(57)【要約】受容者における移植片に対する免疫応答を減少させる一つの方法であって、移植片の宿主拒絶を減少または阻害するのに有効な間葉幹細胞の量で前記受容者を処置する方法。間葉幹細胞は移植の前、移植と同時、または移植後に投与することができる。更に、間葉幹細胞を用いる処置で外来組織、すなわち対宿主性移植片による宿主に対する減少免疫応答を誘導する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種異系抗原に対する免疫応答を減少させる一つの方法であって、免疫応答を減少させるのに有効な量での間葉幹細胞培養物から獲得した上澄みに、免疫エフェクター細胞を接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、ここでエフェクター細胞がＴ細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３】
活性化されたＴ細胞の再活性化を予防しまたは減少させる一つの方法であって、前記活性化Ｔ細胞の再刺激を抑制するのに有効な量での間葉幹細胞から獲得した上澄みに、同種異系抗原でこれまでに活性化されたＴ細胞を接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
提供者移植片に対する免疫応答を減少させる一つの方法であって、移植片に対する受容者の免疫応答を減少させるのに有効な量での間葉幹細胞から獲得した上澄みで受容者を処置することを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が受容者にとって自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が受容者にとって同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が移植片の提供者から得られることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項４記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が移植片の提供者および受容者の双方にとって同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項４記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が移植片の提供者および受容者の双方にとって異種であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４記載の方法であって、ここで移植片が皮膚であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項４記載の方法であって、ここで上澄みが移植片の投与に先立ち受容者に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項４記載の方法であって、ここで上澄みが移植片の投与と同時に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項４記載の方法であって、ここで上澄みが移植片の一部として投与されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項４記載の方法であって、ここで上澄みが移植片の後で投与されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項４記載の方法であって、ここで上澄みが受容者による移植片拒絶を処置するために移植片受容者に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項４記載の方法であって、更に免疫抑制薬を受容者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項４記載の方法であって、ここで移植片が固体器官であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法であって、ここで固体器官が心臓、膵臓、腎臓、肺または肝臓から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
対宿主性移植片病のために移植片受容者を処置する一つの方法であって、移植片による受容者に対する免疫応答を減少させるのに有効な量での間葉幹細胞培養物から獲得した上澄みで、提供者移植片の受容者を処置することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が受容者にとって自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が提供者移植片にとって自己由来であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が提供者および受容者の双方にとって同種異系であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１９記載の方法であって、更に受容者に免疫抑制薬を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
提供者移植片に対して不都合な免疫応答を減少させる一つの組成物であって、提供者移植片に対して不都合な免疫応答を阻害しまたは減少させるのに有効な量での間葉幹細胞培養物から獲得した上澄みと、薬理担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２４記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者にとって自己由来であることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２４記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が提供者にとって自己由来であることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項２４記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者および提供者双方にとって同種異系であることを特徴とする組成物。
【請求項２８】
請求項２４記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者および提供者双方にとって異種であることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
移植片により起こる移植片受容者に対して不都合な免疫応答を減少させる一つの組成物であって、移植片により起こる移植片受容者に対して不都合な免疫応答を減少させるのに有効な量での間葉幹細胞培養物から獲得した上澄みと、薬理担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求項２９記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者にとって自己由来であることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
請求項２９記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が提供者にとって自己由来であることを特徴とする組成物。
【請求項３２】
請求項２９記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者と提供者の双方にとって同種異系であることを特徴とする組成物。
【請求項３３】
請求項２９記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が受容者と提供者の双方にとって異種であることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
請求項１記載の方法であって、ここで上澄みが混合リンパ球反応を受けるＴ細胞と共存培養された間葉幹細胞から獲得されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
同種異系抗原に対する免疫応答を減少させる一つの方法であって、免疫応答を減少させるために有効な量での異種間葉幹細胞に免疫エフェクター細胞を接触させることを特徴とする方法。
【請求項３６】
同種異系抗原に対する免疫応答を減少させる一つの方法であって、同種異系抗原に対する免疫応答を減少させるのに有効な量での間葉幹細胞から獲得した上澄みにエフェクター細胞を接触させ、これにより同種異系抗原と接触した前記エフェクター細胞が前記同種異系抗原に対する減少した免疫応答を持つことを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６記載の方法であって、ここで前記エフェクター細胞が前もって活性化されたＴ細胞であり、また前記免疫応答が前記Ｔ細胞の再活性化であることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３６記載の方法であって、ここで減少される前記免疫応答が試験管内免疫応答であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６記載の方法であって、ここで減少される前記免疫応答が生体内免疫応答であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３６記載の方法であって、ここで減少される前記免疫応答が提供者移植片に対する免疫応答であることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０記載の方法であって、ここで前記提供者移植片が異種提供者移植片であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１９９８年３月１８日に出願された合衆国暫定特許出願番号６０／０７８，４６３と１９９８年６月１９日に出願された合衆国暫定特許出願番号６０／０８９，９６４の優先権に基づきまたこれを主張する１９９９年３月１２日に出願された合衆国特許出願番号０９／２６７，５３６の一部継続出願である１９９９年１０月２６日に出願された合衆国特許出願番号０９／４２７，３３３の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は同種異系抗原に対するＴ細胞応答を阻害することに関し、また更に前活性化Ｔ細胞の再活性化を阻害およびまたは予防することに関する。より詳細には、本発明は免疫エフェクター細胞により引き起こされる外来組織およびまたは細胞およびまたは器官に対する免疫応答を予防し、減少または処置する分野に関する。本発明は更に移植片拒絶およびまたは対宿主性移植片反応を予防し、減少または処置することに関する。
【０００３】
【発明の背景技術】
寛容は通常免疫応答の起こる抗原に対する特異的反応の獲得性欠損である。典型的には、寛容を誘導するには寛容化しようとする抗原に対する露出が必要であり、その結果として若干のリンパ球の死または機能的不活性化が起こる。完全な寛容は、二次抗原攻撃に対する検出可能な免疫応答の欠損が特徴である。部分的寛容は免疫応答の量的減少が特徴である。
【０００４】
免疫機構の機能は病原体を含む外来物質を除去し、自己抗原に対する非応答性または寛容を維持することである。Ｔ細胞寛容は、１）自己ペプチドに反応する胸腺細胞がクローン消失により除去される胸腺において（中心寛容）、および２）免疫寛容を生じる条件下で自己抗原に露出される末梢において（末梢寛容）獲得される。クローン消失は抗原提示細胞に対する細胞死分子の発現からも起こり得る。細胞死分子の代表的な例はＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とＴＲＡＩＬリガンドであり、これらは活性化Ｔ細胞上のそれぞれのレセプターであるＦａｓとＤＲ４に結合しＴ細胞のアポトーシスを誘導する。ＴＮＦＲ上科の構成員であるＣＤ２７およびＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）の相互作用もまたＴ細胞アポトーシスを誘導する。
【０００５】
不都合なことに、免疫機能は移植片組織などの有益な侵入物と有害な侵入物とを区別せず、そのため免疫機構は移植された組織または器官を拒絶する。移植された器官に対する拒絶には、宿主内に存在し提供者同種異系抗原または異種抗原を認識する同種異系反応性Ｔ細胞が大きく介在する。
【０００６】
