(57)【要約】本発明は、官能化ポリスチレンに基づく樹脂、その製造方法、抗−第ＶＩＩＩ因子抗体の精製用のカラムを製造するためのその使用、および抗−第ＶＩＩＩ因子抗体を精製するためのエクスビボ方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜５％架橋され、そしてスルホネート基およびＬ−チロシンのメチルエステルから誘導されるスルファミド基で官能化された、ポリスチレンから作製される樹脂であって、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2004513988.tif 000014
［ここで：
−ａは、５〜１５％であり；
−ｂは、７４〜８２％であり；
−ｃは、０〜５％であり；
−ｄは、５〜１５％であり；
−ｎは、３〜５０００であり；
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄの合計は、１００に等しい。］
に対応することを特徴とする、樹脂。
【請求項２】
インデックスｃが０％に等しい、請求項１に記載の樹脂。
【請求項３】
インデックスｄが７〜１３％である、請求項１または２に記載の樹脂。
【請求項４】
前記ポリスチレンがジビニルベンゼンで架橋されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の樹脂。
【請求項５】
乾燥状態で３５〜８０μｍの直径を有するビーズの形態であることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の樹脂。
【請求項６】
乾燥状態で３５〜７５μｍの直径を有するビーズの形態であることを特徴とする、請求項５に記載の樹脂。
【請求項７】
血漿および血液を精製するためのカラムを製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂の使用。
【請求項８】
前記カラムが、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を吸着し得ることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記カラムが、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を含有する液体を処理するように意図されることを特徴とする、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記液体が、血友病Ａに罹患する患者からの血漿または全血であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
生理学的ｐＨの緩衝液中に平衡化された、請求項１〜６のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有する精製カラム。
【請求項１２】
請求項１１に定義される１以上の精製カラムを含む、連続循環（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）を有する閉鎖回路（ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ）からなる、抗−ＶＩＩＩ抗体を精製するための装置。
【請求項１３】
直列または並列に配置された少なくとも２つのカラムを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の官能化ポリスチレンから作製される樹脂の製造方法であって、
第１工程において、２〜５％架橋された非官能化ポリスチレン（ＰＳ）のビーズ上において、８よりも大きいＨＳＯ３Ｃｌ／ＰＳモル比で、モノクロロスルホン酸（ＨＳＯ３Ｃｌ）を反応させて、パラ−クロロスルホニック官能基を有するポリスチレン（ＰＳＳＯ２Ｃｌ）を得ることを含む、クロロスルホン化反応が行われ、次いで、
第２工程が、このようにして得られたポリスチレンＰＳＳＯ２Ｃｌのパラ−クロロスルホニック官能基（ＳＯ２Ｃｌ）を、第３級アミンの存在下で、有機溶媒媒体中に予め溶解されたヒドロクロリド形態のＬ−チロシンのメチルエステル（ＴｙｒＯＭｅ）でエステル化させ［該ＴｙｒＯＭｅ／ＳＯ２Ｃｌモル比（Ｒ）は０．１〜１であり、該第３級アミン／ＴｙｒＯＭｅモル比（Ｒ’）は１〜２であり、そして該第３級アミン／ＳＯ２Ｃｌモル比（Ｒ”）が１〜２である］、式（Ｉ）の樹脂を得ることを含む、
ことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
モル比（Ｒ）が０．１５に等しく、モル比（Ｒ’）が２に等しく、そしてモル比（Ｒ”）が１に等しいことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１工程において使用される架橋化非官能化ポリスチレンのビーズが、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンのビーズであることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロロスルホン化反応が、３０〜６０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
合成が終了したときに、式（Ｉ）の樹脂が、Ｌ−チロシンメチルエステル官能基を鹸化することなしに残存パラ−クロロスルホニル官能基を加水分解し得る塩基性化剤で洗浄されることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
エクスビボで、液体中に存在する抗−ＦＶＩＩＩ抗体を精製するための方法であって、以下：
ａ）該液体を、請求項１〜６のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有する少なくとも１つの精製カラムと接触させること、および
ｂ）次いで、該抗−ＦＶＩＩＩ抗体が吸着された該式（Ｉ）の樹脂から該液体を分離すること、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
前記液体が血漿または全血であることを特徴とする、請求項１９に記載の精製方法。
【請求項２１】
前記血漿または前記全血が、それぞれ、血友病Ａに罹患する患者からの血漿または全血であることを特徴とする、請求項２０に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、官能化ポリスチレンに基づく樹脂、その製造方法、抗−第ＶＩＩＩ因子抗体を吸着するためのカラムを製造するためのその使用、およびまたエクスビボで抗−第ＶＩＩＩ因子抗体を精製するための方法に関する。
