(57)【要約】そのアミノ酸配列が、(a) Bn1 - Z、(b) Bn1 - Z - Bn2、および(c) Z - Bn1からなり、Bは塩基性アミノ酸残基であり、n1およびn2は1〜6であり、Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、この配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する群より選択される式を有するペプチドを用いた、微生物感染を治療する方法について説明する。これらのペプチドは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方を含む微生物に対して抗菌活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染の治療または予防に効果的な量の、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドを治療を必要とする被験者に投与することを含む、被験者の微生物感染を治療または予防する方法。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、該配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【請求項２】
Zが約14〜約20アミノ酸の配列である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Zがトリプトファン残基1個を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
Bはそれぞれ独立的にリジンまたはアルギニンであり、
Zは19アミノ酸の配列であって、各アミノ酸はアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、チロシン、およびシステインからなる群より独立的に選択される、
請求項1記載の方法。
【請求項５】
Bはそれぞれ独立的にリジンまたはアルギニンであり、
Zは約10〜約23の疎水性アミノ酸の配列であって、該配列内の任意の位置に1〜4個のさらなるアミノ酸であるXが個々に挿入されており、Xは任意のアミノ酸である、
請求項1記載の方法。
【請求項６】
Bはリジンであり、
ZはHyn3 X Hyn4 X Hyn5 W Hyn6 X Hyn7であって、
Hyは疎水性アミノ酸であり、
Xは存在しないか、または存在するならば任意のアミノ酸であり、
n3、n4、n5、n6、およびn7はそれらの総数が10〜20となる整数である、
請求項1記載の方法。
【請求項７】
Xがアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、およびチロシンからなる群より選択される、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが、Xが任意のアミノ酸である式：
2004534084.tif 000026
を有するアミノ配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ペプチドのX残基1個がWで置換される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが
2004534084.tif 000027
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である、
2004534084.tif 000028
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが
2004534084.tif 000029
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドの少なくとも1個のアミノ酸がD-アミノ酸である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが式
2004534084.tif 000030
のアミノ酸配列を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
微生物感染が細菌感染である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
細菌感染がグラム陽性細菌感染である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
細菌感染がグラム陰性細菌感染である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
細菌感染が、大腸菌、枯草菌、緑膿菌、セパシア菌、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、C.クセロシス、およびE.フェカリスからなる群より選択される細菌による感染である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
微生物感染が真菌または酵母感染である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
感染がC. アルビカンス感染である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
経口的、局所的、静脈内、皮下、経鼻的、および吸入からなる群より選択される投与経路によってペプチドを投与する、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む酸型またはアミド型のペプチドを含む薬学的組成物、および薬学的に許容される担体。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、該配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【請求項２３】
ペプチドが
2004534084.tif 000031
