(57)【要約】本発明は、好中球阻害性因子（ＮＩＦ）を調製するための方法に関する。この方法は、動物成分なしの増殖培地中でＮＩＦを発現する哺乳動物細胞の培養を包含する。本発明は、ＮＩＦの大規模調製において用いられ得る。本発明はまた、組換えタンパク質を調製するための方法に関する。この方法は、動物成分なしの増殖培地中での外因性組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養を包含する。本発明の好ましい実施形態は、動物成分がない産生増殖培地が、以下を含むものである：（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム；（ｉｉｉ）チミジン；および（ｉｖ）酵母抽出物。
2004520809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球阻害性因子を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、接種物増殖培地、生成増殖培地および栄養供給物からなる群より選択される動物成分なしの培地中で好中球阻害性因子を発現する細胞株を増殖して、生成培養物を与える工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、前記好中球阻害性因子が配列番号３のタンパク質である、プロセス。
【請求項３】
請求項２に記載のプロセスであって、前記タンパク質が、グリコシル化されており、約３８．３〜約６４．１ｋＤａの相対分子量を有する、プロセス。
【請求項４】
請求項２に記載のプロセスであって、前記タンパク質は、約５〜約２５％がモノシアル化され、約１０〜約３０％がジシアル化され、約１５〜約３５％がトリシアル化され、約１５〜約４５％がテトラシアル化され、そして約１〜約２０％がシアル化されていない、プロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスであって、前記動物成分なしの生成増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液；および
（ｉｉｉ）酵母抽出物、
を含む、プロセス
【請求項６】
請求項１に記載のプロセスであって、前記動物成分なしの生成増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を約５〜約２０ｍｌ；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、酵母抽出物を約０．５〜約５．０ｇ、を含む、プロセス。
【請求項７】
請求項１に記載のプロセスであって、前記動物成分なしの生成増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を１０．０ｍｌ；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、酵母抽出物を約１．５ｇ、
を含む、プロセス。
【請求項８】
請求項１に記載のプロセスであって、以下の工程：
（ａ）動物成分なしの接種物増殖培地中で好中球阻害性因子を発現する細胞株をインキュベートすることにより調製される接種物を提供する工程；および
（ｂ）動物成分なしの生成増殖培地を含む容器に該接種物を入れる工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスであって、前記接種物増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液；
（ｉｉｉ）Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、およびＬ−メチオニンからなる群より選択されるアミノ酸を含むアミノ酸溶液；
（ｉｖ）必要に応じて、Ｌ−メチオニンスルホキシミン溶液；ならびに
（ｖ）Ｌ−システイン溶液、
を含む、プロセス。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、前記接種物増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を約５〜約２０ｍｌ；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−アスパラギン酸（３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（１．５ｇ／ｌ）を含むアミノ酸溶液を約５〜約３０ｍｌ；
（ｉｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−メチオニンスルホキシミンを約０〜約７５μｍｏｌ；ならびに
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−システインを約１０〜約４０ｍｇ、
を含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項８に記載のプロセスであって、前記接種物増殖培地が、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を１０．０ｍｌ；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−アスパラギン酸（３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（１．５ｇ／ｌ）を含むアミノ酸溶液を２０．０ｍｌ；
（ｉｖ）必要に応じて、１リットルの（ｉ）あたり、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシミン溶液を１．０ｍｌ；ならびに
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−システインを約２５．０ｍｇ、
を含む、プロセス。
【請求項１２】
請求項８に記載のプロセスであって、以下：
（ｃ）少なくとも１つの栄養供給物を前記生成培養物に供給する工程、
をさらに包含する、プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記工程（ｃ）が、第１の栄養供給物および第２の栄養供給物を含む、プロセス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記第１の栄養供給物が、１リットルあたり、約１００〜約５００ｇのグルコース水溶液を含む栄養供給物である、プロセス。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記第１の栄養供給物が、１リットルあたり、約２００ｇのグルコース水溶液を含む栄養供給物である、プロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスであって、前記第１の栄養供給が、１日あたり増殖培地１リットルあたり、約０．０〜約６．０ｇのグルコースの速度で添加される、プロセス。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記第２の栄養供給が、以下：
（ｉ）１×Ｌ−シスチン、３×Ｌ−チロシンを含み、グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムを含まないＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液；
（ｉｉ）（ｉ）の溶液１リットルあたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を２５〜１００ｍｌ；および
（ｉｉｉ）１リットルの溶液（ｉ）あたり、酵母抽出物を５〜２０ｇ、
を含む、プロセス。
【請求項１８】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記第２の栄養供給が、以下：
（ｉ）１×Ｌ−シスチン、３×Ｌ−チロシンを含み、グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムを含まないＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液；
（ｉｉ）１リットルの溶液（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を５０ｍｌ；ならびに
（ｉｉｉ）１リットルの溶液（ｉ）あたり、酵母抽出物を７．５ｇ、
を含む、プロセス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプロセスであって、前記第２の栄養供給物が、約２．５ｍｌ／リットル−日の速度で連続的にリアクター中に供給される、プロセス。
【請求項２０】
請求項１３に記載のプロセスであって、前記第１の栄養供給物が、約１００〜約５００ｇ／リットルのグルコースを含み、前記第２の栄養供給物が、（１）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液、（２）（１）の１リットルあたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を約２５〜約１００ｍｌ；および（３）（１）の１リットルあたり、酵母抽出物を約０．５〜約５ｇを含む、プロセス。
【請求項２１】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記栄養供給物が、約１００〜約５００ｇ／リットルのグルコース水溶液を含む栄養供給物である、プロセス。
【請求項２２】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記栄養供給物が、約２００ｇ／リットルのグルコース水溶液を含む栄養供給物である、プロセス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のプロセスであって、前記栄養供給が、１日あたり増殖培地１リットルあたり約０．０〜約６．０ｇのグルコースの速度で添加される、プロセス。
【請求項２４】
請求項１に記載のプロセスによって生成された好中球阻害性因子。
【請求項２５】
動物成分なしの生成増殖培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液；および
（ｉｉｉ）酵母抽出物、
を含む、生成増殖培地。
【請求項２６】
請求項２５に記載の培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を約５〜約２０ｍｌ；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、酵母抽出物を約０．５〜約５ｇ、
を含む、培地。
【請求項２７】
請求項２５に記載の培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を１０．０ｍｌ；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、酵母抽出物を１．５ｇ、
を含む、培地。
【請求項２８】
組換えタンパク質を調製するための方法であって、請求項２５に記載の動物成分なしの増殖培地中で外因性組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の培養を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記哺乳動物細胞が、前記組換えタンパク質のＤＮＡコード領域を含むグルタミンシンセターゼプラスミドベクターでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞である、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記ベクターが、ｐＥＥ１４およびｐＥＥ１４．１から選択される、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクターである、方法。
【請求項３１】
接種物増殖培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液；
（ｉｉｉ）Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、およびＬ−メチオニンからなる群より選択されるアミノ酸を含むアミノ酸溶液；
（ｉｖ）必要に応じて、Ｌ−メチオニンスルホキシミン溶液；ならびに
（ｖ）Ｌ−システイン溶液、
を含む、培地。
【請求項３２】
請求項３１に記載の接種物増殖培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を約５〜約２０ｍｌ；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−アスパラギン酸（約３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（約２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（約１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（約１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（約３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（約１．５ｇ／ｌ）を含むアミノ酸溶液を約５〜約３０ｍｌ；
（ｉｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−メチオニンスルホキシミンを約０〜約７５μｍｏｌ；ならびに
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−システインを約１０〜約４０ｍｇ、
を含む、培地。
【請求項３３】
請求項３２に記載の接種物増殖培地であって、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を１０．０ｍｌ；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−アスパラギン酸（３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（１．５ｇ／ｌ）を含むアミノ酸溶液を２０．０ｍｌ；
（ｉｖ）必要に応じて、１リットルの（ｉ）あたり、２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシミン溶液を１．０ｍｌ；ならびに
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり、Ｌ−システインを２５．０ｍｇ、
を含む、培地。
【請求項３４】
栄養供給物であって、以下：
（ｉ）１×Ｌ−シスチン、３×Ｌ−チロシンを含み、グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムを含まないＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液；
（ｉｉ）１リットルの溶液（ｉ）あたり、１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液を２５〜１１１ｍｌ；ならびに
（ｉｉｉ）１リットルの溶液（ｉ）あたり、酵母抽出物を５〜２０ｇ、
を含む、栄養供給物。
【請求項３５】
細胞株ＰＦＧ−０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）。
【請求項３６】
好中球阻害性因子を調製するための方法であって、該方法は、該好中球阻害性因子の発現を促進する条件下で請求項３５に記載の細胞株を培養する工程、および該好中球阻害性因子を回収する工程、を包含する方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記好中球阻害性因子が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３８】
細胞株ＰＦＧ−０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）を培養することにより調製される、好中球阻害性因子。
【請求項３９】
請求項３６または３７に記載の方法によって調製される、好中球阻害性因子。
【請求項４０】
請求項１〜２３のいずれかに記載のプロセスであって、前記細胞株がＰＦＧ−０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）である、プロセス。
【請求項４１】
請求項２〜２３のいずれかに記載のプロセスにより作製された好中球阻害性因子。
【請求項４２】
好中球阻害性活性を有し、細胞株ＰＦＧ−０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）によって生成された配列番号３のアミノ酸配列を含む、単離された好中球阻害性因子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本願は、２０００年８月２３日に出願された、米国出願番号０９／６４４，９４２の一部継続出願である。この出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、好中球阻害性因子（ＮＩＦ）を調製する方法に関し、この方法は、動物成分のない増殖培地中での哺乳動物細胞の培養を包含する。本発明は、ＮＩＦの大規模な調製において使用され得る。さらに、本発明は、組換えタンパク質の調製のための一般的な方法を提供し、この方法は、動物成分のない培地中での、外因性組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞（特に、ＣＨＯ細胞）の培養を包含する。
【０００３】
（発明の背景および導入）
ＮＩＦとは、好中球の活性の特異的なインヒビターであるタンパク質である。好中球は、顆粒球として公知の細胞型の群のメンバーであり、白血球ファミリーの細胞のサブクラスである。
【０００４】
好中球は、微生物の攻撃に対する宿主における防御系の重要な成分である。外傷の部位において細胞によって放出される可溶性炎症性媒介物に応答して、好中球は、血流から外傷組織の領域に入り、そして活性化されると、食作用および／または細胞傷害性化合物（例えば、酸化剤、プロテアーゼおよびサイトカイン）の放出によって、外来細胞を殺傷する。好中球の活性は、感染と戦うために重要であるが、好中球はまた、宿主組織を損傷することが公知である。好中球は、異常な炎症応答を引き起こし得、これによって、脈管壁または傷のない組織において、重大な組織損傷が、毒性物質の放出によって引き起こされ得る。あるいは、毛細管壁に接着したかまたは細静脈に凝集した好中球は、虚血性の組織損傷を生じ得る。
【０００５】
異常な炎症応答は、種々の臨床的障害の病因に関連する。これらの障害としては、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）；心筋梗塞、ショック、発作、および器官の移植の後の、虚血性再灌流障害；急性および慢性の同種移植拒絶；脈管炎；敗血症；慢性関節リウマチ；頭部の外傷；ならびに炎症性皮膚疾患が挙げられる。Ｈａｒｌａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１１４：５（１９９０）。
【０００６】
ＮＩＦが阻害性すると報告された特定の活性の１つは、脈管内皮細胞への好中球の接着である。
【０００７】