現在は、移植片に対する免疫応答を予防または減少させるために、患者は強力な免疫抑制剤で処置される。Ｔ細胞免疫応答を予防または抑制する薬剤の個々人への注入は移植片拒絶を阻害するが、全面的な免疫抑制、毒性、ましてや日和見感染による死すらも起こし得る。従来の提供者組織拒絶への処置に対する毒性と不完全な応答速度のために、現在の薬剤治療の方式に耐性を持てないまたは良い応答を示さない患者を処置するための代替アプローチが必要である。
【０００７】
従って、免疫エフェクター細胞による移植片に対する望ましくない宿主免疫応答の予防およびまたは減少のために、提供者組織に対する宿主拒絶が起こるのを防ぐ方法が必要である。また受容者組織に対する提供者組織による望ましくない免疫応答を除去または減少させる方法も有益であろう。このような免疫応答は対宿主性移植片病として知られている。
【０００８】
【発明の概要】
間葉幹細胞が移植において免疫機構による応答を改善するために用いることができ、それにより抗原に対する免疫応答は減少または除去されることは知られている。
【０００９】
本発明の一見地に従って、同種異系抗原、特に同種異系組織、器官または細胞に応答するＴ細胞により引き起こされる免疫応答を減少または抑制するための方法が提供され、免疫応答は間葉幹細胞を用いることで減少または抑制される。間葉幹細胞はＴ細胞に対して、自己由来である（同一宿主から獲得した）か、または同種異系あるいは異種のものである。Ｔ細胞に対して同種異系の間葉幹細胞の場合には、間葉幹細胞はＴ細胞が応答する細胞または組織に対して自己由来（同一宿主から獲得）であるかまたはＴ細胞の提供源とＴ細胞が応答する細胞または組織の提供源の両方に同種異系の宿主から獲得したものである。選択肢として、間葉幹細胞はＴ細胞の提供源およびＴ細胞が応答する細胞または組織の提供源のどちらかまたは両方に異種の提供源から獲得することができる。
【００１０】
本発明の別の見地に従って、（同種異系抗原、特に同種異系器官、組織または細胞に対して活性化した）活性化Ｔ細胞を続いて起こる外来抗原に対するＴ細胞応答を予防およびまたは減少させるのに有効な量で間葉幹細胞と接触させることにより、活性化Ｔ細胞の再刺激を予防するためのプロセスが提供される。用いられる間葉幹細胞はＴ細胞に対して自己由来およびまたは同種異系である。同種異系間葉幹細胞を用いる場合、間葉幹細胞はＴ細胞を活性化する組織または細胞と同一の宿主、またはＴ細胞およびＴ細胞を活性化する細胞または組織を提供する宿主の両方に同種異系である宿主から獲得することができる。
【００１１】
本発明のもう一つの見地に従って、間葉幹細胞は、移植片受容者に対して間葉幹細胞を投与することにより移植片（組織、器官、細胞その他）に対する免疫応答を抑制または改善するために用いられる。間葉幹細胞は移植片に対する免疫応答を抑制または改善するのに有効な量で投与される。間葉幹細胞は移植片受容者に対して自己由来または同種異系あるいは異種である。
【００１２】
従って、本発明の一つの方法は提供者組織の受容者の間葉幹細胞への接触を提供する。この見地の一つの実施例において、この方法は間葉幹細胞を提供者移植片の受容者に投与することを含む。間葉幹細胞は移植片の前にまたは同時に、あるいは移植片に続いて受容者に投与することができる。間葉幹細胞は受容者に対して自己由来または同種異系であり、提供者から獲得することができる。本発明の別の見地において、同種異系間葉幹細胞は提供者以外の提供源からも獲得することができ、その提供源は提供者型または受容者型に適合する必要はない。
【００１３】
この方法の更なる見地において、移植方法の一部として間葉幹細胞は細胞死を誘導する分子を発現するように修飾される。間葉幹細胞は、分子に対するレセプターを保持する活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する分子を免疫機構に運搬するために用いることができる。この結果活性化Ｔリンパ球は削除され、移植片に対する望まれない免疫応答は抑制される。本発明のこの見地に従って、同種異系間葉幹細胞は細胞死分子を発現するように修飾される。分子は間葉幹細胞に対して外因性または内因性であり得る。ここに開示された本方法の望ましい実施例において、間葉幹細胞は細胞死分子ＦａｓリガンドまたはＴＲＡＩＬリガンドを発現する。
【００１４】
間葉幹細胞は移植片の一部として受容者に投与することもできる。この目的のために、本発明は間葉幹細胞で灌流しまたは間葉幹細胞を含む提供者組織または器官を受容者に提供することにより免疫応答を減少または改善する方法を提供する。間葉幹細胞は器官または組織の提供者または第三者から獲得したものか、あるいはＴ細胞に対して自己由来のものである。間葉幹細胞は、外来組織が受容者に移植された時に起こる受容者Ｔ細胞による外来組織に対する免疫応答を改善する。
【００１５】
本発明の更なる実施例において、器官または組織に灌流された間葉幹細胞は活性化Ｔ細胞死を誘導する分子を含有することができる。
【００１６】
もう一つの実施例において、本発明の方法は、移植片に対する拒絶症状の発病度を減少または除去するために移植片を受容した患者を処置することを提供する。この処置は提供者組織が受容者に移植された後、提供者移植片の受容者に対して間葉幹細胞を投与することからなる。間葉幹細胞は受容者に対して自己由来または同種異系であり得る。同種異系間葉幹細胞は提供者または第三者提供源から獲得することができる。移植片に対する不都合な免疫応答を受ける受容者への間葉幹細胞の提示は、更なる抗原刺激に対するＴ細胞の無応答を誘導し、それにより活性化Ｔ細胞による提供者組織または器官に対する不都合な応答を減少または除去する。
【００１７】
本発明の更なる一見地において、提供者組織、器官または細胞による受容者に対する免疫応答すなわち対宿主性移植片応答を減少させる方法が提供され、この方法は提供者組織、器官または細胞を生体外で、受容者体内への組織、器官または細胞の移植に先立って、同種異系（提供者に対して同種異系）間葉幹細胞で処置することから成る。間葉幹細胞は、続いて受容者抗原提示細胞に対して活性化するであろう移植片中のＴ細胞の反応性を減少させる。そして移植片は、宿主に対する移植片の不都合な応答を起こすことなくあるいは減少されて受容者（宿主）体内に導入される。このようにして、対宿主性移植片病が起こることを防ぐことができる。
【００１８】
望ましい実施例において、提供者移植片は、提供者移植片中のＴ細胞を活性化するために、最初に受容者、または第三者組織、あるいは細胞に対して生体外で露出される。提供者移植片はその後提供者に対して自己由来または同種異系の間葉幹細胞に接触させられる。間葉幹細胞は受容者または第三者の間葉幹細胞でもあり得る。提供者移植片が続いて受容者体内に置かれたときに、間葉幹細胞は、提供者移植片中のＴ細胞による受容者の抗原刺激に対する不都合な二次免疫応答を減少または阻害するであろう。
【００１９】
従って、間葉幹細胞は例えば移植片に先立って受容者から獲得することができる。間葉幹細胞は単離し、必要時まで凍結保存することができる。また間葉幹細胞は必要量まで培養して増殖させ、必要時まで保存される。間葉幹細胞は、提供者移植片によって引き起こされる、受容者（宿主）に対する進行中の不都合な免疫応答を減少させるまたは除去するのに有効な量で受容者に投与される。移植片によって引き起こされる不都合な免疫応答を受ける受容者に対する間葉幹細胞の提示は、進行中の応答を阻害しＴ細胞の再刺激を予防する。それにより活性化Ｔ細胞による受容者組織に対する不都合な応答を減少または除去する。
【００２０】
更なる実施例は、受容者間葉幹細胞を活性化Ｔ細胞死を誘導する分子で修飾することを含む。
【００２１】
このように、本発明の望ましい実施例に従って、ヒト間葉幹細胞は、移植の結果起こる移植片拒絶およびまたは対宿主性移植片病を処置するために、およびまたは移植片拒絶およびまたは対宿主性移植片病を予防または減少させるために用いられる。ヒト間葉幹細胞はまた異種移植片の使用を容易にするために用いられる。前に記載した目的のために非ヒト霊長類細胞などの異種細胞を用いることも本発明に含まれる。
【００２２】
更に、ＭＳＣ培養系およびＭＳＣ／混合リンパ球反応培養系から得た上澄みは同種異系抗原に対するＴ細胞応答に対して抑制効果を持つことが知られている。従って、本発明は更に上澄みを用いる方法を提供する。
【００２３】
【発明の説明】
ここで定義したように、同種異系間葉幹細胞は受容者と同種の異なる固体から獲得される。提供者抗原は、受容者に移植された提供者組織が発現する抗原を指す。同種異系抗原は受容者が発現する抗原とは異なる抗原である。移植される提供者組織、器官または細胞が移植片である。移植片の例としては皮膚、骨髄および心臓、膵臓、腎臓、肺および肝臓などの固体組織が含まれる。従って、同種異系抗原は受容者に対して外来の抗原である。
【００２４】
発明者は、間葉幹細胞が試験管内で同種異系Ｔリンパ球と接触した時は同種異系Ｔ細胞は増殖しないことを発見した。通常、異なる個体から獲得した細胞の共存培養はＴ細胞の活性化と増殖により発現するＴ細胞応答を引き起こし、これは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）として知られている。
【００２５】
この予期しない結果は、Ｔ細胞が不適合間葉幹細胞に応答しないことを示す。同種異系Ｔ細胞によるヒト間葉幹細胞に対する増殖応答の欠如は予期しないものであった。それはヒト間葉幹細胞が免疫原性を与える表面分子を発現する、すなわち同種異系クラスＩ　ＭＨＣ分子を発現するからである。この発見は間葉幹細胞が免疫機構に対して免疫原性が無いことを示している。
【００２６】
発明者は更に間葉幹細胞が同種異系細胞間のＭＬＲを抑制できることを発見した。間葉幹細胞は投与量依存方法において混合リンパ球反応における同種異系Ｔ細胞応答を積極的に減少させる。加えて、異なる提供者から獲得した間葉幹細胞はＭＨＣ型に関して減少応答の特異性を示さない。従って、間葉幹細胞は、間葉幹細胞に対する同種異系Ｔ細胞の増殖応答を減少させるためには、混合リンパ球反応における標的細胞集団に対してＭＨＣが適合する必要はない。間葉幹細胞は応答または刺激細胞あるいはその両方に対して異種でもあり得る。
【００２７】
発明者はまた、間葉幹細胞培養系から得た上澄みが同種異系細胞間のＭＬＲを抑制することができることも発見した。ここで用いられたように、間葉幹細胞培養系から得た上澄みは、ここでは「ＭＳＣ上澄み」とも示されるが、単独培養した間葉幹細胞または免疫応答を受けている細胞、すなわち混合リンパ球反応を受けているＴ細胞と共存培養した間葉幹細胞から獲得できる。
【００２８】
間葉幹細胞上澄みは、投与量依存方法において混合リンパ球反応における同種異系Ｔ細胞応答を積極的に減少させる。間葉幹細胞の場合と同様に、異なる提供者から獲得した間葉幹細胞培養系から得た上澄みはＭＨＣ型に関して減少応答の特異性を示さなかった。
【００２９】
加えて、間葉幹細胞と接触させた混合リンパ球反応から得た上澄みもまた同種異系細胞間のＭＬＲを抑制することができる。このＭＬＲ／間葉幹細胞上澄みは投与量依存方法において混合リンパ球反応における同種異系Ｔ細胞応答を積極的に減少させ、ＭＨＣ型に関して減少応答の特異性を示さなかった。
【００３０】
可溶性因子または化合物が混合リンパ球反応に対する抑制効果を持つ間葉幹細胞培養培地中に分泌されると考えられる。混合リンパ球反応に露出されたＭＳＣｓから獲得した上澄みの使用では強力な抑制効果が見られる。
【００３１】
従って、本発明は、提供者組織、器官または細胞の受容者に同種異系間葉幹細胞を投与することにより、免疫応答を減少、阻害または除去する方法を提供する。一つの実施例において、間葉幹細胞は移植片と同時に受容者に投与される。選択肢として、間葉幹細胞を移植片の導入に先だって投与することも可能である。例えば、間葉幹細胞を提供者組織移植の約３日乃至７日前に受容者に投与することも可能である。代替的に、間葉幹細胞を移植片に続いて投与することも可能である。
【００３２】
このように間葉幹細胞は、提供者組織の移植に先だって、または同時に受容者に投与することにより、提供者または外来の組織に対する受容者の免疫機構を調整するために用いることが可能である。間葉幹細胞は例えば受容者Ｔ細胞による移植片に対する免疫応答を減少または除去するのに有効な量で投与される。間葉幹細胞は受容者Ｔ細胞に影響を与え、それにより提供者または外来の組織が提示されたときのＴ細胞の応答は減少または除去される。このようにして、移植片に対する宿主拒絶は回避されまたはその発症度は減少する。
【００３３】
発明者は更に、すでに抗原刺激に露出された、すなわち活性化されたＴリンパ球が続いて間葉幹細胞に露出されると、Ｔ細胞は続く同種異系細胞による抗原刺激に対して免疫応答を生じさせないまたは減少した免疫応答を生じさせることを発見した。このように間葉幹細胞はＴ細胞の低反応性状態を誘導する。
【００３４】
これらの予期しない結果は、活性化Ｔ細胞が前活性化Ｔ細胞の間葉幹細胞への露出により、更なる同種異系刺激に対して無応答になることを示す。間葉幹細胞はＴ細胞に対して自己由来または同種異系であり得る。
【００３５】
