(57)【要約】細菌生産細胞において複合糖質を製造するための組成物及び方法が開示される。製造することができる複合糖質には、細菌または哺乳類起源のオリゴ糖及び多糖が包含される。
2004520001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）形質転換した生産細胞を該生産細胞の増殖を助けることができる培養培地に接種すること（ここで、該生産細胞は、（ｉ）末端ヘプトース分子を含有するコア脂質構造及び（ｉｉ）該ヘプトース分子に受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）分子を付加することができる酵素を含んでなる細菌を、形質転換した生産細胞を生成せしめるために複合糖質を合成するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を該細菌中に挿入することによって形質転換することにより調製されるものである）；
（ｂ）該形質転換した生産細胞を増殖させること；
（ｃ）該複合糖質を培養培地から回収すること
の工程を含んでなる複合糖質の製造方法。
【請求項２】
請求項１の形質転換した生産細胞。
【請求項３】
ｋｄｏコア上に末端ヘプトースを有し、そしてヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のオリゴ糖の合成を触媒するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を挿入しているグラム陰性細菌を含んでなる請求項２の形質転換した生産細胞。
【請求項４】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ−１２株ＪＭ１０９を含んでなる請求項３の形質転換した生産細胞。
【請求項５】
細菌がグラム陰性細菌である請求項１の方法。
【請求項６】
細菌がエシェリキア・コリＫ−１２株ＪＭ１０９である請求項１の方法。
【請求項７】
受容体分子が［Ｎ−アセチル］ガラクトースである請求項１の方法。
【請求項８】
単離されたＤＮＡ配列が機能性のヘモフィルス・インフルエンゼ グリコトランスフェラーゼをコードする請求項１の方法。
【請求項９】
単離されたＤＮＡ配列が機能性のナイセリア・ゴノロエエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）グリコトランスフェラーゼをコードする請求項１の方法。
【請求項１０】
請求項１の方法に従って製造される複合糖質。
【請求項１１】
（ａ）（ｉ）末端ヘプトースを含有するコア脂質構造及び
（ｉｉ）該ヘプトースにガラクトース分子を付加する酵素を含んでなるグラム陰性細菌を形質転換すること（ここで、該形質転換したグラム陰性細菌は、オリゴ糖を合成するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を含んでなるベクターを構築することにより調製されるものである）；
（ｂ）該形質転換したグラム陰性細菌を該形質転換した細菌の増殖を助けることができる培養培地に接種すること；
（ｃ）該接種したグラム陰性細菌を増殖させること；及び
（ｄ）該オリゴ糖を培養培地から回収すること
の工程を含んでなるオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
形質転換した細菌が、ヘモフィルス・インフルエンゼからの単離されたＤＮＡ配列で形質転換したエシェリキア・コリＫ−１２である請求項１１の方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法により製造されるオリゴ糖。
【請求項１４】
形質転換した細菌が、ナイセリア・ゴノロエエからの単離されたＤＮＡ配列で形質転換したエシェリキア・コリＫ−１２である請求項１１の方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法により製造されるオリゴ糖。
【請求項１６】
改変されたレベルの複合糖質を含んでなる生産細胞を生成せしめるためにグリコトランスフェラーゼをコードするキメラＤＮＡ配列を含んでなる生産細胞を培養することを含んでなる（ここで、生産細胞は、末端ヘプトース分子を含有するコア脂質構造を含んでなり且つヘプトース分子に受容体分子を付加することができる酵素をコードする細菌である）、複合糖質の製造方法。
【請求項１７】
複合糖質を回収することをさらに含んでなる請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
優先権の請求
本願は、１９９９年５月１８日に出願された米国仮出願第６０／１３４，７５６号から３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． １１９（ｅ）のもとで優先権を請求し、この出願は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
米国政府は本発明にある種の権利を保有する。国立アレルギー感染症研究所により補助金番号Ａ１２４０１６で、そしてＮＩＨ国立研究財源センターから補助金番号ＲＲ０１６１４及びＲＲ０４１１２で財政支援が提供された。
【０００３】
発明の分野
本発明は、グラム陰性細菌におけるＬＰＳ主鎖構造上の複合糖質の製造方法に関する。
【０００４】
発明の背景
複合糖質は天然に存在し、そしてウイルス、細菌及び真菌病原論、細胞対細胞及び細胞内認識、細胞表面レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）へのホルモン及び病原体の結合を包含する多種多様な生物学的機能に、そして抗原−抗体認識に関与する。「複合糖質」という用語は、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する多種多様な化学化合物を包含し、ここで、単量体単位はグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース及びシアル酸を包含するがこれらに限定されるものではない何千もの天然に存在するまたは合成の単量体のいずれかから選択される。糖類は、炭素−水素−酸素コアに加えて、アミノ、硫酸またはリン酸基のような追加の成分を有することができる。２〜１０の糖単位からなる重合体はオリゴ糖（ＯＳ）と呼ばれ、そして１０より多くの糖単位からなるものは多糖（ＰＳ）と呼ばれる。これらの単糖構成単位は少なくとも１０の異なる様式で連結することができ、天文学的な数の異なる組み合わせ及び順列を導く。種内の株及び生物体内の組織でさえ複合糖質構造が異なることが認められている。天然に存在する複合糖質のこの高度の多様性、非常に特異的な組成及び広範囲の生物学的役割は、これらの化合物を特に重要にしている。
【０００５】
グラム陰性細菌は複合糖質を含有し、これらは脂質に結合されてリポオリゴ糖（ＬＯＳ）またはリポ多糖（ＬＰＳ）を形成する。ＬＯＳ及びＬＰＳの免疫原性は糖質部分にあり、一方、病原性は脂質部分にある。この理由で、ＯＳ及びＰＳはグラム陰性病原体に対するワクチンとして、そしてグラム陰性細菌の同定のために有用である。
【０００６】
米国特許出願５，７３６，５３３は、呼吸感染の原因因子である病原体に対する治療薬として有用なオリゴ糖を開示している。病原性細菌は、組織の表面上の糖質に結合することにより組織に集落形成することができ、そして過剰の特定の可溶性オリゴ糖を与えることにより細菌の集落形成の拮抗阻害をもたらすことができると考えられる。
【０００７】
ＬＰＳ及びＬＯＳからのＯＳ及びＰＳは、特定の細菌病原体を培養で増やし、続いて脂質部分を切断し、精製することにより製造することができる。しかしながら、大部分の病原性細菌は、それらの増殖条件及び遅い増殖の点で培養しにくく、この製造方法を実行不可能にしている。例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼは、増殖のために二酸化炭素大気及び脳／心臓抽出を必要とすることが既知である。ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）は、ＯＳ及びＰＳ製造のために必要とされる培地培養においてあまり増殖しない。さらに、これらの細菌病原体の多く（例えばナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））は、エーロゾル及び可能性がある感染蔓延の危険のために大容量で増やすことは危険である可能性がある。迅速に高密度まで増殖するエシェリキア・コリ及びサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のような細菌株において培養しにくい細菌病原体のＯＳ及びＰＳ構造を製造できることは、培養しにくい細菌病原体からのこれらのＯＳ及びＰＳを製造するための迅速な方法を提供する。
【０００８】
