(57)【要約】本発明は、生物学的結合の図形化された活性化表面の大規模な生産方法であって、以下の工程：（ａ）架橋された重合体副分子鎖の集合を含む多官能重合体網目構造の自己支持性フィルム（それぞれの重合体副分子鎖は、該重合体と一つ以上のプローブ分子との相互作用を可能とする一つ以上の官能基を担持する多数の同一又は異なるくり返し単位を含む）を調製する工程、（ｂ）該官能基との相互作用を介して、該自己支持性フィルムに該一つ以上のプローブ分子のパターン化されたアレイを提供する工程、（ｃ）該自己支持性フィルムを固体表面に固定する工程、を含む、生産方法に関する。本発明の好ましい実施形態において、得られたパターン化された活性表面は、望ましい形式のエンドレステープに切断され、ドラム上に巻き上げられる。この「エンドレスチップ」はいかなる材料又は形の固体表面にも固定する準備ができている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的結合のためのパターン化活性表面を大規模に生産する方法であって、
（ａ）架橋結合した重合体副分子鎖の集成材を含み、該重合体副分子鎖が、それぞれ、一つ以上のプローブ分子との重合体の相互作用を可能とする、一つ以上の官能基を有する同一又は異なる多数の繰返し単位を含む、多官能重合体の網目構造の自己支持性薄膜を調製する工程と；
（ｂ）該自己支持性薄膜に、該一つ以上のプローブ分子のパターン化アレーを、該官能基との相互作用によって与える工程と；
（ｃ）該自己支持性薄膜を固体表面に定着させる工程と
を含む方法。
【請求項２】
該重合体副分子鎖が、該重合体の網目構造を水膨潤性にするセグメントを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該水膨潤性を、アクリル酸、メタクリル酸、ジメチルアクリルアミドおよびビニルピロリドンからなる群から選ばれる単量体によって与える、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該架橋結合した重合体副分子鎖を製造するために、ビスアクリラート、ビスメタクリラートおよびビスアクリルアミドからなる群から選ばれる架橋剤を用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該多官能重合体網目構造の該官能基が、カルボン酸、マレインイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、エポキシド、イソチオシアナート、イソシアナートおよびアジ化物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該プローブ分子が、それぞれ、相補的結合パートナーの特異的に作用し合う系の一パートナーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
相補的結合パートナーの該特異的に作用し合う系が、核酸／相補的核酸、ペプチド核酸／核酸、酵素／基質、受容体／エフェクター、レクチン／糖、抗体／抗原、アビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／ビオチンの相互作用に基づく、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）で、該固体表面への該固着を、反応性グルーまたは二官能基リンカーの系を用いて実施し、該系が、該固体表面に該リンカー系を共有結合するのに適した、一つ以上の官能基、および該共有結合されたリンカー系に該多官能重合体網目構造を共有結合させるための、一つ以上の官能基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該リンカー系が、ハロゲンシラン、アルコキシシラン、アシルオキシシラン、アミノシラン、ジスルフィドまたはチオール基を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該リンカー系が、光反応基を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該光反応基が、芳香族ケトン、および含硫芳香族ケトンからなる群から選ばれる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該光反応基が、アントラチオン基またはその誘導体、アントラキノン基またはその誘導体、ベンゾフェノン基またはその誘導体からなる群から選ばれる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該固体表面が、金属または半金属表面、金属酸化物または半金属酸化物表面、および重合体表面からなる群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）で、多官能重合体網目構造の該自己支持性薄膜を、担体薄膜の一表面に形成し、工程（ｃ）で、該担体薄膜を、他方の表面で該固体表面に固着させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）の後の追加的工程で、該自己支持性薄膜を、望みの体裁のシートまたはエンドレステープに裁断して、さらに、該テープを、場合により、ドラムに巻き取ってもよい、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、生物学的結合のためのパターン化活性表面。
【請求項１７】
平面的または非平面的である、請求項１６記載のパターン化活性表面。
【請求項１８】
平面的であり、センサーチップの一部である、請求項１７記載のパターン化活性表面。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のパターン化活性表面を含む、医用または診断用機器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
非常に様々な学術的応用面でのマイクロテクニックの、着実に成長する重要性のために、表面との分子の相互作用を許すシステムの開発が、決定的な争点となり続けている。そのような相互作用は、あるサンプルから特定の分子を取り出して、たとえばそれらの分析／検出を容易にするが、表面の分子も提示して、こうして、その後の反応を生じさせることができる可能性を包含する。分子を固定化するためのこれらの原理は、センサーもしくはクロマトグラフィー系にか、または一般的には、改質された表面の提供に向けて適用することができる。
【０００２】
