(57)【要約】本発明は、新規な分泌性プロトロンビナーゼ様ポリペプチドに対応するポリペプチドおよびそれらの変異体または改変体でコードされた、新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供するものである。これらのポリヌクレオチドは、ヒトの卵巣のｃＤＮＡライブラリーから単離された核酸配列（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号７７３５６５６（配列番号１）および７７２７０６５（配列番号１１）を含む。本発明のその他の特徴としては、新規性のある分泌性プロトロンビナーゼ様ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに特有な抗体を生成するプロセスを含むベクターが挙げられる。
2004508804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜３、１０、１２〜１３もしくは１５、その翻訳された蛋白コード部分、その成熟タンパク質コード部分、その細胞外部分、またはその活性ドメインからなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダズする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであり、該ポリヌクレオチドは請求項１に記載のポリヌクレオチドと約９０％より大きい配列同一性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ配列である、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド含む、ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するように、遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドが、該宿主細胞のポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号４〜９、１４もしくは１６〜１８、その翻訳された蛋白コード部分、その成熟タンパク質コード部分、その細胞外部分、またはその活性ドメインからなる群より選択されたアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項１２】
プロトロンビナーゼ様活性を有するポリペプチドであって、配列番号４〜９、１４もしくは１６〜１８からなる群より選択されたポリペプチド配列の少なくとも１０個連続するアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドであって、配列番号４〜９、１４または１６〜１８からなる群より選択されたポリペプチド配列の少なくとも５個連続するアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドに特異的な、抗体。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドをサンプル中で検出する方法であって、以下：
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドと結合して、複合体を形成する化合物に、該複合体を形成するに必要な期間、該サンプルを接触させる工程、
ｂ）該複合体を検出し、複合体が検出されれば、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出されたものとする工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドをサンプル中で検出する方法であって、以下：
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でアニーリングする核酸プライマーを、そのようなハイブリダイゼーション条件下で該サンプルと接触させる工程；
ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む生成物を増幅する工程；および
ｃ）該生成物を検出し、それによって該サンプル中において請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子を含み、該方法はさらにアニーリングしたＲＮＡ分子をｃＤＮＡポリヌクレオチドに逆転写する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載のポリペプチドをサンプル中で検出する方法であって、以下：
ａ）該ポリペプチドと結合して、複合体を形成する化合物に対して、該複合体を形成するのに十分な条件下および期間、該サンプルを接触させる工程；
ｂ）該複合体の形成を検出し、複合体が検出されれば、請求項１０に記載のポリヌクレオチドが検出されたものとする、工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１０に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法で、以下：
ａ）請求項１０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物の複合体を形成するのに十分な条件下および期間、該化合物を接触させる工程；
ｂ）該複合体を検出し、該ポリペプチド／化合物の複合体が検出されれば、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が検出されたものとする工程、を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法であって、以下：
ａ）請求項１０に記載のポリペプチドと該化合物を、細胞の中で、ポリペプチド／化合物の複合体を形成するに十分な期間、接触させて、該複合体によって該細胞中にレポーター遺伝子配列を出現させる工程；および
ｂ）レポーター遺伝子配列発現を検出することによって該複合体を検出し、該ポリペプチド／化合物の複合体が検出されれば、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が検出されたものとする工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
プロントロンビナーゼ様のポリペプチドの生成方法であって、以下：
ａ） 請求項８に記載の宿主細胞を該細胞中に該ポリペプチドを発現させるために十分な条件下で培養する工程
ｂ）細胞培養物または工程（ａ）の細胞からポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載のポリペプチドを含む、キット。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または表面に付着した請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントを含む、核酸アレイ。
【請求項２７】
請求項２６のアレイであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対する完全適合（フルマッチ）を検出する、アレイ。
【請求項２８】
請求項２６のアレイであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対するミスマッチ（不適合）を検出するアレイ。
【請求項２９】
請求項１０に記載のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドの活性または発現の強化の必要が求められている被験体の治療方法であって、以下の項目よりなる群から選択される成分を該被験体に投与する工程を包含する、方法：
ａ）該ポリペプチドのアゴニストの治療量；
ｂ）該ポリペプチドの治療量；および
ｃ）該ポリペプチドが生成されるような形態と条件の下での、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療量、
ならびに薬学的に受容可能なキャリア。
【請求項３０】
請求項１０に記載のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドの活性または発現を阻害する必要を有する被験体の治療方法であって、以下の項目よりなる群から選択される成分を該被験体に投与する工程を包含する、方法：
ａ）該ポリペプチドのアンタゴニストの治療量；
ｂ）該ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチドの治療量；および
ｃ）プロトロンビナーゼ様ポリペプチドとそのリガンドについて競合するポリペプチドの治療量、
ならびに薬学的に受容可能なキャリア。
【請求項３１】
配列番号２もしくは３に記載のヌクレオチド配列、その成熟タンパク質コード部分、またはその活性ドメインを含む、ヒトのプロトロンビナーゼ活性を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、請求項３１に記載のポリヌクレオチドの相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダズするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、請求項３１に記載のポリヌクレオチドと約９０％より大きい配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドであって、ＤＮＡ配列であるポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３１に記載のヌクレオチドの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３７】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドは、該宿主細胞において該ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項４０】
配列番号４〜９、その成熟タンパク質部分、および活性ドメインからなる群より選択されたアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項４２】
請求項４０に記載のポリペプチドに対する、抗体。
【請求項４３】
サンプルにおいて請求項３１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって、以下：
ａ）請求項３１に記載のポリヌクレオチドと結合して、複合体を形成する化合物に対して、該複合体を形成するのに十分な期間、該サンプルを接触させる工程；および
ｂ）該複合体を検出し、複合体が検出されれば、請求項３１に記載のポリヌクレオチドが検出されたものとする工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
サンプルにおいて、請求項３１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって、以下：
ａ）請求項３１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、アニーリングする核酸プライマーをそのようなハイブリダイゼーション条件下で該サンプルと接触させる工程；
ｂ）請求項３１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む生成物を増幅する工程；および
ｃ）その生成物を検出し、それによって該サンプルで請求項３１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法であって、前記ポリヌクレオチドは請求項４０に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡ分子であり、該方法はさらに、アニーリングしたＲＮＡ分子をｃＤＮＡポリヌクレオチドに逆転写する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４０に記載のポリペプチドをサンプル中で検出する方法であって、以下：
ａ）該ポリペプチドと結合して、複合体を形成する化合物に、該複合体を形成するのに十分な条件下および期間で該サンプルを接触させる工程；および
ｂ）該複合体の形成を検出し、複合体の形成が検出されれば、請求項４０に記載のポリヌクレオチドが検出されたものとする工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４０に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法であって、以下：
ａ）請求項４０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物の複合体を形成するのに十分な条件下および期間で、該化合物を接触させる工程；
ｂ）該複合体を検出し、ポリペプチド／化合物の該複合体が検出されれば、請求項４０に記載のポリペプチドに結合する化合物が検出されたものとする工程、を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法であって、以下：
ａ）請求項４０に記載のポリペプチドと、該化合物を、細胞の中で、ポリペプチド／化合物の複合体を形成するに十分な期間、接触させて、該複合体によって該細胞中にレポーター遺伝子配列の発現を駆動させる工程；および
ｂ）レポーター遺伝子配列発現を検出することによって該複合体を検出し、該ポリペプチド／化合物の複合体が検出されれば、請求項４０に記載のポリペプチドに結合する化合物が検出されたものとする工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４０に記載のポリペプチドを作成する方法であって、以下：
ａ）請求項３８に記載の宿主細胞を、該細胞中に該ポリペプチドを発現させるために十分な期間、培養する工程；および
ｂ）該細胞培養物または工程（ａ）の細胞からポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４０に記載のポリペプチドを含む、キット。
【請求項５１】
請求項３１に記載のポリヌクレオチド、または表面に付着した請求項３１に記載のポリヌクレオチドに特有のセグメント、を含む核酸アレイ。
【請求項５２】
請求項５１のアレイであって、請求項３１に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対する完全適合（フルマッチ）を検出するアレイ。
【請求項５３】
請求項５１のアレイであって、請求項３１に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対する不適合（ミスマッチ）を検出するアレイ。
【請求項５４】
請求項１０に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療量を、それを必要とする哺乳類被験体に、投与する工程を包含する、処置の方法。
【請求項５５】
配列番号４〜９からなる群から少なくとも１０個連続するアミノ酸を含むプロトンビナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号４〜９からなる群から少なくとも５個連続するアミノ酸を含む請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項５５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項５６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５９】
請求項４０に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６０】
配列番号９の少なくとも１個のアミノ酸配列を有するプロトロンビナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、ただし、ここでＡ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである、単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（１．技術分野）
本発明は新規のポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質を提供し、それと共にそれらのポリヌクレオチドおよびタンパク質の用途、例えば、治療法、診断法および研究法における用途を提供する。本発明は、特に新規のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドに関する。
【０００２】
（２．背景技術）
特定されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、診断、法医学、遺伝子地図作成、遺伝子障害またはその他の特性の原因となる突然変異の特定、生物学的多様性を評価するため、およびＤＮＡおよびアミノ酸配列に依存するその他の多くの型のデータおよび生成物の作成するため、数多くの用途を持っている。タンパク質は、たとえばリーダー配列クローニングにおけるその分泌性によるか、ＰＣＲベースの技術におけるその細胞または組織源によるか、または既知の生物学的活性の他の遺伝子との構造的な相同性により、生物学的な活性を持つことが知られている。本発明はポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に新規の可溶性のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドとポリヌクレオチドに関する。
【０００３】
血管の損傷が生じた後の血流制御に関する人体の能力は生存の継続について、重要な要素である。損傷した組織が補修された後の血餅の発生と、その後の血餅の溶解の過程は止血と呼ばれる。止血は、１）血管狭窄、２）血小板活性化および凝集、３）血栓形成、および４）組織補修後の血餅の溶解から成る。血餅の発生過程を開始するために、不活性プロトロンビンがプロトロンビナーゼ複合体によってトロンビンに変換され、後者は血小板リン脂質、Ｃａイオン、プロトロンビンおよびＶａとＸａから構成される。プロトロンビナーゼは免疫凝結原の一種として認知され、性格づけられている（国際特許申請ＷＯ９８／５１３３５号）。プロトロンビンの切断によるトロンビンの発生が中心的な調節プロセスである。トロンビンは血小板を活性化して最初のカスケードを開始させ、そしてまた、主要なプラズマタンパク質であるフィブリノーゲンを分割する。フィブリンは繊維のネットワークを形成し、その結果、血餅が生じる。よって、プロトロンビナーゼは凝縮原であり、その活性の規制は声明維持上、不可欠である。フィブリノーゲン切断生成物はまた、血管収縮および走化活性を表することが示されており、そしていくつかの細胞種類に対して分裂誘発性である（ヘリックら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３１，７４１−７４６）。
【０００４】
凝縮経路の調節不良は、血友病、心筋梗塞、糸状体疾患、糖尿病、腫瘍増殖、劇症製ウイルス肝炎、およびアテローム性動脈硬化症などの重篤な症状を起こし得る。これらの多くの症状は、フィブリン沈着および患部組織の壊死を伴う。血栓症または血液凝固はまた、従来ガンと関係づけられてきた（ドボルジャーク、Ｈ．Ｆ．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１８（３），ｐｐ．２７５−２８４（１９８７））。プロトロンビナーゼはまたウイルス性肝炎とも関係づけられている（レビら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６（４），ｐｐ．１２１７−１２２５（２０００））。一部の研究者らは、プロトロンビナーゼの異常発現は、１型糖尿病の初期段階と関係することを示している（ファンデル・プランケンら、Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．６（２），ｐｐ．６５−６８（２０００））。プロトロンビナーゼまたはプロトロンビナーゼタンパク質は凝結を増進することで傷の治療に貢献し得るとされている（チアガラヤンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９（２１）ｐｐ．６４５９−６４６５（２０００））。プロピトロンビナーゼまたはプロトロンビナーゼタンパク質の抑制は、異常血栓の減少、病原性またはウイルス性肝炎の増加、肝臓の壊死の低減、または１型糖尿病の治療に役立つ。
【０００５】
最近では、ウイルス感染またはサイトカイン治療のいずれかによって誘発される誘発可能なプロトロンビナーゼ遺伝子が存在することが明らかになってきつつある（レビら、（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０，ｐｐ．１２１７−１２２５）。プロトロンビナーゼｆｇ１２タンパク質に対する抗体は、この疾患のマウスモデルにおける劇症肝炎を排除し、肝臓の壊死を減少させることが証明された。同様に、妊娠中のマウスのサイトカイン治療においてｆｇ１２発現をアップレギュレートさせることは、自発的中絶を生じることが示されている（クラークら、（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，３７−４３）。特定の病的状態の下においてのみ発現されるその他の誘発可能なプロトロンビナーゼ様タンパク質を識別することができれば有益である。
【０００６】
（３．発明の要旨）
本発明は、新規のプロトロンビナーゼ様ポリペプチド、そのようなペプチドをコードする新規の単離されたポリヌクレオチド、それらに含まれるものとして、組み換えＤＮＡ分子、クローンされた遺伝子またはそれらの変性改変体、詳細には、天然に存在する改変体、例えば、対立遺伝子改変体、アンチセンスポリヌクレオチド分子、およびそれらのポリペプチド上に存在する１つあるいはそれ以上のエピトープを特に認識する抗体、さらにそれらの抗体を生み出すハイブリドーマの発見に基づいている。特に、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの卵巣から生成されたｃＤＮＡライブラリから単離されたプロトロンビナーゼ様ポリヌクレオチド（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号７７３５６５６（配列番号１）および７７２７０６５（配列番号１１））に基づいている。
【０００７】
本発明の組成物としては、さらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターのようなベクター、そのようなポリヌクレオチドを含むような遺伝子工学的な処理をされた細胞、およびそのようなポリヌクレオチドを発現するような遺伝子工学的な処理をされた細胞が挙げられる。
【０００８】
本発明の組成物は、以下のものを含むがそれらに限定されない、分離されたポリヌクレオチドを提供する：配列番号１〜３、１０〜１３、および１５に指定されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；または、配列番号１〜３、１０〜１３、および１５のフラグメント；配列番号１〜３、１０〜１３、および１５の完全長タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド（たとえば、配列番号４、９、１４、１８）；および任意の配列番号１〜３、１０〜１３、および１５の成熟したタンパク質コード配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。本発明のポリヌクレオチドはまた、以下のものを含むが、それらに限定されないポリヌクレオチドを提供する：（ａ）配列番号１〜３、１０〜１３、および１５に示される任意のヌクレオチド配列の補体；（ｂ）配列番号４〜９、１４、１６〜１８のいずれかをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；上記に列挙した任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であり、このポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を持つ対立遺伝子改変体；上記に列挙した任意のペプチドの種ホモログ（例えばオーソログ）をコードするポリヌクレオチド；あるいは、配列番号４〜９、１４、１６〜１８を含むポリペプチドの特定の領域または短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００９】
本出願に使われる収集物は一つのポリヌクレオチドのみの収集物であっても良い。各配列の配列情報または独特な認識情報の収集物が、核酸アレイ上に提供されても良い。１つの実施形態において、配列情報のセグメントが、そのセグメントを含むポリヌクレオチドを検知するために核酸アレイ上に提供される。アレイは、そのセグメントを含むポリヌクレオチドに対する完全な一致または不一致を検知するように設計され得る。収集物は、コンピュータ読取可能な形式で提供されてもよい。
【００１０】
本発明はさらに、上記に示すポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含むクローニングベクターまたは発現ベクターおよびそれらの発現ベクターによって形質転換された宿主細胞または生物を提供する。有益なベクターの中には、当該技術で周知のプラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミドなどを含む。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびこのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般的に、ベクターは少なくとも１つの生物中での複製機能の起点を含み、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞用の選択可能なマーカーを含む。本発明のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。本発明の宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得、そして単細胞生物または多細胞生物であり得る。
【００１１】
本発明の組成物は、配列番号４〜９、１４および１６〜１８のアミノ酸配列を含む群から選択される単離されたポリペプチドを含むがそれに限定されないポリペプチド；または対応する完全長タンパク質もしくは成熟タンパク質を含む。本発明のポリペプチドはまた、（ａ）配列番号１〜３、１０〜１３、および１５に示されたヌクレオチドを持つ任意のポリヌクレオチド；または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる生物活性をもつポリペプチドをも含む。配列番号４〜９、１４、および１６〜１８に挙げられている任意のタンパク質配列の生物学的または免疫学的活性の改変体、ならびに生物学的または免疫学的活性を保持するそれらの実質的等価物もまた意図される。本発明のポリペプチドは、その全部または一部を化学的に合成してもよいが、本発明の遺伝工学的に処理された細胞（たとえば宿主細胞）を利用して遺伝子組み換え手段で生成されることが望ましい。
【００１２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明の薬学的構成としては、本発明のポリペプチド、ならびに親水性の担体、例えば、薬学的受容可能な担体を含んでもよい。
【００１３】
本発明はまた、望ましいポリペプチドの発現を許すような条件下で適切な培養液中で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、培養物または宿主細胞からのタンパク質またはペプチドを精製することにより本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。望ましい実施例には、そのようなプロセスで製造されたタンパク質が熟成した形態のタンパク質である場合を含む。
【００１４】
本発明によるポリヌクレオチドは、分子生物学の当業者に公知の種々の技術における多数の適用を有する。それらの手法には、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途、オリゴマーまたはプライマーとしての用途、ＰＣＲのために、アレイにおける用途、コンピューター読み取り可能な媒体での用途、染色体および遺伝子マッピングのための用途、タンパク質の組み換え産生における用途、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡその化学アナログの生成における用途、などを含む。例えば、ｍＲＮＡの発現が、特定の細胞または組織型に大きく限定される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、サンプル中の特定の細胞または組織ｍＲＮＡの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。
【００１５】
他の例示的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現された遺伝子を同定するための発現された配列タグとして診断において（当該分野で周知であり、そしてＶｏｌｌｒａｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：５２−５９（１９９２）に例示されるように）または、ヒトゲノムの物理的マッピングのための発現された配列タグとして、用いられる。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に現在適用されている、種々の従来の手順および方法において用いられ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成するために用いられ得る。このような抗体、特にモノクローナル抗体は、組織におけるポリペプチドを検出または定量するために有用である。本発明のポリペプチドはまた、分子量マーカーとして、および食物補充物として用いられ得る。
【００１７】
医学的状態を予防、処置、または緩和する方法がまた提供される。この方法は、本発明のペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の治療上有効な量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する。
【００１８】
詳細には、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、たとえば、血友病、心筋梗塞、糸状体疾患、糖尿病、劇症ウイルス性肝炎およびアテローム性動脈硬化症などの凝結経路の調節不全に関連する疾病の予防および／または処置法の一部として利用することができる。このポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、また、ウイルス性感染症の治療およびある種のガンの治療に有効であり得る。
【００１９】
本発明の方法はまた、本明細書において挙げられるような障害の処置のための方法を提供する。この方法は、本明細書において挙げられる障害に関する症状または傾向を示す哺乳動物被験体への本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の投与を包含し得る。さらに、本発明は、本明細書に挙げられるような疾患または障害を処置するための方法を包含する。この方法は、標的遺伝子産物の全体的活性を調節する組成物および他の物質ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する。化合物および他の物質は、標的遺伝子／タンパク質発現または標的タンパク質活性のいずれかのレベルにこのような調整をもたらし得る。具体的には、本発明のポリペプチド、または本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の治療的有効量、あるいは本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドの結合パートナー（例えば、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドに特異的に反応性する抗体）を含む組成物の治療的有効量を、ヒトを含むがヒトに限らない哺乳動物に投与する工程を含む、ウイルス性疾患を含む病状の、予防、治療または回復のための方法を提供する。治療を必要とする個体にとって、本発明によるポリペプチド、またはヌクレオチド、またはポリペプチドの結合パートナー（またはインヒビター）のいずれかが有効であるかは、特定の状態または病理のメカニズムが決定する。
【００２０】
本方法によると、本発明のポリペプチドは細胞機能のインビトロまたはインビボ抑制を発生させるために投与され得る。本発明のあるポリペプチドは、インビボで単独か、または他の治療法の補助剤（ａｄｊｕｎｃｔ）として、投与され得る。逆に、本発明のタンパク質または他の活性分は、特定の薬剤の処方に含ませて、そのような薬剤の副作用を最小化し得る。
【００２１】
本発明はさらに、上記の方法において有用な医薬を製造するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、サンプル（例えば、組織またはサンプル）中における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在を検出する方法に関する。このような方法は、例えば、本明細書中に列挙されたような障害の予後的または診断的な評価の一部として、およびこのような状態に対する素因を示す被験体の同定のために利用され得る。
【００２３】
本発明は、本発明のポリペプチドが試料中に存在することを検知する方法として、複合体を形成するのに十分な条件下かつ期間、ポリペプチドと結合する化合物に試料を接触させ、そしてこの複合体の形成を検知し、それによって複合体が形成される場合、ポリペプチドが検知される方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチドプローブおよび／またはモノクローナル抗体、ならびに必要に応じて定量基準を備えたキットを提供する。さらに、本発明は、上記に列挙されるような障害の処置のための臨床試験に関連した、薬物の効力を評価する方法および患者の経過をモニタリングする方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現または活性を調節（すなわち、増加または減少）する化合物を同定するための方法を提供する。このような方法は、例えば、本明細書中に列挙されたような障害の症状を改善し得る化合物の同定のために有用であり得る。このような方法としては、本発明のポリペプチドと相互作用する（例えば、結合する）化合物または他の物質を同定するためのアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明は本発明のポリペプチドと結合する化合物を同定する方法として、複合体を形成するのに十分な条件下かつ時間で、化合物をポリペプチドに接触させて、ポリペプチド／化合物複合体を形成する工程、およびこの複合体を検知する工程、を包含し、その結果、ポリペプチド／化合物複合体が検知される場合、ポリペプチドと結合する化合物が同定される方法を提供する。
【００２７】
化合物を同定するための方法であって、ポリペプチド／化合物複合体が形成されるのに十分な時間、化合物を細胞の中でポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、この複合体は、細胞中でのレポーター遺伝子の発現を誘導する、工程、およびこのレポーター遺伝子配列発現を検出することにより複合体を検出する工程を包含し、その結果、ポリペプチド／化合物複合体が検知される場合、ポリペプチドと結合する化合物が同定される方法もまた提供される。
【００２８】
（５．発明の詳細な説明）
配列番号４のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドは、約３８８アミノ酸のタンパク質で、予測分子量が非グリコシル下で約４３ｋＤａである。ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使ったタンパク質データベース検索（アルトシュル、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）およびアルトシュル、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４０３−１０（１９９０）、これらは本明細書中で参考として援用される）は、配列番号４はヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質に相同であることを示す。図１は（「プロトロンビナーゼ様」とも呼ばれる）配列番号３によってコードされたタンパク質（すなわち、配列番号４）とヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質（配列番号１９）との間のＢＬＡＳＴＸアミノ酸配列アライメントを示し、これらは、２つの配列が、配列番号４の２９１のアミノ酸残基について５３％の相同性、配列番号４の２９１のアミノ酸残基について３７％の同一性があることを示している。
【００２９】
予測された約２０残基のシグナルペプチドは、配列番号４の残基約１から２０によってコードされる。成熟部分（配列番号９とも表示される）は、それ自身有用である。これは、哺乳類細胞における発現と切断生成物の配列決定によって確認されている。シグナルペプチドは、カイト／ドリトルのアルゴリズム（Ｋｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５７，ｐｐ．１０５−１３１（１９８２））によって予測された。当業者は、実際の切断部位はコンピュータプログラムで予測されたものと異なる可能性があることを理解するであろう。
【００３０】
プロトロンビナーゼ様はＣ末端領域でフィブリノーゲンβおよびγ鎖を有することがｅＭＡＴＲＩＸソフトウェアパッケージ（スタンフォード大学、カリフォルニア州スタンフォード）を利用して予想される。具体的には、配列番号４の残基１８１から２１７、配列番号４の残基２２２から２３４、配列番号４の残基２７１から２８５、配列番号４の残基３２４から３５３にあることが予想される。配列番号４に対応するドメインは以下である：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである：
残基１８１〜２１７　ＶＭＣＤＭＤＹＲＧＧＧＷＴＶＩＱＫＲＩＤＧＩＩＤＦＱＲＬＷＣＤＹＬＤＧＦＧ（配列番号５と表示される）、
残基３２４〜３５３　ＣＳＨＬＨＮＫＴＧＷＷＦＮＥＣＧＬＡＮＬＮＧＩＨＨＦＳＧＫＬ（配列番号６と表示される）、
残基２７１〜２８５　ＦＫＭＨＬＧＲＹＳＧＮＡＧＤＡ（配列番号７と表示される）、
残基２２２〜２３４　ＥＦＷＬＧＬＫＫＩＦＹＩＶ（配列番号８と表示される）。
【００３１】
配列番号４の予測される可溶性の分泌スプライス改変体は配列番号１４である。ほぼ３２６のアミノ酸タンパク質であり、予測分子量は非グリコシル化されて約３７ｋＤａである。タンパク質データベースをＢＬＡＳＩＸアルゴリズム（アルトシュール、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０〜３００（１９９３）およびアルトシュール、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４０３〜１０　（１９９０）、これらは本明細書中で参考として援用される）での検索は、配列番号１４はヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質と相同であることを示す。図２と３は（「プロトロンビナーゼ様」として同定される）配列番号１３でコードされたタンパク質（すなわち配列番号１４）とヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質（配列番号１９）との間のＢＬＡＳＴＰアミノ酸配列のアライメントを示す。
【００３２】
ｅＭＡＴＲＩＸソフトウェアパッケージ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）を用いて、プロトロンビナーゼ様が、Ｃ末端ドメインにおいてフィブリノーゲンβ鎖およびγ鎖を有することが予想される。特に、配列番号１４の残基１８１〜２１７、配列番号１４の残基２６２〜２９１にある。配列番号１４に対応するドメインは以下のとおりである：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン：
残基１８１〜２１７　ＶＭＣＤＭＤＹＲＧＧＧＷＴＶＩＱＫＲＩＤＧＩＩＤＦＱＲＬＷＣＤＹＬＤＧＦＧ（配列番号５と表示される）、
残基２６２〜２９２　ＣＳＨＬＨＮＫＴＧＷＷＦＮＥＣＧＬＡＮＬＮＧＩＨＨＦＳＧＫＬ（配列番号６と表示される）。
【００３３】
推定されるほぼ２０残基のシグナルペプチドは配列番号１４（配列番号１６）の両方のほぼ残基１から残基２０までコードされる。細胞外部分はそれ自体が有用である。これは哺乳動物の細胞における発現、および切断産物の配列決定によって確認することができる。シグナルペプチド領域は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性予測アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、１５７、１０５〜３１頁（１９８２）（本明細書中に参考として援用される））によって予測された。当業者は、実際の切断部位が、コンピュータプログラムによって予測された切断部位と異なり得ることを認識する。
【００３４】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．のＧｅｎｅＡｔｌａｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および配列プロフィールベース検索プロトコルＰＢ９０を使用し、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにより定義されたドメイン上で最適化されたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴおよびＳｅｑｆｏｌｄベースの検索プロトコルを使用することによって、膜に結合された「プロトロンビナーゼ様」ポリペプチド配列番号１４は、血液凝固に対する特性モチーフ（配列番号２０）を持った残基８２〜３２１（配列番号１７）に領域を持つことが決定された（図４参照）。配列番号１４に対応するドメインは以下のとおりでである：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン：
血液凝固ドメイン（配列番号１４のアミノ酸８２〜３２１と表示される）のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ　ｅ値１．３ｅ−６６、タンパク質データベース同定番号入力＝ｌｆｚｃ＿Ｂ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｂｄ）。
【００３５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドの損失または過剰出現により媒介される障害の予防および／または処置のための方法の一部として利用することができる。そのような障害としては、とりわけ、血友病、心筋梗塞、糸状体疾患、糖尿病、劇症ウイルス性肝炎およびアテローム性動脈硬化症などの凝固経路の調節不全に関連する疾患が挙げられる。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ウイルス感染の処置において、およびいくつかの形態のガンの処置において有益であり得る。
【００３６】
（５．１定義）
本明細書および添付の特許請求範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈がそうでないことを示さない限り、複数形への言及をも含むことに留意しなければならない。
【００３７】
用語「活性」は、任意の天然に存在するポリペプチドの生物学的活性および／または免疫原性活性を保持するポリペプチドの形態をいう。本発明に従って、用語「生物学的に活性」または「生物学的活性」は、天然に存在する分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質またはペプチドをいう。用語「プロトロンビナーゼ様」とはヒトのプロトロンビナーゼの生物学的活性に類似する生物学的活性をいう。同様に、「生物学的に活性な」または「生物学的活性」は天然、組換えもしくは合成のプロトロンビナーゼ様ペプチド、またはそれらの任意のペプチドが、適切な動物または細胞において特異的な生物学的応答を誘導し、特異抗体と結合する能力をいう。
【００３８】
用語「活性化された細胞」は、本出願中で使用される場合、細胞内または細胞外の膜輸送（正常なプロセスまたは罹患プロセスの一部としての分泌分子または酵素分子の外への輸送を含む）に関与する細胞である。
【００３９】
用語「相補的な」または「相補性」とは、塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’は相補的な配列３’−ＴＣＡ−５’と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」であってその結果、一部の核酸のみが結合し得るか、または「完全」であってその結果、全体的な相補性が一本鎖分子の間に存在し得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対して重大な効果を持つ。
【００４０】
用語「胚性幹細胞（ＥＳ）」は、胚または成体へと多くの分化した細胞型（生殖細胞を含む）を生じさせ得る細胞をいう。用語「生殖系列幹細胞（ＧＳＣ）」とは、配偶体の生産のために生殖細胞の定常的でかつ連続した供給源を提供する、始原幹細胞に由来する幹細胞をいう。用語「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」とは、他の細胞系列、特に卵黄嚢、腸間膜、または胚形成中の生殖隆起を除いた、生殖細胞などの細胞に分化する可能性を有する、小集団の細胞セットをいう。ＰＧＣはＧＳＣおよびＥＳ細胞を誘導する供給源である。ＰＧＣ、ＧＳＣおよびＥＳ細胞は自己再生し得る。従って、これらの細胞は生殖系列を増殖させ、成人の特化器官を含めて複数の最終分化細胞を生じさせるだけでなく、自分自身をも再生し得る。
【００４１】
用語「発現調節フラグメント」ＥＭＦは、作動可能に連結されたＯＲＦまたは別のＥＭＦの発現を調節する一連のヌクレオチドを意味する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、配列は、その配列の発現がＥＭＦの存在によって改変される場合に、「作動可能に連結された配列の発現を調節する」といわれる。ＥＭＦとしては、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導性エレメント）が挙げられるが、これらに限定されない。１つのクラスのＥＭＦは、特定の調節因子または生理学的事象に応答して、作動可能に連結されたＯＲＦの発現を誘導する核酸フラグメントである。
【００４３】
