(57)【要約】本発明はポリ硫酸化グリコサミノグリカンを含有する器官保護溶液に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞完全性および細胞活性を維持するために有効な以下の成分量：
ａ）硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ
ｂ）ヒドロキシエチル澱粉５〜１００ｇ／ｌ
を含有する器官保護溶液。
【請求項２】
ａ）硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ
ｂ）ヒドロキシエチル澱粉５〜１００ｇ／ｌ
ｃ）ラフィノーゼ５〜１００ミリモル
を含有する請求項１記載の器官保護溶液。
【請求項３】
ａ）硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ
ｂ）ヒドロキシエチル澱粉５〜１００ｇ／ｌ
ｃ）ラフィノーゼ５〜１００ミリモル
ｄ）ＫＨ２ＰＯ４５〜４０ミリモル
ｅ）ＭｇＳＯ４１〜５０ミリモル
ｆ）アデノシン１〜５０ミリモル
ｇ）アロプリノール０．５〜５ミリモル
ｈ）グルタチオン１〜１０ミリモル
を含有する請求項１または２記載の器官保護溶液。
【請求項４】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のγ−インターフェロン誘発性アップレギュレーションを抑制する医薬組成物を製造するための請求項１から３までのいずれか１項記載の器官保護溶液の適用。
【請求項５】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のγ−インターフェロン誘発性アップレギュレーションと結合した病気を治療および予防するための請求項４記載の器官保護溶液の適用。
【請求項６】
移植患者を治療するための請求項４または５記載の器官保護溶液の適用。
【請求項７】
移植に使用される器官を保護および貯蔵するための請求項４または５記載の器官保護溶液の適用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のインターフェロン（ＩＦＮ）γ−誘発性アップレギュレーションを抑制する医薬組成物を製造するための硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカンの使用に関する。
【０００２】
本発明は更にポリ硫酸化グリコサミノグリカンを含有する器官保護溶液および移植器官を生体外保護する方法に関する。
【０００３】
循環障害を治療する医薬組成物を製造するためのグリコサミノグリカン、特にヘパリンおよびヘパリノイドの使用は周知である。
【０００４】
近年、一連の付加的な疾患へのグリコサミノグリカンの使用が開示されている。米国特許第５２３６９１０号には糖尿病性腎症および神経障害の治療へのグリコサミノグリカンの使用が記載されている。同じ症状への低分子ヘパリンの使用はＰｉｊｌ等（Ｊ．Ａｍｅｒｉｃ　Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９７、８、４５６−４６２）により開示されている。
【０００５】
米国特許第５０３２６７９号には平滑筋細胞増殖および関連する病気を抑制するためのグリコサミノグリカンの使用が記載されている。
【０００６】
米国特許第４９６６８９４号にはレトロウィルスにより引き起こされる病気を治療するためにポリ硫酸化ヘパリンが記載されている。
【０００７】
グラリンスキー（Ｇｒａｌｉｎｓｋｉ）等はポリ硫酸化ヘパリンによる相補系の変調を記載した。
【０００８】
Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７、１０７、５７８−５８４）において、ダグラス（Ｄｏｕｇｌａｓ）等によりヘパリン、ヘパラン硫酸またはヘパリン様分子でのインターフェロンγの炎症促進作用の拮抗性が研究された。ヘパリンはインターフェロンγの免疫抗原性作用に影響を及ぼすことができる。
【０００９】
器官を移植する場合に、好ましくない拒絶反応が頻繁に発生する。これらの拒絶反応を阻止するために、多くの異なる方法が行われた。まず提供者と受容者の組織移植調和性抗原を比較した。提供者と受容者が最高で同じであるかまたはきわめて類似の組織移植調和性抗原を有する器官のみが移植される。
【００１０】
それにもかかわらず、好ましくない器官拒絶が絶えず生じる。この場合に、例えば急性腎臓同種移植拒絶が生じ、この場合にＴリンパ球によるアロＭＨＣ抗原の認識が管状細胞の溶解を伴う主な作用である。更にいわゆる対宿主移植片反応、器官で移植される提供者の免疫細胞からの受容者に対する強い反応を伴う。ホスト器官に対して細胞障害Ｔ細胞および細胞障害抗体が形成される。
【００１１】
移植拒絶の危険を更に減少するために、器官を除去した後直ちに凍結し、器官保護溶液下に貯蔵する。更に受容者の免疫防御を抑制する薬剤を受容者に与える。
【００１２】
器官保護溶液のすべての種類が文献に記載されている。例えばＣｏｌｌｉｎｓ等（Ｌａｎｃｅｔ、２巻、１９６９、１２１９）は器官を保護するために細胞内電解質溶液を記載した。Ｓａｃｋｓ　ＳＡ（Ｌａｎｃｅｔ、１巻１９７３、１０２４）は浸透性安定作用を有する溶液を記載した。ＡＴＰ−ＭｇＣｌ２、ＡＭＰ−ＭｇＣｌ２およびイノシンがこれらの溶液中の有利な試薬として記載される（Ｓｉｅｇｅｌ、ＮＪ等、Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、２５４、Ｆ５３０、１９８３、Ｂｅｌｚｅｒ等、Ｔｒａｎｓｐｌ　Ｐｒｏｃ　１６　１６１　１９８４）。米国特許第４９２０００４号はマンニトール、アデノシンおよびＡＴＰ−ＭｇＣｌ２を含有する溶液を記載する。米国特許第４７９８８２４号および米国特許第４８７３２３０号はヒドロキシエチル澱粉を含有する器官保護溶液を記載する。