(57)【要約】本明細書中でニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）と呼ばれる新規なＥｒｂＢ−４リガンド、ＮＲＧ−４をコードするポリヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ、ＮＲＧ−４由来の短鎖ペプチドを表示するディスプレイライブラリ、ＮＲＧ−４を認識する抗体、ＮＲＧ−４由来のペプチドまたはペプチドアナログ、ならびに、ペプチドもしくはペプチドアナログ、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ、および／またはＥｒｂＢ−４レセプター活性（シグナリング）をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするためのポリヌクレオチド配列を用いる医薬組成物および方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能であり、かつウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５由来のアミノ酸のストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸のストレッチを含むポリペプチドをコードする、ゲノム的、相補的または複合ポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチが４位から５０位である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチが１位から９０位である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸の前記ストレッチが４位から５０位である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸の前記ストレッチが１位から９０位である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項６】
配列番号１４由来の核酸配列を有する請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】
ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１４に記載した核酸配列に少なくとも８０％相同性である核酸配列を有する請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】
請求項１に記載された単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項９】
センスおよびアンチセンス配向からなる群から選択された配向にある単離された核酸の発現を調節するプロモーターをさらに含む請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸構築物を含む宿主細胞または動物。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離された核酸と特異的にハイブリダイズ可能な少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
一対のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１７塩基のそれぞれが対向する配向で請求項１に記載の単離された核酸と特異的にハイブリダイズ可能で、それによって核酸増幅反応においてその一部を直接的に指数関数的増幅する、一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプライマー対を用いて得られた核酸増幅産物。
【請求項１４】
配列番号１５に記載されたタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの一部を用いて、生理学的条件下でインビボにてハイブリダイズ可能である、少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイム配列とを含むリボザイム。
【請求項１７】
ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸をそれぞれ表示する複数のディスプレイビヒクルを含むディスプレイライブラリ。
【請求項１８】
前記ポリペプチド由来の６つの連続するアミノ酸は実質的に全て、前記複数のディスプレイビヒクルのうち少なくとも１つにより表示される請求項１７に記載のディスプレイライブラリ。
【請求項１９】
哺乳動物ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能であり、かつ、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを利用して、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５由来のアミノ酸のストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸のストレッチを含むポリペプチドを含む、組み換えまたは合成タンパク質。
【請求項２０】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチが４位から５０位である請求項１９に記載の組み換えまたは合成タンパク質。
【請求項２１】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチが１位から９０位である請求項１９に記載の組み換えまたは合成タンパク質。
【請求項２２】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸の前記ストレッチが４位から５０位である請求項１９に記載の組み換えまたは合成タンパク質。
【請求項２３】
配列番号１５由来のアミノ酸の前記ストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸の前記ストレッチが１位から９０位である請求項１９に記載の組み換えまたは合成タンパク質。
【請求項２４】
活性成分として請求項１９に記載の組み換えまたは合成タンパク質、および医薬上許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１４またはその一部に少なくとも８０％相同性であるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む組み換えタンパク質。
【請求項２６】
ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを特異的に認識する免疫グロブリンを含む抗体。
【請求項２７】
抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体及び抗体の免疫反応性誘導体からなる群から選択される請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
活性成分として、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬物を含む医薬組成物であって、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である医薬組成物。
【請求項２９】
前記薬物は、前記活性をアップレギュレートさせるように作用する請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なセンスポリヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記薬物は、前記活性をダウンレギュレートするように作用する請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記薬物はイムノアドヘシンであり、前記イムノアドヘシンは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、イムノグロブリンに融合する第１のポリペプチドを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記イムノグロブリンは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群から選択される請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記薬物は活性を輸送する融合タンパク質であり、前記活性を輸送する融合タンパク質は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、薬物、毒素または酵素に融合するポリペプチドを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記毒素は百日咳毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、炭疽菌毒素およびジフテリア毒素からなる群から選択される請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なアンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位にに少なくとも５０％相同性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部を用いて、生理学的条件下でインビボにてハイブリダイズ可能である少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを表すペプチドまたはペプチドアナログを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
インビボでＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節する方法であって、方法がＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬物を投与する工程を含み、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である方法。
【請求項４１】
前記薬物は、前記活性を変化させるように作用する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なセンスポリヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬物は、前記活性をダウンレギュレートするように作用する請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なアンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位にに少なくとも５０％相同性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部を用いて、生理学的条件下でインビボにてハイブリダイズ可能である少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを表すペプチドまたはペプチドアナログを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１４の５５〜１９０位に少なくとも８０％相同性であるポリヌクレオチドストレッチを含むゲノム的、相補的または複合ポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４９】
前記位が配列番号１４の５５〜１９２位に記載された請求項２５に記載の組み換えタンパク質。
【請求項５０】
ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を処置または予防するための方法であって、方法がＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬物を治療有効量で投与することを含む方法であって、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である方法。
【請求項５１】
疾患、症状または症候群は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ベル麻痺、脊髄筋萎縮症、脳外傷、脳外科手術、卒中、脳傷害、虚血、脳および頸部悪性腫瘍、中枢神経系栄養失調、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症、神経性聾、メニエール病、神経障害、辺縁系神経障害、遺伝性神経障害、筋ジストロフィー、哺乳動物外パジェット病、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸管カルシノーマ、子宮内膜アデノカルシノーマ、膵臓Ｄ−細胞ソマトスタチノーマおよびゾリンジャー−エリソン症候群からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記薬物は、前記活性をアップレギュレートさせるように作用する請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なセンスポリヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬物は、前記活性をダウンレギュレートするように作用する請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なアンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを表すペプチドまたはペプチドアナログを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬物は、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を結合可能であるポリペプチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリペプチドは、ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインはＩｇＢ４である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記可溶なポリペプチドは抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体または抗体の免疫反応性誘導体からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断するための方法であって、前記内因性タンパク質はウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、方法は：
（ａ）被検体よりサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルを、内因性タンパク質と結合可能なポリペプチドと共に、複合体を形成するのに十分な時間にわたってインキュベートする工程；
（ｃ）前記複合体のレベルをモニタリングして、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断する工程、
を含む方法。
【請求項６４】
疾患、症状または症候群は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ベル麻痺、脊髄筋萎縮症、脳外傷、脳外科手術、卒中、脳傷害、虚血、脳および頸部悪性腫瘍、中枢神経系栄養失調、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症、神経性聾、メニエール病、神経障害、辺縁系神経障害、遺伝性神経障害、筋ジストロフィー、哺乳動物外パジェット病、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸管カルシノーマ、子宮内膜アデノカルシノーマ、膵臓Ｄ−細胞ソマトスタチノーマおよびゾリンジャー−エリソン症候群からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリペプチドは、ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインはＩｇＢ４である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体または抗体の免疫反応性誘導体からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記複合体の前記レベルのモニタリングが、前記複合体を標識された第２の抗体にさらすことによって実施される請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断するための方法であって、前記内因性タンパク質はウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、前記方法は：
（ａ）被検体よりサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルを、少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの少なくとも１つと共にインキュベートする工程であって、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログが、内因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド鎖の一部にハイブリダイズ可能であり、それによってＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断する工程、
を含む方法。
【請求項７１】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、前記ポリヌクレオチド鎖の前記一部に対向する配向で特異的にハイブリダイズ可能な１対のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを含み、その結果、核酸増幅反応においてそれらの少なくとも一部を直接的に指数関数的増幅する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
疾患、症状または症候群は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ベル麻痺、脊髄筋萎縮症、脳外傷、脳外科手術、卒中、脳傷害、虚血、脳および頸部悪性腫瘍、中枢神経系栄養失調、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症、神経性聾、メニエール病、神経障害、辺縁系神経障害、遺伝性神経障害、筋ジストロフィー、哺乳動物外パジェット病、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸管カルシノーマ、子宮内膜アデノカルシノーマ、膵臓Ｄ−細胞ソマトスタチノーマおよびゾリンジャー−エリソン症候群からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの分布を測定する方法であって、方法は、生物学的サンプルを標識ポリペプチドと共にインキュベートする工程を含み、前記ポリペプチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、これによって前記生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの前記分布を測定する方法。
【請求項７４】
１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝性疾患がＮＲＧ４と関連するかどうかを試験する方法であって、方法は、遺伝性疾患を引き起こすアレルを少なくとも１つ含む個体と前記アレルを含まない個体との間における配列の相違の有無を決定する工程を含み、ここで、前記配列に相違があれば、１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝性疾患がＮＲＧ４と関連することが示される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、本明細書中でニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）と呼ばれる新規なＥｒｂＢ−４リガンド、前記ＮＲＧ−４をコードするポリヌクレオチド配列、および前記ポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ、前記ＮＲＧ−４由来の短鎖ペプチドを表示するディスプレイライブラリ、前記ＮＲＧ−４を認識する抗体、前記ＮＲＧ−４由来のペプチドまたはペプチドアナログ、ならびに、前記ペプチドもしくはペプチドアナログ、前記オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ、および／またはＥｒｂＢ−４レセプター活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするための前記ポリヌクレオチド配列、および種々の疾患、症状および症候群を処置または予防するための医薬組成物および方法に関する。
【０００２】
細胞−細胞シグナリングは、多細胞生物に必須の性質であり、進化の多様化の展開および非常に多様にわたる細胞型のホメオスタシスの調整において重要な役割を果たしている。多数のチロシンキナーゼ成長因子レセプターが、このプロセスにおいて主要な役割を果たしている。ＥｒｂＢ／ＨＥＲタンパク質としても知られるタイプ１チロシンキナーゼレセプターは、成長因子レセプターの良く特徴付けされたファミリーの１つを含み、なかでも、上皮成長因子レセプター（ＥｒｂＢ−１）はプロトタイプである［Ｂｕｒｄｅｎ  ＆  Ｙａｒｄｅｎ，  １９９７に概説］。ＥｒｂＢファミリーは、リガンド刺激の際に二量体化し、それらのシグナルを内因性細胞質チロシンキナーゼにより触媒される引き続く自己リン酸化により誘発し、そして下流のシグナリングカスケードをリクルートする４つの公知のレセプターから構成される。
【０００３】
ＥｒｂＢレセプターは、多数のリガンドにより活性化される。活性化リガンドに依存して、ほとんどのホモ二量体化およびヘテロ二量体化ＥｒｂＢの組み合わせは、リガンド結合の際に安定化されて（Ｔｚａｈａｒら、１９９６）、複雑で多様な下流シグナリングネットワークをこれらの４つのレセプターから引き起こすことができる。しかしながら、異なるＥｒｂＢレセプターに対する二量体化のパートナーの選択は任意のものではない。
【０００４】
異なるＥｒｂＢレセプターの空間的および時間的発現は、いつもインビボでオーバーラップするわけではないので、可能なレセプターの組み合わせのスペクトルは狭くなり、その結果、発現されたリガンドは、所定の細胞型について活性化し得る（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ら，  １９９７；  Ｇａｓｓｍａｎｎ  ら，  １９９５；  Ｌｅｅ  ら，  １９９５；  Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９７；  Ｒｉｅｔｈｍａｃｈｅｒ  ら，  １９９７）。
【０００５】
さらに、異なるＥｒｂＢレセプター複合体によるシグナルの階層的な選択は、リガンド依存的な様式で起こる。なかでも、ＥｒｂＢ−２を含む組み合わせは、しばしば最も強力であり、多数のリガンドにより延長されたシグナリングを発揮するが、これはおそらくＥｒｂＢ−２が媒介するリガンド解離が減速するためである（Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ  ら，  １９９６；  Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９６；  Ｗａｎｇ  ら，  １９９８）。
【０００６】
ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−４がホモ二量体形成し得るのとは対照的に、ＥｒｂＢ−２については公知の直接的リガンドは存在せず、またＥｒｂＢ−３については、内因性のチロシンキナーゼ活性を有しない（Ｇｕｙ  ら，  １９９４）ので、いずれもホモ二量体を形成しない、すなわち不活性である。
【０００７】
ヘテロ二量体ＥｒｂＢ複合体は、インビボで間違いなく重要である。例えば、ＮＲＧ−１またはレセプターＥｒｂＢ−２もしくはＥｒｂＢ−４をコードする遺伝子が欠損したマウスは全て、胚性心臓において柱形成の同一の欠陥を有し、このことは柱形成がＮＲＧ−１によるＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４ヘテロ二量体の活性化を必要とすることと一致する（Ｇａｓｓｍａｎｎ  ら，  １９９５；  Ｌｅｅ  ら，  １９９５；  Ｍｅｙｅｒ  ＆  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，  １９９５）。
【０００８】
生化学的レベルでは、既知のＥｒｂＢリガンドは、いくつかのカテゴリーに分けられる（Ｒｉｅｓｅ  ら，  １９９６ｂ）。１つのカテゴリーであるＥｒｂＢ−１リガンドには、ＥＧＦ、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、エピレギュリン、アムフィレギュリン、ベータセルリンおよびへパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  ら，  １９９１；  Ｍａｒｑｕａｒｄｔ  ら，  １９８４；  Ｓｈｉｎｇ  ら，  １９９３；  Ｓｈｏｙａｂ  ら，  １９８９；  Ｔｏｙｏｄａ  ら；  １９９５）。程度は異なるが、これらのＥｒｂＢ−１結合リガンドはまた、ＥｒｂＢファミリーの他のレセプターを活性化することもでき、従って所定の細胞型についての明確なシグナリング出力を媒介することができる［Ｔｚａｈａｒ  ＆  Ｙａｒｄｅｎ，  １９９８に概説］。
【０００９】
ＥｒｂＢリガンドの別のカテゴリーは、ニューレギュリン（ＮＲＧ）ファミリーを含む。ＮＲＧ−１［Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、ヘレギュリン、グリア成長因子、およびアセチルコリンレセプター誘導活性とも命名されている］は、それがＥｒｂＢ−２を間接的にリン酸化する能力によって同定された（Ｈｏｌｍｅｓ  ら，  １９９２；  Ｐｅｌｅｓ  ら，  １９９２；  Ｗｅｎ  ら，  １９９２）。引き続いて、レセプター二量体化によりＮＲＧ−１がＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４を直接的に結合してＥｒｂＢ−２を形成することが見出された（Ｐｅｌｅｓ  ら，  １９９３；  Ｐｌｏｗｍａｎ  ら，  １９９３；  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ら，  １９９４；  Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９４）。他の役割を果たすＮＲＧ−１の多様なアイソフォームが存在し、異なるＥｒｂＢ複合体に対する均一な結合親和性を許容する（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９４）。ＮＲＧファミリーは現在、ＮＲＧ−２の２つのアイソフォームをまた含み（Ｂｕｓｆｉｅｌｄ  ら，  １９９７；  Ｃａｒｒａｗａｙ  ら，  １９９７；  Ｃｈａｎｇ  ら，  １９９７；  Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  ら，  １９９７）、そのうちαアイソフォームはｐａｎ−ＥｒｂＢリガンド（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９８）およびＮＲＧ−３、ＥｒｂＢ−４のリガンド（Ｚｈａｎｇ  ら，  １９９７）である。
【００１０】
ＥｒｂＢ−１リガンドをコードする遺伝子の多様性は、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４についてのリガンドをコードする既知の遺伝子（すなわち、ＮＲＧ）が少数であるのとは対照的であり、このことにより、本発明者らは、さらなるＮＲＧ遺伝子が哺乳動物のゲノム内に存在するのではないかと考えるに至った。
【００１１】
ＥｒｂＢ−４レセプターチロシンキナーゼにより作用する、ＮＲＧ−４と命名された第４のニューレギュリンが本明細書中に報告される。その新規構造に加えて、この成長因子は、他のＥＧＦ様分子とは異なる発現型を示す。
【００１２】
発明の要旨
このように、レセプターチロシンキナーゼのＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーは、上皮成長因子（ＥＧＦ）様モチーフを共有する多数の成長因子リガンドに結合する４つのレセプターを含む。一方、ＥｒｂＢ−１は、プロトタイプがＥＧＦである７つの異なるリガンドに結合し、ニューレギュリン（ＮＲＧ）の３つのファミリーは、ＥｒｂＢ−３および／またはＥｒｂＢ−４に結合する。一方、本発明を第４のニューレギュリンの実施に移せば、ＥｒｂＢ−４により作用するＮＲＧ−４が同定され、単離されそして特徴付けされた。予測されたｐｒｏ−ＮＲＧ−４は、独特のＥＧＦ様モチーフと短い細胞質ドメインとを有する膜貫通タンパク質である。全長ＥＧＦ様ドメインを含む合成ペプチドは、ＥｒｂＢ−４を局所的に発現するインターロイキン依存性細胞の成長を誘導するが、他の３つのＥｒｂＢタンパク質またはその組み合わせを発現する細胞の成長は誘導しない。ＥｒｂＢ−４の特異性に合致して、ＮＲＧ−４は、ＥｒｂＢ−４結合ＮＲＧ−１と置き換えることができ、このレセプターの下流のシグナリングを活性化することができる。ＮＲＧ−４ｍＲＮＡの発現は、成人の膵臓で検出され、また、筋肉内で弱く検出された。ＮＲＧ−４の主要な構造および発現型は、この成長因子のＥｒｂＢ−４に対する厳格な特異性と共に、既知のＥｒｂＢリガンドとは異なる生理学的役割を示唆している。この結合の厳格な特異性は、多数のバイオ医薬的な目的において開発され得る。
【００１３】
本発明の１つの局面によれば、哺乳動物ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能であり、かつウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列解析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）のアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５由来のアミノ酸のストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸のストレッチを含むポリペプチドをコードする、ゲノム的、相補的または複合ポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。
【００１４】
別の局面によれば、ポリヌクレオチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドをコードする。
【００１５】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、配列番号２または１５またはその一部に記載のポリペプチド、好ましくは結合活性を保持する部分をコードする。
【００１６】
さらに好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１４の５５〜１９０位に少なくとも８０％相同性であるポリヌクレオチドストレッチを含む。
【００１７】
あるいはまたは加えて、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１または１４とハイブリダイズ可能である。
【００１８】
長い核酸（例えば、長さ２００ｂｐを超える）のハイブリッド形成は、ストリンジェントまたは中程度のハイブリッド形成による本発明の好ましい実施態様に従って実施されるが、ここで、ストリンジェントなハイブリッド形成は、１０％硫酸デキストラン、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含むハイブリッド形成溶液を用いて６５℃にて、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液および６５℃での最終洗浄を用いて行われる；一方、中程度のハイブリッド形成は、１０％硫酸デキストラン、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含むハイブリッド形成溶液を用いて６５℃にて、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液および５０℃での最終洗浄を用いて行われる。
【００１９】
さらにあるいはまたは加えて、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、好ましくは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である。
【００２０】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、配列番号１または１４またはその一部に記載した通りであり、この部分は、好ましくは、結合活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００２１】