特定のＮＩＦが、鉤虫および関連する種（特に、イヌ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  Ｃａｎｉｎｕｍ））から単離され（Ｍｏｙｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１０００８−１５（１９９４））、そして組換え方法によって作製された。寄生虫から単離される場合、ＮＩＦは、糖タンパク質である。特定の発現系によって産生される組換えＮＩＦは、翻訳後のグリコシル化およびシアリル化を示すことが報告されている。
【０００８】
ＮＩＦは、好中球活性の他の局面（過酸化水素の放出、スーパーオキシドアニオンの放出、ミエロペルオキシダーゼの放出、エラスターゼの放出、体輻をなす好中球凝集、可塑物表面への接着、脈管内皮細胞への接着、走化性、内皮細胞の単層を横切る移行、および食作用が挙げられる）を阻害することが報告されている。特に、ＮＩＦは、ラットの発作の再灌流モデルにおいて、梗塞のサイズを減少させる際に効果的であることが示された。Ｊｉａｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，３８：３９５−９４２（１９９５）；Ｊｉａｎｇら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７８８：２５−３４（１９９８）。
【０００９】
特定の好中球阻害性因子は、これらを天然の供給源から単離する方法、およびこれらを組換え方法によってクローニングする方法と共に、１９９９年６月６日に発行された米国特許第５，９１９，９００号、１９９８年５月５日に発行された米国特許第５，７４７，２９６号、および１９９８年８月４日に発行された米国特許第５，７８９，１７８号に、さらに詳細に記載されている。これらの特許文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００１０】
現在まで、ＮＩＦを発現する細胞の培養は、ウシ血清アルブミンを含む増殖培地中で実施されてきた。例えば、米国特許第５，９１９，９００号を参照のこと。
【００１１】
一般的な事項として、組換えタンパク質を発現する細胞の培養は、最もしばしば、動物由来の血清または動物から抽出されたタンパク質のいずれかを含む培地中で実施される。しかし、動物成分の使用に関する一般的な懸念、および特に、病原体によるウシ産物の汚染（ウシの海綿状脳症（ＢＳＥ）の発生を引き起こす生物による汚染を含む）に関する一般的な懸念の増加の観点から、動物成分（例えば、血清およびタンパク質）を含まない増殖培地に対する必要性が存在する。米国特許第５，１２２，４６９号においては、無血清培地が列挙されている。しかし、無血清培地はしばしば、細胞増殖、タンパク質産生、および翻訳後修飾のために最適化されていない。
【００１２】
本発明は、動物血清のない、そして動物タンパク質のない培地、およびこれらの無血清かつ無タンパク質の培地を使用してＮＩＦを調製し、高収率でＮＩＦを提供する方法を提供する。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、好中球阻害性因子（ＮＩＦ）を調製するためのプロセスに関し、このプロセスは、ＮＩＦを発現する細胞株を、動物成分のない増殖培地中でインキュベートする工程を包含する。好ましくは、本発明によって産生されるＮＩＦは、２５７アミノ酸タンパク質の、成熟ＮＩＦ−１ＦＬ（「ＮＩＦ１」ともまた呼ばれる）（配列番号３）である。このように産生されるＮＩＦは、グリコシル化され、そして約３８．３〜約６４．１ｋＤａの相対分子量を有する。グリカン構造は、代表的に分枝しており、そしてシアル酸残基によってキャップされ得る。グリコシル化の程度は変動し得るが、好ましくは、産生されるＮＩＦは、モノアンテナ状（ｍｏｎｏ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）、ジアンテナ状、トリアンテナ状、およびテトラアンテナ状のグリカン構造の分布を有する。より好ましくは、産生されるＮＩＦは、約５〜約２５％がモノシアリル化しており、約１０〜約３０％がジシアリル化しており、約１５〜約３５％がトリシアリル化しており、約１５〜約４５％がテトラシアリル化しており、そして約１〜約２０％がシアリル化していない。
【００１４】
本発明の好ましい局面によれば、ＮＩＦを発現する細胞株は、ＮＩＦ遺伝子を含むチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞株であり、より好ましくは、足場依存性ではない細胞株である。
【００１５】
本発明の最も好ましい局面によれば、細胞株は、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシイミン共増幅ベクターｐＥＥ１４（ＮＩＦ１遺伝子を発現する）でのトランスフェクションによって改変された、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）である。ＷＯ８７／０４４６２および８９／１０４０４は、発現系における、組換えＤＮＡ配列、ベクターおよびグルタミンシンテターゼ系の使用を記載する。
【００１６】
本発明のプロセスおよび方法による使用のために最も好ましい細胞株は、細胞株ＰＦＧ０１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）である。
【００１７】
ＮＩＦを発現する最も好ましい細胞株の調製および培養は、以下の実施例１および２に記載されている。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態は、動物成分がない産生増殖培地が、以下を含むものである：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）チミジン；および
（ｉｖ）酵母抽出物。
【００１９】
「ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ」とは、ヒポキサンチンおよびチミジンなしで作製される、ＣＨＯ細胞の懸濁培養のために最適化された無タンパク質培地をいい、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手可能である。「ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭグルコース溶液」とは、グルコースを添加して作製されたＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ培地であり、調製物はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。好ましいＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液は、注文処方番号９８−０２８９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡの部門）であり、これは、さらなるグルコース（３．４５ｇ／ＬのＤ−グルコース）を含み、そしてヒポキサンチンも、チミジンも、Ｌ−グルタミンも含まない、ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液である。
【００２０】
ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液は、それ自体が動物成分を含まない（動物血清および動物タンパク質を含まない）。しかし、動物成分がなく、そしてＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ培地の上記性質および成分を組み込む、他の市販のＣＨＯ細胞培養培地もまた、本発明の範囲内で使用され得ることに、注意するべきである。
【００２１】
好ましい酵母抽出物は、商品名Ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ／Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で購入されるものである。他の市販の酵母抽出物もまた、使用され得る。
【００２２】
フェノールレッドの溶液、好ましくは、フェノールレッドの約０．５％  ｗ／ｖの溶液が、視覚的なｐＨ指示薬としての使用のために、培地に添加され得る。このようなフェノールレッド溶液は、より好ましくは、培地１リットルあたり約０〜約３．０ｍｌの量で使用される。
【００２３】
本発明のより好ましい実施形態は、動物成分を含まない産生増殖培地が以下を含むものである：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約５０〜約１００μｍｏｌのヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約８〜約３２μｍｏｌのチミジン；および
（ｉｖ）１リットルの（ｉ）あたり約０．５〜約５．０グラムの酵母抽出物。
【００２４】
好ましい局面によれば、ヒポキサンチンナトリウムおよびチミジンは、１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭチミジン溶液として添加される。好ましくは、１リットルの（ｉ）あたり約５〜約２０ｍｌのヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液が添加される。
【００２５】
本発明の最も好ましい実施形態は、動物成分がない産生増殖培地が以下を含むものである：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約１０．０ｍｌの、１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭチミジン溶液；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約１．５グラムの酵母抽出物。
【００２６】
必要に応じて、１リットルの（ｉ）あたり約０．５ｍｌの０．５％  ｗ／ｖフェノールレッド溶液が、培地に添加され得る。
【００２７】
本発明はまた、好中球阻害性因子（ＮＩＦ）を調製するためのプロセスに関し、このプロセスは、以下の工程を包含する：
（ｉ）ＮＩＦを発現する細胞株を、動物成分がない接種物増殖培地中でインキュベートすることによって調製された、接種物を提供する工程；および
（ｉｉ）この接種物を、動物成分がない産生増殖培地を含む容器に移す工程。
【００２８】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、この接種物増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）チミジン；
（ｉｖ）Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、およびＬ−メチオニンからなる群より選択される酸を含む、アミノ酸溶液；
（ｖ）必要に応じて、Ｌ−メチオニンスルホキシイミン（「ＭＳＸ」）；ならびに
（ｖｉ）Ｌ−システイン。
【００２９】
必要に応じて、フェノールレッドを含む溶液、好ましくは、フェノールレッドの約０．５％  ｗ／ｖの溶液が、視覚的なｐＨ指示薬としての使用のために、培地に添加され得る；好ましくは、この溶液は、より好ましくは、培地１リットルあたり約０〜約３．０ｍｌの量で使用される。
【００３０】
本発明のこの局面のより好ましい実施形態は、接種物増殖培地が以下を含むものである：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約５０〜約１００μｍｏｌのヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約８〜約３２μｍｏｌのチミジン；
（ｉｖ）以下のアミノ酸の、１リットルの（ｉ）あたり記載される量での添加：Ｌ−アスパラギン酸（約１５〜約９０ｍｇ）、Ｌ−グルタミン酸（約１２〜約７５ｍｇ）、Ｌ−アスパラギン（約５０〜約３００ｍｇ）、Ｌ−プロリン（約６〜約３８ｍｇ）、Ｌ−セリン（約１５〜約９０ｍｇ）、およびＬ−メチオニン（約７〜約４５ｍｇ）；
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり約０〜約７５μｍｏｌのＬ−メチオニンスルホキシイミン（「ＭＳＸ」）；ならびに
（ｖｉ）１リットルの（ｉ）あたり約１０〜約４０ｍｇのシステイン。
【００３１】
（ｉｖ）のアミノ酸は、Ｌ−アスパラギン酸（約３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（約２．５０ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（約１０．００ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（約１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（約３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（約１．５０ｇ／ｌ）を含む、１リットルの（ｉ）あたり約５〜約３０ｍｌのアミノ酸溶液として、簡便に添加され得る。ＭＳＸは、必要に応じて、１リットルの（ｉ）あたり約０．５〜約３ｍｌの２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンスルホオキシイミン（ＭＳＸ）溶液として添加され、約１２．５〜約７５μモル／リットルのＭＳＸを与え得る。ヒポキサンチンナトリウムおよびチミジンは、約５〜約２０ｍｌの１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液として、簡便に添加され得る。
【００３２】
本発明の最も好ましい実施形態において、種菌増殖培地は、以下：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）あたり約１０．０ｍｌの１０ｍＭ  ヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭ  チミジン溶液；
（ｉｉｉ）Ｌ−アスパラギン酸（約３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（約２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（約１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（約１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（約３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（約１．５０ｇ／ｌ）を含む、１リットルの（ｉ）あたり約２０ｍｌのアミノ酸溶液；
（ｉｖ）必要に応じて１リットルの（ｉ）あたり約１．０ｍｌの２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）溶液；および
（ｖ）１リットルの（ｉ）あたり約２５．０ｍｇのＬ−システイン
を含む。必要に応じて１リットルの（ｉ）あたり約０．５ｍｌの約０．５％ｗ／ｖフェノールレッド溶液が、この種菌培地に添加され得る。
【００３３】
本発明はさらに、上記のような、動物成分を含まない増殖培地に関する。さらに、本発明は、動物成分を含まない種菌増殖培地に関する。
【００３４】
さらに、本発明はまた、組換えタンパク質の調製のための方法に関し、この方法は、本発明の動物成分を含まない増殖培地中で、外因性組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養する工程を包含する。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、その組換えタンパク質のＤＮＡコード領域を有する核酸分子を含むグルタミンシンテターゼプラスミドベクターをトランスフェクトした、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。好ましいベクターは、グルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホオキシイミン共増幅ベクター（例えば、ｐＥＥ１４またはｐＥＥ１４１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）である。
【００３５】
（定義）
「好中球阻害性因子」または「ＮＩＦ」とは、天然の供給源から単離され得るか、または組換え方法によって作製され得るタンパク質をいう。好中球阻害性因子は、抗体、インテグリンファミリーまたはセレクチンファミリーのメンバー、あるいは接着タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーのいずれでもなく、かつ寄生虫から単離された場合にグリコシル化されているタンパク質である。組換えＮＩＦは、グリコシル化されていてもされてなくてもよく、あるいは種々の程度でグリコシル化されていてもよく；これは、組換えＮＩＦの産生に使用される発現系および／または培養条件によって影響され得る。
【００３６】
ＮＩＦ１または成熟ＮＩＦ−１ＦＬとは、プロ形態ＮＩＦ−１ＦＬ（配列番号２）で発現され、次いで、合成後、（細胞内で）切断されて成熟ＮＩＦ−１ＦＬまたはＮＩＦ１（配列番号３）を生じるタンパク質をいう。
【００３７】
「ＮＩＦ１ｃｒ」とは、ＮＩＦ１のコード配列をいう。
【００３８】
用語「ＮＩＦ遺伝子」とは、好中球阻害性因子をコードする核酸分子をいう。ＮＩＦをコードする特定の核酸分子は、米国特許第５，９１９，９００号に記載される。
【００３９】
用語「ＮＩＦを発現する細胞株」とは、好中球阻害性因子を発現するようにＮＩＦをコードする核酸分子で形質転換された細胞株をいう。
【００４０】
細胞株ＰＦＧ０１は、ＮＩＦ１遺伝子を発現するグルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホオキシイミン共増幅ベクターｐＥＥ１４でトランスフェクトされた、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−６１）細胞株である。Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．ａ  Ｄｅｌａｗａｒｅ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、２３５  Ｅａｓｔ  ４２ｎｄ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋは、２０００年９月２７日に細胞株ＰＦＧ０１をアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した（ＡＴＣＣＰＴＡ−２５０３）。
【００４１】
用語「ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液」とは、ＣＨＯ細胞の培養用に特別に開発されたグルコースを添加した、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ；ＰＦＭ＝無タンパク質培地）によって製造される増殖培地をいう。
【００４２】
用語「酵母抽出物」とは、酵母細胞から抽出されかつ動物由来の化合物を含まないペプチドを含有する、複合補助剤をいう。
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明のプロセスは、下記のように実施され得る。本発明の利点の１つは、培地（種菌増殖培地、産生増殖培地および栄養供給物を含む）のいずれにおいても動物性成分の使用を包含しないことである。この利点は、医薬の製造における動物由来物質の使用に関する漸増する問題（例えば、ＢＳＥ（ウシの海綿状脳症）の伝染の恐れ）の点で有意である。さらに、動物由来成分を含む培地を使用する以前に使用されていたプロセスとは対照的に、本発明のプロセスは、数日短い処理期間を有し、そして代表的には、３〜４倍大きな適切にグリコシル化されたＮＩＦ力価を達成する。