【０００２】
血友病Ａは、血液凝固因子の１つ、すなわち第ＶＩＩＩ因子を合成する遺伝子の異常に起因する。この疾患は、同一頻度で世界中に渡って分布し、そして５０００出生当たり１個体を冒す。
【０００３】
血友病Ａは、無処置では、ほぼ短期間後に死へと導く、非常に重篤な出血性疾患である。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血液凝固プロセス（止血）に関与する必須因子の１つである。第ＶＩＩＩ因子は、不安定な糖蛋白であり、血漿中の正常濃度は、非常に低い（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）、（Ｍ． Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃ． Ｃｏｎｔｒａｃｅｐ．， １９９１， ７， ２４４−２５８）。
【０００５】
純粋に代用となる現在の処置は、不足しているかまたは存在していないこの凝固因子を血液循環へ静脈内注射によって導入することを可能にし、これは、正常な止血を再構築するためである。
【０００６】
この代用処置の合併症（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、重篤な血友病の症例の２５〜３０％における、ＦＶＩＩＩの生物学的活性に向けられこの活性を中和する同種異系抗体の出現である（Ｙ． Ｓｕｌｔａｎ， Ｇａｚｅｔｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ， １９７８， ８５， １０１７−１０２６ ； Ｌ．Ｍ． Ａｌｅｄｏｒｔ， Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ， １９９８， ４， ３４１−３４５ ａｎｄ Ｊ． Ｃａｂａｎｅ， Ｌｅ Ｃｏｎｃｏｕｒｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， １９８７， １０９， １３９−１４２）。
【０００７】
この合併症が現れる場合、不足しているＦＶＩＩＩを導入することによる代用処置は無効となり、次いで、このように免疫化された血友病患者を処置するための他の方法を使用することが必要となる。
【０００８】
免疫化血友病患者およびまた自己抗体（特に自己免疫疾患に関連する抗−ＦＶＩＩＩ抗体）を発現する個体を助けるための可能な方法の１つは、これらの抗体の血漿を精製することである。
【０００９】
これらの抗体は、免疫系のＢリンパ球によって合成され、そして主にＩｇＧ４（時にはＩｇＧ１およびＩｇＧ２）に属する、免疫ブロブリンＧ（ＩｇＧ）である。
【００１０】
抗−ＦＶＩＩＩ抗体の血漿のこの精製は、一般的に、精製される血漿を、体外循環によって、免疫吸着剤を含有するカラムを通過させることによって行われる。
【００１１】
この操作を行うために使用されるカラムは、抗−ヒトＩｇＧ抗体が結合されてい得るアガロースゲル（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標））から構成され得る。
【００１２】
従って、ヤギからの抗−ヒトＩｇＧ４抗体を、セファロース（登録商標）ゲルへ共有結合させることが、例えば、特にＶ． Ｒｅｇｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９８７， ４５， ５１−５７によって提案されている。このような支持体を用いて、血友病患者の血漿中に存在する抗−ＦＶＩＩＩ抗体の５８〜９４％を除去することが可能であるようである；しかし、この支持体は、それらのいくつかがＩｇＧ１サブクラスへ属するのであれば、抗−ＦＶＩＩＩ抗体全てを除去することを可能にしない。
【００１３】
さらに同一目的で、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から抽出されたプロテインＡをセファロース（登録商標）ゲルへカップリングすることもまた提案されている（Ｈ． Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９７９， １４， ９２５−９３０）。プロテインＡは、様々な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）のＩｇＧのＦｃフラグメントと反応する（Ｈ． Ｈｊｅｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｆｅｂｓ． Ｌｅｔｔ．， １９７２， ２８， ７３−７６）。ヒトにおいて、それは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＦｃフラグメントを認識する。
【００１４】
その特性は、このタンパク質を、全ＩｇＧを精製するための良好なリガンドにし、そしてこの理由のために、それは、多くの抗体の精製において長い間使用されてきた。
【００１５】
しかし、セファロース（登録商標）ゲルへ結合されたプロテインＡから構成されるカラムを使用する血漿の精製は、抗−ＦＶＩＩＩ抗体について特異的でなく、そして全ＩｇＧの血漿レベルの９０％減少にだけでなく、ＩｇＡおよびＩｇＭのそれに導き、従って、血漿の精製が行われる患者の免疫防御をかなり弱める。さらに、この支持体は、それが使用される場合に、プロテインＡの徐々の脱着へと導き得る不十分な安定性を示す。次いで、このプロテインＡは、血漿の精製を受ける患者の血液循環へ流入され（ｅｎｔｒａｉｎｅｄ）、これは、補体系の有害な活性化を引き起こす。
【００１６】
この技術は、このタイプのカラムのコスト費用を考えれば、非常に高く、そしてプロテインＡを介しての可能なウイルス汚染から保護しない。
【００１７】
より最近では、アミノ酸残基（例えば、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、トレオニン、アラニン、またはフェニルアラニン）を保有するクロロスルホニル官能基およびスルホネートで官能化されたポリマー（セルロースポリエステル、セルロースポリエーテル、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリイソプレンまたはポリブタジエン）に基づく支持体からなる吸着カラムを使用しての抗−ＦＶＩＩＩ抗体を分離するための方法がまた、特に特許出願ＦＲ−Ａ−２ ５８２ ８１５において提案されている。
【００１８】
この様式で、Ｃ． Ｂｏｉｓｓｏｎ−Ｖｉｄａｌらによる論文、Ｊ． Ｍａｔ． Ｓｃ．， １９９１， ２， １９３−１９６において、グルタミン酸のジメチルエステルで１８、２４または６５％、あるいはα−ヒドロキシプロリンで８、１６または３５％置換されたポリスチレンに基づく樹脂が提案されている。最善の結果は、グルタミン酸のジメチルエステルで２４％修飾されたポリスチレンからなる樹脂を用いて得られる。
