(57)【要約】本発明は、シナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する新規なポリペプチドであるkIF1Bβタンパク質を提供する。本発明はまた、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリペプチドを調製するための方法、およびそれらの使用、例えば、kif1Bβ遺伝子関連疾患についての診断方法を提供する。本発明のポリペプチド、このポリペプチドをコードする遺伝子、およびKif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する化合物は、kif1Bβ遺伝子関連疾患、例えば、シャルコー・マリー・ツース病2A型に関する治療剤または予防剤を開発するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものからなる群より選択される実質的に純粋なポリペプチド：
（a）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、1つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されており、かつ配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチド；ならびに
（c）配列番号:1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項2記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４】
請求項2記載のポリヌクレオチド、または請求項3記載のベクターを保有する宿主細胞。
【請求項５】
請求項2記載のポリヌクレオチドに対して、またはその相補鎖に対して相補的であり、かつ少なくとも15個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の工程を包含する、請求項1記載のポリペプチドを作製するための方法：
（a）請求項4記載の宿主細胞を培養する工程；
（b）該宿主細胞が、該ポリペプチドを発現することを可能にする工程；および
（c）該発現されたポリペプチドを収集する工程、
【請求項７】
請求項1記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項８】
請求項2記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1記載のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを、発現可能な様式で保有する、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１０】
請求項1記載のポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの発現が抑制される、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１１】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物がマウスである、請求項9または10のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１２】
kif1Bβ遺伝子関連疾患を診断するための方法であって、該方法は
（a）配列番号:1のヌクレオチド配列をコードする遺伝子が位置する対立遺伝子と同じ対立遺伝子に位置する遺伝子の変異を、被験体が有するか否かを検出する工程；
を包含し、該被験体が該変異を有する場合、該被験体は、kif1Bβ遺伝子関連疾患を有することが疑われる、方法。
【請求項１３】
kif1Bβ遺伝子関連疾患を診断するための方法であって、該方法は
（a）被験体の遺伝子の発現レベルを検出する工程であって、該遺伝子は、配列番号:1のヌクレオチド配列をコードする遺伝子が位置する対立遺伝子とおなじものに位置する工程；
を包含し、該被験体は、異常な発現が検出される場合、kif1Bβ遺伝子関連疾患を有するのではないかと推測される方法。
【請求項１４】
kif1Bβ遺伝子関連疾患は、シャルコー・マリー・ツース病2A型である、請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
請求項1記載のポリペプチドに結合する化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は以下の：
（a）試験化合物と、請求項1記載のポリペプチドとを接触させる工程；
（b）該ポリペプチドと、該試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（c）該ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
kif1Bβ遺伝子関連疾患を、処置、緩和、または予防するための候補化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の：
（a）請求項9〜11のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物に対して候補化合物を投与する工程；
（b）トランスジェニック非ヒト脊椎動物において、kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状の変化を観察する工程；および
（c）kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する候補化合物を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
kif1Bβ遺伝子関連疾患が、シャルコー・マリー・ツース病2A型である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
kif1Bβ遺伝子関連疾患を処置、緩和、または予防するための組成物であって、該組成物は、活性成分として請求項15〜17のいずれか1項記載の方法によって選択された化合物の薬学的に有効な量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項１９】
kif1Bβ遺伝子関連疾患がシャルコー・マリー・ツース病2A型である、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
kif1Bβ遺伝子関連疾患を処置、緩和、または予防するための方法であって、該方法は、請求項15〜17のいずれか1項記載の方法によって選択された化合物の薬学的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
kif1Bβ遺伝子関連疾患がシャルコー・マリー・ツース病2A型である、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、シナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する新規なポリペプチドであるKIF1Bβタンパク質に関する。本発明はまた、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリペプチドを調製するための方法、およびkif1Bβ遺伝子関連疾患についての診断方法といったこのペプチドの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
軸索輸送は、進路として微小管を主に用いることによって、神経終末に対して、必須のオルガネラおよび材料を供給する。分子モータータンパク質のキネシンスーパーファミリー(KIF)は、軸索輸送の種々の局面において潜在的に機能する40を超えるメンバーを有する(Hirokawa, N(1998)Science 279, 519-26)。全てのスーパーファミリーメンバーは、同様のモータードメインを有し、これは、複数の遺伝子重複によってなされた進化とも考えられる。この分子の残りの部分は、大きく分岐され、おそらく複数のクラスのカーゴ分子と会合させられる。実際、各々のモーター機能的な特異性は、明白な発達上の表現型および細胞下の表現型を提示する、一連のノックアウトマウスによって支持される(Yonekawa, Y et al. (1998)、J. Cell Biol. 141(2)、431-41；Tanaka，Y et al. (1998)Cell 93(7)、1147-58；Nonaka, S et al. (1998)Cell 95(6)、829-37；Takeda, S et al. (1999)J. Cell Biol. 145(4), 825-36)が、この表現型は、他のKIFによってごくわずかに補償されるのみである。KIFの未知のアイソフォームにおける欠損は、神経学的障害に特異的に関連するかもしれない。従って、これらのアイソフォームの同定および特徴づけを行うことによって、このような障害の診断、治療、および予防がもたらされる。
【０００３】
1/2500という罹患率である、ヒトにおいて最も一般的な通常の遺伝性末梢性神経障害である、シャルコー・マリー・ツース病(CMT)は、末梢の筋肉の弱化および萎縮、深部腱反射の抑制または欠如、および軽度の感覚消失によって臨床的に特徴付けられる(Shy、M. E. et al. ed. (1999)Charcot-Marie-Tooth Disorders. Ann. New York Acad. Sci. 883)。ミエリン変性のマーカーとして、運動神経伝導速度(MNCV)を用いることによって、この疾患は、I型（髄鞘障害）およびII型（軸索障害）に分類されている(Harding、A. E., およびThomas, P. K. (1980)J. Med. Genet. 17(5)、329-36)。CMT2A（II型CMTの常染色体優性サブタイプ）は、ヒト染色体1p35-36に位置づけられた(Ben Othmane, K. B. et al. (1993)Genomics 17(2)、370-5)。興味深いことに、ヒトKif1B遺伝子座は、CMT2Aインターバルに密接に関連する(Gong, T. -W. L. et al. (1996)Mamm. Genome7(10), 790-1；Nakagawa, T et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94(18)9654-9)。しかし、CMT2Aを担う遺伝子は、まだ同定されていない。
【発明の開示】
【０００４】
発明の開示
本発明の目的は、シナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する新規なポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリペプチドを調製するための方法、およびそれらの使用(例えば、kif1Bβ遺伝子関連疾患についての診断方法）を提供することである。
【０００５】
本発明者らは、KIF1Bβと呼ばれる、従来のミトコンドリアモーターKIF1Bの新規なアイソフォーム(Nangaku, M et al. (1994)Cell 79(7), 1209-20；本明細書において以降は、KIF1Bαと名付けられる）を同定し、かつ特徴付けた。2つのアイソフォーム(マウス染色体4E上に位置する同じ遺伝子の酢プライシング改変体）は、N末端モータードメインを共有するが、明白なテールドメインを有する。KIF1Bβのテールドメインは、シナプス小胞前駆体を輸送するモーターである、KIF1Aのドメインと共通点が多い(Okada, Yら (1995)Cell 81(5), 769-80)。それらのテールドメインは、お互いと相同性を共有しないので、KIF1BαおよびKIF1Bβのカーゴは、異なると予想される(Nakagawa, T et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 (18) 9654-9；Nakagawa, T et al. (1998)Mol. Biol. Cell 9、3939)。本発明者らは、KIF1Bβが、シナプス小胞前駆体を輸送するという証拠を示し、またインビボにおけるその機能的な重要性（ノックアウトマウスが神経学的障害を発症したことを示す）を特徴付けた。
【０００６】