からなる群より選択される、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である、
2004534084.tif 000032
からなる群より選択される、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
ペプチドが
2004534084.tif 000033
からなる群より選択される、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
微生物感染を治療または予防するための、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドの使用。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、該配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【請求項２７】
微生物感染を治療または予防するための薬剤の製剤における、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドの使用。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、該配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【請求項２８】
Zが約14〜約20アミノ酸の配列である、請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項２９】
Zがトリプトファン残基1個を含む、請求項27または28記載のペプチドの使用。
【請求項３０】
Bはそれぞれ独立的にリジンまたはアルギニンであり、
Zは19アミノ酸の配列であって、各アミノ酸はアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、チロシン、およびシステインからなる群より独立的に選択される、
請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３１】
Bはそれぞれ独立的にリジンまたはアルギニンであり、
Zは約10〜約23の疎水性アミノ酸の配列であって、該配列内の任意の位置に1〜4個のさらなるアミノ酸、Xが個々に挿入されており、Xは任意のアミノ酸である、
請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３２】
Bはリジンであり、
ZはHyn3 X Hyn4 X Hyn5 W Hyn6 X Hyn7であって、
Hyは疎水性アミノ酸であり、
Xは存在しないか、または存在するならば任意のアミノ酸であり、
n3、n4、n5、n6、およびn7はそれらの総数が10〜20となる整数である、
請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３３】
Xがアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、およびチロシンからなる群より選択される、請求項31または32記載のペプチドの使用。
【請求項３４】
ペプチドが、Xが任意のアミノ酸である式：
2004534084.tif 000034
を有するアミノ酸配列を含む、請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３５】
ペプチドのX残基1個がWで置換される、請求項34記載のペプチドの使用。
【請求項３６】
ペプチドが
2004534084.tif 000035
からなる群より選択される、請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３７】
ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である、
2004534084.tif 000036
からなる群より選択される、請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３８】
ペプチドが
2004534084.tif 000037
からなる群より選択される、請求項27記載のペプチドの使用。
【請求項３９】
ペプチドの少なくとも1個のアミノ酸がD-アミノ酸である、請求項27〜38のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項４０】
ペプチドが式
2004534084.tif 000038
のアミノ酸配列を含む、請求項39記載のペプチドの使用。
【請求項４１】
微生物感染が細菌感染である、請求項27〜40のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項４２】
細菌感染がグラム陽性細菌感染である、請求項41記載のペプチドの使用。
【請求項４３】
細菌感染がグラム陰性細菌感染である、請求項41記載のペプチドの使用。
【請求項４４】
細菌感染が、大腸菌、枯草菌、緑膿菌、セパシア菌、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、C.クセロシス、およびE.フェカリスからなる群より選択される細菌による感染である、請求項41記載のペプチドの使用。
【請求項４５】
微生物感染が真菌または酵母感染である、請求項27〜40のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項４６】
感染がC.アルビカンス感染である、請求項45記載のペプチドの使用。
【請求項４７】
経口的、局所的、静脈内、皮下、経鼻的、および吸入からなる群より選択される投与経路によってペプチドを投与する、請求項27〜46のいずれか一項記載のペプチドの使用。
【請求項４８】
2004534084.tif 000039
