(57)【要約】本発明は、Flaviviridae 科のウイルスを処置するのに有用な 新規の化合物および方法に関する。本発明の化合物は、本明細書に記載の式(Ｉ)−(VI)の構造を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004525881.tif 000020
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化２】
2004525881.tif 000021
を含む群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項２】
式中、Ｘ１はＯであり；
Ｘ２はＣであり：
Ｘ３はＮＨであり；
Ｘ４はＮであり；そして
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式中、Ａは、
【化３】
2004525881.tif 000022
であり；そして
Ｒ６はアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
式中、Ａは、
【化４】
2004525881.tif 000023
であり；そして
Ｒ７とＲ８はそれぞれＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
式中、Ｒ１はアミノである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式中、Ｒ１はニトロである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
該化合物が、式：
【化５】
2004525881.tif 000024
によって表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
該化合物が、式：
【化６】
2004525881.tif 000025
によって表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
該化合物が、式：
【化７】
2004525881.tif 000026
によって表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
該化合物が、式：
【化８】
2004525881.tif 000027
によって表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体中に、請求項１に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
式 II：
【化９】
2004525881.tif 000028
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化１０】
2004525881.tif 000029
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体中に、請求項１４に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１６】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
式 III：
【化１１】
2004525881.tif 000030
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化１２】
2004525881.tif 000031
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項１９】
薬学的に許容される担体中に、請求項１８に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
式 IV：
【化１３】
2004525881.tif 000032
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化１４】
2004525881.tif 000033
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体中に、請求項２２に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２４】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
式Ｖ：
【化１５】
2004525881.tif 000034
[式中、
Ｘ１は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２は、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化１６】
2004525881.tif 000035
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項２７】
式中、Ｘ１はＯであり；
Ｘ２はＣであり；そして
Ｒ２とＲ３はそれぞれＨである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
式中、Ａは、
【化１７】
2004525881.tif 000036
であり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれＨである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２９】
式中、Ｒ１はアルコキシである、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３０】
該化合物が、式：
【化１８】
2004525881.tif 000037
によって示される、請求項２６に記載の化合物。
【請求項３１】
薬学的に許容される担体中に、請求項３０に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項３２】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
式 VI:
【化１９】
2004525881.tif 000038
[式中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２は、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化２０】
2004525881.tif 000039
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８が、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物。
【請求項３５】
式中、Ｘ１はＯであり；そして
Ｘ２はＣである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
式中、Ｘ１はＮＨであり；そして
Ｘ２はＣである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３７】
式中、Ｘ１はＳであり；そして
Ｘ２はＣである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３８】
式中、Ｘ１はＳであり；そして
Ｘ２はＮである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３９】
該化合物が、式：
【化２１】
2004525881.tif 000040
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４０】
該化合物が、式：
【化２２】
2004525881.tif 000041
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４１】
該化合物が、式：
【化２３】
2004525881.tif 000042
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４２】
該化合物が、式：
【化２４】
2004525881.tif 000043
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４３】
該化合物が、式：
【化２５】
2004525881.tif 000044
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４４】
該化合物が、式：
【化２６】
2004525881.tif 000045
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４５】
該化合物が、式：
【化２７】
2004525881.tif 000046
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４６】
該化合物が、式：
【化２８】
2004525881.tif 000047
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４７】
該化合物が、式：
【化２９】
2004525881.tif 000048
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４８】
該化合物が、式：
【化３０】
2004525881.tif 000049
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４９】
該化合物が、式：
【化３１】
2004525881.tif 000050
によって表される、請求項３４に記載の化合物。
【請求項５０】
薬学的に許容される担体中に、請求項３４に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５１】
該組成物が静脈内投与のために製剤されている、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
該組成物が経口投与のために製剤されている、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
式Ｉ および式 II：
【化３２】
2004525881.tif 000051
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化３３】
2004525881.tif 000052
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物 またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物を、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染の処置が必要な対象における、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置する方法。
【請求項５４】
該化合物が、式Ｉの化合物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該化合物が、式：
【化３４】
2004525881.tif 000053
によって表される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
該対象がウシである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
該対象が胎児(embryo)である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