従って、本発明は、免疫応答を減少または抑制するのに有効な量の間葉幹細胞を移植片に対する不都合な免疫応答を受ける患者に投与することにより、患者を処置する方法を提供する。間葉幹細胞は組織提供者、移植片受容者または第三者から獲得される。更に代わって、ＭＳＣｓは提供者、受容者またはその両方に対して異種であり得る。
【００３６】
間葉幹細胞は更に、活性化Ｔ細胞の除去を促進するための細胞死分子を発現するように修飾することができる。例えば細胞死分子は、外因性の細胞死分子を発現するように遺伝子操作された間葉幹細胞によって発現される。
【００３７】
もう一つの見地において、本発明は、提供者移植片（対宿主性移植片）による移植片受容者に対する免疫応答を減少、または阻害、あるいは除去する方法を提供する。
【００３８】
従って、本発明は、移植に先だって提供者器官または組織を間葉幹細胞と接触させることを提供する。間葉幹細胞は、提供者移植片による受容者に対する不都合な応答を改善、阻害または減少させる。
【００３９】
望ましい実施例において、移植に先立って提供者移植片は、提供者移植片中のＴ細胞を活性化する同種異系（受容者）組織または細胞で処置される。提供者移植片はその後、移植の前に自己由来または同種異系の間葉幹細胞で処置される。間葉幹細胞は、続いて起こる抗原刺激に対するＴ細胞の再刺激を予防し、または低反応性を誘導する。
【００４０】
提供者移植片の前調整のために、間葉幹細胞は更に細胞死分子を発現するように修飾され、それにより間葉幹細胞と接触した活性化Ｔ細胞は除去される。
【００４１】
従って、例えば骨髄およびまたは末梢血から獲得した造血幹細胞移植の場合においても、移植片による宿主への攻撃は減少または除去できる。骨髄または末梢血幹細胞の受容者への移植に先だって、提供者骨髄を受容者間葉幹細胞で前処置することができる。望ましい実施例において、提供者骨髄は最初に受容者組織／細胞に露出され、その後間葉幹細胞で処置される。これに限定されないが、最初に受容者組織または細胞に接触させることが骨髄中のＴ細胞を活性化する役割を果たすと考えられている。続く間葉幹細胞での処置が骨髄中でのＴ細胞の更なる活性化を阻害または除去し、それにより提供者組織による不都合な影響を減少または除去する。すなわちこの治療が対宿主性移植片応答を減少または除去する。
【００４２】
更なる実施例において、対宿主性移植片病を患う移植片受容者は、そのような受容者に間葉幹細胞を投与することにより、その発症を減少または除去する処置を受けることができる。間葉幹細胞は提供者に対して自己由来または同種異系であり、同種異系細胞は受容者に対して自己由来の細胞間葉幹細胞または第三者間葉幹細胞であり得る。間葉幹細胞は宿主の移植片拒絶を減少または除去するのに有効な量で投与される。間葉幹細胞は、提供者組織中の活性化Ｔ細胞が受容者に対する免疫応答を持つことを阻害または抑制し、それにより対宿主性移植片応答を減少または除去する。
【００４３】
受容者の間葉幹細胞は移植に先立って受容者から獲得し保存し、およびまたは進行中の宿主に対する移植片の攻撃を処置するのに十分な量の間葉幹細胞を得るために培養して増殖させる。
【００４４】
本発明のもう一つの方法において、提供者組織は間葉幹細胞に露出され、それにより、移植に先立って間葉幹細胞は器官移植片そのものに結合する。この状況では、同種異系受容者細胞により引き起こされる移植片に対する免疫応答は、移植片中に存在する間葉幹細胞によって抑制されるであろう。この免疫応答は移植片拒絶を予防する通常の処置、例えば薬剤を介した免疫抑制を免れたものである。間葉幹細胞は受容者に対して同種異系のものが望ましく、提供者間葉幹細胞、または提供者または受容者以外から獲得した間葉幹細胞である。受容者に対して自己由来の間葉幹細胞を移植片に対する免疫応答を抑制するために用いることができる場合もある。
【００４５】
本方法の更なる実施例において、間葉幹細胞は細胞死分子を発現するように遺伝子操作され、それにより同種異系宿主Ｔ細胞はこの間葉幹細胞と接触させられて除去されるであろう。
【００４６】
更に、初期免疫応答の予防または改善に加えて、局在する間葉幹細胞は起こり得る、続くいずれのＴ細胞応答をも抑制すると考えられる。
【００４７】
ここで用いられるように、「細胞死分子」は、刺激されたＴ細胞上のこれが認識するレセプターと相互作用しまたは結合して、Ｔ細胞死またはアポトーシスを誘導する分子である。Ｆａｓは刺激物質に再び露出され活性化されたＴ細胞のアポトーシスを仲介する（ヴァン　パレイス他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４巻、３２１−３２８ページ（１９９６年））。ＦａｓはＩ型膜レセプターであり、Ｆａｓがコグネイトするリガンドにより架橋されると多様な細胞にアポトーシスを誘導する。標的Ｔ細胞上のＦａｓ分子（ＣＤ９５）と間葉幹細胞上のＦａｓ分子のリガンドＦａｓ　Ｌとの相互作用はレセプター凝集を引き起こし、標的細胞のアポトーシスを引き起こす信号を導入する。Ｆａｓシステムは、胸腺細胞の陰性選択、体内の免疫細胞侵入阻止部位の維持および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）介在性細胞障害を含む生体内での一連の細胞機能に含まれると見なされている（グリーンとウエア、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、９４（１２）巻、５９８６−９０ページ、（１９９７年））。
【００４８】
腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）科のその他はプログラムされた細胞死に役割を持つ。ＴＲＡＩＬリガンドはそのレセプターＤＲ４と相互作用し、種々の形質転換細胞系にアポトーシスを誘導することができる（Ｇ．パン他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７巻、８１５−８１８ページ（１９９７年））。また、ＣＤ２７とそのリガンドＣＤ７０（プラサッド他、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、９４巻、６３４６−６３５１ページ（１９９７年））の発現もアポトーシスを誘導する。Ｆａｓの発現は刺激されたＴ細胞および免疫細胞侵入阻止部位に限られる。ＴＲＡＩＬは多くの通常組織に検出される。
【００４９】
ＴｒａｉｌリガンドおよびＣＤ２７の両方は、Ｆａｓリガンドとは異なり、操作されていないヒト間葉幹細胞上にも発現する。活性化されしかし休止していないＴ細胞はＴｒａｉｌレセプターとＣＤ７０を発現する。体内に見られるＴ細胞のほとんどは休止状態にある。Ｔ細胞は、ＭＨＣおよびＢ７−１またはＢ７−２などの適切な補助的刺激分子の両方の場合において細胞と遭遇したとき活性化される。
【００５０】
このように、間葉幹細胞上に発現するリガンドが活性化Ｔ細胞上の細胞死レセプターへ嵌入することにより、アポトーシスによるＴ細胞死が起こる。リガンドおよびそのレセプターで特に前に記載したもの以外は、間葉幹細胞中に存在するかまたは間葉幹細胞に導入されるかのどちらかでこの機能を果たすことができる。従って、個人に投与される間葉幹細胞は活性化Ｔ細胞を削除し、移植片拒絶病の発症度を減少させる。
【００５１】
ここに開示された本発明の方法に従って、本発明の間葉幹細胞は、提供者組織拒絶または対宿主性移植片病を処置する現行の方法と連係して用いることができる、と考えられる。このような使用法の利点は、移植片受容者体内での免疫応答の発病度を改善することにより、治療に用いる薬剤の量およびまたは薬剤治療の適用頻度を減らすことができ、その結果一般免疫の抑制と望まれない副作用が軽減する、ということになる。
【００５２】
更に考えられるのは、本発明での間葉幹細胞単独の処置だけが必要であり、長期的な免疫抑制剤治療の必要性は除去される、ということである。代わって、多角的な間葉幹細胞の投与が行われる。
【００５３】
従って、ここに開示された本発明は、間葉幹細胞の投与により移植片拒絶を予防または処置することを提供する。間葉幹細胞は、同一種から獲得した器官、組織または細胞、あるいは異種移植器官または組織移植片の移植片拒絶、およびまたは対宿主性移植片病の予防、または処置、あるいは改善のために有効な量で投与される。
【００５４】
間葉幹細胞の単一投与量の投与は、Ｔ細胞に対して同種異系の組織または「非自己」組織に対するＴ細胞応答の減少または除去に有効である。Ｔリンパ球が、間葉幹細胞から分離した後も同種異系細胞に対する非応答性（すなわち、寛容またはアネルギー）を保持する場合には、特に有効である。
【００５５】
間葉幹細胞の投与量は広範囲の制限域内で変更され、もちろんそれぞれ特定の場合における個々人の要求量に合わせられる。一般に非経口投与の場合、通常は受容者体重１ｋｇ当たり約０．０１乃至５百万個の細胞が投与される。用いられる細胞数は受容者の体重と体調、投与量または頻度、そして通常の技術に習熟した人には既知のその他の変数に依存する。間葉幹細胞は移植される組織、器官、または細胞に適した継代を通して、投与することが可能となる。間葉幹細胞は全身に、すなわち非経口的に、静脈内注射によって投与することができ、または、骨髄などの特定組織または器官を標的とすることができる。間葉幹細胞は、細胞の皮下埋め込み、または結合組織、例えば筋肉〔原文通り〕内への幹細胞の注入によって投与することができる。
【００５６】
細胞は適切な希釈液で、１ｍｌ当たり約０．０１乃至約５ｘ１０６個の細胞濃度で懸濁され得る。注入溶液に適切な希釈液は、細胞および受容者に生物学的、生理学的に適合するもので、緩衝生理食塩水またはその他の適切な希釈液などである。投与する組成物は、適切な無菌状態および安定性を満たす通常の方法に従って処方、産生、および保存しなくてはならない。
【００５７】
しかしながら本発明はそれらに限定されることはなく、間葉幹細胞は望ましくは骨髄から単離し、精製して、培養すなわち試験管内で増殖させることができる。間葉幹細胞はここに開示された方法に用いるのに十分な細胞数を獲得するために培養して増殖させる。間葉幹細胞は骨中で発見された形成多能性芽細胞であり、通常骨髄およびその他間葉組織中に非常に低頻度（骨髄では１：１００，０００）で存在する。キャプランとヘインズワース、合衆国特許番号５，４８６，３５９を参照されたい。間葉幹細胞への遺伝子導入は、ガーソン他、合衆国特許番号５，５９１，６２５に開示されている。
【００５８】
別途言及されていない限り、遺伝子操作は、サムブルックとマニエイティス、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス、コールド　スプリング　ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）に開示されたように行われる。
【００５９】
考慮すべきは、ここに開示された方法は多方面で、また通常の技術で良く知られる様々な修正、変更と共に実施されるということである。また十分に留意すべきは、細胞型間の作用または相互作用の形態について説明する理論が本発明をある方法に限定すると解釈されるべきでなく、この理論があることにより本発明の方法をより十分に理解できるということである。
【００６０】
次に記載する実施例は本発明の見地を更に説明する。しかしながら、ここで説明するように、それらは決して本発明の教義または開示を限定するものではない。
【００６１】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
間葉幹細胞の同種異系反応性欠損
混合リンパ球反応は提供者の表面抗原の適合性を測定し、提供者組織の拒絶の可能性を示唆するものである。移植片拒絶を引き出す原因となる細胞表面抗原はクラスＩ、クラスＩＩ　ＭＨＣ抗原である。Ｔ細胞は外来ＭＨＣ抗原に対して同種異系反応性である。クラスＩ、クラスＩＩ　ＭＨＣ分子は混合リンパ球反応を刺激する。
【００６２】
正常ヒト有志者はＣＯＢＥ　ＳＰＥＣＴＲＡＴＭアフェレーシスシステム（コーブ、レークウッド、コロラド）で白血球潟血された。個人Ａから獲得したＴ細胞（ＴＡ）１ｘ１０５個は個人Ｂから獲得された同種異系ＰＢＭＣｓ（ｍＰＢＭＣＢ）を（Ｔ細胞に対するＰＢＭＣｓの増殖を予防するために）処置するマイトマイシンＣと共に平底マイクロタイタウェル内で７日間培養された。ｍＰＢＭＣＢｓは２０Ｋおよび１００Ｋで接種された。培養基は、Ｔ細胞増殖を測定するための培養期間の最終１８時間の間３Ｈ−チミジンで標識された。結果は図１に示され、ＴＡ細胞がＰＢＭＣＢを外来のものと認識したことを示唆している（「ＴＡ＋ｍＰＢＭＣＢ」部参照）。ＰＢＭＣＢｓの量が多いほど、Ｔ細胞増殖も多かった。
【００６３】