本発明の別の局面によれば、本明細書中に記載された単離された核酸を含む核酸構築物が提供される。
【００２２】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面による核酸構築物は、センスまたはアンチセンス配向の単離された核酸の発現を調節するプロモーターをさらに含む。
【００２３】
あるいは、本発明のこの局面による核酸構築物は、ポジティブおよびネガティブの選択マーカーをさらに含み、それ故に、均一な組み換え事象（例えば、ノックインおよびノックアウト手順において用いられる均一な組み換えが挙げられるが、これに限定されない）を選択するのに用いることができる。
【００２４】
結果的に、本発明のさらに別の局面によれば、本明細書記載の核酸構築物を含む宿主細胞または動物が提供される。
【００２５】
本発明のなおさらに別の局面によれば、本明細書記載の単離された核酸と特異的にハイブリダイズ可能な少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２６】
短い核酸のハイブリッド形成（長さ２００ｂｐ未満、例えば、長さ１７〜４０ｂｐ）のハイブリッド形成は、ストリンジェント、中程度または穏やかなハイブリッド形成によって行われるが、ここで、ストリンジェントなハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳のハイブリッド形成溶液により、Ｔｍより１〜１．５℃低いハイブリッド形成温度で、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄溶液でＴｍより１〜１．５℃低い温度で行われる；中程度のハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳のハイブリッド形成溶液により、Ｔｍより２〜２．５℃低いハイブリッド形成温度で、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄溶液でＴｍより１〜１．５℃低い温度で、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液および２２℃での最終洗浄によって行われる；一方、穏やかなハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳のハイブリッド形成溶液により、３７℃のハイブリッド形成温度で、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液および２２℃での最終洗浄によって行われる。
【００２７】
本発明の追加の局面によれば、一対のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１７塩基のそれぞれが対向する配向で本明細書記載の単離された核酸と特異的にハイブリダイズ可能で、それによって核酸増幅反応においてその一部を直接的に指数関数的増幅する、一対のオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２８】
本発明のさらに追加の局面によれば、本明細書記載のプライマー対を用いて得られた核酸増幅産物が提供される。
【００２９】
本発明のさらに追加の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部を用いて、生理学的条件下でインビボにてハイブリダイズ可能である、少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【００３０】
本発明のさらなる局面によれば、本明細書記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３１】
本発明のなおさらなる局面によれば、本明細書記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとそこに融合したリボザイム配列とを含むリボザイムが提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる局面によれば、哺乳動物ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能であり、かつ、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを利用して、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５由来のアミノ酸のストレッチに少なくとも９５％相同性であるアミノ酸のストレッチを含むポリペプチドを含む、組み換えまたは合成タンパク質が提供される。最も好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２または１５の少なくとも一部を含む。加えてまたはあるいは、本発明のこの局面によるポリペプチドは、好ましくは、長い核酸について上述したストリンジェントまたは中程度のハイブリッド形成条件下で、配列番号１もしくは１４またはそれらの一部とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされる。さらに加えてまたはあるいは、本発明のこの局面によるポリペプチドは、好ましくは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４またはそれらの部分に少なくとも５０％相同性であるポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３３】
本発明のなおさらなる局面によれば、活性成分として本明細書記載の組み換えタンパク質、および医薬上許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。
【００３４】
本発明の別の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを含むペプチドまたはペプチドアナログが提供される。好ましくは、本発明のこの局面によるペプチドまたはペプチドアナログは、配列番号２または１５由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを含む。
【００３５】
本発明のさらに別の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸をそれぞれ表示する複数のディスプレイビヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたはバクテリア）を含むディスプレイライブラリが提供される。本発明の局面の好ましい実施態様によれば、ポリペプチド由来の６つの連続するアミノ酸は実質的に全て、複数のディスプレイビヒクルのうち少なくとも１つにより表示されて、高度に代表的なライブラリを提供する。好ましくは、本発明のこの局面によるペプチドまたはペプチドアナログの連続するアミノ酸またはアミノ酸アナログは、配列番号２または１５由来である。
【００３６】
本発明のさらに別の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを特異的に認識する免疫グロブリンを含む抗体が提供される。本発明のこの局面による好ましい実施態様によれば、この抗体は、配列番号２または１５に記載のポリペプチドを特異的に認識する。本発明のこの局面による抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体または抗体の免疫反応性誘導体（例えば、部分）が挙げられる。
【００３７】
本発明のなお別の局面によれば、活性成分として、ＥｒｂＢ−４活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬物であって、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である薬物を活性成分として含む、医薬組成物が提供される。
【００３８】
本発明のなお別の局面によれば、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を処置または予防するための方法であって、前記方法が、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬物であって、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である薬物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００３９】
本発明のなおさらに別の局面によれば、ＥｒｂＢ−４活性に影響を与える内因性タンパク質を調節する方法であって、前記方法が内因性タンパク質活性を調節するための薬物を投与する工程を含み、前記内因性タンパク質がウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムをを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である、方法が提供される。
【００４０】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、活性を変化（例えばアップレギュレート）させるように作用する。
【００４１】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なセンスポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチドを含む。
【００４３】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、活性をダウンレギュレートするように作用する。
【００４４】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物はイムノアドヘシンであり、前記イムノアドヘシンは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である、イムノグロブリンに融合した第１のポリペプチドを含む。
【００４５】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、イムノグロブリンは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＡおよびＩｇＭからなる群から選択される。
【００４６】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４に少なくとも５０％相同性である発現可能なアンチセンスポリヌクレオチドを含む。
【００４７】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位にに少なくとも５０％相同性であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部を用いて、生理学的条件下でインビボにてハイブリダイズ可能である少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００４８】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であるポリペプチド由来の少なくとも６つの連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを表すペプチドまたはペプチドアナログを含む。
【００４９】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、疾患、症状または症候群は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ベル麻痺、脊髄筋萎縮症、脳外傷、脳外科手術、卒中、脳傷害、虚血、脳および頸部悪性腫瘍、中枢神経系栄養失調、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症、神経性聾、メニエール病、神経障害、辺縁系神経障害、遺伝性神経障害、筋ジストロフィー、哺乳動物外パジェット病、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸管カルシノーマ、子宮内膜アデノカルシノーマ、膵臓Ｄ−細胞ソマトスタチノーマおよびゾリンジャー−エリソン症候群からなる群から選択される。
【００５０】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記薬物は、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を結合可能であるポリペプチドを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記ポリペプチドは、ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインである。
【００５２】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記ＥｒｂＢ−４の可溶なリガンド結合ドメインはＩｇＢ４である。
【００５３】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、医薬上許容可能な担体は、移植可能な半透膜デバイスである。
【００５４】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、上記移植可能な半透膜デバイスは、薬物の分泌に用いられる。
【００５５】
本発明のなお別の局面によれば、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断するための方法であって、前記内因性タンパク質はウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、前記方法は、
（ａ）被検体よりサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルを、内因性タンパク質と結合可能なポリペプチドと共に、複合体を形成するのに十分な時間にわたってインキュベートする工程；
（ｃ）前記複合体のレベルをモニタリングして、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断する工程、
を含む、方法が提供される。
【００５６】
本発明のなお別の局面によれば、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断するための方法であって、前記内因性タンパク質はウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性であり、前記方法は、
（ａ）被検体よりサンプルを得る工程；
（ｂ）前記サンプルを、少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの少なくとも１つと共にインキュベートする工程であって、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログが、内因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド鎖の一部にハイブリダイズ可能であり、それによってＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害に関連する疾患、症状または症候群を診断する工程、
を含む、方法が提供される。
【００５７】
記載された好ましい実施態様のなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチド鎖の一部に対向する配向で特異的にハイブリダイズ可能な１対のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを含み、その結果、核酸増幅反応においてそれらの少なくとも一部を直接的に指数関数的増幅することが可能である。
【００５８】
本発明のさらに別の局面によれば、生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの分布を測定する方法であって、前記方法は、前記生物学的サンプルを標識ポリペプチドと共にインキュベートすることにより生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの分布を測定する工程を含み、前記ポリペプチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用い、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４〜５０位に少なくとも５０％相同性である、方法が提供される。
【００５９】
本発明のなお別の局面によれば、１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝性疾患がＮＲＧ４と関連するかどうかを試験する方法であって、前記方法は、遺伝性疾患を引き起こすアレルを少なくとも１つ含む個体とアレルを含まない個体との間における配列の相違の有無を決定する工程を含み、ここで、配列に相違があれば、１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝性疾患がＮＲＧ４と関連することが示される、方法が提供される。
【００６０】
本発明は、例えばＮＲＧ−１βと比べて幾分低い親和性を有するＥｒｂＢ−４と特異的に結合する新規なニューレギュリンを開示することにより、公知のコンフィギュレーションにおける欠点を首尾良く克服する。本発明の種々の局面のさらなる利点、新規な特徴および有用性は、本出願の以下の章に記載される。
【００６１】
図面の簡単な説明
本発明は、本明細書中で以下の添付の図面を参照して例示のためのみに記載される。ここで、図面について特別の参照が詳細になされるが、特に示されるものは例示のためであり、本発明の好ましい実施態様を例を挙げて論述する目的のためであり、また最も有用でありかつ本発明の原理の説明および概念的局面を容易に理解すると考えられるものを提供することを目的としていることを強調する。これに関し、本発明の基礎的理解に必要な以上に本発明の機構的詳細をより詳細に説明することを意図しておらず、図面を考慮した記載によって、当業者が、本発明のいくつかの型がどのように実施され得るかを理解する。
図面において：
図１ａは、マウスｐｒｏ−ＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチドは左側欄に番号付けされ、アミノ酸は右側欄に番号付けされる。６つのシステイン残基を有するＥＧＦ様ドメインは太字で示され、潜在的Ｎ−グリコシル化部位には下線が付されている。網掛け下線は、予測される膜貫通アミノ酸配列を示す。
図１ｂは、マウスｐｒｏ−ＮＲＧ−４のハイドロパシープロファイルを示す。Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）の方法を、１１残基のウインドウと共に用いた。正の値は、疎水性の増加を示す。アミノ酸数をプロファイルの下に示す。ｐｒｏ−ＮＲＧ−４の推定膜貫通ストレッチがマークされる。Ｎ−末端に認識できるシグナルペプチドがないことに留意せよ。
図１ｃは、他の成長因子のＥＧＦ様モチーフを有するＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインのマウスアミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号３〜１３、図中に示すとおりである）。標準的な残基を黒で囲んでいる。ＮＲＧ−４を有する他の個体は灰色で覆っている。モチーフにおける予測される３つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ１−３、Ｃｙｓ２−４およびＣｙｓ５−６）がアラインメントの上記に示されてループＡ、ＢおよびＣと標識されている。使用される略号は以下のとおりである：ＮＲＧ、ニューレギュリン；ＴＧＦα、形質転換成長因子α；ＨＢ−ＥＧＦ、へパリン結合ＥＧＦ様成長因子。特記しない限り、全てのリガンドの源の種はマウスであるが、例外として、ＮＲＧ−１βについてはラットである。アラインメントのために、ＦａｓｔＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）の調査が、以下の調査パラメータを用いて行われた：ワードサイズ２、スコアリングマトリックス−ブロスム（ｂｌｏｓｕｍ）５０、用いられた可変パムファクター（ｐａｍｆａｃｔｏｒ）−ギャップクリエイションペナルティ：１２、ギャップエクステンションペナルティ：２、ジョイニングしきい値：３６，光学しきい値：２４，および光学幅：１６。
図１ｄは、マウスＮＲＧ−４遺伝子の構造を示す。マウスゲノムＮＲＧ−４は、プローブとしてＥＧＦコーディングドメインを用いて、ＰＢＡＣライブラリより単離される。ＥｃｏＲ１消化サブクローンが図示されるが、配列決定された領域には影をつけている。プロトタイプＮＲＧ−１構造において、ゲノム配列中で見出された２つのエクソンを、Ｅｘｏｎ５および６との略号で呼ぶ（Ｅｘ５およびＥｘ６）が、ここで、ＥＧＦドメインにおける不変成分もまた「Ｅｘｏｎ６」と命名する（Ｅｘ６）。ＮＲＧ−１およびＮＲＧ−４の両方についてＥｘ−６のイントロン−エクソン境界は同一であるが、このことは、これらの遺伝子が共通の祖先に由来しているという考えを示唆しており、そしてさらに、ＮＲＧ−４がニューレギュリン遺伝子ファミリーの新規な変異体であることを示唆している。
図１ｅは、ヒトＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１４）および推定アミノ酸配列（配列番号１５）、ならびにそれらのマウスＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）との比較を示す。Ｔ４７Ｄ細胞由来のヒトＮＲＧ−４は、２回の独立したＲＴ−ＰＣＲ反応により配列決定され、マウス配列と比較される。予測されるＥＧＦコーディングドメインおよび膜貫通ドメインはそれぞれ太字でマークされており、下線が付されている。影をつけた囲みは、タンパク質配列の同一性を示す。予測される翻訳産物は、ＥＧＦ様コーディングドメイン内で７８％の全体同一性および９１％の配列同一性を共有する。
図２は、ヒト組織におけるＮＲＧ−４発現のノーザンブロット解析を示す。示されたヒト組織由来のポリ（Ａ）含有ＲＮＡ（１レーンあたり２μｇ）を、カリフォルニア州サンディエゴにあるクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入したニトロセルロースフィルタを用いて分析した。ブロットを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントおよびランダム六量体をプライマーとして用いて放射標識した全長マウスＮＲＧ−４ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。オートラジオグラフィー後、フィルタを放射線から外し、膵臓および筋肉マーカー、α−アミラーゼ−２およびβ−アクチンでそれぞれ順番に再プローブした。マーカー分子の分子量は、キロベース（ｋｂ）で示される。β−アクチンプローブはまた、心臓および骨格筋に存在するより分子量の大きいアイソフォームとハイブリダイズされることに留意されたい。
図３ａは、３２Ｄ細胞のＥｒｂＢ発現誘導体におけるＮＲＧ−４の増殖効果を示す。図示された３２Ｄ細胞の誘導体株は、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル］テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより細胞増殖が試験された。細胞を、血漿因子およびＩＬ−３から取り出し、次いで、ＮＲＧ−４（黒菱形）、ＥＧＦ（黒四角）、ＮＲＧ−１β（白四角）、またはＬ９６（最大用量：５０μｇ／ｍｌ）、抗ＥｒｂＢ−２モノクローナル抗体（白菱形）の連続希釈を含む培地に、濃度５×１０５細胞／ｍｌで蒔いた。ＭＴＴアッセイを２４時間後に実施した。結果は、コントロールの未処理細胞に対するパーセント誘導で示し、４回の測定の平均±Ｓ．Ｄ．である。各実験を、同じ知見に対し少なくとも２回行った。ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３のいずれかを単独で発現する細胞についてはＥＧＦ様リガンドに対する応答は観察されなかったが、これらの細胞の誘導体はＩＬ−３に対する応答を保持したことに留意されたい（データは示さず）。
図３ｂは、３２Ｄ細胞のＥｒｂＢ発現誘導体におけるＮＲＧ−４の生存効果を示す。３２Ｄ細胞の示された誘導体は、ＩＬ−３の非存在下にて、種々の時間間隔にわたってインキュベートされた。以下のリガンドを、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌの濃度にて、細胞と共にインキュベートした：ＮＲＧ−４（黒菱形）、ＥＧＦ（黒四角）、ＮＲＧ−１β（白四角）、または５０μｇ／ｍｌ  ｍＡｂＬ９６（白菱形）。コントロールについては、細胞を、ＩＬ−３産生細胞（白三角）で条件付けされた培地でまたはファクターなし（白丸）でインキュベートした。細胞増殖の程度は、比色定量ＭＴＴアッセイを用いて毎日測定した。示されるデータは、４回の測定の平均±Ｓ．Ｄ．である。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２（Ｄ１２細胞）の共発現は、ＩＬ−３の非存在下での細胞の生存を可能にしたことに留意されたい。この実験を、同じ結果について２回繰り返した。
図４ａは、ＮＲＧ−４の、組み換え可溶性ＥｒｂＢタンパク質に対する共有結合による架橋を示す。ＩｇＧ融合体の形態の、ＥｒｂＢタンパク質の４つの可溶な形態（ＩｇＢ１〜４で示す）を、示される放射標識した成長因子にて個別にインキュベートした。示されるように（下部パネル）、過剰の（１００倍）未標識ＮＲＧ−４を、標識リガンドと共に共インキュベートした。２時間後、２２℃にて、共有結合架橋剤ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）を添加し（１ｍＭ）、そして４５分後リガンド−レセプター複合体をアガロース不動化タンパク質Ａビーズで免疫沈降させた。矢印は、単量体（Ｍ）および二量体（Ｄ）レセプター複合体の位置を記す。
図４ｂは、ＮＲＧ−４の、細胞表面で発現したＥｒｂＢタンパク質に対する共有結合による架橋を示す。ＣＨＯ細胞を、示されるＥｒｂＢタンパク質またはそれらの組み合わせの発現を指向するベクターでトランスフェクトした。２日後、細胞の単層を、１２５Ｉ−ＮＲＧ−１βまたは１２５Ｉ−ＮＲＧ−４（ＥＧＦ様ドメイン、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌにて）のいずれかでインキュベートした。２時間後、４℃にて、共有結合架橋剤ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）を添加し（最終濃度１ｍＭ）、インキュベーションの追加の４５分後に細胞抽出物を調製した。次いで、示されるＥｒｂＢタンパク質をマウスモノクローナル抗体で免疫沈降させ、複合体を電気泳動およびオートラジオグラフィーにて分割した。矢印は、単量体（Ｍ）および二量体（Ｄ）レセプター複合体の位置を記す。
図４ｃは、ＮＲＧ−４のＥｒｂＢ−４発現細胞への結合を示す。放射標識したＮＲＧ−１βの解離の分析を、ＥｒｂＢ−４を発現するＣＨＯ細胞を用いて行った。細胞の単層（２×１０５細胞）を、２時間にわたって４℃にて、標識されたＮＲＧ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて、濃度が増加する未標識ＮＲＧ−４（黒三角）またはＮＲＧ−１β（黒四角）の存在下にてインキュベートした。各データポイントは、２つの測定の平均および範囲（棒）を示す。
図５は、ＮＲＧ−４によるチロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化を示す。ＥｒｂＢ−４を発現する３２Ｄ細胞の誘導体は、単独（Ｄ４細胞）でまたはＥｒｂＢ−２と組み合わせて（Ｄ２４細胞）のいずれかで、５分間、３７℃にて、ＮＲＧ−４またはＮＲＧ−１β（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかと共にインキュベートされた。次いで、全細胞抽出物を調製し、ゲル電気泳動にて分割し、ニトロセルロースフィルタに移した。フィルタの上部を、抗体からホスホチロシン（Ｐ−Ｔｙｒ、１５０−２００ｋＤａ領域が示される）に対して、またはＭＡＰＫの活性化二重リン酸化形態に指向する抗体（Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２、４０〜５０ｋＤａ領域が示される）に対して免疫ブロッティングした。抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した第２の試薬でインキュベートして、引き続いての化学発光による測定を可能にした。
図６は、ＮＲＧ−４の再折り畳みＥＧＦ様ドメインに対して産生した抗体がリガンド機能を中和することを示す。合成再折り畳みＮＲＧ−４ペプチドを、標準のアジュバントプロトコルにより２匹のウサギに注射した。注射を４回繰り返した後、抗血清を集め、それが放射標識されたＮＲＧ−４に結合する特異性を試験した。非特異性リガンドコントロールとして、放射標識されたＥＧＦもまた結合について試験した。熱いリガンドを、２匹のウサギから産生した血清と共に別々にインキュベートし、同時にコントロールとして、第１のウサギからの免疫化前血清（３９１９番）、非関連エピトープに対して産生した血清（抗Ｅｒｋ−１）およびポジティブコントロールとして作用し１２５Ｉ−ＥＧＦ活性を示すＩｇＢ１と共にインキュベートした。これらの結果は、２つの抗血清が非常に強力であり、ＮＲＧ−４  ＥＧＦ様ドメインの特異的ブロッカーであることを示す。それゆえに、これらの抗体は、ＥｒｂＢレセプターに結合しているＮＲＧ−４リガンドと競合する。
図７は、ヒトＮＲＧ４遺伝子のエクソン／イントロン構造の概略図を示す（コンティグ１番および３番については、配列番号１９および２０を参照のこと）。
【００６２】
好ましい実施態様の説明
本発明は、（ｉ）本明細書中でＮＲＧ−４と呼ばれる新規なニューレギュリン；（ｉｉ）ＮＲＧ−４をコードするポリヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチド配列から誘導されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログ；（ｉｖ）前記ＮＲＧ−４から誘導された短鎖ペプチドを表示するディスプレイライブラリ；（ｖ）前記ＮＲＧ−４を認識する抗体；（ｖｉ）前記ＮＲＧ−４から誘導されたペプチドまたはペプチドアナログ、；ならびに（ｖｉｉ）医薬組成物；ならびに（ｖｉｉｉ）ＥｒｂＢ−４活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするための、および種々の疾患、症状および症候群を処置および予防するための、前記ペプチドまたはペプチドアナログ、前記オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログおよび／または前記ポリヌクレオチド配列の使用方法、に関するものである。
【００６３】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照すればよりよく理解できるだろう。
【００６４】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細にわたって説明する前に、本発明は、その用途が、以下の説明に記載されたまたは続く実施例の章において例示された構造の詳細および成分の改変に限定されないことを理解するべきである。本発明は、他の実施態様が可能であるか、あるいは種々の方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いる表現法または用語は、説明を目的としており、限定的であると考えるべきではないことを理解するべきである。
【００６５】
本発明を考えると、さらなる未知のＥｒｂＢチロシンキナーゼレセプターリガンドが存在するかもしれないと仮定された。ＥＳＴデータベースを、多くのＥｒｂＢ−リガンドアイソフォーム中で維持されるモチーフＣＸ７ＣＸＮＧＧＸＣＸ１３ＣＸＣＸ３ＹＸＧＸＲＣ（配列番号１８）でスクリーニングすると、以下のことが明らかになった。（ｉ）ＥＧＦ様ドメインをコードするマウス肝臓ｃＤＮＡライブラリ起源のＥＳＴクローン（受託番号ＡＡ２３８０７７）は、ＮＲＧ−１βアイソフォームと３２％の同一性を共有する（Ｗｅｎ  ら，  １９９２）、（ｉｉ）ＥＧＦ様ドメインを有するヒト由来ＥＳＴクローン（受託番号ＡＩ７４３１１８）は、挿入により破壊した。
【００６６】
本発明を、ニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）と呼ばれるＥＧＦ／ＮＲＧファミリーの未知のリガンドをコードすることにより特徴付けられたこれらのクローンの実施に移す。ＮＲＧ４は、１５ｑ２５−２６座にマッピングされる。ニューレギュリン様ＥＧＦドメインを有するＮＲＧ−４は別として（図１ｃ）、これは公知のＮＲＧ（ＮＲＧ−１〜３）に対して非常にわずかな他の配列相同性を共有し、特に、膜貫通ドメインに近接して、他の３つのＮＲＧが高度な主要配列の相同性を示す領域がある。しかし、ＮＲＧ−４の仮定される前駆体形態は、他の哺乳動物ＥｒｂＢリガンドといくつかの構造的特徴を共有し［それらはＭａｓｓａｇｕｅ  ＆  Ｐａｎｄｉｅｌｌａ，  １９９３に概説される］、これには膜貫通トポロジー、ＥＧＦ様ドメインの膜に並列する位置およびセリンに富む領域のＣ末端からＥＧＦ様ドメインに向かって位置する仮定的なタンパク質分解切断部位が挙げられる。この領域は、ＮＲＧ−４の仮定されるエクトドメインに位置するＮ−グリコシル化の２つの潜在的部位に加えて、Ｏ−グリコシル化の部位として作用する。他のＮＲＧと同様に、しかしほとんどのＥｒｂＢ−１特異的リガンドとは異なり、ＮＲＧ−４は、Ｎ−末端に位置した疎水性シグナルペプチドを有しない。しかしながら、特徴的な配列がないことは、ＮＲＧ−４が分泌された成長因子として作用する可能性を排除するものではない。なぜなら、他のシグナルペプチドを有しない成長因子は、代替の分泌機構によりまたは細胞溶解の際に産生細胞から分泌または遊離することができるからである。ＮＲＧ−４は、通常シグナルペプチドを置換する（例えば、ＮＲＧ−１において）アミノ酸の非極性ストレッチもまた有しないので、かなり独特なケースを表す。事実として、ＮＲＧ−４の仮定されたエクトドメインは、ＮＲＧ／ＥＧＦファミリーメンバーの中で最も短い。加えて、免疫グロブリン様ドメイン、システインに富む領域またはムチン様ドメインのような種々の構造モチーフを含む他のＮＲＧとは異なり、ＮＲＧ−４は、ＥＧＦ様ドメイン以外の認識できる構造モチーフを含まない。
