(57)【要約】本発明は、スルホンアミドスクアラミドの、ケモカイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）により媒介される病状の治療における新規な使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2004521106.tif 000005
（Ｉ）
［式中：
Ｒ１は、独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ１−１０アルコキシ、ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ、アジド、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)ｔＲ４、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールオキシ、アリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ、アリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｒ５、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)３Ｈ，Ｓ(Ｏ)３Ｒ８、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＯＲ１１(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＯＲ１２、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＯＣ(Ｏ）Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＨＳ(Ｏ)２Ｒ１７、(ＣＲ８Ｒ８)ｑおよびＳ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択されるか；あるいは２個のＲ１部分が一緒になってＯ−(ＣＨ２)ｓＯ−または５もしくは６員の不飽和環を形成し；
Ｒｂは、独立して、水素、ＮＲ６Ｒ７、ＯＨ、ＯＲａ、Ｃ１−５アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールＣ２−４アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルＣ１−５アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ２−４アルケニル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルおよびヘテロサイクリックＣ２−４アルケニル部分からなる群より選択され；その部分はすべて、独立して１ないし３回、ハロゲン、ニトロ、ハロ置換Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、アミン、モノまたはジ−Ｃ１−４アルキル置換アミン、ＯＲａ、Ｃ(Ｏ)Ｒａ、ＮＲａＣ(Ｏ)ＯＲａ、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７、ヒドロキシ、ＮＲ９Ｃ(Ｏ)Ｒａ、Ｓ(Ｏ)ｍ'Ｒａ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、Ｓ(Ｏ)２ＮＲ６Ｒ７およびＮＨＳ(Ｏ)２Ｒａにより置換されていてもよく；あるいは２個のＲｂ置換基を結合させて、置換されていてもよく、炭素に加えて、独立して１ないし３個のＮＲａ、Ｏ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２部分を含有してもよい、不飽和とすることのできる３−１０員環を形成し；
ｑは０または１ないし１０の整数であり；
ｔは０または１もしくは２の整数であり；
ｓは１ないし３の整数であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックおよびヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択されるか；あるいはＲ４およびＲ５はそれらの結合する窒素と一緒になって、酸素、窒素または硫黄より選択される付加的なヘテロ原子を含んでいてもよい５ないし７員環を形成し；
Ｙは、独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ１−１０アルコキシ、ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ、アジド、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)ｔＲ４、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールオキシ、アリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル、アリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｒ５、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)３Ｈ、Ｓ(Ｏ)３Ｒ８、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＯＲ１１、Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＯＲ１２、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＯＣ(Ｏ）Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＨＳ(Ｏ)２Ｒｄおよび(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択されるか；あるいは２個のＹ部分が一緒になってＯ−(ＣＨ２)ｓＯ−または５もしくは６員の不飽和環を形成し；
ｎは１ないし５の整数であり；
ｍは１ないし４の整数であり；
Ｒ８は水素またはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１０はＣ１−１０アルキルＣ(Ｏ)２Ｒ８であり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロサイクリックおよび置換されていてもよいヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−１０アルキル、置換されていてもよいアリールおよび置換されていてもよいアリールアルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１７は、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックおよびヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択される；ここでアリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック環はすべて置換されていてもよい］
で示される化合物。
【請求項２】
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,６−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,４−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[３−((Ｓ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
(１−{６−クロロ−３−[２−フェニルアミノ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル}−ピペリジン−４−イル)−カルバミン酸tert−ブチルエステル；
３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−２−ヒドロキシ−３−[２−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[３,４−ジオキソ−２−(２−フェノキシ−フェニルアミノ)−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド
またはその適当な塩である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
有効量の請求項１に記載の化合物および医薬上許容される担体または希釈体を含む医薬組成物。
【請求項４】
哺乳動物においてケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体に結合する、ケモカイン介在病状を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の請求項１に記載の式の化合物を投与することを含む方法。
【請求項５】
哺乳動物が、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人性呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳卒中、感染性ショック、多発性硬化症、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒素ショック症候群、心臓および腎臓再灌流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植片拒絶反応、マラリア、再狭窄、血管形成、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎および望ましくない造血幹細胞放出ならびに呼吸器ウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患、髄膜炎、嚢胞性線維症、早期分娩、咳、そう痒、多器官機能不全、外傷、緊張、捻挫、挫傷、乾癬性関節炎、ヘルペス、脳炎、ＣＮＳ血管炎、外傷性脳傷害、ＣＮＳ腫瘍、クモ膜下出血、手術後外傷、間質性肺炎、過敏症、結晶誘導性関節炎、急性および慢性膵炎、急性アルコール性肝炎、壊死性全腸炎、慢性副鼻腔炎、ブドウ膜炎、多発性筋炎、血管炎、ざ瘡、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、セリアック病、食道炎、舌炎、気流閉塞、気道過敏症、閉塞性細気管支炎器質化肺炎、気管支拡張症、細気管支炎、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺性心、呼吸困難、肺気腫、高炭酸血症、高度膨脹、低酸素血症、過酸素症誘導性炎症、低酸素症、手術肺容積減少、肺線維症、肺高血圧症、右室肥大、サルコイドーシス、末梢気道疾患、換気血流不均等、喘鳴、かぜ、および狼瘡からなる群から選択されるケモカイン介在疾患を患っているところの、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な一群のスルホンアミドスクアラミド（squaramide）化合物、その調製方法、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８介在疾患の治療おけるそれらの使用、ならびにかかる治療に使用するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）に対し、好中球誘引／活性化蛋白−１（ＮＡＰ−１）、単球由来好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）、好中球活性化因子（ＮＡＦ）およびＴ−細胞リンパ球走化性因子などの、多数の異なる名称が使われている。インターロイキン−８は、好中球、好塩基球および下位群のＴ−細胞に対する化学誘引物質である。これは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＬＰＳに曝露されたマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞を含む大部分の有核細胞により、およびＬＰＳまたはＦＭＬＰなどの走化性因子に曝露された場合に好中球それ自体により産生される。M.Baggioliniら、J.Clin.Invest. 84、1045（1989)；J.Schroderら、J.Immunol. 139、3474（1987）およびJ.Immunol. 144、2223（1990)；Strieterら、Science 243 1467（1989）およびJ.Biol.Chem. 264、10621（1989)；Cassatellaら、J.Immunol. 148、3216（1992)。
ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２もまたケモカインαファミリーに属する。ＩＬ−８と同様に、これらのケモカインもまた様々な名称で呼ばれてきた。例えば、ＧＲＯα、β、γは、各々、ＭＧＳＡ（黒色腫増殖刺激活性：Melanoma Growth Stimulating Activity）α、βおよびγと称される。Richmondら、J.Cell Physiology 129、375（1986）およびChangら、J.Immunol 148、451（1992）を参照のこと。ＣＸＣモチーフの直ぐ前にＥＬＲモチーフを有するα−ファミリーのケモカインは、全て、ＩＬ−８Ｂ受容体に結合する。
【０００３】
ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８は、インビトロにて多くの機能を刺激する。それらはすべて好中球に対して化学誘引性を有することが明らかにされたが、ＩＬ−８およびＧＲＯαはＴ−リンパ球および好塩基球走化性活性を示した。加えて、ＩＬ−８は正常な個体由来およびアトピー性個体由来の両方の好塩基球からのヒスタミン放出を誘発しうる。加えて、ＧＲＯ−αおよびＩＬ−８は、好中球からのリソソーム酵素放出および呼吸バーストを誘発しうる。ＩＬ−８はまた、新たに蛋白を合成することなく、好中球上でＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）の表面発現を増加させることが明らかにされた。このことは、好中球の血管内皮細胞への付着の増加を引き起こすかもしれない。多くの既知の疾患が大量の好中球浸潤により特徴付けられる。ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は好中球の蓄積および活性化を促進するので、これらのケモカインは、乾癬および慢性関節リウマチを含む広範囲に及ぶ急性および慢性炎症性障害と関係付けられてきた。Baggioliniら、FEBS Lett. 307、97（1992)；Millerら、Crit.Rev.Immunol. 12、17（1992)；Oppenheimら、Annu.Rev.Immunol. 9、617（1991)；Seitzら、J.Clin.Invest. 87、463（1991)；Millerら、Am.Rev.Respir.Dis. 146、427（1992)；Donnelyら、Lancet 341、643（1993)。加えて、ＥＬＲケモカイン（ＣＸＣモチーフの直前にアミノ酸ＥＬＲモチーフを含有するもの）はまた、血管鬱滞とも関連付けられてきた。Strieterら、Science 258、1798（1992)。