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗菌ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗菌化合物、特に新規抗菌ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗生物質の出現により、細菌感染の治療および多くの早死にの予防が可能となった。しかし、抗生物質の広範囲に及ぶ使用が、多くの細菌の抗生物質耐性株の発生を招いた。
【０００３】
抗生物質耐性細菌は、小児の場合には通常の細菌感染から度々重篤な疾患を、時には死をもたらし得る（Travis (1994), Science, v.264, pp.360-362）。例えば、1997〜1999年における、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の耐性株によって起こる感染による数人の小児の死が、アトランタの疾病管理予防センター（Center for Disease Control and Prevention）から報告された。最もよく知られた抗生物質は特異的な方法で細菌の恒常性を妨げることにより作用するが、細菌は抗生物質が生物体に結合、もしくは侵入するのを妨ぐ、抗生物質を不活性化する酵素を産生する、および／または抗生物質の内部結合部位を変化させる等の機構により、耐性を進化させることができる。抗生物質耐性細菌のさらなる例には、腸球菌（バンコマイシン耐性）、肺炎連鎖球菌（ペニシリン耐性）、および結核菌（多剤耐性）が含まれる。
【０００４】
したがって、新しい種類の抗生物質は、抗生物質耐性細菌に起因する人の健康に対する脅威を解消するよう開発しなければならない。このような状況において、抗菌ペプチドは魅力的な代替物を提供する。数多くの抗菌ペプチドが、ヒト（例えば、デフェンシン）、他の哺乳動物（例えば、米国特許第6,008,195号に記載のウシ顆粒球ペプチド）、両生類（例えば、マガイニン）、植物および昆虫（例えば、セクロピン）、ならびに細菌自体で、「宿主防御」化合物として自然に生じる（Oh, J.E.ら、(1999), J. Peptide Res., V.53, pp.41-46；Scott, M.G.ら、(1999), Infection & Immunity, v.67, pp.2005-2009）。
【０００５】
合成抗菌ペプチドも記載されており、これには米国特許第5,945,507号に記載されるような、アミノ酸配列が様々なウイルス膜タンパク質の配列に関連するかまたは由来する高度の両親媒性のペプチドが含まれる。
【０００６】
ペプチド抗菌剤の重要な利点は、その抗菌作用の広範囲にわたる機構（ペプチドは生体膜に結合および透過する固有の能力を有するため、これらの化合物は細胞膜を物理的に破壊することにより作用し、通常は膜を溶解し、ひいては細胞を死に導く（LaRocca, P.ら、(1999), Biophys. Chem., v.76, pp.145-159））にある。細菌のような生物にはこの物理的機構に対抗し、耐性を獲得する能力がほとんどない。
【０００７】
過去15年間に、およそ500の様々な抗菌ペプチドが単離され、性質決定がなされた。それらのペプチドは、長さ（6〜50残基）、配列、および構造の点で大きく異なるが、(i) 一般的にポリカチオンである、および(ii) それらの有効な構造は通常は両親媒性である、すなわち通常は正に荷電した残基と非極性残基の組み合わせからなり、一次配列に沿った規則的な様式とは異なる、の2つの特徴を共有する。
【０００８】
膜タンパク質の膜貫通ドメインの構造および物理的特性、ならびに合成ペプチドの膜内への挿入に必要な構造の研究により、膜内にペプチドをうまく挿入するのに必要な疎水性閾値が存在するという知見が得られた（Liu, L.-P.およびDeber, C.ら、(1998), Biopolymers (Peptide Science), v.47, pp.41-62；Deber, C.ら、(2001), Protein Science, v.10, pp.212-219）。実験室で調製した脂質膜に関するこれらの研究により、記載されている非両親媒性ペプチドが、哺乳動物であろうと微生物であろうといかなる種類の細胞膜内にも挿入できることが示唆された。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明者らは、強力な抗菌活性を有し、真核細胞に対して重大な細胞毒性効果を及ぼさない新規なペプチド群を同定した。
【００１０】
1つの態様に従って、本発明は、感染の治療または予防に効果的な量の、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドを治療を必要とする被験者に投与することを含む、被験者の微生物感染を治療または予防する方法を提供する。
(a) Bn1 - Zと；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1と
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、この配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【００１１】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000002
からなる群より選択される、上記のような方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である
2004534084.tif 000003
からなる群より選択される、上記のような方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000004
からなる群より選択される、上記のような方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが式
2004534084.tif 000005
のアミノ酸配列を含む、上記のような方法を提供する。
【００１５】