【００４４】
（好ましい細胞株およびＮＩＦ）
本発明は、好ましくは、哺乳動物細胞株、より好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）由来の組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株を使用して実施され、この組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、ＮＩＦ発現プラスミドベクター、好ましくは、ＮＩＦ１  ＤＮＡを含むｐＥＥ１４ベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ；ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩクローニング部位を含む、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシイミン同時増幅ベクター（このベクターがグルタミンシンセターゼおよびクローン化遺伝子を発現する）で形質転換されている（実施例１）。
【００４５】
ＮＩＦ産生細胞株の構築は、組換えタンパク質を産生する細胞培養物の確立のための手順に従い、この手順は、当該分野で公知であり、以下に開示される：米国特許第５，９１９，９００号；同第５，７４７，２９６号；同第５，７８９，１７８号；同第５，５９１，６３９号；同第５，６５８，７５９号；同第５，８４９，５２２号；同第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；および同第５，８２７，７３９号；国際特許公開番号ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ９８／０１０３６；ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／１０４０４；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５（１９９２）（これらの全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００４６】
好ましくは、細胞株は、懸濁培養物を容易に形成するように使用前に選択および適合されるべきであり、故に、足場依存性ではなく、かつ動物血清および動物タンパク質含有培地から数世代にわたって引き離される。一般に、このような適合を行うための手順は、以下の実施例２に記載される細胞株と類似の細胞株を培養することによって、実施され得る。
【００４７】
ＰＦＧ０１と称される細胞株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０３）は、本発明のプロセスに好ましい。ＰＦＧ０１細胞株は、以下の実施例１および２に記載されるように、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）由来であった。ＰＦＧ０１細胞株を、ＮＩＦ１遺伝子を含むｐＥＥ１４プラスミドベクターによるＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のトランスフェクトによって、作製した。このＰＦＧ０１細胞株の発生は、足場依存性株から懸濁培養物を作製し、この組換え細胞をウシ血清から引き離すことによって完了した。
【００４８】
上記の方法によって形質転換された細胞により産生されるＮＩＦのいずれも、本発明のプロセスに従って産生され得る。好ましくは、本発明のプロセスによって産生されるＮＩＦは、２５７アミノ酸タンパク質である、成熟ＮＩＦ−１ＦＬ（ＮＩＦ１）（配列番号３）であり、これは図１に示される。ＮＩＦ１は、約３８．３〜約６４．１ｋＤａの相対分子量を有するグリコシル化されかつシアリル化されたタンパク質として、形質転換細胞によって産生される。好ましい局面によると、ＮＩＦ１は、４１ｋＤａの糖タンパク質として発現され、ここで、その分子量の約３０％〜約５０％は、糖部分（グリカン）のオリゴ糖類（分枝鎖でありかつシアル酸残基でキャップされていてもよい）から構成される。この特定のＮＩＦは、Ｍｏｙｌｅら、（前出）に詳細に記載される；Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，２９：１１４１−１１５５（１９９９）およびその中で引用される参考文献もまた参照のこと。
【００４９】
（ＮＩＦの調製物）
本発明に従ってＮＩＦを調製するためのプロセスは、動物性成分を含まない接種物増殖培地の使用を介する接種物の調製、産物増殖培地を含む容器中でこの接種物を懸濁すること、生きた細胞の培養物を維持すること、およびＮＩＦ産物を収集することを含む。本発明の一つの実施形態において、接種培養物の産生は、ＰＦＧ０１細胞の培養物を増殖することによって導かれ、次いで、これを使用して、産物リアクターに「播種」する。この接種培養物を、通常、実際の産生容器よりも小さいサイズの、振盪フラスコまたは容器中で産生する。
【００５０】
初期の種子細胞は、最初に、予め温められた接種物増殖培地中で懸濁される。この種子細胞が凍結される場合、ＮＩＦを発現する種子細胞、好ましくは、ＰＦＧ０１細胞株の種子細胞（ＮＩＦ１を放出する）は、このアイスペレットがほとんど完全に解けるまで、約３０℃と約３８℃との間の温度の浴中で解凍する。次いで、通常、この解凍したバイアルを生物学的に安全な封入単位またはキャビネットに移動し、そしてこのバイアルの外部を、標準的な手段（例えば、アルコールパッドで拭く手段など）によって徐染する。
【００５１】
次いで、細胞を予め温めた接種物増殖培地中で懸濁し、この培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム（好ましくは、１リットルの（ｉ）当たり約５０〜１００μｍｏｌ）；
（ｉｉｉ）チミジン（好ましくは、１リットルの（ｉ）当たり約８〜約３２μｍｏｌ）；
（ｉｖ）Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリンおよびＬ−メチオニンからなる群からなる選択されるアミノ酸を含む、アミノ酸溶液；
（ｖ）必要に応じて、Ｌ−メチオニンスルホキシミン；および
（ｖｉ）Ｌ−システイン。
【００５２】
好ましい局面に従って、この接種物増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液（好ましくは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；これは、３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない）；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液（好ましくは、ＨＴ上清（１００×）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１０６７−０３０））；
（ｉｉｉ）アミノ酸溶液（好ましくは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、およびＬ−メチオニンから選択される酸から構成される）；
（ｉｖ）必要に応じて、Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）溶液；ならびに
（ｖ）Ｌ−システイン溶液。
必要に応じて、フェノールレッド（好ましくは、その約０．５％ｗ／ｖの溶液を含む）を、視覚性ｐＨ指示薬としての使用のために培地中に添加し得る。より好ましくは、１リットルの培地当たり約０〜約３．０ｍｌの量（０．５％ｗ／ｖの溶液）で添加され、最も好ましくは、１リットルの培地当たり約０．５ｍｌの量で添加される。
【００５３】
上記のようにアミノ酸溶液は、好都合に、脱イオン化水中にアミノ酸を溶解すること、ｐＨを約８．０に水性塩基（好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液）を用いて調節すること、その後の滅菌濾過によって調製され得る。
【００５４】
ＭＳＸ溶液は、脱イオン化水中にＭＳＸを溶解すること、および０．２ミクロンフィルターを使用して溶液を濾過することによって調製され得る。ＭＳＸ溶液のアリコートは、滅菌チューブ中に配置され得、そして好ましくは５℃未満の温度で、３ヶ月以上までの間保存され得る。
【００５５】
より好ましくは、この接種物増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない）；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約５〜約２０ｍｌの１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭのチミジン溶液；ならびに
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり以下に記載の量のアミノ酸：Ｌ−アスパラギン酸（約１５〜９０ｍｇ）、Ｌ−グルタミン酸（約１２〜約７５ｍｇ）、Ｌ−アスパラギン（約５０〜約３００ｍｇ）、Ｌ−プロリン（約６〜約３８ｍｇ）、Ｌ−セリン（約１５〜約９０ｍｇ）およびＬ−メチオニン（約７〜約４５ｍｇ）；より好ましくは、アミノ酸は、１リットルの（ｉ）当たり約５〜約３０ｍｌの以下を含むアミノ酸溶液を加えることによって加えられる：Ｌ−アスパラギン酸（３．０ｇ／ｌ；２２．５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン酸（２．５０ｇ／ｌ；１７．０ｍＭ）、Ｌ−アスパラギン（１０．００ｇ／ｌ；７５．７ｍＭ）、Ｌ−プロリン（１．２５ｇ／ｌ；１０．９ｍＭ）、Ｌ−セリン（３．０ｇ／ｌ；２８．５ｍＭ）、およびＬ−メチオニン（１．５０ｇ／ｌ；１０．１ｍＭ）。
【００５６】
（ｉｖ）必要に応じて、１リットルの（ｉ）当たり約１２．５〜約２５μｍｏｌのＬ−メチオニンスルホキシミン（好ましくは、１リットルの（ｉ）当たり約０．５〜約３．０ｍｌの２５ｍＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）溶液として含まれる）；および
（ｖ）１リットルの（ｉ）当たり約１０〜約４０ｍｇのＬ−システイン。
【００５７】
最も好ましくは、この接種物増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない）；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約１０．０ｍｌの１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム／１．６Ｍのチミジン溶液；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり以下を含む約２０．０ｍｌのアミノ酸溶液：Ｌ−アスパラギン酸（約３．０ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン酸（約２．５ｇ／ｌ）、Ｌ−アスパラギン（約１０．０ｇ／ｌ）、Ｌ−プロリン（約１．２５ｇ／ｌ）、Ｌ−セリン（約３．０ｇ／ｌ）、およびＬ−メチオニン（約１．５ｇ／ｌ）；
（ｉｖ）必要に応じて、１リットルの（ｉ）当たり約１．０ｍｌの２５ｍＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）溶液；ならびに
（ｖ）１リットルの（ｉ）当たり約２５．０ｍｇのＬ−システイン。
【００５８】
次いで、得られた接種物増殖培地は、接種物を作製するのに使用するために、振盪フラスコまたは他の容器に移動され、そしてこの種子細胞は、その接種物中で懸濁される。
【００５９】
開始の際、接種物培地は、例えば、トリパンブルー色素除去法を使用して、サンプリングされ、そして計数され得、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．ＤｏｙｌｅおよびＪ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，１９９８）。細胞の濃度は、１ｍｌ当たり７．０×１０５個の生存細胞（「ｖｃ／ｍｌ」）より多い場合、より予熱された増殖培地が、約２．０×１０５ｖｃ／ｍｌの〜約６．０×１０５ｖｃ／ｍｌの範囲の最終濃度を達成するために添加され得るが、好ましくは、約５．０×１０５ｖｃ／ｍｌの濃度が好ましい。
【００６０】
次いで、この振盪フラスコまたは容器を、約３０〜約３８℃の範囲の温度、好ましくは、約３６．５±１℃の範囲の温度；約２〜約１０％のＣＯ２濃度、好ましくは、５±１％のＣＯ２濃度；約４０〜約９０％の相対湿度、好ましくは、７０±５％の相対湿度；および約５０〜約２００ｒｐｍの攪拌速度、好ましくは、１５０±２０ｒｐｍの攪拌速度（スロー＝３／８インチの直径）で攪拌しながらインキュベートし得る。このフラスコを、毎日、細胞濃度および生存度について、サンプリングし得る。より予熱された増殖培地を、毎日、約２．０×１０５ｖｃ／ｍｌ〜約６．０×１０５ｖｃ／ｍｌ、好ましくは、５．０×１０５ｖｃ／ｍｌの濃度に維持するように添加し得る。この容器中の容積が、培地のさらなる添加によって限度を越えるか、またはこの細胞密度が、約１．０×１０６ｖｃ／ｍｌに達する場合、この培養物は、２以上の培養物中に分けられ、これにより、新たな容器中で約５．０×１０５ｖｃ／ｍｌまで希釈し得る。
【００６１】
引き続いて、この細胞密度が約１．０×１０６ｖｃ／ｍｌに達するたびに、この培養物は、さらなる容器中で約２．０×１０５ｖｃ／ｍｌまで分けられる。バイオリアクター容器に対して約１．５×１０５ｖｃ／ｍｌ〜４．０×１０５ｖｃ／ｍｌ、好ましくは、約２．０×１０５ｖｃ／ｍｌの播種濃度を得るために、十分な体積が達成されるまで、この工程は、シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）を拡張するために繰り返されるべきである。接種物の割合（接種培養物の容積／接種後のリアクター液体容積）は、約１０％〜約２０％である。接種培養物中の細胞密度は、約１．０×１０６ｖｃ／ｍｌと２．５×１０６ｖｃ／ｍｌの間、好ましくは、１．０×１０６ｖｃ／ｍｌと約１．５×１０６ｖｃ／ｍｌとの間であるできである。接種培養物の熟成は、実際の産生期に使用する約３〜４日前である。
【００６２】
ＮＩＦのために、実際の産生（産生増殖培地）段階に使用される培地は、接種物の産生に使用されるものとは異なる。この産生リアクターは、好ましくは、フェッドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）条件下で操作され、すなわち、それに従って、栄養物溶液が、連続的に、産生期間の間にこのリアクターに連続的に供給される。
【００６３】
ＮＩＦ産生段階のための培地（産生増殖培地）は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）ヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）チミジン；および
（ｉｖ）酵母抽出物。
ヒポキサンチンナトリウムおよびチミジンは、都合良く、ヒポキサンチンナトリウム／チミジン溶液、好ましくは、ＨＴ上清（１００×）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１０６７−０３０）として添加され得る。
【００６４】
好ましくは、この産生増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液；
（ｉｉ）好ましくは、１リットルの（ｉ）当たり約５０〜１００μｍｏｌのヒポキサンチンナトリウム；
（ｉｉｉ）好ましくは、１リットルの（ｉ）当たり約８〜約３２μｍｏｌのチミジン；および
（ｉｖ）１リットルの（ｉ）当たり約０．５〜約５ｇの酵母抽出物。このＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液は、好ましくは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない。
【００６５】
必要に応じて、フェノールレッド（好ましくは、その約０．５％  ｗ／ｖの溶液）は、ｐＨ測定を容易にする目的のため；より好ましくは、１リットルの培地当たり約０〜約３．０ｍｌの溶液の量で、最も好ましくは、１リットルの培地当たり約０．５ｍｌの溶液の量で添加され得る。
【００６６】
より好ましくは、この産生増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９によって作製され；３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない）；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約５〜約２０ｍｌの１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム／１．６Ｍのチミジン溶液；および
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約０．５〜約５．０ｇの酵母抽出物。
【００６７】
最も好ましくは、この産生増殖培地は、以下を含む：
（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ／グルコース溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９によって作製され；３．４５ｇ／ｌのＤ−グルコースが加えられており；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含まない）；
（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約１０．０ｍｌの１０ｍＭのヒポキサンチンナトリウム／１．６Ｍのチミジン溶液；
（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり約１．５ｇの酵母抽出物。
【００６８】
好ましくは、２種の栄養供給物は、有利な増殖速度に必要とされる材料と共に培養物を提供するための、産生段階の過程にわたって使用される。この栄養供給物のうちの一つは、約１００〜約５００ｇ／ｌの濃度のグルコース供給物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  １）である。このグルコース供給物は、約０．１〜約５．０ｇ／ｌ、好ましくは、約２．０ｇ／ｌで、反応器中のグルコース濃度を維持するために使用される。この供給物は、通常、長期にわたって拡散するグルコースを添加するための間に、適切なポンプまたは他の手段を使用して１日に１リットルの培地当たり約０．０〜約６．０ｇの速度で、通常、添加される。
【００６９】
