(57)【要約】本発明は、ヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）と、ＤＭＥを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＤＭＥの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８）からなる群から選択されたアミノ酸を含むポリペプチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されるポリペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択された請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項８】
請求項６の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを産出する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
（ｂ）そのように発現されたポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１１】
単離されたポリヌクレオチドであって、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｃ）前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、
（ｄ）前記（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、
（ｅ）前記（ａ）乃至（ｄ）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択された単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１のポリヌクレオチドの少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
サンプルにおける請求項１１に記載のポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルをプローブでハイブリダイズするステップであって、前記プローブが、前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含み、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該ステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するか否かを検出し、存在する場合には必要に応じてその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記プローブが少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおける請求項１１のポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、
（ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には必要に応じてその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチド及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１６の組成物。
【請求項１８】
機能的なＤＭＥ（新規の薬物代謝酵素）の発現低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１６の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項１９】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとして化合物を有効性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法によって同定されたアゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２１】
機能的なＤＭＥの発現低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２０の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２２】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとして化合物を有効性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記サンプルにおけるアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法によって同定されたアンタゴニスト化合物及び医薬的に容認できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２４】
機能的なＤＭＥの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２３の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２５】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの試験化合物と結合させるステップと、
（ｂ）請求項１のポリペプチドと前記試験化合物との結合を検出して、請求項１のポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドの活性を変化させる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを、そのポリペプチドの活性が許容される条件下で、少なくとも１つの試験化合物と結合させるステップと、
（ｂ）前記試験化合物の存在下で請求項１のポリペプチドの活性を評価するステップと、
（ｃ）前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性と、前記試験化合物の非存在下での請求項１のポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、
前記試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性を変化させる化合物の存在を示唆することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させる際の有効性について化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップと、
（ｃ）様々な量の前記化合物の存在下と前記化合物の非存在下とで前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２８】
試験化合物の毒性を評価する方法であって、
（ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、
（ｂ）前記処理した生体サンプルの核酸を、請求項１１のポリヌクレオチドの連続するヌクレオチドを少なくとも２０個含むプローブとハイブリダイズさせるステップであって、該ハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体がそれによって形成されるような条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１１のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドであるようなステップと、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
（ｄ）前記処理した生体サンプルと非処理の生体サンプルとにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を比較するステップとを含み、
前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差が試験化合物の毒性を示唆することを特徴とする試験化合物の毒性評価方法。
【請求項２９】
生体サンプルにおけるＤＭＥの発現に関連する病態または疾患の診断テストであって、
（ａ）請求項１０の抗体を前記ポリペプチドに結合させるのに好適な条件下で、前記生体サンプルを前記抗体と結合させて抗体／ポリペプチド複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記複合体を検出するステップとを含み、
前記複合体の存在が、前記生体サンプルにおける前記ポリヌクレオチドの存在と相関性を有することを特徴とする診断テスト。
【請求項３０】
前記抗体が、
（ａ）キメラ抗体、
（ｂ）一本鎖抗体、
（ｃ）Ｆａｂ断片、
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２断片、または
（ｅ）ヒト化抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項３１】
請求項１０の抗体及び許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項３２】
患者において、ＤＭＥの発現に関連する病態または疾患を診断する方法であって、有効量の請求項３１の組成物を前記患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記抗体が標識されていることを特徴とする請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
患者において、ＤＭＥの発現に関連する病態または疾患を診断する方法であって、有効量の請求項３３の組成物を前記患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項１０の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応が起こる条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有するポリペプチドで動物を免疫化するステップと、
（ｂ）前記動物から抗体を単離するステップと、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を同定するステップとを含むことを特徴とするポリクローナル抗体作製方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法により作製された抗体。
【請求項３７】
請求項３６の抗体及び好適な担体を含む組成物。
【請求項３８】
請求項１０の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応が起こる条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有するポリペプチドで動物を免疫化するステップと、
（ｂ）前記動物から抗体産生細胞を単離するステップと、
（ｃ）前記抗体産生細胞を不死化細胞と融合し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成するステップと、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養するステップと、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する前記培養モノクローナル抗体から単離するステップとを含むことを特徴とするモノクローナル抗体作製方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法で作製したモノクローナル抗体。
【請求項４０】
請求項３９の抗体及び好適な担体を含む組成物。
【請求項４１】
Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングにより得られた請求項１０の抗体。
【請求項４２】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより得られた請求項１０の抗体。
【請求項４３】
サンプルにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項１０の抗体と前記ポリペプチドとの特異的な結合が許容される条件下で、前記抗体を前記サンプルと共にインキュベートするステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出するステップとを含み、
前記特異的な結合が、前記サンプルにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが存在することを示唆することを特徴とする方法。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプルから精製する方法であって、
（ａ）請求項１０の抗体と前記ポリペプチドとの特異的結合が許容される条件下で、前記抗体を前記サンプルと共にインキュベートするステップと、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する精製されたポリペプチドを得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のポリヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、薬物代謝酵素の核酸及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖異常、発達障害、内分泌障害、眼病、代謝障害及び肝臓障害を含む胃腸疾患の診断・治療・予防に関する。
【０００２】
（発明の背景）
体内における薬物の代謝及びその移動（薬物動態学）は、その効果、毒性及びその他の薬物との相互作用の決定において重要である。薬物動態学を司る３つのプロセスは、薬物の吸収、種々の組織への分布、薬物代謝産物の除去である。これらのプロセスは、薬物代謝に密接に結び付いている。それというのも種々の代謝性変異が、溶解性、受容体への結合及び排出率を含む薬物の物理化学的及び薬理学的特性の大部分を変化させるためである。薬物を変化させる代謝性経路はまた、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン及びビタミン等種々の天然の基質を受容する。従って、これらの経路における酵素は、天然の化合物、薬物、発癌物質、変異誘発物質及び生体異物間の物理化学的及び薬理学的相互作用の重要な部位である。
【０００３】
薬物代謝の遺伝的相異は、薬物の有効性及び毒性のレベルを個体間で大いに異なるものにすると長い間考えられてきた。治療係数が狭小な薬物または生理活性化（ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を必要とする薬物（コデイン等）に対して、これらの多形性は重大な意味を持ち得る。更に、有望な新規薬物は、患者群の或るセグメントのみに影響し得る毒性に基づきしばしば臨床試験において排除される。その薬物代謝酵素が重要な部分を構成するような薬理ゲノミクス研究における利点は、薬物の有効性及び毒性の問題に関係するために利用し得るツール及び情報を拡大するのに有望である（Ｅｖａｎｓ， Ｗ．Ｅ． ａｎｄ Ｒ．Ｖ． Ｒｅｌｌｉｎｇ （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：４８７−４９１を参照）。
【０００４】
薬物代謝反応は、薬物分子に官能性を持たせて更なる代謝のためにそれを調製する第１相と、接合性のある第２相とに分類される。通常、第１相反応産物は部分的にまたは完全に不活性であり、第２相反応産物は主要な排出される種である。しかしながら、第１相反応産物は時として元の投与された薬物より活性であり、この代謝性活性原理はプロドラッグ（Ｌ−ドーパ等）に利用される。更に、これらの経路を解して毒性中間体に代謝される非毒性化合物（アフラトキシン、ベンゾピレン等）もある。第１相反応は通常、薬物代謝において律速である。化合物またはその他の化合物に事前に晒すことは、第１相酵素の発現を誘発し得るが、それによって、代謝性経路を通る基質フラックスを増加させる（Ｋｌａａｓｓｅｎ， Ｃ．Ｄ．， Ａｍｄｕｒ， Ｍ．Ｏ． ａｎｄ Ｊ． Ｄｏｕｌｌ （１９９６） Ｃａｓａｒｅｔｔ ａｎｄ Ｄｏｕｌｌ’ｓ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ＮｅｗＹｏｒｋ， ＮＹ， ｐｐ． １１３−１８６、Ｂ．Ｇ． Ｋａｔｚｕｎｇ （１９９５） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ， ＮｏｒｗａＩＫ ＣＴ， ｐｐ． ４８−５９、Ｇ． Ｇ． Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｐ． Ｓｋｅｔｔ （１ ９９４） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ＢｌａｃｋｉｅＡｃａｄｅｍｉｃ： ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ， Ｌｏｎｄｏｎ．を参照）。
【０００５】
薬物代謝酵素（ＤＭＥ）は、広範な基質特異性を有する。これは、抗体の巨大且つ多様な個体群が抗原に高度に特異的であるような免疫系と対比することができる。様々な種類の分子を代謝するＤＭＥの能力は、代謝のレベルで薬物相互作用のための可能性を生み出す。例えば、一化合物によるＤＭＥの誘導は、酵素による別の化合物の代謝に影響し得る。
【０００６】
ＤＭＥは、ＤＭＥが触媒し、コファクターが関与するような反応のタイプに従って分類されてきた。第１相酵素の主クラスには、限定するものではないが、チトクロムＰ４５０及びフラビン含有モノオキシゲナーゼが含まれる。第１相タイプ触媒回路及び反応に関与するその他の酵素クラスには、限定するものではないが、ＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ミクロソームのチトクロムｂ５／ＮＡＤＨチトクロムｂ５レダクターゼ系、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼ酸化還元対、アルド／ケトレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。第２相酵素の主クラスには、限定するものではないが、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０００７】
チトクロムＰ４５０及びＰ４５０触媒回路関連酵素
酵素のチトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーは、種々の基質の酸化的代謝を触媒するが、このような基質には、薬物、発癌物質、突然変異誘発物質、生体異物のみならず、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ビタミン等の天然の化合物も含まれる。チトクロムＰ４５０は、Ｐ４５０ヘム−チオラート（ｔｈｉｏｌａｔｅ）タンパク質としても知られているが、通常はＰ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる多成分性電子伝達鎖の末端オキシダーゼとして作用する。触媒される特異反応には、アゾ、ニトロ、Ｎ−オキシド基のヒドロキシル化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホ酸化、Ｎ−， Ｓ−， 及びＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化及び還元がある。これらの反応は、動物におけるグルココルチコイド、コルチゾール、エストロゲン及びアンドロゲンのステロイド産出、昆虫の殺虫剤抵抗力、植物の除草剤抵抗力及び花色、微生物での環境浄化バイオレメディエーションに関与しする。薬物、発癌物質、突然変異誘発物質及び生体異物に作用するチトクロムＰ４５０は、物質を解毒するか或いはより毒性の強い産物に転換し得る。チトクロムＰ４５０は、肝臓で豊富であるがその他の組織にも発生し、酵素は、ミクロソームに位置付けられる（ＥｘＰＡＳＹ ＥＮＺＹＭＥ ＥＣ １．１４．１４．１、Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｅｍｅ−ｉｒｏｎ ｌｉｇａｎｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ、ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ、Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ａ． （１９９６） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：２０６−２１４を参照）。
【０００８】
細菌、菌類、植物及び動物を含む生物体において、４００のチトクロムＰ４５０が多様に同定されてきた（前出のＧｒａｈａｒａ−Ｌｏｒｅｎｃｅ）。Ｂ−クラスは原核生物及び菌類に見られ、Ｅ−クラスは細菌、植物、昆虫、脊椎動物及び哺乳動物に見られる。５つのサブクラスまたは群は、Ｅ−クラスチトクロムＰ４５０のより大きなファミリー内に見られる（ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【０００９】
全てのチトクロムＰ４５０は、ヘムコファクターを用いており、且つ構造属性を共有する。殆どのチトクロムＰ４５０は、長さ４００乃至５３０のアミノ酸である。酵素の２次構造は、約７０％のαらせん及び約２２％のβシートである。タンパク質のＣ末端部分のヘム結合部位周辺領域は、チトクロムＰ４５０間で保存されている。このヘム−鉄リガンド領域の１０のアミノ酸サイン配列は、第５配位部位でのヘム鉄結合に関与する保存システインを含むものとして同定されてきた。真核生物のチトクロムＰ４５０においては、膜貫通領域は通常タンパク質の最初の１５〜２０アミノ酸に見られ、ここは通常、陽性に荷電された残基が続くような約１５疎水性残基から構成されている（前出のＰｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１及び同Ｇｒａｂａｉｎ−Ｌｏｒｅｎｃｅを参照）。
【００１０】
チトクロムＰ４５０酵素は、細胞増殖及び発達に関与する。酵素は、化学薬品を、ＤＮＡの付加物を形成する反応性中間体へと代謝することによる化学変異誘発及び発癌において役割を有する（Ｎｅｂｅｒｔ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｆ．Ｊ． （１９８７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：９４５−９９３）。このような付加物は、腫瘍形成の原因となるようなヌクレオチド変化及びＤＮＡ転位を生じさせる。肝臓及びその他の組織におけるチトクロムＰ４５０発現は、多環式芳香族炭化水素、ペルオキシソームの増殖因子、フェノバルビタール、グルココルチコイドデキサメサゾン等の生体異物に誘発される（Ｄｏｇｒａ， Ｓ．Ｃ． ら． （１９９８） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２５：１−９）。Ｐ４５０遺伝子ＣＹＰ１Ｂ１における突然変異が原発性先天性緑内障を引き起こす場合、チトクロムＰ４５０タンパク質は眼の発達に関与し得る（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） ＊６０１７７１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ Ｐ４５０， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｉ （ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）， ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １； ＣＹＰ１Ｂｌ）。
【００１１】
チトクロムＰ４５０は、炎症及び感染症に関連する。肝臓のチトクロムＰ４５０活性は、抑制されたり誘導されたりしている種々の感染症及び炎症性刺激に非常に影響される（Ｍｏｒｇａｎ， Ｅ．Ｔ． （１９９７） Ｄｒｕｇ； Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２９：１１２９−１１８８）。ｉｎ ｖｉｖｏで観察される効果は、炎症誘発性サイトカイン及びインターフェロンによって擬態することができる。２つのチトクロムＰ４５０タンパク質に対する抗体は、多腺性自己免疫症候群である自己免疫性多腺性内分泌不全症−カンジダ症−外胚葉性ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）の患者に見られた（ＯＭＩＭ ＊２４０３００ Ａｕｔｏｉｎｉｍｕｎｅ ｐｏｌｙｅｎｏｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ−ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ−ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。
【００１２】
チトクロムＰ４５０における突然変異は、代謝性疾患に関連しており、そのような代謝性疾患には、幼児及び小児期に最もよく見られる副腎官能基不全である先天性副腎過形成、ビタミンＤ偽欠乏性くる病、脳腱黄色腫症、進行性神経官能基障害によって特徴付けられる脂質貯蔵病、早発性アテローム性動脈硬化症及び白内障があり、また、抗凝血薬クマリン及びワルファリンに対する遺伝性抵抗力に関連している（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ， Ｋ．Ｊ． ら （１９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐｐ． １９６８−１９７０、Ｔａｋｅｙａｍａ， Ｋ． ら． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１８２７−１８３０、Ｋｉｔａｎａｋａ， Ｓ． ら （１９９８） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８：６５３−６６１、ＯＭＩＭ ＊２１３７００ Ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ、及びＯＭＩＭ ＃ｌ２２７００ Ｃｏｕｍａｒｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）。チトクロムＰ４５０タンパク質アロマターゼの極度に高レベルの発現は、重度の女性化乳房（女性化）の少年から得た線維層状（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ）肝細胞癌に見られた（Ａｇａｒｗａｌ， Ｖ．Ｒ． （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８３：１７９７−１８００）。
【００１３】
チトクロムＰ４５０触媒回路は、ＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）によるチトクロムＰ４５０の還元によって完了する。チトクロムｂ５及びＮＡＤＰＨチトクロムｂ５レダクターゼを含む別のミクロソームの電子伝達系は、チトクロムＰ４５０触媒回路へ電子を僅かに寄与するものとして広く見られていた。しかしながら、Ｌａｍｂ， Ｄ．Ｃ． ら（１９９９； ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４６２：２８３−２８８）による最近の報告では、ミクロソームのチトクロムｂ５／ＮＡＤＰＨチトクロムｂ５レダクターゼ系によって効率的に低減及び支持され得るカンジダアルビカンスチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ５１）が同定された。従って、この別の電子ドナー系によって支持される多くのチトクロムＰ４５０が存在する可能性がある。
【００１４】
チトクロムｂ５レダクターゼはまた、酸化ヘモグロビン（酸素を運ぶことができないメトヘモグロビンまたはフェロヘモグロビン）を赤血球において活性ヘモグロビン（フェロヘモグロビン）に還元する。効果的に還元されない異常なヘモグロビン（ヘモグロビンＭ）または高レベルのオキシダント薬物の存在は、メトヘモグロビン血症の原因となる。
【００１５】
メトヘモグロビン血症はまた、赤血球シトクロムｂ５レダクターゼにおける遺伝性欠乏症にも起因し得る（Ｍａｎｓｏｕｒ， Ａ， ａｎｄ Ｌｕｒｉｅ， Ａ．Ａ． （１９９３） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４２：７４２にレビューされている）。
【００１６】
チトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーはまた、ビタミンＤ合成及び異化に密接に関連する。ビタミンＤは、２つの生物学的に等価なホルモン前駆体即ち植物組織で産出されるエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）及び動物組織で産出されるコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）として存在する。後者の形態即ちコレカルシフェロールは、７−デヒドロコレステロールを近紫外線（即ち２９０〜３１０ｎｍ）に晒すことにより形成され、通常は太陽への皮膚の露出が最少時間であっても生じる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｐｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １１：３１５−３１９にレビューされている）。
【００１７】
両プロホルモン形態は、酵素２５−ヒドロキシラーゼによって肝臓内で更に代謝されて２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）になる。２５（ＯＨ）Ｄは、ビタミンＤの最も豊富な前駆体形態であり、酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ−ヒドロキシラーゼ１α−ヒドロキシラーゼ（１α−ヒドロキシラーゼ）によって腎臓内で更に活性型１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）に代謝されなければならない。１α，２５（ＯＨ）Ｄ２産出の調節は、合成経路のこの最終ステップで主として行われる。１α−ヒドロキシラーゼの活性は、酵素産物（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ）の循環レベルと、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インシュリン、カルシウム、リンの成長ホルモン及びプロラクチンのレベルとを含む幾つかの生理学的な因子に依存する。更に、腎外１α−ヒドロキシラーゼ活性が報告されており、 １α，２５（ＯＨ）２Ｄ産出の組織特異局部調節もまた生物学的に重要であり得ることを示唆している。酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ ２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）を含む２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ （２４，２５（ＯＨ）２Ｄ）への１α，２５（ＯＨ）２Ｄの触媒作用は、腎臓でも発生する。２４−ヒドロキシラーゼは２５（ＯＨ）Ｄを基質として用いることもできる（Ｓｈｉｎｋｉ， Ｔ． ら． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１２９２０−１２９２５、前出のＭｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｐｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ及びそこに引用されている文献）。
【００１８】
ビタミンＤ ２５−ヒドロキシラーゼ、１α−ヒドロキシラーゼ及び２４−ヒドロキシラーゼは全て、ファミリーのその他のメンバーとの高度の類似性を示すＮＡＤＰＨ依存性Ｉ型（ミトコンドリアの）チトクロムＰ４５０酵素である。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼはまた、広範な基質を示し、胆汁酸中間体の２６−ヒドロキシル化並びにコレステロールの２５， ２６， 及び２７−ヒドロキシル化をも行い得る（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ．Ｊ． ら． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１６７６６−１６７７４、前出のＭｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ． ａｎｄ Ｐｏｒｔａｌｅ，Ａ．Ａ、及びそこに引用されている文献）。
【００１９】
ビタミンＤの活性型（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ）は、カルシウム及びリン酸ホメオスタシスに関与し、骨髄細胞及び皮膚細胞の分化を促進する。ビタミンＤ代謝に関与する酵素（１α−ヒドロキシラーゼ等）の欠失に起因するビタミンＤ欠乏症は、あひる歩行を伴う内反膝即ちＯ脚を含む骨密度の減少及び特有の臨床像によって特徴付けられる疾患であるビタミンＤ依存性（感受性）くる病、低カルシウム血症、低リン酸血症の原因となる。ビタミンＤ ２５−ヒドロキシラーゼの欠乏は、アキレス腱、脳、肺及び多くの他の組織におけるコレステロール及びコレスタノールの付着によって特徴付けられる脂質貯蔵病である脳腱黄色腫症の原因となる。この病気は、青春期後の小脳性運動失調、アテローム性動脈硬化症及び白内障を含む進行性神経官能基障害を呈する。ビタミンＤ ２５−ヒドロキシラーゼの欠乏によってはくる病は発病しないが、このことは２５（ＯＨ）Ｄの合成のための別経路の存在を示唆している（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｚｅｒｗｅｋｈ， Ｊ．Ｅ． （１９８３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ， ７２：１１９０−１１９９； Ｇａｍｂｌｉｎ， Ｇ．Ｔ． ら． （１９８５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７５：９５４−９６０； ａｎｄ 前出のＷ．Ｌ． ａｎｄ Ｐｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ．）。
【００２０】
フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼは、少なくとも１つのヒトチトクロムＰ４５０種、ＣＹＰ２７遺伝子によってコードされるチトクロムＰ４５０ｃ２７を支持する電子伝達副タンパク質である（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ．Ｊ． ら （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２０：２６７−７１）。ストレプトマイセス‐グリセウスのチトクロムＰ４５０即ちＣＹＰ１０４Ｄ１は、大腸菌において非相同的に発現され、内因性フェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼ酵素によって還元されることがわかったが（Ｔａｙｌｏｒ， Ｍ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６３：８３８−４２）、このことは、多くのチトクロムＰ４５０種がフェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼ対に支持され得ることを示唆している。フェレドキシンレダクターゼはまた、モデル薬物代謝系において抗生の抗腫瘍であるアクチノマイシンＤを反応性フリーラジカル種に還元することもわかっている（Ｆｌｉｔｔｅｒ， Ｗ．Ｄ． ａｎｄ Ｍａｓｏｎ， Ｒ．Ｐ． （１９８８） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｒａ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６７：６３２−６３９）。
【００２１】
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）
フラビン含有モノオキシゲナーゼは、基質の例外的範囲のリンヘテロ原子及び求核性窒素、硫黄を酸化する。チトクロムＰ４５０と同様に、ＦＭＯはミクロソームのそれであり、ＮＡＤＰＨ及びＯ２を使用する。また、かなりの基質がチトクロムＰ４５０と重複する。ＦＭＯの組織分布には、肝臓， 腎臓及び肺が含まれる。
【００２２】
哺乳動物には、ＦＭＯの５つの異なる既知のアイソフォーム（ＦＭＯ１、ＦＭＯ２、ＦＭＯ３、ＦＭＯ４、ＦＭＯ５）があり、これらは組織特異の方法で発現される。アイソフォームは、その基質の特異性及びその他の特性、例えば種々の化合物及び反応の立体特異性による阻害が異なる。ＦＭＯは、１３のアミノ酸サイン配列を有し、その成分は、配列の３分の２のＮ末端に及び、多くのＮ−ヒドロキシル化酵素に見られるＦＡＴＧＹモチーフ及びＦＡＤ結合領域を含む（Ｓｔｅｈｒ， Ｍ． ら． （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３：５６−５７、ＰＲＩＮＴＳ ＦＭＯＸＹＧＥＮＡＳＥ Ｆｌａｖｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【００２３】
特異反応には、求核性第三アミンからＮ−オキシドへ、第二アミンからヒドロキシルアミン及びニトロンへ、第一アミンからヒドロキシルアミン及びオキシムへ、そして硫黄含有化合物及びホスフィンからＳ−オキシド及びＰ−オキシドへの酸化がある。ヒドラジン、ヨウ化物、セレン化物及びホウ素含有化合物もまた基質である。ＦＭＯは、化学的にチトクロムＰ４５０と類似の外観を呈するが、通常、例えば、ＦＭＯのより高い熱不安定性及びチトクロムＰ４５０の非イオン性界面活性剤感受性に基づきｉｎ ｖｉｔｒｏチトクロムＰ４５０と区別することができる。しかしながら、同定におけるこれらの特性の利用は、熱安定性及び界面活性剤感受性に関連してＦＭＯアイソフォーム間の更なる変異によって複雑になっている。