ＰＢＭＣｓと同一の提供者から獲得したヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）２ｘ１０４個は個人Ａから獲得したＴ細胞（ＴＡ）１ｘ１０５個と共培養された。細胞は平底マイクロタイタウェル内で合計７日間培養された。培養基はＴ細胞増殖を測定するための培養期間の最終１８時間の間３Ｈ−チミジンで標識された。Ｔ細胞との培養前の２日間、ヒト間葉幹細胞は前に記載された細胞数（密集）でマイクロタイタウェル内に接種され、ＭＳＣｓ上の表面抗原発現を刺激するためにＩＦＮ−γ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）で処置された。非形質導入ｈＭＳＣｓ、またはヒトＢ７−１あるいはヒトＢ７−２補助的刺激分子を導入されたｈＭＳＣｓはＴ細胞と共にインキュベートされた。対照細胞はＮｅｏを導入された。
【００６４】
結果は図１に示され（図１「ＴＡ＋形質導入ｈＭＳＣｓ」参照）、Ｔリンパ球がヒト間葉幹細胞に対して非応答性（増殖しない）であった、すなわち間葉幹細胞が外来のものとして認識されなかったことを示している。
【００６５】
この結果は、間葉幹細胞に対する応答の欠如が個体間の遺伝的適合性に依らなかったことを示している。これはＴ細胞がｈＭＳＣ提供者から獲得した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を外来のものとして認識したためである。
【００６６】
（実施例２）
混合リンパ球反応の抑制
間葉幹細胞が同種異系応答を積極的に抑制するかどうかを確認するために、混合リンパ球反応は、組織培養プレート中に準備された。組織培養プレートは異なる二提供者から獲得した粘着性間葉幹細胞を伴うものと伴わないものである。異なる二提供者は、一方はＭＬＲ中の刺激細胞に適合する提供者であり他方は刺激または応答細胞に無関係の提供者である。
【００６７】
個人Ａから獲得したＰＢＭＣｓ（ＰＢＭＣＡ）１０５個は個人Ｂの標的ＰＢＭＣｓ（ＰＢＭＣＢ）１０５個と混合された。ＰＢＭＣＢｓはＰＢＭＣＡｓによる活性化に依る増殖を予防するために３０００ラドでＸ線を照射された。従って、ＰＢＭＣＡｓのみが増殖する。ＰＢＭＣＡｓとＰＢＭＣＢｓが混合されると混合リンパ球反応が起こり、その中でＰＢＭＣＡｓ細胞（応答細胞）はＰＢＭＣＢｓ（刺激細胞）上の表面抗原により活性化された。培養基は７日間インキュベートされ３Ｈ−チミジンで最終１８時間標識された。ＰＢＭＣＢｓの存在下ではＰＢＭＣＡｓは４０，０００カウントまで増殖した。図２、第一棒グラフ（「ＮＯＮＥ」は間葉幹細胞不在を示す）参照。
【００６８】
しかし間葉幹細胞の存在下でＰＢＭＣＡｓとＰＢＭＣＢｓが混合されると、混合リンパ球反応は抑制された。ＰＢＭＣＡｓ１０５個は、ヒト間葉幹細胞の粘着性単層で覆われたマイクロタイタプレート内でＰＢＭＣＢｓ１０５個と混合された。間葉幹細胞は、ウェル当たり７５００個乃至２２，５００個の範囲の量でウェル内で平板培養された。二つの間葉幹細胞集団が試験された：ヒト間葉幹細胞が個人Ｂから獲得したものおよび個人Ａまたは個人ＢのＭＨＣ型に適合しない個人（第三者）から獲得したものであった。培養基は７日間培養され３Ｈ−チミジンで最終１８時間標識された。ヒト間葉幹細胞の存在下ではＭＬＲは抑制された。図２を参照。従って、間葉幹細胞のＭＨＣ系統に関係なく間葉幹細胞は混合リンパ球反応を抑制した。
【００６９】
結果は図２に示され、ヒト間葉幹細胞が投与依存法において混合リンパ球反応を減少させたことを示唆している。どの提供者からの間葉幹細胞も増殖を同等に十分に抑制し、これはＭＨＣ型に関して抑制の特異性が無かったことを示唆している。これらの結果は、細胞が共存培養された場合、間葉幹細胞が積極的に混合リンパ球反応を抑制したことを示す。
【００７０】
（実施例３）
二次混合リンパ球反応における無応答性
これらの実験は、ＭＳＣｓによる前活性化Ｔ細胞の抑制により二次刺激時に特異的な無応答性が生じるかどうかを確認するために行われた。
【００７１】
提供者２４８（ｄ２４８）から獲得したＴ細胞は提供者２７３（ｄ２７３）から獲得した同種異系ＰＢＭＣｓにより７日間特発され、その後単独または同一提供者（ｄ２７３）から獲得したＩＦＮ−γ処置ＭＳＣｓの存在下で３日間培養された。細胞はその後同一提供者（ｄ２７３）、自己由来（ｄ２４８）または「第三者」（ｄ２４４）ＰＢＭＣｓにより再刺激された。
【００７２】
リンパ球調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はフィコールパック（ファルメイシア）による密度勾配遠心法により調製された。細胞の一部は１０％ＤＭＳＯ添加９０％ＦＣＳ中で凍結され、液体窒素内で保存された。解凍後、細胞はＭＳＣ培地（低グルコースおよび１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ）で２回洗浄され、分析培地（２５ｍＭヘペス、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μＭ可欠アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５．５ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（全試薬はギブコＢＬＲ）および５％ヒトＡＢ血清（シグマ、ＭＬＲ試験済）添加イスコーブ）中に再懸濁された。
【００７３】
Ｔ細胞富化分画を調製するために、免疫磁気陰性選別法によりＰＢＭＣｓから単球とＢリンパ球を除去した。ＰＢＭＣｓはマウス抗ヒトＣＤ１９およびＣＤ１４モノクローナル抗体（非アジ化合物／低菌体内毒素（ＮＡ／ＬＥ）型）と共にインキュベートされ、続いてビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（多部位吸着）抗体（全試薬はファルメイシア）とストレプトアビジンマイクロビーズ（ミルテニー　バイオテック）と共にインキュベートされた。細胞はその後磁気細胞選別機（ＭＡＣＳ、ミルテニー　バイオテック）で分離された。Ｔ細胞富化分画は約７０−約９０％のＣＤ３＋細胞を含む。
【００７４】
ＭＳＣ培養
ヒトＭＳＣｓは、合衆国特許番号５，４８６，３５９に記載された通りに骨髄から単離されて、ＭＳＣ培地を含む培養基中に保持され、３代乃至６代継代したものが使用された。細胞は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて取り出され、ＭＳＣ培地で１回洗浄され、７０−８０％の密集度ですなわち１０ｃｍ組織培養ディッシュに対してプレート当たり１ｘ１０６個で平板培養された。平板培養後、５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ベーリンガー　マンハイム）が添加され、細胞は更に３日間インキュベートされた。Ｔ細胞を移す前に、平板培養されたＭＳＣはＨＢＳＳで４回、イスコーブで１回洗浄され、分析培地が１０ｃｍ組織培養ディッシュ中にウェル当たり１０ｍｌで添加された。
【００７５】
初期（１Ｏ）ＭＬＲ
Ｔ細胞（ｄ２４８）はＸ線照射ＰＢＭＣｓ（ｄ２７３）により活性化された。刺激に用いたＰＢＭＣｓはキャビネットＸ線システム（ファクシトロン・エックスレイ、バッファローグローブ、イリノイ）を用いて３，０００ラドでＸ線を照射された。初期刺激のために応答細胞２ｘ１０７個は、１０ｃｍ組織培養ディッシュ中の分析培地２０ｍｌ中で刺激細胞２ｘ１０７個と混合された。細胞は３７℃、５％二酸化炭素濃度で７日間インキュベートされた。
【００７６】
活性化Ｔ細胞／ＭＳＣ培養
１ＯＭＬＲで活性化されたＴ細胞は回収されＭＳＣ培地で一回洗浄され、分析培地１０ｍｌ中に１０６個／ｍｌで再懸濁された。そして自己由来または同種異系ＭＳＣｓが含まれあるいは培地単独の１０ｃｍ組織培養ディッシュに添加され、更に３日間培養された。
【００７７】
再刺激分析
ＭＳＣｓまたは培地と共に培養されたＴ細胞は回収されＭＳＣ培地で一回洗浄され、始原提供者、無関係の提供者から獲得したＸ線照射ＰＢＭＣｓまたは自己由来ＰＢＭＣｓで再刺激された。分析のために、活性化応答細胞５ｘ１０４個とＸ線照射刺激細胞５ｘ１０４個は９６ウェルプレート内でインキュベートされた。分析は三回行われた。培養細胞は回収前に〔３Ｈ〕チミヂンの１μＣｉ（エイマシャム）で１８時間標識された。培養基はハーベスター９６（トムテック）を用いて回収され、濾過器はマイクロベータトリラックス液体シンチレーションと発光計数器（Ｅ．Ｇ．アンドＧ．ウォーラック）を用いて解析された。データは３回の反復実験の平均ｃｐｍ±ＳＤとして表示されている。
【００７８】
単独培養されたＴ細胞（正の対照）は２日目に最大となる「同一提供者」再刺激に対する応答の促進を示す。「第三者」応答もまた促進されたが、実際には「同一提供者」と同じ動態であるが最大値は低くまたわずかに開始の遅れが見られた（図３）。同種異系ＭＳＣｓ上で培養されたＴ細胞は、続く培養６日目までの間は「同一提供者」または「第三者」ＰＢＭＣｓに対して無応答を示した（図４）。
【００７９】
（実施例４）
二次混合リンパ球反応における無応答性
提供者４１３から獲得されたＴ細胞は提供者２７３から獲得されたＸ線照射ＰＢＭＣｓで７日間再刺激された（容積２０ｍｌ培養基に１．５ｘ１０６ｍｌ）。異なる提供者４１３、４１８および２７３から獲得したＭＳＣｓは１０ｃｍ組織培養ディッシュ中に１ｘ１０６／ディッシュで平板培養された。ディッシュはＩＦＮ−γで３日間前処置され、前活性化Ｔ細胞の混合に先立って洗浄された。
【００８０】
ＭＬＲ中で７日間前活性化されたＴ細胞は単独でまたはＭＳＣｓと共に３日間インキュベートされた（１．０ｘ１０６／ｍｌＴ細胞、１０ｍｌ／ディッシュ）。ＭＳＣｓとのインキュベートの３日後Ｔ細胞は回収され、自己由来（ｄ４１３）ＰＢＭＣの存在または不在下で、Ｘ線刺激ＰＢＭＣ２７３（始原提供者）、４１３（自己由来）、ＰＢＭＣ１０（第三者）またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）で再刺激された。細胞はウェル当たり５ｘ１０４個で添加され、培養細胞は〔３Ｈ〕チミヂンで表示時間で１８時間標識された。
【００８１】
結果は、自己由来（ｄ４１３）（図５Ｃ）、同一提供者（ｄ２７３）（図５Ｂ）および第三者（ｄ４１８）（図５Ｄ）ＭＳＣｓでの活性化Ｔ細胞の処置がＴ細胞中の抗原刺激に対する無応答性を誘導することを示唆している。ＭＳＣ処置を伴わない対照培養（図５Ａ）は同種異系ＰＢＭＣｓに対する露出による細胞の再刺激を示した。
【００８２】
（実施例５）
イヌＭＳＣｓによる初期ＭＬＲの抑制
イヌＰＢＭＣｓはフィコールパック勾配遠心法（１．０７７）により末梢血から精製された。刺激ＰＢＭＣｓは２２００ラド（７分、７０ｋＶ）でＸ線照射された。Ｘ線照射刺激細胞１０５個は、前平板培養イヌＭＳＣ（Ｅ６４７、２ｘ１０４個／ウェル）の存在または不在下で応答ＰＢＭＣｓ１０５個と９６ウェルプレート中で混合された。培養細胞は６日間インキュベートされ〔３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウェル）で１６時間標識された。結果は図６Ａ−６Ｄに示す。Ｅ６４７とＥ６４５は同腹子（ＤＬＡ同一）である。結果は同種異系と同様自己由来ＭＳＣｓも初期ＭＬＲを抑制することを示す。
【００８３】
（実施例６）
非粘着性ＭＳＣｓによる初期ＭＬＲの抑制
ｄ２７３から獲得したＴ細胞（２ｘ１０５個／ウェル）はｄ２４４から獲得したＸ線照射ＰＢＭＣｓ（２ｘ１０５個／ウェル）と混合された。ｄ２４４またはｄ２７３から獲得したＭＳＣｓはＩＦＮ−γ（９００Ｕ／ｍｌ、３日間）で前処置されまたは無処置のままで、試験日にトリプシン処理されＴ細胞およびＰＢＭＣｓと同時に添加された。培養細胞は７日間インキュベートされ、〔３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウェル）が１６−１８時間添加された。結果は図７に示され、非粘着性ＭＳＣｓも初期ＭＬＲを抑制することを示している。
【００８４】
（実施例７）
同種ＭＳＣｓ支持皮膚異系移植片の生存
研究集団
若いヒヒ（パピオ　アヌビス）が研究された。雄と受胎していない雌ヒヒの体重は７―２０ｋｇで３−１６歳の年齢であった。これら動物は結核乳頭腫ウイルスの有無を検査され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）で滴定され、糞便浮遊及び塗沫検査を含むシミアンウイルスの検査より成る霊長類ウイルススクリーンで試験された。提供者と受容者の対はＰＣＲ類別化を通じて主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）不等性により決定された。研究期間中、ヒヒは付き添い動物のそばで個別の地域をあてがわれた。
【００８５】
ＭＳＣ単離と培養抗張のための提供者骨髄収穫
ＭＳＣｓの単離と培養抗張のために骨髄針吸引液が腸骨稜から得られた。骨髄吸引液は週１回連続４週で交互に脇腹から獲得された。吸引液量は動物の血液量の１０％の推定値で決められた。血液量は体重の７％と推定された。従って１０ｋｇのヒヒは推定血液量０．７リットルであった。血液量の１０％の吸引液は従って７０ミリリットルになるであろう。
【００８６】
