(57)【要約】組換え核酸、例えばメガロミシンポリケチド合成酵素および修飾酵素の全てまたは１部分をコードするＤＮＡ化合物は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、ならびに抗生物質、モチライド、および駆虫剤として有用である他のポリケチドの生成のために宿主細胞において組換えポリケチド合成遺伝子を発現するために使用される。有機抽出物を合わせ、飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、約０．１５ｍｇの産物を得た。産物は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応するが、提供される化合物が６−ｄＥＢで異なるので、それらとは異なる、グリコシル化およびヒドロキシル化された化合物である。
2004513605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メガロミシンポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）またはメガロミシン修飾酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸であって、ｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、およびｍｅｇＡＩＩＩからなる群より選択されるＰＫＳオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする、単離された核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸であって、ここでＰＫＳドメインが、ＴＥドメイン、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、およびＥＲドメインからなる群より選択される、単離された核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸であって、ここで該核酸が、メガロミシンＰＫＳのローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、および全ての６つのエクステンダーモジュールについてのコード配列を含む、単離された核酸。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸であって、メガロミシンへの６−ｄＥＢの変換に関与されるメガロミシン修飾遺伝子をコードする、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の単離された核酸であって、ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンの生合成に関与するメガロミシン修飾酵素をコードする、単離された核酸。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸であって、ここで前記ＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素コード配列内の相同な領域の核酸コドンが、相同性を減少または回避するために変化されており、該変化された核酸コドンによってコードされるアミノ酸配列を変化することを伴わない、単離された核酸。
【請求項８】
請求項１に記載の単離された核酸であって、単離された核酸フラグメントが、配列番号１において記載されるヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された核酸によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１０】
プロモーターに作動可能に連結される請求項１に記載の単離された核酸を含む、組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え宿主細胞であって、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組換え宿主細胞であって、以下：
ａ）少なくとも２つの別々の自律的に複製する組換えＤＮＡ発現ベクターであって、該ベクターのそれぞれが、プロモーターに作動可能に連結されるメガロミシンＰＫＳドメインもしくはメガロミシン修飾酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む、組換えＤＮＡ発現ベクター；または
ｂ）少なくとも１つの自律的に複製する組換えＤＮＡ発現ベクターおよび少なくとも１つの改変された染色体であって、該ベクターのそれぞれ、および該改変された染色体のそれぞれは、プロモーターに作動可能に連結されるメガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン修飾酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む、組換えＤＮＡ発現ベクターおよび改変された染色体、
を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ハイブリッドＰＫＳであって、請求項９に記載のポリペプチドを含み、ならびにメガロミシンＰＫＳの少なくとも１部分およびメガロミシン以外のポリケチドについての第２のＰＫＳの少なくとも１部分から構成される、ハイブリッドＰＫＳ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のハイブリッドＰＫＳであって、ここで前記第２のＰＫＳがナルボノライドＰＫＳ、オレアンドライドＰＫＳ、およびＤＥＢＳ　ＰＫＳからなる群より選択される、ハイブリッドＰＫＳ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のハイブリッドＰＫＳであって、ｍｅｇＡＩおよびｍｅｇＡＩＩの遺伝子産物、ならびにｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子産物から構成される、ハイブリッドＰＫＳ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のハイブリッドＰＫＳであって、ここで前記ｍｅｇＡＩ遺伝子産物のモジュール１のＫＳドメインが変異によって不活性化される、ハイブリッドＰＫＳ。
【請求項１８】
ポリケチドを生成する方法であって、該方法は、組換え発現ベクターによってコードされるメガロミシンＰＫＳドメインが生成され、およびポリケチドが細胞によって合成される条件下で請求項１１に記載の組換え宿主細胞を増殖する工程、ならびに合成されたポリケチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】
メガロミシン修飾酵素をコードする組換え発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２０】
メガロミシンを産生しそしてポリケチドにメゴサミンを付着し得る請求項１９に記載の組換え宿主細胞であって、ここで該宿主細胞は、その天然に存在する非組換え状態において、メゴサミンを生成し得ない、組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（優先権出願の引用）
本出願は、３５　Ｕ．Ｓ．Ｃ．§　１１９（ｅ）下の米国仮特許出願番号６０／１５８、３０５（１９９９年１０月８日出願）、および米国仮特許出願番号６０／１９０、０２４（２０００年３月１７日出願）の優先権を主張する．上記参照出願の内容は、その全体を本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術によるポリケチド生成のための組換え方法および材料を提供する。本発明は農学、家畜学、化学、医薬品化学、医学、分子生物学、薬理学、および獣医学の技術分野に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ポリケチドは、一連の縮合および続く改変により２つの炭素の単位から合成される多様な化合物の大きなファミリーを表す。ポリケチドは、真菌類および菌糸体細菌、特に放線菌類を含む、多くの型の生物体に生じる。ポリケチド構造には、広範な多様性があり、ポリケチド群は、多様な活性を有する多くの化合物を包含する。エリスロマイシン、ＦＫ−５０６、ＦＫ−５２０、メガロミシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン、ラパマイシン、スピノシン、およびタイロシンは、このような化合物の例である。伝統的化学方法論によるポリケチド化合物の生成は困難であり、そして一般的に野生型細胞におけるポリケチド生成が低い場合、ここにポリケチド化合物を生成するための改良手段または代替手段を見出す重要な目的がある。ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９３／１３６６３；同ＷＯ　９５／０８５４８；同ＷＯ　９６／４０９６８；同ＷＯ　９７／０２３５８；および同ＷＯ　９８／２７２０３；米国特許第４、８７４、７４８号；同第５、０６３、１５５号；同第５、０９８、８３７号；同第５、１４９、６３９号；同第５、６７２、４９１号；および同第５、７１２、１４６号；Ｆｕら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３３：９３２１〜９３２６；ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：１５４６〜１５５０；およびＲｏｈｒ、１９９５、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４（８）：８８１〜８８８参照のこと。これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【０００４】
ポリケチドは、本来、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素により、合成される。これら酵素は、複数の巨大タンパク質の複合体であり、脂肪酸の生合成において２つの炭素の単位の縮合を触媒するシンターゼと類似する。ＰＫＳ酵素は、一般的には３以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなるＰＫＳ遺伝子によりコードされている。主な２つのＫＳ酵素の型が公知であり、これら２つの違いは、これらの組成および合成の様式にある。これら２つの主なＰＫＳ酵素の型は、一般的に、Ｉ型または「モジュラー」ならびにＩＩ型「反復性」ＰＫＳ酵素といわれる。
【０００５】
モジュラーＰＫＳは、非常に多くの１２、１４、１６員環のマクロライド系抗生物質の生成に寄与し、このようなマクロライド系抗生物質として、エリスロマイシン、メガロミシン、メチマイシン、ナルボマイシン、オレアンドマイシン、ピクロマイシン、およびタイロシンが挙げられる。モジュラーＰＫＳのいずれのＯＲＦも１、２、またはそれ以上のケトシンターゼ活性「モジュール」を含み得、これらのいずれのモジュールも少なくとも２つ（ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）モジュールである場合）、より代表的には３つ（最も単純なエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）モジュール）、または３を超える酵素活性または「ドメイン」からなる。これらの大きな多機能酵素（＞３００、０００ｋＤａ）は、種々のβ−炭素プロセシング活性のサイクル、アシルチオエステル間の脱炭素縮合を包含する多工程の経路継いで、ポリケチドマクロライドの生合成を触媒する（本明細書中で参考として援用される、Ｏ’Ｈａｇａｎ、Ｄ．Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ；Ｅ．Ｈｏｒｗｏｏｄ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと）。
【０００６】
過去５年間、モジュラーＰＫＳ機能および特異性の研究は、６−デオキシエリスロノライドＢ（６−ｄＥＢ）シンターゼ（ＤＥＢＳ）遺伝子に伴って発展したプラスミドに基くＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ発現システムにより非常に容易になった（各々が本明細書中で参考として援用される、Ｋａｏら、１９９４、Ｓｉｅｎｃｅ、２６５：５０９〜５１２、ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９３、Ｓｉｅｎｃｅ　２６２：１５４６〜１５５７、および米国特許第５、６７２、４９１号および同第５、７１２、１４６号を参照のこと）。このプラスミドに基くＤＥＢＳのための遺伝子的システムの利点は、天然のＤＥＢＳ宿主生物を操作するための面倒で限定される技術が克服されていることである。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａは、「クリーンな」宿主背景を提供することにより、組換えＰＫＳの生成をより容易にし、ＰＫＳ分析の複雑さを軽減することを可能にする。このシステムは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける第１の組み合わせのモジュラーポリケチドライブラリー作製を促進した（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公開番号　ＷＯ　９８／４９３１５を参照のこと）。
【０００７】
ＰＫＳの遺伝子操作によるポリケチド生合成の局面（モノマー選択およびβ−炭素プロセシングの程度など）を制御する能力は、新規の抗生物質の組み合わせ技術への大きな興味を刺激してきた（各々が本明細書中で参考として援用される、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｌ：３１９〜３２９；ＣａｒｒｅｒａｓおよびＳａｎｔｉ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：４０３〜４１１；および米国特許第５，７１２，１４６号および同第５，６７２，４９１号を参照のこと）。この興味はＰＫＳ酵素をコードする遺伝子の組換えＤＮＡ技術によるクローニング、分析および操作をもたらした。この得られた技術は、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターを操作することを可能にして、自然にまたはそうでなければポリケチドを生成しない宿主のいずれかにおいて生じるより高いレベルで、このＰＫＳによって合成されたポリケチド生成させる。この技術は、既知のＰＫＳ遺伝子クラスターから生成されるポリケチドと構造的に関連するが、このポリケチドとは異なる生成も可能にする。
【０００８】
メガロミシンは、生物学的に活性な化合物の多くの型を生成する土壌細菌である放線菌目ファミリーの一種であるＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにより生成されるマクロライド系抗生物質である。メガロミシンはエリスロマイシンＡの配糖体であり、広く使用される抗マラリア活性がほとんどない、もしくは抗マラリア活性のない抗菌薬物である。メガロミシンはエリスロマイシンの抗菌特性に類似の抗菌特性を有し、１９９８年に、メガロミシンが強力な駆虫活性および低い毒性を有することもまた見出された。メガロミシンの駆虫活性は、真核生物におけるタンパク質輸送に対するメガロミシンが有する効果と関係し得、ここでメガロミシンはゴルジ内外の小胞輸送を阻害すると考えられ、その結果タンパク質の不十分なシアリル化が起こる。故に、メガロミシンは現在使用されている薬物と異なる作用機構を有する駆虫性薬物の新しいクラスを発展する刺激ある機会を提供し、従って、おそらくＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの薬物耐性型に対して活性である。
【０００９】
メガロミシン誘導体の数および多様性は、以前に組換え形態において利用可能でなかったＰＫＳ遺伝子の操作が不可能であったことに起因して、限定されてきた。メガロミシンの生合成遺伝子の迅速な操作を可能にする遺伝子システムは、薬学的、農学的、および獣医学的な適用のための新規な化合物を作製するために有用である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓおよび他の宿主細胞におけるメガロミシン生合成遺伝子の非相同的な発現が可能である場合に、このような化合物の生成はより迅速に達成され得た。本発明は、これらおよび他の必要性に合致する。
（発明の要旨）
本発明は、組換え宿主細胞において、メガロミシン生合成遺伝子のすべて、または一部に由来するＰＫＳ酵素およびポリケチド改変酵素を発現するための組換え方法および材料を提供する。本発明はまた、このようなＰＫＳ酵素により生成されたポリケチドも提供する。本発明は、組換え形態で、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにおいてメガロミシンの生成を最終的に生じる完全なＰＫＳを構成するタンパク質に対する遺伝子のすべてを提供する。従って、１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのドメイン、モジュール、またはメガロミシンＰＫＳ遺伝子によりコードされたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組換え材料に向けられる。本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明のＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳのローディングモジュールおよびエクステンダーモジュール１〜６のドメインの少なくとも１つ、好ましくは２以上を包含するコード配列を含む。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、１以上のメガロミシン生合成遺伝子の発現を推進するように配置された非相同性プロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。好ましい実施形態において、このプロモーターは、別のＰＫＳ遺伝子由来である、関連した実施形態において、本発明は、メガロミシンまたはメガロミシン誘導体または前駆体を生成する１以上の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒである。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、メガロミシンＰＫＳのすべてまたは一部、および第２のＰＫＳの少なくとも一部分を含むハイブリッドＰＫＳの発現を推進するように配置されたプロモーターを含む組換えの発現ベクターを提供する。関連する実施形態において、本発明は、ハイブリッドＰＫＳおよびその対応するポリケチドを生成するベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒである。
【００１２】
関連する実施形態において、本発明は、ポリケチドのライブラリーを作製するための組換え材料を提供し、ここで、ライブラリーのポリケチドメンバーは、本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素により合成される。得られたポリケチドは、代表的には、ヒドロキシル化および／またはグリコシル化により、さらに改変され、他の有用な化合物（例えば、抗生物質、モチリド、および駆虫剤など）に変換され得る。本発明により提供された駆虫剤の調製における有用な中間体である改変されたマクロライドは、特に有利である。
【００１３】
他の関連した実施形態において、本発明は、改変されたＰＫＳをコードする核酸を調製するための方法を提供する。この方法は、骨格としてメガロミシンＰＫＳをコードする配列を使用する工程、および変異誘発、不活化、欠失、挿入、または置換のいずれかにより、酵素活性をコードする核酸配列一部分を改変する工程、を包含する。従って、メガロミシンＰＫＳをコードする核酸配列は、次いで、適切な細胞において発現され得、この細胞は、メガロミシンＰＫＳにより生成されたポリケチドとは異なるポリケチドを生成するために使用され得る。加えて、メガロミシンＰＫＳをコードする配列の一部は、他のＰＫＳをコードする配列に挿入されて、それらの産物を改変し得る。
【００１４】
別の関連した実施形態において、本発明は、コロニーのライブラリーを構成する多数の細胞コロニーに関し、ここで、それぞれのコロニーのライブラリーは、メガロミシンＰＫＳの全部もしくは一部に由来するモジュラーＰＫＳの生成のための発現ベクターを含む。従って、モジュラーＰＫＳの少なくとも一部分は、メガロミシンを生成するＰＫＳにおいて見出されたものと一致し、そのようなものとして識別可能である。誘導化された部分は、合成的に、またはメガロミシンを生成する生物体由来のＤＮＡから直接的に調製し得る。加えて、本発明は、生成したポリケチドおよび抗生物質ライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、新規なポリケチド、モチライド、抗生物質、駆虫剤、およびそれらから誘導される他の有用な化合物も提供する。本発明の化合物はまた、別の化合物の製造にも使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、動物またはヒトに投与するための混合物または溶液として処方され得る。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、メガロミシンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはメガロミシン改変酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸フラグメントを提供する。単離された核酸フラグメントはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、単離された核酸フラグメントは組換えＤＮＡ化合物である。
【００１７】
単離された核酸フラグメントは、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素の１つの、複数の、または全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。メガロミシンＰＫＳの例示的なＯＲＦとしては、ｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、およびｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子のＯＲＦが挙げられる。単離された核酸フラグメントはまた、メガロミシンＰＫＳのドメインの１つ、複数、または全てをもコードし得る。メガロミシンＰＫＳの例示的なドメインとしては、ＴＥドメイン、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインが挙げられる。好ましい実施形態において、核酸フラグメントはメガロミシンＰＫＳのモジュールをコードする。別の好ましい実施形態において、核酸フラグメントは、メガロミシンＰＫＳのローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、および６つすべてのエクステンダーモジュールをコードする。
【００１８】
メガロミシン改変酵素は、６−ｄＥＢのメガロミシン酵素への転換に関連する酵素（例えば、ｍｅｇＦ、ｍｅｇＢＶ、ｍｅｇＣＩＩＩ、ｍｅｇＫ、ｍｅｇＤＩ、およびｍｅｇＧ（ｍｅｇＹに改名された）遺伝子によりコードされる酵素など）を含む。メガロミシン改変酵素はまた、ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンの生合成に含まれるこれらの酵素をも含み、ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンは、種々のメガロミシン種および他の関連したポリケチドの生合成において、生合成中間体として使用される。ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンの生合成に関連する酵素は、図５および図１０に示される。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸に、低い、中程度または高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする単離された核酸フラグメントを提供する。より好ましくは、核酸フラグメントは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、または配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する核酸からなることか、または、これらから実質的になる。
【００２０】
別の特定の実施形態において、本発明は、実質的に精製されたポリペプチドを提供し、そのポリペプチドは、メガロミシンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはメガロミシン改変酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントによりコードされる。ポリペプチドメイン、複数のドメイン、あるいは、全長メガロミシンＰＫＳまたは全長メガロミシン改変酵素を含み得る。メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素ポリペプチドの機能的なフラグメント、アナログまたは誘導体もまた提供される。好ましくは、このようなフラグメント、アナログまたは誘導体はメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素に対して惹起された抗体により認識され得る。好ましくはまた、このようなフラグメント、アナログまたは誘導体は、これらの野生型の対応物と少なくとも６０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２１】
また、特定の別の実施形態において、本発明は、抗体、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を提供し、これらはメガロミシンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはメガロミシン改変酵素のドメインに免疫特異的に結合する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体もしくは抗体フラグメントであり得る。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり得る。
【００２２】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、少なくともメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素のドメインをコードする組換えＤＮＡ化合物を含む組換えＤＮＡ発現ベクターを提供し、ここで上記ドメインは、プロモーターと作動可能に連結される。好ましくは、組換えＤＮＡ発現ベクターは、複製起点または染色体組込みを可能にするＤＮＡセグメントをさらに含む。
【００２３】
特定のなお別の実施例において、本発明は、少なくともメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素のドメインをコードする、上記の組換えＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含む任意の適切な宿主細胞であり得る。好ましくは組換え宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ細胞などのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ細胞などのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ細胞であり得る。また好ましくは、これらの形質転換されていない、非組換え状態において、組換え宿主細胞は、メガロミシンを生成しない。
【００２４】
組換え宿主細胞が、１を超えるメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変体酵素、あるいはそれらのドメインをコードする核酸を含む場合、このような核酸物質は単一の遺伝子座（例えば、単一プラスミド上、または単一染色体座、または異なる遺伝子座における（例えば、分離したプラスミドおよび／または染色体座上））に位置され得る。１つの例において、本発明は、少なくとも２つの別個の自己複製する組換えＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供し、そして前記いずれのベクターもプロモーターと作動可能に連結したメガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン改変酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む。別の例において、本発明は、少なくとも１つの自己複製するＤＮＡ発現ベクターおよび少なくとも１つの改変染色体を含む組換え宿主細胞を提供する。上記いずれのベクターも、そして上記いずれの改変染色体も、プロモーターと作動可能に連結したメガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン改変酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む。好ましくは、自己複製する組換えＤＮＡ発現ベクターおよび／または改変染色体は、別個の選択マーカーをさらに含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、細胞は、異なる３つのベクターを含み、それらのうち１つは染色体に組み込まれ、それらのうち２つは自己複製し、そしていずれのベクターもｍｅｇＰＫＳ遺伝子を含む。必要に応じて、ｍｅｇＰＫＳ遺伝子のうちの１以上は、例えば、別のＰＫＳ由来のドメインを有するｍｅｇＰＫＳドメインの欠失または置換などのような１つ以上のドメイン変更を含む。
【００２６】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、メガロミシン以外のポリケチドのためのメガロミシンＰＫＳ遺伝子の少なくとも一部および第二のＰＫＳ遺伝子の少なくとも一部を含む組換え遺伝子から生成されるハイブリッドＰＫＳを提供する。例えば、第二のＰＫＳ遺伝子は、ナルボノライド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ遺伝子、オレアンドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ遺伝子、またはラパマイシンＰＫＳ遺伝子であり得るが、限定ではない。１つの実施形態において、ハイブリッドＰＫＳは、ローディングモジュールおよび６つのエクステンダーモジュールより構成され、ここで、エクステンダーモジュール１〜６のいずれか１つ、少なくとも１つのドメインは、包括的にメガロミシンＰＫＳのエクステンダーモジュールのドメインである。好ましい別の実施形態において、ハイブリッドＰＫＳは、モジュール１における非機能性ＫＳドメインを有するメガロミシンＰＫＳを含む。
【００２７】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、ポリケチドを生成する方法を提供する。この方法は、少なくともメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン改変酵素のドメインをコードする組換えＤＮＡ発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、組換え発現ベクターに含まれるメガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン改変酵素が生成され、そして細胞によりポリケチドが合成される条件下で、増殖する工程、および合成されたポリケチドを回収する工程を包含する。好ましくは、組換え宿主細胞は、ｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、またはｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子の少なくとも一部をコードする組換え発現ベクターを含む。
【００２８】
本発明のこれらの、そして他の実施形態は、以下の説明、実施例、上記の特許請求の範囲に詳細に記載される。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、組換え宿主細胞においてポリケチドを生成するための有用な化合物および方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語組換えは、人の介入により生成される化合物または組成物をいう。本発明は、メガロミシン生合成遺伝子の全てまたは一部をコードする組換えＤＮＡ化合物を提供する。本発明は、組換え宿主細胞においてメガロミシンＰＫＳおよびメガロミシンＰＫＳの一部からなるハイブリッドＰＫＳを生成するのに有用な組換え発現ベクターを提供する。本発明はまた、組換えＰＫＳおよびポリケチド改変酵素により生成されるポリケチドを提供する。
【００３０】
本発明の多くのそして多様な利点および応用を確かめるため、本発明の以下の説明は、次のように整理される。第Ｉ節において、本出願全体で使用される共通の定義を提供する。第ＩＩ節において、メガロミシンの構造的および機能的な特徴が記載される。第ＩＩＩ節において、本発明で提供された、組換えメガロミシン生合成遺伝子および他の組換え核酸が記載される。第ＩＶ節において、メガロミシン生合成遺伝子によりコードされたポリペプチドおよびタンパク質、ならびに本発明で提供されるこのようなポリペプチドおよびタンパク質に特異的に結合する抗体が記載される。第Ｖ節において、本発明で提供されるメガロミシン生合成遺伝子の非相同的な発現のための方法が記載される。第ＶＩ節において、本発明で提供されるハイブリッドＰＫＳ遺伝子が、記載される。第ＶＩＩ節において、複数のメガロミシン生合成遺伝子を含む宿主細胞および本発明で提供される別個の発現ベクター上の核酸フラグメントが記載される。第ＶＩＩＩ節において、本発明で提供されるポリケチド化合物およびポリケチド化合物の薬学的組成物が記載される。詳細な説明に次いで本発明を例証する実用的な実施例が記載される。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的そして科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。すべての特許、出願、公開された出願および他の出版物ならびに本明細書中で参照されるＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列は、その全体が参考として援用される。
（第Ｉ節．定義）
