(57)【要約】本発明はヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの活性を調節する化合物のスクリーニング方法、および細胞をヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼ調節剤と接触させることによって細胞の生存度に影響を及ぼす方法を提供する。この接触は細胞中の特定のヒトヘリカーゼの活性を特異的に増大または低下させ、テロメア伸長制御過程に作用することによって、細胞の生存度に影響を及ぼす。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼのすべてまたは生物学的に活性な部分をコードする精製および分離された核酸配列であって、上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼが配列番号：２で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする核酸配列。
【請求項２】
配列番号：１または配列番号：３で示される核酸配列を含む、請求項１記載の核酸配列。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクターおよび核酸分子に機能可能的に結合された発現調節配列を含む、形質転換宿主細胞。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸分子を含む発現ベクターおよび核酸分子に機能可能的に結合された発現調節配列を含む、形質転換宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸配列の補体を含む精製および分離された核酸配列。
【請求項８】
請求項２に記載の核酸配列の補体を含む精製および分離された核酸配列。
【請求項９】
配列番号：２で示されたアミノ酸配列を含む、ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼ。
【請求項１０】
ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの製造方法であって、上記方法が下記の工程：
ａ）上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼをコードする請求項１に記載の核酸配列を適当な発現ベクターに挿入する；
ｂ）上記発現ベクターを適当な形質移入宿主細胞に形質移入する；
ｃ）上記形質移入宿主細胞を適当な培養媒体中で生長させる；および
ｄ）上記培養媒体からヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼを精製する
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの製造方法であって、上記方法が下記の工程：
ａ）上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼをコードする請求項２に記載の核酸配列を適当な発現ベクターに挿入する；
ｂ）上記発現ベクターを適当な形質移入宿主細胞に形質移入する；
ｃ）上記形質移入宿主細胞を適当な培養媒体中で生長させる；
ｄ）上記培養媒体からヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼを精製する
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ストリンジェントな条件下、請求項２に記載の核酸配列にハイブリダイズする、分離された核酸配列。
【請求項１３】
請求項９に記載のヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼであって、下記の工程：
ａ）上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼのすべてまたは一部をコードする核酸配列を適当な発現ベクターに挿入する；
ｂ）上記発現ベクターを適当な形質移入宿主細胞（細菌、昆虫または哺乳動物のどれでもよい）に形質移入する；
ｃ）上記形質移入宿主細胞を適当な培養媒体中で生長させる；
ｄ）上記培養媒体からヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼまたはフラグメントを精製する
ことによって製造されることを特徴とするヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼ。
【請求項１４】
ヘリカーゼｈｐｉｆ１の調節剤の同定方法であって、下記の工程：
（ａ）ＡＴＰの存在下または不存在下でヘリカーゼ活性が試験され得る条件下、ｈｐｉｆ１タンパク質の存在下、ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの可能性のある調節剤を接触させる；および
（ｂ）上記調節剤が特異的に上記活性を増大または低下させるかによって、上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの活性を測定する
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
上記ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼが、配列番号：２で示されるタンパク質のすべてまたは生物学的に活性な部分を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
分離および精製された核酸分子であって、下記の群：
（ａ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するヒトヘリカーゼタンパク質をコードする核酸配列；
（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；
（ｃ）（ａ）と少なくとも９０％の配列同一性を示す核酸配列；および
（ｄ）少なくとも１８個の塩基であり、ストリンジェントな条件下、（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズする、（ａ）または（ｂ）のフラグメント
から選ばれる核酸配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項１７】
高ヘリカーゼ活性または低テロメラーゼ活性を示す細胞の存在が特徴である障害を調整する方法であって、上記細胞をヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの量または活性を阻害する試剤と接触させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
上記障害が老化である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
低ヘリカーゼ活性または高テロメラーゼ活性を示す細胞の存在が特徴である障害を調整する方法であって、上記細胞をヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの量または活性を増大する試剤と接触させることを特徴とする方法。
【請求項２０】
上記障害が、癌または炎症である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
