(57)【要約】マイクロ流動体チャネルを使ってタンパク質の結晶成長を促進する装置。タンパク質のサンプルと溶媒溶液とを薄層状の流れとなるマイクロ流動体チャネル中で組合せて拡散ゾーンを形成させ良質の結晶化に備え、そしてこの装置からタンパク質の結晶を採集する。この装置は小重力場で使われるとき特に有効である。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本体と、
該本体中に設けられる、タンパク質を含む少なくとも１種類の溶液と、溶媒を含む少なくとも１種類の溶液とを入れる手段と、
上記タンパク質溶液と上記溶媒とが上記チャネル中でタンパク質結晶形成を引き起こすよう相互作用するようにされている、上記手段に接続される少なくとも１つのマイクロ流動体チャネルと、
を有することを特徴とする溶液からタンパク質の結晶成長を促進する装置。
【請求項２】
上記タンパク質溶液と上記溶媒溶液とがマイクロ流動体チャネル中に薄層をなして並行に接触しつつ流れて、該チャネル中にタンパク質結晶化につながる一定の濃度勾配を形成することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
上記タンパク質溶液を入れる手段と上記溶媒溶液を入れる手段とが、各々上記結晶化チャネルにマイクロ流動体チャネルを介して接続されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
上記タンパク質のマイクロ流動体チャネルと、上記溶媒のマイクロ流動体チャネルと、上記結晶化チャネルとで、Ｔセンサー構造をなしていることを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
上記形成されたタンパク質結晶を採取するように上記結晶化チャネルに接続された室を有することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
上記タンパク質溶液を入れる手段および上記溶媒溶液を入れる手段に接続された、これら溶液を上記結晶化チャネル中に移動させる流動体駆動手段をさらに有していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
上記流動体駆動手段がフイゴであることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
上記タンパク質溶液を入れる手段と上記溶媒を入れる手段との界面間に連結した混合手段と、該タンパク質溶液と該溶媒溶液とを混合して均質な混合物にする結晶化チャネルを有することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
上記混合手段がジェット渦ミキサーを有することを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
上記混合物中のタンパク質濃度を高めるため上記均質な混合物から溶媒を吸収するため上記結晶化チャネルに接続した溶媒吸収手段を有し、これによってタンパク質の結晶化を向上させることを特徴とする請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
本体と、
該本体内に設けられ、タンパク質を含む少なくとも１種の溶液と、溶媒を含む少なくとも１種の溶液と、タンパク質とバッファとの組合せを含む少なくとも１種の溶液とを入れる手段と、
該タンパク質溶液を入れる手段と該タンパク質とバッファとの組合せ溶液を入れる手段とに接続され、これら溶液を並行に薄層に流して、上記組合せ溶液から不可逆的なタンパク質の集塊を除去するマイクロ流動体構造と、
上記の溶媒を入れる手段と上記のマイクロ流動体装置の出口とに接続される少なくとも１本のマイクロ流動体チャネルであって、上記溶媒溶液と上記組合せ溶液とが相互作用して該チャネル中にタンパク質結晶の形成を誘引するようにされた少なくとも１本のマイクロ流動体チャネルと、
を有することを特徴とする溶液からタンパク質の結晶成長を促進する装置。
【請求項１２】
上記マイクロ流動体装置に接続され上記の不可逆的なタンパク質の集塊を保持する廃棄物室を有することを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
上記結晶化室に接続され、形成されたタンパク質結晶を採集するためことを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
上記のタンパク質溶液を入れる手段、上記溶媒溶液を入れる手段及び上記タンパク質とバッファとの組合せ溶液を入れる手段とに接続され、これらの溶液が上記結晶化チャネル中の移動を促進する、流動体の移動を駆動する駆動手段を有することを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
上記流動体移動を駆動する駆動手段がエアポンプであることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
上記マイクロ流動体装置がＨフィルタを備えていることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１７】
上記本体がプラスチックで構成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【関連する出願】
【０００１】
本願は、２０００年３月３１日提出の米国特許出願第６０／１９３８６７号に基づき優先権を主張して行うもので、ここに同出願内容を全面的に組み入れるものとする。
【発明の背景】
【０００２】
本願の発明は、結晶化させる装置に関する。より詳しくは、マイクロ流動体構造を使ってタンパク質の結晶成長を促進する装置に関する。
【０００３】
高分子結晶は、分子生物学、生物化学、及びバイオテクノロジーにとって基本的な学問となっている。結晶がどのようにその機能を発現するかの理解は、原子レベルでの高分子構造に関する知識に依存することである。
【０００４】
結晶の三次元原子構造を決定することは、応用研究を含めさまざまな研究分野において最重要な課題である。Ｘ線結晶学と呼ばれるこの分野は、結晶の正確な原子配列を決定するため結晶からのＸ線回折を利用している。その結果は金属合金からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）構造までさまざまな物質の原子構造を明らかにするのに役立っている。しかし、この分野の研究における障害は、適切な結晶サンプルを成長させることが容易でないという点にある。
【０００５】
結晶学における重要で急速に発展してきた１分野はタンパク質結晶学である。タンパク質はアミノ酸のポリマーで、各分子中に何千という原子を含む。自然界に２０個の必須アミノ酸があれば、タンパク質分子を形成する無数のアミノ酸結合があるのである。アミノ酸配列すなわち一次構造には三次元構造を予言するのに必要となる情報がある。残念ながらこの情報を迅速かつ容易に得ることができるレベルまで科学はまだ発達していない。核磁気共鳴の分野では相当な進展が見られるが、現在ではタンパク質の非常に正確な三次元構造が作れる唯一の方法はＸ線結晶学を適用する方法しかない。これは相当程度整列したタンパク質結晶（少なくとも３．０オングストロームの解像度でＸ線を回折する結晶）の成長を必要とするもので、Ｘ線結晶学的に判定される構造の正確さは結晶タンパク質中の不整列によって限界つけられる。
【０００６】
回折パターンの最高度は、単純な温度効果の結果なのではなく、タンパク質結晶分子に固有の統計的不整列の関数なのではないかと一般に考えられている。タンパク質結晶中にみられる統計的不整列には２つの基本的原因がある。１は、タンパク質分子の生来的構造もしくは組織の変化［ｖａｌｉａｂｉｌｉｔｙ］、２は、支配されている格子部位周辺における個々の分子の空間的分布、である。
