(57)【要約】本発明は、ヘリコバクターHP30またはHP56ポリペプチド、それから誘導されるポリペプチド（HP30誘導またはHP56誘導ポリペプチド）、該ポリペプチドをコードする核酸、HP30、HP56、HP30誘導またはHP56誘導ポリペプチドと特異的に結合する抗体、ならびにHP30、HP56、HP30誘導またはHP56誘導ポリペプチドに特異的なＴ細胞を開示する。さらに、HP30、HP56、HP30誘導もしくはHP56誘導ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、またはそれに対する抗体を含んでなる予防または治療用組成物（ワクチンなどの免疫原性組成物を含む）も開示する。本発明はさらに、動物においてヘリコバクター細胞または抗原に対する免疫応答を引き出す方法を開示する。
2004520825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター属細菌（Helicobacter spp）の単離されたHP30またはHP56ポリペプチドであって、HP30はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して30kDaの分子量を有しかつ配列番号４または48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合し、HP56はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して56kDaの分子量を有しかつ配列番号２の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする、上記HP30またはHP56ポリペプチド。
【請求項２】
ヘリコバクター属細菌がヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）およびヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）からなる群より選択される、請求項１に記載のHP30またはHP56ポリペプチド。
【請求項３】
ヘリコバクター属細菌がヘリコバクター・ピロリである、請求項２に記載のHP30またはHP56ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２もしくは４もしくは48の配列、またはその断片（ただし、配列番号２もしくは４もしくは48のタンパク質配列と特異的に結合する抗体に特異的に結合する少なくとも６アミノ酸長の断片）；配列番号１もしくは３もしくは47の配列からなる核酸分子によりコードされる配列；あるいは、(a) 6xSSC, 50mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% フィコール, 0.02% BSAおよび500mg/ml 変性サケ精子DNAを含むバッファー中50℃でのフィルターとDNAとのプレハイブリダイゼーション、(b) 100mg/ml 変性サケ精子DNAを含むプレハイブリダイゼーション混合物中65℃でのハイブリダイゼーション、および(c) 2xSSC, 0.01% PVP, 0.01% フィコール, 0.01% BSAを含む溶液中37℃でのフィルターの洗浄を含む高度ストリンジェンシー条件下で、配列番号１もしくは３もしくは47の配列からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる配列；を含んでなる単離されたHP56またはHP30ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２および４または48からなる群より選択される配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合する、請求項１に記載のHP56もしくはHP30ポリペプチドまたはその少なくとも６アミノ酸ペプチド断片。
【請求項６】
少なくとも６アミノ酸長である、請求項１に記載のHP30またはHP56ポリペプチドのペプチド断片。
【請求項７】
前記断片が配列番号５〜20の配列を含んでなる、請求項６に記載のペプチド断片。
【請求項８】
少なくとも２つのペプチドを含む単離された融合ポリペプチドであって、該ペプチドのそれぞれは、配列番号５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20からなる配列より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択されるが、該融合ポリペプチドのペプチドは天然の配置とは異なる配置に並べられていることを条件とする、上記融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが配列番号５、６、７、８、９、10および11を含むが、該融合ポリペプチドのペプチドは天然の配置とは異なる配置に並べられていることを条件とする、請求項８に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが配列番号16、17、18、19および20を含むが、該融合ポリペプチドのペプチドは天然の配置とは異なる配置に並べられていることを条件とする、請求項８に記載の単離された融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のHP56またはHP30ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項６に記載のペプチド断片と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
配列番号５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチド断片と特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
細胞傷害性抗体、細胞増殖抑制抗体、または中和抗体である、請求項11、12または13に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１に記載のHP30ポリペプチドおよびHP56ポリペプチドと、製薬上許容される担体または希釈剤とを含有する、請求項１または請求項４のHP30またはHP56ポリペプチドを含むワクチン組成物。
【請求項１６】
１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物をさらに含有する、請求項15に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記アジュバントまたは免疫刺激化合物が、ミョウバン、mLT、QS21、MF59、CpG DNA、PML、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、PLG、CT、LTBおよびCT/LTからなる群より選択される、請求項16に記載のワクチン。
【請求項１８】
１種のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項16に記載のワクチン。
【請求項１９】
２種の異なるアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項16に記載のワクチン。
【請求項２０】
請求項５または６に記載のペプチド断片および製薬上許容される担体または希釈剤を含有するワクチン。
【請求項２１】
１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物をさらに含有する、請求項20に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物が、ミョウバン、mLT、QS21、MF59、CpG DNA、PML、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、PLG、CT、LTBおよびCT/LTからなる群より選択される、請求項21に記載のワクチン。
【請求項２３】
１種のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項21に記載のワクチン。
【請求項２４】
２種の異なるアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項21に記載のワクチン。
【請求項２５】
請求項８に記載の単離された融合ポリペプチドおよび製薬上許容される担体または希釈剤を含有するワクチン。
【請求項２６】
１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物をさらに含有する、請求項26に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物が、ミョウバン、mLT、QS21、MF59、CpG DNA、PML、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、PLG、CT、LTBおよびCT/LTからなる群より選択される、請求項26に記載のワクチン。
【請求項２８】
１種のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項26に記載のワクチン。
【請求項２９】
２種の異なるアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項26に記載のワクチン。
【請求項３０】
請求項11に記載の抗体および製薬上許容される担体または希釈剤を含有するワクチン。
【請求項３１】
脂質、リポタンパク質、リン脂質、リポオリゴ糖、タンパク質、弱毒化生物および不活化全細胞からなる群より選択される免疫原１種以上をさらに含有する、請求項15、20または25に記載のワクチン。
【請求項３２】
H.ピロリ細胞毒素、H.ピロリhsp60、H.ピロリCagA、H.ピロリウレアーゼ、H.ピロリカタラーゼ、H.ピロリニッケル結合タンパク質、H.ピロリtagA、H.ピロリエノラーゼ、カンピロバクター属細菌、赤痢菌属細菌、腸病原性大腸菌株、コレラ菌またはロタウイルスの弱毒化もしくは死滅させた全生物またはサブユニットからなる群より選択される免疫原１種以上をさらに含有する、請求項15、20または25に記載のワクチン。
【請求項３３】
ヘリコバクター属細菌の単離されたHP30もしくはHP56ポリペプチドまたはその少なくとも６アミノ酸断片をコードする、ヘリコバクター属細菌のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子またはその断片であって、HP30はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して30kDaの分子量を有しかつ配列番号４または48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合し、HP56はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して56kDaの分子量を有しかつ配列番号２の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合し、そして、該核酸の断片は配列番号２または４もしくは48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードしていることを特徴とする、上記単離された核酸分子。
【請求項３４】
ヘリコバクター属細菌の配列番号１または３もしくは47の配列からなる単離された核酸分子、配列番号２または４もしくは48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードするその少なくとも18ヌクレオチド断片、またはその相補体。
【請求項３５】
請求項33に記載の単離された核酸分子を含有する医薬組成物。
【請求項３６】
請求項33に記載の単離された核酸分子を含有するワクチン。
【請求項３７】
請求項１に記載のHP30もしくはHP56ポリペプチドをコードする単離された核酸、あるいは配列番号１または３もしくは47の配列からなる単離された核酸、あるいは配列番号２または４もしくは48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合するポリペプチドをコードする前記核酸のいずれかの少なくとも18ヌクレオチド断片を含有し、さらに同一であっても異なっていてもよい１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有するワクチン。
【請求項３８】
前記１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物が、ミョウバン、mLT、CT、LTB、CT/LT、QS21、MF59、CpG DNA、PML、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、およびPLGからなる群より選択される、請求項37に記載のワクチン。
【請求項３９】
１種のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項37に記載のワクチン。
【請求項４０】
２種の異なるアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有する、請求項37に記載のワクチン。
【請求項４１】
ヘリコバクター属細菌の単離されたHP30もしくはHP56ポリペプチド、またはヘリコバクター属細菌のHP30もしくはHP56ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸の１種以上を含有し、さらにミョウバン、mLT、QS21、MF59、CpG、DNA、PML、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物、PLG、CT、LTBおよびCT/LTからなる群より選択される１種以上のアジュバントまたは免疫刺激化合物を含有するワクチンであって、HP30はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して30kDaの分子量を有しかつ配列番号４または48の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合し、HP56はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して56kDaの分子量を有しかつ配列番号２の配列を有するタンパク質と特異的に結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする、上記ワクチン。
【請求項４２】
ミクロスフェアまたはナノスフェアとして製剤化された、請求項15、20、25、30、36、37、または41に記載のワクチン。
【請求項４３】
ミクロスフェアまたはナノスフェアが腸溶コーティングされている、請求項42に記載のワクチン。
【請求項４４】
免疫原量の請求項１に記載のHP30またはHP56ポリペプチドを動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項４５】
免疫原量の請求項６に記載のペプチド断片を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項４６】
免疫原量の請求項８に記載の単離された融合ポリペプチドを動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項４７】
免疫原量の請求項33または34に記載の核酸分子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項４８】
免疫原量の請求項41、42または43に記載のワクチンを動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項４９】
免疫原量の請求項15、20、25、30、36、37、41、42または43に記載のワクチン１種以上を動物に同時にまたは連続して投与することを含んでなる、動物において免疫応答を引き出す方法。
【請求項５０】
ATCCに寄託されて受託番号PTA-2670を指定された大腸菌から得られるプラスミドM15(PRE4)PQE/HP30。
【請求項５１】
ATCCに寄託されて受託番号PTA-2669を指定された大腸菌から得られるプラスミドM15(PRE4)PQE/HP56。
【請求項５２】
請求項33または34に記載の核酸分子を含む、宿主の形質転換用に適合させた組換え発現ベクター。
【請求項５３】
HP30もしくはHP56タンパク質またはその少なくとも６アミノ酸断片の宿主による発現のために、前記核酸分子に機能的に連結された発現手段をさらに含む、請求項52に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５４】
前記発現手段がHP30もしくはHP56タンパク質を精製するための配列をコードする核酸部分を含む、請求項53に記載の発現ベクター。
【請求項５５】
前記発現手段がさらに、HP30もしくはHP56ポリペプチドの宿主からの分泌を指令する核酸部分を含む、請求項53に記載の発現ベクター。
【請求項５６】
請求項52に記載の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５７】
請求項50または51に記載のプラスミドを含む形質転換宿主細胞。
【請求項５８】
異種プロモーターと機能的に連結された請求項33または34に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５９】
請求項56に記載の形質転換宿主細胞を、HP30もしくはHP56ポリペプチドの発現に適する条件下で培養し、該HP30もしくはHP56ポリペプチドを回収することを含む方法により産生された、ヘリコバクター属細菌の単離された組換えHP30もしくはHP56ポリペプチド。
【請求項６０】
請求項57に記載の形質転換宿主細胞を、HP30もしくはHP56ポリペプチドの発現に適する条件下で培養し、該HP30もしくはHP56ポリペプチドを回収することを含む方法により産生される、単離された組換えHP30もしくはHP56ポリペプチド。
【請求項６１】
請求項58に記載の形質転換宿主細胞を、HP30もしくはHP56ポリペプチドの発現に適する条件下で培養し、該HP30もしくはHP56ポリペプチドを回収することを含む方法により産生される、単離された組換えHP30もしくはHP56ポリペプチド。
【請求項６２】
有効量の請求項１または４に記載のポリペプチドを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６３】
有効量の請求項６に記載のポリペプチド断片を投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６４】
有効量の請求項８に記載の単離された融合ポリペプチドを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６５】
有効量の請求項30に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６６】
有効量の請求項31に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６７】
有効量の請求項32に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６８】
有効量の請求項37に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項６９】
有効量の請求項41に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項７０】
有効量の請求項15に記載のワクチンを投与することによる、動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法。
【請求項７１】
動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法であって、かかる予防、治療または改善が必要な被験者に、有効量の請求項15、20、25、30、31、36、41、42または43に記載のワクチン１種以上を投与することを含んでなり、それぞれのワクチンは脂質、リポタンパク質、リン脂質、リポオリゴ糖、タンパク質、弱毒化生物および不活化全細胞からなる群より選択される免疫原１種以上をさらに含んでいてもよく、前記ワクチン類を同時にまたは連続して投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項７２】
ヘリコバクター殺菌活性を有する抗生物質１種以上を投与することをさらに含み、該抗生物質を前記１種以上のワクチンの投与に先立って、同時にまたは連続して投与する、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
前記１種以上の抗生物質がメプラゾール、クラリスロマイシン、オメプラゾール、メトロニダゾール、テトラサイクリン、ランソプラゾールおよびアモキシシリンからなる群より選択される、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１または４に記載のポリペプチドの活性または発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項７５】
請求項33に記載の核酸の発現を阻害するアンタゴニスト。
【請求項７６】
請求項１に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定する方法であって、該ポリペプチドを含む組成物と、スクリーニングすべき化合物とを、該化合物および該ポリペプチドの間の相互作用を可能にする条件下で接触させ、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項７７】
請求項33に記載の核酸分子の活性と相互作用する化合物を同定する方法であって、該核酸を含む組成物と、スクリーニングすべき化合物とを、該化合物および該核酸の間の相互作用を可能にする条件下で接触させ、該化合物と該核酸との相互作用を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項７８】
動物のヘリコバクター感染に関連した障害または疾患の予防、治療または改善方法であって、かかる予防、治療または改善が必要な被験者に、有効量の請求項32に記載のワクチン１種以上を投与することを含んでなり、それぞれのワクチンは脂質、リポタンパク質、リン脂質、リポオリゴ糖、タンパク質、弱毒化生物および不活化全細胞からなる群より選択される免疫原１種以上をさらに含んでいてもよく、前記ワクチン類を同時にまたは連続して投与することを特徴とする、上記方法。
【請求項７９】
ヘリコバクター殺菌活性を有する抗生物質１種以上を投与することをさらに含み、該抗生物質を前記ワクチンの投与に先立って、同時にまたは連続して投与する、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
前記１種以上の抗生物質がメプラゾール、クラリスロマイシン、オメプラゾール、メトロニダゾール、テトラサイクリン、ランソプラゾールおよびアモキシシリンからなる群より選択される、請求項79に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  発明の分野
本発明は、ある種のヘリコバクター属（Helicobacter）菌種のタンパク質に関し、これらタンパク質の診断用途またはワクチンへの使用に関する。特に、本発明はHP56ファミリーおよびHP30のポリペプチドに関する。
【０００２】
本発明はさらに、本発明のタンパク質と特異的に反応する、細胞傷害性抗体または中和抗体を含めて、抗体に関する。本発明はまた、本発明のタンパク質に特異的なＴ細胞に関する。
【０００３】
本発明はさらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）感染に関係した哺乳動物の障害を予防、治療または軽減するための方法、ならびにヘリコバクター・ピロリに対する免疫応答を引き出すための方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列および縮重配列、該配列を含有するベクター、ならびに該ベクターを含む宿主細胞に関する。診断方法やキットも含まれる。
【０００５】
本発明はさらに、本発明のタンパク質の活性に及ぼす物質の効果を評価することにより、該物質の抗菌活性を調べる方法に関する。
【０００６】
その他の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドと結合する化合物、または他のやり方でその活性を阻害もしくは活性化する化合物を同定する方法に関し、該方法は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、スクリーニングすべき化合物と、該化合物と本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの結合あるいは他の相互作用を可能にする条件下で接触させ、該化合物が本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合して、あるいは他のやり方で相互作用して、その活性を活性化または阻害するかを判定することを含んでなる。
【背景技術】
【０００７】
2.  発明の背景
ヘリコバクター・ピロリは、慢性胃炎患者の胃生検材料から1982年に初めて単離された、曲がった形の微好気性グラム陰性菌である（Warrenら、1983, Lancet:1273）。もともとはカンピロバクター・ピロリと命名されたが、これはその後ヘリコバクターと称する別の属の一部であると認められた（Goodwinら、Int. J. Syst. Bacteriol., 1989, 39:397）。
【０００８】
この細菌はヒト胃粘膜にコロニーを形成し、何十年間も感染が持続しうる。H.ピロリによる感染は世界中で最も広く行き渡っている感染症の一つであり、工業先進国では成人の約50％が、発展途上国では住人の90％以上が感染している。H.ピロリによる慢性感染はＢ型胃炎、消化性潰瘍、胃癌（例えば、腺癌）および低いグレードのＢ細胞リンパ腫の原因または補因子であると考えられている（Blaser, 1987, Gastroenterology 93:371; Dooleyeら、1989, New Eng. J. Med. 321:1562; Personnetら、1991, New Engl. J. Med. 325:1127）。
【０００９】
H.ピロリは経口ルートで伝染すると考えられ、感染のリスクは年齢とともに上昇する（Grahamら、1991, Gastroenterology 100:1495）。先進国においては、H.ピロリ抗原に対する抗体の存在が、30才の人と60才の人ではそれぞれ20％未満から50％以上へと増加する（Jonesら、1986, Med. Microbiol. 22:57）。発展途上国においては、人口の80％以上が20才までにすでに感染している（Grahamら、1991, Digestive Diseases and Sciences 36:1084）。
【００１０】
H.ピロリの病原因子の本性および役割はまだよく理解されていない。これまでに同定された因子として、以下のものが挙げられる。すなわち、粘膜層を横切って移動するのに必要と思われる鞭毛、胃の酸性環境を中和して初期のコロニー形成を可能にするのに必要なウレアーゼ、および真核上皮細胞内に液胞を形成させかつ病気に関係するH.ピロリ株により産生される分子量87Kdaのモノマーにより形成される高分子量の細胞傷害性タンパク質である（Leyingら、Mol. Microbiol., 1992, 6:2863; Cussacら、1992, J. Bacteriol. 174:2466; Perez-Perezら、1992, J. Infect. Immunol. 60:3658; Coverら、1992, J. Biol. Chem. 267:10570）。
【００１１】
現在、H.ピロリ感染をin vitroで根絶する治療薬は多数入手可能である（Hopkinsら、1994, Am. J. Med 97:265）。しかし、こうした薬剤の多くは細菌耐性、薬物の生体内分布の変化、患者の不承諾、または低い薬物利用能のためにin vivoではそれほど有効ではない（Hopkinsら、前掲）。抗生物質とビスマスの併用投与は、H.ピロリ感染の治療に用いられる標準的な治療計画の一部をなす（Malfertheinerら、1993, Clinical Therapeutics 15:Supp.B 37-48）。最近、プロトンポンプインヒビターと単一の抗生物質との併用により十二指腸潰瘍が軽減されることが示された（Malfertheinerら、前掲）。薬物療法はコストが高いこと、抗生物質耐性菌が出現すること、さらに、薬物療法では再感染を防止できないことを考慮すると、免疫感作によるH.ピロリ感染の予防および治療が望ましいものである。
【００１２】
ウレアーゼ、熱ショックタンパク質、およびカタラーゼを含めたH.ピロリタンパク質による免疫感作は、H.ピロリに対する免疫応答を引き出すワクチンをもたらしたが、H.ピロリ攻撃時のコロニー形成を防御することができない（Solnickら、2000, Infection and Immunol. 68:2560）。したがって、その他の抗原に対する免疫応答を引き出すことによってH.ピロリ感染を予防または治療するためのワクチンを開発する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【００１３】
3.  発明の概要
本発明の一つの目的は、ヘリコバクター由来のHP56およびHP30ポリペプチドを提供することである。さらに特定すると、本発明は、単離されたまたは組換え体の、ヘリコバクター・ピロリのHP56およびHP30ポリペプチドを包含し、これらのポリペプチドは分子量がそれぞれ約56kDaと30kDaであり、配列番号２（HP56）または配列番号４もしくは48（HP30）の推定アミノ酸配列を有する。本発明は、前記ポリペプチドの断片も包含する。本発明は、単離または精製されたHP30およびHP56ポリペプチド、それらから誘導されたポリペプチド（HP30誘導およびHP56誘導ポリペプチド、例えば、HP-30およびHP-56の断片を含むがこれらに限らない）、ならびに前記ポリペプチドおよび誘導ポリペプチドの調製方法を包含する。
【００１４】
好ましくは、HP56ポリペプチドは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２と実質的に相同である。前記ポリペプチドの好適な断片には、配列番号５、６、７、８、９、10、11、12、13、14または15が含まれる。
【００１５】
好ましくは、HP30ポリペプチドは配列番号４または48に示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号４と実質的に相同である。前記ポリペプチドの好適な断片には、配列番号16、17、18、19または20が含まれる。
【００１６】
本発明の別の目的は、Ｂおよび／またはＴ細胞刺激活性を有するH.ピロリ融合ペプチドを提供することであり、好ましくは、該融合ペプチドは、同一のまたは異なるH.ピロリポリペプチドに由来する少なくとも２つのＴまたはＢ細胞エピトープが、該ポリペプチドの領域の天然の配置とは異なる配置に並べられている。
【００１７】
本発明の好適なポリペプチドは少なくとも２つのペプチドを含む融合ポリペプチドであり、該ペプチドのそれぞれは配列番号５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を有する。ただし、該融合ポリペプチドのペプチドはHP30またはHP56の天然の配置とは異なる配置に並べられている。
【００１８】
好ましくは、本発明のHP30-またはHP56-誘導ポリペプチドは、それらが誘導されたH.ピロリペプチド／タンパク質と免疫学的に交差反応し、かつ動物においてH.ピロリに対する免疫応答を引き出すことができるものである。本発明の好適なHP30-またはHP56-誘導ポリペプチドは、IgM、IgG、IgA、IgE抗体、H.ピロリ抗原を発現する細胞（マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、またはH.ピロリ抗原を展示する合成抗原提示細胞などの抗原提示細胞を含むが、これらに限らない）、該ポリペプチドが誘導される天然のHP30またはHP56タンパク質、H.ピロリ細胞、またはH.ピロリ細胞溶解物に対して遅延型過敏症Ｔ細胞応答および／または細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き出す。
【００１９】
本発明はまた、HP30またはHP56ポリペプチド、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドおよび／またはその断片と結合し、かつそれに特異的である抗血清および抗体（中和、細胞傷害性、または殺菌性ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含むが、これらに限らない）を包含する。
【００２０】
好ましくは、前記抗体は配列番号２（HP56）または配列番号４もしくは48（HP30）のアミノ酸配列を有するHP56またはHP30ポリペプチドと結合する。また、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドと特異的に結合するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体も含まれ、例えば、配列番号２、４または５〜20または48のいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体を含むが、これらに限らない。さらに、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント、すなわち、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2フラグメントも含まれる。本発明のさらなる態様は、抗HP30またはHP56抗体の１以上の抗原結合領域が異種（例えば、ヒト）抗体のフレームワーク領域に導入されているキメラまたはヒト化抗体である。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明の抗原性または免疫原性組成物に対して惹起されたＴ細胞、あるいは本発明の抗原性もしくは免疫原性ポリペプチドに特異的な、またはH.ピロリ抗原を発現する細胞（樹状細胞、Ｂ細胞、または合成抗原提示細胞などのHP30もしくはHP56ポリペプチドを提示する抗原提示細胞を含むが、これらに限らない）、H.ピロリ細胞、またはH.ピロリ細胞溶解物に対して特異的なＴ細胞に向けられる。
