(57)【要約】本発明はインターフェロン−α投与により上方調節されＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に記述されるｃＤＮＡに対応する遺伝子の同定に関するものである。この遺伝子の発現生成物の測定はＩ型インターフェロン受容体に作用するインターフェロン−α及びその他のインターフェロンによる治療に対する反応性を予測するのに有用性があると提案されている。同遺伝子によりコードされているタンパクを治療に使用することが意図されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列
（ｉｉ）　免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用から選択された実質的に同じ機能を有するその変異体；または
（ｉｉｉ）　免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用から選択された実質的に同じ機能を保持している（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント、
を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
該ポリペプチド及び／または天然に存在するその変異体に対する特異的抗体を作成するのに適したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記述されたアミノ酸配列により規定されるポリペプチドの変異体またはフラグメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸配列またはそのコード配列及び／またはその相補配列；
（ｂ）　（ａ）に定義した配列にハイブリッド形成する配列；
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）に定義した配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列；
（ｄ）　（ａ），（ｂ）または（ｃ）に定義した配列と少なくとも６０％の相同性を有する配列、
を含む、請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１または２に記載のポリペプチドを発現することができる請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドに特異的な抗原結合能力を保持している抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドのインビボ発現を指令する単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するための請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
癌治療に使用するための請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド及び医薬として受容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
該製品が癌治療において同時に、別々にまたは続けて使用するための併用製剤として使用するのに適した請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチド及び抗癌剤を含む製品。
【請求項１４】
抗ウイルス、抗腫瘍または免疫調節剤として治療に使用する医薬の調製のために請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの有効量を患者に投与することを含むＩ型インターフェロンで治療し得る疾患の患者を治療する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することを含むウイルス疾患の患者を治療する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することを含む患者における癌を治療または予防する方法。
【請求項１８】
抗癌剤及び請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載のポリヌクレオチドの有効量を含む併用製剤を該患者に投与することを含む患者の癌を治療または予防する方法。
【請求項１９】
その方法が請求項７に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件で培養しそして該ポリペプチドを単離することからなる請求項１または２に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリペプチドまたは天然に存在するその変異体を発現することができる細胞を準備し、被検化合物と該細胞を培養し、そして該ポリペプチドまたは変異体の上方調節を監視することからなる、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する化合物の同定方法。
【請求項２１】
ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４により規定されるアミノ酸配列のコード配列または該コード配列の天然に存在する変異体に対するアンチセンス配列をインビボで発現することができるポリヌクレオチド。
【請求項２２】
治療に使用するための請求項８に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２３】
該標的配列が請求項５（ａ）項に記載の配列の部分である請求項４に記載のｃＤＮＡ内の配列を標的とした核酸増幅のためのプライマーのセット。
【請求項２４】
そのプローブが請求項５（ａ）項に記載の配列の選択的検出に適している請求項３から５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドから誘導した核酸プローブ。
【請求項２５】
それが固相支持体に接着している請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
該検体をＩ型インターフェロン投与後の該患者から採取するかまたは該測定前にＩ型インターフェロンでインビトロ処理し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４により規定されるアミノ酸配列のコード配列または天然に存在するその変異体または対応するｍＲＮＡの該患者の細胞検体中レベルを測定することからなるＩ型インターフェロンで治療する患者の反応性の予測方法。
【請求項２７】
該検体を採取する前に投与するかまたは該検体のインビトロ処理に使用するインターフェロンが該患者の治療に推奨されるインターフェロンである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者の血液検体から単離した末梢血単核細胞を含む検体をＩ型インターフェロンでインビトロ処理する請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該測定がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４により記述される配列により規定されるタンパクまたは該タンパクの天然に存在するその変異体をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することからなる請求項２６から２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
請求項１に記載のポリペプチドを発現することができる非ヒト形質転換動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、そのコード配列が以前には不明と考えられていたインターフェロン−α（ＩＮＦ−α）により上方調節されるヒト遺伝子の同定に関するものである。この遺伝子の発現生成物の検出はＩ型インターフェロン受容体に作用するＩＦＮ−α及びその他のインターフェロンに対する反応性を予測するのに使用することができる。この遺伝子によりコードされている新規単離タンパクを治療に使用することも意図されている。
【０００２】
（発明の背景）
ＩＦＮ−αは多くの病気の治療に広く使用されている。ＩＦＮ−αを使用して治療し得る病気には、白血病、リンパ腫、及び固形腫瘍、ＡＩＤＳ−随伴カポジ肉腫のような新生物疾患及び慢性肝炎のようなウイルス感染が含まれる。またＩＦＮ−αは、自己免疫、マイコバクテリア、神経変性、寄生虫及びウイスルなどによる病気の治療に経口腔粘膜投与が提案されてきた。特に、ＩＦＮ−αは、例えば、多発性硬化症、癩、結核、脳炎、マラリア、頚癌、性器ヘルペス、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ及びＨＳＶ−１及び２の治療に推奨されてきた。また関節炎、狼瘡及び糖尿病の治療も示されている。新生物疾患、例えば多発性骨髄腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低度リンパ腫、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、類癌腫瘍、頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎腫瘍、腎細胞癌、肝細胞癌、鼻咽頭癌、血液癌、結腸・直腸癌、グリオブラストーマ、喉頭乳頭腫、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫及び脳腫瘍を含む悪性腫瘍、もまた経口腔粘膜、すなわち経口または経鼻、によるＩＦＮ−αの投与により治療し得ることが示されている。
【０００３】
ＩＮＦ−αはＩ型インターフェロンファミリーの１員であり、Ｉ型インターフェロン受容体と相互作用することによりその特異的生物活性を発現する。その他のＩ型インターフェロンとしてはＩＮＦ−β，ＩＦＮ−ω及びＩＮＦ−τがある。
【０００４】
残念ながら、インターフェロン−αのようなＩ型インターフェロンの潜在的治療対照である患者、例えば、慢性ウイルス性肝炎、新生物疾患及び再発多発性硬化症、が全てＩ型インターフェロンの治療に良好に反応することはなく、反応して長期の有用性を示すのは一部に過ぎない。医師がＩ型インターフェロンによる治療結果に信頼を置けないことは、高価な生物製剤の浪費及び治療時間の喪失という点のみならず深刻な副作用に患者を曝すという点においても、この治療の費用−効用比に関して重大な問題が生じる。さらに、ＩＦＮ−αの異常生産は多数の自己免疫疾患に関連することが示されている。このような理由から、Ｉ型インターフェロンは多数の遺伝子の発現を調節することによりその治療作用を発生しているので、Ｉ型インターフェロンが作用する遺伝子を同定することに非常に関心が有る。事実、患者が治療に良好に反応するか否かを決定する、Ｉ型インターフェロンに誘導される遺伝子発現のパターンが存在する。
【０００５】
（発明の要約）
ヒト遺伝子ｃＤＮＡは、経口腔粘膜または静脈内投与したＩＦＮ−αにより上方調節されたマウス遺伝子に対応することが今同定され、そして新規ＤＮＡであると考えられる。またこの対応ヒト遺伝子を今ＩＦＮ−α上方調節遺伝子と命名する。
【０００６】
この遺伝子によってコードされるタンパクを以下ＨＵＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ（ＡＴＰ依存性ＩＦＮ応答）タンパクと称する。このタンパク、及びその機能性変異体、は今治療薬、特に抗ウイルス、抗腫瘍または免疫調節剤として使用することが意図されている。例えば、自己免疫、マイコバクテリア、神経変性、寄生虫またはウイルスの病気、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、癩、結核、脳炎、マラリア、頚癌、性器ヘルペス、Ｂ型またはＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ及びＨＳＶ−１または２、または新生物疾患、例えば多発性骨髄腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低度リンパ腫、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、類癌腫瘍、頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎腫瘍、腎細胞癌、肝細胞癌、鼻咽頭癌、血液癌、結腸・直腸癌、グリオブラストーマ、喉頭乳頭腫、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫及び脳腫瘍を含む悪性腫瘍、の治療に使用することができる。言い換えると、そのタンパクはＩ型インターフェロンで治療し得る疾患の治療に使用することができる。
【０００７】
Ｉ型インターフェロンで治療された患者、例えばＩＦＮ−αを、例えば経口粘膜または静脈内投与により投与された患者、の細胞検体中の、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することはその治療に対する反応性を予測するのにも役立つであろう。さらに、それとは別に、より望ましく、例えばヒト末梢血単核細胞の検体をＩ型インターフェロンでインビトロ処理し、そしてＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子に対応する発現生成物、望ましくはｍＲＮＡ、の上方調節または下方調節を調べることによりその反応性を判断できることが判明した。