本明細書中で使用される場合、ドメインは分子（例えば、タンパク質または核酸）の一部分をいう。この分子の一部は、分子の別の一部分とは、構造的におよび／または機能的に異なる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、抗体は、軽鎖および重鎖の可変領域からなる、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントを含む。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、生物学的活性とは、化合物、組成物または他の混合物のインビボでの投与の結果生じる化合物のインビボでの活性または生理学的応答をいう。従って、生物学的活性は、このような化合物、組成物、および混合物の治療効果および薬学的活性を含む。生物学的活性は、このような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で見られ得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、組み合わせとは、２つ以上の項目間の任意の集合をいう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、組成物とは、任意の混合物をいう。それは、溶液、懸濁液、液体状、粉末状、ペースト状、水性、非水性またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、分子の誘導体またはアナログとは、分子から誘導された部分、または分子の改変型をいう。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、作動可能に連結した、作動的に結合した、作動的に結合したとは、ＤＮＡとヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列（例えば、そのようなヌクレオチドとして、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位、および翻訳停止部位、および他のシグナル配列）との機能的な関係をいう。例えば、プロモーターのＤＮＡの作動的な連結とは、このようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、ＤＮＡに結合し、そしてＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーター間の物理的および機能的関係をいう。発現および／またはインビトロでの転写を最適化するため、クローンの５’非翻訳部分を除去、付加または改変して転写または翻訳の両方のレベルのいずれかで発現を妨害または減少させ得る余分な潜在的に不適切な代替の翻訳開始（すなわち、スタート）コドンまたは他の配列を排除することが結うようであり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．、２６６：１９８６７〜１９８７０（１９９１）を参照のこと）は、開始コドンの５’近傍に挿入され得、そして発現を増加させ得る。このような改変の望ましさ（または必要性）は経験的に決定され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、結合体の薬学的に受容可能な塩、エステルまたは他の誘導体は、任意の塩、エステルまたは誘導体を含み、これらはこのような誘導体化のための公知の方法を使用して、当業者に容易に調製され得、そして動物またはヒトに実質的に有毒な影響なしに投与され得る化合物を生成し、そして薬学的に活性であるかまたはプロドラッグであるかのいずれかである。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、プロモーター領域またはプロモーターエレメントとは、プロモーター領域またはプロモーターエレメントが作動可能に連結したＤＮＡまたはＲＮＡの転写を制御するＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントをいう。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分はプロモーターとして参照される。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合、および翻訳開始活性を調節する配列を含む。これらの配列は、ｃｉｓ作用であり得、またはｔｒａｎｓ作用因子応答性であり得る。調節の性質に依存してプロモーターは、構成的であり得、または調節され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合：ミスマッチのパーセンテージを決定する際のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、以下のとおりである：（１）高いストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳ、６５℃；（２）中程度のストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃；および（３）低いストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳ、５０℃。同等のストリンジェンシーは、代替の緩衝液、塩および温度を使用することで達せられ得る。
【００４１】
実質的に同一または相同的もしくは類似のという用語は、関連分野の当業者により理解される状況により変化し、そして一般的には、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、産物と実質的に同一とは、目的の性質が、十分に変わらないため、実質的に同一な産物は、その産物と置き換えて使用し得るくらい十分に類似することを意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、単離されたとは、物質が、自然の状態もしくは天然に存在するより高い濃度で調製物中に存在すること、または物質が、自然の状態では会合しない物質を含有する他の物質を含む調製物中に存在することのいずれかを意味する。後者の例として、単離されたｍｅｇＰＫＳタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞において発現されたｍｅｇＰＫＳタンパク質を含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、実質的に純粋なとは、標準的な分析方法で定量されるほど容易に検出できる不純物がない程度に十分に均一であることを意味する。当業者によって使用される標準的な方法として、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられ、これらの方法は、物質のこのような純度、またはさらなる精製が、物質の酵素的、生物学的活性などの物理的および化学的性質を検出可能に変化しない程度に十分に純粋であることを評価するために使用される。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体または異性体の混合物であり得る。そのような例においては、さらなる精製が、化合物の特定の活性を増加し得る。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ベクターまたはプラスミドとは、異種のＤＮＡをそれらの発現または複製のいずれかのために細胞に導入するために使用される別個のエレメントをいう。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者には周知である。ＤＮＡを発現することが可能なベクターを含む発現ベクターは、プロモーター領域などの調節配列に作動可能的に連結し、このようなＤＮＡフラグメントの発現に影響し得る。従って、発現ベクターとは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適切な宿主細胞に導入されている他のベクター）をいい、適切な宿主細胞の導入の際にクローン化したＤＮＡの発現を生じる。適切な発現ベクターが当業者に周知であり、例えば、原核生物細胞および／または真核生物細胞において複製可能な発現ベクター、およびエピソームのままである発現ベクターまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現ベクターが挙げられる。
【００４６】
（第ＩＩ節．メガロミシン）
メガロミシンは、１９６９年にＳｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ．において、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにより生成される抗菌剤として発見された（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９６９、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　２２：２５３〜２５８、および米国特許第３、６３２、７５０号を参照のこと。両者は本明細書中で参考として援用される）。最初の構造的配置は間違いであったが、メガロミシンＡ誘導体のＸ線結晶構造とを組み合わせたＮＭＲデータの徹底的な再評価により図３に示すメガロミシンＡの構造が、確立された（本明細書中で参考として援用される、ＮａｋａｇａｗａおよびＯｍｕｒａ、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓ．Ｏｍｕｒａ編集）の「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８４を参照のこと）。メガロミシンは、Ｃ３の位置でミカロース糖の３’’’または４’’’水酸基においてエステル化されたアセチルまたはプロピオニル基を有するエリスロマイシンＣの６−Ｏ−配糖体である。Ｃ６の糖が「メゴサミン」と名づけられてきたが、その５〜１０年前は、一般的にアントラサイクリン抗癌薬物中に存在する、Ｌ−ロドサミンまたはＮ−ジメチルダウノサミン、デオキシアミノ糖として同定されてきた。メガロミシンの抗菌能、活性の範囲（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、および毒性（皮下または経口での急性ＬＤ５０は７〜７．５ｇ／ｋｇ；亜急性は、ＬＤ５０＞５００ｍｇ／ｋｇ）は、エリスロマイシンＡのそれと類似する。
【００４７】
メガロミシンは生物学的活性の２つの形式を有する。抗菌剤として、メガロミシンはエリスロマイシンと同様に作用し、細菌性５０ＳリボゾームＲＮＡに選択的に結合することによってトランスロケーション工程におけるタンパク質の合成を阻害する。メガロミシンはまた、原核細胞でのタンパク質輸送にも影響する（本明細書中で参考として援用される、Ｂｏｎａｙら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７ｌ：３７１９〜３７２６を参照のこと）。作用機構は完全に明らかではないが、中間部ゴルジとトランスゴルジとの間の小胞輸送の阻害を含み、タンパク質の不充分なシアル化が起こると考えられる。メガロミシンはまた、インビボでのリソソームのＡＴＰ依存性の酸性化を強く阻害し（本明細書中で参考として援用される、Ｂｏｎａｙら、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１０：１８３９〜１８４９を参照のこと）、そしてウイルス性タンパク質の異常な糖化を引き起こし、このことがメガロミシンのヘルペスに対する抗ウイルス活性に寄与し得る（Ｔｏｘ５０、７０〜１００μＭ；Ａｌａｒｃｏｎら、１９８４、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．４：２３１〜２４３、およびＡｌａｒｃｏｎら、１９８８、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２３１：２０７〜２１１を参照のこと。両者は、本明細書中で参考として援用される）。
【００４８】
メガロミシンは、目立って強力な駆虫剤であり、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに感染した赤血球の細胞内複製をブロックする際に１μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示す（本明細書中で参考として援用される、Ｂｏｎａｙら、１９９８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２６６８〜２６７３を参照のこと）。メガロミシンは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉおよびＴ．ｂｒｕｃｅｉ（ＩＣ５０、０．２〜２μｇ／ｍｌ）ならびにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｄｏｎｏｖａｎｉおよびＬ．ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ（ＩＣ５０、それぞれ３および８μｇ／ｍｌ）に対して有効である。メガロミシンはまた、細胞内複製的な無鞭毛型Ｔ．ｃｒｕｓｉ対して活性であり、５μｇ／ｍｌの用量で感染したマウスＬＬＣ／ＭＫ２マクロファージにおけるその複製を完全に阻害する。重要なことは、有効な薬物の濃度が、哺乳動物における急性ＬＤ５０より５００倍低く、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ感染に対し完全に治癒力のある用量（５０ｍｇ／ｋｇ）でＢＡＬＢ／ｃマウスへの毒性がない。Ｐ．ｖｉｖａｘおよびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍにより引き起こされるマラリア症に対し、アジスロマイシン（図３）が、急性処置および予防処置に有効であると報告されてきた（本明細書中で参考として援用される、Ｔａｙｌｏｒら、１９９９、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：７４〜８１を参照のこと）が、エリスロマイシンにはこのような活性がないため、メガロミシンの駆虫性作用は、独特であり、おそらくＣ６にデオキシアミノ糖メゴサミンが存在する（図３）ことに関連する。従って、メガロミシンは、高い治療指数を有する有力なマラリア症薬物として開発され得、そして現在使用されているクラスの抗マラリア症剤に耐性のあるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび他の種に対し活性であり得る。これらはまた、レーシュマニア症、トリパノソーマ症、およびシャーガス病に対して強力な駆虫剤をもたらし得る。エリスロマイシンの広範な使用、およびエリスロマイシンの良好な経口利用性ならびに一般的に低いマクロライドの哺乳動物毒性を考慮すると、メガロミシンは、マラリアに抗するために予防的に使用され得、そしてメガロミシンは発酵生成物として比較的低価格で生成されるべきである。
【００４９】
メガロミシンは、そのメンバーが多様な構造的および薬理学的特性を有する天然の産物のポリケチドクラスに属する（ＭｏｎａｇｈａｎおよびＴｋａｃｚ、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２７１を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）。メガロミシンは、酢酸、プロピオン酸、および酪酸のような小有機酸に由来する活性化補酵素−Ａチオエステルモノマーの連続的な縮合を介してポリケチド合成酵素によってアセンブリされる。縮合に必要とされる活性部位は、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、およびβ−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）を含む。各縮合サイクルは、一連のプロセシング活性の全て、いくつかを受ける、または全く受けないβ−ケト基を生じる。これらの反応を行う活性部位は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、およびエノイルレダクターゼ（ＥＲ）を含む。従って、任意のβ−ケトプロセシングドメインの非存在は、ケトンの存在を生じ、ＫＲ単独はヒドロキシルを生じ、ＫＲおよびＤＨはアルケンを生じるが、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲの組み合わせは、アルカンへの完全な還元に導く。ポリケチド鎖のアセンブリ後、分子は典型的に、環化およびＰＫＳ後修飾（例えば、グリコシル化、酸化、アシル化）を受けて最終的な活性化合物を達成する。
【００５０】
エリスロマイシンおよびメガロミシンのようなマクロライドは、モジュラーＰＫＳによって合成される（Ｃａｎｅら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：６３を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）。説明的な目的のために、エリスロマイシンポリケチドを生成するＰＫＳ（６−デオキシエリスロノライドＢシンターゼまたはＤＥＢＳ；米国特許第５，８２４，５１３号を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）が図４において示される。ＤＥＢＳは最も特徴付けられおよび広範に使用されるモジュラーＰＫＳ系である。ＤＥＢＳは特に、これが、メガロミシンＰＫＳによって合成される、同じポリケチドの、６−デオキシエリスロノライドＢ（６−ｄＥＢ）を合成する点において、本発明に関連する。ＤＥＢＳおよびメガロミシンＰＫＳのようなモジュラーＰＫＳ酵素において、縮合および還元の各ラウンドについての酵素的工程は、ポリペプチドの単一の「モジュール」（すなわち、全ての縮合サイクルについて１つの異なる分子）内にコードされる。ＤＥＢＳは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ、およびｅｒｙＡＩＩＩと称される）によってコードされる３つの極めて大きなポリペプチド内のローディングモジュールおよび６つのエクステンダー分子および鎖終結チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインからなる。
【００５１】
ＤＥＢＳの３つのポリペプチドサブユニットのそれぞれ（ＤＥＢＳＩ、ＤＥＢＳＩＩ，およびＤＥＢＳＩＩＩ）は２つのエクステンダーモジュールを含み、ＤＥＢＳＩはさらにローディングモジュールを含む。集合的に、これらのタンパク質は１つのプロピオニルＣｏＡスターター単位および６つのメチルマロニルＣｏＡエクステンダー単位の縮合および適切な還元を触媒する。モジュール１、２、５、および６はＫＲドメインを含み；モジュール４は還元およびデヒドロゲナーゼドメインの完全なセット（ＫＲ／ＤＨ／ＥＲ）を含み；ならびにモジュール３は、機能的な還元ドメインを含まない。縮合および適切な脱水および還元反応に続いて、酵素が結合される中間体は、エクステンダーモジュール６の末端でＴＥによってラクトン化されて６−ｄＥＢを形成する。
【００５２】
より詳細には、ＤＥＢＳのローディングモジュールは２つのドメイン、アシル−トランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインからなる。他のＰＫＳ酵素において、ローディングモジュールは、ＡＴおよびＡＣＰから構成されないが、代わりに不活性化ＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰを利用する。この不活性化ＫＳはたいていの場合において、ＫＳＱと呼ばれ、ここでは上付き文字は、活性に必要とされる活性部位システインの代わりに存在するアミノ酸グルタミンについての略記である。ローディングモジュールのＡＴドメインは特定のアシル−ＣｏＡ（ＤＥＢＳについてプロピオニル、これはまたアセチルを受容し得る）を認識し、そしてこれをチオールエステルとしてローディングモジュールのＡＣＰに移行する。同時に、エクステンダーモジュールのそれぞれにおけるＡＴは特定のエクステンダー−ＣｏＡ（ＤＥＢＳについてメチルマロニル）を認識し、そしてこれをそのモジュールのＡＣＰに移行して、チオエステルを形成する。一旦ＰＫＳがアシル−およびマロニル−ＡＣＰでプライムされると、ローディングモジュールのアシル基は移動して、第一のエクステンダーモジュールのＫＳにてチオールエステルを形成し（トランス−エステル化）；この段階で、エクステンダーモジュールＩはアシル−ＫＳおよびメチルマロニルＡＣＰを保有する。次いでローディングモジュールに由来するアシル基は、マロニル基のα−炭素に共有結合的に付着して炭素−炭素結合を形成して、同時の脱カルボキシル化によって駆動され、そしてローディング単位よりも２炭素長い骨格を有する新しいアシル−ＡＣＰを作製する（伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）あるいは伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））。大きくなるポリケチド鎖は、ＡＣＰから次の分子のＫＳに転移され、プロセスは継続する。
【００５３】
ポリケチド鎖は、各モジュールで２炭素増え、アセンブリライン様プロセスにおいて、共有結合されたチオールエステルとして、モジュール間を連続的に通過する。このプロセス単独によって生成される炭素鎖は、一炭素原子おき毎にケトンを保有し、ポリケトンを生成し、これからポリケチドの名称が生じる。しかし、一般に、各２炭素単位のβケト基はこれが増加するポリケチド鎖に添加された直後であるが、これが、ＫＲ、ＫＲ＋ＤＨ、またはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲのいずれかによって次のモジュールに転移される前に修飾される。上記のように、モジュールはまた、さらなる酵素学的活性を含み得る。
【００５４】
一旦ポリケチド鎖がＰＫＳの最終的なエクステンダーモジュールをトラバースすると、これはほとんどのＰＫＳのカルボキシル末端で見出される放出化ドメインまたはチオエステラーゼを遭遇する。ここでは、ポリケトンは酵素から切断され、および環化される。得られるポリケチドは酵素を改変することによってまたは修飾酵素によってさらに修飾され得；これらの酵素はポリケチドコア分子に対して、炭化水素基またはメチル基を付加するか、または他の修飾、すなわち酸化もしくは還元をなす。例えば、エリスロマイシンＡへの６−ｄＥＢの変換における最終工程は、図５において示されるように、Ｃ−６ヒドロキシル化、ミカロースおよびデソサミン糖の付着、Ｃ−１２ヒドロキシル化（これはエリスロマイシンＣを生成する）、およびＯ−メチル化を介するクラジノースへのミカロースの変換のような、多くの修飾酵素の作用を包含する。
【００５５】
ＰＫＳおよびＰＫＳ後修飾酵素のこの概説を伴って、以下の節において記載されるように本発明によって提供される組換えメガロミシン生合成遺伝子およびその機能をより良好に理解し得る。
【００５６】
（第ＩＩＩ節：メガロミシン生合成遺伝子および核酸フラグメント）
メガロミシンＰＫＳは、以下の手順によって単離およびクローン化された。ゲノムＤＮＡが、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ　ｓｕｂｓｐ．ｎｉｇｒａ（ＡＴＣＣ２７５９８）のメガロミシン産生株から単離され、制限酵素で部分消化され、そして市販のコスミドベクターにクローン化してゲノムライブラリーを生成した。次いで、このライブラリーはエリスロマイシン生合成遺伝子から、およびエリスロマイシン生合成遺伝子に相同な配列を含有するとして同定されたコスミドから作製されたプローブでプローブされた。このプロービングは、あるセットのコスミドを同定し、これはＤＮＡ配列解析および制限酵素消化によって分析されて、所望されるＤＮＡが単離されたこと、および完全なＰＫＳ遺伝子クラスターが同定された４つのコスミド上の重複するセグメント中に含まれたことを示した。図１は、コスミド、およびコスミドの挿入ＤＮＡにおけるメガロミシン生合成遺伝子クラスターの一部分を示す。図１は、完全なメガロミシン生合成遺伝子クラスターが、コスミドのｐＫＯＳ０７９−１３８Ｂ、ｐＫＯＳ０７９−１２４Ｂ、ｐＫＯＳ０７９−９３Ｄ、およびｐＫＯＳ０７９−９３Ａの挿入ＤＮＡ内に含まれることを示す。これらのコスミドのそれぞれは、ブダペスト条約の約定に従ってアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された（コスミドｐＫＯＳ０７９−１３８Ｂは、登録番号ＡＴＣＣ　　　　
の下に入手可能であり；コスミドｐＫＯＳ０７９−１２４Ｂは、登録番号ＡＴＣＣ　　　　の下に入手可能であり；コスミドｐＫＯＳ０７９−９３Ｄは、登録番号ＡＴＣＣ　　　　の下に入手可能であり；およびコスミドｐＫＯＳ０７９−９３Ａは、登録番号ＡＴＣＣ　　　　の下に入手可能である）。本発明の種々のさらなる試薬はこれらのコスミドから単離され得る。ＤＮＡ配列解析はまた、本明細書中で記載されるように、本発明の種々のサブクローンに対して行われた。これらのコスミドおよびコスミドから調製されたサブクローンのさらなる解析は、ＰＫＳをコードするＯＲＦ、これらのＯＲＦによってコードされるモジュール、およびメガロミシン修飾酵素についてのコード配列を含む種々のメガロミシン生合成遺伝子の位置の同定を容易にした。これらの遺伝子およびモジュールの位置は図２において示される。
【００５７】
当業者は、遺伝子コードの縮重の性質に起因して、それらのヌクレオチド配列において異なる多様なＤＮＡ化合物が本発明の所与のアミノ酸配列をコードするために使用され得ることを認識する。メガロミシンＰＫＳおよび他の生合成酵素ならびに、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａの他の生合成酵素をコードするネイティブなＤＮＡ配列は、単に本発明の好ましい実施形態を説明するために本明細書中で示され、そして本発明は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ化合物を包含する。類似の様式において、ポリペプチドは、所望の活性の喪失または有意な喪失を伴わないそのアミノ酸配列における、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を典型的に寛容し得る。本発明は、代替のアミノ酸配列を有するこのようなポリペプチドを包含し、および本明細書中で示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、本発明の好ましい実施形態を説明するにすぎない。
【００５８】
本発明の組換え核酸、タンパク質、およびペプチドは、多種および多様である。本発明、ならびにそれによって提供される多様な化合物および方法を理解することを容易にするために、メガロミシンＰＫＳおよびメガロミシン修飾酵素の種々の領域、ならびに対応するコード配列の以下の記載が提供される。本発明の記載を容易にするために、、本明細書中のＰＫＳ、タンパク質、モジュール、またはドメインへの言及はまた、それらについてのコード配列を含有するＤＮＡ化合物を言及し得、逆もまたそうである。また、他で特定しない限り、異種ＰＫＳへの言及は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ以外の生物体からのそれらについてのコード配列を含有するＰＫＳまたはＤＮＡ化合物を言及する。さらに、ＰＫＳまたはそのコード配列への言及は、その任意の部分への言及を包含する。
【００５９】
従って、本発明は、単離された（すなわち、純粋でないが、豊富なおよび／または濃縮された天然に見出さない調製物中に存在する）、および精製された（すなわち、混入する材料が実質的にないか、または対応するＤＮＡが天然においてともに見いだされれる材料が実質的にない）形態においてＤＮＡ分子を提供する。本発明のＤＮＡ分子は、メガロミシンＰＫＳの１つ以上のＯＲＦにおける１つ以上のモジュールの１つ以上のドメイン（またはこのようなドメインのフラグメント）をコードする１つ以上の配列、およびメガロミシン生合成遺伝子クラスターからのメガロミシン修飾酵素をコードする配列を包含する。ＰＫＳドメインの例としては、メガロミシンＰＫＳ遺伝子クラスターの３つのＯＲＦによってコードされる３つのタンパク質の６つのエクステンダーモジュールおよびローディングモジュールの少なくとも１つの、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ，ＥＲ、ＡＣＰ、およびＴＥドメインを包含する。メガロミシン修飾酵素の例は、ミカロース、デソサミン、およびメゴサミン部分を合成する酵素、それらの糖部分をポリケチド６−ｄＥＢに転移する酵素、Ｃ−６およびＣ−１２でポリケチドをヒドロキシル化する酵素、ならびに糖部分をアシル化する酵素を包含する。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、以下の節においてより詳細に記載されるように、ＤＮＡ分子は組換え発現ベクターまたはプラスミドである。一般に、このようなベクターは宿主細胞の細胞質中で複製し得るか、または宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得るかのいずれかである。いずれの場合においても、ベクターは安定なベクター（すなわち、ベクターは、選択圧のみを伴う場合であっても、多くの細胞分裂にわたって存在し続ける）、または一過性のベクター（すなわち、ベクターは、細胞分裂の数の増加とともに、宿主細胞によって徐々に喪失される）であり得る。
【００６１】
メガロミシンＰＫＳ遺伝子クラスターは、３つのＯＲＦ（ｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、およびｍｅｇＡＩＩＩ）を含む。各ＯＲＦは、ＰＫＳの２つのエクステンダーモジュールをコードし；第１のＯＲＦはまた、ローディングモジュールをコードする。各エクステンダーモジュールは少なくともＫＳ、ＡＴ，およびＡＣＰドメインから構成される。これらのＯＲＦの種々のコード領域の位置は図２において示され、および以下の配列情報に関して記載される。メガロミシンＰＫＳは、図４において示される、６−ｄＥＢとして知られるポリケチドを生成する。メガロミシンを生成する生物体において、６−ｄＥＢは、修飾酵素のセットによってエリスロマイシンＣに変換される。従って、６−ｄＥＢは、ｍｅｇＦ遺伝子産物（ｅｒｙＦ遺伝子産物のホモログ）によってエリスロノライドＢに、次いでｍｅｇＢＶ遺伝子産物（ｅｒｙＢＶ遺伝子産物のホモログ）によって３−α−ミカロシル−エリスロノライドＢに、次いでｍｅｇＣＩＩＩ遺伝子産物（ｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子産物のホモログ）によってエリスロマイシンＤに、次いでｍｅｇＫ遺伝子産物（ｅｒｙＫ遺伝子産物のホモログ）によってエリスロマイシンＣに変換される。
【００６２】
これらの修飾酵素に加えて、このようなメガロミシンを生成する生物体はまた、図５において示されるように、エリスロマイシン生合成において同様に利用されるデソサミンおよびミカロース部分の生合成のために必要な修飾酵素を含む。メガロミシンＡは、完全なエリスロマイシンＣ構造を含み、およびその生合成はさらに、Ｌ−メゴサミン（Ｌ−ロドサミン）の形成、およびそのＣ−６ヒドロキシルへのその付着（図３および５、挿入図）、続いて終結段階としてのＣ−３’’’および（または）Ｃ−４’’’ヒドロキシルのアシル化を包含する。Ｌ−メゴサミンは、Ｎ−ジメチル−Ｌ−ダウノサミンと同じであり；ダウノサミン遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓから特徴付けられた（ＣｏｌｏｍｂｏおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．印刷中；Ｏｔｔｅｎら、１９９６、Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７８：７３１６−７３２１、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）。いくつかのロドサミン遺伝子がクローン化され、そして別のアントラサイクリンを生成するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．から部分的に特徴付けられた（Ｔｏｒｋｋｅｌｌら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６（２）：２０３−２０９を参照のこと）。エリスロノライドＢへのミカロースおよびデソサミンの添加に関連したＴＤＰ−メゴサミンでのグリコシル化、およびＣ−１２ヒドロキシル化の時機が知られていないので、経路は、図５において示される順序とは異なる、グリコシル化およびＣ−１２ヒドロキシル化工程の順序を包含する。それにもかかわらず、メガロミシン生合成遺伝子クラスターは、Ｌ−ロドサミンを作製し、およびこれを正確なマクロライド基質に付着するための遺伝子を含む。
【００６３】
配糖体の、デソサミン、ミカロース、およびメゴサミンを作製するための生合成経路は図６において示される。本発明は、この図において示される各生合成経路についての遺伝子を提供し、およびこれらの組換え遺伝子経路は、単独で、および任意の組み合わせにおいて、異種宿主に経路を付与するために使用され得る。
【００６４】
メガロミシンＰＫＳ遺伝子座は、大きさおよび組成においてｅｒｙＡ遺伝子座に類似する。大部分のデオキシ糖生合成遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａからのｅｒｙＢミカロースおよびｅｒｙＣデソサミン生合成、ならびにグリコシル付着遺伝子のホモログ（Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：３２５１−３２６２；Ｈａｙｄｏｃｋら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１２０−１２８；Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６：２３９−２５１；Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：７８−８８を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）、またはピクロマイシンおよびナルボマイシン産生体からのｐｉｃＣホモログ（ＰＣＴ特許公開第９９／６１５９９号およびＸｕｅら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５、１２１１１−１２１１６を参照のこと、本明細書中に参考として援用される）である。ＴＤＰ−メゴサミン生合成遺伝子は、ｄｎｍ遺伝子（図５を参照のこと）およびピクロマイシンＮ−ジメチルトランスフェラーゼ遺伝子のホモログ、またはＬ−ロドサミン生合成遺伝子において報告されるそのホモログである。推定のＴＤＰ−メゴサミングリコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物（図５における遺伝子Ｘ）は、ｅｒｙＢＶ、ｅｒｙＣＩＩＩ、ｄｎｍＳ、およびピクロマイシンＤｅｓＶＩＩ遺伝子の推定産物に密接に類似するが、それにもかかわらず、これはこれらの遺伝子のそれぞれの産物とは異なる基質を認識する。
【００６５】
以下の表１は、配列番号１において記載されるＤＮＡ配列中の、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａのメガロミシン生合成経路における遺伝子の位置を示す（図７もまた参照のこと；いくつかの遺伝子の名称が図７において異なり得ることに注意のこと）。
【００６６】
【表１】
2004513605.tif 000003
2004513605.tif 000004
特定の実施形態において、本発明は、メガロミシンポリケチド合成酵素またはメガロミシン修飾酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸フラグメントを提供する。単離された核酸フラグメントはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましくは、単離された核酸フラグメントは組換えＤＮＡ化合物である。メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列がまた提供される。
【００６７】
単離された核酸フラグメントは、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素の単一の、複数の、または全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。メガロミシンＰＫＳの例示的なＯＲＦは、ｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、およびｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子を包含する。本発明の単離された核酸はまた、メガロミシンＰＫＳの１つ以上のドメインおよび１つ以上のモジュールをコードする核酸を含む。メガロミシンＰＫＳの例示的なドメインは、ＴＥドメイン、ＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＤＨドメイン、およびＥＲドメインを包含する。好ましい実施形態において、核酸は、メガロミシンＰＫＳのローディングモジュール、チオエステラーゼドメイン、および全ての６つのエクステンダーモジュールについてのコード配列を含む。
【００６８】
メガロミシン修飾酵素は、ｍｅｇＦ、ｍｅｇＢＶ、ｍｅｇＣＩＩＩ、ｍｅｇＫ、ｍｅｇＤＩ、およびｍｅｇＧ（またはｍｅｇＹ）によってコードされる酵素のような、メガロミシンへの６−ＤＥＢの変換に関与するそれらの酵素を包含する。メガロミシン修飾酵素はまた、ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンの生合成に関与するそれらの酵素を包含し、これらは種々のメガロミシン種および他の関連されるポリケチドの生合成において生合成中間体として使用される。ミカロース、メゴサミン、またはデソサミンの生合成に関与する酵素は図５および１０において記載される。メガロミシンＰＫＳおよびメガロミシン修飾酵素は集合的に、メガロミシン生合成酵素として言及され；このような酵素をコードする遺伝子は集合的に、メガロミシン生合成遺伝子として言及され；そしてメガロミシン生合成遺伝子の１部分または全てを含む核酸は集合的にメガロミシン生合成核酸として言及される。
【００６９】