第２の栄養供給（栄養供給２）は、（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５倍濃度または５×）溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９９−０１８０によって作製され；１×のみの（溶解性の理由のため１倍）Ｌ−シスチン、３×（溶解性の理由のため３倍）Ｌ−チロシンを含み；グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムを含まない）；（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり２５〜１００ｍｌの１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭチミジン溶液；および（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり５〜２０グラムの酵母抽出物を含む。さらに好ましくは、栄養供給は、（ｉ）ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９９−０１８０（５×）によって作製され；１×Ｌ−シスチン、３×Ｌ−チロシンを含み；グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムを含まない）；（ｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり５０ｍｌの１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム／１．６ｍＭチミジン溶液；および（ｉｉｉ）１リットルの（ｉ）当たり７．５グラムの酵母抽出物を含む。この第２の供給は、１０ｍＭヒポキサンチン／１．６ｍＭチミジン溶液、好ましくは、ＨＴ補充１００×（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および酵母抽出物を、ＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ（５×）溶液に添加し、これらの成分を一緒に溶解し、そして混合し、水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨを約６．８〜約７．６に調節し、次いで、最終溶液を滅菌濾過する。この第２の供給溶液を、約４８時間で開始する、１日当たりの播種において、培養物１リットル当たり約５〜約５０ｍｌの速度で、反応器に連続的に供給する。この添加は、受容可能な産物の品質で、ＮＩＦの高い生産性を達成するために必須である。
【００７０】
本発明のプロセスは、２リットルＷｈｅａｔｏｎバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）で、Ｆｏｘｂｏｒｏ  ＩＡ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）コンピューターシステム（Ｔｈｅ  Ｆｏｘｂｏｒｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｏｘｂｏｒｏ，ＭＡ）を介して制御されて実行されるが、任意の滅菌可能な容器が、適切な混合能力、十分な供給入口、栄養供給のための２つおよびｐＨコントロールのための１つ、ならびに１つのサンプリングポートを有し、ガス入口を備え、そしてパージング能力が使用され得る限り、バイオリアクターとして使用され得る。容器は、十分なオンライン処理制御を可能にすべきである。好ましくは、容器は、光不透過性であるか、または周囲光への直接の曝露を避けるためにカバーされ得るような性質である。容器の滅菌の後に、滅菌コンディショニング溶液（好ましくは、グルタミンを含まないＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ；Ｃａｔａｌｏｇ  ＮＯ．１１９６０−０４４）またはＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ；Ｃａｔａｌｏｇ  ＮＯ．１４１９０−１３６）のいずれか）を使用して、容器をリンスし得る。適切な期間の後に、容器のサイズに依存して、リンス培地を、新鮮な滅菌産物培地で置換する。播種の前に、培地の温度を、約３０〜約３８℃（好ましくは、約３６．５℃±１℃）の範囲の温度に安定化し、そして必要な場合、ｐＨは、約６．８〜約７．６のｐＨ、好ましくは、約７．４のｐＨに調節すべきである。添加される播種培養物の容量は、好ましくは、約１．０×１０５生存可能細胞／ｍｌ〜約５．０×１０５生存可能細胞／ｍｌ、好ましくは、約２．０×１０５生存可能細胞／ｍｌの、反応器中の初期標的播種密度を作る。
【００７１】
容器の内容物は、容器内容物の完全な混合に十分な、使用される容器およびインペラーのサイズおよび形状に依存した、約５０〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で攪拌されるべきである。そうでない場合、容器の内容物は、同じ程度の混合を達成するために釣り合った（ｃｏｍｍｅｎｓｕｒａｔｅ）様式で攪拌されるべきである。産物培養物のｐＨは、約６．８〜約７．６、好ましくは、約７．４０±０．０５の範囲で、細胞培養物の生存性および生命力を妨害しない適切な制御剤を介して維持されるべきである。本発明の場合において、ＣＯ２ガスおよび約７．５％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３の溶液が、ｐＨ制御剤として好ましい。しかし、他の通常のアルカリ溶液（例えば、ＮａＨＣＯ３およびＮａ２ＣＯ３の混合物、または希釈ＮａＯＨ）もまた、首尾良く使用され得る。
【００７２】
溶解される酸素濃度は、空気飽和の約１０〜約１００％の範囲、好ましくは、空気飽和の約６０％±５％、を適切な制御剤を介して維持されるべきである。産物培養物の温度は、約３０℃〜約３８℃（好ましくは、約３６．５℃±１℃）の範囲に維持されるべきである。産培地のグルコース濃度は、好ましくは、約０．１〜約５．０ｇ／ｌ；好ましくは約２．０ｇ／ｌ±０．５ｇ／ｌの範囲に、グルコース供給溶液（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  １）（これは、所望のレベルを維持するための間隔で、少量で添加される）によって維持される。
【００７３】
二酸化炭素ガスおよび／または酸素および／または空気および／または窒素ガスは、ｐＨおよび溶解される酸素を制御するために、要求に応じて、培養物に散布され得る。窒素ガスまたは空気は、溶解する酸素の制御を補助し、そして／または気泡の生成を減少させるためにヘッドスペースに向けられ得る。
【００７４】
栄養供給２は、１日当たりの播種において、培養物１リットル当たり約５〜約５０ｍｌの速度で、好ましくは、１日当たりの播種において、培養物１リットル当たり約２５ｍｌの速度で、連続的に供給される。この供給は、グルコース供給と同時に、通常４８時間の時点で開始されるべきである。
【００７５】
産物培養物は、播種後すぐにサンプリングされるべきである。以下のパラメーターは、通常、すぐに測定される：最初の細胞密度および生存度；オフラインｐＨ；初期グルコース濃度；初期乳酸濃度；初期アンモニア濃度；および初期浸透圧重量オスモル濃度。オンラインｐＨは、必要な場合に、調節されるべきである。バイオリアクター容器は、好ましくは、光不透過性であるか、または光から産生培地を保護するための不透明光遮断被覆によってカバーされるかのいずれかであるべきである。産物培養物は、通常、以下のパラメーターについて、毎日サンプリングされる：細胞密度；培養生存度；オフラインｐＨ；グルコース濃度；乳酸濃度；アンモニア濃度；浸透圧重量オスモル濃度；およびＮＩＦ濃度、精製または特徴づけ。
【００７６】
グルコース濃度は、栄養供給１を使用して、約０．１ｇ／リットルと約５．０ｇ／リットルとの間、好ましくは、約１．５ｇ／リットルと約２．５ｇ／リットルの間に維持される。代表的には、供給は、３０分サイクルを使用する、オン／オフタイマーに接続された較正ポンプを使用して、約２．０ｇ／（リットル−日）、または一日につき１０９生存可能細胞当たり約２．０〜約３．０グラムのグルコースの初期供給速度で、約４８時間後に開始する。グルコース供給速度は、必要な場合、それぞれの日に調節されるべきである。グルコース消費速度は、しばしば、培養年齢とともに変化するが、必要とされる供給速度は、通常、約０．０〜約６．０ｇ／リットル−日の範囲内を維持する。栄養供給２は、通常、約４８時間で開始する。
【００７７】
本発明のプロセスは、２リットルの攪拌タンクバイオリアクターならびに１０リットル、５０リットルおよび１００リットルの攪拌タンクで首尾良く実行され、従って、実質的に任意のスケールで実行され得る。攪拌タンク反応器内で、ＰＥＧ０１細胞株を使用して、約４．０単位／ｍｌのＮＩＦ力価は、約１１日で再現可能に達成された。産生されるＮＩＦ１の産物の品質は、翻訳後シアリル化／グリコシル化の比較およびラット薬物速度論（ＰＫ）研究に基づいて、高い。本発明の方法によって得られるＮＩＦのＰＫ研究は、上記、Ｗｅｂｓｔｅｒらに記載されるプロトコールおよび技術に従って実行され得る。
【００７８】
実際の２リットル攪拌タンク実験についての処理データを、実施例３〜８に記載する。本発明のプロセスに従って実行される２０を越え得る類似の反応器実験において、１１日間で産生されるＮＩＦ１の平均濃度は、上記アッセイによって測定されるように、約４．２単位／ｍｌ±０．４単位／ｍｌであった。これらの実験から精製されるサンプルは、再現可能な翻訳後修飾（グリコシル化／シアリル化）を示した。
【００７９】
（ＮＩＦ力価の決定）
所与のサンプルにおけるＮＩＦアッセイは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー、または所与のサンプルにおけるＮＩＦの濃度が測定され得る任意の他の手段によって行われ得る。
【００８０】
好ましいＨＰＬＣ方法は、分析カラムの前に、インラインで、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  ＳＳカラム入口フィルター（０．５μｍ）を備えるＨＰＬＣカラム（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ５  ２．０×５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ＣＡ）を利用する。カラムに対する補助として、勾配ポンプ、可変波長ｕｖ検出器、ヒーター／クーラーを備える自動サンプルインジェクター、およびデータ収集統合システムがある。２つの移動相ＡおよびＢが使用される：代表的に、相Ａは、それぞれ、水（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＨＯＬＣグレード）、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）およびトリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ、タンパク質配列決定グレード、無水）の９０／１０／０．０５混合物であり；そして相Ｂは、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸の９０／１０／０．０４混合物である。これらの相は、９００ｍｌおよび１００ｍｌの９０〜１０成分を攪拌し、続いて、濾過し、数分間攪拌しながら脱気し、レザバに移し、そして最終的に、約１０秒間、攪拌しながら、トリフルオロ酢酸（０．５または０．４ｍｌ）を添加することによって、調製される。
【００８１】
使用される代表的なＨＰＬＣ条件は、以下の通りである：注入容積２０μｌ（２０℃に維持されたオートサンプラー中のバイアル中のサンプル）；２１０ｎｍでのｕｖ検出器；０．４ｍｌ／分の初期流速；７５：２５の初期Ａ対Ｂの比；３０℃に設定されたカラムヒーター。代表的なサンプル注入ランタイムは、このような条件下で約４４分である。
【００８２】
ポンプは、勾配プログラムで通常設定される。代表的な勾配プログラムは、以下（表１）の通りであるが、これは、必要および設定に従って、調節され得る。
【００８３】
表１
2004520809.tif 000003
ＮＩＦの標準サンプルは、濃縮物から調製され、そしてＰＢＳ緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水）中で既知の濃度に希釈される。０．５ｍｌの希釈作業標準のアリコートは、凍結状態で維持され得る。アリコートを２つのオートサンプルバイアルに移し、そしてそれぞれを注入する。ＮＩＦのピーク面積を平均化する。（標準濃度／平均ピーク面積＝応答因子）。アッセイサンプルのＮＩＦピークの面積に、応答因子を掛けて、サンプル中のＮＩＦ濃度を得る。
【００８４】
（培養物からの単離／精製）
産生容器におけるＮＩＦ濃度が、約１．０〜約８．０単位／ｍｌ  ＮＩＦの範囲のレベルに達した（または、産生相が、約５日と約２０日の間、実行された）とき、ＮＩＦを培養物から回収し得る。清澄化された培養流体を、細胞を取り出すために遠心分離し、続いて、適切な膜（好ましくは、０．２２μｍフィルターポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜）を通して滅菌濾過することによって得る。一旦、濾過が完了すると、清澄化された培養流体を、多数の精製工程に供する。
【００８５】
（Ａ．クロマトグラフィー工程１：Ｑセファロースファーストフローアニオン交換クロマトグラフィー）
ＮＩＦを含む浄化した液体を、Ｑセファロースファーストフローアニオン交換クロマトグラフィーカラムに通す。それによって、ＮＩＦは、カラムに結合し、次いでより高濃度の塩溶液で溶出される。Ｑセファロースカラムを、１Ｎ水酸化ナトリウムで調整し、その後、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）で平衡化する。０．２２μｍのフィルターを通した培養液をこのカラムに充填し、その後、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、そして５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．０）で溶出する。
【００８６】
（Ｂ．濃縮／ダイアフィルトレーション工程１）
Ｑセファロースカラムからの精製溶出物を、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ  Ｐｌｕｓ、ＨＳ−４ローター、４０００ｒｐｍ、４０分間）においてＰａｌｌ  １００００ＭＷＣＯ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  ｕｎｉｔを用いて濃縮する。ダイアフィルトレーションの間、濃縮したサンプル緩衝液を、緩衝液を添加した後遠心分離する工程を３回行うことにより、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０に交換する。
【００８７】
（Ｃ．クロマトグラフィー工程２：フェニルセファロースファーストフロー疎水性相互作用クロマトグラフィー）
フェニルセファロースカラムを、１Ｎ水酸化ナトリウムで調整し、その後、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１．０Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液（ｐＨ６．０）で平衡化する。等量の２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／２．０Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液（ｐＨ６．０）を、この濃縮およびダイアフィルトレーションしたＱセファロース溶出物に添加し、その後、サンプルが２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液（ｐＨ６．０）中に充填されるように充填する。希釈したダイアフィルトレーション物を、このカラムに充填する。ＮＩＦは、このカラムに結合せず、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１．０Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液（ｐＨ６．０）を通して洗浄する。
【００８８】
（Ｄ．濃縮／ダイアフィルトレーション工程２）
フェニルセファロースカラムからの精製溶出物を濃縮し、次いで、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ  Ｐｌｕｓ、ＨＳ−４ローター、４０００ｒｐｍ、４０分間）においてＰａｌｌ  １００００  ＭＷＣＯ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  ｕｎｉｔを使用してダイアフィルトレートする。ダイアフィルトレーションの間、濃縮したサンプル緩衝液を、緩衝液を添加した後遠心分離する工程を３回行うことにより、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ、ｐＨ４．０に交換する。
【００８９】
（Ｅ．ウイルスの不活性化）
ダイアフィルトレーション後の流出液（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）のｐＨを、酢酸を用いて３．７に調整する。このサンプルを、攪拌しながら３０〜４５分間、ｐＨ３．７で維持し、そしてｐＨ４．１に再調整し、次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを通して濾過する。
【００９０】
（Ｆ．クロマトグラフィー工程３：ＤＥＡＥセファロースファーストフローアニオン交換クロマトグラフィー）
この工程では、ＮＩＦを、カラムに結合させ、次いで、より高塩濃度の溶液を用いて溶出する。ＤＥＡＥセファロースファーストフローアニオン交換カラムを、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整し、次いで、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ溶液（ｐＨ４．１）を用いて平衡化する。次いで、滅菌濾過（すなわち、ＤＶ５０濾過）した物質を、このカラムに充填する。次いで、このカラムを、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ溶液（ｐＨ４．１）で洗浄し、次いで、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ／３０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ４．１）または２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ／５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ４．１）のいずれかで洗浄し、その後、２５ｍＭ  ＣＨ３ＣＯ２Ｎａ／３００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ４．１）で溶出する。この溶出物は、ＮＩＦ産物を含む。
【００９１】
（Ｇ．濃縮／ダイアフィルトレーション工程３）
ＤＥＡＥセファロースカラムからの精製溶出物を濃縮し、次いで、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ  Ｐｌｕｓ、ＨＳ−４ローター、４０００ｒｐｍ、４０分間）においてＰａｌｌ  １００００  ＭＷＣＯ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  ｕｎｉｔを使用してダイアフィルトレートする。ダイアフィルトレーションの間、濃縮したサンプル緩衝液を、緩衝液を添加した後遠心分離する工程を３回行うことにより、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０に交換する。
【００９２】
（グリコシル化の測定）
ゼロ、モノ、ジ、トリ、およびテトラシアリル化のパーセントを決定するためのプロトコルは、Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ、２９（１１）：１１４１−１１５５（１９９９）に記載されており、この文献を本明細書中で参考として援用する。
【００９３】