【０００８】
本発明の第一の態様によると、以下を含む単離ポリペプチドが提供される；
（ｉ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）　本質的に同じ機能、例えば、免疫調節活性及び／または抗ウイルス活性及び／または抗腫瘍活性を有するその変異体；または
（ｉｉｉ）　本質的に同じ機能、例えば、免疫調節活性及び／または抗ウイルス活性及び／または抗腫瘍活性を保持する（ｉ）または（ｉｉ）のフラグメント。
【０００９】
本発明はまた、ヒトまたはヒト以外の動物の薬物治療に使用する、より特異的には抗ウイルス、抗腫瘍または免疫調節剤として使用するタンパクを供給する。上記に示したように、その使用はＩ型インターフェロンで治療できる疾患にはいずれにも拡張することができる。そのタンパクは癌治療用の抗癌剤と併用して使用することができる。
【００１０】
本発明のその他の態様により、上記に定義した本発明のポリペプチドをコードしている単離ポリヌクレオチドまたはその相補体を供給する。そのポリヌクレオチドは下記からなる配列を含んでいる；
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の核酸またはそのコード配列及び／またはその相補的配列；
（ｂ）　（ａ）に定義した配列の相補的配列に、例えば厳密な条件の下に、ハイブリッド形成する配列；
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）に定義した配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列；
（ｄ）　（ａ），（ｂ）または（ｃ）に定義した配列と少なくとも６０％の相同性を持つ配列。
【００１１】
本発明はまた以下を供給する；
−　本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現することができる発現ベクター；
−　本発明の発現ベクターを含む宿主細胞；
−　本発明のポリペプチドに特異的な抗原結合能力を保有する抗体またはそのフラグメント；
−　ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその機能的変異体の有効量を該患者に投与することを含む、Ｉ型インターフェロンで治療し得る病気、ウイスル性疾患の患者を治療する方法または患者における癌の治療または予防の方法；
−　抗ウイルスまたは抗腫瘍または免疫調節剤、より特異的にはＩ型インターフェロンで治療し得る病気の治療に使用する医薬品の製造にそのペプチドの使用；
−　癌治療にそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用及び抗癌剤と併用してそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用または癌治療において同時に、別々に、あるいは続けて使用する併用製剤として治療；
−　本発明のポリペプチド及び医薬として受容し得る担体または希釈剤からなる医薬組成物；
−　本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド及び抗癌剤を含み、癌治療において同時に、別々に、あるいは続けて使用する併用製剤として使用するのに適した製品；
−　ポリペプチドを発現させそして該ポリペプチドを単離するのに適した条件下に本発明の宿主細胞を維持することからなる、本発明のポリペプチドを製造する方法；
−　そのポリヌクレオチド及び医薬として受容し得る担体または希釈剤をからなる医薬組成物；
−　そのポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することからなる、Ｉ型インターフェロンで治療し得る病気、またはウイルス性疾患、の患者の治療方法及び患者の癌の治療及び予防の方法；
−　抗ウイルスまたは抗腫瘍または免疫調節剤、より特異的にはＩ型インターフェロンで治療し得る病気の治療に使用する医薬品、例えばベクター製剤、の製造にそのポリヌクレオチドの使用；及び
−　ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体を発現し得る細胞を供給し、該細胞を被検化合物とインキュベートし、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子発現の上方調節を監視することからなる、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する化合物の同定方法。
【００１２】
その他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １または３の配列またはその相補体、の範囲内に配列するプライマーのセットを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １または ３またはその相補体の選択的検出に適した、本発明のポリヌクレオチドから由来する核酸プローブを提供する。
【００１３】
さらにその他の態様において、本発明は、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α、を経口腔粘膜または静脈内投与した該患者から得たかまたは該測定の前にＩＦＮ−αのようなＩ型インターフェロンでインビトロ処理した患者からの細胞検体中の、例えば血液検体中の、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体、例えば対立変異体、または対応するｍＲＮＡの濃度を測定することからなる、Ｉ型インターフェロンによる治療、例えばＩＦＮ−α治療（例えば経口腔粘膜または非経口、例えば静脈内、皮下、または筋肉内投与によるＩＦＮ−α）に対する患者の反応性を予測する方法を提供する。本発明はその試験を行なうためのキットにも及ぶ。
【００１４】
（配列の簡単な説明）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１はヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲのアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクのアミノ酸配列のみである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３はヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの変異体のアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの変異体のアミノ酸配列のみである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５はマウスＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６はマウスＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクのアミノ酸配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７はディフェレンシャルディスプレーにより単離されたバンドのＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８はマウスにおいて同定されたＩＳＲＥのＤＮＡ配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９から１２はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ１及びＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ２に対するエクソン７を使用する選択的スプライシングの効果を示している（図４参照）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３から１９は以下のタンパクの整列の結果を示している：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ヒトトルシンＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、マウストルシンＡ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、ヒトトルシンＢ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、マウストルシンＢ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒトルシン様タンパク；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９から２１、はそれぞれＣ． ｅｌｅｇａｎｓトルシン様タンパクＹ３７Ａ１Ｂ．１３、ＹＵＹ１及びＹ３７Ａ１Ｂ．１２。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２から２４は以下のタンパクの整列の結果である；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ熱ショックタンパク１０１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４、マウスＳＫＤ３。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
上記に示したように、ヒトタンパクＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及びその変異体は治療上有用な薬剤、より特異的には抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤としての使用が今意図されている。
【００１６】
この目的のＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの変異体は天然に存在する変異体、対立変異体または種変異体のいずれかであり、それは実質的にＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクとして同じ機能活性を有し、そしてＩＦＮ−αの投与に反応して上方調節される。変異体はＡＴＰ依存性である。その他に、治療に使用するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４から変化した配列を含むが、これらは非天然変異体である。
【００１７】
用語「機能的変異体」とは、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクと同一の必須の性質または基本的機能を有するポリペプチドのことである。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの必須の性質は抗ウイルス及び／または抗腫瘍作用であると考えることができる。機能的変異体ポリペプチドはさらにまたはその他に免疫調節性ペプチドとして作用することができる。
【００１８】
癌の治療に使用する機能的変異体は、単独または抗癌剤と併用して細胞増殖を抑制またはアポトーシスを促進する能力を保有する変異体である。望ましい抗癌活性は、例えば例７及び９に記述した方法を使用して試験することができる。
【００１９】
望ましい抗ウイルス活性は、例えば次ぎのように試験することができる：試験すべき変異体をコードする配列を、ウイルスパッケージングシグナルΨ、及び薬物耐性マーカーを含むモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）から誘導したレトロウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター中にクローン化する。次いでウイルスｇａｇ、及びｐｏｌ、遺伝子を含む汎親和性パッケージング細胞に、組換えレトロウイルスベクター及び高力価感染性複製をできなくしたウイルスを作るために水疱性口内炎ウイルスエンベロープグリコプロテインを含むプラスミド、ｐＶＳＶ−Ｇ、を一緒に導入する（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４，５２３２−５２３６）。次いで感染性組換えウイルスをインターフェロン感受性繊維芽細胞またはリンパ芽球細胞に感染導入し、変異タンパクを安定的に発現する細胞系を選択し、標準的インターフェロンバイオアッセイ（Ｔｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２７１， ６２２−６２５， １９７８）においてウイルス感染に対する抵抗性を試験する。標準的増殖検定を使用して増殖抑制（Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６５， ５５−６３， １９８３）及び標準的技術を使用してＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの発現も測定することができる。抗ウイルス活性は例８に記述した方法に従って試験することができる。
【００２０】
