(57)【要約】本発明は、エプスタイン・バーヘルペスウイルス（ＥＢＶ）のＤＮＡ複製の細胞性阻害因子（ＴＢ７と命名）の同定、ＴＢ７のヌクレオチド配列及び核酸配列の決定、並びにＴＢ７の使用、特に感染患者におけるＥＢＶの増殖を抑制するための薬剤の製造のための使用、に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＢ７ポリペプチドをコードしているか又はＴＢ７ポリペプチドをコードする核酸を含んでいることを特徴とする、単離された、濃縮された又は精製された核酸。
【請求項２】
該核酸が、
ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列を有する又はその機能的部分を有するポリペプチドをコードし、
ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的であり、
ｃ）高ストリンジェント条件のもとで（ａ）の核酸にハイブリダイズし、且つＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体をコードする、
ヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項１の核酸。
【請求項３】
該核酸が、ＴＢ７のｃＤＮＡに対応する配列番号２の配列を有し、配列番号１のゲノムＤＮＡの一部であることを特徴とする、請求項１又は２の核酸。
【請求項４】
該核酸が哺乳類から単離されたものであり、該哺乳類が好ましくはヒトであることを特徴とする、上記請求項の何れかの核酸。
【請求項５】
該核酸が、宿主細胞内においてＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体の発現のための発現ベクター中に存在することを特徴とする、上記請求項の何れかの核酸。
【請求項６】
該核酸がＴＢ７のｃＤＮＡを表すものであることを特徴とする、上記請求項の何れかの核酸。
【請求項７】
１個又は２個以上の塩基が遺伝コードの縮重によって変更されているものであることを特徴とする、上記請求項の何れかの核酸。
【請求項８】
該核酸が、ＴＢ７ポリペプチドのドメイン又はエピトープをコードする断片であることを特徴とする、上記請求項の何れかの核酸。
【請求項９】
試料中のＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体をコードする核酸を検出するための核酸プローブ。
【請求項１０】
上記請求項の何れかの核酸から誘導されるＲＮＡ。
【請求項１１】
配列番号１又は配列番号２の核酸によってコードされ、又は配列番号３又は４のアミノ酸配列若しくはそれらの機能的部分若しくは誘導体を有することを特徴とする、単離された、濃縮された又は精製されたポリペプチド。
【請求項１２】
１個又は２個以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換され、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失し及び／又は１個又は２個以上のアミノ酸が追加として含まれ、ここに、ＥＢウイルスＤＮＡの複製のリプレッサーとしてのＴＢ７の機能又はドメイン若しくはエピトープの機能が維持されていることを特徴とする、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４のアミノ酸１０３ないし１５１を有する、上記請求項の何れかのポリペプチド。
【請求項１４】
単離された、精製され又は濃縮されたＴＢ７ポリペプチド、その機能的部分又は誘導体。
【請求項１５】
ＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７ポリペプチドドメイン又はＴＢ７ポリペプチドエピトープに対する特異的結合親和性を有する、抗体又は抗体断片。
【請求項１６】
該抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５の抗体。
【請求項１７】
ＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７ポリペプチドドメイン又はＴＢ７ポリペプチドエピトープに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生することと特徴とする、ハイブリドーマ。
【請求項１８】
ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体を発現することを特徴とする、組換え細胞。
【請求項１９】
ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体をコードする核酸を含むことを特徴とする、組換え細胞。
【請求項２０】
原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である、請求項１８又は１９の組換え細胞。
【請求項２１】
真核細胞、好ましくはＢ細胞であることを特徴とする、請求項１９又は２０の組換え細胞。
【請求項２２】
ＥＢウイルスゲノムを含んだ細胞を、ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体と接触させることを特徴とする、ＥＢウイルスの複製を阻害するための方法。
【請求項２３】
該接触が、ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体を感染細胞内で発現させることによって行われることを特徴とする、請求項２２の方法。
【請求項２４】
ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体を、薬剤学的に有効な量で慣用の担体及び補助剤と共に含有することを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項２５】
ガンマヘルペスウイルス特にＥＢウイルス及びＨＨＶ８、並びにベータヘルペスウイルス特にサイトメガロウイルスの複製の阻害のための、ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体の使用。
【請求項２６】
ガンマヘルペスウイルス特にＥＢウイルス及びＨＨＶ８、並びにベータヘルペスウイルス特にサイトメガロウイルスに関連した疾病の治療のための、請求項２５のＴＢ７ポリペプチドの使用。
【請求項２７】
バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫及び上咽頭癌の治療のための、請求項２６の使用。
【請求項２８】
ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体をコードする核酸であって、該ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体をコードする核酸がＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体の発現を制御している誘導可能プロモーターの調節下にあるものである核酸を含んだ組換え細胞を培養し；該ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体を発現させ；続いてＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体を調製することを特徴とする、上記請求項の何れかのＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体の製造のための方法。
【請求項２９】
上記請求項の何れかの核酸を含んだベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヘルペスウイルスＥＢ（ＥＢＶ）のＤＮＡ複製に対する細胞性レプレッサー（ＴＢ７と命名）の同定、ＴＢ７のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の決定、並びに、ＴＢ７の使用、特に感染患者におけるＥＢＶの増殖を抑制するための薬剤の製造のための使用に関する。
【０００２】
エプスタイン・バーウイルス
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、病原性、感染する細胞タイプ及びの増殖特性に基づいて３つの亜科（α−， β−，及びγ−ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）に分類されているｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科に属する。エプスタイン・バーウイルスは、宿主範囲が非常に狭いことによって特徴付けられるγ−ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅに分類されている。全てのヘルペスウイルスの特徴の１つは、初期感染の後、感染した宿主内において生涯にわたって潜伏状態で感染性粒子を形成することなく存在し続ける能力である。この状態において、そのゲノムは、ヒストンに包まれたエピソーム性のプラスミドの形で細胞内に存在する。
【０００３】
殆どの場合、ＥＢＶによる初期感染は、既に初期の小児期に鼻咽腔の細胞を介して、そして何の臨床症状もなしに、起こっている。もしＥＢＶとの接触が初期の成人期以前に起こらずそれましてそれ以降であると、感染性の単核細胞症（ＩＭ）の病因がしばしば伴なう。感染のこの急性相は、Ｂリンパ球の大量増殖を伴ない、その結果、強度のＴ細胞活性化及びＩＭの臨床症状をもたらす。一般に、殆どのＥＢＶ感染細胞は、免疫系によって非常に効果的に除去されるが、感染した個体は何れも、生涯にわたって、ＥＢＶ陽性のＢリンパ球を血中に担持し、潜伏性に感染している個体の幾らかは、唾液を介してこのウイルスを排出する。ＥＢＶに感染した後に体内に残ったＢリンパ球は、このウイルスを含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖して不死化した細胞株を形成する能力を有する。しかしながら、免疫防護の不全や遺伝的欠損の組み合わせを有する患者においては、ＥＢＶは、致命的な結果を伴なう単核細胞症をもたらし得る。加えて、ＥＢＶはまた、腫瘍の形成にも関与している。すなわち、ＥＢＶゲノムは、ヒトの少なくとも３つのタイプの癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫及びリンパ上咽頭癌において検出されている（総説は、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｋｉｅｆｆ， １９９６を参照のこと）。
【０００４】
ＥＢＶゲノムは、１７２ｋｂｐの長さの鎖状の二本鎖ＤＮＡよりなり、約９０種の異なったタンパク質をコードしている。それは完全にクローンされ配列決定された最初のヘルペスウイルスゲノムであった（Ｓｋａｒｅ ａｎｄ Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ， １９８０； Ｂａｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。各ゲノムの両端には、ＥＢＶ株によってその個数を異にする、約５００ｂｐの長さの反復配列（ＴＲ、「ターミナルリピート」）が存在する。宿主の感染後、これらの配列は、ゲノムを環状化するために働く（Ｋｉｔｎｅｒ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， １９７９））。
【０００５】
全てのヘルペスウイルスにおいてそうであるように、ＥＢＶの増殖サイクルにも２つの相がある。初期感染に際して、このウイルスは、上咽頭領域の粘膜にある上皮細胞及びＢリンパ球に感染する。この相において、ウイルスゲノムは殆どの細胞において細胞溶解的な仕方で複製され、感染性ウイルス粒子の広範囲にわたる放出をもたらす。対照的に、潜伏相は、感染したＢリンパ球の一部において成立し、その間、ウイルスゲノムは、染色体外のプラスミドの形で細胞のサイクルと同期して複製されて、娘細胞に受け継がれる。これら２つの相における複製が、図１に模式的に描かれている。