近年、サンプル分子をセンサー表面に直接または間接的に結合する、二官能分子（いわゆるリンカー）の自己集合した単層を基板とするセンサーチップを組み立てるための無数の取組み方が存在している。代表的には、これらの二官能分子またはリンカーは、シランもしくはチオール／ジスルフィド部分を担持して、無機表面、およびオリゴヌクレオチド、タンパク質または多糖類等々の形態で生物学的サンプルに含まれることが多い、追加の官能基（たとえばアミノまたはエポキシド基）による結合を達成する〔たとえば、Ｃｈｒｉｓｅｙ， Ｌｅｅ ａｎｄ Ｏ’Ｆｅｒｒｅｌｌ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６， Ｖｏｌ． ２４， ｐｐ． ３０３１−３０３９；Ｇｒａｙ， Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎ， Ｆｅｌｌ， Ｄｏｂｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｉｎ Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９９７， Ｖｏｌ． １３， ｐｐ． ２８３３−２８４２；およびそこに引用された追加の参考文献を参照されたい〕。技術的な理由から、従来の技術のこれらのセンサーチップは、パターン化のためには平面的表面を保有しなければならない。
【０００３】
二官能化合物とサンプル分子との間に直接結合を形成することは、可能であるが、サンプル分子は、必ずしも、単層を形成するカプラーと直接作用し合うわけではない。これに代えて、固定化された適切な生体分子自体が、サンプル分子を検出するためのプローブとして作用する。そのようなプローブ分子は、同等に、単層の遊離官能基との反応によって、固定化することができる。特に、生体分子をプローブ分子として用いるならば、それらの存在は、改質された表面とのサンプル分子の相互作用の特異性を有意に強化するであろう。たとえば、ＤＮＡフラグメントまたは分子のサンプルの迅速な分析が必要とされる場合、初めに、二官能分子の単層を、合成オリゴヌクレオチドに接触させて、こうして、それを固定化することになる。次いで、サンプルからの特異的分子、たとえば適合できる鎖のハイブリダイゼーションを、たとえば、染料で標識されたサンプル分子を用いるならば、蛍光顕微鏡法によって検出する。
【０００４】
これらの手法は、この目的には充分に確立されているものの、標準的検出法の用途には、特に、一つの特定の型のサンプル分子の検出に利用できる表面積が、限定されている場合、たとえば、様々な分子を並行処理で分析しようとするならば、単層は、その移植片密度内に限定されることから、問題が生じる。たとえば、センサーの表面単位あたりのハイブリダイズした二本鎖の数は、容易に増加させ得ないことから、適切な検出器は、その感受性に関して非常に高い必要条件を満たさなければならない。そのため、一つの型のオリゴヌクレオチドの検出に必要なセンサー上の最小表面積は、容易に削減することができない。
【０００５】
その上、最大密度、すなわち、カプラーの官能基あたり一つのサンプルまたはプローブ分子は、ほとんど達成することができないが、それは、二次元的に展開された単層上の立体的障害のために、官能基の一画分のみが、サンプルまたはプローブ分子と反応できるにすぎないことになるからである。したがって、全体的な移植片密度は、低く、充分確定されないのを常とする。
【０００６】
表面単位あたりの限定された数の反応部位に関する同様の問題が、大量の分子を表面に固定化するのが望ましい、その他の用途に生じる。
【０００７】
上記に概説した問題を克服するために、様々な試みがなされている。オリゴヌクレオチドの分析については、オリゴマーまたは重合体を用い、それらが、オリゴヌクレオチド鎖を（またはその付着のための官能基を）、これらのオリゴマーまたは重合体がセンサーチップの表面に結合するのを可能とする、適切な基とともに有することによって、表面上の移植片密度を増大させることが、試みられている。該オリゴマーまたは重合体鎖の柔軟性が増すため、表面に結合される、より大きい画分の二官能オリゴマーまたは重合体分子が、オリゴヌクレオチドのプローブ分子を固定化することができる。
【０００８】
しかし、オリゴヌクレオチド移植片密度全体は、表面の二官能オリゴマーまたは重合体分子の移植片密度が限られているため、有意には増大させられない。これは、オリゴマーまたは重合体の自己集合は、速度論上の理由で妨げられる（センサー表面がそのような分子で覆われたならば、それ以上の重合体は、濃度勾配に逆らって拡散して、表面に到達しなければならなくなるため）という事実の結果である。
【０００９】
固定化のための二官能分子の上記の自己集合した単層への異なる取組み方は、ＤＮＡ分析のための網目構造を用いることである。短所は、これらの網目構造は、センサー表面に結合されず、構造化されない、すなわちパターン化アレーを形成しないことである。その上、この網目構造は、用いられるハイブリダイゼーション媒体中で膨潤性でなければならないことから、網目構造が表面から脱着するという危険も存在する。
【００１０】
従来の技術の取組み方のさらに一般的な短所または問題は、適切な表面の範囲が、それのための共有結合する二官能リンカー系が公知であるような表面に限られることである。
【００１１】
その上、生物学的結合向けの活性表面をパターン化することは、印刷技術によって実施されることが多いことから、平面的な表面を有する基板のみしか用い得ない。非平面的表面については、インクジェット印刷によってさえ、正確で再現可能なパターンを得ることは、特に高い空間的解像力が望ましいか、または必要である場合には、充分に可能であるとはいえない。
【００１２】
加えて、生物学的結合向けのパターン化された活性表面の生産を大規模化することは、さらなる苦心なしには不可能である。実施すべき様々な工程は、自動的な高処理量生産のために、より複雑な装置または生産ラインを必要とする。実際、生物学的結合向けのパターン化活性表面は、実際的な理由から、現在までは、バッチ生産されていて、バッチ間の再現性に関するすべての問題を伴う。
【００１３】
上記により、生物学的結合向けのパターン化活性表面の大規模生産を可能とする方法であって、表面単位あたりの作用し合う分子の数を、慣用の二官能分子の単層に比して顕著に増加させ、利用できる相互作用部位の密度が、表面との二官能重合体またはオリゴマーの反応から得られるものより高く、かつ特定のいかなる表面材料または形状にも限定されない方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