真核生物のタンパク質及びペプチドは、しばしば、同様にグリコシル化されているホルモンの特異的結合部位として働く糖質部分をそれらの表面上に有し、すなわち、ペプチド構造に連結された複合糖質を有する。さらに、認識役割に加えて、糖質は機能性糖タンパク質へのポリペプチドの適切な三次元的フォールディングに必要である。細菌はペプチドまたはタンパク質を効率よくまたは真核生物のものと同等にグリコシル化しない。この理由で、細菌は真核生物のペプチド及びタンパク質を増やすための生産細胞として一般に用いられるが、エリトロポエチンのような有用なヒト糖ペプチドは哺乳類細胞において増やされる。米国特許第４，７０３，００８号はエリトロポエチンの製造方法を開示しており、ここでは、このホルモンをコードするＤＮＡでチャイニーズハムスター卵巣細胞のような細胞をトランスフェクションし、そして複合培地中二酸化炭素大気下で増やす。生成するホルモンは、ヒト使用の治療法として有効であるために天然に存在するホルモンに十分に類似している。
【０００９】
単離された細胞特異的糖質のさらなる有用性は、感染が表面認識グリコシル化タンパク質に依存している疾患因子の拮抗阻害にである。例えば、ヒト免疫不全ウイルスは、Ｔ−４リンパ球上の表面レセプターに結合することが既知である。過剰の遊離したＴ−４レセプター糖質が患者の体液中に存在する場合、ウイルスは遊離した糖質に結合し、Ｔ−４リンパ球に感染するのが効果的に妨げられる。
【００１０】
細胞認識分子の投与による細胞表面への抗体の結合の拮抗阻害は、エリテマトーデス、多発性硬化症及び慢性関節リウマチのような自己免疫疾患の処置における治療能力を有することができる。そのような分子は細胞レセプターに結合し、そのような疾患状態において認められる変性を引き起こす自己免疫抗体の結合を妨げることができる。
【００１１】
米国特許第４，７４５，０５１号は、グリコシル化ペプチド及びタンパク質の製造に実用的用途を有する方法である、昆虫細胞においてＤＮＡを発現する方法を開示している。しかしながら、グリコシル化結果は昆虫に固有のものであり、哺乳類細胞に典型的なものより高いレベルのマンノースからなる。
【００１２】
細菌生産細胞におけるペプチド及びポリペプチドの実用的製造は確立している。ペプチド及びタンパク質をグリコシル化するための化学的及び酵素的手段は当該技術分野において周知である。例えば、米国特許５，３７０，８７２は、タンパク質にカルボキシルまたはヒドロキシル基を介してＰＳを連結する方法を開示している。複合糖質の古典的有機合成は長い間既知であるが、限られた実用用途でである。糖重合体分子の複雑さに固有の難点に加えて、多数のグリコシド結合は不安定であり、化学合成中に保護及び脱保護しなければならず、合成の難しさを増し、そして生成物の収率を下げる。
【００１３】
有機合成の難点のために、酵素合成が考案されている。グリコシル化は、グリコトランスフェラーゼのような酵素の作用による単量体の順次付加により進むことが既知である。反応生成物は、リアーゼ、アセチラーゼ、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、キナーゼ、エピメラーゼ、メチラーゼ、トランスフェラーゼ等によりさらに改変することができる。米国特許第５，３０８，４６０号は、固定したマトリックス上でのそのような順次合成を開示している。
【００１４】
複合糖質、並びに種または組織に特異的な複合糖質を含有する糖タンパク質及び糖ペプチドのより効率のよい実用的な製造方法の必要性が依然としてある。
【００１５】
発明の要約
本発明は、生産細胞における複合糖質の製造に関する。エシェリキア・コリ株Ｋ−１２のようなある種の細菌は、末端ヘプトースを有するコアリポ糖をもつことが本明細書において開示される。適当な生産細胞はまた、グリコトランスフェラーゼが他の糖単量体を付加して複合糖質を生成せしめる「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」を形成するために、Ｎ−アセチルグルコサミンのような受容体分子の末端ヘプトースへの転移を触媒する酵素も含有する。別の適当な生産細胞がそのような酵素を欠く場合、ヘモフィルス・インフルエンゼの遺伝子ｒｆｅ （ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ウンデカプレノールＧｌｃＮＡｃ−１リン酸トランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡを生産細胞中に挿入することができる。好ましくは、ｒｆｅの生産は遺伝子ｌｓｇＧの遺伝子産物の存在により高められる。生産細胞中にグリコトランスフェラーゼをコードする遺伝子を挿入することにより、ヘモフィルス・インフルエンゼ、ナイセリア種、サルモネラ種及びエシェリキア・コリのような細菌に特異的な複合糖質が製造される。ポリシアリルのような哺乳類の複合糖質もまた製造することができる。
【００１６】
従って、本発明は、（ａ）形質転換した生産細胞を該生産細胞の増殖を助けることができる培養培地に接種すること、ここで、該生産細胞は、（ｉ）末端ヘプトース分子を含有するコア脂質構造及び（ｉｉ）該ヘプトース分子に受容体分子を付加することができる酵素を含んでなる細菌を、形質転換した生産細胞を生成せしめるために複合糖質を合成するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を該細菌に挿入することによって形質転換することにより調製される；（ｂ）該形質転換した生産細胞を増殖させること；並びに（ｃ）該複合糖質を培養培地から回収することの工程を含んでなる複合糖質の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、（ａ）（ｉ）末端ヘプトースを含有するコア脂質構造及び（ｉｉ）該ヘプトースにガラクトース分子を付加する酵素を含んでなるグラム陰性細菌を形質転換すること、ここで、該形質転換したグラム陰性細菌は、オリゴ糖を合成するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を含んでなるベクターを構築することにより調製される；（ｂ）該形質転換したグラム陰性細菌を該形質転換した細菌の増殖を助けることができる培養培地に接種すること；（ｃ）該接種したグラム陰性細胞を増殖させること；及び（ｄ）該オリゴ糖を培養培地から回収することの工程を含んでなるオリゴ糖の製造方法も提供する。
【００１８】
本願に開示する方法を用いて、他の複合糖質の実用的製造のために適当な生産細胞を同定することができる。そのような適当な生産細胞は、合成する糖質に特有の受容体分子、またはそのような特有の受容体分子を付加するために改変することができる部位を有する。生産細胞は、適切な受容体を形成するための開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ）ｌｓｇＧまたはｌｓｇＦを含有する。次に他の種、株、組織、ホルモン、レセプターまたは他の細胞表面糖質のグリコトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをそのような生産細胞中に挿入することができ、その結果、その種、株、組織、ホルモン、レセプターまたは他の細胞表面糖質に特有のオリゴ糖または多糖が製造される。遺伝子ｒｆｃ及びｌｓＧのヌクレオチド配列は、ＴＩＧＲ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）から利用できるヘモフィルス・インフルエンゼＲｄデータベースのファイル上にある。グリコトランスフェラーゼの配列は、本明細書に開示する参考文献から利用できる。
【００１９】
同様に提供するのは、生成物を分離し精製する方法である。本発明はまた、改変されたレベルの複合糖質を含んでなる生産細胞を生成せしめるために、グリコトランスフェラーゼをコードするキメラＤＮＡ配列を含んでなる生産細胞を培養することを含んでなる複合糖質の製造方法も提供し、ここで、生産細胞は、末端ヘプトース分子を含有するコア脂質構造を含んでなり且つヘプトース分子に受容体分子を付加することができる酵素をコードする細菌である。本発明はまた、複合糖質を回収することをさらに含んでなる方法も提供する。
【００２０】
発明の詳細な記述
本発明は、遺伝子ｒｆｅ （ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ウンデカプレノールＧｌｃＮＡｃ−１リン酸トランスフェラーゼ） （Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７６−７０７９−７０８４）を含有するあらゆるグラム細菌種のコア構造の末端ヘプトースをオリゴ糖合成の受容体として働くように改変することができる方法を提供する。ｒｆｅ遺伝子は、輸送体脂質ウンデカプレノールリン酸上へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ， 「受容体分子」）の転移を触媒するタンパク質をコードする。この遺伝子の調節は、ヘモフィルス・インフルエンゼにおいて同定された調節遺伝子ｌｓｇＧで制御することができる。ｌｓｇＧにより引き起こされるｒｆｅ発現の増加は、エシェリキア・コリ、サルモネラ・ミネソタ及びヘモフィルス・インフルエンゼを包含する様々なグラム陰性細菌種からのＬＰＳ及びＬＯＳの末端ヘプトース上にＧｌｃＮＡｃ基の付着をもたらす。このＧｌｃＮＡｃは、グリコトランスフェラーゼの指揮下で、糖単量体の順次付加の足場を形成する受容体分子として働くことが認められている。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ｌｓｇＦは、ＧｌｃＮＡｃへのガラクトースの付加をもたらす。ヘモフィルス・インフルエンゼのｌｓｇグリコトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列はエシェリキア・コリＫ−１２株生産細胞中に挿入されており、その結果、エシェリキア・コリにおいてヘモフィルス・インフルエンゼ特異的ＬＯＳエピトープが製造される。