ＮＩＦのシアリル化の全体の程度を決定するためのプロトコルは、Ｄｉｏｎｅｘ  ＧＰ４０勾配ポンプ、Ｄｉｏｎｅｘ  ＥＤ４０（パルス式電流測定検出様式で使用されるＥＣディテクター）、Ｄｉｏｎｅｘ  ＡＳ３５００オートサンプラー、およびＤｉｏｎｅｘ  ＰｅａｋＮｅｔ  ５．１ソフトウェア（データの獲得および処理のため）を備えたＰＡ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＡＴＣ−１移動相コンディショナー、Ｄｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ４．６×５０ｍｍ  ＰＡ−１０ガードカラム、およびＤｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ４．６×２５０ｍｍ  ＰＡ−１０分析用カラム）を用いたＨＰＬＣ法である。このアッセイは、２つの移動相Ａ（０．２Ｍ  ＮａＯＨ（Ｆｉｓｈｅｒ）／５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ＡＣＳ等級））およびＢ（０．２Ｍ  ＮａＯＨ／３００ｍＭ  酢酸ナトリウム）を用いる。ＨＰＬＣの代表的な泳動条件は、注入量：２０μｌ、ＰＡＤ検出（炭水化物波形に最適化されている）、流速：０．７ｍｌ／分、開始移動相Ａ：１００％、および泳動時間：４５分間。
【００９４】
通常は、ポンプを勾配プログラム上で使用する。代表的な勾配プログラム（表ＩＩ）は、以下の通りであるが、これは、必要および設定に応じて調節され得る。
【００９５】
【表１】
2004520809.tif 000004
精製したＮＩＦサンプルおよび参照シアル酸標準を、約１．０×１０−３ユニット／ｍｌの濃度に調製する。ＮＩＦおよび参照サンプルの両方の２００μｌのアリコートを、２００μｌの０．２Ｎ  ＨＣｌに加える。このアリコートをボルテックスし、簡単に遠心分離し、次いで、８０℃で１時間加熱する。次いで、サンプルを氷槽中で約１０分間冷却し、続いてさらにボルテックスおよび遠心分離した後、これらを室温まで戻す。２０μｌのサンプルを分析のために注入する。次いで、結果を、参照標準のパーセントとして報告する。
【００９６】
（好中球阻害活性の決定）
培養された細胞株により産生されるＮＩＦの量および生物学的活性を検査するために有用であり得る好中球阻害活性を決定するためのアッセイは、以下に示すプラスチック接着アッセイ、カルセインアッセイ、過酸化水素放出アッセイ、およびＥＬＩＳＡである。
【００９７】
（Ａ．プラスチック接着アッセイ）
（ｉ．好中球の単離）
好中球を、１工程のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（Ｍｏｎｏ−ｐｏｌｙ、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いてヘパリン添加した静脈血から単離した。簡単にいうと、５ｍｌの全血を、１６×１００ｍｍカラス管中の３ｍｌのＭｏｎｏ−ｐｏｌｙ分解培地上に重ねる。白血球の分離を、２０℃にて６０分間、３００×ｇで遠心分離することにより達成する。好中球を含む細胞の層を、パスツールピペットを用いて収集し、そして細胞を、１０容量の冷やしたＤｅｌｂｅｃｃｏｓ’  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）中に懸濁した。好中球を、４℃にて１０分間、２００×ｇでペレット状にした。この細胞ペレットを。５ｍｌの冷やしたＡＣＫ緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ／１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートして、混入している赤血球細胞を溶解した。次いで、好中球を、遠心分離およびＨＢＳＳ（１．３３ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む０．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、および３０ｍｇ／ｌ  フェノールレッド）中におよそ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁することにより一度洗浄した。細胞生存性を、トリプタンブルー除去により決定した。これらの調製物は、自動識別計数により決定したところ、好中球が一貫して９５％よりも多かった。
【００９８】
（ｉｉ．プラスチック接着アッセイ）
刺激したヒト好中球は、プラスチック組織培養用品に接着し、標準的な位相差光学顕微鏡により可視化され得る。上記の工程Ａで単離した好中球を一度洗浄し、そして冷ＨＳＡ緩衝液（リン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１％ヒト血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３を含まないＲＰＭＩ）中に、６．６×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。好中球（２０μｌ）を、滅菌微量遠心管中に入れ、そして３７℃で５分間、ＰＭＡ（５μｌの８００ｎＭ溶液または１６０ｎＭの終濃度）で刺激する。試験したサンプルを、刺激した細胞を含むチューブに添加し（２０μｌ）、穏やかに混合し、そして１０μｌの混合物を直ちに、Ｔｅｒａｓａｋｉ型培養プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）の各ウェルに移す。３７℃でさらに５分後、プレート全体を、Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）に浸し、非接着細胞を除くために軽く叩く（タップする）。このタップ／リンス工程を、合計６回繰り返す。プラスチックウェルに接着した細胞を位相差光学顕微鏡を用いて可視化する。刺激した細胞を含み試験サンプルを含まないコントロールウェルを、「＋＋＋＋」とスコア付けし、刺激した細胞およびモノクローナル抗体ＣＬＢ−５４（インテグリンＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８に対する抗体）を含むコントロールウェルを、「−」とスコア付けする。
【００９９】
（Ｂ．好中球−Ｈｕｖｅｃ接着（カルセイン）アッセイ）
ＨＵＶＥＣ単層へのヒト好中球の接着を、蛍光色素カルセイン−ＡＭ（アセトキシメチルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で予め充填された細胞を用いることによりモニタリングする。ヒト好中球を、以下のように、カルセインで標識する。好中球をペレット状にし、１０μｇ／ｍｌ  カルセイン−ＡＭを含むＨＢＳＳ中に、最終細胞濃度およそ１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。使用用ＨＢＳＳ／カルセイン溶液を調製し、その後直ちに、ジメチルスルホキシド中のカルセインストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、−２０℃にて保存）から使用する。好中球を、カルセイン−ＡＭと共に、３７℃で３０分間、１０分毎に断続的に混合しながらインキュベートする。標識した好中球を一度洗浄し、そして冷ＨＳＡ緩衝液（リン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１％ヒト血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３を含まないＲＰＭＩ）中に、１．３２×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。細胞を、使用するまで４℃で維持する。
【０１００】
カルセイン標識した好中球（１７５μｌ）を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で１７５μｌの試験画分と共に２０℃で１０分間インキュベートする。１ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＡのストック溶液をジメチルスルホキシド中で調製し、そして慣用的に、−７０℃で保存した。１００μｌの試験画分／ＰＭＡ処理細胞（６．６×１０５の好中球）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中で増殖させた初代ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に添加する。３７℃で３０分後、非接着細胞を、逆さにして封をしたプレートを７５×ｇで３分間遠心分離することにより除去する。１００μｌ  ０．１  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で）を添加することにより接着性好中球を溶解し、そして４８５ｎｍの励起からの５３０ｎｍのカルセインの蛍光放出を、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ蛍光光度プレートリーダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて読み取る。各データ点を、三連で実施する。これらの実験において、合計入力好中球の４０％、すなわちおよそ２．６×１０５細胞は、インヒビターの非存在下でＨＵＶＥＣ単層に結合する。
【０１０１】
（Ｃ．過酸化水素放出アッセイ）
刺激されたヒト好中球からの過酸化水素放出は、Ｐｉｃｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３８：１６１−１７０（１９８０）により記載された方法の改変されたものによって決定される。ヒト好中球（６．６×１０６細胞／ｍｌ）を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＨＢＳＳ中に再懸濁する。フェノールレッドおよび第ＩＶ型西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ、８３μｇ／ｍｌおよび０．０１単位／ｍｌの最終濃度でこの細胞懸濁物に添加する。５００μｌのこの細胞懸濁物を、２００μｌの試験サンプル（１０％ウシ胎仔血清を含有するＨＢＳＳ中）に添加する。細胞を、最終濃度２７５μＭでｆＭＬＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて活性化する。ｆＭＬＰ（５００ｎＭ）のストック溶液を、ジメチルスルホキシド中で調製し、そして−２０℃で貯蔵する。この放出アッセイは、３７℃にて、６０分間、ウシ胎仔血清で予め被覆した、１．５ｍｌプラスチックチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中で実施され；被覆されるチューブは、使用前に０．１５Ｎ  ＮａＣｌで２度洗浄される。この放出作用は、３７℃で、９０分間進められて、この時間の後、この細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  中で、３分間、２０００×ｇでペレットにする。２００μｌの上清流体は、９６ウェルマイクロタイタープレートに移され、そして、この反応は、１０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって停止される。各データポイントは、２連で実施される。サンプルは、ＴｈｅｒｍｏＭａｘ  プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて６１０ｎｍで定量される。過酸化水素濃度は、内部標準曲線から計算された。
【０１０２】
（Ｄ．ＮＩＦ１についてのＥＬＩＳＡ）
ＮＩＦ１に対して指向されたポリクローナル抗体が、標準的な技術を使用してウサギの中で調製される。この抗体は、均一なガラスビーズに結合されたｒＮＩＦ１から構成される樹脂（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ．，Ｃｏｎｓｅｔｔ，ＵＫ）を使用して、免疫アフィニティー精製される。ＮＩＦ１に対して指向されたモノクローナル抗体はまた、標準的な技術を使用してマウスの中で調製される。このモノクローナル抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーによってマウス腹水液から精製され、そして、標準的なプロコトルに従って西洋ワサビペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に結合される。免疫アフィニティー精製されたポリクローナル抗体は、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ポリスチレン免疫アッセイプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）のウェルに吸着され、次いで、ウシ血清アルブミンでブロックされる。ＮＩＦ１を含有する試験サンプル（１００μｌ／ウェル）は、この免疫アッセイプレートのウェルに添加され、プレートシェイカーを使用して混合され、そして３７℃で３時間インキュベートされる。このウェルの内容物は取り出され、そしてこのウェルは０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄される。モノクローナル抗体−ＨＲＰ結合体（１００μｌ／ウェル）は、このウェルに添加され、既に述べたように混合され、そして、３７℃で２時間インキュベートされる。吸着しないモノクローナル抗体−ＨＲＰ結合体は、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水でリンスされ、そしてＨＲＰ基質（１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、０．０１２％過酸化水素、および０．４ｍｌのトリメチルベンジジン（０．１Ｍ  ＨＣｌ中溶液中で３ｍｇ／ｍｌ））が、このウェルに添加された。室温にて１０分間で色が顕出され、このときにこの反応は１Ｍの硫酸で停止される。４５０ｎｍにおける光学濃度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ９６−ウェルプレートリーダーを使用して決定される。標準曲線が、既知濃度を含むサンプルで生成される。
【０１０３】
（処方物）
ＮＩＦの薬学的組成物が、処方され得、そして経口投与のための、錠剤、カプセルまたはエリキシル剤；直腸投与のための坐剤；注射投与のための滅菌溶液、懸濁液などとして使用され得る。この用量および投薬方法は、最適な効力を達成するように適応され得るが、体重、食事、同時使用される医薬および医療技術分野の当業者が理解する他の因子のような要因に依存する。一般に、１日毎、体重１ｋｇ当たり、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの間の量が、使用される組成物の効力に依存して投与される。好ましい実施形態は、貯蔵およびその後の投与のために調製される薬学的組成物を包含し、この薬学的組成物は、治療有効量のＮＩＦまたはＮＩＦ濃縮組成物を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中に本明細書中で記載したように含む。治療用途のための受容可能なキャリアまたは希釈剤は、薬学分野で周知であり、そして、これらは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．１９８５）に記載されている。保存剤、安定剤、色素、および香味料さえもが、この薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存剤として添加され得る。さらに、抗酸化剤および懸濁剤が、使用され得る。
【０１０４】
注射剤は、溶液もしくは懸濁液いずれかとしての従来の形態、注射前の液体もしくは懸濁液に適切な固体形態、または乳濁液として調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システインハイドロクロライドなどである。さらに、所望される場合、この注射可能な薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤など）を含み得る。所望される場合、吸収増強調製物（例えば、リポソーム）が、使用され得る。
【０１０５】
（有用性）
本発明において生成されるＮＩＦは、哺乳動物において、異常な好中球活性化または異常な好酸球活性化によって特徴づけられる炎症状態を処置する方法において使用され得、この方法は、治療有効量のＮＩＦまたはこれらの薬学的組成物をこの哺乳動物に投与する工程を包含する。好ましい方法を実施する際に、ＮＩＦまたはこれらの薬学的組成物は、単独で使用され得るか、または互いに併用されるか、または他の治療剤もしくは診断剤と併用され得る。これらの組成物は、インビボ（通常は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて）、またはインビトロで使用され得る。
【０１０６】
ＮＩＦまたはこれらの薬学的組成物をインビボで使用する際に、これらの組成物は、種々の方法で、種々の投与形態を使用して哺乳動物に投与され得、この方法は、非経口、静脈内、皮下、筋内、経結腸、経直腸、経鼻、または腹腔内を含む。当業者に容易に明らかであるように、投与される有用なインビボ投薬量および特定の投与様式は、処置される哺乳動物の種、使用される特定の組成物、およびこれらの組成物が使用される具体的な用途に依存して変化する。有効投薬量レベル（これは、所望の結果を達成するために必要な投薬レベルである）の決定は、当業者の範囲である。代表的には、組成物の適用は、低投薬レベルで開始され、そして所望の効果が達成されるまで投薬レベルが上げられる。
【０１０７】
ＮＩＦまたはこの薬学的組成物についての投薬量は、所望の効果および治療的適応に依存して、広く変動し得る。代表的には、適切な投薬量は、１ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇと約１００ｍｇとの間にあり、好ましくは、１ｋｇ体重当たり、約０．０１ｍｇと約１０ｍｇとの間にある。投与は、好ましくは、非経口的（例えば、毎日または必要とされる基準に基づく静脈内）である。
【０１０８】
本発明の方法によって生成されるＮＩＦは、強力な好中球阻害活性を有し、従って、このＮＩＦは、インビトロでの好中球活性化を含む好中球活性の阻害剤として、および哺乳動物において異常な好中球活性化によって特徴付けられる炎症状態を予防または治療するために、使用され得る。従って、ＮＩＦは、好中球の異常な活性化が重要な役割を担う炎症の治療において有用である。本出願人らは、いかなる理論にも活性の様式にも拘束されることを望まないが、この化合物は、好中球−内皮細胞相互作用による作用に向かわされる炎症性の応答を妨げると考えられている。従って、好中球の内皮への接着が予防された場合、この好中球は組織へと遊出してその後の組織損傷を伴う後炎症性の応答を誘引することができない。これらのＮＩＦによる好中球−好中球の接着および／または凝集の阻害はまた、微小血管閉塞を防ぐはずである。従って、これらのＮＩＦは、種々の臨床的障害（好中球の浸潤および活性化が関係する、ショック、発作、急性もしくは慢性の同種移植片拒絶反応、血管炎、自己免疫性糖尿病、慢性関節リウマチ、頭部外傷、炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、心筋梗塞後の虚血再灌流損傷、および細菌感染によって引き起こされる急性炎症（例えば、敗血症または細菌性髄膜炎）を含む）の処置において有用である。
【０１０９】
本発明により生成されるＮＩＦが好中球活性を阻害する能力によって、このＮＩＦは、炎症、虚血、および他の好中球媒介組織損傷の生理学的プロセスを阻害することにおいて有用となる。これらに関連する機能を行うときのＮＩＦの特異的な活性によって、ＮＩＦは治療剤および／または診断剤として特に有用となる。