【０００６】
エプスタイン・バーウイルスの潜伏相
Ｂリンパ球の感染に続いて、ゲノムは、末端配列（「ターミナルリピート」）の融合によって環状化され、そして、今のとこと確認されていないメカニズムによって増幅され、この潜伏相において細胞あたり２ないし２５０コピーが作られる（Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９； Ｍｅｔｚｅｎｂｅｒｇ， １９９０）。この相にある間には、感染細胞の不死化及びウイルスゲノムの安定した増殖のために必要な僅か数個のウイルスゲノムのみが発現される（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， １９８９； Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３））。
【０００７】
潜伏相におけるＥＢＶゲノムの複製は、開始（ＤＳエレメント）及び終止（ＦＲエレメント）に必要な２つのコンポーネントからなるシス活性複製起点ｏｒｉＰから起こる（Ｇａｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ， １９８９）。ウイルスによってコードされたタンパク質であるＥＢＮＡ１（ＥＢＶ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ １）は、ｏｒｉＰのＦＲエレメントに結合し、おそらくクロマチンとの相互作用によって、有糸分裂の最後においてウイルスエピソームの一定した分配を保証する（Ａｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）（図１Ｂを参照）。潜伏相における複製には他のウイルス因子は関与せしない。ＥＢＶゲノムは、細胞の複製酵素によって、細胞サイクルにおいて正確に１回、染色体の複製起点のと同様に複製し、こうして安定に増殖娘細胞へ入る（Ｙａｔｅｓ ａｎｄ Ｇｕａｎ， １９９１； Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ， １９９９）。
【０００８】
エプスタイン・バーウイルスの細胞溶解相
ＥＢＶのｉｎ ｖｉｖｏでの細胞溶解性の増殖は、上咽頭領域の上皮細胞中で起こり、ウイルスの拡散のために重要である。ｉｎ ｖｉｖｏでの潜伏性に感染した細胞において細胞溶解性のサイクルの再活性化をもたらすメカニズムは知られていない。上皮細胞において細胞溶解性の複製を研究するための天然の細胞培養系が存在しないことから、これまでの我々の知識は、潜伏性に感染して不死化したＢリンパ球における知見のみに基づいている。ＥＢＶに潜伏性に感染したＢリンパ球においては、細胞溶解サイクルの活性化はかなり例外的である。
【０００９】
ウイルスの複製タンパク質
細胞の複製酵素によって制御される潜伏相での複製とは対照的に、細胞溶解相においては、ヘルペスウイルスは、複製に必要な殆どのタンパク質を自ら提供する。細胞溶解性の複製を担うＥＢＶ遺伝子は、一過性トランスフェクション実験において同定されており（Ｆｉｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、表１．１にまとめられている。これら６個のウイルス遺伝子産物は、ＢＺＬＦ１と共に、ｏｒｉＬｙｔプラスミドの複製に十分である。しかしながら、単純ヘルペスウイルス（ＵＬ９）、パピローマウイルス（Ｅ１）及びＳＶ４０（Ｔ−Ａｇ）について記述されているような、ヘリカーゼ活性を有し細胞溶解性の複製起点ｏｒｉＬｙｔに特異的に結合する典型的な開始タンパク質は特定できいない（Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ， １９８６； Ｈａｓｓｅｌｌ ａｎｄ Ｂｒｉｎｔｏｎ， １９９６； Ｓｔｅｎｌｕｎｄ， １９９６）。ｏｒｉＬｙｔへのＢＺＬＦ１の結合は、その活性化に必要ではあるが、ＢＺＬＦ１は、固有のヘリカーゼ活性を欠いている。
【００１０】
【表１】
2004500881.tif 000003
【００１１】
細胞溶解性複製起点、ｏｒｉＬｙｔ
細胞溶解相において、ＥＢＶゲノムの複製は、潜伏相においては機能しないものであるｏｒｉＬｙｔと命名された複製起点から起こる（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， １９８８）。ｏｒｉＬｙｔは、転写及び複製の両方のエレメントを含み、これまで知られている真核細胞の複製起点の何れとも構造的に異なった、複雑な複製起点である（図２）。ｏｒｉＬｙｔの中心領域は、最小限の複製起点を含み相対的位置の故に「上流」及び「下流」と呼ばれるコンポーネントよりなる、２つの必須のコンポーネントを含んでいる（Ｓｃｈｅｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。この中心領域は、所謂複製エンハンサー、すなわち細胞溶解性の複製に重要ではあるが必須ではない配列、によって挟まれている（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， １９８８）。「上流」のコンポーネント内には、隣接のＺＲＥ結合部位へのウイルスのトランス活性化因子ＢＺＬＦ１の結合によって直接活性化されるものである遺伝子ＢＨＬＦ１のプロモーターがある（ＺＲＥ １−４； ＺＲＥ： ＢＺＬＦ１ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）。「上流」コンポーネントのＺＲＥ結合部位へのＢＺＬＦ１の結合は、ｏｒｉＬｙｔの活性化には絶対的に必要であるが、「下流」コンポーネントとＢＨＲＦ１遺伝子プロモーターとの間に位置するＺＲＥ５、６及び７への結合は、細胞溶解性のＤＮＡ複製には必須ではない（Ｓｃｈｅｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。加えて、ＺＲＥ５及び６結合部位の間に、ＢＺＬＦ１と一緒になってＢＨＬＦ１プロモーターにトランス活性化効果を有するものである別のウイルス性トランス活性化因子、ＢＲＬＦ１のための、２つの結合部位がある（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｇｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【００１２】
ｏｒｉＬｙｔの「下流」コンポーネントは「上流」コンポーネントから約５３０ｂｐだけ離れている。変異研究が、このコンポーネント内に、Ｇ／Ｃに富んだ配列領域であるＴＤエレメントが細胞溶解性ＤＮＡ複製に絶対的に必要であること及び、点変異がｏｒｉＬｙｔの複製効率の喪失をもたらすことを示している（Ｓｃｈｅｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。こうして、この配列は、細胞溶解性の複製に関与するタンパク質の特異的結合のためのプラットホームを提供するものと仮定されている。しかしながら、ＴＤエレメントに特異的に結合する数種の細胞タンパク質複合体が同定されたものの、ウイルスのトランス活性化因子ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１の結合は起こらない（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【００１３】
細胞溶解性の複製の制御
実験的に、潜伏性に感染した数種の細胞において、化学物質による処理によって、細胞溶解サイクルを誘導することができる（ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８）。刺激の１時間後には既に、ウイルスのトランス活性化因子ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１をコードしている非常に初期（「当初」）の遺伝子の発現が観察できる（Ｔａｋａｄａ ａｎｄ Ｏｎｏ， １９８９； Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。これらの当初遺伝子の産物は、遺伝子の産生に必須の全ての遺伝子が最終的に発現されるまで各段階のトランス活性化因子がそれぞれ次の段階の活性化因子の遺伝子を活性化するものである、８０を超える遺伝子よりなる発現カスケードの第１段階である（Ｋｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｈｏｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。細胞溶解サイクルはまた、ＢＺＬＦ１又はＢＲＬＦ１をＢリンパ球に（Ｃｏｕｎｔｒｙｍａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８５； Ｒａｇｏｃｚｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）又は上皮細胞に（Ｚａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６）トランスフェクトすることによっても、直接に誘導できる。
【００１４】
ＢＺＬＦ１は、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓ等のようなＡＰ−１転写因子ファミリーのメンバーに相同性を有するトランス活性化因子である（Ｆａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８）。ＢＺＬＦ１は、ホモ２量体の形で且つ細胞の又はウイルスのＣＰ１又はＴＲＥ（ＴＰＡ応答エレメント、ＴＰＡ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）配列に対し高い親和性を以ってｏｒｉＬｙｔのＺＲＥモチーフに結合する（Ｕｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。ＢＲＬＦ１は、ＢＺＬＦ１と一緒になって同期した仕方でウイルスプロモーターを活性化することのできる、もう１つの配列特異的なＤＮＡ結合性トランス活性化因子である（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｈａｒｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ＢＲＬＦ１単独での活性は、しかしながら、組換えＢＺＬＦ１欠損ＥＢＶゲノムを用いた複製研究によって実証できたところによれば、細胞溶解性のＤＮＡ複製の誘導には十分ではない（Ｆｅｅｄｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００１５】
ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１をコードする遺伝子は、重複した転写ユニットに位置しており、ＢＺＬＦ１遺伝子は、それ自身のプロモーターからもまた隣接のＢＲＬＦ１遺伝子のプロモーターからも、転写されることができる（Ｍａｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。ＢＺＬＦ１遺伝子及びＢＲＬＦ１遺伝子の制御は、いまだ完全には理解されていない複雑なメカニズムに付されている。更には、この複雑性は、ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１がそれらの発現において相互に影響し合い且つ自己制御効果をも有するという事実によって、増大されている（Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅｃｋ， １９９０； Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。細胞性因子によるこれら２つの遺伝子産物の転写制御は、潜伏性の維持に必須である。潜伏相から細胞溶解相への切り替えは、ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１の転写を活性化する細胞の転写因子の活性化のみならず、おそらく抑制因子の不活性化をも必要とする。