そのため、本発明は、生物学的結合向けのパターン化活性表面を大規模に生産する方法であって、
【００１５】
（ａ）架橋結合した重合体副分子鎖の集成材を含み、該重合体副分子鎖が、それぞれ、一つまたはそれ以上のプローブ分子との重合体の相互作用を可能とする、一つまたはそれ以上の官能基を有する同一もしくは異なる多数の繰返し単位を含む、多官能重合体の網目構造の自己支持性薄膜を調製する工程と；
【００１６】
（ｂ）該自己支持性薄膜に、該一つまたはそれ以上のプローブ分子のパターン化アレーを、該官能基との相互作用を通じて与える工程と；
【００１７】
（ｃ）該自己支持性薄膜を固体表面に定着させる工程と
を含む方法に関する。
【００１８】
好都合には、したがってまた好ましくは、該多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖は、該重合体網目構造を水膨潤性にするセグメントを含み、たとえば、該水膨潤性は、アクリル酸、メタクリル酸、ジメチルアクリルアミドおよびビニルピロリドンからなる群から選ばれる単量体によって与えられる。
【００１９】
該多官能重合体網目構造の架橋結合した重合体副分子鎖を製造するには、たとえば、ビスアクリラート、ビスメタクリラートまたはビスアクリルアミドを開始剤として用いてよい。注目すべきことに、架橋剤に関しては、特別な制限は皆無であり、慣用のいかなる架橋剤を用いてもよい。
【００２０】
たとえば、該多官能重合体網目構造の官能基は、カルボン酸、マレインイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、エポキシド、イソチオシアナート、イソシアナートまたはアジ化物から選んでよい。
【００２１】
好都合には、したがってまた好ましくは、多官能重合体網目構造の官能基と作用し合うプローブ分子は、それぞれ、相補的結合パートナーの特異的に作用し合う系の一パートナーである。
【００２２】
たとえば、相補的結合パートナーの該特異的に作用し合う系は、核酸／相補的核酸、ペプチド核酸／核酸、酵素／基質、受容体／エフェクター、レクチン／糖、抗体／抗原、アビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／ビオチンの相互作用に基づいてよい。理解すべきことに、多官能重合体網目構造の「網目」は、それぞれの相補的結合パートナーの無制限の接触を許すのに充分なだけ広い。この無制限の接触は、網目構造の水膨潤性によっても支援される。
【００２３】
上記に定義された本発明の方法の工程（ｃ）では、該固体表面への自己支持性薄膜の固着を、たとえば、慣用のいかなる反応性グルー、または慣用のいかなる二官能基リンカーの系を用いて実施してもよく、該系は、該固体表面に該リンカー系を共有結合するのに適した、一つもしくはそれ以上の官能基、および該共有結合されたリンカー系に該多官能重合体網目構造を共有結合するための、一つまたはそれ以上の官能基を含む。
【００２４】
適切な反応グルーは、たとえば、慣用のアクリル系接着剤である。この関係で注目すべきことに、グルーに関しては、固着した自己支持性薄膜が、たとえばプローブとサンプルオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための、与えられた反応条件下で、固体表面から脱着しない限り、特定の限定は皆無である。
【００２５】
適切な二官能リンカー系は、固体表面にリンカー系を共有結合する、たとえば、ハロゲンシラン、アルコキシシラン、アシルオキシシラン、アミノシラン、ジスルフィドまたはチオール基を含む。
【００２６】
さらに、この二官能リンカー系は、共有結合したリンカー系に多官能重合体網目構造を共有結合するための基、たとえば、芳香族ケトンまたは含硫芳香族ケトン、たとえば芳香族β−ケトスルフィド、芳香族β−ケトスルホキシドまたは芳香族β−ケトスルホンからなるか、またはそれらを含む群のような、光反応基を含む。
【００２７】
光反応基のための具体的な例は、アントラチオン基またはその誘導体、アントラキノン基またはその誘導体、ベンゾフェノン基またはその誘導体である。ベンゾフェノン基が好ましい。
【００２８】
自己支持性薄膜を固着させるための固体表面は、特に限定されず、いかなる材料で作成してもよい。例は、金属もしくは半金属表面、金属酸化物もしくは半金属酸化物表面、または重合体表面である。その上、この表面は、いかなる寸法および形状を有しても良く、平面的表面のような特定の表面幾何学に限定されない。たとえば、表面は、平面または非平面、たとえば凸面または凹面、および三角柱または球面さえ用いてよい。
【００２９】
本発明の方法のもう一つの実施態様では、多官能重合体網目構造の自己支持性薄膜を、工程（ａ）で担体薄膜の一表面に形成し、工程（ｃ）で、該担体薄膜を、他方の表面で該固体表面に固着させる。担体薄膜に関しては、限定は皆無であり、たとえば、慣用のいかなる重合体薄膜を用いてもよく、注目すべきことに、担体薄膜の使用は、絶対的に任意である。自己支持性薄膜の機械的強度は、たとえば固着のために、薄膜を固体表面に移転するのに好都合な取扱いを許すのに充分なだけ高い。
【００３０】
本発明の好適実施態様では、場合により担体薄膜上の、自己支持性薄膜を、工程（ｂ）の後の追加の工程で、望みの体裁のシートまたはエンドレステープに裁断し、この体裁で、いかなる量でも、使用まで安定的に貯蔵してよい。さらに、このテープを、場合により、ドラムに巻き取ってもよい。
【００３１】
ドラム上のテープ形態でのそのような「エンドレスチップ」の特別な利点は、単純な装置によって、「エンドレスチップ」を、自動的に、かつ高い処理量で、固体表面を与える基板に移転かつ固着してよいことである。たとえば、与えられた体裁、たとえばガラスの顕微鏡スライドでの、かつ接着剤、またはたとえば光反応性二官能リンカー系の層で覆われた基板を、コンベヤーベルト、または同等の輸送手段を用いて、装置に供給してよい。この装置内で、たとえば適切な送りロールを用い、熱または紫外線照射を印加することによって、「エンドレスチップ」を巻き戻し、適切な長さに切断し、表面に固着する。このための適切な生産ラインは、たとえば箔をブックカバーに積層するための、当技術に公知であるか、または本発明の方法を実施するよう、容易に適応させ得る。「エンドレスチップ」の特定の利点は、末端使用者によって、（単にそれを正しい形状に裁断することによって）望みのか、または所定のチップリーダーの幾何学に容易に適応させ得ることである。
【００３２】