【００２４】
ＦＭＯは、幾つかの薬物及び生体異物の代謝において重要な役割を果たす。ＦＭＯ（肝臓のＦＭＯ３）は、尿に排出される（Ｓ）−ニコチンＮ−１’−オキシドへと（Ｓ）−ニコチンを代謝する主たる原因となる。ＦＭＯはまた、胃潰瘍の治療に広く用いられるＨ２−アンタゴニストであるシメチジンのＳ−酸素付加に関与する。ＦＭＯの肝臓発現形態は、チトクロムＰ４５０と同一の調整制御下にはない。例えばラットでは、フェノバルビタール治療はチトクロムＰ４５０の誘導につながるが、ＦＭＯ１の抑制にはつながらない。
【００２５】
ＦＭＯの内因性基質にはシステアミンがあり、これは酸化されてジスルフィド、シスタミン及びトリメチルアミン（ＴＭＡ）になり、ＴＭＡは代謝されてトリメチルアミノＮ−オキシドになる。ＴＭＡは腐敗した魚のような臭いがする。ＦＭＯ３アイソフォームの突然変異は、悪臭のしない大量のアミンを汗、尿及び息に排出させる。これらの症状は、魚臭症候群（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ｆｉｓｈ−ｏｄｏｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こしていた（ＯＭＩＭ ６０２０７９ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｕｒｉａ）。
【００２６】
リシルオキシダーゼ：
リシルオキシダーゼ（リシン６−オキシダーゼ， ＬＯ）は、架橋コラーゲン及びエラスチンにより結合組織マトリックスの形成に関連付けられた銅依存性アミンオキシダーゼである。ＬＯは、約５０ｋＤａレベルのＮ−グリコシル化前駆体タンパク質として分泌され、前駆体形態もまた活性であるが、メタロプロテアーゼによって切断されて成熟形態の酵素になる。ＬＯ中の銅原子は、これらの細胞外マトリックスタンパク質におけるリシン残基の酸化的脱アミノを促進するような酸素へ及び酸素からの電子の伝達に関与している。銅の配位がＬＯ活性に不可欠である一方で、銅の不十分な食事摂取は、アポ酵素の発現に影響しない。しかしながら、機能ＬＯの不在は、食事性銅欠乏症に関連する骨格組織及び血管性 組織疾患に関連がある。ＬＯはまた、ヘパリンのみならず、種々のセミカルバジド、ヒドラジン及び亜硝酸アミノによっても阻害される。β−アミノプロピオニトリルは、通常用いられる阻害剤である。ＬＯ活性は、トランスフォーミング成長因子β、血小板由来の成長因子、アンギオテンシンＩＩ及び線維芽細胞成長因子等の局部組織外傷に応じて放出される高レベルのホルモン及びオゾン、カドミウムに応じて増加する。ＬＯ活性の異常性は、メンケス症候群及び後角症候群に関連してきた。酵素のサイトソルの形態は、異常細胞増殖に関連付けられてきた（Ｒｕｃｋｅｒ， Ｒ．Ｂ． ら． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ６７．９９６Ｓ−１００２Ｓ及びＳｍｉｔｈ−Ｍｕｎｇｏ， Ｌ．Ｉ． ａｎｄ Ｋａｇａｎ， Ｈ．Ｍ． （１９９８） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． １６：３８７−３９８にレビューされている）。
【００２７】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、テトラヒドロ葉酸へのジヒドロ葉酸のＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒する遍在性の酵素である。この還元は、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジン１リン酸（ｄＴＭＰ）への転換と同様にグリシン及びプリンの新規合成において不可欠なステップである。基本的な反応は次の通りである。
【００２８】
７，８−ジヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰＨ→５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰ＋
酵素は、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ）及びメトトレキセートを含む多数のジヒドロ葉酸類似体によって阻害される。ＤＮＡ合成には多量のＴＭＰが必要なので、急速分割細胞はＤＢＦＲの活性を必要とする。ＤＮＡウイルス（ヘルペスウイルス等）の複製もまた、高レベルのＤＢＦＲ活性を必要とする。結果的に、ＤＨＦＲを標的とする薬物は、癌の化学療法及びＤＮＡウイルス複製の阻害に用いられてきた。（同様の理由で、チミジル酸シンターゼもまた標的酵素である）。ＤＢＦＲを阻害する薬物は、急速分割細胞（即ちＤＮＡウイルス感染細胞）に優先的に細胞毒性を有するが特異性がないので、分割細胞を無差別に破壊する。更に、後天性輸送異常または１若しくは数個のＤＢＦＲ遺伝子の複製の結果として、癌細胞は、メトトレキセートなど、薬物に耐性を有することになり得る（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ Ｃｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐｐ． ５１１−５６１９）。
【００２９】
アルド／ケトレダクターゼ
アルド／ケトレダクターゼは、広範な基質の特異性を有する単量体ＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼである（Ｂｏｂｒｅｎ， Ｋ．Ｍ． ら． （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：９５７４−９５５１）。これらの酵素は、カルボニル含有糖及び芳香族化合物を含むカルボニル含有化合物の、対応するアルコールへの還元を触媒する。従って、種々のカルボニル含有薬物及び生体異物は、このクラスの酵素によって代謝される可能性がある。
【００３０】
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される既知の反応の１つに、ソルビトールへのグルコースの還元があり、ソルビトールは更にソルビトールデヒドロゲナーゼによって代謝されてフルクトースになる。正常な条件下では、ソルビトールへのグルコースの還元は、小経路である。しかしながら高血糖性状態では、ソルビトールの蓄積は糖尿病合併症の発達に関係する（ＯＭＩＭ ＊１０３８８０ Ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １， ｍｅｍｂｅｒ Ｂ１）。この酵素ファミリーのメンバーはまた、肝臓癌においても高度に発現される場合がある（Ｃａｏ， Ｄ． ら． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１１４２９−１１４３５）。
【００３１】
アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、単純アルコールを対応するアルデヒドに酸化する。ＡＤＨは、サイトソル酵素であり、コファクターＮＡＤ＋を好み、亜鉛イオンも結合する。肝臓は、腎臓、肺及び胃粘膜ではより低レベルの、最高レベルのＡＤＨを含む。
【００３２】
既知のＡＤＨアイソフォームは、４０ｋＤａサブユニットからなる二量体タンパク質である。これらのサブユニットをコードする既知の遺伝子座は５つ（ａ， ｂ， ｇ， ｐ， ｃ）あり、特徴付けられた対立遺伝子変異体（ｂ１， ｂ２， ｂ３ ｇ１ ｇ２）を有する座もある。サブユニットは、ホモ二量体及びヘテロ二量体を形成することができ、サブユニット成分は活性酵素の特異的特性を決定する。ゆえに、ホロ酵素は、クラスＩ（サブユニット成分ａａ， ａｂ， ａｇ， ｂｇ， ｇｇ）、クラスＩＩ（ｐｐ）及びクラスＩＩＩ（ｃｅ）のように分類されてきた。クラスＩ ＡＤＨアイソザイムは、エタノール及びその他の小脂肪族アルコールを酸化し、ピラゾールに阻害される。クラスＩＩアイソザイムは、より長鎖の脂肪族及び芳香族アルコールを好み、メタノールを酸化することができず、ピラゾールに阻害されない。クラスＩＩＩアイソザイムは、更に長鎖の脂肪族アルコール（５炭素以長）及び芳香族アルコールを好み、ピラゾールに阻害されない。
【００３３】
短鎖アルコールデヒドロゲナーゼには、種々の基質特異性を有する関連酵素が多数含まれる。このグループに含まれるのは、細菌性酵素アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、グルコース１−デヒドロゲナーゼ、３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、３−オキソアシルレダクターゼ、２，３−ジヒドロ−２，３−ジヒドロキシ安息香酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールリン酸２−デヒドロゲナーゼ、７−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、シス−１ ２−ジヒドロキシ−３，４−シクロヘキサジエン−１−カルボン酸デヒドロゲナーゼ、シス−トルエンジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、シス−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ、ジフェニル−２，３−ジヒドロ−２，３−ジオールデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アシルマンノサミン１−デヒドロゲナーゼ及び２−デオキシ−Ｄ−グルコン酸３−デヒドロゲナーゼのみならず、哺乳動物の酵素Ｄ−β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、（Ｒ） ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性カルボニルレダクターゼ、コルチコステロイドＩＩ−β−デヒドロゲナーゼ及びエストラジオール１７β−デヒドロゲナーゼがある（Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９４） Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５１：１２５−１３０、Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ８４：Ｃ２５−３１、Ｍａｒｋｓ， Ａ．Ｒ． ら． （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１５４５９−１５４６３）。
【００３４】
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼファミリー（ＵＧＴ）のメンバーは、コファクターウリジン２リン酸−グルクロン酸（ＬＴＤＰ−グルクロン酸）から基質へのグルクロン酸群の移行を触媒する。移行は、通常求核性ヘテロ原子（Ｏ， Ｎ， またはＳ）へと行われる。基質には、ビリルビン、ステロイドホルモン、チロイドホルモン等の内因性化合物が含まれるのみならず、第１相反応によって機能されてきたような生体異物が含まれる。基質の分子量が約２５０ｇ／ｍｏｌ以下であればグルクロン酸抱合の産物は尿に排出され、より大きなグルクロニド化された（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｅｄ）基質は胆汁に排出される。
【００３５】
ＵＧＴは、肝臓、腎臓、腸、皮膚、脳、脾臓及び鼻粘膜のミクロソームに位置しているが、ここではＵＧＴはチトクロムＰ４５０酵素及びフラビン含有モノオキシゲナーゼとして小胞体膜の同一の側にあり、従って第１相薬物代謝の産物に接近するのに理想的な位置にある。ＵＧＴは、小胞体膜にＵＧＴを固定するＣ末端膜貫通ドメインと、そのＣ末端部の約５０アミノ酸残基の保存されたサインドメインとを有する（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００３５９ ＵＤＰ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【００３６】
薬物代謝に関与するＵＧＴは、２つの遺伝子ファミリーＵＧＴ１及びＵＧＴ２によってコードされる。ＵＧＴ１ファミリーのメンバーは、コファクター結合及び膜挿入に関与する一定の領域及び可変基質結合ドメインを有する単一遺伝子座の代替スプライシングの結果として生じる。ＵＧＴ２ファミリーのメンバーは、別々の遺伝子座にコードされ、２つのファミリーＵＧＴ２Ａ及びＵＧＴ２Ｂに分けられる。２Ａサブファミリーは嗅上皮に発現され、２Ｂサブファミリーは肝臓ミクロソームに発現される。ＵＧＴ遺伝子における突然変異は、高ビリルビン血（ＯＭＩＭ ＃１４３５００ Ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ Ｉ）、出生からの激烈な高ビリルビン血症に特徴付けられるクリグラー‐ナジャー症候群（ＯＭＩＭ ＃２１８８００ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、及びジルベール病と名付けられた穏やかな形態の高ビリルビン血症（ＯＭＩＭ ＊１９１７４０ ＵＧＴ１）に関連している。
【００３７】
スルホトランスフェラーゼ
硫酸抱合は、Ｏ−グルクロン酸抱合により高度に水溶性の硫酸エステルを産出するような多数の同一基質に生じる。スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、コファクター３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）から基質へＳＯ３−を移行させることによってこの反応を触媒する。ＳＴ基質は、優性なフェノール及び脂肪族アルコールであるが、芳香族アミン及び脂肪族アミンも含み、両アミンは抱合されて対応するスルファミド酸エステルを産出する。この反応の産物は、主として尿に排出される。
【００３８】
ＳＴは、肝臓、腎臓、腸管、肺、血小板及び脳を含む広い範囲の組織に見られる。酵素は通常サイトソルであり、複数の形態がしばしば共発現される。例えば、ラットの肝臓サイトソルにはＳＴの形態が１２以上ある。これらの生化学的に特徴付けられたＳＴは、基質優先度に基づき５つのクラス即ちアリルスルホトランスフェラーゼ、アルコールスルホトランスフェラーゼ、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ、チロシンエステルスルホトランスフェラーゼ及び胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼに区分される。
【００３９】
ＳＴ酵素活性は、ラットの性別及び年齢と共に大いに変化する。発生キュー（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｕｅ）及び性別関連ホルモンの併用効果は、ＳＴ発現プロフィール及びチトクロムＰ４５０等その他のＤＭＥのプロフィールにおけるこれらの相異の原因となると考えられている。特に、ネコにおけるＳＴの高発現は、その低レベルのＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性を部分的に代償する。
【００４０】
ＳＴの幾つかの形態は、ヒト肝臓サイトソルから精製されてクローン化されてきた。熱安定性及び基質優先度が異なるつのフェノールスルホトランスフェラーゼがある。耐熱性酵素は、パラ−ニトロフェノール、ミノキシジル及びアセトアミノフェン等のフェノールの硫酸化を触媒し、熱不安定性酵素は、ドーパミン、エピネフリン及びレボドーパ等のモノアミン基質を好む。その他のクローン化ＳＴには、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼがある。この最後の酵素は、細胞生化学におけるＳＴの別の主要な役割、即ち細胞の分化及びプロテオグリカンの成熟において重要であり得る炭水化物構造の修飾を説明する。実際、スルホトランスフェラーゼの遺伝的欠陥は、成熟硫酸ケラタンプロテオグリカンの合成失敗に特徴付けられる疾患である斑点状角膜ジストロフィーに関連してきた（Ｎａｋａｚａｗａ， Ｋ． ら． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１３７５１−１３７５７； ＯＭＩＭ ＊２１７８００ Ｍａｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ， ｃｏｒｎｅａｌ）。
【００４１】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
ガラクトシルトランスフェラーゼは、溶液中で遊離する糖タンパク質または糖脂質の一部である末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｉｃＮＡｃ）オリゴ糖鎖にガラクトース（Ｇａｌ）を移行させるグリコシルトランスフェラーゼのサブセットである（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ， Ｆ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４３３−４４０； Ａｍａｄｏ， Ｍ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７３：３５−５３）。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ゴルジ体に存在するのみならず、細胞表面上に及び可溶性細胞外タンパク質として検出されてきた。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ形態Ｉ型糖は、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ結合でつながれる。既知のヒト及びマウスβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、８つの保存された領域を有する触媒ドメイン、短いサイトソルドメイン及び単一膜貫通ドメインを有するような外観を呈する（前出のＫｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．及びＨｅｎｎｅｔ， Ｔ． ら． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５８−６５）。マウスＵＤＰ−ガラクトースにおいては、β−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ領域１はアミノ酸残基７８−８３に位置し、領域２はアミノ酸残基９３−１０２に位置付けられ、領域３はアミノ酸残基１１６−１１９に位置し、領域４はアミノ酸残基１４７−１５８に位置し、領域５はアミノ酸残基１７２−１８３に位置し、領域６はアミノ酸残基２０３−２０６に位置し、領域７はアミノ酸残基２３６−２４６に位置し、領域８はアミノ酸残基２６４に位置する。マウスＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１領域８に見られる配列の変異体は、細菌性ガラクトシルトランスフェラーゼにも見られ、この配列がガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを画定することを示唆している（前出のＨｅｎｎｅｔ）。最近の研究によれば、脳の（ｂｒａｉｎｉａｃ）タンパク質は、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであることが示唆されている（Ｙｕａｎ，Ｙ． ら． （１９９７） Ｃｅｌｌ ８８：９−１１、前出のＨｅｎｎｅｔ）。
【００４２】
ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧｌｃＮＡｃ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（−１，４−ＧａｌＴ）（Ｓａｔｏ， Ｔ． ら， （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６．１８５０−１８５７）は、Ｇａｌ （β１−４） ＧｉｃＮＡｃ結合を有するＩＩ型糖鎖の形成を触媒する。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの場合のように、酵素の可溶性形態は、膜結合型アミノ酸の分割によって形成される。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ間で保存されたアミノ酸は、ジスルフィド結合で結合された２つのシステイン及び触媒ドメインの推定上のＵＤＰ−ガラクトース結合部位を含む（Ｙａｄａｖ， Ｓ． ａｎｄ Ｂｒｅｗ， Ｋ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１４１６３−１４１６９、Ｙａｄａｖ， Ｓ．Ｐ． ａｎｄ Ｂｒｅｗ， Ｋ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：６９８−７０３、及びＳｈａｐｅｒ， Ｎ．Ｌ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２．３１３８９−３１３９９）。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質または糖脂質での糖鎖合成に加えて、幾つかの特別な役割を有する。哺乳動物では、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、α−ラクトアルブミンを有するヘテロ二量体として、授乳乳腺ラクトースの産出において機能する。精子の表面上のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、卵を特異的に認識する受容体として機能する。細胞表面β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼはまた、細胞付着、細胞／基底層相互作用及び正常で転移性の細胞遊走において機能する（Ｓｈｕｒ， Ｂ． （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：８５４−８６３； ａｎｄ Ｓｈａｐｅｒ， Ｊ． （１９９５） Ａｄｖ． Ｅｘｐ， Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６：９５−１０４）。
【００４３】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって触媒される基礎反応は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を有する求電子体の抱合である。ＧＳＴは、主としてサイトソルに局在しているホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質であるが、ミクロソームにも活性のレベルが存在することがある。主要アイソザイムは、共通の構造及び触媒特性を共有し、ヒトにおいては４つの主要クラスα、μ、π及びθに分類されてきた。２大クラスα及びμは、各々のタンパク質等電点即ちｐＩ ￣ ７．５−９．０（α）及びｐＩ ￣ ６．６（μ）により同定される。各ＧＳＴは、ＧＳＨに対する共有結合部位及び可変疎水結合部位を有する。各アイソザイムにおける疎水結合部位は、特定の求電子基質に対して特異的である。ＧＳＴ内の特異的アミノ酸残基は、これらの結合部位及び触媒活性に重要であるとして同定されてきた。残基Ｑ６７、Ｔ６８、Ｄ１０１、Ｅ１０４及びＲ１３１は、ＧＳＨの結合に重要である（Ｌｅｅ， Ｈ．−Ｃ． ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９９−１０９）。残基Ｒ１３、Ｒ２０及びＲ６９は、ＧＳＴの触媒活性に重要である（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ， Ｇ． ら （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４：５４９−５５５）。
【００４４】
殆どの場合、ＧＳＴは、変異誘発性及び発癌性化学物質の不活性化及び解毒の有益な機能を実行する。しかしながら、場合によっては、そのような作用は有害であり、結果としての変異誘発性及び発癌性効果を伴う化学薬品の活性化につながる。ラット及びヒトのＧＳＴの形態には、発癌性の検出を補助する信頼できる新生物発生前マーカーであるものもある。公知の突然変異誘発力のためのエイムス試験において用いられるネズミチフス菌等の菌種におけるヒトＧＳＴの発現は、変異誘発性におけるこれらの酵素の役割を確立するのに役立ってきた。ジハロメタンは、マウスの肝臓腫瘍を産出するが、ＧＳＴにより活性化されると信じられている。この考えは、形質移入されていない細胞よりもヒトＧＳＴを発現する細菌細胞においてジハロメタンが変異誘発性であることを発見したことにより支持されている（Ｔｈｉｅｒ， Ｒ． ら． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８５６７−８５８０）。二臭化エチレン及び二塩化エチレンの突然変異誘発力は、ヒトαＧＳＴ， Ａ１−１を発現する細菌細胞において増加し、アフラトキシンＢ１の突然変異誘発力は、ＧＳＴの発現を強化することにより実質的に低減される（Ｓｉｍｕｌａ， Ｔ．Ｐ． ら （１９９３） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １４：１３７１−１３７６）。従って、ＧＳＴ活性の制御は、変異誘発性及び発癌性の制御に有用であり得る。
【００４５】
ＧＳＴは、多剤耐性（ＭＤＲ）として知られている現象である、多くの癌の薬物治療への後天性抵抗力に関係付けられてきた。ＭＤＲは、シクロホスファミド等の細胞毒で癌患者を治療する際に発生し、引き続いてこの薬物及び種々のその他の細胞毒性薬剤に対しても抵抗性がつく。増加したＧＳＴレベルは、これらの薬物抵抗癌の幾つかに関連し、この増加は、ＧＳＴ触媒されたＧＳＨ抱合反応によって次に不活性化されるような薬剤に応じて生じると信じられている。増加したＧＳＴレベルは次に、ＧＳＴに結合するその他の細胞毒性薬剤から癌細胞を保護する。腫瘍において増加したレベルのＡ１−１は、シクロホスファミド治療に誘発される薬物抵抗力に関連してきた（Ｄｉｒｖｅｎ Ｈ．Ａ． ら． （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４： ６２１５−６２２０）。従って、癌性組織のＧＳＴ活性の制御は、癌患者のＭＤＲの治療に有益であり得る。
【００４６】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
γ−グルタミルトランスペプチダーゼは、γ−グルタミルアミド結合の切断によって細胞外グルタチオン（ＧＳＨ）分解を開始するような遍く発現される酵素である。ＧＳＨの分解は、生合成経路のための限局性システインプールを有する細胞を提供する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼはまた、細胞のアンチオキシダント防御に寄与し、発現は酸化ストレスによって誘発される。細胞表面局在糖タンパク質は、癌細胞に高レベルで発現される。研究が示唆するところによれば、癌細胞の表面に存在する高レベルのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性は、前駆体薬物を活性化させる、結果的に高局在密度の抗癌治療薬を作るのに利用することができる（Ｈａｎｉｇａｎ， Ｍ．Ｈ． （１９９８） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １１１−１１２：３３３−４２、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ． ａｎｄ Ｉｋｅｄａ， Ｙ． （１９９８） Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７２：２３９−７８、Ｃｈｉｋｈｉ， Ｎ． ら （１９９９） Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２２：３６７−３８０）。
【００４７】
アシルトランスフェラーゼ
Ｎ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、活性化カルボキシル基へのアミノ酸抱合の移行を触媒する。内因性化合物及び生体異物は、サイトソル、ミクロソーム及びミトコンドリアでアシル−ＣｏＡシンセターゼに活性化される。アシル−ＣｏＡ中間体は次に、サイトソルまたはミトコンドリアでＮ−アシルトランスフェラーゼによってアミノ酸（通常はグリシン、グルタミンまたはタウリンであるが、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸及び幾つかのジペプチドの場合もある）に抱合され、アミド結合を有する代謝産物を形成する。この反応は、Ｏ−グルクロン酸抱合に相補的であるが、アミノ酸抱合は、グルクロン酸抱合からしばしば生じる反応性及び毒性代謝産物を産出しない。
【００４８】
このクラスのよく特徴付けられた酵素の１つに、胃腸管の洗浄剤として働く胆汁酸抱合を生成する原因となる胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＴ）がある（Ｆａｌａｎｙ， Ｃ．Ｎ． ら． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１９３７５−１９３７９、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ．Ｒ． ら． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３）。ＢＡＴはまた、部分肝切除後の肝細胞癌患者の予後に対する予測指標として有用である（Ｆｕｒｕｔａｎｉ， Ｍ． ら． （１９９６） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２４：１４４１−１４４５）。
【００４９】
アセチルトランスフェラーゼ
アセチルトランスフェラーゼについては、ヒストンアセチル化におけるその役割が広範に研究されてきた。ヒストンアセチル化は、真核生物細胞のクロマチン構造の緩和をもたらし、転写制御因子がゲノムの患部（または通常のゲノム）のＤＮＡ鋳型のプロモーター要素に接近し得るようにする。対照的に、ヒストン脱アセチル化は、クロマチン構造を閉じて転写制御因子の接近を制限することにより、転写の減少の原因となる。この目的のため、細胞転写を刺激する共通手段は、ヒストン（酪酸ナトリウム等）の脱アセチル化を阻害する化学薬剤の使用であり、遺伝子発現の全体的な（例え人為現象的であっても）増加をもたらす。アセチル化による遺伝子発現の変調はまた、限定するものではないが、ｐ５３、ＧＡＴＡ−１、ＭｙｏＤ、ＡＣＴＲ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ及び高易動度群タンパク質（ＨＭＧ）を含むその他のタンパク質のアセチル化によって生じる。ｐ５３の場合、アセチル化はＤＮＡ結合の増加をもたらし、ｐ５３により調整される遺伝子の転写の刺激につながる。プロトタイプのヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）は、酵母由来のＧｃｎ５である。Ｇｃｎ５は、テトラヒメナｐ５５、ヒトＧｅｎ５及びヒトｐ３００／ＣＢＰを含むアセチラーゼのファミリーのメンバーである。ヒストンアセチル化については、（Ｃｈｅｕｎｇ， Ｗ．Ｌ． ら （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：３２６−３３３及びＢｅｒｇｅｒ， ＳＸ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：３３６−３４１）にレビューされている。アセチルトランスフェラーゼ酵素には、限定するものではないがアセチルコリンエステラーゼ及びカルボキシエステラーゼを含む酵素の幾つかのその他の主クラスに共通するα／βヒドロラーゼフォールド（Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ − Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｌｚｂｕｒｇ， ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｉｒｂｍ−ｃｏｕｒｓｅ９７／Ｄｏｃｓ／ｍｓ／）を有するものがある（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００５０】
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
芳香族アミン及びヒドラジン含有化合物は、肝臓及びその他の組織のＮ−アセチルトランスフェラーゼ酵素によりＮ−アセチル化される。同一酵素によってある程度までＯ−アセチル化され得る生体異物がある。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、コファクターアセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）を利用してアセチル基を２ステッププロセスで移行させるサイトソル酵素である。第１ステップでは、アセチル基をアセチル−ＣｏＡから活性部位システイン残基に移行させ、第２ステップでは、アセチル基を基質アミノ基に移行させ、酵素を再生する。
【００５１】
殆どのその他のＤＭＥクラスとは対照的に、既知のＮ−アセチルトランスフェラーゼの数は限定されている。ヒトにおいては、２つの高度に類似の酵素ＮＡＴ１及びＮＡＴ２があり、マウスは第３の形態の酵素ＮＡＴ３を有するような外観を呈する。ヒト型のＮ−アセチルトランスフェラーゼは、非依存性調節（ＮＡＴ１は広範に発現されるが、ＮＡＴ２は肝臓及び腸にしか発現しない）及び重複する基質優先度を有する。両酵素は、殆どの基質をある程度まで受容する外観を呈するが、ＮＡＴ１は或る基質（パラアミノ安息香酸、パラアミノサリチル酸、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド）を好み、ＮＡＴ２は他の基質（イソニアジド、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、スルファメチアジン）を好む。
【００５２】
抗結核薬イソニアジドを１９５０年代に服用していた患者の臨床観察から、化合物の高速及び緩徐アセチレータ（ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）に関する記述が導かれる。これらの表現型は、引き続いて、酵素活性または安定性に影響するＮＡＴ２遺伝子の突然変異によるものであることを示していた。緩徐イソニアジドアセチル代謝表現型は、中東人の個体群に非常に多く（約７０％）、白人の個体群（約５０％）及びアジア人の個体群（＜２５％）にはそれ程多くなかった。より最近では、ＮＡＴ１の機能多形性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が、低アセチル代謝表現型として示される約８％の試験された個体群で検出されている（Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｎ． Ｊ． ら． （１９９８） Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：６７−７２）。ＮＡＴ１は既知の芳香族アミン発癌物質を活性化することができる場合があるので、広範に発現されたＮＡＴ１酵素における多形性は、癌の危険性を判定する際に重要であり得る（ＯＭＩＭ ＊１０８３４５ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）。
【００５３】
アミノトランスフェラーゼ
アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の形質転換を触媒するピリドキサル５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素のファミリーを含む。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＡＴ）は、最も広範に研究されたＰＵ含有酵素である。ＡｓｐＡＴは、ジカルボキシルＬ−アミノ酸、アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに対応する２−オキソ酸、オキサル酢酸エステル及び２−オキソグルタラートの可逆アミノ基転移を触媒する。ファミリーのその他のメンバーには、ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、キヌレニンアミノトランスフェラーゼがある（Ｖａｃｅａ， Ｒ．Ａ． ら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２．２１９３２−２１９３７）。
【００５４】
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型は、肝臓特異ペルオキシソームの酵素であるアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ１の欠乏を引き起こす常染色体劣性疾患である。この疾患の表現型は、グリオキシル酸代謝の欠乏である。ＡＧＴの不在下では、グリオキシル酸はグリシンにアミノ基転移されるよりむしろ酸化されてシュウ酸エステルになる。その結果、腎臓及び尿路に不溶性シュウ酸カルシウムが付着し、最終的には腎不全を引き起こす（Ｌｕｍｂ， Ｍ．Ｊ． ら （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２０５８７−２０５９６）。
【００５５】
キヌレニンアミノトランスフェラーゼは、Ｌ−トリプトファン代謝産物Ｌ−キヌレニンの不可逆アミノ基転移を触媒してキヌレン酸を形成する。酵素はまた、Ｌ−２−アミノアジピン酸エステル及び２−オキソグルタラート間の可逆アミノ基転移反応を触媒して２−オキソアジパート及びＬ−グルタメートを産出し得る。キヌレン酸は、グルタミン酸作動性神経伝達の推定上のモジュレータであるので、キヌレニンアミノトランスフェラーゼの欠乏は多面発現性（ｐｌｅｏｔｒｏｐｈｉｃ）効果に関連し得る（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ． ら （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【００５６】