【００１９】
しかし、このような支持体は、抗−ＦＶＩＩＩ抗体に関するそれらの不十分な吸着特異性および抗−ＦＶＩＩＩ抗体に関するそれらの精製からの低すぎる収率の観点から、必ずしも十分でない。
【００２０】
Ｌ． Ｄａｈｒｉらによる論文、Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｅｄｎ．， １９９４， ８， ６９５−７０５は、Ｌ−チロシンまたはＬ−チロシンのメチルエステルで種々の程度まで置換された（約５〜５５％）ポリスチレンに基づく吸着樹脂を記載する。
【００２１】
しかし、これらの樹脂の特異性は十分でなく、何故ならば、その使用がまた、２５％を超える凝固第Ｖ因子（ＦＶ）（この存在は凝固プロセスの正確な機能に必須である）の血漿からの除去へ導くからである。さらに、不純物（塩素）の存在が実証されている。
【００２２】
これらの問題を取り除くために、本発明者らは、驚くことに、本発明の主題を形成するものを開発した。
【００２３】
彼らは、実際に、Ｌ−チロシンのメチルエステルから誘導されるスルファミド官能基を５〜１５％含有する官能化ポリスチレンから作製される樹脂を調製する（合成する、コンディションニングする（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ））ための新規の方法を開発した。これらの樹脂は、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を特異的に吸着し得、従ってそれらがこれらの抗体を発現している個体における体外精製のためのカラムを製造するための免疫吸着剤として使用されることを可能にする。
【００２４】
従って、本発明の主題は、２〜５％架橋され、そしてスルホネート基およびＬ−チロシンのメチルエステルから誘導されるスルファミド基で官能化された、ポリスチレンから作製される樹脂であって、それらは以下の式（Ｉ）：
【００２５】
【化２】
2004513988.tif 000002
【００２６】
［ここで：
−ａは、５〜１５％であり；
−ｂは、７４〜８２％であり；
−ｃは、０〜５％であり；
−ｄは、５〜１５％であり；
−ｎは、３〜５０００であり；
ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄの合計は、１００に等しい。］
に対応することを特徴とする。
【００２７】
以下の記載において、そして便宜のために、本発明に従う式（Ｉ）の樹脂は、ＰＴｙｒＯＭｅ（または、ＢＩＯＴＹＲ）と名付けられ得る。
【００２８】
インデックスｃが０〜２％である式（Ｉ）の樹脂が好ましく、そしてなおより詳細には、インデックスｃが０％であるものが好ましい。
【００２９】
本発明によれば、インデックスｄは、好ましくは７〜１３％である。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記ポリスチレンはジビニルベンゼンで架橋されている。
【００３１】
上述のように、ポリスチレンの架橋度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）は、２〜５％である。実際に、２％未満の（１％のオーダーの）架橋度を示すポリスチレンの使用は、不安定な樹脂を生じさせる。５％を超える架橋度を示すポリスチレンの使用は、官能化するのが困難である樹脂を生じさせる。
【００３２】
式（Ｉ）の樹脂は、一般的に、好ましくは乾燥状態で３５〜８００μｍ、そしてなおより好ましくは３５〜７５μｍの直径を有するビーズの形態である。
【００３３】
式（Ｉ）の樹脂は、クロマトグラフィーカラムを製造するために、特に血漿および血液を精製するためのカラムを製造するために使用され得る。これらのカラムは、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を吸着し得る。
【００３４】
従って、本発明の主題はまた、上記に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有し、そして一般的に約７．３〜７．４の生理学的ｐＨの緩衝液中に平衡化された、精製カラムである。
【００３５】
これらのカラムは、連続循環（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）を有する閉鎖回路（ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ）からなる、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を精製するための装置の一部であり得、ここで、上記に定義される１以上のカラムが搭載され得、該カラムは、直列または並列に配置されており、その結果、抗−ＦＶＩＩＩ抗体精製収率を増加させる一方で同時におそらく精製時間を減少させる。
【００３６】
これらの精製回路（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｉｒｃｕｉｔｓ）は、好ましくは、注入バルブ、および循環を提供するポンプを備える。この精製装置が血液サンプルを処理するために使用される場合、それはまた、この血漿が本発明に従うカラムを通過される前に、血液を構成する細胞要素から血漿を分離する、細胞分離器（ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｏｒ）を備え得る。
【００３７】
精製回路は、好ましくは、精製の持続期間にわたって、３７℃に等しいかまたはこれに近い温度に維持される。
【００３８】
従って、本発明の主題はまた、抗−ＦＶＩＩＩ抗体を含有する液体を処理するように意図されるカラムを製造するための、上記に定義される式（Ｉ）の１以上の樹脂の使用である。処理される液体は、好ましくは、血漿または全血であり、そしてなおより好ましくは、血友病Ａに罹患する患者からの血漿または全血である。
【００３９】
本発明者らは、実際に、本発明に従う式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有する少なくとも１つのカラムを含む血漿精製装置を使用しての、血友病Ａに罹患する個体からの血漿の精製が、該血漿中に存在する大部分の抗−ＦＶＩＩＩ抗体を除去することを可能にすることを実証した。
【００４０】
さらに、この精製後、血漿中の残存する全てのＩｇＧのレベル、および凝固因子のそれは、非常に少ない割合内で変化し、従って、抗−ＦＶＩＩＩ抗体の吸着に関する式（Ｉ）の樹脂の非常に大きな特異性を実証する。
【００４１】