該化合物が静脈内投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
該化合物が経口投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
式 III および 式 IV：
【化３５】
2004525881.tif 000054
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化３６】
2004525881.tif 000055
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される化合物を、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染の処置が必要な対象における、牛ウイルス性下痢ウイルス感染(ＢＶＤＶ)を処置する方法。
【請求項６１】
式Ｖおよび式 VI：
【化３７】
2004525881.tif 000056
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化３８】
2004525881.tif 000057
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物を、
牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染の処置が必要な対象における、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置する方法。
【請求項６２】
該対象がウシである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
該対象が胎児である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
該化合物が静脈内投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
該化合物が経口投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
該化合物が、式：
【化３９】
2004525881.tif 000058
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
該化合物が、式：
【化４０】
2004525881.tif 000059
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
該化合物が、式：
【化４１】
2004525881.tif 000060
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
該化合物が、式：
【化４２】
2004525881.tif 000061
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７０】
該化合物が、式：
【化４３】
2004525881.tif 000062
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
該化合物が、式：
【化４４】
2004525881.tif 000063
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
該化合物が、式：
【化４５】
2004525881.tif 000064
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７３】
該化合物が、式：
【化４６】
2004525881.tif 000065
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７４】
該化合物が、式：
【化４７】
2004525881.tif 000066
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７５】
該化合物が、式：
【化４８】
2004525881.tif 000067
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７６】
該化合物が、式：
【化４９】
2004525881.tif 000068
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７７】
該化合物が、式：
【化５０】
2004525881.tif 000069
で表される、請求項６１に記載の方法。
【請求項７８】
式Ｉおよび式 II:
【化５１】
2004525881.tif 000070
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９は、Ｈまたはアルキルである}から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化５２】
2004525881.tif 000071
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される化合物を、Ｃ型肝炎感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、Ｃ型肝炎感染の処置が必要な対象における、Ｃ型肝炎感染を処置する方法。
【請求項７９】
該化合物が 式Ｉの化合物である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
該化合物が式：
【化５３】
2004525881.tif 000072
で表される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
該対象がヒトである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
該化合物が静脈内投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
該化合物が経口投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
式 III および 式 IV:
【化５４】
2004525881.tif 000073
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化５５】
2004525881.tif 000074
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはその薬学的に許容される塩から選択される化合物を、Ｃ型肝炎感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、Ｃ型肝炎感染を処置する必要がある対象における、Ｃ型肝炎感染を処置する方法。
【請求項８５】
式Ｖおよび式 VI：
【化５６】
2004525881.tif 000075
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化５７】
2004525881.tif 000076
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはその薬学的に許容される塩から選択される化合物を、Ｃ型肝炎感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、Ｃ型肝炎感染を処置する必要がある対象における、Ｃ型肝炎感染を処置する方法。
【請求項８６】
該対象がヒトである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
該化合物が静脈内投与される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
該化合物が経口投与される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
該化合物が、式：
【化５８】
2004525881.tif 000077
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
該化合物が、式：
【化５９】
2004525881.tif 000078
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
該化合物が、式：
【化６０】
2004525881.tif 000079
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
該化合物が、式：
【化６１】
2004525881.tif 000080
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
該化合物が、式：
【化６２】
2004525881.tif 000081
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
該化合物が、式：
【化６３】
2004525881.tif 000082
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
該化合物が、式：
【化６４】
2004525881.tif 000083
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
該化合物が、式：
【化６５】
2004525881.tif 000084
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
該化合物が、式：
【化６６】
2004525881.tif 000085
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
該化合物が、式：
【化６７】
2004525881.tif 000086
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９９】
該化合物が、式：
【化６８】
2004525881.tif 000087
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項１００】
該化合物が、式：
【化６９】
2004525881.tif 000088
で表される、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０１】
式Ｉおよび式 II:
【化７０】
2004525881.tif 000089
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化７１】
2004525881.tif 000090
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、ハライド、アルキルハライド、アミジン、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]の化合物、またはその薬学的に許容される塩から選択される化合物を、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置するのに十分な量で、対象に投与することを含む、Flaviviridae 科のウイルスを処置する必要がある対象における、Flaviviridae 科のウイルスを処置する方法。
【請求項１０２】
該化合物が式 II の化合物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
該化合物が、式：
【化７２】
2004525881.tif 000091
で表される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
