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量が１０ｍｇ／ｋｇ体重（対象）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
対象が、ヒト、サル、類人類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなる群から選ばれる請求項１または１３記載の方法。
【請求項２６】
製薬的に許容される担体および可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を含有する、リウマチ疾患を処置するための医薬組成物。
【請求項２７】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図２３に示す＋１０４位のロイシンがグルタミン酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位における変異および図２３に示す＋２９位のアラニンがチロシンと置換しているＣＴＬＡ４の＋２９位における変異を含有している、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子がＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３１】
製薬的に許容される担体がイオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、リン酸緩衝化食塩水、水、乳液、塩類または電解液、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基本物質、ポリエチレングリコール、滅菌水、錠剤、賦形剤、スクロース、グルコース、マルトース、香料および色素添加物、脂質組成物、および高分子化合物からなる群から選ばれる請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項３２】
リウマチ疾患に関連する病態生理学的変化を減少させる方法であって、請求項１または１３記載の方法によってリウマチ疾患に罹患した対象を処置する方法。
【請求項３３】
リウマチ疾患に関連する病態生理学的変化が構造的障害の減少である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
Ｂ７分子と結合する可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量を含有する、慢性関節リウマチを処置するためのキット。
【請求項３５】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子が、図２３に示す＋１０４位のロイシンがグルタミン酸と置換しているＣＴＬＡ４の＋１０４位における変異および図２３に示す＋２９位のアラニンがチロシンと置換しているＣＴＬＡ４の＋２９位における変異を含有している、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子がＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである、請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが図１９に示す−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンで終わる、請求項３６記載のキット。
【請求項３９】
コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤、シクロスポリン、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とする生物薬剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラの中から選ばれる免疫抑制剤の有効量をさらに含む、請求項３４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
明細書全体にわたり、種々の文献を引用している。これらの文献の開示事項はすべて、発明の属する分野の従来技術をより充分に説明するものとして、引用によって本明細書に包含される。
【０００２】
【技術分野】
本発明は一般に、リウマチ疾患の分野に属す。詳細には、本発明は、可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量を対象に投与することによる、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患を処置するための方法および組成物に関する。
【０００３】
【背景技術】
現在のところ、リウマチ疾患を治癒させることはできない。よって、その症状を処置するための治療剤が使用されている。そして、そのような治療剤の投与は長期に及び、治療効果は有害な副作用によって減じられることが多いのが通常である。
【０００４】
リウマチ疾患は身体の筋骨格や結合組織に影響を与える一群の疾患を包含する。これらの疾患は、永久的な組織障害、変形、萎縮および能力障害を導くことが多い慢性の炎症を特徴とする。リウマチ疾患は関節、骨、軟部組織または脊髄を侵し（Ｍａｔｈｉｅｓ，Ｍ． １９８３）、そして炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチまたはコラーゲン疾患に分類される。リウマチ疾患のなかには、対象の免疫応答の改変に起因する自己免疫疾患であるとして知られているものがある。
【０００５】
慢性関節リウマチは進行性リウマチ疾患であり、先進国の約２％の成人が罹患している（Ｕｔｓｉｎｇｅｒ， Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ｐ．１４０）。この疾患は、軟骨の破壊および骨侵食の原因となる持続的な炎症性滑膜炎を特徴としており、末梢関節の構造的変形を導く。慢性関節リウマチに付随する症状には、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および特に屈曲の際の痛みがある。進行した段階にある関節炎を有する対象は、骨侵食を伴う関節破壊などの構造的障害に見舞われる（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， １３ｔｈ版， １６４８−１６５５頁）。さらに、患者は、自己免疫反応に関連する血管炎に由来する皮膚、腎、心臓、肺、中枢神経系および眼の損傷など、他の種々の器官損傷の臨床的症状を示す場合がある。
【０００６】
慢性関節リウマチに関連する他の症状には、赤血球凝集率の上昇や、血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および／または可溶性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ｒ）のレベル上昇がある。この赤血球凝集率は活動的慢性関節リウマチの患者では殆どすべてにおいて上昇する。血清Ｃ反応性タンパク質のレベルも上昇し、疾患活動度や進行性関節障害の可能性と相関している。さらに、活性化Ｔ細胞産物である可溶性ＩＬ−２受容体のレベルは活動的慢性関節リウマチの患者の血清および滑液中において増大している（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， １３ｔｈ版， １６５０頁参照）。
【０００７】
慢性関節リウマチは、Ｔ細胞および抗原提示細胞間における抗原非特異的な細胞間相互作用が絡むＴ細胞介在性自己免疫疾患と考えられている。一般に、Ｔ細胞応答の強度は、Ｔ細胞表面分子とそのリガンドとの相互作用によって引き起こされる共刺激応答に基づき決定される（Ｍｕｅｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：４４５−４８０）。重要な共刺激シグナルは、Ｔ細胞表面受容体であるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４とそれらのリガンド、例えば抗原提示細胞上のＢ７関連分子ＣＤ８０（即ちＢ７−１）およびＣＤ８６（即ちＢ７−２）との相互作用によってもたらされる（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．１９９３ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：１９１−２１２）。
【０００８】
共刺激の無いＴ細胞活性化は、免疫系が刺激に対して非感応性となるアネルギー性Ｔ細胞応答を導く（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．，１９９２ Ｃｅｌｌ ７１：１０６５−１０６８）。
慢性関節リウマチはＴ細胞性免疫系疾患と考えられるので、それを処置するための新たな薬剤を開発する１つのストラテジーは内生ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４とＢ７との間の相互作用を遮断することにより、Ｔリンパ球および抗原提示細胞間の共刺激シグナルを遮断する分子を同定することである。可能性ある分子には、野生型ＣＴＬＡ４（その配列は図２３に示している）またはＣＤ２８よりも高い結合力でＢ７と結合するよう修飾した可溶性ＣＴＬＡ４分子などである。
【０００９】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４の可溶型は、ＣＤ２８やＣＴＬＡ４の可変（Ｖ）様細胞外ドメインを免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインと融合させ、ＣＤ２８ＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇとすることにより構築されている。ＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２４に示し、ここではこのタンパク質は＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンから始まり、＋３５７位のリジンで終わっている。ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ２８Ｉｇよりも強くＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性の両細胞と結合する（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０）。多くのＴ細胞依存性免疫応答がインビトロおよびインビボの両方においてＣＴＬＡ４Ｉｇによって遮断されることが見出されている（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９１ｂ，前掲、Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９２ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７９２−７９５； Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．， １９９２ｂ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５９５−１６０４； Ｌｅｎｓｃｈｏｗ， Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２； Ｔａｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６５−１７３； Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１１１０２−１１１０５）。
【００１０】
Ｂ７などの天然のリガンドとの結合親和性を改変するため、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合分子は、その分子のＣＴＬＡ４部分内のアミノ酸を変異して修飾されている。Ｂ７リガンドとの結合親和性または結合力を改変するために変異されるＣＴＬＡ４の領域は、相補性決定領域１（米国特許６，０９０，９１４、５，７７３，２５３、５，８４４，０９５；同時継続の米国特許出願番号６０／２１４，０６５：およびＰｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８においてＣＤＲ−１と称されている）および相補性決定領域３（ＣＤＲ−３）様領域などである（ＣＤＲ−３は米国特許６，０９０，９１４、５，７７３，２５３、５，８４４，０９５；同時継続の米国特許出願番号６０／２１４，０６５：およびＰｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８に記載されているＣＴＬＡ４細胞外ドメインの保存領域である。ＣＤＲ−３様領域はＣＤＲ−３領域を包含し、ＣＤＲ−３モチーフの上流および／または下流までアミノ酸数個が延びている。）ＣＤＲ−３様領域はすべてのＣＤ２８およびＣＴＬＡ４ファミリーに高度に保存されているヘキサペプチドＭＹＰＰＰＹを含む。ＣＴＬＡ４のヘキサペプチドを介しおよびＣＤ２８Ｉｇ内の選択した残基におけるアラニン走査突然変異により、ＣＤ８０に対する結合性が減少または消滅されている（Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９９４ １８０：２０４９−２０５８）。
【００１１】
ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の相同領域を交換することによりさらに修飾を施し、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子が可溶化された。これらキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同変異分子には、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８に共通するＭＹＰＰＰＹヘテロペプチドモチーフ、およびＣＴＬＡ４とＣＤ８０との結合力の増大に寄与する領域としてのＣＴＬＡ４のＣＤＲ−１およびＣＤＲ−３様領域における特定の非保存アミノ酸残基が同定された（Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９９４ １８０：２０４９−２０５８）。
【００１２】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、上記のＣＴＬＡ４変異分子またはキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同変異体などの可溶性ＣＴＬＡ４分子は、リウマチ疾患を処置するための新たな一群を提供する。
【００１３】
慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患に対する現在の処置は、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）ブロッカーまたはアンタゴニストなどの非特異的細胞毒性免疫抑制剤を投与することを含む。これらの免疫抑制剤は対象の免疫系全体を抑制し、その長期使用は感染症の危険を増大させる。さらに、これらの薬剤は慢性関節リウマチの進行を遅らせるに過ぎず、治療を中断した後は加速度的に再発する。さらに、これら非特異的薬剤による長期療法は、特定の悪性度、腎不全、骨髄抑制、肺繊維症、悪性疾患、糖尿病および肝機能疾患の発達に対する傾向など、毒性の副作用を生じさせる。これらの薬剤はさらに、およそ２−５年後には有効性が徐々に消失する（Ｋｅｌｌｅｙ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，６ｔｈ版， １００１−１０２２頁）。
【００１４】
また、非特異的な免疫抑制性の治療剤および抗炎症剤が症状の緩解のために使用されている。これらの薬剤は用量依存的であり、疾患の進行を予防するものでない。このような薬剤にはプレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンなどのステロイド化合物が含まれる。ステロイド類はその長期使用に付随する有意に毒性の副作用も有する（Ｋｅｌｌｅｙ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，６ｔｈ版， ８２９−８３３頁）。
【００１５】
従って、慢性関節リウマチのための現在の処置はその効能が限られており、有意な毒性副作用を示し、長期に連続して使用できないものである。
このように、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患を処置するために有効かつより強力な、従来の方法や薬剤の不都合な点を回避している、自己免疫の病態生理学的メカニズムを標的とした処置が求められている。
【００１６】
【発明の概要】
本発明は、Ｂ７陽性細胞上のＢ７分子に結合する可溶性ＣＴＬＡ４分子を対象に投与することにより、内生Ｂ７分子がＴ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合するのを阻害する、免疫系疾患を処置するための組成物および方法を提供する。本発明の方法にて使用される可溶性ＣＴＬＡ４分子にはＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが含まれる。
【００１７】
本発明はまた、ヒトにおいてＢ７陽性細胞を可溶性ＣＴＬＡ４と接触させることにより、ヒトにおけるＴ細胞機能を阻害するが、Ｔ細胞を枯渇（減少）させない方法を提供する。可溶性ＣＴＬＡ４の例としては、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４変異分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが含まれる。
【００１８】
本発明はまた、慢性関節リウマチと診断された対象にＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／または可溶性ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇなどの可溶性ＣＴＬＡ４分子を投与する、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患を処置する（例えば、症状を減少させる）ための方法をも提供する。例えば、図１９に示す＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンから始まり＋３５７位のリジンまでのＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが本発明の方法に使用するのに好ましい。
【００１９】
本発明はまた、慢性関節リウマチと診断された対象に可溶性ＣＴＬＡ４分子を投与する、構造的障害などの、リウマチ疾患に付随する病態生理学的変化を減少させるための方法をも提供する。
【００２０】
本発明はまた、製薬的に許容される担体および可溶性ＣＴＬＡ４分子などの生物的に有効な物質を含有する、慢性関節リウマチなどの免疫系疾患を処置するための医薬組成物をも提供する。
【００２１】
免疫系疾患を治療するための医薬組成物を含むキットも本発明に含まれる。１つの態様では、１つまたはそれ以上の本発明の医薬組成物を含むキットを、免疫系疾患、例えば慢性関節リウマチの処置に使用する。例えば、医薬組成物は、Ｂ７陽性細胞上のＢ７分子に結合する可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の有効量を含むことにより、Ｂ７分子がＴ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８と結合するのを阻害する。さらに、本発明のキットは、本発明の医薬組成物と一緒に使用される１つまたはそれ以上の免疫抑制剤を含むことができる。可能性ある免疫抑制剤には、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤（例えば、Ｃｏｘ２阻害剤）、シクロスポリン、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とする生物薬剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラがあるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明はさらに、慢性関節リウマチに付随する赤血球凝集率を減少させる方法をも提供する。
さらに、本発明は慢性関節リウマチに付随する血清の特定成分、例えば血清Ｃ反応性タンパク質、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性Ｅ−セレクチンおよび／または可溶性ＩＬ−２ｒのレベルを減少させる方法をも提供する。
【００２３】
【発明の詳しい説明】
定義
本明細書に使用しているすべての科学および技術用語は、特に明記しない限り当技術分野にて普通に使用されている意義を有している。本明細書では、以下の用語またはフレーズはここに明記する意味を有する。
【００２４】
本明細書に使用する「リガンド」は、自身以外の分子を特異的に認識し結合する分子であり、例えばＣＴＬＡ４に対するリガンドはＢ７分子である。
【００２５】
本明細書に使用する「野生型ＣＴＬＡ４」または「非変異ＣＴＬＡ４」は、図２３に示す（また米国特許５，４３４，１３１、５，８４４，０９５、５，８５１，７９５にも記載されている）天然に存在する全長ＣＴＬＡ４、またはＢ７を認識し結合するかＢ７を妨害しＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４（例えば、内生ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）との結合を遮断するその一部または誘導体、のアミノ酸配列を有している。具体的態様では、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは＋１位のメチオニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わるか、または野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは−１位のアラニンから始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４は、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＣ末端細胞質ドメインを有する細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはＢ７分子などの標的分子と結合する。細胞では、天然に存在する野生型ＣＴＬＡ４タンパク質は、シグナルペプチドをＮ末端に含む未成熟ポリヌクレオチドとして翻訳される。未成熟ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドの切断と除去を含む翻訳後プロセッシングを受け、未成熟型のＮ末端とは異なる新たに生成されるＮ末端を含むＣＴＬＡ４切断産物が生成する。当業者であれば、新たに生成されるＣＴＬＡ４切断産物のＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸を除去する付加的な翻訳後プロセッシングが起こり得ることは理解されよう。あるいは、シグナルペプチドは完全には除去されず、通常の開始アミノ酸メチオニンよりも前から始まる分子が生成される場合もある。従って、成熟ＣＴＬＡ４タンパク質は＋１位のメチオニンまたは−１位のアラニンから開始することができる。ＣＴＬＡ４分子の成熟型にはＢ７と結合する細胞外ドメインまたはその一部が含まれる。