手続きに先立ち、セファゾリン５００ｍｇが手術時抗菌予防のために筋肉内（ＩＭ）投与された。ヒヒは手術のためにケタミン１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ、またキシラジン１ｍｇ／ｋｇ、ＩＭで手術のために鎮静化され麻酔された。針挿入部位はポビドンヨードでこすり洗いされ次いでアルコールで洗浄された。吸引液は腸骨稜から１６ゲージ、２インチ骨髄針を使って獲得された。注射器が針に取付けられ、骨髄液を抜くための吸入装置が利用された。手術後の痛みを除くために鎮痛剤ブプレノルフィンが０．０３ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ．Ｑ１２ｘ２用量で与えられた。
【００８７】
提供者骨髄吸引液の送り
骨髄吸引液は注射器からヘパリンナトリウムを含む無菌バキュテーナー（Ｒ）に移された。この管はスタイロフォームコンテナーに安置され、室温（ＲＴ）で細胞処理設備に送られた。
【００８８】
ＭＳＣｓの単離と培養物の樹立
骨髄の５乃至１０ｍｌアリコートがポリプロピレン培養管内でダルベッコ食塩加リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）５０ｍｌで希釈された。細胞懸濁液は２２００ＲＰＭで１０分室温（ＲＴ）で遠心された。全有核細胞数は酢酸４％液で確認された。細胞は次いで最終濃度で２０ｘ１０６細胞／ｍｌになるようにＤＰＢＳで希釈された。１０ｍｌまたは２００ｘ１０６細胞が５０ｍｌの円錐管でパーコール２０ｍｌ（比重１．０７３ｇｍ／ｍｌ）に負荷され１３００ＲＰＭで２０分遠心された。単核細胞を含む細胞中間期はＤＰＢＳで洗浄され、完全培地に再懸濁され、回収物を得るために計数された。パーコール中間期で得られた洗浄単核細胞は完全培地３０ｍｌと１５−２０ｘ１０６細胞／フラスコ（８．１ｘ１０４ＭＳＣ／ｃｍ２）を含むＴ−１８５フラスコ内で確立され、炭酸ガス濃度５％で３７℃のインキュベーターに安置された。
【００８９】
ＭＳＣの収穫
三つ組フラスコ内の培地は傾瀉されフラスコはＤＰＢＳ５０ｍｌで洗浄された。ＤＰＢＳを傾瀉した後、０．０５％のトリプシン２３ｍｌが各三つ組みフラスコに加えられた。フラスコは３７℃インキュベーターに３分配置された。細胞剥離後に、完全培地２３ｍｌが各フラスコに加えられた。細胞懸濁液は５０ｍｌ円錐管に移されフラスコは３０ｍｌのＨＢＳＳで洗浄された。管は２２００ＲＰＭ、５分ＲＴで遠心された。
【００９０】
形成／パッケージング
収穫されたＭＳＣｓはプラズマ−ライトＡ（バクスターＩＶセラピー）８５％、ＤＭＳＯ、１０％およびＭＳＣ提供者血清５％よりなる不凍溶液内で約１０ｘ１０６細胞／ｍｌに形成され、１５−２０ｍｌを含む袋で冷凍保存された。
【００９１】
標識／貯蔵／送り
細胞は１分１−２°で９０℃の制御速度フリーザー（クライオメド、フォーマ・サイエンティフィック）を用いて冷凍保存された。サンプルは次いで気相（−１２０°乃至−１５０℃）で液体窒素貯蔵フリーザーに移された。
【００９２】
用量
２０ｘ１０６細胞／ｋｇのＭＳＣ用量を達成するために、最終産物は注入日必要とされる用量の１１５％で調製された。
【００９３】
皮膚の収穫
手術に先立ち、ヒヒは手術時抗菌予防として５００ｍｇ、ＩＭでセファゾリンを与えられた。ヒヒは１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭでのケタミンで鎮静化され、また静脈内チオペンタール誘導、１−２％イソフルラン吸入麻酔で麻酔された。皮膚が腹前壁から収穫され、前もって標識された食塩水湿潤ガーゼパットに置かれた。創傷欠損部は次いで閉じられた。ヒヒは麻酔から覚めた時にコロニーに戻された。手術後の痛みを除くために、鎮痛剤ブプレノルフィンがＱ１２ｘ２用量でまたアンセフは２日間毎日投与された。
【００９４】
受容者皮膚移植とＭＳＣ注入
手術に先立ち、ヒヒは手術時抗菌予防として５００ｍｇ、ＩＭでセファゾリンを与えられた。ヒヒは鎮静化され１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭと静脈内チオペンタール誘導、１−２％イソフルラン吸入麻酔で麻酔された。皮膚が腹前壁から収穫され前もって標識された食塩水湿潤ガーゼパッドに置かれた。この皮膚は２個の移植片に分割された。１個はも一つの受容者ヒヒの第三者パーティ対照として使用され、も一つはこの同じ動物の自己由来対照として使用された。動物は次いでうつぶせの位置に置かれた。３個の３ｘ２ｃｍの皮膚の切片が肩甲骨の棘に沿った背中から除去された。前にＭＳＣ提供者第三者パーティおよび自身に適合するよう手入れされ、適所に縫合された。
【００９５】
移植後ヒヒは２０ｘ１０６提供者ＭＳＣ／ｋｇの用量でＭＳＣの静脈内注入を受けた。末梢血サンプルはＭＳＣ注入前、注入１時間後、およびＭＳＣ注入１−３日後に確保された。骨髄吸引液はＭＳＣ注入０日後、３日、１４日および３０日後に得られた。
【００９６】
手術後の痛みを除くために、鎮痛剤ブプレノルフィンがＱ１２ｘ２用量で、またアンセフが２日間毎日投与された。動物は毎日観察され、移植片は移植７日後に開始して１日おきに写真撮影された。
【００９７】
物理的試験と診断検査
各ヒヒは試験のためにケタミン１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭで鎮静化された。鎮静の間に、２−３ミリリットルの骨髄が腸骨稜から針吸引で確保され、４日、１３日および研究終了の３０日後にヘパリンナトリウムに収集された。皮膚生検が骨髄吸引の得られた同じ日に収穫された。
【００９８】
結果
皮膚同種異系移植片生存に対するＭＳＣ注入の作用
未処置対照動物（Ｎ＝２）は皮膚同種異系移植片平均生存時間が８日±０日であった。未処置ＭＳＣ提供者のＭＳＣ提供者（Ｎ＝２）への注入は皮膚移植片平均生存時間が１１．５±０．７１日への延長をもたらした（マン−ホイットニー　Ｕ　テスト、Ｐ＜０．０５）。未処置第三者提供者ＭＳＣの提供者同種異系移植片（Ｎ＝４）への注入は平均生存時間１２．３±０．９６日の著しい延長をもたらした（マン−ホイットニー　Ｕ　テスト、Ｐ＜０．００３）。
【００９９】
受容者６１４０と６２００はＭＳＣ提供者６２４３から、お互いから（第三者移植片）、また彼等自身から（自己移植片）同種移植片を受けた。ＭＳＣ提供者６２４３から皮膚移植片収穫の２４時間前に６２４３からのＭＳＣが移植のために輪郭を描かれた腹前部皮膚下部に注射された。移植後に受容者は２０ｘ１０６ＭＳＣ／ｋｇ（６２４３）の静脈内注入を投与された。第三者同種移植片はいずれも１３日に拒絶された。ＭＳＣ提供者（６２４３）同種移植片は４日目に出血したことが発見され、この出血は技術的な失敗によるものとされた。病理学試験では、ケラチンは真皮の下でわだち状に徐々に入り込んでいることが認められた。これらのわだちの性質はそれが皮下ＭＳＣ注射の際に針で形成されたことを示唆している。これら細胞の存在は非常に大きい炎症性応答を引き出した。この炎症性応答は皮膚移植片が適切に粘着／取り込む能力を妨げ、これらの移植片は７日までに完全に壊死した。自己移植片に拒絶されなかった。
【０１００】
受容者６６５４と６６５９はＭＳＣ提供者６５９３から、お互いから（第三者移植片）、また彼等自身から（自己移植片）同種移植片を受けた。移植後に受容者は２０ｘ１０６ＭＳＣ／ｋｇの静脈内注入を投与された。ＭＳＣ提供者同種移植片は１１日と１２日に拒絶され、また第三者提供者同種移植片は１１日と１２日に拒絶された。自己移植片は拒絶されなかった。
【０１０１】
同様に受容者６６６３と６６５８はＭＳＣ提供者６６５６から、お互いから（第三者移植片）、また彼等自身から（自己移植片）同種移植片を受けた。移植後受容者は２０ｘ１０６ＭＳＣ／ｋｇの静脈内注入を投与された。ＭＳＣ提供者同種移植片は１１日に拒絶され、また第三者同種移植片は１０日と１２日に拒絶された。自己移植片は拒絶されなかった。
【０１０２】
研究の対照部門にある受容者６５３２と６７２０はＭＳＣの投与なしで注入または注射により自己移植片と同種移植片を受けた。同種移植片は８日に拒絶された。自己移植片は拒絶されなかった。
【０１０３】
同種異系ＭＳＣ注入と関連する同定可能毒性は存在せず、また続く３０日の追跡期間に不都合な臨床的後遺症は見られなかった。血液サンプルはＭＳＣの注入前および移植とＭＳＣ注入後１時間、２時間、更に１日、２日、および３日後に獲得された。骨髄吸引液は移植とＭＳＣ注入後４日と１３日に確保された。
【０１０４】
これらの結果は、同種異系ヒヒＭＳＣｓの単一注入が同種異系皮膚移植片の拒絶を遅延できることを示している。他の免疫抑制治療法は行なわれなかった。同種異系または第三者ＭＳＣｓの１回の投薬量は拒絶に至る時間を５０％増加した（グッドマン他、Ａｍ　Ｓｕｒｇ　６２巻（６号）：４３５−４４２ページ（１９９６年））。
【０１０５】
（実施例８）
本研究の目的は、イヌにおける適度に高い投与量の提供者イヌ白血球抗原（ＤＬＡ）−同一同腹子イヌ間葉幹細胞（ｃＭＳＣ）の注入の実現可能性および安定性を証明することである。提供者イヌ白血球抗原（ＤＬＡ）−同一同腹子イヌ間葉幹細胞（ｃＭＳＣ）は同種異系骨髄移植片定植において細胞１０ｘ１０６個／ｋｇで投与される。第二の目的は、移植後５０および１００日目での提供者ｎｅｏ−およびＧＦＰ−標識ｃＭＳＣの分布および機能を調べることである。
【０１０６】
材料と方法
実験動物
ビーグル犬が本研究のために用いられた。０日目で７または９カ月齢のＤＬＡ同一同腹子の雄２匹、雌２匹が用いられた。分類のために用いられた方法は、主要組織適合抗原複合体が同じイヌのイヌ白血球抗原（ＤＬＡ）中クラスＩＩ　ＤＲＢ領域の遺伝形質を追跡するための高い多型マイクロサテライト標識の使用を含む。マイクロサテライトは小さい２、３，または４ヌクレオチドの反復であり、対立遺伝子中で十分な長さの違いが見られるため、多世代交雑を経た染色体断片の遺伝形質の追跡に用いることができる。対立遺伝子の分離は、通常各反復を取り囲むＤＮＡの特有な配列から得たプライマーを用いた一段階ポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定される。加えて、混合白血球反応はＰＣＲマイクロサテライト標識分析の結果を確定するために、研究用ＤＬＡ同一同腹子のつがいに対して行われた。
【０１０７】
研究計画
研究用イヌはＤＬＡ同一同腹子の同一提供者から獲得したｃＭＳＣおよび骨髄の移植を受けた。骨髄移植片は、全身性Ｘ線照射（ＴＢＩ）に先だって０日目に２匹のＤＬＡ同一同腹子提供者から回収され交換された。骨髄離解は、０日目にイヌに９２０センチグレイ（ｃＧｙ）（７ｃＧｙ（９．３Ｒ）／分の割合で送られる二つの阻害６０ＣＯ源からの正中大気露出）の単独ＴＢＩ照射により誘発された。移植４週前またはそれ以上前の週で提供者骨髄吸引液から単離された培養増殖ｃＭＳＣは、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子を含むＰａｐｐ＠ＯＴ−２４〔原文通り〕が導入された。ｃＭＳＣは継代１（Ｐ１）または継代２（Ｐ２）の後に低温保存された。ＴＢＩに続いて、ｃＭＳＣｓは解凍され携帯注入ポンプにより１５分間静脈内に輸送された。ｃＭＳＣ注入後の１時間乃至２時間の間、骨髄移植片は全有核細胞（ＴＮＣ）≧１ｘ１０８個／ｋｇの投与量で静脈内に注入された。
【０１０８】
シクロスポリンは移植片対宿主性病（ＧＶＨＤ）の予防のために０日目乃至５日目にかけて１０ｍｇ／ｋｇ　ＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）（サンジミューン（Ｒ）インジェクションソリューション、サンド　ファーマシューティカル　コーポレーション）の投与量で４頭のイヌ全ての静脈内に投与された。グループＩ．１．ａについては６日目乃至５０日目（研究の終了）にかけて、またはグループＩ．１．ｂについては６日目乃至１００日目にかけてシクロスポリンは１０ｍｇ／ｋｇ　ＢＩＤ　ＰＯ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）（ネオラル（Ｒ）ソフトゼラチンカプセル、サンド　ファーマシューティカル　コーポレーション）で投与された。受容者への抗生物質の経口投与による通常の補助介護は５日前から、抗生物質の全身性投与は０日目から開始し、移植片が得られるまで続けられた。液体補助は必要に応じて行われた。血小板輸注は、回復中の４頭のイヌ全てに必要とされなかった。標準イヌ処置法では、血小板値が一定して１０，０００個／ｍｍ３より下に下がりまたは処置スタッフが出血の徴候を確認した場合には全血輸血が必要である。必要であれば血小板輸注は、任意の提供者から獲得した全Ｘ線照射（２０００ｃＧｙ）血の５０ｍｌ量で実施される。移植片は最初の完全好中球細胞＞５００個／ｍｍ３、＞１，０００個／ｍｍ３および血小板＞１０，０００個／ｍｍ３、５０，０００個／ｍｍ３＞、および＞１００，０００個の３連続した測定値の時に定植された。
【０１０９】
