(57)【要約】本発明は、ＨＩＶに対する効果的な予防用及び治療ワクチンを得るために、細胞毒性Ｔ−細胞活性を拮抗しないで、ＨＩＶ−１特異的免疫応答を誘発できる新規及び修飾されたペプチドを含んで成る。前記ペプチドは、ＨＩＶ Ｔａｔ及びＲｅｖ、調節タンパク質及びＮｅｆ、補助タンパク質の保存された領域に基づかれている。前記ペプチドの少なくとも１つを含んで成る遊離−又はキャリヤー−結合された形での抗原、前記抗原の少なくとも１つを含むワクチン組成物、そのような抗原を用いてＨＩＶ又はＨＩＶ特異的ペプチドにより誘発される検体を検出するためのイムノアッセイキット及び方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列群：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｒｙ Ｘａａ１２ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ （配列番号１）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
ペプチド誘導体の位置１のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ａｓｐ， Ｖａｌ，Ｓｅｒであるか又は存在せず、
位置３のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｇｌｎ， Ｐｒｏ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ又はＰｈｅであり、
位置４のＸａａは、Ｖａｌ又はＩｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ａｓｐ， Ａｓｎ又はＩｌｅであり、
位置６のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｈｉｓ又はＡｌａであり、
位置７のＸａａは、Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｓｅｒ， Ｌｙｓ， Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、
位置１２のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置１５のＸａａは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ， Ａｓｎ又はＡｌａであり、
位置１７のＸａａは、Ｇｌｎ， Ｌｙｓ又はＴｈｒであり、
位置１８のＸａａは、Ｐｒｏ又はＨｉｓであり、
位置１９のＸａａは、Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， Ｓｅｒ， Ａｌａ， Ａｒｇ， Ｐｒｏ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置２０のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＩｌｅであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｐｒｏ， Ａｓｐ又はＶａｌであり、
位置２２のＸａａは、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり、
位置２３のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置２４のＸａａは、Ａｓｎ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ａｌａ， Ｐｒｏ又はＴｈｒであり、
前記ペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成る］；
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｐｈｅ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｘａａ１２ −Ｚ−Ｔｙｒ Ｘａａｉ Ｇｌｙ Ｘａａ１５ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ （配列番号４）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
位置１のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｔｈｒ， Ｔｙｒ又はＶａｌであり、
位置２のＸａａは、Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ又はＬｅｕであり、
位置３のＸａａは、Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＮｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｇｌｎ， Ｍｅｔ又はＴｈｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ， Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置７のＸａａは、Ｌｙｓ， Ａｒｇ又はＧｌｎであり、
位置８のＸａａは、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、
位置９のＸａａは、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
位置１１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＧｌｙであり、
位置１２のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｈｅ又はＴｙｒであり、
位置１４の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置１５のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
位置１９のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ， Ｇｌｙ又はＣｉｔであり、
位置２０のＸａａは、Ｇｌｎ， Ａｒｇ又はＰｒｏであり、
位置２１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＬｅｕであり、
位置２２のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２３のＸａａは、Ｇｌｙであるか又は存在せず、
ここで配列番号４の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成り、そして−Ｚ−は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は ［Ｇｌｙ］ｎ（ここで、ｎは１，２又は３である）の意味を有する］；
Ｘａａ１ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１‐Ｚ‐Ｘａａ１２ Ｌｅｕ１３ Ｘａａｉ Ｘａａｊ Ｘａａ１４ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ （配列番号７）
［ここで位置１のＸａａは、Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＡｒｇであり、
位置４のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｃｙｓ， Ｖａｌ， Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ， Ａｓｐ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｃｙｓ， Ｐｈｅ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｖａｌ又はＬｅｕであり、
位置１０のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１１のＸａａは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、
位置１３の後に挿入されるＸａａｉは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１４の前に挿入されるＸａａｊは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１４のＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ又はＡｓｎであり、
位置１５のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ａｌａ又はＡｓｎであり、
位置１６のＸａａは、Ｖａｌ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１７のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｌｅｕ， Ａｒｇ， Ｔｈｒ， Ａｓｐ又はＩｌｅであり、
位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ，Ｐｈｅ又はＶａｌであり、
位置１９のＸａａは、Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
ここで配列番号７の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、そしてリンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）の意味を有する］；
Ｘａａ１ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ５ Ｐｒｏ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｐｒｏ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｐｒｏ−Ｚ− ［Ａｒｇ］ｍ Ｘａａｉ Ｘａａ１３ Ｘａａ１４ Ｐｒｏ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１（配列番号１０）：
［ここで位置１でのＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり、
位置７のＸａａは、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
位置８のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ａｌａ又はＭｅｔであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｎ又はＨｉｓであり、
位置１１のＸａａは、Ｖａｌ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１３の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕであり、