【００６７】
ＮＲＧ−４の種間保全は、ヒトおよびマウスのＮＲＧ−４アミノ酸配列の間で比較することにより同定された。ヒトおよびマウスの配列は、ＥＧＦドメイン中で７８％の全体同一性および９１％の配列同一性を共有し、このことは、ＮＲＧ−４は哺乳類間で発現され、特にＥＧＦドメイン中における高度な種間相同性がこの遺伝子にとって重要な生理学的役割を果たすことを示す。
【００６８】
プロトタイプのＮＲＧ−１遺伝子は、多数のアイソフォームをコードする（Ｂａｒｕｃｈ  ＆  Ｙａｒｄｅｎ，  １９９４）。しかしながら、ＮＲＧ−１のＥｒｂＢ結合部位は、ＥＧＦをコードするドメインにより規定され、そのうち変異体が２つだけ存在する（αおよびβ）。この２つのＮＲＧ−１  ＥＧＦドメインによりコードされる変異体は、エクソン６によりコードされる不変のＮＨ３成分と、引き続く代替のエクソンスプライシングにより産生する２つの代替のＣＯＯＨ末端とを共有する。分析によれば、マウスＮＲＧ−４ゲノムの位置は、エクソン６を架橋する同じゲノムエクソン−イントロン構造を共有する。この知見は、ＮＲＧ−４が祖先的にＮＲＧ−１に関連することを支持するだけでなく、ＮＲＧ−４座が、おそらくＥＧＦ様ドメインの２つの変異体を含む多くのアイソフォームをコードし得る疑いを強める。事実として、ノーザンブロット分析により、ＮＲＧ−４へのハイブリッド形成の明確なバンドの存在が明らかになったが、このことは、異なるサイズのアイソフォームが存在するであろうことを示す。多くのまたは全てのこれらのアイソフォームがＥＧＦ−ドメインを保持すること、およびこの新規なリガンドと同一のＥｒｂＢ−結合部位が導き出されることが、本研究で報告される。
【００６９】
ＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインがレセプター−結合部位として機能することは、細胞株を発現するよう操作された全ての４つのＥｒｂＢタンパク質  （例えば、図３〜５）についてのインビトロでの研究により示された。ＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインは制限された結合特異性を示し、ＥｒｂＢ−４に直接的に結合するが、ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３には結合しない。  ＥｒｂＢ−４への類似する選択的結合もまたＮＲＧ−３について報告されており（Ｚｈａｎｇ  ら，  １９９７）、このことは、発育の間および成人においては、制限されたＥｒｂＢ特異性を有するリガンドが重要な役割を果たし得ることを示し得る。ＮＲＧ−３はＮＲＧ−４  に最も近いＥＧＦ様リガンドである（ＥＧＦ様ドメインにおいて４２％配列同一性）ことに注目するのもまた興味深い。ＥｒｂＢ−３に結合する成長因子と比較してより広いレパートリーのＥｒｂＢ−４−特異的リガンドの出現もまた関連する。ＮＲＧ−１、ＮＲＧ−２およびＮＲＧ−３、ＥｒｂＢ−４はまた、βセルリン（Ｒｉｅｓｅ  ら，  １９９６ａ）、エピレギュリン（Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８）およびＨＢ−ＥＧＦ（Ｅｌｅｎｉｕｓ  ら，  １９９７）に結合する。さらに、高いリガンド濃度において、または共発現されたＥｒｂＢ−２の存在下において、ＥｒｂＢ−４はＥＧＦおよびＴＧＦαにも結合する（Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８；  Ｗａｎｇ  ら，  １９９８）。ＥｒｂＢ−４のより広範な特異性は、遺伝子変異実験においてもまた反映された。より多くのＮＲＧ−１変異体が、ＥｒｂＢ−４と比較してＥｒｂＢ−３のより大きな親和性喪失を示した（Ｊｏｎｅｓ  ら，  １９９８）。
【００７０】
ＥｒｂＢ−４に対する特異性に加えて、  ＮＲＧ−３およびＮＲＧ−４は、ＮＲＧ−１と比較して、このレセプターに対する相対的に低い親和性を共有する  ［図４および（Ｚｈａｎｇ  ら，  １９９７）］。エピレギュリン（Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８）およびＮＲＧ−１のαアイソフォーム（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９４）のようないくつかの他のリガンドもまた、ＥｒｂＢ−４に対して相対的に低い親和性を示す。これらの観察は、これらの低親和性リガンドについて高親和性レセプターとして作用する追加の未発見のＥｒｂＢタンパク質の存在を示唆し得る。あるいは、低親和性リガンドは、通常の、細胞外スペースからの迅速なエンドサイトーシスのクリアランスを回避し得るので、高親和性成長因子と比べて異なる生物学的機能を有し得る（Ｒｅｄｄｙ  ら，  １９９６；  Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８）。あるいは、ＥｒｂＢ−４のリガンドを有しない共レセプターすなわちＥｒｂＢ−２  （Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ  ら，  １９９６）は、ＮＲＧ−３およびＮＲＧ−４のような低親和性リガンドの場合により効果的であり得、それゆえに、ＥｒｂＢシグナリングの良好なチューニングのための機構を提供する。ＥｒｂＢリガンドのＥｒｂＢ−２との相互作用は、ＥｒｂＢ−２の乱雑な結合部位への直接結合に関与するようである（Ｋｌａｐｐｅｒ  ら，  １９９７；  Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９７）。このモデルによれば、全てのＥＧＦ様成長因子は、それらのＥｒｂＢレセプターの特異的対への結合特異性が異なる２価のリガンドである（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９７）。この仮定は、ホモおよびヘテロ二量体ＥｒｂＢタンパク質を安定化するそれらの異なる能力という点からのＥｒｂＢリガンドの多様性を説明することができる。ＮＲＧ−４に適用した場合、この２価モデルは、ＥｒｂＢ−４に対するヘテロ二量体パートナーをリクルートする能力において、ＮＲＧ−３を含む他のＥｒｂＢ−４−特異的リガンドとは異なり得ることを予測する。
【００７１】
このモデルと一致して、ＥｒｂＢ−４と共に共発現された場合、ＮＲＧ−４はＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２の両方をヘテロ二量体にリクルートし得ることが示された（図４ｂ）。これらのＮＲＧ−４誘導ヘテロ二量体複合体は、増殖アッセイにおいて示されるように、生理学的重要性を有し得る：骨髄細胞の成長を弱く刺激してＥｒｂＢ−４を単独で発現するように操作されたＮＲＧ−４（Ｄ４細胞）。対照的に、この応答は、ＥｒｂＢ−２の共発現の際に、内部ＮＲＧ−１コントロールと比較して著しく増強された（Ｄ２４細胞，図３ａ−ｂ）。この知見は、いくつかの生理学的条件下では、ＥｒｂＢ−４単独の発現はＮＲＧ−４への生物学的応答を惹起するのに十分ではなく、そのシグナルを形質導入するためにＥｒｂＢ−２のような共レセプターを必要とし得ることを示し得る。このシナリオは、ＮＲＧ−１の場合に優位である：インビトロ実験により、共発現されたＥｒｂＢ−２  によるＥｒｂＢ−４−媒介分裂促進効果の明らかな増強が示され（Ｗａｎｇ  ら，  １９９８）、マウスにおける遺伝子標的は、ＥｒｂＢ−２がＮＲＧ−１およびＥｒｂＢ−４により媒介される心臓の柱形成に必須であることを示した（Ｌｅｅ  ら，  １９９５）。
【００７２】
乳、尿および唾液のような体液中で高濃度で見出されるＥＧＦの例外として  （Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＆  Ｃｏｈｅｎ，  １９７９；  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ら，  １９７９）、全てのＥＧＦ／ＮＲＧファミリーメンバーは、パラクリンまたはオートクリンループによってのみ隣接する細胞に影響を及ぼすショートレンジリガンドとして作用すると考えられる［Ｂｅｎ−Ｂａｒｕｃｈ  ら，  １９９８に概説］。ショートレンジリガンド−レセプター相互作用と一致して、ＮＲＧ−３は、その唯一知られたレセプターであるＥｒｂＢ−４と共に、主に中枢神経系で発現する（Ｐｌｏｗｍａｎ  ら，  １９９３；  Ｚｈａｎｇ  ら，  １９９７）。しかしながら、ＥｒｂＢ−４はまた、筋肉、心臓、膵臓、唾液腺および肺においても発現する（Ｇａｓｓｍａｎｎ  ら，  １９９５；  Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９７；  Ｐｌｏｗｍａｎ  ら，  １９９３）。ノーザンブロット分析（図２）は、成人において、これらのＥｒｂＢ−４−ポジティブ組織のうちの２つである膵臓および筋肉が、ＮＲＧ−４の３つの分子量のｍＲＮＡ種を発現することを示した。同様に、ＮＲＧ−１およびＮＲＧ−２の複数のｍＲＮＡ種が報告されている（Ｃｈａｎ  ら，  １９９５；  Ｗｅｎ  ら，  １９９２）。これに関し、ＮＲＧ−１およびＮＲＧ−２の多くのアイソフォーム（Ｂｕｓｆｉｅｌｄ  ら，  １９９７；  Ｃａｒｒａｗａｙ  ら，  １９９７；Ｃｈａｎｇ  ら，  １９９７；  Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ  ら，  １９９３；  Ｗｅｎ  ら，  １９９４）が、複数の代替でスプライシングされるＮＲＧのｍＲＮＡに由来することが知られている。
【００７３】
従って、本発明の１つの局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相同性の（類似の＋同一の酸）哺乳類ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能なポリペプチドをコードするゲノム的、相補的または複合ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸が提供される。好ましくは、本発明による哺乳類ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能な前記ポリペプチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号１５（例えば、ＥＧＦ様ドメインを形成するアミノ酸４−５０）に由来するアミノ酸のストレッチに少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相同性のアミノ酸のストレッチを含む。
【００７４】
本明細書および後述の特許請求の範囲の章中で使用される句「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたメッセンジャーＲＮＡの逆転写から最初に生じる配列を含む。このような配列は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、インビボまたはインビトロで引き続いて増幅され得る。
【００７５】
本明細書および後述の特許請求の範囲の章中で使用される句「ゲノム的ポリヌクレオチド配列」は、染色体に最初に由来し、かつ染色体の連続部分を反映する配列を含む。
【００７６】
本明細書および後述の特許請求の範囲の章中で使用される句「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補性および少なくとも部分的にゲノム性の配列を含む。複合性の配列は、ポリペプチドをコードするのに必要とされるいくつかのエクソン配列、ならびにそれらの間に挟まれたいくつかのイントロン配列を含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子、および典型的には保持されたスプライシングシグナル配列を含む任意の源であり得る。このようなイントロン配列は、シス作用性発現調節性要素をさらに含み得る。
【００７７】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、る配列番号２または１５に記載のポリペプチドまたはそれらの一部をコードし、好ましくはそれらの一部、例えば、ＥｒｂＢ−４レセプターへの結合を保持するアミノ酸４−５０またはそれら由来の少なくとも２０のアミノ酸の一部である。
【００７８】
本発明のこの局面によるポリヌクレオチドの好ましい実施態様は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１４の５５−１９０位に少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のポリヌクレオチドストレッチを含む。
【００７９】
あるいはまたは加えて、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１または１４とハイブリダイズ可能である。
【００８０】
好ましい本発明の実施態様による長い核酸（例えば、長さ２００ｂｐを超える）のハイブリッド形成は、ストリンジェントまたは中程度のハイブリッド形成により行われ、ストリンジェントなハイブリッド形成は、１０％硫酸デキストラン、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含むハイブリッド形成溶液により、６５℃にて、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの最終洗浄溶液を用いて、６５℃での最終洗浄により行われる；一方、中程度のハイブリッド形成は、１０％硫酸デキストラン、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含むハイブリッド形成溶液により、６５℃にて、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液を用いて、５０℃での最終洗浄により行われる。
【００８１】
さらにあるいはまたは加えて、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、好ましくは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号ｌまたは１４に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％  少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。
【００８２】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面によるポリヌクレオチドは、配列番号ｌまたは１４またはそれらの一部に記載され、前記部分は、好ましくは、ＥｒｂＢ−４への結合活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００８３】
従って、本発明のこの局面は、（ｉ）配列番号ｌまたは１４記載のポリヌクレオチド；（ｉｉ）それらのフラグメント；（ｉｉｉ）それらとハイブリダイズ可能な配列；（ｉｖ）それらに相同性の配列；（ｖ）異なるコドン使用により類似のポリペプチドをコードする配列；（ｖｉ）１以上のヌクレオチドの欠失，挿入または置換のような変異により特徴付けられる、天然に存在するかまたはランダムまたはターゲティングされた様式のいずれかで人工で導入された改変された配列を包含する。
【００８４】
本発明の別の局面によれば、本明細書記載の単離された核酸を含む核酸構築物が提供される。
【００８５】
好ましい実施態様によれば、本発明のこの局面による核酸構築物は、単離された核酸のセンスまたはアンチセンス配向での発現を調節するためのプロモーターをさらに含む。このようなプロモーターは、それらの下流に存在する配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合するように作用するので、転写に必要なシス作用配列要素として知られる。このような下流配列は、典型的には翻訳可能な配列を含まないが内因性の配列と共に二重らせん化または三重らせん化することができるリボザイム機構またはアンチセンスＲＮＡによって翻訳可能なセンスＲＮＡの転写をもたらす２つの可能な配向のうちいずれか１つ、ｍＲＮＡまたは染色体性ＤＮＡのいずれかであり、遺伝子発現を妨害し得る。その全てを本明細書中以下にさらに詳述する。
【００８６】
本明細書記載の単離された核酸は、本発明の必須要素であるが、それはモジュールであり、異なる状況において用いることができる。本発明と組み合わせて用いられる選択したプロモーターは、第２の重要性を有し、任意の適切なプロモーター配列を含む。しかしながら、当業者に理解されるように、転写開始部位がオープンリーディングフレームの上流に位置することを確認することが必要である。本発明の好ましい実施態様によれば、選択されたプロモーターは、目的とする特定の宿主細胞内で活性な要素を含む。これらの要素は、ストレスまたは飢餓の症状においてこれらの細胞が生存するのに必須の遺伝子の転写を活性化する転写調節因子（ヒートショックタンパク質を含む）から選択され得る。
【００８７】
本発明の構築物は、好ましくは、適切な選択可能なマーカーをさらに含む。本発明のより好ましい実施態様では、構築物は、複製の起源をさらに含む。本発明の他の最も好ましい実施態様では、構築物は、大腸菌中で伝播可能であり（ここで、構築物は、適切な選択可能なマーカーおよび複製の起源を含む）、かつ選択した生物の細胞中での伝播またはゲノムへの一体化に適合するシャトルベクターである。本発明のこの局面による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
【００８８】
本発明は、トランスジェニック遺伝子および多形遺伝子動物および細胞（細胞株）モデルならびにノックアウトおよびノックインモデルを提供する能力を有する。これらのモデルは、当分野で公知の標準的方法を用いて、および以下の米国特許に記載の方法を用いて構築され得る：米国特許５，４８７，９９２号、同第５，４６４，７６４号、同第５，３８７，７４２号、同第５，３６０，７３５号、同第５，３４７，０７５号、同第５，２９８，４２２号、同第５，２８８，８４６号、同第５，２２１，７７８号、同第５，１７５，３８５号、同第５，１７５，３８４号、同第５，１７５，３８３号、同第４，７３６，８６６号および  Ｂｕｒｋｅ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９４：  ２５１−２７０  １９９１）；  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：  １２８８−１２９２  １９８９）；  Ｄａｖｉｅｓ  ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０  （１１）  ２６９３−２６９８  １９９２）；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ら，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２  （８）：  １２９９−１３０２  １９９３）；  Ｄｕｆｆ  ａｎｄ  Ｌｉｎｃｏｌｎ，“Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａ  ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＰＰ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ”，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  １９９５；Ｈｕｘｌｅｙ  ら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ９：  ７４２−７５０  １９９１）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：  ２５５−２６１  １９９３）；  Ｌａｍｂ  ら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５  ：  ２２−２９  １９９３）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９３）．  ９０：  １０５７８−８２；  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９４：  ２８１−３０１  １９９１）；  Ｓｃｈｅｄｌ  ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：  ２５８−２６１  １９９３）；  Ｓｔｒａｕｓｓ  ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５９：  １９０４−１９０７  １９９３）。さらに、  特許出願ＷＯ  ９４／２３０４９、ＷＯ  ９３／１４２００、  ＷＯ  ９４／０６９０８、  ＷＯ  ９４／２８１２３もまた情報を提供する。
【００８９】
本発明の特許請求された実施態様に由来する全てのこのようなトランスジェニック遺伝子および多形遺伝子動物および細胞（細胞株）モデルおよびノックアウトまたはノックインモデルは、本発明の好ましい実施態様を構成する。
【００９０】
本明細書における遺伝子治療は、目的とする遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主に輸送して、遺伝的または後天的疾患または症状または表現型を処置または予防することを意味する。目的とする遺伝物質は、インビボでのその産生が所望される産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）をコードする。例えば、目的とする遺伝物質は、治療上有益なリガンド、ホルモン、レセプター、酵素、ポリペプチドまたはペプチドをコードし得る。概説としては、一般的に、テキスト「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）を参照されたい。
【００９１】
遺伝子治療への２つの基本的アプローチである（ｉ）エクソビボおよび（ｉｉ）インビボ遺伝子治療が出現した。エクソビボ遺伝子治療では、細胞を患者から取り出し、処置された細胞をインビトロで処置する。一般的に、機能的に置き換えられた遺伝子を、および必要に応じて発現系を、適切な遺伝子輸送ビヒクル／方法（トランスフェクション、トランスダクション、相同性組み換え等）により細胞に導入し、ついで、この改変された細胞を培地中で培養し宿主／患者に戻す。これらの遺伝的に再培養された細胞は、インサイチュでトランスフェクトされた遺伝物質を発現することが見出された。
【００９２】
インビボ遺伝子治療においては、標的細胞を被検体から取り出さず、輸送されるべき遺伝物質をインサイチュすなわちレシピエントの体内でレシピエント生物の細胞に導入する。代替の実施態様では、宿主遺伝子が欠損している場合、遺伝子をインサイチュで修復する（Ｃｕｌｖｅｒ，  １９９８．  （Ａｂｓｔｒａｃｔ）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ  ＆  ＲＮＡ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９８，  Ｃｏｒｏｎａｄｏ，  ＣＡ）。
【００９３】
これらの遺伝的に改変された細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をインサイチュにて発現することが見出された。
【００９４】
遺伝子発現ビヒクルは、異種核酸を宿主細胞に輸送／移送し得る。発現ビヒクルは、核酸の細胞中での標的、発現および転写を当分野で公知の細胞選択的様式でコントロールする要素を含み得る。遺伝子の５′ＵＴＲおよび／または３′ＵＴＲ  はしばしば発現ビヒクルの５′ＵＴＲおよび／または３′ＵＴＲで置き換えられ得ることに留意すべきである。従って、本明細書中で使用する発現ビヒクルは、必要に応じて、輸送されるべき実際の遺伝子の５′ＵＴＲおよび／または３′ＵＴＲを含まず、特異的アミノ酸コーディング領域のみを含んでいてもよい。
【００９５】
発現ビヒクルは、異種物質の転写をコントロールするためのプロモーターを含んでいてもよく、選択的転写を可能にする構成型のまたは誘導性のプロモーターのいずれであってもよい。必要な転写レベルを得るのに必要とされ得るエンハンサーが必要に応じて含まれ得る。エンハンサーは、一般的に、プロモーターに支配される基底転写レベルを変化させるためのコーディング配列（シス）により連続的に作用する翻訳されていないＤＮＡ配列である。発現ビヒクルはまた、本明細書の以下に記載の選択遺伝子を含み得る。
【００９６】
ベクターは、当分野において公知の種々の方法のうちいずれか１つで細胞または組織に導入することができる。このような方法は、一般的に、以下に記載されている方法：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，１９９２），  Ａｕｓｕｂｅｌ  ら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  １９８９），Ｃｈａｎｇ  ら，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  １９９５），Ｖｅｇａ  ら，  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ  （９９５），  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ  １９８８）およびＧｉｌｂｏａ  ら  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４  （６）：  ５０４−５１２，１９８６）、ならびに、例えば、安定または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組み換えウイルスベクターでの感染が挙げられる。加えて、中枢神経系に関連するベクターについては米国特許第４，８６６，０４２号を、ポジティブ−ネガティブ選択法については米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【００９７】
核酸の感染による導入は、他の列挙された方法に比べて、いくつかの利点を提供する。それらの感染性の性質により、高い効率が得られ得る。さらに、ウイルスは非常に特定され、かつ典型的には特定の細胞型で感染および伝播する。従って、それらの天然の特異性は、ベクターを特定の細胞型インビボまたは細胞の組織または混合培地内に標的化することができる。ウイルス性ベクターもまた、特定のレセプターまたはリガンドを用いて、レセプター媒介事象による標的特異性を変化させることができる。
【００９８】
組み換え配列を導入および発現するＤＮＡウイルスベクターの特定の例は、アデノウイルス由来ベクターＡｄｅｎｏｐ５３ＴＫである。このベクターは、ポジティブまたはネガティブな選択のいずれかについてヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現し、所望の組み換え配列に対しカセットを発現する。このベクターは、上皮性起源のほとんどの癌ならびに他の癌を含む、アデノウイルスレセプターを有する感染細胞に用いることができる。このベクターおよび類似の所望の機能を発現する他のベクターは、細胞の混合集団、例えば、細胞のインビトロまたはエクソビボ培養、組織またはヒト被検体を処置するのに用いることができる。
【００９９】
特定の細胞型に対する発現を制限する特徴もまた含むことができる。このような特徴には、例えば、所望の細胞型に特異的なプロモーターおよび調節要素を挙げることができる。
【０１００】
さらに、組み換えウイルスベクターは、所望の核酸のインビボ発現に有用である。なぜなら、これらは、水平感染および標的特異性という利点を有するからである。水平感染は、例えば、レトロウイルスのライフサイクルに特有であり、単独で感染した細胞が発芽する多くの子孫ビリオンを産生して隣接する細胞に感染するプロセスである。その結果、広範囲が迅速に感染するが、そのほとんどは、最初に、最初のウイルス粒子によって感染していない。これは、感染性薬剤が娘子孫を介してのみ広がる垂直型感染とは対照的である。ウイルス性ベクターはまた、水平に広がらないように産生され得る。この特徴は、特定の遺伝子を限られた数の標的細胞のみに導入する目的が望まれる場合に有用であり得る。
【０１０１】
上記のように、ウイルスは、多くの場合宿主防御機構を回避するために出現した非常に特定された感染性薬剤である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型において感染および伝播する。ウイルスの標的特異性は、ウイルスベクターがその標的の所定の細胞型に対する天然の特異性を用いるという天然の特異性を利用して、それにより組み換え遺伝子を感染した細胞に導入する。本発明の方法で用いられるベクターは、標的とすべき所望の細胞型に依存し、このことは当業者に明らかとなろう。例えば、乳癌を処置すべきである場合、このような上皮細胞に特異的なベクターが用いられるであろう。同様に、造血系の疾患または病理学的症状を処置すべきである場合、血液細胞およびそれらの前駆体、好ましくは造血性細胞の特異型に特異的なウイルスベクターが用いられ得るであろう。
【０１０２】
レトロウイルスベクターは、感染性粒子として、または単一の最初の感染ラウンドのみを受けるように構築され得る。前者の場合、ウイルスのゲノムは、新規なウイルスタンパク質およびＲＮＡを合成するために全ての必要な遺伝子、調節性配列およびパッケージングシグナルを維持するように改変される。これらの分子が一旦合成されると、宿主細胞は、ＲＮＡを、感染のさらなるラウンドを受け得る新規なウイルス粒子にパッケージングし得る。ベクターのゲノムもまた、所望の組み換え遺伝子をコードおよび発現するように操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ベクターのゲノムは、通常は突然変異して、ＲＮＡをウイルス粒子にカプセル化するのに必要なウイルスパッケージングシグナルを破壊する。このようなシグナルなしで形成される粒子はゲノムを含まず、それ故に、引き続く感染ラウンドに進むことができない。ベクターの特異型は、意図する用途に依存する。実際のベクターもまた当業者に公知であり、容易に入手できるか、または当業者に周知の方法を用いて構築され得る。
【０１０３】
組み換えベクターは、いくつかの方法で得ることができる。ウイルスベクターを用いる場合、例えば、前記手順はそれらの標的特異性の利点を有し、その結果、疾患部位に局所投与する必要がない。しかしながら、局所投与はより迅速かつより効果的な処置を提供し得るが、例えば、被検体への静脈内または皮下注射によっても投与を行うことができる。ウイルスベクターの髄液への注射もまた投与の様式として用いられ得る。注射後、ウイルスベクターは、それらが感染に対し適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環させられる。
【０１０４】
従って、代替の実施態様によれば、本発明の核酸構築物は、ポジティブおよびネガティブな選択マーカーをさらに含み、それ故に、相同性の組み換え事象、例えば、ノックインおよびノックアウト手順で用いられる相同性組み換えを選択するために使用され得るが、これらに限定されない。当業者は、構築物を用いた相同性の組み換え事象を受けるトランスフェクトされた胚性幹細胞を効率的に選択するためのポジティブおよびネガティブ選択遺伝子の両方を含む、ノックアウトまたはノックイン構築物を容易に設計し得る。このような細胞は、発育中の胚に導入されてキメラを産生することができ、その子孫のノックアウトまたはノックイン構築物の有無を試験することができる。本発明によるノックアウトおよび／またはノックイン構築物は、さらに、ＮＲＧ−４の機能を研究するのに用いることができる。このような構築物もまた、欠損の活性を破壊し、機能（例えば、優位なＮＲＧ−４アレル）を獲得するための、または生物においてサイレントなＮＲＧ−４アレルの欠如を置き換えるための、体細胞性および／または胚細胞性の遺伝子治療に用い、それにより必要に応じてＥｒｂＢ−４活性ダウンレギュレートまたはアップレギュレートすることができる。ノックアウトおよびノックイン構築物の構築および使用に関するさらなる詳細は、以下に見出すことができる：Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｉｋｅｄａ，Ｊ．Ｅ．：  Ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｒｅ−ｌｏｘ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ３  （１９９６）  ７３−８０；  Ｂｅｄｅｌｌ，  Ｍ．Ａ．，  Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｎ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，  Ｎ．Ｇ．：  Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐａｒｔ  Ｉ  ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１  （１９９７）  １−  １１；  Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｓｃｈｅｒｅｒ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｓ．，  Ａｒｒｏｙｏ，  Ｅ．，  Ｋａｌｌａ，  Ｋ．Ａ．，Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｍ．Ｇ．：  Ｔｓｔ−１／Ｏｃｔ−６／ＳＣＩＰ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｔｅｐ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０  （１９９６）  １７５１−６２。これらは参考のために本明細書中で援用される。