用語「ヌクレオチド配列」または「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では交換可能に使用され、そしてヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列をいう。これらの用語はまた、一本鎖もしくは二本鎖であり得て、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノムもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または任意のＤＮＡ様またはＰＮＡ様物質をいう。一般的に、本発明により提供される核酸セグメントは、ゲノムおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーのフラグメントから、または一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレオチドから組立てられて、微生物またはウイルスオペロン、または真核生物遺伝子由来の調節エレメントを含む組換え転写単位で発現され得る合成核酸を提供し得る。
【００４４】
用語「オリゴヌクレオチドフラグメント」もしくは「ポリヌクレオチドフラグメント」、「部分」または「セグメント」または「プローブ」または「プライマー」は、交換可能に使用され、そして少なくとも約５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約９個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１１個のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約１７個のヌクレオチドであるヌクレオチド残基の配列をいう。フラグメントは、好ましくは約５００個未満のヌクレオチド、好ましくは約２００個未満のヌクレオチド、より好ましくは約１００個未満のヌクレオチド、より好ましくは約５０個未満のヌクレオチド、そして最も好ましくは３０個未満のヌクレオチドである。プローブは、好ましくは約６個のヌクレオチド〜約２００個のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１７個〜３０個のヌクレオチド、そして最も好ましくは、約２０個〜２５個のヌクレオチドである。好ましくは、フラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、各種のハイブリダイゼーション手順またはマイクロアレイ手順において、ｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の同一または関連部分の同定または増幅に使われ得る。フラグメントまたはセグメントは本発明の各ポリヌクレオチド配列を独自に同定し得る。好ましくは、フラグメントは配列番号１〜３、１０〜１３および１５の一部と実質的に類似する配列を含む。
【００４５】
プローブは例えば、細胞または組織の中に特定のｍＲＮＡ分子が存在するかどうかを決定するため、またはＷａｌｓｈらによって記載された染色体ＤＮＡから類似の核酸配列を単離するために使われ得る（Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓ．ら、１９９２、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ　１：２４１〜２５０）。これらは、ニックトランスレーション、クレノーフィルイン反応、ＰＣＲ、または当該分野で周知の他の方法によって標識され得る。本発明のプローブ、その調製および／または標識は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．ら，１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹによって詳述されている（これらは両方とも、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００４６】
本発明の核酸配列はまた、配列番号１〜３、１０〜１３および１５の任意の核酸配列からの配列情報を含んでいる。配列情報は、配列番号１〜３、１０〜１３および１５の配列情報を独自に同定するかまたは表す、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のセグメントであり得る。１つのそのようなセグメントは２０マー核酸配列でもあり得る。なぜなら、その理由はヒトのゲノムにおいて２０マーが完全に一致する確率は３００分の１であるからである。ヒトのゲノムの場合、１組の染色体の中に３０億個の塩基対がある。４２０の２０マーが存在し得るので、１組のヒトの染色体に存在する塩基対の数の３００倍を超える２０マーが存在することになる。同じ分析を用いて、１７マーがヒトのゲノムにおいて完全にマッチする確率は約５分の１である。これらのセグメントを発現研究のためにアレイにおいて使用する場合は、１５マーセグメントを使うことができる。同様に、１５マーが発現された配列において完全にマッチする確率もまた、発現された配列がゲノム配列全体の約５％未満を構成するので、ほぼ５分の１である。
【００４７】
同様に、単一のミスマッチを検出するために配列情報を使う上で、１つのセグメントは２５マーであり得る。ヒトのゲノムにおいて２５マーがミスマッチ１個を伴って現れる確率は、完全マッチの確率（１÷４２５）に各ヌクレオチド位置におけるミスマッチの増えた確率（３×２５）を掛けることで計算される。１つのミスマッチを有する１８マーが、発現研究のためのアレイにおいて検出され得る確率は約５分の１である。１つのミスマッチを有する２０マーがヒトのゲノムの中で検出され得る確率は約５分の１である。
【００４８】
用語「オープンリーディングフレーム」ＯＲＦは、いかなる終結コドンをも含まない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレットを意味し、タンパク質へと翻訳可能な配列である。
【００４９】
用語「作動可能に連結された」または「作動可能に結合した」とは、機能的に関連した核酸配列をいう。例えば、あるプロモーターがあるコード配列の転写を制御するとき、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に結合または作動可能に連結されている。作動可能に連結された核酸配列は連続し得、同一のリーディングフレーム内にあり得、一方、ある遺伝的エレメント（例えば、リプレッサー遺伝子はコード配列に連続して連結されていないが、依然としてこのコード配列の転写／翻訳を制御する。
【００５０】
用語「多能性」は、細胞が、成体生物中に存在する多数の分化した細胞型へと分化する能力をいう。多能性細胞は、全能性細胞と比較して、その分化能力が制限されている。
【００５１】
用語「ポリペプチド」または「ペプチド」または「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列またはそれらのフラグメントをいい、天然に存在する分子または合成分子をいう。ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」、または「セグメント」は、少なくも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約７個のアミノ酸、より好ましく約９個のアミノ酸、そして最も好ましくは約１７個以上のアミノ酸の一連のアミノ酸残基である。ペプチドは、好ましくは２００個以下のアミノ酸、より好ましくは１５０個以下のアミノ酸、そして最も好ましくは１００個以下のアミノ酸である。好ましくは、ペプチドは約５個から約２００個のアミノ酸である。活性であるためには、任意のポリペプチドは、生物学的および／または免疫学的活性を示すための十分な長さを持っていなければならない。
【００５２】
用語「天然に存在するポリペプチド」は、遺伝子操作されていない細胞によって産生されたポリペプチドをいい、そして特に、ポリペプチドの翻訳後改変（アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない）から生じる種々のポリペプチドを意図する。
【００５３】
用語「翻訳されたタンパク質コード部分」は、任意のリーダー配列またはプロセシング配列を含み得る、全長のタンパク質をコードする配列を意味する。
【００５４】
用語「成熟タンパク質コード配列」は、何のリーダー／シグナル配列も伴わないペプチドまたはタンパク質をコードする配列をいう。ペプチドは、細胞中でのプロセシングの間に除去されるリーダー配列を有し得るか、またはこのタンパク質は、合成的に、もしくは成熟タンパク質コード配列のみをコードするポリヌクレオチドを使用して産生されてもよい。
【００５５】
用語「誘導体」は、ヒトタンパク質において通常は生じない、ユビキチン結合、標識（例えば、放射性核種または種々の酵素による）、共有結合ポリマー付着（例えば、ペグ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化））、およびオルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技術によって化学的に改変されたポリペプチドをいう。
【００５６】
用語「改変体」（または「アナログ」）は、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された、アミノ酸の挿入、欠失および置換によって、天然に存在するポリペプチドとは異なる任意のポリペプチドをいう。どのアミノ酸残基が、目的の活性を損なうことなく置換、付加、または欠失され得るかを決定する際の指針は、特定のポリペプチドの配列を相同なペプチドの配列と比較すること、および相同性の高い領域（保存領域）においてなされるアミノ酸配列変化の数を最少にすることによってか、またはアミノ酸をコンセンサス配列で置換することによって、見出され得る。
【００５７】
あるいは、これらの同一または類似のポリペプチドをコードする組換え改変体は、遺伝コードにおける「冗長性」を利用することにより、合成または選択することができる。各種のコドン置換（例えば、各種の制限部位を生じるサイレント変化）を導入して、プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニングまたは特定の原核生物系または真核生物系における発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列における変異は、このポリペプチドまたはこのポリペプチドに付加される他のペプチドの領域に反映されて、このポリペプチドの任意の部分の特性を改変し得、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転率のような特徴を変更し得る。
【００５８】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換した結果（すなわち、保存的アミノ酸置換）である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１〜２０、より好ましくは１〜１０アミノ酸の範囲である。許容されるバリエーションは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に作製すること、そして生じた組換え改変体を活性についてアッセイすることによって、実験的に決定され得る。
【００５９】
あるいは、機能の改変が所望される場合には、挿入、欠失または非保存的改変を操作して、改変されたポリペプチドを生じさせ得る。このような改変は、例えば、本発明のポリペプチドの１以上の生物学的機能または生化学的特徴を改変し得る。例えば、このような改変は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転速度のようなポリペプチドの特徴を変化させ得る。さらに、このような改変は、発現のために選択された宿主細胞中における発現、スケールアップなどのためにより良く適したポリペプチドを生成するように選択され得る。例えば、システイン残基が、ジスルフィド架橋を排除するために、欠失され得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る。
【００６０】
用語「精製された」または「実質的に精製された」は、本明細書中で使用される場合、示された核酸またはポリヌクレオチドは、他の生体高分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が実質的に存在せずに存在することを示す。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する示された生体高分子のうちの少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％を構成するように精製される（しかし、水、緩衝剤、および他の低分子（特に１０００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在し得る）。
【００６１】
用語「単離された」とは、本明細書中で使用される場合、その自然の供給源においてその核酸またはポリペプチドと共に存在する少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドをいう。１つの実施形態では、核酸またはポリペプチドは、（もしあるとすれば）溶媒、緩衝剤、鉄、またはその溶液に通常存在する他の成分のみの存在下で見出される。用語「単離された」または「精製された」は、天然の供給源中に存在する核酸またはポリペプチドを包含しない。
【００６２】
用語「組換え」は、ポリペプチドまたはタンパク質をいうために本明細書中で使用される場合、そのポリペプチドまたはタンパク質が、組換え（例えば、微生物、昆虫または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。「微生物（性）」は、細菌または真菌（例えば、酵母）の発現系において作製された組換えポリペプチドまたはタンパク質をいう。生成物として、「組換え微生物（性）」は、ネイティブな内因性物質を本質的に含まず、かつネイティブな結合グリコシル化を付随していないポリペプチドまたはタンパク質を規定する。大半の細菌培養物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化改変を含まず；酵母において発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞中において発現されるポリペプチドまたはタンパク質とは一般的に異なるグリコシル化パターンを有する。
【００６３】
用語「組換え発現ビヒクルまたはベクター」は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現させるための、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。発現ビヒクルは、以下のアセンブリを含む転写単位を含み得る：（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝的エレメント（１つまたは複数）（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）；（２）ｍＲＮＡへと転写され、そしてタンパク質へと翻訳される構造配列またはコード配列；ならびに（３）適切な転写開始配列および転写終結配列。酵母または真核生物の発現系において使用されることを意図された構造単位は、好ましくは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質が、リーダー配列も輸送配列も伴わずに発現される場合、これは、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、最終産物を与えるために、発現された組換えタンパク質からその後に切断されても、切断されなくともよい。
【００６４】
用語「組換え発現系」は、染色体ＤＮＡ中に組換え転写単位が安定に組み込まれた宿主細胞、または染色体外で組換え転写単位を保有する宿主細胞を意味する。本明細書中で規定される組換え発現系は、発現されるべきＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結された調節エレメントの誘導に際して、異種ポリペプチドまたは異種タンパク質を発現する。この用語はまた、遺伝子発現において調節的役割を有する組換え遺伝子エレメント（１つまたは複数）（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）を安定的に組み込んだ宿主細胞を意味する。本明細書中で規定される組換え発現系は、発現されるべき内因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子に連結された調節エレメントの誘導に際して、細胞に対して内因性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この細胞は、原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよい。
【００６５】
用語「分泌」とは、膜を越えてかまたは膜を通して輸送されたタンパク質を包含し、適切な宿主細胞にそれが発現されたときに、そのアミノ酸配列中のシグナル配列の結果としての輸送を含む。「分泌」タンパク質としては、それが発現される細胞から完全に分泌されたタンパク質（例えば、可溶性タンパク質）かまたは部分的に分泌されたタンパク質（例えば、レセプター）が挙げられるが、これらに限定はしない。「分泌」タンパク質としてはまた、小胞体の膜を越えて輸送されるタンパク質が挙げられるが、限定はしない。「分泌」タンパク質はまた、非典型的シグナル配列を含むタンパク質（例えば、インターロイキン−１β（Ｋｒａｓｎｅｙ，Ｐ．およびＹｏｕｎｇ，Ｐ．Ｒ．（１９９２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　４（２）：１３４〜１４３）および損傷した細胞から放出される因子（例えば、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト）Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．ら（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２７〜５５を参照））を包含することも意味する。
【００６６】
必要な場合は、発現ベクターは、ポリペプチドが細胞の膜を通ることを導く「シグナル配列またはリーダー配列」を含むように設計されていてもよい。そのような配列は、本発明のポリペプチド上に天然に存在していてもよいし、または組み換えＤＮＡ技術によって異種のタンパク質供給源から提供されてもよい。
【００６７】
「ストリンジェントな」という用語は、当該分野において通常ストリンジェントとして理解されている条件をいう。ストリンジェントな条件としては、高度にストリンジェントな条件（すなわち、フィルター固定したＤＮＡを、０．５　Ｍ　ＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡに６５℃でハイブリダイゼーションし、６８℃の０．１Ｘ　ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳで洗浄すること）、および中程度にストリンジェントな条件（すなわち、４２℃の０．２Ｘ　ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳで洗浄）が挙げられ得る。その他の例示的ハイブリダイゼーション条件は、本文中に実施例において説明する。
【００６８】
デオキシンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、さらなるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドに対して）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドに対して）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドに対して）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドに対して）の６Ｘ　ＳＳＣ／０．０５　％ピロリン酸ナトリウムで洗浄することが挙げられる。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「実質的に等価」とは、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両方をいい得、例えば、参照配列から１つ以上の置換、欠失または付加から変化する変異体配列があり、ここでその１つ以上の置換、欠失または付加の正味の効果は、参照配列と対象配列との間に機能上不利な差異を生じない。代表的には、そのような実質的に等価な配列は、本明細書中に列挙されたものの１つから３５％以下異なる（すなわち、対応する参照配列との比較した場合に、実質的に等価な配列における個々の残基の置換、付加、および／または欠失の数を、その実質的に等価な配列の残基の総数で除した値が約０．３５以下である）。そのような配列は列挙された配列に対して６５％の配列同一性を有すると言われる。１つの実施形態において、本発明の実質的に等価な（例えば、変異体）配列は、列挙された配列から３０％以下変化し（７０％配列同一性）；本実施例のあるバリエーションでは、２５％以下変化し（７５％配列同一性）；本実施例のさらに別のバリエーションでは、２０％以下変化し（８０％配列同一性）；本実施例のさらに別のバリエーションでは、１０％以下変化し（９０％配列同一性）；本実施例のさらに別のバリエーションでは、５％以下変化する（９５％配列同一性）。本発明による実質的に等価な（例えば、変異体）アミノ酸配列は、好ましくは、列挙されたアミノ酸配列と８０％の同一性を有し、より好ましくは、９０％の同一性を有する。本発明の実質的に等価なヌクレオチド配列は、遺伝子コードの重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）または縮重を考慮して、より低い配列同一性パーセントを有し得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも約６５％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも約７５％の同一性を有し、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する。本発明の目的のために、実質的に等価な生物学的活性特徴および実質的に等価な発現特徴を有する配列は、実質的に等価なものとみなされる。等価性の決定のためには、成熟配列の切断は（例えば、擬似ストップコドンを生成する変異を介して）無視されるべきである。配列同一性は、例えば、Ｊｏｔｕｎ　Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６〜６４５）を使用して決定され得る。配列間の同一性はまた、当該分で公知の他の方法（例えば、ハイブリダイゼーション条件を変えること）によって、決定され得る。
【００７０】
用語「全能」とは、成体生物の細胞型すべてへと細胞が分化する能力を指す。
【００７１】
用語「形質転換」とは、適切な宿主細胞にＤＮＡを導入して、そのＤＮＡが染色体外エレメントとしてかまたは染色体組込みによってかのいずれかで複製可能であるようにすることを意味する。用語「トランスフェクション」とは、いくらかのコード配列が実際に発現されるかどうかにかかわらず、適切な宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。用語「感染」とは、ウイルスまたはウイルスベクターの使用によって適切な宿主細胞に核酸を導入することを指す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「取り込み調節フラグメント」ＵＭＦとは、連結されたＤＮＡフラグメントが細胞へ取り込まれるのを媒介する、一連のヌクレオチドを意味する。ＵＭＦは、既知のＵＭＦを標的配列もしくは標的モチーフとして、以下に説明するようなコンピュータベースの系を使用してで容易に同定され得る。ＵＭＦの存在および活性は、疑わしいＵＭＦをマーカー配列に付着させることによって、確認され得る。その後、生じた核酸分子が、適切な条件下で、適切な宿主とともにインキュベートされ、そしてそのマーカー配列の取り込みを決定される。上述のように、ＵＭＦは、連結されたマーカー配列の取り込みの頻度を増加する。
【００７３】
上述の各用語は、文脈上他の意味を示さないかぎり、各々について記載されたすべてを包含することが意味される。
【００７４】
（５．２　本発明の核酸）
本発明は、新規な分泌プロトロンビナーゼ様ポリペプチド、そのプロトロンビナーゼ様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発見、そして神経学的状態および神経学的障害の診断、処置または予防のためのこれらの組成物の使用に基づく。
【００７５】
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号１〜３、１０〜１３および１５のヌクレオチド配列のいずれかを含む、ポリヌクレオチド；配列番号１〜３、１０〜１３および１５のフラグメント；配列番号１〜３、１０〜１３および１５の全長タンパク質コード配列を含む、ポリヌクレオチド（例えば配列番号４、９、１４、１８）；ならびに配列番号１〜３、１０〜１３および１５のいずれかのポリヌクレオチドの成熟タンパク質コード配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、以下とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）配列番号１〜３、１０〜１３または１５のヌクレオチド配列のいずれかの相補体；（ｂ）配列番号４〜９、１４または１６〜１８のポリペプチドのいずれか一つをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）上記の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｄ）上記のタンパク質のいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；あるいは（ｅ）配列番号４〜９、１４または１６〜１８のポリペプチドの特定のドメインもしくは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。目的のドメインは、コードされたポリペプチドの性質に依存し得、例えば、レセプター様ポリペプチド中のドメインとしては、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、もしくは細胞質ドメイン、またはそれらの組み合わせが挙げられ；免疫グロブリン様タンパク質中のドメインとしては、免疫グロブリン様可変ドメインが挙げられ；酵素様ポリペプチド中のドメインとしては、触媒ドメインおよび基質結合ドメインが挙げられ；そしてリガンドポリペプチド中のドメインとしては、レセプター結合ドメインが挙げられる。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドとしては、天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡ、または全合成ＤＮＡおよびＲＮＡもしくは部分合成ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、例えば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられ、例えば、ｍＲＮＡが挙げられる。
【００７７】
本発明はまた、本明細書中で開示されるｃＤＮＡ配列に対応した遺伝子も提供する。これらの対応した遺伝子は、本明細書中で開示される配列情報を使いて、既知の方法に従って単離され得る。そのような方法としては、適切なゲノムのライブラリー、または他のゲノム材料供給源における遺伝子の同定および／または増幅のための、開示された配列情報からプローブまたはプライマーの調製が挙げられる。さらなる５’配列および３’配列が、当該分野で公知の方法を使用して入手され得る。例えば、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のポリヌクレオチドのいずれかに対応する、全長ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡが、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のポリヌクレオチドのいずれかまたはその一部をプローブとして使用して、適切なハイブリダイゼーション条件下で適切なｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、入手され得る。あるいは、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のポリヌクレオチドは、適切なゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の同定および／または増幅を可能にする適切なプライマーについての基礎として使用され得る。
【００７８】
本発明の核酸配列は、一個以上の公開データベース（例えばｄｂＥＳＴ、ｇｂｐｒｉおよびＵｎｉＧｅｎｅ）から取得されるＥＳＴおよび配列（ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列を含む）から組み立てられ得る。このＥＳＴ配列は、全長遺伝子に関する、配列情報、例示フラグメントもしくはセグメントの情報、または全長遺伝子についての新規なセグメント情報を提供し得る。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドと実質的に等価のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、そしてさらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。
【００８０】
本発明における核酸配列の範囲に含まれるものは、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のヌクレオチドの配列のいずれかまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、そのフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きく、好ましくは７ヌクレオチドより大きく、より好ましくは９ヌクレオチドより大きく、そして最も好ましくは１７ヌクレオチドより大きい。選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）、例えば、１５ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上または２０ヌクレオチド以上のフラグメントが、考慮される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることができるプローブは、同じファミリーの遺伝子中の他のポリヌクレオチド配列から本発明のポリヌクレオチド配列を区別し得るか、あるいは他種の遺伝子からヒト遺伝子を区別し得、好ましくは、独自のヌクレオチド配列に基づく。
【００８１】
本発明の範囲内にある配列は、これら特定の配列に限定されず、そしてまた、その対立遺伝子改変体および種改変体をも含む。対立遺伝子改変体と種改変体は、配列番号１〜３、１０〜１３および１５にて提供される配列、その代表的なフラグメント、または配列番号１〜３、１０〜１３および１５と少なくとも９０％同一であり好ましくは９５％同一のヌクレオチド配列を、同種の他の単離物からの配列と比較することによって、慣用的に決定され得る。さらに、コドンの可変性に順応するため、本発明は、本明細書中に開示された特定のＯＲＦと同様に、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含する。即ち、ＯＲＦのコード領域において、あるコドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンで置換することが、明らかに意図される。
【００８２】
本発明の核酸（配列番号１〜３、１０〜１３および１５を含む）の最も近接する近似物（ｔｈｅ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ）の結果は、アルゴリズムまたはプログラムを使ってデータベースを検索することにより取得され得る。好ましくは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌの略語である）を使って、局所配列アラインメントが検索される（Ａｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｊ　Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６　２９０〜３００（１９９３）およびＡｌｔｓｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら．Ｊ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４０３〜４１０（１９９０））。
【００８３】
開示されたポリヌクレオチドおよびタンパク質の種ホモログ（オルソログ）もた、本発明により提供される。種ホモログは、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして望ましい種から適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離され得そして同定され得る。
【００８４】
本発明はまた、開示したポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子改変体も包含し；対立遺伝子改変体は即ち、単離されたポリヌクレオチドの天然に存在する代替形態であり、それはまたポリヌクレオチドによりコードされたものと同一であるか、相同であるか、または関連するタンパク質をコードする。
【００８５】
本発明の核酸配列はさらに、記載された核酸の改変体をコードする配列に関する。これらのアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化をネイティブポリヌクレオチドもしくは改変体ポリヌクレオチドに導入することによって、当該分野で公知の方法によって調製され得る。アミノ酸配列改変体の構築には、以下の２つの変数が存在する：変異の位置および変異の性質である。アミノ酸配列改変体をコードする核酸は、天然に存在しないアミノ酸配列をコードするようにそのポリヌクレオチドを変異させることによって、好ましくは構築される。これらの核酸変化は、異なる種からの核酸中で異なる部位（可変位置）または高度に保存された領域（定常領域）で作製され得る。そのような位置の部位は、代表的には、例えば、まず保存的選択肢で（例えば、疎水性アミノ酸を、異なる疎水性アミノ酸に）置換し、それからより遠い選択肢で（例えば、疎水性アミノ酸を、荷電アミノ酸に）置換することによって、連続して改変され、その後、欠失もしくは挿入が標的部位でなされ得る。アミノ酸配列の欠失は、一般的に、約１〜３０残基の範囲であり、好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、代表的には連続している。アミノ酸の挿入としては、１〜１００残基以上の範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一アミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入は、一般には、約１〜１０アミノ酸残基の範囲であり得、好ましくは１〜５残基の範囲であり得る。末端挿入の例としては、異なる宿主細胞中での分泌または細胞内ターゲッティングに必要な、異種シグナル配列、ならびに発現されたタンパク質を精製するために有用な配列（例えば、ＦＬＡＧ配列またはポリヒスチジン配列）が挙げられる。
【００８６】
好ましい方法において、新規なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、部位特異変異誘発により変化される。この方法は、オリゴヌクレオチド配列を使って、ポリヌクレオチドが所望のアミノ酸改変体をコードするように変化させ、ならびに変化したアミノ酸の両側で隣接する十分な長さのヌクレオチドが、変化される部位のいずれの側でも安定な二重鎖を形成するように変化させる。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当業者に周知であり、そしてこの技術は、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ　２：１８３（１９８３）のような刊行物によって例示される。ポリヌクレオチド配列において部位特異的変化を作製するための汎用的かつ効率的な方法は、ＺｏｌｌａｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００（１９８２）により公開された。ＰＣＲもまた、新規な核酸のアミノ酸配列改変体を生成するために使用され得る。開始材料として少量のテンプレートＤＮＡを使う場合、そのテンプレートＤＮＡ内の対応する領域とわずかに異なるプライマーが、望ましいアミノ酸改変体を生成し得る。ＰＣＲ増幅は、そのプライマーにより特定の位置で、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドテンプレートと異なる生成物ＤＮＡフラグメントの集団を生じる。この生成物ＤＮＡフラグメントは、プラスミド内の対応する領域を置換し、そしてこれは、望ましいアミノ酸改変体をコードするポリヌクレオチドを生じる。
【００８７】
アミノ酸改変体を生成するさらなる技術は、カセット変異誘発技術（これはＷｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ　３４：３１５（１９８５）に記載される）；ならびに当該分野で周知の他のの変異誘発技術であり、これは例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら）における技術である。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じアミノ酸配列または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、これらの新規な核酸のクローニングおよび発現のために本発明の実施において使用され得る。このようなＤＮＡ配列としては、ストリンジェントな条件の下、適切な新規な核酸配列にハイブリダイゼーズ可能な配列が挙げられる。
【００８８】
本発明の好ましいポリペプチド短縮物をコードするポリヌクレオチドは、本発明の１個以上のドメインと異種タンパク質配列とを含む、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生成するために使用され得る。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、上記ポリヌクレオチドのいずれかの相補対を包含する。そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅したＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）であってもＲＮＡであっても良い。そのようなポリヌクレオチドを取得するための方法およびアルゴリズムは、当業者には周知であり、そしてそのような方法およびアルゴリズムとしては、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを慣用的に単離し得るハイブリダイゼーション条件を決定する方法が挙げられ得る。
【００９０】
本発明に従って、配列番号１〜３、１０〜１３および１５、またはその機能的等価物のいずれか１つに対応する成熟タンパク質コード配列を含む、ポリヌクレオチドの配列が、適切な宿主細胞におけるその核酸の発現を指向する組換えＤＮＡ分子またはその機能的等価物を生成するために使用され得る。また、本明細書中で同定されたクローンのいずれかのＤＮＡインサートも、包含される。
【００９１】
本発明によるポリヌクレオチドは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術により他の種々のヌクレオチド配列のいずれにも結合され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹを参照のこと）。ポリヌクレオチドに結合するために有用なヌクレオチド配列としては、様々なベクター（例えば、当該分野で周知である、プラスミド、コスミド、ラムダファージ誘導体、ファージミドなど）が挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一般に、そのベクターは、少なくとも１個の生物中で機能する複製起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞についての選択マーカーを含む。本発明によるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。本発明による宿主細胞は、原核生物細胞であってもまたは真核生物細胞であっても良く、そして単細胞生物であってもまたは多細胞生物の一部であってもよい。
【００９２】
本発明はさらに、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいは本発明の他のポリヌクレオチドのいずれかを有する核酸を含む、組換え構築物を提供する。１つの実施形態では、本発明の組換え構築物は、ベクター（プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含み、そのベクターの中に、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントのいずれかを有する核酸が、順方向でかまたは逆方向に挿入されている。本発明のＯＲＦの１つを含むベクターの場合、そのベクターはさらに、調節配列を含み得、この調節配列としては、例えば、そのＯＲＦに作動可能に連結されたプロモーターが挙げられる。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして本発明の組換え構築物を作製するために商業的に入手可能である。下記のベクターは例として挙げる。細菌ベクター：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓ　ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物ベクター：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００９３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、そのタンパク質を組換え生成するために、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９、４４８５〜４４９０（１９９１）において開示された発現制御配列（ｐＭＴ２発現ベクターまたはｐＥＤ発現ベクター）に作動可能に連結され得る。多数の適切な発現制御配列が当該分野で公知である。組換えタンパク質を発現する一般的方法もまた公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５、５３７〜５６６（１９９０）に例証されている。本明細書中にて定義される場合、「作動可能に連結される」とは、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび発現制御配列が、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主細胞によってそのタンパク質が発現されるように、ベクターまたは細胞の中に配列されることを意味する。
【００９４】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、または選択マーカーを含む他のベクターを使って、所望の任意の遺伝子から選択され得る。２個の適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の名前がついた細菌プロモーターとしてはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λ　ＰＲ、およびｔｒｃが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられる：ＣＭＶ極初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルスからのＬＴＲプロモーター，およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、および宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向するための、高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、ａ−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列と、そして好ましくは、翻訳されたタンパク質のペリプラズム空間もしくは細胞外媒質への分泌を指向し得るリーダー配列と、適切な位相でアセンブルされる。必要に応じて、異種配列が、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化またはその精製の単純化）を付与するアミノ末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコードし得る。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードする、構造ＤＮＡ配列を挿入することによって構築される。このベクターは、宿主中でのそのベクターの維持を確実にし、所望する場合はそのベクターの増幅を確実にするために、１個以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種が挙げられるが、他のものもまた、選択肢として使用され得る。
【００９５】
代表的だがそれに限らない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、選択マーカー、および周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ　３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌複製起点を含み得る。そのような商業的ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ　１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と結合される。適切な宿主菌株の形質転換ならびに適切な細胞密度までのその宿主株の増殖の後、選択されたプロモーターが、適切な手段（例えば、温度変更または化学的誘導）により誘導または抑制解除され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破壊され、そして生じた粗抽出物が、さらなる精製のために保持される。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、免疫応答を誘導するために使用され得る。例えば、Ｆａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８７０〜８７２（１９９９）（本明細書中に参考として援用される）に記述されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列は、裸のプラスミドＤＮＡの局所投与後またはそのＤＮＡの注射（好ましくは、筋肉内注射）後に、コードされるポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得る。その核酸配列は、好ましくは、組換え発現ベクター中に挿入され、そして裸のＤＮＡの形態であってもよい。