位置１４のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＴｈｒであり、
位置１５のＸａａは、Ａｒｇ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
位置１７のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｖａｌ， Ｉｌｅ， Ｎｌｅ又はＬｅｕであり、
位置１８のＸａａは、Ｔｈｒ又はＡｓｐであり、
位置１９のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｐｈｅ又はＡｒｇであり、
位置２０のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｇｌｕ又はＧｌｎであり、
位置２２のＸａａは、Ａｌａ， Ｓｅｒ又はＶａｌであり、
ここで配列番号１０の配列が少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、リンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）を有し、そしてｎとは無関係に、［Ａｒｇ］ｍにおけるｍは０，１，２又は３である］
から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を含んで成り、
前記配列の末端は、遊離カルボキシル−又はアミノ基、アミド、アシル、アセチル又はそれらの塩であり得、
複数のＣｙｓ残基は、鎖間ジスルフィド結合の一部、−Ｓ−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｐ−架橋（ここでｐは１〜８である）を形成し、任意には、１又は複数のヘテロ原子、例えばＯ， Ｎ及びＳにより介在され、そして／又は前記ペプチド配列は、固体支持体に固定されていることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列が、配列番号２、３及び１４の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項３】
前記配列番号４のアミノ酸配列が、配列番号５及び６の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
前記配列番号７のアミノ酸配列が、配列番号８及び９の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
前記配列番号１０のアミノ酸配列が、配列番号１１、１２及び１５の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項６】
少なくとも請求項１記載のペプチドを含んで成ることを特徴とする抗原。
【請求項７】
配列番号１，４，７及び１０の群の少なくとも１つから選択された少なくとも１つのペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項６記載の抗原。
【請求項８】
請求項６記載の抗原、医薬的に許容できる稀釈剤及び任意にはアジュバント、キャリヤー及び／又はビークル、並びに任意には追加の免疫刺激化合物を含んで成ることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項９】
配列番号１，４，７及び１０の群から選択された少なくとも１つのペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項８記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
配列番号１４及び１５のペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、無菌水溶液に溶解され、そして前記任意の免疫刺激化合物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
モノホスホリン脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、完全な不完全フロイントアジュバント、又はアルミニウムヒドロキシドの群から選択されたアジュバントを含んで成ることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項６記載の抗原が、リポペプチド及び／又はリポソーム配合物として配合されていることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１４】
体液サンプルにおけるＨＩＶ又はＨＩＶ−特異的ペプチド又はタンパク質により誘発される抗体の検出方法であって、抗原が請求項１，２，３，４及び５記載のペプチドから選択されるイムノアッセイに、前記サンプルをゆだねることを特徴とする方法。
【請求項１５】
体液のサンプルにおけるＨＩＶ又はＨＩＶ−特異的ペプチド又はタンパク質により誘発される抗体の検出のためのイムノアッセイキットであって、診断用抗原が請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項６及び７記載の抗原と選択的に反応することができることを特徴とする抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、調節及び補助ＨＩＶタンパク質の保存された領域に基づいての新規ペプチド、少なくとも１つの前記ペプチドを含んで成る遊離又はキャリヤー−結合された形での抗原、少なくとも１つの前記抗原を含むワクチン組成物、そのような抗原を用いて、ヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）又はＨＩＶ‐特異的ペプチドにより誘発される抗体を検出するイムノアッセイキット及び方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
ヒト免疫欠損ウィルス型１（ＨＩＶ−１）、すなわち後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質は、発展途上国における健康に対して恐るべき攻撃をし続けている。西洋においては、ＨＩＶ複製及び成熟を標的化する治療方法が、疾病進行に対して顕著な影響を有している。しかしながら、現在の処置の高い費用、薬物の高い毒性、及び治癒の欠乏は、完全且つ効果的なワクチンの開発がＡＩＤＳ流行病の制御のために最良であることを意味する。
【０００３】
ＨＩＶ−１は、単純レトロウィルスに見出されない６個の調節及び補助遺伝子、すなわちｔａｔ， ｒｅｖ， ｎｅｆ， ｖｉｆ， ｖｐｒ及びｖｐｕをコードする複合レトロウィルスである（表１）。真核細胞においては、完全にスプライシングされたｍＲＮＡのみが、翻訳のために細胞質に輸送される。スプライシングされていないか又は部分的にスプライシングされたＲＮＡは維持され、そして結果的に、核において分解される。
【０００４】
この場合、多様にスプライシングされたＲＮＡ種に由来するｔａｔ， ｒｅｖ及びｒｅｆ遺伝子（Ｔａｔ， Ｒｅｖ及びＮｅｆと称する）によりコードされるタンパク質がまず発現され、そして初期ＨＩＶ−１遺伝子発現を構成する。単独でスプライシングされたＲＮＡを発現し、そしてまた十分な長さのスプライシングされていないＲＮＡゲノムをパッケージングのために細胞質中に輸送するためには、ＨＩＶ−１はＲＮＡ輸送に対する制限を克服するための手段を明らかにして来た。Ｔａｔ及びＲｅｖは、それらのタンパク質における突然変異がＨＩＶ−１生成を排除するので、ＨＩＶ−１複製のために必須である（Ｒａｙｔｏｎ Ａ．Ｉ．， など．， （１９８６） Ｃｅｌｌ， ４４： ９４１−９４７， 及びＦｉｓｈｅｒ，Ａ． Ｇ．， など．， （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ， ３２０： ３６７−３７１）。
【０００５】
補助遺伝子は、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子、例えばｖｉｆの完全に上流に位置するエキソン、又はｅｎｖの上流及びその内部ではあるが、しかし異なった読み取り枠、例えばｔａｔ， ｒｅｖにおけるエキソンから誘導される。スプライシングの効率は、異なった補助タンパク質の遺伝子発現のレベルを一部調節することである。
【０００６】
ＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡの組み込みに続いて、ｍＲＮＡの優先的に切断された形が、プロウィルスＤＮＡの５’側の長い末端反復体（ＬＴＲ）上の部位と相互反応する細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより合成される。ｔａｔは、発現されるべき第１の遺伝子の１つであり、そして核局在化シグナルを担持する。それは、ＬＴＲ−指図された転写を１０００倍まで増強する有能な転写活性化因子である。Ｔａｔの連続した発現は、連続した高レベルの遺伝子発現のための正のフィードバックループを確保する。ＤＮＡ配列と相互作用する従来の転写活性化因子とは異なって、Ｔａｔは、特定のステム−ループ二次構造、すなわちＴＡＲ（トランス活性化応答要素）ですべてのＨＩＶ−１ ＲＮＡの５’末端に直接的に結合する。
【０００７】
前記ループ構造は、高く保存され、そいてＴａｔ機能のために必要である。Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて分析されている（Ｐｕｇｌｉｓｔなど． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７： ７６−８０）。Ｔａｔは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ Ｃ−末端ドメインをリン酸化するＣＤＫ９を結合する細胞タンパク質、すなわちサイクリンＴと共にＴＡＲを結合し、それにより、ＲＮＡ転写体の延長を促進する。それらのＴａｔ細胞補因子は活性化された細胞においてのみ存在し、それらのＴリンパ球における“擬似潜伏性”をもたらすプロウィルスＤＮＡの転写を制御する。Ｔａｔは、２種のエキソンから発現され、核局在化シグナル及びＴＡＲ結合領域の両者が第１エキソンに位置する。
【０００８】
Ｔａｔは、感染された細胞から分泌され、そして隣接する細胞に対して異種効果を発揮することができる。それらは、細胞活性化（Ｈｏｆｍａｎなど． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ， ８２： ２７７４−２７８０）、細胞アポプトシスの誘発（Ｍａｃｈｏなど． （１９９９） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８： ７５４３−７５５１， １９９５）、分泌可能成長因子としての機能（Ｔｒｉｎｈ， Ｄ．Ｐ． など． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２５６： ２９９−３０６）、及びウィルスタンパク質合成のための宿主細胞タンパク質合成の調節（Ｘｉａｏなど． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２４４： ３８４−１９９８）を包含する。従ってＴａｔを標的化する治療方法は、ＨＩＶ−１感染に対する強い衝撃を有する。
【０００９】