さらに、本発明者らは、kif1B＋/-マウスの表現型がシャルコー・マリー・ツース病(CMT)の症状に似ているということを実証した。従って、本発明者らは、CMT2A患者におけるKIF1B遺伝子座を分析した。そして本発明者らは、モータードメインのATP結合コンセンサスにおいてQ98Lミスセンス変異を発見した。次いで、本発明者らは、Q98L変異体KIF1Bβタンパク質が、低下したATPase活性および運動性を有することを示した。このことは、このモータータンパク質のハプロ不全が、このマウスモデルおよびヒトの両方において、CMT2A神経障害を担うということを示唆する。
【０００７】
上述の結果は、以下のように考察することができる。
【０００８】
本明細書において、本発明者らは、シナプス小胞前駆体を輸送する新しいモータータンパク質であるKIF1Bβを同定した。さらに、本発明者らは、ヒトCMT2A神経障害を模倣するkif1Bヘテロ接合性マウスを生成した。ここに存在する本発明者らの証拠によって、CMT2Aの常染色体優性遺伝性パターンが、KIF1Bのハプロ不全によって説明できることが示される。（1）kif1B＋/-マウスは、KIF1Bβレベルを半分に低下させ、そしてCMT2Aに類似の遅発性軸索変性症を生じた。（2）ヒトKIF1Bβは、CMT2Aに密接に関連する。（3）ヒトQ98L変異体は、臨床兆候に完全に関連した。（4）Q98L変異体は、KIF1Bβのモーター機能を破壊した。（5）機能的な結果として、シナプトタグミンおよびSV2のようなシナプス小胞タンパク質であるカーゴのレベルは、kif1B＋/-マウスの抹消軸索において特異的に低下した。
【０００９】
KIF1Bの機能的な重大性は、無呼吸によって死亡したkif1B-/-新生児マウスにおいて、なおさらに明白であった。脳幹核および交連軸索の発達障害、ならびに脊髄におけるシナプス形成の障害は、kif1B＋/-マウスに見られた末梢神経障害の、さらに重篤な表現型であると考えることができる。kif1B-/-ニューロンの低い生存率（KIF1BβcDNAを発現することによって救済されるが、KIF1Bαによっては救済されない）によって、KIF1Bβが、ニューロンにおいて細胞に自律的に作用することが示唆され、髄鞘障害ではなく、軸索障害としてのCMT2Aの臨床的定義と一致する。
【００１０】
シナプス小胞前駆体の輸送はまた、関連のモーターであるKIF1Aを欠くマウスにおいて障害された(Yonekawa, Y et al. (1998)J. Cell Biol. 141(2), 431-41)。kif1A-/-マウスはまた、新生児期間に、致死的な神経学的表現型を示し、このことは、神経末端におけるシナプス小胞の密度の低下を示唆した。しかし、kif1B-/-マウスの表現型は、kif1A-/-マウス（出生後約24時間生存し得たマウス）の表現型よりも重篤であった。前肢の垂れ下がり(dropping)、前弯性の姿勢、および無呼吸のような神経学的知見もまた、kif1B-/-新生マウスに特異的であった。このような重篤度の差異は、KIF1Bが発生の早期段階に表れる（図8）が、KIF1Aは神経発達の後期段階で表れる(Yonekawa, Y et al. (1998)J. Cell Biol. 141(2)、431-41)という事実によって説明できた。発達中のKIF1BβおよびKIF1Aの発現のパターンは異なっていたが、それらは、シナプス小胞前駆体の輸送のために同じニューロンにおいて機能的に冗長であると考えられた。KIF1Aは、ニューロン特異的であるが、KIF1Bβは、広範なスペクトルの組織分布を有しており、その結果、KIF1Bβはまた、非神経組織において他の小胞を輸送するのに何らかの役割を果たし得る。これらの2つの関連遺伝子の間の遺伝的相互作用の評価は、将来の研究課題である。
【００１１】
分子モーター欠乏は、どのようにして記載された神経学的症状を生じることができたのか。軸索は、タンパク質合成機構を欠くので、ニューロン生存に必須のタンパク質は、分子モーターによって軸索に輸送されなければならない。従って、モータータンパク質のレベルが低下すると、軸索の要件を維持できない。KIF1Bの不活性化に起因する、シナプス小胞前駆体または他の未同定のカーゴ分子（例えば、神経栄養因子レセプター）の輸送の欠損はおそらく、神経終末の障害（電子顕微鏡分析および電気生理学的分析によって、ならびにノックアウトマウスにおける神経生存の減少によって明らかになる）を生じた。軸索神経障害の従来の末梢性一次(distal-first)理論であって、遠位筋肉が、近位筋肉よりも早期かつ重度に罹患することを述べている理論は、軸索が長いほど、より高レベルのモーター分子を必要とするという考えによって部分的に説明されることができる。従って、本発明者らは、軸索神経障害のモータータンパク質由来病原性についてのパラダイムを示す「モータータンパク質症(motor proteinopathy)」の新しい疾患実体をここで提唱する。
【００１２】
本発明は、シナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する新規なポリペプチドである、kif1Bβタンパク質に関する。本発明はまた、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリペプチドを調製する方法、およびそれらの使用、例えば、kif1Bβ遺伝子関連疾患の診断方法に関する。より具体的には、本発明は、以下に関連する。
[1]  以下のものからなる群より選択される実質的に純粋なポリペプチド：
（a）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、1つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されており、かつ配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチド；ならびに
（c）配列番号:1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチド。
[2]  [1]記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[3]  [2]記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[4]  [2]記載のポリヌクレオチド、または[3]記載のベクターを保有する宿主細胞。
[5]  [2]記載のポリヌクレオチドに対して、またはその相補鎖に対して相補的であり、かつ少なくとも15個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
[6]  以下の工程を包含する、[1]記載のポリペプチドを作製するための方法：
（a）[4]記載の宿主細胞を培養する工程；
（b）該宿主細胞が、該ポリペプチドを発現することを可能にする工程；および
（c）該発現されたポリペプチドを収集する工程、
[7]  [1]記載のポリペプチドに結合する抗体。
[8]  [2]記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド。
[9]  [1]記載のポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを、発現可能な様式で保有する、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
[10]  [1]記載のポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの発現が抑制される、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
[11]  トランスジェニック非ヒト脊椎動物がマウスである、[9]または[10]のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
[12]  kif1Bβ遺伝子関連疾患を診断するための方法であって、該方法は
（a）配列番号:1のヌクレオチド配列をコードする遺伝子が位置する対立遺伝子と同じ対立遺伝子に位置する遺伝子の変異を、被験体が有するか否かを検出する工程；
を包含し、該被験体が該変異を有する場合、該被験体は、kif1Bβ遺伝子関連疾患を有することが疑われる、方法。
[13]  kif1Bβ遺伝子関連疾患を診断するための方法であって、該方法は
（a）被験体の遺伝子の発現レベルを検出する工程であって、該遺伝子は、配列番号:1のヌクレオチド配列をコードする遺伝子が位置する対立遺伝子とおなじものに位置する工程；
を包含し、該被験体は、異常な発現が検出される場合、kif1Bβ遺伝子関連疾患を有するのではないかと推測される方法。
[14]  kif1Bβ遺伝子関連疾患は、シャルコー・マリー・ツース病2A型である、[12]または[13]記載の方法。
[15]  [1]記載のポリペプチドに結合する化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は以下の：
（a）試験化合物と、[1]記載のポリペプチドとを接触させる工程；
（b）該ポリペプチドと、該試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（c）該ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を包含する、方法。
[16]  kif1Bβ遺伝子関連疾患を、処置、緩和、または予防するための候補化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の：
（a）[9]〜[11]のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物に対して候補化合物を投与する工程；
（b）トランスジェニック非ヒト脊椎動物において、kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状の変化を観察する工程；および
（c）kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する候補化合物を選択する工程、
を包含する、方法。
[17]  kif1Bβ遺伝子関連疾患が、シャルコー・マリー・ツース病2A型である、[16]記載の方法。
[18]  kif1Bβ遺伝子関連疾患を処置、緩和、または予防するための組成物であって、該組成物は、活性成分として[15]〜[17]のいずれか1項記載の方法によって選択された化合物の薬学的に有効な量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
[19]  kif1Bβ遺伝子関連疾患がシャルコー・マリー・ツース病2A型である、[18]記載の組成物。
[20]  kif1Bβ遺伝子関連疾患を処置、緩和、または予防するための方法であって、該方法は、[15]〜[17]のいずれか1項記載の方法によって選択された化合物の薬学的に有効な量を投与する工程を包含する、方法。
[21]  kif1Bβ遺伝子関連疾患がシャルコー・マリー・ツース病2A型である、[20]記載の方法。
【００１３】
本発明は、KIF1Bβと名付けられた新規のタンパク質に関するものであって、このタンパク質はシナプス小胞前駆体を輸送する新しいモータータンパク質である。本発明に包含される、単離されたKIF1Bβ cDNAのヌクレオチド配列は、配列番号:1に示され、そしてこのcDNAによってコードされるKIF1Bβタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号:2に示される。
【００１４】
本明細書において用いられる所定のポリペプチドに関して、「実質的に純粋な」という用語は、このポリペプチドが、生物学的な他の高分子を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドとは、乾燥重量で少なくとも75％（例えば、少なくとも80、85、95、または99％）純粋である。純度は、任意の適切な標準的方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析）によって測定することができる。
【００１５】
マウスKIF1Bβタンパク質に対して構造的に類似のポリペプチドもまた、それらがシナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する限り、本発明に包含される。このような構造的に類似のポリペプチドはまた、他の生物体に由来するKIF1Bβタンパク質の改変体を含む。
【００１６】
