(57)【要約】異常な血管形成により特徴付けられる疾患の治療に有用な薬剤としての天然起源の化合物のシリーズを開示する。これらの化合物は、式（Ｉ）を有するクリサンソンＡ；式（ＩＩ）を有するクリサンソンＢ；および、式（ＩＩＩ）を有するクリサンソンＣである。【化１】2004500395.tif 000011
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004500395.tif 000008
を有するクリサンソンＡの、抗血管形成活性を有する薬剤の調製のための使用。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
【化２】
2004500395.tif 000009
を有するクリサンソンＢの、抗血管形成活性を有する薬剤の調製のための使用。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2004500395.tif 000010
を有するクリサンソンＣの、抗血管形成活性を有する薬剤の調製のための使用。
【請求項４】
腫瘍型の疾患の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項５】
腫瘍転移の予防および治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項６】
関節炎疾患の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項７】
糖尿病性網膜症の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項８】
乾癬の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項９】
慢性炎症性疾患の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症の治療のための、請求項１、２または３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に開示する発明は、異常な血管形成に伴う疾患の治療のための、天然起源の化合物の使用に関する。
成人における血管形成は、普段は静止しているが、例えば創生治癒または女性の性周期中の子宮内膜の復元において典型的な機能を示す。
血管形成反応は、血管機能が低下し、および組織の潅流が不十分である場合に生理的に刺激される。
より一般的には、生理的条件下において血管形成は、不十分な潅流に対するポジティブなフィードバック、または例えば動脈の閉塞の場合に、組織塊増殖状況の下で（例えば、筋肉組織の形成に付随する新血管形成）、および作業量が増加した場合に酸素および栄養素の要求の増加に関連して起こるような、酸素および栄養素の供給の低下に対するポジティブなフィードバックを構成すると主張できる。
【０００２】
局所虚血の間に、動脈の部分的または完全な閉塞のために、潅流を維持するために必然的に側副血管が発達する。
血管形成の典型的なプロセスは、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、胎盤増殖因子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、アンギオゲニン、インターロイキン−８、および肝細胞増殖因子などのプロ−血管形成分子、および負の血管形成調節因子、例えばトロンボスポンジン−１、アンギオスタチン、アルファインターフェロン、プロラクチン１６−Ｋｄフラグメント、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰＳ）のインヒビター、血小板因子４、およびゲニステインなどの間の釣り合いにより調節される。
【０００３】
一次腫瘍の増殖は、腫瘍組織が十分に血管化することにより助長されることはよく知られている。酸素および栄養素が十分に供給されると、腫瘍そのものの迅速な増殖が促される。
血管形成の程度は腫瘍の予後において、最大の負の要因となり得ることが示されている（ｖａｎ Ｈｉｎｓｂｅｒｇｈ ＶＷ， Ｃｏｌｌｅｎ Ａ， Ｋｏｏｌｗｉｊｋ Ｐ； Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １０ Ｓｕｐｐｌ．， ４： ６０−３， １９９９； Ｂｕｏｌａｍｗｉｎｉ ＪＫ； Ｃｕｒｒ．， Ｏｐｉｎ．， Ｃｈｅｍ．， Ｂｉｏｌ．， ３（４）： ５００−９， １９９９ Ａｕｇ．）。
また、腫瘍分野において、腫瘍細胞の生理における基本的段階は、転移能力の獲得であることが知られている。
【０００４】
転移する腫瘍細胞は周囲の構造への接着力を失い、血管およびリンパ管に侵入し、そして隔たった他の組織にてコロニー形成し、そこで自己複製し続ける。
転移は疾患の臨床歴における重要事項でもあり、癌による死亡の主要原因である。それは、腫瘍部位または隣接領域における血管組織の存在と密接に関連し、および腫瘍部位または隣接領域における血管組織の存在により促される。
【０００５】
腫瘍細胞が周囲の構造を横切って移動し、既存の、または新血管形成により形成された腫瘍内の血管に細胞が到達し、およびこうして血流に達することが可能となる（Ｒａｙ ＪＭ．， Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＷＧ； Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ．， ７（１１）： ２０６２−７２， １９９４； Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＷＧ， Ｌｉｏｔｔａ ＬＡ， Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ Ｊｒ； ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ７（１５）： １４３４−４１， １９９３ Ｄｅｃ．）。