Ｔａｔ， Ｒｅｖ及びＮｅｆをコードする小さな多様にスプライシングされたｍＲＮＡは、感染の後、初期相の間、卓越する。限界レベルのＲｅｖが生成される場合、スプライシングされていない及び単独でスプライシングされたＲＮＡは翻訳のために細胞質に蓄積し、活発な感染の進行を可能にする。この限界レベルのＲｅｖの生成の失敗は、ＨＩＶ擬似潜在性に寄与することができる。Ｒｅｖは、ＲＮＡ構造、すなわちゲノムのｅｎｖコード領域に位置するＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）を担持するＲＮＡに単に結合することができる。Ｒｅｖは、タンパク質のアミノ末端半分に存在する塩基性アルギニンに富んでいる領域を通してマルチマーとしてＲＲＥと相互作用する。この相互作用の結果は、遺伝子生成物、例えばＥｎｖ， Ｖｉｆ， Ｖｐｎ及びＶｐｒを供給するであろう部分的にスプライシングされたＲＮＡ、及び集合する粒子中への組み込みのために新規ゲノムとして作用するであろうスプライシングされていないＲＮＡの輸送である。
【００１０】
Ｒｅｖ／ＲＲＥ相互作用の構造分析はまた、ＮＭＲを用いて行われている（Ｂａｔｔｉｓｔｅなど． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７３： １５４７−１５５１， １９９６）。Ｒｅｖは、新たに合成されたＲＮＡの連続した輸送のために核と細胞質とのシャトルを可能にする、ロイシンに富んでいる輸送シグナルを担持する（Ｋａｌｌａｎｄなど． （１９９４）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８： １４７５−１４８５； Ｍｅｙｅｒ ＆ Ｍａｌｉｍ， （１９９４） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ８： １５３８−１５４７）。この場合、Ｒｅｖは、構造遺伝子が調節遺伝子に続いて後期で発現されることを確保する。Ｒｅｖに対して指図された治療方法は、感染初期でのウィルス生活環境を中断するであろう。
【００１１】
負の因子として本来記載されているが、Ｎｅｆは後に、ウィルス複製に対する正の効果を有することが示されており、そして感染の初期及び感染の間、Ｔａｔ及びＲｅｖの量よりも多い量で発現される。Ｎｅｆは、Ｎ−末端でミリスチル化され、そして形質膜の内部側と連結されている。Ｎｅｆは、エンドサイトーシスにより表面ＣＤ４のダウンレギュレーション及び分解を部分的に担当できる（Ｐｉｇｕｅｔなど． （１９９８） ＥＭＢＯ Ｊ．， １７： ２４７２−２４８１）。細胞表面からのＣＤ４の除去は、他のＨＩＶ−１株による超感染、又は新しく放出されるウィルスによる再感染を妨げる。
【００１２】
Ｎｅｔはまた、ＭＨＣクラスのダウンレギュレーションを担当し、それにより、細胞毒性Ｔ−リンパ球による破壊から感染された細胞を保護する（Ｌｅ Ｇａｌｌなど．， （１９９７）， Ｒｅｓ． Ｖｉｒｏｌ． １４８： ４３−４７）。Ｎｅｆは、末梢血液リンパ球又はＴ−細胞系のインビトロ感染のために必要とされないので、必須ウィルスタンパク質ではない。しかしながら、Ｎｅｆ欠失変異体は、長期間にわたって低い病原性である。Ｎｅｆはまた、細胞におけるシグナルトランスダクション経路に対して複雑な効果を有し、そしてＴ−細胞活性化、すなわち効果的なＨＩＶ複製のために必要な特徴に包含されるキナーゼのＳＨ３ドメインと相互作用できる、プロリンに富んでいる領域を含む（Ｍｏａｒｅｆｉなど． （１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ， ３８５： ６５０−６５３）。
【００１３】
Ｎｅｆ包含ウィルスは、Ｎｅｆ遺伝子に検出されるウィルスよりもよりウィルスＤＮＡを合成することができ、このことは、Ｎｅｆがウィルス逆転写酵素を直接的に又は間接的に活性化することを示す。ビリオンに関する低レベルのＮｅｆが、この現象を担持することができる。低レベルのＮｅｆはまた、感染された細胞から放出されるが、但し、隣接する細胞に対する可能性ある効果は不明である。Ｎｅｆは感染の初期で発現され、そしてＣＤ４及びＭＨＣクラスＩ発現、及び疾病の進行に対して有意な効果を有するので、それは将来の治療手段のための重要な標的物を提供する。
【００１４】
Ｔａｔ及びＮｅｆは、分泌され、そしてマクロファージにより摂取され、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子と共に発現される。これは、またＭＨＣクラスＩＩにおいて発現される、ペプチドに基づく治療のための標的物としてのそれらの適合性を改良する。ＨＩＶ−１複製のために必須である初期遺伝子生成物、例えばＴａｔ及びＲｅｖの標的化が、初期で発現され、そして疾病の進行に影響を及ぼすＮｅｆの他に、重要であることは明確である。
【００１５】
【表１】
2004508382.tif 000002
【００１６】
ワクチン候補体における天然に存在するＨＩＶ配列は、免疫系のために提供されるエピトープの外観を変えることによって、隠れるＨＩＶ固有の能力のために、安定した長期免疫応答を刺激することはできない。エピトープのこの種々の表示を克服するためには、一定のアミノ酸置換及びアミノ酸組み合わせが、信頼できる態様で及び従って、高い程度にそれらの外来性ウィルス抗原を提供し、そして認識する免疫を維持するであろう。
【００１７】
上記バックグラウンドに基づいて、本発明者は、調節及び補助ＨＩＶタンパク質からのエピトープを模倣することができる新規合成ペプチドを、それらが効果的な治療用及び／又は予防用ワクチンのための必要性を満たすために、免疫系の体液及び細胞部分の両者に対して暴露され得るような態様で企画する可能性を調べることを決定した。
【００１８】
この初期研究は、Ｋｏｒｂｅｒ Ｂ．， など．， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９９７ Ｅｄｓ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， ＮＭ により公開される生来のＴａｔアミノ酸配列に基づかれた。第１のＴａｔエピトープは、ｔａｔタンパク質のアミノ酸１とアミノ酸２４との間に位置する：
【００１９】
【表２】
2004508382.tif 000003
【００２０】
本明細書を通して与えられる配列におけるアミノ酸を定義する１文字及び３文字コードは、国際標準に従い、そしてテキストブック、例えばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ Ａ．Ｌ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２に与えられている。左欄の右側に与えられるアミノ酸は、配列の天然の変動性を表す。本発明者の分析は、この修飾されたエピトープを含む配列をもたらした：
【００２１】
【化１】
2004508382.tif 000004
【００２２】
ここで、ＮＩは２−アミノヘキサン酸（ノルロイシン；それぞれ３文字及び１文字コードによりＮＩｅ及びＮＩとして略される）を示し、そしてシステイン残基は酸化された状態で存在し、すなわち鎖間ジスルフィド架橋を形成する。ペプチドのシステイン残基〜Ｃ−末端部分（位置２２における）は、この選択されたエピトープ外の分子内ジスルフィド結合の部分であるので、類似するペプチド内ジスルフィド結合が選択されたエピトープのＮ−末端部分にシステインを配置することによって形成される。もう１つの方法は、配列の二量体化により分子間ジスルフィド結合を形成することである：
【００２３】
【化２】
2004508382.tif 000005
【００２４】
もう１つの方法は、Ｔａｔから選択されたもう１つのエピトープによる二量体化である。Ｔａｔ上の第２のエピトープは、Ｃ−末端方向において、アミノ酸３５と５７との間に位置し、エピトープの個々におけるＣｙｓ残基の他に、５個のＣｙｓ残基を含む１０個のアミノ酸により、第１のエピトープから分離される。Ｃｙｓ残基の相対的に高い数は、種々の分子間及び分子内架橋可能性を提供する。たぶん、このＣｙｓに富んでいるドメインは、このタンパク質の免疫学的暴露を支配し、そして従って、２種の適切なエピトープの“隠れ（Ｈｉｄｉｎｇ）”を引き起こす。２種の隣接するエピトープの選択及び修飾は、より最適な手段で、Ｔａｔをタンパク質の必須部分を暴露することができる。
【００２５】
エスケープ変異体の成長についての確立を低めるためには、エピトープの数はさらに高められ、そして２種の追加のペプチド配列が選択される。それらの配列は、Ｒｅｖ（残基５８−７８）及びＮｅｆ（残基６５−８５）上に位置する。生来の配列は、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９９９； Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｅｄｓ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ， Ｌｏｓ Ａｌｕｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ に公開されている：
【００２６】
【表３】
2004508382.tif 000006
【００２７】
【表４】
2004508382.tif 000007
【００２８】
【表５】
2004508382.tif 000008
【００２９】
いくつかの修飾されたペプチドが、ＨＩＶ−１抗原としてのそれらのユニーク性及び感受性と組合して、免疫系の刺激のための配列の特異性及びそれらの性質を決定するために合成されている。
【００３０】
発明の記載：
本発明のペプチドは、ＨＩＶ−１エピトープのユニーク性（免疫原性、感受性及び特異性）を維持する性質を有する、上記に記載されるＨＩＶ−１Ｔａｔ、Ｒｅｖ及びＮｅｆタンパク質の４種の異なった保存された領域に起因する。さらに、本発明の新規ペプチドは、認識される細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）拮抗効果を有さず、そして少なくとも１つの可能性あるＣＴＬエピトープを有するであろう。
【００３１】
上記基準を満たす本発明のペプチドは、次の群：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｒｙ Ｘａａ１２ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ （配列番号１）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
ペプチド誘導体の位置１のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ａｓｐ， Ｖａｌ，Ｓｅｒであるか又は存在せず、
位置３のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｇｌｎ， Ｐｒｏ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ又はＰｈｅであり、
位置４のＸａａは、Ｖａｌ又はＩｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ａｓｐ， Ａｓｎ又はＩｌｅであり、
位置６のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｈｉｓ又はＡｌａであり、
位置７のＸａａは、Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｓｅｒ， Ｌｙｓ， Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、