特定の実施形態において、メガロミシン生合成核酸は、配列番号１の配列、またはそのコード領域、または全てもしくは部分においてメガロミシン生合成酵素タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。単離された核酸は典型的に、メガロミシン生合成核酸配列の少なくとも２５（連続的な）ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、もしくは２００ヌクレオチド、また全長のメガロミシン生合成コード配列からなる。別の実施形態において、核酸は、３５、２００、または５００ヌクレオチド長よりも小さい。核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。上述の配列にハイブリダイズするかまたは相補的である核酸、特に上述の配列にハイブリダイズする核酸に対する逆相補体（すなわち、核酸鎖の逆相補体は、鎖の逆方向に走る相補的な配列を有し、それによって逆相補体が核酸鎖に対するミスマッチを伴わずにハイブリダイズする）がまた提供される。特定の局面において、メガロミシン生合成遺伝子の、少なくとも１０、２５、５０、１００、もしくは２００ヌクレオチド、または完全なコード領域に相補的な配列を含む（具体的にはその逆相補体である）核酸が提供される。
【００７０】
本明細書中で提供されるメガロミシン生合成核酸は、ネイティブなメガロミシン生合成酵素タンパク質において見出されるのと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、ならびに機能的に等価なアミノ酸を有するアミノ酸配列、および第ＩＶ節において記載されるようなメガロミシン生合成酵素誘導体またはアナログをコードする核酸を包含する。
【００７１】
メガロミシンＰＫＳ遺伝子のいくつかの領域は、配列の解析によって容易に同定され得るように、互いに高度に相同であるかまたは同一である。モジュール２のＫＳおよびＡＴドメインについてのコード配列は、モジュール６のＫＳおよびＡＴドメインについてのコード配列と有意な同一性を共有する。核酸、例えばＤＮＡ、レベルでのこの配列相同性または同一性は、ある宿主細胞において核酸を不安定にし得る。メガロミシンＰＫＳ遺伝子およびメガロミシン修飾酵素遺伝子の１部分または全てを含む核酸の安定性を改善するために、核酸またはＤＮＡ配列は配列相同性または同一性を減少または回避するように変化され得る。好ましくは、ＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素コード配列内の相同な領域のＤＮＡコドンは、当該変化されたＤＮＡコドンによってコードされるアミノ酸配列を変化することなく、配列相同性または同一性を減少または回避するように変化される（以下の実施例を参照のこと）。核酸またはＤＮＡはまた、アミノ酸配列をまた変化しながら配列相同性または同一性を減少または回避するコドン変化によって改善され得るが、但しアミノ酸配列の変化は、コードされるメガロミシンＰＫＳの所望される活性を実質的に変化しない。従って、例えば、ｍｅｇＡＩＩＩ　ＯＲＦの代わりに、ｅｒｙＡＩＩＩ、ｏｌｅＡＩＩＩ、ｐｉｃＡＩＩＩ、またはｐｉｃＡＩＶ遺伝子からのＯＲＦを単純に用い得る。
【００７２】
メガロミシンＰＫＳおよび修飾タンパク質またはその部分をコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物は、多様な適用において有用である。多くのこれらの適用は、メガロミシン生合成遺伝子の異種発現またはハイブリッドＰＫＳ酵素の構築に関するが、多くの有用な適用は、天然のメガロミシン産生体のＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａを包含する。例えば、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにおける相同組換えによってメガロミシン生合成遺伝子を破壊するために、本発明の組換えＤＮＡ化合物を使用し得る。得られる宿主細胞は、メガロミシンに類似の様式において酸化、ヒドロキシル化、グリコシル化、およびアシル化によって修飾されるポリケチドを作製するために好ましい宿主細胞である。なぜなら、これらの反応を行うタンパク質をコードする遺伝子はもちろん宿主細胞に存在するからであり、およびなぜなら宿主細胞は目的のポリケチドの産生または精製を妨げ得るメガロミシンを産生しないからである。
【００７３】
本発明によって提供される１つの例示的な組換え宿主は、モジュール１ＫＳドメインが欠失または他の変異によって不活性化される組換えメガロミシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ＰＫＳを発現する。好ましい実施形態において、不活性化は、基質に結合し得なくするＫＳドメインにおける変化（ＫＳ１変異と呼ばれる）によって媒介される。特に好ましい実施形態において、この不活性化は、コドンをアラニンコドンのような別のコドンに変化する、活性部位のシステインについてのコドンにおける変異によって与えられる。このような構築物は、メガロミシンのエクステンダーモジュール１および２または別のＰＫＳの対応するモジュールを有する翻訳リーディングフレームに配置される場合に特に有用である。これらの構築物の有用性は、それによってコードされるタンパク質を含むＰＫＳを、発現する宿主細胞、または含有する無細胞抽出物が、目的のポリケチドを調製するために前駆体分子のＮ−アシルシステアミンチオエステルを給餌または供給され得ることである。２０００年１月２７日に出願された米国特許出願第０９／４９２，７７３号およびＰＣＴ特許公報００／４４７１７号を参照のこと、これらの両方は本明細書中に参考として援用される。本発明のこのようなＫＳＩ°構築物は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ宿主細胞における１３置換メガロミシン化合物の生成に有用である。本発明の好ましい化合物としては、１３位での置換体がプロピル、ビニル、プロパルギル、他の低級アルキル、および置換されたアルキルであるそれらの化合物が挙げられる。
【００７４】
本実施形態の変形において、モジュール１のＡＣＰドメインが不活性にされたメガロミシンＰＫＳを用い得る。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳのローディングドメインを欠失し得、そしてＰＫＳの残りの部分によるプロセシングのためにモノケチド基質を提供し得る。
【００７５】
本発明の化合物はまた、本発明の組換え宿主細胞を構築するために使用され得、ここではメガロミシンＰＫＳの１つ以上のドメインもしくはモジュールについての、または別のメガロミシン生合成遺伝子についてのコード配列は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ染色体ＤＮＡとの相同組換えによって欠失されている。当業者は、組換えプロセスにおいて使用される化合物は、染色体ＤＮＡとのそれらの相同性によって特徴付けられ、染色体ＤＮＡの部分を欠失するかそうでなければ変化するそれらの意図される機能に起因して機能的タンパク質をコードすることによって特徴付けられるのではないことを理解する。このおよび多様な他の適用について、本発明の化合物は、機能的タンパク質をコードするＤＮＡ化合物のみでなく、メガロミシン生合成遺伝子の任意の部分に相補的であるかまたは同一であるＤＮＡ化合物もまた包含する。
【００７６】
従って、本発明は、１つ以上のメガロミシン生合成遺伝子が変異されたかまたは破壊された、多様な改変されたＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ宿主細胞を提供する。Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａについての形質転換系は、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：７００４−１１；およびＴａｋａｄａら、１９９４、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：１１６７−１１７０によって記載され、これらの両方は本明細書中に参考として援用される。これらの細胞は特に、破壊された機能を、組換えＤＮＡ発現ベクターによって発現される遺伝子産物で置き換えることが所望される場合に有用である。本発明のこのような発現ベクターは、以下の節においてより詳細に記載されるが、当業者はベクターがＭ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａへの適用も同様に有することを理解する。このようなＭ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ宿主細胞は、本発明のメガロミシン誘導体を発現するために好ましい宿主細胞であり得る。このタイプの特に好ましい宿主細胞は、ローディングモジュールについてのコード配列が変異されたかもしくは破壊された宿主細胞、１つ以上の任意のＰＫＳ遺伝子ＯＲＦが変異されたかもしくは破壊された宿主細胞、および／または１つ以上の修飾（グリコシル化、アシル化、ヒドロキシル化）についての遺伝子が変異されたかもしくは破壊された宿主細胞を包含する。
【００７７】
本発明は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａへの適用を有する多くの有用な化合物、およびＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａに由来する組換え宿主細胞を提供するが、本発明の多くの重要な適用は、第Ｖ節において記載されるように、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ以外の細胞におけるメガロミシン生合成遺伝子の全てまたは一部分の異種発現に関する。
【００７８】
（第ＩＶ節：メガロミシン生合成酵素およびこのような酵素を認識する抗体）
別の特定の実施形態において、本発明は実質的に精製されたポリペプチドを提供し、これはメガロミシンポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）またはメガロミシン修飾酵素のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸フラグメントによってコードされる。ポリペプチドは単一のドメイン、複数のドメイン、または全長のメガロミシンＰＫＳもしくはメガロミシン修飾酵素を含み得る。メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素ポリペプチドの機能的なフラグメント、アナログ、または誘導体がまた、提供される。好ましくは、このようなフラグメント、アナログ、または誘導体はメガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン修飾酵素に対して惹起される抗体を認識し得る。また好ましくは、このようなフラグメント、アナログ、または誘導体は、それらの野生型対応物に対して、少なくとも６０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
メガロミシン生合成酵素をコードする例示的なヌクレオチド配列、およびこの対応するアミノ酸配列は、配列番号１において開示される。相同体（例えば、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ以外の種の上述で列挙される遺伝子の核酸）または他の関連する配列（例えば、パラログ）は、本発明の方法に従って、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングについて当該分野において周知の方法（例えば、第ＩＩＩ節において記載される）を使用して、プローブとして提供される特定の配列の全てまたは一部分との、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって得られ得る。
【００８０】
本発明のメガロミシン生合成酵素タンパク質、またはそのドメインは、本発明の方法に従って、タンパク質精製および組換えタンパク質発現について当該分野において周知の方法によって得られ得る。１つ以上のタンパク質の組換え発現のために、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含有する核酸が、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入され得る。転写および翻訳シグナルは、メガロミシン生合成遺伝子についてのネイティブなプロモーターおよび／または隣接領域によって提供され得る。
【００８１】
多様な宿主−ベクター系がタンパク質コード配列を発現するために利用され得る。これらには、ウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの特性において変化する。利用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適切な転写および翻訳エレメントのいずれかが使用され得る。
【００８２】
特定の実施形態において、メガロミシン生合成酵素、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点、および必要に応じて１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが、使用される。
【００８３】
目的の配列を含有する発現ベクターは、３つの一般的なアプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現によって同定され得る。第１のアプローチにおいて、メガロミシン生合成核酸配列は、挿入された配列に相同なまたは相補的な配列を含むプローブへの核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクターにおける目的の配列の挿入によって引き起こされる特定の「マーカー」機能（例えば、抗−メガロミシン生合成酵素抗体への結合、抗生物質に対する耐性、バキュロウイルスにおける封入体の形成など）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。例えば、メガロミシン生合成遺伝子、またはその一部分が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、メガロミシン生合成遺伝子フラグメントを含有する組換え体はマーカー遺伝子機能の非存在によって同定される。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは組換えベクターによって発現されるメガロミシン生合成遺伝子産物についてアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系において相互作用する種の物理的または機能的な特性、例えば、メガロミシン合成活性、タンパク質に特異的な抗体に対する免疫反応性に基づき得る。
【００８４】
一旦、組換えメガロミシン生合成遺伝子または核酸が同定されると、当該分野において公知のいくつかの方法が、本発明の方法に従ってそれらを増殖するために使用され得る。一旦、適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターは、大量に増殖および増幅され得る。上記のように、使用され得る発現ベクターまたは誘導体としては：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス、酵母ベクター；λファージのようなバクテリオファージベクター；ならびにプラスミドおよびコスミドベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式に発現されるタンパク質を改変もしくはプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下で上昇され得；従って遺伝子操作されたメガロミシン生合成酵素の発現が制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングならびに修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）について特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、外来タンパク質の所望される修飾およびプロセシングが達成されることを確実にするように選択され得る。例えば、細菌系における発現は、グリコシル化されないコアタンパク質を生成するために使用され得、一方、哺乳動物細胞における発現は、異種タンパク質の「ネイティブ」なグリコシル化を確実にする。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度にプロセシング反応を達成し得る。
【００８６】
特に、メガロミシン生合成酵素誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、付加、または欠失によってそれらの配列を変化することにより作製され得る。ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、メガロミシン生合成遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使用され得る。これらには、配列内のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換、従ってサイレントな変化を生成することによって変化されるメガロミシン生合成遺伝子の全てまたは一部分を含むヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、本発明のメガロミシン生合成酵素誘導体としては、一次アミノ酸配列として、メガロミシン生合成酵素のアミノ酸配列の全てまたは一部分を含み、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基に代わって用いられる変化された配列を含み、サイレントな変化を生じる誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得、サイレントな変化を生じる。配列内のアミノ酸についての置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電される（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電される（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００８７】
本発明の特定の実施形態において、少なくとも６つの（連続的な）アミノ酸からなるメガロミシン生合成酵素のドメインまたはフラグメントからなるタンパク質、またはこれを含むタンパク質をコードする核酸が提供される。他の実施形態において、ドメインまたはフラグメントは、メガロミシン生合成酵素の少なくとも１０、２０、３０、４０、または５０アミノ酸からなる。特定の実施形態において、このようなドメインまたはフラグメントは３５、１００、または２００アミノ酸よりも長くない。メガロミシン生合成酵素の誘導体またはアナログは、同一の大きさのアミノ酸配列にわたって少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の同一性の、またはアラインメントが本発明の方法に従って当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによって行われるアラインされた配列に比較される場合の、またはそのコード配列が、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントでない条件下でメガロミシン生合成酵素をコードする配列にハイブリダイズし得る、種々の実施形態において、メガロミシン生合成酵素に実質的に相同である領域を含む分子を包含するが、それらに限定されない。
【００８８】
本発明のメガロミシン生合成酵素のドメイン、誘導体、およびアナログは、本発明の方法に従って当該分野において公知の種々の方法によって生成され得る。それらの生成を生じる操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローン化されたメガロミシン生合成遺伝子配列は、本発明の方法に従って当該分野において公知の任意の多くのストラテジー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によって改変され得る。配列は、適切な部位で制限エンドヌクレアーゼで切断され得、続いて所望される場合、さらに酵素的に修飾され、単離され、そしてインビトロでライゲーションされる。
【００８９】
さらに、メガロミシン生合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、翻訳開始配列および／または翻訳終結配列を作製および／もしくは破壊するために、またはコード領域における改変を作製するために、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するために、もしくは既存の部位を破壊してさらなるインビボ改変を容易にするために、インビトロ、インビボで変異され得る。当該分野において公知の変異誘発のための任意の技術が、本発明の方法に従って使用され得、化学的突然変異誘発およびインビトロ部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１−６５５８（１９７８））、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
一旦メガロミシン生合成酵素タンパク質、またはそのドメイン、フラグメント、もしくは誘導体を発現する組換え細胞が同定されると、個々の遺伝子産物は単離および分析され得る。これは、産物の放射活性標識化、続いてゲル電気泳動による分析、免疫アッセイ、マーカー標識化産物への架橋などを含むがこれに制限されない、タンパク質の物理的および／または機能的特性に基づくアッセイによって達成される。
【００９１】
メガロミシン生合成酵素タンパク質は、カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、限外濾過、逆相高圧、高速タンパク質液体など）、示差的な遠心分離、示差的な可溶性を含むがこれに制限されない、本発明の方法に従った当該分野において公知の標準的な方法、または複合体もしくはタンパク質を発現する組換え宿主細胞によって、またはタンパク質の精製について使用される任意の他の標準的な方法によって、単離および精製され得る。機能的特性は、本発明の方法に従った当該分野において公知の任意の適切なアッセイを使用して評価され得る。
【００９２】
あるいは、一旦メガロミシン生合成酵素またはそのドメインもしくは誘導体が同定されると、タンパク質のアミノ酸配列は、これをコードする遺伝子のヌクレオチド配列から推定され得る。結果として、タンパク質またはそのドメインもしくは誘導体は、本発明の方法に従った当該分野において公知の標準的な化学的な方法によって合成され得る（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。
【００９３】
メガロミシン生合成酵素の操作は、タンパク質レベルでなされ得る。本発明の範囲内に含まれるのは、メガロミシン生合成酵素のドメイン、誘導体、またはアナログ、もしくはフラグメントであり、これらは翻訳の間または後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質溶解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって差示的に改変され得る。任意の多くの化学的改変が、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成などを含むがこれに制限されない公知の技術によって行われ得る。
【００９４】
特定の実施形態において、メガロミシン生合成酵素は、蛍光標識を含むように改変される。他の特定の実施形態において、メガロミシン生合成酵素は、複合体のメンバーを架橋するために使用され得る異種機能（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎ）性試薬のような異種機能性試薬を有するように改変される。
【００９５】
さらに、メガロミシン生合成酵素のドメイン、アナログ、および誘導体は、化学的に合成され得る。例えば、メガロミシン生合成酵素の１部分に対応するペプチドは、所望されるドメインを含むか、または所望されるインビトロ活性を媒介し、ペプチド合成機の使用によって合成され得る。さらに、所望される場合、非伝統的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログは、メガロミシン生合成酵素配列への置換または付加として導入され得る。非伝統的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、および概してアミノ酸アナログを包含するが、これらに制限されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【００９６】
天然の産物が、変異体であると疑われるか、または新規の種から単離される場合において、天然の供給源から単離されたメガロミシン生合成酵素、およびインビトロで、またはインビボもしくはインビトロで合成された発現ベクターから発現されたメガロミシン生合成酵素のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の分析から、またはあるいは単離されたタンパク質の直接的な配列決定により決定され得る。このような解析は、手動配列決定、または自動化アミノ酸シーケンサーの使用を介して行われ得る。
【００９７】
メガロミシン生合成酵素タンパク質はまた、親水性解析（ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８（１９８１））によって解析され得る。親水性プロフィールは、タンパク質の疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得、および結合実験、抗体合成などにおけるような実験操作のための基質の設計においてそれらの配向を予測することを補助する。二次構造解析はまた、特異的な構造を推定するメガロミシン生合成酵素の領域を同定するためになされ得る（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２−２３（１９７４））。操作、翻訳、二次構造予測、親水性および疎水性プロフィール、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング、ならびに配列相同性の決定は、当該分野において利用可能なコンピューターソフトウェアプログラムを使用して達成され得る。
【００９８】
Ｘ線結晶構造学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３（１９７４））、質量分光法およびガスクロマトグラフィー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９７）、およびコンピューターモデリング（ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ編、１９８６、コンピューターグラフィックスおよび分子モデリング、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を含むがこれに制限されない構造解析の他の方法がまた用いられ得る。
【００９９】
本発明はまた、抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体を提供し、これはメガロミシンポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）またはメガロミシン修飾酵素のドメインに免疫特異的に結合する。特定の実施形態において、配列番号１において記載されるヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸によってコードされるメガロミシン生合成酵素のドメインに免疫特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含有する当該抗体のフラグメントもしくは誘導体が提供される。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１００】
メガロミシン生合成酵素タンパク質、ならびにそのドメイン、フラグメント、相同体、および誘導体は、免疫原として、このような免疫原を免疫特異的に結合する抗体を作製するために使用され得る。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーを含むがこれらに制限されない。
【０１０１】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明の方法に従って、本発明のメガロミシン生合成酵素タンパク質、そのドメイン、誘導体、フラグメント、またはアナログに対するポリクローナル抗体の産生のために使用され得る。
【０１０２】
抗体の産生のために、種々の宿主動物が、ネイティブなメガロミシン生合成酵素タンパク質もしくは合成バージョン、または架橋されたメガロミシン生合成酵素のような前述の誘導体での注射によって免疫され得る。このような宿主動物は、ウサギ、マウス、ラットなどを包含するが、これらに制限されない。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して免疫学的応答を増加するために使用され得、これらとしてはフロイント（完全または不完全）、水酸化アンモニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような表面活性基質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳濁液、ジニトロフェノール、およびバシルＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）およびコリネ細菌パルバン（ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１０３】
メガロミシン生合成酵素、またはそのドメイン、誘導体、フラグメント、もしくはアナログに対して指向されるモノクローナル抗体の調製について、培養における連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され得る。このような技術は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５））によって元来開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３））、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁（１９８５））を包含するがこれらに制限されない。さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、無菌動物において産生され得る（ＷＯ８９／１２６９０）。ヒト抗体が使用され得、およびヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０（１９８３））、またはインビトロでＥＢＶウイルスでヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁（１９８５））、得られ得る。メガロミシン生合成酵素タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによる、キメラ抗体の産生について開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得；このような抗体は、本発明の範囲内にある。
【０１０４】
１本鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、メガロミシン生合成酵素特異的１本鎖抗体を産生するために適合され得る。さらなる実施形態は、メガロミシン生合成酵素、またはそのドメイン、誘導体、もしくはアナログについての所望される特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載される技術（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１（１９８９））を利用する。非ヒト抗体は、公知の方法によって「ヒト化」され得る（米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）。
【０１０５】
メガロミシン生合成酵素のイディオ型を含む抗体フラグメントは、本発明の方法に従って、当該分野において公知の方法によって作製され得る。例えば、このようなフラグメントとしては：抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製され得るＦａｂ’フラグメント；パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにって作製され得るＦａｂフラグメント、ならびにＦｖフラグメントを包含するが、これらに制限されない。
【０１０６】
抗体の産生において、所望される抗体についてのスクリーニングは本発明の方法に従って、当該分野において公知の技術、例えばＥＬＩＳＡ（酵素固定化免疫吸着アッセイ）によって達成され得る。メガロミシン生合成酵素の特定のドメインに特異的な抗体を選択するために、このようなドメインを含むメガロミシン生合成酵素のフラグメントに結合する産物について、作製されたハイブリドーマをアッセイし得る。
【０１０７】
上述の抗体は、本発明の方法に従って、メガロミシン生合成酵素タンパク質の局在化および／または定量化に関連した当該分野において公知の方法で、例えば、サンプル中のこれらのタンパク質を画像化するか、またはそのレベルを測定するために、使用され得る。
【０１０８】
（第Ｖ節：メガロミシン生合成遺伝子の異種発現）
１つの重要な実施形態において、本発明は、１つ以上のメガロミシン生合成遺伝子の異種発現のための方法、およびこの方法において有用な組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明の目的のために、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ以外の任意の宿主細胞は、異種宿主細胞である。従って、メガロミシンＰＫＳおよび修飾酵素のドメイン、モジュール、またはタンパク質をコードする単離された核酸に加えて本発明の範囲内に含まれるものは、このような核酸を含む組換え発現ベクターである。用語発現ベクターは、宿主細胞、または無細胞の転写および翻訳系に導入され得る核酸をいう。発現ベクターは、染色体、または細胞中のもしくは任意の細胞画分中のいずれにしろ他のＤＮＡの部分（例えば、細胞質における複製ベクター）として、永久的にまたは一過的に細胞中で維持され得る。発現ベクターはまた、ＲＮＡの発現を駆動するプロモーターを含み、ＲＮＡは典型的に細胞または細胞抽出物中でポリペプチドに翻訳される。タンパク質へのＲＮＡの効率的な翻訳のために、発現ベクターはまた典型的に、発現される遺伝子のコード配列の開始コドンの上流に配置されるリボソーム結合部位配列を含む。エンハンサー、分泌シグナル配列、転写終結配列、およびベクターを含有する宿主細胞が同定および／または選択され得る１つ以上のマーカー遺伝子のような他のエレメントはまた、発現ベクターに存在し得る。選択マーカー、すなわち、抗生物質耐性または感受性を付与する遺伝子は好ましく、および細胞が適切な選択培地中で増殖される場合、形質転換された細胞に対して選択可能な表現型を付与する。
【０１０９】
発現ベクターの種々の成分は広範に変化し得、ベクター、およびベクターが複製すること、または発現を駆動することが意図される宿主細胞の意図される使用に依存する。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、および他の一般的に使用される細胞における遺伝子の発現およびベクターの維持に適切な発現ベクター成分は、広範に公知であり、および市販される。例えば、本発明の発現ベクターにおける包含のために適切なプロモーターは、真核生物または原核生物宿主細胞において機能するプロモーターを包含する。プロモーターは宿主細胞の増殖に関して発現の調節を許容する、または化学的もしくは物理的刺激に応答してオンもしくはオフされる遺伝子の発現を引き起こす調節配列を含み得る。Ｅ．ｃｏｌｉおよびある他の細菌宿主細胞について、生合成酵素、抗生物質耐性を付与する酵素、およびファージタンパク質の遺伝子に由来するプロモーターが使用され得、および例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）、マルトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）、バクテリオファージλＰＬ、およびＴ５プロモーターを包含する。さらに、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）のような合成プロモーターがまた使用され得る。
【０１１０】