配列番号：１または配列番号：３で示される配列の少なくとも３０個の近接する塩基を含む、精製または分離された核酸配列。
【請求項２２】
配列番号：１または配列番号：３で示される配列の少なくとも５０個の近接する塩基を含む、精製または分離された核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は酵母ヘリカーゼのヒト相同体のヌクレオチド配列、ｐｉｆ１、タンパク質のアミノ酸配列およびヘリカーゼの用途を記載する。好ましくは、本発明はヒトｐｉｆ−１型ヘリカーゼを含む。
【０００２】
発明の背景
ヒト正常体細胞（例えば、線維芽細胞、内皮および上皮細胞）は、豊富な成長因子の存在にもかかわらず増殖の休止を特徴とする５０−１００個体群倍加の有限の複製能力を示す。このインビトロの複製の休止はさまざまに細胞の老化または細胞の加齢とかいう。細胞の複製寿命はドナーのインビボ年齢に逆比例しており、従って、細胞の老化はインビボの加齢に重要な役目を果たしていると思われる。
【０００３】
細胞の不死化（無制限複製能力の獲得）は細胞休止からの異常な逸脱とみなすことができる。Ｓｈａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． （１９９１） １９６：３３。正常なヒト体細胞は死ぬべき運命にある、すなわち、有限の増殖能力を有している。反対に、生殖系列および悪性腫瘍細胞は不死である（無制限の増殖能力を有する）。インビトロ培養ヒト細胞は、不死性になるためにウイルス腫瘍性タンパク質の形質転換およびテロメラーゼ過剰発現の助けが必要であると思われる（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４００：４６４−４６８， １９９９）。
【０００４】
染色体末端のＤＮＡはテロメアの簡単な配列の繰り返しの欠失および付加の動力学的平衡を維持しいる。配列欠失は細胞複製中に生じ、一部はＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによる染色体末端の不完全な複製から起こる。テロメア反復付加は、酵素テロメラーゼ：ポリメラーゼ反応の鋳型としてＲＮＡ内の短い領域を用いるリボ核タンパク質酵素によって触媒される。細胞は欠失および付加を平衡化することによって一定数のテロメア反復を維持することができるが、全ての細胞ができるわけではない。ヒト生殖系列および腫瘍細胞は一定数のテロメア反復を維持し得るが、正常ヒト体細胞は細胞分化の各サイクル毎にテロメア反復を失う。上述のように、安定したテロメアの長さを維持しない細胞は有限の増殖能力を示す；一定数の個体群倍加後のこれらの細胞老化は、臨界的最短の長さまでのテロメアの侵食と相関関係にある。
【０００５】
正常体細胞はテロメラーゼを発現または必要とするとは思われないし、染色体末端を維持しないし、また全てのまたは殆ど全ての腫瘍細胞はテロメラーゼ活性を高発現し、染色体末端を維持しているから、テロメラーゼ活性を阻害するか、または変化させる化合物は効果的および非−毒性抗腫瘍剤を提供できる。同様に、寄生性または感染性病原体（例えば、トリパノゾーマ、菌類など）は、これらの病原体の生存度または増殖を低下させるための具体的な方法を提供できる。逆にいえば、増殖−制限細胞（正常体細胞、例えば、血液、脈管構造、肝臓、皮膚など）におけるテロメラーゼの活性化は付加的増殖寿命を延長する（すなわち、細胞の老化を避ける、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ， １９９９）メカニズムを提供し得る。テロメラーゼおよびその機能については、米国特許第５，７７０，４２２を参照し、ここに引用してそのすべてをこの明細書の記載とする。
【０００６】
Ｐｉｆ−１ヘリカーゼは新生テロメア形成およびテロメア延長の両方の必須の協力者としてサッカロミセス酵母中で同定された。米国特許第５，４６６，５７６号（そのすべてをここに引用して明細書の記載とする）。Ｐｉｆ−１ヘリカーゼはテロメアの活性および／または複製機構の要素との相互作用の制御によって働く。酵母ｐｉｆ−１またはそれと密接に関連するｐｉｆ−様ヘリカーゼＲＲＭ３のいずれかの欠失突然変異は、正常な長さのテロメアを複製および維持する細胞の能力に影響を与える（すなわち、ヘリカーゼは細胞老化に関係する）。テロメアＤＮＡ末端の環状構造の最近の報告はテロメアの維持および複製におけるヘリカーゼについての重要な役目を示唆している（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ９７：５０３−５１４， １９９９）。
【０００７】
ヘリカーゼ活性を調節する（小分子量の）標的化合物を効果的にスクリーニングするために、当分野においてヒトｐｉｆ−１ヘリカーゼの核酸配列を知る必要性がある。ヘリカーゼ活性を調節するそのような化合物は２つの方法で有用である：（１）ヒトヘリカーゼの活性を減少させることによって、テロメラーゼ活性の濃度またはテロメラーゼの大きさは減少し、細胞の生存度は減少する（すなわち、複製が遅延、減速または停止）；および（２）細胞内のヘリカーゼ活性を増大させることによって、テロメラーゼの活性またはテロメアの長さが増大し、細胞の生存度が高くなる（すなわち、細胞老化の回避）。従って、発明者はここに初めて、現在までに報告されたテロメア維持に関与する唯一の哺乳動物のヘリカーゼである、ヒトｐｉｆ−１型ヘリカーゼの核酸およびアミノ酸配列を提供する。
【０００８】
発明の要約
発明者はここにヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの核酸配列を提供する。また、ヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼのアミノ酸配列およびヒトヘリカーゼの活性を調節し得る化合物のスクリーニング方法を提供する。すなわち、本発明は従って、ヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼ、または本発明のＰｉｆ−１ヘリカーゼに独特の核酸分子のオリゴヌクレオチドフラグメントをコードしている配列を有する、精製および分離された核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子を提供する。本発明の好ましい実施態様において、精製および分離された核酸分子は配列番号：１で示される配列を有する。
【０００９】
本発明はまた、相補性ヌクレオチド塩基配列と水素結合している、本発明の核酸分子またそのオリゴヌクレオチドフラグメントを含む二本鎖核酸分子を含む。
【００１０】
本発明はまた提供する：（ａ）配列番号：１で示される配列を含む精製および分離された核酸分子；（ｂ）（ａ）に相補性である核酸配列；（ｃ）（ａ）と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なお好ましくは少なくとも９５％、もっとも好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列；または（ｄ）少なくとも１８個の塩基であり、ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズする（ａ）または（ｂ）のフラグメント。特に、ヘリカーゼに特徴的な保存性モチーフを含むそれらの配列を提供する。
【００１１】
