(57)【要約】プロテアーゼ阻害剤：プロテアーゼ阻害剤および、トロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンからなる群より選択されるプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを、ホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーの有効量と接触させることによる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンからなる群より選択されるプロテアーゼを阻害する方法であって、当該方法が、当該プロテアーゼを、ホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーの有効量と、接触させることを含む当該方法。
【請求項２】
当該プロテアーゼがトロンビンである、請求項１の方法。
【請求項３】
当該プロテアーゼが、キモトリプシンである、請求項１の方法。
【請求項４】
当該プロテアーゼが、ニューロプシンである、請求項１の方法。
【請求項５】
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーが、哺乳動物ＰＥＢＰまたはそのフラグメントである、請求項１ないし４のいずれかの方法。
【請求項６】
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーが、ヒトＰＥＢＰである、請求項５の方法。
【請求項７】
当該ＰＥＢＰが図２に提供される配列によってコードされる、請求項５の方法。
【請求項８】
当該プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤を、可能性のあるプロテアーゼモジュレーターと接触させること、および、当該プロテアーゼ阻害剤が不存在のときと比較したときの、プロテアーゼ活性のレベルの変化を決定すること、をさらに含む、請求項１ないし７のいずれかの方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかの方法の使用のための、ホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーを含むキット。
【請求項１０】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーの生物学的活性のモジュレーターを同定する方法であって、
ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼを、当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの部分的阻害量の存在下で、候補化合物と接触させること、
感受性基質、当該候補化合物および当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの部分的阻害量の存在下で、当該プロテアーゼのタンパク質分解活性をアッセイすること、および
プロテアーゼと当該基質の間の接触を、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの部分的阻害量の存在下、かつ、当該候補化合物の不存在下で実施するときにアッセイされる活性の標準レベルと、該タンパク質分解活性とを比較すること、
を含む当該方法。
【請求項１１】
該標準を超えるタンパク質分解活性の阻害の増加を、ＰＥＢＰ阻害活性のアゴニストの存在と相関づけることをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該標準と比較したときのタンパク質分解活性の阻害の減少を、ＰＥＢＰ阻害活性のアンタゴニストの存在と相関づけることをさらに含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
当該プロテアーゼが、体液または細胞抽出物のサンプル中に提供される、請求項１０の方法。
【請求項１４】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーの生物学的活性のモジュレーターを同定する方法であって、
ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼを、ＰＥＢＰポリペプチドおよび候補化合物と接触させること、および
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの、当該ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼへの結合が、該候補化合物の存在によって、増加するか減少するかを決定すること、を含む当該方法。
【請求項１５】
当該プロテアーゼが、トロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンからなる群より選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
血液を、血液凝固を阻害するのに十分量のホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーと接触させることを含む、血液凝固を阻害する方法。
【請求項１７】
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーが、哺乳動物ＰＥＢＰまたはそのフラグメントである、請求項１６の方法。
【請求項１８】
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーが、図２に提供される配列によってコードされる、請求項１６の方法。
【請求項１９】
当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーが、固体表面と血液の接触前に、当該固体表面上を被覆する、請求項１６の方法。
【請求項２０】
血液を、追加的な抗凝固剤と接触させることをさらに含む請求項１６の方法。
【請求項２１】
血液を、血液凝固を促進する化合物と接触させることをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項２２】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーで被覆された受容器。
【請求項２３】
哺乳動物ＰＥＢＰまたはそのフラグメントで被覆された請求項２２の受容器。
【請求項２４】
血管内カニューレ、血液透析患者における血管アクセスシャント、血液透析機、および心肺バイパス機からなる群より選択される請求項２２の受容器。
【請求項２５】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼの活性の増加によって特徴づけられる障害または疾患、またはその素因を処置する方法であって、個体にＰＥＢＰファミリーのメンバーの有効量を投与することを含む当該方法。
【請求項２６】
当該障害が、神経変性性障害である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーと、薬学的に適当な担体を含む組成物。
【請求項２８】
当該薬学的に適当な担体が、リポソームである、請求項２７の方法。
【請求項２９】
医薬としてのＰＥＢＰファミリーのメンバーの使用。
【請求項３０】
ＰＥＢＰファインリーのメンバーとカテーテルを含むキット。
【請求項３１】
図２に提供される配列を含む、ＰＥＢＰファミリーのメンバー。
【請求項３２】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼの活性の増加によって特徴付けられる障害または疾患を診断する方法であって、当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの存在が、非罹患個体からの標準レベルと比較して、サンプル中で減少しているか否か決定することを含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、タンパク質化学、血栓形成、癌および神経生物学の分野で有用なプロテアーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
導入
セリンプロテアーゼは、組織発達中およびホメオスタシス中の多くの過程に関係する。他の機能のなかでも、これらは、細胞外マトリクスの構成要素を分解し、神経過程の外成長（Ｍｏｎａｒｄ， Ｄ． （１９８８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１．５４１−５４４）または細胞移動（Ｓｅｅｄｓ， Ｎ．Ｗ．， Ｂａｓｈａｍ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ Ｈａｆｆｋｅ， Ｓ．Ｐ．（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４１１８−１４１２３）を可能とし、これらは細胞死を促進し（Ｔｓｉｒｋａ， Ｓ．Ｅ．，Ｒｏｇｏｖｅ， Ａ．Ｄ．， Ｂｕｇｇｅ， Ｔ．Ｈ．， Ｄｅｇｅｎ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ， Ｓ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，５４３−５５２）、そして細胞分裂促進性物質または生存因子として作用する（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｐ．Ｊ．， Ｐｉｋｅ， Ｃ．Ｊ．， Ｃｏｔｍａｎ， Ｃ．Ｗ．， ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ， Ｄ．Ｄ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５， ５３８９−５４０１）。プロテアーゼの活性を、これらの同類（ｃｏｇｎａｔｅ）阻害剤によって調節し、これらは、正常な発達およびホメオスタシスを確保するために、正確にバランスのとれた様式で作用しなければならない。神経系におけるこのバランスの妨害は、病理学的障害、例えば、アルツハイマー病に関係するはずだと提唱された（Ｔｕｒｇｅｏｎ， Ｖ．Ｌ． ａｎｄ Ｈｏｕｅｎｏｕ， Ｌ．Ｊ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．２５， ８５−９５； Ｗａｇｎｅｒ ＳＬ， Ｇｅｄｄｅｓ ＪＱ， Ｃｏｔｍａｎ ＳＷ， Ｌａｕ ＡＬ， Ｇｕｒｗｉｔｚ Ｄ， Ｉｓａｃｋｓｏｎ ＰＪ， ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＤＤ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（２１）：８２８４−８）。
【０００３】
現在、いくつかのセリンプロテアーゼは、中枢神経系で検出され、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、キモトリプシン、ニューロプシン、エラスターゼ、およびトロンビンを含む（Ｄａｖｉｅｓ， Ｂ．Ｊ．， Ｐｉｃｋａｒｄ， Ｂ．Ｓ．， Ｓｔｅｅｌ．Ｍ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｒ．Ｇ．， ａｎｄ Ｌａｔｈｅ， Ｒ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３，２３００４−２３０１１）。これらのプロテアーゼの活性を調節する、多くのセリンプロテアーゼ阻害剤が、脳に見出されている。しかし、プロテアーゼ・ネキシン−１（ＰＮ−１； Ｇｌｏｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６）Ｃｅｌｌ ４７， ６８７−６９３； Ｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｒ．， Ｎｉｃｋ， Ｈ．， Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ， Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｎａｒｄ， Ｄ．（１９８７）Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２５２， ２３７−２４４）は、唯一知られる、中枢神経系に存在する内因性トロンビン阻害剤である。インビトロでは、トロンビンおよびＰＮ−１の相互作用は、神経細胞の神経突起外成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）（Ｍｏｎａｒｄ， Ｄ．， Ｎｉｄａｙ， Ｅ．， Ｌｉｍａｔ， Ａ．， ａｎｄ Ｓｏｌｏｍｏｎ， Ｆ．（１９８３）Ｐｒｏｇ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ．５８，３５９−３６４； Ｇｕｒｗｉｔｚ， Ｄ． ａｎｄ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｄ．Ｄ．（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５， ３４４０−３４４４；Ｚｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １０，１７−２４； Ｆａｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９０）Ｄｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：７３−８０）および星状細胞の星状化（Ｃａｖａｎａｕｇｈ， Ｋ．Ｐ．， Ｇｕｒｗｉｔｚ， Ｄ．， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｒａｄｓｈａｗ， Ｒ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５４， １７３５−１７４３）を調節することが示さた。さらに、ＰＮ−１は、神経系の損傷に応答して高度に発現される（Ｍｅｉｅｒ， Ｒ．， Ｓｐｒｅｙｅｒ， Ｐ．， Ｏｒｔｍａｎｎ， Ｒ．， Ｈｅｒｅｌ， Ａ．， ａｎｄ Ｍｏｎａｒｄ， Ｄ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２， ５４８−５５０ ２５； Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４９：３９７−４０８）。これらの観察にもかかわらず、ＰＮ−１を欠くマウスは、神経系にわずかな表現型を示すのみであり（Ｌｕｅｔｈｉ， Ａ．， Ｐｕｔｔｅｎ， Ｈ．， Ｂｏｔｔｅｒｉ， Ｆ．Ｍ．， Ｍａｎｓｕｙ， Ｉ．Ｍ．， Ｍｅｉｎｓ， Ｍ．， Ｆｒｅｙ， Ｕ．， Ｓａｎｓｉｇ， Ｇ．， Ｐｏｒｔｅｔ， Ｃ．，Ｓｃｈｍｉｔｚ， Ｍ．， Ｓｃｈｒｏｄｅｒ， Ｍ．， Ｎｉｔｓｃｈ， Ｃ．， Ｌａｕｒｅｎｔ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｍｏｎａｒｄ， Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７， ４６８８−４６９９）、このことはこれらの動物においてＰＮ−１機能の欠如を補足するものの存在を示唆している。