続く造血回復のために、完全血球算定（ＣＢＣｓ）が０日目乃至５０日目にかけて、１００日の研究グループについてはその後各週で得られた。血清化学分析は０、２日目、それ以降は毎週一回行われた。末梢血サンプルはＤＮＡ単離のために全ＭＳＣ注入の０日目、５分および１５分、１時間および２時間そして１日、２日、３日および４日目に採取された。ＤＮＡは、産物中に取り込まれるジゴキシゲニンを用いた抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ法および第２段階として抗ジゴキシゲニン比色定量分析によりＧＦＰ標識細胞の存在について評価された。骨髄吸引液は血小板数値が一定して５０，０００個／ｍｍ３に達した時に得られ、同一ＰＣＲ法を用いてＧＦＰ標識細胞の存在について調べられた。培養ｃＭＳＣはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を調べるために、また更なる抗ＥＧＦＰ　ＰＣＲ分析用にｃＭＳＣを増殖させるために樹立された。剖検時に末梢血、骨髄吸引液および骨髄生検材料は抗ＥＧＦＰ　ＰＣＲ分析のために得られた。ＣＦＵ分析は骨髄吸引液に対して行われ、抗ＥＧＦＰ　ＰＣＲ分析は培養増殖ｃＭＳＣに対して行われた。組織学的解析は種々の組織におけるＧＦＰの存在について行われた。
【０１１０】
ｃＭＳＣの単離、培養増殖、形質導入および低温保存
両側の骨髄吸引液はｃＭＳＣの単離、およびイヌＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２については４週前で、イヌＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４については９週前での培養樹立のために得られた。骨髄１５ｍｌ（各上腕骨から７ｍｌ）は各イヌから得られた。イヌはブトルファノールの注入、続くジアゼパムおよび塩酸ケタミンの混合物（アベコ　カンパニー，インコーポレイテッド、フォートダッジ、アイオワ）の注入により麻酔をかけられた。針挿入部位はポビドンヨードで洗浄されその後アルコールですすぎ落とした。吸引液は、１６ゲージ、２インチの骨髄針を用いて各イヌの両上腕骨顆から得られた。注射器は針に取り付けられ、各上腕骨から骨髄８ｍｌを取り出すために吸引した。骨髄吸引液は無菌的手法で１５ｍｌのポリプロピレン円錐形チューブに移された。本方法に続いてイヌは回復のために温床に置かれた。
【０１１１】
骨髄の一部５ｍｌ乃至１０ｍｌはポリプロピレン培養チューブ中で、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で５０ｍｌに希釈された。細胞懸濁液は室温（ＲＴ）で１０分間、２２００ＲＰＭで遠心された。全有核細胞数は４％酢酸中で測定された。細胞はその後、最終濃度２０ｘ１０６個／ｍｌまでＤＰＢＳ中で希釈された。１０ｍｌまたは２００ｘ１０６個の細胞は５０ｍｌ円錐形チューブ中で２０ｍｌのパーコール（ｓｐ．ｇｒ．　１，０７３ｇｍ／ｍｌ）に乗せられ、２０分間１３００ＲＰＭで遠心された。単核細胞を含む細胞界面はＤＰＢＳ中で洗浄され、完全培地中に再懸濁され、回復割合を得るために計数された。細胞はその後完全培地中に希釈され、培養細胞は前に記載されたように樹立され５％二酸化炭素濃度で３７℃のインキュベーター中に置かれた。
【０１１２】
２シストロンＭｕＬＶレトロウイルスベクターの構成
グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レトロウイルスはクラゲ、エクオレアビクトリア（クロンテック、カリフォルニア）からＥＧＦＰ−１遺伝子を単離することにより構成された。ＥＧＦＰ遺伝子はレトロウイルスベクターｐＪＭ５７３−ｎｅｏ（帰属プラスミドの名称はｐＯＴ−２４）中にクローン化された。ｐＪＭ５７３−ｎｅｏプラスミドは、修飾されたｐＮ２（ケラー他、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ　３１８巻：１４９ページ）から得られた。ｐＮ２の修飾は次のようであった：マウスレトロウイルスｇａｇ開始部位が枠内終止コドンで置換され、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲが同一カセット内に構成され、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）および内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）がｐＮ２中に挿入された。ＥＧＦＰ　ｐＯＴ２４プラスミドの模式図は図８に示す。
【０１１３】
組換えレトロウイルスの調製
ｐＯＴ−２４は、製造者によって示されたようにＤＯＴＡＰ（ベーリンガー　マンハイム）を用いてＧＰ＆Ｅ８６環境栄養性産生細胞中に形質移入された。形質移入細胞は、１０％熱失活ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ　テクノロジーズ）および選択標識としての硫酸プロタミン−Ｇ４１８（シグマ）０．５ｍｇ／ｍｌの補足されたＤＭＥＭ−高グルコース（ＨＧ）培地中で生育された。培養細胞は密集度７０％になるまで維持され、その時点で培地は新鮮レトロウイルス培地（Ｇ４１８無し）に交換され、細胞は３２℃で２日間維持された。レトロウイルスを含む培養培地は回収され０．４５μｍフィルターを通して濾過され−７０℃で保存された。両栄養性レトロウイルスは、遠心導入法と続くＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）での選別法を用いてＰＡ３１７細胞を環境栄養性ウイルスに２回形質導入することにより調製された。レトロウイルス上澄みは回収された。貯留ＥＧＦＰウイルスの３Ｔ３細胞に対する力価は１．２ｘ１０６ＣＦＵ／ｍｌであった。ＧＦＰレトロウイルス上澄みは−７０℃で低温保存された。
【０１１４】
ＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２
パーコール界面から得られた洗浄された単核細胞は完全培地３０ｍｌおよび細胞数１０ｘ１０６個／フラスコを含むＴ−１８５フラスコ１０個中で樹立された。
【０１１５】
培養２、６、９日目にフラスコ中の培地は新鮮完全培地と交換された。初期培養の１２日目に写真を撮り、細胞は継代０（Ｐ０）から継代１（Ｐ１）に移された。培地は吸引されフラスコは８ｍｌＤＰＢＳで２回洗浄された。トリプシン８ｍｌが添加され、フラスコは３７℃インキュベーター中に３分間置かれた。細胞が剥離し、完全培地８ｍｌの添加により反応は止められた。細胞は５０ｍｌ円錐形チューブに移され貯留された。フラスコはＤＰＢＳで洗浄され貯留細胞は室温で５分間、２０００ＲＰＭで遠心された。上澄みは除去され細胞のペレットは完全培地中に再懸濁された。細胞は貯留され、測定され生存可能性が調べられた。細胞は完全培地１８ｍｌおよび細胞数フラスコ当たり０．４ｘ１０６個を含むＴ８０フラスコ１５個中で平板培養された。
【０１１６】
培養１５日目、１８フラスコのうち１５フラスコに最初の形質導入が行われた。培地は除かれた。レトロウイルス上澄みの一部が解凍され、形質導入混合物を作るためにポリブレンが最終濃度８μｇ／ｍｌまで添加された。細胞培地は形質導入混合物１０ｍｌと交換されフラスコは３２℃で１時間、３０００ＲＰＭで遠心された。遠心後、熱失活胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を用いて調製された完全培地１０ｍｌは（形質導入混合物を含む）各フラスコに添加され、フラスコはインキュベーターに戻された。フラスコ３つは形質導入をせず、新鮮培地が交換された。培養１６日目、培地は新鮮完全培地に交換された。培養１７日目に形質導入法が繰り返された。
【０１１７】
培養１８日目、細胞は前に記載したように回収されＰ１からＰ２に移された。細胞３ｘ１０６個は完全培地１００ｍｌ中に添加され三つ組みフラスコ（５００ｍｍ２）中に注入された。三つ組みフラスコ１５個は形質導入細胞で調製され３個は非形質導入細胞で調製された。残りの細胞は低温保存された。凍結溶液は１０％ＤＭＳＯおよび９０％ＦＢＳを含むように調製された。細胞１０ｘ１０６個は凍結溶液１ｍｌ中に再懸濁された。バイアルはラベルを貼られ最低４時間はナルジーン　クリオ　コンテナ中に低温保存された。
【０１１８】
Ｐ２培養２２日目、細胞分布と形態を記録するために写真が撮られ、Ｐ２細胞は回収され前に記載されたように低温保存された。
【０１１９】
ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４
パーコール界面で得られ洗浄された単核細胞は、完全培地２０ｍｌおよび細胞１２ｘ１０６個／フラスコを含むＴ−７５フラスコ１５個中に樹立された。
【０１２０】
培養２日目、フラスコおよびディッシュ中の培地は新鮮完全培地と交換された。ｃＭＳＣの初代培養の６日目、最初の形質導入が前に記載したように行われた。フラスコ３個は形質導入されず新鮮培地は６日目に交換された。培養７日目、培地は新鮮培地に交換された。
【０１２１】
培養８日目、形質導入法は繰り返された。培養９日目、写真が撮られ、細胞は前に記載されたようにＰ０からＰ１に進められた。細胞３ｘ１０６個は完全培地１００ｍｌに添加され三つ組みフラスコ中に注入された。三つ組みフラスコ１５個は形質導入細胞で調製され３個は非形質導入細胞で調製された。
【０１２２】
骨髄吸引液１５ｍｌは提供者ＣＡＮ−０７−０１、ＣＡＮ−０７−０２、ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４からそれぞれ有核細胞９１０、１２１２、８５６および１９４８ｘ１０６個を産生した。パーコール界面から得られた単核細胞数は６１２、６６６、５８８および４６２ｘ１０６個であり６７．２、５５、６８．７および２３．７％の回復であった。Ｐ１時、細胞生存可能性は平均９７．１（９３．３乃至１００の範囲）％であった。提供者ＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２のＰ２および提供者ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４のＰ１細胞の時、形質導入細胞の細胞の生存可能性は平均９６．７（９６．３乃至９７．９の範囲）％であった。非形質導入細胞は９５．４（９３．３乃至９６．９の範囲）％の生存可能性であった。ｃＭＳＣの低温保存のための回収時には、形質導入細胞の生存可能性は平均９９．４（９７．４乃至１００の範囲）％であり、非形質導入細胞は９９．４（９７．６乃至１００の範囲）％であった。
【０１２３】
継代２後４日目に回収されフラスコ当たり３ｘ１０６個で平板培養された、提供者ＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２のフラスコ当たりの産生された形質導入ｃＭＳＣは５．９および６．７ｘ１０６個であり、フラスコ当たりの産生された非形質導入ｃＭＳＣは８．４および７．５ｘ１０６個であった。継代１（異なる形質導入および継代設定）後４日目に回収されフラスコ当たり３ｘ１０６個で平板培養された、提供者ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４のフラスコ当たりの産生された形質導入ｃＭＳＣは２０．０および１４．０ｘ１０６個であり、フラスコ当たりの産生された非形質導入ｃＭＳＣは２５．３および１８．０ｘ１０６個であった。
【０１２４】
Ｐ０培養細胞から獲得したｃＭＳＣに対するＣＦＵ分析
ＣＦＵコロニー分析は完全培地１０ｍｌを含む１００ｍｌディッシュ３個内で細胞０．５ｘ１０６個を平板培養することにより初代培養樹立時に調製された。ディッシュは３７℃、５％二酸化炭素濃度でインキュベートされた。培地は２日目、４日目に新鮮培地と交換された。培養１０日目、ＣＦＵ分析ディッシュはＨＢＳＳで２回すすぎ落とされ、１％グルタルアルデヒドで１５分間固定され、ＨＢＳＳで２回すすぎ落とされ風乾された。ディッシュ中のｃＭＳＣはその後０．１％クリスタルバイオレットで染色され、脱イオン水で３回洗浄され風乾された。コロニーは平板培養された細胞１０６個当たりのコロニー形成数を算定するために測定された。
【０１２５】
単核細胞単離および培養樹立の日に平板培養され１０日目に回収されたＣＦＵ分析はイヌＣＡＮ−０７−０１、ＣＡＮ−０７−０２、ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４それぞれから細胞１０６個当たり５６、４６．７、１１４および７２コロニーを産生した。
【０１２６】
Ｐ１培養の１３日目、細胞分布と形態を記録するために写真が撮られ、Ｐ１細胞はトリプシン処理により回収され前に記載されたように低温保存された。
【０１２７】
