(57)【要約】本発明は、標的細胞の分化能を測定する方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらし、前記標的細胞の子孫を検出することを含んでなる方法に関する。本発明はさらに、治療又は予防のための細胞の特定又は提供のためにこれらの方法を使用すること、及び治療又は予防に使用するための薬剤の製造に前記細胞を使用することに関係する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の分化能を測定する方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらし、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記初期胚環境が胚性幹細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記初期胚環境がインヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エックスヴィヴォ（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で提供されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
初期胚環境が胚、胚培養物、胚葉体又は胚性幹細胞によって提供されることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
初期胚環境が胚葉体、胚性幹細胞又は原腸形成が完了していない胚若しくは胚培養物からなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
初期胚環境が標的細胞の特定の分化能を発現させることができる一つ以上のシグナルを提供することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
標的細胞の分化能を測定する方法であって、前記標的細胞を胚葉体と共に培養し、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記胚葉体が胚性幹細胞から生成されることを特徴とする請求項４又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記胚葉体が前記標的細胞と同じか、又は異なる種又は属から派生することを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
標的細胞の分化能を測定する方法であって、前記標的細胞を鳥類又は両生類の胚に前記胚の中に、原腸形成の完了するまでの任意の時に導入し、前記胚を発達させ、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記胚が鳥類又は両生類の胚であることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚がひなどり胚であることを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記胚が卵に含まれ、該卵をインキュベートすることによって前記胚が発達することを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞が前記胚の羊膜腔に導入されることを特徴とする請求項１０ないし請求項１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が前記胚の原条の上若しくは中に、原腸形成中の原外胚葉の中若しくは上に、又は胚の形成中の中胚葉若しくは内胚葉の中若しくは上に導入されることを特徴とする請求項１０ないし請求項１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
標的細胞の発生能を測定する方法であって、前記標的細胞を培養胚に導入し、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
培養胚が受精後から子宮内の１１ｄｐｃ（ｄｐｃは受胎後の日数の略）に相当する時期までインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養されることを特徴とする請求項４、請求項５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的細胞が前記胚の原腸形成完了までの任意の時に導入されることを特徴とする請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養胚が哺乳動物のものであり、前記標的細胞が着床しつつある（ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ）胚の胚盤胞の胚結節若しくは二層性胚盤の上若しくは中に、羊膜腔中に、又は原条上に導入されることを特徴とする請求項１６ないし請求項１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記胚又は胚培養物において前記標的細胞の前記子孫の位置を測定することを特徴とする請求項１ないし請求項１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
種−、アロタイプ−、細胞及び／又は分化−特異的マーカーの検出によって検出が行われることを特徴とする請求項１ないし請求項２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細胞及び／又は前記子孫が分離されることを特徴とする請求項１ないし請求項２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が診断的目的のために使用されることを特徴とする請求項１ないし請求項２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
治療若しくは予防のための細胞を特定、提供若しくは診断し、又は治療的若しくは予防的に有用な細胞を生成するための細胞類を特定、提供若しくは診断することを特徴とする請求項１ないし請求項２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記治療又は予防が、特定され、提供され、診断され、又は生成された細胞の移植を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
治療的又は予防的に有用な細胞の生成のために使用するのに適切な細胞型を特定及び測定することを特徴とする請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療又は予防に使用されることを特徴とする請求項２４に記載の細胞。
【請求項２８】
治療又は予防に使用するための薬剤の製造における請求項２４に記載の細胞の使用。
【請求項２９】
対象の疾患を治療又は予防する方法であって、前記対象に適切な量の請求項２４に記載の細胞を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
標的細胞の種々の細胞型への分化を誘導する方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらすことを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記方法が請求項１ないし請求項２３のいずれか１つに記載したものであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
分化した細胞が分離されることを特徴とする請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物又は組成物の細胞に対する効果を分析試験する方法であって、前記方法は請求項１ないし請求項２３又は請求項３０ないし請求項３２のいずれか１つに記載の方法を含み、さらに、前記標的細胞及び／又はそれらの子孫を前記化合物又は組成物にさらし、前記細胞に対する前記化合物又は組成物の効果を分析試験する段階を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は細胞の分化能を試験するための分析試験に関するものである。より詳細に述べれば、本発明の分析試験は細胞の完全分化能を試験するものである。
【０００２】
種々の異なる細胞型に分化する能力を有する幹細胞は近年大きな関心の的である。多細胞生物は単一の全能性（又は多能性）幹細胞から形成される。この細胞及びその子孫が細胞分割を受けるにつれて、これら細胞の上記能力は制限されるようになり、それらは或る系統（ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞を発生するように特殊化される。若干の組織では、幹細胞集団は成人の器官にも維持されており、それは連続的に、又は損傷に反応して、新しい細胞を生成することができる。この特徴は興味深いものである。なぜならば、この特徴により、幹細胞を使用して治療に使用するための細胞集団、例えば疾患又は損傷によって組織に引き起こされたダメージを修復するための細胞集団を生成する可能性が生まれるからである。これは神経系の分野で特に興味深いものである。
【０００３】
最近まで、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞の運命に関しては、新しい神経細胞は成哺乳動物脳には発生し得ないとする“静的”考え方が一般的であった。しかし今や、神経細胞のリニューアルや、神経組織のその他の細胞型である星状膠細胞及び乏突起［神経膠］細胞の発生が、成熟ＣＮＳの或る領域で起き得ることが多数のグループによって証明されている（例えば、マッケイ（Ｒ．Ｍｃｋａｙ）著、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６巻、６６７１ページ（１９９７）；ヴァイス（Ｓ．Ｗｅｉｓｓ）他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、３６巻、３０７（１９９８）；モンマ（Ｓ．Ｍｏｍｍａ）他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１０巻、４５ページ（２０００）；シアブジン（Ｌ．Ｓ．Ｓｈｉａｂｕｄｄｉｎ）他、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ５巻、４７４ページ（１９９９）；テンプル（Ｓ．Ｔｅｍｐｌｅ）他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９巻、１３５ページ（１９９９）を参照されたい）。これは神経幹細胞の研究を活発にし、我々の先の特許出願ＷＯ９９／６７３６３を含めて種々の報告がこれに関する文献に発表された。
【０００４】