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ； ＳＡＭ）ドナーのメチル基の、カテコール基質のヒドロキシル基の１つ（Ｌ−ドーパ、ドーパミンまたはＤＢＡ等）への移行を触媒する。３’−ヒドロキシル基のメチル化は４’−ヒドロキシル基のメチル化に対して好ましく、ＣＯＭＴの膜結合アイソフォームは可溶性形態よりもレジオ特異的である。酵素の可溶性形態の翻訳は、完全長ｍＲＮＡ（１．５ｋｂ）の内部開始コドンの利用または内部プロモーターから転写されるようなより短いｍＲＮＡ（１．３ｋｂ）の翻訳に起因する。提唱されたＳＮ２様メチル化反応は、Ｍｇ＋＋を必要とし、Ｃａ＋＋によって阻害される。ドナー及び基質のＣＯＭＴへの結合は、経時的に発生する。ＡｄｏＭｅｔは先ずＭｇ＋＋非依存性様式でＣＯＭＴを結合し、その後Ｍｇ＋＋の結合及びカテコール基質の結合が行われる。
【００５７】
組織中のＣＯＭＴの量は、通常必要な活性の量に比べて比較的多く、従って阻害は疑わしい。それにもかかわらず、阻害剤はｉｎ ｖｉｔｒｏ使用（没食子酸エステル、トロポロン、Ｕ−０５２１及び３’， ４’−ジヒドロキシ−２−メチル−プロピオフェトロポロン（ｐｒｏｐｉｏｐｈｅｔｒｏｐｏｌｏｎｅ）等）及び臨床的使用（ニトロカテコールベースの化合物及びトルカポン等）のために開発されてきた。これらの阻害剤の投与は、Ｌ−ドーパの半減期及びドーパミンの結果的な形成を増加させる結果となっている。ＣＯＭＴの阻害は、おそらくは様々な他のカテコール構造化合物の半減期をも増加させる。そのようなカテコール構造化合物には、限定するものではないが、エピネフリン／ノルエピネフリン、イソプレナリン、リミテロール、ドブタミン、フェノルドパム（ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ）、アポモルフィン及びα−メチルドーパがある。ノルエピネフリンの欠失は臨床的抑制に関連していたので、ＣＯＭＴ 阻害剤の使用は、抑制の治療に有用であり得る。ＣＯＭＴ阻害剤は、通常最小限の副作用に十分な耐性を有し、最終的には体内の代謝産物の蓄積は極僅かで肝臓で代謝される（Ｍａｎｎｉｓｔｏ， Ｐ．Ｔ． ａｎｄ Ｋａａｋｋｏｌａ， Ｓ． （１９９９） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５１：５９３−６２８）。
【００５８】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは、酸化損傷に対する細胞の防御に関与する緻密なホモ二量体メタロ酵素である。酵素は、サブユニット当たり１原子の亜鉛及び１原子の銅を含有し、Ｏ２及びＨ２Ｏ２へのスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒する。不均化率は、基質と酵素活性部位との間に好適な静電相互作用が存在することにより、拡散律速で、結果的に向上される。このクラスの酵素の例は、幾つかの細菌性種の周辺質のみならず全ての真核生物細胞の細胞質において同定されてきた。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼは、尿素及びＳＤＳにより変性させ、タンパク分解消化に高度に抵抗性を有する強い酵素である。酵素の緻密構造に加えて、金属イオンの存在及びサブユニット内のジスルフィド結合は酵素安定性に寄与すると信じられている。酵素は、７０℃の高温で可逆変性を受ける（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ， Ａ． ら （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ． ２７３：５６５５−５６６１）。
【００５９】
スーパーオキシドジスムターゼの過剰発現は、ジフェニルエーテル除草剤、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）等の環境毒素に対する抵抗力の供与のみならず、遺伝子導入アルファルファの耐凍性の向上に関与してきた（ＭｃＫｅｒｓｉｅ， Ｂ．Ｄ． ら． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０３：１１５５−１１６３）。更に、酵母細胞は、スーパーオキシドジスムターゼの発現を上方制御することにより酵母細胞を更なる過酸化ストレスに適合させる過酸化水素への露出に続く凍結融解損傷への耐性が向上する。この研究では、酵母スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子への突然変異は、凍結保存のプロセスにより生物体生存を決定するのに重要であると長い間思われていたグルタチオン代謝の調節に影響する突然変異より有害な作用を凍結融解抵抗力に与える（Ｊｏｎｇ−Ｉｎ Ｐａｒｋ， Ｊ．−ｌ． ら． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２２９２１−２２９２８）。
【００６０】
スーパーオキシドジスムターゼの発現はまた、結核を引き起こす生物体である結核菌に関連している。スーパーオキシドジスムターゼは、結核菌が分泌する１０大主要タンパク質の１つであり、その発現は、酸化ストレスに応じて約５倍上方制御される。結核菌は、非病原性スメグマ菌よりスーパーオキシドジスムターゼを約１００倍分だけ多く発現し、発現された酵素のより多くの割合を分泌する。その結果、スメグマ菌よりも結核菌によって〜３５０倍以上の酵素が分泌され、酸化ストレスに対してかなりの抵抗力を提供する（Ｈａｒｔｈ， Ｇ． ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｍ．Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４．４２８１−４２９２）。
【００６１】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現の低減は、アンチオキシダント能力を有するその他の酵素と同様に、癌の初期段階で関係付けられてきた。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現は、正常な前立腺組織と比べると前立腺上皮内新形成及び前立腺癌では少ないことが示されてきた（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， Ｄ． Ｇ． （２０００） Ｃａｎｃｅｒ ８９：１２３−１３４）。
【００６２】
ホスホジエステラーゼ
ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル化合物における２つのエステル結合の１つの加水分解を触媒する酵素のクラスを作成する。従って、ホスホジエステラーゼは、種々の細胞のプロセスに重大なである。ホスホジエステラーゼは、細胞成長及び複製に不可欠なＤＮＡ及びＲＮＡエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと、ＤＮＡの位相転位中に核酸鎖を切断及び再結合するトポイソメラーゼとを含む。Ｔｙｒ−ＤＮＡホスホジエステラーゼは、Ｉ型トポイソメラーゼとＤＮＡとの間に形成される行き止まり（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）共有結合中間体の加水分解によるＤＮＡ修復において機能する（Ｐｏｕｌｉｏｔ， Ｊ．Ｊ． ら． （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５５２−５５５、Ｙａｎｇ， Ｓ．−Ｗ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５３４−１１５３９）。
【００６３】
酸スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質を加水分解するホスホジエステラーゼである。ホスホリルコリンは、無数の細胞内シグナル伝達経路に関与するホスファチジルコリンの合成に用いられ、セラミドは、神経組織に高密度で見られる膜脂質であるガングリオシドの発生に不可欠な前駆体である。酸スフィンゴミエリナーゼの欠失によって、リソソームにスフィンゴミエリン分子が構築され、ニーマン‐ピック病の原因となる（Ｓｃｈａｃｌｕｎａｎ， Ｅ．Ｈ． ａｎｄ Ｓ．Ｒ． Ｍｉｒａｎｄａ （１９９７） Ｇｅｎｅｔ． Ｔｅｓｔ． １：１３−１９）。
【００６４】
グリセロホスフォリルジエステルホスホジエステラーゼ（グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼとしても知られている）は、脱アセチル化されたリン脂質、グリセロホスホジエステルを加水分解してｓｎ−グリセロール−３−リン酸及びアルコールを産出するホスホジエステラーゼである。グリセロホスホリルコリン、グリセロホスホリルエタノールアミン、グリセロホスホグリセロール及びグリセロホスホイノシトールは、グリセロホスフォリルジエステルホスホジエステラーゼのための基質の例である。大腸菌由来のグリセロホスフォリルジエステルホスホジエステラーゼは、グリセロホスホジエステル基質に対して広範な特異性を有する（Ｌａｒｓｏｎ， Ｔ．Ｊ． ら． （１９８３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４８：５４２８−５４３２）。
【００６５】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、サイクリックヌクレオチドｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの調節において重大な酵素である。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、ホルモン、光及び神経伝達物質を含む種々の細胞外シグナルを形質導入する細胞内第２メッセンジャーとして機能する。ＰＤＥはサイクリックヌクレオチドを対応する１リン酸に分解し、それによって、サイクリックヌクレオチドの細胞内密度及びそのシグナル伝達への効果を制御する。シグナル伝達の制御因子としての役割により、ＰＤＥは化学療法の標的として広範囲に研究されてきた（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１； Ｔｏｒｐｈｙ， Ｊ．Ｔ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：３５１−３７０）。
【００６６】
哺乳動物のＰＤＥのファミリーは、その基質及び親和性、コファクターに対する感受性及び阻害剤に対する感受性に基づき分類されてきた（Ｂｅａｖｏ， Ｊ．Ａ． （１９９５） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−７４８、Ｃｏｎｔｉ， Ｍ． ら． （１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）。これらのファミリーの幾つかは特徴的な遺伝子を含み、そのような遺伝子の多くはスプライスバリアントとして異なる組織に発現される。ＰＤＥファミリー内には、複数のアイソザイム及びアイソザイムの複数のスプライスバリアントがある（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｓ．− Ｌ．Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。複数のＰＤＥファミリー、アイソザイム及びスプライスバリアントの存在は、サイクリックヌクレオチドに関与する調節経路の多様性及び複雑性を示す（Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｇ． Ｍｉｌｌｉｇａｎ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２２：２１７−２２４）。
【００６７】
Ｉ型ＰＤＥ（ＰＤＥ１）は、Ｃａ＋＋／カルモジュリン依存性であり、各々が少なくとも２つの異なるスプライスバリアントを有するような少なくとも３つの異なる遺伝子によってコードされている外観を呈する（Ｋａｋｋａｒ， Ｒ． ら． （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５５：１１６４−１１８６）。ＰＤＥ１は、肺、心臓及び脳に見られる。リン酸化／脱リン酸化によってｉｎ ｖｉｔｒｏで調整されるＰＤＥ１アイソザイムもある。これらのＰＤＥ１アイソザイムのリン酸化は、カルモジュリンに対する酵素の親和性を低下させ、ＰＤＥ活性を低下させ、ｃＡＭＰの定常状態レベルを増加させる（前出のＫａｋｋａｒ）。ＰＤＥ１は、サイクリックヌクレオチド及びカルシウムシグナル伝達の両方におけるＰＤＥ１の関与に起因する中枢神経系、心血管性及び免疫系の疾患に対する有益な治療標的を提供し得る（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｉｇｇｓ（１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００６８】
ＰＤＥ２は、小脳、新皮質、心臓、腎臓、肺、肺動脈及び骨格筋に見られるｃＧＭＰ誘導ＰＤＥである（Ｓａｄｈｕ， Ｋ． ら． （１９９９） Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４７：８９５−９０６）。ＰＤＥ２は、カテコールアミン分泌へのｃＡＭＰの効果を媒介し、アルドステロンの調節に関与し（前出のＢｅａｖｏ）、嗅覚シグナル伝達の役割を果たす（Ｊｕｉｌｆｓ， Ｄ．Ｍ． ら， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３３８８−３３９５）と考えられている。
【００６９】
ＰＤＥ３は、ｃＧＭＰとｃＡＭＰの両方に高い親和性を有するので、これらのサイクリックヌクレオチドはＰＤＥ３に対する競合的基質として作用する。ＰＤＥ３は、心筋収縮性を刺激し、血小板凝集を阻害し、血管及び気道平滑筋を弛緩し、Ｔ−リンパ球及び培養血管性平滑筋細胞の増殖を阻害し、脂肪組織からの遊離脂肪酸のカテコールアミン誘導放出を調整するのに役割を果たす。ホスホジエステラーゼのＰＤＥ３ファミリーは、シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、エノキシモン（ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ）及びリクサジノン（ｌｉｘａｚｉｎｏｎｅ）等の特異的阻害剤に敏感である。ＰＤＥ３のアイソザイムは、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼまたはインシュリン依存性キナーゼによって調節することができる（Ｄｅｇｅｒｍａｎ， Ｅ． ら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６８２３−６８２６）。
【００７０】
ＰＤＥ４は、ｃＡＭＰに特異的であり、気道平滑筋、血管性内皮及び全ての炎症性細胞に局在し、ｃＡＭＰ依存性リン酸化によって活性化され得る。ｃＡＭＰレベルの上昇は、炎症性細胞活性化の抑制及び気管支平滑筋の弛緩を導くことができるので、ＰＤＥ４については、喘息治療の発見に特に重きを置いた新規な抗炎症剤の可能な標的として広範囲に研究されてきた。ＰＤＥ４阻害剤については、喘息、慢性閉塞性肺疾患及びアトピー性湿疹のための治療として目下臨床試験が進められている。ＰＤＥ４の既知のアイソザイムは４つ全て、阻害剤ロリプラムに感受性が高いが、ロリプラムはマウスの行動記憶を向上させることが示されてきた化合物である（Ｂａｒａｄ， Ｍ． ら． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５０２０−１５０２５）。ＰＤＥ４阻害剤はまた、急性肺損傷、内毒血症、リウマチ様関節炎、多発性硬化症並びに種々の神経性及び胃腸の適応症に対する可能な治療剤としても研究されてきた（Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ａ．Ｍ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：４６６−４７３）。
【００７１】
ＰＤＥ５は、基質としてｃＧＭＰに対して高度に選択的であり（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ．Ｙ． ら． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ ３７：４２００−４２０５）、２つのアロステリックｃＧＭＰ特異結合部位を有する（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ， Ｌ．Ｍ． ら． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０６７１−３０６７９）。ｃＧＭＴのアロステリック結合部位への結合は、触媒活性の直接制御に対してよりもむしろｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼによるＰＤＥ５のリン酸化に対して重要であるように思われる。高レベルのＰＤＥ５は、血管性平滑筋、血小板、肺及び腎臓に見られる。阻害剤ザプリナストは、ＰＤＥ５及びＰＤＥ１に効果的である。ＰＤＥ５に対する特異性を提供するザプリナストの変調によって、男性の勃起不全治療のためのシルデナフィル（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， ＮｅｗＹｏｒｋ ＮＹ）が作られる（Ｔｅｒｒｅｔｔ， Ｎ． ら． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ６：１８１９−１８２４）。ＰＤＥ５の阻害剤は、心血管治療のための薬剤として目下研究されている（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００７２】
光受容体サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼであるＰＤＥ６は、光伝達カスケードの重大な成分である。Ｇタンパク質トランスデューシンに関連して、ＰＤＥ６はｃＧＭＰを加水分解して光受容体膜のｃＧＭＰ作動型カチオンチャネルを制御する。ｃＧＭＰ結合活性部位に加えて、ＰＤＥ６は、ＰＤＥ６官能基において調節的な役割を果たすと考えられている２つの高親和性ｃＧＭＰ結合部位も有する（Ａｒｔｅｍｙｅｖ， Ｎ．Ｏ． ら （１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９３−１０４）。ＰＤＥ６の欠失は、網膜の疾患に関連してきた。ｒｄマウスの網膜変質（Ｙａｎ， Ｗ． ら （１９９８） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３９：２５２９−２５３６）、ヒトの常染色体劣性色素性網膜炎（Ｄａｎｃｉｇｅｒ， Ｍ． ら． （１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１−７）、アイリッシュセッター犬の桿体／錐状体異形成１（Ｓｕｂｅｒ， Ｍ．Ｌ． ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３９６８−３９７２）は、ＰＤＥ６Ｂ遺伝子の突然変異に起因してきた。
【００７３】
ＰＤＥのＰＤＥ７ファミリーは、複数のスプライスバリアントを有する唯一の既知のメンバーから構成される（Ｂｌｏｏｍ， Ｔ．Ｊ． ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｂｅａｖｏ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１４１８８−１４１９２）。ＰＤＥ７は、ｃＡＭＰ特異的であるが、その生理学的機能については他に殆ど知られていない。ＰＤＥ７をコードするｍＲＮＡは骨格筋、心臓、脳、肺、腎臓及び膵臓に見られるが、ＰＤＥ７タンパク質の発現は、特異的組織タイプに限定されている（Ｈａｎ， Ｐ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６１５２−１６１５７、Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８ｌ）。ＰＤＥ７は、ＰＤＥ４ファミリーに非常に密接に関係しているが、ＰＤＥ７はＰＤＥ４の特異的阻害剤であるロリプラムによって阻害されない（前出のＢｅａｖｏ）。
【００７４】
ＰＤＥ８は、ｃＡＭＰ特異的であり、ＰＤＥ４ファミリーに密接に関連している。ＰＤＥ８は、甲状腺、精巣、眼、肝臓、骨格筋、心臓、腎臓、卵巣及び脳に発現される。ＰＤＥ８のＣＡＭＰ加水分解活性は、ＰＤＥ阻害剤ロリプラム、ビンポセチン、ミルリノンまたはＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）またはザプリナストによって阻害されないが、ＰＤＥ８はジピリダモールによって阻害される（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．Ａ． ら （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５７０−５７７、Ｈａｙａｓｈｉ， Ｍ． ら． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−７５６、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ．Ｈ． ら （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５：８９９１−８９９６）。
【００７５】
ＰＤＥ９は、ｃＧＭＰ特異的であり、ＰＤＥのＰＤＥ８ファミリーに最もよく似ている。ＰＤＥ９は、腎臓、肝臓、肺、脳、脾臓及び小腸に発現される。ＰＤＥ９は、シルデナフィル（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、ロリプラム、ビンポセチン、ジピリダモールまたはＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）によって阻害されないが、ＰＤＥ５阻害剤ザプリナストに敏感である（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．Ａ． ら． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−１５５６４、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ．Ｈ． ら． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−１５５５８）。
【００７６】
ＰＤＥ１０は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解する二重基質ＰＤＥである。ＰＤＥ１０は、脳、甲状腺及び精巣に発現される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ．Ｈ． ら （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６、Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ， Ｋ． ら （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５、Ｌｏｕｇｈｎｅｙ， Ｋ． ら （１９９９） Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７）。
【００７７】
ＰＤＥは、約２７０〜３００アミノ酸の触媒ドメインと、結合コファクターに責任があるＮ末端調節ドメインと、場合によっては、未知の官能基の親水性Ｃ末端ドメインから構成される（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｓ．−Ｌ．Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。保存された推定上の亜鉛結合モチーフＨＤＸＸＨＸＧＸＸＮは、全てのＰＤＥの触媒ドメインにおいて同定されてきた。Ｎ末端調節ドメインには、ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、ＰＤＥ６の非触媒ｃＧＭＰ結合ドメイン、ＰＤＥ１のカルモジュリン結合ドメイン、ＰＤＥ３及びＰＤＥ４のリン酸化部位を含むドメインがある。ＰＤＥ５では、Ｎ末端ｃＧＭＰ結合ドメインは約３８０アミノ酸残基に及び、保存された配列モチーフのタンデムリピートＮ（Ｒ／Ｋ）ＸｎＦＸ３ＤＥを含む（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ， Ｌ．Ｍ． ら （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２２８６３−２２８７３）。ＮＫＸｎＤモチーフは、変異誘発性によってｃＧＭＰ結合に重要であることが示されてきた（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ．Ｖ． ら． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２２４０−２２２４４）。ＰＤＥファミリーは、触媒ドメインと約３０％のアミノ酸同一性を示すが、同一ファミリー内のアイソザイムは通常、この領域（ＰＤＥ４ＡｖｓＰＤＥ４Ｂ等）において約８５〜９５％の同一性を示す。更に、或るファミリー内では、触媒ドメイン以外にかなりの類似性（＞６０％）があるが、ファミリー全体では、このドメイン以外に配列類似性は殆どまたは全くない。
【００７８】
免疫及び炎症反応の構成機能の多くは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させるような薬剤によって阻害される（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ， Ｍ．Ｗ． ら． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４７．１１６４−１１７１）。種々の疾患は、ＰＤＥ活性の増加及びサイクリックヌクレオチドのレベルの減少に関連してきた。例えば、マウスの尿崩症の或る形態は、ＰＤＥ４活性の増加に関連してきた。ｌｏｗ−Ｋｍ ｃＡＭＰ ＰＤＥ活性の増加は、アトピー患者の白血球に報告されてきた。ＰＤＥ３は心臓病に関連してきた。
【００７９】
ＰＤＥの多くの阻害剤が同定され、臨床評価を受けてきた（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ．Ｊ． ａｎｄ Ｇ．Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１、Ｔｏｒｐｈｙ， Ｔ．Ｊ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ， １５７：３５１−３７０）。ＰＤＥ３阻害剤は、うっ血性心不全の治療に有用である強心剤、抗血栓剤及び降圧剤として開発されてきた。ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラムは、うつ病の治療に用いられてきた。ＰＤＥ４のその他の阻害剤は、抗炎症剤として評価を受けている。ロリプラムはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１複製を強化することが示されてきたリポ多糖（ＬＰＳ）誘導ＴＮＦ−ａを阻害することが示されてきた。よって、ロリプラムは、ＨＩＶ−１の複製を阻害し得る（Ａｎｇｅｌ， Ｊ．Ｂ． ら （１９９５） ＡＩＤＳ ９：１１３７−１１４４）。更に、ロリプラムは、ＴＮＦ−ａ、ｂ及びインターフェロンｇ等のサイトカインの産出を抑制する能力に基づき、脳脊髄炎の治療に効果的であることが示されてきた。ロリプラムはまた、遅発性ジスキネジアの治療にも効果的であり、実験動物モデルの多発性硬化症の治療に効果的であった（Ｓｏｍｍｅｒ， Ｎ． ら． （１９９５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２４４−２４８、Ｓａｓａｋｉ， Ｈ． ら． （１９９５） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８２：７１−７６）。
【００８０】
テオフィリンは、気管支喘息及びその他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的ＰＤＥ阻害剤である。テオフィリンは、気道平滑筋機能に作用し、呼吸器疾患の治療の抗炎症または免疫調節能力において作用すると信じられている（Ｂａｎｎｅｒ， Ｋ．Ｈ． ａｎｄ Ｃ．Ｐ． Ｐａｇｅ （１９９５） Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ８：９９６−１０００）。ペントキシフィリンは、間欠性跛行及び糖尿病誘導末梢血管疾患の治療に用いられる別の非特異的ＰＤＥ阻害剤である。ペントキシフィリンはまた、ＴＮＦ−ａ産出を遮断し、ＨＩＶ−１複製を阻害し得ることが知られている（前出のＡｎｇｅｌら）。
【００８１】
ＰＤＥは、種々の細胞タイプの細胞増殖に影響し（Ｃｏｎｔｉ ら （１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）、種々の癌に関連することが報告されてきた。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰの成長は、ｃＡＭＰ誘導体及びＰＤＥ阻害剤の運搬に阻害された（Ｂａｎｇ， Ｙ．Ｊ． ら， （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５３３０−５３３４）。これらの細胞はまた、上皮形態から神経形態への表現型の恒久的な転換を示した。ＰＤＥ阻害剤が、メサンギウム細胞増殖（Ｍａｔｏｕｓｏｖｉｃ， Ｋ． ら． （１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：４０１−４１０）及びリンパ球増殖（Ｊｏｕｌａｉｎ， Ｃ． ら． （１９９５） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ． １１：６３−７９）を調整する可能性を有することも示唆されてきた。癌治療は、腫瘍の特定の細胞室へのＰＤＥの細胞内輸送に関与し、細胞死を招くことが述べられてきた（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ， Ｍ．Ｐ． ａｎｄ Ａ．Ａ． Ｅｐｅｎｅｔｏｓ （１９９４） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０：７８ ６−７９４）。
【００８２】
ホスホトリエステラーゼ
ホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ， パラオキソナーゼ（ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ））は、毒性有機リン化合物を加水分解する酵素であり、種々の組織から単離されてきた。酵素は、鳥及び昆虫で不足し、哺乳動物で豊富にあるような外観を呈し、鳥及び昆虫の有機リン化合物への耐性の低下を表している（Ｖｉｌａｎｏｖａ， Ｅ． ａｎｄ Ｓｏｇｏｒｂ， Ｍ．Ａ． （１９９９） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２９：２１−５７）。ホスホトリエステラーゼは、哺乳動物による殺虫剤の解毒において中心的な役割を果たす。ホスホトリエステラーゼ活性は、個体により異なり、成体よりも幼児の方が低い。ノックアウトマウスは、有機燐酸エステルベースの毒即ちジアゾキソン（ｄｉａｚｏｘｏｎ）及びクロルピリホスオキソンに感受性が顕著により高い（Ｆｕｒｌｏｎｇ， Ｃ．Ｅ．， ら （２０００） Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２１：９１−１００）。ＰＴＥは、殺虫薬及び殺虫剤に加えて、有機燐酸エステル含有化学廃棄物及び化学兵器（パラチオン等）の解毒が可能な酵素として興味を引いている。アテローム性動脈硬化症及びリポタンパク質代謝に関与する疾患におけるホスホトリエステラーゼに関係する研究もある。
【００８３】
チオエステラーゼ
脂肪酸生合成に関与する２つの可溶性チオエステラーゼが哺乳動物の組織から単離されているが、一方は長鎖脂肪酸アシルチオエステルに対してのみ活性であり、他方は広範囲の脂肪酸アシル鎖長を有するチオエステルに対してのみ活性である。これらのチオエステラーゼは、脂肪酸の新規生合成における鎖終結ステップを触媒する。鎖終結は、脂肪酸アシル鎖を脂肪酸シンターゼのアシル輸送タンパク質（ＡＣＰ）サブユニットの４’−ホスホパンテテイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）補欠分子族へ結合させるチオエステル結合の加水分解に関与する（Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ａ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８１−１８８、Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ｂ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８８−２００）。
【００８４】
大腸菌は２つの可溶性チオエステラーゼを含み、１つは長鎖アシルチオエステルにのみ活性であるチオエステラーゼＩ、もう１つは広範な鎖長特異性を有するチオエステラーゼＩＩ（ＴＥＩＩ）である（Ｎａｇｇｅｒｔ， Ｊ． ら （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１１０４４−１１０５０）。大腸菌ＴＥＩＩは、新規脂肪酸生合成において鎖終結酵素として機能する２種類の哺乳動物チオエステラーゼの何れとも配列類似性を示さない。哺乳動物のチオエステラーゼとは異なり、大腸菌ＴＥＩＩは、特徴的なセリン活性部位ｇｌｙ−Ｘ−ｓｅｒ−Ｘ−ｇｌｙ配列モチーフが欠失し、セリン改質剤ジイソプロピルフルオロリン酸によって不活性化されない。しかしながら、ヨードアセトアミド及びジエチルピロカルボネートによるヒスチジン５８の改変は、ＴＥＩＩ活性を消滅させた。ＴＥＩＩの過剰発現は、大腸菌において脂肪酸の含有量を変化させ、このことは脂肪酸生合成において鎖終結酵素として機能しないことを示唆する（前出のＮａｇｇｅｒｔ ら）。そのため、Ｎａｇｇｅｒｔら（前出）は、大腸菌ＴＥＩＩのための生理的基質をＡＣＰ−ホスホパンテテイン−脂肪酸エステルに代えてコエンザイムＡ（ＣｏＡ）−脂肪酸エステルとし得ることを提案した。
【００８５】
カルボキシエステラーゼ
哺乳動物のカルボキシエステラーゼは、種々の組織及び細胞タイプに発現される多重遺伝子ファミリーからなる。アイソザイムは、かなりの配列類似性を有し、主としてアミノ酸配列に基づいて分類され、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ及びカルボキシエステラーゼは、エステラーゼのセリンスーパーファミリー（Ｂ−エステラーゼ）に区分される。その他のカルボキシエステラーゼには、チログロブリン、トロンビン、因子ＩＸ、グリオタクチン（ｇｌｉｏｔａｃｔｉｎ）及びプラスミノゲンがある。カルボキシエステラーゼは、分子からのエステル基及びアミド基の加水分解を触媒し、薬物、環境毒素及び発癌物質の解毒に関与する。カルボキシエステラーゼのための基質には、短鎖及び長鎖アシル−グリセロール、アシルカルニチン、炭酸エステル、塩酸ジピベフリン、コカイン、サリチル酸塩、カプサイシン、パルミトイル−コエンザイムＡ、イミダプリル、ハロペリドール、ピロリジジンアルカロイド、ステロイド、ｐ−ニトロフェニル酢酸、マラチオン、ブタニリカイン（ｂｕｔａｎｉｌｉｃａｉｎｅ）及びイソカルボキサジド（ｉｓｏｃａｒｂｏｘａｚｉｄｅ）がある。酵素はしばしば、低基質特性を立証する。カルボキシエステラーゼは、各遊離酸へのプロドラッグの転換にも重要であり、各遊離酸は薬物（血液コレステロールを低下させるために用いられるロバスタチン等）の活性型であり得る（Ｓａｔｏｈ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｓｏｋａｗａ， Ｍ． （１９９８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：２５７−２８８にレビューされている）。
【００８６】
ニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）は、（ｉ）Ｎ末端シグナル配列を有し、（ｉｉ）細胞表面受容体に類似し、（ｉｉｉ）カルボキシエステラーゼドメインを含み、（ｉｖ）脳に高度に発現され、（ｖ）カルシウム依存性様式でニューレキシンに結合する一類の分子である。カルボキシエステラーゼに類似しているが、ニューロリギンは活性部位セリン残基が欠失し、触媒作用よりも基質結合における役割を含む（Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ， Ｋ． ら． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６−２６８２）。
【００８７】
スクアレンエポキシダーゼ
スクアレンエポキシダーゼ（スクアレンモノオキシゲナーゼ， ＳＥ）は、真核生物細胞のステロール生合成経路における第１酸素付加ステップを触媒するミクロソームの膜結合ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼである。コレステロールは、ＬＤＬ受容体媒介経路または生合成経路を経由して得られる細胞質膜の不可欠な構造成分である。後者の場合、コレステロール分子中の２７の炭素原子全てがアセチル−ＣｏＡに由来する（前出のＳｔｒｙｅｒ）。ＳＥはスクアレンを２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンに変換し、２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンはラノステロールに変換され、次いでコレステロール変換される。コレステロール生合成に関するステップについての概略を以下に示す（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐｐ． ５５４−５６０ ａｎｄ Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ． ら． （１９９５） ２７０：１７−２０）：アセターテ（アセチル−ＣｏＡから）→３−ヒドロキシメチル−グルタリルＣｏＡ→メバロン酸塩→５−ホスホメバロン酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）→５−ピロホスホメバロン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）→イソペンテニルピロリン酸→ジメチルアリルピロリン酸→ゲラニル二リン酸→ファルネシルピロリン酸→スクアレン→スクアレンエポキシド→ラノステロール→コレステロール。