この血漿精製装置の別の利点は、本発明に従う精製カラム上の血漿の通過は、補体系のタンパク質の吸着によるこの血漿のいずれの有意な脱補体化（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）へ導かないことである。
【００４２】
本発明に従う使用によれば、精製が終了した場合、上記に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含む精製カラムは、食塩水溶液、一般的に３Ｍ ＮａＣｌ溶液をカラム上に通過させることによる、樹脂上に吸着された血漿フラクションの脱着によって、再生され得る。次いで、樹脂は、生理学的ｐＨ（約７．３〜７．４）の緩衝溶液を使用して再平衡化される。本発明の特定の実施形態によれば、そして精製回路が、並列に配置された本発明に従う少なくとも２つの精製カラムを備える場合、それらの一つは、他のものが抗−ＦＶＩＩＩ抗体を吸着するために使用されている間に、再生される。
【００４３】
これらの精製カラムの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、式（Ｉ）の樹脂の化学分解（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）へ導かず、この結果および利点は、抗−ＦＶＩＩＩ抗体に対するその特異性が修飾されないということである。
【００４４】
本発明の主題はまた、式（Ｉ）の官能化ポリスチレンから作製される樹脂の製造方法である。
【００４５】
式（Ｉ）の樹脂は、２つの主な工程：ポリスチレンの芳香族環上へクロロスルホニル官能基を導入することを可能にするクロロスルホン化（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎａｔｉｏｎ）、および次いで該クロロスルホニル基を介してのＬ−チロシンのメチルエステルの結合、で製造される。
【００４６】
この方法によれば、そして第１工程において、２〜５％架橋された非官能化ポリスチレン（ＰＳ）のビーズ上において、８よりも大きいＨＳＯ３Ｃｌ／ＰＳモル比で、モノクロロスルホン酸（ＨＳＯ３Ｃｌ）（過剰）を反応させて、パラ−クロロスルホニック官能基を有するポリスチレン（ＰＳＳＯ２Ｃｌ）を得ることを含む、クロロスルホン化反応が行われ、次いで、第２工程が、このようにして得られたポリスチレンＰＳＳＯ２Ｃｌのパラ−クロロスルホニック官能基（ＳＯ２Ｃｌ）を、第３級アミンの存在下で有機溶媒媒体中に予め溶解されたヒドロクロリド形態のＬ−チロシンのメチルエステル（ＴｙｒＯＭｅ）でエステル化させて上記に定義される式（Ｉ）の樹脂を得ることを含み、該ＴｙｒＯＭｅ／ＳＯ２Ｃｌモル比（Ｒ）は０．１〜１であり、該第３級アミン／ＴｙｒＯＭｅモル比（Ｒ’）は１〜２であり、そして該第３級アミン／ＳＯ２Ｃｌモル比（Ｒ”）が１〜２である。
【００４７】
この合成方法は、簡略化された様式で、以下の一般スキームＡによって表され得、ここで、インデックスｄは、式（Ｉ）についての化合物について上述されたものと同一の意味を有する。
【００４８】
【化３】
2004513988.tif 000003
【００４９】
この製造方法の好ましい実施形態によれば、モル比（Ｒ）は０．１５に等しく、モル比（Ｒ’）は２に等しく、そしてモル比（Ｒ”）は１に等しい。
【００５０】
第１工程の間に使用される非官能化の架橋ポリスチレンのビーズは、好ましくは、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンのビーズである。
【００５１】
それらは、好ましくは、ジクロロメタン、ニトロメタン、ペルクロロエチレン、ジメチルホルムアミド、メチレンクロリドまたはテトラヒドロフランのような、ポリスチレンのための溶媒化媒体中に、予め、膨潤（ｓｗｏｌｌｅｎ）されている。溶媒化媒体中でのポリスチレンの膨潤（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）は、アクセス可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）表面領域を増加させることを可能にし、その結果、試薬が完全にビーズに浸透し得、高い収率を有するようになる。
【００５２】
第１工程のクロロスルホン化反応は、好ましくは、２つのサブ工程（ｓｕｂｓｔｅｐｓ）で、ジクロロメタン中でのＰＳの先行する膨潤の後に行われる：クロロスルホン酸が、非官能化ポリスチレン上で反応し、そして中間体ポリマー、ポリ（スルホニック）スチレンの形成へ、そして次いでポリ（パラ−クロロスルホニル）スチレンの形成へ導く。
【００５３】
クロロスルホニル化反応は、好ましくは、３０〜６０℃、そしてなおより特別には４０℃の温度で、約４時間行われ、これは、反応速度を増加させる目的を伴い、そしてポリスチレンのビーズの細砕を避けるために穏やかな攪拌を行う。これらの条件は、７０〜９０％のオーダーの収率を得ることを可能にする。
【００５４】
第１工程の終了時に、ＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂は、好ましくは、先ず、過剰の酸を除去するためにジクロロメタンで、そして次に、媒体中に残存する酸のいかなる痕跡をも除去しそして樹脂の乾燥を促進するためにアセトンで洗浄される。
【００５５】
第２工程を行うために、ＰＳＳＯ２Ｃｌビーズは、好ましくは、真空下で乾燥され、次いで溶媒化媒体（例えば、第１工程で使用され、そして上記で定義されるもの）で膨潤され、第２工程で使用される試薬へアクセス可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）領域を増加させる。
【００５６】
第２工程の間、Ｌ−チロシンのメチルエステルを、後者のヒドロクロリド形態の縮合によって、第３級アミン（例えば、トリエチルアミン（ＮＥｔ３））の存在下、無水溶媒中で、ＰＳＳＯ２Ｃｌへ結合させる。第３級アミンは、ヒドロクロリドを遊離アミンへ変換し、これは次いで、クロロスルホニックポリスチレンと反応する。次に、アミノ酸溶液を、好ましくは予め膨潤されているＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂と接触させる。反応の間に生成された塩酸を、第３級アミン（例えば、ＮＥｔ３）を反応媒体へ添加することによって中和する。
【００５７】
使用される試薬（第３級アミンおよびＬ−チロシンのメチルエステルのヒドロクロリド）の量の決定は、銀滴定アッセイ（ａｒｇｅｎｔｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）および元素分析によって決定される、第１工程の間に結合されるＳＯ２Ｃｌの量に依存する。
【００５８】