本発明はまた、細胞また複数の細胞（単に「細胞」という）中のヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの活性の調節剤と細胞を接触させることによって細胞の生存度に影響を及ぼす方法に関する。このような接触が細胞中のヘリカーゼの活性、従って、細胞の生存度、を特異的に増大または減少させる。好ましくは、このような調節剤はヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの特異的阻害剤である。好ましくは、このような調節剤は、ヘリカーゼ活性に影響を及ぼす化学的に定義された小分子または他のポリペプチドである。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は下記の本発明の好ましい具体例および請求の範囲の記載から明らかである。この明細書に引用された上掲または下記のすべての文献は引用してそのすべてをこの明細書の記載とする。
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、好ましくは配列番号：１で示される核酸配列を含むヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼをコードする核酸配列を開示する。ヒトヘリカーゼをコードする核酸配列を含むプラスミドがアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号２０４１６９が付与された。ここでいう寄託は、特許手続の目的で微生物の寄託に関する国際的承認によるブタペスト条約の条件のもとで維持されるものである。これらの寄託は当業者に便利なように行われたのであり、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１２のもとで要求されることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによってコードされるポリヌクレオチドのアミノ酸配列は引用することによって明細書の記載とされ、ここに含まれる配列の記載と何らかの齟齬が生じた場合に照合される。寄託物の製造、使用または販売には契約が必要であり、そのような契約がこれによって認められたのではない。
【００１４】
本発明は、図１（配列番号：１）に示される新規ヒトヘリカーゼの核酸配列またはそのフラグメント（ここで「ポリヌクレオチド」という）、およびヒトヘリカーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）、およびその生物学的活性部分に関する。「生物学的活性部分」とは、ヘリカーゼの活性を示す（すなわち、テロメア形成または延長に作用する）か、ＤＮＡ結合、ＤＮＡ鎖分割に関与するか、またはＡＴＰ結合またはヘリカーゼによる加水分解に関与するという本発明のヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの部分をいう。
【００１５】
好ましい具体例において、本発明のヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼは、図の配列番号：１に示される核酸配列によってコードされている。
【００１６】
好ましい具体例において、ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼは、この核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。これらのデータから演繹されるもっとも可能性のある配列を図の配列番号：２に示す。
【００１７】
本発明はさらに、配列番号：２の推論されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体をコードするここに上記記載の核酸配列の変異体に関する。核酸配列の変異体は核酸配列の天然由来の変異体または核酸配列の非−天然由来の変異体であってもよい。
【００１８】
すなわち、本発明は配列番号：２で示されるのと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされたのと同じ成熟ポリペプチドおよびそのようなポリヌクレオチドの変異体であって、この変異体は配列番号：２のポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされたポリペプチドのフラグメント、誘導体または類似体をコードしている。このようなヌクレオチド変異体は削除変異体、置換変異体および付加または挿入変異体を含む。
【００１９】
用語「分離および精製された核酸」および「実質的に純粋な核酸」、例えば、実質的に純粋なＤＮＡは、下記の１つまたは両方である核酸分子をいう：（１）核酸が誘導される生物体からの天然由来のゲノム中でその核酸分子が直接接している（すなわち、５’末端でまたは３’末端で）配列、例えば、コード配列、の１つまたは両方のいずれかと直接接していない；または（２）核酸が誘導される生物体中に核酸分子が生じる核酸配列が実質的に存在しない。この用語は、例えば、ベクター中、例えば、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス中、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に組入れられる組換ＤＮＡ、または他のＤＮＡ配列から独立した分離した分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生じたｃＤＮＡフラグメントまたはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換ＤＮＡを含む。実質的に純粋なまたは分離および精製されたＤＮＡはまた、追加のタンパク質をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換ＤＮＡを含む。
【００２０】
本発明は以下のような具体例を含む：（ａ）ヒトヘリカーゼタンパク質をコードする配列（データから推論される最も可能性のあるアミノ酸配列は配列番号：２で示される）を含む分離および精製された核酸分子；（ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；（ｃ）少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、なお好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％が（ａ）に一致する配列；または（ｄ）少なくとも１８個の塩基であって、ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズする、（ａ）または（ｂ）のフラグメント。ヒトおよび酵母ｐｉｆ１ヘリカーゼ間で検出される相同性があるならば、相同性の類似または高い程度は、げっ歯類、類人猿などのより密接に関連する哺乳動物の配列に存在するはずである。
【００２１】
未変性および変異体配列間の相同性の程度（同一％）は、例えば、通常この目的のために用いられるコンピュータープログラムを用いて２つの配列を比較することによって決定することができる。適切なプログラムはＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：３８７に記載のＧＡＰコンピュータープログラムである。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２：４８２によって修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４３３の整列化法を用いている。要約すれば、ＧＡＰプログラムは同一性を、２つの配列のより短い方の記号の総数で一致している整列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した数として定義している。