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの望ましい機能的変異体は本質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の配列を含むことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の機能的変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の少なくとも２０、望ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも１００隣接アミノ酸または全長に亘って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸配列と少なくとも６０％から７０％相同性、望ましくは８０％、少なくとも９０％及び特に望ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％相同性であるポリペプチドであり得る。タンパク相同性の測定方法は当業者にはよく知られている。
【００２１】
アミノ酸の置換は、例えば、１，２または３から１０，２０または３０置換されることがある。保存的置換を、例えば、下表に従って行なうことができる。第２列の同じ枠内のアミノ酸及び望ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸は相互に置換することができる。
【表１】
2004508820.tif 000002
【００２２】
本発明に従って治療に使用される変異ポリペプチド配列はより短いポリペプチド配列のこともあり得る、例えば、少なくとも２０アミノ酸または５０， ６０， ７０， ８０， １００， １５０または２００アミノ酸の長さのペプチドは、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの適当な生物活性を保持しているならば、本発明の範囲内に入ると考えられる。特に、しかし除外はしないが、本発明のこの態様は変異体が完全な天然に存在するタンパク配列そのもののフラグメントであるような状態を包含している。
【００２３】
抗ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパク抗体を作るために使用することができるＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及びそのフラグメントの修飾型も本発明に包含される。そのような変異体はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの抗原決定基を含むであろう。
【００２４】
本発明のポリペプチドは化学的に修飾、例えば、翻訳後に修飾することができる。例えば、グリコシル化する及び／または修飾アミノ酸を含むことができる。またＮ−末端及び／またはＣ−末端に配列を付加すること、例えばその精製を助けるためのヒスチジン残基またはＴ７タグの付加によるまたは細胞の膜への挿入を促進するシグナル配列を付加することによる修飾もできる。
【００２５】
本発明のポリペプチドは提示標識を付けることができる。提示標識は検出すべきポリペプチドを指し示す適当な標識のことである。適当な標識としては、１２５Ｉ，３５Ｓのような放射性同位元素または酵素、抗体、ポリヌクレオチド及びビオチンのようなリンカーがある。本発明の標識ポリペプチドは検定に使用することができる。その検定において、固相に接着したポリペプチドを供給することが望ましいであろう。本発明はまた容器の中にキットの形態にして収納した標識及び／または固定化ポリペプチドにも関係している。このキットはその他の適当な試薬、対照または説明書などを任意に含んでいる。
【００２６】
本発明のポリペプチドは合成的にまたは組換え法により作成することができる。本発明のそのポリペプチドは修飾により天然に存在しないアミノ酸、例えば、Ｄアミノ酸を含むことができる。本発明の変異ポリペプチドはインビトロ及び／またはインビボの安定性を増すように修飾することができる。ポリペプチドが合成法により製造される場合は、そのような修飾は製造中に導入される。ポリペプチドは合成または組換えによる製造の後に修飾することもできる。
【００２７】
多数の側鎖修飾がタンパク修飾技術において知られており、本発明のポリペプチド中にも存在し得る。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドと反応した後ＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化によるアミノ酸修飾、メチルアセチミデートによるアミジン化または無水酢酸によるアセチル化がある。
【００２８】
本発明のポリペプチドは実質的に単離の形であろう。ポリペプチドはその意図する目的を妨害しない担体または希釈剤と混合されるがそれでも実質的に単離されていると見なし得ることは理解されるであろう。本発明のポリペプチドは、一般的に標品中に含まれるポリペプチドの重量の９０％以上、例えば、９５％、９８％または９９％以上が本発明のポリペプチドである場合に、実質的に精製された形とすることができる。
【００２９】
ポリヌクレオチド
本発明はまたＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその変異体をコードする単離ヌクレオチド配列並びにそれと相補的である単離ヌクレオチド配列を含んでいる。ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ、単鎖または２重鎖であり得る。望ましくはヌクレオチド配列はＤＮＡ配列そして最も望ましいのはｃＤＮＡ配列である。
【００３０】
上記に示したように、そのポリヌクレオチドは典型的に下記を含む配列を含んでいる：
（ａ）　ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の核酸またはそのコード配列及び／またはそれに対する相補的配列；
（ｂ）　（ａ）に定義した配列の相補的な配列に、例えば厳密な条件で、ハイブッド形成する配列；
（ｃ）　（ａ）または（ｂ）に定義した配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列；
（ｄ）　（ａ），（ｂ）または（ｃ）に定義した配列と少なくとも６０％の相同性を有する配列。
【００３１】
適当なコード配列を含むポリヌクレオチドはヒト細胞から単離することもできるし、またＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．中の例に記述されているように、当業者には既知の方法に従って合成することができる。
【００３２】
適当なコード配列を含むポリヌクレオチドはその中に合成的または修飾ヌクレオチドを含むことができる。多数の異なるタイプのポリヌクレオチドに対する修飾方法が当業者には既知である。それにはメチルホスフォネート及びホスフォチオネート骨格、分子の３’及び／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖付加がある。そのような修飾はインビトロ活性の増強または本発明のポリペプチドの寿命を延長するために行なわれる。
【００３３】
典型的に本発明のポリペプチドは、ヌクレオチドの連続配列であることが望ましく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のコード配列またはコード配列の相補体に選択的条件下にハイブリッド形成することができるヌクレオチドの配列を含むであろう。そのようなハイブリッド形成はバックグランド以上の有意レベルで生じるであろう。バックグランドハイブリッド形成は、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡのために生じることがある。本発明のポリヌクレオチド及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のコード配列またはコード配列の相補体の間の相互作用により発生するシグナルのレベルは、他のポリペプチドとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のコード配列の間の相互作用の強さの典型的に少なくとも１０倍、望ましくは少なくとも１００倍であろう。相互作用の強さは、例えば、３２Ｐでプローブを放射標識することにより測定することができる。選択的ハイブリッド形成は典型的に低ストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約４０℃）、中間ストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃）または高ストリンジェンシー（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約６０℃）の条件を使用して行なうことができる。
【００３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１または ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のコード配列はヌクレオチド置換、例えば１，２または３から１０，２５，５０または１００置換による修飾をすることができる。縮重置換を行なうことができそして／または修飾配列が翻訳された時に保存的アミノ酸置換、例えば上記表に示したような結果になる置換を行なうことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１または ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のコード配列はその他にまたはさらに１以上の挿入及び／または欠失及び／または両末端のいずれかの延長により修飾することができる。
【００３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１または ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３から選択されたＤＮＡ配列と選択的にハイブリッド形成できる本発明のポリヌクレオチド、そののコード配列及びそれに相補的なＤＮＡ配列は一般的に標的配列に対して少なくとも７０％、望ましくは少なくとも８０％または９０％そしてより望ましくは少なくとも９５％または９７％相同であろう。その相同性は典型的に少なくとも２０、望ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０，６０または１００またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域に亘っている。
【００３６】
相同性及び最小サイズの上記程度の組合せは、望ましくはより厳密な組合せ（すなわち、より長い鎖に亘るより高度な相同性）を使用して、本発明のポリペプチドを規定するために使用できる。したがって、例えば２５、望ましくは３０ヌクレオチドに亘って少なくとも８０％相同であるポリヌクレオチドは適当と認められる得るし、同様に４０ヌクレオチドに亘って少なくとも９０％であるポリヌクレオチドも認められる。
【００３７】
本発明による変異ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８の推定ＩＳＲＥ配列を含み得る。
【００３８】
ここに関係するポリヌクレオチドまたはタンパク配列の相同性はよく知られている相同性算出法に従って決定することができる、例えば、タンパク相同性はアミノ酸同一性に基づいて計算することができる（時には「ハード相同性」と言う）。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために、例えばそのデフォルトセッティングで使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは相同性の計算または配列の整列または同等または対応配列の同定のために、典型的にデフォルトセッティングで、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ． （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６， ２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３−１０ ，に記述されているように、使用することができる。
【００３９】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／） から公開されている。このアルゴリズムは最初にデータベース配列の同じ長さの文字列と整列した時に一致するかあるいはある正の閾値スコアＴを充たす問題配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを必要とする。Ｔを近隣文字列スコア閾値という（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， 上記）。このような最初の近隣文字列発見がそれを含むＨＳＰを発見するための調査を開始する種として作用する。この文字列発見は各配列に沿って両方向に、累積整列スコアが増加する限り、拡張される。各方向における文字列発見の拡張は次の場合に中止される：累積整列スコアが最大に達した値から数値Ｘ低下する；１以上の負スコア残基の整列の累積のために累積スコアが零かそれ以下になる；または配列の端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ， Ｔ及びＸは整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして文字列長（Ｗ）を１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １０９１５−１０９１９を参照）整列（Ｂ）を５０、期待値（Ｅ）を１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。