特に、最近、次の２種類の幹細胞が成熟中枢神経系に確認された：上衣細胞（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ）（ヨハンソン（Ｃ．Ｂ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）他、Ｃｅｌｌ ９６巻、７０３ページ（１９９９））及び脳室下領域の星状膠細胞（ドウチ（Ｆ．Ｄｏｕｔｓｃｈ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻、５３４ページ（１９９９））。ただし、これら２種類の細胞型が独立的集団であるか、又はそれらが一つの系統関係を共有しているのかどうかはまだ明らかでない（モンマ他、同上；バレス（Ｂ．Ａ．Ｂａｒｒｅｓ）、Ｃｅｌｌ ９７巻、６６７ページ（１９９９））。これらの細胞はニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）と呼ばれるクローン細胞凝集体として培養できる（レイノルズ（Ｂ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５巻、１７０７ページ（１９９２））。
【０００５】
伝統的に、成人の組織における幹細胞の分化能は、それらから誘導された器官に存在する細胞系統に限られると考えられてきたが、若干の幹細胞はより広い分化領域を有するという証拠が若干ある。例えば放射線照射を受けた成熟マウスでは成熟前脳から分離した神経幹細胞は造血系を再生し、血球を産出することが最近証明された（ビョルンソン（Ｃ．Ｒ．Ｂｙｏｒｎｓｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻、５３４ページ（１９９９））。
【０００６】
マウス胚の神経管における、並びに髄芽腫細胞系からの、筋細胞の生成も報告された（タジュバクッシュ（Ｓ．Ｔａｊｂａｋｈｓｈ）他、Ｎｅｕｒｏｎ ３巻、８１３ページ（１９９４）；ヴァルツ（Ｎ．Ｌ．Ｖａｌｔｚ）他、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３巻、３６４ページ（１９９１））。その他に、他の幹細胞集団は、制限されずに、それらが存在する組織に特異的な細胞型を生成するという証拠も最近見いだされた。例えば、脳に移植した骨髄基質細胞は［神経膠］星状細胞を生成することができる（コペン（Ｇ．Ｃ．Ｋｏｐｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６巻、１０７１１（１９９９））。さらに、造血幹細胞は筋細胞を発生でき、筋−祖先細胞は血球を発生できる（グッソニ（Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉ）他、Ｎａｔｕｒｅ ４０１巻、３９０ページ（１９９９）；ジャクソン（Ｋ．Ａ．Ｊａｃｋｓｏｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６巻、１４４８２（１９９９））。
【０００７】
或る幹細胞から種々の細胞型を発生する能力は、種々の疾患及び損傷を治療するために移植する所望の細胞型を生成する手っ取り早い手段を提供しうるという点で、臨床的に非常に重要であるかも知れない。よって、細胞が広範囲の異なる系統に分化する能力を分析試験し又は評価できなければならない、特にその細胞が由来した組織とは別の系統に分化する能力を評価する必要がある。本発明はこの必要性に向けられたものである。
【０００８】
入手し得るデータの大部分は、神経系幹細胞から誘導される子孫が神経細胞の運命に限定されることを示唆している（マッケイ、同上；ヴァイス他、同上；モンマ他、同上；シアブジン他、同上；テンプル他、同上）。例えば、モリソン（Ｓ．Ｔ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）他、Ｃｅｌｌ ９６巻、７３７ページ（１９９９）；ホワイト（Ｐ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ）他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６巻、４３５１ページ（１９９９）は齧歯類神経堤細胞の系統的制限を報告した。
【０００９】
しかし、上に述べたような先行技術でこれまでに使用された分析試験法は細胞の完全発生能を試験するようには設計されていなかった。実際、先行技術のこのような分析試験法では、或る細胞の完全発生能を発現させることはできず、したがってそれを試験することはできないと我々は考える。特に、このような先行技術系の試験条件は、発生するかも知れない子孫細胞の範囲を制限するようなものであったと我々は考える。
【００１０】
このような問題に取り組むために、そして所与の細胞の発生能を完全に測定又は評価できるように、本発明によって新規の分析試験法が開発された。それは特に、所与の細胞の完全分化能を発現させ、試験することができるように設計されている。これは、この試験細胞を、完全な分化能に誘導し又はその分化能を発現若しくは明示し得る条件にさらすことによって実現される。
【００１１】
本発明の一観点において、本発明は標的細胞の分化能を測定する方法を提供し、前記方法は標的細胞を子宮外で（ｅｘ ｕｔｅｒｏ）初期胚環境にさらし、前記標的細胞の子孫を検出することを含んでなる。
【００１２】
より詳細に述べれば、本発明は標的の非ＥＳ細胞の分化能を測定する方法を提供し、前記方法は標的の非ＥＳ細胞を子宮外で、胚体又は原腸形成が完了していない胚若しくは胚培養物からなる初期胚環境に、前記標的の非ＥＳ細胞の未分化及び分化子孫を十分検出できるだけの時間、さらすことを含んでなる。
【００１３】
本発明の方法は、標的細胞の完全な又は広範囲の分化を検出することができるという利点を有する。
【００１４】
本明細書に使用する用語“測定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）”は標的細胞の分化能の分析試験又は評価の全ての方式を含む。
【００１５】
“分化能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）”は、ここでは、標的細胞の分化能、すなわち細胞が種々の細胞型に発達（又は分化）する能力（ポテンシャル）を含むと定義される。一つ以上の特定の細胞型に発達するこの能力（すなわち潜在能力）は、成長因子のようなシグナル分子又はその他の分子（より詳細は以下を参照）の存在によるのかも知れないし、又は実際、特定の細胞環境の存在によるのかもしれない。所与の標的細胞が発達してなる細胞型はそれ自体さらに分化することができるかも知れないし、又は“分化系”の終端となるかも知れない。つまり、上記分化能は、細胞が異なる細胞型（それはより組織化された、又は発達した細胞型、又は全く異なる細胞型）に変化（すなわち発生又は分化）する能力である発生能若しくは分化能又は細胞の適応性である。こうして本明細書に使用される用語“分化能”又は“分化”は、標的細胞が特殊化の程度を落とす（又は脱分化、又は未分化又は分化程度を低める）能力をも含む。その後このような細胞は元の標的細胞と同じか又は異なる細胞型のより特殊化した細胞に発達することができる。
【００１６】
細胞の“完全（ｆｕｌｌ）”分化能は、標的細胞の最も広い形で起こりうる分化の能力である。言い換えれば、それは細胞の完全な又は最大の発達レパートリー又は発達能力を示す。そのため本発明の分析試験法の一つの目的又は目標は、所与の標的細胞がもつ種々の可能性又は能力の全て、実質的に全て、ほとんど全て、又は関連する全て（その細胞が由来したものとは異なる型の細胞への分化能を含める）を試験することである。
【００１７】
このため、本発明は、一観点において、標的細胞の分化能を決定する方法を提供する。前記方法は標的細胞を子宮外で、上記標的細胞の可能な分化能を発現させ得る一種類以上又は多数のシグナルを提供する初期胚環境にさらし、前記標的細胞の子孫を検出することを含んでなる。理想的には前記方法は標的細胞の全ての可能な分化能を発現させることができる。
【００１８】
細胞の“広範囲の（ｂｒｏａｄ）”分化能とは、通常の自然の環境で細胞が発達していくはずの型とは異なる１種類以上の細胞型（例えば２種類以上）に上記細胞が分化する能力を含む。より詳細に言えば、細胞の広範囲の分化能とは、多数の（例えば１種類より多い）異なるシグナル環境にさらされたときのその細胞の分化能を含む。この分化には胚外組織及び胚組織（胚葉）両方への分化が含まれる。
【００１９】
本発明の分析試験法は、広範囲の、そして実際好適には全ての可能な系統（上記標的細胞が誘導され、又は由来するものとは異なる系統を含む）に分化するためのシグナルを与える環境を標的細胞に提供する。本発明の分析試験法の環境は、完全又は広範囲の分化能が発現するための適切かつ可能な条件を提供する。
【００２０】
“標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）”とは、対象となる細胞又は試験細胞のことである。それは、幹細胞、より拘束（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）の強い祖先細胞、胚性癌種細胞、トランスフォームド（形質転換）細胞又は細胞系、非トランスフォームド連続細胞系、又は実際、完全に分化した細胞等、いかなる細胞でもよい。幹細胞は多能性、複能性又は全能性の幹細胞でよく、その細胞が由来する、又はその細胞の起源である生物内で得ることができる子孫細胞の広範囲のレパートリーに分化することができる。或いは、上記細胞は、すでに特定の系統又は諸系統に拘束又は単分化されてはいるが、まだ１種類以上の細胞型にさらに分化することができる部分的に分化した祖先細胞でもよい。上記標的細胞は、完全に分化した、例えば特定の系統の“最終点”であると見なされる細胞でもよい。例えば、脳の上衣細胞はこれまで完全に分化したものと考えられてきた。しかし最近の研究から、実際は上衣細胞は成熟ＣＮＳの幹細胞であることが判明した。
【００２１】
標的細胞はその元の生物のいずれの発達段階からも誘導され、又は得られる。例えばそれは胎児、新生児、子供、青年又は成人でよい。それは細胞培養物又は細胞系のような人工的系から誘導することもできる。標的細胞は、天然のものでも、遺伝的改変等のような改変がなされたものでもよい。標的細胞は、選択した組織、体部分又は体液から得ることができる。例えば、標的細胞は、皮膚に由来するものでもよい。標的細胞はヒト又はヒト以外の所望の属若しくは種の動物の細胞でもよい（例えば哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、昆虫等、動物界のあらゆる種）。本発明の好ましい実施態様において、標的細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）ではない、すなわち非ＥＳ細胞である。その他の好ましい実施態様において、標的細胞は、生後若しくは誕生後の対象、子供、青年又は成人から誘導される幹細胞を含む。
【００２２】
標的細胞は一般的方法において、１個以上の分離細胞として得られる。それは新たに分離したものでも、増殖、培養又は継代培養等を行ったものでもよい。標的細胞は、組織又は液又は細胞懸濁液内に含まれて、又はこれらの部分として提供され、或いは所望の又は適切な媒質（ｍｅｄｉｕｍ）に含まれていてもよい。このため、標的細胞は当業者には公知の技術によって、所望の、又は好都合な方法で標的細胞集団として提供される。例えば標的細胞は最初の細胞単離体、最初の単離体の一次培養物、増幅培養物から、又はクローン培養物から誘導することができる。神経幹細胞は単離細胞又はニューロスフェアー（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）として提供される。
【００２３】
“子宮外（Ｅｘ ｕｔｅｒｏ）”は、この方法が子宮内の胚の着床（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）及び発生を含む段階を排除することを意味する。言い換えれば、本発明の分析試験法はどの段階でも、試験動物の子宮内で行われるいかなる段階も含まない。このため標的細胞は決して子宮内に挿入されず、特にこの分析試験系の初期胚環境は子宮内ではなく、又は子宮内には移されない。