該化合物が、式：
【化７３】
2004525881.tif 000092
で表される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
該化合物が静脈内投与される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
該化合物が経口投与される、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の記載
本明細書は、米国仮出願 第 60/261,654 号(出願：2001年1月13日)に関する優先権を主張しており、その全体に言及することによって本明細書に組み込んでいる。
【０００２】
政府の援助の記述
本発明は、the National Institutes of Health から、認証番号 K08 AI01728-01 および U0I-A133383 の下に、政府の援助を受けた。合衆国政府は、本発明にある種の権利を有しうる。
【０００３】
本発明の分野
本発明は、牛ウイルス性下痢ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの感染の処置に関する。
【０００４】
本発明の背景
牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)は、Pestivirus 属 および Flaviviridae 科の、エンベロープ型一本鎖ポジティブ・センス ＲＮＡウイルスである。感染しやすい細胞の単層が感染した場合、目に見える細胞変形の結果があるか無いかに基づいて、ＢＶＤＶの２つの病理学的なバイオタイプ(細胞変形および非細胞変形と言われる)が識別される[Perdrizet JA in: B.P. Smith (ed), Large Animal Internal Medicine, First Edition (Mosby Press, St Louis, 731-737 (1990))]。区別はまた、ゲノムの５'の非翻訳領域における、特定のウイルスのＲＮＡ配列に基づいて、ＢＶＤＶの生物型の間(生物型ＩとIIと呼ばれる)にもなされる [Pellerin C, et al., Virology 203, 260-268 (1994); J.F. Ridpath et al., Virology 205, 66-74 (1994)]。
【０００５】
ＢＶＤＶは、ウシにおいて急性感染し、ウシの呼吸器疾患、下痢、および重度の生殖機能喪失を引き起こし得る。急性ＢＶＤＶ感染の臨床的症候は、ほとんど検出できない程度から重度の範囲であり得る。妊娠したウシ、および未経産の若いウシの感染は、繁殖の問題(例えば異常発情など)、堕胎、早産、または弱いもしくは発育障害の子牛を発生させ得る。幾つかの場合において、臨床的症候が明らかでない時でさえも、動物の免疫系への一次的な損傷が起こり得る。ウイルス自身によって引き起こされる疾患に加えて、感染された動物は、肺炎のような他の疾患に、より罹患しやすい。
【０００６】
急性疾患を起こすことに加え、ＢＶＤＶはまた、持続感染を起こし得る[Potgieter, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract 11, 501-520 (1995)]。持続性のＢＶＤＶ感染は、一般的に、非細胞変形ＢＶＤＶでの、成長している胎児の子宮内感染を介して成立する。その結果生まれてきた動物は、感染している特定のＢＶＤＶの先天性免疫耐性があり、そして継続的にその生涯を通じてウイルスを広め得る。幾つかの持続感染した動物は、ＢＶＤＶ感染のために先天的な奇形を示すが、ＢＶＤＶに持続感染した多くの動物は、臨床的に正常に見える[Baker, Rev. Sci. Tech 9, 25-41 (1990); Bielefeldt-Ohmann, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract 11, 447-476 (1995)]。持続感染した動物は、ウシの集団におけるＢＶＤＶの主要な感染源であると考えられている。
【０００７】
アメリカにおいて、ＢＶＤＶに対する１４０個以上のワクチンが市販されている[Bolin, Am J. Vet Res. 46, 2476-2470 (1995)]。不幸にも、幾頭かのワクチンを投与されたウシは、すでにウイルスに感染しているため、ワクチンの投与は、ＢＶＤＶの感染に対する完全な保護を提供しない。現在、ＢＶＤＶ感染への治療は知られていない。それゆえに、ＢＶＤＶ感染への効果的な処置に対する要請が存在する。
【０００８】
胎児(embryo)の in vitro での生産は、動物の生殖の増大に対する、そして動物およびヒトの不妊を処置するのに有用な治療となっている。ウシの胎児の in vitro での生産は、ウシの間の遺伝物質のヒトによる全世界への輸送を可能にした一方、多くの病原体の伝染を制限した。しかし、in vitro で生産されたウシの胎児は、ＢＶＤＶの伝染が可能なベクターである[B. Avery et al., Vet Rec 132, 660 (1993); A. Bielanski et al., Theriogenology 46, 1467-1476 (1996); T. Tsuboi et al., Vet Microbiol 49, 127-134 (1996); O. Zurovac et al., Theriogenology 41, 841-853 (1994)]。ＢＶＤＶが生殖細胞、血清、体細胞、卵丘−卵母細胞複合体(ＣＯＣ)を伴う胎児生産系に導入され、そしてその結果 in vitro 受精胎児(ＩＶＦ) または細胞系に混入し得る [K.V. Brock et al., J Vet Diagn Invest 3, 99-100 (1991); C.R. Rossi et al., Am J Vet Res 41, 1680-1681 (1980); P.J. Booth et al., J Reprod Fert Abstr Ser Suppl 9, 28 (1992); M.D. Fray et al., Vet Pathol 35, 253-259 (1998); R. Harasawa et al., Microbiol Immunol 39, 979-985 (1995); T. Shin et al., Theriogenology 53, 243 (2000)]。非細胞変形ＢＶＤＶと感染したＩＶＦ胎児との合併が、胎児レシピエント感染、初期胎児の死、早産、または持続感染した子の誕生を引き起こし得る。
【０００９】
類似の危険が、ヒトの in vitro での胎児の生産において存在する。胎児汚染した胎児の培養物を介した ヒト胎児および胎児レシピエントへのウイルス感染が、報告されている。in vitro で生産された胎児を囲む培養培地への 抗ウイルス薬の添加は、ウイルスの胎児または胎児レシピエントへの伝染を妨げるもしくは減少させ得た[P.M. Grosheide et al., Vaccine  9, 682-687 (1991); W.G. Quint et al., J Clin Microbiol 32, 1099-1100 (1994); H.C. van Os et al., Am J Obstet Gynecol 165, 152-159 (1991)]。あるいは、動物およびヒトの両方の in vitro での胎児の生産系へ加え得る抗ウイルス薬は、重要な適応を有し得る。
【００１０】
ウイルスの複製に用いられるタンパク質をコードするＢＶＤＶゲノムの一部の構成は、別のフラビウイルスであるヒトのＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)のゲノムの一部に非常に類似している[S.W. Behrens et al., J Virol 72, 2364-2372 (1998)]。ＨＣＶに感染した個人の８０％以上が、最後には該疾患の慢性型となる。該疾患にかかると、感染した患者の肝臓は進行性の損傷をうけ、一般的に肝硬変および肝臓機能不全(例えば黄疸、腹部膨満、および最後には昏睡など)に相当する症状をもたらす。感染から重大な肝臓の損傷までのサイクルは、２０年以上かかり得る。ＨＣＶによる肝機能不全は、現在、合衆国における肝臓移植の主要な原因である。現在、合衆国で５００万人以上がＨＣＶに感染していると考えられており、そして多分全世界で２００万人ほどがＨＣＶ感染によってかなりの公衆健康の脅威を与えている。
【００１１】
ＨＣＶ感染に対するワクチンの開発は、ウイルスの高い変異速度のためもあって、不確実である。リコンビナントのインターフェロンα−２ｂ(INTRON A(登録商標)/Schering)は、幾つかの慢性Ｃ型肝炎の場合に効果的であることが分かっている。しかし、インターフェロン α−２ｂ処置を止めた後、少なくとも半数の患者で再発が起こる。さらに、インターフェロン α−２ｂは、慢性自己免疫活性肝炎によって引き起こされる肝細胞損傷を悪化させ得る[J.Y.N. Lau et al., Br Med J. 306, 469-470 (1993)]。ヌクレオチド類似物リバビリン(VIRAZOLE(登録商標)/ICN Pharmaceuticals)は、感染した患者において、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡの濃度を減少させるが、インターフェロン α−２ｂよりその速度が遅いことが示されている。ＢＶＤＶ感染のように、ＨＣＶ感染の効果的な処置の要請が存在している。
【００１２】
本発明の要約
前述の点において、本発明の１つの態様は、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染およびＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染のような、フラビウイルス科のウイルスを処置するのに有用な新規の化合物に関する。本発明の化合物は、以下の式(Ｉ)−(VI)：
【化１】
2004525881.tif 000002
【化２】
2004525881.tif 000003
【化３】
2004525881.tif 000004
[式中、
Ｘ１とＸ３は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ９{式中、Ｒ９はＨまたはアルキルである}からなる群から選択され；
Ｘ２とＸ４は、それぞれ独立に、ＣＨまたはＮであり；
Ａは、Ｈ、アルキル、アリール、
【化４】
2004525881.tif 000005
からなる群から選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アミジン、ハライド、アルキルハライド、ニトロ、およびアミノからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；そして
Ｒ７とＲ８は、それぞれ独立に、Ｈおよびアルキルからなる群から選択される]に記載の構造を有する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体中に、式(Ｉ)−(VI)に記載の構造を有する化合物、またはその薬学的な塩(すなわち“活性化合物”)を含む医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は、牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)感染、およびＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染の処置に有用である。
【００１４】