【００２１】
ｒｆｅと同様の開始酵素を含有するあらゆる生産細胞は、適切な受容体を付加して足場を形成することができる。製造はまた、好ましくは、調節遺伝子ｌｓｇＧも含有する。次に他の種、株、組織、ホルモン、レセプターまたは他の細胞表面糖質のグリコトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをそのような生産細胞中に挿入することができ、その結果、その種、株、組織、ホルモン、レセプターまたは他の細胞表面糖質に特有のオリゴ糖または多糖が製造される。
定義：
複合糖質：ＳＯ４、ＰＯ４、ＣＯ４、ＣＨ３、ＮＨ４を包含するがこれらに限定されるものではない追加の置換基を有する重合体を包含する、式（ＣＨ２Ｏ）ｎのあらゆる重合体、ここで、ｎは少なくとも３単量体単位に等しい、並びに脂質、ペプチド及びタンパク質に連結したそのような重合体。
生産細胞：本発明に有用な生産細胞は、ある分子で終わるＬＰＳまたはＬＯＳ−糖内部コアを含有し且つ延長の足場として働くように末端の分子に受容体分子を付加することができる酵素を含有し、そしてグリコシルトランスフェラーゼをコードする外来ＤＮＡで形質転換することができるあらゆる細菌として定義される。他の点では適当であるが適切な受容体分子を欠く細胞は、足場の形成に受容体分子として働くようにＬＰＳまたはＬＯＳを適切に改変するために、それらをｒｆｅ及びｌｓｇＧのような遺伝子で共形質転換する場合に生産細胞として用いることができる。
Ｈｉｂ生産細胞：ヘモフィルス・インフルエンゼＢ型特異的ＯＳの製造のための好ましい細胞は、好ましくはグラム陰性細菌、最も好ましくはエシェリキア・コリＫ−１２株ＪＭ１０９である。
合成遺伝子（１または複数）：所望の複合糖質を合成する酵素または複数の酵素をコードするＤＮＡ。これらの遺伝子には、グリコトランスフェラーゼ、リアーゼ、アセチラーゼ、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、キナーゼ、エピメラーゼ、メチラーセ等をコードするものが包含される。
実施例１．Ｈｉｂ生産細胞の選択
ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型（Ｈｉｂ）の莢膜株は、髄膜炎及び肺炎を包含する、ヒトにおける様々な侵襲性及び菌血症性感染を招く。Ｈｉｂの表面リポオリゴ糖（ＬＯＳ）は、微生物毒力及び病原論における重要な因子であることが既知である。野生型及び突然変異体株からのＨｉｂ ＬＯＳの構造研究により、ＬＯＳが保存されたヘプトース三糖コアを含有し、これを各ヘプトース上で追加の糖で延長できることが示されている。最近、エシェリキア・コリＫ−１２コア領域の修正構造が報告され、これは同様にヘプトース三糖内部コア及び主オリゴ糖分岐の末端に存在する第四のヘプトースを含有する：
以前の研究により、合成酵素遺伝子で形質転換したエシェリキア・コリのコア領域は、ヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子の指揮下で糖単量体の付加により延長して約５単量体単位延長された改変されたエシェリキア・コリＬＰＳを製造できることが示された。単量体はヘプトースの各々で付加されると考えられた。（Ｋｗａｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ５：２４７５−２４８０ （１９９０））。それ故、ヘモフィルス・インフルエンゼのものと実質的に同一であるＬＯＳを製造できるかどうかを決定しようと試みてＪＭ１０９と呼ばれるエシェリキア・コリＫ−１２株をヘモフィルス・インフルエンゼ合成遺伝子で形質転換する作業を行った。
【００２２】
エシェリキア・コリ株は、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天または培地を用いて３７℃で慣例的に培養した。これらの研究に使用したベクターは以前に記述された。（Ｋｗａｉｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０））。エシェリキア・コリＪＭ１０９からのＬＰＳは、Ｄａｒｖｅａｕ及びＨａｎｃｏｃｋの抽出法（Ｄａｒｖｅａｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５５（２）， ８３１−８３８ （１９８３））により調製した。ＬＰＳは、１５％アクリルアミドを含有する分離ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色により視覚化した。
【００２３】
このキメラＬＰＳの構造を決定するために、各サンプルからの数ミリグラムのＬＰＳを無水ヒドラジンで３７℃で２０分間処理し、次いで冷アセトンで沈殿させた。
【００２４】
エシェリキア・コリコアの化学構造を確定し、そしてエシェリキア・コリ受容体基を決定するために、エシェリキア・コリ株ＪＭ１０９からのＬＰＳを以下の実施例６において記述するように組成分析、結合分析及び質量分析法を用いて部分的に特性化した。
２．ＨｉｂからのＬＯＳ合成遺伝子の単離
Ｈｉｂ株Ａ−２は、髄膜炎にかかっている子どもの髄液から最初に単離された。Ｈｉｂ Ａ−２は、アミノ酸及びビタミンを補足したチョコレート寒天または４％ Ｆｉｌｄｅｓ試薬（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ）を補足した脳心臓浸出物寒天上で５％ ＣＯ２大気中３５℃で増やした。
【００２５】
ＬＯＳ合成遺伝子（ｌｓｇ）を含有するＨｉｂ株Ａ−２からの遺伝子クラスターは以前にクローン化された。（Ｋｗａｉｋ ｅｔ ａｌ， （１９９０））。ｌｓｇ遺伝子座は、７個の完全なオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）からなる７．４ｋｂ ＤＮＡフラグメント内に含まれる。この領域は、リポ多糖（ＬＰＳ）生合成と関連しているＨｉｂ株Ｒｄのゲノム配列にも存在するいくつかの異なる遺伝子座の一つである。
【００２６】
ラムダバクテリオファージＥＭＢＬ３においてゲノムライブラリーを構築するためにＨｉｂ株Ａ−２のｌｓｇ領域からのＤＮＡを用いた（Ｋｗａｉｋ ｅｔ ａｌ， １９９０）。エシェリキア・コリ株ＬＥ３９２においてＨｉｂ ＬＯＳオリゴ糖エピトープを発現した２６個のファージクローンを調製した。ＥＭＢＬＯＳ−Ｉと称するファージ形質転換体は、エシェリキア・コリＬＥ３９２の４．１ｋＤａ ＬＰＳに１．４ｋＤａのオリゴ糖が付加されたキメラＬＰＳを生産した。Ｈｉｂ Ａ２ ＬＯＳ混合物中の２つの成分を認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）６Ｅ４は、キメラＬＰＳ中の新規な５．５ｋＤａ成分も認識し、Ｈｉｂ ＬＯＳに対するいくらかの免疫化学的類似性を示す。
実施例３．Ｈｉｂ生産細胞の形質転換
エシェリキア・コリ株ＪＭ１０９を改変して提示したキメラの一連のより高質量ＬＰＳ種を生産するクローンを与える一連のプラスミドを作製するためにＥＭＢＬＯＳ−Ｉの制限フラグメントを用いた。ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７と称する形質転換体は、それぞれ、５．５、５．１及び４．５ｋＤａの改変されたまたはキメラのＬＰＳを生じた。ｐＧＥＭＬＯＳ−４からのＬＰＳのみが６Ｅ４エピトープを発現したが、３つ全てがエシェリキア・コリからの４．１ｋＤａ ＬＰＳ種を明らかに改変した。株ｐＧＥＭＬＯＳ−５からのＬＰＳはＭＡｂ ３Ｆ１１と陽性に反応することが認められ、末端のＮ−アセチルラクトサミンの存在を示唆した。ＭＡｂ ６Ｅ４により認識されるエピトープはまた、ヘモフィルス・インフルエンゼ非類別株２０１９のＬＯＳ並びにサルモネラ・ミネソタＲｅ突然変異体からのＬＰＳにも存在する。ヘモフィルス・インフルエンゼＬＯＳへのこのモノクローナル抗体の結合は、Ｋｄｏ及びサルモネラ・ミネソタのＲｅ突然変異体からのＫｄｏ三糖により阻害することができる。６Ｅ４エピトープはヘモフィルスＬＯＳのコアと関連しているので、エシェリキア・コリにおいて発現されるキメラ構造は、エシェリキア・コリ４．１ｋＤａ ＬＰＳ種の受容体基へのヘモフィルスコア構造の付加から生じるのかもしれないと最初は提示された。
【００２７】
ヘモフィルス・インフルエンゼ株Ａ−２ ｌｓｇ遺伝子座からの異なるＤＮＡ制限フラグメントが連結されているプラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ＋でＨｉｂ生産細胞を形質転換した（表１及び図１参照）。プラスミドｐＧＥＭＬＯＳ−４は、ｌｓｇ遺伝子座を含んでなる７個全てのオープンリーディングフレーム（Ａ−Ｇ）を含むＤＮＡの７．４ｋｂ ｂａｍｈＩ−ｐｓｔＩフラグメントを含有した。プラスミドｐＧＥＭＬＯＳ−５は、ｌｓｇの５個のオープンリーディングフレーム（Ｃ−Ｇ）を含んでなるＤＮＡの５．５ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｓｔＩフラグメントを含有した。プラスミドｐＧＥＭＬＯＳ−７は、ｌｓｇ遺伝子座の２個のオープンリーディングフレーム（Ｆ−Ｇ）を含んでなるＤＮＡの２．８ｋｂ ｓｐｈＩ−ｐｓｔＩフラグメントを含有した。インサートを含まないプラスミドｐＧＥＭ３ｚｆ＋もまた株ＪＭ１０９中に形質転換した。この株及びそれから単離したＬＰＳをＰＧＥＭと称した。