【００２４】
本明細書において使用される用語“初期胚環境”とは、初期胚形成の条件を与える環境、又はそれに類似する環境と定義される。“初期胚形成”とは受精時点から胚が発生を開始し、原腸形成が完了するまでの期間と定義される。機能的に、この定義の重要性は、初期胚環境があるシグナル環境（又はむしろ、多数のシグナル環境）を提供することである。シグナル環境は、その環境にさらされた細胞の完全又は広範囲の分化能を発現させることができる。こうして初期胚形成の環境は生じうるシグナル環境の全域を提供するという利点を有しており、それは細胞分化に導く。この初期胚形成の段階において、標的細胞は広範囲の種々様々の潜在的分化指向シグナル、例えば誘導シグナルにさらされる。“誘導性シグナル”は、細胞又は細胞群に直接又は間接に作用して特殊の細胞系又は細胞型を形成するシグナル化プロセス又はシグナル化環境である。より詳細に述べれば、標的細胞は、その自然の状態では普通はさらされないような非常に多様なシグナル化環境にさらされる。シグナル化環境は初期胚形成環境において発現する分子シグナル（例えば成長因子等の分子）によって、及び／又は初期胚環境の細胞性環境、例えば存在する細胞類によって与えられる。
【００２５】
特に或るタイプのシグナル化は発生中に起こり、本発明によるシグナル化環境に寄与すると考えられる。例えば一つのシグナル化環境は２種類のタイプのシグナル又は運命制御信号を含むものでも良く、第一は外因性信号又はシグナル、第二は内因性信号又はシグナルである。
【００２６】
細胞が生まれ（又は細胞がその中に存在し）、そして細胞が徐々に分化する環境は、拡散性分子、細胞膜付着因子、及び細胞外基質結合シグナル分子を含む外因性信号（シグナル）を提供する。これらの外因性信号は徐々にシグナル導入カスケードを活性化し、受容細胞における差次的遺伝子発現を制御する。しかし外因性信号は必ずしもシグナル化のアクチベータ（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ではなく、いわゆる“形質転換シグナル”、すなわち一次アクチベータ・シグナル化分子のシグナルを抑制する分子を含む誘導性シグナルでもある。活性化シグナルと形質転換シグナルとの比率は或る種の細胞分化において重要であると考えられる。
【００２７】
分化が始まる前に、細胞自体が内因性信号（シグナル）を発現し、又はその前駆体から内因性信号を引き継ぐ。このような内因性信号には転写アクチベータ又はリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）がある。内因性信号は、異なる／特殊の環境にさらされると反応するように幹細胞（又は本発明による標的細胞）集団によって維持されることもあり得る。
【００２８】
細胞の運命は単一のイベントによって決定されるものではなく、異なる時に異なる信号によって決まる潜在的に独立的な複数のイベントからなる。本発明の分析試験系では、（理論によって束縛されるものではないが）標的細胞が初期胚環境から受けるシグナルは、これら細胞内の固有のシグナル化イベントを設定する誘導性外因性シグナル（信号）であると考えられる。これらシグナルによって細胞はそれらの正常の環境におけるよりもより広い分化能をあらわすことができる。
【００２９】
初期胚環境には、胚性幹細胞、特に多能性胚性幹細胞が存在し得る。
【００３０】
以下により詳細に述べるように、初期胚環境は胚によって、又は人工系、例えば胚培養物のようなインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系や胚様体の調製物等によって作ることができる。このような初期胚環境は胚性幹細胞によっても作ることが出来る。このため、インヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エックスヴィヴォ（ｅｘ ｖｉｖｏ）及びインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境が包含される。好ましくは初期胚環境は、胚様体、胚性幹細胞、又は原腸胚形成が完了していない胚若しくは胚培養物を含んでなる。好ましくは、標的細胞は前記初期胚環境に、前記標的細胞の未分化の子孫及び分化した子孫を検出できるほど十分な時間さらされる。
【００３１】
或る種、特に鳥類の初期発生又は胚形成においては、“原条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ）”が胚に形成される。“原結節（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｏｄｅ）”は原条の尾側端の小さい隆起である。原条及び原結節は細長いブラストフォア（ｂｌａｓｔｏｐｈｏｒｅ）であって、そこを通って中胚葉物質が内部に移動すると考えられる。その後、原結節は尾側に後退し、中胚葉からの脊索、体節及び側板の形成を誘発する。後退する原結節は原条物質からの胚の軸性器官への再組織化を誘発する。もしも上記原結節を胚盤の別の位置に移植するならば、脊索、神経管及び体節を含む第二の完全な体軸がこの部位に発生する。したがって上記原結節は体軸の形成体（ｏｒｇａｎｉｚｅｒ）としてのその機能において、両生類の胚における脊索−中胚葉複合体に相当する。このため原条は総体的誘導因子で、原結節は総体的形成体とみなされる。このような誘導因子及び形成体（他の種におけるそれらの発生的相対物を含む）は、本発明によるシグナル化環境に貢献するシグナル類を与え、又は生成することができる。こうして本発明の初期胚環境には誘導因子（例えば原条）及び形成体（例えば原結節）も存在し得る。
【００３２】
こうして本発明によると、初期胚環境はその性質上、分化のための多数のシグナルを提供する。言い換えれば、２種類以上のシグナル、又はシグナル化環境がもたらされる。
【００３３】
初期胚環境の性質は次のようなものである：胚の固有膜及び胚体外膜に貢献する、始原的（一次的）でもあり決定的（最終的）でもある全ての異なる胚葉（又は上皮的構造）、すなわち外胚葉、内胚葉及び中胚葉が発達しつつあり、又は発達する能力を有し、したがって上記環境は或る生物の細胞の全レパートリーを発達又は分化させる能力を有し、広範囲の系統（ｌｉｎｅａｇｅｓ）に分化するためのシグナルを多数（すなわち２種類以上）提供することができる。
【００３４】
上述のように、本発明によれば、初期胚環境は多数の異なる方法で提供され、上記方法は多数の異なる実施態様をとることが可能である。
【００３５】
本発明の一実施態様において、初期胚環境は胚様体によってもたらされることができる。胚性幹（ＥＳ）細胞は多能性であり、胚様体として培養される際には種々の異なる細胞型に分化するように誘導されることができる（ケラー（Ｇ．Ｍ．Ｋｅｌｌｅｒ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７巻、８６２ページ（１９９５））。この実施態様を支持する理論的解釈は、胚様体のこのような培養が種々様々の系統に分化するためのシグナルを与えるというものである。本発明の方法では、ＥＳ細胞のこのようなシグナルの、標的細胞の分化を導き、又は上記細胞の分化に影響を与え得る能力を評価する。この実施態様においては、標的細胞は胚様体と接触する。具体的には、標的細胞は胚様体とともに同時培養される。
【００３６】
つまり、この実施態様において、本発明は標的細胞の分化能を測定する方法を提供し、前記方法は前記標的細胞を胚様体と共に培養し、前記標的細胞の子孫を検出することを含んでなる。
【００３７】
胚様体の製法及び培養法は当業者には公知であり、各種文献に記載されている（例えば“細胞生物学、実験室ハンドブック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ）”、１巻、Ｊｕｌｉｏ Ｅ．Ｃｅｌｉｓ 編、１９９４；サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻（３３号）２２４１９−２２４２６ページ（１９９１）；メツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）他、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７６巻、７１０−７１９ページ、１９９５）。胚様体形成のためのＥＳ細胞又はその他の細胞は、所望の、又は好適なソースから得られる。例えばＥＳ又はその他の細胞種には、選択によって、あらゆる後生動物（例えば無脊椎動物：環形動物、節足動物、甲殼類、軟体動物、棘皮動物；脊椎動物：魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳動物；その他：刺胞動物；及び海綿動物）からの胚性幹細胞又は始原生殖細胞等がある。下記の実施例では、マウスＥ１４のＥＳ細胞を使用して胚様体を生成する。
【００３８】
上記胚様体は、評価対象の標的細胞と同じ種若しくは属から、又は異なる種若しくは属から誘導できる。
【００３９】
概して、胚性幹（ＥＳ）細胞（又は一般にいかなる種類の幹細胞若しくは始原生殖細胞でも、又はこれらから誘導されるいかなる細胞でも）を、それらが胚様体（ＥＢｓ）生成能力を維持できる培養条件下で増殖させる。このような条件は当業者には技術的にありふれたものである。ＥＢｓとして、細胞クラスターはさらに分化を開始し、その結果、原始外胚葉、内胚葉及び中胚葉を形成する。これらの異なる胚葉の存在により、上記ＥＢはこれら自体の細胞にも、それらと密に接触しているその他の細胞（本発明によると標的細胞）に対してもシグナルを発生することができる。
【００４０】
ＥＢｓの形成のための代表的方法を以下に述べる。しかし、そのような方法の変形が可能であることは当業者には理解できると思われる。この方法の基礎的段階は、適切な培養系において胚葉体を形成することである。その後、胚葉体を収集し、標的細胞、例えば標的細胞集団と接触させる。胚葉体が必要な初期胚環境を提供する能力を維持する限り、胚葉体の形成後いつでも上記標的細胞を上記胚葉体と接触させることができる。例えば上記標的細胞を、胚葉体の形成直後に上記胚葉体と接触させてもよいし、標的細胞をそれらと接触させる前に胚葉体をしばらく培養器に保存することもできる。
【００４１】
“標的細胞”対“胚葉体”の比率は厳密ではなく、使用する特定の胚葉体系及び特定の標的細胞に依存する。例えば、“胚葉体”対“標的細胞（又は標的細胞クラスター）”の比が１０：１ないし１：１の範囲、例えば６：１ないし２：１、例えば３：１が用いられる。しかし、もしも例えば標的細胞が、或る濃度で活性を誘発する胚葉体に対して抑制的であるシグナル化分子を分泌するような場合は、このような比を変える必要があり得る。より多くの胚葉体を加えることによって、このような効果を補償することができる。比率のこのような変更及び決定は熟練せる当業者には容易に実施できる。その後、標的細胞及び胚葉体の混合物は当業者に公知の標準的培養法によって培養される。適切な時間培養した後（例えば１分ないし１００時間、又は特に５ないし３６時間、例えば１０ないし２４時間、例えば１２時間、又は子孫細胞が発生し、それらが検出できるまでの十分な時間）、上記細胞培養物を検査し、標的細胞の子孫を検出する。ここでも培養時間は可変であり、は使用した特定の系及び／又は標的細胞によって決まる。検出段階は、以下に詳しく述べるように、標準的公知の方法によって行われる。検出段階を容易にするために、使用する培養条件によって、胚葉体及び標的細胞の培養物をプレート上で培養し、付着培養物として培養させる。検出段階では、検出段階の仕方によっては胚葉体は取り出しても取り出さなくともよい（詳細は以下を参照されたい）。