【００２２】
本発明はさらに、HP30もしくはHP56ポリペプチド、HP56-誘導ポリペプチド、またはHP30-誘導ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（DNAまたはRNA）、該核酸分子を含有するベクター、該ベクターを含む宿主細胞、それから産生された組換えポリペプチド、ならびに該ヌクレオチド配列の核酸分子、ベクターおよび細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
前記核酸配列は、コードされるHP56もしくはHP30タンパク質またはポリペプチドが配列番号２、４または５〜20または48のいずれかのアミノ酸配列を含むものが好適である。また、配列番号１または３のDNA配列またはその相補配列；配列番号１または３または47のいずれかの核酸配列を有するDNA配列またはその相補配列の断片を含む単離された核酸分子；およびストリンジェント条件下で上記配列のいずれか１つとハイブリダイズする核酸分子も含まれる。ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸は、上記配列のいずれかと約70％、80％、90％、95％、または99％の配列相同性を有することが好ましく、約90％の配列相同性を有することがより好ましい。
【００２４】
本発明はさらに、本発明の１以上のHP30、HP56、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドを、場合により、１以上の他の成分と組み合わせて、融合させて、またはコンジュゲートさせて含んでなる、ワクチンをはじめとする免疫原性組成物でありうる、予防用または治療用組成物を含めた医薬組成物を包含する。前記他の成分は、脂質、リン脂質、リポ多糖などの炭水化物、当技術分野で新規のまたは公知のタンパク質、不活性化した全生物もしくは弱毒化した生物（ウイルス、酵母、真菌および細菌、例えば、カンピロバクター菌、赤痢菌、腸管病原性大腸菌、コレラ菌、またはロタウイルスを含むが、これらに限らない）を含む成分類から選択される。
【００２５】
本発明はさらに、１以上のHP30、HP56ポリペプチド、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチド、および弱毒化もしくは不活性化H.ピロリ、または野生型H.ピロリと比較して多量にHP30またはHP56ポリペプチドを発現する弱毒化もしくは不活性化H.ピロリ菌株を含んでなる、ワクチンをはじめとする免疫原性組成物でありうる、予防用または治療用組成物を含めた医薬組成物を包含する。
【００２６】
本発明はさらに、H.ピロリ感染を検出する方法またはH.ピロリもしくはH.フェリス（H. felis）による感染に関係した疾患もしくは障害を治療するかまたはその重症度を軽減する方法において使用することができる、本発明のHP30、HP56ポリペプチド、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含んでなる医薬組成物を包含する。そのような組成物には、限定するものではないが、前記核酸分子を含むベクターまたは組換え宿主細胞または宿主が含まれる。
【００２７】
本発明はまた、診断試薬を含み、かかる試薬は、天然のHP30もしくはHP56タンパク質、組換えHP30もしくはHP56タンパク質、HP30-誘導もしくはHP56-誘導ポリペプチド、核酸分子、免疫原性組成物、抗原性組成物、抗血清、Ｔ細胞、抗体、該核酸を含むベクター、および該ベクターを含む形質転換細胞などの、上記態様のいずれか１つ以上を含みうる。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、試験サンプル中のHP30、HP56タンパク質、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドをコードする核酸の存在を確認する方法、ならびにHP30、HP56タンパク質、HP30-またはHP56-誘導ポリペプチドをコードする核酸の存在を確認するための診断キットおよび試薬を提供する。
【００２９】
本発明にはまた、ヘリコバクター属の菌種に対する免疫応答を引き出す方法、ならびに有効量の本発明の医薬組成物またはワクチン組成物を投与することを含んでなる、哺乳動物におけるヘリコバクター関連疾患または障害を予防、治療または軽減する方法が含まれる。好適な障害または疾患としては、Ｂ型胃炎、消化性潰瘍、腺癌のような胃癌、および低いグレードのＢ細胞リンパ腫が挙げられる。本明細書で用いる「治療」または「療法」という用語は、存在する生物または多数の生物により直接または間接的に引き起こされる病気の症状の排除またはその重症度の軽減または改善を包含する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドもしくは核酸分子の活性または発現を抑制あるいは増強するアンタゴニストまたはアゴニストである。好ましいものは静菌性または殺菌性のアゴニストもしくはアンタゴニストである。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドもしくは核酸分子と相互作用して、その活性を阻害または活性化する化合物の同定方法であり、この方法は、該ポリペプチドもしくは核酸分子を含む組成物を、スクリーニングすべき化合物と、該化合物と該ポリペプチドもしくは核酸分子との相互作用を可能にする条件下で接触させて、化合物の相互作用を評価することを含んでなる。該化合物と該ポリペプチドもしくは核酸分子との相互作用を判定するには、該ポリペプチドもしくは核酸分子と該化合物との相互作用に応答して検出可能シグナルを提供できる第２の化合物（例えば、抗体）を結合させ、該化合物と該ポリペプチドもしくは核酸分子との相互作用から生成されるシグナルの有無を調べる。あるいはまた、該化合物と該ポリペプチドもしくは核酸分子との相互作用は、該ポリペプチドもしくは核酸分子の活性を阻害する該化合物の能力により決定される。
【００３２】
3.1  略語
2004520825.tif 000003
本明細書中で規定されるヌクレオチドまたは核酸配列は、以下のような塩基の一文字表記で表される：
A（アデニン）
C（シトシン）
G（グアニン）
T（チミン）
U（ウラシル）
M（AまたはC）
R（AまたはG）
W（AまたはT/U）
S（CまたはG）
Y（CまたはT/U）
K（GまたはT/U）
V（AまたはCまたはG；T/Uではない）
H（AまたはCまたはT/U；Gではない）
D（AまたはGまたはT/U；Cではない）
B（CまたはGまたはT/U；Aではない）
N（AまたはCまたはGまたはT/U）あるいは（不明）
本明細書中で規定されるペプチドまたはポリペプチド配列は、以下のようなアミノ酸残基の一文字表記で表される：
A（アラニン）
R（アルギニン）
N（アスパラギン）
D（アスパラギン酸）
C（システイン）
Q（グルタミン）
E（グルタミン酸）
G（グリシン）
H（ヒスチジン）
I（イソロイシン）
L（ロイシン）
K（リシン）
M（メチオニン）
F（フェニルアラニン）
P（プロリン）
S（セリン）
T（トレオニン）
W（トリプトファン）
Y（チロシン）
V（バリン）
X（不明）
本発明は、以下の詳細な説明、具体的な実施形態の非限定的な例、および図面を参照することで、より一層理解されるだろう。
【００３３】
4.  図面の説明
図１．「M15(PRE4)PQE/HP30」、略して「PQE/Hp30」と呼ばれるH.ピロリHP30発現プラスミド（例えば、大腸菌内で発現させることができる）の概略図。一例として、H.ピロリタンパク質は大腸菌内でMRGS-(H)6GSドメインを有する融合タンパク質として発現される。このタンパク質をコードする代表的な発現組換えタンパク質および核酸の配列を、配列番号44および43および46および45に示す。大腸菌M15(PRE4)PQE/HP30により発現されるタンパク質の最初の12個のアミノ酸残基はベクターに起因し、6X HISドメイン、BamHI部位およびリボソーム結合部位を含む。概略図の最後の9個の核酸残基は、停止コドン(*)とベクター中のSal I部位に相当する。
【００３４】
図２．「M15(PRE4)PQE/HP56」、略して「PQE/HP56」と呼ばれるH.ピロリHP56発現プラスミド（例えば、大腸菌内で発現させることができる）の概略図。一例として、H.ピロリタンパク質は大腸菌内でMRGS-(H)6GSドメインを有する融合タンパク質として発現される。このタンパク質をコードする発現組換えタンパク質および核酸の配列を、配列番号42および41に示す。発現タンパク質の最初の12個のアミノ酸残基はベクターに起因し、6X HISドメイン、BamHI部位およびリボソーム結合部位を含む。概略図の最後の9個の核酸残基は、停止コドン(*)とベクター中のSal I部位に相当する。
【００３５】
図３．大腸菌M15(PRE4)PQE/HP30から発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP30タンパク質のウェスタンブロット。レーン１、分子量マーカー（Novex MultiMark）；レーン２、非誘導細胞；レーン３および４、IPTG誘導細胞。HP30は矢印で示してある。分子量マーカー（レーン１）は、ミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼＢ（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）およびインスリン（〜6 kDa）である。
【００３６】
図４．大腸菌においてM15(PRE4)PQE/HP30プラスミドから発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP30組換えタンパク質のクーマシーブルー染色SDS-ゲル。このタンパク質は30 kDaタンパク質として泳動する。レーン１、分子量マーカー（Novex MultiMark）；レーン２、IPTG誘導細胞。HP30は矢印で示してある。分子量マーカー（レーン１）は、ミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼＢ（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）およびインスリン（〜6 kDa）である。
【００３７】
図５．大腸菌M15(PRE4)PQE/HP56から発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP56組換えタンパク質のウェスタンブロット。レーン１および２、IPTG誘導細胞。レーン３、分子量マーカー（Novex MultiMark）。HP56は矢印で示してある。分子量マーカー（レーン１）は、ミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼＢ（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）およびインスリン（〜6 kDa）である。
【００３８】
図６．HP56発現プラスミドである大腸菌M15(PRE4)PQE/HP56を担持する大腸菌細胞のクーマシーブルー染色SDS-ゲル。レーン１、分子量マーカー（Novex MultiMark）；レーン２、非誘導細胞；レーン３、IPTG誘導細胞。HP56は矢印で示してある。分子量マーカー（レーン１）は、ミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼＢ（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）およびインスリン（〜6 kDa）である。
【００３９】
図7aおよび7b．HP56ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列（配列番号１および配列番号２）。
【００４０】
図８．HP30ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列（配列番号３および配列番号４）。
【００４１】
図９．マウスのグループにHP30組換えタンパク質を単独で（50μgタンパク質／回）、または数種の非経口アジュバント［ミョウバン、フロイント完全アジュバント(CFA)、もしくはミョウバンと大腸菌易熱性エンテロトキシン(LT)の組合せ］との組合せで、含有するワクチンを投与した。0日目、21日目および42日目にワクチンを3回、皮下投与した。3回目の投与の約14日後に、およそ5.0×108cfuのH.ピロリ（Sydney株）を用いて連続3日間、動物を経口的にチャレンジした。3回目のチャレンジの約14日後に動物を犠牲にし、胃をホモジナイズした。H.ピロリを選択的に増殖させるために6種類の抗生物質を用いて処方したBrucella Blood寒天平板にプレーティングすることにより、胃の中のH.ピロリ負荷量を定量化した。グラフ上のポイントは個々の動物からの胃ホモジネート中に測定されたH.ピロリの数cfuを示し、バーはそのグループの平均cfuを表す。
【００４２】
図１０．マウスのグループにH.ピロリの粗細胞溶解物、またはHP30およびHP56組換えタンパク質を含有する組合せサブユニット調製物、のいずれかを含有する経口ワクチンを投与した。溶解物（100μgタンパク質／回）およびHP30/HP56抗原（50μgタンパク質／回）は単独で、またはアジュバントとして25μgの改変型の大腸菌易熱性エンテロトキシン（AB5）と共に、投与した。0日目、14日目および28日目にワクチンを3回投与した。3回目の投与の約14日後に、およそ5×108cfuのH.ピロリ（Sydney株）を用いて連続3日間、動物を経口的にチャレンジした。3回目のチャレンジの約14日後に動物を犠牲にし、胃を無菌的に摘出してホモジナイズした。H.ピロリを選択的に増殖させるために6種類の抗生物質を用いて処方したBrucella Blood寒天平板にプレーティングすることにより、胃の中のH.ピロリ負荷量を定量化した。グラフ上のポイントは個々の動物からの胃ホモジネート中に測定されたH.ピロリの数cfuを示し、バーはそのグループの平均cfuを表す。
【００４３】
図１１．M15(PRE4)PQE/HP30のHP30コード化挿入物によりコードされるHP30ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列。プラスミドpQE/Hp30は、HP30コード化核酸のN-末端部分にヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を含有する。図に示されるHP30コード化核酸（配列番号47）は、ヌクレオチド37で開始するATGから始まり、そしてHP30を構成するアミノ酸配列（配列番号48）は、この図の2番目のM、すなわち、アミノ酸残基13から始まる。ヒスチジンタグをもつ挿入物の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号45および配列番号46である。
【００４４】
5.  発明の詳細な説明
5.1. H.ピロリHP30およびHP56ポリペプチド
本発明は、一般的に、ヘリコバクター属細菌感染症の診断、予防および治療を目的とする組成物および方法に関する。ある態様において、本発明の組成物は、ヘリコバクター抗原の少なくとも1つの免疫原性部分を含んでなる、単離された、または純粋な天然（野生型）HP30およびHP56ポリペプチド、または組換えによって作製された同ポリペプチドを提供する。
【００４５】
特定の実施形態において、「ヘリコバクター」という用語は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）もしくはヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）を包含するがそれに限定されない、あらゆるヘリコバクター属細菌を示す。
【００４６】
上記生物のいずれかに属する菌株を世界中のあらゆる生物材料寄託機関から入手することができるが、特にATCCには、ヘリコバクター菌株43504, 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D, および700932が寄託されている。
【００４７】
特定の実施形態において、ヘリコバクターのタンパク質もしくはポリペプチドは、配列番号2に示される推定アミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。別の特定の実施形態において、ポリペプチドは配列番号1のヌクレオチド配列によってコードされる。また別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号2に実質的に相同なアミノ酸配列もしくはその一部を含んでなり、または配列番号1のヌクレオチド配列に実質的に相同なヌクレオチド配列、もしくはその一部によってコードされる。
【００４８】
もう1つの特定の実施形態において、ヘリコバクタータンパク質もしくはポリペプチドは、配列番号4もしくは48に示される推定アミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3もしくは47のヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。別の実施形態において、ヘリコバクターポリペプチドは、配列番号4に実質的に相同なアミノ酸配列、もしくはその一部を含んでなり、または配列番号3もしくは47のヌクレオチド配列に実質的に相同なヌクレオチド配列、またはその一部によってコードされる。
【００４９】
本明細書中で用いる「実質的に相同な」配列は、当業界で知られているコンピューターホモロジープログラムもしくは検索アルゴリズムによってアラインメントもしくは比較を行って参照配列と比較するとき、同一サイズの参照アミノ酸もしくは核酸配列に対して少なくとも70%、望ましくは80％を超える、より望ましくは90%もしくは95%を超える同一性を示す。限定ではなく一例として、有用なコンピューターホモロジープログラムには、次のものがある：Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschulら、1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, “The BLAST Algorithm; Altschulら、1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402)、これは統計的手法（KarlinおよびAlschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77）を用いて有意性があるとみなす配列類似性を検索するように適応させた発見的検索アルゴリズムである。5つの特定の目的をもつBLASTプログラムは下記のタスクを実行する：
１）BLASTPプログラムは、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する。
【００５０】
２）BLASTNプログラムは、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する。
【００５１】
３）BLASTXプログラムは、タンパク質配列データベースに対して、ヌクレオチドクエリー配列（二本鎖）の、概念上の6つの読み枠の翻訳産物を比較する。
【００５２】
４）TBLASTNプログラムは、全部で6つの読み枠で翻訳されたヌクレオチド配列データベース（二本鎖）に対して、タンパク質クエリー配列を比較する。
【００５３】
５）TBLASTXプログラムは、ヌクレオチド配列データベースの6つの読み枠での翻訳産物に対して、ヌクレオチドクエリー配列の6つの読み枠での翻訳産物を比較する。
【００５４】
Smith-Waterman（データベース：European Bioinformatics Institute）（Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197）は配列アラインメントのための数学的に厳密なアルゴリズムである。
【００５５】
FASTA（Pearsonら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448）は、Smith-Watermanアルゴリズムに対する発見的近似法である。BLAST, Smith-WatermanおよびFASTAアルゴリズムの手順と利点に関する一般的考察については、Nicholasら、1998, “A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods”およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００５６】
限定するものではないがもう１つの例として、同一性パーセントを決定するために有用なコンピューターホモロジーアルゴリズムおよびパラメーターには下記のものがある：
2つのアミノ酸配列の、もしくは2つの核酸配列の、同一性パーセント（たとえばHP56もしくはHP30と他の既知の配列との同一性）を決定するために、配列を、最適な比較のために位置を合わせて整列させる（例えば、第１のアミノ酸もしくは核酸配列の配列中に、第２のアミノ酸もしくは核酸配列との最適アラインメントのためにギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置で、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているならば、当該分子はその位置では同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、当該配列に共通する同一の位置数の関数である（すなわち、同一性パーセント ＝ 同一の位置数／位置の総数(例えば、重なり合う位置) × 100）。ある実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【００５７】
２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数値計算用アルゴリズムによって行うことができる。２つの配列の比較に用いられる数値計算用アルゴリズムの好ましい、限定されない一例は、KarlinおよびAltschulのアルゴリズムである（1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68; 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77によって修正された）。こうしたアルゴリズムは、Altschul(1990, J. of Molec. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて実施され、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索はXBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて行われ、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列が得られる。比較の目的でギャップを入れたアラインメントを得るために、Altschul, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402に記載のように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいはまた、PSI-BLASTを用いて、分子間の遠い関係を検出する繰り返し検索を行うことができる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI- BLASTプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。配列を比較するために利用される数値計算用アルゴリズムの、別の、好ましい、限定的でない例は、MyersおよびMiller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを利用するならば、PAM120 weight residue table、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いることができる。配列分析のためのさらに別のアルゴリズムが当技術分野で知られており、TorellisおよびRobotti, 1994, Comput. Appl. Biosc., 10:3-5に記載のADVANCEおよびADAM、およびPearsonおよびLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448に記載のFASTAを包含する。FASTAにおいては、ktupが検索の感度およびスピードを設定するコントロールオプションである。ktup = 2ならば、比較されるべき２つの配列における類似領域は、整列配置された残基対を調べることによって見いだされる；ktup = 1ならば、単一の整列配置されたアミノ酸が調べられる。タンパク質配列についてはktupを2または1に、またヌクレオチド配列については1から６に設定することができる。Ktupが指定されていないならば、デフォルトはタンパク質については2，ヌクレオチドに関しては6である。あるいはまた、Higginsら、1996, Methods Enzymol., 266:383-402に記載のCLUSTAL Wアルゴリズムを用いてタンパク質配列アラインメントを行ってもよい。
【００５８】
ギャップあり、または、なしで、上記のような技術を利用して2つの配列間の同一性パーセントを決定することができる。同一性パーセントの計算に際しては、正確に一致するものだけをカウントする。
【００５９】
本発明の様々な態様によれば、本発明のポリペプチドは見かけの分子量によって特徴づけられるが、これはSDS-PAGEにおける既知の分子量マーカーの移動に相関するペプチドの移動に基づいている。当技術分野で既知のあらゆる分子量標準物質をSDS-PAGEで使用することができるが、好ましい分子量マーカーは、ホスホリラーゼB、GDH、CAH、ミオグロブリン-ブルー、ミオグロブリン-レッドおよびリゾチームを包含する。
【００６０】
本発明のポリペプチドが異なるタイプのゲル系（例えば、異なるバッファー、異なる種類および異なる濃度のゲル、架橋剤もしくはSDS、など）において異なる移動を示すことは、当業者に理解されるであろう。また、ポリペプチドが、SDS-PAGEで使用される異なる分子量マーカーが原因で、異なる見かけの分子量を示すことも当業者に認識されるであろう。したがって、本発明のポリペプチドの分子量評価は、いかなるSDS-PAGE系でも、どのような分子量マーカーセットを使用しても、同一のポリペプチドをカバーすることを目的とすることが意図される。これらは、当該ポリペプチドについて、本明細書に記された分子量とはやや異なる見かけの分子量を示す可能性がある。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明はヘリコバクター抗原の免疫原性部分を含んでなるHP30またはHP56ポリペプチドを明らかにするが、ここにおいて、ヘリコバクター抗原は、(a)配列番号1または配列番号3または配列番号47に列挙されたヌクレオチド配列、(b)前記ヌクレオチド配列の相補配列、および(c) こうした配列の変異体（対立遺伝子変異体を包含するがそれに限定されない）、からなる群から選択される配列を含んでなる核酸分子によってコードされた、アミノ酸配列を含んでなる。
【００６２】
5.2.  ヘリコバクター由来のポリペプチド
本明細書および特許請求の範囲において使用される「抗原」およびそれに関連した「抗原性」という用語は、抗体もしくはヘルパーT細胞に特異的に結合する物質を示す。本明細書で使用されるように、抗血清、抗体およびT細胞が抗原と特異的に結合もしくは反応するが、無関係なタンパク質とは検出可能な反応をしないならば、これらは「抗原特異的」である。好ましくは、前記抗原は免疫原性である。
【００６３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「免疫原性」という用語は、動物、望ましくは哺乳類において、たとえば抗体および／または細胞性免疫反応のような免疫応答を誘導する能力を表す。
【００６４】
本発明の特定の実施形態においては、HP56タンパク質の少なくとも8個の（連続する）アミノ酸で構成される、HP56タンパク質の断片からなる、またはこれを含んでなる、ヘリコバクター由来ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、断片は配列番号2の少なくとも10〜500アミノ酸からなる。特定の実施形態において、こうした断片は10, 11, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 425または450アミノ酸より大きくはない。好ましい実施形態において、断片はHP56ポリペプチドの抗原性もしくは免疫原性エピトープを含んでなる。
【００６５】
特定の実施形態において、HP56誘導ポリペプチドは、配列番号5〜15の任意の配列を含んでなるHP56の断片である。別の特定の実施形態において、HP56誘導ポリペプチドは、配列番号5〜15の任意の配列を含んでなるが、追加の上流もしくは下流HP56配列も含んでなる、HP56の断片である。
【００６６】
本発明の特定の実施形態においては、配列番号4もしくは48の少なくとも8個の（連続する）アミノ酸で構成されるHP30タンパク質の断片からなる、もしくはこれを含んでなる、ヘリコバクター由来ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、断片は配列番号4もしくは48の少なくとも10〜200アミノ酸からなる。特定の実施形態において、こうした断片は10, 11, 12, 15, 20, 25, 35, 50, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250アミノ酸より大きくはない。好ましい実施形態において、断片はHP30ポリペプチドの抗原性もしくは免疫原性エピトープを含んでなる。
【００６７】
特定の実施形態において、HP30誘導ポリペプチドは、配列番号16〜20の任意の配列を含んでなるHP30の断片である。別の特定の実施形態において、HP30誘導ポリペプチドは、配列番号16〜20の任意の配列を含んでなるが、追加の上流もしくは下流HP30配列も含んでなる、HP30の断片である。
【００６８】
本発明のHP56誘導ポリペプチドはHP56ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であり、動物において、ヘリコバクター、ヘリコバクター細胞溶解物、もしくはヘリコバクター抗原を示す抗原提示細胞に対する免疫反応を惹起する能力を有することが望ましい。
【００６９】
本発明のHP30誘導ポリペプチドはHP30ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であり、動物において、ヘリコバクター、ヘリコバクター細胞溶解物、もしくはヘリコバクター抗原を示す抗原提示細胞に対する免疫反応を惹起する能力を有することが望ましい。より望ましくは、本発明のHP30誘導もしくはHP56誘導ポリペプチドが、ヘリコバクターの天然のHP56もしくはHP30ポリペプチドの1以上のエピトープ（すなわち、ヘリコバクターの生菌中に存在するHP56もしくはHP30ポリペプチドのエピトープ）を形成する配列を含んでなる。こうした好ましいHP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドは、HP56もしくはHP30ポリペプチドと交差反応性の免疫反応を誘発し、ヘリコバクターの生菌に対して生じた抗体（例えば、ホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドで固定されたヘリコバクター細胞またはヘリコバクター細胞溶解物によって誘発された抗体；こうした抗体は本明細書では「抗ホールセル」抗体と称される）と特異的に結合する能力によって同定される。例えば、HP56ポリペプチドまたはHP30ポリペプチドを標準的な方法によって分画し、抗ホールセル抗体との結合能について調べる。次いで、反応性ポリペプチドを単離して、そのアミノ酸配列を当技術分野で公知の方法によって決定する。
【００７０】
望ましい特異的な抗原性を保持する一方で、親ポリペプチドの一部を取り除く欠失によって、ポリペプチド誘導体を構築することもできる。欠失は、菌株間で高度に変動性の領域を除去することもできる。
【００７１】
また、望ましくは、本発明のヘリコバクター由来ポリペプチドは、殺菌抗体、中和抗体またはオプソニン化抗体をもたらす、天然のヘリコバクターポリペプチド（HP30またはHP56）の1以上のエピトープを形成する配列を、含んでなる。ヘリコバクター属細菌、詳細にはヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリス細胞を死滅させる抗体を生成する能力によって、こうした好ましいヘリコバクター由来ポリペプチドを同定することができる。例えば、HP56もしくはHP30ポリペプチドの限定的もしくは完全なプロテアーゼ消化、または化学的切断によって得られたポリペプチドを、標準的な方法によって（例えば、トリプシン、パパインもしくは関連のタンパク質分解酵素といった、酵素を用いた限定的なタンパク質分解性消化によって、または臭化シアンのような試薬を用いた化学的切断によって、さらにその後の消化産物もしくは切断産物の分画によって）分画し、動物に注射し、そこで産生された抗体の、ヘリコバクター細胞を害する能力もしくは死滅させる能力について検討する。ひとたび同定・単離されたならば、このような好ましいヘリコバクター由来ポリペプチドのアミノ酸配列を標準的な配列決定法を用いて決定する。決定された配列を用いて、化学合成法および／または遺伝子工学的手法によって、そうしたポリペプチドの生産を可能にすることができる。