以下、本発明を、より詳細に、また例示のためにのみ説明する。実施例は、付記されたクレームに定義されたとおりの本発明の対象範囲のいかなる限定としても解されてはならない。
【００３３】
本明細書に用いられる限りで、用語「相互作用」は、共有結合の形成はもとより、求引性のイオンおよびファンデルワールス力、ならびに水素結合も包含する。多官能重合体網目構造またはプローブ分子内の、相互作用の種類を規定するそれぞれの官能部分は、与えようとする生物学的結合向けのパターン化活性表面の望みの応用に従って選ばれることになる。
【００３４】
表現「固定化する」は、以下では、選ばれた条件下で恒久的である結合の形成を生じる、多官能重合体網目構造との分子の相互作用に対して用いられる。たとえば、プローブ分子は、多官能重合体網目構造によって、センサー表面でのそれらの適用の際に固定化される。しかし、条件（たとえば、ｐＨ値、特定の切断剤の添加）を変えることによって、固定化は、逆転されることもあり得る。
【００３５】
用語「サンプル分子」は、以下では、サンプル中に存在し、多官能網目構造に一時的または恒久的に結合する分子に対して用いられるものとする。サンプル分子との多官能網目構造の相互作用については、二つの一般的原則がある。第一の実施態様では、多官能網目構造内に含まれる官能基は、サンプル分子との鎖の直接的相互作用を許すよう選ぶ。第二の実施態様では、プローブ分子は、多官能網目構造の官能基で固定化され、相互作用は、これらのプローブ分子とサンプル分子との間に発生する。
【００３６】
適切なプローブ分子は、少なくとも二官能性である分子のため、多官能重合体網目構造に結合した後、新たな相互作用部位が、多官能網目構造内に存在して、それが、サンプル分子との相互作用を可能にする。好ましくは、プローブ分子は、サンプル分子に対して高度に特異的な相互作用部位を与える。それらは、天然または非天然の供給源から誘導することができる。特に好ましいプローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）、最も好ましくはオリゴヌクレオチドもしくはアプタマーを包含する核酸、多糖類、グリコシド的に修飾されたタンパク質もしくは抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンもしくは抗生物質を包含するタンパク質、およびペプチドのような生体分子である。たとえばセンサーの用途の際に、充分な安定性を確保するために、プローブ分子は、好ましくは、多官能重合体網目構造に共有結合させる。注目すべきことに、プローブ分子は、同じであるか、または異なってもよい。後者の場合、複数のサンプル分子の並行検出が可能である。
【００３７】
網目構造への分枝鎖重合体の導入は、望みであれば、可能である。ある場合には、網目構造の物理的特性を、望みの用途に応じて誂えることを許す、共単量体の付加も適切である。
【００３８】
網目構造の最小限の構成要素は、機能化された繰返し単位、および架橋結合単位である。機能化された繰返し単位のためには、重合体網目構造の副分子鎖が、サンプルまたはプローブ分子と作用し合える少なくとも一つの官能基を有する、繰返し単位を有する。しかし、一定の好都合な特性を多官能重合体網目構造に賦与するには、サンプルまたはプローブ分子との相互作用に特異的な官能基を有する、これらの単量体（以下、「官能化単量体」と称する）からその他の共単量体とともに形成された、共重合体を用いることができる。
【００３９】
たとえば、多官能重合体網目構造とのサンプルまたはプローブ分子の反応は、多官能重合体網目構造が、これらの分子を含有する溶媒中で膨潤できるならば、有意に促進されるため、好ましくは、問題の溶媒との強い相互作用を示す共単量体を、選ばなければならない。これは、網目構造の膨潤性を向上させる、共単量体を用いることによって達成することができる。本発明の最も好適な実施態様では、水溶液中に通常存在する生体分子が、多官能重合体網目構造と作用し合うことから、該多官能重合体網目構造は、好ましくは、水膨潤性である。
【００４０】
したがって、官能化単量体の単独重合体が、検出しようとする分子と官能基との急速な反応を許すのに充分な、水との相互作用を示さないならば、たとえば、極性に富むか、または水に可溶性でさえある、１種類またはそれ以上の共単量体を用いることができる。官能化され、かつ共単量体である、両形式の単量体とも、好ましくは、ラジカル重合反応で反応することができる、Ｃ−Ｃ二重結合を有する。水膨潤性重合体を生じる、適切な共単量体についての例は、アクリル酸、メタクリル酸、およびそれらの誘導体、たとえば、アルコールまたはアミンとのこれらの酸の、１〜１２個の炭素原子を含むエステルおよびアミドである。
【００４１】
この群の単量体の一般的な例は、ヒドロキシエチル＝メタクリラート、アクリルアミドおよびジメチルアクリルアミドである。適切なもう一つの単量体は、ビニルピロリドンである。初めは水不溶性であり、次いで、水溶性誘導体へと移行させ得る重合体を生じる、単量体を用いることも可能である。この群の重合体の適切な例は、ポリビニルアルコールであって、たとえば、ポリ酢酸ビニルの鹸化によって得ることができる。
【００４２】
共重合体を用いるならば、官能化単量体に対する共単量体の比率は、重合工程の前に決定して、多官能重合体網目構造の得られる重合体鎖の組成を規定する。好ましくは、共単量体体官能化単量体の比率は、５０／１〜１／１、より好ましくは２０／１〜２／１にわたる。
【００４３】
サンプルまたはプローブ分子との多官能重合体網目構造の相互作用を可能とするのに必要な官能基は、好ましくは、該多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖の側鎖中に存在する。本発明の多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖に含まれる、「多数の」官能基は、重合体副分子鎖あたり少なくとも１個、しかし好ましくは２個を上回る基を意味する。問題の官能基は、好ましくは、多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖を形成する、繰返し単位に含まれることから、それらの数は、固定化しようとするプローブまたはサンプル分子の大きさに応じて、単一の副分子鎖中に存在するこれらの基の、数千、たとえば１０，０００に達してよい。好ましくは、それぞれの鎖は、２０〜１，０００のこれらの官能基を含む。
【００４４】