米国特許第４８７９２８３号にはＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、アデノシン、アロプリノール、ラフィノーゼおよびヒドロキシエチルセルロースを含有する溶液が記載されている。これはウィスコンシン大学溶液（＝ＵＷ溶液）として知られている。この溶液は肝臓、腎臓および心臓を良好に保存するために記載された（Ｊａｍｉｅｓｏｎ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４６巻、１９８８、５１７、Ｐｌｏｅｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４６巻、１９８８、１９１およびＷｉｃｏｍｂ　ＷＮ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４７巻、１９８８、７３３）。米国特許第５２００３９８号にはグルクロン酸、その塩およびエステルを有するこれらの保護溶液中の付加的な添加剤が記載されている。
【００１３】
移植用器官の保護および好ましくない器官拒絶の抑制に試みられた成功にもかかわらず、更に改良する必要がなお残っている。
【００１４】
従って、本発明の課題は、移植の前および移植中の器官の保護および器官拒絶の危険の減少の両方の改良を達成することである。
【００１５】
前記課題は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のインターフェロンγ−誘発性アップレギュレーションを抑制する医薬組成物を製造するために、硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカンを使用することにより解決される。
【００１６】
本発明は、更に細胞完全性および細胞活性を効果的に維持する適当な製薬組成物のための硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン量を含有する器官保護溶液に関する。
【００１７】
例えば器官保護溶液が含まれる、本発明による使用のために製造される製薬組成物は、前記の化合物を、遊離化合物として、その生理的活性の塩またはエステルの形で、その互変異性体および／または異性体の形で、または遊離化合物と種々の塩の組み合わせの形で含有することができる。有利な生理的に有効な塩として、例えばＮａ塩、Ｃａ塩またはＭｇ塩が記載されるべきである。同様にジエチルアミン、トリエチルアミンまたはトリエタノールアミンのような有機塩基との塩が適している。製薬組成物は有利には少なくとも１種の遊離物質または少なくとも１種の化合物をその塩または混合物の形で含有することができる。
【００１８】
本発明により使用されるポリ硫酸化グリコサミノグリカン（＝ムコ多糖）は、例えばＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のようないわゆるウロン酸の１つの分子がグルコサミンまたはガラクトサミンのようなアミノ糖の３位または４位でグリコシド結合している二糖の種々の結合単位からなる負の電荷の多糖類（＝グリカン）である。二糖中の少なくとも１つの糖は、酸素原子または窒素原子により結合することができる、負の電荷のカルボキシレート基またはスルフェート基を有する。ウロン酸および硫酸エステル基とグリコサミノグリカンは強い酸性に反応する。これらの酸性反応基は一部はすでに天然に存在するが、例えば硫酸化を化合物に合成により導入することにより、本発明により必要な硫酸化の程度を得るために重要である。硫酸化法として、文献には、例として硫酸および硫黄−塩素酸での硫酸化（米国特許第４７２７０６３号、米国特許第４９４８８８１号）、ピリジン中の硫黄−塩素酸での硫酸化（Ｗｏｌｆｒｏｍ等、Ｊ．Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ、１９５３、７５、１５１９）または亜硝酸での硫酸化（Ｓｈｉｖｅｌｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５巻、ｎｏ１８、１９７６、３９３２）が記載されている。当業者には他の方法が知られている。例としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸のような天然のグリコサミノグリカンの硫酸化のための使用である。ヘパラン硫酸の構造はヘパリンの構造に相当し、ヘパリンと対照的にわずかのＮ硫酸基およびＯ硫酸基および多くのｎアセチル基を有することが相違する。
【００１９】
グリコサミノグリカンは腸粘膜のような動物の組織からまたは豚および牛の耳から容易に単離することができる。グリコサミノグリカンの単離に使用される組織は、例えば自己分解し、アルカリで抽出する。次いでプロテインを放置して凝結し、例えば酸性化により沈殿する。沈殿物をエタノールまたはアセトンのような極性の非水性溶液中に加えた後、有機溶剤で抽出することにより脂肪を除去する。蛋白質分解消化によりプロテインを最終的に除去し、グリコサミノグリカンを回収する。Ｃｈａｒｌｅｓ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　３０巻、１９３６、１９２７−１９３３）およびＣｏｙｎｅ　Ｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　ＮＹ　Ｌｕｎｂｌａｄ　ＲＬ　ｅｄ１９８１）には、例えばヘパリンを単離する方法が記載されている。
【００２０】