【００２２】
この明細書で用いられる用語「ストリンジェントな条件」とは、その条件下で、ヌクレオチド配列がここに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列を含む分離および精製された核酸分子に、または（ａ）に相補的な核酸配列（ｂ）にハイブリダイズする当業者に公知の条件を含む。ストリンジェントな条件下でポリヌクレオチドをスクリーニングすることは、Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：４０２−４０４（１９８５）に記載の方法によって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列は、例えば、開示されたＤＮＡ配列の対立遺伝子であってもよく、または他の哺乳動物源から誘導されるものであってもよい。核酸ハイブリダイズの一般的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ”， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）； ａｎｄ Ｈａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９８５）に記載されており、これらの文献を引用して明細書の記載とする。
【００２３】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡの区間を意味する；コード領域の前後にある領域（リーダーおよびトレーラー）および個々のコード区間（エクソン）の間にある介在配列（イントロン）を含む。
【００２４】
本発明の完全な全長遺伝子のフラグメントは、完全な全長遺伝子を分離するためおよび本発明の遺伝子に対して高い配列類似性を持つかまたは類似の生物学的活性を持つ他の遺伝子を分離するために、ｃＤＮＡライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。このタイプのプローブは少なくとも２０〜３０個の塩基を持つことが好ましく、例えば５０個またはそれ以上の塩基を含有してもよい。それらのプローブは、完全な長さの転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよび、調節領域、プロモーター領域、エクソンおよびイントロンを含む本発明の遺伝子全体を含有する１または複数のゲノムクローンを同定するためにも使用できる。
【００２５】
さらに本発明は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは９８％の同一性がある場合は、この明細書に開示するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関する。特に本発明はストリンジェントな条件で本明細書に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。
【００２６】
別法として、上記のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本発明のポリヌクレオチドに対して上記のような同一性を有し、活性は保持しても保持しなくてもよい、少なくとも２０個の塩基、好ましくは少なくとも３０個の塩基、より好ましくは少なくとも５０個の塩基を持ってもよい。例えばこのようなポリヌクレオチドは配列番号：１のポリヌクレオチドのプローブとして、例えば、ポリヌクレオチドを回収するために、または診断用プローブとして、またはＰＣＲプライマーとして使用できる。
【００２７】
すなわち、本発明は、配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドに対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは９８％の同一性を有するポリヌクレオチドならびにそのフラグメントであって、このフラグメントは少なくとも２０または３０個の近接する塩基、好ましくは少なくとも５０個の近接する塩基を有し、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。
【００２８】
さらに本発明は、配列番号：２で示される推定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡよってコードされたアミノ酸配列を有するＰｉｆ−１型ヘリカーゼポリペプチド、およびそのようなポリペプチドのフラグメント、類似体および誘導体に関する。
【００２９】
本発明の新規ヒトヘリカーゼの類似体も本発明の範囲に含まれる。類似体は本発明の天然のヒトヘリカーゼとはアミノ酸配列が異なり、変異体かまたはスプライスバリアントのいずれかであるか、配列に無関係な形で相違するか、またはその両者であってもよい。非配列修飾には本発明のヒトヘリカーゼのインビボまたはインビトロでの化学的誘導体化が含まれる。非−配列修飾にはアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化が含まれる。
【００３０】
好ましい類似体には、１もしくは複数の保存的アミノ酸置換または本発明のヒトヘリカーゼの生物学的活性を消失させない１もしくは複数の非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入によって、野生型配列と異なる配列を持つ新規ヒトヘリカーゼ（またはその生物学的活性フラグメント）が含まれる。典型的には、類似した特徴を持つ別のアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換には、例えば、次の各群内での置換が含まれる：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニンおよびフェニルアラニン、チロシン。他の保存的アミノ酸置換は下記の表から選択できる。
【００３１】
【表１】保存的アミノ酸置換
2004513606.tif 000003
【００３２】
本発明に含まれる他の類似体は、タンパク質またはペプチドの安定性を増加させる修飾を有する類似体である；例えば、そのような類似体はそのタンパク質またはペプチド配列中に１または複数の（ペプチド結合の代わりをする）非ペプチド結合を含有し得る。また、天然由来のＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸または非天然由来または合成アミノ酸、例えばβ−またはε−アミノ酸）を含む類似体も含まれる。
【００３３】
他の類似体は保存されたヘリカーゼのモチーフを含むが関連および／または重複機能を有していてもよい関連ヘリカーゼの可能性のある変異体、例えば、酵母中のｐｉｆ１および関連するＲＲＭ３などを含む。
【００３４】
他の類似体は当業者に自明な方法（ハイブリダイズ、データ検索、配列相同性研究）によってヒトヘリカーゼ配列との相同性によって回収された他の高度な真核生物ヘリカーゼを含む。