腫瘍の血管区域においてリンパ管と血管の間に連絡が存在すると、腫瘍細胞は両脈管系中を移動することできる。
【０００６】
近年の研究により、血管形成と関節炎疾患の間の直接的な関連性が示されている（Ｋｏｃｈ ＡＥ； Ａｔｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４１： ９５１−９６２， １９９８）。特に、関節軟骨の新血管形成は、パンヌスの形成および関節炎の発症において重要な役割を演じる。正常な軟骨は血管を持たないが、関節炎患者の滑液は、内皮細胞により産生される血管形成刺激因子（ＥＡＳＦ）を含む。
この因子の存在は、軟骨の血管形成および崩壊に関連する。
異常な血管形成には他の疾患も関連する。
【０００７】
糖尿病性網膜症［Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ １９９９ Ｏｃｔ； １４（４）： １２８７−９４］、乾癬［Ｂｒ． Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ； １４１（６）： １０５４−６０］、慢性炎症およびアテローム性動脈硬化症［Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ １９９８ Ｄｅｃ； ６４（８）： ６８６−９５］において、冒された組織の新血管形成が、その助長要因となることが見出されている。
新血管形成の制御はそれゆえ、これら疾患の制御および治療の基本要素の一つである。
【０００８】
ヒトの治療に有用な抗血管形成活性を有する天然起源の化合物がすでに公知である。
例えば、真菌アスペルギルス  フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）から抽出される化合物は、かなりの抗血管形成能力を示す。その合成誘導体、ＴＮＰ−４７０は、腫瘍の治療に関する臨床試験段階にある（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＥＣ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９８， ９５（２６）， １５１６３−８）。
【０００９】
アフリカヤナギの樹皮から抽出される活性成分、コンブレスタチンは、新血管形成の強いインヒビターであり、および既に形成されている血管の内皮に直接および選択的に作用する（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ， １９９７， ５７， １８２９）。この化合物は近年、血管形成のインヒビターとしてフェーズＩ臨床試験に組み込まれ、次いでその後、フェーズＩＩ試験に組み込まれている。
生薬ウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ）から単離されるフェノール性化合物、クルクミンは、多くのプロテアーゼの活性を調節して内皮の形態形成に直接作用することにより、血管形成を阻害する（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ． １９９８， ９（４）， ３０５−１２）。
トンキンニッケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ Ｂｌｕｍｅ）の樹皮から単離される化合物、桂皮アルデヒドは、同様の活性を有するゲニステインなどの他の天然の化合物の抗血管形成特性よりも大きな実質上の抗血管形成特性を示している（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９７， ７（１９）， ２４７３−６）。
【００１０】
近年なされた進歩にも関わらず、薬理学研究のこの分野は、医学分野の多くの専門家により、異常な血管形成により特徴付けられる疾患および特に腫瘍の治療のための新規薬物の発見のための最も有望な分野の一つと考えられている。
これらの疾患に関し、実際、そのような疾患の原因である異常な血管形成のメカニズムを遮断または妨害することができ、従ってそれらに関する治療が見出されることを可能とする新規化合物の必要性が、今なお強く認識されている。
【００１１】
すでに記載したように、そのような疾患には、関節炎疾患、腫瘍、糖尿病性網膜症、乾癬、慢性炎症およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。
真菌起源の一の天然産物、真菌アスコキタ  クリサンセミ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）からＮａｓｉｎｉらにより単離された代謝産物、クリサンソンＡ［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９， ９２３ （１９８９）］が静菌および抗菌活性を有することが見出されている。この真菌株に関するさらなる研究により、クリサンソンＡに関連する２つの他の化合物、およびより詳細にはクリサンソンＢおよびクリサンソンＣを単離することが可能となっており、Ｎａｓｉｎｉらにより単離されている［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２９， Ｎ°８， ｐｐ． ２４９９−２５０２ （１９９０）］。