天然の供給源から単離されるこれらのグリコサミノグリカンを、有利には、例えば米国特許第５０１３７２４号に記載されるかまたは前記のように、ポリ硫酸化により他の誘導化に供給することができる。このポリ硫酸化によりグリコサミノグリカンは硫黄含量６〜１５質量％を示す。本発明による使用または医薬組成物のために、硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカンを選択する。有利にはこれらのポリ硫酸化グリコサミノグリカンは硫黄含量１３〜１６質量％、より有利には１３〜１５質量％、特に１３．５〜１４．５質量％を有する。これらの物質を、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のインターフェロンγ−誘発性アップレギュレーションを抑制するために適している医薬組成物を製造するために使用する。これらの物質を生理的に有効な量で、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のインターフェロンγ−誘発性アップレギュレーションと結合した病気を治療および予防するために使用することが有利である。これらの物質の誘導体のなかで、１つの誘導体が、使用されるポリ硫酸化グリコサミノグリカンの適用特性を、その作用、安定性および特に身体からの排出に関して改良する化合物を含む。
【００２１】
平均分子量１０００〜２００００ドルトン、有利には１５００〜９０００ドルトン、特に２０００〜９０００ドルトン、最適には２０００〜６０００ドルトンを有するヘパリンおよび／またはデルマタン硫酸を有利に使用すべきである。遊離酸または生理的に認容性の塩基との塩またはこれらの化合物から製造される混合物の形の低分子のポリ硫酸化ヘパリンおよび／またはデルマタン硫酸が特に有利である。これらの物質はわずかな凝結防止作用を有し、従って本発明により使用する場合に治療および予防に特に適している。ポリ硫酸化グリコサミノグリカンの有利な塩は、例えばナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩である。
【００２２】
低分子グリコサミノグリカン、例えば低分子ヘパリンおよび／またはデルマタン硫酸は一連の方法により製造することができる。亜硝酸を用いる解重合を介した低分子ヘパリンの製造は、例えば欧州特許第００３７３１９号またはＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５巻、１９７６、３９３２に記載されている。低分子ヘパリンまたは低分子グリコサミノグリカンの製造は酵素を用いて（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．１０８巻、１９６８、６４７）、硫酸および硫黄塩素酸を用いて（フランス特許第２５３８４０４号、同時の硫酸化）、過ヨウ素酸塩またはγ放射線（欧州特許第０２６９９３７号）または超音波（Ｆｕｃｈｓ等、Ｌｅｂｅｎｓｍ　Ｕｎｔｅｒｓ　Ｆｏｒｓｃｈ、１９８巻、１９９４，４８６−４９０）のような物理的方法を用いて実施することができる。
【００２３】
本発明による付加的な使用は器官保護溶液である。器官保護溶液へのポリ硫酸化グリコサミノグリカンの有利な添加により、提供者の器官から除去した後に、すなわち生体外の器官の貯蔵を、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩプロテインおよびＩＣＡＭ１のインターフェロンγ−誘発性アップレギュレーションを抑制することにより更に高めることができる。有利には器官を当業者に周知のように凍結すべきである。
【００２４】
前記のこれらの一連の溶液は文献から公知である。これらの溶液は一般に塩、緩衝液、浸透により器官を安定すると予想されるかまたは酸化を防止すると予想される物質、例えば糖、糖アルコール、プロテイン、アミノ酸、低級カルボン酸、プリン、ピリミジンまたは薬剤を含有する。これらの物質の例として、以下のものが挙げられる。ラフィノーゼ、グルコース、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、塩化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、アデノシン、アルブミン、マンニトール、クエン酸塩、ベラパミル、アロプリノール、インシュリン、デキサメタソン、ヒドロキシエチル澱粉、グルアチオンまたはグルクロン酸。
【００２５】
器官保護溶液への本発明の目的とする使用は、今まで一般的であったよりよい状態で器官を移植し、またはより長い時間にわたり貯蔵することを可能にし、拒絶反応を減少することができる。
【００２６】
器官の拒絶の危険を更に減少するために、ポリ硫酸化グリコサミノグリカンを移植患者または移植提供者に、可能な場合は移植の前に経口でまたは腸管外で投与することができる。術後の前記物質での患者の治療も実施できる。
【００２７】
ポリ硫酸化グリコサミノグリカンは器官保護溶液または他の製薬組成物に１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、有利には１０ｍｇ／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌ、更に有利には５０〜３０００ｍｇ／ｌ、きわめて有利には１００ｍｇ／ｌ〜３０００ｍｇ／ｌの量で含まれる。付加的にヒドロキシエチル澱粉を含有する浸透安定物質５〜１００ｇ／ｌが有利である。
【００２８】
他の有利な器官保護溶液は以下の組成を有する。
【００２９】
ａ）硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、
ヒドロキシエチル澱粉５〜１００ｇ／ｌおよび
ラフィノーゼ５〜１００ミリモル、または
ｂ）硫黄含量少なくとも１２．５質量％を有するポリ硫酸化グリコサミノグリカン１０ｍｇ／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、
ヒドロキシエチル澱粉５〜１００ｇ／ｌ、
ラフィノーゼ５〜１００ミリモル、
ＫＨ２ＰＯ４５〜４０ミリモル、
ＭｇＳＯ４１〜５０ミリモル、
アデノシン１〜５０ミリモル、
アロプリノール０．５〜５ミリモルまたは
グルタチオン１〜１０ミリモル。
【００３０】
患者の処理のために、ポリ硫酸化グリコサミノグリカンを常用の製剤処理物質と一緒に使用することができる。
【００３１】