【０１０５】
本発明のさらに他の局面によれば、宿主細胞（原核生物または真核生物）または本明細書記載の核酸構築物またはそれらの一部を含む動物が提供される。このような部分は、コーディング領域および必要に応じてシス作用調節性配列を含み得る。このような構築物または部分は、細胞または生物の一部であり得るか、あるいはそれらのゲノムに安定に一体化し得る。
【０１０６】
本発明のさらに別の局面によれば、本明細書記載の単離された核酸と特異的にハイブリダイズ可能な、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０塩基のオリゴヌクレオチドが提供される。
【０１０７】
短い核酸（長さ２００ｂｐ未満、例えば長さ１７−４０ｂｐ）のハイブリッド形成は、ストリンジェント、中程度または穏やかなハイブリッド形成により行われ、ストリンジェントなハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳のハイブリッド形成溶液により、Ｔｍより１〜１．５℃低いハイブリッド形成温度にて、３Ｍ  ＴＭＡＣｌ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄溶液により、Ｔｍより１〜１．５℃低い温度で行われる；中程度のハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳ハイブリッド形成溶液により、Ｔｍより２〜２．５℃低いハイブリッド形成温度にて、３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄溶液により、Ｔｍより１〜１．５℃低い温度にて、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液により、２２℃での最終洗浄により行われる；一方、穏やかなハイブリッド形成は、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ  ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００  μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂乾燥牛乳のハイブリッド形成溶液により、３７℃のハイブリッド形成温度で、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液により、２２℃の最終洗浄にて行われる。
【０１０８】
本発明のさらなる局面によれば、本明細書記載の単離された核酸と、対向する配向で特異的にハイブリダイズ可能であってそれによりそれらの一部が直接的に指数関数的に増幅する（すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅反応で１５〜３０００ｂｐに増幅する）互いに独立して少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０塩基の一対のオリゴヌクレオチドが提供される。ポリメラーゼ連鎖反応および他の核酸増幅反応は、当分野で周知であり、本明細書にさらに記載する必要はない。本発明のこの局面によれば、このオリゴヌクレオチドの対は、好ましくは、適切な融解温度（Ｔｍ）、例えば、融解温度差が７℃未満、好ましくは５℃未満、より好ましくは４℃未満、最も好ましくは３℃未満、理想的には３℃〜０℃であるように選択される。
【０１０９】
結果として、本発明のなおさらなる局面によれば、本明細書記載のプライマー対を用いて得られた核酸増幅産物が提供される。このような核酸増幅産物は、ゲル電気泳動または任意のサイズに基づく分離技術により単離され得る。あるいは、このような核酸増幅産物は、鎖親和性または配列親和性のいずれかによるアフィニティー分離により単離され得る。加えて、一旦単離されると、このような産物は、制限、連結等によりさらに遺伝子操作されて、本明細書にさらに詳述するＮＲＧ−４活性アップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに関連する複数の用途のいずれか１つとして作用し得る。
【０１１０】
本発明のなおさらなる局面によれば、少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜１５、より好ましくは５〜２０塩基、最も好ましくは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログであって、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相同性の（類似の＋同一の酸）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部と、インビボ、生理学的条件下にてハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中以下にさらに詳述するように、発現をダウンレギュレートするのに用いられ得る。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド合成を用いて容易に合成可能である。
【０１１１】
選択された所定の配列を有する、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログの能力とは、遺伝子発現をダウンモジュレートすることをいう。遺伝子発現調節の３つのタイプのストラテジーを考慮することができる。
【０１１２】
転写レベルにおいて、鎖置換または三重らせん形成によりゲノムに結合するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログは、転写を予防し得る。転写レベルにおいて、標的ｍＲＮＡ分子に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログは、細胞内ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によるハイブリッドの酵素的切断をもたらす。この場合、標的ｍＲＮＡに対するハイブリッド形成により、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素によって認識されかつ破壊される二重鎖ハイブリッドを提供する。あるいは、このようなハイブリッド形成は、正確なスプライシングの妨害をもたらし得る。結果として、両方の場合において、翻訳のため準備された標的ｍＲＮＡインタクト転写物は、数が低減されるかまたは除去される。翻訳レベルにおいては、標的ｍＲＮＡ分子に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログは、立体障害、必須翻訳因子（リボソーム）の結合によって標的ｍＲＮＡに対して妨げられ、これはハイブリッド形成の停止、このようなｍＲＮＡの翻訳ができないこととして当分野で公知の事象である。
【０１１３】
従って、本明細書で上述したアンチセンス配列は、それらの特異的配列に依存する内因性および／または外因性遺伝子の発現を停止することができ、このことは新規な薬理学的手段へのアンチセンスアプローチの開発に貢献した科学者および薬理学者から多くの注目を集めた。
【０１１４】
例えば、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、造血性細胞増殖を停止すること（Ｓｚｃｚｙｌｉｋ  ら，  １９９１）、成長を停止すること（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ  ら，  １９９１）、細胞サイクルのＳ相への進入を停止すること（Ｈｅｉｋｈｉｌａ  ら，  １９８７）、生存率を低下させること（Ｒｅｅｄ  ら，  １９９０）およびレセプター媒介応答を予防すること（Ｂｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｈａｎ，  １９９１）が示されている。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログを用いた遺伝子発現の効率的なインビボ阻害のために、オリゴヌクレオチドまたはアナログは、以下の要件を満たさなければならない：（ｉ）標的配列への結合の十分な特異性；（ｉｉ）水への溶解性；（ｉｉｉ）細胞内および細胞外ヌクレアーゼに対する安定性；（ｉｖ）細胞膜を貫通する能力；および（ｖ）生物の処置に用いた場合の低毒性。
【０１１６】
未改変オリゴヌクレオチドは、インビボ半減期が短く、その間にヌクレアーゼによって迅速に分解されるので、典型的にはアンチセンス配列への使用は実用的ではない。さらに、これらはミリグラムを超える量での調製が難しい。さらに、このようなオリゴヌクレオチドは細胞膜貫通性に乏しい。
【０１１７】
従って、上記で列挙した全ての要件に適合するために、オリゴヌクレオチドアナログを適切な様式で考案することが必要なことは明らかである。故に、改変オリゴヌクレオチドのさらなる調査が開始された。
【０１１８】
例えば、三重らせん形成による二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の認識に関連して生じる問題は、賢明な「スイッチバック」化学結合により解決されたが、ここで、１つの鎖上のポリプリン配列が認識され、そして「スイッチバック」により鎖上のホモプリン配列が認識され得る。また、人工塩基の使用により良好ならせん形が得られ、それによってイオン強度およびｐＨに関する結合条件が改善される。
【０１１９】
加えて、半減期および膜貫通を改善するために、ポリヌクレオチド骨格の多数の改変がなされた。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドは、塩基、糖またはリン酸部位中のいずれかにおいて改変され得る。これらの改変には、例えば、メチルホスホネート、モノチオリン酸、ジチオリン酸、ホスホルアミデート、リン酸エステル、架橋ホスホルチオエート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、シロキサン架橋を有するデホスホヌクレオチド内アナログ、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミド架橋、カーバメート架橋、チオエーテル架橋、スルホキシ架橋、スルホノ架橋、種々の「プラスチック」ＤＮＡ、α−アノマー性架橋およびホウ素誘導体の使用が挙げられる。
【０１２１】
国際特許出願ＷＯ  ８９／１２０６０は、オリゴヌクレオチドアナログを合成するための種々のビルディングブロック、ならびにこのようなビルディングブロックを規定された配列で結合させて形成したオリゴヌクレオチドアナログを開示する。ビルディングブロックは、「剛直」（すなわち、環構造を含む）または「屈曲性」（すなわち、環構造を含まない）のいずれかであり得る。両方の場合において、ビルディングブロックは水酸基およびメルカプト基を含み、これによりビルディングブロックが結合してオリゴヌクレオチドアナログを形成すると述べられている。オリゴヌクレオチドアナログ中の結合部位は、スルフィド（−Ｓ−）、スルホキシド（−ＳＯ−）およびスルホン（−ＳＯ２−）からなる群から選択される。
【０１２２】
国際特許出願ＷＯ  ９２／２０７０２号は、任意の選択された化学核酸塩基またはアナログがその上で配列しており、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにおけるのと同様のコーディング特性を提供するペプチド骨格を含む非環状オリゴヌクレオチドを記載する。ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られるこれらの新規化合物は、それらの天然の対応物質よりも細胞中でより安定であるだけでなく、天然のＤＮＡおよびＲＮＡと、互いに付着して、天然の核酸よりも５０〜１００倍強く結合する。ＰＮＡオリゴマーは、メリフィールド固相ペプチド合成により、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む４つの保護された単量体から合成することができる。水への溶解性を増大させ凝集を予防するために、リジンのアミド基はＣ−末端領域に位置する。
【０１２３】
従って、１つの好ましい局面では、アンチセンス技術は、メッセンジャーＲＮＡがオリゴヌクレオチドと対を形成して、翻訳を抑制する二重らせんを形成することを必要とする。アンチセンス−媒介遺伝子治療の概念は、１９７８年に既に癌治療に導入された。このアプローチは、癌細胞の細胞分化および成長において決定的な特定の遺伝子に基づいていた。遺伝物質ＤＮＡの合成フラグメントは、この目的を達成し得る。このような分子は、腫瘍細胞ＲＮＡ中の標的の遺伝子分子に結合し、それにより遺伝子の翻訳を抑制しこれらの細胞の成長不全をもたらす。他の機構もまた提案されている。これらのストラテジーは、癌ならびにウイルス性および他の感染性疾患を含む疾病の処置におけるいくつかの成功と共に用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には長さ１３−３０ヌクレオチドで合成される。血液中でのオリゴヌクレオチド分子の寿命はかなり短い。従って、これらを化学的に修飾して、体内に存在するユビキチンヌクレアーゼによる分解を防がなければならない。ホスホロチオエートは、臨床試験におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に非常に広範に用いられる。アンチセンス分子の新規な産物は、合成ＤＮＡの中心部分を有するハイブリッドアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、ここで各末端にある４つの塩基は２′Ｏ−メチルリボースで修飾されてＲＮＡを模倣する。実験動物の臨床前研究において、このような化合物は、体組織中での代謝に対して大きな安定性を示し、未修飾ホスホロチオエートの最初の産生と比較してより改善された安全性プロファイルを示した（ハイブリドン社ニュース（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ  Ｉｎｃ．  ｎｅｗｓ））。多くの他のヌクレオチドアナログもまた、アンチセンス技術において試験された。
【０１２４】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標的と共に安定なＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成するので、これもまたアンチセンス抑制に用いられ得、効率的な抑制を示唆する。しかしながら、それらの安定性の低さにより、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、この目的のために設計されたベクターを用いて、細胞内で発現される。このアプローチは、多量のおよび寿命が長いタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする場合に好ましい。
【０１２５】
近年の科学的刊行物は、肝炎、癌、冠状動脈再狭窄および他の疾患の動物モデルにおけるアンチセンス化合物の有効性を確認した。最近、最初のアンチセンス薬物がＦＤＡに承認された。イシス（Ｉｓｉｓ）により開発されたこの薬物フォミヴィルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）は、ＣＭＶ網膜炎のための他の処置に耐えられないかまたは禁忌を示す、あるいはＣＭＶ網膜炎のための従前の処置に応答不十分であるＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルスの局所処置が示されている（ファーマコセラピー  ニュース  ネットワーク（Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｅｗｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ））。
【０１２６】
いくつかのアンチセンス化合物は、現在、アメリカ合衆国で臨床治験中である。これらには、局所投与された抗ウイルス剤、全身性癌治療が挙げられる。アンチセンス治療は、多くの生命を脅かす疾患を処理できる可能性があり、従来の薬物と比べて多くの利点を有する。従来の薬物は、疾患を引き起こすタンパク質が形成された後に干渉する。しかしながら、アンチセンス治療はｍＲＮＡの転写／翻訳を遮断し、タンパク質が形成される前に干渉し、またアンチセンス治療は１つだけの特異的ｍＲＮＡを標的とするので、現在のタンパク質−阻害治療よりも副作用が少なくより効果的であるはずである。
【０１２７】
転写レベルにて遺伝子発現を妨害するための第２の選択は、二重鎖ＤＮＡとハイブリッド形成し得る合成ヌクレオチドを用いる。三重らせんが形成される。このようなオリゴヌクレオチドは、遺伝子のプロモーターへの結合を防止して転写を抑制することができる。あるいは、これらは二重鎖がほどけるのを防いて三重らせん構造内で遺伝子の転写を抑制することができる。
【０１２８】
従って、本発明のさらなる局面によれば、本明細書記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。医薬上許容可能な担体は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを負荷したリポソームであり得る。本発明の被検体および他の医薬組成物に関連するさらなる特定のものは、本明細書の以下に提供される。
【０１２９】
本発明のなおさらなる局面によれば、本明細書記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれに融合したリボザイム配列を含むリボザイムが提供される。このようなリボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を用いて容易に合成可能である。
【０１３０】
リボザイムは、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現を配列特異的に阻害するために、次第に使用されてきている。リボザイムは、それらが任意の特異的標的ＲＮＡを切断するように設計する可能性により、基礎研究および治療用途の両方において有益な手段となってきた。治療領域において、リボザイムは、感染性疾患、癌における優位オンコジーンおよび遺伝的障害における特異的な体細胞性変異におけるウイルスＲＮＡをターゲティングするために利用されてきた。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルは既に第１フェーズ治験中であるということである。より最近では、リボザイムは、トランスジェニック動物の研究、遺伝子標的の変更および経路の明確化のために用いられるようになった。いくつかのリボザイムは、臨床試験の種々の段階にある。アンジオザイム（ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ）は、ヒト臨床試験のために、最初に化学的に合成されたリボザイムである。アンジオザイムはＶＥＧＦ−ｒ（血管上皮成長因子レセプター）の形成を特異的に抑制し、血管形成経路において鍵となる成分である。リボザイムファーマシューティカルス社（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）および他の会社は、動物モデルにおける抗血管形成治療の重要性を示した。肝炎Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  （ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するよう設計されたリボザイムであるヘプタザイム（ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ）は、細胞培養アッセイにおいて肝炎ＣウイルスＲＮＡを効果的に減少させることが見出された（リボザイムファーマシューティカルス社ウェブホームページ）。
【０１３１】
本発明のなおさらなる局面によれば、ＥｒｂＢ−４レセプターに結合可能であり、かつウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドを含む組み換えまたは合成（すなわち、固相ペプチド合成で合成された）タンパク質が提供される。
【０１３２】
最も好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号２または１５の少なくとも一部を含む。この部分は、ＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインを含む４位〜５０位に位置するアミノ酸を含み得る。
【０１３３】
加えてまたはあるいは、本発明のこの局面によるポリペプチドは、好ましくは、上記の長い核酸についてのストリンジェントまたは中程度のハイブリッド形成の条件下のいずれかで配列番号１または１４またはそれらの一部とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによりコードされる。さらに加えてまたはあるいは、本発明のこの局面によるポリペプチドは、好ましくは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号１または１４またはそれらの一部と少なくとも５０％、少なくとも５５％  少なくとも６０％  少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３４】
従って、本発明のこの局面は、（ｉ）配列番号２または１５記載のポリペプチド；（ｉｉ）それらのフラグメント；（ｉｉｉ）それらに相同性のポリペプチド；および（ｉｖ）欠失、挿入または１以上のアミノ酸の置換等による変異により特徴付けられ、天然に存在するかまたは人工のいずれかの、ランダムまたはターゲティングされた様式のいずれかで、天然、非天然または合成においてまたは合成後のいずれかに修飾された修飾ポリペプチド、を包含する。
【０１３５】
本発明のなおさらなる局面によれば、イムノアドヘシンを含む医薬組成物が提供される。本明細書中で使用される用語「イムノアドヘシン」は、結合タンパク質（通常はレセプター、細胞付着分子またはリガンド）およびそれに結合した免疫グロブリンの機能的ドメインを含むキメラ抗体様分子を記載するのに用いられる。このタイプの分子は「イムノアドヘシン」と呼ばれるが、これはこの分子が「免疫」および「付着」機能を組み合わせているからである。イムノアドヘシンを記載するのにしばしば用いられる他の名前は、「Ｉｇ−キメラ」、「Ｉｇ−」および「Ｆｃ−融合タンパク質」である。
【０１３６】
文献で報告されているイムノアドヘシンには、例えば、Ｔ細胞レセプターの融合（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ら  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ２９３６−２９４０）；  ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：  ５２５−５３１；  Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：  ６８−７０；  Ｚｅｔｔｎｅｉｓｓｌ  ら（１９９０）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ＵＳＡ  ９：  ３４７−３５３；  Ｂｙｒｎ  ら（１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ６６７−６７０）；  ＬＦＡ−３（Ｋａｎｎｅｒ  ら（１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：  ２３−２９）；  ＬＩ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｄｏｈｅｒｔｙ  ら  （１９９５）  Ｎｅｕｒｏｎ  １４：  ５７−６６）；  ＴＮＦ−Ｒ１（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  １０５３５−５３９）；  Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ら（１９９１）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１：  ２８８３−８６；  Ｐｅｐｐｅｌ  ら（１９９１）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：  １４８３−１４８９）およびＥｒｂＢ−４（Ｔｚａｈａｒ  ら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６：  ５２７６−８７）が挙げられる。
【０１３７】
最も単純でかつ最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、「結合」タンパク質の結合領域と、免疫グロブリン重鎖のヒンジおよびＦｃ領域とを結合する。
【０１３８】
従って、本発明の局面の好ましい実施態様によれば、ＮＲＧ４−免疫グロブリンイムノアドヘシンを調製する際に、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％  少なくとも６０％  少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメイン配列をコードする他のポリヌクレオチドのＣ−末端に、好ましくはＮ−末端に融合するが、所望のＮＲＧ４配列のＮ−末端への免疫グロブリンの融合もまた適用できる。典型的には、このような融合において、コードされたキメラポリペプチドは、少なくとも機能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常部のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ−末端に、または重鎖のＣＨ１のＮ−末端または軽鎖の対応する領域に直接なされる。融合される正確な部位は重要ではなく、特定の部位は周知であり、ＮＲＧ４−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択され得る。
【０１３９】
好ましい実施態様によれば、本発明のイムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリンは、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。ヒトイムノアドヘシンについては、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ−１およびＩｇＧ−３免疫グロブリンの使用が好ましい。ＩｇＧ−１を使用することの主な利点は、ＩｇＧ−１イムノアドヘシンが固定タンパク質Ａを用いて効率的に精製され得ることである。
【０１４０】
対照的に、ＩｇＧ−３の精製は、固定タンパク質Ｇ、著しく多機能な媒体の使用を必要とする。しかしながら、特定のイムノアドヘシン構築のためのＩｇ融合パートナーを選択する際には、免疫グロブリンの他の構造および機能的特性が考慮されるべきである。例えば、ＩｇＧ−３ヒンジはより長くかつより屈曲性であるので、例えばＩｇＧ−１に融合された場合に折り畳まれないかまたは適切に機能しないであろうより大きなアドへシンドメインに適合する。ＩｇＧイムノアドヘシンは典型的には１価または２価であるが、ＩｇＡおよびＩｇＭのような他のＩｇサブタイプもまた、基本のＩｇホモ二量体単位である二量体または五量体構造を与え得る。多量体イムノアドヘシンは、それらの対応する標的と、それらのＩｇＧに基づく対応物質よりも長く結合することができるという点で有利である。【０１４１】
本発明のなおさらなる局面によれば、活性を輸送する融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。活性を輸送するタンパク質は当分野で周知であり、毒素、薬物または酵素を化学修飾するために開発されたが、これは、前記毒素、薬物または酵素を成長因子、抗体および他の生物学的に活性な分子に結合可能にすることにより、前記毒素、薬物または酵素を標的に選択的結合し得るようにして標的に集中させ、それによって腫瘍または細胞表面で特異的な分子を示す他の型の細胞のような標的細胞の挙動を破壊または調節するためである。
【０１４２】
例えば、シュードモナス外毒素（ＰＥ）は、特定のヒト腫瘍を認識する種々のモノクローナル抗体（セタス社（Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））と、およびヒトＨ１型血液群基質を認識するモノクローナル抗体  ［Ｒｉｃｈｅｒｔ  ら  （１９８３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５８：  ８９０２−８９０７，およびＦｒｅｄｍａｎ  ら（１９８３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５８：  １１２０６−１１２１０］と複合体を形成する。
【０１４３】
毒素複合体はこのように設計されて、適切な標的細胞を特異的に殺す。ＰＥのような毒素は、それによって、標的細胞にレセプター特異的に反応する種々のペプチド、タンパク質および成長因子に結合する。このようなタンパク質および成長因子には、例えば、肉腫成長因子、メラニン形成細胞（ｍａｌａｎｏｃｙｔｅ）刺激ホルモン（ＭＳＨ）、ソマトスタチン、グルカゴン、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、カルシトニン、α２−マクログロブリンおよびリジンブラジキニンが挙げられる。ＭＳＨおよびリジンブラジキニンとの複合体は既に調製されており、これらは生物学的活性を示す。
【０１４４】
従って、本発明の局面の好ましい実施態様によれば、ＮＲＧ４−薬物、毒素または酵素融合タンパク質を調製する場合、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが毒素に融合される。融合部位は重要でないので、融合は、ＮＲＧ４に対してＣ−末端またはＮ−末端で起こり得る。
【０１４５】
本発明の好ましい実施態様によれば、シュードモナス外毒素−ＮＲＧ４融合体または複合体（ＰＥ−ＮＲＧ４）が調製され、前記複合体は、百日咳毒素、炭疽菌毒素、ジフテリア毒素のような他の周知の毒素を含んでいてもよいが、これらに限定されない。シュードモナス外毒素は、容易に大量調製でき、ヒトはこれを中和する抗体を有さず（ジフテリア毒素の場合のように）かつ複合体化される前にサブユニットに分離する必要がないので、（リシンまたはジフテリア毒素などの）他の毒素と比べて特に好ましい。あるいは、ＮＲＧ４は、薬物または酵素に複合体化され得る。
【０１４６】
構築は、好ましくはジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することによってのいずれかによりなされる。一般的に、１分子当たり２つのチオール基を導入するために、ＰＥをメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ＭＭＢ）で処理する。この工程は、１０  ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ  ８．５）中で最適に実行される。次いで、上記工程で誘導体化されたＰＥを、ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させる。組み換えＮＲＧ４はまた、１分子当たり１つより少し多いチオール基を導入するために、ＭＭＢで処理される。次いで、処理されたＮＲＧ４を過剰処理されたＰＥと混合して、２時間にわたって２３℃にてインキュベートさせる。あるいは、ＮＲＧ４をｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）で修飾し、得られた活性化ＮＲＧ４をＳＨ−ＰＥ−ＳＨと反応させてチオエーテル結合を含む複合体を形成してもよく、これはジスルフィド結合の還元によって不活性化され得ないので、動物環境においてより安定である。
【０１４７】
次いで、得られたＰＥ−ＮＲＧ４複合体を多段階手順で精製する。典型的には、１ｍｌの複合体を、３〜５ｍｇ／ｍｌでセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに通す。低活性を示す空洞体積中の多量の凝集物を捨てる。セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラムに残存している物質をさらに精製し、複合体をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムに通すことにより、前記物質を未反応のＰＥから分離する。本発明で用いられるＰＥ−ＮＲＧ４複合体を含む第一のプールは、１または２の抗体分子に結合した各ＰＥ分子を含む。この物質をＤＴＮＢと反応させ、次いでシステインと反応させて、全ての遊離ＳＨ基を誘導体化する。分離手順を行うために微量の１２５Ｉ−ＰＥを用いることができる。複合体を、それをＨｅＬａ細胞等のＥｒｂＢ４を有する腫瘍細胞に添加し、タンパク質合成または細胞死の抑制を測定することによりアッセイする。複合体のＡＤＰ−リボシル化活性もまた、細胞抽出物（通常は網状赤血球ライセート）中で、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ら，Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．  ３２，  ｐ．  ６０７（１９８３）記載の１４Ｃ−ＮＡＤを用いてアッセイされる。
