(57)【要約】本発明は、基底細胞癌にｉｎ  Ｖｉｖｏのシクロパミンの使用により、通常表皮基底層及び毛包の未分化細胞を含む、正常組織細胞を維持しながら、腫瘍細胞の分化、さらに同時に、高い効率でアポトーシス及び腫瘍細胞の除去による、治療効果を実現することに関する。シクロパミンによるアポトーシスの因果関係は、非遺伝子毒性である。これらの効果は、シクロパミンの使用が、基底層細胞癌、及び増殖と、アポトーシスの抑制のためのヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する他の腫瘍細胞の治療に著しく望ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底細胞癌の局所治療における、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項２】
基底細胞癌の局所治療に使用するために、シクロパミン、又は医学的に許容可能な化合物を製造するためのシクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項３】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療における、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項４】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に使用のための医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項５】
基底細胞癌の局所治療における、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項６】
基底細胞癌の局所治療に使用のための、医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項７】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による、基底細胞癌の治療における、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項８】
腫瘍内注射を含む、非局所的手段による基底細胞癌の治療に使用のための医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項９】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項１０】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用方法。
【請求項１１】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【請求項１２】
増殖のため、及び／又はアポトーシス或いは細胞分化の防止のための、ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号伝達経路を使用する腫瘍の治療における、医学的に許容可能な化合物を製造するための、シクロパミン、医学的に許容可能なシクロパミン塩、又はシクロパミン誘導体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
基底細胞癌及び他の腫瘍の治療におけるシクロパミンの使用方法。
本発明は、正常な表示基底層及び毛包の未分化細胞を含む、正常な組織細胞を維持しながら、腫瘍細胞の分化、及びこれと同時にアポトーシス及びこれらの腫瘍細胞の除去を生じることによって治療効果を達成するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの基底細胞癌（ＢＣＣ）へのシクロパミンの使用に関する。シクロパミンによりアポトーシスを引き起こすことは、非遺伝毒性の機構によるものであり、従って、ＤＮＡに損傷を引き起こす作用を有する放射線治療及び、現在使用されるほとんどの癌の化学療法薬とは異なっている。従来の癌の化学療法薬により達成されなかった、これらの新規の効果により、癌治療に、さらにＢＣＣと、増殖のため、及びアポトーシスの防止のためのヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄシグナル信号伝達経路を使用する他の腫瘍との治療において、シクロパミンの使用が、非常に望ましいものとなった。
【背景技術】
【０００２】
基底細胞癌は、一般的な上皮腫瘍である。発病率は、加齢により上昇する。現在のＢＣＣの治療は、正常組織の縁と共に腫瘍を外科的に削除することと、手術の実現可能性がないか、又は望ましくない場合における、電離放射線又は他の手段による、腫瘍細胞の破壊とを含む。潜在的な副作用として、傷及び美感を損なうことがあるが、腫瘍細胞を残さない外科的切除は、回復を実現する。放射線治療は、回復不可能なほどの大量のＤＮＡの損傷を起こし、次に、腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにより、作用する。放射線治療の作用の形態、すなわちＤＮＡの損傷に続く、アポトーシスは、癌治療に現在使用されている多くの化学療法剤と同様である。しかし、放射線治療、及び細胞障害性の癌の化学治療は、腫瘍細胞に加えて、患者の正常細胞内のＤＮＡ損傷を生じる可能性を有する。その結果、癌治療におけるそれらの有効性及び実用性は著しく限定される。さらに、放射線及び遺伝毒性癌の化学療法の使用に伴うジレンマとして、最初の腫瘍の治療が実現できたとしても、最初の腫瘍の治療中に被ったＤＮＡの損傷及び生じた変異により、患者の新規癌の発生リスクが著しく上昇していくという、不安な要因がある。従って、非遺伝毒性手段により、選択的に腫瘍細胞にアポトーシスを起こすことは、癌治療の分野において、最適であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＢＣＣはしばしば、発生中に組織のパターニングに影響を与えることにより、最初に同定されたヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質に対する受容体として作用する、膜貫通型のタンパク質をエンコードするパッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）遺伝子の非活性変異を示している。ヘッジホッグによってリガンドされない場合、パッチドタンパク質は、他の膜貫通タンパク質ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄによる細胞内情報伝達を抑制するように作用する。ヘッジホッグとパッチドの結合は、この抑制の緩和を生じる。ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄによって緩和された細胞内情報伝達は、次に、ヘッジホッグ標的遺伝子の発現、及び細胞内の役割の変性を最終的に生じる一連の細胞内の事象を開始する。ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路の情報伝達の一般的な形態は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で同定され、ショウジョウバエからヒトまで多様な生体組織へ受け継がれている。しかし、経路は、より進化した組織では、より複雑である（ヒトにおいては、ショウジョウバエの単一パッチド遺伝子に非常に類似を示す一つ以上の遺伝子が存在する等）。パッチドの非活性変異は、ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路を経由する構造的な（リガンドなしの）信号伝達を生じることが見出された。ヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路の過活性は、パッチド及び／又は更に下流の経路の要素の変異により生じ、全てのＢＣＣ内で見出される。母斑性基底細胞癌症候群（ＮＢＣＣＳ）は、パッチドのハプロ不全により生じる。ＮＢＣＣＳの患者は、全ての細胞が既に変異パッチドのため、老化するにつれ、複数のＢＣＣを発生させる。
