(57)【要約】本発明は、単離されたポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームＯＲＦＸ、ならびにＯＲＦＸをコードするポリペプチドおよびＯＲＦＸまたは任意の誘導体、改変体、変異体に免疫特異的に結合する抗体、またはＯＲＦＸポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体のフラグメントを提供する。本発明は、さらに、ＯＲＦＸポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が、広範囲の病理学的状態の検出および処置において使用される方法、ならびに他の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子は、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列またはその相補体を含むポリペプチドをコードし、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該分子は、配列番号２ｎ−１からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列、またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ここで、ｎは、任意の整数１〜１３６１である、単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該分子は、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列において１以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子であって、ここで、該分子は、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸分子であって、ここで、該分子は、配列番号２ｎ−１からなる群から選択されるヌクレオチドの配列、またはその相補体を含み、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、単離された核酸分子。
【請求項６】
１００未満のヌクレオチド長であり、かつ配列番号２ｎ−１からなる群から選択される少なくとも６個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、またはその相補体であって、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドであって、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、精製されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは、任意の整数１〜３１６１である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項１３】
以下：
ａ）請求項１に記載の核酸；
ｂ）請求項１０に記載のポリペプチド；および
ｃ）請求項１２に記載の抗体；
からなる群から選択される治療的または予防的に有効な量の治療剤、ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
１以上の容器において、治療的または予防的に有効な量の、請求項１３の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項１５】
請求項１０に記載のポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、前記核酸分子が発現される条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
サンプル中の請求項１０に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、該方法は、前記ポリペプチドと前記化合物との間の複合体の形成を可能にする条件下で該ポリペプチドに選択的に結合する化合物に該サンプルを接触させる工程、ならびに存在する場合、該複合体を検出し、それによって該サンプル中の該ポリペプチドを同定する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
サンプル中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、該方法は、該サンプルを該核酸分子に選択的に結合する核酸プローブまたはプライマーと接触させる工程および請求項１に記載の核酸分子に結合された該核酸プローブまたはプライマーが、該サンプル中に存在するか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１０に記載のポリペプチドを含む細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するために十分な量で該ポリペプチドに結合する化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
ＯＲＦＸ関連障害を伴なう症候群を処置するための、医薬の製造における治療剤の使用であって、ここで、該治療剤は、以下：
ａ）請求項１に記載の核酸；
ｂ）請求項１０に記載のポリペプチド；および
ｃ）請求項１２に記載の抗体；
からなる群から選択される、使用。
【請求項２０】
ＯＲＦＸ関連障害に対する活性または潜在期のモジュレーターあるいは素因についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）試験化合物を請求項１０に記載のポリペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該試験化合物が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、該試験化合物の該ポリペプチドへの結合は、該試験化合物がＯＲＦＸ関連障害に対する活性または潜在期のモジュレーターあるいは素因であることを示す、方法。
【請求項２１】
ＯＲＦＸ関連障害に対する活性または潜在期のモジュレーターあるいは素因についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）危険性が増大したＯＲＦＸ関連障害において試験化合物を試験被験体に投与する工程であって、ここで、該試験被験体は、請求項１に記載のヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを組み換え的に発現する、工程；
ｂ）該試験被験体中の該タンパク質の活性を測定する工程；
ｃ）該タンパク質を組み換え的に発現し、そしてＯＲＦＸ関連障害についての危険性が増大してないコントロール被験体における該タンパク質の活性を測定する工程；ならびに
ｄ）該試験被験体および該コントロール被験体における該タンパク質の発現を比較する工程であって、ここで、該コントロール被験体に比較した該試験被験体における該タンパク質の活性の変化は、該試験化合物がＯＲＦＸ関連障害に対する潜在期のモジュレーターまたは素因であることを示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記試験動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、またはプロモーターの制御下で野生型試験動物に比較して増大したレベルで該導入遺伝子を発現する組み換え試験動物であり、そしてここで、該プロモーターは、該導入遺伝子のネイティブ遺伝子プロモーターでない、方法。
【請求項２３】
被験体における、請求項１１に記載のポリペプチドの変化されたレベルを伴なう疾患の存在またはこの疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該被験体からサンプル中の該ポリペプチドの量を測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）における該ポリペプチドの量を、コントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程；
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較される場合の、工程（ａ）における該ポリペプチドのレベルにおける変化は、該被験体の疾患の存在またはこの疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項２４】
前記被験体は、ヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における、請求項１に記載の核酸分子の変化したレベルを伴なう疾患の存在またはこの疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）哺乳動物被験体からサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
ｂ）工程（ａ）における該核酸の量をコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程；
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較される場合の、工程（ａ）における該核酸のレベルにおける変化は、該被験体中の該疾患の存在またはこの疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項２６】
前記被験体はヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験体における、ＯＲＦＸ関連障害を伴なう病理学的状態を処置または予防する方法であって、該方法は、該病理学的状態を軽減または予防するために十分な量で請求項１０に記載のポリペプチドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記被験体が、ヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体における、ＯＲＦＸ関連障害を伴なう病理学的状態を処置または予防する方法であって、該方法は、該病理学的状態を軽減または予防するために十分な量で請求項１に記載の核酸分子を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記被験体は、ヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
被験体における、ＯＲＦＸ関連障害を伴なう病理学的状態を処置または予防する方法であって、該方法は、該病理学的状態を軽減または予防するために十分な量で請求項１２に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
前記被験体は、ヒトである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、概して、核酸およびそれによってコードされるポリペプチド、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを用いる方法に関する。
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、新規ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸、およびそれによってコードされるポリペプチドの発見に基づく。この核酸およびポリペプチドは、総称して「ＯＲＦＸ」と本明細書において称する。
【０００３】
従って、１つの局面において、本発明は、単離された核酸分子（配列番号２ｎ−１、ここで、ｎは１〜３１６１の間の整数である）を提供する。これらは、新規ポリペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログもしくは誘導体をコードする。この核酸は、例えば、配列番号２ｎのアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ここで、ｎは、１〜３１６１の間の整数である。この核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００４】
本発明に含まれるのはまた、本明細書において記載される核酸の１つ以上を含むベクター、および本明細書において記載されるベクターもしくは核酸を含む細胞である。
【０００５】
本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００６】
別の局面において、本発明は、薬学的組成物を含み、この組成物は、ＯＲＦＣ核酸および薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈物を含む。
【０００７】
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＯＲＦポリペプチド（例えば、ＯＲＦＸ核酸ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体によってコードされる任意のＯＲＦＸポリペプチド）を含む。本発明はまた、薬学的組成物を含み、この組成物は、ＯＲＦＸポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤を含む。
【０００８】
なおさらなる局面において、本発明は、ＯＲＦＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。この抗体は、例えば、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログおよび誘導体であり得る。本発明はまた、ＯＲＦＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤を含む薬学的組成物を包含する。本発明はまた、上記の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドにおけるエピトープに結合する、単離された抗体に関する。
【０００９】
本発明はまた、上記の薬学的組成物のいずれかを含むキットを包含する。
【００１０】
本発明はさらに、ＯＲＦＸポリペプチドを生産するための方法を提供する。この方法は、ＯＲＦＸ核酸（例えば、ＯＲＦＸ核酸を含むベクター）を含む細胞を提供する工程、およびその細胞を、その核酸によってコードされるＯＲＦＸポリペプチドを発現するに充分な条件下で培養する工程による。次いで、発現されたＯＲＦＸポリペプチドは、その細胞から回収される。好ましくは、この細胞は、内因性のＯＲＦＸポリペプチドを殆どまたは全く生産しない。この細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００１１】
本発明はまた、サンプル中のＯＲＦＸポリペプチドまたは核酸を、そのサンプルに、そのポリペプチドまたはかくさんに特異的に結合する化合物を接触させる工程、および存在する場合に複合体形成を検出する工程によって同定する方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、ＯＲＦＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ＯＲＦＸポリペプチドに化合物を接触させる工程およびそのＯＲＦＸポリペプチド活性が改変されるか否かを決定する工程による。
【００１３】
本発明はまた、ＯＲＦＸポリペプチドにその化合物に接触させる工程、およびその化合物がＯＲＦＸポリペプチドの活性を改変するか否かを決定する工程によって同定されたＯＲＦＸポリペプチド活性を調節し、そのＯＲＦＸポリペプチドに結合するか、またはＯＲＦＸポリペプチドをコードする核酸分子に結合する、化合物に関する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、被験体においてＯＲＦＸ関連障害の存在またはその素因を決定する方法を提供する。この方法は、その被験体からサンプルを提供する工程、およびＯＲＦＸポリペプチドをその被験体サンプルにおいて測定する工程を包含する。次いで、その被験体サンプルにおけるＯＲＦＸポリペプチドの量は、コントロールサンプルにおいてＯＲＦＸポリペプチドの量と比較される。その被験体タンパク質サンプルにおいて、そのコントロールタンパク質サンプルにおけるＯＲＦＸポリペプチドの量に比較しての、ＯＲＦＸポリペプチドの量における変化は、組織増殖関連条体をその被験体が有することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、適合した個体（すなわち、類似の年齢、性別または他の全体的状態を有するが、組織増殖関連状態を有するとは推測されない被験体）からとられる。あるいは、そのコントロールサンプルは、その被験体が組織増殖関連障害を有するとは推測されないときに、その被験体からとられ得る。いくつかの実施形態において、ＯＲＦＸは、ＯＲＦＸ抗体を用いて検出される。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、被験体においてＯＲＦＸ関連障害の存在または素因を決定する方法を提供する。この方法は、その被験体から核酸サンプル（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはその両方）を提供する工程、およびそのＯＲＦＸ核酸の量を、その被験体核酸サンプルにおいて測定する工程を包含する。次いで、その被験体核酸におけるＯＲＦＸ核酸サンプルの量を、コントロールサンプルにおけるＯＲＦＸ核酸の量と比較する。そのサンプルにおけるＯＲＦＸ核酸量の、コントロールサンプルにおけるＯＲＦＸの量に比較しての変化は、組織増殖関連障害をその被験体が有することを示す。
【００１６】
なおさらなる局面において、本発明は、ＯＲＦＸ関連障害を処置または予防または遅延させる方法を提供する。この方法は、そのような処置または予防または遅延が所望される被験体に、ＯＲＦＸ核酸、ＯＲＦＸポリペプチドまたはＯＲＦＸ抗体を、その被験体における組織増殖関連障害の処置、予防または遅延に充分な量で、投与する工程を包含する。
【００１７】
他に言及しない限り、本明細書において使用されるすべての技術および化学的な用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、本明細書においてその全体が参考として援用される。背反する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示のみであり、そして限定することは意図しない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規ポリペプチドおよびそれによってコードされるヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドおよびそれがコードするポリペプチドは、その遺伝子産物によって果たされる機能に従って分類され得る。そのような機能としては、構造タンパク質、脂質代謝、糖分解、中間代謝、カルシウム代謝、プロテアーゼおよびアミノ酸代謝などの代謝経路に関連するタンパク質を包含する。
【００２０】
本発明に包含されるのは、３１６１の新規核酸配列をよびそれがコードするポリペプチドである。この配列は総称して、「ＯＲＦＸ核酸」またはＯＲＦＸポリヌクレオチド」と呼ばれる。そして、対応するコードされるポリペプチドは、「ＯＲＦＸポリペプチド」またはＯＲＦＸタンパク質」と呼ばれる。例えば、本発明に従うＯＲＦＸ核酸は、ＯＲＦ１核酸を含む核酸であり、そして本発明に従うＯＲＦポリペプチドは、ＯＲＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。他に言及しない限り、「ＯＲＦＸ］とは、本明細書において開示されるＯＲＦ１−３１６１配列のいずれかをいうことが意味される。
【００２１】
表１は、ＯＲＦＸ核酸のまとめを提供し、そしてそれがコードするポリペプチドは表１にまとめられている。本発明に従うＯＲＦＸ核酸についての核酸配列およびポリペプチドの配列は、本明細書において「ＯＲＦＸ核酸およびポリペプチドの配列の開示される配列」と称する節において提供される。
【００２２】
表１の第１欄の「ＯＲＦ番号」と称されるものは、本発明に従うオープンリーディングフレームを含む核酸に割り当てられるＯＲＦ番号を示す。
【００２３】
表１の第２欄の「内部識別番号（核酸配列識別番号、ポリペプチド配列識別番号）」は、示されるＯＲＦに対応する、示されるＯＲＦについての内部識別番号を、配列識別番号（配列番号）とともに提供する。一般に、本発明に従うＯＦＸｎ（ここで、ｎは、１〜３１６１の任意の整数である）、ＯＲＦに対応する核酸は、配列番号２ｎ−１であり、そしてそのＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号２ｎである。例えば、ＯＲＦ１核酸に対応する核酸配列は、配列番号１であり、そしてＯＲＦ１ポリペプチドに対応するポリペプチド配列は、配列番号２である。同様に、ＯＦＧ４核酸に対応する核酸配列は、配列番号７であり、そしてＯＲＦ４ポリペプチドに対応するポリペプチド配列は、配列番号８であり；ＯＲＦ１９８核酸に対応する核酸配列は、配列番号３９５であり、そしてＯＲＦ１９８ポリペプチドに対応するポリペプチド配列は、配列番号３９６である。本明細書に従うＯＲＦＸ核酸についての核酸配列およびポリペプチド配列は、本明細書において、「ＯＲＦＸ核酸およびポリペプチド配列の開示された配列」と称する節において提供される。
【００２４】
表１の第２欄の「タンパク質類似性」と称するものは、ＯＲＦによってコードされるポリペプチドに関連するとして以前に記載されるタンパク質を列挙する。以前に記載されるタンパク質についてのＧｅｎｂａｎｋ識別子が提供される。これらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／から取り出すことができる。
【００２５】
以前に記載されたタンパク質に対する類似性を決定するために、ＯＲＦＸ　ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドを、Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｈｙｔｈｍを用いて、非縮重型のＧｅｎＰｅｐｔ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＢＩ／Ｇｅｎｂａｎｋから）に対して試験した。公知タンパク質に対して「９０」以上のスコアを有したＤＮＡ配列（Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ　ａｌｇｏｔｒｉｔｈｍ　ｓｃｏｒｅ、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＧＣＧ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を選択した。オープンリーディングフレームを、標準的なＤＮＡ翻訳およびコドン表を用いて、適合したタンパク質の領域を超えて展開した。タンパク質適合を欠く新規タンパク質を、標準的な遺伝子コドンに対して翻訳し、そして少なくとも８０アミノ酸を伴い、そしてメチオニン開始を含むタンパク質をその表に含ませた。
【００２６】
表３の第３欄の「タンパク質ドメイン」と称するものは、ＯＲＦによってコードされるポリペプチドに存在する、ｐｆａｍエントリーによって命名された以前に記載されたタンパク質ドメインを列挙する。第３欄に含まれるのはまた、これらのドメインが存在するタンパク質である。ｐｆａｍエントリーは、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／からとることができる。ＤＮＡ配列を、すべての６つのフレームにおいて翻訳し、そしてＨｍｍｅｒ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いて、Ｐｆａｍ　Ｄａｔａｂａｓｅ（アルゴリズムおよびＰｆａｍデータベースに対する参照は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕにおいて見出され得る）に対して試験した。ＰｆａｍデータベースＡＮＤにおいてタンパク質ドメインエントリーに適合した翻訳されたＤＮＡ配列は、７．５のスコアを有したものを選択した。
【００２７】
表３第４欄の「タンパク質分類」と称するものは、その相同性に基づいて、そのタンパク質について割り当てられた分類の型を列挙する。その分類におけるタンパク質の例は、以下のタンパク質を含む：
（アミラーゼ）
アミラーゼは、オリゴサッカリドおよびポリサッカリドにおいて１，４−α−グルコシド結合の内部加水分解を担う。アミラーゼ遺伝子の変異は、遅延性成熟ならびに種々のアミラーゼ産生癌および癌腫の指標であり得る。
【００２８】
（アミロイド）
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質は、脊椎動物タンパク質のファミリーを含む。このファミリーは、おもに高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に関連する。このファミリーの特定のメンバーの合成は、炎症において非常に増加している。慢性炎症１５におけるような、血漿ＳＡＡレベルの長期の上昇は、アミロイド症と呼ばれる病理条体を生じ、これは、肝臓、腎臓および脾臓に罹患し、そしてこれらの組織におけるＳＡＡの高度に不溶な蓄積によって特徴付けられる。アミロイドは、筋肉におけるインスリン刺激されるグルコース利用およびグリコーゲン沈着を選択的に阻害するが、脂肪細胞グルコース代謝には影響を与えない。神経線維変化のように神経内部で、プラークのような細胞外で、および血管内での線維状アミロイドタンパク質の沈着は、アルツハイマー病および加齢性ダウン症候群の両方の特徴である。アミロイド沈着はまた、ＩＩ型糖尿病に関連する。
【００２９】
（アンギオポイエチン）
アンギオポイエチン／フィブリノゲンファミリーのメンバーは、新規の血管の生成を刺激すること、新規の血管の生成を阻害すること、および血餅形成においていくつかの役割を果たすことが示されている。この新規の血管の生成（新脈管形成と呼ばれる）はまた、腫瘍増殖においてその腫瘍が拡張するに必要な血液供給をその腫瘍が得るために必須の工程である。これらの遺伝子における変異は、心臓疾患、多数の血餅形成障害、不全、高血圧、ならびに腫瘍形成および転移の素因の予測指標であり得る。特に、これらの変異は、種々の抗項血圧薬物および化学両方剤および抗腫瘍剤に対する応答の予測指標であり得る。
【００３０】
（アポトーシス関連タンパク質）
能動的細胞自殺（アポトーシス）は、増殖因子の消失および毒素のような事象によって誘導される。アポトーシスはモジュレーターによって制御される。そのモジュレーターは、プログラムされた細胞死に対して阻害（抗アポトーシス）効果またはインヒビターの保護効果をブロックする（プロアポトーシス）効果のいずれかを有する。多くのウイルスは、その自分の標的細胞をあまり早くに死ぬことを妨害するその自分の抗アポトーシス遺伝子をコードすることによって防衛的アポトーシスを相殺する経路を見入らす。アポトーシス関連遺伝子の変異は、＿加齢性薬物の処方物において有用であり得る。
【００３１】
（カドヘリン、サイクリン、ポリメラーゼ、オンコジーン、ヒストン、キナーゼ）
細胞分裂／細胞周期経路のメンバー（例えば、サイクリン、多くの転写因子およびキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ヒストン、ヘリカーゼおよび他のオンコジーン）は、癌発生において重要な役割を果たしており、ここでは、細胞の制御されない増殖が腫瘍形成をもたらし、それによって最終的に転移をもたらす。これらの遺伝子における変異は、任意の形（腫瘍形成の危険の増加から転移の速度の増加まで）の癌の素因の予測指標であり得る。特に、これらの変異は、種々の化学療法剤および抗腫瘍剤に対する応答の予測指標であり得る。
【００３２】
（コロニー刺激因子関連タンパク質）
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子は、造血において作用するサイトカインである。これは、血液の２つの関連する白血球である顆粒球および単球マクロファージの集団の生産、分化および機能を制御することによる。
【００３３】
（補体関連タンパク質）
補体タンパク質は、免疫に関連する細胞傷害性因子であり、連鎖反応で作用して、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成することによって、抗体でオプソニン化された（プライム刺激された）標的細胞を根絶させるように作用する。殺傷機構は、その標的細胞の膜に穴をあけることによる。２０個の補体遺伝子における変異またはそのインヒビターは、多くの自己免疫疾患に関連する。改変された血清レベルの補体産物は、種々の組織浮腫、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、脈管炎、糸球体腎炎、腎不全、溶血性貧血、血小板減少症および関節炎を生じる。これらは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）の機構に介入し、免疫能力をかなり損なわせ、そして食細胞能力を低減させる。補体遺伝子の変異はまた、Ｉ型糖尿病、髄膜炎神経障害（例えば、ネマリンミオパシー）、新生児低血圧、筋肉障害（例えば、先天性ミオパシーおよび他の疾患の指標である。
【００３４】
（シトクロム）
呼吸鎖は、重要な生化学的経路であり、これは、すべての好気性細胞にとって必須である。呼吸鎖に関与する５つの異なるシトクロムが存在する。これらは、ヘム結合タンパク質であり、電子キャリアとして作用する。これらの遺伝子における改変は、運動失調反射消失、痴呆ならびに筋肉におけるミオパシー変化およびニューロパシー変化の予測指標であり得る。また、種々の固形腫瘍とも関連する。
【００３５】
（カイネシン）
カイネシンは、チューブリン分子モーターであって、細胞内でオルガネラを輸送し、そして細胞分裂の間微小管に沿って染色体を移動させるように機能する。これらの遺伝子の改変は、脳のピック病、結節硬化のような神経学的障害の指標であり得る。
【００３６】
（サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン）
サイトカインファミリーのメンバーは、細胞増殖および分裂を低濃度でさえ刺激する強力な能力で知られる。サイトカイン（例えば、エリスロポイエチン）は、その増殖刺激が細胞特異的であり、エリスロポイエチンは、赤芽球の増殖の刺激に有用である。サイトカインにおける変異は、広汎な種々の疾患（癌の素因を含む）について予測指標であり得る。
【００３７】
（Ｇタンパク質共役レセプター）
Ｇタンパク質共役レセプター（Ｒ７Ｇとも呼ばれる）は、広汎な群のホルモン、神経伝達物質、臭気物質および光のレセプターであり、これらは、細胞外シグナルをグアニンヌクレオチド結合（Ｇ）タンパク質との相互作用によって伝達する。Ｇ共役タンパク質をコードする遺伝子における改変は、膨大な数の生理学的状態に関与し得そしてその指標であり得る。これらとしては、血圧調節、腎臓不全、雄性不妊、ドパミン関連認識、冠状および内分泌機能、高カルシウム血症、軟骨形成不全および骨粗鬆症、擬性上皮小体機能低下、成長遅延、および小人症が挙げられる。
【００３８】
（チオエステラーゼ）
真核生物チオールプロテアーゼは、活性部位であるシステインを含むタンパク質分解酵素のファミリーである。触媒は、チオエス照り中間体を介して進行し、そして付近のヒスチジン側鎖によって容易にされる。アスパラギンは、必須の触媒三つ組みと競合する。チオエステル関連遺伝子の変異は、神経障害および精神病（例えば、セロイド脂褐素沈着症，、神経１、乳児性、サンタブオリ（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ）病など）の予測指標であり得る。
【００３９】
この分子型にとって重要であるのは以下のとおりである：
略語　　　　　　　　　　　　　　　　　タイトル
ａｍｙｌａｓｅ　　　　　　　　　　　　アミラーゼタンパク質
ａｍｙｌａｓｅｉｎｈｉｂ　　　　　　　アミラーゼインヒビター
ａｍｙｌｏｉｄ　　　　　　　　　　　　アミロイドタンパク質
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　　　　　　　　　　アポトーシス関連タンパク質
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｈｉｂ　　　　　アポトーシスインヒビター
ａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｃｅｐ　　　　　アポトーシスレセプター
ＡＴＰａｓｅ＿ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　アポトーシスレセプター
ｂｉｏｔｉｎｄｅｐ　　　　　　　　　　ビオチン依存性酵素／タンパク質
ｃａｄｈｅｒｉｎ　　　　　　　　　　　カドヘリンタンパク質
ｃａｌｃｉｕｍ＿ｃｈａｎｎｅｌ　　　　カルシウムチャネルタンパク質
ｃａｒｂｏｚｙｌａｓｅ　　　　　　　　カルボキシラーゼタンパク質
ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　　　　　　　　　　カテプシン／カルボキシペプチダーゼ