【０００４】
ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、インビトロにて、７回膜貫通型Ｇ−蛋白結合ファミリーの受容体と結合してそれを活性化することにより、特に、ＩＬ−８受容体、最も顕著には、Ｂ受容体と結合することにより、好中球の形状変化、走化性、顆粒放出および呼吸バーストを誘発する。Thomasら、J.Biol.Chem. 266、14839（1991)；およびHolmesら、Science 253、1278（1991)。この受容体ファミリーのメンバーに対する非ペプチド性小型分子アンタゴニストの開発が進められてきた。総説については、R.Freidinger in:Progress in Drug Research、Vol.40、pp.33-98、Birkhauser Verlag、Basel 1993 を参照のこと。したがって、ＩＬ−８受容体は新規な抗炎症剤を創薬するための有望な標的である。
２つの高親和性ヒトＩＬ−８受容体（７７％相同性）が特徴付けられている：ＩＬ−８ＲαはＩＬ−８のみと高親和性をもって結合し、ＩＬ−８ＲＢはＩＬ−８に対して、ならびにＧＲＯ−α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２に対して高親和性を有する。Holmesら、前掲；Murphyら、Science 253、1280（1991)；Leeら、J.Biol.Chem. 267、16283（1992)；LaRosaら、J.Biol.Chem. 267 25402（1992)；およびGayleら、J.Biol.Chem. 268、7283（1993）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該分野において、ＩＬ−８αまたはβ受容体との結合能を有する化合物に対する処理が依然として必要とされている。したがって、ＩＬ−８産生の増加（好中球およびＴ−細胞下位群の炎症部位への走化性に関与する）に付随する症状はＩＬ−８受容体結合の阻害物質である化合物により利益を得るであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体に結合するものであるケモカイン介在疾患の治療法であって、有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。特に、ケモカインはＩＬ−８である。
本発明はまた、ＩＬ−８とその受容体との結合の阻害を必要とする哺乳動物におけるかかる阻害方法であって、かかる哺乳動物に有効量の式（Ｉ）で示される化合物を投与することを含む方法に関する。
【０００７】
本発明において有用な式（Ｉ）の化合物は、構造式：
【化１】
2004521106.tif 000002
（Ｉ）
【０００８】
Ｒ１は、独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ１−１０アルコキシ、ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ、アジド、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)ｔＲ４、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールオキシ、アリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ、アリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｒ５、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)３Ｈ，Ｓ(Ｏ)３Ｒ８、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＯＲ１１(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＯＲ１２、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＯＣ(Ｏ）Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＨＳ(Ｏ)２Ｒ１７、(ＣＲ８Ｒ８)ｑおよびＳ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択されるか；あるいは２個のＲ１部分が一緒になってＯ−(ＣＨ２)ｓＯ−または５もしくは６員の不飽和環を形成し；
【０００９】
Ｒｂは、独立して、水素、ＮＲ６Ｒ７、ＯＨ、ＯＲａ、Ｃ１−５アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールＣ２−４アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルＣ１−５アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロアリールＣ２−４アルケニル、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキルおよびヘテロサイクリックＣ２−４アルケニル部分からなる群より選択され；その部分はすべて、独立して１ないし３回、ハロゲン、ニトロ、ハロ置換Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキル、アミン、モノまたはジ−Ｃ１−４アルキル置換アミン、ＯＲａ、Ｃ(Ｏ)Ｒａ、ＮＲａＣ(Ｏ)ＯＲａ、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７、ヒドロキシ、ＮＲ９Ｃ(Ｏ)Ｒａ、Ｓ(Ｏ)ｍ'Ｒａ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ７、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲａ、Ｓ(Ｏ)２ＮＲ６Ｒ７およびＮＨＳ(Ｏ)２Ｒａにより置換されていてもよく；あるいは２個のＲｂ置換基を結合させて、所望により置換されていてもよく、炭素に加えて、独立して１ないし３個のＮＲａ、Ｏ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２部分を含有してもよい、所望により不飽和とすることのできる３−１０員環を形成し；
ｑは０または１ないし１０の整数であり；
ｔは０または１もしくは２の整数であり；
ｓは１ないし３の整数であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックおよびヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択されるか；あるいはＲ４およびＲ５はそれらの結合する窒素と一緒になって、酸素、窒素または硫黄より選択される付加的なヘテロ原子を含んでいてもよい５ないし７員環を形成し；
【００１０】
Ｙは、独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ハロ置換Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ１−１０アルコキシ、ハロ置換Ｃ１−１０アルコキシ、アジド、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)ｔＲ４、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１−４アルキル、アリール、アリールＣ１−４アルキル、アリールオキシ、アリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールＣ１−４アルキルオキシ、ヘテロサイクリック、ヘテロサイクリックＣ１−４アルキル、アリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロアリールＣ２−１０アルケニル、ヘテロサイクリックＣ２−１０アルケニル、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｒ５、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ５、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＮＲ４Ｒ１０、Ｓ(Ｏ)３Ｈ、Ｓ(Ｏ)３Ｒ８、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)Ｒ１１、Ｃ２−１０アルケニルＣ(Ｏ)ＯＲ１１、Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＣ(Ｏ)ＯＲ１２、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＯＣ(Ｏ）Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＲ４Ｃ(Ｏ)Ｒ１１、(ＣＲ８Ｒ８)ｑＮＨＳ(Ｏ)２Ｒｄおよび(ＣＲ８Ｒ８)ｑＳ(Ｏ)２ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択されるか；あるいは２個のＹ部分が一緒になってＯ−(ＣＨ２)ｓＯ−または５もしくは６員の不飽和環を形成し；
【００１１】
ｎは１ないし５の整数であり；
ｍは１ないし４の整数であり；
Ｒ８は水素またはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１０はＣ１−１０アルキルＣ(Ｏ)２Ｒ８であり；
Ｒ１１は、水素、Ｃ１−４アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいヘテロアリールＣ１−４アルキル、置換されていてもよいヘテロサイクリックおよび置換されていてもよいヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−１０アルキル、置換されていてもよいアリールおよび置換されていてもよいアリールアルキルからなる群より選択され；および
Ｒ１７は、Ｃ１−４アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールＣ１−４アルキル、ヘテロサイクリックおよびヘテロサイクリックＣ１−４アルキルからなる群より選択される；ここでアリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリック環はすべて置換されていてもよい］
で示される。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
式（Ｉ）の化合物は、ＩＬ−８の阻害あるいはＩＬ−８ＲＡおよびＲＢ受容体に結合する他のケモカインの阻害を必要とするヒト以外の哺乳動物の獣医学上の治療に関しても用いることができる。動物において治療的または予防的に処理されるケモカイン介在疾患は、本明細書中、治療方法のセクションにおいて言及される病状を包含する。
本明細書において用いられる以下の用語は、次のとおりである：
・「ハロ」は、すべてのハロゲン、すなわち、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードである。
・「Ｃ２−５アルキル」または「アルキル」は、鎖長に特に断りのない限り、炭素数２ないし５の直鎖および分岐鎖の両方の部分であり、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどを含むがこれらに限定されるものではない。
・「アルケニル」なる語は、本明細書において、あらゆる場合に、鎖長に特に断りのない限り、炭素数２−１０の直鎖または分岐鎖部分を意味するのに用いられ、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどを含むがこれらに限定されるわけではない。
・「アリール」はフェニルおよびナフチルである。
【００１３】
「ヘテロアリール」（それ自体または「ヘテロアリールオキシ」または「ヘテロアリールアルキル」などの組合せにおいて）は、５ないし１０員の芳香族環系であって、１またはそれ以上の環がＮ、ＯまたはＳからなる群から選択される１またはそれ以上のヘテロ原子を含む、ピロール、ピラゾール、フラン、チオフェン、キノリン、イソキノリン、キナゾリニル、ピリジン、ピリミジン、オキサゾール、チアゾール、チアジアゾール、トリアゾール、イミダゾールまたはベンズイミダゾールなどの芳香族環系であるが、これらに限定されるものではない。
・「ヘテロサイクリック」（それ自体または「ヘテロサイクリックアルキル」などの組合せにおいて）は、飽和または部分的に不飽和の４ないし１０員環系であって、１またはそれ以上の環がＮ、Ｏ、またはＳからなる群から選択される１またはそれ以上のヘテロ原子を含む、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラヒドロピランまたはイミダゾリジンなどの環系であるが、これらに限定されるものではない。
「アリールアルキル」または「ヘテロアリールアルキル」または「ヘテロサイクリックアルキル」なる語は、本明細書において、特に限定しない限り、上記したアリール、ヘテロアリールまたはヘテロサイクリック部分に結合した上記したＣ１−１０アルキルを意味するのに用いられる。
【００１４】
式（Ｉ）の代表的な化合物は：
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,６−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,４−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[３−((Ｓ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
【００１５】
６−クロロ−３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
(１−{６−クロロ−３−[２−フェニルアミノ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル}−ピペリジン−４−イル)−カルバミン酸tert−ブチルエステル；