【００７２】
これらの好ましいヘリコバクター由来ポリペプチドは、抗ホールセル抗体を使用して、ヘリコバクターゲノムDNAのランダム断片、またはHP56もしくはHP30ポリペプチドまたはその断片をコードするクローニングされたヌクレオチド配列を発現する細菌ライブラリーをスクリーニングすることによっても、同定可能である。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Press, NY, 第1巻、12章を参照されたい。反応性クローンを同定し、その挿入断片を単離し、配列決定をおこなって、こうした好ましいヘリコバクター由来ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【００７３】
本発明で検討される抗原の免疫原性部分の例は、表1および2に示す断片を含んでなる、またはそれらで構成される、ポリペプチドを包含する。この表において、HP56（表1、第1列）またはHP30（表2、第1列）名称に続く数字は、それぞれ配列番号2または4中のアミノ酸残基を示す。1以上のヘリコバクター抗原の少なくとも1つの免疫原性部分、または本明細書に記載の免疫原性部分を含んでなるポリペプチドを、一般に、ヘリコバクター感染を検出、予防、治療し、またはその重症度を低減させるために、単独で、または組み合わせて使用することができる。
【表１】
2004520825.tif 000004
【表２】
2004520825.tif 000005
【００７４】
本発明のポリペプチドの１つと相同な配列を有するポリペプチドは、本発明のHP56またはHP30ポリペプチドに類似した（すなわち、これと交差反応する）天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに突然変異体、変異体もしくは他の天然に存在しない変異体を含めて、本発明に包含される。
【００７５】
対立遺伝子変異体は自然界で非常に多く見られる。例えば、H.ピロリのような細菌種は通常、小さな対立遺伝子変異によって互いに異なる様々な菌株または血清型で表される。実際、異なる菌株において同一の生物学的機能を果たすポリペプチドが、それぞれの菌株で同一ではないアミノ酸配列をもつことがある。こうした対立遺伝子変異は核酸分子レベルでも同様に反映されている。
【００７６】
対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させない、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を有すると特徴づけられた代替型のポリペプチドである。「生物学的機能」とは、たとえその機能が細胞の増殖もしくは生存に必要でなくても、細胞において自然に生じるポリペプチドの機能を意味する。
【００７７】
例えばDNA分子のような、対立遺伝子変異体をコードする核酸分子は、従来の方法によって抽出された細菌ゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって容易に回収することができる。これは、コードするドメインの5’および3’末端の、上流および下流の配列に適合する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴う。一般に、プライマーは10〜40ヌクレオチドからなるが、15〜25ヌクレオチドが望ましい。効率的なハイブリダイゼーションを確実なものとするのに十分な比率でCおよびGヌクレオチドを含有するプライマーを選択することも有利であると考えられる。例えば、CおよびGヌクレオチドの量は、ヌクレオチド全体量の少なくとも40%、好ましくは50%とする。
【００７８】
本明細書に記載の本発明のポリペプチドおよび核酸分子と相同もしくは同一の配列を共有するH.ピロリ変異株も、本発明に包含される。当業界で公知のコンピューターホモロジープログラムもしくは検索アルゴリズムを用いたアラインメントまたは比較によって、同じサイズの参照配列に対する相同性もしくは同一性％を決定する方法の例については第5.1.節を参照されたい。血清型相同体は、本明細書に記載の対応するポリペプチド配列に対して70, 80, 85, 90, 95または99%の相同性もしくは同一性を示すことが望ましい。もっとも望ましいのは、血清型相同体が、本明細書に記載の対応するポリペプチド配列に対して95〜99%の相同性を示すことである。また、相同ヌクレオチド配列は、本明細書に記載の対応するヌクレオチド配列に対して70, 80, 85, 90, 95または99%の同一性を示す。
【００７９】
ヘリコバクター由来のHP56またはHP30ポリペプチドは、その断片または変異体、すなわち、野生型ヘリコバクター配列の1個以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を有する、またはin vivoもしくはin vitroで化学的に修飾されたアミノ酸を有する、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド、または断片を包含する。こうした修飾は、その結果得られたヘリコバクター由来ポリペプチド産物の免疫原性を増強する可能性があるが、そうした活性に影響を与えないかもしれない。本明細書で使用される「免疫原性を増強する」という用語は、修飾されていないポリペプチド、またはホルマリンもしくはグルタルアルデヒドで固定したヘリコバクターによって惹起される免疫反応と比較して、抗体価または細胞性免疫反応が増加することを意味する。利用できる修飾法は、米国特許第4,526,726号で公表された方法を包含するがそれに限定されない。同特許は、全体として本明細書に含めるものとする。
【００８０】
説明のための、限定的でない例として、HP56誘導またはHP30誘導ポリペプチド配列内の1以上のアミノ酸残基を、機能的に同等なものとして作用する、極性の類似した別のアミノ酸で置換することができるが、これは結果的にサイレントな変化となる。配列内のアミノ酸と置換されるアミノ酸は、そのアミノ酸が属するクラスを構成する他のアミノ酸から選択される。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがある。負電荷を持つ（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００８１】
本発明の範囲に含まれるのは、HP30誘導またはHP56誘導ポリペプチドであるが、このポリペプチドは、HP30またはHP56のポリペプチド断片、または他の誘導体もしくは類似体であって、これらは、翻訳中または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、リピド化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子もしくは他の細胞性リガンドとの結合などによって、異なって修飾される。多数の化学修飾を、いずれも公知の方法によって行うことができる。これは、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下での代謝合成；などを包含するがそれに限定されない。
【００８２】
さらに、必要ならば、非古典的アミノ酸もしくは化学的なアミノ酸類似体を置換または付加としてヘリコバクターポリペプチド配列に導入することができる。非古典的アミノ酸は、一般のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、α-Abu、α-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、たとえばメチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、PNAおよびアミノ酸類似体を一般に包含するが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はD（右旋性）またはL（左旋性）とすることができる。
【００８３】
HP56またはHP30誘導ポリペプチドは、さらに、完全なHP56もしくはHP30ポリペプチド、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端または内部のアミノ酸に融合された、ヘリコバクター起源の、または他の細菌もしくはウイルス起源の1以上の異種ポリペプチド、脂質、リン脂質、またはリポ多糖を含んでなるキメラポリペプチドとすることもできる。このようなキメラポリペプチドを含んでなる有用な異種ポリペプチドには、a)宿主細胞において、完全なHP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドの輸送、トランスロケーションおよび／またはプロセシングを促進する、プレ-および／またはプロ-配列、b)アフィニティ精製配列、およびc)あらゆる有用な免疫原性配列（例えば、病原微生物の表面に露出されたタンパク質の1以上のエピトープをコードする配列）があるが、それに限定されない。キメラポリペプチドの好ましい異種タンパク質の１つは、Hin47（全体として本明細書に組み入れられる米国特許第5,679,547号を参照されたい）である。キメラポリペプチドの別の好ましい異種タンパク質は、アデノウイルスキャプシド（外被）タンパク質、例えば、タンパク質II(ヘキソン)、タンパク質III(ペントン)；タンパク質IV(ファイバー)；タンパク質VI；タンパク質VIIIまたはタンパク質IXである。より好ましい実施形態において、異種タンパク質は、アデノウイルスキャプシドタンパク質ヘキソン、ペントンまたはファイバーである。Vaccines、第3版；PlotkinおよびOrenstein, 1999, 609-628ページ、より詳細には612ページを参照されたい；Crystalら、米国特許第6,127,525号および第6,153,435号も参照されたい；参考として本明細書にその全体を含めるものとする。
【００８４】
HP56またはHP30誘導ポリペプチドはまた、T細胞または抗体を刺激する活性をそれぞれ有する、ヘリコバクタータンパク質に由来する少なくとも2つの領域を含んでなる融合ポリペプチドを包含するが、これに限定されない。この領域は、同一のヘリコバクタータンパク質を起源とすることもできるが、2種以上のヘリコバクター抗原由来の領域を包含してもよい。これらのポリペプチドは、不連続な順序すなわち隣接しない順序で（例えば、天然タンパク質のアミノ酸の順序とは異なる順序で）配列される。本発明の好ましいポリペプチドは、少なくとも2つのペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであり、前記ペプチドは、配列番号5〜20で構成される群から選択されるペプチドからなるが、ただしポリペプチドの中のペプチドは、天然に存在する配置とは異なる配置で配列される。
【００８５】
他の好ましい、本発明のHP30もしくはHP56誘導ポリペプチドは単離された融合ポリペプチドであって、ここにおいてポリペプチドは配列番号2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,または20のうちのいずれか最低1つ、望ましくは最低2つを含んでなるが、ただし前記融合ポリペプチドの中のペプチドは天然に存在する配置とは異なる配置で配列される。
【００８６】
必要ならば、上記領域のアミノ酸配列を作製し、リンカーによって結合することができる。適当なペプチドリンカー配列は、下記の要因に基づいて選択される：(1)柔軟で伸長する構造をとることができること；(2)第1および第2のポリペプチドの機能性エピトープと相互作用することが可能な2次構造をとることができること；(3)ポリペプチド機能性エピトープと反応する可能性のある疎水性残基もしくは荷電残基をもたないこと；(4)溶解性を高めることができること；および(5)抗原提示細胞によるプロセシングに対する感受性を高めることができること。こうしたリンカーは、任意のアミノ酸配列、または適当な連結剤もしくは結合剤とすることができる。本発明に有用なリンカーには、例えばKKもしくはRRといった荷電アミノ酸対を含んでなるリンカー、カテプシンおよび／または他のトリプシン様酵素、トロンビン、Xa因子に対して感受性のリンカー、またはポリペプチドの溶解性の増加をもたらすリンカーがある。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含有する。リンカーとして有効に使用することができるアミノ酸配列には、Marateaら、1985, Gene 40:39-46; Murphyら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562、米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に記載の配列がある。リンカー配列のアミノ酸長は1から約50までとすることができる。
【００８７】
本発明に包含される融合ポリペプチドの別の特別な例は、例えばコレラ毒素または大腸菌易熱性毒素のいずれかのBサブユニットのような、アジュバント活性を有するポリペプチドと融合した、またはmLTと融合した、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド誘導体である。融合ポリペプチドのもう一つの特別な例には、サイトカイン（例えば、IL-2, IL-10, IL-12, IL-4, インターフェロンであるが、それに限定されない）と融合した、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体がある。本発明のポリペプチドを、アジュバント活性を有するポリペプチドのC-末端と融合させることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドを、アジュバント活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に融合させることもできる。
【００８８】
また、望ましくは、本発明のヘリコバクター由来融合ポリペプチドは、殺菌性抗体もしくはオプソニン化抗体および／またはT細胞をもたらす、天然のヘリコバクターポリペプチドの1以上のエピトープを形成する配列を含んでなる。このような好ましいヘリコバクター由来ポリペプチドは、ヘリコバクター属細菌またはHP56またはHP30を発現する細胞を死滅させる抗体および／またはT細胞を生じる能力によって同定される。
【００８９】
5.3. HP56、HP30、HP56誘導またはHP30誘導ポリペプチドの単離と精製
本発明は単離されたHP56、HP30ポリペプチド、HP56誘導およびHP30誘導ポリペプチドを提供する。本明細書中で用いる「単離された」という用語は、産物が本来付随している他の生体物質から取り出され、分離されること、すなわち、例えば、当該産物を発現するように遺伝子工学によって作製された組換え宿主細胞に由来する他の生体物質から分離され、またはそれらを含まないことを意味し、あるいは、化学合成であれば、化学的前駆物質もしくは他の化学物質から生成物が分離され、またはそれらを含まないこと、すなわち、当該生成物の合成に関わる化学的前駆物質もしくは他の化学物質から分離され、またはそれらを含まないこと、を意味する。本明細書中で用いる「精製された」という用語は、産物が実質的に本来付随している他の生体物質を含まないこと、すなわち、例えば、当該産物を発現するように遺伝子工学によって作製された組換え宿主細胞に由来する他の生体物質を実質的に含まないこと、または、化学合成であれば、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないこと、すなわち、当該生成物の合成に関わる化学的前駆物質もしくは他の化学物質から分離されていること、を意味する。「実質的に含まない」という用語は、産物または生成物が、重量比で組成物の最低70%、望ましくは最低95%を構成していることを意味する。すなわち、精製されたHP30またはHP56ポリペプチド組成物とは、重量比で少なくとも70〜95%の純度のHP30またはHP56ポリペプチドであり、重量比で少なくとも純度75%のHP30またはHP56ポリペプチドが望ましく、重量比で少なくとも純度95%のHP30またはHP56ポリペプチドが一層望ましい。したがって、ヘリコバクター溶菌液もしくはヘリコバクターの膜調製物の、1以上のタンパク質バンドを含有するゲルの一部を包含する（SDSを含むまたは含まない）アクリルアミドゲル上のヘリコバクター溶菌液もしくは膜調製物は、HP30またはHP56の精製された調製物もしくは組成物ではない。なぜならば、ゲルは他のヘリコバクタータンパク質を含んでなり、重量比でHP30もしくはHP56が、少なくとも重量比70%または95%純度のHP30もしくはHP56とはならないためである。しかしながら、アクリルアミドゲルからHP30もしくはHP56バンドを溶出す
ることによって得られたHP30もしくはHP56の調製物は、HP30もしくはHP56の精製された調製物である。
【００９０】
本発明のHP56またはHP30ポリペプチドは、ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリスを包含するがそれに限定されない、あらゆるヘリコバクター属細菌の、細胞全体の抽出物を含めたタンパク質抽出物から単離される。上記のあらゆる生物の菌株は、世界中のあらゆる生物材料寄託機関から入手することができるが、特にATCC 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D, および700932の菌株が得られる。
【００９１】
また別のHP56またはHP30ポリペプチドの起源は、HP56、HP30、HP56誘導ポリペプチドまたはHP30誘導ポリペプチドをコードするクローン化配列を発現する遺伝子発現系に由来するタンパク質調製物である（下記の第5.5節を参照されたい）。
【００９２】
当業者によく知られたあらゆる生化学的手法および研究方法を用いて、HP56またはHP30ポリペプチドを原材料から単離して精製することができる。ある方法において、ヘリコバクター細胞を溶菌し、望ましくは細胞破片を遠心分離によって除去する。抽出液中のポリペプチドを濃縮し、SDS含有Laemmliゲル試料バッファー中で100℃、5分間インキュベートした後、約4%から約12%までの変性ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル(PAG)において、還元剤の存在下または不在下で、電気泳動によって分画する。Laemmli, 1970, Nature 227:680-685を参照されたい。上記のように、見かけの分子量30 kd（HP30）または56 kDa（HP56）を有する、HP30またはHP56ポリペプチドと同定されたバンド、すなわち画分は、次に、そのHP30またはHP56ポリペプチドを含有する画分すなわちゲル切片から直接、単離される。好ましい実施形態において、HP30ポリペプチドは、変性SDS-PAGEにおける移動距離もしくは移動度をミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼB（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）、およびインスリン（〜6 kDa）と比較することによって測定された、約30 kDaの見かけの分子量を有する。
【００９３】
好ましい実施形態において、HP56ポリペプチドは、変性SDS-PAGEにおける移動距離もしくは移動度をミオシン（〜250 kDa）、ホスホリラーゼB（〜148 kDa）、GDH（〜60 kDa）、CAH（〜42 kDa）、ミオグロブリン-ブルー（〜30 kDa）、ミオグロブリン-レッド（〜22 kDa）、リゾチーム（〜17 kDa）、アプロチニン（〜6 kDa）、およびインスリン（〜6 kDa）と比較することによって測定された、約56 kDaの見かけの分子量を有する。
【００９４】
HP56またはHP30ポリペプチドを精製する別法は、抗HP56またはHP30抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによる（第5.4節を参照されたい）。ポリクローナルまたはモノクローナル抗HP56またはHP30抗体を使用する。1以上のモノクローナル抗体が好ましい。抗体は、臭化シアンもしくはスクシンアミドエステルで、または当業者に公知の他の方法で活性化されたアガロースゲルに共有結合で結合される（Affi-Gel, BioRad, Inc.）。タンパク質抽出物を上記のゲルの上部にのせる。HP56もしくはHP30ポリペプチドが抗体に結合するのに十分な時間、接触させる。望ましくは、固相支持体はクロマトグラフィーカラムにおいて使用される材料とする。次にHP56またはHP30ポリペプチドを抗体から解離させ、それによってHP56またはHP30ポリペプチドを、単離されたまたは望ましくは精製された状態で回収することが可能になる。
【００９５】
単離されたまたは精製されたポリペプチドを化学的にかつ／または酵素的に切断もしくは分解することによって、本発明のHP30もしくはHP56誘導ポリペプチドを作製することができる。HP56もしくはHP30誘導ポリペプチドは、異種ペプチドと融合したHP56もしくはHP30ポリペプチドとすることもできるが、さらに、異種ポリペプチドのアミノ酸配列を当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NYを参照されたい。
【００９６】
HP30またはHP56誘導ポリペプチドをコードする配列を含んでなる組換えヌクレオチド構築物を発現する遺伝子発現系において、HP56誘導またはHP30誘導ポリペプチドを作製することもできる。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成またはクローニングし、当業者によく知られた手法に従って発現させる。例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1-3巻、Cold Spring Harbor Press, NY, 第9章を参照されたい。
【００９７】
標準的なタンパク質精製法を適用することによって、本発明のHP56誘導またはHP30誘導ポリペプチドを分画して精製することができるが、この精製法は、本明細書に記載した発見および教示にしたがって変更して適用される。
【００９８】
必要ならば、下記を包含するがそれに限定されない標準的なタンパク質もしくはペプチド精製法を用いて、本発明のポリペプチドをさらに精製することができる：電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈澱、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着アフィニティクロマトグラフィー、色素結合クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーおよびゲル浸透高速液体クロマトグラフィーを包含する）、等電点電気泳動、ならびにそれらの変法および組み合わせ。
【００９９】
本発明のHP56、HP30ポリペプチド、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドを、その物理的もしくは化学的性質にしたがって、単離および／または精製するために考案された手順において、1以上の上記技法を順次使用することができる。こうした性質には、当該タンパク質の疎水性、電荷、結合能、および分子量がある。それぞれの方法の後に得られた試料の様々な画分を、HP56またはHP30抗体との結合能について、または機能的な活性（「試験」活性、例えばヘリカーゼ活性）を有する可能性について、試験した。次に、このような活性を示す画分を、一連の手順における次の技法に供し、新たな画分を再び試験する。上記の「試験」活性を有する唯一の画分が残り、その画分が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくはクロマトグラフィーに供されたときに、唯一のバンドすなわち存在物を示すまで、その過程を繰り返す。
【０１００】
5.4. HP56またはHP30免疫原および抗体
本発明は、HP56、HP30、HP56誘導ポリペプチドまたはHP30誘導ポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。このような抗体を作製するために、単離された、または望ましくは、精製されたHP56、HP30、HP56誘導ポリペプチドもしくはHP30誘導ポリペプチド調製物を、免疫原性組成物において免疫原として使用する。
【０１０１】
ある実施形態において、HP56またはHP30ポリペプチドは、SDS-PAGEによってヘリコバクター細胞の抽出物中に存在する他のタンパク質から分離され（上記第5.3.節を参照されたい）、HP56またはHP30ポリペプチドを含有するゲル切片は、免疫原として使用されて、動物（例えばウサギ）に注射され、ポリクローナルHP56またはHP30抗体を含有する抗血清を生じる。同じ免疫原を用いて、モノクローナル抗HP56またはHP30抗体を産生するハイブリドーマ系の作製を目的として、マウスを免疫することができる。特定の実施形態において、免疫原は、ヘリコバクター・ピロリもしくはヘリコバクター・フェリスを包含するがそれに限定されない、あらゆるヘリコバクター菌株由来の単離されたHP56またはHP30を含有するPAGE切片である。特に好ましい菌株は、ヘリコバクター・ピロリATCC 43504, 43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D, および700932である。
【０１０２】
他の実施形態において、HP56またはHP30ポリペプチドのペプチド断片が、免疫原として使用される。精製されたHP56またはHP30のペプチド断片を使用することが望ましい。プロテアーゼ消化、化学合成または組換えによって、こうしたペプチドを作製し、さらに単離または精製することができる。このような単離、または精製されたペプチドを直接、免疫原として使用することができる。特定の実施形態において、有用なペプチド断片は、6以上のアミノ酸長である。ハプテン-タンパク質コンジュゲートに関する考察については、例えば、Hartlowら、1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY,またはRoittら、1985, IMMUNOLOGY, C. V. Mosby Co., St. Louis, MoもしくはKlein, J., 1990, IMMUNOLOGY, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MAといった標準的な免疫学教科書を参照されたい。
【０１０３】
さらに別の実施形態において、天然に存在するHP56またはHP30ポリペプチドの1以上のエピトープに特異的に結合する抗体を作製するために、インタクトなヘリコバクター細胞またはヘリコバクター溶菌液を免疫原として使用する。免疫感作の前にホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドのような薬剤で細胞を固定することができる。HarlowおよびLane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 第15章を参照されたい。このような抗ホールセル抗体はモノクローナル抗体であることが望ましい。精製されたHP56またはHP30ポリペプチド、インタクトなヘリコバクター細胞、それから調製されるヘリコバクター溶菌液、またはヘリコバクター抗原を発現する細胞を、スクリーニング用リガンドとして使用することによって、望ましいモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ系を同定することができる。このような抗体を誘導するための免疫原は、ヘリコバクター・ピロリもしくはヘリコバクター・フェリスを包含するがそれに限定されない、あらゆるヘリコバクター属のホールセル（全細胞）、抽出物もしくは溶菌液である。望ましい菌株は43504D, 43526, 49503, 51652, 51653, 51932, 700392, 700392D, 700824D, 51110, 51111, 51407, 51652, 51653, 700392, 700392D, 43504, 43504D, 43526, 43579, 49503, 51110, 51111, 51407, 51211, 51480, 51482, 51630, 51631, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 700030, 700031, 700242, 700932, 49286, 49396, 49615, 51101, 51102, 51103, 51104, 51212, 51401, 51402, 51448, 51449, 51450, 51478, 51480, 51482, 51630, 51632, 51800, 51801, 51802, 51863, 51864, 51932, 700030, 700031, 700242, 700824D, および700932である。
【０１０４】
ヘリコバクター細胞による免疫感作によって産生されるポリクローナル抗体は、他のヘリコバクタータンパク質と結合する抗体（「非-抗HP56またはHP30抗体」）を含有する。したがって、試料が他のヘリコバクタータンパク質、またはこのような他のタンパク質と交差反応する物質を含有することが明らかである、または推測される場合には、非常に使いにくい。このような状況下では、所定の試料またはバンドの抗ホールセル抗体による結合はいずれも、HP56またはHP30ポリペプチドに特異的に結合する抗体（例えば抗-HP56、抗-HP30、抗-HP56誘導および／または抗-HP30誘導ポリペプチド）による同じ試料またはバンドの結合が同時に起こることによって、または抗HP56、抗HP30、抗HP56誘導および／または抗HP30を競合剤として使用する競合試験（すなわち、抗HP56抗体、抗HP30抗体、HP56誘導ポリペプチド、HP30誘導ポリペプチドを反応混合物に添加すると、抗ホールセル抗体による試料の結合が低下し、または消失する）によって、確認されなければならない。あるいはまた、このような「非-抗HP56またはHP30」抗体を含有するポリクローナル抗血清から、標準的な方法によって、このような抗体を取り除くことができる。例えば、HP56またはHP30ポリペプチドを含有しないことが明らかなヘリコバクター菌株の細胞とともに沈澱させることによって、またはそのような細胞もしくはそのような細胞の溶菌液を含んでなるカラムに吸着させることによって、非-抗HP30またはHP56抗体を除去することができる。
【０１０５】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体を誘発するための有用な免疫原は、上記の個々の免疫原のいずれか2つ以上からなる混合物を含んでなる。
【０１０６】
本明細書に記載の免疫原による動物（ヒト、ウサギ、ラット、フェレット、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマ）の免疫感作は、ポリクローナル抗体を含有する抗血清、もしくはモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ系を得ることを目的として、当業者によく知られた手順に従って行われる。
【０１０７】
本明細書に包含される教示を受けて、標準技法によってモノクローナル抗体を調製することができる。このような技法は、例えば、米国特許第4,271,145号および米国特許第4,196,265号に開示されている。簡単に述べると、免疫原を用いて動物を免疫する。免疫された動物の脾細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマを作製する。それが産生する、免疫原に結合する抗体について、融合産物をスクリーニングする。陽性ハイブリドーマクローンを単離し、そうしたクローンからモノクローナル抗体を回収する。
【０１０８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体をいずれも産生させる免疫感作法は、当業者によく知られている。皮下、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、粘膜、またはこれらの組み合わせを包含する、多数の投与経路のいずれによっても、免疫原を注入することができる。免疫原は、溶解した状態で、凝集した状態で、ゲル切片のような物理的担体に付着させて、またはアジュバントと混合して、当業者に公知の方法および材料を用いて注入される。当業者によく知られているカラムクロマトグラフィー法によって抗血清および抗体を精製することができる。
【０１０９】
HP30またはHP56ポリペプチドまたはその断片をコードする挿入断片を有する発現ライブラリーにおいて、クローンを同定するためのプローブとして、抗体を使用することもできる。抗体、HP56、HP30、HP56誘導ポリペプチドまたはHP30誘導ポリペプチドをイムノアッセイ（例えば、ELISA、RIA、ウェスタン法）に使用して、生物学的試料中のヘリコバクターもしくは抗ヘリコバクター抗体を特異的に検出および／または定量することもできる。本発明の抗HP56またはHP30抗体は、ヘリコバクター・ピロリもしくはヘリコバクター・フェリスのHP56もしくはHP30ポリペプチドと特異的に結合する。したがって、抗HP30またはHP56抗体を用いてヘリコバクター感染症を診断することができる。
【０１１０】
また、細胞傷害性抗体、細胞増殖抑制性抗体、または中和抗体を包含するがこれに限定されない本発明の抗体を、ヒトを含めた動物のヘリコバクター感染症を予防し、弱めるために、受動免疫法において使用することができる。（本明細書中で用いる細胞傷害性抗体は、抗体に結合された細菌のオプソニン化を高め、かつ／またはその死滅を補足する抗体である。本明細書中で用いる中和抗体は、ヘリコバクターの感染力を低下させ、かつ／またはヘリコバクターの標的細胞への結合を阻止する抗体である。）本発明の免疫原に対して産生された、有効な濃度のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を宿主に投与して、上記のような効果を達成することができる。投与される抗体の正確な濃度は、それぞれの特異抗体調製物によって異なるが、当業者に公知の標準的な技法によって決定することができる。抗体の投与は、ワクチン送達に関する第5.7.節に記載の方法を包含するが、それに限定されない様々な方法によって行われる。