ｃａｔｈｅｐｓｉｎｉｎｈｉｂ　　　　　カテプシン／カルボキシペプチダーゼインヒビター
ｃｈｌｏｒｉｄｅ＿ｃｈａｎｎｅｌ　　　クロリドチャネルタンパク質
ｃｏｌｌａｇｅｎ　　　　　　　　　　　コラーゲン
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　　　　　　　　　補体タンパク質
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｒｅｃｅｐｔ　　　補体レセプタータンパク質
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｈｉｂ　　　　補体インヒビター
ｃｓｆ　　　　　　　　　　　　　　　　コロニー刺激因子
ｃｓｆｒｅｃｅｐｔ　　　　　　　　　　コロニー刺激因子レセプター
ｃｙｃｌｉｎ　　　　　　　　　　　　　サイクリンタンパク質
ｃｙｔｏ４５０　　　　　　　　　　　　シトクロム４５０タンパク質
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍ　　　　　　　　　　シトクロム関連タンパク質
ｄｅａｍｉｎａｓｅ　　　　　　　　　　デアミナーゼ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　　　　　　デヒドロゲナーゼ
ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ　　　　　　　　　デサチュラーゼ
ｄｎａ＿ｒｎａ＿ｂｉｎｄ　　　　　　　ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質／因子
ｄｎａ＿ｒｎａ＿ｉｎｈｉｂ　　　　　　ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質／因子インヒビター
ｄｙｎｅｉｎ　　　　　　　　　　　　　ダイネイン
ｅｌａｓｔａｓｅ　　　　　　　　　　　エラスターゼ
ｅｌａｓｔａｓｅｉｎｈｉｂ　　　　　　エラスターゼインヒビター
ｅｐｈ　　　　　　　　　　　　　　　　チロシンキナーゼのＥＰＨファミリー
ｅｒａｓｔａｓｅｉｎｈｉｂ　　　　　　エラスターゼインヒビター
ｆｇｆ　　　　　　　　　　　　　　　　線維芽細胞増殖因子
ｆｇｆｒｅｃｅｐｔｏｒ　　　　　　　　線維芽細胞増殖因子レセプター
ｇａｂａ　　　　　　　　　　　　　　　ＧＡＢＡレセプター
ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ　　　　　　　グルコアミラーゼ
ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ　　　　　　グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　　　　　　　糖タンパク質
Ｇｕａｎｙｌｙｌ　　　　　　　　　　　グアニレートシクラーゼ
ｈｅｌｉｃａｓｅ　　　　　　　　　　　ヘリカーゼ
ｈｉｓｔｏｎｅ　　　　　　　　　　　　ヒストン
ＨＯＭ　　　　　　　　　　　　　　　　相同性
ｈｏｍｅｏｂｏｘ　　　　　　　　　　　ホメオボックスタンパク質
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　　　　　　　　　　ヒドロラーゼ
ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ　　　　　ヒドロキシステロイド関連タンパク質
ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　　　　　　　ヒポキサンチン関連タンパク質
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂ　　　　　　　　　免疫グロブリン
ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｒｅｃｅｐｔ　　　免疫グロブリンレセプター
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　　　　　　　　インターフェロン
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　　　　　　　　インターロイキン
ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｒｅｃｅｐｔ　　インターロイキンレセプター
ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　　　　　　　　　　イソメラーゼ
ｉｓｏｍｅｒａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　イソメラーゼインヒビター
ｉｓｏｍｅｒａｓｅｒｅｃｅｐｔｏｒ　　イソメラーゼレセプター
ｋｉｎａｓｅ　　　　　　　　　　　　　キナーゼ
ｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　　　　キナーゼインヒビター
ｋｉｎａｓｅｒｅｃｅｐｔｏｒ　　　　　キナーゼレセプター
ｋｉｎｅｓｉｎ　　　　　　　　　　　　カイネシン
ｌａｍｉｎｉｎ　　　　　　　　　　　　ラミニン関連タンパク質
ｌｉｐａｓｅ　　　　　　　　　　　　　リパーゼ
ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　　　　メタロチオネイン
ＭＨＣ　　　　　　　　　　　　　　　　主要組織適合性複合体
ｍｉｓｃ＿ｃｈａｎｎｅｌ　　　　　　　種々のチャネル
ｎｇｆ　　　　　　　　　　　　　　　　神経成長因子
ｎｕｃｉ＿ｒｅｃｐｔ　　　　　　　　　核レセプター
ｎｕｃｌｅａｓｅ　　　　　　　　　　　ヌクレアーゼ
ｏｎｃｏｇｅｎｅ　　　　　　　　　　　オンコジーン関連タンパク質
ｏｘｉｄａｓｅ　　　　　　　　　　　　オキシダーゼ
ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　　　　　　　　　　オキシゲナーゼ
ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　　　　　　　　　　ペプチダーゼ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　　　　　　　　　ペルオキシダーゼ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　　　　　　　　ホスファターゼ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂ　　　ホスファターゼインヒビター
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　　　　　　ホスホリラーゼ
ＰＩＲ　　　　　　　　　　　　　　　　ＰＩＲ　ＤＡＴＡＢＡＳＥ　（リリース５６，２９−ＯＣＴ　１９９８）
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　　　　　　　　　ポリメラーゼ
ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ　　カリウムチャネルタンパク質
ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　　　　　　プロスタグランジン
ｐｒｏｔｅａｓｅ　　　　　　　　　　　プロテアーゼ
ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂ　　　　　　プロテアーゼインヒビター
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　　　　　　　　　　レダクターゼ
ｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔ　　　　　　リボソーム関連タンパク質
ＲＴＲ　　　　　　　　　　　　　　　　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（２０−ＪＵＬ−１９９８）に取り込まれていないＥＭＢＬＤＡＴＡＢＡＳＥ翻訳エントリー
ＳＩＭ　　　　　　　　　　　　　　　　類似
ＳＰＴＲ　　　　　　　　　　　　　　　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（２０−ＪＵＬ−１９９８）に取り込まれたＥＭＢＬ　ＤＡＴＡＢＡＳＥ翻訳エントリー
ｓｔｒｕｃｔ　　　　　　　　　　　　　構造関連タンパク質
ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　　　スルホトランスフェラーゼ
ＳＷＰ　　　　　　　　　　　　　　　　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　ＤＡＴＡＢＡＳＥ（リリース　１８−ＯＣＴ−１９９８）
ＳＷＰＮ　　　　　　　　　　　　　　　ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ　Ｕｐｄａｔｅ（リリース１１−ＮＯＶ−９８）
ｓｙｎｔｈａｓｅ　　　　　　　　　　　シンターゼ
ｔｇｆ　　　　　　　　　　　　　　　　トランスフォーミング増殖因子
ｔｇｆｒｅｃｅｐｔｏｒ　　　　　　　　トランスフォーミング増殖因子レセプター
ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ　　　　　　　チオエステラーゼ
ｔｈｉｏｌａｓｅ　　　　　　　　　　　チオラーゼ
ｔｍ７　　　　　　　　　　　　　　　　７回膜貫通ドメインＧ共役レセプター
ｔｎｆ　　　　　　　　　　　　　　　　壊死因子レセプター
ｔｒａｆｆｉｃ　　　　　　　　　　　　腫瘍壊死因子
ｔｎｆｒｅｃｅｐｔｏｒ　　　　　　　　腫瘍トラフィキング関連タンパク質
ＴＲＮ　　　　　　　　　　　　　　　　ＥＭＢＬ　ＤＡＴＡＢＡＳＥ翻訳エントリーアップデート（２０−ＪＵＬ−１９９８）
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｆａｃｔｏｒ　　　転写因子
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　　　　　　　　トランスフェラーゼ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　　　　　　　　　　輸送タンパク質
ｔｕｂｕｌｉｎ　　　　　　　　　　　　チューブリン
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　　　　　　　　　　ユビキチン
ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　　　　　　　上記タンパク質ファミリーのどれにも分類されないタンパク質
ｗａｔｅｒ　ｃｈａｎｎｅｌ　　　　　　水チャネルタンパク質
表１第５欄の「遺伝子が発現される細胞または組織」と称するものは、５桁の数字で表される組織を示し。この組織では、ＯＲＦ核酸配列に相同なＲＮＡが存在する。その数字に対応する組織または細胞は表２に提供する。
【００４０】
本発明に従うＯＲＦＸ核酸およびそれがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。例えば、本発明に従う種々のＯＲＦＸ核酸およびポリペプチドは、とりわけ、表１に示されるタンパク質ファミリーの新規メンバーとして、そして／または表１にまとめられる以前に記載されたタンパク質に関連するドメインおよび配列の存在に従って有用である。
【００４１】
本発明に従うＯＲＦＸ核酸およびポリペプチドはまた、本発明に従う示されたＯＲＦＸについて表１に列挙される細胞型を同定するために使用され得る。本発明に従うＯＲＦＸ核酸およびポリペプチドについてのさらなる有用性は、本明細書において開示される。
【００４２】
（ＯＲＦＸ核酸）
本発明の新規核酸は、ＯＲＦＸまたはＯＲＦＸ様タンパク質、あるいはその生物学的活性部分をコードするものを包含する。その核酸としては、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１である）の１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。従って、そのコードされたポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、６、８、１０．．．、６３１０、６３１２、６３１６、６３１８、６３２０、および／または６３２２のアミノ酸配列を含み得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかの核酸配列、またはそのフラグメントを含む。さらに、本発明は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかまたはそのフラグメントの変異体または改変体の核酸を含む。これらの塩基のいずれかは、ＯＲＦＸ様の活性および生理学的なその機能を維持するタンパク質をなおもコードしつつ開示された配列から変化され得る。本発明は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎは１〜３１６１である）（そのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）の相補体を含む。本発明はさらに、核酸または核酸フラグメント、あるいはそれらの相補体を含み、その構造は、化学改変を含む。
【００４４】
含まれるものはまた、ＯＲＦＸコード核酸（例えば、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するに充分な核酸フラグメント、およびＯＲＦＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するためのフラグメントである。本明細書において使用される場合、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。この核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４５】
「プローブ」とは、可変長の核酸配列をいう。使用に応じて、好ましくは、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）であり、１００ｎｔ、または例えば、約６０００ｎｔほどの大きさである。プローブは、同一の、類似のまたは相補的な核酸配列の検出において使用される。より長い長さのプローブが、通常、天然のまたは組換えの供給源から得られ、オリゴマーよりもより高度に特異的であり、そしてはるかにハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計され得る。
【００４６】
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。単離されたか核酸分子の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおけるその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’または３’末端において配置される配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、その単離されたＯＲＦＸ核酸分子は、５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または１ｋｂの核酸配列未満を含み得、これらは、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子に天然に隣接する。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって生成されるとき他の細胞物質も培養培地も実質的に含まず、しかも、化学合成されるときその化学的前駆体も他の化学物質も含まない。
【００４７】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号２ｎ−１（ここでｎは１〜３１６１）を有する核酸分子）またはこのヌクレオチド配列のいずれかの相補体は、標準的な分子生物学的技術および本明細書において提供される配列情報を用いて単離され得る。配列番号２ｎ−１のいずれかの核酸配列のすべてまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて（ここで、ｎは１〜３１６１）、ＯＲＦＸ核酸配列を、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて単離し得る（例えば、以下に記載される：Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　２ｎｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ａｎｄ　Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３）。
【００４８】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはあるいはＤＮＡをテンプレートとして、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、ＯＲＦＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術によって調製し得る（例えば、自動ＤＮＡ合成器）。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応を用いて使用されるべき充分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づくかまたはそれから設計され得、そしてこれを使用して、特定の細胞または組織において同一、類似または相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを増幅、確認またはその存在を明らかにする。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含み、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態において、１００ｎｔ未満の長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎは１〜３１６１）のいずれかの少なくとも６つの連続したヌクレオチドまたはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてこれをプローブとして使用し得る。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかにおいて示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに示されたヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列の一部のの相補体である核酸分子を含む。示されたヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに示されるヌクレオチド配列に充分に相補的であるものであり、これは、それが配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかにおいて示されるヌクレオチド配列とは殆どまたは全くミスマッチを有さずに水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成し得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド単位の間のワトソンクリックまたはホーフステーン塩基対合をいい、そして用語「結合」とは、２つのポリペプチドもしくは化合物またはそれに関連するポリペプチドもしくは化合物あるいはそれらの組合せを意味する。結合には、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性の相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接または間接的のいずれかであり得る。間接的な相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じるかまたはそれに起因し得る。直接結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じるかまたは起因しては生ぜす、代わりにほかに実質的な化学的中間体を伴わない相互作用である。
【００５２】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかの核酸配列の一部のみを含み得る（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント、またはＯＲＦＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）。本明細書に提供されるフラグメントは、少なくとも６（連続する）核酸のまたは少なくとも４（連続する）アミノ酸の配列と定義される。この長さは、それぞれ、核酸の場合には特異的ハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識を可能にするために充分である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接あるいは改変または部分的置換のいずれかによってネイティブ化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、特定の成分または側鎖に関してネイティブ化合物と類似するが同一でない構造を有するが、ネイティブ化合物とは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物もであり得、または異なる進化起源由来であり得、そして野生型と類似または反対の代謝活性を有し得る。
【００５３】
誘導体およびアナログは、その誘導体またはアナログが下記のように改変された核酸またはアミノ酸を有する場合、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：種々の実施形態において、同一のサイズの核酸またはアミノ酸の配列に対して、またはアラインメントが当該分野において公知のコンピュータ相同性プログラムによってなされるアラインメントされた配列に対して比較される場合、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％でさえの同一性（ここで、好ましい同一性は８０〜９９％）分、本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれをコードする核酸が、ストリンジェント、中程度のストリンジェント、または低ストリンジェントの条件下で、上記タンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る分子。例えば、以下を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３，および下記。例示的なプログラムは、デフォルト設定を用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　ＵＮＩＸ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。これは、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２−４８９。これは、その全体が本明細書において参考として援用される）を用いる。
【００５４】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変種は、上記のヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＯＲＦＸポリペプチドのイソ形態についてコードする配列をコードする。イソ形態は、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、イソ形態は、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＯＲＦＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、これには、哺乳動物が含まれるがそれらに限定されず、そして従って、それは、例えば、マウス、ラット、ラビット、イヌ、ネコ、ウシ、馬、および他の生物を含み得る。相同なヌクレオチド配列としてはまた、以下が挙げられるがそれらに限定されない：本明細書において示されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子改変体および変異体。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＯＲＦＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかにおいて保存的アミノ酸置換（以下を参照）およびＯＲＦＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＯＲＦＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載される。相同なアミノ酸配列は、ヒトＯＲＦＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【００５５】
ヒトＯＲＦＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、開示された細胞型を同定するにおいて使用するために設計されるプローブまたはプライマーを生成することを可能にし、そして／または他の細胞型（例えば、他の組織から）におけるＯＲＦＸホモログおよび他の哺乳動物からＯＲＦＸホモログをクローニングすることを可能にする。プローブ／プライマーは代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、代表的に、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）または配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の天然に存在する変異体の、少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００あるいはそれを超える連続するセンス鎖ヌクレオチド配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００５６】
ヒトＯＲＦＸヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出し得る。種々の実施形態において、そのプローブはさらに、それに付着した標識基を含み、例えば、その標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素の補因子であり得る。そのようなプローブは、ＯＲＦＸタンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断試験の一部として使用され得る。これは、例えば、被験体からの細胞のサンプルにおいてＯＲＦＸコード核酸のレベルを測定すること（例えば、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡレベルを決定すること、またはゲノムＯＲＦＸ遺伝子が変異されたかまたは欠失されているか否かを判定すること）による。
【００５７】
「ＯＲＦＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」本発明のポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似する（必ずしも同一ではない）（特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような）活性を用量依存性または非依存性で示すポリペプチドをいう。「ＯＲＦＸの生物学的活性部分」をコードする核酸フラグメントは、ＯＲＦＸ生物学的活性（ＯＲＦＸタンパク質の生物学的活性は、表１にまとめられている）を有するポリペプチドをコードする、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の一部を単離すること、ＯＲＦＸタンパク質のそのコードされた部分を発現させること（例えば、インビトロ組換え発現による）およびＯＲＦＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＯＲＦＸの生物学的活性部分をコードする核酸フラグメントは、必要に応じて、表１第４欄に示すようなドメインを含み得る。
【００５８】
（ＯＲＦＸ改変体）
本発明はさらに、開示されたヌクレオチド配列とは、遺伝子コードの縮重に起因してことなる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎは１〜３１６１）に示すヌクレオチド配列によってコードされる野と同じＯＲＦＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２ｎ（ここで、ｎは１〜３１６１）のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５９】
配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに示すヒトＯＲＦＸヌクレオチド配列に加えて、当業者は、ＯＲＦＸのアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団内（例えば、ヒト集団内）に存在し得ることを理解する。そのようなＯＲＦＸ遺伝子における遺伝子多型は、天然の対立遺伝子改変に起因して、集団内の個体の間に存在し得る。本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＯＲＦＸタンパク質、好ましくは哺乳動物ＯＲＦＸをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。そのような天然の対立遺伝子改変体は、代表的に、ＯＲＦＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散を生じ得る。天然の対立遺伝子改変の結果であり、そしてＯＲＦＸの機能的活性を変更しないＯＲＦＸにおける任意のおよびすべてのそのようなヌクレオチド変異および生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００６０】
さらに、他の種からのＯＲＦＸタンパク質をコードし、従って、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図される。本発明のＯＲＦＸ　ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトｃＤＮＡまたはその部分を用いて、本明細書において開示されたヒトＯＲＦＸ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離され得る。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６つのヌクレオチド長であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子に対してハイブリダイズする。別の実施形態において、その核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、コード領域とハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件であって、互いに少なくとも６０％相同であるヌクレオチド配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるものを記載することを意図する。
【００６２】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種から由来するＯＲＦＸタンパク質をコードする核酸）または関連する配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングについて当該分野において周知の方法を用いて、プローブとして特定のヒト配列のすべてまたは一部を用いて、低、中程度または高度のストリンジェンシーによって得られ得る。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはしない条件をいう。ストリンジェント条件は、配列に依存し、そして異なる環境において異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、所望のイオン強度およびｐＨで、その特定の配列について熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブがその標的配列に対して平衡でハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度）である。その標的配列配列番号、一般に、過剰に存在することから、Ｔｍにおいて、５０％のプローブが平衡に達する。代表的には、ストリンジェント条件は、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（代表的には、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）で、ｐＨ７．０〜８．３であり、その温度は、短いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件はまた、例えば、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によって達成され得る。