【００４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは二つの配列間の類似性について統計解析を行なう：例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は最小合計確立（Ｐ（Ｎ））であり、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確立の指標を提供する。例えば、もし第一の配列を第二の配列と比較した際の最小合計確立が約１以下、望ましくは約０．１以下、より望ましくは約０．０１以下、そして最も望ましいのは０．００１以下であるならば、その配列はもう一つの配列と類似している。
【００４１】
本発明によるポリヌクレオチドは、インビトロ、インビボまたはエクスビボにおいて行われる、本発明によるタンパクの生成に有用である。そのポリヌクレオチド中において、本発明の求めるタンパクのためのコード配列は、選ばれた宿主細胞中において求めるタンパクの発現を指令することができるプロモーター配列に作動的に結合しているであろう。そのようなポリヌクレオチドは一般的に発現ベクターの形になっているであろう。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する本発明のポリペプチドのインビボ発現を指令する発現ベクターの形で、治療用薬剤として使用することができる。
【００４２】
その目的の発現ベクターは組換えＤＮＡ技術の通常の作業により構築することができる。それらは、例えば、プラスミドＤＮＡの使用を必要とする。それらには複製の起源が準備されている。そのベクターは１以上の選別を容易にするマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含むことができる。本発明のベクターのその他の特徴は適当なイニシエーター、エンハンサー及びその他の配列、例えばタンパク発現のために望ましくそして正しい方向に位置しているポリアデニル化シグナルを含んでいる。その他の適当な非プラスミドベクターは当業者には明白であろう。これに関するその他の例は再度Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（上記）を参照。そのベクターはさらに、例えば、ウイルスベクターを含む。適当なウイルスベクターの例としては、単純疱疹ウイルスベクター、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＰＶウイルス（ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８のような）を含む複製不能レトロウイルス、及び弱毒インフルエンザウイルスがある。
【００４３】
プロモーター及びその他の発現調節シグナルは発現を命じられる宿主細胞に適合するように選択することができる。例えば、イーストプロモーターにはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、 Ｓ．ｐｏｍｂｅ ｎｍｔｌ及びａｄｈプロモーターがある。哺乳動物プロモーターにはカドミウムのような重金属に反応して導入することができるメタロチオネインプロモーター及びβ−アクチンプロモーターがある。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターも使用することができる。使用し得るウイルスプロモーターの例としてはモロニーネズミ白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬ Ｖ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、及びＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）がある。その他の適当なプロモーターは組換えＤＮＡ技術において同業者にはよく知られているであろう。
【００４４】
本発明のベクターはさらに本発明の求めるポリペプチドに対するコード配列に隣接し真核ゲノム配列に相同な配列、望ましくは哺乳動物ゲノム配列またはウイルスゲノム配列、を提供する配列を含むことができる。これにより本発明のそのポリヌクレオチドを真核細胞またはウイルスのゲノム中へ相同組換えにより導入することができる。特に、ウイルス配列に隣接した発現カセットを含むプラスミドベクターは本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するのに適したウイルスベクターを調製するために使用することができる。
【００４５】
本発明は、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその変異体を発現するように修飾されたインビトロの細胞、例えば原核細胞または真核細胞、も含んでいる。その細胞は、例えば、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその変異体をコードしたポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に取込んで安定した真核細胞系を含んでいる。本発明の宿主細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞、イーストのような下等真核細胞または細菌細胞のような原核細胞であり得る。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により修飾することができる細胞の個別例としては哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ，ＣＨＯ，ＨｅＬａ及びＣＯＳ細胞がある。望ましくは細胞系は安定であるだけでなく、ポリペプチドの充分なグリコシル化もできるものが選択される。発現は、例えば、形質転換卵母細胞において行なうことができる。
【００４６】
本発明のポリペプチドは遺伝子導入非ヒト動物、望ましくはマウスの細胞においても発現することができる。本発明のポリペプチドを発現することができる遺伝子導入非ヒト動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００４７】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンス配列の生産に提供するためにアンチセンスを指向して上記のようにベクター中に挿入することもできる。アンチセンスＲＮＡ及びその他のアンチセンスポリヌクレオチドは合成的方法によっても生産できる。
【００４８】
例えば、発現ベクターの形で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４または天然に存在するその変異体により定義されるアミノ酸配列のコード配列に対するアンチセンス配列をインビボで発現することができ、ヒトまたは非ヒト動物の治療に使用するためのポリヌクレオチド、も本発明の追加の態様を構成すると考えられる。そのポリヌクレオチドはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの上方調節が原因の病気の治療に使用できるであろう。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドｃＤＮＡ内の配列を標的とする核酸増幅用のプライマーの組合せ、例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマー対に拡張する。特に、そのプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１または３またはそれに相補的な配列内の領域を標的にすることができる。本発明はまた、明示標識、例えば、放射活性標識または酵素またはビオチンのような非放射性標識で標識することができる本発明のポリペプチドに対するｃＤＮＡまたはＲＮＡ内の配列を標的とするに適したプローブを提供する。特に、そのプローブはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１または３またはそれに相補的な配列に与えられたポリヌクレオチドのような本発明のポリヌクレオチドを選択的に検出するのに適していなければならない。そのプローブは固相に接着することができる。その固相は、その他の核酸、例えば、他のＩ型インターフェロン上方調節遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの経口腔粘膜または静脈内投与に反応して上方調節されることが同定されているような遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはその増幅生産物に対するプローブを含むマイクロアレイ（一般的には核酸に関しては、プローブまたはＤＮＡチップとも呼ばれている）であり得る。そのようなマイクロアレイの構築方法はよく知られている（例えば、ＥＰ−Ｂ ０４７６０１４ ａｎｄ ０６１９３２１ ｏｆ Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ． Ｖ． ａｎｄ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｊａｎｕａｒｙ １９９９ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｔｈｅ Ｃｈｉｐｐｉｎｇ Ｆｏｒｅｃａｓｔ”を参照）。
【００５０】
そのプライマーまたはプローブの核酸配列は望ましくは少なくとも１０、望ましくは少なくとも１５または２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または４０のヌクレオチドの長さであろう。しかし、４０，５０，６０，７０，１００または１５０ヌクレオチドの長さまたはそれ以上長くてもよい。
【００５１】
本発明のその他の態様は、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子における突然変異、例えば一塩基多形（ＳＮＰ）の同定に本発明のプローブまたはプライマーを使用することである。
【００５２】
上記に示したように、その他の態様において本発明は、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体を発現することができる細胞を準備し、被検化合物と共に該細胞を培養し、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子発現の上方調節を監視することからなる、免疫調節作用及び／または抗ウイルス作用及び／または抗腫瘍作用を有する化合物を同定する方法を提供する。その監視はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体をコードするｍＲＮＡに対するプローブにより行われる。その他にはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及び天然に存在する変異体の１つ以上と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを使用することができる。
【００５３】
抗体
その他の態様によると、本発明はまた、通常の技術により得られ、そして本発明のポリぺプチドに対して特異的である抗体（例えばポリクロナールまたは望ましくはモノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び抗原結合能力を保持するそのフラグメント）にも関係している。その抗体は、例えば、精製、単離または免疫沈降を含むスクリーニング法に使用することができ、またＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその変異体の機能を更に解明するための道具として使用できる。それら自身が治療薬になり得る資格を有している。その抗体は本発明によるタンパクの抗原決定基に対して作ることができる。抗体は、それが特異的であるタンパクとは高親和性でそのタンパクに結合するが他のタンパクには結合しないかまたは低親和性で結合する場合に、特異的にタンパクに結合する。抗体の特異的結合能力を測定するための競合結合または免疫放射検定のための種々のプロトコールはよく知られている。
【００５４】
医薬組成物