本発明の特定の態様は、牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)感染の処置が必要な対象において、牛ウイルス性疾患ウイルス感染を処置する方法に関する。該方法は、式(Ｉ)−(VI)に記載の化合物 またはその薬学的に許容される塩を、牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)感染を処置するのに効果的な量で、該対象に投与することを含む。
【００１５】
本発明の他の態様は、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染の処置が必要な対象において、Ｃ型肝炎ウイルス感染を処置する方法に関する。該方法は、式(Ｉ)−(VI)に記載の化合物 またはその薬学的に許容される塩を、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染を処置するのに効果的な量で、該対象に投与することを含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)感染の処置が必要な対象において、牛ウイルス性疾患ウイルスを処置するための医薬の製造のための、本明細書中に記載の活性化合物の使用である。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染の処置が必要な対象において、Ｃ型肝炎ウイルス感染を処置するための医薬の製造のための、本明細書中に記載の活性化合物の使用である。
本発明の前述の態様および別の態様は、以下に示した明細書中で詳細に説明している。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の化合物の合成に有用な４個の化学スキームを表している。
【００１９】
本発明の詳細な説明
本発明は、添付の明細書および図面に関して、以下に、より完全に記載されている。本発明の好ましい具体的態様を示す。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、そして本明細書中に示した具体的態様に制限されると解釈するべきではない。むしろ、これらの具体的態様は、この開示を詳細にそして完全にし、そして当業者に本発明の範囲を完全に伝えるために、提供されている。
【００２０】
本明細書中の本発明の説明で用いられている用語は、特定の具体的態様を記載することのみを目的とし、そして本発明を制限することを意図していない。本発明の説明および添付の請求項に用いられるように、単数形は、その前後ではっきりと別記していない限り、複数形も含むことを意図している。
【００２１】
別に定義しない限り、本明細書中で用いられている全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する業界の普通の者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中で記載した出版物、特許明細書、特許、および他の参考文献は、記載によって、その全体が組み込まれている。
【００２２】
本明細書中で用いられる式(Ｉ)−(VI)の化合物に関して、“アルキル”という用語は、全ての直鎖、分枝、もしくは環状の、飽和 もしくは不飽和のＣ１−１０炭化水素鎖(すなわちアルケニル およびアルキニル)を言い、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアレニルを含む。
【００２３】
“アルキル”という用語は、特にシクロアルキル炭化水素鎖を含み、本明細書中で用いられる場合、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルのようなＣ３−Ｃ６環状アルキルを言う。本発明において、望ましいアルキルは、低級アルキルである。“低級アルキル”という用語は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルのような、直鎖または分枝の Ｃ１−Ｃ４アルキルを言う。
【００２４】
“アルキル”という用語はまた、置換されたアルキルを含み、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、酸素置換アルキル(すなわちアルコキシ)、およびハロゲン置換アルキル(すなわちアルキルハライド、ポリハロアルキル)を含む。本明細書で用いる“アミノアルキル”という用語は、直鎖または分枝の Ｃ１−Ｃ４ アミノ置換アルキルを言い、“アミノ”という用語は、ＮＲ'Ｒ"{式中、Ｒ'とＲ"は、独立に、Ｈ、または上記で定義した通りの低級アルキルである}、すなわち−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２などを言う。本明細書で用いる“ヒドロキシアルキル”は、直鎖または分枝の Ｃ１−Ｃ４ ヒドロキシ置換アルキル、すなわち、−ＣＨ２ＯＨ、−(ＣＨ２)２ＯＨなどを言う。本明細書で用いる“アルコキシ”は、Ｃ１−Ｃ４酸素置換アルキル、すなわち−ＯＣＨ３などを言う。本明細書で用いる“低級アルコキシ”という用語は、直鎖または分枝の Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、イソプロピルオキシ、およびｔ−ブチルオキシを言う。
【００２５】
“ハロ”および“ハライド”は、慣用の意味を有し、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードを言う。望ましいハロは、クロロを含み、本発明の望ましいハロゲン化アルキルは、ＣＦ３を含む。
本発明で用いる“ニトロ”は−ＮＯ２構造を有する。
【００２６】
本明細書中で用いる“アリール”は、Ｃ３−Ｃ１０環状芳香族、例えばフェニル, ナフチルなどを言い、特にトリル、置換フェニル、置換ナフチルを含む(これらに制限されない)置換アリールを含む。アリールは、ハロ、アミノ、ニトロなどで置換され得る。複素環状芳香環および多環式芳香環はまた、この“アリール”の定義に含まれている。本発明に含まれるアリールの特定の例は、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジンなどを含み、これらに制限されない。
【００２７】
本発明の化合物はまた、薬学的に許容される塩形で利用される。該塩は、本化合物の、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、および塩酸塩を含み得、これらに制限されない。式(Ｉ)−(VI)の化合物およびその薬学的に許容される塩を、本明細書中で“活性化合物”または“活性薬剤”と言う。
【００２８】
式(Ｉ)−(VI)で表される化合物は、以下の実施例に記載された合成方法によって、および当業界で既知の特定の方法によって作られ得る。これらの既知の方法のいくつかは、以下の実施例で記載する もしくは言及することによって示されている(言及することによってその全体を組み込む)。
【００２９】
本発明で有用な化合物の例を、以下の表１に示す。表１において、Ａは、
【化５】
2004525881.tif 000006
である。
【００３０】
【表１】
2004525881.tif 000007
【００３１】
上記の化合物の式は、
【化６】
2004525881.tif 000008
【００３２】
【化７】
2004525881.tif 000009
【００３３】
【化８】
2004525881.tif 000010
【００３４】
【化９】
2004525881.tif 000011
【化１０】
2004525881.tif 000012
【００３５】
【化１１】
2004525881.tif 000013
【化１２】
2004525881.tif 000014
【００３６】
【化１３】
2004525881.tif 000015
である。
【００３７】
上記のように、本発明の化合物、方法、および組成物は、牛ウイルス性下痢ウイルス(ＢＶＤＶ)感染、およびＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染を処置するのに有用である。牛ウイルス性下痢ウイルス感染という用語は、牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)と分類されるウイルスによって引き起こされる、何れかの感染(例えば急性、潜伏性、または持続性)を意味する。上記のように、ＢＶＤＶは、Pestivirus属およびFlaviviridae 科の、エンベロープ型一本鎖ポジティブ・センス ＲＮＡウイルスである。本明細書で用いる牛ウイルス性疾患ウイルス(ＢＶＤＶ)という用語は、全てのＢＶＤＶ株、およびその全てのセロタイプおよび変異体を含み、生きた、弱毒化した、致死させた、または他の何らかの方法で不活化したものをむ。ＢＶＤＶという用語は、特に細胞変形株（cytopathic）および非細胞変形株を含み、バイオタイプＩおよびバイオタイプIIの両方の株を含む。“Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染”という用語は、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)[ＨＣＶの全ての株、セロタイプ、および変異体を含む]によって引き起こされる如何なる感染も含む。
【００３８】
本発明の１つの具体的態様において、対象動物は、治療上効果的な量の式(Ｉ)−(VI)の化合物 またはその薬学的に許容される塩を投与される。本明細書に用いられる“治療上効果的な”量は、ＢＶＤＶもしくはＨＣＶの感染に伴う少なくとも１つの症候を緩和する(例えば軽減する、減少させる、短くするなど)のに十分な、式(Ｉ)−(VI)の化合物の量である。化合物の投与の利益が害に勝る限り、本化合物の投与がＢＶＤＶもしくはＨＣＶの症状をなくする必要はない。同様に、ＢＶＤＶもしくはＨＣＶに関して、本明細書中で用いる“処置する”および“処置すること”という用語は、対象動物のＢＶＤＶもしくはＨＣＶが必ずしも完治すること、またはその全ての臨床的な兆候がなくなることを意味することを意図せず、そして患者の状態の幾らかの軽減もしくは改善に、式(Ｉ)−(VI)の化合物の投与によって影響を与えることを意味することのみを意図している。
【００３９】
本発明の適切な対象は、ヒトおよび動物を含む。対象が動物の場合は、哺乳動物が望ましく、家畜(例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなど)、および霊長類(例えば尾のあるサル、尾のないもしくは短いサルなど)が特に望ましい。本発明の１つの具体的態様において、ＢＶＤＶを処置するには、ウシ（例えばウシ、雄牛、子牛など）を対象とするのが望ましい。本発明の具体的態様において、ＨＣＶ感染を処置するには、ヒトが望ましい対象である。対象は、成人、青年、少年、幼年、または新生児であってもよい。本発明の１つの具体的態様において、対象は生きた胎児であり、そして子宮内であっても in vitro であってもよい(胎児が in vitro 受精のために維持されている場合)。
【００４０】
対象は、本発明の化合物および組成物を、何れかの適切の方法によって投与され得る。具体例としての方法は、経口投与(例えば液体もしくは固体の形態で)、筋肉注射、皮下注射、および静脈注射である。本発明の医薬製剤は、薬学的に許容される担体中の本発明の活性化合物を含む。適切な医薬製剤は、吸入、経口、直腸、局所(口内、舌下、皮膚、膣、および眼内)、非経腸(皮下、皮内、筋肉内、静脈、および関節内)、および経皮の投与に適切な医薬製剤を含む。前述の何れかの場合における最も適切な投与経路は、対象において処置される状態の解剖学的位置、処置される状態の性質および重症度、および用いられる特定の活性化合物に依存し得る。製剤は、便宜的に単位投与形で与えられ、当業者に周知の何れかの方法によって製造され得る。
【００４１】