【００１２】
クリサンソンＡ、クリサンソンＢおよびクリサンソンＣが抗血管形成活性を有すること、およびそれゆえ、異常な血管形成により特徴付けられる疾患の治療に有用な薬剤であることが今回見出された。
本明細書に開示する発明による化合物は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９， ９２３ （１９８９）に開示される式（Ｉ）：
【００１３】
【化４】
2004500395.tif 000002
を有するクリサンソンＡ；
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２９， Ｎ°８， ｐｐ． ２４９９−２５０２（１９９０）に開示される式（ＩＩ）：
【００１４】
【化５】
2004500395.tif 000003
を有するクリサンソンＢ；
およびＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２９， Ｎ°８， ｐｐ． ２４９９−２５０２（１９９０）に開示される式（ＩＩＩ）：
【００１５】
【化６】
2004500395.tif 000004
を有するクリサンソンＣである。
【００１６】
本発明による化合物が抗血管形成活性を有することが示されたが、それゆえ本発明による化合物は、異常な血管形成により特徴付けられる疾患の治療に有用な薬剤である可能性がある。
本明細書に開示する発明の一対象は、抗血管形成活性を有する薬剤の調製のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。本明細書に開示する発明の他の対象は、腫瘍型疾患の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
【００１７】
本明細書に開示する発明の他の対象は、腫瘍転移の予防および縮小のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
本明細書に開示する発明の他の対象は、関節炎疾患の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
本明細書に開示する発明の他の対象は、糖尿病性網膜症の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
【００１８】
本明細書に開示する発明の他の対象は、乾癬の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
本明細書に開示する発明の他の対象は、慢性炎症性疾患の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
本明細書に開示する発明の他の対象は、アテローム性動脈硬化症の治療のためのクリサンソンＡ、またはクリサンソンＢ、またはクリサンソンＣの使用である。
【００１９】
本発明による化合物は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９， ９２３ （１９８９）およびＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２９， Ｎ°８， ｐｐ． ２４９９−２５０２ （１９９０）に開示されているように得ることができる。
以下に、本発明を説明するいくつかの実験データを示す。
【００２０】
実施例１
クリサンソンＡに関する活性試験
この化合物の薬理活性を、主要な血管形成メカニズムを再現する予測生物試験を用いてインビトロで評価した。これらの試験は、被験化合物のプロ−血管形成活性または抗−血管形成活性を評価するために一般に用いられる。
【００２１】
毒性試験
クリサンソンＡ固有の毒性の評価を、以下に開示するスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）細胞毒性試験を用いてそれをスラミンと比較することにより行った。
ウシの微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）を、９６穴マイクロタイタープレート上、通常の培養培地（２００μｌ／ウェル）中３０００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、試験化合物をスカラー濃度でウェルに添加した。播種後３日目に、培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄終了時、２００μｌの培養培地を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に、さらに４８時間置いた。このインキュベーション工程終了時、培地を除去し、次いで細胞を１時間１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液で冷処理した。プレートを水に浸し、その後ひっくり返して水を除去することにより、蒸留水を用いてウェルを３回洗浄した。２００μｌ／ウェルの１％酢酸中０．４％のＳＲＢをプレートに添加し、次いで３０分間インキュベートした。ウェルを３回１％酢酸で洗浄し、そして最終的に２００μｌ／ウェルのトリス１０ｍＭを添加した。
ウェルの染色を、５４０ｎｍの波長での分光光度計の記録により定量した。試験化合物および対照を含むウェルに関して得られた値の比較により、細胞毒性活性の５０％対応する濃度（ＩＣ５０）および最も高い非細胞毒性濃度（ＩＣ０）としてそれぞれ規定される、本発明による化合物のＩＣ５０およびＩＣ０を決定することができた。