【００６４】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、その条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％，８５％，９０％，９５％，９８％，または９９％の相同な配列が互いにハイブリダイズしたままであるようなものである。非限定的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、６Ｘ　ＳＳＣ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％　ＢＳＡ、および５００　ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中で６５℃でのハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションに続いて、６０℃で０．２×ＳＳＣ，０．０１％　ＢＳＡ中での１回以上の洗浄が続く。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかの配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡの分子をいう（例えば、天然のタンパク質をコードする）。
【００６５】
第二の実施形態において、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体に対して中程度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能である核酸配列が提供される。非限定的な中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００　ｍｇ／ｍｌ　変性サケ精子ＤＮＡ中で５５℃でのハイブリダイゼーション、続いて３７℃で１×ＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。使用され得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である。例えば、以下を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ。
【００６６】
第三の実施形態において、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体に対して、低ストリンジェントの条件下でハイブリダイズ可能な核酸が提供される。非限定的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、４０℃での３５％　ホルムアミド、５Ｘ　ＳＳＣ，５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５），５　ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．０２％　ＰＶＰ，０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ，０．２％　ＢＳＡ，１００　ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ，１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストランサルフェート中でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ，２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．４），５　ｍＭ　ＥＤＴＡ，および　０．１％　ＳＤＳ中での５０℃での洗浄である。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である（例えば、種交叉ハイブリダイゼーションについて使用される）。例えば、以下を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２。
【００６７】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＯＲＦＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、ＯＲＦＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＯＲＦＸタンパク質のアミノ酸配列における変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を有意に変更することなく、ＯＲＦＸの野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＯＲＦＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れられないと予測される。
【００６８】
ＯＲＦＸファミリーメンバーの間で保存されるアミノ酸残基は、より変更されやすくないことが予想される。例えば、本発明によるＯＲＦＸタンパク質は、代表的には、ＯＲＦＸファミリーメンバー中の保存された領域である少なくとも１つのドメイン（例えば、表１に示されるような）を含有し得る。そのため、これらの保存されたドメインは、変異を受けやすいようではない。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＯＲＦＸファミリーのメンバー間で保存されていないか、または半保存的であるにすぎないもの）は、活性に必須ではないなもしれず、従って、より変更を受け易い。
【００６９】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＯＲＦＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＯＲＦＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれのものとも異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、それぞれ、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％の相同性であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸によってコードされるタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに対して少なくとも約８０％の相同性であり、より好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９８％の相同性であり、そして最も好ましくは配列番号２に少なくとも約９９％の相同性である。
【００７０】
配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのタンパク質に対して相同なＯＲＦＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、対応するヌクレオチド配列、すなわち、対応するｎについての配列番号２ｎ−１のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【００７１】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＯＲＦＸ中の予測された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＯＲＦＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異は、ＯＲＦＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【００７２】
１つの実施形態では、変異ＯＲＦＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（１）他のＯＲＦＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分とタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変異ＯＲＦＸタンパク質と、ＯＲＦＸのレセプターとの間の複合体形成；（３）変異ＯＲＦＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（４）ＢＲＡタンパク質に結合する能力；または（５）抗ＯＲＦＸタンパク質抗体に特異的に結合する能力。
【００７３】
（アンチセンス）
本発明の別の局面は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドのまたはＯＲＦＸコード鎖全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのＯＲＦＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のＯＲＦＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００７４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＯＲＦＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基（例えば、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに対応するヒトＯＲＦＸのタンパク質コード領域）に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＯＲＦＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【００７５】
本明細書中に開示されるＯＲＦＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１））を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【００７６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションにさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００７７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＯＲＦＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。これは、例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによる。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【００７８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、ａ−アノマー核酸分子である。ａ−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：３２７〜３３０）を含み得る。
【００７９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
このような改変には、限定的でない例として、その糖リン酸骨格が改変されているかまたは誘導体化されている改変された塩基および核酸が含まれる。このような改変は、少なくとも部分的に、改変された核酸の化学的安定性を増強し、その結果、それらが、例えば、被験体の治療的適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るようにするために行われる。
【００８０】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＯＲＦＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＯＲＦＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＯＲＦＸ　ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１））に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＯＲＦＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００８１】
あるいは、ＯＲＦＸ遺伝子発現は、ＯＲＦＸの調節領域（例えば、ＯＲＦＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＯＲＦＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【００８２】
種々の実施形態において、ＯＲＦＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ　９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【００８３】
ＯＲＦＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。例えば、ＯＲＦＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用され得る。
【００８４】
別の実施形態において、ＯＲＦＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＯＲＦＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：３３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ　５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【００８５】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【００８６】
（ＯＲＦＸポリペプチド）
本発明の新規のタンパク質は、その配列が配列番号２ｎ（ｎ＝１〜３１６１）のいずれかにおいて提供されるＯＲＦＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、その残基のいずれもが、図１に示される対応する残基から変更され得る一方でなお、ＯＲＦＸ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする、変異体タンパク質もしくは改変体タンパク質を含む。例えば、本発明は、上記の改変体ＯＲＦＸ核酸によってコードされるポリペプチドを含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、２０％以上までの残基がこのように変化し得る。
【００８７】
一般に、ＯＲＦＸ様機能を保存するＯＲＦＸ様改変体には、配列中の特定の位置でのその残基が、他のアミノ酸によって置換されている任意の改変体が含まれ、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基の間にさらなる残基（単数または複数）を挿入する可能性ならびに親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性も含まれる。任意のアミノ酸置換、挿入、または欠失は、本発明に包含される。好ましい状況において、その置換は、上記のように定義した保存的置換である。さらに、本発明の範囲を限定することなしに、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかの位置は、置換され得、その結果、変異体もしくは改変体が１つ以上の置換を含み得る。
【００８８】
本発明はまた、単離されたＯＲＦＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを包含する。抗ＯＲＦＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＯＲＦＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＯＲＦＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＯＲＦＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【００８９】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＯＲＦＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。句「細胞性物質を実質的に含まない」は、タンパク質がそれが単離または組換え産生された細胞の細胞性成分から分離されている、ＯＲＦＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、句「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＯＲＦＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＯＲＦＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＯＲＦＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＯＲＦＸタンパク質を約５％未満有する、ＯＲＦＸタンパク質の調製物を含む。ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、これはまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【００９０】
句「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＯＲＦＸタンパク質調製物を含む。１つの実施形態において、句「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＯＲＦＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＯＲＦＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＯＲＦＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＯＲＦＸ化学物質を約５％未満有する、ＯＲＦＸタンパク質調製物を含む。
【００９１】
ＯＲＦＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＯＲＦＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＯＲＦＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＯＲＦＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＯＲＦＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＯＲＦＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＯＲＦＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチドであり得る。
【００９２】
本発明のＯＲＦＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、タンパク質のＦＧＦファミリー間で保存されている上記で同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。さらに、そのタンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そして天然のＯＲＦＸタンパク質の１つ以上の機能的活性について評価され得る。
【００９３】
１つの実施形態において、ＯＲＦＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＯＲＦＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかに実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＯＲＦＸタンパク質は、配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列、そしてより好ましくは、約５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８，またはさらに９９％相同であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２ｎ（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の配列を有する対応するポリペプチドのＯＲＦＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【００９４】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント類似性を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、その配列間の至適な整列のために比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【００９５】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ　１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを用いると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。
【００９６】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較する工程、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導く工程、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算する工程、そして結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導く工程。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性残基のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を、比較の領域にわたって比較し、上記で定義した同一のおよび保存的なアミノ酸置換が両方の配列において生じる位置の数を決定して、整合する位置の数を得、その整合した位置の数を比較の領域（すなわち、ウインドウサイズ）の位置の総数によって分割し、そしてその結果に１００をかけて、陽性残基のパーセンテージを得ることによって、計算される。
【００９７】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＯＲＦＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＯＲＦＸ「キメラタンパク質」またはＯＲＦＸ「融合タンパク質」は、非ＯＲＦＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＯＲＦＸポリペプチドを含む。「ＯＲＦＸポリペプチド」は、ＯＲＦＸに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、一方、「非ＯＲＦＸポリペプチド」は、ＯＲＦＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＯＲＦＸタンパク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＯＲＦＸ融合タンパク質において、このＯＲＦＸポリペプチドは、ＯＲＦＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＯＲＦＸ融合タンパク質は、ＯＲＦＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＯＲＦＸ融合タンパク質は、ＯＲＦＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態では、ＯＲＦＸ融合タンパク質は、ＯＲＦＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＯＲＦＸポリペプチドおよび非ＯＲＦＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＯＲＦＸポリペプチドは、ＯＲＦＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００９８】
例えば、１つの実施形態では、ＯＲＦＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに連結されたＯＲＦＸドメインを含む。このような融合タンパク質は、ＯＲＦＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【００９９】
さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＯＲＦＸ融合タンパク質であり、ここではＯＲＦＸ配列は、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質は組換えＯＲＦＸの精製を容易にし得る。
【０１００】
別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＯＲＦＸタンパク質である。例えば、天然のＯＲＦＸシグナル配列は、除去され得、そして別のタンパク質由来のシグナル配列と置換され得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ＯＲＦＸの発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用を通して増加させ得る。
【０１０１】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ＯＲＦＸ免疫グロブリン融合タンパク質であり、そこでは、１つ以上のドメインを含むＯＲＦＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のＯＲＦＸ免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中の組み込まれ得、そして被験体に投与されて、細胞表面上でのＯＲＦＸリガンドとＯＲＦＸタンパク質との間の相互作用を阻害し得、それによりインビボでのＯＲＦＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。１つの非限定的な例では、本発明の意図されたＯＲＦＸリガンドは、ＯＲＦＸレセプターである。ＯＲＦＸ免疫グロブリン融合タンパク質は、ＯＲＦＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティーを調節するために使用され得る。ＯＲＦＸリガンド／ＯＲＦＸ相互作用の阻害は、増殖および分化の障害の両方の処置、ならびに細胞生存の調節（例えば、促進または阻害）において治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＯＲＦＸ免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体において抗ＯＲＦＸ抗体を産生するための免疫原として、ＯＲＦＸリガンドを精製するために、そしてＯＲＦＸのＯＲＦＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【０１０２】
本発明のＯＲＦＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ技術により生成し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術に従って（例えば、連結のために平滑末端または付着末端を使用すること、適切な末端を与えるための制限酵素消化、適切なように粘着末端を埋める（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）こと、所望されない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結によって）、インフレームで共に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、従来技術（自動化ＤＮＡ合成装置を含む）により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的突出を生じるアンカープライマーを使用して実施し得、これを引き続いて、アニールおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を作製し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、既に融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが、市販されている。ＯＲＦＸをコードする核酸を、このような発現ベクター中にクローニングし得、その結果、融合部分はインフレームでＯＲＦＸタンパク質に連結される。
【０１０３】
（ＯＲＦＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＯＲＦＸアゴニスト（模倣物）またはＯＲＦＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＯＲＦＸタンパク質の改変体に関する。ＯＲＦＸタンパク質の改変体は、変異誘発によって生成され得る（例えば、ＯＲＦＸタンパク質の不連続の点変異または切断）。ＯＲＦＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＯＲＦＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性か、またはサブセットの生物学的活性を維持し得る。ＯＲＦＸタンパク質のアンタゴニストは、ＯＲＦＸタンパク質の天然に存在する形態の１つ以上の活性を、例えば、ＯＲＦＸタンパク質を含む細胞シグナリングカスケードの下流または上流のメンバーへの競合結合により、阻害し得る。従って、特定の生物学的効果は、限定された機能を有する改変体で処置することによって誘発し得る。１つの実施形態において、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、天然に存在する形態のＯＲＦＸタンパク質での処置に比較して被験体における副作用が少ない。
【０１０４】
ＯＲＦＸアゴニスト（模倣物）かまたはＯＲＦＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＯＲＦＸタンパク質の改変体は、ＯＲＦＸアゴニストまたはアンタゴニスト活性についての、ＯＲＦＸタンパク質の変異体（例えば、切断型変異体）のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって同定し得る。１つの実施形態において、ＯＲＦＸ改変体の様々なライブラリーは、核酸レベルでコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして様々な遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＯＲＦＸ改変体の様々なライブラリーは、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に結合することによって（例えば、酵素的に結合することによって）産生され得、その結果、縮重セットの潜在的ＯＲＦＸ配列が、個々のポリペプチドとして発現可能であるか、またはＯＲＦＸ配列のセットをそこに含有するより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として、発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から、潜在的なＯＲＦＸ改変体のライブラリーを生成するために使用され得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機において行われ得、そしてその合成遺伝子は、次いで、適切な発現ベクターに連結される。縮重セットの遺伝子を使用することにより、所望のセットの潜在的なＯＲＦＸ配列をコードする全ての配列を、１つの混合物において、提供することが可能である。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１１：４７７を参照のこと）。