樹脂１グラム当たりのミリ当量（ｍｅｑ／ｇ）で表現されるこの量は、使用される試薬の量を決定するために、算出のための基礎として役立つ。
【００５９】
第１工程において、クロロスルホン化収率は、一般的に、少なくとも７６％に等しく、すなわち、樹脂１グラム当たり塩素４〜５ｍｅｑ、または樹脂１グラム当たりＳＯ２Ｃｌ官能基４〜５ｍｍｏｌである。
【００６０】
使用されるＬ−チロシンのメチルエステル（ＴｙｒＯＭｅ）および第３級アミン（ＡＩＩＩ）の量は、以下のモル比に基づいて算出される：
−Ｒ＝ＴｙｒＯＭｅ／ＰＳＳＯ２Ｃｌ＝０．１５；
−Ｒ’＝ＡＩＩＩ／ＴｙｒＯＭｅ＝２；および
−Ｒ”＝ＴｙｒＯＭｅ／ＰＳＳＯ２Ｃｌ＝１。
【００６１】
合成が終了したとき、このように得られた樹脂を濾過し、好ましくはアルコール（例えば、エタノール）で洗浄し、次いで４０〜５０℃の温度で真空下で乾燥する。
【００６２】
合成が終了したとき、式（Ｉ）の樹脂のインデックスｃが可能な限り低く、そして好ましくは０％に等しくなるように、塩素のいかなる痕跡をも除去することがまた望ましい。
【００６３】
これを行うために、樹脂は、好ましくは、Ｌ−チロシンメチルエステル官能基を鹸化することなしに残存パラ−クロロスルホニル官能基を加水分解し得る塩基性化剤（例えば、水酸化ナトリウム）で洗浄される。約１０回の洗浄後、残存塩素レベルは無視し得るようになる。
【００６４】
それが使用される前に、樹脂は、好ましくは、血漿タンパク質と相互作用し得る不純物のいかなる痕跡をも除去するために、一連の洗浄および遠心分離によってコンディショニングされる（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）。
【００６５】
これを行うために、樹脂は、種々のタイプの溶液（：塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ緩衝液）を使用する一連の洗浄によって与えられる。
【００６６】
合成の各工程後、本発明に従う式（Ｉ）の樹脂は、好ましくは、一連の物理化学的キャラクタライゼーションに供される。
【００６７】
特に、樹脂の顕微鏡観察は、合成の各工程の前後の粒子の形態およびサイズ分布に関する情報を得ることを可能にする。
【００６８】
各樹脂の置換度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）の測定は、樹脂を構成する元素（：窒素、硫黄、塩素およびナトリウム）の元素分析によって行われ得る。
【００６９】
樹脂の塩素含量はまた、水酸化ナトリウム水溶液中に懸濁の樹脂のサンプルの加水分解後に放出される塩素イオンの銀滴定アッセイ（ａｒｇｅｎｔｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）によって測定され得る。
【００７０】
Ｌ−チロシンのメチルエステルの含量（式（Ｉ）−インデックスｄ）はまた、例えば水酸化ナトリウム水溶液による、エステル官能基のプレ加水分解によって放出されるカルボキシリック官能基の酸滴定アッセイ（ａｃｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）によって測定され得る。
【００７１】
本発明に従う製造方法が行われる条件下で得られる、Ｌ−チロシンのメチルエステルの置換度は、５〜１５％の間で変化し、この合成方法の良好な再現性を実証する。
【００７２】
合成の終了時に、合成の種々の工程の間のポリスチレンのビーズの可能な破壊から生じる微細な粒子が、好ましくは排除される。この排除は、好ましくは７．２〜７．４のｐＨの緩衝溶液中の樹脂において一連の連続的洗浄および遠心分離を行うことによって行われ得る。これらの洗浄は、好ましくは、上澄みが完全に透明になるまで行われ得る。
【００７３】
樹脂中の微細粒子の不存在は、生物学的試験を使用して制御され得る（トロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間など）。
【００７４】
これらの生物学的試験は、試薬業者の説明書に従って行われる。
【００７５】
それらの使用の直前に、そして式（Ｉ）の樹脂が精製カラムへ導入されたとき、後者は、好ましくは、緩衝液（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｏｗｅｎ Ｃｏｌｅｒ緩衝液またはベロナール緩衝液）中で生理学的ｐＨ（一般的に、７．４）に平衡化される。
【００７６】
最後に、本発明の主題は、エクスビボで、液体中に存在する抗−ＦＶＩＩＩ抗体を精製するための方法であって、それは以下：
ａ）該液体を、上記に定義される式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有する少なくとも１つの精製カラムと接触させること、および
ｂ）次いで、該抗−ＦＶＩＩＩ抗体が吸着された該式（Ｉ）の樹脂から該液体を分離すること、
を含むことを特徴とする。
【００７７】
この精製方法の好ましい実施形態によれば、該液体は、血漿または全血、そしてなおより特別には、血友病Ａに罹患する患者からの血漿または全血である。
【００７８】
上記のアレンジメントに加えて、本発明はまた、本発明に従う式（Ｉ）の官能化樹脂の合成の実施例、式（Ｉ）の樹脂およびプロテインＡ−セファロース（登録商標）樹脂上における凝固因子の吸着の比較実施例、抗−ＦＶＩＩＩ抗体に関しての式（Ｉ）の樹脂の吸着の特異性の実証の実施例、直列または並列に組み立てられた式（Ｉ）の少なくとも１つの樹脂を含有する２つのカラム上への凝固因子の吸着の研究、ならびに式（Ｉ）の樹脂による補体タンパク質の吸着の研究の実施例に言及する、以下の説明から明らかとなるであろう他のアレンジメントを含む。
【００７９】
しかし、これらの実施例は、本発明の主題を単に例示するために与えられるのであって、ここでそれらは決して限定を構成しないことが理解されるべきである。
【００８０】
実施例１：式（Ｉ）の樹脂の調製（ＢＩＯＴＹＲ ４）
１）合成のための調製を含む工程
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社からＢｉｏ−Ｂｅａｄｓ Ｓ−Ｘ３（登録商標）（２００−４００メッシュ）の名で市販されている、３％架橋した１００ｇのポリスチレンのビーズを、８００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁する。混合物全体を周囲温度で１時間穏やかに撹拌する。次いで、懸濁液を濾過し、８００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。樹脂は、最後に４００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁する。
【００８１】
