(57)【要約】一般式ＡＢを有する、新規ペプチド配列であって、式中、ＡおよびＢは各々、アミノ酸残基鎖を示し、そして前記Ａ鎖は抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合可能であり、そして前記Ｂ鎖は抗原提示細胞上のシグナル−２受容体と結合可能である、前記ペプチド配列。該ペプチド配列の好ましい型は、Ａ鎖およびＢ鎖の間に配置されるＹ鎖をさらに含む。さらに、好ましい型は、シグナル１部分と少なくとも約１０％の配列相同性を有するか、またはシグナル−１部分のペプチド擬似体であるＡ鎖を含み、前記Ｂ鎖は、シグナル−２受容体部分と少なくとも１０％の配列相同性を有するか、前記Ｂ鎖は、シグナル−２受容体部分と少なくとも１０％の配列相同性を有するか、またはシグナル−２受容体部分のペプチド擬似体であり、そしてＸ鎖は、少なくとも１のアミノ酸残基を有するか、またはアミノ酸残基のペプチド擬似体である。好適に、新規ペプチド配列は、１型免疫反応から２型免疫反応に、または２型免疫反応から１型免疫反応にシフトすることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の部分および第二の部分を含んでなるペプチドであって、前記第一の部分が、ＴＣＲエピトープ由来のペプチドと少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含み、前記第二の部分が、シグナル−２部分由来のペプチドと少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む、前記ペプチド。
【請求項２】
連結部分をさらに含んでなる、請求項１のペプチド。
【請求項３】
前記連結部分が少なくとも１のアミノ酸残基を含んでなる、請求項２のペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸が柔軟な非基質アミノ酸である、請求項３のペプチド。
【請求項５】
前記連結部分がアミノ酸残基の配列を含んでなり、前記配列が親水性アミノ酸と交互に非基質アミノ酸を含んでなる、請求項２のペプチド。
【請求項６】
前記連結部分が一般式（Ａ，Ｂ）xを有する、請求項２のペプチドであって、式中、ＡおよびＢはアミノ酸残基であり、そして前記Ａアミノ酸残基は、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択され、そして前記Ｂアミノ酸残基はグリシンであり、そしてＸは１〜１００の範囲である、前記ペプチド。
【請求項７】
前記Ａアミノ酸残基がアミノカプロン酸である、請求項６のペプチド。
【請求項８】
前記第一の部分が、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項１のペプチド。
【請求項９】
配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約５０％の配列相同性を有する、請求項８のペプチド。
【請求項１０】
配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有する、請求項９のペプチド。
【請求項１１】
前記第一の部分が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドのペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）を含んでなる、請求項１のペプチド。
【請求項１２】
前記第一の部分が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドの誘導体を含んでなる、請求項１のペプチド。
【請求項１３】
前記ＴＣＲエピトープが既知の疾患状態と相関する、請求項１のペプチド。
【請求項１４】
前記第一の部分が、抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合可能である、請求項１のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチド：ＭＨＣ複合体が、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体と結合可能である、請求項１４のペプチド。
【請求項１６】
前記第二の部分が、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項１のペプチド。
【請求項１７】
配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約５０％の配列相同性を有する、請求項１６のペプチド。
【請求項１８】
配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有する、請求項１７のペプチド。
【請求項１９】
前記第二の部分が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドのペプチド擬似体を含んでなる、請求項１のペプチド。
【請求項２０】
前記第二の部分が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドの誘導体を含んでなる、請求項１のペプチド。
【請求項２１】
前記第二の部分が、抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと結合可能である、請求項１のペプチド。
【請求項２２】
Ｔ細胞において、二次シグナルを開始可能である、請求項２１のペプチド。
【請求項２３】
免疫反応を、１型が優性である反応から２型が優性である反応に変更可能である、請求項１のペプチド。
【請求項２４】
免疫反応を、２型が優性である反応から１型が優性である反応に変更可能である、請求項１のペプチド。
【請求項２５】
前記第二の部分が特定の型の免疫反応と関連する、請求項１のペプチド。
【請求項２６】
前記連結部分が、前記第一の部分および前記第二の部分の間に配置されている、請求項２のペプチド。
【請求項２７】
１つの連続配列として合成可能である、請求項１のペプチド。
【請求項２８】
下記のステップを含む、免疫反応を変更する方法：
（ａ）抗原提示細胞をペプチドと接触させるステップ、ここで前記ペプチドは、前記抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合してペプチド：ＭＨＣ複合体を形成する第一の部分と、前記抗原提示細胞上の二次シグナル部分に結合する第二の部分とを含んでなり；
（ｂ）前記ペプチド：ＭＨＣ複合体の形成に反応して、Ｔ細胞においてＴ細胞受容体の結合を引き起こすステップ；
（ｃ）前記二次シグナル部分への前記第二の部分の結合に反応して、Ｔ細胞において二次シグナルを遮断または改変するステップ；および
（ｄ）前記第一および第二のシグナルが、前記ペプチド：ＭＨＣ複合体と一般的に関連する免疫反応から外れた免疫反応を生じるステップ。
【請求項２９】
前記免疫反応が１型免疫反応から外れて２型免疫反応となる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記免疫反応が２型免疫反応から外れて１型免疫反応となる、請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記第一の部分が、シグナル−１部分由来のペプチドと少なくとも１０％の配列相同性を有する、請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記第二の部分が、シグナル−２受容体部分由来のペプチドと少なくとも１０％の配列相同性を有する、請求項２８の方法。
【請求項３３】
一般式ＡＢを有するペプチドであって、式中、前記ＡおよびＢは各々、アミノ酸残基の鎖を示し、そして前記Ａ鎖は少なくとも約５アミノ酸残基を含んでなり、そしてシグナル−１部分と少なくとも約１０％の配列相同性を有し、そして前記Ｂ鎖は少なくとも約４アミノ酸残基を含んでなり、そしてシグナル−２受容体部分由来のペプチドと少なくとも約１０％の配列相同性を有する、前記ペプチド。
【請求項３４】
少なくとも約１のアミノ酸残基を含んでなるアミノ酸残基のＸ鎖をさらに含んでなる、請求項３４のペプチド。
【請求項３５】
前記Ｘ鎖が前記Ａ鎖および前記Ｂ鎖の間に配置されている、請求項３４のペプチド。
【請求項３６】
１つの連続配列として合成可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項３７】
前記Ｘ鎖が、一般式（Ｙ，Ｚ）tを有する、可動性の非基質リンカーを含んでなる、請求項３４のペプチドであって、式中、ＹおよびＺはアミノ酸残基であり、そして前記Ｙアミノ酸残基は、独立して、それぞれ、非基質アミノ酸からなる群より選択され、そして前記Ｚアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、親水性アミノ酸からなる群より選択され、そしてＴが１〜１００の範囲である、前記ペプチド。
【請求項３８】
前記非基質アミノ酸が、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択される、請求項３７のペプチド。
【請求項３９】
前記非基質アミノ酸残基がアミノカプロン酸である、請求項３８のペプチド。
【請求項４０】
前記親水性アミノ酸がグリシンである、請求項３７のペプチド。
【請求項４１】
前記Ａ鎖が、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項３３のペプチド。
【請求項４２】
前記Ａ鎖が、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも５０％の配列相同性を有する、請求項４１のペプチド。
【請求項４３】
前記Ａ鎖が、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有する、請求項４２のペプチド。
【請求項４４】
前記Ａ鎖が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドのペプチド擬似体を含んでなる、請求項３３のペプチド。
【請求項４５】
前記Ａ鎖が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドの誘導体を含んでなる、請求項３３のペプチド。
【請求項４６】
前記シグナル−１部分が、既知の健康状態と関連する、請求項３３のペプチド。
【請求項４７】
抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合して、ペプチド：ＭＨＣ複合体を形成可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項４８】
前記ペプチド：ＭＨＣ複合体がＴ細胞と結合可能である、請求項４７のペプチド。
【請求項４９】
前記Ｂ鎖が、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項３３のペプチド。
【請求項５０】
前記Ｂ鎖が、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約５０％の配列相同性を有する、請求項４９のペプチド。
【請求項５１】
前記Ｂ鎖が、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有する、請求項５０のペプチド。
【請求項５２】
前記Ｂ鎖が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドのペプチド擬似体を含んでなる、請求項３３のペプチド。
【請求項５３】
前記Ｂ鎖が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドの誘導体を含んでなる、請求項３３のペプチド。
【請求項５４】
抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと結合可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項５５】
前記シグナル−２部分との結合に際して、Ｔ細胞への二次シグナルを遮断または改変可能である、請求項５４のペプチド。
【請求項５６】
免疫反応を、１型が優性である反応から２型が優性である反応に変更可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項５７】
免疫反応を、２型が優性である反応から１型が優性である反応に変更可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項５８】
細胞仲介免疫反応を体液性免疫反応にシフトすることが可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項５９】
体液性免疫反応を細胞仲介反応にシフトすることが可能である、請求項３３のペプチド。
【請求項６０】
下記のステップを含む、免疫反応を調節するペプチドを調製する方法：
シグナル−１部分由来の配列と少なくとも約１０％の配列相同性を有する、第一のペプチド配列を選択するステップ；
シグナル−２受容体部分由来の配列と少なくとも約１０％の配列相同性を有する、第二のペプチド配列を選択するステップ；および
前記第一のペプチド配列と前記第二のペプチド配列とを含む連続ペプチド鎖として、前記ペプチドを合成するステップ。
【請求項６１】
少なくとも１のアミノ酸残基を含んでなる第三のペプチド配列を選択するステップをさらに含んでなる、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記第一のペプチド配列が、既知の健康状態と関連する、請求項６０の方法。
【請求項６３】
前記第一のペプチド配列が、抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合して、ペプチド：ＭＨＣ複合体を形成可能である、請求項６０の方法。
【請求項６４】
前記第二のペプチド配列が、抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと結合可能である、請求項６０の方法。
【請求項６５】
抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と前記ペプチドを接触させるステップをさらに含んでなる、請求項６０の方法。
【請求項６６】
抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと前記ペプチドを接触させるステップをさらに含んでなる、請求項６０の方法。
【請求項６７】
下記を含むペプチド：
Ｔ細胞において、一次シグナルを開始可能な第一のペプチド配列；および
Ｔ細胞において、二次シグナルを開始可能な第二のペプチド配列。
【請求項６８】
少なくとも１のアミノ酸残基を含んでなる連結ペプチド配列をさらに含んでなる、請求項６７のペプチド。
【請求項６９】
前記第一のペプチド配列がシグナル−１部分由来である、請求項６７のペプチド。
【請求項７０】
前記第二のペプチド配列がシグナル−２受容体部分由来である、請求項６７のペプチド。
【請求項７１】
前記第一のペプチド配列が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項６７のペプチド。
【請求項７２】
前記第二のペプチド配列が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項６７のペプチド。
【請求項７３】
前記連結ペプチド配列が一般式（Ｙ，Ｚ）tを有する、請求項６８のペプチドであって、式中、ＹおよびＺはアミノ酸残基であり、そしてＴは１〜１００の範囲である、前記ペプチド。
【請求項７４】
前記Ｙアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択される、請求項７３のペプチド。
【請求項７５】
前記Ｚアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、親水性アミノ酸残基からなる群より選択される、請求項７３のペプチド。
【請求項７６】
前記親水性アミノ酸残基がグリシンである、請求項７５のペプチド。
【請求項７７】
前記Ｙアミノ酸残基がアミノカプロン酸である、請求項７３のペプチド。
【請求項７８】
下記を含む、ＢＰＩを構築する方法：
（ａ）既知の健康状態を選択するステップ；
（ｂ）前記健康状態に特異的なＴＣＲエピトープを同定するステップ；および
（ｃ）前記ＴＣＲエピトープをＢＰＩに取り込むステップ。
【請求項７９】
シグナル−２受容体部分を選択し、そして前記シグナル−２受容体部分を前記ＢＰＩに取り込むステップをさらに含んでなる、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記ＴＣＲエピトープを前記シグナル−２受容体部分にコンジュゲート化させるステップをさらに含んでなる、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記コンジュゲート化ステップが、前記ＴＣＲエピトープと前記シグナル−２受容体部分との間にリンカーを配置することを含む、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記リンカーが少なくとも１のアミノ酸残基を含んでなる、請求項８１の方法。
【請求項８３】
前記リンカーが一般式（Ｙ，Ｚ）tを有する、請求項８１の方法であって、式中、ＹおよびＺはアミノ酸残基であり、そしてＴは１〜１００の範囲である、前記方法。
【請求項８４】
前記Ｙアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択される、請求項８３の方法。
【請求項８５】
前記Ｚアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、親水性アミノ酸残基からなる群より選択される、請求項８３の方法。
【請求項８６】
前記親水性アミノ酸残基がグリシンである、請求項８５の方法。
【請求項８７】
前記ＴＣＲエピトープが、抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合して、ペプチド：ＭＨＣ複合体を形成可能である、請求項７８の方法。
【請求項８８】
前記シグナル−２受容体部分が、抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと結合可能である、請求項７９の方法。
【請求項８９】
前記ＴＣＲエピトープが、配列番号１〜２５から選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項７８の方法。
【請求項９０】
前記シグナル−２受容体部分が、配列番号３０〜４１から選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項７９の方法。
【請求項９１】
下記の組み合わせ：
抗原提示細胞上の主要組織適合複合体と結合可能な第一のペプチド配列；および
抗原提示細胞上のシグナル−２リガンドと結合可能な第二のペプチド配列。
【請求項９２】
前記第一のペプチド配列と前記第二のペプチド配列との間に配置されたリンカーをさらに含む、請求項９１の組み合わせ。
【請求項９３】
前記第一のペプチド配列がシグナル−１部分由来である、請求項９１の組み合わせ。
【請求項９４】
前記第二のペプチド配列がシグナル−２受容体部分由来である、請求項９１の組み合わせ。
【請求項９５】
前記第一のペプチド配列が、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項９１の組み合わせ。
【請求項９６】
前記第二のペプチド配列が、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約１０％の配列相同性を有する、請求項９１の組み合わせ。
【請求項９７】
前記リンカーが少なくとも１のアミノ酸残基を含んでなる、請求項９２の組み合わせ。
【請求項９８】
前記リンカーが一般式（Ｙ，Ｚ）tを有する、請求項９２の組み合わせであって、式中、ＹおよびＺはアミノ酸残基であり、そしてＴは１〜１００の範囲である、前記組み合わせ。
【請求項９９】
前記Ｙアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択される、請求項９８の組み合わせ。
【請求項１００】
前記Ｙアミノ酸残基がアミノカプロン酸である、請求項９９の組み合わせ。
【請求項１０１】
前記Ｚアミノ酸残基が、独立して、それぞれ、親水性アミノ酸残基からなる群より選択される、請求項９８の組み合わせ。
【請求項１０２】
前記親水性アミノ酸残基がグリシンである、請求項１０１の組み合わせ。
【請求項１０３】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約１０％の配列相同性を有するペプチド。