本発明による使用を目的とする製薬組成物は通常の方法で経口でまたは腸管外（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）で投与することができるが、経口または静脈内投与が有利である。
【００３２】
用量は患者の年齢、状態および体重および投与の種類に依存する。
【００３３】
グリコサミノグリカンは最も有利には毎日体重１ｋｇ当たり０．１〜５００ｍｇの用量で投与する。腸管外投与の場合は、グリコサミノグリカンは毎日体重１ｋｇ当たり０．１〜３０ｍｇの用量で最適に投与され、経口投与の場合は毎日体重１ｋｇ当たり０．２〜５００ｍｇの用量で最適に投与され、投与される用量は１回または数回の用量で投与することができる。例えば少なくとも１種の低分子ヘパリンおよび／またはそのポリ硫酸化誘導体および／または少なくとも１種の低分子デルマタン硫酸および／またはそのポリ硫酸化誘導体の混合物を、腸管外投与の場合は毎日体重１ｋｇ当たり０．１〜３０ｍｇの用量でまたは経口投与の場合は毎日体重１ｋｇ当たり０．２〜５００ｍｇの用量で投与する。
【００３４】
器官移植と関連する病気の治療および予防のためのポリ硫酸化グリコサミノグリカンを含有する製薬組成物のうち１つの組成物は、原則的に固体であるかまたは液体である、経口または腸管外投与のための常用の製剤投与形、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、糖衣錠、座薬、溶液または懸濁液を含む。これらは通常の方法で製造する。活性物質は錠剤形成剤、充填剤、保存料、錠剤崩壊剤、流動調節剤、軟化剤、湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶剤、遅延剤、酸化防止剤および／または噴射ガスのような常用の製剤処理物質とともに処理することができる（Ｈ．Ｓｕｃｋｅｒ等　Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ　Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９９１参照）。こうして得られた投与形は一般に０．１〜９０質量％の量で活性物質を含有する。
【００３５】
錠剤、被覆錠剤、糖衣錠および硬質ゲルカプセルを製造するために、ポリ硫酸化グリコサミノグリカンを製薬的に不活性の、無機または有機賦形剤とともに処理することができる。錠剤、糖衣錠および硬質ゲルカプセルのためのこれらの賦形剤として乳糖、トウモロコシ澱粉またはこれらの誘導体、タルク、ステアリン酸またはこれらの塩を使用することができる。軟質ゲルカプセルのために、賦形剤として植物油、ワックス、脂肪、半固体および液体ポリオールが適している。
【００３６】
溶液およびシロップの製造のために、適当な賦形剤は、例えば水、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース等である。注入溶液のために、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油が賦形剤として適している。座薬のためには、適当な賦形剤は天然油または硬化油、ワックス、脂肪、半液体ポリオールまたは液体ポリオール等である。
【００３７】
製薬組成物は付加的に保存料、溶剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、柔軟剤、着色物質、芳香剤、浸透圧調節用塩、緩衝剤、保護層および／または酸化防止剤を含有することができる。
【００３８】
例
試験のために、ＰＴＥＣ（近位尿細管上皮細胞）およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を使用することができる。ＰＴＥＣ細胞をＤｅｔｒｉｓａｃ等（Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ２５、１９８４：３８３）に記載の方法により培養した。ＰＴＥＣ細胞をコラーゲンＩ（Ｓｉｇｍａ　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）および胎児牛血清（＝ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で被覆された組織培地びん中に定着させた。培地はインシュリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン（５ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチソン（３６ｎｇ／ｍｌ）、トリヨードチロニン（４ｐｇ／ｍｌ）、表皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）およびペニシリン／ストレプトマイシン［（５ｌＵ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ）すべてＳｉｇｍａ社］が補充された、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地およびＨａｍｓ　Ｆ１２培地（両者ともＧｉｂｃｏＢＲＬ）の１：１の比により変性されたイーグル培地からなっていた。移植前組織の生検、移植に使用できない同種移植のような種々の源泉からおよび標準的外科的腎臓試料から細胞系が得られた。細胞で１回〜４回の通過から試験を実施した。上皮膜抗原（＝ＥＭＡ、Ｄａｋｏ　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）およびアデノシン−デアミナーゼ結合プロテイン（Ｄｒ、Ｄｉｎｊｅｎｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより供給された）での正のマーキングによりＰＴＥＣを特性化した。
【００３９】