【００９７】
（５．３　アンチセンス）
本発明の別の局面は、配列番号１〜３、１０〜１３および１５のヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、アナログ又は誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズし得るか又は相補的な、単離されたアンチセンス核酸分子に関連する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む：例えば、二本鎖のｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的か、又はｍＲＮＡの配列に相補的である。特定の局面では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドを、又はコード鎖全体、あるいはその一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号４〜９、１４および１６〜１８のいずれかのタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体、およびアナログをコードする核酸分子、又は、配列番号１〜３、１０〜１３および１５の核酸配列に相補的なアンチセンス核酸が更に提供される。
【００９８】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子が、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域（即ち、５’および３’非翻訳領域ともいう）に隣接した５’および３’の配列をいう。
【００９９】
本明細書中に開示された核酸をコードする、コード鎖の配列（例えば、配列番号１〜３、１０〜１３および１５）を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリック、又はフーグスティーンの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個のヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成又は当該分野で公知の手順を使って酵素学的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくは、アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを使って化学合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。
【０１００】
アンチセンス核酸を生成する為に使用され得る改変ヌクレオチドの例には、下記のものが挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使って生物学的に生成され得る（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である。以下のサブセクションでさらに記載する）。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的に、被験体に投与されるか、またはそれらが本発明のタンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズ又は結合し、それによってタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）ようにインサイチュで生成される。そのハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成するための従来のヌクレオチドの相補性、又は、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、２重ヘリックスの大きな溝（ｇｒｏｏｖｅ）内での特異的相互作用により得る。本発明によるアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は、組織部位へ直接注射することを含む。あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞を標的化するように改変し得、次いで、全身的に投与され得る。例えば、全身的に投与する場合、アンチセンス分子を、選択された細胞の表面に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変し得る（例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面のレセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる）。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に述べたベクターを使って細胞に送達される。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成する為に、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩ又はｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が望ましい。
【０１０２】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常の単位とは対照的に、鎖が互いに平行に走る（ゴーチエー（Ｇａｕｌｔｉｅｒ）ほか（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：　６６２５〜６６４１）。また、アンチセンス核酸分子は２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（井上（Ｉｎｏｕｅ）ほか（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：　６１３１〜６１４８）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（井上（Ｉｎｏｕｅ）ほか（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：　３２７〜３３０）を含み得る。
（５．４　リボザイムおよびＰＮＡの部分）
更に別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸がリボザイムである。リボザイムはリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的なＲＮＡ分子であり、これは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような１本鎖の核酸を切断し得る。従って、リボザイム（例えば、ハマーヘッド型リボザイム；（ハーゼルホフおよびゲアラック（Ｈａｓｅｋｈｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ）著（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１に記述）は、ｍＲＮＡの転写物を触媒的に切断して、それによりｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用され得る。本発明の核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示したＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る（即ち、配列番号１〜３、１０〜１３および１５）。例えば、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体を構築し得る。ここでは、活性部位のヌクレオチド配列が、本発明に従うｍＲＮＡのコード領域中の切断されるべきヌクレオチド配列に相補的である。例えば、チェック（Ｃｅｃｈ）ほか、米国特許第４，９８７，０７１号、及びチェック（Ｃｅｃｈ）ほか米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ｍＲＮＡを使って、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒的なＲＮＡを選択し得る。例えば、バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ほか（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１０３】
あるいは、調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞内の遺伝子の転写を防げる三重ヘリックス構造を形成することにより、遺伝子の発現が阻害され得る。一般的には、へレン（Ｈｅｌｅｎｅ）（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；ヘレン（Ｈｅｌｅｎｅ）ほか（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；及びメーハー（Ｍａｈｅｒ）（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１０４】
種々の実施形態では、本発明の核酸は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、又は可溶性を改善する為に、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において改変され得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するように改変され得る（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）ほか（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３）。本明細書中で使われる場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」の用語は、核酸模擬体（例えば、ＤＮＡ模擬体）をいう。ここでは、デオキシリボースリン酸骨格は、偽性ペプチド骨格に置換され、４個の天然の核酸塩基のみが保持される。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡとＲＮＡとを特異的にハイブリダイズさせることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的な固相ぺプチド合成プロトコールを使って実施され得る。このプロトコールはハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）ほか著の上記書（１９９６）；ぺリー−オキーフ（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ）ほか著（１９９６）　ＰＮＡＳ　９３：　１４６７０〜６７５に説明されてある。
【０１０５】
本発明のＰＮＡは、治療的適用および診断的適用に使用され得る。例えば、ＰＮＡは、配列特異的な遺伝子発現の調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）薬剤として使用され得、これは例えば、転写もしくは翻訳停止を誘導することか、又は複製を阻害することによる。本発明のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）による遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（ハイラップ　ビー．（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．）（１９９６）上記））と組合わせて使う場合の人工的制限酵素として；又はＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）ほか（１９９６）、前出；ぺリー−オキーフ（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ）（１９９６）、前出）使用され得る。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明のＰＮＡを改変して、例えば、親油脂性基または他のヘルパー基をＰＮＡに付加することによるか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によるか、又はリポソームもしくは当該分野で公知の他の薬物送達技術を使用することによって、その安定性または細胞性取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得るＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。その様なキメラは、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ部分と相互作用させ、同時にＰＮＡ部分は高度の結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、及び方向に関して選択された適切な長さのリンカーを使って連結し得る（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ）（１９９６）前出およびフィン（Ｆｉｎｎ）ほか（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：　３３５７−６３に説明されたように実行され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイト結合化学を使用して、固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）を、ＰＮＡと、ＤＮＡの５’末端との間で使用し得る（マグ（Ｍａｇ）ほか（１９８９）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：　５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式で連結され、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（フィン（Ｆｉｎｎ）ほか（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントで合成され得る。ピーターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）ほか（１９７５）　Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ　５：　１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１０７】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドには、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）又は細胞膜（例えば、レツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ほか、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；ルメートル（Ｌｅｍａｉｔｒｅ）ほか、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０）、もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。更に、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断薬剤（例えば、クロール（Ｋｒｏｌ）ほか、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）又はインターカレート剤で（例えば、ゾン（Ｚｏｎ）、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：　５３９〜５４９を参照のこと）改変され得る。この目的ために、オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送薬剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断薬剤などに結合体化され得る。
【０１０８】
（５．５　宿主）
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクション又は感染方法を使ってその宿主細胞に導入された本発明の核酸を含み得る。本発明はなお更に、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供し、その中では、このようなポリヌクレオチドは、細胞内でのポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に対して異種の調節配列と作動可能に連結される。
【０１０９】
プロトロンビナーゼ様ＤＮＡ配列の知識は、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドの発現を許容するか、又は増加させるように細胞を改変することを可能にする。細胞は、改変（例えば、相同組換えによって）されて、天然に存在するプロトロンビナーゼ様プロモーターの全部かまたは一部を、異種のプロモーターの全部かまたは一部で置換することにより、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドの発現を増加を提供し得、その結果、細胞のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドがより高いレベルで発現される。この異種プロモーターは、プロトロンビナーゼ様コード配列に作動的に連結される様な様式で挿入される。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０８０８、及びＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５を参照のこと。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、及び多機能を有する、カルバミルリン酸シンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ及びジヒドロオロターゼをコードするＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡが異種プロモーターＤＮＡと共に挿入され得ることもまた意図する。プロトロンビナーゼ様コード配列に連結される場合には、標準的な選択方法によるマーカーＤＮＡの増幅が、細胞内でのプロトロンビナーゼ様コード配列の同時増幅を引き起こす。
【０１１０】
宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物宿主細胞でも、酵母細胞のような下等真核生物宿主細胞でもよく、又は宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞でも良い。組換え構築物を宿主細胞へ導入することは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストランに媒介性トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによってもたらされ得る。（デイビス、エル．（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．）ほか著、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明の１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、従来の方法で使用されて、単離されたフラグメントによってコードされる遺伝子産物を生成し得る（ＯＲＦの場合）か又はＥＭＦの制御下で異種タンパク質を生成する為に使用され得る。
【０１１１】
任意の宿主／ベクター系を使って、本発明の１以上のＯＲＦを発現させ得る。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：真核生物宿主、例えば：ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＳｆ９細胞、ならびに原核生物宿主、例えば：Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ。最も好ましい細胞は、通常、特定のポリペプチドもしくはタンパク質を通常発現しない細胞、又はポリペプチドもしくはタンパク質を天然の低いレベルで発現する細胞である。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳動物細胞、酵母、細菌、又は他の細胞内で発現され得る。無細胞翻訳系もまた使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使ってそのようなタンパク質を生成し得る。原核生物および真核生物の宿主に使用するために適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に記述されてあり、その開示は本明細書中で参考として援用される。
【０１１２】
種々の哺乳動物細胞の培養系もまた使用して、組換えタンパク質を発現し得る。哺乳動物の発現系の例は、グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）著、Ｃｅｌｌ、２３：１７５（１９８１）に記述された、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株を含む。適合可能なベクターを発現し得る他の細胞株は、例えば、Ｃ１２７、サルＣＯＳ細胞，チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞　ＣＶ−１細胞，他の形質転換された霊長類の細胞株、正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物、一次外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞である。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及びまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプターの部位、転写終結配列、及び　５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０のウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使って、必要な非転写遺伝子エレメントを提供し得る。細菌培養で生成された組換えポリペプチドおよびタンパク質は、通常、細胞ペレットからの最初の抽出、次に、１回以上の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、又はサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離される。必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置の完了においてタンパク質再折りたたみ工程が使用され得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製手順のために使用し得る。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、凍結−融解サイクル、音波破粋、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の簡便な方法で破壊され得る。
【０１１３】
あるいは、タンパク質を酵母または昆虫のような下等真核生物中で、又は細菌のような原核生物中で生成することが可能であり得る。潜在的に適切な酵母株には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、又は異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｒｉｕｍ、又は異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株を含む。タンパク質が酵母または細菌で作製される場合、機能的なタンパク質を得る為に、例えば、適切な部位のリン酸化、又はグリコシル化により、そこで生成されたタンパク質を改変する必要があり得る。そのような共有結合的付着は、公知の化学的又は酵素的な方法を使用して達成され得る。
【０１１４】
本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導可能な調節エレメントの制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作され得、その場合、内因性遺伝子の調節配列は相同組換えで置き換えられ得る。本明細書中で説明されたように、遺伝子標的化を使って、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離された調節配列、又は遺伝子工学方法で合成された新規な調節配列で置き換え得る。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場結合領域、負の調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、又はそれらの配列の組合せで構成され得る。あるいは、生成されたＲＮＡ又はタンパク質の構造又は安定性に影響する配列は、置換され得るか、除去され得るか、付加され得るか、さもなくば標的化により改変され得る。これらの配列には、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性エレメント、スプライス部位、タンパク質の輸送又は分泌特性を増強または改変するためのリーダー配列、あるいは、タンパク質もしくはＲＮＡ分子の機能又は安定性を変更又は改善する他の配列を含む。
【０１１５】
標的化事象は、単純に調節配列を挿入すること、遺伝子を新しい調節配列の制御下に置くこと、例えば、新しいプロモーターもしくはエンハンサー又は両方を遺伝子の上流に挿入することであり得る。あるいは、標的化事象は、単純に調節エレメントを欠失させることで、例えば、組織特異的な負の調節エレメントを欠失させることであり得る。あるいは、標的化事象は、既存のエレメントを置き換え得る；例えば、組織特異的エンハンサーは、天然に存在するエレメントよりも広いか、又は天然に存在するエレメントとは異なった細胞型特異性を有するエンハンサーで置き換えられ得る。ここでは、天然に存在する配列は欠失され、そして新しい配列が付加される。いずれの場合でも、標的化事象の同定は、標的化ＤＮＡと連続した１個以上の選択可能なマーカー遺伝子を使って容易にされ得、外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれた細胞の選択を可能にする。標的化事象の同定はまた、負の選択可能マーカーを外因性ＤＮＡに連結するように、陰性選択の特性を示す１以上のマーカー遺伝子を使用することによって容易にされ得るが、この負の選択可能マーカーが標的配列に隣接し、かつ宿主細胞ゲノム内における配列との正確な相同組換え事象が、この負の選択可能マーカーの安定な組み込みを引き起こさないように構成され得る。この目的のために有用なマーカーには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、又は細菌性キサンチン‐グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
本発明のこの局面に従って使用され得る遺伝子標的化、又は遺伝子活性化技術は、更に詳しく下記に説明されている：米国特許第５，２７２，０７１号、チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌ）；米国特許第５，５７８，４６１号、シャーウイン（Ｓｈｅｒｗｉｎ）他；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）セルデン（Ｓｅｌｄｅｎ）ほか；及び国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）スクールチ（Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ）ほか。これらの各々の内容全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１１７】
（５．６　本発明のポリペプチド）
本発明の単離されたポリペプチドとしては、下記を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない：配列番号４〜９、１４もしくは１６〜１８のいずれか１つとして示されるアミノ酸配列、又は配列番号１〜３、１０〜１３、もしくは１５のヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされたアミノ酸配列、あるいは対応する全長タンパク質又は成熟タンパク質。本発明のポリペプチドはまた、好ましくは、以下によりコードされた生物学的活性又は免疫学的な活性のあるポリペプチドを含む：（ａ）配列番号１〜３、１０〜１３、もしくは１５に示されるヌクレオチド配列のいずれか一つを有するポリヌクレオチド、又は（ｂ）配列番号４〜９、１４又は１６〜１８に示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、又は（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド。本発明はまた、配列番号４〜９、１４もしくは１６〜１８として示されるアミノ酸配列のいずれかの生物学的もしくは免疫学的に活性な改変体、又は対応する全長タンパク質もしくは成熟タンパク質；および生物学的活性を保持するそれらの「実質的に等価なもの」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、典型的には少なくとも約９５％、更に典型的には少なくとも約９８％、又は最も典型的には少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を有する）を提供する。対立遺伝子改変体によりコードされたポリペプチドは、配列番号４〜９、１４又は１６〜１８を含むポリペプチドと比較して、類似した活性か、より高い活性か、又はより低い活性を有し得る。
【０１１８】
生物学的活性を示し得る本発明のタンパク質のフラグメントもまた、本発明によって包含される。タンパク質のフラグメントは、直鎖形態であり得るか又は、公知の方法を使って環化され得る。例えば、これらの方法としては、エイチ．ユー．サラゴヴィ（Ｈ．Ｕ．Ｓａｒａｇｏｖｉ）ほか著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０、７７３−７７８（１９９２）およびアール．エス．マクドウエル（Ｒ．Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌ）ほか著、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、９２４５−９２５３（１９９２）、に記述されてあり、この両方が本明細書中で参考として援用される。そのようなフラグメントは、タンパク質の結合部位の価数の増加を含む多くの目的のために免疫グロブリンのようなキャリア分子に融合され得る。
【０１１９】
本発明はまた、開示されたタンパク質の全長形態および成熟形態（例えば、シグナル配列も前駆配列も伴わない）の両方を提供する。このタンパク質コード配列は、開示されたヌクレオチド配列の翻訳によって、配列表において同定される。そのようなタンパク質の成熟形態は、適切な哺乳動物細胞、又は他の宿主細胞における全長のポリヌクレオチドの発現により獲得され得る。成熟形態のタンパク質の配列はまた、全長形態のアミノ酸配列から決定可能である。本発明のタンパク質が膜に結合している場合、可溶性形態のタンパク質もまた提供される。そのような形態では、タンパク質を膜に結合させる領域の一部又は全部を欠失させ、それによりタンパク質が、その発現される細胞から完全に分泌される。
【０１２０】
本発明のタンパク質組成物は、受容可能なキャリア（例えば、親水性（例えば、薬学的に受容可能な）キャリア）をさらに含み得る。
【０１２１】
本発明はさらに、本発明の核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重改変体によってコードされる、単離されたポリペプチドを提供する。 「縮重改変体」によって、本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とヌクレオチドフラグメントで異なるが、遺伝コードの縮重性に起因して同一のポリペプチド配列をコードする、ヌクレオチドフラグメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメントは、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【０１２２】
当該分野で公知の種々の方法を利用して、本発明の任意の単離されたポリペプチドまたはタンパク質を取得し得る。最も単純なレベルでは、このアミノ酸配列は、市販のペプチド合成機を使用して合成され得る。これらの合成的に構築したタンパク質配列は、一次、二次または三次構造上の特性および／あるいはコンフォーメーション特性をタンパク質と共有するので、タンパク質と共通する生物学的特性（タンパク質活性を含む）を保持し得る。この技術は、大きいポリペプチドの小さいペプチドおよびフラグメントの生成に特に有用である。フラグメントは、例えば、ネイティブポリペプチドに対する抗体の生成において有用である。従って、これらは、治療化合物のスクリーニングおよび抗体開発のための免疫学的プロセスにおける、天然の精製されたタンパク質に対する生物学的に活性な代替物または免疫学的代替物として使用され得る。
【０１２３】
あるいは、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更された細胞から精製され得る。本明細書中で使用される場合、細胞に、遺伝子操作を介して、その細胞が通常には産生しないかまたはその細胞が通常にはより低いレベルで産生するポリペプチドまたはタンパク質を産生させる場合に、この細胞は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更されていると言われる。当業者は、真核生物細胞または原核生物細胞内へ組換え配列または合成配列のいずれかを導入および発現させるための手順を容易に適応し、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを産生する細胞を産生し得る。
【０１２４】
本発明はまた、ポリペプチドを産生するための方法に関し、この方法は、本発明の宿主細胞の培養物を適切な培養培地中で増殖させる工程、およびその細胞またはその細胞を増殖させる培養物からタンパク質を精製する工程を包含する。例えば、本発明の方法は、ポリペプチドを産生するためのプロセスを包含し、ここで、本発明のポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを含む宿主細胞を、そのコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する。このポリペプチドは、培養物（都合よくは、培養培地）からか、または宿主細胞から調製しそしてさらに精製した溶解物から、回収され得る。好ましい実施形態としては、このようなプロセスによって産生されたタンパク質が、そのタンパク質の全長形態または成熟形態である実施形態が挙げられる。
【０１２５】
代替的方法において、このポリペプチドまたはタンパク質は、このポリペプチドまたはタンパク質を天然で産生する細菌細胞から精製される。当業者は、ポリペプチドおよびタンパク質を単離するための公知の方法に容易に従って、本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質を取得し得る。これらには、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。生物学的／免疫学的活性を保持するポリペプチドフラグメントとしては、約１００アミノ酸以上または約２００アミノ酸以上を含むフラグメント、および特定のタンパク質ドメインをコードするフラグメントが挙げられる。
【０１２６】
精製されたポリペプチドを、当該分野で周知のインビトロ結合アッセイにおいて使用し、そのポリペプチドに結合する分子を同定し得る。これらの分子としては、例えば、小分子、コンビナトリアルライブラリー由来の分子、抗体または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、この結合アッセイにおいて同定された分子を、当該分野で周知のインビボ組織培養物または動物モデルにおいて、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性について試験する。手短には、これらの分子を、複数の細胞培養物または動物において力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）し、次いで、細胞／動物の死またはその細胞／動物の延長された生存性のいずれかについて試験する。
【０１２７】
さらに、本発明のペプチドまたはこれらのペプチドに結合し得る分子は、毒素（例えば、リシンまたはコレラ）と複合体化され得るかまたは細胞に対して毒性である他の化合物と複合体化され得る。次いで、この毒素−結合分子複合体を、配列番号４〜９、１４または１６〜１８に対する結合分子の特異性によって、腫瘍または他の細胞に標的化する。
【０１２８】
本発明のタンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物（例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳汁の成分）として発現され得、これらのトランスジェニック動物は、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる。
【０１２９】
本明細書中に提供されるタンパク質にはまた、精製されたタンパク質のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列によって特徴付けられるが、その中に改変が天然において提供されるかまたは人為的に操作されているタンパク質が含まれる。例えば、改変（ペプチドまたはＤＮＡ配列における）は、公知の技術を使用して当業者に作製され得る。このタンパク質配列における目的の改変としては、そのコード配列の選択されたアミノ酸残基の変更、置換、交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入または欠失が含まれ得る。例えば、１以上のシステイン残基が、欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され、この分子のコンフォメーションを変更し得る。変更、置換、交換、挿入または欠失についての技術は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照のこと）。好ましくは、このような変更、置換、交換、挿入または欠失は、そのタンパク質の所望の活性を保持する。そのタンパク質機能に重要なタンパク質の領域は、当該分野で公知の種々の方法によって決定され得る。これらの方法としては、アラニンスキャニング方法が挙げられ、これは、アラニンでの単一のアミノ酸またはアミノ酸列の系統的置換を含み、その後、その得られたアラニン含有改変体を生物学的活性について試験する。この型の分析は、生物学的活性におけるその置換されたアミノ酸の重要性を決定する。タンパク質機能に重要なタンパク質の領域は、ｅＭＡＴＲＩＸプログラムによって決定され得る。
【０１３０】
全体または部分的にタンパク質活性を保持することが予測され、そしてスクリーニング方法または他の免疫学的方法に有用な、タンパク質配列の他のフラグメントおよび誘導体もまた、本明細書中の開示を考慮して当業者によって容易に作製され得る。このような改変は、本発明に含まれる。
【０１３１】
このタンパク質は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを１以上の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に作動可能に連結し、そして昆虫発現系を使用することによって産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｔＴＭキット）からキット形態で市販されており、そしてこのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る昆虫細胞は、「形質転換」されている。
【０１３２】
本発明のタンパク質は、形質転換された宿主細胞を、組換えタンパク質を発現するのに適切な培養条件下で培養することによって調製され得る。次いで、その得られた発現タンパク質を、公知の精製プロセス（例えば、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー）を使用して、このような培養物（すなわち、培養培地または細胞抽出物）から精製し得る。このタンパク質の精製はとしては、このタンパク質に結合する薬剤を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡアガロース、ヘパリン−トーヨーパールＴＭまたはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭのようなアフィニティー樹脂上での１回以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１回以上の工程；または免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられる。
【０１３３】
あるいは、本発明のタンパク質は、精製を容易にする形態で発現され得る。例えば、本発明のタンパク質は、融合タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合タンパク質）としてかまたはＨｉｓタグとして発現され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。このタンパク質はまた、エピトープでタグ化され、そしてその後、このようなエピトープに対する特異的抗体を使用して精製され得る。１つのこのようなエピトープ（「ＦＬＡＧ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．）から市販されている。
【０１３４】
最後に、１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程（疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシルカゲル）を使用する）が、このタンパク質をさらに精製するために使用され得る。種々の組み合わせにおいて、前述の精製工程のいくつかまたは全てを使用して、実質的に均質な単離された組換えタンパク質を提供する。このように精製されたタンパク質は、実質的に他の哺乳動物タンパク質を含まず、そして本発明に従って「単離されたタンパク質」として定義される。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、アナログ（改変体）を含む。本発明のポリペプチドは、プロトロンビナーゼ様アナログを含む。これは、本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドのフラグメント、ならびに欠失、挿入または置換された１以上のアミノ酸を含むプロトロンビナーゼ様ポリペプチドを包含する。本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドのアナログは、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドの融合体またはプロトロンビナーゼ様ポリペプチドの改変体を含み、ここで、このプロトロンビナーゼ様ポリペプチドまたはアナログは、別の部分（単数または複数）（例えば、標的化部分または別の治療的部分）に融合される。このようなアナログは、改善された特性（例えば、活性および／または安定性）を示し得る。プロトロンビナーゼ様ポリペプチドまたはアナログに融合され得る部分の例としては、例えば、ニューロンへのポリペプチドの送達を提供する標的化部分（例えば、中枢神経系に対する抗体、または神経細胞上に発現されるレセプターおよびリガンドに対する抗体）が挙げられる。プロトロンビナーゼ様ポリに融合され得る他の部分としては、処置に使用される治療的薬剤（例えば、抗うつ剤または神経学的障害用の他の医薬）が挙げられる。また、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドは、ニューロン増殖モジュレーター、および標的化された送達のための他のケモカインに融合され得る。
【０１３６】
（５．６．１　ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの同一性および類似性の決定）
好ましい同一性および／または類似性は、試験した配列間の最も大きい一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、以下を含むが、これらに限定されない、コンピュータープログラム中に体系化される：ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰを含む）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２（１）：３８７　（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０　（１９９０））、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．ｖｏｌ．２５、ｐｐ．３３８９−３４０２（本明細書中に参考として援用される））、ｅＭａｔｒｉｘソフトウェア（Ｗｕら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．６、ｐｐ．２１９−２３５（１９９９）（本明細書中に参考として援用される））、ｅＭｏｔｉｆソフトウェア（Ｎｅｖｉｌｌ−Ｍａｎｎｉｎｇら、ＩＳＭＢ−９７、ｖｏｌ４、ｐｐ．２０２−２０９（本明細書中に参考として援用される））およびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性予測アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１５７、ｐｐ．１０５−３１（１９８２）（本明細書中に参考として援用される））。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら．ＮＣＢ　ＮＬＭ　ＮＩＨ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ　２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手可能である。