実施例４．オリゴ糖の単離及び精製
ＰＧＥＭ（３１ｍｇ）、ｐＧＥＭＬＯＳ−４（２５ｍｇ）、ｐＧＥＭＬＯＳ−５（１５ｍｇ）及びｐＧＥＭＬＯＳ−７（４．４ｍｇ）からのＬＰＳを１％酢酸（２ｍｇ ＬＰＳ／ｍｌ）中で１００℃で２時間加水分解した。加水分解産物を４℃で５０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を除いた。ペレットを２ｍｌのＨ２Ｏで洗浄し、再び遠心分離した（５０００ｇ， ２０分， ４℃）。上清及び洗浄液をプールし、凍結乾燥してオリゴ糖画分を得た。基準として、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） ＴＶ １１９ Ｒａ突然変異体からの１０ｍｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）を同じように処理した。
【００２８】
ＥＳＩ−ＭＳ分析のための脱塩したオリゴ糖プールを調製するために、０．０５Ｍ酢酸ピリジニウム（ｐＨ５．２）を１ｍｌ／分の流速で用いて、直列につないだ２本のＢｉＯ−Ｓｅｌｅｃｔ ＳＥＣ １２５−５ ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）上で粗オリゴ糖画分の少量のアリコート（＜２ｍｇ）をクロマトグラフィーにかけた。カラム流出液をモニターするために屈折率検出器を用い、そしてクロマトグラムを積分器で記録して保存した。
【００２９】
大規模分離のために、ＰＧＥＭ（１０．２ｍｇ）、ｐＧＥＭＬＯＳ−４（９．３ｍｇ）及びｐＧＥＭＬＯＳ−５（７．０ｍｇ）からのオリゴ糖画分を０．３ｍｌの０．０５Ｍ酢酸ピリジニウムバッファー（ｐＨ５．２）に溶解し、０．４５ｇｍナイロン−６６膜を通して遠心分離−濾過した。ＰＧＥＭ及びｐＧＥＭＬＯＳ−４サンプルは１本のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−４カラム（１．６ｘ８４ｃｍ， ＜４００メッシュ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にかけ、そしてｐＧＥＭＬＯＳ−５サンプルは直列につないだ２本のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−４カラム（１．６ｘ７９ｃｍ及び１．６ｘ７６．５ｃｍ）にかけた。カラムには、３０℃で保った水ジャケットを備え付けた。１０ｍｌ／時間の流速での上方溶出は、Ｐ−１ぜん動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ） （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）で実施した。溶出液は屈折率でモニターし、そして画分を１０分間隔で集め、濃縮装置で蒸発乾固させた。
実施例５．オリゴ糖の脱リン酸
オリゴ糖画分を１．５ｍｌポリプロピレンチューブ中に置き、冷４８％フッ化水素水で処理して５−１０μｇ／ｍｌ溶液を作った。サンプルを４℃で１８時間保ち、次いでＨＦ水を蒸発させた。次に、脱リン酸したサンプルを、直列につないだ２本のＢｉＯ−Ｓｅｌｅｃｔ ＳＥＣ １２５−５ ＨＰＬＣカラム上で０．０５Ｍ酢酸ピリジニウム（ｐＨ５．２）を用いて再びクロマトグラフィーにかけた。
実施例６．生成物の特性化
天然に存在するＨｉｂ ＬＯＳに対して作製したモノクローナル抗体との反応性により、実施例２において示すように、生成物が天然に存在するＨｉｂ ＬＯＳと同じ免疫化学機能を有することが示された。所望の複合糖質に対する構造の同一性を決定するためにサンプルを異なる技術によりさらに分析した。
ａ．単糖組成分析
脱リン酸したオリゴ糖画分を４００μｌの２Ｍトリフルオロ酢酸に溶解し、１００℃で４時間加熱した。加水分解産物をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ濃縮装置で蒸発乾固させ、２０μｌのＨ２Ｏに再溶解し、そして再び乾燥させた。加水分解産物を、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを有するＤｉｏｎｅｘ ＢｉｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いてパルス電流検出で高速陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。
ｂ．メチル化分析
粉末ＮａＯＨでの使用のために改変した微量分析規模方法を用いて、脱リン酸したオリゴ糖画分に対して結合分析を実施した。部分的にメチル化された酢酸アルジトールを質量分析計でＥ１及びＣ１モードでＧＣ／ＭＳにより分析した。
ｃ．液体二次イオン質量分析法（ＬＳＩＭＳ）
セシウムイオン源を有する質量分析計を用いてＬＳＩＭＳを実施した。オリゴ糖サンプル（１μｌ Ｈ２Ｏ中）をステンレス鋼プローブ先端上で１μｌのグリセロール／チオグリセロール（１：１）に加えた。１０ｋｅＶのＣｓ＋イオン一次ビームエネルギーを用い、そして二次サンプルイオンを８ｋｅＶに加速した。走査を３００ｓ／ｄｅｃａｄｅで陰イオンモードで取り、静電記録計で記録した。スペクトルを±０．２Ｄａよりよい精度までＵｌｔｒａｍａｒｋ １６２１ （ＰＣＲ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ， ＦＬ）で手動で質量検定した。
ｄ．電気スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）
オリゴ糖及びＯ−脱アシル化ＬＰＳを、陰イオンモードで運転する電気スプレーイオン源を有する質量分析計で分析した。運転溶媒（４μｌ中１μｌ）と混合したＨ２Ｏにオリゴ糖サンプルを溶解し、約２０μｌ／分の流速で、１％酢酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリル（１／１， ｖ／ｖ）の流れに注入した。質量検定を陰イオンモードでＣｓＩで実施した。
【００３０】
ある場合には、陰イオンモードでＥＳＩ条件下で運転する配列検出器を有するセクター−直交飛行時間（ＴＯＦ）装置を用いて、選択したオリゴ糖画分をより高解像力（Ｍ／ΔＭ＝２０００）で分析した。この場合、溶媒系及び流速は、四重極ＥＳＩ実験について上に記述したのと本質的に同じであった。４ｋＶの加速電圧及び３．５−４ｋＶの間より高いＥＳＩ針電圧で５００〜３０００のｍ／ｚ範囲にわたって全てのサンプルに５秒／ｄｅｃａｄｅの走査速度を用いた。液体二次イオン質量分析法条件下で取ったＣｓ１からなる外部基準で質量検定を実施し、続いて、陰イオンＥＳ−ＭＳモードでサルモネラ・チフィムリウムＲａ突然変異体のＬＰＳからのオリゴ糖の二重に荷電した脱プロトン化分子イオンの１点補正を行った（（Ｍ−２Ｈ）２−ｅｘａｃｔ＝９７３．２）。
ｅ．マトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法
窒素レーザー（３３７ｎＭ）を備えたＶｏｙａｇｅｒまたはＥｌｉｔｅ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）で、Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルを分析した。全てのスペクトルは、他の所で詳細に記述されているような遅延抽出条件を用いて陰イオンモードで記録した。（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ ８：６４５−６５８ （１９９７））。サンプルをＨ２Ｏに溶解し（約２５０ｐｍｏｌ／μｌ）、マトリックス溶液（アセトン中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸の飽和溶液）と１：１で混合し、金めっきしたＭＡＬＤＩプレート上で室温で乾燥させた。各サンプルに対して約１００レーザーショットを記録し、平均し、次にレニン基質テトラデカペプチド、酸化したインシュリン鎖Ｂ及びウシインシュリン（全てＳｉｇｍａより）からなる外部質量標準物質を用いて質量検定した。これらの条件下での外部検定では、０．１％の質量精度が得られた。比較目的のために、予想される脂質Ａフラグメントイオン（（Ｍ−Ｈ）平均＝９５２．００９）を用いてＰＧＥＭからのＯ−脱アシル化ＬＰＳのスペクトルに一点補正を行い、次にこの脂質Ａフラグメントイオン及び４つ全てのサンプルに存在するＰＧＥＭからの追加のイオン（ｍ／ｚ ２８３５．７）を用いて３つのキメラ株のスペクトルを再検定した。
ｆ．四重極−ＴＯＦ （ｑＴＯＦ）を用いる縦列質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）