３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン；
６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−２−ヒドロキシ−３−[２−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[３,４−ジオキソ−２−(２−フェノキシ−フェニルアミノ)−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド；
６−クロロ−３−[２−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド
またはその適当な塩を包含する。
【００１６】
（調製法）
式（Ｉ）の化合物は、そのいくらかを以下のスキームに示す、合成操作を適用することによって得ることができる。これらのスキームにおいて提供される合成法は、本明細書に概説される反応と適合するように、適宜保護された任意の置換基を利用し、反応性の種々の異なるＲ、Ｒ１およびアリール基を有する式（Ｉ）の化合物の生成に適用できる。このようなケースにおいては、その後に脱保護を行い、ついで一般に開示された性質の化合物が得られる。一旦、グアニジン核が確立されると、当該技術分野で周知の官能基相互変換の標準的技術を適用することによってこれらの式のさらなる化合物を調製できる。スキームを式（Ｉ）の化合物だけで示すが、これは単に例示を目的とするものに過ぎない。
【００１７】
【化２】
2004521106.tif 000003
【００１８】
式（Ｉ）の望ましい化合物はスキーム１に概説するようにして調製することができる。ジクロロスクアレート（dichlorosquarate)２はスクアリック酸（squaric acid)１から塩化メチレン中のオキサリルクロリドおよび触媒量のＤＭＦおよび４５℃に加熱といった当該技術分野で周知の標準的塩素化方法を用いて調製できる。ＴＨＦなどの有機溶媒中でのジクロロスクアレート２と所望のフェノールアニリン３との反応によってモノ−クロロスクアレート４が得られる。ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で室温または４５℃に加熱してのモノ−クロロスクアレート４と所望のアニリン５との反応により標的とする式（Ｉ）の化合物が得られる。
【００１９】
【化３】
2004521106.tif 000004
【００２０】
スキーム１における所望のフェノールアニリン３が市販されていない場合は、スキーム２において概説するようにして調製することができる。市販されている置換３−クロロアニリン１を、塩化メチレンなどの適当な有機溶媒中、塩化ピバボリルおよびトリエチルアミンなどの当該分野にて周知の標準的条件を用いてアミド２に変換することができる。このアミド２は、−２０℃と−４０℃の間の低い反応温度の下で、ＴＨＦなどの適当な有機溶媒中のブチルリチウムなどの強塩基を触媒量にて用い、つづいて該反応を二酸化硫黄気体でクエンチして、ベンズオキサゾール３に変換することができる。このスルホン酸３は、塩化メチレンなどの適当な有機溶媒中での塩化スルフリルなどの当該分野にて周知の標準条件を用い、塩化スルホニル中間体を得、スルホンアミド４に変換することができる。その塩化スルホニル中間体は、当該分野にて周知の標準条件を用い、塩化メチレンなどの適当な有機溶媒中、トリエチルアミンなどの適当なアミンの塩基の存在下、その中間体をアミン：ＨＮ(Ｒｂ)２と反応させることによりスルホンアミド４に変換することができる。所望のフェノールアニリン５は、水中硫酸および８５℃での加熱などの、当該分野にて周知の標準的加水分解条件を用いてベンズオキサゾール４から得ることができる。
【００２１】
（合成例）
本発明を以下の実施例に言及して記載するが、これは単に例示的なものであって本発明の範囲を限定するためのものではない。特に断りのない限り、すべての温度は摂氏温度であり、すべての溶媒は入手可能な最高純度のものであり、すべての反応はアルゴン雰囲気下で無水条件下で行った。
実施例における温度はすべて摂氏温度（℃）である。質量スペクトルは、特に断りのない限り、高速原子衝撃を用いるＶＧ  Ｚａｂ質量分析計で行った。１Ｈ−ＮＭＲ（以下、「ＮＭＲ」と称する）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭ２５０またはＡｍ４００分光計を用いて２５０ＭＨｚで記録した。示された多重度は：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線およびｂｒはブロードなシグナルを示す。Ｓａｔ．は飽和溶液を示し、ｅｑは主反応物に対する試薬のモル当量の割合を示す。
【００２２】
実施例１
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
Ｎ−(３,４−ジクロロ−フェニル)−２,２−ジメチル−プロピオンアミド
ＴＢＭＥ（１Ｌ）中の３,４−ジクロロアニリン（１５０ｇ）を１０−１５℃に冷却した。３０％水性ＮaＯＨ（１４１ｇ、１.１４当量）を添加し、その溶液をオーバーヘッド式攪拌機を用いて激しく攪拌した。塩化トリメチルアセチル（「ＰｉｖＣｌ」、１２６ｍＬ）を内部温度が３０℃より低く維持されるような速度で加えた。この添加の間に、この混合溶液は白色固体生成物で混濁するようになった。添加完了（１０−１５分）後、混合物を３０−３５℃に１時間加熱し、ついで冷却した。反応混合物を−５℃に（一夜）保持し、ついで濾過し、まず水／ＭｅＯＨ（９０：１０、６００ｍＬ）で、次に水（９００ｍＬ）でリンスした。真空下で乾燥させて、灰白色結晶として生成物（１９５ｇ、８６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ２４６（Ｍ−Ｈ）＋。
【００２３】
塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル
Ｎ−(３,４−ジクロロ−フェニル)−２,２−ジメチル−プロピオンアミド（１０ｇ、４１ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中溶液をアルゴン下で−７２℃に冷却した。ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ、６４ｍＬ、１０２ミリモル）を滴下した。該溶液を約−５０℃に４５分間加温し、ついで−２５ないし−１０℃の範囲で２時間維持した。ついで、該溶液を−７８℃に再び冷却し、二酸化硫黄をその溶液に３０分間にわたって通気した。ついで、該溶液を２時間にわたって室温まで加温し、その加温の間に過剰量の二酸化硫黄を逃がすことができるように排気口を設けて、その溶液にアルゴン流を通気した。そのＴＨＦ溶液を氷浴中で冷却し、塩化スルフリル（３.５８ｍＬ、４４.９ミリモル）を滴下した。２、３分後、該溶液を一夜室温にて加温した。混合物を濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。脱色炭を添加し、その混合物を濾過した。得られた溶液を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、濃縮して標記化合物を得た（１２.４ｇ、９８％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ７.９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.４Ｈｚ）、１.５７（ｓ，９Ｈ）。
【００２４】
スルホニルアミドを合成する一般的操作
２−tert−ブチル−６−クロロ−７−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−ベンゾオキサゾール
０℃での、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル（２.６９ｇ、８.７３ミリモル）およびトリエチルアミン（２.４４ｍＬ、１７.５ミリモル）のＴＨＦ（６０ｍＬ）中溶液に、１−メチルピペラジン（０.９８ｍＬ、８.８３ミリモル）を添加した。反応物を室温まで加温し、一夜攪拌させた。その溶液を濃縮し、ついで水で希釈し、酢酸エチル（３回）抽出した。合した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（８０％酢酸エチル／２０％エタノール）に付して標記化合物（２.４５ｇ、７６％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ３７２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２５】
ベンゾオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的操作
６−アミノ−３−クロロ−２−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェノール
２−tert−ブチル−６−クロロ−７−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−ベンゾオキサゾール（２.４４ｇ、６.５６ミリモル）の１,４−ジオキサン（２０ｍＬ）中溶液を水（４ｍＬ）および濃Ｈ２ＳＯ４（４ｍＬ）で処理した。この混合物を８５℃に１４時間加熱した。反応物を室温に冷却し、ついで２５％水性ＮａＯＨを用いてｐＨ＝１４の塩基性にし、洗浄した。混合物を酢酸エチル（３回）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して濃縮し、標記化合物（１.３５ｇ、６８％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ３０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２６】
３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
０℃での３,４−ジヒドロキシ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１０ｇ、８８ミリモル）のジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液に、ＤＭＦ（１０滴）を加え、つづいて塩化オキサリル（１６.８ｍＬ、１９３ミリモル）を１０分間にわたって滴下した。反応物を室温にまで加温し、４５℃に４時間加熱した。その反応物を室温にまで冷却し、濃縮してafford 標記化合物（１１ｇ、８３％）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ １９０、１８８。
【００２７】
フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法
３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
０℃での３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（５０９ｍｇ、３.３７ミリモル）のＴＨＦ（４３ｍＬ）中溶液に、６−アミノ−３−クロロ−２−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェノール（１.０３ｇ、３.３７ミリモル）のＴＨＦ（１３ｍＬ）中溶液を２０分間にわたって添加した。当該反応物を室温にまで加温し、１４時間攪拌した。得られた混合物を濃縮して標記化合物（１.４０ｇ、９９％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４２１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２８】
ビフェニルスクアレートの一般的合成方法
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１.１０ｇ、２.６２ミリモル）のＤＭＦ（１０.０ｍＬ）中溶液をアニリン（０.２７０ｍＬ、２.９６ミリモル）と室温で１４時間反応させた。水（２５ｍＬ）および１Ｎ ＨＣl（１０ｍＬ）を反応物に加え、得られた沈殿物を遠心分離により沈降させ、水層をデカントさせた。メタノールを該固体に加え、ついでトリエチルアミン（２ｍＬ）を加えて大部分の固体を溶解させた。当該混合物を１時間攪拌させ、ついでセライトを介して濾過して濃縮した。得られた固体を一夜ポンプで真空状態にし、ついでＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈した。ＨＣl（ １,４−ジオキサン中１．４Ｎ、４.０ｍＬ）を該溶液に加え、得られた沈殿物を濾過して標記化合物（５２０ｍｇ、４２％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４７７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００２９】
実施例２
３−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）と２−ブロモアニリン（１１２ｍｇ、０.６５１ミリモル）をＤＭＦ（１.７ｍＬ）中３９℃で反応させ、標記化合物（９８.４ｍｇ、５０％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５５５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３０】
実施例３
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）および２−クロロアニリン（０.０６９ｍＬ、０.６５ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中４０℃で反応させ、標記化合物（５７.５ｍｇ、３２％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５１１（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３１】
実施例４
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５２ｍｇ、０.３６ミリモル）および２−メトキシアニリン（０.０６０ｍＬ、０.５３ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中室温で４８時間反応させ、標記化合物（１１９ｍｇ、６６％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５０７（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３２】
実施例５