【０１０５】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＯＲＦＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーが、ＯＲＦＸタンパク質の改変体をスクリーニングし、そして引き続いて選択するために、ＯＲＦＸフラグメントの様々な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＯＲＦＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが１分子あたりわずか一回生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理し、その二本鎖ＤＮＡを変性し、そのＤＮＡを再生してセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを異なるニック産物から形成し、一本鎖部分を再形成した二重鎖からＳ１ヌクレアーゼで処理することによって除去し、そしてその得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって、生成され得る。この方法によって、発現ライブラリーが得られ、これは、Ｎ末端およびＯＲＦＸタンパク質の種々のサイズの内部フラグメントをコードする。
【０１０６】
点変異、または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野で公知である。このような技術は、ＯＲＦＸタンパク質の組み合わせ変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためにハイスループット分析に受け入れられやすい最も広汎に使用される技術は、代表的には、複製可能な発現ベクター中への遺伝子ライブラリーのクローニング、適切な細胞の得られるベクターのライブラリーでの形質転換、および所望の活性の検出が、その産物が検出されるその遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのその組み合わせ遺伝子の発現を含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増強する新たな技術である反復的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）が、ＯＲＦＸ改変体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７−３３１）。
【０１０７】
（抗ＯＲＦＸ抗体）
本発明は、本発明の任意のタンパク質に免疫特異的に結合するＦａｂまたは（Ｆａｂ）２のような、抗体および抗体フラグメントをさらに包含する。
【０１０８】
単離されたＯＲＦＸタンパク質、またはそれらの部分もしくはフラグメントが、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して、ＯＲＦＸを結合する抗体を生成するために免疫原として用いられ得る。全長のＯＲＦＸタンパク質が用いられ得る。あるいは、本発明は、ＯＲＦＸの抗原性のペプチドフラグメントを免疫原としての用途のために提供する。ＯＲＦＸの抗原性のペプチドは、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１である）のいずれかに示されるアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドは、ＯＲＦＸのエピトープを、このペプチドに対して惹起された抗体がＯＲＦＸと特異的な免疫複合体を形成するように含む。この抗原性ペプチドは、少なくとも６のアミノ酸残基、少なくとも８のアミノ酸残基、少なくとも１０のアミノ酸残基、少なくとも１５のアミノ酸残基、少なくとも２０のアミノ酸残基、または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。本発明の１つの実施の形態では、抗原性のペプチドは、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１である）のいずれかの少なくとも６の連続アミノ酸を含む。
【０１０９】
本発明の実施態様では、抗原性ペプチドにより含まれるエピトープは、タンパク質の表面に配置されるＯＲＦＸの領域、例えば親水性領域である。抗体産生を標的にするための手段として、疎水性の領域を示すヒドロパシープロットおよび疎水性は、例えば、いずれもＦｏｕｒｉｅｒ変換をともなうか、またはそれをともなわない、Ｋｙｔｅ　ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む当該分野で周知の任意の方法により生成され得る。例えば、これらの全体が参考として本明細書に援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。
【０１１０】
本明細書で開示されるように、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１である）の任意のＯＲＦＸタンパク質配列は、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成における免疫原として利用され得る。本願明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、すなわち、ＯＲＦＸのような、抗原に特異的に結合する（これと免疫反応する）抗原結合部位を含む分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様において、ヒトＯＦＦＸタンパク質に対する抗体が開示される。当該分野で公知の種々の手順が、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１）の任意のＯＲＦＸタンパク質配列、あるいはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産のために用いられ得る。これらのタンパク質のいくつかは、以下で議論される。
【０１１１】
ポリクローナル抗体の生成のため、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）がネイティブタンパク質もしくはそれの合成改変体、またはそれらの誘導体を用いる注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例え、ば組換え的に発現されたＯＲＦＸタンパク質、または化学的に合成されたＯＲＦＸポリペチドを含み得る。調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増加するために用いられる種々のアジュバントとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：フロイント（完全および不完全）アジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）アジュバント、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）または類似した免疫刺激因子。所望の場合、ＯＲＦＸに対する抗体分子が、哺乳動物（例えば、血液から）単離され得、そしてさらに、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知の技術によって精製され、ＩｇＧ画分を獲得し得る。
【０１１２】
本願明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、ＯＲＦＸの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、それが免疫反応する、特定のＯＲＦＸタンパク質に対して、単一の結合親和性を示す。特定のＯＲＦＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製のために、連続的細胞株培養により抗体分子の生成を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７〜９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において利用され得、ヒトハイブリドーマを用いること（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはエプスタインバーウイルスを用いるインビトロでのヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７〜９６頁を参照のこと）によって生成され得る。上記の引用の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０１１３】
本発明に従って、ＯＲＦＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の生成のために、技術は適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法論はＦａｂ発現ライブラリーの構築に適応され（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）、ＯＲＦＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログに対して所望の特性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的同定を可能にする。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。上記の引用の各々は参考として本明細書中に援用される。ＯＲＦＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、以下を含むがこれに限定されない当該分野で公知の技術により生成され得る：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって生産されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生じるＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０１１４】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、組換えの抗ＯＲＦＸ抗体（これらは、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により生成され得る。この技術は、例えば、以下に記載の方法を用いる：ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３、４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４１：４０５３〜４０６０。上記の引用の各々は、参考として本明細書中に援用される。
【０１１５】
１つの実施態様において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の実施態様において、ＯＲＦＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＯＲＦＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＯＲＦＸタンパク質内の１つ以上のドメイン（例えば、図９と比較したときＯＲＦＸに特異的な最初の５０アミノ末端残基に亘るドメイン）に特異的である抗体、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログがまた、本願明細書において提供される。
【０１１６】
抗−ＯＲＦＸ抗体は、ＯＲＦＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプル内のＯＲＦＸタンパク質のレベルを測定する際の使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施態様において、ＯＲＦＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに対する抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物［本明細書中、以降において「治療剤」］として利用される。
【０１１７】
抗−ＯＲＦＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＯＲＦＸを単離するために用いられ得る。抗−ＯＲＦＸ抗体は、細胞からの天然のＯＲＦＸ、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＯＲＦＸの精製を容易にし得る。さらに、抗−ＯＲＦＸの抗体が、（例えば、細胞の溶解液または細胞上清における）ＯＲＦＸタンパク質を検出するために用いられ、ＯＲＦＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗−ＯＲＦＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、この抗体を検出可能物質に連結する（すなわち、（物理的に連結する）ことにより容易であり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、生物発光材料および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１１８】
（ＯＲＦＸの組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＯＲＦＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。他の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を導き得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術における有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本願明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウィルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１１９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられるべき宿主細胞に基づいて選択される、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されるという意味を意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者には明白である。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＯＲＦＸタンパク質、またはＯＲＦＸの変異体、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１２０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＯＲＦＸの発現のために設計され得る。例えば、ＯＲＦＸは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１２１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の可溶性を増加させること；および（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質の分離を組換えタンパク質に可能にする。このよな酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１２２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０１２３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現することである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明のこのような核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０１２４】
別の実施態様において、ＯＲＦＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１２５】
あるいは、ＯＲＦＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１２６】
なお別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ　６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１２７】
別の実施態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指示し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ　８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ　ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびａ−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　３：５３７−５４６）。
【０１２８】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。この調節配列は、種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指示する。例えば、アンチセンスＲＮＡの組織特異的発現、または細胞特異的発現を構成的に指示する、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１２９】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０１３０】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＯＲＦＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１３１】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」およびトランスフェクションとは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１３２】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するもの（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＯＲＦＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する）。
【０１３３】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物細胞および真核生物細胞）は、ＯＲＦＸのタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＯＲＦＸのタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施態様において、本発明の方法は、ＯＲＦＸのタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＯＲＦＸをコードする組換え発現ベクターが導入された）を培養する工程を包含する。別の実施態様において、本発明はさらに、培地または宿主細胞からＯＲＦＸを単離する工程を包含する。
【０１３４】
（トランスジェニック動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施態様において、本発明の宿主細胞は、ＯＲＦＸコード配列が導入された、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＯＲＦＸの配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物に導入され、ここで内因性のＯＲＦＸの配列は変更された。このような動物は、ＯＲＦＸの機能および／または活性を研究するため、およびＯＲＦＸの活性のモジュレーターを同定および／または評価するためにに有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここで１つ以上の動物の細胞が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）のゲノムに組み込まれ、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＯＲＦＸの遺伝子は、内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０１３５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＯＲＦＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精した卵母細胞の雄性前核に導入すること、および卵母細胞が偽妊娠の雌性フォスターアニマル（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１）の、ヒトのＯＲＦＸのｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＯＲＦＸの遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＯＲＦＸの遺伝子）は、ヒトのＯＲＦＸのｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（以下にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＯＲＦＸのタンパク質の発現を指示するために、ＯＲＦＸの導入遺伝子に作動可能に連結される。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で一般的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、動物の組織または細胞中のＯＲＦＸのｍＲＮＡの、そのゲノムおよび／または発現におけるＯＲＦＸの導入遺伝子の存在に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＯＲＦＸをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に繁殖させ得る。
【０１３６】
相同組換え動物を作製するために、少なくとも、ＯＲＦＸの遺伝子の一部を含むベクターを調製し、そこで欠失、付加、または置換が導入され、それによって変化させる（例えば、ＯＲＦＸの遺伝子を機能的に破壊する）。ＯＲＦＸの遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１））であり得るが、より好ましくは、ヒトのＯＲＦＸの遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号２ｎ（ここでｎ＝１〜３１６１）のヒトのＯＲＦＸの遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性のＯＲＦＸの遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施態様において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性のＯＲＦＸの遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０１３７】
あるいは、このベクターは、相同組換えに対して、内因性ＯＲＦＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＯＲＦＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＯＲＦＸ遺伝子ｌの変更された部分は、ＯＲＦＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる内因性ＯＲＦＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＯＲＦＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＯＲＦＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。代表的には、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）は、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記述についてのＴｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚幹細胞株に導入され、導入されたＯＲＦＸ遺伝子は、内因性ＯＲＦＸ遺伝子と相同的に組換えられた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：９１５を参照のこと）。
【０１３８】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ　１１３頁〜１５２頁を参照。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そして胚は一定期間おかれる。それらの胚芽細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを保有する子孫が、動物を繁殖させるために使用され得、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達による、相同的に組換えられたＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ／９３／０４１６９。
【０１３９】
別の実施態様において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することにより「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０１４０】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って産生され得る。要約すれば、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）は単離および誘導され、増殖サイクルから脱出しそしてＧ０フェイズに入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、静止性細胞が単離される同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構成された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物の産まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０１４１】
（薬学的組成物）
本発明のＯＲＦＸ核酸分子、ＯＲＦＸタンパク質、および抗ＯＲＦＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性な化合物」として参照される）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これは参考として本明細書に援用される。このようなキャリアまたは希釈剤の好適な例は、水、生理食塩水、フィンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。不揮発性動物油のようなリポソームおよび非水ビヒクルもまた用いられ得る。薬学的に活性な基質におけるこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性な化合物と不適合である限りを除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補助活性化合物はまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０１４２】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調製され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスまたはプラスチックから作製される多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０１４３】
注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌水性溶液（ここで、水溶解性）または分散物、滅菌注入可能な溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性であるべきであり、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなかければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染行為に対して維持されるべきである。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、砂糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の遅延吸収は、組成物に吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０１４４】
滅菌注射可能液剤は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＯＲＦＸタンパク質あるいは抗ＯＲＦＸ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性媒体および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌散剤の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および既に滅菌濾過されたその液剤からの任意のさらなる所望の成分の散剤を得る。
【０１４５】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そしてさっと動かされ、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０１４６】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１４７】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤によって達成され得る。経皮投与については、この活性成分は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０１４８】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０１４９】
１つの実施態様において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され、手に入れることができる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１５０】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０１５１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体に（例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載のように）任意の数の経路により送達され得る。従って、送達はまた、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる除放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０１５２】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書とともに、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１５３】
