(57)【要約】腫瘍増殖を抑制するための薬学的組成物および方法が提供される。組成物は、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニストおよび／またはＩＬ−１７レセプターアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。この組成物は腫瘍細胞増殖を阻害するに効果的な量で投与される。本発明の１つの実施形態において、非免疫原性腫瘍増殖は、有効量のＩＬ−１７アンタゴニストまたはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストを投与することによって、妨害または阻害される。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、ＩＬ−１７に結合する抗体またはＩＬ−１７レセプターに結合する抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効な量でＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニストおよび／またはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−１７アンタゴニストがＩＬ−１７に結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−１７レセプターアンタゴニストがＩＬ−１７レセプターに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍増殖を抑制するための薬学的組成物であって、ＩＬ−１７アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項６】
前記ＩＬ−１７アンタゴニストがＩＬ−１７に結合するモノクローナル抗体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
腫瘍増殖を抑制するための薬学的組成物であって、ＩＬ−１７レセプターアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＩＬ−１７レセプターアンタゴニストがＩＬ−１７レセプターに結合するモノクローナル抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
腫瘍増殖を抑制するための薬学的組成物であって、ＩＬ−１７および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患状態の処置におけるサイトカイン、サイトカインアンタゴニストおよび／またはサイトカインレセプターアンタゴニストの使用に関する。より詳細には、本発明は、癌のような特定の細胞増殖性疾患を処置するための、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）、ＩＬ−１７アンタゴニスト、および／またはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストを使用する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
サイトカインとして公知の可溶性タンパク質は、細胞分化の多くの局面、細胞相互作用、細胞増殖および免疫応答の発生において、重要な役割を果たす。
【０００３】
インビトロにおいて、インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、骨髄腫、リンパ腫、カポージ肉腫、黒色腫、卵巣および腎臓細胞または膀胱細胞の癌腫由来の多くの腫瘍細胞株に対する増殖因子として作用する（ＦｒｉｄｍａｎおよびＴａｒｔｏｕｒ　１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１８：３−９０）。マウスにおいて、ＩＬ−６でトランスフェクトされた腫瘍は、しばしば、増加した腫瘍形成を示す（Ｖｉｎｋら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：９９７−１０００；Ｄｕｒａｎｄｙら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６１−５３６７）。骨髄腫患者において、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体投与は、一過性に骨髄腫細胞の増殖を阻害する（Ｂａｔａｉｌｌｅら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ．８６：６８５−６９１）。
【０００４】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）（走化性サイトカインのＣＸＣファミリーのメンバー）もまた、腫瘍細胞の増殖を刺激し、同様に、ＩＬ−８は、ヒト黒色腫に対するオートクライン増殖因子である（Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６６７−２６７５）。腫瘍細胞によるＩＬ−８の発現は、ヌードマウスにおいて、その転移能力と直接関連する（Ｓｉｎｇｈら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：３２４２−３２４７）。
【０００５】
頸部癌は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染と関連するが、さらなる因子がその病因に寄与するに違いない。なぜなら、ＨＰＶ感染の少数のみが、持続的な病変または悪性腫瘍への進行を引き起こすからである（ＳｃｈｉｆｆｍａｎｋおよびＢｒｉｎｔｏｎ、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ　７６：１８８８−１９０１）。種々の議論は、ＩＬ−６が頸部癌の病因および発症に関与し得ることを示唆する。ＩＬ−６は、正常な頸部細胞、ＨＰＶで不死化されかつ頸部癌由来の細胞株の両方の増殖を刺激する（Ｉｇｌｅｓｉａｓら、１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：９４４−９５２；Ｅｕｓｔａｃｅら、１９９３、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．５０：１５−１９）。インビトロにおいて、頸部癌細胞はまた、ＨＰＶ感染された頚部上皮細胞および正常頸部上皮細胞よりも、より高いレベルのＩＬ−６およびＩＬ−８を分泌する（ＷｏｏｄｗｏｒｔｈおよびＳｉｍｐｓｏｎら、１９９３、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：１５４４−１５５５）。ＩＬ−６　ｍＲＮＡの増加した発現が、頸部上皮内新形成または正常な頚部と比較して、浸潤頸部癌腫由来の生検材料において示された（Ｔａｒｔｏｕｒら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：６２４３−６２４８）。
【０００６】