ＨＵＶＥＣ細胞（＝ヒト臍帯静脈の内皮細胞）を、Ｊａｆｆｅ等（臍帯静脈由来のヒト上皮細胞の培地、形態的および免疫的基準による同定（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｃｒｉｔｅｒｉａ．）Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　５２　１９７３　２７４５−２７５６）に記載の方法により新たな臍帯から回収した。操作は簡単には以下のように記載する。
【００４０】
臍帯静脈からコラゲナーゼＶを用いて消化することにより（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ　３７℃、２０分）上皮細胞を単離した。引き続き静脈を無菌培地ですすぎ、上皮細胞を収集した。培地は１５％胎児牛血清（＝ＦＳＣ）、上皮細胞成長因子および抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充されたメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）からなっていた。細胞を１％ゼラチンで被覆した２５ｃｍ２びん中で培養した（Ｓｉｇｍａ　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）。
【００４１】
細胞で３回目〜６回目の細胞培地の通過からすべての試験を実施した。ＨＵＶＥＣ細胞をファクターＶＩＩＩ関連抗原（Ｄａｋｏ　Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃｏｍｂｅ　英国）および上皮マーカーＥＮ４（ＣＤ３１）で正の着色により特性化した。
【００４２】
ＩＦＮγ刺激、ヘパリンおよび塩素酸ナトリウム処理
ＰＴＥＣ細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の集密的細胞単層をトリプシンで処理し、２４ウェルプレート中で散布した。集密が達成される場合に、ヘパリンブラウン（Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｂｒａｕｎ（Ｒ）　Ｂｒａｕｎ−Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ　Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ　ドイツ）、低分子ヘパリンフラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ（Ｒ））Ｐ　Ｐｆｒｉｍｍｅｒ　Ｋａｂｉ　Ｅｒｌａｎｇｅｎ　ドイツ）および変性低分子ヘパリン（Ｋｎｏｌｌ社、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ　ドイツ）のような種々のヘパリンに含まれる濃度を変動した種々のヘパリノイドの存在または不在で７２時間にわたり細胞をＩＦＮγ（Ｓｉｇｍａ　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）で刺激した。
【００４３】
一部の試験で、細胞結合ヘパラン硫酸プロテオグリカン（＝ＨＳＰＧ）での硫酸化を抑制するために、培地を塩素酸ナトリウムで補充した。塩素酸塩を５０〜１５０ｍＭの濃度で使用した。塩素酸塩をＩＦＮγ投与の２４時間前に培地に添加した。ＩＦＮγの刺激を塩素酸塩の存在で実施した。浸透圧調節剤として塩化ナトリウムを使用した。培養した細胞を培養後、フローサイトメトリーのためにトリプシンＥＤＴＡ処理で回収した。
【００４４】
フローサイトメトリー
種々の被覆物の細胞を収集し、引き続き２個の試験管に分配し、洗浄した。細胞同位体に結合せず、ＲＰＥおよびＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ　デンマーク）およびＣｙ−５（Ｄｉａｎｏｗａ　ハンブルグ　ドイツ）と結合した抗体を第１の試験管に投与した。この被覆物をＦＡＣＳバックグラウンドのための負の対照として使用した。第２被覆物中の細胞をＭＨＣクラスＩ（ＲＰＥ複合、Ｗ６／３２、Ｄａｋｏ）、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｃｙ−５複合、ＣＲ３／４３、Ｄｉａｎｏｗａ）およびＩＣＡＭ１（ＦＩＴＣ複合、Ｄｉａｎｏｗａ）に対する抗体で製造者に指示された濃度でマークした。４℃で３０分細胞を培養後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。少なくとも１００００個の正の事例を分析した。結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表現した。
【００４５】
ドットブロット分析
ドットブロット分析のために、ニトロセルロース膜の細いストリップを製造し、これにヘパリン、フラグミンおよび種々の他のＮ脱硫酸Ｎ−アセチル化グリコサミノグリカン（＝ＧＡＧｓ、すべて１ｍｇ／ｌの濃度で）１μｌを塗布した。乾燥後、ＧＡＧ損失を阻止するために、ストリップを１％グルタルアルデヒド＋０．５％セチル−ピリジニウムクロリドで固定し、引き続きトリス緩衝液で洗浄した。完成したストリップを最後にコダックフィルムに露出した。
【００４６】
統計的分析
抗原発現の変化の重要性をＳｔｕｄｅｎｔｓ　Ｔ試験により決定した。０．０５より少ないＰ値が重要であると考えられた。
【００４７】
結果
ＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩおよびＩＣＡＭ１プロテインの発現が用量に依存してＩＦＮγによりＰＴＥＣで変動した。ＭＨＣクラスＩおよびＩＣＡＭ１発現はＩＦＮγ５０ｎｇ／ｍｌの濃度によりアップレギュレートされた。更にＩＦＮγの同じ濃度で、ＰＴＥＣでのＭＨＣクラスＩＩの発現が上昇した（図１参照）。培養したＨＵＶＥＣ細胞で相当する結果が得られた。
【００４８】
ＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現を変動するＩＦＮγ能力へのヘパリンの影響を研究するために、ＨＵＶＥＣ培養基およびＰＴＥＣ培養基の両方をヘパリンの存在または不在でＩＦＮγで刺激した。ＨＵＶＥＣ培養基への０．０３〜３ｍｇ／ｍｌの濃度のヘパリンの投与はＩＦＮγ１００ｎｇ／ｍｌにより引き起こされるＭＨＣクラスＩおよびＩＣＡＭ１プロテインのアップレギュレーションを完全に阻止する。同様にＭＨＣクラスＩプロテインの誘発がこれらの細胞でヘパリンの投与により抑制された。ヘパリンそれ自体はＩＦＮγの不在で検査した３個の抗原の発現に影響を及ぼさなかった（図２）。
【００４９】
ＰＴＥＣでの比較試験において、同様にＩＦＮγ１００ｎｇ／ｍｌで誘発されたＩＣＡＭ１のアップレギュレーションおよびＭＨＣクラスＩＩプロテインの誘発がヘパリンにより抑制できることが示される。しかしながらＩＦＮγでのＭＨＣクラスＩプロテインのアップレギュレーションはヘパリンで影響されない。無視できるＩＦＮγ濃度により誘発されるＭＨＣクラスＩプロテインのアップレギュレーションがヘパリンにより妨害されるかどうかを調べるために、ＩＦＮγで刺激した細胞１０ｎｇ／ｍｌで同じ試験を実施した。ヘパリンそれ自体は３ｍｇ／ｍｌの濃度でＩＦＮγでのＭＨＣクラスＩのアップレギュレーションの不十分な影響を有するのみであることが判明した（図３ａ参照）。対照的にＭＨＣクラスＩＩの誘発およびＩＣＡＭ１のアップレギュレーションは０．０３ｍｇ／ｍｌヘパリン（ｐ＜０．０１）により著しく阻害される（図３ｂおよび３ｃ参照）。ＩＦＮγで刺激後のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現の阻害に関するヘパリンの硫酸化の程度の影響を調べるために、この試験システムで種々のヘパリノイドを検査した（表１）。ヘパリノイドはすべてＩＦＮγで刺激後のＭＨＣクラスＩおよびＩＣＡＭ１を阻害するその能力に関して３ｍｇ／ｍｌの濃度で検査した。ＭＨＣクラスＩＩ試験をＩＦＮγ１０ｎｇ／ｍｌで刺激して実施した。標準的な、低分子ヘパリンに匹敵して、過硫酸化ＧＡＧ（ＧＡＧ６〜８）はＩＦＮγで刺激後、ＨＵＶＥＣおよびＰＴＥＣの両方でＭＨＣおよびＩＣＡＭ１の発現を阻害した。対照的に脱硫酸Ｎアセチル化ＧＡＧ（ＧＡＧ１〜５）はＩＦＮγで刺激後、これらの細胞中でＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に影響を与えることができなかった（図４ａ〜ｃおよび５ａ〜ｃ）。過硫酸化ＧＡＧｓが標準的な低分子ヘパリンより明らかに阻害により効果的であることが明らかな傾向として示された。これはＰＴＥＣ培地でより強調される（図５ａ）。ＩＦＮγ１０ｎｇ／ｍｌで刺激後の低分子ヘパリンおよびＧＡＧ６〜８およびＰＴＥＣ細胞での他の用量に関連した試験は、ＩＦＮγで刺激した培地への０．０３ｍｇ／ｍｌの濃度のＧＡＧ６〜８の投与によりＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現が阻害される（ｐ＜０．０５）ことを示した。これらの条件下でヘパリンはＭＨＣクラスＩおよびＩＩ発現に関する重要な影響を示さず、ＩＣＡＭ１は同様にこれらの条件下でヘパリンにより阻害された。しかしながら過硫酸化ＧＡＧより著しく少ない（図６ａ）。これらの結果は明らかに過硫酸化ＧＡＧｓがＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現の阻害において匹敵するヘパリンより有効であることを示した。
【００５０】
グリコサミノグリカンの硫酸化の程度がＩＦＮγで刺激後のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に関するＧＡＧの阻害作用に重要な影響を有するかどうかを調べるために、ＰＴＥＣ細胞をＮａＣｌＯ３の存在で培養した。このようにしてＨＳＰＧの硫酸化がブロックされることが予想された。対照として、細胞を等モル濃度のＮａＣｌで処理した。その後両方の被覆物をＩＦＮγで０〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で刺激した。ＩＦＮγがＮａＣｌＯ３で処理したＰＴＥＣ細胞でのＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現を変動できるにもかかわらず、この変動はＮａＣｌで処理した細胞よりかなり少なかった（図７ａ〜ｃ）。これは、ＨＳＰＧの硫酸化の程度がＩＦＮγでのこれらの抗原の発現の変動に重要な役割を果たすことを意味する。
【００５１】
ＩＦＮγ結合のためにＧＡＧｓを硫酸化しなければならないことを明らかにするために、１２５ＩＦＮγで結合試験を実施した。結果は両方のヘパリンおよび過硫酸化ＧＡＧｓが１２５ＩＦＮγを結合できることを示した。これはもはやわずかの硫酸基のみを示す脱硫酸Ｎアセチル化ＧＡＧｓ（ＧＡＧ３〜５）により行うことができない。高い割合の硫酸を有する脱硫酸化Ｎアセチル化ＧＡＧｓ（ＧＡＧ１および２）は１２５ＩＦＮγを結合するが、ヘパリンまたは過硫酸化ＧＡＧｓより明らかに少ない。ニトロセルロースフィルターに結合したヘパリンまたはＧＡＧへの１２５ＩＦＮγの結合は結合溶液中の３０００倍より多いヘパリンによりブロックすることができる。これらの条件下でＧＡＧ１および２に関してより多くの結合は行われないが、ヘパリン、フラグミンおよび過硫酸化ＧＡＧｓへの結合は明らかに減少した（図８）。
【００５２】
【表１】
2004513060.tif 000002
【００５３】
＊）この試験で使用される種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの特性
Ｍｐ：分子数で割った全質量
Ｍｗ：分子量
ＮＤ：測定されず、