【０００７】
さらに、結晶化に対するその他の生来的限界は、分子対流効果、温度効果、浮力など、すべて地球の重力場に起因する。したがって、スペースシャトル上でとか、国際スペースステーションでとか、その他そういった宇宙船などといった宇宙の小重力場（１／１０００ｇ〜１／１０，０００ｇ）において結晶化実験を行ってみることが提案されている。いくつかの特許は小重力場での結晶化が結晶の大きさ、形態学、及び回折特性を向上させることを述べている。米国特許第５，３６２，３２５号及び第４，７５５，３６３号は、こうした小重力場における結晶化に関する発明例である。
【０００８】
タンパク質の結晶成長［ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ； ＰＣＧ］の小重力場における研究の焦点は、小重力場におけるＰＣＧが不整列を減少させてタンパク質結晶を生み出すという知見に基づく。小重力場におけるタンパク質の結晶成長は地上における成長に比し格子の不整列を減少させるという事実は、回折強度の向上した解像度を提供し、タンパク質構造の知識を原子レベルでより正確に解釈させることになる。リガンドがどのように結合部位と相互作用するかに関する原子レベルでの詳しい知識は、触媒メカニズムについての洞察や生物学的系における認識を可能にし、構造的にやさしい薬物の前提条件を可能にする。医薬品工業設備において、より高度な分析結果の知見は薬物の結合部位に関する研究における合成化学方面に投入するべき人材を著しく減らすことにつながり、薬物ターゲットとの相互作用に関して最適化を促進する。促進された医薬品設計は非常に対投資効果が大きく、医薬品企業の研究開発費を急速に取り戻し利益率を上げる結果につながるのである。
【０００９】
重要ないくつかの技術革新は、より小さな結晶を使って構造決定工程を促進することを可能にした。それらの技術革新には、セレノメチオニルタンパク質、低温結晶学、高速シンクロトロン放射源、ＣＣＤ検出器、マルチ波長変則回折［ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ； ＭＡＤ］相などがある。技術革新によって、シンクロトロン放射源でわずか数時間のＭＡＤ相データ収集でタンパク質構造は解析されるようになっている。タンパク質結晶学が直面している際立った不確定性は、良質のタンパク質結晶の成長である。
【００１０】
ごく近い将来、ゲノム構成に関する分野がタンパク質構造の決定を求める劇的な欲求を募らせるであろうことが期待されている。ゲノム配列は、疾病に関係するものや病原性有機体に特有の新規なタンパク質の特定を通して我々の生物学的プロセスの理解を変更させ、生物学の研究に著しいインパクトを与えている。ゲノム研究計画の成果は殆どの有機体、タンパク質の５０％以上が、決まった機能をもっていないということを明らかにした。ヒトゲノムの場合これは５万個以上のタンパク質に相当する。これら特性のないタンパク質は、未だ蓋を開けられていない生物学的情報源を代表するものとして、次世代のタンパク質治療法および薬学開発のターゲットとして広く認識されている。今やなんら注目を集めるものではなくなったが大規模ゲノム配列にとって、構造やこれら生物学的高分子の機能を理解することに焦点がおかれている。未知のタンパク質の三次元構造に関する知識がタンパク質の機能を考察する糸口を提供することができるという最近発見された例は、良質な構造決定にとっておおがかりな必要性への門を開くものとして期待される。
【００１１】
結晶化には一般に、核化や核化後の成長といった何段階かの明確に異なる相がある。核化は数個のタンパク質分子の整列した集まり［ｇｒｏｕｐｉｎｇ］が最初にできるもので、核化後の成長はタンパク質分子が結晶格子の成長面に増加していくもので、核化相より低い濃度が必要とされる。
【００１２】
殆どのタンパク質結晶は典型的には大略１０００％にまで達する非常に高レベルの過飽和で核化する。このような過飽和レベルでは、核化後結晶成長は非常に好ましくない状態で行われる。非常に高レベルの過飽和に達することが必要な濃度における大半の高分子は集塊［ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ］となり、そして整列したオリゴマー種、及び／又はランダムなアモルファス集塊がクラスター［ｃｌｕｓｔｅｒ］構造になる傾向がある。こうしたクラスターの半減期及び濃度によっては、核心形成は部分的に整列した集塊種を取り込む［ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］ことができる。不活発な状態は比較的大きいクラスターまたは核心を形成するため、あらゆる集塊種の衝突頻度を減らすから、過飽和下で不完全な核化後成長するのを軽減する。タンパク質溶液のマイクロ播種、すなわち新たに打ち砕いた結晶を導入することは、不完全な核心から包囲成長へと進むことの簡潔なアプローチとなる。
【００１３】
高レベルの過飽和における結晶面への三次元的核心の吸収による成長は、タウマチン、カタラーゼ、ｔＲＮＡ、リゾチーム、リパーゼ、ＳＴＭＶウィルス、カナバリン［ｃａｎａｖａｌｉｎ］の結晶化に関する研究で観察された。三次元的核心はコロイド状の１〜１０μｍのレンジの平均寸法が観察されている。こうした核心の起源は、短期の内的整列を有するタンパク質に富んだ小滴から生起し、基本層の結晶格子との相互作用による長期整列の、タンパク質クラスターと考えられる。
【００１４】
低程度の過飽和で不活発状態にあるとき、その低い拡散率ゆえに成長する結晶周りに濃度勾配ないし枯渇ゾーンを生成する周囲の媒体から、個々のタンパク質分子、モノマー、を取り込むことによってタンパク質結晶が成長する。リゾチームにとって、大きな１ｍｍ大の結晶周りのＭａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉分析で測定されるタンパク質の濃度勾配は、２〜３ｍｍの距離につき〜１０％のオーダーである。バルク［ｂｕｌｋ］な溶液中の大きい集塊はタンパク質モノマーより緩慢に拡散するのであって、大きな集塊の結晶格子への取り込みを運動学的に遅らせる枯渇ゾーンを形成する。その結果、枯渇ゾーンはマスフィルタと同じように作用する。枯渇ゾーンは大きな集塊をフィルタからはじくばかりでなく、流体力学的に大きい半径の部分的に変性したタンパク質もはじくから、緊密な天然球状タンパク質よりも低い拡散率となる。マスフィルタによる濾過は長続きせず、さまざまな種の異なる拡散に基づいているから、タンパク質の結晶成長は系が平衡に近づくにつれ自己不純物［ｓｅｌｆ−ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ］に最終的に落ち着く。地上制御でのＡＦＭ研究は高分子結晶が、結晶面へのアクセスを制限するタンパク質の非常に不純な吸収層の形成があるため成長を止めてしまう傾向があることを明らかにした。
【００１５】
小重力においては、沈殿と浮力の流動効果が抑制されて、拡散こそがタンパク質移動の支配的メカニズムとなる。したがって枯渇ゾーンは広がり、より効果的に高いオーダーのタンパク質の集塊を成長中のタンパク質結晶への取り込みから排除するから、より高度な結晶成長へと導かれる。最近の小重力場でのリゾチーム二量体の自己不純物を使ったＰＣＧ（タンパク質の結晶成長）研究は、この仮説を支持している。成長している結晶に隣接する大きめの核心や結晶体の減重力下での沈殿のような不活発ではない状態は、枯渇ゾーン中に乱れを生み出し、自己不純物のより高い濃度の取り込みを促進して、そのマスフィルタの機能を損なう［ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ］。より高い過飽和レベルで観察される三次元的核心の吸収による核化後成長は、沈殿効果と浮力駆動の流れ効果の影響を特に受けやすい。コロイド大の核心のような粒子は重力効果の影響を受けやすいから、これがＰＣＧにとって小重力が有利に作用することの基本的な理由であろう。