多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖中に存在する、官能化された適切な繰返し単位は、重合性のＣ−Ｃ二重結合はもとより、重合工程に参加しない官能部分もさらに含むような繰返し単位である。好ましくは、この官能基は、スペーサーとしてのＣ２〜Ｃ１０、より好ましくはＣ３〜Ｃ７アルキル鎖を介して、多官能重合体網目構造の主要な重合体副分子鎖に結合されている。
【００４５】
このスペーサー分子は、官能化単量体の一部であることができる。本取組み方に適する単量体は、Ｃ２〜Ｃ１０アルコールまたはＣ２〜Ｃ１０アミンのアクリルおよびメタクリルエステルもしくはアミドを包含する。スペーサーとして役立つには、これらのアルコールまたはアミンは、エステルまたはアミン結合を形成するのと反対の末端に、追加の官能基を有する。この官能基は、サンプルまたはプローブ分子との相互作用に必要なそれを表すか、またはその後の工程で、そのような適切な官能基へと変換することができる。
【００４６】
これに代えて、これらのスペーサー分子を、多官能重合体網目構造の形成後に、その重合体副分子鎖内の適切な反応性セグメントに付着させることもできる。この場合、反応性単量体、たとえば、アクリル酸もしくはメタクリル酸塩化物、またはそれらの反応性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシインイミドその他の単量体、たとえば無水マレイン酸として、重合の際に存在しなければならない。これらの好適な反応性単量体は、スペーサーとして用いてよい、二官能アルコールまたはアミンとの共有結合を形成することができる。
【００４７】
スペーサー単位を有する単量体は、それぞれのアクリル酸もしくはメタクリル酸塩化物または無水物、およびω−アミノまたはヒドロキシカルボン酸から、容易に合成することができる。得られる生成物は、たとえばＮ−ヒドロキシスクシインイミドを用いることによって、活性エステル誘導体へと変換することができる。そのような単量体のいくつかの例を合成する詳しい手順は、文献、たとえばＨ．−Ｇ． Ｂａｔｚ， Ｊ． Ｋｏｌｄｅｈｏｆｆ， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １７７ （１９７６） ６８３に見出すことができる。
【００４８】
上記に概説したとおり、多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖を直接生じる、反応性単量体を用いることが可能である。これに代えて、最終的な表面に用いようとする官能基の前駆体を有する、単量体、たとえば酸塩化物または酸無水物を選ぶことができる。次いで、それらを、反応基、たとえばＮＨＳエステルまたはグリシジルエステル基へと変換することができて、それが、望みの条件下で、サンプルまたはプローブ分子との多官能重合体網目構造の相互作用を可能とする。
【００４９】
したがって、重合性単量体は、すべて、サンプル分子またはプローブ分子との多官能重合体網目構造の相互作用を可能とするのに必要な官能基と組み合わせるか、またをそれを含むことができる限り、本発明の目的に適する。
【００５０】
本発明の目的に用いることができる官能基は、相互作用を達成しようとする分子に従って選ぶのが好ましい。この相互作用は、ただ１種類のサンプル分子、または様々なサンプル分子を対象とすることができる。本発明の一つの重要な適用は、生物学的サンプル中の特定の分子の検出であることから、多官能重合体網目構造内に存在する官能基は、好ましくは、生物学的サンプル中の分子と特異的に作用し合って、その検出へと導く、天然または合成の生体分子と特異的に作用し合うことになる。適切な官能部分は、好ましくは、核酸およびその誘導体、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ、たとえばオリゴヌクレオチドもしくはアプタマー、多糖類、グリコシド的に修飾されたタンパク質もしくは抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、または抗生物質もしくはペプチド、または標識化されたそれらの誘導体と反応することができる。
【００５１】
その上、検出しようとする分子、または合成オリゴヌクレオチドと多官能重合体網目構造との、サンプルまたはプローブ分子に有害でない条件下での結合を実施することができると思われる。その結果、核酸センサーの用途では、反応は水溶液中で実施されなければならず、温度は、９５℃を超えて上昇させてはならない。
【００５２】
また、この結合反応は、検出が、好ましくは、極端なｐＨ値を溶液中に必要とすることなしに、２４時間未満以内に達成できるよう、合理的な速度で進行しなければならない。合成オリゴヌクレオチドの１本鎖を固定化するには、ｐＨは、７〜１１、好ましくは７〜１０にわたらなければならない。プローブ分子との核酸のサンプル分子のハイブリダイゼーション反応の際は、官能基と合成オリゴヌクレオチドの１本鎖との結合ばかりでなく、基板への多官能重合体網目構造の固着も、６５℃を超える温度、および６〜９のｐＨに耐えられなければならない。ＤＮＡをサンプル分子として用いる場合、温度は、約９５℃まで上昇させて、ハイブリダイゼーションに必要である、ＤＮＡ鎖の分離を実行しなければならないであろう。
【００５３】
プローブ分子、特に生物学的または医学的用途でのそれのほとんどは、立体障害のない親核性部分を含むことから、多官能重合体網目構造との好適な相互作用は、親核性置換または付加反応を含んで、重合体副分子鎖とサンプルまたはプローブ分子との共有結合へと導く。たとえば、合成オリゴヌクレオチドは、通常、遊離アミン基が一端（５′または３′）に与えられている。そのため、例示的な官能基は、たとえば、反応性二重結合、（たとえばエポキシのような）二重結合の等価体、または反応性離脱基を与える。しかし、イオンまたはファンデルワールス力はもとより、水素結合も、官能基をそれに応じて選ぶならば、サンプル分子を多官能重合体網目構造に結合するのに用いることができる。
【００５４】
好適な官能基は、固定化しようとする分子の分類群に関する従来の文献から、かつ上記のようなその他の要件（反応時間、温度、ｐＨ値）に従って、選ぶことができる。包括的なリストは、たとえば、Ｇ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる教科書「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６中に見出すことができる。アミノ終端オリゴヌクレオチドの場合は、適切な基の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシインイミド（ＮＨＳエステル）、エポキシド、好ましくは、グリシジル誘導体、イソチオシアナート、イソシアナート、アジ化物、カルボン酸基またはマレインイミドのような、いわゆる活性または反応性エステルである。