【０１１０】
本発明によって生成されるＮＩＦに指向された抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は、診断目的、および種々の生物学的流体中におけるこの目的のペプチドの濃度レベル同定のために有用である。これらの抗体を使用する免疫アッセイは、例えば、寄生虫による哺乳動物宿主の感染を検出するためか、または哺乳動物宿主組織内の寄生虫からのＮＩＦを検出するための診断的試験として使用され得る。また、このような免疫アッセイは、組織ホモジネート、クローン化した細胞などからのＮＩＦの検出および単離において使用され得る。本発明の別の局面として、ＮＩＦは、ＮＩＦ模倣物を検出するための他の化合物をスクリーニングするためか、またはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８レセプターへのＮＩＦ結合を及ぼすこれらの活性に対するＮＩＦアンタゴニストを検出するための試験方法において使用され得る。
【０１１１】
本発明のなお別の局面において、適切なアジュバントを使用して本発明によって生成されるＮＩＦは、哺乳動物における寄生虫感染に対するワクチンとして使用され得る。ＮＩＦワクチンでの免疫は、寄生虫感染の予防および治療の両方において使用され得る。ＮＩＦフラグメントおよびＮＩＦのアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドはまた、ワクチンとして使用され得る。寄生虫によって引き起こされる疾患状態は、ＮＩＦに拮抗する物質（例えば、ＮＩＦアンタゴニスト）をこれらの寄生虫に感染した動物に投与することによって処置され得る。これらの抗ＮＩＦ効果について、化合物が本明細書において上に記載されたようなスクリーニング方法に従ってスクリーニングされ得る。このような駆虫薬の例としては、ＮＩＦに対する抗体（血清から単離された天然に存在する抗体ならびに上記のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）が挙げられる。ＮＩＦのインヒビターとして作用する化学合成された化合物はまた、適切な駆虫薬である。
【０１１２】
以下の実施例は、本発明のプロセスを例示する役割を果たす。プロセスの制御パラメータおよびプロセスのスケールについての実際に可能な範囲は、かなり広範であり得る。
【０１１３】
（実施例）
（実施例１）
（ＮＩＦを発現する細胞株）
（Ａ．ＮＩＦをコードする核酸）
組み換えＮＩＦについてのコード配列は、イヌの鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）のｃＤＮＡライブラリー由来であり、このコード配列に対して、標準的な発現調節配列を、プラスミド構築の間に加えた。ＮＩＦ−１ＦＬ、成熟ＮＩＦ−１ＦＬ（ＮＩＦ１）およびこれらに対応する全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、それぞれ、図１および図２に提示する。図２のヌクレオチド配列は、２７４アミノ酸のポリペプチドをコードする８２２ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド３１３〜ヌクレオチド１１３４）を有している。
【０１１４】
（Ｂ．発現ベクターの構築）
上述したＮＩＦ１  ｃＤＮＡを、一連のシャトルベクターおよび宿主にクローニングして、そして以下のように、ｐＥＥ１４ベクターに最終的にクローニングした。図３は、ＮＩＦ１  ｃＤＮＡからＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトするために使用されるｐＥＥ１４ベクターへの経路の概略図である。この細胞株構築プロセスにおいて使用される生物化学薬品のいくつかおよびこれらのそれぞれの供給者は、以下（表ＩＩＩ）のとおりである：
【０１１５】
【表２】
2004520809.tif 000005
ＮＩＦ１コード領域（「ＮＩＦ１ｃｒ」）（配列番号１）を、ｐＳＧ５ベクター中にレスキューし、ヌクレオチド配列を決定した。コード領域自体（発現を促進するよう変更された開始ＡＴＧから直ぐ上流の配列は無視する）は、図２に図示するように、元のＮＩＦ１  ｃＤＮＡクローンの塩基３１３から１１３７において正確に対応する。
【０１１６】
ｐＳＧ５／ＮＩＦ１ｃｒトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、活性なＮＩＦ１を産生した。産生されたＮＩＦ１は、鉤虫由来のＮＩＦと同様に、ヒト好中球のＨ２Ｏ２産生を、濃度依存的様式で阻害した。いずれのコントロールトランスフェクション（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞またはモックトランスフェクトされた細胞）も、ＮＩＦ様活性を生じなかった。
【０１１７】
ｐＳＧ５の限定されたマルチクローニングサイトは、コード領域と反対の末端上の異なる制限部位を供し得るプラスミドを介したＮＩＦ１ｃｒの継代を必要とした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋は、広範囲のマルチクローニングサイトの中央にＥｃｏＲＩ部位が存在することおよびその取り扱いの容易さに起因して選択された。これに続いて、ｐＥＥ１４発現プラスミド中へのクローニングを行った。発現構築物ｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒを用いて、ＣＨＯ  Ｋ１細胞をトランスフェクトした。
【０１１８】
最終構築物および中間構築物の適切な単離および配列を、制限酵素マッピングまたは配列決定によって、重要な工程において確認した。ＮＩＦ配列の全長を、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ配列決定ベクター中にクローニングした時に、まず配列決定によって確認した（配列については、図２を参照のこと）。配列決定されたコード領域を、ＰＳＧ５シャトルベクター中にクローニングした後に、両方向からの配列決定により確認した。
【０１１９】
（Ｃ．発現ベクター）
その表記により示されるように、ｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒ発現プラスミドは、図４に示すように、広範に使用される９．４ｋｂのｐＥＥ１４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に由来した。ｐＥＥ１４ベクターは、以下を含む：（１）ヒトＣＭＶ主要極（ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）初期プロモーター（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）、（２）マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、（３）ＳＶ４０初期ポリＡ部位（ｐＡ）、（４）Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（Ｃｏｌ  Ｅ１）、（５）アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）、および（６）グルタミンシンセターゼミニ遺伝子（ＧＳ−ミニ遺伝子）を誘導するＳＶ４０後期プロモーター（ＳＶ４０Ｌ）。マルチクローニングサイトに存在する制限エンドヌクレアーゼ部位は、この図に示される。５’ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位は、ＭＣＳに対しわずかに５’よりにある。ベクター部分についてのヌクレオチド配列は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９９２）ならびにＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：７１１０（１９８９）から入手可能である。
【０１２０】
ｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒ挿入断片は、８２５ｂｐのＮＩＦ１コード配列（配列番号１）を含み、これは、図１に示される２７４アミノ酸（配列番号２）をコードする。成熟ＮＩＦ−１ＦＬ（ＮＩＦ１）タンパク質は、図１で示されるようにコドン１８で開始する配列によってコードされる２５７アミノ酸（配列番号３）を含む。さらなる非コード配列（配列番号１０および１１）は、図５に示すように、クローニング工程の間に挿入断片中に、コード配列の両端に取りこまれた。
【０１２１】
ｐＥＥ１４ベクターに対する主要な改変は、ｐＥＥ１４のＨｉｎｄＩＩＩ部位（ｂｐ９２９２）とＳｍａＩ部位（ｂｐ９３３４）との間にあるベクターの挿入断片発現領域中へのＮＩＦ１コード配列の挿入である。この構築物は、高レベルのＮＩＦ１発現を、ｐＥＥ１４のヒトＣＭＶ主要極初期（「ｈＣＭＶ−ＭＩＥ」）プロモーターの制御下で可能にする。ＮＩＦ１ｃｒ（ｃｒ＝コード領域）挿入断片の構築物を、図５に示す。
【０１２２】
図５に示すように、挿入配列の５’末端は、ｐＥＥ１４発現ベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ部位（図４には、部位を示していない）で始まり、これは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩシャトルベクター（「ＢＳＩＩ」）ポリリンカー由来の５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に由来する相補配列に結合する。５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、ＥｃｏＲＩ部位の次にあり、５’−ＰＣＲ  ＮＩＦ１ｃｒレスキュープライマーによって提供され、ＢＳＩＩ中にＮＩＦ１ｃｒをクローニングするのに使用される。ＮＩＦ１のＮＩＦ１コード領域配列は、このＥｃｏＲＩ部位で始まり、およそ８５０ヌクレオチドまで伸長する。
【０１２３】
ＮＩＦ１ｃｒは、ＮＩＦ１ｃｒをＢＳＩＩ中にクローニングするのに必要な３’末端を作るのに使用される３’−ＰＣＲ  ＮＩＦ１レスキュープライマーによって作られるＥｃｏＲＩ部位の次にある。コード領域の３’末端は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩシャトルベクター由来のＰｓｔＩ部位の次にあり、最終的にＳｍａＩ部位およびｐＥＥ１４由来の他の配列の次にある（図４および５）。ＮＩＦ１タンパク質コード配列は、大文字で示され、下線は、指示された制限酵素に対する切断点を示す。ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＳｍａＩ部位との間のｐＥＥ１４配列を、ＮＩＦ１ｃｒクローニングの間に除去する。
【０１２４】
（Ｄ．発現ベクターのトランスフェクション）
ｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）中に、以下のように標準的なカルシウム法を用いて、導入した。形質転換のために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、Ｔ−７５フラスコ中のＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、７．５％〜１０％  ＣＯ２雰囲気において増殖させた。各５００ｍｌ  ＤＭＥＭに対し、以下を添加した：標準栄養素および５０ｍｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）。トランスフェクションの前に、ブタトリプシンを用いて、上記のように細胞をフラスコから取りだし、ＤＭＥＭ−Ｓ（透析したＦＢＳを用いる以外は、上記のように調製したＤＭＥＭ）で洗浄し、直径１０ｃｍの組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上に、１×１０６細胞／プレートで蒔いた。この細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を形質転換する直前に、これらをＦＢＳ不含のＤＭＥＭで１度リンスした。ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物を以下のように２工程で調製した。まず、６２μｌ  ２Ｍ塩化カルシウムを１０μｇ  ｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒ  ＤＮＡと混合し、滅菌水で５００μＬまで増やした。次いで、この混合物を、気泡流で穏やかに一定の攪拌をしながら、５００μＬの２×ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水に滴下した。一旦、ＤＮＡ混合物の全てを加えて、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物を含むチューブをボルテックスした。ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物をＦＢＳ不含の２ｍｌ  ＤＭＥＭで希釈し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含む直径１０ｃｍのディッシュに添加した。このプレートを３７℃、７．５％  ＣＯ２で、４時間穏やかに揺らした。この培地とＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿物を細胞から除き、１５％グリセロール入りＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水３ｍｌに置き換えた。３７℃で９０秒後、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ１０ｍｌを添加し、直ちに吸引によって除いた。次いでこの細胞を、１０ｍｌのＤＭＥＭ−Ｓで覆い、３７℃、７．５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。この培地を、２５μＭメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含む新鮮なＤＭＥＭ−Ｓで置換した。ＣＯ２が１０％まで上がって培地のｐＨが低くなった場合、プレートをさらに７日間インキュベートした。この場合、プレートは、種々の大きさの多くのクローンを含んだ。細胞を、前のようにブタトリプシンで処置してディッシュから取りだし、前のように遠心して収集し、そして馴化培地ならびに２０％透析ＦＢＳおよび２５μＭ  ＭＳＸを補充した新鮮なＤＭＥＭ−Ｓの等量混合物５０ｍｌ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を９６ウェル培養プレート中に移し（１００μｌ／ウェル）、３７℃、１０％  ＣＯ２でインキュベートし、個々のコロニーを得た。プレートした７日後に、１００μｌのクローニング培地（５０％のＣＨＯ−Ｋ１馴化ＤＭＥＭ−Ｓ（２０％透析ＦＢＳを含む）、５０％の新鮮なＤＭＥＭ−Ｓ（２０％透析ＦＢＳを含む）、２５μＭ  ＭＳＸ）を添加して、蒸発してなくなった培地に置き換えた。プレートした１０日後に、２０１のウェルが個々のコロニーを含み、３ウェルが２または３コロニーを含んだ。
【０１２５】
プレートして２０日後に、１５ウェルは、増殖がコンフルエントを呈し、細胞を含まない上清液を、ＮＩＦ（すなわちＮＩＦ１）活性についてプラスチック接着アッセイ（上記）に用いて評価した。陽性クローンを、以下のように２４ウェル培養プレートへと展開した。細胞を９６ウェルプレートから、ブタトリプシン処理し、トリプシンで消化してトリプシンインヒビターで停止することにより剥がした。１ｍｌのクローニング培地を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。３日後に２５μＭのＭＳＸを含む５００μｌのクローニング培地を添加した。展開して７日後に、細胞を、ＮＩＦ１活性について、プラスチック接着アッセイおよびカルセインアッセイを用いて評価した。陽性クローンを直径１０ｃｍの組織培養ディッシュ中に展開した。最も高いレベルのＮＩＦ１活性を発現した１つのクローンを、約１×１０６細胞／ｍｌで、クローニング培地（２０％透析ＦＢＳ、２５μＭ  ＭＳＸおよび１０％ジメチルスルホキシドを含む）中で凍結した。
【０１２６】
このクローンを、限定した希釈によって２回のクローニングに供し、１個のトランスフェクト細胞に由来する最終的な細胞株を確保した。ＤＭＥＭ−Ｓ（１０％透析ＦＢＳおよび２５μＭ  ＭＳＸを含む）中でコンフルエンスまで増殖したクローンを、トリプシン処理により培養ディッシュから取り出し、クローニング培地で２５細胞／ｍｌまで希釈し、そして９６ウェルプレート中に２．５細胞／ウェルでプレートした。このプレートを３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。培養の１７日後に、３３のウェル（増殖を呈してる）を、ＮＩＦ活性について、カルセインアッセイを用いて評価した。増殖速度およびＮＩＦ活性の発現に基づいて、いくつかのクローンを、ＤＭＥＭ−Ｓ（１０％透析ＦＢＳおよび２５μＭ  ＭＳＸを含む）中でコンフルエンスまで増殖させ、約１×１０６細胞／ｍｌで、クローニング培地中で凍結した。全ての培養物について、ＮＩＦ１を産生することをＥＬＩＳＡにより確認した（発明の詳細な説明を参照のこと）。
【０１２７】
（実施例２）
（懸濁培養と無血清培地への適応）
（Ａ．Ｔフラスコ培養における細胞株の継代培養）
実施例１において調製されるような１つの培養物をさらに、以下からなる培地中で増殖した：ＤＭＥＭ：ＲＰＭＩ１６４０  ５０：５０（グルタミンを含まない）（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１９６０）とＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号２１８７０）の５０：５０混合物）；１０％  品質保証熱非働化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）；培地１リットルあたり１ｍｌの２５ｍＭ（１０００×）Ｌ−メチオニンスルホキシム貯蔵溶液（Ｓｉｇｍａ）。
【０１２８】
培地をデカントして捨てた。単層を１０ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）で２回リンスした；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳをデカントし、２ｍｌのベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）を、単層に添加した。ベルセンを含む培養物を３７℃で５分間インキュベートした。このフラスコを数回たたいて、細胞を剥がして、添加した１８ｍｌの新鮮な培地中で再懸濁し、新たなＴフラスコに１：５で分けた。この培養物を５％ＣＯ２および湿度７０％において３７℃でインキュベートし、継代Ｘ＋１として示した。０．２５％トリプシン  ＥＤＴＡの溶液を、Ｔフラスコ中の引き続く全ての継代培養について、ベルセンの代りに用いた。培養物を典型的には、必要に応じて週２回、１：１０〜１：２５で、分割した。可能な場合、細胞を１００％コンフルエンスに達しないようにした。
【０１２９】
（Ｂ．懸濁増殖のための培養物の適応）
