(57)【要約】【課題】【解決手段】プローブ-ターゲット結合の相互作用又はその硬化を界面で測定する際に用いられる、二次高調波光又は和周波数といった表面選択性の非線形光学技術である。さらに、非線形光の方向は、界面から明確な方向に散乱される。従って、当該界面からある程度離れた検出器に対するその入射について、当該界面における特異的且つ既知の位置を容易に定めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブとターゲットとの間の相互作用を界面で測定する方法であって、このプローブとターゲットとの間の相互作用の効果を、ラベル非存在下で表面選択性の非線形光学法を使って測定すること、を含む方法。
【請求項２】
前記反応や反応の効果が、前記界面付近の水分子、溶媒分子または標識物質に影響し且つ、この影響を表面選択性の非線形光学技法を使って測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが、表面の一部である、又は表面に取り付けられたものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブと前記ターゲットとの間の前記相互作用が、光学活性標識物質を使って測定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非線形光学法が、第二高調波、和周波数発生又は差周波数発生である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非線形光学波の発生、集光や検出の様式が、反射と、透過と、一過性波と、多重内部反射と、近接場光学技法と、共焦点と、光学的キャビティと、平面導波路と、光ファイバーと、誘電体スラブの導波路とからなる群から選ばれる一以上の様式を使う請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記技法が、前記界面から発せられた非線形光学放射の変化を測定することよりなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブと前記ターゲットとが、生体成分である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標識物質分子又は一部が、結合反応前若しくは反応中に存在する、又は結合反応が起こった後に加えられる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
界面でのプローブとターゲットとの間の結合の程度や範囲を表面選択性の非線形光学的な技法を使って調べるための方法であって、前記結合が溶媒分子、水分子又は標識分子に与える効果を測定することを含む方法。
【請求項１１】
前記プローブ、前記ターゲット又はその両方が、帯電している又は双極子である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識物質の非線形光学的性質や超分極率が、トリガーとして働く薬剤または光線によって変化或いは活性化される請求項２と請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識物質が、ケージ化されている、又は分子ビーコンである請求項２と請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識物質中の非線形活性な部分ともう一つの部分との化学結合を切断するために、紫外光が作用する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つの領域又は複数の領域における非線形光の強度を所定期間の間で測定することによって、前記光学法が非線形光の強度を決定する請求項１に記載の方法
【請求項１６】
１つの領域又は複数の領域における非線形光の強度を、ターゲット濃度を変えながら測定することによって、前記光学法が非線形光の強度を決定する請求項１に記載の方法
【請求項１７】
前記界面が、固体またはゲル表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブが、前記表面に共有結合又は非共有結合で取り付けられる請求項１と１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面が、金属表面、半導体表面、ガラス表面、ラテックス表面、光ファイバー表面、シリカ表面、又はビーズ表面である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記界面が表面を含み、且つ、この表面が化学的に誘導されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面が、自己組織化単層膜またはオルガノシランで誘導される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記表面が、平面形状または非平面形状である請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブとターゲットとの間の反応が、核酸と、リガンドと、タンパク質と、小分子と、有機分子と、生物細胞と、ウィルスと、リポソームと、受容体と、アゴニストと、抗体と、抗原と、ペプチドと、受容体と、薬と、遮断剤と、酵素と、リガンドと、炭水化物と、ヌクレオシドと、オリゴ糖と、有機分子と、毒と、オリゴヌクレオチドと、ポリヌクレオチドと、ホルモンと、核酸類似体と、ペプチド核酸(PNA)と、イオンチャンネル受容体とからなる群から選ばれる一以上の要素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ターゲットが、核酸と、タンパク質と、小分子と、有機分子と、生物細胞と、ウィルスと、リポソームと、受容体と、抗体と、アゴニストと、アンタゴニストと、インヒビターと、リガンドと、抗原と、卵母細胞と、ホルモンと、タンパク質と、ペプチドと、受容体と、薬と、遮断剤と、酵素と、ヌクレオシドと、炭水化物と、cDNAと、オリゴヌクレオチドと、ポリヌクレオチドと、オリゴ糖と、ペプチド核酸(PNA)と、毒と、核酸類似体と、イオンチャンネル受容体とからなる群から選ばれる一以上の要素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブが、核酸と、タンパク質と、小分子と、有機分子と、生物細胞と、卵母細胞と、ウィルスと、リポソームと、受容体と、抗体と、アゴニストと、アンタゴニストと、インヒビターと、リガンドと、抗原と、ホルモンと、タンパク質と、ペプチドと、受容体と、薬と、遮断剤と、酵素と、ヌクレオシドと、炭水化物と、cDNAと、オリゴヌクレオチドと、ポリヌクレオチドと、オリゴ糖と、ペプチド核酸(PNA)と、毒と、核酸類似体と、イオンチャンネル受容体とからなる群から選ばれる一以上の要素を含む請求項１に記載の方法。
前記基板と前記センサとの間に位置する任意の第二光学系、この第二光学系が、前記基板に対する第二の角度で前記ターゲットとそれに取り付けられたプローブとから発せられた放射を受け取り、前記角度が予め定められ、そして前記第二光学系が、放射を前記センサに導く。
【請求項６１】
前記第二光学系が、前記プローブ及び前記ターゲットから受け取った放射中の予め定められた周波数を分離するための周波数セレクタを含む請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
前記光源が、各パルスがフェムト秒からナノ秒の継続期間をもつパルス列を生成するレーザーである請求項５９に記載の装置。
【請求項６３】
前記第二光学系が、前記予め定められた第１の周波数の略二倍である予め定められる周波数の放射を選択するための要素を含む請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６４】
前記予め定められた周波数が、予め定められた第１の周波数であり、且つ、前記光源が第１のレーザー源であると共に、更に前記予め定められた第２の周波数の電磁波を発生する第２のレーザー源と、前記予め定められた第２の周波数のレーザー放射の付加的なビームを導くため及び前記付加的なビームを前記基板上の前記プローブ及び前記ターゲットに導くための要素を含む前記第１の光学系とを有する請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６５】
前記プローブ及び前記ターゲットから発せられた放射が、非線形応答によるものであり、前記予め定められた周波数が、前記プローブ及び前記ターゲットからの非線形放射の発光を誘導するように選択される請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６６】
前記予め定められた周波数の放射の前記ビームに応答して前記プローブ及び前記ターゲットにより発せられた放射の殆ど又は全てが、前記予め定められた第２の角度で発せられる請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６７】
次の技法、即ち、多重内部反射、近接場光学的技法、共焦点、光学的キャビティ、平面導波路、光ファイバー及び誘電体スラブ導波路、近接場技法の中の一以上を使って、前記第２の光学系が前記放射の前記界面に対する供与や集光を考慮して構成される請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６８】
前記界面から発せられた放射が、前記界面の非線形応答によるものである請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項６９】
前記予め定められた周波数の放射の前記ビームに応答して前記界面から発せられた放射が、前記予め定められた第２の角度で発せられる請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項７０】
前記ターゲットが、帯電している又は双極子である請求項５９〜請求項６０に記載の装置。
【請求項７１】
取り付けられたプローブ-ターゲット反応の効果を測定する目的で、一または複数の領域を有する界面を使用した、表面選択性の非線形光学法のための方法と装置。
【請求項７２】
プローブ-ターゲット反応が、イオンチャンネル又は受容体を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記効果が、イオンチャンネルの通門、閉門又は変調を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
非線形光学的活性な標識物質であって、表面選択性の非線形光学法を使って、プローブ-ターゲット反応又はそれらの効果を界面で検出する用途のための光学的非線形活性な部分を有する前記標識物質。
【請求項７５】
前記標識物質が、オキサゾール又はオキサゾール分子、5-アリール-2-(4-ピリジル)オキサゾ−ル、2-アリール-5-(4-ピリジル)オキサゾール、2-(4-ピリジル)シクロアルカノ[d]オキサゾール、メロシアニン、スチルベン、インドジカルボシアニン、へミシアニン、スチルバジウム、アゾ染料、シアニン、ストリリルベースの染料、メチレンブルー、ジアミノベンゼン化合物、ポリエン、ジアゾスチルベン、トリシアノビニルアニリン、トリシアノビニルアゾ、メラニン、フェノチアジンスチルバゾール、ポリイミド、スルホニル置換アゾベンゼン、インダンジオン-1,3-ピリジニウムベタイン、フルオレセイン、ベンゾオキサゾール、ペリレン、ポリメタクリレート、オキソノールからなる群から選ばれる部分を含む請求項７３に記載の標識物質。
【請求項７６】
前記標識物質が、1,3-オキサゾールを基にしたオキサゾール部分を有する請求項７３に記載の標識物質。
【請求項７７】
前記オキサゾール部分が、第四級塩である請求項７５に記載の標識物質。
【請求項７８】
前記オキサゾール部分が、2-(4-N-メチルピリジニウム)-4,5-ジヒドロナフト[2,1-d]-1,3-オキサゾールp-トルエンスルホネートである請求項７３に記載の標識物質。
【請求項７９】
前記オキサゾールが、2-(4-N-メチルピリジニウム)-4,5-ジヒドロ6-メトキシナフト[2,1-d]-1,3-オキサゾールp-トルエンスルホネートである請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８０】
前記オキサゾール部分が、5(2)アリール-2(5)-(4-ピリジル)オキサゾールである請求項７５に記載の標識物質。
【請求項８１】
前記オキサゾール部分が、2,5-ジアリール-1,3-オキサゾールである請求項７５に記載の標識物質。
【請求項８２】
標識物質が、1-(3-(コハク酸イミジルオキシカルボニル)ベンジル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムブロマイドである請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８３】
標識物質が、1-(2,3-エポキシプロピル)-4-((5-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムメタンスルホネート（PyMPOエポキシド）である請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８４】
非線形活性な標識物質が、非中心対称的な金属又は半導体の粒子である請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８５】
非線形活性な標識物質が、基本光の波長の10%以上のサイズで中心対称的な金属又は半導体の粒子を含む請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８６】
標識物質が、リンカー分子を含み、この標識物質の非線形活性な部分がこのリンカー分子に結合している請求項７３に記載の標識物質。
【請求項８７】
非線形光学部分を備え、
少なくとも１の非線形光学部分が取り付けられる表面を与える足場として用いられる個体物体を有する非線形活性標識物質。
【請求項８８】
前記成分が、固体表面への取り付けのためのリンカー分子を含む請求項８６に記載の標識物質。
【請求項８９】
前記リンカー分子が、固体物体の表面に直接取り付けられ、このリンカーによって前記標識物質を前記固体表面へ結合し得る請求項８７に記載の標識物質。
【請求項９０】
前記リンカー分子が、誘導体化表面層を通じて、前記固体表面に取り付けられると共に、前記層が表面に取り付けられており、前記リンカーによって前記標識物質を前記層へ結合し得る請求項８７に記載の標識物質。
【請求項９１】
固体物体が、表面層で誘導さている請求項８６に記載の標識物質。
【請求項９２】
表面層が、自己組織化単層膜である請求項８９と請求項９０に記載の標識物質。
【請求項９３】
表面層が、シラン化合物の化学的類中にある請求項９１に記載の標識物質。
【請求項９４】
固体物体が、粒子、クラスター、コロイド粒子、サイズスケールがナノメータからミクロンの範囲にあるナノ結晶又はナノ粒子である請求項８６に記載の標識物質。
【請求項９５】
固体物体が、ポリマー、ラテックス、ポリスチレン、シリカ、ガラス又はシリコン、金属、半導体、又は絶縁体である請求項８６に記載の標識物質。
【請求項９６】
前記リンカーが、8炭素原子長より長い請求項８７に記載の標識物質。
【請求項９７】
固体物体が、次の群即ち、Au、Ag、Pt、CdS、CdSe、TiO2、GaAs、InP、GaPの中の材料を有する請求項９３に記載の標識物質。
【請求項９８】
前記粒子が、請求項７４〜８２に記載の部分又は分子のいずれかに複合化される又は取り付けられる請求項８７に記載の標識物質。
【請求項９９】
非線形活性な部分が、前記固体物体に、官能化アルキルチオールを通じて取り付けられる請求項８６に記載の標識物質。
【請求項１００】
前記固体物体が、非中心対称的である請求項８６に記載の標識物質。
【請求項１０１】
前記固体物体が、中心対称的で、基本波光の波長の10%以上のサイズをもつ請求項８６に記載の標識物質。
【請求項１０２】
前記アルキルチオールが、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、ビシナルジオール、グルタミン、オリゴ糖、グアジニウム、NHSエステル、メチルエステル、ヒドロキシル、アジドメチルクマリン、スルホNHSエステル、マレイミド、ヨードアセチル、ビニルスルホン、-CH結合、カルボジイミド活性化カルボキシル、ビオチン、ストレプタビジン、ホスファチジルコリン部分に対して反応性である基で官能化されている請求項９８に記載の標識物質。
【請求項１０３】
単独の標識物質を含む、二以上の異なる種類の種を有し、前記第一種類の種の効果が、前記第二種類の種の非線形活性を共鳴的に増強するものである請求項７３に記載の標識物質。
【請求項１０４】
第一種類の種が、金属又は半導体の粒子であり、共鳴増強効果を生み出すのに使われる請求項１０２に記載の標識物質。
【請求項１０５】
金属や半導体の粒子が、中心対象的または非中心対称的である請求項１０３に記載の標識物質。
【請求項１０６】
第二種類の種が、任意の光学的に非線形活性な部分、分子又は粒子である請求項１０２に記載の標識物質。
【請求項１０７】
二種類の種が、互いに、化学的に結合され、結び付き、又はリンクされる請求項１０２に記載の標識物質。
【請求項１０８】
二種類の種の間の平均距離が、オングストローム又はナノメータのオーダーである請求項１０２に記載の標識物質。
【請求項１０９】
標識物質が、超分極率を有する分子や粒子である請求項７３と請求項１０２に記載の標識物質。
【請求項１１０】
前記界面が表面を有し、前記プローブがアレイ中の一以上の既知の領域又は要素内で前記表面に取り付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記界面が、固体表面、細胞表面、リポソーム又は小胞表面から構成される請求項１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記プローブが、生物細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記プローブが、タンパク質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記プローブが、核酸又はPNAを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記界面が固体基板を含み、前記プローブが前記固体基板に取り付けられたウィルス粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記結合が、前記ターゲットの前記固体基板上への吸着過程である請求項１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記反応が核酸ハイブリダイゼーションを含み、前記プローブ又はターゲットが核酸、オリゴヌクレオチド、RNA又はDNA又はPNAを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１８】
前記プローブが細胞表面を含み、前記ターゲットがウィルスを含み、前記反応が前記ウィルスが前記細胞表面に結合することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１９】
標識物質分子又は粒子が、生体的要素、核酸、タンパク質、小分子、生物細胞、ウィルス、リポソーム、受容体、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター、ホルモン、抗体、抗原、ペプチド、受容体、薬、遮断剤、酵素、リガンド、ヌクレオシド、ポリヌクレオシド、炭水化物、cDNA、ホルモン、アレルゲン、cDNA、ハプテン、オリゴヌクレオチド、ビオチン、ストレプタビジン、ポリヌクレオチド、オリゴ糖と、ペプチド核酸(PNA)、核酸類似体を含む請求項７３に記載の方法。
【請求項１２０】
標識物質を用いた表面選択性の非線形光学法を用いて、表面を光学的に画像化するための方法と装置。
【請求項１２１】
前記表面が、取り付けられたプローブを含む請求項１１９の方法。
【請求項１２２】
前記表面が、本来の位置の、生体内または生体外の生体組織である請求項１１９の方法。
【請求項１２３】
前記画像化が、内視鏡のタイプである請求項１１９の方法。
【請求項１２４】
放射の照射と集光が、光ファイバー線を使って達成される請求項１１９の方法。
【請求項１２５】
分子又は粒子の表面への吸着反応を、前記反応が有する、表面付近の前記標識物質の非線形性質、分極又は配向に対する間接的な効果を用いた表面選択性の非線形光学法を使って、測定するための方法と装置。
【請求項１２６】
非線形光学的な放射強度を所定期間の間で測定するステップ１と、
前記測定強度の平方根を取るステップ２と、
数学的な関係を使い、所定の時間でハイブリダイズしたターゲットの量を表面電荷密度の増加または減少と関係付けるステップ３と、
数学的な関係を使い、所定の時間で表面電荷密度の増加または減少を非線形光強度の増加または減少と関係付けるステップ４と
を有するプローブ-ターゲット結合反応をモデル化するためのソフトウェア手順。
【請求項１２７】
前記ステップ３の関係が、Gouy-Chapman、Stern又は他の表面電荷密度を表面ポテンシャルに関係付ける当技術分野に知られた式である請求項１２５。
【請求項１２８】
前記ステップ２の関係が、Langmuir、修正Langmuir又は他のバルク成分濃度をその対応する表面関連濃度に関係付ける当技術分野に知られた式である請求項１２５。
【請求項１２９】
前記手順が、ターゲットとプローブとの間の平衡結合強度を決定するのに使われる請求項１２５。
【請求項１３０】
前記手順が、ターゲット-プローブ結合を含む反応又は前記反応の効果の反応速度論的性質を決定するのに使われる請求項１２５。
【請求項１３１】
前記界面が、浮遊した細胞、リポソーム、ビーズ又は粒子の表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３２】
取り付けられたプローブとターゲットとの間の界面での相互作用を、前記ターゲットが、細胞、リポソーム又はイオンチャンネルを含む支持された二重層表面における生体成分である場合に、測定する方法であって、表面選択性の非線形光学法を使って検出される標識物質の非線形性質の変化を導く、イオン性質の変化を測定することを含む方法。
【請求項１３３】