ＩＬ−１７（以前、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−８（ＣＴＬＡ−８）と名付けられた）は、活性化ヒト記憶ＣＤ４　Ｔ細胞によって主に発現される１７ｋＤａのサイトカインである（Ｒｏｕｖｉｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４４５−５５５６；Ｆｏｓｓｉｅｚら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３；Ｓｐｒｉｇｇｓ、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：３６６−３６９）。ＩＬ−１７のアミノ酸配列は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（サルおよびウサギのＴ細胞リンパ腫を引き起こすγヘルペスウイルス）の１３番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ−１３）のアミノ酸配列と顕著な相同性を共有する（ＦｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎおよびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、１９９２、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ、Ｒｏｉｚｍａｎ編（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｐｒｅｓｓ）２５３−３３２頁）。インビトロにおいて、このウイルスは、未知の機構を介してヒトＣＤ４およびＣＤ８　Ｔ細胞を不死化し得、この機構は、これらの細胞に、ＣＤ２による活性化に続くＩＬ−２ベースのオートクライン増殖を与える（Ｍｉｔｔｒｕｃｋｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：９０９−９１３；Ｂｉｅｓｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３１１６−３１１９）。ＩＬ−１７は、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインであると考えられる。なぜなら、マクロファージ、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび滑膜細胞におけるインターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の産生（Ｆｏｓｓｉｅｚら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３；Ｙａｏら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　３：８１１−８２１；Ｃｈａｂａｕｄら、１９９８　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０９−４１４）およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼおよび核因子κＢの活性化を介したヒト変形性関節症軟骨における一酸化窒素の産生（Ｓｈａｌｏｍ−Ｂａｒａｋら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７４６７−２７４７３；Ａｔｔｕｒら、１９９７、Ａｒｔｈｒ．Ｒｈｅｕｍ．４０：１０５０−１０５３）を、ＩＬ−１７が増加させることが示されたからである。ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストおよびストロメライシンの放出はまた、ヒト活性化マクロファージにおいてｒｈＩＬ−１７によって刺激される（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３５１３−３５２１）。
【０００７】
細胞の種々の生理学的状態、発達状態または増殖状態を誘導、維持または調節する分子の役割および機構の特徴付けは、免疫系、造血細胞および他の細胞型に影響を与える状態に対する治療の開発に大きく寄与する。従って、関連する細胞型の発達、生理または増殖の、異常または不適切な調節によって特徴付けられる疾患の十分な処置に対する必要性が当該分野に存在する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、異常な腫瘍細胞増殖によって特徴付けられる疾患状態を処置するための物質および方法を提供することによって前記の要求を満たす。
【０００９】
本発明は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニスト、またはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストが必要である個体に腫瘍増殖を阻害するに十分な量でそれらを投与する工程を包含する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、非免疫原性腫瘍増殖は、有効量のＩＬ−１７アンタゴニストまたはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストを投与することによって、妨害または阻害される。好ましい実施形態において、アンタゴニストは、ＩＬ−１７に結合する抗体またはＩＬ−１７レセプターに結合する抗体である。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、免疫原性腫瘍増殖は、有効量のＩＬ−１７を投与することによって、妨害または阻害される。
【００１２】
ＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニストおよび／またはＩＬ−１７レセプターアンタゴニストは、他のサイトカインおよび／または化学療法剤と組み合わせて投与され得る。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００１４】
ここに、ＩＬ−１７が腫瘍増殖を促進することおよびＩＬ−１７の腫瘍増殖促進効果が、ＩＬ−１７の生物学的活性をブロックすることによって阻害され得ることが、発見された。ＩＬ−１７の増殖促進活性は、ＩＬ−１７特異的抗体またはＩＬ−１７に対するアンタゴニスト分子を用いてＩＬ−１７の循環をブロックすることによって、減少または排除され得る。あるいは、ＩＬ−１７レセプターは、ＩＬ−１７レセプター特異的抗体またはＩＬ−１７レセプターに対するアンタゴニスト分子を使用することによって、ブロックされ得る。ＩＬ−１７および／またはＩＬ−１７レセプターを阻害することによって、腫瘍細胞の増殖速度が減少される。天然に存在する形態および組換え形態の両方の、ＩＬ−１７およびＩＬ−１７レセプター（ＩＬ−１７Ｒ）を使用して、アンタゴニストとしての使用ならびに薬物スクリーニングおよび薬物開発における使用のための抗体を調製し得る。
【００１５】
ＩＬ−１７が免疫原性腫瘍に抗増殖効果を有することがまた、発見された。免疫原性腫瘍上のＩＬ−１７の抗増殖効果は、Ｔ細胞によって媒介される。天然に存在するＩＬ−１７および組み換え形態のＩＬ−１７の両方は、免疫原性腫瘍の増殖を阻害するために使用され得る。ＩＬ−１７はまた、標準的な遺伝子治療技術（例えば、組織への直接的なＤＮＡの注入、組み換えウイルスベクターの使用、またはトランスフェクトされた細胞の移植を含む）によって送達され得る。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｔ　１９９２　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０．１８０を参照のこと。