この培養物を、振盪フラスコ中での懸濁増殖のため、血清を補充したＣＨＯ  ＩＩＩ  ＰＦＭ培地に適応した。この懸濁培養物を、継代Ｘ＋４にあるＴフラスコ由来の細胞に蒔いた。懸濁培地の組成は、以下からなる：ＣＨＯ  ＩＩＩ  ＰＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ＃９６−０３３４５Ａ）；１０％  品質保証熱非働化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  １００８２）；１ｍｌ／ｌの２５ｍＭ（１０００×）Ｌ−メチオニンスルホキシム溶液；および１０ｍｌ／ｌ  １００×ＨＴ補充物（Ｇｉｂｃｏ  １１０６７）。
【０１３０】
この懸濁培養物を１．７×１０５細胞／ｍｌの密度で蒔いた。培地容積は、２５０ｍｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇ使い捨て振盪フラスコ中に５０ｍｌであった。この培養物を、５％ＣＯ２および湿度７０％において３７℃で、１３０ｒｐｍの振盪器上でインキュベートした。この培養物を、細胞密度が１×１０６細胞／ｍｌに達した場合、必要に応じて１：３〜１：５に分割し、２×１０５細胞／ｍｌ未満の密度には分割しなかった。
【０１３１】
振盪フラスコ懸濁培養物中の細胞の初回の継代を、継代Ｘで示した（ＴフラスコからＸ＋５）。この培養を、１０％ウシ胎児血清で継代Ｘ＋７まで続けた。血清を補充した培地中での懸濁物の増殖のための適応は、約２０日かかった。
【０１３２】
（Ｃ．無血清懸濁増殖に対する適応）
懸濁培養物を、培地中の血清濃度を漸進的に減じて無血清増殖に適応した。培地組成の他の全ての成分は、離脱工程の間、不変であった。懸濁増殖適応のために、細胞を、必要に応じて１：３〜１：５に分割することにより、２．５×１０５細胞／ｍｌと１×１０６細胞／ｍｌの間で維持した。この培養物を、５％ＣＯ２および湿度７０％において３７℃で、１３０ｒｐｍの振盪器上でインキュベートした。継代８において、血清を５％まで減じ；継代９において、２％まで；継代１０において１％まで；継代１１において、細胞を遠心し、新鮮な培地４０ｍｌ／馴化培地１０ｍｌに再懸濁し、血清濃度を１％に維持した（大きな塊および細胞細片を培養物から沈殿させて除去した）；継代１２〜１５において、血清を１％に維持した；継代１５において、培地をＬ−アスパラギン酸６０ｍｇ／ｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン２００ｍｇ／ｌおよびＬ−メチオニン６０ｍｇ／ｌで補充し、ｐＨ７．５に合わしかつ濾過滅菌した５０×貯蔵溶液として添加した；継代１６〜２１において、血清を０％まで減じアミノ酸補充物を維持した；継代２１において、播種前貯蔵（ＰＳＳ）凍結バイアル貯蔵所を１×１０７細胞／バイアルで調製した。無血清培地への適応におよそ５５日かかった。本明細書で実施するような無血清懸濁培養物をＰＧＦ０１として示した。
【０１３３】
（Ｄ．培養物の凍結）
上記のように調製した細胞を、凍結および貯蔵のために、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ遠心機を用いて５００ｒｐｍで１０分間、細胞を遠心することにより調製した。この細胞を、５０％の完全培地（１ｍｌ／ｌ  ２５ｍＭ（１０００×）メチオニンスルホキシイミンストック溶液、１０ｍｌ／ｌ  ＨＴサプリメント、２０ｍｌ／ｌ  ５０×アミノ酸ストック溶液、３ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン酸、６ｇ／ｌ  Ｌ−セリン、１０ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン、３ｇ／ｌ  Ｌ−メチオニンを含有するＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ）；５０％馴化培地からなる凍結培地に再懸濁した。「馴化」培地は、細胞を数日間増殖させた培地であり、この細胞を遠心分離し、そして分画し、次いで濾過滅菌し；１０ｇ／ｌウシ血清アルブミン（保護剤として）；および７５ｍｌ／ｌ  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｓｔｅｄ  Ｄ２６５０）を用いて１×１０７細胞／ｍｌの密度にし、そして凍結バイアルに分注した。この細胞を、１℃／分の速度に制御された冷蔵庫で−７５℃まで凍結させ、次いで貯蔵のための液体窒素に移した。
【０１３４】
（Ｅ．マスターセルバンク（ＭＣＢ）の無血清懸濁物の調製）
マスターセルバンクを、液体窒素の貯蔵庫から第Ｘ＋２１継代のバイアルを１つ取りだし、そして３７℃の水浴で迅速に融解した第Ｘ＋２１継代細胞培養物から調製した。バイアルの成分を、以下からなる新しい培地（９ｍｌ）を有する１５ｍｌコニカルチューブに移した：ＣＨＯ  ＩＩＩ  ＰＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ＃９６−０３３４５Ａ）；１ｍｌ／ｌの２５ｍＭ（１０００×）Ｌ−メチオニンスルホキシミンストック溶液；１０ｍｌ／ｌ  １００×ＨＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ  １１０６７）；ｐＨ７．５に調整し、そして濾過滅菌した２０ｍｌ／ｌ  ５０×アミノ酸ストック溶液（ストック溶液：３ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン酸、６ｇ／ｌ  Ｌ−セリン；１０ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギンおよび３ｇ／ｌ  Ｌ−メチオニン）。
【０１３５】
このチューブを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＰＲ遠心機を用いて１０分間、５００ｒｐｍで遠心分離させた。この上清を除去し、そして細胞をこのチューブの底から取り除いた。１０ｍｌの新しい培地をチューブに添加し、そしてこの懸濁した細胞を、コーニングの２５０ｍｌ振盪フラスコに移した。この培地の容積を、培養物の最初の細胞密度を２×１０５細胞／ｍｌの密度になるように５０ｍｌに調整した。この培養物を、３７℃で７０％の湿度を伴う５％  ＣＯ２中の１００ｒｐｍのロータリーシェイカー上で一晩インキュベーションした。インキュベーションの第一日目の後、このロータリーシェイカーの速度を１３０ｒｐｍに速めた。無血清／無動物タンパク質の懸濁物増殖における５代の継代の後、ＭＣＢを１×１０７細胞／バイアルで調製した。
【０１３６】
（実施例３）
（Ａ．接種物培養の生成用の培地）
接種物培養物のための培養物培地を、以下の成分から調製した：
グルコースを含有する１．０リットルＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；３．４５ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースを含有し；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含有しない）；
１０．００ｍｌ／ｌ  ＨＴサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１０６７−０３０；１００×＝１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１．６ｍＭチミジン）；
２０．００ｍｌ／ｌアミノ酸ストック（以下の３Ｂにおいて調製されるように）；
１．００ｍｌ／ｌ  ２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンスルホキシイミンストック（以下の３Ｃにおいて調製されるように）；
２５．００ｍｇ／ｌ  Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ）；および
０．５０ｍｌ／ｌフェノールレッド（Ｓｉｇｍａ、０．５％（ｗ／ｖ）溶液）。
【０１３７】
（Ｂ．アミノ酸のストック）
上記の接種物培養培地において使用されるアミノ酸ストックを、以下：３．００ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ）、２．５０ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン酸（Ｓｉｇｍａ）、１０．００ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ）、１．２５ｇ／ｌ  Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ）、３．００ｇ／ｌ  Ｌ−セリン（Ｓｉｇｍａ）、そして１．５０ｇ／ｌ  Ｌ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ）を、脱イオン水に溶解して１リットルの溶液を作製し、水性の５Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調整し、次いで生じる溶液を滅菌濾過することによって調製した。
【０１３８】
（Ｃ．Ｌ−メチオニンスルホキシイミンストック）
Ｌ−メチオニンスルホキシイミン（２５ｍｍｏｌ、ＦＷ  １８０．２、Ｓｉｇｍａ）を、１リットルの脱イオン水に溶解した。生じた溶液を、０．２ミクロンフィルターを用いて濾過した。この溶液を、３ヶ月間まで４℃で保存し得るか、またはより長期の保存のために−２０℃以下で凍結保存し得る。
【０１３９】
（実施例４）
（接種物の生成）
凍結ＰＦＧ０１種細胞のバイアルを、小さな氷のペレットが残るだけになるまで、３６．５±１℃の水浴で溶解した。このバイアルを、バイオセーフティーキャビネットに移し、その外側を、滅菌の７０％イソプロパノールワイプで汚染を除去した。この細胞を、実施例３Ａで調製したような２５ｍｌの予め温めた増殖培地に再懸濁し、そして１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。この培養物を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｄｙｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．ＤｏｙｌｅおよびＪ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，１９９８））を用いてサンプリングした。必要ならば、より多くの予め温めた増殖培地を、最終細胞濃度を約５．０×１０５ｖｃ／ｍｌに調整するように添加した。このフラスコを、３６．５±１℃、５±１％のＣＯ２濃度、７０±５％の相対湿度、かつ１７０±５ｒｐｍの攪拌速度で攪拌しながらインキュベートした。このフラスコを、細胞濃度および細胞生存能力を確認するために毎日サンプリングした。
【０１４０】
フラスコに５．０×１０５ｖｃ／ｍｌの濃度を維持するために十分な予め温めた増殖培地を添加した。振盪フラスコの容積が５０ｍｌに達し、そして細胞密度が１．０×１０６ｖｃ／ｍｌに達した場合、この培養物を２５０ｍｌ振盪フラスコに移し、そして５．０×１０５ｖｃ／ｍｌ（１００ｍｌ）に希釈した。この細胞密度が再び１．０×１０６ｖｃ／ｍｌに達した場合、この培養物を分けて半分を別の２５０ｍｌ振盪フラスコに移し、そして２．０×１０５ｖｃ／ｍｌに希釈した。種の列が拡大することを可能にするこれらの工程を、バイオリアクター中で２．０×１０５ｖｃ／ｍｌの播種密度を得るために十分な容積を達成するまで、維持した。この理想の接種物率（接種物培養物の容積／接種後の反応液体容積）が、約１０〜２０％になることを判断した。従って、この接種物培養物の細胞密度を、理想的には１．０×１０６ｖｃ／ｍｌと２．０×１０６ｖｃ／ｍｌの間に調整した。この接種物培養物の齢は約３日齢であった。
【０１４１】
（実施例５）
（産生バイオリアクターにおける使用のための培地）
（Ａ．バッチ培地）
ＮＩＦ１産生用のバッチ培地を、以下を合わせることによって調製した：
グルコースを含有する１．００リットルのＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８−０２８９；３．４５  ｇ／ｌ  Ｄ−グルコースを含有し；ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミンを含有しない）；
１０．００ｍｌ／ｌ  ＨＴサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；
１．５０ｇ／ｌ酵母抽出物（Ｂａｃｔｏ、Ｄｉｆｃｏ／Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）；および
０．５０ｍｌ／ｌフェノールレッド（０．５％（ｗ／ｖ）溶液、Ｓｉｇｍａ）。
【０１４２】
（Ｂ．栄養分供給物１）
栄養分供給物１として使用するために、２００ｇのグルコース（セレロース（ｃｅｒｅｌｏｓｅ）由来、Ｃｏｒｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、脱イオン水に溶解し、１リットルの溶液にした。グルコース供給物を、グルコース濃度を、リアクターにおいて約１．５〜２．５ｇ／ｌの濃度に制御するために使用した。
【０１４３】
（Ｃ．栄養分供給物２）
栄養分供給物２として使用するために、以下の成分を合わせた：
１．０リットルのＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭ  ５×（ｐＨ７．４に調整）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｆｏｒｍｕｌａ  ９９−０１８０；１×Ｌ−シスチン、３×Ｌ−チロシンを含有する５×；グルコース、ヒポキサンチン、チミジン、Ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含有しない）。
【０１４４】
５０ｍｌ／ｌ  ＨＴサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１１０６７−０３０；および１００×＝１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１．６ｍＭチミジン）。
【０１４５】
７．５０ｇの酵母抽出液（Ｄｉｆｃｏ、Ｂａｃｔｏ／Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【０１４６】
このＨＴサプリメントおよび酵母抽出液を、５×のＣＨＯ−ＩＩＩ−ＰＦＭに添加した。この成分を、完全に溶解するまで混合し、次いでｐＨを、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて７．４に調整し、次いで生じた溶液を滅菌濾過した。
【０１４７】
（実施例６）
（２リットルの滅菌したタンクバイオリアクターの操作）
ＮＩＦ１の産生を、Ｆｏｘｂｏｒｏ  ＩＡ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）コンピューターシステム（Ｆｏｘｂｏｒｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｏｘｂｏｒｏ、ＭＡ．）によって制御される２リットルのＷｈｅａｔｏｎバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＰＡ）で実施した。バイオリアクターの滅菌後、１リットルの無菌状態の馴化溶液（無グルタミンＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を添加した。４時間後、リンス培地を１リットルの新しい滅菌産生バッチ培地（実施例５Ａにおいて調製したような）と置換した。この培地の温度を３６．５±１℃で安定化させ、そしてｐＨをｐＨ７．４に調整した。リアクターにおいて約２．０×１０５生存細胞／ｍｌの目標密度を得るために、約２００ｍｌの接種物培養物の容積を１．２リットルの最初の液体容積を得るために添加した。
【０１４８】
（Ａ．実施の設定値）
このバイオリアクター実施のための以下のパラメーターを適切に含んだ。
【０１４９】
攪拌：１００ｒｐｍ（直径４インチの単一プラスチックの垂直ブレード）
ｐＨ：７．４０±０．１５（制御因子：ＣＯ２ガスおよび７．５％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３溶液。
【０１５０】
溶解した酸素濃度：６０％±５％空気飽和（制御：Ｏ２およびＮ２）。
【０１５１】
温度：３６．５℃。
【０１５２】
栄養分供給物１：２００ｇ／ｌグルコース溶液−約０．０〜約６．０ｇ／（リットル・日）で供給。
【０１５３】
ガス流通量：ヘッドスペースへのガス流通を２００〜３００ｍｌ／分に維持する。ＣＯ２およびＯ２（安全の目的で、Ｎ２中６０％のＯ２を使用した）を、ｐＨおよび溶解酸素の制御に対する要求に応じて培養物に噴霧した。溶解した酸素の濃度がその上限（６５％）を超える場合、Ｎ２を時々ヘッドスペースに向けた。
【０１５４】
栄養分供給物２を３０ｍｌ／日（すなわち、一日当たりの接種で、培養物の１リットルあたり２５ｍｌの割合）の一定割合で持続的に与えた。この供給を、４８時間でグルコース供給物とともに同時に開始し、産生の実施の経過にわたって、このレベルで維持した。
【０１５５】
（Ｂ．サンプリングおよび維持）
このバイオリアクターを、接種直後にサンプリングした。次の測定を実施した：最初の細胞密度および細胞生存能力；オフラインのｐＨ；最初のグルコース濃度；最初の乳酸塩濃度；最初のアンモニア濃度；および最初の重量オスモル濃度。必要な場合には、オンラインｐＨを調整した。このバイオリクターを、光から培地を保護するために黒いプラスチックで覆った。
【０１５６】
このバイオリアクターを以下のパラメーターについて毎日サンプリングした：細胞密度；培養生存能力；オフラインのｐＨ；グルコース濃度；乳酸塩濃度；アンモニア濃度；重量オスモル濃度；および成熟ＮＩＦ１濃度（４日目に開始）。グルコース濃度を、栄養分供給物１を用いて０．１ｇ／リットルと３．０ｇ／リットルの間で維持した。栄養分供給物１の供給を、３０分サイクルのオン／オフタイマーに接続した較正したポンプを用いて、約２．０ｇ／（リットル・日）、または約２．０〜３．０ｇグルコース／１０９生存細胞／日の最初の供給割合で４８時間後に開始した。グルコース供給割合を、必要に応じて毎朝調整した。必要とされる供給割合を、０．０〜６．０ｇ／ｌ日の範囲内で通常維持した。一定の栄養分供給物２を、グルコース供給とともに同時に開始した。
【０１５７】
（Ｃ．ＰＦＧ０１を用いたＮＩＦ１の産生プロフィール）
表ＩＶに記載した以下の測定を、ＰＦＧ０１細胞を用いたＮＩＦ１の産生の実施について観察した。
【０１５８】
【表３】
2004520809.tif 000006
細胞数および生存率の測定を、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．ＤｏｙｌｅおよびＪ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，１９９８）に記載のトリパンブルー染色排除法に従って測定した。ＮＩＦ１力価を、上記の発明の詳細な説明に記載したプロトコールによって測定した。グルコース、ラクテートおよびアンモニアの測定を、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏｌｙｚｅｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実行した。重量オスモル濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ３３３０，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を用いて測定した。
【０１５９】
（実施例７）
（ＮＩＦ１のシアリル化／グリコシル化のプロフィール）