【０１１１】
本発明の別の態様は、本発明の抗原性もしくは免疫原性組成物に対して誘導された抗血清、およびその抗血清中に存在する、HP56もしくはHP30タンパク質またはその断片もしくは類似体と特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、配列番号2および4〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはHP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドと結合することが望ましい。配列番号2および4〜20からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体も包含される。
【０１１２】
「抗体」という用語は、例えばポリクローナル、モノクローナル、精製IgG、IgMもしくはIgA抗体、およびそのフラグメントを含むが、それに限定されないすべての形態を包含することを意味するものであり、例えばFv、一本鎖Fv(scFv)、F(ab)2、FabおよびF(ab)’フラグメントのような抗原結合フラグメント（Harlowら、1988, Antibody, Cold Spring Harbor）；一本鎖抗体（米国特許第4,946,778号）および相補性決定領域(CDR)（VerhoeyenおよびWindust, 1996, Molecular Immunology 第2版、B. D. HamesおよびD. M. Glover編、IRL Press, Oxford University Press 、pp. 283-325を参照されたい）などを包含するが、それに限定されない。
【０１１３】
本発明のさらに別の態様は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体（Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851, 1984; Neubergerら、Nature 81:6851, 1984）であって、これらにおいては、抗HP56または抗HP30抗体の1以上の抗原決定領域が、異種（例えば、ヒト）抗体のフレームワーク領域に導入されている。本発明のキメラ抗体もしくはヒト化抗体は、非ヒト抗体よりも、ヒトにおいて弱い抗原性を示すが、望ましい抗原結合活性およびその他の活性を有している。この活性は、中和活性、細胞傷害活性、オプソニン化活性または防御活性を包含するがそれに限定されない。
【０１１４】
本発明のまた別の態様は、ヘリコバクターに特異的なT細胞、またはヘリコバクター抗原を展示する抗原提示細胞である。HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドに特異的なT細胞を濃縮したT細胞調製物は、当技術分野で公知の方法によって作製され、単離される（第5.8.節を参照されたい）。
【０１１５】
5.5. HP30、HP56、HP30誘導、またはHP56誘導ポリペプチドをコードする核酸
HP56、HP30、HP56誘導またはHP30誘導ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、DNAおよびRNAを含めて、本発明の単離された核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば、従来の化学的方法、または適切なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、および1連の連続したオリゴヌクレオチドを用いたリガーゼ連鎖反応によって合成される。こうした配列はまた、ヘリコバクター属のあらゆる細菌種に由来するHP56もしくはHP30タンパク質遺伝子の同定およびクローニング、例えばヘリコバクターゲノムライブラリーもしくは発現ライブラリーのスクリーニングを可能にする。
【０１１６】
特定の実施形態において、上記ポリペプチドは配列番号2または4または48に示す推定アミノ酸配列を含んでなり、核酸は前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。HP56もしくはHP30の特に好ましい断片は、配列番号2もしくは4、またはそれに実質的に相同な配列に示されるアミノ酸配列に由来する6、7または8個またはそれ以上の推定アミノ酸からなる配列を有するが、さらに本発明は、前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含んでなる核酸を包含する。別の特定の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号1または3または47のヌクレオチド配列によってコードされ、特に好ましい断片は配列番号21〜36またはそれに実質的に相同な配列に示される。
【０１１７】
「単離された核酸」、「単離された核酸分子」、「単離されたヌクレオチド」または「単離されたヌクレオチド分子」という用語は、天然に存在する環境から取り出された核酸分子またはヌクレオチド分子と定義される。例えば、生きた細菌のゲノム中に存在する、またはジーンバンクの一部として存在する天然のDNA分子は単離されていないが、例えばクローニング（増幅）の結果として、細菌ゲノムの残りの部分から分離された同分子は、単離されている。概して、単離されたDNA分子は、天然に存在するゲノムにおいて5’または3’末端に直に隣接するDNA領域（例えば、コード領域）をもたない。このような単離された核酸分子、核酸分子もしくはヌクレオチド分子は、ベクターまたは組成物の一部であってもよいが、そうしたベクターもしくは組成物は天然の環境の一部ではないという点で、やはり単離されているとみなされる。
【０１１８】
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができる。また、本発明は配列番号1、3、47もしくはその断片にハイブリダイズ可能な、または相補的な核酸を提供する。特定の態様において、HP56、HP30、HP56誘導ポリペプチドまたはHP30誘導ポリペプチドをコードする核酸の、少なくとも10, 15, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300または1400の連続したヌクレオチドに対して完全に相補的なまたは相補的な配列を含んでなる核酸が提供される。特定の実施形態においては、低い、中程度の、もしくは高いストリンジェンシーの条件のもとで、HP56もしくはHP30をコードする核酸（例えば、配列番号1または3の配列を有する）と、またはHP56誘導またはHP30誘導ポリペプチドをコードする核酸と、ハイブリダイズすることができる核酸が提供される。
【０１１９】
限定ではなく、例として、このようなストリンジェンシーの低い条件を用いた手順は、下記の通りである（ShiloおよびWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792も参照されたい）：DNAを含有するフィルターを、35%ホルムアミド、5X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中、40℃で6時間、前処理する。次のような変更を加えた同溶液中でハイブリダイゼーションを行う：0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10%（重量／容量）デキストラン硫酸、および5〜20X 106cpm 32P-標識プローブを使用する。フィルターはハイブリダイゼーション混合液中で18〜20時間、40℃でインキュベートした後、2X SSC、25 mM Tris-HCl(pH 7.4)、5 mM EDTA、および0.1% SDSを含有する溶液中、55℃で1.5時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液と交換し、さらに1.5時間、60℃でインキュベートする。フィルターを吸い取って乾燥させ、オートラジオグラフィーのために露光する。必要ならば、3度目にフィルターを65〜68℃で洗浄し、再度フィルムに露光する。使用することができる低いストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野でよく知られている（例えば、異種間ハイブリダイゼーションのために使用される条件）。
【０１２０】
別の特定の実施形態においては、HP30もしくはHP56ポリペプチド、またはHP30誘導もしくはHP56誘導ポリペプチドをコードする核酸と高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる核酸が提供される。限定ではなく例として、このような高いストリンジェンシーの条件を用いた手順は、下記の通りである： 6X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、および500mg/ml変性サケ精子DNAを含むバッファー中で、アニーリング温度を50℃まで下げる以外は上記のように、DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、8時間から一晩、65℃で実施する。100mg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20X 106cpm 32P-標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中、65℃で16または48時間、フィルターをハイブリダイズする。フィルターの洗浄は37℃で1時間、2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll、および0.01% BSAを含有する溶液中で行う。これに続いて、0.1X SSC中、50℃で45分間洗浄した後、オートラジオグラフィーを行う。使用できる他の高いストリンジェンシー条件は、当業者に公知である。
【０１２１】
もう一つの特定の実施形態において、HP30もしくはHP56ポリペプチド、またはHP30誘導もしくはHP56誘導ポリペプチドをコードする核酸と中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズすることができる核酸が提供される。
【０１２２】
核酸のハイブリダイゼーションを促進する様々な他のストリンジェンシー条件を使用することができる。例えば、約45℃で6X SSCにてハイブリダイゼーションを行い、続いて50℃で2X SSCにて洗浄を行うことができる。また、洗浄ステップにおける塩濃度は、低いストリンジェンシーの50℃で約5X SSCから、中程度のストリンジェンシーの50℃で約2X SSCまで、高いストリンジェンシーの50℃で約0.2X SSCまでの範囲とすることができる。さらに、洗浄ステップの温度は、低いストリンジェンシー条件の室温から、中程度のストリンジェンシー条件の約42℃まで、高いストリンジェンシー条件の約65℃まで高くすることができる。他の条件には、0.5 M NaHPO4(pH7.2)/1 mM EDTA/7% SDS中で68℃でのハイブリダイズ、または50%ホルムアミド/0.25M NaHPO4(pH7.2)/25 M NaCl/1 mM EDTA/7% SDS中でのハイブリダイゼーション；続いて、40 mM NaHPO4(pH7.2)/1 mM EDTA/5% SDS中で42℃での洗浄、もしくは40 mM NaHPO4(pH7.2)/1 mM EDTA/1% SDS中で50℃での洗浄が含まれるが、これらに限定されない。温度と塩の双方を変更してもよく、あるいは、一方の変動要因を一定に維持したままで、他方を変更してもよい。
【０１２３】
低い、中程度の、および高いストリンジェンシー条件は、当業者に広く知られており、特定の核酸配列の塩基組成に応じて、さらにその核酸配列の起源となる特定の生物に応じて、予測可能に変化するものである。こうした条件に関する指針としては、例えば、Sambrook ら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Press, N. Y., pp. 9.47-9.57；およびAusubelら、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.を参照されたい。
【０１２４】
ゲノムライブラリーの作製においては、DNA断片が生成され、そのいくつかはヘリコバクターHP30もしくはHP56タンパク質の一部または全部をコードする。様々な制限酵素を用いて、特定の部位でDNAを切断することができる。あるいはまた、DNアーゼを用いてマンガン存在下でDNAを断片化する、もしくは、例えば超音波処理によってDNAを物理的に剪断することができる。次に、DNA断片は標準的な技法によってサイズに従って分離される。その技法は、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーおよびショ糖密度勾配遠心法を包含するがそれに限定されない。その後、DNA断片は、プラスミド、コスミド、ラムダもしくはT4バクテリオファージ、バクミドおよび酵母人工染色体(YAC)を包含するがそれに限定されない適当なベクターに挿入される。（例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M.編、1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. 第I, II巻を参照されたい。）ゲノムライブラリーは、標識プローブとの核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる（BentonおよびDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961）。
【０１２５】
HP56またはHP30タンパク質の任意のペプチドのアミノ酸配列に相当する、標識された縮重オリゴヌクレオチドプローブを用いて、当技術分野で公知の最適な方法によって、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。使用するプローブはいずれも、15ヌクレオチド以上であることが望ましい。
【０１２６】
本明細書中で用いる「プローブ」という用語は、上記で定義されたストリンジェント条件下で、配列番号1もしくは配列番号3と同一のまたは相同な配列、または相補的もしくはアンチセンス配列を有する核酸とハイブリダイズするDNA（望ましくは1本鎖）もしくはRNA分子を指す。一般に、プローブは、配列番号1または3に示される全長配列よりもかなり短い。例えば、プローブは、約5から約100までのヌクレオチドを含有することができるが、約10から約80までが望ましい。より詳細には、プローブは、配列番号1もしくは3に示す配列、またはそうした配列に相補的な配列の一部に対して、少なくとも75%、望ましくは少なくとも85%、より望ましくは95%相同な配列を有する。プローブは、イノシン、メチル-5-デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ-5-デオキシウリジン、またはジアミノ-2,6-プリンといった修飾塩基を含有することができる。
【０１２７】
HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドをコードするインサートDNAを含むライブラリーのクローンは、1以上の縮重オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするだろう。こうしたオリゴヌクレオチドプローブのゲノムライブラリーとのハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知の方法によって実施される。例えば、2つの上記オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションは、2X SSC、1.0% SDS中、50℃で実施して、同じ条件を用いて洗浄することができる。
【０１２８】
さらに別の態様において、ヘリコバクター発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても、HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドの一部または全部をコードするヌクレオチド配列のクローンを得ることができる。例えば、ヘリコバクターDNAまたはRNAから生成されたヘリコバクターcDNAを単離して、ランダムな断片を調製し、これを発現ベクター（例えば、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミドまたはコスミド）中に連結し、その結果として、ベクター中に挿入された配列を宿主細胞（後にそのベクターが導入される）において発現させることが可能である。その後、様々なスクリーニングアッセイを用いて、発現されたHP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドを選択することができる。ある実施形態において、本発明の様々な抗HP56またはHP30抗体を使用して、当技術分野において公知の方法によって、望ましいクローンを同定することができる。例えば、HarlowおよびLane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, Cold spring Harbor, N. Y., Appendix  IVを参照されたい。ライブラリー由来のクローンもしくはプラークを抗体と接触させて、結合するクローンを同定する。
【０１２９】
ある実施形態において、HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドをコードするDNAを含有するコロニーもしくはプラークは、参考として本明細書に含められるOlsvickら、1989, 29th ICAAC, Houston, Tex.にしたがって、DYNA Beadsを用いて検出することができる。抗HP56もしくはHP30抗体をDYNA Beads M280に架橋結合して、この抗体含有ビーズを用いてHP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドを発現するコロニーまたはプラークに吸着させる。HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドを発現するコロニーまたはプラークは、このようなビーズに結合するものとして同定される。
【０１３０】
もう一つの方法として、抗HP56もしくはHP30抗体を適当な支持体、例えばシリカまたはセライト（商標）樹脂に、非特異的に固定化することができる。このような材料を用いて、前節に記載のように、HP56、HP30、HP56誘導、またはHP30誘導ポリペプチドを発現するコロニーまたはプラークに吸着させる。
【０１３１】
別の態様において、PCR増幅を利用して、ヘリコバクターゲノムDNAに由来するHP56またはHP30タンパク質の一部または全部をコードする実質的に純粋なDNAを調製することができる。既知のHP56またはHP30タンパク質配列に対応する、縮重したあるいは縮重していない、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【０１３２】
例として、N-末端プライマーをコードするオリゴヌクレオチドを、内部の下流のタンパク質コード配列に相補的な3’リバースPCRオリゴヌクレオチドと共に、用いることにより、N-末端に特異的なHP56またはHP30 DNA断片を増幅することができる。あるいはまた、内部のHP56もしくはHP30コード配列をコードするオリゴヌクレオチドを5’フォワードPCRプライマーとして、下流にある内部のHP56もしくはHP30タンパク質コード配列に相補的な3’リバースPCRオリゴヌクレオチドと共に使用して、内部のHP56またはHP30に特異的なDNA断片をPCR増幅することができる。また別の方法として、上記フォワードプライマーを、C-末端HP56もしくはHP30タンパク質コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドと組み合わせて、HP56もしくはHP30タンパク質ORFをPCR増幅することができる。こうしたHP56もしくはHP30タンパク質に特異的なPDR産物は、適当な発現ベクターにクローニングして、個別のタンパク質もしくは融合タンパク質として、HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドの全部もしくは一部の合成を指令することができる。あるいは、こうしたHP56もしくはHP30タンパク質特異的PCR産物は、適切に標識してハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、ゲノムDNAライブラリー由来のHP56もしくはHP30タンパク質遺伝子の全部または一部を同定することができる。
【０１３３】
PCRは、例えば、Perkin-Elmer CetusサーマルサイクラーおよびTaqポリメラーゼ（Gene Amp(商標)）を用いて行うことができる。PCR反応に使用する目的で、いくつかの異なる縮重プライマーを選択して合成することができる。PCR反応を準備する際に用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変更することも可能で、縮重プライマーと、ヘリコバクターDNA中の対応する配列との間のヌクレオチド配列の類似性の度合いを大きくすることも小さくすることもできる。HP56もしくはHP30タンパク質をコードする配列のセグメントを十分に増幅した後、そのセグメントを分子クローニングして配列決定し、これをプローブとして使用して完全なゲノムクローンを単離することができる。このことは、ひいては、その遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の解析、および機能解析のためのそのタンパク質産物の産生を、下記に記載のように、可能にするであろう。
【０１３４】
HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列が、あるヘリコバクター属細菌、菌株、もしくは培養株から単離されたならば、同じ方法を用いて他のヘリコバクター属細菌、菌株および培養株からHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列を単離することができる。本発明のHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチド（またはその断片）をコードするDNAまたはRNA配列を用いて、中程度から高いストリンジェンシー条件下で、当技術分野で公知の一般的技法を用いて、前記配列とハイブリダイズする他のDNAまたはRNA配列を得ることができることは、当業者に理解されるであろう（上記を参照されたい）。高いストリンジェンシー条件下での、あるヘリコバクター菌株もしくは培養株を起源とするHP56もしくはHP30タンパク質配列とのハイブリダイゼーションは、他の菌株および培養株由来の相当する配列を同定すると考えられる。高いストリンジェンシー条件は、プローブの長さおよび塩基組成によって変化する。そうした条件を決定するための常法は、当技術分野で広く知られている。Sambrookら、1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 第11章を参照されたい。例として、300塩基よりも長いプローブに適用されるような高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、0.1X SSC/0.1%SDSによる、68℃で最低1時間の最終洗浄を必要とする（Ausbelら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻、Greene Publishing Associates, Inc、およびJohn Wiley & Sons, Inc. New York, p. 2.10.2）。
【０１３５】
当業者は、HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列の完全なクローンを、当技術分野で公知の方法によって同定することができるであろう。単離されたクローンに含まれるHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列の長さを確認するには、クローニングされた挿入断片の配列を決定し、そのオープンリーディングフレーム（ORF）によってコードされるポリペプチドの推定サイズを、HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドのサイズと比較するか、および／または推定アミノ酸配列を、精製されたHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドの既知のアミノ酸配列と比較する。HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列の部分クローンが単離された場合には、その部分クローンの挿入断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用することによって、完全なクローンを単離することができる。あるいはまた、完全なHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドコード配列は、部分的に重なり合ったクローンから、それらのHP56もしくはHP30タンパク質挿入断片を継ぎ合わせることによって再構築することができる。
【０１３６】
HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドの配列、または、これらの完全なアミノ酸配列が利用できない場合には、HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドのペプチド断片の配列と一致するか、または実質的に相同な推定アミノ酸配列を示すORFを有し、かつHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドに相当する分子量を有するクローンはいずれも、完全なクローンと考えられる。さらに、完全なクローンは、その挿入断片を発現ベクターに入れたときに、HP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドのアミノ末端に特異的な抗体、およびHP56もしくはHP30タンパク質ポリペプチドのカルボキシ末端に特異的な抗体に結合するポリペプチドを産生する能力によって同定される。
【０１３７】
HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド、およびそれらの融合タンパク質をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。ある態様において、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドをコードする配列は、本明細書で開示した教示内容を考慮して、組換えDNA法によってHP56もしくはHP30ポリペプチドコード配列から得られる。例えば、HP56もしくはHP30ポリペプチドのコード配列を変化させて、そのポリペプチドの免疫原性に影響しない、またはその免疫原性を向上させる、上記の保存的置換もしくは半保存的置換のような、アミノ酸置換を生じさせることができる。オリゴヌクレオチドを標的とした部位特異的突然変異誘発を包含するがそれに限らない様々な方法を使用することができる。上記の、および当業界で公知の他の技法を用いて、BotsteinおよびShortle, 1985, Science 229: 1193-1210に記載のように、単一の、もしくは複数の突然変異、たとえば置換、挿入、欠失および転位を生じさせることができる。
【０１３８】
さらに、HP30またはHP56ポリペプチドコード配列のDNAは、制限酵素またはエキソヌクレアーゼ消化によって切断される。連結反応もしくはPCR増幅によって異種コード配列をHP30またはHP56ポリペプチドコード配列に付加することができる。さらに、HP30またはHP56誘導ポリペプチドの全体もしくは一部をコードするDNAは、当該ポリペプチドの既知のもしくは推定上のアミノ酸配列、およびその配列への何らかの望ましい変更に基づいて、化学合成もしくはPCR増幅によって合成することができる。
【０１３９】
別の望ましい実施形態において、HP30またはHP56タンパク質をコードするDNAは、そのタンパク質が産生される宿主細胞において発現が増加するようにコドンが最適化された合成DNAである。遺伝暗号の縮重は、天然型DNA配列によってコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生するにもかかわらず、ヌクレオチド配列が異なることを可能にする。アミノ酸に関する個々の同義コドンの頻度は、真核生物および原核生物の間で、ゲノムごとに大幅に異なる（Wadaら、Nucleic Acid Research 20:S211-2118, 1992およびAyersら、Virology 202:586, 1994に要約されるが、これらを全体として本明細書中に含めるものとする）。このようなコドン選択パターンの相違は、ペプチド伸長速度を調節する個々の遺伝子の全体的な発現レベルに寄与すると思われる。こうした理由により、特定の発現系を意図した核酸分子をデザインすることは、望ましく、また有用であり、この場合、コドン使用頻度は、宿主細胞のもしくはタンパク質を発現する生物の、tRNAの頻度を反映する。天然型のコドンを宿主細胞において高度に発現される遺伝子のコドンに置き換える。例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、ピキア）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ）、または哺乳動物細胞もしくは動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ、もしくはマウスなどの細胞または動物）においてコード化タンパク質を発現させるために、核酸分子を最適化することができる。
【０１４０】
遺伝子の合成およびDNA操作のために重要な制限酵素部位は、核酸およびベクターの構築、ならびにコードされたタンパク質の発現を促進するために、保存または破壊される。本発明の合成遺伝子または核酸を構築する場合、CpG配列は遺伝子サイレンシングを引き起こす可能性があるので、この配列を避けることが望ましい。したがって、好ましい実施形態において、合成核酸分子のコード領域は「cg」配列を含まないか、もしくは5回未満で出現する「cg」配列を含む。コドンを最適化した配列は、当業者に公知の従来の技法によって、合成され、アセンブルされ、そして適当な発現ベクターに挿入される。
【０１４１】
特に好ましい実施形態において、HP30もしくはHP56タンパク質をコードする合成核酸は少なくとも1つのコドン置換を含んでなるが、この場合、そのタンパク質をコードする天然遺伝子の好ましくないまたはやや好ましくないコドンが同アミノ酸をコードする好ましいコドンに置き換えられている。例えば、ヒトにおいて、好ましいコドンは、Ala(gcc); Arg(cgc); Asn(aac); Asp(gac); Cys(tgc); Gln(cag); Gly(ggc); His(cac); Ile(atc); Leu(ctg); Lys(aag); Pro(ccc); Phe(ttc); Ser(agc); Thr(acc); Tyr(tac); およびVal(gtg)である。やや好ましくないコドンは、Gly(ggg); Ile(att); Leu(ctc); Ser(tcc); Val(gtc); およびArg(cgg)である。上記の好ましいコドンにも、やや好ましくないコドンにも当てはまらないコドンはすべて、好ましくないコドンである。一般に、特定のコドンの優先度は、高発現遺伝子におけるコドンの出現率によって示される。高発現ヒト遺伝子に関するコドンの優先性は、表3に示すとおりである。例えば、「atc」は、高発現の哺乳動物遺伝子においてIleコドンの77%を占めており、好ましいIleコドンである；「att」は、高発現の哺乳動物遺伝子においてIleコドンの18%を占めており、やや好ましくないIleコドンである。「ata」という配列は、高発現ヒト遺伝子においてわずか5%に相当し、好ましくないIleコドンである。あるコドンを、高発現のヒト遺伝子においてより多く見られる別のコドンで置き換えることは、一般に、哺乳動物細胞における遺伝子発現を増大させると考えられる。したがって、本発明は、好ましくないコドンを好ましいもしくはやや好ましくないコドンに置き換えることはもとより、やや好ましくないコドンを好ましいコドンに置き換えることも包含する。
【０１４２】
合成核酸は、コードされるタンパク質の発現のために最適化され、タンパク質をコードする核酸分子内の少なくとも1つの好ましくないもしくはやや好ましくないコーディングは、同アミノ酸をコードする好ましいもしくはより好ましいコドンに置き換えられる。この合成核酸は、in vitro細胞培養系において同一条件下で、前記の最適化されない核酸分子によって発現されるレベルの、少なくとも110%、125%、150%、200%、500%のレベルで、コードされたタンパク質を発現する。合成核酸分子は配列CGの出現を5回未満とすることが望ましい。核酸分子において、望ましくは、好ましくないコドンおよびやや好ましくないコドンのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%もしくは90%が好ましいコドンまたはより好ましいコドンによって置き換えられている。
【０１４３】
特定の好ましい実施形態において、核酸は、ヒトもしくは哺乳動物の細胞または生物体におけるコードされたタンパク質の発現のために最適化される。
【表３】
2004520825.tif 000006
2004520825.tif 000007
2004520825.tif 000008
【０１４４】
HP56、HP30、HP56誘導、もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列を含有する同定および単離されたDNAは、適当なクローニングベクターに挿入することができる。当技術分野で公知の数多くの宿主-ベクター系が使用できる。本明細書および特許請求の範囲で使用される「宿主」という用語は、動物におけるin vivo、または哺乳動物細胞培養物におけるin vitroのいずれかを表す。