脱リン酸したオリゴ糖を、ナノスプレーイオン源を備えた質量分析計で陽イオンモードで分析した。分析器は、高圧ＲＦのみのイオンガイド及びそれに続く四重極質量フィルターからなる。高圧四重極衝突セルは第一の質量フィルターに続く。ＴＯＦ質量分析器は、２．５メートルの有効飛行経路を有する反射を含んでなる。１％酢酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリル（１／１， ｖ／ｖ）にサンプルを溶解し、各々の２μｌをナノスプレー先端に注入した。ナノスプレー針電圧は典型的に８００−１０００Ｖであった。一つのサンプル添加は、通常３０−４０分の分析時間を与え、これによりＣＩＤ ＭＳ／ＭＳのいくつかの個々のイオンの選択の前に通常の質量スペクトルが得られた。ＭＳモードでは、高解像能（８，０００ＦＷＨＭ）により各イオンの電荷状態が明白に決定された。ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ運転には、大部分の場合において二重に荷電している（Ｍ＋２Ｈ）２＋、フラグメンテーションのための前駆体イオンを選択するためにＩ ｍ／ｚ単位の質量ウインドウを有する四重極質量分析器を用いた。選択したイオンを衝突セルにおいて空気を衝突気体としてフラグメントにし、そして２０ｋＶの加速電位で運転する直交ＴＯＦで分析した。フラグメントイオンスペクトルを１０秒〜１分の間の期間にわたってコンピューター制御下で蓄積した。外部検定に基づく質量指定は、一般に、計算した単同位体値の５０ｐｐｍ以内であり、一方、内部検定は＋５ｐｐｍまで正確な質量を与えた。
ｇ．ＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
我々は、ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型Ａ−２株のｌｓｇ領域からのＤＮＡの重複する制限フラグメントを含有する一連のプラスミドでのエシェリキア・コリ株ＪＭ１０９ （Ｏ−側鎖を欠くラフＬＰＳ （ｒ−ＬＰＳ）を生産するＫ−１２株）の形質転換を以前に報告している（Ｋｗａｉｋ ｅｔ ａｌ， １９９０）。部分ＬＯＳセグメントが製造された。図１に示すように、ｐＧＥＭＬＯＳ−４クローンはｌｓｇ領域中の完全なｏｒｆの全て （ｏｒｆ Ａ−Ｇ）を含有し、一方、ｐＧＥＭＬＯＳ−５はｏｒｆ Ｃ−Ｇを含有し、そしてｐＧＥＭＬＯＳ−７はｏｒｆ Ｆ−Ｇを含有する。クローンｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７は、４．１ｋＤａのエシェリキア・コリコアにそれぞれ１．４、１．０及び０．４ｋＤａの成分を付加した改変されたＬＰＳ構造を生じることがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示された（図２）。
ｈ．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＯ−脱アシル化ＬＰＳの分析
質量分析法によるＬＰＳ分子量及び不均質性の初期スクリーニングのために、ＰＧＥＭ、ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７からのＬＰＳの少量のアリコートを無水ヒドラジンで処理して脂質Ａ部分からＯ−連結脂肪酸を取り除いた。ＰＧＥＭ Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルは、主要なエシェリキア・コリコア構造に相当する、２７３８−３１７２Ｄａの範囲のいくつかの種を含有する。提示組成に合わせると、認められた種はヘプトース（Ｈｅｐ）、ヘキソース（Ｈｅｘ）、３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（Ｋｄｏ）、リン酸エステル（Ｐｈｏｓ）及びホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の不均質性を示すことが見出された（表２）。特に、両方とも多様な量のリン酸エステル及びＰＥＡ有する、３ Ｈｅｘと３ Ｈｅｐ （２もしくは３ Ｋｄｏを有する）または４ Ｈｅｘと４ Ｈｅｐ （２ Ｋｄｏを有する）のいずれかを含有する２つの主要なコアタイプが認められた。ｐＧＥＭＬＯＳ−７ Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ混合物は、（Ｍ−Ｈ）−３３３４．５及び３４５６．８の２つの主要な新しい種に加えて、これらの同じ種の多くを含有した。ｍ／ｚ ３３３４．５種は、明らかに、４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ、２ Ｋｄｏ、２ Ｐｈｏｓ及び１ Ｏ−脱アシル化ジホスホリル化脂質Ａ （Ｏ−ＤＰＬＡ）成分を含有するＰＧＥＭコア構造へのＨｅｘ及びＮ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）の付加から生じる。１ ＰＥＡ成分のさらなる付加は、ｍ／ｚ ３４５６．８種を与える。これらのデータは、ｐＧＥＭＬＯＳ−７を生じる形質転換がエシェリキア・コリＬＰＳへのＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ成分の付加をもたらすことを示唆する。同様に、ｐＧＥＭＬＯＳ−５ Ｏ−脱アシル化ＬＰＳにおける主要な種（ｍ／ｚ ３７００．６及び３８２３．６）は、４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ、２ Ｋｄｏ、２ Ｐｈｏｓ、１ Ｏ−ＤＰＬＡ及び０または１ ＰＥＡを含有するＰＧＥＭコア構造への２ Ｈｅｘと２ ＨｅｘＮＡｃの付加から生じることが見出された（表２参照）。これらの構造はまた、ｐＧＥＭＬＯＳ−４ Ｏ−脱アシル化ＬＰＳにおいても、この場合、４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ、３ Ｋｄｏ、２ Ｐｈｏｓ、１ Ｏ−ＤＰＬＡ及び０または１ ＰＥＡを含有するＰＧＥＭコア構造へのもう一つのＨｅｘ （ｍ／ｚ ４０８３．２及び４２０６．４）またはＨｅｘＮＡｃ （ｍ／ｚ ４１２４．５及び４２４６．８）のいずれかのさらなる付加から生じる新しい種に加えて認められた（表２参照）。キメラＬＰＳ構造のうち、これらの高分子量ｐＧＥＭＬＯＳ−４成分のみが第三のＫｄｏ成分を含有した。
ｉ．ＥＳＩ−ＭＳ及びＬＳＩＭＳによるオリゴ糖の分析
ＰＧＥＭ、ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７からのＬＰＳを穏やかな酸加水分解に供して遊離オリゴ糖を遊離させた。最初に、オリゴ糖画分の少量のアリコートをサイズ排除ＨＰＬＣにより脱塩し、陰イオンＥＳＩ−ＭＳにより混合物として分析した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、主として二重に荷電したイオン、（Ｍ−２Ｈ）２−を含有した。一般に、データは、Ｏ−脱アシル化ＬＰＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析からの結果と一致した。ＰＧＥＭサンプルは、１４５９．３〜２０１６．７Ｄａの分子量に及ぶ、７つの主要なオリゴ糖及びいくつかの微量の種を含有することが認められた。表３に示すように、提示組成が様々な種に対して決定され、これらは構造が２つの主要なコアタイプ； ３ Ｈｅｘ、３ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏを含有するもの及び４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏを含有するものからなることを示した。リン酸エステル及びＰＥＡ基の数の多様性が、混合物中に存在する多数の種の原因である。
【００３１】
ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７サンプルは、より大きい分子量のオリゴ糖に加えて、ＰＧＥＭサンプル中に存在する種の多くを含有した（表３）。４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ、１ Ｋｄｏ、２ Ｐｈｏｓ及び０または１ ＰＥＡを含有するＰＧＥＭコア構造への１個のＨｅｘ及びＨｅｘＮＡｃ基の付加と一致する、Ｍｒ ２１７７．７及び２３０２．５の新しいＬＰＳ糖形態がｐＧＥＭＬＯＳ−７サンプルにおいて認められた。ｐＧＥＭＬＯＳ−５サンプルの高分子量成分（Ｍｒ ２５４３．９及び２６６６．５）は、さらに別のＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ単位のさらなる付加を示唆し、そしてｐＧＥＭＬＯＳ−４サンプルは、もう一つのＨｅｘまたはＨｅｘＮＡｃ成分の付加と一致するさらに高分子量の物質（Ｍｒ ２７０６．１〜２８７０．０に及ぶ）を含有した。
【００３２】