ＦｌｌａおよびＦｘａ活性は、低分子ヘパリンに関する最初の国際規格（１９８７年に導入された、コードＮｏ．８５／６００）を使用してＨａｎｄｅｌａｎｄ等（Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ　ａｎｄ　ＬＭＷ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：Ｔｗｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｉｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ　１９８４　３５　６２７）に記載の方法により決定した。
【００５４】
図１
ＩＦＮγで刺激後のＰＴＥＣでの用量に関連したＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩおよびＩＣＡＭ１発現。
【００５５】
細胞を７２時間以上にわたり種々のＩＦＮγ濃度で刺激した。その後ＭＨＣクラスＩ（左側目盛り）、ＭＨＣクラスＩＩ（右側目盛り）およびＩＣＡＭ１（左側目盛り）の発現をＦＡＣＳ（＝フローサイトメトリー）により決定した。結果を相当する試験の平均蛍光強度として図面に示す。
【００５６】
図２
ＩＦＮγで刺激したＨＵＶＥＣ細胞のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に関するヘパリンの作用。
【００５７】
ＩＦＮγで刺激した（１００ｎｇ／ｍｌ、７２時間、灰色の棒グラフ）ＨＵＶＥＣまたは刺激していない（白い棒グラフ）ＨＵＶＥＣを種々のヘパリン濃度で刺激しながら培養した。その後ＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。結果を相当する試験の平均蛍光強度として図面に示す。
【００５８】
図３
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に関するヘパリンの作用。
【００５９】
ＩＦＮγで刺激した（１０ｎｇ／ｍｌ、７２時間）ＰＴＥＣまたは刺激していないＰＴＥＣを種々のヘパリン濃度で刺激しながら培養した。その後３個の模造した培養基のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。図３ａはＭＨＣクラスＩ発現を示す。図３ｂはＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。図３ｃはＩＣＡＭ１発現を示す。結果を平均蛍光強度＋／−２ＳＤとして図面に示す。
【００６０】
図４
ＩＦＮγで刺激した細胞のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用。
【００６１】
ＩＦＮγで刺激した（１０ｎｇ／ｍｌ、７２時間、黒い棒グラフ）ＨＵＶＥＣ細胞または刺激していない（斜線のグラフ）ＨＵＶＥＣ細胞を種々のヘパリンまたはグリコサミノグリカンを用いて刺激期間中３ｍｇ／ｍｌの濃度で培養した。その後ＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。図４ａはＭＨＣクラスＩ発現を示し、図４ｂはＭＨＣクラスＩＩ発現を示し、図４ｃはＩＣＡＭ１発現を示す。結果を平均蛍光強度＋／−２ＳＤとして図面に示す。
【００６２】
図５
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用。
【００６３】
ＩＦＮγで刺激した（１０ｎｇ／ｍｌ、７２時間、黒い棒グラフ）ＰＴＥＣ細胞または刺激していない（斜線のグラフ）ＰＴＥＣ細胞を種々のヘパリンまたはグリコサミノグリカンを用いて刺激期間中３ｍｇ／ｍｌの濃度で培養した。その後ＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。図５ａはＭＨＣクラスＩ発現を示し、図５ｂはＭＨＣクラスＩＩ発現を示し、図５ｃはＩＣＡＭ１発現を示す。結果を相当する試験の平均蛍光強度として図面に示す。
【００６４】
図６
ＧＡＧ６〜８およびヘパリンの、ＩＦＮγで刺激した（１０ｎｇ／ｍｌ、７２時間）ＰＴＥＣ細胞のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現を阻害するその作用の比較。
【００６５】
ＰＴＥＣ細胞を刺激期間中に種々の濃度のＧＡＧ６、ＧＡＧ７、ＧＡＧ８およびヘパリンを用いて培養した。その後ＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。これらの抗原の発現はＧＡＧ（−ＧＡＧ）の不在でまたはＩＦＮγ（−ＩＦＮ）の不在で決定した。図６ａはＭＨＣクラスＩ発現を示す。図６ｂはＭＨＣクラスＩＩ発現を示し、図６ｃはＩＣＡＭ１発現を示す。結果を平均蛍光強度＋／−２ＳＤとして図面に示す。
【００６６】
図７
ＩＦＮγにより生じたＰＴＥＣ細胞でのＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現の刺激の範囲のＮａＣｌＯ３の作用。
【００６７】
ＰＴＥＣ細胞を、ＩＦＮγで刺激する前に、一日、ＮａＣｌＯ３１５０ｍＭ（黒い棒グラフ）または浸透圧調節剤としてＮａＣｌ１５０ｍＭ（斜線のグラフ）で処理した。その後細胞を種々のＩＦＮγ濃度で、同じ濃度のＮａＣｌＯ３またはＮａＣｌの存在で７２時間刺激した。引き続き３個の模造培養基のＭＨＣおよびＩＣＡＭ１発現をＦＡＣＳにより決定した。図７ａはＭＨＣクラスＩ発現を示し、図７ｂはＭＨＣクラスＩＩ発現を示す。図７ｃはＩＣＡＭ１発現を示す。結果を平均蛍光強度＋／−２ＳＤとして図面に示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ　Ｔ試験において１つ星はｐ＜０．０５を意味し、２つ星はｐ＜０．０１を意味する。
【００６８】
図８
ヘパリン、フラグミンおよび種々の他のグリコサミノグリカンへの１２５ＩＦＮγの結合。
【００６９】