三つ組みフラスコ中の培地は傾瀉され、フラスコはＤＰＢＳ５０ｍｌですすぎ落とされた。ＤＰＢＳの傾瀉後０．２５％トリプシン２３ｍｌが各三つ組みフラスコに添加された。フラスコは３分間３７℃インキュベーター中に置かれた。細胞剥離後２３ｍｌ完全培地が各フラスコに添加された。細胞懸濁液は５０ｍｌ円錐形チューブに移され、フラスコはＨＢＳＳ３０ｍｌで洗浄された。チューブは室温で５分間、２２００ＲＰＭで遠心された。形質導入または非形質導入細胞を含むペレットはそれぞれ貯留され計数された。細胞１ｘ１０７個の一部は、抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ分析による形質導入割合の測定のために取っておかれた。
【０１２８】
回収後、回復され、Ｐ１またはＰ２形質導入され、培養増殖されたｃＭＳＣは５分間１３００ＲＰＭで遠心され、８５％プラスマ−ライトＡ（バクスター　ＩＶ　セラピー）、１０％ＤＭＳＯおよび５％自己由来イヌ血清を含む氷冷不凍溶液中でｃＭＳＣ１ｘ１０７個／ｍｌの１ｍｌ中に再懸濁された。細胞のアリコートは別々の低温バイアルに各１ｍｌずつ分けられた。チューブはイヌ提供者番号および全生存可能細胞数の書かれたラベルを貼られた。ｃＭＳＣｓは細胞バイアルをナルジーン　フリージング　コンテナ中に置いて低温保存され、４時間−７０℃冷凍庫に置かれその後−７０℃で貯蔵庫に移された。
【０１２９】
産物の低温保存のために細胞を回収した時に、細胞１ｘ１０７個のアリコートは形質導入効率の測定のために得られた。形質導入効率は、産物中に取り込まれるジゴキシゲニンを用いた抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ法および第２段階として抗ジゴキシゲニン比色定量分析により分析された。
【０１３０】
ｃＭＳＣ注入産物
注入の１時間乃至２時間前にｃＭＳＣのバイアルは３７℃ウォーターバス中で回転させて解凍され、７０％エタノールが噴霧されバイオセイフティーキャビネット中で開けられた。ｃＭＳＣ産物はＤＭＥＭ−ＬＧ、細胞提供者に自己由来の３０％血清を含む注入培地５０ｍｌ中に懸濁された。ｃＭＳＣ産物の生存可能性は、実際の生存可能投与量を測定するためにトリパンブルー除去により測定された。各ｃＭＳＣ産物のアリコートは酵母菌単離、好気的および嫌気的生育を受けた。ｃＭＳＣは、組織培養プラスチックへの接着およびＰ２（ＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２に対してはＰ３）培地中での増殖能力について評価された。ｃＭＳＣ１ｘ１０６および０．１６ｘ１０６個のアリコートは、３個のＴ−２５プラスチック培養フラスコ中で完全イヌ培養培地中に平板培養された。ｃＭＳＣ１ｘ１０６個を平板培養したフラスコは２４時間後、ｃＭＳＣ０．１６ｘ１０６個を平板培養したフラスコは３日目にトリプシン処理により回収され計数された。
【０１３１】
ＴＢＩに続きｃＭＳＣ懸濁液は、１５分乃至２０分の間５０ｍｌ輸送するために手持ちのハーバード　バード　ミニ　インフューザーを用いて頭側静脈に挿入されたカテーテルを通して注入された。
【０１３２】
生存可能ｃＭＳＣ７．４９、７．３５、１０．０および１０．０（平均８．７）ｘ１０６個／ｋｇの適度に高い投与量は、０日目にイヌＣＡＮ−０７−０１、ＣＡＮ−０７−０２、ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４にそれぞれ注入された。これらの投与量は被験者が受容する通常の投与量の４倍乃至１０倍増に相当する。注入された全生存可能ｃＭＳＣは６７．７乃至１２９（平均９３．９）ｘ１０６個の範囲であった。細胞の生存可能性はトリパンブルー除去による測定で９２．１乃至９７．６（平均９４．９）の範囲であった。ｃＭＳＣ注入はＴＢＩ後７１乃至１４６（平均１１０）分の間に行われた。
【０１３３】
注入後の血液サンプリング
血液サンプル（２ｍｌ）はｃＭＳＣ注入の前におよび注入の間すなわち注入開始後５分および１５分、１時間および２時間そして１、２、３および４日目に得られた。細胞溶解産物はピュアジーンＴＭ（ジェントラ　システムズ，インコーポレイテッド）ＤＮＡアイソレーションキットを用いて調製された。このキットは、血流中のＧＦＰ標識ｃＭＳＣのレベルを検出するために産物中に取り込まれるジゴキシゲニンを用いた抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ法および第２段階として抗ジゴキシゲニン比色定量分析を使用する目的で用いられた。
【０１３４】
骨髄回収および移植片注入
移植片として用いられる骨髄はＴＢＩに先立ってＤＬＡ同一同腹子から回収された。吸引液は、１１ゲージ、４−６インチのボールトップステンレススチール回収針を用いて両上腕骨から得られた。回収針は１００ｍｌの組織培養培地１９９およびヘパリン４ｍｌ（４０００Ｕ）を含む真空フラスコのポリビニルチューブに取り付けられた。骨髄は３００μｍおよび２００μｍサイズの小孔を通され輸送パックコンテナ中に４℃で保存された。骨髄は提供者および受容者のラベルを貼られ後日の注入まで保存された。骨髄全有核細胞数（ＢＭ−ＴＮＣ）は、骨髄回収の間に得られた多量の末梢血中に存在する有核細胞を除外することで修正された。
【０１３５】
骨髄の全有核細胞数（ＴＮＣ）は骨髄回収の間に得られた多量の末梢血中に存在するＴＮＣを除去することにより修正された。骨髄の修正投与量は、イヌＣＡＮ−０７−０１、ＣＡＮ−０７−０２、ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４に対してそれぞれＴＮＣ４．３、３．５、３．１および２．０（平均３．２）ｘ１０８個／ｋｇであった。無修正骨髄投与量はＴＮＣ５．６、４．２、４．５および２．７（平均４．３）ｘ１０８個／ｋｇであった。
【０１３６】
注入の２０分前に骨髄は室温に置かれた。ｃＭＳＣ注入の一時間後骨髄は、１分乃至２分の間バックに圧力を加えることにより頭側静脈に挿入された蝶形針を通って静脈内に注入された。
【０１３７】
補助介護
５日前に、抗生物質の経口投与（硫酸ネオマイシンおよび硫酸ポリミキシン）は１日３回行われた。これらの抗生物質の経口投与は、完全好中球数が５００個／ｍｍ３に達するまで投与された。０日目、全身性抗生物質ベイトリルは静脈内に１日２回投与され完全好中球数が一定して１，０００個／ｍｍ３に達するまで続けられた。短時間の放射線毒性の結果としての液体および電解質損失は、食物と水が摂取されるまで１日２回のリンガー液５００ｍｌの皮下投与により補われた。
【０１３８】
種々の血液細胞数
血液サンプル（２ｍｌ）は、ｃＭＳＣの単離のための骨髄吸引の朝、０日目乃至５０日目までおよびそれ以降は２週間に１回研究の終了まで、頸静脈または頭側静脈から回収された。血液はＥＤＴＡを含むバキュテーナー中に移された。１ｍｍ３当たりの全白血球（ＷＢＣ）および血小板数はシスメックスＥ２５００を用いて測定され、種々の細胞数は固定およびライト染色液での染色後指示どおりに測定された。
【０１３９】
剖検
血液サンプルはＣＢＣ、化学２３分析およびＰＣＲ評価のために得られた。イヌはブトルファノールと続くジアゼパムおよび塩酸ケタミンの混合物により鎮静された。鎮静後、生検材料および両側の骨髄吸引液は上腕骨、大腿骨および腸骨稜から得られた。その後、安楽死が鎮静剤ペントバルビタールナトリウムの過剰投与で遂行された。５０日グループのイヌ（ＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２）は研究４３日目に安楽死させられ、１００日グループのイヌ（ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４）は研究１００日目に安楽死させられた。組織の全組合わせは動物の剖検時に回収された。
【０１４０】
組織学的調査のための組織の回収は続いて即座に行われた。組織のサブセットは抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ分析に用いられた。骨髄吸引液および生検材料は抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ分析、更なるＰＣＲ分析のための培養増殖およびＣＦＵ分析に用いられた。
【０１４１】
組織は約１インチ平方の小片に形を整えられ、１０％中性緩衝ホルマリン（ｐＨ６．８−７．２）で満たされた、ラベルの貼られた別々の５０ｍｌ円錐形チューブ中に置かれた。組織はパラフィン中に包埋され、薄切されヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。骨髄サンプルは過ヨウ素酸シッフ染色で染色された。
【０１４２】
剖検に先だって得られた骨髄吸引液は各イヌの左右の上腕骨、大腿骨および超骨稜からラベルの貼られた１５ｍｌチューブ中に回収された。組織サンプルのサブセットは剖検時に得られ約１／４インチ平方の小片に形を整えられ、ＰＢＳに浸したガーゼに包まれてラベルの貼られたジップロックバック中に別々に置かれた。骨髄吸引液は氷中に浸けられた。
【０１４３】
ＣＦＵ分析のための骨髄吸引液の調製
各イヌからＰＣＲ分析のために得られた左右上腕骨、大腿骨および腸骨稜の骨髄吸引液の一部は、別々のラベルの貼られた１５ｍｌチューブ中に分けられた。骨髄サンプルは氷中に浸けられた。
【０１４４】
剖検時に得られた骨髄から獲得したｃＭＳＣに対するＣＦＵ分析
剖検時に得られた骨髄から獲得したｃＭＳＣに対して行われたＣＦＵコロニー分析は完全培地１０ｍｌを含む１００ｍｍディッシュ三つ組みに細胞０．５ｘ１０６個を平板培養することにより調製された。ディッシュは３７℃および５％二酸化炭素濃度でインキュベートされた。培地は２日間乃至４日間で新鮮培地に交換された。培養１０日目、ＣＦＵ分析ディッシュはＨＢＳＳで２回すすぎ落とされ１％グルタルアルデヒドで１５分間固定されて、ＨＢＳＳで２回すすぎ落とされ風乾された。ディッシュ中のｃＭＳＣはその後０．１％クリスタルバイオレットで染色され脱イオン水で３回洗浄されて風乾された。コロニーは、平板培養された細胞１０６個当たりのコロニー数を算定するために算出された。
【０１４５】
ＤＮＡの単離および精製
ＤＮＡは各組織片から単離された。サンプルの残りは−７０℃フリーザー中で低温保存された。ＤＮＡは、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に置きプロテイナーゼＫ溶液を添加し、５５℃で３時間または組織が溶解するまでインキュベートすることにより単離された。サンプルは続いて３７℃で６０分間ＲＮアーゼで処置された。サンプルは室温に冷やされタンパク質は沈殿した。サンプルは遠心され、水溶層は１００％イソプロパノール中に丁寧に回収された。サンプルは混合され遠心された。ペレットは７０％エタノール中で洗浄された。チューブは遠心され、上澄みは抽出され、ペレットはおおよそ１時間乃至６時間乾燥された。ＤＮＡは室温で一晩水和され、続いて４℃で保存された。
【０１４６】
末梢血および骨髄サンプルは最初にＲＢＣ溶解溶液（塩化アンモニウム緩衝液）で溶解された。ＤＮＡはその後前に記載したように溶解液から単離された。ＤＮＡは、脱イオン水９９８μｌおよびサンプルから得られたＤＮＡ２μｌをキュベット中に添加することにより増量され撹拌された。分光光度計は光学密度（ＯＤ）を測定するために用いられた。ＯＤは２６０および２８０で読み取られ、ＤＮＡ濃度はμｇ／ｍｌで算出された。ＤＮＡ濃度は脱イオン水を用いて１μｇ／ｍｌに調整された。
【０１４７】
抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ
本研究で用いられた抗ＥＧＦＰ　ＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｅｌｉｓａ分析は、ＧＦＰに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用して注入ｃＭＳＣｓを検出する。遺伝子発現の分析のために、我々はＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ（ＤＩＧ標識／検出）キット（ベーリンガー　マンハイム）を利用した。要約すると、ＰＣＲは、増幅産物を標識するためのジゴキシゲニン標識ヌクレオチドの存在下で行われた。次にＰＣＲ産物２５μｌは、ストレプトアビジンがコートされたマイクロタイタプレートにおいて、３７℃の５’−ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブ溶液中で変性されハイブリッド形成された。プローブ−ＰＣＲ結合産物は、抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ複合体によりおよび比色定量基質２，２’アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いることにより検出された。滴定基準曲線は、分析に用いられたＤＮＡの量当たりのＤＮＡ濃度を近似するために形質移入対照ｃＭＳＣを用いて作成された。ＤＬＡクラスＩＩゲノムＤＮＡのＰＣＲに対する内部標準との最初の相互作用、その後のＤＮＡ濃縮液の同量の細胞に対する相互作用および形質導入細胞当たりの一つのレトロウイルスの組込みの推定により概算細胞数を得ることができる。