位置１２のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
【００３２】
位置１５のＸａａは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ， Ａｓｎ又はＡｌａであり、
位置１７のＸａａは、Ｇｌｎ， Ｌｙｓ又はＴｈｒであり、
位置１８のＸａａは、Ｐｒｏ又はＨｉｓであり、
位置１９のＸａａは、Ｌｙｓ， Ｔｈｒ， Ｓｅｒ， Ａｌａ， Ａｒｇ， Ｐｒｏ， Ｇｌｕ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置２０のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＩｌｅであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｐｒｏ， Ａｓｐ又はＶａｌであり、
位置２２のＸａａは、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり、
位置２３のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置２４のＸａａは、Ａｓｎ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ａｌａ， Ｐｒｏ又はＴｈｒであり、
前記ペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成り、さらに複数のＣｙｓ残基は、鎖間ジスルフィド結合の一部、−Ｓ−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｐ−架橋（ここでｐは１〜８である）を形成し、任意には、１又は複数のヘテロ原子、例えばＯ， Ｎ及びＳにより介在される］；
【００３３】
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｐｈｅ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｘａａ１２ −Ｚ−Ｔｙｒ Ｘａａｉ Ｇｌｙ Ｘａａ１５ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ （配列番号４）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
位置１のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｔｈｒ， Ｔｙｒ又はＶａｌであり、
位置２のＸａａは、Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ又はＬｅｕであり、
位置３のＸａａは、Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＮｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｇｌｎ， Ｍｅｔ又はＴｈｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ， Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置７のＸａａは、Ｌｙｓ， Ａｒｇ又はＧｌｎであり、
位置８のＸａａは、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、
位置９のＸａａは、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
位置１１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＧｌｙであり、
位置１２のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｈｅ又はＴｙｒであり、
【００３４】
位置１４の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置１５のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
位置１９のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ， Ｇｌｙ又はＣｉｔであり、
位置２０のＸａａは、Ｇｌｎ， Ａｒｇ又はＰｒｏであり、
位置２１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＬｅｕであり、
位置２２のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２３のＸａａは、Ｇｌｙであるか又は存在せず、
ここで配列番号４の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成り、そして−Ｚ−は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は ［Ｇｌｙ］ｎ（ここで、ｎは１，２又は３である）を有し、さらに複数のＣｙｓ残基は、鎖間ジスルフィド結合の一部、−Ｓ−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｐ−架橋（ここでｐは１〜８である）を形成し、任意には、１又は複数のヘテロ原子、例えばＯ， Ｎ及びＳにより介在される］；
【００３５】
Ｘａａ１ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１‐Ｚ‐Ｘａａ１２ Ｌｅｕ１３ Ｘａａｉ Ｘａａｊ Ｘａａ１４ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ （配列番号７）
［ここで位置１のＸａａは、Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＡｒｇであり、
位置４のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｃｙｓ， Ｖａｌ， Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ， Ａｓｐ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｃｙｓ， Ｐｈｅ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｖａｌ又はＬｅｕであり、
位置１０のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１１のＸａａは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、
位置１３の後に挿入されるＸａａｉは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
【００３６】
位置１４の前に挿入されるＸａａｊは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１４でＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ又はＡｓｎであり、
位置１５でＸａａは、Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ａｌａ又はＡｓｎであり、
位置１６でＸａａは、Ｖａｌ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１７でＸａａは、Ｐｒｏ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｌｅｕ， Ａｒｇ， Ｔｈｒ， Ａｓｐ又はＩｌｅであり、
位置１８でＸａａは、Ｌｅｕ，Ｐｈｅ又はＶａｌであり、
位置１９でＸａａは、Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
ここで配列番号７の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、そしてリンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）を有する］；
【００３７】
Ｘａａ１ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ５ Ｐｒｏ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｐｒｏ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｐｒｏ−Ｚ− ［Ａｒｇ］ｍ Ｘａａｉ Ｘａａ１３ Ｘａａ１４ Ｐｒｏ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１（配列番号１０）：
［ここで位置１のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり、
位置７のＸａａは、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
位置８のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ａｌａ又はＭｅｔであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｎ又はＨｉｓであり、
位置１１のＸａａは、Ｖａｌ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１３の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕであり、
位置１４のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＴｈｒであり、
位置１５のＸａａは、Ａｒｇ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
【００３８】
位置１７のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｖａｌ， Ｉｌｅ， Ｎｌｅ又はＬｅｕであり、
位置１８のＸａａは、Ｔｈｒ又はＡｓｐであり、
位置１９のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｐｈｅ又はＡｒｇであり、
位置２０のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｇｌｕ又はＧｌｎであり、
位置２２のＸａａは、Ａｌａ， Ｓｅｒ又はＶａｌであり、
ここで配列番号１０の配列が少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、リンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）を有し、そしてｎとは無関係に、［Ａｒｇ］ｍにおけるｍは０，１，２又は３である］から選択され、
前記配列の末端は、遊離カルボキシル−又はアミノ基、アミド、アシル、アセチル又はそれらの塩であり得、そして／又は前記ペプチド配列は、固体支持体に固定されていることを特徴とする。
【００３９】