【０１４５】
考えられるベクターには、プラスミドおよび改変ウイルスがあるが、それに限定されない。しかし、ベクター系は、使用する宿主細胞と適合しなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはpET、pBAD、pTrcHis、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体のようなプラスミドが挙げられるが、これに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクターへのDNA断片の連結によって行われる。しかしながら、DNAを断片化するために用いられた相補的な制限酵素認識部位がクローニングベクター中に存在しないならば、そのDNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいはまた、いかなる望ましい部位も、DNA末端へのヌクレオチド配列（リンカー）の連結によって、作製することができる；このような連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを包含することができる。別法において、ホモポリマーのテーリングによって、切断されたDNAを修飾することができる。形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等によって、組換え分子を宿主細胞に導入することができるが、その結果、その遺伝子配列の多数のコピーが生成される。
【０１４６】
別法において、HP56、HP30、HP56誘導、もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列を含有する望ましいDNAは、ショットガン法で適当なクローニングベクターに挿入後、同定して単離することができる。例えばサイズ分画によって、クローニングベクターに挿入する前に、望ましい配列を富化することができる。
【０１４７】
特定の実施形態において、HP56、HP30、HP56誘導、もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列を含有する組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、そうしたコード配列の多数のコピーの生成を可能にする。こうして、形質転換体を増殖させ、その形質転換体から組換えDNA分子を単離し、さらに必要ならば単離された組換えDNAから挿入されたコード配列を回収することによって、コード配列を大量に得ることができる。
【０１４８】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、他のタンパク質遺伝子の相補的なストレッチとの二本鎖分子を選択的に形成することができるために有用である。用途に応じて、様々なハイブリダイゼーション条件を使用して、様々な配列アイデンティティーを得ることができる。特定の態様において、HP56またはHP30タンパク質をコードする核酸分子の少なくとも10, 15, 25, 50, 100, 200または250ヌクレオチドに相補的な配列を含む核酸が提供される。特定の実施形態において、低い、中程度の、もしくは高いストリンジェンシー条件のアニーリング条件下で、HP56もしくはHP30タンパク質の核酸（例えば、配列番号1または3の配列を有する）とハイブリダイズする核酸が提供される。
【０１４９】
高度な選択性のために、限定ではなく一例として、0.02M〜0.15M NaCl、約50℃〜70℃までの温度で与えられるような、低い塩濃度および／または高温の条件といった、比較的ストリンジェントな条件を用いると、二本鎖が形成される。ある用途のために、限定ではなく一例として、0.15M〜0.9M塩、約20℃〜55℃までの範囲の温度のような、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が必要とされる。また、ハイブリッド二本鎖を脱安定化させるために、漸増量のホルムアミドを添加することによって、ハイブリダイゼーション条件を一層ストリンジェントにすることもできる。このようにして、特別なハイブリダイゼーション条件は簡単に操作することができるが、一般的に、所望の結果に応じて選択される方法であるだろう。
【０１５０】
5.6. HP56、HP30、HP56誘導、もしくはHP30誘導ポリペプチドの組換え体の産生
特にヘリコバクター属細菌の一種の培養物から単離されるような天然のタンパク質が、微量の有毒物質もしくは他の混入物を包含する可能性がある場合には、本発明にしたがって、組換え法によって本発明のヘリコバクタータンパク質を作製することが好ましい。異種系において組換え的に産生された本発明のタンパク質を使用することによって、こうした問題を回避することが可能であり、本発明のタンパク質を、単離された物質中の混入物を最小にするように、宿主から単離することができる。この場合、こうしたタンパク質は、当該ポリペプチドをコードするDNAによって形質転換された適当な宿主細胞によって産生される。
【０１５１】
本発明のHP30、HP56、HP30もしくはHP56誘導ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列を転写および翻訳するために必要な要素を含有するベクター、に挿入することができる。HP56、HP30ポリペプチド、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適当な条件下で発現されるように（例えば、正しい方向および正確な読み枠で）、ベクター中に挿入される。組換え発現ベクターはまた、「発現手段」も含んでなる。「発現手段」という用語は、タンパク質をコードする核酸の転写および翻訳に必要なベクターの要素を表し、プロモーター／エンハンサーエレメント、複製部位、RNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列、表現型の選択（例えば、アンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性）およびレプリコンを提供できる配列、ならびに宿主細胞を形質転換するために用いることができる制御配列を包含するが、それらに限定されない。発現手段は、発現ベクター内に挿入された核酸分子を連結することによって、機能的に核酸分子に結合されている。
【０１５２】
挿入された配列の発現を制御するために用いることができるプロモーター／エンハンサーエレメントとしては、動物細胞での発現に関して、SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、1982, Nature 296:39-42）；細菌細胞での発現に関して、ラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroffら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）、tac（DeBoerら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）、もしくはtrc（「組換え細菌由来の有用なタンパク質(Useful proteins from recombinant bacteria)」, Sientific American、 1980, 242:74-94も参照されたい）；植物細胞での発現に関して、ノパリン合成酵素のプロモーター領域、もしくはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら、1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）、および光合成の酵素であるリブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら、1984, Nature 310:115-120）；酵母もしくは他の真菌における発現に関して、Gal4プロモーター、ADC（アルコール脱水素酵素）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
使用する宿主ベクター系に応じて、多くの好適な転写および翻訳エレメントのうちいずれか1つを使用することができる。好ましい実施形態において、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド配列、ならびに、宿主細胞のプレ、および／またはプロ配列を含んでなるキメラタンパク質が発現される。他の好ましい実施形態においては、例えば、アフィニティー精製ペプチド（マルトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、チオレドキシン、およびヒスチジンタグを包含するが、これらに限定されない）と融合したHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド配列を含んでなるキメラタンパク質が発現される。さらなる好ましい実施形態において、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド配列、および有用な免疫原性ペプチドもしくはタンパク質を含んでなるキメラタンパク質が発現される。
【０１５４】
DNA断片をベクター内へ挿入するための、当業界に公知の任意の方法を用いて、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドをコードする核酸分子を含有する発現ベクターを構築することができる。この発現ベクターは、適当な転写／翻訳制御シグナルおよび上記ポリペプチドコード配列からなる。これらの方法は、in vitro組換えDNA技法および合成法、ならびにin vivo組換え体（遺伝的組換え）を包含しうる。
【０１５５】
酵母宿主に外来DNAを導入する方法としては、スフェロプラストの形質転換、またはアルカリカチオン処理した、無傷の酵母細胞の形質転換のいずれかが挙げられる。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種類によって変わる。例えば、カンジダ(Candida)については、Kurtzら、1986, Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunzeら、1985, J. Basic Microbiol. 25:141を；ハンセヌラ(Hansenula)については、Gleesonら、1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkampら、1986, Mol. Gen. Genet. 202:302を；クルイベロミセス(Kluyveromyces)については、Dasら、1984, J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourtら、1983, J. Bacteriol. 154:1165; Van Den Bergら、1990, Bio/Technology 8:135を；ピキア(Pichia)については、Creggら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunzeら、1985, J. Basic Microbiol. 25:141;米国特許第4,837,148号および米国特許第4,929,555号を；サッカロミセス(Saccharomyces)については、Hinnenら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Itoら, 1983, J. Bacteriol. 153:163を；シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)については、Beachら、1981, Nature 300:706を；Davidowら、1985, Curr. Genet. 10:39を参照されたい。
【０１５６】
HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列を含有する発現ベクターを、3つの一般的な方法によって同定することができる：(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在、および(c)挿入配列の発現。第1の方法において、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入されたHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列に相同な配列を含んでなるプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第2の方法において、組換えベクター／宿主系を、外来遺伝子のベクターへの挿入によって引き起こされる、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体の形成等）の存在又は不在に基づいて同定および選択することができる。例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性細胞の遺伝子を含有するpBR322を用いて、大腸菌を形質転換することができる。HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、そのインサートを含有する組換え体は、そのマーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。第3の方法において、組換え発現ベクターを、組換え体によって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって同定できる。こうしたアッセイは、例えば、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドin vitroアッセイ系の物理的もしくは機能的活性（例えば、Hisタグのカラムへの結合、リガンドもしくは受容体への結合、または本発明の抗 HP56もしくはHP30抗体との結合）に基づくことができる。
【０１５７】
細菌宿主において異種タンパク質を発現するための市販のベクターとしては、pZERO、pTrc99A、pUC19、pUC18、pKK223-3、pEX1、pCAL、pET、pSPUTK、pTrxFus、pFastBac、pThioHis、pTrcHis、pTrcHis2およびpLExが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、λGEM（商標名）-11におけるファージを、組換えファージベクターを作製するために使用することができるが、このベクターを使用して大腸菌LE392のような宿主細胞を形質転換することができる。好ましい実施形態において、ベクターはpQE30もしくはpBAD/ThioEであって、これを用いて大腸菌のような宿主細胞を形質転換することができる。
【０１５８】
多くの酵母への形質転換のための発現および形質転換ベクターが利用可能である。例えば、以下の酵母のために発現ベクターが開発されている：カンジダ・アルビカンス(Candida albicans), Kurtzら、1986, Mol. Cell. Biol. 6:142;カンジダ・マルトサ(Candida maltosa), Kunzeら、1985, J. Basic Microbiol. 25:141；ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula Polymorpha), Gleesonら、1986, J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkampら、1986, Mol. Gen. Genet. 202:302；クルイベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis), Dasら、1984, J. Bacteriol. 158:1165; クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis), De Louvencourtら、1983, J. Bacteriol. 154:737; Van den Bergら、1990, Bio/Technology 8:135; ピキア・クイレリモンジイ(Pichia quillerimondii), Kunzeら、1985, J. Basic Microbiol. 25:141；ピキア・パストリス(Pichia pastoris), Creggら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:3376;米国特許第4,837,148号および米国特許第4,929,555号; サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae), Hinnenら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Itoら, 1983, J. Bacteriol. 153:163; シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe), Beachら、1981, Nature 300:706; およびヤロワイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica), Davidowら、1985, Curr. Genet. 10:380471; Gaillardinら、1985, Curr. Genet. 10:49。
【０１５９】
様々な宿主ベクター系を利用して、ポリペプチドコード配列を発現させることができる。これらは、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物；植物細胞もしくはトランスジェニック植物を包含するがこれらに限定されない。本発明の核酸分子、その断片、類似体もしくは変異体の発現に適した宿主は、大腸菌、バシラス(Bacillus)属細菌、ヘモフィルス(Haemophilus)、真菌、酵母、例えば、サッカロミセス、ピキア、ボルデテラ(Bordetella)、もしくはカンジダを包含しうるが、またはバキュロウイルス発現系を使用することができる。好ましくは、宿主細胞は酵母もしくは細菌である。本件の発現のために特に望ましい宿主としては、LPSを持たず、したがって内毒素のないグラム陽性細菌が挙げられる。もっとも好ましい細菌は、大腸菌、枯草菌（B. subtilis）もしくはサルモネラ（Salmonella）である。別の実施形態において、また宿主細胞は、少なくとも1つの他の異種タンパク質も発現する。該異種タンパク質としては、H.ピロリ（H, pylori）細胞毒素（Covacciら、2000 米国特許第6,130,059号）、H.ピロリ熱ショックタンパク質（hsp60）（Covacciら、2000米国特許第6,077,706号）、H.ピロリCagA（Covacciら、2000 米国特許第5,928,865号）、H.ピロリウレアーゼ（Michettiら、1999米国特許第5,972,236号）、H.ピロリカタラーゼ（Doidgeら、1999米国特許第6,005,000号）、H.ピロリニッケル結合タンパク質（Plautら、1999米国特許第5,972,348号）、H.ピロリtagA（Coverら、1999米国特許第5,876,943号）、H.ピロリエノラーゼ（Thompsonら、1997米国特許第5,703,219号）、腸病原性大腸菌HtrA（a/k/a Deg P; Seolら、1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:730; Lipinskaら、1990, J. Bacteriol. 172:1791; Pallenら、1997, Molecular Microbiol. 26:209）を包含するが、これらに限定されない。
【０１６０】
さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、あるいは特定の望ましい様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする、宿主細胞株を選択することができる。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で高めることができる；こうして、遺伝子工学的に作製されたHP30、HP56、HP30誘導もしくはHP56誘導ポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の、翻訳および翻訳後のプロセシングおよび修飾について、特徴的で特異的な機構を有する。適当な細胞系統もしくは宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセシングを確かなものとすることができる。
【０１６１】
ひとたび、好適な宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増殖させ、大量に調製することができる。発現されると、本発明の組換えポリペプチドが産生され、さらに、これを細胞ペースト、細胞抽出物から、または組換え細胞培養物の遠心分離後の上清から、当業界で周知の技法を用いて、回収し、実質的に精製することができる。例えば、抗体に基づいたアフィニティー精製、分取ゲル電気泳動、もしくは組換えポリペプチドに含まれるタグ（例えば、6Xヒスチジンタグ）を用いたアフィニティー精製によって、組換えポリペプチドを精製することができる（第5.3節を参照されたい）。
【０１６２】
5.7.  組成物
また本発明は、治療用および予防用組成物も提供する。該組成物は抗原性組成物とすることができるが、好ましくは、動物（哺乳動物を含む）の、さらに具体的には、齧歯類および霊長類（ヒトを含む）のヘリコバクター感染に対するワクチンを包含する免疫原性組成物とすることができる。好ましい免疫原性組成物は、ヒトに使用するワクチンを包含する。本発明の、抗原性、好ましくは、免疫原性組成物は、当業者に公知の技法によって調製することができ、例えば、免疫学的に有効な量の、第5.1もしくは5.2節に開示するHP30もしくはHP56免疫原のいずれかを含んでなるが、場合によっては、1以上の他の免疫原と組み合わせて、または融合して、または結合して含んでなることもでき、脂質，リン脂質、炭水化物、リポ多糖、ヘリコバクター起源もしくは他の細菌起源の、不活化もしくは弱毒化した全生物および他のタンパク質、製薬上許容される担体、場合によっては適当なアジュバント、および、場合によっては、従来からワクチン中に見られる他の物質を包含する。このようなカクテルワクチン（いくつかの免疫原を含んでなる）は、1つの病原体の1以上の菌株に対する免疫、または1以上の病原体に対する免疫が、1回の投与で得られうるという利点を有する。他の免疫原の例としては、既知のDPTワクチンで使用される免疫原、H.ピロリ細胞毒素（Covacciら、2000 米国特許第6,130,059号）、H.ピロリ熱ショックタンパク質（hsp60）（Covacciら、2000米国特許第6,077,706号）、H.ピロリCagA（Covacciら、2000 米国特許第5,928,865号）、H.ピロリウレアーゼ（Michettiら、1999米国特許第5,972,236号）、H.ピロリカタラーゼ（Doidgeら、1999米国特許第6,005,000号）、H.ピロリニッケル結合タンパク質（Plautら、1999米国特許第5,972,348号）、H.ピロリtagA（Coverら、1999米国特許第5,876,943号）、H.ピロリエノラーゼ（Thompsonら、1997米国特許第5,703,219号）、腸病原性大腸菌HtrA（a/k/a Deg P; Seolら、1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 176:730; Lipinskaら、1990, J. Bacteriol. 172:1791; Pallenら、1997, Molecular Microbiol. 26:209）、カンピロバクター属細菌（Campylobacter spp.）、赤痢菌属細菌（Shigella spp.）、腸病原性大腸菌、コレラ菌（Vibrio Cholera）またはロタウイルスの完全に弱毒化された、もしくは死滅した生物、またはそれに由来するサブユニットが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６３】
「免疫学的に有効な量」という用語は、本明細書において、抗体、T細胞および／またはサイトカインならびに他の細胞性免疫応答成分を生じる免疫応答を誘導するのに十分な量という意味で使用される。免疫原性組成物は、ヘリコバクター感染症を予防する、または前から存在する、もしくはその後のヘリコバクター感染の重症度を軽減するものであることが好ましい。ワクチンにおいて使用される免疫原の免疫学的に有効な量は、本明細書の教示を考慮して当業界に公知の手段によって決定される。正確な濃度は、投与されるべき特定の免疫原によって決まるが、免疫応答の発生をアッセイするための、当業者に周知の標準的技法を用いることによって決定することができる。
【０１６４】
組成物は、被験者において免疫応答を引き出す。抗HP56もしくは抗HP30タンパク質抗体、および中和、オプソニン化、もしくは殺菌性抗体を含めた抗体を誘導する組成物は、本発明の一態様である。好ましいが限定的ではない本発明の実施形態によれば、有効量の本発明の組成物は、投与前の抗体価の少なくとも3倍までの抗体価の上昇をもたらす。好ましく、特定の、限定されない本発明の実施形態において、約0.01〜2000μg、好ましくは0.1〜500μgが、宿主に投与される。殺菌性である、もしくはヘリコバクター抗原を表示する細胞（例えば、限定されないが樹状細胞およびマクロファージを含めた抗原提示細胞）と反応性である、T細胞応答を誘導する組成物もまた、本発明の一態様である。アジュバントを追加として含んでなる組成物が好ましい。メプラゾール、クラリスロマイシン、オメプラゾール、メトロニダゾール、テトラサイクリン、ランソプラゾール、またはアモキシシリンを包含するが、これらに限定されない、H.ピロリに対して殺菌活性を有する抗生物質を、追加として含んでなる組成物が好ましい。
【０１６５】
組合せた免疫原、および担体もしくは希釈剤は、水溶液、乳濁液もしくは懸濁液とすることができるが、乾燥調製物であってもよい。一般に、ポリペプチド免疫原の量は、1用量当たり0.1〜500μgの間であろう。担体は当業者に公知であり、安定化剤、希釈剤および緩衝剤を包含する。好適な安定化剤は、炭水化物、例えば、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、澱粉、ショ糖、デキストランおよびグルコース、ならびにタンパク質、例えばアルブミンもしくはカゼインを包含する。好適な希釈剤としては、生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液、およびリンゲル液が挙げられる。好適な緩衝剤としては、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、もしくはアルカリ土類金属炭酸塩が挙げられる。
【０１６６】
本発明の免疫原性組成物(ワクチンを含む)は、本明細書に含まれる教示を考慮の上、当業者に公知の技法によって調製される。一般に、免疫原は担体と混合されて、溶液、懸濁液、もしくは乳濁液を形成する。上記の1以上の添加物が担体中に存在していてもよく、または後から添加することもできる。保存または製剤を目的として、ワクチン調製物を、例えば、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥によって乾燥させることができる。これらの調製物を、後に、適当な液体担体を添加することによって再構成して液体ワクチンとするか、または当業者に公知の乾燥製剤で、特にカプセルもしくは錠剤型で投与することができる。
【０１６７】
有効量の、本発明の抗原性、免疫原性、医薬組成物（ワクチンを包含するがこれに限定されない）が投与されるべきであるが、ここで、「有効量」は、被験者において、望ましい予防、治療もしくは改善的な応答（免疫応答を包含するがこれに限らない）を生じるのに十分な量として定義される。必要とされる量は、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドの免疫原性、使用される核酸、ならびに投与される被験者の種および体重に応じて変わるだろうが、標準的な技法を用いることによってこれを確認することができる。
【０１６８】
免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物は、さらに1以上の補助的物質、例えば、湿潤剤、もしくは乳化剤、pH緩衝剤、またはアジュバントを、その有効性を高めるために含有することができる。免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物を、ヒト、または反芻動物、齧歯類もしくは霊長類を含めた他の哺乳動物に、非経口、皮内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内投与することができる。
【０１６９】
あるいはまた、本発明にしたがって形成した免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物は、粘膜表面で免疫応答を引き起こすように製剤化され、送達されてもよい。したがって、免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物を、例えば、経鼻、経口、眼球、細気管支、膣内、もしくは直腸内経路によって粘膜表面に投与することができる。あるいは、座剤および経口製剤を含めた他の投与様式が望ましい場合がある。座剤のための結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドを包含することができる。経口製剤は、通常使用される賦形剤、例えば、医薬品グレードのサッカリン、セルロース、および炭酸マグネシウムを包含することができる。これらの組成物は、ミクロスフェア、ナノスフェア、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、もしくは粉末の形態をとり、約0.001〜95%のHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導タンパク質を含有することができる。特定の実施形態において、経口製剤は、腸保護性、例えば腸溶コーティングされている製剤の形態である。免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物は、投薬処方に適合するように、さらに治療上もしくは予防上有効である、保護的である、または免疫原性であるような量で投与される。アジュバントを追加して含んでなる組成物が好ましい。
【０１７０】
さらに、免疫原性組成物、抗原性組成物、医薬組成物およびワクチン組成物を、粘膜表面のような免疫系の特定の細胞に送達するための、1以上のターゲッティング分子と組み合わせて、または結合して、使用することができる。幾つかの例としては、ビタミンB12，細菌毒素もしくはその断片、モノクローナル抗体、および他の特異的ターゲッティング脂質、タンパク質、核酸もしくは炭水化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
投与される量は、治療される被験者に依存するが、これは例えば、抗体を合成し、必要ならば細胞媒介性免疫応答を生じる個体の免疫系の能力を包含する。投与に必要な活性成分の正確な量は、実行者の判断に依存する。しかしながら、好適な投与量の範囲は、当業者によって容易に決定可能であり、0.1〜1000μgオーダーのHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドであると考えられる。初回投与および追加免疫用量に関する好適な処方計画は、変更可能であるが、初回投与と、それに続くその後の投与を包含しうる。また用量は、投与経路に依存し、受容者の大きさによって変動するだろう。本発明の抗原性組成物、免疫原性組成物もしくは医薬組成物におけるHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドの濃度は、概して、約0.001〜95%である。
【０１７２】
ワクチンを含めた抗原性調製物、免疫原性調製物、もしくは医薬調製物は、免疫刺激物質として、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部分を包含するヌクレオチドベクターを含んでなることができる。
【０１７３】
ワクチンは、1以上のHP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド、または本明細書に記載の融合タンパク質をコードし、当該ポリペプチドがin situで生成されるような核酸分子を含んでなることができる。このようなワクチンにおいて、上記核酸分子は、核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含めた、当業者に公知の任意の様々な送達系内に存在させることができる。適当な核酸発現系は、患者における発現に必要な核酸分子配列、例えば好適なプロモーターおよび終結シグナルを含有する。好ましい実施形態において、非病原性（欠陥）ウイルスの使用を包含しうるウイルス発現系（例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて、核酸分子を導入することができる。こうした発現系に核酸分子を組み込む技法は、当業者に周知である。例えば、Ulmerら、1992, Science 259:1745-1749に記載され、Cohen, 1993, Science 259:1691-1692で概説されるように、核酸分子を「裸の」プラスミドベクターとして投与することもできる。こうしたベクターにDNAを組み込むための技法は当業者に周知である。レトロウイルスベクターは、追加として、選択マーカーの遺伝子（形質導入された細胞の同定もしくは選択に役立つ）、および／またはターゲティング部分の遺伝子（ベクターを標的特異的にするための、例えば、特異的な標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする遺伝子)を導入もしくは組み込むことができる。当業者に公知の方法によって、抗体を用いてターゲティングを達成することもできる。