【００１６】
従って、腫瘍の型に依存して、ＩＬ−１７は、腫瘍増殖を刺激する（すなわち、非免疫原性腫瘍増殖）か、または免疫原性腫瘍拒絶を活性化するかのいずれかである。
【００１７】
原発性癌および転移性癌の両方は、本発明に従って処置され得る。処置され得る癌の型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：黒色腫、頸部、胸部、膵臓、結腸、肺、神経膠腫、肝細胞、子宮内膜、胃、腸、腎臓、前立腺、甲状腺、卵巣、精巣、肝臓、頭頚部、結腸直腸、食道、胃、眼、膀胱、神経膠芽細胞腫および転移性の癌腫。用語「癌腫（腫瘍）」は、上皮または内分泌組織の悪性疾患をいい、これは、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む。転移性（この用語が本明細書中に使用される場合）は、局所リンパ節に対して離れた部位への腫瘍の拡大として定義される。
【００１８】
一般的に、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニストおよび／またはＩＬ−１７Ｒアンタゴニストは、薬学的キャリア中に有効量のＩＬ−１７／ＩＬ−１７アンタゴニスト／ＩＬ−Ｒアンタゴニストを含有する薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、生理学的に無害の安定剤および賦形剤と共に、さらなる活性成分または不活性成分（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント））と、治療的使用のためにあわせられ得る。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するに適した、任意の適合性の、非毒性の物質であり得る。
【００１９】
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存し、これらの因子には、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の薬物（ｍｅｄｉｃａｎｔ）を含む。従って、処置投薬量は、安全性および効果を最適化するために滴定されるべきである。特定の癌の処置に対する効果的な用量の動物試験は、ヒトの投薬量のさらなる予測的な指標を提供する。種々の考慮は、例えば以下に記載される：Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７編（１９９０）Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。投与方法は、これらの中および以下に考察される：例えば、静脈内投与、腹腔内投与、または筋内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物が挙げられる。徐放性処方物、または徐放性装置が、連続投与に使用され得る。
【００２０】
本願発明の実施におけるＩＬ−１７、ＩＬ−１７アンタゴニストおよびＩＬ−１７レセプターアンタゴニストの好ましい生物学的に活性な用量は、投薬が細胞増殖の最大の抑制または阻害を誘導する用量である。用語、抑制および阻害は、同義的に使用され、確立した腫瘍のさらなる増殖の妨害または腫瘍細胞増殖の速度における遅延もしくは減少をいう。一般的に、処置は、化合物の最適用量よりも少ない、より小さい投薬量で開始される。その後、投薬量は、その環境下で最適の効果が達成されるまで、小さい増分で増加させる。特定の状況に対する適切な投薬量および投与レジメンの決定は、当業者の範囲内である。例えば、ＩＬ−１７およびＩＬ−１７レセプターアンタゴニストの投薬量の範囲は、通常、適切なキャリアと共に、１ｍＭ濃度より低い量と予想され、代表的には、約１０μＭ濃度未満、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル）の量であると予想される。
【００２１】
（ＩＬ−１７アンタゴニスト／ＩＬ−１７Ｒアンタゴニスト）
ＩＬ−１７アンタゴニストは、レセプター結合を競合するタンパク質の形態（例えば、これは、レセプターを活性化する能力を欠くがＩＬ−１７結合またはＩＬ−１７結合分子（例えば、抗体）をブロックする）をとり得る。
【００２２】
抗体は、ＩＬ−１７サイトカイン、フラグメントおよびアナログの、その天然に存在する形態およびその組み換え形態の両方に対して惹起され得る。ＩＬ−１７ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸配列は、公開された国際出願ＷＯ９５／１８８２６およびＷＯ９７／１５３２０に開示される。ＩＬ−１７に対するレセプターおよびそのようなレセプターをコードする核酸は、米国特許第５，８６９，２８６号に開示される。さらに、抗体は、活性形態または不活性形態のいずれかのＩＬ−１７に対して惹起され得、この形態の差異は、活性なサイトカインに対する抗体の方が活性なコンフォーション中にのみ存在するエピトープをより認識するようである、ということである。
【００２３】
所望の抗原（例えば、サイトカイン）の予め決定されたフラグメントに対する抗体（結合フラグメントおよび単鎖バージョンを含む）は、免疫原性タンパク質を有するフラグメントの結合体を用いた動物の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常もしくは不活性なアナログに対する結合に関してスクリーニングされ得るか、またはアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭのＫＤで結合し、より通常では少なくとも約３００μＭ、代表的には少なくとも約１０μＭ、より代表的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭ、またはより良く結合する。抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、ＩＬ−１７レセプターに結合し、レセプターへのリガンド結合を阻害するかまたは生物学的応答を誘発するＩＬ−１７の能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。ＩＬ−１７またはフラグメントは、他の物質（特に、ポリペプチド）に、免疫原として使用される融合または共有結合ポリペプチドとして連結され得る。前述はＩＬ−１７に焦点を当てたが、同様の抗体が、他のアナログ、ＩＬ−１７レセプター、およびアンタゴニストに対して惹起される。ＩＬ−１７またはＩＬ−１７レセプター（ＩＬ−１７Ｒ）に対して惹起された抗体はまた、アンタゴニスト特性に関して試験され得る抗イディオタイプ抗体の惹起に有用である。これらは、種々の細胞応答の調節に有用である。本発明は、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ｒに特異的に結合する抗体の使用を含む。本発明の実施に有用な抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体は、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ｒタンパク質もしくはそれらのフラグメントを用いて免疫することによって動物宿主中で誘発され得るか、または免疫細胞のインビトロ免疫化（感作）によって形成され得る。抗体産生を誘発するために使用される免疫原性成分は、細胞から単離され得るか、または化学合成され得る。抗体はまた、適切な抗体をコードするＤＮＡを用いてプログラムされた組み換え系で産生され得る。あるいは、抗体は、精製された重鎖および軽鎖の生化学的再構成によって構築され得る。抗体としては、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および一価抗体が挙げられる。抗体のＦａｂ’およびＦ（ａｂ）２フラグメントを含むＦａｂフラグメントもまた、含まれる。