【００１６】
小重力場でＰＣＧ実験を行う前に、純化したタンパク質を数週間という長期間高濃度で貯蔵しておくことが頻繁に行われている。溶解し得る状態に維持されたタンパク質にとっては、タンパク質の不安定性ないし変性が不可逆的な集塊の生成を促進する。したがって核化に必要な高レベルの過飽和状態があれば、タンパク質結晶の核心はアモルファスな集塊の有意な濃度を含むことになる。自己不純物の存在は事後的に整列する核化後成長にとって有害であるから、結晶の質は核化後成長および適切なモノマー種の集中を促進するのに適する核心能力の関数と言える。明らかに、高度に整列している核心はアモルファスな集塊より運動学的に安定であり、これは核化後成長を達成させるために必須である。しかし長期にわたる溶液貯蔵は、不可逆的なタンパク質の集塊がＰＣＧの達成を損ないかねないのである。
【００１７】
前世紀中にタンパク質結晶化のための方法がいくつも開発され、実際に使われている。例えば気相拡散法、液体・液体間の界面拡散法、液体・液体間の混合乱流法、段階勾配法などがある。
【００１８】
過去１０年間における小重力場（及び地上）でのタンパク質結晶化実験の約９０％が、水をタンパク質と沈殿剤の溶液の水滴から気相を介して濃縮した沈殿剤溶液へ移動させるという、気相拡散法または懸滴法で行っている。この方法はいくつかの長所をもつ。特に、容器の表面が相対的に無くてすむこと、過飽和へ緩慢に進行すること、少量で足りること、そして結晶の核化および成長の観察が容易なことなどの利点があり、また、粘性にそれほど影響されないという利点もある。反面、短所も多くある。懸滴法では量が限られてくること（定着ならいい）、飽和速度の制御が困難、液体・空気間の界面における対流の確立の可能性が限られる、などの短所である。懸滴法と同様に定着／懸滴は結晶成長溶液からのみ水を除去する。しかし定着滴法における懸滴とは違って、浮力駆動流れのアップウエリング［ｕｐｗｅｌｌｉｎｇ］が頻繁に行われるもので、水の排除速度は蒸気圧に左右される。気相拡散法を使った装置の例は、米国特許第４８８６６４６号、第５１０３５３１号、第５０９６６７６号および第５１３０１０５号にある。
【００１９】
界面拡散法、すなわちタンパク質結晶成長技術としての液体・液体界面拡散法はタンパク質・沈殿剤溶液の１界面にわたる重層法である。ＰＣＧはこれら液体間に結果的にできる界面を乗り越える両液相互間の自己拡散の程度次第でタンパク質結晶を成長させる。流動効果があるため、これらの界面は互いに安定せず小重力場で再生産的に生成することができる。一時的な濃度勾配は空間的な核化の場所を減らすことによって核化活動を制御可能にする。系が平衡するにつれ行われる沈殿剤溶液によるタンパク質溶液の希釈は、タンパク質集塊の核心への取り込み及び結晶化の可能性を減少させる。この方法によると系が平衡に近づけば枯渇ゾーンが確立するだけである。非常に粘度の高い液体どうしが界面拡散で混合するのは非常に緩慢に行われるから、シャトルのミッション期間内では成立しない時間になるもので、ただ国際スペースステーションのミッションなら成立し得るに過ぎない。
【００２０】
乱流混合法はＰＣＧ実験の開始時に平衡値にされる系に本質的に結果するもので、実験中ずっと平衡を維持される。系の最終的な終点を知る上で重要な場合であって１バッチの結晶化に類似する場合に、行われるべき比較を可能にするのに有益である。乱流混合はまた粘性沈殿剤を混合するときの困難をも克服する。
【００２１】
段階勾配法では、均質な核化と結晶成長とは別段階に処理される。均質な核化は、タンパク質の近飽和溶液を沈殿剤の高度に過飽和な溶液（例えば１．２〜３．０倍の飽和濃度）と慎重に接触させることで誘導される。これを核化が引き起こされるに十分な時間さらすと、やや飽和した沈殿剤の濃縮へと結晶が不活発な結晶成長に向かって変化する。この方法は宇宙でタンパク質結晶を成長させるのに成功している。
【００２２】
気相拡散法と液体・液体界面拡散法との本質的違いは、タンパク質の溶解度相の平衡へのそれぞれの互に直角なアプローチに存する。蒸気拡散法は平衡状態に濃縮されるタンパク質の希釈溶液から出発するが、液体・液体界面拡散法はタンパク質の開始状態を希釈するのである。
【００２３】
上記の方法はすべて重力に依存した構成になっている。母液より濃厚な結晶は結晶化ゾーンから沈殿して分離し、一方、それほど濃厚でない結晶は結晶化ゾーンから浮きあがって分離する。容器壁に溜まる沈殿作用は結晶慣性を変える。透析膜または容器壁上における急速な結晶は、ときとして多数の小結晶をもたらす。理想的には、動かず接触しない結晶成長が好ましいが、スペースフライトのような小重力場はこのような状態を作り出すのに非常に近い所にある。
【００２４】
近年のタンパク質結晶学のデータ収集技術は、放射線損傷を最小にするため液体窒素中で瞬間凍結したタンパク質結晶を利用する。大きい結晶（０．５〜１ｍｍ）は瞬間凍結中に比較的簡単に損傷するが、小さい結晶（平均〜０．２ｍｍ以下）は氷結できないほど急速に冷却することができる。第２、第３世代のシンクロトロン放射源とＣＣＤ検出器を使って、もっと小さい結晶をうまく創出することができた。本発明の装置は高品質の小または中サイズの結晶を成長させることを目的としている。大きい結晶の成長に関係する長時間に大いに起因して、タンパク質の変性現象から一層敏感に影響を受ける、自己不純物の存在は、小さい結晶より大きい結晶の成長を損傷する傾向がある。
【００２５】
タンパク質変性が小重力場でＰＣＧ活動をする前に生じるときは、タンパク質変性はタンパク質溶液中の不可逆的な集塊、自己不純物の形成によりＰＣＧの達成を不十分なものにし得る。不可逆的な集塊形成が地上での実験では起こらずＰＣＧの達成を不十分なものにするときは、ＰＣＧ活動時のタンパク質集塊の固体数を軽減することができるものでなければならない。
【００２６】
タンパク質結晶は採集中、あるいはその後の取り扱い中に、圧迫されたり損傷したりするから、データ収集には不適当となる。本発明の装置は瞬間凍結にしてはタンパク質の採集を容易にする。特に結晶が角から採集できなくなるのを回避できる。
【００２７】
本発明の装置は、飛行後に出る結果のドキュメンテーションを容易にするばかりでなく、ＰＣＧミッションの統一センターによる多数のＰＣＧ実験の統一と分散を容易にする。
【００２８】
ＰＣＧ実験は、研究室での日常的ＰＣＧスクリーニングで使われる量（μＬ）と比較して少量で結晶化ができるように準備しておく必要があり、できるだけ少しのタンパク質を消費する。
【００２９】
技術的には、小重力ミッションの仕事を通して液体の吸収や漏出なしに、軌道活動に先立って、施設はタンパク質と沈殿剤とを効果的に分離できなければならない。
【００３０】
マイクロ流動体装置は、ＤＮＡ配列や医療診断といった分野で偉大な能力を有していることが認められてきた。さらに同装置は、全血とか汚染環境サンプルなど微量の複合体サンプルに対して直接行わなければならない、分離、化学反応、無目盛の分析測定などを可能にする能力ももつ。したがって使い捨てのマイクロ流動体装置が小重力場でタンパク質結晶を成長させる手段として研究されなければならないのである。
【００３１】
次の実施例はマイクロ流動体のために一体化した回路を使うものである。この装置は薄い透明なプラスチックまたは硝子構造で大略クレジットカード大にされる。この装置中の薄層流れ構成は、回路設計の仕方によって自由な液体・液体界面拡散法、バッチ方式、または蒸気拡散法で結晶成長を行う。この装置は液体サンプルを簡単に乗せることができ、透明な材料で造られ、ＰＣＧ結果を容易にドキュメンテーションできて、タンパク質の結晶成長の採集が簡単にできるものである。