【０１４８】
本発明のなおさらなる局面によれば、活性成分として本明細書記載の組み換えタンパク質またはイムノアドヘシンを、およびさらに上述された医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１４９】
本発明の別の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドから誘導される、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、１０〜１５、１２〜１７、または１５〜２０の連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを含むペプチドまたはペプチドアナログが提供される。好ましくは、本発明のこの局面による前記ペプチドまたはペプチドアナログは、配列番号２または１５に由来する少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、１０〜１５、１２〜１７または１５〜２０の連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを含む。
【０１５０】
本明細書および以下の特許請求の範囲の章で使用される句「ポリペプチドに由来する」は、特定のタンパク質（単数または複数）に由来し、同一または別の種の特定のタンパク質に相同性のタンパク質の等価な領域に由来する相同性のペプチドにさらに由来するペプチドを意味する。この用語はさらに、特定のタンパク質またはそれらの相同性タンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計された許容され得るアミノ酸改変体およびペプチドミメティックに関する。
【０１５１】
本明細書および以下の特許請求の範囲の章で使用される用語「アミノ酸」は、２０の天然に存在するアミノ酸を含むものと理解される。これらのアミノ酸は、翻訳後にインビボでしばしば修飾され、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンおよび他の通常的ではないアミノ酸、例えば、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語「アミノ酸」は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方を含む。本発明で使用できる可能性があるアミノ酸のさらなる選択および非天然のアミノ酸の例を、本明細書中以下に示す。
【０１５２】
親水性脂肪族天然アミノ酸は、合成アミノ酸、好ましくはＮｌｅｕ、Ｎｖａｌおよび／またはα−アミノ酪酸で置き換えられてもよいし、または一般式−ＨＮ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは３〜５である）の脂肪族アミノ酸で置き換えられてもよいし、ならびに以下に示すその分岐鎖誘導体で置き換えられてもよく、前記分岐鎖誘導体には以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１５３】
【化１】
2004525603.tif 000002
【０１５４】
（式中、Ｒは、例えば、メチル、エチルまたはプロピルであり、ｎ個の炭素のうちの任意の１つ以上に位置する。）
【０１５５】
１つ以上のアミノ酸のそれぞれは、それらのＤ−異性体を含んでいてもよい。正に荷電した脂肪族カルボン酸には、例えばＨ２Ｎ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは２〜４である）およびＨ２Ｎ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは２〜３である）が挙げられるが、これらに限定されず、ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルリジンまたはオルニチン（Ｏｒｎ）もまた用いることができる。加えて、大きい芳香族残基には、例えばＨ２Ｎ−（Ｃ６Ｈ６）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｈ２Ｎ−Ｆ（ＮＨ）−ＮＨ−（Ｃ６Ｈ６）−ＣＨ２−ＣＯＯＨが挙げられるが、これらに限定されず、ｐ−グアニジノフェニルアラニンまたはピリジノアラニン（Ｐａｌ）もまた用いることができる。アミノ酸誘導体の側鎖（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＯｒｎの場合）は、アルキル、アリール、アルキロイルまたはアリーロイル部に結合することにより保護され得る。環状アミノ酸誘導体もまた用いることができる。環化は、アミド結合（−ＣＯ−ＮＨまたは−ＮＨ−ＣＯ結合）形成、例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ，ジ−アミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）を鎖中の種々の位置に組み込むことによって得られる。骨格−骨格環化もまた、式Ｈ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＣＯＯＨまたはＨ−Ｎ（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｒ）Ｈ−ＮＨ２（式中、ｎ＝１〜４であり、Ｒは任意の天然または非天然のアミノ酸側鎖である）の修飾アミノ酸を組み込むことによって得られる。２つのＣｙｓ残基導入によってＳ−Ｓ結合を形成することによる環化もまた可能である。追加の側鎖−側鎖環化は、式−（−ＣＨ２−）ｎ−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ−（式中、ｎ＝１または２である）の相互作用結合の形成により得られ、この環化は、例えば、ＣｙｓまたはホモＣｙｓの組み込みおよびその遊離のＳＨ基のブロモアセチル化Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｂまたはＤａｐとの反応により可能である。ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキルであり、例えばメチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン性二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である）により置換可能である。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のいずれかで起こり得、同時にいくつか（２〜３）起こり得る。天然の芳香族アミノ酸であるＴｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチレラニン（ｎａｐｈｔｈｙｌｅｌａｎｉｎｅ）（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはｏ−メチル−Ｔｙｒのような合成の非天然の酸で置き換えることができる。
【０１５６】
【表１】
2004525603.tif 000003
【０１５７】
【表２】
2004525603.tif 000004
2004525603.tif 000005
2004525603.tif 000006
【０１５８】
本発明のさらに別の局面によれば、複数のディスプレイビヒクル（例えば、ファージ、ウイルスまたは細菌）を含むディスプレイライブラリであって、前記ディスプレイビヒクルのそれぞれが、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドに由来する少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、１０−１５、１２−１７または１５−２０の連続するアミノ酸を表示する、ディスプレイライブラリが提供される。
【０１５９】
本発明のこの局面の好ましい実施態様によれば、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドに由来する実質的に全ての  ６、７、８、９、１０、１０−１５、１２−１７または１５−２０の連続するアミノ酸が、上記複数のディスプレイビヒクルの少なくとも１つにより表示され、それによって高度に代表的なライブラリが提供される。好ましくは、本発明のこの局面のペプチドまたはペプチドアナログの連続するアミノ酸またはアミノ酸アナログは、配列番号２または１５に由来する。
【０１６０】
ディスプレイライブラリを構築する方法は当分野で周知である。このような方法は、例えば、以下に記載される：Ｙｏｕｎｇ  ＡＣ，  ら，“Ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９７  Ｄｅｃ  １２；  ２７４（４）：  ６２２−３４；  Ｇｉｅｂｅｌ  ＬＢ  ら“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５  Ｎｏｖ  ２８；  ３４（４７）：  １５４３０−５；  Ｄａｖｉｅｓ  ＥＬ  ら，“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５  Ｏｃｔ  １２；  １８６（１）  ：  １２５−３５；Ｊｏｎｅｓ  Ｃ  ＲＴ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  １９９５  Ｊｕｌ  １４；  ７０７（１）  ：  ３−２２；  Ｄｅｎｇ  ＳＪ  ら“Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５  Ｍａｙ  ２３  ；  ９２  （１１）：  ４９９２−６；およびＤｅｎｇ  ＳＪ  ら“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４  Ａｐｒ  １；  ２６９  （１３）：  ９５３３−８。これらは本明細書中で参考のため援用される。本発明のこの局面によるディスプレイライブラリは、ＥｒｂＢ−４活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし得るポリペプチドを同定および単離するのに用いることができる。
【０１６１】
本発明のさらに別の局面によれば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドを特異的に認識および結合する免疫グロブリンを含む抗体が提供される。本発明のこの局面の好ましい実施態様によれば、抗体は、配列番号２または１５記載のポリペプチドを特異的に認識および結合する。
【０１６２】
本発明は、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはそれらのフラグメント（すなわち、抗体の免疫反応性誘導体）、あるいはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを用いることができる。抗原結合領域の少なくとも一部（例えば、Ｆｖ，  Ｆ（ａｂｌ）２、Ｆａｂフラグメント（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９８８  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）、キメラまたはヒト化抗体および相補的決定領域（ＣＤＲ））を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の精製フラグメントは、従来の手順により調製され得る。これらの血清免疫グロブリン抗体またはフラグメントの精製は、当業者に公知の種々の方法により達成することができ、前記方法には、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムにより沈殿した後生理食塩水で透析する、イオン交換クロマトグラフィー、親和性またはイムノアフィニティークロマトグラフィーならびにゲル濾過、ゾーン電気泳動等  （ＧｏｄｉｎｇのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｐｐ．  １０４−１２６，１９８６，Ｏｒｌａｎｄｏ，  Ｆｌａ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）が挙げられる。通常の生理学的条件下では、抗体は、血漿および他の体液ならびに特定の細胞の膜内で見出されるか、型が指定されたＢ細胞またはそれらの機能的等価物のリンパ球により産生される。ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合で共に結合された４つのポリペプチド鎖からなる。完全なＩｇＧ分子の４つの鎖は、Ｈ−鎖と呼ばれる２つの同一の重鎖およびＬ−鎖と呼ばれる２つの同一の軽鎖である。追加のクラスには、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび関連するタンパク質が挙げられる。
【０１６３】
モノクローナル抗体を産生および選択する方法は当分野で周知であり、例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｏｅｄｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７８，５５１−５６８，１９８９等で概説される通りである。本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４またはそれらの一部は、インビトロで抗体を産生するのに用いることができる。より好ましくは、本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４は、インビボで抗体を惹起するのに用いられる。一般的に、適切な宿主動物は、本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４あるいは少なくとも１つの連続的なまたは非連続的なエピトープを含むそれらの一部で免疫化される。有利には、用いられる動物宿主は、同系株のマウスである。動物は、典型的には、本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４あるいはそれらの一部の生理学的に許容され得るビヒクル溶液と、任意の適切なアジュバントとを含む混合物で免疫化され、これにより免疫原に対して増強された免疫応答が達成される。例えば、最初の免疫化は、本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４あるいはそれらの一部の溶液とフロイントの完全アジュバントとの混合物により簡便に達成され、前記混合物は、油中水型エマルジョン中の水の形態により調製される。典型的には、免疫化は、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、足蹠内または任意の適切な投与経路により動物に投与することができる。免疫原の免疫化スケジュールは、必要に応じて適合させることができるが、慣例上、フロイントの不完全アジュバントのようなより穏やかなアジュバントを用いるいくつかの引き続くまたは第二の免疫化が含まれる。抗体滴定および結合特異性は、例えばラジオイムノアッセイ、またはＥＬＩＳＡアッセイとして知られる固相酵素結合免疫吸収アッセイのような任意の簡便な方法による免疫化スケジュールの間に測定することができる。適切な抗体滴定が達成される場合、当分野で公知のように、免疫化された動物の抗体からリンパ球を産生させ、これらを培養し、選択しそしてクローン化する。典型的には、リンパ球は、免疫化された動物の脾臓から多く得ることができるが、循環系、リンパ節または他のリンパ系器官からも得ることができる。次いで、リンパ球を、当分野で周知のように任意の適切なミエローマ細胞株に融合させて、ハイブリドーマを得る。あるいは、リンパ球を培地中で刺激して成長させ、そして確立されたプロトコルに従って、当分野で公知の方法（リンパ球をウイルス、化学物質またはオンコジーンのような核酸に曝露することが挙げられる）により不死化することもできる。融合後、ハイブリドーマを適切な培養条件下で、例えば多穴プレート中で培養し、培養上清をスクリーニングして、選択したハプテンを認識する抗体を含む培地を同定する。本発明の組み換えまたは合成ＮＲＧ−４を認識する抗体を分泌するハイブリドーマは、適切な培地条件下で希釈を限定して膨張させることにより、クローン化される。モノクローナル抗体を精製し、免疫グロブリン型および結合親和性について特徴付けする。
【０１６４】
本発明の以下の実施態様は、ＮＲＧ−４活性の干渉およびＥｒｂＢ−４レセプターシグナリングに関する。
【０１６５】
従って、本発明のさらに他の局面によれば、インビボまたはインビトロでのＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための薬剤を活性成分として含む医薬組成物であって、前記内因性タンパク質が、  ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性（同一の＋類似の）である、医薬組成物に関する。
【０１６６】
本発明のさらに他の実施態様によれば、インビボまたはインビトロでのＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節するための方法が提供される。本発明のこの局面によれば、前記方法は、インビボで内因性タンパク質を調節するための薬剤を投与することにより行われ、前記内因性タンパク質は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性（同一の＋類似の）である。
【０１６７】
本発明のさらに別の局面によれば、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害と関連する疾患、症状または症候群を処置または予防する方法が提供される。本発明のこの局面の方法は、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質を調節する薬剤を治療上効果的な量で投与することによって行われ、前記内因性タンパク質は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の４−５０位に少なくとも５０％相同性である。
【０１６８】
内因性タンパク質の活性をアップレギュレートするためおよび／あるいはＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質の調節障害と関連する疾患、症状または症候群を処置または予防するために用いることができる本発明の薬剤には、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号ｌまたは１４に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の発現可能なセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１６９】
あるいは、内因性タンパク質の活性をアップレギュレートするための本発明による薬剤には、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ものを挙げることができる。
【０１７０】
内因性タンパク質の活性をダウンレギュレートするのに用いることができる本発明の薬剤には、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、アベレージマッチ＝１０およびアベレージミスマッチ＝−９で測定して、配列番号ｌまたは１４に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の発現可能なアンチセンスポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１７１】
あるいは、内因性タンパク質の活性をダウンレギュレートするために用いることができる本発明の薬剤には、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部と、インビボ、生理学的条件下でハイブリダイズ可能な、少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜１５、より好ましくは５０〜２０塩基、最も好ましくは、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを挙げることができる。
【０１７２】
さらにあるいは、本発明による内因性タンパク質の活性をダウンレギュレートするための薬剤には、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上、すなわち少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性または相同性の（同一の＋類似の）ポリペプチドに由来する少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、１０−１５、１２−１７または１５−２０の連続するアミノ酸またはそれらのアナログのストレッチを表すペプチドまたはペプチドアナログを挙げることができる。
【０１７３】
本発明による、相互作用するＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインを含むペプチドまたはペプチドアナログは、タンパク質相互作用により競合してＥｒｂＢ−４とタンパク質複合体を形成し、ＥｒｂＢ−４が関与する経路を阻害または促進する。
【０１７４】
本発明の教示に関連する疾患、症状または症候群の予防または処置のために、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を与える内因性タンパク質に結合可能なポリペプチドの滴定による使用（例えば、ＥｒｂＢ−４の可溶性のリガンド結合ドメイン（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９６））または上記の抗ＮＲＧ４抗体の使用を考慮することができる。本発明の１つの実施態様では、ＥｒｂＢ−４可溶性のリガンド結合ドメインは、ＩｇＢ４、イムノアドヘシンである（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９６）。
【０１７５】
本明細書中で活性成分として言及される薬剤は、それ自身で生物に投与され得るか、または適切な担体または賦形剤と混合された医薬組成物として投与され得る。
【０１７６】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、１以上の本明細書記載の薬剤またはそれらの生理学的に許容され得る塩またはプロドラッグと、生理学的に適切な担体および賦形剤のような他の化学成分との組成物である。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【０１７７】
本明細書中の以下において、用語「生理学的に許容され得る担体」および「医薬上許容可能な担体」は、生物を著しく刺激することなく、投与された化合物の生物学的活性および特性を損なわない担体または希釈剤を表すために、交換可能に用いることができる。
【０１７８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、医薬組成物に添加されて薬剤の投与をさらに容易にする不活性な物質を意味する。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールのタイプが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
薬物の製剤および投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡの最新版に見出すことができ、これは本明細書中で参考として援用される。
【０１８０】
適切な投与経路には、例えば、経口的、経直腸的、経粘膜的、経腸的または非経口的輸送を挙げることができ、筋肉内、皮下および髄内注射ならびにクモ膜下腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が挙げられる。
【０１８１】
あるいは、薬剤は、全身性様式ではなく局所的に投与することもでき、例えば、しばしばデポー中で行われる固形腫瘍への組成物の直接注射、または後述するような徐放性製剤が挙げられる。
【０１８２】
さらに、薬物は、標的薬物送達システム、例えば、腫瘍特異的抗体でコーティングされたリポソーム中で投与することもできる。リポソームは、腫瘍の標的となり、そして腫瘍に選択的に取り込まれる。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、当分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣製造、粉末化、乳化、カプセル化、包囲または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。
【０１８４】
このように、本発明で使用するための医薬組成物は、活性成分を薬学的に使用され得る組成物に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む１以上の生理学的に許容され得る担体を用いて、従来の様式により処方され得る。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１８５】
注射用には、本発明の薬剤を、水溶液中、好ましくはハンク溶液、リンガー溶液または生理学的生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合し得る緩衝液で処方することができる。経粘膜的投与用には、透過すべきバリアに適切な透過剤を処方に用いる。このような透過剤は、一般的に当分野で公知である。
【０１８６】
経口投与用には、薬剤は、活性薬剤を当分野で周知の医薬上許容可能な担体と組み合わせることにより容易に処方することができる。本発明の薬剤を、錠剤、丸薬、糖衣、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することを可能にするこのような担体は、患者の経口的摂取用である。経口用薬理学的組成物は、固体賦形剤を用い、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な補助剤を添加した後に混合物を顆粒に加工して、錠剤または糖衣核を得ることにより製造することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤［例えば、糖類（乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールが挙げられる）；セルロース組成物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム等）；および／または生理学的に許容され得るポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン  （ＰＶＰ））］である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天あるいはアルギン酸またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤を加えてもよい。
【０１８７】
糖衣核は、適切なコーティングと共に提供される。この目的のために濃縮糖溶液を用いることができ、これは必要に応じて、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。活性薬剤用量の異なる組み合わせを同定または特定するために、錠剤または糖衣コーティングに染料または顔料を添加してもよい。
【０１８８】
経口的に使用され得る医薬組成物には、ゼラチンからなるプッシュフィット（ｐｕｓｈｆｉｔ）カプセル剤ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤からなる軟質の密封されたカプセル剤が挙げられる。プッシュフィットカプセル剤は、活性薬剤を、乳糖のような充填剤、デンプンのようなバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤および必要に応じて安定化剤との混合物として含み得る。軟質カプセル剤では、活性薬剤は、油脂、液状パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、経口投与に適切な用量であるべきである。
【０１８９】
経頬（ｂｕｃｃａｌ）投与用には、組成物は、従来の様式で処方される錠剤またはトローチの形態をとり得る。
【０１９０】
吸入投与用には、本発明で使用される薬剤は、圧縮容器からまたは適切な推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）を用いるネブライザーからのエアロゾルスプレーの噴霧の形態により簡便に輸送される。圧縮エアロゾルの場合、用量単位は、計られた量を輸送するためのバルブを提供することにより測定され得る。吸入器または注入器に用いるための、例えばゼラチンのカプセルおよび容器は、薬剤と乳糖またはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含んで処方され得る。
【０１９１】
本明細書記載の組成物は、非経口的投与、例えば、ボーラス注射または連続的灌流のような非経口的投与用に処方され得る。注射用組成物は、単位投与形態で提供され得、例えば、必要に応じて保存剤が添加されたアンプルまたは多回投与容器で提供される。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方用薬剤を含んでいてもよい。
【０１９２】
非経口的投与用の医薬組成物には、可溶性形態の活性組成物の水溶液が挙げられる。加えて、活性薬剤の懸濁液は、適切な油性の注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油のような油脂、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性の注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。懸濁液は、必要に応じて、適切な安定化剤または薬剤の溶解性を増加させる薬剤を含んでいてもよく、これにより高度に濃縮された溶液の組成物を処方することも可能になる。
【０１９３】
あるいは、活性成分は、使用の前に粉末であってもよく、前記粉末は、例えば、無菌のパイロジェンを含まない水のような適切なビヒクルを用いて構成される。
【０１９４】
本発明の組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または保持浣腸のような経直腸組成物に処方することもできる。
【０１９５】
既に述べた処方物に加えて、本発明の組成物はまた、デポー組成物のような局所投与用製剤に処方することもできる。このような長く作用する製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、組成物は、適切なポリマーまたは疎水性物質を用いて（例えば、許容され得るオイル中のエマルジョンとして）あるいはイオン交換樹脂あるいは溶解性に乏しい塩のような溶解性に乏しい誘導体を用いて処方され得る。局所投与用の処方物には、ローション、懸濁液、軟膏、ゲル、クリーム、点眼剤、液体、スプレーエマルジョンおよび粉末が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本発明の好ましい実施態様によれば、医薬組成物は、薬剤を徐放するように設計される。組成物には、徐放性担体（典型的には、ポリマー担体）（例えば、ポリ乳酸）および薬剤を含む粒子が挙げられる。徐放性生分解性担体は当分野で周知である。これらは活性薬剤をその中に捕捉し得る粒子を形成し、適切な環境下（例えば、水性、酸性、塩基性等）で分解／溶解し、それにより体液中で分解／溶解して活性薬剤を放出することができる物質である。粒子は、好ましくはナノ粒子である（すなわち、ナノメーター範囲、例えば、直径約１〜約５００ｎｍ、好ましくは直径約５０〜２００ｎｍ、最も好ましくは直径約１００ｎｍの範囲内）。
【０１９７】
さらに本発明によれば、徐放性の医薬組成物を調製する方法が提供される。
【０１９８】
上記方法は、以下の工程を含む：
徐放性担体（典型的には、ポリマー担体）と本明細書記載の薬剤とを、有機溶媒中に溶解または分散させて、担体および本明細書記載の薬剤を含む有機溶液を得る。次いで、この有機溶液を水性溶液に添加して、水中油型エマルジョンを得る。好ましくは、水性溶液は、界面活性剤を含む。最終的に、有機溶媒を水中油型エマルジョンから蒸発させて、徐放性担体および本明細書記載の薬剤を含む粒子のコロイド懸濁液を得る。
【０１９９】
本発明の好ましい実施態様によれば、徐放性担体はポリ乳酸である。
【０２００】
本明細書記載の医薬組成物は、適切な固体のゲル相担体または賦形剤を含んでいてもよい。このような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
本発明の状況で使用するのに適切な医薬組成物には、活性成分が、目的を達成するのに有効な量で含まれた組成物が挙げられる。より詳細には、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または緩和するかまたは処置された被検体の生存を延長するのに効果的な薬剤の量を意味する。