【００８８】
コレステロールが真核生物細胞の生存力に不可欠である一方で、過度に高い血清コレステロールレベルは、より高度の生物体の動脈にアテローム斑を形成することになる。高度に不溶性の脂質が不可欠な血管（冠状動脈等）の壁に付着すると、血液の流れが悪くなり、組織の潜在的壊死が好適な血流を奪うことになる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、コレステロール生合成の第１の関係付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ステップを表すメバロン酸塩への３−ヒドロキシル３−メチル−グルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）の転換に責任がある。ＨＭＧ−ＣｏＡは、血漿コレステロールレベルを低下させるようにデザインされた多数の医薬化合物の標的である。しかしながら、ＭＨＧ−ＣｏＡの阻害はまた、その他の生化学経路に必要な非ステロール中間体（メバロン酸塩等）の合成を減少させ得る。ＳＥは、ステロール合成経路に後で発生し、ＳＥによって触媒されるステップに続く経路の最終産物のみにおいてコレステロールを生じさせる律速反応を触媒する。結果的に、ＳＥは、その他の必要な中間体を減少させない抗高脂血症剤のデザインのための理想的な標的である（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ． ら （１９９６） ２７１：８０５３−８０５６）。
【００８９】
エポキシドヒドロラーゼ
エポキシドヒドロラーゼは、エポキシド含有化合物への水の添加を触媒し、それによってエポキシドを対応する１，２−ジオールに加水分解する。これらは、細菌性ハロアルカンデハロゲナーゼに関連し、酵素のα／βヒドロラーゼフォールド（ｆｏｌｄ）ファミリーのその他のメンバー（ストレプトマイセス−オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のブロモペルオキシダーゼＡ２、シュードモナス‐プチダ由来のヒドロキシムコン（ｈｙｄｒｏｘｙ ｍｕｃｏｎｉｃ）セミアルデヒドヒドロラーゼ、水素細菌（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のハロアルカンデハロゲナーゼ等）との配列類似性を示す。エポキシドヒドロラーゼは、天然に遍在し、哺乳動物、脊椎動物、植物、菌類及び細菌内に見られる。このファミリーの酵素は、生物体に導入される際にしばしば高度に求電子性及び破壊性であるような生体異物エポキシド化合物の解毒に重要である。エポキシドヒドロラーゼ反応の例には、対応するジオール， トレオ−９，１０−ジヒドロキシオクタデカ−１２（Ｚ）−エノン酸（ロイコトキシンジオール）を形成するためのｃｉｓ−９，１０−エポキシオクタデカ−９（Ｚ）−エノン酸（ロイコトキシン）の加水分解や、対応するジオールトレオ−１２，１３−ジヒドロキシオクタデカ−９（Ｚ）−エノン酸（イソロイコトキシンジオール）を形成するためのｃｉｓ−１２，１３−エポキシオクタデカ−９（Ｚ）−エノン酸（イソロイコトキシン）の加水分解がある。ロイコトキシンは、膜透過性及びイオン輸送を変化させ、炎症反応を生じさせる。更に、エポキシド発癌物質は、薬物及び環境毒物の解毒における中間体としてチトクロムＰ４５０により産出されることが知られている。
【００９０】
酵素は、Ａｓｐ（求核試薬）、Ａｓｐ（ヒスチジンを補助する酸）及びＨｉｓ（水を活性化するヒスチジン）からなる触媒三連構造を有する。エポキシドヒドロラーゼの反応メカニズムは、共有結合エステル中間体を導くような標的分子のエポキシド環の第１級炭素原子におけるＡｓｐ残基の１つの求核攻撃によって惹起される共有結合エステル中間体を介して進行する（Ｍｉｃｈａｅｌ Ａｒａｎｄ， Ｍ． ら． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：４２２３−４２２９、Ｒｉｎｋ， Ｒ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７、Ａｒｇｉｒｉａｄｉ， Ｍ．Ａ． ら． （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５．１５２６５−１５２７０）。
【００９１】
チロシン触媒作用に関与する酵素
アミノ酸チロシンをコハク酸塩及びピルビン酸塩またはフマル酸塩及びアセト酢酸塩のいずれかに分解するには、多くの酵素が必要であり、多くの中間体化合物が生成される。更に、多くの生体異物化合物は、チロシン異化経路の一部である１若しくは数個の反応を用いて代謝され得る。経路が主として細菌において研究されてきた一方で、チロシン分解は種々の生物体で起こることが知られており、同じ生物反応の多くに関与している可能性がある。
【００９２】
酵素は、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸３−ヒドロキシラーゼ、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸２，３−ジオキシゲナーゼ、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコンセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ−５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコナーテ（ｈｙｄｒｏｘｙ ｍｕｃｏｎａｔｅ）イソメラーゼ、ホモプロトカテチュアーテ（ｈｏｍｏｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ）イソメラーゼ／デカルボキシラーゼ、ｃｉｓ−２−３−オキソヘプテン（ｃｉｓ−２−ｏｘｏｈｅｐｔ−３−ｅｎｅ）−１，７−ジオアートヒドラターゼ（ｄｉｏａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ）、２，４−ｔｒａｎｓ−２−ジヒドロキシヘプテン（２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔ−ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｅ）−１，７−ジオアートアルドラーゼ（ｄｉｏａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）及びコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むコハク酸塩及びピルビン酸塩（アルスロバクター種等における）へのチロシンの分解に関与している。
【００９３】
フマル酸エステル及びアセト酢酸エステル（シュードモナス種等における）へのチロシンの分解に関与する酵素には、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチシン酸１，２−ジオキシゲナーゼ、マレイルアセト酢酸イソメラーゼ及びフマリルアセトアセターゼが含まれる。コハク酸／ピルビン酸経路からの中間体が受け入れられるのであれば、４−ヒドロキシフェニル酢酸１−ヒドロキシラーゼを含めてもよい。
【００９４】
異なる生物体におけるチロシン代謝に関連する追加酵素には、４−クロロフェニル酢酸−３，４−ジオキシゲナーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、５−３−オキソペンテン（５−ｏｘｏｐｅｎｔ−３−ｅｎｅ）−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ、２−３−オキソヘプテン−１，７−ジオアートヒドラターゼ及び５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコナーテイソメラーゼがある（Ｅｌｌｉｓ， Ｌ．Ｂ．Ｍ． ら． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７．３７３−３７６、Ｗａｃｋｅｔｔ， Ｌ．Ｐ． ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ， Ｌ．Ｂ．Ｍ． （１９９６） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２５：９１−９３、及びＳｃｈｍｉｄｔ， Ｍ． （１９９６） Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｎｅｗｓ ６２：１０２）。
【００９５】
ヒトにおいて、チロシン分解経路の酵素の後天性または遺伝性の遺伝的欠陥は、遺伝性チロシン血症の原因となり得る。この疾患の一形態である遺伝性チロシン血症１（ＨＴ１）は、チロシンをフマル酸エステル及びアセト酢酸エステルに代謝する生物体の経路における最後の酵素である酵素フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼの欠乏により生じる。ＨＴ１は、乳児期に開始する進行性肝障害及び肝臓癌の危険性の増加によって特徴付けられる（Ｅｎｄｏ， Ｆ． ら． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２４４２６−２４４３２）。
【００９６】
新規の薬物代謝酵素およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖異常、発達障害、内分泌障害、眼病、代謝障害及び肝臓障害を含む胃腸疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、薬物代謝酵素の核酸及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響についての評価にも有用である。
【００９７】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＤＭＥ」、個別にはそれぞれ「ＤＭＥ−１」、「ＤＭＥ−２」、「ＤＭＥ−３」、「ＤＭＥ−４」、「ＤＭＥ−５」、「ＤＭＥ−６」、「ＤＭＥ−７」、「ＤＭＥ−８」、「ＤＭＥ−９」、「ＤＭＥ−１０」、「ＤＭＥ−１１」、「ＤＭＥ−１２」、「ＤＭＥ−１３」、「ＤＭＥ−１４」、「ＤＭＥ−１５」、「ＤＭＥ−１６」、「ＤＭＥ−１７」及び「ＤＭＥ−１８」と呼ばれる精製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択された単離されたポリペプチドを提供する。別法では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００９８】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたポリペプチドをコードする。更に別の方法では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択される。
【００９９】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。更に別の方法では、本発明は、組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を提供する。
【０１００】
また、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドの産出方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドの発現に好適な条件下で、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、（ｂ）このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。
【０１０１】
更に、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【０１０２】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｃ）前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）前記（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｅ）前記（ａ）‐（ｄ）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１０３】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｃ）前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）前記（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｅ）前記（ａ）‐（ｄ）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択されたポリヌクレオチド配列を有するサンプルにおける標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）前記サンプル内の標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を含む少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片とでハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該ステップと、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在するか否かを検出し、存在する場合には必要に応じてその収量を測定するステップとを含む。別法では、前記プローブは、少なくとも６０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１０４】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（ｃ）前記（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｄ）前記（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（ｅ）前記（ａ）‐（ｄ）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択されたポリヌクレオチド配列を有するサンプルにおける標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅法を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、（ｂ）増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には必要に応じてその収量を測定するステップとを含む。
【０１０５】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択された有効量のポリペプチド及び好適な医薬用賦形剤を含む組成物を提供する。一実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。本発明は更に、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的ＤＭＥの発現低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０６】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドのアゴニストとして化合物を有効性についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）このサンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更に別の方法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＤＭＥの発現低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０７】
更に、本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとして化合物を有効性についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）このサンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＤＭＥの過剰発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０８】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、（ａ）このポリペプチドを好適な条件下で少なくとも１つの試験化合物と結合させるステップと、（ｂ）このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、このポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含む。
【０１０９】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される群から選択されたポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、（ａ）このポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも１つの化合物と結合させるステップと、（ｂ）この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性を評価するステップと、（ｃ）この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性と、この試験化合物の非存在下でのこのポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性の変化が、このポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆する。
【０１１０】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させる際の有効性について化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【０１１１】
本発明はさらに、試験化合物の毒性を評価する方法を提供する。この方法は、（ａ）核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処理するステップと、（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸をプローブとハイブリダイズするステップと、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を測定するステップと、（ｄ）前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、非処理の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量とを比較するステップとを含み、前記処理した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差異が試験化合物の毒性を示唆する。この方法における前記プローブが、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（３）前記（１）に相補的な配列を有するポリヌクレオチドと、（４）前記（２）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（５）前記（１）‐（４）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択されたポリヌクレオチドの少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む。また、前記ハイブリダイゼーションは、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行わる。また、前記標的ポリヌクレオチドが、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、（３）前記（１）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（４）前記（２）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドと、（５）前記（１）‐（４）のＲＮＡ等価物とで構成される群から選択される。別法では、標的ポリヌクレオチドは、その標的ポリヌクレオチドの断片である。
【０１１２】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【０１１３】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には公知の等価物なども含まれる。
【０１１４】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【０１１５】
（定義）
用語「ＤＭＥ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＤＭＥのアミノ酸配列を指す。
【０１１６】
用語「アゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＤＭＥに直接相互作用するか、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＤＭＥの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１１７】
用語「アレル変異配列」は、ＤＭＥをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。ある遺伝子は、天然型のアレル変異配列が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で１回或いはそれ以上生じる。
【０１１８】
ＤＭＥをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＤＭＥと同じポリペプチド或いはＤＭＥの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＤＭＥと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＤＭＥの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれ得る。
【０１１９】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１２０】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は、この技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって行われる。
【０１２１】
用語「アンタゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＤＭＥに直接相互作用するか、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＤＭＥの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１２２】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２、及びそれらの断片、Ｆｖ断片などの無傷の分子を指す。ＤＭＥポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて作製可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から、或いは化学的に合成可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【０１２３】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の特定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１２４】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、ＤＮＡと、ＲＮＡと、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート、ベンジルホスホネート（ｂｅｎｚｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）などの修飾された骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を有するオリゴヌクレオチドと、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などの修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドと、５−メチルシトシンまたは２’−デオキシウラシル、７−デアザ−２’−デオキシグアノシンなどの修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の核酸配列と塩基対となって二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。
【０１２５】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＤＭＥ、合成のＤＭＥまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１２６】
用語「相補的」は、塩基対によってアニーリングする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「５’ＡＧＴ３’」が相補的な配列「３’ＴＣＡ５’」と対をなす。
【０１２７】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。ＤＭＥ若しくはＤＭＥの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液に展開され得る。
【０１２８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。
【０１２９】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
元の残基　　　　　　　保存的な置換
Ａｌａ　　　　　　　　　Ｇｌｙ， Ｓｅｔ
Ａｒｇ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｌｙｓ
Ａｓｎ　　　　　　　　　Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ａｓｐ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ｇｌｕ
Ｃｙｓ　　　　　　　　　Ａｌａ， Ｓｅｒ
Ｇｌｎ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ
Ｇｌｕ　　　　　　　　　Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ｇｌｙ　　　　　　　　　Ａｌａ
Ｈｉｓ　　　　　　　　　Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｉｌｅ　　　　　　　　　Ｌｅｕ， Ｖａｌ
Ｌｅｕ　　　　　　　　　Ｉｌｅ， Ｖａｌ
Ｌｙｓ　　　　　　　　　Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｍｅｔ　　　　　　　　　Ｌｅｕ， Ｉｌｅ
Ｐｈｅ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｍｅｔ， Ｌｅｕ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ
Ｓｅｒ　　　　　　　　　Ｃｙｓ， Ｔｈｒ
Ｔｈｒ　　　　　　　　　Ｓｅｒ， Ｖａｌ
Ｔｒｐ　　　　　　　　　Ｐｈｅ， Ｔｙｒ
Ｔｙｒ　　　　　　　　　Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ
Ｖａｌ　　　　　　　　　Ｉｌｅ． Ｌｅｕ， Ｔｈｒ
一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、ａ）置換された領域のポリペプチドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、ｂ）置換された部位の分子の電荷または疎水性、及び／または、ｃ）側鎖の大半が維持される。
【０１３０】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１３１】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも１つを維持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドのことである。
【０１３２】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１３３】
「異なる発現」とは、少なくとも２つの異なったサンプルの比較により決められる遺伝子またはタンパク質の発現の上昇即ちアップレギュレーションや、減少即ちダウンレギュレーション、または発現しないことを指す。このような比較は、例えば、処置したサンプルと未処置のサンプルとの間、または病変サンプルと正常なサンプルとの間で行う。
【０１３４】
用語「断片」は、ＤＭＥまたはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、５〜１０００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の２５０若しくは５００のアミノ酸（或いは、ポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【０１３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【０１３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【０１３７】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１３８】
「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えることができる。
【０１３９】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比較を行うことができる。
【０１４０】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 及び Ｐ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１４１】
別法では、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）が提供する、広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム一式が、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を含む幾つかのソース及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（後述）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメータと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【０１４２】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１４３】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【０１４４】
ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」または「％の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）が保存される。
【０１４５】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ バージョン３．１２ｅ配列アラインメントプログラム（上述）に組込まれるＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いる対方式のポリぺプチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、及び「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【０１４６】
別法では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用し得る。そのようなデフォルトパラメータは、例えば以下のようにし得る。
【０１４７】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペプチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも１５、２０または３０、４０、５０、７０、１５０の残基の断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【０１４８】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【０１４９】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１５０】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ちストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のストリンジェンシーにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【０１５１】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低く選択される。このＴｍは、（所定のイオン強度とｐＨの下）標的の配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は、公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他による， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版の１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ； 特に２巻の９章に記載されている。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約１％のＳＤＳの存在下で、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、４２℃の温度で行う。ＳＳＣの濃度は、約０．１％のＳＤＳの存在下で、約０．１〜２ｘ ＳＳＣの範囲である。通常は、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング試薬には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの切断され変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には公知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【０１５３】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基質）に固定されたもう１つの核酸配列とで形成され得る。
【０１５４】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１５５】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴をもつ。
【０１５６】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で公知のあらゆる抗体生産方法に有用なＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１５７】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１５８】
用語「エレメント」及び「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１５９】
用語「調節」は、ＤＭＥの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＤＭＥのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１６０】
用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、任意のＤＮＡ様物質、及びＲＮＡ様物質である。
【０１６１】
「機能的に結合した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、機能的に結合したＤＮＡ配列は、同じ読み枠内で２つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【０１６２】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組成物が溶解性となる。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る。