本発明の方法において、in vitro 受精(ＩＶＦ)方法で処置が行われる場合、該化合物は、活性化合物を適切な濃度で、胎児が維持される培養液に加えることによって、胎児に投与され得る。
【００４２】
本発明に記載の医薬(“製剤”)の製造において、活性化合物またはその薬学的に許容される塩(“活性化合物”)は、典型的に、とりわけ許容される担体と混合される。担体は、製剤中の何れの他の成分とも併存可能であるという意味で、当然に許容されなければならないし、対象の身体に有害であってはならない。担体は、固体であっても液体であっても、またはその両方であってもよく、そして好ましくは、単位用量の製剤として、活性化合物が０.５重量％から９９重量％含み得る、例えば錠剤として、化合物を製剤する。１もしくはそれ以上の活性化合物が、本発明の製剤に組み込まれ得、該製剤は、任意に１もしくはそれ以上の補助的な治療成分を含む成分を混合することを本質的に含む、医薬で周知の何れかの方法によって製造され得る。
【００４３】
経口投与に適切な製剤は、カプセル、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤のような個別単位で与えられ得、それぞれは、粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性の液体中の、溶液もしくは懸濁液として；または水中油型の もしくは油中水型の乳液として、予め決められた量の活性化合物を含む。該製剤は、活性化合物と、適切な担体(１もしくはそれ以上の上記の付属的な成分を含み得る)を組み合わせる段階を含む、医薬の何れかの適切な方法によって製造され得る。一般的に、本発明の製剤は、活性化合物を、液体の もしくは微粉砕した固体の担体と、またはその両方と、均一に よく混合し、そして必要であれば、得られた混合物を成形することによって製造される。例えば、錠剤は活性化合物を含む粉末もしくは顆粒を、任意に１もしくはそれ以上の付属的な成分と共に、圧縮するもしくは成形することによって製造され得る。圧縮錠剤は、適切な機械で圧縮することによって製造され得、該混合物は、粉末もしくは顆粒のような自由流動形で、任意に結合剤、潤滑剤、不活性な希釈剤、および／または界面活性剤／分散化剤と混合することによって製造し得る。成形錠剤は、適切な機械で、不活性な液体の結合剤で湿らせた粉末化合物を成形することによって製造され得る。経口投与のための製剤は、胃の中で製剤が分解するのを妨げ、そして小腸内で薬剤を放出させるために、任意に当業界で既知の腸溶性コーティングを含み得る。
【００４４】
非経腸の投与に適切な本発明の製剤は、活性化合物の、滅菌処理した水性の および非水性の注射溶液を含み、製剤は、好ましくは意図された被投与者の血液と等張性である。これらの製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図された被投与者の血液と等張性にする溶質を含み得る。水性の および非水性の滅菌処理された懸濁液は、懸濁化剤と増粘剤を含み得る。本製剤は、単位用量もしくは多回用量の容器で、例えば封をしたアンプルおよびバイアルなどで与えられ得、そして滅菌処理された液体の担体、例えば生理食塩水もしくは注射用水などを 使用する直前に添加することのみを要する、冷凍−乾燥した(凍結乾燥した)状態で保存され得る。即席の注射溶液および懸濁液は、前述の種類の 滅菌された粉末、顆粒、および錠剤から製造され得る。例えば、本発明の１つの態様において、封をした容器中の、単位用量形の式(Ｉ)−(VI)の化合物 またはその塩を含む、注射可能な安定な滅菌処理された組成物を提供する。本化合物または塩は、対象に注射するのに適切な液体の組成物を形成するのに適切な薬学的に許容される担体で再構成される、凍結乾燥された形態で提供される。単位用量形は、典型的に、本化合物または塩を約１０mgから約１０ｇ含む。本化合物または塩が実質的に水に不溶である場合、十分な量の生理学的に許容される乳化剤を、水性の担体に、本化合物または塩を乳化するのに十分な量で用い得る。
【００４５】
さらに、本発明は、本明細書中で開示している化合物およびその塩の、リポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成する方法は、当業界で周知である。本化合物またはその塩が、水に可溶な塩である場合、慣用のリポソーム方法を用いて、脂質小胞に組み込み得る。該例では、本化合物または塩の水への溶解性のために、本化合物またはその塩は、リポソームの親水性の中心もしくは核に、実質的に保持される。用いられた脂質層は、何れかの慣用の組成物の層であり得、そしてコレステロールを含んでもコレステロールを含まなくてもよい。本化合物または塩が水に不溶であれば、慣用のリポソーム製剤方法を用いて、塩が、リポソームの構造を形成する 疎水性の脂質二重層に、実質的に保持され得る。何れかの例において、生産されたリポソームは、標準的な超音波処理およびホモジニゼーション法の使用によって、サイズを小さくし得る。
【００４６】
当然に、本明細書中で記載された方法で同定される 薬学的に活性化合物を含む、本リポソーム製剤を凍結乾燥し、水のような薬学的に許容される担体で再構成され、リポソーム懸濁液を再生し得る、凍結乾燥物を製造し得る。
【００４７】
活性化合物に加えて、医薬製剤は、ｐＨ調整添加剤のような他の添加物を含み得る。特に、有用なｐＨ調整剤は、塩酸のような酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、またはグルコン酸ナトリウムのような、塩基もしくは緩衝剤を含む。さらに、本組成物は、殺菌保存料（microbial preservatives）を含み得る。有用な殺菌保存料は、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールを含む。殺菌保存料は、典型的に、製剤が多回用量の使用のために設計されたバイアルに入っている場合に用いられる。当然、示されたように、本発明の医薬製剤は、当業界で周知の方法を用いて凍結乾燥され得る。
【００４８】
本発明の医薬製剤は、凍結乾燥された形態の本発明の化合物を含み得る。あるいは、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容される担体中の本発明の化合物を含み得る。該医薬製剤は、一般的に、本明細書中に記載の化合物を、薬学的に許容される担体と混合することによって製造される。薬学的に許容される担体は、好ましくは液体、特に水性の担体であり、その選択は、当業界で既知である。該製剤を製造する目的で、本化合物は、緩衝生理食塩水(例えばｐＨ６から８)、または慣用の培養培地に混合され得る。製剤は、シリンジによって液体を注入し、そして製剤を抜き得るゴム栓で封をされた、滅菌処理されたガラス容器に保存され得る。
【００４９】
本明細書に記載の全ての方法に関して、治療上効果的な用量の何れかの特定の化合物、本発明の範囲でのそれの使用は、化合物毎に、そして対象毎にいくらか変化し得、また対象の状態および送達経路に依存する。対象の体重当たり約１mg/kgから約１５mg/kg、または約２０mg/kg、または約２５mg/kgでさえ、静脈注射もしくは経口投与を用い得る。
【００５０】
本発明の製剤中の、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩の濃度は、熟練した技術者によって決定され、そして処置されるべき対象の性質(例えば種、年齢、体重など)、重症度、および感染したウイルスのタイプ、または対象がワクチン投与された株、用いられた投与形などを含む、特定の状態に従って変化する。
【００５１】
本発明の化合物は、他の抗ウイルス化合物と組み合わせて投与され得、それは熟練した技術者によって決定され得る。
本発明は、下記の実施例でより詳細に説明されている。これらの実施例は、本発明を例示することを意図しており、それを制限するものではない。
【００５２】
実施例１−１２：本発明の化合物の合成
下記の実施例において、化合物番号(化合物２、５、５ａなど)は、図１に示した構造を有する化合物を言う。
【００５３】
実施例１
一般的な方法：化学合成と分析
融点を、MEL-TEMP(登録商標) 3.0 キャピラリー融点測定装置で決定し、補正していていない。１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを、Varian Unity +300 または Varian VRX 400 で記録し、ピークの帰属を、残余ＤＭＳＯ(2.49ppm) またはＣＨＣｌ３(7.24ppm)と比較して行った。質量分析を、VG Instruments 70-SE spectrometer (the Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA)で記録した。元素分析を、Atlantic Microlab, Norcross, GA で行った。全ての最終化合物は、元素分析の前に、真空下(オイルポンプ)、５０−６０℃で、少なくとも３６時間乾燥した。別記しない限り、全ての試薬および溶媒(無水溶媒を含む)は、Aldrich Chemical Co., Fisher Scientific または Lancaster Synthesis から購入してそのまま用いた。アセトニトリル(ＣａＨ２)、トリエチルアミン(ＣａＨ２)、およびエタノール(Ｍｇ／Ｉ２)は、示した乾燥剤を用いて蒸留した。２,６−ジメチル−４−ニトロブロモベンゼン、およびＳ−(２−ナフチルメチル)チオアセトイミデートは、文献に従って製造した[B.M. Wepster, Rec. Trav. Chim. 73, 809-818 (1954); D.N. Kravtsov, J. Organometal. Chem. 36, 227-237 (1972); B.G. Shearer et al., Tetrahedron Lett. 38, 179-182 (1997) 参照]。
【００５４】
実施例２
２,５−ビス(４−ニトロフェニル)フラン
下記に示した製法は、先の A. Kumar et al., Heterocyclic Comm. 5, 301-304 (1999) に記載された一般的な製法を変えた方法である。
【００５５】
２,５−ビス(２−メチル−４−ニトロフェニル)フラン(化合物２ｂ)
無水１,４−ジオキサン(５０ml)中の、２−ブロモ−５−ニトロトルエン(４.３２ｇ, ２０mmol)と、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)(０.４０ｇ)の溶液に、２,５−ビス(トリ−ｎ−ブチルスタンニル)フラン(６.４６ｇ, １０mmol)を加え、混合物を、窒素雰囲気下、９５−１００℃で一晩加熱した。得られたオレンジ色の懸濁液をヘキサン(１５ml)で希釈し、室温まで冷却し、ろ過し、ヘキサンですすぎ、オレンジ色の固体(３.１０ｇ)を得た。
ｍｐ  ２４１−２４３℃；
生成物をＤＭＦ(１００ml)から再結晶し、明橙色の綿状固体(２.８７ｇ, ８５％)を得た。
ｍｐ  ２４２−２４３℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  2.69 (s, 6H), 7.31 (s, 2H), 8.12 (m, 4H), 8.23 (s, 2H)；
元素分析：Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ５(３３８.３１)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００５６】
２,５−ビス(４−ニトロフェニル)フラン(化合物２ａ)
収率：８８％；
オレンジ色の綿状固体；
ｍｐ  ２６９−２７０℃(再結晶せず)；文献値 ｍｐ  ２７０−２７２℃；
Ling, C. et al.,  J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 8784-8792.