【００１６】
ＢＺＬＦ１遺伝子及びＢＲＬＦ１遺伝子のプロモーターは、Ｓｐ１の結合によって活性化されることが示された（Ｚａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． １９９７）。これらのプロモーターへの転写因子ＹＹ１（Ｙｉｎ−Ｙａｎｇ １）（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）の結合により、それらの転写は、負に制御される（Ｍｏｎｔａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｚａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。別の仕事が、細胞のトランス活性化因子ＲｅｌＡ（Ｇｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４）及びＳμｂｐ−２（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）が、ＢＺＬＦ１依存性のプロモーターに対して阻害効果を有し、従って潜伏相の維持を担っているかも知れないことを示している。転写調節の他に、ＢＺＬＦ１タンパク質の活性に直接に作用する翻訳後制御メカニズムも記述されている。転写基本因子ＴＦＩＩＡ及びＴＦＩＩＤとの相互作用によってプロモーターへの結合が安定化される（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）一方、ＢＺＬＦ１のｐ５３との相互作用が、ＢＺＬＦ１によるトランス活性化を阻害する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００１７】
最も最近の研究は、ＢＺＬＦ１と、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する転写の共活性化因子（ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）であるＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）との直接的相互作用を明らかにしている（Ａｄａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｙ， １９９９； Ｚｅｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＣＢＰ仲介性のヒストンのアセチル化は、変更されたクロマチン構造（「クロマチン改造」）寄与している可能性があり、従って、一方ではＢＺＬＦ１に制御さえるプロモーターのトランス活性化を促進し、他方ではｏｒｉＬｙｔにおける開始複合体の形成を容易にしている可能性がある（Ｋｏｄａｄｅｋ， １９９８）。
【００１８】
ウイルスの制御のレベルにおいて、ＢＺＬＦ１のＤＮＡ結合ドメイン及び２量体形成ドメイン及びＢＲＬＦ１のＤＮＡトランス活性化ドメインよりなり、ＢＺＬＦ１とヘテロ２量体を形成することによってＢＺＬＦ１の機能を阻害するものである、選択的スプライシングされたタンパク質ＲＡＺ（ＢＲＬＦ１ ａｎｄ ＢＺＬＦ１）の関与が議論されている（Ｆｕｒｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。
【００１９】
このように、潜伏性の複製から細胞溶解性の複製への変換の制御は、ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１の活性の細胞性による制御によって行われている可能性がある。加えて、ｏｒｉＬｙｔへの細胞性因子の結合による、細胞溶解性の複製の直接的な活性化及び／又は抑制が起こっているように思われる。上述したように、ｏｒｉＬｙｔの「下流」コンポーネント中のＴＤエレメントは、細胞溶解性の複製には絶対的に必須である。ＢＺＬＦ１もＢＲＬＦ１もこの配列と相互作用しないことから、これまで同定されていない他の因子が、ＴＤエレメントへの結合によって潜伏性の複製から細胞溶解性の複製へのこの変換を制御しているように思われる。転写因子Ｓｐ１を含む数種のタンパク質複合体が、結合研究でＴＤエレメントの位置に同定できている。細胞溶解性の複製におけるＳｐ１の機能に関するより最近のデータは、Ｓｐ１及び少なくとももう１つ別の細胞性因子がＴＤエレメントに結合して、複製起点へウイルスの複製因子を呼び込むことを示した（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００２０】
細胞性因子の結合によるｏｒｉＬｙｔの抑制は、これまで証明はされていない。ＥＢＶの細胞溶解性の複製を阻害する細胞性タンパク質の同定と特徴付けは、科学的な興味があるというだけのものではないであろう。すなわち、このタンパク質は、ＥＢＶ感染による患者の治療において特に有用であろう。
【００２１】
従って、本発明の一目的は、そのような細胞溶解性のＤＮＡ複製の細胞性リプレッサーの存在を証明することのみならず、特にまた、そのゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列並びにアミノ酸配列を明らかにすることである。
【００２２】
本発明によればこの目的は、ＴＢ７タンパク質の存在を証明することによって、及び、添付の請求項に示されているようにＴＢ７のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を記述することによって、達成された。この細胞性リプレッサーＴＢ７は、ＥＢＶの複製を抑制するために使用でき、従って、ＥＢＶ感染患者の治療に、特に感染性の単核細胞症の治療のために使用できる。ＥＢＶは腫瘍性疾患にも関連していることから、ＴＢ７はまた、形成にＥＢＶが関係している腫瘍、特にバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫及び上咽頭癌の治療にも有用である。
【００２３】
薬理学的な意味におけるＴＢ７のもう１つの可能性ある用途として、ＨＨＶ８によって例示されるヒトのガンマヘルペスウイルスに非常に密接に関係した、及びサイトメガロウイルスによって例示されるヒトベータヘルペスウイルスに比較的密接に関係した抗ウイルス剤が挙げられる。これらのヘルペスウイルスは、非常に相同な複製起点を有しており、それらの構造的関連性のために、ＴＢ７の同様の効果が期待できる。
【００２４】
本発明のその他の具体例は、従属の請求項、次の記述及び実施例より明らかである。しかしながら、本発明は次の好ましい具体例に限定されない。
【００２５】
特に、本発明は、ＴＢ７遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列並びにこれによってコードされたアミノ酸配列に関する。本発明は、更に、ＴＢ７タンパク質の断片及び他の誘導体及び類縁体に関する。
【００２６】
更には、本発明は、上記断片又は誘導体をコードする核酸を含む。特に、本発明は、ヒト起源のＴＢ７遺伝子のみでなく脊椎動物起源の特に哺乳類例えばマウス、ラット又は家兎からのＴＢ７遺伝子をも含む。本発明はまた、上記タンパク質及びその誘導体の製造のための方法、例えば組換え技術による方法をも含む。
【００２７】
本発明は、ＴＢ７のこれらの断片のうち、１個又は２個以上の機能的ユニットを含んだ断片をも含む。尚も更には、本発明は、ＴＢ７及びその誘導体及び類縁体に特にそのエピトープ及びドメイン対するポリクローナルな又はモノクローナルな抗体にも関する。
【００２８】
以下において、本出願において使用されている幾つかの用語が、更に詳細に定義されよう。
【００２９】
核酸に関し、語「単離された」は、該核酸がその天然の環境すなわち細胞の染色体から取り出されたことを意味する。核酸は、従って、無細胞の溶液中に存在するか又はその起源である細胞の環境からは明確に異なった環境中に存在する。この語は、他の核酸成分が存在してはならないことを意味せず、それが天然の染色体環境から取り出されたことを特に意味する。同じことが、同様にタンパク質又はポリペプチドにも適用される。
【００３０】
語「濃縮した」は、核酸又はタンパク質の比率が、細胞内において天然に存在する比率よりも高いことを意味する。
【００３１】
語「精製された」は、絶対的な純度、すなわち同質の調製物をいうものではな。語「精製された」は、天然の環境中に存在するよりも高い純度の核酸又はタンパク質が得られることを意味する。
【００３２】
語「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡの核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい与えられた核酸分子と高い親和性を以って結合することを意味する。高ストリンジェント条件下では、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは、「高ストリンジェント」は、２０個のヌクレオチド中に１個又は２個のミスマッチがあるとハイブリダイゼーションがもはや起こらないことを意味する。
【００３３】
ストリンジェンシーは、塩類濃度又は変性剤濃度の違いの結果である。高ストリンジェント条件は、例えば、次の条件を意味する：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ ＮａＨ３ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１％超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５×デンハード（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液中でのハイブリダイゼーション、４２℃終夜；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる４５℃での洗浄；０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる４５℃での洗浄。条件は特異性及び選択性に依存して変化することは当業者に周知である。
【００３４】
ｃＤＮＡは、ＲＮＡから逆転写された分子を意味する。
【００３５】
語「哺乳類」は、マウス、ラット、家兎、ヤギ、サル及び好ましくはヒト等のような生物を含む。
【００３６】
本発明によれば、「誘導体」は、化合物の変更物又は修飾物又は類縁体を意味する。本発明によれば、類縁体は、化合物の空間的構造が実質的に変化していない、化合物の誘導体である。
【００３７】
核酸誘導体は、例えば、１個又は２個以上のヌクレオチドが置換され、変更され又は修正された核酸を含む。１個又は２個以上のヌクレオチド塩基又は糖部分に追加のアルキル、アリール及び／又はアリールアルキル基を有する核酸において、それらの基自身が官能基によって誘導体化されてよい、。更には、核酸誘導体はまた、例えば、１個のヌクレオチドの糖部分が他の化合物で置換され又は糖部分が変性されている類縁体を含む。
【００３８】
本発明によれば、アミノ酸誘導体は、側鎖が修飾、交換及び／又は置換されている化合物を含む。可能な修飾又は置換は、例えば、それ自身官能基によって誘導体化されていてよいアルキル、アリール及び／又はアリールアルキル基である。本発明によれば、天然に存するＬ−アミノ酸に加えて、Ｄ−アミノ酸もまた含まれる。
【００３９】
好ましい具体例が以下に記述されよう。
【００４０】