【００２４】
モノクローナル抗体を作製するために使用される本発明のハイブリドーマは、周知の技術によって産生される。通常、このプロセスは、所望の抗体を産生するＢリンパ球を用いた不死化細胞株の融合を含む。あるいは、不死化抗体産生細胞株を作製するための非融合技術（例えば、ウイルス誘導形質転換（Ｃａｓａｌｉら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：４７６））が可能であり、そして本発明の範囲内になる。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。最も頻繁には、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が、簡便かつ利用可能であるとして使用される。
【００２５】
ハイブリドーマは、標準的な手順（例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択）によって、選択される。これらのハイブリドーマの間から、所望の抗体を分泌するハイブリドーマが、標準的な免疫アッセイ（例えば、イムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）など）によってそれらの培養培地をアッセイすることによって選択される。抗体は、標準的なタンパク質精製技術を用いて培地からから回収される（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９８５，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００２６】
（ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ｒアンタゴニストに関するスクリーニング）
天然に存在する形態および組み換え形態の両方のヒトＩＬ−１７／ＩＬ−Ｒは、薬物スクリーニングおよび薬物開発に使用され得る。ＩＬ−１７をコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）およびＩＬ−１７ポリペプチドは、例えば、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ｒ結合活性に対して化合物をスクリーニングすることによって、アンタゴニストをスクリーニングするために有利に使用され得る。ＩＬ−１７／ＩＬ−Ｒまたはそれらのフラグメントは、ＩＬ−１７／ＩＬ−Ｒアンタゴニストを同定するための低スループットアッセイおよび高スループットアッセイの基礎として使用され得る。阻害因子は、以下を含み得る：核酸、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド；ペプチド；オリゴ糖；脂質；前記のいずれかの誘導体または他の分子。
【００２７】
阻害因子は、当該分野で周知の方法を用いて（例えば、本発明の核酸もしくはポリペプチドに結合する能力、および／または本発明の核酸もしくはポリペプチドの機能を阻害もしくは変化させる能力について、化学物質または天然産物のライブラリーをスクリーニングすることによって）同定され得る。そのような化合物は、例えば、天然産物のライブラリー、発酵物のライブラリー（植物および微生物を含む）、コンビナトリアルライブラリー、化合物ファイル、および合成化合物ライブラリー中に見いだされ得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、以下から市販される：Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）。希有な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物形態の天然の化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から入手可能であるか、あるいはこれらは容易に生成し得る。さらに、天然および合成産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通じて容易に改変される（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、１９９６、ＴｉｂＴｅｃｈ  １４：６０）。リガンド−結合アッセイは、特定の標的タンパク質機能を妨害する阻害化合物の同定に有用である。これらのアッセイは、試験化合物の特定の標的への結合を検出するように設計される。検出は、結合の直接的な測定を含み得る。あるいは、結合の間接的な指標としては、タンパク質構造の安定化または生物学的機能の破壊が挙げられ得る。有用なリガンド結合アッセイの非限定の例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって開発され、製造者のプロトコール（ＬＫＢ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に記載されるＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＡｃｏｒｅ）システム、酵母ツーハイブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，２８３，１７３号）、およびシンチレーション近接アッセイ（米国特許第４，５６８，６４９号）である。
【００２８】
ＩＬ−１７／ＩＬ−Ｒポリペプチドに結合するか、さもなくばその機能を妨害するとして同定された化合物は、薬学的組成物における使用のために、ＩＬ−１７／ＩＬ−Ｒアンタゴニストとして強力に有用である。
【００２９】
一旦特定の試験化合物が、候補因子として同定されると、２つの特徴に関して試験される：（ｉ）腫瘍増殖を阻害する能力；および（ｉｉ）異なる動物に対する効果の欠失。腫瘍増殖抑制活性を示し、そして動物細胞に対して毒性の欠失を示す因子が、特に好ましい。
【００３０】
（薬学的組成物）
治療に適した薬学的処方物は、１つ以上の生物学的に受容可能なキャリアと組み合わせたＩＬ−１７／ＩＬ−１７アンタゴニスト／ＩＬ−Ｒアンタゴニストを含む。適切な生物学的に受容可能なキャリアとしては、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物学的に受容可能なキャリアは、生理学的または薬学的に受容可能なキャリアである。
【００３１】
組成物は、腫瘍増殖を抑制する量の活性因子を含む。この量は、因子、腫瘍の位置および性質、ならびに特定の宿主に依存する。この量は、当該分野で公知の実験、例えば、マトリックスの投与量および頻度を確立し、そしてマトリックス中の各点に対する実験単位または被検体の群を比較することによって決定され得る。治療有効量は、１回の投与または繰り返しの投与にわたって投与され得る。
【００３２】