【０１７４】
本発明の核酸分子（DNAもしくはRNA）を治療もしくは予防目的のワクチンとして投与することができる。典型的には、DNA分子は哺乳動物細胞における発現に適したプロモーターの制御下におかれる。プロモーターは、遍在に、もしくは組織特異的に機能することができる。非組織特異的プロモーターの例としては、初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（米国特許第4,168,062号に記載）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（NortonおよびCoffin, 1985, Molec. Cell Biol. 5:281）が挙げられる。デスミンプロモーター（Liら、1989, Gene 78:243, Li Paulin, 1991, J. Biol Chem 266:6562、ならびにLiおよびPaulin, 1993, J. Biol Chem 268:10401）は組織特異的であって、筋肉細胞において発現を駆動する。さらに一般的には、有用なベクターは、とりわけ、国際公開第94/21797号およびHartikkaら、1996, Human Gene Therapy 7:1205に記載されている。
【０１７５】
本発明の組成物は、本発明の1または数個の核酸分子を含有することができる。H.ピロリ（H, pylori）細胞毒素（Covacciら、2000 米国特許第6,130,059号）、H.ピロリ熱ショックタンパク質（hsp60）（Covacciら、2000米国特許第6,077,706号）、H.ピロリCagA（Covacciら、2000 米国特許第5,928,865号）、H.ピロリウレアーゼ（Michettiら、1999米国特許第5,972,236号）、H.ピロリカタラーゼ（Doidgeら、1999米国特許第6,005,000号）、H.ピロリニッケル結合タンパク質（Plautら、1999米国特許第5,972,348号）、H.ピロリtagA（Coverら、1999米国特許第5,876,943号）、およびH.ピロリエノラーゼ（Thompsonら、1997米国特許第5,703,219号）、または腸病原性大腸菌HtrAを包含するが、これらに限定されない、別のヘリコバクター抗原もしくは断片誘導体をコードする、少なくとも1つの核酸分子を追加して含有することもできる。インターロイキン-1、インターロイキン-4、インターロイキン-12もしくはインターフェロンなどのサイトカインをコードする核酸分子を組成物に添加して、免疫応答を高めることもできる。本発明のDNA分子および／または追加のDNA分子は、同一組成物において異なるプラスミドもしくはベクター上に存在してもよく、または同じプラスミドもしくはベクターに担持されていてもよい。
【０１７６】
治療を目的とする核酸分子の他の製剤は、滅菌生理食塩水もしくは滅菌緩衝生理食塩水、コロイド分散系、たとえば高分子複合体、ナノカプセル、シリカ微粒子、タングステン微粒子、金微粒子、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを包含する）を包含した。in vitroおよびin vivoの送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工小胞）である。細胞に効率的に輸送する生分解性ビーズの内部への、および／または表面上への核酸分子の組み込みによって、裸の核酸分子の取り込みを増加させることができる。このような系の調製および使用は、当業界で周知である。
【０１７７】
細胞取り込みを助ける薬剤に核酸分子を結合させることができる。ブピバカイン（例えば、国際公開第94/16737号を参照されたい）のような、細胞透過性を改変させる化学薬剤とともに製剤化することができる。
【０１７８】
カチオン性脂質も当業界で知られており、DNA送達に広く用いられる。こうした脂質には、DOTMAとしても知られるリポフェクチン（商標名）(N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド）、DOTAP(1,2-ビス(オレイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)、DDAB（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、DOGS（ジオクタデシルアミドログリシスペルミン）、およびコレステロール誘導体、例えばDC-Chol（3β-(N-(N',N'-ジメチルアミノメタン)-カルバモイル)コレステロールが含まれる。これらのカチオン性脂質に関する記述は、欧州特許第187,702号、国際公開第90/11092号、米国特許第5,283,185号、国際公開第91/15501号、国際公開第95/26356号、および米国特許第5,527,928号に見いだすことができる。DNA送達を目的とするカチオン性脂質は、例えば国際公開第90/11092号に記載のように、DOPE(ジオレイルホスファチジルエタノールアミン)のような中性脂質と共に使用されることが好ましい。
【０１７９】
カチオン性リポソームを含有する製剤に、他のトランスフェクション促進化合物を添加することができる。こうした化合物は、とりわけ、核膜を通り抜けるDNA輸送を促進するために有用なスペルミン誘導体（例えば、国際公開第93/18759号を参照されたい）、ならびに、GALA、グラミシジンSおよびカチオン性胆汁酸塩のような、膜透過性化合物（例えば、国際公開93/19768号を参照されたい）を包含する。
【０１８０】
ワクチン受容者において使用されるべき核酸分子の量は、例えば、DNA構築物に用いられたプロモーターの強さ、発現される遺伝子産物の免疫原性、投与様式、および製剤の種類に依存する。一般に、治療もしくは予防上有効な用量である約0.1mg〜約100mg、好ましくは、約10mg〜約80mg、さらに好ましくは、約0.5mg〜約25mgをヒト成人に投与することができる。単一用量で、もしくは間隔をおいて繰り返し、投与を行うことができる。
【０１８１】
投与経路は、ワクチン分野で使用されるあらゆる従来の経路とすることができる。一般的指針として、本発明の核酸分子を、粘膜表面、例えば、眼球、鼻腔内、肺、口、腸、直腸、膣および尿路表面を経て；または非経口的経路を経て、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、表皮内、もしくは筋肉内の経路によって、投与することができる。投与の選択は、選ばれた製剤に依存するだろう。例えば、ブピバカインとともに製剤化された核酸分子は、筋肉内投与が好都合である。
【０１８２】
赤痢菌属細菌、サルモネラ属細菌、コレラ菌、乳酸桿菌、BCGおよび連鎖球菌を包含する、HP56、HP30タンパク質、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチドをコードする核酸分子を組換え発現するために遺伝子工学によって作製された組換え細菌ワクチンを、ヘリコバクター感染症の予防もしくは治療に使用することもできる。経口生ワクチンとして有効な、非毒素産生コレラ菌変異株が、Mekalanosら、Nature 306:551, 1983および米国特許第4,882,278号に記載されている。本発明のDNA分子によってコードされるポリペプチドもしくはポリペプチド誘導体を発現することができるコレラ菌株の有効なワクチン用量を投与することができる。好ましい投与経路は、すべての粘膜経路を含むが、鼻腔内もしくは経口がもっとも好ましい。
【０１８３】
異種抗原の組換え発現のために遺伝子工学的に作製された、もしくはそうではない、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の弱毒化菌株、および経口ワクチンとしてのその利用が、Nakayamaら、1988, Bio/Technology 6:693および国際公開第92/11361号に記載されている。好ましい投与経路は、すべての粘膜経路を含むが、鼻腔内もしくは経口がもっとも好ましい。
【０１８４】
ワクチンベクターとして有用な他の細菌菌株は、Highら、1992, EMBO 11:1991; Sizemoreら、1995, Science 270:299(フレキシナ赤痢菌（Shigella flexneri）); Medagliniら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6868(ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)); およびFlynn, 1994, Cell Mol.Biol. 40:31、国際公開第88/6626号、国際公開第90/0594号、国際公開第91/13157号、国際公開第92/1796号および国際公開第02/21376号（カルメット・ゲラン桿菌）に記載される。
【０１８５】
遺伝子工学的に作製された組換え細菌ベクターにおいて、本発明の核酸分子を細菌ゲノムに挿入し、プラスミドに担持させ、もしくは自由な状態におくことができる。
【０１８６】
ワクチン剤として使用される場合には、本発明の組換え細菌ワクチン、核酸分子およびポリペプチドを、多段階の免疫化プロセスの一部として、順次、もしくは同時に使用することができる。例えば、ポックスウイルスのような本発明のワクチンベクターを用いて、例えば、非経口経路で、哺乳動物を初回抗原刺激し、次にポリペプチドを用いて、例えば粘膜経路を経て、数回追加免疫することができる。別の例において、ポリペプチドを用いて哺乳動物に、粘膜経路を経てワクチン接種し、同時に、もしくはその後すぐに、筋肉内経路を介して核酸分子をワクチン接種することができる。
【０１８７】
組換え細菌を含有するワクチン組成物にアジュバントを添加することもできる。体液性免疫応答（HIR）および細胞性免疫（CMI）を効率的に誘導するために、免疫原は典型的にアジュバント中で乳化している。免疫原がアジュバントと同時に投与されるならば、免疫原性は著しく向上することができる。アジュバントは、投与部位に近い局所に免疫原を保持することによって作用し、免疫系細胞への、緩やかに持続する抗原の放出を促進する、貯留効果を生じることができる。またアジュバントは免疫系細胞を免疫原の貯留箇所に引きつけ、そうした細胞を刺激して免疫応答を引き出すこともできる。
【０１８８】
多くのアジュバントは毒性があり、肉芽腫、急性および慢性炎症（フロイント完全アジュバント、FCA）、細胞溶解（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱作用、関節炎および前部ブドウ膜炎（LPSおよびMDP）を誘導する。FCAは優れたアジュバントであり、研究では広く用いられるが、その毒性のために、ヒトもしくは獣医学的なワクチンにおける使用には認可されていない。
【０１８９】
免疫刺激剤もしくはアジュバントは、例えばワクチンに対する、宿主の免疫応答を改善するために長年使用されてきた。リポ多糖のような内因性アジュバントは、通常、ワクチンとして使用される死滅した、もしくは弱毒化された細菌の成分である。外因性アジュバントは、免疫調節剤であるが、これは典型的には、抗原に非共有結合し、宿主の免疫応答を増強するように製剤化される。よって、非経口的に送達される抗原に対する免疫応答を増強するアジュバントが同定された。ヒトおよび獣医学的なワクチンにおいて、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（集合的、一般的にミョウバンと呼ばれる）が常套的にアジュバントとして使用される。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増加させることに関してミョウバンの有効性は十分確立されており、HBsAgワクチンは、ミョウバンによって抗原性が強められた(adjuvanted)。
【０１９０】
他の外因性アジュバントは、ケモカイン、サイトカイン（例、IL-2）、膜タンパク質抗原に複合体化したサポニン（免疫刺激性複合体）、鉱油とのプルロニックポリマー、鉱油中の死滅したマイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、細菌産物（例えば、ムラミルジペプチド（MDP）およびリポ多糖（LPS）、ならびにリピドA）およびリポソームを包含することができる。
【０１９１】
国際特許出願第PCT/US95/09005号および米国特許第6,019,982号（参照によって本明細書に組みこまれる)は、腸毒素原性(enterotoxigenic)大腸菌（「mLT」）の易熱性毒素の変異型を記載する。米国特許第5,057,540号(参照により本明細書に組みこまれる)は、アジュバントであるQS21、南米の樹木Quiliaja saponaria molinaの樹皮からHPLC精製されたサポニンの無毒性画分を記載する。3D-MPLは、英国特許第2,220,211号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
Lockhoffらに1989年8月8日に付与された米国特許第4,855,283号(参照により本明細書に組み込まれる)は、N-グリコシルアミド、N-グリコシル尿素及びN-グリコシルカーバメートを含めた糖脂質類似体を教示する。これらはそれぞれ、免疫調節剤もしくはアジュバントとして、糖残基においてアミノ酸に置換されている。Lockhoffは、N-糖リン脂質およびグリセロ糖脂質が、単純ヘルペスウイルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスワクチンの双方において、強力な免疫応答を引き出すことができることを報告した。アノマー炭素原子を介して直接に糖に連結された長鎖アルキルアミンおよび脂肪酸から、いくつかの糖脂質が合成され、天然に存在する脂質残基の機能を模倣する。
【０１９３】
Moloneyに付与された米国特許第4,258,029号(参照により本明細書に組み込まれる)は、破傷風トキソイドならびにホルマリン不活化I, II, およびIII型ポリオウイルスワクチンとともに複合体化としたとき、オクタデシルチロシン塩酸塩（OTH）がアジュバントとして機能したことを教示する。合成ペプチドの脂質化も、それらの免疫原性を増加するために利用された。
【０１９４】
したがって、本発明に従えば、HP56、HP30、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド、または本発明のポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸、ベクターもしくは同一物を発現する細胞、を含んでなる免疫原性、抗原性、医薬組成物（ワクチンを包含する）は、さらにアジュバントを含んでなることができる。アジュバンドとしては、例えばミョウバン、mLT、（腸病原性大腸菌の修飾された易熱性毒素）QS21、MMPL、CpG DNA、MF59、リン酸カルシウム、PLGおよび上記で列挙したすべてのものが挙げられるが、それらに限定されない。アジュバントは、以下のうち1以上から選択されることが好ましい：ミョウバン、QS21、CpG DNA、PLG、LT、3D-mPLもしくはカルメットゲラン桿菌（BCG）および上記の変異型もしくは修飾型、特にmLT、例えばLTR192GもしくはAB5。また本発明の組成物は、さらに、好適な製薬担体を含んでなることができる。製薬担体は、生理食塩水、炭酸水素塩、デキストロースもしくは他の水溶液を包含するがこれらに限定されない。他の好適な製薬担体は、この分野で標準的な参考書であるRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０１９５】
免疫原性、抗原性、及び医薬組成物（ワクチンを包含する）は、好適な非毒性製薬担体中で投与され、マイクロカプセルに包含され、および／または徐放性インプラントに含まれることができる。
【０１９６】
免疫原性、抗原性、および医薬組成物（ワクチンを包含する）は、抗体レベルおよび／またはT細胞レベルを維持するために、間隔をおいて数回投与されることが望ましい。免疫原性、抗原性、および医薬組成物（ワクチンを包含する）は、他の殺菌もしくは静菌法と併せて用いられてもよい。
【０１９７】
本発明のワクチンの別の実施形態は、1以上の：
a)  SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、56kDaの分子量を有する、ヘリコバクター属細菌の単離されたHP56；
b)  SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、30kDaの分子量を有する、ヘリコバクター属細菌の単離されたHP30；
c)  SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、56kDaの分子量を有する、ヘリコバクター属細菌の単離されたHP56ポリペプチドをコードする、単離された核酸；または
d)  SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、30kDaの分子量を有する、ヘリコバクター属細菌の単離されたHP30ポリペプチドをコードする、単離された核酸、
を含んでなり、さらに、ミョウバン、CT、LTB、CT/LT、mLT、QS21、MF59、CpG DNA、MPL、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム二水和物およびPLGからなる群から選択される1以上の成分を含んでなるワクチンである。
【０１９８】
本発明には、また、有効量の、本発明の1以上のポリペプチド、もしくは本発明のポリペプチドの1つをコードする核酸、同上を含んでなる組成物および同上を含んでなるワクチンを用いて、動物を免疫することを含んでなる、動物において免疫応答を生じさせる方法も含まれる。本発明のポリペプチド、核酸、組成物、および本発明の同上を含んでなるワクチンを、同時に、もしくは連続して投与することができる。同時投与の例は、同一もしくは異なってもよい2以上のポリペプチド、核酸、組成物、もしくはワクチンが、同一もしくは異なる製剤で投与される、または、例えば、異なる、もしくは同一の製剤ではあるが、互いに短時間（例えば、数分もしくは数時間）のうちに、別々に投与される場合を包含する。連続投与の例には、同一もしくは異なってもよい2以上のポリペプチド、核酸、組成物、もしくはワクチンが互いに短時間のうちに一緒に投与されないが、例えば数日、数週間、数ヶ月、もしくは数年の間隔をおいて別々に投与されうる場合が含まれる。
【０１９９】
ヘリコバクター殺菌活性を有する抗生物質を、本発明のいずれかのワクチン組成物の前に、それと同時に、もしくは、それに続いて、投与することによって、ヘリコバクター感染に関連した疾患を治療もしくは改善することも本発明に包含される。
【０２００】
本発明のポリペプチド、核酸分子、もしくは組換え細菌ワクチンは、上記のような抗体生成、もしくはT細胞の生成にも有用である。T細胞については、ヒトも含めた動物を上記のように免疫する。免疫化に続いて、末梢血細胞（PBL）、脾細胞もしくはリンパ節細胞を採取し、多数のリンパ球を、血清含有培地とともにフラスコ中に置くことによってin vitroで刺激する。本発明のポリペプチドを添加する。T細胞を採取し、X線照射された末梢血単核細胞とともに新たなフラスコに置く。ポリペプチドを、直接加える。IL-2の存在下で細胞を増殖させる。細胞がヘリコバクター特異的T細胞であると判明したら直ちに、それらをより高いIL-2(20ユニット)による刺激サイクルに移行して、それらを拡大させる。
【０２０１】
あるいは、本発明のポリペプチドの存在下で増殖した1以上のT細胞の数を、クローニングによって、拡大することができる。
【０２０２】
細胞をクローニングする方法は当業界で周知である。例えば、T細胞系は、in vitroで樹立され、限界希釈によってクローニングすることができる。レスポンダーT細胞は、照射された自己のフィラー(filler)細胞の存在下でわずかな抗原で刺激することによって、培養において確立された末梢血から精製される。CD4+ T細胞系を生成させるために、ヘリコバクターポリペプチドが抗原刺激として用いられ、自己PBL、もしくはエプスタインバールウイルスの感染によって不死化されたリンパ芽球様(lymphoblastoid)細胞系（LCL）が、抗原提示細胞として使用される。CD8+ T細胞系を生成させるために、関連するヘリコバクターポリペプチドを産生する発現ベクターをトランスフェクトした自己抗原提示細胞が、刺激細胞として使用されうる。抗原刺激後に、刺激されたT細胞をPBLもしくはLCL細胞および組換えインターロイキン-2（rIL-2）（50 U/ml）と共に96ウェル平底プレートにプレーティングすることによって、T細胞系が樹立される。樹立されたクローンの増殖したウェルを、最初のプレーティングからおよそ2〜3週間後に同定して、自己抗原提示細胞の存在下で適当な抗原によって再刺激した後、続いて低い量のrIL-2の添加によって拡大させる。T細胞クローンは、24ウェルプレートで、約2週間ごとの抗原およびrIL-2による定期的な再刺激によって維持される。
【０２０３】
Kendricksらの米国特許第5,595,881号に開示の方法を用いて抗原反応性に特異的なT細胞を単離することによって、T細胞調製物をさらに富化することができる。
【０２０４】
本発明のワクチン組成物は、ヘリコバクター感染に関連した疾患もしくは障害を有する動物の病状の予防、治療、または改善に有用である。こうした疾患もしくは障害は、ヘリコバクター細菌感染、B型胃炎、消化性潰瘍(peptide ulcers)、胃癌（例えば、腺癌）、および低悪性度B細胞リンパ腫を包含するが、それらに限定されない。
【０２０５】
5.8.  イムノアッセイおよび診断試薬
HP56もしくはHP30ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸、およびその断片は、診断試薬として有用である。抗HP56もしくは抗HP30抗体を生成するための、または酵素結合免疫吸着法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ（RIA）および他の非酵素結合抗体結合アッセイを含めたイムノアッセイにおける抗原としての、抗原もしくは免疫原、あるいは抗細菌、抗ヘリコバクター、および抗HP56もしくは抗HP30タンパク質抗体を検出するための当業界で公知の方法は、本発明に包含される。
【０２０６】
ELISAアッセイにおいて、タンパク質は、選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのような、タンパク質を結合できる表面に固定化される。洗浄して、不完全に吸着されたタンパク質を除去した後、検査試料に関して、抗原性として中立的であることが分かっている非特異的タンパク質溶液を、上記の選択された表面に結合させることができる。これによって、固定化表面上の非特異的吸着部位をブロッキングすることが可能となり、それによって表面上への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドが低下する。
【０２０７】
次に、免疫複合体（抗原／抗体）形成に資するように、検査されるべき試料、例えば臨床的もしくは生物学的材料に固定化表面を接触させる。これは、希釈剤、例えばウシγグロブリン（BGG）および／またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）／Tweenの溶液、による試料の希釈を包含してもよい。次いで、試料を、2時間〜4時間、例えば約20℃〜37℃のオーダーの温度でインキュベートさせる。インキュベーションの後、試料接触表面を洗浄して、免疫複合体を形成しない物質を除去する。洗浄手順は、PBS/Tweenもしくはホウ酸バッファーのような溶液による洗浄を包含しうる。検査試料と結合されたタンパク質との間の特異的免疫複合体の形成、およびそれに続く洗浄の後、免疫複合体形成の発生およびその量までも、第1抗体に対する特異性を有する第2抗体に、その免疫複合体を供することによって決定することができる。検査試料がヒト起源のものであるならば、第2抗体は、ヒト免疫グロブリン、しかも一般的にはIgGに特異性を有する抗体である。
【０２０８】
検出手段を提供するために、第2抗体は、適当な色素産生基質と共にインキュベートすると例えば発色を生じるであろう酵素活性のような、付随する活性を有することができる。その場合、検出は、発色を検出することによって達成できる。そこで、定量は、例えば可視分光光度計を用いて、発色の度合いを測定し、適当な標準と比較することによって達成できる。当業者に公知のあらゆる他の検出手段が含まれる。
【０２０９】
ウェスタンブロットアッセイにおいて、ポリペプチドは、精製調製物としても、または細胞抽出物としても、Laemmli, 1970, Nature 227: 690に記載のSDS-PAGE電気泳動にかけられる。ニトロセルロース膜に転写した後、その膜をさらに、約1:5〜1:5000、好ましくは約1:100〜約1:500の希釈範囲で希釈された血清試料、ポリクローナル抗体調製物、もしくはモノクローナル抗体と共にインキュベートする。反応は標準的な方法によって明らかにされる。例えば、ヒト抗体を使用する場合、膜を、適当な時間、ヤギ抗ヒトペルオキシダーゼコンジュゲートにおいてインキュベートする。膜を洗浄する。適当な基質との反応が生じ、終了する。反応は着色したバンドの出現によって可視的に、たとえば比色分析によって測定される。
【０２１０】
ドットブロットアッセイにおいて、精製された、もしくは部分精製されたポリペプチド、または細胞抽出物を使用することができる。簡単に述べると、約100μg/mlの抗原溶液を、50mM Tris-HCL(pH7.5)で連続して2倍希釈する。100mlの各希釈物を96ウェルドットブロット装置にセットされたニトロセルロース膜0.45umに適用する。系に吸引をかけることによってバッファーを除去する。50μM Tris-HCl（pH7.5）の添加によってウェルを洗浄し、膜を風乾する。膜をブロックバッファー（50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.15M NaClおよび10g/l 脱脂粉乳）で飽和させ、約1:50〜約1:500の抗血清希釈物と共にインキュベートする。反応は標準的な方法によって明らかにされる。例えば、ウサギ抗体を使用するときはヤギ抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲートをウェルに添加する。インキュベーションを37℃で90分間実施してから、ブロットを洗浄する。適当な基質との反応が生じ、終了する。反応は着色したスポットの出現によって可視的に、たとえば比色分析によって測定される。
【０２１１】
HP56、HP30、HP56誘導もしくはHP30誘導ポリペプチド、またはこれらをコードする核酸、およびその断片も、抗HP56もしくはHP30タンパク質T細胞応答を生じるための抗原もしくは免疫原として、またはT細胞増殖アッセイ、サイトカイン産生、遅延型過敏反応もしくは細胞傷害性T細胞（CTL）反応を含めたイムノアッセイにおける抗原として有用である。
【０２１２】
ヘリコバクターペプチドに特異的なT細胞増殖性応答を分析するために、新鮮末梢血、脾臓もしくはリンパ節細胞を採取する。細胞を96ウェル丸底マイクロタイタープレートにプレーティングし、ペプチドと共にインキュベートする。データは刺激指数（SI）として表され、これは対照ウェル（抗原なし）の平均値で割った実験ウェルの平均値として定義される。ヘリコバクター特異的T細胞の表現型（例えば、CD4+もしくはCD8+）の分析は、免疫蛍光染色法、FACS分析によって、または適当な抗血清による枯渇によって、判定することができる。
【０２１３】
ヘリコバクターポリペプチドに応答したT細胞のサイトカイン放出を分析するために、レスポンダー細胞をポリペプチドと混合する。上清を集め、サイトカインに対する抗体（例えば、抗IFN-γもしくは抗IL-2抗体）でコーティングした酵素結合免疫吸着法（ELISA）に加える。洗浄後、ウサギ抗サイトカインポリクローナル抗体（例えば、抗IFN-γもしくは抗IL-2）を添加する。標識されたヤギ抗ウサギIgGポリクローナルを添加する。基質を添加して、上清中に放出されたサイトカインの量を、ELISAテストにおける発色量に基づいて測定する。
【０２１４】
別の実施形態は、本発明の望ましいイムノアッセイを実施するために必要とされる不可欠な試薬のすべてを含んでなる診断キットを包含する。この診断キットは、必要な試薬を入れた1以上の容器の組み合わせとして、商業的に包装された形態で与えられうる。こうしたキットは、本発明のHP56、HP30、HP56誘導もしくはHP30ポリペプチド、もしくはこれらをコードする核酸、またはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を、いくつかの従来のキット成分と組み合わせて、含んでなる。従来のキット成分は、当業者には、容易に明白であろうし、Antibodies A Laboratory Manual(E. Harlow, D. Lane, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を含めて、多数の刊行物で開示されている。従来のキット成分は、例えば、マイクロタイタープレート、アッセイ混合物のpHを維持するためのバッファー（例えば、Tris、HEPESなどを含むが、これらに限らない）、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスIgGのようなコンジュゲート第2抗体（もしくは、第1抗体が由来した動物に対するあらゆる抗IgG）など、および他の標準試薬、ならびに望ましいアッセイもしくはテストを実施するための使用説明書、といった品目を包含しうる。
【０２１５】
本発明の核酸配列を、ハイブリダイゼーションを測定するための標識のような、適当な指標手段と組み合わせて使用することができる。非常に多様な、適当な指標手段が当業界において知られており、放射性、酵素的もしくは他のリガンド、例えばアビジン／ビオチン、およびジゴキシゲニン-標識を包含するが、これらは検出可能なシグナルを与えることができる。ある診断の実施形態において、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを、放射性タグの代わりに使用することができる。酵素タグの場合には、比色分析で指標基質が知られており、これを用いて、人の眼に見える、もしくは分光光度計的な手段を提供でき、HP56もしくはHP30タンパク質遺伝子配列を含有する試料との特異的なハイブリダイゼーションを同定することができる。
【０２１６】
本発明のプローブを捕捉プローブもしくは検出プローブとして診断テストに使用することができる。従来的に、このような捕捉プローブを固相支持体に、直接もしくは間接的に、共有結合手段によって、または受動的な吸着によって固定化することができる。検出プローブは、放射性同位元素；酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および色素産生、蛍光発生、または発光性の基質を加水分解することができる酵素；色素産生、蛍光発生、もしくは発光性である化合物；ヌクレオチド塩基類似体；およびビオチンから選択される検出マーカーによって標識できる。
【０２１７】
ドットブロット（Maniatisら、1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）、サザンブロット（Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503）、ノーザンブロット（標的としてRNAを用いる以外、サザンブロットと同じ）、またはサンドイッチ技法（Dunnら、1977, Cell, 12:23）といったあらゆる従来のハイブリダイゼーション技法に、本発明のプローブを使用することができる。
【０２１８】
固相法に関する実施形態において、浸出液、体液（例えば、血清、羊水、中耳浸出液、痰、精液、尿、涙液、粘液、気管支肺胞洗浄液）、もしくは組織さえを含めた、臨床試料のような、試料由来のテストDNA（もしくはRNA）を選択されたマトリックスもしくは表面に吸収させるか、そうでないならば添付させる。固定された1本鎖核酸を、次に、望ましい条件下で、本発明のタンパク質をコードする遺伝子、またはその断片もしくは類似体の核酸配列を含んでなる、選択されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに供する。選択される条件は、例えば、G+C含量、標的核酸のタイプ、核酸の起源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ、などに応じて必要とされる特定の基準に基づいて、特定の状況に依存するだろう。非特異的に結合したプローブ分子を除去するために、ハイブリダイゼーション表面を洗浄した後、特異的ハイブリダイゼーションを検出し、もしくは標識手段によって定量さえする。ヘリコバクター属細菌の間で保存されている核酸配列部分を選択することが好ましい。選択されたプローブは、少なくとも15bpであって、約30〜90bpの範囲内とすることができる。
【０２１９】
5.9.  適用
本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、T細胞および核酸は、ヘリコバクター感染症の臨床的もしくは医学的診断のための試薬として、さらにヘリコバクターの病原性、毒性および感染性の特性、ならびに宿主防御機構に関する科学的研究のための試薬として有用である。例えば、本発明のDNAおよびRNAをプローブとして使用して、ハイブリダイゼーションもしくはPCR増幅によって生物学的試料におけるヘリコバクターの存在を同定することができる。またこのDNAおよびRNAを用いて、ヘリコバクターHP56もしくはHP30タンパク質に関連するポリペプチドをコードしうる他の細菌を同定することもできる。本発明のタンパク質を用いて、本発明のタンパク質を含有する組成物をアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製するために使用することができる、または診断薬として使用するための、または予防もしくは治療薬として使用するための、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製することができる。また生物学的試料においてヘリコバクターに対する抗体もしくはT細胞の存在をスクリーニングするための標準イムノアッセイに、このタンパク質を使用することもできる。