さらなる態様に従って、本発明は、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドを含む薬学的組成物、および薬学的に許容される担体を提供する。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、この配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【００１６】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000006
からなる群より選択される、上記のような薬学的組成物を提供する。
【００１７】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である、
2004534084.tif 000007
からなる群より選択される、上記のような薬学的組成物を提供する。
【００１８】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000008
からなる群より選択される、上記のような薬学的組成物を提供する。
【００１９】
さらなる態様に従って、本発明は、微生物感染を治療または予防するための、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドの使用を提供する。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、この配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【００２０】
さらなる態様に従って、本発明は、微生物感染を治療または予防するための薬剤の製剤における、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、酸型またはアミド型のペプチドの使用を提供する。
(a) Bn1 - Z；
(b) Bn1 - Z - Bn2；および
(c) Z - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、この配列は少なくとも0.3、好ましくは少なくとも0.4の平均疎水度を有する。
【００２１】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000009
からなる群より選択される、上記のようなペプチドの使用を提供する。
【００２２】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが、Xがアラニンより大きいまたは等しい疎水親水度を有する任意の疎水性アミノ酸である、
2004534084.tif 000010
からなる群より選択される、上記のようなペプチドの使用を提供する。
【００２３】
さらなる態様に従って、本発明は、ペプチドが
2004534084.tif 000011
からなる群より選択される、請求項27記載のペプチドの使用を提供する。
【００２４】
さらなる態様に従って、本発明は、
2004534084.tif 000012
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗菌ペプチドを提供する。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明者らは、優れた抗菌活性を示し、真核細胞に対して重大な細胞毒性副作用を及ぼさない新規なペプチド群を同定した。
【００２６】
本明細書で用いる「抗菌」ペプチドとは、例えば細菌、ウイルス、真菌、酵母、およびマイコプラズマのような病原体を抑制および／または死滅させるペプチドのことである。
【００２７】
「微生物感染」とは、例えば細菌、ウイルス、真菌、酵母、またはマイコプラズマのような病原体による、被験者、または被験者の組織もしくは器官の感染のことである。被験者はヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物であってよい。
【００２８】
被験者における「微生物感染の治療」とは、被験者に感染する微生物の数を減少させること、および／または微生物感染により被験者に起こる症状を軽減することを意味する。
【００２９】
以前に記載された両親媒性抗菌ペプチドとは対照的に、本発明のペプチドは非両親媒性であり、ペプチドの一端または両端に極性アミノ酸残基を有するが、非極性のコアペプチド配列を有する。
【００３０】
本明細書において、アミノ酸は1文字または3文略語のいずれかとして、標準のIUPAC-IUB命名法に基づいて引用する。
【００３１】
本明細書において、「アミノ酸」とは、20の天然アミノ酸を含む任意のアミノ酸のことであり；
「塩基性アミノ酸」とは、例えばリジンまたはアルギニンのような塩基性の側鎖を有するアミノ酸のことであり；
「疎水性」とはアミノ酸残基またはアミノ酸配列の性質のことであり、その残基または配列は水溶性環境を回避する傾向および細胞膜の脂質コアのような非極性環境内に存在する傾向があり；
「疎水性アミノ酸」とは生理的pHにおいて荷電しておらず、水溶性環境を回避する傾向および非極性環境内に存在する傾向があるアミノ酸であり；
「疎水性アミノ酸配列」 とは、配列に疎水性の特徴を付与するに十分な疎水性アミノ酸を含むアミノ酸配列のことである。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「疎水性」および「疎水親水度」は互換的に用いられ、同様の意味を有する。
【００３３】
アミノ酸残基の「疎水度」とは、表1に示すようなまたは本明細書に記載する方法により計算されるような残基の疎水度を意味する。
【００３４】
アミノ酸配列またはペプチドの「疎水度」とは、その配列の構成アミノ酸残基の個々の疎水度の相加平均を意味する。
【００３５】
本発明は、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含む、効果的な量のペプチドを治療を必要とする被験者に投与することを含む、微生物感染を治療または予防する方法を提供する。
Bn1 - Z、Bn1 - Z - Bn2、およびZ - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、少なくとも0.3の平均疎水性を有する。