新規ペプチド配列は、配列番号１，４，７又は１０の配列群から選択された少なくとも１つのペプチドを含んで成る良好な抗原として作用する可能性を有する。抗原性は、例えば固相への二量体化又は多量体化、及び／又は固定化により、種々のペプチドの割合又は濃度、又はペプチドのサイズを調節することにより適合され得る。前記抗原は、Ｏ， Ｓ又はＮのような１又は複数のヘテロ原子により、たぶん介在されるＣ１−Ｃ８アルキレンのような鎖又は架橋のＣｙｓ残基間での架橋又はジスルフィド架橋により連結されるか、又は好ましくは、連結されていない、本発明の複数のポリペプチド配列を含んで成る。前記鎖は、モノマー、ダイマー又はオリゴマー形で固相に固定され得る。さらに、アミノ酸は、固定化を促進するための“アーム（ａｒｍ）”を達成するために、その末端に付加され得る。
【００４０】
ＰＥＧはポリエチレングリコール（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＨ）であり、そしてリンカー−Ｚの一部であり得、任意にはＰＥＧは、ジカルボン酸（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａＣＯ（ＣＨ２）ｂＣＯＯＨ）又は末端カルボキシル基（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−１ＣＨ２ＣＯＯＨ）（ここで、ａは１〜１０であり、そしてｂは２〜６である）により、連結の前、修飾される。
リンカー−Ｚ−は、ＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ又はそれらの組合せ、及び／又は１又は複数の組合されたＧｌｙ残基から成ることができる。他方では、リンカー−Ｚ−は、Ｇｌｙ−架橋 ［Ｇｌｙ］ｎ（ここで、ｎは１，２または３である）から成る。
【００４１】
本発明のペプチドにおけるすべてのアミノ酸は、Ｄ−又はＬ−形の両者で存在することができるが、但し天然に存在するＬ−形が好ましい。
ペプチド配列のＣ−及びＮ−末端は、末端ＮＨ２−基及び／又はＣＯＯＨ−基の修飾により天然の配列と異なり、すなわちそれらは例えば、キャリヤー又はもう１つの分子のための結合部位を供給するために、アシル化され、アセチル化され、アミド化されるか又は修飾され得る。
本発明のペプチドは、少なくとも６〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸から成る。それらは、同定される位置におけるアミノ酸のすべての天然の変動性を包含する。
【００４２】
本発明のポリペプチド抗原は、遊離形又はキャリヤー結合された形で存在する。ペプチドが任意には結合されるキャリヤー又は固相は、広範囲の種類の既知キャリヤーから選択され得る。それは、診断用抗原として、又はワクチンにおける免疫化成分として、固定されたポリペプチドの意図された使用に関して、選択されるべきである。
【００４３】
例えば、診断目的のために使用され得るキャリヤーの例は、磁気ビーズ、又はコポリマー、例えばスチレン−ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化されたスチレン−ジビニルベンゼン、ポリスチレン、カルボキシル化されたポリスチレンのラテックス、カーボンブラックのビーズ、活性化されていないか又はポリスチレン又はポリ塩化ビニル活性化ガラス、エポキシ−活性化された多孔性磁気ガラス、ゼラチン又は多糖粒子又は他のタンパク質粒子、赤血球細胞、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそのような抗体のＦａｂフラグメントである。
【００４４】
本発明のさらなる態様によれば、抗原は、キャリヤー、アジュバント、又は他の免疫刺激要素、例えばｅｎｖ遺伝子を担持するカナリアポックスウィルスと共にたぶん組合されるワクチンの一部を形成することができる。ワクチン目的のためのキャリヤー及び／又はアジュバントの例は、他のタンパク質、例えばヒト又はウシ血清アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニン及び脂肪酸である。免疫刺激材料は、次の３種のグループに分けられ得る：アジュバント、抗原のためのキャリヤー及びビークル。
【００４５】
アジュバントの例は、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウム塩、サポニン、ムラミルジ及びトリペプチド、モノホスホリル脂質Ａ、パルミチン酸、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、及びＴｈ１サイトカインＩＬ−１２及びＩＬ−１を含む種々のサイトカインを包含する。多数のタンパク質のトキシンが、ＣＴＬワクチンの開発において有用である、シトソール中に細胞膜を通してパッセンジャータンパク質を運ぶために使用され得る。キャリヤーは、細菌トキソイド、例えば不活性化された破傷風菌及びコレラトキシン、遺伝子的に解毒された細菌トキシン、例えばＥ．コリからの熱不安定性エンテロトキシン、脂肪酸、生存ベクター、例えばポリオキメラ、及び粒質物を形成するためにハイブリッドタンパク質、例えば酵母レトロランスポゾンハイブリッドＴＹ粒子及びＨＢｃＡｇ粒子を包含する。
【００４６】
近代的なワクチンにおいて時折存在する成分であるビークルは、鉱油エマルジョン、完全及び不完全フロイントアジュバント、植物油エマルジョン、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤、スクアレン又はスクアラン、リポペプチド、リポソーム及び生分解性微小球から成る。新規ワクチンの開発のために有意な可能性を有する２種の最近のアジュバントは、水中油マイクロエマルジョン（ＭＦ５９）及びポリマー微小球を包含する。抗原の免疫原性を増強することができるいずれかの物質が使用され得、そしていくつかの追加の異なったキャリヤー又はアジュバントがアメリカ又はヨーロッパ薬局により提供されている。
【００４７】
免疫刺激使用のための抗原の適切な配合物はまた、インターフェロン、例えばＩＮＦ−γ、鉱ウィルスケモカイン又は造血成長因子、例えば顆粒球マクロファージ成長因子を含んで成ることができる。
例えば小腸における刺激及び吸収を増強するためのもう１つのアプローチは、小さなペプチド、例えばジ、トリ又はテトラペプチドと共に、本発明のペプチドを投与することである。それらのペプチドは、本発明のペプチド以外に又はそれと組合して投与され得る。好ましくは、ペプチドは、Ｄ−又はＬ−形、好ましくはＤ−形でのアミノ酸から成るトリペプチドＹＧＧと共に投与される。
【００４８】
例えば粘膜を通してワクチンの非経口投与するための最近のアプローチは、粘膜アジュバントの非毒性誘導体を創造するための遺伝子融合技法、必須遺伝子に欠失を有する遺伝子的に不活性化された抗原、抗原、及び粘膜免疫応答の調節及び制御において重要である特定のサイトカインの同時発現、及びＤＮＡ又はＲＮＡ摂取及び宿主細胞におけるその内因性発現を可能にする遺伝子材料自体を包含する。
細胞介在性免疫性が必要とされる耐久性のある応答を開発する１つのアプローチは、１又は複数の特異的抗原をコードするプラスミドＤＮＡによりワクチン接種することである。
【００４９】
ＨＩＶ感染に対して保護するためには、ワクチンは、粘膜性及び全身性免疫応答を誘発すべきであり、そしていずれかの便利な経路により、例えば非経口的に、例えば皮下的に、皮膚下的に、静脈内に、筋肉内的に、経口的に、粘膜的に又は鼻腔内的に投与され得た。
本発明のワクチンの好ましい態様においては、それは、配列番号１，４，７及び１０の群から選択された少なくとも１つのペプチドを含む抗原を含んで成り、より好ましい異なったペプチドは等量で存在する。
【００５０】
さらなる好ましい態様においては、ワクチン組成物は、下記抗原を含む：
Ｆ Ｖ Ｉ Ｈ Ｒ Ｌ Ｅ Ｐ Ｗ Ｌ Ｈ Ｐ Ｇ Ｓ Ｑ Ｈ ＮＩ Ｔ Ａ Ｓ Ｔ Ｎ−ＮＨ２（配列番号１４）及び
Ｒ Ｌ Ｖ Ｇ Ｆ Ｐ Ｖ Ｋ Ｐ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｌ Ｌ Ｒ Ｐ Ｌ Ｔ Ｙ Ｋ Ａ Ａ−ＮＨ２（配列番号１５）。
前記配列は、細胞免疫系を活性化することができ、そしてＣＴＬ−エピトープと共に寄与することができる。ＣＴＬ−エピトープの骨格内に包含されるアミノ酸変化が、増強された結合を達成するために企画される。他のアミノ酸変化は、ペプチドの合成を促進し、そして／又はペプチドの溶解能力を高めるために行われて来た。
【００５１】
本発明の抗原を用いて、体液のサンプルにおける、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１特異的ペプチド又はタンパク質により誘発される抗体を検出するための方法は、本発明の追加の態様である。この検出のために企画されるイムノアッセイキット、及び前記抗原と選択的に反応することができる抗体がまた、本発明により包含される。
【００５２】
ペプチドの調製の記載：
本発明のペプチドは、線状アミノ酸配列を生成するいずれかの既知の方法、例えば組換えＤＮＡ技法により生成され得る。本発明の１又は複数のペプチド又は前記ペプチドのマルチマーをコードする核酸配列は、発現ベクター中に導入される。適切な発現ベクターは例えば、複製及び発現のための必要な制御領域を含んで成る、プラスミド、コスミド、ウィルス又はＹＡＣ（酵母人工染色体）である。発現ベクターは、宿主細胞における発現のために刺激され得る。適切な宿主細胞は例えば、細菌、酵母細胞及び哺乳類細胞である。
【００５３】
そのような技法は、当業界において良く知られており、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋなど．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９により記載されている。他の良く知られている技法は、例えば、いわゆるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成により、液相において又は好ましくは固相（樹脂）上で１つのアミノ酸残基を次のアミノ酸残基にカップリングすることによる分解又は合成である。例えば、Ｂａｒａｎｇ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ， Ｅｄ． （Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ．， １９８０）， Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｏｎｉｅｒ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｎ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ３０， ｐ． ７０５−７３９ （１９８７）， 及びＦｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ Ｉｎｔ． Ｊ． ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ３５， ｐ． １６１−２１４ （１９９０） を参照のこと。
【００５４】
結合された又は環状のペプチドが所望される場合、アミノ酸配列は、適切な線状アミノ酸配列が合成される場合、１つのペプチド配列内に、又は２種のペプチド配列間で２個のシステイン残基を環化するか又は連結するために化学的酸化段階にゆだねられる。Ｋａｊａなど．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ， ３３， ８， ｐ．１０７３−１０７６， １９９２を参照のこと。
【００５５】