多数の異なるバイオリアクター運転から収集したＮＩＦ１を、シアリル化／グリコシル化の程度について試験し、標準サンプルについての結果と比較した。標準ＮＩＦ１（ＳＴＤ）は、実施例２に記載のように懸濁増殖に適応させたがウシ血清アルブミンを含む培地上で育てる、実施例１の細胞から得た。シアリル化／グリコシル化プロフィールを、以下のようにＷｅｂｓｔｅｒら，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，２９（１１），１１４１−５５頁（１９９９）に記載される方法を介して調べた。
【０１６０】
（Ａ．ＮＩＦ１の脱シアリル化）
ＮＩＦ１の脱シアリル化の手順は、酸加水分解を使用し、シアル酸を放出させる。ＮＩＦ１サンプル（２ｍｇ／ｍｌ）を、０．２Ｎ  ＨＣｌ（１：１  Ｖ／Ｖ）の添加によって脱シアリル化し、８０℃にて１時間加熱した。酸加水分解反応によって遊離したシアル酸を、Ｗａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，１９７１−５頁（１９５９）によって開発されたチオバルビツール酸方法を用いて決定する。遊離のシアル酸におけるさらなる増加が観察されなくなったときに、インキュベーションを終了した。
【０１６１】
（Ｂ．総シアル酸の決定）
シアル酸残基を、酸加水分解を用いてＮＩＦ１から放出させ（直ぐ上の第Ａ部）、そしてＮＩＦタンパク質のグリカンと関連する優勢なシアル酸（５−アセチルノイラミン酸（５−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ｎｅｕ５ａｃ））を、パルス電流測定検出を伴なうイオンクロマトグラフィーによって分析した。精製したＮＩＦ１サンプルを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。次いで、サンプル（２００μｌ）を２００μｌの０．２Ｎ  ＨＣｌと混合し、８０℃で１時間加熱した。次いで、このサンプルを氷浴で１０分間冷却し、遠心分離した。５−アセチルノイラミン酸を含む上清（２０μｌ）を、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃａｒｂｏｐａｃ（ＰＡ−１０  ４．６×２５０ｍｍカラム（０．２Ｍ  ＮａＯＨおよび０．０５Ｍ  Ｃ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ可動相を伴なうガードカラム４．６×５０ｍｍ  Ｃａｒｂｏｐａｃ（ＰＡ−１０）（流速＝０．７  ｍｌ／分、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＡＴＣ−１  可動相調整装置を用いて条件付けした可動相））を用いて分析し、検出を、最適化した炭水化物波形設定を使用するＤｉｏｎｅｘ  ＥＤ４０検出器を用いて実行した。５−アセチルノイラミン酸標準物は、上記のＨＰＬＣ条件下で１０分間の保持時間を有する。５−アセチルノイラミン酸の溶出後、洗浄工程を実施し（０．２Ｍ  ＮａＯＨおよび０．３Ｍ  Ｃ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ、５分間）、このカラムを、次の注入前に３０分間再平衡化した。データは、コントロールバッチ（すなわち、懸濁に対して適応させたがウシ血清アルブミンの存在下で作製した実施例１の細胞から調製したＮＩＦ１の標準サンプル（ＳＴＤ））のパーセンテージとして示し、シアリル化について提示する値の増加は、ＮＩＦ１分子に対するシアル酸の量における増加を示す。総シアリル化データを、表Ｖに示す。
【０１６２】
（Ｃ．オリゴ糖電荷プロフィールアッセイ）
Ｎ−結合型オリゴ糖を、酵素ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ−Ｆ）を用いてＮＩＦ１から放出させる。放出されたオリゴ糖を、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）を用いて標識し、陰イオン交換クロマトグラフィーで分離する。精製ＮＩＦ１を、まず約０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し；５０μｌの希釈したＮＩＦを、４μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび６μｌの１．４４Ｍ  β−メルカプトエタノールの添加によって変性させた。サンプルを脇に約５分間設定した後、２０μｌの７．５％  ＮＰ−４０および３０μｌの緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−二ナトリウム、ｐＨ７．６）を、このサンプルに添加した。この後、１０μｌの１ｍＵ／ｍｌ  ＰＮＧａｓｅ−Ｆを添加し、このサンプルを、インキュベーター中、３７℃で１８〜２４時間保存した。放出されたオリゴ糖をエタノール沈降によって脱グリコシル化タンパク質から分離し、上清を除去し、乾燥させた。オリゴ糖を含むこの乾燥サンプルを、標識キット（サンプルを再懸濁するために使用される５μｌの標識試薬、Ｓｉｇｎａｌ  ２−ＡＢ標識キット（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ，製品番号Ｋ−４０４））を用いて２−ＡＢで標識した。インキュベーションの終りに、過剰の標識試薬を、親水性膜でのクロマトグラフィー（このキットと共に供給される）によって除去した。試薬混合物を、アセトニトリル中のディスクにロードし、過剰の試薬を、アセトニトリルおよびアセトニトリル／水での連続した洗浄を用いて除去した。２−ＡＢ標識オリゴ糖を、水を用いてこのディスクから溶出し、乾燥させた。次いで、２−ＡＢを用いて標識したオリゴ糖を、Ｇｌｙｃｏｓｅｐ  Ｃ  ＨＰＬＣカラムでの陰イオン交換ＨＰＬＣ（１００×４．６ｍｍ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。オリゴ糖を、３５分間かけて８０％  水／２０％  アセトニトリル〜８０％  ２５０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）／２０％  アセトニトリルの勾配で溶出し、流速は、０．３ｍｌ／分であった。蛍光検出を、３３０ｎｍの励起波長および４２０ｎｍの発光波長で実行した。代表的なクロマトグラムは、最初に溶出する荷電していない種を伴なうピークのクラスター、続いてモノシアリル化クラスター、ジシアリル化クラスター、トリシアリル化クラスターおよびテトラシアリル化クラスターからなる。
【０１６３】
ＮＩＦ１バッチ（ＳＴＤ）をプロファイリングのコントロールのために指定した。シアリル化プロフィールデータを、表Ｖに示す。
【０１６４】
（実施例８）
（ＮＩＦ１薬物動態学的プロフィール）
多数の異なるバイオリアクター運転から収集したＮＩＦを、薬物動態学的クリアランスおよび半減期データについて試験し、ＮＩＦ１の標準サンプル（ＳＴＤ）についての結果と比較した。この標準サンプルは、実施例２に記載のように懸濁増殖に対して適応させたが動物タンパク質（ＢＳＡ）の存在下で作製した、実施例１の細胞から得た。ＮＩＦ１の標準サンプルと比較した結果を、以下の表に列挙する。
【０１６５】
（Ａ．動物の調製）
頸静脈にカテーテルを入れたＦｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラットを、カニューレ（０．５８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、０．９ｍｍ  Ｏ．Ｄ．、ポリテンチュービング、Ｐｏｒｔｅｘ  Ｌｔｄ．）を頸静脈に挿入することによって調製し、このカニューレを、古典的な獣医学的技術を用いて頸部の後ろから外に出した。手術の間、ラットを、腹腔内注射として投与した７０ｍｇ／ｋｇ  ケタミンＨＣｌ（Ｖｅｔａｌａｒ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ；１００ｍｇ／ｍｌ）／１０ｍｇ／ｋｇ  キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ注射２％、Ｂａｙｅｒ）を用いて麻酔した。手術の後、キシラジンの反転を、皮下注射として投与した５倍希釈したＡｎｔｉｓｅｄａｎ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，アチパメゾール（ａｔｉｐａｍｅｚｏｌｅ）；５ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌ／ｋｇ注射を用いて実行した。痛覚脱失法を、皮下投与した実験期間に提供した（ブプレノルフィンＨＣｌ、４倍希釈したＶｅｔｅｒｇｅｓｉｃ（ＲｅｃｋｉｔｔおよびＣｏｌｍａｎ；０．３ｍｇ／ｍｌ）の０．１ｍｌ）。２日間の回復期間の後、２ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＮＩＦ１を用いて、ラットに尾静脈（ボーラス）投与した（用量は、２ｍｇ／ｍｌの濃度で構成し、１ｍｌ／ｋｇ基準で投与した）。頸静脈にカテーテルを入れたラットの使用によって、連続サンプリングが可能となり、２匹のラットをＮＩＦ１の各バッチの薬物動態を決定するために使用した。血液サンプル（５０μｌ）を、以下の時点：投与前、０．２５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、および４８時間において、ヘパリン処理したチューブへの留置カテーテルを用いて取り出した。血液サンプルを遠心分離し、血漿を取り出し、引続く分析のために凍結保存した。血漿サンプルをＤｅｌｆｉａイムノアッセイを用いてＮＩＦ１について分析した（実施例８Ｃ）。
【０１６６】
（Ｂ．単離した灌流ラット肝臓調製）
単離した灌流ラット肝臓（ＩＰＲＬ）調製を、Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，２５，１８５−１８７頁（１９９５）に詳述される方法論を用いて実行した。約２５０ｇの重量で選択した雄性ラットを、麻酔し（Ｉｎｔｒａｖａｌ）、そして手術を実行して胆管、肝門脈および上大静脈にカニューレ挿入した。
【０１６７】
灌流液（洗浄したヒト赤血球（１３％）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（２６％）を含む、ｐＨ  ７．４  Ｋｒｅｂｓ高重炭酸塩緩衝液（６１％）からなる）を、１５ｍｌ／分の流速で肝臓を通して灌流させた。灌流液を、９５％  酸素／５％  二酸化炭素を用いて酸素化させ、肝門脈を介して肝臓に進入させ、大静脈と介して出した。総灌流液容量１５０ｍｌを用いて、ＩＰＲＬを再循環モードで実行した。タウロコール酸（２４ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液を、胆汁速度を維持するために、この実験期間の間１．３３ｍｌ／ｈの速度で注入した。アシアロＮＩＦ１（０．２５ｍｇ、実施例７Ａ）をリザーバに投与し、灌流液サンプルを、２分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、４５分後、６０分後、７５分後、および９０分後にこのリザーバから引き出した。胆汁をこの実験期間の間（０〜９０分）に収集した。競合研究のために、アシアロＮＩＦ（０．２５ｍｇ）をアシアロフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）（１０ｍｇ，Ｓｉｇｍａ  Ａ１９０８）と共に同時投与した。灌流液サンプルを遠心分離し、上清を除去し、引続く分析のために凍結保存した。胆汁サンプルをまた分析のために凍結保存した。ＩＰＲＬ灌流液および胆汁サンプル中のＮＩＦ１濃度を、血漿について詳述するＤｅｌｆｉａイムノアッセイを用いて決定した（実施例８Ｃ）。
【０１６８】
（Ｃ．ＮＩＦ１についての血漿サンプルの分析）
血漿サンプルを、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｄｅｌｆｉａ）を用いて分析した。このアッセイは、検出試薬としてユーロピウム標識モノクローナル抗ＮＩＦ抗体を使用する「サンドイッチ非競合イムノアッセイ」である。ポリクローナルウサギ抗ＮＩＦ抗体は、抗ウサギ抗体でコーティングされたプレートに結合する。次いで、サンプルまたは標準物中のＮＩＦが、ポリクローナル抗体に結合し、最終的に、ユーロピウム標識したモノクローナル抗体が結合ＮＩＦ上の別のエピトープに結合する。ユーロピウムは、「増強」溶液の添加後に決定される。このアッセイを実行するために、５μｌの血漿を要した。
【０１６９】
血漿におけるアッセイ範囲は、０．１〜４０μｇ／ｍｌであった。このアッセイの精度を評価し、そして累積変分は、それぞれ、０．１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌにおいて、１０．５％、３．４％、６．３％であった。アッセイの日と日の間の実行能力は、品質コントロールサンプルを用いてモニターした。Ｄｅｌｆｉａイムノアッセイは、十分に特徴付けられており、以下の分子を含む多くのタンパク質の血漿濃度を決定するために以前に使用されている：インターフェロン（Ｒｏｎｎｂｌｏｍら，ＡＰＭＩＳ，１０５，５３１−５３６頁（１９９７））、アポリポプロテインＤ（Ｋｎｉｐｐｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２，８５−９５頁（１９９７））、サイログロブリン（Ｄａｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，４６１−４６５頁（１９９６））およびリポタンパク質リパーゼ（Ｗｉｃｈｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９２，１−１１頁（１９９６））。
【０１７０】
（Ｄ．薬物動態学的分析）
薬物動態を、標準アルゴリズムを用いて決定した。排出速度定数（Ｋｅｌ）は、ｌｏｇ（血漿濃度）  対  時間の線形回帰を用いて、血漿濃度  対  時間のプロットから決定した。以下の式：半減期＝（Ｌｎ２）／Ｋｅｌ−血漿濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ）、を用いて決定される半減期を、線形台形法則を使用して時間０〜最後のデータポイントまで計算した。ＡＵＣを、排除速度定数を用いて無限大まで外挿した。クリアランスを、以下の関係：用量÷ＡＵＣ（０〜∞）、を用いて計算した。分布の容積を、以下の関係：クリアランス÷排除速度定数、によって計算した。
【０１７１】
ＩＰＲＬにおける肝臓抽出値は、ＩＰＲＬにおいて得たクリアランス値をＩＰＲＬ流速（１５ｍｌ／分）で除算し、そしてこの値に１００を乗算することによって計算した。クリアランス決定および半減期決定の結果を、以下の表Ｖに示す。ＮＩＦ１力価は、上記の説明に記載される方法によって測定した。
【０１７２】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＮＩＦ１のコード配列（配列番号１）、対応するアミノ酸翻訳物（配列番号２）および成熟ＮＩＦ１のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヌクレオチドは、５’末端から数えられ、そしてアミノ酸は、成熟ポリペプチド（配列番号３）の開始点（Ｎ末端Ａｓｎが示される）から数えられる。左側の縁に沿った番号は、各列の最初の核酸配列のヌクレオチド番号または成熟ＮＩＦ１配列のアミノ酸番号（太字）を示す。アミノ酸配列決定によって同定されたペプチドに下線を付す。ペプチドＴ−２０（配列番号４）、Ｔ−２２（配列番号５）、Ｄ−９６（配列番号６）、およびＤ−１０２（配列番号７）を使用して、開始およびその後のクローニングプロセスのための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを設計した。小文字で表されるヌクレオチド配列は、ＢＳＩＩシャトルベクター（配列番号８）へのクローニングのためのコード領域のレスキューの間に、これらのＰＣＲプライマーによって付加されたヌクレオチドを示す。この図は、｛ＢＳＩＩ／｝｛ｐＥＥ１４／｝｛ｐＳＧ５｝ＮＩＦ１ｃｒ構築物を使用して、ＤＮＡの両鎖から決定した配列を表す。
【図２】
図２は、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｍＲＮＡの調製物から得られた、λｇｔ１０／ＥｃｏＲＩベクターへのｃＤＮＡのクローニング、およびＢＳＩＩレスキューベクターへのサブクローニング後の、全長ｃＤＮＡの配列（配列番号９）を示す。ＮＩＦ１のヌクレオチド配列を、サンガージデオキシヌクレオチド配列決定法を使用して決定した。左側の縁に沿った番号は、この配列の５’末端からのヌクレオチド数を示す。太字で強調したヌクレオチド（３１３〜１１３７）（配列番号１）は、ＮＩＦ１のコード領域を表す。
【図３】
図３は、ＮＩＦ産生細胞株の構築の図であり、これは、ＮＩＦ１  ｃＤＮＡからｐＥＥ１４ベクターへの経路の概略図を示し、このｐＥＥ１４ベクターを使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトした。
【図４】
図４は、ＮＩＦ発現細胞株の構築に使用したｐＥＥ１４発現ベクター構築物を示す。その名に示されるように、このｐＥＥ１４／ＮＩＦ１ｃｒ発現プラスミドは、広く使用されている９．４ｋｂ  ｐＥＥ１４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に由来した。このｐＥＥ１４ベクターは、以下を含む：（１）ヒトＣＭＶ主要最初期プロモーター（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）；（２）マルチクローニング部位（ＭＣＳ）；（３）ＳＶ４０初期ポリＡ部位（ｐＡ）；Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点（Ｃｏｌ  Ｅ１）；（５）アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）；および（６）ＳＶ４０後期プロモーター（ＳＶ４０Ｌ）（これは、グルタミンシンセターゼミニ遺伝子（ＧＳ−ミニ遺伝子）を駆動する）。マルチクローニング部位に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位は、この図において示される。５’ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部位は、ＭＣＳに対してわずかに５’側である。
【図５】
図５は、クローニングプロセスの間に、コード配列（大文字の隣接「ＮＩＦ１ｃｒ」）の両端の挿入物に組み込まれたさらなる非コード配列（小文字）（配列番号１０および１１）を示す。挿入配列の５’末端は、ｐＥＥ１４発現ベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ部位（図４には示されていない部位）から開示することが示され、この配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩシャトルベクター（「ＢＳＩＩ」）ポリリンカー由来の５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位由来の相補配列に連結される。この５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、ＮＩＦ１ｃｒ配列をＢＳＩＩにクローニングするために使用される、５’−ＰＣＲ  ＮＩＦ１ｃｒレスキュープライマーにより提供される、ＥｃｏＲＩ部位の後に存在する。このＥｃｏＲＩ部位から始まるＮＩＦ１のＮＩＦ１コード領域配列は、約８５０ヌクレオチドにわたる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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