【００４２】
ＥＳ、幹細胞又は始原生殖細胞、すなわちＥＢｓを生成するために使用する細胞類（必要ならば、細胞の潜在能力を維持するための細胞の支持層と共に）をトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）し、新鮮な培養培地（それらの多能性を維持する）中ですすぎ、培養する。例えば支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）が付着するまで、組織培養用プラスチック上で培養する。未付着のＥＳ細胞（速やかに付着しない細胞）はその後取り除き、細菌プレート（細胞の付着を促進しない非組織培養用プラスチック）にクローン密度若しくはクラスター密度で移すか、又は１滴に約１０個の細胞を含む滴として細菌プレート上で培養する。これらの３条件の全ては、細胞がその子孫に付着し、かつ細胞同士が付着する（プラスチックには付着しない）という細胞クラスターの形成を可能にする。上記細胞を、上記と同じ培地中で上記の条件で１２時間培養する。その後、上記細胞を新鮮培地に移す。新鮮培地は、ＥＢｓへの分化を阻害する因子を含まない（普通は白血病阻止因子（ＬＩＦ）を除去することによる）ということを除けば上記の培地と同じである。上記細胞クラスターを再び細菌プレート上で培養し、分化促進培地中で非付着細胞クラスターとして維持する。培養培地は２４時間おきに代える。約８日後、ＥＳ細胞は、クラスターと、外面に原始内胚葉が現れていることから大雑把にＥＢｓと名付けられた細胞の嚢状シリンダー（これは原始内胚葉を認識する抗体で可視化することができる）とを形成した。その後これらの細胞を集め、試験すべき標的細胞集団と均質に混合し（約“３ ＥＢ”：“１  標的細胞（又は標的細胞群）”）、試験すべき標的細胞群に特異的な培地（好ましくはＥＢｓを最低１２時間生存させる培地）中で、重力によって円錐形１．５ｍｌ管の底部にランダムに、だが濃密に沈降させた。これらの濃密に詰まった細胞クラスターを円錐管に入れたまま通常の加湿組織培養インキュベーター中に直立に置き、３７℃／５％ＣＯ２で１２時間静置した。１２時間後、細胞を組織培養用プラスチック上で、又は特異的分化を促進する適切な基質又は付着基質上で培養した。これには例えばポリ−オルニチン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、又は基質の組み合わせを含むことができる。検出のためには、そしてもしもＥＢ細胞を除去したければ、培養後１２時間に、適切な抗生物質、又は培養物からＥＢｓのみを排除できる選択因子で、ＥＢ細胞に対する選択を始める。しかし、ＥＢｓの除去は、評価すべき標的細胞集団を最終的に確認できる限り、絶対に必要というわけではない（例えばヒト　対　マウス細胞）。この時、特異的分化因子類を標的細胞培地に加えて標的細胞及び／又はそれらの子孫を生存させ、及び分化させてもよい。培養物をその後上記因子類を含む標的細胞培地中で維持し、その培地は４８時間ごとに５０％新鮮培地：５０％調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）に代えることができる。上記培養物がインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で維持できる限り、上記培養物を調べて標的細胞の子孫を検出又は検査することができる（例えば特異的分化マーカーを調べる。詳しくは以下に述べる）。
【００４３】
以下の実施例１は本発明の方法の“胚葉体”の実施態様の代表的例を含む。以下により詳しく述べるように、この分析試験系を用いて得られた結果は、成熟神経幹細胞由来細胞がインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において筋肉の運命を選択することができることを示す。
【００４４】
本発明の分析試験法の別の実施態様において、初期胚環境は鳥類又は両生類の胚によってもたらされる。鳥類又は両生類の種のいずれも使用できるが、にわとりは好適なソースであり、ひなどり胚は入手が容易であるため、好適に用いられる。
【００４５】
鳥類又は両生類の使用が利点を有するのは、卵を好適に使用して、胚が母親の外で発生する状態にすることができ、その状態で胚は容易に、好適に、そして速やかにインヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）様状態で成長することができ、胚に容易に簡単にアクセスすることができ、それによって胚の操作が容易になるからである。
【００４６】
こうして本発明の方法のもう一つの実施態様は標的細胞の分化能の測定法を提供する。前記方法は前記標的細胞を、鳥類又は両生類の胚の原腸形成の完了までに前記胚に導入し、前記胚を発生させ、前記標的細胞の子孫を検出することを含む。
【００４７】
上記のように、鳥類又は両生類の胚は、産み落とされ、したがって母体の外にある卵に含まれているので都合がよい。そして胚は、単に卵をインキュベートするだけで都合よく発生し始める。
【００４８】
標的細胞を原腸形成の完了前に又は完了までに、例えば原腸形成中の何れかの時期に導入することは本発明の重要な特徴である。これが重要なのは、この時期に加えられる標的細胞は原腸形成過程に参加することができ、それによって胚の種々の胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）において種々のシグナル化環境にさらされるからである。
【００４９】
標的細胞を胚の羊膜腔に挿入するのが好都合である。このやり方で標的細胞を、羊膜腔に面している原始外胚葉に合体させ、原腸形成中に完全に発達した外胚葉、内胚葉及び中胚葉に分布させることができる。こうして上記標的細胞は種々の胚葉の種々のシグナル化環境にさらされる。
【００５０】
卵が生まれたとき、胚盤は約６０，０００個の細胞を含んで形成されている。これらの細胞は、卵がインキュベーション温度に置かれると直ぐに原腸形成を開始する準備として組織化し始める。インキュベーション温度は理想的には３９．５℃であるが、他の温度、例えば１１℃ないし４３℃の範囲も使用できる。例えば約３７℃の温度が使用できる。発生速度等を遅くすることによって誘導シグナルに、より長くさらすことを望む場合には、より低い温度（例えば３９．５℃未満）を使用できる。
【００５１】
本発明の方法において卵はインキュベーション前から原腸形成の完了時まで利用することができる。例えば、標的細胞を胚にいつでも、すなわち上記細胞を卵が生まれた時に存在するインキュベートしていない胚盤に導入することから始まり、原腸形成が完了するまでの原腸形成過程中の原腸形成胚（原外胚葉）のいかなる時期にも導入できる。例えば鳥類の胚において、標的細胞は退縮中の原条に導入されるか、又は胚盤（原外胚葉）上の、原腸形成が始まる時に原条が形成される部位に導入される。
【００５２】
こうして標的細胞を原腸形成の前又は最中、又は原腸形成の後期に、鳥類又は両生類の胚に導入する。
【００５３】
標的細胞の導入は当業者に公知の方法によって便利なやり方で行われる。例えば、標的細胞を胚上に置くというやり方で標的細胞を胚に加える。標的細胞は原条の上若しくは中に、又は原腸形成中の原外胚葉の上若しくは中に、又は形成中の中胚葉若しくは内胚葉層の中若しくは上に導入される。標的細胞は注射によって、例えばミクロピペット（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ）、又は胚の上記領域に細胞を配置するために使用できるあらゆるデリバリーシステム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて導入される。
【００５４】
標的細胞の導入は生まれたばかりの卵（インキュベーション前）又は胚のステージ１から、ステージ１２までのあらゆる時点、特にステージ６まで、例えばステージ４までの時点に行われる。ひなどり胚のステージの説明は、ハンバーガー（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ）及びハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）の“ひなどり胚の発生における正常なステージシリーズ”４９−９２ページ、を参照されたい。
【００５５】
標的細胞の導入に続き、上記胚を発生させる。上記のように、これは卵をインキュベート（保温）することによって好都合に実現する。上記胚は孵化前若しくは孵化後の時点まで、又はオタマジャクシのような変態期に、又は完全に分化した成虫にまでも発達させることができる。上記卵はインキュベーション温度で（例えば上記のように１１℃ないし４３℃で）インキュベートできる。
【００５６】
下記の実施例１は、ひなどり胚を利用する本発明の実施態様の分析試験を説明する。結果は、成熟神経上皮細胞の単一細胞培養物から誘導されるニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）は種々の系統の子孫を生成する広い潜在能力を有することを示す。
【００５７】
本発明の別の実施態様において、初期胚環境は胚の培養によってもたらされる。この実施態様において胚は当業者に公知の方法によってインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養される（例として、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙの Ｈｓｕ、７６巻、４６５−４７４ページ、１９８０；ワッサマン（Ｗａｓｓｕｒｍａｎ）及びデパンフィリス（ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ）編の“マウスの発生における技術ガイド”、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３２５巻、１９９３；及びホーガン（Ｈｏｇａｎ）等編集の“マウス胚の操作、実験室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｔｈ Ｅｍｂｒｙｏ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）”第２版、１９９４、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、を参照されたい）。
【００５８】
よって、本発明のこの観点は、標的細胞の発生能の測定法を提供するものであり、前記方法は前記標的細胞を培養胚に導入し、前記標的細胞の子孫を検出することを含む。
【００５９】
培養胚は受精後から子宮内の１１ｄｐｃ（ｄｐｃは受胎後の日数の略）に相当する時期までインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養される。この時期は胚盤胞形成前から初期器官形成までを含む。例えば培養は子宮内の４、５、６、７、８、９又は１０ｄｐｃに相当するまで行うことがでできる。
【００６０】
好適な実施の態様において、標的細胞は胚の原腸形成の完了までのいかなる時期にも導入できる。
【００６１】