【００３２】
ほとんどの流動体は、０．５ｍｍ以下のチャネル幅の小型流れ構造中を薄層状に流れるようにされる。こうした流れ構造中を移動する２本またはそれ以上の流動体は、それら流動体間の界面とか毛細管壁との界面で乱流を発生させない。混和し得る流動体や粒子の別々の層は、それらを構成する分子や個々の微粒子の成分が拡散する以外は、隣接し合いながら相互作用することもなく細管中を流れることができる。マイクロ流動体のチャネルは５００μｍ以下の幅および高さにされるのが普通である。水と同等な粘度の液体または１秒に数ｃｍ以下の遅さで流れる。こうした状態はレイノールズ数１以下の値に相当するものである。レイノールズ数は流れる液体の乱流生起傾向を表現するもので、２０００以上の値は乱流を意味する。１〜２０００の値は、マイクロ流動体の混合構造でよく使われるもので、いわゆる薄層状のリサーキュレーション［ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ］を可能にする。
【００３３】
最近の小型化技術の発展は、いわゆるチップ上のラボと呼ばれるマイクロ流動体装置の一体化を可能にした。こうした小さなマイクロチップには溝や室がエッチングされて、多数のチャネルや化学分析とか化学合成ができる物理的構成が設けられている。こうした装置はミクロの全分析系［ｍｉｃｒｏ−ｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍｓ； μＴＡＳ］とも言われ、半導体工業で使われているのと同様な技術でシリコンを大量生産することができるし、プラスチックを使って成型技術や、カッティング、スタンピング技術によって、もっと安く造ることもできる。微小製品製造技術の最近の発展は、さまざまな材料の使用にまで拡大している。従来の分析器を超える革新があって、サンプルも試薬も極めて少量しか使わない。チップは安価で小さい。サンプリングから結果を得るまでの時間は著しく短縮されている。さらに細管中を流れる流動体が示す特性があるため、分析器や分析フォーマットの設計はマクロでは機能し得ないということがある。ＰＣＧにとってマイクロ流動体構造は、従来のＰＣＧ装置とは異なる新規で革新的なモジュール方式の技術を提供するものである。こうしたマイクロ流動体構造がＰＣＧに関係する仕方はさまざまである。
【００３４】
さまざまなタイプの使い捨て結晶化チップのための「構築用ブロック」として使えるマイクロ流動体構造がいくつか最近開発された。こうした装置は、１秒間にナノリットルという流速で微量（数十ナノリットルから数十マイクロリットル）のサンプルと試薬を移動させることができる。
【００３５】
マイクロ流動体系ではレイノールズ数が低いため、混合は薄層拡散混合法または薄層リサーキュレーション混合法に通常限られている。しかしマイクロ流動体系中に乱流を生起させることはできる。２種以上の単相の液体や固形粒子を含む液体を混合する準乱流混合法を使える装置も開発されている。この装置は細いチャネルで連結された一連の室を設けている。ミキサーに流動体が満たされると、流動体は一連の方向反転にさらされる。流動体が正逆方向に律動的に動かされるたびに、流動体と接線方向に触れる各チャネルは各室に薄層ジェットを生起させる。各薄層ジェットは各室中の流動体を同一方向の渦として回転させるから、回転剪断流が混合効果をあげるのである。流動体の混合は流動体の各チャネルを指状に分かれる細管に枝分かれさせた後、これらの細管を１本のチャネルに再びまとめることによっても行うことができる。
【００３６】
米国特許第５７１６８５２号及び第５９３２１００号は微細なチャネル中を流れる薄層流の原則に則ったマイクロ流動体構造に係るものだが、そこでは入ってくる流れを１本のチャネル内で薄層接触させて、所望の粒子が拡散によって検出されるか抽出されるかできるようにしている。米国特許第５７１６８５２号は、ここに言及して本明細書に取り込むものとするが、Ｔセンサーと呼ばれる装置に関し、拡散原理によって小さい粒子も大きい粒子もともに含む流れの中の小さい粒子の存否を判断し、かつ濃度分析するのに使われる。拡散混合の速度は拡散粒子の大きさの関数である。米国特許第５９３２１００号もまた、ここに言及して本明細書に取り込むが、Ｈフィルタと呼ばれる装置に関し、薄層流によって拡散係数に基づき、半透性膜なしに継続的に粒子の分別を可能にする。Ｈフィルタは希釈部材としても、あるいはＨフィルタを一連にして使うことで非常に精確な連続希釈装置としても使うことができる。
【００３７】
原理的な記述には直接ならないがＴセンサーの使い方についての理解はＰＣＧ原理をよりよく理解するうえで必要であるのでここに記載する。Ｔセンサーは、Ｈフィルタの分別機能を検出機能と結合したもので、ミクロの全分析系［ｍｉｃｒｏ−ｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍｓ； μＴＡＳ］である。Ｔセンサーシステムは、サンプル溶液、指示薬溶液、および対照溶液を１つの同じチャネル中に入れて使う。これらの流動体は並行に流れる間に、装置の構造体から出るまでには相互に作用する。血液細胞のような大きな粒子は、流れが構造体内にある時間内には十分に拡散しないかもしれない。Ｈ＋とかＮａ＋のような小さい原子や小さい分子は流れ間を迅速に拡散するが、装置へ入る前よりは、大きいポリマーは緩慢に拡散して流れ間に平衡する。相互拡散が進むにつれ、相互作用ゾーンが形成されてサンプルと試薬とが結合し作用し合う。Ｔセンサーは、２つの異なる混和性の流れから出る成分が相互に拡散して作用し合うように使うことができる。例えば１つの流れの中に含まれる抗原が、抗原を含む並行な流れの中に拡散することができて、それらの抗原と作用し合うが、２本のもとの流れはほとんど分離したままでいるのである。
【００３８】
Ｔセンサー型装置は、サンプル成分の沈降ないし結晶化を引き起こすために使うことができる。例えば１つの流れから出る成分は、それと並行な流れの中に拡散してその成分と作用し合い沈降することができる。あるいは１つの流れから出る溶媒分子は別の溶媒と粒子とを含む並行に流れる流れの中に拡散することができる。拡散界面ゾーンに沿う溶媒の特性変化は、次に結晶化や沈降を誘引し得る。あきらかに微細チャネルの横方向または縦方向に温度勾配を適用して沈降特性を変化させることもできる。マイクロ播種ももう一つの可能性である。
【００３９】
マイクロ流動体技術を使ってタンパク質の不安定性を緩和することができるということは注目すべきことである。タンパク質の変性は比較的高いオーダーでタンパク質の集塊を含む多分散［ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ］タンパク質の固体群に結果する。天然タンパク質の拡散係数とタンパク質集塊の拡散係数の違いがあるため、集塊の濃度をＨフィルタを使用することで低下させ、あるいは零にすることができる。Ｈフィルタ構造はフィルタから出る単分散［ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ］天然タンパク質を選択的に濃縮する。
【００４０】
ＰＣＧをするために有益なもう一つのマイクロ流動体装置については米国特許第５７２６７５１号に記載されている。ここに言及して本明細書に取り込む。この特許はマイクロサイトメーター［ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ］と呼ばれる鞘状流れのサイトメータ装置をベースにするもので、マイクロ流動体装置用に特別に開発された使い捨て薄層カートリッジ技術を心臓部に備えるものである。この技術を使ってマイクロ流動体の流体力学と幾何学的焦点装置とを組合せることで沈降する結晶に焦点を合わせることができるかもしれない。これは粒子が検出器を通過するとき一列に並べるとか、あるいは粒子をよく制御した精確な方法で装置の底面に落ち着かせることができるものである。