本発明は、ＴＢ７ポリペプチドをコードする、又はＴＢ７ポリペプチドをコードする核酸を含んだ、単離された、濃縮された又は精製された形の核酸を開示する。これらは、例えば、ＴＢ７遺伝子のエキソン配列を含んでなるゲノムＤＮＡ配列、ＴＢ７遺伝子をコードするｃＤＮＡ、又は更に、ＴＢ７ポリペプチドをコードする核酸を含んだベクターを、含む。
【００４１】
本発明によって提供される核酸は、特に、配列番号１のゲノムＤＮＡ並びに配列番号３のｃＤＮＡを含む。本発明はまた、配列番号１又は配列番号３の核酸配列に相補的な核酸、並びに、上記において規定された高ストリンジェント条件のもとで配列番号１の核酸にハイブリダイズし、且つ、機能的なＴＢ７ポリペプチドをコードしている核酸をも含む。本発明は更に、ＴＢ７ポリペプチドの機能的部分をコードする核酸をも含む。
【００４２】
本発明によれば、語「機能的部分」は、機能的特徴を充足するＴＢ７ポリペプチドの一部分をコードする核酸を意味することが意図されている。これらは、例えば、ＴＢ７のエピトープ及びドメイン、特に、ＥＢＶのＤＮＡ特にＥＢＶのＴＤエレメントの認識及び／又はこれとの結合を担う、又は抗原特性を有するポリペプチドのドメインを含む。
【００４３】
これは特に、ジンクフィンガードメインの定義から始まるアミノ酸１０３ないし１５１を含む、ＴＢ７遺伝子産物のＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００４４】
該核酸の好ましい起源は哺乳類であり、例えばマウス、ラット、家兎、モルモット、ヤギその他であり、更に好ましくはサル及び特に好ましくはヒトである。
【００４５】
本発明はまた、遺伝コードの縮重のために別の核酸により置換をされた核酸をも含む。本発明はまた、ＴＢ７ポリペプチドの誘導体そ、又は、ここに一層詳細に説明するＴＢ７ポリペプチドの機能的部分の誘導体をコードする核酸を含む。
【００４６】
本発明はまた、上に説明した核酸から誘導されるＲＮＡを含む。
【００４７】
本発明はまた、ＴＢ７ポリペプチドをコードする核酸の検出のための核酸をも含む。「核酸プローブ」により、我々は、ＴＢ７に特異的な核酸配列に相補的であり、これに好ましくは上述のような高ストリンジェントな条件のもとで結合することのできる核酸分子を意味する。
【００４８】
これらのプローブを使用する手順は、ＴＢ７のＲＮＡ又はＤＮＡの存在の検出、又は試料中におけるＴＢ７のＲＮＡ又はＤＮＡの量の測定を含み、核酸プローブは、ＴＢ７のＲＮＡ又はＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションと結合の検出とを可能にするような条件のもとで試料と接触させられる。
【００４９】
これらの及びその後の研究を行うために、当業者に知られた方法への、及びこれらの方法を記載した文献への一般的言及を行う。方法論的教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ．Ｍ． （ｅｄ．）， １９８５， ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ．， ｖｏｌ． Ｉ， ＩＩ． が挙げられる。
【００５０】
別の１具体例においては、本発明はまた、本発明のＴＢ７ ＤＮＡを有する核酸又はその機能的部分を含んだベクターを含む。ベクターとは、細胞にトランスフェクトできる、又は細胞を形質転換するために用いることのできる、独立して又はそして宿主細胞のゲノムと一緒に複製する能力のある、一本鎖又は二本鎖の、大抵は環状の核酸分子を意味する。そのようなベクターは、当業者に周知である。それらは、宿主細胞内においてＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分の発現を可能にするベクターであることが特に好ましい。宿主細胞とは、ＴＢ７のＤＮＡを有する組換えベクターが導入され且つ中において複製できる、如何なる原核細胞又は真核細胞をもいうことが意図されている。特に好ましい原核細胞としては、例えば大腸菌細胞が挙げられる。特に好ましい真核細胞には、例えばＢ細胞が含まれる。
【００５１】
原核細胞又は真核細胞中にＤＮＡ、特にベクターＤＮＡを導入する方法はそれ自体知られている。語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、そのような方法の概略を示している。ベクターＤＮＡは、染色体外の仕方で複製してもよく、又、宿主細胞のゲノム内に一体に組み込まれて宿主細胞のＤＮＡと一緒に複製してもよい。
【００５２】
これらの宿主細胞内に導入されたＴＢ７のＤＮＡは、一般に、天然では細胞内においてＴＢ７遺伝子の転写の制御を担っていないそして好ましくは誘導可能であるプロモータ要素による調節下にある。プロモータ要素は、転写因子のための、ポリメラーゼのための、及びベクターＤＮＡをＲＮＡに転写するための、結合部位を含む。プロモーター要素の他に、既知の他の要素がベクターＤＮＡの複製及び転写を制御し、その取り扱いを単純化し、そしてベクターＤＮＡ中に組み込まれることができる。これらには、例えば、複製起点、リボソーム結合部位、耐性遺伝子、ＴＢ７ポリペプチド又はその機能性部分の分泌を可能にするヌクレオチド配列、該ポリペプチドの精製のためのシグナル等が含まれる。
【００５３】
本発明はまた、組換えＴＢ７ ＤＮＡ又はその機能的部分若しくはその誘導体を含んだ組換え細胞をも含む。これらは、原核細胞と真核細胞の双方並びに細胞株をも含んでよい。原核細胞の典型例の１つは、大腸菌であり、真核細胞の典型例の１つは哺乳類細胞、好ましくはヒトの細胞または細胞株である。組換えＴＢ７ ＤＮＡ又はその機能的部分若しくはその誘導体は、組換え細胞、細胞株及び勿論組換え生物内に、染色体外の形でもまた染色体に組み込まれた形の何れでも、存在してよい。すなわち、それらは、宿主ゲノムと一緒に複製しても、またそれらから独立して複製してもよく、宿主ゲノムに組み込まれ一体化してもしなくてもよい。
【００５４】
本発明はまた、単離され、濃縮され、又は精製されたＴＢ７ポリペプチド又は該ポリペプチドの機能的部分並びに該ポリペプチドの誘導体をも記述している。該ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２の核酸によってコードされており、配列番号３又は配列番号４に記述されたアミノ酸配列を有する。好ましくは、それはグリコシレーションされていない形で存在する。
【００５５】
本発明はまた、ＴＢ７ポリペプチドの誘導体、１個又は２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換され、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失し、及び／又は１個又は２個以上のアミノ酸が追加で含まれており、ＥＢＶ ＤＮＡ複製のリプレッサーとしてのＴＢ７の機能が保存されているそのようなポリペプチド又はその機能的部分をも含む。同じことは、ＴＢ７リプレッサーの機能的部分についても適用される。
【００５６】
「機能的部分」により、我々は、ＴＢ７ポリペプチドのドメイン及びエピトープを意味している。「ドメイン」は、該タンパク質の機能、相互作用又は活性を担う、ＴＢ７ポリペプチドの部分を意味することが意図されている。ＥＢＶのＴＤ配列と相互作用する、ＴＢ７タンパク質の部分を意味することが特に意図されている。
【００５７】
語「誘導体」は、上記のように置換、付加又は欠失によって天然の配列と異なった該ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。これらは、アミノ酸のいわゆる保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）又は非保存的（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な置換を含んでよい。「保存的」により、我々はあるアミノ酸を、例えば電荷、疎水性、構造等に関して類似の性質を有するアミノ酸によって置換することを意味している。
【００５８】
「エピトープ」により、我々は、抗原性を有し且つＴＢ７ポリペプチドに特異的なアミノ酸の配列を意味する。そのようなエピトープは、抗体の産生のために使用してよい。
【００５９】
本発明はまた、上記のように組換えＤＮＡ技術によって製造され且つ上記のようにポリペプチド、それらの機能的部分並びにそれらの誘導体を含む、ＴＢ７の組換えポリペプチドに関する。
【００６０】
本発明はまた、ＴＢ７ポリペプチド、その機能的部分及びその誘導体に対するモノクローナルな及びポリクローナルな抗体をも記述する。ＴＢ７ポリペプチドに対する特的結合活性を示すそのような抗体は、試料中のＴＢ７ポリペプチドの検出及び／又は定量に使用してよい。それぞれの方法は当業者に周知であり、文献に記載されている。
【００６１】
ポリクローナル抗体は、抗原又はその機能的部分で免疫感作された動物の血清から得られる抗体分子からなる不均質な集団である。
【００６２】
モノクローナル抗体は、特定の抗原、この場合はＴＢ７ポリペプチドのエピトープに対する抗原よりなる、実質的に均質な集団である。細胞培養物でのモノクローナル抗体の製造の手順は知られている。一例は、最初の参考文献たる・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・及び 米国特許第４，３７６，１１０である。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞、すなわち、ＴＢ７ポリペプチドの認識と結合に適したモノクローナル抗体を産生する不死化した細胞株をも含む。
【００６３】
本発明はまた、細胞溶解性のＥＢＶ複製を阻害するための手順であって、ＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７ポリペプチドの機能的部分又はその誘導体をＥＢＶ含有細胞と接触させ、ここに、該ＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７ポリペプチドの機能的部分が、ＥＢＶのＴＥエレメントにＴＢ７が結合することにより細胞溶解性の複製が抑制されるに十分な量で存在しているものである手順をも記述している。代わりの一具体例において、ＴＢ７ポリペプチドを又はその機能的部分を若しくはその誘導体をコードしている遺伝情報が、治療されるべき細胞に、又は治療されるべき患者に導入され、少なくともＥＢＶの複製を阻害又は抑制するために、該ポリペプチドの発現が誘導される。
【００６４】
本発明の別の一具体例においては、ＴＢ７ポリペプチド又は該ポリペプチドの機能的部分若しくはその誘導体を薬剤学的に有効な量で含んだ、薬剤組成物が提供される。ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくはその誘導体は、慣用の担体又は補助剤と共に存在する。この薬剤組成物は、全身的に又は局所的に投与してよい。製剤化しそして投与するための適切な技術が、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”， １９９０， １８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ に説明されている。製剤化、投与及び投与量の具体的な方法は、治療すべき疾病、治療すべき患者、医師及び薬剤師に応じて選択してよい。適当な手順は記載されており、この点に関して、例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， ｃｈａｐ． １， ｐ． １， １９７５ が参照される。
【００６５】