【０１６３】
ＤＭＥの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＤＭＥの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【０１６４】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＤＭＥやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレオチドにアニーリングした後、あるＤＮＡポリメラーゼ酵素によって、標的のＤＮＡ一本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、ＰＣＲ法における核酸配列の増幅（及び同定）に用いることができる。
【０１６５】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも２０または２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【０１６６】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．他による、１９８９年発行の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版の１−３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）、またはＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他による、１９８７年発行の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、並びに Ｉｎｎｉｓ他による、１９９０年発行の「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ．）を参照されたい。ＰＣＲ用のプライマーの組は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ） などそのような目的のためのコンピュータプログラムを用いて、ある既知の配列から誘導することができる。
【０１６７】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で公知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、それぞれが最大１００ヌクレオチドまでのＰＣＲ用のプライマーの対の選択、及び３２，０００塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大５，０００ヌクレオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈ Ｗｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ ＴＸより入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｓｃｏｐｅ）におけるプライマーの設計に有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡより入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「ミスプライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。また、Ｐｒｉｍｅｒ３は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後者２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することもできる）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（ＵＫ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例えば、ＰＣＲ法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレメント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に限定されるものではない。
【０１６８】
「組換え核酸」は天然のものではない配列であり、２以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工的組合せは、化学合成によって作られる場合も多いが、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ に記載されたような遺伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【０１６９】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニアウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【０１７０】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはＲＮＡの安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１７１】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分が含まれる。
【０１７２】
ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１７３】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＤＭＥ、ＤＭＥをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基質に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１７４】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１７５】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１７６】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１７７】
用語「基質」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基質には、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこにポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１７８】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１７９】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当分野で公知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こり、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の公知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージまたはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１８０】
本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で公知の遺伝子組換え技術などを用いて、人間が生物の１つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的な交雑育種やｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精ではなく、組換えＤＮＡ分子を導入することである。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物が含まれる。本発明の単離されたＤＮＡは、当分野で公知の、例えば、感染、形質移入、形質転換、トランス接合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などの方法によって、宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをそのような生物に導入する技術は公知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。
【０１８１】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「一塩基多型」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。
【０１８２】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）を用いるｂｌａｓｔｐによって、あるポリペプチド配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも５０％または６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【０１８３】
（発明）
本発明は、新規のヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、これらの組成物を利用した自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖異常、発達障害、内分泌障害、眼病、代謝障害及び肝臓障害を含む胃腸疾患の診断、治療及び予防に関する。
【０１８４】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の識別番号を示す。各ポリヌクレオチドおよびそれに対応するポリペプチドは、１つのインサイトプロジェクト識別番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ＩＤ）に相関する。各ポリペプチド配列は、記載されているようにポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）の両方によって示されている。各ポリヌクレオチド配列は、記載されているようにポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）の両方によって示されている。
【０１８５】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｅｐｔ）データベースにおいてＢＬＡＳＴ解析により同定された本発明のポリペプチドに相同性を有する配列を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、ＧｗｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１８６】
表３は、本発明の各ポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するインサイトポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、潜在的なリン酸化部位および潜在的なグリコシル化部位を示す。列６は、サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１８７】
表２および表３は共に、本発明の各ポリペプチドの特性を一覧にしたものであって、これらの特徴が、請求するポリペプチドが薬物代謝酵素であることを立証する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって決定されるような（表２を参照）、カルボキシルエステラーゼ様ドメインを有する神経細胞表面タンパク質であるラットニューロリギン２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１４５７８９）と９８％の同一性を有する。ＢＬＡＳＴ確率スコアは０．０である。これは、観測しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はまた、保存されたタンパク質ファミリードメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースＰＦＡＭデータベースにおける統計的に有意な一致の検索により決定されるような（表３を参照）、カルボキシルエステラーゼドメインも含む。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２がカルボキシルエステラーゼであることを更に実証する。
【０１８８】
別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３が、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって決定されるような（表２を参照）、Ｂｌａｂｅｒｕｓ ｄｉｓｃｏｉｄａｌｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１４５９４７）からのシトクロムＰ４５０と４６％の同一性を有する。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．２ｅ−１１８であり、これは観測しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はまた、保存されたタンパク質ファミリードメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースＰＦＡＭデータベースにおける統計的に有意な一致の検索により決定されるような（表３を参照）、シトクロムＰ４５０活性部位ドメインも含む。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３がシトクロムＰ４５０であることを更に実証する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５が、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ， 表２を参照）によって決定されるような、ロイコトリエンＢ４ ω−ヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３９１７１６）として同定されるシトクロムＰ−４５０の形式で、ヒトシトクロムＰ−４５０ＬＴＢＶと７５％の同一性を有する。ＢＬＡＳＴ確率スコアは７．１ｅ−２１５であり、これは観測しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はまた、保存されたタンパク質ファミリードメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースＰＦＡＭデータベースにおける統計的に有意な一致の検索により決定されるような（表３を参照）、シトクロムＰ−４５０サイン配列も含む。ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５がシトクロムＰ−４５０スーパーファミリーのメンバーであることを更に実証する。別の例では、ＢＬＡＳＴ分析（表２を参照）に基づき、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０が、確率スコア７．１ｅ−４６で、ヒトＵＰＤ−ガラクトース：２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース３β−ガラクトシルトランスフェラーゼと３６％の同一性を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１が、確率スコア１．４ｅ−３５で、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅからのＮ−アセチルトランスフェラーゼと４９％の同一性を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３が、確率スコア９．１ｅ−１６７で、ホスホトリエステラーゼ関連タンパク質であるマウスパラチオンヒドロラーゼと８７％の同一性を有する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４が、確率スコア３．６ｅ−１３で、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌによって決定されるようなラットγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ ｇ５７８０６）と３４％の同一性を有する。ＢＬＩＭＰＳ分析は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４がγ−グルタミルトランスペプチダーゼであることを更に実証する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５が、確率スコア８．８ｅ−９８で、ゴキブリ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ ｇ１５５９４７）からのシトクロムＰ４５０と４４％の同一性を有する。ＨＭＭＥＲ−ＰＦＡＭデータ及び��ＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５がシトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーであることを更に実証する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６が、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ， 表２を参照）によって決定されるようなヒトシトクロムＰ４５０ ＩＩＩＡ４（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ ｇ６６４４３７２）と７３％の同一性を有する。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．３ｅ−１９５であり、これは観測しているポリペプチド配列アラインメントが偶然の一致により得られる確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はまた、保存されたタンパク質ファミリードメインの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースＰＦＡＭデータベースにおける統計的に有意な一致の検索により決定されるような（表３を参照。ＨＭＭＥＲ−ＰＦＡＭデータとしても参照される）、シトクロムＰ４５０サインドメインも含む。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６がシトクロムＰ４５０スーパーファミリーのメンバーであることを更に実証する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７が、確率スコア１．９ｅ−１２７で、ヒトクロルデコンレダクターゼ（アルド／ケト レダクターゼスーパーファミリーのメンバー、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ ｇ４２６１７１０）と７１％の同一性を有する。ＨＭＭＥＲ−ＰＦＡＭデータ及びＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、ＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７がアルド／ケト レダクターゼであることを更に実証する。別の例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８が、確率スコア６．５ｅ−１５７で、別のヒトアルド／ケト レダクターゼ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ ｇ３４９３２０９）と９１％の同一性を有する。ＨＭＭＥＲ−ＰＦＡＭデータ及びＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、ＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ分析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８がアルド／ケト レダクターゼであることを更に実証する。同様の方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−９を分析し、アノテーションを付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１８の分析に用いたアルゴリズム及びパラメータを表７に記載する。
【０１８９】
表４に示されているように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列またはｃＤＮＡ配列、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせたものを用いて組み立てた。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）と対応するインサイトポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）とを示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから推定されるコード配列（エキソン）、および／またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方からなる群に対応する識別番号を示す。これらの配列を用いて本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を組み立てた。表４の列６および列７はそれぞれ、それぞれの完全長配列に対する列５のｃＤＮＡ配列及び／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１９０】
表４の列５に示されている識別番号は、具体的には、例えばインサイトｃＤＮＡおよびそれらに対応するｃＤＮＡライブラリの識別番号を示す。例えば、６２７４４６１Ｔ８はインサイトｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＢＲＡＩＦＥＮ０３はそれが由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないインサイトｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリに由来する。または、列５の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇ７１３５６６２８Ｖ１）の識別番号の場合もある。または、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）データベース由来の配列（即ち記号「ＥＮＳＴ」を含む配列）を同定し得る。または、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（即ち記号「ＮＭ」または「ＮＴ」を含む配列）またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ（即ち記号「ＮＰ」を含む配列）に由来し得る。または、列５の識別番号は、「エキソンステッチ（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムによって得られたｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ推定エキソンの両方からなる集合体の場合もある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４は「ステッチされた」配列を表し、ここでＸＸＸＸＸＸはアルゴリズムが適用された配列のクラスターの識別番号、ＹＹＹＹＹはアルゴリズムによって生成された推定の番号、Ｎ１， ２， ３．．（もしあれば）は分析中に手作業で編集され得た特定のエキソンを表す（実施例５を参照）。または、列５の識別番号は、「エキソンステッチ」アルゴリズムによって１つにされたエキソンの集合体の場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎは「ステッチされた」配列の識別番号を表し、ここでＸＸＸＸＸＸはインサイトプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンステッチ」アルゴリズムが適用されたヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢはＧｅｎＢａｎｋ識別番号または最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎは特定のエキソンを表す（実施例５を参照）。「エキソンステッチ」アルゴリズムのためのタンパク質相同体としてＲｅｆＳｅｑ配列が用いられた例では、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号（ｇＢＢＢＢＢ等）の代わりにＲｅｆＳｅｑ識別子（「ＮＭ」、「ＮＰ」または「ＮＴ」で表される）が用いられ得る。
【０１９１】
また、接頭語は、手作業で編集され、ゲノムＤＮＡ配列から予想されるか或いは配列分析方法の組合せに由来するような部分配列を同定する。部分配列の接頭語及び接頭語と関連する対応する配列分析方法の例を次表に示す（実施例４，５を参照）。
【０１９２】
2004514416.tif 000002
場合によっては、列５に示されている配列の範囲と重複するインサイトｃＤＮＡの範囲が得られ、最終的なコンセンサス配列が決定されるが、それに相当するインサイトｃＤＮＡの識別番号は示されていない。
【０１９３】
表５は、インサイトｃＤＮＡ配列を用いて組み立てられたこれらの完全長ポリヌクレオチド配列が由来する代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。代表的なｃＤＮＡライブラリとは、上記ポリヌクレオチド配列の組み立ておよび決定に用いられたインサイトｃＤＮＡ配列を最も多く含むインサイトｃＤＮＡライブラリのことである。表５に示されているｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターが表６に示されている。
【０１９４】
本発明はまた、ＤＭＥの変異体も含む。好適なＤＭＥの変異体は、ＤＭＥアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、或いは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴を少なくとも１つは有する。
【０１９５】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、ＤＭＥをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１９６】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、或いは少なくとも８５％、または少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された核酸配列と少なくとも７０％、或いは少なくとも８５％、または少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６からなる群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。
【０１９７】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＤＭＥをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、天然のＤＭＥのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１９８】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＤＭＥのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＤＭＥ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞または原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１９９】
本発明はまた、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＤＭＥまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【０２００】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０２０１】
当分野で公知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で公知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で公知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【０２０２】
当分野で公知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＤＭＥをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で公知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． ら （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、入れ子プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【０２０３】
完全長のｃＤＮＡをスクリーニングする場合は、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長のｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０２０４】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【０２０５】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＤＭＥ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＤＭＥのクローン化及び発現に利用可能である。
【０２０６】
種々の目的でＤＭＥをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能である。
【０２０７】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． ら （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． ら （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． ら （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＤＭＥの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＤＭＥの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャフリングは、ＰＣＲ法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有する遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ましい変異体をプールし、ＤＮＡシャフリング及び選択／スクリーニングを繰り返す。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな位置に変異がある１つの遺伝子の断片を、目的の特性が最適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもできる。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【０２０８】
別の実施例によれば、ＤＭＥをコードする配列は、当分野で公知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＤＭＥ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ５５−６０； Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＤＭＥのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２０９】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出、ｐｐ２８−５３を参照）。
【０２１０】
生物学的に活性なＤＭＥを発現させるために、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＤＭＥをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＤＭＥをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【０２１１】
当業者に公知の方法を用いて、ＤＭＥをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９、１３、１６章を参照）。
【０２１２】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＤＭＥをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１； Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． １９１−１９６、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． ら（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． ら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． ら（１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２１３】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＤＭＥをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＤＭＥが必要な場合は、ＤＭＥの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＳＰ６またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【０２１４】
ＤＭＥの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． ら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、及びＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． ら （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４．を参照）。
【０２１５】
植物系もＤＭＥの発現に使用可能である。ＤＭＥをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． ら． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３： １６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： ８３８−８４３； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７ ： ８５−１０５を参照）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０２１６】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＤＭＥをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの可欠Ｅ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＤＭＥを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【０２１７】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０２１８】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＤＭＥの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＤＭＥをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２１９】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ−またはａｐｒ−細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． ら （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． ら（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． ら． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． ら（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１を参照）。