従って、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの発現系を含み、これは次いで、プロモーターに作動可能に連結されるメガロミシンＰＫＳおよび／または他のメガロミシン生合成遺伝子コード配列の少なくとも１つの部分、および必要に応じて適合性の宿主細胞においてコード配列の発現を達成するために作動する終結配列から構成される。宿主細胞は、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターでの形質転換によって、発現系配列を、染色体外エレメントとしてまたは染色体中に取り込まれるかのいずれかで含むように修飾される。本発明の得られる宿主細胞は、ＰＫＳおよびＰＫＳ後修飾酵素、ならびにポリケチドおよび抗生物質およびそれに由来する他の有用な化合物を生成するための方法において有用である。
【０１１１】
本発明の発現ベクターのためのベクター成分を選択する目的のために好ましい宿主細胞は、酵母のような真菌宿主細胞、およびＥ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような原核生物宿主細胞が挙げられるが、哺乳動物宿主細胞もまた使用され得る。通常はポリケチドを生成しない酵母、植物、哺乳動物の細胞のような宿主細胞において、典型的に組換え手段によって、組換え的に生成されるＰＫＳを機能性に変換するために適切なホロ−ＡＣＰ合成酵素を提供することがまた必要であり得る。このような酵素の提供は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／１３８４５および９８／２７２０３において記載され、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される。本発明の目的のために特に好ましい宿主細胞は、以下により詳細に考察されるように、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞である。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の組換えＰＫＳを発現する異種組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞を構築するために使用される。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓは、ポリケチドが特定のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種において天然で産生されるので、ポリケチドを発現するために便利な宿主であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞は、一般に、所望されるポリケチドを形成するために必要な前駆体を産生する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞がＰＫＳ酵素の任意の部分を産生するか、またはポリケチド修飾酵素を生成する場合、組換えベクターは、所望されるＰＫＳ酵素の残りの部分または他のポリケチド修飾化酵素の残りを構成するそれらの遺伝子のみの発現を駆動することを必要とすることを当業者は認識する。従って、このようなベクターは、単一のＯＲＦのみを含み得、ＰＫＳを構成するポリペプチドの所望される残りの部分は、宿主細胞染色体ＤＮＡ上の遺伝子によって提供される。
【０１１３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたは他の宿主細胞が通常ポリケチドを産生する場合、本発明の組換えＰＫＳを発現するためのその使用の前に、内因性ポリケチドの産生を妨げるように宿主を改変することが所望され得る。このような改変された宿主としては、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，６７２，４９１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ　９５／０８５４８およびＷＯ９６／４０９６８に記載される、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＣＨ９９９および同様に改変されたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。このような宿主において、組換え的に産生されたＰＫＳを作製する酵素の所望される翻訳後修飾の全てについて、酵素的活性を提供する必要はないかもしれない。なぜなら、この宿主はこのような酵素を天然に発現するからである。特に、これらの宿主は、一般に、ＰＫＳの機能性のために必要とされるホスホパントテイニル（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｏｔｈｅｉｎｙｌ）残基を提供するホロ−ＡＣＰ合成酵素を含む。
【０１１４】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける使用のための広範な種々の発現ベクターを提供する。本発明の複製発現ベクターは、例えば、ＳＣＰ２＊（Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．、１９８５）；Ｌｙｄｉａｔｅら、１９８５、Ｇｅｎｅ　３５：２２３−２３５；ならびにＫｉｅｓｅｒおよびＭｅｌｔｏｎ，１９８８、Ｇｅｎｅ　６５：８３−９１を参照のこと、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）、ＳＬＰ１．２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８２、ＧＥＮＥ　２０：５１−６２、本明細書中に参考として援用される）、ならびにｐＳＧ５（ｔｓ）（Ｍｕｔｈら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１９：３４１−３４８、およびＢｉｅｒｍａｎら、１９９２、Ｇｅｎｅ　１１６：４３−４９、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）のような低いコピー数のベクター、またはｐＩＪ１０１およびｐＪＶ１（Ｋａｔｚら、１９８３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１２９：２７０３−２７１４；Ｖａｒａら、１９８９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５７８２−５７８１；およびＳｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、１９９３、Ｐｌａｓｍｉｄ　３０：１３１−１４０、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）のような高いコピー数のベクターからの複製起点を含むベクターが挙げられるが、これらに限定されない。複製されないベクターおよび取り込まれないベクターについて、ならびに一般に任意のベクターについて、ｐＵＣ、ｐｌＰ、ｐｌＩ、およびｐＢＲからのような少なくともＥ．ｃｏｌｉの複製起点を含むことが有用である。ファージベースのベクターについて、ファージｐｈｉＣ３１およびその誘導体のＫＣ５１５が使用され得る（Ｈｏｐｗｏｏｄら、前出を参照のこと）。また、プラスミドｐＳＥＴ１５２、プラスミドｐＳＡＭ、プラスミドｐＳＥ１０１、およびｐＳＥ２１１（これらの全てはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの染色体ＤＮＡ中に部位特異的に取り込まれる）は、本発明の目的のために用いられ得る。
【０１１５】
本発明のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ組換え発現ベクターは、典型的に、ｅｒｍＥ（エリスロマイシンおよびリンコマイシンに対する耐性を付与する）、ｔｓｒ（チオストレプトンに対する耐性を付与する）、ａａｄＡ（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する）、ａａｃＣ４（アプラマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、およびネオマイシンに対する耐性を付与する）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）、およびｖｐｈ（ビオマイシンに対する耐性を付与する）耐性を付与する遺伝子からなる群より選択される、抗生物質耐性を付与する遺伝子を含む１つ以上の選択マーカーを含む。あるいは、いくつかのポリケチドは天然で着色され、そしてこの特徴は細胞を同定するための備え付けマーカーを提供し得る。
【０１１６】
メガロミシンは現在、比較的遺伝的に処理しにくい宿主Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎｅａによってのみ生成される。この細菌は、抗生物質の大規模産生のために発酵工業において一般に使用されておらず、そしてメガロミシンおよびそのアナログの高いレベルの産生のための方法が必要とされる。対照的に、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ細菌はほぼ５０年間の間、広範に使用されており、そしてメガロミシンおよびそのアナログの生成についての優れた宿主である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒは、異種ＰＫＳ系の発現のために開発された。これらの生物体は、クローン化された異種ＰＫＳ遺伝子を安定に維持し得、制御された条件下で高いレベルでそれらを発現し得、そして対応するＰＫＳタンパク質を修飾（例えば、ホスホパントテイン化）し得、それによって、それらはそれらがコードするポリケチドの産生を可能にする。さらに、これらの宿主はポリケチド合成について必要とされる基質；例えば、プロピノイル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡを生成するための必要な経路を含む。広範な種々のクローニングベクターおよび発現ベクターは、外来ＤＮＡの大きなセグメントの導入および安定な維持のための方法が利用可能であるので、これらの宿主について利用可能である。Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｓｐｐ．と比較して、Ｓ．ｌｉｖｕｄａｎｓ、およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒは多くの培地上で良好に増殖し、そして発酵器中でのポリケチドの高レベルの生成について適合されてきた。産生レベルが低い場合、多くの関連のアプローチが、収率を改善するために利用可能である（本明細書中に参考として援用されるＨｏｓｔｅｄおよびＢａｌｔｚ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（７）：２４５−５０を参照のこと）。これらのマクロライドの力価を増加するための経験的な方法は、多数の細菌ポリケチドについて有効であることがずっと前に証明されたので、用いられ得る。
【０１１７】
本発明の好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞／ベクターの組み合わせは、米国特許第５，８３０，７５０号および同第６，０２２，７３１号、ならびに１９９８年１０月２８日に出願された、米国特許出願第０９／１８１，８３３号（これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される）において記載されるように、ポリケチドアクチノロジンを生成しないように改変されたＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＣＨ９９９およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓＫ４−１１４宿主細胞、ならびにｐＲＭ１およびｐＲＭ５ベクターに由来する発現ベクターを包含する。これらのベクターは、これらが複数のおよび多様なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．と適合性のプロモーターを含む点で、特に好ましい。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞について特に有用なプロモーターは、二次代謝としてポリケチドの産生を生じるＰＫＳ遺伝子クラスターからのプロモーターを包含し、芳香族（ＩＩ型）ＰＫＳ遺伝子クラスターからのプロモーターを含む。ＩＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスタープロモーターの例は、ａｃｔ遺伝子プロモーターおよびｔｃｍ遺伝子プロモーターであり；Ｉ型ＰＫＳ遺伝子クラスタープロモーターの例は、スピラマイシンＰＫＳ遺伝子およびＤＥＢＳ遺伝子のプロモーターである。本発明はまた、メガロミシン生合成遺伝子プロモーターを組換え形態において提供する。これらのプロモーターは、プロモーターが機能する宿主細胞、特にＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、および一般に任意のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種において、メガロミシン生合成遺伝子または目的の任意の他のコード配列の発現を駆動するために使用され得る。
【０１１８】
上記のように、特に有用な制御配列は、栄養性菌糸体において増殖期から静止期への移行の間に、単独でまたは安定な調節系とともに発現を活性化する配列である。上記のプラスミドｐＲＭ５において含まれるプロモーター、すなわち、ａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーター対およびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４アクチベーター遺伝子は、特に好ましい。他の有用なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターとしては、構成的に作用するｅｒｍＥ遺伝子およびｍｅｌＣＩ遺伝子由来のプロモーター、ならびに任意の増殖段階で誘導され得るｔｉｐＡ遺伝子およびｍｅｒＡ遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ系は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに形質転換されており、そして本発明のベクターおよび宿主細胞において用いられ得る。この系において、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼについてのコード配列は、染色体の中性の部位に、または誘導性ｍｅｒＡプロモーターの制御下のベクター中に挿入され、そして目的の遺伝子はＴ７プロモーターの制御下に置かれる。上記のように、１つ以上のアクチベーター遺伝子はまた、プロモーターの活性を増強するために用いられ得る。上記のａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４遺伝子に加えて、アクチベーター遺伝子は、ｄｎｒＩ、ｒｅｄＤ、およびｐｔｐＡ遺伝子を包含する（米国特許出願第０９／１８１，８３３号、前出を参照のこと）。
【０１１９】
本発明の目的のための好ましい宿主細胞およびベクターを提供するために、メガロミシン生合成遺伝子は、組換え発現ベクター上に置かれ、そしてマクロライドを産生しない宿主Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４およびＳ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＣＨ９９９に移行される。この発現ベクターでのＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４またはＳ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　ＣＨ９９９の形質転換は、ＬＣ／ＭＳによる抽出物の解析によって決定されるように、検出可能な量のメガロミシンを生成する系統を生じる。上記のように、本発明はまた、コードされたメガロミシンモジュール　１　ＫＳドメインが不活性化される（ＫＳ１°変異）組換えＤＮＡ化合物を提供する。ＫＳ１°ドメインを有するメガロミシンＰＫＳをコードする本発明の組換え発現ベクターの、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒへの導入は、ジケチド給餌として公知のプロセスによって、ポリケチドを作製するために有用な宿主細胞を生成する。得られる宿主細胞は、メガロミシン誘導体を調製するために、前駆体分子のＮ−アシルシステアミンチオエステルが給餌または供給され得る。本発明のこのような細胞は、組換え宿主細胞における１３−置換化−６−デオキシエリスロノライドＢ化合物の産生において得に有用である。本発明の好ましい化合物としては、１３−位での置換体が、プロピル、ビニル、プロパルギル、他の低級アルキル、および置換されたアルキルであるそれらの化合物が挙げられる。好ましい実施形態において、ｍｅｇＰＫＳは、ＭｅｇＡＩＩＩ遺伝子が、そうでなければこれはＭｅｇＡＩ遺伝子と共有する同一のコード配列の領域を無効にするように変化されるか、またはｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子産物がｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子産物によって置き換えられたハイブリッドＰＫＳが用いられる、組換え構築物から生成される。組換えｏｌｅＡＩＩＩ遺伝子は、例えば、ＰＣＴ特許公開番号００／０２６３４９および１９９９年１０月２８日に出願された米国特許出願番号０９／４２８，５１７（これらの両方は本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【０１２０】
本発明の組換え宿主細胞は、メガロミシン生合成酵素の全て、またはこれのサブセットのみを発現し得る。例えば、メガロミシンＰＫＳについての遺伝子のみが、そうでなければ産生されるポリケチドに対して作用し得るポリケチド修飾酵素を生成しない宿主細胞において発現される場合、宿主細胞は、マクロライドアグリコンと呼ばれる未修飾のポリケチドを産生する。このようなマクロライドアグリコンは、例えば、必須の修飾酵素を含有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａのような株の発酵にそれらを添加することによってヒドロキシル化およびグリコシル化され得る。
【０１２１】
有用な活性を有する化合物を提供するようにマクロライドアグリコンを修飾し得るか、または有用な活性を有するように容易に修飾され得る広範な種々の多様な生物体が存在する。例えば、図５において示されるように、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａは６−ｄＥＢを多様な有用な化合物に変換し得る。エリスロノライド６−ｄＥＢは、ｅｒｙＦ遺伝子産物によってエリスロノライドＢに変換され、これは次いで、ｅｒｙＢＶ遺伝子産物によってグリコシル化されて３−Ｏ−ミカロシルエリスロノライドＢを得、これはＬ−ミカロースをＣ−３で含む。次いでｅｒｙＣＩＩＩ遺伝子産物は、Ｄ−デソサミンを用いるＣ−５でのグリコシル化によってこの化合物をエリスロマイシンＤに変換する。それゆえ、エリスロマイシンＤは、グリコシル化を介して、およびＣ−６でのヒドロキシル基の付加によって、６−ｄＥＢとは異なる。エリスロマイシンＤは、Ｃ−３でＬ−ミカロース残基をメチル化することによってｅｒｙＧ遺伝子産物により触媒される反応において、エリスロマイシンＢに変換され得る。エリスロマイシンＤは、ｅｒｙＫ遺伝子産物によって触媒される反応において、Ｃ−１２でのヒドロキシル基の付加によりエリスロマイシンＣに変換される。エリスロマイシンＡは、ｅｒｙＧ遺伝子産物によって触媒される反応においてミカロース残基のメチル化によってエリスロマイシンＣから得られる。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓにおいて産生される、６−ｄＥＢまたは６−ｄＥＢアナログのような、本発明によって提供される未修飾のメガロミシン化合物は、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの培養物に提供され得、そして以下の実施例において提供される手順に従って、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの対応する誘導体に変換され得る。所望される化合物のみが生成されることを確実にするために、６−ｄＥＢを生成し得ないがなお所望される変換を行い得るＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ｅｒｙＡ変異体を使用し得る（Ｗｅｂｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６４（１）：４２５−４３３）。また、好ましい化合物を蓄積するために、ｅｒｙＢ、ｅｒｙＣ、ｅｒｙＧ、および／またはｅｒｙＫ変異体のような他の変異体株、または複数の遺伝子における変異を有する変異体株を用い得る。変換はまた、商業的な産生のため大きな発酵器において行われ得る。
【０１２２】
さらに、本発明の化合物をヒドロキシル化および／またはグリコシル化するために用いられ得る他の有用な生物体が存在する。上記のように、生物体は、その生物体において通常産生されるポリケチドを生成し得ない変異体であり得、発酵は、プレート上でまたは大きな発酵器において行われ得、産生される化合物は発酵の後に化学的に変化され得る。従って、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅは、ピクロマイシンを産生し、デソサミニル基をＣ−５ヒドロキシルに、およびヒドロキシ基をＣ−１２位に転移し得る酵素を含む。さらに、Ｓ．Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅはデソサミン糖の２’−ヒドロキシル基をグリコシル化するグリコシル化活性を含む。この後者の修飾は、抗生物質活性を減少させるが、グリコシル残基は、細胞からのポリケチドの放出の前に酵素的作用によって除去される。別の生物体、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓは、Ｃ−１２ヒドロキシラーゼを除いて、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅと同じ修飾酵素を含む。従って本発明は、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓおよびＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに対して内因性の酵素の作用により、本発明のマクロライドアグリコンのヒドロキシル化およびグリコシル化によって生成される化合物を提供する。
【０１２３】
本発明の化合物を生成するために適切な他の生物体としては、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ（上で議論される）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓが挙げられる。Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓは、オレアンドマイシンを産生し、そしてＣ−６およびＣ−１２位をヒドロキシル化し、オレアンドローズでＣ−３ヒドロキシルを、およびデソサミンでＣ−５ヒドロキシルをグリコシル化し、ならびにＣ−８−Ｃ−８ａでエポキシドを形成する酵素を含む。Ｓ．ｆｒａｄｉａｅは、ミカミノースでＣ−５ヒドロキシルを、次いでミカロースでミカミノースの４’−ヒドロキシルをグリコシル化し、二糖を形成する酵素を含む。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓはＳ．ｆｒａｄｉａｅと同じ活性およびアシル化活性を含む。従って、本発明は、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓに対して内因性の酵素の作用による本発明のマクロライドアグリコンのヒドロキシル化およびグリコシル化によって生成される化合物を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、本発明のグリコシル化および／またはヒドロキシル化される化合物を、目的の宿主細胞において直接的に生成するための方法および遺伝子構築物を提供する。従って、本発明の組換え遺伝子は、異種ＰＫＳ遺伝子からの遺伝子フラグメントでのｍｅｇＡ遺伝子フラグメントのと置換を含む（次の切のおいて議論されるように）、１つ以上の欠失および／または挿入を伴う組換えｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、ｍｅｇＡＩＩＩＩ遺伝子を包含し、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓにおけるコードされた遺伝子産物の発現に適切な発現ベクターにおいて含まれ得る。
【０１２５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａおよびＳｔｒｅｐｕｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅの多くのエリスロマイシン高産生株が開発され、および好ましい実施形態において、メガロミシンＰＫＳおよび／または他のメガロミシン生合成遺伝子は、対応する修飾されたメガロミシン化合物を高い収率で提供するために、このような株（またはそのエリスロマイシンを生成しない変異体）に導入される。当業者は、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａがデソサミンおよびミカロース生合成および転移遺伝子ならびにＤＥＢＳを含むことを理解し、これは上記のように、同じマクロライドアグリコン（６−ｄＥＢ）をメガロミシンＰＫＳとして作製する。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａはメゴサミンまたはその対応するトランスフェラーゼ遺伝子を作製せず、そしてＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａのアシル化遺伝子を含まない。最後に、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ｅｒｙＧ遺伝子産物はミカロースをカラジノースに変換し、これはＭ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにおいて生じない。従って、本発明は広範に多様なＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ組換え宿主細胞を提供し、例えば、以下のを含む宿主細胞を包含する：
（ｉ）組換えメゴサミン生合成および転移遺伝子を有し、メガロミシンアシル化遺伝子を有するおよび有しない、野生型エリスロマイシン生合成遺伝子；
（ｉｉ）組換えメゴサミン生合成および転移遺伝子を有し、メガロミシンアシル化遺伝子を有するおよび有しない、ｅｒｙＧ以外の野生型エリスロマイシン生合成遺伝子；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）におけるとおりであるが、但しｅｒｙＡ遺伝子が不活性化されるかまたは欠失され、そして組換えｍｅｇＡ遺伝子が導入されている。
【０１２６】
本発明は、他のＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株も同様に提供し、任意の１つ以上のエリスロマイシン生合成遺伝子が欠失されるか、またはそうでなければ不活性化されている株、および少なくとも１つのメガロミシン生合成遺伝子が導入されている株を包含する。
【０１２７】
例えば、本発明は、株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｒａ　ｅｒｙＧ変異体（ここでは、この変異体によって作製されるエリスロマイシンＣがメガロミシンＡに変換される）においてメガロサミン遺伝子を発現することを可能にする。あるいは、エリスロマイシンＣが、メゴサミン生合成およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のみを保有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ株に与えられる生体内変化において、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシンＣを高産生する株を使用し得る。別の代替において、メガロミシンＡを産生するために、適切なエリスロマイシン産生遺伝子を、ダウノサミン生合成遺伝子ならびに図５の遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙ、または全てのメガロミシン生合成遺伝子とともに保有する、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓの株を使用し得る。
【０１２８】
全てのまたはいくつかのメガロミシン遺伝子クラスターは、１つまたは２つのいずれかのプラスミド中で、ｐＣＫ７またはｐＳＥＰ１５２における適切なプロモーターの制御下で容易にクローン化され得、そしてＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｒａ　ｅｒｙＧ変異体に導入され得る。ｐＳＥＴにおけるａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４／ａｃｔＩｐ系およびｐｈｉＣ３１／ｉｎｔ系はこの生物体において良好に機能する。（Ｒｏｗｅら、１９９８、Ｇｅｎｅ、２１６：２１５−２３を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）。あるいは、メゴサミン生合成遺伝子は、同じプラスミド上でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓに組み込まれ、そして生物変換によって媒介されるメガロミシンＡまたはその前駆体の生成は、エリスロノライドＢ、３−α−ミカロシルエリスロノライドＢ、エリスロマイシンＤ、またはエリスロマイシンＣを、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株に与えることによってなされる。
【０１２９】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるメガロミシンＡに対する十分な耐性の欠損は予期されない。なぜなら両方の生物体はＭＬＳ耐性遺伝子（それぞれ、ｅｒｍＥおよびｍｇｔ／Ｉｒｍ）を有し、これはいくつかの１４−員のマクロライドに対する耐性を付与する（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９、Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：２０７−３３；ＪｅｎｋｉｎｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８；５５−６２；およびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９９２、Ｇｅｎｅ、１１５：７５−８４を参照のこと、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）。メガロミシンＡに対するＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ｅｒｙＧ変異体およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞の耐性のレベルをまた、プレート試験においておよび液体培地においての両方で、容易に決定し得る。メガロミシンＡが産生されるレベルを決定するために、高いエリスロマイシンＡを産生するＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株のｅｒｙＧ変異体（または必要とされる場合、ｅｒｙＢもしくはｅｒｙＣ変異体）を使用する生物変換法を反復し得る。さらに、経験が、高いレベルのメガロミシンＡが、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓに存在するよりも高いレベルのこのマクロライドに対する耐性を必要とすることを示す場合、必要とされるメガロミシン自己耐性遺伝子は、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａからクローン化され、そして異種宿主のいずれか１つに移される。自己耐性遺伝子が、マクロライド生合成遺伝子のクラスターにおいて通常見出され、公知のマクロライド耐性遺伝子に対するそれらの相同性によって、および（または）通常は感受性である株に遺伝子が与える耐性表現型によって同定され得るので、これは直接的な研究である。
【０１３０】
あるいは、インビボでＴＤＰ−メゴサミンを作製し、そしてエリスロマイシンアグリコンにこれを付着する能力を提供するために、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙ（図５）は、関連のダウノサミン（ｄｎｍ）生合成遺伝子（図５）を含有するカセットに付加され得る。ＴＤＰ−ダウノサミン生合成遺伝子は、２つの適合性および相互に選択可能なプラスミドにおいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓから再クローン化され得る。これらの２つのプラスミド、およびＴＤＰ−ダウノサミングリコシルトランスフェラーゼについてのｄｎｍＳ遺伝子を含有するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株が添加されたε−ロードマイシノンの存在下で増殖される場合、ロードマイシンＤと呼ばれる、Ｌ−ダウノサミンを有するその配糖体は、良好な収率で生成される。従って、メガロミシンＡへのエリスロマイシンのうちの１つの生物変換は、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙが存在する場合、観察される。全ての５つの組み合わせ（２つのＮ−ジメチルトランスフェラーゼ遺伝子および３つのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子）を、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙをメガロミシン経路におけるミカロースおよびデソサミンの生合成および付着と関連されるそれらから区別するために構築し得る。
【０１３１】
メゴサミン添加のタイミングは知られていないので、エリスロノライドＢ、３−α−ミカロシルエリスロノライドＢ、エリスロマイシンＤ，およびエリスロマイシンＣを、メゴサミン生合成およびトランスフェラーゼ遺伝子を発現する株に提供される基質として試験し得る。メガロミシンＣ１のようなＣ３’’’および（または）Ｃ４’’’アシル化代謝を試験する必要性がある。なぜならこれらの代謝物は、チロシン（Ａｒｉｓａｗａら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０；２６５７−２２６１を参照のこと）、カルボマイシン（Ｅｐｐら、１９８９、Ｇｅｎｅ　８５：２９３−３０１）、およびミデカマイシン（ＨａｒａおよびＨｕｃｈｉｎｓｏｎ、１９９２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、５１４１−５１４４）の生合成における前例に基づいてメガロミシンＡから作製される（変換ではない）。エリスロノライドＢまたは３−α−ミカロシルエリスロノライドＢ（図５）のＣ−６グリコシル化が、Ｃ−５へのデソサミンの付加の前に生じる場合、エリスロマイシン遺伝子は、エリスロマイシングリコシルトランスフェラーゼがＣ−６配糖体を寛容し得ない場合、いくつかの１または２配糖体からのメガロミシンＡの形成を完了し得ないかもしれない。予期されなかったが、このような克服は、メガロミシンＡを生成する組換え株を作製するために、さらなるメガロミシン生合成遺伝子−具体的には必要なデオキシ糖生合成および付着遺伝子−を適切なＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａバックグラウンドにまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓにクローン化することによって、本発明の方法に従って迂回され得る。
【０１３２】