前記イオンチャンネル性質の変化が、リガンド-受容体結合反応を含む請求項１３１。
【請求項１３４】
前記イオンチャンネル性質の変化が、前記細胞、リポソーム又は支持された二重層表面の電気ポテンシャル又は電荷密度の変化を導く請求項１３２。
【請求項１３５】
前記効果が、次の
1) 非線形或いは基本波光の強度、
2) 非線形或いは基本波光の波長やスペクトル、
3) 表面又は基板上における基本波光の入射位置、及び
4) 1)、2)、或いは3)の時間推移
の中の一以上を有する一以上の性質により測定される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的成分の反応またはその反応の効果を、表面で且つ成分のラベリングの必要無く検出する方法および種々の構成をもつ装置を開示する。本発明は更に、様々な表面で生物学的成分を画像化するための方法および装置も開示する。水分子、溶媒分子や標識物質が、表面における非線形光学的応答を検出または画像化するのに用いられる。
【背景技術】
【０００２】
生体分子間の結合を検出し定量化する事は、現代の分子生物学および医学の中心的関心事である。ゲノミクスとプロテオミクスの研究は、この問題、すなわち多様である生物学的相互作用を高効率で分析することが必要とされる問題へ向けられる。これを行うための多くのスキームでは、オリゴヌクレオチド又はタンパク質といった分子を固体表面に固定している。取り分け、サンプルのマイクロアレイ形式は、高度の並列処理で情報を得るのに使用できる。例えば、Fodorら（1991、その関連部分を参照により組み入れる）は、光直接合成法（light-direct synthesis）により形成された高密度アレイを開示している。この場合、表面プローブはオリゴヌクレオチドであり、ターゲットとのその結合（ハイブリダイゼーション）が検査される。溶液中に自由に拡散しているこのターゲットは、蛍光的にラベルされたオリゴヌクレオチドであり、プローブのヌクレオチド配列がターゲットの配列とマッチする所で結合が起こる。非結合ターゲットが洗浄により取り除かれると、残っているターゲットの配列を表面の蛍光をスキャンすることにより決定できる。何故なら、プローブの配列は表面上の各場所で設計により既知であり、ターゲット及びプローブは相補的配列が対合するようにマッチングしていなければならないからである。この方法に基づく多くの変形が導入されてきたが、一塩基対だけ異なる配列間の結合度従って蛍光強度を調べるといったSNP（一塩基多型）の調査、一のタンパク質（プローブ）が表面に固定化され様々のターゲットとの結合を検査されるといったタンパク質対タンパク質相互作用の検出、更にはタンパク質対タンパク質相互作用が薬の存在によって変調するタンパク質対薬相互作用等を含む、この方法に基づく多くの変形が導入されてきた。
【０００３】
これら全ての場合で、読み取りステップは蛍光ベースの検出を伴う。しかしながら、蛍光での検出は幾つかの欠点をもつ。即ち、ラベルの使用は更なる時間と費用とをもたらし、サンプルは通常乾燥しており（バックグラウンドの蛍光つまりバルク中の非結合ターゲットを除くため）従ってバルクからの蛍光バックグラウンドのために平衡（自由エネルギー、解離定数、等々）の測定が容易には行えない。非結合ターゲットが先ず洗浄ステップでサンプルから取り除かれ、これが、平衡や反応速度の測定を排除し、更には所与サンプル上での多くのスキャン実施或いは多くのサンプル検査をしなければならないことを思えば、時間を食い過ぎることになり得る。また、蛍光の源である励起は、それが検出光学系中に入れた基板によって散乱される可能性があり、蛍光から完全に濾波されることは難しいであろうことから、バックグラウンド信号にも寄与するであろう。更に、スキャンが、例えば共焦点ベースの検出スキームによる場合のように、ピクセル毎の獲得を要する場合があるので、“読み取り”ステップ又は検出ステップにはバックグラウンドの自己蛍光やボトルネックがあるかもしれない。スキャンの各ステップで繰り返される自動フォーカスは又、画像獲得の著しい減速に至らしめ得る。
【０００４】
相互作用の平衡及び反応速度の両性質を測定し得る、生体分子の結合相互作用を定量化する他の方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)である。SPRは、導電性又は半導体の層（典型的には金）を、基板（典型的にはガラス）とそれが浸漬される液体溶液との間に要する。入射光は、プリズムや回折格子によって導電性層中に結合されそして、特定の波長や入射角で共鳴が起こり、反射率の鋭い極小や減少を生ぜしめる。通常、バイオ適合層またはその複数層は、導電性層の上に形成される。一例としては、タンパク質をバイオ適合層（しばしばデキストランベースの）に固定化し、標的タンパク質をこの層に接触するようにする。共鳴波長や角は基板付近の溶液の屈折率に依存し、その結果これが、導電性層からの一過性波長内の吸着生体分子の総数及び質量に依存していることになる。標的タンパク質が固定化タンパク質に結合した場合に共鳴波長や角の変化が起こる。しかしながら、各アレイ要素へ独立に励起を結合することの困難性のため、SPR技術はアレイ形式のサンプルの検出には使い難い。更に、検出感度が低いことが予想され、この技術では、特定と非特定結合とを識別できず、そしてSPRは通常、生体分子が導電性層と接触した場合に起こり得る相殺的相互作用を防ぐために、余分の生物学的に適合的な層を要する。このバイオ適合層が、必ずしも安定で金表面との相殺的相互作用を防ぐとは限らず、そして固定化タンパク質はしばしば、バイオ適合層への結合に適するように切断されねばならず、従ってその性質が変化しうるという可能性に曝される。特に重大な問題が起こるのは、膜タンパク質の場合である。膜タンパク質は、ガラス表面上に調製できる横方向に流動的なリン脂質膜というような本来的な環境で最も適切に調べられる。しかし、金と脂質との相殺的相互作用のために、これら膜を金表面に調整することはできない。
【０００５】
第二高調波発生(SHG)のような表面選択性非線形光学(SSNLO)技術は、バルク種の存在下に界面の分子や粒子（この界面は非中心対称でなければならない）を検出することを可能ならしめる。強レーザー光線（基本波）をサンプルの界面上に当て、もし界面が非中心対称であれば、サンプルは非線形光つまり基本波の高調波を発生し得る。基本波か第二高調波光線であるかは、ストークスシフトでより狭く分離される、励起及び発光を用いた蛍光技術での典型的な場合とは異なり、容易に他者から分離できる。各分子や粒子は、もしそれらが、1)非線形的に活性であり（超分極率をもち）そして、2)表面の近くにあり且つその影響（化学的または電気的力を通じて）で非ランダム的に配向されているならば、検出され得る。この正味の配向と種の内在的なSHG-活性とが、界面におけるSHG-許容効果の原因である。例えば、平面状の固体表面（ガラス及びシリカ）への染料分子、空気-水界面でのリポソームや固体ビーズ（シリカ及びポリスチレン）の吸着過程が測定されてきた。この技術は、界面での電子移動や溶媒和ダイナミクスのような過程の追跡にも用いられてきた。
【０００６】
SHGと云った非線形のSSNLO技術は、内在的に非線形的に活性である生物学的なサンプルが相対的に少ないため、以前は主に物理と化学に限られてきた。先行技術例としては、生物細胞の画像化に使われる光学的に非線形活性の染料の使用がある（Campagnolaら、Pelegら）。この先行技術では、非線形活性の染色が膜に固定化され、これら染色が細胞表面の画像化に使われる。しかしながら、染色が上方、下方の何れかで膜中に挿入され、従って相殺的干渉のため全体の非線形信号が低減する。非線形光学活性の染料は、リポソーム中の脂質二重層を横切るそれら染料の運動速度の測定にも用いられてきた（SrivastavaとEisenthal）。最近、先行技術であるが、第二高調波活性ラベル（“SHGラベル”）の概念と方法が発表され、任意の非線形活性分子や粒子を非線形活性にすることができる (Salafsky)。これの最初の例は、タンパク質シトクロムcをオキサゾールでラベリングし第二高調波発生で空気-水界面のタンパク質コンジュゲートを検出することにより明示された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、第二高調波（又は和・差周波数）発生の表面選択性と、帯電表面付近で極性又は配向した水、溶媒または極性標識物質の非線形活性との両方に基づく。加えて、非線形光線（例えば、第二高調波）は、蛍光検出（蛍光は略等方的に放射される）とは対照的に、界面から明確な方向に散乱されるので、これは、画像化法やアレイの使用に向いている。表面選択性非線形光学法はコヒーレントな技法であり、基本波と非線形光線とが明確な位相関係を持ち、巨視的サンプル中の非線形光線の伝播波面は、位相が揃っている（コヒーレント長内で）。これらの性質は、例えばマイクロアレイ表面が調べられるといった、表面や高処理量の調査に有用な数々の利点を提供する。第二高調波発生と云った非線形光学表面選択性に基づいた検出は、非線形光の発生は界面のみで起こるので極小に組み立てられた光学系を要し、その結果、極めて高い深度識別と速い走査性をもたらす。
【０００８】
更に、プローブとターゲット間の結合過程は、結合過程が表面上に電荷及びポテンシャル、その結果の水分子、溶媒や界面付近の標識物質の分極化するといった間接的な効果によって、ラベルを要せずして検出され、そしてこれが、ラベルを要する方法に比べて時間と費用の節約という結果になる。SSNLOは、蛍光ベース検出が可能ならしめるものより余程高い検出の信号対雑音比へと導き得る。
【０００９】
以下に、第二高調波発生を使う方法と概念を説明するが、これらはどんな非線形表面選択法にも同様に当てはまる。第二高調波(SH)分光法は、表面付近の分子の薄い層内の分子を検出するための非線形、表面選択性の技法である（Eisenthal,1996、CornとHiggns,1994）。この分子は化学的または静電気的力を介して表面によって配向されており、基本波光線（ω）による照射が第二高調波（2ω）の発生へと導く、ランダムに配向しているバルク中の分子はSH光を生み出さない。通常、分子のSH研究は、共鳴的に強められる過程で検出される大きな超分子分極率（β）をもつ種を含む。しかし、例えばシリカの帯電界面における水は、界面で直接的に配向された単分子の水層と帯電表面の静電場により分極する水分子による長距離の寄与との両方により、SH光を生み出すことが示された（Ongら,1992、Zhaoら,1993）。
【００１０】
以下によって本発明の理論的背景が、説明可能になっているが、限定されない。帯電界面の水によるSH光の生成は、次の等式によって説明し得る、
【数１】
2004530105.tif 000002
ここに、ISHはSH強度、EはSH光の電場、χ(2)とχ(3)は二次と三次の非線形感受率、Φは表面ポテンシャル、そしてAとBは表面の固有な性質に依存する定数である（Ongら,1992）。事実上、発生する全SH光は、単分子表面の寄与（χ(2)部分）と帯電表面の電場による水分子の分極による寄与（χ(3)部分）との二つに帰する。電解質に接している帯電表面の電気的ポテンシャル、及びそのバルクへの減衰値は、Gouy-Chapmanモデルに従い、
【数２】
2004530105.tif 000003
σ 表面電荷密度（μC/cm2）、C バルク電解質濃度、z 電解質の電荷、Φ0表面ポテンシャル、Φ 表面から距離xでのポテンシャル、及びκ 25°でのデバイ長の下で上記となる（BardとFaulkner,1980）。先行技術で示したように、帯電タンパク質が帯電表面に吸着すると、表面ポテンシャル（Φ0）は帯電タンパク質によって変調され、これはその結果、表面によって配向された水の量に従って第二高調波信号に影響する。この効果は高い感度、実時間で測定でき、ラングミュア吸着等温線、反応速度、及びタンパク質の表面密度を測定できる。
【００１１】
帯電界面近くで分極している水に加えて、溶媒や標識物質分子または粒子を分極し得る。標識物質は超分極率を有し、界面付近のそれらの分極や配向が表面帯電変化に従い変調され得る。それらは媒質中の溶解または浮遊状態であることができ、それらはプローブ対ターゲット反応に感知できるほど関与し得ない。標識物質の使用は、もしそれらの超分極率および分極応答が水や他の溶媒分子のそれより高ければ、測定の非線形応答を高め得る。表面ポテンシャルとその対応する電場(E*)、そして次の平均双極子モーメントの式、
【数３】
2004530105.tif 000004
μ 水(1.85/D)、溶媒や標識物質の基底双極子モーメント、及びkT 温度(K)倍のボルツマン定数から、表面により配向した水分子、溶媒や標識物質の数を計算できる。この数は、L=μmean/μ、ここにLはランジュバン関数、である。例えば、100mVという典型的な表面ポテンシャル及び106V/cmのオーダーの界面付近の電場を仮定すると、表面分極化を経た体積内の1016以下程度の水分子が配向している（約10%）と計算できる。配向した水分子によって発生する第二高調波の強度は、それらの数について二次であり、超分極率に比例する。本技法の信号雑音比とその感度とを考慮すると、可能な最も高い非線形光学的信号を生成することが有利である。
【００１２】
本発明は、生体的ターゲット−プローブ反応（プローブは表面結合され、細胞、リポソーム、ビーズ、等々の場合と同様に表面を構成する）に関する。プローブの表面（又は表面結合プローブ）とターゲット間の結合反応は、表面電荷密度またはポテンシャルを変調する。SSNLO技術は、これら相互作用を表面電荷密度またはポテンシャルが界面付近の水分子、溶媒分子や標識物質に及ぼす効果を介して測定するのに使用できる。タンパク質、ウィルス及び核酸と云った多くの生体要素は、正味電荷をもち、界面で相補的なプローブ要素に結合すると表面ポテンシャが変化する（式2を通じて）。この表面ポテンシャルの変化は、その結果界面付近の水分子、溶媒分子や標識物質の分極や配向そしてこの界面が生成する第二高調波信号（式１を通じて）を変化させる。通常、標識物質分子、部分や粒子は、画像化される表面を含む溶液或いは水相或いはターゲット要素を含む相中に溶解或いは浮遊させることができる（そして明確な変化やターゲット−プローブ反応に関与しないはずである）。
【００１３】
要約すると、プローブ−ターゲット反応（結合反応のような）やこれらの反応の効果は、界面の電荷密度やポテンシャルの変化を引き起こす。水や溶媒分子、或いは標識物質の非線形光学的な応答を測定し、非線形光の性質の変化（例えば、第二高調波光線の強度や波長の変化）をプローブ−ターゲット結合反応の量や割合、又はこれら反応の効果と相関させることができる。反応は、プローブ対ターゲット反応やこのプローブ対ターゲット反応により引き起こされる第二、第三等々の反応を変調（例えば、結合度や反応速度を増減）する一以上の要素（例えば、分子、薬、粒子等々）の存在下に行うことができる。この非線形光学光の性質とプローブ対ターゲット反応の量や割合、或いはそれらの効果との相関は、表面ポテンシャルを測定された非線形光学的性質に関係させるとして知られた任意の数学的関係式または複数関係式を使うことによっても為され得る。これら関係式の例として、Langmuir或いは修正Langmuir式、Gouy-Chapman式、Stern-Volmer式、修正Gouy-Chapman式、Stern式等々がある。
【００１４】
プローブは、或る方式で固体表面または基板に固定化され或いは表面（細胞表面やリポソームのような）中に埋め込まれた生体的要素（細胞、核酸、核酸類似体、タンパク質等々）であり、或いは細胞やリポソームがそうであるように表面を構成し、或いはサンプル細胞中に自由に浮遊した細胞、リポソーム、ビーズ、粒子等々である。全ての場合で、一の表面とその他との界面が、非線形表面選択性の光の発生のための必要条件である。ターゲットは、化学反応でプローブに結合し得る自由に移動する生体的要素である。表面の電荷密度、従ってポテンシャルは、界面付近で分極化される水の量を決定する一方、例えば、分極した水分子の数は、界面により発生する非線形光の量（例えば、第二高調波強度）を決定する。帯電したターゲット、プローブ又はターゲットとプローブの両方が帯電或いは双極子の場合に、プローブ対ターゲット結合反応が、界面付近の水や標識物質の分極や配向従って非線形放射の強度、周波数等々を変調し得る。更に、表面電荷やポテンシャル（細胞表面、例として）の変化を引き起こすどんなプローブ対ターゲット結合反応も、表面ポテンシャルが水分子や標識物質に及ぼす間接的効果を通じてSSNLO技術により検出し得る。これの例として、表面上の帯電していない（又は部分的に帯電した）プローブに結合する帯電ターゲット、帯電プローブに結合する帯電ターゲット、帯電プローブに結合する双極子ターゲット、帯電していないプローブに結合する双極子ターゲット等々がある。電荷を帯びた表面は、非線形光学的性質、分極や配向が表面電荷に敏感である標識物質を使って画像化し得る。
【００１５】
本発明は、単一表面やマイクロアレイ表面のいずれの場合も研究されている表面或いは高効率の研究に有用な数々の利点を提供する。第二高調波発生を用いるような非線形光学的表面選択性に基づいた検出を用いる装置は、非線形光の発生が界面で起こるのみなので、極小に組み立てられた光学系を必要とし、そうして原則的に極めて高い深度識別と速い走査性を可能ならしめる。プローブ−ターゲット相互作用、或いはその効果は、本発明によって次の測定可能な情報に関係付けられ得る、例えば、
1) 非線形或いは基本波光の強度。
2) 非線形或いは基本波光の波長やスペクトル。
3) 表面或いは基板上の基本波光の入射位置（例えば、画像化のため）。
4) 1)、2)又は3)の時間的推移。
5) 1)、2)及び3)の一以上の組み合わせ。
【００１６】
例えば、プローブ−ターゲット結合は、非線形光学的光（例えば、第二高調波光）の強度を表面結合プローブをもつ基板上の或る位置で検出することにより測定することができ、ターゲットが表面でプローブに結合して標識分子、水や溶媒分子の分極や配向の変化を誘導する時、第二高調波の強度が変化する。界面でのプローブ−ターゲット結合複合体の濃度に応ずる光の強度のモデル化は、様々な方法を使って、例えば、所定のプローブ−ターゲット相互作用を求める技法を放射性ラベルや蛍光タグを使って較正することにより、遂行できる。
【００１７】
本発明の利点は、次のように列挙される。
【００１８】
1) バルク種の存在下、実時間での相互作用種の検出。この性質は、結合過程を検出する（例えば、もし平衡や実時間の速度論的データが、例えばターゲット濃度変化を通じて必要なら）のにバルク種の存在が不可避、或いは非結合材料を除去する洗浄ステップが時間を食い過ぎ、不完全又は人工的な結果与える場合に、取り分け有用であり得る。
【００１９】
2) SSNLOが非中心対称な表面でのみ発生することから、蛍光ベース検出より高い対雑音信号（より低いバックグラウンド）を示す。SSLNO技法は従って、非常に狭い“場の深さ”を有する。蛍光ベース検出スキームの蛍光源は、視野にあり焦面にはない材料からのもの、自己蛍光と、偶発的な励起光による発光蛍光の汚染とを含む、一方これらは、バックグラウンド非線形光学的放射の源とならない。
【００２０】
3) この技法は、液体溶液の存在が測定に必要な場合、つまり、結合過程が洗浄ステップにより除去され又は乱されるような場合に有用である。この発明の側面は、バルク種の存在や或る時間期間に亘ってなされる測定による速度論的測定を要求するような平衡測定（自由エネルギー、結合定数等々）に有用であり得る。
【００２１】
4) SSNLO技法の非線形効果を招く散乱過程は、蛍光ラベルでの場合のように速く標識物質の不可逆な脱色へとは至らない一方、二光子吸収断面積は一光子断面積より遥に低く、非線形技法は散乱を含むが吸収を含まない。
【００２２】
5) 極小に組み立てられた光学系を必要とし、基本波と非線形光線（つまり、第二高調波）とが界面に対して明確な入出方向を有するので、高い信号雑音比が期待される。これは、蛍光が等方的に発せられ、対象平面（例えば、プローブを含む界面）外の多量の自己蛍光バックグラウンドが生じうる蛍光ベース検出に比べて、有利である。
【００２３】
6) 蛍光ベース検出と異なり、ラベルが必要でない。
【００２４】
7) その表面がサポート媒質、溶液等々との界面を形成するビーズ、細胞やその他の粒子での使用が容易。
【００２５】
本発明の使用例
本発明は分析に関する多くの科学分野、取り分け化学的かつ生物学的技術で使われるであろうが、本発明は、特に非常に高効率な検出の速さ及び容易性が決定的に重要であるゲノミクスまたはプロテオミクスで有用であり得る。それは、例えば、DNAハイブリダイゼーションやタンパク質対タンパク質の検出といった、バルク種の存在下に表面の種を検出するのに有利であり、非結合分子の洗浄ステップを必要としない。更に、蛍光ベース検出と云った多くの技法では、界面或いは界面近くにない（つまり、バルク中）サンプルの大きな部分が、測定に望ましくない寄与をする或いは干渉する可能性がある。従って、界面にのみ敏感である第二高調波や和周波数発生と云った表面選択性の技法を使用することが有利となる。
【００２６】
SSNLO技法は、タンパク質、細胞や他の分子をある表面上のアレイ形式（固体表面上のサンプルの二次元順序付け）で調べるのに使われる場合に、先行技術の上を行く他の重要な利点をもつ。技法が散乱（反射様）過程によっているので、非線形光線は明確な方向をもつ。蛍光ベース検出では、発光が等光的であり且つ視野の厚みの無い深さからの発光のみを目的としており、組み立てられる光学系が複雑で高価となる場合もある。しかし、非線形光学的技法を使えば、技法は本来的に表面選択的であり、“場の深さ”は、技法の性格によって界面付近の極めて薄い層に制限される。更に、表面からの散乱光が明確な方向をもち、検出器側でのその位置がアレイ表面上の場所に直接的に位置付けできる。
【００２７】
マイクロアレイのスキャニング技術には、共焦点ベースのスキームと非共焦点ベースのスキームがある。米国特許5834758号（Trulsonら、この関連部分を参照により組み入れる）は、蛍光検出を用いてマイクロアレイを画像化するための非共焦点ベースのスキームを記載している。しかしながら、サンプルは、良好な平面外識別を目的として唯一の焦平面内で専ら画像化するように非常に平坦に並べなくてはいけない。従って、特殊な部品を要する非常に精密に調節可能な移動ステージをこの目的のために使用しなければならず、器械の費用がかかり、更に運転時間もかさむ。この種の装置の画像品質は、機械的振動に敏感になる傾向がある。更に、平面外（非表面結合）蛍光団の識別は、技法の感受性を制限する。米国特許6134002号（Stimsonら、この関連部分を参照により組み入れる）は、サンプル表面つまりマイクロアレイを画像化する共焦点走査顕微鏡の一例である。共焦点ベースの技法は良好な深度識別を有するが、走査速度がデスキャニングの必要から低くく光処理能も低くなりがちで、総合的な信号雑音比および技法の感受性を低減させる。