【００３６】
本発明は、以下からなる群より選択される式を有するアミノ酸配列を含むペプチドをさらに提供する。
Bn1 - Z、Bn1 - Z - Bn2、およびZ - Bn1
式中、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
n1およびn2は1〜6であり、
Zは約11〜約24アミノ酸残基の配列であって、少なくとも0.3の平均疎水性を有する。
【００３７】
1つの態様に従って、本発明の方法で用いられるペプチドは疎水性の「コア」アミノ酸配列、Zを含み、コア配列の各末端に少なくとも1個の塩基性アミノ酸残基を伴う。
【００３８】
さらなる態様においては、本発明の方法で用いるペプチドは疎水性コアアミノ酸配列を含み、コア配列の一端にのみ1個またはより多くの塩基性アミノ酸を伴う。
【００３９】
コアアミノ酸配列、Zは、表1または本明細書に記載するような計算による疎水性の尺度に基づいて、少なくとも0.3、好ましくは少なくとも約0.4の平均疎水度を有する。
【００４０】
0.3未満のコア配列平均疎水性を有する類似のペプチドは抗菌剤として効果がないのに対し（MIC＞64μM）、少なくとも0.3のコア配列平均疎水性を有する上記のようなペプチドは抗菌剤として有効である。
【００４１】
本発明のペプチドは、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方を含む広範囲の細菌に対して、低μM範囲のMIC値で抗菌活性を示す。
【００４２】
本発明の方法は、例えば大腸菌、枯草菌、緑膿菌、セパシア菌、表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、C.クセロシス（C.xerosis）、およびE.フェカリス（E.faecalis）等による感染を治療するのに使用することができる。
【００４３】
本発明の方法はまた、C.アルビカンス等の酵母、真菌、ウイルス、およびマイコプラズマ等による感染を治療するのにも使用することができる。
【００４４】
当業者には明らかなように、本発明の任意の個々のペプチドは、ある微生物に対してその他の微生物に対するよりもより優れた抗菌活性を示してよい。例えば、実施例5に記載する数個のペプチドはC.クセロシスに対して活性を示すが、試験した他の細菌に対しては活性を示さなかった。例えば本明細書の実施例に記載する試験により、任意の特定の生物に対する抗菌活性のレベルを求めて本発明のペプチドを選別すること、およびその生物に対して最も高い抗菌活性を示すペプチドを選択することは、当業者の技術の範囲内である。
【００４５】
タンパク質およびアミノ酸についての様々な疎水性の尺度が文献に記載されているが、本発明者らは、LiuおよびDeber（(1998)、Biopolymers(Peptide Science), v.47, pp.41-62）に記載されているような一連の疎水性モデルペプチドのHPLCにおける保持時間に基づいた表1の疎水性尺度を確立した。
【００４６】
「疎水親水度」として各アミノ酸について表1に示す疎水度は、その疎水度を計算すべき任意のペプチドにおけるアミノ酸の疎水度として使用することができる。表1に示すアミノ酸を含むペプチドの「平均疎水性」は、その配列の構成アミノ酸の表1「疎水親水度」値の相加平均を決定して算出する。
【００４７】
表1は、天然アミノ酸すべての疎水度または疎水親水度を一覧表にしてある。本発明に基づくペプチドは、他のアミノ酸を含んでもよい。表1に含まれないアミノ酸については、その疎水度は表1の値を得る本明細書に記載する方法と同様の方法により決定することが可能である。例えば、
2004534084.tif 000013
のようなペプチドを合成することが可能であるが、Xは疎水度を決定すべきアミノ酸であり、実施例に記載するようにそのペプチドのHPLCにおける保持時間を測定する。XがLysまたはPheである類似のペプチドも調製し、そのHPLC保持時間を測定する。保持時間、Rxは、以下の等式
H = (10 x ΔtRX-Lys / ΔtRPhe-Lys) - 5.00
ΔtRX-Lys = Rxと試験した中で最も親水性の高いペプチド（X = Lys）との間の分  での保持時間の相違、および
ΔtRPhe-Lys = 試験した中で最も疎水性の高いペプチド（  X = Phe）と最も親水性  の高いペプチド（X = Lys）との間の分での保持時間の相違。
を用いて、選択したアミノ酸の疎水親水度Hに変換する。
【００４８】
一般式、B-Z、B-Z-B、またはZ-Bにおいて、Bは任意の塩基性アミノ酸でよいが、リジンまたはアルギニンが好ましい。
【００４９】
本発明のペプチドの1個またはより多くのアミノ酸は、D-アミノ酸であってよい。好ましくは、コア配列、Zの1個またはより多くの末端残基はD-アミノ酸である。
【００５０】
本発明のペプチドのC末端は、遊離の酸型もしくは薬学的に許容されるその塩でよく、またはアミド化してもよい。
【００５１】
さらなる態様においては、コア配列Zは、1個またはより多くのアミノ酸、Xが疎水性配列内の任意の位置に挿入される疎水性アミノ酸、Hyの配列である。疎水性アミノ酸は、独占的にアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはフェニルアラニン、またはこれらアミノ酸の任意の組み合わせであってよい。Xは、コア配列の平均疎水度を少なくとも0.3、好ましくは0.4に維持する任意のアミノ酸であってよい。
【００５２】
さらなる態様に従って、コア配列Zは
Hyn3 X Hyn4 X Hyn5 X Hyn6 X Hyn7
であり、
Hyは疎水性アミノ酸であり、
Xは存在しないか、または存在するならば任意のアミノ酸であり、
n3、n4、n5、n6、およびn7は総数が10〜20となる整数である。
【００５３】
Hyは同じでも異なってもよく、好ましくはアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸である。
【００５４】