【０００４】
２５ｋＤａのカルボキシペプチダーゼＹ阻害剤は、ｌｃまたはＴＦＳ１遺伝子産物とよばれ、コウボで以前に記載された（Ｂｒｕｕｎ， Ａ．Ｗ．， Ｓｖｅｎｄｓｅｎ， Ｉ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｓ．Ｏ．， Ｋｉｅｌｌａｎｄ−Ｂｒａｎｄｔ， Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， ３３５１−３３５７）。カルボキシペプチダーゼＹは、触媒性Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐの３つ組みおよびトリプシン様オキシアニオンホールを含む。したがって、その触媒性機構は、トリプシン型のセリンプロテアーゼに類似するものと信じられる（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ．， Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｗｏｅｓｓｎｅｒ， Ｊ．Ｆ．， ｅｄｓ）ｐｐ．３８９−３９３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ中、Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｕ．Ｈ．， Ｏｌｅｓｅｎ， Ｋ．，ａｎｄ Ｂｒｅｄｄａｍ， Ｋ．（１９９８））。ＴＦＳ１（ｌｃ）と２１−２３ｋＤａ脂質結合タンパク質、例えば、フォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）の間の配列における類似性は、その著者に、２１−２３ｋＤａ脂質結合タンパク質がまた、特異的細胞性セリンカルボキシペプチダーゼの阻害剤であり得ることを考えさせる。マウスのフォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質である、ＰＥＢＰは、１８７アミノ酸で作成され、そして顕花植物から哺乳動物までの広範囲の種に見出されるリン脂質結合タンパク質のファミリーに属する（Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ．（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３６９，２２−２６）。ＴＦＳ１およびマウスＰＥＢＰは、アミノ酸レベルで３１％同一性を共有する。
【０００５】
フォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質は、もともとウシ脳から精製され、可溶性２３ｋＤａ塩基性細胞質タンパク質として記載されるとおりである（Ｂｅｒｎｉｅｒ， Ｉ． ａｎｄ Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ． （１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７９０， １７４−１８１）。結合研究は、ホスファチジルエタノールアミン（Ｂｅｒｎｉｅｒ， Ｉ．，Ｔｒｅｓｃａ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８７１， １９−２３）、ＧＴＰおよびＧＤＰのようなヌクレオチドおよび小ＧＴＰ−結合タンパク質および他の疎水性リガンド（Ｂｕｃｑｕｏｙ， Ｓ．， Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ．， ａｎｄ Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ，Ｆ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２５， １２０３−１２１０）へのその親和性を明らかにした。独立的に、ＰＥＢＰは神経ポリペプチドｈ３としてヒト脳から精製され（Ｂｏｌｌｅｎｇｉｅｒ， Ｆ．ａｎｄ Ｍａｈｌｅｒ， Ａ．（１９８０）Ｎｅｕｒｏｐｅｐｕｔｉｄｅｓ １， １１９−１３５ ２６）：このタンパク質の配列決定（Ｓｅｄｄｉｑｉ， Ｎ．， Ｂｏｌｌｅｎｇｉｅｒ， Ｆ．， Ａｌｌｉｅｌ， Ｐ，Ｍ．， Ｐｅｒｉｎ， Ｊ．Ｐ．， Ｂｏｎｎｅｔ， Ｆ．， Ｂｕｃｑｕｏｙ， ＡＳ．， Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ．， ａｎｄ Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ， Ｆ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．３９， ６５５−６６０）は、ウシＰＥＢＰの配列との９５％アミノ酸配列同一性を示す（Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ， Ｆ．， Ｓａｃｃｏｃｃｉｏ， Ｆ．， Ｊｏｌｌｅｓ， Ｊ．， Ｂｅｒｎｉｅｒ， Ｉ．， ａｎｄ Ｊｏｌｌｅｓ， Ｐ． （１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６，３３３−３３８）。今日このファミリーのメンバーは、ラット（Ｇｒａｎｄｙ， Ｄ．Ｋ．， Ｈａｎｎｅｍａｎ， Ｅ．， Ｂｕｎｚｏｗ， Ｊ．， Ｓｈｉｈ， Ｍ．， Ｍａｃｈｉｄａ， Ｃ．Ａ．， Ｂｉｄｌａｃｋ，Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｌｉｖｅｌｌｉ， Ｏ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１３７０−１３７６）、マウス（Ａｒａｋｉ， Ｙ．， Ｖｉｅｒｕｌａ， Ｍ．Ｅ．，Ｒａｎｉｋｉｎ， Ｔ．Ｌ．， Ｔｕｌｓｉａｎｉ， Ｄ．Ｒ．， ａｎｄ Ｏｒｇｅｂｉｎ−Ｃｒｉｓｔ， Ｍ．Ｃ．（１９９２）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４７，８３２−８４３）およびサル（Ｐｅｒｒｙ， ａ．Ｃ．， Ｈａｌｌ， Ｌ．， Ｂｅｌｌ， Ａ．Ｅ．， ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ｒ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１（Ｐｔ１）， ２３５−２４２）を含む他の哺乳動物において同定された。ＰＥＢＰファミリーの他のメンバーは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの推定臭気性結合物質タンパク質（Ｐｉｋｉｅｌｎｙ， Ｃ．Ｗ．， Ｈａｓａｎ， Ｇ．， Ｒｏｕｙｅｒ， Ｆ．， ａｎｄ Ｒｏｓｂａｓｈ， Ｍ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ １２， ３５−４９）、マラリヤ原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの推定ＰＥＢＰ（Ｔｒｏｔｔｅｉｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｃｏｗｍａｎ， Ａ．Ｆ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．７０， ２３５−２３９）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒａ ｖｏｌｖｕｌｕｓＯｖ−１６抗原（Ｌｏｂｏｓ， Ｅ．， Ａｌｔｍａｎｎ， Ｍ．， Ｍｅｎｇｏｄ， Ｇ．，Ｗｅｉｓｓ， Ｎ．，Ｒｕｄ��ｎ， Ｗ．，ａｎｄ Ｋａｒａｍ， Ｍ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３９，１３５−１４５）およびＴｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓのトキソカラ排出分泌抗原２６（Ｇｅｍｓ， Ｄ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｃ．Ｊ．， Ｒｏｂｅｒｔｏｓｏｎ， Ｂ．Ｄ．， Ｎｉｅｖｅｓ， Ｒ．， Ｐａｇｅ， Ａ．Ｐ．， Ｂｌａｘｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．， ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ， Ｒ．Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７０， １８５１７−１８５２２）であって、２種の寄生線虫である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＤＣ２５突然変異の投与依存性サプレッサーである、２５サプレッサー１（ＴＦＳ１， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｌ．Ｃ．ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ， Ｋ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０， ２４１−２５０）、および顕花植物のいくつかのタンパク質（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｏｈｓｈｉｍａ， Ｓ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｍ．， Ｓａｋａｍｏｔｏ， Ｗ．， Ｏｇｕｒａ， Ｙ．， ａｎｄ Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ， Ｆ．（１９９７）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２５４， １８６−１９４ ２７； Ｋａｒｄａｉｓｋｙ， Ｉ．， Ｓｈｕｋｌａ， Ｖ．Ｋ．， Ａｈｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｄａｇｅｎａｉｓ， Ｎ．， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｓ．Ｋ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｒｙ， Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｗｅｉｇｅｌ， Ｄ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， １９６２−１９６５； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｋａｙａ， Ｈ．， Ｇｏｔｏ， Ｋ．， Ｉｗａｂｕｓｈｉ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｒａｋｉ， Ｔ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， １９６０−１９６２）およびＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ（Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ｒ．，Ｃｏｐｓｅｙ， Ｌ．， Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｃ．， Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｒｎ，Ｅ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９， ７９１−７９７））はまたこのファミリーに含まれる。
【０００６】
この広分布発現およびＸ線結晶回折によるウシおよびヒトＰＥＢＰの３Ｄ構造の解決（Ｓｅｒｒｅ， Ｌ．， Ｖａｌｌｅｅ， Ｂ．， Ｂｕｒｅａｕｄ， Ｎ．， Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ， Ｆ．， ａｎｄ Ｚｅｌｗｅｒ， Ｃ．（１９８８）Ｓｔｒｃｔｕｒｅ ６， １２５５−１２６５；Ｂａｎｆｉｅｌｄ， Ｍ．Ｊ．， Ｂａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｊ．， Ｐｅｒｒｙ， Ａ．Ｃ．， ａｎｄ Ｂｒａｄｙ， Ｒ．Ｌ．（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６， １２４５−１２５４） にもかかわらず、このファミリーのタンパク質の機能または特性についてほとんど知られていない。ラット海馬では、ＰＥＢＰは、海馬神経刺激ペプチド（ＨＣＮＰ）の前駆体である、コリンアセチルトランスフェラーゼの合成を増強することによって医学的中隔核のニューロンの分化に関係するウンデカペプチドであると、記載された（Ｏｊｉｋａ， Ｋ．，Ｍｉｔａｋｅ， Ｓ．， Ｔｏｈｄｏｈ，Ｎ．， Ａｐｐｅｌ， Ｓ．Ｈ．， Ｏｔｓｕｋａ， Ｙ．， Ｋａｔａｄａ， Ｅ．， ａｎｄ Ｍａｔｓｕｋａｗａ， Ｎ．（２０００）Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ６０， ３７−８３）。しかし、脾臓、精巣、卵巣、および胃を含む、中枢神経系外でのＰＥＢＰの広分布発現（Ｂｏｌｌｅｎｇｉｅｒ， Ｆ．ａｎｄ Ｍａｈｌｅｒ， Ａ．（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５０， １２１０−１２１４； Ｆｒａｙｎｅ， Ｊ．， Ｉｎｇｒａｍ，Ｃ．， Ｌｏｖｅ， Ｓ．， ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９８，４１５−４２３）は、このタンパク質の追加的役割を示唆する。
【０００７】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーはしばしば、成長または拡張しつつある細胞、例えば、希突起膠細胞、精子細胞、および顕花植物の花序成長点に高度に発現される。ともに、この発現パターンおよび原形質膜の内部リーフレット上におもに位置するリン脂質への結合は、細胞成長および発達の間の原形質膜の組織化におけるＰＥＢＰの役割を示唆する。ＰＥＢＰはヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ビリオン内部に存在するいくつかの細胞性タンパク質のいずれかであると報告され（Ｏｔｔ， Ｄ．Ｅ．， Ｃｏｒｅｎ， Ｌ．Ｖ．， Ｊｐｈｎｓｏｎ， Ｄ．Ｇ．， Ｋａｎｅ， Ｂ．Ｐ．， Ｓｏｗｄｅｒ， Ｒ．Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｙ．Ｄ．， Ｆｉｓｈｅｒ， Ｒ．Ｊ．， Ｚｈｏｕ， Ｘ．Ｚ．， Ｌｕ， Ｋ．Ｐ．， ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｌ．Ｅ．（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６６， ４２−５１）、このことは、膜組織化におけるＰＥＢＰの可能な役割を支持している。