本発明の分析試験のこの実施態様において、胚はドナー動物（例えばマウス）の子宮から分離される。上記胚は脱落膜、胚体外膜及びレイチェルト膜から切り離される。上記胚をその後その胚の性質に応じて適した条件下で適切な培地、例えば３７℃の化学的に定義された培地に置き、異なる齢の胚の代謝的要求によって変わる酸素レベルで培養する。原腸形成の原条ステージを超える発生には、ローラー及び回転ドラム方法の組み合わせの使用と、新たに調製したヒト臍帯血清を含む新鮮培地を毎日交換することが必要である。
【００６２】
哺乳動物（例えばマウス）の胚培養系において、標的細胞は胚の適切な部分又は表面の上に又は中に導入される。より詳細に述べれば標的細胞は、原腸形成の終わるまでに、胚盤胞の胚結節の上若しくは中に、移植胚の二層性（ｂｉｌａｍｉｎａｒ）胚盤の上若しくは中に、羊膜腔中に、又は原条上に導入される。
【００６３】
標的細胞は、上述の鳥類／両生類分析試験系のような便利なやり方で、例えばミクロピペット等を使う注射によって導入される。
【００６４】
標的細胞の導入後、胚培養物を１１ｄｐｃに相当（初期器官形成又は“後肢芽（ｈｉｎｄ ｌｉｍｂ ｂｕｄ）”ステージであり、２９−３１原節ステージとも呼ばれる）するまで、又は上記のｄｐｃステージのいずれかまで続ける。
【００６５】
その他の実施態様では、その後、標的細胞の子孫を培養胚中で検出する。（詳細は以下を参照）。
【００６６】
培養する胚は所望の又は都合の良い属又は種の胚でよい。例えば囓歯動物（マウス又はラット）等の哺乳動物の胚を後生動物種から得た胚と同様に使用することができる。胚は標的細胞と同じか、又は異なる種又は属のものでよい。
【００６７】
標的細胞の分化能を測定するために、標的細胞の子孫を検出する。
【００６８】
胚又は胚培養物を使って初期胚環境を生成する本発明の実施態様において、上記胚又は胚培養物中の子孫細胞の局在性又は位置も確認できる。
【００６９】
本明細書において使用する用語“子孫”は、標的細胞から誘導、分化又は発生する細胞を言う。前記子孫細胞は標的細胞から、上記標的細胞が受ける第一又はその後の細胞分割の結果として誘導されたものでもよく、実際、分化した、又は細胞分割しない発達を受けた標的細胞そのものも含むことができる。上に述べたように、上記標的細胞は本明細書に記載の本発明の方法において初期胚環境にさらされた際、多かれ少なかれ特殊化される。このため、上記標的細胞の子孫は、未分化し、又は脱分化し、或いは標的細胞に比べて分化し、言い換えれば、多かれ少なかれ標的細胞よりも分化している。子孫細胞はそれだけでさらに分化することができ、又は分化系統の終端と成り得る。子孫細胞は標的細胞と同じ型の、多かれ少なかれ組織化された細胞型である細胞を含むかも知れないし、又は標的細胞とは全く異なる細胞型を含むかも知れない。例えば標的細胞型は成熟神経系から誘導され、例えば成熟神経幹細胞かも知れないし、子孫細胞は例えば筋細胞、腎細胞、心臓細胞、神経系の種々の細胞型及び／又は種々の型の上皮細胞の一つ以上の特徴をもった一つ又は複数の細胞型を含むかも知れない。
【００７０】
用語“検出される”は、本明細書では、標的細胞の子孫の存在を検出し、又は標的細胞の子孫を分析し、若しくは特定するあらゆる方法を含めて用いられる。
【００７１】
分化能は多くの異なる方法で評価され、又は測定される。例えば、標的細胞の、種々の組織の形成に貢献する能力は子孫細胞の運命を辿ることによって見いだすことができる。言い換えれば、胚を使う分析試験の範囲では、上記子孫は上記胚の種々の組織を検査して、どの組織に上記標的細胞の子孫が存在するかを調べることによって見いだされる。例えば或る実施態様では、標的細胞の子孫の検出は標的細胞の特徴を見いだすことによって行われる。例えば、上記標的細胞が特定の種（例えばヒト又はマウス）のものであるか、又は胚のホスト環境とは異なる種（例えば近交系マウスの系統）内の異なるアロタイプである場合、それは特殊の種−又はアロタイプ−特異的マーカー、例えばネズミ又はヒトマーカー（例えばマウス特異的エピトープＨ−２ Ｋｂ）によって検出される。或いは、上記標的細胞は人工的マーカー系でもよい、例えば上記標的細胞は検出可能の生成物、又はシグナルを与える生成物をコードするマーカー又はリポーター遺伝子（すなわち遺伝マーカー）を組み込んだトランスジェニック動物から得られるものでもよい。例えば、下記の実施例には、ＲＯＳＡ２６マウスが使用される（フリードリッヒ（Ｇ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５巻、１５１３ページ（１９９１））。その標的細胞はβ−ガラクトシダーゼを発現し、それはＸ−ｇａｌ組織化学によって、又は抗体で、それらの子孫を確認することができる。或いは上記標的細胞（したがってそれから誘導される全ての子孫）は、その後の研究のためにそれらを同時培養物又は胚から選択的に分離できる遺伝子を発現する。このような遺伝子には例えば抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子がある。この遺伝子はそのようなマーカーを発現しない細胞を選択的に排除し、標的細胞の子孫を生育可能に残すことができる。例えばＲＯＳＡ２６細胞もネオマイシン耐性遺伝子を発現する。
【００７２】
こうして、標的細胞の子孫を見いだす一つの方法は、上記標的細胞のマーカーを見つけることである。これは胚の種々の組織内（インヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又は胚培養物内）で検出され、それによって標的細胞の子孫がどの組織に貢献したかについての情報を与える。或いは、ひとたび標的細胞の子孫が見つかると、さらにそれらの分化マーカーが検査される。このため特定の型の細胞、特に組織が、その細胞型又は組織に特異的なマーカーを担持することが多い（例えば、細胞表面又は細胞内タンパク質、又は炭水化物構造等の分子を発現する）。例えば、筋細胞はデスミン（ｄｅｓｍｉｎ）を発現し、中腎管細胞はＰａｘ２を発現し、内胚葉細胞は内胚葉特異的エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）、ＴＲＯＭＡ−１、を発現し、サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）２０は腸上皮組織に発現し、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）は肝臓に発現する。分化マーカーのその他の例としては、星状膠細胞のグリア細胞繊維性タンパク質（ＧＦＡＰ）、神経繊維のベータＩＩＩチュブリン、上皮細胞のケラチン、肝臓のアルファ・フェト・タンパク質、そして心臓及び骨格筋のミオシン重鎖がある。このようなマーカー類は形態学的でもある（例えば筋細胞には線条がある）。こうしてこの方法で標的細胞の子孫を検査又は分析して、それらがどの組織又はどの細胞型に分化したのかが測定され、又はそれらが特定の細胞又は組織型に分化したのか、しなかったのかが測定される。
【００７３】
このような分子マーカー又は形態学的マーカーは当業者には公知であり、文献に広く記載されており、新しいマーカー類が継続的に文献にあらわれている。このようなマーカーを検出及び確認する方法もよく知られ、広く使用されており、例えば免疫組織化学等の組織化学又はその他の免疫学的系、及びハイブリッド形成法又はＲＴ−ＰＣＲ等の分子生物学的方法に基づいている。
【００７４】
こうして、標的細胞の子孫の検出において、上記標的細胞が特定の細胞又は組織型に分化しているかどうか、そしてそれがそれ自体とは異なる細胞型に分化しているかどうかを見いだすことができる。好都合なことに、上記標的細胞が２種類以上、又は３種類以上の細胞型に分化しているかどうかを試験又は検出することができる。上記標的細胞がそれ自体とは異なる胚葉起源の細胞に分化しているかどうかを見いだすことができ、さらに、３種類全ての胚葉又は上皮的構造（内胚葉、中胚葉、外胚葉）の子孫細胞が発生したかどうかを確認できる。
【００７５】
標的細胞が上記標的細胞の元の起源の細胞型（例えば脳幹細胞の場合）にも分化できるかどうか、それらが、新しい、正常に発達した場合とは異なる種類の神経細胞になるか、又はそれに貢献するか、も確認できる。神経幹細胞が神経系の異なる種類に発達又は分化することもあり得る（例えばＣＮＳからＰＮＳ及び／又はＡＮＳに）。
【００７６】
本明細書に記載した発明は標的細胞及び／又は上記標的細胞の子孫細胞を分離する方法にも向けられている。さらに、本明細書に記載される発明の方法によって得ることのできる、より好ましくは得られた子孫細胞が本発明のもう一つの観点を形成する。
【００７７】
標的細胞及び／又は子孫細胞の単離に関連して本明細書に使用する用語“分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）”は、前記細胞を同時培養物又は胚に存在するその他の細胞から分離、又は取り出し、又は単離することを言う。所望の標的細胞及び／又は子孫細胞の全て又は実質的全てが、対象外のその他の細胞から分離されるのが好ましい。しかし、生物学的系はそれらの性質によって様々であり、１００％の分離／単離は必ずしも実現せず、実際、必ずしも必要でない。しかし、前記標的細胞及び／又は子孫細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％が分離されるのが好ましい。
【００７８】
上記分離はいかなる適切な方法によっても行うことができる。上記分離は例えば物理的手段によって行われる。この際には例えば親和性分離法（例えば磁気ビーズ分類）を利用し、標的細胞及び／又は子孫細胞には発現されるが所望でない細胞には発現されない細胞表面マーカーに基づいて、標的細胞及び／又は子孫細胞を残りの細胞から分離する。或いは、分離すべき上記細胞類を、直接又は間接的に検出できる蛍光マーカー等の可視マーカーで標識化し、これらマーカーにより、ＦＡＣＳ分析等を使用して分離を行う。細胞を蛍光標識する好適な方法は、その細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を発現するように操作することである。実際、細胞分離において、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）や磁気ビーズ分類等を利用して細胞を分類するために利用できるタンパク質をコードする遺伝子を発現するような細胞操作が行われている。
【００７９】
適切な分離法は、上記標的細胞及び／又は子孫細胞上のマーカーの使用に限られるものでなく、除去が望まれる細胞、すなわち初期胚環境を作り上げる細胞類、例えば胚葉体、胚又は胚培養物を構成する非標的誘導性細胞等に発現する天然マーカー又は誘導性マーカーを利用して同様に行うこともできる。このような細胞類はインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で発現するようにトランスフェクトされ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、或いは、これら細胞類を遺伝子操作して、分類後に“陰性”細胞（この場合は所望標的及び標的誘導細胞）が維持され、その後増殖できるように、適切なマーカーを発現する導入遺伝子を含むようにする。さらに、初期胚環境を与える細胞類はインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でトランスフェクトされ、発現し、さもなければ、適切な作用物質（ＴＫ遺伝子の場合はガングシクロヴィル（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ））で処理した後に所望でない細胞類が死滅し、標的細胞集団に由来する細胞のみが残るように、自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子）を発現する導入遺伝子を含むように操作され、或いはトランスジェニック動物から誘導される。また、上記標的細胞（及びそれらの子孫）は非所望の細胞の死を誘導することによって選択できる。これは、標的細胞及びそれらの子孫が耐性遺伝子、例えば上記のように抗生物質耐性遺伝子を含む場合には、容易に行うことができる。