【請求項１０４】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約５０％の配列相同性を有する、請求項１０３のペプチド。
【請求項１０５】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドと、少なくとも約９５％の配列相同性を有する、請求項１０４のペプチド。
【請求項１０６】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドの誘導体。
【請求項１０７】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドのペプチド擬似体。
【請求項１０８】
配列番号４２〜４６からなる群より選択されるペプチドのペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃ）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（配列表）
印刷した配列表が本出願に付随し、そしてまた、フロッピー（Ｒ）ディスクおよびＣＤＲＯＭ上、コンピュータ読み取り可能ＡＳＣＩＩファイルの形でも、同一の内容で提出している。
【０００２】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞による抗原提示細胞表面上のペプチド：ＭＨＣ複合体の認識によって開始される免疫反応に関する。本発明はまた、シグナル−２部分の、抗原提示細胞表面上の相補タンパク質への結合によって開始される免疫反応にも関する。より具体的には、本発明は、Ｔ細胞によるペプチド：ＭＨＣの認識によって、そしてシグナル−２部分のその相補タンパク質への結合によって開始される免疫反応に関する。さらにより具体的には、本発明は、この結合に反応して、特定の個体が生成する典型的な免疫反応の変更に関する。より具体的には、本発明は、１型から２型、または２型から１型に、所定の免疫反応を変更するかまたはシフトするため、ペプチド：ＭＨＣ複合体のペプチド部分由来のペプチドを、好ましいシグナル−２部分にコンジュゲート化することに関する。これは、サプレッサーＴ細胞を含む、特定の表現型の制御Ｔ細胞を含むことが可能である。
【０００３】
先行技術の説明
自己免疫疾患は、自己抗原に対するＴ細胞の活性化に特徴付けられる。これらのＴ細胞はその後、これらの抗原を提示する細胞を破壊する。例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病とも呼ばれる）は、膵臓のインスリン産生細胞に対するＴ細胞の活性化およびそれに続くこれらのＴ細胞による破壊に特徴付けられる。自己免疫反応に関連する疾患および異常は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と呼ばれる細胞表面タンパク質の特定のサブタイプ（対立遺伝子）と強く関連する。ＭＨＣ分子は、感染性病原体由来のタンパク質、アレルゲン、および自己タンパク質の断片（ペプチド）に結合し、そしてこのＭＨＣ：ペプチド複合体は、Ｔ細胞がその受容体（Ｔ細胞受容体、またはＴＣＲと呼ばれる）で認識する構造である。ＭＨＣ：ペプチド複合体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる免疫系の他の細胞（すなわちＢ細胞、樹状細胞およびマクロファージ）の表面上に提示される。免疫反応が後に続くためには、免疫系の主要な制御細胞である未分化Ｔ細胞は、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）侵入物の小さい分解産物（ペプチド）を提示されなければならない。この提示は、ＡＰＣ表面上で起こる。その後、Ｔ細胞はＡＰＣと相互作用しなければならず、そしてこの相互作用は、Ｔ細胞が分裂し、そして分化して、直接または間接的に、同一のまたは非常に類似のＭＨＣ：ペプチド複合体を提示する細胞を攻撃する分子を産生するのを刺激する。ＭＨＣ分子をコードする遺伝子は、種内で非常に多様であり、そして異なるＭＨＣ対立遺伝子が、他のものよりもいくつかのペプチドに結合するのを好むことがよく知られている。他の遺伝的および環境的要因と共に、異なるＭＨＣ対立遺伝子の存在は、なぜ種のあるメンバーは例えば自己免疫疾患、アレルギー、喘息、さらには特定の感染性疾患等の状態を呈するのに、他のメンバーは同じ物質に影響を受けないか、または免疫であるままなのかを説明するのに役立つ。他の相違は、ペプチド：ＭＨＣ複合体と異なる細胞表面タンパク質もまた、Ｔ細胞上の特定の受容体に結合しなければならないため、生じる。Ｔ細胞およびＡＰＣ膜の境界面で、これらの他のタンパク質：タンパク質対は、シグナル−２として知られる同時刺激シグナルを提供し、このシグナルは、ＭＨＣ：ペプチド複合体のＴＣＲ認識によって生じるシグナル（シグナル−１として知られる）と共に、免疫反応を開始する。
【０００４】
免疫反応を特徴付ける段階は、２つのシグナルの結果としての、ＣＤ４+  Ｔ細胞の１型ヘルパーＴ細胞（ＴH１細胞）または２型ヘルパーＴ細胞（ＴH２細胞）への分化である。ＴH細胞のこれらの２つのサブタイプおよびこれらが選択的に活性化する細胞制御ネットワークは、ヒトの健康状態および疾患状態の公知の相関物である。ＴH１細胞への分化は、主に細胞仲介免疫を生じ、一方、ＴH２細胞への分化は、主に体液性免疫を生じる。これらの免疫型は各々、異なる種類の侵入に対して、体を防御するのを補助する。１型免疫は、細菌などの細胞内病原体に対して体を防御するが、器官特異的自己免疫疾患にも関与する。２型免疫は、細胞外寄生虫に対しての保護に重要であるが、アレルギー性反応にもまた関連する。ＴH１細胞の発展は、マクロファージおよび樹状細胞として知られる免疫細胞に産生される、インターロイキン−１２と呼ばれるサイトカインによる。インターロイキン−１２は、未処置（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞（ＣＤ４+  Ｔ細胞）を誘導または刺激して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生する。これらの２つのサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン性増殖、マクロファージ活性化、および感作細胞の補体溶解を仲介するＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチに関与する。ＴH１免疫反応への拘束は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体の発現を上方制御するが、ＴH２細胞の発展を阻害する、ＩＦＮ−γの存在によって増進される。ＴH２免疫は、未処置Ｔ細胞によるインターロイキン−４（ＩＬ−４）産生から生じる。ＩＬ−４はＴH２発展、並びにそれに続く、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、−５（ＩＬ−５）、−１０（ＩＬ−１０）、および−１３（ＩＬ−１３）の産生を誘導する。ＩＬ−４はまた、発展中の細胞上のＩＬ−１２受容体発現を下方制御するよう作用して、それによってＴH１発展を阻害し、そして未分化Ｔ細胞がＴH２細胞発展に拘束されるのを補助する。さらに、ＩＬ−４およびＩＬ−５は、Ｂ細胞を活性化し、そして中和抗体（マウスではＩｇＧ１）および即時型過敏の開始因子であるＩｇＥに切り換えることが知られる。
【０００５】
これらの免疫経路いずれかを活性化するため、Ｔ細胞を完全に活性化するのに、２シグナルの機構が必要である。シグナル−１（Ｓ−１）は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体を認識した際に生じる。この最初のシグナルは、Ｔ細胞受容体を通過して、そしてキナーゼおよびホスファターゼが仲介するチロシンリン酸化／脱リン酸化事象のカスケードを開始し、そしてＣａ++流束、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦ−ＡＴ）およびＮＦκＢ転写因子の活性化を導く。これらの因子は、Ｔ細胞の核に進入し、そしてエフェクター機能に関与する遺伝子のプロモーターに結合する。シグナル−２（Ｓ−２）は、シグナル−２受容体が、ＡＰＣ表面上のリガンドに結合することから生じる。シグナル−２受容体にはＣＤ２８およびそのリガンドＢ７と共にＬＦＡ−１およびそのリガンドＩＣＡＭ−１が含まれる。シグナル−２受容体およびそのリガンドが、Ｔ細胞およびＡＰＣ受容体膜間の境界面で複合体を形成すると、一連のシグナル伝達事象が起こる。これらの事象には、ＧＴＰアーゼ活性を持つアダプタータンパク質を活性化する、グアニンヌクレオチド交換因子の活性化と、セリン／スレオニンリン酸化／脱リン酸化とが含まれる。これらのシグナル伝達事象は、別個の組の転写因子を活性化する。ＣＤ２８：Ｂ７複合体を通じて搬送されるシグナルは、ＩＣＡＭ−１：ＬＦＡ−１複合体から搬送されるものとは異なり、特にＣＤ４+  Ｔ細胞のＴH１エフェクター集団対ＴH２エフェクター集団への分化に関しては異なる。
主な結合がＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の間で起こる場合、ＣＤ４+  Ｔ細胞分化は、ＴH１細胞を支持し、該細胞はＩＬ−２およびＩＦＮγを豊富に産生し、これらは遅延型過敏（ＤＴＨ）、細胞内病原体に対する免疫、およびいくつかの自己免疫疾患を含む、炎症性免疫反応の傑出した開始因子である。主な結合がＣＤ２８およびＢ７の間で起こる場合、ＣＤ４+  Ｔ細胞はＴH２細胞に分化する。ＴH１細胞と対照的に、ＴH２細胞は、ＩＬ−２またはＩＦＮγサイトカインを豊富に産生しないが、その代わり、アレルギーおよび喘息などの即時型過敏の仲介因子、すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を放出する。したがって、二次シグナルを提供する複合体の相対的な寄与を操作する能力は、与えられた自己組織抗原に対して引き出される免疫反応の種類に対して、重大な影響を有する。
【０００６】
ＴＣＲおよびＡＰＣ間の会合は、免疫学的シナプスと呼ばれるＴＣＲおよびＡＰＣ間の特殊な結合部または境界面で起こる。免疫シナプスを、図１に模式的に示す。この免疫シナプスは、Ｔ細胞およびＡＰＣ間の境界面で組み立てられる活性化分子の編成された構造と定義可能である。神経系のシナプス同様、免疫シナプスは、細胞膜間の緊密な会合である。免疫反応が後に続くためには、免疫系の主要な制御細胞である未分化Ｔ細胞は、外来侵入物の小さい分解産物（ペプチド）を提示されなければならない。不活性化Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび接着分子は、Ｔ細胞膜上で、無作為に分散している。免疫学的シナプスの形成は、Ｔ細胞が潜在的な抗原性リガンドを区別するのを可能にする活性でそして動的な機構である。免疫学的シナプスは、接着分子の輪に取り巻かれたＴ細胞受容体の中央クラスターからなる。免疫シナプスの安定な形成は、内部にＴＣＲそして外部にＬＦＡ−１を有するドーナツ様構造を形成するため、ＬＦＡ−１などの接着分子およびペプチド認識受容体（ＴＣＲ）を必要とする。活性化中、ＴＣＲおよびＬＦＡ−１分子は、ドーナツ様構造形成中に、Ｔ細胞脂質二重層内で互いにすれ違う（このプロセスは転位置（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）と呼ばれる）。これらの分子が、免疫シナプス内で転位置しない場合、Ｔ細胞シグナルは完全には受け取られず、そしてＴ細胞内で遺伝子活性の異なるプログラムが後に続く可能性がある。このことは、Ｔヘルパー細胞が、ＩＦＮγ放出を導くであろう遺伝子プログラム（ＴH１細胞および１型免疫）から、最終的にＩＬ−４産生を活性化するプログラム（すなわちＴH２細胞および２型免疫）に外れる場合には、特に、免疫反応に劇的な影響を与える可能性がある。
【０００７】
さらに詳細には、ＴH１優性を導く経路を活性化するには、ＴＣＲは、ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体を認識し、そしてシグナル−１をＴ細胞に送る。さらに、ＬＦＡ−１がＩＣＡＭ−１に結合し、そしてこれらの分子は、ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体と共に転位置して、最終段階の免疫シナプスを形成する。これが、非拘束ＴH細胞によるＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）の有効な発現を導く。ＣＤ４０（抗原提示細胞上に発現される）とリガンドとの相互作用は、炎症性サイトカインＩＬ−１２のＮＦκＢ上方制御を生じる。その後、ＩＬ−１２は未分化ＴH細胞上の受容体に結合し、そして転写制御因子、Ｓｔａｔ４およびＴｂｅｔの上方制御を含む、ＴH１プログラムを開始する。これは、自己抗原（例えばグルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＧＡＤ６５）に対するＴH１優性を導き、これはＴＣＲ：ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体のＧＡＤ６５ペプチド構成要素に開始された。ＴH２優性を導く経路に関しては、ＴＣＲは、同一のペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体を認識でき、それによってシグナル−１を送る。しかし、この場合、シグナル−１の強度がより弱くおよび／またはシグナル−２部分との間の結合が変わったりまたはブロックされていると、最終段階免疫シナプスが変更された形となることになる。同様に、シグナル−１のこのより弱い強度またはＬＦＡ−１二次シグナルの別個の関与が、こうした優性ＴH２分化という異なる結果を導く。例えば、変更された免疫シナプスは、ＣＤ４０リガンドが発現されずしたがってＩＬ−１２がＡＰＣに放出されないことを指示可能である。この経路を図２に模式的に示す。ここでは、ＩＬ−４は集積しており、それによってＴ細胞内のＳｔａｔ６およびＧＡＴＡ−３の上方制御したがってＴH２パターンの分化への拘束が導かれる。
【０００８】
現代の応用免疫学の主要なゴールは、ＴH１優性免疫（例えば自己免疫疾患および移植拒絶で見られるようなもの）からこれらの同一の組織抗原に対するＴH２反応へのスイッチを可能にすることである。他の症例では、弱いＴH２免疫をＴH１優性に置き換えて、強いＴ細胞増殖および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の有効な生成を導くことが非常に有用であろう。これらの症例には、Ｃ型肝炎およびＡＩＤＳのような慢性ウイルス疾病が含まれる可能性があり；そして黒色腫のような特定の癌が含まれる可能性がある。したがって、当該技術分野で必要なのは、異なるヒト疾患状態または健康状態と戦うために望ましいように、２型免疫を１型免疫に置き換え可能であるか、または１型免疫を２型免疫に置き換え可能であるような、これらの免疫反応の調節因子である。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、先行技術に見られた問題を解決し、そして最先端の明確な進歩をもたらす。簡潔には、本発明は、一端にシグナル−１部分の一部を、そして他方の端にシグナル−２部分の一部を含むペプチドを含む。これらの二端は、互いに直接連結されているか、または柔軟な非基質リンカーを介して連結されていることが可能である。ペプチド部分の直接のまたはリンカーを介した連続ペプチド鎖へのこのコンジュゲート化は、二官能性ペプチド阻害剤（ＢＰＩ）と称する新規種類の免疫療法ペプチドをもたらす。これらのＢＰＩは、Ｔ細胞活性化の２シグナルの機構に基づき、そしてＴ細胞活性化を変更するため、シグナル−１およびシグナル−２部分を連結する。言い換えると、本発明は、Ｔ細胞の特定の疾患関連集団のみが、本発明の産物に標的とされるような、非常に特定された方式で、Ｔ細胞およびそれに続く免疫を調節する方法を提供する。したがって、本発明は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫系に必要な構成要素が、その名目上の（ｎｏｍｉｎａｌ）防御方式で作動するままにしておく。
【００１０】
より詳細には、本発明は、目的のＴＣＲエピトープ（シグナル−１部分）を一端に、そしてシグナル−２を生じるタンパク質：タンパク質相互作用由来のペプチド（シグナル−２部分）を有するペプチド配列を構築することを記載する。これらの２つのペプチド配列は、シグナル−１部分をシグナル−２部分にカップリングする柔軟なリンカーを介して連結可能であるし、または直接共に連結可能である。いくつかの場合、２つのペプチド配列間の連結は、各部分由来の隣接残基を含むことが可能である。シグナル−２部分とカップリングしたシグナル−１部分の組み合わせがＢＰＩを構成する。したがって、目的のＴＣＲエピトープをひとたび同定し、そして望ましい免疫反応（１型または２型）を決定したら、本発明にしたがったＢＰＩを生成可能である。
【００１１】
上述のように、免疫反応の重要な段階は、１型ヘルパーＴ細胞（ＴH１細胞）または２型ヘルパーＴ細胞（ＴH２細胞）いずれかへのＣＤ４+  Ｔ細胞の分化である。ＴH１細胞への分化は、主に細胞仲介免疫を生じ、一方、ＴH２細胞への分化は、主に体液性免疫を生じる。これらの免疫種は各々、異なる種類の侵入に対して体を防御するのを助ける。ＴH１細胞は、細菌などの細胞内病原体に対して体を防御し、そしてまた器官特異的自己免疫疾患にも関与する。ＴH２細胞は、細胞外寄生虫に対しての防御と共にアレルギー性反応に重要である。ＴH１細胞の発生は、免疫細胞（マクロファージおよび樹状細胞として知られる）が産生するインターロイキン−１２と呼ばれるサイトカインによって駆動される。インターロイキン−１２は、未処置Ｔ細胞を誘導または刺激して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生させる。これらの２つのサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン性増殖、マクロファージ活性化、および感作細胞の補体溶解を仲介するＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチなどの古典的細胞仲介機能に関与する。ＴH１免疫反応への拘束は、ＩＦＮ−γ（インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体の発現を上方制御するがＴH２細胞への発展を阻害する）の存在によって増進される。この経路を図３に模式的に示す。
【００１２】
ＴH２免疫は、未処置Ｔ細胞によるインターロイキン−４（ＩＬ−４）産生から生じる。ＩＬ−４は、ＴH出現を、そしてそれに続いて、転写制御因子Ｓｔａｔ６の活性化を通じて、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、５（ＩＬ−５）および１３（ＩＬ−１３）の産生を誘導する。ＩＬ−４はまた、発展中の細胞上のＩＬ−１２受容体発現を下方制御するよう作動して、それによってＴH１への発展を阻害し、そして未分化Ｔ細胞がＴH２細胞への発展に拘束されるのを助ける。さらに、ＩＬ−４およびＩＬ−５は、Ｂ細胞を活性化し、そして中和抗体（マウスではＩｇＧ１）および即時型過敏の開始因子であるＩｇＥに切り換えることが知られる。このプロセスは図２に模式的に提示される。
【００１３】
上述のように、ＴH細胞を完全に活性化するのに、２シグナルの機構が必要である。シグナル−１は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体を認識するかまたは該複合体に結合する際に生じる。この最初のシグナルは、Ｔ細胞受容体を通じて伝達され、そしてキナーゼおよびホスファターゼが仲介する、チロシンリン酸化／脱リン酸化事象のカスケードを開始し、そしてＣａ++流束、ＮＦ−ＡＴおよびＮＦκＢ転写因子の活性化を導く。これらの因子は、Ｔ細胞の核に進入し、そしてエフェクター機能に関与する遺伝子のプロモーターに結合する。シグナル−２は、Ｔ細胞上のシグナル−２受容体が、ＡＰＣ上のタンパク質リガンドに結合することから生じる。シグナル−２受容体にはＣＤ２８およびそのリガンドＢ７と共にＬＦＡ−１およびそのリガンドＩＣＡＭ−１が含まれる。シグナル−２受容体およびそのリガンドが、Ｔ細胞の細胞膜とＡＰＣ膜との間の境界面で複合体を形成すると、一連のシグナル伝達事象が起こり、これらの事象には、セリン／スレオニンリン酸化／脱リン酸化と共に、ＧＴＰアーゼ活性を持つアダプタータンパク質を活性化する、グアニンヌクレオチド交換因子の作動が含まれる。これらのシグナル伝達事象は、別個の組の転写因子を活性化する。ＣＤ２８：Ｂ７複合体を通じて搬送されるシグナルは、ＩＣＡＭ−１：ＬＦＡ−１複合体から搬送されるものとは異なり、特にＴH２エフェクター集団と対比して、ＴH１へのＣＤ４+  Ｔ細胞の分化に関しては異なる。このシグナル伝達は、本明細書において、図４として模式的に提示する。主な結合がＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の間で起こる場合、ＣＤ４+  Ｔ細胞は、ＴH１細胞に分化する。ＴH１分化状態のＣＤ４+  Ｔ細胞はＩＬ−２およびＩＦＮγを豊富に産生し、この２つのサイトカインは遅延型過敏（ＤＴＨ）、細胞内病原体に対する免疫、およびいくつかの自己免疫疾患などの、炎症性免疫反応の傑出した開始因子である。主な結合がＣＤ２８およびＢ７の間で起こる（すなわちＬＦＡ−１：ＩＣＡＭ−１シグナル伝達が減少する）場合、ＣＤ４+  Ｔ細胞はＴH２細胞に分化する。ＴH１細胞と対照的に、ＴH２細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮγサイトカインを産生しないが、その代わり、アレルギーおよび喘息などの即時型過敏の仲介因子、すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を放出する。したがって、シグナル−２を提供する複合体の相対的な寄与を操作する能力は、自己組織抗原に対して惹起される免疫反応の種類に重大な影響を及ぼす。