本発明はまた、ＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７ポリペプチドの機能的若しくはその誘導体の製造のための手順をも開示している。この目的のために、例えば、ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくはその誘導体の発現のための情報を含んだ核酸が、プロモーター要素、エンハンサー要素、ポリアエニレーションシグナル等のような慣用の調節及び制御配列と共に、ベクターに載せて細胞に導入される。適した方法は、当業者に入手可能であり、これに関し、エレクトロポレーション又はトランスフェクションが挙げられる。ＴＢ７ポリペプチド又はその機能的部分若しくは誘導体の発現は、転写の誘導によって起こる。組換え細胞又は細胞株は、それぞれ、培養されそして組換えＴＢ７ポリペプチド又はＴＢ７の機能的部分若しくは誘導体が得られ、適当な方法で精製される。
【００６６】
以下において、ＴＢ７ ＤＮＡ及びポリペプチドの単離及び特徴づけが詳細に記述されよう。
【００６７】
ＤＮＡ結合性タンパク質を単離するための１つの実験的アプローチは、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｒｅｅｄによって初めて記述されその間「ワンハイブリッドスクリーン」（”ｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎ”） （Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｒｅｅｄ， １９９３）．の名で教科書に受け入れられた、酵母における遺伝的選択系の改良形である。この系は、多くの真核細胞転写活性化因子がＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとを含んでいる、という観察に基づいている。ＤＮＡ結合ドメインを含んだ如何なるｃＤＮＡも、もし活性化ドメインと融合させたなら、融合タンパク質は、標的配列への結合によって、指標遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬａｃＺ）の活性を制御できる。酵母におけるこの選択は、細胞内にあるタンパク質はそれらの天然のフォールディングを保持しており、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の感受性が高まっているという点で、生化学的手順に対して有利である。
【００６８】
ワンハイブリッドスクリーンを用いた Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ におけるＴＢ結合タンパク質の単離
【００６９】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＴＤ結合タンパク質の遺伝的選択系のために、適した酵母株が先ず開発された（図３ Ａ）。この目的のために、酵母株 ＲＨ１５３３ （ＭＡＴＳＹＭＢＯＬ ９７ ￥ｆ ”Ｓｙｍｂｏｌ” ￥ｓ １１； ｌｅｕ２−３，−１１２； ｕｒａ３−５２； ｈｉｓ−ｄｅｌ２００； ｔｒｐ１−ｄｅｌ９０１； ｌｙｓ２−８０１； ｓｕｃ ２−ｄｅｌ９； ＭＣＩ−） を、２つの鎖状にした組み込みプラスミドによって連続して形質転換した。このプラスミドは、多量体化したＴＤエレメントと、マーカー遺伝子Ｈｉｓ３又はＬａｃＺを異なった最小プロモーターの制御下に担持している。プラスミドの組み込みは、酵母株のそれぞれ、Ｌｙｓ２又はＵｒａ３遺伝子中へと標的化した仕方で行われ、酵母株は、ヒスチジン及びウラシル原栄養性によって選択した。この遺伝子工学により作られた酵母株をＥＢＶ不死化ヒトＢ細胞株より誘導されたｃＤＮＡライブラリー（Ｄｕｒｆｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３）．でトランスフェクトした。このライブラリーにおけるｃＤＮＡは、ＧＡＬ４活性化ドメインに融合させてある。ＴＤエレメントの配列モチーフへの融合タンパク質の特異的結合に続いて、ヒスチジン遺伝子又はＬａｃＺ遺伝子のプロモータが、それぞれ、ＧＡＬ４活性化ドメインによって活性化される。選択の厳格性を高めるため、Ｈｉｓ−３によりコードされる酵素であるイミダゾール　グリセロール−３リン酸デヒドロゲナーゼの合成を阻害するために、先に評価された濃度の３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を培地に添加した。ベクター部分にロイシン（Ｌｅｕｃｉｎ）遺伝子を担持したｃＤＮＡライブラリーのプラスミドのトランスフェクションに成功したものを選択するためにロイシン欠乏が用いられた（図３ Ｂ）。
【００７０】
ＴＢ７及びＴＤ−ＢＰ７が、同一の語として使用されていることを指摘しなければならない。
【００７１】
ロイシン、ウラシル及びヒスチジンを含まず３０ｍＭの３−ＡＴを含有する最少培地で増殖し、且つ、プラスミドＤＮＡの調製及び酵母の再形質転換の後に最少培地で増殖する（データ示さず）、２個のクローンが単離された。後でこれらのクローンのＤＮＡが配列決定された。以下においてＴＤ結合タンパク質７（ＴＤ−ＢＰ７）と呼ばれるｃＤＮＡ配列は、９５１ｂｐの長さであった。この単離されたクローンは、２個のジンクフィンガードメインを有する部分的ｃＤＮＡを含んでいた。同定されたオープンリーディングフレームは、単離されたｃＤＮＡで直ちに開始し、最初の位置に開始コドンを含んでいなかった。この配列は、既知のタンパク質との相同性を示さない。ジンクフィンガードメインの領域においてのみ、ジンクフィンガー構造を有する他のタンパク質との明らか相同性がある。タンパク質の機能を研究するために、全長ｃＤＮＡがクローンされた。
【００７２】
完全長ｃＤＮＡの単離：ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
完全なｃＤＮＡをクローンするために、ヒトＨｅＬａ細胞のＲＮＡから調製された市販のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＃ＨＬ１１５２Ｘ）を、「ワンハイブリッドスクリーン」から得られた部分的ｃＤＮＡをプローブとして用いて、スクリーニングした。このライブラリーにおいて、ｃＤＮＡは、ファージベクター ＳＹＭＢＯＬ １０８ ￥ｆ ”Ｓｙｍｂｏｌ” ￥ｓ １１ｐＤＲ２ の ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ 制限部位内に、２個の直接に反復したファージＰ１のｌｏｘＰ認識部位に挟まれた仕方で、クローンされている。ファージベクターのこの構造の根拠は、慣用のλベクターに関しては、ｃＤＮＡは、苦労してサブクローンする必要がなく、Ｃｒｅを発現している大腸菌株（ＡＭ１）の感染の間に部位特異的組換えによってｌｏｘＰ配列においてｉｎ ｖｉｖｏで組換えが起こるということである。組換えにより、クローンされたｃＤＮＡを含んだ組換えプラスミドが形成される。
【００７３】
ライブラリーをスクリーニングするために、１．２ｘ１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）を先ず２４枚の細菌皿（Φ１４０ｍｍ）に播種し（約５０，０００ ｐｆｕ／皿）、３７℃にて終夜インキュベートした。その後、プラークをニトロセルロースフィルターに移し、フィルター上のＤＮＡの変性及び固定の後、３２Ｐ放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションを行った。「ワンハイブリッドスクリーン」より単離された部分的ｃＤＮＡ ＴＤ−ＢＰ７を、特異的プローブとして用いた。非特異的なシグナルを排除するために、各々の場合につき２枚のフィルターレプリカを調製し、２枚のフィルターのシグナルを比較した。ＴＤ−ＢＰ７特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、レプリカフィルター上に確認される正のシグナルを明らかにした。Ｃｒｅを介した部位特異的組換えの及びこれに続く環状化の後、得られた新規の組換えプラスミドが単離され、ＤＮＡが精製された。ｃＤＮＡの分析は、先ず制限酵素による処理、次いでゲル電気泳動によって行った。「ワンハイブリッドスクリーン」から得られたクローンが検証でき、そして配列は、５’−３’方向で完成された。配列決定の後、ＴＤ−ＢＰ７のｃＤＮＡは、長さ２３０８ｂｐで、１９３個のアミノ酸よりなるオープンリーディングフレームを有することが見出された。
【００７４】
ＴＤ−ＢＰ７のゲノム配列の特徴付け
ＴＤ−ＢＰ７をコードする遺伝子の制御要素及び構造を決定するために、ヒト胎盤ライブラリーを、ＴＤ−ＢＰ７特異的プローブでスクリーニングした。合計で５×１０５プラークを、標準的手順に従ってハイブリダイズし（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、３個の陽性のファージプラークからＤＮＡを精製した。ファージからＴＤ−ＢＰ７遺伝子の望みのゲノム領域を単離するために、それらを制限酵素ＳａｌＩで切断し、対応する断片を単離しＸｈｏＩで鎖状化したベクターｐＡＣＹＣ１７７中にライゲートした。３個の組換えプラスミドが得られた（ｐ２１４７， ｐ２１４８， ｐ２１４９）。形質転換及びプラスミドＤＮＡの調製に続いて、クローンを、広範な制限酵素解析に付した。クローンｐ２１４７は、クローンｐ２１４８及びｐ２１４９より小さいこと、及び、後者の２つのクローンは同一であり、プラスミドベクターに逆方向にクローンされたものであることが判明した。加えて、分離された制限酵素断片を含んだアガロースゲルを、ＤＮＡの同一性を確認するため及びゲノム断片とベクター部分の間の識別をするために、ＴＤ−ＢＰ７特的プローブを用いてサザンブロット分析に付した。
【００７５】
既知のＴＤ−ＢＰ７配列及びｐＡＣＹＣベクター配列から開始して、プライマーを選択しそしてクローン２１４８を配列決定した。計２３回の配列決定反応の後、該ゲノム部分の配列は、長さ１４３２８ｂｐであることが判明した。これを、以下においてＴＤ−ＢＰ７遺伝子という。この命名は、ＴＢ７という命名と同等である。コンピュータ解析及びｃＤＮＡ配列とゲノム配列の比較により、以下の構造がＴＤ−ＢＰ７遺伝子について導かれた（図５）。すなわち、ＴＤ−ＢＰ７遺伝子は、ＣｐＧアイランド内に位置して且つ転写因子Ｓｐ１のための結合部位がこれに先行している、５’ＵＴＲ（５’非翻訳領域）を含む。第２のエキソンは、良好なコザックのコンセンサス配列（ＡＴＣＡＧＣａｔｇＧ； （Ｋｏｚａｋ， １９９６））内に埋め込まれた翻訳開始コドンを含む。オープンリーディングフレームは、９６ｂｐ後には第２のイントロンによって既に中断されており、長さを異にする５個の更なるエキソンがこれに続き、一方、第７のエキソンは、ストップコドンによってオープンリーディングフレームを終止させている。ｍＲＮＡは、ポリＡ配列を有する１．２ｋｂの長さの３’ＵＴＲ（３’非翻訳領域）の後に終止するが、明確なポリアデニレーションシグナルがこれに先行していない。ジンクフィンガー（タイプＣ２Ｈ２）をコードする配列は、エキソン５と７に位置している。第５イントロンの以降部（ＧＴ．．．ＣＡ）を例外として、全ての５’−３’スプライス部位は、スプライシングコンセンサスモチーフ（ＧＴ．．．ＡＧ）に対応している。
【００７６】
ＴＤ−ＢＰ７及びＴＤＢＰ１７のｃＤＮＡは、未知タンパク質をコードする。
ＴＤ−ＢＰ７のｃＤＮＡが既知の機能を有するタンパク質をコードしているか否かを決定するために、ＢｌａｓｔＮアルゴリズム及びＧＥＮＩＵＳｎｅｔデータバンク（ＤＫＦＺ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて配列比較を実施した。５’及び３’非翻訳領域におけるｃＤＮＡ配列にＥＳＴ（”ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ”）ｃＤＮＡとの相同性が見出された。更に、上述したように、ジンクフィンガーをコードする配列領域において、既知のジンクフィンガータンパク質との相同性があった。相同な領域の概略図が図４に示されている。
【００７７】
ＴＤ−ＢＰ７に対するモノクローナル抗体の製造