【０２０２】
治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内であり、詳細には、本明細書中の詳細な開示に照らしてなされる。
【０２０３】
本発明の方法で用いられる任意の組成物について、治療有効量または用量は、最初に細胞培養アッセイから概算される。例えば、ある用量を動物モデルで処方して、細胞培地中で測定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲に到達することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に測定するのに用いることができる。
【０２０４】
本明細書記載の薬剤の毒性および治療有効性は、細胞培地または実験動物における標準的な薬学的手順を用いて、例えば、目的の薬剤のＩＣ  ５０およびＬＤ５０（試験動物の５０％の死亡を引き起こす致死量）を測定することによって決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲を処方するのに用いることができる。用量は、用いられる投与形態および用いられる投与経路に依存して変動し得る。正確な処方、投与経路および用量は、医師個人によって、患者の症状を考慮して選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ，  ら，  １９７５，  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，  Ｃｈ．  １  ｐ．  ｌを参照）。
【０２０５】
投与の量および間隔は、個別に調節されて、最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる、必要とされる効果を維持するのに十分な活性部位の血漿レベルを提供することができる。ＭＥＣは組成物毎に異なるが、インビトロデータ（例えば、５０〜９０％抑制を達成するのに必要な濃度）から概算することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に依存する。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイもまた、血漿濃度を測定するのに用いられ得る。
【０２０６】
投与間隔もまた、ＭＥＣ値を用いて測定することができる。組成物は、ＭＥＣを超える血漿レベルで１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％および最も好ましくは５０〜９０％の時間にわたって維持する投与法を用いて投与されるべきである。
【０２０７】
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度に関係しないことに留意すべきである。このような場合、当分野で公知の他の手順を用いて有効な局所濃度を測定することができる。
【０２０８】
処置されるべき症状の重篤性および応答性に依存して、投与は、治癒が達成されるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで数日から数週間にわたる一連の処置の過程で、本明細書で上記した徐放性組成物の単回投与であってもよい。
【０２０９】
当然のことながら、投与されるべき組成物の量は、処置される被検体、疾患の重篤性、投与様式、処方した医師の判断等に依存する。
【０２１０】
本発明の組成物は、所望ならば、活性成分を含む１以上の単位投与形態を含み得る、ＦＤＡ承認キットのようなパックまたはディスペンサーデバイスとして提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックのような金属またはプラスチックの箔を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬の製造、使用または販売を調節する政府機関によって定められた様式で容器に関する注意書きが添付されていてもよい。この注意書きは、前記機関がヒトまたは動物への投与の形態を承認したことを反映している。このような注意書きは、例えば、定められた薬物についてのＦＤＡの承認または承認された食品添加物のラベルであり得る。適合し得る薬学的担体中で処方された本発明の薬剤を含む組成物もまた調製され、適切な容器に入れられ、示された症状の処置のためのラベルが貼られ得る。ラベルに示される適切な症状は、本明細書の以下にさらに記載される。
【０２１１】
従って、本明細書で上記した医薬組成物は、ＮＲＧ−４の調節障害に関連しＥｒｂＢ−４活性に影響を与える疾患または症状または症候群の処置または予防に有用である。
【０２１２】
ＮＲＧ４によるＥｒｂＢ４レセプターの結合および活性化は、細胞を発現するＥｒｂＢ４レセプターにおける生理学的応答、例えば、細胞成長、細胞増殖および細胞分化を媒介することが予想される。このことは、特に、ＥｒｂＢ４レセプターおよびその新規なＮＲＧ４リガンドの両方が発現され、オートクリンおよび／またはパラクリン効果が可能な骨格筋組織について予想されるが、これに限定されない。
【０２１３】
本明細書中に記載の医薬組成物の投与により処置できるおよび／または予防できる疾患、症状および症候群には以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）神経系の損傷によって起こる障害（例えば、外傷、外科手術、卒中、虚血、感染、代謝性疾患、栄養失調、悪性腫瘍または毒薬）；（ｉｉ）  運動ニューロン障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、ベル麻痺）；（ｉｉｉ）脊髄筋萎縮症または麻痺を含む種々の症状；（ｉｖ）遺伝性家族性または後天性の神経退化障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病，ダウン症，神経性聾およびメニエール病）；（ｖ）神経障害、および特に末梢神経障害［運動性、感覚性、感覚運動性または自律神経失調（例えば、末端感覚運動性神経障害あるいは消化管の運動低下または膀胱アトニーを含む自律神経障害）の１つまたはこれらの組み合わせによってしばしば明らかになる末梢神経系障害］；神経障害と関連する全身性疾患（例えば、ポリオ後症候群）；遺伝性神経障害（例えば、シャルコー−マリー−トゥース型疾患、レフサム病、βリポタンパク質血症、タンジール病、クラッベ病、異染色性ロイコジストロフィー、ファブリー病およびデジェリーヌ−ソッタ症候群）；ならびに毒性薬剤により生じた神経障害［例えば、毒性薬剤により生じた障害（例えば、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサートまたは３′−アジド−３′−デオキシチミジンのような化学療法薬剤での処置により生じた障害）］；（ｖｉ）骨格筋または平滑筋の疾患（例えば、筋ジストロフィー）または骨格筋または平滑筋の痩せにより生じた疾患；（ｖｉｉ）膵臓疾患（例えば、膵臓癌、膵炎、ソマトスタチノーマおよびゾリンジャー−エリソン症候群）；ならびに（ｖｉｉｉ）  悪性腫瘍（例えば、哺乳動物外パジェット病、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌（Ｇｉｌｍｏｕｒ  ＬＭＲ．  ら  ２００１）、子宮頚カルシノーマおよび子宮内膜カルシノーマ）。
【０２１４】
以下の生化学および分子システムは、タンパク質−タンパク質相互作用および基質としてのペプチドのペプチド分析による特徴付けおよび同定として知られ、前記システムは、抑制性ペプチド配列を同定するのに用いることができる。このようなシステムの１つは、機能的タンパク質をコードする遺伝物質の導入または突然変異したタンパク質の形態（アミノ酸の欠失および細胞への置換を含む）を用いる。このシステムは、その活性および細胞中の変異体由来の活性を分析することによりタンパク質の機能的ドメインを同定するのに用いられ得る。他のこのようなシステムは、遺伝子の小さなコード化フラグメントの細胞への導入（例えば、ディスプレイライブラリまたは指向性でランダムに開始した遺伝子のフラグメントを含むｃＤＮＡライブラリにより、および内因性タンパク質の存在下におけるそれらの活性を分析することにより行われる）を用いる（例えば、Ｇｕｄｋｏｖ  ら  （１９９３）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｃＤＮＡ”Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ３２３１−３２３６；  Ｇｕｄｋｏｖ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  （１９９７）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  （ＧＳＥｓ）  ｆｒｏｍ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６９  ；  ２２１−２４０；  ａｎｄ  Ｐｅｓｔｏｖ  ら  （１９９９）“Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｅｌｌ  ｆｉｘａｔｉｏｎ”  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：  １０２−１０６を参照のこと）。なお、さらなるシステムは、例えば、Ｙａｍａｂｈａｉ  ら  （１９９８  “Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｏ  Ｅｐｓ１５  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｆｉｖｅ  Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  Ｄｏｍａｉｎｓ”．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：  ３１４０１−３１４０７）に例示のようなペプチドドメインを用いた発現ライブラリのスクリーニングにより理解される。さらに、特異的遺伝子産物に由来する合成ペプチドをオーバーラップさせる他のシステムが、インビボおよびインビトロタンパク質−タンパク質相互作用の研究および実行に用いられる。例えば、ＨＩＶ−１  ｖｉｆ遺伝子（２０−３０アミノ酸）に由来する合成オーバーラッピングペプチドが、異なるウイルス活性についてアッセイされ（Ｂａｒａｚ  ら  （１９９８）“Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｖｉｆ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４１：  ４���９−４２６）、そして、精製されたウイルスプロテアーゼ活性を抑制すること、ウイルスプロテアーゼに結合すること、Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質切断を抑制することおよびヒト細胞において成熟したウイルスの産生を抑制することが見出された。
【０２１５】
Ｈｅｒ／ＥｒｂＢチロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーは、４つの細胞膜架橋レセプター、ＥｒｂＢ−１（上皮成長因子レセプターとしても知られる）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４を含むことが現在知られている。
【０２１６】
これらのレセプターチロシンキナーゼは、典型的には、リガンド依存性の様式で活性化されて、レセプターのオリゴメリゼーション、鍵となる細胞内チロシン残基におけるそれらの自己リン酸化および下流シグナリングカスケードの引き続く活性化をもたらす。ＥｒｂＢレセプターおよびそれらの対応するリガンドは、哺乳類の発育において多くの助けになる役割を果たし、例えば、乳癌（ＥｒｂＢ  １およびＥｒｂＢ２）およびグリア芽細胞腫  （ＥｒｂＢｌ）における強力なオンコジーンとして作用することが示されている。多くの他の癌における異なるＥｒｂＢｓの過剰発現は、不良な生存予後としばしば相関し、このことはＥｒｂＢｓおよびそれらのリガンドが発癌性においてより大きな機能的役割を果たすことに密接に関連している（Ｂｕｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ．，  １９９７；  Ｋｌａｐｐｅｒ  ら  ２０００に概説される）。
【０２１７】
特定の細胞型について、ＥｒｂＢシグナリングは、２つの主要な因子（ｉ）細胞が発現するＥｒｂＢレセプターの量および型；ならびに（ｉｉ）ＥｒｂＢレセプターを発現する細胞を活性化するリガンドの量および型に依存する。
【０２１８】
活性化の際に、各ＥｒｂＢレセプターは異なる細胞内基質をリクルートする能力を有し、それにより代替のシグナリングカスケードの活性化が可能になる。内部ＥｒｂＢヘテロ二量体のリガンドが誘導する形成（例えば、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４オリゴマー）は、好ましくはＥｒｂＢホモ二量体の存在下でしばしば起こる（例えば、ＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ４オリゴマー）。ヘテロ二量体化は、ＥｒｂＢシグナリングにおいて重要なプロセスである。例えば、高度に活性でありかつ発癌性が強い（ｏｎｃｏｐｏｔｅｎｔ）ＥｒｂＢ２レセプターは、その結合により他のＥｒｂＢレセプターをトランスで活性化し得るが、それを直接的に結合する公知のリガンドを今日まで有しなかった（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９７  ａｎｄ  １９９８）。
【０２１９】
典型的には、ＥｒｂＢは、リガンド依存性の様式で活性化される。特定のレパートリーのＥｒｂＢレセプターを発現する細胞は、それらに結合した付随的なＥｒｂＢリガンドに依存して、異なる様式で活性化され得る。例えば、ＥｒｂＢ−リガンドである上皮成長因子（ＥＧＦ）は、通常の生理学的条件下で、ＥｒｂＢ４を活性化することなくＥｒｂＢ１ホモ二量体を強く活性化する（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９６）。対照的に、本発明の主題であるニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）は、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４ヘテロ二量体を強く活性化し、ＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ４ホモ二量体を弱く活性化し、そしてＥｒｂＢ１ホモ二量体を活性化しない。従って、特定の細胞がＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４を発現するシナリオでは、ＥｒｂＢシグナリングネットワークの異なる成分がリクルートされるので、ＥＧＦまたはＮＲＧ−４による活性化は非常に異なる応答をもたらし得る。
【０２２０】
本発明は、ＥｒｂＢリガンドファミリーの新規のメンバーであるＮＲＧ−４の第一の特徴付けを記載し、その構造、発現型および制限されたレセプター−結合特性は、独特の生理学的役割を示唆する。組み換えＮＲＧ−４を用いた遺伝子標的化およびインビトロ研究は、この成長因子の仮定された明確な生物学的役割および他のＥＧＦ／ＮＲＧファミリーリガンドとの関連性を解明し得る。従って、本発明は、以下のものを例示する。
【０２２１】
第一に、ＥｒｂＢ結合に必須のＥＧＦ様ドメインをコードする領域を含むマウスＮＲＧ−４の第一のｃＤＮＡ変異体の発見である。
【０２２２】
第二に、マウスゲノムＤＮＡの単離および特徴付けである。これは、上述のマウスｃＤＮＡにおいて見出された２つのエクソンを含み、そのうちの１つは、ＥＧＦ様ドメインの不変なアミノ−末端をコードするエクソンである。これらのエクソンの１つについてのイントロンエクソン境界は、プロトタイプのＮＲＧ−１遺伝子について見出されたものと同一であり、このことは、２つの遺伝子が祖先的に関連することを示す。ＮＲＧ−４がプロトタイプのＮＲＧ−１遺伝子の例に従っているのは事実であるに違いなく、それ故に、ＥＧＦ様ドメインの他のアイソフォームは、今まで通り、代替的にコードされるＣＯＯＨ−末端と共に存在すると思われる。
【０２２３】
第三に、ヒトＮＲＧ−４ｃＤＮＡ遺伝子の単離は、マウス配列への相同性が高い。
【０２２４】
第四に、ＮＲＧ−４のＥｒｂＢレセプターへの結合の特徴付けである。ＥｒｂＢ４レセプターに直接的に結合するＮＲＧ−４を表すのに種々のストラテジーが用いられたが、好ましくは、ＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ２ヘテロ二量体により活性化する。
【０２２５】
第五に、そのＥＧＦ様ドメインによりＮＲＧ−４結合を遮断するための薬理学的手段としてのＮＲＧ−４抗体の産生および中和の特徴付けである。
【０２２６】
第六に、このリガンドの筋肉、膵臓内における天然的役割に関与するＮＲＧ−４の発現プロファイルであり、これらの知見は、治療上の利益を有し得るこのリガンドの天然の生理学的役割を試験するための出発点の働きをする。
【０２２７】
非常に特異的でありかつ異常に制限されたＮＲＧ−４の結合プロファイルは、薬理学的および診断の目的の両方に利用され得る。
【０２２８】
追跡可能な合成／組み換えＮＲＧ−４−タギングされた分子は、ＮＲＧ−４を結合する細胞の測定が可能な診断手段として役立ち得る。例えば、発癌性ＥｒｂＢ２レセプターは、標準的化学療法プロトコルの後には寛解の機会が少ないと予測される乳癌患者におけるマーカーとして役立つ。しかしながら、多くの研究は、ＥｒｂＢ２が他のＥｒｂＢと共に共活性化する必要性を暗示している。従って、異なるＥｒｂＢと共にＥｒｂＢ２を共過剰発現する乳癌患者のサブグループの層別化は、十分に定義されていない。追跡可能なＮＲＧ−４−タギングされた分子は、これらのＥｒｂＢ２過剰エクスプレッサーがＥｒｂＢ４もまた共過剰発現するか否かを解明するための敏感な生理学的手段として役立つ。
【０２２９】
極度に限定されているが特異的なＮＲＧ−４のＥｒｂＢ−結合プロファイルは、ＮＲＧ−４に対する親和性を有する細胞に薬物を特異的に結合することができるＮＲＧ−４−タギングされた分子の産生に利用することができる。公知のＥｒｂＢレセプターのうち、本明細書中では、ＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインが、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ２を共発現する細胞にのみ高親和性で結合し得、おそらくＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４を共発現する細胞に対しては親和性の程度が低いことを示す。この極度に限定された結合プロファイルは、薬物を限定されたレパートリーの細胞に輸送することを可能にし、用いられる薬物の用量をより少なくすることができ、患者において一般的に毒性の副作用が起こる機会を限定することができる。例えば、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ２を共過剰発現する癌に罹った患者は、ＮＲＧ−４タギングされた薬物輸送ビヒクルの利益を受けることができる。
【０２３０】
極度に限定されているが特異的であるＮＲＧ−４のＥｒｂＢ結合プロファイルはまた、高親和性レセプターを発現し、前記高親和性レセプターにより活性化され得る少ないレパートリーの細胞を活性化するのにも利用され得る。成人の膵臓および筋細胞におけるＮＲＧ−４の発現は、ＮＲＧ−４が、発育中および成人の両方において、明確な生理学的プロセスを調節し得ることを示す。ヒトおよびマウスＮＲＧ−４の、特にＥＧＦコーディングドメイン内における高い保全は、ＮＲＧ−４の哺乳類における重要な役割をさらに暗示する。これらの生理活性は、バイオ医薬目的にさらに利用され得る。
【０２３１】
従って、本発明は、生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの分布の測定方法を提供する。この方法は、生物学的サンプルを標識されたポリペプチドと共にインキュベートすることにより行われ、それによって生物学的サンプル中のＥｒｂＢ−４レセプターの分布が測定されるが、前記ポリペプチドは、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４−５０位に少なくとも５０％相同性である。
【０２３２】
本発明は、ＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を及ぼす内因性タンパク質の調節障害と関連する疾患、症状または症候群を診断する方法をさらに提供し、前記内因性タンパク質は、ウィスコンシン配列解析パッケージのベストフィットソフトウェアを用い、スミスおよびウォーターマンのアルゴリズムを用いて、ギャップクリエイションペナルティ＝８およびギャップエクステンションペナルティ＝２で測定して、配列番号２または１５の少なくとも４−５０位に少なくとも５０％相同性である。前記方法は、サンプルを被検体から得る工程および前記サンプルを少なくとも１７塩基のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの少なくとも１つと共にインキュベートする工程により行われ、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、前記内因性タンパク質をコードするポリヌクレオチド鎖の一部とハイブリダイズ可能であり、それによってＥｒｂＢ−４レセプター活性に影響を及ぼす内因性タンパク質の調節障害と関連する疾患、症状または症候群を診断する。前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、好ましくは、ポリヌクレオチド鎖の部分に対向する配向で特異的にハイブリダイズ可能な一対のオリゴヌクレオチドまたはアナログを含み、それにより、核酸増幅反応において、少なくともそれらの一部が直接的に指数関数的に増幅される。
【０２３３】
本発明のさらに別の局面によれば、１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝的疾患がＮＲＧ４と関連するか否かを試験する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、遺伝的疾患を引き起こす少なくとも１つのアレルを有する個体と、アレルを含まない個体との間における配列の差異の有無を測定することにより行われ、ここで、配列に差異があれば、１５ｑ２５−２６にマッピングされた遺伝的疾患はＮＲＧ４と関連する。
【０２３４】
個体間における配列の差異の測定は、典型的には、シグナル増幅法または直接検出法のいずれかの使用を含み、その後少なくとも１つの配列変化を検出する。
【０２３５】
本発明の種々の好ましい実施態様によるシグナル増幅法は、例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を増幅することができる。本発明の一部として用いられ得るシグナル増幅法には、ＰＣＲ、ＬＣＲ（ＬＡＲ）、自助合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）またはＱ−Ｂｅｔａ（Ｑβ）レプリカーゼ反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
ＭｕｌｌｉｓおよびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングまたは精製することなく、ゲノムＤＮＡの混合物中で標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法である。この技術は、標的配列の濃度が低いという問題への１つのアプローチを提供する。ＰＣＲは、標的の濃度を容易に検出可能なレベルまで直接的に増加させるのに用いることができる。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、それらの二重鎖標的配列の対応する鎖に対して相補的である２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に対して過剰モル量で導入することを含む。混合物を変性し、次いでハイブリッド形成する。ハイブリッド形成後、プライマーをポリメラーゼで伸長し、相補鎖を形成する。比較的高濃度な所望の標的配列のセグメントを得るために、変性、ハイブリッド形成（アニーリング）およびポリメラーゼ伸長（伸長）の工程を必要な回数繰り返してもよい。
【０２３７】
所望の標的配列のセグメントの長さは、プライマーの互いの相対位置により測定されるので、この長さは、コントロール可能なパラメータである。標的配列の所望のセグメントは、混合物中で優位な配列となるので（濃度に関して）、「ＰＣＲ増幅された」といわれる。
【０２３８】
Ｂａｒａｎｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８：  １８９  （１９９１）；  Ｂａｒａｎｙ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．，  １：  ５  （１９９１）；およびＷｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：  ５６０  （１９８９）に記載のリガーゼ連鎖反応［ＬＣＲ；「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲ）と呼ばれることもある］は、核酸を増幅するためのよく知られた代替方法となった。ＬＣＲでは、４つのオリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡの１つの鎖に独特にハイブリッド形成する２つの隣接するオリゴヌクレオチドおよび対向する鎖にハイブリッド形成する隣接するオリゴヌクレオチドの相補な組を混合し、この混合物にＤＮＡリガーゼを添加する。ただし、完全な相補性が隣接する場合、リガーゼは、ハイブリッド形成された分子の組のそれぞれに共有結合するであろう。重要なことであるが、ＬＣＲにおいては、２つのプローブが標的サンプル中の配列を有する塩基対である場合のみ、それらをギャップまたはミスマッチなしで共に結合する。変性の繰り返しサイクルおよび連結は、ＤＮＡの短いセグメントを増幅する。ＬＣＲもまたＰＣＲと組み合わせて用いられ、単一塩基の変化の検出を強化することを達成する。ＳｅｇｅｖのＰＣＴ公開公報Ｗ０９００１０６９  Ａｌ  （１９９０）。しかしながら、このアッセイで用いられる４つのオリゴヌクレオチドは対になって２つの短く結合可能なフラグメントを形成し得るので、標的に依存しないバックグラウンドシグナルを産生する可能性がある。ＬＣＲの変異体スクリーニングへの使用は、特異的核酸の位置の検査に限定される。
【０２３９】
自助配列複製反応（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：  １８７４−１８７８，１９９０）（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：  ７７９７，１９９０は誤記である）は、転写に基づくインビトロ増幅システム（Ｋｗｏｋ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８６：  １１７３−１１７７，１９８９）であり、単一の温度でＲＮＡ配列を指数関数的に増幅することができる。増幅されたＲＮＡは、次いで、変異体検出のために用いることができる（Ｆａｈｙ  ら，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．  Ａｐｐｌ．，  １：  ２５−３３，１９９１）。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ファージ  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを目的とする配列の５′末端に添加する。酵素ならびに第２のプライマー、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む基質を含むカクテルにおいて、標的配列は、数回繰り返される転写を受けて、ｃＤＮＡを合成および第２の鎖を合成して、目的とする領域を増幅する。変異を検出するための３ＳＲの使用は、運動学的に、ＤＮＡの小さいセグメント（例えば、２００−３００塩基対）に限定される。
【０２４０】
Ｑ−Ｂｅｔａ（Ｑβ）レプリカーゼ法では、目的の配列を認識するプローブを、Ｑβについての複製可能なＲＮＡテンプレートに結合させる。ハイブリッド未形成のプローブの複製から生じる誤ったポジティブについての従来から認識されていた主要な問題は、配列特異的な連結工程を使用することによって取り組まれてきた。しかしながら、入手可能な熱安定性ＤＮＡリガーゼはこのＲＮＡ基質上で効果的ではないので、連結は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより低温（３７℃）で行わなければならない。これは、ＬＣＲにおける特異性（ｓｐｅｃｉｆｉａｓ）の達成手段として高温を用いることを避け、連結事象は結合部位における変異を検出するのに用いられ得るが、他の場合には用いられない。
【０２４１】
首尾良い診断方法は、非常に特定されるに違いない。核酸ハイブリッド形成の特異性をコントロールする直接的な方法は、反応温度をコントロールすることである。３ＳＲ／ＮＡＳＢＡおよびＱβシステムは全て、多量のシグナルを産生することができるが、それぞれに関与する１以上の酵素は、高温（すなわち、５５℃を超える）で用いることはできない。それ故、プローブの非特異的ハイブリッド形成を防ぐためには、反応温度を上げることはできない。プローブを、それらが低温で容易に溶融するように短縮する場合は、複雑なゲノムにおける１より多い完全なマッチ（ｍａｔｃｈ）を有する可能性が増大する。これらの理由により、ＰＣＲおよびＬＣＲは、現在のところ、検出技術における研究分野で最も有力である。
【０２４２】
ＰＣＲおよびＬＣＲにおける増幅手順の基本は、１つのサイクルにおける産物が全ての引き続くサイクルにおける有用なテンプレートとなり、結果的に各サイクルにおいて数を連続的に倍化させるという事実である。このような倍化システムの最終収量は、次のように表すことができる：（１＋Ｘ）ｎ  ＝ｙ（式中「Ｘ」は平均効率（各サイクルでコピーされた割合）であり、「ｎ」はサイクル数、および「ｙ」は全体効率または反応収率である（Ｍｕｌｌｉｓ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．，  １  ：  １，  １９９１）。標的ＤＮＡの全てのコピーがポリメラーゼ連鎖反応の全サイクルでテンプレートとして用いられる場合、平均効率は１００％である。ＰＣＲの２０サイクルが実行される場合、収量が２２０、すなわち出発物質のコピーが１，０４８，５７６個である。反応条件が平均効率を８５％に低下させた場合、これら２０サイクルの収量は、１．８５２０のみ、すなわち出発物質のコピーが２２０，５１３個である。言い換えると、８５％効率で実行するＰＣＲは、１００％効率で実行する反応と比較して最終産物がわずか２１％しかないということである。平均効率を５０％まで低下させた反応は、１％未満の可能な産物を産生する。
【０２４３】
実際は、慣用のポリメラーゼ連鎖反応で理論的最大収率を達成することは稀であり、ＰＣＲは、通常、低収率を補うために２０より多いサイクルで実行される。５０％平均効率において１００万倍の増幅を達成するためには３４サイクルを必要とし（理論的には２０サイクルで可能）、低い効率においては、必要とされるサイクルの数はひどく多くなる。加えて、意図する標的よりも良好な平均効率で増幅するいかなるバックグラウンド産物も、優位な産物となる。
【０２４４】
多くの変数もまた、ＰＣＲ平均効率に影響を及ぼし得、これには、標的ＤＮＡの長さおよび第２の構造、プライマーの長さおよびデザイン、プライマーおよびｄＮＴＰの濃度、および緩衝液組成物が挙げられるが少ない。外因性ＤＮＡによる反応の汚染（例えば、研究室の表面にこぼれたＤＮＡ）または交差汚染もまた主な懸念である。反応条件は、異なるプライマー対および標的配列毎に慎重に最適化されるべきであり、このプロセスは、経験を積んだ研究者でも数日を要することがある。多数の技術的考慮および他の要因を含むこのプロセスの困難性は、臨床の環境でＰＣＲを用いるにあたって重大な欠点を示す。事実として、ＰＣＲは、未だに臨床の市場に著しく浸透してはいない。ＬＣＲは、標的配列毎に、異なるオリゴヌクレオチド配列を用いるために最適化されなければならないので、同様の懸念は、ＬＣＲにおいても生じる。加えて、いずれの方法も、正確な温度サイクリングが可能な高価な装置を必要とする。
【０２４５】
アレル変異の研究のような多くの核酸検出技術の用途は、複雑なバックグラウンドにおける特異的配列の検出だけでなく、少数または単一のヌクレオチドの差異を有する配列の分別においても用いられる。ＰＣＲによるアレル特異的変異体の検出の１つの方法は、テンプレート鎖とプライマーの３′末端との間にミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が存在する場合、ＴａｑポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成するのが難しいという事実に基づいている。アレル特異的変異体は、１つの可能なアレルのみと完全にマッチするプライマーを用いることにより検出され得る；他のアレルへのミスマッチは、プライマーの伸張を防いで、それによりこの配列の増幅を防ぐ。この方法は、ミスマッチの塩基組成物がミスマッチを横切って伸張を防ぐ能力に影響を与え、特定のミスマッチは伸張を防がないかまたは最小の効果しか有しないという点で、実質的に限定される（Ｋｗｏｋ  ら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：  ９９９，１９９０）。