合成の一般的な記載：
下記例において調製されるすべてのペプチド誘導体は、標準のプログラムを用いて、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上で合成された。使用される樹脂は、０．２０ｍ当量／ｇの理論負荷用量を有するＴｅｎｔａ Ｇｅｌ Ｐ ＲＡＭ （ＲＡＰＰ ＰＯｌＹＭＥＲＥ ＧｍｂＨ， Ｔｕｂｉｎｇｅｎ） であった。合成の最終生成物は、真空下で一晩、乾燥された。次に、ペプチドは、スキャベンジャーとしてエタンジチオール（５％）及び水（５％）の存在下での９０％トリフルオロ酢酸による処理により樹脂から分離された（ＲＴで１．５時間）。
【００５６】
次に、樹脂が濾過され、そして追加のトリフルオロ酢酸（１００％）（２×２０ｍｌ）によりフィルター上を洗浄された。組合された濾液が真空下で蒸発され（ＲＴで水浴）、そして樹脂がエチルエーテル（２００ｍｌ）と共に粉砕され、そして沈殿された生成物が濾過された。フィルター上の固形物が氷酢酸（１００ｍｌ）によりすばやく溶解され、そしてメタノール中、２０％酢酸１．５Ｌに添加され、そして淡褐色が残るまで、メタノール中、ヨウ素の０．１Ｍ溶液により処理された。
【００５７】
次に、酢酸塩形でのＤｏｗｅｘ×１×８イオン交換体（１５ｇ）（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）が添加され、そしてその混合物が濾過された。濾液が蒸発され、そして残留物が酢酸から凍結乾燥された。次に、生成物が、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル水溶液を含む適切なシステム中、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００−５ Ｃ８ （ＥＫＡ Ｎｏｂｅｌ， Ｓｕｒｔｅ， Ｓｗｅｄｅｎ） により充填されたカラム上での逆相液体クロマトグラフィーにより分析された。順類な物質を含む画分がプールされ、溶液が蒸発され、そして生成物が酢酸から凍結乾燥された。最終ＨＰＬＣ分析が最終生成物に対して行われ、そしてペプチドの構造アミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめられた。
【００５８】
合成の間に使用されるすべてのアミノ酸はＬ−アミノ酸であり、そしてそれらは、α−アミノ官能基でフルオレニルメトキシ−カルボニル基により保護された。側鎖は次の通りに保護された：
Ｃｙｓ （Ｔｒｔ）， Ｇｌｎ （Ｔｒｔ）， Ｇｌｕ （ＯｔＢｕ）， Ｔｈｒ （ｔＢｕ）；
前記括弧内の略語は次の通りである：
Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル；ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル；ＯｔＢｕ＝ブチルエステル。
アミノ酸誘導体は、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより供給された。
【００５９】
実施例
例１．Ｃ Ｓ Ｗ Ｖ Ｎ Ｐ Ｒ Ｌ Ｅ Ｐ Ｗ ＮＩ Ｈ Ｐ Ｇ Ｓ Ｑ Ｈ ＮＩ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｎ−ＮＨ２（配列番号２）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。次に、前記ペプチドを、Ｉ２による酸化により環化した。前記ペプチドを、酢酸／メタノール（１：４）に溶解し、そしてメタノール中、０．１ＭのＩ２溶液を添加した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２７４６．２。
【００６０】
例２．Ｆ Ｖ Ｉ Ｐ Ｒ Ｌ Ｅ Ｐ Ｗ ＮＩ Ｈ Ｐ Ｇ Ｓ Ｑ Ｐ ＮＩ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｎ−ＮＨ２（配列番号３）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２５３８．０。
【００６１】
例３．Ｙ Ｌ Ｌ Ｆ Ｌ Ｔ Ｋ Ｇ Ｌ Ｇ Ｉ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｙ ＮＩ Ｇ Ｃｉｔ Ｋ Ｋ Ｒ Ｃｉｔ Ｑ Ｉ Ｌ Ｇ−ＮＨ２（配列番号５）
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
【００６２】
例４．Ｙ Ｌ ＮＩ Ｆ Ｌ Ｔ Ｒ Ｇ Ｌ Ｇ Ｉ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｙ ＮＩ Ｇ Ｃｉｔ Ｋ Ｋ Ｒ Ｃｉｔ Ｑ Ｉ Ｃ Ｇ−ＮＨ２（配列番号６）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：３０９７．７。
【００６３】
例５．Ｒ Ｉ Ｌ Ｓ Ｔ Ｙ Ｌ Ｇ Ｒ Ｉ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｗ Ｌ Ｓ Ａ Ｅ Ｐ Ｖ Ｐ Ｌ Ｑ Ｌ Ｐ Ｐ Ｌ−ＮＨ２（配列番号８）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２９９０．６。
【００６４】
例６．Ｒ Ｉ Ｌ Ｓ Ｔ Ｙ Ｌ Ｇ Ｒ Ｉ Ｓ Ｇ Ｇ Ｇ Ｙ Ｌ Ｓ Ａ Ｅ Ｐ Ｖ Ｐ Ｌ Ｑ Ｌ Ｐ Ｐ Ｌ−ＮＨ２（配列番号９）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
【００６５】
例７．Ｋ Ｌ Ｖ Ｇ Ｆ Ｐ Ｖ Ｋ Ｐ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｇ Ｇ Ｒ Ｌ Ｌ Ｃｉｔ Ｐ ＮＩ Ｔ Ｙ Ｋ Ａ Ａ−ＮＨ２（配列番号１１）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
【００６６】
例８．Ｒ Ｌ Ｖ Ｇ Ｆ Ｐ Ｖ Ｋ Ｐ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｇ Ｇ Ｒ Ｌ Ｌ Ｒ Ｐ Ｌ Ｔ Ｙ Ｋ Ａ Ａ−ＮＨ２（配列番号１２）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：。
分子式：Ｃ１３０Ｈ２１７Ｏ３９Ｎ２９。
【００６７】
例９．ジスルフィド架橋を通しての二量体化
例２のペプチド配列を、酸化段階を通して連結し、システイン残基がジスルフィド架橋を形成するジペプチドを形成する。架橋を次のいずれかの手段により形成する：
Ａ）Ｉ２による酸化。ペプチド（異なる場合、等量）を、酢酸／メタノール（１：４）に溶解し、そしてメタノール中、０．１ＭのＩ２溶液を添加し、ホモダイマーの混合物を生成し、又は
【００６８】
Ｂ）［Ｃｙｓ（Ｓｐｙ）２２］−配列番号３を通しての酸化。２ＭのＡｃＯＨ（水性）及び２−プロパノール（１：１）に溶解された、２．３ｍＭの配列番号３のペプチドを、２，２−ジチオジピリジン（３当量）により処理し、［Ｃｙｓ（Ｓｐｙ）２２−配列番号３を得る。［Ｃｙｓ（Ｓｐｙ）２２］−配列番号３を、１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ（水性、ｐＨ＝６．５）及びメタノール（５：２）に溶解し、配列番号３のダイマーを得る。
得られるダイマーの純度を、ＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造を、アミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめる。
【００６９】
例１０．Ｆ Ｖ Ｉ Ｈ Ｒ Ｌ Ｅ Ｐ Ｗ Ｌ Ｈ Ｐ Ｇ Ｓ Ｑ Ｈ ＮＩ Ｔ Ａ Ｓ Ｔ Ｎ−ＮＨ２（配列番号１４）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９８％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２５４０．２。
【００７０】
例１１．Ｒ Ｌ Ｖ Ｇ Ｆ Ｐ Ｖ Ｋ Ｐ Ｑ Ｖ Ｐ Ｇ Ｌ Ｌ Ｒ Ｐ Ｌ Ｔ Ｙ Ｋ Ａ Ａ−ＮＨ２（配列番号１５）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９９％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２５２０．３。
【００７１】
例１２．参照例：ｎａｔｉｖ ｔａｔ１配列Ｍ Ｅ Ｓ Ｖ Ｄ Ｐ Ｒ Ｌ Ｅ Ｐ Ｗ Ｋ Ｈ Ｐ Ｇ Ｓ Ｑ Ｐ Ｋ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｎ−ＮＨ２（配列番号１６）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９７％以上（１％以下の単一の不純物）；
分子量（遊離塩基）：２７０８．１。
【００７２】
例１３．参照例：ｎａｔｉｖ ｔａｔ２配列Ｑ Ｖ Ｃ Ｆ Ｉ Ｔ Ｋ Ｇ Ｌ Ｇ Ｉ Ｓ Ｙ Ｇ Ｒ Ｋ Ｋ Ｒ Ｒ Ｑ Ｒ Ｒ Ｒ−ＮＨ２（配列番号１７）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９４％以上；
分子量（遊離塩基）：２８０６．４。
【００７３】
例１４．参照例：ｎａｔｉｖ Ｎｅｆ配列Ｅ Ｅ Ｖ Ｇ Ｆ Ｐ Ｖ Ｒ Ｐ Ｑ Ｖ Ｐ Ｌ Ｒ Ｐ Ｍ Ｔ Ｙ Ｋ Ａ Ａ−ＮＨ２（配列番号１８）の調製
前記ペプチドを、合成の一般的記載に従って、対応する出発材料から、アミド形で合成した。純度をＨＰＬＣ分析により決定し、そして構造をアミノ酸分析及び質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）により確かめた。
純度（ＨＰＬＣ）：９５％以上；
分子量（遊離塩基）：２３８４．４。
【００７４】
例１５．
配列番号３及び１２のペプチドを含んで成るワクチンを調製する。凍結乾燥されたペプチドを、無菌水に溶解し、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の調製をまた、製造業者の使用説明書に従って調製し、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度の調製物を得る。前記２種の溶液を、皮下注射する。典型的な注射用量は１００μｌである。
【００７５】
例１６．
配列番号１４及び１５のペプチドを含んで成るワクチンを調製する。凍結乾燥されたペプチドを、無菌水に溶解し、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の調製をまた、製造業者の使用説明書に従って調製し、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度の調製物を得る。前記２種の溶液を、皮下注射する。典型的な注射用量は１００μｌである。
【００７６】
例１７．
抗原溶液又は懸濁液を、等部のＢｅｈｒｉｎｇの完全又は不完全フロイントアジュバントと共に混合し、そして次に、注射器又はホモジナイザーにより吸い上げたり、出したりすることにより、細かく乳化し、そして強く圧縮する。そのエマルジョンは、少なくとも３０分間、安定して持続すべきである。抗原−アジュバントエマルジョンを、補充物として最良に皮下注射する。
【００７７】
例１８．ＨＩＶ−１により誘発された抗体の検出のためのイムノアッセイ