【０００８】
他方、ＰＥＢＰと小−ＧＴＰ結合タンパク質間の相互作用は、ＰＥＢＰがシグナル化機構に関係し得るという考察につながる。最近、ＰＥＢＰは、ＭＡＰ−キナーゼシグナル化を抑制するＲａｆ−１キナーゼ阻害剤タンパク質（ＲＫＩＰ）として記載された（Ｙｅｕｎｇ， Ｋ．， Ｓｅｉｔｚ， Ｔ．， Ｌｉ， Ｓ．， Ｊａｎｏｓｃｈ， Ｐ．， ＭｃＦｅｒｒａｎ， Ｂ．， Ｋａｉｓｅｒ， Ｃ．， Ｆｅｅ， Ｆ．， Ｋａｔｓａｎａｋｉｓ， Ｋ．Ｄ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｗ．， Ｍｉｓｃｈａｋ， Ｈ．， Ｓｅｄｉｖｙ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｋｏｌｃｈ， Ｗ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０１， １７３−１７７； Ｙｅｕｎｇ，Ｋ．， Ｊａｎｏｓｃｈ， Ｐ， ＭｃＦｅｒｒ ｎ，Ｂ．， Ｒｏｓｅ， Ｄ．Ｗ．， Ｍｉｓｃｈａｋ，Ｈ．， Ｓｅｄｉｖｙ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｋｏｌｃｈ， Ｗ．（２０００）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０， ３０７９−３０８５）。この研究論文の著者は、ＰＥＢＰが、Ｒａｆ−１およびＭＥＫに結合することによってＲａｆ／ＭＥＫ界面のＥＲＫ経路を調節し、それによってＥＲＫ経路の競合的阻害につながることを示唆する。彼らはさらに、ＰＥＢＰ／ＲＫＩＰのＲａｆ−１への結合が、細胞分裂刺激中に減少することを示した。
【０００９】
まとめると、可能性のあるＰＥＢＰ機能は当業界で示唆されたが、ＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性の決定的な実証はない。ＰＥＢＰは、他の既知のクラスのセリンプロテアーゼ阻害剤、例えば、セルピン、Ｋｕｎｉｔｚ、ＫａｚａｌまたはＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋファミリーと有意には相同性を共有しない（Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｓａｌｖｅｓｅｎ， Ｇ．（１９８６）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ， Ｅｌｓｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ２８）。
【００１０】
発明の要約
本発明にしたがって、我々はプロテアーゼ、好ましくは、トロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンからなる群より選択されるセリンプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを、ホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバー、好ましくはＰＥＢＰの有効量と接触させることによって、阻害する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの生物学的活性を増強または阻害することのできる化合物を同定するスクリーニング方法であって、ＰＥＢＰファミリーのメンバーによって阻害されるプロテアーゼを、候補化合物と、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの部分的阻害量の存在下で接触させ、候補化合物および部分的阻害量のＰＥＢＰファミリーのメンバーの存在下で感受性基質への該プロテアーゼのタンパク質分解活性をアッセイし、そしてＰＥＢＰファミリーのメンバーの部分的阻害量の存在下、かつ、候補化合物の不存在下で、該プロテアーゼとその基質の間で、接触が実施されるときにアッセイされる活性の標準レベルと、該タンパク質分解活性を比較することに関係する方法を提供する。このアッセイでは、該標準を超えるタンパク質分解活性の阻害の増加は、該候補化合物が、ＰＥＢＰ阻害活性のアンタゴニストであること、および該標準と比較されるタンパク質活性の阻害の減少は、該化合物が、ＰＥＢＰ阻害活性のアンタゴニストであることを、指摘する。
【００１２】
もう１つの側面では、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングアッセイを提供し、候補化合物が、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの、感受性プロテアーゼへ、好ましくはその活性部位への結合に及ぼす影響を決定することに関係するアッセイを提供する。特に、該方法は、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼを、ＰＥＢＰファミリーのメンバーおよび候補化合物と接触させること、および該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼへの結合が、該候補化合物の存在のために増加または減少するか否か決定することに関係する。
【００１３】
本発明のいずれかの方法での使用のためのホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーを含むキットをまた提供する。
【００１４】
本発明はまた、血液凝固を阻害する方法であって、血液を、血液凝固を阻害するのに十分量のホスホエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーと接触させることを含む方法を提供する。この点では、血液と接触される受容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）および他の固体表面を、ＰＥＢＰファミリーのメンバー、好ましくはＰＥＢＰで処理し、血液凝固を阻害することができる。加えて、抗血栓発生性疾患または障害を処置する方法であって、ＰＥＢＰファミリーのメンバー単独または他の医薬、例えば、抗凝固剤と組み合わせて使用する方法を提供する。
【００１５】
本発明の更なる側面は、ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼの活性増加によって特徴付けられる障害または疾患またはその素因を処置する方法であって、ＰＥＢＰファミリーのメンバーまたはそのアゴニストの有効量を個体に投与することによるものである方法を提供する。そのような障害は、血栓発生性障害、神経変性性障害および癌を含む。こうして、ＰＥＢＰファミリーのメンバーおよび薬学的に適当な担体、例えば、処置の必要な個体への投与のためのリポソームを含む組成物をまた提供する。
【００１６】
疾患、特に認知障害の処置方法を提供し、そして医薬組成物の有効量を投与することによって実施される。特に、アルツハイマー病、認知欠損、ダウン症候群、パーキンソン病、アミロイドーシスによる脳出血、拳闘家痴呆、頭部外傷、および、脳において、プロテアーゼ活性、特にトロンビン、ニューロプシン、またはキモトリプシン活性の増加によって特徴付けられる任意の障害から選択される神経変性性疾患を罹患している患者を、治療有効量のＰＥＢＰポリペプチドを投与することによって処置する方法。
【００１７】
また、図２（配列番号１）に提供される配列を含むＰＥＢＰファミリーのメンバーを提供する。
本発明のさらなる側面は、ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼの活性の増加によって特徴付けられる障害または疾患を、サンプル中のＰＥＢＰファミリーのメンバーの存在が、非罹患個体からの標準レベルと比較して減少しているか否かを決定することによって、診断する方法を提供する。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１　野生型およびＰＮ−１（−／−）マウスの脳でのトロビン阻害活性。
種々の部分の野生型の（△、小脳；□、皮質；○、残りの部分）およびＰＮ−１（−／−）（▲、小脳；■、皮質；●、残りの部分）脳を、ホモジナイズし、そしてそれらのタンパク質含量を測定した。等タンパク質含量のアリコートを、段階的に希釈し、そしてトロンビン阻害についてアッセイした。
【００１９】
図２　ナノＥＳＩ質量分析による阻害の同定。
マウスＰＥＢＰ（配列番号１）に同一であるべきと見出された、トリプシンによって生じたペプチドを太字で示す。最初に公開された（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ７０２９６）１１６位のセリンは、フォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質ファミリーに属する、すべての既知タンパク質中に実際に保存されているグリシンであるべきであると見出された。この発見は、以前公開された （ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４３２０６）ＡＧＴの代わりにＧＧＴを第１１６番目のコドンとして有するＩＭＡＧＥクローン番号１９２１２７４のＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００２０】
発明の詳細な記載
本発明者は、ＰＮ−１（−／−）マウスの、トロンビン阻害剤ＰＮ−１の欠如を補償することのできるプロテアーゼ阻害剤を同定した。該プロテアーゼ阻害剤を、フォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーとして同定し、そして特異的セリンプロテアーゼ阻害活性、特にトロンビン、ニューロプシン、およびキモトリプシン阻害活性を有するとして特徴付けた。こうして、本発明の１側面は、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、より好ましくはトロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンからなる群より選択されるセリンプロテアーゼ阻害する方法であって、該プロテアーゼを、有効量のフォスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）ファミリーのメンバーと接触させることを含む方法を提供する。
【００２１】
ここで使用するように、用語「ＰＥＢＰファミリーのメンバー」は、ＰＥＢＰホモログまたはフラグメントを含むことを意図し、これらは、Ｂｒｕｕｎ ｅｔ ａｌによって開示された（そのなかの図１Ｃ、第３配列参照；配列番号２）ようなヒトＰＥＢＰのアミノ酸残基６５−８６および１１５−１２８にわたる領域に、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性、より好ましくは少なくとも８０％同一性、最も好ましくは少なくとも９０％同一性の領域を含むことによって同定することができる。関連哺乳動物ＰＥＢＰタンパク質のほか、ＰＥＢＰファミリーの他のメンバーは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの推定臭気物質結合タンパク質（Ｐｉｋｉｅｌｎｙ， Ｃ．Ｗ．， Ｈａｓａｎ， Ｇ．， Ｒｏｕｙｅｒ， Ｆ．， ａｎｄ Ｒｏｓｂａｓｈ， Ｍ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ １２， ３５−４９）、マラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの推定ＰＥＢＰ（Ｔｒｏｔｅｉｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｃｏｗｍａｎ， Ａ．Ｆ．（１９９５）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ７０， ２３５−２３９）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒａ ｖｏｌｃｕｌｕｓのＯｖ−１６抗原（Ｌｏｂｏｓ， Ｅ．， Ａｌｔｍａｎ， Ｍ．， Ｍｅｎｇｏｄ， Ｇ．， Ｗｅｉｓｓ， Ｎ．， Ｒｕｄｉｎ， Ｗ．， ａｎｄ Ｋａｒａｍ， Ｍ．（１９９０）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ３９， １３５−１４５）およびＴｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓのトキソカラ排出分泌抗原２６（Ｇｅｍｓ， Ｄ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｃ．Ｊ．， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．Ｄ．， Ｎｉｅｖｅｓ， Ｒ．， Ｐａｇｅ， Ａ．Ｐ．， Ｂｌａｘｔｅｒ， Ｍ．Ｌ．， ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ， Ｒ．Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１８５１７−１８５２２）、ＴＦＳ−１遺伝子産物（ＴＳＦ１， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｌ．Ｃ．ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ， Ｋ．（１９９１）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３０， ２４１−２５０）、および顕花植物のいくつかのＰＥＢＰ類（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｏｈｓｈｉｍａ， Ｓ．， Ｍｕｒａｔａ， Ｍ．， Ｓａｋａｍｏｔｏ， Ｗ．， Ｏｇｕｒａ， Ｙ．， ａｎｄ Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ， Ｆ．（１９９７）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５４， １８６−１９４ ２７； Ｋａｒｄａｉｌｓｋｙ， Ｉ．， Ｓｈｕｋｌａ， Ｖ．Ｋ．， Ａｈｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｄａｇｅｎａｉｓ， Ｎ．， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｓ．Ｋ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｊ．Ｔ．， Ｃｈｏｒｙ， Ｊ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｍ．Ｊ．， ａｎｄ Ｗｅｉｇｅｌ， Ｄ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， １９６２−１９６５； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｋａｙａ， Ｈ．， Ｇｏｔｏ， Ｋ，ｍ Ｉｗａｂｕｃｈｉ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｒａｋｉ， Ｔ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， １９６０−１９６２）およびＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ（Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．， Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ， Ｒ．， Ｃｏｐｓｅｙ， Ｌ．， Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｃ．， Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｅｎ， Ｅ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３７９， ７９１−７９７））である。