このようなポリペプチドは、当業者であれば、例えば、標準的な変異導入法を用いて調製することができる。当業者に公知のタンパク質中のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、deletion-mutant作製方法(Kowalski. D. et al., 1976, J. Biochem., 15, 4457; McCutchan, T.F. et al., 1984, Science, 225, 626-628)、Kunkel法(kunkel, T.A., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel, T.A. et al., 1987, Methods Enzymol. 154: 367-382)、Gapped-duplex法(Kramer, W. and Fritz, H.-J., 1987, Methods Enzymol. 154: 350-367; Zoller, M.J. and Smith, M., 1983, Methods Enzymol. 100: 468-500; 広瀬進, 1991, 村松正実および岡山博人 編, 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社, pp246-252）、PCR法（村松正実 編, ラボマニュアル遺伝子工学 第３版, 丸善株式会社, 1996, pp.227-230）、カセット変異法（岸本利光, 1991, 村松正実および岡山博人 編, 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社, pp253-260）などのsite-directed mutagenesis法などが挙げられる。例えば、Transformer（商標）Site-Directed Mutagenesis Kit (CLONTECH #K1600-1)を用いることができる。
【００１７】
ポリペプチドにおけるアミノ酸の人為的な改変は、通常30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、さらに好ましくは5アミノ酸以内である。また、ポリペプチドのアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このようにシナプス小胞前躯体を輸送するモーター活性を有する限り、人為的なまたは自然界におけるアミノ酸の置換、欠失、付加、および/または挿入により天然型マウス「KIF1Bβ」タンパク質（配列番号:2）に対してアミノ酸配列が異なるポリペプチドも、本発明に含まれる。
【００１８】
置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。また、β分岐鎖アミノ酸にはThr、Val、Ileが挙げられ、芳香族アミノ酸にはTyr、Phe、Trp、Hisが挙げられる。
【００１９】
マウスKIF1Bβタンパク質にアミノ酸残基を添加することによって形成されるポリペプチドは、マウスKIF1Bβタンパク質と他のペプチド
【００２０】
また、シナプス小胞前駆体を転送するモーター活性を有する、マウス「KIF1Bβ」タンパク質と構造的に類似したタンパク質の調製は、公知のハイブリダイゼーション技術（細胞工学別冊8, 新細胞工学実験プロトコール, 1991, 秀潤社, pp. 188-193および79-87; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 8.46-8.52)やポリメラーゼ連鎖反応技術（細胞工学別冊8, 新細胞工学実験プロトコール, 1991, 秀潤社, pp. 171-186; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 14.1-14.35)を利用して行うことができる。即ち、当業者にとってはマウス「KIF1Bβ」cDNA配列（配列番号:1）またはその一部をプローブとして、また、マウス「KIF1Bβ」cDNA（配列番号:1）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の他の生物からマウス「KIF1Bβ」cDNAと相同性の高いDNAを単離し、さらに単離したDNAからマウス「KIF1Bβ」タンパク質と構造的に類似したタンパク質を得ることが常套手段となっている。
【００２１】
本発明においては、シナプス小胞前駆体を転送するモーター活性を有する限り、マウス「KIF1Bβ」cDNAとハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを包含する。このようなポリペプチドを単離する他の生物としては、例えば、ヒト、サル、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばニューロン、脳、および培養ニューロンを材料として単離することができる。
【００２２】
マウス以外の生物に由来する「KIF1Bβ」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、通常、マウス「KIF1Bβ」cDNAの塩基配列（配列番号:1）と高い相同性を有する。「高度に同一である」とは、アミノ酸レベルで少なくとも60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の配列の同一性を指す。本明細書において用いる場合、2つのアミノ酸配列、または2つの核酸の「同一性の割合(percent identity)」とは、Karlin、およびAltschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264-2268、1990)のアルゴリズムを、Karlin、およびAltschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877, 1993)にあるように改変して用いて、決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215：403-410、1990)のNBLAST、およびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド研究は、NBLASTプログラム（スコア＝100, ワード長＝12）を用いて実施される。タンパク質の相同性検索は、FASTAプログラム、BLASTプログラムなどを用いることによって、例えば、DNA Databank of Japan(DDBJ；National Institute of Genetics：Yata 1111, Mishima, Shizuoka 411, Japan)において容易に実施することができる。XBLASTプログラム(スコア＝50、ワード長＝3）を用いて、BLASTタンパク質検索を実施する。2つの配列の間にギャップが存在する場合、Altsuchlらに記載されるような、ギャップ化BLASTを利用する(Nucleic Acids Res. 25：3389-3402、1997)。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用するときは、各々のプログラム（例えば、XBLAST、およびNBLAST）のデフォールトパラメーターを用いる。
【００２３】
マウス「KIF1Bβ」タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド（ストリンジジェントな条件では、50％ホルムアミド）、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml 変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、室温、2×SSC、0.1％SDS（ストリンジェントな条件では、50℃、0.5×SSC、0.1％SDS）で洗浄する。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度やホルムアミドの濃度、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である（細胞工学別冊8, 新細胞工学実験プロトコール）。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、天然のポリペプチドの他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えポリペプチドとして調製することができる。天然のポリペプチドは、例えば、「KIF1Bβ」タンパク質が発現していると考えられる組織（例えばニューロンおよび脳）の抽出液に対し、後述する「KIF1Bβ」タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う方法により調製することが可能である。一方、組換えポリペプチドは、後述するように「KIF1Bβ」タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞を培養し、これらポリペプチドを回収することにより調製することが可能である。
【００２５】
また、本発明の部分ペプチドとしては、例えば、シグナル配列が除去されたタンパク質のN末端領域の部分ペプチドや、C末端領域の部分ペプチドが挙げられ、該ペプチドは抗体の調製に利用することができる。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有する部分ポリペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは少なくとも8アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも9アミノ酸の鎖長を有する。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することがきでる。
【００２６】
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、これらポリペプチドをコードしうるものであれば特に制限はなく、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく所望の塩基配列を有する全てのDNAが含まれる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド(isolated polynucleotide)」とは、ポリヌクレオチドであって、その構造が任意の天然に存在するポリヌクレオチドの構造に対して、または3つを超える別々の遺伝子にまたがる天然に存在するゲノムポリヌクレオチドの任意のフラグメントの構造に対して同一でないポリヌクレオチドである。従って、この用語は、例えば、以下を包含する。（a）DNAであって、天然に存在するゲノムDNA分子の一部の配列を、それが天然に存在する生物体のゲノムにおいて有する、DNA；（b）得られた分子が、任意の天然に存在するベクターまたはゲノムDNAに対して同一でないような様式で、ベクター中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれたポリヌクレオチド；（c）cDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)によって生成されたフラグメント、または制限フラグメントのような別々の分子；および（d）ハイブリッド遺伝子（すなわち、融合ポリペプチドをコードする遺伝子）の一部である組み換えヌクレオチド配列。この定義から特別に除外されるのは、異なる、以下の混合物中に存在するDNA分子のポリヌクレオチドである。（i）DNA分子、（ii）トランスフェクトされた細胞、または（iii）細胞クローン（例えば、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーのようなDNAライブラリーに存在するものなど）。
【００２８】
従って、1つの局面において、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、この単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を包含する。より好ましくは、この単離された核酸分子は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である。参照配列、例えば、配列番号1に対して、それより長いかまたは等価な長さである単離されたポリヌクレオチドの場合、この参照配列の全長を用いて比較がなされる。この単離されたポリヌクレオチドが、この参照配列よりも短い場合、例えば、配列番号1よりも短い場合、同じ長さの参照配列のセグメント（相同性算出によって必要ないずれのループも除外する）に対して比較がなされる。