【０１３７】
（５．７　キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、別のポリペプチドに作動可能に連結された、本発明のポリペプチドを含む。融合タンパク質内で、本発明のポリペプチドは、本発明のタンパク質の全てまたは一部に対応する。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明のタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明のタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」とは、本発明のポリペプチドおよび他のポリペプチドが互いにインフレームで融合されていることを示すことが意図される。このポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端あるいは中間において融合され得る。
【０１３８】
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結された、本発明のポリペプチドを含む。
【０１３９】
別の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質であり、ここで、本発明のポリペプチド配列は、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。
【０１４０】
別の実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、本発明のポリペプチド配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合される、１以上のドメインを含む。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に含まれ得、そして被験体に投与され、リガンドと細胞の表面上の本発明のタンパク質との間の相互作用を阻害し、これによって、インビボでのシグナル伝達を抑制し得る。免疫グロブリン融合タンパク質は、同族のリガンドのバイオアベイラビリティに影響を及ぼすために使用され得る。リガンド／タンパク質相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の処置（例えば、癌）ならびに細胞生存の調節の両方について治療的に有用であり得る。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、レセプターに結合しそして二量体化し、これによって細胞内シグナルを伝達するために使用され得る。免疫グロブリン融合タンパク質はまた、被験体において抗体を産生するための免疫原として、リガンドを精製するために、そしてリガンドとの本発明のポリペプチドの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、使用され得る。
【０１４１】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または突出末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、付着末端の適切な充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態において、この融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して行われ得、その後、これら２つのフラグメントは、アニールされそして再増幅され、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが、市販されており。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、その融合部分が、本発明のタンパク質にインフレームで連結されるように、クローニングされ得る。
【０１４２】
（５．８　遺伝子治療）
本発明の遺伝子のポリヌクレオチドにおける変異は、そのコードされるタンパク質の正常な機能の損失を生じる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドの正常な活性を回復するため；または本発明のポリペプチドに関連する疾患状態を処置するための、遺伝子治療を提供する。適切な細胞への本発明のポリペプチドをコードする機能的な遺伝子の送達は、ベクター、そしてより詳細にはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用によって、エキソビボ、インサイチュまたはインビボでもたらされるか、または物理的なＤＮＡ移入法（例えば、リポソームまたは化学的処理）の使用によってエキソビボでもたらされる。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３９２に対する補遺、ｎｏ．６６７９，ｐｐ．２５−２０（１９９８）；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０（１９９２）を参照のこと。本発明のヌクレオチドの任意の１つまたは本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の導入はまた、染色体外基質（一過的発現）または人工染色体（安定な発現）を用いて達成され得る。細胞はまた、このような細胞を増殖するため、あるいはこのような細胞に対する所望の効果またはこのような細胞における所望の活性を生じるために、本発明のタンパク質の存在下で、エキソビボで培養され得る。次いで、処理された細胞を、治療目的のためにインビボで導入し得る。あるいは、他のヒト疾患状態において、本発明のポリペプチドの発現を妨げることかまたは本発明のポリペプチドの活性を阻害することが、これらの疾患状態の処置において有用であることが意図される。アンチセンス治療または遺伝子治療を適用し、本発明のポリペプチドの発現をネガティブに調節し得ることが意図される。
【０１４３】
タンパク質の発現を阻害する他の方法としては、当該分野で公知の方法による、本発明の核酸、それらの相補体またはそれらの翻訳されるＲＮＡに対するアンチセンス分子の導入が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、標的化欠失方法、または組織特異的なネガティブ調節エレメント（例えば、サイレンサー）の挿入によって、阻害され得る。
【０１４４】
本発明はなおさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するようにインビボで遺伝子操作された細胞を提供し、ここで、このようなポリヌクレオチドは、この宿主細胞においてこのポリヌクレオチドの発現を駆動するこの宿主細胞に対して異種の調節配列に、作動可能に連結されている。これらの方法は、本発明のポリヌクレオチドの発現を増加または減少するために使用され得る。
【０１４５】
本発明によって提供されるＤＮＡ配列の知識は、内因性ポリペプチドの発現を可能にするか、増加するかまたは減少するように細胞を改変することを可能にする。細胞は、天然に存在するプロモーターの全体または一部を異種プロモーターの全体または一部で置換することによって、ポリペプチド発現の増加を提供するように改変（例えば、相同組換えによって）改変され得、その結果、これらの細胞は、このタンパク質をより高いレベルで発現する。異種プロモーターは、それが、所望のタンパク質コード配列に作動可能に連結されている様式で挿入される。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０８０８、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５を参照のこと。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、および多機能ＣＡＤ遺伝子（これは、カルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをコードする））および／またはイントロンＤＮＡを、その異種プロモーターＤＮＡと共に挿入され得ることもまた意図される。所望のタンパク質コード配列に連結される場合、標準的な選択方法によってマーカーＤＮＡの増幅が、これらの細胞における所望のタンパク質コード配列の同時増幅を生じる。
【０１４６】
本発明の別の実施形態において、細胞および組織は、誘導性の調節エレメントの制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように改変され得、この場合、この内因性遺伝子の調節配列は、相同組換えによって置換され得る。本明細書中に記載されるように、遺伝子標的化を使用して、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離された調節配列または遺伝子工学方法によって合成された新規調節配列と置換し得る。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場付着領域、ネガティブ調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位または上記配列の組み合わせから構成され得る。あるいは、産生されるＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響する配列を、置換するか、除去するか、付加するか、または標的化によって改変し得る。これらの配列としては、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性エレメント、スプライシング部位、タンパク質の輸送または分泌特性を増強または改変するためのリーダー配列、あるいはタンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変更または改善する他の配列が挙げられる。
【０１４７】
標的化事象は、調節配列の単純な挿入であり得、これは、その遺伝子を、新規調節配列の制御下に配置する（例えば、遺伝子の上流への新規プロモーターまたはエンハンサーあるいは両方の挿入）。あるいは、標的化事象は、調節エレメント（例えば、組織特異的ネガティブ調節エレメントの欠失）の単純な欠失であり得る。あるいは、標的化事象は、既存のエレメントを置換し得；例えば、組織特異的エンハンサーが、天然に存在するエレメントよりも広いかまたは異なる細胞型特異性を有するエンハンサーによって置換され得る。ここで、この天然に存在する配列は、欠失され、そして新規配列が付加される。全ての場合において、標的化事象の同定は、その標的化ＤＮＡと連続する１以上の選択マーカー遺伝子の使用によって容易にされ得、これらは、その外因性ＤＮＡがその細胞ゲノムに組み込まれた細胞の選択を可能にする。標的化事象の同定はまた、ネガティブ選択の特性を示す１以上のマーカー遺伝子の使用（そのネガティブ選択マーカーが、外因性ＤＮＡに連結されているが、そのネガティブ選択マーカーが標的化配列に隣接するように構成され、その結果、宿主細胞ゲノムにおける配列との正確な相同組換え事象が、そのネガティブ選択マーカーの安定な組み込みを生じないように）によって容易にされ得る。この目的のための有用なマーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１４８】
本発明のこの局面に従って使用され得る遺伝子標的化技術または遺伝子活性化技術は、Ｃｈａｐｐｅｌに対する米国特許第５，２７２，０７１号；Ｓｈｅｒｗｉｎに対する米国特許第５，５７８，４６１号；Ｓｅｌｄｅｎらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）；およびＳｋｏｕｌｔｃｈｉらによる国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に詳細に記載される。
【０１４９】
（５．９　トランスジェニック動物）
本発明のポリペプチドのインビボでの生物学的機能を決める好ましい方法では、相同組換えを使っている動物の生殖細胞系で、本発明が提供する１個以上の遺伝子は過剰発現されているか、または不活性化されている［カペッキ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２（１９８９）］。外因性または内因性プロモーターエレメントの調節制御の下で遺伝子が超過発現されている動物は、トランスジェニック動物として公知である。相同組換えによって活性停止となっている内生の遺伝子をもつ動物は“ノックアウト”動物と称される。ノックアウト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、については本明細書中に参考として援用される米国特許Ｎｏ．５，５５７，０３２に記載のとおり、調製できる。トランスジェニック動物は、生物学的なプロセスで、そして好ましくは疾患状態で、本発明のポリペプチドが演じる役割を決めるのに役立つ。トランスジェニック動物は、脂質の代謝を調節する化合物を識別するモデル系として有用である。トランスジェニック動物は、好ましくは非ヒト哺乳動物で、本明細書中に参考として援用される米国特許Ｎｏ．５，４８９，７４３とＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を使って生成される。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターの全部か一部が活性化か不活性化されて、本発明のポリヌクレオチドの発現のレベルが変更された、トランスジェニック動物が調製できる。不活性化は、上記の相同組換え方法を使って実行できる。活性化は、タンパク質発現を増加するために、同族性のプロモーターを補充するか、または取替えてでも達成できる。同族性のプロモーターは、特定の組織にプロモーター活性化を与えることが公知である１個以上の異種エンハンサーエレメントを挿入して補充できる。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドは又、例えば相同組換えまたはノックアウトストラテジーを使って、機能的プロトロンビナーゼ様ポリペプチドを発現しない、またはプロトロンビナーゼ様ポリペプチドの改変体を発現する動物を開発することを可能にする。そのような動物は、プロトロンビナーゼ様ポリペプチドのインビボの活性とプロトロンビナーゼ様ポリペプチドのモジュレーターを研究するモデルとして役に立つ。
【０１５２】
本発明のポリペプチドのインビボでの生物学的機能を決める好ましい方法では、相同組換えを使って動物の生殖細胞系で、本発明が提供する１個以上の遺伝子は超過発現されているか、または活性停止となっている［カペッキ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２（１９８９）］。外生または内生プロモーターエレメントの規制管理の下で遺伝子が超過発現されている動物は、トランスジェニック動物として公知である。相同組換えによって活性停止となっている内生の遺伝子をもつ動物は”ノックアウト”動物と称される。ノックアウト動物、好ましくは非ヒト哺乳動物は、本明細書中に参考として援用される米国特許Ｎｏ．５，５５７，０３２に記載のとおり、調製できる。トランスジェニック動物は、生物学的なプロセスで、そして望ましくは疾患の段階で、本発明のポリペプチドが演じる役割を決めるのに役立つ。トランスジェニック動物は、脂質の代謝を調節する化合物を識別するモデルシステムとして有用である。トランスジェニック動物は、望ましくはヒト以外の哺乳類で、ここに参考として含まれた米国特許Ｎｏ．５，４８９，７４３とＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載された方法を使って生成できる。
【０１５３】
本発明のプロモーターのポリヌクレオチドの全部か一部が活性化か非活性化されて、本発明のポリペプチドの発現のレベルが変更されたトランスジェニック動物が、調製できる。不活性化は、上記の相同組換え方法を使って実行できる。活性化は、タンパク質発現を増加するために、同族性のプロモーターを補充するか、または取替えてでも達成できる。同族性のプロモーターは、特定の組織にプロモーター活性を与えるとされる１個以上の異族性のエンハンサーエレメントを挿入して補充できる。
【０１５４】
（５．１０，プロトロンビナーゼ様ポリペプチドの用途と生物学的活性）
本発明のポリヌクレオチドとタンパク質は、ここに特定された１個以上の用途または生物学的活性（ここに挙げたアッセイに関連するものを含む）を示すことが期待される。本発明のタンパク質について説明された用途または活性は、そのタンパク質またはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与または使用によって提示され得る（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡの導入に適したベクター）。特殊な状態または病理学における機構が、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたはそのモジュレーター（アクティベーターまたはインヒビター）は治療を必要とする被験体に効果があるかどうかを決める。従って、“本発明の治療組成物”は、以下を含む組成物を含む：単離されたポリヌクレオチド（組換えＤＮＡ分子、クローンされた遺伝子とその変性改変体を含む）、または本発明のポリペプチド（全長タンパク質、成熟タンパク質および短縮物またはそのドメインを含む）、または化合物と他の物質で、標的遺伝子／タンパク質発現または標的タンパク質の活性のレベルでの、標的遺伝子産物の全体的活性を調整するもの。そのようなモジュレーターとしては、以下が挙げられる：フラグメントと融合タンパク質、抗体そして他の結合タンパク質を含む、ポリペプチド、アナログ、（改変体）；本発明のポリペプチドを直接または間接に活性化または抑制する（本明細書中で述べられたように、薬物スクリーニングアッセイで同定された）化合物；三重螺旋の形成に適するアンチセンスポリヌクレオチドとポリヌクレオチド；そして特に、本発明のポリペプチドの１個以上のエピトープを特異的に認識する抗体または他の結合パートナー。
【０１５５】
本発明のポリペプチドは、同様に細胞の活性化に関係し得るか、または本明細書中に述べられた、その他の生理学的な経路の１つに関連し得る。
【０１５６】
（５．１０．１　調査用途と実用性）
本発明が提供するポリヌクレオチドは調査研究社会で色々な目的に使用できる。そのポリヌクレオチドは以下の様に使用できる：分析、特徴付けまたは治療の用途に組換えタンパク質を発現するために；対応するタンパク質が優先的に発現される組織のマーカーとして（構成的に、または組織分化、発達もしくは疾患状態の特定の段階で）；ゲル上の分子量マーカーとして；染色体識別、または関連した遺伝子位置のマッピングのための染色体のマーカー、またはのタグとして（標識される場合）；潜在的な遺伝子障害を特定するために、患者の内因性ＤＮＡ配列と比較するために；ハイブリダイズのプローブとして、従って新規性のある、関連したＤＮＡ配列を発見するために；遺伝子のフィンガープリンティングのためにＰＣＲプライマーを誘導する情報源として；他の新規のポリヌクレオチドを見つける過程で、既知の配列を“除外”するプローブとして；”遺伝子チップ”または発現パターンの検査などのその他の支持体に添付するためのオリゴマーを選択および作製するため；ＤＮＡ免疫技術を使って、抗タンパク質抗体を惹起すること；そして、抗ＤＮＡ抗体を惹起するか、または他の免疫反応を惹起する抗原として。ポリヌクレオチドが、他のタンパク質を結合するか、または潜在的に結合する、タンパク質をコードする場合（例えば、レセプターとリガンドの相互作用において）、ポリヌクレオチドはまた相互作用トラップアッセイにおいて（例えばギュリスほか、細胞　７５：７９１−８０３（１９９３）で記述されたもの）、結合が起こる他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するために、または結合の相互作用のインヒビターを同定するために使用する。
【０１５７】
本発明が提供するポリペプチドは、同様に生物学的活性を決定するために、下記のようにアッセイで使用できる：高スループットスクリーニングのための複数のタンパク質のパネルで；抗体を惹起するため、または他の免疫反応を惹起するため；生物学的液体におけるタンパク質（またはそのレセプター）のレベルを定量的に決定するよう設計されたアッセイでの試薬（標識された試薬を含む）として；対応するポリペプチドが優先的に発現される組織のマーカーとして（構成的に、あるいは組織分化もしくは発達または疾患状態の特定の段階で）；そして勿論、相関したレセプターまたはリガンドを単離するため。これらの結合の相互作用に係わるタンパク質は、ペプチド、または結合相互作用の低分子インヒビターもしくはアゴニストのスクリーニングにも使用され得る。
【０１５８】
本発明のポリペプチドはまた、プロトロンビナーゼ様タンパク質と特異的に免疫反応する抗体物質を作るのに役立つ。本発明のポリペプチドに結合する抗体とその部分（例えば、Ｆａｂフラグメント）は、試料の中にその様なポリペプチドが存在することの確認に使用できる。その決定は、任意の適切な免疫アッセイ形式を使って行われ、この抗体に特異的に結合された任意の本発明のポリペプチドはポジティブコントロールとして使える。
【０１５９】
これらの調査用途のいずれかまたは全てが、試薬の品質にまたはキット形態にして商品化のために調査用製品として開発可能である。
【０１６０】
上記に示した用途を実行する方法は当業者には周知である。その様な方法を開示した参考資料は、以下のものを制限なく含む：”分子のクローニング：研究所マニュアル”、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、サムブルック，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．フリッチとＴ．マニアティス編、１９８９、および“酵素学方法論：分子クローニング技術への手引き”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、バーガー，Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．キンメル編、１９８７。
【０１６１】
（５．１０．２　栄養面での用途）
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは、また栄養源または補充品として使用できる。そのような用途は、制限無く、タンパク質またはアミノ酸の補充品として、炭素、窒素、炭水化物のそれぞれの供給源として使用できる。その場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特定の生物の飼料に添加できるか、あるいは粉末、錠剤、溶液、縣濁液、またはカプセルの形態のような、別個の固体または液体の調製物として投与できる。微生物の場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは微生物が培養されている培地に添加できる。
【０１６２】
さらに、本発明のポリペプチドは、分子量マーカーとして、また食料補充品として使用できる。例えば、配列番号４からなるポリペプチドは、その未処理でグリコシル化されていない状態では、約４３ｋＤＡの分子量を持つ。タンパク質の食料補充品は周知であり、本発明のポリペプチドを含む、適切な食料補充品の処方は、食料調製の技術レベルで対応できる。
【０１６３】
（５．１０．３　サイトカインと細胞増殖／分化の活性）
本発明のポリペプチドは、サイトカイン、細胞増殖（誘発または抑制のどちらか）、または細胞分化（誘発または抑制のどちらか）の活性を示し得るか、あるいは細胞集団における他のサイトカインの生成を誘発し得る。本発明のポリヌクレオチドはそのような特質を示すポリペプチドをコードすることができる。全ての公知のサイトカインを含む、これまで発見された多くのタンパク質因子は１回以上の因子依存の細胞増殖アッセイで活性を示した。従って、アッセイはサイトカイン活性の便利な確認方法として役立つ。本発明の治療的組成物の活性は、細胞株に対する多数の慣用的な因子に依存する細胞増殖のアッセイのいずれかによって立証され、これらの細胞株としては、制限無く、以下が挙げられる：３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ　Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、ＣＭＫ、ＨＵＶＥＣ、およびＣａｃｏ．本発明の治療的組成物は下記に使用できる：
Ｔ−細胞または胸腺細胞増殖のアッセイは、下記に述べられたものを制限無く含む：免疫学における現在のプロトコール、編集　Ｊ．Ｅ．コリガン、Ａ．Ｍ．クルイスビーク、Ｄ．Ｈ．マーグリース、Ｅ．Ｍ．シェバック、Ｗ．ストローバー、出版．Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（第３章、ネズミのリンパ球機能のインビトロアッセイ３．１〜３．１９；第７章、ヒトにおける免疫学の研究）；高井ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；バータニオリほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６−１７１２、１９９０；バータニオリほか、細胞免疫学１３３：３２７−３４１、１９９１；バータニオリほか、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３、１９９２；ボウマンほか、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６−１７６１、１９９４．
サイトカイン生成および／または膵臓細胞、リンパ節細胞、もしくは胸腺細胞の増殖のアッセイは下記に述べられたものを制限なく含む：ポリクローナルＴ細胞の刺激、クルイスビーク、Ａ．Ｍ．およびシェバック、Ｅ．Ｍ．免疫学における現在のプロトコール．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．コリガン編集．第１巻ｐｐ．３．１２．１〜３．１２．１４、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４；および、ネズミとヒトのインターロイキン−γの測定、シュライバー、Ｒ．Ｄ．免疫学における現在のプロトコール．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．コリガン編集、Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．８．１−６．８．８、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４。
【０１６４】
造血およびリンパ球産生性細胞の増殖と分化のアッセイは、下記に述べられたものを制限無く含む：「ヒトとネズミ類のインターロイキン２およびインターロイキン４の測定」、ボトムリ、Ｋ．、デイビス、Ｌ．Ｓ．およびリプスキーＰ．Ｅ．；「免疫学における現在のプロトコール」Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．コリガンｅｄｓ．Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．３．１−６．３．１２、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；デフリースほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１、１９９１；モローほか、自然　３３６：６９０−６９２、１９８８；グリーンバーガーほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１−２９３８、１９８３；ネズミとヒトのインターロイキン６の測定−ノーダン、Ｒ．免疫学における現在のプロトコール．Ｊ．Ｅ．コリガン編．Ｖｏｌ　１　ｐｐ．６．６．１−６．６．５、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；スミスほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７−１８６１、１９８６；ヒトのインターロイキン１１の測定−ベネット、Ｆ．、ジアノッティ、Ｊ．、クラーク、Ｓ．Ｃ．およびターナー、Ｋ．Ｊ．免疫学における現在のプロトコール．Ｊ．Ｅ．コリガン編集．第１巻ｐｐ．６．１５．１　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；ネズミとヒトのインターロイキン９の測定−シアレッタＡ．、ジアノッティ、Ｊ．、クラーク、Ｓ．Ｃ．およびターナー、Ｋ．Ｊ．免疫学における現在のプロトコール．Ｊ．Ｅ．コリガンｅｄｓ．第１巻　ｐｐ−６．１３．１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１。
【０１６５】
Ｔ−細胞クローンの抗体への応答のアッセイ（これは、とりわけ、ＡＰＣ−Ｔ細胞の相互作用と直接なＴ細胞効果に影響するタンパク質を、増殖とサイトカイン生成を測定することによって識別する）は下記に述べられたものを制限無く含む：免疫学における現在のプロトコール、編集：Ｊ．Ｅ．コリガン、Ａ．Ｍ．クルイスビ−ク、Ｄ．Ｈ．マーグリース、Ｅ．Ｍ．シェバック、Ｗ．ストローバー、出版社Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、ネズミのリンパ球機能のインビトロアッセイ；第６章、サイトカインとそれらの細胞レセプター；第７章、ヒトにおける免疫学の研究）；ワインバーガーほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：６０９１−６０９５、１９８０；ワインバーガーほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５−４１１、１９８１；高井ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；高井ほか、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２、１９８８。
【０１６６】
（５．１０．４　幹細胞増殖因子の活性）
本発明のポリペプチドは、幹細胞増殖因子活性を示し得、原始の生殖細胞、胚幹細胞、造血幹細胞および／または生殖株の幹細胞を含む多能性および全能な幹細胞の増殖、分化と生存に関与しているかもしれない。本発明のポリペプチドをインビボまたはエキソビボの幹細胞に投与すると、全能または多能性な状態で細胞集団を維持しそして拡大するかもしれない。それは、損傷した、または病気にかかった組織の再構築、移植、生物学的薬剤の製造、バイオセンサーの開発に役立つ。大量のヒト細胞を製造する能力は、ヒトタンパク質の生成に重要な実際用途を持ち、パーキンソン病、アルツハイマー病、その他の神経変性疾患を治療するために、現在それは非ヒト供給源、またはドナー、細胞移植物；移植用の組織、例えば骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、網膜、神経細胞、胃腸の細胞など；そして移植用の器官、例えば、腎臓、肝臓、膵臓（島細胞を含む）、心臓および肺から取得されねばならない。
【０１６７】
望ましい効果を達成するために、複数の異なった外因性の増殖因子および／またはサイトカインを本発明のポリペプチドと共に投与し得ることを考慮しており、これらは本明細書中に記載の増殖因子のいずれか、他の幹細胞の維持因子を含み、そして特に幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、インターロイキンのいずれか、ＩＬ−６に融合された、組換え可溶性のＩＬ−６レセプター、マクロファージ炎症性タンパク質１−α（ＭＩＰ−１−α）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、血小板因子４（ＰＦ−４）、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子、そして基本的な線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む。
【０１６８】
全能幹細胞は、実際的に任意の成熟細胞型を発生させるので、培養中のこれらの細胞の拡大は、大量の成熟細胞の生産を助ける。幹細胞の培養技術は当該分野において公知であり、本発明のポリペプチドの投与（必要に応じて他の増殖因子および／またはサイトカインと共に）は、幹細胞集団の生存と増殖を高めることが期待されている。これは、本発明のポリペプチドを培養培地に直接投与することによって達成できる。代替方法としては、本発明のポリペプチドに代わってコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた支質細胞が培養物またはインビボの幹細胞集団のためのフィーダー層として使える。フィーダー層の支質支持細胞は、胚の骨髄線維芽細胞、骨髄支質細胞、胎児の肝細胞、または培養された胚の線維芽細胞を含み得る（参照：米国特許Ｎｏ．５，６９０，９２６）。
【０１６９】
幹細胞自体は、本発明のポリペプチドのオートクライン発現を誘発するために本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。これによって、分化されていない全能／多能性な幹細胞株の生成が可能となり、それらはそのまま使用可能で、またはそれから望ましい成熟細胞型に分化できる。これらの安定した細胞株はまた分化されていない全能／多能性なｍＲＮＡの源となり、ポリメラーゼ連鎖反応実験用のｃＤＮＡのライブラリやテンプレートを作製できる。これらの研究によって、幹細胞の増殖および／または維持を規制する幹細胞集団において異なって発現された遺伝子の単離と同定が可能となる。
【０１７０】
全能な幹細胞集団の拡大と維持は、多くの病理学的な症状の治療に役立つ。例えば、本発明のポリペプチドは、培養物中の幹細胞を操作するために使われ、病気、自己免疫疾患、事故による傷害、または遺伝障害によって損傷を受けた細胞を補充したり、取替えたりするために使用され得る神経上皮細胞を生じ得る。本発明のポリペプチドは、神経細胞の増殖を誘導したり、神経と脳の組織を再生したりする上で有用であり得、即ち、中枢および末梢神経の疾病やニューロパシー、ならびに神経細胞や神経組織の変性、死滅、または傷害を伴う機械的障害および外傷的障害の治療に使われる。さらに、拡大された幹細胞の集団は、遺伝子療法の目的のため、そして移植または注入の後、植え付けた組織を宿主が拒否する可能性を減らすため、遺伝学的に変更することもできる。
【０１７１】
本発明のポリペプチドの発現と幹細胞に対するその影響も操作可能で、幹細胞の管理された分化を達成してさらに分化された細胞型にすることができる。分化されていない幹細胞集団から特定の分化された細胞型の純粋な集団を取得する広範的な方法は、選択マーカーを作動する、細胞型に特異的なプロモーターを使用することを含む。この選択マーカーは、望ましい型の細胞だけを生存させる。例えば、幹細胞は心筋細胞に（ウオバスほか、分化、４８：１７３−１８２、（１９９１）；クルグほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、９８（１）：２１６−２２４、（１９９８））または骨格筋肉細胞に（ブラウダ−、Ｌ．Ｗ．組織工学理論　ｅｄｓ．ランザほか、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９７））分化するように誘発できる。代替方法としては、レチン酸のような分化因子と、内因性幹細胞因子活性の効果を抑制して分化を進めるように、本発明のポリペプチドのアンタゴニストとの存在下でその幹細胞を培養することによって、幹細胞の指向された分化を達成できる。
【０１７２】
幹細胞のインビトロ培養物を使って、本発明のポリペプチドが幹細胞の増殖因子活性を示すかどうかを判定することができる。幹細胞は様々な細胞源（造血幹細胞と胚の幹細胞を含む）のいずれかから単離され、トンプソンほかによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２：７８４４−７８４８（１９９５）で述べられているように、本発明のポリペプチド単独で、または他の増殖因子またはサイトカインとの組合せの存在下で、フィーダー層で培養される。本発明のポリペプチドの、幹細胞の増殖を誘発する能力は、例えばバーンスタイン他の“血液”７７：２３１６−２３２１（１９９１）に述べられてあるように、半固体支持体上でのコロニー形成によって決定される。
【０１７３】
（５．１０．５　造血調節活性）
本発明のポリペプチドは造血調節に関連し得、従って、骨髄またはリンパ細胞障害の治療に関連し得る。コロニー形成細胞の支持、あるいは因子依存性細胞系の支持においてわずかでも生物学的活性があることから、造血調節への関与を示し、例えば、赤血球前駆細胞単独で、または他のサイトカインと共に成長や増殖を支持し、それによって、例えば、種々の貧血治療、または赤血球前駆体および／または赤血球の産生を刺激するための照射／化学療法と併用して；例えば、結果的に生じる骨髄抑制の予防または治療のための化学療法との併用において有用な顆粒球や単球／マクロファージ（すなわち、従来のＣＳＦ活性）などのような骨髄細胞の成長および増殖の支持において；巨核球の成長と増殖、したがって、血小板の成長および増殖を支持し、それによって、血小板減少症のような様々の血小板障害に、一般に血小板輸血の代わりに、または補助として使用してその予防または治療を可能にする際、および／あるいは、上記の造血細胞のいずれか、またはすべてに対して成熟を可能にする造血幹細胞の成長および増殖を支持する際に使用するなどの利用性が示され、したがって、種々の幹細胞障害（通常、再生不良性貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症をこれらに限らず含む移植によって通常治療される疾患など）、および、インビボか、またはエキソビボ（すなわち、骨髄移植、または末梢前駆細胞移植（相同または異種）と併せて）のいずれかにおいて、照射／化学療法後の幹細胞区画を正常細胞として、または遺伝子療法用に遺伝子操作された細胞として再増殖させるなど、これらに限らず治療的利用性が示される。
【０１７４】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０１７５】
種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイは前記に引用した。
【０１７６】
胚性幹細胞分化（とりわけ、胚性分化造血に影響を及ぼすタンパク質を同定する）アッセイにはＪｏｈａｎｓｓｏｎらＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１５：１４１−１５１、１９９５；　Ｋｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３：４７３−４８６、１９９３；　ＭｃＣｌａｎａｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ　８１：２９０３−２９１５、１９９３に記載のアッセイがあり、またこれに限らない。
【０１７７】
幹細胞の生存および分化のためのアッセイ（とりわけ、リンパ−造血を調節するタンパク質を同定する）はＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ａｓｓａｙｓ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｍ．Ｇ．Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．１．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ら編、Ｖｏｌ　ｐｐ．２６５−２６８、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｈｉｒａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：５９０７−５９１１、１９９２；Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、ＭｃＮｉｅｃｅ、Ｉ．Ｋ．およびＢｒｉｄｄｅｌｌ、Ｒ．Ａ．Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ｖｏｌ　ｐｐ．２３〜３９、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｎｅｂｅｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　２２：３５３〜３５９、１９９４；Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ　ａｒｅａ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ａｓｓａｙ、Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ、Ｒ．Ｅ．Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ｖｏｌ　ｐｐ．１−２１、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ、Ｓｐｏｏｎｃｅｒ、Ｅ．、Ｄｅｘｔｅｒ、Ｍ．ａｎｄ　Ａｌｌｅｎ、Ｔ．Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｐｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．Ｒ．１．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ｖｏｌ　ｐｐ．１６３−１７９、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４；Ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ａｓｓａｙ、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｈ．Ｊ．Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ．　Ｒ．１．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ｖｏｌ　ｐｐ．１３９−１６２、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４に記載のアッセイを含み、またこれらに限らない。
【０１７８】
（５．１０．６　組織成長活性）
本発明のポリペプチドはまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織の成長あるいは再生、ならびに創傷治癒および組織修復ならびに置換および火傷、切開および潰瘍の治癒にも関与し得る。
【０１７９】
骨が正常に形成されていない場合において、軟骨または骨あるいはその両者の成長を促す本発明のポリペプチドは、人および他の動物における骨折および軟骨損傷あるいは欠損症の治癒において使用できる。本発明のポリペプチド、抗体、結合パートナーまたは他のモジュレータの組成物は、開放骨折同様皮下骨折の軽減において予防的に使用でき、また人工関節の固定をも改善する場合がある。骨形成物質によって誘発される新規の骨形成は、先天性、外傷性、または腫瘍学的切除性頭蓋顔面欠損の修復に役立つし、また美容整形外科においても有用である。
【０１８０】
本発明のポリペプチドはまた、骨形成細胞の誘引、骨形成細胞の成長刺激、骨形成細胞前駆体の分化の誘導に関与し得る。骨もしくは軟骨修復またはその両者の刺激によるか、あるいは、炎症または炎症過程により媒介される組織破壊過程（コラゲナーゼ活性化、破骨細胞活性化など）を阻止するによる、骨粗しょう症、変形性関節炎（骨関節炎）、骨変性疾患、または歯周病の治療もまた本発明の組成物の使用が可能な場合がある。
【０１８１】
本発明のポリペプチドが関与し得る組織再生活性のもう一つのカテゴリーは、腱／靭帯様組織形成である。腱／靭帯様組織または他の組織形成の誘発は、これらの組織が正常に形成されていない場合において、人および他の動物における腱あるいは靭帯の損傷、奇形および他の腱または靭帯欠損の治癒に使用できる。このような腱／靭帯様組織誘発性タンパク質を使用した製剤は、腱または靭帯の骨あるいは他の組織への固定改善や、腱または靭帯組織の欠損修復にも使用できるだけでなく、腱または靭帯組織の破損を防ぐための予防にも使用できる場合がある。本発明の組成物によって誘発されたデノボ腱／靭帯様組織形成は、先天性、外傷性、または他の原因の腱あるいは靭帯欠損の修復に寄与し、また、腱または靭帯の取付け、修復のための美容整形手術にも使用できる。本発明の組成物は腱または靭帯形成細胞の誘発、腱または靭帯形成細胞の成長刺激、腱または靭帯形成細胞前駆体の分化の誘導、あるいは、腱／靭帯細胞または組織修復に作用するようインビボに戻すエキソビボ前駆体の成長の誘発を行う環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群および他の腱または靭帯欠損症の治療にも有用である。本組成物には、また適切な基質および／または当該分野で周知のキャリアとしての隔離作用物質も含まれていることがある。
【０１８２】
本発明の組成物はまた、神経細胞の増殖と神経や脳組織の再生、すなわち、中枢および末梢神経系疾患や神経障害の治療に有用であるだけでなく、また神経細胞や神経組織の変性、死または外傷を含む機械的、外傷性障害にも有用である。さらに厳密には、末梢神経損傷、末梢神経障害および限局性神経障害などのような末梢神経系疾患、また、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイ−ドレーガー症候群などの中枢神経系疾患の治療にも使用することができる。さらに、本発明によって治療され得る状態には、脊髄障害、脳外傷のような機械的、外傷性疾患および脳卒中のような脳血管疾患が含まれる。化学療法または他の医学療法から生じる末梢神経障害はまた、本発明の組成物を用いて処置され得る。
【０１８３】
本発明の組成物はまた、プレッシャー潰瘍、血管性機能不全に関連する潰瘍、手術創傷および外傷性創傷などをこれらに限らず含む非治癒性創傷の閉合をより良く、より速く促進するのに役立つ場合がある。
【０１８４】
本発明の組成物はまた、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋肉、心筋）および血管（血管内皮を含む）組織などのような他の組織の産生または再生、あるいは、このような組織を構成する細胞の増殖の促進にも関与する。望ましい効果の一部は正常組織の再生を可能する線維性瘢痕の抑制または変調による。本発明のポリペプチドはまた、血管形成作用をも示す場合がある。
【０１８５】
本発明の組成物はまた、腸保護、または肺や肝臓線維症、種々の組織の再灌流損傷および全身性サイトカイン損傷から生じた状態の再生および処置にも有用である。
【０１８６】
本発明の組成物はまた、前駆体組織や前駆体細胞からの、前記した組織の分化を促進または阻害するために、または前記の組織の成長阻害にも有用であり得る。
【０１８７】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０１８８】
組織生成アッセイにはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．ＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載のアッセイがあり、またこれに限らない。
【０１８９】