Xは、存在するならば、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、およびチロシンからなる群より選択される。
【００５５】
好ましい態様においては、本発明のペプチドは、
2004534084.tif 000014
の一般式を有する。
【００５６】
アラニン鎖内に分散されるアミノ酸残基Xは、少なくとも0.3のコア配列平均疎水度を維持する任意のアミノ酸であってよい。
【００５７】
さらなる態様においては、コア配列はHyn3 X Hyn4 X Hyn5 W Hyn6 X Hyn7 または
2004534084.tif 000015
である。トリプトファン残基、Wにより、ペプチドの蛍光検出が可能となる。HyおよびXは、上記のように定義する。少なくとも0.3のコア配列平均疎水度を有するペプチドは、有効な抗菌剤であった。
【００５８】
本発明のペプチドは、従来の化学法、好ましくは本明細書の実施例に記載する方法のような固相合成法によって合成することが可能である。そのような方法を用いて、D-アミノ酸をペプチド内に組み込むことが可能である。ペプチドは、やはり従来のペプチド精製法によって精製することが可能であり、代表的な方法を本明細書に記載する。
【００５９】
あるいは、本発明のペプチドは当業者に周知の方法により、望ましいアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組換え発現によって作製することも可能である。
【００６０】
本発明の抗菌ペプチドは、細菌、ウイルス、真菌、酵母、およびマイコプラズマを含む様々な病原体と対抗するために用いることができる。
【００６１】
本発明は、本発明の少なくとも1つのペプチドを含む薬学的組成物および薬学的に許容される担体を提供する。
【００６２】
本発明のペプチドは、経口的、局所的、静脈内、皮下、眼内、経鼻的、および吸入を含む、様々な経路で投与することができる。
【００６３】
ペプチドは、例えば経口投与には錠剤、丸薬、粉剤、カプセル剤等、局所的塗布にはクリームもしくは軟膏剤、または静脈内投与には液体製剤といった、特定の投与形態に必要とされるように調剤する。
【００６４】
適切な製剤形態および活性成分としての本発明のペプチドとの併用に適切な薬学的に許容される担体は、Remington’s Pharmaceutical Science, latest edition, Mack Publising Co., Easton, PA等の標準的な著作物に記載されている。
【００６５】
ペプチドへのD-アミノ酸の導入は、経口投与した際にペプチドを消化から保護する助けとなる。経口投与するにはペプチドを腸溶コーティングした製剤として提供することも望ましく、そのような製剤形態は当業者に周知である。
【００６６】
実施例
実施例は説明の目的で記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６７】
本開示および実施例で引用するが明確に記載しない化学的方法ならびにタンパク質およびペプチドの生化学的方法は、科学文献に報告されており、当業者には周知である。
【００６８】
方法
材料
ペプチド合成、切断、および精製のための試薬には、Fmoc‐保護アミノ酸（ノババイオケム（Novabiochem））、Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、カリフォルニア州）、N,N-ジメチルホルムアミド、ペプチド等級（カレドン（Caledon）、オンタリオ州）、ピペリジン（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州、またはアクロス（Acros））、メタノール（カレドン、オンタリオ州）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（アルドリッチ（Aldrich））、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-yl)1,1,3,3-テトラメチル-ヘキサフルオロリン酸ウロニウム（HATU）（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州、またはGLバイオケム社（GL Biochem Ltd.）（上海））、ジエチルエーテル（カレドン、オンタリオ州）、トリイソプロピルシラン（TIPS）（アルドリッチ）、フェノール（ギブコ（Gibco））、およびアセトニトリル（カレドン、オンタリオ州）を含んだ。
【００６９】
マイクロ-BCAタンパク質アッセイ法の試薬は、ピアス（Pierce）（イリノイ州ロックフォード）から入手した。ミュラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth）およびバクトアガー（Bacto agar）は、ディフコ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）から購入した。他の試薬はすべて、分析用の等級である。
【００７０】
細菌菌株
使用した細菌菌株は、大腸菌C498、大腸菌C500、大腸菌UB1005、および抗生物質超感受性派生体DC2(22)；表皮ブドウ球菌の臨床分離株（C621）；コリネ型細菌菌株コリネバクテリウム クセロシス（Corynebacterium xerosis）（C875）；ならびにすべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション由来の大腸菌ATCC 25922、黄色ブドウ球菌ATCC 25923、エンテロコッカス・フェカリスATCC 29212、枯草菌ATCC 6633、および緑膿菌ATCC 27853である。
【００７１】
ペプチド合成