活性な因子または組成物は、投薬単位形態（例えば、クリーム、軟膏、ローション、散剤、液体、錠剤、カプセル、坐剤、スプレーなど）に処方され得る。組成物が投薬単位形態に処方される場合、投薬単位形態は、有効量の活性因子を含み得る。あるいは、複数の投薬単位形態または複数の投薬が、活性因子の総投薬量を投与するのに使用される場合、投薬単位形態は、そのような量より少なく含み得る。投薬単位形態は、さらに、１つ以上の賦形剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、可塑剤、着色剤、投薬ビヒクル、吸収促進剤、安定剤、殺菌剤などを含み得る。
【００３３】
処方に関する一般的な情報は、例えば、以下を参照のこと：Ｇｉｌｍａｎら（編）、１９９０、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７編、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ａｖｉｓら（編）１９９３、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００３４】
組成物は、局所的または全身的に投与され得る。局所適用は、代表的に、上記に記載されるように、クリーム、軟膏、ローション、またはスプレーの投与によって達成される。全身性投与としては、経口経路および非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）経路の両方が挙げられる。非経口経路としては、非限定として、皮下、筋内、腹腔内、静脈内、経皮、および鼻腔内の投与が挙げられる。
【００３５】
以下の例は、本発明の範囲を限定することなく本発明をさらに例示することが意図される。
【００３６】
（実施例）
実施例１〜６に使用される種々の物質および方法は、以下に記載される。
【００３７】
（腫瘍細胞株）
ＨｅＬａ頸部腫瘍細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＩＣ１頸部癌細胞株は、Ｊ．Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ博士から提供された（Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４５３４−４５３８）。ヒト黒色腫細胞株のＷＭ７９３、１３４１Ｄ、ＭＺ２およびＨＴ１４４は、Ｍｏｎｔｅｒｏら（１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：１４４３−１４５１）によって記載される。全ての細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、５％ピルビン酸ナトリウム、および０．０１％メルカプトエタノール（これらの全ては、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからである）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で増殖させた。
【００３８】
（ＨｅＬａ細胞およびＩＣ１細胞のトランスフェクション）
ｈＩＬ−１７をコードするｃＤＮＡを、ｐＢＲ３２２中のＳＲαプロモーターの制御下の発現ベクターに挿入し、この中にネオマイシン耐性遺伝子を導入した（ＮＴ−Ｎｅｏ）（Ｄａｅｒｏｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６３５−６４６）。６４０ｂｐのＩＬ−１７  ｃＤＮＡを含むかまたは含まないＮＴ−Ｎｅｏを、Ｓｃａ  Ｉ制限酵素を用いて直線化し、そしてエレクトロポレーションによってＨｅＬａ細胞およびＩＣ１細胞に安定にトランスフェクトした。エレクトロポレーションは、２６０Ｖの電圧および９６０ｍＦのキャパシタンスでＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いて実施した。エレクトロポレーションの７２時間後、トランクフェクト体を、１  ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネティシン）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養することによって選択した。Ｇ４１８耐性クローンを選択培地中で発達させ、そしてＩＬ−１７発現に関して試験した。
【００３９】
（組み換えタンパク質および抗体）
組み換えｈＩＬ−１７は、Ｆｏｓｓｉｅｚら（１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３）によって記載されるようにＩＬ−１７がトランスフェクトされたＮＳＯ細胞の上清から精製した。中和抗ＩＬ−１７  ｍＡｂ  ５ならびに抗ＩＬ１７  ｍＡｂ  １６および抗ＩＬ１７  ｍＡｂ  ２５は、腹水から産生され、そしてこれを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した（Ｆｏｓｓｉｅｚら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３）。
【００４０】
（アッセイ）
ヒトＩＬ−６およびＩＬ−８を、それぞれ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＭｅｄｇｅｎｉｘ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）キットを用いてアッセイした。
【００４１】
ＥＬＩＳＡを使用して、培養上清中のヒトＩＬ−１７濃度を測定した。簡単に言うと、９６の分離された、平らな底のウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、カルボネート緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に希釈した５０ｍｌの抗ＩＬ−１７  ｍＡｂ  ２５（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて４℃で一晩コートした。次いで、プレートを２００ｍｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡを用いて室温で１時間飽和させた。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｍｅｒｃｋ、Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて洗浄した後、５０ｍｌの組み換えｈＩＬ−１７またはＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈したサンプルを添加し、そして３７℃で３時間インキュベートした。洗浄後、次いでプレートを、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に希釈した５０ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗ＩＬ−１７  ｍＡｂ  １６（５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃で２時間インキュベートした。反応は、ペルオキシダーゼ基質（ｏ−フェニレンジアミン−ジヒドトクロライド）の添加によって明確にし、そしてＯＤを４９２ｎｍの波長で読みとった。検出されたヒトＩＬ−１７の最低濃度は、０．０５ｎｇ／ｍｌであった。