【００４１】
最後にマイクロ流動体技術として開発された装置として、米国特許第５４７４３４９号、第５７２６４０４号、第５９７１１５８号、第５９７４８６７号、第６００７７７５号、第５９４８６８４号、第５９２２２１０号がある。これらもまたここに言及して本明細書に取り込む。
【発明の目的】
【００４２】
本発明の目的は、マイクロ流動体構造を使ってタンパク質結晶を成長させる装置を提供することにある。
【００４３】
また、種々の分析を同時に行うことができる装置を提供することにある。
【００４４】
さらに、タンパク質の結晶成長［ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｙｓｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ； ＰＣＧ］の実験を行うため、微量の液体でも使うことができる装置を提供することにある。
【００４５】
さらに、小重力状態であっても容易に使うことができる装置を提供することにある。
【００４６】
上記の目的、ならびにこれら以外の目的は、以下に述べる詳細な説明から具体的に了解されることであろう。
【００４７】
タンパク質の集塊整列を促進する溶解条件は、タンパク質の結晶化に好ましいものである。集塊というのはタンパク質の表面トポロジー及び表面グループの化学的特性に敏感な特殊な力に仲介されたタンパク質細胞の相互作用に関連する。この相互作用の複雑さがＸ線回折で高品質な結晶を得るのを困難にしている。一方でごく単純な粒子の相互作用を発展させるとともに、溶解度に関連する溶解状態の結果をどのように特徴づけて表現するかの考察を、順逆相転移という統計学的メカニカルモデルが提案している。タンパク質を単純な流動体として表現しようとする試みは、殆どの結晶化条件の下で、タンパク質細胞はその大きさよりずっと短いレンジの引力を示すことを示唆する。これはタンパク質の溶解相挙動に重要な影響をもたらす。第一に、一定長さの引力における溶解度は、引力の度合に微弱にしか左右されない。したがって大きなクラスのタンパク質は、一定レベルの引力では狭いレンジの溶解度を示し、タンパク質の結晶化はそれに左右される。
【００４８】
引力の度合を表現する１方法は、第２タンパク質のビリアル係数を測定する方法である。相互作用力の短期的な二次的効果は、タンパク質溶液が濃度の濃淡に因って準安定の流動体／流動体相転移を示すことである。この転移は１つの相が２つの溶液に分離する様相を示す。つまり一方はタンパク質に富み、他方はタンパク質が乏しい溶液である。この相転移の決定点は、流動体と結晶との相境界より強い引力があるか否かである。したがって結晶は、タンパク質に富む相に分離した状態から最終的に成長を始める。この流動体と結晶との相境界の決定点に近づくことは、結晶への核化に重要な役割を果たし、タンパク質が結晶化する第２タンパク質ビリアル係数値の狭いレンジにつながる。添加物を加えたり別の開始条件にすれば、流動体と結晶との相境界が変更され、タンパク質の結晶化にとって有利な溶解状態を作ることもできる。
【００４９】
タンパク質分子間の相互作用は濃度依存性であるから、光散乱測定で分析評価することができる。タンパク質希溶液中のタンパク質の濃度の光散乱依存度は、タンパク質細胞の相互作用の程度に直接関連するもので、この依存度の定数は第２タンパク質のビリアル係数Ｂ２である。Ｂ２のポジティブ値はタンパク質分子間にある斥力の質的表現であり、Ｂ２のネガティブ値はタンパク質分子間の引力を表す。Ｂ２の大きいネガティブ値はタンパク質分子間の引力が強いことを示し、ゲル形成やアモルファス沈降［ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ］となる。ＧｅｏｒｇｅとＷｉｌｓｏｎは、タンパク質の結晶化にとって好ましい溶解状態に共通の特徴があることを発見し、それは第２タンパク質のビリアル係数Ｂ２で表すことができると主張した。多くのさまざまなタンパク質溶媒ペアを使って測定したＢ２の測定値はすべて、明白に、結晶化域［ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｌｏｔ］と呼ばれるかなり狭いレンジ内におさまった。この結晶化域とは、ＰＣＧ（タンパク質の結晶成長）が確実になる溶解状態の経験的表現である。結晶化位置をなすＢ２値は、僅かな程度から緩やかな程度にネガティブ（約−１〜−８×１０−４ｍｏｌ ｍｌ ｇ−２）で、タンパク質分子間に僅かな程度から緩やかな程度のネット引力を示す。
【００５０】
静的光散乱法［ｓｔａｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ； ＳＬＳ］は第２ビリアル係数Ｂ２を決定するのに使われる分析法である。この方法は溶媒で過度なバックグラウンドとなっているタンパク質溶液によって散乱する光の強度を必要とするもので、散乱した光をタンパク質濃度の関数として測定するのである。ＳＬＳデータを分析するのに使われる関係式は次の通りである。
【数式１】
2004500241.tif 000003
ただし、Ｋは、屈折率、アボガドロ数、入射光の波長、およびタンパク質濃度ｃによって変化する屈折率に左右される光定数である。散乱角θにおける余分なレイリー比Ｒθがタンパク質濃度ｃの関数として決定される。Ｍは分子量。Ｋｃ／Ｒθに対するｃをプロットすることによって第２ビリアル係数Ｂ２を限定勾配［ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｌｏｐｅ］から得ることができる。Ｂ２は希釈溶液パラメータであって、ＳＬＳデータに使われるタンパク質濃度は検出感度に左右され、典型的なレンジは大きな分子量のタンパク質にあっては０．０５ｍｇ／ｍｌ、リゾチームにあっては１ｍｇ／ｍｌである。ＰＣＧに使われるタンパク質濃度に比し、第２ビリアル係数は少量のタンパク質を使って決定できる。
【００５１】
膜タンパク質を溶解させるには界面活性剤が必要である。したがって膜タンパク質を結晶化するには、使われる界面活性剤に結合するタンパク質複合体を結晶化しなければならない。今までの大半の膜タンパク質の結晶は、使われる界面活性剤の曇り点付近でその形成が観察されている。この曇り点というのは界面活性剤ミセルの集塊に対応した界面活性剤相の分離境界である。溶液が曇り点に近づくにつれて、ミセル間にある力が斥力から引力へと切り換えられるのである。静的光散乱はミセル構造に敏感だから、タンパク質と界面活性剤の複合体の第２浸透ビリアル係数Ｂ２は、散乱ミセル間の相互作用に注意を向けなければならない。後述のＴセンサー検出構造は、界面活性剤ミセルがあるときのタンパク質と界面活性剤複合体の第２浸透ビリアル係数を測定することができる。
【００５２】
第２ビリアル係数値は結晶化を予想させるものではあるが、第２ビリアル係数の結晶化域値に一致する開始状態すべてが回折質の結晶形成を保証するものなのではない。だから第２ビリアル係数値はＰＣＧさせるのに役立つ開始状態をフィルタするのに使われ、Ｂ２結晶化域値をくくる弱く引き合うタンパク質細胞の相互作用に対応してすべての状態はスクリーニングされる。
【００５３】