本発明のポリペプチドは典型的に医薬として受容し得る担体または希釈剤と共に投与するために製剤化される。医薬用担体または希釈剤は、例えば、等張溶液であり得る。例えば、固体の経口用形態は活性化合物と共に、下記を含むことができる、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ、またはジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、及び／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン類、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニールピロリドン；分離防止剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム；発泡混合物；色素；甘味剤；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸のような湿潤剤；及び、一般的には、医薬製剤に使用される毒性のない薬理的に不活性の物質。そのような医薬製剤は既知方法、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖−コーティング、またはフィルムコーティングの操作により製造することができる。
【００５５】
経口投与用の液体分散体はシロップ、乳剤及び懸濁剤のことがある。シロップは担体として、例えば、サッカロースまたはサッカロースとグリセリン及び／またはマンニトール及び／またはソルビトールを含むこともある。
【００５６】
懸濁剤及び乳剤は担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含むことがある。筋肉内注射用の懸濁剤または溶液は、活性化合物と共に、医薬品として受容し得る担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類、例えば、プロピレングリコール、及びもし必要であれば、適当な量の塩酸リドカインを含むことができる。
【００５７】
静脈内投与または点滴用の溶液は担体として、例えば、滅菌水またはを含むことができるしまた望ましくは滅菌水、等張食塩溶液の形態になっている。
【００５８】
本発明に従って使用するためのＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたはその機能的同族体の適切な用量は、種々のパラメータ、特に使用される要素；年齢、体重及び治療する患者の状態；投与経路；及び必要な治療法によって決定することができる。さらに、医師は個別の患者に必要な投与経路及び投与量を決めることができるであろう。典型的な１日用量は、特異的阻害剤の活性、年齢、体重及び治療する患者の状態、及び投与の回数及び経路により、約０．１から５０ ｍｇ／ｋｇ、望ましくは０．１ ｍｇ／ｋｇから１０ ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。望ましくは、１日用量レベルは５ ｍｇから２ ｇであろう。
【００５９】
治療用に適した本発明のポリヌクレオチドはまた典型的に医薬として受容し得る担体または希釈剤と共に投与するために製剤化されるであろう。そのようなポリヌクレオチドは、求めるポリペプチドの発現をインビボで達成することができる既知の技術のいずれかにより投与することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、望ましくは皮内、皮下または筋肉内注射により導入することができる。その他には、核酸は粒子介在投与器を使用して皮膚を通して直接投与することができる。治療用核酸に適した本発明のポリヌクレオチドはその他に、例えば鼻腔内または口腔内投与より口腔粘膜表面に投与することもできる。
【００６０】
治療用に適した本発明の非ウイルスベクターは、例えば、リポソーム中にまたは表面活性剤含有ベクター供給粒子に詰め込むこともできる。本発明の核酸構築の取り込みは、例えば導入試薬の使用を含む既知の導入技術により促進される。そのような試薬の例としては、カチオン性試薬、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン及びリポフェクタント、例えばリポフェクタム及びトランスフェクタムがある。投与すべき核酸の投与量は変動し得る。典型的に、核酸は粒子介在遺伝子投与では１ ｐｇから１ ｍｇ、望ましくは１ ｐｇから１０μｇ、そしてその他の経路では１０μｇから１ ｍｇの範囲で投与されるであろう。
【００６１】
本発明によると、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは両者の変異体は他の薬物または治療と併用することができる。癌の予防及び／または治療のために、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及び抗癌剤または治療の併用を行なうことができる。例えば、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及び抗癌剤または治療を、同じ医薬製剤で同時に行なうか、または別の医薬製剤で別々に同時にまたは異なる時間に；すなわち続けて投与できる製剤で、おこなうことができる。
【００６２】
このように、本発明により抗癌剤と共に本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する製品が供給され、その製品は癌治療において同時に、別々にまたは続けて使用するための併用製剤として使用するのに適している。本発明は癌治療におけるそのような併用製剤の使用法も供給する。
【００６３】
適切な投与方法は医師により決められそして多くの因子、例えば製剤の安定性、薬物または処置の作用時間及び潜在的な副作用、によるであろう。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及び抗癌剤または治療の併用は、単独投与の有効量以下でありそして患者に対して毒性がない用量の抗癌剤を使用できるという利点がある。適当な抗癌剤または治療としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチンのような遺伝子毒性抗癌剤、またはγ線照射であろう。
【００６４】
抗ウイルス治療には、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその変異体を、単独または他の抗ウイルス治療と組合わせて投与することができる。例えば、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲはＩＦＮ−αのようなインターフェロンと組合わせて使用することができる。二つの治療は別々に、同時にまたは続けて行なうことができる。
【００６５】
Ｉ型インターフェロン反応性の予測
上記に示したように、本発明のその他の態様において、Ｉ型インターフェロンの投与後該患者から採取したかまたは該測定前にＩ型インターフェロンでインビトロ処理された該患者の細胞検体中のＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することからなる、Ｉ型インターフェロンによる治療、例えば、経口腔粘膜または静脈内によるＩＦＮ−αのようなＩＦＮ−α治療に対する患者の反応性を予測する方法を提供する。
【００６６】
望ましくは、反応性試験に使用するＩ型インターフェロンは治療のために選択されたＩ型インターフェロンであろう。それは推奨投与経路及び推奨治療用量で投与することができる。望ましくは、その後の分析検体は、例えば、血液検体または血液検体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であろう。
【００６７】
より便利で望ましいのは、患者から採取し、血液から単離したＰＢＭＣを含む検体をＩ型インターフェロンで、例えば、１から１０，０００ ＩＵ／ｍｌの用量範囲においてインビトロで処理することであろう。その処理は数時間、例えば、７から８時間であろう。そのインビトロ試験の望ましい処理条件は正常提供者から採取したＰＢＭＣを試験しそして適当な発現生成物の上方調節を調べることにより決定することができる。繰り返しになるが、使用するＩ型インターフェロンは患者の治療に提案されているＩ型インターフェロン、例えば、組換えＩＦＮ−αであることが望ましい。その試験に使用するＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配を使用して血液検体から通常の方法で単離することができる。Ｉ型インターフェロン反応性のインビトロ試験に適したプロトコールの例は下記例３に示されている。
【００６８】
Ｉ型インターフェロンでのインビトロ処理後もし適するならば、検体をＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体のレベルについて分析する。これはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体、例えば、その対立変異体の１以上と特異的に結合することができる抗体を使用して行われる。しかし、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクまたは天然に存在するその変異体をコードするｍＲＮＡについて検体を分析することも望ましいであろう。そのｍＲＮＡ分析にはｍＲＮＡを検出する既知技術のいずれか、例えば、ノーザンブロット検出またはｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレーを使用することができる。種々の既知核酸増幅プロトコールを、検出に先立って、検体中に存在する関心のｍＲＮＡ、またはその部分、の増幅に使用することができる。関心のｍＲＮＡ、または対応する増幅核酸、は固相に接着した核酸プローブを使用して調べることができる。その固相支持体は上記に既に記述したような、Ｉ型インターフェロン上方調節遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの経口腔粘膜または静脈内投与に反応して上方調節することが同定されている遺伝子、に対応するその他のｍＲＮＡまたはその増幅生成物のレベルを測定するためのプローブを有するマイクロアレイであり得る。
【００６９】
以下の例により本発明を説明する：
【００７０】
例
例１
以前の実験において正常成獣マウスの鼻腔へ５μｌのクリスタルバイオレットをＰ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して適用したところ、直ちに口腔喉頭腔の全表面へ色素が分布することが認められた。口腔咽頭腔の染色は色素適用後３０分でも明らかであった。この結果は１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して同様に適用することにより確認された。同じ投与方法は下記試験における口腔粘膜投与を行なうために使用された。
【００７１】
６週齢雄ＤＢＡ／２マウスをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃから購入した組換えネズミインターフェロンα（ＩＦＮα）の１００，０００ ＩＵ、またはＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃから購入した組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の１０μｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１００μｇ／ｍｌを含むＰＢＳのいずれかで処置するか、または無処置とした。８時間後マウスを頚椎脱臼により屠殺し、口腔咽頭腔からリンパ組織を採取し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存した。ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ １９８７（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２， １５６−１５９）の方法によりリンパ組織から抽出し、ｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレー分析（Ｌａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７， ９６７−９７１）を行なった。
【００７２】
ディフェレンシャルディスプレー分析
ディフェレンシャルディスプレー分析はＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「メッセージクリーン」及び「ＲＮＡイメージ」キットを本質的にメーカーの説明に従って使用して行なった。簡単に言うと、ＲＮＡはＲＮＡ分解酵素を含まないＤＮＡ分解酵素で処理し、そして１μｇを１００μｌの反応バッファー中で、３種の１塩基固定オリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ，Ｃ，またはＧの１つまたはその他を使用して、逆転写した。ＲＮＡはまた９種の２塩基固定オリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＡＣ，ＣＡ，ＧＡ，ＡＧ，ＣＧ，ＧＣの１つまたはその他を使用して逆転写した。比較すべき全検体を同一実験において逆転写し、分割して凍結した。増幅はわずか１μｌの逆転写検体とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びα−３３Ｐ ｄＡＴＰ（３，０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含む１０μｌの増幅混合液中において実施した。８０種の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを（ＨＴ１１）Ａ，Ｃ，Ｇ，ＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＡＣ，ＣＡ，ＧＡ，ＡＧ，ＣＧまたはＧＣプライマーのそれぞれと組合わせて使用した。次いで検体を７％変性ポリアクリルアミドゲルに展開し、オートラジオグラフィーを行なった。ディフェレンシャル発現と推定されるバンドを切り出し、メーカー説明に従って再増幅を行なった。１２５ ｂｐディフェレンシャル発現したｃＤＮＡが同定され、そしてポリＡ末端の１４ ｂｐ上流に位置する典型的なポリアデニル化部位を持つ以前未確認の転写物の３’ＵＴＲの末端として確認された。新規ｃＤＮＡはＩＦＮ処置、ＩＬ−１５処置及び賦形剤処置の動物から採取した口腔咽頭腔組織のＲＮＡのノーザンブロットを調べるために使用した。