【０００４】
ステロイドアルカロイドである、シクロパミンは、以下に示す化学式である。
【０００５】
【化１】
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シクロパミンは、ユリ科のベラトラム  カリフォルニカム（Ｖｅｒａｔｒｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）により見出され、ベラトラム  カリフォルニカム及び他のソースから精製により取得され得る。シクロパミンによるヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路の抑制は、鶏の胚及びマウスの培養細胞により見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
局所適用のため、シクロパミンは、エタノール又は、他の適した溶剤、及び適したもととなる（ベース）クリーム、軟膏、又はゲルの混合物により溶解され得る。シクロパミンは、ハイドロゲル、又は放出制御可能な医学的に適用可能な形態により取り込まれ得、且つ皮膚班において吸収され得る。図１Ａ〜図１Ｄ、図２Ａ〜図２Ｆ、図３Ａ〜図３Ｇ、図４Ａ〜図４Ｄに示される効果は、クリーム内に最終濃度が１８ｍＭのシクロパミンを得るために、エタノール内のシクロパミンの溶液をベースクリームと混合することにより取得されたクリーム調合液により得られてきた。使用したベースクリームは、重パラフィンオイル（１０重量％）、ワセリン（１０重量％）、ステアリルアルコール（８重量％）、ポリオキシルステアレス−４０（３重量％）及び水（６８重量％）から主に製造されるが、他の適切に調合したベースクリームがさらに可能である。最適な投薬量として医学的に適用可能な形態のシクロパミンの最適な濃度及び投与のスケジュールは、特定の医学的に適用可能な形態、局在化、腫瘍を含む皮膚の特性（表皮の厚さ等）、及び腫瘍の大きさ等の因子により、明らかに影響を受け得る。しかしこれは、周知の公開された最適化の方法に従って、判定され得る。図１Ａ（鼻唇溝上のＢＣＣ、表面に約４×５ｍｍ）及び図１Ｃ（額のＢＣＣ、表面に約４×４ｍｍ）に示される腫瘍に従った、投薬量及び投与のスケジュールは、以下の通りである。１０±２μｌのクリームが、約午前９時から開始して、約３時間半の間隔で一日に４回、鉄へらを使用して、ＢＣＣ上に直接塗布された。睡眠中に患者の皮膚からシーツへ、クリームを失う可能性のために避けられた、夜間の塗布は、適切な皮膚班に対して実施され得る。本発明に記載された、シクロパミンへの露出による、正常な上皮細胞及び毛包細胞の未分化細胞の維持は、水溶液を直接腫瘍内に注射、水溶液又は、リポソームに取り込まれたシクロパミンの全身投与等の他の可能な投薬形態により耐容投薬量についての情報を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、シクロパミンへの露出によりＢＣＣの急速な臨床的退行を示している。シクロパミンの露出の一週間以内の幾つかの腫瘍領域の視覚的な消失の他に、図１Ｂと図１Ａ、図１Ｄと図１Ｃの比較により見られるように、典型的な半透明の外観が失われる。
【０００８】
図２Ａ〜図２Ｆは、シクロパミンの投与から５、６日目の正常組織縁と共に外科削除の対象となった、腫瘍領域の顕微鏡による外観を示し、ＢＣＣが、ほとんどの前治療領域で消失されるが、ほんの一部の領域で、高さの著しい減少はあるが、完全には未だ消失しておらず、従って、顕微鏡観察の対象の残留腫瘍細胞を有している。
【０００９】
図２Ａ及び図２Ｂは、組織切片上で、視覚的に消失した腫瘍の小結節に対応した皮膚領域を示している。腫瘍は、非常に少量の物質の内部と、検出不可能な腫瘍細胞とを含む嚢胞性の構造を残して、消失したように観察され得る。
【００１０】
図２Ｃは、ｉｎＶｉｖｏにおいて、依然として可視的なＢＣＣが含まれる皮膚領域の顕微鏡の外観を示している。これらの領域は、腫瘍の中心内の巨大な嚢胞を示す残留ＢＣＣ、及び外周に向かう、様々な大きさにより、残留ＢＣＣ細胞の間に位置した小さな嚢胞構造が含まれることが観察される。
【００１１】
図２Ｄ及び図２Ｅは、残留ＢＣＣの、内部と柵状化した周囲の領域の１０００倍の外観を示し、腫瘍領域には関係なく、残留ＢＣＣ細胞の間の大規模なアポトーシス活性の存在を示している。高倍率は、アポトーシスの形態、及び、図２Ｄにおいて実証されたように、アポトーシス性の中隔細胞の除去により、三つの小さな嚢胞が、大きな嚢胞に近接結合する、細胞のアポトーシス性の除去による、嚢胞構造の形成を示すＢＣＣ細胞の非常に増加した頻度を示している。
【００１２】
図２Ｆは、偽薬のクリーム（即ち、偽薬中に、シクロパミンが存在しないことを除けば、シクロパミンクリームと同一の調合のクリーム）による治療後のＢＣＣを示し、対照的に、腫瘍性ＢＣＣ細胞とアポトーシス活性が検出されないことを示している。
【００１３】
アポトーシスとなった細胞はマクロファージ、及び正常組織内の近隣の細胞により除去されることが公知であり、ヘマトキシリン  エオジン染色済みの切片上の形態学的な基準によるアポトーシス活性の定量は、過小評価を提供することが公知である。それにも関わらす、表１に示される定量データは、残留ＢＣＣ細胞間にシクロパミンにより生じたアポトーシス活性の著しい上昇を示している。
【００１４】
シクロパミン治療されたＢＣＣ内の透過性の喪失は、シクロパミンの影響による、興味深いＢＣＣの分化の可能性を上昇する。ＢＣＣの免疫組織化学分析によって検査され得る、この可能性は、本発明の事例において、見出せられ得る。正常な表皮では、基底層細胞から上皮層細胞への分化は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４モノクローナル抗体を使用した標識の喪失に付随して実現される。さらに、Ｂｅｒ−Ｅｐ４はＢＣＣ細胞を標識し、それらの新生物に対するマーカとして公知である。図３Ａ、図３Ｂ、及びテーブル１の定量データは、Ｂｅｒ−Ｅｐ４が、偽薬治療後の全ての周縁柵状細胞と、ＢＣＣの内部細胞の９０％以上を強力に標識するが、シクロパミン治療後の残留周辺細胞、又は内部細胞が、Ｂｅｒ−Ｅｐ４により、標識されないことを示している。シクロパミンの影響によるＢＣＣの分化は、今まで他の手段は知られておらず、免疫組織化学の基準によるｉｎ  Ｖｉｔｒｏ及び全ての細胞で実現するため、非常に例外的な、癌の治療の独立した価値を有する。
【００１５】
他の分化のマーカ、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型は、ＢＣＣ又は正常表皮の基底層細胞を通常標識しないが、分化後の上層細胞を標識する。図３Ｃは、レクチンを使用して、シクロパミン治療後のＢＣＣの残留細胞の異質の標識を示し、Ｂｅｒ−Ｅｐ４により検出される分化の工程から、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型により検出される工程までずっと、ＢＣＣ細胞の分化の一部を示している。
【００１６】
Ｐ５３は、ＤＮＡ損傷に対する細胞の反応の主要な調整因子である。このタンパク質の量は、遺伝子毒性剤への細胞の露出により細胞核内に増加することが公知である。ＤＮＡ損傷が、閾値を越えて増加した場合、ｐ５３は細胞にアポトーシス性の死を引き起こす。現在一般的に公知のガンの放射線治療、及び遺伝子毒性の癌の化学療法は、この機構により、即ち、ＤＮＡの損傷により生じるアポトーシスを引き起こすことにより、大部分が作用する。モノクローナル抗体ＤＯ−７は、正常形態及びミスセンス変異形態（非機能的な）のｐ５３の双方に結合し得、ＤＮＡ損傷剤に露出した細胞内のｐ５３の増加を検出する能力を有することが公知である。