【００２６】
本明細書に使用する「ＣＴＬＡ４変異分子」は、１つの変異または複数の変異を（好ましくは野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン内に）有する図２３に示す野生型ＣＴＬＡ４またはその一部もしくは誘導体を意味する。ＣＴＬＡ４変異分子は野生型ＣＴＬＡ４の配列と類似しているが同一でなく、しかし依然Ｂ７とは結合する配列を有している。変異には、保存的な構造または化学的性質（例えばロイシンのイソロイシンとの置換）または非保存的な構造または化学的性質（例えばグリシンのトリプトファンとの置換）を持つアミノ酸との１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換、アミノ酸欠失、付加、フレームシフト、または断頭が含まれる。ＣＴＬＡ４変異分子はその内部にＣＴＬＡ４でない分子を含むことができ、またはそれを結合することができる。さらなるＣＴＬＡ４変異分子には、米国特許出願番号０９／８６５，３２１、６０／２１４，０６５および６０／２８７，５７６、および米国特許第６，０９０，９１４号、第５，８４４，０９５号および第５，７７３，２５１号、並びにＰｅａｃｈ，Ｒ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：２０４９−２０５８（１９９４）に記載されているものが含まれる。ＣＴＬＡ４変異分子は合成法または組換え法で調製することができる。
【００２７】
本明細書に使用する「ＣＴＬＡ４Ｉｇ」は、Ｉｇテールが結合している野生型ＣＴＬＡ４、またはＢ７を結合するその一部を含む可溶性融合タンパク質である。具体的な態様は、＋１位のメチオニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わるかまたは−１位のアラニンから始まって＋１２４位のアスパラギン酸で終わる野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（図２３に示す）、＋１２５位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む（ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡはバージニア州２０１１０−２２０９マナッサス・ユニバーシティブルバード１０８０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に１９９１年５月３１日、ブタペスト条約の下に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６８６２９がＡＴＣＣから付与されている；Ｌｉｎｓｌｅｙ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０）。ＣＴＬＡ４Ｉｇを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＴＬＡ４Ｉｇ−２４は１９９１年５月３１日にＡＴＣＣ同定番号ＣＲＬ−１０７６２として寄託されている）。本発明の方法および／またはキットに使用される可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子はシグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。本発明の方法および／またはキットでは、典型的にはこの分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００２８】
「Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ」は、アミノ酸変化Ａ２９Ｙ（２９位のアラニンがチロシンアミノ酸残基と置換）およびＬ１０４Ｅ（＋１０４位のロイシンがグルタミン酸アミノ酸残基と置換）を有する野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、またはＢ７分子と結合するその一部がＩｇテールと結合しているものを含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子である融合タンパク質である（図１９に含まれる；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＤＮＡは２０００年６月１９日にＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４として寄託されている；米国特許出願番号０９／５７９，９２７、６０／２８７，５７６および６０／２１４，０６５に継続中（これらは引用により本明細書に包含される））。本発明の方法および／またはキットに使用される可溶性Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子はシグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。本発明の方法および／またはキットでは、典型的にはこの分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００２９】
本明細書に使用する「可溶性」とは細胞に結合または接合していない、即ち循環しているあらゆる分子、またはその断片もしくは誘導体を意味する。例えば、ＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８はそれぞれＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８の細胞外ドメインに免疫グロブリン（Ｉｇ）部分を結合することにより可溶性にすることができる。または、ＣＴＬＡ４などの分子は、その膜貫通ドメインを除去することによって可溶性にすることができる。典型的には、本発明の方法に使用する可溶性分子はシグナル（リーダー）配列を含まない。
【００３０】
本明細書に使用する「可溶性ＣＴＬＡ４分子」は、細胞表面に結合していない（即ち、循環している）ＣＴＬＡ４分子またはＢ７に結合するＣＴＬＡ４分子の機能的部分を意味し、例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが免疫グロブリン（Ｉｇ）部分と融合しその融合分子が可溶性になっているＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質（例えばＡＴＣＣ６８６２９）またはその断片および誘導体；生物学的に活性なまたは化学的に活性なタンパク質と融合または結合しているＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有するタンパク質、例えばパピローマウイルスＥ７遺伝子産物とのもの（ＣＴＬＡ４−Ｅ７）、メラノーマ関連抗原ｐ９７とのもの（ＣＴＬＡ４−ｐ９７）またはＨＩＶｅｎｖタンパク質とのもの（ＣＴＬＡ４−ｅｎｖｇｐ１２０）またはその断片および誘導体；ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４Ｉｇなどの雑種（キメラ）融合タンパク質またはその断片および誘導体；膜貫通ドメインが除去されて可溶性にされているＣＴＬＡ４分子（Ｏａｋｓ， Ｍ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１：１４４−１５３）またはその断片および誘導体などがあるが、これらに限定されない。「可溶性ＣＴＬＡ４分子」はさらに、ＣＴＬＡ４結合活性を有する可溶性ＣＴＬＡ４変異分子、およびその断片、一部または誘導体を包含する。本発明の方法に使用される可溶性ＬＣＴＬＡ４分子はシグナル（リーダー）ペプチド配列を含んでも含まなくてもよい。本発明の方法では、典型的にはこの分子はシグナルペプチド配列を含まない。
【００３１】
本明細書に使用する「ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン」は、Ｂ７分子などのＣＴＬＡ４リガンドを認識し結合するＣＴＬＡ４の一部である。例えば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む（図２３）。あるいは、ＣＴＬＡ４のある細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸までを含む（図２３）。細胞外ドメインにはＢ７分子を結合するＣＴＬＡ４の断片または誘導体が包含される。図２３に示すＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、Ｂ７分子とのＣＴＬＡ４分子の結合力を変化させる変異を含むことができる。
【００３２】
本明細書に使用する「変異」とは、野生型分子のヌクレオチドまたはアミノ酸配列中の変化を意味し、例えば野生型ＣＴＬＡ４細胞外ドメイン中のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の変化である。ＤＮＡの変異は、コドンを変化させてアミノ酸配列の変化を導くことができる。ＤＮＡ変化は置換、欠失、挿入、代替スプライシング、または断頭であり得る。アミノ酸変化は、置換、欠失、挿入、付加、断頭、またはタンパク質のプロセッシングもしくは切断エラーであり得る。あるいは、当技術分野ではよく知られているように、ヌクレオチド配列の変異はアミノ酸配列のサイレント変異をもたらす場合がある。これに関連し、特定のヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。例えばアミノ酸アルギニン（Ｒ）をコードするヌクレオチドコドンＣＧＵ、ＣＧＧ、ＣＧＣおよびＣＧＡ、またはアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンＧＡＵおよびＧＡＣが、その例である。従って、タンパク質は、ヌクレオチド配列の詳細は異なっているがそれでもなお同じ配列を持つタンパク質分子をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子によってコードされ得る。アミノ酸のコード配列は以下の通りである。
【００３３】
【表１】
2004517806.tif 000002
変異分子は１つまたはそれ以上の変異を含むことができる。
【００３４】
本明細書に使用する「非ＣＴＬＡ４タンパク質配列」または「非ＣＴＬＡ４分子」は、Ｂ７を結合せず、ＣＴＬＡ４がその標的に結合するのを妨害しない任意のタンパク質分子を意味する。一例として免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその一部が挙げられるが、これらに限定されない。Ｉｇ定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルＩｇ定常領域、例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＣ（ガンマ）１である。Ｉｇ定常領域は、変異によってそのエフェクター機能を低下させることができる（米国特許第５，６３７，４８１号、第５，８４４，０９５号および第５，４３４，１３１号）。
【００３５】
本明細書に使用する「断片」または「一部」はＣＴＬＡ４分子の部分またはセグメントであり、好ましくはその標的、即ちＢ７分子を認識し結合するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはその部分もしくはセグメントである。
【００３６】
本明細書に使用する「Ｂ７」とは、Ｂ７ファミリー分子を意味し、例えば、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８を認識し結合できるＢ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）およびＢ７−３があるが、これらに限定されない。
本明細書に使用する「Ｂ７陽性細胞」はその細胞表面に１つまたはそれ以上の型のＢ７分子を発現している細胞である。
【００３７】
本明細書に使用する「誘導体」は、その親分子の配列相同性と活性を保持している分子である。例えば、ＣＴＬＡ４の誘導体には、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を持ち、Ｂ７を認識し結合する可溶性ＣＴＬＡ４分子、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇまたは可溶性ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが含まれる。
【００３８】
本明細書に使用する、受容体、シグナルまたは分子を「遮断」または「阻害」するとは、当業界にて認識されている試験によって検出されるような、受容体、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味する。例えば、細胞性免疫応答の遮断は、リウマチ疾患に関連する症状の減少を測定することにより検出できる。遮断または阻害は部分的であっても全体であってもよい。
【００３９】
本明細書に使用する「Ｂ７相互作用を遮断する」とは、Ｂ７のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４などのそのリガンドに対する結合を妨害することにより、Ｔ細胞およびＢ７陽性細胞の相互作用をブロック（遮断）することを意味する。Ｂ７相互作用を遮断する物質の例としては、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８またはＢ７分子（例えばＢ７−１、Ｂ７−２）を認識し結合する抗体（またはその一部もしくは誘導体）などの分子；可溶性ＣＴＬＡ４などの分子の可溶型（またはその一部もしくは誘導体）；ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７介在性相互作用を解する細胞シグナルを妨害するよう設計されたペプチド断片または他の小分子があるが、これらに限定されない。好ましい態様では、遮断物質は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２１０４）などの可溶性ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）などの可溶性ＣＤ２８分子、Ｂ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）などの可溶性Ｂ７分子、抗−Ｂ７モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０１、ＡＴＣＣ ＨＢ−１１３４１、および米国特許第６，１１３，８９８号にてＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が、またはＹｏｋｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８２． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．， １２８（２）８２３−８２７にて開示しているモノクローナル抗体、抗−ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０４、および引用文献８２−８３が開示しているモノクローナル抗体）および／または抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体（例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ１１９４４およびＨａｎｓｅｎ（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２４７−２６０）またはＭａｒｔｉｎ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４． Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．， ４（１）：１８−２２）が記載しているｍＡｂ９．３）がある。
【００４０】
本明細書に使用する「免疫系疾患」とはＢ陽性細胞とのＴ細胞相互作用によって媒介される疾患を意味し、これには自己免疫疾患、移植片関連障害および免疫増生性疾患が含まれるが、これらに限定されない。免疫系疾患の例としては、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）（例えば骨髄移植によって起こるもの、または寛容誘導をもたらすもの）；移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種移植もしくは異種移植に関係する免疫障害がある。免疫増生性疾患の例には、乾癬、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、狼蒼（例：狼蒼エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インシュリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病などがあるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書に使用する「リウマチ疾患」は関節、骨、軟部組織または脊髄を侵す疾患を意味し（Ｍａｔｈｉｅｓ，Ｍ． １９８３）、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチおよびコラーゲン疾患を含む。さらに、リウマチ疾患には、慢性多発性関節炎、乾癬関節障害、強直性脊椎炎、慢性関節リウマチ、結節性動脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、汎発性強皮症、関節周囲炎、上腕肩甲炎、ウラチカ関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｕｒａｔｉｃａ）、軟骨石灰化、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋肉炎、および筋原症（ｍｙｏｇｅｌｏｓｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。リウマチ疾患の中には、対象の免疫応答の改変に起因する自己免疫疾患であることが知られているものがある。
【００４２】
本明細書に使用する「遺伝子治療」は、核酸配列を細胞に移入し、その核酸によってコードされている遺伝子産物を細胞に発現させる遺伝子操作、により疾患を処置する方法を意味する。例えば、当業者に周知のように、核酸移入は、例えばリン酸カルシウム沈降法、ジエチルアミノエチルデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エレクトロポレーション、直接注入、リポフェクション、またはウイルス注入など種々の手法により、目的の核酸を含む発現ベクターを細胞にｅｘ ｖｉｖｏまたはインビトロにて挿入することによって行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）およびＭｕ， Ｍｅｈｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）これらは引用により本明細書に包含される）。あるいは、目的の核酸配列は、例えば核酸を対象に直接投与する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ＰＮＡＳ ８８：２７２６−２７３０）、または核酸をウイルスベクターに挿入しそのウイルスを対象に感染させる（Ｂａｔｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １３：９４−９５１； Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７Ｅ：２４１； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． 米国特許第５，３５４，６７８号；Ｄａｖｉｓｏｎ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３））などの種々の方法によって種々のベクターにてインビボにおいて細胞に移入させることができる。インビボ移入のための他の方法には、核酸をリポソームに包嚢させること、および対象に対してリポソームを直接移入することまたは血球凝集性センダイウイルスと組合わせたリポソームを移入させることがある（米国特許第５，８２４，６５５号、引用によって本明細書に包含される）。トランスフェクトまたは感染細胞は、疾患または疾患の症状を改善するため、核酸にコードされるタンパク質産物を発現する。
【００４３】
本明細書に記載の発明をさらに詳しく理解することができるように、以下に説明を行う。
本発明の組成物および方法
本発明は、Ｂ７を結合するリガンド、例えば可溶性ＣＴＬＡ４分子（例えばＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）およびＢ７を認識し結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の有効量を対象に投与することによる、リウマチ疾患などの免疫系疾患を処置するための方法および組成物に関する。有効量は、Ｂ７陽性細胞上のＢ７分子と結合した場合にＢ７分子がＣＴＬＡ４およびＣＤ２８などの内生リガンドを結合するのを阻害する可溶性ＣＴＬＡ４分子の量として規定される。
【００４４】
好ましい態様では、免疫疾患はリウマチ疾患である。リウマチ疾患は次の特徴とする疾患である：（ｉ）身体の筋−骨または結合組織構造、特に関節や、筋肉、腱、軟骨、滑膜および線維性組織の炎症または変性、（ｉｉ）関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および／または痛み、または歩行運動の障害やこれら組織の機能障害を伴うこと、およびある場合には、リウマチ因子および他の炎症性の代替マーカーの血清学的証拠を伴うことがある。
【００４５】
リウマチ疾患には慢性関節リウマチが含まれるが、これに限定されない。慢性関節リウマチの症状には関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および身体障害を導く痛みがある。関節炎が進行した対象は、構造的障害や消耗性の痛みを伴う。他の器官も自己免疫機構により障害を受けることがある。
【００４６】
組成物
本発明は、可溶性ＣＴＬＡ４分子を含む、慢性関節リウマチなどの免疫疾患を処置するための組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒトのＢ７陽性細胞を可溶性ＣＴＬＡ４と接触させることによる、ヒトにおけるＴ細胞機能を阻害するがＴ細胞を枯渇（減少）させない生物薬剤を含む組成物を提供する。可溶性ＣＴＬＡ４の例には、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４変異分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがある。
【００４７】
変異型または野生型配列を有するＣＴＬＡ４分子はＣＴＬＡ４膜貫通セグメントを除去することにより可溶化することができる（Ｏａｋｓ， Ｍ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１：１４４−１５３）。
【００４８】