【００２２】
好ましいメンバーは、哺乳動物ＰＥＢＰまたは哺乳動物配列に由来する合成ＰＥＢＰであり、天然に存在するＰＥＢＰと比較してアミノ酸置換、欠失および付加を含む。天然に存在するＰＥＢＰはまた、生物の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の変化形態である「対立遺伝子変異体」を含む（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ＳＯｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。ヒトＰＥＢＰ（配列番号２）または図２（配列番号１）によって提供する配列によってコードされるＰＥＢＰがもとも好ましい。こうして、本発明の１側面では、図２によって提供する配列（配列番号１）によってコードされるＰＥＢＰポリペプチドを提供する。
【００２３】
ここで提供した特定の例は、ＰＥＢＰファミリーの既知メンバーに限定されているが、ＰＥＢＰファミリーのメンバーはなおも同定されるであろうことが、当業者に明かであり、またはそのフラグメントを、本明細書の教示に鑑みて容易に調製する。例えば、種々のＰＥＢＰポリペプチドのコード配列のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドテンプレートを、既知のおよび新しいＰＥＢＰファミリーのメンバーの間の相同性の程度にしたがって、およびハイブリダイゼーション条件に依存して使用のため修飾できる。代替的に、２配列の間に十分な同一性が存在するならば、同じテンプレートをさらなる修飾なくして使用できる。代替的に、オリゴヌクレオチドテンプレートの好適な対を、使用できる。加えて、天然に存在する配列の変異体、特にプロテアーゼ阻害活性に必須ではないアミノ酸の保存置換を予測する。
【００２４】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーを、融合タンパク質として調製し、精製またはある種のアッセイ形式を促進することができる。融合タンパク質は例えば、ＰＥＢＰファミリーのメンバー配列に加えて、タグまたはレポーター分子を含み得る。タグは例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、反復性ヒスチジン残基（Ｈｉｓ６）などであることができる。レポーター分子（すなわち、シグナル発生分子）は、検出可能な変化を提供することのできる任意の分子であることができる。そのようなレポーター分子は、蛍光部分（例えば、蛍光タンパク質または化学的蛍光標識）、放射活性部分、リン光性部分、抗原、レポーター酵素などを含み得る。好ましくは、レポーター分子は、活性が検出可能な変化をもたらすレポーター酵素である。そのようなレポーター酵素は、以下の：ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅｓ）、ルシフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼ、およびウレアーゼを含み得るがこれらに限定されない。適当なレポーター分子の選択は、当業者には容易に明かである。
【００２５】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーまたは融合タンパク質は、組換えまたは化学的方法によって、並びに標準的タンパク質生成技法を使用することによって容易に調製でき、当業者に明らかなとおりである。例えば、ＰＥＢＰファミリーのメンバーをコードするＤＮＡまたは融合タンパク質は、ＰＥＢＰファミリーのメンバーまたは融合タンパク質をコードする核酸に、および所望により転写終結シグナルに、作動可能に連結されているプロモーターを含む核酸発現カセットに含まれ得る。融合タンパク質の融合ポリペプチドを、直接的にまたはスペーサーによって結合し得る。
【００２６】
タンパク質を、天然源に由来するよりむしろ合成手段によって、商業的に入手可能なタンパク質合成機を使用して取得し、またはなお商業的ペプチド合成役務から注文し得る。合成したタンパク質は、変化アミノ酸残基の使用、またはポリペプチドへの異種基または側鎖の付加、および標識またはタグの取りこみを含む、任意の望まれる配列修飾を含み得る。化学的に合成されたタンパク質はまた、非ペプチド結合を含み得、当業者に明かな通りである。
【００２７】
プロテアーゼ阻害についてここで使用する用語「有効量」は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％またはより多く、感受性プロテアーゼを阻害するのに十分であることを意味する。
【００２８】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーのプロテアーゼ阻害活性は、タンパク質精製、特にプロテイナーゼ精製（例えば、トロンビン、キモトリプシン、およびニューロプシン）、並びに他の生産および調査適用のために有用である。こうして、ＰＥＢＰファミリーのメンバーは、包材、望まれる目的のために有効であるＰＥＢＰポリペプチドを含む許容される組成物、および該組成物がプロテアーゼ阻害剤、特にトロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンとして使用されることを指摘する標識を含む製品として包装され得る。
【００２９】
本発明の１側面では、スクリーニング方法であって、ここでＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼを、ＰＥＢＰファミリーのメンバー、および追加的な可能性のあるプロテアーゼモジュレーターと接触させる、スクリーニング方法を提供する。可能性のあるプロテアーゼモジュレーターが存在しないときと比較して、可能性のあるプロテアーゼモジュレーターの存在下で検出されるプロテアーゼ活性のレベルの変化は、プロテアーゼモジュレーターの存在を指摘する。ここで使用する用語「ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼ」が、ＰＥＢＰファミリーのメンバーによって、好ましくは哺乳動物ＰＥＢＰによって阻害される任意のプロテアーゼを含むことを意図する。より好ましくは、プロテアーゼはトロンビン、キモトリプシンまたはニューロプシンである。
【００３０】
特に、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの生物学的活性のモジュレーターを同定するための方法であって、ＰＥＢＰファミリーのメンバーによる阻害に感受性のプロテアーゼを、部分的阻害量の当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの存在下、候補化合物と接触させること、当該プロテアーゼのタンパク質分解活性を、感受性基質、当該候補化合物および部分的阻害量の当該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの存在下でアッセイすること、および該タンパク質分解活性を、標準的レベルの活性であって、該標準的レベルは、プロテアーゼと当該基質の間の接触を、部分的阻害量のＰＥＢＰファミリーメンバーの存在下、かつ、当該候補化合物の不存在下で実施するときにアッセイされる標準的活性レベルに対して比較することを含む方法を提供する。該標準を上回るタンパク質分解の阻害の増加を、ＰＥＢＰ阻害活性のアゴニストの存在と相関付け、一方、該標準と比較したときのタンパク質分解活性の阻害の減少を、ＰＥＢＰ阻害活性のアンタゴニストの存在と相関付ける。したがって、現文脈のアゴニストは、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの天然の生物学的機能を増加させる、またはＰＥＢＰファミリーのメンバーに類似の態様で機能する化合物であり、一方、アンタゴニストは、そのような機能を減少または制限する。
【００３１】
本発明はまた、プロテアーゼ、特にトロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンと相互作用する能力に基づいて、プロテアーゼヘのＰＥＢＰファミリーのメンバーの作用を増強、または阻止するものを同定するために、化合物をスクリーニングする方法を提供する。こうして、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼ、好ましくはトロンビン、キモトリプシンまたはニューロトリプシンを、ＰＥＢＰポリペプチドおよび候補化合物と接触させ、該候補化合物の存在のために、該ＰＥＢＰファミリーのメンバーの当該ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼへの結合が、増加するか減少するか決定することによって、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの生物学的活性のモジュレーターを同定する方法を提供する。
【００３２】
例えば、ＰＥＢＰファミリーのメンバーを結合する分子、例えば、シグナル化または調節経路の分子またはフォスファチジルエタノールアミンを結合する分子を発現する、または含む細胞、または体液から調製し得る細胞性エキストラクトまたはフラクションを、ここで記載のスクリーニングアッセイで使用できる。調製品を、ＰＥＢＰアゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補化合物の不存在または存在下で、標識したＰＥＢＰファミリーのメンバーとインキュベートすることができる。該候補分子の、結合分子を結合する能力は、標識されたリガンドの減少した結合に反映される。無償的に、すなわちＰＥＢＰの、ＰＥＢＰ結合分子に結合することに及ぼす影響を誘導することなく結合する分子は、最も良好なアンタゴニストでありそうである。よく結合し、かつＰＥＢＰと同じまたは緊密に関連する効果を誘発する分子は、アゴニストである。
【００３３】
ＰＥＢＰアンタゴニストについてのアッセイの他の例は、ＰＥＢＰファミリーのメンバーと、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼ、特にトロンビン、キモトリプシンまたはニューロプシンの可能性のあるアンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適当な条件下、組み合わせる競合的アッセイである。ＰＥＢＰファミリーのメンバーを、例えば放射性活性によって標識し、その結果プロテアーゼ分子に結合したＰＥＢＰファミリーのメンバー分子の数を正確に決定し、可能性のあるアンタゴニストの有効性を評価することができる。
【００３４】
可能性のあるアンタゴニストは、ＰＥＢＰファミリーのメンバーに結合し、それによってその活性を阻害または制限する、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を含む。可能性のあるアンタゴニストは、また、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、例えば、緊密に関連したタンパク質または抗体であって結合分子、例えば、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼ分子の同じ部位を、ＰＥＢＰ誘導活性を誘導せずに結合し、それによりＰＥＢＰを結合から排除することによってＰＥＢＰの作用を防止するものであり得る。
【００３５】
ひとたび可能性のあるアゴニスト／アンタゴニストを同定すると、さらなる分析を該同定を確認するために実施できる。そのようなテストは、当業界で知られ、そして神経突起外成長アッセイ、ホスホイノシチド加水分解活性、Ｃａ２＋流束アッセイ、および血小板凝集アッセイを含む。
【００３６】
他の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技法を使用し、アンチセンスＤＮＡ、またはＲＮＡを介して、または三つ組みヘリックス形成を介して遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技法は、例えば、Ｏｋａｎｏ， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５６：５６０（１９９１）； ’’Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．（１９８８）中に議論される。三つ組みヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｓｅａｒｃｈ ６： ３０７３（１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）； ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： １３６（（１９９１）中に議論される。該方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、成熟ＰＥＢＰファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用し、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、転写に関係する遺伝子の領域に相補的であるように設計し、それによって転写およびＰＥＢＰ生産を防止することができる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＰＥＢＰポリペプチドへの翻訳を阻止する。前記オリゴヌクレオチドをまた細胞に送達し、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボで発現させ、ＰＥＢＰの生産を阻害することができる。