【００２９】
本発明のポリペプチドをコードするcDNAは、例えば、配列番号:1に記載のcDNAあるいはその断片、それらに相補的なRNA、または該cDNAの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを32Pなどで標識し、本発明のポリペプチドが発現している組織（例えばニューロンや脳など）由来のcDNAライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらcDNAの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、適当な組織（例えばニューロンや脳など）由来のcDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローニングすることもできる。ゲノムDNAは、例えば、配列番号:1に記載のcDNAあるいはその断片、それらに相補的なRNA、または該cDNAの配列の一部を含む合成オリゴヌクレオチドを32Pなどで標識し、ゲノムDNAライブラリーにハイブリダイズさせることによりスクリーニングすることができる。あるいは、これらcDNAの塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、本発明のポリペプチドをコードするcDNAをクローニングすることもできる。一方、合成DNAは、例えば、配列番号:1に記載のcDNAの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、アニーリングさせて二本鎖にし、DNAリガーゼで結合させることにより調製することができる。
【００３０】
これらDNAは、組換えポリペプチドの生産に有用である。即ち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号:1に記載のポリヌクレオチド）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより本発明のタンパク質を組換えタンパク質として調製することが可能である。本発明のポリペプチドは分泌タンパク質であるため、例えば哺乳動物細胞で発現させ、細胞外に分泌させて調製することが可能である。
【００３１】
具体的には、例えば大腸菌で発現させるためのベクターとしては、pKK223-3、pKK233-2、pJLA502等が挙げられる。また、例えば他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。そのためのベクターとしては、例えば、pRIT2T、pGEX-2T、pGEX-3Xなどが挙げられる。これらの融合タンパク質は、アフィニティーカラムを用いて容易に回収することができる。融合タンパク質の所望のポリペプチドとパートナーポリペプチドの間にトロンビン切断部位やファクターXa切断部位を有するベクターを用いれば、目的のタンパク質のみを切り出すことができる。また、タンパク質を菌体外やペリプラズム中に分泌させるためのベクターとしては、pKT280やpRIT5などが挙げられる（岡田雅人・宮崎香 編, 無敵のバイオテクニカルシリーズ タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製, 羊土社, 1996年発行, pp.139-149）。
【００３２】
また、バキュロウイルスを用いて、昆虫細胞や哺乳動物細胞で本発明のポリペプチドを発現させることも可能である。哺乳動物細胞用のバキュロウイルスベクターとしては、例えばpAcCAGMCS1が挙げられる（村松正実 編, ラボマニュアル遺伝子工学 第３版, 丸善株式会社, 1996年発行, pp.242-246）。
【００３３】
宿主細胞において発現させた組換えポリペプチドは、公知の方法により精製することができる。また、本発明のポリペプチドを、例えば、N末端にヒスチジン残基のタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST)などを結合した融合タンパク質の形で発現させた場合には、ニッケルカラムやグルタチオンセファロースカラム等により精製することができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、また、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に応用することも可能である。遺伝子治療に用いるためのベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターや、カチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターが挙げられる(Y. Niitsu, M. Takahashi, Molecular Medicine, Vol 35, No. 11, 1385-1395, 1998)。遺伝子の導入は、in vivo や ex vivo などが考えられる。また、他のサイトカイン遺伝子と共導入することも考えられる。
【００３５】
本発明はまた、配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15塩基の鎖長を有するDNAに関する。「特異的にハイブリダイズする」とは、上記した通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなDNAには、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイム等）が含まれる。
【００３６】
本発明のタンパク質をコードするcDNAあるいはその配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子やcDNAのクローニング、あるいPCRによる増幅に利用できる。さらに、制限断片長多型(RFLP)、１本鎖DNA高次構造多型(SSCP)などの方法により、遺伝子あるいはcDNAの多型あるいは異常の検出(遺伝子診断など）に利用できる。
【００３７】
また、本発明は、本発明のタンパク質に結合する抗体に関する。本発明の抗体には、ポリクーナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。ポリクローナル抗体は、例えば文献「東京大学医科学研究所  制癌研究部 編, 細胞工学別冊8, 新細胞工学実験プロトコール, 1993年発行, 秀潤社, pp. 202-217」に記載された方法に従って作製することができる。例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に精製した本発明のタンパク質、その部分ペプチド、または本発明のタンパク質のアミノ酸配列を基に合成したペプチドを、耳の静脈内、そけい部、四肢指の爪の裏などに注射する。抗原ポリペプチドの投与は、フロイントの完全アジュバント、またはフロイントの不完全アジュバントと共に行ってもよい。抗原は通常、数週間ごとに投与され、追加免疫により抗体価を上げることができる。定期的に採血を行い、ELISA等により抗体価の上昇を確認し、最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。抗血清は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC等により、IgG画分を精製することができる。また、固定化抗原を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、さらに抗体を精製することもできる。
【００３８】
一方、モノクローナル抗体は、例えば文献「小池隆夫、谷口克 著, 1991, 村松正実および岡山博人 編, 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社, pp70-74」に記載の方法に従って作製することができる。具体的には、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC等により、IgG画分を精製することができる。また、固定化抗原を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、さらに抗体を精製することもできる。
【００３９】
これにより調製された抗体は、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製のために用いられる。また本発明のポリペプチドの発現異常や構造異常起因する疾患の検査や診断、本発明のタンパク質の発現量の検出などに利用することが可能である。例えば組織、血液、または細胞などからポリペプチドを抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等を通して、本発明のポリペプチドの発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。また、本発明の抗体を抗体治療に用いることも考えられる。抗体治療に用いる場合、ヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。
【００４０】
ヒト型モノクローナル抗体は、例えば、文献「磯貝秀和, 1988, 実験医学 Vol.6, No.10, 55-60」に従って行うことができる。また、文献「T. Tsunenari et al., 1996, Anticancer Res., 16, 2537-2544」に記載されたように、分子生物学的手法を用いて作製することもできる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスに本発明のタンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
【００４１】
本発明は、また、本発明のDNAを外来的に発現可能に保持するトランスジェニック非ヒト脊椎動物に関する。このような動物には、外来のポリヌクレオチドを発現している動物、および該外来のポリヌクレオチドの発現を誘導することができる動物が含まれる。発現は全身的な発現であっても、細胞、組織、または器官特異的であってもよい。また、時期特異的であってもよい。また、例えば外的な刺激により発現が誘導されたり、掛け合わせによる後代において発現が改変（誘導または抑制）されるものであってもよい。
【００４２】
本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、例えば本発明のポリヌクレオチドを発現するベクターを受精卵に導入して作製することが可能である。ポリヌクレオチドの導入は、ベクターと卵を混合してリン酸カルシウムで処理したり、または倒立顕微鏡下におけるマイクロインジェクション法等により行うことができる。または、胚性幹細胞（ES細胞）に本発明のベクターを導入し、選別したES細胞を受精卵（肺盤胞）にマイクロインジェクションにより導入してもよい(Gordon, J.W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980)。得られた受精卵は、輸精管結紮雄マウスとの交配により偽妊娠させたレシピエントの卵管内に移植し、産仔を得ることができる。産仔の尾からDNAを調製し、PCRにより導入DNAの保持を確認する（勝木元也編, 発生工学実験マニュアル, 講談社 (1989); 日本生化学学会編, 新生化学実験講座 動物実験法, 東京化学同人 (1991); Hogan, B. et al., 1986, "Manipulating the mouse embryo", in "A laboratory manual", Cold Spring Harbor laboratory press)。生殖系列に遺伝子が導入されたキメラ動物からは、正常動物と交配することによりヘテロ接合体が得られる。ヘテロ接合体同士の交配によリホモ接合体を得ることができる。
【００４３】
本発明のポリペプチドを生体内で発現させるために用いるプロモーターとしては、例えば全身発現性のプロモーターや、その他の組織特異的、時期特異的プロモーターを用いることができる(Sauer, B., 1998, Methods 14:381-92)。
【００４４】