【００５５】
多官能重合体網目構造の多官能重合体副分子鎖を直接生じる、好適な官能単量体としては、下記の化合物を、本発明の目的に用いることができる：
・アクリル酸またはメタクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシインイミド、
・Ｎ−メタクリロイル−６−アミノプロパン酸ヒドロキシスクシインイミドエステル、
・Ｎ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシインイミドエステル、
・アクリル酸またはメタクリル酸グリシジルエステル。
【００５６】
用途に応じて、多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖に、二つまたはそれ以上の官能基を、たとえば、異なる種類の官能化単量体の存在下で重合体副分子鎖へと導く重合を実施することによって与えられる可能性がある。これに代えて、官能基は、同一であってもよい。
【００５７】
多官能重合体網目構造の重合体副分子鎖は、たとえば、連鎖反応によって製造してよく、同時に架橋結合させてもよい。実際的な理由からは、ラジカル機構が好ましいが、イオン重合その他の重合手法の適用も可能である。
【００５８】
熱で開始されるラジカル機構を用いるならば、たとえば、重合開始剤を含むペルオキソ基またはアゾ基を用いてよい。ベンゾイン、ベンジルまたはベンゾフェノン誘導体のような芳香族ケトンは、好ましくは、光化学的開始によって重合体を形成するならば、重合開始剤として用いてよい。硫黄を含む芳香族ケトンは、望みであれば、光開始に適する波長をより長い波長域に移動するために、同等に用いてよい。例としては、芳香族β−ケトスルフィド、芳香族β−ケトスルホキシドまたは芳香族β−ケトスルホンを列挙し得る。同じであるか、または異なる開始剤を、重合混合物に用い得ることが理解される。
【００５９】
表面固着のために本発明の方法の一実施態様に用いられる、二官能リンカーに含まれる官能基は、用いられる表面に適合させなければならない。金属酸化物に対しては、特に酸化ケイ素の表面（蒸発またはスパッタリングさせたＳｉＯｘ層、シリコンウェファーのＳｉＯ２表面、ガラス、石英）、クロロシラン部分またはアルコキシシランを用いてよい。金の表面に固着させるには、チオールまたはジスルフィド基を用いることができる。シランは、通常、表面での安定性が高いために好適である。しかし、本発明の方法は（これが著しい利点であるが）、無機表面に限られない。いかなる表面、特に望ましい有機重合体表面も、多官能重合体網目構造を担持するための基板として用いることができる。適切な有機重合体のための例は、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ、プレキシガラス）、ポリスチレン、ポリエチレンまたはポリプロピレンである。適切なＣＯＣは、たとえば、Ｔｉｃｏｎａから「Ｔｏｐａｓ」の商品名のもとに入手することができる。
【００６０】
適切な架橋剤についての好適な例は、ビスアクリラート、ビスメタクリラート、たとえばエチレングリコールビスメタクリラートのような、オリゴエチレングリコールビスメタクリラート、およびビスアクリルアミド、たとえばエチレンジアミンビスアクリルアミドである。
【００６１】
好ましくは重合性官能化単量体および架橋剤の存在下での加熱工程（熱開始反応）または放射線（光開始反応）による、重合反応の開始に際しては、重合体副分子鎖を形成することができ、同時に架橋結合させる。重合は、当技術に公知の標準的な反応条件下で実施することができる。
【００６２】
架橋結合密度および膨潤挙動のようなパラメータを精密に制御することができるため、個々の多官能重合体網目構造の特性を、様々な用途に適合させることができる。反応条件を調整することによって、数ナノメートルから数ミリメートルまたはそれ以上までにわたる厚さの網目構造を製造し得る。得られる多官能重合体網目構造の特性を、たとえば、その後結合させる、大きさおよび構造が大幅に異なり得るプローブおよびサンプル分子に対する、官能基の接触可能性に関して微調整することもできる。
【００６３】
重合後に、反応しなかった単量体はもとより、結合または架橋結合しなかった重合体鎖も、適切な溶媒によって除去するよう、注意を払わなければならない。
【００６４】
代替的方法によれば、最初の工程で、適切な官能基を有する、長い重合体鎖を合成した後、前者を架橋結合させる。
【００６５】
多官能重合体網目構造のパターン化アレーを生成することは、様々な手段によって可能となる。一つの方法は、標準的な写真平板法であって、この工程（開始単層マスクの光分解または光溶発）に先立つ重合後に（マスク越しの重合体の溶発）か、または重合の間にかのいずれかに、マスク越しの光重合によって適用することができる。パターン化された多官能重合体網目構造の生成のための、可能なその他の手法は、マイクロコンタクト印刷または関連する方法であって、重合の間に適用してよい。最後に、インクジェットの手法、または他のマイクロプロッティング法も、パターン化多官能重合体網目構造を生成するのに用いることができる。これらのいかなる手法を用いても、マイクロメートルの範囲の寸法を有する表面構造を、生成することができる。シグナル生成の高度の並行様式、および分析データの集積における有意な改良が、そのような手法の最も有望な特徴であって、自動分析の手順の最適化をしかるべく許す。
【００６６】
多官能重合体網目構造上でのサンプルまたはプローブ分子の成功裡の固定化を検出するには、様々な手法を適用することができる。特に、多官能重合体網目構造は、その厚さの有意な増加を生じることが見出されていて、それは、適切な方法、たとえば偏光解析法で検出することができる。質量感知法も適用し得る。
【００６７】
生物学的サンプル中の望みのヌクレオチド配列を有する核酸、たとえばオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ分子を分析しようとするならば、合成オリゴヌクレオチドの一本鎖を、多官能重合体網目構造と反応させることができる。この反応は、高い湿度下で、好ましくは緩衝させた水溶液中で実施する。反応温度は、オリゴヌクレオチドに有害でない限り、室温より高くすることができる。好適な温度は、４０〜６０℃の範囲内にある。この用途では、同一の多数の合成オリゴヌクレオチド鎖、または異なる鎖の混合物を用いることができる。異なる鎖を用いるならば、それらの配列は、好ましくは、既知でなければならない。