【００２８】
核酸ハイブリダイゼーション（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、RNA等々）での使用に対しては、標的オリゴヌクレオチドを全表面と反応させることができ、配列相補的ハイブリダイゼーションが起こるアレイ中のプローブオリゴヌクレオチド配列（既知の位置に対応している）で、基本波光が非線形光学的信号或いはそのような信号のバックグラウンドの変化を生み出す。これは検出でき、アレイ要素従ってオリゴヌクレオチド配列と関係づけることができる。
【００２９】
例えば、核酸マイクロアレイの二つの主要な応用は、1)配列の同定（遺伝子または遺伝子突然変異）、例えばDNA変異を観察する、と2)遺伝子の表現レベル（冗長性）の決定とである。アレイ調製には多くの形式がある。例えば、ある場合にはcDNA（長さ500から5000塩基対）を、ガラスと云った固体表面にロボットスポッティングを使って固定化し、ターゲット一式に別々に又は混合して曝すことができる（EkinsとChu参照）。他の形式は、オリゴヌクレオチド（20から25merオリゴ）やペプチド核酸のin-situプローブ（固体基板上、Fodorら）を、或いは従来合成続いてオンチップ固定化によって、合成することを伴う。そしてこのアレイは、ターゲットDNAに曝され、ハイブリダイズされ、相補配列の同定や冗長性が決定される。多くのタンパク質アレイを調製でき（例えば、MacBeathとSchreiber、2000を見られたし）、所定のターゲットが表面上の固定化プローブタンパク質に結合するや否かを決定する。これらのアレイは、プローブタンパク質に結合する小分子を調べるのに使われた。マイクロアレイ技術の多くの概説と応用が、先行技術内で入手できる。例えば、Ramsay（1998、この関連部分を参照により組み入れる）、Marshall（1998、この関連部分を参照により組み入れる）、Fodor（1997、この関連部分を参照により組み入れる）、Duggan ら（1999、この関連部分を参照により組み入れる）、Schenaら（1995、この関連部分を参照により組み入れる）、Brownら（1999、この関連部分を参照により組み入れる）、McAllisterら(1997)、そしてBlanchardら（1996、この関連部分を参照により組み入れる）である。
【００３０】
本発明は、他の生体要素間の結合過程を調べるのに使い得る、ウィルス付きの細胞、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-リガンド、細胞-リガンド、タンパク質-薬、核酸-薬、細胞-小分子、細胞-核酸、ペプチド-細胞、オリゴやポリヌクレオチド、ウィルス-細胞、タンパク質-小分子等々。リン脂質支持二重層と云った生体模倣膜（例えば、卵ホスファチジルコリン）も使うことができ、これは研究がプローブとして膜タンパク質を伴う場合に取り分け有用である。
【００３１】
タンパク質アレイは、与えられた標的タンパク質が表面上の固定化プローブタンパク質に結合するや否やを決定するのに使うことができる一方、これらアレイは、プローブタンパク質に結合する小分子を研究するのにも使われた。タンパク質アレイは、例えばMacBeathとSchreiber(2000)の方法によって調製でき、所与ターゲットが表面上の固定化プローブタンパク質に結合するや否やを決定する。
【００３２】
その上に配列が形成される支持体は、生体的でも、非生体的、有機的、無機的或いはこれらの組み合わせの何れでもよい広範囲の材料からなり、粒子、鎖、沈殿、ゲル、シート、管、球、容器、キャピラリ、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド等々として存在してよい。基板は、任意の便利な形、例えば、ディスク、四角、球、円等の形でよい。基板は、好ましくは平坦であるが、様々な代わりの表面形状を呈してよい。例えば基板は、サンプルが設置された凸或いは凹領域を含んでいてもよい。基板及びその表面は、その上にサンプルが設置され得る堅い土台をなすのが好ましい。基板及びその表面は又、適当な光吸収特性を与えるようにも選ばれる。例えば、基板は重合ラングミュア・ブロジェット膜、機能ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、変性シリコン、或いは様々なゲルやポリマー、例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はそれらの組み合わせの何れか一、でもよい。他の基板材料は、この開示の再吟味によって当業者に容易に明らかになるであろう。
【００３３】
実施形態によれば、基板表面は所望の表面特徴を用意するよく知られた技法を使ってエッチングされる。例えば、溝形成により、V字の溝、メサ構造等、これら構築領域が、照射光の焦点内により密に配置されることができよう。この表面は、それから収集される放射の最大化のために、反射的“ミラー”構造を有してもよい。
【００３４】
プローブの素性（例えば、タンパク質構造やオリゴヌクレオチド配列）は、固体表面を横断してサイトからサイトへと異なることができ、或いは同一プローブが一様に表面を覆ってもよい。ターゲットは、単一素性でも、異なる素性をもつターゲットの組み合わせでもよい。
【００３５】
個々の分子や粒子が非線形活性標識物質としての使用の候補かどうかは、大気-水界面での第二高調波発生を使って調べることによる。例えば、粒子の場合、粒子が粒子の正味配向を（コヒーレンス長の長さスケールで）与えるように大気-水界面に集まるならば、粒子の層は、第二高調波光を発生するだろう。これを行う他の手段は、粒子の懸濁サンプルを測定し超レイリー散乱を検出することによる。更なる他の手段は、EFISH（電場誘導第二高調波発生）の使用を含む。EFISHは、候補分子や粒子が非線形活性かどうかを決定するのに使うことができる。電場誘導第二高調波(EFISH)は、非線形光学の分野でよく知られている。これは、三次の非線形光学的効果であり、P(2)(ω3)=χ(2)(-ω3;ω1,ω2):Eω1Eω2として示される分極源をもつ。この効果は、溶液中の分子の超分極率を、媒質中にアラインメントを誘導する直流場を使用してSHGが観測されるようにすることにより、測定するのに使うことができる。この型の測定は、界面での粒子自体を規則正しく配置する必要がないが、粒子が非線形活性従って非中心対称であることを要す。
【００３６】
本発明は、候補の薬が、そのプローブ−ターゲット結合への効果、つまりプローブ−ターゲット結合を抑制するか又は増進するかを検査される、薬スクリーニングや高効率スクリーニングのために使用することができる。他の場合では、例えば、生体細胞の表面上で受容体や他の分子に結合するその能力により、薬の効能を検査され得る。
【００３７】
アレイでの本技法使用の他の例には、細胞のアレイ、膜又は取付タンパク質付き若しくは無し脂質二重層アレイ等々がある。生体分子（例えば、核酸、タンパク質及び細胞）をアレイ形式で固体支持体に結合する多くの方法が従来技術に存在する。広い柔軟度が、アレイを創り出す手段を提供する際に行使されてよい。それらは例えば、直接的に基板や表面に、化学的に誘導された基板に、ある種の中間層（例えば、自己組織化単層膜、ヒドロゲルや他の当技術分野で知られた生体適合性層）に結合する共有または非共有結合を含む。プローブの素性（例えば、タンパク質構造やオリゴヌクレオチド配列）は、固体表面を横断してサイトからサイトへと異なることができ、或いは同一プローブが一様に表面を覆ってもよい。ターゲットは、単一素性でも、異なる素性をもつターゲットの組み合わせでもよい。アレイは多様な方法で調製でき、これに限られないが、インクジェット印刷、フォトリソグラフィ、微細密着印刷、或いはこれを製造する当業者に知られた他のやり方がある。
【００３８】
結合過程を非線形光学的技法の表面選択性により実時間そしてバルク生体的成分の存在下で測定できるので、平衡結合曲線と反応速度とを測定でき、要素のバルク濃度が変えられ、蛍光ベースの検出で使われるような自由な要素を除去する“洗浄”ステップが不要でよい。
【００３９】
発明の他の側面においては、標識物質を、第二高調波（又は和・差周波数）顕微鏡又は共焦点顕微鏡検査と云った技法を含んだ、細胞、膜及び組織の研究の画像化のために使用し得る。標識物質は、よく知られた技法、例えば、内視鏡や他の染料による蛍光ベースの画像化のための先行技術で使われるよく知られた技法により、生体内の画像化したい場所へ導入することができる。しかし、標識物質を要せずともよく、生体内の組織等の直接画像化を、表面選択性非線形光学的技法とその自然のままの環境中にある組織や細胞（例えば、プラズマ中、他の組織と接触状態、血液中等々）により創り出される自然の界面とを使って、達成し得る。生体内の組織の画像化は、同じやり方により、標識物質が有っても無くても達成され得る。
【００４０】
本発明は、細胞膜中のイオンチャンネルタンパク質又は受容体を含む細胞（例えば、発現したイオンチャンネルタンパク質をもつ卵母細胞）で使うこともできる。細胞は、ある媒質、例えばバッファー媒質中に浮遊している場合がある。標識物質も、その媒質中に浮遊させ得る。基本波光線で懸濁液（透過モードでの）を照射すると、細胞と媒質の界面での非線形光学的信号の発生が導かれる。イオンチャンネルは、リガンド関門タイプであり得る。バックグラウンド非線形光学的信号が時刻t0で測定されて、リガンドが懸濁に加えられ、これがイオンチャンネル状態又はその性質を変調（例えば、イオンチャンネルを開く或いは閉じる、チャンネルのイオン透過性を増大或いは減少させる等々）し、その結果これが、細胞表面の電気的ポテンシャルの変化従って水分子、溶媒分子や標識物質により表面付近で発生する非線形光学的放射の性質（例えば、強度）の変化へと導く。受容体に結合するリガンドは、リガンド濃度の関数として発生した非線形光学的放射の強度を追跡することにより定量的に測定することができ、更にその効果を、リガンド-受容体結合相互作用をブロック或いは変化させうる薬候補の存在下に、観察することができ、結合過程を実時間で測定し、イオンチャンネルの開閉を動的に決定することもできる。一般に、任意の要素を媒質中に加え、本文書中に記載の非線形光学的方法を使って、そのリガンド-受容体結合相互作用への効果を調べることができる。
【００４１】
広い柔軟度が、これに限られないが、基本波光源、基本波及び非線形光線を制御、フォーカス、走査や指向するのに必要な光学列等を含む装置の設計、アレイ、検出システムの設計、そして回折格子又はフィルタと集光光学系の使用、に予期される。発生（照射）や集光の様式は変更することができ、例えば、一過性波（全内部反射）の使用、平面導波路、反射または透過の幾何学的構成、光ファイバー、近接場照明、共焦点技法やマイクロキャビティや積分検出システムの使用がある。固体表面上のマイクロアレイをスキャンするための数々の先行技術の方法が説明されている。例としては、Trulsonら(1998、この関連部分を参照により組み入れる)、Trulsonら(2000)、Sternら(1997、この関連部分を参照により組み入れる)そしてSampas(2000、この関連部分を参照により組み入れる)がある。
【００４２】
第二高調波光線は表面平面に対して定まった角度を成すので、非線形光学的放射の性質（例えば、二次元のアレイ形式における基本波入射位置の関数として）を、検出器やサンプルを機械的に移動する必要無くまた高価な集光光学系を要せず読み出せる。“光線走査”の実施形態においては、サンプル表面や検出器の機械的移動を要せず、サンプル上の基本波の方向及び又は角度の変化（固定したサンプルと検出器に対する）のみ要して、装置は、遥に速い走査能、製造と長い運転時間に関する改善された容易性を提供し得る。
【００４３】
界面は、シリカ、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック、金属、半導体や絶縁体表面、や生体的要素を吸着または取り付け得る任意の表面より成ることができる。界面は、生体細胞及びリポソーム表面をも含み得る。付着や固定化は、当技術分野でよく知られた様々な技法により行われ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、“Microarry Biochip Technology”,M.Schena(編),Eaton Publishing,1998、この関連部分を参照により組み入れる、に記載されている技法により調製できる。そしてタンパク質での例として、生体分子の表面上のアミンに結合するアルデヒドシランにより表面を誘導体化できる（MacbeathとSchreiber,2000、この関連部分を参照により組み入れる）。BSA-NHS（BSA-N-ヒドロキシコハク酸イミド）表面は、最初にBSAの分子層を表面に付着させそしてN,N’-ジコハク酸イミジルカーボネートでそれを活性化することによって使用できる。BSA上の活性化リシン、アスパラギン酸やグルタミン酸残基は、タンパク質上の表面アミンと反応する。
【００４４】
支持されたリン脂質二重層も、膜タンパク質又は他の膜関連成分付き或いは無しで使うことができる。これらの成分は、例えばSalafsky,“Biochemistry”,1996、この関連部分を参照により組み入れる、“Biomembranes”,Gennis,Springer-Verlag,Kalbら,1992及びBrianら,1984に記載されている。支持されたリン脂質二重層は当技術分野でよく知られており、それらの製作に利用できる、結合した膜タンパク質付き或いは無しの、多数の技法がある。これら支持された二重層は通例、それらが空気に曝されるようになった時にその破壊を防ぐために、水性溶液に漬けなければならない。
【００４５】
もし固体表面が使用（例えば、平面基板、ビーズ等々）されるなら、それは、プローブ-ターゲット相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション過程）の検出を最適化するためにその正味表面電荷密度を減少或いは増大させる様々な化学反応を通して誘導することもできる。
【００４６】
結合過程は、小分子、薬、遮断剤又は結合過程を変調する他の要素の存在下に行うことができる。
【００４７】
表面アレイは、当技術分野に見られる多くの方法に従って作製できる。DNAマイクロアレイに対しては、大抵は三つの標準ではないアプローチの中の一つで調整される(Case-Green,1998)、即ちAffymetrix,Inc.は、プローブアレイをパターン化された光先導組合せ化学的合成を使って調製する(Fodor,1997)、スポッティドアレイは、Duggan(1999)、Schena(1995)、Brown及びBotstein(1999)そしてMcAllister(1997)に従って作製できる。インクジェット技法も、適当な基板上で連続した溶液に基づいた反応を通じて塩基ごとにヌクレオチドを合成するのに使うことができる（Blanchard,1996、この関連部分を参照により組み入れる）。
【００４８】
例えば、核酸、オリゴや普通のヌクレオチドのアレイは、米国特許6110426号、5143854号、6110426号、この関連部分を参照により組み入れる、米国特許5143854号、この関連部分を参照により組み入れる、又はFodor(1991)に従って造ることができる。可溶性のタンパク質アレイは、Ekins(1999)、この関連部分を参照により組み入れる、に従って造ることができる。膜タンパク質アレイは、流動性の脂質膜のマイクロパターニングにより、例えばGrovesら（1997、この関連部分を参照により組み入れる）に従って造ることができる。アレイ基板は、ガラス、シリコン、インジウム錫酸化物、や当技術分野で知られた任意の基板から成るとしてよい。検査に供される表面アレイは成分間の物理的バリアを含んでよく、その結果、成分（及びそれらの生体分子）は、化学反応ステップの間ずっと互いから孤立したままでいることができる。アレイ区画は、異なるプローブ、全領域同一プローブ、又はこれらの組合せで構成することができる。アレイは、光線の全内部的反射及び非線形光の一過性な発生を考慮して、プリズムの下側に造ることもできる。或いは、アレイ基板がプリズムに接するようにすることができ、結果は同じである。
【００４９】
例えば、フローチャンネルやマイクロキャピラリを使って一の或いは複数の区画に試薬や生体要素を供給するために、電気泳動システムを表面アレイと共同して使うこともできる。例えばサンプルは、各員が他と区別され各員がターゲット-プローブ反応の生起を可能ならしめるマイクロキャピラリチャンネルのアレイを含むことができ、そして画像化技法は、アレイ成分、各一のマイクロキャピラリチャンネルやこのチャンネルが注入及び排出を行う反応チャンバから構成することができる。
【００５０】
標識物質を使い得るサンプルの例には、これに限られないが、タンパク質、オリゴヌクレオチドや細胞を有する固体表面と支持されたリン脂質二重層とがある。表面の幾何的形状は種々様々であってよく、実際球形ビーズ及び他の非平面の幾何的形状が、非線形光学的技法と共に一般的に使用し得る。
【００５１】
基本波及び非線形光線の偏光は、偏光光学系要素で選択できる。非線形光線の強度を基本波及び非線形分極の関数として分析することにより、ターゲット-プローブ複合体に関するより多くの情報（例えば、高い対雑音信号）が得られる。更に、基本波や非線形光学的放射の偏光を選択し分析することにより、バックグラウンド放射を低減できる。
【００５２】
検出を多重内部的反射板を使用して遂行することができ（N.J.Harrick、この関連部分を参照により組み入れる）、基本波光線がアレイ表面と多重接触する結果、発生非線形光の強度を増大させることを可能ならしめる。他の代替案は、アレイの一表面と非線形光の出力カップリングを可能にする一端の喪失的カプラとを有する光キャビティであって、共鳴下において非常に高い強度の蓄積を可能にする結果、発生した非線形光の量を増加する光マイクロキャビティを作り出す光キャビティを構成することである。
【００５３】
基板に結合した細胞は、タンパク質-細胞結合、ウィルス-細胞結合等々を決定するのに使うことができ、そこでは、細胞がプローブ成分、そしてタンパク質、ウィルス等々がターゲット成分である。次節では、細胞を固体基板に連結するためのよく知られた先行技術について検討する。
【００５４】
表面選択性非線形光学法の使用を含まない種々の技術が、本発明にとっての関連部分を含み、次の代表的なリストとそれらに含まれるその参照を本文書で参照する。スキャン動作とスキャンの解析については、Kingら、米国特許5633724号。スキャニングに適したレーザーアレイを製造するためのレーザーの多重化については、Forkら、米国特許6121983号。取り付けプローブのアレイを含む基板とプローブとターゲット間の結合反応の速度及び平衡論的性質の決定のためのスキャンの解析とについては、Foster、米国特許5485277号、Fodorら、米国特許5324633号、及びFodorら、米国特許6124102号。基板のレーザースキャニングについては、Kainら、米国特許5847400号。パワー増大のための光共鳴キャビティについては、Kingら、米国特許 5432610号。光ファイバーに基づく装置については、Waltら、米国特許5320814号、Waltら、米国特許5250264号、Waltら、米国特許5298741号、Waltら、米国特許5252494号、Waltら、米国特許6023540号、Waltら、米国特許5814524号、Waltら、米国特許5244813号。画像化と画像のソフトウェアベースの解析については、Fiekowskyら、米国特許6095555号。データ取得については、Sternら、米国特許5631734号。共焦点画像化技法については、Stimsonら、米国特許6134002号。CCDベースの画像化技法については、Sampas、米国特許6084991号。表面に付けるプロ−ブの光リソグラフィによる調整については、Sternら、米国特許5631734号。表面上の取り付けプローブを創造するための方法と装置については、Shalonら、米国特許6110426号。位置ベースのスキャニング技法については、Slettnes、米国特許6040586号。表面上のプローブ-ターゲット結合の画像化の方法については、Trulsonら、米国特許6025601号。
【００５５】
細胞のマイクロアレイ
この節は、表面上の生体細胞アレイを作製することに関するいくつかの方法を略述する。アレイの一類型は本発明を使った研究に馴染むものである。他の応用のために細胞が一様に微細パターン化されたアレイを作るための多くの方法が、例えば光化学的レジスト光リソグラフィを使って説明されている。（MrksichとWhitesides、Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.25,55-78,1996、この関連部分を参照により組み入れる）。このフォトレジスト方法によれば、ガラス板がフォトレジストで一様にコートされ、フォトマスクが所望の“アレイ”やパターンを定めるためにフォトレジスト被膜の上に配置される。露光後、マスクされていない領域のフォトレジストは除去される。光リソグラフィ的に定められた表面全体は、露出したガラス領域とフォトレジストで覆われた領域との両方に結合するオルガノシランと云った疎水性の物質で一様にコートされる。そして、フォトレジストがガラス表面から取り除かれ、露出したガラスのスポットのアレイを露出する。そしてガラス板は、末端にあるアミノ基と云った親水性の基または化学的に反応可能な基をもつオルガノシランで洗われる。疎水性のオルガノシランは露出したガラスのスポットと結合する結果、ガラス板は、親水性表面を横断する（元のフォトレジストの領域に位置する）親水性の又は反応可能なスポットを持つに至る。親水性基のスポットのアレイは、非特異的かつ非共有結合的な或る細胞であって、ニューロン起源の細胞を含む細胞のための基質を提供する（Klienfeldら、J.Neurosci.8,4098-4120,1988、この関連部分を参照により組み入れる）。反応性イオンエッチングはシリコンウェハの表面上で、二つの異なるタイプのテクスチャーでパターンされた表面を作出するために同様に使われてきた（Craigheadら、Appl.Phys.Lett.37,653,1980、この関連部分を参照により組み入れる、Craigheadら、J.Vac.Sci.Technol.20,316,1982、この関連部分を参照により組み入れる、Suhら、Proc.SPIE382,199,1983、この関連部分を参照により組み入れる）。