【００４２】
（逆ランスクリプターゼＰＣＲ増幅）
ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔａｒｔｏｕｒら（１９９８、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４：２８７−２９４）によって記載されるように実施した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：ヒト（ｈ）ｂアクチンセンス（ＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣ）、ｈｂアクチンアンチセンス（ＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣ）、ｈＩＬ−６センス（ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＡ）、ｈＩＬ−６アンチセンス（ＣＡＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣ）、ｈＩＬ−８センス（ＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＧ）、ｈＩＬ−８アンチセンス（ＧＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴ）、ｈＩＬ−１７センス（ＡＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧ）、ｈＩＬ−１７アンチセンス（ＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＣＧ）、ｈＣＤ４センス（ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＴＡＧＧＣＡＣＴＴＧＣ）、ｈＣＤ４アンチセンス（ＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＣ）、ｈＣＤ８センス（ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧ）、ｈＣＤ８アンチセンス（ＧＣＣＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧ）、マウス（ｍ）ＩＬ−６センス（ＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧ）、ｍＩＬ−６アンチセンス（ＴＣＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＣＣＡＣ）、ｍ−ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）センス（ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ）、ｍＨＰＲＴ  アンチセンス（ＧＡＴＴＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＧＧＣ）（それぞれ、配列番号１〜１６）。
【００４３】
（インビトロ増殖アッセイ）
細胞を、平らな底の９６ウェルプレートに１ウェルあたり１０４細胞の密度でプレートした。細胞を３日間培養し、そしてそれらの増殖をＭＴＴアッセイによって測定した（Ｈａｎｓｅｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１１９：２０３−２１０）。簡単に言うと、２０ｍｌのＭＴＴ（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（Ｓｉｇｍａ）を５ｍｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加し、そして４時間暗所でインキュベートした。次いで、ホルマザン粒子をジメチルスルホキシド中に溶解し、そして５７０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読み取った。ＭＴＴ試験物の吸光度と細胞数との間の標準曲線を、各細胞株について決定した。ＭＴＴのホルマザンへの変換は、生細胞の数と直接関係していた。
【００４４】
（ヌードマウスにおける腫瘍増殖）
８週齢の雄の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（Ｉｆｆａ  Ｃｒｅｄｏ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を記載された実験に使用した。ヒト頸部腫瘍を１０６個の細胞の皮下接種によってマウスに注射した。１群あたり８〜１０匹のマウスを、１実験あたりに使用した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、式：体積＝ａｂ２／２によって、腫瘍の長さ（ａ）および幅（ｂ）から概算した。生検材料を、液体窒素に素早く凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、そしてＲＮＡ抽出のために−７０℃で保存した。
【００４５】
（免疫細胞化学）
腫瘍異種移植片の５ｍＭの凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔ  ｓｅｃｔｉｏｎ）をアセトン中４℃で５分間固定した。トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中での洗浄後、これらを、Ｍａｃ１に対するビオチン化ラットｍＡｂ（Ｍ１／７０ハイブリドーマ）またはアイソタイプが一致したコントロールのビオチン化ラットｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＳＡ）を用いてインキュベートした。ＴＢＳ中での洗浄後、スライドを引き続いてアルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてインキュベートし、そして酵素活性を、１ｍＭのレバミゾール（内因性アルカリホスファターゼの既知のインヒビター）と連結したＦａｓｔ  Ｒｅｄ試薬（Ｄａｋｏ）を用いて明らかにした。切片を、マイヤーのヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【００４６】
（統計分析）
種々の群のマウス間における腫瘍サイズのインビボ比較を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によって分析した。
【００４７】
（実施例１）
（ｒｈＩＬ−１７を用いて刺激された腫瘍細胞株によるＩＬ−６およびＩＬ−８産生）
１０６個のヒト頸部癌細胞（ＨｅＬａまたはＩＣ１）または黒色腫細胞（ＷＭ７９３、ＨＴ１４４、ＭＺ２、１３４１Ｄ）を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり添加し、そして、組み換えｈＩＬ−１７（１００ｎｇ／ｍｌ）、１ｍｇ／ｍｌの中和抗ｈＩＬ−１７  ｍＡｂ５を用いて３７℃で３０分間プレインキュベートされたｈＩＬ−１７（１００ｎｇ／ｍｌ）の混合物、または培養培地単独で刺激した。２４時間後、培養上清を収集し、そして、市販のＥＬＩＳＡを用いてＩＬ−６濃度に関して試験した。
【００４８】