【００７３】
１．９及び３．５ ｋｂの２種類のＲＮＡ転写物がＩＦＮ処置動物の検体から同定された。２種類の類似の転写物が同用量のＩＦＮαを腹腔内投与したマウスの肝臓及び脾臓中にも高レベルで検出された。同じ２本のバンドはブロットを過剰露光することにより対照マウスの組織にも認められた。さらに弱い２．４ ｋｂのバンドもブロットの過剰露光によりＩＦＮ処置動物の脾臓及びその他の組織中に検出された。
【００７４】
クローニング及び配列分析
簡潔に述べると、再度増幅したディフェレンシャルディスプレースクリーニングのバンドをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｆｒ １部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅により増幅したｃＤＮＡをｐＣＲ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＴＡクローニングにより単離した。ＤＮＡは自動ジデオキシシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７）を使用して配列を分析した。
【００７５】
１２５ ｂｐ ｃＤＮＡをＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用した。１３個の重複するｃＤＮＡが１０６ラムダファージから得られ、そしてそれらの配列は合わせて２３００ ｂｐ（図１）のコンティグを形成した。この配列は推定分子量４４ ｋＤａの新規タンパクをコードする１１５８ ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた（図２）。推定アミノ酸配列は、シグナルペプチドであるらしい２１アミノ酸及び典型的なＡ，Ｂ及びＢｏｘ ＩＶモチーフ及びその他によく解明されているタンパク（Ｏｚｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １７：４０−４８； Ｏｚｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ ７８：９３−１０５； Ｓｃｈｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ８：２８９−２９６）のＡＴＰ結合ドメインとの相同性により同定された特徴的ウォーカーＡＴＰ／Ｍｇ２＋結合部位（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ １：９４５−９５１）を含んでいた。
【００７６】
２３００ ｂｐコンティグはディフェレンシャル発現した１２５ ｂｐ ｃＤＮＡバンドを１６６２−１８１０の位置に包含していた（図１、太字）。ディフェレンシャル発現したバンドの３’末端はノーザンブロットにより同定された１．９ ｋｂ転写物の３’末端に相当すると考えられた。２２５３−２２５８の位置に検出された第２の推定ポリアデニル化部位を使用して弱く示された２．４ ｋｂ転写物を生じることができる。ファージ配列から構築されたコンティグはＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ ｄｂｅｓｔデータベースの重複するＥＳＴ配列を追加することにより３’末端方向へ延長した。この長い配列は３２５０ ｂｐの位置に典型的なＡＡＴＡＡＡポリアデニル化部位を含んでいた。これらの知見は、ノーザンブロットにおいて同定された３．５ ｋｂのメッセージは短いｍＲＮＡがこの第２ポリアデニル化部位へ連続することを意味することを示している。
【００７７】
ＩＦＮ処置によるＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡの増加はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲプロモーター中のインターフェロン感受性反応配列（ＩＳＲＥ）の存在を反映するものか否かを検討するために、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子の８００ ｂｐの５’隣接領域をゲノム歩行法を使用してクローン化し、配列分析を行ない（ＡＪ３１８０４３）、ｍＲＮＡ配列の開始部位から−１８５から−１７１上流の位置に、ＩＦＮに刺激される遺伝子の主な転写活性化物であるＩＳＧＦ３に対する結合部位と推定されるものに良く一致する、配列ＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＧＧＡを含むことが示された。
【００７８】
ヒトｃＤＮＡの単離
ディフェレンシャルディスプレーにより同定されたディフェレンシャル発現したネズミ３’配列を、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） のＧｅｎＢａｎｋＴＭのｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較した。ディフェレンシャルディスプレースクリーニングから単離したネズミＥＳＴに関係しそうな配列をコンティグに含め、理論的ｃＤＮＡに対応するヒト共通配列を構築するために使用した。次いで全長ｃＤＮＡをＤａｕｄｉ細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより作成し、クローン化し、配列を分析した。ヒトｃＤＮＡは１２８５ヌクレオチドの長さであることが判明した。これは、ＩＦＮ−αを経口腔粘膜投与したマウスの口腔内リンパ組織中にその発現が約５倍増強されることが判明しているマウスの遺伝子と一致した。
【００７９】
予想されたサイズをもつ独特のｃＤＮＡフラグメントが得られ、クローン化され、そして配列が分析された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）。このヒトｃＤＮＡは計算分子量４６ ｋＤａの３９７アミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）のタンパクをコードする１１９４ ｂｐの長さのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を７４−１２６７の位置に含み、そしてヒト染色体１に存在していた。ヒト及びマウスｃＤＮＡは８５％の相同性を示し、それらがコードするタンパクは７０％相同であり、また疎水性Ｎ−末端配列及び典型的Ａ，Ｂ及びＢｏｘ ＩＶモチーフを有するＡＴＰ結合ドメインを含む類似する特徴を示す。また８個のリン酸化部位及び１個のＮ−グリコシル化部位と推定されるものが保存されている。
【００８０】
上記方法によって得られた多数の異なるクローンについて配列分析した。大部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示したヌクレオチド配列を有していた。一部のクローンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示したヌクレオチド配列を有していた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示したヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示した配列と１１０及び１２５６の位置において異なっている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３によってコードされているタンパクはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されている。このタンパクはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２によって示されるタンパクと１３及び３９５の位置において異なっている。
【００８１】
マウス遺伝子のプロモーター領域を対応するヒト染色体１上のＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ配列と比較することにより、多数の高度保存ボックスとの明らかな相同性を示したが、推定マウスＩＳＲＥと相同な配列はヒト遺伝子には認められなかった。これらの知見はマウス遺伝子と比較してヒト遺伝子のインターフェロン処置に対する感受性が低下していることの説明となるであろう。
【００８２】
例２
ＩＦＮ−αの投与
雄ＤＢＡ／２マウスにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． から購入した組換えネズミＩＦＮ−αの１００，０００ ＩＵを腹腔内（ｉｐ）または口腔粘膜（ｏｍ）に注射した。ｉｐ投与の場合は、動物を２００μｌのＰＢＳ中１００，０００ ＩＵ ＩＦＮ−αで処置、または同量のＰＢＳのみで処置した。ｏｍ投与の場合は、１０μｌのＩＦＮ−αまたは賦形剤を１から２０μｌ容量を調節できるマイクロピペットを使用してマウスの鼻腔に適用した。ｉｐまたはｏｍ投与４時間後に動物を頚椎脱臼により屠殺し、常法により口腔の組織及び脾臓を摘出した。総ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ （Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８７） １６２， １５６−１５９）の方法により抽出し、検体当たり総ＲＮＡの１０．０μｇについてグリオキサールの存在下にノーザンブロットを行ない、そしてＤａｎｄｏｙ−Ｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９８） ２７３， ７６９１−７６９７）による記述に従ってＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ブロットは最初にオートラジオグラフィーに露光し、次いでメーカー説明書に従ってＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを使用して定量化した。
【００８３】
１．９及び３．５ ｋｂの２種のＲＮＡ転写物がＩＦＮ処置動物の検体中に同定された。同じ２本のバンドがブロットの過剰露光により対照マウスの組織中にも認められた。定量的分析の結果、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ＲＮＡ転写物は処置４時間後の口腔咽頭腔の組織中で約５倍から６倍、そしてｉｐ投与４時間後の脾臓及び肝臓中でそれぞれ約８及び１５倍増加した。
【００８４】
例３
ＥＣＭＶの投与
６週齢のスイスマウスに神経親和性ウイルス脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）を感染させた。ＥＣＭＶのＪＨ株をＧｒｅｓｓｅｒ ａｔ ａｌ （１９６８）（Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ １２７： ４９１−４９６）に記述の標準的方法を使用してネズミＬ９２９細胞で増殖した。使用した保存ウイルスはネズミＬ９１９細胞に対して２．１ｘ１０９ ＴＣＩＤ ５０の力価を有していた。約１００ ＬＤ５０のＥＣＭＶを２００μｌのダルベッコ最小必須培地＋２％ウシ胎児血清に入れて腹腔内注射してマウスを感染させた。注射４時間後マウスを頚椎脱臼により屠殺し、例２に記述したようにＲＮＡを抽出した。ＥＣＭＶの感染により末期症状の動物の脳内における新ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡ転写物のレベルは非感染動物に比較して２０から４０倍増加した。これに対して、スクレイピー責任遺伝子１（Ｓｃｒｇ１）ｍＲＮＡはＥＣＭＶ感染により変化しなかった。
【００８５】
例５
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡの発現
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲコード配列を増幅し、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡの組織分布及びその発現に対するＩＦＮの影響を測定するためのプローブとして使用した。５０個のヒト組織からのＡ＋ＲＮＡを個別の点に固定化した膜をメーカー説明書に従ってヒトＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｃＤＮＡとハイブリダイズし、膜をホスフォイメージ定量化した。５０個の異なるヒト組織のＲＮＡを含むマスターブロットを分析した。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ 転写物は分析した成人及び胎児の全組織において検出され、胃、唾液腺及びリンパ節に最も多かった（図３参照）。