【００８０】
ひとたび必要な標的細胞及び／又は子孫細胞の集団を分離すると、これらをその後、例えば治療又はその他のインヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又はインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）法に直接使用することができる。或いは、これらの細胞を所望の用途に使う前にさらに処理又は操作することができる。その後の処理の例としては、さらに培養する、さらに分化させる、又は、例えばそれら細胞をより効果的にするとか、所望用途、例えば所望治療等に特に適するようにするための遺伝子操作又は遺伝子変更等がある。特に、上記治療が対象への細胞類の移植に関係する際には、その細胞が拒絶反応を受けにくくするために遺伝子変更を行うことができる。
【００８１】
上記のように、本発明の方法は、治療のための細胞を作るという臨床的有用性を有する。このような方法を用いて、種々の疾患又は損傷の治療等のための種々の有用な細胞型を生成できる。特にこのような方法を用いて種々の疾患及び損傷を治療するための移植用として１種類以上の所望細胞型を生成することができる。
【００８２】
さらに、本発明の方法は、例えば或る標的細胞が或る治療のために、又は或る治療のための細胞を作り、若しくは生成するために有効かどうかを診断する診断目的のために利用することができる。例えば、或る患者又は対象は、或る治療に使用するには適さないような、又は或る治療に使用する潜在的能力若しくは使用するための細胞を作り若しくは生成する潜在的能力をもたないような幹細胞（又はその他の標的細胞）を有するかも知れない。例えば、或る患者は治療のための必要な細胞型に発達することができない幹細胞を有するかも知れない。このような場合、対象の幹細胞（又はその他の標的細胞）を本発明の方法を使って試験し（すなわち本発明の方法における標的細胞として使用する）、これらの細胞が特定の治療（例えば自家移植）に使用できる潜在的能力を有するかどうかを“診断”することができる。このような“診断”は一般に、子孫細胞の位置及び／又は細胞型を検出し、適切な型の子孫細胞が作り出されたかどうかを測定することにより行われる。
【００８３】
こうして、本発明のもう一つの観点は、本明細書で規定する標的細胞の分化能を測定する方法を提供することである。前記方法は診断的目的に利用され、又は上記標的細胞が本明細書に述べる治療又は予防法に使用できる潜在能力（ポテンシャル）を有するかどうかを“診断”するために利用される。
【００８４】
こうして、本発明のさらにもう一つの観点は、治療又は予防のための細胞を特定、提供若しくは診断する本発明の方法の使用を提供し、又は治療的又は予防的に有用な細胞を生成するための細胞を特定、提供若しくは診断するための本発明の方法の使用を提供することである。前記治療又は予防が、特定され、提供され、又は生成された細胞類の移植を含むのが好ましい。より詳細に述べれば、本発明の方法を使用して、治療的又は予防的に有用な細胞類を生成するために用いる適切な細胞型を特定し、決定することができる。ひとたび生成したこのような細胞類、例えば適切な幹細胞は、直接患者に投与し、インヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で分化させることができ、又は例えば本発明の方法を使用してインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で分化させ、その後投与することができる。
【００８５】
こうして、本発明のさらにまた別の観点では、本明細書に記載の方法によって特定、診断、提供又は生成された細胞を治療また予防に使用するために提供することができる。治療又は予防に使用する薬剤の製造におけるこのような細胞の使用も含まれる。
【００８６】
別の見地からすると、本発明は対象の疾患の治療又は予防する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の方法によって特定、診断、提供又は生成された細胞の適切な量を前記対象に投与することを含んでなる。
【００８７】
本発明によって治療又は予防される疾患の例には、細胞治療による治療を受け得る疾患、例えば臓器又は組織移植によって治療できる疾患等がある。このような治療は、治療と関連して従来の臓器又は組織移植の諸問題をかかえるのが普通である。このような疾患の特殊な例には、心臓病（例えば虚血性病変又はその他の萎縮）、骨格筋萎縮（例えばドュシェンニュ型筋ジストロフィー）、肝臓病（例えば肝炎、癌による切除後の組織修復）、糖尿病（好ましくはＩ型糖尿病）等がある。本発明の方法は、パーキンソン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患の治療にも有用である。
【００８８】
治療又は予防に使用する際、これらの細胞は１種類以上の生理的に容認される担体又は賦形薬との組成物として投与することができる。概してこのような細胞は、生理的に容認される緩衝液又はその他の液を含む懸濁剤として投与される。上記細胞組成物は、対象に適切に投与できるように概ね無菌であり、混入物を可能な限り含まない。それらは適切な体部に注射によって投与するのが普通である。投与するための細胞を組成物にする方法及びこれらの組成物の適した成分類は、熟練せる当業者には公知であり、いかなる適した方法又は成分も使用できる。組成物中の必要な細胞の濃度／用量は目的とする治療又は予防的用途及びその他の、患者の体重や投与法等の要因に依存する。適切な用量は熟練せる当業者によって容易に決定される。上記細胞は、対象となる特定疾患の治療又は予防に有効なその他の治療薬と共に処方及び／又は投与される。このような薬剤は例えば上記細胞が投与された後にこれらの性能に影響を与えるような作用物質でよい。例えば、細胞生存率を高め、免疫系によるこれら細胞の拒絶反応を減らし、又はその場における細胞の移動、分化又は増殖を誘発するような作用物質が使用できる。特殊な例には、抗アポプトーシス剤、細胞特異的増殖因子、遊離ラジカル掃去剤及び免疫抑制剤がある。上記細胞はこれらのその他治療薬と同時に投与してもよいし、逐次、又は別々に適切に投与してもよい。
【００８９】
本発明は、発生及び分化過程の調査及び研究にも有用である。例えば、遺伝子及び薬剤等の分子物質の発生及び分化に与える影響を研究できる。
【００９０】
これに関連して、本発明の方法を使用して、医薬品開発の候補となりうる種々の化合物又は組成物の細胞に与える影響又は副作用を試験するための分析試験法（アッセイ）を開発できる。このような実施態様において、特定の、又は選択された標的細胞を本発明の方法によって取得し、その後その子孫細胞を任意に分離し、上記子孫細胞に与える１種類以上の化合物の影響を、その細胞を上記化合物にさらすことによって測定する。このような方法を使って、例えば候補の薬剤が特定の子孫細胞型に不都合な副作用をあらわすかどうか、例えば上記細胞型に対して毒性をもつかどうか、又は候補の薬剤が上記細胞型に所望の好都合の効果をあらわすかどうかを試験することができることになる。
【００９１】
このような方法は、本明細書に記載される例えば胚葉体、胚又は胚培養系から適切な実験系を選択することによって、実施が容易で、インヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、インヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又はエックスヴィヴォ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で実行できる化合物類の適切なスクリーニング試験法を提供する。このような方法は候補の薬剤の有用、適切、かつ速やかで費用効果的な臨床前のスクリーニングを提供することができる。
【００９２】
このような方法のより特殊の実施例において、成人又は成熟マウスの幹細胞、例えば神経幹細胞、を標的細胞として使用し、例えば本明細書に記載されるひなどり胚系を用いて種々の子孫細胞型、例えば心臓、腎及び筋子孫細胞等に分化するように誘導することができる。ひなどりから誘導される細胞は、その後例えば本明細書に記載される分離法を用いて除去し、１種類以上の子孫細胞型を使用して試験化合物又は薬剤を分析試験することができる。この方法で、例えば心臓細胞（又はその他の子孫細胞型）に特に好都合な影響又は不都合な影響を有する薬剤をスクリーニングすることができることになる。
【００９３】
こうして本発明のもう一つの観点は、化合物類又は組成物類の細胞に対する影響を分析試験する方法を提供し、前記方法は標的細胞の分化能を測定する方法又は本明細書に記載されるように標的細胞の分化を誘発する方法のいずれかを含み、さらに、標的細胞及び／又は子孫細胞を前記化合物又は組成物にさらし、前記細胞に対するそれらの効果を分析試験する段階を含んでなる。
【００９４】
上記の記述及び説明から、本明細書に記載される本発明の方法を使用して標的細胞を異なる細胞型に分化させ得ることが判明する。この分化を誘発する好ましい方法及び条件は上述したとおりである。こうして本発明のその他の観点は、標的細胞を異なる細胞型に分化させる方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらすことを含んでなる方法を提供する。
【００９５】
このような分化した細胞を、本明細書に記載した治療及び予防のための使用等、あらゆる用途に使用できる。分化した細胞を残りの及び／又は不要な細胞から分離することが好ましく、都合がよい。このような細胞分離を行う方法も上述したとおりである。さらに、標的細胞をこのように分化誘導する方法により得ることのできる、又は得られた分化した細胞も、本発明の範囲に含まれる。
【００９６】
（発明の実施の形態）
本発明を以下の実施例において図面を参照してより詳細に説明する。
【００９７】
（実施例１）
この実施例において、成熟マウス脳からの神経幹細胞の分化能を２種類の検査法、すなわち第一は胚葉体と共に培養することに基づく検査法、第二はひなどり胚を使用する検査法を用いて研究する。
【００９８】
（方法）
成熟マウス脳の側脳室の側壁の前方部分を切り取り、０．７ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸、０．２ｍｇ／ｍｌキヌレン酸及び１．３３ｍｇ／ｍｌトリプシンを加えた２ｍＭグルコース含有ＨＢＳＳ中で３７℃で３０分間、酵素的に解離させ、その後、７０μｍナイロンメッシュ（ファルコン社製）を通過させた。細胞を２００Ｇで５分間遠心分離し、０．５Ｘ ＨＢＳＳ中０．９Ｍスクロース中に再懸濁し、７５０Ｇで１０分間遠心分離してミエリン断片を除去した。細胞ペレットを培養培地２ｍｌに再懸濁し、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＥＢＳＳ溶液１０ｍｌの最上部に置き、２００Ｇで７分間遠心分離した。培養培地は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ライフ・テクノロジーズ社製）中、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社製）、Ｂ２７サプリメント（ライフ・テクノロジーズ社製）、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなるものとした。ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を最初の細胞の植付け後４８時間おきに培地に加えた。最初のニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を経て、第二次のニューロスフェアを生成し、それを、別途述べる場合を除いて、全ての実験に用いた。