【０２２０】
5.10.  生物寄託
本発明のヘリコバクタータンパク質をコードするHP30およびHP56遺伝子のオープンリーディングフレームを有する遺伝子の一部を含有する特定のプラスミドを、大腸菌に挿入し、ブダペスト条約に従って、および37 CFR 1.808に従って、さらに本出願の出願前に、American Type Culture Collection (ATCC)（所在地：10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209,U.S.A.）に寄託した。これらのプラスミドに存在する遺伝子の各部分の識別を下記に示す。
【０２２１】
寄託された材料のサンプルは、本米国特許出願に基づく特許付与の際に、一般に利用可能となるだろう。本明細書に記載され、請求される発明は、寄託されたプラスミドの範囲によって限定されるべきではない。なぜならば、寄託の実施形態は、発明の単なる例証にすぎないためである。本出願に記載の、類似の、もしくは同等のタンパク質、またはその断片もしくは類似体をコードする、あらゆる同等の、もしくは類似のプラスミドが、本発明の範囲内に包含される。
【０２２２】
生物寄託                          ATCC受託番号             寄託日     
大腸菌(E.coli)M15(PRE4)PQE/HP30   ATCC PTA-2670       2000年11月15日
大腸菌(E.coli)M15(PRE4)PQE/HP56   ATCC PTA-2669       2000年11月15日
【実施例】
【０２２３】
6.  実施例
上記開示内容は本発明を全般的に説明する。下記の実施例を参照することによって、本発明をより完全に理解することができる。実施例は例証の目的でのみ記載され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって便法が示唆もしくは与えられる場合、形式上の変更および均等物への置換が予想される。本明細書において特有の用語が使われるが、そうした用語は説明的な意味であって、限定する目的を意図するものではない。
【０２２４】
本明細書および実施例に使用されるが明確には記載されていない、分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告されており、当業者の能力で十分に行うことができる。
【０２２５】
6.1. H.ピロリの増殖
H.ピロリG1-4(以後G1-4と称する)を十二指腸潰瘍の患者から分離した。G1-4の保存培養は、15%グリセロールおよび4%熱失活子ウシ血清を添加したブレインハートインフュージョンブロス（Difco Laboratories, Sparks, MD）中、-70℃で保存した。H.ピロリは、4%熱失活ウシ胎児血清を加えたブレインハートインフュージョン（BHI）培地中で、24-48時間、微好気性の環境で培養した。解凍した保存培養2ミリリットルを、熱失活ウシ胎児血清もしくは子ウシ血清を添加した50ml BHIを含有する500ml振盪フラスコに植菌した。培養物を混合ガス（5% O2, 10% CO2および85% N2）で通気して、37℃、150rpm撹拌によってインキュベートした。
【０２２６】
6.2. HP30およびHP56ポリペプチドのアミノ末端配列決定
N-末端アミノ酸配列を得るために、十分量のHP30もしくはHP56タンパク質（＞5mg）をPVDF膜(Applied Biosystems)上にエレクトロブロットし、クーマシーブルーで染色する。固定化されたタンパク質を膜から遊離して、低レベルのエンドペプチダーゼLys-C、エンドペプチダーゼArg-Cおよび／またはエンドペプチダーゼGlu-Cでin situで処理して、天然のタンパク質を断片化する。その結果得られたペプチド断片をHPLCによって精製し、ABI 430 タンパク質配列決定装置および標準的なタンパク質配列決定法によって、そのN-末端アミノ酸配列を決定する。
【０２２７】
6.3. H.ピロリ染色体DNAの単離
H.ピロリ株G1-4を、単コロニーを目的として、TVAP(Remel)を含有するカンピロバクター用チョコレート寒天プレートに画線し、微好気性環境下、37℃で一晩生育させる。3もしくは4個の単コロニーを採取し、〜1.5mlブロス種培養（4%子ウシ血清を含有するBHIブロス）に接種するために使用し、このブロスを振盪培養器で、〜150rpm、37℃として一晩培養した。〜50mlのBHIブロスを入れた500ml三角フラスコに種培養を植菌し、〜24-48時間37℃、微好気性環境下で、振盪培養器において〜175 rpmで増殖させ、DNA単離のための細胞集団を生じさせる。室温で、〜2000×g、15分間、Sorvall GSAローターでの遠心分離によって細胞を集めた。上清を除き、細胞ペレットを〜5.0mlの滅菌水に懸濁した。同量の溶解バッファー（200mM NaCl, 20mM EDTA, 40mM Tris-HCl pH8.0, 0.5%(w/v)SDS, 0.5%(v/v)2-メルカプトエタノール、および250μg/mlプロテイナーゼK）を加え、緩やかな撹拌および摩砕によって細胞を懸濁した。次に、この細胞懸濁液を〜12時間、50℃で、インキュベートして、細菌を溶解し、染色体DNAを遊離した。タンパク質性の物質は、5.0mlの飽和NaCl（〜6.0M、滅菌水中）添加、および室温でSorvall SS34ローターにおいて〜5,500×gでの遠心分離によって沈澱した。染色体DNAは、透明化された上清から、2容の100%エタノールの添加によって沈澱した。凝集したDNAを集め、少量の70%エタノール溶液中で緩やかに撹拌することによって洗浄した。精製された染色体DNAを、滅菌水に懸濁し、穏やかに揺り動かすことによって4℃で一晩、溶解／分配した。溶解したDNAの濃度は、分光光度法によって260nmで、1.0 O.D.単位〜50mg/mlの吸光係数を用いて、測定した。
【０２２８】
6.4.  リーシュマニア属のLeIFに相同性を有するH.ピロリのオープンリーディングフレームの同定
リーシュマニア属のリーシュマニア主要開始因子4A（LeIF）が、T細胞免疫応答を増強するアジュバントであることが明らかになっている（国際公開第99/29341号を参照されたい）。相同タンパク質がH.ピロリで産生されるかどうかを判定するために、GeneBankから入手できるLeIFのアミノ酸配列を、ヘリコバクター・ピロリゲノム配列データベース（The Institute for Genomic Research, Rockville, MD）を検索するためのBLAST(TBLASTN)サブジェクトクエリとして用いて、LeIFタンパク質とある程度の類似性を共有する可能性のある直鎖状アミノ酸配列を同定することができる。このH.ピロリデータベースから得られた推定アミノ酸配列はいずれも、LeIFタンパク質配列に対して〜50-55%より高い類似性を示さなかった。H.ピロリデータベースからの候補アミノ酸配列は、コンピュータの使用によって、特定のゲノムDNA配列「コンティグ」、および短い関連配列をコードする推定オープンリーディングフレーム内に得られた。次に、リーシュマニア主要LeIFのサイズである〜50Kdalのタンパク質をコードすることができると考えられる推定ORFを選択した。こうした基準に合致する、いくつかの推定オープンリーディングフレームをH.ピロリゲノムから同定した。大半の検索基準を満たすタンパク質をコードする1つの推定H.ピロリORFが、HP56と称されて、アジュバントとして以後のクローニング、発現および分析のために選ばれた。
【０２２９】
6.5. HP56 ORF特異的DNA断片のPCR増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、発現クローニングおよび遺伝的変異性分析のためにHP56特異的DNA断片を作製した。このタンパク質の最初の〜7アミノ酸に対するDNA配列（すなわち、翻訳開始Metから始まる〜21ヌクレオチド配列）をコードするN末端PCRフォワードプライマーは、化学的に合成された。ORF特異的配列のほかに、フォワードPCRプライマーは、効果的なPCR増幅のために短い5’G/Cクランプ（〜6ヌクレオチド）も包含した。サブクローニングに使用するBamHI制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、このプライマーのG/CクランプとORF特異的配列の間に、適切に設計された。
【０２３０】
HP56 N末端PCRフォワード鎖プライマーの配列は、
2004520825.tif 000009
ORF特異的配列は太字とし、BamHI制限酵素切断部位は下線を付した。
【０２３１】
内在する終止コドン（TAA）から始まる、HP56 ORFタンパク質の最後の〜7アミノ酸をコードする配列に相補的なDNA配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、リバースPCRプライマーとして使用した。フォワードPCRプライマーと同様に、リバースプライマーは短いG/Cクランプ（〜6ヌクレオチド）を効率的なDNA増幅のために含有し、SalI制限エンドヌクレアーゼ部位をサブクローニングのために適当な位置に入れた。
【０２３２】
HP56 C末端PCRリバース鎖プライマーの配列は：
2004520825.tif 000010
ORF特異的配列は太字とし、SalI制限酵素切断部位は下線を付した。
【０２３３】
Applied Biosystems Inc. (ABI) Model 380B DNAシンセサイザーで、0.2 nmolスケールカラム（末端様式：Trityl-ON、自動切断）および標準的なホスホルアミダイト化学を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。粗製オリゴヌクレオチドは、C18逆相シリンジカラム（OPCカラム、ABI）によって、メーカーの記載のように、手作業で精製された。純度および収率は、分光学的測定で確認された（230/260/280比）。標準的なPCR増幅反応（2mM Mg2+、200μmol dNTP、2.5ユニット組換えAmpliTaq(PE Biosystems)、最終反応容量200μlとする）は、約0.5μg H.ピロリG1-4染色体DNA（シングルコピーならば、およそ3×10-7コピーのLeIF様遺伝子）ならびに約100 pmolの各フォワード（N-末端特異的オリゴ）およびリバース（C-末端特異的オリゴ）PCRプライマーを用いて、プログラムされた。PCRプライマーと標的遺伝子配列の間の、考えられるあらゆる配列バリエーションを補うために、通常より高濃度のプライマー（〜100pmol/200μl 反応液）を増幅に使用した。ゲノム配列決定によって決定される推定HP56 ORFのDNA配列は100%正確ではないかもしれないので、通常より高濃度のプライマーを使用することが必要であった。さらに、ゲノム配列決定に使用されたH.ピロリとは異なるH.ピロリ株を、後のPCR増幅をプログラムするために使用される染色体DNA源として使用した。〜1.0分間95℃まで増幅反応を加熱して染色体鋳型DNAを完全に変性させた後、3段階の熱による増幅プロフィール、すなわち95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、1分、を32サイクル行うことによって、標的配列の増幅が達成された。密封された200μl 薄壁タイプのポリプロピレン製反応チューブにおいて、PE Biosystems Model 9700 サーマルサイクラーを用いて、増幅を行った。PCR増幅後、反応液の一部（〜20μl）をとり、アガロースゲル電気泳動（0.8%アガロース、Tris-酢酸-EDTA(TAE)バッファー）によって適当な1.3Kbp DNA断片の生成について調べた。DNA分子量標準（1Kb DNAラダー、Life Technologies）をPCRサンプルと並行して電気泳動した。臭化エチジウム染色および紫外線照明によって、ゲル中のDNAを可視化した。
【０２３４】
6.6 HP56 PCR産物のPQE30発現ベクターへのクローニング
フォワードおよびリバース増幅プライマー内にそれぞれ作製されたBamHIおよびSalI制限酵素切断部位によって、〜1.3Kbp PCR産物を、市販の大腸菌発現プラスミドpQE30（Qiagen、アンピシリン耐性）中に、一定方向にクローニングすることが可能となった。その結果HP56タンパク質を、 N末端に(His)6アフィニティークロマトグラフィータグを含有する融合タンパク質として発現させることができた。1.3Kbp HP56 PCR産物は、シリカゲル型スピンカラム（Qiagen）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがって、増幅反応液から精製された。クローニングに必要な、必須のBamHIおよびSalI末端を作製するために、精製されたPCR産物を、順次、BamHIおよびSalI制限酵素を用いて、メーカー（Life Technologies）の推奨にしたがって完全に消化した。最初の制限酵素消化後、PCR産物を上記のようなスピンカラムによって精製して塩を除去し、次の酵素消化の前に滅菌水で溶出した。消化されたDNA断片は、pQE30プラスミドと連結する前に、シリカゲル型スピンカラムを用いて、再度精製された。発現プラスミドを連結反応に向けて調製するために、このプラスミドを同様にBamHIおよびSalI制限酵素を用いて完全に消化し、次に、自己連結を防ぐために子ウシ腸ホスファターゼ（CIP, 〜0.02ユニット／pmol 5’末端、Life Technologies）を用いて、メーカーの指示に従って処理した。調製されたベクターに対して、モル濃度で5倍過剰量の消化断片を使用して、連結反応を計画した。Maniatisら（1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）によって記載されるように、標準的な〜20ml連結反応（〜16℃、〜16時間）を、T4 DNAリガーゼ（〜2.0ユニット／反応、Life Technologies）を用いて行った。連結反応から取り分けた一部（〜5ml）を用いて、標準的な方法によってエレクトロコンピテントM15(pREP4)細胞を形質転換した。〜1.0mlのLB培地中37℃で〜2-3時間の増殖期の後、形質転換細胞をカナマイシン（40μg/ml）およびアンピシリン（100μg/ml）含有LB寒天平板上に塗布した。
【０２３５】
すべての形質転換細胞がpREP4プラスミド（KnR）およびpQE30- HP56プラスミド（ApR）の両方を保有していることを確認するために、2つの抗生物質はいずれも選択培地に含まれる。ここでpREP4プラスミドは、pQE30におけるタンパク質のIPTG-誘導発現に必要なlacIq遺伝子を保有する。プレートを37℃で〜16時間培養した。個々のKnR/ApRコロニーを滅菌爪楊枝で採取し、〜1.0ml LB KnR/ApR培養液のみならず、新しいLB KnR/ApRプレートに「パッチ」接種するために使用した。パッチプレートと培養液はいずれも、標準的な培養器（プレート）で、または振盪水槽で、37℃で一晩培養した。
【０２３６】
形質転換体がHP56 DNAインサートを含有することを確認するために、細胞全体に基づくPCR分析を使用した。ここで、〜1.0mlのLB Kn/Ap培養液を1.5mlポリプロピレンチューブに移し、Beckmann微量遠心機（〜3分、室温、〜12K×g）での遠心分離によって細胞を集めた。細胞ペレットを〜200ml滅菌水に懸濁し、そのうち〜10mlを用いて、HP56-Bam-FフォワードおよびHP56-Sal-RCリバース増幅プライマーの両方を含有する〜50ml最終容量のPCR反応液をプログラムした。PCR反応成分の最終濃度は、〜5.0ユニットのampliTaqポリメラーゼを使用した以外は実施例6.5の記載と基本的に同様であった。最初の95℃変性ステップは、細菌細胞の熱による破壊およびプラスミドDNAの遊離を確実にするために、3分に増やした。ABI Model 9700サーマルサイクラー、および3段階の熱による増幅プロフィール、すなわち95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、1分、を32サイクル行うことによって、溶解した形質転換体試料からHP56断片を増幅した。熱による増幅の後、反応液のうち〜20mlを、アガロースゲル電気泳動によって分析した（0.8%アガロース、Tris-酢酸-EDTA(TAE)バッファー）。ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色後、DNA断片をUV照明によって可視化した。DNA分子量標準（1Kbラダー、Life Technologies）をテスト試料と並行して電気泳動し、これを用いてPCR産物の分子量を推定した。予想される〜1.3Kbp PCR産物を産生する形質転換体を、HP56発現構築物を含有する菌株として同定した。発現プラスミドの概略地図を図2に示す。発現プラスミドを含有する菌株を、さらに、ヘリコバクター・ピロリLeIF様組換えタンパク質の誘導性発現について分析した。
【０２３７】
6.7. PCR陽性形質転換体の発現分析
上記で同定されたそれぞれのPCR陽性形質転換体について、カナマイシン（40mg/ml）およびアンピシリン（100mg/ml）含有〜5.0ml LB培養液にパッチプレートから細胞を接種して、振盪しながら（〜250rpm）37℃で一晩培養した。一晩培養した種培養の一部（〜1.0ml）を、〜25のLB Kn/Ap培地を入れた125ml三角フラスコに植菌し、培養の濁度が〜0.5のO.D.600（すなわち、対数増殖期中期）に達するまで（通常約1.5-2.0時間）振盪しながら（〜250rpm）37℃で増殖させた。このとき、培養液の約半分（〜12.5ml）を第２の125mlフラスコに移し、組換えヘリコバクター・ピロリLeIF様HP56組換えタンパク質の発現を、最終濃度1.0mMとするIPTG（滅菌水で調製した1.0M原液、Sigma）の添加によって誘導した。IPTG誘導および非誘導培養のインキュベーションはいずれも、さらに〜4時間、37℃で振盪して続行した。誘導および非誘導培養の試料（〜1.0ml）をいずれも、誘導期間後に採取し、室温で〜3分間、微量遠心機で遠心分離することによって細胞を集めた。それぞれの細胞ペレットを〜50ml滅菌水に懸濁し、次に同量の2-メルカプトエタノール含有2X Lamelli SDS-PAGEサンプルバッファーと混合し、沸騰水浴に〜3分間入れてタンパク質を変性させた。同量（〜15ml）の粗製IPTG誘導および非誘導細胞溶解液をいずれも、2連の12% Tris/グリシンポリアクリルアミドゲル（厚さ1 mmのMini-gel, Novex）にロードした。誘導および非誘導溶解液試料を着色分子量マーカー（SeeBlue, Novex）と共に、従来の条件で、標準SDS/Tris/グリシン泳動用バッファー（Bio-Rad）を用いて電気泳動した。電気泳動後、一方のゲルは、クーマシーブリリアントブルーR250（Bio-Rad）で染色し、次にメタノール：酢酸：水（30%:10%:60%）で脱色して、新規の約50kDaヘリコバクター・ピロリLeIF様組換えタンパク質を可視化した（図6）。もう一つのゲルは、BioRad Mini-Protean IIブロッティング装置およびTowbin’sメタノール（20%）転写バッファーを用いて4℃で〜2時間、PVDF膜（0.45μm孔径、Novex）にエレクトロブロットした。膜のブロッキングおよび抗体インキュベーションは、従来の方法によって行われた。HRP(QiaGen)とコンジュゲートさせた抗RGS(His)6モノクローナル抗体を1/5,000に希釈して使用して、発現を確認し、〜50kDaの誘導タンパク質をHP56組換えタンパク質と同定した（図5）。抗体反応性パターンの可視化は、Hyperfilm上で、Amersham ECL化学発光システムを用いて達成された。
【０２３８】
6.8.  組換え大腸菌HP56細胞集団の生成
H.ピロリ由来のLeIF様遺伝子をコードする組換えプラスミドを含有する大腸菌M15(pREP4)の組換え菌株を用いて、組換えタンパク質の精製を目的とする細胞集団を生成させた。発現菌株（大腸菌M15pRE4PQE/HP56）を、50μg/mlカナマイシンおよび100mg/mlアンピシリン含有LB寒天プレート上で培養して、pREP4 lacIqコントロールプラスミドおよびpQE30-HP56 ORF発現構築物の両者が共に維持されていることを確認した。−80℃で凍結保存するために、この菌株を、同濃度の抗生物質を含有するLB培地で増殖させ、次に等量の30%(w/v)グリセロール含有LB培地と混合した。
【０２３９】
組換えタンパク質の生産に使用される発酵培地は、50μg/mlカナマイシンおよび100μg/mlアンピシリン含有2XYT broth（Difco）からなる。消泡剤を発酵槽用培地に0.25ml/L(Antifoam 204, Sigma)の濃度で添加した。HP56組換えタンパク質の発現を誘導するために、IPTG（イソプロピル-D-チオガラクトピラノシド）を発酵槽に添加した（最終濃度1mM）。
【０２４０】
50ml容量を入れた500ml三角フラスコに0.3mlの急速解凍した凍結培養物、または選択寒天プレート培養から得られた複数のコロニーを植菌し、振盪台で150rpmにて（Innova 2100, New Brunswick Scientific）、37±1℃でおよそ12時間培養した。次に、この種培養を用いて、2XYT培地、ならびにKnおよびAp抗生物質を共に含有する5-L容量の発酵槽に植菌した。発酵槽（Bioflo 3000, New Brunswick Scientific）を37±1℃、0.2-0.4VVM通気、250rpm（Rushtonインペラーにて2 x yyy）で運転した。フラスコの種培養でも発酵槽でも、pHは調整しなかった。発酵中、発酵槽ではpHは6.5から7.3までの範囲であった。培養が対数増殖期中期（〜0.7 O.D.600ユニット）に達したときに、IPTG（1.0M原液、滅菌水で調製）を発酵槽に添加した。細胞を2-4時間誘導してから、28RS Heraeus（Sepatech）またはRC5C超高速遠心機（Sorvall Instrument）のいずれかを用いて遠心分離によって収集した。細胞ペレットは、処理するまで-20℃で保存した。
【０２４１】
6.9. HP30オープンリーディングフレームの同定
H.ピロリ細胞（HWC）のみではなく、アジュバントを加えたHWCで免疫されたマウスは、ヘリコバクター細胞に曝されたとき、ヘリコバクター感染による感染症から保護された。アジュバントを加えたH.ピロリ細胞（HWC）でワクチン接種されたマウスから得られた血清、およびHWCのみで免疫されたマウス由来の血清を、ウェスタンブロット分析によって、H.ピロリ細胞溶解液に対する反応性についてスクリーニングした。HWCプラス アジュバントで免疫されたマウスの血清のIgA抗体は、およその分子量が30ｋDaであるタンパク質と反応性であった。HWCのみで免疫されたマウス由来の血清のIgA抗体はこの30kDaタンパク質に反応性ではなかった。HP30タンパク質に対する免疫応答の誘発は感染予防と関連があるので、HP30タンパク質の特性をさらに検討した。ウェスタンブロットのバンドからタンパク質を電気的に溶出し、N末端配列を上記第6.2.節に記載の方法によって決定した。ヘリコバクター・ピロリゲノム配列データベース（The Institute for Genomic Research, Rockville, MD）に照会することにより、30kDaタンパク質のN-末端配列を有するアミノ酸配列を同定した。このタンパク質をHP30と称する。
【０２４２】
6.10. HP30 ORF特異的DNA断片のPCR増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、発現クローニングおよび遺伝的変異性分析のためにHP30特異的DNA断片を作製した。このタンパク質の最初の〜7アミノ酸に対するDNA配列（すなわち、Met翻訳開始から始まる〜21ヌクレオチド配列）をコードするN末端PCRフォワードプライマーは、化学的に合成された。ORF特異的配列のほかに、フォワードPCRプライマーは、効率的なPCR増幅のために短い5’G/Cクランプ（〜6ヌクレオチド）も包含した。サブクローニングに使用するBamHI制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、このプライマーのG/CクランプとORF特異的配列との間に適切に設計された。
【０２４３】
HP30 N末端PCRフォワード鎖プライマーの配列は：
5’-GCG GGA TCC ATG GCA TAC AAA TAT GAT AGA-3’  （配列番号39）
内在する終止コドン（TAA）から始まる、HP30タンパク質の最後の〜7アミノ酸をコードする配列に相補的なDNA配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、リバースPCRプライマーとして使用した。フォワードPCRプライマーと同様に、リバースプライマーは短いG/Cクランプ（〜6ヌクレオチド）を効率的なDNA増幅のために含有し、SalI制限エンドヌクレアーゼ部位をサブクローニングのために適当な位置に入れた。HP30 C末端PCRリバース鎖プライマーの配列は：
5’-GCG GTC GAC TTA AAT GGA TTC TAT TTG CAA CG-3’  （配列番号40）
【０２４４】
Applied Biosystems Inc. (ABI) Model 380B DNAシンセサイザーで、0.2 nmolスケールカラム（末端様式：Trityl-ON、自動切断）および標準的なホスホルアミダイト化学を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。粗製オリゴヌクレオチドは、C18逆相シリンジカラム（OPCカラム、ABI）によって、メーカーの記載のように、手作業で精製された。純度および収率は、分光学的測定で確認された（230/260/280比）。標準的なPCR増幅反応（2mM Mg2+、200μmol dNTP、2.5ユニット組換えAmpliTaq(PE Biosystems)、最終反応容量200μlとする）は、約0.5μg H.ピロリG1-4染色体DNAならびに約100 pmolの各フォワード（N-末端特異的オリゴ）およびリバース（C-末端特異的オリゴ）PCRプライマーを用いて、プログラムされた。PCRプライマーと標的遺伝子配列の間の、考えられるあらゆる配列バリエーションを補うために、通常より高濃度のプライマー（〜100pmol/200μl 反応液）を増幅に使用した。ゲノム配列決定によって決定される推定HP30タンパク質のDNA配列は100%正確ではないかもしれないので、通常より高濃度のプライマーを使用することが必要であった。さらに、ゲノム配列決定に使用されたH.ピロリとは異なるH.ピロリ株を、後のPCR増幅をプログラムするために使用される染色体DNA源として使用した。〜1.0分間95℃まで増幅反応を加熱して染色体鋳型DNAを完全に変性させた後、3段階の熱による増幅プロフィール、すなわち95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、1分、を32サイクル行うことによって、標的配列の増幅が達成された。密封された200μl 薄壁タイプのポリプロピレン製反応チューブにおいて、PE Biosystems Model 9700 サーマルサイクラーを用いて、増幅を行った。PCR増幅後、反応液の一部（〜20μl）をとり、アガロースゲル電気泳動（0.8%アガロース、Tris-酢酸-EDTA(TAE)バッファー）によって適当なDNA断片の生成について調べた。DNA分子量標準（1Kb DNAラダー、Life Technologies）をPCRサンプルと並行して電気泳動した。臭化エチジウム染色および紫外線照明によって、ゲル中のDNAを可視化した。
【０２４５】
6.11. HP30 PCR産物のQE30発現ベクターへのクローニング
フォワードおよびリバース増幅プライマー内にそれぞれ作製されたBamHIおよびSalI制限酵素切断部位によって、〜1Kbp PCR産物を、市販の大腸菌発現プラスミドpQE30（Qiagen、アンピシリン耐性）中に、一定方向にクローニングすることが可能となった。その結果HP30タンパク質を、N末端に(His)6アフィニティークロマトグラフィータグを含有する融合タンパク質として発現させることができた。〜1 Kbp HP30 PCR産物は、シリカゲル型スピンカラム（Qiagen）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがって、増幅反応液から精製された。クローニングに必要な、必須のBamHIおよびSalI末端を作製するために、精製されたPCR産物を、順次、BamHIおよびSalI制限酵素を用いて、メーカー（Life Technologies）の推奨にしたがって完全に消化した。最初の制限酵素消化後、PCR産物を上記のようなスピンカラムによって精製して塩を除去し、次の酵素消化の前に滅菌水で溶出した。消化されたDNA断片は、pQE30プラスミドと連結する前に、シリカゲルを基本とするスピンカラムを用いて、再度精製された。発現プラスミドを連結反応に向けて調製するために、このプラスミドを同様にBamHIおよびSalI制限酵素を用いて完全に消化し、次に、自己連結を防ぐために子ウシ腸ホスファターゼ（CIP, 〜0.02ユニット／pmol 5’末端、Life Technologies）を用いて、メーカーの指示に従って処理した。調製されたベクターに対して、モル濃度で5倍過剰量の消化断片を使用して、連結反応を計画した。Maniatisら（1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）によって記載されるように、標準的な〜20μl連結反応（〜16℃、〜16時間）を、T4 DNAリガーゼ（〜2.0ユニット／反応、Life Technologies）を用いて行った。連結反応から取り分けた一部（〜5μl）を用いて、標準的な方法によってエレクトロコンピテントM15(pREP4)細胞を形質転換した。〜1.0mlのLB培地で37℃、〜2-3時間の増殖期の後、形質転換細胞をカナマイシン（40μg/ml）およびアンピシリン（100μg/ml）含有LB寒天プレート上に塗布した。すべての形質転換細胞がpREP4プラスミド（KnR）およびpQE30- HP30プラスミド（ApR）の両方を保有していることを確認するために、2つの抗生物質はいずれも選択培地に含まれる。ここでpREP4プラスミドは、pQE30におけるタンパク質のIPTG-誘導発現に必要なlacIq遺伝子を保有する。プレートを37℃で〜16時間培養した。個々のKnR/ApRコロニーを滅菌爪楊枝で採取し、〜1.0ml LB KnR/ApR培養液のみならず、新しいLB KnR/ApRプレートに「パッチ」接種するために使用した。パッチプレートと培養液はいずれも、標準的な培養器（プレート）で、または振盪水槽で、37℃で一晩培養した。
【０２４６】
形質転換体がHP30 DNAインサートを含有することを確認するために、細胞全体に基づくPCR分析を使用した。ここで、一晩培養した〜1.0mlのLB Kn/Ap培養液を1.5mlポリプロピレンチューブに移し、Beckmann微量遠心機（〜3分、室温、〜12K×g）での遠心分離によって細胞を集めた。細胞ペレットを〜200μl滅菌水に懸濁し、そのうち〜10mlを用いて、HP56-Bam-FフォワードおよびHP56-Sal-RCリバース増幅プライマーの両方を含有する〜50μl最終容量のPCR反応液をプログラムした。PCR反応成分の最終濃度は、〜5.0ユニットのampliTaqポリメラーゼを使用した以外は実施例6.1の記載と基本的に同様であった。最初の95℃変性ステップは、細菌細胞の熱による破壊およびプラスミドDNAの遊離を確実にするために、3分に増やした。ABI Model 9700サーマルサイクラー、および3段階の熱による増幅プロフィール、すなわち95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、1分、を32サイクル行うことによって、溶解した形質転換体試料からHP30断片を増幅した。熱による増幅の後、反応液のうち〜20μlを、アガロースゲル電気泳動によって分析した（0.8%アガロース、Tris-酢酸-EDTA(TAE)バッファー）。ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色後、DNA断片をUV照明によって可視化した。DNA分子量標準（1Kbラダー、Life Technologies）をテスト試料と並行して電気泳動し、これを用いてPCR産物の分子量を推定した。予想される〜1. Kbp PCR産物を産生する形質転換体を、HP30発現構築物を含有する菌株として同定した。HP30発現プラスミドの概略マップを図1 に示す。HP30発現プラスミドpQEHp30によってコードされる、ヒスチジンタグを有する、HP30の完全長核酸およびアミノ酸配列を図11に示す。発現プラスミドを含有する菌株を、さらに、ヘリコバクター・ピロリHP30組換えタンパク質の誘導性発現について分析した。
【０２４７】
6.12. HP30 PCR陽性形質転換体の発現分析