【００５７】
２,５−ビス(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)フラン(化合物２ｃ)
収率：７７％；
明橙色の粒状固体；
ｍｐ  ３０８−３１０℃(ＤＭＦ)；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  4.10 (s, 6H), 7.37 (s, 2H), 7.90 (s, 2H), 7.94 (d, 2H), 8.22 (d, 2H)；
元素分析：Ｃ１８Ｈ１４Ｎ２Ｏ７・０.１Ｈ２Ｏ(３７２.１１)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００５８】
２,５−ビス(２−クロロ−４−ニトロフェニル)フラン(化合物２ｄ)
収率：７１％；
綿状のオレンジ色の固体；
ｍｐ  ２４７−２４７.５℃(ＤＭＦ／ＭｅＯＨ)；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  7.70 (s, 2H), 8.29 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 2H), 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.43 (d, J = 2.2 Hz, 2H)；
元素分析：Ｃ１６Ｈ８Ｃ１２Ｎ２Ｏ５(３７９.１５)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００５９】
２,５−ビス(４−ニトロ−２−トリフルオロメチルフェニル)フラン(化合物２ｅ)
収率：７４％；
綿状黄色針状固体；
ｍｐ  １５８.５−１５９℃(ＥｔＯＨ)；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  7.38 (s, 2H), 8.24 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.57 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 8.62 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 2H)；
元素分析：Ｃ１８Ｈ８Ｆ６Ｎ２Ｏ５(４４６.２６)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００６０】
２,５−ビス(２,６−ジメチル−４−ニトロフェニル)フラン(化合物２ｆ)
収率：６５％；
黄色針状固体；
ｍｐ  １５６.５−１５７.５℃(ＤＭＦ／ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ)；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 2.34 (s, 12H), 6.85 (s, 2H), 8.04 (s, 4H)
元素分析：Ｃ２０Ｈ１８Ｎ２Ｏ５(３６６.３６)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００６１】
実施例３
２,５−ビス(４−アミノフェニル)フランの製法
下記の製法を示す。
２,５−ビス(４−アミノ−２−メチルフェニル)フラン(化合物３ｂ)
ＥｔＯＡｃ(９０ml)と乾燥ＥｔＯＨ(１０ml)中の、化合物２ｂのビス−ニトロ誘導体(２.８７ｇ)の懸濁液に、Ｐｄ／Ｃ(１０％)(０.４０ｇ)を加え、パール社製の装置で、〜５０ｐｓｉの初期圧力で、混合物を水素化した。水素吸収が停止した後(一般的に３−６時間)、得られた溶液をセライトでろ過し、薄黄色から無色のろ液を真空下でほとんど乾固するまで濃縮し、ヘキサンで希釈した後、純粋なジアミンを薄黄色／緑色の固体として得た(２.１７ｇ, ９１％)。
ｍｐ  １７４−１７６℃(精製を要しなかった)；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  2.33 (s, 6H), 5.15 (br s, 4H), 6.42 (s, 2H), 6.46 (m, 4H), 7.35 (d, 2H)；
ＭＳ  (ＥＩ)：ｍ／ｚ  ２７８(Ｍ＋).
【００６２】
２,５−ビス(４−アミノフェニル)フラン(化合物３ａ)
収率：９４％；
薄緑色／黄褐色の固体；
ｍｐ  ２１８−２２１℃；
文献値４６  ｍｐ  ２１３−２１６℃；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ  ２５０(Ｍ＋).
【００６３】
２,５−ビス(４−アミノ−２−メトキシフェニル)フラン(化合物３ｃ)
元の油状物をベンゼンで再度濃縮し、エーテルでトリチュレートし、黄色／褐色の固体を得た。
収率：７９％；
ｍｐ  ２０１−２０２.５℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  3.80 (s, 6H), 5.25 (br s, 4H), 6.24 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 2H), 6.30 (d, J = 1.9 Hz 2H), 6.56 (s, 2H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H)；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ  ３１０(Ｍ＋).
【００６４】
２,５−ビス(４−アミノ−２−トリフルオロメチルフェニル)フラン (化合物３ｅ)
元の赤い油状物は、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから結晶化され、第２晶までを赤色／橙色の固体として得た。
合併収率：８１％；
ｍｐ  (第１晶／主要部分)  ８９.５−９１℃；
ｍｐ  (第２晶)  ９１.５−９２℃；
１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６): 5.79 (br s, 4H), 6.52 (s, 2H), 6.82 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H)；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ  ３８６(Ｍ＋).
【００６５】
２,５−ビス(４−アミノ−２,６−ジメチルフェニル)フラン(化合物３ｆ)
収率：９９％；
白色綿状固体；
ｍｐ  １４４.５−１４６  ℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  2.01 (s, 6H), 5.06 (br s, 4H), 6.24 (s, 2H), 6.29 (s, 4H)；
ＭＳ  (ＥＩ)：ｍ／ｚ  ３０６(Ｍ＋).