【００６８】
こうして製造された表面をハイブリダイゼーション反応に用いる前に、反応しなかった官能基を、適切な親核化合物、好ましくはＣ１〜Ｃ４アミン、たとえば単純な第一級アルキルアミン（たとえばプロピルまたはブチルアミン）、第二級アミン（ジエチルアミン）またはアミノ酸（グリシン）の付加によって失活させる。
【００６９】
標識化された、たとえばＰＣＲから得られたような、オリゴヌクレオチド一本鎖の混合物に接触させると、合成鎖をＰＣＲ産物に相補的なプローブとして与えるような表面部域のみが、走査の際に、検出できるシグナルをハイブリダイゼーションのために示すことになる。異なるオリゴヌクレオチド配列の並行検出を促進するには、異なる種類の合成オリゴヌクレオチドプローブを試験溶液に提示する部域への、センサー表面の分離を許す、印刷手法を用いることができる。
【００７０】
本明細書に用いられる限りでの用語「ハイブリダイゼーション」は、緊縮または非緊縮条件に関連し得る。さらに指定されないならば、条件は、好ましくは非緊縮性である。該ハイブリダイゼーション条件は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌの「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）、またはＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｍｓ（編）の「Ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ， （１９８５）に記載された、慣用のプロトコルに従って、確立してよい。条件の設定は、当業者の技量の範囲内に充分にあり、当技術に記載されたプロトコルに従って決定されるはずである。従って、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出が、通常、たとえば０．１ｘＳＳＣ、６５℃の０．１％ＳＤＳのような、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を必要とすると思われる。相同であるか、または厳密に相補的ではない配列を検出するための、例示的なストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、６５℃の１％ＳＤＳに設定してよい。周知のとおり、プローブの長さ、および決定しようとする核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件の追加的なパラメータを構成する。
【００７１】
分析しようとする核酸は、合成または半合成核酸ライブラリーを包含する、ＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーに由来してよい。好ましくは、この核酸ライブラリーは、オリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
固定化された状態でのその検出を容易にするには、核酸分子は、好ましくは、標識化しなければならない。適切な標識は、放射能、蛍光、リン光、生物発光もしくは化学発光の標識、酵素、抗体もしくはその機能性フラグメントもしくは機能性誘導体、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンを包含する。
【００７３】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラもしくは一本鎖抗体、またはそのような抗体の機能性フラグメントもしくは機能性誘導体を包含するが、それらに限られない。
【００７４】
抗体を生成する一般的な方法論は、周知であり、たとえば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９４に記載されていて、Ｊ．Ｇ．Ｒ． Ｈｕｒｒｅｌ， ｅｌ．， ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８２）に総説されている。Ｌ．Ｔ． Ｍｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６ （１９９０）， ６０４−６１９が教示する方法も、適用できる。上記のとおり、用語「抗体」は、本明細書では、モノクローナルまたはポリクローナル抗体に関する。機能性抗体フラグメントまたは誘導体は、本来の抗体と同じ特異性を与え、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦＶフラグメントを含む；たとえば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ １９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい。好ましくは、本明細書に用いられる抗体は、モノクローナル抗体である。さらに、誘導体は、ペプチド模倣論によって生成することができる。そのような生成法は、当技術に周知であり、当業者がそれ以上の苦心なしに適用することができる。
【００７５】
適用される標識化の方法に応じて、検出は、当技術に公知の方法によって、たとえばレーザー走査、またはＣＣＤカメラの使用により、実施することができる。
【００７６】
検出を間接的に実施する方法も、適用可能である。そのような間接検出の例は、抗体のような、問題の生物学的分子（サンプル分子）に結合する第一化合物に指向させた、二次標識された抗体の使用である。
【００７７】
固定化を実施した後のセンサー表面の再生は、可能であるが、結果の質を確保するには、ただ一回の使用が好ましい。
【００７８】
多官能重合体網目構造により、異なる種類のサンプルを、直列ならびに並列的な検出法で、上昇させた精度、および／または低下させた空間の必要性を伴って分析することができる。そのため、多官能重合体網目構造が、本発明による方法によって固着されたセンサー表面は、たとえば、生理学的流体、たとえば血液、血清、喀痰等々の中の成分の検出を検出するための、診断機器その他の医学的用途に役立つことができる。
【００７９】
本明細書に終始引用された文書の、開示された内容は、これをもって、参照によって組み込まれる。
【００８０】
以下の項目において、本発明の実施態様をさらに例示する。
【００８１】