【００１７】
図３Ｄ、図３Ｅ及びテーブル１の定量データは、ＤＯ−７標識強度、及び標識細胞の頻度が、偽薬治療後のＢＣＣと比較して、シクロパミン治療後のＢＣＣでは顕著に減少されていることを示している。従って、シクロパミンは、シクロパミン治療後のＢＣＣ細胞の核内のｐ５３を増加させないだけではなく、むしろ減少を生じさせる。ｐ５３の発現が、分化による表皮細胞の減少であると公知であるため、シクロパミン治療後のＢＣＣのＤＯ−７標識の減少は、ＢＣＣ細胞のシクロパミン−誘発分化のために生じる可能性が高い。いかなる場合においても、ｐ５３の発現の顕著な減少にも関わらず、シクロパミン治療後のＢＣＣの大量のアポトーシス活性は、シクロパミン−誘発した腫瘍細胞のアポトーシスが非遺伝毒性によるものであることを意味する。
【００１８】
ＢＣＣの増殖の停止は、基質からの収縮に関連することが公知である。基質からの収縮が、不適切な固定及び組織の処理により人工的に生じ得るが、公知の技術的な詳細の遵守は、このような影響の回避を保証する。図３Ｆ及び図３Ｇに示すように、偽薬治療ではないが、シクロパミン治療後のＢＣＣでは、一貫して基質から収縮される。従って、シクロパミンへのＢＣＣの露出は、さらに、増殖の停止に関連することは明白である。
【００１９】
図４Ａ〜図４Ｄは、シクロパミン治療後のＢＣＣ上及び周囲に見出される通常の皮膚組織のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示している。シクロパミンを使用して治療した、異なる表皮領域が、図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示されることにより、Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用して標識した通常のパターン、即ち基底層細胞の標識を表示する。同様に図４Ｄは、シクロパミンに露出した毛包に対する通常のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示している。従って、通常表皮及び毛包の未分化細胞は、ＢＣＣと同様の、同一のスケジュール及び量のシクロパミンに露出されるにもかかわらず、維持される。
【００２０】
未分化組織細胞を維持する量において、シクロパミンによるｉｎ  Ｖｉｖｏの腫瘍細胞の高効率の分化、及びアポトーシスの発生は、非遺伝子毒性のシクロパミンの作用とあわせて、ＢＣＣだけでなく、増殖と、アポトーシスの及び／又は、分化の抑制とにヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路を利用する、他の内部の腫瘍へのシクロパミンの使用を支持する、従来未知の功績である。
【００２１】
【表１】
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図１Ａ〜図１Ｄは、一週間未満の期間内で、消失した腫瘍領域（矢印で示される）、皮膚の表面から高さの顕著な減少及び、透光性の消失によって示されるように、シクロパミン治療後のＢＣＣの急速な退行の顕微鏡外観である。
【００２２】
図２Ａ〜図２Ｆは、シクロパミン誘引の大量のアポトーシス、及び腫瘍細胞の除去、及び腫瘍細胞が無い嚢胞空間を残した腫瘍小塊の消失を示す、シクロパミン治療後のＢＣＣ、及び偽薬治療後のＢＣＣの顕微鏡の外観である。通常組織の縁と共に、ＢＣＣの前治療の位置に対応する皮膚領域が、シクロパミンの露出の５日目及び６日目に、外科的削除され、及び従来法による固定の対象とされ、切開削除、顕微鏡解析のためにヘマトキシリン  エオジン染色したものである。
【００２３】
図３Ａ〜図３Ｇは、シクロパミンに露出に付随した、シクロパミンの影響と、ＢＣＣ内のｐ５３発現の減少により、全ての残留ＢＣＣ細胞の分化を示すシクロパミン治療、及び偽薬治療後のＢＣＣの免疫組織化学解析である。全ての免疫組織化学標識は、ビオチン標識の二次抗体と結合したストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼを使用した。
【００２４】
図３Ａ及び図３Ｂは、シクロパミン治療後のＢＣＣ内の全ての残留細胞が、Ｂｅｒ−Ｅｐ４により、検出される工程に向けて、又は工程を越えて分化されることを示している。Ｂｅｒ−Ｅｐ４は、正常の表皮基底層、及び毛包の未分化細胞と同様に、ＢＣＣ細胞を染色するが、正常表皮の分化後の上層細胞は染色しない、公知の分化マーカである。
【００２５】
図３Ｄ及び図３Ｅでの、ｐ５３の発現は、表皮基底細胞の分化、及び培養後のケラチノサイトの分化を減少することが公知である。細胞が遺伝毒性剤に露出された場合に、ＤＯ−７で検出可能なｐ５３の量が細胞内で増加することは周知である。
【００２６】
図３Ｆ及び図３Ｇで示された切片は、過ヨウ素酸シッフ、及びアルシアンブルーを使用して染色された。
図４Ａ〜図４Ｄは、ＢＣＣと同じように、シクロパミンの同一のスケジュール及び投薬量に露出したにもかかわらず、正常の表皮及び毛包の未分化細胞が維持されることを示している。免疫組織化学検出の手順は、図３Ａ，図３Ｂと同様であり、標識は茶色で示される。
【００２７】
免疫組織化学のデータ及び知見が、グレースケールよりカラーの方が最適に伝達し得るため、１２ページと同一の図のカラープリント（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ，図１Ｄ、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ，図２Ｅ，図２Ｆ、図３Ａ，図３Ｂ，図３Ｃ，図３Ｄ，図３Ｅ，図３Ｆ，図３Ｇ，図４Ａ，図４Ｂ，図４Ｃ，図４Ｄ）を、１２ａページとして加えた。出願人は、特許庁によりこの事実を考慮され及び、１２ａページを特許出願の一部として扱われることを要求する。しかしながら、ページ１２ａは、特許庁により必要であるとみなされた場合、本特許出願より除去され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】治療前の、左鼻唇溝に位置するＢＣＣ。
【図１Ｂ】局所シクロパミン治療が５日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図１Ｃ】治療前の、額に位置するＢＣＣ。
【図１Ｄ】局所シクロパミン治療が６日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図２Ａ】残留腫瘍細胞が無いことを示す腫瘍細胞小隗が消失した位置に対応する真皮内の大きな嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｂ】シクロパミン治療前はＢＣＣを含んでいるが、治療後はＢＣＣを含まなくなった他の表皮領域内の同様な嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｃ】残留細胞と、細胞の間の多数の小型の嚢胞が結合することによる大型の嚢胞の形成とを示す図１ＤのＢＣＣ領域の低出力画像（倍率１００倍）。