「重力駆動」のマイクロ流動体構造の２つのタイプを作った。１つは「垂直」（ＧＶＴおよびＧＶＨ）型で、サンプルと試薬の液槽を一体にして縦方向にするか傾斜させて使う。もう１つは「水平」（ＧＨＴおよびＧＨＨ）型で、サンプルと試薬を入れるためのチューブを取り付けたものである。ＧはＧｒａｖｉｔｙ−ｄｒｉｖｅｎつまり重力駆動、ＶはＶｅｒｔｉｃａｌつまり垂直，ＨはＨｏｒｉｚｏｎｔａｌつまり水平、またＨはＨ−ＦｉｌｔｅｒつまりＨフィルタまたはＴセンサーのことである。Ｈフィルタは２個の入口と２個の出口をもち、サンプル溶液の成分を分離するように設計され、排出する溶液を集めることができるようになっている。Ｔセンサーは２個または３個の入口と１個だけの排出液の出口をもち、複合体サンプル溶液（例えば全血）中に直接被分析体を検出することができる。そしてサンプル溶液および指示薬溶液が入れられ、入口が３個のＴセンサーにあっては、既知の濃度の対照溶液も入れられる。
【００５４】
ＧＨタイプ、ＧＶタイプの両構造とも、流速は各入口または各出口における流体柱の静水力学的高さによって決まる。このことは２本の流れの間の中心線の相対的位置と流速とが、各々の入口と出口における流体柱の高さを変えることで調節されることを意味する。Ｔセンサー型のあるものは、流体柱の高さの変化にそれほど敏感ではないものもあるが、それでも中心線を非常に正確に調節することができる。
【００５５】
ＧＶＴタイプ、ＧＨＴタイプの両構造とも、「注入注射器」で充填することができる。ＧＶ型の場合、各カートリッジの先端にある液槽の穴の中に先の丸い針を入れる。針をいくぶん穴側に入れて、カートリッジをいくぶん下方に向けて保持すれば容易になるから、気泡が入らないようにゆっくりと慎重に充填する。液槽には全部充填する必要はないが、入口チャネルに接する接続部に近い箇所には流体が入れられていなければならない。
【００５６】
ときとして液体がチューブに入れられると同時に流れ出すこともあるから、流体がＴセンサーの主チャネルに入る前に別種の液体が交じり合わないようにするには、ＧＶカートリッジを平らに寝かしておいて全部の液槽を充填すればよい。ＧＨＴ型のカートリッジを充填するのは容易である。２個の注射器またはピペットを使って、サンプル溶液と指示薬溶液とをチューブのそれぞれの入口から同時に同一レベルまで入れればよい。
【００５７】
ＧＨ型およびＧＶ型の両方とも、流体がチューブや入口の液槽中にあるときは流れが溶液自身の力では始まらないことがしばしばある。こうした場合、（封入）シリコンチップ付きの「吸引器」を出口チャネルの開口部にもっていって、上記すべての入口から流体が流れ出すまで慎重に吸引すればよい。吸引し続ければ不本意に入ってしまった気泡もチャネルから取り除くことができる。そうすれば流体は何らの補助がなくても静水力学的圧力だけで流れることができる。
【００５８】
入口チューブ（ＧＨ型）に流動体を追加するか、それから取ることによって、あるいはカートリッジ（ＧＶ型）の傾斜を加減することによって、流速を調節することができる。入口と出口の流動体レベルの高低差が高ければ高いほど、一定の構造において、それだけ速く流動体は流れる。あるいは（流動体が出口に到達した時点で）出口の開口部にＱチップを乗せれば、劇的に吸引するから、流れを速めることができる。
【００５９】
以下、本発明の具体的実施例をいくつか記載する。しかし本発明はこれら記載以外にも、この請求項の記載に従いさまざまに実施することができるものである。なお、図面で示した部分の引用数字は、同一部分につき同一数字を当ててある。
【実施例】
【００６０】
図１は、拡散［ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ］に基づく結晶化の原理を示すもので、Ｔセンサー様構造体１０が示されている。タンパク質を溶解したサンプル１２と、さまざま異なる溶媒と塩とを含む試薬１４とが、Ｔセンサー１０のチャネル１５中を並行に流れている。薄層の流れという外形をなすようになったら、流れはずいぶん遅くなり停止することもある。いろいろな成分からなるサンプル１２と試薬１４の両方の流れは一定速度で互いに拡散し合うようになり、流れ中の分子の大き影響される拡散界面ゾーン１６、１８をＴセンサー１０のチャネル１５中に形成する。この挙動は非常に明確な結晶化につながる濃度勾配をＴセンサー１０中に確立する。一方の流れの溶媒分子は別の溶媒や粒子を含む並行に隣り合う流れの中に拡散していく。拡散界面ゾーン１６、１８中の溶媒特性の変化は、結晶化ないし沈降を引き起こし得る。言うまでもないが、チャネルの横方向または流れ方向に温度勾配を細いチャネルに適用して、沈降特性に影響を与えることも可能である。またマイクロ播種［ｍｉｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ］もこのＴセンサー１０に使うことができる。
【００６１】
次に図２において、米国特許出願６０／２０６８７８号に記載されている薄層のジェット乱流のようなマイクロ流動体の急速混合構造２０、スプリットチャネル拡散ミキサー、あるいはその他の、低いレイノールズ数環境下で急速に流動体を混合するミキサーを、結晶化チャネル１５の上流に設置することができる。タンパク質サンプルと試薬を一定比率で混合してから結晶化チャネル１５中に流し込むと、均質に混合した溶液２２が流速を落とし、場合によっては停止する。するとチャネル１５中で結晶化が起こる。ここでもマイクロ播種や温度勾配を適用することができる。
【００６２】
図４および図５は、拡散ミキサーを使って混合された２つの異なる分子の挙動を示している。図は分岐チャネル拡散ミキサーの１００ミクロン幅のチャネル中で、大きな分子ですら約２分以内に完全に平衡させられたことを示す。図４は、１２０秒（Ｙ）間で１００ミクロンのチャネル（Ｘ）中にホスビチンコンプレックス（１，４９０，０００ＭＷ）の濃度（Ｚ）を示した。一方、図５は１２０秒（Ｙ）間で１００ミクロンのチャネル（Ｘ）中にチロゴブリン（ボビン）（６６９，０００ＭＷ）の濃度（Ｚ）を示した。
【００６３】
図３に戻って、図２のＴセンサー１０をまた使って説明するが、この実施例では結晶化チャネル１５は部分的にしか充填されない。チャネル１５の出口には吸引体２４が連結して、所定量の溶媒混合溶液２２を継続的に吸引し、タンパク質濃度を高めて結晶化を誘因している。この実施例でも又、マイクロ播種や温度勾配を適用することができる。
【００６４】
図６及び図７は、１枚のカード上における１２個のＰＣＧ実験器の２つの異なるモードの１例を示す。１個のマイクロ流動体ＰＣＧ実験器は次のエレメントを含む。すなわち、駆動流動体界面３０と、１対の流動体槽３２、３４と、マイクロ流動体チャネル弁３６ならびにマイクロ流動体チェック弁３８と、結晶化室３９と、採取室４０と、マイクロチャネル接続部４２と、及び接着シーリングテープ４４とである。
【００６５】
図６において、マイクロ流動体のカートリッジ５０は、多数の流動体槽３２、３４を有している。流動体槽３２はタンパク質サンプルが充填され、流動体槽３４は沈降剤溶液で充填される。槽３２、３４中の流動体は、チャネル３０中の流動体にエアまたは不活性油などによる圧力をかけることで動かされる。槽３２、３４は結晶化チャネル３３とでＴセンサー構造に形成される。薄層状の流れは２つの流動体が結晶化室３９内で互いの自己拡散以外には混合しないことを確実にする。結晶化室３９の内容物は採取室４０中に出て行く。流動体槽３２、３４各々は、充填中のエア抜きをするための空気穴５４があけられていて、流動体入口５２、マイクロ流動体チャネルのチェック弁３６、３８経由で充填される。流動体槽３２、３４に接続する面が小さい直径なので、表面張力効果がこれら流動体槽３２、３４から流動体が流れ出すのを防止している。ひとたび充填されると、図７に示すように流動体槽３２、３４は接着シールテープ４４で慎重にシーリングされる。この接着シールテープ４４は、カートリッジ５０を直接縛り付けてもよい。採取室４０は別の接着シールテープ４４でシーリングされる。このとき接着シールテープ４４は、カートリッジ５０を直接縛り付けてもよい。小重力または流動体が活性化する前の長期貯蔵において、流動体チャネルのチェック弁３６、３８は流動体槽３２、３４からの蒸発ロスを最小限に抑えている。チェック弁３６、３８は逆流を阻止して１方向流れにするもので、マイクロ流動体循環系に正しく設置されて流動体封入を一定レベルにするよう作用する。