ヘパリン（Ｈｅｐ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）１〜８およびフラグミン（Ｆｒａｇｍ）を前記のように製造したニトロセルロースフィルターでブロットした。ニトロセルロースストリップを３０００倍過剰のヘパリンの存在または不在で１２５ＩＦＮγで培養した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＩＦＮγで刺激後のＰＴＥＣでの用量に関連したＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩおよびＩＣＡＭ１発現の結果を相当する試験の平均蛍光強度として示した図である。
【図２】
ＩＦＮγで刺激したＨＵＶＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩおよびＩＣＡＭ１発現に関するヘパリンの作用の結果を相当する試験の平均蛍光強度として示した図である。
【図３ａ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ発現に関するヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図３ｂ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩＩ発現に関するヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図３ｃ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＩＣＡＭ１発現に関するヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図４ａ】
ＩＦＮγで刺激したＨＵＶＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図４ｂ】
ＩＦＮγで刺激したＨＵＶＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩＩ発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図４ｃ】
ＩＦＮγで刺激したＨＵＶＥＣ細胞のＩＣＡＭ１発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図５ａ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図５ｂ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩＩ発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図５ｃ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＩＣＡＭ１発現に関する種々のヘパリンおよびグリコサミノグリカンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図６ａ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ発現を阻害するＧＡＧ６〜８およびヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図６ｂ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＭＨＣクラスＩ発現を阻害するＧＡＧ６〜８およびヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図６ｃ】
ＩＦＮγで刺激したＰＴＥＣ細胞のＩＣＡＭ１発現を阻害するＧＡＧ６〜８およびヘパリンの作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図７ａ】
ＩＦＮγにより生じるＰＴＥＣ細胞でのＭＨＣクラスＩ発現の刺激へのＮａＣｌＯ３の作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図７ｂ】
ＩＦＮγにより生じるＰＴＥＣ細胞でのＭＨＣクラスＩＩ発現の刺激へのＮａＣｌＯ３の作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図７ｃ】
ＩＦＮγにより生じるＰＴＥＣ細胞でのＩＣＡＭ１発現の刺激へのＮａＣｌＯ３の作用の結果を平均蛍光強度として示した図である。
【図８】
ヘパリン、フラグミンおよび種々の他のグリコサミノグリカンへの１２５ＩＦＮγの結合を示す図である。
【図１】
2004513060.tif 000003
【図２】
2004513060.tif 000004
【図３Ａ】
2004513060.tif 000005
【図３Ｂ】
2004513060.tif 000006
【図３Ｃ】
2004513060.tif 000007
【図４Ａ】
2004513060.tif 000008
【図４Ｂ】
2004513060.tif 000009
【図４Ｃ】
2004513060.tif 000010
【図５Ａ】
2004513060.tif 000011
【図５Ｂ】
2004513060.tif 000012
【図５Ｃ】
2004513060.tif 000013
【図６Ａ】
2004513060.tif 000014
【図６Ｂ】
2004513060.tif 000015
【図６Ｃ】
2004513060.tif 000016
【図７Ａ】
2004513060.tif 000017
【図７Ｂ】
2004513060.tif 000018
【図７Ｃ】
2004513060.tif 000019
【図８】
2004513060.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004513060.tif 000021
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【国際調査報告】
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