【００９９】
クローン実験では、単細胞をミクロピペットで９６ウェルのプレートのミクロウェルに移し、小ニューロスフェアを形成させた。各ニューロスフェアを単細胞に分離し、再びそれぞれをプレートに移し、小ニューロスフェアを形成させた。各ニューロスフェアはその後、皿の中に別々に分離されて、再び小ニューロフェアを形成させた。このようなニューロスフェア２つをステージ４のヒナドリ胚の羊膜腔に注入した。細胞の各移動後に上記ウェルを検査し、場合によっては、１個より多い細胞を含むウェルは分析から省いた。上記単細胞を、５０％が新鮮培養培地及び５０％が０．２μｍフィルターで濾過したニューロスフェア調整培地からなる培地の中で培養した。
【０１００】
上衣由来ニューロスフェアを選択するために、マウスを抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、０．２％ｗ／ｖ ＤｉＩ（１、１’−ジオクタデシル−６、６’−ジ（４−スルホフェニル）−３、３、３’−テトラメチルインドカルボシアニン、分子プローブ）３μｌを含むＤＭＳＯを右側脳室に定位に注入した。注入の座標位置は、ブレグマの後方０．５ｍｍ、側方０．３ｍｍで、硬膜の下２．２ｍｍであった。注入の３時間後に上記のように対側の脳室から培養物を作製した。ＥＳ細胞（Ｅ１４クローン）を標準条件下で培養し（ジョイナー（Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ）編、遺伝子ターゲティング。実際的アプローチ、オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３）、上記培地を２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに変えることによって胚葉体形成を誘発した。小さい第二次のニューロスフェアを単純胚葉体と一緒にエッペンドルフ管中のニューロスフェア培地中で１２時間培養し、ＥＳ細胞と密に接触させた。それら細胞をその後ゼラチン又はフィブロネクチン・コーテド・組織培養プレート上に培養し、１２時間後、３００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の添加によって、ＥＳ細胞由来細胞を培養器から除去した。この結果、８日以内にＥＳ細胞は完全に除去された。非神経細胞型の生成は、幹細胞を小ニューロスフェアとしてＥＳ細胞に添加した場合には起きるが、上記スフェアが解離している場合には起きないことが観察された。したがって全ての実験に第二次のニューロスフェアを使用した。
【０１０１】
免疫組織化学のために、培養細胞又はクリオスタット切片（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を一次抗体と共に３７℃で１時間、又は４℃で一晩、インキュベートし、ＰＢＳで洗い、二次的抗血清で室温で４５分間インキュベートした。下記の一次抗体を使用した：マウスモノクローナル抗筋ミオシン重鎖（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、ベイダー（Ｄ．Ｂａｄｅｒ）、マサキ（Ｔ．Ｍａｓａｋｉ）、フィッシュマン（Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｍａｎ）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９５巻、７６３ページ（１９８２））、ビオチンに結合したマウスモノクローナル抗−Ｈ−２Ｋｂ（クローンＡＦ６−８８．５、ファーミンゲン社製）、マウスモノクローナル抗デスミン（ダコ社製）、ウサギ抗−Ｐａｘ２（バークレー・アンティボディー・カンパニー社製）及びヤギ抗−β−ガラクトシダーゼ（バイオゲネシス社製）。
【０１０２】
白色レグホン種（にわとり）の卵をステージ４までインキュベートし、１０％墨汁を胚盤葉に注入して、胚を可視化した。ニューロスフェア（４−５）を、抜き身のガラス毛細管を通して羊膜腔に注入した。操作した卵を分析前にさらに１〜９日間インキュベートした。Ｘ−ｇａｌ組織化学を“ジョイナー編、遺伝子ターゲティング。実際的アプローチ、オックスフォード大学出版、オックスフォード、１９９３）”に記載のように行った。
【０１０３】
（結果及び検討）
ＥＳ細胞からのシグナルが神経幹細胞の分化を導く能力を評価するために、成熟神経幹細胞を胚葉体と一緒に培養した。ＲＯＳＡ２６マウスから誘導された上記神経幹細胞（フリードリッヒ（Ｇ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５巻、１５１３ページ（１９９１））は、Ｘ−ｇａｌ組織化学によって、又は抗β−ガラクトシダーゼ−抗体でそれらの子孫を確認できるβ−ガラクトシダーゼを発現する（ヨハンソン（Ｃ．Ｂ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）他、Ｃｅｌｌ ９６巻、２５−３４ページ（１９９９）、上記の“方法”及び図３も参照されたい）。さらにＲＯＳＡ２６細胞はネオマイシン耐性遺伝子を発現する。それを利用してその後、同時培養物からＧ４１８感受性ＥＳ細胞を排除することができ、残りの耐性神経幹細胞由来細胞を特異的に研究することができた。胚葉体と共に培養した際、神経幹細胞の子孫は、筋細胞によって発現する中間径細糸タンパク質であるデスミン（図１Ａ、１Ｂ）に対して免疫反応性をあらわすことがしばしば見いだされた（ラザリデス（Ｅ．Ｌａｚａｒｉｄｅｓ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３巻、４３４４ページ（１９７６））。その上、神経幹細胞由来細胞の多くは融合して筋細胞様合胞体を形成し、筋細胞タンパク質、ミオシン重鎖に対する免疫反応性を示した（ベイダー（Ｄ．Ｂａｄｅｒ）他、Ｎｅｕｒｏｎ １３巻、８１３ページ（１９９４））（図１Ｃ、１Ｄ）。これら細胞は細胞形質の転換の兆候を何ら示さなかった。同じ条件下で、ただしＥＳ細胞の不在下で培養した神経幹細胞はこれらのマーカーを全く発現せず、合胞体も形成しなかった。抗内胚葉特異的エピトープ抗体（ＴＲＯＭＡ−１、データは示されず）を用いる免疫組織化学により、内胚葉の細胞の運命に分化する証拠は見いだされなかった。この考察は、一般的に観察される筋細胞の分化とは異なり、胚葉体培養における内胚葉の分化は稀であるという事実と矛盾しない。これらのデータは成熟神経幹細胞由来細胞がインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で筋肉の運命を選択し得ることを証明する。
【０１０４】
インヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における成熟神経幹細胞の分化能を分析するために、次にそれらを初期胚環境に導入し、それらの子孫の運命を辿るという方法で、それらが種々の組織形成に寄与し得るかどうかを分析試験した。成熟マウス脳の神経幹細胞をステージ４のひなどり胚の羊膜腔に注入した（上述の“方法”を参照）。こうすることによって若干の神経幹細胞が、羊膜腔に面する原始外胚葉に合体し、原腸形成中に、最終的外胚葉、内胚葉及び中胚葉に分布するようになると推論した（図２Ａ−２Ｂ）。これら細胞はその後異なる胚葉において、種々の誘導性環境にさらされる。ニューロスフェアの注入を受けて生き残った胚（２６％）のなかで、１０９中２４がキメラで、成熟神経幹細胞から誘導されるｌａｃＺ陽性細胞を含んでいた。分離したニューロスフェア細胞の注入からはキメラ性胚は誘導されなかった。キメラ胚におけるＸ−ｇａｌ染色の特異性は、抗β−ガラクトシダーゼ抗血清による免疫組織化学的標識と一致することによって裏付けられた。これらのネズミ由来の細胞が、マウス特異的エピトープＨ−２Ｋｂに対する免疫反応性と一致することによってさらに確認された（図２Ｆ）。高度のキメラ現象が再現性をもって観察される神経系の他に、ｌａｃＺ発現細胞が中腎や脊索等の中胚葉誘導部位、並びに、中胚葉由来性の肝臓及び腸の上皮細胞にしばしば見いだされた（表１、図２）。ｌａｃＺ発現細胞を含む組織には、種々の割合の神経幹細胞由来細胞による標識のモザイク模様があった（図２）。ｌａｃＺ発現細胞は、周囲のホスト細胞とは見分けられない形態を有し、特定組織の細胞に通常存在するマーカー、例えば中腎管細胞のＰａｘ２（図２Ｇ）や上皮細胞のケラチン等を発現する。単一神経幹細胞が種々の細胞型に分化できる子孫を生成する能力を有するかどうかを試験するために、分離したニューロスフェアから単細胞をミクロピペットでミクロウェルに移すという方法でクローン培養物を作った。単細胞培養物から誘導されるニューロスフェアをひなどり検査法で試験し、単一成熟神経幹細胞が種々の系統の子孫を生成する潜在能力を有することをあらわす上記と同様の広い分化能を有することが判明した。特定された神経幹細胞の分化能を詳細に試験するために、蛍光色素ＤｉＩの注射を受けた動物の側脳室壁から得た細胞を培養した。このような培養において、上衣細胞からのＤｉＩ標識ニューロスフェア（ヨハンソン他、同上）をミクロピペットで分離し、ひなどり胚の羊膜腔に注入した、これらの上衣由来神経幹細胞は上記のように同じ広い分化能を示した（データは示されず）。
【０１０５】
ひなどり胚の種々の器官に神経幹細胞の子孫を再現性をもって見いだしたとはいえ、ｌａｃＺ発現細胞を決して含まないその他の組織があった。例えば造血系に対する貢献を見いだすことはできなかった。これは興味深いことである。なぜならば、成熟神経幹細胞は放射線照射成熟マウスに移植された後、この系統に沿って分化し得るからである（ビョルンソン（Ｃ．Ｒ．Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３巻、５３４ページ（１９９９））。ＥＳ及びホスト細胞の種属的背景は特殊の組織ではキメラ現象の程度に大きい影響を与え、或る種属の組み合わせは或る種の器官ではキメラ現象を全く起こさないか、非常に低いキメラ現象を起こすことが、ＥＳ細胞の研究から十分証明されている（ウェスト（Ｊ．Ｄ．Ｗｅｓｔ）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４４巻、２１ページ（１９９９））。こうしてＥＳ細胞が多能性であるとはいえ、それらは或る状況のもとでは十分な能力を発揮することはできない。これに従うと、神経幹細胞はひなどり検査法で明らかにされたよりもより広い分化能を有するようにみえる。
【０１０６】
本明細書に示すデータは、異なる成熟組織における幹細胞は、これまで考えられていたよりもより類似しており、多分若干の場合にはＥＳ細胞のそれに近い発達レパートリーを有することを示唆する。
【０１０７】
【表１】
神経幹細胞の子孫を含む種々のひなどり組織におけるキメラ現象の出現率
組織
外胚葉
前脳                              ７１％（１７／２４）