【００６６】
２,５−ビス(４−アミノ−２−クロロフェニル)フラン(化合物３ｄ)
乾燥ＥｔＯＨ(１００ml)とＤＭＳＯ(２０ml)中、対応するビス−ニトロ誘導体２ｄ(１.２２ｇ, ３.２mmol)の懸濁液に、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ(５.８０ｇ, ２５.７mmol)を加え、混合物を、窒素雰囲気下、８０℃で加熱した。４−５時間後、ＴＬＣで出発物質が消費されたことが示された。それから、混合物を冷却し、ＮａＯＨ(ａｑ)で中和し、ＥｔＯＡｃで抽出した。抽出物を水、塩水で洗浄し、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４)し、濃縮した。得られた油状物をベンゼン／ヘキサン混合液から部分濃縮によって結晶化させ、明褐色の固体を得た(０.７４ｇ, ７１％)。
ｍｐ  １９１.５−１９３℃；
接触還元法は検討しなかった；
１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：5.60 (br s, 4H), 6.61 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 2.2 Hz 2H), 6.82 (s, 2H), 7.56 (d, J = 8.6 Hz, 2H)；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ  ３１８(Ｍ＋).
【００６７】
実施例４
２,５−ビス(４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン誘導体の製法
下記に手順を示す。
【００６８】
２,５−ビス(４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン (化合物４ａ)
無水ＤＭＦ中の、２,５−ビス(４−アミノフェニル)フラン(０.６２６ｇ, ２.５mmol)と、１,３−ビス(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル)−２−メチル−２−チオ シュード ウレア(１.５６ｇ, ５.３mmol)の室温の溶液に、トリエチルアミン(１.５９ｇ, １５.７mmol)を、次に塩化水銀(II)(１.５７ｇ, ５.８mmol)を加え、得られた懸濁液を室温で２２時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２と炭酸ナトリウム溶液で希釈した後、懸濁液をセライトでろ過し、ろ液を水でよく洗浄し(３回)、最後に塩水で洗浄した。乾燥後(Ｎａ２ＳＯ４)、溶媒を真空下で除去し、残さをＭｅＯＨで希釈し、ＢＯＣ保護ビス−グアニジンを、薄黄色の固体として得た。集めた生成物をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨから再沈殿させることによって精製し、綿状の黄色の固体を得た(１.２５ｇ, ６８％)。
ｍｐ  ＞４００℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.50 and 1.53 (2s, 36H), 6.65 (s, 2H), 7.66 (s, 8H), 10.38 (br s, 2H), 11.61 (br s, 2H).
【００６９】
２,５−ビス(２−メチル−４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン(化合物４ｂ)
黄色の固体；
ｍｐ  ＞２５０℃  分解；
収率：６２％；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.51 and 1.52 (2s, 36H), 2.53 (s, 6H), 6.60 (s, 2H), 7.40 (s, 2H), 7.62 (d, 2H), 7.74 (d, 2H), 10.34 (s, 2H), 11.62 (br s, 2H).
【００７０】
２,５−ビス(２−メトキシ−４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン(化合物４ｃ)
黄色の固体；
ｍｐ  ＞３００℃  分解；
収率：７９％；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.50 and 1.53 (2s, 36H), 3.95 (s, 6H), 6.95 (s, 2H), 7.13 (d, 2H), 7.59 (s, 2H), 7.86 (d, 2H), 10.36 (s, 2H), 11.55 (br s, 2H).
【００７１】
２,５−ビス(２−クロロ−４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン(化合物４ｄ)
薄黄色／褐色の固体；
ｍｐ  ＞４００℃  分解；
収率：６３％；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.52 (s, 36H), 7.17 (s, 2H), 7.63 (dd, 2H), 7.79 (d, 2H), 7.88 (d, 2H), 10.43 (s, 2H), 11.59 (br s, 2H).
【００７２】
２,５−ビス(２−トリフルオロメチル−４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン(化合物４ｅ)
明橙色の固体；
収率：８８％；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.51 and 1.53 (2s, 36H), 6.77 (s, 2H), 7.82 (d, 2H), 7.94 (s, 2H), 8.00 (d, 2H), 10.52 (s, 2H), 11.59 (br s, 2H).
【００７３】
２,５−ビス(２,６−ジメチル−４−Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジノフェニル)フラン(化合物４ｆ)
薄黄色／灰白色の固体；
ｍｐ  ＞３００℃  分解；
収率：８９％；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３):  1.51 and 1.53 (2s, 36H), 2.23 (s, 12H), 6.31 (s, 2H), 7.33 (s, 4H), 10.27 (s, 2H), 11.63 (br s, 2H).
【００７４】
実施例５
Ｎ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジンの脱保護
下記に手順を表し、さらに図１に示す。
２,５−ビス(４−グアニジノフェニル)フラン 二塩酸塩(化合物５ａ)
ＣＨ２Ｃｌ２(１５ml)中の、対応するＮ,Ｎ'−ジ−ＢＯＣ−グアニジン(１.１９ｇ, １.６２mmol)の溶液を、乾燥ＥｔＯＨ(１０ml)で希釈し、氷−水浴温度で、無水ＨＣｌで飽和にした。溶液を室温で２−３日間攪拌すると(乾燥チューブ)、生成物がゆっくりと沈殿した(一般的に、より短い反応時間では、脱保護が不完全になる)。得られた懸濁液をほとんど乾固するまで濃縮し、固体を熱ＥｔＯＨにとった。澄明化するためにろ過した後、溶液をほとんど乾固するまで濃縮し、懸濁液を得た。それをエーテルで希釈し、真空下、５０−６０℃で、２日間乾燥した後、ビス−グアニジノ二塩酸塩を、灰白色／褐色の固体として得た(０.６６ｇ, 定量的)。
ｍｐ  ＞３００℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  7.12 (s, 2H), 7.31 (d, 4H), 7.58 (br s, 8H), 7.86 (d, 4H), 10.09 (br s, 2H)；
ＭＳ(ＦＡＢ, thioglycerol)：ｍ／ｚ  ３３５.３(ＭＨ＋, １００)；
元素分析  Ｃ１８Ｈ１８Ｎ６Ｏ・２ＨＣｌ・０.２５ＥｔＯＨ(４０７.３０)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００７５】
２,５−ビス(４−グアニジノ−２−メチルフェニル)フラン二塩酸塩(化合物５ｂ)
褐色の固体；
ｍｐ  ２６５−２７１℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  2.53 (s, 6H), 6.93 (s, 2H), 7.17 (m, 4H), 7.56 (br s, 8H), 7.82 (d, 2H), 10.06 (br s, 2H)；
ＭＳ(ＦＡＢ, thioglycerol)：ｍ／ｚ  ３６３.３(ＭＨ＋, １００)；
元素分析  Ｃ２０Ｈ２２Ｎ６Ｏ・２ＨＣｌ・１.５Ｈ２Ｏ・０.６６ＥｔＯＨ(４９６.９３)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００７６】
２,５−ビス(４−グアニジノ−２−メトキシフェニル)フラン二塩酸塩(化合物５ｃ)
明褐色の固体；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  3.95 (s, 6H), 6.92 (dd, 2H), 6.99 (d, 2H), 7.02 (s, 2H), 7.58 (br s, 8H), 7.95 (d, 2H), 10.08 (br s, 2H)；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ  ３５２(Ｍ＋−ＮＨ２ＣＮ, ３８.０), ３１０(１００), ２６７(３８.９), ２５１(８.８), １５５(１８.７)；
元素分析  Ｃ２０Ｈ２２Ｎ６Ｏ３・２ＨＣｌ・１.０Ｈ２Ｏ・０.３３ＥｔＯＨ(５００.５７)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００７７】
２,５−ビス(２−クロロ−４−グアニジノフェニル)フラン二塩酸塩(化合物５ｄ)
褐色の固体；
ｍｐ  ３００−３０４℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 7.31 (s, 2H), 7.33 (d, 2H), 7.47 (s, 2H), 7.72 (br s, 8H), 8.04 (d, 2H)；
ＭＳ(ＤＣＩ, アンモニア)：ｍ／ｚ  ３６５, ３６３, ３６１(ＭＨ＋−ＮＨ２ＣＮ, ８, ５２, ７８), ３２３, ３２１, ３１９(１１, ６６, １００)；
元素分析  Ｃ１８Ｈ１６Ｃｌ２Ｎ６Ｏ・２ＨＣｌ・０.５Ｈ２Ｏ(４８５.２１)：Ｃ, Ｈ, Ｎ, Ｃｌ.