【００１４】
ＴＣＲおよびＡＰＣ間の会合は、免疫学的シナプス（図１に示す）と呼ばれる特別な結合部で起こる。免疫反応が進行するため、未分化ＴH細胞は、ＡＰＣ表面上に外来侵入物のペプチドを提示されなければならない。不活性化Ｔ細胞において、ＴＣＲおよび接着分子は、Ｔ細胞膜上に無作為に分散している。免疫学的シナプスの形成は、Ｔ細胞が潜在的な抗原性リガンドを区別するのを可能にする、活性でそして動的な機構である。免疫学的シナプスは、接着分子の輪に取り巻かれたＴ細胞受容体の中央クラスターからなる。この配置を図１に模式的に示す。この図では、ＴＣＲ：ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体は、黒い円の中心であり、これは、シグナル−２受容体およびシグナル−２リガンドを構成するタンパク質：タンパク質対を示す。免疫シナプスの安定な形成は、内部にペプチド認識受容体（ＴＣＲ）そして外部にＬＦＡ−１などの接着分子を有するドーナツ様構造を形成するため、ＬＦＡ−１等およびＴＣＲを必要とする。活性化中、ＴＣＲおよびＬＦＡ−１分子は、実際にＴ細胞脂質二重層内で互いを通り越して転位置する。これらの分子が免疫シナプス内で転位置しない場合、Ｔ細胞シグナルは完全には受け取られず、そしてＴ細胞内で遺伝子活性の異なるプログラムが起こる可能性がある。これは、Ｔヘルパー細胞（ＴH）が、ＴH１免疫反応を導く遺伝子プログラムから、ＴH２免疫反応を活性化するプログラムに外れることを引き起こす場合は特に、免疫反応に劇的な影響を与える可能性がある。図２に示すように、ＢＰＩ機構の解釈によって、ＢＰＩがＭＨＣ−ＩＩおよび二次シグナルリガンド両方に結合することが示唆される。これは、ＭＨＣ−ＩＩ：ペプチドおよびＩＣＡＭ−１分子を有効に束縛し、それによって免疫シナプス形成の転位置ステップを妨げる。
【００１５】
本発明の１つの側面において、既知のＴＣＲエピトープをＢＰＩの第一のペプチド部分として用いる。この方式では、免疫原としての能力のある最小ペプチド配列を利用する。これらの最小ペプチド配列（例えば抗原性ペプチド）は、目的の免疫反応（すなわち自己免疫疾患、感染性疾患、アレルギー、癌など）に関与するＴＣＲと効果的に結合する。すでに多くの既知の興味深いＴＣＲエピトープ（シグナル−１部分）があり、そしてその配列は文献に定義されてきている。いくつかの代表的なシグナル−１部分のリストの一部を表１に示す。シグナル−１部分は何千もありえるから、このリストはいかなる意味でも包括的ではない。
【００１６】
本発明の別の側面において、ＢＰＩの第一の部分が合成可能であるように、目的のＴＣＲエピトープを同定する。この側面では、これらの優性ＴＣＲエピトープは、先行技術によってそう決定されてきており、そして配列は文献中に開示されている。あるＴ細胞反応の焦点となるペプチド（例えば糖尿病関連抗原ＧＡＤ６５に対する反応）は、大部分のエフェクターＴ細胞が抗原のこの部分に反応し、そして他の部分に反応しないという事実によって同定される。マウスモデル系において、動物を全タンパク質抗原で免疫する。次に、抗原が免疫系をプライミングした後、Ｔ細胞を除去する。これらのＴ細胞は、抗原の短い重複ペプチドと共に、別個に培養中に入れる。反応の大部分は、単一のペプチドに対するものであろうし、そしてこれは優性ＴＣＲエピトープである。ヒトにおいて、Ｔ細胞をまず、患者からクローニングする。これらのクローニングしたＴ細胞を、重複するペプチド（関与する抗原の個々の部分、例えばＨＩＶ−１、ｐ２４（配列番号８）に相当する）と共に、別個に培養中に入れる。再び、大部分のＴ細胞クローンが反応するペプチドは、優性ＴＣＲエピトープである。前述の内容は、Ｓｃｈｏｕｎｔｚら，  ＭＨＣ遺伝子型は、リガンド密度の容量を調節して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴヘルパー（Ｔｈ）−１／Ｔｈ−２プライミングを切り換える，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６）に記載され、この文献の解説および内容は、本明細書に援用される。
【００１７】
本発明の別の側面において、シグナル−２受容体由来のペプチドを用いて、Ｔ細胞上の名目上の受容体およびＡＰＣ表面上の相補リガンド間の相互作用を変更する。表３は、いくつかの既知のシグナル−２受容体部分の代表的なリストを含む。もちろん、このリストは代表であり、そしてすべてを含んではいないため、一般の当業者は、該表に列挙されていない他のシグナル−２部分を同定可能であろう。
【００１８】
本発明の別の側面は、生じる免疫反応を変更するため、ＴＣＲエピトープ（すなわちシグナル−１部分）をシグナル−２受容体ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｉｃ）（すなわちシグナル−２部分）に連結することである。この連結は、シグナル−１部分およびシグナル−２部分間に直接にまたは隣接残基を介して存在できる。あるいは、この連結は、シグナル−１部分およびシグナル−２部分間に配置されるリンカーを介して行うことも可能である。リンカーは、天然存在アミノ酸または化学合成アミノ酸を含む、いかなるアミノ酸であることも可能である。好ましくは、プロテアーゼ攻撃に耐性であるため、非基質アミノ酸を使用するであろう。さらにより好ましくは、リンカーは、小アミノ酸または親水性アミノ酸と交互に非基質アミノ酸を含んでなるであろう。さらにより好ましくは、リンカーは、リンカーの各端に隣接するシグナル−１部分およびシグナル−２部分と共に、１つの連続配列として合成可能である。さらにより好ましくは、リンカーは、一般式（Ａ，Ｂ）xを有し、式中、ＡおよびＢはアミノ酸残基であり、そしてＡアミノ酸残基は、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択され、そしてＢアミノ酸残基は小または親水性アミノ酸である。この式において、Ｘが１〜１００の範囲であることが可能である。特に代表的なＢ残基はグリシンである。この態様において、リンカーは、潜在的に、グリシン残基（Ｇ）と交互にアミノカプロン酸（Ａｃ）、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、アミノドデカン酸（Ａｄｏ）、およびβ−アラニン（βＡ）を有することが可能である（例えばＡｃ−Ｇ−Ａｈｘ−Ｇ−Ａｄｏ−Ｇ−βＡ）。リンカーを構築するのに用いる残基の選択は、リンカーの望ましい長さとともに静電妨害に関する考慮に基づくことができる。１つの好ましいリンカーは、交互に現れるＡｃ残基およびＧ残基を含んでなる。このリンカーは、選択する他アミノ酸残基（Ａｈｘ、Ａｄｏ、βＡ）を含むことによって、長くすることもまたは短くすることも可能である。いくつかの代表的なリンカーが、配列番号２６〜２９として表２に含まれる。
【００１９】
およそ１０9の異なるＴＣＲが、大量の感染性病原体に対する防御免疫の原因となり、そしてこのＴＣＲは、自己免疫疾患において、自己に背く可能性があるＴＣＲのレパートリーを含有する。さらに、ＴＣＲはまた、潜在的な腫瘍抗原および環境中の無数のアレルギー性物質にも特異的である。所定のＢＰＩのＴＣＲエピトープを変化させることによって、我々はＢＰＩの免疫調節能力を、選択したＴＣＲ群に向ける。言い換えると、ＢＰＩに取り込むＴＣＲエピトープの選択は、非常に特異的な様式で、特定のヒト疾患に関与するＴ細胞を標的とする。例えば、ＧＡＤ６５エピトープをＢＰＩに取り込むと、１型糖尿病の誘導に関与する自己攻撃Ｔ細胞が標的とされる。特定のＴＣＲのこうした標的化によって、感染性病原体または癌に対する免疫に必要なＴ細胞が顕著な影響を及ぼされることはないだろう。したがって、ＢＰＩは、Ｔ細胞免疫を１つの抗原に特異的に調節する一方、感染性病原体および癌発症に対する防御免疫に必要なＴ細胞レパートリーには影響を与えないでおく可能性をもたらす。
【００２０】
上述のように、本発明のシグナル−１部分は、好ましくは、ＴＣＲエピトープに由来し、そして既知の代表的なエピトープのリストを表１に示し、これらの既知のエピトープは、配列番号１〜２５として示す。ＴＣＲエピトープの誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を用いてＢＰＩを構築する場合、好ましくは、選択するＴＣＲエピトープは、既知の健康状態または疾患状態と相関するであろう。ＢＰＩを構築するのに、表１に示す代表的なペプチドの１つを用いる際、該ペプチドが、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含むことが好ましい。より好ましくは、ペプチドは、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも３０％の配列相同性を有するであろう。より好ましくは、ペプチドは、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも５０％の配列相同性を有するであろう。さらにより好ましくは、ペプチドは、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも７０％の配列相同性を有するであろう。最も好ましくは、ペプチドは、配列番号１〜２５からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有するであろう。もちろん、ＴＣＲエピトープ由来のペプチドと同様の機能を有する部分を構築するための、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）の使用もまた、当該技術分野にはよく知られている。これに関連して、Ｆａｌｃｉｏｎｉら，  自己免疫疾患関連クラスＩＩ主要組織適合分子による抗原提示を阻害する、ペプチド擬似体化合物，  １７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ５６２−５６７（１９９９）の解説が本明細書に援用される。したがって、ＢＰＩのこのシグナル−１部分ポーションのすべてまたは一部を、こうしたペプチド擬似体に含むことが可能である。好ましくは、ペプチド擬似体は、配列番号１〜２５からなる群より選択されるペプチドの擬似体であろう。あるいは、シグナル−１部分は、配列番号１〜２５からなる群より選択されるＴＣＲエピトープまたはペプチドの誘導体であろう。いずれにしても、ＢＰＩのこの第一の部分（または一次シグナルを開始するのに関与する部分）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と結合可能であることが望ましい。さらに、この生じたペプチド：ＭＨＣ複合体が、重要なＴＣＲと結合し、そしてＴ細胞へのいくつかの型のシグナルを開始可能であることが好ましい。
【００２１】
上述のように、リンカーの、シグナル−１部分と反対側に用いるペプチドは、好ましくは、シグナル−２受容体由来である。ＢＰＩのこの第二の部分は、直接またはリンカーを介して、第一の部分に連結される。好ましい型において、第二の部分は、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含む。より好ましくは、第二の部分のペプチドは、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約３０％の配列相同性を有する。さらにより好ましくは、第二の部分のペプチドは、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約５０％の配列相同性を有する。さらにより好ましくは、第二の部分のペプチドは、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約７０％の配列相同性を有する。最も好ましくは、第二の部分のペプチドは、配列番号３０〜４１からなる群より選択される配列と、少なくとも約９５％の配列相同性を有する配列を含む。第一の部分の場合のように、第二の部分のアミノ酸残基のすべてまたはいくつかの代わりに、ペプチド擬似体が使用可能である。好ましい型において、第二の部分のペプチド擬似体は、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドの模倣体であろう。あるいは、ＢＰＩの第二の部分は、配列番号３０〜４１からなる群より選択されるペプチドの誘導体を含んでなるであろう。第一の部分同様、第二の部分が、抗原提示細胞上の相補リガンド（例えばシグナル−２リガンド）と結合可能であることが好ましい。例えば、ＬＦＡ−１由来のペプチドを、ＢＰＩのこのシグナル−２部分として用いる場合、ＡＰＣ表面上のＩＣＡＭ−１に結合するべきである。さらに、ＡＰＣ上のシグナル−２リガンドとのこの結合が、この部分の親受容体（Ｔ細胞上）のこの同一のＡＰＣリガンドへの結合を阻害するかまたは改変することが好ましい。
【００２２】
上に説明するように、免疫反応はシグナル２つの機構を伴い、そして本発明の目的は、所定の免疫反応を、例えば１型免疫から２型免疫に、または２型免疫から１型免疫に変更することである。免疫反応表現型のこの変更またはシフトは、本発明にしたがったＢＰＩによって達成される。いくつかの場合、ＢＰＩが、免疫反応を、ＴH１優性または細胞溶解免疫反応から、ＴH２優性反応に変更することが好ましく；そして、他の場合、ＢＰＩが、免疫反応を、ＴH２優性反応から、ＴH１または細胞溶解優性反応に変更することが好ましい。ある場合、ＢＰＩは、非常に特異的なＴ細胞表現型、例えばペプチド特異的サプレッサーＴ細胞の活性化を介して作動する可能性がある。抗原がＴH１反応に向かう系を刺激する名目上の状況と対照的に（図２に示す）、ＧＡＤ  ６５−ＣＤ１１ａＢＰＩに類似したＢＰＩが免疫シナプスに導入される際に生じる反応は非常に異なり、反応を１型から２型にシフトするよう作動する。この状況を図２に模式的に示す。この方式で、シグナル−１部分、柔軟な非基質リンカー、およびシグナル−２部分を含んでなるＢＰＩを形成し、そして免疫シナプスに導入する。ＴＣＲがＡＰＣ上のペプチド：ＭＨＣ複合体を認識し、そして一次シグナルを開始する。しかし、ＢＰＩの第二の部分（シグナル−２部分）が、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１（または他のＢＰＩ：ＣＴＬＡ−４／Ｂ７、またはＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、またはＦａｓＬ：Ｆａｓ）間で典型的なシグナル−２相互作用が生じるのを遮断し、そして中央クラスターへのＴＣＲの転位置を遮断する。ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７相互作用が、特定のＢＰＩ構築物に標的とされるのかどうかに応じて、おそらくＭＨＣ−ＩＩ：ペプチド複合体を二次シグナルリガンドに束縛することによって、シグナルは、異なる分化方向に改変されるであろう。例えば、ＢＰＩのシグナル−２ペプチド部分がＬＦＡ−１由来である場合、このことはＣＤ４０リガンド発現の減少、したがってＩＬ−１２放出を欠如させるように助けるであろう。対照的に、最初のＴ細胞活性化中に放出されるＩＬ−４は、シナプス周囲に、より高いレベルで集積するであろう。ＩＬ−４のこの集積は、未処置Ｔ細胞におけるＳｔａｔ６およびＧＡＴＡ−３上方制御を導き、そして最終的に、２型パターンへの拘束を導く。あるいは、ＢＰＩのシグナル−２部分のペプチド部分がＣＴＬＡ−４由来である場合、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ−２８のＢ７リガンドへの通常の結合が影響を受け、そしてしたがってより多くのＣＤ４０リガンドが発現され（すなわち高親和性ＬＦＡ−１：ＩＣＡＭ−１のより大きい役割が、Ｂ７受容体を遮断することによって決定づけられる）；したがって、ＩＬ−１２の放出が増加する。インターロイキン−１２は、未処置Ｔ細胞がより多くのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を産生するよう誘導または刺激し、こうして１型免疫に向かう正のフィードバックをもたらす。これらの２つのサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン性増殖、マクロファージ活性化、および感作細胞の補体溶解を仲介するＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチなどの古典的細胞仲介機能に関与する。こうした反���は、ヒトウイルス疾患に対する防御免疫の顕著な特徴である。これはまた、ＴＣＲエピトープをＦａｓの受容体に連結するのにも作動するであろう。Ｆａｓ：ＦａｓＬ相互作用はアポトーシスを支配するため、アポトーシス事象を遮断することによって、特定のＴＣＲを持つ細胞の頻度を増加させることもできるであろう。これは、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、および癌に対するＢＰＩ設計に重要であろう。
【００２３】
したがって、本発明の重要な側面は、特定のＴＣＲエピトープをシグナル−２受容体ペプチド模倣体に束縛すると、これらの受容体のみを持つＴ細胞および／またはこれらのペプチド特異的サブセットに間接的に結び付けられるＴ細胞集団が関与するＴ細胞分化の改変が導かれることである。所定の免疫優性ペプチド抗原に対するＴ細胞反応を遮断するかまたは改変する能力は、免疫病理学的状態に対する非常に正確な処置を提供するであろう。現在の免疫療法の主な欠点は、広い特異性範囲のＴ細胞が影響を受けるため、宿主を感染および癌により罹りやすいままにすることである。本発明のＢＰＩは、所望のＴ細胞集団およびこれらの初期Ｔ細胞に依存して起こる反応だけを遮断および／または改変するはずである。また、ＢＰＩは、所望のエフェクター機能へと活性化させるために、特定のＴＣＲを有する集団を標的とするであろう。
【００２４】
本発明の別の側面において、Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用によって生じるシグナルの相対強度は、最終的な免疫反応が１型または２型反応であるかどうかに影響を及ぼす。これに関連して、Ｍｕｒｒａｙ，  ＭＨＣはどのようにＴH１／ＴH２免疫を選択するか，  １９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３（１９９８）の解説が本明細書に援用される。
【００２５】
本発明の別の側面において、ＡＰＣ上のＭＨＣおよびシグナル−２リガンドに結合可能なペプチドとＡＰＣとを接触させ、そしてＴ細胞に伝達されるシグナルの改変を引き起こすことによって、免疫反応を変更する。こうして、免疫反応は、免疫原ペプチドやその対応する抗原（すなわち感染性病原体、自己タンパク質、またはアレルゲン）と一般的に関連する免疫反応から外れていく。
【００２６】