（本発明のさらなる使用および方法）
本明細書中で記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体が、以下の１つ以上の方法において使用され得る：（ａ）スクリーニングアッセイ；（ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、細胞および組織タイピング、法医学生物学）；（ｃ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験、および薬理ゲノミックス（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））；ならびに（ｄ）処置の方法（例えば、治療および予防）。
【０１５４】
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＯＲＦＸタンパク質（例えば、遺伝子治療用途における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）を発現するため、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＯＲＦＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＯＲＦＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＯＲＦＸタンパク質は、ＯＲＦＸ活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＯＲＦＸタンパク質の不十分なもしくは過剰な産生によって特徴付けられる障害（例えば、増殖性障害または分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｖｅ）障害）、あるいはＯＲＦＸ野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な活性を有するＯＲＦＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＯＲＦＸ抗体が、ＯＲＦＸタンパク質を検出して単離するため、およびＯＲＦＸ活性を調節するために使用され得る。
【０１５５】
本発明は、さらに、上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０１５６】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＯＲＦＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＯＲＦＸの発現またはＯＲＦＸの活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。
【０１５７】
１実施態様において、本発明は、ＯＲＦＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはその活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ　１２：１４５）。
【０１５８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ　Ｉｎｔ　Ｅｄ　Ｅｎｇｌ　３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　３７：１２３３。
【０１５９】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　ＵＳＰ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
【０１６０】
１実施態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、ＯＲＦＸタンパク質の膜結合形態、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＯＲＦＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＯＲＦＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、この試験化合物のＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって、達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１実施態様において、このアッセイは、ＯＲＦＸタンパク質の膜結合形態、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＯＲＦＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここでこの試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物がＯＲＦＸ、またはその生物学的に活性な部分と、公知の化合物と比較して優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０１６１】
別の実施態様において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ＯＲＦＸタンパク質の膜結合形態またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＯＲＦＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＯＲＦＸタンパク質が、ＯＲＦＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＯＲＦＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＯＲＦＸ相互作用タンパク質を発現する細胞の表面の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外の環境の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＯＲＦＸ標的分子は、本発明の非ＯＲＦＸ分子またはＯＲＦＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１実施態様において、ＯＲＦＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＯＲＦＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞間タンパク質または下流シグナル分子のＯＲＦＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０１６２】
ＯＲＦＸタンパク質がＯＲＦＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接の結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１実施態様において、ＯＲＦＸタンパク質がＯＲＦＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞第二メッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質の標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＯＲＦＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０１６３】
なお別の実施態様において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＯＲＦＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１実施態様において、このアッセイは、ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＯＲＦＸに結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＯＲＦＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に相互作用する能力を決定する工程を包含する。
【０１６４】
別の実施態様において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＯＲＦＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＯＲＦＸタンパク質が、ＯＲＦＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施態様において、この試験化合物がＯＲＦＸの活性を調節する能力の決定は、ＯＲＦＸタンパク質が、ＯＲＦＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上に記載のように決定され得る。
【０１６５】
なお別の実施態様において、無細胞アッセイは、ＯＲＦＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＯＲＦＸに結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＯＲＦＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＯＲＦＸタンパク質が、ＯＲＦＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０１６６】
本発明の無細胞アッセイは、ＯＲＦＸの、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＯＲＦＸを含む無細胞アッセイの場合には、ＯＲＦＸの膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０１６７】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施態様において、ＯＲＦＸまたはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイと自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＯＲＦＸへの結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＯＲＦＸの標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施態様において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインの付加を提供し得る融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＯＲＦＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質またはＯＲＦＸのいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＯＲＦＸの結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０１６８】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＯＲＦＸまたはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＯＲＦＸまたは標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジン被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＯＲＦＸまたは標的分子と反応性であるがＯＲＦＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＯＲＦＸが、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＯＲＦＸまたは標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＯＲＦＸまたは標的分子に関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０１６９】
別の実施態様において、ＯＲＦＸの発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中におけるＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下での、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物不在下でのＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＯＲＦＸの発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、その候補化合物の不在下よりも大きい（統計的に有意に大きい）場合、候補化合物は、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下でその候補化合物の不在下よりも小さい（統計的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中におけるＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、ＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０１７０】
本発明のなお別の局面において、ＯＲＦＸのタンパク質は、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおける「えさ（ｂａｉｔ）たんぱく質」として使用され得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、（１９９３）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、（１９９３）Ｏｎｃｏｎｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＯＲＦＸと結合するかまたは相互作用する他のタンパク質（「ＯＲＦＸ結合タンパク質」または「ＯＲＦＸ−ｂｐ」）を同定し、そしてＯＲＦＸの活性を調節する。このようなＯＲＦＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＯＲＦＸの経路の上流または下流の要素として、ＯＲＦＸのタンパク質によるシグナルの伝播に関与するようである。
【０１７１】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュラの性質の基づく。手短には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を使用する。１つの構築物において、ＯＲＦＸをコードする遺伝子は、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物において、ＤＮＡ配列のライブラリーからの、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列は、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「えさ」および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用し得、ＯＲＦＸ依存複合体を形成する場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが密接に近接される。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されるレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能性転写因子を含む細胞コロニーが単離され得、そしてＯＲＦＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用され得る。
【０１７２】
本発明は、さらに、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規試薬および本明細書中に記載される処置のためのこれらの使用に関する。
【０１７３】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の部分またはフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列は、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし；それによって遺伝病に関連する遺伝子領域を位置決めする；（ｉｉ）微小な生物学的サンプルから個体を同定する（組織型決定）；そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的同定の補助のために使用され得る。
【０１７４】
本発明のＯＲＦＸの配列はまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そしてサザンブロットで検査され、同定のための独特のバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載される「制限酵素ＤＮＡ断片長の多型性」）についてのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０１７５】
さらに、本発明の配列は、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替の技術を提供するために使用され得る。従って、本明細書中に記載されるＯＲＦＸの配列は、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得る。次いで、これらのプライマーは、個体のＤＮＡを増殖し、そして続いてそれを配列決定するために使用され得る。
【０１７６】
この方法で調製される、個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が対立遺伝子の差に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、独特の個体同定を提供し得る。本発明の配列は、個体からおよび組織からのこのような同定配列を得るために使用され得る。本発明のＯＲＦＸの配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子のバリエーションが、これらの配列のコード領域においてはある程度生じ、そして非コード領域においてはより大きな程度に生じる。個々のヒトの間の対立遺伝子のバリエーションは、５００個の塩基の各々当たり約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子のバリエーションの大部分は、単一のヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）に起因し、これは、制限酵素ＤＮＡ断片長の多型性（ＲＦＬＰ）を含む。
【０１７７】
本明細書中に記載された配列のそれぞれは、個体からのＤＮＡが同定の目的のために比較され得る標準として、ある程度、使用され得る。より多くの数の多型性が非コード領域において生じるので、より少ない配列が個体を区別するために必要である。上述したような配列番号２ｎ−１（ここでｎ＝１〜３１６１）の非コード配列は、それぞれが１００個の塩基の非コード増幅配列を産生する、およそ１０〜１，０００個のプライマーのパネルを用いてポジティブな個体の同定を満足に提供し得る。推定されたコード配列が使用される場合、ポジティブな個体の同定のためのより適切な数のプライマーは、５００〜２，０００であり得る。
【０１７８】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミックスおよびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＯＲＦＸのタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＯＲＦＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、異常なＯＲＦＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。本発明はまた、個体がＯＲＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＯＲＦＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＯＲＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０１７９】
本発明の別の局面は、個体におけるＯＲＦＸのタンパク質、核酸の発現あるいはＯＲＦＸの活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬理ゲノミックス」とよばれる）を選択する。薬理ゲノミックスは、個体の遺伝型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０１８０】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＯＲＦＸの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０１８１】
（法医学生物学における部分ＯＲＦＸ配列の使用）
ＤＮＡに基く同定技術はまた、法医学生物学においても使用され得る。法医学生物学は、例えば、犯罪を行う者を積極的に同定する手段として、事件の現場で発見された生物学的証拠の遺伝的型決定を用いる科学分野である。このような同定を行うために、ＰＣＲ技術が、事件の現場で発見された非常に少量の生物学的サンプル（例えば、組織（例えば、毛髪もしくは皮膚）または体液（例えば、血液、唾液、もしくは精液））から採取したＤＮＡ配列を増幅するために使用され得る。次いで、増幅された配列は、標準に対して比較され得、それにより、生物学的サンプルの起源の同定を可能にする。
【０１８２】
本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に対して標的とされるポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供するために使用され得る。これは、例えば、別の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に対して独自の別のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡに基く法医学的同定の信頼度を高め得る。上述したように、実際の塩基配列情報は、制限酵素生成フラグメントにより形成されたパターンの正確な代替として同定のために使用され得る。配列番号　　の非コード化領域に対して標的とされた配列は、より多くの数の多型が非コード化領域で生じるので、この使用のために特に適切であり、この技術を用いて個体を区別することをより容易にする。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＯＲＦＸ配列またはその一部（例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）の１つ以上の非コード化領域に由来するフラグメント）（少なくとも２０塩基、好ましくは、少なくとも３０塩基の長さを有する）が挙げられる。
【０１８３】
本明細書中に記載のＯＲＦＸ配列はさらに、特定の組織（例えば、脳組織など）を同定するために、例えばインサイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得るポリヌクレオチド試薬（例えば、標識されたプローブもしくは標識可能なプローブ）を提供するために使用され得る。これは、法医学病理学者が未知の起源の組織を提示された場合に非常に有用であり得る。このようなＯＲＦＸプローブのパネルは、種および／または器官タイプによって組織を同定するために使用され得る。
【０１８４】
同様の様式で、これらの試薬（例えば、ＯＲＦＸプライマーまたはプローブ）は、組織培養を混入についてスクリーニング（すなわち、培養中の異なるタイプの細胞の混合物の存在についてスクリーニング）するために使用され得る。
【０１８５】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＯＲＦＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＯＲＦＸ活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、異常なＯＲＦＸ発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。本発明はまた、ＯＲＦＸタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＯＲＦＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＯＲＦＸタンパク質、核酸の発現または活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０１８６】
本発明の別の局面は、個体におけるＯＲＦＸタンパク質、核酸の発現あるいはＯＲＦＸ活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の試薬に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための試薬（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０１８７】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＯＲＦＸ発現または活性に対する試薬（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０１８８】
これらおよび他の試薬は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０１８９】
（診断アッセイ）
細胞の増殖が役割を演じる他の状況には、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症、カポージ肉腫および慢性関節リュウマチが挙げられる。
【０１９０】
ＯＲＦＸポリペプチドは、サンプルまたは組織中の相互作用するポリペプチドを同定するために使用され得る。この方法は、サンプルまたは組織をＯＲＦＸと接触させる工程、ＯＲＦＸポリペプチドと相互作用するポリペプチドとの間に複合体を形成させる工程、および存在するならばその複合体を検出する工程を包含する。
【０１９１】
本発明のタンパク質はタンパク質を特異的に結合する抗体の産生を刺激するために使用され得る。このような抗体は、サンプル中のタンパク質の存在を検出するための免疫診断手順において使用され得る。本発明のタンパク質は、細胞増殖（ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ、ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を、このような増殖が好ましい条件下において刺激するために使用され得る。例としては、例えば、造血および血小板形成、胃腸管の管壁（ｌｉｎｉｎｇ）、および毛包に対する化学療法剤の毒性の副作用を中和するために使用され得る。これらはまたは、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病を含む）における新規な細胞増殖を刺激するために使用され得る。あるいは、拮抗的な処置がなされ得、ここで、本発明のＯＲＦＸ様タンパク質を特異的に結合する抗体が、タンパク質の特異的な増殖誘導効果を取り消す。このような抗体は、例えば、種々の腫瘍および良性の過形成を含む増殖性障害の処置において有用であり得る。
【０１９２】
配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）のＯＲＦＸ核酸のいずれか１つの部分に対応するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、対応するＯＲＦＸ遺伝子を含むＤＮＡを検出するため、あるいは、対応するＯＲＦＸ遺伝子またはＯＲＦＸ様遺伝子の発現を検出するために使用され得る。例えば、表２に記載されるように、特定の細胞または組織において発現されるＯＲＦＸ核酸は、その特定の細胞型の存在を同定するために使用され得る。
【０１９３】
生物学的サンプルにおけるＯＲＦＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＯＲＦＸタンパク質またはＯＲＦＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＯＲＦＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＯＲＦＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＯＲＦＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＯＲＦＸ核酸（例えば、配列番号２ｎ−１（ここで、ｎ＝１〜３１６１）、もしくはその部分の核酸（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＯＲＦＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸））であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０１９４】
ＯＲＦＸタンパク質を検出するための薬剤は、ＯＲＦＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプローブもしくは抗体の間接的に標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＯＲＦＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＯＲＦＸ　ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＯＲＦＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＯＲＦＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＯＲＦＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＯＲＦＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０１９５】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０１９６】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０１９７】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＯＲＦＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＯＲＦＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＯＲＦＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、ＯＲＦＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＯＲＦＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０１９８】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＯＲＦＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害（例えば、増殖性障害または分化障害（例えば、過形成、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症、または慢性関節リュウマチ）；および、グリア関連障害（例えば、大脳障害、糖尿病性ニューロパシー、脳浮腫、老年性痴呆、アルツハイマー病など）を有するかまたはその発症の危険に有る被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険に有る被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＯＲＦＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＯＲＦＸのタンパク質または核酸の存在は、ＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体についての診断指標である。本明細書において使用される「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０１９９】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置され得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法は、被験体が、増殖性障害、分化障害、グリア関連障害などのような障害に対する薬剤を用いて効果的に処置され得るかどうかを決定するために使用され得る。従って、本発明は、ＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＯＲＦＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＯＲＦＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤を投与してＯＲＦＸの異常発現または異常活性に関連する障害を処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０２００】