【０２２０】
マーカー遺伝子の発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＤＭＥをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＤＭＥをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＤＭＥをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２２１】
一般に、ＤＭＥをコードする核酸配列を含み、ＤＭＥを発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２２２】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＤＭＥの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で公知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＤＭＥ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． ら（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． ら Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪを参照）。
【０２２３】
種々の標識技術及び結合技術が当業者には公知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＤＭＥをコードする配列、またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では公知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【０２２４】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＤＭＥの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２２５】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０２２６】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードする自然の或いは修飾された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＤＭＥタンパク質が、ＤＭＥの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＤＭＥをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＤＭＥが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０２２７】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＤＭＥの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０２２８】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＤＭＥへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２２９】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＤＭＥの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． ら （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、化合物は、ＤＭＥが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＤＭＥを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。ＤＭＥを発現する細胞またはＤＭＥを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＤＭＥまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０２３０】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＤＭＥと結合させるステップと、ＤＭＥとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２３１】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、ＤＭＥが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＤＭＥの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性が試験化合物非存在下でのＤＭＥの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性の変化は、ＤＭＥの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をＤＭＥの活性に適した条件下でＤＭＥを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、ＤＭＥの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２３２】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＤＭＥまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において公知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子を「ノックアウト」し得る（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２３３】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． ら （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０２３４】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、潜在的な医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＤＭＥを乳汁内に分泌するなどＤＭＥを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． ら （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２３５】
（治療）
ＤＭＥの領域と薬物代謝酵素の領域との間に、例えば配列及びモチーフとの関連で、化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＤＭＥの発現は、副腎腫瘍、胎児の脳、乳房腫瘍、病変子宮内膜組織及び急速増殖性細胞に密接に関連する。従って、ＤＭＥは、自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖異常、発達障害、内分泌障害、眼病、代謝障害及び肝臓障害を含む胃腸疾患においてある役割を果たすと考えられる。ＤＭＥの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２３６】
従って、一実施例において、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。このような疾患には、限定するものではないが、自己免疫／炎症性疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれ、また発達障害が含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、また内分泌障害が含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠に関連する梗塞症、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷に起因する合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって引き起こされやすい抗利尿ホルモン分泌（ＡＤＨ）不適切症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、���菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な形態、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、コン症候群（慢性高カルシウム血症）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病等の膵臓疾患及び関連する合併症と、副腎皮質の過形成、癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫腫瘍、アジソン病などの副腎に関連した障害と、女性においては異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性においてはライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−レダクターゼ症候群、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれ、また眼病が含まれ、その中には結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、中毒性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、また代謝障害が含まれ、その中にはアジソン病、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性フルクトース不耐症、アドレナリン過剰症、副腎機能低下症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症が含まれ、また胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、言語障害、消化不良、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝��、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含まれる。
【０２３７】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２３８】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＤＭＥを含む組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０２３９】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０２４０】
更なる実施例では、ＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＤＭＥのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症性疾患、細胞増殖異常、発達障害、内分泌障害、眼病、代謝障害及び肝臓障害を含む胃腸疾患が含まれる。一実施態様では、ＤＭＥと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＤＭＥを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０２４１】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２４２】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０２４３】
ＤＭＥのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＤＭＥを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＤＭＥと特異的に結合するものを同定が可能である。ＤＭＥの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療目的の使用には、中和抗体（即ち二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０２４４】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＤＭＥまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０２４５】
ＤＭＥに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＤＭＥアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０２４６】
ＤＭＥに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ら． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０２４７】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．ら． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４を参照）。別法では、当分野で公知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＤＭＥ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０２４８】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、得ることもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． ら （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２４９】
ＤＭＥに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させて生成されるＦａｂ断片が含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となるように、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することもできる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． ら． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０２５０】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合アッセイ、または免疫放射線アッセイの様々なプロトコルが、当分野では公知である。通常このようなイムノアッセイでは、ＤＭＥとその特異的抗体との間で形成された複合体の測定が含まれる。二つの非干渉性ＤＭＥエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２５１】
ラジオイムノアッセイ技術と共にスキャッチャード分析などの様々な方法を用いて、ＤＭＥに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＤＭＥ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＤＭＥエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のＫａは、ＤＭＥに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＤＭＥエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体医薬は、ＤＭＥ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、ＤＭＥが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２５２】
ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＤＭＥ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である（例えば前出のＣａｔｔｙ及びＣｏｌｉｇａｎ を参照）。
【０２５３】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＤＭＥをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では公知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＤＭＥをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， ｅｄ． （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪ等を参照）。
【０２５４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することができる（例えばＳｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． ら （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５； ａｎｄ Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． ら （１９９５） ９ （１３）：１２８８−１２９６．を参照）。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１； Ａｕｓｕｂｅｌ， 前出； Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ、及び当分野で公知のその他の系が含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ， Ｒ．Ｊ．ら （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）： １３０８−１３１５； ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）： ２７３０−２７３６．を参照）。
【０２５５】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、（ｉ）遺伝子欠損症（例えば、Ｘ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ． ら （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１）、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０； Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）に関連する重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ． ら （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． ら （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６； Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． ら （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損による血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５　Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０； Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療したり、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物（例えば、細胞増殖の制御不能による癌の場合）を発現させたり、及び（ｉｉｉ）細胞内の寄生虫（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６； Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）や、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、カンジダアルビカンスやＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生虫、熱帯熱マラリア原虫やトリパノソーマ‐クルージ等の原虫寄生体）に対する防御機能を有するタンパク質を発現させて行うことができる。ＤＭＥの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＤＭＥを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２５６】
本発明の更なる実施例では、ＤＭＥの欠損による疾患や異常症は、ＤＭＥをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＤＭＥ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的な導入技術には、（ｉ）個々の細胞内へのＤＮＡのマイクロインジェクション、（ｉｉ）金粒子の打ち込み、（ｉｉｉ）リポソーム仲介性トランスフェクション、（ｉｖ）受容体仲介性遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソン（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−１８７； Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． ａｎｄ Ｈ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）の使用が含まれる。
【０２５７】
ＤＭＥの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＤＭＥを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． ａｎｄ Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＤＭＥをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２５８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売しているＰＥＲＦＥＣＴ ＬＩＰＩＤ及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ ＫＩＴ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法 （Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． ら （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代細胞にＤＮＡを導入するためには、これらの標準的な哺乳動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。
【０２５９】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えば、ＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能であり、公表データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． ら （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。このベクターは、ＶＳＶｇ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． ら （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０； Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６； Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６； Ｄｕｌｌ， Ｔ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１； Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． ら （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治療の分野では公知であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９； Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７； Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６； Ｒａｎｇａ， Ｕ． ら （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６： Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２６０】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他． （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． ら （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４； ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２６１】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＤＭＥを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では公知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． ら （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製は、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも１つの内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。また上記特許には、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ株の作製及び使用方法が開示されている。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． ら （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ ａｎｄ Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペスウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で公知の技術である。
【０２６２】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的な研究が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）がＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． ａｎｄ Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡが完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルで複製されるため、酵素活性（例えば薬物代謝酵素及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が過剰に産生される。同様に、ＤＭＥをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＤＭＥをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＤＭＥが合成される。通常、αウイルス感染は２〜３日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に変更することが可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． ら （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＤＭＥを導入することできる。ある集団における細胞のサブセットの特定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合がある。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの操作、αウイルスｃＤＮＡ及びＲＮＡのトランスフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で公知である。
【０２６３】
例えば開始部位から約−１０から約＋１０までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を阻害することが可能である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重鎖ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． ら． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０２６４】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＤＭＥをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０２６５】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０２６６】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で公知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＤＭＥをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０２６７】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏメチルを用いる修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュェオシン及びワイブトシンなどの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０２６８】
本発明の更なる実施例は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポリペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化させ得る。従って、ＤＭＥの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６９】
特定のポリヌクレオチドの発現変化における有効性を調べるために、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は、有効な化合物の化学修飾を含む当分野で公知の任意の方法で得ることができる。このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販されている或いは専売の、天然または非天然の化学化合物ライブラリから選択する場合、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づいて化合物を合理的にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効である。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊離系または再構成生化学系が含まれ得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの収量を定量し、その値が１或いは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発現の変化に試験化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えば分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． ら （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． ら （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． ら （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリのスクリーニングを含む（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． ら （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２７０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で公知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． ら （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６を参照）。
【０２７１】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０２７２】
本発明の別の実施例は、医学上認められる賦形剤で処方された活性成分を通常含む組成物の投与に関する。賦形剤には、糖、デンプン、セルロース、ガム、タンパク質等があり得る。種々の処方については、通常知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版においても徹底的に考察されている。このような組成物は、ＤＭＥ、ＤＭＥの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＤＭＥのインヒビターなどからなる。
【０２７３】
本発明に用いられる組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０２７４】
肺投与用の組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば、従来の低分子量有機薬剤）の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドやタンパク質）の場合には、肺の肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬剤を実際に血中に輸送することが可能となった（例えばＰａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． らの米国特許第５，９９７，８４８号を参照）。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要なくなる。
【０２７５】
本発明に用いる好適な組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力に見合う範囲内で行われる。
【０２７６】
ＤＭＥまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、ＤＭＥまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入されることが確認されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． ら （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２７７】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０２７８】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＤＭＥまたはその断片、ＤＭＥの抗体、ＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある用量）またはＬＤ５０（服用に対して集団の５０％に致命的である用量）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０２７９】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用期間が長い組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０２８０】