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５２ｍｇ、０.３６ミリモル）および２−フルオロアニリン（０.０５０ｍＬ、０.５２ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中室温で反応させ、標記化合物（１１８ｍｇ、６９％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４９５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３３】
実施例６
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）および４−フルオロアニリン（０.０４８ｍＬ、０.５１ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中室温で反応させ、標記化合物（１２３ｍｇ、７３％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４９５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３４】
実施例７
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,６−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）および２,６−ジフルオロアニリン（０.０６８ｍＬ、０.６３ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中４０℃で反応させ、標記化合物（１２４ｍｇ、６８％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５１３（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３５】
実施例８
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２,４−ジフルオロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）および２,４−ジフルオロアニリン（０.０５５ｍＬ、０.５４ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（１３５ｍｇ、７５％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は必要なく、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄だけを要した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５１３（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３６】
実施例９
３−(２−クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ)−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３６ミリモル）および２−クロロ−４−フルオロアニリン（０.０９０ｍＬ、０.７５ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中４０℃で反応させた。（トリエチルアミン／ＤＣＭの代わりに）ギルソン（Gilson）分取性ＨＰＬＣを用いて、標記化合物（６８.３ｍｇ、１９％）を単離した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５２９（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３７】
実施例１０
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
４−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル)−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル（５.０ｇ、１６.２ミリモル）、トリエチルアミン（２.４ｍＬ、１７.２ミリモル）およびピペラジン−カルボン酸tert−ブチルエステル（３.６２ｇ、１９.４ミリモル）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（５.４４ｇ、６７％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４０２（Ｍ−Ｈ）＋（望ましい−Ｂｏｃ）。
【００３８】
６−アミノ−３−クロロ−２−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェノール
実施例１に概説した、ベンゾオキサゾールの所望のアニリンへの加水分解の一般的合成方法に従って、４−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル)−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（２.０ｇ、４.３ミリモル）、水（３.６５ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（３.６５ｍＬ）を１,４−ジオキサン（６０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（１.２２ｇ、９６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ２９２（Ｍ−Ｈ）＋。
【００３９】
４−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル
６−アミノ−３−クロロ−２−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェノール（３０３ｍｇ、１.０４ミリモル）のＤＣＭ（１２ｍＬ）中溶液に、ジ炭酸ジ−tert−ブチル（２２９ｍｇ、１.０５ミリモル）を加え、反応混合物を室温で１８時間攪拌させた。反応物をＤＣＭで希釈し、１Ｎ ＨＣl（２回）洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物（３６１ｍｇ、８９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ６.８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.４８Ｈｚ）、６.８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.４８Ｈｚ）、３.３６（ｍ，４Ｈ）、３.１９（ｍ，４Ｈ）、１.３８（ｓ，９Ｈ）。
【００４０】
４−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、フェニルモノクロロ スクアレートの一般的合成方法に従って、４−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（３５９ｍｇ、０.９１６ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１３５ｍｇ、０.８９３ミリモル）をＴＨＦ（７.０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（４１０ｍｇ、８９％）を形成させた。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４０６（Ｍ−Ｈ）＋（望ましい−Ｂｏｃ）。
【００４１】
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(ピペラジン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、４−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペラジン−１−カルボン酸tert−ブチルエステル（４１０ｍｇ、０.８１ミリモル）およびアニリン（０.１４６ｍＬ、１.６０ミリモル）をＤＭＦ（３.０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（９２.７ｍｇ、２５％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４６３（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４２】
実施例１１
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
２−tert−ブチル−６−クロロ−７−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−ベンズオキサゾール
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル（３.１７ｇ、１０.３ミリモル）、トリエチルアミン（２.９０ｍＬ、２０.８ミリモル）および１−メチルホモピペラジン（１.２９ｍＬ、１０.４ミリモル）をＴＨＦ（８０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（２.２１ｇ、５６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ３８６（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４３】
６−アミノ−３−クロロ−２−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェノール
実施例１に概説した、ベンズオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的方法に従って、２−tert−ブチル−６−クロロ−７−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−ベンゾオキサゾール（２.２０ｇ、５.７０ミリモル））、水（３.０ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（３.０ｍＬ）を１,４−ジオキサン（２５ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１.３９ｇ、７７％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ３２０（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４４】
３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って、６−アミノ−３−クロロ−２−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェノール（１.３８８ｇ、４.３４ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（６５７ｍｇ、４.３４ミリモル）をＴＨＦ（７０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１.３０３ｇ、７０％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４３４(Ｍ−Ｈ）＋。
【００４５】
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１５０ｍｇ、０.３５ミリモル）およびアニリン（０.０４１ｍＬ、０.４５ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（２６.３ｍｇ、１６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４９１（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４６】
実施例１２
３−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−４−(２−クロロ−フェニルアミノ)−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−クロロ−４−[４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−(４−メチル−[１,４]ジアゼパン−１−スルホニル)−フェニルアミノ]−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１４７ｍｇ、０.３４ミリモル）および２−クロロアニリン（０.１２ｍＬ、１.１４ミリモル）をＤＭＦ（１.６ｍＬ）中、３８℃で４８時間反応させ、標記化合物（５３.６ｍｇ、３０％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭを用いる精製は不要であり、遠心分離に付した固体のＤＣＭ洗浄を必要としただけであった。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５２５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４７】
実施例１３
６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミドの調製
２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホン酸（２−ジエチルアミノ−エチル)−メチル−アミド
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンズオキサゾール−７−スルホニル（２.５０ｇ、８.１２ミリモル）、トリエチルアミン（２.２６ｍＬ、１６.２ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジエチル−Ｎ'−メチレンジアミン（１.３４ｍＬ、８.２８ミリモル）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１.７３ｇ、５３％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ４０２（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４８】
３−アミノ−６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド
実施例１に概説した、ベンズオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的方法に従って、２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホン酸（２−ジエチルアミノ−エチル)−メチル−アミド（８６０ｍｇ、２.１４ミリモル）、水（１.７ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（１.７ｍＬ）を１,４−ジオキサン（１３ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（６１５ｍｇ、８７％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ３３６（Ｍ−Ｈ）＋。
【００４９】
６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って、３−アミノ−６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド（９８ｍｇ、０.２９２ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（７６.４ｍｇ、０.５０ミリモル）をＴＨＦ（２.８ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（９２.８ｍｇ、７１％）を形成させた。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ４５０（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５０】
６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド（９８ｍｇ、０.２２ミリモル）およびアニリン（０.０２６５ｍＬ、０.２９ミリモル）をＤＭＦ（１.２ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（３５.０ｍｇ、３２％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５０７（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５１】
実施例１４
６−クロロ−３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミドの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド（９９.５ｍｇ、０.２２１ミリモル）および２−クロロアニリン（０.０５４ｍＬ、０.５１ミリモル）をＤＭＦ（１.２ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１８.３ｍｇ、１７％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は不要であり、遠心分離に付した固体をＤＣＭで洗浄しただけであった。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５４１（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５２】
実施例１５
３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミドの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−Ｎ−(２−ジエチルアミノ−エチル)−２−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−ベンゼンスルホンアミド（１００ｍｇ、０.２２ミリモル）および２−ブロモアニリン（０.０４７８ｇ、０.２７７ミリモル）をＤＭＦ（１.２ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１９.２ｍｇ、１５％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は不要であり、遠心分離に付した固体をＤＣＭで洗浄しただけであった。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５８５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５３】
実施例１６
３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
１'−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンズオキサゾール−７−スルホニル)−[１,４']ビピペリジニル
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル（２.５０ｇ、８.１２ミリモル）、トリエチルアミン（２.２６ｍＬ、１６.２ミリモル）および４−ピペリジノ−ピペリジン（１.３６８ｇ、８.１３ミリモル）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１.６５ｇ、４６％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ４４０（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５４】
６−アミノ−２−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−３−クロロ−フェノール
実施例１に概説した、ベンズオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的方法に従って、１'−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル)−[１,４']ビピペリジニル（８２７ｍｇ、１.８８ミリモル）、水（１.７ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（１.７ｍＬ）を１,４−ジオキサン（１３ｍＬ）中で反応させて標記化合物（６２３ｍｇ、８９％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ３７４（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５５】
３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−クロロ− シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って、６−アミノ−２−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−３−クロロ−フェノール（２６７ｍｇ、０.７１４ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１０７ｍｇ、０.７１８ミリモル）をＴＨＦ（８.０ｍＬ）中で反応させて
標記化合物（２５０ｍｇ、７２％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ４９０（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５６】
３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、３−[３−([１,４']ビピペリジニル−１'−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−クロロ− シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（３４５ｍｇ、０.７０６ミリモル）およびアニリン（０.０８０ｍＬ、０.８７７ミリモル）をＤＭＦ（５.０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（１９６ｍｇ、５２％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ５４５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５７】
実施例１７
３−[３−(アミノ−ピペリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
[１−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンズオキサゾール−７−スルホニル)−ピペリジン−４−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンズオキサゾール−７−スルホニル（５.０５ｇ、１６.４ミリモル）、トリエチルアミン（４.５７ｍＬ、３２.８ミリモル）および４−Ｎ−Ｂｏｃ−アミノピペリジン（３.２８８ｇ、１６.４ミリモル）をＴＨＦ（１２５ｍＬ）中で反応させて標記化合物（４.１８ｇ、５４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ７.９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.４８Ｈｚ）、７.６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.４７Ｈｚ）、３.７３（ｄ，２Ｈ）、３.３５（ｂｓ，２Ｈ）、２.９２（ｍ，２Ｈ）、１.７５（ｄ，２Ｈ）、１.３５（ｓ，１０Ｈ）。
【００５８】
６−アミノ−２−(４−アミノ−ピペリジン−１−スルホニル)−３−クロロ−フェノール
実施例１に概説した、ベンズオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的方法に従って、[１−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル)−ピペリジン−４−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（４.１８ｇ、８.８６ミリモル）、水（５.５ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（５.５ｍＬ）を１,４−ジオキサン（５５ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（２.０３ｇ、７５％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ３０６（Ｍ−Ｈ）＋。
【００５９】
[１−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピペリデン−４−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル
６−アミノ−２−(４−アミノ−ピペリジン−１−スルホニル)−３−クロロ−フェノール（２９０ｍｇ、０.９５ミリモル）のＤＣＭ（８.２ｍＬ）中溶液に、ジ炭酸ジ−tert−ブチル（２０７ｍｇ、０.９５ミリモル）を加え、この反応混合物を室温で１８時間攪拌した。当該反応物をＤＣＭで希釈し、１Ｎ  ＨＣl（２回）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物（２４２ｍｇ、６３％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ４０５（Ｍ−Ｈ)−。
【００６０】
{１−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペリジン−４−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って、[１−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピペリデン−４−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（８０３ｍｇ、１.９７ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（２９５ｍｇ、１.９６ミリモル）をＴＨＦ（５４ｍＬ）中で反応させて標記化合物（７４１ｍｇ、７２％）を形成した。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４２０（Ｍ−Ｈ）＋（望ましい−Ｂｏｃ）。
【００６１】
３−[３−(アミノ−ピペリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、{１−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペリジン−４−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２４９ｍｇ、０.４７ミリモル）およびアニリン（０.０５７ｍＬ、０.６２ミリモル）をＤＭＦ（２.２ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（１１９ｍｇ、５４％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４７７（Ｍ−Ｈ）＋（ＮＭＲにてＢｏｃのピークなし）。
【００６２】
実施例１８
{１−[６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペリジン−４−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステルの調製
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、{１−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピペリジン−４−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１７９ｍｇ、０.３４４ミリモル）およびアニリン（０.０３７ｍＬ、０.４０６ミリモル）をＴＨＦ／ＤＭＦ（３.０ｍＬ／０.５ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（３６.３ｍｇ、１８％）を得た。トリエチルアミン／ＤＣＭでの精製は不要であった。所望の化合物はゆっくりと水洗浄で取り除かれた。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４７７（Ｍ−Ｈ）＋。
【００６３】
実施例１９
３−[３−((Ｒ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオンの調製