また、変異型または野生型配列を有する可溶性ＣＴＬＡ４分子は、ＣＴＬＡ４分子が非ＣＴＬＡ４分子部分、例えばＣＴＬＡ４分子を可溶化する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子と融合している融合タンパク質であることができる。例えば、ＣＴＬＡ４融合タンパク質には、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが免疫グロブリン定常ドメインと融合した、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子（図２４）が含まれる（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７９３−８０）。
【００４９】
臨床プロトコールには、免疫グロブリン領域は有害な免疫応答を対象において惹起させないのが好ましい。好ましい部分は、ヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域などの免疫グロブリン定常領域である。適当な免疫グロブリン領域の一例は、Ｆｃ受容体などのエフェクター機能を媒介でき、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介でき、または抗体依存性細胞依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介できるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むヒトＣ（ガンマ）１である。免疫グロブリン部分は１つまたはそれ以上の変異を含むことができ（例えば、ＣＨ２ドメインなら、ＣＤＣまたはＡＤＣＣなどのエフェクター機能が低下）、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリンの結合能力を増大または低下させることによりその変異によりリガンドに対する免疫グロブリンの結合能力が調整される。例えば、免疫グロブリンの変異には、ヒンジドメイン内のシステイン残基のいくつかまたはそのすべての変化、例えば＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインにおけるセリンとの置換（図２４）が含まれる。免疫グロブリン分子は図２４に示すように、さらに＋１４８位のプロリンにおけるセリンとの置換も含むことができる。また、免疫グロブリン部分の変異には＋１４４位のロイシンのフェニルアラニンとの置換、＋１４５位のロイシンのグルタミン酸との置換、または＋１４７位のグリシンのアラニンとの置換をも含むことができる。
【００５０】
可溶性ＣＴＬＡ４分子または可溶性ＣＴＬＡ４変異分子に使用される非ＣＴＬＡ４部分のさらなるものには、ｐ９７分子、ｅｎｖｇｐ１２０分子、Ｅ７分子、およびｏｖａ分子（Ｄａｓｈ， Ｂ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５（Ｐｔ６）： １３８９−９７；Ｉｋｅｄａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｇｅｎｅ １３８（１−２）： １９３−６； Ｆａｌｋ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０（２）：４４７−５２； Ｆｕｊｉｓａｋａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４（２）：７８９−９３）。他の分子も可能性がある（Ｇｅｒａｒｄ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ６２（３）：７２１； Ｂｙｒｎ，Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９８９ ６３（１０）：４３７０； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１７０４； Ｌａｓｋｙ， Ｌ． １９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：２０９）。
【００５１】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子はその分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端と連結したシグナルペプチド配列を含むことができる。シグナルペプチドは、オンコスタチンＭ（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ９：２８４７−２８５３）またはＣＤ５（Ｊｏｎｅｓ， Ｎ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４６−３４９）由来のシグナルペプチドまたはあらゆる細胞外タンパク質由来のシグナルペプチドなど、分子を分泌させるあらゆる配列であることができる。
【００５２】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子はＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＮ末端と連結したオンコスタチンＭシグナルペプチド、およびＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（野生型または変異型）のＣ末端と連結したヒト免疫グロブリン分子（例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）を含むことができる。この分子は、−２６位のメチオニンから−１位のアラニンまでのアミノ酸配列を含むオンコスタチンＭシグナルペプチド、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン部分を含む。
【００５３】
詳細には、以下に記載のように変異されたＣＴＬＡ４配列を含む本発明の可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は、変異ＣＴＬＡ４断片と融合したヒトＩｇＣγ１部分を含む融合分子である。
【００５４】
１つの態様では、可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は、細胞外ドメインに単一変異を含むＣＴＬＡ４断片と融合したヒトＩｇＣγ１部分を含む。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（例えば図２３）。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むことができる（例えば図２３）。単一部位変異の例としては、＋１０４位のロイシンが他のアミノ酸に変化している次のものが挙げられる：
【００５５】
【表２】
2004517806.tif 000003
【００５６】
さらに、本発明は、ＩｇＣγ１部分に融合した、２つの変異を含むＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する変異分子を提供する。これらの例としては、＋１０４位のロイシンが他のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に変化し、＋１０５位のグリシン、＋２５位のセリン、＋３０位のスレオニンまたは＋２９位のアラニンが他のアミノ酸に変化している次のものが挙げられる：
【００５７】
【表３】
2004517806.tif 000004
【００５８】
さらに、本発明は、ＩｇＣγ１部分に融合した、３つの変異を含むＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する変異分子を提供する。これらの例としては、＋１０４位のロイシンが他のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）に変化し、＋２９位のアラニンが他のアミノ酸（例えばチロシン）に変化し、そして＋２５位のセリンが他のアミノ酸に変化している次のものが挙げられる：
【００５９】
【表４】
2004517806.tif 000005
【００６０】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は分子のＣＴＬＡ４部分とＩｇ部分との間に位置する連絡アミノ酸残基を含むことができる。この連絡アミノ酸はグルタミンなどのアミノ酸であることができる。連絡アミノ酸は、当業界にて既知の分子または化学的合成法によって導入することができる。
【００６１】
本発明は、変異分子のＣＴＬＡ４部分の細胞外ドメインのＮ末端と連結したシグナルペプチド配列を含むＣＴＬＡ４変異分子を提供する。シグナルペプチドは、オンコスタチンＭ（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ９：２８４７−２８５３）またはＣＤ５（Ｊｏｎｅｓ， Ｎ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４６−３４９）由来のシグナルペプチドまたは細胞外タンパク質由来のシグナルペプチドなど、変異分子を分泌させるあらゆる配列であることができる。
【００６２】
本発明は、Ｌ１０４ＥＩｇ（図１８に含まれる）またはＬ１０４ＳＩｇなどの、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに単一部位変異を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を提供する、ここに、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＳＩｇはＣＴＬＡ４配列が変異しており、＋１０４位のロイシンがそれぞれグルタミン酸またはセリンに置換している。単一部位変異分子はさらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。この変異分子の免疫グロブリン部分はさらに、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンと置換し＋１４８位のプロリンがセリンに置換するように変異することができる。あるいは、単一部位可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６３】
本発明は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇなどの、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに２部位変異を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を提供する、ここに、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸に、＋２９位のアラニンはそれぞれチロシン、ロイシン、スレオニンおよびトリプトファンに置換している。＋１位のメチオニンから＋３５７位のリジンで終わりさらにシグナル（リーダー）ペプチド配列を含むＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇの配列はそれぞれ、図１９−２２に示す配列に含まれている。２部位変異分子はさらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。この変異分子の免疫グロブリン部分はさらに、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンと置換し＋１４８位のプロリンがセリンに置換するように変異することができる。あるいは、これらの変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６４】
本発明は、Ｌ１０４ＥＧ１０５ＦＩｇ、Ｌ１０４ＥＧ１０５ＷＩｇおよびＬ１０４ＥＧ１０５ＬＩｇなどの、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに２部位変異を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を提供する、ここに、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸に、＋１０５位のグリシンはそれぞれフェニルアラニン、トリプトファンおよびロイシンに置換している。この２部位変異分子はさらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。この変異分子の免疫グロブリン部分はさらに、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンと置換し＋１４８位のプロリンがセリンに置換するように変異することができる。あるいは、これらの変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６５】
本発明は、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む２部位変異分子であるＬ１０４ＥＳ２５ＲＩｇを提供する。ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを有する部分は、＋２５位のセリンがアルギニンに置換し、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸に置換するよう変異されている。あるいは、Ｌ１０４ＥＳ２５ＲＩｇは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６６】
本発明は、Ｌ１０４ＥＴ３０ＧＩｇおよびＬ１０４ＥＴ３０ＮＩｇなどの、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに２部位変異を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を提供する、ここに、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸に、＋３０位のスレオニンはそれぞれグリシンおよびアスパラギンに置換している。この２部位変異分子はさらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。この変異分子の免疫グロブリン部分はさらに、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンと置換し＋１４８位のプロリンがセリンに置換するように変異することができる。あるいは、これらの変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６７】
本発明は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇなどの、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに３部位変異を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を提供する、ここに、＋１０４位のロイシンはグルタミン酸に置換しており、＋２９位のアラニンはチロシンに変化しており、＋２５位のセリンはそれぞれリジン、アスパラギンおよびアルギニンに変化している。３部位変異分子はさらに、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分、＋１２５位の連絡アミノ酸残基グルタミン、および＋１２６位のグルタミン酸から＋３５７位のリジンまでを含む免疫グロブリン部分を含む。この変異分子の免疫グロブリン部分はさらに、＋１３０、＋１３６および＋１３９位のシステインがセリンと置換し＋１４８位のプロリンがセリンに置換するように変異することができる。あるいは、これらの変異分子は、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含むＣＴＬＡ４部分を含むことができる。
【００６８】
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子のさらなる態様には、Ｂ７を結合するキメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８相同変異分子が含まれる（Ｐｅａｃｈら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９４，１８０：２０４９−２０５８）。キメラＣＴＬＡ４／ＣＤ２８変異分子の例としては、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３，ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ６、ＨＳ４Ａ、ＨＳ４Ｂ，ＨＳ７、ＨＳ８、ＨＳ９、ＨＳ１０、ＨＳ１１、ＨＳ１２、ＨＳ１３およびＨＳ１４（米国特許第５，７７３，２５３号）が挙げられる。
【００６９】
本発明の好ましい態様は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２４に示すように＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンに終わる）および可溶性ＣＴＬＡ４変異体Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９に示すように＋１位のメチオニンから始まり＋３５７位のリジンに終わる）などの可溶性ＣＴＬＡ４分子である。本発明はさらに、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をも提供する。１つの態様では、核酸分子はＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）またはそのハイブリッドである。ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡ（図２４）は、１９９１年５月３１日にバージニア州２０１１０−２２０９マナッサス・ユニバーシティブルバード１０８０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６８６２９がＡＴＣＣから付与されている。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをコードするＤＮＡ（図１９に示す配列）は、２０００年６月１９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２１０４が付与されている。あるいは、核酸分子はＲＮＡまたはそのハイブリッドである。
【００７０】
さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。発現ベクターの例には、哺乳類宿主細胞用のベクター（例えばＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、レトロウイルスベクター（例えばｐＦＢベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＣＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはそれらの修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばｐＳＥＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などがあるが、これらに限定されない。
【００７１】
また宿主ベクター系も提供する。宿主ベクター系は適切な宿主細胞に本発明のベクターを含んでなる。適切な宿主細胞の例としては原核生物細胞および真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明を実施するには、真核生物が好ましい適切な宿主細胞である。真核生物細胞の例には、初代または不死化を問わず、動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞は、宿主として使用することができる動物細胞の例である。ＣＨＯ細胞の具体例には、例えばＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ． １２：５５５−５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＡＣＣ ８５０５０３０２と呼称されるＣＨＯ（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＥＣＡＣＣ ９３０６１６０７と呼称されるＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））およびＥＣＡＣＣ ９２０５２１２９と呼称されるＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））などがある。植物細胞の代表例としては、タバコ（植物全体、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびコメ種子も利用できる。
【００７２】
本発明のＣＴＬＡ４変異分子は天然に存在するポリペプチドとして、または天然、合成、半合成または組換えを問わない供給源から単離することができる。従って、ＣＴＬＡ４変異ポリペプチド分子は、あらゆる種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマなどの哺乳類、好ましくはヒトから天然に存在するタンパク質として単離することができる。あるいは、ＣＴＬＡ４変異ポリペプチド分子は、原核生物または真核生物宿主細胞から発現する組換えポリペプチド、または化学的合成されたポリペプチドとして単離することができる。
【００７３】
当業者であれば、単離されるＣＴＬＡ４変異分子を得るための標準的な単離方法を容易に利用することができる。単離の性質や程度は単離する分子の目的とする用途および供給源に依存する。
【００７４】
ＣＴＬＡ４変異分子およびその断片または誘導体は組換え法によって調製することができる。従って、野生型ＣＴＬＡ４分子をコードする単離ヌクレオチド配列を操作して変異を導入し、ＣＴＬＡ４変異ポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、ＣＴＬＡ４変異分子をコードするヌクレオチド配列は、プライマーおよびＰＣＲ増幅を使用し、部位特異的突然変異によって調製できる。プライマーは、所望の変異を導入できるよう設計した個別の配列を含むことができる。あるいは、プライマーはランダム変異を導入するための無作為または半無作為配列を含むよう設計することができる。ＣＴＬＡ４変異ポリペプチドをコードするＣＴＬＡ４変異ポリヌクレオチドを調製し単離するには、標準的な組換え法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＦｒｉｔｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓら編、（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）およびＰＣＴ手法（米国特許第４，６０３，１０２号）を利用できる。
【００７５】