【００３７】
アゴニストおよびアンタゴニストを、薬学的に許容される担体、例えば、前記のものと組成物中に使用し得る。
【００３８】
セリンプロテアーゼは、脳虚血症、神経変性性障害、白内障、心筋虚血症、筋ジストロフィーおよび血小板凝集を含む種々の障害の病理で役割を演じる。こうして、セリンプロテアーゼ阻害剤としての活性を有する化合物は、有用であると、当業者によって考えられる。例えば、トロンビンは、血栓発生でのキープロテアーゼである。血管内凝固は、ショック、敗血症、癌、出産に伴う余病、火傷、および肝臓疾患で頻繁に発生する。こうしてトロンビン阻害剤は、血液凝固を阻害しまたは塞栓を予防するのに特に有用である。
【００３９】
本発明の１側面では、したがって、血液を、血液凝固を阻害するのに十分量の、ＰＥＢＰファミリーのメンバーまたはアゴニスト、好ましくは哺乳動物またはヒトＰＥＢＰと接触させることを含む、血液凝固を阻害または遅延させる方法を提供する。
【００４０】
ガラス管に置くとき、血液は、インビトロで４ないし８分で一般に凝固する。凝固を、もしキレート化剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはクエン酸塩（エステル）を結合Ｃａ２＋に添加するならば、防止し得る。ＰＥＢＰファミリーのメンバーの、血液凝固を遅延させる能力は、適当量のＰＥＢＰファミリーのメンバーを、血液に添加し、血液凝固を完全に阻害し、または８分を超えて血液凝固が遅延することによって示すことができ、前記のとおりである。必要量は経験的に決定できる。
【００４１】
急性血管疾患、例えば、心筋梗塞、発作、末梢動脈閉塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および他の血液系血栓症を含む血栓性障害は、主要な健康リスクを構成する。そのような障害は、フィブリンおよび血小板凝集からなる血液凝固による血管の部分的または全体的閉塞によって引き起こされる。凝固形成を防止または遅延する剤（すなわち抗凝固剤）での、または血液凝固を溶解する剤（すなわち血栓溶解剤）での治療的介入は共通の実務である。ＰＥＢＰファミリーのメンバーの、予測されない抗トロンビン特性は、そのような血栓性障害を処置するのに適用することができる。凝固形成中に血液中に存在する、投与したＰＥＢＰファミリーのメンバーは、凝固時間を遅延させ、そして／または、よりゆるく、安定でない凝固を形成させる凝固の特性を変化させ得る。
【００４２】
ここで使用する用語「血栓性障害」は、血栓と関連または起因する状態または血栓へと向かう傾向を含む。これらの状態は、動脈血栓症、例えば、心臓動脈血栓症およびその結果の心筋梗塞、脳動脈血栓症または心臓内血栓症（例えば、心房性細動のための）、および結果としての発作、および他の末梢動脈血栓および閉塞と関連する状態；静脈血栓、例えば、深部静脈血栓症および肺塞栓症と関連する状態；患者の血液の外来または傷害組織表面ヘの曝露と関連する状態であって、疾患性心臓弁、機械的心臓弁、血管移植片、および他の体外装置、例えば、血管内カニューレ、血液透析患者、血液透析機および心肺バイパス機械中の血管アクセスシャントを含む外来性傷害性組織表面ヘの、患者の血液の曝露と関連する状態；および凝固傷害と関連する状態、例えば、凝固性昂進、および播種性血管内凝固傷害であってエンドトキシン開始性凝固カスケードの結果ではないものを含む。
【００４３】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーを、慣行的抗血栓性剤、例えば、抗血小板剤、抗凝固剤（ヘパリン）、ビタミンＫアンタゴニスト（クマリン誘導体、ワルファリン）および血栓溶解剤とともに、投与および通常の臨床実務と矛盾しない経路によって投与することができる［全般に、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ ｅｄ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎ．Ｙ．（１９９６）参照］。
【００４４】
抗血栓剤をまたルーチンに使用し、体外装置の閉塞を防止する：血管内カニューレ、血液透析患者内の血管アクセスシャント、血液透析機、および心肺バイパス機。こうして、本発明の更なる側面では、表面を血液と接触するに先立ち、限定しないが前列挙のものを含む、ＰＥＢＰファミリーのメンバーを固体表面上に被覆する。
【００４５】
セリンプロテアーゼは、多くの他の障害への影響を有すると知られ、したがってＰＥＢＰファミリーのメンバーは、ＰＥＢＰ活性の増加レベルの（またはＰＥＢＰ感受性プロテアーゼ、特にトロンビン、キモトリプシン、およびニューロプシンの減少したタンパク質分解活性の）必要な個体を処置するのに有用であり、そのような個体へ、そのような個体でＰＥＢＰ活性レベルを増加させるのに有効な量の、ＰＥＢＰファミリーのメンバー、特にＰＥＢＰファミリーのメンバーの成熟形態を含む医薬組成物を投与する（およびそれによって、ＰＥＢＰ感受性プロテアーゼ活性を減少させる）ことを含む。そのような個体は、特定の障害または疾患に罹患し、または障害または疾患を得る高リスクにあり得る。
【００４６】
該障害または疾患は：アルツハイマー病、認知欠損、ダウン症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、および他の神経変性性疾患、アミロイドーシスによる脳出血、拳闘家痴呆、頭部損傷、血栓溶解または出血性発作に起因する神経細胞骨格の分解によって特徴付けられる状態、肺気腫、関節炎、多発性硬化症、歯周病、嚢胞性繊維症、呼吸疾患、血栓、癌、悪液質、アンギナ、緑内障、炎症性障害、骨粗鬆症、心臓血管障害、例えば、高血圧、アテローム性動脈効果症障害、例えば、心筋梗塞、および発作、喘息、乾癬、ミエリン除去性疾患、ＡＩＤＳ免疫不全、光受容体変性症、水晶体白内障形成、臓器移植拒絶、再狭窄、筋ジストロフィー、腎不全、脳血管痙攣、膵炎、細胞分裂促進剤誘導性細胞成長の障害および糖尿病性腎障害を含み得るがこれらに限定されない。
【００４７】
ここで使用するように障害を処置するための化合物の有効量は、症状を緩和するのに、またはある態様で減少するのに、または状態の進行を停止または逆転するのに十分である量である。そのような量は、単回投与として投与し得、または養生法にしたがって投与し得、それによりそれが有効である。ここで使用する「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患の任意の処置を含み、そして：
（ａ）疾患／状態または症状の素因があり得るが、それを有するとして診断されていない対象中に存在する疾患／状態または症状を予防すること；
（ｂ）疾患／状態または症状を阻害すること、すなわちその進行を拘束すること；または
（ｃ）疾患／状態または症状を軽減すること、すなわち疾患。状態の緩解を生じること
を含む。
【００４８】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーはトロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンの選択的阻害を示すことが示された。加えて、インビトロ酵素的活性は、組換え的に発現される精製タンパク質について実証された。実施例４および５参照。前記の様に、ＰＥＢＰは、ＰＮ−１（−／−）マウスのＰＮ−１の欠如を補償する。プロテアーゼ・ネキシンＩ（ＰＮ−１またはグリア誘導性ネキシン、ＧＤＰ）は、トロンビンを特異的に阻害し、そしてインビトロで、神経芽細胞株並びに始原海馬および交感神経ニューロンの神経突起伸長を促進することが示された。ＰＮ−１遺伝子を転写的に誘導し、そしてタンパク質レベルが、ラット座骨神経軸索切断に続いて増加する。チック発達運動ニューロン、すなわち通常アポトーシスを経験するＥ６−Ｅ９虫様筋仙骨運動ニューロンは、ＰＮ−１によって、運動ニューロンの増加生存という結果である。マウスの座骨神経損傷によって実験的に誘導される運動ニューロン死は、また、ＰＮ−１添加によって減少する。アルツハイマー病脳領域は、遊離ＰＮＩと比較して、正常脳よりもより高いＰＮ−１／トロンビン複合体を含み、ＰＮ−１がＣＮＳ病理に役割を有することを示唆する。キモトリプシンは、またアルツハイマー病、および脳組織へのニューロプシンの局在化にリンクし、またこれらのタンパク質の神経科学的機能を示唆する。
【００４９】
こうして、ＰＥＢＰとＰＮ−１の間の機能的類似性および組織局在化のために、ＰＥＢＰファミリーのメンバーを神経変性性障害および末梢神経障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多発性硬化症を処置するために使用することができる。脊髄損傷に起因する運動ニューロンまたは感覚ニューロン損傷はまた、ＰＥＢＰファミリーのメンバーでの処置によって予防し得る。加えて、アルツハイマー病のような中枢神経系疾患は、ＰＥＢＰファミリーのメンバーまたは、血液−脳障壁を横断することのできる小分子アゴニストで処置し得、このアゴニストは本発明の方法によって同定できる。ある処置のために、ＰＥＢＯファミリーのメンバーまたはアゴニストを、血液−脳障壁を横断させるのが有利である。ＰＥＢＰの、フォスファチジルエタノールアミンを結合する能力は、血液−脳障壁を横断するリポソーム送達を容易化する。
【００５０】
前記神経系関連性障害はさておき、ＰＮ−１は、繊維芽細胞腫瘍細胞株の細胞外マトリクスの分解を阻害することが示された。そのような分解は、関連のない細胞の、組織を経由する貫通を通常防止する細胞外マトリクスの弱体化によって、腫瘍細胞が転移するのを可能とすると考えられる。こうして、ＰＥＢＰファミリーのメンバーをまた使用し、細胞外マトリクス破壊、特にＰＥＢＰ感受性プロテアーゼを分泌する腫瘍、例えば、神経組織腫瘍分泌トロンビン、キモトリプシンまたはニューロプシンと関連するものを阻害し得る。
【００５１】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーを含む組成物を製剤化し、良好な医学実務と矛盾のない様式で投与し、個々の患者の臨床条件（ＰＥＢＰファミリーのメンバー単独での処置の副作用）、組成物の送達の部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および臨床医に既知の他の要因を考慮に入れる。ここでの目的のための「有効量」のＰＥＢＰファミリーのメンバーは、こうしてそのような考慮によって決定する。
【００５２】
一般的な提案として、投与あたり、非経腸的に投与されるＰＥＢＰファミリーのメンバーの薬学的に有効な総量は、患者体重あたり、約１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、しかし前記の様に、これは治療判断に服する。より好ましくは、この用量は少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくはヒトについて、約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日の間である。連続的に与えるならば、ＰＥＢＰファミリーのメンバーは典型的に、約１μｇ／ｋｇ／時間ないし約５０／μｇ／ｋｇ／時間の用量割合で、１日あたり１−４注射によって、または連続皮下点滴によって、例えばミニポンプを使用して投与する。静脈内バッグ溶液をまた、使用し得る。変化を観察するのに必要とされる処置の長さおよび応答のため処置に続く間隔は、望まれる効果に依存して変化するようである。
【００５３】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーを含む医薬組成物を、硬膜周辺に（ｐｅｒｉｄｕｒａｌｌｙ）に、経口的に、経腸的に、非経腸的に、膣内に、腹腔内に、局所的に、（粉末剤、軟膏によって、滴下または経皮パッチによって）、口腔内に（ｂｕｃａｌｌｙ）、または経口または経鼻噴霧として投与し得る。「薬学的に許容される担体」によって、非毒性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意の型の製剤付属品を意味する。ここで使用する用語「非経腸」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、および関節内注射および点滴を含む投与の様式をいう。
【００５４】
ＰＥＢＰファミリーのメンバーはまた、好適には持続性放出系によって投与する。持続性放出組成物の好適な例は、成形製品の形態の半透過性ポリマーマトリクス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルを含む。ＰＥＢＰファミリーのメンバーを含むリポソームを、当業界で既知の方法によって調製する：ＤＥ３２１８１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）； Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：４０３０−４０３４（１９８０）； ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３９４９；Ｐ１４２６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許４４８５０４５および４５４４５４５；およびＥＰ１０２３２４。通常は、脂質含量が約３０ｍｏｌより大きい、小（約２００−８００オングストローム）ユニラメラー型である。コレステロールパーセント、選択された割合は、最適ＰＥＢＰ治療のために調節される。
【００５５】
一般に、製剤を、ＰＥＢＰファミリーのメンバー（および所望により、その活性を増強し得るコファクター）を、斉一かつ十分に、液体担体または微粉砕固体担体または両方と接触することによって調製する。次いで、必要ならば、産物を望まれる製剤に成形する。好ましくは担体は非経腸担体、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体賦形剤の例は、水、塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む。非水性賦形剤、例えば固体化オイルおよびエチルオレエートは、またここで、並びにリポソームで有用である。
【００５６】
ＢＰＥＰファミリーのメンバーは典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌないし１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１−１０ｍｇ／ｍｌの濃度、約３ないし８のｐＨで、そのような賦形剤中に製剤化する。ある種の前記賦形剤、担体、または溶解剤の使用が、塩の形成という結果となることが理解される。