【０２４６】
ＬＣＲにおける連結を防ぐ効果がずっと大きい類似の３′−ミスマッチストラテジーが用いられる（Ｂａｒａｎｙ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．  Ａｐｐｌｉｃ．，  １：  ５，１９９１）。いかなるミスマッチも、熱安定性リガーゼの作用を効果的に遮断するが、ＬＣＲは、標的非依存性のバックグラウンド連結産物が増幅を開始するという欠点を有する。さらに、ＰＣＲと引き続くＬＣＲとの組み合わせにより目的の位置でヌクレオチドを同定することも、臨床研究室にとっては厄介な問題である。
【０２４７】
本発明の種々の好ましい実施態様による直接検出方法は、例えば、サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）または分岐鎖ＤＮＡ分析であり得る。
【０２４８】
検出されるべき十分な量の核酸が入手可能な場合は、標的のコピー（例えば、ＰＣＲおよびＬＣＲにおけるような）がより多く作られる代わりに、配列が直接的に検出されるという利点を有する。最も留意すべきは、シグナルを指数関数的に増幅しない方法は、定量分析においてより扱いやすいことである。単一のオリゴヌクレオチドに結合した複数の染料によってシグナルが増強される場合でさえも、最終シグナル強度と標的の量は直接的に相関する。このようなシステムは、反応の産物がそれ自身ではさらなる反応を促進しないので、前記産物による研究室表面の汚染について大して懸念しなくてよいというさらなる利点を有する、直接的な検出の従来の方法には、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）およびサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）のバンドＲＮａｓｅ保護アッセイが挙げられるが、この方法は、通常は放射活性の使用を必要とし、自動化するには扱いにくい。最近考案された技術では、放射活性の使用をやめようと試みているおよび／または自動化可能なフォーマットの感度を改善しようと試みている。２つの例は、「サイクリングプローブ反応」（ＣＰＲ）および「分岐鎖ＤＮＡ」（ｂＤＮＡ）である。
【０２４９】
サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）（Ｄｕｃｋ  ら，  ＢｉｏＴｅｃｈ．，  ９：  １４２，１９９０）は、中心部分がＲＮＡからなり２つの末端はＤＮＡからなる長いキメラオリゴヌクレオチドを用いる。プローブの標的ＤＮＡへのハイブリッド形成および熱安定性ＲＮａｓｅ  Ｈへの曝露は、ＲＮＡ部分の分解を引き起こす。このことは、二重らせん中に残存するＤＮＡ部分を不安定化して、標的ＤＮＡからのプローブの残りを放出し、他のプローブ分子にこのプロセスを繰り返させる。シグナルは、切断したプローブ分子の形態で、直線的速度で蓄積する。この繰り返しのプロセスは、シグナルを増大させるが、オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分はＲｎａｓｅにより損傷されやすく、この損傷はサンプル調製により起こり得る。
【０２５０】
Ｕｒｄｅａ  ら，  Ｇｅｎｅ  ６１：  ２５３−２６４  （１９８７）記載の分岐鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）は、分岐鎖構造のオリゴヌクレオチドを含み、これにより各被検体オリゴヌクレオチドは３５〜４０標識を有する（例えば、アルカリホスファターゼ酵素）。一方、このことは、ハイブリッド形成事象からのシグナルを増強し、非特異性結合からのシグナルもまた同様に増強される。
【０２５１】
本発明の種々の好ましい実施態様による少なくとも１つの配列変化の検出は、例えば、制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰ分析）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、単鎖コンフォメーション多形（ＳＳＣＰ）分析またはジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）により達成することができる。
【０２５２】
特異的核酸配列および配列変化を検出する方法への要求は、臨床診断において急速に増えている。ヒトおよび病原性生物からの遺伝子の核酸配列についてのデータが蓄積されるにつれ、迅速で、コストが効率的でありかつ特異的配列におけるさらなる変異への使用が容易な試験への要求が急速に増えている。
【０２５３】
変異の核酸セグメントをスキャンするために一握りの方法が考案された。１つの選択肢は、各試験サンプルの完全な遺伝子配列を決定することである（例えば、細菌の単離）。約６００ヌクレオチド未満の配列については、この方法は、増幅された物質（例えば、ＰＣＲ反応産物）を用いて達成され得る。これは、目的とするセグメントのクローニングに関連する時間および費用を避ける。しかしながら、特別な装置および高度に訓練された職員が必要であり、かつ、この方法は多大な労力がかかり、臨床環境で実用的かつ効果的に行うための費用もかかる。
【０２５４】
配列決定に関する困難性の観点から、所定の核酸セグメントは、いくつかの他のレベルで特徴付けされ得る。最も低い解像度では、分子サイズは、同じゲルにおける公知の標準的な実行との比較による電気泳動により測定され得る。分子のより詳細な様子は、電気泳動の前に制限酵素の組み合わせにより切断してマップを構築することにより達成され得る。フラグメント内での特異的配列の存在は、標識プローブのハイブリッド形成にて検出されるか、あるいは、正確なヌクレオチド配列は、部分的化学分解により、または鎖終結ヌクレオチドアナログの存在でプライマー延長することにより測定され得る。
【０２５５】
同様の配列間で単一の塩基の差異を検出するために、分析ではしばしば最高レベルの解像度が必要とされる。問題とするヌクレオチドの位置が予め分かっている場合には、直接的に配列決定することなく単一の塩基の変化を試験するための方法がいくつか開発されている。例えば、目的とする変異が制限認識配列内に偶然に入っている場合、分解の型の変化を、診断の手段として用いることができる（例えば、制限フラグメント長多形［ＲＦＬＰ］分析）。
【０２５６】
単一の位置の変異もまた、ＲＦＬＰの変異の発生または破壊により検出されてきた。変異は、ミスマッチにおける、ＲＮＡフラグメントにより産生する切断の存在およびサイズにより検出され突き止められた。ＤＮＡヘテロ二重鎖における単一のヌクレオチドミスマッチもまた、いくつかの化学物質によって認識かつ切断され、「ミスマッチ化学切断（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅ、ＭＣＣ）」と呼ばれる単一の塩基の置換を検出するための代替のストラテジーを提供する（Ｇｏｇｏｓ  ら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：  ６８０７−６８１７，１９９０）。しかしながら、この方法は、臨床研究室での使用には適さない高毒性の２つの化学物質である三酸化オスミウムおよびピペリジンの使用を必要とする。
【０２５７】
ＲＦＬＰ分析は、感度が低く多量のサンプルが必要とされるという難点を有する。ＲＦＬＰ分析は、位置の変異の検出に用いる場合、その性質により、公知の制限エンドヌクレアーゼの制限配列の範囲内の単一の塩基変化のみの検出に限定される。さらに、主要な入手可能な酵素は、４〜６の塩基対認識配列を有し、多くの大規模ＤＮＡ操作にとっては切断が多すぎる（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ  （ｅｄｓ．），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ２，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  １９８８）。従って、この方法は少量の場合のみ適用できるが、ほとんどの変異はそのような範囲内の部位には入らない。
【０２５８】
８塩基対特異性を有する一握りのレアカッティング（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限酵素が単離され遺伝マッピングに広く用いられてきたが、これらの酵素は数が少なく、Ｇ＋Ｃに富む配列の認識に限られ、高度にクラスター化する傾向のある部位を切断する（Ｂａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌｅｈｒａｃｈ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，  ３：  １６７，１９８７）。近年、グループＩイントロンによりコードされるエンドヌクレアーゼが発見され、これはおそらく１２より多くの塩基対特異性を有するが（Ｐｅｒｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｔｏｗ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：  １１０６，１９８９）これもまた数が少ない。
【０２５９】
変化が認識配列内ではない場合、アレル特異的オリゴヌクレオチド  （ＡＳＯ）を突然変異したヌクレオチドの近位にハイブリッド形成するよう設計することができ、その結果、プライマー伸張または連結事象をマッチまたはミスマッチの指標として用いることができる。放射活性標識されたアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によるハイブリッド形成もまた特異的位置の変異の検出に適用される（Ｃｏｎｎｅｒ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８０：  ２７８−２８２，１９８３）。この方法は、単一ヌクレオチドが異なる短いＤＮＡフラグメントの融解温度の差異に基づいている。ストリンジェントなハイブリッド形成および洗浄条件により、変異体と野生型アレルを区別することができる。ＰＣＲ産物に適用されるＡＳＯアプローチもまた、遺伝子の位置変異を検出および特徴付けるために種々の研究者により広く用いられてきた（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ら，  Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３１９：  ５２５−５３２，１９８８；およびＦａｒｒ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８５：  １６２９−１６３３，１９８８）およびｇｓｐ／ｇｉｐ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ（Ｌｙｏｎｓ  ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  ６５５−６５９，１９９０）。複数の位置における種々のヌクレオチドの変化が存在することにより、ＡＳＯ法は、全ての可能性のある発癌性変異をカバーするために、多くのオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。
【０２６０】
上記の技術のいずれ（すなわち、ＲＦＬＰおよびＡＳＯ）を用いる場合にも、試験に先立って、疑いのある変異の正確な位置が知られていなければならない。すなわち、目的とする遺伝子または配列内の変異の存在を検出する必要がある場合には、これらの技術は適用できないということである。
【０２６１】
２つの他の方法は、少数の配列変化に対応した電気泳動の移動度における変化の検出による。「変性勾配ゲル電気泳動」（ＤＧＧＥ）と呼ばれるこれらの方法のうちの１つは、わずかに異なる配列を勾配ゲル上で電気泳動的に分割した場合に、異なる型の局所的溶融を示すという観察に基づく。この様式によれば、変異体は、ヘテロ二重鎖に対するホモ二重鎖の溶融特性の差異として検出され得、単一のヌクレオチドにおける差異により、標的配列の変異を検出することができるが、これは電気泳動移動度におけるそれらの対応する変化による。分析されるべきフラグメントは、通常はＰＣＲ産物であるが、Ｇ−Ｃ塩基対（３０−８０）の長いストレッチの片方の末端に「クランプ（ｃｌａｍｐｅｄ）」されて、完全に鎖が解離することなく、目的とする配列が完全に変性する。ＧＣのＤＮＡフラグメントへの結合である「クランプ」は、ＤＧＧＥにより認識され得る変異の割合を増加させる（Ａｂｒａｍｓ  ら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７：  ４６３−４７５，１９９０）。ＧＣクランプの１つのプライマーへの結合は、増幅された配列が低い解離温度を有することを確認するのに重要である（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８６：  ２３２−２３６，１９８９；およびＬｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５５：  ４８２−５０１，  １９８７）。温度勾配を用いたこの技術の改変もまた開発されており（Ｗａｒｔｅｌｌ  ら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：  ２６９９−２７０１，１９９０）、この方法もまたＲＮＡ：  ＲＮＡ二重鎖に適用され得る（Ｓｍｉｔｈ  ら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３：  ２１７−２２３，１９８８）。
【０２６２】
ＤＧＧＥの有用性が限定されることは、変性条件を、試験されるＤＮＡの型毎に最適化する必要性を含む。さらに、この方法は、ゲルの調製のためおよび電気泳動の間に必要な高温を維持するための特別な装置を必要とする。試験されるべき各配列毎にオリゴヌクレオチドのクランプ末端を合成することに関する費用もまた、主な懸念である。加えて、ＤＧＧＥには長い実行時間が必要とされる。ＤＧＧＥの長い実行時間は、一定変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）と呼ばれるＤＧＧＥの改変により短縮された（Ｂｏｒｒｅｎｓｅｎ  ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  ８４０５，１９９１）。ＣＤＧＥは、変異の検出を高効率で達成するために、このゲル電気泳動が異なる変性条件下で行われることを要する。
【０２６３】
ＤＧＧＥに類似の技術である、区間温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）は、化学変性剤の勾配ではなく温度勾配を用いる（Ｓｃｈｏｌｚ，  ら，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：  ２１５５，１９９３）。ＴＧＧＥは、電場に対して垂直に配向する温度勾配を生じ得る特別な装置の使用を必要とする。ＴＧＧＥは、ＤＮＡの小さいフラグメントにおける相対的な変異を検出するので、大きな遺伝子セグメントのスキャンニングには、ゲル電気泳動に先立って複数のＰＣＲ産物を使用することが必要である。
【０２６４】
「単鎖コンフォメーション多形（ＳＳＣＰ）」と呼ばれる他の一般的な方法は、Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｓｅｋｙａおよび共同研究者により開発され（Ｈａｙａｓｈｉ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．  Ａｐｐｌ．，  １：  ３４−３８，１９９１により概説）、この方法は、核酸の単鎖が非変性条件で特徴的なコンフォメーションをとり得、これらのコンフォメーションが電気泳動移動度に影響を与えるという観察に基づく。相補鎖は、１つの鎖が他の鎖から分離できるのに十分に異なる構造を有すると仮定される。フラグメント中での配列の変化もまたコンフォメーションを変え、結果として移動度を変え、そしてこの方法を配列改変のためのアッセイに用いることが可能になる。（Ｏｒｉｔａ，  ら，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：  ８７４−８７９，１９８９）．
【０２６５】
ＳＳＣＰプロセスは、両方の鎖上で標識されたＤＮＡセグメント（例えば、ＰＣＲ産物）の変性およびその後の非変性ポリアクリルアミドゲル上での遅い電気泳動分離を含み、その結果、分子内相互作用が形成し得、かつ実行の間に妨害されない。この技術は、ゲル組成物および温度の変化に極度に感受性である。この方法の重大な制限は、見かけ上類似する条件下で異なる研究室において作成されたデータを比較するのが比較的難しいことである。
【０２６６】
ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）は、遺伝子における変異の存在についてスキャンするために開発されたもう１つの技術である（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉ．，  ４：  ９７，１９９４）。ｄｄＦ技術は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ配列決定の要素とＳＳＣＰとを組み合わせている。ジデオキシ配列決定は、１つのジデオキシ終結剤を用い、次いで、反応産物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、ＳＳＣＰ分析におけるような終結セグメントの移動性の変化を検出する。ｄｄＦは、感度が増大するという点ではＳＳＣＰに比べて改善されているが、ｄｄＦは高価なジデオキシヌクレオチドの使用を必要とし、この技術はまだ、ＳＳＣＰに適切なサイズのフラグメントの分析に限定されている（すなわち、変異の最適な検出のために、２００〜３００塩基のフラグメント）。
【０２６７】
上記限定に加えて、これらの方法は全て、分析され得る核酸フラグメントのサイズについて限定されている。直接的に配列決定するアプローチについては、６００塩基対を超える配列は、全フラグメントをカバーするために、連続する遅延および欠失サブクローニングまたはプライマーウォーキングのいずれかの費用が伴うクローニングを必要とする。ＳＳＣＰおよびＤＧＧＥは、より厳しいサイズの限定を有する。配列変化への感度が低減するため、これらの方法は、より大きなフラグメントについては適切とは考えられていない。ＳＳＣＰは、２００塩基対のフラグメント内で９０％の単一塩基置換を検出できることが報告されているが、４００塩基対フラグメントについては、検出は５０％未満である。同様に、ＤＧＧＥの感度は、フラグメントの長さが５００塩基対に到達するにつれて低下する。直接配列決定とＳＳＣＰとの組み合わせとしてのｄｄＦ技術もまた、スクリーニングされ得る比較的小さいサイズのＤＮＡに限定される。
【０２６８】
本発明の現在好ましい実施態様によれば、上記に列挙した遺伝子のいずれか（例えば、腫瘍細胞または癌患者由来細胞における還元葉酸担体（ＲＦＣ）遺伝子等）の変異（単数または複数）を調査する工程は、単一鎖コンフォメーション多形（ＳＳＣＰ）技術（例えば、ｃＤＮＡ−ＳＳＣＰまたはゲノムＤＮＡ−ＳＳＣＰ）を用いて行われる。しかしながら、代替の方法を用いることができ、これには以下の方法が挙げられるが、これらに限定されない：核酸配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、自助合成反応、Ｑβ−レプリカーゼ、サイクリングプローブ反応、分岐鎖ＤＮＡ、制限フラグメント長多形分析、ミスマッチ化学切断、ヘテロ二重鎖分析、アレル特異的オリゴヌクレオチド、変性勾配ゲル電気泳動、一定変性ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動およびジデオキシフィンガープリンティング。
【０２６９】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、以下の実施例を試験することにより当業者に明らかになるが、前記実施例は限定することを意図していない。加えて、本明細書で上述したおよび特許請求の範囲の章中で請求した種々の実施態様および本発明の局面のそれぞれは、以下の実施例において実験的サポートが見出される。
【０２７０】
実施例
以下の実施例を、本発明を非限定的な様式で例示した上記記載と共にここで参照する。
【０２７１】
本明細書中で用いられる命名法および本発明で用いられる実験手順は、分子、生化学、微生物学的および組み換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、以下の文献中で詳細に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ら，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．（１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ら，  “  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ら，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ら（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；  米国特許第４，６６６，８２８号；  同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；  同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．（１９９４），  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．（１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ら（ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）を参照のこと。利用可能なイムノアッセイは、以下の特許および科学文献にさらに記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；���Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．（１９８５）；  “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．（１９８４）；  “Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．，  ｅｄ．  （１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，（１９８４）  ａｎｄ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ      Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ  ら，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；を参照のこと。これら全ては、その全てが本明細書中に記載されたのと同様に本明細書中で参考として援用される。他の一般的な参考文献は、この書類を通して提供される。本明細書記載の手順は当分野で周知であり、読者の便宜のために提供される。本明細書中に含まれる全ての情報は、参考として援用される。
【０２７２】
材料および実験方法
材料：
ＥＧＦ（ヒト、組み換え）は、ベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）より購入した。組み換えヒトＮＤＦβ１  ｌ７７  ２４６（ＮＲＧ−１−βｌ）は、アムジェン社（Ａｍｇｅｎ）（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，  ＣＡ）より得た。ヨードゲンおよびビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸（ＢＳ３）は、ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）より得た。ＥｒｂＢタンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（Ｃｈｅｎ  ら，  １９９６；  Ｋｌａｐｐｅｒ  ら，  １９９７）は、免疫沈降に用いた。緩衝溶液の組成物は、Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９４に記載されていた。ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分を含む融合タンパク質の形態の、組み換えの可溶性の４つのＥｒｂＢタンパク質細胞外ドメイン（ＩｇＢ−１〜４と示す）（Ｃｈｅｎ  ら，  １９９６）は、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３ヒト胚性腎細胞の血清非含有培地から採取した。ＰＹ２０抗体は、サンタクルズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）より購入した。ＭＡＰキナーゼの活性形態に対するｍＡｂ（Ｙｕｎｇ  ら，  １９９７）は、イスラエルのワイズマンインスティテュート（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｓｒａｅｌ）のＲ．セジャー氏（Ｒ．  Ｓｅｇｅｒ）より贈呈された。
【０２７３】
ペプチド合成  ：
ＮＲＧ−４のマウスＥＧＦ様ドメイン（４〜５０残基、配列番号２）は、Ｂａｒｂａｃｃｉ  ら，  １９９５に記載の標準的ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）化学プロトコルを用いて、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ＡＢＩ）４３０Ａペプチドシンセサイザーにて合成した。それぞれの活性化エステル結合後に、無水酢酸キャッピングを行った。ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−シクロヘキシル）およびｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−シクロヘキシル）を用いる以外は標準的な側鎖保護を用いて、ペプチドをフェニルアセトアミドメチルポリスチレン樹脂上で組み立てた。ペプチドを、「低−高」フッ化水素酸（ＨＦ）法（Ｔａｍ  ら，  １９８３）を用いて脱保護した。未精製のＨＦ生成物を、逆相ＨＰＬＣにより精製し（Ｃ−１８  Ｖｙｄａｃ，  ２２  ｘ  ２５０  ｍｍ）、乾燥することなく折り畳み溶液（１Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ８．０、１．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．７５ｍＭ還元グルタチオン、１０ｍＭメチオニン）中で希釈し、４℃にて４８時間撹拌した。折り畳まれた完全に酸化したペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより折り畳み混合物から精製し、電子スプレーマススペクトルにより特徴付けた。還元されたペプチドは、折り畳みの前に、平均分子質量（Ｍｒ）５３７１．５０を有する単一のＨＰＬＣピークを示した。この質量は、理論的Ｍｒ（５３７１．２０）と一致する。折り畳まれたおよび酸化されたペプチドは、わずかに低い分子質量５３６６．８８を示した。
【０２７４】
データベース調査：
ユニックスインターフェースドＧＣＧサーバ（Ｕｎｉｘ（登録商標）−ｉｎｔｅｒｆａｃｅｄ  ＧＣＧ  ｓｅｒｖｅｒ）およびバイオアセレレーター装置（コンプジェン社、イスラエル（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、Ｉｓｒａｅｌ））の両方を用いて、ブラスト（Ｂｌａｓｔ）およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）のアルゴリズム（Ｓａｍｕｅｌ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０；  Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  １９８１）により、ＮＲＧ−ｌβ（ＮＤＦ−β）のＥＧＦ様ドメインの相同性についてＥＳＴデータベースをスキャンした。得られたクローン（受託番号ＡＡ２３８０７７（マウス）およびＡＩ７４３１１８（ヒト））を、公開された配列の正確さを確認するため、およびＥＳＴデータベースで公開されたクローンの配列を延長するため、二方向に配列決定した。オープンリーディングフレームへの見かけ上の挿入を含むヒトＥＳＴクローンの場合、ＲＴ−ＰＣＲ（以下を参照）により、この挿入を含むことなく変異体を取り出すために、ＰＣＲプライマーを作製した。
【０２７５】
ゲノムのスクリーニング：
予測されるＮＲＧ−４のエクソン６を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを合成し、マウス株１２９に由来するＰ１ゲノムのライブラリをスクリーニングするのに用いた。単一のポジティブＰ１クローンを同定し、引き続いて、ショットガン連結（ｓｈｏｔｇｕｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によりサブクローン化し、エクソン６ポジティブなブルースクリプトインテグラント（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を同定した。１０Ｋｂ挿入を含む１つのこのようなベクターをマッピングし、部分的に配列決定して、エクソン５およびエクソン６配列を明らかにした。
【０２７６】
ＲＴ  ＰＣＲ：
全ＲＮＡを、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株（トリゾル（ＴＲＩＺＯＬ）試薬）から抽出した。全ＲＮＡの５μｇをテンプレートとして、５００μｇ／ｍｌのオリゴ−（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして用い（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬスーパースクリプトキット（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｋｉｔ）；（オリゴ）Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ）、ｃＤＮＡ由来のｍＲＮＡを誘導した。順５′−ＣＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＣ−３′（配列番号１６）および逆５′−ＡＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣＧ−３′（配列番号１７）オリゴヌクレオチドを、ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）のエクスパンド（Ｅｘｐａｎｄ）（登録商標）ハイフィデリティ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲ増幅システムにより、会社が推奨する増幅条件および６８℃のアニーリング／伸長温度を用いて、ＮＲＧ−４プライマーとして合成した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で流出させた。予測された移動度のバンドを、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７細胞の両方から同定し、配列決定の前に、抽出しｐＧＥＭＴ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））中にサブクローン化した。公開されたヒトＮＲＧ−４配列は、２つの独立したＰＣＲ反応から同一であることがわかった。
【０２７７】
ノーザンブロット：
ノーザンブロットフィルターを、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より購入し（ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ  ７７６０１番）、各レーンは、健康なヒト組織由来の約２μのポリ（Ａ）＋精製ｍＲＮＡを含み、変性１．２％ホルムアルデヒド／アガロースゲル上に流出された。ｃＤＮＡプローブへの、およびマウスＮＲＧ−４およびヒトβ−アクチンへのハイブリッド形成は、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ」を用い、製造者により提供されるプロトコルを用いて行われた。ヒトアミラーゼｃＤＮＡプローブを用いたプロービングは、標準的な技術を用いて行われた。各ハイブリッド形成後、ブロットを、室温にて、４０分にわたって、低ストリンジェンシー洗浄溶液（２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ）を何回か取り替えて洗浄し、次いで、５０℃にて、４０分にわたって、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を少なくとも２回取り替えて洗浄した。
【０２７８】
ウエスタンブロット分析用のライセート調製物：