創傷治癒活性アッセイにはＷｉｎｔｅｒ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ、ｐｐ．７１−１１２（Ｍａｉｂａｃｈ、Ｈ．Ｉ．ａｎｄ　Ｒｏｖｅｅ、Ｄ．Ｔ．、ｅｄｓ．）、Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｍｅｒｔｚ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ　７１：３８２−８４（１９７８）による改変に記載のアッセイがあり、またこれに限らない。
【０１９０】
（５．１０．７　免疫刺激または抑制活性）
本発明のポリペプチドはまた、ここに記載のアッセイによる活性をこれに限らず含む免疫刺激活性または免疫抑制活性を示し得る。本発明のポリヌクレオチドはこのような活性を示すポリペプチドをコードできる。タンパク質は、種々の免疫不全や免疫疾患（重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）など）の治療、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の成長や増殖の調節（上方、または下方）と同様、ＮＫ細胞や他の細胞集団の細胞溶解活性への作用においても有用であり得る。これらの免疫不全は細菌あるいは真菌感染によるだけでなく、遺伝的またはウイルス（例えば、ＨＩＶ）であり得るか、あるいは自己免疫疾患によって引き起こされる場合がある。さらに詳細には、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｓｐｐ（リーシュマニア属）、マラリア種による感染症およびカンジダ症などのような種々の真菌感染症を含み、ウイルス、細菌、真菌または他の感染症によって生じる感染疾患は、本発明のタンパク質を用いて治療できる場合がある。もちろん、この点で、本発明のタンパク質は、免疫系へのブーストが一般に望ましい場合に、つまり、癌の治療においてもまた有用である。
【０１９１】
本発明のタンパク質を用いて処置される自己免疫疾患には、例えば、結合組織病、多発性硬化病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リューマチ、自己免疫肺性炎症、ギラン−バレー症候群、自己免疫甲状腺炎、インシュリン依存性真性糖尿病、重症筋無力症、移植片対宿主疾患および、自己免疫炎症性眼疾患が挙げられる。このような本発明のタンパク質（または抗体を含むその拮抗物質）は、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸器系障害のようなアレルギー反応および状態（例えば、アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒液アレルギー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、蕁麻疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多型性紅疹、スティーヴンス−ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭状結膜炎、接触アレルギー）の処置にも有用である。免疫抑制が望まれる（例えば、臓器移植を含む）他の状態もまた、本発明のタンパク質（またはその拮抗物質）を用いて治療することができる場合がある。ポリペプチドまたはその拮抗物質のアレルギー反応に対する治療効果は、累積性接触増加テスト（Ｌａｓｔｂｏｍ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　１２５：５９−６６、１９９８）、皮膚突き傷テスト（Ｈｏｆｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｌｌｅｒｇｙ　５４：４４６−５４、１９９９）、モルモット皮膚感作テスト（Ｖｏｈｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｏｃｏｌ．７３：５０１−９）、およびマウス局部リンパ節試験ａｓｓａｙ（Ｋｉｍｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　５３：５６３−７９）などのインビボ動物モデルによって評価できる。
【０１９２】
本発明のタンパク質を用いる場合、また、多くの方法で免疫反応を変調することも可能である。下方調節は、すでに進行中の免疫反応を抑制するか、または阻止するやり方で行われるか、あるいは、免疫反応の誘導の防御に関与する。活性Ｔ細胞の機能はＴ細胞反応の抑制によるか、またはＴ細胞における特異的トレランス（寛容）の誘導によって、あるいはその両方によって抑制される。Ｔ細胞反応の免疫抑制は一般に活性、非抗原特異的過程であり、これはＴ細胞の抑制物質への持続的暴露を必要とする。Ｔ細胞での非反応性または無反応の誘導に関連するトレランスは、それが一般に抗原特異的であり、寛容化物質への暴露が中止された後にも持続するという点で免疫抑制と区別される。操作的には、トレランスは、寛容化物質の無い状態における特定抗原への再暴露時にＴ細胞反応が起こらないことによって示される。
【０１９３】
下方調節または１つ以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７のように）をこれに限らず含む）の防御、例えば、活性Ｔ細胞による高度レベルのリンホカイン合成の防御は、組織、皮膚および臓器移植の状態において、また、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能を阻止することは、組織移植における組織破壊を減少する結果となるはずである。一般に、組織移植において移植の拒絶反応は、Ｔ細胞がそれを異物として認識することによって開始され、その後に移植片を破壊する免疫反応が続く。本発明の治療的組成物の投与は、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカインの合成を妨げ、したがって、免疫抑制剤として作用する。さらに、同時刺激がないことによって、Ｔ細胞が無反応化（アネルギー化）されることになり、これによって、被験者におけるトレランスが誘導される場合もある。Ｂリンパ球抗原阻止試薬による長期トレランスの誘導によって、これらの阻止剤の反復投与の必要性がなくなる。被験者において十分な免疫抑制またはトレランスを得るには、Ｂリンパ球抗原の組合せの機能を阻止する必要がある場合もある。
【０１９４】
臓器移植拒絶反応またはＧＶＨＤの予防における特定の治療的組成物の効力は、ヒトにおける有効性についての予測である動物モデルを用いて評価することができる。使用できる適切なシステムの例として、ラットにおける同種心臓移植片や、マウスにおける異種間膵島細胞移植片があり、これらのどちらもが、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：７８９−７９２（１９９２）　およびＴｕｒｋａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ、８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）に述べられているようにインビボＣＴＬＡ４Ｉｇ　融合タンパク質の免疫抑制効果を検査するために使われている。さらに、ＧＶＨＤ（移植片対宿主疾患）のマウスモデル（Ｐａｕｌ　ｅｄ．、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９、ｐｐ．８４６−８４７参照）はこの疾患の進展時の本発明の治療的組成物の効果を測定するために使うことができる。
【０１９５】
抗原機能の阻止はまた、自己免疫疾患の治療に対して治療的に有用である。多くの自己免疫疾患は、自己組織に反応的なＴ細胞の不適切な活性化の結果、および、その疾患の病態に関与するサイトカインや自己抗体の産生を促進した結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防御は病状を減少するか、または除去する。Ｔ細胞の刺激を阻止する試薬の投与は、Ｔ細胞活性化の抑制、およびこの疾患の過程に関与する自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産出の防御に使うことができる。さらに、ブロッキング試薬の効力によって、この疾患からの長期的緩解につながる自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的トレランスが誘導される場合がある。自己免疫疾患の予防または緩解におけるブロッキング試薬の効力は、多くのよく特徴化された、ヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて測定できる。この例には、マウス実験的自己免疫脳炎、ＭＥＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢ　ハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫性膠原関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、マウス実験的重症筋無力症（Ｐａｕｌ　ｅｄ．、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９、ｐｐ．８４０−８５６参照）がある。
【０１９６】
免疫反応を上げる手段としての抗原機能の上方調節（例、Ｂリンパ球抗原機能）は、また治療においても有用である。免疫反応の上方調節は既存の免疫反応を亢進させる形式か、または初期の免疫反応を誘発する形式で行われる。例えば、免疫反応の亢進は、インフルエンザ、感冒、および脳炎などのような全身性ウイルス疾患を含むウイルス感染の場合に有用な場合がある。
【０１９７】
あるいは、感染した患者の抗ウイルス性免疫反応は、患者からＴ細胞を除去し、本発明のペプチドを発現するか、あるいは本発明の可溶性ペプチドの刺激性形態のものと共に、ウイルス抗原パルス化ＡＰＣで、インビトロでＴ細胞を同時刺激し、そして、インビトロ活性Ｔ細胞を患者に再び導入することによって増強されることがある。抗ウイルス免疫反応を亢進させる他の方法は、患者から感染細胞を分離し、それらに、細胞がその表面にタンパク質のすべて、または一部を発現するように、ここに記載する本発明のタンパク質をコードする核酸で形質移入し、そして、形質移入された細胞を患者に再び導入することであろう。ここで、感染細胞は同時刺激シグナルを送ることができ、それによってインビボでＴ細胞を活性化できるであろう。
【０１９８】
本発明のポリペプチドは形質移入された腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応を誘導するために必要な刺激シグナルを提供し得る。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を持たない、または、十分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現できない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩアルファ鎖タンパク質とβ２　ミクログロブリンタンパク質、あるいは、ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖タンパク質とＭＨＣクラスＩＩベータ鎖タンパク質のすべて、または一部（例えば、細胞質内ドメイン切断部分）のすべて、または一部をコードする核酸で形質移入して、それによって、細胞表面にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現させることができる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと共に、適切なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣを発現させることによって、形質移入された腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫反応が誘導される。随意に、インバリアント（不変異）鎖のようなＭＨＣ　クラス　ＩＩ結合タンパク質の発現を阻止するアンチセンス構築物をコードする遺伝子は、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡで同時形質移入して、腫瘍関連抗原の提示を促進し腫瘍特異的免疫を誘導することができる。このようにして、ヒト被験者におけるＴ細胞媒介免疫反応の誘導は、被験者における腫瘍特異的トレランスを十分克服できる。
【０１９９】
本発明のタンパク質の活性は、他にも方法はあるが、次の方法によって測定され得る。
【０２００】
適切な胸腺または脾細胞の細胞毒性アッセイには、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ　３、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｍｏｕｓｅ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　３．１〜３．１９；Ｃｈａｐｔｅｒ　７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎｓ）；Ｈｅｒｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：２４８８−２４９２、１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４、１９８２；Ｈａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２、１９８５；Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｏｗｍａｎ　ｅｔ　ａｌ，、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１：１９９２−１９９８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３０７９−３０９２、１９９４に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０１】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン反応およびアイソタイプスイッチング（Ｔ細胞依存性抗体反応を変調し、Ｔｈｌ／Ｔｈ２プロフィールに影響するタンパク質を他から同定する）のアッセイにはＭａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８−３０３３、１９９０；およびＡｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｂ　ｃｅｌｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｍｏｎｄ、Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｍ．Ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ　ｅｄｓ．Ｖｏｌ　１　ｐｐ．３．８．１〜３．８．１６、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（主にＴｈ１とＣＴＬ反応を生じるタンパク質を他から同定する）には、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ　３、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｍｏｕｓｅ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　３．１〜３．１９；Ｃｈａｐｔｅｒ　７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３、１９９２に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０３】
樹状突起細胞依存性アッセイ（未処置のＴ細胞を活性化する樹状突起細胞によって発現されるタンパク質を他から同定する）にはＧｕｅｒｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｉｍｍｏｌ．１３４：５３６−５４４、１９９５；Ｉｎａｂａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１７３：５４９−５５９、１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５４：５０７１−５０７９、１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１８２：２５５−２６０、１９９５；Ｎａｉｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６７：４０６２−４０６９、１９９３；Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６４：９６１−９６５、１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１６９：１２５５−１２６４、１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　９４：７９７−８０７、１９９４；およびＩｎａｂａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１７２：６３１−６４０、１９９０に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０４】
リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（スーパー抗原誘導後のアポトーシスを防ぐタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を他から同定する）には、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１３：７９５−８０８、１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　７：６５９−６７０、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５３：１９４５−１９５１、１９９３；Ｉｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ　６６：２３３−２４３、１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４５：４０３７−４０４５、１９９０；Ｚａｍａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１４：８９１−８９７、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１：６３９−６４８、１９９２に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０５】
Ｔ細胞コミットメントおよび発達の初期段階に影響するタンパク質のアッセイには：　Ａｎｔｉｃａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ　８４：１１１−１１７、１９９４；Ｆｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５５：１１１−１２２、１９９４；Ｇａｌｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ　８５：２７７０−２７７８、１９９５；Ｔｏｋｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：７５４８−７５５１、１９９１に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０６】
（５．１０．８　アクチビン／インヒビン活性）
本発明のポリペプチドは、またアクチビンまたはインヒビン関連活性をも示す。本発明のポリヌクリオチドはこのような特性を示すポリペプチドをコードし得る。インヒビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を抑制する能力によって特徴づけられており、一方、アクチビンは卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の遊離を刺激する能力によって特徴づけられている。このように、本発明のポリペプチドは、単独で、またはインヒビン系統群の一メンバーとのヘテロダイマー（ヘテロ二量体）として、雌哺乳動物の受精能を減少させ、雄哺乳動物の精子形成を減少させるインヒビンの機能に基づいた避妊薬として有用である。十分量の他のインヒビンを投与することによって、これらの哺乳動物における不妊を誘発できる。あるいは、本発明のポリペプチドは、ホモダイマーとして、または他のタンパク質のインヒビン群サブユニットを持つヘテロダイマーとして、脳下垂体前葉細胞からのＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）遊離の刺激におけるアクチビン分子の機能に基づいた、受精能誘発治療剤として有用である。例えば、米国特許番号．４，７９８，８８５を参照されたい。本発明のポリペプチドは、また雌牛、羊および豚に限らず、このような家畜類の生涯生殖能を増加するように、性的に未熟な哺乳動物の受精能の開始を前進させるためにも有用であり得る。
【０２０７】
本発明のポリペプチドの活性は、他にも方法はあるが、次の方法によって測定できる。
【０２０８】
アクチビン／インヒビン活性のアッセイには、Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　９１：５６２−５７２、１９７２；Ｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７９−７８２、１９８６；Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７６−７７９、１９８６；Ｍａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６５９−６６３、１９８５；Ｆｏｒａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：３０９１〜３０９５、１９８６に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２０９】
（５．１０．９　走化性／化学運動性活性）
本発明のポリペプチドは、例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞または／および内皮細胞を含む哺乳動物細胞の走化性または化学運動性活性に関与し得る。本発明のポリヌクレオチドは、そのような属性を示すポリペプチドをコードすることができる。走化性および化学運動性レセプターの活性は、作用の望ましい部位へ望ましい細胞集団を動員するか、誘引するために使うことができる。走化性／化学運動性組成物（例えば、タンパク質、抗体、結合パートナー、または発明のモジュレータ）は、局所性感染症の治療においてだけでなく、創傷や他の組織の外傷の治療においても特定の利益を与える。例えば、リンパ球、単球または好中球の、腫瘍または感染部位への誘引によって、腫瘍または感染物質に対する免疫反応が改善される場合がある。
【０２１０】
タンパク質または、ペプチドは特定の細胞集団に対して、そのような細胞集団の方向または運動を直接または間接的に刺激できる場合、走化性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは細胞の有向運動を直接刺激する機能を有する。特定のタンパク質が細胞集団に対する走化性活性を有するかどうかは、そのタンパク質またはペプチドに公知の細胞走化性アッセイを行うことによって容易に判定できる。
【０２１１】
本発明の治療的組成物は以下において用いることができる。
【０２１２】
走化性活性のアッセイ（走化性を誘導する、または防ぐタンパク質を同定する）は、蛋白質が１つの細胞集団の他の細胞集団への付着を誘導する能力だけでなく、タンパク質が膜内で細胞の遊走を誘導する能力をも検定するアッセイからなる。移動および付着の適切なアッセイにはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄ　ｂｙ　１．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ　６．１２、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｂｅｔａ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ　６．１２．１−６．１２．２８；Ｔａｕｂ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１３７０−１３７６、１９９５；Ｌｉｎｄ　ｅｔ　ａｌ．ＡＰＭＩＳ　１０３：１４０−１４６、１９９５；Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５８６０−５８６７、１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１７６２−１７６８、１９９４に記載のアッセイがあり、またこれらに限らない。
【０２１３】
（５．１０．１０　止血活性および血栓溶解活性）
本発明のポリペプチドはまた、止血、血栓溶解あるいは血栓症にも関与する場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、そのような属性を示すポリペプチドをコードできる。組成物は種々の凝固障害（血友病のような遺伝的疾患を含む）の治療において、または外傷、手術あるいは他の原因から生じた創傷の治療において凝固や他の止血を促進させるために有用である。本発明の組成物はまた、血栓の溶解または形成抑制およびそれから生じる状態（例えば、心臓や中枢神経血管の梗塞（例えば、脳卒中）のような）の治療や予防にも有用である。
【０２１４】
本発明の治療的組成物は以下において使用できる。
【０２１５】
止血や血栓溶解活性のアッセイには、Ｌｉｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１−１４０、１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ．４５：４１３−４１９、１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　５：７１−７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　３５：４６７−４７４、１９８８に記載のアッセイがあり、またこれに限らない。
【０２１６】
（５．１０．１１　癌の診断および治療）
本発明のポリペプチドは癌細胞の産生、増殖または転移に関与し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、１種以上のタイプの癌の診断および／または予知に有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または増加した発現は、癌の遺伝の危険性、前癌性状態または進行性悪性腫瘍を示し得る。逆に、遺伝子における欠損、またはこのポリペプチドの不在は、癌状態に関連し得る。また、癌または癌の素因に関連する単一ヌクレオチド多型の同定は、診断あるいは予測にも役立ち得る。
【０２１７】
癌の治療では、腫瘍細胞増殖の阻害、血管新生（腫瘍増殖の補助に必要な新血管の成長）の阻害および／または腫瘍細胞の運動性や侵襲性を減らすことによる転移の予防によって、腫瘍の退行を促進する。本発明の治療的組成物は成人および小児腫瘍において有効であり得、これには、固相腫瘍／悪性腫瘍、局所進行性腫瘍、ヒト軟部組織肉腫、転移性癌（リンパ性転移を含む）、血球悪性腫瘍（多発性骨髄腫、急性および慢性白血病、ならびにリンパ腫を含む）、頭部および頸部の癌（口癌、喉頭癌、甲状腺癌を含む）、肺癌（小細胞癌、および非小細胞癌を含む）、乳癌（小細胞癌および管性癌を含む）、消化管癌（食道癌、胃癌、大腸癌、結腸直腸および結腸直腸異常増殖に合併するポリープを含む）、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌（膀胱癌および前立腺癌を含む）、女性生殖器官の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮（子宮内膜を含む）癌、卵胞の固形腫瘍を含む）、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、脳腫瘍（内因性脳腫瘍を含む）、神経芽細胞腫、アストロサイト（星状細胞）脳腫瘍、神経膠腫、中神経系における転移腫瘍細胞侵襲を含む脳腫瘍、骨癌（骨腫を含む）、皮膚癌（悪性黒色腫（メラノーマ）、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、血管外皮細胞腫およびカポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ）肉腫を含む）が挙げられる。
【０２１８】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのモジュレータ（本発明のポリペプチドの生物活性のインヒビターおよび刺激物質を含む）は癌の治療のために投与され得る。治療的組成物は、単独に、または手術、化学療法、放射線療法、温熱療法およびレーザー療法のような癌の補助的療法と併せて治療的有効用量で投与することができ、有利な効果（例えば、腫瘍のサイズを減少させる効果、腫瘍の成長速度を低下させる効果、転移を阻害する効果、または他に、全体的な臨床状態を改善する効果）を、癌を必ずしも根絶させないで提供し得る。
【０２１９】
本組成物はまた、抗癌カクテルの一部として治療的有効量を投与することができる。抗癌カクテルは、本発明のポリペプチドまたはモジュレータと薬学的に受容可能な送達用キャリアに一種以上の抗癌剤を加えた配合剤である。癌の治療として抗癌カクテルを使用することは、日常的になっている。本発明のポリペプチドまたはモジュレータと組み合わせて治療として使用できる技術上周知の抗癌剤には、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、塩酸シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、ダクチノマイシンン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、エストラムスチン燐酸ナトリウム、エトポシデ（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミデ、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、酢酸リュープロライド（ＬＨＲＨ−遊離因子類似体）、ロムスチン、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラニン、インターロイキン−２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシデ、およびビンデシン硫酸がある。
【０２２０】
さらに、本発明の治療的組成物は、癌の予防的治療用に使うことができる。個体が癌になりやすい、技術上周知の遺伝的状態および／または環境状態（例えば、発癌物質への暴露）がある。これらの環境において、癌になる危険を少なくするために、治療的有効量の本発明のポリペプチドでこれらの個体を治療することは、有利な場合がある。
【０２２１】
インビトロモデルを用いて、強力な癌の治療としての本発明のポリペプチドの有効量を測定することができる。これらのインビトロモデルには、培養腫瘍細胞の増殖アッセイ、軟寒天における培養腫瘍細胞の増殖（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ　Ｃｈ　１８　ａｎｄ　Ｃｈ　２１を参照）、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ、５２：９２１〜３０（１９７４）に記載のヌードマウスにおける腫瘍システム、Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、１７：４１０７−９（１９９７）に記載のＢｏｙｄｅｎ　Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおける腫瘍細胞の移動性と侵襲性の可能性、ならびにＲｉｂａｔｔａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｉｎｔｌ、Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、４０：１１８９−９７（１９９９）およびＬｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１７：４２３−９（１９９９）に各々記載の鶏絨毛尿膜の血管新生の誘導または血管内皮細胞遊走の誘導のような血管形成のアッセイがある。適切な腫瘍細胞系は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　カタログから入手できる。
【０２２２】
（５．１０．１２　レセプター／リガンドの活性）
本発明のポリペプチドはまた、レセプター／リガンド相互作用の、レセプター、レセプターリガンドもしくはインヒビター、またはアゴニスト（作動薬）としての活性を示す。本発明のポリヌクレオチドはこのような特性を示すポリペプチドをコードし得る。このようなレセプターおよびリガンドの例には、サイトカインレセプターとそのリガンド、レセプターキナーゼとそのリガンド、レセプターホスファターゼとそのリガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターとそのリガンド（セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガンドのような）細胞接着分子をこれに限らず含む）、ならびに細胞性免疫応答および体液性免疫応答の抗原提示、抗原認識および進展に関与する、レセプター／リガンド対が挙げられるが、これらに限らない。レセプターとリガンドはまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性があるペプチドまたは小分子インヒビターのスクリーニングにも役立つ。本発明のタンパク質（レセプターおよびリガンドのフラグメントをこれらに限らず含む）は、それ自体レセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
【０２２３】
本発明のポリペプチドの活性は、他に方法もあるが、以下の方法によって測定できる。
【０２２４】
レセプター−リガンド活性の適切なアッセイには、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄ　ｂｙ　Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ　７．２８，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｓｔａｔｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　７．２８．１−７．２８．２２），Ｔａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：６８６４−６８６８、１９８７：Ｂｉｅｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０　１９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１７５：５９−６８、１９９４；Ｓｔｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ　８０：６６１−６７０、１９９５に記載のアッセイがあり、またアッセイはこれらに限らない。
【０２２５】
例として、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のリガンドのレセプターとして使われ、それによってそのリガンドの生物活性が伝達される。リガンドは結合アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、ダイハイブリッドスクリーニングアッセイ、ＢＩＡコアアッセイ、ゲルオーバーレイアッセイまたは技術上周知の他の方法によって同定できる。
【０２２６】
薬物またはタンパク質を、アゴニスト（作動薬）か、またはアンタゴニスト（拮抗薬）、あるいは部分的アゴニストか、または部分的アンタゴニストとして特徴付けする試験には、競合的リガンドとしての他のタンパク質を使う必要がある。本発明のポリペプチドまたはそのリガンドは、従来の方法によって放射性同位元素、比色定量分子または毒素分子に結合されて標識される（”Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｍｕｒｒａｙ　Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１８２（１９９０）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）。放射性同位元素の例としては、トリチウムや炭素−１４があるが、これらに限定されない。比色定量分子の例には、フルオレサミンのような蛍光分子、またはローダミンや他の比色定量分子があり、またこれらに限定されない。毒素の例には、リシンがあり、またこれに限定されない。
【０２２７】
（５．１０．１３　薬物スクリーニング）
本発明は様々な薬物スクリーニング技法のいずれかにおいて、新しいポリペプチドまたはその結合フラグメントを用いて、化合物をスクリーニングするのに特に役立つ。このような試験に用いるポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面に保たれるか、または細胞内にあるかのいずれかであり得る。薬物スクリーニングの１つの方法では、真核または原核宿主細胞を利用し、これらはポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組み換え核酸で安定に形質転換される。薬物は、競合結合アッセイで、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。生存能力のある、または固定化されたいずれかの型のこのような細胞は、標準結合アッセイに使うことができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはフラグメントとテストされた薬剤との間の複合体形成を測定するか、または新規のポリペプチドと技術上周知の適切な細胞系との間の複合体形成における減少を調べることができる
結合能力、または本発明のポリペプチドの活性を変調する（すなわち、増加または減少させる）能力についてスクリーニングできる試験化合物の供給源として、（１）無機および有機化合物ライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダムまたは模倣ペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子のいずれかを含むコンビナトリアルライブラリーがある。
【０２２８】
ケミカルライブラリーは多くの市販源から容易に合成または購入でき、また、これには既知の化合物の構造的類似体、または天然物スクリーニングを介して「ヒット」または「リード」と同定されている化合物が含まれ得る。
【０２２９】
天然物ライブラリーの供給源は、微生物（細菌や真菌を含む）、動物、植物もしくは他の植生、または海洋生物、およびスクリーニング用混合のライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、または（２）微生物自体からの抽出によって作製できる。天然物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソームペプチドおよびその（非天然性発生）変異体がある。総説は、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：６３−６８（１９９８）を参照されたし。
【０２３０】
コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物を含み、従来の自動合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは特許化された合成方法によって容易に作成することができる。ペプチドとオリゴヌクレオチドコンビナトリアル・ライブラリーが特に興味深い。なお、この他に興味深いライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣、多平行型合成収集、リコンビナトリアル、およびポリペプチドライブラリーがある。コンビナトリアルケミストリーとそれから作成されたライブラリーの総説は、Ｍｙｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたし。ペプチド模倣ライブラリーの総説および例は、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９（３）：２０５−２３（１９９８）；Ｈｒｕｂｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｃｈｅｍ　Ｂｏｉｌ、１（１）：１１４−１９（１９９７）：Ｄｏｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ、４（５）：７０９−１５（１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照されたし。
【０２３１】
本明細書中に記載する種々のライブラリーを使用してモジュレータを同定することによって、本発明のポリペプチドに結合する「ヒット」の能力を至適化するための「ヒット」（または「リード」）候補の修飾（変更）が可能になる。次に、結合アッセイで同定された分子を、インビボ組織培養または技術上周知の動物モデルにおけるアンタゴニストまたはアゴニスト活性について測定を行う。要するに、分子を多数の細胞培養または動物に滴定して、次に細胞／動物の死亡または細胞／動物の生存延長のいずれかについてテストする。
【０２３２】
このように、同定された結合分子は、毒素（例えば、リシンまたはコレラ）と複合体を作るか、または放射性同位元素のような細胞に対して毒性のある他の化合物と複合体を作る。次に、毒素結合分子複合体は、結合分子の本発明のポリペプチドに対する特異性によって腫瘍または他の細胞を標的にする。あるいは、結合分子は標的化および映像目的のためのイメージング（画像）剤と複合体を作る。
【０２３３】
（５．１０．１４　レセプター活性のアッセイ）
本発明はまた、ポリペプチド（例えばリガンドまたはレセプター）の特異的結合を検出する方法をも提供する。この技術は、以前は不明であった、本発明のレセプターポリペプチドの結合パートナーの同定に、特に役立つ多くのアッセイを提供する。例えば、哺乳類または細菌の細胞、あるいはダイハイブリッドスクリーニングアッセイを用いた発現クローニングは、結合パートナーをコードするポリヌクレオチドの同定に使うことができる。他の例として、適切に固定化された本発明のポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーは、本発明のポリペプチドを認識し、そして結合するポリペプチドを単離するために使用することができる。本発明のポリペプチドの生物活性を変調する（つまり、増加または減少する）化合物、特に小分子の同定に用いられる多くの異なったライブラリーがある。本発明のレセプターポリペプチド用リガンドは、本発明のレセプターの発現以外は遺伝学的に同じである２種の細胞集団に、外来性リガンドまたはリガンドのカクテルを加えることによって同定できる。１種の細胞集団は本発明のレセプターを発現するが、他の細胞集団は発現しない。次いで、加えられたリガンドに対する２種の細胞集団の応答を比較する。あるいは、発現ライブラリーは、細胞内で本発明のポリペプチドと同時発現させることができ、強力なリガンドを同定するためにオートクライン応答についてアッセイすることができる。さらに、他の例として、ＢＩＡコア検定、ゲルオーバーレイまたは技術的に周知の他の方法を用いて結合パートナーのポリペプチドを同定できるが、これには、（１）有機および無機化学ライブラリー、（２）天然物ライブラリーおよび（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子のようなコンビナトリアルライブラリーが含まれる。
【０２３４】
下流細胞内情報伝達分子の、本発明のポリペプチドの情報伝達カスケードにおける役割は決定できる。例えば、本発明のポリペプチドの細胞質内ドメインが、リガンドが同定されているタンパク質の細胞外部分に融合したキメラタンパク質は、宿主細胞内で産生される。次に、この細胞をキメラタンパク質の細胞外部分に特異的なリガンドと一緒に培養し、それによってキメラレセプターを活性化する。次に、細胞内情報伝達に関与する既知の下流タンパク質は、予測される修飾、すなわち、燐酸化についてアッセイできる。また、技術上公知の他の方法も、また、レセプター活性に関与する情報伝達分子の同定に使用できる。
【０２３５】
（５．１０．１５　抗炎症活性）
本発明の組成物は、また抗炎症活性をも示す。抗炎症活性は、炎症反応に関与する細胞に刺激を与えるか、細胞間相互作用（例えば、細胞接着のような）を阻害または促進するか、炎症過程に関与する細胞の走化性を阻害または促進するか、細胞の血管外遊走を阻害または促進するか、あるいは、炎症応答をより直接的に阻害または促進する他の因子の産出を刺激または抑制することによって達成され得る。このような活性を持つ組成物は、感染（敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害、菌体内毒素致死、関節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、あるいはＴＮＦやＩＬ−１のようなサイトカインの産出過剰から生じる疾患に関連する、慢性または急性炎症状態の治療に、これらの適用に限らず用いることができる。本発明の組成物はまた、抗原性物質または抗原性材料に対するアナフィラキシーまたは過敏症の治療にも有用である。本発明の組成物は、敗血症、急性膵炎、エンドトキシンショック、サイトカイン性ショック、慢性関節リューマチ、慢性炎症性リューマチ、真性糖尿病タイプ１による膵臓細胞障害、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、肺疾患に合併する炎症、他の自己免疫疾患もしくは炎症性疾患のような状態を予防または治療するために、急性もしくは慢性骨髄性白血病の抗増殖性剤として、または子宮内感染症の前段階における早期分娩の予防において使用することができ、また使用はこれらに限らない。
【０２３６】
（５．１０．１６　白血病）
白血病および関連障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの機能を促進または阻害する治療剤を投与することによって治療または予防することができる場合がある。このような白血病および関連障害には、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球（顆粒球）性白血病、および慢性リンパ性白血病（これらの疾患の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８５、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２ｄ　Ｅｄ．、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ参照）があり、またこれらに限らない。