【図２Ｄ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｅ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの周辺領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｆ】腫瘍の典型的な腫瘍細胞、及びアポトーシスが無い偽薬治療後のＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図３Ａ】シクロパミン治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が染色されないことを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｂ】図３Ａと対照的に、偽薬治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が非常に強く染色されていることを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｃ】ＢＣＣ細胞、又は正常皮膚の基質層細胞を通常、標識しないが、分化後の上層細胞を標識するこのレクチンにより検出される工程までずっと同一のＢＣＣ細胞の分化を示す、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型を使用したシクロパミン治療後のＢＣＣの残留細胞の異質の標識を示している免疫組織化学解析（倍率１０００倍）。
【図３Ｄ】シクロパミン治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現の減少を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｅ】図３Ｄと比較して、偽薬治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｆ】シクロパミン治療後により観察される、腫瘍細胞の増殖の停止に関すると公知の形態である、基質からのＢＣＣの一貫した収縮を示している免疫組織化学解析（矢印は収縮を示す）（倍率１００倍）。
【図３Ｇ】偽薬治療後により、収縮が観察されないことを示している免疫組織化学解析（基質からの収縮に関してシクロパミン治療後のＢＣＣと偽薬治療後のＢＣＣの違いは、更に３Ｄ、２Ｃ対３Ｂ、３Ｅにおいても観察される）（倍率１００倍）。
【図４Ａ】シクロパミン治療後の表皮の基底層細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識（倍率４００倍）。
【図４Ｂ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｃ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｄ】Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用した正常標識を示しているシクロパミン治療後の毛包の高出力画像（倍率１０００倍）。
【国際公開パンフレット】
2004536045.tif 000004
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536045.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成14年5月25日(2002.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、正常な表示基底層及び毛包の未分化細胞を含む、正常な組織細胞を維持しながら、腫瘍細胞の分化、及びこれと同時にアポトーシス及びこれらの腫瘍細胞の除去を生じることによって治療効果を達成するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの基底細胞癌（ＢＣＣ）へのシクロパミンの使用に関する。シクロパミンによりアポトーシスを引き起こすことは、非遺伝毒性の機構によるものであり、従って、ＤＮＡに損傷を引き起こす作用を有する放射線治療及び、現在使用されるほとんどの癌の化学療法薬とは異なっている。従来の癌の化学療法薬により達成されなかった、これらの新規の効果により、癌治療に、さらにＢＣＣと、増殖のため、及びアポトーシスの防止のためのヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄシグナル信号伝達経路を使用する他の腫瘍との治療において、シクロパミンの使用が、非常に望ましいものとなった。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
未分化組織細胞を維持する量において、シクロパミンによるｉｎ  Ｖｉｖｏの腫瘍細胞の高効率の分化、及びアポトーシスの発生は、非遺伝子毒性のシクロパミンの作用とあわせて、ＢＣＣだけでなく、増殖と、アポトーシスの及び／又は、分化の抑制とにヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路を利用する、他の内部の腫瘍へのシクロパミンの使用を支持する、従来未知の功績である。
更なる実施例
図５Ａは、上部鼻領域上に巨大な潰瘍を生じた６８歳の男性の治療前のＢＣＣを示している。シクロパミンクリーム（上記のベースクリームに１８ｍＭシクロパミン）は図５Ａで示されるＢＣＣの下半分に塗布された。３時間ごとに、約２０μｌのクリームが直接下半分に塗布され、上半分が治療されなかった。したがって、最上部の腫瘍細胞（図５Ａ）は、直接塗布された領域からの拡散により受け取ったシクロパミンはほとんどありえず、たとえあったとしても、比較的に、非常に低濃度のシクロパミンに露出される。図５Ｂは、研究のために外科的削除する直前の治療５４時間の腫瘍を示している。急速に収縮した腫瘍が、シクロパミンを塗布した下半分では起きた一方、直接塗布した領域からもっとも離れた腫瘍領域では、比較的に変化が見られない（図５Ｂの図の右上部に対する領域）。図５Ｃは、削除した組織の下部（シクロパミン治療後）をヘマトキシレン  エオシン染色した切片を示している。多くのアポトーシス細胞が、腫瘍細胞の死と除去により生じて形成される様々な嚢胞とともに示される（図５Ｃ）。対照的に、シクロパミンを塗布した領域からもっとも離れた同一の腫瘍の非治療領域は、分裂を示し、アポトーシス細胞が検出されない凝集した腫瘍組織を示している（図５Ｄ）。図５Ｅと、図５Ｆは、Ｋｉ６７抗原に対して、ＫｉＳ５抗体（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ  Ｇｌｏｓｔｒｕｐデンマーク）を使用して、シクロパミン治療後と非治療のそれぞれを免疫組織化学染色した組織切片を示している。Ｋｉ６７抗原は、増殖細胞の公知のマーカであり、腫瘍細胞のシクロパミン治療後の領域では発現していないが（図５Ｅ）、シクロパミン治療した領域からもっとも離れた腫瘍細胞では明らかに増殖活性を示している（図５Ｆ）。Ｋｉ６７抗原に対する抗体により染色された組織切片は、記載した条件の下でシクロパミンにより腫瘍細胞の増殖がさらに停止されることを示している。
毛包上皮腫はＨｅｄｇｅｈｏｇ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号の増加を生じる遺伝子変異に関する別の腫瘍である（ボレチョブスキー  エル（Ｖｏｒｅｃｈｏｖｓｋｙ  ｌ）等、（１９９７年）キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）５７、４６７７−４６８１、ニルソン  エム（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍ）等、（２０００年）  プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  サイエンス  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）９７、３４３８−３４４３）。図６Ａは、８２歳の男性の頬にある治療前の毛包上皮腫を示し、図６Ｂは、シクロパミンクリームに２４時間のみ露出した後の同一の皮膚領域を示している（ベースクリームに１８ｍＭシクロパミン、約２５μｌのクリームを腫瘍に３時間ごと塗布）。急速な収縮のため、治療は２４時間で中止され、最初の腫瘍に対応するすべての皮膚の領域が研究のために削除された。図６Ｃと図６Ｄは２４時間の残留腫瘍細胞を含む組織領域を示し、それらの残留腫瘍細胞内の、著しいアポトーシス性の活性を明らかにする。腫瘍の単核細胞性の浸潤と（図６Ｄ）同様に、腫瘍細胞のアポトーシス性の除去により生じた嚢胞空間（図６Ｃと図６Ｄ）が示される。別の本発明の注目に値する発見は、２４時間の治療により、治療した腫瘍の近傍に位置したあざの大きさや色素沈着の減少である（図６Ｂと図６Ａとを対比して）。シクロパミンが、適用した近接領域から拡散され得るように、あざ（良性のメラニン性腫瘍）は、比較的低濃度のシクロパミンに感受性を示している。