２）ポリスチレンのクロロスルホン化を含む工程（ＰＳＳＯ２Ｃｌの合成）
６５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２及び５５０ｍｌのＨＳＯ３Ｃｌからなる混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２の懸濁液の樹脂上に非常にゆっくり注ぐ。混合物全体を４時間穏やかに撹拌しながら４０℃で還流させる。次いで、樹脂を濾過し、１リットルのＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄する。樹脂の洗浄を１リットルのアセトン３回で続け、この樹脂を濾過する。最後に、ＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂を回収し、質量を測り、真空下４０℃で乾燥する。
【００８２】
３）ＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂の特徴付け
上記の工程２）で得られたＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂のサンプルを、樹脂の塩素含量を測定するために取る。この分析は、以下のような銀滴定アッセイによって行われる：１００ｇのＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂が７５ｍｌの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いて加水分解される。この混合物を、９０から１００℃の間の温度で、穏やかに撹拌しながら３時間還流し続ける。このようにして加水分解されたＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂は濾過され、蒸留水でリンスされる。濾液は、１Ｍ硝酸を加えることによって３と４の間のｐＨに酸性化される。次いで、塩素含量を測定するために溶液は０．１Ｍ硝酸銀溶液を用いてアッセイされる。ＰＳＳＯ２Ｃｌのビーズの顕微分析及び元素分析もまた行われる。
【００８３】
ＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂は以下の特徴を示した：
【００８４】
【表１】
2004513988.tif 000004
【００８５】
４）Ｌ−チロシンのメチルエステルの結合を含む工程（ＢＩＯＴＹＲ ４樹脂の例）
上記の工程２）で得られた１００ｇのＰＳＳＯ２Ｃｌ樹脂を周囲温度で３０分間５００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中で膨潤させる。
【００８６】
１５ｇのＴｙｒＯＭｅを還流下に４０℃で１リットルのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、１８ｍｌのＮＥｔ３を１時間かけて徐々に添加する。
【００８７】
２つの混合物を混合する。次に、６０ｍのＮＥｔ３をその混合物に穏やかに添加する。反応媒体全体を、穏やかに撹拌しながら４０℃で２時間還流させる。
【００８８】
次いで、樹脂を濾過し、６リットルのエタノール、次いで１５リットルの１０−２Ｍの水酸化ナトリウム溶液で洗浄する。
【００８９】
最後に、ＢＩＯＴＹＲ ４樹脂を回収し、質量を測り、インキュベーター中で真空下４０℃で乾燥させる。
【００９０】
５）Ｌ−チロシンのメチルエステルの結合の特徴付けを含む工程
上の工程ＩＶ）で得られた２００ｍｇのＢＩＯＴＹＲ ４樹脂を、５０℃で２４時間、１００ｍｌの２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で加水分解する。次いで、樹脂を濾過し、蒸留水で洗浄し、インキュベーター中で乾燥させる。
【００９１】
このようにして加水分解された１９０ｍｇのＢＩＯＴＹＲ ４樹脂を７０ｍｌの蒸留水中で懸濁し、滴定スタンド上で０．１Ｍ水酸化ナトリウムの滴定溶液でアッセイする。顕微分析及び元素分析も行われる。
【００９２】
ＢＩＯＴＹＲ ４樹脂は、以下の特徴を示した：
【００９３】
【表２】
2004513988.tif 000005
【００９４】
実施例２：式（Ｉ）の樹脂の調製
上の実施例１に記載されるのと同じ方法で、本発明に従う式（Ｉ）の樹脂（ＢＩＯＴＹＲ １からＢＩＯＴＹＲ ３及びＢＩＯＴＹＲ ５からＢＩＯＴＹＲ ８）が調製された。それらの特徴は以下の表Ｉに表される。
【００９５】
【表３】
2004513988.tif 000006
【００９６】
実施例３：凝固因子のＢＩＯＴＹＲ １及びプロテインＡ−セファロース（登録商標）樹脂への吸着の比較研究
１）スタンダードプロトコール
使用される精製装置の特徴は以下の通りである：
−使用されるカラム：ベロナール（ｖｅｒｏｎａｌ）バッファー１ｍｌあたり、上の表Ｉで記載されたＢＩＯＴＹＲ １樹脂０．４８０ｇの懸濁液１．７ｍｌ、又はベロナールバッファー１ｍｌあたり０．２７０ｇのプロテインＡ−セファロース（登録商標）のゲル１ｍｌで満たされた、長さ４ｃｍ、直径０．７ｃｍ のＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）カラム。カラムをベロナールバッファーｐＨ７．３６で平衡化させる。
−流速：連続閉鎖循環中０．１ｍｌ／分
−温度：３７℃
−使用される血漿：１時間以内に採取され、９０分間閉鎖循環装置中に置かれた６ｍｌの通常の血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）。いくつかの血漿は、行われる全ての実験のために調べられた。サンプルは以下の時間で取られた：
−Ｔ０：樹脂と接触前
−Ｔ１：接触の１５分後
−Ｔ２：接触の３０分後
−Ｔ３：接触の４５分後
−Ｔ４：接触の６０分後
−Ｔ５：接触の９０分後。
【００９７】
同じ血漿を３７℃に維持し、樹脂に接触させずにベンチに置いておき、コントロールとして役立たせるために同じようにサンプルとした（コントロール１）。
【００９８】
同じ血漿を、３７℃で樹脂を含まないＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）カラムに循環させ、使用されたシステム中での研究される様々な因子の安定性を測定するために、同じようにサンプルとした（コントロール２）。
【００９９】
このサンプルを取ることによって、研究される様々の因子の吸着キネティックスを作ることが可能になる。
【０１００】
２）プラスミドタンパク質のアッセイ
２．１）抗ＦＶＩＩＩ活性の測定