部位特異的または時期特異的に本発明のポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物を作製する場合、Cre-loxPの系や酵母のFLP系を利用することが可能である。例えば、部位特異的または時期特異的なプロモーターの下流にCreリコンビナーゼ遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製し、別に汎用プロモーターの下流に本発明のポリペプチドをコードするDNAを連結させたベクターを保持するトランスジェニック動物を作製する。この時、プロモーターと本発明のポリペプチドをコードするDNAとの間にloxPに挟まれたストップコドンまたは転写終結シグナル等を挿入しておく。２つの個体を掛け合わせることにより、Creの発現に伴なって本発明のポリペプチドを発現させることができる(Sauer, B., 1998, Methods 14:381-92)。
【００４５】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物には、内因性の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部が置換、欠失、付加および／または挿入されることにより、該ポリヌクレオチドの発現が抑制されているトランスジェニック非ヒト脊椎動物が含まれる。このようなトランスジェニック動物は、例えば、ジーンターゲティングにより製造することができる。このようなトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、例えば、
（ａ）本発明のタンパク質をコードするゲノムDNAの少なくとも一部を置換、欠失、付加および／または挿入により変異させたベクターを調製する工程、
（ｂ）哺乳動物の胚性幹細胞に該ベクターを導入する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞から、該ベクターが相同組換えによりゲノムに導入された細胞を選択する工程、
（ｄ）該哺乳動物の胚を調製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた胚に、工程（ｃ）で得られた細胞を注入する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた胚を発生させる工程、
（ｇ）発生した個体から、該ベクターが相同組換えによりゲノムに導入された細胞を保持する個体を選択する工程、を含む方法により作製することができる。
【００４６】
具体的なジーンターゲティングの方法については、例えば、文献(Capecchi, M.R. (1989) Science 244, 1288-1292)に記載された方法で実施することが可能である。
【００４７】
また、内因性の本発明のタンパク質をコードするDNAの発現が抑制されているトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、アンチセンス法を利用して作製することもできる。アンチセンス法においては、(1)本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写産物に相補的なRNAをコードするDNAを含むベクターを、上記と同様に哺乳動物の胚性幹細胞に導入し、(2)これを哺乳動物の胚に注入し、(3)該胚から個体を得ればよい。ベクターの投与は、脳室内投与(Kagiyama, S. et al. (1999) Brain Res. 829, 120-124)、腫瘍に対する局所投与(Rubenstein, M. et al. (1996) J. Surg. Oncol. 62, 194-200)、静脈投与(Zhao, Q. et al. (1998) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 451-458)等の方法で行なうことができる。
【００４８】
本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、kif1Bβ遺伝子関連疾患(例えば、シャルコー・マリー・ツース病2A型）のモデルとして特に有用である。これらのトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、kif1Bβ遺伝子関連疾患の分子解析のため、およびkif1Bβ遺伝子関連疾患に関する治療薬または予防薬の開発のために利用することができる。本発明のこのトランスジェニック非ヒト脊椎動物については、哺乳動物、特にげっ歯類(例えば、マウスおよびラット）が好ましく用いられる。
【００４９】
本発明の試験および診断は、kif1Bβ遺伝子の構造的バリエーションまたは異常な発現を検出することによって実施することができる。例えば、kif1Bβ遺伝子の構造的バリエーションの検出は、PCRなどによって、被験体由来のゲノムDNAまたはmRNAからkif1Bβ遺伝子を増幅し、そのヌクレオチド配列を決定することによって実施することができる。正常な遺伝子のヌクレオチド配列に対して比較することによって、変異の有無、および変異のタイプを決定する。ここで、変異は、多形性を含む。すなわち、kif1Bβ遺伝子におけるSNP（一塩基遺伝子多型）の検出によって、kif1Bβ遺伝子関連疾患（例えば、シャルコー・マリー・ツース病2A型）の発症リスク、および予後の試験および診断が可能になると考えられる。モーター活性（例えば、KIF1Bβタンパク質のATPase活性、およびインビボにおける細胞運動性）を減弱するkif1Bβ遺伝子変異は、kif1Bβ遺伝子関連疾患の発症および進行のリスクファクターであると判断される。また、kif1Bβ遺伝子の異常な発現を検出するために、例えば、患者由来のニューロンにおけるkif1Bβ遺伝子の発現が、マイクロアレイ分析、定量的RT-PCRまたは半定量的RT-PCR、免疫組織化学的染色、ウエスタンブロットなどによって分析される。異常な発現は、正常な組織における発現に対する比較によって決定される。異常な発現としては、発現の上昇、低下、および消失が挙げられる。kif1Bβ遺伝子発現における減少は、kif1Bβ遺伝子関連疾患の発症および進行についてのリスクファクターであると判断される。本発明の試験および診断とは、kif1Bβ遺伝子関連疾患の発症の前に実施されたリスク試験、およびkif1Bβ遺伝子関連疾患の発症の後に実施された分類、治療計画を作成するための試験、などを含む。例えば、kif1Bβ遺伝子関連疾患の発症後、kif1Bβ遺伝子の構造的なバリエーションまたは異常な発現は、神経組織を試験することによって検出され、そしてバリエーションおよび異常の有無およびタイプが決定される。さらに、発症の前の試験によって、kif1Bβ遺伝子関連疾患についてリスクが高いと決定される場合、初期段階でkif1Bβ遺伝子関連疾患を検出する可能性を、頻繁な予防的健康診断計画を設定することによって上昇することができる。また、それが発症後である場合は、kif1Bβ遺伝子関連疾患の分類または区別を通じて、処置の予測または選択の合理的な予測が可能である。本発明の試験はまた、本発明のスクリーニングによって得られた薬物が有効であるか否かを決定するために有用である。これらの試験によって、個人個人のkif1Bβ遺伝子関連疾患に従う、テーラーメード処置の実現が可能になる。
【００５０】
上述の本発明の試験において、kif1Bβ遺伝子ヌクレオチド配列、もしくはそれらの相補的な配列の一部を含むポリヌクレオチド、またはKIF1Bβタンパク質に対する抗体を用いる。kif1Bβ遺伝子ヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖の一部を含むポリヌクレオチドは、mRNA、cDNA、またはゲノムDNA中にこの遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補鎖の一部を含むポリヌクレオチドであってもよく、そして例えば、タンパク質コード領域中の配列、5’および3’UTS、イントロン、エキソン、ならびに転写調節領域における配列であってもよい。上述のポリヌクレオチドは好ましくは、kif1Bβ遺伝子ヌクレオチド配列またはその相補鎖の内の連続的ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、これは、少なくとも15ヌクレオチド以上、好ましくは16ヌクレオチド以上、そしてより好ましくは、17、18、または20ヌクレオチド以上である。これらのポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよい。これはまた、改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、プローブとして、DNAマイクロアレイ中に固定されたポリヌクレオチドとして、またはRT-PCRのためのプライマーなどとして、試験において用いられてもよい。また、抗体は、タンパク質レベルでkif1Bβ遺伝子の発現を検出するために、そしてタンパク質構造解析を通じて試験を実施するために有用である。本発明は、これらのポリヌクレオチドまたは抗体を含む、kif1Bβ遺伝子関連疾患のための試験、または診断の試薬を提供する。ポリヌクレオチドおよび抗体を、キャリアまたは支持体に結合させてもよい。例えば、それは、DNAマイクロアレイなどの形式であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドおよび抗体を、溶媒および溶質と適切に組み合わせてもよい。本発明の試験および診断の試薬は、例えば、水溶液として提供される。本発明の試薬は、試験キットおよび診断キットであってもよく、これは適切な容器（包装、および／または指示書を含む）内に入れられる。本発明の試験および診断の試薬は、好ましくは、その容器、包装、または指示書に、それは、シャルコー・マリー・ツース病2A型を含むkif1Bβ遺伝子関連疾患の試験および診断のために用いることができる旨について記載しているか、さもなければ、他の印刷物、URLなどに示された情報が、この試薬に添付される。
【００５１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する化合物についてスクリーニングする方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、以下を包含する。（a）試験化合物と、本発明のポリペプチドとを接触させる工程、（b）ポリペプチドと、試験化合物との間の結合活性を検出する工程、および（c）本発明のポリペプチドに結合する化合物を選択する工程。
【００５２】
本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドは、例えば、細胞の培養上清または抽出物（本発明のポリペプチドに対して結合するポリペプチドを発現することが予想される）を、アフィニティーカラム（これに対して本発明のポリペプチドが付着（固定）される）に供与し、このカラムに特異的に結合するポリペプチドを精製することによってスクリーニングすることができる。
【００５３】
あるいは、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドは、ウエスタンブロット法またはツーハイブリッドシステムによってスクリーニングすることができる。前者の方法では、ファージベクターを使ったcDNAライブラリーを、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドを発現すると予想される組織または細胞（例えば、脳、ニューロン、など）から調製し、そしてアガロース上のクローニングされたcDNAからポリペプチドを発現させ、フィルターに転写し、固定して、本発明の標識されたポリペプチドと反応させて、結合しているポリペプチドを発現しているプラークを検出する。後者の方法では、本発明のポリペプチドは、GAL4 DNA結合領域、およびGAL4転写活性化領域のような試験タンパク質との融合タンパク質として発現され、試験タンパク質に対する本発明のポリペプチドの結合は、GAL4 DNA結合タンパク質の結合配列を有するプロモーターの下流に連結されたレポーター遺伝子の発現によって検出される。
【００５４】
他のスクリーニング方法は、（1）合成化合物、天然タンパク質、またはランダムファージペプチド提示ライブラリーと、本発明の固定されたポリペプチドとを接触させる工程、および結合分子を検出する工程を包含する方法、ならびに（2）コンビナトリアルケミカル技術に基づくハイスループットを用いて、本発明のポリペプチドに結合する化合物を単離する工程を包含する方法、を含む。