【００３５】
本発明の新規ヒトヘリカーゼタンパク質の一般的な用途に関して、既述のように、本発明のヒトヘリカーゼは、ヒトヘリカーゼの調節剤のスクリーニングおよび細胞分化の停止に有用である。本発明の新規核酸配列はまた、遺伝子治療のためのヒトヘリカーゼの製造に有用であり、宿主細胞に組入れることができる。
【００３６】
上記のように、「生存度」は分化する細胞の能力をいう。Ｐｉｆ−１ヘリカーゼ活性の調節剤はその細胞がそれによってその細胞が経験する細胞分化の数を増大かまたは減少させるかのいずれかである。そのような数は、当業者に周知の方法によって容易に測定し得る。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、患者の疾患または症状の治療方法であって、細胞中のテロメラーゼ活性の程度の高低によって引き起こされる疾患または症状に悩む患者を確認し、患者の細胞を上記の調節剤と接触させることを特徴とする方法を含む。例えば、高度に増殖する癌細胞は、このようなヘリカーゼ阻害剤によって、停止、減衰または死滅させることができる。
【００３８】
さらなる側面において、本発明はヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの調節剤の同定方法であって、可能性のある調節剤とヒトヘリカーゼを接触させ、インビトロまたはインビボでヘリカーゼの活性を測定することを特徴とする方法を提供する。有用な調節剤は、特異的にヒトヘリカーゼの活性を増大または減少させる調節剤を含み、ヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼと、またはヒトヘリカーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、ヒトヘリカーゼの天然由来の阻害剤または活性化剤と、またはそのようなヒトヘリカーゼの天然由来の阻害剤または活性化剤をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと、特異的に相互作用し得るオリゴヌクレオチド、ペプチド、および／または小分子を含む。
【００３９】
本発明の遺伝子構築物は、遺伝子治療方法の一部として、本発明のヒトヘリカーゼをコードする核酸を送達するために使用することもできる。本発明はヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼのインビボでのトランスフェクション、発現および過剰発現のための発現ベクターを特徴とする。本発明の発現構築物は、生物学的に有効な担体に保持させて、例えば、ヒトヘリカーゼ遺伝子を生体内の細胞に効果的に送達し得る製剤または組成物の形で投与できる。その方法としては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純疱疹ウイルス１型などのウイルスベクター中、または組換え細菌プラスミドまたは真核細胞プラスミドへの当該遺伝子の挿入が挙げられる。ウイルスベクターは細胞に直接トランスフェクトする。細胞をウイルスベクターに感染させることの利点は、標的細胞の大部分がその核酸を受容できる点である。ウイルス送達系が当技術分野でいくつか知られており、本発明を実施する場合はそれらを利用することができる。
【００４０】
ウイルス導入法の他に、非ウイルス法を使用して、動物の組織でヒトヘリカーゼを発現させることもできる。ほとんどの非ウイルス的遺伝子導入法は、哺乳動物細胞が巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送に利用する通常の機構によるものである。この種の遺伝子送達系の例としては、リポソーム由来系（例えば、リポフェクチンなど）、ポリリジンコンジュゲート、Ｃａ−燐酸塩沈澱物および人工ウイルスエンベロープなどがある。本発明のＤＮＡは遺伝子構築物の直接注入によって細胞に導入することもできる。
【００４１】
臨床的には、それぞれ当技術分野で知られているいくつかの方法のいずれかによって、治療用ヒトヘリカーゼ遺伝子のための遺伝子送達系を患者に導入することができる。例えば、上記遺伝子送達系の医薬製剤は全身的に例えば静脈内注射によって導入することができ、標的細胞でのタンパク質の特異的形質導入は、主に、その遺伝子送達媒体のもたらすトランスフェクション、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型もしくは組織型発現、またはその組み合わせによって起こる。ここではまた、ウイルス性ベクターを送達のために用いることができる。
【００４２】
遺伝子治療用構築物の医薬製剤は許容され得る希釈剤中の遺伝子送達系から実質的に構成されるか、または遺伝子送達媒体が包埋されている徐放性マトリックスを含むことができる。別法として、遺伝子送達系全体を完全な状態で組換え細胞から産生させることができる場合（例えばレトロウイルスベクター）、医薬製剤はその遺伝子送達系を産生する１または複数の細胞からなってもよい。
【００４３】
本発明の別の側面は「アンチセンス」治療における分離された核酸の使用に関する。この明細書で用いる「アンチセンス」治療という用語は、コードされているタンパク質の発現が、例えば転写および／または翻訳の阻害によって抑制されるように、細胞条件下で本発明のヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を投与するか、または当該部位で生成させる治療をいう。一般に「アンチセンス」治療とは、当技術分野で一般的に採用される技術範囲をいい、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する治療を含む。
【００４４】
配列番号：２で示されるヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼ、およびそのフラグメントもまた本発明の範囲に含まれる。タンパク質のフラグメントはいくつかの方法、例えば、組換的に、タンパク質分解によって、または化学合成によって製造され得る。ポリペプチドの内部または末端フラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸の一端（末端フラグメント）、または両端（内部フラグメント）から１またはそれ以上のヌクレオチドを除去することによって生成させることができる。すなわち、「エンドニブリング（ｅｎｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼによる消化で、一連のフラグメントをコードするＤＮＡを生成させることができる。ヒトヘリカーゼタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡは、無作為切断、制限消化、ｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅または上記方法の組み合わせによって生成させることもできる。これらの部分的ＤＮＡフラグメントはまた、当業者によって行われる方法によって、コードされたタンパク質の選択領域を発現させるためのベクター中に用いることができる。これらのフラグメントまたは全タンパク質は、診断または臨床目的のためのｈＰｉｆ１タンパク質の検出のための抗体を生成させるために用いることができる。
【００４５】