タンパク質レベルでのｃＤＮＡの発現の試験を可能にするために、及び、結合研究においてＴＤ−ＢＰ７の特異的ＤＮＡ相互作用を検出するために、このタンパク質に対するモノクローナル抗体を製造した。ラットの免疫感作のために、先ずタンパク質抗原を産生して精製する必要があった。この目的のために、ＴＤ−ＢＰ７ ｃＤＮＡとグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との間の融合プラスミドを大腸菌での過剰発現に続いて調製し精製した。
【００７８】
モノクローナル抗血清は、Ｌｏｕ／ｃラットをＭＢＰ−ＴＤ−ＢＰ７抗原で免疫感作することによって得た。ラットから単離した脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株との必要な融合及び陽性クローンのダブル・リクローニングを、標準の手順に従って行った（・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・）。それぞれのハイブリドーマ細胞株の各々につき２０の培養上清を、ウエスタンブロット分析により試験した。モノクローナル抗体がＭＢＰ−（ＴＤ−ＢＰ７）部分に対する、あるいはＮｅｏ決定基に対するものであることを排除するために、ハイブリドーマ上清は、ＳＧＴ−（ＴＤ−ＢＰ７）融合タンパク質として得られ部分的に精製した、免疫感作には用いなかった抗原によって、各々試験した。ＴＤ−ＢＰ７に対するモノクローナル抗原（１０Ｃ１）を選択した。
【００７９】
このモノクローナル抗体は、対応する抗原を検出する。しかしながら、ＨｅＬａタンパク質抽出物中に内因性に発現されたＴＤ−ＢＰ７をこれらの抗体を用いて検出することはできなかった。しかしながら、２３９細胞におけるｐＣＭＶ−ＴＤ−ＢＰ７の発現に続いて、特異的シグナルが検出できた。従って、我々は、ＴＤ−ＢＰ７に対するモノクローナル抗体の製造に成功しており、しかし、その親和性は、ＴＤ−ＢＰ７の内因性の遺伝子産物を検出するには低すぎた。固定化していないタンパク質ＤＮＡ複合体に結合する能力につき抗体を試験するのに、ゲルシフト実験を用いた。
【００８０】
ｏｒｉＬｙｔの「下流」コンポーネントとのＴＤ−ＢＰ７及びＴＤ−ＢＰ１７との相互作用：ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合試験
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの「ワンハイブリッド系」におけるＴＤエレメントとのタンパク質相互作用は、ＴＤ−ＢＰ７のｃＤＮＡの単離をもたらした。以下において、我々は、このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質が、ＴＤエレメントにｉｎ ｖｉｔｒｏでも結合できるか否か、試験しようとした。これまでの研究から、「下流」コンポーネントにおいて全部で６種類の細胞性複合体が形成されることが知られていることから（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、我々は更に、これらのタンパク質がそれら記載された複合体の一部であるか否かを明らかにしようとした。
【００８１】
組換えタンパク質ＴＤ−ＢＰ７及びＴＤ−ＢＰ１７は、ｏｒｉＬｙｔのＴＤエレメントにｉｎ ｖｉｔｒｏで結合する
ＴＤ−ＢＰ７タンパク質がＴＤエレメントにｉｎ ｖｉｔｒｏで結合するか否かを決定するために、我々は先ず、組換え融合タンパク質を用いてゲルシフト分析を行った。ｏｒｉＬｙｔのＴＤエレメントの６２ｂｐの配列を放射性標識し、組換えＭＢＰ−ＴＤ−ＢＰ７タンパク質抽出物とのインキュベーションのためにＤＮＡプローブとして用いた。複合体の特異性を評価するために、「下流」コンポーネントの領域からの非標識オリゴヌクレオチド（Ｔ１−Ｔ６及びＴＤ）を用いて、更なる競合実験を行った。該タンパク質は、ＴＤエレメントと相互作用することが判明した。ＭＢＰ−ＴＤ−ＢＰ７抽出物とのＴＤエレメントのインキュベーションに続いて、２つの複合体が形成し、それらのうち上側の複合体Ｉは、非標識のＴＤエレメントによって殆ど完全に競合された。「下流」コンポーネントからのオリゴヌクレオチドＴ４との競合は、同じ結果を示したが、一方、上側の複合体Ｉへの結合は、オリゴヌクレオチドＴ３、Ｔ３．４及びＴ６を用いた場合に完全にブロックされた。非標識のオリゴヌクレオチドの添加は、下側の複合体ＩＩの形成を僅かしか阻害しなかった。加えて、これらの複合体の特異性は、タンパク質ＴＤ−ＢＰ７に対するモノクローナル抗体を添加した後の超シフトの出現によって確認された。
【００８２】
ＴＤ配列の外側に位置するオリゴヌクレオチドＴ６によるＴＤエレメントにおける複合体形成の競合は、これら２つの配列の高い配列類似性に帰すことができる。これらの結果は、組換え形で発現されたタンパク質ＴＤ−ＢＰ１７及びＴＤ−ＢＰ７が、ｏｒｉＬｙｔのＴＤエレメントにｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に結合することを明らかにしている。これに関し、この相互作用は正しくＴＤエレメントのその領域（ＥＢＶ ＃５３，３５５ − ＃５３，３９５）で起こり、そこではＥＢＶの細胞溶解性のＤＮＡ複製を完全な阻害を達成するのに点変異で十分である（Ｓｃｈｅｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。
【００８３】
細胞溶解性のＥＢＶ複製に対するＴＤ−ＢＰ７タンパク質の効果
上記の結果は、タンパク質ＴＤ−ＢＰ７がｏｒｉＬｙｔのＴＤエレメントにｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に結合することを示している。このタンパク質がＥＢＶの場合に細胞溶解性の複製効率に影響を及ぼすか否かは、中心的な問題であった。ＥＢＶの細胞溶解性の複製起点は、一過性複製実験を用いてＷ． Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔによって同定された（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， １９８８）。この方法においては、組換えプラスミドの複製が、ＥＢＶの細胞溶解相を支持することのできるＥＢＶ陽性細胞において検討された。この目的のために、ＥＢＶ株Ｂ９５−８のｏｒｉＬｙｔ配列を有する組換えプラスミドがＢＺＬＦ１発現プラスミドと共にＥＢＶ陽性Ｄ９８／ＨＲ１細胞にトランスフェクトされた。ＢＺＬＦ１は、内因性のＥＢＶの細胞溶解サイクルを誘導する。トランスフェクション２日後に、細胞を収穫し、溶解しそしてＤＮＡを単離した（Ｈｉｒｔ， １９６７）。ＢａｍＨＩ及びＤｐｎＩによる処理の後、新たに複製されたＤＮＡをサザンブロットハイブリダイゼーションにより定量した。このプラスミドＤＮＡを特異的に認識する原核細胞の配列が、プローブとして用いられた。トランスフェクトされたＤＮＡと新たに複製されたＤＮＡの識別は、ｄａｍ＋大腸菌株内でメチル化されたＤＮＡのみを切断する酵素によるＤＮＡの切断によって達成した。ＤｐｎＩ認識配列ＧＡＴＣは、真核細胞では非常に頻繁に存在するため、トランスフェクトされたＤＮＡは高度に断片化される。真核細胞内で複製されたＤＮＡは、消化を受けず、無傷で残る。
【００８４】
ｏｒｉＬｙｔプラスミドｐ９６８．２２の複製効率は、ＣＭＶ発現プラスミドの共トランスフェクションの後、ＴＤ−ＢＰ７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）につき、一過性複製実験において試験した。ｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＯＲＦの共トランスフェクションは、ベクター対照に比して複製効率の顕著な抑制をもたらした。ＴＤ−ＢＰ７が、ＴＤエレメントの必須の複製因子の結合と競合するか否か、又は観察された結果が積極的抑制か否かを決定するために、ＴＤ−ＢＰ７のＤＮＡ結合ドメイン（ｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＤＢＤ）のための発現プラスミドを比較目的でトランスフェクトした。ＴＤ−ＢＰ７ ＤＮＡ結合ドメインのみで、複製を抑制するのに十分であることが判明した。すなわち、ｏｒｉＬｙｔの複製の抑制は、おそらく必須の複製因子を積極的に押し退けることとなるものである、ＴＤ−ＢＰ７のＴＤエレメントへの競合的結合に帰すことができる。
【００８５】
トランスフェクション時にｐＣＭＶ発現プラスミドが転写因子を求めて競合しそのために試料中のｐＣＭＶ−ＢＺＬＦ１による細胞溶解性サイクルの誘導に差が生じるということを排除するために、トランスフェクトされた細胞を更にＢＺＬＦ１の発現量についてウエスタンブロット分析により検討した。ＢＺＬＦ１の発現は、全てのサンプルにおいて同等であった。
【００８６】
上記の結果は、ＴＤ−ＢＰ７が特異的にｏｒｉＬｙｔのＴＤエレメントに結合することを実証している。ＴＤ−ＢＰ７の発現は、細胞溶解性の複製の完全な抑制をもたらし、これは細胞溶解性の複製起点への該タンパク質の結合に帰すことができる。
【００８７】
ＴＤ−ＢＰ７はＳｐ１のＴＤエレメントへの結合を抑制する
ＴＤ−ＢＰ７とＴＤエレメントとの間の接触部位は、転写因子Ｓｐ１のための結合モチーフ（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）としてこれまで記述されている配列内に位置する。細胞溶解性の複製におけるＳｐ１の役割についての非常に最近の研究においては、細胞の転写因子がＴＤエレメントに結合しそして細胞溶解性の複製起点ｏｒｉＬｙｔにウイルスの複製因子を呼び込むことが判明している（Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＴＤ−ＢＰ７は細胞溶解性のＥＢＶ複製を抑制することから、ＴＤ−ＢＰ７がＴＤエレメントへのＳｐ１の結合を抑制することができるか否かを検討するのは当然のことであった。この仮説は、ＤＮａｓｅＩ保護実験を用いて検討された。組換えＳｐ１又はＭＢＰ−ＢＰ７の量を増加しつつ、放射性標識した「下流」コンポーネントの断片と共にインキュベートし、続いて、所定の条件下でのＤＮａｓｅＩによるＤＮＡの切断及び変性性ＰＡＡゲル上での分離を行った（図６）。用いたＭＢＰ−ＢＰ７の最低量において既に、「下流」コンポーネントへの結合は、Ｔ３．４及びＴ６領域（ＥＢＶ ＃５３，４０３−５３，４２４ 及び ＥＢＶ ＃５３，３６４−５３，３９１）におけるＤＮａｓｅＩ消化からのＤＮＡの顕著な保護をもたらし、このことは、競合的ゲルシフト実験の結果と整合し、且つ、より多い量のＭＢＰ−ＢＰ７では一層顕著であった。このタンパク質の結合は、結合部位の両側にある配列をＤＮａｓｅＩに対し高感受性にした。Ｓｐ１の結合もまた、Ｔ６及びＴＤエレメントの領域における保護をもたらしたが、顕著性は低く且つＭＢＰ−ＢＰ７に比して僅かにシフトしていた（それぞれ、ＥＢＶ ＃５３，４０３−５３，４２２ 及び ＥＢＶ ＃５３，３５９−５３，３７９）。一定量（各インキュベーションの最高濃度）のＳｐ１及び漸増量のＭＢＰ−ＢＰ７と共に、又はこの逆で行った試料の同時インキュベーションは、全ての試料においてＳｐ１保護パターンの形成を完全に阻害した。
【００８８】
これらの結果は、ｏｒｉＬｙｔの「下流」コンポーネントへの結合を求めてＴＤ−ＢＰ７が転写因子Ｓｐ１と競合することを示している。観察されたＴＤ−ＢＰ７の結合による細胞溶解性の複製の抑制はまた、細胞の及び／又はウイルスの因子を、細胞溶解性複製起点から押し退けるということによっても説明できよう。
【００８９】
ＴＤ−ＢＰ７の発現は、ＥＢＶのＤＮＡ複製を阻害する