本発明は、医薬有効量の可溶性ＣＴＬＡ４分子を含む、免疫系疾患を処置するために使用される医薬組成物を包含する。特定の態様では、免疫系疾患は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７相互作用によって媒介される。可溶性ＣＴＬＡ４分子は好ましくは、野生型配列を有する可溶性ＣＴＬＡ４分子、および／またはＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに１またはそれ以上の変異を持つ可溶性ＣＴＬＡ４分子である。医薬組成物は、可溶性ＣＴＬＡ４タンパク質分子および／またはこの分子をコードする核酸分子および／またはベクターを含むことができる。好ましい態様では、可溶性ＣＴＬＡ４分子は、図２４または１９のいずれかに示すＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（それぞれＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙ）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は本明細書に開示するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである。本組成物はさらに、例えば薬物毒素、酵素、抗体またはコンジュゲート体など、他の治療薬を含んでもよい。
【００７６】
当分野の標準的手法と同様、当業者に既知の許容される担体またはアジュバントとともに混合した本発明の分子を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は好ましくは、本発明の分子（例えばＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９Ｙなどの可溶性ＣＴＬＡ４分子）と混合したときに本発明分子の活性を損なわず、かつ対象の免疫系と反応しない適切な材料である担体およびアジュバントを含む。適切な担体およびアジュバントの例としてはイオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝剤（リン酸塩、グリシンなど）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、リン酸緩衝化食塩水、水、エマルジョン（例えば水／油エマルジョン）、塩類または電解質（硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基本物質およびポリエチレングリコールなど）が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体には滅菌溶液、コート錠などの錠剤、カプセル剤を挙げることもできる。典型的には、このような担体は賦形剤、例えばデンプン、ミルク、糖（例えばスクロース、グルコース、マルトース）、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪または油、ゴム、グリコールまたは他の既知の賦形剤を含む。このような担体には香料および着色料または他の成分を含めることもできる。このような担体を含む組成物は周知の通常の方法によって製剤化される。そのような組成物は例えばリポソームなどの様々な脂質組成物およびポリマーマイクロスフェアなどのポリマー組成物中に製剤化することもできる。
【００７７】
方    法
本発明は、機能的なＣＴＬＡ４−およびＣＤ２８−陽性細胞とＢ７陽性細胞との相互作用を調節するための方法を提供する。この方法は、Ｂ７細胞を本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子と接触させ、可溶性ＣＴＬＡ４／Ｂ７複合体を生成し、この複合体が内生ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８分子とＢ７分子との反応を妨害する。
【００７８】
さらに、本発明は、ヒトにおいてＢ７陽性細胞を可溶性ＣＴＬＡ４と接触させることによる、ヒトにおけるＴ細胞機能を阻害するがＴ細胞を枯渇（減少）させない方法を提供する。可溶性ＣＴＬＡ４の例には、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび可溶性ＣＴＬＡ４変異分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇがある。
【００７９】
さらに本発明は、リウマチ疾患などの免疫系疾患を処置する方法も提供する。この方法では、免疫系疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩解するに有用な量の、本発明可溶性ＣＴＬＡ４分子を含む治療用組成物を対象に投与する。さらに、本発明は、Ｔ細胞／Ｂ７陽性細胞相互作用を遮断することによりＣＤ２８と結合するＢ７などの共刺激シグナルによってＴ細胞刺激を遮断し、Ｔ細胞アネルギーまたは寛容性を導く、免疫系疾患のための長期療法を提供することができる。免疫系疾患には自己免疫疾患、免疫増生疾患、および移植片関連障害があるが、これらに限定されない。移植片関連疾患の例には、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）（例えば骨髄移植によって起こるもの、または寛容の誘導をもたらすもの）、移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種移植もしくは異種移植に関係する免疫障害がある。免疫増生疾患の例には、乾癬、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えば狼蒼（例：エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インシュリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病などがあるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子はインビボにて阻害特性を示す。Ｔ細胞／Ｂ７陽性細胞相互作用、例えばＴ細胞／Ｂ細胞相互作用がＴ細胞とＢ７陽性細胞との接触の結果として起こっているような状態では、導入されたＣＴＬＡ４分子が結合してＢ７陽性細胞、例えばＢ細胞に対する反応を起こすことにより、Ｔ細胞／Ｂ７陽性細胞相互作用が妨害、即ち阻害され、その結果、免疫応答が調節される。
【００８１】
本発明は免疫応答をダウンレギュレート（下方調節）する方法を提供する。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子による免疫応答のダウンレギュレーションは、既に進行中の免疫応答を阻害または遮断してもよいし、免疫応答の誘導を予防するものであってもよい。本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、Ｔ細胞応答を抑制もしくはＴ細胞に特異的寛容を誘発することによって、またはその両方によって、例えばＴリンパ球増殖やサイトカイン分泌などの活性化Ｔ細胞の機能を阻害することができる。さらに、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８／Ｂ７経路を妨害する本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子はＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌を阻害し、それにより組織破壊を低下させ、Ｔ細胞非応答性やアネルギーを誘導できる。
【００８２】
本発明の好ましい態様は、可溶性ＣＴＬＡ４分子、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを使用し、機能的ＣＴＬＡ４−およびＣＤ２８−陽性細胞とＢ７陽性細胞との相互作用を調節し、リウマチ疾患などの免疫系疾患を処置し、および／または免疫応答をダウンレギュレートする。本発明のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、＋１０４位におけるロイシン（Ｌ）からグルタミン酸（Ｅ）、および＋２９位におけるアラニン（Ａ）からチロシン（Ｙ）への変化である少なくとも２つのアミノ酸変化を含む可溶性ＣＴＬＡ４変異分子である。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は２つの特定の変異以上の変異をさらに含むことができる。
【００８３】
好ましい態様では、有効量の可溶性ＣＴＬＡ４分子を対象に投与することにより、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患を処置する方法を包含する。治療組成物の有効量を投与することにより、疾患に付随する少なくとも１つの対象における症状を緩解、例えば関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および痛み、ならびに爾後に身体障害を低下させる構造的障害を減少させる。本発明の方法を使用すればさらに、慢性関節リウマチに付随する少なくとも１つ症状を減少、例えば赤血球凝集率、Ｃ反応性タンパク質、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性Ｅセレクチンおよび／または可溶性ＩＬ−２ｒの血清レベルを減少させることができる。
【００８４】
本発明によってもたらされる症状の緩解量は、臨床設定において症状緩解を測定し記録するのに確立されている許容された基準を用いて測定できる。症状緩解を測定するための許容された基準には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙにより確立された基準に基づく評点（例えば、ＡＣＲ２０）、症状緩解の４つの測定値（ＣＤＥＲ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｎｔｉｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ−ＦＤＡ １９８８）、および健康評価問診表（ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒａ）（ＨＡＱ）（Ｆｒｉｅｓ，Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ９：７８９−７９３）などがある。これら基準の一般的説明については、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇｓ， Ｄｅｖｉｃｅｓ， ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ （ＲＡ）， １９９９ ２月を参照のこと。
【００８５】
本発明によって試験される対象には哺乳類対象、例えばヒト、サル、類人類、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットがある。
【００８６】
本発明は可溶性ＣＴＬＡ４分子を投与するための局所または全身の種々の方法を提供する。この方法には、静脈内、筋肉内、腹腔内、経口、吸入および皮下方法、ならびに移植可能ポンプ、連続注入、遺伝子治療、リポソーム、坐剤、局所接触、小胞、カプセル、および注入方法が含まれる。担体と複合化した治療物質は保存のため通常凍結乾燥し、投与前に水または緩衝化溶液を用いて中性ｐＨ（約ｐＨ７−９、例えばｐＨ７．５）に再構成する。
当業界の標準的な方法のようにして、本発明の組成物は医薬的に許容される形態にて対象に投与すればよい。
【００８７】
本発明を実施する方法は、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子を対象に投与し、Ｂ７陽性細胞とＣＤ２８−および／またはＣＴＬＡ４−陽性細胞との相互作用を調節する。Ｂ７陽性細胞を、有効量の本発明可溶性ＣＴＬＡ４分子またはその断片もしくは誘導体に接触させ、可溶性ＣＴＬＡ４／Ｂ７複合体を形成させる。この複合体は内生ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８分子とＢ７ファミリー分子との相互作用を妨害する。
【００８８】
可溶性ＣＴＬＡ４分子は、対象の体内で内生Ｂ７分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および／または複数回）対象に投与すればよい。内生Ｂ７／リガンド結合の遮断により、Ｂ７陽性細胞とＣＤ２８−および／またはＣＴＬＡ４−陽性細胞との相互作用が阻害される。
【００８９】
治療物質の用量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、対象の健康状態、その薬剤による処置に対する反応性など（これらに限定されない）、多くの因子に依存する。従って、薬剤の用量は個々の対象および投与形式に依存して変動しうる。可溶性ＣＴＬＡ４分子は０．１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ−患者体重／日、好ましくは０．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与することができる。
【００９０】
本発明はさらに、免疫系疾患を処置するために他の医薬物質とともに本発明の組成物を使用することを包含する。例えば、リウマチ疾患は、本発明の分子とともに次の免疫抑制剤で処置することができる；例えばコルチコステロイド、シクロスポリン（Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ １９８９ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，４４（２）：１５１−１５６）、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート（Ｒ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ「第５３章：免疫抑制に使用される薬物（Ｃｈａｐｔｅｒ ５３： Ｄｒｕｇｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」１２６４〜１２７６頁）、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ．３４０：２５３−２５９， １９９９； Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ｖｏｌ．３５４：１９３２−３９， １９９９， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｖｏｌ． １３０：４７８−４８６）、または炎症性サイトカインを標的とする他の生物薬剤、非ステロイド系抗炎症薬／Ｃｏｘ−２阻害剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン、金塩、エタナーセプト、インフリキシマブ、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、バシリキシマブ、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、アナキンラ、および／または他生物製剤など。
【００９１】
可溶性ＣＴＬＡ４分子（好ましくはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）は、免疫応答を調節するために、以下の薬剤の１つまたはそれ以上と併用することもできる：可溶性ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１５４、Ｔ−ＢＡＭ、ＴＲＡＰとしても知られている）、可溶性ＣＤ２９、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ８０（例えばＡＴＣＣ６８６２７）、可溶性ＣＤ８６、可溶性ＣＤ２８（例えば６８６２８）、可溶性ＣＤ５６、可溶性Ｔｈｙ−１、可溶性ＣＤ３、可溶性ＴＣＲ、可溶生ＶＬＡ−４、可溶性ＶＣＡＭ−１、可溶性ＬＥＣＡＭ−１、可溶性ＥＬＡＭ−１、可溶性ＣＤ４４、ｇｐ３９と反応する抗体（例えばＡＴＣＣ ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ ＨＢ−１２０５５およびＡＴＣＣ ＨＢ−１２０５６）、ＣＤ４０と反応する抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ−９１１０）、Ｂ７と反応する抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ ＨＢ−３０１、ＡＴＣＣ ＨＢ−１１３４１など）、ＣＤ２８と反応する抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ−１１９４４またはＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ． ４（１）：１８−２２，１９８０）に記載されているｍＡｂ９．３）、ＬＦＡ−１と反応する抗体（例えばＡＴＣＣ ＨＢ−９５７９およびＡＴＣＣ ＴＩＢ−２１３）、ＬＦＡ−２と反応する抗体、ＩＬ−２と反応する抗体、ＩＬ−１２と反応する抗体、ＩＦＮ−ガンマと反応する抗体、ＣＤ２と反応する抗体、ＣＤ４８と反応する抗体、ＩＣＡＭと反応する抗体（例えばＩＣＡＭ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２５２）、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４と反応する抗体（例えばＡＴＣＣ ＨＢ−３０４）、Ｔｈｙ−１と反応する抗体、ＣＤ５６と反応する抗体、ＣＤ３と反応する抗体、ＣＤ２９と反応する抗体、ＴＣＲと反応する抗体、ＶＬＡ−４と反応する抗体、ＶＣＡＭ−１と反応する抗体、ＬＥＣＡＭ−１と反応する抗体、ＥＬＡＭ−１と反応する抗体、ＣＤ４４と反応する抗体。ある態様では、モノクローナル抗体が好ましい。また他の態様では抗体断片が好ましい。当業者には容易に理解されるように、併用には、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子と他の１つの免疫抑制剤を、可溶性ＣＴＬＡ４分子と他の２つの免疫抑制剤を、可溶性ＣＴＬＡ４分子と他の３つの免疫抑制剤などを含めることができる。最適な併用の組合わせおよび用量は、当分野にて周知の方法を使って決定し、最適化することができる。
【００９２】
具体的な併用の例には以下の組合わせがある：  Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ８６ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０ｍＡｂおよびＣＤ８６ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびｇｐ３９ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ４０ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＤ２８ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６ｍＡｂならびにｇｐ３９ｍＡｂ；Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、ＣＤ８０およびＣＤ８６ｍＡｂならびにＣＤ４０ｍＡｂ；ならびにＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、抗ＬＦＡ１ｍＡｂ、および抗ｇｐ３９ｍＡｂ抗体。ｇｐ３９ｍＡｂの具体例はＭＲ１である。当業者には他の組合わせもすぐにわかるだろう。
【００９３】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子、例えばＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは唯一の活性物質として、または免疫調節療法に使用される他の薬物と共に、または他の抗炎症剤と共に使用し、例えば同種または異種移植片の急性または慢性拒絶または炎症もしくは自己免疫障害を処置または予防、または寛容を誘導することができる。例えば、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子は、以下の薬物と併用することができる：カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６、免疫抑制性マクロライド、例えばラパマイシンまたはその誘導体、例えば４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシン、リンパ球ホーミング剤、例えばＦＴＹ７２０またはその類似体、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｅｎｅ）、メトトレキセート、レフルノミドまたはその同族体、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスパガリンまたはその同族体、免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球受容体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体、または他の免疫調節化合物、例えばＣＴＬＡ４／ＣＤ２８−Ｉｇ、または他の接着分子阻害剤、例えばモノクローナル抗体もしくはＬＦＡ−１アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストなどの低分子量阻害剤。本化合物は、ＣＤ４０およびそのリガンドを妨害する化合物、例えばＣＤ４０に対する抗体およびＣＤ４０−Ｌに対する抗体と併用するのが特に有用である。
【００９４】
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を、例えば上述したような他の免疫抑制／免疫調節または抗炎症療法とともに投与する場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性化合物の用量は当然、使用する併用薬のタイプ（例えばそれがステロイドかシクロスポリンか）、実際に使用する薬物、処置しようとする状態などに依存して変動する。
【００９５】
上記の説明に従って、本発明はさらなる一側面として、遊離型または医薬的に許容できる塩形態の本発明の可溶性ＣＴＬＡ４分子、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの治療的有効量を、第２の医薬物質と一緒にまたは逐次的に同時投与することを含み、この第２の医薬物質が例えば上述の免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬であるような、上に定義した方法を提供する。さらに本発明は、免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬を含む少なくも１つの医薬組成物と同時にまたは逐次的に使用される遊離型または医薬的に許容できる塩形態の可溶性ＣＴＬＡ４分子を含む、上に定義した方法で使用される治療的組合わせ、例えばキットも提供する。キットは投与のための指示書を含む。
【００９６】
本発明はさらに、本発明の可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を調製するための方法をも提供する。可溶性ＣＴＬＡ４変異分子の発現は原核生物細胞または真核生物細胞において行うことができる。
【００９７】
原核生物細胞は最も一般的には種々の細菌株によって代表される。細菌はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。典型的には、大腸菌などのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物株も使用できる。可溶性ＣＴＬＡ４変異分子をコードする配列は、大腸菌などの原核生物細胞において外来配列を発現できるよう設計されたベクターに挿入することができる。これらのベクターは普通に使用される原核制御配列を含むことができる；この原核制御配列とは、本明細書では、リボソーム結合部位配列と共に転写開始用のプロモーターを含み、所望によりオペレーターを含んでもよいと定義され、例えばβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７）およびラムダ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）などといった一般に使用されるプロモーターを含む。