【００５６】
特異的であるが非共有結合的な相互作用に基づく他の方法では、フォトレジストスタンピングが、タンパク質吸着性アルカンチオールで被覆された金表面を生成するために使われる（Singhviら、Science264,696-698,1994、この関連部分を参照により組み入れる）。そして、裸の金表面はタンパク質吸着を阻むポリエチレン末端のアルカンチオールで被覆される。細胞外マトリックスに見られる細胞結合性のタンパク質である全表面のラミニンへの暴露後、生肝細胞が、ラミニン被覆の島に一様に付着し、その上で成長する（Singhviら、1994）。
【００５７】
強いが非共有結合の金属キレートを含む同化が、金表面を特定タンパク質のパターンで被覆するのに使われてきた（Sigalら、Anal.Chem.68,490-497,1996、この関連部分を参照により組み入れる）。この場合、金表面はニトリロ酢酸を末端とするアルカンチオールでパターン化される。金の裸領域は、タンパク質の吸着を低減するためにトリ（エチレングリコール）で被覆される。Ni2+の添加後、五つのヒスチジンでタグされたタンパク質の特異的吸着が、反応速度論的に安定であることが見出される。
【００５８】
より特異的で一様な細胞結合反応が、パターンされた基板上のサイトに特異的なタンパク質と云った化学的に架橋している分子によって達成され得る。（AlpinとHughes、Analyt.Biochem.113,144-148,1981、この関連部分を参照により組み入れる）。基板の光学的パターニングの他の同化は、反応可能スポットのアレイを創造する。ガラス板は、ガラスを被覆するためにガラスに化学収着するオルガノシランで洗われる。オルガノシラン被覆は、アレイのパターンを定める光マスク後、ディープUV光により照射される。この照射が、Si--C結合を切断し反応性Siラジカルを形成する。水との反応は、Siラジカルに極性シラノール基を形成させる。極性シラノール基は、米国特許5324591号、この関連部分を参照により組み入れる、に開示されているように、アレイ上のスポットを構成し、他の反応可能な分子をスポットに結合させるために更に修飾される。例えば、遊離アミノ部分と云った生体官能基を含むシランは、シラノール基と反応し得る。そして、自由アミノ基は、タンパク質、核酸、炭水化物、及び脂質と云った生体分子のための共有結合部位として使われ得る。表面上の自己組織化単層膜を使った哺乳類細胞の表面への接着をパターン化する他の方法として、Lopezら、1993と、Stenger1ら、1992、がある。これらの関連部分を参照により組み入れる。
【００５９】
細胞表面と相互作用するとして知られるレクチンの、ガラス基板への反応性アミノ基を介した非パターン化された、共有結合性の取り付けが明示されている（AlpinとHughes、1981）。この支持体上の細胞の一様なアレイを形成する光学的方法は、フォトレジスト方法より少ないステップで済みそしてより速い（即ち、二つのステップのみ）が、それは、高価な光源からの高強度の紫外光の使用を要する。
【００６０】
生体的に特異的な分子が微小パターンの化学的アレイに一様に結合するので、これら全ての方法において、得られる細胞のアレイは一様である。フォトレジスト方法では、細胞が、親水性スポット及び又はスポットに取り付けた特異的分子のアレイに結合する、結果これが細胞に結合する。従って、細胞はアレイ中の全てのスポットに同様に結合する。光学的方法では、細胞は自由アミノ基のスポットのアレイに接着により結合する。様々の細胞タイプを、これら細胞に対して同時に結合させるために、同一基板に取り付ける方法も存在する。
【００６１】
ペプチド核酸
他の実施形態では、ペプチド核酸やオリゴマー、これらは核酸の類似体であり、例えば、ペプチド様主鎖骨格が無帯電主鎖骨格で置き換えられている、が本発明と共に使用できる。種々PNAが、当技術分野でよく知られている。以下の参照は、種々PNAが表面に取り付けられ配列相補的な種々DNAやRNAと結合することを許す表面及びアレイベースのハイブリダイゼーションを含む、広い範囲の応用におけるこれら核酸類似体の使用の広範な概説を提供する。
【００６２】
例えば、PNAのオリゴマーは、DNAオリゴマーの代わりに表面取り付けプローブ成分として使える。種々PNAの使用に対する重要な利点は、種々DNAやRNA（帯電リン酸基を含む）とのハイブリダイゼーション反応が、例えば、通常のDNA-DNA等々のハイブリダイゼーションに見られるような電荷による斥力が非常に少ないため、イオン強度に弱くしか依存しないことである。従って、任意の所望イオン強度で、帯電表面により配向された水分子、溶媒や標識物質の分極応答を極大化する手段となる表面選択性非線形光学法をプローブ-ターゲットのハイブリダイゼーションを追跡するのに使用できる。例えば、もしPNAプローブが表面に取り付けられDNAターゲットと反応し得るなら、ハイブリダイゼーションは、表面上の負電荷の正味増加をもたらし、これにより界面によって分極化される水分子の量を変化させ、その結果、非線形光（例えば、第二高調波光）を発生しうる。
【００６３】
強いイオン強度依存性を持たないことの利点の一側面は、低イオン強度を使えることである。従ってシステムのデバイの長さを増大し、水分子や標識物質が分極する表面からの距離を増大する。これは、PNAの配向の水の分極への寄与を低減する。つまり、もしPNAの表面上の配向がランダムなら、表面付近の分極応答は零に近くなるが、配向効果が表面から遠い所で減少するので表面からずっと遠い水分子が分極化され得る。
【００６４】
種々PNAは商業的に入手可能(Applied Biosystems,Foster City,CA)であり又、他のDNA類似体は合成でき使うことができる。
【００６５】
以下の参照文献は、PNA使用の大まかな概観である。
【００６６】
Nielsenら、"Peptide nucleic acids (PNA): Oligonucleotide analogues with a polyamide backbone" Antisense Research and Applications (1992) 363-372
Nielsenら、"Peptide nucleic acids (PNAs): Potential Antisense and Anti-gene Agents."Anti- Cancer Drug Design 8 (1993) 53-63
Buchardtら、"Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology"TIBTECH 11 (1993) 384-386
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Nobleら、"Impact on Biophysical Parameters on the Biological Assessment of Peptide Nucleic Acids, Antisense Inhibitors of Gene Expression"Drug. Develop. Res. 34 (1995) 184-195
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Falkiewicz, B."Peptide nucleic acids and their structural modifications"Acta Biochim. Pol. 46 (1999) 509-529。
【００６７】
次の参照文献は、アレイに基づく検出におけるPNAsの使用の記述であり、PNAプローブを固体表面に取り付ける手段を含んでいる。
【００６８】
Hoffmann, R.ら、"Low scale multiple array synthesis and DNA hybridization of peptide nucleic acids"Pept. Proc. Am. Pept. Symp., 第15回 (1999) 233-234
Matysiak, S., Hauser, N. C., Wurtz, S. 及び Hoheisel, J. D."Improved solid supports and spacer/linker systems for the synthesis of spatially addressable PNA-libraries"Nucleosides Nucleotides 18 (1999) 1289-1291。
【００６９】
定義
本明細書中で使われる次の用語は、概略次の定義をもつことを意味する。
【００７０】
1. 相補的：リガンド分子及びその受容体をもつような二つの生体要素間で相互作用する表面のトポロジカル及び化学的な適合性のことを云う（当技術分野で時に‘分子認識’としても引用される）。従って、受容体とそのリガンドは、相補的である記述でき、そして更に、接触表面は互いに相補的であると記述できる。
【００７１】
2. 生体（成分）：この用語は、生物学に見出される任意の天然に存在する又は修飾された粒子や分子、又はプローブやターゲットと云った生物学研究に使われる分子や粒子である。これらの例として、これに限られないが、生物細胞、タンパク質、核酸、抗体、受容体、ペプチド、小分子、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、リポソーム、ポリヌクレオチドそして薬、毒及び遺伝子工学的に作られたタンパク質やペプチドと云ったその他がある。
【００７２】
3. リガンド：リガンドは、特定の受容体によって認識される分子である。本発明と共に使用し得るリガンドの例は、これに限られないが、細胞膜受容体、毒及び毒液、ウィルスのエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬（例えば、アヘン剤、ステロイド等々）、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、及びモノクローナル抗体のためのアンタゴニストやアゴニストがある。
【００７３】
4. 受容体：所定のリガンドに対する化学的親和力をもつ分子。受容体は、天然または人工の分子であり得る。また、それらは不変の状態で又は他の生体的成分をもつ集合体として使用され得る。受容体は、結合相手に共有結合や非共有結合的に、直接的にも或いは特定の結合物質を介しても結び付き得る。本発明により利用可能な受容体の例は、これに限られないが、抗体、細胞膜受容体、モノクローナル抗体及び特異的な抗原決定基（例えば、ウィルス、細胞や他の材料上の）と反応する抗血清、薬、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポリサッカリド、細胞、細胞膜及びオルガネラがある。受容体は、当技術分野で時折りアンチリガンドとして引用される。レセプターズという用語が本文書で使われる時は、意味の差は意図されていない。“リガンド受容体対”は、二の高分子が分子認識を通じて結合して複合体を形成した場合に形成される。
【００７４】
本発明により研究され得る受容体の他の例としては、これに限られないが、
a)微生物受容体：微生物の生存に不可欠である特異的な輸送タンパク質や酵素と云った受容体に結合するリガンドの決定は、抗体の新しい類の開発に有用である。日和見の真菌、原生動物、及び抗生物質耐性のバクテリアに対する抗生物質は、非常に重要であろう。
【００７５】
b)酵素：例えば、受容体の一類型は、神経伝達物質の分解を担当する酵素というような酵素の結合サイトである。異なる神経伝達物質に分解する酵素の作用を調節する所定の受容体に結合するリガンドの決定は、神経伝達の不調の処置に使い得る薬の開発に有用である。
【００７６】
c)抗体：例えば、本発明は、対象とする抗原のエピト−プに結び付く抗体分子上のリガンド結合サイトを調べるのに有用である。抗原のエピト−プに良く似た配列を決定することは、その免疫源が一以上のそのような配列に基づくようなワクチンの開発に通じ、自己免疫疾患に対する治療的処置（例えば、“自己”抗体の結合を阻害することによる）に有用な同類の診断薬や化合物の開発に通じ得る。
【００７７】
d)核酸：核酸の配列は、DNAやRNAの結合配列を立証するために合成される場合がある。
【００７８】
e)触媒性ポリペプチド：ポリマー、好ましくはポリペプチドであり、一以上の反応物の一以上の生成物への変換を含む化学反応を促進する能力があるもの。このようなポリペプチドは一般に、少なくとも一の反応物または反応中間物に特異的な結合サイトと結合サイト近くの活性な官能価とを含む。この官能価は結合した反応物を化学的に修飾する能力がある。触媒性ポリペプチドは、例えば、米国特許5215899号、これをあらゆる目的のために参照により組み入れる、に記載されている。
【００７９】
f)ホルモン受容体：ホルモン受容体の例は、例えば、インシュリンと成長ホルモンの受容体がある。受容体に高親和力をもって結合するリガンドの決定は、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を和らげるために実行しなければならない日常的な注射の経口代替物、他の場合には、死体から或いは組換えDNA技術によってしか得られない乏しいヒト成長ホルモンに代わる代替物、の開発に有用である。他の例は、血管収縮ホルモン受容体であり、受容体に結合するそれらのリガンドの決定は、血圧を制御するための薬の開発に通じ得る。
【００８０】
g)アヘン剤受容体：脳中のアヘン剤受容体に結合するリガンドの決定は、モルヒネ及び同類薬に代わる中毒性の少ない代替物の開発に有用である。
【００８１】
h)イオンチャンネルタンパク質または受容体、またはイオンチャンネル受容体を含む細胞。
【００８２】
5. 表面選択性：この用語は、第二高調波や和／差周波数発生と云った非線形光学技術を指して云い、対象性によって非中心対照的な表面（アレイ、基板、溶液、生体的要素、等々からなる）のみが、非線形光を発生する能力がある。
【００８３】
6. アレイ：基板や固体支持体を指して云い、その上でアレイは、一又は複数の既知の位置にある一のタイプ又は複数タイプの生体的成分で作製されている。これには、これに限られないが、二次元マイクロアレイ及び他のパターンされたサンプルが含まれる。‘アレイ’の代わりに互換的に用いられる当技術分野での他の用語としては、遺伝子チップ、遺伝子アレイ、バイオチップ、DNAチップ、タンパク質チップ及びマイクロアレイがあり、最後の用語は、その大きさがミクロンのオーダーであるアレイ要素（取り付けられたプローブをもつパターンされた区画）をもつアレイである。
【００８４】
7. ラベル：非線形活性な部分、粒子や分子で、分子、粒子や相（例えば、脂質二重層）に（共有結合または非共有結合で）取り付けられ得る者を指して云い、後者をより非線形光学的に活性にすること目的としている。ラベルは、分子や粒子に予め取り付けられ、且つ測定前は、ラベルされる実体とは別個の未結合或いは未反応のラベルである。
【００８５】
8. リンカー：二つ異なる対象を一つに化学的にリンク（通常、共有結合を通じて）する役を果たす分子。本文書中ではリンカーは、ターゲットと非線形活性粒子や部分、ターゲットと非線形活性誘導粒子、表面層とターゲット、表面層と非線形活性粒子や部分等での連結に使い得る。リンカーは例えば、同種二官能価または異種二官能価の架橋分子、ビオチンが二つの対象の中の一つに結び付けられストレプトアビジンが他方に結び付けられるビオチン-ストレプアビジン対、等々であり得る。多くのリンカーは例えば、Pierce Chemical Inc.、Sigma-Aldrich、Fluka等から商業的に入手可能である。技術によっては、用語‘テザー’、‘スペイサー’或いは‘クロスリンカー’も同じ意味で使われる。
【００８６】
9. エレメント：‘アレイ’や‘マイクロアレイ’と共に使われる場合、その意味する処は、アレイ表面上の複数の位置の中の一の特定位置である。各エレメントは、固体支持体や基板の表面上に形成された有限面積の分離している区画である。
【００８７】
10.非線形：本文書中では入射光線（基本波と呼ばれる）の周波数を変換する能力がある光学技術を指して云う。非線形光線は、そのような変換から生じたより高次周波数の光線、例えば、第二高調波等である。第二高調波又は和周波数や差周波数発生において、非線形光線はコヒーレントに発生する。第二高調波発生(SHG)において、基本波光線の２つの光子が、界面により実質上散乱されて第二高調波の１つの光子を生成する。本文書中では、非線形光学的または表面選択性非線形（光学的）としても、或いは様々なそれらの組合せによっても引用される。
【００８８】
11.プローブ：本文書中では、表面（例えば、固体基板、細胞表面、リポソームン表面等）に取り付けられる、又は、細胞、リポソーム、粒子、ビーズや、例えばサンプル細胞中の媒質中に自由に浮遊している表面よりなる他の成分、である生体的要素（例えば、細胞、タンパク質、ウィルス、リガンド、小分子、薬、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、cDNA等）のことを云う。（当技術分野の文献によっては、この用語はこのプローブに対する結合を検査される自由な要素のことを云う）。
【００８９】
12.ターゲット：本文書中では、プローブの表面または表面に未結合でプローブに結合し得る生体成分のことを云う。
【００９０】
13.取り付けられる（取り付ける）：本文書中では、例えば、例えば固体表面、細胞表面、リポソーム表面、ゲル基体等へのリンカー分子の使用を含む、共有結合または非共有結合の手段を通じて、表面に取り付けられるように調製或いは生体外で加工された生体成分のことをいう。或いは、プローブが、細胞膜、組織、器官（生体外或いは生体内）中に埋め込まれている自然のままの膜受容体という例のような場合に、表面に‘取り付けられる’という用法である。本文書中の幾つかの場合では、‘取り付けられる’や‘取り付ける’という用語は、リンカーやスペイサーのターゲットへの化学的或いは物理的な取り付けのことをも云う。本文書中では‘表面取り付け’としても引用される。
【００９１】
14.中心対称的：分子や物質の様相は、その点で全ての原子の反転(x,y,z)→(-x,-y,-z)を行っても分子や物質が不変である空間内の点（中心または反転中心）が存在する場合、中心対称的である。非中心対称的な分子や物質は、この反転の中心を欠く。例えば、もし分子が一様な組成で形状が球或いは立方体であれば、それは中心対称的である。中心対称的な分子や物質は、第二高調波、和周波数および差周波数の発生に必要な非線形感受率や超分極率を持たない。
【００９２】
15.核酸類似体：何らかの方法で天然の核酸として機能する非天然の核酸。例えば、ペプチド核酸(PNA)は、天然の核酸のリン酸主鎖骨格ではなくペプチド様主鎖骨格をもつので、非天然の核酸である。このPNAは、塩基対相互作用を介して天然核酸にハイブリダイズできる。核酸類似体の他の例としては、何らかの方法で塩基対が非天然であるものがあり得る。
【００９３】
16.標識物質：非線形活性な分子や粒子（超分極率をもつ）で、表面又は界面の近くでその非線形光学的な性質又は配向が、表面の電荷密度やポテンシャルが変調されるに従い変調されるものを云う。本発明の一の観点としては、界面の電荷やポテンシャルが、ターゲットと表面上に固定化されたプローブとの結合によって変調される。他の観点では、細胞の表面電気ポテンシャルが、イオンチャンネルの性質の変化、例えば、ターゲット（リガンド）結合に応ずる開口、閉鎖、イオン透過性の増減、によって変化する。本発明の他の相では、標識物質は画像化目途、例えば細胞や組織の画像化、のためのマーカーとして働く。標識物質は、はっきりとは変化せず、或いは、ターゲット-プローブ反応自体には関与しない。標識物質は、ターゲット成分を含む液体、媒質、溶液や水性相中に溶解または浮遊しているとしてよい。ここに定義されたような標識物質は、小胞や細胞の脂質二重層の中へはトランスロケーションしない。標識物質は、表面電荷密度やポテンシャルの変化に応答するように移動の自由度を持っていなければならない。水や溶媒中の溶解或いは浮遊標識物質の存在下に、ガラス-溶媒やガラス-水界面の非線形光学的な応答を測定することは、候補分子や標識物質が標識物質として機能するかどうかを試す一手段となるであろう。ガラスは正味負電荷を帯びるので、もしこの分子の存在下に界面により発生した非線形光学的な放射の強度が、それ無しのバックグラウンドより大きければ、この分子は標識物質として機能するとしてよいであろう。候補分子の標識物質としての能力を試す他の方法は、半導体-液体界面により発生した非線形光学的な放射の強度を、半導体と液体のバルクとの間に印加された電圧の関数として測定することによる。更なる他の手段は、標識物質候補の溶液または懸濁液からの超レイリー散乱(HRS)を測定することであり、もしHRSが発生し候補自体が帯電する或いは双極子であるなら、それは標識物質として十分に働くとしてよい。
【００９４】
17.結合親和力または親和力：プローブとターゲットと云った結合パートナー間の特異的な物理化学的相互作用であり、それらの間の結合複合体（親和）に導くもの。結合反応は、パートナー間結合のエネルギー強度の尺度である平衡定数によって特徴づけられる。結合反応における特異性は、プローブ-ターゲット結合が、ランダムでなく特定の結合パートナーという条件でのみはっきりと判る程に起こるということを意味する。例えば、タンパク質免疫グロブリンG(IgG)は、タンパク質Gに対する且つ他のタンパク質に対してはより少ない又は全く無い特異的な結合親和力をもつ。技術によっては、用語‘分子認識’が要素間の結合親和力を表現するのに使われる。
【００９５】
18.電気的に帯電した又は電荷：本文書中では粒子や分子上の正味電荷として定義され、電場中の該粒子や分子の移動（速度）を与えるものである。この正味電荷は、分子の部分、例えば、核酸主鎖骨格上のリン酸基、タンパク質中のアミノ酸残基の側鎖、膜脂質や細胞膜中の脂質ヘッド基等の一部である。電荷は、正または負であり得、そして該粒子や分子が所定の向き（正または負の電気的ポテンシャルの方向）をもつ電場中に置かれると、この粒子や分子の移動方向を決定するだろう。電荷は、電荷の基本単位（q〜1.6×10-19C）の非整数倍、或いは電荷の基本単位の分数であることができ、当業者に良く知られている所謂‘部分電荷’である。
【００９６】