得られた、表１に示す結果は、クリサンソンＡがＢＭＥＣに関して１．５μＭのＩＣ５０を有することを示す。
【００２２】
化学走性試験
本試験は、血管形成阻害活性または血管形成促進活性を有する可能性のある化合物に関する最初のスクリーニングアッセイである（Ｇｌａｓｅｒ Ｂ． Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， １９８０； ２８８： ４８３−４）。
本発明が関する化合物の一つ、クリサンソンＡをＢｏｙｄｅｎチャンバーを用いる化学走性試験に供した（Ｗｅｒｎｅｒ Ｆ．， Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｒ． Ｈ． ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ Ｅ． Ｊ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８０； ３３： ２３９−２４７）。
【００２３】
このインビトロアッセイの実現には、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）およびウシ副腎髄質内皮細胞（ＢＭＥＣ）両細胞の単離および培養のための技術、ならびに適当な参照化合物の同定のための技術の開発が必要であった。化学走性試験のためにＢｏｙｄｅｎチャンバーを用いる利点の一つは、定量データを得ることができることである。Ｂｏｙｄｅｎチャンバーは、８μｍの孔を有するポリカーボネートフィルターにより分けられる上部のウェルと下部のウェルから成る。化学誘引物質を含む溶液を下部のウェルに入れ、細胞を上部のウェルに入れる。インキュベーション工程後、化学走性刺激に反応してフィルターを横切って移動した細胞を、膜の底面において数える。
【００２４】
化学走性試験において、選択した化学走性誘引物質は、ウシ血清（ＤＭＥＭ培養培地中１％）であった。ＢＭＥＣ内皮細胞を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ中に新たに懸濁し、次いでこの試験にて４時間分析した。化学走性は、光学顕微鏡下で直接細胞数を数えることにより定量した。「％移動」として示す化学走性に関する表に示す移動率は、式：
（Ｔ−Ｃ／Ｃ）×１００
式中、Ｔ＝試験試料において移動している細胞の平均数（ｎ°）、およびＣ＝対照において移動している細胞の平均数である；
に従い算定した。
【００２５】
試験化合物で処理しなかった細胞から成る、血清の方へ移動している対照が、各化学走性実験に含まれた。
移動している細胞の平均数は、試料当たり４つの独立の化学走性ウェルにおける、５つの顕微鏡視野／ウェルの記録に関するものである。
通常通り、化学走性試験には参照化合物としてスラミンを用いる。
得られた結果を表１に示すが、ＩＣ０に対応する０．４μＭのクリサンソンＡを用いる２つの独立した実験において、ＢＭＥＣの移動の阻害はそれぞれ４４％±０．７および５２％±２．８であったことが示される。
【００２６】
【表１】
2004500395.tif 000005
【００２７】
実施例２
クリサンソンＣに関する活性試験
本試験は、実施例１に開示する方法を用いて行った。
得られた、表２に示す結果は、クリサンソンＣがＢＭＥＣに関して３５μＭのＩＣ５０を有することを示す。
化学走性試験
本試験は、実施例１に開示する方法を用いて行った。
得られた、表２に示す結果は、そのＩＣ０に対応する１０μＭのクリサンソンＣを用いて、ＢＭＥＣの移動の阻害が５４％±７．６であったことを示す。
【００２８】
【表２】
2004500395.tif 000006
【００２９】
実施例３
クリサンソンＡを用いるヒト腫瘍系統に関する細胞毒性試験
本実験は、実施例１に開示する毒性試験法を用いて行った。
以下の４のヒト腫瘍系統を試験した：ＭＣＦ−７；Ｍｅｓ−Ｓａ；ＬｏＶｏ；およびＬｏＶｏ−Ｄｘ。
得られた、表３に示す結果は、クリサンソンＡが被験腫瘍系統において直接的な細胞毒性効果を持つことを示す。
【００３０】
【表３】
2004500395.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004500395.tif 000012
2004500395.tif 000013
2004500395.tif 000014
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2004500395.tif 000016
2004500395.tif 000017
2004500395.tif 000018
2004500395.tif 000019
2004500395.tif 000020
2004500395.tif 000021
2004500395.tif 000022
2004500395.tif 000023
2004500395.tif 000024
2004500395.tif 000025
2004500395.tif 000026
2004500395.tif 000027
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500395.tif 000028
2004500395.tif 000029
【国際調査報告】
2004500395.tif 000030
2004500395.tif 000031
2004500395.tif 000032
2004500395.tif 000033