[(Ｒ)−１−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル)−ピロリジン−３−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、スルホニルアミドの一般的合成方法に従って、塩化２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンゾオキサゾール−７−スルホニル（３.０ｇ、９.７４ミリモル）、トリエチルアミン（１.６３ｍＬ、１１.７ミリモル）および(Ｒ)−ピロリジン−３−イル−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２.１８ｇ、１１.７ミリモル）をＴＨＦ（３０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（３.０ｇ、６７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７.７７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、４.６７（ｂｍ，１Ｈ）、４.２２（ｂｍ，１Ｈ）、３.６６（ｂｍ，２Ｈ）、３.５２（ｂｍ，１Ｈ）、３.４１（ｂｍ，１Ｈ）、２.１９（ｂｍ，１Ｈ）、１.９０（ｂｍ，１Ｈ）、１.４８（ｓ，９Ｈ）。
【００６４】
６−アミノ−２−((Ｒ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−３−クロロ−フェノール
実施例１に概説した、ベンズオキサゾールを所望のアニリンに加水分解する一般的方法に従って、[(Ｒ)−１−(２−tert−ブチル−６−クロロ−ベンズオキサゾール−７−スルホニル)−ピロリジン−３−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（２.０ｇ、４.３１ミリモル）、水（３.６ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（３.６ｍＬ）を１,４−ジオキサン（６０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（１.２ｇ、９４％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ２９２（Ｍ−Ｈ）＋。
【００６５】
[(Ｒ)−１−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピロリジン−３−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル
６−アミノ−２−((Ｒ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−３−クロロ−フェノール（３００ｍｇ、１.０２ミリモル）のＤＣＭ（８.５ｍＬ）中溶液に、ジ炭酸−ジ−tert−ブチル（２３７ｍｇ、１.０８ミリモル）を加え、この反応混合物を室温で１８時間攪拌した。当該反応物をＤＣＭで希釈し、１Ｎ ＨＣl（２回）洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物（３６５ｍｇ、９１％）を得た。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ３９１（Ｍ−Ｈ)−。
【００６６】
{(Ｒ)−１−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピロリジン−３−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステル
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って、[(Ｒ)−１−(３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル)−ピロリジン−３−イル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（３６５ｍｇ、０.９３ミリモル）および３,４−ジクロロ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン（１４０ｍｇ、０.９３ミリモル）をＴＨＦ（７.０ｍＬ）中で反応させ、標記化合物（３８６ｍｇ、８２％）を形成させた。ＥＩ−ＭＳ ｍ／ｓ ５０６（Ｍ−Ｈ)−。
【００６７】
３−[３−((Ｒ)−３−アミノ−ピロリジン−１−スルホニル)−４−クロロ−２−ヒドロキシ−フェニルアミノ]−４−フェニルアミノ−シクロブト−３−エン−１,２−ジオン
実施例１に概説した、ビフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って、{(Ｒ)−１−[６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホニル]−ピロリジン−３−イル}−カルバミン酸tert−ブチルエステル（４７０ｍｇ、０.９３ミリモル）およびアニリン（０.１０ｍＬ、１.０９ミリモル）をＤＭＦ（４.０ｍＬ）中で反応させて標記化合物（２３.４ｍｇ、６％）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４６３（Ｍ−Ｈ）＋（ＮＭＲではＢｏｃのピークなし）。
【００６８】
実施例２０
６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成：
実施例１に概説した、フェニルモノクロロスクアレートの一般的合成方法に従って；ジクロロスクアレート（４.５ミリモル）および３−アミノ−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（４.５ミリモル）をＴＨＦ（１ｍＬ）中で２４時間攪拌させ、０.７８g（５０％）の６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得、それをさらに精製することなく次工程に用いた。
【００６９】
６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（０.８６ミリモル）およびアニリン（１.７ミリモル）をＤＭＳＯ（１.０ｍＬ）中で２４時間攪拌させ、６−クロロ−３−(３,４−ジオキソ−２−フェニルアミノ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ３９６（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７０】
実施例２１
３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（０.２９ミリモル）および２−ブロモアニリン（０.８６ミリモル）をＤＭＳＯ（３ｍＬ）中で２４時間攪拌し、６０ｍｇ（４４％）の３−[２−(２−ブロモ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４７４（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７１】
実施例２２
３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（０.８６ミリモル）および２−クロロアニリン（１.７ミリモル）をＤＭＳＯ（１.０ｍＬ）中で２４時間攪拌し、１９ｍｇ（５％）の３−[２−(２−クロロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４３０（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７２】
実施例２３
３−[２−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（２.４ミリモル）および２−メトキシアニリン（７.３ミリモル）をＤＭＳＯ（３ｍＬ）中で２４時間攪拌し、０.５７ｇ（５５％）の３−[２−(２−メトキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４２５（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７３】
実施例２４
３−[２−(２−フェノキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（０.４３ミリモル）および２−フェノキシアニリン（１.３ミリモル）をＤＭＳＯ（３ｍＬ）中で２４時間攪拌し、４９ｍｇ（２４％）の３−[２−(２−フェノキシ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４８９（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７４】
実施例２５
３−[２−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドの合成
実施例１に概説した、ジフェニルスクアレートの一般的合成方法に従って；６−クロロ−３−(２−クロロ−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ)−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミド（０.６７ミリモル）および４−フルオロアニリン（１.３ミリモル）をＤＭＳＯ（１.０ｍＬ）中で２４時間攪拌し、３−[２−(４−フルオロ−フェニルアミノ)−３,４−ジオキソ−シクロブト−１−エニルアミノ]−６−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゼンスルホンアミドを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｓ ４１２（Ｍ−Ｈ）＋。
【００７５】
（治療法）
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を、ヒトまたは他の哺乳動物における、かかる哺乳動物の細胞、例えば、限定されないが、単球および／またはマクロファージによる過剰または未制御のＩＬ−８サイトカイン産生、またはＩＬ−８α受容体もしくはβ受容体（Ｉ型受容体もしくはＩＩ型受容体とも称する）と結合する他のケモカインにより悪化するかまたは引き起こされる病状の予防的または治療的処置用医薬の製造において用いることができる。
したがって、本発明は、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するものであるケモカイン介在疾患の治療法であって、有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。特に、ケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８である。
【００７６】
本明細書における目的のため式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物はすべて同じ用量を有し、式（Ｉ）のもののような製剤は互換可能に用いられる。
式（Ｉ）で示される化合物は、サイトカイン機能、特に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を阻害して、生理学的機能を正常なレベルまたは場合によっては正常下レベルに生物学的にダウンレギュレートして病状を改善するのに十分な量で投与される。例えば、本発明に関するＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の異常なレベルとは、（ｉ）１ピコグラム／ｍＬ以上の遊離ＩＬ−８のレベル；（ｉｉ）正常な生理学的レベルより高いいずれかの細胞結合性ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８；または（ｉｉｉ）ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を各々産生する細胞または組織における基底レベル以上のＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の存在である。
【００７７】
過度または未制御のＩＬ−８産生が疾患の憎悪および／または発生に関与している多くの病状がある。ケモカイン介在疾患としては、乾癬、アトピー性皮膚炎、骨関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人性呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、脳卒中、感染性ショック、多発性硬化症、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒素ショック症候群、心臓および腎臓再潅流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植片拒絶反応、マラリア、再狭窄、血管形成、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎および望ましくない造血幹細胞放出、ならびに呼吸器ウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスによって引き起こされる疾患、髄膜炎、嚢胞性線維症、早期分娩、咳、そう痒、多器官機能不全、外傷、緊張、捻挫、挫傷、乾癬性関節炎、ヘルペス、脳炎、ＣＮＳ血管炎、外傷性脳損傷、ＣＮＳ腫瘍、クモ膜下出血、手術後外傷、間質性肺炎、過敏症、結晶誘導性関節炎、急性および慢性膵炎、急性アルコール性肝炎、壊死性全腸炎、慢性副鼻腔炎、ブドウ膜炎、多発性筋炎、血管炎、ざ瘡、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、セリアック病、食道炎、舌炎、気流閉塞、気道過敏症、閉塞性細気管支炎器質化肺炎、気管支拡張症、細気管支炎、閉塞性細気管支炎、慢性気管支炎、肺性心、呼吸困難、肺気腫、高炭酸血症、高度膨張、低酸素血症、過酸化症誘導性炎症、低酸素症、手術肺容積減少、肺線維症、肺高血圧症、右室肥大、サルコイドーシス、末梢気道疾患、換気血流不均等、ぜん鳴、かぜおよび狼瘡が挙げられる。
【００７８】
これらの疾患は、主に、大量の好中球浸潤、Ｔ細胞浸潤、または新生血管成長により特徴付けられ、好中球の炎症部位への走化性または内皮細胞の定方向増殖を引き起こすＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８産生の増加に付随する。他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）とは異なり、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、好中球走化性、エラスターゼ放出を包含するがこれに限定されない酵素放出、ならびにスーパーオキシド産生および活性化を促進する独特の性質を有する。ＩＬ−８ Ｉ型またはＩＩ型受容体を介して作用するα−ケモカイン、特に、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、内皮細胞の定方向増殖の促進により腫瘍の新生血管形成を促進しうる。したがって、ＩＬ−８誘発性走化性または活性化の阻害は好中球浸潤の直接的減少をもたらす。