19.双極性：粒子や分子上に電気双極子或いは‘双極子モーメント’をもっていることとして定義され、これは当業者に知られた標準的定義が採用される。全てのベクトルμ=Q・Rの和である。ここにQは粒子や分子中の個々の空間的位置（デカルト座標中のx,y,z）の電荷（正または負）の量、Rは座標系(x,y,z)の原点から正味電荷Qへ指しているベクトルである。もし、これらベクトルの和が、非零トレース（この結果ベクトルのx,y,z成分の和）をもつベクトルに結果するなら、粒子や分子は双極子モーメントをもち電気的に双極性である。
【００９７】
20.電気的に中性：本文書中では粒子や分子上の零である正味（正と負の和）電荷として定義され、電場中での該粒子や分子のはっきりとした移動（速度）を結果しないだろう。
【００９８】
21.超分極率または非線形感受率：非線形光の発生を許容した分子、粒子、界面や相の性質。第二高調波発生に対する非線形相互作用を記述する典型的な等式は、α(2)(2ω)=β:E(ω)E(ω)又はP(2)(2ω)=χ(2):E(ω)E(ω)である。ここにαとPはそれぞれ周波数2ωで振動している誘起分子双極子と巨視的双極子であり、βとχ(2)はそれぞれ超分極率テンソルと第二高調波（非線形）感受率テンソルであり、E(ω)は周波数ωで振動している入射放射の電場成分である。巨視的非線形感受率χ(2)は、微視的なβ超分極率の方向的な平均に関係する。和や差周波数発生に対しては、駆動電場（基本波）は異なる周波数（つまり、ω1とω2）で振動し、そして非線形放射は和または差周波数（ω1±ω2）で振動する。超分極率、二次非線形分極率および非線形感受率という用語は、最後の用語は一般には物質や化学的相や界面の巨視的な非線形活性のことを意味するが、時々互換的に使われる。また、本文書中に使われる用語‘非線形活性’や‘非線形的に活性’は、１又は複数の入射放射ビームによる駆動時に非線形光学的な放射を発生する分子、粒子、界面や相の能力という漠然とした性質のことを云う
22.分極率：空間領域中の単位体積（又は面積）当たりの正味双極子。分極率は、時間に依存することも一定のこともある。分極率は∫μ(R)dR と定義される。ここに、正味双極子の積分は界面付近の全ての空間体積要素dRに亙って為される。
【００９９】
23.放射：本文書中では、非線形光学的な効果を発生するために使用される基本波光線や、基本波によって発生した非線形光学的な光線と云った、電磁放射或いは光のことを云う。本文書中では、‘波’や‘非線形信号’や‘信号’、‘光線’や‘光’とも呼ばれる。
【０１００】
24.近接場技術：先行技術で回折限界距離以下の横方向の分解能で表面や基板上の光学的放射を測定や画像化することができるとして知られた技術。近接場技術（又は近接場画像化）の例としては、NSOM（近接場走査光学顕微鏡）があり、光学的放射（蛍光、第二高調波発生、等々から）が表面に大変近い点で集められる。
【０１０１】
25.検出すること、検出：本文書で非線形光学的な方法に言及している場合には、表面選択性の非線形光学的な放射の性質を使うことができ、その結果、プローブ-ターゲット相互作用の性質や相互作用の効果を非線形光学的な光の性質（例えば、強度、波長、偏光や電磁放射に共通の他の性質）で検出、測定或いはと関係させることができる技法のことに言及している。
【０１０２】
26.界面：本発明の目的に対しては、界面は、非線形光学的な信号を発生する領域または、その中に正味配向をもつ非線形活性でラベルされたターゲットが存在する表面付近の領域として定義できる。界面は更に、二の表面からなる、異なる媒質に接している（例えば、水性溶液に接しているガラス表面、バッファに接している細胞表面）一の表面である、異なる物理的または化学的性質の二の媒質間の接触付近の領域等でありうる。
【０１０３】
27.コンジュゲートした、対になった：本文書中では、一方の粒子、部分や分子が他方の粒子部分、分子、表面や基板に、化学結合した、共有結合や非共有結合的に繋がった、又はある手段によって取り付けられた状態のことを云う。これらの取り付け手段は、静電気力、共有結合、非共有結合的な結合、物理吸着、化学吸着、水素結合、ファンデルワールス力、又はプローブを結合エネルギーを有して基板に維持する他の任意の力によることができる（この定義の一帰結は、基板によって捉えられているプローブを基板から引き離すのに力が必要であるということである）。
【０１０４】
28.反応：本文書中では、これに限られないが、次のもの：プローブ、ターゲット、インヒビター、小分子、薬、アンタゴニスト、抗体等を含む化学的、物理的または生物学的な反応のことを云う。用語‘反応の効果’や‘該反応の効果’は、本文書中ではプローブ-ターゲット反応の物理的或いは化学的な効果のことを云う。例えば、プローブ-ターゲット反応は、結果としてイオンチャンネルの開口と細胞の表面電荷密度の変化とを導くリガンド-受容体結合反応を含む。この細胞の表面電荷密度の変化が非線形光学的技法によって検出される。プローブ-ターゲット反応の効果またはプローブ-ターゲット反応自体は、技術によっては‘第二メッセンジャー’反応と呼ばれるかもしれない。場合によっては、‘反応’と‘相互作用’は互換的に用いられる。
【０１０５】
29.表面層：本文書中では固体支持体の表面を機能的に誘導体化する化学的な層のことを云う。例えば、表面の化学基は、誘導体化剤の特異的な化学的官能性に従って、誘導体化層に変化し得る。例えば、その表面上に負に帯電したシラノール基をもつシリカビーズは、オルガノシラン試薬によって、アミン反応性、アミン含有性等々の表面に変換され得る。
【０１０６】
30.届ける、イルミネーション、集光：光学的放射（例えば、光線）を操作するという文脈において、届ける及びイルミネーションは本文書中では基本波光線の界面または界面の対処魚領域への誘導のことを云い、集光は界面で生成した非線形光（例えば、第二高調波光）の光学的集光のことを云う。
【０１０７】
31.インヒビター、忌避する：本文書中では、ターゲットと競合してプローブに結合する部分、分子、化合物や粒子として定義され、インヒビター化合物、分子や粒子の存在下では、プローブ-ターゲット相互作用が減少または抑止される。本文書中では遮断剤は、プローブ-ターゲット相互作用（例えば、プローブとターゲット間結合反応）を抑止する化合物、分子、部分や粒子のことを云う。
【０１０８】
32.アゴニスト：本文書中では、それらが受容体に結合した場合に細胞内応答を活性化する部分、分子、化合物や粒子として定義される。
【０１０９】
33.アンタゴニスト：本文書中では、細胞表面上のアゴニストと同じサイトの受容体に競合的に結合するが、受容体の活性様式（例えば、アゴニストが結合することによって作動される）によって開始される細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストや部分アゴニストの細胞内応答を忌避し得る部分、分子、化合物や粒子として定義される。アンタゴニストは、アゴニストや部分アゴニスト不存在下の基礎細胞内応答を低減しない。
【０１１０】
34.部分アゴニスト：本文書中では、それらが細胞表面上の受容体に結合すると、アドニストが為すより少ない程度や範囲で細胞内応答を活性化する部分、分子、化合物や粒子として定義される。
【０１１１】
35.相互作用：本文書中ではサンプル中の成分間のある物理的や化学的な反応や相互作用として定義される。例えば、相互作用は、プローブとターゲット間の物理化学的な結合反応、二分子間の双極子-双極子牽引または反発作用、２つの原子または分子種間のファンデルワールス相互作用、化学親和相互作用、分子間の共有結合、分子間の非共有結合、静電相互作用（反発的または牽引的）、水素結合その他であり得る。本文書中では‘反応’とも呼ばれる。
【０１１２】
36.効果：本文書中では測定可能なプローブ-ターゲット相互作用の測定可能な性質や相互作用の結果（例えば、二次反応、イオンチャンネル開口や閉鎖等）として定義される。これらは、次の性質を含む。例えば、
1) 非線形または基本波光の強度。
2) 非線形または基本波光の波長やスペクトル。
3) 表面または基板上の基本波光の入射位置（例えば、画像化のため）。
4) 1)、2)又は3)の時間的推移。
5) 1)、2)及び3)の一以上の組み合わせ。
【０１１３】
37.時間的推移：本文書中では光強度や光の波長と云った測定可能な実験の時間変化のことを云う。例えば、ある種のプローブ-ターゲット相互作用やプローブ-ターゲット-他の要素相互作用についての‘反応速度論’とも呼ばれる。
【０１１４】
38.明確な：‘明確な方向’という文脈では、本文書中では基板からの光（基本波や非線形光線）の決定論的な散乱のことを云う。対照的に、例えば、蛍光発光は幾分ランダムな方向に放たれる。
【０１１５】
39.サンプル：本発明により調査中のプローブ、ターゲットや他の分子、粒子や部分を含む。サンプルは、非線形光学的な光を発生可能な少なくとも一の界面を含み、該界面は取り付けられたプローブを含む少なくとも一の表面よりなる。サンプルの要素の例としては、プリズム、ウェル、マイクロ流体光学、基板、ターゲットをもつバッファ、バッファ中の薬、取り付けられたプローブをもつ表面がある。用語‘基板’と‘表面’は、本文書中ではしばしば互換的に用いられる。場合によっては、用語‘支持体’が‘表面’を意味すると解釈される。
【０１１６】
40.モジュレータ、変調する：この用語は本文書中では、プローブ-ターゲット相互作用（例えば、結合反応）の反応速度論または平衡の性質に影響する任意の物質、部分、分子、生体成分や化合物のことを云う。モジュレータは、プローブ-ターゲット結合の速度、プローブ-ターゲット結合の平衡定数を変化させ、又は、プローブ-ターゲット相互作用を増強または低減する。モジュレータの例は、次の通り：インヒビター、薬、小分子、アゴニスト及びアンタゴニスト。
【０１１７】
標識物質
次の節は、標識物質をより詳細に記載している。
【０１１８】
オキサゾ−ル染料4-[(5-メトキシフェニル)-2-オキサゾリル]ピリジニウムメタンスルホネート（4PyMPO-MeMsとしても知られる）は、強く第二高調波活性で中性pHで化学的に安定である（SalafskyとEisenthal、Chemical Physics Letters）。更に、二光子吸収の結果である蛍光のストークスシフトが大きく、第二高調波光線を蛍光から容易に分離し得る。この族の他の染料は同様の性質をもつ(J.H.Hall,1992)。EFISH（電場誘導第二高調波発生）は、例えば、候補分子や粒子が非線形的に活性かどうかを決定するのに使える。電場誘導第二高調波(EFISH)は非線形光学の分野でよく知られている。これは、三次の非線形光学的効果であり、P(2)(ω3)=χ(2)(-ω3;ω1,ω2):Eω1Eω2と書かれる分極源をもつ。この効果は、溶液中の分子の超分極率を、媒質中にアラインメントを誘導する直流場を使用してSHGが観測されるようにすることにより、測定するのに使うことができる。これはしばしば再配向機構と呼ばれる。これらと他の分子、又は分子の集合体は、本発明中の標識物質として使用し得る：
5-(4-メトキシフェニル)-2-(4-メトキシフェニル)-2-(4-ピリジル)オキサゾール
2-(4-メトキシフェニル)-5-(4-ピリジル)オキサゾール
2-(4-メトキシフェニル)-5-(4-ピリジル)オキサジゾール
2-(4-メトキシフェニル)-5-(4-ピリジル)フラン
2-(4-ピリジル)-4,5-ジヒドロナフトール[1,2-d]-1,3-オキサゾ−ル
5-アリール-2-(4-ピリジル)-4-R-オキサゾ−ル、ここにRは、水素原子、メチル基、エチル基または他のアルキル基。
【０１１９】
2-(4-ピリジル)シクロアルカノ[d]オキサゾール
2-(4-ピリジル)フェナントレノ[9,10-d]-1,3-オキサゾール
6-メトキシ-4,4-ジメチル-2-(4-ピリジル)インデノ[2,1-d]オキサゾール
4,5-ジヒドロ-7-メトキシ-2-(4-ピリジル)ナフトール[1,2-d]-1,3-オキサゾール
他の分子や次の族の分子が標識物質として使用できる、例えば：
メロシアニン、スチルベン、インドジカルボシアニン、へミシアニン、スチルバジウム、アゾ染料、シアニン、ストリリルベースの染料、メチレンブルー、ジアミノベンゼン化合物、ポリエン、ジアゾスチルベン、トリシアノビニルアニリン、トリシアノビニルアゾ、メラニン、フェノチアジンスチルバゾール、ポリイミド、スルホニル置換アゾベンゼン、インダンジオン-1,3-ピリジニウムベタイン、フルオレセイン、ベンゾオキサゾール、ペリレン、ポリメタクリレート、オキソノール
誘導された粒子標識物質
大きさのスケールがナノメータ位からミクロン位である固体ミクロ粒子やナノ粒子、例えばこれに限られないが、球（ラテックス、ポリスチレン、シリカ等々）やストリップは、化学的または静電的手段を通じて非線形活性な部分をもつように誘導できる表面領域を提供し結果、全対象が別のやり方で得られるものよりずっと高い超分極率をもつ。例えば、非線形活性な染料をシリカ表面上に静電相互作用（染料は正に帯電し、シリカ表面は負に帯電する）を介して召還できる結果、全体ビーズは、もしターゲット反応性リンカーをもつように誘導されていれば、標識物質として働き得る。非線形活性な部分を固体表面上に並列して、部分間の位相衝突が小さいならば、全体的な超分極率はそれらの数に対して非線形的に（例えば、二次的に）増大する傾向を示す。その固体粒子は、整った形状とすることができ、その大きさは、スケールがナノメータからμmの範囲とすることができる。使用される粒子の例としては、これに限られないが、ポリスチレンビーズ及びシリカビーズがあり、両方とも商業的に容易に入手できる。
【０１２０】
a.共有結合性取り付け
固体粒子は、先行技術で利用できる様々な化学作用を使って表面誘導化できる。非線形活性部分は、固体粒子にも誘導層にも共有結合で結合できる。
【０１２１】
例えば、ポリスチレンビーズは、デキストラン、ラクトースやアミン（例えば最後の場合、エチレンジアミンをもつクロロメチル基を通じて）で誘導できる。シリカは、オルガノ官能性シランを使って、例えばトリクロロシランや他の官能性シラン（例えばメトキシ、アミンや他の官能基）を使って誘導でき、様々な化学的官能性をもつ表面を生み出せる。そして誘導ビーズの表面は、非線形活性な部分と適当な化学作用を通じて反応でき、標識物質を生み出せる。
【０１２２】
b.静電的取り付け
非線形活性部分は又、ミクロンまたはナノメータサイズの粒子表面に静電的に結合でき、大きな超分極率をもつ標識物質を生み出せる。帯電した非線形活性な部分、例えば有機染料は、逆に帯電した微小粒子表面で配向でき、こうして適当な幾何形状を使った場合に対象の正味超分極率を可能ならしめる。適当な幾何形状の例は、直径が基本波光の波長程度、つまり10ナノメータ位からミクロン位である微小粒子球であり、その結果、球の対向する面上の非線形活性な部分間の打ち消しあうような位相衝突が極小化される。球表面の各染料の超分極率は、光の波長程度の大きさの球の全表面に亘ってまとめると、大きくて正である。例えば、シリカビーズ（〜200nm、凡そ球形）は、低濃度の3-アミノプロピルトリメトキシシランや3-アミノオクチルトリメトキシシランと反応する結果、ほんの〜5-10%の表面シラノールがシラン剤と共有結合的に結合する。そしてこれらのアミノ基は、アミン反応性の同種二官能価架橋剤であるジコハク酸イミジルグルタル酸エステル(DSG,Pierce Chemical)と反応し、〜5-10%のビーズ表面上にアミン反応性のリンカーを作ることとなる。そしてこのビーズは、4-[(5-メトキシフェニル)-2-オキサゾリル]ピリジニウムメタンスルホネート（4PyMPO-MeMsとしても知られる）と共にインキュベートされる。4PyMPO-MeMsは表面上の帯電シラノールに静電的に結合し、ある方向に配向する正に帯電した染料である。過剰の染料は、遠心分離によってビーズから取り除かれる。静電的吸着は、場合によっては、そのバルク濃度が不足していても、帯電染料を固定化するのに十分に高いものであり得る。
【０１２３】
誘導された非中心対称のナノ結晶、ナノ粒子、クラスター及びコロイド
先行技術は、サイズが1nmから25以上ミクロンまでの範囲の金属ナノ粒子及びクラスターが、電子顕微鏡、X線散乱及び他の応用のための染色用途のために、誘導され生体分子にコンジュゲートされ得ることを示している。この技術は又、金属ナノ粒子が極めて高い超分極率を呈し得ること示す(3,5,9)。従って、本発明の他の側面は、非中心対称的な金属ナノ結晶やナノ粒子を標識物質として使用することである。様々な形およびサイズの金属や半導体のナノ粒子が、先行技術で入手可能である。これらの金属粒子を採用した多くの実施形態が、本文書中に記載されている。
【０１２４】
リンカー及び金属や半導体の粒子の、非常に様々な幾何形状での、様々な組合せが、標識物質を生み出すのに使用できる。粒子は、中心対称的、非中心対称的の両方とも可能である。もし中心対称的なら、それらは、全体的に非中心対称的である複合粒子を作製するために、クラスター中に合併されねばならないか又は、非線形光学的な技法に使用される基本波光の波長の略10%より大きいか等しくなければならない。
【０１２５】
他の実施形態では、金属や半導体の粒子（中心対称的または非中心対称的の何れも）は、SHG活性な粒子（例えばオキサゾール、ストリリル染料や他の分子や粒子）に結合される。これらの共鳴的に強化する粒子は、先行技術によく知られており、すぐ近くの非線形活性な部分から散乱された非線形光の強度を強く増大させる。例えば、金ナノ粒子は、スチリル染料のSH活性を強く高めるのに使用されてきた[14]。これらの共鳴的に強化する粒子はそれ自身では非線形光を発生していないので、それらは中心対称的或いは非中心対称的であることができる。それらは、双極子-双極子相互作用を通じて起こる共鳴的強化効果を生み出すに足る程十分にSH活性な部分に近くなければならない。この効果が起こる二種間の距離は典型的にはナノメータに比してオングストロームのオーダーである。非線形光学的への一般的な共鳴強化効果は、銀粗表面という状況でMcAllister(1977)とBlanchard(1996)に検討されている。共鳴的に強化する粒子は、オキサゾールと云ったSH活性な分子への結合に馴染む様々な表面の化学的性質と共に商業的に入手可能である（サクシミジルエステル、マレイミド等々、Molecules Probes,Eugen,ORより提供）。又は、粒子による非線形活性部分の複合体が、先行技術で利用できる数々のスキームに従って構成できる。
【０１２６】
他の実施形態では、リンキング分子で結び合わされた金属粒子の集団や鎖が標識物質として使用できる。例えば、Au粒子は、ジメルカプロアルキル鎖を伴う先行技術の化学反応で、粒子を化学的に連結するように誘導できる。
【０１２７】
本発明の全体的スキーム
本発明を使ってプローブ-ターゲット相互作用やそれらの効果を測定する全体的なスキームは次の通りである。
【０１２８】
1) 第二高調波光を受けうる光でサンプルを照らす。プローブかターゲットの何れか又は両方が無いこの状態では、第二高調波光の強度及び/又はスペクトル及び/又は強度かスペクトルの何れか又は両方の時間的推移はバックグラウンドや基底値に使える。
【０１２９】
2)プローブ、ターゲット、プローブ及びターゲット、薬等、又はプローブ-ターゲット相互作用やそれらの効果を変調し得る他の要素を加え（同時に或いは別個に）そして結果第二高調波光強度及び又はスペクトル（又は時間の関数として、即ち、時間的推移）を測定する。この測定情報は所望の相互作用の信号に使える。
【０１３０】
3) 測定情報の直接的、光学的読み出しを実行できるか、又は、測定情報は任意に、遮断剤、インヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト等々と共に又は無しで、プローブ-ターゲット相互作用の例えば反応速度論的又は平衡的の性質を決定するようにモデル化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３１】
本発明の最良の実施形態では、PNAオリゴヌクレオチドのマイクロアレイが、以下の取り扱い説明や参考に従って、ガラス又はシリカカバースリップ上に作製される。Hoffman,Rらの“低スケール多重アレイ合成とペプチド核酸のDNAハイブリダイゼーション”Pept.Proc.Am.Pept.Symp、第15回(1999)233-234の中の、又はMatysiak,S.,Hauser,N.C.,Wurtz,S.及びHoheisel,J.D.“改質された固体サポートと空間的にアドレス可能なPNAライブラリ合成のためのスペーサー・リンカーシステム”Nucleosides Nucleotides 18(1999)1289-1291。PNAオリゴヌクレオチドに接触するバッファーや溶液は、先行技術で知られているものの範囲から選ぶことが出来る。ターゲット成分（ターゲットオリゴヌクレオチドであり、PNAではない）を含むバッファ又は溶液は、標識分子を含む。本発明の最良の実施形態では、標識分子は4-[(5-メトキシフェニル)-2-オキサゾリル]ピリジニウムメタンスルホネート（4PyMPO-MeMsとしても知られる）であり、ターゲットを含む溶液中に溶解され、1mM濃度でハイブリダイゼーションが検査される（或いは、標識物質をハイブリダイゼーション反応が起こった後で加えることもできる）。ハイブリダイゼーション解明法は、先行技術に見られる。例えば、ウェブサイトcmgm.stanford.edu/pbrown/protocolsは、プローブ−ターゲットハイブリダイゼーションの詳しい取り扱い説明を提供している。これらは、「プローブ」オリゴヌクレオチドである。
【０１３２】
そしてターゲットオリゴヌクレオチドの混合物が、カバースリップを屈折率の合った流体やゲルでダブプリズムに結合しつつ、カバースリップに接触しているテフロンチャンバーの溶液中に加えられる。もしターゲットオリゴヌクレオチドが特定プローブ（特定既知の位置で塩基対配列をもつ）と相補的であれば、その位置でハイブリダイゼーション結合反応がプローブとターゲット配列間で起こる。このハイブリダイゼーション反応に対して、技術の詳細な手順が存在し、例えばウェブサイトcmgm.stanford.edu/pbrown/ protocolsは一例を載せている。非結合オリゴヌクレオチドはバルク溶液中に残留する。ハイブリダイゼーションがターゲットオリゴの負電荷リン酸基による表面の電荷とポテンシャルとの変化を招き、その結果、これが標識物質の分極と第二高調波信号との変化に至らしめる。この信号は、ラングミュア吸着曲線を使って量的にモデル化され、ソフトウェアとPCとを使ってハイブリダイズしたプローブ対ターゲット二重オリゴヌクレオチドの濃度を決定する。
【０１３３】