メガロミシンＢ、Ｃ１、およびＣ２（図３）においてミカロースのＣ３’’’またはＣ４’’’位にアセテートまたはプロピオネートを付加するアシルトランスフェラーゼ遺伝子は、本発明のコスミド内に含まれ、そしてチロシン産生体からのｃａｒＥおよびｍｄｍＢの相同体またはそれらのａｃｙＡ相同体を配置するためにメガロミシン遺伝子クラスターについての配列データーをスキャニングすることによって同定され得る。ｃａｒＥおよびａｃｙＡ遺伝子は、それぞれ、カルボマイシンおよびチロシン経路においてＣ４’’’アクリル化を支配する。メガロミシン相同体は、メガロミシン生合成と等価な機能を有する（しかし、Ｃ３’’’およびＣ４’’’アクリル化に特異的である）。遺伝子は、メガロミシンＡの所望されるアシル誘導体を生成するために適切なプロモーターの制御下でクローン化され得、そしてＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓに導入され得る。あるいは、ｃａｒＥ遺伝子の導入は、メガロミシンＢを形成し得る。この遺伝子は、カルボマイシン、スピラマイシン、またはチロシン産生体からクローン化され得る。
【０１３３】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａもしくはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓまたは他の組換え宿主細胞によって産生されるメガロミシンの量が所望されるよりも少ない場合、収率は増殖培地および発酵条件を最適化することによって、構築される組換え株により蓄積される経路中間体のレベルに基づいて、速度を制限するようである遺伝子の発現を増加することによって、ならびに株改良についてより安定な組換え株を提供するためにゲノムに取り込まれ得る、ｐＳＥＴ１５２のようなベクターにおけるｅｒｙ、ｄｎｍ、およびメガロミシン生合成遺伝子を再構築することによって、改善され得る。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明は１つ以上のメゴサミン、デソサミン、およびミカロース生合成および転移遺伝子をコードする組換えベクター、ならびにこれらのベクターを含む異種宿主細胞を提供する。本発明のこの実施形態において、異種宿主細胞は典型的に、本発明のベクターが導入されない限り、糖を生成し得ず、およびこれをポリケチドに転移し得ない細胞である。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓもＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒも天然で、メゴサミン、デソサミン、もしくはミカロースを作製し得ず、またはこれらの部分をポリケチドに転移し得ない。しかし、本発明は、メゴサミン、デソサミン、および／またはミカロースを作製し得、それらの部分をポリケチドに転移し得る、組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ宿主細胞を提供する。
【０１３５】
さらに、さらなる組換え遺伝子産物は、所望されるポリケチドの産生を改善するために宿主細胞において発現され得る。１つの非限定的な例において、本発明の特定の組換えＰＫＳタンパク質は、予測されるポリケチド以外の、またはこれに加えてポリケチドを生成し得る。なぜなら、ポリケチドがＰＫＳにおける他のドメイン、特に、モジュール６における任意のＫＲ、ＤＨ、および／またはＥＲドメインによってプロセシングされる前に、モジュール６におけるチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインによってＰＫＳから切断されるからである。予測されるポリケチドの産生は、遺伝子からＴＥドメインコード配列を欠失し、および、必要に応じて別々のタンパク質としてＴＥドメインを発現することによるこのような例において増加され得る。Ｇｏｋｈａｌｅら、１９９９年２月、「エリスロマイシンポリケチド合成酵素からの末端チオエステラーゼドメインの機構および特異性」、Ｃｈｅｍ．＆　Ｂｉｏｌ．６：１１７−１２５（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１３６】
従って、１つの重要な局面において、本発明は、異種宿主細胞においてメガロミシン、ならびにメガロミシンのヒドロキシル化およびグリコシル化された誘導体の産生を可能にする方法、発現ベクター、および組換え宿主細胞を提供する。本発明はまた、以下の節において記載されるように、メガロミシンＰＫＳまたは他の生合成遺伝子から一部由来する広範に多様なポリケチドを作製するための方法を提供する。
【０１３７】
（第ＶＩ節：ハイブリッドＰＫＳ遺伝子）
本発明は、メガロミシンＰＫＳおよび他のメガロミシン生合成酵素のモジュールのそれぞれの各ドメインをコードする組換えＤＮＡ化合物を提供する。これらの化合物の利用可能性は、異種ＰＫＳおよび必要に応じて１つ以上のポリケチド修飾酵素の全てまたは１部分に、融合されるか、またはこれらと組み合わせて発現されるメガロミシンＰＫＳの所望される部分の産生のために、組換え手順におけるそれらの使用を許容する。これらの化合物はまた、種々のメガロミシン修飾酵素でのポリケチドの修飾を許容する。次いで、得られるハイブリッドＰＫＳは、所望されるポリケチドまたはそれらの修飾された形態を生成するために、宿主細胞において発現され得る。
【０１３８】
従って、本発明の方法に従って、特定の活性をコードするメガロミシン生合成遺伝子コード配列の１部分は、例えば、異なるモジュラーＰＫＳ遺伝子または修飾酵素遺伝子における対応する領域を置換するために、単離および操作され得る。さらに、メガロミシンＰＫＳの個々のタンパク質、モジュール、ドメイン、およびこれらの部分についてのコード配列は、適切な発現系にライゲーションされ得、そしてコードされるタンパク質の部分を産生するために使用され得る。得られるタンパク質は、単離および精製され得るか、またはポリケチド合成を達成するためにインサイチュで用いられ得る。ドメイン、モジュール、タンパク質、またはタンパク質の組み合わせの組換え産生のための宿主に依存して、プロモーター、終結配列、エンハンサーなどのような適切な制御配列が、上記のように発現ベクターの構築において、所望されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結される。
【０１３９】
１つの重要な実施形態において、本発明は従って、ハイブリッドＰＫＳ酵素、およびそれらのハイブリッドＰＫＳ酵素をコードする対応する組換えＤＮＡ化合物を提供する。本発明の目的のために、ハイブリッドＰＫＳが、第１のＰＫＳの１つ以上のエクステンダーモジュール、ローディングモジュール、および／またはチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全てもしくは１部分、ならびに第２のＰＫＳの１つ以上のエクステンダーモジュール、ローディングモジュール、および／またはチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全てもしくは１部分を含む組換えＰＫＳである。１つの好ましい実施形態において、第１のＰＫＳは全てではないが大部分がメガロミシンＰＫＳであり、そして第２のＰＫＳは非メガロミシンＰＫＳの部分のみである。このようなハイブリッドＰＫＳの説明的な例は、メガロミシンＰＫＳローディングモジュールが、別のＰＫＳのローディングモジュールで置換されたメガロミシンＰＫＳを包含する。このようなハイブリッドＰＫＳの別の例は、エクステンダーモジュール３のＡＴドメインが、マロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインで置換されるメガロミシンＰＫＳである。別の好ましい実施形態において、第１のＰＫＳは全てでないが大部分が非メガロミシンＰＫＳであり、そして第２のＰＫＳはメガロミシンＰＫＳの部分のみである。このようなハイブリッドＰＫＳの説明的な例は、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴが、メチルマロニルＣｏＡに特異的なメガロミシンＰＫＳからのＡＴで置換されるラパマイシンＰＫＳを包含する。本発明の別の説明的なハイブリッドＰＫＳは以下に記載される。
【０１４０】
当業者は、本発明のハイブリッドＰＫＳにおいて第１のまたは第２のいずれかのＰＫＳの全てまたは部分は、天然に存在する供給源から単離される必要がないことを認識する。例えば、ＡＴドメインの小さな部分だけでその特異性を決定する。本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ　ＵＳ９９／１５０４７号、およびＬａｕら、下記を参照のこと。ＤＮＡ合成における技術水準は、当業者がＰＫＳモジュールまたはドメインの有用な部分を構築するために十分なサイズの新規ＤＮＡ化合物を構築することを許容する。従って、所望される誘導的なコード配列が、Ｊａｙｅら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３３１によって記載される方法のような標準的な固相合成法、および例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から市販される自動化合成のための装置を使用して合成され得る。本発明の目的のために、このような合成ＤＮＡ化合物は、ＰＫＳの１部分であると考えられる。
【０１４１】
本発明のハイブリッドＰＫＳに関する一般的なバックグラウンドを伴って、メガロミシンＰＫＳを含む個々のドメイン、モジュール、およびタンパク質をコードする本発明のＤＮＡ化合物によって提供される利益を、より良好に理解し得る。上記のように、メガロミシンＰＫＳは、ローディングモジュール、ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ、および０、１、２または３個のＫＲ、ＤＨ、およびＥＲドメインから構成される６つのエクステンダーモジュール、ならびにチオエステラーゼドメインから構成される。これらのドメインをコードする本発明のＤＮＡ化合物は個々に、または組み合わせて、本発明のＤＮＡ化合物をコードするハイブリッドＰＫＳの構築において有用である。例えば、エクステンダーモジュールまたはエクステンダーモジュールの部分をコードする本発明のＤＮＡ化合物は、ＰＫＳのタンパク質のサブ成分をコードするコード配列の構築において有用である。ＰＫＳサブユニットタンパク質のコード配列を含む本発明のＤＮＡ化合物は、他のサブユニットを発現し、従って機能的なＰＫＳを産生する宿主細胞において、サブユニットの発現を駆動する発現ベクターの構築において有用である。
【０１４２】
メガロミシンＰＫＳのローディングモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用に対して有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳローディングモジュールをコードする配列を含有するＤＮＡ化合物は、１つ以上の異種ＰＫＳエクステンダーモジュールについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのローディングモジュールについてのコード配列が、メガロミシンＰＫＳローディングモジュールのコード配列についてのコード配列に置換され、新規なＰＫＳを提供する。例は、ＤＥＢＳ、ラパマイシン、ＦＫ−５０６、ＦＫ−５２０、リファマイシン、およびアベルメクチンＰＫＳコード配列を包含する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳローディングモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳ、またはメガロミシン誘導体を生成する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１４３】
別の実施形態において、ローディングモジュールコード配列の１部分は、異種コード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ（プロピオニル）特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ（アセチル）、エチルマロニルＣｏＡ（ブチリル）、または他のＣｏＡ特異的ＡＴで置換することを提供する。さらに、ＡＴおよび／またはＡＣＰは、別のＡＴおよび／または別のＡＣＰもしくはＫＳＱのような不活性化ＫＳ、ＡＴ、および／または別のＡＣＰによって置換され得る。得られる異種ローディングモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１４４】
メガロミシンＰＫＳの第１のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ分子およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは多様な適用に対して有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第１のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列が、メガロミシンＰＫＳの第１のエクステンダーモジュールについてのコード配列に置換されるか、または後者としてはこれが異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に単に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳコード配列を提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第１のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１４５】
別の実施形態において、第１のエクステンダーモジュールコード配列の１部分または全ては、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること（これは不活性化を包含する）；ＤＨ、もしくはＤＨおよびＥＲを挿入すること；ならびに／またはＫＲを別のＫＲ、ＤＨおよびＫＲ，もしくはＤＨ、ＫＲ、およびＥＲで置換することを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置換され得る。これらの置換または挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳの別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについての遺伝子から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第１のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１４６】
しかし、当業者は、エクステンダーモジュール１のＫＲドメインの欠失、またはエクステンダーモジュール１へのＤＨドメインもしくはＤＨおよびＫＲドメインの挿入が、このようなハイブリッドモジュールが、ハイブリッドＰＫＳにおいて第１のエクステンダーモジュールとして用いられるか、またはそうでなければ環化が生じるポリケチドの１部分を生成するにおいて関与される場合、ＫＲによって作製されるヒドロキシル基でのポリケチドの典型的な環化を妨げることを認識する。しかし、このような欠失または挿入は、直鎖状分子を作製するために、または分子中の別の部位で環化を誘導するために有用であり得る。
【０１４７】
上記のように、本発明はまた、組換えＰＫＳ、ならびに第１のエクステンダーモジュールのＫＳドメインが不活性化されているこのようなＰＫＳをコードする組換えＤＮＡ化合物およびベクターを提供する。このような構築物は典型的に、単一のタンパク質上で第１の２つのエクステンダーモジュールとともに翻訳リーディングフレームにおいて発現され、メガロミシン、メガロミシン誘導体、またはハイブリッドＰＫＳの残りのモジュールおよびドメインは、マルチタンパク質機能的ＰＫＳを形成するために、１つ以上の、典型的に２つのタンパク質として発現される。これらの構築物の有用性は、それによってコードされるＰＫＳを発現する宿主細胞またはそれによってコードされるＰＫＳを含有する無細胞抽出物が、メガロミシン誘導体化合物を調製するために、前駆体分子のＮ−アシルシステアミンチオエステルを給餌され得るかまたはこれを供給され得ることである。２０００年１月２７日に出願された、米国特許出願第０９／４９２，７３３号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４７１７号、同第９９／０３９８６号、および同第９７／０２３５８号を参照のこと（これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される）。
【０１４８】
メガロミシンＰＫＳの第２のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用について有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第２のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列がメガロミシンＰＫＳの第２のエクステンダーモジュールについてのコード配列によって置換されるか、または後者としてはこれが単に異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第２のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１４９】
別の実施形態において、第２のエクステンダーモジュールコード配列の１部分または全ては、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること（もしくは不活性化すること）；ＫＲを、ＫＲ、ＫＲおよびＤＨ、もしくはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲで置換すること；ならびに／またはＤＨ、もしくはＤＨおよびＥＲを挿入することを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置換され得る。これらの置換または挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳの別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについてのコード配列から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第２のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１５０】
メガロミシンＰＫＳの第３のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用に対して有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第３のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列がメガロミシンＰＫＳの第３のエクステンダーモジュールについてのコード配列によって置換されるか、または後者としてはこれが単に異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第３のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１５１】
別の実施形態において、第３のエクステンダーモジュールコード配列の１部分または全ては、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置き換えること；不活性なＫＲを欠失すること；ならびに／またはＫＲを、活性なＫＲ、ＫＲおよびＤＨ，もしくはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲで置き換えることを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置き換えられ得る。これらの置き換えまたは挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳの別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについての遺伝子から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第３のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１５２】
メガロミシンＰＫＳの第４のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用について有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第４のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列がメガロミシンＰＫＳの第４のエクステンダーモジュールについてのコード配列によって置き換えられるか、またはこれは単に異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第４のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１５３】
別の実施形態において、第４のエクステンダーモジュールコード配列の１部分は、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置き換えること；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの任意の１つの、２つの、もしくは３つ全てを欠失もしくは不活性化すること；ならびに／またはＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの任意の１つの、２つの、もしくは３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、もしくはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲのいずれかで置き換えることをを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置き換えられ得る。これらの置き換えまたは挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳ（ＤＨおよびＥＲドメインを除く）の別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについてのコード配列から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第４のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１５４】
メガロミシンＰＫＳの第５のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用について有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第５のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列がメガロミシンＰＫＳの第５のエクステンダーモジュールについてのコード配列によって置き換えられるか、またはこれは単に異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第５のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１５５】
別の実施形態において、第５のエクステンダーモジュールコード配列の１部分または全ては、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置き換えること；ＫＲを欠失すること（もしくは不活性化すること）；ＤＨ、もしくはＤＨおよびＥＲを挿入すること；ならびに／またはＫＲを、別のＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、もしくはＤＨ、ＫＲ、およびＥＲで置き換えることを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置き換えられ得る。これらの置き換えまたは挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳの別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについてのコード配列から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第５のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１５６】
メガロミシンＰＫＳの第６のエクステンダーモジュールをコードする本発明の組換えＤＮＡ化合物、およびそれによってコードされる対応するポリペプチドは、多様な適用について有用である。１つの実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第６のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、異種ＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。得られる構築物は、異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列がメガロミシンＰＫＳの第６のエクステンダーモジュールについてのコード配列によって置き換えられるか、またはこれは単に異種ＰＫＳのモジュールについてのコード配列に付加されるかのいずれかであり、新規なＰＫＳを提供する。別の実施形態において、メガロミシンＰＫＳの第６のエクステンダーモジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳまたはメガロミシン誘導体を産生する組換えメガロミシンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入される。
【０１５７】
別の実施形態において、第６のエクステンダーモジュールコード配列の１部分または全ては、ハイブリッドモジュールを作製するために他のＰＫＳコード配列と組み合わせて利用される。この実施形態において、本発明は例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、もしくは２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置き換えること；ＫＲを欠失もしくは不活性化するか、またはＫＲを、別のＫＲ，ＫＲおよびＤＨ、もしくはＫＲ、ＤＨ，およびＥＲで置き換えること；ならびに／またはＤＨ、もしくはＤＨおよびＥＲを挿入することを提供する。さらに、ＫＳおよび／またはＡＣＰは、別のＫＳおよび／またはＡＣＰで置き換えられ得る。これらの置き換えまたは挿入のそれぞれにおいて、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲ、またはＡＣＰコード配列は、メガロミシンＰＫＳの別のモジュールについてのコード配列から、メガロミシン以外のポリケチドを産生するＰＫＳについてのコード配列から、または化学的合成から起源し得る。得られる異種の第６のエクステンダーモジュールコード配列は、メガロミシン、メガロミシン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列と組み合わせて利用され得る。
【０１５８】
メガロミシンＰＫＳの第６のエクステンダーモジュールは、チオエステラーゼドメインが続く。このドメインは、ポリケチドの環化およびＰＫＳからのその切断において重要である。本発明は、メガロミシンＰＫＳが異種チオエステラーゼに融合されるか、または異種ＰＫＳがメガロミシンＰＫＳチオエステラーゼに融合される、ハイブリッドＰＫＳ酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を提供する。従って、例えば、別のＰＫＳ遺伝子からのチオエステラーゼドメインコード配列は、本発明の組換えＤＮＡ化合物における６番目（もしくは他の最終）のエクステンダーモジュールコード配列の末端で挿入され得るか、またはメガロミシンＰＫＳチオエステラーゼが同様に異種ＰＫＳに融合され得る。このチオエステラーゼドメインをコードする組換えＤＮＡ化合物は、メガロミシンＰＫＳ、メガロミシン誘導体を産生するＰＫＳ、およびメガロミシンまたはメガロミシン誘導体以外のポリケチドを産生するＰＫＳをコードするＤＮＡ化合物を構築するにおいて有用である。
【０１５９】
従って、本発明のハイブリッドモジュールは、本発明のハイブリッドＰＫＳを提供するためにＰＫＳに取り込まれる。本発明のハイブリッドＰＫＳは、以下：
（ｉ）その産物がＰＫＳに組み込まれる、ＰＫＳ遺伝子中に含まれるハイブリッドモジュールコード配列を生成するための異種ドメインコード配列の融合物（ここで異種は、モジュール中のドメインが、少なくとも２つの異なって天然に存在するモジュールに由来することを意味する）からのみでなく、また：
（ｉｉ）その産物がＰＫＳに組み込まれる、ＰＫＳ遺伝子中に含まれるハイブリッドコード配列を生成するための異種モジュールコード配列の融合物（ここで異種モジュールは、天然に存在するＰＫＳ酵素において互いに近接しない２つのモジュールが互いに近接することを意味する）から、
（ｉｉｉ）天然に存在するおよび組換えの両方の非メガロミシンＰＫＳ遺伝子を含む、１つ以上の非メガロミシンＰＫＳ遺伝子とともに、１つ以上のメガロミシンＰＫＳ遺伝子の発現から、ならびに
（ｉｖ）上述の組み合わせ、
から生じ得る。これらの種々の代替物を示す本発明のハイブリッドＰＫＳのそれぞれについて、以下に説明する。
【０１６０】
融合されたモジュールを含むハイブリッドＰＫＳの例は、ハイブリッドｍｅｇＡＩ遺伝子を生成するために、メガロミシンＰＫＳのエクステンダーモジュール１および２と、ＤＥＢＳ　ＰＫＳまたはナルボノライドＰＫＳのローディングモジュール（ＰＣＴ特許出願第ＵＳ９９／１１８１４号を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）との融合から生じる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓのような適切な宿主におけるこれらの２つのハイブリッドｍｅｇＡＩ遺伝子のうちのいずれか１つと、ｍｅｇＡＩＩおよびｍｅｇＩＩＩ遺伝子との同時発現は、組換え宿主細胞において６−デオキシエリスロノライドＢ（天然のｍｅｇＡ遺伝子のポリケチド産物）を生成する本発明のハイブリッドＰＫＳの発現を生じる。これらの２つのハイブリッドｍｅｇＡＩ遺伝子のいずれか１つと、ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子との同時発現は、６−ｄＥＢの産生を生じるが、類似のナルボノライドＰＫＳ遺伝子、ｐｉｃＡＩＩ、ｐｉｃＡＩＩＩ、およびｐｉｃＡＩＶとの同時発現は、３−デオキシ−３−オキソ−６−ｄＥＢ（３−ケト−６−ｄＥＢ）の産生を生じ、強力な抗細菌活性を有する化合物のケトリドの産生において有用である。
【０１６１】
ハイブリッド分子を含むハイブリッドＰＫＳの別の例は、ｍｅｇＡＩおよびｍｅｇＡＩＩ遺伝子を、ナルボノライドＰＫＳのモジュール６のＡＣＰおよびＴＥのＡＣＴに融合されたメガロミシンＰＫＳのエクステンダーモジュール５ならびにエクステンダーモジュール６のＫＳおよびＡＴをコードするｍｅｇＡＩＩＩハイブリッド遺伝子とともに同時発現することによって、調製される。本発明の得られるハイブリッドＰＫＳは、３−ケト−６−ｄＥＢを生成する。この化合物はまた、メガロミシンＰＫＳのモジュール６のＫＲドメインが欠失されている本発明の組換えメガロミシン誘導体ＰＫＳによって調製され得る。さらに、本発明は、上述の変化が作製されたのみでなく、モジュール６のＡＴドメインがマロニル−特異的ＡＴで置き換えられたハイブリッドＰＫＳを提供する、これらのハイブリッドＰＫＳは、強力な抗生物質活性を有する化合物の、２−デスメチルケトライドを調製するにおいて有用な中間体の、２−デスメチル−３−デオキシ−３−オキソ−６−ｄＥＢを生成する。
【０１６２】
ハイブリッドＰＫＳの別の説明的な例は、まさに記載されるハイブリッドＰＫＳの後者の変化からのみ生じる本発明のハイブリッドＰＫＳを包含する。従って、ｍｅｇＡＩおよびｍｅｇＡＩＩ遺伝子と、モジュール６のＡＴドメインがマロニル特異的ＡＴによって置き換えられたハイブリッドｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子との同時発現は、組換え宿主細胞において２−デスメチル−６−ｄＥＢを生成するハイブリッドＰＫＳの発現を生じる。この化合物は、本発明の組換え宿主細胞において２−デスメチルエリスロマイシンを作製するための、ならびに２−デスメチル半合成ケトリドを作製するための、有用な中間体である。
【０１６３】
上記の多くのハイブリッドＰＫＳがメガロミシンＰＫＳタンパク質から主に構成されるが、当業者は本発明が、メガロミシンＰＫＳの小部分のみから構成されるハイブリッドＰＫＳを含む多くの異なるハイブリッドＰＫＳを提供することを認識する。例えば、本発明は、ＤＥＢＳのエクステンダーモジュール１および２に融合されるメガロミシンＰＫＳローディングモジュールをコードするハイブリッドｅｒｙＡＩ遺伝子が、ｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子とともに同時発現されるハイブリッドＰＫＳを提供する。得られるハイブリッドＰＫＳは、ネイティブなＤＥＢＳの産物の６−ｄＥＢを生成する。構築物がＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞において発現される場合（染色体における染色体取り込みを介するか、またはハイブリッドＰＫＳをコードするベクターを介するかのいずれかである）、本発明の得られる組換え宿主細胞は、エリスロマイシンを産生する。別の説明的な例は、ｍｅｇＡＩならびにｅｒｙＡＩＩおよびｅｒｙＡＩＩＩ遺伝子産物から構成される本発明のハイブリッドＰＫＳである。この構築物はまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞においてエリスロマイシンを発現するにおいて有用である。好ましい実施形態において、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞は、６−デオキシエリスロノライドＢを生成しないｅｒｙＡＩ変異体である。
【０１６４】
別の例は、ｐｉｃＡＩおよびｐｉｃＡＩＩ遺伝子の産物（ナルボノライドＰＫＳの、ローディングモジュールおよびエクステンダーモジュール１〜４、包括的、を含む２つのタンパク質）、ならびにｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子の産物から構成される本発明のハイブリッドＰＫＳである。得られるハイブリッドＰＫＳは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞においてマクロライドアグリコン３−ヒドロキシ−ナルボノライド、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞において対応するエリスロマイシンを生成する。
【０１６５】
本発明の上述のハイブリッドＰＫＳ酵素のそれぞれ、および本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素は一般に、機能的なｏｌｅＰ遺伝子産物をまた発現する宿主細胞において発現され得る。ｏｌｅＰ遺伝子は、オレアンドマイシン修飾酵素をコードし、本発明のハイブリッドＰＫＳとともの遺伝子の発現は、Ｃ−８ヒドロキシル、Ｃ−８ａ、またはＣ−８−Ｃ−８ａエポキシドが存在する本発明の化合物を提供する。
【０１６６】
ハイブリッドＰＫＳ酵素を作製するためにモジュールＰＫＳ遺伝子を操作するための組換え方法は、米国特許第５，６７２，４９１号；同第５，８４３，７１８号；同第５，８３０，７５０号；および同第５，７１２，１４６号において；ならびにＰＣＴ公開第９８／４９３１５号および９７／０２３５８号において記載され、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される。多くの遺伝子操作ストラテジーが、ポリケチドの構造が新規な天然産物（主に、エリスロマイシンのアナログ）を生成するように操作され得ることを実証するために、ＤＥＢＳを用いて使用された（本明細書中に参考として援用される、上述で参照される特許の公報、ならびにＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９９８、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３１９−３２９、およびＢａｌｔｚ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：７６−８３を参照のこと）。メガロミシンＰＫＳの活性とＤＥＢＳの活性とが類似しているので（両方のＰＫＳ酵素はマクロライドアグリコン６−ｄＥＢを生成する）、これらの方法は本発明の組換えメガロミシンＰＫＳ遺伝子に容易に適用され得る。