【００５５】
スクリーニングのために用いられる試験サンプルとしては、例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子量化合物、合成ペプチド、天然の化合物などが挙げられるが、それらに限定されない。スクリーニングのために用いられるそれらの試験サンプルは、機会要求としての使用の前に標識されてもよい。標識としては、例えば、放射活性標識および蛍光標識などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５６】
さらに、本発明はまた、本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物を用いて、kif1Bβ遺伝子関連疾患を、処置、緩和、または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法に関する。例えば、トランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、本発明のポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの少なくとも一部を置換、欠失、付加、および／または挿入されることによってこのポリペプチドの発現が抑制される脊椎動物を、本発明のスクリーニング方法のために用いることができる。なぜなら、その脊椎動物は、シャルコー・マリー・ツース病2A型のようなkif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を示すからである。本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を包含する。
（a）本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物に対して候補化合物を投与する工程；
（b）トランスジェニック非ヒト脊椎動物においてkif1Bβ遺伝子関連疾患の症状における変化を観察する工程；および
（c）kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する候補化合物を選択する工程。
【００５７】
例えば、本発明のスクリーニングにおいて用いられる候補化合物としては、天然または合成の化合物、種々の有機化合物、天然または合成の多糖類、タンパク質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの産物、細胞抽出物、および細菌または真菌の成分を挙げることができる。これらの候補化合物を、kif1Bβ遺伝子関連疾患のために、トランスジェニック非ヒト脊椎動物に経口的に投与しても、非経口的に投与してもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチド、または本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を薬剤として用いる場合には、それらを直接患者に投与する、または公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことができる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体（滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）と適宜組み合わせて製剤化して投与することができる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００５９】
本発明に引用されるいかなる患者、患者適用法、刊行物は参照として組み入れられる。
【００６０】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、実施例を参照して以下に詳細に説明されるが、それに限定されると解釈されるべきではない。
【００６１】
実施例１  新しいモーターKIF1Bβは、シナプス小胞前駆体と会合する。
分子クローニング、イムノブロット、免疫組織化学、細胞内画分、GSTプルダウン、および小胞免疫沈澱を、以前に記載されたとおり実施した(Setou, M et al. (2000)Science 288(5472)、1796-802)。以前に記載の方法に従って(Takeda, S et al. (2000)J. Cell Biol. 148(6)、1255-65)ラットの馬尾由来の小胞のイムノEMを実施した。抗シナプトタグミンモノクローナル抗体1D12C5は、タカハシマサミ博士(三菱化成生命科学研究所、日本）から寄贈された。抗シナプトフィジン、および抗SV2モノクローナル抗体は、A. Davies博士、およびI. Jones博士(Inst Viol ＆ Enviol Microbiol)から寄贈された。抗SNAP-25、および抗Mint1(mLin-10)；抗シンタキシン；抗COX I；抗GFP抗体は、それぞれ、BD Transduction Laboratories；Sigma；Molecular Probes；およびClontechから購入した。
【００６２】
kif1Bモータードメイン(Nangaku, M et al. (1994)Cell 79(7)、1209-20)のcDNAフラグメントを用いてプローブした4週齢のICRマウス脳cDNAライブラリーから、マウスkif1Bβ cDNAをクローニングした。このcDNAの配列決定によって、この新しくかつ長いアイソフォームが、1770アミノ酸（199kDの予想分子量を有する）からなることが明らかになった（GenBankアクセッション番号AB023656；Nakagawa, T et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94(18)9654-9)。そのN末端モータードメイン(1〜660aa)は、KIF1BαのN末端モータードメインに対して、ヌクレオチドレベルで100％同一であった。しかし、2つのうち他のドメインは、有意な相同性を共有せず、このことは、別のスプライシング機構が、単一の遺伝子から2つの異なるモーターを生成したことを示唆する（図1A）。
【００６３】
KIF1Bβテールドメインに特異的なウサギポリクローナル抗体が、KIF1Aテールと相同でない、1505〜1536aaに相当する合成ペプチドTTTFESAITPSESSGYDSADVESLVDREKELAC（配列番号:3）に対して産生された。この抗体を用いて、本発明者らは、KIF1Bβのカーゴオルガネラを特徴付け、そして、脳において予想されるサイズの単一のバンド、および他の組織において他のサイズのバンド（おそらく、スプライシング改変体、または翻訳後改変型）を検出した（図1B；Conforti, L et al. (1999)Mamm. Genome 10(6)、617-22；Gong, T. W. et al. (1999)Gene 239(1)、117-27)。この抗体は、KIF1Aと交差反応しない。なぜなら、本発明者らは、抗原としてKIF1Bβ特異的配列を選択したからである。KIF1Bβは、細胞体(cell body)およびニューロンの軸索の両方に広範に分布し（図1CおよびD、図8も参照）、そのテールドメインは、シナプス小胞前駆体のKIF1Aモーターのアミノ酸に対して61％のアミノ酸同一性を有する(Okada, Y et al. (1995)Cell 81(5)、769-80)ため、本発明者らは、種々のシナプスタンパク質とKIF1Bβの会合を試験した。密度勾配遠心分離において、KIF1Bβは、シナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミンを含有する膜オルガネラと同じ画分に分画された(図2A）。GSTプルダウンおよび免疫沈降アッセイ（マウス脳の膜小胞画分(P3)を用いた）によって、KIF1Bβは、シナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミン、シナプトフィジン、およびSV2を含有する小胞と特異的に会合することが示された。しかし、シナプスの原形質膜タンパク質SNAP-25、およびシンタキシン、ミトコンドリアマーカーCOXI、またはKIF17関連タンパク質mLin-10を用いて特異的な会合は検出されなかった（図2B、およびC；Setou, M et al. (2000)Science 288(5472)、1796-802)。これらの結果を、免疫電子顕微鏡（イムノEM）によってさらに確認し、KIF1Bβは小胞膜上のシナプス小胞タンパク質と有意に共存することが示唆された（図2D）。
【００６４】
実施例２  kif1B-/-マウスにおける致死性の神経障害
インビボにおいて、KIF1Bの機能的な重要性を評価するために、本発明者らは、ジーンターゲティングによって、ノックアウトマウスを作製した。本発明者らは、陽性選択カセットを用いて、モータードメインのATP結合コンセンサスPループのコード領域を含む2.2kb部分を置換した（図3）。特に、マウスkif1Bゲノムクローンを、ES細胞株J1のλEMBL3ゲノムライブラリーから得た（Tanaka, Y et al. (1998)Cell 93(7)、1147-58)。Pループエキソンと上流エキソン(P-1)の一部との間にまたがる2.2kbの領域を、ポリ(A)なしのneo選択(neo-selection)カセットによって置換し、そして以前に記載されたとおり、ノックアウト手順を実施した(Harada、A et al. (1994)Nature. 369(6480)、488-91)。キメラマウスを、特別な無菌環境中でC57BL/6J雌性マウスと戻し交配し、そして2つの独立した株を同時に用いた。野生型kif1B対立遺伝子を、以下のプライマーセットを用いてPCR増幅によって検出した：5'-CGCTAGGGTTAAAGCACACGCTAC-3'（配列番号:4）、および5'-TGAACTTAGAAATCCACCTGCCTC-3'（配列番号:5）。以前に記載されたとおりneo導入遺伝子を増幅した(Tanaka, Y et al. (1998)Cell 93(7)、1147-58)。
【００６５】
kif1B-/-仔は、正常なメンデル比で分娩されたが、出生の30分以内に死んだ。それらの肺胞は、拡張せず、従って無呼吸によって、新生児の死亡の原因が十分に説明できた（図3E）。この無呼吸は、おそらく末梢起源ではなかった。なぜなら、呼吸に関与する肺および肋間筋の組織学および超構造は、なんら重大な欠陥を示さなかったからである（図9を参照のこと）。
【００６６】
新生kif1B-/-仔は、複数の神経学的異常を示した。それらは、つねる(pinching)刺激に対して鈍感であり（表1）、それらの身体の姿勢は、前肢が垂れ下がって、極度に前弯性であり（図3D）、このことは、運動感覚神経の機能の全体的な低下を示す。kif1B-/-脳は、コントロールに比べてサイズで約10％低下していた。断面では、脳幹の核および交連線維の細胞質、組織化、および発達は有意に影響された（図3F-I、また図10も参照のこと）。ニューロン細胞体の数は、コントロール中の数の25％未満であった。kif1B-/-の呼吸中枢、または背側および腹側の延髄網様核（MdDおよびMdV）におけるニューロンの損失は、新生児無呼吸の主な原因であり得る。海馬の細胞質および組織化がまた、影響された（図3HおよびI）
【００６７】
（表１）  新生仔の成長異常、および反応性低下
2004534534.tif 000002
全てのデータは、平均±SDで示される。＊p＜0.05、＊＊p＜0.001、t検定
【００６８】
シナプスの構造を試験するために、本発明者らは、シナプス小胞密度を定量した。脊髄の後角をC4レベルで、従来の電子顕微鏡用に処理した。シナプスの60の領域を100nm厚の断片の電子顕微鏡写真から無作為に選択して、以前に記載されたとおり(Yonekawa, Y et al. (1998)J. Cell Biol. 141(2)、431-41)、4対の同腹仔について定量した。結果として、本発明者らは、神経末端のシナプス小胞の密度における有意な低下を見出した（図3Jまた図9Cも参照のこと）。
【００６９】
実施例３  KIF1Bβは、ニューロンにおいて自律的に細胞に作用する。