図1は、非線形光学装置を図説している。0.5W未満の平均パワーのサブ100fsパルスにより800nm、80MHzで運転するフェムト秒パルスレーザー5（スペクトラ・フィジックス株式会社）を基本波の光源として使用する[代わりに、10Wアルゴンイオンレーザー（コヒーレント株式会社）を使って、Tiサファイア振動子（レクセル株式会社）をポンプし、フェムト秒或いはピコ秒パルスの光を生成してもよい]。基本波の偏光は、半波長板10（Melles Griot,16MLB751）を使って任意に選択され、基本波を透過するが第二高調波放射をブロックするように設計されたカラーフィルタ20（CVI株式会社、LP780）上へとレンズ15でフォーカスされ得る。そして基本波は、ミラー25により反射され、特定位置に特定角度で以ってサンプル30上に当たる。基板表面の光線直径は、約100ミクロンである。ミラー25は、検流計制御のミラースキャナ、回転する多角形ミラースキャナ、ブラッグ回折器、音響・光学偏向器、又は他のミラー位置制御を可能ならしめる従来技術に知られた手段を使ってスキャンされる。例えば、サンプル表面上の基本波光の入射角及び方向が、圧電ミラー台を使った精密調節可能なミラー台及び多角形ミラー（17ASM001 Melles Griot及びMirror02 MLQ 011/003, Melles Griot）の使用と、ミラー台をステッパー駆動モータ（17PCS001及び17PCC001 Melles Griot）及びPC制御の使用を通じて駆動することとによる既知のやり方で変えられる。検流計ミラーやその他のPC制御可能な光線偏向光学が使用できる。例えば、16ビットガルボポジショナは、General Scanning,Inc.とCambridge Researchから入手でき、これは閉ループのサーボ制御システムを使い精密な調節制御を達成する。
【０１３４】
シリカのサンプル30は、x-y移動ステージ35（スタックトリニアステージ、Newpot Corp. PM500-Lから成り、コンピュータ制御される）上に載置され、第二高調波光線の発生のために表面上の特定位置を選択する。サンプル表面30は、液体で取り囲まれ表面は液体に接する。基本波光は、第二高調波光のみ残すカラーフィルタ（Schott）を使って濾波される。
【０１３５】
第二高調波は、ミラー40（例えば、01MFG033/023,Melles-Griot Corp.）から反射され、基本波をブロックしながら第二高調波を通過させるパスフィルタ45を通って送られ、もし必要なら偏光光学系50によりその偏光を選択し、そしてレンズ11を使って光線を、それが画像化センサの部分に当たる冷却CCDアレイ検出器（S7015 浜松）13上へとフォーカスする。このセンサが当たった光の量に比例する電圧信号を生成する。モノクロメータを測定のために波長やスペクトル帯域を選択するのに使い得る。光線直径が往々にしてマイクロアレイ中の単一要素よりも大きいことから、光線中心のXY-位置はCCD中のセンサアレイ及び標準的な処理ソフトから決定される。アレイ表面上の空間的位置は特定のCCDアレイセンサ要素と関係付けることができ、従ってマイクロアレイ表面位置と非線形光強度との写像を決定できる。アレイ内の単一領域でも、時間期間に亘って走査領域をサンプルするように時間中領域間の後退・前進走査でも、実時間データを同じやり方で取得できる。このやり方では、強度値及びその時間依存性をマイクロアレイ中の任意の或いは全ての領域に対して獲得できる。固定化検出器と入射角及び方向とステージ位置とを与えれば、反射ミラーの位置を照射されるアレイ領域を決めるのに使うことができる。何故なら、非線形光線は表面に対して明確な方向をもつものだからである。移動ステージ、ミラースキャナ或いは両方を制御し、それらの位置をCCDアレイの要素（フォトダイオード）の測定信号に関係付けることが、米国特許6084991に開示されている。
【０１３６】
ステージを平行移動するか基本波光の入射位置を変えること、又はそれらの組み合わせによって、Labview(Labview,Inc.)や他の特注のソフトウェアと云った標準的ソフトウェアプログラムを使ってアレイ内の別個の領域または要素に第二高調波光の強度を付与しながら、アレイ表面全体からの第二高調波強度の画像が作り出される。第二高調波光の強度は、表面上のターゲットの量に比例し、従ってターゲットと表面取り付けプローブ間のハイブリダイゼーションに比例する。PNAプローブにハイブリダイズする標的オリゴ上のリン酸基の負電荷は、表面電荷密度をより負にし、その結果、界面付近の分極した標識物質の量を増やし、第二高調波放射強度の増大という結果を生ずる。ハイブリダイズしたターゲットの量と測定された第二高調波強度の間の関係は、プローブ付き（及びターゲット無しの）表面の既知の電荷密度とターゲットの電荷とで定量化される。
【０１３７】
代替的な実施形態
代替的な実施形態において、マイクロアレイは、プローブを含む界面での全内部反射を許す能力があるプリズムと接触し、当該プリズムに取り付けられ、又は、当該プリズム上に直接パターンされてもよい。従って、この様式では、基本波光線はプローブを含む界面で全内部反射を受け、その一過性光は非線形光を発生するのに使われるであろう。図2は、このタイプの実施形態を説明している。図2において、屈折率調和材や液体(75)は、プリズム(70)を、ターゲットを含んでいる溶液(85)と接触しているマイクロアレイを含んでいる基板(80)に連結するのに使われ、これによって材料 (80)と溶液(85)間の界面で全内部反射が起こる。プリズム材は、例えば、BK7タイプのガラス(Melles Griot)及び商業的にCorning Corp.やNye Corp.から手に入れた屈折率調和材でよい。
【０１３８】
代替的な実施形態において、その実験の調整はSalafskyとEisenthal,2000及び其処に記載されている参照文献に説明されている。フェムト秒パルスレーザー(Mail-Tai,Spectra Physics)は、1Wの平均パワーの200fsを超えるパルスをもつ80MHzで、800nmの基本波光の光源として使われる。レーザー光線は、凹レンズ(Oriel)（スポットサイズ〜1mm2）で、テフロンホルダ内に搭載され溶液（10mMリン酸バッファ、pH7）や蒸留水と接触しているダブプリズム(Melles Griot,BK-7)の入口開口部上に合わせられる。この光線は、プリズム内で全内部反射（一過性波発生）を受け、基本波と第二高調波光線とが凡そ共線的に出口開口部に現れる。カラーフィルタは、第二高調波をモノクロメータ（2nmバンド幅スリット）に送りながら基本波光をブロックするのに使われる。モノクロメータは、380-500nmをスキャンし第二高調波スペクトルを検出する。必要なら、更に基本波光波長を調節することができる。一光子計数検出器及び光電子増倍管は、モノクロメータの出力を検出するのに使われ、ソフトウェア搭載PCはデータ記録及びモノクロメータ波長制御に使われる。バックグラウンド第二高調波が測定される。
【０１３９】
代替的な実施形態において、平面導波構造110が固体基板のために使われる（図3）。この実施形態では、TiO2,Ti2O5と云った高屈折率の屈折材115（導波路）の薄層が、基板110（典型的にはガラス）の上に堆積される。薄い回折格子115はこの導波路に刻み付けられ、レーザーからの光100がこの格子を使って導波路の中へ結び付けられる。第二高調波光は、レンズ及びフィルタを使って集められPMT型装置かCCDカメラで検出され得る。
【０１４０】
図4a-4cは、プローブ-ターゲット反応を行うためのフローセルの実施形態を説明している。フローセル3220が詳細に示されている。図4aはキャビティの前面図、図4bはキャビティの断面図、そして図4cはキャビティの背面図である。図4aを参照してフローセル3220は、その上の表面4202にキャビティ3235を含む。キャビティの深さは、例えば約10と1500.mu.mとの間としてよいが、他の深さを用いてもよい。通例、キャビティの表面面積はプローブサンプルのサイズより大きく、約13×13mmとしてよい。入口ポート4220及び出口ポート4230はキャビティに連通する。実施形態によっては、これらポートが約300から400.mu.mの直径をもち、キャビティ内の温度制御のために、各々チューブ4221と4231で冷却された循環バスに連結されるとしてよい。冷却されているバスは、指定された温度の水をキャビティの中へそして通り抜けて循環させる。
【０１４１】
複数のスロット4208が、キャビティの周りにそれをフローセルボディの残りから熱的に孤立化させるために形成されてよい。フローセルの熱容量が低減するので、キャビティはより効率的で迅速に制御される。
【０１４２】
実施形態によっては、実質的に平坦な表面をもつパネル4205は、キャビティを２つのサブキャビティに分割する。パネル4205は、例えば、RG1000nm長パスフィルタと云った光吸収性ガラスであってよい。RG1000ガラスの可視スペクトルに亘る高い吸光度（RG1000の表面放射率は、700nmを下回るどんな波長も検出不可能である）は、入射波長によって励起されるであろうバックグラウンドの如何なる発行も実質的に抑制する。光を吸収するガラスの磨かれた平坦な表面は、入射光の散乱をも低減し、入射波長の迷光をフィルタリングするという負荷を小さくする。ガラスは、DNAハイブルダイゼーション実験や他の化学反応でよくある大量の塩環境下での腐食作用に比較的影響されないので、キャビティを分割する丈夫な中間物をも提供する。
【０１４３】
パネル4205は、複数のネジ、クリップ、RTVシリコンセメントや他の接着剤によって、フローセルに搭載されるとしてよい。図4bを参照して、入口ポート4220と出口ポート4230とを含むサブキャビティ4260は、パネル4205によって密封される。これによって冷却バスからの水は、キャビティ3235から隔離される。この設計は、化学反応の実施用と温度制御用との独立したキャビティを提供する。温度制御用キャビティが反応キャビティの直下にあるので、反応の温度パラメータがより効果的に制御される。
【０１４４】
基板130は、表面4202と連合してキャビティ3235を密封する。好ましくは基板上のプローブアレイは、基板がフローセルに装着される場合にキャビティ3235内に含まれる。実施形態によっては、Oリング4480や他のシーリング材を、基板とフローセル間の連合を改善するために備えてよい。パネル4205の縁4206は、キャビティ容積を増やすこと無く連合を改善するためにより大きなシール断面を使用することを見越して、随意に斜に切られてよい。場合によっては、温度や化学種の濃度と云った反応パラメータをより迅速に制御するために、キャビティ容積を可能な限り小さく維持することが望ましい。加えて、より小さい容積は実験を行うのにより少量の材料しか要さないので、ゴミが低減するだろう。
【０１４５】
図4aに戻って、溝4211は随意に表面4202上に形成される。溝は、例えば、深さ約2mm、幅約2mmとしてよい。一実施形態では、溝4211は、基板によってそれが表面4202上に搭載された際に覆われる。溝は管4213及び真空ポンプに接続される真空取り付け4212と連通する。真空ポンプは溝に真空を作り出し、これが基板の表面4202への接着を惹き起こす。随意に、一以上のガスケットを、フローセルと基板間のシーリングを改善するために備えてもよい。
【０１４６】
図4dは基板をフローセルに連合する代替的な技法を説明している。フローセル上に搭載されると、パネル4290が、それらの間の基板130を固定化するのに十分な力を発揮する。パネル4290は、例えば、複数のネジ4291、クリップ、クランプ、ピンや他の搭載用具によって搭載されるとしてよい。実施形態によっては、パネル4290は、サンプルを入射光に曝すための開口部4295を含む。開口部4295は随意に、ガラスや他の実質的に透明或いは半透明な材料で覆われてよい。或いは、パネル4290は、実質的に透明或いは半透明な材料よりなるとしてよい。
【０１４７】
図4aを参照すると、パネル4205は、サブキャビティ3235と連通するポート4270と4280とを含む。チューブ4271はポート4270に接続され、チューブ4281はポート4280に接続される。チューブ4271と4281は各々、コネクターズ4222経由でチューブ4221と4231を通して挿入される。コネクターズ4222は、例えば、各とも開口部4223に位置するシール4225をもつT字コネクターズでよい。シール4225は、冷却バスからの水がコネクター経由で漏出するのを防止する。ポート4220及び4230と同類の更なるポートを備えると云ったその他の構成が採用されてよいことは、理解されよう。
【０１４８】
チューブ4271及び4281は、選ばれた流体がキャビティ内に導入される又はキャビティを通じて循環されることを可能ならしめる。実施形態によっては、チューブ4271及び4281は、流体をキャビティを通して循環させるポンプに接続されてよい。一実施形態では、チューブ4271及び4281は、キャビティを通して流体を撹拌し循環させる撹拌システムに接続される。
【０１４９】
図4cを参照して、溝4215は随意に、フローセルの表面4203上に形成される。溝の大きさは、例えば、深さ約2mm、幅約2mmとしてよい。一実施形態によれば、表面4203は移動ステージに連合する。溝4211は、移動ステージによって、フローセルがそれに連合させられた際に覆われる。溝4215は管4217及び真空ポンプに接続される真空取り付け4216と連通する。真空ポンプは溝4215に真空を作り出し、表面4203を移動ステージへ接着させる。随意に、更なる溝を連合力の増加のために形成してよい。或いは、フローセルを移動ステージ上に、ネジ、クリップ、ピン、様々なタイプの接着剤や他の固定技法によって搭載してよい。
【０１５０】
更なる代替的な実施形態では、図5に示すように、ビーズの懸濁、細胞、リポソームや他の対象がプローブ(130)である、又はそれらに取り付けられたプローブよりなる。そのようなサンプル、例えば各ビーズや他の対象が約コヒーレンス長だけ又はより遠く離れている等方的なサンプルから散乱された非線形光は、ある強度分布で全方向に発生する。基本波光が懸濁(130)を通過するように送られて、非線形放射が集められる。散乱非線形光を集める数々の方式が利用できる。例えば、第二高調波の集光は、前方で(A)、基本波光に直角に(B)、又は積分球アプローチを使うこと(C)であり得る。Cは、サンプル150が内部に配されている積分球165を示す。基本波光(145)は、入口ポート(170)に入り、サンプル(150)を通過し、球壁での反射を経て、そしてバッフル(175)によって止められる。散乱第二高調波は、球表面から出口ポート(155)を通って集められ、球外に光ファイバー線(160)によって繋がれる。ビーズが、リン脂質二重層（例えば、膜タンパク質をもつ）支持するか又は、タンパク質や核酸と云ったプローブが、それらの表面に取り付けられ得る。ビーズは、サンプル中に分配された多量の表面面積を提供し、且つ、特に基本波及び非線形光が透過モードで使用される場合に平面表面幾何に対する有用な代替案となりうる。
【０１５１】
代替的な実施形態（図6）では、励起光が様々の光学系を用いて点様形状から他の形状に変換される。例えば、基本波光の点様の光線形状が線形状へと変換でき、サンプル表面の走査には有効である。しかし、非線形光線の強度が、他の因子に混じって基本波の強度に依存（典型的には、基本波強度に二次依存）するので、この変換は、所定の位置でのより少ない発生非線形光強度を結果してしまう。基本波（通常、〜2mm直径の丸い点としてよい）の線形状を発生するためには、基本波光線を、先行技術によく知られ、米国特許5834758号に詳細に開示されているような光線を平行にするための150mmアクロマートが後に続く拡大率約10倍の顕微鏡対物レンズの中に導くことができる。図6に示すように、基本波光180は典型的には2〜3mm直径の光線である。この光線は、顕微鏡対物レンズ185を通るように導かれる。この対物レンズは、拡大率が10倍で、光線を約30mmに拡大する。そして光線はレンズ190を通過する。このレンズは、150mmのアクロマートであっても良く、光線を平行にする。典型的には、拡大平行化された光線の半径方向の強度はガウス分布形である。光線中の強度変化を極小化するために、マスク195をレンズ190後に挿入して光線の最高部と最低部をマスクすることができ、これにより光線の中央部分のみが通過する。一実施形態では、マスクは約7.5mmの水平な帯を通す。その後、光線は水平な円柱軸をもつ円柱レンズ200を通過する。円柱レンズ200はMelles Griot製の焦点距離100mmであってよい。この円柱レンズは、光線スポットを鉛直方向に拡大する。或いは、双曲型レンズを使って均された半径方向強度分布を生ぜしめながら光線を鉛直方向に拡大することができる。円柱レンズから、光はレンズ205を通過する。平面ミラーが、励起光をレンズ205に向かって反射させるために、円柱レンズ後に随意に挿入されてよい。約15mmの光線高を達成するために、円柱レンズ200とレンズ205の焦点距離の比は、略1:2であり、これにより光線は約15mmに拡大される。レンズ205は、実施形態によっては80mmアクロマートであり、光をサンプル表面210で約15mm×50ミクロンの線に集める。
【０１５２】
図7に示す代替的な実施形態では、二次元アレイ（A図、表面上のアレイの上面図）にパターン化されたプローブとラベルされたターゲットとが、結合を検出するのに使用される。ここに表面上の各区画、例中の{1,35}は、異なるオリゴヌクレオチドやタンパク質配列（又は同じ及び異なる配列の組み合わせ）であってもよい。Bは、ここではタンパク質対象として示されたターゲット(225)を含むウェル(215)中のサンプル表面(220)の側面図を示す。このウェルは、液体やバッファを保持でき、ウェルの中身を基板の他の部分や基板アレイ中の他の要素から物理的に隔離する働きをする。基本波光は多重化でき、結果として生じる各光線は別個のミラーでガイドされ、アレイ内の異なるラインや領域を同時に走査でき、これにより高処理高の研究のための技法の効率をなお一層大きくする。
【０１５３】
代替的な実施形態において、Levickyらの方法やL.A.Chriseyらの方法が、基板にプローブDNAを取り付けるのに使われる。図8に説明されるようなChriseyの方法では、溶融シリカや酸化されたシリコン基板が用いられ(230)、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン(EDA)で誘導体化される(235)。一実施形態では、このEDA修飾された表面は次いで、そのコハク酸イミドエステル部分がEDAの第一級アミノ基と反応する異種二官能価の架橋剤(SMPB)で処理される(240)。後続が塩基対配列(xzzy)（ここに‘xzzy’は全配列を表現する）であるチオール-DNAオリゴマー(245)が、SMPB架橋剤のマレイン酸イミド部位と反応し、(250)に示す共有結合で結合した種を産出する。
【０１５４】
代替的な実施形態では、表面アレイ中の要素は、図9に示すように物理的に孤立化しており、異なるターゲット、ターゲット溶液等々が、選択的に任意の或いは全ての要素に加えられることができる。Aは、異なるウェル区画（例では16ウェル）を分離する仕切り又は壁(260)をもつ基板(255)の上面図である。Bは、取り付けられたプローブ(270)をもつウェル(265)の側面図を示す。このようなアレイは、当技術分野で普通に見られる、例えば96-ウェル板等々、そして商業的に入手可能である（Fisher Scientific,Inc.等）。
【０１５５】
代替的な実施形態では、ガラス基板表面は、銀と云った反射的な金属の層で被覆されてよい。この金属層は、非線形光学的な発生と収集を増加せしめるものである。生体分子や他の粒子は、金属の上に形成された誘導体化層に取り付けられ得る。例えば、金属が二酸化ケイ素(SiO2)の層で、次いで3-アミノ-オクチル-トリメトキシシランと云ったアミノシランの層で被覆されてよい。次いでオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドが、オリゴの3’や5’末端をアミノ基に接続するリンカーを使って、アミノシラン層に取り付けられてよい。或いは、オリゴ又はポリヌクレオチドを、アミノシラン層に吸着させることができる。図10は、このタイプの実施形態を説明しており、ガラス基板(275)がAg層(280)で誘導されている。そしてSiO2の薄い被覆が、銀層(285)の上に堆積され、アミノシラン(290)で誘導体化される。
【０１５６】
代替的な実施形態では、ビーズベースの光ファイバーアレイが用いられ（参照文献34）、光線（例えば、基本波及び第二高調波）は、ファイバーの道に沿って全内部反射により進む。基本波光が束の或いは個々の光ファイバーの中へと繋がれ、そして非線形光が先端表面で発生し、ファイバーを逆に通って集められる。この実施形態では、個々の光ファイバーは、末端にDNAプローブを取り付けることにより（参照文献17,18）、又は光ファイバーのクラッド層を除去してDNAプローブをコアの外側に取り付けることにより（参照文献19乃至22）、DNAセンサへと改造されてよい。扱い易いDNAアレイが、多数のファイバーを一体に物理的に束ねることにより、このような光ファイバーから作製され得る（参照文献23）。この主題についての多くのバリエーションがあり、例えば、末端部のクラッド層を選択的にエッチングすることによりファイバーの末端部で異なる深さのウェルを作ることができる（参考文献24）。ここでファイバーの先端はウェルの底部を構成することができる。ラテックス又はシリカビーズは、その後、ウェル内に導入することができる（参照文献25）。光ファーバー・オリゴヌクレオチド・アレイは、DNAプローブを微小球に取り付け、そして各ウェルを異なるDNAプローブを保持している微小球で満たすことにより、調製できる。各異なるタイプの微小球は、プローブ取り付けの前後で、蛍光染料やDNAプローブの独特の組合せによりタグ付けられる（参照文献26,27）。普遍的な作成のための‘郵便番号’（参照文献29）及びラベル無し検出のための分子ビーコン（参照文献28,30）も、光学センサ・ビーズ付きアレイで使用し得る。図11は、光ファイバー束アレイを説明している。Aは、ビーズ(300)を配する末端部のウェルをもつ光ファーバーケーブル(295)を示す。Bは、単独の光ファイバーの近接図を示す。基本波光は、ビーズをもつ末端部に向かって（ω）で進む(305)。基本波光によっては、第二高調波光（2ω）と一緒にビーズから逆に散乱され、ファイバーを通って逆に基部に進み、其処で光学列及び検出システム（図示せず）が基本波放射を第二高調波放射から分離する。ビーズ(310)は、取り付けられたプローブで覆われる。
【０１５７】