ペプチドは、PerSeptive Biosystems Pioneerペプチド合成機で、標準のFmoc化学法を用いて合成した。合成には、Pioneerの標準（45分）サイクルの使用を採用した。低装填（＞0.15mmol/g）PAL-PEG-PS樹脂を用いて、アミド化C末端を作製した。HATU/DIEA活性化剤対を、4倍過剰のアミノ酸と共に用いた。ペプチドの脱保護および切断は、95% TFA、2.5%水、2.5% TIPS（v/v/v）または88% TFA、5%フェノール、5%水、2% TIPS（v/v/v/v）の混合液内で、窒素雰囲気下、室温にて2時間行った。切断し脱保護したペプチドは、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させた。遠心分離したペレットを乾燥させ、水に再溶解し、凍結乾燥した。
【００７２】
ペプチドの精製は、C4調製用逆相（RP）HPLCカラム（21.2 x 250 mm, 300Å, 10μm）で、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いて行った。粗製ペプチド（5〜12 mg）を水に溶解し、カラムに供した。主要なピークの画分を手動で収集し、凍結乾燥した。
【００７３】
精製したペプチドは、分析用RP-HPLC、質量分析法、およびアミノ酸解析により性質決定した。RP-HPLC分析は、Vydac C4カラム（4.6 x 250 mm, 300 , 5μm）で、水／0.1%トリフルオロ酢酸（A）およびアセトニトリル／0.1%トリフルオロ酢酸（B）の直線勾配を用い、1 ml／分の流速で、10%Bで開始し1% B/mmで行った。ペプチド濃度は、アミノ酸解析およびマイクロ-BCAタンパク質アッセイ法により測定した。
【００７４】
逆相HPLC
C4逆相カラム（4.6 x 250 mm、300 Aポアサイズ、10μ粒子サイズ）で、各ペプチドの保持時間を測定した。等量の各ペプチドをカラムに注入し、緩衝液Aが0.1% TFA/ddH2Oであり緩衝液Bが0.1% TFA/アセトニトリルである直線AB勾配（2% B/mm）を利用し、1 mL／分の流速で溶出した。本明細書で報告する各ペプチドの保持時間は、3回測定した平均値である。
【００７５】
抗菌活性のアッセイ法
ペプチド抗菌活性は、R. Hancockら（Wu & Hancock (1999), J. Biol. Chem., v.274, pp.29-35）の方法により評価した。ミュラー・ヒントン寒天（MHA）プレートから細菌の試験菌株を試験管内の5ml ミュラー・ヒントン・ブロス（MHB）に播種し、振盪機（180 rpm）で37℃にて一晩培養した。以下のようにして、ポリプロピレンまたはコーティングしたガラス試験管内で、0.01%酢酸、0.2% BSAで試験ペプチドの段階希釈（必要な試験濃度の10倍で）を作製した：試験ペプチドを(a) 必要な最高濃度の20倍で蒸留水に溶解し（所定の日に全試験が行えるに十分な最終容量）；(b) 等量の0.02%酢酸、0.4% BSAで希釈し、必要な最高濃度の10倍濃度を得て；(c) 0.01%酢酸、0.2% BSAで段階的に2倍希釈していき、例えば、640, 320, 160, …2.5μg/mlのように必要な試験濃度の10倍濃度のペプチドの段階希釈を提供した（これらの媒体でペプチドを長期間保存しても、悪影響がないことが認められた）。一晩培養した細菌培養液を、2〜7 x 105コロニー形成単位/mlになるようMHBで希釈した。細菌懸濁液（100μl）を各ウェルに分配し；細菌のない対照を並列させた。各ウェルに10x試験ペプチド11μlを添加し、プレートを37℃にて18〜24時間インキュベートし、40〜48時間後に再度検査した。プレートは、視覚的におよびマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス（Molecular Devices））を用いて600 nmで測定した。本明細書で用いる最小発育阻止濃度（MIC）とは、試験微生物の増殖を完全に阻害したペプチドの最低濃度のことである。
【００７６】
実施例1
一般式
2004534084.tif 000016
の多数のペプチドを合成した。これらのペプチドの抗菌活性を、グラム陽性細菌（表皮ブドウ球菌、コリネバクテリウム クセロシス）およびグラム陰性細菌（大腸菌の様々な菌株）の両方に対して測定した。結果を、本明細書に記載するように計算した各ペプチドの平均疎水性と共に、表2に示す。
【００７７】
平均疎水性が少なくとも0.3であるペプチドは、試験したすべての細菌に対して抗菌活性を示した（表2）。
【００７８】
一方、閾値よりも低い疎水性を有するペプチドでは、64μg/mlまで抗菌活性は検出されなかった（S25：表2）。
【００７９】
表2のデータより、ペプチドF21のようにコア疎水性部分を15残基まで短縮したり；Fに基づく11残基のコア部分のN末端に6個のLys残基を配置したり[F17(K6)]；および6個のLys残基を6つのアルギニン（Arg）残基で（各末端に3個ずつ）置換しても（F17R）、すべてペプチドは高い抗菌活性を維持したままであることがさらに示される。
【００８０】
実施例2
ベロ細胞（ATCC CCL-81、ミドリザル腎臓）を用いて、細胞増殖に及ぼす効果で示されるような、本発明のペプチドが真核細胞に及ぼす任意の細胞毒性効果を調べた。
【００８１】
ベロ細胞を10,000細胞／ウェルでプレーティングし、サブコンフルエントな層にした。ペプチドを最終濃度320μg/mlとなるよう添加した（ペプチドを1.28 mg/mlで水に溶解し、その溶液を10X PBS溶液で150 mMの生理食塩水濃度となるよう調整した）。このペプチド溶液50μlを、培地150μlを含むウェルに添加した。細胞増殖は、対照ウェル（PBS）と比較してモニターした。細胞生存度のモニタリングは、生細胞を固定し10%酢酸に可溶化したクリスタルバイオレットで染色する標準のクリスタルバイオレット・アッセイ法により行った。560 nmで測定した吸光度が生細胞を示す。試験したペプチドは、W25、F25、K25、およびS25であった。本発明のペプチドは細胞毒性がなく、細胞増殖速度に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
【００８２】
実施例3