タンパク質フラグメントは従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当技術分野で公知の技術を使って化学的に合成することもできる。本発明のヒトヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列変異体は、タンパク質またはそのタンパク質の特定のドメインもしくは領域をコードするＤＮＡの無作為または目的とした突然変異誘発法によって製造することができる。ＰＣＲ突然変異導入法や飽和突然変異体作製など有用な方法が当技術分野では知られている。一組の変性オリゴヌクレオチド配列の合成により、任意のアミノ酸配列変異体のライブラリーを作製することもでき、当業者に知られ実施されている方法である。
【００４６】
非−無作為、すなわち目的とした突然変異導入技術を使って特定の領域に特定の配列または突然変異をもたらすこともできる。これらの技術は、本発明のヒトヘリカーゼタンパク質の公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入または置換などを含む変異体を創造するために使用し得る。突然変異部位は例えば、（１）まず保存的アミノ酸で置換し、次に達成された結果に応じてさらに過激な選択をする；（２）標的残基を削除する、または（３）特定した部位に隣接して同じ種類または異なる種類の残基を挿入する、または（１）〜（３）の組み合わせなどの方法によって、個別にまたは連続的に改変することができる。アラニンスキャニング突然変異導入法は、突然変異を導入するのに好ましい位置またはドメインである所望のタンパク質の一定の残基または領域を同定するのに役立つ方法である。オリゴヌクレオチド−仲介突然変異導入法、カセット突然変異導入法および組合せの突然変異導入法は、ＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体を製造する有用な方法として当業者に知られている。
【００４７】
本発明は薬物スクリーニング試験法も提供する。本発明の精製組換えヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼまたはそのフラグメントを利用し得ることにより、当業者は、ヒトヘリカーゼの活性を増大させるかまたは減少させるかのいずれかの薬物のスクリーニングするためにこのヒトヘリカーゼを用いることができる。一般に、特定のヘリカーゼ試験法をヒトヘリカーゼの調節剤を同定するために、Ｌａｈａｙｅ， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０：９９７に記載と同様にして用いることができる。「調節剤」という用語は、ヒトヘリカーゼの活性を増大もしくは活性を低下、または作用もしくは産生を活性化もしくは不活性化する化合物を含む。調節剤はポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（例えば、既述のアンチセンス治療に有用なもの）、ペプチド、タンパク質、および小分子量化合物を含む。「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、個々のヌクレオチドおよびＤＮＡおよびＲＮＡ配列またはそのフラグメントを含む。
【００４８】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、与えられた期間内に調査される化合物の数を最大にするために、高処理試験法が望ましい。例えば精製または半精製タンパク質を使って誘導され得るなどの無細胞系で行われる試験法は、試験化合物によって媒介される分子標的の変化を迅速に生じさせ比較的容易に検出できるようにさせ得る点で、多くの場合、一次スクリーニングとして好ましい。
【００４９】
それによって、テロメア生成または延長を調節する、本発明のヒトヘリカーゼを調節する方法も本発明の範囲に含まれる。「調節する」という用語は、本発明のヒトヘリカーゼの活性の増大、活性の低下、活性化または不活化を含む。ヒトヘリカーゼの活性を調節することはヘリカーゼ−関連疾患の治療に望ましい。「ヘリカーゼ−関連疾患」とは、ヒトヘリカーゼがその障害または疾患の経路で重要な役目を果たしているか、またはヘリカーゼ活性の調節が結果を緩解し得る疾患または疾患の状態をいう。このような疾患は、これに限定されないが、細胞の老化および腫瘍を含む。この明細書で、用語「治療」とは、ある患者における特定の障害の症状の緩解、特定の障害に関連する確認可能な測定値の改善、または特定の細胞の状態（細胞の老化または腫瘍など）の防止をいう。
【００５０】
テロメアの生成または伸長の調節剤は、細胞の存在下、本発明のヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼと、テロメア生成または伸長の可能性のある調節剤との接触；および上記調節剤が特異的にヘリカーゼ活性を増大または減少させ、それによって上記テロメアの生成または伸長を調節するヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの活性の測定によって同定することができる。
【００５１】
例えば、小分子量化合物、オリゴヌクレオチドまたはリボザイムなどのヒトヘリカーゼの調節剤は、予防的に、またはヘリカーゼ−関連疾患に罹患している患者に、例えば、リポソーム、放出制御媒体などの適当な送達媒体によって、電気穿孔法またはイオン対化合物、または共有結合付加物、および他の薬理学的に認められている送達方法を用いて、患部にその化合物を外来送達することによって投与することができる。
【００５２】
選択された化合物の具体的な送達経路は、その化合物の用途によって変わる。一般的に、各試剤の具体的な送達計画は、細胞内局在化に関して化合物そのものの取り込み、その後効果の立証に焦点を合わせる。別法として、臓器または組織中のこれらの同じ細胞への送達を行うことができる。
【００５３】
例えば、ポリヌクレオチドの採用され得る送達方法のいくつかは、リポソームへの封入、レトロウイルスベクターによる形質導入、コレステロールとの結合、ほとんどのｓｎＲＮＡに見られる抗原結合部位を用いる核区画への局在化、ヌクレオチド誘導体を用いるポリヌクレオチドの電荷の中和およびポリヌクレオチドを身体中へ分配するための血液幹細胞の使用を含む。
【００５４】
本発明の範囲にはまたヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼの活性を調節し得る少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物が含まれる。ヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼ調節剤は単独でまたは少なくとも１種の追加の活性化合物、および医薬的に許容され得る担体、補助剤または溶媒とともに投与され得る。「追加活性化合物」には例えば免疫抑制剤、抗癌薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬、抗真菌薬、抗生物質または抗血管過剰増殖化合物からなる群より選択される１または複数の試剤が含まれるが、これらに限らない。
【００５５】