組み換えヒトＩＬ−１７（ｒｈＩＬ−１７）が、２つのヒト頸部細胞株（ＨｅＬａおよびＩＣ１）によって有意にＩＬ−６分泌を増加させることが見い出された。この作用は、頸部癌由来の腫瘍細胞株に制限されなかった。なぜなら、試験された４つの黒色腫細胞株のうちの２つもまた、ｒＩＬ−１７に対して感受性であったからである。抗ＩＬ−１７  ｍＡｂの添加は、ＩＬ−１７によるＩＬ−６産生のアップレギュレーションを阻害した。腫瘍細胞は、有意なレベルのＩＬ−１７を構成的に分泌せず、抗ＩＬ−１７抗体単独は、ＩＬ−６分泌に影響を与えなかった。基底レベルのＩＬ−６が既に産生された細胞株のみ、ＩＬ−１７に応答性であったようである。
【００４９】
ＩＬ−８の増加した産生がまた、ｒＩＬ−１７を用いたＨｅＬａ、ＩＣ１、ＷＭ７９３およびＨＴ１４４細胞株の処理後に示された。処置は、ｈＩＬ−１７を用いたＨｅＬａ細胞のインビトロ処理後に増加したＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を引き起こした。実施された実験において、ヒト頸部癌細胞株（ＨｅＬａ）を、１ｍｌあたり１０６個の細胞でプレートし、そして種々の濃度の精製されたｈＩＬ−１７を用いて培養した。２４時間後、上清中のＩＬ−６およびＩＬ−８のレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。対照的に、ｒＩＬ−１７誘導のＩＬ−６産生に耐性であった細胞株（ＭＺ２、ＷＭ３５）は、ＩＬ−１７処理後ＩＬ−８を分泌しなかった。ｒＩＬ−１７の活性を、０．２と２ｎｇ／ｍｌとの間の用量範囲で観察した。Ｇ−ＣＳＦ産生に対するＩＬ−１７の効果（これは、他の細胞型においてＩＬ−１７によって調節されることが示された（Ｆｏｓｓｉｅｚら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３；Ｃａｉら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６２：５１−５８））は、観察されなかった。
【００５０】
ＩＬ−１７の作用機構をより徹底的に分析するために、ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡ発現を、ｒＩＬ−１７処理された頸部癌細胞および未処理の頸部癌細胞においてＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＨｅＬａ細胞から抽出されたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、培地単独またはｈＩＬ−１７（１０および１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて６時間培養し、βアクチン、ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。次いで、増幅されたＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルにロードし、そして紫外線可視化のためにエチジウムブロマイドを用いて染色した。ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡの明らかなアップレギュレーションが、ｒＩＬ−１７を用いたＨｅＬａ細胞のインビトロ刺激後６時間観察された。従って、ＩＬ−１７は、ＩＬ−６およびＩＬ−８を転写レベルでか、またはそれらのｍＲＮＡ半減期を増加させることによってかのいずれかで調節するようである。
【００５１】
（実施例２）
（ＩＬ−１７トランスフェクトされたヒト頸部癌細胞株の特徴付け）
ＩＬ−１７のヒト頸部癌細胞株に対する役割をさらに分析するために、２つの腫瘍細胞株（Ｈｅｌａ、ＩＣ１）を、ヒトＩＬ−１７をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ＮＴプラスミド単独（Ｎｅｏ）またはヒトＩＬ−１７をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた、野生型（ＷＴ）またはヒト頸部癌細胞（ＨｅＬａ、ＩＣ１）を、２４ウェルの平らな底のプレートに１ウェルあたり１０６個の細胞の密度でプレートした。細胞を２４時間培養し、そしてＩＬ−６またはＩＬ−１７レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。有意な量のＩＬ−１７をそれらの上清に分泌する（５×１０５個の細胞で２４時間にわたって４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）安定なトランスフェクト体が得られた。ＩＬ−１７のｍＲＮＡ発現もタンパク質発現もいずれも、トランスフェクトの前に分析された腫瘍細胞株のいずれにも検出され得なかった。興味深いことに、ＩＬ−１７トランスフェクトされた細胞株は、親の頸部癌細胞株またはベクター単独でトランスフェクトされた細胞よりも、より多くのＩＬ−６を産生し、これは、ｒＩＬ−１７を用いて得られた結果を確証する。ＩＬ−８分泌の明らかな増加は、これらのＩＬ−１７トランスフェクト体において観察されず、これは、これらの細胞における、ＩＬ−１７の、ＩＬ−８調節におけるＩＬ−６調節よりも弱い効果によって説明され得る。
【００５２】
種々のクローンの増殖速度をまた調べた。野生型（ＷＴ）またはＮＴプラスミド単独（Ｎｅｏ）もしくはヒトＩＬ−１７をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたヒト頸部癌細胞（ＨｅＬａ、ＩＣ１）を、９６ウェルの平らな底のプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞の密度でプレートした。これらの細胞を３日培養し、そしてこれらの増殖を、ＭＴＴアッセイによって測定した。これらの実験に関して、全ての細胞を、Ｇ４１８／ネオマイシンがない同じ培地で培養した。各細胞株に対して、ＭＴＴ試験物の吸光度と細胞数との間の標準曲線を決定した。同一のインビトロ増殖が、ＩＬ−１７発現細胞および親細胞（Ｈｅｌａ、ＩＣ１）で観察された。同様に、外因性組み換えＩＬ−１７は、ヒト頸部細胞株の増殖に影響を与えなかった。
【００５３】
（実施例３）
（ヌードマウスにおけるヒト頸部癌細胞およびそれらのＩＬ−１７トランスフェクト体の腫瘍増殖）
頸部癌細胞株のインビトロ増殖に対してＩＬ−１７のいずれの有意な効果もないことと対照的に、ヒトＩＬ−１７  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされ、次いでヌードマウスに移植された２つの頸部癌細胞株（ＨｅＬａおよびＩＣ１）は、モック（ｍｏｃｋ）がトランスフェクトされた細胞よりも、速く増殖することが見い出された。
【００５４】
モック（Ｎｅｏ）またはＩＬ−１７がトランスフェクトされたヒト頸部細胞株のＨｅＬａまたはＩＣ１を、１０６個の細胞の皮下接種によってマウスに注射した。１群あたり８〜１０匹のマウスを１実験あたり使用し、そして腫瘍サイズを上記のように評価した。結果は、２つの独立した実験を示す。例えば、移植後３１日目において、２６ｍｍ３の平均腫瘍体積が、移植された親のＨｅＬａ細胞で測定されたが、ＩＬ−１７トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞株の腫瘍体積は、４０４ｍｍ３に達した（ｐ＝０．０００３）（統計的に有意な結果  ｐ＜０．０５）。