代替的な実施形態では、本発明の技術は開口、閉鎖や、細胞、リポソーム、支持された二重層、生体内または生体外の組織又は他の膜ベースのシステム（例えば、図5に図示されるように媒質中に浮遊する、或いは固体基板に取り付けられる）中のイオンチャンネル受容体又は他のイオノフォア（inophores）の振舞いの変調を、イオンチャンネルを通るイオンフローが引き起こす表面電気ポテンシャル及び電荷密度の変化に応答した検出非線形光学的放射の変化を通して観察するのに使うことができる。イオンチャンネル受容体は、電圧でゲート、化学的にゲート、又は機械的にゲートされ得る。アゴニスト、アンタゴニスト、薬、シグナル分子、サンプルを横断する印加電圧の変化、これらの組合せ等々に応答したチャンネルの開閉を追跡することにより、非線形光学的技法は、イオンチャンネルタンパク質や受容体の機構への分子作用の様式を決定するラベル無し手段として使い得る。イオンチャンネルの開閉は、関連イオンの作用を通じて、膜表面の電気ポテンシャルを変化させ、従ってそれに近い水分子、溶媒や標識物質の分極や配向を変化させてしまうものであり、これにより非線形光の強度をチャンネル活動のモニターとして使うことが可能になる。この技術は又、開閉イベントを時間分解するのに使うこともでき、アゴニスト、アンタゴニスト、小分子等々の濃度の関数として測定することが可能である。加えて、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、小分子等々と云った化合物の組合せを、イオンチャンネル受容体へのそれらの共同効果を追跡する単独の実験に使える。
【０１５８】
この実施形態では、神経細胞及び他の細胞（他の細胞の例は、これに限られないが、筋肉細胞（平滑筋及び横紋筋）、心臓、内分泌、腎臓の細胞、等々）内での薬の効果を観察する場合に特に有用であり得る。神経系（CNSや末梢神経系）に作用する殆ど全ての薬は、化学的なシナプス伝達中のある段階を変更することによりそれらの効果を生じさせる。対象となる化合物の例として、これに限られないが、グリシン、GABA（γ-アミノ酪酸）、グルタミン酸、アスパラギン酸、他のアミノ酸、アセチルコリン、モノアミン、ドーパミン、ノルエピネフリン、5-ヒドロキシトリプタミン、ペプチド、一酸化窒素、これらの化合物の作用を変更する薬等がある。特定の薬のイオンチャンネル受容体への作用の様式は、基礎的研究の及び医薬品、薬や他の治療剤を開発するための関心事である。例えば、ベンゾジアゼピンのGABA-ベンゾジアゼピン受容体への影響を、バルビツール誘導体、イミダゾピリジン等々と云った他の化合物の存在を伴って又は伴わずに、調べることができる。他の例は、心臓の細胞中の様々なチャンネルに影響する抗不整脈薬の多くの類の研究である。サンプルの構成は、多様なやり方で調製できる。例えば、研究中の細胞やリポソームが、懸濁液または溶液中であり得、そして基本波がそれらを通過する（透過モード）、或いはそれらが、一過性モードの相互作用のために界面（例えば、プリズム-溶液界面）に近い（又は取り付けられる）ことがあり得る。或いは代わりに、例えば生体外または生物システムの一部として（生体内）組織を研究できる。受容体も、単離されて人工膜を伴う再構成システムの一部として研究することができる。これらの例は、説明を意図し、発明のこの側面が使われる手段の範囲を制限することを意図しない。バックグラウンドの非線形光学的な信号を測定されうる。ターゲットの付加は適切な時間で、非線形光学的信号強度の定量化可能な変化を導く。ターゲットが結合する受容体は、イオンチャンネルの一部、又はその始動がイオンチャンネル受容体の状態や性質の変調をもたらす他の受容体、例えば当技術分野でよく知られた‘第二メッセンジャー’、であり得る。薬、アゴニストや受容体-ターゲット相互作用を変調し得る他の化合物の付加は、ターゲット付加の前に、ターゲットと同時に、ターゲット-受容体反応中に、又は反応が起こった後に、これを行うことができる。変調要素の付加を伴う及び伴わない受容体-ターゲット相互作用の非線形光学的な応答を比較することにより、これら要素が、受容体-ターゲット相互作用に影響するかどうか、どの程度のどのようなタイプの影響（例えば、ターゲット-受容体相互作用の減少または増大、受容体-ターゲット相互作用が起こる速度の増大または減少、イオンチャンネルの通門または閉門の速度の増大または減少、イオンチャンネルの透過性の増大または減少、等々）かを決定できる。
【０１５９】
代替的な実施形態では、図1中の非線形放射の検出器(65)は、一光子計数モードで運転する光電子増倍管である。光子流のパルスは、Model SR445 Fast Preamplifier 及びModel SR400 Discriminator（Stanford Research System,Inc提供）を使って、電圧変換され、増幅され、識別に委ねられ、そしてカウンター（Kinetic Systems 提供のModel 3615 Hex Scalar）に送られるとしてよい。DAC出力（Kinetic Systems 提供のModel 3112,12-Bit DAC）による光子カウンターのゲート操作及び検流計制御は、デジタル遅延／パルス発生器（Stanford Research System,Inc 提供のModel DG535）を使って同期化される。PCコンピュータ29との通信は、パラレルレジスタ（DSP Technologies,Inc 提供のModel PR-604）、CAMACコントローラカード（DSP Technologies,Inc 提供のModel 6002）及びPCアダプタカード（DSP Technologies,Inc 提供のModel PC-004）を使って達成され得る。
【０１６０】
他の実施形態によれば、非線形光学的な光の検出は、光電子増倍管や他の光検出器の代わりに電荷結合検出器(CCD)を使って達成される。このCCDサブシステムは、コンピュータに組み込まれたデータ取得ボードと通信し、によって制御される。データ取得ボードは、例えばComputer Board Inc.製造のCIO-DAS16/Jrのような当業界でよく知られたタイプでよい。データ取得ボード及びCCDサブシステムは、例えば次のように動くとしてよい。データ取得ボードは、CCDサブシステムにクロック信号を送ることによってCCD積分期間を制御する。一実施形態では、CCDサブシステムはCCD積分期間を4096クロック期間に設定しており、クロックレートを変えることにより、CCDがデータを積分する実時間を操作できる。
【０１６１】
積分期間中、各フォトダイオードは、それに届いた光の量に比例する電荷を蓄積する。積分期間の終了に当たり、電荷はCCDのシフトレジスタに移され、そして新たな積分期間が始まる。このシフトレジスタは、CCDアレイ上に入射した光のパターンを表す電圧として電荷を蓄える。そしてこの電圧は、データ取得ボードにこのクロックレートで送信され、其処で電圧はデジタル化されてコンピュータの記憶装置に格納される。このようにして、サンプルのストリップは各積分期間中に画像化される。その後、サンプルが完全にスキャンされるまで次の行が積分される。
【０１６２】
代替的な実施形態では、干渉、ノッチパス、バンドパス、反射や吸収フィルターが、基本波や非線形光学的な光線を通過させたりブロックしたりするために、図面中のフィルタの代わりに使われ得る。
【０１６３】
代替的な実施形態では、プローブのターゲットとの結合をブロック又は低減する薬、アンタゴニスト、アゴニストや他の種を見つけることが注目されている。これら化合物は、“インヒビター”と呼ばれている。本出願においてラベル化されたターゲットは界面においてプローブと結合している。このインヒビターをサンプルに加え、テスト中の特定の種がプローブ-ターゲット結合のブロック又は低減に成功した場合には、測定される非線形光学光が変化することとなる。即ち、この実施形態におけるバックグランド放射はターゲット-プローブ結合状態に拠り、インヒビターによる界面でのターゲットのプローブからの移動は、例えば界面により発生する非線形放射強度の減少や非線形放射スペクトルの波長シフトとして、測定される非線形光学的な光の変化を生じさせる。
【０１６４】
代替的な実施形態では、非線形放射（例えば、第二高調波）を、二以上のスペクトルの点またはバンドで、モノクロメータ、フィルタやこれを達成するための他の波長を選択するデバイスを使って測定することにより、サンプルの非線形スペクトルは測定される。
【０１６５】
代替的な実施形態では、モノクロメータ(60)は、非線形光学的放射を空間的に分解するために、装置中の検出要素の前に置かれてよい（図1）。
【０１６６】
代替的な実施形態では、第二高調波光の強度対プローブ結合ターゲットの濃度の較正は、蛍光的にタグ付けられたターゲットを使うことにより得られる。
【０１６７】
代替的な実施形態では、核酸やPNAマイクロアレイは、商業的に取得、又は公開文献（例えば、http://cmgm.Stanford.edu/pbrown/mguide/index.html）に従って作製できる。使用される表面化学は、Chrisey,L.A.ら(1996)にあるもので、オリゴヌクレオチドが溶融シリカスライド上に自己組織化単層シラン膜に取り付けられるものである。シラン化は、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランにより達成される。
【０１６８】
代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドやPNAが、光前駆の合成法（Fodaorら、1997）や化学的な合成法（例えば、Chrisey,L.A.,1996）により固体基板に取り付けれ得る。
【０１６９】
代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドやPNAの表面やマイクロアレイは、商業的に取得、又は公開文献（例えば、http://cmgm.Stanford.edu/pbrown/mguide/index.html）に従って作製できる。
【０１７０】
DNAマイクロアレイは、商業的に取得、又は公開文献（例えば、http://cmgm.Stanford.edu/ pbrown/mguide/index.html）に従って作製できる。使用される表面化学は、Chrisey,L.A.ら(1996)にあるもので、オリゴヌクレオチドが溶融シリカスライド上に自己組織化単層シラン膜に取り付けられるものである。シラン化は、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン及びHoheisel, J. D."Improved solid supports and spacer/linker systems for the synthesis of spatially addressable PNA-libraries"Nucleosides Nucleotides 18 (1999) 1289-1291によりガラスやシリカ上に為される。PNAオリゴヌクレオチドに接触するバッファや溶液は、先行技術で知られたものの範囲から選び得る。ターゲット成分（ターゲットオリゴヌクレオチド、PNAではない）を含む溶液は、標識物質分子を含む。好ましい実施形態では、標識物質分子は、4-[(5-メトキシフェニル)-2-オキサゾリル]ピリジニウムメタンスルホネート（4PyMPO-MeMsとしても知られる）であり、バッファ溶液中に1mM濃度で溶解される。ハイブリダイゼーション及び洗浄溶液は、先行技術に見られる。例えば、ウェブサイトcmgm.stanford.edu/pbrown/protocolsは、プローブ-ターゲットハイブリダイゼーションのための詳細な指示を与えている。
【０１７１】
マイクロアレイは、x-y移動ステージ上に据え付けられ、動力装置をもつトランスレータ（Oriel,Incより入手）を使って又は先行技術中の多くのやり方（例えば、V.G.Cheungら、1999）のうちの一つを使ってパーソナルコンピュータ（PC制御）により駆動される。
【０１７２】
代替的な実施形態では、先行技術に説明されている画像化技法（Pelegら、又はCampagnolaら）は、先行技術で使われた膜挿入染料の代わりに標識物質を使って実施できる。これらの画像化技法は、固体表面、細胞表面や他の界面を標識物質を使って画像化するのに使える。
【０１７３】
代替的な実施形態では、光線でサンプルを照射すると標識物質が非線形光学的活性（又は多かれ少なかれ非線形光学的活性）になるように、標識物質が光線（例えば、基本波でなく）で光活性化または光変調され得る。光線は、例えば、化学結合を切断でき（例えば、UV光を使う）、これは先行技術で‘ケージ化’化合物として良く知られている。
【０１７４】
代替的な実施形態では、あるプローブ-ターゲット結合反応の反応速度論が、ターゲットのある濃度で測定されることになる。この実施形態では、非線形光学的な光の強度及び/又はスペクトルの時間推移が測定される。測定情報は、結合ターゲット濃度の時間推移に変換され得る（例えば、mM/sまたはμM/sのプローブ-ターゲット濃度）。薬又は、例えばプローブ-ターゲット結合平衡や形成の速度の他のエンハンサやレデューサは、プローブ-ターゲット反応への添加物質の効果を比較するために使い得る。
【０１７５】
代替的な実施形態では、装置を、取り付けられたプローブを有する使い捨て基板（例えば、バイオチップ）を挿入し除去するオプションの付いたユーザ制御のインターフェース（例えば、LEDパネル、やPCベースのソフトウェア）を備えるユーザよりの製品に作り上げることができる。
【０１７６】
代替的な実施形態では、非線形光学的な測定は、取り付けられたプローブを有する基板に接触している溶液、液体やバッファ中のターゲットの存在下に為され得る（例えば、非結合のラベルされたターゲットを除去するための洗浄ステップが不要である）。
【０１７７】
代替的な実施形態では、積極的移動、ポンピング、電気泳動的な手段や当技術分野で知られた成分フローを反応チャンバー中へ及び外へと操作する他の手段により、チャンネル（又は微小流体）が要素をサンプルセル内に導入するために使用され得る。
【０１７８】
代替的な実施形態では、図1において、フォトダイオード(65)が、光検出手段として使われる。
【０１７９】
代替的な実施形態では、表面アレイは固定された位置であり、入射光線が、検流計ミラーや多角形ミラーと云った当技術分野でよく知られた方法を使って、表面を横断してスキャンされる。
【０１８０】
代替的な実施形態では、スキャニング方法は、ステージ移動(x-y)と光線スキャニングの両方の組合せであってよい。ここに、後者はアレイ表面上の基本波光線の入射位置を制御する。
【０１８１】
代替的な実施形態では、ストップフロー混合室が、サンプルセル中の要素を素早く混合するのに使われ得る。
【０１８２】
代替的な実施形態では、ターゲット付きプローブ-ターゲット相互作用は、組織表面、表面上のパターンされた細胞、表面に取り付けられたプローブ（例えば、マイクロアレイやDNA、タンパク質等々のアレイ）と云ったいくつかの表面上で、標識物質、溶媒分子、水分子又は表面を取り巻く生体内の自然の媒質を使用して画像化できる。この画像化は、生体内或いは生体外で行われ得る。生体内画像化の場合は、画像化は、内視鏡や生体内に光を導入し集めるための当技術分野で知られた他の器械を使って実施できる。
【０１８３】
代替的な実施形態では、生物的なプローブ-ターゲット結合反応が、該プローブ-ターゲット結合反応の結合度（例えば、平衡定数）を変調し得るアゴニスト、アンタゴニスト、薬や小分子の存在下に測定され得る。この実施形態は、多くの場合に有用であり、例えば、医療用或いは基礎研究のためにある決まったプローブ-ターゲット反応をブロックする薬の能力の程度を知りたい場合である。
【０１８４】
代替的な実施形態では、非線形光学的、表面選択性の装置は、光励起源を欠いたユニット（例えば、サンプル室、フィルタ、検出器、モノクロメータ、コンピュータインターフェース、ソフトウェア、や他のパーツ）を備えるため、その結果、ユーザは、自ら励起源を補うことができ、その使用を本文書に記載の方法に合わせることができる。
【０１８５】
代替的な実施形態では、測定可能情報は、実時間で記録できる。
【０１８６】
代替的な実施形態では、ターゲット-プローブ相互作用は、相互作用のモジュレータの存在下に測定できる。このモジュレータは、例えば、小分子、薬又は他のターゲット-プローブ相互作用をあるやり方で変化させる（例えば、ブロック、抑制等々）部分、分子又は粒子である。モジュレータは、プローブ-ターゲット反応が起きる時間の前、中または後に加えることができる。
【０１８７】
プローブ-ターゲット反応の検出のために表面選択性非線形光学的技法を使う装置の様々な構成
プローブ-ターゲット反応又はそれらの効果を検出するための装置は、様々な構成を取り得る。最も簡単な形式では、装置は以下を備える。
【０１８８】
1) 基本波光の源
2) 表面に取り付けられたプローブを有する基板又はサンプル
3) 第二高調波や他の非線形光学的ビームの強度を測定する検出器
装置のより複雑なバージョンは、例えば、モノクロメータ（波長選択のため）、パスフィルタ、カラーフィルタ、干渉若しくは他のスペクトルフィルタ（波長選択や基本波を高調波から分離するため）、一以上の偏光光学器、光線を導きフォーカスするための一以上のミラーやレンズ、コンピュータ制御、ソフトウェア等々を採用しうる。
【０１８９】
非線形光学光（例えば、SHG）を生み出す又は発生する様式は、次の手段の中の一以上に基づき得る。TIR（全内部反射）、光ファイバー（取り付けられたビーズあり又は無し）、透過（基本波がサンプルを通過）、反射（基本波がサンプルから反射）、スキャニング画像化（サンプルを走査可能ならしめる）、共焦点画像化またはスキャニング、パワー増強のための共鳴キャビティ、多重パス配置。
【０１９０】
測定情報は、次のパラメータの中の一以上を含み得るベクトル形式を取り得る。｛光の強度（典型的には、PMTやフォトダイオードにより光電圧に変換される）、光の波長（モノクロメータ及び又はフィルタで決定される）、時間、基板位置（アレイサンプル、例えば、ここで、異なるサブサンプルが基板位置の関数として符号化され、基本波は様々な(x,y)位置に導かれる。）｝。装置の二つの一般的な構成は、画像スキャニング（基板の画像化、即ち、x,y座標の関数としての強度、波長等々）と分光（平面表面のため、或いは細胞、リポソームや他の粒子の懸濁液のための強度、波長等の測定）である。
【０１９１】
基本波光線は、様々なやり方でサンプルに届けられ得る。図12〜16は、基本波を届け、第二高調波を発生する様々な様式の概念図である。和や差周波数構成の場合には、基本波光線は二以上の光線を有し、界面で差や和周波数の光線を発生するものと解釈する。説明のために、第二高調波発生の場合のみここに詳細に記載する。更に、全ての場合のサンプルセル3は、界面の相互作用体積の正確な位置を選択するために、移動ステージ（1、2、又は3次元的自由度）上に搭載され得ることが理解されよう。全ての場合のサンプルセルは、分子、粒子、細胞等々と云った成分を導入する（又は洗い出す）のに利用され得るフローポート及びチューブを取り付けられ得る。
【０１９２】
透過
図12Aは、基本波及び第二高調波の透過に依拠した配置の概念図である。基本波320（ω）は、サンプルセル330を通過し、第二高調波光線325（2ω）を発生する能力がある一以上の界面を含む体積要素（円で示す）内で相互作用する。基本波及び第二高調波は、光線325で示すように実質上共線である。サンプルセルは、浮遊したビーズ、粒子、リポソーム、生物細胞等々を、ある媒質中に含むことができ、基本波光線に応答して第二高調波を発生する能力のある界面領域を与える。図示されているように、第二高調波が、基本波方向と共線的に検出されているが、代わりに基本波から離れた角度、例えば基本波光線に対して90度で検出することもできる。
【０１９３】
図12Bは、基本波及び第二高調波の透過に依拠する他の配置の概念図である。基本波335が、サンプルセル345の上に導かれ、第二高調波が上部表面で発生する。この表面は固定化プローブで、或いは吸着粒子、リポソーム、細胞等々で誘導されているとしてよい。第二高調波340は、上部表面とセル内に含まれる媒質との間の界面にある円で示された体積要素内で発生する。
【０１９４】
図12Cは、上部ではなくサンプルセル3の底部表面が、第二高調波の発生に使われることを除いて、図12Bに示されるものと実質上同様の配置の概念図である。
【０１９５】
全内部反射
図13Aは、基本波365を屈折し、導波路380とサンプルセル375との間の界面の位置にそれを導く全内部反射導波路として働く能力のある導波路4の概念図である。円で示されるこの位置で、基本波は第二高調波を発生し全内部反射を受けることになり、第二高調波は、基本波と実質上共線的に伝播しプリズム380を出ることになる。導波路380は通常、空気と接触することになる。この図示では、導波路380はダブプリズムである。
【０１９６】
図13Bは、導波路400が、導波路4とサンプルセル395との間の全内部反射の多数点を考慮し、基本波光線から発生する第二高調波光の量を増やしていることを除いて、図13Aに示されるものと実質上同様の配置の概念図である。
【０１９７】
光ファイバー
図14は、基本波又は第二高調波光線を届け或いは集める光ファイバー手段の様々な配置を図示している。図14Aでは、基本波の源と光ファイバーとの間の結合要素410が描かれている。基本波は、これによって光ファイバー導波路405中に結合され、サンプルセル415へ進む。図14Aにおいて、ファイバーの先端は、第二高調波を発生する能力のある対象の界面として利用でき、或いは先端は単に、浮遊した細胞、粒子等々を含むサンプルセルに基本波を導入するのに利用され得る。図14Aにおいて、第二高調波光は、光ファイバーを逆に通って集められる。
【０１９８】
図14Bは、ビーズが光ファイバーの先端に取り付けられている（当技術分野でよく知られた手段によって）ことを除いて図14Aと全く同じである。このビーズは、第二高調波光の集光効率を改善したり、プローブや吸着種で誘導化するのに利用でき、そして第二高調波光を発生することが可能なサンプルセル425の媒質との界面を提供する。
【０１９９】
図14Cは、第二高調波光も集光が、立体角検出器450を使って達成されることを除いて、図14A及び14Bと全く同じである。
【０２００】
光学的共鳴キャビティ