ヘパリン処理したウサギまたはヒト血液の赤血球をリン酸緩衝食塩水（PBS；5 mMリン酸緩衝液、0.14 M生理食塩水、pH 7.3）で3回洗浄し、1000 x gで4℃にて15分間遠心分離した。PBSで赤血球を4% (v/v)に希釈した。マイクロタイタープレート（Costar 3790、ポリプロピレン）に、PBSで希釈したペプチドを100μl容量で、赤血球懸濁液100μlと共にプレーティングした。PBSを対照として使用し、100%の溶解は0.1% Triton X-100で測定した。プレートを37℃で1時間インキュベートした後、1000 x gで5分間遠心分離した。上清の100μl分割量をマイクロタイタープレート（Nunc、ポリスチレン）に移し、マイクロプレートリーダーで540 nmでの吸光度を測定し、ヘモグロビンの放出をモニターした。ペプチド濃度50μmおよび200μmについて、結果を表6に示す。1〜2個の例外があるのみで、溶血はほとんどまたはまったく見られなかった。
【００８３】
実施例4
以下に示すように、病原体のさらなる範囲のATCC菌株についても、本発明のペプチドの抗菌活性を測定した。試験したペプチドは、F25、F17(K6)、およびF17Rであった。病原体試験の設定は、MICをヒツジ血液寒天プレート（ミュラー・ヒントン・プレートではなく）で試験する点以外は、本明細書に「抗菌活性のアッセイ法」として記載したものとほぼ同様である；2種類のプレート間に、コロニー形成単位の量における相違は見られなかった。
【００８４】
抗菌活性を+または++として示す。
枯草菌                  ++
緑膿菌                  +
セパシア菌              +
カンジダ・アルビカンス  +
【００８５】
実施例5
実施例1の直前に記載したアッセイ法により、本発明のさらに多数のペプチドを、各種グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する抗菌活性について試験した。
【００８６】
結果を表3、4、5A、および5Bに示す。ペプチドコア部分の疎水性は、本明細書に記載するように算出した。X=AlaまたはValである2、3の例において、グラム陽性のC.クセロシスのみに対する活性が見られた。
【００８７】
【表１】
2004534084.tif 000017
上記表1は、
2004534084.tif 000018
により決定した、一般に存在する20残基の疎水親水尺度を示す。
a中央の「X」残基はCysで置換し、他の2つの「X」残基はLeuで置換した。したがって、Cysの疎水親水度は、
等式：HCys = [(10 x ΔtRCys-Lys/ΔtRPhe-Lys) - 5.00 - HLeu x 2/3]x 3
で計算した。
【００８８】
【表２】
2004534084.tif 000019
MIC = 最小発育阻止濃度
aC498: 大腸菌、野生株
bC500: 大腸菌、抗菌株
cC621: 表皮ブドウ球菌
dC875: コリネバクテリウムxerosis
+ = 活性あり、定量せず
- = 活性なし
nd、未検
【００８９】
【表３】
2004534084.tif 000020
上記表3は、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌に対する25残基
2004534084.tif 000021
のMICを示す。
a値は、3回またはより多く個々に実験した代表値である。
【００９０】
【表４】
2004534084.tif 000022
上記表4は、アミノ酸配列および抗菌ペプチドの疎水性を示す。
a明確にするために、PheおよびTrp残基を太字にしてある。小文字のアミノ酸はD-鏡像体である。
【００９１】
【表５Ａ】
2004534084.tif 000023
上記表5aは、グラム陰性細菌に対するペプチドのMICを示す。
n.d.、未検
a値は、3回またはより多く個々に実験した代表値である。
【００９２】
【表５Ｂ】
2004534084.tif 000024
上記表5bは、グラム陽性細菌に対するペプチドのMICを示す。
n.d.、未検
a値は、3回またはより多く個々に実験した代表値である。
【００９３】
【表６】
2004534084.tif 000025
上記表6は、ウサギヒト赤血球（赤血球、RBC）における抗菌ペプチドの溶血活性を示す。
n.d. 未検
割合は最も近い+/-0.5%で示す。値は、2〜3回実験した代表値である。
【国際公開パンフレット】
2004534084.tif 000040
2004534084.tif 000041
2004534084.tif 000042
2004534084.tif 000043
2004534084.tif 000044
2004534084.tif 000045
2004534084.tif 000046
2004534084.tif 000047
2004534084.tif 000048
2004534084.tif 000049
2004534084.tif 000050
2004534084.tif 000051
2004534084.tif 000052
2004534084.tif 000053
2004534084.tif 000054
2004534084.tif 000055
2004534084.tif 000056
2004534084.tif 000057
2004534084.tif 000058
2004534084.tif 000059
2004534084.tif 000060
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2004534084.tif 000077
2004534084.tif 000078
2004534084.tif 000079
2004534084.tif 000080
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534084.tif 000081
【国際調査報告】
2004534084.tif 000082
2004534084.tif 000083
2004534084.tif 000084
2004534084.tif 000085
2004534084.tif 000086