【００９８】
このような発現ベクターは複製起点と、抗生物質に対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの選択マーカーを含むものであり、それにより、ベクターは細菌中で複製でき、かつそのプラスミドを保有する細胞はアンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質の存在下で生育した時に選択され得る。
【００９９】
発現プラスミドは、様々な標準的方法により原核生物細胞に導入することができ、例えばＣａＣｌ２ショック（Ｃｏｈｅｎ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋら編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））およびエレクトロポレーションなどであることが、これらの限定されない。
【０１００】
本発明を実施するには、真核生物細胞も適切な宿主細胞である。真核生物細胞の例には、初代または不死化動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞は宿主として使用できる動物細胞の例である。ＣＨＯ細胞の具体例には、例えばＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎら，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ． １２：５５５−５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｋ１ Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＡＣＣ ８５０５０３０２と称されるＣＨＯ（ＣＡＭＲ（英国ウィルとシャー・ソールズベリー））、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ（イタリア・ジェノバ））、ＥＣＡＣＣ ９３０６１６０７と称されるＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））およびＥＣＡＣＣ ９２０５２１２９と称されるＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））などがある。植物細胞の代表例としては、タバコ（全草、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびコメ種子も利用することができる。
【０１０１】
ＣＴＬＡ４変異分子をコードする核酸配列は、真核生物宿主にて外来配列を発現するよう設計されたベクターに挿入することもできる。このベクターの調節要素は、使用する真核生物宿主に応じて様々である。
【０１０２】
発現ベクターにおいて普通に使用される真核生物制御配列は、哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列であり、例えばＣＭＶプロモーター（ＣＤＭ８ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ＡＳＶ）（πＬＮベクター）などを含む。他の普通に使用されるプロモーターには、サルウイルス４０（ＳＶ４０）の初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら（１９７３）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３）、または他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス２およびウシ乳頭腫ウイルス由来のものなどがある。ｈＭＴＩＩ（Ｋａｒｉｎら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９９：７９７−８０２）などの誘導プロモーターも使用できる。
【０１０３】
真核生物にてＣＴＬＡ４変異分子を発現させるためのベクターはさらに、エンハンサー領域と呼ばれる配列を持ってもよい。これらは遺伝子発現の最適化に重要であり、プロモーター領域の上流または下流に見いだされる。
【０１０４】
真核宿主細胞用の発現ベクターの例には、哺乳類宿主細胞用のベクター（例えばＢＰＶ−１、ｐＨｙｇ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ２、ｐＴＫ２（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＳＦＶ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｐＶＰａｋｃベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＳＧ５ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、レトロウイルスベクター（例えばｐＦＢベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＣＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはそれらの修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばｐＳＥＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））などがあるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ＣＴＬＡ４変異分子をコードする核酸配列は、真核生物宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムの複製と共に複製することができる。あるいは、ＣＴＬＡ４変異分子を保有するベクターに複製起点を含ませ、染色体外複製を可能にすることもできる。
【０１０６】
サッカロミセス・セレビシエにて核酸配列を発現させるには、内生の酵母プラスミド２μサークル由来の複製起点を使用することができる（Ｂｒｏａｃｈ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ． １０１：３０７）。もう一つの選択肢として、自律的複製を促進する酵母ゲノム由来の配列を使用することもできる（例えばＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：１５７、およびＣｌａｒｋｅら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ． １０１：３００を参照のこと）。
【０１０７】
酵母ベクター用の転写制御配列としては例えば解糖系酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる（Ｈｅｓｓら（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９、Ｈｏｌｌａｎｄら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００）。当分野にて知られている他のプロモーターには、例えばＣＤＭ８ベクターに含まれるＣＭＶプロモーター（ＴｏｙａｍａおよびＯｋａｙａｍａ（１９９０）ＦＥＢＳ ２６８：２１７−２２１）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３）および他の解糖系酵素のプロモーターなどがある。
【０１０８】
その他、誘導プロモーターもあり、これらは環境刺激または細胞の発育培地によって調節することができる。これらの誘導プロモーターには、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素異化に関係する酵素、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素の遺伝子に由来するものなどがある。
【０１０９】
調節配列はコード配列の３’末端に置くこともできる。これらの配列はメッセンジャーＲＮＡを安定化するように作用する。そのようなターミネーターはいくつかの酵母由来遺伝子および哺乳類遺伝子のコード配列に続く３’非翻訳領域に見いだされる。
【０１１０】
植物用ベクターおよび植物細胞には、アグロバクテリウムＴｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）などがあるが、これらに限定されない。
【０１１１】
哺乳類細胞宿主系の形質転換における一般的側面は、Ａｘｅｌ（１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２１６号）により開示された。哺乳類細胞は、例えばリン酸カルシウム存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの方法、またはウイルスベクターによる形質導入（これらに限定されない）によって形質転換することができる。
【０１１２】
植物および酵母ゲノムに外来ＤＮＡ配列を導入する方法としては、（１）機械的方法、例えば単一細胞またはプロトプラストへのＤＮＡのマイクロインジェクション、ＤＮＡの存在下で細胞をガラスビーズと共にボルテックスする方法、またはＤＮＡで覆ったタングステンまたは金球体を細胞またはプロトプラストに撃ち込む方法など、（２）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルスの印加（エレクトロポレーション）によって巨大分子に対して細胞膜を透過性にすることにより、ＤＮＡを導入する方法、または（３）リポソーム（ｃＤＮＡを含むもの）を使って細胞膜に融合させる方法などが挙げられる。
【０１１３】
本発明のＣＴＬＡ４変異分子を発現させれば、当分野にて周知の細胞溶解などの方法（例えば、音波処理、リゾチームおよび／または洗浄剤）によって収獲でき、そしてタンパク質の回収は標準的なタンパク質精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて実質的に純粋な産物を得ることによって行うことができる（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９））。ＣＴＬＡ４変異分子の発現は当分野にて知られた方法によって検出することができる。例えば、変異分子はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色およびＣＴＬＡ４を結合する抗体を使った免疫ブロッティングによって検出することができる。
【０１１４】
本発明を説明し、当業者がそれを製造し使用する際の助けとなるように、以下に実施例を記載する。以下の実施例は本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【０１１５】
実施例１
以下は、本発明のＣＴＬＡ４分子をコードするヌクレオチド配列を作成するために使用される方法の説明である。
米国特許５，４３４，１３１、５，８４４，０９５、５，８５１，７９５に記載されているようにして、ＣＴＬＡ４Ｉｇをコードするプラスミドをまず構築し、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を発現することを示した。次いで、単一部位変異分子（例えばＬ１０４ＥＩｇ）をＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする配列から作成し、発現し、種々のＢ７分子に対する結合動態について試験した。Ｌ１０４ＥＩｇヌクレオチド配列（図１８に示す配列に含まれる）を鋳型として使用し、２部位ＣＴＬＡ４変異配列（図１９−２２に示す配列に含まれる）を作成し、それをタンパク質として発現させ、結合動態について試験した。２部位ＣＴＬＡ４変異配列にはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇが含まれる。３部位変異体も作成した。
【０１１６】
ＣＴＬＡ４Ｉｇの構築
米国特許５，４３４，１３１、５，８４４，０９５、５，８５１，７９５（これらは引用により本明細書に包含される）に記載されているようにして、ＣＴＬＡ４およびＩｇＣガンマ１ドメインを含有するＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする遺伝子構築物を作成した。ＣＴＬＡ４遺伝子の細胞外ドメインを、公開されている配列（Ｄａｒｉａｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：１９０１−１９０５（１９８８））に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによりクローニングした。
【０１１７】
ＣＴＬＡ４のシグナルペプチドはＣＴＬＡ４遺伝子には同定されていないので、ＣＴＬＡ４推定配列のＮ末端にオンコスタチンＭ（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ９：２８４７−２８５３（１９８９））のシグナルペプチドを重複オリゴヌクレオチドを使用する２工程により融合した。第１工程では、オリゴヌクレオチド：ＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣ（これはＣＴＬＡ４のＮ末端の７アミノ酸が融合しているオンコスタチンＭシグナルペプチド由来のＣ末端の１５アミノ酸をコードする）をフォワードプライマーとして、そしてＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＧ（ＣＴＬＡ４受容体をコードするアミノ酸配列の１１９−１２５アミノ酸残基をコードし、ＢｃＩ制限酵素部位を含有する）をリバースプライマーとして用いた。この工程の鋳型は、Ｈ３８細胞（Ｓａｌａｈｕｄｉｎ博士およびＧａｌｌｏ博士から提供を受けたＨＴＬＶ ＩＩ感染Ｔ細胞白血病細胞株、ＮＣＩ、ベセスダ、ＭＤ）由来の全ＲＮＡ１μｇから合成したｃＤＮＡであった。この第１工程にて得られたＰＣＲ産物の一部を、以下のプライマーを用いて再度複製した：オンコスタチンＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードしＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する重複フォワードプライマー：ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣ、および同じリバースプライマー。このＰＣＲの反応産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩで消化し、得られた消化産物を、ＩｇＣ（ガンマ）１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列をコードする配列をＢｃｌＩ／ＸｂａＩで切断したｃＤＮＡ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断発現ベクターＣＤＭ８またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断発現ベクターｐｉＬＮ（πＬＮとしても知られている）中に結合させた。
【０１１８】
ＣＴＬＡ４Ｉｇに相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは１９９１年５月３１日にＡＴＣＣにブタペスト条約の下に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８６２９が付与されている。
【０１１９】
ＣＴＬＡ４Ｉｇコドンベース変異誘発
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子からの解離速度（「オフ」速度）が遅く、即ち結合能が向上している変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を同定するため、変異誘発およびスクリーニング方法を開発した。ここでは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２（Ｃ’ストランドとしても知られている）および／またはＣＤＲ−３領域内の残基および／またはその付近に変異を施した（米国特許６，０９０，９１４、５，７７３，２５３、５，８４４，０９５；同時継続の米国特許出願番号６０／２１４，０６５：およびＰｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８。ＣＤＲ様領域はそれぞれのＣＤＲ領域を包含し、ＣＤＲモチーフの上流および／または下流までアミノ酸の数個が延びている）。キメラＣＤ２８／ＣＴＬＡ４融合タンパク質の研究（Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８）、どのアミノ酸残基側鎖が溶媒に暴露されるかを予測するモデル、およびＣＤ２８とＣＴＬＡ４の間で一定の位置にアミノ酸残基同一性または相同性が欠けていることに基づいて選択した。また、同定した残基と空間的に近い（５−２０オングストローム単位）残基も本発明の一部であると考える。
【０１２０】
Ｂ７分子（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６）に対する親和性が変化している可溶性ＣＴＬＡ４変異分子を合成しスクリーニングするために、２工程法を採用した。これらの実験では、まず、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの特定コドンにおける変異のライブラリーを作製し、次にＢＩＡｃｏｒｅ解析によってそれらをスクリーニングし、Ｂ７に対する反応性が変化している変異体を同定した。ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））では、検出器に配置されたデキストラン被覆センサーチップに対するＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇいずれかの共有結合が基本的に必要な表面プラズモン共鳴検出システムを使用する。次に、センサーチップを含むチャンバーに試験分子を注入し、結合する相補タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価することができ、分子量の変化は検出システムによって測定することができる。
【０１２１】
詳細には、鋳型としてＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする非変異（例えば野生型）ＤＮＡ（米国特許第５，４３４，１３１号、第５，８４４，０９５号、第５，８５１，７９５号および第５，８８５，７９６号、ＡＴＣＣ受託番号６８６２９）を使用し、単一部位変異ヌクレオチド配列を作製した。コドンの１位および２位は任意の塩基であってよいが３位はグアニンまたはチミンのみ（ＸＸＧ／ＴまたはＮＮＧ／Ｔともいう）とすることにより、特定コドンのランダム変異誘発用の変異原オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを設計した。この方法でアミノ酸をコードする特定コドンを、２０アミノ酸のそれぞれをコードするよう無作為に（ランダムに）変異させることができる。このＸＸＧ／Ｔ変異誘発により、２０アミノ酸のそれぞれをコードする可能性ある３２種類のコドンが得られる。ＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤＲ３様ループ（ＭＹＰＰＰＹ）付近に変異をコードするＰＣＲ産物をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇπＬＮ発現ベクター（図２４に含まれる）にサブクローニングした。この方法を使用し、単一部位ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＩｇ（図１８に含まれる）を作製した。
【０１２２】
ＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤＲ１様ループ付近の変異誘発のため、ＰＣＲプライマー指定変異誘発法によって、まず、このループの５’側にサイレントなＮｈｅＩ制限部位を導入した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇ発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使用し、２部位ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９に含まれる）を作製した。具体的には、単一部位ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＩｇをコードする核酸分子を鋳型として使用し、２部位ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作製した。
【０１２３】
Ｌ１０４ＥＩｇを鋳型として使用する上述の変異誘発手法を繰り返し、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（バージニア州２０１１０−２２０９マナッサス・ユニバーシティブルバード１０８０１のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２０００年６月１９日に寄託され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２１０４が付与されている）などのＣＴＬＡ４変異分子をコードする２部位変異ヌクレオチド配列を作製した。この方法を使用し、ＣＴＬＡ４分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図１９に示す配列に含まれる）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＬＩｇ（図２０に示す配列に含まれる）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＴＩｇ（図２１に示す配列に含まれる）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＷＩｇ（図２２に示す配列に含まれる）などの、種々の２部位変異ヌクレオチド配列を作製した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＫＩｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＮＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＳ２５ＲＩｇをコードするなどの３部位変異体も作製した。
【０１２４】
可溶性ＣＴＬＡ４分子を核酸配列から発現させ、後述の実施例３に記載の第ＩＩ相臨床試験に使用した。
当業者であれば、核酸配列の複製、特にＰＣＲ増幅による複製により、ＤＮＡストランドに塩基変化を容易に導入できることは理解されよう。しかし、コドンには縮重により同じアミノ酸をコードするものがあるので、ヌクレオチド変化が必ずしもアミノ酸変化に翻訳されるとは限らない。元来の、即ち野生型配列からのヌクレオチド変化はサイレント（即ち翻訳アミノ酸に変化を生じさせないもの）または明示的に本明細書に記載していないその他のものも、本発明の範囲内にある。
【０１２５】
実施例２