【００５５】
ＩＬ−１７は、ヌードマウスにおいて、腫瘍発生率に影響を与えず、そしてその効果は、最初の増殖期後により明白なようであった。従って、ＩＬ−１７は、腫瘍発達の初期段階で役割を果たさなかったが、むしろその進行を増強した。
【００５６】
（実施例４）
（ヌードマウスにおけるヒトＩＬ−１７外来遺伝子の発現および活性の分析）
ＩＬ−１７  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされ、ヌードマウスに移植された腫瘍中のＩＬ−１７導入遺伝子のインビボ持続性を測定するために、生体組織検査を、移植後５６日目に実施した。モックがトランスフェクトされた細胞（Ｈｅｌａ−Ｎｅｏ）またはＩＬ−１７がトランスフェクトされた細胞（Ｈｅｌａ−ＩＬ−１７）から抽出されたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ヒトＩＬ−１７、マウスＩＬ−６およびマウスＨＧＰＲＴのｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルにロードし、そして紫外線可視化のためにエチジウムブロマイドを用いて染色した。ヒトＩＬ−１７  ｃＤＮＡは、ＨｅＬａ−ＩＬ−１７細胞を用いて移植されたマウス由来の４／４の生検材料に検出されたが、コンロトールのトランスフェクト体（ＨｅＬａ−Ｎｅｏ）を用いて事前に注射されたマウスでは検出されず、導入遺伝子が腫瘍発達の間に失われていないことを示す。
【００５７】
ヒトＩＬ−１７がマウス細胞で生物学的に活性であることが種々の研究で報告されているので（Ｋｅｎｎｅｄｙら、１９９６、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｃｙｔ．Ｒｅｓ．１６：６１１−６１７）、ＩＬ−１７によって通常調節される遺伝子（例えば、ＩＬ−６）のインサイチュ発現を分析した。マウスＩＬ−６  ｍＲＮＡの増加した発現が、ＨｅＬａ−ＩＬ−１７細胞から切除された生検材料中で示された。本研究に使用されたマウスＩＬ−６プライマーは、ヒトインターロイキン−６と交差反応しなかった。同様の分析がヒトＩＬ−６  ｍＲＮＡに対して実施され得なかった。なぜなら、使用されたこのプライマーは、マウスＩＬ−６  ｍＲＮＡも増幅し得たからである。ヒトＩＬ−８のマウス対応物は、未だ単離されておらず、従ってその発現は試験されなかった。
【００５８】
ヌードマウスに移植されたＩＬ−１７またはモックでトランスフェクトされたＨｅＬａ頸部癌腫由来の生検材料の凍結切片を、アセトン中に固定し、そしてビオチン化ラット抗Ｍａｃ  １またはコントロールビオチン化ラットｍＡｂと一致したアイソタイプを用いてインキュベートした。ＴＢＳ中での洗浄後、スライドを引き続きアルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンを用いてインキュベートし、そして酵素活性をＦａｓｔ  Ｒｅｄ試薬を用いて明らかにした。切片を、マイヤーのヘマトキシリンを用いて対比染色した。免役組織化学分析により、ＨｅＬａ−ＩＬ−１７腫瘍のマウスマクロファージによる顕著な浸潤が明らかとなり、一方、モックでトランスフェクトされたＨｅＬａ腫瘍は、単球マクロファージ系から細胞をリクルートしなかったようである。この選択的な周囲および腫瘍内のマクロファージの漸増はまた、マクロファージ上の抗原決定基を認識する他の抗体（抗Ｍａｃ３）を用いてＩＣ１−ＩＬ１７腫瘍中で検出された。Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球のような他の免疫細胞の腫瘍内浸潤は、モックまたはＩＬ−１７でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞由来の腫瘍異種移植片において異ならないようであった。
【００５９】
（実施例５）
（浸潤頸部癌由来の生検材料中のヒトＩＬ−１７  ｍＲＮＡ発現）
本研究は、ＩＬ−１７が頸部癌患者由来の腫瘍生検材料に発現するか否かを決定するために実施した。６つの原発性浸潤頸部癌から抽出されたｍＲＮＡ由来の６つのｃＤＮＡを、ヒトＩＬ−１７、ＣＤ４およびＣＤ８に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにロードし、そして紫外線可視化のためにエチジウムブロマイドを用いて染色した。ＩＬ−１７の有意な発現が、試験された４／６のサンプルに示された。ＣＤ８  Ｔ細胞によってのみ浸潤される腫瘍中に、ＩＬ−１７  ｍＲＮＡ発現は観察され得なかった。ＲＴ−ＰＣＲによって評価された種々のサンプルにおける等量のβアクチン  ｍＲＮＡによって、総ｍＲＮＡレベルの変化に起因するこれらの結果の解釈における偏りを除外する。ＣＤ４ポジティブＴ細胞の存在は、ＩＬ−１７  ｍＲＮＡ発現と関連するようであり、このサイトカインの活性化記憶ＣＤ４起源を示す以前の研究（Ｆｏｓｓｉｅｚら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５９３−２６０３）と一致する。
【００６０】
（実施例６）
（ＩＬ−１７は、Ｔ細胞依存性機構によって免疫原性腫瘍細胞の増殖を阻害する）
本研究を、Ｔ細胞がＩＬ−１７の生物学的活性に果たす潜在的な役割を評価するために実施した。２つの免疫原性マウス腫瘍（Ｐ８１５およびＪ５５８Ｌ）を、本研究に使用した。２つの免疫原性マウス腫瘍を、マウスＩＬ−１７をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした。モックのトランスフェクト体を、コントロールとして使用するために２つの免疫原性マウス腫瘍に対して実施した。腫瘍を免疫応答性宿主に移植した。ＩＬ−１７は、腫瘍発生率に影響を与えないようであった。しかし、モックがトランスフェクトされた腫瘍と比較して、腫瘍産生ＩＬ−１７は、それらの増殖中で有意に阻害された。トンネル（ｔｕｎｎｅｌ）アッセイを使用して、この腫瘍由来の生検材料中のアポトーシス細胞の量を測定した。ＩＬ−１７がトランクフェクトされた腫瘍由来の生検材料中でアポトーシス細胞の増加が存在した。
【００６１】
これをさらに調べるために、マウスをＰ８１５肥満細胞腫産生ＩＬ−１７を用いて免疫した。コントロールとして、マウスを、モックがトランスフェクトされたＰ８１５腫瘍を用いて免疫した。Ｐ８１５腫瘍産生ＩＬ−１７を用いて免役されたマウスは、モックがトランスフェクトされたＰ８１５腫瘍を用いて予防接種されたマウスと比較して、有意に増加したレベルの抗Ｐ８１５細胞傷害性Ｔリンパ球を有した。従って、Ｔ細胞は、ＩＬ−１７がこれらの腫瘍に対して有する抗増殖効果を媒介するようである。
【００６２】
本発明の多くの改変および変化が、本発明の精神および範囲から離れることなくなされ得、同様にこれは当業者に明らかである。本明細書中に記載された特定の実施形態は、例示のためのみに提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲の用語をそのような特許請求の範囲が与えられる権利と等価の完全な範囲を伴なってのみ、限定される。
【国際公開パンフレット】
2004500325.tif 000002
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【国際調査報告】
2004500325.tif 000023
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