通常の薬用量は、投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ、合計で最大約１グラムまで変え得る。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０２８１】
（診断）
別の実施例では、ＤＭＥに特異的に結合する抗体が、ＤＭＥの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＤＭＥやＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＤＭＥの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＤＭＥを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で公知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０２８２】
ＤＭＥを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では公知であり、変わった或いは異常なレベルのＤＭＥの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＤＭＥの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＤＭＥに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）などの種々の方法で定量され得る。被験者のＤＭＥの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【０２８３】
本発明の別の実施例によれば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＤＭＥを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＤＭＥの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＤＭＥ値の変化を監視する。
【０２８４】
一実施形態では、ＤＭＥまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＤＭＥをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＤＭＥをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２８５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＤＭＥをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６の配列、或いはＤＭＥ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２８６】
ＤＭＥをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＤＭＥ及びＤＭＥ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には公知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０２８７】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＤＭＥの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症性疾患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫多発性内分泌腺障害症（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌の合併症、血液透析、体外循環、ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症及び外傷が含まれ、また細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれ、また発達障害が含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、また内分泌障害が含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠に関連する梗塞症、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷に起因する合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって引き起こされやすい抗利尿ホルモン分泌（ＡＤＨ）不適切症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な形態、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢進症と、コン症候群（慢性高カルシウム血症）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病等の膵臓疾患及び関連する合併症と、副腎皮質の過形成、癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫腫瘍、アジソン病などの副腎に関連した障害と、女性においては異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性においてはライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−レダクターゼ症候群、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれ、また眼病が含まれ、その中には結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、中毒性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、交叉腫瘍が含まれ、また代謝障害が含まれ、その中にはアジソン病、脳腱黄色腫症、副腎皮質過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、フルクトース−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性フルクトース不耐症、アドレナリン過剰症、副腎機能低下症、上皮小体亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂血症、脂質ミオパシー、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損症が含まれ、また胃腸疾患が含まれ、その中には嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、言語障害、消化不良、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝炎、肝脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性肝脂肪、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性再生及び腺腫、癌腫を含む肝癌とが含��れる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＤＭＥの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では公知である。
【０２８８】
ある実施態様では、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＤＭＥをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０２８９】
ＤＭＥの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＤＭＥをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と公知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【０２９０】
疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日間から数ヶ月間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０２９１】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２９２】
ＤＭＥをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェントな条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０２９３】
或る実施態様において、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、ヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿入及び欠失である。限定するものではないが、ＳＮＰの検出方法には、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）法が含まれる。ＳＳＣＰでは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。このＤＮＡは、例えば病変或いは正常な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ産物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識することによって、ＤＮＡシークエンシング装置などのハイスループット機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出をすることが可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ：ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するＤＮＡ断片の配列を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシークエンシングエラーや研究室でのＤＮＡの調整に起因する配列のばらつきを排除する。別法では、例えばハイスループットのＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２９４】
ＤＭＥの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．ら（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．ら（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度は、ハイスループット型のアッセイを用いることで速くなるであろう。このアッセイでは、目的のオリゴマーやポリヌクレオチドが様々な希釈液中に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速である。
【０２９５】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを、上記したように多数の遺伝子の相対的な発現レベルを同時にモニタリングする転写イメージング技術に用いることができる。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行／後退をモニタリングし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うことができる。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありながら副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２９６】
別の実施例では、ＤＭＥ、ＤＭＥの断片、ＤＭＥに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようにタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニタリング及び測定することが可能である。
【０２９７】
特定の実施例は、或る組織または細胞型の転写イメージを生成する本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞型により遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ らの米国特許第５，８４０，４８４号「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする）。従って、特定の組織または細胞型の転写物または逆転写物の全てに本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列をハイブリダイズすることにより、転写イメージが生成され得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列がマイクロアレイ上に複数のエレメントのサブセットを構成するハイスループット型でハイブリダイゼーションさせる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルとなり得る。
【０２９８】
転写イメージは、組織、細胞株、生検サンプル、またはその他の生体サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。従って、転写イメージは、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子発現を反映する。
【０２９９】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロファイルを示す転写イメージはまた、合成化合物または天然化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用され得る。全ての化合物は、作用及び毒性の機構を示唆する、頻繁に分子フィンガープリント若しくは毒性サイン（ｔｏｘｉｃａｎｔ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを引き起こす（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． ら （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、また言及することを以って本明細書の一部とする）。試験化合物が、毒性を有する既知の化合物のサインと同一のサインを有する場合には、毒性特性を共有している可能性が高い。フィンガープリントまたはサインが、より多くの遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいれば、より有用かつ正確になる。理想としては、発現のゲノム全域にわたって測定し、最高品質のサインを提供することである。任意の試験化合物によっても発現が変化しない遺伝子も同様に重要である。それは、これらの遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを標準化することができるためである。標準化処理は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性サインのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるサインの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、毒性サインを用いる毒性スクリーニングにおいて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要でありまた望ましいことである。
【０３００】
一実施例では、試験化合物の毒性は、核酸を含有する生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１若しくは複数のプローブでハイブリダイズさせ、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量することができる。処理した生体サンプル中の転写レベルを、非処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差が、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示唆する。
【０３０１】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞型のプロテオームを分析することに関連する。「プロテオーム」という用語は、或る特定の組織または細胞型におけるタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームを構成する各タンパク質は、個々に更なる分析をすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロファイルは、所定の条件下で所定の時間に発現したタンパク質の数及びそれらの相対的な存在量を定量することにより分析する。従って、ある細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞型のポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、このような分離は２次元ゲル電気泳動によって行う。この２次元ゲル電気泳動法では、まず、１次元の等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に、２次元のドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に従って分離する（前出のＳｔｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。これらのタンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの染色剤を用いてゲルを染色して、分散した個別の位置にあるスポットとしてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理済みまたは非処理のいずれかの生体サンプルから得られる等位置にあるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を調べる。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的に切断した後、質量分析する標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基であるその部分的な配列を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０３０２】
プロテオームのプロファイルは、ＤＭＥに特異的な抗体を用いてＤＭＥ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上のエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝露して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． ら． （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． ら． （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３０３】
プロテオームレベルでの毒性サインも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性サインと並行して分析するべきである。或る組織における或るタンパク質では、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関性が低いことがあるため（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． ａｎｄ Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、プロテオーム毒性サインは、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを変化させる化合物の分析において有用たり得る。更に、体液中での転写の分析は、ｍＲＮＡが急速に分解するため困難である。しがたがって、このような場合にはプロテオームのプロファイル作成はより信頼でき、情報価値がある。
【０３０４】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理して評価する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質を分離して、各タンパク質の量が定量できるようにする。各タンパク質の量を、非処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプル間におけるタンパク質の量の差は、処理されたサンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。個々のタンパク質は、それらのアミノ酸残基をシークエンシングし、これらの部分配列を本発明のポリペプチドと比較することで同定する。
【０３０５】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処理することにより評価する。生体サンプルから得たタンパク質を、本発明のポリペプチドに特異的な抗体と共にインキュベートする。その抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、非処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプル間におけるタンパク質の量の差が、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。
【０３０６】
当分野で公知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． ら （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ら（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．ら （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． ら（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． ら （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， ｅｄ． （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。また、この文献を引用することを以って本明細書の一部とする。
【０３０７】
本発明の別の実施例ではまた、ＤＭＥをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存されていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． ら （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４、Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． ａｎｄ Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０３０８】
ｉｎ ｓｉｔｕ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝子地図データと相関し得る（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈらによる（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８を参照）。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のワールドワイドウェブのサイトで見つけることができる。物理的な染色体地図上のＤＭＥをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０３０９】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張することもできる。マウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることにより、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や症候群に関与する１つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えばＧａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．らによる（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０３１０】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＤＭＥと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３１１】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えばＧｅｙｓｅｎらによる（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基質の上に合成される。試験用化合物は、ＤＭＥ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＤＭＥが、当分野で公知の方法で検出される。精製されたＤＭＥはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０３１２】
別の実施例では、ＤＭＥと結合可能な中和抗体がＤＭＥと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＤＭＥと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３１３】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＤＭＥをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０３１４】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０３１５】
本明細書中に記載された全ての特許出願、特許、刊行物は、米国特許出願第６０／２１６，８０４号、同第６０／２１８，９４８号、同第６０／２２０，０３７号及び同第６０／２２１，８３７号を含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【０３１６】
（実施例）
１　ｃＤＮＡライブラリの作製
インサイトｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に含まれているｃＤＮＡライブラリに由来し、表４の列５に示されている。ある組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液においてホモジナイズして溶解する一方、別の組織を、フェノールにおいて、或いはグアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの変性剤の好適な混合液においてホモジナイズして溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離によって、或いはクロロホルムで抽出した。ＲＮＡは、イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムとエタノールのどちらか、或いは別の一般的な方法でこの溶解物から沈殿させた。
【０３１７】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０３１８】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出，ユニット５．１−６．６を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはアガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮＣＹプラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、またはそれらの誘導体などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５αまたはＤＨ１０Ｂ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し形質転換した。
【０３１９】
２　ｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように得たプラスミドは、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用したｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、またはＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、またはＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いた。沈殿させた後、０．１ ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３２０】
別法では、ハイスループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリングステップは、１つの反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０３２１】
３　シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したインサイトｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は標準的な方法で行うか、またはＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）或いはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ） 液体移送装置と共にＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） サーマルサイクラー或いはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などのハイスループット装置を用いて行った。ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の試薬、またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれる試薬を用いて行った。ｃＤＮＡシークエンシングの反応物の電気泳動的による分離及び標識したポリヌクレオチドの検出は、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または当分野で公知のその他の配列解析システムを用いて行った。ｃＤＮＡ配列内の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長した。
【０３２２】
インサイトｃＤＮＡに由来する本ポリヌクレオチド配列の確認は、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング、およびジヌクレオチドの分布による解析（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー、およびポリＡ配列を取り除き、更にあいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、インサイトｃＤＮＡ配列およびそれらの翻訳を、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベース、およびＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にしたタンパク質ファミリーのデータベースから選択した配列に対して問合せた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス主構造を分析する確率的手法である。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６： ３６１−３６５を参照）。このような問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＲに基づいたプログラムを用いて行った。インサイトｃＤＮＡ配列を組み立てて、完全長ポリヌクレオチド配列を作製した。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡｓ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチ配列（ｓｔｉｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ストレッチ配列（ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、またはＧｅｎｓｃａｎ−推定コード配列（実施例４および５を参照）を用いて、インサイトｃＤＮＡ群を完全長の配列に伸長した。配列の組み立ては、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、およびＣｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて行い、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ、およびＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いて、オープンリーディングフレームを決定するべくｃＤＡＮ群をスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長ポリペプチド配列を得た。別法では、本発明のポリヌクレオチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基から始まり得る。次に、完全長ポリペプチド配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問合せて分析した。こられの完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯ ソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアラインメントを、アライメントした配列間のパーセント同一性も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって指定されたデフォルトパラメータを用いて作成した。
【０３２３】
表７は、インサイトｃＤＮＡおよび完全長配列の組み立て、および組み立てた配列の分析に利用したツール、プログラム、およびアルゴリズム、並びにそれらの説明、引用文献、閾値パラメータを簡単に示す。表７の列１は用いたツール、プログラム、およびアルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列４の記載されている部分は２つの配列の一致の程度を評価するために用いたスコア、確率値、及びその他のパラメータを示す（スコアが高くなれば高くなるほど即ち確率値が低ければ低いほど、配列間の相同性が高くなる）。
【０３２４】
完全長のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０３２５】
４　ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定および編集
推定上の薬物代謝酵素は、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物に由来するゲノムＤＮＡ配列を分析するための汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８： ７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８： ３４６−３５４を参照）。このプログラムは推定エキソンを連結して、メチオニンから停止コドンまで伸長した組み立てｃＤＮＡ配列を構築する。Ｇｅｎｓｃａｎにより得られる配列は、ＦＡＳＴＡデータベースのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列になる。Ｇｅｎｓｃａｎによって一回で解析できる配列の最大長さは３０ｋｂに設定されている。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が薬物代謝酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいて薬物代謝酵素について問合せて分析した。潜在的な薬物代謝酵素が、薬物代謝酵素としてアノテーションが付けられたインサイトｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。次に、これらの選択されたＧｅｎｓｃａｎ推定配列を、ＢＬＡＳＴ解析を用いてｇｅｎｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースの配列と比較した。必要に応じて、Ｇｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して、Ｇｅｎｓｃａｎ推定配列における余分なエキソンや省いてしまったエキソンなどのエラーを修正し、編集した。ＢＬＡＳＴ解析を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含むインサイトｃＤＮＡまたは公共のｃＤＮＡを見つけ出すことにより、転写の証拠が得られる。インサイトｃＤＮＡがＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列を含む場合、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ推定配列を修正或いは確認できる。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に説明した組み立て方法でＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列とインサイトｃＤＮＡおよび／または公共のｃＤＮＡ配列を組み立てて作製した。別法では、完全長ポリヌクレオチド配列は、その全てが編集した或いは未編集のＧｅｎｓｃａｎ推定コード配列から作製した。