これらの種の提示組成の決定を助けるために、ＰＧＥＭ、ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７サンプルからのオリゴ糖をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、画分をＬＳＩＭＳ及び／またはＥＳＩ−ＭＳにより分析した。次に、２つの主要なＰＧＥＭコアタイプ及び様々なキメラ構造に相当する選択した画分をプールし、ＨＦ水で脱リン酸し、サイズ排除ＨＰＬＣ上で再びクロマトグラフィーにかけ、陰イオンＬＳＩＭＳまたはＥＳＩ−ＭＳにより再び分析した。ＨＦ処理後に認められる分子イオンの提示組成を表４に記載する。リン酸エステル及びＰＥＡ成分を除去した際に、ｐＧＥＭＬＯＳ−７サンプル中に存在する主要な高質量種はＭｒ （平均）２０２０．３のオリゴ糖である （１ ＨｅｘＮＡｃ、５ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏ）。ｐＧＥＭＬＯＳ−５サンプルは、ｐＧＥＭＬＯＳ−７ ＬＰＳへの１ Ｈｅｘ及び１ ＨｅｘＮＡｃのさらなる付加から生じる、Ｍｒ （平均）２３８６．３のオリゴ糖を含有する （２ ＨｅｘＮＡｃ、６ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏ）。この種はｐＧＥＭＬＯＳ−４サンプルにおいても、さらなるＨｅｘ （Ｍｒ （平均） ２５４８．４）またはＨｅｘＮＡｃ （Ｍｒ （平均）２５８９．５）を含有するさらに高分子量の構造に加えて存在する。
ｊ．単糖組成及び結合分析
ＰＧＥＭ、ｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７からの遊離オリゴ糖の質量分析法の分析により、異なるキメラ構造が、４ Ｈｅｘ、４ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏを含有する多様にリン酸化されたＰＧＥＭコア構造への理論量のヘキソース及びＨｅｘＮＡｃ基の付加から生じることが示された。いかなるキメラ構造も３ Ｈｅｘ、３ Ｈｅｐ及び１ Ｋｄｏコアを含有することが認められなかった。
【００３３】
比較目的のために、２つのＰＧＥＭコアタイプ並びにｐＧＥＭＬＯＳ−４、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−７からの主要なキメラ構造を含有する脱リン酸したオリゴ糖画分を２Ｎトリフルオロ酢酸中で加水分解してそれらの単糖組成、従ってＨｅｘ及びＨｅｘＮＡｃ基の同一性を決定した。パルス電流検出で高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析した場合、ＰＧＥＭ加水分解産物はガラクトース、グルコース及びＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースのみを含有することが認められた（表５）。（Ｋｄｏ基はこれらの加水分解条件下で回収されない。）２つのコアタイプは、ＧａｌＧｌｃ２Ｈｅｐ３及びＧａｌＧｌｃ３Ｈｅｐ４と同定された。ｐＧＥＭＬＯＳ−７サンプルはＧｌｃＮＨ２Ｇａｌ２Ｇｌｃ３Ｈｅｐ４を含有し（表５）、大きい方のＰＧＥＭコアが１個のＧａｌ及び１個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）基の付加により改変されていることを示唆した。同様に、ｐＧＥＭＬＯＳ−５サンプルの組成は、大きい方のＰＧＥＭコアが、Ｇａｌ及びＧｌｃＮＡｃ基のみでさらにグリコシル化されていることを示唆した。ｐＧＥＭＬＯＳ−５と同じ種を含有したｐＧＥＭＬＯＳ−４からの画分２は同様の結果を与え、そして３つの主要な種を含有するｐＧＥＭＬＯＳ−４からの画分１ （表４参照）はわずかに多いＧｌｃＮＨ２を含有した。
【００３４】
単糖組成分析に使用した同じ６つの脱リン酸したオリゴ糖画分のアリコートをメチル化分析のために利用して糖結合位置を確定した。ＧＣ／ＭＳにより認められる部分的にメチル化された酢酸アルジトールを表６に記載する。再び、２つのＰＧＥＭコアタイプを比較することにより、大きい方のＰＧＥＭコアの第二の末端ヘプトースがキメラ構造の全てにおいて１，７−結合したヘプトースに転化され、従って新規なグリコシル化の結合部位に相当するはずであるとみなすことは比較的容易である。いかなるキメラ構造もＨｅｐ３コアでは認められなかったので、おそらく、Ｋ−１２コア構造中のオリゴ糖分枝上に最近同定された非還元末端ヘプトースは改変された末端ヘプトースである。さらに、いかなる新しい３結合糖もキメラオリゴ糖から得られず、おそらく、糖は全て直鎖で付加されることを示唆した。
ｋ．ＭＳ／ＭＳによるキメラオリゴ糖の配列決定
エシェリキア・コリＬＰＳコア及び新規なオリゴ糖成分間の結合部位の同一性を確かめるため及び付加される糖の配列を決定するために、脱リン酸したオリゴ糖をＭＳ／ＭＳ分析に供した。これらの実験のために、サンプルを陽イオンモードで試験し、二重に荷電した分子イオン、（Ｍ＋２Ｈ）２＋を衝突誘導解離（ＣＩＤ）のために選択した。様々な還元末端（Ｙタイプ）及び非還元末端（Ｂタイプ）配列イオンがスペクトルに存在する。ＰＧＥＭオリゴ糖では、Ｙ６α’ （ｍ／ｚ ７３２．２ （２＋））、Ｙα５’ （ｍ／ｚ ６５１．２ （２＋））及びＹ４α’ （ｍ／ｚ １１３９．３）フラグメントイオンを包含するＹイオン系列、並びにＢ３α’ （ｍ／ｚ ５１７．２）、Ｂ４α’ （ｍ／ｚ ８４１．３）、Ｂ５ （ｍ／ｚ １２２５．４）及びＢ６ （ｍ／ｚ １４１７．４）フラグメントイオンを包含する対応するＢイオン系列は、最も大きいオリゴ糖分枝の非還元末端上に第四のヘプトースを有する公開された構造を裏付ける。これらの配列イオンに加えて、スペクトルに存在するいくつかのイオンは、明らかに、高エネルギーＣＩＤ条件下で起こり得る内部切断から生じる。ｐＧＥＭＬＯＳ−５オリゴ糖のスペクトルにおいて、２つの同様のＹ及びＢタイプイオン系列は、付加された四糖の配列及び結合部位を明確に特定する。ｍ／ｚ ３６６．１ （Ｂ２α’）及び７３１．３（Ｂ４α’）の強いＢイオンは、２個のＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ成分の順次切断から生じる。これらの喪失はまた、対応するＹ９α’ （ｍ／ｚ ２０２０．６）及び７α’ （ｍ／ｚ １６５５．５）フラグメントイオンによっても示される。ｍ／ｚ ９２３．３ （Ｂ５α’）０及びｍ／ｚ １４６３．４（Ｙ６α’）のフラグメントイオンは、Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ成分がヘプトースに連結されることを裏付け、そして大きいオリゴ糖分枝にさらに沿った追加切断は、新規な四糖がＰＧＥＭコア構造の最も大きい分枝に結合されることを裏づける。
【００３５】
ｐＧＥＭＬＯＳ−７及びｐＧＥＭＬＯＳ−４からのキメラオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、強いＢイオンはまた、付加された糖成分の構造も明確に特定した。ｐＧＥＭＬＯＳ−７オリゴ糖（Ｍｒ ２０１９．７）において、ｍ／ｚ ３６６．１のＢイオンは１個のＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ二糖成分に対応する。Ｍｒ ２５８７．９のｐＧＥＭＬＯＳ−４オリゴ糖 （ＨｅｘＮＡｃ３Ｈｅｘ６Ｈｅｐ４→ｄｏ）は、ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃフラグメント（ｍ／ｚ ５６９．２）及びＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃフラグメント（ｍ／ｚ ９３４．３）を失い、一方、Ｍｒ ２５４６．８のｐＧＥＭＬＯＳ−４オリゴ糖（ＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ７Ｈｅｐ４Ｋｄｏ）は、Ｈｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ （ｍ／ｚ ５２８．２）及びＨｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ （ｍ／ｚ ８９３．３）フラグメントを失った。これらのＢタイプイオンに加えて、後者のスペクトルは、この場合明らかに内部フラグメントとして生じるｍ／ｚ ３６６．１及び７３１．３の大きいイオンも含有した。
【００３６】
オリゴ糖が順次、すなわち、ｐＧＥＭＬＯＳ−７からｐＧＥＭＬＯＳ−５、ｐＧＥＭＬＯＳ−４へと組み立てられると仮定すると、ＭＳ／ＭＳデータは、我々のメチル化分析結果と組み合わせて、図３に示すような推定されるキメラオリゴ糖の部分配列を与える。
【００３７】
構造データは、ＬＯＳ生合成に関与するヘモフィルス・インフルエンゼからの８遺伝子セグメントの一部を含有するプラスミドで形質転換したエシェリキア・コリＫ−１２が、ヘモフィルス・インフルエンゼのものと本質的に同一であるオリゴ糖を製造するように改変することができるキメラＬＰＳを作るという予測を裏付ける。さらに、キメラＬＰＳは分離されたハイブリッドタイプ構造であり、ここで、エシェリキア・コリＲ−ＬＰＳコア構造は最初に合成され、次いで親エシェリキア・コリ株に存在しない別の独立した一組の糖を付加するためにヘモフィルス・インフルエンゼＬＯＳ生合成酵素の足場として働くことが示された。従って、生合成経路は順次であり（分離され）、混ざっていないようである。
【００３８】