細胞溶解性のＥＢＶのＤＮＡ複製に対するＴＤ−ＢＰ７の効果を検討するために、組換えＥＢＶゲノムを担持する細胞株２０９８−３１にＢＺＬＦ１をトランスフェクトすることによって細胞溶解性の複製を誘導した。ＴＤ−ＢＰ７のオープンリーディングフレーム又はＤＮＡ結合ドメインのためのＣＭＶフラッグ発現プラスミドを同時に共トランスフェクトした。３日後、濾過した培養上清でＲａｊｉ細胞を培養し、更に３日後、蛍光顕微鏡下にＧＦＰ発現につき検討した（図８）。ベクター対照のトランスフェクションによって得られた上清を用いると、Ｒａｊｉ細胞の約４０％がＧＦＰを発現した。ｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＤＢＤ又はｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＯＲＦでトランスフェクトした後に得られた細胞培養上清は、Ｒａｊｉ細胞の感染率から見る限り、明らかに少ない感染性粒子しか含んでいなかった。特に顕著であったのは、プラスミドｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＯＲＦのトランスフェクション後におけるこの効果であり、それは、ＥＢＶのＤＮＡ複製の抑制において、明らかに特に強力であった。トランスフェクション試料のＢＺＬＦ１及びフラッグ特異的抗体によるウエスタンブロット分析を、トランスフェクトされたプラスミドにおける発現レベルの対照として用いた（図８）。プラスミドｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＤＢＤの低い発現は、プラスミドｐＣＭＶ−ＢＰ７／ＯＲＦのトランスフェクション後に得られた効果に比して複製抑制効果が減少していることを説明付ける。これらの結果は、一過性複製実験及び結合試験で得られたデータを確認している。ＴＤ−ＢＰ７は、ｏｒｉＬｙｔのＤＮＡ複製を強力に抑制し、この効果は、細胞溶解性の複製起点へのこのタンパク質の結合に基づくものである。
【００９０】
こうして、一過性複製実験において、細胞性因子ＴＢ７の発現が、ｏｒｉＬｙｔのＤＮＡ複製の殆ど完全な抑制をもたらすことが実証できた。
【００９１】
添付の図面は以下を示している。
【００９２】
図１　エプスタイン・バーウイルスの２つの相。宿主に感染した後、鎖状のＤＮＡは放出され、ターミナルリピート（ＴＲ）配列を介して環状化される。細胞溶解相（Ａ）において、細胞溶解性の複製起点ｏｒｉＬｙｔにおいて、ＤＮＡ複製が起こる。ＤＮＡ合成は、おそらく、バクテリオファージλについて記述されているような、いわゆる「ローリングサークル」メカニズムにより単一方向に行われる。産物としてコンカテマー分子が形成され、これは塩基特異的な仕方でそれらのＴＲ配列において切断され、ウイルスカプシドにパーケージングされる。潜伏性に感染している細胞内では、ウイルスゲノムは染色体外エピソームの形で存在している。この潜伏相においては、ウイルスゲノムは細胞サイクルに同期して、プラスミド複製起点ｏｒｉＰ（Ｂ）によって複製する。潜伏性に感染した僅か２、３の細胞が、自発的な細胞溶解性の複製を支持している。しかしながら、化学物質による、又はウイルスにコードされたトランス活性化因子ＢＺＬＦ１によって処理すると、細胞の一部（Ｃ）において細胞溶解性のサイクルが実験的に誘導できる。
【００９３】
図２　エプスタイン・バーウイルスの細胞溶解性の複製起点ｏｒｉＬｙｔの概要図。細胞溶解性の複製起点は、複雑な構造を有し、転写及び複製の各種エレメントを含んでいる。中心領域（約１ｋｂｐ）に、複製に必須な２個の「上流」及び「下流」コンポーネントがあり、反対方向に転写される２個の遺伝子に挟まれている。これら隣接領域は、複製を促進するが絶対必要なものではないことから、複製エンハンサーと呼ばれる。図の下側部分に、これまで特徴づけられたｏｒｉＬｙｔの要素が描かれている。ＢＨＬＦ１遺伝子プロモーター（ＴＡＴＡ）は、「上流」コンポーネントと共に位置し、ウイルスのトランス活性化因子ＢＺＬＦ１のための４個の結合部位（ＺＲＥ： ＢＺＬＦ１ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含んでいる。更なるＺＲＥ結合部位が、「下流」コンポーネントとＢＨＲＦ１プロモーターとの間に位置しており、ここにも、ウイルスのトランス活性化因子ＢＲＬＦ１のための２個の結合部位（Ｒ）が位置している。「下流」コンポーネントはまた、６０ｂｐの長さの／Ｃリッチな配列（ＴＤエレメント）をも含み、これへのＳｐ１及び他の未だ特徴づけられていない細胞性タンパク質の結合が検出されている。ＴＤエレメント内における変異は、（Ｇｒｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５等によると）細胞溶解性のＥＢＶ複製を阻害する。
【００９４】
図３　 Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける「ワンハイブリッドスクリーン」の概略図。（Ａ）酵母株の調製。酵母株ＲＨ１５３３を、欠損遺伝子ＬＹＳ２及びＵＲＡ３内に標的化した仕方で組み込まれる２つのプラスミドで形質転換した。これらの組み込みプラスミドは、異なったプロモーターの調節下にある２つのマーカーＨＩＳ３及びＬａｃＺを導入し、それらの活性は、多量体化したＴＤエレメントによって決定される。ＨＩＳ３マーカー遺伝子の導入後は、最少のＨＩＳ３プロモーターの活性のために酵母は、ヒスチジン不含の培地での増殖可能である。ｃＤＮＡライブラリーのトランスフェクションに続く選択のためには、プロモーターの残存活性は３−アミノトリアゾールの添加によりブロックしなければならない。組み込みのための選択は、ヒスチジン及びウラシルを含まない最少培地上での増殖を用いて行われた。（Ｂ）調製された酵母株を用いた、ｃＤＮＡライブラリーの形質転換。ＨＩＳ３及びＬａｃＺ遺伝子プロモーターは、融合タンパク質が特異的にＴＤのＤＮＡ配列モチーフに結合しそれによりＧＡＬ４活性化ドメインをプロモーターの近傍にもたらした場合にのみ、活性化される。ロイシン欠乏が、ｃＤＮＡライブラリーの形質転換に成功した、Ｌｅｕ２遺伝子をそのベクター部分に担持するものを選択するために用いられた。
【００９５】
図４　ＴＢ７は未知の遺伝子産物をコードする。ＧＥＮＩＵＳｎｅｔデータベースからのＥＳＴ配列とＴＢ７ ｃＤＮＡとの相同な領域の概略図。矢印の数字は、表に記載した配列をいう。矢印の方向は、それら相同の配列が、コード鎖と非コード鎖の何れにあるかを示す。白のバーは、ジンクフィンガードメインの位置を示す。
【００９６】
図５　ＴＤ−ＢＰ７遺伝子の構造の概要的表示。ＴＤ−ＢＰ７のクローンされた配列は、長さ１４３２８ｂｐである。提示されているのは、エキソン１〜７及び３’ＵＴＲ（斜線）、イントロン（灰色）及びゲノム配列（白色）を含んだコード領域である。転写開始点（＋１）は、ＣｐＧアイランド内に位置している。転写因子Ｓｐ１のための推定の結合部位が示されている。長さはｂｐで示されている。
【００９７】
図６　ＴＤ−ＢＰ７は、「下流」コンポーネントへの結合を求めてＳｐ１と競合する。「下流」コンポーネントの２４２ｂｐの断片が、放射性標識され、組換えＳｐ１及び／又はＭＢＰ−ＴＤ−ＢＰ７の存在下にＤＮａｓｅＩと共にインキュベートされた。用いられた組換えタンパク質の量が示されている。配列位置の決定のために、断片のＭａｘａｍ−ＧｉｌｂｅｒｔのＧ＋Ａ配列決定反応（Ｇ＋Ａ）が用いられた。タンパク質とのインキュベーションを予め行うことなしでのＤＮａｓｅＩ反応が、陰性対照として用いられた。ＤＮａｓｅＩ高感受性部位が、アスタリスクで示されている。側方に、ＴＤ−ＢＰ７及びＳｐ１との結合によってＤＮａｓｅＩ消化から保護された「下流」コンポーネントの領域が、それぞれ概念的に描かれている（それぞれ、点を打った及び斜線を入れたバー）。ｆｐｕ：「フットプリント単位」
【００９８】
図７　ＴＢ７及び変異体を用いた一過性複製実験
図の上側のパネルにおいて、ＴＢ７及び種々の欠失変異体のオープンリーディングフレームの構造が示されている。Ｄ９８／ＨＲ１細胞へのこれら異なった発現プラスミド及びＢＺＬＦ１のための発現プラスミド（細胞溶解性の複製の誘導物質としてのｐＣＭＶ−ＢＺＬＦ１）の共トランスフェクションの後、ｏｒｉＬｙｔプラスミドの複製効率を検討した。無傷のＴＢ７タンパク質及び５’領域を僅かに切り取った変異体の発現により、細胞溶解性のＤＮＡ複製は完全に抑制された（それぞれ、ｐ２０６５ 及び ｐ２１８１）。５’領域の切除は、この抑制効果の部分的な放棄をもたらしたが（ｐ２６０８）、ＤＮＡ結合性のジンクフィンガードメインの欠失は、細胞溶解性のＤＮＡ複製に影響を及ぼさなかった。
【００９９】
図８　ＴＢ７はＥＢＶのＤＮＡ複製を抑制する。２０９８−３１細胞は、染色体外のＦ因子プラスミド上に、組換えＥＢＶゲノム及びヒグロマイシン及びＧＦＰの遺伝子とを担持している。これらの細胞が、ＴＢ７発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＴＢ７／ＯＲＦ）でトランスフェクトされた。細胞溶解サイクルは、ＢＺＬＦ１の共トランスフェクションによって誘導された。トランスフェクションの３日後、濾過された細胞上清がＲａｊｉ細胞と共にインキュベートされ、更に３日後、細胞はＧＦＰ発現について蛍光顕微鏡下に分析された。比較のために、Ｒａｊｉ細胞が、対照（ベクター）トランスフェクションの濾過された細胞上清と共にインキュベートされた。ＴＢ７発現プラスミドのトランスフェクション後の細胞培養上清の感染性は、対照に比して強く減少した（下側のパネル）。Ｒａｊｉ細胞の対応する位相差顕微鏡観察（上側パネル）。
【０１００】
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Ｇｏｌｄｂｌｕｍ， Ｎ．， Ｄａｅｆｌｅｒ， Ｓ．， Ｌｌａｎａ， Ｔ．， Ａｂｌａｓｈｉ Ｄ．， Ｊｏｓｅｐｈｓ， Ｓ． ａｎｄ Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ， Ｚ． （１９９０）． Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， ＤＧ７５， ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ７２： ３０９−３１３．
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Ｇｒｕｆｆａｔ， Ｈ．， Ｒｅｎｎｅｒ， Ｏ．， Ｐｉｃｈ， Ｄ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ， Ｗ． （１９９５）． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９： １８７８−１８８６．
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Ｇｕｔｓｃｈ， Ｄ．Ｅ．， Ｈｏｌｌｅｙ−Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｅ．Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｑ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｂ．， Ｂｌａｎａｒ， Ｍ．Ａ．， Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｙ， Ｓ．Ｃ． （１９９４）． Ｔｈｅ ｂＺＩＰ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ， ＢＺＬＦ１， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐ６５ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＮＦ−ｋＢ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４： １９３９−１９４８．