【０３２６】
５　ｃＤＮＡ配列データを用いるゲノム配列データの組み立て
「ステッチされた」配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列を、実施例４に記載したＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムによって推定されたエキソンで伸長した。実施例３に記載されたように組み立てられた部分ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡと１或いは複数のゲノム配列から推定されるＧｅｎｓｃａｎエキソンとを含む複数のクラスターに分けた。各クラスターをグラフ理論および動的計画法に基づいたアルゴリズムを用いて分析し、ｃＤＮＡおよびゲノム情報を統合し、完全長の配列を作製するために、その後に確認、編集、または伸長して潜在的なスプライスバリアントを生成した。クラスターの２つ以上の配列に配列区間の全長が存在する配列区間を同定し、このように同定した区間を推移により等しいと考えた。例えば、或る区間がｃＤＮＡおよび２つのゲノム配列に存在する場合、これら３つ全ての区間を等しいと考えた。この方法によって、関連しないが連続するゲノム配列をｃＤＮＡ配列によって繋ぎ１つにした。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製した。１種類の親配列に沿って連結される区間と区間との繋ぎ合わせ（ｃＤＮＡとｃＤＮＡ、またはゲノム配列とゲノム配列）は、親配列の種類が異なる連結（ｃＤＮＡとゲノム配列）よりも優先された。得られたステッチ配列を翻訳し、ＢＬＡＳＴ解析でｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉ公共データベースにおける配列と比較した。Ｇｅｎｓｃａｎによって推定された不適当なエキソンを、ｇｅｎｅｐｔにおいてＢＬＡＳＴで最もヒットした配列と比較して修正した。必要に応じて、このような配列を更なるｃＮＤＡ配列若しくはゲノムＤＮＡ検査により伸長した。
【０３２７】
「ストレッチされた」配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴ解析に基づいたアルゴリズムで完全長に伸長した。まず、実施例３に記載したように組み立てた部分ｃＤＮＡを、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベースなどの公共のデータベースに対して問い合わせた。次に、ＧｅｎＢａｎｋの相同性の最も高いタンパク質を、実施例４に記載したインサイトｃＤＮＡ或いはＧｅｎＳｃａｎエキソン推定配列の何れかと比較した。得られた複数の高スコアのセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を作製し、ＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質上に翻訳した配列をマッピングした。元のＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質に関連して、キメラタンパク質に挿入や欠失が起こり得る。公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索するために、ＧｅｎＢｎａｋの相同タンパク質およびキメラタンパク質の両方をプローブとして用いた。このようにして、部分ＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。得られたストレッチ配列を完全な遺伝子を含んでいるかについて検査した。
【０３２８】
６　ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６を組み立てるために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、インサイトＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐ（表７）などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｎｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＳＨＧＣ）、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＷＩＧＲ）及びＧｅｎｅｔｈｏｎなどの公共の情報源から入手できる放射線ハイブリッド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）及び遺伝子マッピングのデータを用いて、クラスター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスターにマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列（特定のＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含む）をそのマッピング位置に割り当てた。
【０３２９】
遺伝子地図の位置は、ヒト染色体の範囲または区間によって表される。センチモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染色体の短腕（ｐ）の末端から測定したセンチモルガン（ｃＭ）は、同一染色体上の遺伝子間の組換え率に基づいた距離を表す単位である。平均すると、１ｃＭはヒトの染色体の１メガベースに概ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分があるため、大きく変化し得る）。距離ｃＭは、配列がそれぞれのクラスターに含まれている放射線ハイブリッドマーカーの境界を検出できるＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝子マーカーに基づいている。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの公に入手可能なヒト遺伝子マップ及びその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３３０】
このようにして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４が、第１１染色体の６２．５ ｃＭ〜７０．９ ｃＭの範囲内にマッピングされた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９が、第１４染色体の４２．９ ｃＭ〜５９．０ ｃＭの範囲内にマッピングされた。
【０３３１】
７　ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． ら、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０３３２】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなｃＤＮＡデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
【０３３３】
【数１】
2004514416.tif 000003
として定義される積スコアである。積スコアは、０〜１００の標準化された値であり、以下のように求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除す。高スコアのセグメントの対（ＨＳＰ）において一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより離隔される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、ＢＬＡＳＴアラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合にのみ得られる。積スコア７０は、１００％の同一性で重畳が７０％であるか、或いは８８％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。積スコア５０は、１００％の同一性で重畳が５０％であるか、或いは７９％の同一性で重畳が１００％であるかの何れかの場合である。
【０３３４】
或いは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば、ある完全長の配列は、少なくとも部分的にインサイトｃＤＮＡ配列をオーバーラップさせて組み立てられる（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。同様に、各ヒト組織は、癌、細胞系、発生、炎症、神経、外傷、心血管、プール（ｐｏｏｌｅｄ）などの１つの疾患／症状のカテゴリーに分類され、各カテゴリーにおけるライブラリの数をカウントし、その合計数を全カテゴリーのライブラリ数で除す。得られるパーセンテージは、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３３５】
８　ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチド配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【０３３６】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要若しくは望ましい場合は、追加の或いは入れ子のプライマーの組を設計する。
【０３３７】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０３３８】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【０３３９】
伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０３４０】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３４１】
同様に上述の手順で完全長のポリヌクレオチド配列を検査し、或いは完全長のポリヌクレオチド配列を利用して、この伸長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適なゲノムライブラリを用いて５′調節配列を得る。
【０３４２】
９　個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９−３６から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０３４３】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、例えば、最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して比較する。
【０３４４】
１０　マイクロアレイ
マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾプリント（インクジェットプリンター、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一な非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９）．前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線、または化学的或いは機械的な結合手段で基質の表面にエレメントを配置して結合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正な数のエレメントを含めることができる（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． ら （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． ａｎｄ Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０３４５】
完全長ｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片やオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片やオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしなかったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけるハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０３４６】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルは、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第１鎖緩衝液、０．０３単位／μｌのＲＮアーゼインヒビター、５００μＭ ｄＡＴＰ、５００μＭ ｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＴＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ、４０μＭ ｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。この逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて、２００ ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含む２５ ｍｌ容量で行う。特異的なコントロールポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により非コーディング酵母ゲノムＤＮＡから合成する。３７０℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（一方はＣｙ３標識、他方はＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ 水酸化ナトリウムで処理し、８５０℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを変性する。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプルを、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌ ５×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３４７】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡ挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３４８】
精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定する。顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に大量の蒸留水での洗浄と、０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライドガラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、９５％エタノール中の０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
【０３４９】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基質にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを分注する。
【０３５０】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１回洗浄し、蒸留水で３回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）における０．２％カゼイン中で６０℃、３０分間マイクロアレイをインキュベートし、その後上述したように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することによってブロックする。
【０３５１】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、６５℃で５分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから１．８ｃｍ２ のカバーガラスで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移す。チャンバーの角に１４０μｌの５×ＳＳＣを加えて、チャンバー内を湿度１００％に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間それぞれ３回洗浄し、その後乾燥させる。
【０３５２】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３を励起するための４８８ｎｍ、及びＣｙ３を励起するための６３２ｎｍのスペクトル線を生成し得るＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０ Ｗレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御Ｘ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンする。
【０３５３】
２つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは２つの蛍光体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて２つの蛍光体に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルタを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルタを用いて、蛍光体１つにつき１回スキャンし、各アレイを通常２回スキャンする。
【０３５４】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比１：１００，０００に相関するようにする。異なる試料（例えば検査細胞及びコントロール細胞を代表する）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズさせる場合には、較正は２つの蛍光体を有する較正するｃＤＮＡのサンプルを標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。
【０３５５】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（ＡＩＤ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、リニア２０色変換を用いてシグナル強度が青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示される。データはまた、定量的に分析される。２つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話（重複発光スペクトルに起因する）に対して補正される。
【０３５６】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３５７】
１１　相補的ポリヌクレオチド
ＤＭＥをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＤＭＥの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＤＭＥのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＤＭＥをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３５８】
１２　ＤＭＥの発現
ＤＭＥの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＤＭＥが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＤＭＥを発現する。真核細胞でのＤＭＥの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． ら （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０３５９】
殆どの発現系では、ＤＭＥが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＤＭＥからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＤＭＥを直接用いて以下の実施例１６、１７及び１８のアッセイを行うことができる。
【０３６０】
１３　機能アッセイ
ＤＭＥの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＤＭＥをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０３６１】
遺伝子発現におけるＤＭＥの影響は、ＤＭＥをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＤＭＥ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３６２】
１４　ＤＭＥに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＤＭＥを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３６３】
別法では、ＤＭＥアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に公知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（例えば前出の１９９５年発行Ａｕｓｕｂｅｌ， １１章を参照）。
【０３６４】
通常、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出の１９９５年Ａｕｓｕｂｅｌを参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＤＭＥ活性を検査するには、ペプチドまたはＤＭＥを基質に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３６５】
１５　特異的抗体を用いた天然ＤＭＥの精製
天然ＤＭＥ或いは組換えＤＭＥを、ＤＭＥに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＤＭＥ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する。
【０３６６】
ＤＭＥを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＤＭＥを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＤＭＥとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファ、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＤＭＥを回収する。
【０３６７】
１６　ＤＭＥと相互作用する分子の同定
ＤＭＥまたはＤＭＥの生物学的に活性な断片を、１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する（Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９等を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＤＭＥと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＤＭＥ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＤＭＥ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＤＭＥの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３６８】
別法では、ＤＭＥと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３６９】
ＤＭＥはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３７０】
１７　ＤＭＥ活性の実証
ＤＭＥのチトクロムＰ４５０活性は、アニリンの４−ヒドロキシル化を用いて測定する。アニリンは酵素により４−アミノフェノールに置換され、６３０ ｎｍで最大の吸収を有する（前出のＧｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｋｅｔｔ）。このアッセイは便利な測定であるが、２−及び３−位置でも生じるような全ヒドロキシル化を過小評価する。アッセイは３７℃で実行され、酵素のアリコート及び適量（約２ ｍＭ）のアニリンを反応バッファに含む。この反応のために、バッファはＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰＨ生成補因子系を含んでいなければならない。この反応バッファのための１つの調合物には、８５ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｍＭニコチンアミド、４０ ｍｇイソクエン酸三ナトリウム及び２単位のイソクエン酸デヒドロゲナーゼを含み、アッセイの直前に１０ ｍＬ反応バッファストックに８ ｍｇ ＮＡＤＰ＋ を添加する。反応は、光学キュベット内で行い、６３０ ｎｍでの吸光度を測定する。吸光度の増加率は、アッセイの酵素活性に比例する。４−アミノフェノールの既知の濃度を用いて標準曲線を描き得る。
【０３７１】
ＤＭＥのフラビン含有モノオキシゲナーゼ活性は、代謝産物のクロマトグラフィー分析によって測定する。例えば、Ｒｉｎｇ， Ｂ． Ｊ． ら （１９９９； Ｄｒａｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． ２７：１０９９−１１０３） は０．１ Ｍリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ７．４または８．３）及び１ ｍＭ ＮＡＤＰＨにおいて３７℃でＦＭＯをインキュベートし、有機溶媒で反応を停止させ、ＨＰＬＣによって産物形成を決定した。或いは、クラーク型電極を用いて酸素吸収をモニターすることにより活性を測定する。例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｄ． Ｍ． ａｎｄ Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ． Ｌ． （１９７８； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５２：１４２−１５１） は、基質メチマゾールを含むＮＡＤＰＨ生成補因子系（上述のものと類似）中で３７℃で酵素をインキュベートした。酸素吸収率は、酵素活性に比例する。
【０３７２】
ＤＭＥのＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性は、遊離アミノ基の比色定量を用いて測定する（前出のＧｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｋｅｔｔ）。２−アミノフェノール等のアミノ含有基質は、必要な補因子（４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、７．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ ｍＭアスコルビン酸、０．７５ ｍＭ ＵＤＰグルクロン酸）を含む反応バッファ内で酵素のアリコートにより３７℃でインキュベートする。十分な時間が経過した後、０．１ Ｍリン酸バッファ ｐＨ ２．７に氷冷の２０％トリクロロ酢酸を加えることにより反応を停止させ、氷上でインキュベートし、遠心分離して上澄を清澄する。未反応の２−アミノフェノールは、このステップで破壊される。次に十分な新鮮に調整した亜硝酸ナトリウムを添加する。このステップで、グルクロニド化された産物のジアゾニウム塩の形成が可能となる。十分なスルファミン酸アンモニウムの添加により過剰な亜硝酸塩を除去し、ジアゾニウム塩を芳香族アミン（例えばＮ−ナフチルエチレンジアミド）と共に反応させて分光光度的に（例えば５４０ ｎｍで）アッセイ可能な有色アゾ化合物を生成する。２−アミノフェノールグルクロニドと類似の特性を有する発色団を形成することになるアニリンの既知の濃度を用いて標準曲線を描き得る。
【０３７３】
ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性の測定は、［３５Ｓ］ＰＡＰＳからの３５Ｓをフェノール等のモデル基質に組み入れることを利用して行う（Ｆｏｌｄｓ， Ａ． ａｎｄ Ｍｅｅｋ， Ｊ． Ｌ． （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２７：３６５−３７４）。１ ｍＬの１０ ｍＭリン酸バッファ ｐＨ ６．４、５０μＭフェノール、０．４−４．０μＭ［３５Ｓ］ＰＡＰＳで酵素のアリコートを３７℃でインキュベートする。５〜２０％の放射標識を基質に移行させるのに十分な時間が経過した後、沈降タンパク質及びリン酸バッファに０．２ ｍＬの０．１ ｍＭ酢酸バリウムを添加する。次に０．２ ｍＬの０．１ ｍＭ Ｂａ（ＯＨ）２、続いて０．２ ｍＬ ＺｎＳＯ４を添加する。上澄は遠心分離して清澄する。このとき、未反応の［３５Ｓ］ＰＡＰＳと共にタンパク質も除去される。上澄の放射能をシンチレーションにより測定し、酵素活性を反応生成物中の放射能の分子の数から決定する。
【０３７４】
ＤＭＥのグルタチオンＳトランスフェラーゼ活性は、グルタチオンと反応して生成物を形成する２，４−ジニトロ−１−クロロベンゼン、３４０ ｎｍで最大の吸光度を有する２，４−ジニトロフェニルグルタチオン等のモデル基質を用いて測定する。ＧＳＴは異なる基質特性を有し、モデル基質はＧＳＴの基質優先度に基づき選択すべきであることに留意することが重要である。アッセイは大気温度で行い、好適な反応バッファ（例えば１ ｍＭグルタチオン、１ ｍＭジニトロクロロベンゼン、９０ ｍＭリン酸カリウムバッファ ｐＨ ６．５）に酵素のアリコートを含む。反応は、光学キュベット内で行い、３４０ ｎｍでの吸光度を測定する。吸光度の増加率は、アッセイの酵素活性に比例する。
【０３７５】
ＤＭＥのＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性は、放射標識されたアミノ酸基質を用いて、共役産物への放射標識の組み込みを測定して、測定する。非標識のアシルＣｏＡ化合物及び標識されたアミノ酸を含む反応バッファ内で酵素をインキュベートし、放射標識されたアセチル共役はｎ−ブタノールまたは他の好適な有機溶媒に抽出することによって未反応のアミノ酸から分離する。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ．ら （１９９０； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３） は、コリル−ＣｏＡ及び３Ｈ−グリシンまたは３Ｈ−タウリンで酵素をインキュベートし、ｎ−ブタノールに抽出することによって三重水素化コラート共役を分離し、抽出された産物の放射能をシンチレーションにより測定することによって、胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定した。或いは、後述するように、還元されたＣｏＡ（ＣｏＡＳＨ）の分光光度測定を用いてＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定する。
【０３７６】
ＤＭＥのＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性は、［１４Ｃ］アセチル−ＣｏＡから基質分子への放射標識の移行を利用して測定する（例えばＤｅｇｕｃｈｉ， Ｔ． （１９７５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２４：１０８３−５を参照）。或いは、ＣｏＡＳＨとのＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ−ｂｉｓ（２）−ニトロ安息香酸；エルマン試薬）反応に基づく、より新しい分光光度アッセイを用いてもよい。アセチル基をＮ−アセチルトランスフェラーゼの触媒で基質に移行させる間に遊離チオール含有ＣｏＡＳＨが形成される。ＣｏＡＳＨは、４１２ ｎｍでのＤＴＮＢ共役の吸収度を用いて検出される（Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｊ． ら （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３０４５−３０５０）。酵素活性は、基質への放射活性の組込率に比例する。或いは分光光度アッセイにおいて吸収率が増加する。
【０３７７】
ＤＭＥのアルド／ケトレダクターゼ活性は、ＮＡＤＰＨが消費される際、３４０ ｎｍでの吸収度の減少を利用して測定する。基準反応混合物は、１３５ ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（酵素によりｐＨ ６．２−７．２）、０．２ ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３ Ｍ硫酸リチウム、０．５−２．５μｇ酵素及び好適なレベルの基質である。反応は３０℃でインキュベートし、分光光度計で連続的にモニターする。酵素活性は、消費されたＮＡＤＰＨ［ｍｏｌ］／酵素［μｇ］として計算する。
【０３７８】
ＤＭＥのアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤ＋ がＮＡＤＨに還元される際、３４０ ｎｍでの吸収度の増加を利用して測定する。基準反応混合物は、５０ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５、０．２５ ｍＭ ＥＤＴＡである。反応は２５℃でインキュベートし、分光光度計で連続的にモニターする。酵素活性は、生成されたＮＡＤＨ［ｍｏｌ］／酵素［μｇ］として計算する。
【０３７９】
１８　ＤＭＥ阻害剤の同定
実施例１７のアッセイで説明したように、試験する化合物を、適切なバッファ及び基質と共に様々な濃度にし、マルチウェルプレートのウェルの中に配列する。各ウェルに対してＤＭＥ活性を測定し、ＤＭＥ活性を阻害する各化合物の能力並びに容量反応速度を決定し得る。このアッセイは、ＤＭＥの活性を向上させる分子を同定することにも用い得る。
【０３８０】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適な実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施例の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【０３８１】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に対する系統的な名称を示す。
【０３８２】
表２は、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋの相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号およびアノテーションを示す。ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋの相同体との間の一致を表す確率値スコアも示す。
【０３８３】
表３は、推定上のモチーフおよびドメインを含むポリペプチド配列の構造的な特徴、並びにポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム、および検索可能なデータベースを示す。
【０３８４】
表４は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたｃＤＮＡ断片のリスト、並びにポリヌクレオチド配列の選択された断片のリストを示す。
【０３８５】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３８６】
表６は、表５に示すｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを示す付録である。
【０３８７】
表７は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメータを示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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