本発明がなされる前に、オリゴ糖延長の受容体としてのエシェリキア・コリＲ−ＬＰＳ中の末端分枝ヘプトースの役割または機能性インシエーター酵素の必要条件は未知であった。完全なエシェリキア・コリＫ−１２コアの公開された構造は、第二の末端ヘプトースを含有しないが、むしろ内部コア領域の一部としてこの第四のヘプトースを有した。オリゴ糖分枝はグルコースで終わると考えられ、これはＯ−抗原及び他の置換基の受容体部位であると提示された。イニシエーター酵素の役割は未知であった。今回、この第四のヘプトースを含有するエシェリキア・コリＲ−ＬＰＳ構造（すなわち、完全なコア構造）のみが、プラスミドで形質転換したキメラ株において延長を受け、従って、この組成を有するエシェリキア・コリのみがヘモフィルス・インフルエンゼの製造の生産細胞として有用である。キメラ構造において、ＧｌｃＮＡｃは、このヘプトースの７位に付加される最初の糖である。延長順序におけるこの重要な第一段階には２つの可能な説明がある。１、ｏｒｆｆもしくはｏｒｆｇにコードされるヘモフィルスからのＮ−アセチルグルコサミン特異的グリコシルトランスフェラーゼがこの正確な特異性を有するか、またはこの反応を起こさせるために十分に無差別であるかのいずれかである。２、ある類似したエシェリキア・コリグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子がヘモフィルス調節遺伝子により活性化されている。このプラスミドに含まれる７個の遺伝子の配列比較は、グリコシルトランスフェラーゼ及び調節遺伝子が両方とも存在することを示唆するので、両方の説明が可能である。しかしながら、末端ＧｌｃＮＡｃ及び１，７−結合したヘプトースが、エシェリキア・コリＫ−１２のいくつかの他の株において非理論量で存在していることは、オリゴ糖分枝の末端へのこの糖の付加がエシェリキア・コリ酵素により成し遂げられることを示唆する。最近、エシェリキア・コリＫ−１２におけるラフ表現型をもたらす突然変異を補足した場合に、補足された株が、反復単位の還元末端にＧｌｃＮＡｃを有するＯ−抗原を生産することが報告された。ＰＧＥＭコアの延長におけるこの重要な第一段階の機構にかかわらず、改変されていないＰＧＥＭコアＲ−ＬＰＳの大部分はキメラ混合物中に残るので、このＧｌｃＮＡｃの付加が律速であることは明らかである。さらに、ｐＧＥＭＬＯＳ−７からｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−４へと進む場合に非常にわずかしかまたは全く中間体構造が認められず、いったんこの最初のＧｌｃＮＡｃが付加されると、他のヘモフィルス関連糖の付加が特定の終点に迅速に起こることを示唆する。キメラＬＰＳの生合成における他の段階がこの最初のＧｌｃＮＡｃの付加と同様に不完全である場合、これらの他の中間体構造が認められると予想されるが、何も認められなかった。従って、ｏｒｆｆまたはｏｒｆｇの産物により調節されるエシェリキア・コリからのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、キメラ構造におけるこの最初の重要な糖を付加すると思われる。ｏｒｆｇのみを含有するキメラ構築物に関する予備データは、２０３Ｄａ （ＨｅｘＮＡｃ）の質量移動を示し、ｏｒｆｇがこの調節遺伝子をコードすることを示唆した。
【００３９】
キメラＬＰＳの生合成における第二段階は、末端ＧｌｃＮＡｃの３位へのガラクトースの付加である。生成する二糖、Ｇａｌ１３ＧｌｃＮＡｃは、ｐＧＥＭＬＯＳ−７において認められる構造成分であり、これは形質転換プラスミドがヘモフィルスからのｏｒｆ Ｆ−Ｇを含有する場合に生じる。これらの遺伝子産物の予測されるアミノ酸配列の検討により、ｏｒｆｆはエルウィニア・アミロボラ （Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）からのガラクトシルトランスフェラーゼ（ａｓｍＥ）に高い相同性を有することが示され（６６％一致）、これがヘモフィルスにおいてガラクトシルトランスフェラーゼをコードする可能性があることを示唆する。ｏｒｆＧは既知のオリゴ糖生合成遺伝子にいかなる相同性も示さないが、エシェリキア・コリにおいてＭｏｄＥタンパク質をコードする遺伝子に相同である（６４％一致）。このタンパク質はモリブデン輸送及び転写の調節に関与し、ｏｒｆＧがヘモフィルスからの調節タンパク質（キメラ株においてエシェリキア・コリからのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子を調節している可能性がある）をコードする可能性があることを示唆する。
【００４０】
ｐＧＥＭＬＯＳ−５株では、追加の３個の遺伝子が形質転換プラスミドに含まれ（ｏｒｆ Ｃ−Ｇ）、生成するＬＰＳにおいて追加のＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌが認められる。これらの糖は、今度は、四糖Ｇａｌ１−４ＧｌｃＮＡｃ−３Ｇａｌ１３ＧｌｃＮＡｃを特定する。この形質転換体からのＬＰＳは今度は３Ｆ１１ ＭＡｂに反応し、この新しい二糖がβ結合して末端の三糖、Ｇａｌ１４ＧｌｃＮＡｃ１−３Ｇａｌを形成することを示唆する。このプラスミドに含まれる新しいｏｒｆは全て、既知のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子といくらかの相同性を有し：ｏｒｆＣは、エキソ多糖合成のためのグリコシルトランスフェラーゼをコードするエルウィニア・アミロボラからのａｓｍＤ （２６％一致）及びＬＰＳ内部コア合成に関与する遺伝子であるエルジニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）からのＴｒｓＤ （３８％一致）と相同性を有し、ｏｒｆＤは、ナイセリア・ゴノロエエからのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｌｓｔ）と相同性を有し（２７％一致）、そしてｏｒｆＥは、アクチノバチルス種からの推定のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（７７％一致）及びエルウィニア・アミロボラからのガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、ａｍｓＢ （２７％一致）と相同性を有する。形質転換プラスミドにおけるこれら３個の追加のｏｒｆが、明らかに、大きくなるオリゴ糖鎖にさらに２個の糖のみの付加をもたらすことは、グリコシルトランスフェラーゼの一つの受容体がキメラＬＰＳに存在しないことを示すことができる。
【００４１】
さらに２個のｏｒｆを形質転換プラスミドに加えて（ｏｒｆ Ａ−Ｇ）ｐＧＥＭＬＯＳ−４キメラ株を生成せしめると、３Ｆ１１エピトープは消失し、エプトープの末端Ｇａｌ基が、Ｇａｌの６位に明らかに結合した第二のＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃ成分のいずれかにより覆われることが認められる。ｐＧＥＭＬＯＳ−４ ＬＰＳ集団に存在するこれらの新しい種はまた、おそらくそれらのコア領域のどこかに、第三のＫｄｏ成分を含有することも認められた。野生型エシェリキア・コリＫ−１２ ＬＰＳ集団に存在する不完全なコア構造にも第三のＫｄｏを含有するものがあるが、キメラ構造のうち、ｐＧＥＭＬＯＳ−４に特有の構造のみが第三のＫｄｏを含有することが認められた。このキメラ株はまた、ヘモフィルス・インフルエンゼにおける内部コア、Ｋｄｏ関連エピトープを認識するＭＡｂ ６Ｅ４によっても認識され、この第三のＫｄｏが野生型エシェリキア・コリＬＰＳのコア構造に存在するものと異なるエピトープを形成することを示唆する。従って、株ｐＧＥＭＬＯＳ−４をフォンネッド（ｆｏｎ−ｎｅｄ）する形質転換プラスミドにｏｒｆ Ａ及びＢを加えることは、キメラＬＰＳ構造に複数の影響を有するようである。ＯｒｆＢは、ナイセリア・ゴノロエエからのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子に相同である（４６％一致）。ＯｒｆＡは、エシェリキア・コリからのＲｆｂ Ｘ遺伝子産物（２２％一致）及びエルジニナ・エンテロコリチカのＴｒｓＡ （２４％一致）の両方に相同である。これらは推定のＯ−抗原輸送体であり（３６， ３７）、ｏｒｆＡはフリッパーゼをコードする可能性があることを示唆する。
【００４２】
シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを含有する構造は、野生型ヘモフィルス・インフルエンゼｂ型株Ａ２ ＬＯＳ集団のほんのわずかな成分であるが、ｌｓｇ遺伝子がこのエプトープの合成に関与することを我々は以前に認めている。ｏｒｆＤのトランスポゾン突然変異誘発により、Ｈｉｂ ＬＯＳ糖形態にガラクトースを付加する全ての能力を失った突然変異体株２８１．２５が生成した。この株は、４個のグルコース及び３個のヘプトースを含有する主要な種より大きい野性型ＬＯＳ構造をいずれも作ることができなかった。（ｏｒｆＤの下流にある）ｏｒｆＥの突然変異により、一つの重要な違い：株２７６．４はシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープを作る能力を保持したことを除いて、本質的に同じ欠損を有する株２７６．４が生成した。これらの結果は、トランスポゾン突然変異体において、ｏｒｆＤのノックアウトがｏｒｆＥに対する極性作用（ｐｏｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ）を有することを示唆し、これは、ｏｒｆＥの遺伝子産物が、それらのグルコース二糖分枝上に末端ガラクトース（１または複数）を含有するより高分子量の野生型構造の合成のために必要なガラクトシルトランスフェラーゼであり、そしてｏｒｆＤの遺伝子産物が、おそらくシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンエピトープの合成のために必要なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼであることを意味する。これらの指定のケースは、上記の相同性（ｏｒｆＥはガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に相同である）並びに２７６．４及び２８１．２５突然変異体株において認められるＬＯＳ糖形態に基づいて行うことができる。シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン構造のいかなる末端欠失バージョンも２７６．４ ＬＯＳ集団において認められなかった（すなわち、シアル酸またはシアル酸とガラクトースのいずれかを欠く種がない）ので、ｏｒｆｄ遺伝子は、おそらく、オリゴ糖分枝にＧｌｃＮＡｃを付加するグリコシルトランスフェラーゼをコードすると考えられる。このことはまた、ｏｒｆ Ｃ−Ｅの遺伝子の一つがｐＧＥＭＬＯＳ−７ ＬＰＳ構造の末端であるＧａｌの３位にＧｌｃＮＡｃを付加することを明らかに招くという結果とも一致する。
【００４３】
このキメラ糖質発現系は、これらのｌｓｇ遺伝子の機能を解明することに関係のある情報を提供しており、そしてヘモフィルス・インフルエンゼに対する通常の内因性遺伝子バックグラウンドなしに実施するというさらなる利点を有する。実際、ヘモフィルス・インフルエンゼにおけるｌｓｇ遺伝子のいくつかの遺伝子ノックアウトが完成されているが、下流または調節遺伝子の作用がしばしばそれらの機能分析を複雑にし得る。このエシェリキア・コリ発現系では、生成するキメラＬＰＳの構造分析により、合成が順次（非平行）合成として進んだこと、すなわち、キメラＬＰＳの新しい成分はエシェリキア・コリＲ−ＬＰＳの形成後に付加されたことが示されている。この合成が（例えば、Ｒ−ＬＰＳ合成と組み合わされるよりむしろ）順次的であることにより、これらのヘモフィルス・インフルエンゼ遺伝子産物の機能をキメラオリゴ糖構造からより容易に概説することができた。さらに、モノクローナル抗体でのキメラＬＰＳ生成物のスクリーニングにより、プラスミドＤＮＡが由来するヘモフィルス株に特有の末端糖配列（エピトープ）の形成をたどることができた。
【００４４】
本明細書に引用する全ての公開及び特許は、十分に説明するように引用することにより組み込まれる。
【００４５】
本発明は特定の実施例及び態様に関して記述されている。しかしながら、当業者は本発明の精神及び範囲内である変形または改変を行うことができると理解される。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【表５】
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【００５１】
【表６】
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【００５２】
【表７】
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【００５３】
【表８】
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ａ ｌｓｇＡ及びｌｓｇＢが両方とも存在する場合には、ｐＧＥＭＬＯＳ−５四糖構造を６−結合ガラクトースまたはＧｌｃＮＡｃのいずれかで延長してｐＧＥＭＬＯＳ−４ ＬＰＳにおいて認められる構造を生成せしめることができ、これはＭＡｂ ６Ｅ４により認識されるエピトープである可能性がある第三のＫｄｏ成分も含有する。従って、これら２個のヘモフィルスｏｒｆの機能ははっきりしないままである。
ｂ ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）のシアリルトランスフェラーゼに高い相同性を有する遺伝子（１５）ｌｓｔ、及びｌｓｇＢの二重遺伝子ノックアウトでの最近の研究は、ｌｓｇＢもまたシアリルトランスフェラーゼをコードする可能性があることを示唆する。
ｃ ｐＧＥＭＬＯＳ−５ ＬＰＳの構造は、３個のｏｒｆ、Ｃ、Ｄ及びＥの一つが１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードし、そしてもう一つが１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードすることを示唆する。ｌｓｇＤまたはｌｓｇＥを突然変異体株２８１．２５及び２７６．４においてそれぞれノックアウトした場合に生成するＬＯＳの我々の以前の研究（１６）に基づいて、ｌｓｇＤがおそらく１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードし、そしてｌｓｇＣ及びｌｓｇＥが両方ともおそらくガラクトシルトランスフェラーゼをコードすると結論付けることができる。
ｄ ｌｓｇＥをノックアウトした場合に生成するＬＯＳ （１６）は、受容体がキメラＬＰＳに存在しない可能性があるガラクトシルトランスフェラーゼをｌｓｇＥがコードすることを示唆する。
【００５４】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヘモフィルス・インフルエンゼＤＮＡのｌｓｇ領域。
（Ａ）８個のｏｒｆの図。（Ｂ）ｍ−Ｔｎ３（Ｃｍ）挿入部位の位置（６）。（ｃ）エシェリキア・コリＪＭ１０９ ＬＰＳを改変したＥＭＢＬＯＳ−１サブクローンの制限地図。
【図２】
エシェリキア・コリ株ＪＭ１０９ （ｐＧＥＭと称する）並びに３つのキメラ株、ｐＧＥＭＬＯＳ−７、ｐＧＥＭＬＯＳ−５及びｐＧＥＭＬＯＳ−４からのＬＰＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＬＰＳは〜３．３〜５．５ｋＤａの分子量に及ぶ。
【図３】
キメラオリゴ糖の提示構造。オリゴ糖分枝の末端上に第四のヘプトースを含有する完全なエシェリキア・コリＫ−１２コアのみが改変を受ける。さらなる糖（Ｒと称する）がこのヘプトースの７位に付加されてキメラオリゴ糖を生成せしめる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成12年12月15日(2000.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生産細胞としての使用のための形質転換した細菌であって、
（ａ）末端ヘプトースを含有するコア領域を有するリポオリゴ糖またはリポ多糖；
（ｂ）末端ヘプトースに受容体分子を付加することができる酵素；及び
（ｃ）オリゴ糖または多糖を製造するための糖単量体の順次付加による受容体分子の延長のためのグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡの挿入配列
を有する細菌。
【請求項２】
グラム陰性である請求項１の細菌。
【請求項３】
ｒｆｅ遺伝子を含有する請求項２の細菌。
【請求項４】
ｌｓｇＧ調節遺伝子を含有する請求項３の細菌。
【請求項５】
エシェリキア・コリまたはサルモネラ・ミネソタであるあらゆる先の請求項の細菌。
【請求項６】
エシェリキア・コリＫ１２株ＪＭ１０９であるあらゆる先の請求項の細菌。
【請求項７】
ｋｄｏコア上に末端ヘプトースを有するあらゆる先の請求項の細菌。
【請求項８】
酵素が、Ｎ−アセチルグルコサミンである受容体分子を付加することができるあらゆる先の請求項の細菌。
【請求項９】
ヘモフィルス・インフルエンゼ、ナイセリア種またはサルモネラ種のオリゴ糖の合成を触媒するグリコトランスフェラーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列を挿入しているあらゆる先の請求項の細菌。
【請求項１０】
（ａ）請求項１−９のいずれかに記載の細菌である生産細胞を該生産細胞の増殖を助けることができる培養培地に接種すること；
（ｂ）該生産細胞を増殖させること；及び
（ｃ）複合糖質を培養培地から回収すること
の工程を含んでなる複合糖質の製造方法。
【請求項１１】
培養した細胞からキメラリポオリゴ糖またはリポ多糖を抽出すること、抽出したリポオリゴ糖またはリポ多糖を加水分解すること及び生成したオリゴ糖または多糖を回収することの工程を含んでなる請求項１０の方法。
【請求項１２】
オリゴ糖または多糖がグラム陰性病原体に対するワクチン中に含まれる請求項１０または１１の方法。
【国際調査報告】
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2004520001.tif 000058
2004520001.tif 000059
2004520001.tif 000060