【００６６】
外的な弁作用と流動体の駆動は次の２つのうちの１で達成できる。すなわちマイクロ流動体カートリッジに組み込む外的駆動装置あるいはフイゴである。外的な流動体駆動装置（図７）はエアポンプ６０でもよく、それに各カードをフックで吊るしておく。エアポンプ６０は循環系中に流動体を駆動するための正確な量の圧力を送り出す。ほかには図６に示すようなフイゴ６２を使う方法もある。流動体をマイクロ流動体系中にポンプ圧で駆動することができる循環板上にフイゴ６２を直接設置するのである。フイゴ６２は空気穴６４を備えていてもよく、その場合はボールベアリングでシールしておく。加圧されればフイゴ６２は再び流動体の駆動装置として作用する。突然に圧力供給が止まって圧力を解放することは、エアをマイクロ流動体循環系中に放出することになり、系を平衡にする。チェック弁３６、３８はいずれの場合も流動体の逆流を阻止して一定レベルの封入状態を守る。フイゴ６２に開けられた空気穴６４の利点は、カートリッジ５０が一度稼働すると、ゆっくりと平衡状態に戻ることができるようにし、フイゴ６２に次の圧力をかければ採取室４０から結晶採取するのを容易にすることである。フイゴ６２には流動体駆動のために不活性油を装填することもできる。必要に応じてこうすれば、ＰＣＧ実験器の長期的使用によるマイクロ流動体カートリッジ５０から蒸発ロスを防止することになる。
【００６７】
チャネル３０中の駆動流動体にフイゴ６２で圧力をかけて稼働させると、結晶化室３９の中へとチェック弁３６、３８を介して流動体槽３２、３４の内容物がポンプされる。チェック弁３６、３８は結晶化室３９からの逆流がないことを確実にするとともに、流動体封入のレベルをさらに確実にする。特定のＰＣＧ実験器１本を採取するのは、接着シールテープ４４を部分的に剥がしてその選択した採取室４０を取り上げればよい。流動体駆動装置のポンプ６０またはフイゴ６２を介してかかっている循環圧力は、結晶化室３９の内容物の不活性油またはエアと同じ高さにする。そうすれば結晶は採取室４０内で容易に移動したり取り扱ったりできる。現在のところ懸滴実験器をシールするには、Ｈａｍｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈが市販している透明なプラスチック接着テープを使っている。このテープは平衡状態をうまくシールすると同時に懸滴実験器を保持することができる。このテープは、流動体がチャネル中にポンプで入れられたとき結晶の採取室４０をカバーするテープが生ずる微小な抗圧力に対応することができる。万一こうした対応が問題となるなら、疎水性の高い小さな空気穴を出口側に設けておいてエア以外、液体は出ないようにしておけばよい。
【００６８】
ＰＣＧ装置における典型的な結晶化チップは、空気を抜く空気穴のあるフイゴタイプのものである。このタイプは実験を簡単にし、使い勝手をよくする。各結晶化室４０は２０μＬという微量を使うことができるが、より小さい室、たとえば１０〜１００ナノリットルという微量も可能である。タンパク質の結晶化工程を始めるには、マイクロ流動体循環系カートリッジ内で３つのアプローチがあり得る。これら３つのアプローチをすべて１枚の板の上でミックスしマッチさせることができるのである。ＰＣＧは、薄層境界を横切って沈降剤とタンパク質とが自己拡散し（図８）、全成分が乱流して混合し−バッチモード（図９）、そして乾燥剤とか沈降剤中へ蒸気移動する（図１０）。
【００６９】
図８において、界面における拡散は、各流動体槽（量＞１０μＬ）中に２倍濃度のタンパク質と沈降剤からなり、各々１倍濃度の同量のバッファ、塩および洗剤の中にある。次にこれら２種の流動体をマイクロチャネル４２の直径で制御して１：１の混合比で加圧下に結晶化室３９に注入する。室は少なくとも約５００ミクロン以下の大きさにして、慎重に指で押さえてゆっくり充填してゆくなら、室は薄層状の流れで充填することができる（すべてのマイクロ流動体構造は、薄層状の流れでなければならないという条件を容易に満たすのに十分な小ささにされる）。系中の圧力は空気穴６４から指をゆっくりとどかすことで平衡にできる。流動体槽３２、３４と採取室３９をシールしたときのように慎重に、フイゴ６２を透明な接着テープでシールする。結晶化室４０から採取室３９への移動は、採取室３９をシールしている接着テープを剥がし、フイゴ６２を加圧することで行う。
【００７０】
図９において、全成分を乱流混合するカートリッジ５０は、バッチモードで使われる。乱流混合室７０が流動体槽３２、３４と結晶化室３０との間に挿入されている。乱流混合室７０はタンパク質流動体と沈降剤流動体を均質な液体に混合し、この液体が結晶化室３９に結晶化させるため送られる。粘性の高い沈降剤は混合する時間がなくて核化を引き起こすおそれがあるので、この構成はスペースシャトルのような小重力状態では特に有用である。
【００７１】
図１０は、蒸気拡散原理を使った図９のカートリッジ５０の例を示す。この実施例では流動体は乱流混合室７０中で混合されると、結晶化室３９には部分的にしか充填されない。採取室４０中に一定量の溶液を吸収させるため所定の乾燥剤または沈降剤７２を採取室４０中に入れ、結晶化室３９中のタンパク質濃度を高めて結晶化を促進する。
【００７２】
特殊なバッファ中に長期的に軌道内［ｉｎ−ｏｒｂｉｔ］貯蔵することがタンパク質の安定性にとって有害なら、タンパク質の開始溶液を選び、結晶化実験をする前にＨフィルタで、タンパク質の開始溶液を適切な流動体の開始成分に対して透析することもできる。Ｈフィルタ装置は不可逆的なタンパク質の集塊を除去する構成に組み込むことができる。図１１において、前記の実施例に示したように、カートリッジ５０はサンプルのタンパク質を充填した流動体槽３２と、沈降剤溶液を充填した流動体槽３４とを有している。それにもう一つの流動体槽８０が、タンパク質とバッファの溶液を入れたカートリッジ５０に追加されている。すべての槽は入口５２から入れられる。槽３２、８０からの流動体はマイクロチャネル４２を経由して、不要な粒子を分離して廃棄物槽８４に落とすＨフィルタとして作用するチャネル８２を通過する。濾過された溶液は、流動体槽３４からの流動体に接触するチェック弁３８を通って、結晶化室３９へ薄層状の流れとなって入る。別の方法は、直接カートリッジ５０に組みつけてタンパク質流動体槽３２の後でチェック弁３８の前に設置した０．２２μフィルタを使って、タンパク質槽３２の内容物を濾過する方法である。このタイプのフィルタは動的光散乱実験における特殊な物質を除去するのに用いられている。
【００７３】
図１２は高密度スクリーニングの結晶化カートリッジ５０を示す。カートリッジ５０は４つの結晶化室３９を有する。結晶化室３９は約０．５×０．５ｍｍの断面径である。タンパク質溶液は一連のポート８６から入れられ、沈降剤溶液は一連のポート８８から入れられる。一連の弁９０がフイゴ６２を一連の充填室９２に接続していて、これら充填室９２は各々ポート８６に対応している。室９２は各々１−１０μｌの容量にされている。一連の採取室４０は各々、結晶化室３９に接続されている。ポート８８は各々流動体槽３４に接続され、流動体槽３４は対応する採取室４０に接続されている。各々の採取室４０には空気穴９４があけられている。採取室４０は約５０μｌ、また流動体槽は０．１〜０．５ｍｌの、それぞれ容量にされている。
【００７４】