【０１６７】
これらの技術は：（ｉ）鎖長を制御するためのモジュールの欠失または挿入、（ｉｉ）β−炭素プロセシング工程を迂回するための還元ドメイン／脱水ドメインの不活性化、（ｉｉｉ）開始単位およびエクステンダー単位を変更するためのＡＴドメインの置換、（ｉｖ）触媒活性を導入するための還元ドメイン／脱水ドメインの付加、ならびに（ｖ）ヒドロキシル立体化学を制御するためのケトレダクターゼＫＲドメインの置換を包含する。さらに、ＤＥＢＳの操作されブロックされた変異体は、合成的に得られる開始単位を組み込んだアナログの前駆体指向性の生合成のために使用された。例えば、１００を超える新規なポリケチドが、ＤＥＢＳの複数のモジュールにおける単一のおよび組み合わせの変化を操作することによって生成された。３つまでの触媒ドメイン置換を伴うＤＥＢＳに基づくハイブリッドＰＫＳ酵素は、カセット変異誘発によって構築され、ここでは種々のＤＥＢＳドメインが、ラパマイシンＰＫＳからのドメイン（本明細書中に参考として援用される、Ｓｃｈｗｅｋｅら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２、７８３９−７８４３を参照のこと）で置き換えられるか、またはさらにもう１つのＤＥＢＳ　ＫＲドメインが欠失された。単一のドメインの機能的な置換または欠失は、２重および３重の触媒ドメイン置換を伴うＤＥＢＳ酵素を作製するために組み合わされた（本明細書中で参考として援用される、ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６、１８４６−１８５１を参照のこと）。類似のメガロミシン／ラパマイシンハイブリッドＰＫＳ酵素を提供することによって、本発明は、これらのポリケチドを作製するための代替手段を提供する。
【０１６８】
ポリケチドのライブラリーを作製するための方法は、それぞれが異なる野生型または変異体ＰＫＳ遺伝子を保有する３つ以上の相互に選択可能なプラスミドのセットとして、ＰＫＳ遺伝子をクローニングし、次いで同じ宿主に、野生型、変異体、およびハイブリッドＰＫＳコード配列を有するプラスミドの全ての可能な組み合わせを導入することによって非常に改善された（１９９９年４月１６日に出願された米国特許出願第６０／１２９，７３１号およびＰＣＴ公開公報第９８／２７２０３号を参照のこと（これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される））。この方法はまた、これは変異的な生合成によってジケチド開始単位から作製されるポリケチドを生成し得るＫＳ１°変異体の使用（本明細書中に参考として援用される、Ｊａｃｏｂｓｅｎら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７７、３６７−３６９を参照のこと）、および１２員のマクロライドに導を短縮された遺伝子または１６員のケトライドを導く伸長された遺伝子の使用を組み込み得る。さらに、メゴサミン（ｍｅｇｏｓａｍｉｎｅ）、デソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）、オレアンドロース（ｏｌｅａｎｄｒｏｓｅ）、クラジノース（ｃｌａｄｉｎｏｓｅ）、および／またはミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）についての本発明のベクターのように（任意の組み合わせにおいて）、グリコシル生合成および伝達遺伝子をコードする１つ以上のベクターをさらに利用することによって、グリコシル化されたポリケチドの大きなコレクションが調製され得る。
【０１６９】
以下の表は、本発明の組換えハイブリッドＰＫＳおよびこれをコードする対応するＤＮＡ化合物の構築において利用され得る、例示的なＰＫＳ遺伝子および対応する酵素を記載する参考文献を列挙する。また示されるのは、本発明の方法に従って用いられ得る調整（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素および対応する遺伝子を記載する種々の参考文献である。
【０１７０】
【表２】
2004513605.tif 000005
2004513605.tif 000006
2004513605.tif 000007
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅゲノムのｔｙｌＢＡ領域からの５つのチロシン生合成遺伝子の分析）
上述の表が説明するように、本発明のハイブリッドＰＫＳをコードするＤＮＡ化合物を構築する際に使用するための、ＤＮＡおよび配列情報の容易に利用可能な供給源として作用する広範に多様なＰＫＳ遺伝子がある。
【０１７１】
本発明のハイブリッドＰＫＳを構築する際に、ある一般的な方法が役立ち得る。例えば、ハイブリッドＰＫＳを作製するために変更されるモジュールのフレームワークを保持することはしばしば有益である。従って、ＤＨおよびＥＲの機能性をモジュールに付加することを所望する場合、元来のモジュールのＫＲドメインを、単にＤＨドメインおよびＥＲドメインを挿入する代わりに、別のモジュールからの同族のＫＲ、ＤＨ、およびＥＲドメインを含有するセグメントで置き換えることがしばしば好ましい。異なる立体化学を特定するモジュールからのＫＳドメインでのＫＳドメインの置換によってモジュールの立体化学的特異性を変更し得る。本明細書中で参考として援用される、Ｌａｕら、１９９９「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ｍｏｄｕｌａｒ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｏｉｃｅ　ａｎｄ　ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｆａｔｅ　ｏｆ　ｅｘｔｅｎｄｅｒ　ｕｎｉｔｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８（５）：１６４３−１６５１を参照のこと。ドメインの小さなセグメントのみを変更することによってＡＴドメインの特異性を変更し得る。Ｌａｕら、前出を参照のこと。２つの異なるＰＫＳからのモジュールを連結してハイブリッドＰＫＳを作製するためにＰＫＳタンパク質において公知のリンカー領域を利用し得る。本明細書中に参考として援用される、Ｇｏｋｈａｌｅら、１９９９年４月１６日、「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ　Ｉｎｔｅｒｍｏｄｕｌａｒ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４：４８２−４８５を参照のこと。
【０１７２】
本発明のハイブリッドＰＫＳをコードするＤＮＡ化合物は、２つを超えるＰＫＳ遺伝子のハイブリッドであり得、およびしばしばそうである。２つのみの遺伝子が使用される場合であっても、モジュールの全てまたは部分が第２の（または第３の）ＰＫＳ遺伝子に由来するハイブリッド遺伝子中に２つ以上のモジュールがしばしばある。従って、１つの説明的な例として、本発明は、メガロミシンＰＫＳの天然に存在するローディングモジュールおよびチオエステラーゼドメイン、ならびにエクステンダーモジュール１、２、４、および６を含有し、そしてさらにハイブリッドまたは異種エクステンダーモジュール３および５を含有するハイブリッドＰＫＳを提供する。ハイブリッドまたは異種エクステンダーモジュール３および５は、マロニルＣｏＡに特異的であり、および例えば、ラパマイシンＰＫＳ遺伝子に由来する、ＡＴドメインを含む。
【０１７３】
本発明はまた、ＰＫＳ遺伝子、ＰＫＳタンパク質、および最終的にポリケチドのライブラリーを提供し、ポリケチドは、生成されるタンパク質複合体が、１つ以上の点において変化された活性を有し、従ってＰＫＳの天然の産物以外のポリケチドを生成するように、メガロミシンＰＫＳにおいて改変を作製することによって構築される。従って新規なポリケチドが調製され得るか、または一般にポリケチドは、より容易に、本発明の方法を使用して、調製され得る。非常に多くの異なる遺伝子、または天然に存在するＰＫＳ遺伝子クラスターに由来する遺伝子クラスターを提供することによって、これらのそれぞれはネイティブなクラスターとは異なる方法によって修飾されており、ポリケチドの効率的なコンビナトリアルライブラリーが、これらの活性における複数の変化の結果として、生成され得る。以下にさらに記載されるように、本発明の実施形態の配分および境界は、ポリケチド、タンパク質、およびコードするヌクレオチド配列レベルに対して記載され得る。
【０１７４】
上記されるように、メガロミシンまたは他の天然に存在するＰＫＳに「由来する」モジュラーＰＫＳは、天然に存在する遺伝子の利用される部分の足場を保持するモジュラーＰＫＳ（またはその対応するコード遺伝子）を包含する。全てのモジュールが構築物中に含まれる必要はないが；構築物はまた、６つを超えるモジュールを含み得る。１つの一定の足場において、少なくとも１つの酵素的活性が、元来の（ネイティブな）ＰＫＳに関して得られるＰＫＳの活性を変化するように、変異、欠失、置換、または挿入される。これらの活性が欠失されるか、または活性の異なるバージョンによって置き換えられるか、または天然の産物以外のポリケチドはこれらの集合的な活性から生じるような方法において単に変異される場合に変化が生じる。これは、開始単位および／もしくは伸長単位、立体化学、鎖長、もしくは環化の得られる変化、ならびに／または産物のポリケチド中の対応する部位での還元もしくは脱水サイクルの結果があるので生じる。欠失された活性が置き換えられる場合、置換活性の起源は、異なって天然に存在するＰＫＳにおける対応する活性から、またはメガロミシンＰＫＳの異なる領域から生じ得る。任意のまたは全てのメガロミシンＰＫＳ遺伝子は、これらの任意の誘導体または部分に含まれ得るが、機能的なＰＫＳタンパク質の足場は、どのような誘導体が構築されても、保持される。誘導体は好ましくは、メガロミシンまたは別のＰＫＳからのチオエステラーゼ活性を含む。
【０１７５】
従って、メガロミシンＰＫＳに由来するＰＫＳは、メガロミシンＰＫＳの全てまたは部分の足場を含むＰＫＳを包含する。得られるＰＫＳはまた、機能的である少なくとも２つのエクステンダーモジュール、好ましくは３つのエクステンダーモジュール、およびより好ましくは４つ以上のエクステンダーモジュール、ならびに最も好ましくは６つのエクステンダーモジュールを含む。得られるＰＫＳはまた、メガロミシンＰＫＳの機能的なモジュールの活性の１つ以上の変異、欠失、挿入、または置換を含み、それによって得られるポリケチドの性質は、タンパク質およびＤＮＡ配列レベルの両方において変化される。特に好ましい実施形態は、ＫＳ、ＡＴ、またはＡＣＰドメインが欠失されるか、または異なるＰＫＳからの、もしくは同じＰＫＳ内の別の位置からの活性のバージョンによって置換されたものを包含する。また好ましいのは、少なくとも１つの非縮合サイクル酵素活性（ＫＲ，ＤＨ、またはＥＲ）が、欠失もしくは付加された誘導体であるか、または任意のこれらの活性のいずれかが、ＰＫＳによって合成されるポリケチドの構造を変化するように変異されている誘導体である。
【０１７６】
逆に、またメガロミシンＰＫＳに由来するＰＫＳの定義内に含まれるものは、機能的な非メガロミシンＰＫＳモジュールまたはこれらのコード遺伝子であり、ここではメガロミシンＰＫＳモジュールの少なくとも１つのドメインまたはそれについてのコード配列が挿入されている。例は、エクステンダーモジュール２についてのメガロミシンＡＴの使用であり、これは、別のＰＫＳにおけるマロニル特異的ＡＴを置き換えるために、マロニルＣｏＡではなくメチルマロニルＣｏＡ伸長単位を受容する。別の例は、ＤＮＡおよびタンパク質の両方のレベルでの、異種ＰＫＳへの非縮合サイクル酵素活性の部分、またはメガロミシン合成酵素活性の他の領域の挿入を包含する。
【０１７７】
従って、生成されるポリケチドに関して、ハイブリッドＰＫＳを構築するための少なくとも５の自由度がある。第１に、ポリケチド鎖長はＰＫＳのエクステンダーモジュールの数によって決定され、そして本発明は６つの、および６つよりも少ないかまたは多いエクステンダーモジュールを含むハイブリッドＰＫＳを包含する。第２に、ＰＫＳの炭素骨格の性質は、各部位で伸長単位の性質を決定するアシルトランスフェラーゼの特異性によって決定される（例えば、マロニル、メチルマロニル、エチルマロニル、または他の置換されたマロニル）。第３に、ローディングモジュール特異性はまた、得られるポリケチドの炭素骨格に対する効果を有する。ローディングモジュールは、アセチル、ブチリルなどのような異なる開始単位を使用し得る。上記のように、ローディングモジュール特異性を変化するための別の方法は、エクステンダーモジュール１におけるＫＳ活性（ＫＳ１）を不活性化する工程、およびエクステンダーモジュール２について、ジケチドと呼ばれる、エクステンダーモジュール１ジケチド産物の化学的に合成されたアナログである、代替の基質を提供する工程を包含する。このアプローチは、ＰＣＴ公開公報第９７／０２３５８号および同第９９／０３９８６号において説明され、本明細書中に参考として援用され、ここではＫＳ１活性は変異を介して不活性化された。第４に、ポリケチドの種々の部位での酸化状態は、モジュールのデヒドラターゼおよびレダクターゼの部分によって決定される。これは、ポリケチドにおけるケトンおよびアルコール部分、Ｃ−Ｃ二重結合、またはＣ−Ｃ単結合の存在および位置を決定する。
【０１７８】
最後に、得られるポリケチドの立体化学は、合成酵素の３つの局面の関数である。第１の局面は伸長単位として置換されたマロニルに関連するＡＴ／ＫＳ特異性に関し、これは還元サイクルが損なわれる場合、またはこれがケトレダクターゼのみを含む場合にのみ、立体化学を影響する。なぜなら、デヒドラターゼはキラリティーを回避するからである。第２に、ケトレダクターゼの特異性は、任意のβ−ＯＨのキラリティーを決定し得る。最後に、伸長単位としての置換されたマロニルについてのエノイルレダクターゼ特異性は、利用可能な完全なＫＲ／ＤＨ／ＥＲがある場合、立体化学を影響し得る。
【０１７９】
従って、モジュラーＰＫＳ系は一般に、およびメガロミシンＰＫＳ系は特に、広範囲のポリケチドが合成されることを許容する。芳香族ＰＫＳ系に比較される場合に、モジュラーＰＫＳ系は、広範囲の開始単位を受容し、脂肪族モノマー（アセチル、プロピニル、ブチリル、イソバレリルなど）、芳香族（アミノヒドロキシベンゾイル）、脂環（シクロヘキサノイル）、および複素環（チアゾリル）を包含する。あるモジュラーＰＫＳは、それらの開始単位について緩和された特異性を有する（Ｋａｏら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出）。モジュラーＰＫＳはまた、各縮合サイクルにおける伸長単位の選択に関してかなりの多様性を示す。縮合反応後のβ−ケト還元の程度は遺伝子操作によって変化され得る（Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、前出；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：７１１９−７１２３）。同様に、ポリケチド産物の大きさは、モジュールの適切な数を有する変異体を設計することによって変化され得る（Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　１１６：１１６１２−１１６１３）。最後に、モジュラーＰＫＳ酵素は特に、非常に制御された様式においてそれらの産物における不斉中心の印象的な（ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ）範囲を作製することが周知である。本発明の方法によって生成されるポリケチド、抗生物質、および他の化合物は典型的に、単一の立体異性形態である。本発明の化合物は、立体異性体の混合物として生じ得るが、個々の立体異性体を作製することがいくつかの例において有益であり得る。従って、メガロミシン、ＰＫＳ足場のような任意の天然に存在するモジュラーに基づいた、モジュラーＰＫＳ経路内の組み合わせの可能性は、事実上制限されない。
【０１８０】
ハイブリッドＰＫＳは最もしばしば、ＰＫＳコード配列の部分を「混合および適合すること」によって生成されるが、ＰＫＳをコードするＤＮＡにおける変異はまた、コードされるポリペプチドにおける活性を導入、変化、または欠失するために使用され得る。変異は、従来の技術を使用してネイティブな配列に対して作製され得る。変異のための基質は、遺伝子の完全なクラスターまたはそれらの１つもしくは２つのみであり得；変異のための基質はまた、これらの遺伝子の１つ以上の部分であり得る。変異のための技術は、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製する工程、および制限エンドヌクレアーゼ消化を使用してＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子に変異された配列を挿入する工程を包含する。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、１９８７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５：７８６を参照のこと。あるいは、変異は、ミスマッチ二重鎖の融解温度を下回る温度にて、ネイティブなヌクレオチド配列にハイブリダイズするミスマッチプライマー（一般的に１０〜２０ヌクレオチド長）を使用して達成され得る。プライマーは、比較的狭い制限内でプライマー長および塩基組成を維持することによって、ならびに配置される変異体の塩基を中心に維持することによって特異的にされ得る。ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８を参照のこと。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して達成され、産物はクローン化され、そして変異されたＤＮＡを含むクローンは、プライマーが伸長された鎖の分離によって得られ、選択される。同定は、変異されたプライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用して達成され得る。技術はまた、複数の点変異を作製するために適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：６４０９を参照のこと。ＰＣＲ変異誘発はまた、所望される変異を達成するために使用され得る。
【０１８１】
酵素活性をコードするヌクレオチド配列の選択された部分のランダムな変異誘発はまた、本発明の方法に従って、当該分野において公知のいくつかの異なる技術によって、例えば、プラスミドにオリゴヌクレオチドリンカーをランダムに挿入することによって、Ｘ線もしくは紫外線光での照射によって、インビトロＤＮＡ合成の間に不正確なヌクレオチドを組み込むことによって、エラー傾向性ＰＣＲ変異誘発によって、合成変異体を調製することによって、または化学製品でインビトロでプラスミドＤＮＡを損傷することによって達成され得る。化学的変異原は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ニトロソグアニジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸のような塩基を損傷または除去し、それによって正常な塩基対合を妨げる薬剤、５−ブロモウラシル、２−アミノプリンのようなヌクレオチド前駆体のアナログ、またはプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンのようなアクリジン挿入化剤などを包含する。一般に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは化学変異原で処理され、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換され、そして変異体プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖される。
【０１８２】
本発明のハイブリッドＰＫＳを構築するにおいて、酵素活性をコードする領域、すなわち、異なるＰＫＳ合成酵素からのまたは同じＰＫＳにおける異なる位置からの対応する活性をコードする領域は、例えば、適切なプライマーを用いるＰＣＲ技術を使用して回復され得る。「対応する」活性をコードする領域によって、同じ一般のタイプの活性をコードする領域が意味される。例えば、遺伝子クラスターの１つの位置にてコードされるＫＲ活性は、遺伝子クラスターにおいて別の位置における、または異なる遺伝子のクラスターにおけるＫＲコード活性に「対応する」。同様に、完全なレダクターゼサイクルは、対応することが考慮され得る。例えば、ＫＲ／ＤＨ／ＥＲは、ＫＲ単独に対応し得る。
【０１８３】
宿主ＰＫＳにおける特定の標的領域の置き換えが作製されるべきである場合、この置き換えは適切な制限酵素を使用してインビトロで行われ得る。置き換えはまた、組換え技術を使用してインビボで達成され得、ドナープラスミドにおける置き換え遺伝子およびレシピエントプラスミドにおけるレセプター領域をフレーム化する相同配列を包含する。異なる温度感受性のプラスミドを有利に包含するこのような系は、例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９６／４０９６８号において記載され、本明細書中に参考として援用される。宿主ＰＫＳ遺伝子における酵素活性を置き換えるための、または宿主ＰＫＳ遺伝子のこれらの領域における変異を支持するための、種々の操作を行うために使用されるベクターは、コード配列の発現が適切な宿主において達成され得るような様式において、得られるコード配列に作動可能に連結される制御配列を含むように選択され得る。
【０１８４】
しかし、単純なクローン化ベクターが同様に使用され得る。得られるＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子を得るために用いられるクローニングベクターが、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現のための制御配列を欠損する場合、ヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターに挿入される。これは個々になされる必要はなく、単離されたコードヌクレオチド配列のプールは、発現ベクターに挿入され得、得られるベクターは、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして得られる細胞は、個々のコロニーにプレートされる。本発明は、メガロミシンＰＫＳのドメインおよびモジュールについての種々のコード配列が天然に存在しない制限酵素認識部位によって隣接される多様な組換えＤＮＡ化合物を提供する。
【０１８５】
種々のＰＫＳヌクレオチド配列は、１つ以上の組換えベクターに、別々の制御エレメントとともに、または例えば、単一のプロモーターの制御下で、個々のカセットとしてクローン化され得る。ＰＫＳサブユニットコード領域は、他のＰＫＳサブユニットをコードする配列の容易な欠失および挿入を許容するための隣接する制限部位を含み得、それによってハイブリッドＰＫＳが作製され得る。このような独特な制限部位の設計は当業者に公知であり、そして部位特異的変異誘発およびＰＣＲのような、上記の技術を使用して達成され得る。
【０１８６】
異なるポリケチドの生成のための種々のＰＫＳ酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターは、次いで、ライブラリーを構築するために適切な宿主細胞に形質転換される。１つの直接的なアプローチにおいて、このようなベクターの混合物が、選択された宿主細胞に形質転換され、そして得られる細胞は個々のコロニーにプレートされ、そして首尾よい形質転換体を同定するために選択される。各個々のコロニーは、特定のＰＫＳ合成酵素、および最終的に特定のポリケチドを生成する能力を有する。典型的に、いくつかの、ほとんどの、または全てのコロニーにおける重複があり；各メンバーコロニーにおいて異なるＰＫＳを含む形質転換されたコロニーのサブセットは、ライブラリーを考慮される。あるいは、発現ベクターは、宿主を形質転換するために個々に使用され得、この形質転換された宿主は次いで、ライブラリーにアセンブリされる。多様なストラテジーが、天然に存在する宿主遺伝子クラスターに由来するＰＫＳ遺伝子クラスターをそれぞれが含むコロニーの多様性を得るために利用可能であり、それによってライブラリーにおける各コロニーは、異なるＰＫＳおよび最終的には異なるポリケチドを生成する。ライブラリーによって生成される異なるポリケチドの数は典型的に少なくとも４つ、より典型的には少なくとも１０個、および好ましくは少なくとも２０個、およびより好ましくは少なくとも５０個であり、異なる変化されたＰＫＳ遺伝子クラスターおよびＰＫＳ遺伝子産物の類似の数を反映する。ライブラリーにおけるメンバーの数は恣意的に選択されるが；開始、伸長単位、立体化学、酸化状態、および鎖長のバリエーションに関して上述で概説される自由度の程度は、非常に大きなライブラリーの作製を可能にする。
【０１８７】
本発明の組換えベクターを適切な宿主に導入するための方法は、当業者に公知であり、および典型的に、ＣａＣｌ２または他の２価カチオンのような試薬、リポフェクチン、ＤＭＳＯ、プロトプラスト、形質転換、結合、感染、トランスフェクション、およびエレクトロポレーションの使用を包含する。ポリケチドを生成するコロニーは、公知の技術を使用して同定および単離され得、そして生成されるポリケチドはさらに、特徴付けられる。これらのコロニーによって生成されるポリケチドは、ライブラリーを示すパネルにおいて集合的に使用され得るか、または活性について個々に評価され得る。
【０１８８】
従って、本発明のライブラリーは、４つのレベルで考慮され得る：（１）異なるＰＫＳコード配列をそれぞれ伴うコロニーの多様性；（２）コード配列から生成されるタンパク質；（３）機能的なＰＫＳにアセンブリされるタンパク質から生成されるポリケチド；および（４）ポリケチドに由来する他の所望される活性を有する抗生物質または化合物。もちろん、組み合わせのライブラリーがまた構築され得、ここでは例えば、メガロミシンＰＫＳに由来するライブラリーのメンバーは、例えば、ラパマイシンＰＫＳまたはＤＥＢＳに由来するのと同じライブラリーの一部分として考慮され得る。
【０１８９】
ライブラリーにおけるコロニーは、関連の合成酵素を生成するために、および従ってポリケチドのライブラリーを得るための関連のポリケチドを生成するために、誘導される。培地中に分泌されるポリケチドは、レセプター、シグナル伝達タンパク質などのような所望の標的を結合することについてスクリーニングされ得る。上清自身がスクリーニングのために使用さ得るか、またはポリケチドの部分的なもしくは完全な精製が最初に達成され得る。典型的に、このようなスクリーニング方法は、レセプターまたは他の標的リガンドへのライブラリーの各メンバーの結合を検出することを包含する。結合は、直接的に、または競合アッセイを介するかのいずれかで検出され得る。結合についてのこのようなライブラリーをスクリーニングするための手段は、当該分野において周知であり、および本発明の方法に従って適用され得る。あるいは、ライブラリーの個々のポリケチドメンバーは、所望される標的に対して試験され得る。この事象において、標的の生物学的応答が測定されるスクリーニングは、より容易に含まれ得る。抗生物質活性は、本明細書中に参考として援用されるＬｅｈｒｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３７：１６７−１７３において、および以下の実施例において記載されるアッセイのような典型的なスクリーニングアッセイを使用して、確認され得る。
【０１９０】
本発明は、非常に多くのポリケチドの調製のための方法を提供する。これらのポリケチドは、上記のように、ヒドロキシル化反応、エポキシ化反応、およびグリコシル化反応を介した、抗生活性または他の活性を有する化合物の形成において有用な中間体である。一般に、ＰＫＳのポリケチド産物は、強力な抗生物質活性を示すように典型的にヒドロキシル化およびグリコシル化によってさらに修飾されなくてはならない。ヒドロキシル化は、Ｃ−６にヒドロキシル基を含む本発明の新規なポリケチドを生じる（これはｅｒｙＦ遺伝子によってコードされるヒドロキシラーゼを使用して達成され得る）、および／またはＣ−１２で（これはｐｉｃＫまたはｅｒｙＫ遺伝子によってコードされるヒドロキシラーゼを使用して達成され得る）。また、ｏｌｅＰ遺伝子は、組換えの形態において利用可能であり、これは任意の宿主細胞においてｏｌｅＰ遺伝子産物を発現するために使用され得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞またはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞のような宿主細胞は、ｏｌｅＰを発現するように改変され、従ってオレアンドマイシンに存在するＣ−８−Ｃ−８ａエポキシドを含むポリケチドを生成するために使用され得る。従って、本発明はこのような修飾されたポリケチドを提供する。それぞれの位置でのヒドロキシル基の存在は、得られる化合物の抗生物質活性を、そのヒドロキシル化されていない対応物に比較して増強し得る。
【０１９１】
ポリケチドグリコシル化するための方法は一般に当該分野において公知であり、および本発明の方法に従って適用され得；グリコシル化は適切なグリコシル化酵素を提供することによって細胞内で達成され得るか、または本明細書中および本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開公報第ＷＯ９８／４９３１５号において記載されるような化学的合成手段を使用して、インビトロで達成され得る。好ましくはデソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）、および／またはメゴサミン（ｍｅｇｏｓａｍｉｎｅ）でのグリコシル化は本発明によって提供される組換え宿主細胞において本発明の方法に従って達成される。一般に、グリコシル化を達成するためのアプローチは、ヒドロキシル化に関して上記されるアプローチを反映する。ネイティブな供給源から単離された、または組換え的に生成された、精製された酵素は、インビトロで使用され得る。あるいは、および注記されるように、グリコシル化は内因性または組換え的に生成される細胞内グリコシラーゼを使用して細胞内で達成され得る。さらに合成化学方法が、用いられ得る。
【０１９２】
抗生物質モジュラーポリケチドは、多くの異なる糖のいずれかを含み得るが、Ｄ−デソサミンまたはその密接なアナログが最も一般的である。エリスロマイシン、ピクロマイシン、メガロミシン、ナルボマイシン、およびメチマイシンはデソサミンを含む。エリスロマイシンはまた、Ｌ−クラジノース（３−Ｏ−メチルミカロース）を含む。チロシンは、ミカミノース（４−ヒドロキシデソサミン）、ミカロース、および６−デオキシ−Ｄ−アロースを含む。２−アセチル−１−ブロモデソサミンは、Ｍａｓａｍｕｎｅら、１９７５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７：３５１２−３５１３により、ポリケチドをグリコシル化するためのドナーとして使用された。他の明らかにより安定なドナーは、グリコシルフッ化物、チオ配糖体、およびトリクロロアセトイミデートを含む；Ｗｏｏｄｗａｒｄら、１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３２１５；Ｍａｒｔｉｎら、１９９７、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：３１９３；Ｔｏｓｈｉｍａら、１９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３７１７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２９：３５７５を参照のこと。グリコシル化はまた、開始材料としてポリケチドアグリコンを使用して、および変換させるためにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｎｅｚｕｅｌａｅまたは他の宿主細胞を使用して、好ましくは先行する節において記載されるようにマクロライドを合成し得ない変異体を使用して、達成され得る。
【０１９３】
従って、広範に多様なポリケチドが、本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素によって生成され得る。これらのポリケチドは、以下の節において記載されるように、抗生物質としておよび他の有用な化合物の合成における中間体として、有用である。
【０１９４】
（第ＶＩＩ節：複数の発現ベクターを含有する宿主細胞）
本発明の組換え宿主細胞は、メガロミシンＰＫＳドメイン、モジュール、もしくはタンパク質、または単一の遺伝子座での（例えば、単一のプラスミドにおける、もしくは単一の染色体遺伝子座での）、または異なる遺伝子座（例えば、別々のプラスミドおよび／もしくは染色体遺伝子座での）メガロミシン改変酵素をコードする核酸を含み得る。「複数の」によって、２つ以上が意味され；「ベクター」によって宿主系を形質転換するために使用され得る、ならびにプロモーターおよび必要に応じて選択マーカーおよび発現を調節する任意の他の適切な配列の制御下でコード配列を含む独立した発現系を含む、核酸分子を意味する。典型的なこのようなベクターはプラスミドであるが、ファージミド、コスミド、ウイルスベクターなどのような他のベクターが、宿主の性質に従って使用され得る。もちろん、別々のベクターの１つ以上が、宿主の染色体に取り込まれ得る（選択は、取り込まれたベクターの維持に必要とされないかもしれない）。
【０１９５】
１つの実施形態において、本発明は組換え宿主細胞を提供し、これは少なくとも２つの自己複製される組換えＤＮＡ発現ベクターを含み、当該ベクターのそれぞれは、プロモーターに作動可能に連結される、メガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン修飾酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む。別の実施形態において、本発明は、組換え宿主細胞を提供し、これは少なくとも１つの自己複製する組換えＤＮＡ発現ベクターおよび少なくとも１つの改変された染色体を含み、当該ベクターのそれぞれ、および当該改変された染色体のそれぞれは、プロモーターに作動可能に連結される、メガロミシンＰＫＳドメインまたはメガロミシン修飾酵素をコードする組換えＤＮＡ化合物を含む。好ましくは、自己複製する組換えＤＮＡ発現ベクターおよび／または修飾された染色体はさらに、異なる選択マーカーを含む。
【０１９６】
上述の複数のベクター（染色体）発現系はまた、異種ポリケチド生合成酵素を発現するために、例えば、同じ宿主細胞において、他の起源からのＰＫＳタンパク質、モジュール、もしくはドメイン、または修飾酵素とともに、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａのメガロミシンＰＫＳタンパク質、モジュール、もしくはドメイン、またはメガロミシン修飾酵素を発現するために、使用され得る。異なる発現ベクターに対する種々の活性を配置することによって、高い程度の改変が効率的な様式において達成され得る。多様な宿主が使用され得；複数のベクターを維持し得る任意の適切な宿主細胞が容易に使用され得る。好ましい宿主は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の放線菌、および植物細胞を包含し、ならびに哺乳動物もしくは昆虫細胞または他の適切な組換え宿主がまた使用され得る。酵母株の中で好ましいのは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓである。好ましい放線菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種々の株を包含する。
【０１９７】
ポリケチドを天然で生成しない宿主細胞を使用することを選択する場合、組換え宿主細胞がまた、アシルキャリアタンパク質のパンテトエイニレーション（ｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を達成するホロＡＣＰ合成酵素活性を含むように改変されることを確実にする必要があり得る。本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ公開公報第ＷＯ９７／１３８４５号を参照のこと。複数のベクターのうちの１つがこの目的のために使用され得る。この活性化工程は、ＡＣＰの活性化に必要である。ホロＡＣＰ合成酵素についての発現系は、ＰＫＳコード配列を保有するベクターとは別のベクター上に供給され得るか、同じベクター上に供給され得るか、または宿主の染色体に取り込まれ得るか、またはポリケチド合成酵素の全てまたは１部分を有する融合タンパク質についての発現系として供給され得る（米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）。
【０１９８】