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Ｈａｒｄｗｉｃｋ， Ｊ．Ｍ．， Ｔｓｅ， Ｌ．， Ａｐｐｌｅｇｒｅｎ， Ｎ．， Ｎｉｃｈｏｌａｓ， Ｊ． ａｎｄ Ｖｅｌｉｕｏｎａ， Ｍ．Ａ． （１９９２）． Ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ Ｒ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ （Ｒｔａ） ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ， ｐｏｔｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＶＰ１６． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６６： ５５００−５５０８．
Ｈａｓｓｅｌｌ， Ｊ．Ａ． ａｎｄ Ｂｒｉｎｔｏｎ， Ｂ．Ｔ． （１９９６）． ＳＶ４０ ａｎｄ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｎ ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ， Ｍ． （ｅｄ．）， ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ６３９−６７７．
Ｈｅｓｔｏｎ， Ｌ．， Ｒａｂｓｏｎ， Ｍ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｎ． ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， Ｇ． （１９８２）． Ｎｅｗ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒｍ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ ｏｆ Ｐ３ＨＲ−１ Ｂｕｒｋｉｔｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ２９５： １６０−１６３．
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Ｈｏｌｌｅｙ， Ｇ．Ｅ．， Ｑｕｉｎｌｉｖａｎ Ｅ．Ｂ．， Ｍａｒ， Ｅ．Ｃ． ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｙ， Ｓ． （１９９０）． Ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ （ＥＢＶ） ＢＭＲＦ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ａｎｔｉｇｅｎ （ＥＡ−Ｄ） ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＥＢＶ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒｓ， ＢＲＬＦ１ ａｎｄ ＢＺＬＦ１， ｉｎ ａ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４： ３７５３−３７５９．
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Ｊａｌｌｅｐａｌｌｉ， Ｐ．Ｖ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ， Ｔ．Ｊ． （１９９７）． Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｏ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎｓ： ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｗｉｔｃｈ？ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９： ３５８−３６３．
Ｊｏｎｅｓ， Ｈ．Ｗ．， Ｊｒ．， ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｖ．Ａ．， Ｈａｒｐｅｒ， Ｐ．Ｓ． ａｎｄ Ｗｕｕ， Ｋ．Ｄ． （１９７１）． Ｇｅｏｒｇｅ Ｏｔｔｏ Ｇｅｙ． （１８９９−１９７０）． Ｔｈｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ａｎｄ ａ ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｉｔｓ ｏｒｉｇｉｎ． Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ３８： ９４５−９４９．
Ｋｅｍｐｋｅｓ， Ｂ．， Ｐｉｃｈ， Ｄ．， Ｚｅｉｄｌｅｒ， Ｒ．， Ｓｕｇｄｅｎ， Ｂ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ， Ｗ． （１９９５）． Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７１ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９： ２３１−２３８．
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Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｃｏｎｎｅｒ， Ｄ．Ａ．， Ｃｈａｏ， Ｓ．， Ｇｅｉｓｔｅｒｆｅｒ−Ｌｏｗｒａｎｃｅ， Ａ．Ａ． ａｎｄ Ｓｅｉｄｍａｎ， Ｊ．Ｇ． （１９９２）． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２： ２３９１−２３９５．
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Ｓｃｈｅｐｅｒｓ， Ａ．， Ｐｉｃｈ， Ｄ．， Ｍａｎｋｅｒｔｚ， Ｊ． ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ， Ｗ． （１９９３）． Ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｙｔｉｃ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７： ４２３７−４２４５．
Ｓｅｄｉｖｙ， Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｄｕｔｒｉａｕｘ， Ａ． （１９９９）． Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ＿ａ ｒｅｂｉｒｔｈ ｏｒ ａ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ？ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５： ８８−９０．
Ｓｅｄｉｖｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ．， Ｌｉｂｅｒ， Ｈ．Ｌ．， Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｅ．Ａ． ａｎｄ Ｒｏｓｍａｒｉｎ， Ａ． （１９９９）． Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ＤＮＡ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３： ９−９ａ．
Ｓｈｉ， Ｙ．， Ｓｅｔｏ， Ｅ．， Ｃｈａｎｇ， Ｌ． ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， Ｔ． （１９９１）． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＹＹ−１， ａ ｈｕｍａｎ ＧＬＩ−Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｔｒｏｔｅｉｎ， ａｎｄ ｒｅｌｉｅｆ ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ１Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ ６７： ３７７−３８８．
Ｓｉｎｃｌａｉｒ， Ａ．Ｊ．， Ｂｒｉｍｍｅｌｌ， Ｍ．， Ｓｈａｎａｈａｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｐ．Ｊ． （１９９１）． Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｙｃｌｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５： ２２３７−２２４４．
Ｓｋａｒｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ， Ｊ．Ｌ． （１９８０）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＢａｍＨＩ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｂ９８−８ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ． Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７： ３８６０−３８６４．
Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｏ．， Ｇｒｅｇｇ， Ｒ．Ｇ．， Ｂｏｇｇｓ， Ｓ．Ｓ．， Ｋｏｒａｌｅｗｓｋｉ， Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ， Ｒ．Ｓ． （１９８５）． Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｌｏｃｕｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３１７： ２３０−２３４．
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ．Ｍ． （１９７５）． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９８： ５０３−５１７．
Ｓｔｅｎｌｕｎｄ， Ａ． （１９９６）． Ｐａｐｉｌｌｉｏｍａ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｎ ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ， Ｍ． （ｅｄ．）， ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ６７９−６９７．
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【０１０１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】エプスタイン・バーウイルスの２つの相
【図２】エプスタイン・バーウイルスの細胞溶解性の複製起点ｏｒｉＬｙｔの概要図
【図３】Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける「ワンハイブリッドスクリーン」の概略図
【図４】ＴＢ７は未知の遺伝子産物をコードする
【図５】ＴＤ−ＢＰ７遺伝子の構造の概要的表示
【図６】ＴＤ−ＢＰ７は、「下流」コンポーネントへの結合を求めてＳｐ１と競合する
【図７】ＴＢ７及び変異体を用いた一過性複製実験
【図８】ＴＢ７はＥＢＶのＤＮＡ複製を抑制する
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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