【０２３７】
（５．１０．１７　神経系障害）
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの活性を変調する化合物の介入の効力をテストできる細胞タイプに関連し、またしたがって、治療的有用性の指標を見ながら治療できる神経系障害には、神経系損傷、およびアクソンの連絡切断、神経細胞の退縮もしくは変性、または脱髄のいずれかを生じる疾患または障害が、これらに限らず含まれる。本発明にしたがって患者（ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む）において治療される神経系病変には、以下の、中枢（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のどちらかの病変が含まれるが、これらに限らない：
（ｉ）物理的傷害により生じるか、または手術（例えば、神経系の一部を切断する病変または圧迫損傷）に関連する病変を含む外傷性病変；
（ｉｉ）脳梗塞または脳虚血、あるいは脊髄の梗塞または虚血などの神経系の一部における酸素欠乏により、神経細胞損傷または死亡にいたる虚血性病変；
（ｉｉｉ）神経系の一部が、例えば、膿瘍による感染の結果として破壊もしくは損傷を受けるか、あるいはヒト免疫不全症ウイルス、帯状疱疹、もしくは単純疱疹ウイルスによる感染、またはライム病、結核、梅毒に関連する、感染性病変；
（ｉｖ）パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症に関連する変性に限らず、これらを含む変性過程の結果として、神経系の一部が破壊または損傷する変性（退縮）病変；
（ｖ）栄養障害または代謝障害によって神経系の一部が破壊または損傷する、栄養疾患または栄養障害に関連する病変であって、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウエルニッケ病、タバコ・アルコール性弱視、マルキャファーヴァ・ビニャミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性が含まれるが、これらに限らない、病変；
（ｖｉ）全身性疾患に関連する神経性病変であって、糖尿病（糖尿病性神経障害、顔面麻痺）、全身性エリトマトーデス、癌または肉腫症が含まれるが、これらに限らない、神経性病変；
（ｖｉｉ）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む毒性物質によって生じた病変；
（ｖｉｉｉ）脱髄疾患によって神経系の一部が破壊または損傷する脱髄病変であって、多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症、種々の病因論、進行性多病巣性白質脳障害、および中央脳橋ミエリン溶解が含まれるが、これらに限らない、脱髄病変。
【０２３８】
本発明にしたがった有用な神経系疾患用治療剤は、神経細胞の生存または分化の促進についての生物活性を試験することによって選択できる。例えば、制限としてではなく、次の作用のいずれかを誘発する治療剤は本発明に従って、有用である：
（ｉ）培養液において神経細胞の増加した生存時間；
（ｉｉ）培養液またはインビボにおいて、神経細胞の増加した出芽；
（ｉｉｉ）培養液またはインビボにおいて、神経細胞関連分子（例えば、運動ニューロンに関連するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）の増加した産生；
（ｉｖ）インビボでの神経細胞機能障害の症状の減少。
【０２３９】
このような効果は技術上公知のいずれの方法によっても測定できる。好ましくは、実施例に限らず、神経細胞の生存率増加は、Ａｒａｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７−３５１５）に示される方法によって測定でき；神経細胞の出芽の増加は、Ｐｅｓｔｒｏｎｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９８０、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５−８２）またはＢｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７−４２）に示される方法によって検出でき；神経細胞関連分子の産生増加は、測定される分子に依存して、バイオアッセイ、酵素学的アッセイ、結合抗体、ノーザンブロットアッセイなどで測定でき；そして、運動ニューロン機能不全は、運動ニューロン障害（例えば、脱力感、運動ニューロン伝達速度または機能的能力障害）の物理的症状の評価によって測定できる。
【０２４０】
特定の実施形態において、本発明に従って治療される運動ニューロン障害には、運動神経細胞および神経系の他の成分に影響を与え得る障害（梗塞、感染症、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患または悪性腫瘍）が挙げられるが、これに限定されず、そして筋萎縮性側索硬化症のような神経細胞に選択的に影響する障害には、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児性、若年性筋萎縮、幼児期の進行性球麻痺（ファチオ・ロンデ症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群、ならびに遺伝性運動感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・トゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
（５．１０．１８　その他の活性）
本発明のポリペプチドはまた、さらに、次のような活性または作用のうちの１つ以上を示す：細菌、ウイルス、真菌および他の寄生虫をこれらに限らず含む、感染性物質の成長、感染もしくは機能を阻害または抑止すること；身長、体重、髪の色、眼の色、皮膚、脂肪の細い部分に対する割合もしくは他の組織色素沈着、または臓器もしくは身体部分のサイズもしくは形（例えば、乳房の増大もしくは縮小、または骨の形態もしくは形状における変化のような）をこれらに限らず含む身体的特徴に作用（抑制または亢進）すること；男性または女性の受精能に作用すること；食餌脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補助因子、他の栄養的因子または成分の、代謝、異化、同化、処理、利用、保存、または排出に影響を与えること；食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、抑鬱（鬱病性障害を含む）および狂暴症をこれらに限らず含む行動性特徴に作用する、鎮痛効果または他の痛み減少作用を与える、造血系以外の系における胚幹細胞の分化および成長を促進すること；ホルモンまたは内分泌の活性化；酵素の場合、酵素の欠乏症を修正すること、および欠乏関連性疾患を治療すること；過剰増殖疾患（例えば、乾癬のような疾患）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体を結合する能力のような活性）；ならびにワクチン成分において抗原として作用して、そのようなタンパク質、または、そのようなタンパク質と交差反応する他の物質もしくは実体に対して免疫反応を促進すること。
【０２４２】
（５．１０．１９　多型の同定）
多型の実証は、ヒト被験体におけるこのような多型の同定ならびに診断および処置のためのこの情報の薬理学的使用を可能にする。このような多型は、例えば、種々の疾患状態（例えば、炎症または免疫応答に関連する障害）に対する差次的な素因または感受性あるいは薬物投与に対する差次的応答に関連し得、そしてこの遺伝情報は、予防的または治療的処置を適切に合わせるために使用され得る。例えば、炎症または自己免疫疾患に対する素因に関連する多型の存在は、その多型の存在を同定することによって、ヒトにおけるこの状態の診断を可能にする。
【０２４３】
多型は、当該分野で公知の種々の方法で同定され得、これら全ては、一般に、患者からサンプルを得る工程、そのサンプル由来のＤＮＡを分析する工程（必要に応じて、ＤＮＡの単離または増幅を含む）、およびそのＤＮＡにおける多型の存在を同定する工程を包含する。例えば、ＰＣＲを使用して、ゲノムＤＮＡの適切なフラグメントを増幅し得、次いで、このゲノムＤＮＡを配列決定し得る。あるいは、ＤＮＡを、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ここでは、適切なオリゴヌクレオチドが、一塩基ミスマッチの検出を可能にする条件下で、そのＤＮＡにハイブリダイズされる）または一ヌクレオチド伸長アッセイ（ここでは、多型の位置に直ぐ隣接してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが、１以上の標識されたヌクレオチドで伸長される）に供し得る。さらに、従来の制限フラグメント長多型分析（多型の存在または非存在に依存してゲノムＤＮＡの差次的な消化を提供する制限酵素を使用する）を、行い得る。本発明のヌクレオチド配列を有するアレイを使用して、多型を検出し得る。このアレイは、本発明の改変されたヌクレオチド配列を検出するために、本発明のこれらのヌクレオチド配列を含み得る。代替的に、本発明のヌクレオチド配列のうちの任意の１つが、それらの配列由来の変化を検出するために、アレイ上に配置され得る。
【０２４４】
あるいは、アミノ酸配列における変化を生じる多型は、そのタンパク質のアミノ酸配列における対応する変化を検出することによって（例えば、改変体配列に特異的な抗体による）、検出され得る。
【０２４５】
（５．１０．２０　関節炎および炎症）
慢性関節リウマチに対する本発明の組成物の免疫抑制効果は、実験動物モデル系において決定される。この実験モデル系は、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎であり、そしてこのプロトコルは、Ｊ．Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚら、１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：５６またはＢ．Ｗａｋｓｍａｎら、１９６３，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１２９によって記載される。この疾患の誘導は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の死化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの懸濁液の単回注射（一般には、経皮的に）によって引き起こされ得る。注射の経路は、様々であり得るが、ラットは、その尾の基部にアジュバント混合物を注射され得る。ポリペプチドを、約１〜５ｍｇ／ｋｇの用量でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で投与する。コントロールは、ＰＢＳのみの投与からなる。
【０２４６】
試験化合物の効果を試験するための手順は、ＣＦＡ中の死化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの経皮注射、その直後の試験化合物の投与、およびその後の２４日目までの１日おきの処置からなる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＣＦＡの注射後１４日目、１５日目、１８日目、２０日目、２２日目および２４日目に、全体的関節炎スコアを、上記のＪ．Ｈｏｌｏｓｋｉｔｚに記載のように獲得し得る。これらのデータの分析は、その試験化合物が、この関節炎スコアの減少によって測定されるように、関節の隆起に対する劇的な影響を有することを示す。
【０２４７】
（５．１１　治療方法）
本発明の組成物（ポリペプチドフラグメント、アナログ、改変体および抗体、あるいは他の結合パートナーまたはモジュレーター（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む））は、種々の治療方法における多くの適用を有する。治療適用の例としては、本明細書中に例示される適用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４８】
（５．１１．１　実施例）
本発明の１つの実施形態は、本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドまたは他の組成物の有効量を、本発明の可溶性プロトロンビナーゼ様レセプターを調節することによって調節され得る疾患または障害に罹患する個体に対して投与することである。投与形態は、特に重要ではないが、非経口投与が、好ましい。例示的な投与形態は、静脈内ボーラスを送達することである。本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドまたは他の組成物の投薬量は、通常、処方医によって決定される。この投薬量は、その個体患者の年齢、体重、状態および応答に従って変化することが予測される。代表的には、１用量あたりに投与されるポリペプチドの量は、約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、好ましく用量は、約０．１μｇ／ｋｇ患者体重〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。非経口投与のために、本発明のプロトロンビナーゼ様ポリペプチドは、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと合わせた注射形態に処方される。このようなビヒクルは、当該分野で周知であり、そしてこれらには、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および少量のヒト血清アルブミンからなる溶液が挙げられる。ビヒクルは、このポリペプチドまたは他の活性成分の等張性および安定性を維持する、わずかな量の添加剤を含み得る。このような溶液の調製物は、当業者の範囲内である。
【０２４９】
（５．１２　薬学的処方物および投与経路）
本発明のタンパク質または他の組成物（組換え供給源および非組換え供給源（これらに限定されない）を含む任意の供給源由来であり、抗体および本発明のポリペプチドの他の結合パートナーを含む）は、種々の障害を処置または改善するための用量で、それ自体でかまたは薬学的組成物（ここでは、それは、適切なキャリアまたは賦形剤と共に混合される）中で、必要とされる患者に投与され得る。このような組成物は、必要に応じて、（タンパク質または他の活性成分およびキャリアに加えて）希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当該分野で周知の他の材料を含み得る。用語「薬学的に受容可能」とは、その活性成分の生物学的活性の効果を干渉しない、非毒性の材料を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子およびエリスロポイエチン）を含み得る。さらなる組成物において、本発明のタンパク質は、問題の疾患または障害の処置に有益な他の薬剤と合わせられ得る。これらの薬剤としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ））ならびに本明細書中に記載のサイトカインが挙げられる。
【０２５０】
薬学的組成物はさらに、タンパク質または他の活性成分の活性を増強するかあるいは処置におけるその活性または用途を補足する、他の薬剤を含み得る。このようなさらなる因子および／または薬剤が、薬学的組成物に含まれて、本発明のタンパク質または他の活性成分と相乗効果を生じ得るかまたは副作用を最小化し得る。逆に、本発明のタンパク質または他の活性成分は、特定の凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊因子、あるいは抗炎症剤の処方物に含まれて、この凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊因子、あるいは抗炎症剤（例えば、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１　Ｈｙ１、ＩＬ−１　Ｈｙ２、抗ＴＮＦ、コルチコステロイド、免疫抑制剤）の副作用を最小化し得る。本発明のタンパク質は、マルチマー（例えば、ヘテロダイマーまたはホモダイマー）あるいはそれ自体または他のタンパク質との複合体において活性であり得る。結果として、本発明の薬学的組成物は、このようなマルチマーまたは複合体化形態における本発明のタンパク質を含み得る。
【０２５１】
第１のタンパク質を含む本発明の薬学的組成物に含まれる代替物として、第２のタンパク質または治療剤が、この第１のタンパク質と共に（例えば、同じ時点で、または異なる時点（これらの薬剤の組み合わせの治療濃度がその処置部位で達成される場合）で）投与され得る。即時適用の化合物の処方および投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（最新版）に見出され得る。治療有効用量はさらに、症状の改善（例えば、関連する医学状態の処置、治癒、予防または改善）あるいはこのような状態の処置、治癒、予防または改善の速度の増加を生じるに十分な化合物の量をいう。単独で投与される個々の活性成分に適用する場合、治療有効用量とは、その成分単独をいう。組み合わせに適用される場合、治療有効用量とは、連続的にかまたは同時にかのいずれで組み合わせて投与されるかに関わらず、治療効果を生じるそれらの活性成分の合わせた量をいう。
【０２５２】
本発明の処置または使用の方法の実施において、本発明のタンパク質または他の活性成分の治療有効量が、処置される状態を有する哺乳動物に投与される。本発明のタンパク質または活性成分は、本発明の方法に従って、単独でかまたは他の治療（例えば、サイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子を使用する処置）との組み合わせで、投与され得る。１以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子と共に共投与する場合、本発明のタンパク質または他の活性成分は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊因子と同時にかまたは連続的に投与され得る。連続的に投与される場合、主治医が、本発明のタンパク質または他の活性成分を、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊因子または抗血栓崩壊因子と組み合わせて投与する適切な順序を決定する。
【０２５３】
（５．１２．１　投与経路）
適切な投与経路には、例えば、以下が挙げられ得る：経口投与、直腸投与、経粘膜投与または腸投与；非経口送達（筋内注射、皮内注射、髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射を含む）。薬学的組成物中においてあるいは本発明の方法を実施するために使用される本発明のタンパク質または他の活性成分の投与は、種々の従来の様式（例えば、経口摂取、吸入、局所適用、あるいは皮膚注射、皮下注射、腹腔内注射、非経口注射または静脈内注射）において行われ得る。患者への静脈内投与が、好ましい。
【０２５４】
あるいは、関節炎性の関節または線維症組織への化合物の直接的な注射を介して（しばしば、デポー処方物または持続放出処方物にて）、全身様式よりむしろ局所様式で化合物を投与し得る。緑内障手術の合併症として頻繁に起こる瘢痕プロセスを防止するために、この化合物は、例えば、点眼剤として局所的に投与され得る。さらに、例えば、関節炎または線維症組織を標的とする特定の抗体でコーティングしたリポソームの形態の、標的薬物送達システムの形態で、この薬物を投与し得る。このリポソームは、罹患組織に標的化され、そしてこの罹患組織によって選択的に取り込まれる。
【０２５５】
本発明のポリペプチドは、作用の所望の部位に有効な投薬量を送達する任意の経路によって投与される。投与の適切な経路および特定の症状のために有効な投薬量の決定は、当業者のレベルの範囲に含まれる。好ましくは、創傷処置のために、治療化合物が部位に直接投与される。本発明のポリペプチドの適切な投薬量範囲は、これらの投薬量または適切な動物モデルにおける類似の研究から推定し得る。次いで、投薬量は、最大の治療効果を提供するように医師によって必要に応じて調整され得る。
【０２５６】
（５．１２．２　組成物／処方物）
従って、本発明に従って使用するための薬学的組成物は、薬学的に利用される調製物への活性化合物の加工を容易にする１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア（賦形剤および補助剤を含む）を使用する従来の様式で処方され得る。これらの薬学的組成物は、それ自体が公知の様式（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、微粒子化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって）で製造され得る。適切な処方物は、選択された投与経路に依存する。治療的有効量の本発明のタンパク質または他の活性成分が経口投与される場合、本発明のタンパク質または他の活性成分は、錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物は、固体キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）をさらに含み得る。錠剤、カプセル剤および散剤は、約５〜９５％の本発明のタンパク質または他の活性成分、および必要に応じて、約２５〜９５％の本発明のタンパク質または他の活性成分を含む。液体形態で投与される場合、液体キャリア（例えば、水、鉱油、動物または植物由来の油（例えば、ピーナツオイル、ダイズ油、またはゴマ油）、または合成油）が添加され得る。液体形態の薬学的組成物は、生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）をさらに含み得る。液体形態で投与される場合、この薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％の本発明のタンパク質または他の活性成分、および必要に応じて、約１〜５０％の本発明のタンパク質または他の活性成分を含む。
【０２５７】
治療的有効量の本発明のタンパク質または他の活性成分が静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、本発明のタンパク質または活性成分は、発熱物質を含まない経口的に受容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、および安定性に起因して、このような経口的に受容可能なタンパク質または他の活性成分の溶液の調製は当業者の範囲内である。静脈内注射、皮膚注射または皮下注射に好ましい薬学的組成物は、本発明のタンパク質または他の活性成分に加えて、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、デキストロース注射液、デキストロース＋塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンガー液、または当該分野で公知の他のビヒクル）を含まなければならない。本発明の薬学的組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝剤、酸化防止剤または他の当該分野で公知の添加剤を含み得る。注射について、本発明の薬剤は、水溶液の形態、好ましくは薬学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンがー溶液、または生理食塩緩衝液）の形態で処方され得る。経粘膜投与について、浸透されるバリアに適切な浸透剤がこの処方物に使用される。このような浸透剤は一般的に当該分野で公知である。
【０２５８】
経口投与について、この化合物は、活性成分を当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアにより、本発明の化合物は、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、処置される患者によって経口摂取のために処方され得る。経口用途のための薬学的調製物は、固体賦形剤で得られ、必要に応じて得られた混合物を顆粒化し、この下流の混合物を処理し、必要に応じてその後適切な賦形剤に添加し、錠剤または糖衣コアを得る。適切な賦形剤は、特に、フィラー（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望ならば、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギニン酸、またはアルギニン酸ナトリウムのようなそれらの塩）が添加され得る。糖衣コアは、適切なコーティングを用いて提供される。この目的のために、濃縮された糖溶液が使用され、これは必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒および溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、同定のためまたは活性化合物用量の異なる組み合わせの特徴付けのために錠剤または糖衣コーテイングに添加され得る。
【０２５９】
経口で使用され得る薬学的調製物は、ゼラチンから作製されたプッシュフィットカプセルならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟質密閉カプセルを含む。このプッシュフィットカプセルは、フィラー（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、および／または潤滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）、ならびに必要に応じて安定剤を混合された活性成分を含み得る。軟質カプセルにおいて、この活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量出なければならない。経頬粘膜投与について、この組成物は、従来の様式で処方される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０２６０】
吸入による投与について、本発明に従って使用するための化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）を使用して圧縮パックまたはネブライザーにより提供されるエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達される。圧縮したエアロゾルの場合、投薬単位は、測定量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。例えば、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、この化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の混合物を含んで処方され得る。これらの化合物は、注射（例えば、ボーラス入射または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、保存剤を添加した単位投薬形態（例えば、アンプル）または複数用量容器の形態で提供され得る。これらの組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、そして処方剤（例えば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。
【０２６１】
非経口投与のための薬学的処方物は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、胡麻油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加する物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、この懸濁液はまた、この化合物の溶解度を増加し、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含み得る。あるいは、この活性成分は、適切なビヒクル（例えば、滅菌した発熱物質を含まない水）で使用前に構築するための粉末形態であり得る。
【０２６２】
この化合物はまた、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む直腸組成物（例えば、坐剤または保持浣腸）の形態で処方され得る。上で所望される処方物に加えて、この化合物はまた、蓄積調製物として処方され得る。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、これらの化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂と共に、不溶性の誘導体（例えば、不溶性の塩）として処方され得る。
【０２６３】
本発明の疎水性化合物のための薬学的キャリアは、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水相を含む共溶媒系である。この共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であり得る。ＶＰＤは、３％　ｗ／ｖベンジルアルコール、８％　ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート　８０、および６５％ｗ／ｖ　ポリエチレングリコール　３００の溶液であり、無水エタノール中で作製される。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、水溶液中５％デキストロースで１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、そしてそれ自体、全身投与の際に低い毒性を生じる。自然に、共溶媒系の比率は、その溶解度および毒性を壊すことなく、相当変化し得る。さらに、共溶媒成分の同一性は変化し得る：例えば、他の毒性比極性界面活性剤は、ポリソルベート８０の代わりに使用され得；ポリエチレングリコールのフラクションサイズは変化し得；他の生体適合性ポリマーはポリエチレングリコール（例えば、ポリビニルピロリドンと交換し得；そして他の糖または多糖類は、デキストロースと交換し得る。あるいは、疎水性薬学的化合物のための他の送達系が用いられ得る。リポロームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のための送達ビヒクルまたはの周知の例である。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）もまた用いられ得るが、通常、より大きな毒性という代償をはらう。さらに、これらの化合物は、持続性放出系（例えば、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス）を使用して送達され得る。様々なタイプの持続性放出材料が確立されており、そして当業者に周知である。持続性放出カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日にわたって化合物を放出する。治療剤の化学的性質および生物学的活性に依存して、タンパク質または他の活性成分の安定化のためのさらなるストラテジーが用いられ得る。
【０２６４】
薬学的組成物はまた、適切な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の活性成分の多くは、薬学的に受容可能な対イオンとの塩として提供され得る。このような薬学的に受容可能な塩基付加塩は、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩であり、無機塩基または有機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基性アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミンなど）との反応によって得られる。
【０２６５】
本発明の薬学的組成物は、タンパク質またはペプチド抗原と共に、本発明のタンパク質または他の活性成分の複合体の形であり得る。タンパク質およいび／またはペプチド抗原は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の両方に刺激シグナルを伝達する。Ｂリンパ球は、その表面にある免疫グロブリンレセプターを通して抗原に反応する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣタンパク質による抗原の提示の後に、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して抗原に反応する。ＭＨＣおよび構造的に関連のあるタンパク質（クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ遺伝子により宿主細胞上にコードされているものを含む）は、ペプチド抗原のＴリンパ球への提示に貢献する。抗原成分もまた、精製されたＭＨＣペプチド複合体単独で、またはＴ細胞に直接シグナル伝達し得る同時刺激分子と共に供給され得る。あるいは、表面免疫グロブリンおよびＢ細胞上の他の分子に結合し得る抗体、ならびにＴＣＲおよびＴ細胞上の他の分子に結合し得る抗体は、本発明の薬学的組成物と組み合わされ得る。
【０２６６】
本発明の薬学的組成物は、リポソームの形態であり得、ここで、本発明のタンパク質は、薬学的に受容可能な他のキャリアに加えて、脂質のような両親媒性の因子と組み合わされる。脂質は、ミセル、不溶性の単一層、液晶、またはラメラ層のような凝集形態で水溶液中に存在する。リポソーム形成に適切な脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、サルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるがこれらに限定されない。このようなリポソーム処方物の調製は、当業者の範囲内であり、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，７３７，３２３号に開示され、これらは全て本明細書中に参考として援用される。
【０２６７】
本発明の薬学的組成物における、本発明のタンパク質または他の活性成分の量は、処置される状態の性質およびその重症度、ならびにこの患者が経験した以前の処置の性質に依存する。最終的には、本発明のタンパク質または他の活性成分の量は担当医が決定し、これによって各個々の患者が処置される。担当医は最初に、本発明のタンパク質または他の活性成分を少量投与し、患者の反応を観察する。この患者について最適な治療効果が得られるまで、より多くの用量の本発明のタンパク質または他の活性成分が投与され得、その点に達したらもはや用量は増加されない。本発明の方法を実施するために使用される種々の薬学的組成物は、本発明のタンパク質または他の活性成分を体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１μｇ〜約１ｍｇ）含むべきであると意図される。骨、軟骨、腱、または靭帯の再生に有用な本発明の組成物について、この治療方法は、この組成物を、局所的、全身的、またはインプラントやデバイスとして局所的投与する工程を包含する。投与される場合、本発明における使用のための治療組成物は、当然ながら、発熱物質を含まない生理学的に受容可能な形態である。さらに、この組成物は、望ましくは、骨、軟骨、または組織の損傷部位へ送達するために、粘稠性形態でカプセル化または注入され得る。創傷治癒および組織の修復のために、局所的投与が適切であり得る。本発明のタンパク質または他の活性成分以外の治療的に有用な因子（これらもまた、上記のような組成物中に必要に応じて含まれ得る）は、本発明の方法において、この組成物の代替として、またはこの組成物に加えて、同時または連続的に投与され得る。好ましくは、骨および／または軟骨の形成のために、この組成物は、タンパク質または他の活性成分を含む組成物を骨および／または軟骨の損傷部位に送達し得、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、そして必要に応じて身体に再吸収され得るマトリックスを含む。このようなマトリックスは、現在他の移植医療用途で使われている材料で形成され得る。
【０２６８】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生物分解性、機械的性質、外見、および境界面の性質に基づく。この組成物の特定の適用は、適切な処方を規定する。この組成物の可能性のあるマトリックスは、生物分解性かつ化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生物分解性でありかつ生物学的に十分に規定された、例えば骨や皮膚のコラーゲンである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分で構成される。他の可能性のあるマトリックスは、非生物分解性でありかつ化学的に規定された、例えば焼結されたヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックである。マトリックスは、上記に言及した型の材料の任意の組合せ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウム）からなり得る。生体セラミックは組成が変更され得る。例えば、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩で、空孔サイズ、粒子サイズおよび粒子の形状、および生物分解性を変えるために処理され得る。１５０〜８００ミクロン範囲の直径を有する多孔質粒子の形態の、乳酸およびグリコール酸の５０：５０（モル重量）のコポリマーが現在好ましい。いくつかの適用において、タンパク質組成物のマトリックスからの解離を防ぐために、カルボキシルメチルセルロースのような金属イオン封鎖剤または自家凝血を利用することが有用である。
【０２６９】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーは、アルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）のようなセルロース材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩が最も好ましい。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレン酸化物、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本明細書中で有用な金属イオン封鎖剤の量は、全処方物重量に基づいて０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これはタンパク質のポリマーマトリックスからの脱離を防ぎ、そしてこの組成物の適切な取り扱いを提供するために必要な量を表しており、しかも前駆細胞がマトリックスに侵入するのを妨げる程の多くはないので、これによって、タンパク質が前駆細胞の骨形成活性を助ける機会を提供する。さらなる組成物において、本発明のタンパク質または他の活性成分は、骨および／または軟骨の欠陥、創傷、または問題のある組織の処置に有益な他の因子と組み合わされ得る。これらの因子としては、種々の増殖因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにインスリン様増殖因子（ＩＧＦ））が挙げられる。
【０２７０】
この治療組成物はまた、現在獣医学用途についても価値が見出されている。ヒトに加えて、特定の家畜およびサラブレッドのウマは、本発明のタンパク質または他の活性成分を用いるこのような処置のための所望の患者である。組織再生において使用されるタンパク質含有薬学的組成物の投薬量レジメンは、このタンパク質の作用を改変する種々の要因（例えば、形成が所望される組織の重量、損傷部位、損傷を受けた組織の状態、創傷の大きさ、損傷を受けた組織の種類（例えば骨）、患者の年令、性別、および食事、任意の感染の重症度、投与の時間、ならびに他の臨床的要因）を考慮して、担当医によって決定される。投薬量は、再生に使われるマトリックスの種類、または薬学的組成物中に含まれる他のタンパク質の有無によって変化し得る。例えば、最終組成物にＩＧＦ　Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のような他の公知の増殖因子を加えることはまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、組織および／または骨の成長および／または修復の定期的な診断によって（例えばＸ線、組織形態計測決定およびテトラサイクリン標識によって）モニターされ得る。
【０２７１】
本発明のポリヌクレオチドもまた、遺伝子治療に使用され得る。このようなポリヌクレオチドは、哺乳動物被験体における発現のために、インビボまたはエキソビボのいずれかで細胞に導入され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、核酸（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形態が挙げられるがこれらに限定されない）を細胞または生物体に導入するための公知方法によって投与され得る。細胞はまた、増殖させるためまたはこのような細胞に所望の効果または活性を生じるために、本発明のタンパク質の存在下でエキソビボで培養され得る。次いで、処置された細胞は、治療目的のためインビボで導入され得る。
【０２７２】
（５．１２．３　有効投薬量）
本発明の使用に適した薬学的組成物は、意図される目的を達成するために活性成分を有効量含む組成物を含む。より具体的に述べると、治療的有効量とは、処置される被験体の現在の症状の進行を予防するかまたは緩和するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中で提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の範囲内である。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的に有効な用量は、まず適切なインビトロアッセイから推定され得る。例えば用量は、動物モデルにおいて循環濃度範囲を達成するように処方され得、次にそれを使ってより正確にヒトにおける有用な用量が決定され得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて循環濃度範囲を達成するように処方され得，が、その中に細胞培養物で決定されるＩＣ５０（すなわち、タンパク質の生物学的活性の最大値の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０２７３】
治療的に有効な用量とは、症状の回復または患者の生存期間の延長を生じる化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に効果な用量）の決定のために）。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、そしてこれはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比で表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータを使って、ヒトにおける使用のための投薬寮の範囲を処方し得る。このような化合物の投薬量は、好ましくはＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり、毒性が全くあるいはほとんどない。この投薬量は、用いられる薬形および用いられる投与経路に基づいてその範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路、および投薬量は、患者の状態を見ながら、個々の医者によって選択され得る。例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１　ｐ．１を参照のこと。投薬量および間隔は、所望の効果を維持するのに十分な活性部分の血漿レベル、または最低有効濃度（ＭＥＣ）を提供するように個々に調整され得る。ＭＥＣは、各化合物について変化するが、インビトロデータから推測され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個人の特性および投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたは生物検定は、血漿濃度を決定するために使用され得る。
【０２７４】
投薬の間隔もまた、ＭＥＣ値を使って決定され得る。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％の間、最も好ましくは５０〜９０％の間、血漿レベルをＭＥＣより高く維持するレジメンを使って投与されるべきである。局所投与または選択的摂取の場合、この薬物の有効局所濃度は、血漿濃度とは無関係であり得る。
【０２７５】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物についての例示的な投薬量レジメンは、毎日体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜１００ｍｇの範囲であり、好ましい用量は、毎日患者の体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜２５ｍｇの範囲であり、大人と子供では変化する。投薬は、１日１回であり得るか、または等量の用量がより長い間隔またはより短い間隔で送達され得る。
【０２７６】
当然ながら、投与される組成物の量は、処置される被験体、被験体の年齢および体重、苦痛の度合い、投与の様式、および処方医の判断に依存する。
【０２７７】
（５．１２．４　包装）
この組成物は、所望の場合、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置において示され得る。このパックは、例えば金属またはブリスターパックのようなプラスチックホイルで構成され得る。このパックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書を添付し得る。適合性の薬学的キャリア中に処方される、本発明の化合物を含む組成物もまた調製され得、適切な容器に配置され、そして指示される状態の処置のためにラベルされ得る。
【０２７８】
（５．１３　抗体）
本発明の中には、本発明のタンパク質またはタンパク質のフラグメントに対する抗体も含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のうち免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する（免疫反応を生じる）抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体の中としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかのクラスに関係しており、これらは、この分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。特定のクラスは、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのようなサブクラスを有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中での抗体への言及は、このような全てのクラス、サブクラス、そしてヒト抗体の型への言及を含む。