いくつかの組換え宿主において、このような修飾を有するポリケチドが所望される場合、合成後修飾を介して、産生されるポリケチドを活性化することが必要であり得ることが注意されるべきである。これが特定の宿主についての場合である場合、宿主は、これらの修飾を達成するために必要なそれらの酵素を含むように、例えば形質転換によって、改変される。このような酵素の１つは、例えば、グリコシル化酵素である。複数のベクターの使用は、このような酵素についての発現系の導入を容易にし得る。
【０１９９】
好ましい実施形態において、複数のベクター系は、ポリケチドおよびそれらを生成するＰＫＳ／修飾酵素のコンビナトリアルライブラリーを迅速におよび効率的にアセンブリするために使用される。例示的な実施形態において、複数のベクター系は、４つの異なるベクターを含み、１つはｍｅｇＡＩ遺伝子、１つはｍｅｇＡＩＩ遺伝子、１つはｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子、および１つは修飾酵素の遺伝子を含む。これらのベクターのそれぞれは、ベクターのセットを作製するために修飾され得る。例えば、１つのセットは、ｍｅｇＡＩ遺伝子産物のローディングならびに第１および第２のエクステンダーモジュールにおける全ての可能なＡＴ置換を含み得た。別のセットは、多様な異なる修飾酵素についての発現系を含み得た。これらの４つのベクターのセットを用いて、および各セットの各メンバーと、他の３つのセットの各メンバーとを組み合わせることによって、細胞、ベクターセット、およびポリケチドの非常に大きなライブラリーが、迅速におよび効率的にアセンブリされ得る。
【０２００】
メガロミシンＰＫＳのようなモジュラーＰＫＳの組み合わせの可能性（異なる修飾酵素系のさらなる可能性は無視する）は、ＡＴＬＸ（ＡＴＥＸ４）Ｍによって最小に与えられ、ここでＡＴＬはローディングアシルトランスフェラーゼの数であり、ＡＴＥは伸長アシルトランスフェラーゼの数であり、Ｍは遺伝子クラスターにあるモジュールの数である。番号４は式に存在する。なぜならこれはケト基が１）反応なし；２）ＫＲ活性単独；ＫＲ＋ＤＨ活性；または４）ＫＲ＋ＤＨ＋ＥＲ活性のいずれかによって修飾され得る方法の数を示すからである。エリスロマイシンＰＫＳの最初の２つのモジュールのみの発現が、予測される短縮されるトリケチド生成物の生成を生じることが示された（Ｋａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１６：１１６１２−１１６１３（１９９４）を参照のこと）。メチマイシンアグリコンに類似する新規な１２員のマクロライドが、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおけるこのＰＫＳのモジュール１〜５の発現によって生成された（Ｋａｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１７：９１０５−９１０６（１９９５）を参照のこと）。この研究は、ＰＫＳモジュールが機能的に独立し、それによってラクトン環の大きさが存在するモジュールの数により制御され得ることを示す。
【０２０１】
モジュールの数を制御することに加えて、例えば、Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：６７５−６７９（１９９１）；およびＤｏｎａｄｉｏら、Ｇｅｎｅ、１１５：９７−１０３（１９９２）によって記載されるように、ケトレダクターゼドメインの欠失によってモジュールは遺伝的に改変され得る。さらに、エノイルレダクターゼドメインの変異は、Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：７１１９−７１２３（１９９３）によって報告された。これらの改変はまた、改変されたＰＫＳ、従って改変されたポリケチドを生じた。
【０２０２】
上述のように、本発明において、天然において見出されるメガロミシンＰＫＳ系に由来する触媒活性についてのコード配列は、それらのネイティブな形態において使用され得るか、または活性を欠失もしくは減少するために、または元来存在しないモジュールに活性を導入するために、標準的な変異誘発技術によって改変され得る。例えば、ＫＲ活性は、その機能を通常は欠損するモジュールに導入され得る。
【０２０３】
本明細書中の本発明の１つの実施形態において、単一の宿主細胞は、ベクターの多様度を含むように改変され、各ベクターは、メガロミシンＰＫＳおよび修飾酵素（もしあれば）系の合成の一部に寄与する。メガロミシンＰＫＳ系の生成のための複数のベクターのそれぞれは典型的に、少なくとも２つのモジュールをコードし、そしてベクターのうちの少なくとも１つは宿主の染色体に取り込まれる。取り込みは適切なファージもしくは取り込みベクターを使用して、または相同組換えによって達成され得る。相同組換えが使用される場合、取り込み事象はまた、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９５／０８５４８号において記載されるように、染色体中にある内因性ＰＫＳ遺伝子を欠失するように設計され得る。これらの実施形態においてまた、ハイグロマイシンまたはチオストレプトン耐性のような選択マーカーが、取り込みを達成するベクターに含まれ得る。
【０２０４】
上記のように、メガロミシンＰＫＳにおける酵素系に対して翻訳後修飾を達成するさらなる酵素が、適切な組換え発現系を介して宿主に導入され得る。さらに、例えば、グリコシル化を介してポリケチド自身を活性化する酵素が付加され得る。ポリケチド生合成において利用される特定の基質の多くを生成するように細胞を改変することがまた、所望され得る。例えば、酵母におけるマロニルＣｏＡレベルは、メチルマロニルＣｏＡよりも高いことが一般的に考えられ；酵母が宿主として選択される場合、メチルマロニルＣｏＡレベルを、それについての１つ以上の生合成酵素を付加することによって増加することが所望され得る。
【０２０５】
複数のベクター発現系がまた、第１のモジュールにおいて不活性化されたケトシンターゼ（ＫＳ）を含むＰＫＳへの合成開始単位の付加によって生成されるポリケチドを作製するために使用され得る。上記のように、Ｊａｃｏｂｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：３６７−３６９（１９９７）によって記載されるように、この改変は、系が、３−ヒドロキシ−２−メチルパントン酸−Ｎ−アセチルシステアミンチオエステルのような適切なジケチドチオエステル、またはジケチドアナログの類似のチオエステルを取り込むことを許容する。不活性化されたケトシンターゼ領域を含有するＰＫＳモジュールの構築は本発明の方法に従って、それぞれが本明細書中に参考として援用される、米国特許第６，０８０，５５５号およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ９９／０３９８６号および同第９７／０２３５８号において記載される方法のような、当該分野において公知の方法によって行われ得る。
【０２０６】
複数のベクター発現系は、ポリケチドを生成するために、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母のような、通常はこれを生成しない宿主において使用され得る。これはまた、Ｅ．ｃｏｌｉもしくは酵母宿主において、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような他のより伝統的に使用される宿主において、導入されたＰＫＳのエレメントを供給することによって多様なポリケチド産物を提供するためのより効果的な手段を提供する。本発明はまた、本発明の方法を使用して調製されるポリケチドのライブラリーを包含する。
【０２０７】
（第ＶＩＩＩ節：化合物）
本発明の方法および組換えＤＮＡ化合物は、ポリケチドの生成において有用である。１つの重要な局面において、本発明は、エリスロマイシン、強力な抗生物質化合物に構造において関連される抗生物質化合物を作製するための手段を提供する。本発明はまた、新規なケトライド化合物、細菌の抗生物質耐性株に対する活性に起因する有意な目的の強力な抗生物質活性を有するポリケチド化合物を提供する。Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、１９９６、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４９：４６５−４７７号を参照のこと、本明細書中に参考として援用される。今日調製される全てでなくても大部分のケトライドは、エリスロマイシンＡ、６−ｄＥＢの誘導体を、中間体として使用して、合成される。１つの実施形態において、本発明は、抗生物質としての使用のための、メガロミシンの３−ケト誘導体を提供する。特に、メガロミシンＡの３−ケト誘導体は、本発明の好ましいケトライドである。これらの化合物は、先行技術において記載されるケトライドを作製するための手順に実質的に従って、化学的に、またはメゴサミンおよびデソサミン生合成およびトランスフェラーゼ遺伝子が存在するが、ミカロース部分を作製またはトランスファーしない、ならびに／もしくはＰＫＳがエクステンダーモジュール６のＫＲドメインを欠失するように改変された、本発明の組換え宿主細胞において、作製され得る。本発明はまた、伝統的な６−ｄＥＢおよびエリスロマイシン由来のケトライド化合物を調製するにおいて有用な中間体を作製するための方法を提供する。Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、前出；Ａｇｏｕｒｉｄａｓら、１９９８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４０８０−４１００、米国特許第５，７７０，５７９号；同第５，７６０，２３３号；同第５，７５０，５１０号；同第５，７４７，４６７号；同第５，７４７，４６６号；同第５，６５６，６０７号；同第５，６３５，４８５号；同第５，６１４，６１４号；同第５，５５６，１１８号；同第５，５４３，４００号；同第５，５２７，７８０号；同第５，４４４，０５１号；同第５，４３９，８９０号；同第５，４３９，８８９号；ならびにＰＣＴ公開公報第ＷＯ９８／０９９７８号および同第９８／２８３１６号を参照のこと、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される。
【０２０８】
上記のように、本発明のハイブリッドＰＫＳ遺伝子は、デソサミン、メゴサミン、および／またはミカロース生合成遺伝子および対応するトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに必要とされるヒドロキシラーゼ遺伝子（これは例えば、そして制限を伴わずに、ｐｉｃＫ、ｍｅｇＫ、もしくはｅｒｙＫ（Ｃ−１２位について）および／またはｍｅｇＦ、ｏｒｅｒｙＦ（Ｃ−６位について）のいずれかであり得る）を含む宿主細胞において発現され得る。得られる化合物は、抗生物質活性を有するが、改善されたまたはそうでなければ所望の特性を有する所望される化合物を生じるために、上述で参照される特許公報において記載されるように、さらに改変され得る。あるいは、アグリコン化合物は、組換え宿主細胞において生成され得、そして所望されるグリコシル化およびヒドロキシル化工程は、インビトロまたはインビボで行われ得、後者の場合において、上記のように変換する細胞にアグリコンを供給することによる。
【０２０９】
従って、本発明の化合物はＣ−６もしくはＣ−１２のいずれかで、または両方でヒドロキシル化される、以下の式（１）において記載されるポリケチドの、必要に応じてグリコシル化された形態である。式（１）の化合物は、モジュラーＰＫＳのローディングおよび６つのエクステンダーモジュールを使用して調製され得るか、改変され得るか、または本明細書中で記載されるようなハイブリッド形態において調製され得る。これらのポリケチドは式：
【０２１０】
【化１】
2004513605.tif 000008
を有し、そのグリコシル化されたおよび単離された立体異性体の形態を包含し；
ここでＲ＊は、１〜１５Ｃの直鎖、分岐鎖、または環状の、飽和されたまたは不飽和の、置換されたまたは未置換のヒドロカルビルであり；
Ｒ１〜Ｒ６のそれぞれは独立して、Ｈまたはアルキル（１〜４Ｃ）であり、ここでＲ１での任意のアルキルは必要に応じて置換され得；
Ｘ１〜Ｘ５のそれぞれは独立して、２つのＨ、ＨおよびＯＨ、もしくは＝Ｏであるか；または
Ｘ１〜Ｘ５のそれぞれは独立してＨであり、そして式（２）の化合物は、２−３、４−５、６−７、８−９、および／または１０−１１にて当該Ｘの位置に隣接する環中に、二重結合を含み；
但し：
Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つはアルキル（１から４Ｃ）である。
【０２１１】
式２を含む好ましい化合物は、Ｒ１〜Ｒ５のうちの少なくとも３つがアルキル（１〜４Ｃ）、好ましくはメチルまたはエチルである化合物であり；より好ましくはここでＲ１〜Ｒ５のうちの少なくとも４つは、アルキル（１〜４Ｃ）、好ましくはメチルまたはエチルである化合物である。また好ましいのは、Ｘ２が２つのＨ、＝Ｏ、もしくはＨおよびＯＨであり、ならびに／またはＸ３がＨであり、ならびに／またはＸ１がＯＨであり、ならびに／またはＸ４がＯＨであり、ならびに／またはＸ５がＯＨである化合物である。また好ましいのは、Ｒ１〜Ｒ５がメチルであり、Ｘ２が＝Ｏであり、そしてＸ１、Ｘ４、およびＸ５がＯＨである場合に、可変性のＲ＊を伴う化合物である。上述のグリコシル化された形態（すなわち、Ｃ−３でのミカロースもしくはクラジノース、Ｃ−５でのデソサミン、および／またはＣ−６でのメゴサミン）はまた好ましい。
【０２１２】
上記のように、有用な活性を伴うか、または有用な活性を有するように容易に改変され得る化合物を提供するための本明細書中に記載される生物体のような、化合物を改変し得る広範に多種の多様な生物体が存在する。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａは、６−ｄＥＢを多様な有用な化合物に変換し得る。本発明によって提供される化合物は、以下の実施例において提供される手順に従って、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａの培養物に提供され得、そしてエリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの対応する誘導体に変換され得る。所望される化合物のみが生成されることを確実にするために、６−ｄＥＢを生成し得ないが、所望の変換をなお行い得るＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ｅｒｙＡ変異体を使用し得る（Ｗｅｂｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（１）：４２５−４３３）。また、好ましい化合物を達成するために、ｅｒｙＢ、ｅｒｙＣ、ｅｒｙＧ、および／もしくはｅｒｙＫ変異体のような他の変異体株、または複数の遺伝子における変異を有する変異体株を用い得る。変換はまた、商業的な生成のために大きな発酵器において行われ得る。エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ，およびＤのそれぞれは抗生物質活性を有するが、エリスロマイシンＡは最も高い抗生物質活性を有する。さらに、これらの化合物のそれぞれは、温和な酸での処理の下で、モチライド活性を有するＣ−６からＣ−９のヘミケタールを形成し得る。モチライド活性を有するヘミケタールの形成のために、Ｃ−１２ヒドロキシルの存在が、Ｃ−９とＣ−１２との間に形成されるヘミケタールを有する不活性な化合物の形成を許容するので、エリスロマイシンＢ、Ｃ、およびＤは好ましい。
【０２１３】
従って、本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａおよびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの変異体株に内因性の酵素の作用による本発明の化合物のヒドロキシル化およびグリコシル化によって生成される化合物を提供する。このような化合物は、抗生物質としてまたはモチライドとして、直接的にまたは化学修飾後に有用である。抗生物質として使用するために本発明の化合物は、さらなる化学修飾を伴わずに直接的に使用され得る。エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは全て、抗生物質活性を有し、そしてＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａによって修飾される化合物から生じる本発明の対応する化合物はまた、抗生物質活性を有する。しかし、これらの化合物は、強力な抗生物質活性を伴う本発明の他の化合物を提供するために、化学的に修飾され得る。例えば、Ｃ−６ヒドロキシルでのエリスロマイシンのアルキル化は、強力な抗生物質（クラリスロマイシンはＣ−６−Ｏ−メチルである）を生成するために使用され得、他の有用な修飾は、例えば、Ｇｒｉｅｓｇｒａｂｅｒら、１９９６、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４９：４６５−４７７、Ａｇｏｕｒｉｄａｓら、１９９８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４０８０−４１００、米国特許第５，７７０，５７９号、同第５，７６０，２３３号；同第５，７５０，５１０号；同第５，７４７，４６７号；同第５，７４７，４６６号；同第５，６５６，６０７号；同第５，６３５，４８５号；同第５，６１４，６１４号；同第５，５５６，１１８号；同第５，５４３，４００号；同第５，５２７，７８０号；同第５，４４４，０５１号；同第５，４３９，８９０号；同第５，４３９，８８９号；ならびにＰＣＴ公開公報第ＷＯ９８／０９９７８号および同第９８／２８３１６号に記載され、これらのそれぞれは本明細書中に参考として援用される。
【０２１４】
モチライドとしての使用のために、本発明の化合物はさらなる化学修飾を伴わずに直接的に使用され得る。エリスロマイシンおよび特定のエリスロマイシンアナログは、移動する運動複合体の第３相を誘導するために、ＧＥＲＤを伴う患者において食道蠕動およびＬＥＳ圧を増加するために、胃不全麻痺を伴う患者において胃の空化を加速するために、ならびに胆石除去後の患者においておよび自律神経障害を伴う糖尿病患者において胆嚢収縮を刺激するために、プロカイネティックな薬剤として臨床学的に使用され得るモチラインレセプターの強力なアゴニストである。Ｐｅｅｔｅｒｓ、１９９９、Ｍｏｔｉｌｉｄｅ　Ｗｅｂ　Ｓｉｔｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｋｕｌｅｕｖｅｎ．ａｃ．ｂｅ／ｍｅｄ／ｇｉｈ／ｍｏｔｉｌｉｄ．ｈｔｍ、およびＯｍｕｒａら、１９８７、Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ　ｗｉｔｈ　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｍｏｔｏｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１９４１−３を参照のこと）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａによって修飾される本発明の化合物から生じる本発明の対応する化合物はまた、特に変換後に、モチライド活性を有し、これはまた、温和な酸での処理によってＣ−６〜Ｃ−９ヘミケタルに対して、インビボで生じ得る。Ｃ−１２ヒドロキシルを欠損する化合物は特に、モチリンアゴニストとしての使用のために好ましい。しかし、これらの化合物はまた、強力なモチライド活性を有する本発明の他の化合物を提供するために、さらに化学的に修飾され得る。
【０２１５】
さらに、およびまた上記されるように、本発明の化合物をヒドロキシル化および／またはグリコシル化するために用いられ得る他の有用な生物が存在する。上記のように、生物体は、その生物体で通常生成されるポリケチドを生成し得ない変異体であり得、発酵はプレート上でまたは大きな発酵器において、行われ得、そして生成される化合物は、発酵の後に化学的に変化され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａに加えて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓがまた使用され得る。抗生物質活性に加えて、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ酵素での処理によって生成される本発明の化合物は、駆虫活性を同様に有し得る。従って本発明は、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓに内因性の酵素の作用によるヒドロキシル化およびグリコシル化によって生成される化合物を提供する。
【０２１６】
本発明はまた、目的の宿主細胞において直接的に本発明のグリコシル化されたおよび／またはヒドロキシル化された化合物を生成するための方法および遺伝子構築物を提供する。従って、本発明の組換え遺伝子は、異種ＰＫＳ遺伝子からの遺伝子フラグメントでのｍｅｇＡ遺伝子フラグメントの置換を含む、１つ以上の欠失および／または挿入を伴う組換えｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、ｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子を含み、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓにおいて、コードされる遺伝子産物の発現に適切な発現ベクター上に含まれ得る。
【０２１７】
本発明の化合物は、他のポリケチドの生成について当該分野において公知の条件下で本発明の宿主細胞を増殖および発酵することによって生成され得る。本発明の化合物は、これらの培養された細胞の発酵ブロスから単離され得、そして標準的な手順によって精製され得る。化合物は本発明の薬学的組成物を提供するために容易に処方され得る。本発明の薬学的組成物は、薬学的調製物の形態において、例えば、固体、半固体、または液体の形態において、使用され得る。この調製物は、外部の、経腸的な、または非経口的な適用に適切な有機性または無機性のキャリアまたは賦形剤との混合物中の有効成分として本発明の化合物の１つ以上を含む。有効成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、座薬、溶液、乳濁液、懸濁液、および使用のために適切な任意の他の形態について、通常非毒性の、薬学的に受容されるキャリアとともに配合され得る。
【０２１８】
使用され得るキャリアは、水、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、および調製物を製造するにおける使用に適切な他のキャリアを、固体、半固体、または液体形態で包含する。さらに、補助安定化剤、増粘剤、着色剤、香料を使用することができる。例えば、本発明の化合物は、本明細書中に参考として援用される、米国特許第４，９１６，１３８号において記載されるように本質的にヒドロキシプロピルメチルセルロースとともに、または本明細書中に参考として援用されるＥＰＯ、特許公報第４２８，１６９号において記載されるように本質的に界面活性剤と共に、利用され得る。
【０２１９】
経口投薬形態は、本明細書中に参考として援用される、Ｈｏｎｄｏら、１９８７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ＸＩＸ、増刊．６：１７−２２によって記載されるように本質的に調製され得る。外部適用のための投薬形態は、本明細書中に参考として援用される、ＥＰＯ特許出願第４２３，７１４号において記載されるように本質的に調製され得る。活性な化合物は、疾患プロセスまたは状態に対する所望の効果を生じるのに十分な量において薬学的組成物中に含まれる。
【０２２０】
感染によって引き起こされる状態および疾患の処置のために、本発明の化合物は、従来の非速毒性の薬学的に受容されるキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含有する投薬単位処方物において、経口的に、局所的に、非経口に、吸入スプレイによって、または直腸的に、投与され得る。用語非経口は、本明細書中で使用されるように、皮下注射、静脈内、筋肉内、および胸骨内注射または注入技術を包含する。
【０２２１】
本発明の化合物の投薬レベルは、約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の桁である。投薬レベルは、上記の状態の処置において有用である（約０．７ｍｇ〜約３．５ｍｇ／患者／日、７０ｋｇの患者を想定する）。さらに、本発明の化合物は、間欠的な基準で、すなわち、半週、１週、半月、または１ヶ月の間隔にて、投与され得る。
【０２２２】
単一の投薬形態を生成するためにキャリア材料とを組み合わせられ得る有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定の態様に依存して変化する。例えば、ヒトへの経口投与について意図される処方物は、０．５ｍｇ〜５ｇｍの活性剤化合物を、適切なおよび簡便な量のキャリア材料と共に含み得、これは全組成物の約５パーセント〜約９５パーセントまで変化し得る。投薬単位形態は一般に約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分を含む。外部投与について、本発明の化合物は例えば、０．００００１重量％〜６０重量％、好ましくは０．００１重量％〜１０重量％、および最も好ましくは約０．００５重量％〜０．８重量％の範囲内で処方され得る。
【０２２３】
しかし、任意の特定の患者についての特定の用量レベルは、種々の因子に依存することが理解される。これらの因子は、用いられる特定の化合物の活性；年齢、体重、一般的な健康状態、性別、被験体の食餌；薬物の投与の時間および経路、および排泄の速度；薬物の組み合わせが処置において用いられるか否か；ならびに治療が求められる特定の疾患または状態の重篤度を包含する。
【０２２４】
上述で提供された本発明の詳細な説明、以下の実施例は、本発明を説明する目的のために与えられ、本発明または請求の範囲の範囲に対する制限であるとして解釈されない。
【０２２５】
（実施例１）
（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａからのメガロミシン生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび特徴づけ）
（実験手順）
細菌株、培地、および増殖条件
慣用的なＤＮＡ操作を、標準的な培養条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１　ＢｌｕｅまたはＥ．ｃｏｌｉ　ＸＬ１　Ｂｌｕｅ　ＭＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において行った。Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ　ｓｕｂｓ．ｎｉｇｒａ　ＮＲＲＬ３２７５を、ＡＴＣＣコレクションから得、そして推奨されるプロトコルに従って培養した。ゲノムＤＮＡの単離のために、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａを、３０℃でＴＳＢ（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５）において増殖した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４（ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９）は、アクチノロジン生合成遺伝子クラスターの欠失を保有し、ｍｅｇＡＩ−ＡＩＩＩ遺伝子の発現のための宿主として使用した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ株を、Ｒ５寒天上で３０℃にて維持し、そしてプロトプラストの調製のために液体ＹＥＭＥ中で増殖した（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５）。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ＮＲＲＬ２３３８を、メゴサミン（ｍｅｇｏｓａｍｉｎｅ）遺伝子の発現のために使用した。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を、Ｒ５寒天上で３４°にて維持し、そしてプロトプラストの調製のために液体ＴＳＢ中で増殖した。
【０２２６】
（ＤＮＡおよび生物体の操作）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡの操作および形質転換を、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって、または供給者のプロトコルによって行った。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのプロトプラストを、標準的な手順を使用してプラスミドＤＮＡによる形質転換のために作製した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ形質転換体を、２ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌチオスロレプトン重層を使用してＲ５上で選択した。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ形質転換体を、１．５ｍｌの０．６ｍｇ／ｍｌアプラマイシン重層を使用してＲ５上で選択した。
【０２２７】
（ｍｅｇ遺伝子クラスターの単離）
コスミドライブラリーを、Ｓａｕ３Ａ　Ｉで部分消化されたＭ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ全ＤＮＡから、ＳｕｐｅｒＣｏｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で調製し、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　ＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）インビトロパッケージングキットを使用してＥ．ｃｏｌｉに導入した。ｅｒｙＤＥＢＳからのＫＳ２ドメインを含有する３２Ｐ−標識したＤＮＡプローブ、またはｅｒｙＤＥＢＳからのモジュール１および２を包含するセグメントの混合物を別々に使用して、コロニーハイブリダイゼーションによってコスミドライブラリーをスクリーニングした。プローブでハイブリダイズされるいくつかのコロニーをさらに、Ｔ３およびＴ７プライマーを使用してそれらのコスミドインサートの末端を配列決定することによって分析した。配列のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）分析は、ｅｒｙクラスターからの遺伝子に非常に相同なＤＮＡ配列を有するいくつかのコロニーを示した。制限分析とともに、これは２つの重複するコスミド、ｐＫＯＳ０７９−９３ＡおよびｐＫＯＳ０７９−９３Ｄの単離を導き、これはｍｅｇクラスターの約４５ｋｂを含んだ。４００ｂｐ　ＰＣＲフラグメントを、ｐＫＯＳ０７９−９３Ｄの左末端から作製し、そしてコスミドライブラリーを再プローブするために使用した。同様に、ｐＫＯＳ０７９−９３Ａの右末端から作製された２００ｂｐ　ＰＣＲフラグメントを、コスミドライブラリーを再プローブするために使用した。上記のようにハイブリダイズするコロニーの分析は、２つのさらなるコスミド、ｐＫＯＳ０７９−１３８ＢおよびｐＫＯＳ７９−１２４Ｂの同定を生じ、これは以前の２つのコスミドを重複する。これらのコスミドのはるか左および右末端配列のＢＬＡＳＴ分析は、ポリケチド生合成に関連される任意の公知の遺伝子に何ら相同性を示さず、それゆえ、４つのコスミドセットが、完全なメガロミシン生合成遺伝子クラスターに及ぶことを示した。
【０２２８】
（ＤＮＡ配列決定および分析）
ＰＣＲベースの２本鎖ＤＮＡ配列決定を、製造業者によって提供される試薬およびプロトコルを使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＣＥＱ２０００キャピラリーシーケンサーにおいて行った。完全なコスミドｐＫＯＳ０７９−９３Ｄインサートのショットガンライブラリーを以下のように作製した：ＤＮＡを先ず、ＤｒａＩで消化してベクターフラグメントを排除し、次いで、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した。アガロース電気泳動後、１〜３ｋｂの間のバンドをゲルから切り出し、そしてＢａｍＨ　Ｉ消化したｐＵＣ１９でライゲーションした。別のショットガンライブラリーを、コスミドｐＫＯＳ０７９−９３Ａからサブクローン化した１２ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントから作製して、ｍｅｇＦ遺伝子に配列を伸長した。コスミドｐＫＯＳ０７９−１３８Ｂからの４ｋｂ　ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、プライマーウォーキングによって配列決定して、ｍｅｇＴ遺伝子への配列決定に拡大した。配列をシーケンサー（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ　Ｃｏｒｐ．）ソフトウェアパッケージを使用してアセンブリし、そしてＭａｃ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒｏｕｐ）およびＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で分析した。
【０２２９】
（プラスミド）
プラスミドｐＫＯＳ１０８−６は、ｐＫＡ０１２７’ｋａｎ’（ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９；ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、２０００）の改変されたバージョンであり、ＰａｃＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のｅｒｙＡＩ−ＩＩＩ遺伝子が、ｍｅｇＡＩ−ＩＩＩ遺伝子で置き換えられている。これは、ｐＫＡ０１２７’ｋａｎ’ベクターフラグメントのＰａｃＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で、合成ヌクレオチドＤＮＡ二重鎖（５’−ＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣ（配列番号２１）、相補的なオリゴ５’−ＡＡＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴ（配列番号２２）を最初に置換することによってなされた。ｍｅｇＡＩ−ＩＩ遺伝子を含有するコスミドｐＫＯＳ０７９−９３Ｄからの２２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを、得られるプラスミドのＥｃｏＲＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位に挿入して、ｐＫＯＳ０２４−８４を作製した。ｍｅｇＡＩＩＩ、およびｍｅｇＣＩＩ遺伝子の部分を含有する１２ｋｂ　ＢｇｌＩＩ／ＢｂｖＣＩフラグメントを、ｐＫＯＳ０７９−９３Ａからサブクローン化し、そしてＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＫＯＳ０２４−８４の対応する部位にライゲーションして、最終的な発現プラスミドｐＫＯＳ１０８−０６を得た。
【０２３０】
メゴサミン組み込みベクター、ｐＫＯＳ９７−４２を以下のように構築した：Ｌｉｔｍｕｓ　２８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、ｐＫＯＳ７９−９３Ｄ由来の１．７ｋｂ　ＳｃａＩ／ＰｓｔＩフラグメントと共に、ｐＫＯＳ７９−１３８Ｂ由来の４ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＳｃａＩフラグメントを含有するサブクローンを作製した。次いで、この全５．７ｋｂフラグメントを、ＳｐｅＩ／ＰｓｔＩフラグメントとして切り出し、そしてＫＯＳ７９−９３Ｄからの６．３ｋｂ　ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化されたｐＳＥＴ１５２（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を組み合わせて、プラスミドｐＫＯＳ９７−４２を構築した。
【０２３１】
（二次代謝物の生成および分析）