「医薬的に許容され得る担体、補助剤または溶媒」という用語は、患者にヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼ調節化合物と一緒に投与され得、その薬理学的活性を破壊しない担体、補助剤または溶媒をいう。本発明の医薬組成物に使用され得る医薬的に許容され得る担体、補助剤または溶媒としては、例えば以下の物質が挙げられるが、これらに限らない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ｄ−トコフェロール　ポリエチレングリコール　１０００　コハク酸塩などの自己乳化型薬物送達システム（「ＳＥＤＤＳ」）、ツイーンなどの医薬投与形態に使用される界面活性剤または他の類似のポリマー送達マトリックス、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系の物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂。α−、β−およびγ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、または２−および３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリン、または他の可溶化誘導体などの化学修飾誘導体も、本発明の化合物の送達を増進するために使用され得る。
【００５６】
本発明の医薬組成物は下記のような他の治療薬を含んでいてもよく、例えば通常の固形もしくは液状の溶媒または希釈剤および所望の投与形態に適した種類の医薬添加物（例えば賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料など）を使用して、製薬技術分野でよく知られている技術に従って製剤化できる。
【００５７】
本発明のヒトＰｉｆ−１調節化合物を少なくとも１種含む医薬組成物は、適当な手段によって、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤または散剤などの形態で経口的に；または舌下投与により；またはバッカル投与により；皮下、静脈内、筋肉内もしくは胸骨内注射もしくは注入法などによって（例えば滅菌した注射用の水性または非水性溶液もしくは懸濁液として）非経口的に；または吸入スプレーなどによって経鼻的に；またはクリーム剤もしくは軟膏などの形態で局所的に；または坐剤などの形で経直腸的に；無毒性の医薬的に許容できる溶媒または希釈剤を含有する投与単位製剤として投与することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、即時放出または持続放出に適した形態で投与され得る。即時放出または持続放出は本発明の化合物を含む適当な医薬組成物の使用によって、または持続放出の場合は特に、皮下植込錠または浸透圧ポンプなどの装置の使用によって達成され得る。本発明のヒトＰｉｆ−１調節化合物はリポソームを使って投与することもできる。
【００５８】
経口投与のための組成物の例として、懸濁液（これは例えば、嵩高くするための微結晶セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロースおよび当技術分野で知られているような甘味剤または着香剤などを含有してよい）や即時放出錠（これは例えば微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または当技術分野で知られているような他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤などを含有してよい）が挙げられる。本化合物は舌下および／またはバッカル投与によって口腔を通して送達してもよい。湿製錠剤、圧縮錠剤または凍結乾燥錠剤は、使用され得る形態の例である。組成物の例は、マンニトール、乳糖、ショ糖および／またはシクロデキストリンなどの速溶性希釈剤とともにヒトＰｉｆ−１調節化合物を製剤化した組成物が挙げられる。このような製剤に含まれるものは、セルロース（アビセル）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子量賦形剤を含んでもよい。またこのような製剤は、粘膜付着を助ける、例えばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（例えばＧａｎｔｒｅｚ）などの賦形剤と、放出を制御する例えばポリアクリルコポリマー（例えばカーボポール９３４）などの薬剤を含んでもよい。製造と使用が容易なように滑沢剤、流動促進剤、香料、着色料および安定剤を加えてもよい。
【００５９】
鼻腔エアロゾル投与または吸入投与用の組成物の例として、食塩水溶液が挙げられ、これは例えばベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、生物学的利用能を向上させるための吸収促進剤および／または当技術分野で知られているような他の溶解剤もしくは分散剤などを含有してよい。
【００６０】
非経口投与用の組成物の代表例としては注射用の溶液または懸濁液が挙げられ、これらは例えば適当な無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶剤、例えばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、等張食塩溶液または他の適切な分散もしくは湿潤および懸濁化剤（合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）ならびに脂肪酸（オレイン酸など）を含有してよい。本明細書で用いられる「非経口」という用語は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。
【００６１】
直腸投与のための代表的組成物としては坐剤が挙げられ、これは常温では固体であるが直腸腔内では液化および／または溶解して薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤、例えばカカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールなどを含んでいてもよい。
【００６２】
局所投与のための代表的組成物にはプラスチベース（ポリエチレンでゲル化した鉱油）などの局所外用担体が含まれる。
【００６３】
本発明化合物のヒトＰｉｆ−１調節化合物の「治療的有効」量は当業者が決定するとができ、これを単回投与の形で、または複数分割投与の形で投与することができる。「治療的有効」とは、所望の結果、例えば、患者の特定の疾患の症状の緩解、特定の疾患に関連する確かめ得る数値の改善または特定の免疫応答の抑制を達成するのに必要な量をいう。特定の患者の具体的用量レベルと投薬頻度は様々であり、使用する具体的な化合物の活性、その化合物の代謝的安定性および作用の長さ、処置対象の種、年齢、体重、全身の健康状態、性別および食餌、投与方式と投与時間、排泄およびクリアランスの速度、併用薬ならびに当該状態の重症度を含む様々な要因によって変化することは理解されるだろう。好ましい処置対象には動物、最も好ましくはヒトなどの哺乳動物種が含まれる。
【００６４】
本発明のヒトＰｉｆ−１調節剤および上記ヒトＰｉｆ−１調節化合物を含む医薬組成物は単独で、または例えば、抗炎症剤、抗増殖剤、化学療法剤および免疫抑制剤などのそれぞれおよび／または複数の他の適当な治療剤と組合せて用いることができる。
【００６５】
ヒトＰｉｆ−１ヘリカーゼまたは本発明のヒトＰｉｆ−１調節化合物によって処置され得る疾患の症状としては、細胞の老化、癌または腫瘍（固形腫瘍、リンパ腫および白血病など）、胸、肺および前立腺の癌、ウイルス性複製疾患（レトロウイルス疾患およびヘルペスなどのＤＮＡおよびＲＮＡウイルス性複製疾患）、炎症反応などが挙げられる。