【０２７９】
本発明の単離された関連タンパク質は、抗原またはその一部またはフラグメントとして役立つように意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製についての標準的技術を使用して、この抗原を免疫特異的に結合する抗体を産生するための免疫原として使用され得る。全長タンパク質を使用して、あるいは本発明によって、免疫原として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントが提供され得る。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列のような、全長タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも６つのアミノ酸残基からなり、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が全長タンパク質またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的免疫複合体を形成するように、そのエピトープを含む。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、または少なくとも１５のアミノ酸残基、または少なくとも２０のアミノ酸残基、または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置しているタンパク質の領域であり；通常これらは親水性領域である。
【０２８０】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面に位置している関連タンパク質の領域（例えば、親水性領域）である。ヒトの関連タンパク質配列の疎水性分析は、関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、したがって標的抗体生産のために有用な表面性残基をコードしそうであるかを示す。標的抗体生産の手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットは、フーリエ変換を用いてまたは用いずに、当該分野で周知の任意の方法（例えば、Ｋｙｔｅ　Ｄｏｏｌｉｔｔｅｌ法またはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む）によって作成され得る。ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２（いずれもその全体において本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。抗原性タンパク質、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログ、またはホモログ中の１つまたはそれ以上のドメインに特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０２８１】
本発明のタンパク質、あるいは誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ、またはオルソログは、これらタンパク質構成分と免疫特異的に結合する抗体の生産において、免疫抗原として利用され得る。
【０２８２】
当該分野で公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログ、またはオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産のために用いられ得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ａｎｋｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｌｏｗ　Ｅ．およびＬａｎｅ　Ｄ、１９８８、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で議論される。
【０２８３】
（５．１３．１　ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の生産のために、種々の適切な宿主動物（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）は、天然のタンパク質、その合成改変体、またはそれらの誘導体を１回またはそれ以上注射することによって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を表す化学的に合成されたポリペプチド、または組み換え発現された免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知の第２のタンパク質と結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズのトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。この調製物は、さらにアジュバントを含み得る。免疫反応を高めるために使用される種々のアジュバントとしては、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、カルメット‐ゲラン杆菌およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）、または同様の免疫刺激因子が挙げられるがこれらに限定されない。用いられ得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロース・ジコリノミコール酸）が挙げられる。
【０２８４】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを使ったアフィニティークロマトグラフィー）によってさらに精製され得、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する。引き続いて、または代替として、免疫グロブリン探求の標的である特定の抗原またはそのエピトープは、カラム上に固定され得、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製する。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ　ＰＡ発行のＴｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８（２０００年４月１７日），ｐｐ．２５−２８）によって議論される。
【０２８５】
（５．１３．２　モノクローナル抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみ含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、抗原の特定のエピトープと免疫反応し得、これに対する独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原結合部位を含む。
【０２８６】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）に記述されているようなハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発するために、免疫剤で代表的に免疫される。あるいは、このリンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０２８７】
免疫剤としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメント、またはその融合タンパク質が挙げられる。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合には抹消血リンパ球が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が所望される場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、このリンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８６），５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の基質を含む適切な培養培地で培養され得る。例えば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠如している場合、ハイブリドーマの培養培地は、通常、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を阻害する基質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
【０２８８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体発現を安定した高いレベルで支持するもの、およびＨＡＴ培地のような培地に感受性であるものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばＳａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得られ得るマウスの骨髄腫細胞株である。ヒトの骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）５１−６３頁）。
【０２８９】
次いで、このハイブリドーマが培養される培養培地を、この抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、このハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降反応により、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で周知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄのスキャッチャード分析、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）により決定される。好ましくは、標的抗原に対して高程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体が単離される。
【０２９０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈法によりサブクローニングされ、そして標準的な方法によって成長させ得る。この目的に対して適切な培養培地として、例えば、ダルベッコのＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいはハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腹水としてインビボで成長させ得る。
【０２９１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、伝統的な免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー）により、培養培地または腹水流体から単離、または精製され得る。
【０２９２】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組み換えＤＮＡ法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、伝統的な手順を用いて容易に単離され、そして配列決定でされ得る（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役に立つ。一旦単離されたＤＮＡは発現ベクターに置かれ得、次いで免疫グロブリンタンパク質を他で産生しない宿主細胞（例えば、猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞）中にトランスフェクトされ、モノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同性ネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ　３６８、８１２−１３（１９９４））、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたじゃ一部を免疫グロブリンのコード配列に共有結合することによって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いられ得、キメラ二価抗体を作製し得る。
【０２９３】
（５．１３．２　　ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含み得る。このような抗体は、投与された免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を生じることがないので、ヒトへの投与に適している。抗体のヒト化された形態は、キメラ性の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗体の抗原結合サブ配列）であり、これらは主にヒト免疫グロブリンの配列で構成され、そして非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含んでいる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび彼の同僚の方法を踏襲し（Ｊｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：　５２２−５２５（１９８６）；　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：　３２３−３２７（１９８８）；　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：　１５３４−１５３６（１９８８））、ヒト抗体の対応する配列の代わりに、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることにより実行され得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み構造残基を、それに対応する非ヒト残基で置換される。
【０２９４】
ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、外来性ＣＤＲにも、枠組み構造配列にもいずれにも見出されない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。その場合、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応しており、そして枠組み構造領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンの共通配列の枠組み構造領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）を含む（Ｊｏｎｅｓら　１９８６；　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；　およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐ．　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　２：　５９３−５９６（１９９２））。
【０２９５】
（５．１３．３　　ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、抗体分子に関連する。ここで軽鎖および重鎖の両方（ＣＤＲを含む）の全体の配列が、ヒト遺伝子から惹起される。このような抗体は、本明細書中では「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」という。ヒトモノクローナル抗体は、トリオマ（ｔｒｉｏｍａ）技術（ヒトＢ細胞のハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７−９６頁を参照のこと））によって調整され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマを使うことにより（Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのエプスタイン　バー　ウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することにより（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０２９６】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージ表示ライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたマウス）に導入することによって作製され得る。チャレンジに対し、ヒト抗体産生は観察され、全ての点（遺伝子の再配列、集合、および抗体のレパートリーを含む）においてヒトで見られる産生に厳密に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０、７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ　３６８、８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ　３６８、８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３　６５−９３（１９９５）に記載される。
【０２９７】
さらに、ヒト抗体は、抗原によるチャンレンジに対応する動物の内因性の抗体よりもむしろ完全なヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使って生成することも可能である（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主において免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子は、不活性化し、そして免疫グロブリンの重鎖および軽鎖コードする活性遺伝子座が、宿主のゲノムの中に挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母の人工染色体を使って導入される。次いで所望の改変を全て提供する動物は、改変の完全な相補体をほとんど含まない中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより後代として得られる。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、そしてＰＣＴ公報ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０８６に開示されるように示されているように、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、目的の免疫原で免役された後の動物（例えば、ポリクローナル抗体の調整物）からあるいは動物由来のような不朽化Ｂ細胞（たとえば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から得られ得る。さらに、ヒト可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子が回収され得、そして発現させて、直接抗体を得、またはさらに改変され得、抗体アナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得る。
【０２９８】
内因性の免疫グロブリン重鎖の発現を欠失している非ヒト宿主（例えばマウス）を生成する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それは、胚性幹細胞における少なくとも１つの内因性の重鎖遺伝子座由来のＪセグメント遺伝子を削除する工程を包含する方法によって得られ得、その遺伝子座の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写の形成を防ぐ。削除する工程は、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含む標的ベクターによって影響され；そして胚性幹細胞から、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を体細胞および生殖細胞が含むトランスジェニックマウスを生成する。
【０２９９】
目的の抗体（例えばヒト抗体）を生成する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養中の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびその２つの細胞を融合してハイブリッド細胞を作製する工程を包含する。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０３００】
本手順におけるさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、およびその関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相補的な方法は、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０３０１】
（５．１３．４　Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、技術が、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体を生成するために適用され得る（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法が、タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、相同体に対し所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントの同定を迅速かつ効果的し得るため、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について適用され得る（例えばＨｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術を用いて生成され得る（（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）　Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合を減らすことにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成されるＦａｂフラグメント；および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない）。
【０３０２】
（５．１３．５　生物特異的な抗体）
二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル（好ましくはヒトまたはヒト化）抗体である。本場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有益な細胞表面のタンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０３０３】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗体の遺伝子組み換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づく。この場合２つの重鎖は、異なる特異性を有している（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのため、そのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の強力な混合物を産生する。その中で１つだけが、正しい二重特異性の構造を有する。その正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様の手順は、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１　ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０：３６５５−３６５９に開示される。
【０３０４】
所望の結合特異性（抗原抗体結合部位）を持つ抗体の可変ドメインは、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合され得る。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖の定常ドメインとである。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが、好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、そして所望の場合、免疫グロブリン軽鎖体をコードするＤＮＡが、別個の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に共トランスフェクトされる。二重特異性抗体の生成のさらに詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｒｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０３０５】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の表面は、操作され、組み換え細胞培養物から回収されたヘテロダイマーの割合を最大にし得る。好ましい表面は、少なくとも一対の抗体定常ドメインのＣＨ３領域を含む。本方法において、１つ以上の第一の抗体分子の表面由来の小さいアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンやトリプトファン）で置換される。大きな側鎖に対して同一のまたは同様のサイズの代償性「腔」は、大きいアミノ酸側鎖を小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２の抗体分子の表面上に作製される。、この方法は、他の好ましくない最終産物（例えば、ホモダイマー）以上にヘテロダイマーの収量を増やす機構を提供する。
【０３０６】
二重特異性抗体は、完全長抗体、または抗体のフラグメント　（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調整され得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調整され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断され、Ｆ（ａｂ’）２のフラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いでＦａｂ’‐ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンで還元することでＦａｂ’‐チオールに再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’‐ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０３０７】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から直接回収され、そして化学的に結合されて二重特異性抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から別個に分泌され、インビトロで直接化学カップリングに供され、二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト乳房腫瘍標的に対して細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーし得る。
【０３０８】
組み換え細胞培養物から直接二重特異性抗体のフラグメントを作製し、そして単離する種々の技術もまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２つの異なる抗体のＦａｂ’領域に連結された。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元され、モノマーを形成し、そして次いで、再び酸化されて抗体へテロダイマーを形成した。本方法はまた、抗体ホモダイマーの生成について利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される「ｄｉａｂｏｄｙ」技術は、二重特異性抗体のフラグメントを作製するための代替機構を提供している。そのフラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。リンカーは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間でペアリング不可能である。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインをＶＬドメインは、別のフラグメントのＶＬドメインおよびＶＨドメインとペアリングするように強制され、その結果、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３０９】
２価より多い抗体が、意図される。例えば、３重特異性抗体もまた、調整され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得る。そのうちの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、Ｂ７））、またはＩｇＧ（ＦｃγＲ）のＦｃレセプター（例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に結合するアームと結合され得る。これは、細胞の防御機構を、特定の抗原を発現する細胞に集中させるためである。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性薬剤を思考するために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞傷害性薬剤または放射性核種キレート剤（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）を結合するアームを有する。目的の別の二重特異性抗体は、明細書中に記載されるタンパク質抗原を結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）を結合する。
【０３１０】
（５．１３．６　ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合をした抗体で構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に対して標的にする（米国特許第４，６７６，９８０号）ため、および、ＨＩＶ感染の処置（ＷＯ　９１／００３６０；ＷＯ　９２／２００３７３；ＥＰ　０３０８９）ため提供され得る。この抗体は、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を包含する）を使用してインビトロで調整されることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築され得る。本目的の適切な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、および例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示載された試薬などである。
【０３１１】
（５．１３．７　エフェクター機能工学）
エフェクター機能に関する本発明の抗体を改変することが所望され得る。これは例えば、癌処置において抗体の効果を高めるためである。例えば、シスチン残基は、Ｆｃ部位に導入され得、それによりこの領域において鎖内ジスルフィド結合形成をし得る。従って生成されたホモダイマー抗体は、内面化能力を改良し、そして／または、相補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大させ得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性を強められたホモダイマー抗体はまた、ヘテロ二機能性の架橋剤を使用して（Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように）調整され得る。あるいは、抗体は、操作され得、二重Ｆｃ領域を持ち、そしてそれにより相補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増進し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、３：２１９−２３０（１９８０）を参照のこと。
【０３１２】
（５．１３．８　免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物、または動物起源、またはそれらのフラグメントの酵素学的な活性毒素）または放射性アイソトープ（すなわち放射性結合体））に結合体化された抗体を含む免疫結合体に関係する。（、　このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は、上記されている。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ　ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ｄｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ　タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテシンを含む。種々の放射性核種は、放射性結合体化抗体の産物に対して入手可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３１３】
抗体および細胞傷害性薬剤の結合体は、種々の二機能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−サクシンイミジル‐３‐（２‐ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオレーン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチル・アジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジサクシンイミジル・スベリン酸塩など）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（Ｐ−アジドベンゾイル）へキサンジアミンなど）、ビス‐ジアゾニウム誘導体（ビス‐（Ｐ‐ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸塩（トリエン２，６−ジイソシアン酸塩など）、ビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼンなど）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：　１０９８　（１９８７）に記載されるように調整され得る。炭素１４標識化された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性核種の結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３１４】
別の実施形態において、抗体は、腫瘍前標的における利用のため「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合体化され得る。ここで、この抗体レセプター結合体は、患者に投与され、引き続いて、結合されない結合体を洗浄剤および次いで細胞傷害性薬剤に結合体化された「リガンド」（例えば、アビジン）の投与を使用して循環器系から除去される。
【０３１５】
（５．１４　　コンピューター読取り可能な配列）
本実施形態の１つの局面において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター読取り可能媒体上に記録され得る。本明細書中で使用する場合、「コンピューター読取り可能媒体」は、コンピューターにより読取りおよびアクセスされ得る任意な媒体をいう。このような媒体として、磁気記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）；光学記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ；電子記憶媒体（ＲＡＭおよびＲＯＭ）；これらのカテゴリーのハイブリッド（例えば、磁気／光学記憶媒体）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、任意の現在公知のコンピューター読取り媒体が使用され、本発明のヌクレオチド配列をその上に記録しているコンピューター読取り媒体を含む製品を作製し得ることを容易に理解し得る。した本明細書中で使用される場合、「記録される」は、コンピューター読取り媒体に情報を保存するプロセスをいう。当業者は、本発明のヌクレオチド配列方法を含む製品を作成するためコンピューター読取り媒体上に情報を記録する任意の現在公知の方法を容易に適用し得る。
【０３１６】
種々のデータ保存構造物は、本発明のヌクレオチド配列をその上に記録しているコンピューター読取り媒体を作成するため当業者にとって入手可能である。データ保存構造物の選択は、一般的に、保存された情報にアクセスするために選択された手段に基づく。さらに、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットは使用され、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピューター読取り媒体上に記録し得る。配列情報は、市販されているソフトウェア（例えば、ワードパーフェクトやマイクロソフト・ワード）でフォーマットされたワードプロセシングテキストファイルに表され得るか、または、データベースアプリケーションにおいて保存されるＡＳＣＩＩファイルの形式（例えば、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、オラクル）で表され得る。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報をその上に記録されているコンピューター読取り媒体を得るために任意の数のデータ処理構造のフォーマット（例えば、テキストファイルかデータベース）を容易に適用し得る。
【０３１７】
ヌクレオチド配列番号　１〜３、１０〜１３もしくは１５、またはその代表的なフラグメントのいずれか；又は配列番号　１〜３、１０〜１３または１５のヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を、コンピューター読取り可能な形で提供することにより、当業者は、種々の目的のために、その配列情報にいつでも日常的にアクセスし得る。コンピューター読取り可能な媒体で提供される配列情報にアクセスすることを可能にするコンピューターソフトウェアは、公に入手可能である。以下の例は、核酸配列内のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を同定するために、どのようにしてＳｙｂａｓｅシステム上でＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：　４０３−４１０　（１９９０））　及びＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇ等、Ｃｏｍｐ．　Ｃｈｅｍ．　１７：　２０３−２０７　（１９９３））探索アルゴリズムを実行するソフトウェアが使用されるかを示している。このようなＯＲＦは、タンパク質をコードするフラグメントであるかも知れないし、発酵反応に使われる酵素や、商業的に有用な代謝産物の生産に使用される酵素のように、商業的に重要なタンパク質の産生に有用であり得る。
【０３１８】
本明細書中で使用される場合、「コンピューターベースシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するのに使われるハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースシステムにとって最低限必要なハードウェア手段は、中央演算処理手段（ＣＰＵ）、インプット手段、アウトプット装置、そしてデータ記憶手段を含む。当業者であれば、現在入手可能なコンピューターベースシステムのいずれかが、本発明の使用に適しているのがどれであるか容易に理解し得る。上述の如く、本発明のコンピューターベースシステムは、本発明のヌクレオチド配列をそこに記録したデータ記憶手段、及び探索手段の支援と実行に必要なハードウェア手段とソフトウェア手段からなる。
【０３１９】
本明細書中で使用される場合、「データ記憶装置」は、本発明のヌクレオチド配列情報を記録し得る記憶装置（メモリー）か、本発明のヌクレオチド配列情報をそこに記録している製品にアクセスし得るメモリー・アクセス手段のいずれかをいう。
【０３２０】
本明細書中で使用される場合、「探索手段」は、標的配列又は標的構造モチーフとデータ記憶手段内に記録した配列情報とを比較するために、コンピューターベースシステム上で実行される１つ以上のプログラムをいう。探索手段は、特定の標的配列又は標的モチーフと一致するフラグメントや既知の配列の領域を同定するのに使用される。種々の公知のアルゴリズムが公に開示されており、そして、種々の市販されている検索手段を行うためのソフトウェアが、本発明のコンピューターベースシステムで使用されており、そして使用され得る。このようなソフトウェアの例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ　（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＡ（ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）等があるがこれらに限定されない。当業者は、相同性探索を行うための利用可能なアルゴリズム又は実行ソフトウェアパッケージのいずれか１つが、本発明のコンピューターベースシステムでの使用のために適用され得ることを容易に理解する。本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、任意の核酸または６つ以上のヌクレオチドのアミノ酸配列、あるいは２つ以上のアミノ酸を意味している。標的配列は長ければ長いほど、データベースにおけるランダムな出現として、標準配列は存在する可能性が低いことを当業者は容易に認識し得る。標的配列のうち最も好ましい配列の長さは、約１０〜１００のアミノ酸、又は約３０〜３００のヌクレオチド残基である。しかし既に良く知られていることであるが、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関連する配列フラグメントのような商業的に重要なフラグメントの探索は、より短い長さであり得る。
【０３２１】
本文書に使用される「標的構造モチーフ」又は「標的モチーフ」という用語は、合理的に選択された配列又は配列の組み合わせのことであり、その配列は、標的モチーフのひだ上に形成される３次元構造に基づいて選ばれる。医学業界では種々の種類の標的モチーフが知られている。タンパク質の標的モチーフは、例えば、酵素の活性部位やシグナル配列などである。核酸の標的モチーフには、プロモーター（促進因子）配列、ヘアピン構造、誘発性発現要素（タンパク質結合配列）等が含まれる。
【０３２２】
このような方法における使用に適したポリヌクレオチドは、通常、長さが２０〜４０塩基であり、転写に関係する遺伝子の領域（三重へリックス‐Ｌｅｅ等、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　６：　３０７３　（１９７９）；　Ｃｏｏｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５２４１：　４５６　（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：　１３６０　（１９９１）を参照のこと）、又はｍＲＮＡ自身（アンチセンス‐Ｏｌｍｎｏ、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５６：　５６０　（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　ＦＬ（１９８８））に相補的であるように設計されている。三重へリックス形成は、必要に応じてＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じ、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする。両技術とも、モデルシステムにおいて有効であることが実証されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンス又は三重へリックスオリゴヌクレオチドの設計に必要である。
【０３２３】
（５．１６　　診断用アッセイおよびキット）
本発明は、核酸プローブ又は本発明の抗体（必要に応じて結合体化されるかまたは他に適切な標識と結合される）を使用することにより、本発明のＯＲＦの１つ又はそのホモログの存在又は発現を、試験サンプル中で同定する方法もさらに提供する。
【０３２４】
一般的に、本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法は、ポリヌクレオチドに結合し複合体を形成する化合物をその複合体の形成に必要な時間サンプルと接触させる工程、およびその複合体を検出する工程を包含し得る。その結果、もし複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドもサンプル中で検出される。このような方法はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このような条件下で本発明のポリヌクレオチドをアニールする核酸プライマーにサンプルと接触させる工程、そしてアニールされたポリヌクレオチドを増幅させる工程を包含し得る。その結果、もしポリヌクレオチドが増幅すれば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中に検出される。
【０３２５】
一般的に、本発明のポリペプチドを検出する方法は、ポリペプチドに結合し複合体を形成する化合物をその複合体の形成に必要な時間サンプルと接触させる工程、そしてその複合体を検出する工程を包含する。その結果、もし複合体が検出されれば、本発明のポリペプチドもサンプルの中に検出される。
【０３２６】
詳細には、このような方法は、試験サンプルを本発明の抗体の１つ以上、又は核酸プローブの１つ以上とインキュベートさせる工程、そして試験サンプル内の成分と核酸プローブまたは抗体の結合についてアッセイする工程を包含する。