【００７９】
最近の証拠は、また、ＨＩＶ感染の治療におけるケモカインの役割を示している。Littlemanら, Nature 381, pp. 661（1996）および Koupら, Nature 381, pp. 667（1996)。
最近の証拠は、また、アテローム性動脈硬化症の治療におけるＩＬ−８阻害剤の使用を示している。第一の文献、Boisvertら, J. Clin. Invest, 1998, 101: 353-363 は、骨髄移植を介して、幹細胞（および、したがって、単球／マクロファージ）上のＩＬ−８受容体の不在がＬＤＬ受容体欠損マウスにおいてアテローム性硬化性斑の発生を減少させることを証明している。さらなる支持文献には以下のものがある：Apostolopoulos,ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1996, 16: 1007-1012；Liu,ら, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 1997, 17: 317-323；Rus,ら, Atherosclerosis. 1996, 127: 263-271.；Wangら, J. Biol. Chem. 1996, 271: 8837-8842；Yue,ら, Eur. J. Pharmacol. 1993, 240: 81-84；Koch,ら, Am. J. Pathol., 1993, 142: 1423-1431.；Lee,ら, Immunol. Lett., 1996, 53, 109-113.；および Terkeltaubら, Arterioscler. Thromb., 1994, 14: 47-53。
【００８０】
本発明は、また、式（Ｉ）で示されるケモカイン受容体アンタゴニスト化合物による、ＣＮＳ損傷の急性発症における治療手段、およびＣＮＳ損傷に罹患し易いと考えられる個体における予防手段を提供する。
本明細書で定義されるＣＮＳ損傷は、手術によるような開放性もしくは穿通性頭部外傷、または頭部への損傷によるような非開放性頭部外傷の両方を包含する。また、特に、脳領域の虚血性発作もまたこの定義に含まれる。
虚血性発作は、通常、血管の塞栓、血栓、または局所性アテローム性閉鎖の結果として、特定の脳領域への不十分な血液供給により引き起こされる焦点神経障害であると定義できる。この領域における炎症性サイトカインの役割が明らかになってきており、本発明は、これらの損傷の有効な治療手段を提供する。これらのような急性損傷について利用可能な治療法は比較的少ない。
【００８１】
ＴＮＦ−αは、内皮白血球接着分子発現を包含する炎症誘発作用を有するサイトカインである。白血球は虚血性脳病変へ浸潤し、故に、ＴＮＦのレベルを阻害するかまたは減少させる化合物は、虚血性脳損傷の治療に有用である。Liuら、Stroke, Vol. 25., No. 7, pp. 1481-88（1994）を参照のこと（出典明示によりその内容を本明細書の一部とする）。
非開放性頭部損傷のモデルおよび５−ＬＯ／ＣＯ混合薬剤での処置は、Shohamiら、J. of Vaisc & Clinical Physiology and Pharmacology, Vol. 3, No. 2, pp. 99-107（1992）において検討されている（出典明示により本明細書の一部とする）。浮腫形成を減少させる処置は、これらの治療される動物における機能的結果を改善することが判明した。
【００８２】
式（Ｉ）で示される化合物を、例えば、好中球走化性および活性化の減少により証明されるような、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するＩＬ−８がこれらの受容体と結合するのを阻害するのに十分な量で投与する。式（Ｉ）で示される化合物がＩＬ−８結合の阻害物質であるという知見は、本明細書において記載するインビトロ受容体結合検定における式（Ｉ）で示される化合物の効果に基づいている。式（Ｉ）で示される化合物はＩＬ−８ ＩＩ型受容体の阻害物質であることが明らかにされた。
【００８３】
本明細書において用いる場合、「ＩＬ−８介在疾患または病状」なる語は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８その物の産生により、またはＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が限定されないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦなどの別のモノカインを放出させることにより役割を果たす全ての病状を意味する。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病状は、ＩＬ−８により媒介される病状であると考えられる。
【００８４】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン介在疾患または病状」なる語は、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するケモカイン、例えば、限定されないがＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８などが役割を果たす全ての病状を意味する。これは、ＩＬ−８が、ＩＬ−８その物の産生により、またはＩＬ-８が限定されないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦなどの別のモノカインを放出させることにより役割を果たす病状を包含する。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病状は、ＩＬ−８により媒介される病状であると考えられる。
【００８５】
本明細書において用いる場合、「サイトカイン」なる語は、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインとしては、どの細胞が産生するかにかかわらず、モノカインおよびリンホカインが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、モノカインは、一般に、単核細胞、例えば、マクロファージおよび／または単球により産生および分泌されるものをいう。しかしながら、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄ストローマ細胞、表皮性ケラチノサイトおよびＢ−リンパ球などの多くの他の細胞もまたモノカインを産生する。リンホカインは、一般に、リンパ球により産生されるものをいう。サイトカインの例としては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００８６】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン」なる語は、上記した「サイトカイン」なる語と同様に、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。ケモカインは主に細胞膜貫通を介して分泌され、特定の白血球、好中球、単球、マクロファージ、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、内皮細胞および平滑筋細胞の走化性および活性化を引き起こす。ケモカインの例としては、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＰＦ４、ならびにＭＣＰ１、２および３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を治療において用いるためには、通常、これを標準的製薬プラクティスにしたがって医薬組成物に処方する。したがって、本発明は、また、有効な非毒性量の式（Ｉ）で示される化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００８７】
式（Ｉ）で示される化合物、その医薬上許容される塩およびこれを配合した医薬組成物は、好都合には、薬剤投与に慣用的に用いられる経路のいずれか、例えば、経口、局所、非経口または吸入によって投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、それを慣用的な方法に従って標準的医薬担体と組み合わせることにより調製される慣用的な投与剤形で投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、公知の第二の治療上活性な化合物と組合せて慣用的な投与形態で投与できる。これらの方法は、成分を、所望の調製物に適するように、混合し、造粒し、次いで、圧縮または溶解させることからなる。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性は、組合せる有効成分の量、投与経路および他のよく知られている要因に依存すると考えられる。担体は、他の処方成分と適合し、レシピエントに有害でないという意味で「許容され」なければならない。
【００８８】
用いられる医薬担体は、例えば、固体または液体のいずれでもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、水などである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの当該分野で周知の遅延性物質を単独でまたはワックスと共に含んでもよい。
広範囲に及ぶ医薬形態を用いることができる。したがって、固体担体を用いる場合、製剤は、錠剤にしたり、粉末またはペレット形態でハードゼラチンカプセル中に入れたり、トローチまたはロゼンジの形態にできる。固体担体の量は、広範囲に及ぶが、好ましくは、約２５ｍｇないし約１ｇである。液体担体を用いる場合、製剤は、シロップ剤、乳剤、ソフトゼラチンカプセル剤、滅菌注射液剤、例えば、アンプル剤、または非水性液体懸濁剤の形態にされる。
【００８９】
式（Ｉ）で示される化合物は、局所的に、すなわち、非全身性投与により投与してもよい。これは、式（Ｉ）で示される化合物の表皮へまたは口腔内への外用、およびかかる化合物の耳、目および鼻への滴下注入を包含し、化合物が著しく血流に入らないようにする。これに対して、全身性投与は、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。
局所投与に適した処方は、皮膚を通して炎症部位へ浸透するのに適した液体または半液体製剤、例えば、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤、および目、耳または鼻への投与に適した滴剤を包含する。有効成分は、局所投与の場合、処方物の０.００１％ｗ／ｗないし１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％ないし２重量％を含む。しかしながら、それを処方物の１０％ｗ／ｗほども含んでもよいが、好ましくは、５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは、０.１％ないし１％ｗ／ｗ含む。
【００９０】
本発明のローション剤は、皮膚または目への適用に適したものを包含する。眼ローション剤は、所望により殺菌剤を含んでもよい無菌水溶液を含み、滴剤の調製法と類似の方法により調製される。皮膚へ適用するためのローション剤またはリニメント剤は、また、アルコールまたはアセトンなどの皮膚の乾燥を促進し、冷却する薬剤および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくは落花生油などの油を含んでもよい。
【００９１】
本発明のクリーム剤、軟膏剤またはペースト剤は、外用のための有効成分を含む半固体処方物である。これらは、有効成分を微粉末または粉末形態で、単独または水性または非水性流体中溶液または懸濁液の形態で、適当な機械を用いて、グリース状または非グリース状基剤と混練することにより調製される。基剤は、炭化水素、例えば、固型、軟または流動パラフィン、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸；漿剤；扁桃油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸などをアルコール、例えば、プロピレングリコールまたはマクロゲルとともに含んでもよい。処方物は、いずれの適当な界面活性剤、例えば、アニオン、カチオンまたは非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を配合してもよい。懸濁化剤、例えば、天然ガム、セルロース誘導体または無機物質、例えば、ケイ酸質シリカ（silicaceous silicas）、および他の成分、例えば、ラノリンを配合してもよい。
【００９２】
本発明の滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでもよく、有効成分を殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液に溶かし、好ましくは、界面活性剤を配合することにより調製される。次いで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、次いで、これを密封し、オートクレーブ処理または９８〜１００℃に半時間維持することにより滅菌する。別法として、溶液を濾過滅菌し、無菌技法により容器に移す。滴剤に配合するのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０.００２％）、塩化ベンザルコニウム（０.０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０.０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【００９３】
式（Ｉ）で示される化合物は、非経口的、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、直腸内、膣内または腹腔内投与により投与してもよい。皮下および筋肉内形態の非経口投与が一般に好ましい。かかる投与に適する投与剤形は慣用技術により調製される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、吸入、すなわち、鼻内または経口吸入投与によっても投与できる。エアゾール処方物または定量型吸入器などのかかる投与に適した投与形態は、慣用技術により調製される。
【００９４】