次いで、本発明者らは、kif1B＋/＋、またはkif1B-/-の海馬ニューロンを培養して、インビトロにおいてニューロン損失表現型を評価した。ニューロンをプレート後、5日連続して観察し、ニューロン分化について確立された基準(Goslin、K、およびBanker, G(1991)Rat hippocampal neurons in low-density culture. In Culturing Nerve Cells, G. Banker, and K. Goslin, ed. (Cambridge, MA；MIT Press), 251-82)を用いて、分化段階0〜4に分類して、定量した。以前に記載されたとおり(Goslin, K, and Banker, G(1991)Rat hippocampal neurons in low-density culture. In Culturing Nerve Cells, G. Banker, and K. Goslin ed. (Cambridge, MA；MIT Press), 251-82；Yonekawa、Y et al. (1998) J. Cell Biol. 141 (2), 431-41)、培養手順および定量的観察を実施した。図4A〜Bに示されるとおり、kif1B-/-ニューロンの生存度は、2日後、有意に低下した。5日目まで、それぞれkif1B-/-およびkif1B＋/＋のニューロンの5％、10％、および90％が生存した（図4B）。ノックアウトニューロンを野生型グリアと同時培養した場合、本発明者らは、kif1Bが、細胞の生存度に対する寄与において、ニューロン中で自律的に細胞に作用すると結論した。
【００７０】
KIF1Bのどのアイソフォームがニューロン損失表現型についての原因である可能性が高いかを評価するため、本発明者らは、救済実験を企てた。EGFPタグ化アイソフォームをコードするアデノウイルスベクターを最初に用いて線維芽細胞を感染させて、イムノブロットによって発現を確認した（図4E）。アデノウイルス構築物の調製のために、KIF1BαおよびKIF1Bβの全長cDNAをEGFP（Clontech)を用いてC末端でタグ化し、そして以前に記載されたとおり（Nakata, T et al. (1998) J. Cell Biol. 140 (3), 659-74)、CAGプロモーターを有するpAdex-Wt1ベクター中に連結して、組み換えアデノウイルスを作製した。直径35mmの皿一枚あたり、1.0×105個のニューロンをプレートし、プレートの日に、同じ力価のKIF1BαまたはKIF1Bβアデノウイルスを感染させ、5日後に生存率を観察した。感染効率は90％を超えており、そして感染したkif1B＋/＋ニューロンの50〜80％が、5日目まで生存した。重要なことに、KIF1Bβを用いた感染（ただしKIF1Bα発現ウイルスではない）は、kif1B-/-ニューロンの生存度を有意に救済した（図4C〜D）。KIF1Bαの欠失によって生じたミトコンドリア輸送における任意の潜在的な欠陥は、冗長なミトコンドリアモーター（例えば、従来のキネシンKIF5A、B、およびC：Tanaka, Y et al. (1998) Cell 93(7), 1147-58；Kanai, Y et al. (2000)J. Neurosci. 20(17)、6374-84)によって明らかに補償された。なぜなら、インビトロ（図11を参照）でも、インビボ（示さず）でも、ノックアウトマウスにおいて、ミトコンドリア分布に変化は観察されなかったからである。このように、KIF1Bβはおそらく、kif1B-/-マウスにおけるニューロン欠失を担う主なアイソフォームであった。
【００７１】
実施例４  kif1B＋/-マウスにおける軸索輸送の特異的な障害
次いで、シナプス小胞前駆体の特定の輸送がモータータンパク質のハプロ不全によって障害されるか否かを試験するために、本発明者らはヘテロ接合体の末梢神経のタンパク質含量を評価した。研究のために、2ヶ月齢kif1B＋/-マウスの坐骨神経を選択した。なぜなら、それらは二次的な欠陥を発症し得る明白な表現型を示さなかったからである。本発明者らは、kif1B＋/＋およびkif1B＋/-マウスの末梢神経におけるいくつかのタンパク質のレベルを、定常状態（図5A）および2時間の神経結紮による累積性の様式（図5B）において比較した。坐骨神経の結紮の2時間後、結紮した部位に対して近位または遠位で1cmの長さの部分を収集して、直ちに液体窒素中で凍結させ、プロテアーゼインヒビターを補充したRIPA緩衝液を含む乳鉢中で砕いて、標準的な方法(Hirokawa, N et al. (1990)J. Cell Biol. 111(3), 1027-37；Takeda, S et al. (2000)J. Cell Biol. 148(6)、1255-65)によってAP結合体化二次抗体を用いてイムノブロットのために処理した。kif1B＋/-マウスの坐骨神経におけるKIF1Bβタンパク質のレベルは、kif1B＋/＋マウスにおけるレベルの半分であって、このことは、ハプロ不全の存在を支持した（図5A〜B）。シナプス小胞タンパク質に関して、シナプトタグミンおよびSV2のレベルは、野生型の約60％であったが、シナプス膜タンパク質SNAP-25およびシンタキシン、ミトコンドリアタンパク質COX I、またはコントロールのキネシンKIF5Aのレベルは、ヘテロ接合体において有意に変化しなかった（図5A）。神経結紮実験によってさらに、シナプス小胞タンパク質の輸送が特別に減少されたことが示された（図5B）。この実験において、ヘテロ接合型軸索において近位部位で蓄積されているシナプス小胞タンパク質の量は、野生型軸索における量に比べて低下していたが、近位部分に蓄積されているシナプス原形質膜タンパク質の量は、ヘテロ接合型と野生型軸索との間で変化はなかった。総タンパク質を染色しても、主な細胞骨格タンパク質のレベルにおいて明白な相違は示されなかった（図5D）。このように、シナプス小胞タンパク質輸送における低下は、軸索輸送の非特異的な全体的障害に起因する可能性は低かった。ニューロンの細胞体が位置する脊髄において、KIF1Bβのレベルのみが低下していたが、シナプトタグミンおよびSV2のレベルは低下しなかった（図5C）。これらのデータを考慮すると、シナプス小胞タンパク質のレベルは、神経軸索において低下したが、ヘテロ接合体の細胞体においては低下しなかったことが示唆され、このことはKIF1Bβモーターによって正常に作動された軸索輸送の特異的な障害を反映する。
【００７２】
実施例５  慢性性末梢神経障害に罹患したkif1B＋/-マウス
kif1B＋/-マウスは、1年齢を超えると徐々に千鳥足になった。彼らは、最終的に自分の体重を支えることができなくなり、時折、跳ねることによってしか動けなくなった（図6A）。本発明者らは、慢性神経障害を疑い、以下の行動学的および生理学的試験によって2ヶ月齢、および12ヶ月齢のマウスを試験した。
【００７３】
kif1B＋/-マウスは、行動学的試験において、進行性の筋力低下、および運動調整不全(discoordination)を示した。本発明者らは、固定バー試験およびロータロッド試験を実施した。固定バー試験では、20mm幅の水平な木製のバーの上にマウスを置いた。3回訓練した後、マウスの保持時間は、以前に記載されたとおり、最大60秒と記録された(Kadotani, H et al. (1996)J. Neurosci. 16(24), 7859-67)。ロータロッド試験では、5分間に4rpmから40rpmに加速する回転ロッド上にマウスを置いた。そしてその保持時間を、本質的に以前に記載されたとおり測定した(Jones, B. J. 、およびRoberts, D. J. (1968)J. Pharm. Pharmacol. 20(4), 302-4)。5日間連続して1日あたり3回試行した。結果として、本発明者らは、12ヶ月齢のkif1B＋/-マウスについては、コントロールについてよりも有意に短い保持時間を検出した（表2）。固定バー試験において、12ヶ月齢のkif1B＋/-マウス（このマウスは、震えていた）は、コントロールよりも、落下する傾向が有意に高かった（表2）。ロータロッド試験において、ヘテロ接合体マウスはまた、訓練の連続する5日を通じて、有意な能力の障害を示した（図6B；表2）。12ヶ月齢のkif1B＋/-マウスの把握力は、kif1B＋/＋マウスの把握力よりも20〜25％弱かった（表2）が、ホットプレート試験を用いて検査した感覚障害は有意ではなかった（データ示さず）。把握強度は、以前に記載されたように測定した(Meyer, O. A. et al. (1979)Neurobehav. Toxicol. 1(3)、233-6)。ホットプレート試験では、56℃のヒートブロックの上にマウスを置き、前肢および後肢をなめる(licking)までの潜時を、60秒のカットオフ潜時で記録した。
【００７４】
（表２）  動物の行動解析
2004534534.tif 000003
データは、固定バー実験および把握力実験において平均±SEとして記し、電気生理学的実験では平均±SDとして記す。＊p＜0.01（マン-ホイットニーのU検定）。＊＊p＜0.0005（t検定）。＊＊＊p＜0.05（マン-ホイットニーのU検定）。
【００７５】
筋力低下の性質を評価するため、本発明者らは、真ん中高めのレベルで、直接刺激後、足底筋で記録した12ヶ月齢の坐骨神経の誘発された複合活動電位を分析した（図6C）。末梢神経伝導速度を、以前に記載されたとおり(Robertson, A et al. (1993)Acta Neuropathol. (Berl)86(2)、163-71)（ただしわずかに改変して）、坐骨神経について決定した。遺伝子型を知らない状態で、全ての記録を実施した。エーテル麻酔下で、坐骨神経を見て、0.1ミリ秒の方形波の坐骨のノッチまたは真ん中高めのレベルで直接刺激し、後肢の足底筋において経皮的に刺入した電極を用いて、複合筋活動電位を記録した。伝導時間を刺激電極と記録電極との間の距離で割ることによって、運動神経伝導速度(MNCV)を算出した。結果として、振幅はkif1B＋/-マウスでは有意に低下したが、伝導速度は、なんら有意な相違を示さなかった（図6C〜D；表2）、このことは、神経の脱髄が要因ではないことを示唆した。さらに、遠位筋肉の組織学的分析は、有意な変化を示さなかった（データ示さず）。このように、神経軸索における欠陥が、kif1B＋/-マウスの末梢神経障害に最も有意に寄与する可能性が高い。
【００７６】
実施例６  ヒトKIF1B変異体は、CMT2A神経障害を起こす
最終的に、本発明者らは、CMT2A（II型シャルコー・マリー・ツース病の常染色体優性サブタイプ）が、ヒトにおけるKIF1Bに基づく神経障害であることを示した。本発明者らがこのことを疑った理由は、ヒト疾患に対するマウス表現型の類似性、およびKIF1Bが第一染色体上でマッピングしたCMT2Aの間隔に関連するからである。本発明者らは、CMT2Aの、以前に十分特徴付けられたヒトの系図（常染色体優性の遺伝的パターンを有する）を分析した（図7A；Saito, M et al. (1997)Neurology 49(6)、1630-5)。CMT2Aの家族＃694における12例の日本人個体由来の末梢血白血球から、高分子量DNAを調製した(Saito, M et al. (1997)Neurology 49(6)、1630-5)。ヒトKIF1B遺伝子の完全なエキソン-イントロン構造に基づいて(Yang, H. W. et al. (2001)Oncogene, 20(36)、5075-83)、各々の47個のエキソンを、記載されたとおりゲノムPCRによって増幅して(Yang, H. W. et al. (2001)Oncogene，20(36)、5075-83)、SSCPおよび／または直接シーケンス解析に供した。低pH緩衝系を用いてSSCP解析を実施して、より長いフラグメントを分離した(Kukita, Y et al. (1997)Hum. Mutat. 10(5), 400-7)。PCR産物を精製して、ABIシーケンサー(Perkin Elmer)を用いて直接配列決定した。多くの一塩基遺伝子多型(SNP)の中でも、本発明者らは、エキソン3中の異常なSSCP移動度シフトが、完全に臨床的兆候と関連していることを検出した。このことは、この系図の4例の罹患した人全部において検出されたが、8例の罹患していない兄弟姉妹でも、95例の関連のない日本人コントロールでも検出されなかった（図7B）。以下のプライマーセット、5'-TGGAAGCAATCAAGTAAGTATAGA-3'（配列番号6）、および5'-CCCCGCATAATGTTCAAGCC-3'（配列番号7）を用いて、95℃30秒、60℃30秒、および72℃30秒を35サイクルの条件下で、続いて72℃で10分の伸長によって、ヒトkif1Bβオーソログのエキソン3を増幅した。次いで、本発明者らは、PCR産物を直接配列決定して、ヘテロ接合性のA→Tの点突然変異（これが、罹患した個体においてQ98をLに転換した）を明らかにした（図7C）。