本発明の別の側面において、一般式ＡＸＢを有するペプチドを提供する。Ａ、Ｘ、およびＢは、アミノ酸残基の鎖を表し、Ａ鎖は、少なくとも約５残基を、そしてＴＣＲエピトープと少なくとも約１０％の配列相同性を有し、Ｂ鎖は、少なくとも４残基を、そしてシグナル−２部分由来のペプチドと少なくとも約１０％の配列相同性を有し、そしてＸ鎖はリンカーである。リンカーは、天然存在アミノ酸または化学合成アミノ酸を含む、いかなるアミノ酸であってもよい。さらに、Ｘ鎖は少なくとも１残基を有する。Ｘを伴わず、ＡをＢに直接連結することもまた可能であるが、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ−ＩＩおよび二次シグナルリガンド間の距離を補うため、ある程度の大きさのリンカーが好ましい。上述のように、好ましくは、プロテアーゼ攻撃に耐性であるため、非基質アミノ酸を用いるであろう。さらにより好ましくは、リンカーは、小アミノ酸または親水性アミノ酸と交互に非基質アミノ酸を含んでなるであろう。さらにより好ましくは、リンカーは、リンカーの各端に隣接するシグナル−１部分およびシグナル−２部分と共に、１つの連続配列として合成可能である。さらにより好ましくは、リンカーは、一般式（Ａ，Ｂ）xを有し、式中、ＡおよびＢはアミノ酸残基であり、そしてＡアミノ酸残基は、独立して、それぞれ、アミノカプロン酸、アミノヘキサン酸、アミノドデカン酸、およびβ−アラニンからなる群より選択され、そしてＢアミノ酸残基は小アミノ酸または親水性アミノ酸である。この式において、Ｘが１〜１００の範囲であることが可能である。特に代表的なＢ残基はグリシンである。この態様において、リンカーは、潜在的に、グリシン残基（Ｇ）と交互にアミノカプロン酸（Ａｃ）、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、アミノドデカン酸（Ａｄｏ）、およびβ−アラニン（βＡ）を有することが可能である（例えばＡｃ−Ｇ−Ａｈｘ−Ｇ−Ａｄｏ−Ｇ−βＡ）。リンカーを構築するのに用いる残基の選択は、リンカーの所望の長さとともに静電妨害に関する考慮、疎水性、電荷などに基づくことが可能である。１つの好ましいリンカーは、交互に現れるＡｃおよびＧ残基を含んでなる。このリンカーは、他のアミノ酸残基（Ａｈｘ、Ａｄｏ、βＡ）を選択して含むことによって、長くすることもまたは短くすることも可能である。いくつかの代表的なリンカーが、配列番号２６〜２９として表２に含まれる。さらに、Ｘ鎖は、Ａ鎖およびＢ鎖の間に配置され、そして全ペプチドは、１つの連続配列として合成可能である。いくつかの好ましい配列は、配列番号１〜２５のいずれか１つと少なくとも約１０％の配列相同性を有するＡ鎖、配列番号２６〜２９のいずれか１つと少なくとも約２％の配列相同性を有するＸ鎖、および配列番号３０〜４１のいずれか１つと少なくとも約１０％の配列相同性を有するＢ鎖、を有するであろう。ペプチドは、１型反応から２型反応へ、またはその逆のシフトを行うことが可能であることが好ましい。もちろん、ペプチド擬似体を合成して、リンカーを含む、ＢＰＩのいかなる部分も模倣することが可能である。好ましくは、Ａ鎖はＡＰＣ上のＭＨＣに結合して、ペプチド：ＭＨＣ複合体を形成する。この複合体は、決定的なＴ細胞集団上にあるＴＣＲに結合可能である。���らにより好ましくは、Ｂ鎖は、ペプチド：ＭＨＣ複合体の形成と同時点で、ＡＰＣ上のシグナル−２リガンドに結合可能である。このＡＰＣへの結合の組み合わせは、Ｔ細胞に搬送されるシグナルを改変可能であるはずである。一次シグナルおよび二次シグナルの組み合わせは、Ｔ細胞を完全に活性化可能であり、そしてＡ鎖に用いるペプチドおよびＢ鎖に用いるペプチドを選択することによって、免疫反応を通常の進行から外れさせることができる。正常に活性化された、ＴH１細胞の上方制御を導く１型反応の場合には、この反応を、ＴH２細胞の上方制御を導く２型反応を生じるよう改変可能である。正常に活性化された、ＴH２細胞の上方制御を導く２型反応の場合には、この反応を、ＴH１細胞の上方制御を導く１型反応を生じるよう、改変可能である。Ａ鎖は、その配列と通常関連する健康状態に基づいて、選択可能である（例えば表４を参照されたい）。
【００２７】
本発明の別の側面において、免疫反応を調節するペプチドを調製する方法を提供する。この方法は、ＴＣＲエピトープ由来の配列と少なくとも約１０％の配列相同性を有する第一のペプチド配列を選択し、シグナル−２受容体部分由来の配列と少なくとも約１０％の配列相同性を有する第二のペプチド配列を選択し、柔軟な非基質リンカーである第三のペプチド配列を選択し、そしてこれらのペプチドを連続ペプチド鎖として合成するステップを含んでなる。好ましくは、リンカーは、ＴＣＲエピトープ由来のペプチドと一端で隣接し、そしてシグナル−２部分由来のペプチドと他方の端で隣接する。好ましくは、第一のペプチド配列は、既知の健康状態と関連し、そしてＡＰＣ上のＭＨＣと結合可能であるべきである。同様に、第二のペプチド配列が、ＡＰＣ上のシグナル−２リガンド部分と結合可能であることが好ましい。この方法は、ＴＣＲと名目上のペプチド免疫原を接触させ、それによって第一のペプチド配列をＭＨＣに結合させ、そして第二のペプチド配列をシグナル−２リガンドに結合させ、それによって、一次シグナルリガンドおよび改変／遮断された二次シグナルリガンド（これらのシグナルリガンドは所望の免疫反応を活性化する強力なものである）を所持するＡＰＣを生じるステップをさらに含んでなることが可能である。
【００２８】
ＢＰＩ設計に固有なのは抗原特異的部分であるが、この抗原特異的部分は、所定のＴ細胞集団が活性化されてそれに対して反応し（すなわちＴＣＲエピトープ）、最終的に防御またはある場合は病的免疫反応を生じる免疫反応のカスケードを導く。これらのエピトープは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した際、Ｔ細胞活性化の２シグナルの機構のシグナル−１を提供する。したがって、重要な考慮は、ＭＨＣ分子に対する所定のペプチドの親和性である。マウスおよびヒトにおいて、この親和性は、ビオチン化ペプチドを、Ｔ細胞にペプチド：ＭＨＣ複合体を提示する細胞に結合させることによって、直接試験した。可能性のあるペプチドエピトープに対するＴ細胞クローンを生成し、Ｔ細胞機能を特異的に刺激するある反応の免疫優性ＴＣＲへの結合に関して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＴＣＲに実際に接触するペプチド残基の変更は、ＢＰＩ開発の一部であるため、ＭＨＣ分子に結合するエピトープの既知の結晶構造が利用可能であることもまた、好ましい。これによって、特定のアミノ酸置換または擬似体が、発展中のＴ細胞が遭遇する実際の構造にどのように影響を与えるかを正確に三次元予測することが可能になる。しかし、既知の結晶構造なしでも、他のペプチド：ＭＨＣ構造の入手可能な座標に基づき、仮説的なペプチド：ＭＨＣ構造の形状を予測することが可能である。この予測可能性は、部分的には、確立されたペプチド結合モチーフに負うものであり、これが、エピトープのどの残基が、与えられたＭＨＣ対立遺伝子の特定の結合ポケットに、最も容易に適合するかの予測を可能にする。これらの予測は、コラーゲンペプチドに結合する２つの異なる対立遺伝子（Ｉ−ＡsおよびＩ−Ａb）結合を用いて達成される（Ｉ−Ａ分子の各多型位をこれらの位で既知のアミノ酸で置換した）。全体の構造は、異なるペプチドに結合する参照対立遺伝子Ｉ−Ａkの公表された座標に基づいた。したがって、特定の疾患関連エピトープの３Ｄ構造が知られていない場合でも、同様の対立遺伝子置換およびモデリングアプローチによって、ＴＣＲがペプチドに接触する場所を予測する構造をもたらすことができる。これらのＴＣＲ接触位を同定する（または少なくとも予測する）ことが重要である。ＴＣＲ接触位に対するある種の改変は、免疫の経過を決定可能なＴH１またはＴH２型へのＴ細胞の機能的分化を変化可能であることがよく知られている（Ｍｕｒｒａｙら，  主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子は、ＴH１またはＴH２反応において、同一の免疫原ペプチドの反対側にＴＣＲ特異性を向ける（未公表原稿、２０００）；およびＭｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３（１９９８）、この文献の解説は本明細書に援用される）。
【００２９】
特に、ペプチドが生存ＡＰＣ上のＭＨＣ分子に結合することが確認された。簡潔には、脾臓細胞密度勾配分画（マウス由来）、またはＰＢＬ、またはＡＰＣ株（ヒト由来）を、増加する濃度の個々のビオチン化ペプチドと共に、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベーションした。ＡＰＣへのＢＰＩの結合後、アビジン−ＦＩＴＣを、細胞と氷上で３０分間インキュベーションし、その後、ビオチン化抗アビジンと１時間インキュベーションし、その後、再びアビジン−ＦＩＴＣとインキュベーションした。ＢＰＩ力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）には、滅菌０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の０．１−１００μＭへ増加する濃度のビオチン化誘導体を、上述のように、ＡＰＣと１６時間インキュベーションした。図５に示すように、予測されるとおり、ＧＡＤ６５  ＢＰＩはＮＯＤ  ＡＰＣに優先的に結合する。ＬＦＡ−１部分またはＧＡＤ６５部分は、糖尿病系統のＡＰＣへ対するこのような増加した結合を示さなかった。三色解析は、商業的に入手可能な、ＡＰＣの既知の表面マーカーに対するＣｙ−クロムまたはＰＥ−コンジュゲート化抗体を用いた。結合ペプチドのアビジン−ＦＩＴＣおよびビオチン化抗アビジン検出は、Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６）に先に記載されるとおりであった。この方法のわずかな変更を用いて、生存ＡＰＣ表面上で直接にＭＨＣおよびＩＣＡＭ分子の同時キャッピングおよびペプチド阻害（すなわちペプチド親和性）を試験した。まず、ＭＨＣまたはＩＣＡＭ分子に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はＢＰＩ結合を遮断し、したがって、ＢＰＩがこれらの分子に結合することが示された（図６）。非標識ペプチドを競合アッセイで用いて、ＡＰＣに対するＢＰＩの相対親和性を得て、そしてＢＰＩがＡＰＣ上のＭＨＣおよびＩＣＡＭ分子を架橋する能力は、ＩＣＡＭを抗ＭＨＣ  ｍＡｂで同時キャッピングすることによって調べた。ここでは、細胞をＢＰＩとインキュベーションした。次に、抗ＭＨＣ  ｍＡｂを添加した。３７℃で３０分間処理した後、細胞を氷上に移し、そしてＰＥ標識抗ＩＣＡＭで染色した（図７）。
【００３０】
次に、ＢＰＩで後に使用するための、ＴＣＲエピトープを決定するため、Ｔ細胞クローンを生成した。これらの実験は、先に記載する方法（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））を用いて、予測されるＴＣＲエピトープに対して免疫した、ヒトまたはマウス由来のＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを利用した。これらのクローンは、照射組織適合リンパ球、ペプチド、および組換えＩＬ２で隔週、再刺激することによって維持した。所定のＴＣＲエピトープが、サイトカイン合成の活性化に有効であるか決定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた。もちろん、他のサイトカインアッセイもまた使用可能である。解析のためには、予測されるＴＣＲ接触位で置換したＢＰＩを用いて、これらのＢＰＩ変異体のうちどれが、上で解析するような、増殖、および個々のクローンからのサイトカイン放出の阻害に最も有効であるかを決定するであろう。分子モデリングによってもたらされた構造において、予測される位を、異なるアミノ酸または擬似体でスキャンして、ＴＣＲとの相互作用を改変するであろう。
【００３１】
次に、分子動力学／エネルギー最小化（ＭＤＥＭ）を用いて、ペプチドコンホメーションを研究するであろう。ＭＤシミュレーションを結晶データと組み合わせて用いて、ＢＰＩの溶液コンホメーションを予測するであろう。ＭＤＥＭシミュレーションは、柔軟度、並びにＢＰＩのＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１への結合中のコンホメーション変化を予測可能である。これらのモデル研究によってまず予測されるように、両受容体への同時結合を助けるため、シグナル−１部分および／またはシグナル−２部分にアミノ酸置換を導入することも可能である。Ｉ−Ａg7：ＢＰＩ：Ｄ１構造（図８を参照されたい）は、疾患関連ペプチド：ＭＨＣ構造（Ｉ−Ａg7：ＧＡＤ６５ペプチド）の結晶構造座標を用いる例である。この図では、ＩｎＳｉｇｈｔＩＩ（ＭＳＩ／Ｂｉｏｓｙｍ）を用いて、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｏｃｔａｎｅワークステーション上でドッキング研究を行った。ＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１構造は、既知の回折座標から取り、そしてＩ−Ａg7：ＧＡＤ６５ペプチドは既知の座標由来であった。もちろん、マウスおよびヒトの多様なＭＨＣ分子に結合するため、類似の方法を用いて、表１、２、３および４に列挙するＢＰＩをモデリングすることが可能である。
【００３２】
ＢＰＩプロセスの第二の段階は、Ｔ細胞の機能的分化に関与する、確立された二次シグナル受容体分子のペプチド模倣体の選択である。これらの構造を決定するため、結晶構造およびその生理学的リガンドに結合する二次シグナル受容体の入手可能なモデルを用いて、リガンドと接触する受容体の領域を予測するであろう。このアプローチを用いて
【００３３】
【化１】
2004536783.tif 000002
【００３４】
と示すことが可能なＥＧＡＤ−ＢＰＩを設計した。
これらの相互作用はまた、二次シグナル分子に部位特異的変化を作成して、そしてこうした突然変異体分子がなお、問題のリガンドに結合するかどうか決定することによって、経験的に決定可能である。しかし、これらの研究の多くは、ＬＦＡ−１、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０Ｌ、およびＣＤ９５Ｌを含む、既知の二次シグナル受容体を用いて行われてきた。分子モデリング研究を上述のように用いて、これらの二次シグナル部分とそのリガンドの相互作用を別個に、そして該部分がＢＰＩ構造の一部である場合、モデリングするであろう。
【００３５】
ＭＨＣおよび二次シグナルリガンドに有効に結合して、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞機能を改変する、候補ＢＰＩ部分をひとたび同定したら、これらの部分を、相対的に短い合成ペプチドの反対側で合成し、多様な長さの非タンパク質分解基質リンカーによってこれらを連結した。原型的なＥＧＡＤ−ＢＰＩに記載されるように、シグナル−１部分（すなわち疾患関連ＴＣＲエピトープ）は、この柔軟なリンカーによって、シグナル−２受容体模倣ペプチド（すなわちＴH１／ＴH２分化に関与すると考えられる二次シグナル受容体）に連結した。これらの合成ペプチドは、ペプチド合成の従来法によって生成した。いくつかの場合、ＢＰＩは、単離ＭＨＣおよび二次シグナルリガンドへの結合に関して試験し、そしてＮＭＲ、分子モデリングおよび結晶学を用いて、その正確な３Ｄ構造を決定する。最後に、与えられたＢＰＩがｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であるかどうかを決定した。マウスをＢＰＩで処置し、そして免疫細胞を単離し、そしてＥＬＩＳＰＯＴによってサイトカイン産生に関して試験した（図９および１０を参照されたい）。もちろん、他のサイトカインアッセイが一般の当業者によく知られているであろうし、そしてＥＬＩＳＰＯＴの代わりに使用可能である。ＮＯＤ．Ｓｃｉｄモデルと同様のｉｎ  ｖｉｖｏモデル（すなわちヒトＳｃｉｄ、トランスジェニックノックアウト系統など）を、ＢＰＩ有効性のより厳密な試験として用いた（調べる各疾患に必要な変更を行ったが)。例えば、ＨＩＶ−１  ｐ２４  ＴＣＲエピトープの場合、養子移植実験に、ヒト−Ｓｃｉｄマウスを用いる。この実験においては、患者由来のＴ細胞をまず、従来法によってクローニングし、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＢＰＩで刺激するであろう。次にこれらの細胞をヒト−Ｓｃｉｄマウスに移植し、そしてＮＯＤ．Ｓｃｉｄ養子移植実験においてＥＧＡＤ−ＢＰＩのように解析するであろう。これらの実験の結果は、図１１〜１３に示す。
【００３６】
ＢＰＩを合成するため、クロロトリチル樹脂上のＦｍｏｃ化学反応を用いた。保護アミノ酸は、８倍過剰で１時間、二重カップリングした。樹脂をＤＭＦとＭｅＯＨで洗浄し、そして試薬Ｒ：ＴＦＡ、ＥＤＴＡ、チオアニソール、アニソール中で切断した。溶液中にペプチドを含有するＴＦＡ混合物は、エーテル中で沈殿させ、そして徹底的に洗浄した。ペプチドの調製用ＨＰＬＣは、０．１％ＴＦＡ中の０−８０％アセトニトリルの勾配によって達成した。多様な分画の凍結乾燥およびＶｏｙａｇｅｒ質量分析計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる確認によって、ＴＦＡ塩として、合成ペプチドを得た。上述のようなモデリング、結晶学および結合についての研究を用いて、予測されるＢＰＩ複合体構造を作り出した。
【００３７】
糖尿病ＢＰＩをｉｎ  ｖｉｖｏで試験する別の例において、１５００万の疾患関連リンパ球（すなわち患者Ｔ細胞、または疾患過程に関連するＴ細胞集団）を、（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで）ＢＰＩ化合物を投与したＴ細胞を含みまたは含まずに注入し、そして組換えＩＬ−２中、２４時間増殖させた。いくつかの実験では、養子移植の前に、ＣＤ１５４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１５２などに対するｍＡｂおよび磁気粒子を用いてＴ細胞の特定のサブセットを枯渇させるであろう。ＢＰＩの個々の部分で処理したＴ細胞（マウスまたはヒト由来）が、生理食塩水のみで処置したマウス由来のＣＤ４＋細胞と共に、陰性対照として用いられるであろう（図９）。自発的糖尿病をブロックするため、５つの群の１０匹のメスＮＯＤマウス（１２週齢）を用いて、標準的糖計測装置（ＡｃｃｕＣｈｅｋ−ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、非糖尿病性血液グルコースレベルをモニターした。各マウスを標識し、そして実験の経過中、毎週、それぞれの血液グルコースレベルをモニターした。この５群には、（ａ）８週齢でＢＰＩの静脈内（ｉ．ｖ．）注射（１００μｇ、１００μｌ内毒素不含生理食塩水／注射液中）、（ｂ）同用量のＧＡＤ６５（２０８−２１７）エピトープのみ、（ｃ）同用量のＣＤ１１ａ（２３７−２４７）ペプチドのみ、または（ｄ）生理食塩水のみ、のいずれかを投与した。他の系に関しては、異なるシグナル−１ペプチド、シグナル−２ペプチド、ＢＰＩを伴う同様の処置群を用いるであろう。マウスは、問題の特定のＢＰＩに応じて、適切な感染性病原体または抗原での攻撃によって試験されるであろう。
【００３８】
免疫組織学によって疾患過程を評価するため（例えば図１２Ａ〜Ｄを参照されたい）、脾臓、膵臓、または他の標的器官（例えばＭＢＰペプチドＢＰＩに関してはＣＮＳ、またはＲＳＶペプチドＢＰＩに関しては肺）を、各群の安楽死させたマウスから除去し、そして中性緩衝ホルマリン中で固定しパラフィン中に包埋することによって組織像用に調製するか、またはＯ．Ｃ．Ｔ．培地中で瞬間凍結した。炎症をスコア化するため、各マウスから最小５切片を用いて、与えられたＢＰＩのブロッキング効果を評価した。細胞浸潤上の標準的Ｔ細胞マーカーを性質決定するため、多様な細胞表面抗原に対するビオチン化ｍＡｂをクリオスタット切片とそれぞれインキュベーションし（２時間）、その後、アビジン−アルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションするであろう。あるいは、細胞サブセットは、Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６）に記載されるような標準的フローサイトメトリー法によって表現型決定されるであろう。最後に、スチューデントｔ−検定またはＡＮＯＶＡを用いて、群および個々のマウス間に観察される統計学的有意差を推定するであろう。
【００３９】
リンカーを介して共に連結されるシグナル−１部分およびシグナル−２受容体部分からなる、組み立てられたＢＰＩのいくつかの代表を、配列番号４２〜４６として、表４に示す。これらの代表的なＢＰＩは、１型から２型反応に、そしてその逆に、特定の免疫反応をシフトするよう作動可能である。都合よいことには、他の抗原性ペプチドに対する他の免疫反応は、好ましくは影響を受けないであろう。
【００４０】
（好ましい態様の詳細な説明）