本発明の方法はまた、ＯＲＦＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が増殖性障害、分化障害、グリア関連障害などについての危険に有るか否か、または罹患しているか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＯＲＦＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える変更の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＯＲＦＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（１）ＯＲＦＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（２）ＯＲＦＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（３）ＯＲＦＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（４）ＯＲＦＸ遺伝子の染色体再配置；（５）ＯＲＦＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（６）ＯＲＦＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（７）ＯＲＦＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＯＲＦＸタンパク質の非野生型レベル、（９）ＯＲＦＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（１０）ＯＲＦＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＯＲＦＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、核酸を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０２０１】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮＡＳ　９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＯＲＦＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る）（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＯＲＦＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＯＲＦＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物の大きさを検出する工程およびその大きさをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されるために所望され得ることが予想される。
【０２０２】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ、ら、１９８９、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７）、または他の任意の核酸増幅方法、それに続く、当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０２０３】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＯＲＦＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０２０４】
他の実施形態において、ＯＲＦＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２：７５３−７５９）。例えば、ＯＲＦＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら、上記、のように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレイを用い、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いて、特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０２０５】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＯＲＦＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルのＯＲＦＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）ＰＮＡＳ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）ＰＮＡＳ　７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（Ｎａｅｖｅら、（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　３８　：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０２０６】
ＯＲＦＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断薬剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＯＲＦＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて消化し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に処理することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさで分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０２０７】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＯＲＦＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＯＲＦＸ配列（例えば、野生型ＯＲＦＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２０８】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＯＲＦＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ　２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ　Ａｐｐｌ　９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＯＲＦＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化さえも検出し得る。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が、配列中の変化に対してより感受的である、（ＤＮＡよりもむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する（例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　７：５を参照のこと）。
【０２０９】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと）。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全に変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される（例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　２６５：１２７５３を参照のこと）。
【０２１０】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡがハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０２１１】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、もしくは適切な条件下でミスマッチが妨げされ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有する（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ　１１：２３８）。さらに、変異の領域において新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る（例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される（例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと）。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位で既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２１２】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＯＲＦＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０２１３】
さらに、ＯＲＦＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０２１４】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＯＲＦＸ活性（例えば、ＯＲＦＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＯＲＦＸ活性に関連する障害（例えば、神経障害、癌関連障害、または妊娠障害）を処置（予防的または治療的に）するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来薬物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性および治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＯＲＦＸタンパク質の活性、ＯＲＦＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＯＲＦＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０２１５】
薬理ゲノム学は、罹患された人において変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物への応答における臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｐｈｙｓｔｏｌ，１９９６，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，１９９７，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。遺伝的状態は、薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達されるか（変更された薬物作用）、または遺伝的状態は、身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂取（ｃｏｎｓｏｍｐｔｉｏｎ）後の溶血である。
【０２１６】
具体的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、なぜ、いく人かの患者が、標準的かつ安全な用量の薬物を受けた後に、期待される薬物効果が得られないのか、または強調された薬物応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を与えている。これらの多型は、集団において２つの表現型（広範なメタボライザー（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および貧弱なメタボライザー（ＰＭ））において発現される。ＰＭの罹患率は、種々の集団について異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性であり、そして数個の変異が、ＰＭにおいて同定されている。この変異は、全て、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠如を導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の貧弱なメタボライザーは、これらを標準的な用量で与えた場合に、強調された薬物応答および副作用を非常に頻繁に経験する。代謝産物が、活性な治療的部分である場合、ＰＭは、そのＣＹＰ２Ｄ６により形成される代謝産物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない超急速メタボライザー（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）と呼ばれるものである。最近、超急速代謝（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の分子基盤が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定されている。
【０２１７】
ＯＲＦＸタンパク質の活性、ＯＲＦＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＯＲＦＸ遺伝子の変異含量を決定して、それによって、その個体の治療的および予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性表現型の同定に対して、薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＯＲＦＸモジュレーター（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定されるモジュレーター）を用いて処置する場合に、治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２１８】
（臨床試験の間の効果のモニタリング）
ＯＲＦＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的なスクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においてもまた適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＯＲＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＯＲＦＸ活性をアップレギュレートする効力を、減少したＯＲＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＯＲＦＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＯＲＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＯＲＦＸの活性をダウンレギュレートする効力を、増加したＯＲＦＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＯＲＦＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。このような臨床試験において、ＯＲＦＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞性増殖に関与している他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答のマーカーとして使用され得る。
【０２１９】
例えば、ＯＲＦＸを含む遺伝子（これは、ＯＲＦＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＯＲＦＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＯＲＦＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、この遺伝子パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いて、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＯＲＦＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＯＲＦＸの発現または活性を増加するために（すなわち、この薬剤の効力を増加するために）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＯＲＦＸの発現または活性を減少するために（すなわち、この薬剤の効力を減少するために）望ましくあり得る。
【０２２１】
（処置の方法）
本発明は、異常なＯＲＦＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（すなわち疑いのある）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的方法の両方を提供する。
【０２２２】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患または障害は、活性をアンタゴナイズする（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性をアンタゴナイズする治療剤は、治療的または予防的様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ＯＲＦＸのペプチド、あるいはそのアナログ、誘導体、フラグメントまたはホモログ；（ｉｉ）ＯＲＦＸのペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＯＲＦＸのペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、ＯＲＦＸのペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入物に起因する）核酸の投与が、相同組換えによってＯＲＦＸのペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）ＯＲＦＸのペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０２２３】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患または障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＯＲＦＸのペプチド、あるいはそのアナログ、誘導体、フラグメントまたはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０２２４】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチドのＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性（あるいはＯＲＦＸのペプチドのｍＲＮＡ）をインビボでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の免疫沈降、免疫細胞学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０２２５】
１つの局面において、本発明は、被験体において、異常なＯＲＦＸの、発現または活性と関連する疾患または状態を、以下を調節する薬剤を被験体に投与することによって予防するための方法を提供する：ＯＲＦＸの発現、あるいは少なくとも１つのＯＲＦＸの活性。異常なＯＲＦＸの、発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、あるいはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＯＲＦＸの異常を特徴とする症状の発現の前に生じ得る。このＯＲＦＸの異常な型に依存して、例えば、ＯＲＦＸのアゴニスト薬剤、あるいはＯＲＦＸのアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて、決定され得る。
【０２２６】
本発明の別の局面は、治療目的のために、ＯＲＦＸの、発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関する、ＯＲＦＸのタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＯＲＦＸのタンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。そのような薬剤は、例えば、ＯＲＦＸのタンパク質の、核酸またはタンパク質、ＯＲＦＸのタンパク質の天然に存在する同属リガンド、ペプチド、ＯＲＦＸのペプチド模倣物、あるいは他の低分子である。１つの実施態様において、この薬剤は、ＯＲＦＸのタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、以下が挙げられる：その細胞に導入された、活性なＯＲＦＸのタンパク質、およびＯＲＦＸをコードする核酸分子。別の実施態様において、この薬剤は、ＯＲＦＸのタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、ＯＲＦＸのアンチセンス核酸分子、および抗ＯＲＦＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）、実施され得る。このように、本発明は、ＯＲＦＸの、タンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施態様において、この方法は、ＯＲＦＸの、発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）、薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施態様において、この方法は、ＯＲＦＸの、タンパク質または核酸分子を、ＯＲＦＸの、低減したかまたは異常な、発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０２２７】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々実施態様において、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイが利用され、特定の治療剤の効果、およびその投与が罹患した組織の処置に指示されるか否かを決定する。
【０２２８】
種々の特定の実施態様において、インビトロアッセイを、患者の障害に関与する細胞の代表的な型で実行し、所定の治療剤がこの細胞型に所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療における使用のための化合物は、ヒト被験体における試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがこれに限定されない適切な動物モデル系において試験され得る。同様に、インビボ試験において、当該分野で公知の任意の動物モデル系がヒト被験体への投与の前に用いられ得る。
【０２２９】
（悪性疾患）
いくつかのＯＲＦＸのペプチドが、癌細胞において発現される（例えば、表１および２を参照のこと）。従って、対応するＯＲＦタンパク質が、細胞増殖の調節に関与する。従って、本発明の治療剤は、細胞の過剰増殖および／または細胞増殖の制御の欠損（例えば、癌、悪性疾患および腫瘍）に関連する疾患または障害の治療的処置または予防的処置において有用であり得る。そのような過剰増殖障害の総説について、例えば、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、ＭＥＤＩＣＩＮＥ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０２３０】
本発明の治療剤を、悪性疾患および関連する障害の処置または予防における効力について、当該分野内において公知の任意の方法によってアッセイし得る。そのようなアッセイとしては、形質転換された細胞または患者の腫瘍由来の細胞を利用するインビトロアッセイ、ならびに癌または悪性疾患の動物モデルを使用するインビボアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。可能性のある有効な治療剤は、例えば、コントロールと比較して、培養物中での腫瘍由来細胞または形質転換細胞の増殖を阻害するか、または動物モデルにおいて腫瘍の後退を生じる治療剤である。
【０２３１】
本発明の実施において、一旦、悪性疾患または癌が、活性を調節すること（すなわち、阻害するか、アンタゴナイズするか、またはアゴナイズする）による処置に対して感受性であることが示されると、引き続いて、その癌または悪性疾患が、タンパク質機能を調節するように作用する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０２３２】
（前悪性状態）
癌または悪性疾患の治療または予防処置において有効な本発明の治療剤はまた、前悪性状態の処置および／または前悪性から新生物状態もしくは悪性疾患状態への進行を防ぐための処置のために投与され得る。そのような予防的用途または治療的用途が、先行する新生物または癌への進行が知られているか、またはそれが疑われる状態（特に、過形成、化生、または最も特に、異形成からなる非新生物細胞増殖が生じた場合）において、示される。そのような異常な細胞増殖の総説について、例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、１９７６、ＢＡＳＩＣ　ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０２３３】
過形成は、細胞の構造または機能における有意な変化なしに、組織または器官における細胞数の増加を含む、制御された細胞の増殖の形成である。例えば、子宮内膜の過形成は、しばしば子宮内膜癌に進行することが実証されている。化生は、成熟した細胞または十分に分化した細胞の１つの型が、成熟した細胞の別の型に置換する、制御された細胞増殖の形成である。化生は、上皮組織細胞または結合組織細胞において生じ得る。異形成は、一般に癌の前駆体であると考えられ、そして上皮において主に見出される。異形成は、非新生物細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構築上の配向の損失を含む。異形成は、慢性の刺激または炎症が存在する場所で特徴的に生じ、そしてしばしば、頸部、気道、口腔、および胆嚢において見出される。
【０２３４】
過形成、化生、または異形成として特徴付けられる異常な細胞増殖の存在に代えて、またはこれらに加えて、患者由来の細胞サンプル内で、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて示される形質転換表現型または悪性疾患表現型の１つ以上の特徴の存在が、上記のタンパク質の活性を調節する能力を有する治療剤の予防的／治療的投与の望ましさの指標である。形質転換された表現型の特徴としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）形態学的変化；（ｉｉ）よりゆるい、下層への付着；（ｉｉｉ）細胞間接触阻止の喪失；（ｉｖ）足場依存性の喪失；（ｖ）プロテアーゼ放出；（ｖｉ）増加した糖輸送；（ｖｉｉ）減少した血清要求性；（ｖｉｉｉ）胎児抗原の発現；（ｉｘ）２５０ｋＤａｌの細胞表面タンパク質の消滅など。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら１９８６、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０２３５】
本発明の特定の実施態様において、悪性疾患についての以下の１つ以上の素因を示す患者が、治療剤の有効量の投与によって処置される：（ｉ）悪性疾患に関連する染色体転座（例えば、慢性骨髄性白血病についてのフィラデルフィア染色体（ｂｃｒ／ａｂｌ）および濾胞性リンパ腫についてのｔ（１４；１８）など）；（ｉｉ）家族性ポリープ症またはガードナー症候群（結腸癌の可能性のある前兆）；（ｉｉｉ）未確認の重要性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄腫の可能性のある前駆体）；ならびに（ｉｖ）メンデル（遺伝子）遺伝パターンを示す癌または前癌疾患（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝性外骨腫症、多発性内分泌腺腫症（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ）、ポイツ−ジェガーズ症候群、フォン・レックリングハウゼン病の神経線維腫症、アミロイド産生および褐色細胞腫をともなう甲状腺髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｃａｒｉｃｉｎｏｍａ）、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚の黒色癌、眼内の黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、チェディアック−東症候群、白子症、ファンコーニ再生不良性貧血およびブルーム症候群）を有する人の一親等。
【０２３６】
別の実施態様において、本発明の治療剤が、ヒト患者に投与されて、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、または子宮癌、あるいは黒色腫または肉腫の進行を防ぐ。
【０２３７】
（過剰増殖性障害および異常増殖性（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害）
本発明の１つの実施態様において、治療剤が、過剰増殖性障害または良性の異常増殖性障害の治療的処置または予防的処置において投与される。過剰増殖性疾患または障害の処置または予防における本発明の治療剤の効力が、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイされ得る。そのようなアッセイとしては、インビトロの細胞増殖アッセイ、過剰増殖性疾患または障害の動物モデルを使用するインビトロまたはインビボアッセイなどが挙げられる。可能性のある効果的な治療剤は、例えば、コントロールとの比較において、培養物中の細胞増殖を促進し得るか、あるいは動物モデルにおける増殖または細胞増殖を生じ得る。
【０２３８】
本発明の特定の実施態様は、肝臓の肝硬変（瘢痕が、通常の肝臓再生プロセスを上回っている状態）；瘢痕プロセスが通常の再生を妨げる、皮膚の形状を損じることを生じるケロイド（過形成性瘢痕）形成の処置；乾癬（皮膚の過剰な増殖および適切な細胞運命の決定の遅延によって特徴付けられる一般的な皮膚の状態）；良性腫瘍；線維性嚢状態および組織肥厚（例えば、良性膵臓肥厚）の処置または予防に向けられる。