光学的共鳴キャビティは、少なくとも２つの反射性要素の間に規定され、キャビティ内光線径路に沿うキャビティ内光線を有する。この光学的キャビティまたは共鳴器は、入射光が前後に撥ね返りながらミラー間にトラップされ得るように配された二以上のミラー表面から構成されている。このようにして、キャビティ内の光は、入射光より大きさが数階級も強烈に成り得る。この現象は、よく知られており、様々なやり方で利用されてきた（例えば、Yariv A.”Introduction to Optical Electronics”,第二版,Holt,Reinhart and Winston,NY 1976,8章を見られたし）。サンプルセルは、光学的キャビティ内に存在することができ、又はそれが光学的キャビティの外にある場合もある。
【０２０１】
図15は、光学的共鳴パワー増強キャビティ配置の概念図である。図15Aは、サンプルセル465がキャビティ内に設置され、基本波及び第二高調波光線がそれを透過する光学的共鳴キャビティの概念図であり、浮遊した粒子、細胞、ビーズ等々を含むサンプルセルにとって有用な配置である。基本波光線455は、反射性光学器460で光学的共鳴器に入り、反射性要素460と462との間でパワーを増強する（キャビティ内光線）。ミラー460は、好ましくは傾けられ（入射基本波455の方向に直交しない）、キャビティ内光線の直進的な反射が光源へと逆行するのを防ぐ。460と462の未処理の反射率と透過率は、基本波がキャビティ内でパワーを都合の良いレベルまで蓄積するように調節され得る。基本波は、円で示されたサンプルセル内の体積要素中で第二高調波光を発生する。反射性光学器460が、基本波及び第二高調波を反射できる一方、反射性光学器462は実質上、基本波を反射するが、続いて検出されることになる第二高調波光線475を通過させる。米国特許5432610号（Kingら）は、化学的センシングのためのダイオードでポンプされたパワー増強キャビティを記載しており、これとこれが為した参照とを、参照により本文書中に組み入れる。
【０２０２】
図15Bは、基本波光線475が光学器480から反射により光学的キャビティに入る光学的共鳴パワー増強キャビティ配置の概念図である。第二の反射性光学要素482が、光学的共鳴キャビティを規定する。要素490は、サンプルセル485に接触している導波路（例えばプリズム）であり、導波路とサンプルセルの表面間の界面で第二高調波を発生しながら基本波光線を全内部反射させる。要素482は実質上、基本波を反射するが、続いて検出されることになる第二高調波光線495を通過させる。
【０２０３】
反射
図16Aは、基本波と第二高調波光線の反射を含む配置の概念図である。基板525は、例えば金属の反射性材料520の薄い層で被覆され、そしてこれの上にプローブの取り付けや、粒子、細胞等々の吸着に適した層515が堆積される（例えばSiO2）。この層は、サンプルセル510と接触する。基本波500は、サンプルセル510を通過し、層515と520間の界面で第二高調波を発生する。基本波と第二高調波505は、層520の表面から反射して撥ね返る。
【０２０４】
図16Bは、第二高調波と基本波光線がサンプルセル540中に含まれる媒質と層545との間の界面から反射される535ことを除いて、図15Aと実質上同じである。層545は、基板550に堆積された反射性または部分的反射性の層であり、粒子、細胞等々の吸着やプローブの取り付けに適する。
【０２０５】
図16Cは、サンプルセル565のみが、反射的配置として使われる必要があるものを説明する概念図である。サンプルセル565は、ある媒質570で部分的に満たされ、基本波と第二高調波光線が、570の表面の気体-液体または蒸気-液体界面から反射される560。
【０２０６】
検出様式
電荷結合検出器(CCD)アレイ検出器は、情報が基板位置(x,y)の関数として所望されている場合に特に有用であり得る。CCDは、ピクセル（つまり、フォトダイオード）のアレイを備え、その各ピクセルは、それに当たった光を独立に測定し得る。与えられた装置配置に対し、特定基板位置(x,y)から生じた非線形光は、基板から或る距離のCCDアレイ位置(Q,R)に当たった非線形光の強度を測定することにより決定できる。これが可能なのは、蛍光発光の自発的、確率的そして多様な方向という性格に比して、非線形光学的な光線が、コヒーレントで平行（通常、基本波と共に伝播する）だからである。CCDアレイによる、検出器中の一以上のアレイ要素{Q,R}は、基板位置(x,y)の関数として情報を容易に決定することを考慮して、基板表面の特定領域に位置づけられる。フォトダイオード検出器及び光電子増倍管(PMTs)、アバランシェフォトダイオード、光トランジスタ、真空フォトダーオードや他の入射光を電気信号（つまり、電流、電圧等々）に変化する先行技術で知られた検出器をも、光強度を検出するのに使うことができる。CCD検出器については、CCDは、装置コンピュータに組み込まれたデータ取得ボードと通信し、これによって制御される。データ取得ボードは、Computer Boards Inc.製作のCIO-DAS16/Jrと云った当技術分野でよく知られたタイプのものでよい。データ取得ボード及びCCDサブシステムは、例えば次のように操作できる。データ取得ボードが、CCD積分期間を、CCDサブシステムにクロック信号を送ることにより制御する。一実施形態では、CCDサブシステムはCCD積分期間を4096クロック期間に設定している。クロックレートを変えることにより、CCDがデータを積分する実時間を操作できる。積分期間中、各フォトダイオードは、それに届いた光の量に比例する電荷を蓄積する。積分期間の終了に当たり、電荷はCCDのシフトレジスタに移され、そして新しい積分期間が始まる。このシフトレジスタは、CCDアレイ上に入射した光のパターンを表す電圧として電荷を蓄える。そしてこの電圧は、データ取得ボードにこのクロックレートで送信され、ここで電圧はデジタル化されてコンピュータの記憶装置に格納される。このようにして、サンプルのストリップは各積分期間中に画像化される。その後、サンプルが完全にスキャンされるまで次の行が積分される。
【０２０７】
サンプル基板とサンプルセル
サンプル基板とセルは、これに限られないが、次の特徴の一以上から引き出される様々な形式をとる。十分に密封される、密封若しくは密封されずにフローセル及びポンプに接続される、非線形光線の一過性発生を考慮した全反射プリズムをもつ統合基板、基本波パワー増強のための共鳴キャビティをもつ統合基板、増加された非線形応答のための基本波の多重パスを考慮した光学配備、浮遊した生物細胞、粒子、ビーズ等々を含むサンプルセル。
【０２０８】
データ解析
データ解析は、検出器で測定された情報ベクトルを処理する。情報は、時間依存で反応速度論的であってよい。それは、一以上の生体的要素の濃度に依存してよく、測定中或いは測定間で変化し得る。それは波長等に依存してもよい。一般に、非線形光の強度は、特定の状態の濃度や量（例えば、表面に結び付いた要素の濃度や細胞膜中の通門或いは閉門イオンチャンネルの量）へと変換される。一例として、第二高調波の生成は、式
【数４】
2004530105.tif 000005
に従う。ここに、ISHは第二高調波光の強度、E2ωは第二高調波の電場振幅、AとBは所定の界面とサンプル幾何に固有の定数、Φ0は電気的表面ポテンシャル、そしてχ(2)及びχ(3)は二次及び三次の非線形感受率テンソルである。表面結合反応はラングミュア型の式に従うとしてよく、
【数５】
2004530105.tif 000006
ここに、Nは表面に結合したターゲットの量（例えば、プローブに結合したターゲット）、Nmaxは平衡時の表面での結合種の最大数、k1は会合速度定数、k-1は解離速度定数、dN/dtは表面結合ターゲットの量の変化の瞬間速度、そしてCは種のバルク濃度である。修正ラングミュア式や他の先行技術で表面吸着または表面結合種の量を決定するのに使われる式も、データ解析に使われ得る。
【０２０９】
他の関連する式は、表面電荷密度を表面電気ポテンシャルとバルク電解質濃度に関係付けるGouy-Chapman式であり、
【数６】
2004530105.tif 000007
ここに、σは表面電荷密度、Cはバルク電解質濃度、zは電解質種の電荷、そしてΦ0は表面ポテンシャルである。このタイプの他の式も使うことができ、例えばGouy-Chapman-Stern式は、Φ0をσに関係付ける式中でイオンの有限サイズを考慮している。
【０２１０】
データ解析の詳細は、各特定ケースに依存することになる。表面上の正味電荷による分極応答、つまりχ(3)があれば、それは測定実行時に取り去ることができる。従って、表面結合種の数Nが、このようにして第二高調波強度から直接的に計算できる。反応速度論や平衡の性質は、例えば式2と先行技術でよく知られた手順に従って、N（平衡時または実時間の）から決定し得る。このプロセスを詳細に記述した当技術分野の数々の関連文献があり、例えば、J.S.Salafsky, K.B.Eisenthal,"Second Harmonic Spectroscopy: Detection and Orientation of Molecules at a Biomembrane Interface", Chemical Physics Letters 2000, 319, 435 及び Eisenthal, K. B."Photochemistry and Photophysics of Liquid Interfaces by Second Harmonic Spectroscopy" J.Phys.Chem. 1996, 100, 12997がある。
表面電荷密度の変化を直接的に或いは間接的にもたらすプローブ-ターゲット過程として、間接タイプの例は、イオンチャンネル実験においてある。ここでターゲットがプローブに結合してイオンチャンネルの動的変調に至り、その結果これが表面電荷密度に至り、その結果水分子、溶媒分子や標識物質の極性の変化に至る。このケースでは、所定のNの量に対する表面の電荷の量は、分子の正味電荷により定まり、従ってNがσ（表面電荷密度）に関係付けられる。式2と云った公式を使って、表面電気ポテンシャルが決定でき、これが式1に使われ、その結果、電場振幅または第二高調波の強度を決定する。これによって、測定第二高調波強度を表面結合種（ターゲット）の量に関係付けることができる。この種のデータ解析の例は、J. S. Salafsy, K. B. Eisenthal,"Protein Adsorption at Interfaces Detected by Second Harmonic Generation",Journal of Physical Chemistry B,2000,104(32),7752-7755に与えられている。従って、非線形光学的な放射の測定データを使うことにより、Nと結合の自由エネルギーと結合過程の反応速度論とを、当技術分野でよく知られた手順に従って決定できる。
【０２１１】
図面の細かい説明
図面は、第二高調波発生を使った装置とサンプルの様々な実施形態を説明している。和や差周波数の使用は、本文書中で図説されていないが、２つの基本波光線（ω1,ω2）の使用と共に同様のセットアップが要求される。ここで、ω1±ω2=Ω、Ωは和または差周波数である。サンプル表面が分離した要素で構成されたアレイである場合には、一の要素または平行な一以上が、基本波光で反応を見られ得る。更に、検出が、特定の装置セットアップに依存して１つの要素または平行な多数に対してなされ得る。
【０２１２】
図1は、第二高調波光が表面からの入射基本波光の反射によって発生する実施形態を説明している。光源5は、サンプルで第二高調波光を発生するのに必要な基本波光を生み出す。通常、これはピコ秒又はフェムト秒レーザーであり、波長調節可能か又は調節不可能であり、そして商業的に入手可能である。基本周波数（ω）の光が、レーザーを出射し、例えば光の周波数と強度に適当な半波長板10（例えば、Melles Griot、OrielやNewpot Corp.から入手できる）を使ってその偏光が選択される。そしてこの光線は、レンズ15でフォーカスされ、基本波光を通過するが非線形光（例えば、第二高調波）をブロックするように設計されたパスフィルタ20を通過する。このフィルタは、レーザーキャビティに入ってレーザー放射性質の擾乱を引き起こし得る第二高調波光線の逆反射を防ぐのに用いられる。この光線が、ミラー25から反射され、表面上の特定位置に特定角度θで当たる。ミラー25は、必要なら検流計制御のミラースキャナ、回転する多角形ミラースキャナ、ブラッグ回折器、音響・光学偏向器、又は他のミラー位置制御を可能ならしめる従来技術に知られた手段を使ってスキャンされ得る。サンプル表面30は、第二高調波光線の発生のための表面上の特定位置を選択するために、x-y移動ステージ35（コンピュータ制御）上に搭載され得る。この表面は、ガラス、プラスチック、シリコンや他の基本波や第二高調波光線を反射する固体表面でよい。このサンプル表面は囲われており、表面が液体に接している。更に、サンプル30は、マイクロキャピラリーや他の液体輸送チャンネル（図示せず）、ポンプや電気泳動要素によって、供給或いは排出されることができ、そしてこれらの機器はコンピュータで制御され得る。その後、基本波と第二高調波の出射光線（表面対して特定の角度、つまりθ1で、それらは通常、方向が略共線的である）が、表面から反射されて、基本波が第二高調波用のパスフィルタ45を使って濾波され、倍周波数光線（2ω）のみを残す。第二高調波がミラー40から反射されて、その偏光が必要なら偏光光学器50により選択されて、レンズ55を使って検出器60上へフォーカスされる。レンズ15及び55は、フォーカス動作やビーム形状を整えるための当技術分野に知られたレンズの如何なる組合せでもよい。必要ならモノクロメータ60を、第二高調波のスペクトル帯域の特定波長を選択するのに使うことができる。検出器は、光電子増倍管、CCDアレイ、や他の当技術分野に高感度で知られた検出装置であり得る。例えば、一光子計数モードで操作した光電子増倍管を使い得る。検出器で、光は強度に比例した電圧を生成する。アレイがステージによって移動され、アレイ表面上の各位置に対してデータがスキャンされる（又はこれらの組合せ）のに従って、記録され、表面上の各領域から発生した第二高調波強度の画像が形成される。
【０２１３】
図2は、全内部反射（一過性波発生）が第二高調波光を発生するのに使われる実施形態を説明している。基本波光（ω）は、プリズム要素70の表面の上に誘導される。この光線は、位置(a)で屈折してプリズムを通り、屈折率調和フィルム75を通って、基板80に当たる。プリズム70及び基板80は、光学的に透明な材料でできており、好ましくは同じタイプである。プリズム70は、ダブプリズムや他の一過性場を維持し得る要素（例えば、導波路、ファイバー及び薄い金属膜）でよい。屈折率調和フィルム75は、油であり得るが、好ましくは圧縮可能な光ポリマーであり、例えばSjodin,“Optical interface means”,PCT 公開 WO90/05317,1990によって開示されたものである。プリズム75及び基板80は、同じ材料で作られた、単一の完全なピースであってもよい（つまり、屈折率調和フィルム無し）。一過性波は、80と85中の屈折率とそれらの界面でのビームの入射角とに従って、80とサンプル室85中の媒質との間の界面で発生する。その電場振幅は、基板から離れるにつれて指数関数的に減衰し、表面電気ポテンシャル、サンプル室中の対応イオン密度（もし、あれば）を含む幾つかの因子に依存して、1/e長はナノメータからミクロンの範囲となる。サンプル室は、空気、気体、或いは溶液や水と云った液体で満たされてよい。サンプル室に面する80の表面上の‘x’マークは、対象のサンプル（例えば、作成プローブ）がこの側に設置されていることを強調して示す。基板80は、異なる基板の測定を考慮して、75と85との間で滑り出すことのできる‘チップ’であってもよい。図中の要素90は、サンプル室に対して、例えばポンプ、静電気的手段等によって液体や気体を引き入れ、又は、引き出すためのサンプル室のポートを参照している。サンプル集合全体は、必要ならx-y移動ステージ上に搭載し得る。
【０２１４】
図3は、スラブ誘電体導波路が基本波光をサンプル表面に届けるのに使われる実施形態を説明している（光線は、図1中要素1〜5及び8〜13で、発生、指向、そして検出される）。平行板や誘電体導波路を、基本波光を導波路伝播モードへ結合されるのに使い得る。この図は、二のスラブ(110と115)と領域(120)を示している。スラブ115と領域120の屈折率が、光の屈折率（基本波と第二高調波両方に対する）より小さければ、導波モードが発現し得る。このモードは、界面により発生する第二高調波光の量を増加させるのに使える基板での多重全内部反射を生じさせる。基本波光線100は、例えば導波路の上部表面上に刻まれた或いは浮き上がった回折格子105を使って、導波路中に結合し得る。基本波光は、導波路の長さに沿って伝播し、上部及び底部表面で多数の全内部反射を為す。基板110上の‘x’マークは、測定される表面サンプル（つまり、プローブを含む）を示す。この界面が、材料110と115との間の界面よりも著しく多い第二高調波光を発生するなら、その光強度を無視できる。例えば、もしSHラベルされたターゲットが‘x’位置で固定化プローブに結び付き、110と115の間の界面の原子構造がエピタキシャルに整合しているなら、界面110/120は、界面110/115より余程多い第二高調波光を発生するだろう。
【０２１５】
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【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図1は、第二高調波光の発生及び集光の様式が表面取り付けプロ−ブをもつ基板からの反射によるような装置の一実施形態を示す。
【図２】図2は、第二高調波光の発生及び集光の様式がプリズムを介した全内部反射によるような装置の一実施形態を示す。このプリズムは、表面取り付けプロ−ブを有する基板に屈折率調和材によって連結される。
【図３】図3は、第二高調波光の発生及び集光の様式が、導波路内の破線により示されるような多重反射で導波路を通る全内部反射による装置の一実施形態を示す。
【図４】図4は、生体的要素及び他の流体の、取り付けられたプローブを含む基板に対して届ける及び除去のためのフローセルの一実施形態を示す。
【図５】図5は、第二高調波光の発生及び集光の様式が、サンプルを通過する透過による装置の三つの実施形態を示す。図5Aでは、第二高調波光線が基本波と共線である。図5Bでは、第二高調波が基本波に直交する方向から集められる（‘直角集光’）。図5Cでは、第二高調波光が積分球および光ファイバー線によって集められる。
【図６】図6は、一連の光学的な要素を使った、基本波光を平行化したビームを基板のスキャニングに適した線形状へ変換する実施形態を示す。
【図７】図7Aは、アレイ形式（要素1〜35）へとパターン化された基板表面（取り付けられたプローブを含む）の実施形態を示す。図7Bは、表面取り付けプローブを有する基板アレイの一要素を示している。各要素は壁付きウェルであり、このウェルが、何れかの液体を保持しウェルの内容物を隣接するウェルや基板の他の部分から物理的に隔離することができるものである。
【図８】図8は、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドのサンプルを基板表面に取り付けるために使用される表面化学の一実施形態を示す。
【図９】図9Aは、多数のウェル(1〜16)を含む基板の実施形態を示し、その各々は図9Bに示すような表面取り付けプローブを含む。
【図１０】図10は、反射性被膜の上のアミノシランの表面取り付け層を使用した装置基板の実施形態を示す。アミノシラン層の下の反射性被膜は、非線形光の集光を改善する。アミノシラン層は、生体分子や他のプローブ要素を基板に結び付けるのに適している。
【図１１】図11は、光ファーバーを通じた第二高調波光の発生と集光の様式である装置の実施形態を示す。図11Aは光ファイバー束の使用を示し、図11Bはプローブ取り付けのためのファイバー端に結合したビーズの使用を示す。
【図１２】図12は、サンプルの透過による第二高調波光の発生と集光の様式である装置の三つの実施形態を示す。図12Aは、基本波と第二高調波光線の両方がサンプル中を共線的に進むものを示す。図12Bは、基本波と第二高調波光線が、基板の上部表面（上部表面が取り付けプローブを含む）で、この表面で第二高調波光を発生しながら屈折するものを示す。図12Cは、底部表面（底部表面が取り付けプローブを含む）が第二高調波を発生することを除いて、図12Bに示されるものと同様の装置を示す。
【図１３】図13は、第二高調波光が界面での全内部反射によって発生する装置の二つの実施形態を示す。第二高調波光の発生点は、円で示される。図13Aでは、ダブプリズムが、第二高調波光を発生し得る表面（プリズムの底部表面、しかし屈折率調和材を介してプリズムに連結する他の面でもよい）に、光を案内するのに使われる。図13Bでは、導波路構造が、第二高調波発生の多数点を生じるのに使われる。
【図１４】図14は、第二高調波光が、光ファイバー線（ファイバー端に取り付けプローブをもつ）を使って発生する装置の三つの実施形態を示す。図14Aは、第二高調波光の発生と集光とを共に同じファイバーで行われる装置を示す。図14Bは、ファイバー端に表面取り付けプローブを含むビーズの使用を示す。図14Cは、第二高調波光が、光ファイバーの端（含取り付けプローブを含む）で発生し、光ファイバー外のミラーやレンズを使って集光される装置を示す。
【図１５】図15は、基本波のパワー増強のために光キャビティを使う装置の二つの実施形態を示す。
【図１６】図16は、第二高調波光の発生と集光の様式が界面からの光の反射を用いる装置の三つの実施形態を示す。
【図１】
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【図２】
2004530105.tif 000009
【図３】
2004530105.tif 000010
【図４】
2004530105.tif 000011
【図５】
2004530105.tif 000012
【図６】
2004530105.tif 000013
【図７】
2004530105.tif 000014
【図８】
2004530105.tif 000015
【図９】
2004530105.tif 000016
【図１０】
2004530105.tif 000017
【図１１】
2004530105.tif 000018
【図１２】
2004530105.tif 000019
【図１３】
2004530105.tif 000020
【図１４】
2004530105.tif 000021
【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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