サンプル核酸分子、好ましくは一本鎖核酸分子を、本発明の方法によって製造された、生物学的結合向けのパターン化活性表面を用いて検出する好適な方法は、
【００８２】
自己支持性薄膜のパターン化アレーを形成するオリゴヌクレオチドの一本鎖と、サンプル核酸分子との間にハイブリダイゼーション反応が生じるのを許す工程と、
【００８３】
ハイブリダイズしなかった核酸分子を洗浄段階で除去する工程と、
【００８４】
ハイブリダイズした核酸分子を、好ましくは蛍光測定法によって検出する工程とを含む。
【００８５】
以下、本発明を、実施例を参照して、より詳しく開示する。しかし、記載された具体的な形態、または好適実施態様は、すべての面で、例示的であって、限定的ではなく、発明の対象範囲は、下記の記載によってではなく、付記されたクレームによって示されていると考えなければならず、したがって、クレームの意味および等価性の範囲内にあるすべての変化は、これに包含されるものとする。
【００８６】
実施例
官能化単量体の合成
一例として、Ｎ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシインイミドエステルの合成を説明する。反応経路を下記に示す。この図中の指数ｉ〜ｉｉｉは、本文中の様々な工程の記載を意味する。
【００８７】
【化１】
2004513344.tif 000002
【００８８】
（ｉ）水１００ｍｌおよび１，４−ジオキサン５０ｍｌ中の６−アミノカプロン酸１３．２ｇ、およびＮａＨＣＯ３２０ｇの溶液を、１，４−ジオキサン５０ｍｌ中のメタクリル酸塩化物１０．３ｍｌの溶液に徐々に加えた。溶液を終夜撹拌した。次いで、水５０ｍｌを加え、混合物を、酢酸エチルの１００ｍｌ部分で３回洗浄した。水層を、希塩酸で酸性化し（ｐＨ２）、次いで、酢酸エチルの１００ｍｌ部分３回で抽出した。併せた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、約５０ｍｌの体積とし、冷ヘキサン３５０ｍｌに加えた。この混合物を、−２０℃に冷却し、生成物を、終夜、白色結晶として徐々に分離した（収量：約１４ｇ）。
【００８９】
（ｉｉ）塩化メチレン３００ｍｌ中のこの酸１４ｇの溶液を５℃に冷却し、Ｎ−ヒドロキシスクシインイミド（ＮＨＳ）８．２ｇ、およびＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド１４．６ｇを加えた。混合物を５℃に終夜保った。沈澱（ジシクロヘキシル尿素）を濾取し、溶媒を蒸発させた。この工程の間に、追加の尿素が分離した場合があり、やはり濾取した。未精製生成物を、イソプロパノールから再晶出させて、ＮＨＳエステル単量体約１５ｇを得た。
【００９０】
多官能重合体網目構造の形成
下記の成分を含む溶液を用いた：
・４０モル％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（水膨潤性基材重合体用）、
・１０モル％のＮ−メタクリロイル−６−アミノカプロン酸ヒドロキシスクシインイミドエステル（官能化繰返し単位用）、
・５モル％のエチレングリコールビスメタクリラート（架橋結合単位用）、
・残余部分として（１００モル％まで）のエタノール。
【００９１】
７０℃に加熱した後、重合を１０時間実施した。その後、得られた重合体網目構造を、エタノールで洗浄し、ベンゾフェノンに基づく二官能シランリンカーの層で被覆した、顕微鏡スライド上に移し、紫外線照射（Ｏｒｉｅｌからの５００ワット水銀灯、５〜４５分の照射時間、３２０〜４２０ｎｍの二色フィルター、または３２０ｎｍの遮光フィルターによる）による照射によって表面に固着させた。
【００９２】
オリゴヌクレオチド鎖の検出
得られた表面を、１０μＭオリゴヌクレオチド溶液１ｎｌに接触させ、結合反応を、水溶液中、約４０〜５０℃で２時間進行させた。
【００９３】
合成オリゴヌクレオチドを、５−アミノ改質し、溶液を、８．０のｐＨの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で緩衝液化した。結合反応の後、センサー表面を、リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。センサー表面上の並行検出用の特定の種類のオリゴヌクレオチドの空間的拡がりを明確にするため、多官能重合体網目構造に、反応物を印刷した。
【００９４】
こうして調製された表面を、Ｃｙ５標識化されたＰＣＲ産物と、２ｘＳＳＣ、１０％硫酸デキストラン、および５０％ホルムアミドの緩衝液中、２８℃で１２時間反応させた。ＤＮＡ含量は、ＤＮＡ１００μｇ／サンプル８０μｌであった。ハイブリダイゼーション反応を実施した後、表面をＳＳＣ緩衝液で洗浄し、結果を、レーザー活性化により、ＣＣＤを用いた蛍光測定法で検出した。蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物に相補的である合成オリゴヌクレオチドを有するような部域についてのみ、検出できたにすぎなかった。
【国際公開パンフレット】
2004513344.tif 000003
2004513344.tif 000004
2004513344.tif 000005
2004513344.tif 000006
2004513344.tif 000007
2004513344.tif 000008
2004513344.tif 000009
2004513344.tif 000010
2004513344.tif 000011
2004513344.tif 000012
2004513344.tif 000013
2004513344.tif 000014
2004513344.tif 000015
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2004513344.tif 000017
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2004513344.tif 000019
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2004513344.tif 000030
2004513344.tif 000031
2004513344.tif 000032
2004513344.tif 000033
2004513344.tif 000034
2004513344.tif 000035
【国際調査報告】
2004513344.tif 000036
2004513344.tif 000037
2004513344.tif 000038