実施例１に記載の構築物から発現された単一部位および２部位変異ＣＴＬＡポリペプチドであって、Ｂ７分子に対して非変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子より高い結合力を示すもの、を同定するために使用されるスクリーニング方法を以下に説明する。
【０１２６】
現在のインビトロおよびインビボ研究により、ＣＴＬＡ４Ｉｇ単独では抗原特異的活性化Ｔ細胞のプライミングを完全には遮断できないことが示されている。ＣＴＬＡ４ＩｇとＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに特異的なモノクローナル抗体とを用いてＴ細胞増殖の阻害を測定するインビトロ研究では、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体がＣＴＬＡ４Ｉｇ阻害を増強しなかったことが示されている。しかし、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体は阻害を増強したことから、ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ８６相互作用の遮断にはあまり有効でないことがわかる。これらのデータは、ＣＤ８０が媒介する細胞応答の阻害に必要なＣＴＬＡ４Ｉｇ濃度はＣＤ８６が媒介する細胞応答の場合の約１／１００低いことを示したＬｉｎｓｌｅｙらによる初期の知見（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７９３−８０１）を支持している。これらの知見に基づいて、ＣＤ８６に対して野生型ＣＴＬＡ４より高い結合力を持つ可溶性ＣＴＬＡ４変異分子は、抗原特異的活性化細胞のプライミングをＣＴＬＡ４Ｉｇよりも良好に遮断できると推測した。
【０１２７】
そこで、新しいスクリーニング法を用いて上記実施例１に記載の可溶性ＣＴＬＡ４変異分子をスクリーニングし、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合力を向上させるＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン中の変異をいくつか同定した。「オフ」速度の決定は濃度に依存しないので、このスクリーニング方法は、「オフ」速度が遅くなっていると思われる変異体を、タンパク質精製または定量を行わずに直接同定するための効果的な方法になる（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１２：４５７−４６８）。
【０１２８】
個々のミニプレップ精製プラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、数日間増殖させた。３日ならし培養培地を可溶性ＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇで被覆したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ（スウェーデン・ウプサラ）に適用した。変異タンパク質の特異的結合および解離を、表面プラズモン共鳴によって測定した（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：４５７−４６８）。実験は全てＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００バイオセンサーを使って２５℃で行った。リガンドは標準的なＮ−エチルーＮ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＮ−ヒドロキシスクシンイミドカップリング法を使って研究用ＮＣＭ５センサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定化した（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８：２６８−２７７、Ｋｈｉｌｋｏ，Ｓ．Ｎ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：５４２５−１５４３４）。
【０１２９】
スクリーニング法
２４ウエル組織培養平板で生育したＣＯＳ細胞に、変異型ＣＴＬＡ４Ｉｇを一過性にトランスフェクトした。３日後に、分泌された可溶性変異ＣＴＬＡ４Ｉｇを含む培養培地を収集した。
【０１３０】
ＣＤ８６ＩｇまたはＣＤ８０Ｉｇで誘導体化したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップにＣＯＳ細胞ならし培養培地を流し（Ｇｒｅｅｎｅら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６２−２６７７１に記載されているようにして）、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇに見られる「オフ」速度より遅い「オフ」速度を持つ変異分子を同定した。選択した培地試料に対応するＤＮＡを配列決定し、より多くのＤＮＡを調製して、ＣＯＳ細胞の一過性トランスフェクションを大規模に行い、培養培地のプロテインＡ精製によってそこからＣＴＬＡ４Ｉｇ変異タンパク質を調製した。
【０１３１】
ＢＩＡｃｏｒｅ解析条件および平衡結合データ解析はＪ．Ｇｒｅｅｎｅら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６２−２６７７１および米国特許出願０９／５７９，９２７および６０／２１４，０６５（これらは引用により本明細書に包含される）に記載されているようにして行った。
【０１３２】
ＢＩＡｃｏｒｅデータ解析
分析に先立ってセンサーグラムの基準線をゼロ応答単位（ＲＵ）に標準化した。試料をモック誘導化フローセルに流し、溶液間のバルク屈折率差によるバックグラウンド応答単位（ＲＵ）値を測定した。平衡解離定数（Ｋｄ）はＲｅｑ対Ｃのプロットから計算した（ここに、Ｒｅｑは（定常状態応答）−（モック誘導化チップでの応答）であり、Ｃは分析物のモル濃度である）。結合曲線は市販の非線形カーブフィッティングソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使って解析した。
【０１３３】
実験データは、まず単一受容体への単一リガンド結合のモデル（１部位モデル、即ち単純なラングミュアー系、Ａ＋Ｂ←→ＡＢ）にあてはめ、平衡結合定数（Ｋｄ＝［Ａ］・［Ｂ］／［ＡＢ］）を式：Ｒ＝Ｒｍａｘ・Ｃ／（Ｋｄ＋Ｃ）から計算した。次に、データを、リガンド結合の最も簡単な２部位モデル（即ち、式：Ｒ＝Ｒｍａｘ１・Ｃ／（Ｋｄ１＋Ｃ）＋Ｒｍａｘ２・Ｃ／（Ｋｄ２＋Ｃ）で表される２つの相互作用しない独立した結合部位を持つ受容体）にあてはめた。
【０１３４】
これら２つのモデルの適合度を、実験データとの比較によって視覚的に、また平方和のＦ検定によって統計的に解析した。２部位モデルの方が適合度が有意に高くない場合（ｐ＜０．１）、より単純な１部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０１３５】
結合および解離解析は、ＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って行った。結合速度定数ｋｏｎは均一な単一部位相互作用および並行２部位相互作用の両方を仮定して２つの方法で計算した。単一部位相互作用の場合、式：
Ｒｔ＝Ｒｅｑ（１−ｅｘｐ−ｋｓ（ｔ−ｔ０））［式中、Ｒｔは時刻ｔにおける応答、Ｒｅｑは定常状態応答、ｔ０は注入を開始した時刻、そしてｋｓ＝ｄＲ／ｄｔ＝ｋｏｎ・Ｃｋｏｆｆ（ここに、Ｃはモノマー結合部位に関して計算した分析物の濃度である）］に従ってｋｏｎ値を計算した。２部位相互作用の場合は、式：Ｒｔ＝Ｒｅｑ１（１−ｅｘｐ−ｋｓ１（ｔ−ｔ０））＋Ｒｅｑ２（１−ｅｘｐｋｓ２（ｔ−ｔ０））に従ってｋｏｎ値を計算した。各モデルについて、ｋｓ対Ｃのプロットの傾き（最大結合の約７０％まで）の計算値からｋｏｎの値を決定した。
【０１３６】
解離データは単一部位モデル（ＡＢ＝Ａ＋Ｂ）または２部位モデル（ＡｉＢｊ＝Ａｉ＋Ｂｊ）に従って解析し、速度定数（ｋｏｆｆ）をベストフィット曲線から計算した。誤差が機械のバックグランド（機械によって２−１０ＲＵ）より大きい場合（この場合は２結合部位モデルを使用）を除いて、上記結合部位モデルを使用した。受容体占有の半減期は、ｔ１／２＝０．６９３／ｋｏｆｆの関係を使って計算した。
【０１３７】
フローサイトメトリー
マウスモノクローナル抗体Ｌ３０７．４（抗ＣＤ８０）はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州サンホゼ）から購入し、ＩＴ２．２（抗Ｂ７−０［ＣＤ８６とも呼ばれる］）はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。免疫染色のため、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートすることにより、ＣＤ８０陽性および／またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞を培養器から取り出した。ＣＨＯ細胞（１−１０×１０５個）をまずモノクローナル抗体または免疫グロブリン融合タンパク質と共に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした後、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第２工程試薬と共にインキュベートした（Ｔａｇｏ（カリフォルニア州バーリンゲーム））。細胞に最終洗浄を施し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはトリス／グリシン４−２０％アクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ（カリフォルニア州サンディエゴ））で行った。分析用ゲルはクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによって湿ゲルの画像を得た。０．０２％ＮａＮ３を含むリン酸緩衝化食塩水で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３００ ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈａａｓ（ペンシルバニア州モントゴメリービル））を使用し、１．０ｍｌ／分の流速で、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５μｇ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（２５μｇ）をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１３９】
ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓ
一本鎖ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０Ｓを先に記述されているようにして調製した（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４１７−１５４２４）。簡単に述べると、オンコスタチンＭ ＣＴＬＡ４（ＯＭＣＴＬＡ４）発現プラスミドを鋳型として使用し、ベクター中の配列に適合するようにフォワードプライマー：
ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧ
を選択した。またリバースプライマー：
ＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣ
は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの最後の７アミノ酸（即ちアミノ酸１１８−１２４）に相当し、制限酵素部位および停止コドン（ＴＧＡ）を含んでいる。リバースプライマーはＣ１２０Ｓ（１２０位におけるシステインからセリンへの）変異を指定している。具体的には、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列ＧＣＡ（ヌクレオチド３４−３６）を以下のヌクレオチドの一つと置き換える：ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴ。当業者に理解されるように、ヌクレオチド配列ＧＣＡはシステインのコドンＴＧＣの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴはセリンのコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、発現ベクターπＬＮ（Ｂｒｉｓｔｒｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ（ニュージャージー州プリンストン））に特定の向きでサブクローニングした。各構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１４０】
高結合力変異体の同定および生化学的特徴づけ
２４のアミノ酸を変異誘発用に選択し、得られた約２３００の変異型タンパク質を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ；上記の方法）によりＣＤ８６Ｉｇ結合に関して検定した。各部位での変異誘発の主な効果を以下の第ＩＩ表に要約する。ＣＤＲ−１領域（Ｓ２５−Ｒ３３）中のアミノ酸の一部にはランダム変異を施してもリガンド結合は明らかに変化しなかった。Ｅ３１およびＲ３３ならびに残基Ｍ９７−Ｙ１０２の変異誘発はリガンド結合の低下をもたらした。残基Ｓ２５、Ａ２９およびＴ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、Ｌ１０４およびＧ１０５の変異誘発は「オン」速度の低下および／または「オフ」速度の低下をもたらした。これらの結果は、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域中の残基およびＭ９７−Ｙ１０２中またはその近傍にある残基がリガンド結合に影響するという先の知見（Ｐｅａｃｈら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：２０４９−２０５８）を裏付けている。
【０１４１】
部位Ｓ２５、Ｔ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３およびＧ１０５の変異誘発によって、「オフ」速度がＣＤ８６Ｉｇより遅い変異体がいくつか同定された。しかしこれらの例では、遅い「オフ」速度が遅い「オン」速度と相殺し、ＣＤ８６Ｉｇに対する全体結合力は野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇで見られる結合力と見かけ上同じ程度の変異体であった。また、Ｋ９３の変異誘発はかなりの凝集をもたらしたが、これも観察された動態変化の原因になっている可能性がある。
【０１４２】
Ｌ１０４にランダム変異誘発を行った後、ＣＯＳ細胞のトランスフェクションおよび固定化ＣＤ８６Ｉｇに対する培養培地試料のＳＰＲによるスクリーニングを行ったところ、「オフ」速度が野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのおよそ１／２しかない変異タンパク質を含む６つの培地試料が得られた。これら変異体の対応するｃＤＮＡを配列決定したところ、いずれもロイシンからグルタミン酸への変異（Ｌ１０４Ｅ）をコードすることがわかった。ロイシン１０４からアスパラギン酸への置換（Ｌ１０４Ｄ）はＣＤ８６Ｉｇ結合に影響を及ぼさなかった。
【０１４３】
次に、今度はＰＣＲ鋳型として上記の野生型ＣＴＬＡ４ＩｇではなくＬ１０４Ｅを使用し、第ＩＩ表に列挙した各部位で、変異誘発を繰り返した。再び固定化ＣＤ８６Ｉｇを使ってＳＰＲ解析を行ったところ、アラニン２９の変異誘発により、「オフ」速度が野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのおよそ１／４しかないタンパク質を含む培養培地試料が６つ同定された。最も遅い２つはチロシン置換（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ）、２つはロイシン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｌ）、１つはトリプトファン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｗ）、そして１つはスレオニン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔ）だった。野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇのアラニン２９を単独でランダムに変異させても、遅い「オフ」速度を持つ変異体は同定されないようだった。
【０１４４】
精製したＬ１０４ＥおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの相対分子量および凝集状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（約１μｇ；レーン３）およびＬ１０４ＥＩｇ（約１μｇ；レーン２）は、還元条件（約５０ｋＤａ；＋βＭＥ；＋２−メルカプトエタノール）でも非還元条件（約１００ｋＤａ；−βＭＥ）でも、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（約１μｇ；レーン１）と見かけ上同じ電気泳動移動度を持っていた（図２５Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図２５Ｃ）は二量体ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）と見かけ上同じ移動度を持つことが証明された。主要ピークはタンパク質二量体に相当し、図２５Ｂで速く溶出するマイナーピークは高分子量凝集体に相当する。ＣＴＬＡ４Ｉｇの約５．０％は高分子量凝集体として存在したが、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの凝集を示す証拠は認められなかった。従って、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに見られたＣＤ８６Ｉｇへの強い結合は、変異誘発が誘発した凝集に起因するものではないと考えられる。
【０１４５】
平衡結合解析および速度論的結合解析
プロテインＡで精製したＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに対し、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使って、平衡結合解析および速度論的結合解析を行った。結果を以下の第Ｉ表に示す。観察された平衡解離定数（Ｋｄ；第Ｉ表）はある濃度範囲（５．０−２００ｎＭ）にわたって作成した結合曲線から計算した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＬ１０４ＥＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇより強くＣＤ８６Ｉｇに結合する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＫｄ（３．２１ｎＭ）がＬ１０４ＥＩｇ（６．０６ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（１３．９ｎＭ）より低いことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの方がＣＤ８６Ｉｇに対して高い結合力を持つことを示している。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＫｄ（３．６６ｎＭ）がＬ１０４ＥＩｇ（４．４７ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（６．５１ｎＭ）より低いことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの方がＣＤ８０Ｉｇに対して高い結合力を持つことを示している。
【０１４６】
速度論的結合解析により、ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ結合の比較上の「オン」速度は同じぐらいであり、ＣＤ８６Ｉｇに関する「オン」速度も同様であることがわかった（第Ｉ表）。しかし、これらの分子の「オフ」速度は等しくなかった（第Ｉ表）。ＣＴＬＡ４Ｉｇと比較すると、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＤ８０Ｉｇからの「オフ」速度は約２倍遅く、ＣＤ８６Ｉｇからの「オフ」速度は約４倍遅かった。Ｌ１０４Ｅの「オフ」速度はＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇとＣＴＬＡ４Ｉｇの中間だった。これらの変異の導入は「オン」速度に有意な影響を与えなかったので、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで観察されたＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇに対する結合力の増大は、主として「オフ」速度の低下によると思われた。
【０１４７】
ＣＤ８６ＩｇおよびＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの結合力の増大が、各単量体が二量体として会合する仕方に変異が影響を与えたためかどうか、あるいは結合力を増大させる構造変化が各単量体に導入されたためかどうかを決定するため、ＣＴＬＡ４およびＬ１０４ＥＡ２９Ｙ細胞外ドメインの１本鎖構築物を、上述のように、そしてＬｉｎｓｌｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１５４１７−１５４２４に記載のように、システイン１２０のセリンへの変異誘発によって作製した。精製したタンパク質ＣＴＬＡ４ＸＣ１２０ＳおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０Ｓが単量体であることをゲル透過クロマトグラフィーによって明らかにした後（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９５）前掲）、それらのリガンド結合特性をＳＰＲによって解析した。その結果、ＣＤ８６Ｉｇに対する両単量体タンパク質の結合親和性はそれぞれの二量体で観察される結合親和性のおよそ３５−８０分の１であることがわかった（第Ｉ表）。これは、高結合力リガンド結合にはＣＴＬＡ４の二量化が必要であることを示す先に公表されたデータ（Ｇｒｅｅｎｅら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２６７６２−２６７７１）を裏付けている。
【０１４８】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸＣ１２０ＳはＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇの両者に対してＣＴＬＡ４ＸＣ１２０Ｓより約２倍高い親和性で結合した。この親和性の増大は、どちらのリガンドからも解離速度が約１／３に低下したためだった。従って、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙによる強いリガンド結合は、分子の二量化という変化があったからではなく、おそらく結合力を増大させる構造変化が各単量体の鎖に導入されたためであろう。