本出願において、以下の定義が適用されるであろう：「配列同一性」は、当該技術分野に知られるように、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列、すなわち参照配列と与えられた配列（参照配列と比較しようとする配列）との関係を指す。配列同一性は、こうした一連の配列間のマッチによって決定されるような、最高の度合いの配列類似性を生じるように配列を最適に並列した後、参照配列に所定の配列を比較することによって決定する。こうした並列に際して、配列同一性は、位対位に基づいて確かめ、例えば、特定の位で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であるならば、配列はその位で「同一」である。その後、こうした位同一性の総数を、参照配列におけるヌクレオチドまたは残基の総数で割って、％配列同一性を得る。配列同一性は、限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｎ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８８），  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｇｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．ら監修，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．ら，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３（１９８８）に記載されるものなどを含む、既知の方法によって、容易に計算可能であり、これらの文献の解説は、本明細書に援用される。配列同一性を決定するのに好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大マッチを得る。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する、公共に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。こうしたプログラムの例には、限定されるわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源から公共に入手可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．ら，  ＮＣＶＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０（１９９０）、これらの文献の解説は、本明細書に援用される）。これらのプログラムは、与えられた配列および参照配列間に最高レベルの配列��一性を生じるため、デフォルトギャップ加重を用いて、配列を最適に並列する。例えば、参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによっては、与えられたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５までの点突然変異を含むことが可能であること以外は、参照配列と同一であることを意図する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に比較して、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列中の５％までのヌクレオチドが、欠失しているかまたは別のヌクレオチドで置換されていることが可能であり、あるいは、参照配列の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、参照配列に挿入されていることが可能である。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５'または３'末端位で、あるいはこれらの末端位の間のどこかで、参照配列のヌクレオチドの間に個々に分散しているかまたは参照配列内の１以上の隣接基で、生じることが可能である。同様に、参照アミノ酸配列に、少なくとも、例えば９５％の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、このポリペプチドの所定のアミノ酸配列が、参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり５アミノ酸までの改変を含むことが可能であること以外は、参照配列に同一であることを意図する。言い換えると、参照アミノ酸配列に比較して、少なくとも９５％の配列同一性を有する所定のポリペプチド配列を得るには、参照配列中の５％までのアミノ酸残基が、欠失しているかまたは別のアミノ酸で置換されていることが可能であり、あるいは、参照配列のアミノ酸残基総数の５％までの数のアミノ酸が、参照配列に挿入されていることが可能である。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位で、あるいはこれらの末端位の間のどこかで、参照配列の残基の間に個々に分散しているか、または参照配列内の１以上の隣接基で、生じることが可能である。同一でない残基位は、保存的アミノ酸置換によって異なっていることが好ましい。しかし、保存的置換は、配列同一性を決定する際のマッチには含まれない。
【００４１】
同様に、「配列相同性」もまた、本願において、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２以上の配列を上述のように最適に並列し、そして必要な場合、ギャップを導入する。しかし、「配列同一性」と対照的に、保存的アミノ酸置換は、配列相同性を決定する際のマッチに数える。言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るには、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの９５％は、別のアミノ酸またはヌクレオチドとマッチするか、またはそれらとの保存的置換を含んでならなければならず、あるいは、参照配列において、保存的置換を含まない、総アミノ酸残基または総ヌクレオチドの５％までの数のアミノ酸またはヌクレオチドが、参照配列に挿入されることが可能である。
【００４２】
「保存的置換」は、アミノ酸残基またはヌクレオチドの置換であって、全体の機能性が顕著に変化しないように、同様の特徴または特性（サイズ、荷電、疎水性など）を有する別のアミノ酸残基またはヌクレオチドでの、アミノ酸残基またはヌクレオチドの置換を指す。
【００４３】
「単離」は、「人の手によって」天然状態から改変されること、すなわち天然に生じる場合、その元来の環境から変化したかまたは除去されているか、あるいは両方であることを意味する。例えば、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されていないが、該用語を本明細書において使用する際、天然状態の同時存在物質から分離されている、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されている。最後に、本明細書に明らかには援用されていない、本明細書に引用する参考文献および解説はすべて、本明細書に援用される。
【００４４】
配列番号１〜４６のいずれか１つと少なくとも約１０％の配列同一性を有する配列を含むかまたは有し、かつＡＰＣへの同様の結合特性または２つのペプチド配列間の連結特性を示す配列が、本発明の範囲内である。好ましくは、こうした配列は、配列番号１〜４６のいずれか１つと、少なくとも約３０％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約５０％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％の配列同一性、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性を有するであろう。あるいは、配列番号１〜４６のいずれか１つと少なくとも約１０％の配列相同性を有する配列を含むかまたは有し、かつＡＰＣへの同様の結合特性または２つの隣接ペプチド配列間の連結特性を示す配列が、本発明に含まれる。より好ましくは、こうした配列は、配列番号１〜４６のいずれか１つと、少なくとも約３０％の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約５０％の配列相同性、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％の配列相同性、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％の配列相同性を有するであろう。さらに、突然変異事象、一連の突然変異事象、または化学的誘導体化により、配列番号１〜４６のいずれか１つと異なってはいるが、なお、望ましい特性を示す配列もまた、本発明に含まれる。こうした突然変異事象または誘導体化には、限定されるわけではないが、点突然変異、欠失、挿入、再編成、ペプチド擬似体、および他の化学的修飾が含まれる。
【００４５】
「リンカー」は、天然存在アミノ酸または化学合成アミノ酸を含む、いずれかのアミノ酸と定義する。好ましくは、「リンカー」は、タンパク質分解性分解に耐性であるアミノ酸残基の柔軟な非基質配列であり、シグナル−１部分をシグナル−２部分にコンジュゲート化および／またはカップリングするのに使用可能である。
【００４６】
「シグナル−１部分」は、ペプチドエピトープ、すなわち、重要なＴＣＲが結合する、抗原のペプチド部分および／またはこれらの抗原性ペプチドの擬似体と定義する。
「シグナル−２部分」または「シグナル−２受容体部分」は、ＡＰＣ上の相補リガンドに結合するおよび／または受容体がＡＰＣ上のその相補リガンドに結合するのに影響を及ぼす、二次シグナル受容体のペプチド部分と定義する。これは、目的の受容体／リガンド構造のペプチド模倣体および擬似体を含むことが可能である。
【００４７】
「シグナル−２リガンド」は、受容体部分および／またはシグナル−２受容体部分が顕著な親和性を有しそして結合する、ＡＰＣ上のシグナル−２受容体部分の相補タンパク質である。
【００４８】
本明細書において、「誘導体」は、ペプチドに関しては、アミノ酸付加、欠失、交換、置換、および／または修飾によって生じる変化；組換えおよび／またはＤＮＡシャッフリングによって生じる突然変異体；および部分的に、ペプチドの塩、溶媒和物、および他の化学合成／修飾型であって単離天然ペプチドの活性を保持するものを指す。
【００４９】
ＢＰＩは、標準法によって、Ｆｍｏｃアミノ酸化学反応を使用する、ロボット多重ペプチド合成装置による自動化ペプチド合成を用いて生成した。Ｗａｎｇ樹脂（ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコールポリスチレン）を固体支持体として用いた。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析によって性質決定した。メリフィールドペプチド合成と呼ばれるこの合成は、ペプチド鎖を長くしながら支持体構造に付着させるように、固体支持体上で行う伝統的有機化学反応を利用する。ペプチドは、ＴＦＡを用いて樹脂から切断し、そして逆相ＨＰＬＣによって精製し、そして質量分析によって解析するであろう。あるいは、これらの反応は、より多い量のペプチドが望まれる場合、溶液中で行うことが可能である。もちろん、本発明のペプチドは、当該技術分野によく知られたいくつかの技術によって合成するかまたは調製することが可能である。例えば、本明細書に完全に援用される、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  １９８３，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  ニューヨークを参照されたい。例えば、短いペプチドは、固体支持体上で、または溶液中で、合成可能である。より長いペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて作成可能である。ここで、一般的な当業者に公知の技術にしたがって、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成、および／またはクローニングし、そして発現させることが可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌｓ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨークを参照されたい。
【００５０】
あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドのアミノ酸残基を連結する１以上の結合が非ペプチド結合であるように、合成可能である。これらの代替の非ペプチド結合は、当業者に公知の反応を利用することによって形成可能であり、そして限定されるわけではないが、いくつかのみを挙げると、アミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、およびアゾ結合を含むことが可能である。本発明のさらに別の態様において、上述の配列を含んでなるペプチドは、例えば、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または阻害活性を増進させるように、アミノおよび／またはカルボキシ末端に存在するさらなる化学基を含んで合成することが可能である。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基をペプチドのアミノ末端に付加することが可能である。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基をペプチドのアミノ末端に置くことが可能である。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基をペプチドのカルボキシ末端に付加することが可能である。
【００５１】
あらかじめ形成されたペプチドが商業的なペプチド合成実験室から容易に購入可能であるため、これらを購入することによって、２５アミノ酸以下を有するペプチドの別の代替供給源が提供される。後の合成スキームにおいて、ペプチド擬似体化合物を、ペプチド部分の代わりに合成し、そして同じ化学反応によって連結することが可能である。ペプチド擬似体の設計は、確立された技術であり、そしてペプチドの重要なアミノ酸の既知の相関物を、先に公表された方法によって、合成可能である。さらに、当該技術分野によく知られているように、本明細書に詳細に記載する好ましいペプチドと同じ調節特性を有するペプチド擬似体を開発可能である。これらのペプチド擬似体は、常用的な当該技術分野の技術以上のものを必要とすることなく作り出せるため、こうしたペプチド擬似体は、本出願に含まれる。特に、これらのペプチド擬似体の側鎖は本明細書の好ましいペプチドの側鎖と構造が非常に類似であろうが、そのペプチド主鎖は非常に異なるかまたはまったく似ていなくてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に対する耐性またはより大きいコンホメーション安定性が望ましい場合、本発明のペプチドは、いかなる公知の方法によって、環化することも可能である。１つのこうした方法は、ＮおよびＣ末端にペニシラミン（Ｐｅｎ）およびシステイン（Ｃｙｓ）残基を付加して、ＰｅｎおよびＣｙｓ残基間のジスルフィド結合を介した環状ペプチドを形成する。この環状ペプチドの形成は、ペプチドコンホメーションを制限して、コンホメーション安定性を生じ、それによって、その直鎖対応物よりも、細胞表面受容体に対する、より優れた選択性を提供する。
【００５２】
シグナル−１部分およびシグナル−２部分間に渡るＢＰＩの部分をリンカーと称する。上述のように、リンカーは、ＢＰＩを形成するのに必須ではない。しかし、リンカーを用いる場合、リンカーは、いかなる天然存在アミノ酸または化学合成アミノ酸であることも可能である。好ましくは、リンカーは、プロテアーゼ攻撃を妨げるのを補助する非基質アミノ酸残基鎖である。特に好ましいリンカーは、非天然アミノ酸であるアミノカプロン酸（Ａｃ）、およびアミノ酸グリシン（Ｇ）の反復鎖である（例えばＡｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ）。リンカーにもっと短い長さが必要である場合、１以上のＡｃ残基をベータ−アラニン残基（βＡｌａ）で置き換えることが可能である。リンカーにもっと長い鎖が必要である場合、１以上のＡｃ残基をアミノ−ドデカン酸残基（Ａｄｏｄ）で置き換えることが可能である。当該技術分野によく知られているように、これらのリンカーアミノ酸のペプチド擬似体もまた、合成してＢＰＩ構造に挿入することが可能である。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示す。しかし、これらの実施例は、例示のためにのみ提供するものであり、実施例中のいずれも本発明の全体の範囲に対する限定とみなしてはならないことを理解すべきである。
【００５４】
（実施例１）
本実施例は、ＢＰＩを作り出す方法を記載する。
材料および方法：
ペプチド合成は、クロロトリチル樹脂上のＦｍｏｃを介した。保護アミノ酸は、８倍過剰で１時間、二重カップリングした。樹脂を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とメタノール（ＭｅＯＨ）で洗浄し、そして試薬Ｒ：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオアニソール、アニソール中で切断した。溶液中にペプチドを含有するＴＦＡ混合物は、エーテル中で沈殿させ、そして徹底的に洗浄した。ペプチドの調製用ＨＰＬＣは、０．１％ＴＦＡ中の０〜８０％アセトニトリルの勾配によって達成した。多様な分画の凍結乾燥および質量分析による確認によって、ＴＦＡ塩として、合成ペプチドを得た。モデリング、結晶学および結合についての研究は上述のとおりである。
【００５５】
結果：
本実施例で作り出したペプチドを表１に示し、配列番号１〜４６としても列挙する。これらのペプチドには、シグナル−１部分、シグナル−２部分およびこれら２つの部分間の非基質リンカーが含まれる。ＢＰＩを作り出すために、上述のペプチド合成を用いて、いかなるシグナル−１部分を、いかなるシグナル−２部分に、いかなるリンカーを介して、連結することも可能である。言い換えると、ＢＰＩは、シグナル−１ペプチド配列、続いてリンカー配列、続いてシグナル−２ペプチド配列を含んでなる１つの連続ペプチド鎖として作り出される。さらに、いくつかの代表的なＢＰＩを、後に実験で使用するためにつくった。これらのＢＰＩは、本明細書において、表４に含まれる。しかし、これらのＢＰＩは代表（表１−４に列挙される各ＢＰＩ部分も同様）であり、そしてまったく包括的でないことに注目することが重要である。
【００５６】
表１．シグナル−１ペプチド
【００５７】
【表１】
2004536783.tif 000003
【００５８】
表２．リンカー
【００５９】
【表２】
2004536783.tif 000004
【００６０】
表３．シグナル−２ペプチド
【００６１】
【表３】
2004536783.tif 000005
【００６２】
表４．いくつかの代表的なＢＰＩ
【００６３】
【表４】
2004536783.tif 000006
【００６４】
考察：
リンカー、シグナル−１部分、およびシグナル−２部分をひとたび選択したら、上述の方法を用いて、完全なＢＰＩが合成可能である。本発明と組み合わせて使用可能な、潜在的なシグナル−１部分は数千ある。これらの部分は各々、別個の免疫学的反応または疾患状態と関連する可能性がある。エピトープ構造および配列をひとたび決定したら、適切なリンカーを選択し、そしてＢＰＩの他の部分、すなわち二次シグナル部分を選択することが可能である。これらの配列すべてを決定したら、ペプチド配列自体、ペプチド擬似体、または２つの組み合わせを用いて、ＢＰＩを設計することが可能である。適切なペプチド擬似体の構築は、その内容および解説が本明細書に援用される、Ｆａｌｃｉｏｎｉら，  １７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ５６２−５６７（１９９９）に詳述される。
【００６５】
図８は、本発明の方法によって産生した、ＣＤ１１ａ（２３７−２４７）二次シグナル部分に連結したＴＣＲエピトープ、ＧＡＤ６５（２０８−２１７）の構造を例示する。これは、Ｉ−Ａg7の溝およびＩＣＡＭ−１のＤ１ドメインに結合することが示される。Ｉ−Ａg7：ＧＡＤ６５ペプチド構造をモデリングするため、ＩｎＳｉｇｈｔＩＩソフトウェア（ＭＳＩ／Ｂｉｏｓｙｍ）を用いて、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｏｃａｔａｎｅワークステーション上でドッキング研究を行った。ＬＦＡ−１ペプチド：ＩＣＡＭ−１ドメイン構造は、その解説および開示が本明細書に援用される、Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｃ．Ｐ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２８９３７（１９９８）のドッキングモデルに基づく。Ｉ−Ａg7のアルファ炭素リボンはピンクで示し；ＩＣＡＭ−１のＤ１は明るい青で示し；ＢＰＩは、原子によって、炭素は緑、酸素は赤、そして窒素は青で示す。この構造は、ＧＡＤ６５（２０８−２１７）−［Ａｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ］−ＣＤ１１ａ（２３７−２４７）と命名可能である。好都合には、リンカーの長さは、シグナル−１部分とシグナル−２部分との間を最適な長さにつなぐため、必要に応じてまたは得られた実験データいずれかに示されるように、変更可能である。