中脳                              ７１％（１７／２４）
後脳                              ７１％（１７／２４）
脊髄                              ９６％（２３／２４）
表皮                              ７９％（１９／２４）
中胚葉
脊索                              ９６％（２３／２４）
中腎上皮                          ９２％（２２／２４）
中腎間葉                          ９２％（２２／２４）
体節                              ７１％（１７／２４）
心筋                              ３８％（９／２４）
内胚葉
肺上皮                            ４５％（９／２０）
胃上皮                            ８３％（２０／２４）
胃壁                              ８３％（２０／２４）
腸上皮                            ９６％（２３／２４）
腸壁                              ８３％（２０／２４）
肝臓                              ９２％（２２／２４）
【図面の簡単な説明】
【図１】
成熟神経幹細胞からの筋細胞の生成を示す図である。ＲＯＳＡ２６マウスからの神経幹細胞クローンを胚葉体と共に培養し、分化を誘導した。ＥＳ細胞はその後、Ｇ４１８選択によって排除した。β−ガラクトシダーゼ−免疫反応性（Ａ）神経幹細胞子孫のサブ集団は細長く、筋細胞マーカー デスミン（Ｂ）に対する免疫反応性を示す。若干の神経幹細胞由来細胞はミオシン重鎖免疫反応性であり、種々の程度の融合及び合胞体形成を示す（Ｃ、Ｄ）。核は青色ヘキスト染料で可視化される（Ｄ）。スケールの棒はＢとＣでは２０μｍであり、Ｄでは５０μｍである。
【図２】
成熟神経幹細胞がひなどり胚において数種の器官の形成に貢献することを示す図である。（Ａ）は、ステージ８のひなどり胚の全載Ｘ−ｇａｌ染色を示し、散乱する青色神経幹細胞由来細胞を可視化している。ラインは（Ｂ）に示されるものと同じ胚の切断面を示す。神経外胚葉（ｎｅ）、中胚葉（ｍ）及び内胚葉（ｅ）が示される。（Ｃ）は、清浄にした高度にキメラ性のステージ２３の胚の体幹部分を示す。（Ｃ）の胚の断面（ラインによって示される断面）は（Ｄ）に示されている。肝臓（ｌｉ）、脊索（ｎ）、脊髄（ｓｃ）及び中腎（ｍｎ）が示される。（Ｅ）は、ステージ２３のひなどり胚の肝臓のホスト細胞と混ぜ合わせた抗マウス特異的エピトープＨ−２Ｋｂ抗体で可視化した神経幹細胞由来細胞を示す。（Ｆ）では、胃上皮が、Ｈ−２Ｋｂ−免疫反応性（褐色）及びＸ−ｇａｌ染色（青色）を示す。（Ｇ）では、中腎管細胞（青色）におけるｌａｃＺの細胞質発現が核Ｐａｘ２−免疫反応性（赤；ボックス部分ではより高倍率）を示す。スケール棒は、ＡとＤでは２５０μｍ、Ｂでは５０μｍ、Ｃでは５００μｍ、Ｅ−Ｇでは２５μｍである。
【図３】
原腸形成中のひなどり胚の洋腹腔中へのＲＯＳＡ２６成熟神経幹細胞の注入を示す略図である（Ａ）。（Ｂ）及び（Ｃ）は２つのステージ２３のひなどり胚の体幹領域を通る断面の例を示す。脊髄神経上皮（ｎｅ）及び前角（ｖｈ）、中腎（ｍｎ）、脊索（ｎ）、肝臓（ｌｉ）、胃（ｓ）及び腸（ｉ）では、成熟神経幹細胞の子孫（青色）の寄与が明らかである。（Ｄ）では、散乱したｌａｃＺ発現細胞が、Ｘ−ｇａｌ染色によってステージ２３のひなどり前肢の上皮に検出される。（Ｅ）では、ボックス領域はより高倍率で示される。（Ｆ）には、この領域のケラチン−免疫反応性が示される。（Ｇ）には、中腎管の片側だけにｌａｃＺ発現神経幹細胞由来細胞との低い程度のキメラ現象を有するステージ２３のひなどり胚が示される。（Ｈ）には、（Ｇ）（ボックスに示される）の細部がより高倍率で示され、（Ｉ）及び（Ｊ）は、β−ガラクトシダーゼ及びＨ−２Ｋｂのそれぞれに対する抗体で標識した２つの隣接切片を示す。（Ｈ−Ｊ）では、１本の中腎管の細胞サブ集団が標識化され、隣接細い管は陰性である。（Ｋ）は、ステージ２３のひなどり胚の断面を示し、矢印は体節の皮膚筋節（ｄｅｒｍａｍｙｏｔｏｍｅ）のｌａｃＺ発現細胞を指している。挿入図では左の体節がより高倍率で示される。（Ｌ）では、ステージ３６のひなどり胚において、ｌａｃＺ発現上皮細胞を含む多数の管が未標識管と混じり合っている。スケール棒は、ＢとＣでは４００μｍ、Ｄでは５０μｍ、ＥとＦでは５μｍ、ＧとＬでは１００μｍ、Ｈと、Ｋの挿入図では４０μｍ、Ｋでは２００μｍである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月19日(2002.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の分化能を測定する方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらし、前記標的細胞の子孫を検出することを含み、前記標的細胞は両生類又は鳥類の胚、胚葉体又は胚性幹細胞によって提供される初期胚環境に導入され、且つ前記標的細胞は胚性幹細胞ではないことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記初期胚環境が胚性幹細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
初期胚環境がインヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、エックスヴィヴォ（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で提供されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
初期胚環境が胚葉体、胚性幹細胞又は原腸形成が完了していない胚からなることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
初期胚環境が前記標的細胞の可能な分化能を発現させ得る１つ以上のシグナルを提供することを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記標的細胞が新生児、子供、青年又は成人ソースから誘導されることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記方法が前記標的細胞を胚葉体と共に培養し、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
胚葉体が胚性幹細胞から生成されることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
胚葉体が前記標的細胞と同じか、又は異なる種又は属から誘導されることを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記標的細胞を鳥類又は両生類の胚の中に、前記胚の原腸形成の完了するまでの任意の時に導入し、前記胚を発生させ、前記標的細胞の子孫を検出することを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記胚がひなどり胚であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚が卵の中に含まれ、該卵をインキュベートすることによって前記胚が発生することを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細胞が胚の羊膜腔内に導入されることを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞が胚の原条の上若しくは中に、原腸形成中の原外胚葉の中若しくは上に、又は形成中の中胚葉若しくは内胚葉の中若しくは上に導入されることを特徴とする請求項１０ないし請求項１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
胚における前記標的細胞の子孫の位置を測定することを特徴とする請求項１ないし請求項１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
検出が種−、アロタイプ−、細胞及び／又は分化−特異的マーカーの検出によって行われることを特徴とする請求項１ないし請求項１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記標的細胞及び／又は前記子孫が分離されることを特徴とする請求項１ないし請求項１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が診断的目的のために使用されることを特徴とする請求項１ないし請求項１７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
治療若しくは予防のために細胞を特定、提供若しくは診断し、又は治療的若しくは予防的に有用な細胞を生成するための細胞を特定、提供若しくは診断することを特徴とする請求項１ないし請求項１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記治療又は予防が、特定され、提供され、診断され、又は生成された細胞の移植を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
治療的又は予防的に有用な細胞を作製するために使用するのに適切な細胞型を特定及び測定することを特徴とする請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療又は予防に使用されることを特徴とする請求項１９に記載の細胞類。
【請求項２３】
治療又は予防に使用するための薬剤の製造における請求項１９に記載の細胞類の使用。
【請求項２４】
対象の疾患を治療又は予防する方法であって、前記対象に適切な量の請求項１９に記載の細胞を投与することを特徴とする方法。
【請求項２５】
標的細胞を異なる細胞型に分化するように誘導する方法であって、前記標的細胞を子宮外で初期胚環境にさらすことを含み、前記標的細胞は両生類又は鳥類の胚、胚葉体又は胚性幹細胞によって提供される初期胚環境に導入され、且つ前記標的細胞は胚性幹細胞ではないことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記方法が請求項１ないし請求項１８のいずれか１つに記載されたものであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記分化した細胞が分離されることを特徴とする請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物又は組成物の細胞に与える効果を分析試験する方法であって、前記方法は請求項１ないし請求項１８のいずれか１つに記載の方法又は請求項２５ないし請求項２７のいずれか１つに記載の方法を含み、さらに前記標的細胞及び／又はそれらの子孫を前記化合物又は組成物にさらし、前記細胞に対する前記化合物又は組成物の効果を評価する段階を含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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