磁気粒子試薬は、製造業者により推薦されるプロトコールに従って調製されるべきである。Ｄｙｎａｌ ＡＳは、使用されるＤｙｎａｂｅａｄｓの製造業者である。リガンドにより被覆された磁気粒子は、試薬１と呼ばれる。本発明のペプチドを、磁気粒子の予備活性化された表面に共有結合する。磁気粒子の表面にペプチドを物理的に吸収することもまた可能である。試薬１における粒子の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲内である。粒度は０．２μｍ〜１５μｍである。ペプチドの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｇ粒子〜１ｍｇ／ｍｇ粒子の範囲内である。
【００７８】
抗ヒトＩｇアルカリホスファターゼ（ＡＰ）接合の抗体試薬を、Ｄａｋｏ ＡＳの推薦されるプロトコールに従って調製する。このプロトコールはこの分野においては標準の方法である。この試薬は試薬２と呼ばれる。
基質溶液フェノールフタレイン−一リン酸は、Ｆｌｕｋａ ＡＧの推薦されるプロトコールに従って調製されるべきである。このプロトコールは、この分野においては標準の方法である。この基質溶液は試薬３と呼ばれる。
使用される洗浄及びインキュベーション緩衝液は、次の追加の化合物を含む標準の０．０５Ｍのトリス−基材の緩衝液である：Ｔｗｅｅｎ２０（０．０１％〜０．１％）、グルセロール（０．１％〜１０％）、及び塩化ナトリウム（０．２％〜０．１％）。
【００７９】
アッセイ方法は、１滴の試薬１を、個々のウェルにおいて、２滴の洗浄緩衝液と共に混合するインキュベーション段階を包含する。混合の後、３０μｌのサンプルを添加し、そしてその溶液を５分間、インキュベートする。磁気粒子を磁石により取り、そして磁石を分離する前、液体を除く。次に、ウェルを、４滴の洗浄溶液により２度、洗浄し、次に、試薬２と共にインキュベートする。１滴の試薬２を、２滴の洗浄緩衝液と共に添加し、そしてその溶液を５分間インキュベートする。
【００８０】
磁気粒子を磁石により取り、そして液体を除去し、その後、磁石を分離する。次に、洗浄段階を反復し、その後、試薬３と共にインキュベートする。２滴の試薬３を個々のウェルに添加し、そしてその溶液を３分間インキュベートする。結果は、白色バックグラウンドに対して読み取られ得る。正の結果が読み取られ（３＋＝強い赤色）、そして負の結果は、負の対照において得られるように、明らかに淡黄／褐色溶液である。
イムノアッセイキットは、ＨＩＶウィルス又はＨＩＶ−特異的ペプチド又はタンパク質、例えば本発明のペプチドにより誘発される抗体の検出に使用され得る。
【００８１】
例１９．治療用又は予防用ワクチン
配列番号１，４，７及び１０の配列群から選択された本発明のポリペプチドの少なくとも１つが、抗原を形成し、そしてヒト免疫欠損ウィルス型１（ＨＩＶ−１）に対する保護を提供するよう意図された予防用又は治療用ワクチンの活性素因を構成することができる。ワクチンは、宿主免疫系（ヒト又は脊椎動物）の保護又は刺激において有益な効果を有する化合物、例えばインターロイキン、インターフェロン、顆粒マクロファージ成長因子、造血成長因子又は同様のものを含むことができる。
【００８２】
好ましくは、ワクチン組成物はさらに、アジュバント又はビークルを含み、より好ましくは前記アジュバント又はビークルは、たぶんみょうばんを含むモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、フロイトアジュバント（完全又は不完全）又はアルミニウムヒドロキシである。アジュバント／ビークルの最適な量は、選択されるその型に依存するであろう。
【００８３】
本発明のペプチドは、リポペプチドワクチンを形成するために、単一の脂肪酸、例えば単一のパルミトイル鎖のＣ−末端付加により修飾され得る。さらに、リポペプチドが、凍結−融解方法によりリポソーム膜中に導入され、それらの表面上にペプチドリガンドを担持するポリソームがもたらされる。
【００８４】
ペプチド又はワクチン配合物は、貯蔵の前、凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたペプチドを、無菌水に溶解し、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。ワクチンは好ましくは、すぐに使用するために、１又は複数の用量単位を含むアンプルにおいて、低温で貯蔵され得る。本発明のペプチドの典型的な用量単位は、次の濃度範囲内である：０．０５μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１５μｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ体重。当業者は、適切な用量が患者の体重、疾病のタイプ、病状の重症度、投与路及びいくつかの他の要因に依存するであろうことを理解するであろう。治療用ワクチンとして使用される場合、ワクチンは、注射により約１２度、投与されるであろう。さらなる追加免疫が追随し、そして極端な場合、患者の一生を通して投与される。注射溶液の調製においては、ペプチドは、１ｍｇ／ｍｌペプチドの最終濃度になるよう、無菌水に溶解される。
【００８５】
典型的には、注射液の体積は１００μｌ〜２００μｌ（２×１００μｌ）である。ペプチドは好ましくは、適切なアジュバント及び／又は顆粒球−マクロファージ成長因子、例えば０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲内に、製造業者に推薦に従って製造されたＬｅｕｃｏｍａｘ（商標）（Ｓｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）と共に同時−投与される。本発明のペプチドが、国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＮＯ００／００７５号及び／又は同時継続出願のノルウェイ特許出願番号第２０００４４１３号に記載されるペプチドと共に投与される組み合わせ治療が特に好ましい。ペプチドは、連続的に又は同時に投与され得る。適切な投与は、皮膚内、皮膚下、静脈内、経口、筋肉内、鼻腔内、粘膜又は他のいずれかの適切な経路であり得る。追加の免疫投与は、保護を維持するために必要とされ得る。当業者は、本発明のワクチン組成物が感染においてのみならず、感染の処理において有用であることを理解するであろう。
【００８６】
本発明のペプチドの非毒性効果は、１００μｇ／体重の用量でマウスに注射される場合に観察される。
上記例は、本発明を単に例示している。当業者は、本明細書に記載されるペプチド、抗原及びワクチンを、本発明の範囲内で修飾され得ることを理解すべきである。
【国際公開パンフレット】
2004508382.tif 000009
2004508382.tif 000010
2004508382.tif 000011
2004508382.tif 000012
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2004508382.tif 000052
2004508382.tif 000053
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508382.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月13日(2002.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生来の配列に比較して、修飾を含み、そして下記アミノ酸配列群：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｒｙ Ｘａａ１２ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ （配列番号１）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
ペプチド誘導体の位置１のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ａｓｐ， Ｖａｌ，Ｓｅｒであるか又は存在せず、
位置３のＸａａは、Ｔｒｐ， Ｔｙｒ又はＰｈｅであり、
位置４のＸａａは、Ｖａｌ又はＩｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ｉｌｅであり、
位置６のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｈｉｓ又はＡｌａであり、
位置７のＸａａは、Ａｒｇ， Ａｓｎ， Ｓｅｒ， Ｌｙｓ， Ｇｌｕ又はＡｓｐであり、
位置１２のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置１５のＸａａは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１６のＸａａは、Ｓｅｒ， Ａｓｎ又はＡｌａであり、
位置１７のＸａａは、Ｇｌｎ， Ｌｙｓ又はＴｈｒであり、
位置１８のＸａａは、Ｐｒｏ又はＨｉｓであり、
位置１９のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置２０のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＩｌｅであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｐｒｏ， Ａｓｐ又はＶａｌであり、
位置２２のＸａａは、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり、
位置２３のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置２４のＸａａは、Ａｓｎ， Ｌｙｓ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ａｌａ， Ｐｒｏ又はＴｈｒであり、
前記ペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成る］；
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｐｈｅ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｘａａ１２ −Ｚ−Ｔｙｒ Ｘａａｉ Ｇｌｙ Ｘａａ１５ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ （配列番号４）
［ここで前記鎖のアミノ酸は次の意味を有し：
位置１のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｔｈｒ， Ｔｙｒ又はＶａｌであり、
位置２のＸａａは、Ｖａｌ， Ａｌａ， Ｃｙｓ又はＬｅｕであり、
位置３のＸａａは、Ｃｙｓ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＮｌｅであり、
位置５のＸａａは、Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｇｌｎ， Ｍｅｔ又はＴｈｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｓｎ， Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置７のＸａａは、Ｌｙｓ， Ａｒｇ又はＧｌｎであり、