【００６６】
これらの構造は、模式的に（図２および３）、および構造モデル（図８）に示す予備的機構によって例示する。用いたリンカーは配列−［Ａｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ］−を有する。リンカーを長くするため、アミノドデカン酸の代わりに１以上のアミノカプロン酸（Ａｃ）残基が使用可能である。リンカーを短くするため、アミノカプロン酸の代替物としてベータ−２アラニンが使用可能である。
【００６７】
もちろん、一般の当業者の１人が、ＢＰＩと類似の活性を有するであろういかなる数のペプチド擬似体または誘導体を産生することも可能であり、そしてこうした修飾は、上により詳細に記載されるように、本発明に含まれる。
【００６８】
（実施例２）
本実施例は、ビオチン化ＢＰＩを用いて、非標識ペプチドまたは生存ＡＰＣ上のＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体によるＢＰＩ結合の競合的阻害に関して試験し、そして生存ＡＰＣに対する抗原性ペプチド結合を確める。さらに、ＭＨＣ−ＩＩまたはＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体が、糖尿病ＢＰＩ（ＧＡＤ６５（２０８−２１７）−［Ａｃ−Ｇ−Ａｃ−Ｇ−Ａｃ］−ＣＤ１１ａ（２３７−２４７））（以後、ＥＧＡＤ−ＢＰＩと称する）のＮＯＤ脾臓細胞への結合を有効に遮断することを示した。
【００６９】
材料および方法：
ビオチン化ＢＰＩを得るため、合成したＥＧＡＤ  ＢＰＩを、Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）に記載されるように、ＮＨＳ−ビオチンでビオチン化した。正常（非免疫）ＮＯＤ、ＢＡＬＢ／ｃおよび他のＭＨＣコンジェニック系統由来の脾臓細胞密度勾配分画を、増加する濃度の個々のビオチン化ペプチドと共に、丸底９６ウェルプレート中、３７℃、５％ＣＯ2で１６時間インキュベーションした。ＢＰＩのＡＰＣへの結合後、アビジン−ＦＩＴＣを、氷上で細胞と３０分間インキュベーションし、その後、ビオチン化抗アビジンと１時間、その後、再びアビジン−ＦＩＴＣとインキュベーションした。ＢＰＩ力価測定のため、滅菌０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の０．１−１００μＭへ増加する濃度のビオチン化誘導体を、上述のように、ＡＰＣと１６時間インキュベーションした。三色解析は、Ｃｙ−クロムまたはＰＥ−コンジュゲート化抗Ｂ２２０（ｍＡｂ  ＲＡ３−６Ｂ２（ＣＤ４５Ｒ  Ｂ細胞マーカー））、抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＫＨ７４または１０−３．６２ｍＡｂ）、または抗ＩＣＡＭ−１（３Ｅ２  ｍＡｂ）を用いた；（すべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴから購入）。結合ペプチドは、前方／側方散乱解析によってゲート処理された生存細胞上で、アビジン−ＦＩＴＣ／ビオチン化抗アビジン／アビジン−ＦＩＴＣで検出した。対照はビオチン化ペプチド以外のすべての検出試薬を含有した；各ヒストグラムに関して、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターで、２０，０００の事象を解析した。
【００７０】
非標識ペプチドまたは生存ＡＰＣ上のＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体でのＢＰＩ結合の競合的阻害に関して試験するため、単離したばかりの新鮮脾臓細胞分画を、あらかじめビオチン化しておいたＢＰＩとインキュベーションした。しかし、実験のこの部分に関しては、実験ウェルは、多様な非標識ペプチド（例えば抗原性ペプチドまたはＬＦＡ−１ペプチド）および／またはモノクローナル抗体（例えば抗ＭＨＣ−ＩＩまたは抗ＩＣＡＭ−１  ｍＡｂ）阻害剤を含有した。磁気粒子にコンジュゲート化したモノクローナル抗体を用いたネガティブ選択法を用いて、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹状細胞に関して脾臓細胞分画を濃縮すると共に、これらの異なる集団へのＢＰＩ結合の相違を調べた。これらの方法は、Ｓｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６）に詳述され、該文献の解説および内容は、本明細書、上記に援用される。
【００７１】
生存ＡＰＣへの抗原性ペプチド結合を確かめるため、最初のＥＧＡＤ−ＢＰＩを、ＮＯＤ（Ｉ−Ａg7）ＡＰＣへの選択的結合に関してスクリーニングし、そして生存ＡＰＣを用いたフローサイトメトリー法によって、ＭＨＣ−ＩＩまたはＩＣＡＭ−１いずれかに対するモノクローナル抗体を用いた同時結合に関してアッセイした（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））。このアッセイでは、増加する濃度のビオチン化−ＢＰＩ、−ＣＤ１１ａ（２３７−２４７）もしくは−ＧＡＤ６５（２０８−２１７）ペプチドを、各近交系由来の脾臓細胞と一晩インキュベーションした。結合ペプチドは、ビオチン化抗アビジン試薬の使用によって、アビジン−ＦＩＴＣ蛍光の増幅、その後、二周期目のアビジン−ＦＩＴＣ結合で検出した。ビオチン化ペプチドは、５０μＭのペプチド濃度で、１０6生存細胞とインキュベーションした。結合ペプチドは、アビジン−ＦＩＴＣ／ビオチン化抗アビジン−ＦＩＴＣで検出した。解析のため、前方／側方散乱ゲートを生存リンパ球上にセットし、そしてこのゲートで、２０，０００の事象を収集した。バックグラウンド蛍光（検出試薬のみ）を、５０μＭバイオ−ペプチドヒストグラム（ペプチド−蛍光強度＝ＦＬ１）と共に、図５ａ〜５ｃの各パネルに示す。陽性細胞（Ｍ２）の割合は、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔTMプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって決定し、そしてＭ２集団の中央値チャネル蛍光（ＭＣＦ）と共に、各パネルに示す（すべてのデータは、Ａｐｐｌｅ  Ｇ３コンピュータ上で作動させたＣＥＬＬＱｕｅｓｔTMプログラムの直接出力である）。
【００７２】
ＭＨＣ−ＩＩまたはＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体が、ＮＯＤ脾臓細胞への糖尿病ＢＰＩ（ＥＧＡＤ−ＢＰＩ）の結合を有効に遮断することを明らかにするため、図５ａ〜５ｃに用いたのと同一のアッセイを用いた。しかし、精製１０−３．６２（抗ＭＨＣ−ＩＩ）または３Ｅ２（抗ＩＣＡＭ−１）いずれかを脾臓細胞とビオチン化ＢＰＩの一晩インキュベーションに含ませた。両抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入し、そして５μｇ／ｍｌ最終濃度で用いた。モノクローナル抗体をまったく添加しない対照も、試験した。解析は、生存リンパ球に関して、前方／側方散乱ドットプロット上でゲート処理し、そして各ヒストグラムに関して、２０，０００事象を解析した。この例の結果を図６ａ〜６ｃに示す。
【００７３】
結果および考察：
図５ａ〜５ｃに提供するデータに例示するように、ＮＯＤ脾臓細胞は、ＢＡＬＢ／ｃ、Ａ．ＳＷ、またはＡ．ＢＹからまったく同じに精製した脾臓細胞より高い密度で、糖尿病ＢＰＩ（ＥＧＡＤ−ＢＰＩ）に結合する。先のデータは、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）密度勾配遠心分離によって単離したこれらの脾臓細胞調製において、Ｂ細胞が主な抗原性ペプチド結合細胞であることを示した（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））。高密度結合細胞の割合には、３０％（ＮＯＤ）から６％（Ａ．ＢＹ）までの顕著な相違があった。対照的に、シグナル−１（ＧＡＤ６５ペプチド）部分およびシグナル−２（ＣＤ１１ａペプチド）部分が別々では、優先的にＮＯＤ  ＡＰＣに結合しなかった。これを支持するデータを図５ｂおよび５ｃに示す。図５ｂは、図５ａに示すものと同一の脾臓細胞調製への、ビオチン化ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ  ２３７−２４７）ペプチドの直接結合を例示する。このシグナル−２部分がすべての系統の脾臓細胞に同様に結合したことに注目されたい。図５ｃは、図５ａおよび５ｂに示すのと同一の脾臓細胞調製への、ビオチン化ＧＡＤ６５（２０８−２１７）ペプチドの直接結合を例示する。これらのデータは、その各解説が本明細書に援用される、Ｃｏｒｐｅｒら，  Ｉ−Ａg7および自己免疫糖尿病間の関連を解読するための構造的フレームワーク，  ２８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０５−５１１（２０００）、およびＤｅｓｓｅｎら，  ヒトコラーゲンＩＩ由来のペプチドと複合体化したＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＡ*０１０１、ＤＲＢ*０４０１）のＸ線結晶構造，  ７  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４７３−４８１（１９９７）に論じられるように、ＢＰＩを操作して、特定のＭＨＣペプチド結合モチーフに適合させることが可能であることを示す。
【００７４】
さらに、図６ａ〜６ｃに例示するように、他の研究は、ＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体が、ＮＯＤ脾臓細胞へのペプチド結合を遮断することを示した。これらのデータは、糖尿病ＢＰＩが、ＡＰＣ表面上の両受容体に結合することを示す。したがって、ＭＨＣ−ＩＩまたはＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は、糖尿病ＢＰＩ（ＥＧＡＤ−ＢＰＩ）のＮＯＤ脾臓細胞への結合を有効に遮断する。事実上、ＢＰＩの予測される二官能性の性質は、これらの結果によって明らかにされ、そしてＢＰＩがＡＰＣ表面上で、ＭＨＣ−ＩＩをＩＣＡＭ−１に連結するであろうことが示唆される。この機構は、同時キャッピング実験によって、さらに明らかにされた。
【００７５】
（実施例３）
本実施例は、同時キャッピング実験を利用して、ＢＰＩがＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１分子へ同時結合することを明らかにする。
【００７６】
材料および方法：
ＢＰＩがＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１分子に同時結合する、さらなる裏付けを、ビオチン化ｍＡｂ１０−３．６２およびストレプトアビジンを用いてＢＰＩの存在下または非存在下でＭＨＣ−ＩＩをキャッピングする同時キャッピング実験で観察した。ＢＰＩペプチドが、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１分子を連結する能力を試験するため、我々は、同時キャッピング実験（もともとはモノクローナル抗体に関して記載されたもの）を変更して行った。簡潔には、あらかじめ所定のＢＰＩ変異体または生理食塩水の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって処置したＮＯＤマウスから新たに単離したＡＰＣと、ＭＨＣ−ＩＩに対するビオチン化モノクローナル抗体（１０−３．６２）とをインキュベーションする。その後、抗体結合細胞をストレプトアビジンとインキュベーションして（３７℃ｘ１５分間）、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ−ＩＩ分子をキャッピングする。細胞を氷上に移し、そしてＩＣＡＭ−１に対する蛍光（ＰＥ）モノクローナル抗体（３Ｅ２）で標識した。細胞を蒔き、そして所定のＢＰＩがＩＣＡＭ−１をＭＨＣ−ＩＩキャップに連結する証拠を、標準的蛍光顕微鏡法および画像解析によって観察する。１つの実験において、１６時間前にＥＧＡＤ−ＢＰＩ（ｉ．ｖ．）で処置したマウス由来のＴ枯渇脾臓細胞は、バイオ−１０−３．６２／ストレプトアビジンの存在下、ＭＨＣ−ＩＩとＩＣＡＭ−１の同時キャッピングを示した。他の実験において、１６時間前に生理食塩水のみで処置したマウス由来のＴ枯渇脾臓細胞は、同時キャッピングを示さなかった。これらの実験の結果は、図７に示す。
【００７７】
結果：
図７の上部パネルは、１６時間前にＥＧＡＤ−ＢＰＩ（ｉ．ｖ．）で処置したマウス由来のＴ枯渇脾臓細胞の結果を例示し、ここで、ＩＣＡＭ−１は、バイオ−１０−３．６２／ストレプトアビジンの存在下、ＭＨＣ−ＩＩと同時キャッピングした。図７の下部パネルは、生理食塩水のみで処置したマウスの結果を例示し、ここでは同時キャッピングは示されない。これは、ＩＣＡＭ−１の残りがＢ細胞膜上に分散したままであることによって立証される。示されるように、１６時間前に４０ナノモルのＥＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水（ＰＢＳ）のみいずれかのｉ．ｖ．注射によって処置したＮＯＤマウスから単離したＢ細胞は、氷上のＰＥ標識化３Ｅ２（抗ＩＣＡＭ−１）で染色することによって測定するように、ＩＣＡＭ−１発現の２つの別個のパターンを示した。ＢＰＩ処置マウス由来の細胞上では、ＩＣＡＭ−１は、ＭＨＣ−ＩＩ分子と同時キャッピングされているようである（上部パネルのＩＣＡＭ−１赤色蛍光の単一の濃縮された点に注目されたい）。対照的に、ＩＣＡＭ−１の名目上の分散した密度は、ＰＢＳ処置ＮＯＤマウスから単離した細胞上に観察される（下部パネルの全表面の赤色蛍光染色に注目されたい）。
【００７８】
したがって、ＢＰＩが生存ＡＰＣ表面上のＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１構造に同時に結合する能力を有し、そしてしたがってＴH１／ＴH２分化に必要な経路を伴うシグナル改変を提供する可能性があることが明らかなようである。ＴH１／ＴH２免疫逸脱に対するＢＰＩの影響を直接調べるため、ＥＧＡＤ−ＢＰＩを注射したマウス由来のＴ細胞を、サイトカイン解析によって調べた。
【００７９】
（実施例４）
本実施例は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて、ＢＰＩ注射によって改変されるような、ＴH１／ＴH２頻度を決定した。
【００８０】
材料および方法：
３〜５のＮＯＤマウスの群を、尾の付け根で、ＣＦＡ中のＧＡＤ６５ペプチド（４０ナノモル／マウス）を用いて皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。ＥＧＡＤ−ＢＰＩ、その単一のＴＣＲエピトープ（シグナル−１部分）、またはそのＣＤ１１ａペプチド（シグナル−２部分）いずれかを、それぞれ異なる群にｉ．ｖ．（すべて４０ナノモル／マウス）で投与した。６〜８日後、もう一度同一物の４０ナノモル注射を各マウスに行い、そして翌日、ｓ．ｃ．注射部位の領域リンパ節を、培養のため単一細胞懸濁物にした。同一の一次培養を９６時間インキュベーションし；その後、生存Ｔ細胞を密度勾配遠心分離によって回収した。これらの細胞１００万を、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌの濃度の、マウスＩＦＮγ（クローンＲ４−６Ａ２）またはマウスＩＬ−４（クローンＢＶＤ４−１Ｄ１１）いずれかに対するｍＡｂであらかじめコーティングした（５０μｌ／ウェル）ニトロセルロース底９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ−ＨＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）中で合わせた。３つ組培養の群を、コンカナバリン−Ａ（２μｇ／ｍｌ）あるいは２０Ｕ／ｍｌ組換えＩＬ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｍｅｍｓ）を加えたシグナル−１ペプチド部分のいずれかとインキュベーションした。３７℃および５％ＣＯ2で７２−９６時間培養した後、プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。適切なウェルに、１μｇ／ｍｌの濃度で、ビオチン化抗ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２）またはビオチン化抗ＩＬ−４（クローンＢＶＤ６−２４Ｇ２）を添加して、そして室温で１時間インキュベーションする。陽性対照ウェルには、正常Ｔ細胞の代わりに、既知のＴH１またはＴH２クローンを入れる。ＩＬ１２、ＩＬ１０、およびＩＬ２に対するｍＡｂ対もまた入手可能であり、そしてこれを用いて、同一アッセイにおいてこれらのサイトカインに関して試験するであろう。すべてのｍＡｂおよび組換え対照は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入する。最後に、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、そしてその後、１：２０００希釈のストレプトアビジン・アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）１００μｌに１時間曝露し、そして前と同様に洗浄した。サイトカイン産生細胞は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質キット（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｓ、カリフォルニア州リッチモンド）を用いて膜を現像し、その後、デジタルカメラおよびＮＩＨ画像ソフトウェアと連結した標準的立体顕微鏡を用いて、画像捕捉し、そして解析することによって数えた（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））。先に記載する方法によって、ＧＡＤ６５（２０８−２１７）ペプチドで免疫したＮＯＤマウス由来のＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンを、別個の実験において、同一アッセイで使用することが可能である。クローンは、Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  ���．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）に記載する方法を用いて生成し、該文献の解説は本明細書に援用される。これらのクローンは、照射ＮＯＤリンパ球、ＧＡＤペプチド、および組換えＩＬ−２で、隔週で再刺激することによって維持されるであろう。予測されるＴＣＲ接触位で置換したＢＰＩは、増殖および個々のクローンからのサイトカイン放出の阻害（上記のように解析される）において、これらのＢＰＩ変異体のいずれが最も有効であるかを決定するさらなる解析のために用いられるであろう。システインを除くすべてのアミノ酸でスキャンされるであろう、予測される位は、アミノ酸２０８、２１３、および２１６である。これらの残基は、最近解明された、Ｉ−Ａg7に結合するＧＡＤ６５ペプチドの結晶構造において、ＴＣＲに面している（Ｃｏｒｐｅｒら，  ２８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０５−５１１（２０００）および図８を参照されたい）。
【００８１】
結果：
重要なことに、本実施例は、与えられたＢＰＩの機能的免疫反応を調節する能力を示す。このＢＰＩで処置したマウスが豊富なＩＬ−４を産生し、一方、対照マウスがこのサイトカインを産生しないことがわかる（図９ａおよび９ｃに例示する）。ＩＬ−４は、２型免疫の代表的なサイトカインであるため、本実施例は、ＢＰＩが、優性１型免疫からＴH２分化および２型反応に切り換える能力を有することを示す。さらに、我々は、このｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系を発展させて、与えられたＢＰＩの免疫制御効果の比較的迅速な検査を提供した。ＴH１／ＴH２調節が、本実施例におけるように確認されたら、その後、研究は、以下に記載するような養子移植を用いた、ＢＰＩ効果のより厳密な試験へと移ることが可能である。