このアッセイの原理（Ｋａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒ．， １９７５，３４，８６９−８７２）は、ＦＶＩＩＩ（ＤＡＤＥ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社、フランスによって販売されている）を含む全凝固因子の１００％を含む参照血漿（ＲＰｓ）のプールと、試験される血漿との等量での混合物を３７℃で２時間インキュベートした後の、残ったＦＶＩＩＩの凝固活性の測定である。
【０１０１】
試験される血漿の異常が欠損因子によって起こるなら、正常な血漿の存在下で補正されるだろう。異常が阻害因子の存在の二次的なものなら、正常な血漿の存在下によっては修正されないだろう。抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルは、このアッセイの原理に従って測定される。抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、血漿１ｍｌあたりのベセズダ単位（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ｕｎｉｔｓ）（ＢＵ）で定義される。１ ＢＵは、３７℃での２時間のインキュベーションの後、１ｍｌの健康な血漿中の第ＶＩＩＩ因子を５０％阻害することができる抗体濃度に対応する。
【０１０２】
２．２）全ＩｇＧアッセイ
このアッセイは、放射状免疫拡散法（ＲＩＤ）又はＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）によって行われる。
【０１０３】
２．２．１）ＲＩＤによるアッセイ
試験される血漿は、アガロースゲル（ＮＯＲ ＰＡＲＴＩＧＥＮ（登録商標）ＩｇＧ ＨＣプレート、Ｂｅｈｒｉｎｇ）でできたウェル（５μｌ）に入れ、その中にヒトＩｇＧのγ鎖に対する特定の抗血清を加える。従来の方法で、拡散の２日後、目盛り付き拡大レンズ（ｇｒａｄｕａｔｅｄ ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ ｌｅｎｓ）を用いて０．１ｍｍ以内の沈降リングの直径を測定する。沈降リングの直径の二乗は、抗原（アッセイされるＩｇＧ）の濃度に比例し、結果はｍｇ／ｍｌ又はｇ／ｌで表される。
【０１０４】
２．２．２）ＥＬＩＳＡによるアッセイ
慣用のＥＬＩＳＡプロトコールに従い、マイクロ滴定プレートウェルは、５μｇ／ｍｌ（ＳＩＧＭＡ）の１００μｌの抗ヒトＩｇＧ抗体と結合させる。フィッシュゼラチン溶液で飽和にした後、アッセイされるＩｇＧは室温で２時間インキュベートされる。アッセイされるＩｇＧは、周囲温度で２時間インキュベートした後、ビオチン化抗ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）によって示す。次いで、１００μｌのストレプトアビジン−パーオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ）溶液を３７℃で１５分間添加する。
【０１０５】
発覚（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ）は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下にテトラメチルベンジジンジハイドロクロライド（ＴＭＢ）基質を用いて行われる。反応は、５分後に１００μｌの２Ｍ硫酸溶液を添加することにより停止する。光学密度（Ｏ．Ｄ．）は自動プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読まれた。
【０１０６】
標準範囲は、標準ＩｇＧ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて同じ条件下で確立される。
【０１０７】
２．３）凝固因子のアッセイ
凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ＋Ｘ）及びフィブリノーゲンは、色素原基質を添加することによる時間測定法（ｃｈｒｏｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）又はアミドリティック（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）アッセイを用いて従来通りにアッセイされる。
【０１０８】
３）結果
３．１）樹脂と接触せずに３７℃で循環された凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ＋Ｘ）、フィブリノーゲン及び全ＩｇＧの安定性
コントロール１及び２の結果の分析は、わずかな不活性化がみられ、９０分後に２０％オーダーの、この因子の非常に高い壊れやすさを確認した第Ｖ因子を除いて、使用された実験条件が、研究される様々な凝固因子の活性の損失を全く生じないことを示す。
【０１０９】
３．２）全ＩｇＧのＢＩＯＴＹＲ １及びプロテインＡ−セファロース（登録商標）樹脂への吸着の比較
結果は、以下の表ＩＩ及びＩＩＩに示す：
【０１１０】
【表４】
2004513988.tif 000007
【０１１１】
【表５】
2004513988.tif 000008
【０１１２】
結果は、接触９０分後に、ＢＩＯＴＹＲ １樹脂に吸着されたＩｇＧの割合が、プロテインＡ−セファロース（登録商標）樹脂に吸着されたＩｇＧの割合よりも明らかに低いことを示す。
【０１１３】
従って、本発明の式（Ｉ）の樹脂は、従来技術のプロテインＡ−セファロース（登録商標）タイプの樹脂よりもはるかに少ない循環しているＩｇＧを吸着することを可能にし、それによって、明らかにプラスミドの精製が行われる患者の免疫防御のより良い保護が得られる。
【０１１４】
３．３）第ＦＩＩ、ＦＶ及びＦＶＩＩ＋Ｘ因子、及びフィブリノーゲンの、ＢＩＯＴＹＲ １及びプロテインＡ−セファロース（登録商標）樹脂への吸着の比較
６ｍｌのＰＰＰ（様々なバッチ）の溶出の後に得られた結果を、以下の表ＩＶに示す：
【０１１５】
【表６】
2004513988.tif 000009
【０１１６】
これらの結果は、これらの様々な凝固因子の２つのタイプの樹脂への吸着が、第Ｖ因子の場合でさえも非常に低く、不活性化がコントロール１及び２の場合よりも高くないことを示す。
【０１１７】
実施例４：抗ＦＶＩＩＩ抗体に関する式（Ｉ）の樹脂の吸着の特異性の証明
１）血漿精製装置
この研究のために選択された実験条件は、治療的精製の間に使用される条件に近い。使用される装置の特徴は以下の通りである：
−使用されるカラム：ベロナールバッファー１ｍｌあたり、上の実施例１で調製されたＢＩＯＴＹＲ ４樹脂の０．４８０ｇの懸濁液４ｍｌで満たされた、高さ４ｃｍ、直径１ｃｍ のＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）カラム。カラムをベロナールバッファー、ｐＨ７．３６で平衡化させる。