【００５７】
本発明はまた、ＰＥＢＰファミリーのメンバーと薬学的に適当な担体、例えば、前記のものを含む組成物、並びに本発明の医薬組成物の成分の１または２以上で充填された１または２以上の受容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。そのような受容器（複数もある）は、医薬および生物学的産物の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定の形態での注意書を伴うことができ、この注意書は、ヒト投与のための製造、使用または販売の代理店による承認を反映する。そのようなキットは所望により、組成物を投与するのに有用な装置、例えば吸入器、シリンジなどを含むことができる。
【００５８】
加えて、ＰＥＢＰファミリーのメンバーを、他の治療的化合物と組み合せて使用し得る。ＰＥＢＰのアゴニストを、例えば、前記の任意の障害または疾患を処置するために、ＰＥＢＰファミリーのメンバーの代わりにまたはそれに加えて使用し得る。
【００５９】
同様に、ＰＥＢＰファミリーのメンバーのアンタゴニスト、例えば、抗ＰＥＢＰ抗体を、体内のＰＥＢＰ活性の減少レベルの（すなわちＰＥＢＰへ感受性のプロテアーゼのより小さい阻害の）必要な個体を処置するために使用し、そのような個体に、治療有効量のＰＥＢＰアンタゴニストを含む組成物を投与することを含む。前記のように、相同的組換えによるＰＮ−１（前記）の排除は、学習による長期薬効の減少につながり、一方ＰＮ−１の過剰発現は、海馬ニューロンの増強された長期薬効（ＬＴＰ）という結果となる。Ｉｄ．同様に、血液−脳障壁を通過することのできるアンタゴニストＰＥＢＰ活性を使用し、過剰ＰＥＢＰ発現によって特徴づけられる神経系状態の海馬ニューロンのＬＴＰを増強することができる。
【００６０】
前記のように、本発明者は、ＰＥＢＰが脳のＰＮ−１活性を補償することのできること、そしてさらに、ＰＥＢＰがセリンプロテアーゼ、例えば、トロンビン、キモトリプシンおよびニューロプシンを阻害することを発見した。特に中枢または末梢神経系の障害、および血栓発生のある数の障害について、「標準的」ＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性、すなわち神経系障害を有しない個体からの健康組織中のＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性レベルに対する、有意より高いまたは低いレベルのＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性を、そのような障害を有する個体からとった、ある種の組織（例えば、中枢および末梢神経系組織および精巣）または体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、精液、滑膜液、または脳脊髄液）中に検出し得る。こうして、本発明は、神経系障害の診断中に有用な診断方法を提供し、これは：（ａ）個体の細胞または体液中のＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性レベルをアッセイすること；（ｂ）ＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性レベルを、標準的ＰＥＢＰプロテアーゼ阻害活性レベルと比較し、それによって標準レベル（非罹患個体からのそれ）と比較した、アッセイしたＰＥＢＰプロテアーゼ阻害レベルの増加または減少が、その個体の障害を示すことを含む。
【００６１】
個体は、哺乳動物個体、好ましくはヒトを意図し、成人、子供、赤子、および胚または胎児を含む。「ＰＥＢＰのレベルを測定すること」は、サンプル中の、ＰＥＢＰ活性のレベル、ＰＥＢＰタンパク質量、またはＰＥＢＰｍＲＮＡを直接的に（例えば、絶対的タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的に（例えば、第２の生物学的サンプル中のＰＥＢＰタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することによって）、定性的または定量的に測定または評価することを意図する。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のＰＥＢＰレベルを、測定または評価し、そして障害を有しない個体から取得される第２の生物学的サンプルからとった標準、または障害を有しない個体の集団からのレベルを平均することによって決定される標準ＰＥＢＰレベルと比較する。当業者に明らかなように、標準レベルはひとたび知られると、比較のための標準として繰り返し使用できる。
【００６２】
「生物学的サンプル」は、個体、体液、細胞株、組織培養物、またはＰＥＢＰタンパク質またはｍＲＮＡを含む他の源から取得される任意の生物学的サンプルを意図する。指摘されるように、生物学的サンプルは、体液（例えば、血清、血漿、精液、尿、滑膜液、および脳脊髄液）、神経系組織、およびＰＥＢＰを発現することが見出される他の組織源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を取得する方法は、当業界で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むものである場合は、組織生検は好ましい源である。
【００６３】
総細胞性ＲＮＡを、任意の好適技法、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７）に記載の、単一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法を使用して生物学的サンプルから単離できる。ＰＥＢＰｍＲＮＡのレベルを次いで、任意の適当な方法を使用してアッセイする。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応を組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【００６４】
生物学的サンプル中のＰＥＢＰタンパク質レベルをアッセイすることは、当業界既知方法を使用して実施できる。生物学的サンプル中のＰＥＢＰレベルをアッセイするため、抗体に基づく技法または活性に基づく技法が好ましい。例えば、組織中のＰＥＢＰ発現を、古典的免疫組織学的方法で研究できる。これらにおいて、特異的認識を、１次的な抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供するが、２次的な検出系は、蛍光、酵素、または他のコンジュゲート生二次的抗体を利用できる。結果として、病理学的実験のための組織切片免疫組織学的染色を取得する。組織をまた、ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡアッセイのためのＰＥＢＰタンパク質の遊離のために、例えば、尿素または中性洗剤で抽出することができる（Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５： ３０８７−３０９６（１９８７））。カチオン性固相の使用に基づく、この技法では、ＰＥＢＰタンパク質の定量を、標準として単離ＥＰＢＰタンパク質を使用して達成することができる。この技法を、体液に有利に適用できる。本発明での使用のためのＰＥＢＰタンパク質特異的抗体を、ルーチンプロトコールを使用して調製できる。
【００６５】
前記のおよび以下に例示のＰＥＢＰ活性のアッセイが好ましい。以下の例は、単に例示目的であり、本発明の範囲を限定しない。
【００６６】
実施例
実施例１；ＰＮ−１（−／−）脳でのトロンビン阻害活性の検出
ＰＮ−１は中枢神経系で重要な役割を演じると考えられるが、驚くべきことに、ＰＮ−１を欠くマウスは、神経系にわずかな表現型を示し、これらの動物でＰＮ−１機能の欠如を補償する分子の潜在的存在を指摘している。この実施例は、セリンプロテアーゼ阻害剤がＰＮ−１（−／−）の脳ホモジネート中に存在し、これは、ＰＮ−１として同じように機能し得ることを実証する。
【００６７】
脳組織は、種々の齢の野生型のＣ５７ｂｌ／６マウス（ＢＲＬ）またはＰＮ−１（−／−）マウスから調製し、そしてプロテアーゼ阻害活性について試験した。簡単には、深く麻酔した動物を、心臓周囲にＣａ２＋またはＭｇ２＋のないＰＢＳで５−１０分かん流し、血液フリー脳組織を取得した。脳組織を、全部または、それぞれのフラクションをホモジナイズする前に脳の小脳、髄質および残りの部分に分割してホモジナイズした。組織またはフラクションを、１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．２％　Ｔｗｅｅｎ−２０、３２０ｍＭスクロースおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ中でポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＧｍｂＨ）を使用して、４０秒間ホモジナイズした。ホモジネートを、遠心分離（１２０００ｘｇ、３０分間、４℃）によって清澄化し、そして上清を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＡ ０．４５μｍフィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を経由して濾過した。
【００６８】
得られた上清をトロンビン阻害活性の存在についてアッセイした。ヒトα−トロンビンを、Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｒ．ａｎｄ Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ， Ｊ． （１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５， ４６２２−４６２８）によって記載の用に調製し、そして酵素バッファ（６７ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１３３ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１３％　ＰＥＧ−６０００）中に希釈し、最終的アッセイ混合物中０．００５ｐｍｏｌとした。段階的希釈（１：１６０；１：８０；１：４０；１：２０および１：１０）のアリコートのホモジネート上清であって等量のタンパク質を含むもの（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定される１２＋／−ｍｇ／ｍｌ）を、アッセイのためのサンプルとして調製した。８０μｌのサンプルを、９６ウェルプレート中で、１０μｌのトロンビン（０．００５ｐｍｏｌ）と混合し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。１０μｌの発色基質（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−パラ−ニトロアニリド、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｈ２Ｏ中１．２５ｍｇ／ｍｌ）の添加後、いずれかのアミド分解性活性を、ＴＥＥＲＭＯｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して３０分間にわたり４０５ｎｍで発色性基質の加水分解の速度を測定することによって決定した。
【００６９】
このアッセイは、ここに試験された種々の脳区画中、本質的に均等なレベルの活性で、すべての調査した脳区画のトロンビン阻害活性の存在を明かにした。（図１参照）。たとえトロンビン阻害が、ＰＮ−１（−／−）脳組織におけるよりも野生型脳組織中に近似的に３倍より高いとしても、トロンビン阻害剤の存在は、ＰＮ−１（−／−）脳組織中に存在することを明らかに実証した。ＰＮ−１（−／−）脳ホモジネートの心臓の処理（９５℃５分間）は、トロンビン阻害を完全に喪失させ、該阻害活性がタンパク質によることを示唆している。
【００７０】
実施例２：ＰＮ−１（−／−）脳中のトロンビン結合タンパク質の検出
電気泳動移動性シフトアッセイを実施し、トロンビンと、ＰＮ−１（−／−）脳組織の１または２以上の構成要素の間に複合体が形成されるか否かという疑問を解決した。簡単には、かん流ＰＮ−１（−／−）マウスから実施例１に記載のように調製した、アリコート（８μｌおよび２４μｌ）の脳全体ホモジネート上清（μｌあたりの３．２μｇ　タンパク質）を、４０μｌの最終体積の酵素バッファ中の４０ｎｇのヒトα−トロンビンと、３７℃３０分間前培養した。前培養工程後、５μｌの非還元性サンプルバッファー（３１２．５ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ６．８、５０％グリセロールおよび０．０５％　ブロモフェノールブルー）を添加し、そして負荷前にサンプルの熱変性はなく、該タンパク質を非還元性、セミネイティブ（０．１％　ＳＤＳ）条件下、ＳＤＥＳ−ＰＡＧＥによって展開した。
【００７１】
展開したタンパク質を、トランスブロットＳＤセミドライトランスファーセル（ＢｉｏＲａｄ）中のＰｒｏｔｒａｎニトロセルローストランスファー膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に、３ｍＡ／ｃｍ２で４０分間エレクトロブロットし、そして第１抗体としてポリクローナルウサギ抗ヒトトロンビン抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ＃４７０２）および第２抗体としてＨＲＰを結合したロバ抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、高分子量複合体について分析した。ウェスタンブロットを、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して可視化した。
【００７２】
このような脳ホモジネートの、トロンビンとの前培養は、近似的に６０ｋＤａの複合体の形成という結果であった。このサイズは、トロンビン（３７ｋＤａ）と、近似的に２３ｋＤａの第２タンパク質の複合体を示唆している。
【００７３】