【０３２７】
核酸プローブまたは抗体を試験サンプルと共にインキュベートする条件は変化する。インキュベーション条件は、アッセイに使われるフォーマット、使用される検出方法、アッセイに使用される核酸プローブまたは抗体の型及び性質に依存している。当業者は、一般に入手可能なハイブリダイゼーション、増幅、又は免疫学的アッセイフォーマットのうちのいずれか１つが、本発明の核酸プローブ又は抗体を使用するために容易に適合され得ることを認識する。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ、Ｔ．，Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｈｔｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ　第一巻（１９８２）、第二巻（１９８３）、第三巻（１９８５）；Ｔｉｊｉｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）において見出され得る。本発明の試験サンプルとしては、細胞、タンパク質又は細胞の膜抽出物、生体液（痰、血液、血清、血漿、尿等）が挙げられる。上述の方法に使用される試験サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、アッセイされるサンプルとして使われる組織、細胞、又は抽出物の性質等に依存して変化する。細胞のタンパク質抽出物又は膜抽出物の調製のための方法は当該分野で周知であり、利用されるシステムと適合性のサンプルを獲得するために容易に適合され得る。
【０３２８】
本発明の別の実施形態では、本発明のアッセイを実行するのに必要な試薬を含むキットが提供される。特に本発明は、１つ以上の容器を密接に閉じ込めて受容する区画キットを提供し、この容器は、以下を包含する：（ａ）本発明のプローブ又は抗体のうちの１つを含む第一の容器；および（ｂ）以下の１つ以上を含む１つ以上の他の容器：洗浄試薬、結合プローブ又は抗体の存在を検出し得る試薬。
【０３２９】
詳細には、区画キットには、試薬を各々異なる容器に入れている任意のキットが含まれる。このような容器としては、小さいガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチックや紙の切れ端が挙げられる。このような容器を使うと、試薬を１つの区画から別の区画に効果的に効率的に移すことが可能となり、その結果サンプルおよび試薬は混じり合うことがないし、各容器に入っている因子や溶液を定量的に、１つの区画キットから別の区画キットへ添加し得る。このような容器としては、試験サンプルを入れる容器、アッセイに使用される抗体を入れる容器、洗浄試薬（リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝液等）を入れる容器、および結合抗体やプローブを検出するのに使われる試薬を入れた容器等がある。検出試薬の型には、標識された核酸プローブ、標識された二次抗体、あるいは一次抗体が標識されている場合は、標識された抗体と反応可能な酵素又は抗体の結合試薬が含まれる。当業者は、本発明で開示されたプローブ又は抗体が、当該分野で周知の確立されたキットフォーマットのいずれに組み込まれているか容易に分かるはずである。
【０３３０】
（５．１７　　医療画像化）
本発明の新規のポリペプチド及び結合パートナーは、本発明の分子を発現する部位の医療画像化にとって有益である（例えば本発明のポリペプチドが免疫反応に関係している場所、炎症又は感染部分の画像化等）。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ等、米国特許第５，４１３，７７８号を参照のこと。このような方法には、標識薬又は画像剤の化学的付着、薬学的に受容可能なキャリア中で被験体に標識ポリペプチドを投与、標的部位でインビボでの標識ポリペプチドの画像化を含む。
【０３３１】
（５．１８　　スクリーニングアッセイ）
本発明は、単離されたタンパク質及びポリヌクレオチドを使うことにより、配列番号１〜３、１０〜１３又は１５に示されているヌクレオチド配列のいずれかに対応するＯＲＦによりコードされているポリペプチドと結合した因子、又はその核酸によりコードされたポリペプチドの特異的ドメインと結合している因子を獲得および同定する方法をさらに提供する。上記方法の詳細は、以下の工程を包含する：
（ａ）本発明のＯＲＦによりコードされた単離されたタンパク質または本発明の核酸を因子に接触させる工程；および
（ｂ）その因子が上記タンパク質又は上記核酸と結合するかどうか決定する工程。
従って一般的に、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定するためのこのような方法は、本発明のポリヌクレオチドと化合物をポリヌクレオチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させる工程、およびその複合体を検出する工程を包含し、その結果、もしポリヌクレオチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される。
【０３３２】
従って同様に一般的に、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するためのこのような方法は、本発明のポリペプチドと化合物をポリペプチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させる工程、およびその複合体を検出する工程を包含する。その結果、もしポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定される。
【０３３３】
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法はまた、本発明のポリペプチドと化合物を細胞中で、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに必要な時間接触させる工程であって、ここで、その複合体は細胞中でレセプター遺伝子配列の発現を促す工程、レセプター遺伝子配列の発現を検出することによって、その複合体を検出する工程を包含する。その結果、もしポリペプチド／化合物複合体が検出されれば、本発明のポリペプチドに結合する化合物が同定される。
【０３３４】
このような方法を介して同定される化合物には、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物（つまりその化合物の非存在下で観察される活性と比べポリペプチドの活性を増大させたり減少させたりする化合物）も含めることができる。あるいは、このような方法で同定される化合物の中には、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する化合物（つまりその化合物の非存在下で観察される発現レベルと比べ発現を増大させたり減少させたりする化合物）を含み得る。本発明の方法を使って同定されるような化合物は、当該分野で周知の標準アッセイ方法を用いて、活性／発現の調節能力について試験され得る。
【０３３５】
上述のアッセイでスクリーニングされる因子には、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、他の薬学的な因子を含むがこれらに限定されない。これらの因子は、無作為に選別およびスクリーニングされ得るか、またはタンパク質モデリング技術を使って、合理的に選別もしくは設計され得る。
【０３３６】
無作為スクリーニングの場合、ペプチド、炭水化物、薬学的に受容可能な因子などは無作為に選択され、本発明のＯＲＦによりコードされているタンパク質へ結合する能力についてアッセイされる。あるいは、因子は合理的に選別又は設計することも可能である。本明細書中では、ある因子が特定のタンパク質の構造に基づいて選択される時、その因子は「合理的に選別又は設計される」といわれる。例えば、当業者は、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えばＨｕｒｂｙ等、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，「Ｉｎ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ（１９９２），２８９−３０７、およびＫａｓｐｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９２３０−８（１９８９））、又は薬学的な因子などを作るために、現在利用可能な手順を容易に適用して、特定のペプチド配列に結合する能力を持つペプチドや薬学的因子などを生産する。
【０３３７】
前述の内容に加えて、広義に記載されるように、本発明のあるクラスの因子は、本発明のＯＲＦ又はＥＭＦの１つへの結合を通して、遺伝子発現をコントロールするために使用できる。上述のように、このような因子は無作為にスクリーニングされ得るか、または合理的に設計／選別され得る。当業者は、ＯＲＦ又はＥＭＦを標的にすることにより、単一のＯＲＦ又は複数のＯＲＦ（いずれも発現制御の面で同じＥＭＦに依存）のいずれかの発現を調節し、配列特異的又は要素特異的の因子を設計することができる。あるクラスのＤＮＡ結合因子は、ハイブリダイズするか、あるいはＤＮＡ又はＲＮＡに結合することにより三重へリックスを形成する、塩基の残基を含む因子である。このような因子は、古典的なリン酸ジエステル、リボ核酸骨格に基づいていても良いし、塩基付着能力を有する種々のスルフヒドリル誘導体又は重合誘導体でも良い。
【０３３８】
このような方法に使用される因子は、普通２０〜４０の塩基を含んでおり、転写に関係する遺伝子の領域に相補的であるように（三重へリックス‐Ｌｅｅ等、Ｎｕｅｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．　６：３０７３　（１９７９）；　Ｃｏｏｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６　（１９８８）；　及びＤｅｒｖａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：　１３６０　（１９９１）を参照のこと）、あるいはｍＲＮＡ自体に相補的であるように（アンチセンス‐Ｏｋａｎｏ、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５６：５６０　（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））設計されている。三重ヘリックス形成は、必要に応じてＤＮＡからＲＮＡへの転写阻害をもたらし、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡをポリペプチドへの翻訳をブロックする。両技術とも、モデル・システムに於いて有効であることが証明されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンス、三重ヘリックスオリゴヌクレオチド、その他のＤＮＡ結合因子の設計にとって必要である。
【０３３９】
本発明のＯＲＦの１つによりコード化されているタンパク質に結合する因子は、診断剤として使用され得る。本発明のＯＲＦの１つによりコードされているタンパク質に結合する因子は、薬学的組成物の生成のために既知の技術を使用して処方され得る。
【０３４０】
（５．１９　プローブとしての核酸の使用）
本発明の別の局面は、天然に存在するヌクレオチド配列を使ってハイブリダイズし得るポリペプチド特有の核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することにある。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列番号１〜３、１０〜１３または１５のうちのいずれかに由来し得る。対応する遺伝子は限られた数の組織にしか発現されないので、ヌクレオチド配列番号１〜３、１０〜１３および１５のいずれかに由来するハイブリダイゼーションプローブは、サンプル中の組織のような細胞型のＲＮＡの存在の指標として使用され得る。
【０３４１】
例えば、インサイチュハイブリダイゼーションのような任意の適切なハイブリダイゼーション手法が使用され得る。米国特許第４，６８３，１９５号と同４，９６５，１８８号に記載されるＰＣＲは、ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドのさらなる用途を提供する。ＰＣＲに用いられるこのようなプローブは組み換え起源であってもよいし、化学的に合成されてもよいし、またはその混合でもよい。プローブは、同一配列の検知のための別々のヌクレオチド配列、または密接に関係したゲノム配列の同定のための可能性のある配列の変性プールを含む。
【０３４２】
核酸のための特定のハイブリダイゼーションプローブを製造する他の手段には、ｍＲＮＡプローブの製造のためのベクターに核酸配列をクローン化する手段が含まれる。このようなベクターは、当業者に公知であり、市販されており、Ｔ７またはＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼのような適切なＲＮＡポリメラーゼ、および適切に放射線標識したヌクレオチドを添加することによって、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。ヌクレオチド配列は、それぞれのゲノム配列をマップするためのハイブリダイゼーションプローブを構成するために使用され得る。本明細書中で提供されるヌクレオチド配列は、周知の遺伝子および／または染色体地図作成手法を使用して、ある染色体または染色体の特定領域に対してマップすることができる。これらの手法には、インサイチュハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、ライブラリーを使ったハイブリダイゼーションスクリーニングまたは既知の染色体特異的なフローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体調製などがある。染色体分布の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションの手法は、とりわけＶｅｒｍａら（１９８８）　Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ＮＹ．に記載されている。
【０３４３】
染色体調製物の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションおよびその他の物理的染色体地図作成手法は、さらなる遺伝子地図データと相関し得る。遺伝子地図データの例は、１９９４　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）に見出され得る。物理的な染色体地図上の核酸の位置と特定の疾病（または特定の疾病に罹りやすい性質）の相関性は、その遺伝疾患と関連するＤＮＡの領域を限定する上で役立つ。本発明のヌクロチド配列は正常者、保菌者または罹患した個体の間の遺伝子配列の違いを検知するのに使用され得る。
【０３４４】
（５．２０　　支持体に結合されるオリゴヌクレオチドの調製）
オリゴヌクレオチド、すなわち、核酸の小セグメントは、例えば自動オリゴヌクレオチド合成装置を使って一般的に行われているように化学的方法によってオリゴヌクレオチドを直接合成することによって、容易に調製され得る。
【０３４５】
支持体結合されたオリゴヌクレオチドは、当業者には公知のガラス、ポリスチレンまたはテフロン（登録商標）のような任意の適当な支持体を使う方法のいずれかによって調製され得る。１つのストラテジーは、標準的な合成装置を使って合成されたオリゴヌクレオチドを正確にスポットするストラテジーである。固定は、受動的吸着を使用して（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｈｏｎｄｏ、１９９０　Ｊ．　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　２８（６）　１４６２−７２）；紫外線を使用して（Ｎａｇａｔａら、１９８５；Ｄａｈｌｅｎら、１９８７、ＭｏｒｒｉｓｓｅｙおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　１９８９　３　（２）　１８９−２０７）または改変されたＤＮＡの共有結合（Ｋｅｌｌｅｒら、１９８８；　１９８９）などによって達成され得、これらの参考文献は本明細書中に明確に援用される。
使用され得る別のストラテジーは、リンカーとして強力なバイオチン−ストレプトアビジン相互作用の使用である。例えば、Ｂｒｏｕｄｅら（１９９４）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９１（８）　３０７２−６は、ビオチン化したプローブの使用について記載しており、それらはストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ上に固定された二重鎖プローブである。ストレプトアビジンを被覆したビーズはＤｙｎａｌ，Ｏｓｌｏから購入され得る。もちろん、同じリンクのための化学はストレプトアビジンを用いる任意の表面を被覆するのに適用され得る。ビオチン化したプローブは、例えば、Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）のような種々の供給源から入手され得る。
【０３４６】
Ｎａｎｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）もまた、使用され得る適切な材料を販売している。Ｎａｎｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＤＮＡが、Ｃｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨと呼ばれるマイクロウェル表面に共有結合し得る方法を開発した。Ｃｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨは、更なる共有結合のための橋頭堡（ｂｒｉｄｅ−ｈｅａｄ）として役立つ第２のアミノ基（＞ＨＮ）が移植されたポリスチレン面である。Ｃｏｖａｌｉｎｋモジュールは、Ｎａｎｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され得る。ＤＮＡ分子はホスホラミダイト結合によりＣｏｖａｌｉｎｋの５’端に排他的に結合され得、１ｐｍｏｌ以上のＤＮＡの固定を可能にする（Ｒａｓｍａｓｓｅｎら、（１９９１）　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８（ｌ）　１３８−４２）。
【０３４７】
ＤＮＡ分子の５’端への共有結合のためのＣｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨストリップの使用が記載されている（Ｒａｓｍａｓｓｅｎら、１９９１）。この技術においては、ホスホラミド結合が使用されている（Ｃｈｕら、１９８３　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　１１（１８）　６５１３−２９）。これは、単一の共有結合のみを使用しる固定が好ましいときに有利である。ホスホラミダイト結合が、ＤＮＡをＣｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨ第２アミノ基に加える。これは、長さ２ｎｍのスペーサーアームを介して、ポリスチレン表面に共有結合的に移植したスペーサーアームの端部に位置している。オリゴヌクレオチドを、ホスホラミダイト結合を介してＣｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨにリンクするためには、オリゴヌクレチド末端は５’端リン酸基を有さなければならない。おそらくビオチンをＣｏｖａｌｉｎｋに共有結合し、ストレプトアビジンはプローブを結合するために使用され得る。
【０３４８】
より詳細には、この連結方法はＤＮＡを水（７．５　ｎｇ／ｕｌ）に溶解する工程、１０分間９５℃で変性する工程、氷で１０分間冷やす工程を包含する。次に、氷で冷やした０．１　Ｍ　１−メチルイミダゾール、ｐＨ　７．０　（１−ＭｅＩｍ７）を加えて、最終的な濃度を１０　ｍＭ　Ｉ−ＭｅＩｍ７．とする。次いで、ｓｓ　ＤＮＡ溶液を氷上のＣｏｖａｌｉｎｋ　ＮＨストリップ（７５　ｕｌ／ｗｅｌｌ）に分配する。
【０３４９】
１０　ｍＭ　１−ＭｅＩｍ７　に溶解したカルボジイミド０．２Ｍ　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）を新たに作り、ウエルあたり２５ｕｌ加えた。ストリップは５０℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後、ストリップを例えばＮａｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　Ｗａｓｈを使って洗浄した；最初に、ウエルを３回洗い、その後５分間洗浄液に浸漬し、最後に３回洗浄した（ここで、洗浄液は５０℃に温めた０．４Ｎ　ＮａＯＨ、０．２５　％　ＳＤＳであった）。
【０３５０】
本発明の使用にさらに適した方法は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ　９０／０３３８２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＆Ｍａｓｋｏｓ）に記載される方法であることが意図され、これは、本明細書中に参考として援用される。支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを調製する方法は、支持体によって保有される脂肪性ヒドロキシル基への共有結合リン酸ジエステル結合によって、リン酸基を介してヌクレオシド３’−試薬を連結する工程を包含する。次いで、オリゴヌクレオチドは、支持されたヌクレオシドと合成オリゴヌクレオチド鎖から取り除かれた保護基に、支持体からオリゴヌクレオチドを切断しないような標準条件下で合成される。適切な試薬としては、ヌクレオシドホスホラミダイトおよびヌクレオシドリン水素ホスファレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ）が含まれる。
【０３５１】
ＤＮＡプローブアレイの調製のためのＤＮＡプローブの調製についてのオンチップのストラテジーが用いられ得る。例えば、アドレス可能なレーザー操作光防護解除（ｐｈｏｔｏｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）は、ガラス表面上での直接的なオリゴヌクレオチドの化学合成に用いられ得る。このことに関しては、Ｆｏｄｏｒ（（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１（４９９５）７６７−７３）らにより開示されており、本明細書中で参考として援用される。プローブはまた、ナイロン支持体の上に固定され得、このことに関しては、Ｖａｎ　Ｎｅｓｓら（（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９（１２）３３４５−５０）により開示される。また、プローブは、ＤｕｎｃａｎおよびＣａｖａｌｉｅｒ（（１９８８）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１６９（ｌ）１０４−８）の方法を用いてテフロン（登録商標）に連結され得る；これらすべての参照文献は、本明細書中で参考として援用される。
【０３５２】
オリゴヌクレオチドをナイロン支持体に連結するために、Ｖａｎ　Ｎｅｓｓら（１９９１）に記載されるように、ナイロン表面をアルキル化によって活性化および、シアヌル酸塩化物でオリゴヌクレオチドの５’−アミンの選択的活性化が必要とされる。
【０３５３】
支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを調製するための１つの特定の方法は、Ｐｅａｓｅら（（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９１（１１）５０２２−６）により記載された光合成法を用いることである。これらの著者は、固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイ（ＤＮＡチップ）を作成するために近年の写真平版技術を用いた。光を使って高密度でのオリゴヌクレオチドプローブを合成に指向するこれらの方法、ミニチュア化されたアレイは、感光性５’−保護Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシドホスホラミダイト、表面リンカー化学特性および多様な複合合成ストラテジーを用いる。この方法で、２５６個の空間的に定義されたオリゴヌクレオチドプローブのマトリクスが作成され得る。
【０３５４】
（５．２１　核酸フラグメントの調製）
核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、マイクロ切断染色体バンド、コスミドまたはＹＡＣインサート、およびＲＮＡ（任意の増幅工程のないｍＲＮＡを含む）のような任意の適切な供給源から獲得され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）は、哺乳類細胞由来の高分子量ＤＮＡの単離のためのプロトコルについて記載している（９．１４〜９．２３頁）。
【０３５５】
ＤＮＡフラグメントは、Ｍ１３、プラスミドまたはラムダベクターにクローンとして、および／もしくはＰＣＲまたは他の増幅方法によってゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから直接調製され得る。サンプルは、マルチウェルプレート上で調製または分配され得る。約１００−１０００ｎｇのＤＮＡサンプルが、終容量２−５００ｍｌ中に調製され得る。
【０３５６】
次いで核酸は、当業者に公知の任意の方法により（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の９．２４〜９．２８に記載される制限酵素を用いることにより、超音波とＮａＯＨ処理で切断することにより）、断片化される。
【０３５７】
低圧せん断法もまた、Ｓｃｈｒｉｅｆｅｒら（（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８（２４）７４５５−６）により記載されるように、適切である。この方法では、ＤＮＡサンプルは、低圧から中圧の種々の圧力の小型のフレンチプレッシャーセルを通過する。レバーデバイスは、細胞に対する低圧から中圧の圧力の制御された適用を可能にする。これらの研究の結果は、低圧切断が超音波および酵素によるＤＮＡフラグメンテーション法の有用な代替であることが示す。
【０３５８】
ＤＮＡのフラグメンテーションのための１つの特定の適切な方法として、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０（１４）３７５３−６２）によって記載される２塩基認識エンドヌクエアーゼ、ＣｖｉＪＩを使用する方法が考慮される。これらの著者は、彼らがショットガンクローニングおよび配列決定に適当であると考える特定のサイズへのＤＮＡの迅速なフラグメンテーションおよび分画のためのアプローチを記載した。
【０３５９】
制限エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩは通常、ＧとＣとの間の認識配列ＰｕＧＣＰｙを切断して平滑末端を残す。この酵素（ＣｖｉＩＬ＊＊）の特異性を変化させる特殊な反応条件は、低分子ｐＵＣ１９（２６８８個の塩基対）に形成される、ＤＮＡフラグメントの準無作為的な産生を可能にする。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら（１９９２）は、高速ゲル過法によってサイズ分画されたｐＵＣ１９のＣｖｉＪＩ＊＊消化および末端修復なしの、ｌａｃＺマイナスＭ１３クローニングベクターへの直接的な連結を用いて、このフラグメンテーションストラテジーの無作為度を定量的に評価した。７６個のクローンの配列決定分析は、ＣｖｉＪＩ＊＊が、ｐｙＧＣＰｙとＰｕＧＣＰｕ、それに加えてＰｕＧＣＰｙ部位を制限すること、および新しい配列データがランダムフラグメンテーションと一致する割合で累積されることを示した。
【０３６０】
文献で報告されているように、超音波破砕およびアガローズゲル分画と比較したこのアプローチの利点は：必要なＤＮＡの量が少ないこと（２−５μｇの代わりに０．２−０．５μｇ）；処理ステップが少ない（プレライゲーション、末端修復、化学的抽出、またはアガローズゲル電気泳動および溶出が不要）という点が挙げられる。
【０３６１】
核酸フラグメントの獲得または調製の方法の如何にかかわらず、ＤＮＡを変性してハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖片を提供することが重要である。これは、ＤＮＡ溶液を８０−９０℃で２−５分間インキュベートすることによって達成される。この溶液を次に２℃まで急冷し、ＤＮＡフラグメントがチップに接触する前に再び再生することを防ぐ。リン酸基はまた、当業者に公知の方法でゲノムＤＮＡから除去されなければならない。
【０３６２】
（５．２２　ＤＮＡアレイの調製）
アレイは、ナイロンメンブレンのような支持体の上にＤＮＡサンプルをスポットすることによって調製され得る。スポットは、金属製ピンのアレイ（その位置はマイクロタイタープレートのウェルのアレイに対応する）を使い、約２０ｎｌのＤＮＡ溶液をナイロンメンブレンに移すことを繰り返すことで行われ得る。オフセットプリントにより、ウェルの密度より高いドット密度が得られる。１〜２５のドットは、使用されるラベルのタイプに依存して１ｍｍ２　当たりで達成され得る。いくつかのあらかじめ選ばれた数の行と列にスポットすることを避けることにより、別のサブセット（サブアレイ）を形成し得る。１つのサブアレイ中のサンプルは、異なる個体のＤＮＡの同じゲノムセグメント（または同じ遺伝子）であるか、または異なるオーバーラップするゲノムクローンでであり得る。各サブアレイは同じサンプルのレプリカのスポットを表し得る。１つの例では、選択された遺伝子セグメントは、６４人の患者から増幅されたものである。各患者に対して、増幅された遺伝子セグメントが、１枚の９６ウェルプレート上にあり得る（全９６ウェルが同じサンプルを持っている）。６４人の患者１人１人に１枚のプレートが調製される。９６ピンのデバイスを使うことにより、すべてのサンプルが１枚の８×１２ｃｍのメンブレンにスポットされ得る。サブアレイは、各患者から１つずつ、６４サンプルを含み得る。９６のサブアレイが同一であるとき、ドットスパンは１ｍｍ２で、サブアレイ間に１ｍｍの間隔があり得る。
【０３６３】
別のアプローチとしては、物理的なスペーサ−（例えば、プラスチックグリッド（メンブレンに渡って成形されており、そのグリッドはマルチウェルプレート、または疎水性ストリップの底部に適用されるメンブレンの種類と類似である））によって分配され得るメンブレンまたはプレート（ＮＵＮＣ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使う方法である。固定された物理的スペーサーは、平面リン保存スクリーン（ｆｌａｔ　ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｓｔｏｒａｇｅ　ｓｃｒｅｅｎ）、またはＸ線フィルムへの曝露によるイメージングには好ましくない。
【０３６４】
本発明を以下の例で説明する。この開示により、当業者には本発明の範囲の中で、多くの他の実施例や変更ができることは明らかである。したがって、本発明の広範囲の局面は、以下の実施例の開示によって制限されるべきではない。本発明は、本発明の１つの局面を示すことを意図した実施例によって範囲を制限されるべきではなく、そして、機能的に同等な組成物および方法は発明の範囲内にある。事実、ここに示す望ましい実施例を考察すれば当業者にとって本発明の実施において多くの修飾および改変が可能である。したがって、本発明の範囲における唯一の制限は、添付された請求項によるもののみである。
【０３６５】
本明細書中に列挙されるすべての参考文献は、その全体を参考として援用される。
【０３６６】
（６．０　実施例）
（実施例１）
（ヒト白血球のｃＤＮＡライブラリー由来の配列番号１の単離）
複数の新規の核酸を、標準のＰＣＲ、ハイブリダイゼーション配列シグネチャー分析による配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列技術を用いて、ヒトの卵巣から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得た（Ｈｙｓｅｑクローン認識番号７７３５６５６（配列番号１）および７７２７０６５（配列番号１１））。ライブラリーのインサートを、インサートに隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使ってＰＣＲにより増幅した。このサンプルを、ナイロンのメンブレンにスポットし、そしてオリゴヌクレオチドプローブを使って検定し、配列シグネチャーを与えた。これらのクローンを、類似のまたは同一の配列ごとに分類し、単一の代表的なクローンを、ゲル配列決定のために各グループから選択した。次いで増幅されたインサートの５’配列を、典型的なＳａｎｇｅｒ配列プロトコルにおける逆Ｍ１３配列プライマーを使って推定した。ＰＣＲ生成物を精製し、そして蛍光色素ターミネーターサイクル配列決定（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）に供した。シングルパスゲル配列決定を、３７７Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサーを使って行った。インサートを、このライブラリーからは従来得られなかったものであり、また、公開されているデータベースにはない新規な配列であると同定した。この配列は配列番号１および配列番号１１と名付けられた。
【０３６７】
（実施例２）
（配列番号２および配列番号１２の集合）
配列番号２および配列番号１２と名付けられた本発明の核酸を、ＥＳＴ配列、配列番号１または配列番号１１をそれぞれシードとして使って集合させた。次に因果循環（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）アルゴリズムを用いて、異なるデータベース（すなわち、ＨｙｓｅｑのＥＳＴ配列を含むデータベース、ｄｂＥＳＴバージョン１１４、ｇｂ　ｐｒｉ　１１４、およびＵｎｉＧｅｎｅバージョン１０１）からこの集合体に属するさらなる配列を引き出すことによりシードを伸長し伸長集合体を得た。集合体を伸長する上述のデータベースからのさらなる配列がそれ以上なくなったとき、アルゴリズムを停止した。構成要素配列の集合体への組み入れは、伸長集合体に対するＢＬＡＳＴＮヒットが３００以上のＢＬＡＳＴスコアであり、９５％以上の同一性であることに基づいた。
【０３６８】
集合コンティグに対する最も近い結果を、ＦＡＳＴＸＹアルゴリズムを使い、Ｇｅｎｐｅｐｔリリース１１４に対してＦＡＳＴＡバージョン３のサーチを行うことにより得た。ＦＡＳＴＸＹはＦＡＳＴＡアラインメントの改良版で、インコドンフレームシフトを可能にする。最も近い結果は、Ｇｅｎｐｅｐｔからの各集合体に対して最も近いホモログ（およびこの集合体がコードする翻訳されたアミノ酸配列を含む）を示した。最も近い結果を以下に示す。
【０３６９】
【表１】
2004508804.tif 000003
シグナルペプチド配列およびその切断部位をコードする集合コンティグ内のヌクレオチド配列を、Ｎｅｕｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　ＳｉｇｎａｌＰ　Ｖ１．１プログラム（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｅ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｄｅｎｍａｒｋ）を使って決定し得た。原核生物および真核生物シグナルペプチドおよびそれらの切断部位を同定するためのプロセスはまた、Ｈｅｎｒｉｋ　Ｎｉｅｌｓｏｎ，Ｊａｃｏｂ　Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｓｏｒｅｎ　ＢｒｕｎａｋおよびＧｕｎｎａｒ　ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅの“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓｉｔｅｓ”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、第１号、１−６頁（１９９７）によって開示されており、これは本明細書中で参考として援用される。Ｎｉｅｌｓｏｎらの参考文献に記載される最大Ｓスコアおよび平均Ｓスコアは、それぞれの集合コンティグに対して獲得される。予測されるシグナル配列の最初のアミノ酸から始まり、４５個のアミノ酸配列が記載される。配列中の４５個のアミノ酸のすべてがシグナルペプチドを含むわけではない。
【０３７０】
【表２】
2004508804.tif 000004
配列番号２に対して予測されるアミノ酸配列は、翻訳された新規ポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドとを比較することによって、ポリペプチドを選択するＦＡＳＴＹ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ：ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕから入手可能）と呼ばれるソフトウェアプログラムを使って得られた（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６３−９８（１９９０）、これは本明細書中で参考として援用される）。
【０３７１】
【表３】
2004508804.tif 000005
（実施例３）
（配列番号３の集合）
配列番号３の新規のヌクレオチド配列の集合を、ＥＳＴ配列、配列番号１をシードとして使って得た。このシードを、ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアプログラムとＨｙｓｅｑ（特許）ソフトウェアを使って、ＥＳＴ配列を含むＨｙｓｅｑ（特許）データベースからさらなる配列を引き出すことにより、および３’末端を伸長するプライマーを用いるゲル配列決定（３７７　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサー）することにより伸長した。構成要素配列の集合体への組み入れは、ＢＬＡＳＴスコアが１０００以上、ｐ値がｐ−３（ホモロジーの長さ依存する）であることに基いた。５’末端は、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡユーザーマニュアル（ＰＴ１１５６−１）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示されるようにＲＡＣＥを使って伸長した。
【０３７２】
（実施例４）
（配列番号１０の集合）
配列番号１０の新規のヌクレオチド配列の集合を、ＥＳＴ配列、配列番号１をシードとして用いて達成した。このシードは、３’末端を伸長するためのプライマーを用いたゲル配列決定（３７７　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサー）により、さらに伸長された（プライマー伸長）。５’末端を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ　ｃＤＮＡユーザーマニュアル（ＰＴ１１５６−１）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示されるようにＲＡＣＥを使って伸長した。
【０３７３】
（実施例５）
（配列番号１３の集合）
ＰＨＲＡＰ（Ｕｎｉｖ．　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）またはＣＡＰ４（Ｐａｒａｃｅｌ）を使用して、全長遺伝子ｃＤＮＡ配列およびそれに対応するタンパク質配列を配列番号１２の集合体から生成した。任意のフレームシフトおよび停止ゴドンの誤りは手動で訂正した。編集中に、配列を、ＦＡＳＴＹおよび／またはＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎｂａｎｋ（すなわち、Ｇｅｎｅｐｅｐｔリリース１１５）に対してチェックした。編集過程で使用され得た他のコンピュータプログラムとしては、ｐｈｒｅｄＰｈｒａｐおよびＣｏｎｓｅｄ（Ｕｎｉｖ．　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）およびｅｄ−ｒｅａｄｙ、ｅｄ−ｅｘｔおよびｃｇ−ｚｉｐ−２（Ｈｙｓｅｑ、Ｉｎｃ．）がある。この全長ヌクレオチド配列を配列番号１３として示す。
【０３７４】
ポリペプチド（配列番号１４）は、以下に示す配列番号１３によってコードされると予測された。このポリペプチドを、翻訳された新規のポリヌクレオチドと既知のポリペプチドとの比較に基づいて、ポリペプチドを選択するＢＬＡＳＴＸ／ＦＡＳＴＹと呼ばれるソフトウェアプログラムを使って予測した。最初のメチオニンＡＴＧは、ヌクレオチド配列および推定ストップコンドンの５４位から始まり、ＴＡＡ、１０３４位のコード領域で終わる。
【０３７５】
（実施例６）
（Ａ．細胞における配列番号４〜９、１４および１６〜１８の発現）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはその他の適切な細胞型を、ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）中で、７０％の集密度になるまで培養する。トランスフェクションの前に、培地をＤＭＥＭおよび０．５％　ＦＣＳに交換する。細胞を、ＦｕＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）によって、配列番号２−３、１０、１２−１３または１５のｃＤＮＡもしくはｐＢＧａｌベクターを用いてトランスフェクションする。要約すれは、４μｌのＦｕＧＥＮＥ−６を１００μｌのＤＭＥＭに希釈し、５分間インキュベートする。次いで、これに１μｇのＤＮＡが加えられ、１５分間インキュベートしたのち、これを３５　ｍｍディッシュのＣＨＯ細胞に加える。ＣＨＯ細胞を、３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートする。２４時間後に、培地と細胞溶解産物を収集し、遠心分離し、そしてアッセイ緩衝液に対して透析する（１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３４ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、３ｍＭ　ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２）。
【０３７６】
（Ｂ．　配列番号２−３、１０、１２−１３または１５を使った発現研究）
さまざまな組織における配列番号２−３、１０、１２−１３または１５の発現を、準定量的ポリメラーゼ連鎖反応をベースとする技術を使って分析した。ヒトのｃＤＮＡライブラリーを、目的の組織（成人の膀胱、成人の脳、成人の心臓、成人の腎臓、成人のリンパ節、成人の肝臓、成人の肺、成人の卵巣、成人の胎盤、成人の直腸、成人の脾臓、成人の精巣、骨髄、胸腺、甲状腺、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肝臓−脾臓、胎児の皮膚、胎児の脳、胎児の白血球およびマクロファージ）から発現された遺伝子の供給源として用いる。遺伝子特異的プライマーを使って、サンプルから配列番号２−３、１０、１２−１３または１５の配列の部分を増幅する。増幅された生成物を、アガローズゲルで分離し、ナイロンフィルターに転移して化学的に連結させる。このフィルターは、次に配列番号２−３、１０、１２−１３または１５から生成された放射線標識（３３Ｐ−ｄＣＴＰ）二本鎖プローブと、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使い、ランダムプライム法でハイブリダイズさせる。そのフィルタを洗浄し（高ストリンジェンシー）、数時間にわたりホスホイメージングスクリーンに曝す。バンドは、特定のライブラリー内の配列番号２−３、１０、１２−１３または１５の配列を含むｃＤＮＡの存在、したがって対応する細胞タイプまたは組織中のｍＲＮＡの発現の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、（「プロトロンビナーゼ様」として同定される）配列番号３でコードされたタンパク質（すなわち配列番号４）とヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質（「プロトロンビナーゼＦｇ１２」）（配列番号１９）との間のＢＬＡＳＴＸアミノ酸配列のアライメントを示し、これは、この２つの配列が、配列番号４の２９１アミノ酸残基について５３％の相同性、配列番号４の２９１のアミノ酸残基について３７％の同一性を共有することを示す：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである。ギャップを破線で示す。
【図２】
図２は、（「プロトロンビナーゼ様」として同定される）配列番号１３でコードされたタンパク質（すなわち配列番号１４）とヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質（配列番号１９のアミノ酸１−２６９）との間のＢＬＡＳＴＰ配列のアライメントを示し、これは、２つの配列が、配列番号１４の１３２のアミノ酸残基について５４％の相同性、配列番号１４の１３２のアミノ酸残基について３７％の同一性があることを示す：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである。ギャップを破線で示す。
【図３】
図３は、（「プロトロンビナーゼ様」として同定される）配列番号１３でコードされたタンパク質（すなわち配列番号１４）とヒトのプロトロンビナーゼＦｇ１２タンパク質（配列番号１９のアミノ酸１６３−２７０）との間のＢＬＡＳＴＰアライメントを示し、これは、２つの配列が、配列番号１４の１１５のアミノ酸残基について４０％の相同性、配列番号１４の１１５のアミノ酸残基について３７％の同一性があることを示す：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである。ギャップを破線で示す。
【図４】
図４は、配列番号１４と、凝血、ｐｄｂ番号＝Ｉｆｚｃ＿ＢとのＭＳＩ　ＧｅｎｅＡｔｌａｓ（ジーンアトラス）アライメントを示す、これは、２つの配列が、２２４個のアミノ酸について３２％相同性、２２４個のアミノ酸について６９％の同一性が在ることを示す：ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシンである。スコア８６．２２、推定ｐ値は７．２ｅ−０４で、そして上限ｐ値は１．１ｅ−１１である。ＭＳＩ　ＧｅｎｅＡｔｌａｓレポートは、機能的予測に基づくタンパク質構造相同性（２次および３次のタンパク質構造の両方とも）を可能にし、これはスレッディング（ＳＥＱＦｏｌｄ）、高スループットモデリング、および配列プロフィールに基づく検索（ＰＢ９０）手法を利用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004508804.tif 000298
2004508804.tif 000299
2004508804.tif 000300
2004508804.tif 000301
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