図７Ａは、５９歳の男性の下部眼陰部における色素沈着した治療前のＢＣＣを示している。シクロパミンクリーム（ベースクリーム内に１８ｍＭシクロパミン）が、矢印で示された一つを除き、患者の全ての小塊に適用された。この小塊は、近接した治療後の領域から拡散によるシクロパミンのみを受け取り得たとすると、比較的低濃度のシクロパミンに露出しうる。この腫瘍の色素性の性質が、臨床的追跡を容易にし、治療（約２０μｌシクロパミンクリームを４時間ごとに適用）は、治療領域内の腫瘍が大幅に退行したが、依然として可視部を含む３日目に、中断された（図７Ｂ）。次に腫瘍は、遅行効果の可能性を研究するために、治療せずに、追跡された。更なる明示の退行が治療なしでは観測されず、最初の腫瘍に対応する領域は、追跡の６日目に削除された（治療開始から９日目）。腫瘍の治療領域のヘマトキシレン  エオシン染色切片は、多くの腫瘍細胞が消失した嚢胞空間を明らかにする（図７Ｃ）。上皮を裏打ちが欠落するこれらの嚢胞は（図７Ｃ）、腫瘍細胞により以前占められていた組織領域の嚢胞の表示に準ずる。この時点で（治療せずに追跡して６日目）、比較的少数のアポトーシス細胞を表す組織切片は（図７Ｃ）、生組織からアポトーシス細胞の公知の急速な排除に準じた。一方で、残留細胞、特に嚢胞の端の近傍は、著しく高頻度で細胞が突起形状へ分化を示している（例えば、図７Ｃの左下部に対する領域、図７Ｄの別の領域で例証される高倍率でより明確に観察される）。分化又は嚢胞の同一の領域は、治療の開始前の同一の腫瘍から取得したパンチ生検には存在しない（図７Ｅ）。比較的低濃度のシクロパミンを受けた腫瘍の小塊は（図７Ａにおいて矢印で示される）、追跡６日目の大きな嚢胞中心を有した（図７Ｆ）。しかし、残留小塊の周辺は、（例えば、増大、さらに、好酸性細胞質を伴う）分化した形態の細胞の頻度が、さらに増加し、及び小型の嚢胞が、この周辺内部に存在していたが、典型的なＢＣＣ形態を有し続ける（図７Ｆ）。したがって、最適な濃度のシクロパミンに応答する腫瘍は、比較的急速であり、最適に及ばない濃度の露出は、追跡中に生存する腫瘍細胞を残す。
これらの更なる例は、ＢＣＣと、増加したｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号を示す他の腫瘍（毛包上皮腫）との急速臨床収縮を得る記載した治療の効率性を立証する。臨床収縮は、腫瘍細胞のシクロパミン誘導分化及びアポトーシスに関するように見える。これに加えて、腫瘍細胞の増殖は、阻害される。異なる遺伝型の血縁関係を持たない患者のいくつかの独立した腫瘍に対する効率性は、記載した治療の一般的な実用性に準じた。
シクロパミンはシュロソウ植物の催奇性要素として発見された（ケリア  アール．エフ．（Ｋｅｅｌｅｒ．Ｒ．Ｆ）、（１９６９年）、サイトケミストリ（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃｔｒｙ）８  ２２３−２２５）。脳の発達において腹部細胞前駆体の分化を阻害することが、報告された（インカードナア  ジェイ．ピー．（Ｉｎｃａｒｄｏｎａ  Ｊ．Ｐ．）等、（１９９８年）、ディベロップメント１２５  ３４４３−３５６２、クーパー  エム．ケイ（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｍ．Ｋ）等、（１９９８年）、サイエンス２８０、１６０３−１６０７）。シクロパミンによる細胞の分化の抑制は、骨髄細胞から赤血球細胞への分化（デトマー  ケイ（Ｄｅｔｍｅｒ  Ｋ）等、（２０００年）、ディベロップメント  バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ）２２２−２４２）、尿生殖洞から前立腺への分化（バーマン  ディ．エム．（Ｂｅｒｍａｎ  Ｄ．Ｍ）、（２０００年）、ジャーナル  オブ  ウロロジ―（Ｊ．Ｕｒｏｌ）１６３，２０４）を含む、他の機構内でも報告されて来ている。しかし、反対のことが、シクロパミンに露出した腫瘍細胞を伴う本発明では真実であると見出された。腫瘍細胞のシクロパミン誘導の分化と同様に、さらに腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される。以前に記されていない、シクロパミンによる腫瘍細胞のアポトーシスの誘導は、高い効率を示している。さらにシクロパミンによるアポトーシスの誘導は、続いて生じる遺伝毒性作用を持たず、さらに腫瘍細胞が分化され、アポトーシスを受ける一方、腫瘍細胞に近接した毛包の外毛根鞘細胞、及び正常表皮基底細胞が、十分に維持されるという著しい特異性を有する。記載した悪影響の無い治療は、患者のシクロパミン適用領域にて臨床的に正常に見える健康な皮膚の存在により確認された（被験者に対して最も長期の追跡は、本記載時で１５ヶ月以上、さらに長期間の治療の安全性も示された）。上記の要約された形態の本発明に記載された治療は、がん治療で非常に求められ、がん治療の長年にわたる問題の解決策を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
免疫組織化学のデータ及び知見が、グレースケールよりカラーの方が最適に伝達し得るため、１２ページと同一の図のカラープリント（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ，図１Ｄ、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ，図２Ｅ，図２Ｆ、図３Ａ，図３Ｂ，図３Ｃ，図３Ｄ，図３Ｅ，図３Ｆ，図３Ｇ，図４Ａ，図４Ｂ，図４Ｃ，図４Ｄ）を、１２ａページとして加えた。出願人は、特許庁によりこの事実を考慮され及び、１２ａページを特許出願の一部として扱われることを要求する。しかしながら、ページ１２ａは、特許庁により必要であるとみなされた場合、本特許出願より除去され得る。
免疫組織化学のデータ及び知見が、グレースケールよりカラーの方が最適に伝達し得るため、ページ１２ｂの同一の図のカラー印刷（図５Ａ，図５Ｂ，図５Ｃ，図５Ｄ，図５Ｅ、図６Ａ，図６Ｂ，図６Ｃ，図６Ｄ，図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ，図７Ｄ，図７Ｅ，図７Ｆ）を、１２ｃページとして加えた。出願人は、特許庁によりこの事実を考慮され及び、１２ｃページを特許出願の一部として扱われることを要求する。しかしながら、ページ１２ｃは、特許庁により必要であるとみなされた場合、本特許出願より除去され得る。
免疫組織化学のデータ及び知見が、グレースケールよりカラーの方が最適に伝達し得るため、１２ページと同一の図のカラープリント（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ，図１Ｄ、図２Ａ，図２Ｂ，図２Ｃ，図２Ｅ，図２Ｆ、図３Ａ，図３Ｂ，図３Ｃ，図３Ｄ，図３Ｅ，図３Ｆ，図３Ｇ，図４Ａ，図４Ｂ，図４Ｃ，図４Ｄ）を、１２ａページとして加えた。出願人は、特許庁によりこの事実を考慮され及び、１２ａページを特許出願の一部として扱われることを要求する。しかしながら、ページ１２ａは、特許庁により必要であるとみなされた場合、本特許出願より除去され得る。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１Ａ】治療前の、左鼻唇溝に位置するＢＣＣ。