位置８のＸａａは、Ｇｌｙ又はＡｌａであり、
位置９のＸａａは、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ又はＡｌａであり、
位置１１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＧｌｙであり、
位置１２のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｈｅ又はＴｙｒであり、
位置１４の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕ， Ｉｌｅ又はＮｌｅであり、
位置１５のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
位置１９のＸａａは、Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ｓｅｒ， Ｇｌｙ又はＣｉｔであり、
位置２０のＸａａは、Ｇｌｎ， Ａｒｇ又はＰｒｏであり、
位置２１のＸａａは、Ｉｌｅ又はＬｅｕであり、
位置２２のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｃｙｓであるか又は存在せず、
位置２３のＸａａは、Ｇｌｙであるか又は存在せず、
ここで配列番号４の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸を含んで成り、そして−Ｚ−は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は ［Ｇｌｙ］ｎ（ここで、ｎは１，２又は３である）の意味を有する］；
Ｘａａ１ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｘａａ４ Ｘａａ５ Ｘａａ６ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１‐Ｚ‐Ｘａａ１２ Ｌｅｕ１３ Ｘａａｉ Ｘａａｊ Ｘａａ１４ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ （配列番号７）
［ここで位置１のＸａａは、Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＡｒｇであり、
位置４のＸａａは、Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ａｓｎ， Ａｓｐ， Ｃｙｓ， Ｖａｌ， Ｔｈｒ， Ａｌａ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｌａ， Ａｓｐ， Ａｓｎ又はＳｅｒであり、
位置６のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｃｙｓ， Ｐｈｅ， Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｖａｌ又はＬｅｕであり、
位置１０のＸａａは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１１のＸａａは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１２のＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ又はＰｈｅであり、
位置１３の後に挿入されるＸａａｉは、Ｓｅｒ， Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１４の前に挿入されるＸａａｊは、Ａｌａ， Ｔｈｒ， Ｇｌｕ， Ｇｌｎ， Ｖａｌ， Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、
位置１４のＸａａは、Ｇｌｕ， Ｌｙｓ， Ｇｌｎ， Ａｓｐ又はＡｓｎであり、
位置１５のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ａｌａ又はＡｓｎであり、
位置１６のＸａａは、Ｖａｌ， Ａｓｎ， Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、
位置１７のＸａａは、Ｐｒｏ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ， Ｓｅｒ， Ｌｅｕ， Ａｒｇ， Ｔｈｒ， Ａｓｐ又はＩｌｅであり、
位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ，Ｐｈｅ又はＶａｌであり、
位置１９のＸａａは、Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ又はＧｌｕであり、
ここで配列番号７の配列は、少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、そしてリンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）の意味を有する］；
Ｘａａ１ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ５ Ｐｒｏ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｐｒｏ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｐｒｏ−Ｚ− ［Ａｒｇ］ｍ Ｘａａｉ Ｘａａ１３ Ｘａａ１４ Ｐｒｏ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１（配列番号１０）：
［ここで位置１のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置５のＸａａは、Ｐｈｅ又はＬｅｕであり、
位置７のＸａａは、Ｉｌｅ又はＶａｌであり、
位置８のＸａａは、Ｔｈｒ， Ａｒｇ， Ｌｙｓ， Ａｌａ又はＭｅｔであり、
位置１０のＸａａは、Ｇｌｎ又はＨｉｓであり、
位置１１のＸａａは、Ｖａｌ， Ｌｅｕ又はＩｌｅであり、
位置１３の前に挿入されるＸａａｉは、Ｌｅｕであり、
位置１３のＸａａは、Ｌｅｕ， Ｖａｌ又はＴｈｒであり、
位置１４のＸａａは、Ａｒｇ又はシトルリン（Ｃｉｔ）であり、
位置１６のＸａａは、Ｍｅｔ， Ｖａｌ， Ｉｌｅ， Ｎｌｅ又はＬｅｕであり、
位置１７のＸａａは、Ｔｈｒ又はＡｓｐであり、
位置１８のＸａａは、Ｔｙｒ， Ｐｈｅ又はＡｒｇであり、
位置１９のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
位置２０のＸａａは、Ａｌａ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｇｌｕ又はＧｌｎであり、
位置２１のＸａａは、Ａｌａ， Ｓｅｒ又はＶａｌであり、
ここで配列番号１０の配列が少なくとも６個の連続したアミノ酸から成り、リンカー‐Ｚ‐は任意であり、そしてＰＥＧ、修飾されたＰＥＧ及び／又は［Ｇｌｙ］ｎ（ここでｎは１，２又は３である）の意味を有し、そしてｎとは無関係に、［Ａｒｇ］ｍにおけるｍは０，１，２又は３である］
から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を含んで成り、
前記配列の末端は、遊離カルボキシル−又はアミノ基、アミド、アシル、アセチル又はそれらの塩であり得、
複数のＣｙｓ残基は、鎖間ジスルフィド結合の一部、−Ｓ−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−又は−（ＣＨ２）ｐ−架橋（ここでｐは１〜８である）を形成し、任意には、１又は複数のヘテロ原子、例えばＯ， Ｎ及びＳにより介在され、そして／又は前記ペプチド配列は、固体支持体に固定されていることを特徴とする、ＨＩＶ−調節及び補助タンパク質に由来するペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列が、配列番号２、３及び１４の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項３】
前記配列番号４のアミノ酸配列が、配列番号５及び６の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
前記配列番号７のアミノ酸配列が、配列番号８及び９の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
前記配列番号１０のアミノ酸配列が、配列番号１１、１２及び１５の群から選択されることを特徴とするペプチド。
【請求項６】
少なくとも請求項１記載のペプチドを含んで成ることを特徴とする抗原。
【請求項７】
配列番号１，４，７及び１０の群の少なくとも１つから選択された少なくとも１つのペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項６記載の抗原。
【請求項８】
請求項６記載の抗原、医薬的に許容できる稀釈剤及び任意にはアジュバント、キャリヤー及び／又はビークル、並びに任意には追加の免疫刺激化合物を含んで成ることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項９】
配列番号１，４，７及び１０の群から選択された少なくとも１つのペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項８記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
配列番号１４及び１５のペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項９記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、無菌水溶液に溶解され、そして前記任意の免疫刺激化合物が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
モノホスホリン脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、完全な不完全フロイントアジュバント、又はアルミニウムヒドロキシドの群から選択されたアジュバントを含んで成ることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項６記載の抗原が、リポペプチド及び／又はリポソーム配合物として配合されていることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１４】
体液サンプルにおけるＨＩＶ又はＨＩＶ−特異的ペプチド又はタンパク質により誘発される抗体の検出方法であって、抗原が請求項１，２，３，４及び５記載のペプチドから選択されるイムノアッセイに、前記サンプルをゆだねることを特徴とする方法。
【請求項１５】
体液のサンプルにおけるＨＩＶ又はＨＩＶ−特異的ペプチド又はタンパク質により誘発される抗体の検出のためのイムノアッセイキットであって、診断用抗原が請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドであることを特徴とするキット。
【請求項１６】
請求項６及び７記載の抗原と選択的に反応することができることを特徴とする抗体。
【国際調査報告】
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