レセプター活性化の研究のために、３２Ｄ細胞株の誘導体をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして２２℃にて１５分にわたってインキュベートし、その後、成長因子を加えて３７℃にて５分にわたってインキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、氷冷した可溶化緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ−４０、０．５％  Ｎａ−デオキシコレート、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  Ｎａ−オルトバナジン酸、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１０μｇ／ｍｌロイペプチン］中に溶解し、氷上に１５分間置いた。次いで、全細胞抽出物を、遠心分離によりクリアーし（１０分間、４℃にて１２，０００×ｇで）、還元したゲルサンプル緩衝液中ですぐに沸騰させ、ニトロセルロースに移す前に１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分離した。フィルターを、牛乳を１％含むＴＢＳＴ緩衝液（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で４０分にわたって２２℃にてブロックし、ＴＢＳＴ中の第１の抗体を用いて、一晩４℃にてブロッティングし、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した第２の抗体（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．））と組み合わせ、化学発光により引き続いて検出した。
【０２７９】
リガンドの放射標識、共有結合架橋およびリガンドの置換分析：
成長因子を、Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ  ら，  １９９５に記載のように、ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）のヨードジェン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）で標識した。異なるＥｒｂＢの組み合わせを発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への化学架橋を、実質的にＴｚａｈａｒ  ら，  １９９６記載の通りに行った。簡潔には、放射標識された（１００  ｎｇ／ｍｌにて）リガンドを、２時間にわたって、細胞単層を用いて、４℃にてインキュベートした。次いで、化学架橋剤ＢＳ３（１  ｍＭ）を加え、細胞を、４５分間にわたって２２℃にてさらにインキュベートした。マウス抗体を、まずウサギ抗マウスＩｇＧに結合させ、タンパク質Ａ−セファロースビーズに結合させ、次いでこれらを細胞抽出物にて２時間にわたって４℃にてインキュベートした。次いで、免疫沈降化複合体を、氷冷ＳＢＮ緩衝液（１％ＮＰ−４０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中、ｐＨ７．４；１洗浄当たり１ｍｌ）で３回洗浄し、ゲルサンプル緩衝液中で加熱（５分間９５℃にて）し、ゲル電気泳動により分解し、ニトロセルロースに移し、オートラジオグラフィに供した。ＩｇＢでの架橋については、ＩｇＢを含む条件付け培地と放射標識されたリガンドとを共インキュベーションした後、複合体をセファロース−タンパク質Ａビーズを用いて直接的に免疫沈降させた。リガンド置換分析については、細胞単層を結合緩衝液で１回洗浄し、次いで放射標識されたＮＲＧ−ｌβ（５ｎｇ／ｍｌ）および示される種々の濃度の標識されたリガンドを用いて、２時間にわたって４℃にてインキュベートした。非特異性結合を、１００倍モル過剰の未標識リガンドの存在下で測定した。次いで、細胞を洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中に溶解させ、γ線計数器により放射活性を測定した。
【０２８０】
抗体の産生およびスクリーニング：
２匹のウサギ（３９１９番および３９２０番）を、５回の注射のプロトコル（各注射につき１０μｇ／ウサギのペプチド、および第一の注射についてはフロイントの完全アジュバントおよび引き続く注射についてはフロイントの不完全アジュバントを用いる）により、マウスＮＲＧ−４  ＥＧＦ様ドメインをコードする再折り畳み合成ペプチドに対して免疫化した。クリアされた血清を、ＮＲＧ−４に対する結合について以下の実験により試験した：２匹のウサギ由来の血清および免疫前血清（３９１９番）、非特異的ウサギ抗血清（抗Ｅｒｋ−１β；ワイズマンインスティテュートのロニー・セジャー博士（Ｄｒ．  Ｒｏｎｎｙ  Ｓｅｇｅｒ、ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より贈呈された）およびＩｇＢ１条件付け培地を、タンパク質−Ａセファロースビーズ上に、３０分間にわたって、４℃にて、１  ｍｌおよび１０μｌ血清／条件付け培地で、予め吸収させた。次いで、ビーズをＨＮＴＧ中で３回洗浄し、次いでＨＮＴＧ＋０．１％ＢＳＡ中で４℃にて３０分にわたってブロックした。ペレットをスピンダウンし、５μｌの１２５Ｉ−放射標識されたＥＧＦまたはＮＲＧ−４と共に０．２  ｍｌ  ＨＮＴＧ中に再懸濁し、これらを２時間にわたって４℃にてインキュベートし、次いでＨＮＴＧ中で４回洗浄し、タンパク質サンプル緩衝液中で沸騰させ、７．５％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分解した。ゲルを乾燥し、シグナルをフギ社（Ｆｕｇｉ）のホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）により観察した。
【０２８１】
細胞増殖アッセイ  ：
ＥｒｂＢタンパク質の全ての組み合わせを発現する一連のインターロイキン３（ＩＬ−３）−依存性３２Ｄ骨髄細胞の確立は、Ａｌｉｍａｎｄｉ  ら，  １９９７；  Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９６；  Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８に記載されている。細胞を、ＲＰＭＩ培地中で１０％仔牛血清（ＦＢＳ）と共に維持し、ＩＬ３−を含む条件付け培地を希釈した。増殖アッセイの前に、細胞をＲＰＭＩ／ＦＢＳ中で３回洗浄し、指示された濃度でまたはＩＬ−３（条件付け培地の１：１０００希釈）と共に９６穴平底プレートに蒔いた（５×１０５細胞／ｍｌ；０．１ｍｌ／穴）。細胞の生存を、上述のＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｍａｎ，  １９８３）により、２４時間後に測定するかまたは指示された時間間隔後に測定した。ＭＴＴ（０．０５  ｍｇ／ｍｌ）を、分析した細胞と共に２時間にわたって３７℃にてインキュベートした。生存細胞は、テトラゾリウム環を濃い青色のホルマザン結晶に転換することができ、これは細胞を酸性イソプロパノールで溶解した後、５４０−６３０ｎｍでの光学密度を読み取ることにより定量できる。
【０２８２】
実験結果
新規なＥｒｂＢリガンド候補の同定：
新規なＥｒｂＢ特異的リガンドがまだ存在し得るという仮定の下、新規なファミリーメンバーを相同性により調査することに決定した。ＤＮＡデータベースに加えられたＤＮＡ配列決定データの最近の急増は、主にヒトゲノムプロジェクトイニシアチブ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ）からであり、ＥｒｂＢ−３−およびＥｒｂＢ−４−特異的リガンドＮＲＧ−１（ＮＤＦ）に対する相同性を有するリガンドをコードする新規な転写物を提供する。ほとんどのＮＲＧ−１のアイソフォーム中で保持されるモチーフＣＸ７ＣＸＮＧＧＸＣＸ１３ＣＸＣＸ３ＹＸＧＸＲＣ（配列番号１８）は、入手可能な新規ＤＮＡ配列をスキャンするのに用いられた。マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリ（受託番号ＡＡ２３８０７７）起源の発現配列タグ（ＥＳＴ）クローンを同定したが、その配列は、ＮＲＧ−１βアイソフォームと３２％同一性（Ｗｅｎ  ら，  １９９２）を共有するＥＧＦ様ドメインをコードする。このクローンを得、完全に配列決定し、その仮定された翻訳産物は１１５アミノ酸のタンパク質をコードする（図ｌａ、配列番号１および２）。カイト−ドリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｌｅ）のアルゴリズム（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）を用いたハイドロパシー分析は、ほとんどのＮＲＧアイソフォームに特徴的な膜貫通ドメイン（図ｌｂ）の存在を指示する（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ  ら，  １９９３；  Ｗｅｎ  ら，  １９９４）。明らかに、このタンパク質配列は、シグナルペプチドモチーフにおいて通常見出される疎水性アミノ末端ストレッチを有さず、このことはタンパク質を細胞膜から引き離すのに重要である。ＮＲＧ−１のほとんどのアイソフォームもまた、大多数のシグナルペプチド配列を欠くが、無極性のＮ−末端配列を有し、これが前駆体分子の膜貫通配向を可能にすると考えられている。前駆体タンパク質の予測された細胞外ドメインは、ＥＧＦ様ドメインを含み、その１次構造は、ＥＧＦ／ＮＲＧファミリーに特徴的な全構造モチーフを示す（図ｌｃ）。前駆体タンパク質の推定される細胞質ドメインは比較的短く、Ｎ−グリコシル化の可能性がある部位を１つ含む。２つのさらなる部位は、おそらくエクトドメインに位置する。
【０２８３】
哺乳類起源の、全ての公知のＥｒｂＢ−特異的リガンドのＥＧＦ様ドメインの配列は、このファミリーの新規なメンバーをコードする新規な転写物である（図１ｃ）。その特徴的な６つの細胞外システイン残基およびそれらの保持された間隔は、３つのジスルフィド架橋の存在を予測し、これらはＡ、ＢおよびＣと命名され全てのＥＧＦ様ペプチドの標的である。６つの保持されたシステイン残基に加えて、新規なＥＧＦ様ドメインは、多くの半保持された（ｓｅｍｉｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基と共に、ＮＲＧファミリーの他のメンバー（２１位のグリシン（Ｇｌｙ−２１）、Ｇｌｙ−４２およびＡｒｇ−４４）と非常に高い相同性を共有する。留意すべきは、予測されるタンパク質のＢループは、ＥＧＦおよびＮＲＧ−２のループと同様に、残基３つ分だけ短いということである。新規な予測されるタンパク質のＥＧＦ様ドメインおよび膜貫通トポロジーは例外として、これは他のＥｒｂＢリガンドと著しい配列相同性または構造のモチーフを共有しない。
【０２８４】
ＥＳＴ由来のクローンは、しばしば人工配列であり得る。ＥｒｂＢ−リガンドのＥＧＦコーディングドメインは、単独でＥｒｂＢ結合を誘発することができ、従って、特にこの推定上の新規なリガンドのＥＧＦコーディングドメインをコードする配列を、このドメインの同定を確認するに最も少ない量で、より詳細に検査することを決定した。２つの代替のストラテジーがこの試験において用いられた。
【０２８５】
第一は、ＥＧＦ様ドメインをコードするプローブを用いて、新規なリガンドのゲノムの位置を孤立させることであった。マウス株１２９ゲノムライブラリに由来するＰ１クローンを単離したが、そこから、Ｐ１ベクターのプラスミドサブクローンがショットガン連結により産生した。これらのフラグメントを、ＥＧＦ様ドメインコーディングプローブについてのハイブリッド形成により、もう一度スクリーニングした。これらのサブクローンのうち最も大きいものは、より完全に特徴付けされた。詳細な制限マップを作成し、クローンを部分的に配列決定した（図１ｄ）。２つのエクソンを同定したが、後者はＥＧＦ様ドメインの５′成分をコードし、これを特別にプロトタイプＮＲＧ−１ゲノムの位置のエクソン６に対応するエクソン６と示した。エクソン５および６は、配列決定されたマウスＥＳＴ−ｃＤＮＡに対して１００％配列同一性を示し、ＥＳＴクローンの品質を確かなものにする。重要なことには、ＮＲＧ−１および新規な遺伝子の両方に対するエクソン６のイントロン−エクソン境界は同一であり、これは、これらの遺伝子が共通の祖先に由来していることを支持し、新規なリガンドが、ニューレギュリンの遺伝子ファミリーの新たな変異体によりコードされることを意味する。このデータは、新規なＥｒｂＢリガンドがニューレギュリンであることくを支持しているので、それはニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）と命名された。
【０２８６】
第二は、ＲＴ−ＰＣＲによる方法であり、ヒトＮＲＧ−４ホモログを単離し配列決定した（図ｌｅ）。ヒトプライマーは、最初に第二のＥＳＴクローンＡＩ７４３１１８に由来し、これは本明細書に記載の逆転写されサブクローン化されたヒト由来ＮＲＧ−４アイソフォームと部分的に同一の配列を共有するが、コードされたＥＧＦ−ドメイン配列を妨害する挿入もまた共有する。
【０２８７】
オリゴヌクレオチドを上述のＲＴ−ＰＣＴプライマーとして用い、１０ＲＴ−ＰＣＲ産物をＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞からサブクローニングした。１０のＰＣＲ産物のうち８つは、ＥＧＦコーディングドメイン内に挿入を含み、その結果、全ての場合においてＥＧＦドメインが破壊され、膜貫通結合モチーフを並行して有しない、予測されたアミノ酸配列の短縮が起こった。類似の挿入は、ＥＳＴクローンＡＩ７４３１１８番において見出された。機能的関連性は、存在する場合、必要に応じて代替的にスプライシングされるアイソフォームの関連性である。それらが事実として成熟ｍＲＮＡを示すならば、予測されたタンパク質産物は、ＥｒｂＢレセプターを活性化しないであろう。これらの転写物は、部分的に加工されたＲＮＡであるか、またはそうでない場合は、ＥｒｂＢ結合を抑制するタンパク質をコードし得ることが仮定される。
【０２８８】
ヒトおよびマウスＮＲＧ−４について予測された翻訳産物は、ＥＧＦ様コーディングドメイン内で７８％の全体同一性および９１％の同一性を共有する。ＥＧＦ様ドメインにおける全ての差異は、エクソン６により完全にコードされ、ＣＯＯＨ末端において正確なマッチングアミノ酸配列を有する。この保持された第一の構造は、これらの２つの遺伝子が、両方の種について、ＮＲＧ−４  ＥＧＦ様ドメインの同じアイソフォームをコードすることを示す。ＮＲＧ−４についてのＥＧＦ様ドメインの他のアイソフォームもまた、ＮＲＧ−１についてと同様に存在し、分解されないままで残っているはずである。しっかりと保持された一次構造、特に、マウスおよびヒトＮＲＧ−４間のＥＧＦ様ドメインの一次構造はまた、選択的進化の圧力によりこの位置の完全性が維持されてきたことを示しており、この遺伝子が、哺乳動物の発育および／または維持において必須の役割を果たすことを支持している。
【０２８９】
多くのオーバーラッピングゲノムのＨＴＧ配列（ＮＣＢＩ）がＮＲＧ４配列を含むことは、ＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＮ配列調査分析により見出されている。これらのオーバーラッピングＨＴＧ配列は全てフラグメント化されかつ無秩序である。これらの配列を合わせ、分解し、シークエンチャーソフトウェアパッケージ（ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ）を用いて多数のより大きいサイズのＤＮＡコンティグを再び組み立てた。これらのコンティグのうち２つを、コンティグ１番（配列番号１９）およびコンティグ３番（配列番号２０）と命名し、これらはヒトＮＲＧ４  ｃＤＮＡをコードする第一の３つのエクソンを含む（図７参照）。これらのエクソンは、開始メチオニン（Ｍｅｔ  １）残基、全ＥＧＦドメインおよび仮定された膜貫通配列をコードする。ｃＤＮＡおよびゲノムのエクソン配列は、約１００％の同一性を共有する。ヒト染色体１５に対するこのコンティグマップは、受託番号ＳＨＧＣ−１０７１９４番の短い配列タグ、ヒトゲノムのほぼ１５ｑ２５−２６座に正確に対応する。
【０２９０】
多数の遺伝性疾患および癌に感受性のある座は、この座をマッピングすることにより見出された。例えば、インスリン依存性の第３型糖尿病（ＩＤＤＭ３）に遺伝的に感受性の位置は、ＮＲＧ４に近接してマッピングされ、これにより、ＮＲＧ４はこの疾患に関与する／共に関与する標的遺伝子であることが暗示される。従って、ヒト配列およびそれらのこの位置への正確なマッピングを公開することにより、この遺伝子と関連する遺伝性疾患（例えば、ＩＤＤＭ３の候補例）とを遺伝的に結び付けることが可能になる。
【０２９１】
新規な転写の組織特異的発現：
発現の分析は、ＮＲＧ−４活性の可能性のある標的部位の解明の助けとするために実行された。異なるヒト成人組織から単離されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、骨格筋における適度なＮＲＧ−４発現および膵臓における高レベルのＮＲＧ−４発現が明らかになった（図２）。脳および胎盤を含む他の組織において、多くの異なる成長因子に富む２つの源は、存在する場合、非常に低い発現を示した。３つの識別可能な分子量の種（０．８、１．８および３．０キロベース）が膵臓および筋肉内で検出可能であったが、このことは、いくつかのｍＲＮＡアイソフォームの存在を示し、最も小さいバンドは、本研究で説明されるＮＲＧ−４クローンとサイズが一致する。
【０２９２】
ＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインは、ＥｒｂＢ−４発現細胞の増殖を刺激する：新規な転写物がＥｒｂＢ−特異的リガンドをコードするという予測を試験するために、対応する全長ＥＧＦ様ドメイン（４−５０残基、図ｌａ、配列番号２）を合成し、変性し、再折り畳みして、適切にジスルフィド架橋させた。この方法は、他のＥＧＦ様成長因子の機能的活性誘導体を合成するのに以前から用いられていた（Ｂａｒｂａｃｃｉ  ら，  １９９５；  Ｌｉｎ  ら，  １９８８；  Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８）。異なるＥｒｂＢレセプターまたはそれらの組み合わせを発現するよう操作された３２Ｄ細胞株の一連の誘導体は、以前に記載されている（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９６；Ｓｈｅｌｌｙ  ら，  １９９８）。骨髄３２Ｄ親細胞はその成長のためにインターロイキン３（ＩＬ３）等のサイトカインによる刺激を必要とし、これらは、内因性のＥｒｂＢ発現を有しないので選択された。異なるＥｒｂＢレセプターによるシグナリングは、ＩＬ３−依存性の分裂促進性およびこれらの細胞株の生存にとって代わることができ、それゆえに、このシステムは、リガンド誘導成長シグナルの検出に感受性の手段を提供し、これは、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル］テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、細胞代謝活性の機能として簡便に測定される（Ｍｏｓｍａｎ，  １９８３）。
【０２９３】
ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２またはＥｒｂＢ−３を単一に発現する細胞（それぞれＤｌ、Ｄ２またはＤ３と命名する）は、２４時間用量応答アッセイにおいて、合成の新規なペプチドに応答しなかったが、ＥＧＦ（Ｄ１細胞）、ＥｒｂＢ−２刺激性モノクローナル抗体［Ｄ２細胞、（Ｋｌａｐｐｅｒ  ら，  １９９７）］またはＩＬ−３（Ｄ３細胞）に対する応答は保持された（図３Ａ、データは示さず）。後者の細胞株は、欠損のあるＥｒｂＢ−３キナーゼに起因して、ＮＲＧに応答性ではない。しかしながら、細胞（Ｄ４）を発現するＥｒｂＢ−４は、対応するＮＲＧ−１βコントロールと比較して、適度な用量依存性の分裂促進性応答を示した。ＥｒｂＢタンパク質の異なるヘテロ二量体複合体は多様であり、ＥＧＦ様リガンドによるシグナリングを増強することができる（Ｃｏｈｅｎ  ら，  １９９６；  Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  ら，  １９９６；  Ｒｉｅｓｅ  ら，  １９９５）ので、２つのＥｒｂＢタンパク質を共発現する細胞（例えば、ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２を共発現するＤ１２細胞）もまたＮＲＧ−４誘導分裂促進性について試験された。試験された組み合わせ、すなわちＤ１２、Ｄ１３、Ｄ２３およびＤ２４細胞のうち、ＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−４との組み合わせを発現する細胞株（Ｄ２４細胞）は、新規なペプチドに分裂促進的に応答した唯一の株であった（図３Ａ）。留意すべきは、ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２の共過剰発現は、相対的に高い基礎的増殖活性をもたらしたが、これらの細胞はなおＥＧＦに応答したことである（図３Ｂ）。加えて、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−４を共過剰発現する細胞において、ＮＲＧ−１および新規なリガンドはほとんど等電位であったが（図３ＡにおいてＤ４およびＤ２４のパネルを比較されたい）、このことは、ＥｒｂＢ−２は、他のＥｒｂＢリガンドに対してと同様に、新規なリガンドの分裂促進効果を増強し得ることを示している（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ  ら，  １９９５；  Ｋａｒｕｎａｇａｒａｎ  ら，  １９９６；  Ｗａｎｇ  ら，  １９９８）。
【０２９４】
長期の細胞生存アッセイにより、新規な成長因子がＥｒｂＢ−４を刺激する能力が確認された。このアッセイは、添加された成長因子がＩＬ−３の非存在下において特定の３２Ｄ誘導体の生存を維持する能力を試験した。用量応答実験において、新規な合成ペプチドは、我々が試験した２つのＥｒｂＢ−４発現細胞株、すなわちＤ４およびＤ２４細胞の生存のみを刺激した（図３ｂ）。短期間の用量応答アッセイについても同様に、Ｄ２４細胞の刺激が最も強く、そしてＤ４細胞の応答はＮＲＧ−１処理コントロールと同様であった。これらのデータは、ＮＲＧ−４成長因子はＥｒｂＢ−４単独のみによって弱い増殖シグナルを発揮することができるが、ＥｒｂＢ−２とＥｒｂＢ−４との共発現は、ＮＲＧ−１における場合と同様に、優れた分裂促進応答を可能にすることを示す（Ｗａｎｇ  ら，  １９９８）。合成ペプチド由来のＮＲＧ−４がニューレギュリンレセプターの１つによって生物学的効果を与える能力に基づいて、このデータは、これがニューレギュリン、すなわちニューレギュリン−４（ＮＲＧ−４）であることをさらに支持する。
【０２９５】
ＮＲＧ−４はＥｒｂＢ−４を認識し活性化する：
ＮＲＧ−４シグナリングに関与する分子相互作用を解明するために、この成長因子を４つのＥｒｂＢタンパク質へ特異的に結合させるためのいくつかの異なるアプローチが用いられた。
【０２９６】
第１のアッセイにおいて、細胞を含まない系における結合の研究は、４つのＥｒｂＢタンパク質の組み換え可溶性の形態を用いて行われた。ＩｇＢ−１〜４で表される可溶性のタンパク質は、対応するＥｒｂＢの細胞外ドメインと、ヒト免疫グロブリンＧのＦｃ部分との二量体融合からなる（Ｃｈｅｎ  ら，  １９９６）。ＮＲＧ−４、ＥＧＦおよびＮＲＧ−１βを１２５Ｉで放射標識し、可溶性レセプターでインキュベートし、次いでＢＳ３共有結合架橋剤を用いてＩｇＢに不可逆的に結合させた。
【０２９７】
コントロールについて予測されたように、ＮＲＧ−１βとは対照的に、ＩｇＢ−１へのＥＧＦ結合についての強いシグナルが検出された（３つはＩｇＢ−３およびＩｇＢ−４に強く結合したが、ＩｇＢ−２に結合したリガンドはなかった（図４ａ）。ＮＲＧ−１と比較すると、１２５Ｉ−ＮＲＧ−４は可溶性形態のＥｒｂＢ−４（ＩｇＢ−４）に弱く結合するだけであり、他のＩｇＢタンパク質に対しては弱く結合するかまたは結合しなかった（図４ａ）。
【０２９８】
共有結合架橋アッセイの特異性を確認するため、未標識ＮＲＧ−４を１００倍モル過剰で共インキュベートし、放射活性リガンドおよびＩｇＢ−４の効果的な置換が観察された（図４ａの下部パネル）。従って、ＮＲＧ−４が成長を誘導する能力およびＥｒｂＢ−４発現細胞の生存能力とは一致するが、他の３つのＥｒｂＢレセプターを単一に発現する細胞については一致しないので、このリガンドは、溶液中でＥｒｂＢ−４（ＩｇＢ４）のみを認識する。
【０２９９】
ＮＲＧ−４は表面で発現したＥｒｂＢ−４を認識するが膜に結合した他のＥｒｂＢタンパク質を認識しないという予測を試験するために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を用いた。これらの細胞は、少量のＥｒｂＢ−２を発現するが、他のＥｒｂＢレセプターは発現しないので、ＮＲＧ−４または任意の他のニューレギュリンを結合しない［（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９６）データは示さず］。ＣＨＯ細胞をＥｒｂＢ−４を直接発現するプラスミドベクターでトランスフェクトするか、またはＥｒｂＢ−４プラスミドを用いて、３つの他のＥｒｂＢタンパク質のうち１つを発現するベクターと共に共トランスフェクトした。２日後、細胞を、１２５Ｉ−  ＮＲＧ−４と共に、またはコントロールとしての放射標識されたＮＲＧ−１と共にインキュベートし、そして引き続いて、形成したリガンド−レセプター複合体を、共有結合架橋剤を用いて安定化した。発現したＥｒｂＢタンパク質を免疫沈殿することにより、共有結合で保持された複合体の分析が可能になる。ＥｒｂＢ−４単独の発現は、ＣＨＯ細胞に、ＮＲＧ−４およびＮＲＧ−１と複合体を形成する能力を与える（図４ｂ）。ＮＲＧ−４の分裂促進活性が低いことと一致して、このリガンドを用いて得られた共有結合架橋のシグナルは、放射活性ＮＲＧ−１のそれと比較して弱かった。それにもかかわらず、ＥｒｂＢ−４の単量体および二量体のいずれも、２つのリガンドにより形成された（ＮＲＧ−４含有二量体の検出は、長時間のフィルム露光を必要とした）。ＥｒｂＢ−１またはＥｒｂＢ−３の共発現は、放射活性シグナルに著しく影響しなかったが、ＥｒｂＢ−２の場合は、ＮＲＧ−１について増強効果が観察された。
【０３００】
抗ＥｒｂＢ−１および抗ＥｒｂＢ−２抗体が、ＮＲＧ−４で標識された単量体および二量体レセプター種を沈降させる能力（図４Ｂ）は、おそらくＥｒｂＢ−４の共免疫沈降に起因しており、このことは、ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２によってＮＲＧ−４が促進されるヘテロ二量体の存在を示している。興味深いことに、ＥｒｂＢ−３は、ＮＲＧ−１またはＮＲＧ−４の結合後、ＥｒｂＢ−４とのヘテロ二量体化をほとんど免れた。
【０３０１】
ＮＲＧ−４の生物学的効果およびそのＥｒｂＢ−４との複合体形成を共に考慮すると、認識の特異性だけではなくＮＲＧ−１に対する弱い相互作用もまた暗示される。相互作用を定量するために、ＥｒｂＢ−４を発現するＣＨＯ細胞についてのリガンド置換分析を行った。未標識ＮＲＧ−４が表面に結合した放射線標識ＮＲＧ−１βを置換する能力を、未標識ＮＲＧ−１のそれと比較した。この実験の結果は、ＥｒｂＢ−４に対するＮＲＧ−４の結合親和性は約８分の１であることを示した（図４ｃ）。ＮＲＧ−１が低いｎＭ範囲内にある見かけ上の親和性により結合した一方、ＮＲＧ−４は、見かけ上約２０ｎＭ  ｋＤａを示した。結論として、ＮＲＧ−４は、ＮＲＧ−１βの親和性よりも低い親和性によりＥｒｂＢ−４に特異的に結合する。なぜなら、ＮＲＧ−１βと比較して、αアイソフォームは、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４の両方に対して５分の１〜８分の１の親和性を示すことが既に報告されているので（Ｔｚａｈａｒ  ら，  １９９４）、ＥｒｂＢ−４に結合するＮＲＧ−４およびＮＲＧ−ｌαも類似の親和性を有することが想像されるからである。
【０３０２】
明らかに、ＮＲＧ−４はＥｒｂＢ−４に結合し、かつ、このレセプターの活性化により細胞増殖を媒介する。他のＥｒｂＢリガンドは、それらの対応するレセプターのチロシンリン酸化および介在する分裂促進活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの活性化により細胞成長を刺激するので、これらの２つのシグナリング工程を、ＮＲＧ−４応答性の骨髄細胞発現ＥｒｂＢ−４（Ｄ４およびＤ２４細胞株）について行った。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの活性リガンドで５分間刺激し、次いで溶解し、免疫ブロッティングにより分析した。ＮＲＧ−４は、Ｄ４およびＤ２４細胞中の１８０−ｋＤａ  ＥｒｂＢレセプターのリン酸化を刺激し、付随するＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２）の活性化もまた検出された（図５）。これら２つの細胞株とは対照的に、かつ成長および結合アッセイと一致して、１μｇ／ｍｌの用量のＮＲＧ−４は、他の３２Ｄ細胞株（Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ１２、Ｄ１３およびＤ２３細胞）を刺激しなかった。これらの結果は、ＮＲＧ−４が、ＥｒｂＢ−４を含むレセプター複合体と選択的に相互作用するＥｒｂＢレセプターファミリーの真正なリガンドであるという結論をさらに支持する。
【０３０３】
ＮＲＧ−４をブロックするための抗体の中和：
ＮＲＧ−４のＥＧＦ−ドメインに対する中和抗体を調製した。このような抗体は、ＮＲＧ−４のその標的レセプターへの結合を遮断し得るので特に有用であり、それ故に薬学的環境において用いられる。合成の再折り畳みＮＲＧ−４ペプチドを、標準的アジュバントプロトコルにより２匹のウサギに注射した。４回の繰り返しの注射後、血清を回収し、その放射標識されたＮＲＧ−４への結合の特異性を試験した。リガンドコントロールについては、放射標識されたＥＧＦもまた結合について試験した。熱いリガンドを、２匹のウサギから生じた血清、ならびにこれらのウサギの一方に由来の免疫前血清、非関連エピトープ（抗Ｅｒｋ−１）に対して産生した血清およびポジティブコントロールとして作用するＩｇＢＩと共にそれぞれインキュベートし、１２５Ｉ−ＥＧＦ活性を示した（図６）。これらの結果は、２つの抗血清が極度に強力であり、ＮＲＧ−４  ＥＧＦ様ドメインの特異的遮断剤であることを示す。従って、これらの抗体は、ＥｒｂＢレセプターに結合しているＮＲＧ−４リガンドと競合する。
【０３０４】
本発明を、その特定の実施態様と関連させて説明してきたが、多くの代替、修飾および改変が当業者に明らかであることは明白である。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲に入る全てのこのような代替、修飾および改変を含むことを意図する。本明細書で述べた全ての刊行物、特許および特許出願は、各刊行物、特許および特許出願が本明細書中に参考として援用されことが特別にかつ個々に示されるのと同程度に、その全体が参考として本明細書中に引用される。加えて、本出願におけるいかなる参考文献の引用および特定も、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であると認めることを意図すべきではない。
【参考文献】
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「配列表フリーテキスト」
（１）配列番号１６は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
（２）配列番号１７は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
（３）配列番号１８は大部分の哺乳動物ＥｒｂＢリガンドアイソフォームにおいて保存されているモチーフである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、マウスｐｒｏ−ＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。図１ｂは、マウスｐｒｏ−ＮＲＧ−４のハイドロパシープロファイルを示す。図１ｃは、他の成長因子のＥＧＦ様モチーフを有するＮＲＧ−４のＥＧＦ様ドメインのマウスアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１ｄは、マウスＮＲＧ−４遺伝子の構造を示す。図１ｅは、ヒトＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１４）および推定アミノ酸配列（配列番号１５）、ならびにそれらのマウスＮＲＧ−４のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）との比較を示す。
【図２】
図２は、ヒト組織におけるＮＲＧ−４発現のノーザンブロット解析を示す。
【図３】
図３ａは、３２Ｄ細胞のＥｒｂＢ発現誘導体におけるＮＲＧ−４の増殖効果を示す。図３ｂは、３２Ｄ細胞のＥｒｂＢ発現誘導体におけるＮＲＧ−４の生存効果を示す。
【図４】
図４ａは、ＮＲＧ−４の、組み換え可溶性ＥｒｂＢタンパク質に対する共有結合による架橋を示す。図４ｂは、ＮＲＧ−４の、細胞表面で発現したＥｒｂＢタンパク質に対する共有結合による架橋を示す。図４ｃは、ＮＲＧ−４のＥｒｂＢ−４発現細胞への結合を示す。
【図５】
図５は、ＮＲＧ−４によるチロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化を示す。
【図６】
図６は、ＮＲＧ−４の再折り畳みＥＧＦ様ドメインに対して産生した抗体がリガンド機能を中和することを示す。
【図７】
図７は、ヒトＮＲＧ４遺伝子のエクソン／イントロン構造の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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