【００８２】
図９ａおよび９ｃに示すように、ＩＬ−４産生は、Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂促進因子を用いて刺激したＢＰＩ処置動物由来である場合、およそ１０倍増加する。ＩＦＮ−γ産生もまた増加するが、より少ない度合いである（図９ｂおよび９ｄを参照されたい）。
【００８３】
（実施例５）
本実施例は、ＢＰＩがＮＯＤマウスにおいて膵臓島のリンパ球浸潤を阻害する能力を試験した。リンパ球浸潤は、膵島炎および１型糖尿病発症の顕著な特徴である。
【００８４】
材料および方法：
これらの研究は、免疫優性ＧＡＤ６５  ＴＣＲエピトープ（ＥＧＡＤ−ＢＰＩ）を含有するＢＰＩがｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であり、そして膵臓炎症の発症を阻害することを確認するのが目的であった。３匹の正常血糖のＮＯＤオス（８週齢）の群を、実施例４に記載するように、ＣＦＡ中のＧＡＤ６５（２０８−２１７）ペプチドで免疫した。対照群にはＰＢＳを投与し、そして別個の実験群には、ＥＧＡＤ−ＢＰＩ、ＧＡＤペプチドのみ（すなわちＴ細胞受容体エピトープ）、またはＣＤ１１ａペプチドのみ（すなわち二次シグナル受容体部分）いずれかを、実施例４に記載するような２回の静脈内注射によって、投与した。第１０日、膵臓を除去して１０％ＰＢＳ緩衝ホルマリンに入れ、パラフィンに包埋し、そしてその全体が本明細書に援用される、Ｙｏｏｎら，  β細胞におけるＧＡＤ発現または抑制による、ＮＯＤマウスにおける自己免疫糖尿病の調節，  ２８４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１８３−１１８７（１９９９）に先に記載されるように、単核細胞浸潤に関して、５ミクロン連続切片を組織学的に検査した。
【００８５】
結果：
この実験の結果は、図１１および１２に示す。図１１は、この解析の累積的データを示し、ここで、島浸潤の重症度をスコア化し、そして調べた島の割合としてプロットした。５より多い組織切片で、各群から１００を超える島を、３人の独立の観察者によって解析した。図１１に示すように、単核細胞浸潤（膵島炎）に対するＥＧＡＤ−ＢＰＩ処置の明らかな阻害効果があった。ＢＰＩ処置動物の９５％を超える島が損なわれておらず、そして浸潤を示さなかった（すなわち等級０の島）。他の群はすべて、疾患のこの初期の段階であってさえ、膵島炎の何らかの徴候を示した。特に、ＧＡＤペプチド処置動物は、最大の膵島炎を示した（等級０の島は６２％に減少し、そして３７．５％の島は等級２以上にスコア付けされた）。これを、ＣＤ１１ａペプチド処置群の６６．７％の正常な島およびＰＢＳ処置動物の７１．４％の正常な島に比較した。したがって、ＰＢＳ対照と比較すると、ＥＧＡＤ−ＢＰＩ処置は、膵島炎の８４％の阻害を提供した［％島＠等級１−４（ＰＢＳ  Ｒｘ）から％島＠等級１−４（ＥＧＡＤ−ＢＰＩ  Ｒｘ）を減じ、％島＠等級１−４（ＰＢＳ  Ｒｘ）で除して１００を乗じたものとして計算］。実験の各群の代表的な島を、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したものとして、以下、図１２ａ〜１２ｄに示す。図１２ｂおよび１２ｄでは、単一のシグナル−１部分またはシグナル−２部分で処置した群で重度のリンパ球浸潤が観察されたが、一方、ＥＧＡＤ−ＢＰＩ処置マウスの島は、損なわれていないものが優勢であったことに注目されたい（図１２ｃを参照されたい）。総合すると、これらのデータは、これらのシグナル−１ペプチド部分およびシグナル−２ペプチド部分を含有する糖尿病ＢＰＩでの処置が、１型糖尿病のこの動物モデルでは、膵臓島へのリンパ球の浸潤を有意に阻害することを強く示す。したがって、ＢＰＩは、膵臓自己抗原に対する自己寛容の通常の瓦解に関与する機構を介して作動する、と予測される。これらのデータは、ＢＰＩが免疫逸脱を通じて作動し、膵臓抗原に対する自己免疫反応を遮断可能であることを示す。この理論をさらに試験するため、我々は、ＥＧＡＤ−ＢＰＩの存在下でプライミングしたＴ細胞を、糖尿病発症が遺伝的にプログラミングされたＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスに移植した。
【００８６】
（実施例６）
本実施例は、免疫学的に再構成したＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスの、よく説明されている、損なわれていない免疫系において、糖尿病発症のＢＰＩ遮断を試験して、糖尿病進行を研究した。
【００８７】
材料および方法：
ＮＯＤマウスモデルにおいて、Ｔ細胞主導型の糖尿病の進行をブロックするための既知の免疫優性ペプチドＧＡＤ６５に対するＴH１／ＴH２反応の調節に関して活性であることが証明されたＢＰＩを試験した。ＮＯＤ．Ｓｃｉｄ養子移植モデル（ＣＤ２５枯渇ＮＯＤ脾臓細胞が、養子移植後２〜４週間程度の早期に糖尿病を誘導することが観察されている）をこの目的に用いた。ＮＯＤ．Ｓｃｉｄ養子移植は、その内容が本明細書に援用される、Ｓｏｌｏｍｏｎら，「自己免疫糖尿病を調節するＣＤ４+  ＣＤ２５免疫制御Ｔ細胞の恒常性に、Ｂ７／ＣＤ２８同時刺激が必須である」  １２  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３１−４４０（２０００）に記載するプロトコルを変更して行った。８週齢（非糖尿病）メスのＮＯＤ脾臓細胞を用いて、精製モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ７Ｄ４、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、その後、低毒性（ｌｏｗ−ｔｏｘ）ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）での処理によって、ＣＤ２５−／ＣＴＬＡ４−枯渇集団を濃縮した（ＰＥ標識ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１  ｍＡｂでのフロー解析による、ＣＴＬＡ４＋細胞の８０％枯渇；未提示）。これらの誘導細胞（１５ｘ１０6／マウス）を、ＥＧＡＤ−ＢＰＩで処置したマウスかあるいはＥＧＡＤ−ＢＰＩの代わりにＰＢＳを用いたこと以外は同一に処置したマウスのいずれか由来の３ｘ１０6  ＣＤ４＋  Ｔ細胞と共に、６週齢ＮＯＤ．Ｓｃｉｄメス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に注射した（ｉ．ｖ．）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローン増殖は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験に関して記載するように、組換えＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＣｏｎＡいずれかを用いた。動物および細胞の操作はすべて、ラミナフローフード中で行い、そして動物は、オートクレーブした餌および水を与えて、ラミナフローバリアの後ろのマイクロアイソレーターケージ中でずっと飼育した。いくつかの実験は、養子移植前に、ＣＤ１５４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１５２などに対するｍＡｂおよび磁気粒子を用いて、ＣＤ４＋細胞の特定のサブセットを枯渇させるであろう。ＢＰＩの個々の部分で処置したマウス由来のＣＤ４＋細胞は、生理食塩水のみで処置したマウス由来のＣＤ４＋細胞と共に、陰性対照として使用可能である。所定のＢＰＩで処置した、マッチしたＮＯＤマウスから濃縮したＣＤ４＋Ｔ細胞の同時移植は、ＢＰＩ処置により糖尿病の開始を遅延させることが可能な制御Ｔ細胞が導かれることを示す。さらに、表１に列挙する他の疾患を、この同じ方式で（すなわち制御Ｔ細胞の養子移植によって）試験することが可能である。
【００８８】
結果：
重要なことに、我々は、現在、２つの実験群間で、高血糖症および糖尿病の発症に、明らかな相違があることを見出した。図１３でわかるように、養子移植７週後、ビヒクル（ＰＢＳ）を投与したマウスの８０％が、高血糖症および糖尿病を発症した。対照的に、ＥＧＡＤ−ＢＰＩで処置したマウスのわずか４０％しか、高血糖症と糖尿病への進行とを示さなかった。したがって、これらのデータは、ＢＰＩ処置に仲介されるものとして、糖尿病進行のブロックを示す。ＢＰＩ構造へのさらなる変更は、このモデルにおいて、そして１型糖尿病の治療において、その有効性を増進させる可能性がある。これらのデータは、糖尿病発症を抑制可能であるＴ細胞が、ＢＰＩの存在下に生成され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで作動して、ＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスの損なわれていない系内で糖尿病進行を阻害したことを示す。したがって、同様の制御Ｔ細胞が、他の疾患関連抗原のＴＣＲエピトープを含有するＢＰＩによって活性化されると予期されるであろう。例えば、コラーゲン−ＩＩペプチドエピトープは、慢性関節リウマチに関与するサプレッサーＴ細胞を惹起することが可能である。さらに、ＴH１集団を拡大するであろう制御Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４二次シグナル部分を含有するＢＰＩによって生成される可能性があり、そしてこれらは、ＨＩＶ１感染または他の慢性ウイルス疾患などの疾患に使用可能である。ＮＯＤモデルは、ヒト疾患の有意な代表と認識されているため、この実施例から臨床試験への推定は容易なはずである（例えばＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＬｅｉｔｅｒ，  １型糖尿病のＮＯＤマウスモデル：これ以上よくならない？  ５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ６０１−６０４（１９９９）を参照されたい）。
【００８９】
（実施例７）
ここで、他の自己免疫疾患のＢＰＩの予測される例を、簡潔に詳述する。具体的には、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）およびミエリン塩基性タンパク質誘導実験アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の免疫優性ＴＣＲエピトープを含有するＢＰＩが論じられるだろう。また、ＣＤ４０シグナルを遮断すると、ＩＬ１２産生が減少すると予測されるため、ＣＤ４０Ｌペプチド模倣体は、ＴH２免疫を助けると予測される（Ｒｕｅｄｌら，  抗原用量は、ＣＤ４０リガンドの制御によって、Ｔヘルパーサブセット発展を決定する，  ３０  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０５６−２０６４（２０００））。したがって、これらの自己免疫モデルにおいて、そしてＮＯＤモデルにおいて、適切なＴＣＲエピトープをＣＤ４０Ｌペプチド模倣体と共に、糖尿病阻害で用いるＣＤ１１ａ模倣体に連結することによって、ＴH２免疫を助けることを試みるであろう。このループペプチドにおける突然変異は、ＣＤ４０Ｌの結合および機能に影響を及ぼすことが示された。
【００９０】
材料および方法：
異なる交差反応性免疫優性エピトープ、異なるマウス系統、および解析する組織を使用する、いくつかの自己免疫モデルがある。これらの種類のモデルは、ＥＧＡＤ−ＢＰＩを試験するのに我々が設計した糖尿病発展の短期モデルに非常に似ている。ＣＩＡに関しては：Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）に記載するようなＣＦＡ注射プロトコルにおいて、単一ペプチドによって疾患を誘導するであろう。ＮＯＤ系と同様、これらのマウスには、ＢＰＩ、ＰＢＳ、または単一ペプチド部分いずれかを投与するであろう。最小免疫優性コラーゲンＩＩエピトープは上に列挙され、そしてＢＰＩへの変更は、この複合体のｘ線構造に基づくであろう（Ｄｅｓｓｅｎら，  ７  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４７３−４８１（１９９７））。ＥＡＥに関しては、疾患は、Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）の方法によって誘導する。この方法はまた、我々のＮＯＤ系において記載するのと似た方法によって、ＣＦＡ中の単一ペプチド（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド、８５−１０１）注射を用いる。
【００９１】
結果：
コラーゲンおよびＭＢＰで構築したＢＰＩは、これらの抗原に対する免疫をＴH２優性パターンに調節する際に有効であろうと予期される。これらの疾患は、主なＴH１免疫病理（上記参考文献を参照されたい）を伴うと考えられるため、こうしたスイッチは、これらのマウスの疾患を表面上遅延させるかまたは治癒させるであろう（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））。ＮＯＤマウスにおけるように、こうした結果は、これらの種類の免疫反応が臨床的に観察される、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症のヒト疾患において使用するための類似の化合物の開発を標的とするであろう。最も重要なことには、ＢＰＩは、自己免疫Ｔ細胞反応を遮断する能力を提供しつつ、感染性病原体および癌発症に対する宿主免疫を維持する。
【００９２】
（実施例８）
本実施例は、感染性疾患および特定の癌の予測されるＢＰＩを記載する。具体的には、特定のヒト病原体の免疫優性ＴＣＲエピトープを含有する所定のＢＰＩを試験する一般的なプロトコルを、ＨＩＶ−１  ｐ２４エピトープの例を用いて記載するであろう（Ｈａｒｃｏｕｒｔら，  ＨＩＶ−１変異は、ＣＤ４  Ｔリンパ球認識を減少させる，  １８８  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７８５−１７９３（１９９８））（配列番号８）。
【００９３】
材料および方法：
先の実験例と対照的に、これらのＢＰＩは、主に、ヒト患者由来の長期Ｔ細胞クローンに対する影響によって試験するであろう。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を患者および対照全血から調製し、そして磁気粒子を用いたネガティブ選択プロトコルによって、ＣＤ８＋細胞を除去する。これらの細胞は、１ｍｌ中、４ｘ１０6細胞で、組織培地中、２０μＭのｐ２４ペプチドの存在下、６日間増殖させ、そして密度勾配遠心分離によって芽球を単離する。これらの細胞の二次培養は、組換えヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を含有し、そして最大１０〜１４日間続ける。組織適合ドナー由来の照射ＡＰＣと共にｐ２４ペプチドを含む再培養過程およびＩＬ−２中でのＴ細胞芽球の増殖を反復することによって、株を増殖させた。クローンは、照射ＡＰＣ、ペプチドおよびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を含有する新鮮なプレートにおいて、限界希釈クローニングを行うことによって、調製した（Ｍｕｒｒａｙら，  ２４  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３３７−２３４４（１９９４）；Ｍｕｒｒａｙ；１９  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５７−１６３；およびＳｃｈｏｕｎｔｚら，  １５７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８９３−３９０１（１９９６））。Ｓｃｈｏｕｎｔｚら，  ペプチド配列における非自己位の自己置換によって明らかになった、ペプチド抗原の正確な自己相関物のユニークなＴ細胞アンタゴニスト特性，  １６８  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９３−２００（１９９６）に記載される、我々の詳細な方法によって、ヒトＴ細胞のこれらの樹立株の増殖およびサイトカイン放出をＢＰＩが阻害する能力に関して試験するであろう。ここで、我々は、重要なＴＣＲ接触残基でアミノ酸置換によって変化したペプチドが、クローン化されたＴ細胞の増殖およびサイトカイン放出を改変することを示す。与えられたＢＰＩが、ｐ２４ペプチド特異的クローンへのサイトカイン放出を、顕著に阻害するかまたは改変するならば、このことにより、このＢＰＩはより厳密なｉｎ  ｖｉｖｏ試験の対象となるだろう。マウスモデルを用いて、感染性疾患に関する候補ＢＰＩを試験することが可能である。これらの研究は、ＧＡＤ６５  ＢＰＩに関して記載するように、ＧＡＤ６５  ＴＣＲエピトープペプチドに対する感染性病原体の免疫優性ペプチドの置換を伴って、行うであろう。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究における肯定的な結果は、生存病原体を使った動物研究を具体化するであろう。ヒト組織がＳｃｉｄマウスに養子移植される、Ｓｃｉｄ−ヒトマウスモデルを用いて、ＨＩＶ（Ｊｅｎｋｉｎｓら，  Ｂｌｏｏｄ（１９９８）８：２６７２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Ｂｒｏｎｏｗｉｃｋｉ，  Ｊ．ら，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９８）２８：２１１）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（Ｔｅｗａｒｉら，  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．（２０００）７７：１３７）、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（Ｎａｄａｌら，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８５：３５８）感染に対する防御免疫を調べることが可能である。
【００９４】
結果：
二次シグナル部分として、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ペプチドまたはＦａｓリガンドペプチドを取り込むと、ＴH１サブセットの方に免疫がシフトし、そしてＣＴＬ反応が誘導または増進されるであろうと仮定される（Ｐａｄｒｉｄ，  Ｐ．ら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９９８）１８：４５３）。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化のネガティブ制御因子であり、そしてＣＤ２８を通じたシグナル伝達は、ＴH２分化と結び付けられてきている（Ｒｕｌｉｆｓｏｎ，  Ｉ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５８：６５８）。ＬＦＡ−１シグナルがＴH２分化に阻害性であり、そしてＣＤ２８シグナル伝達がＴH２分化を助ける証拠を考慮し、この選択的分化パラダイムを用いて、ＢＰＩ設計をさらに変更して、これらの研究を進めるであろう。同様に、証拠は、ＣＤ９５（Ｆａｓとも呼ばれる）とＣＤ９５リガンド（ＦａｓＬ）との相互作用がＴH１分化を助けることを示唆する（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０００）１８：９７４）。ＦａｓＬのＹ２１８ループ由来のＦａｓＬ（Ｔ細胞：ＡＰＣ境界面でＦａｓと相互作用すると予測される）のペプチド模倣体を持つＢＰＩは、ＴH１活性化と慢性ＴH２−優性疾患に対するＣＴＬ反応とを助けるのに使用されるだろう。
【００９５】
（実施例９）
ここで、我々は、記載されるアレルゲン配列（予測されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ペプチド模倣体および／または予測されるＦａｓＬペプチド模倣体に合成的に連結されている）のＴＣＲエピトープを含有する、いくつかの可能性のあるＢＰＩを記載する。
【００９６】
材料および方法：