【０２３９】
（神経変性性障害）
いくつかのＯＲＦＸのタンパク質は、細胞成熟およびアポトーシスの脱調節（この両方が神経変性性疾患の特徴である）に関係している細胞型で見出される。従って、本発明の治療剤（限定されることはないが、特に上記のタンパク質の活性を調節（または供給）する治療剤）が、神経変性性疾患の処置または予防において効果的であり得る。神経変性性障害に関与する上記のタンパク質の活性を調節する本発明の治療剤を、そのような神経変性性疾患または障害を処置または予防することにおける効力について、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイし得る。そのようなアッセイとしては、調節された細胞成熟もしくはアポトーシスの阻害についてのインビトロアッセイ、または神経変性性疾患または障害の動物モデルを使用するインビボアッセイ、あるいは以下に記載する任意のアッセイが挙げられる。可能性のある効果的な治療剤は、例えば限定されないが、コントロールと比較して、調節された細胞成熟を促進し、培養物中の細胞アポトーシスを防ぎ、あるいは動物モデルにおける神経変性を減少する。
【０２４０】
一旦、神経変性性疾患または障害が、調節活性による処置に対して感受性であることが示されると、その神経変性性疾患または障害が、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。そのような疾患としては、加齢に関与する全ての変性性障害（特に、変形性関節症および神経変性性障害）が挙げられる。
【０２４１】
（器官移植に関連する障害）
いくつかのＯＲＦＸは、器官移植に関連する障害（特に、限定されないが、器官拒絶反応）に関係し得る。本発明の治療剤（特に、活性を調節（または供給）する治療剤）は、器官移植に関連する疾患または障害の処置または予防において効果的であり得る。本発明の治療剤（特に、上記タンパク質のレベルまたは活性を調節する治療剤）は、このような器官移植に関連する疾患および障害の処置または予防における効力について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイとしては、下記のような細胞培養モデルを使用するインビトロアッセイ、または器官移植に関連する疾患および障害の動物モデルを使用するインビボアッセイが挙げられ、例えば、以下を参照のこと。潜在的に効果的な治療剤は、例えば、限定されないが、コントロールと比較して、動物モデルにおける免疫拒絶応答を減少する。
【０２４２】
従って、一旦、器官移植に関連する疾患および障害が、活性の調節による処置に受け入れ可能であることが示されると、このような疾患または障害は、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０２４３】
（心臓血管疾患）
ＧＥＮＸは、アテローム性動脈硬化症のプラーク形成を含む、心臓血管障害に関係し得る。心臓血管疾患（脳血栓症または脳出血を含む）、虚血性心疾患または虚血性腎疾患、末梢血管疾患、または他の主要な血管の血栓症、および他の疾患（真性糖尿病、高血圧、甲状腺機能不全、コレステロールエステル貯蔵病、全身性エリテマトーデス、ホモシステイン症（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ）、および家族性のタンパク質または脂質プロセシング疾患などを含む）のような疾患は、アテローム性動脈硬化症に直接的または間接的のいずれかで関連する。従って、本発明の治療剤（特に、活性または形成を調節（または供給）する治療剤）は、アテローム性動脈硬化症に関連する疾患または障害の処置または予防に有効であり得る。本発明の治療剤（特に、レベルまたは活性を調節する治療剤）は、このような疾患および障害の処置または予防における効力について、当該分野で公知の任意の方法（以下に記載の方法を含む）によってアッセイされ得る。
【０２４４】
広範な動物モデルおよび細胞培養モデルが、アテローム性動脈硬化症に関与するプロセスについて存在する。動物モデルの限定的かつ非排他的リストは、以下を含む：早発性アテローム性動脈硬化症についてのノックアウトマウス（ＫｕｒａｂａｙａｓｈｉおよびＹａｚａｋｉ，１９９６、Ｉｎｔ．Ａｎｇｉｏｌ．１５：１８７−１９４）、アテローム動脈硬化症のトランスジェニックマウスモデル（Ｋａｐｐｅｌら、１９９４、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．８：５８３−５９２）、動物モデルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置（Ｃａｌｌｏｗ，１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０：５６９−５７６）、アテローム性動脈硬化症についてのトランスジェニックウサギモデル（Ｔａｙｌｏｒ，１９９７，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　８１１：１４６−１５２）、高コレステロール血症動物モデル（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．３０　Ｓｕｐｐｌ．：１−１１）、高脂血症マウス（Ｐａｉｇｅｎら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．５：２５８−２６４）、および動物におけるリポキシゲナーゼの阻害（Ｓｉｇａｌら、１９９４、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１４：２１１−２２４）。さらに、インビトロ細胞モデルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：低密度リポタンパク質に曝露された単球（Ｆｒｏｓｔｅｇａｒｄら、１９９６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１２１：９３−１０３）、クローン化された血管平滑筋細胞（Ｓｕｔｔｌｅｓら、１９９５、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．２１８：３３１−３３８）、化学誘引物質に曝露された内皮細胞由来のＴ細胞（Ｋａｚら、１９９４、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５５：５６７−５７３）、培養されたヒト大動脈内皮細胞（Ｆａｒｂｅｒら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：Ｈ１０８８−１０８５）、および泡沫細胞培養物（Ｌｉｂｂｙら、１９９６、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｌｉｐｉｄｏｌ　７：３３０−３３５）。潜在的に効果的な治療剤は、例えば、限定されないが、コントロールと比較して、細胞培養モデルにおける泡沫細胞形成、またはアテローム性動脈硬化症の高コレステロール血症マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症のプラーク形成を減少する。
【０２４５】
従って、一旦、アテローム性動脈硬化症に関連する疾患または障害が、活性または形成の調節による処置に受け入れ可能であることが示されると、このような疾患または障害は、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０２４６】
（サイトカインおよび細胞増殖／分化活性）
本発明のＧＥＮＸタンパク質は、サイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導するか、または阻害するかのいずれか）、または細胞分化（誘導するか、または阻害するかのいずれか）を示し得るか、あるいは特定の細胞集団における他のサイトカインの産生を誘導し得る。全ての既知のサイトカインを含む、現在までに発見された多くのタンパク質因子は、因子依存性の１以上の細胞増殖アッセイにおいて活性を示してきた。従って、これらのアッセイは、サイトカイン活性の簡便な確認法として作用する。本発明のタンパク質の活性は、以下を含むが、これらに限定されない細胞株についての多くの従来の因子依存性細胞増殖アッセイの任意の１つによって確認される：３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ　Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫ。
【０２４７】
本発明のタンパク質の活性は、数ある手段でもとりわけ、以下の方法によって測定され得る：以下に記載されるアッセイを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞増殖または胸腺細胞増殖についてのアッセイ：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章および第７章）；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｉｌｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４５：１７０６−１７１２、１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４９：３７７８−３７８３、１９９２；Ｂｏｗｍａｎら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５２：１７５６−１７６１，１９９４。
【０２４８】
脾細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖についてのアッセイとしては、ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、３．１２．１−１４頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９４；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．８．１−８頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９４に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４９】
造血細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化についてのアッセイとしては、以下によって記載されるアッセイが挙げられるが、これに限定されない：Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．３．１−６．３．１２頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９１；ｄｅＶｒｉｅｓら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７３：１２０５−１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：６９０−６９２、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１−２９３８，１９８３；Ｎｏｒｄａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．６．１−５頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９１；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７−１８６１，１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１１−Ｂｅｎｎｅｔｔら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．１５．１頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９１；Ｃｉａｒｌｅｔｔａら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．１３．１頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９１。
【０２５０】
抗原に対するＴ細胞クローン応答についてのアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによって、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響し、そしてＴ細胞の効果を指向するタンパク質を同定する）としては、以下に記載されるアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第６章および第７章）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７：６０９１−６０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎ　１１：４０５−４１１，１９８１；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４０：５０８−５１２，１９８８。
【０２５１】
（免疫刺激活性または免疫抑制活性）
本発明のＧＥＮＸタンパク質はまた、免疫刺激活性または免疫抑制活性（そのアッセイが本明細書中に記載される活性を含むが、これらに限定されない）を示し得る。タンパク質は、種々の免疫不全および免疫障害（重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を含む）の処置（例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の成長および増殖を（上方または下方）の調節、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性の誘発）において有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝性であり得るか、またはウイルス（ｖｉｔａｌ）（例えば、ＨＩＶ）感染および細菌感染または真菌感染によって引き起こされ得るか、あるいは自己免疫障害から生じ得る。よい詳細には、ウイルス（ｖｉｔａｌ）感染、細菌感染、真菌感染または他の感染によって引き起こされる感染性疾患は、本発明のタンパク質を使用して処置可能であり得、これらには、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、マラリア種による感染、およびカンジダ症のような種々の真菌感染が挙げられる。もちろん、この点に関して、本発明のタンパク質はまた、免疫系に対するブーストが、一般に所望され得る（すなわち、癌の処置において）場合に有用であり得る。
【０２５２】
本発明のタンパク質を使用して処置され得る自己免疫障害としては、例えば、以下が挙げられる：結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性真性糖尿病、重症筋無力症、対宿主性移植片病および自己免疫性炎症性眼疾患。本発明のこのようなタンパク質はまた、喘息（特に、アレルギー性喘息）または他の呼吸系障害のような、アレルギー反応およびアレルギー状態の処置に有用であり得る。免疫抑制が所望される他の状態（例えば、器官移植を含む）もまた、本発明のタンパク質を使用して処置可能であり得る。
【０２５３】
本発明のタンパク質を使用して、多くの方法で、免疫応答することが可能であり得る。下方調節は、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形態であり得るか、免疫応答の誘導を妨げることを含み得る。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制することによってか、またはＴ細胞における特異的寛容を誘導することによってか、あるいはその両方によって阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般に、抑制剤に対するＴ細胞の連続的曝露を必要とする、能動的な非抗原特異的プロセスである。寛容（Ｔ細胞における非応答性またはアネルギー（ｅｎｅｒｇｙ）を誘導することを含む）は、免疫抑制と識別可能である。つまり、寛容は、一般的に抗原特異的であり、そして寛容化剤に対する曝露が停止した後で持続する。操作的には、寛容は、寛容化剤の非存在下における特異的抗原に対する再曝露の際に、Ｔ細胞応答の欠如によって実証され得る。
【０２５４】
１以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７のような）を含むが、限定されない）を下方調節するか、または妨げること（例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げること）は、組織、皮膚および器官の移植の状況、ならびに対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは、組織移植における組織破壊の減少を生じるはずである。代表的に、組織移植において、移植片の拒絶は、Ｔ細胞によるその外来としての認識、それに続く移植片を破壊する免疫反応を介して開始される。移植前の、Ｂ７リンパ球抗原の免疫細胞上のその天然のリガンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（例えば、可溶性の、Ｂ７−２活性を有するペプチドのモノマー形態単独、あるいは別のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）またはブロッキング抗体の活性を有するペプチドのモノマー形態との組み合わせ）の投与は、対応する同時刺激シグナルの伝達を伴わずに、その分子の免疫細胞上の天然のリガンドへの結合を導き得る。このような形態でＢリンパ球抗原機能をブロックすることは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によるサイトカイン合成を妨げ、従って、免疫抑制剤として作用する。さらに、同時刺激の欠如はまた、Ｔ細胞を活性化して、それによって被験体において寛容を誘導するのに十分であり得る。Ｂリンパ球抗原ブロッキング試薬による長期の寛容の誘導は、これらのブロッキング試薬の繰り返しの投与の必要性を回避し得る。被験体において十分な免疫抑制または寛容を達成するために、Ｂリンパ球抗原の機能をブロックすることも必要であり得る。
【０２５５】
器官移植片拒絶またはＧＶＨＤの予防における特定のブロッキング試薬の効力は、ヒトにおける効力を予測する動物モデルを使用して評価され得る。使用され得る適切な系の例は、ラットにおける同種異系の心臓移植片およびマウスにおける外因性膵臓島細胞移植片が挙げられ、その両方は、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：７８９−７９２（１９９２）およびＴｕｒｋａら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）に記載されるようなインビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を試験するために使用されている。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル（Ｐａｕｌ編、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９、８４６〜８４７頁を参照のこと）は、その疾患の発症に対する、インビボでのＢリンパ球抗原機能のブロックの効果を決定するために使用され得る。
【０２５６】
ブロッキング抗原機能はまた、自己免疫疾患の処置に治療的に有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性であり、そしてその疾患の病理に関係するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する、Ｔ細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の予防は、疾患の症状を軽減し得るか、または排除し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用を破壊することによってＴ細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、そしてその疾患プロセスに関係し得る自己抗体またはＴ細胞誘導性サイトカインの産生を妨げるために使用され得る。さらに、ブロッキング試薬は、疾患の長期の軽減を導き得る自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し得る。自己免疫障害の予防または軽減におけるブロッキング試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患のよく特徴付けられた多くの動物モデルを使用して決定され得る。例としては、マウス実験用自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、およびマウス実験用重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９、８４０〜８５６頁を参照のこと）。
【０２５７】
免疫応答を上方調節する手段として、抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節もまた、治療に有用であり得る。免疫応答の上方調節は、既存の免疫応答を増強するか、または開始免疫応答を誘発する形態であり得る。例えば、Ｂリンパ球抗原機能の刺激を介して免疫応答を増強することは、ウイルス感染の場合において有用であり得る。さらに、全身性ウイルス疾患（例えば、インフルエンザ、感冒および脳炎）は、Ｂリンパ球抗原の刺激形態の全身性投与によって軽減され得る。
【０２５８】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を除去し、本発明のペプチドを発現するか、または本発明の可溶性ペプチドの刺激形態を伴うかのいずれかの、ウイルス抗原をパルスしたＡＰＣで、このＴ細胞をインビトロで同時刺激し、そして患者にこのインビトロ活性化Ｔ細胞を再導入することによって、感染患者において増強され得る。抗ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、患者から感染細胞を単離し、本明細書中に記載されるような本発明のタンパク質をコードする核酸で、この感染細胞をトランスフェクトして（その結果、これらの細胞がその表面上でこのタンパク質の全てまたは一部を発現する）、そしてこのトランスフェクト細胞を患者に再導入することである。ここで、この感染細胞は、インビボでＴ細胞に対して同時刺激シグナルを送達し、それによってＴ細胞を活性化することが可能である。
【０２５９】
別の適用では、抗原機能（好ましくはＢリンパ球抗原機能）の上方調節または増大が腫瘍免疫の誘導において有用であり得る。本発明の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）を、被験体中の腫瘍特異的耐性を克服するために被験体に投与され得る。所望であれば、腫瘍細胞はトランスフェクトされてペプチドの組み合わせを発現し得る。例えば、患者から得られた腫瘍細胞を、Ｂ７−２−様活性を有するペプチド単独、またはＢ７−１−様活性および／またはＢ７−３−様活性を有するペプチドを組み合わせた発現を指向する発現ベクターを用いて、エクスビボでトランスフェクトされ得る。このトランスフェクトされた腫瘍細胞は、患者に戻され、トランスフェクトされた細胞の表面上にペプチドの発現を生じる。あるいは、遺伝子治療技法を用いて、インビボのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的化する。
【０２６０】
腫瘍細胞の表面上のＢ細胞リンパ球抗原の活性を有する本発明のペプチドの存在は、Ｔ細胞に対する必要な同時刺激シグナルを提供し、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くか、または十分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現しない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質およびβ２マイクログロブリンタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩａ鎖タンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞質−ドメイン切り欠き部分）をコードする核酸でトランスフェクトされ得、それによって細胞表面上にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現する。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと組み合わせた適切なクラスＩまたはクラスＩＩ　ＭＨＣの発現は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対する、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。必要に応じて、不変鎖のようなＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子もまた、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトされ得、腫瘍関連抗原の提示を促進し、そして腫瘍特異的免疫を誘導する。従って、ヒト被験体におけるＴ細胞媒介免疫応答の誘導は、被験体における腫瘍特異的耐性を克服するに十分であり得る。
【０２６１】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法により測定され得る：以下に記載のアッセイを含む、胸腺細胞または脾細胞の細胞傷害性のための適切なアッセイであるが、これらに限定されない：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第７章）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：２４８８−２４９２、１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２８：１９６８−１９７４、１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３５：１５６４−１５７２、１９８５：Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４０：５０８−５１２、１９８８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：２４８８−２４９２、１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２８：１９６８−１９７４、１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３５：１５６４−１５７２、１９８５；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｂｏｗｍａｎら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５３：３０７９−３０９２、１９９４。
【０２６２】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングのための（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節し、しかもＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響するタンパク質を同定する）アッセイとしては、以下に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４４：３０２８−３０３３、１９９０；ならびにＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、３．８．１．−３．８．１６頁、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ　１９９４中のＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ。
【０２６３】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（特に、優先的にＴｈ１およびＣＴＬ応答を生成するタンパク質を同定するアッセイ）としては、以下に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第７章）；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４９：３７７８−３７８３、１９９２。
【０２６４】
樹状細胞依存性アッセイ（特に、ネイティブＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるタンパク質を同定するアッセイ）としては、以下に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：Ｇｕｅｒｙら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３４：５３６−５４４、１９９５；Ｉｎａｂａら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７３：５４９−５５９、１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５４：５０７１−５０７９、１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１８２：２５５−２６０、１９９５；Ｎａｉｒら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６７：４０６２−４０６９、１９９３；Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６４：９６１−９６５、１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６９：１２５５−１２６４、１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ　９４：７９７−８０７、１９９４；およびＩｎａｂａら、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７２：６３１−６４０、１９９０に記載のアッセイを含む。
【０２６５】
リンパ球生存／アポトーシスについてのアッセイ（特に、スーパー抗原誘導後アポトーシスを妨げるタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を同定する）としては、以下に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１３：７９５−８０８、１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　７：６５９−６７０、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：１９４５−１９５１、１９９３；Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ　６６：２３３−２４３、１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４５：４０３７−４０４５、１９９０；Ｚａｍａｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１４：８９１−８９７、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ　１：６３９−６４８、１９９２。
【０２６６】
Ｔ細胞の拘束および発生の初期工程に影響するタンパク質のアッセイは、制限されないで：Ａｎｔｉｃａら、Ｂｌｏｏｄ　８４：１１１−１１７、１９９４；Ｆｉｎｅら、Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５５：１１１−１２２、１９９４；Ｇａｌｙら、Ｂｌｏｏｄ　８５：２７７０−２７７８、１９９５；Ｔｏｋｉら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：７５４８−７５５１、１９９１に記載のアッセイを含む。
【０２６７】
（造血調節活性）