【００７７】
このQ98L突然変異は、コンセンサスATP結合部位である、Pループの真ん中に存在しており、それによってこのメカノケミカル酵素の機能を破壊すると予測される。従って、本発明者らは、Q98L突然変異を用いて、組み換えマウスKIF1Bβのモーター活性を試験した。Q98L突然変異を、PCR増幅によって、全長マウスkif1Bβ cDNA中に導入して、配列決定によって確認した。最初に、以前に記載されたような標準的方法を用いて(Maeda, K et al. (1992)Mol. Biol. Cell 3(10), 1181-94)、本発明者らは、野生型およびQ98L組み換えKIF1Bβの全長タンパク質の微小管活性化ATP代謝回転を測定したが、これはそれぞれ3.6±0.5、および0.0±0.4nmol/mg/分であった。このように、突然変異されたモーターのATPase活性は有意に低下した。本発明者らは、さらに、Vero細胞において、Q98Lまたは野生型KIF1Bβを発現させて、インビボにおけるそれらの運動性を試験した。陽イオン性脂質を用いて、Vero細胞をトランスフェクトして、24時間培養し、そして抗KIF1Bβポリクローナル抗体および抗αチューブリンモノクローナル抗体DM1A(Sigma)を用いて免疫染色した。微小管の陽極末端に向かうその運動性に起因して、過剰発現した野生型KIF1Bβタンパク質は、細胞周辺に蓄積した（図7D、左側）。対照的に、Q98L変異体タンパク質は、核周囲の領域に残留して凝集した（図7D、右側）。これらのデータによって、Q98L点突然変異がモーター活性の機能的な損失を生じることが示唆された。
【００７８】
産業上の利用可能性
本発明は、シナプス小胞前駆体を輸送するモーター活性を有する新規なポリペプチドであるKIF1Bβタンパク質を提供する。本発明はまたこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターを保有する宿主細胞、このポリペプチドを調製するための方法、およびkif1Bβ遺伝子関連疾患を診断するための方法を提供する。さらに、本発明は、kif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。本発明のポリペプチド、このポリペプチドをコードする遺伝子、およびkif1Bβ遺伝子関連疾患の症状を緩和する化合物は、kif1Bβ遺伝子関連疾患、例えば、シャルコー・マリー・ツース病2A型のための治療剤または予防剤を開発するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】マウスKIF1Bβの分子クローニングおよび抗体特徴付けを示すダイアグラムおよび写真を示す。（A）kif1B cDNAの略図。DNAマトリックスプロット（ウインドウサイズ＝30、最小スコア％＝65）は、テールドメインにおけるスプライシングバリエーションを示す。（B）抗KIF1Bβ抗体でプローブした成体マウス組織のイムノブロット。（CおよびD）KIF1Bβに対する免疫蛍光顕微鏡検査法。（C）前角における運動ニューロン。（D）軸索路を示す、脊髄の断面。バーは、10μm。
【図２】マウスKIF1Bβとシナプス小胞前駆体の会合を示す写真である。（A）ナイコデンツ（Nycodenz）密度勾配フローテーションアッセイであって、これは、KIF1Bβがシナプトタグミンを含有する小胞画分に存在することを示す。矢印は、浮かんだ(floated)ピークを示す。（B）KIF1Bβ会合小胞のGSTプルダウンアッセイ。シナプス小胞タンパク質は、KIF1Bβテール領域(aa885-1700)に会合した小胞中で特異的に検出されたが、プレックストリン(pleckstrin)相同性(PH)ドメインを欠く短縮構築物(ΔPH；aa885-1528)に会合した小胞中では検出されなかった。（C）抗KIF1Bβ、およびいくつかの抗シナプス小胞タンパク質抗体を用いる、マウス脳の小胞画分の免疫沈降。コントロールには、KIF17を用いた。シナプス小胞タンパク質であるシナプトタグミン、シナプトフィジン、およびSV2を、KIF1Bβ、COXI、チトクロムオキシダーゼI（ミトコンドリアのマーカー）と同時免疫沈降した小胞中で特異的に検出した。（D）軸索小胞上のKIF1Bβ（10-nm金）、およびシナプス小胞タンパク質（5-nm金）の共存を示すイムノEM。バーは、100nm。無作為に選択した領域における、全ての小胞の数を上回る、両方のシグナルを担持する小胞の数の割合を示した。＊＊、p＜0.001（独立性検定、カイ二乗）。
【図３】マウスkif1B遺伝子の標的化破壊を示すダイアグラムおよび写真を示す。（A）kif1Bノックアウトについてのターゲティングストラテジー。HincIIによるゲノムサザンブロットについてのストラテジーがまた示される。A＋T/pau、AT-リッチ休止(pausing)シグナル；pBS、pBluescriptII-SK(＋)；Hc、HincII。（B）ゲノムサザンブロットであって、ここでは、組み換え対立遺伝子は、2.1kbのさらなるバンドを与える。（C）それぞれ、抗KIF1Nβ抗体、および抗KIF1Bα抗体を用いる、18.5dpcのマウス脳からの粗抽出物のイムノブロット解析。両方の場合とも、kif1B-/-サンプルからバンドは検出されなかった。（D）新生同腹仔の外観。kif1B-/-仔で特異的に見出される、前肢の垂れ下がり（矢印）、および前弯性姿勢（矢尻型）に注目のこと。（E）HE染色した肺断面。肺胞（アスタリスク）は、コントロールマウスにおいては、空気で膨張させられただけであることに注意のこと。バーは、25μm。（F〜I）kif1B-/-マウスにおける脳欠陥。（F〜G）18.5dpcでの、kif1B＋/＋（F）、およびkif1B-/-（G）マウスの延髄の断面における呼吸中枢の比較。MpD:背側延髄網状核、MdV:腹側延髄網状核、VLRt:腹外側網状核。バーは、500μm。（H〜I）18.5dpcでの、kif1B＋/＋（H）、およびkif1B-/-（I）の胚の大脳半球の前額断（交連線維の不完全形成を伴う）。矢尻型は、前交連；矢印は、内包。バーは、600μm。（J）18.5dpcでのkif1B-/-マウスの脊髄の前角領域の神経末端におけるシナプス小胞の密度の低下。＃1〜＃4は、カウントした4つの異なる領域を示す。
【図４】kif1B-/-海馬の初代培養における神経細胞死を示すダイアグラムおよび写真を示す。（A）各々の遺伝子型の初代培養の時間的経過。分化の有意な遅延を伴うkif1B-/-ニューロンの重篤なニューロン死亡に注意のこと。矢印は、死亡した細胞。バーは、20μm。（B）各々の遺伝子型のプレートしたニューロンの生存曲線および分化曲線。1単位面積あたりの最初の細胞数を100％として、ニューロン細胞数の相対指数を算出した。（C〜E）救済実験である。（C）感染の5日目のkif1B-/-海馬ニューロンの救済された培養物。緑色蛍光は、各々のアデノウイルスベクター（EGFPによってタグ化されたkif1Bアイソフォームを発現する）を発現するニューロンを示す。ニューロンは、kif1Bβ構築物のみを用いて高度に分化した段階に到達したことに注目のこと。矢印は、死亡した細胞。バーは、10μm。（D）kif1B-/-ニューロンの救済効率の定量。＊p＜0.001．βはkif1Bβ、αはkif1Bα、Nは、非感染コントロール。（E）抗GFP抗体を用いる、感染した線維芽細胞溶解物のイムノブロット。各々のEGFPタグ化タンパク質は、予期される分子量のバンドを生じた。
【図５】kif1B＋/-坐骨神経軸索におけるシナプス小胞タンパク質のレベルの低下を示す写真を示す。（A）坐骨神経抽出物のイムノブロット。各々のレーンに10μgのタンパク質をロードした。kif1B＋/-神経におけるタンパク質レベルは、kif1B＋/＋神経におけるタンパク質レベルの割合として示された。（B）ライゲーションの2時間後の坐骨神経におけるプールされたオルガネラのイムノブロット。結紮された部位に対して1cmの領域近位(Prox）、および遠位(Dist）からのタンパク質レベルを、比較した。（C）（A）と同様に調製した脊髄抽出物のイムノブロット。（D）坐骨神経および脊髄由来の抽出物のクマーシーブリリアントブルーによるタンパク質染色。各々のレーンに10μgの総タンパク質をロードした。
【図６】kif1B＋/-マウスにおける慢性的末梢神経障害を示すダイアグラムおよび写真を示す。（A）1.5歳齢のマウスの代表的な姿勢。kif1B＋/-マウスは、自身の体重を支持できなかったことに注目のこと。（B）5つ連続するトライアルにおける2ヶ月齢および12ヶ月齢のマウスのロータ-ロッド試験における保持時間。5日間のトレーニング後の改善にかかわらず、12ヶ月齢のkif1B＋/-マウスの保持時間は、kif1B＋/＋マウスの保持時間よりも依然として有意に短かった(n＝12、p＜0.005、ANOVA検定)。（C〜D）12ヶ月齢のマウスの坐骨神経の電気生理学的解析。（C）足底筋肉での誘発された活動電位の典型的トレース。（D）運動神経伝導速度(MNCV）、および誘発された筋電位の振幅の数値化。振幅は低下されたが、MNCVは、有意に変化しなかった。このことは、この疾患が軸索起源であることを示唆する。
【図７】CMT2A患者由来のヒトKIF1B遺伝子における、機能損失の変異を示すダイアグラムおよび写真を示す。（A）＃694ファミリーの系図。丸印は雌性、四角は雄性、斜線は死亡した個体、白抜きの図形は未影響、黒塗りの図形は影響されたもの。（B）P-ループエキソン3についてのPCR-SSCP解析における運動度シフト。矢印は、影響を受けた個体における、特別に観察されたシフトしたバンド。（C）P-ループ領域における配列のエレクトロフェログラム(electropherogram)。影響を受けた個体由来のサンプルにおいては、AおよびTは、変異したコドンで同時に読まれ、その結果、ヘテロ接合性のQ98L点突然変異が生じる。（D）野生型またはQ98L変異KIF1Bβ構築物のいずれかによってトランスフェクトされたVero細胞の免疫蛍光検査。赤および緑のシグナルは、それぞれKIF1Bβおよびチューブリンを示す。KIF1Bβタンパク質の蓄積された位置における相違（矢印）に注目のこと。バーは、15μm。
【図８】KIF1Bβの空間時間的な発現パターンについてのイムノブロットを示す写真を示す。（A）4週齢のマウス神経系におけるKIF1Bβの広範な分布。（B）脳におけるKIF1Bβの連続的な発生上の発現。20μgのタンパク質を各々のレーンにロードした。
【図９】kif1B-/-マウスにおける新生児無呼吸表現型の中央起源（ただし末梢起源ではない）を示す写真を示す。（A）各々の遺伝子型の新生児の肺におけるII型肺胞上皮細胞の電子顕微鏡写真。分泌された層板体（矢印）が、両方のサンプル中で見出されることに注目のこと。このことは、肺上皮の機能が、kif1B-/-マウスにおいて保存されることを示唆した。バーは2μmである。（B）各々の遺伝子型の新生児の肋間筋の電子顕微鏡写真。kif1B-/-マウスにおける筋線維の正常な発達によって、この表現型が筋肉起源であることは除外される。バーは2μm。（C）脊髄の後角領域の電子顕微鏡写真であって、神経終末におけるシナプス小胞の密度がkif1B-/-マウスにおいて有意に低下したことを示す。テキストを参照のこと。バーは、400nmである。
【図１０】kif1B-/-マウスにおける顔面神経核の不完全な発達を示す写真を示す。（A）各々の遺伝子型の各々の段階での、延髄のHE染色した7μm厚のパラフィン包埋断面。顔面神経核（丸で囲んだ）のサイズは、kif1B＋/＋胚において徐々に増大したが、kif1B-/-胚においては有意に減少しており、このことは、インビボにおけるニューロンの発達および生存における、kif1B遺伝子の機能的な重要性を示す。バーは400μm。（B）各々の遺伝子型の18.5dpcの顔面神経核（丸囲み）のトルイジンブルー染色した7μm厚のパラフィン断面。細胞体の数の有意な減少に注目のこと。ニッスル小体の染色が弱いほど、kif1B-/-ニューロンの生存度の低さを反映する。バーは80μm。
【図１１】Mitotracker(Molecular Probes)によってプローブされた各々の遺伝子型の培養された海馬ニューロンにおけるミトコンドリア染色を示す写真を示す。このミトコンドリアは、両方の表現型の神経軸索において同様に分布したことに注目されたい。バーは10μm。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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