【００６６】
【実施例】
下記の実施例は本発明を理解するために記載されたものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
【００６７】
ヒトＰｉｆ−１型ヘリカーゼの同定
全長の配列を得るために、ＥＳＴクローンの配列に基づいてプライマーを設計した。５’−ＲＡＣＥを行い、ヒト心臓、胎児肺、および胎児胸腺のｃＤＮＡからのＰＣＲ生成物をサブクローニングし、配列決定した。第１回のＰＣＲから誘導しされた新規５’配列を次回の５’−ＲＡＣＥのプライマー設計に用いた。３回以上の５’−ＲＡＣＥを行い、可能性のある開始コドンＡＴＧを同定した。データベース調査によってｈｐｉｆ１コード配列の大部分を含むＥＳＴクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．＃１３３５６９１）を同定できた。ＥＳＴ＃１３３５６９１と５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ生成物を結合して全長のｃＤＮＡクローン複合体を作成した。このｈｐｉｆ１遺伝子は、Ｃ．エレガンスのｐｉｆ−１の大きさ（６７７個のアミノ酸）に近い６８９個のアミノ酸のポリペプチドをコードしている。
【００６８】
図３に示すように、推定アミノ酸配列は、酵母および線虫、Ｃ．エレガンスからの公知のＰＩＦ１タンパク質と高い類似性を示す。相同性の追加的な証拠は推定されるＡおよびＢ結合部分およびＤＮＡ結合部位の領域およびその周辺に見られる強い配列保存性を示す。これらの領域はｐｉｆ１の機能的活性に直接関与していると信じられている。
【００６９】
分離された核酸配列は公共のデータベース中に寄託されている多くのＥＳＴおよびＳＴＳ（ＧｅｎＢａｎｋ　受託番号：ＡＡ８２７７５５、ＡＡ４６４５２１、ＡＡ２７９１０２、Ｔ８５１２６、ＡＡ７４３６４７、ＡＡ４６４５２２、Ｔ５４６８３、Ｗ６０８８０、Ｇ１４４５３、ＡＡ２７８８３８、Ｔ８８８７０、Ｔ５４５９９、ＡＡ８７２５４１、Ｇ１４８５８、ＡＡ６４２９２４およびＷ６０６５１）と重複している。これらのヌクレオチドフラグメントはこの申請以前のｐｉｆ１活性と無関係である。
【００７０】
これらのＳＴＳ（複数）、ＳＨＧＣ−１３８３２（ＧｅｎＢａｎｋ　受託番号：Ｇ１４９５８）の１つが、ヒト染色体１５のＤ１５Ｓ１１７−Ｄ１５Ｓ１５９領域に位置付けられていたという事実は直接関係がある。ＳＨＧＣ−１３８３２はヒトｐｉｆ１遺伝子の３’末端で重複している（図２参照）。２５０塩基対領域にわたる配列同一性は９７％以上である。３’遺伝子配列領域に関して差異があるならば、この証拠は、８ｃＭ領域（染色体１５のｐ−テロメアから５０．８〜５８．８ｃｍ間）内のヒトｐｉｆ１の位置付けの部位を確定するのに十分である。
【００７１】
ｐｉｆ１のコード領域を含むｃＤＮＡインサートはＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼによって転写され、３５Ｓメチオニンの存在下網状赤血球細胞ライセート結合系［Ｐｒｏｍｅｇａ］で翻訳される。翻訳後混合物を沸騰させ、１００ｖにて１時間室温にて電気泳動によって１０％ポアミドアクリルゲル［バイオラド］中でタンパク質を分離する。ゲルを乾燥させ、一夜暴露後のオートラジオグラフを下記に示す。約８０ｋＤａの単一のバンドはインビトロの合成されたｈｐｉｆ１タンパク質を示す。
【００７２】
下記の実験操作を上記の実施例に用いた：当分野で周知の記載と同様にアプライドバイオシステム自動シークエンサーおよび蛍光標識鎖状ターミネーターを用いて配列を決定した。
【００７３】
本発明を明解にし説明する目的で具体的説明および実施例によっていくらか詳細に記載したが、ある種の変更および修正が添付の請求の範囲の範囲内で行い得ることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】分離された核酸分子の配列（配列番号：１）
【図２Ａ】図２は推定ヒトｐｉｆ１コード領域（配列番号：２）。推定アミノ酸配列は小文字でヌクレオチド配列の下に示されている。ＳＴＳ ＳＨＧＣ−１３８３２（遺伝子銀行受託番号Ｇ１４８５８、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍｙｅｒｓ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒによって寄託）と重なっているヌクレオチド配列の領域は太字体の文字で示されている（なお、図２は２Ａ〜２Ｄで構成されている）。
【図２Ｂ】図２Ａのつづき
【図２Ｃ】図２Ｂのつづき
【図２Ｄ】図２Ｃのつづき
【図３Ａ】図３は推定タンパク質配列とｐｉｆ１相同体との比較。下記の図において、共通配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に一致する残基は大文字で示されている。共通配列（配列番号：７）は配列の５０％以上が一致している残基を含む。すべての配列においてアミノ酸が保存されているとき、共通配列は大文字で示されている。示されている配列は、Ｃａｅｎｏｒｈａｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＰＩＦ１（遺伝子銀行受託番号ＡＢ０１５０４１、Ｔ． Ｍａｔｓｕｄａ， Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって寄託）、（配列番号：３）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＩＦ１（ＰＩＲ登録Ａ２９４５７、Ｆ． ＦｏｕｒｙおよびＡ． Ｌａｈａｙｅ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６， １４４１−１４４９， １９８７）（配列番号：４）およびＰＩＦ１相同体ＹＨＲ０３１ｃ（ＰＩＲ登録、Ｓ４６７４４、遺伝子銀行受託番号Ｕ０００６２、Ｍ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５， ２０７７−２０８２， １９９４）（配列番号：５）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｒｏｍｂｅ ＲＲＭ３／ＰＩＦ１相同体ｒｐｈ１（遺伝子銀行受託番号ＡＦ０７４９４４、Ｖ．Ａ． ＳｈｕｌｚおよびＶ．Ａ． Ｚａｋｉａｎ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって寄託）（配列番号：６）。結合モチーフおよび推定ＤＮＡ結合部位の位置は酵母のＰＩＦ１のＰＩＲ登録Ａ２９４５７から採用した（なお、図３は３Ａ〜３Ｄで構成されている）。
【図３Ｂ】図３Ａのつづき
【図３Ｃ】図３Ｂのつづき
【図３Ｄ】図３Ｃのつづき
【図４】網状赤血球細胞ライセート中ヒトｐｉｆ１ ｃＤＮＡのインビトロ翻訳。ｃＤＮＡはＴ３ ＲＮＡ　ポリメラーゼによって転写され、３５Ｓメチオニンの存在下で翻訳される。標識タンパク質は当分野で公知であるポリアクリルアミドゲル中で分離される。このゲルは乾燥され、オートラジオグラフを下記に示す。約８０ｋＤａのバンドはｃＤＮＡ配列から推定されたｈｐｉｆ１の全長タンパク質に相当する。
【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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