本発明のＧＥＮＸタンパク質は、造血の調節において、そして結果として骨髄細胞欠損またはリンパ球細胞欠損の処置において有用であり得る。コロニー形成性細胞またはファクター依存性細胞株を支援する周縁の生物学的活性でさえ、造血を調節することにおける、例えば、単独またはその他のサイトカインとの組み合わせで、赤血球系前駆体細胞の成長および増殖を支援することにおける関与を示し、それによって、例えば、種々の貧血を処置することにおけるか、または赤血球系前駆体細胞および／または赤血球細胞の産生を刺激するための照射／化学的療法と組み合わせた使用のための有用性；例えば、結果として骨髄抑制を防ぐかまたは処置するための化学的療法と組み合わせて有用な、顆粒球のような骨髄細胞および単球／マクロファージの成長および増殖を支持する（すなわち伝統的なＣＳＦ活性）ことにおける有用性；巨核球そして結果として血小板の成長および増殖を支持し、それによって血小板減少症のような種々の血小板障害の予防または処置を可能にすること、そして一般に、血小板輸血に代わる使用か、またはその補足的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）使用；および／または上記の造血幹細胞のいずれかおよびすべてに成熟し得、そしてそれ故、種々の幹細胞障害（再生不良性貧血および発作性夜行性ヘモグロビン尿を含むがこれらに限定されない、通常、移植で処置されるような障害）における治療有用性を提供する造血幹細胞の成長および増殖を支持することにおける有用性、ならびに正常細胞または遺伝子治療のために遺伝子操作された細胞として、インビボまたはエキソビボ（すなわち、骨髄移植または末梢前駆体細胞移植（同種または異種）と組み合わせた）のいずれかで、照射／化学的療法後に幹細胞区画を再増殖させることにおける有用性、を示す。
【０２６８】
本発明のタンパク質の活性は、特に、以下の方法により測定され得る。種々の造血株の増殖および分化の適切なアッセイは上記で引用される。
【０２６９】
胚幹細胞分化のアッセイ（特に、胚分化造血に影響するタンパク質を同定するアッセイ）は、制限されずに：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１５：１４１−１５１、１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３：４７３−４８６、１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ　８１：２９０３−２９１５、１９９３に記載のアッセイを含む。
【０２７０】
幹細胞生存および分化のアッセイ（特にリンパ−造血を調節するタンパク質を同定するアッセイ）は、制限されずに：メチルセルロースコロニー形成アッセイ、ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ　ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ　２６５−２６８頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ　１９９４における、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ；Ｈｉｒａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：５９０７−５９１１、１９９２；ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ　ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ　２３−３９頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ　１９９４における、ＭｃＮｉｅｃｅおよびＢｒｉｄｄｅｌｉ；Ｎｅｂｅｎら、Ｅｘｐ　Ｈｅｍａｔｏｌ　２２：３５３−３５９、１９９４；ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ　ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ　１−２１頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ　１９９４における、Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ；ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ　ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ　１６３−１７９頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ　１９９４における、Ｓｐｏｏｎｃｅｒｅｔら；ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ　ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ　１３９−１６２頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ　１９９４における、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、に記載のアッセイを含む。
【０２７１】
（組織増殖活性）
本発明のＧＥＮＸタンパク質はまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織成長または再生のために使用される組成物、ならびに創傷治癒および組織修復および組織置換のために使用される組成物、そして火傷、切開および潰瘍の処置における有用性を有し得る。
【０２７２】
本発明のタンパク質は、骨が正常に形成されない状況で軟骨および／または骨増殖を誘導し、ヒトおよびその他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒における適用を有する。本発明のタンパク質を採用するこのような調製物は、閉鎖骨折整復および開放骨折整復における予防的使用、そしてまた人工間接の改善された固定における予防的な使用を有し得る。骨形成剤により誘導されたデノボ骨形成は、先天的、外傷誘導、または腫瘍切除誘導脳顔面頭蓋欠陥の修復に寄与し、そしてまた美容成形手術に有用である。
【０２７３】
本発明のタンパク質はまた、歯周病の処置において、およびその他の歯修復プロセスで用いられ得る。このような薬剤は、骨形成性細胞を誘因するか、骨形成性細胞の増殖を刺激するか、骨形成性細胞の前駆体の分化を誘導する環境を提供し得る。本発明のタンパク質はまた、骨および／または軟骨修復の刺激によるか、または炎症プロセスにより媒介される組織破壊の炎症またはプロセス（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）をブロックすることによるような、骨粗鬆症または変形性関節炎の処置で有用であり得る。
【０２７４】
本発明のタンパク質に寄与し得る組織再生活性の別のカテゴリーは、腱／靭帯形成である。このような組織が通常形成されない状況で、腱／靭帯様組織またはその他の組織形成を誘導する本発明のタンパク質は、ヒトおよびその他の動物における、腱または靭帯断裂、変形およびその他の腱または靭帯欠陥の治癒における適用を有する。腱／靭帯様組織誘導性タンパク質を採用するこのような調製物は、腱または靭帯組織への損傷を防ぐことにおける予防的使用、ならびに腱または靭帯の骨またはその他の組織の改善された固定、および腱または靭帯組織への欠陥を修復することにおける使用を有し得る。本発明の組成物により誘導されるデノボの腱／靭帯様組織形成は、先天的、外傷誘導、またはその他の起源のその他の腱または靭帯欠陥の修復に寄与し、そしてまた腱または靭帯の付着または修復のための美容成形手術で有用である。本発明の組成物は、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞を誘引するか、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞の増殖を刺激するか、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞の前駆体の分化を誘導するか、または組織修復を行うためにインビボに戻すためにエキソビボで腱／靭帯の細胞または前駆体の増殖を誘導する環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、毛根管症候群およびその他の腱または靭帯欠陥の処置において有用であり得る。この組成物はまた、当該分野で周知であるキャリアとして、適切なマトリックスおよび／または金属イオン封鎖剤を含み得る。
【０２７５】
本発明のタンパク質はまた、ニューロン細胞の増殖のため、および神経および脳組織の再生のために、すなわち、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患および神経障害、ならびにニューロン細胞または神経組織への変性、死滅または外傷を含む機械的および外傷障害の処置のために有用であり得る。より詳細には、タンパク質は、末梢神経損傷、末梢神経障害および局所神経障害のような末梢神経系の疾患、ならびにアルツハイマー病，パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群のような中枢神経系の疾患の処置で用いられ得る。本発明に従って処置され得るさらなる症状は、脊髄障害，頭部外傷および発作のような脳血管性疾患のような機械的および外傷的障害を含み得る。化学的療法またはその他の医療治療から生じる抹消神経障害もまた、本発明のタンパク質を用いて治療可能であり得る。
【０２７６】
本発明のタンパク質はまた、圧迫性潰瘍、血管不全に関連する潰瘍、手術または外傷創傷などを含むがこれらに限定されない非治癒創傷のより良好な、またはより迅速な閉鎖を促進するために有用であり得る。
【０２７７】
本発明のタンパク質がまた、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）および血管（血管内皮を含む）組織のようなその他の組織の生成または再生に、またはこのような組織を含む細胞の増殖を促進するために活性を示し得ることが予想される。所望の効果の一部分は、繊維症瘢痕の阻害または調整によってであり得、正常組織を再生させる。本発明のタンパク質はまた、血管形成活性を示し得る。
【０２７８】
本発明のタンパク質はまた、腸の保護または再生のため、または肺若しくは肝臓の繊維症、種々の組織における再灌流傷害、および全身サイトカイン損傷から生じる症状の処置のために有用であり得る。
【０２７９】
本発明のタンパク質はまた、前駆体組織または細胞から上記の組織の分化を促進若しくは阻害するため；または上記の組織の増殖を阻害するために有用であり得る。
【０２８０】
本発明のタンパク質の活性はまた、特に、以下の方法により測定され得る：
組織生成活性のためのアッセイは、制限されずに：国際特許公開番号ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；国際特許公開番号ＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載されるアッセイを含む。
【０２８１】
創傷治癒活性のためのアッセイは、制限されずに：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｎｚ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ　７１：３８２−８４（１９７８）によって改変されるような、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ、７１−１１２頁（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ編）、Ｙｅａｒ　Ｂｏｏｋ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏに記載のアッセイを含む。
【０２８２】
（アクチビン／インヒビン活性）
本発明のＧＥＮＸタンパク質はまた、アクチビン関連活性またはインヒビン関連活性を示し得る。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害するその能力によって特徴付けられ、一方、アクチビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するその能力によって特徴付けられる。従って、本発明のタンパク質は、単独またはインヒビンファミリーのメンバーとのヘテロ二量体において、雌性哺乳動物における受胎能を減少し、そして雄性哺乳動物における精子形成を減少するインヒビンの能力に基づく避妊薬として有用であり得る。他のインヒビンの十分な量の投与は、これら哺乳動物における不妊症を誘導し得る。あるいは、本発明のタンパク質は、ホモ二量体としてか、またはインヒビンｂ群の他のタンパク質サブユニットとのヘテロ二量体として、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激するアクチビン分子の能力に基づいて、受胎能誘導治療として有用であり得る。例えば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照のこと。本発明のタンパク質はまた、ウシ、ヒツジ、およびブタのような家畜の一生の生殖効率を増加するように、性的に未熟な哺乳動物における受胎能の開始の促進のために有用であり得る。
【０２８３】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：　アクチビン／インヒビン活性のアッセイとしては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｖａｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　９１：５６２〜５７２、１９７２；Ｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７９〜７８２、１９８６；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７７６〜７７９、１９８６；Ｍａｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６５９〜６６３、１９８５；Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：３０９１〜３０９５、１９８６。
【０２８４】
（走化性／ケモキネシス活性）
本発明のタンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞を含む）についての走化性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカインとして作用する）を有し得る。走化性およびケモキネシスタンパク質を使用して、所望の細胞集団を所望の作用部位に動員または誘引し得る。走化性またはケモキネシスタンパク質は、組織に対する創傷および他の外傷の処置、ならびに局所的感染の処置において、特に利点を提供する。例えば、リンパ球、単球、好中球の、腫瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する改善された免疫応答を生じ得る。
【０２８５】
タンパク質またはペプチドは、それが直接的または間接的に、特定の細胞集団の指向された方向付けまたは移動を刺激し得る場合、そのような細胞集団について走化性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは、細胞の移動を直接刺激する能力を有する。特定のタンパク質が細胞の集団について走化性活性を有するか否かは、細胞の走化性についての任意の公知のアッセイにおいて、そのようなタンパク質またはペプチドを使用することによって、容易に決定され得る。
【０２８６】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る。
【０２８７】
走化性活性についてのアッセイ（走化性を誘導するか、または妨げるタンパク質を同定する）は、細胞の膜を横切っての移動を誘導するタンパク質の能力、ならびに１つの細胞集団の別の細胞集団に対する接着を誘導するタンパク質の能力を測定するアッセイからなる。移動および接着についての適切なアッセイとしては以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（第６．１２章、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｂｅｔａ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ　６．１２．１〜６．１２．２８）；Ｔａｕｂら、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　９５：１３７０〜１３７６、１９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ　１０３：１４０〜１４６、１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２５：１７４４〜１７４８；Ｇｒｕｂｅｒｅｔら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５２：５８６０〜５８６７、１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５３：１７６２〜１７６８、１９９４。
【０２８８】
（うっ血活性および血栓崩壊活性）
本発明のタンパク質はまた、うっ血活性または血栓崩壊活性を示し得る。結果として、そのようなタンパク質は、種々の凝固障害（血友病のような遺伝性疾患を含む）の処置において有用であること、または凝固および外傷、外科手術または他の原因によって生じる創傷の処置における他のうっ血事象を促進することが予測される。本発明のタンパク質はまた、血栓症の溶解または形成阻害のため、およびそこから生じる状態（例えば、心臓血管および中枢神経系血管の梗塞（例えば、発作））の処置および予防のために有用であり得る。
【０２８９】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る。
【０２９０】
うっ血および血栓崩壊活性のアッセイとしては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｌｉｎｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１〜１４０、１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ．４５：４１３〜４１９、１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　５：７１〜７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　３５：４６７〜４７４、１９８８。
【０２９１】
（レセプター／リガンド活性）
本発明のタンパク質はまた、レセプター、レセプターリガンドまたはレセプター／リガンド相互作用のインヒビターもしくはアゴニストとしての活性を実証し得る。そのようなレセプターおよびリガンドの例としては、限定することなく、サイトカインレセプターおよびそのリガンド、レセプターキナーゼおよびそのリガンド、レセプターホスファターゼおよびそのリガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターおよびそのリガンド（限定することなく、細胞接着分子（例えば、セレクチン、インテグリンおよびそのリガンド）、ならびに抗原提示、抗原認識および細胞性免疫応答および液性免疫応答の発生に関与するレセプター／リガンド対を含む）が挙げられる。レセプターおよびリガンドはまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性のあるペプチドまたは低分子インヒビターのスクリーニングにおいて有用である。本発明のタンパク質（限定することなく、レセプターおよびリガンドのフラグメントを含む）が、それ自体で、レセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
【０２９２】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る。
【０２９３】
レセプター−リガンド活性の適切なアッセイとしては、限定することなく、以下に記載されるものが挙げられる：ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｓｔａｔｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　７．２８．１−７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：６８６４〜６８６８、１９８７；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５〜１１５６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９〜１６０　１９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１７５：５９〜６８、１９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ　８０：６６１〜６７０、１９９５。
【０２９４】
（抗炎症活性）
本発明のタンパク質はまた、抗炎症活性を示し得る。抗炎症活性は、炎症応答に関与する細胞に対する刺激を提供すること（細胞間相互作用（例えば、細胞接着）を阻害するか、または促進することによって）によってか、炎症プロセスに関与する細胞の走化性を阻害するか、または促進することによってか、細胞の血管外遊出を阻害するか、または促進するかによってか、あるいは炎症応答を直接的により阻害するか、またはより促進する他の因子の産生を刺激するか、または抑制することによって、達成され得る。そのような活性を示すタンパク質を使用して、炎症状態（慢性状態または急性状態を含む）（限定することなく、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血−灌流損傷、内毒素の致死性、関節炎、補体媒介性激症拒絶症、腎炎、サイトカイン誘導性肺損傷またはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のようなサイトカインの過剰産生より生じるものが挙げられる）を処置し得る。本発明のタンパク質はまた、抗原性物質または抗原性材料に対する、アナフィラキシーおよび過敏症の処置のためにも、有用であり得る。
【０２９５】
（腫瘍阻害活性）
腫瘍の免疫学的処置または予防について上記に記載された活性に加えて、本発明のタンパク質は、他の抗腫瘍活性を示し得る。タンパク質は、直接的または間接的（例えば、ＡＤＣＣを介して）腫瘍増殖を阻害し得る。タンパク質は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に作用することによって、腫瘍増殖を支持するために必要な組織の形成を阻害することによって（例えば、新脈管形成を阻害することによって）、腫瘍増殖を阻害する他の因子、物質または細胞型の産生を生じることによって、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、物質または細胞型を、抑制、除去または阻害することによって、その腫瘍阻害活性を示し得る。
【０２９６】
（他の活性）
本発明のタンパク質はまた、以下のさらなる活性または効果の１つ以上を示し得る：限定はされないが、細菌、ウイルス、真菌および他の寄生生物を含む感染因子の、増殖、感染または機能を阻害するか、あるいは死滅させること；身体的特徴（限定することなく身長、体重、髪の色、目の色、皮膚、赤肉に対する脂肉の比、または他の組織色素沈着、あるいは器官または身体部分のサイズまたは形状（例えば、胸部増大または減少、骨の形態または形状の変化）が挙げられる）を生じること（抑制または増強）；バイオリズムあるいはサーカディアンサイクルまたはサーカディアンリズムを生じること；雄性被験体または雌性被験体の受胎能を生じること；食事脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子または他の栄養因子もしくは栄養成分の、代謝、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、貯蔵または除去を生じること；行動的特徴（食欲、性欲、ストレス、認識（認識障害を含む）、うつ病（抑うつ障害を含む）および狂暴症を含むが、これらに限定されない）を生じること；鎮痛性効果または他の疼痛減少効果を提供すること；造血系列以外の系列における胚性幹細胞の分化または増殖を促進すること；ホルモン活性または内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠損を矯正すること、および欠損関連疾患を処置すること；過剰増殖障害（例えば、乾癬）の処置；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体に結合する活性）；ならびにワクチン組成物において抗原として作用し、そのようなタンパク質または他の物質あるいはそのようなタンパク質と交差反応する実体に対する免疫応答を惹起する能力。
【０２９７】
通常、神経疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、神経系の腫瘍、神経毒への曝露、急性脳損傷、末梢神経外傷または損傷、および他の神経障害、てんかん、および／または振せんが挙げられる。
【０２９８】
（等価物）
前述の本発明の特定の実施形態の詳細な記載より、以下のことが明らかである。核酸、ポリペプチド、抗体、検出および処置に関する特定の新規な組成物および方法が記載されたことは明らかである。これらの特定の実施形態は、本明細書中で詳細に開示されたが、このことは、例示の目的のためのみになされ、そして上記の添付の請求項の範囲を限定することを意図しない。特に、本発明者らによって以下のことが考えられる。本発明の当業者の慣用的なこととして、請求項によって定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の代用、変更および修飾がなされ得ること、が考えられる。実は、本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の種々の改変は、上述の記載および添付の図面より当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の請求項の範囲内にあると意図される。
【０２９９】
【表１】
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2004507202.t晩ꃂ〰㈵㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㘸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㠸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵〹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㈵㠹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰ㄳ㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰ㄳ㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰ㄳ㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰ㄳ㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰ㄳ㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㈳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㈳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㈳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㈳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㈳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㌳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㌳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㌳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㌳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㌳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㐳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㐳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㐳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㐳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㐳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㔳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㔳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㔳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㔳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㔳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㘳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㘳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㘳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㘳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㘳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㜳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㠳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵〹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤳㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤳㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤳㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤳㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㌵㠹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰㤳㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〴㰱愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〴㰳愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〴㰵愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〴㰷愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵㠰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴쉦゠㔰〴㰹愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰〵㈷㈰琮晩㸢〲㐰〵㈷㈰琮晩ꃂ〰㐵〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㜰〲⸲楴≦㈾〰㔴㜰〲⸲楴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