式（Ｉ）で示される化合物に関して本明細書に記載したあらゆる使用法に関して、１日の経口投与量は、好ましくは、全体重１ｋｇあたり約０.０１ないし約８０ｍｇである。１日の非経口投与量は、全体重１ｋｇあたり約０.００１ないし約８０ｍｇである。１日の局所投与量は、好ましくは、０.１ｍｇないし１５０ｍｇであり、１日に１ないし４回、好ましくは、２または３回投与する。１日の吸入量は、好ましくは、１日に約０.０１ｍｇ／ｋｇないし約１ｍｇ／ｋｇである。式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の最適量および個々の投与間隔は、治療する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療する個々の患者により決定されること、およびこのような最適値は慣用技術により決定できることも当業者には理解できるであろう。また、最適な治療過程、すなわち、特定の日数の間、１日につき投与される式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の投与回数は、慣用的な治療過程決定試験を用いて当業者により確認できることも、当業者には理解できるであろう。
単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない以下の生物学的実施例を引用して本発明を記載する。
【００９５】
（生物学的実施例）
本発明の化合物のＩＬ−８、およびＧｒｏ−αケモカイン阻害効果を以下のインビトロ検定により測定した：
【００９６】
受容体結合検定
比活性が２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである[125Ｉ]ＩＬ−８（ヒト組換体）をイリノイ州アーリントン・ハイツのアマシャム・コーポレイション（Amersham Corp.）から入手した。Ｇｒｏ−αをエヌイーエヌ−ニュー・イングランド・ニュークリア（NEN-New England Nuclear）から入手した。他の薬品はすべて分析用であった。すでに開示されているようにして（Holmesら, Science, 1991, 253, 1278）、高レベルの組換えヒトＩＬ−８αおよびβ型受容体を、個別に、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。すでに開示されているプロトコル（Haourら, J. Biol. Chem., 249, pp 2195−2205（1974)）に従って、チャイニーズハムスター卵巣膜をホモジナイズした。ただし、ホモジナイゼーション緩衝液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭ ＰＭＳＦ（α−トルエンスルホニルフルオリド）、０.５ｍｇ／Ｌ ロイペプチン、ｐＨ７.５に変更した。膜蛋白濃度を、ピアス・カンパニー（Pierce Co.）のミクロ検定キットを用いて、ウシ血清アルブミンを標準として用いて測定した。すべての検定は、９６−ウェルマイクロプレートフォーマットで行った。各反応混合物は、１.２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌおよび０.０３％ ＣＨＡＰＳを含有する２０ｍＭ ビス−トリスプロパンおよび０.４ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）中125Ｉ ＩＬ−８（０.２５ｎＭ）または125Ｉ Ｇｒｏ−αおよび０.５μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒαまたは１.０μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒβ膜を含有した。加えて、あらかじめＤＭＳＯに溶解させて最終濃度を０.０１ｎＭ〜１００μＭにした目的の薬物または化合物を添加した。検定を、125Ｉ−ＩＬ−８の添加により開始した。室温で１時間後、Ｔｏｍｔｅｃ ９６−ウェルハーベスターを用いて１％ポリエチレンイミン／０.５％ ＢＳＡでブロックしたガラス繊維フィルターマット上にてプレートを収穫し、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０３％ ＣＨＡＰＳ（Ｈ７.４）で３回洗浄した。次いで、フィルターを乾燥させ、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンターで計数した。組換えＩＬ−８ＲαまたはＩ型受容体は、また、本明細書において非許容受容体とも称され、組換えＩＬ−８ＲβまたはＩＩ型受容体は許容受容体と称される。
【００９７】
合成化学セクションの実施例１ないし１５に記載した式（Ｉ）で示される代表的化合物は、全て、ＩＬ−８受容体阻害のための許容モデルにおいて約４５ないし約＜１μｇ／ｍＬのＩＣ50を示した。これらの試験化合物のうち実施例１ないし１２は、ほぼ同一レベルのＧｒｏ−α結合の阻害物質であることも判明した。
【００９８】
走化性検定
Current Protocols in Immunology, vol. I, Suppl 1, Unit 6.12.3.（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているようにして好中球走化性検定法でこれらの化合物のインビトロ阻害特性を測定する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）に開示されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。化学誘引物質ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γおよびＮＡＰ−２を０.１と１００ｎＭの間の濃度で４８マルチウェルチャンバー（メリーランド州キャビン・ジョンのニューロ・プローブ（Neuro Probe））の下部チャンバーに入れる。２つのチャンバーは５μｍポリカーボネートフィルターで隔てられている。本発明の化合物を試験する場合、細胞を上部チャンバーに添加する直前に、該化合物を細胞と混合する（０.００１−１０００ｎＭ）。インキュベーションは、５％ＣＯ2を有する加湿インキュベータ中にて約３７℃で約４５〜９０分間行う。インキュベーション期間の最後に、ポリカーボネート膜を取り出し、最上部を洗浄し、次いで、該膜を、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ染色プロトコル（アメリカ合衆国イリノイ州マックゴー・パークのバクスター・プロダクツ（Baxter Products））を用いて染色する。ケモカインに対して走化性を示した細胞を顕微鏡を用いて目視により計数する。一般に、各サンプルについて４つのフィールドを計数し、これらの数を平均して、移動した細胞の平均数を求める。各サンプルを三重に試験し、各化合物を少なくとも４回繰り返し試験する。特定の細胞（陽性対照細胞）には化合物を添加せず、これらの細胞は細胞の最大走化性応答を示す。陰性対照（刺激しない）が望ましい場合には、下部チャンバーにケモカインを添加しない。陽性対照と陰性対照との差異は、細胞の走化性活性を表す。
【００９９】
エラスターゼ放出検定：
ヒト好中球からのエラスターゼ放出を防止する能力について本発明の化合物を試験する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1.に記載されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。リンゲル溶液（ＮａＣｌ １１８、ＫＣｌ ４.５６、ＮａＨＣＯ3 ２５、ＫＨ2ＰＯ4 １.０３、グルコース １１.１、ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ、ｐＨ７.４）中に懸濁したＰＭＮ ０.８８×１０6細胞を、５０μｌの容量で９６ウェルプレートの各ウェルに入れる。このプレートに、５０μｌの容量の試験化合物（０.００１−１０００ｎＭ）、５０μｌ（２０μｇ／ｍｌ）の容量のサイトハラシンＢおよび５０μｌの容量のリンゲル緩衝液を添加する。これらの細胞を５分間加温（３７℃、５％ ＣＯ2、９５％ ＲＨ）した後、最終濃度０.０１−１０００ｎＭのＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγまたはＮＡＰ−２を添加した。該反応を４５分間進行させた後、９６ウェルプレートを遠心分離し（８００×ｇ、５分）、上清１００μｌを取り出した。この上清を第２の９６ウェルプレートに添加し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した人工エラスターゼ基質（ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ、カリフォルニア州ラ・ジョラのノヴァ・ビオケム（Nova Biochem））を最終濃度６μｇ／ｍｌになるように添加する。直ちに、プレートを蛍光９６ウェルプレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３５０、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Millipore））に入れ、Nakajimaら, J. Biol Chem 254 4027（1979）の方法に従って３分間隔でデータを集める。ＰＭＮから放出されたエラスターゼの量を、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ分解速度を測定することにより計算する。
【０１００】
外傷性脳傷害検定におけるＴＮＦ−α
この検定は、ラットにおいて実験的に誘発した側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の後に起こる特定の脳領域における腫瘍壊死因子ｍＲＮＡの発現を調べるために行う。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２.４ ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術、ｎ＝１８）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を断頭により屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行い、ＴＮＦ−α陽性対照ＲＮＡと比較して定量化する（マクロファージ＝１００％）。傷害の１時間後、損傷した半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の著しい増加がＬＨ（陽性対照の１０４±１７％、擬似処置と比較してｐ＜０.０５）、ＬＣ（１０５±２１％、ｐ＜０.０５）およびＬＡ（６９±８％、ｐ＜０.０１）にて見られる。傷害の６時間後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の増加がまたＬＨ（４６±８％、ｐ＜０.０５）、ＬＣ（３０±３％、ｐ＜０.０１）およびＬＡ（３２±３％、ｐ＜０.０１）にて見られ、２４時間後まで続く。対側性半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現は、傷害の１時間後には、ＲＨ（４６±２％、ｐ＜０.０１）、ＲＣ（４±３％）およびＲＡ（２２±８％）において増加し、６時間後にはＲＨ（２８±１１％）、ＲＣ（７±５％）およびＲＡ（２６±６％、ｐ＜０.０５）において増加するが、２４時間後には増加しない。擬似処置（傷害を伴わない手術）またはナイーブ動物においては、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現の一貫した変化は、いずれの時点でもいずれの半球における６つの脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、側矢状液衝撃脳傷害後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの一時的発現が、損傷していない半球のものを含めて特定の脳領域において変えられることを示す。ＴＮＦ−αは、神経成長因子（ＮＧＦ）を誘発でき、活性化星状細胞からの他のサイトカインの放出を刺激するので、ＴＮＦ−αの遺伝子発現におけるこの外傷後の変化は、ＣＮＳ外傷に対する急性応答および再生性応答の両方において重要な役割を果たす。
【０１０１】
ＩＬ−β ｍＲＮＡについてのＣＮＳ傷害モデル
この検定は、ラットにおいて実験的側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）後の特定の脳領域におけるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの局所的発現を特徴付ける。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２.４ ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行い、脳組織ＩＬ−１β ｍＲＮＡの量を、同一ゲルにロードしたＩＬ−１β陽性マクロファージＲＮＡの相対的な放射能の％として表す。脳傷害の１時間後、損傷した半球において、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現の著しくかつ有意な増加がＬＣ（陽性対照の２０.０±０.７％、ｎ＝６、擬似処置動物と比較してｐ＜０.０５）、ＬＨ（２４.５±０.９％、ｐ＜０.０５）およびＬＡ（２１.５±３.１％、ｐ＜０.０５）にて見られ、傷害の６時間後まで、ＬＣ（４.０±０.４％、ｎ＝６、ｐ＜０.０５）およびＬＨ（５.０±１.３％、ｐ＜０.０５）にて上昇し続ける。擬似処置またはナイーブ動物においては、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現は、個々の脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、ＴＢＩ後、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの一時的発現が特定の脳領域において局部的に刺激されることを示す。ＩＬ−１βのようなサイトカインにおけるこれらの局部的変化は、外傷後において役割を果たす。
【０１０２】
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典明示により本明細書の一部とする。
好ましい実施態様を包含する上記記載事項は本発明を十分に開示する。本明細書に具体的に開示した実施態様の変更および改良は特許請求の範囲の範囲内に含まれる。さらに推敲することなく、当業者は上記記載事項を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、本明細書における実施例は単に例示的であって、如何なる場合も本発明の範囲を制限するものではないと考えられる。排他的性質および優先権を主張する本発明の実施態様は特許請求の範囲に定義するとおりである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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