【００８６】
多組織のノーザンブロットをヒトＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲコード配列から誘導した放射標識プローブでハイブリダイズした。１種類の２．３ ｋｂのＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡが全てのヒト組織から検出された。その他に１．２５ ｋｂ ｍＲＮＡ転写物が胎盤に検出された。ヒト組織の範囲と同じ量のＲＮＡを含むノーザンブロットをＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ １のコード配列に特異的なプローブまたは代わりに使用されたエクソン７に選択的なプローブでハイブリダイズした。エクソン７プローブによりＡＤＩＲ２と命名した小型のタンパクをコードする１．２５ ｋｂ転写物を同定した。ブロットをＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲのコード配列に特異的なプローブでハイブリダイズした。バンドのＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ定量を正規化するためにＧ３ＰＤＨを使用した。
【００８７】
ＲＴ−ＰＣＲで増幅したＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｃＤＮＡと染色体１のゲノム配列の整列により、正常ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡは６エクソンの転写により生じること、また主要タンパクモチーフは異なるエクソンによりコードされていることが示された。通常のエクソン６（１０２５ ｂｐ）でなく下流エクソン７（１９６ ｂｐ）を使用する推定選択的スプライシング部位が同定された。これが典型的なポリアデニル化部位で終わる短い１．１５ ｋｂ転写物を作るのであろう、そしてその大きさは胎盤において同定された短いメッセージに相当する。２００ ｂｐのｃＤＮＡを胎盤ＲＮＡからエクソン５及びエクソン７に特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅した。このフラグメントのクローニング及び配列分析の結果、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ遺伝子の選択的スプライシングが生じることを確実にするエクソン５−エクソン７の直接結合が明らかとなった。多組織ノーザンブロットのエクソン７特異的プローブによるハイブリダイゼーションにより１．２５ ｋｂ ｍＲＮＡは胎盤のみに認められた。この転写物は３３７アミノ酸の短いタンパクをコードしており、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ２と命名され、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲに存在するｂｏｘ ＩＶモチーフを欠失している（図４ｂ）。
【００８８】
例４
インビトロＩ型インターフェロン反応性試験
ＨｅＬａ細胞をインビトロでＰＢＳ中１０，０００ ＩＵの組換えヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウからのイントロン）または同量のＰＢＳのみで処理した。８時間後細胞を遠心分離し（８００ｘｇ、１０分間）、細胞ペレットを得た。総ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉの方法により細胞ペレットから抽出し、検体当たり１０．０μｇの総ＲＮＡをグリオキサールの存在下にノーザンブロットにかけ、そして上記例２に記述したようにＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ＰＢＳのみで処理された検体に比較して、増強されたレベル（約１０倍）のＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクｍＲＮＡがＩＦＮ−α処理ＨｅＬａ細胞から抽出されたＲＮＡ検体中に検出された。同じ方法を使用して、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ＲＮＡは１０４ＩＵのＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−γでインビトロ処理したマウスＬ９２９細胞においてもそれぞれ１１及び４倍増加し、１０４ＩＵのＩＦＮ−αで処理したヒトＤａｕｄｉ細胞において２から３倍増加した。その他の実験において、ＨｅＬａ，ＭＲＣ５及びＨｕＨ７細胞はＩＦＮαまたはＩＦＮγで処理したがＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｍＲＮＡのレベルを有意には変化させなかった。
【００８９】
同じ方法は、Ｉ型インターフェロンを使用する治療を勧めている患者から採取したヒト末梢血単核細胞ＰＢＭＣを使用してＩ型インターフェロン反応性を予測するために使用することができる。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配で単離し、１０，０００ ＩＵの組換えヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウのイントロンＡ）でＰＢＳ中または同容量のＰＢＳのみでインビトロ処理する。８時間後細胞を遠心分離し（８００ｘｇ、１０分間）、細胞ペレットを得る。総ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、検体当たり１０μｇのＲＮＡを上記のようにノーザンブロットにかける。
【００９０】
例５
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの既知遺伝子及びタンパクとの相同性
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬタンパクデータベースを調査した結果、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲとヒト、サル及びマウスを含む異なる哺乳動物種のトルシンＡ及びＢに対応する５個の配列との間の高い相同性が明らかとなった。また、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲは４個のトルシン様配列；３個は線虫 Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓから、１個は果実ハエ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから、と若干低い相同性を示した。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲのトルシンファミリーとの相同性は著しく高くそして強く、３０９ ｂｐ整列においてトルシンに対して３８％のアミノ酸及び６０％の類似性であった（図５）。相同の配列はトルシンＡ配列のほとんど全部を含んでいた。同様の相同性が密接に関係するトルシンＢタンパクとの間に認められた。トルシンＡ及びＢ ｃＤＮＡは最近マッピング及びポジショナルクローニングにより単離され（Ｏｚｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｎａｔ ｇｅｎｅｔ １７： ４０−４８ ； Ｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４４：１９−２８； Ｏｚｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６２： ３７７−３８４）そしてその機能不明のＡＴＰ結合タンパクをコードしていることが示された。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲとトルシンＡ及びＢのタンパクが高度な相同性を示すにもかかわらず、それらのヌクレオチド配列はそれに合致する相同性を示さないことは注目に値する。このように、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲはトルシン遺伝子と関係しないかまたはよくても別の関係であるが、多分相同性配列及びトルシンに類似した構造と機能の生成物をコードしている。
【００９１】
トルシンタンパクは４個の特徴的モチーフ；正規のウォーカーＡ及びＢヌクレオチド及びＭｇ２＋−結合配列、保存的ＳＮモチーフ、及びカルボキシ末端記号配列、Ｂｏｘ ＩＶモチーフ、を含む推定ＡＴＰ結合部位であることが既に報告されている（Ｏｚｅｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｔ １７： ４０−４８； Ｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４４： １９−２８）。４個のモチーフ全ての配列はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパク中に高度に保存されていることが認められた。またＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及びトルシンＡ及びＢそのものの間の相同性に特異的な相同配列のブロックを同定した：ＹＣｘＦｘｘＣＣ（ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ中の位置１０５−１１２）、ＬｘＧＱＨＬ（１１４−１３９位）、及びＧＣＫ（３８４−３８６位）。これらの３個のアミノ酸ボックスはＣ． ｅｌｅｇａｎｓ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのトルシン様配列中にも存在する。その他の著しい特徴はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ配列の全体に分布する６個のシステインの位置であり、それはトルシンＡ、トルシンＢ、及びその他のトルシンファミリーのメンバー全てに保存されている。さらにＡモチーフ共通配列（ＬＳｘＨＧＷｓＧＴＧＫＮＦＶ）に関係した推定ホスフォキナーゼＣリン酸化部位はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及びトルシンタンパクに完全に保存されている。推定チロシンキナーゼリン酸化部位もＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ及びトルシンＡのＡモチーフの直ぐ後ろに同様に保存されていたが、トルシンＢにはなかった。
【００９２】
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲはまた、種々の細胞活性化に関係する大きなＡＴＰ分解酵素のファミリー（ＡＡＡ）（Ｎｅｕｗａｌｄ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ９：２７−４３； Ｃｏｎｆａｌｏｎｉｅｒｉ ＆ Ｄｕｇｕｅｔ （１９９５） Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １７： ６３９−６５０）に属すシャペロン様 （Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ８： ２８９−２９６）のＣｌｐ／ＨＳＰ１００ファミリーのメンバーと弱いがかなりの相同性を示した。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲは２００から２７０アミノ酸の整列において３個の異なる細菌性ＡＴＰ結合鎖のクラス、ＣｌｐＡ，ＣｌｐＢ及びＣｌｐＣと及びイーストの熱ショックタンパクＨＳＰ７８，ＨＳＰ１０１及びＨＳＰ１０４と２０から３０％相同性（４０から５０％類似性）を示した。大部分のＣｌｐ／ＨＳＰ１００メンバーは大きなタンパクであり、そしてそれらがＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲと共有する相同性は主としてＡＴＰ結合に関与する領域内にある。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲはまた、Ｃｌｐ／ＨＳＰ１００に類似したＡＴＰ結合ドメインを含む哺乳動物タンパクであるＳＫＤ３（Ｐｅｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９５） Ｇｅｎｅ １５２： １５７−１６３）と程度の低い相同性を示した。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲは１個のみの予想ＡＴＰ結合ドメインを含んでいるので、Ｃｌｐ／ＨＳＰ１００タンパクのクラス２サブファミリーに属するであろう。
【００９３】
ウイルス及び腫瘍細胞に対する抗原提示及び免疫監視に重要な遺伝子の発現調節にインターフェロンが中心的役割を演じており、これらのデータは、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲが小胞体中のタンパク処理に関与するＡＴＰ分解酵素であることを示している。そのタンパクはしばしばアポトーシスに至る過程、インターフェロンの抗腫瘍活性そして、ウイルスは複製するために生存細胞を必要とするので、その抗ウイルス活性に重要な役割を演ずることが知られている過程に関与する。