トロンビンと可能性のある阻害タンパク質の間の複合体の形成を明確化するために、共免疫沈降を実施した。簡単には、２つの全体、野生型マウス脳を、実施例１の記載のようにホモジナイズした。サンプルの半分を、酵素バッファー（６７ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１３３ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１３％ＰＥＧ６０００）中の、６０μｌのヒトα−トロンビン（１ｎＭ）とインキュベートし、そして他の半分を、６０μｌ酵素バッファー単独（負のコントロール）と、３７℃で３０分間インキュベートした。前培養後、免疫沈降を、抗トロンビンモノクローナル抗体ＥＳＴ−６でコートしたタンパク質Ａ−セファロースビーズで実施した。タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、別に記載のように（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．（１９８８） ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．， ｅｄｓ）ｐｐ．５２２−５２３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）、トロンビンに対するモノクローナル抗体であるＥＳＴ−６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でコートした。ＥＳＴ−６は、遊離トロンビン並びに阻害剤（例えば、抗トロンビンＩＩＩ）と複合体化されたトロンビンを認識するモノクローナル抗体である（Ｄａｗｅｓ， Ｊ．， Ｊａｍｅｓ， Ｋ．， Ｍｉｃｋｌｅｍ， Ｌ．Ｒ．， Ｒｅｐｐｅｒ， Ｄ．Ｓ．， ａｎｄ Ｐｒｏｗｓｅ， Ｃ．Ｖ．（１９８４）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．３６， ３９７−４０９）。５０μｌの、ＥＳＴ−６でコートしたビーズを、サンプルに添加し、そして混合物を、４℃で終夜おだやかに振とうしながらインキュベートした。ビーズを次いで、１ｍｌ酵素バッファーでそれぞれ３回洗浄し、それから共免疫沈降したタンパク質を、５０μｌのサンプルバッファー中にビーズを再懸濁することによって回収した。９５℃で５分間変性後、ビーズ上清を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開した。ゲルを次いで、製造者（ＢｉｏＲａｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ）のプロトコルにしたがって銀染色し、タンパク質を可視化した。
【００７４】
トロンビンと推定阻害剤の間の結合特性は当初は知られていなかったので、共免疫沈降を、非常に低ストリンジェンシー条件下で実施し、高いバックグランドという結果であった。にもかかわらず、近似的に２０ｋＤａのタンパク質が、ヒトα―トロンビンとの前培養後共免疫沈降するが、バッファとではそうではないことが同定され得る。
【００７５】
まとめると、これらのデータは、可能性のある候補トロンビン阻害剤として、２０−２３ｋＤａのトロンビン結合タンパク質の存在を示唆した。
【００７６】
実施例３：ＰＮ−１（−／−）脳中のトロンビン結合タンパク質のトロンビン阻害活性の同定
脳ホモジネートを、ゲル濾過による分子量にしたがって分画化し、該トロンビン結合タンパク質が、トロンビン阻害活性を有するとして実施例１で同定された部分と共溶出するか否か確立した。種々の齢（１４日；６ヶ月；１年；２年）のＰＮ−１（−／−）または野生型マウスからの脳ホモジネート（全体）を、実施例１に本質的に記載のように調製した。阻害剤の部分的精製を、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、４℃、流速０．２５ｍｌ／分と平衡化バッファーで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、ホモジネートを適用することによって取得した。０．２５ｍｌのフラクションを収集し、そしてトロンビン阻害活性についてアッセイした。
【００７７】
トロンビン阻害活性は、フラクション番号５６−６３のカラムから溶出し、１４−１５．７５ｍｌの溶出体積に対応する。リボヌクレアーゼＡ（１３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、卵アルブミン（４３ｋＤａ）、およびウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ）での、ゲル濾過カラムの、同じ溶出条件下での更正は、阻害活性の分子量は、２１−２４ｋＤａであることを指摘した。２１−２４ｋＤａ阻害活性の量は、種々の齢（１４日から２年まで）のマウスから調製した脳ホモジネート中で、並びに野生型とＰＮ−１（−／−）の間で近似的に同じである。加水分解速度のピークは、より高齢の動物からのフラクション化脳組織のフラクション６４−６６に見出され、恐らく、２０ｋＤａより実質的に小さい分子量を有するプロテイナーゼに対応し、これは年齢により上方調節されている。
【００７８】
阻害剤の更なる精製を追跡し、トロンビン阻害剤の同定を可能とした。以前の実験では、阻害剤はｐＨ９．０で、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、またはｐＨ５．０でＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しないことが見出された。これらのカラムの貫流液または溶出液中の活性を監視する必要のために、より高いまたは低いｐＨ値でのクロマトグラフィー工程を実施することは適当でなかった。したがって、アニオン交換およびヘパリンアフィニティクロマトグラフィー、次いでカチオン交換クロマトグラフィーを使用し、カラムの貫流液から阻害剤の回収を可能とした。ヘパリンカラムを含め、なぜならトロンビン阻害活性が良く確立されているＰＮ−１を結合するその能力のためである（Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ， Ｗ．Ｅ．， Ｗａｇｎｅｒｍ Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃｕｍｍｉｎｇｈａｍ， Ｄ．Ｄ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７， ２１７６−２１８１； Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ．４：１９６３−１９６６）。
【００７９】
イオン交換クロマトグラフィーのための脳組織ホモジネートを、実施例１の２野生型マウスの脳組織から調製した。ただし、ホモジネーションバッファーとして２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ９．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、３２０ｍＭスクロース、１ｍＭ　ＥＤＴＡを使用し、そして微粒子材料を清澄化した。清澄化および濾過したホモジネートを、１ｍＭ　ＨｉＴｒａｐヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に直接的に接続された１ｍｌ　ＨｉＴｒａｐ　Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に、２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ９．０、１００ｍＭ　ＮａＣｌと、２ｍｌ／分の流速で適用した。貫流液（２ｍｌ）を、１０ｍｌ　５０ｍＭ　アセテート、ｐＨ５．０、７０ｍＭ　ＮａＣｌで希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−１０（５．０００ｘｇ、１時間、４℃）を使用して３ｍｌに濃縮した。バッファーをカチオン交換クロマトグラフィーに適当なバッファー（５０ｍＭ　アセテート、ｐＨ５、）で交換後、サンプルを、２ｍｌ／分の流速の同じバッファーと、１ｍｌ　ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｕｍａｃｉａ）上に負荷した。貫流液を、前記の様に３００μｌに濃縮した。濃縮した、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−Ｓｐｈａｒｏｓｅ精製工程の貫流液を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、そしてゲルの銀染色は、２０−２５ｋＤａの単一バンドのみを明示した。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を、ゲルから切除し、ＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、そしてトリプシン（シーケンシング等級、Ｐｒｏｍｅｇａ）で切断し、記載される通りであった（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ， Ａ．， Ｗｉｌｍ， Ｍ．， Ｖｏｒｍ， Ｏ．， ａｎｄ Ｍａｎｎ， Ｍ．（１９９６）Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８， ８５０−８５８）。切除したトリプシン切断したペプチドを、Ｈ２Ｏ中５％蟻酸、５％メタノールで、１μｌ Ｐｏｒｏｓ Ｐ２０カラム上で脱塩し、そしてＨ２Ｏ中５％蟻酸、５０％メタノールで１μｌに濃縮し、直接的にナノエレクトロスプレーイオン化（ＮａｎｏＥＳＩ）ニードルに。ＮａｎｏＥＳＩマススペクトロメトリー（ＭＳ）を、Ｗｉｌｍ ｅｔ ａｌ．（ＷｉｌｍｍＭ． ａｎｄ Ｍａｎｎ， Ｍ．（１９９６） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８， １−８）の公開された方法にしたがって実施した。マススペクトルを、ＮａｎｏＥＳＩソース（Ｐｒｏｔａｎａ）を装着したＡＰＩ ３００マススペクトロメーター（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）上で獲得した。
【００８１】
５ペプチドからの配列タグを取得し、すべてがマウスホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ７０２９６）に適合した。ただし、例外としてＧｅｎＢａｎｋ　Ｐ７０２９６配列の１１６位のセリンがグリシンであることが見出された（配列番号１）。
【００８２】
実施例４：マウスＰＥＢＰの組換え発現
組換えＰＥＢＰを、プロテアーゼ阻害剤として作用できることを確立するように調製した。マウスＰＥＢＰをコードするｃＤＮＡを、Ｐｗｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、テンプレートとしてＩＭＡＧＥクローン１９２１２７４（Ｓｕｇａｎｏマウス、腎臓）、および適当なプライマーを使用して増幅した。１９２１２７４クローンの配列決定は、このｃＤＮＡの３’末端がマウスＰＥＢＰ−ｍＲＮＡの公開された配列（ＧｎｅＢａｎｋ受託番号Ｕ４３２０６）と比較して変化し、ＰＥＢＰの最後の１０アミノ酸の置換と言う結果であることが示された。結果的に、我々は、正確な最後の１０アミノ酸をコードするＰＣＲのアンチセンスプライマーを使用した。このプライマーで増幅したｃＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介して、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子の代わりにプロマイシンを有するｐＣＥＰ−Ｐｕ発現ベクター、すなわちｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｏｅｏｇｅｎ）にクローン化した。すべての構築物の正確な構造を、ＤＮＡ配列決定により確認した。配列決定反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００または２４００サーモサイクラーと、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（Ｂｉｇ Ｄｙｅ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施し、そしてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサー上で分析した。
【００８３】
ｐＣＥＰ−Ｐｕ−ＰＥＢＰ構築物および負のコントロールとしてのからのベクターを、Ｒａｔ−１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。代替的な細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用し得る。Ｒａｔ−１細胞（１．２ｘ１０５）を、２ｍｌ　通常成長培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅの培地、ウシ胎児血清を有する）中、６０ｍｍ細胞培養皿上に置いた。２４時間後に細胞を、供給者の指示にしたがってＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、４μｇ　ｐＣＥＰ−Ｐｕ−ＰＥＢＰまたはｐＣＥＰ−Ｐｕでトランスフェクトした。成長培地を、トランスフェクション２４時間後、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、１６μｇ／ｍｌプトレッシン、および１０ｎｇ／ｍｌプロジェステロンで補足した血清のないＤＭＥＭに交換した。さらに４８時間後、調質した培地を収集し、そしてアリコート（５、１０、２０、４０および８０μｌ）をトロンビン阻害活性についてアッセイした。ＰＥＢＰトランスフェクションした細胞によって調質された培地は、コントロール細胞の上清と比較してトロンビンの阻害の有意な増加と、調質した培地を増加するにつれ阻害活性が増加することを示した。
【００８４】
検出された阻害活性が実際にＰＥＢＰのためであることを示すために、Ｒａｔ−１をｐＣＲＰ−ＰＵ−ＰＥＢＰ−ＨＡでトランスフェクトした。Ｃ末端ヘマグルチニンタグを有するマウスＰＥＢＰ（ＰＥＢＰ−ＨＡ）をコードするｃＤＮＡを、ＨＡタグを導入する適当なプライマーを使用して前記の様に、ＩＭＡＧＥクローン１９２１２７４（Ｓｕｇａｎｏマウス、腎臓）から増幅した。ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介して、ＣＭＶプロモーターの制御下である、発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕにクローン化した。該構築物の正確な構造を、前記の様にＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｒａｔ−１細胞を、ｐＣＥＰ−Ｐｕ−ＰＥＢＰ−ＨＡ（４μｇ）でトランスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞を本質的に前記の様に成長させた。
【００８５】
ＨＡタグしたＰＥＢＰの存在を、抗ＨＡ抗体を使用して細胞溶解物並びに調質した培地中で決定した。簡単には、調質した培地を収集し、そしてＴＣＡ沈降させ、一方細胞をＳＤＳサンプルバッファーで溶解させた。細胞溶解物の２０μｇ総タンパク質、または１ｍｌの調質した培地のＴＣＡ沈降したタンパク質（サンプルバッファー中に溶解した）を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開し、ニトロセルロース膜に電気移動させ、そして抗［ＨＡ］ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。