これらの研究は再び、ヒトクローン化Ｔ細胞株、およびこれらの公知のアレルギー剤に対するアレルギーの動物モデルを用いた解析の組み合わせを用いるであろう。アレルギーは、ヒトの非常に多数の集団に影響を及ぼし、多くのアレルギーおよび喘息の概算は、そうでなければ健康な個体の１０％に達する。我々は、先に記載した７〜１０日プロトコルを用いて、表に記載するアレルゲンペプチドに対する免疫反応のＢＰＩ調節を調べるであろう。先に記載されるように、このプロトコルは、第１日、ＣＦＡ中のアレルゲンペプチドの注射、その後、第１日および第６、７、８または９日のＢＰＩの注射を伴う。第７、８、９または１０日、領域リンパ節を培養し、そしてＥＬＩＳＰＯＴによってＴH１対ＴH２サイトカインを比較する（詳細な方法に関しては実施例４を参照されたい）。所定のアレルゲンの候補ＢＰＩが、この比較的短期の実験によって同定されたら、アトピー患者からクローニングした株を用いて、ＣＤ４  Ｔ細胞反応の改変に関して、これらのＢＰＩを試験するであろう。簡潔には、ＣＤ４  Ｔ細胞クローンは、実施例８に記載するように、患者末梢血リンパ球から樹立するであろう。先に記載するようなＥＬＩＳＰＯＴを用いて、所定のＢＰＩが、これらの細胞によるサイトカイン放出を阻害または改変する能力を試験するであろう。最後に、所定のＢＰＩの検査を、ヒトＭＨＣ（ＨＬＡ）トランスジェニックマウスにおいてこれらの特定のアレルゲンを用いて、同一に記載される方法を用いる臨床試験に移すであろう（Ｓｖｅｔｌａｎａ，  Ｐ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１：２０３２）。これらのマウスは、ヒトＭＨＣ分子を有する利点を提供し、そしてしたがって、ＢＰＩ結合は、このモデルにおいてヒトアレルギー状態と非常に類似であろう。所定のＢＰＩが、天然アレルゲンに対して、これらのマウスにおいて、ＴH２活性化を遮断するならば、ヒトＳｃｉｄマウスでの養子移植研究（実施例８で用いるのと類似）を、ヒト臨床試験の前置きとして用いることが可能である。
【００９７】
結果：
ＬＦＡ−１シグナル伝達を優先するＣＴＬＡ４／ＣＤ２８経路を遮断すると、ＢＰＩの存在下、これらのアレルゲンに対するＴH１分化が助けられるであろう。また、ＦａｓＬ部分を持つＢＰＩは、１型免疫を助けるはずである。注射によって与えられるアレルゲンでアトピー患者を「脱感作」するのは長く続けられている実務であり、そして脱感作は、特定のアレルゲンに対するＴH１反応へのシフトを介して作動すると考えられる（Ｈｏｌｔら，  Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０２：６７６０  ｓｕｐｐｌ：Ｂ１２−１７）。したがって、慢性ＴH２関連感染性疾患の症例におけるように、我々の作業仮説は、この結果を達成するため、ＬＦＡ−１シグナル伝達がＴH１を促進する能力と共に、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８分子を介してＴH２シグナル伝達を阻害する可能性を用いることである。また、ＡＰＣ内のＦａｓおよび抗原の二重発現がＴH１免疫およびＣＴＬ誘導を助長することが示されているため、Ｆａｓペプチド模倣体に連結したアレルゲンエピトープの影響もまた調べるであろう（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，  Ｍ．ら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０００）１８：９７４）。アレルギーおよび喘息において、アレルゲンエピトープを提示するＡＰＣの細胞死を誘導し、それによってＲＳＶ誘起小児期および老年期細気管支炎を含む、ＴH２型制御細胞の活性化を制限することが可能である可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
本特許のファイルは、少なくとも１つのカラーで作成した図を含有する。カラー図（類）を含むこの特許のコピーは、要望し、そして必要な料金を支払うと、特許商標庁（Ｐａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅ）に提供されるであろう。
【図１】図１は、Ｔ細胞およびＡＰＣ間の免疫シナプスの模式的提示であり、ＴＣＲ：ペプチド：ＭＨＣ位のドーナツ構造を例示する。
【図２】図２は、代表的なＢＰＩがどのようにＴH１優性免疫反応を導く分化を遮断し、そして免疫をＴH２優性免疫反応にシフトするか、模式的に提示する。
【図３】図３は、免疫シナプス内の細胞表面タンパク質間の相互作用を通じた、１型免疫反応の名目上の活性化の模式的提示である。
【図４】図４は、Ｔ細胞活性化の２シグナルの機構の、単純化した模式的提示である。
【図５−ａ】図５ａは、異なるマウス系統への代表的ＢＰＩの結合を比較する、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図５−ｂ】図５ｂは、異なるマウス系統への代表的ＢＰＩ部分の結合を比較する、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図５−ｃ】図５ｃは、異なるマウス系統への代表的ＢＰＩ部分の結合を比較する、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図６−ａ】図６ａは、ＭＨＣ−ＩＩまたはＩＣＡＭ−１に対する抗体を含まない、マウス系統のＡＰＣに結合する代表的ＢＰＩ結合のフローサイトメトリー解析の結果を例示するグラフである。
【図６−ｂ】図６ｂは、ＩＣＡＭ−１に対する抗体が存在した場合の、マウス系統のＡＰＣに結合する代表的ＢＰＩ結合のフローサイトメトリー解析の結果を例示するグラフである。
【図６−ｃ】図６ｃは、ＭＨＣ−ＩＩに対する抗体が存在した場合の、マウス系統のＡＰＣに結合する代表的ＢＰＩ結合のフローサイトメトリー解析の結果を例示するグラフである。
【図７】図７は、ＭＨＣ−ＩＩに対する抗体で同時キャッピングすることによって、ＮＯＤ  ＡＰＣ上のＭＨＣ−ＩＩおよびＩＣＡＭ−１構造に同時に結合する代表的ＢＰＩの蛍光顕微鏡解析の結果を示すカラー写真であり、上部パネルは、代表的なＢＰＩで処置したマウスＡＰＣ由来であり、そして下部パネルは、生理食塩水ビヒクルのみで処置している。
【図８】図８は、ＮＯＤマウスのＭＨＣ−ＩＩ（Ｉ−Ａg7）およびＩＣＡＭ−１のＤ１ドメインへの代表的ＢＰＩ結合の分子モデルのカラー写真であり、ＭＨＣ−ＩＩはピンクで表し、ＩＣＡＭ−１は明るい青色であり、ＢＰＩは原子によって、炭素は緑、酸素は赤、そして窒素は青で示す。
【図９−ａ】図９ａは、ＥＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水対照で処置したＮＯＤマウスから採取したＴ細胞による、ＩＬ−４サイトカイン放出のＥＬＩＳＰＯＴ解析を示すグラフである。
【図９−ｂ】図９ｂは、ＥＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水対照で処置したＮＯＤマウスから採取したＴ細胞による、ＩＦＮ−γサイトカイン放出のＥＬＩＳＰＯＴ解析を示すグラフである。
【図９−ｃ】図９ｃは、ＡＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水対照で処置したＮＯＤマウスから採取したＴ細胞による、ＩＬ−４サイトカイン放出のＥＬＩＳＰＯＴ解析を示すグラフである。
【図９−ｄ】図９ｄは、ＡＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水対照で処置したＮＯＤマウスから採取したＴ細胞による、ＩＦＮ−γサイトカイン放出のＥＬＩＳＰＯＴ解析を示すグラフである。
【図１０】図１０は、図９ａ〜９ｄのグラフに用いたＥＬＩＳＰＯＴ解析の生データの代表的な写真である。
【図１１】図１１は、ＥＧＡＤ−ＢＰＩ、ＥＧＡＤ−ＢＰＩの別個の部分、そして生理食塩水による、膵島炎の阻害の示標としての、島浸潤の重症度のグラフである。
【図１２】図１２ａは、生理食塩水対照で処置したＮＯＤマウスにおける、単核細胞による膵臓浸潤の組織学的解析の代表的なカラー写真である。
図１２ｂは、ＧＡＤペプチドで処置したＮＯＤマウスにおける、単核細胞による膵臓浸潤の組織学的解析の代表的なカラー写真である。
図１２ｃは、ＥＧＡＤ−ＢＰＩで処置したＮＯＤマウスにおける、単核細胞による膵臓浸潤の組織学的解析の代表的なカラー写真である。
図１２ｄは、ＣＤ１１ａペプチドで処置したＮＯＤマウスにおける、単核細胞による膵臓浸潤の組織学的解析の代表的なカラー写真である。
【図１３】図１３は、ＣＤ２５ネガティブ糖尿病誘導細胞と共に、ＥＧＡＤ−ＢＰＩまたは生理食塩水いずれかを注射したＮＯＤマウス由来のＴ細胞を投与したＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスにおける血液グルコースレベルの１０週間のモニター結果を例示するグラフである。
【図１】
2004536783.tif 000007
【図２】
2004536783.tif 000008
【図３】
2004536783.tif 000009
【図４】
2004536783.tif 000010
【図５−ａ】
2004536783.tif 000011
【図５−ｂ】
2004536783.tif 000012
【図５−ｃ】
2004536783.tif 000013
【図６−ａ】
2004536783.tif 000014
【図６−ｂ】
2004536783.tif 000015
【図６−ｃ】
2004536783.tif 000016
【図９−ａ】
2004536783.tif 000017
【図９−ｂ】
2004536783.tif 000018
【図９−ｃ】
2004536783.tif 000019
【図９−ｄ】
2004536783.tif 000020
【図１０】
2004536783.tif 000021
【図１１】
2004536783.tif 000022
【図１３】
2004536783.tif 000023
【国際公開パンフレット】
2004536783.tif 000024
2004536783.tif 000025
2004536783.tif 000026
2004536783.tif 000027
2004536783.tif 000028
2004536783.tif 000029
2004536783.tif 000030
2004536783.tif 000031
2004536783.tif 000032
2004536783.tif 000033
2004536783.tif 000034
2004536783.tif 000035
2004536783.tif 000036
2004536783.tif 000037
2004536783.tif 000038
2004536783.tif 000039
2004536783.tif 000040
2004536783.tif 000041
2004536783.tif 000042
2004536783.tif 000043
2004536783.tif 000044
2004536783.tif 000045
2004536783.tif 000046
2004536783.tif 000047
2004536783.tif 000048
2004536783.tif 000049
2004536783.tif 000050
2004536783.tif 000051
2004536783.tif 000052
2004536783.tif 000053
2004536783.tif 000054
2004536783.tif 000055
2004536783.tif 000056
2004536783.tif 000057
2004536783.tif 000058
2004536783.tif 000059
2004536783.tif 000060
2004536783.tif 000061
2004536783.tif 000062
2004536783.tif 000063
2004536783.tif 000064
2004536783.tif 000065
2004536783.tif 000066
2004536783.tif 000067
2004536783.tif 000068
2004536783.tif 000069
2004536783.tif 000070
2004536783.tif 000071
2004536783.tif 000072
2004536783.tif 000073
2004536783.tif 000074
2004536783.tif 000075
2004536783.tif 000076
2004536783.tif 000077
2004536783.tif 000078
2004536783.tif 000079
2004536783.tif 000080
2004536783.tif 000081
2004536783.tif 000082
2004536783.tif 000083
2004536783.tif 000084
2004536783.tif 000085
2004536783.tif 000086
2004536783.tif 000087
2004536783.tif 000088
2004536783.tif 000089
2004536783.tif 000090
2004536783.tif 000091
2004536783.tif 000092
2004536783.tif 000093
2004536783.tif 000094
2004536783.tif 000095
2004536783.tif 000096
2004536783.tif 000097
2004536783.tif 000098
2004536783.tif 000099
2004536783.tif 000100
2004536783.tif 000101
2004536783.tif 000102
2004536783.tif 000103
2004536783.tif 000104
2004536783.tif 000105
2004536783.tif 000106
2004536783.tif 000107
2004536783.tif 000108
2004536783.tif 000109
2004536783.tif 000110
2004536783.tif 000111
2004536783.tif 000112
2004536783.tif 000113
2004536783.tif 000114
2004536783.tif 000115
2004536783.tif 000116
2004536783.tif 000117
2004536783.tif 000118
2004536783.tif 000119
2004536783.tif 000120
2004536783.tif 000121
2004536783.tif 000122
2004536783.tif 000123
2004536783.tif 000124
2004536783.tif 000125
2004536783.tif 000126
2004536783.tif 000127
2004536783.tif 000128
2004536783.tif 000129
2004536783.tif 000130
2004536783.tif 000131
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536783.tif 000132
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536783.tif 000133
2004536783.tif 000134
2004536783.tif 000135
2004536783.tif 000136
2004536783.tif 000137
2004536783.tif 000138
2004536783.tif 000139
2004536783.tif 000140
2004536783.tif 000141
2004536783.tif 000142
2004536783.tif 000143
2004536783.tif 000144
2004536783.tif 000145
2004536783.tif 000146
2004536783.tif 000147
2004536783.tif 000148
2004536783.tif 000149
2004536783.tif 000150
2004536783.tif 000151
2004536783.tif 000152
2004536783.tif 000153
2004536783.tif 000154
2004536783.tif 000155
2004536783.tif 000156
2004536783.tif 000157
2004536783.tif 000158
2004536783.tif 000159
2004536783.tif 000160
2004536783.tif 000161
2004536783.tif 000162
2004536783.tif 000163
2004536783.tif 000164
2004536783.tif 000165
2004536783.tif 000166
2004536783.tif 000167
2004536783.tif 000168
2004536783.tif 000169
2004536783.tif 000170
2004536783.tif 000171
2004536783.tif 000172
2004536783.tif 000173
2004536783.tif 000174
2004536783.tif 000175
2004536783.tif 000176
2004536783.tif 000177
2004536783.tif 000178
2004536783.tif 000179
2004536783.tif 000180
2004536783.tif 000181
2004536783.tif 000182
2004536783.tif 000183
2004536783.tif 000184
2004536783.tif 000185
2004536783.tif 000186
2004536783.tif 000187
2004536783.tif 000188
2004536783.tif 000189
2004536783.tif 000190
2004536783.tif 000191
2004536783.tif 000192
2004536783.tif 000193
2004536783.tif 000194
2004536783.tif 000195
2004536783.tif 000196
2004536783.tif 000197
2004536783.tif 000198
2004536783.tif 000199
2004536783.tif 000200
2004536783.tif 000201
2004536783.tif 000202
2004536783.tif 000203
2004536783.tif 000204
2004536783.tif 000205
2004536783.tif 000206
2004536783.tif 000207
2004536783.tif 000208
2004536783.tif 000209
2004536783.tif 000210
2004536783.tif 000211
2004536783.tif 000212
2004536783.tif 000213
2004536783.tif 000214
2004536783.tif 000215
2004536783.tif 000216
2004536783.tif 000217
2004536783.tif 000218
2004536783.tif 000219
2004536783.tif 000220
2004536783.tif 000221
2004536783.tif 000222
2004536783.tif 000223
2004536783.tif 000224
2004536783.tif 000225
2004536783.tif 000226
2004536783.tif 000227
2004536783.tif 000228
2004536783.tif 000229
2004536783.tif 000230
2004536783.tif 000231
2004536783.tif 000232
2004536783.tif 000233
2004536783.tif 000234
2004536783.tif 000235
2004536783.tif 000236
2004536783.tif 000237
2004536783.tif 000238
2004536783.tif 000239
2004536783.tif 000240
【国際調査報告】
2004536783.tif 000241
2004536783.tif 000242