【図１Ｂ】局所シクロパミン治療が５日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図１Ｃ】治療前の、額に位置するＢＣＣ。
【図１Ｄ】局所シクロパミン治療が６日目の図１Ａと同一のＢＣＣ。
【図２Ａ】残留腫瘍細胞が無いことを示す腫瘍細胞小隗が消失した位置に対応する真皮内の大きな嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｂ】シクロパミン治療前はＢＣＣを含んでいるが、治療後はＢＣＣを含まなくなった他の表皮領域内の同様な嚢胞（倍率１００倍）。
【図２Ｃ】残留細胞と、細胞の間の多数の小型の嚢胞が結合することによる大型の嚢胞の形成とを示す図１ＤのＢＣＣ領域の低出力画像（倍率１００倍）。
【図２Ｄ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｅ】アポトーシス性の細胞と、ＢＣＣ細胞のアポトーシス性の除去による嚢胞の拡大と同時の形成との頻度の顕著な増加を示す図２Ｃのように、同一の残留ＢＣＣの周辺領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図２Ｆ】腫瘍の典型的な腫瘍細胞、及びアポトーシスが無い偽薬治療後のＢＣＣの内部領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図３Ａ】シクロパミン治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が染色されないことを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｂ】図３Ａと対照的に、偽薬治療後のＢＣＣの全ての残留細胞内にモノクローナル抗体Ｂｅｒ−Ｅｐ４が非常に強く染色されていることを示している免疫組織化学解析（倍率４００倍）。
【図３Ｃ】ＢＣＣ細胞、又は正常皮膚の基質層細胞を通常、標識しないが、分化後の上層細胞を標識するこのレクチンにより検出される工程までずっと同一のＢＣＣ細胞の分化を示す、Ｕｌｅｘ  ＥｕｒｏｐａｅｕｓレクチンＩ型を使用したシクロパミン治療後のＢＣＣの残留細胞の異質の標識を示している免疫組織化学解析（倍率１０００倍）。
【図３Ｄ】シクロパミン治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現の減少を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｅ】図３Ｄと比較して、偽薬治療後のＢＣＣ内のモノクローナル抗体ＤＯ−７により検出されるｐ５３の発現を示している免疫組織化学解析（倍率１００倍）。
【図３Ｆ】シクロパミン治療後により観察される、腫瘍細胞の増殖の停止に関すると公知の形態である、基質からのＢＣＣの一貫した収縮を示している免疫組織化学解析（矢印は収縮を示す）（倍率１００倍）。
【図３Ｇ】偽薬治療後により、収縮が観察されないことを示している免疫組織化学解析（基質からの収縮に関してシクロパミン治療後のＢＣＣと偽薬治療後のＢＣＣの違いは、更に３Ｄ、２Ｃ対３Ｂ、３Ｅにおいても観察される）（倍率１００倍）。
【図４Ａ】シクロパミン治療後の表皮の基底層細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識（倍率４００倍）。
【図４Ｂ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｃ】基底細胞のＢｅｒ−Ｅｐ４標識を示す治療後の表皮の領域の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図４Ｄ】Ｂｅｒ−Ｅｐ４を使用した正常標識を示しているシクロパミン治療後の毛包の高出力画像（倍率１０００倍）。
【図５Ａ】６８歳男性の上部鼻領域の潰瘍を生じた治療前のＢＣＣを示す顕微鏡写真。
【図５Ｂ】下半分に、シクロパミン適用した５４時間時点の図５Ａと同一のＢＣＣを示す顕微鏡写真。
【図５Ｃ】５４時間時点のＢＣＣのシクロパミンを適用した半分からの切片であって、ヘマトキシレン  エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による、倍率が４００倍の顕微鏡写真。
【図５Ｄ】同一のＢＣＣの非治療部位からの切片であって、ヘマトキシレン  エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による、倍率が４００倍の顕微鏡写真。
【図５Ｅ】５４時間時点のＢＣＣのシクロパミンを適用した半分からの切片であって、Ｋｉ６７抗原に免疫組織化学染色を使用した、倍率２００倍の顕微鏡写真。
【図５Ｆ】シクロパミン治療した領域からもっとも離れた腫瘍細胞では明らかに増殖活性を示している切片であって、Ｋｉ６７抗原に免疫組織化学染色を使用した、倍率２００倍の顕微鏡写真。
【図６Ａ】８２歳男性の頬の治療前の毛包上皮腫を示す顕微鏡写真。
【図６Ｂ】シクロパミン治療２４時間後の図６Ａと同一の皮膚領域を示す顕微鏡写真。
【図６Ｃ】残留腫瘍細胞とともに図６Ｂで示された削除した皮膚領域の切片であって、Ｈ＆Ｅ、倍率４００倍の顕微鏡写真。
【図６Ｄ】図６Ｃと同一の組織の別の領域であって、多くのアポトーシス細胞及び除去により形成された嚢胞構造に加えて、腫瘍が単核細胞により進入されることが観察される、Ｈ＆Ｅ、倍率２００倍の顕微鏡写真。
【図７Ａ】５９歳男性の下部眼陰部上の色素沈着した治療前のＢＣＣを示す顕微鏡写真。
【図７Ｂ】シクロパミン治療３日目の図７Ａと同一のＢＣＣを示す顕微鏡写真。
【図７Ｃ】図７Ｂに示されたＢＣＣの治療後の領域からの切片であって、Ｈ＆Ｅ、倍率２００倍の顕微鏡写真。
【図７Ｄ】ＢＣＣの治療後の領域からの切片内の残留腫瘍細胞の領域の接写であって、Ｈ＆Ｅ、倍率４００倍の顕微鏡写真。
【図７Ｅ】治療前の、図７Ａに示されたＢＣＣから取得されたパンチ検体物質からの切片であって、Ｈ＆Ｅ、倍率４００倍の顕微鏡写真。
【図７Ｆ】図７Ａの矢印により示されたＢＣＣの小塊の一部を含む切片であって、組織が治療の３日後に削除され、非治療で６日追跡した、Ｈ＆Ｅ、倍率１００倍の顕微鏡写真。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2004536045.tif 000020
【図１Ｂ】
2004536045.tif 000021
【図１Ｃ】
2004536045.tif 000022
【図１Ｄ】
2004536045.tif 000023
【図２Ａ】
2004536045.tif 000024
【図２Ｂ】
2004536045.tif 000025
【図２Ｃ】
2004536045.tif 000026
【図２Ｄ】
2004536045.tif 000027
【図２Ｅ】
2004536045.tif 000028
【図２Ｆ】
2004536045.tif 000029
【図３Ａ】
2004536045.tif 000030
【図３Ｂ】
2004536045.tif 000031
【図３Ｃ】
2004536045.tif 000032
【図３Ｄ】
2004536045.tif 000033
【図３Ｅ】
2004536045.tif 000034
【図３Ｆ】
2004536045.tif 000035
【図３Ｇ】
2004536045.tif 000036
【図４Ａ】
2004536045.tif 000037
【図４Ｂ】
2004536045.tif 000038
【図４Ｃ】
2004536045.tif 000039
【図４Ｄ】