【０１４８】
ＧＦＰのためのＤＮＡの量的測定は全ての骨髄ヘラ／生検材料において示された。
【０１４９】
移植後の血球回復
血小板閾値（３連続の数値）が１０，０００個／ｍｍ３となる平均日数は１２．８（１１−１７の範囲）日、５０，０００個／ｍｍ３となるのは１９．８（１６−２５の範囲）日および１００，０００個／ｍｍ３となるのは２３．０（２０−２７の範囲）日であった。完全好中球細胞の閾値（３連続の数値）が５００個／ｍｍ３となる平均日数は９．３（８−１１の範囲）日および１，０００個／ｍｍ３となるのは１０．５（９−１３の範囲）日であった。
【０１５０】
仮骨髄吸引液
血小板が回復して１ｍｍ３当たり５０，０００個以上の値に一定したとき、仮骨髄吸引液は腸骨稜から回収された。この方法は本研究においてＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２については２７日目に、ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４については２９日目に行われた。
【０１５１】
結果
４３日目に安楽死させられたＣＡＮ−０７−０１およびＣＡＮ−０７−０２から獲得した全組織の組織病理学評価については、結果は異所性結合組織および亜急性のＧＶＨＤに対して陰性であった。
【０１５２】
検出可能なＤＮＡシグナルは注入の１時間の間および２日目に再び観察できた。サンプルの一つはＧＦＰ　ＤＮＡについて注入３日後に量的に測定できた。この時間は、自己由来のイヌ移植研究においてシグナルが２および３日目に見られたという前の観察と一致している。
【０１５３】
ＣＡＮ−０７−０３およびＣＡＮ−０７−０４におけるＧＦＰ＋細胞についての１００日目剖検データは、ＣＡＮ−０７−０３の大腿骨および上腕骨に、ＣＡＮ−０７−０４の上腕骨にＧＦＰシグナル（ＰＣＲ挿入ＤＮＡ１０μｇ当たりの同量の１ＧＦＰ＋細胞）を示した。
【０１５４】
このモデルにおいては、動物の目および耳の充血を観察することにより皮膚移植片対宿主性病（ＧＶＨＤ）を検出することが可能であった。この指標を用いて、間葉肝細胞を受容した動物は間葉肝細胞で処置されなかった対照動物と比較してＧＶＨＤの発症度が低かったことが測定された。
【０１５５】
これらの結果は、同種異系ＭＳＣｓが骨髄造血細胞の迅速な移植を補助できることを証明している。輸液補助は必要でなかった。ＧＶＨＤの臨床徴候は無かった。血小板回復はこれまでの対照よりも早かった。これらは同種異系移植後の同質細胞におけるキメラ現象の証拠である。同種異系ＭＳＣｓを用いることによる移植同種異系組織の選択は、臨床移植の場面で用いることができる移植片材料の範囲を広げる。
【０１５６】
（実施例９）
ＭＳＣ上澄み（ＭＬＲ９５）による混合リンパ球反応の抑制
上澄みの産生
提供者１５５から獲得したＴ細胞は、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニー　バイオテック）を用いた陰性免疫磁気選別法によりＰＢＭＣから精製された。提供者４１３から獲得したＰＢＭＣは３６００ラド（７０ｋＶで１２分）でＸ線照射された。２４ウェル組織培養プレート中で、Ｔ細胞（９ｘ１０５個／ウェル）は３日間Ｘ線照射ＰＢＭＣｓと混合され、その後異なる提供者（２１９、４５９、４６１−全て）から獲得したＭＳＣｓが３日間１．２ｘ１０５個／ウェルで培養細胞中に添加された。対照培養では、同量の培地がＭＳＣｓの代わりに添加された。別々のウェルにおいて、同数のＭＳＣｓは単独で平板培養され３日間培養された。培養３日後（初期ＭＬＲの開始後６日目）細胞はピペッティングにより再懸濁され、細胞懸濁液２００μｌは９６ウェルプレート三つ組みに移され、増殖レベルを測定するために〔３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウェル）で１８時間標識された。残りの細胞は１２５０ｒｐｍで１０分間遠心され、上澄みは回収され、分別されて−８０℃で凍結された。
【０１５７】
上澄みによる初期ＭＬＲの抑制
提供者１５５から獲得したＴ細胞は、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニー　バイオテック）を用いた陰性免疫磁気選別法によりＰＢＭＣｓから精製された。提供者４１３または提供者２７３から獲得したＰＢＭＣｓは３６００ラド（７０ｋＶで１２分）でＸ線照射された。９６ウェル組織培養プレート中でＴ細胞（１．５ｘ１０５個／ウェル）は、種々の上澄みの存在または不在下でＰＢＭＣｓ（１．５ｘ１０５個／ウェル）と混合された。この上澄みは培養開始時に各希釈濃度（１／８、１／３２、１／１２８、１／５１２、１／２０４８および１／８１９２）で添加されたものである。対照培養においては、同量の培地が上澄みの代わりに添加された。培養細胞は６日間インキュベートされ、その後〔３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウェル）で１８時間標識された。
【０１５８】
図９はＴ１５５ｘＰＢＭＣ４１３間のＭＬＲの結果を示す。ＭＳＣｓ＋ＭＬＲ（＃１）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ２１９（＃２）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ４５９（＃３）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ４６１およびＭＳＣｓ単独（＃８）、ＭＳＣ２１９単独（＃９）、ＭＳＣ４５９単独（＃１０）、ＭＳＣ４６１単独の上澄みの存在下では、初期ＭＬＲは抑制された。ＭＬＲ単独（＃５）の上澄みの存在下では初期ＭＬＲは抑制されなかった。
【０１５９】
進行中のＭＬＲの抑制
提供者１５５から獲得したＴ細胞は、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニー　バイオテック）を用いた陰性免疫磁気選別法によりＰＢＭＣｓから精製された。提供者４１３から獲得したＰＢＭＣｓ（１．５ｘ１０５個／ウェル）は３６００ラド（７０ｋＶで１２分）でＸ線照射された。９６ウェル組織培養プレート中でＴ細胞（１．５ｘ１０５個／ウェル）はＰＢＭＣｓ（１．５ｘ１０５個／ウェル）と４日間混合され、その後上澄みは種々希釈濃度（１／８、１／３２、１／１２８、１／５１２、１／２０４８および１／８１９２）で培養細胞に添加された。対照培養においては、同量の培地が上澄みの代わりに添加された。培養細胞は２日間（ＭＬＲ開始後６日目）インキュベートされ、その後〔３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウェル）で１８時間標識された。
【０１６０】
図１０はＴ１５５ｘＰＢＭＣ４１３間のＭＬＲの結果を示す。ＭＳＣｓ＋ＭＬＲ（＃１）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ２１９（＃２）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ４５９（＃３）、ＭＬＲ＋ＭＳＣ４６１から獲得した上澄みは進行中のＭＬＲｓの強い抑制を示した。ＭＳＣｓ単独（＃８）、ＭＳＣ２１９単独（＃９）、ＭＳＣ４５９単独（＃１０）、ＭＳＣ４６１単独から獲得した上澄みは投与依存法において抑制し、１／５１２希釈まで顕著な効果を示した。ＭＬＲ単独（＃５）の上澄みの存在下では進行中のＭＬＲは抑制されなかった。
【０１６１】
（実施例１０）
異種間葉幹細胞による混合リンパ球反応の抑制
ヒヒＭＳＣｓによるヒトＭＬＲｓの抑制
ヒト提供者（Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１）から獲得した応答ＰＢＭＣｓは、マイクロタイタウェル内でＸ線照射（３０００Ｒ）同種異系ヒトＰＢＭＣｓ（Ｓ４、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ１１）と混合された。各集団は細胞１．５ｘ１０５個／ウェルである。培養は５％ヒトＡＢ血清を含む標準細胞培養培地中で行われた。提供者８６２４３から獲得したヒヒＭＳＣｓ（ｂＭＳＣｓ）はＭＬＲの開始時に２ｘ１０４個／ウェルで添加された。ＭＳＣｓはＩＦＮγで処置されなかった。リンパ球増殖は、培養７日目にシンチレーション測定のための細胞回収に先立って細胞を３Ｈ−チミジンで１８時間標識することにより測定された。図１１に示された結果は、ヒヒＭＳＣｓが強固なヒトＭＬＲｓを５０％以上抑制したことを示している。
【０１６２】
ヒトまたはヒヒＭＳＣｓによる異種ＭＬＲの抑制
提供者２７３から獲得した応答ヒトＴ細胞（ｈＴ）は、提供者５９５７または提供者５９０９から獲得したＸ線照射（３０００Ｒ）ヒヒＰＢＭＣ（ｂＰＢＭＣ）と５％ヒトＡＢ血清を含む標準細胞培養培地中で培養された。提供者２４４から獲得したヒトＭＳＣｓ（ｈＭＳＣｓ）または提供者６２４３から獲得したヒヒＭＳＣｓ（ｂＭＳＣｓ）は開始時に培養細胞に添加された。リンパ球増殖は、培養７日目にシンチレーション測定のための細胞回収に先立って細胞を３Ｈ−チミジンで１８時間標識することにより測定された。図１２（ｂＰＢＭＣ提供者５９５７）および図１３（ｂＰＢＭＣ５９０９）に示された結果は、ヒトおよびヒヒＭＳＣｓの両方が異種ヒトｘヒヒＭＬＲを抑制することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】同種異系間葉幹細胞が免疫応答を誘導しないことを示す図。Ａから獲得されたＴ細胞は、投与依存法において異なる量のＢから獲得されたＰＢＭＣｓと混合されたとき増殖した。Ａから獲得されたＴ細胞は、Ｂから獲得された間葉幹細胞との接触に対する応答として増殖しなかった。間葉幹細胞が十分なＴ細胞活性化を提供するように操作されていた場合（間葉幹細胞はＩＦＮ−γで処置され、また補助的刺激分子Ｂ７−１またはＢ７−２を形質導入された）においても増殖しなかった。
【図２】間葉幹細胞が異なる二個体から獲得したリンパ球間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を積極的に抑制することを示す図。受容者に対して同種異系（第三者または提供者）のｈＭＳＣｓは、ＭＬＲ中の刺激細胞および応答細胞の両方に不適合であった（白抜き部）か、またはＭＬＲ中の刺激細胞に対して適合（提供者）していた（斜線部）。このように、間葉幹細胞はＭＨＣ型に関して特異性を持たずにＭＬＲを抑制した。間葉幹細胞は投与依存法においてＭＬＲを抑制した。
【図３】刺激（同種異系）ＰＢＭＣｓにより特発され、ＭＳＣｓへの露出をせず、その後自己由来ＰＢＭＣｓ、同種異系ＰＢＭＣｓ（刺激細胞または第三者）に露出されまたは細胞に露出されなかった応答Ｔ細胞の二次応答を示す図。
【図４】刺激（同種異系）ＰＢＭＣｓにより活性化され、続いて同種異系ＭＳＣｓ（刺激細胞）と共に培養され、その後自己由来ＰＢＭＣｓ、同種異系ＰＢＭＣｓ（刺激細胞または第三者）に露出されまたは細胞に露出されなかった応答Ｔ細胞の二次応答を示す図。
【図５Ａ】刺激同種異系ＰＢＭＣｓにより前活性化され、活性化後、同種異系（同一提供者（図５Ｂ）、または第三者（図５Ｄ））あるいは自己由来ＭＳＣｓ（図５Ｃ）と共に培養され、その後自己由来または同種異系（同一提供者または第三者）刺激細胞に露出された応答者Ｔ細胞の二次応答が抑制されたことを示す図。
【図５Ｂ】図５Ａと同じ。
【図５Ｃ】図５Ａと同じ。
【図５Ｄ】図５Ａと同じ。
【図６Ａ】イヌモデルにおけるＭＳＣｓによる初期ＭＬＲの抑制を示す図。ａｕｔｏｌ＝自己由来、ｉｄｅｎｔ＝ＤＬＡ同一同腹子、ｕｎｒｅｌ＝無関係
【図６Ｂ】図６Ａと同じ。
【図６Ｃ】図６Ａと同じ。
【図６Ｄ】図６Ａと同じ。
【図７】非粘着ＭＳＣｓによる初期ＭＬＲの抑制を示す図。
【図８】実施例８において用いられるＥＧＦＰ　ｐＯＴ２４プラスミドの模式図を示す図。
【図９】ヒト間葉幹細胞またはヒト間葉幹細胞抑制混合リンパ球反応培養系から産生されたＭＳＣ上澄みの初期混合リンパ球反応に対する抑制効果を示す図。
【図１０】ヒト間葉幹細胞またはヒト間葉幹細胞抑制混合リンパ球反応培養系から産生されたＭＳＣ上澄みの進行中の混合リンパ球反応に対する抑制効果を示す図。
【図１１】ヒヒ間葉幹細胞によるヒト応答Ｔ細胞とヒト刺激ＰＢＭＳ細胞との間の混合リンパ球反応の抑制を示す図。
【図１２】ヒヒまたはヒト間葉幹細胞によるヒト応答Ｔ細胞とヒヒ刺激ＰＢＭＣ細胞（提供者５９５７）との間の混合リンパ球反応の抑制を示す図。
【図１３】ヒヒまたはヒト間葉幹細胞によるヒト応答Ｔ細胞とヒヒ刺激ＰＢＭＣ細胞（提供者５９０９）との間の混合リンパ球反応の抑制を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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