使うときは、ポート８６と８８から上記それぞれの溶液を充填する。弁９０を閉めておいて、結晶化室３９中で各溶液を互いに混合し、分子が界面ゾーンを越えて拡散しタンパク質溶液を希釈して一定の濃度勾配に落ち着かせる。次に弁９０を１個づつ開き、フイゴ６２を作動して溶液を結晶化室３９から移動させる。このタンパク質の結晶化成長が続く間、空気穴９４と６４、ポート８６、８８、及び採取室４０は、接着テープでシールされている。採取は弁９０を開いて行うが、弁を開くと結晶化室３９の内容物が採取室４０へと駆動させられる。
【００７５】
マイクロ流動体の結晶化チップの設計をテストするには、タンパク質を使うことが必要となる。このチップの機能の評価を最初に制御するものとして、リゾチームとタウマチンのＰＣＧシステムを実施例において使うことができる。
【００７６】
第１に重要なことは、充填中に形成される気泡を効率的に排除するため流動体槽を湿らせておくことである。これは液体を取り扱う上で適切なピペットであって流動体を取り入れる口の寸法が適切であるかという問題である。湿らすのを制御するためシリコン処理［ｓｉｌｉｃｏｎｉｚａｔｉｏｎ］を行う。角が丸かったり、楕円形や円形の流動体槽の形は、気泡を最小限に止めるように調べられる。空気穴の大きさや配置、また、液体の充填が気泡を上手に避けるためカートリッジを傾斜させる姿勢で行うのがよいのかどうかなどを研究する。どんな流動体も充填前にガス抜きしておく。
【００７７】
結晶化室の形状は、液体充填中に２種類の液体が薄層状に流れるのを確実にするために重要である。Ｔセンサーの結晶化室は使い方が完全でなければならない。しかしＰＣＧ結果を迅速に調べるには、ＰＣＧを限られた域に局限することが有利である。結晶化室中の薄層状の流れは、異なる色で染めた２種の流動体を注入することで容易にモニターすることができる。
【００７８】
採取室の容量は、母液や凍結防止バッファの分別量のほか結晶化室中の内容物全部を収容するに十分な大きさでなければならない。採取室の形状は角が丸くて、結晶を収集するのに容易なものでなければならない。
【００７９】
流動体槽と採取室のシールにはプラスチックの透明テープを使うが、マイクロ流動体の丸いカートリッジと長期的にしっくり安定するかどうかをテストする。ＰＣＧ実験のときは、サーキットボードからテープを剥がすことが容易にできるか十分注意されなければならない。後にシールするときのために、接着面を露出させて剥がすプラスチックの透明接着テープにバッキングを加えておくことも取り扱いを容易にする。接着テープが施されるべき丸いカートリッジ箇所に見える印をつけておくのもよい。
【００８０】
マイクロ流動体用のカードは、複数枚のプラスチック薄層を接着剤で重ね合させて作る。プラスチック薄層の組成は耐性の高いマイラー［ｍｙｌａｒ］である。しかし流動体との適合性および長期的完全性があるものでなければならず、パッケージされても問題のないものでなければならない。ＰＣＧの流動体適合性に関する問題は薄層接着剤またはマイラーとは予想されていない。しかし流動体の非適合性が大きいときは、ガラスまたはシリコンを使うことができる。こうした環境下では、薄層法を使ってどんな種類の流動体でも結晶化に向かわせることができるが、大量生産ということになると構造をガラスまたはシリコンで構成することが好ましい。
【００８１】
マイクロ流動体の一体化回路カートリッジを接着フィルムで被覆してシールしたら、一定レベルの流動体封入体となる。この回路カートリッジにおける流動体を移動させる界面接合は空気に対して密閉されていて、フイゴは、この密閉レベルをなさない。個々に行われる２０回のＰＣＧ実験または一遍に１０００回行われるＰＣＧ実験を含むマイクロ流動体を一体化した５０個の回路カードを、第２の封入レベルの、また必要なら温度制御して、ミッドデッキロッカーの容量内の封入容器中に外的コントローラを用いて組み込む。
【００８２】
一般にマイクロ流動体システムは、例えばピエゾ電気ポンプ、マイクロシリンジポンプ、電気浸透ポンプなどの流動体を移動させる何らかの駆動装置を必要としている。先行の２つの米国特許出願、第０９／４１５，４０４号と第６０／１８９，１６３号には（これら２出願をここに組み込む）重力とか、毛管作用、多孔材の吸引作用、化学的に生起される圧力または真空圧（例えば乾燥剤に対する水の反応）、あるいは手で簡単に作られる真空圧や圧力といった利用可能な力で流動体を駆動するマイクロ流動体システムが記載されている。こうした装置は電気も必要なく、非常に簡単で安価であって、例えばプラスチックのような単一材料から射出成型といった方法で製造することができ、また使用法も簡単である。
【００８３】
本発明の１実施例は、流体静力学的な圧力で駆動されるカートリッジであって、流体静力学的な水頭がカートリッジ自身の一部として作られるものである。このカートリッジは、重力がチャネル中を液体を引き込むように横に寝かされる。
【００８４】
別の実施例は、柔らかい薄膜下にある空間がマイクロ流動体の回路と液体接触しているカートリッジである。こうした押圧可能な空間はチャネル中へと液体を押し出したり、例えば重力によって移動し始めるまでマイクロ流動体循環またはサイフォンによる吸い上げを開始させることで、液体をカートリッジのいろいろな箇所へ押し出すことができる。
【００８５】
また別の実施例は、特定の化学液（例えば、エタノール、ブタン、二酸化炭素、有機溶剤など、すなわち所望の流速でマイクロ流動体系中に液体を押し出すのに十分な力を出すことができる一定温度下での分圧を有する何らかの物質）がその気体相と平衡を保つ室を有するものである。そこにおける空間はマイクロ流動体および他の試薬の部分をなす液体と接触していて、室内の圧力は試薬およびサンプル液をマイクロ流動体回路のチャネル中に押し出す。
【００８６】
重力または注射器による充填のほかにも、フイゴ駆動のマイクロ流動体構成もある。そこではフイゴが吸引または押出しの気泡として薄層中に一体化されている。流動体の一定方向への流れを可能にするためカートリッジのいろいろな箇所に空気穴を穿設している。
【００８７】
製造工程においてカートリッジをあらかじめ充填しておくこともできる。オープンな薄層の上に乗せた槽に所定量の流動体を入れてから、テープまたは被覆膜でシールする。こうすると流動体をマイクロ流動体回路中にあるべき場所に駆動することにもなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に使うことができるＴセンサーのグラフ的表現である。
【図２】
２種類の流動体をあらかじめ混合しておいて使う図１のＴセンサーのグラフ的表現である。
【図３】
タンパク質結晶化の気相すなわち懸滴拡散方式をシミレーションする図２のＴセンサーのグラフ的表現である。
【図４】
一定時間経過後、拡散ミキサー中で混合されたいくつかの分子をグラフ的に表現した図である。
【図５】
一定時間経過後、拡散ミキサー中で混合されたいくつかの分子をグラフ的に表現した図である。
【図６】
本発明で使うマイクロ流動体用のカートリッジのローディングモードにおける平面図である。
【図７】
図５のカートリッジのアクティベーションモードにおける平面図である。
【図８】
本発明の別の実施例を示すマイクロ流動体用カートリッジのローディングモードを示す平面図である。
【図９】
本発明を実施するもう一つ別の実施例を示すマイクロ流動体用カートリッジのローディングモードを示す平面図である。
【図１０】
本発明を実施するもう一つ別の実施例を示すマイクロ流動体用カートリッジのローディングモードを示す平面図である。
【図１１】
本発明を実施するもう一つ別の実施例を示すマイクロ流動体用カートリッジのローディングモードを示す平面図である。
【図１２】
高密度スクリーニング結晶化を実施するマイクロ流動体用カートリッジのローディングモードを示す平面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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