【０１４９】
結合力を増大させる変異の位置および構造解析
最近、ＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインの解析構造がＮＭＲ分光法によって決定された（Ｍｅｔｚｌｅｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４：５２７−５３１）。これにより、三次元フォールドにおけるロイシン１０４およびアラニン２９の正確な位置特定が可能になった（図２６の左および右図）。ロイシン１０４は高度に保存されたＭＹＰＰＰＹアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン２９は、ＭＹＰＰＰＹ領域に空間的に隣接するＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域のＣ末端近くに位置する。これら２つの領域の基礎をなす残基間には有意な相互作用があり、Ｌ１０４とＡ２９はどちらもタンパク質内の隣接する疎水コアの一部を構成しているもののＬ１０４とＡ２９の間には直接的な相互作用はないようである。結合力を増大させる２つの変異が構造にもたらす結果をモデリングによって評価した。Ａ２９Ｙ変異はＣＤＲ１（Ｓ２５−Ｒ３３）領域とＭＹＰＰＰＹ領域の間の溝に容易に収納され、ＭＹＰＰＰＹ領域のコンフォメーションを安定化する役割を果たしうる。野生型ＣＴＬＡ４では、Ｌ１０４はＭＹＰＰＰＹ領域に近いＬ９６およびＶ９４と強い疎水相互作用を形成する。グルタミン酸変異がＬ１０４に似たコンフォメーションをとることは２つの理由からまずあり得ない。第１に、ＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３領域）に有意な摂動を加えずに構造上長いグルタミン酸側鎖を収容するには空間が不十分である。第２に、グルタミン酸側鎖の負電荷を疎水領域に埋め込むとエネルギー損失が大きい。むしろモデリング研究によれば、グルタミン酸側鎖は表面に飛びだし、表面ではその電荷が溶媒和によって安定化されうることが予測される。このようなコンフォメーション変化は、当該領域中の他の残基に最小限の歪みしか与えずに、Ｇ１０５によって容易に調整されうる。
【０１５０】
ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するＣＨＯ細胞への高結合力変異体の結合
安定にトランスフェクトされたＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋ＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ４Ｉｇおよび変異分子結合のＦＡＣＳ解析（図２７）を本明細書に記載するようにして行った。ＣＤ８０陽性およびＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞を様々な濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇと共にインキュベートした後、洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使用して検出した。
【０１５１】
図２７に示すように、ＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞（１．５×１０５個）を、表示した濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ（黒四角）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（丸）またはＬ１０４ＥＩｇ（三角）と共に２３℃で２時間インキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。合計５，０００個の生細胞への結合をＦＡＣＳｃａｎで解析し（単回測定）、ＰＣ−ＬＹＳＹＳを使ってデータヒストグラムから平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。第２段階試薬のみと共にインキュベートした細胞で測定されたバックグラウンド蛍光（ＭＦＩ＝７）に対して、データを補正した。対照Ｌ６モノクローナル抗体（８０μｇ／ｍｌ）はＭＦＩ＜３０を示した。これらは４回の独立した実験の結果である。
【０１５２】
ヒトＣＤ８０トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合はほぼ同等である（図２７Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇはヒトＣＤ８６を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く結合する（図２７Ｂ）。
【０１５３】
機能アッセイ
ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞を免疫磁気ネガティブ選択法によって単離した（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７６：１５９５−１６０４）。単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下にホルバール（ｐｈｏｒｂａｌ）ミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびＣＤ８０陽性またはＣＤ８６陽性ＣＨＯ細胞で刺激した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞（８−１０×１０４個／ウエル）を１ｎＭ ＰＭＡの存在下で、照射ＣＨＯ細胞刺激因子と共にまたは同刺激因子なしで培養した。７２時間培養の最後の７時間にわたって１μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］チミジンを添加することにより、増殖応答を測定した。ＰＭＡ＋ＣＤ８０陽性ＣＨＯまたはＣＤ８６陽性ＣＨＯ刺激Ｔ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる阻害を行った。結果を図２８に示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＣＤ８０陽性ＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く阻害した（図２８Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはＣＤ８６陽性ＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖の阻害にも、ＣＴＬＡ４Ｉｇより有効だった（図２８Ｂ）。従って、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｔ細胞のＣＤ８０媒介性共刺激およびＣＤ８６媒介性共刺激のどちらについても、より強力な阻害剤である。
【０１５４】
図２９は、上で調製したアロ刺激ヒトＴ細胞をＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するＰＭと呼ばれるヒトＢリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）でさらにアロ刺激し、その細胞のＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる阻害を示している（３．０×１０４個／ウエルのＴ細胞および８．０×１０３個／ウエルのＰＭ）。一次アロ刺激を６日間行った後、細胞に３Ｈ−チミジンを７時間パルスし、次いで放射ラベルの取込みを測定した。
【０１５５】
二次アロ刺激は以下のようにして行った。７日間一次アロ刺激したＴ細胞をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）（ＩＣＮ（オハイオ州オーロラ））上に収集し、２４時間休止させた。次に、滴定量のＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの存在下、上と同じ比率のＰＭを加えることにより、Ｔ細胞を再び（二次）刺激した。３日間刺激した後、細胞に放射標識をパルスし、上記のようにして収獲した。一次アロ刺激Ｔ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図２９Ａに示す。二次アロ刺激Ｔ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図２９Ｂに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは一次、二次共にＴ細胞増殖応答をＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く阻害する。
【０１５６】
サイトカイン産生（図３０）を測定するために、一対の二次アロ刺激平板を用意した。３日後にＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（カリフォルニア州カマリロ））を使用し製造者の推奨する条件で培養培地をアッセイした。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、二次アロ刺激後のＴ細胞のＩＬ−２、ＩＬ−４およびγ−ＩＦＮサイトカイン産生の遮断に関して、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強力であることがわかった（図３０Ａ−Ｃ）。
【０１５７】
サル混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの効果を図３１に示す。２匹のサルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；各サルから３．５×１０４細胞／ウエル）をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）で精製し、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と混合した。細胞を３日間刺激した後、放射標識を１６時間パルスし、次いで収獲した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはサルＴ細胞増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く阻害した。
【０１５８】
平衡定数および見かけの速度定数を以下の表に示す（値は３回の異なる実験から得た平均±標準偏差である）：
【表５】
第Ｉ表
2004517806.tif 000006
【０１５９】
以下に挙げる部位でのＣＴＬＡ４Ｉｇの変異誘発によるＣＤ８６Ｉｇ結合に対する効果を上述のＳＰＲによって決定した。主な効果を「＋」記号で示す。
【表６】
第ＩＩ表
2004517806.tif 000007
【０１６０】
実施例３
可溶性ＣＴＬＡ４変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＬＥＡ２９ＹまたはＬＥＡとしても知られる）またはＣＴＬＡ４Ｉｇをヒト患者に投与し、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、および痛みの低下など、慢性関節リウマチに関連する少なくとも１つの症状を緩解させる第２相試験について、以下説明する。ここに使用するＣＴＬＡ４Ｉｇ分子は図２４に示すように、＋１位のメチオニン（または−１位のアラニン）から始まって＋３５７位のリジンで終わる。ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子の１態様をコードするＤＮＡはＡＴＣＣ６８６２９として寄託されている。ここに使用するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子は図１９に示すように、＋１位のメチオニン（または−１位のアラニン）から始まって＋３５７位のリジンで終わる。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子の１態様をコードするＤＮＡはＡＴＣＣ ＰＴＡ２１０４として寄託されている。
【０１６１】
さらに、以下の説明は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇをヒト患者に投与し、赤血球凝集率、およびＣ反応性タンパク質および／またはＩＬ−２受容体の血清レベルの低下など、慢性関節リウマチに関連する少なくとも１つの生物学的代替マーカーを緩解させる説明である。
【０１６２】
患者コホート
男性５４名および女性１６０名の計２１４名の患者が本試験に参加した（図１Ａ、１Ｂ）。基準線の患者は、平均疾患期間が３．４（±２．０）年であり、少なくとも１つの疾患改変性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を要求している。安定な非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）またはステロイド（＜ １０ｍｇ／日）の投薬は許し、ＤＭＡＲＤの併用は禁じた。患者を処置群ごとに２５−３２名の群に無作為に振り分けた。３２名の患者にはプラセボを、９２名の患者にはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを、９０名の患者にはＣＴＬＡ４Ｉｇを投与した。以下のプロトコールガイドラインに従い５７日まで中止しなかった患者には、１、１５、２９および５７日目の計４回静脈注射した。すべての患者を１、１５、２９、４３、５７、７１および８５日目に評価した。投与量はＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇについて０．５、２．０または１０．０ｍｇ／ｋｇ（図１Ａ−１ＥにおいてそれぞれＬＥＡ．５、ＬＥＡ２およびＬＥＡ１０と表示）またはＣＴＬＡ４Ｉｇについて０．５、２．０または１０．０ｍｇ／ｋｇ（図１Ａ−１ＥにおいてそれぞれＣＴＬＡ．５、ＣＴＬＡ２およびＣＴＬＡ１０と表示）であった。
【０１６３】
すべての対象について、可能性ある有害事象をリストした問診表に答えてもらうことにより注射周囲の有害事象と安全度全体をモニターした。注射後２４時間以内に起こり得る可能性ある有害事象について患者に質問した。さらに、患者には経験した有害事象を自発的に報告するよう奨励した。医師は、患者からの研究試料について血液化学および血液学の異常を規定通りにモニター、例えばサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６）、トリプターゼおよび補体などの炎症応答メディエーターのレベルを評価した。最初の終了点は、８５日目におけるＡＣＲ２０に適合した被験者の割合であった。
【０１６４】
試験材料の保存
ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇはそれぞれ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ２００ｍｇ／バイアル、またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ１００ｍｇ／バイアル、を含む単一使用ガラスバイアルとして供給した。注射の前に、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）で終濃度２５ｍｇ／ｍｌにまで希釈した。
【０１６５】
投与プロトコール
すべての注射は１時間の静脈内投与で行った（図１−１７）。すべての対象には試験治療の注射を少なくとも１回行った。
１群：  ３２名の患者、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ適合プラセボ；
２群：  ２６名の患者、ＣＴＬＡ４Ｉｇ０．５ｍｇ／ｋｇ用量；
３群：  ３２名の患者、ＣＴＬＡ４Ｉｇ２．０ｍｇ／ｋｇ用量；
４群：  ３２名の患者、ＣＴＬＡ４Ｉｇ１０．０ｍｇ／ｋｇ用量；
５群：  ３２名の患者、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ０．５ｍｇ／ｋｇ用量；
６群：  ２９名の患者、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ２．０ｍｇ／ｋｇ用量；
７群：  ３１名の患者、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ１０．０ｍｇ／ｋｇ用量。
【０１６６】
臨床モニターリング
注射投与前に、疾患活動度の基準症状について患者を評価した。この基準評価には、関節腫脹、関節圧痛、炎症、朝のこわばり、患者および医師により評価される疾患活動度、および健康問診表により評価される能力障害（図１Ｃにおける身体機能スコアとして報告される）、ならびに痛み（図１Ａ−１Ｄ）が含まれた。さらに、基準評価には、赤血球凝集率（ＥＳＲ）、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および／または可溶性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２ｒ）の血清レベル（図１Ｃおよび１Ｄ）が含まれた。
【０１６７】
臨床応答試験はアメリカン カレッジ オブ リューマトロジー（ＡＣＲ）により確立された基準を基本とした。圧痛および腫脹関節カウントが２０％改善し、患者および医師の疾患変化全体、痛み、能力障害および急性期反応体などの、測定される残りの症状の５つのうち３つにおいて２０％改善が認められれば、その対象はＡＣＲ２０基準を満足している（Ｆｅｌｓｏｎ， Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３６：７２９−７４０； Ｆｅｌｓｏｎ， Ｄ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３８：１−９）。
【０１６８】
生物マーカー
疾患活動度の可能性ある生物マーカー（リウマチ因子、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＩＬ−２ｒ、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性Ｅ−セレクチンおよびＭＭＰ−３）も評価した。有効なエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法を使用し、ＩＬ−２ｓＲα、ｓＩＣＡＭ−１、ｓＥ−セレクチンおよびＭＭＰ−３の血清濃度を測定した。ＴＮＦαおよびＩＬ−６は要すれば、注射前と注射後２時間に評価した。
【０１６９】
ＩＬ−２ｓＲα、ｓＩＣＡＭ−１およびｓＥ−セレクチンは、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネアポリス，ＭＮ）から市販されている比色ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の下限および上限はそれぞれ、３１２−２０，０００ｐｇ／ｍｌ、４０−９０７ｎｇ／ｍｌおよび１０−２０６ｎｇ／ｍｌであった。検定間変動係数はそれぞれ、４．４８−８．４％、３．８−５．０％および５．５−９．０％であった。キット製造元の説明によると、正常血清値はそれぞれ６７６−２，１３２ｐｇ／ｍｌであった。
【０１７０】
ＭＭＰ−３はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ピスパッタウエイ，ＮＪ）から市販されている比色ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の下限および上限は３０−７，６８０ｎｇ／ｍｌであった。検定間変動係数は６．３−１０．６％であった。キット製造元の説明によると、正常血清値は２８−９９ｎｇ／ｍｌであった。
【０１７１】
ＩＬ−６およにＴＮＦαは、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネアポリス，ＭＮ）から市販されている比色ＥＩＡキットを用いて測定した。定量の下限および上限はそれぞれ、０．３−３，０００ｐｇ／ｍｌおよび０．７−７，０００ｐｇ／ｍｌであった。検定間変動係数はそれぞれ、３．１−５．７％および６．４−２０．７％であった。キット製造元の説明によると、正常血清値は＜０．３−１２ｐｇ／ｍｌおよび＜０．７−７．５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１７２】
抗体試験
１日目の投与前、および１５、２９、５７、８５および１６９日目に血清試料を入手し、薬物特異的な抗体を評価した。投与分子の免疫グロブリン（Ｉｇ）部分に対する事前の高い力価のため、Ｉｇ定常領域を含まないＬＥＡ２９ＹおよびＣＴＬＡ４Ｉｇに対する特異的抗体の形成も評価した。
【０１７３】
９６ウエルイムロンＩＩ ＥＬＩＳＡ平板（Ｄｙｎｅｘ， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， バージニア）をＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｉｇ定常領域を含まないＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＬＥＡ２９ＹまたはＩｇ定常領域を含まないＬＥＡ２９Ｙのそれぞれリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２、４、２または１μｇ／ｍｌで被覆し、２−８℃にて一晩インキュベートした。得られた平板を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで３７℃にて１時間ブロッキングした。次いで、平板を洗浄し、試験血清の連続希釈液または品質維持（ＱＣ）血清を適当なウエルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした。血清は、０．２５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を１：１０希釈率で含むＰＢＳで３倍に希釈した。平板を洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトカッパおよびラムダ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， バーミングハム， アラバマ）抗体カクテルを加えた。３７℃にて１時間インキュベートした後、平板を洗浄し、ジエタノールアミン緩衝液中、１ｍｇ／ｍｌパラ−ニトロフェニル ホスフェートを各ウエルに加えた。２５℃にて３０分経過後、３Ｎ水酸化ナトリウムで反応を停止させ、吸光度を記録した（二波長：４０５ｎｍおよび５５０ｎｍ）。結果は、平板バックグランド吸光度の平均よりも５倍高いまたは同等の吸光度読み値を与える最高希釈率の逆数として規定される、終点力価（ＥＰＴ）で表した。平板バックグランドは、血清不存在下において記録される吸光度測定値として測定した。値は、投与前のＥＰＴ値と比較して少なくとも２連続希釈率（９倍）またはそれよりも大きい場合、血清転換について陽性と判断した。ＣＴＬＡ４Ｉｇ−またはＬＥＡ２９Ｙのいずれかに特異的な抗体について陽性である血清ＱＣ試料は、免疫したサルから調製した。適当なＱＣ試料を各分析期間に検定した。ＱＣ試料が検定の許容基準内にある場合のみ、分析を行った。
【０１７４】
ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは一般に、すべての投与量において充分に寛容性であった。注射周囲の有害事象はすべての投与群にわたり、頭痛を除き、類似していた。８５日目における患者の頭痛応答は０．５、２．０および１０．０ｍｇ／ｋｇにおいて用量依存的にそれぞれ、ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置患者では２３％、４４％および５３％と増大し、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ処置患者では３４％、４５％および６１％と増大した。対照的に、プラセボを投与した患者では３１％が頭痛を経験した。
【０１７５】
関節炎発赤や他の有害事象のために臨床試験を中断した患者のパーセンテイジは図２に要約している。プラセボ投与患者はより高いパーセンテイジで関節炎発赤により処置を中断した。ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置患者は投与量の増大に伴い処置の中断率が減少した。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇで処置した患者は僅かな患者しか処置を中断しなかった。これらの結果は、ＣＴＬＡ４Ｉｇに対する用量依存的な逆の応答が良好であり、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ治療ではより強力な治療応答であることを示している。
【０１７６】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボで処置した患者の８５日目におけるＡＣＲ−２０、−５０および−７０応答を図３Ａにまとめている。同様に、図３ＢおよびＣは９５％信頼区間をもったＡＣＲ−２０応答を説明している。これらの応答は明らかに用量依存的であり、１０ｍｇ／患者ｋｇ体重において明確な有意な応答性を示している。
【０１７７】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボでの処置に対して応答しない患者と比較し腫脹および圧痛関節カウントが減少している患者パーセンテイジを図４ＡおよびＢに示す。治療応答は用量依存的であった。両化合物ともに２および１０ｍｇ／ｋｇ群においては、パーセンテイジが大きな患者は２０、５０、７０および１００％の改善を示している。
【０１７８】
患者および医師により評価される疾患活動度の平均スコア単位である痛みがＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボにより減少した患者のパーセンテイジを図５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに示す。リカートスケール（Ｌｉｋｅｒｔスケール）によりモニターした治療応答は明らかに用量依存的であり、８５日目においてプラセボと比較して活動処置群のほうが良好であった。リカートスケールは、症状を分類するための形容詞を使用した、確立されている言語による評価スケールである（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ ｏｆ Ｄｉｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ： Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ６月 １９９３， ３６（６）：７２９−７４０）。
【０１７９】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボによる処置により、少なくとも２単位が基準線と変化した疾患活動度の患者および医師評価を図６ＡおよびＢに示す。応答は明らかに用量依存的であり、有効薬物が高用量なほどより顕著に改善を示す。
【０１８０】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボで処置した患者におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの減少％を図７ＡおよびＢに示す。応答は明らかに用量依存的であり、２および１０ｍｇ／ｋｇ薬物処置群において明りょうな減少をみた。さらに、図７Ｂは、その相違がプラセボと比較して９５％信頼区間をもって極めて有意であることを示した。図７Ｃは８５日目における基準線からの血清レベルの変化を示している。
【０１８１】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボで処置した患者における血清可溶性ＩＬ−２受容体の量を図８に示す。可溶性ＩＬ−２受容体レベルの減少は明らかに用量依存的である。
【０１８２】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボで処置した患者における血清可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチンの量を図３３に示す。可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチンレベルの減少は明らかに用量依存的である。
【０１８３】
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者における経時的な圧痛関節カウントの中央値および平均値を図９ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば圧痛関節の減少）は明らかに、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群よりも２および１０ｍｇ／ｋｇ処置群において重要である。
【０１８４】
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者における経時的な腫脹関節カウントの中央値および平均値を図１０ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば腫脹関節の減少）は明らかに、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群よりも２および１０ｍｇ／ｋｇ処置群において重要である。
【０１８５】
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者における経時的な痛み評価スコアの平均値を図１１に示す。基準線からの差異（例えば痛みの減少）は明らかに、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群よりも２および１０ｍｇ／ｋｇ処置群において重要である。
【０１８６】
ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはプラセボで処置した患者における疾患活動度の患者または医師評価スコアの平均値を図１２ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば疾患活動度の減少）は明らかに、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群よりも２および１０ｍｇ／ｋｇ処置群において重要である。
【０１８７】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図ではＬＥＡと表示）またはプラセボで処置した患者における経時的な圧痛関節カウントの中央値および平均値を図１３ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば圧痛関節の減少）は明らかに用量依存的である。
【０１８８】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図ではＬＥＡと表示）またはプラセボで処置した患者における経時的な腫脹関節カウントの中央値および平均値を図１４ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば腫脹関節の減少）は明らかに、プラセボまたは０．５ｍｇ／ｋｇ群よりも２および１０ｍｇ／ｋｇ処置群において重要である。
【０１８９】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図ではＬＥＡと表示）またはプラセボで処置した患者における経時的な痛み評価スコアの平均値を図１５に示す。基準線からの差異（例えば痛みの減少）は明らかに、用量依存的である。
【０１９０】
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図ではＬＥＡと表示）またはプラセボで処置した患者における疾患活動度の患者または医師評価スコアの平均値を図１６ＡおよびＢに示す。基準線からの差異（例えば疾患活動度の減少）は明らかに、用量依存的である。
【０１９１】
ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはプラセボにより処置した患者における８５日目の、ＨＡＱにより評価した身体障害における改善パーセンテイジを図１７に示す（健康評価問診表（ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒａ）（ＨＡＱ）；Ｆｒｉｅｓ，Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｊ． ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ９：７８９−７９３）。このパラメータにより、明らかな用量依存的な完全が認められる。
【０１９２】
可溶性ＩＬ−２ｒおよびＣ反応性タンパク質レベルの基準線からの変化は両処置群ともに用量依存的であった。処置後、可溶性ＩＬ−２ｒレベルは０．５、２．０および１０．０ｍｇ／ｋｇにおいて、ＣＴＬＡ４Ｉｇについて−２％、−１０％および−２２％であり、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇについて−４％、−１８％および−３２％であり、これに対しプラセボは＋３％であった。Ｃ反応性タンパク質レベルは０．５、２．０および１０．０ｍｇ／ｋｇにおいて、ＣＴＬＡ４Ｉｇについて＋１２％、−１５％および−３２％であり、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇについて＋４７％、−３３％および−４７％であり、これに対しプラセボは＋２０％であった（図７Ａ）。
【０１９３】
通常の血液学的試験、化学研究試験、医師知見または生命徴候評価などの臨床的に顕著な知見は、高用量の両薬物におけるＩｇＡおよびＩｇＧレベルの若干の抑制を除き、何ら見出されなかった。いずれの治療も薬物特異的な抗体を誘導しなかったことは注目に値する。
【０１９４】
実施例４
Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇをヒト患者に投与し、骨または関節侵食などの構造的障害を低下または予防するための第２相試験を、信頼のおける放射線撮影スケールを用いてい以下説明する。構造的障害の低下または予防の改善は臨床パラメータにより測定される臨床改善度に匹敵する。
【０１９５】
ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを処置する前に、幾人かのヒト患者の骨構造の状態をモニターする。これらの患者には、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを０．５−２０ｍｇ／ｋｇで２週または１２週毎に長期にわたり投与し（単独または他の薬物と共に）、治療改善度を経時的に維持させる。患者の手足の放射線撮影を、ＦＤＡガイドラインが推奨する前もって決めた間隔、６ヶ月および次いで毎年、行う。６および１２ヶ月後に長期モニターを行い、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇによる処置が骨悪化の進行を低下させているかを決定し、次いで毎年行う。放射線撮影は当業界の標準的手法に従い、Ｘ線および／または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などによって行い患者をモニターする（Ｌａｒｓｅｎ， Ａ． Ｋ．およびＭ．Ｅｅｋ １９７７ Ａｃｔａ． Ｒａｄｉｏｌ． Ｄｉａｇ． １８：４８１−４９１； Ｓｈａｒｐ， Ｊ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２８：１３２６−１３３５）。放射線撮影データの結果は、関節空間の狭窄および／または新たな侵食の防止を伴って骨侵食および軟骨障害の進行を遅らせるなどの、構造的障害の予防について評価する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】患者コホートの人口統計データである。人口統計データには後述の実施例３に記載している性別、種族および疾患期間が含まれる。
【図１Ｂ】患者コホートの人口統計データである。人口統計データには後述の実施例３に記載している性別、年齢、体重、および患者や医師によって評価された疾患活動度が含まれる。
【図１Ｃ】後述の実施例３に記載している患者コホートの人口統計データである。人口統計データには疾患活動度、赤血球凝集率（ＥＳＲ）、身体機能（問診表によって評価された身体障害）、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が含まれる。
【図１Ｄ】後述の実施例３に記載している患者コホートの人口統計データである。人口統計データには関節腫脹、関節圧痛、朝のこわばり、および痛みが含まれる。
【図１Ｅ】後述の実施例３に記載している患者コホートの人口統計データである。人口統計データには処置前が含まれる。
【図２】後述の実施例３に記載している理由によって８５日目に中断した概要である。
【図３Ａ】後述の実施例３に記載している８５日目のＡＣＲ応答である：ＡＣＲ−２０、−５０および−７０応答。
【図３Ｂ】後述の実施例３に記載している、プラセボ応答を含む８５日目のＡＣＲ−２０応答である：９５％信頼限界のＡＣＲ−２０応答。
【図３Ｃ】後述の実施例３に記載している８５日目のＡＣＲ−２０応答である：ＡＣＲ−２０応答における９５％信頼区間の差異。
【図４Ａ】後述の実施例３に記載している８５日目における関節腫脹および圧痛カウントの基本（２０％改善）臨床応答の患者パーセンテイジ：基本臨床応答、ＡＣＲ−２０。
【図４Ｂ】後述の実施例３に記載している８５日目における関節腫脹および圧痛カウントの臨床応答の患者パーセンテイジ（改善パーセンテイジ）：改善パーセンテイジの臨床応答の変化。
【図５Ａ】後述の実施例３に記載している８５日目における痛み応答の患者パーセンテイジ（基準線からの平均単位変化によるリッカートスケール（Ｌｉｋｅｒｔ ｓｃａｌｅ）に基づく）：基準線からの痛みスケール変化。
【図５Ｂ】後述の実施例３に記載している８５日目における患者の全体疾患変化の患者パーセンテイジ（基準線からの平均単位変化によるリッカートスケールに基づく）：患者全体疾患活動度変化。
【図５Ｃ】後述の実施例３に記載している８５日目における医師の全体疾患変化の患者パーセンテイジ（基準線からの平均単位変化によるリッカートスケールに基づく）：医師全体疾患活動度変化。
【図５Ｄ】後述の実施例３に記載している８５日目における痛みの患者パーセンテイジ（基準線からの平均単位変化によるリッカートスケールに基づく）：基準線からの痛み変化。
【図６Ａ】後述の実施例３に記載している８５日目における基準線からの２単位範囲の疾患活動度の変化の患者の全体評価：疾患活動度の改善。
【図６Ｂ】後述の実施例３に記載している８５日目における基準線からの２単位範囲の疾患活動度の変化の医師の全体評価：疾患活動度の改善。
【図７Ａ】後述の実施例３に記載している８５日目におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの減少パーセンテイジ：基準線からのＣＲＰレベルの減少パーセンテイジ。
【図７Ｂ】後述の実施例３に記載している８５日目におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの減少の差異：９５％信頼区間をもつＣＲＰレベルの減少パーセンテイジの差異。
【図７Ｃ】後述の実施例３に記載している８５日目におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの減少の平均：基準線からの平均変化。
【図８】後述の実施例３に記載している８５日目における可溶性ＩＬ−２受容体レベルの基準線からの平均変化の減少。
【図９Ａ】後述の実施例３に記載している、関節圧痛に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図９Ｂ】後述の実施例３に記載している、関節圧痛に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図１０Ａ】後述の実施例３に記載している、関節腫脹に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図１０Ｂ】後述の実施例３に記載している、関節腫脹に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果：基準線からの差異の平均。
【図１１】後述の実施例３に記載している、基準線からの痛み評価平均差異に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果。
【図１２Ａ】後述の実施例３に記載している、基準線からの疾患活動度平均差異の患者評価に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果。
【図１２Ｂ】後述の実施例３に記載している、基準線からの疾患活動度平均差異の医師評価に対するＣＴＬＡ４Ｉｇの経時的効果。
【図１３Ａ】後述の実施例３に記載している、関節圧痛に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図１３Ｂ】後述の実施例３に記載している、関節圧痛に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図１４Ａ】後述の実施例３に記載している、関節腫脹に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果：基準線からの差異の中央値。
【図１４Ｂ】後述の実施例３に記載している、関節腫脹に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果：基準線からの差異の平均。
【図１５】後述の実施例３に記載している、痛み評価に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果：基準線からの経時的平均変化。
【図１６Ａ】後述の実施例３に記載している、基準線からの疾患活動度平均差異の患者評価に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果。
【図１６Ｂ】後述の実施例３に記載している、基準線からの疾患活動度平均差異の医師評価に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの経時的効果。
【図１７】後述の実施例３に記載しているＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ処置による８５日目における基準線と比較した、健康評価問診表（ＨＡＱ）により評価した患者の身体障害における改善パーセンテイジ。
【図１８】後述の実施例１に記載しているＬ１０４ＥＩｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図１９】後述の実施例１に記載しているＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２０】後述の実施例１に記載しているＬ１０４ＥＡ２９ＬＩｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２１】後述の実施例１に記載しているＬ１０４ＥＡ２９ＴＩｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２２】後述の実施例１に記載しているＬ１０４ＥＡ２９ＷＩｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２３】ＣＴＬＡ４受容体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２４】ＣＴＬＡ４Ｉｇのヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図２５】ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）、およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のＳＤＳゲル（図２５Ａ）、ならびにＣＴＬＡ４Ｉｇ（図２５Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図２５Ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図２６】左図および右図：  ＮＭＲスペクトロスコピーによって測定された解析像から得られた、ＣＴＬＡ４細胞外Ｉｇ Ｖ様折り畳みのリボンダイアグラム。図２６の右図はＣＤＲ−１（Ｓ２５−Ｒ３３領域）およびＭＹＰＰＰＹ領域の拡大図であり、結合力を増大する変異Ｌ１０４およびＡ２９の位置と側鎖配向性を示している。
【図２７】ＡおよびＢ：  後述の実施例２に記載している、ヒトＣＤ８０−またはＣＤ−８６トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を示すＦＡＣＳアッセイ。
【図２８】ＡおよびＢ：  後述の実施例２に記載している、ヒトＣＤ８０−陽性およびＣＤ−８６陽性ＣＨＯ細胞の増殖阻害を示すグラフ。
【図２９】ＡおよびＢ：  後述の実施例２に記載している、初代および二次アロ刺激Ｔ細胞の増殖阻害において、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが効果的であることを示すグラフ。
【図３０】Ａ−Ｃ：  後述の実施例２に記載している、アロ刺激ヒトＴ細胞のＩＬ−２（図３０Ａ）、ＩＬ−４（図３０Ｂ）およびγ−インターフェロン（図３０Ｃ）サイトカイン産生阻害において、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが効果的であることを示すグラフ。
【図３１】後述の実施例２に記載している、フェトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）−刺激サルＴ細胞の増殖阻害において、ＣＴＬＡ４ＩｇよりもＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが効果的であることを示すグラフ。
【図３２】Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよび野生型ＣＴＬＡ４ＩｇのＣＤ８６Ｉｇに対する平衡結合分析を示すグラフ。
【図３３】ＡおよびＢ：  後述の実施例３に記載している８５日目における基準線からの可溶性ＩＣＡＭ−１および可溶性Ｅ−セレクチンレベルの減少。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図２３】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517806.tif 000187
【国際調査報告】
2004517806.tif 000188
2004517806.tif 000189
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