【００９４】
例６
ＨＵＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ−ＨＡＴ及びＨＵＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ−ＥＧＦＰ融合タンパクのＨｅＬａ細胞における発現
３個の別のアミノ酸によって隔てられた６個のヒスチジン残基を含むプラスミドＰＨＡＴ１０／１１／１２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のヒスチジン親和性タグ（ＨＡＴ）をＰＣＲ増幅し、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ｃＤＮＡの完全なコード配列と同調して融合し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって開発された汎親和性レトロウイルスシステムをメーカー説明書に従って使用してレトロウイルス介在遺伝子導入用発現ベクターｐＬＮＣＸ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に挿入した。ＨｅＬａ細胞の安定遺伝子導入クローンをＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＡＭ，ＵＳＡ）の存在下に選択した。粗細胞抽出を次いで１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦフィルターに移転し、そしてウサギ抗−ＨＡＴポリクロナール抗体１／１０，０００希釈で免疫ブロットし、そしてさらにパーオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）１／２０，０００希釈とインキュベートした。タンパクはメーカー説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ＵＫ）に従って増強化学ルミネッセンスにより検出した。２種のクローン（クローン３及び７）の細胞抽出をウエスタンブロットにより分析し、５０ ｋＤａ、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクの予想サイズ、のタンパクの高レベルの生産が認められた。これらのクローンは次いで形質転換されていない親ＨｅＬａ細胞またはＨＡＴ−ＰＨＡＴ１０／１１／１２ベクターのみを導入したＨｅＬａ細胞と平行して試験を行なった。
【００９５】
ＨｅＬａ細胞はまたＨＵＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ−ＥＧＦＰ融合タンパクでの形質転換も行なった。ＨＵＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ−ＥＧＦＰ融合タンパクは細胞質全体に発現しそしてＥＲのマーカーであるタンパクジスルフィド−イソメラーゼ（ＰＤＩ）と共局在した。同様に、融合タンパクはカルレチキュリンのＥＲ標的配列を含む共導入したＥＣＦＰ−ＥＲ融合タンパクと高度に共局在し、そしてＥＲの内腔に局在した。同様な結果は一過性形質転換ＨｅＬａ細胞及び安定形質転換したクローンの両者に認められた。
【００９６】
例７
ヒト腫瘍細胞に対するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの効果
親ＨｅＬａ細胞またはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクを発現するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ＨＡＴ−ＰＨＡＴ１０／１１／１２ベクターを導入したＨｅＬａ細胞（クローン３及び７）を９６ウエルマイクロタイタープレートに１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中に５μｍの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下または非存在下に１０５細胞濃度で接種した。細胞増殖をヘモサイトメーター及び細胞の生死を区別するためのトリパンブルー色素排除試験を標準的方法に従い使用して毎日追跡した。図６は、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲは５−ＦＵの存在下に大量のヒト腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することを示している。事実、ヒト腫瘍細胞の増殖またはアポトーシスには有意な影響を与えない濃度（５μＭ）の５−ＦＵであっても、５−ＦＵとＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの存在下において全ての腫瘍細胞が死滅した。ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ単独ではヒト腫瘍細胞のアポトーシスには有意な影響を及ぼさなかったが、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの存在下に９６時間培養した後には統計的に有意な細胞増殖の抑制が認められた（図７）。
【００９７】
例８
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの抗ウイルス活性
親ＨｅＬａ細胞またはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲタンパクを発現するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ ＨＡＴ−ＰＨＡＴ１０／１１／１２ベクターを導入したＨｅＬａ細胞（クローン７）を９６ウエルマイクロタイタープレートに１０５細胞の濃度で２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中に接種し、１００ ＩＵのＩＦＮ−αの存在下または非存在下に３７℃で終夜インキュベートした。次いでＩＦＮ含有培地を除去し、そして細胞を２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地中で水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に感染多重度０．０１で感染させた。１時間後ウイルスを除去し、２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、次いで３７℃で終夜インキュベートした。次いで培養を凍結・解凍を６回行い、１０分間１５，０００ｘｇで遠心分離を行なって細胞破片を除去し、ウイルス収量を標準的方法に従いＬ９２９細胞上各培養上清の１０倍希釈の滴定により測定した。
【００９８】
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲはＶＳＶに感染した細胞におけるＩＦＮ−αの抗ウイルス作用を著しく増強することが認められた。感染多重度０．０１でＶＳＶに感染したＨｅＬａ細胞におけるウイルス収量は無処置対照培養では６ｘ１０７であり、１００ ＩＵのＩＦＮ−α処理培養では２ｘ１０４であった（図８）。これに対して、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲを発現するＨｅＬａ細胞（クローン７）を親ＨｅＬａ細胞と同じ条件でＶＳＶに感染させた場合のウイルス収量は対照培養において５ｘ１０７及び１００ ＩＵのＩＦＮ−α処理培養では７ｘ１０２であった。このように、ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲは１００ ＩＵのＩＦＮ−αの抗ウイルス作用を約３０倍増強することが認められた。
【００９９】
例９
ＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲのヌードマウス中のヒト腫瘍細胞に対する効果
６週齢雄ＢＡＬＢ／ｃ Ｎｕ＋／Ｎｕ＋ヌードマウスの皮下に４ｘ１０６個の親ＨｅＬａ細胞またはＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲを発現するＨｅＬａ細胞（クローン７）を注射した。皮下腫瘍が親ＨｅＬａ細胞及びクローン７がそれぞれ２６．８＋／−１．５８ ｍｍ２及び２２．４＋／−２．４６ ｍｍ２の大きさに達する７日後に、動物をＰＢＳ中３０ ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ（有効量以下）またはＰＢＳのみを７，８，９，１０，１４，１５，１６，１７，１８及び２１に投与した。毎日腫瘍の大きさを測定した。次いで２９日に動物を屠殺し、腫瘍を摘出し、標準的方法を使用して組織学的検査を行なった。
【０１００】
図９に示す結果は５−ＦＵの抗腫瘍活性はＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの存在下に明らかに増大することを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＢＡＬＢ／Ｃマウス脾臓ｃＤＮＡライブラリーから単離したｃＤＮＡクローンを配列分析し、組み立てた。最長ＯＲＦは網掛け部分で区切った枠内に太字で示されている。ポリアデニル化可能部位はアンダーラインを引いてある。
【図２】
マウスＯＲＦから推定したアミノ酸配列をヒトＡＤＩＲタンパクの配列とＭＵＬＴＡＬＩＮ整列プログラムを使用して比較した。相同は黒枠で、類似は灰色で囲った。ＡＴＰ結合タンパクの典型的なモチーフ、Ａ，Ｂ，及びＢｏｘＩＶが示されている。ヒト及びマウスのいずれの配列中にも保存されているホスフォリレーション（ＰＫＣ，プロテインキナーゼＣ，ＣＫ２，カゼインキナーゼＩＩ； ＴＫ，チロシンキナーゼ）及びグリコシレーション（Ｇｌｙ）の推定部位のみが示されている。
【図３】
ヒトＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲ転写物の分析及び組織分布。１から１４：脳（全脳、小脳扁桃、尾状核、小脳、大脳皮質、前葉、海馬、延髄、後頭葉、被核、黒質、側頭葉、視床、視床下部核）１５から２０脊髄、心臓、大動脈、骨格筋、結腸、膀胱、２１から３０子宮、前立腺、胃、睾丸、卵巣、膵臓、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、３１から４３乳腺、腎臓、小腸、脾臓、胸腺、末梢白血球、リンパ節、骨髄、盲腸、肺、器官、胎盤、４４から５０胎児組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、胸腺、肺）。大脳皮質及び成人肝臓以外の大部分の組織は数人から集めたものである。胎児ｍＲＮＡは１７から２５週齢の少なくとも１４胚から集めたものである。膜に接着したｍＲＮＡ検体は８種類の異なる自家保存検体のｍＲＮＡ発現レベルに対して正規化した。
【図４】
ヒトＡＤＩＲ遺伝子の構成。ヒト染色体１上のエクソンは灰色の枠で示し、各エクソンによりコードされている顕著なタンパクモチーフが示されている（Ａ）。エクソン７を使用する選択的スプライシングにより修飾Ｃ末端を有しＡＤＩＲ１に存在するＢｏｘＩＶモチーフが除去されたＡＤＩＲ２と呼ぶタンパクを生じる（Ｂ）。
【図５】
トルシンＡ及びＣｌｐ／ＨＳＰ１００タンパク類に対するＡＤＩＲの相同性。ヒトＡＤＩＲ、ヒト及びマウストルシンＡ及びトルシンＢタンパク、及び果実ハエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及び線虫 Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓのトルシン様配列の整列（Ａ）。濃い網は相同、薄い網は類似を示す。保存は共通配列に示されている；同一アミノ酸は大文字太字で示し、類似アミノ酸は大文字または小文字で示す。機能に関与する可能性が有る高度に保存された配列は共通配列を枠で囲った。矢印は保存されたシステインの位置を示す。（Ｂ）。ＡＤＩＲ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ熱ショックタンパク１０１、ＨＳＰ１０１／Ｃｌｐタンパクファミリーの１員、及びマウスＳＫＤ３の整列。
【図６】
５μＭの５−ＦＵの存在下における細胞増殖に対するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの効果。結果は各時点について６培養の平均及び標準誤差で示す。
【図７】
細胞増殖に対するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの効果。
【図８】
水疱性口内炎ウイルスの複製に対するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの効果。
【図９】
ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の増殖に対する５−ＦＵの抗腫瘍活性に対するＨｕＩＦＲＧ４６／ＡＤＩＲの効果。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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