【００８６】
ＰＥＢＰ−ＨＡを、膜上の近似的に２４−３０ｋＤａバンドとして細胞溶解物中に、そしてまたより小さい程度まで、調質培地中に検出し得る。溶解物およびこれらの細胞の調質培地でのトロンビンアッセイを、実施例１の記載の溶に実施し、また阻害活性の増加を明らかにした。
【００８７】
ＰＥＢＰは、細胞質性タンパク質であり、そしてその配列中に分泌シグナルを欠くと考えられ、ＰＥＢＰ発現細胞の調質培地中にそれを検出することはまったく予測されなかった。ＰＥＢＰのこの細胞外局在化を明確化するために、ＲＡＴ−１細胞をｐＣＥＰ−Ｐｕ−ＨＡ−ＰＥＢＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰという緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合されたＨＡタグＥＰＢＰをコードする構築物でトランスフェクトした。Ｎ末端ヘマグルチニンタグを有するマウスＰＥＢＰ（ＨＡ−ＰＥＢＰ）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ末端ＨＡタグを導入する適当なプライマーを使用して、本質的に前記の様に増幅した。ＰＣＲ産物をＣＭＶプロモーター制御下の、発現ベクターｐＣＲＰ−Ｐｕ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してクローン化した。この構築物の正確な構造を、前記の様にＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００８８】
Ｒａｔ−１細胞を、ｐＣＥＰ−Ｐｕ−ＨＡ−ＰＥＢＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰで、本質的に前記の様にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、成長培地を脱気し、細胞をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、そして再び、ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中３％のＢＳＡでの３０分間の阻止後、細胞を阻止溶液中ローダミン−抗［ＨＡ］コンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ）と１時間インキュベートし、そしてＰＢＳで洗浄した。透過化のために、細胞を４％パラホルムアルデヒドと１５％ピクリン酸で固定し、ＰＢＡＳと０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を使用し、そして細胞を、１．５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８、０．４％　ＳＤＳ中の阻止に先立ちインキュベートした。
【００８９】
ＨＡ−ＰＥＢＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ構築物でトランスフェクトしたＲａｔ−１細胞は、これらの表面にＨＡ−ＰＥＢＰをディスプレイした。非透過化細胞および透過化細胞を、抗［ＨＡ］ローダミンコンジュゲートで免疫染色し、そして非透過化および透過化細胞の両方が、細胞表面および細胞質の染色されることが見出された。
【００９０】
ＰＥＢＰのアミノ酸配列は、明白な分泌シグナルを含み、そして以前の免疫組織学研究は、細胞質への局在化をこのタンパク質のためであるとした。トランスフェクト細胞の上清中における活性ＰＥＢＰの存在、およびここに示される細胞表面上のＨＡタグされたＰＥＢＰの免疫検出は、少なくともインビトロでは、ＰＥＢＰの局在化が細胞質または原形質膜のその内部リーフレットに限定されないことを実証している。ＨＡ陽性だが非トランスフェクトの（ＧＦＰ陰性）細胞は観察されなかったので、ＨＡ免疫反応性は、もしかしたら細胞を乾燥することによって培地へ放出されたＨＡ−ＰＥＢＰの結合のためではない。
【００９１】
実施例５：ＰＥＢＰのプロテアーゼ阻害プロフィール
ＰＥＢＰの阻害プロフィールを評価するために、ＲＡＴ−１細胞を、Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグを有するＰＥＢＰをコードする構築物でトランスフェクトした。マウスＰＥＢＰをコードするｃＤＮＡを、適当なプライマー（５’― ＣＴＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＴＣ―３’、配列番号３および５’― ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＴＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＧＴ ＴＡＣ Ａ ＧＣ ＣＴＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＡＴＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＣＡ ＣＴＣ―３’、配列番号４）を使用して、ＩＭＡＧＥクローン１９２１２７４（Ｓｕｇａｎｏマウス、腎臓）からＰｗｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で増幅した。ＰＣＲ産物を、ＣＭＶプロモーターの制御下の発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕに、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してクローン化した。カルボキシ末端に融合された６ヒスチジン残基のストレッチを有するＰＥＢＰをコードするｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５’― ＣＴＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＴＣ―３’、配列番号３および５’―ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＧＧ Ｃ ＣＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＣＧ―３’、配列番号５を使用して、この構築物から増幅した。すべての構築物の正確な構造を、前記の様にＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９２】
Ｒａｔ−１細胞（４ｘ１０５）を、１０ｃｍ細胞培養皿に置き、そして２４時間後、本質的に実施例４に前記の様に、１６μｇのｐＣＥＰ−Ｐｕ−６ｘＨｉｓ−ＰＥＢＰまたはｐＣＥＰ−Ｐｕでトランスフェクトした。さらに２４時間後、培地を、補足のある血清フリーＤＭＥＭに交換した。トランスフェクションの７２時間後、培地を４つの皿から収集し、そして細胞を、１０ｍＭ　イミダゾールを含む、６００μｌ　酵素バッファー（６７ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１３３ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１３％　ＰＥＧ６０００）中で溶解させた。組換え６ｘＨｉｓ−ＰＥＢＰタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ ＳｐｉｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ここで洗浄バッファーとして２０ｍＭ　イミダゾール、および溶出バッファーとして２５０ｍＭイミダゾールを含む酵素バッファーで、製造者のプロトコルにしたがって、ネイティブ条件下で実施した。溶出液を、ＮＡＰ−５カラムによって脱塩し、イミダゾールを除去し、総体積１ｍｌという結果であった。「からの」ベクターでトランスフェクトした細胞の細胞溶解物を、同じように処理し、そしてコントロールとして供した。代替的に、２０ｍＭ　リン酸ナトリウムｐＨ６．８、３２０ｍＭスクロース、０．２％ＴＷＥＥＮ−２０および１ｍＭ　ＥＤＴＡを酵素バッファとして使用できる。
【００９３】
６種の異なるセリンプロテアーゼを、酵素バッファー（６７ｍＭ　トリス、ｐＨ８．０、１３３ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＰＥＧ６０００）中に希釈し、そして以下の最終量でプロテアーゼ活性アッセイで使用した：トロンビン、トリプシンおよびキモトリプシン、０．００５ｐｍｏｌ；ｔ−ＰＡおよびニューロプシン、０．５ｐｍｏｌ；および膵型エラスターゼ、４ｐｍｏｌ。ヒトαトロンビンを調製し、Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｒ．ａｎｄ Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ， Ｊ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５， ４６２２−４６２８）にしたがい；すべての他のプロテアーゼは商業的に入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ， Ｆｌｕｋａ）。それぞれの希釈したプロテアーゼ（１０μｌ）を、８０μｌの６ｘＨｉｓ−ＰＥＢＰ調製品と前培養し、それは、０．００５ｐｍｏｌトロンビンのアミド分解性活性を、近似的に５５％まで阻害することが示された。前培養を、３７℃で３０分間９６ウェルプレート中で実施した。１０μｌの発色性プロテアーゼ基質（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−パラーニトロアニリド、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， キモトリプシン以外のすべてのプロテアーゼについてＨ２ＯＩ中１．２５ｍｇ／ｍｌ；またはＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラ−ニトロアニリド、Ｓｉｇｍａ，キモトリプシンのためにＨ２Ｏ中２．３ｍｇ／ｍｌ）、任意の残りのアミド分解性活性を、３０分にわたる４０５ｎｍの発色性基質の加水分解速度を、ＴＨＥＲＭＯｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｃｉｃｅｓ）を使用して測定することによって決定した。６ｘＨｉｓ−ＰＥＢＰサンプルは、０．００５ｐｍｏｌキモトリプシンの２５％阻害および０．５ｐｍｏｌの７０％阻害を引き起こした。トリプシン（０．００５ｐｍｏｌ）、組織プラスミノーゲナクチベーター（０．５ｐｍｏｌ）、および膵型エラスターゼ（４ｐｍｏｌ）のアミド分解性活性は影響を受けなかった。
【００９４】
阻害定数を決定するために、発色性基質の加水分解の速度を、固定酵素濃度、３．５μＭないし２１６μＭの範囲の基質濃度、および０と２．９μＭの間のＰＥＢＰ−Ｈ６濃度で前記の様に測定した。測定した値を、ソフトウェアＧｒａＦｉｔ４．０（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で、競合的阻害剤のための等式に当てはめた。トロンビンおよびキモトリプシンは、それぞれ明かな３．８＋／−１．３ｘ１０−７と１．８＋／−１．０ｘ１０−６のＫｉで、ＰＥＢＰ−Ｈ６によって競合的に阻害される。
【００９５】
Ｃ末端ヒスチジンタグの妨害を、精製Ｎ末端Ｈｉｓ−タグしたＰＥＢＰである、ＮおよびＣ末端ヘマグリチニンタグを有する部分的に精製したＰＥＢＰ、並びにＣ末端の１０の異なるアミノ酸を有するＩＭＡＧＥクローン番号１９２１２７４によってコードされるタンパク質の使用によって排除し得る。すべてのこれらの種々のタンパク質は、類似の阻害特性を示した。
【００９６】
まとめると、脳組織由来のセリンプロテアーゼ阻害剤であるＥＰＢＰは、トロンビン、ニューロプシン、およびキモトリプシンのアミド分解性活性を阻害するが、トリプシン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、または膵型エラスターゼはそうではないことを実証した。ＰＥＢＰの、セリンプロテアーゼカリクレインおよび活性化タンパク質Ｃを阻害する能力を支持するデータを、また部分的に精製したＰＥＢＰフラクションを使用して取得した。
【００９７】
実施例６：ＰＥＢＰに対する抗体の調製およびＰＥＢＰの局在化
ＰＥＢＰに対してポリクローナル抗血清を惹起するために、マウスＰＥＢＰの２種のＣ末端ペプチド（アミノ酸１４４−１５９、および１７４−１８７）を卵アルブミンに架橋し、そして標準的プロトコールにしたがってウサギに注射した。免疫血清の特異性を、マウス脳ホモジネートのイムノブロット上の単一２１ｋＤａバンドの検出によって評価した。
【００９８】
Ｒａｔ−１繊維芽細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、そしてＰＢＳで再び洗浄した。透過化のために、細胞を、ＰＢＳ中の１５％ピクリン酸と４％パラホルムアルデヒド中で固定し（２０分、室温）、そして０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００とＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中３％ＢＳＡで３０分間阻止後、細胞を、抗血清（阻止溶液中１：１５００）とともに１時間インキュベートし、それからＰＢＳで洗浄した。免疫蛍光検出を、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧコンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）使用して実施した。ＰＥＢＰ−免疫反応性が、透過化および非透過化細胞中でみられた。非透過化Ｒａｔ−１細胞の表面でのＰＥＢＰ免疫反応性の検出は、その細胞質局在化に加えて、ＰＥＢＰの細胞外局在化を支持している。
【００９９】
この明細書で引用したすべての刊行物は、ここに引用をもって、それぞれ個々の刊行物が具体的かつ個別に示され、そして、あたかも完全に示されているようにここに引用により含ませる。
【図面の簡単な説明】
【図１】野生型およびＰＮ−１（−／−）マウスの脳でのトロビン阻害活性。種々の部分の野生型の（△、小脳；□、皮質；○、残りの部分）およびＰＮ−１（−／−）（▲、小脳；■、皮質；●、残りの部分）脳を、ホモジナイズし、そしてそれらのタンパク質含量を測定した。等タンパク質含量のアリコートを、段階的に希釈し、そしてトロンビン阻害についてアッセイした。
【図２】ナノＥＳＩ質量分析による阻害の同定。マウスＰＥＢＰに同一であるべきと見出された、トリプシンによって生じたペプチドを太字で示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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