2004536045.tif 000040
【図５Ａ】
2004536045.tif 000041
【図５Ｂ】
2004536045.tif 000042
【図５Ｃ】
2004536045.tif 000043
【図５Ｄ】
2004536045.tif 000044
【図５Ｅ】
2004536045.tif 000045
【図５Ｆ】
2004536045.tif 000046
【図６Ａ】
2004536045.tif 000047
【図６Ｂ】
2004536045.tif 000048
【図６Ｃ】
2004536045.tif 000049
【図６Ｄ】
2004536045.tif 000050
【図７Ａ】
2004536045.tif 000051
【図７Ｂ】
2004536045.tif 000052
【図７Ｃ】
2004536045.tif 000053
【図７Ｄ】
2004536045.tif 000054
【図７Ｅ】
2004536045.tif 000055
【図７Ｆ】
2004536045.tif 000056
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月23日(2003.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として、使用されるシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩。
【請求項２】
治療用適用に、ｉｎ  Ｖｉｖｏにおける細胞分化を誘導する能力を有する薬剤を製造するためにシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項３】
治療用適用に、ｉｎ  Ｖｉｖｏにおける細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する薬剤を製造するためにシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項４】
治療用適用に、ｉｎ  Ｖｉｖｏにおける細胞分化、及びアポトーシスを誘導する能力を有する薬剤を製造するためにシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項５】
薬剤は、ｉｎ  Ｖｉｖｏにおいて、腫瘍細胞に適用される請求項２乃至４のいずれか一項に記載のシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項６】
前記腫瘍細胞は、基底細胞癌である請求項５に記載のシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項７】
薬剤は、局所に適用される請求項２乃至６のいずれか一項に記載のシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項８】
薬剤の短期投与は、正常細胞を保護するが、腫瘍細胞の分化及び／又はアポトーシスを生じるためには十分である請求項５乃至７のいずれか一項に記載のシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項９】
適用は、化粧品目的である請求項２乃至４のいずれか一項に記載のシクロパミン又は、医学的に許容可能なシクロパミン塩の使用。
【請求項１０】
濃度０．００１ｍＭから１００ｍＭの範囲のシクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩と、灯油と、ワセリンと、一以上の種類のアルコールとを備える局所投与のために適した薬剤組成。
【請求項１１】
シクロパミン、又は医学的に許容可能なシクロパミン塩と、リポソームに取り込まれた医学的に許容可能なキャリアとを備える薬剤組成。
【請求項１２】
取り込みは、ハイドロゲル又は他の放出制御の薬剤形態である請求項１１に記載の薬剤組成。
【請求項１３】
シクロパミンの誘導体は、シクロパミンの代わりに使用され、前記誘導体が、生物学的標的へのシクロパミンの結合のために必要とされるシクロパミンの原子の集団を含み、しかし、新規の誘導した分子は継続的に前記同一の標的に特異的に結合する能力を有することにより、細胞分化及び／又はアポトーシスを誘導するような方法により、親シクロパミンの変更を含む分子である請求項１乃至９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
シクロパミンの誘導体は、シクロパミンの代わりに使用され、前記誘導体が、生物学的標的へのシクロパミンの結合のために必要とされるシクロパミンの原子の集団を含み、しかし、新規の誘導した分子は継続的に、前記同一の標的に特異的に結合する能力を有することにより、細胞分化及び／又はアポトーシスを誘導するような方法による、親シクロパミンの変更を含む分子である請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の薬剤組成。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
未分化組織細胞を維持する量において、シクロパミンによるｉｎ  Ｖｉｖｏの腫瘍細胞の高効率の分化、及びアポトーシスの発生は、非遺伝子毒性のシクロパミンの作用とあわせて、ＢＣＣだけでなく、増殖と、アポトーシスの及び／又は、分化の抑制とにヘッジホッグ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ経路を利用する、他の内部の腫瘍へのシクロパミンの使用を支持する、従来未知の功績である。
分子が、シクロパミンから誘導され得、又、構造形態を処理することにより、シクロパミンと同一の受容体の結合特性及び生物的／治療的作用を及ぼす方法によって、分子が合成され得ることが特に考えられる。本開示において、この分子は、「シクロパミン誘導体」と呼ばれ、以下のように定義される。分子は、生物学的標的にシクロパミンの結合を要求するシクロパミン分子の原子集団を含むが、新規のシクロパミン誘導体が同一の生物学的標的と特に結合する能力が継続することにより、本開示のシクロパミンの生物学的作用を及ぼすような方法で親シクロパミン分子の変更を含む。このようなシクロパミンの変更は、シクロパミン分子の許容可能な置換と、除去と、又は、生じた分子が、安定し、さらにシクロパミンと同一の生物学的標的に特に結合する能力となるよう処理されることにより、本開示による生物学的作用を及ぼすように提供されたシクロパミン分子への分子集団（特にメタノール族などの小分子集団）の付加とである。シクロパミンから誘導した新規の分子は、当業者により、容易に実現され、さらに、新規の誘導分子内のシクロパミンの生物学的作用の有無は、当業者による本開示の生物学的作用の試験により容易に判定され得る。
更なる実施例
図５Ａは、上部鼻領域上に巨大な潰瘍を生じた６８歳の男性の治療前のＢＣＣを示している。シクロパミンクリーム（上記のベースクリームに１８ｍＭシクロパミン）は図５Ａで示されるＢＣＣの下半分に塗布された。３時間ごとに、約２０μｌのクリームが直接下半分に塗布され、上半分が治療されなかった。したがって、最上部の腫瘍細胞（図５Ａ）は、直接塗布された領域からの拡散により受け取ったシクロパミンはほとんどありえず、たとえあったとしても、比較的に、非常に低濃度のシクロパミンに露出される。図５Ｂは、研究のために外科的削除する直前の治療５４時間の腫瘍を示している。急速に収縮した腫瘍が、シクロパミンを塗布した下半分では起きた一方、直接塗布した領域からもっとも離れた腫瘍領域では、比較的に変化が見られない（図５Ｂの図の右上部に対する領域）。図５Ｃは、削除した組織の下部（シクロパミン治療後）をヘマトキシレン  エオシン染色した切片を示している。多くのアポトーシス細胞が、腫瘍細胞の死と除去により生じて形成される様々な嚢胞とともに示される（図５Ｃ）。対照的に、シクロパミンを塗布した領域からもっとも離れた同一の腫瘍の非治療領域は、分裂を示し、アポトーシス細胞が検出されない凝集した腫瘍組織を示している（図５Ｄ）。図５Ｅと、図５Ｆは、Ｋｉ６７抗原に対して、ＫｉＳ５抗体（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ  Ｇｌｏｓｔｒｕｐデンマーク）を使用して、シクロパミン治療後と非治療のそれぞれを免疫組織化学染色した組織切片を示している。Ｋｉ６７抗原は、増殖細胞の公知のマーカであり、腫瘍細胞のシクロパミン治療後の領域では発現していないが（図５Ｅ）、シクロパミン治療した領域からもっとも離れた腫瘍細胞では明らかに増殖活性を示している（図５Ｆ）。Ｋｉ６７抗原に対する抗体により染色された組織切片は、記載した条件の下でシクロパミンにより腫瘍細胞の増殖がさらに停止されることを示している。