上記で同定されたそれぞれのPCR陽性形質転換体について、カナマイシン（40μg/ml）およびアンピシリン（100μg/ml）含有〜5.0ml LB培養液にパッチプレートから細胞を接種して、振盪しながら（〜250rpm）37℃で一晩培養した。一晩培養した種培養の一部（〜1.0ml）を、〜25のLB Kn/Ap培地を入れた125ml三角フラスコに植菌し、培養の濁度が〜0.5のO.D.600（すなわち、対数増殖期中期）に達するまで（通常約1.5-2.0時間）振盪しながら（〜250rpm）37℃で増殖させた。このとき、培養液の約半分（〜12.5ml）を第２の125mlフラスコに移し、組換えヘリコバクター・ピロリHP30組換えタンパク質の発現を、最終濃度1.0mMとするIPTG（滅菌水で調製した1.0M原液、Sigma）の添加によって誘導した。IPTG誘導および非誘導培養のインキュベーションはいずれも、さらに〜4時間、37℃で振盪して続行した。誘導および非誘導培養の試料（〜1.0ml）をいずれも、誘導期間後に採取し、室温で〜3分間、微量遠心機で遠心分離することによって細胞を集めた。それぞれの細胞ペレットを〜50μl滅菌水に懸濁し、次に同量の2-メルカプトエタノール含有2X Lamelli SDS-PAGEサンプルバッファーと混合し、沸騰水浴に〜3分間入れてタンパク質を変性させた。同量（〜15ml）の粗製IPTG誘導および非誘導細胞溶解液をいずれも、2連の12% Tris/グリシンポリアクリルアミドゲル（厚さ1 mmのMini-gel, Novex）にロードした。誘導および非誘導溶解液試料を着色分子量マーカー（SeeBlue, Novex）と共に、従来の条件で、標準SDS/Tris/グリシン泳動用バッファー（Bio-Rad）を用いて電気泳動した。電気泳動後、一方のゲルは、クーマシーブリリアントブルーR250（Bio-Rad）で染色し、次にメタノール：酢酸：水（30%:10%:60%）で脱色して、新規の〜30kDaヘリコバクター・ピロリ組換えタンパク質を可視化した（図4）。もう一つのゲルは、BioRad Mini-Protean IIブロッティング装置およびTowbin’sメタノール（20%）転写バッファーを用いて4℃で〜2時間、PVDF膜（0.45μm孔径、Novex）にエレクトロブロットした。膜のブロッキングおよび抗体インキュベーションは、従来の方法によって行われた。HRP(QiaGen)とコンジュゲートさせた抗RGS(His)6モノクローナル抗体を1/5,000に希釈して使用して、発現を確認し、〜30kDaの誘導タンパク質をHP30組換えタンパク質と同定した（図3）。抗体反応性パターンの可視化は、Hyperfilm上で、Amersham ECL化学発光システムを用いて達成された。
【０２４８】
6.13.  組換え大腸菌HP30細胞集団の生成
H.ピロリ由来の30 kDaタンパク質をコードする遺伝子をコードする組換えプラスミドを含有する大腸菌M15(pREP4)の組換え菌株を用いて、組換えタンパク質の精製を目的とする細胞集団を生成させた。発現菌株（M15pRE4PQE/HP30）を、50μg/mlカナマイシンおよび100μg/mlアンピシリン含有LB寒天プレート上で培養して、pREP4 lacIqコントロールプラスミドおよびpQE30-HP30 ORF発現構築物の両者が共に維持されていることを確認した。−70℃で凍結保存するために、この菌株を、同濃度の抗生物質を含有するLB培地で増殖させ、次に等量の30%(w/v)グリセロール含有LB培地と混合した。
【０２４９】
組換えタンパク質の生産に使用される発酵培地は、50μg/mlカナマイシンおよび100mg/mlアンピシリン含有2XYT broth（Difco）からなる。消泡剤を発酵槽用培地に0.25ml/L(Antifoam 204, Sigma)の濃度で添加した。HP30組換えタンパク質の発現を誘導するために、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を発酵槽に添加した（最終濃度1mM）。
【０２５０】
50ml容量を入れた500ml三角フラスコに0.3mlの急速解凍した凍結培養物、または選択寒天プレート培養から得られた複数のコロニーを植菌し、振盪台で150rpmにて（Innova 2100, New Brunswick Scientific）、37±1℃でおよそ12時間培養した。次に、この種培養を用いて、2XYT培地、ならびにKnおよびAp抗生物質を共に含有する5-L容量の発酵槽に植菌した。発酵槽（Bioflo 3000, New Brunswick Scientific）を37±1℃、0.2-0.4VVM通気、250rpm（Rushtonインペラーにて2 x yyy）で運転した。フラスコの種培養でも発酵槽でも、pHは調整しなかった。発酵中、発酵槽ではpHは6.5から7.3までの範囲であった。培養が対数増殖期中期（〜0.7 O.D.600ユニット）に達したときに、IPTG（1.0M原液、滅菌水で調製）を発酵槽に添加した。細胞を2-4時間誘導してから、28RS Heraeus（Sepatech）またはRC5C超高速遠心機（Sorvall Instrument）のいずれかを用いて遠心分離によって収集した。細胞ペレットは、処理するまで-20℃で保存した。
【０２５１】
6.14. HP56およびHP30組換えタンパク質の精製
約15 gmの凍結細胞ペーストをボルテックスで撹拌し、さらに磨砕することによって、〜40mlの氷冷50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH8.0）、10mM Tris-HCl（pH8.0）、100mM NaClに再懸濁し、メーカーの推奨（流速〜5ml/分、〜450バール）にしたがってNiro-Soavi高圧ホモジナイザーに通すことによって破砕した。次にこの細胞溶解液を5分間、〜500×g（4℃）でSorvall SS34ローターにて遠心分離し、未破壊の細胞を除去した。
【０２５２】
清澄化したホモジネートを、次に、3-5mlのNi-NTA Sepharose固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（IMAC）樹脂（QiaGen）と混合し、250ml滅菌三角フラスコに移し、回転台に載せ、さらに、N-末端（His）6アフィニティタグを含有する組換えHP56またはHP30を〜16時間4℃でその樹脂と結合させた。バッチ結合後、ホモジネート-樹脂スラリーを従来のガラス製クロマトグラフィーカラム（BioRad Econo Column）に移し、溶解液を流出させた。2-100ml容量の洗浄バッファー（50mM NaH2PO4, pH7.0; 100mM NaCl）でカラムをゆっくりと洗浄することによって、未結合の混入タンパク質を樹脂から取り除いた。樹脂に結合した、アフィニティタグを付した組換えHP56またはHP30は、イミダゾールを主とする溶出バッファー（20mM Tris-HCl, pH8.0; 100mM NaCl; 100-200mMイミダゾール）によって2ml容量で溶出された。それぞれの溶出画分から分け取った一部をSDS-PAGEによって、4-20% Tris-グリシン勾配ゲル（Novex）および市販の着色分子量マーカーセット（MultiMark, Novex, San Diego, CA）を用いて、分析した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーR250溶液（BioRad）で染色してから脱色し、溶出されたタンパク質を可視化した。組換えHP56またはHP30タンパク質が＞80%の純度である画分をプールし、残存するイミダゾールおよび塩を除去するために、Tris-HCl(pH7.3)に対して、市販の透析カセット（MWCO = 10kDa; Slidalyzer, Pierce Chem.）において、一晩（〜14-18時間）透析した。次に透析された溶出液を、30kDaスピン濃縮装置（Centricon-30; Amicon）を使用した限外濾過によって濃縮した。
【０２５３】
濃縮されたHP56もしくはHP30のタンパク質濃度は、Micro BCA法（Pierce Chem.）でBSAを標準として用いて測定した。精製されたHP56もしくはHP30（〜1.0mg/mlタンパク質濃度）の純度、同一性、および残存する内毒素負荷量を、それぞれSDS-PAGE、ウェスタンブロット、および比色分析による内毒素アッセイ（Bio Whittaker）によって測定した。ゲルで精製したHP56もしくはHP30試料は、ゲル分析によって予想分子量（それぞれ〜56kDaもしくは30kDa）の単一バンドとして＞80%の純度を示し、ウェスタンブロットにおいて抗-RGS-(His)6抗体と活発に反応した。残存内毒素は、＜0.05EU/μgと算出された。
【０２５４】
6.15. HP30およびHP56の特性
HP30ポリペプチドは、H.ピロリ抽出物のウェスタンブロットによって判定されるように天然の状態では約30kDaのタンパク質として存在する。HP56ポリペプチドは、H.ピロリ抽出物のウェスタンブロットによって判定されるように天然の状態では約56kDaのタンパク質として存在する。
【０２５５】
6.16  抗HP30もしくは抗HP56抗血清
当業者に広く知られたいずれかの方法によって、HP30もしくはHP56ポリペプチドを動物、例えばウサギ、マウスもしくはモルモットに、アジュバントと共に、またはアジュバントなしで、注射することによって、HP30もしくはHP56に対する抗血清を調製した。例えば、HP30をフロイント完全アジュバントと共にウサギに注射したのち、HP30をフロイント不完全アジュバントと共に注射した。通常、部分精製された、もしくは精製された状態のタンパク質が注射される。例えば、既報（Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685）のように、当業者に公知の標準技法に従って、変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルを用いて、HP30ポリペプチドを他のタンパク質から分離し、HP30を含有するバンドをゲルから切り出す。切り出されたHP30含有バンドを浸軟させ、動物に注射して、このポリペプチドに対する抗血清を生じさせる。あるいはまた、rHP30もしくはrHP56を上記のように精製し、動物に注射した。抗体価を決定するために公知の一般に認められたELISA法を用い、タンパク質への結合を判定するウェスタンブロットによって、免疫蛍光染色について、および補体によって媒介されるヘリコバクターに対する細胞傷害活性について、上記の抗血清を検査した。
【０２５６】
6.17. ELISA
精製されたHP30もしくはHP56タンパク質（〜1μg/ウェル）を用いて、ELISAによって抗HP30もしくは抗HP56抗体価を測定した。あるいは、当業者に公知のいずれかの方法によって、H.ピロリ（ホールセル調製物もしくは粗製溶菌液）を捕捉リガンドとして使用した。抗血清の連続希釈をPBSで行い、2連でELISAによってテストした。こうしたアッセイにおいて、希釈されたHRPコンジュゲート抗体が第２のレポーター抗体として使用される。抗体価は陽性のELISA反応を示す最大希釈、すなわちネガティブコントロール（例えば、あらかじめ採血されたウサギ血清）の平均値を上回るO.D.450値＞２SD、として表された。
【０２５７】
6.18.  ウェスタンブロット
第6.1節に記載のようにH.ピロリを増殖させ、H.ピロリ溶菌液を調製した。あるいは、HP30もしくはHP56をコードするプラスミドを保有する大腸菌の溶菌液を調製した。可溶化した細胞を、Laemmliに従って4-12%ポリアクリルアミドゲルで分離し、分離されたタンパク質をすでに記載されたように100Vにて1.5時間、電気泳動でPVDF膜に転写した（Thebaineら、1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354）。次に、このPVDF膜を0.5%カゼインナトリウム、0.5%ウシ血清アルブミン、および1%ヤギ血清を含有する25mlのDulbecco’sリン酸緩衝生理食塩水で前処理した。以後すべてのインキュベーションは、この前処理バッファーを用いて行った。
【０２５８】
PVDF膜は、免疫前の血清、または（上記のように）HP30もしくはHP56ポリペプチドで免疫された動物の血清の希釈物25mlと共に、室温で1時間インキュベートした。PVDF膜を次に、洗浄バッファー（150mM塩化ナトリウムおよび0.05% Tween-20を含有する20mM Trisバッファー[pH 7.5]）で2回洗浄した。PVDF膜を25mlペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ（もしくはマウス抗体に対する抗マウス）免疫グロブリン（例えば、抗IgGまたは抗IgA）（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）と共に、室温で30分間インキュベートした。次にPVDF膜を洗浄バッファーで4回洗浄して、3,3’ジアミノベンジジン四塩酸塩および過酸化尿素（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. カタログ番号D-1148）でそれぞれ4分間発色させた。
【０２５９】
過免疫抗血清もしくはマウス抗体（免疫したマウス由来の血清、またはモノクローナル抗体を包含するがこれに限定されない）を使用して、H.ピロリ粗抽出物のウェスタンブロットのプローブとし、さらにHP30もしくはHP56タンパク質に対して生じた血清と反応性のタンパク質を同定した。
【０２６０】
6.19.  ウレアーゼアッセイ
動物組織を0.5mlのウレアーゼ検査溶液（.0468% NaH2PO42H2O, .0007%フェノールレッド、2.4% 尿素）にいれて、およそ4時間（H. フェリス）もしくはおよそ24時間（H.ピロリ）インキュベートした。ピンク色の発色がテスト試料中のウレアーゼの存在を示す。
【０２６１】
6.20. H.ピロリ コロニー形成アッセイ
H.ピロリもしくはH.フェリスでチャレンジした後、マウスの胃を摘出し、PBSですすいで食物片を除去した。胃をカミソリの刃で縦方向に分割し、秤量してホモジナイズした。胃の連続希釈物を作製し、選択培地上に塗布した。7日間37℃でインキュベーションした後、平板を取り出し、コロニーを計数した。
【０２６２】
6.21. H.ピロリ感染に関するワクチン有効性マウスモデル
H.ピロリ感染から動物を保護するHP30およびHP56の有効性を評価するために、ヘリコバクターに感染していないマウスを使用した。予防研究を目的として、0.5mlの5%炭酸水素ナトリウムを最初に投与し、10分後にPBS中にアジュバントを含有する、または含有しない0.25mlワクチンを投与することによって、テスト群のマウスに経口でワクチン接種した。経口ワクチン接種は3回、第0日、第14日および第28日に行われた。鼻腔内ワクチン接種は、HP30、HP56、もしくはヘリコバクターホールセル（HWC）をPBS溶液として、アジュバント有り、もしくは無しで投与することによって実施された。ワクチンの皮下注射は、各マウス2カ所の皮下部位（例えば、頸の後ろ側、および腹部）に注射することによって、第0、21および35日に行われた。最後のワクチン接種（治療的）の2週間後に、107 個のH.フェリスの1回投与もしくは5日間のうちに3回の108 個のH.ピロリ投与による胃内接種によって、マウスをチャレンジした。治療研究を目的として、最初（第0日）にH.フェリスもしくはH.ピロリを上記のようにマウスに植え付け、次に、チャレンジ後第21、35および49日に経口ワクチン接種するか、第21日に1回投与で鼻腔内ワクチン接種するか、または第21、42および56日に皮下ワクチン接種した。チャレンジ（予防的）の2週間後もしくは最後のワクチン接種（治療的）後、マウスをCO2で安楽死させ、胃全体を縦方向に切断した部分（H.ピロリ）または幽門洞の半分（H.フェリス）を摘出した。ウレアーゼ活性を測定するために、胃を第6.19.節に記載のようにアッセイした。H.ピロリを定量するために、第6.20.節に記載のように胃をアッセイした。
【０２６３】
すでにH.ピロリに感染したマウスにおいてH.ピロリの常在化を減少させるまたは排除する治療薬として、rHP30およびrHP56が機能を果たすことができることを表3に示す。従来、生きたH.ピロリの常在化したマウスは、約106から107 CFU/mlを有している。第0日に上記のように生きたH.ピロリをマウスに植え付け、第21、42および56日に、rHP30、rHP56、もしくはrHP30およびrHP56の両方、のいずれかをアジュバント（ミョウバン、CFAまたはミョウバン＋AB5）と共に用いて、皮下にワクチン接種した。アジュバントとしてミョウバンを用いてrHP30、rHP56、もしくはrHP30およびrHP56の両方、のいずれかを用いてワクチン接種したマウスは、ヘリコバクターのレベルが減少していた。アジュバントとしてミョウバンおよびAB5をもちいて、rHP30およびrHP56でマウスを免疫したとき、ヘリコバクター感染は完全に排除された。アジュバントとしてCFAを用いてrHP30またはrHP56でワクチン接種されたマウスにおいても、ヘリコバクター感染は完全に排除された。
【表３】
2004520825.tif 000011
【０２６４】
rHP30もしくはrHP56がマウスをその後のH.ピロリ感染から保護することができることを、表4、ならびに図9および10で示す。表4に示すように、アジュバントとしてAB5を用いてrHP30もしくはrHP56で経鼻的にワクチン接種を受けたマウスは、ヘリコバクターの常在化から保護されなかった。しかしながら、rHP30およびrHP56の両者とアジュバントAB5による鼻内ワクチン接種を受けたマウスは、ヘリコバクターのチャレンジに際して、常在化から保護された。
【０２６５】
図9のデータは、組換えHP30で皮下ワクチン接種を受けた動物の＞50%が、その後のH.ピロリの胃での常在化から保護されることを明白に示す。上記の結果はまた、HP30抗原の予防効果が、非経口アジュバントの同時投与を伴って、または伴わずに、皮下接種による免疫化によって達成されることを示す。
【０２６６】
図10のデータは、組換えHP30およびHP56で経口ワクチン接種を受けた動物の＞50%が、その後のH.ピロリの胃での常在化から保護され、残りの動物では粗製H.ピロリ溶菌液で免疫化したマウスより低レベルで常在化していることを明白に示す。こうした結果は、HP30およびHP56抗原の予防効果がアジュバントの同時投与を伴って、または伴わずに、達成されることを明白に示す。
【表４】
2004520825.tif 000012
【０２６７】
rHP30またはrHP56抗ヘリコバクター体液性応答を測定するために、血液試料を免疫化およびチャレンジ期の間、眼窩採血によって定期的に採取し、遠心分離によって血清を調製した。第6.17節に記載のように、ELISAによる抗体（Ab）応答の定量を実施する。抗体レベルを測定するためのマイクロウェルELISAプレート（Maxisorb, NUNC）を、10mM炭酸／重炭酸バッファー（pH9.6）中の〜0.5-10 (g精製rHP30もしくはrHP56、またはH.ピロリ ホールセル（〜6×108細胞個／ウェル）でコーティングし、0.1% Tween-20含有PBS（洗浄バッファー）で洗浄し、3% BSA含有PBS溶液で37℃にて〜1時間ブロックする。抗原特異的血清IgGレベルを測定するために、0.5% BSAを含有する洗浄バッファーでテスト血清を連続希釈して、一定量（100μl）を、抗原でコーティングされたウェル内で37℃にて〜2時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体(Sigma)とともに37℃にて〜1時間インキュベートする。HRP結合ヤギ抗マウスIgA二次抗体を使用して、HP30もしくはHP56特異的IgAの存在を検出する。適当な二次抗体とのインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で〜20〜30分間、TMB基質(Sigma)と共にインキュベートする。2M H2SO4の添加によって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて450 nmで吸光度を測定する。抗体価は、450nmでの光学密度1.0に相当する試料希釈度の逆数として決定される。
【０２６８】
アジュバントとしてミョウバン、ミョウバン＋AB5、またはCFAを用いてrHP30、rHP56、またはrHP30およびrHP56によって皮下ワクチン接種を受けたマウスにおける抗ヘリコバクターIgG抗体応答を表5に示す。アジュバントとしてミョウバンを用いてrHP30およびrHP56で免疫されたマウスは、アジュバントとしてCFAを用いてHP30およびHP56で免疫されたマウスと同様に高い抗ヘリコバクターIgG抗体価を示した。アジュバントとしてミョウバンとAB5を使用してrHP30およびrHP56によって免疫されたマウスのIgG抗体価は低かった。
【表５】
2004520825.tif 000013
【０２６９】
6.22. HP30もしくはHP56に対する特異的細胞性応答の測定
マウス群を、rHP30および／またはrHP56と、場合によりアジュバントと、を含んでなるワクチンで免疫する。例えば、マウスは、HP30およびアジュバントで免疫される。最後の免疫化から7日後、それぞれの群の動物をCO2窒息によって屠殺し、脾臓を摘出して、従来の方法によって単個細胞浮遊液を調製する。免疫された動物の脾細胞を個別に分析し、または動物2個体の脾臓をプールする。陽性対照群（疑似免疫および疑似感染）および陰性対照群（疑似免疫、感染）の両者について、脾細胞をプールし、再刺激をテストする。
【０２７０】
脾細胞の増殖を測定するために、10%ウシ胎児血清、25mM HEPES、 50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および50M 2-メルカプトエタノール（Gibco-BRL）を添加した5mlのRPMI 1640 Glutamax I中で脾臓を細かくばらばらにする（5-10回転）。トリパンブルー染色によって生細胞を数え、1.0-2.0×106細胞数／mlの細胞密度になるように同じ培養液で希釈する（Falcon 2063ポリプロピレンチューブ）。200μl培養液中にウェル当たり〜5×105個のレスポンダー細胞を用いて丸底96ウェル培養プレート（Nunclon, Nunc）で、3連培養を調製する。刺激の陽性対照として、1.0μg/mlのrHP30もしくはrHP56のいずれかを用いて細胞を刺激するか（抗原特異的増殖）、または4μg/mlコンカナバリンA（Boerhinger Mannheim）を用いて細胞を刺激し、再刺激されない細胞培養物を細胞活性化の陰性対照として使用する。5% CO2中で37℃にて72-96時間インキュベートした後、ウェル当たり1.0 Ci 3H-チミジン（Amersham）を用いて〜18時間、細胞をパルス標識する。Tomtec Cell Harvester (Mk III)を用いてパルス細胞をガラス繊維シート上に回収し、3-チャンネルWallac 1450 Trilux 液体シンチレーションカウンターでβ線放出をカウントする。試料（個別の、またはプールされた）の刺激指数（SI）は、抗原もしくはConAで刺激されたT細胞による3Hチミジンの取り込みの平均値(3連ウェル)を、刺激されていないT細胞による取り込みの平均値（3連ウェル）で割った値として定義される。抗原特異的（rHP30もしくはrHP56特異的）およびConA特異的増殖の両者に対するSIを測定する。
【０２７１】
サイトカインレベルを測定するために、最後のワクチン接種の10日後に脾臓およびリンパ節細胞を採取した。適当な抗原で細胞を刺激し、24、48および72時間インキュベートして上清を回収した。サンドイッチELISAキット（Endogen, Woburn, MA）を用いてサイトカインレベルを測定した。サイトカイン産生のユニット数は、刺激された細胞から得られる405nmの吸光度を標準曲線と比較して決定した。
【０２７２】
6.23.  アジュバント活性の評価
ヘリコバクター・フェリス幽門洞常在化モデルを用いて、組換えHP56に関するアジュバント効果を評価した。4群の雌Balb/Cマウス（〜6週齢、Jackson Labs）をこの評価のために使用した。動物5個体からなる1群は、ホルマリン不活化ヘリコバクター・ピロリホールセル（HWC）抗原（〜1.0×109HWC粒子）および〜10μg精製組換えHP56（滅菌PBS溶液中総容量〜30ml）からなるワクチンの鼻内投与を2回受けた。各群当たり5個体の雌マウスからなる2つの群を同様に免疫した；一方の群はHP56プロトタイプアジュバント（〜10μg、ホールセル抗原無し）のみを含有する調製物の投与を受けたのに対して、もう一方の群は、対照粘膜アジュバントとしての〜5μg変異型大腸菌易熱性毒素（mLT）とともにHWC抗原（〜1.0×109粒子）から構成されるワクチンを受けた。5個体の動物からなる第4群は、無アジュバント対照としての役目をするものであり、不活化HWC抗原とアジュバント活性のない〜10μg組換えタンパク質からなるワクチンで免疫された。免疫化は14日の間隔をおいて行われた。免疫化の前に、68% PBS(発熱物質を含まない)中16% Ketajectおよび16% Xylajectからなる麻酔混合物(100ml i.p./動物)を用いてマウスを鎮静化した。鎮静化したマウスを仰向けにおき、標準的な実験用ピペットを用いて、ワクチン製剤；鼻孔当たり〜10μlワクチン溶液を投与した。
【０２７３】
2回目の免疫化のおよそ10日後、眼窩採血によって血液を採取し、遠心分離によって血清を調製した。HWCテスト抗原もしくはHP56プロトタイプアジュバントのいずれかに対する個別の血清IgGおよびIgA力価は、ELISAによって測定された。抗体（Ab）レベルを測定するためのマイクロウェルELISAプレート（Maxisorb, NUNC）を、10mM炭酸／重炭酸バッファー（pH9.6）において、ウェル当たり〜0.5-1.0μgの不活化HWC抗原もしくは組換えHP56を用いて、4℃で一晩コーティングした。一旦、捕捉抗体でコーティングしたら、マイクロタイタープレートを0.1% Tween-20含有PBS（洗浄バッファー）で洗浄し、3% BSA含有PBS溶液で37℃にて〜1時間ブロックした。血清IgGおよびIgAレベルを測定するために、テスト血清を、0.5% BSAを含有する洗浄バッファーで連続希釈し、一定量（100μl）を、抗原をコーティングしたウェル内で、37℃にて〜2時間インキュベートした。次にこのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体（Sigma）と共に37℃で〜1時間インキュベートした。HRP結合ヤギ抗マウスIgA二次抗体を使用して、膣分泌液中のHWC特異的IgAの存在を検出した。適当な二次抗体とともにインキュベーション後、プレートを洗浄し、TMB基質（Sigma）と共に室温で〜20-30分間インキュベートした。2M H2SO4の添加によって反応を止め、Molecular Devices SpectroMaxマイクロプレートリーダーで450nmにて吸光度を測定した。力価は、450nmでの光学密度1.0に対応する試料の希釈度の逆数として算出された。下記の表6に示すように、組換えHP56の鼻内投与は、HWC特異的血清IgAおよびIgGの産生レベルをそれぞれ約10倍および約35倍に促進した。
【表６】
2004520825.tif 000014
【０２７４】
6.23.  放射標識されたスクリーニングプローブの作製
上記の配列情報を用いて、1対の非縮重オリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。アニーリング温度を50℃に下げる以外は上記と同様の条件下で、DNA断片のPCR増幅を実施する。前述のようにアガロースゲルからDNA断片を単離し、標準的な方法にしたがって、[32P]-γ-ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標識する。G25 Sepharoseスピンカラムにて、取り込まれなかった放射標識をプローブから分離する。使用前に、アニーリング温度を50℃に下げる以外は上記のように、このプローブを2分間95℃で変性させた後、氷上（4℃）で冷却する。
【０２７５】
6.24.  プラークリフトフィルターのハイブリダイゼーションおよび放射標識プローブによるサザンブロット
ライブラリープレートから得られたファージプラークを、当業者に公知の標準的な転写方法によってナイロンフィルター上に固定化する。消化された細菌ゲノムDNA、ファージもしくはプラスミドDNAを0.8% TAE-アガロースゲル上で電気泳動し、圧力ブロッター（Stratagene）を用いて、製造業者の推奨に従ってナイロンフィルター上に転写した。選択されたプローブとのハイブリダイゼーションは、アニーリング温度を50℃に下げる以外は上記のように37℃にて行われる。他のプローブとのハイブリダイゼーションは一般に、アニーリング温度を50℃に下げる以外は上記のように、60℃でおこなわれる。ストリンジェンシーを高める洗浄が、それぞれのハイブリダイゼーション温度で、非特異的バックグラウンドが最小となるまで行われる。
【０２７６】
6.25. H.ピロリ ゲノムDNAライブラリーの構築
Stratageneから入手したλZAPII置換ベクターにおいてゲノムライブラリーを構築する。ベクターアームをEcoRIで消化する。H.ピロリDNAのEcoRIによる消化を行って、1kbから5kbまでの断片サイズを生じる。標準的な手順に従ってベクターアームとインサートDNAのライゲーションを行う。ライゲーション反応はin vitroでStratagene GigaPack Gold III Extractを用いてin vitroで行われる。パッケージされたファージを大腸菌XI Blue MRA(P2)(Stratagene)上に塗布する。最初のライブラリー力価を測定し、pfu数として表す。
【０２７７】
8×103pfu/130mmプレートの密度で塗布された4×104pfuを用いて、このライブラリーをスクリーニングする。数個の推定陽性ファージプラークが存在し、もっとも強くハイブリダイズしたファージが、円筒形に切り離されたアガロースプラグから溶出、力価測定され、二次スクリーニングのために再び塗布される。選択されたファージを低密度（約100pfu/プレート）で再塗布し、プラークを、プライマー対を用いたPCRによって分析する。適当なヘルパーウイルスを大腸菌細胞に同時感染させることによって、選択されたファージからインサート保有プラスミド（ファージミド）を回収する。
【０２７８】
6.26.  インサートサイズの測定およびDNA断片のマッピング
インサートの大きさを測定するために、ファージミドDNAをNotIで消化し、消化物を適当なDNAマーカーと共に並行して0.5% TAE-アガロースゲルで分析する。プローブとハイブリダイズする制限酵素断片を地図上に位置づけるために、ファージミド分離株由来のDNAを、いくつかの一般的な制限酵素単独で、もしくはNotIと組み合わせて、消化する。この方法を行う根本的理由は、インサート／ファージミドベクター結合部にかかる断片とNotIインサート上に位置する断片を区別することにある。一連の単独消化および二重消化をそれぞれのファージ分離株について並行して行い、放射標識プローブを用いたサザン分析によって分析する。
【０２７９】
6.27. HP30またはHP56遺伝子の配列決定
Perkin-Elmer製Dye Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて、メーカーの使用説明書にしたがってrHP30またはrHP56をコードする核酸の配列決定を行う。配列決定反応は、ABI Prism 310 Genetic Analyzerによって読み取られる。その配列は、ABI Prism 310 シークエンサー添付のAuto Assembler ソフトウェア(Perkin-Elmer)を用いて、アラインされる。
【０２８０】
本発明は、寄託された微生物、または本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されない。機能的に同等な変化は本発明の範囲に包含されることが理解されるであろう。実際、本明細書に示され記載されることのほかに、本発明の様々な改変が、前記の記載および添付の図面から、当業者に明白となるであろう。こうした改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることを主旨とする。
【０２８１】
様々な出版物が本明細書に引用されているが、その開示内容は参照によりその全体を含めるものとする。
【０２８２】
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受託番号 寄託日
PTA-2669              2000年11月15日
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
【図１】「M15(PRE4)PQE/HP30」、略して「PQE/Hp30」と呼ばれるH.ピロリHP30発現プラスミド（例えば、大腸菌内で発現させることができる）の概略図である。
【図２】「M15(PRE4)PQE/HP56」、略して「PQE/HP56」と呼ばれるH.ピロリHP56発現プラスミド（例えば、大腸菌内で発現させることができる）の概略図である。
【図３】大腸菌M15(PRE4)PQE/HP30から発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP30タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図４】大腸菌においてM15(PRE4)PQE/HP30プラスミドから発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP30組換えタンパク質のクーマシーブルー染色SDS-ゲルを示す。
【図５】大腸菌M15(PRE4)PQE/HP56から発現させ、ゲル精製したH.ピロリHP56組換えタンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図６】HP56発現プラスミドである大腸菌M15(PRE4)PQE/HP56を担持する大腸菌細胞のクーマシーブルー染色SDS-ゲルを示す。
【図７Ａ−Ｃ】HP56ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列（配列番号１および配列番号２）を示す。
【図８Ａ−Ｂ】HP30ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列（配列番号３および配列番号４）を示す。
【図９】組換えHP30を用いた皮下免疫感作により賦与された、マウスにおけるH.ピロリの胃コロニー形成に対する防御を示すグラフである。
【図１０】ヘリコバクター溶解物またはサブユニットワクチンを用いた経口免疫感作により賦与された、マウスにおけるH.ピロリの胃コロニー形成に対する防御を示すグラフである。
【図１１】M15(PRE4)PQE/HP30のHP30コード化挿入物によりコードされるHP30ポリペプチドの全長核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2004520825.tif 000023
【図７Ｂ】
2004520825.tif 000024
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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