−流速：連続閉鎖循環中１ｍｌ／分
−温度：３７℃
−使用される血漿：重度の血友病Ａに罹患する個体由来の８ｍｌの血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）であり、１０００ＢＵ／ｍｌに等しい力価を有する抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＳＨＡ Ｉ＋）を含む。
【０１１８】
サンプルは以下の時間で取られた：
−Ｔ０：樹脂と接触前
−Ｔ１：接触の３０分後
−Ｔ２：接触の６０分後
−Ｔ３：接触の９０分後。
【０１１９】
３つの一連の実験が行われた：
−抗ＦＶＩＩＩ抗体のカラムへの９０分間での吸着
−抗ＦＶＩＩＩ抗体の第１カラムへの９０分間での吸着、及び更なる９０分間での並列に組み立てられた第２カラムへの吸着
−上述したのと同じ実験（並列に組み立てられた２つのカラム）。ｐＨ２．２の２５ｍｌのクエン酸を用いた使用されていないカラムの連続再生及び再使用前のカラムのリコンディショニング（ｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）後に、２サイクルが各カラムについて行われる。
【０１２０】
２）結果
結果は以下の表Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩに示す。
【０１２１】
表Ｖは、８ｍｌのＳＨＡ血漿をＢＩＯＴＹＲ ４樹脂で充填されたカラムに９０分間通した後に得られた結果を与える。
【０１２２】
表ＶＩは、８ｍｌのＳＨＡ Ｉ＋血漿を上記したように２つのカラムに通した後に得られた結果を与える。
【０１２３】
表ＶＩＩは、上述した方法に従ってカラムの再生の後に得られた結果を与え、２０ｍｌのＳＨＡ Ｉ＋血漿（１０００ＢＵ／ｍｌ）は、その２つのカラム上で精製される。
【０１２４】
【表７】
2004513988.tif 000010
【０１２５】
これらの結果は、４２％の抗ＦＶＩＩＩ抗体がカラム上で保持されていることを示す。
【０１２６】
【表８】
2004513988.tif 000011
【０１２７】
これらの結果は、２つのカラム上を連続して通過した後、約６０％の抗ＦＶＩＩＩ抗体が保持されていることを示す。各カラムは、血漿と９０分間接触した後、１３１２及び１０８７ＢＵ／乾燥樹脂ｇ、のオーダーの等価な吸着能力を有する。
【０１２８】
【表９】
2004513988.tif 000012
【０１２９】
これらの結果は、血漿を第１カラムに６０分間通した後、約４２％の抗ＦＶＩＩＩ抗体が保持されることを示す。カラム１の再生の間、血漿はカラム２上で精製され、全抗ＦＶＩＩＩ抗体のうちの約６４％が保持される。血漿を再生されたカラム１上を通すことによって、７２％の抗ＦＶＩＩＩ抗体の保持を導く。最後に、再生されたカラム２への最後の通過によって、血漿から約８０％の抗ＦＶＩＩＩ抗体の減少が得られた。
【０１３０】
実施例５：ＢＩＯＴＹＲ １樹脂による補体タンパク質の吸着の研究
研究はＣ３タンパク質、補体システムの初期のそして中心的な成分の１つに関するように選ばれた。それは、１．０から１．３ｇ／ｌのオーダーの高い正常の血清濃度を有する可溶性タンパク質である。Ｃ３の活性化の結果の１つは、Ｃ３Ｃへの変換である。この活性化は、血清又は血漿のカルシウム再沈着、及びＣ３Ｃの形成を生じる活性化因子であるイヌリンの添加によって起こり得る。
【０１３１】
１）使用される血漿
６ｍｌの正常ＰＰＰは、０．４８ｇのＢＩＯＴＹＲ １樹脂の懸濁液１ｍｌを含む精製カラム上で循環される。
【０１３２】
Ｃ３Ｃタンパク質は、以下の時間に取られたサンプル上で間接的にアッセイされる：
−Ｔ０：カラムに通す前のＰＰＰ
−Ｔ１：ＢＩＯＴＹＲ １との接触１５分後のＰＰＰ
−Ｔ２：ＢＩＯＴＹＲ １との接触３０分後のＰＰＰ
−Ｔ３：ＢＩＯＴＹＲ １との接触４５分後のＰＰＰ
−Ｔ４：ＢＩＯＴＹＲ １との接触６０分後のＰＰＰ
同じドナー由来の血清学的サンプルは、Ｃ３Ｃのために調製及びアッセイされた（コントロールＳ、精製カラムに通さない）。
【０１３３】
２）Ｃ３タンパク質のアッセイ
このアッセイは、間接的に、即ち、イヌリンの作用によってＣ３タンパク質をＣ３Ｃに活性化した後で行われた。イヌリンによる活性化は、２ｇ／ｌ血漿の割合でのイヌリンの存在下に、３７℃で５時間、試験されるサンプルのプレインキュベーションが必要である。
【０１３４】
次いで、Ｃ３Ｃタンパク質は、従来通りＲＩＤによって血清上でアッセイされる。該技術は、全ＩｇＧをアッセイするために上述され、ＮＯＮ−ＰＡＲＴＩＧＥＮ（登録商標）プレート上の、Ｃ３Ｃタンパク質に対する特異的な抗血清を使用する。
【０１３５】
３）結果
得られた結果は、以下の表ＶＩＩＩで明らかにする。各結果は、２つの測定の平均である。
【０１３６】
【表１０】
2004513988.tif 000013
【０１３７】
これらの結果は、Ｃ３Ｃタンパク質の濃度が血清及び血漿Ｔ０（１．２ｇ／ｌ）において同じであることを示す。それらはまた、Ｃ３Ｃタンパク質の濃度がＢＩＯＴＹＲ １樹脂に接触させて３０分後に１．２ｇ／ｌから１．０ｇ／ｌに減少し、その後一定に保っていることを示す。健康な血漿をＢＩＯＴＹＲ １樹脂に接触させた６０分後においても、この血漿の補体除去はほとんどない。
【０１３８】
ＢＩＯＴＹＲ ４樹脂に接触させた１８０分後のＳＨＡ Ｉ＋血漿に対する同じ実験は、ここでもまた、血友病患者の血漿の弱い補体除去、つまり１２％のオーダーを示す。
【０１３９】
これらの補体除去の程度は、患者に対して不利ではない。
【０１４０】
結論として、この全結果のセットは、いかなる不利な補体除去を見ることなく、且つ、処理される血漿から多量のＩｇＧを奪うことなく、本発明に従う式（Ｉ）の樹脂が、高いレベルの抗ＦＶＩＩＩ抗体を有する血友病患者の血漿から抗ＦＶＩＩＩ抗体を非常に効果的に除去することを可能にすることを示す。
【国際公開パンフレット】
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2004513988.tif 000043
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513988.tif 000044
【国際調査報告】
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2004513988.tif 000046
2004513988.tif 000047
2004513988.tif 000048
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