毛包上皮腫はＨｅｄｇｅｈｏｇ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号の増加を生じる遺伝子変異に関する別の腫瘍である（ボレチョブスキー  エル（Ｖｏｒｅｃｈｏｖｓｋｙ  ｌ）等、（１９９７年）キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）５７、４６７７−４６８１、ニルソン  エム（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍ）等、（２０００年）  プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  サイエンス  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）９７、３４３８−３４４３）。図６Ａは、８２歳の男性の頬にある治療前の毛包上皮腫を示し、図６Ｂは、シクロパミンクリームに２４時間のみ露出した後の同一の皮膚領域を示している（ベースクリームに１８ｍＭシクロパミン、約２５μｌのクリームを腫瘍に３時間ごと塗布）。急速な収縮のため、治療は２４時間で中止され、最初の腫瘍に対応するすべての皮膚の領域が研究のために削除された。図６Ｃと図６Ｄは２４時間の残留腫瘍細胞を含む組織領域を示し、それらの残留腫瘍細胞内の、著しいアポトーシス性の活性を明らかにする。腫瘍の単核細胞性の浸潤と（図６Ｄ）同様に、腫瘍細胞のアポトーシス性の除去により生じた嚢胞空間（図６Ｃと図６Ｄ）が示される。別の本発明の注目に値する発見は、２４時間の治療により、治療した腫瘍の近傍に位置したあざの大きさや色素沈着の減少である（図６Ｂと図６Ａとを対比して）。シクロパミンが、適用した近接領域から拡散され得るように、あざ（良性のメラニン性腫瘍）は、比較的低濃度のシクロパミンに感受性を示している。
図７Ａは、５９歳の男性の下部眼陰部における色素沈着した治療前のＢＣＣを示している。シクロパミンクリーム（ベースクリーム内に１８ｍＭシクロパミン）が、矢印で示された一つを除き、患者の全ての小塊に適用された。この小塊は、近接した治療後の領域から拡散によるシクロパミンのみを受け取り得たとすると、比較的低濃度のシクロパミンに露出しうる。この腫瘍の色素性の性質が、臨床的追跡を容易にし、治療（約２０μｌシクロパミンクリームを４時間ごとに適用）は、治療領域内の腫瘍が大幅に退行したが、依然として可視部を含む３日目に、中断された（図７Ｂ）。次に腫瘍は、遅行効果の可能性を研究するために、治療せずに、追跡された。更なる明示の退行が治療なしでは観測されず、最初の腫瘍に対応する領域は、追跡の６日目に削除された（治療開始から９日目）。腫瘍の治療領域のヘマトキシレン  エオシン染色切片は、多くの腫瘍細胞が消失した嚢胞空間を明らかにする（図７Ｃ）。上皮を裏打ちが欠落するこれらの嚢胞は（図７Ｃ）、腫瘍細胞により以前占められていた組織領域の嚢胞の表示に準ずる。この時点で（治療せずに追跡して６日目）、比較的少数のアポトーシス細胞を表す組織切片は（図７Ｃ）、生組織からアポトーシス細胞の公知の急速な排除に準じた。一方で、残留細胞、特に嚢胞の端の近傍は、著しく高頻度で細胞が突起形状へ分化を示している（例えば、図７Ｃの左下部に対する領域、図７Ｄの別の領域で例証される高倍率でより明確に観察される）。分化又は嚢胞の同一の領域は、治療の開始前の同一の腫瘍から取得したパンチ生検には存在しない（図７Ｅ）。比較的低濃度のシクロパミンを受けた腫瘍の小塊は（図７Ａにおいて矢印で示される）、追跡６日目の大きな嚢胞中心を有した（図７Ｆ）。しかし、残留小塊の周辺は、（例えば、増大、さらに、好酸性細胞質を伴う）分化した形態の細胞の頻度が、さらに増加し、及び小型の嚢胞が、この周辺内部に存在していたが、典型的なＢＣＣ形態を有し続ける（図７Ｆ）。したがって、最適な濃度のシクロパミンに応答する腫瘍は、比較的急速であり、最適に及ばない濃度の露出は、追跡中に生存する腫瘍細胞を残す。
これらの更なる例は、ＢＣＣと、増加したｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ信号を示す他の腫瘍（毛包上皮腫）との急速臨床収縮を得る記載した治療の効率性を立証する。臨床収縮は、腫瘍細胞のシクロパミン誘導分化及びアポトーシスに関するように見える。これに加えて、腫瘍細胞の増殖は、阻害される。異なる遺伝型の血縁関係を持たない患者のいくつかの独立した腫瘍に対する効率性は、記載した治療の一般的な実用性に準じた。
シクロパミンはシュロソウ植物の催奇性要素として発見された（ケリア  アール．エフ．（Ｋｅｅｌｅｒ．Ｒ．Ｆ）、（１９６９年）、サイトケミストリ（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃｔｒｙ）８  ２２３−２２５）。脳の発達において腹部細胞前駆体の分化を阻害することが、報告された（インカードナア  ジェイ．ピー．（Ｉｎｃａｒｄｏｎａ  Ｊ．Ｐ．）等、（１９９８年）、ディベロップメント１２５  ３４４３−３５６２、クーパー  エム．ケイ（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｍ．Ｋ）等、（１９９８年）、サイエンス２８０、１６０３−１６０７）。シクロパミンによる細胞の分化の抑制は、骨髄細胞から赤血球細胞への分化（デトマー  ケイ（Ｄｅｔｍｅｒ  Ｋ）等、（２０００年）、ディベロップメント  バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ）２２２−２４２）、尿生殖洞から前立腺への分化（バーマン  ディ．エム．（Ｂｅｒｍａｎ  Ｄ．Ｍ）、（２０００年）、ジャーナル  オブ  ウロロジ―（Ｊ．Ｕｒｏｌ）１６３，２０４）を含む、他の機構内でも報告されて来ている。しかし、反対のことが、シクロパミンに露出した腫瘍細胞を伴う本発明では真実であると見出された。腫瘍細胞のシクロパミン誘導の分化と同様に、さらに腫瘍細胞のアポトーシスが誘導される。以前に記されていない、シクロパミンによる腫瘍細胞のアポトーシスの誘導は、高い効率を示している。さらにシクロパミンによるアポトーシスの誘導は、続いて生じる遺伝毒性作用を持たず、さらに腫瘍細胞が分化され、アポトーシスを受ける一方、腫瘍細胞に近接した毛包の外毛根鞘細胞、及び正常表皮基底細胞が、十分に維持されるという著しい特異性を有する。記載した悪影響の無い治療は、患者のシクロパミン適用領域にて臨床的に正常に見える健康な皮膚の存在により確認された（被験者に対して最も長期の追跡は、本記載時で１５ヶ月以上、さらに長期間の治療の安全性も示された）。上記の要約された形態の本発明に記載された治療は、がん治療で非常に求められ、がん治療の長年にわたる問題の解決策を提供する。




【国際調査報告】
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