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４／ｐＫＯＳ１０８−６およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４／ｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’についてのポリケチドの生成のための発酵、ＬＣ／ＭＳ分析および６−ｄＥＢの定量は、本質的に以前に記載される（Ｘｕｅら、１９９９）とおりであった。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ　ＮＲＲＬ２３３８およびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ／ｐＫＯＳ９７−４２を、６日間、Ｆ１培地（Ｂｒｕｎｅｋｅｒ、１９９８）中で増殖させた。ブロスのサンプルを、微量遠心分離（５分間、１３，０００ｒｐｍ）において清澄化した。ＬＣ／ＭＳ調製物用に、イソプロパノールを、この上清に添加し（１：２の比率）、そして再度遠心分離した。エリスロマイシンおよびメガロミシンを、エレクトロスプレー質量スペクトルによって検出し、そして量を、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）によって決定した。エリスロマイシンおよびメガロミシンのＬＣ保持時間および質量スペクトルは公知の標準に同一であった。
【０２３２】
（ｍｅｇ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列）
ｍｅｇクラスターを含有する一連の４つの重複するインサート（図９）を、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａの全ゲノムＤＮＡから調製しそして１００ｋｂよりも大きいゲノムを含む、コスミドライブラリーから単離した。メガロミシンＰＫＳおよびいくつかのデオキシ糖生合成遺伝子をコードする連続的な４８ｋｂセグメントを、配列決定および分析した。このセグメントは１７個の完全なＯＲＦ、および各末端で不完全なＯＲＦで含み、図９において示されるように組織化された。
【０２３３】
（ＰＫＳ遺伝子）　ＯＲＦのｍｅｇＡＩ、ｍｅｇＡＩＩ、ｍｅｇＡＩＩＩは、６−ｄＥＢの合成を担うポリケチドシンターゼをコードする。（酵素複合体）　ｍｅｇＤＥＢＳは、ｅｒｙＤＥＢＳに非常に類似し、３つの推定ポリペプチドの各々は、これらのｅｒｙＰＫＳ対応物と平均８３％の全体的な類似性を有する。両方のＰＫＳは、６つのモジュール（１ポリペプチドあたり２つのモジュール）から構成され、各モジュールは同一の様式において組織化されている（図９）。７０個のアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインを用いる樹状図分析（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５）は、メチルマロニルＣｏＡを取り込むＡＴドメインを有する、６つのｍｅｇ伸長ＡＴドメインクラスターを示した（示さず）。ｍｅｇＤＥＢＳのローディングモジュールはまた、ポリケチド合成を開始するためのスターター単位の脱カルボキシル化のための、大部分のマクロライドＰＫＳによって利用されるＫＳＱドメイン（Ｂｉｓａｎｇら、１９９９：Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６；Ｋａｋａｖａｓら、１９９７；Ｘｕｅら、１９９８）を欠き、プライミングが、プロピオネート単位を用いて開始することを示唆する。さらに、モジュール３のケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインのＮＡＤＰＨ結合領域における、保存されたＧｌｙのＰｒｏへの置換が、ｍｅｇＤＥＢＳにおいて観察され、これは、ｅｒｙＤＥＢＳにおけるその不活性を説明すると提唱されている（Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１）。
【０２３４】
（デオキシ糖遺伝子）　ＰＫＳに隣接する遺伝子のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）分析により、１２個の完全なＯＲＦおよび１つの部分的なＯＲＦが、３つのメガロミシンデオキシ糖のうちの１つの合成に必要とされる機能をコードするようであることが示された。特定のデオキシ糖経路に対する各ＯＲＦの割り当てを、ｅｒｙ遺伝子とデオキシ糖生合成に関与する他の関連される遺伝子との比較に基づいて行った（表２）
【０２３５】
【表３】
2004513605.tif 000009
３つのＯＲＦ、ｍｅｇＢＶ、ｍｅｇＣＩＩＩおよびｍｅｇＤＩは、明らかに、マクロライドへの各デオキシ糖の結合のための１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする。ｍｅｇＢＶは、ＥｒｙＢＶ、エリスロマイシンミカロシルトランスフェラーゼに最も類似し、従って、ｍｅｇクラスターにおけるミカロース経路に割り当てられた。残りのグリコシルトランスフェラーゼの両方についての最も密接に適合するのは、ＥｒｙＣＩＩＩ、エリスロマイシン生合成におけるデソサミニルトランスフェラーゼであった。ＥｒｙＣＩＩＩとＭｅｇＣＩＩＩとの間のより高い程度の類似性を考慮して（表２）、ＭｅｇＣＩＩＩを、デソサミニルトランスフェラーゼと定め、残りのＭｅｇＤＩを、その提唱されたメゴサミニルトランスフェラーゼと定めた。類似の様式で、割り当てを、以下のように行った：ＭｅｇＣＩＩおよびＭｅｇＤＶＩ、ＥｒｙＣＩＩに類似する２つの推定３，４−イソメラーゼ；ＭｅｇＢＩＩおよびＭｅｇＤＶＩＩ、ＥｒｙＢＩＩに相同な２，３−レダクターゼ；ＭｅｇＢＩＶおよびＭｅｇＤＶ、ＥｒｙＢＩＶに類似する推定４−ケトレダクターゼ（表２）。デオキシ糖生合成に関与する残りのＯＲＦ、ｍｅｇＴ、ｍｅｇＤＩＩ、ｍｅｇＤＩＩＩおよびｍｅｇＤＩＶは、それぞれ、推定２，３−デヒドラターゼ、アミノトランスフェラーゼ、ジメチルトランスフェラーゼ、および３，５−エピメラーゼコードする（表２）。メゴサミン経路およびデソサミン経路の両方が、アミノトランスフェラーゼおよびジメチルトランスフェラーゼを必要とし、そしてミカロースおよびメゴサミンの各々は、２，３−デヒドラターゼおよび３，５−エピメラーゼを必要とするので、これらの４つの遺伝子の特定の経路への割り当ては、配列比較のみに基づいてなされ得なかった。しかし、後者の３つは、以下に記載される実験によって、メゴサミン生合成に関連付けられた。
【０２３６】
（他の遺伝子）　ｍｅｇＹおよびｍｅｇＨと命名した２つのさらなる完全なＯＲＦ、ならびにｍｅｇＦと命名した不完全なＯＲＦがまた、このクラスターにおいて同定された。ＭｅｇＨおよびＭｅｇＦは、ＥｒｙＨおよびＥｒｙＦと高い程度の類似性を共有する。ＥｒｙＨおよび他のマクロライド遺伝子クラスターにおけるホモログは、ポリケチド遺伝子クラスターにおける未知の機能を有するチオエステラーゼ様タンパク質である（Ｈａｙｄｏｃｋら、１９９１；Ｘｕｅら、１９９８；Ｂｕｔｌｅｒら、１９９９；Ｔａｎｇら、１９９９）。ＥｒｙＦは、エリスロノライドＢ　Ｃ−６ヒドロキシラーゼをコードする（図８）（Ｗｅｂｅｒら、１９９１；ＡｎｄｅｒｓｅｎおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１９９２）。ＭｅｇＹは、ｅｒｙ対応物を有しないが、短いアシル鎖をマクロライドに転移するＯ−アシルトランスフェラーゼの（小さな）ファミリーに属するようである。以下の２つのクラスが存在する：ＡｃｙＡおよびＭｄｍＢは、アセチルまたはプロピオニル基を１６員環のマクロライドのＣ−３ヒドロキシルに転移する（Ａｒｉｓａｗａら、１９９４；ＨａｒａおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１９９２）；ＣａｒＥおよびＭｐｔは、それぞれ、カルボマイシンおよびミデカマイシンのミカロシル部分に、イソバレレートまたはプロピオネートを転移する（Ｅｐｐら、１９８９；Ａｒｉｓａｗａら、１９９３；Ｇｕら、１９９６）。これらの種々のメガロミシンの構造は、ＭｅｇＹが、後者のクラスに属し、そしてメガロミシンＡをメガロミシンＢ、Ｃ１またはＣ２に変換する、アシルトランスフェーラーゼであることを示唆する（以下に実験的に確認される）。
【０２３７】
（ｍｅｇＰＫＳ遺伝子の異種発現）
ｅｒｙＤＥＢＳの野生型および遺伝子改変されたバージョンは、酵素研究および新規なポリケチド化合物の生成のために、異種Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主において広範囲に使用されてきた。ｅｒｙＤＥＢＳとｍｅｇＤＥＢＳとの間の類似性を考慮して、生成の特徴を、一般的に使用されるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主株において比較した。３つのｍｅｇＡ　ＯＲＦを、発現プラスミドｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ（ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９）に、ｅｒｙＡ　ＯＲＦに代えてクローン化した。両方のプラスミド、ｅｒｙＤＥＢＳをコードするｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’およびｍｅｇＤＥＢＳをコードするｐＫＯＳ１０８−０６を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ　Ｋ４−１１４に導入し、６−ｄＥＢの生成を、振盪フラスコ発酵によって決定した。生成プロフィールは、両方の場合において類似し、そして６−ｄＥＢの最大の力価は、３０〜４０ｍｇ／Ｌの間であった。さらに、両方のＰＫＳは、少量（約５％）の８，８ａ−デオキシオレアンドライドを生成し、これは、ＰＫＳを、プロピオネートの代わりにアセテートでプライムすることから得られる（ＫａＯら、１９９４ｂ）。この観察は、ＰＫＳのローディングＡＴドメインが、スターター単位に対して類似の緩やかな特異性を示すことを示す。
【０２３８】
（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるメガロミシンへのエリスロマイシンの変換）
ｍｅｇクラスターの試験は、推定メゴサミン生合成酵素が、ＰＫＳ遺伝子の上流で直接的にクラスター化されていることを示した。これらの遺伝子が、メゴサミン生合成およびエリスロマイシンの中間体へのその結合に十分であるという仮説が正しい場合、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのようなエリスロマイシンを生成する株における、これらの遺伝子の機能的な発現は、メガロミシンの産生を生じるはずである。一番左のＸｈｏＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間の全ての遺伝子を保有する１２ｋｂ　ＤＮＡフラグメント（図９）を、部位特異的組み込みベクターｐＳＥＴ１５２（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を使用して、Ｓ．ｅｒｙｔｈａｅａの染色体に組み込ませた。このフラグメントの左末端および右末端が、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにおける遺伝子の集合セットの転写についての必要なプロモーター領域を含むこと、および、これらの領域が、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいておそらく作動することが推測された。
【０２３９】
この組み込まれたｍｅｇ遺伝子を含有するＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ／ＫＯＳ９７−４２からの発酵ブロスを、ＬＣ／ＭＳによって分析し、そしてｍｅｇ遺伝子を有さない親Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株のＬＣ／ＭＳプロフィールおよびＭ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａから精製されたメガロミシン標準に比較した。この新規な株が、エリスロマイシンＡおよび種々のメガロミシン（約４：１の比率）の混合物を生成することが見い出され、それによって、推定メゴサミン生合成遺伝子およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、このクローン化されたｍｅｇフラグメント内に含まれることが示された。同定された２つの最も豊富な同族体は、メガロミシンＢおよびＣ１であった。メガロミシンＡおよびＣ２もまた、少量において検出された。メガロミシンＢ、Ｃ１およびＣ２の存在はまた、この組み込まれたｍｅｇフラグメントに存在する、Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、ＭｅｇＹの機能についての直接的な証拠を提供する。
【０２４０】
（考察）
モジュラーＰＫＳ間で観察された相同性は、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａからのｍｅｇ生合成遺伝子クラスターをクローン化するためのｅｒｙＰＫＳ遺伝子の使用を可能にした。メガロミシン生合成経路とエリスロマイシン生合成経路との間の密接な類似性はまた、それらの遺伝子の全体の組織化において、および対応する個々の遺伝子にコードされるポリペプチドの高い程度の相同性において反映される。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるｍｅｇＤＥＢＳからの６−ｄＥＢの生成およびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるｍｅｇＤ遺伝子を使用するメガロミシンへのエリスロマイシンの変換は、同定された遺伝子クラスターがメガロミシンの合成を担うという直接的な証拠を提供する。
【０２４１】
図９において示されるように、左側のｅｒｙ／ｍｅｇＢＶで開始し、ｅｒｙ／ｍｅｇＦ遺伝子を介する２つのクラスターの約４０ｋｂセグメントは、ほぼ同一な組織化配置を保持する。この領域における顕著な差異は、ｅｒｙＧおよびＩＳ１１３６であり、これは，分析されたｍｅｇクラスターのセグメントからは不在である。ｅｒｙＧ遺伝子は、エリスロマイシンＣをエリスロマイシンＡに変換するＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性のミカロシルメチルトランスフェラーゼをコードする（図８）（Ｗｅｂｅｒら、１９９０；Ｈａｙｄｏｃｋら、１９９１）。ミカロース部分は、メガロミシン生合成においてエステル化（ＭｅｇＹ）によって修飾され（図８）、それゆえ、ｅｒｙＧ相同体の不在が、ｍｅｇクラスターにおいて予測される。ｅｒｙＡＩとｅｒｙＡＩＩとの間に位置されるＩＳ１１３６エレメント（ＤｏｎａｄｉｏおよびＳｔａｖｅｒ、１９９３）は、エリスロマイシン生合成において役割を果たすことが知られておらず、およびｅｒｙクラスターにおけるその起源は決定されていない。
【０２４２】
共通のｍｅｇ／ｅｒｙ　ＢＩＶ遺伝子およびＢＶ遺伝子の上流で、遺伝子クラスターは多様である。ｅｒｙＢＶとｅｒｙＫとの間の、ｅｒｙ遺伝子クラスターのレフトボーダーの約６ｋｂセグメント（Ｐｅｒｅｄａら、１９９７）は、ミカロース（ｅｒｙＢＶＩおよびＢＶＩＩ）、ならびにデソサミン生合成（ｅｒｙＣＩＶ、ＣＶ、およびＣＶＩ）、ならびにＣ−１２ヒドロキシラーゼ（ｅｒｙＫ）（Ｓｔａｓｓｉら、１９９３）について必要とされる残りの遺伝子を含む。対照的に、ｍｅｇＢＶの上流の領域は、メガロミシン生合成に独特の全ての活性について考慮され得る遺伝子のセット（ｍｅｇＤＩ〜ＤＶＩＩおよびｍｅｇＹ）をコードする（図９）。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａへのこのｍｅｇＤＮＡセグメントの導入は、メガロミシンの生成を生じるので、これらの遺伝子がＴＤＰ−メガロミシン生合成についての機能をコードし、ならびにその推定の基質であるエリスロマイシンＣに転移し、そしてメガロミシンＡをアシル化することが明らかである（図８）。それゆえ、ｍｅｇＤＶＩの上流の残りの領域は、ミカロースおよびデソサミンの生合成についての遺伝子のみをコードするべきである。
【０２４３】
Ｏｌａｎｏら（Ｏｌａｎｏら、１９９９）は近年、ＴＤＰ−Ｌ−ダウノサミン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｕｃｅｔｉｕｓによって生成される抗腫瘍化合物ダウノルビシンおよびデキソルビシンのデオキシ糖成分の生合成についての経路を記載した。それらの経路は、遺伝子クラスターｄｎｍＪＱＴＵＶＺによって制御される中間体、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコースからの４つの工程を提唱するが、ｄｎｍＱおよびｄｎｍＺについての機能は同定され得ず、および経路における反応の正確な順序は決定され得なかった。遺伝子ｄｎｍＴ、ｄｍｎＵ、ｄｍｎＪ、およびｄｍｎＶはそれぞれ、ｍｅｇクラスターにおいて提唱される対応物（それぞれ、ｍｅｇＴ、ｍｅｇＤＩＶ、ｍｅｇＤＩＩ、およびｍｅｇＤＶ）を有する（図１０を参照のこと）。
【０２４４】
ｍｅｇＤＩＶ、ｍｅｇＤＶ、ｍｅｇＤＩＩ、およびｍｅｇＤＩＩＩの遺伝子を用いて、５−エピマー化、４−ケト還元、３−アミノ化、および３−Ｎ−ジメチル化の順序を介した、ＴＤＰ−２，６−ジデオキシ−３，４−ジケト−Ｄ−ヘキソース（またはそのエノール互変異体）、ミカロース経路およびメゴサミン経路に共通の最後の中間体をＴＤＰ−メゴサミンに変換するための経路を記載することが可能である。これは、ＯｌａｎｏらによるＴＤＰ−ダウノサミンの生合成について提唱される同じ機能を用いるが、異なる連続する順序においてである。しかし。これはｍｅｇＤＶＩ遺伝子およびｍｅｇＤＶＩＩ遺伝子について考慮されない。なぜならそれらの活性はこの経路に必要とされないからである。これらの遺伝子を用いる平行な経路はまた、図１０において示される。この代替の経路において、２，３−還元および３，４−互変異体化は、それぞれ、ｍｅｇＤＶＩＩ遺伝子産物およびｍｅｇＤＶＩ遺伝子産物によって行われる。４−ケト還元（ｍｅｇＤＶ）および２，３−還元（ｍｅｇＤＶＩＩ）の両方を用いる一体化された単一の経路は決定され得なかった。ＴＤＰ−メゴサミンを生成するためにｍｅｇＤＶＩ〜ｍｅｇＤＶＩＩまでの完全な遺伝子セットが、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａに導入されたので、もしあれば、２つの代替の経路のどちらが、有効であるかを決定することは不可能であるが、これは、体系的な遺伝子破壊および相補を介してとりかかられ得る。
【０２４５】
配列決定された４８ｋｂセグメントはまた、ＴＤＰ−Ｌ−ミカロースおよびＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの合成に必要とされる遺伝子を含む（図１０）。後者の、推定の３，４−イソメラーゼをコードするｍｅｇＣＩＩについて、ほとんど正確に、そのエリスロマイシン対応物としてのｅｒｙＣＩＩは、ｅｒｙＡＩＩＩに翻訳的に結合されることが見出された（Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７）ので、関連されるＴＤＰ−デソサミン経路における最初の工程は、ｍｅｇＡＩＩＩに翻訳的に結合されるようである。ＭｅｇＣＩＩとＥｒｙＣＩＩとの間の高い程度の類似性は、メガロミシンおよびエリスロマイシンを生成する生物体におけるデソサミンへの経路が、ほとんど同じようであることを示唆する。同様に、ｍｅｇＢＩＩおよびｍｅｇＢＩＶは、２，３−レダクターゼおよび４−ケトレダクターゼをコードし、エリスロマイシンについてのミカロース経路において密接な相同体を含むという知見はまた、２つの宿主生物体におけるＴＤＰ−Ｌ−ミカロース合成が同じであることを示唆する。
【０２４６】
興味深いのは、推定の２，３−レダクターゼをコードする２つの遺伝子であるｍｅｇＢＩＩおよびｍｅｇＤＶＩＩである。なぜなら、ＭｅｇＢＩＩは最も密接に、公知のミカロース生合成酵素であるＥｒｙＢＩＩに類似する（Ｗｅｂｅｒら、１９９０）ので、そしてｍｅｇＢＩＩは、ｅｒｙクラスターにおけるその対応物としてｍｅｇクラスターの同じ位置にあるので、ｍｅｇＢＩＩはミカロース経路に割り当てられ、およびｍｅｇＤＶＩＩはメゴサミン経路に割り当てられる。さらに、ＭｅｇＤＶＩＩとＥｒｙＢＩＩまたはＭｅｇＢＩＩのいずれかとの間のより低い程度の類似性（表２）は、反対のＬ異性体基質およびＤ異性体基質をそれぞれの酵素に割り当てるための基準を提供する（図１０）。最後に、ｍｅｇＴは、推定の２，３−デヒドラーゼをコードし、ｅｒｙミカロース経路における遺伝子であるｅｒｙＢＶＩにまた関連される。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて、ＥｒｙＢＶＩによって作製される提唱される中間体は、ミカロースの生合成における最初の関連される工程を示す（図１０）。しかし、図１０において提唱される経路は、これが、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａにおいてカロースおよびメゴサミンの生合成の両方に共通の中間体であり得ることを示唆する。それゆえ、ｍｅｇＴはダウノサミン経路における等価な遺伝子であるｄｎｍＴの名称に従って命名される（Ｏｌａｎｏら、１９９９）。
【０２４７】
本明細書中に記載されるｍｅｇＤＥＢＳの発現について好ましい宿主ベクター系は、エリスロマイシン経路（Ｋａｏら、１９９４ａ；ＺｉｅｒｍａｎｎおよびＢｅｔｌａｃｈ、１９９９）、ピクロマイシン経路（Ｔａｎｇら、１９９９）、およびオレアンドマイシン経路からのモジュラーＰＫＳ遺伝子の異種発現について、ならびに種々の組み合わせにおいてドメインが除去されるか、付加されるか、または交換された新規なポリケチド骨格の作製について、以前に使用された（ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９９）。近年、ハイブリッドポリケチドは、異なるＰＫＳ系けらのサブユニットの同時発現を介して作製された（Ｔａｎｇら、２０００）。
【０２４８】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるｍｅｇＤＶＩ〜ｍｅｇＤＶＩＩセグメントの発現、およびこの宿主におけるメガロミシンの対応する生成は、メガロミシン合成における糖付着の起こり得る順序を確立する。さらに、これは、より遺伝的に好都合な宿主生物体においてメガロミシン生成するための手段を提供し、ＰＫＳを操作することによるメガロミシンアナログの作製を導く。６０を超える６−ｄＥＢアナログが、ｅｒｙＰＫＳを使用するコンビナトリアル生合成によって生成された（ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９９；Ｘｕｅら、１９９９）。メガロミシンの力価はまた、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの産業的に至適化された株への遺伝子の導入によって、Ｍ．ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｅａから得られた５ｍｇ／Ｌを上回って有意に増加され得、この多くは、１０ｇ／Ｌほどのエリスロマイシンを生成し得る。
【０２４９】
（参考文献）
【０２５０】
【化２】
2004513605.tif 000010
（実施例２）
（コドン操作によるｍｅｇＰＫＳ発現プラスミドの安定化）
（材料および方法）
すべての細菌株を、実施例１において記載されるように培養および形質転換した。
【０２５１】
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの発酵およびジケチド給餌）
初代Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ形質転換体を拾い、そして５０μｇ／Ｌのチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）を有する６ｍＬのＴＳＢ液体培地中におき、そして３０℃で増殖した。培養物がいくらかの増殖を示した時点（３〜４日目）で、これを２５μｇ／Ｌのチオストレプトンおよび１ｇ／Ｌのジケチド（（２ｓ，３Ｒ）２−メチル−３−ヒドロキシヘキサノエート　Ｎ−プロピオニルシステアミンチオエステル）を有する５０ｍＬのＲ６培地（ｐＨ７．０）を含有する２５０ｍＬフラスコに移し、そして３０℃のインキュベーター中に７日間置いた。
【０２５２】
（コドン変更およびプラスミド作製）
メガロミシンＰＫＳ遺伝子クラスターのモジュール２およびモジュール６についてのコード配列には、いくつかの同一の配列が存在する。完全長のメガロミシンＰＫＳを含有する発現プラスミドは幾分不安定であるようであり、そしてプラスミド内相同組換えによってＥＴ１２４５６７およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのようにｒｅｃＡ＋株における欠失に供されるようである。顕著な相同組換えを防止するために、従って発現プラスミドを安定化するために、モジュール２コード配列中の領域と同一であるモジュール６コード配列の２つの領域のコドンを、コードされるタンパク質の配列を変化させることなく変化させた。モジュール６において変化された２つの領域は、２６７３９番目の塩基〜２７，２６７番目の塩基および２７，６９７番目の位置の塩基〜２７，９８７番目の塩基であり、これらはそれぞれ、６８１０番目の位置の塩基〜７３３８番目の塩基の領域、および７７７８番目の位置の塩基〜８０６８番目の塩基の領域と同一であった。ｍｅｇＰＫＳのローディングドメインの開始コドンは、１番目の塩基であると設定された。これらの配列は以下に示される。
【０２５３】
【化３】
2004513605.tif 000011
上記の２つの領域に由来する３片のＤＮＡをＲｅｔｒｏｇｅｎにより合成および確認し、合成したＤＮＡを以下の表３に示すように、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ−ＴＯＰＯ中にクローン化した。
【０２５４】
【表４】
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（発現プラスミドのアセンブリ）
最初に、ｐＫＯＳ９７−１６１３のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、ｐＫＯＳ９７−１６２２のＢａｍＨＩ−ＢｓｍＩフラグメント、ならびにＢｓｍＩ−ＰｓｔＩ線状化ｐＫＯＳ９７−９０のライゲーションによって、ｐＫＯＳ９７−１５１を生成した。次いで、ｐＫＯＳ９７−１５１へのｐＫＯＳ９７−１６２８のＳｆａＮＩ−ＦｓｅＩフラグメントの挿入によって、ｐＫＳＯ９７−１５２を生じた。次いで、ｐＫＯＳ９７−１２５のＰｓｔＩ−ＢｌｐＩフラグメントを、ｐＫＯＳ９７−９０ａのＰｓｔＩ−ＢｌｐＩフラグメントを置き換えるために使用し、そしてｐＫＯＳ９７−１６０を生成した。
【０２５５】
最終的な発現プラスミド（ｐＲＭ５における）ｐＫＯＳ９７−１６２は、ｐＫＯＳ１０８−０４のＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入されたｐＫＯＳ９７−１６０のＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントの結果であった。
【０２５６】
別の発現プラスミドであるｐＫＯＳ９７−１５２ａを、４つのフラグメントのライゲーションによって作製した。４つのフラグメントは、ｐＫＯＳ９７−９２ａのＢｌｐＩ−ＸｂａＩフラグメント（ｃｏｓ部位を含む）、ｐＫＯＳ９７−８１のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント、ｐＫＯＳ９７−１５２のＰｓｔＩ−ＢｌｐＩフラグメント、およびｐＫＯＳ１０８−０４のＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメント（ベクターとして）であった。
【０２５７】
構築されたプラスミドの試験は、改変されたコード配列を含むプラスミドが未改変のコード配列を含むプラスミドよりも安定であることを示した。
【０２５８】
（実施例３）
（Ｏｌｅ−ＭｅｇハイブリッドＰＫＳの構築）
（ＯｌｅＰＫＳモジュール１〜４の発現のためのｐＲＭ１ベースのｐＫＯＳ０９８−４８の構築）
ｏｌｅＡＩＩ遺伝子の３’末端部分を含む２４０ｂｐのフラグメント（ヌクレオチド１１２１０〜１１４５２；ｏｌｅＡＩＩの開始コドンの最初の塩基がヌクレオチド１である）を、以下のプライマー
【０２５９】
【化４】
2004513605.tif 000013
を用いてＰＣＲ増幅した。フラグメントは、その５’末端で天然に存在するＮｏｔＩ部位、ならびにその３’末端でｏｌｅＡＩＩ停止コドンに続いて操作されたＸｂａＩ（太字）およびＥｃｏＲＩ部位（下線）を含む。ｐＫＯＳ３８−１８９を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化して、８ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、２．５ｋｂ、および２ｋｂの５つのフラグメントを得た。ｏｌｅＡＩＩ遺伝子ヌクレオチド２９６１〜ヌクレオチド１１２１０を含む８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント、および２４０ｂｐのＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ処理されたＰＣＲフラグメントを、３つのフラグメントライゲーションを介してＥｃｏＲＩ部位でｌｉｔｍｕｓ２８にライゲーションして、ｐＫＯＳ９８−４６を得た。ｐＫＯＳ９８−４６からの８．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｏｌｅＡＩおよびｏｌｅＡＩＩのヌクレオチド１〜ヌクレオチド２９６０を含有するｐＲＭ１由来のプラスミドであるｐＫＯＳ３８−１７４にクローン化して、ｐＫＯＳ９８−４８を得た。
【０２６０】
（ｍｅｇＰＫＳモジュール５〜６の発現のためのｐＳＥＴ１５２ベースのｐＫＯＳ９８−６０の構築）
ｍｅｇＡＩＩＩのヌクレオチド１〜ヌクレオチド３６６を含む３６０ｂｐフラグメントを、以下のプライマー
【０２６１】
【化５】
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を用いてＰＣＲ増幅した。ＰａｃＩ部位およびＮｄｅＩ部位、ならびにリボゾーム結合部位を、ｍｅｇＡＩ開始コドンの５’末端で導入した。３６０ｂｐのＰａｃＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＫＯＳ１０８−０６に挿入して、２２ｋｂ　ＰａｃＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを置き換えて、ｐＫＯＳ９８−５５を得た。ｍｅｇＡＩＩＩ遺伝子を含有する１０ｋｂ　ＰａｃＩ−ＸｂａＩフラグメントおよびアニールされたオリゴＮ９８−２３−１（５’−ＡＡＴＴＣＡＴＡＧＣＣＴＡＧＧＴ−３’）（配列番号３３）およびＮ９８−２３−２（５’−ＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧＧＣＴＡＴＧ−３’）（配列番号３４）を、３つのフラグメントライゲーションを介してＰａｃＩおよびＥｃｏＲＩ処理したｐＳＥＴ１５２由来のｐＫＯＳ９８−１４にライゲーションして、ｐＫＯＳ９８−６０を得た。
【０２６２】
（実施例４）
（エリスロマイシンへのエリスロノライドの変換）
ポリケチド（約５０〜１００ｍｇ）のサンプルを、０．６ｍＬのエタノール中に溶解し、そして滅菌水で３ｍＬに希釈した。この溶液を、３０℃にて１００ｍｍ　Ｒ２ＹＥ寒天プレート上で増殖されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈａｅａ　ＷＨＭ３４（ｅｒｙＡ変異体）の３日間の古い培養物を重層するために使用する。乾燥後、プレートを３０℃で４日間インキュベートする。寒天を切り刻み、次いでエチル酢酸中の１％トリエチルアミンの１００ｍＬ部分で３回抽出した。抽出物を合わせ、そしてエバポレートした。粗生成物を、分取用ＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相、１％酢酸を含有する水−アセトニトリル勾配）によって精製した。フラクションを質量分析によって分析し、そして純粋な化合物を含有するフラクションをプールし、トリエチルアミンで中和し、そしてシロップにエバポレートした。このシロップを水中に溶解し、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。有機抽出物を合わせ、飽和されたＮａＨＣＯ３水溶液で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、約０．１５ｍｇの産物を得た。産物は、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応するが、提供される化合物が６−ｄＥＢとは異なるので、それらとは異なる、グリコシル化およびヒドロキシル化された化合物である。
【０２６３】
（実施例５）
（抗細菌活性の測定）
抗細菌活性を、試験生物体としてＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓを用いるディスク拡散アッセイを使用するか、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感受性株および耐性株に対する液体培養中での最小阻害濃度（ＭＩＣ）の測定によるかのいずれかで決定する。
【０２６４】
（実施例６）
（駆虫活性の評価）
化合物を最初に、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ＦＣＲ−３およびＫ１株の培養物を使用してインビトロで、次いでＰ．ｂｅｒｇｈｅｉに感染したマウスを使用してインビボでスクリーニングし得る。哺乳動物細胞毒性は、ＦＭ３ＡまたはＫＢ細胞において決定され得る。化合物をまた、Ｐ．ｂｅｒｈｅｉに対する活性についてスクリーニングし得る。化合物をまた、駆虫活性（抗マラリア、トリパノソーマ症、およびリーシュマニア症）を広範に試験するために動物研究および臨床治験において試験し得る。
【０２６５】
本発明は、記載の説明および実施例によってここに記載され、当業者は、本発明が多様な実施形態において実施され得ること、ならびに上述の説明および実施例は、例示の目的のためであり、以下の特許請求の範囲の制限でないことを理解する。
【０２６６】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のコスミドである、ｐＫＯＳ０７９−１３８Ｂ、ｐＫＯＳ０７９−９３Ｄ、ｐＫＯＳ０７９−９３Ａ、およびｐＫＯＳ０７９−１２４Ｂにおける挿入ＤＮＡの制限部位および機能地図を示す。種々の制限部位（ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｓｉＩ）もまた示される。メガロミシン生合成遺伝子の位置は、コスミド挿入を示す実線の下に示される。遺伝子は、転写の方向を指す矢印として示される。遺伝子クラスターのおおよその大きさ（キロベース（ｋｂ）対で）は、遺伝子を示す矢印の下の太い実線上に５０００ｂｐ（つまり、５Ｋ、１０Ｋなど）づつの増加として示される。
【図２】
図２は、メガロミシン生合成遺伝子クラスターのより詳細な地図を示す。種々のオープンリーディングフレームが、転写の方向を指す矢印として示される。線は、遺伝子クラスターの塩基対（１０００ｂｐずつ増加での）の大きさを示す。メガロミシンＰＫＳの種々のドメインもまた示される。この図中に示されないメガロミシン生合成遺伝子クラスターの他の遺伝子は、コスミドｐＫＯＳ０１３８ＢおよびｐＫＯＳ０１２４Ｂの挿入ＤＮＡに位置する。
【図３】
図３はメガロミシン、アジスロマイシンおよびエリスロマイシンＡの構造を示す。
【図４】
図４は、ＤＥＢＳのモジュールおよびドメイン、ならびにメガロミシンＰＫＳを示す。
【図５】
図５は、エリスロマイシン生合成経路における化合物および反応、ならびにまた、メガロミシン合成に対する化合物および反応を示す。生合成経路における各々の工程を触媒する種々の酵素を生成する遺伝子が示される。
【図６】
図６は、デソサミン、ロドサミン、およびミカロースの形成のための生合成経路、ならびに生合成経路における各々の工程を触媒する種々の酵素を生成する遺伝子を示す。
【図７】
図７は、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａのメガロミシン生合成遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６３２４５、本明細書中で参考として援用する）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す。
【図８】
図８は、エリスロマイシンおよびメガロミシンの生合成および各々の生合成を媒介する酵素を表す。
【図９】
図９は、クローン化したメガロミシン生合成遺伝子クラスターおよびクラスターの一部を含む本発明の特定のコスミドを表す。
【図１０】
図１０は、メゴサミン、ミカロースおよびデソサミンの生合成を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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