【００７８】
２,５−ビス(４−グアニジン−２−トリフルオロメチルフェニル)フラン二塩酸塩(化合物５ｅ)
橙色／赤色の固体；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  6.99 (s, 2H), 7.63 (d, 2H), 7.69 (s, 2H), 7.79 (br s, 8H), 7.91 (d, 2H), 10.37 (br s, 2H)；
ＭＳ(ＣＩ, イソブタン)：ｍ／ｚ  ４７１(ＭＨ＋, １４), ４２９(１００), ３８７(１９)；
元素分析  Ｃ２０Ｈ１６Ｆ６Ｎ６Ｏ・２ＨＣｌ・０.６７Ｈ２Ｏ・０.６７ＥｔＯＨ(５８６.２４)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００７９】
２,５−ビス(４−グアニジノ−２,６−ジメチルフェニル)フラン二塩酸塩(化合物５ｆ)
灰白色の固体；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６)：2.20 (s, 12H), 6.56 (s, 2H), 7.01 (s, 4H), 7.57 (br s, 8H), 10.09 (br s, 2H)；
ＭＳ(ＦＡＢ, thioglycerol)：ｍ／ｚ  ３９１.２(ＭＨ＋, １００)；
元素分析  Ｃ２２Ｈ２６Ｎ６Ｏ・２ＨＣｌ・０.５Ｈ２Ｏ(４７２.４１)：Ｃ, Ｈ, Ｎ.
【００８０】
実施例６
２−[５(６)−アミジノ−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−ニトロフェニル)フランの製法
４０mlのエタノール中(窒素雰囲気下)の、５−(４−ニトロフェニル)フルフラール(０.６５１ｇ, ０.００３mol)と、４−アミジノ−１,２−フェニレンジアミン(０.６１４ｇ, ０.００３mol)と、１,４−ベンゾキノン(０.３２４ｇ, ０.００３mol)の混合物を、８時間還流した。反応混合物の容積を減圧下で２０mlまで減らし、冷却し、得られた固体をろ過によって集めた。固体を冷エタノールとエーテルで洗浄した。生成物を乾燥し、一塩酸塩０.８ｇを得た(７０％)。一塩酸塩(０.６５ｇ)を、１２０mlのエタノールに溶解し、ＨＣｌ飽和エタノールで酸性にし、冷蔵庫で一晩放置した後、得られた固体をろ過し、エーテルで洗浄し、真空下、７０℃のオーブンで、２４時間乾燥し、０.６ｇ得た(８５％)。
ｍｐ  ３００℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６):  9.3 (br s,  2H), 9.09 (br s, 2H), 8.33 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 7.6 Hz 2H), 8.19 (s,1H), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 3.6 Hz 1H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 165.9, 152.6, 146.4, 145.4, 145.3, 141.6, 138.7, 134.7, 124.6, 124.0, 122.1, 121.5, 116.0, 114.6, 114.0, 111.9；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３４８(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ１８Ｈ１３Ｎ５Ｏ３・２ＨＣｌ)：Ｃ, ５１.４４；Ｈ, ３.５９；Ｎ, １６.６６；
実測値：Ｃ, ５１.２４；Ｈ, ４.０３；Ｎ, １６.９２ .
【００８１】
実施例７
２−[５(６)−アミジノ−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−アミノフェニル)フランの製法
１３０mlのメタノール中の、上記のニトロ アナログ(０.５ｇ, ０.００１３mol)と、０.３ｇの１０％ Ｐｄ／Ｃを、５０ｐｓｉで４時間水素化した。触媒をろ過助剤を用いるろ過によって除き、溶媒を減圧下で除去した。固体をメタノール性のＨＣｌに取り、水浴上で０.５時間温め、溶媒を減圧下で除いた。残さをエーテルで処理し、固体をろ過によって集め、真空下、７５℃で１２時間乾燥し、０.４４ｇ得た(７３％)。
ｍｐ  ＞３６０℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ):  8.07 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.74(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.66 (dd, J = 1.6 and 8.4 Hz 2H), 7.39 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 3.6 Hz, 1H),6.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ): 166.2, 156.7, 145.8, 142.0, 141.0, 138.1, 126.2, 123.2, 122.3, 119.2, 116.6, 116.0, 115.1, 107.5；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３１８(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ１８Ｈ１５Ｎ５Ｏ・３ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ)：Ｃ, ４３.５９；Ｈ, ６.０９；Ｎ, １６.９２；
実測値：Ｃ, ４３.７１；Ｈ, ６.０１；Ｎ, １６.８１ .
【００８２】
実施例８
[２−[５(６)−{２−イミダゾリニル}−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−ニトロフェニル)フランの製法
４０mlのエタノール(窒素雰囲気下)中の、５−(４−ニトロフェニル)フルフラール(０.４３４ｇ, ０.００２mol)と、４−(２−イミダゾリニル)−１,２−フェニレンジアミン塩酸塩水和物(０.４６１ｇ, ０.００２mol)と、１,４−ベンゾキノン(０.２１６ｇ, ０.００２mol)の混合物を、８時間還流した。反応混合物の容積を減圧下で２０mlまで減らし、冷却し、得られた固体をろ過によって集めた。固体を冷エタノールとエーテルで洗浄した。生成物を乾燥し、０.５２ｇ得た(６３％)。本化合物を２００mlのエタノールに溶解し、ＨＣｌ飽和エタノールで酸性にし、室温で３時間攪拌した。混合物を氷上で冷却し、固体を集め、真空下、７５℃のオーブンで乾燥し、０.５１ｇ得た(９０％)。
ｍｐ  ＞３００℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ): 8.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.81 (s, 2H), 7.52 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.03 (s,4H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６ ／Ｄ２Ｏ): 165.6, 153.1, 146.8, 145.7, 145.2, 134.7, 124.9, 124.2, 122.8, 116.9, 115.8, 115.1, 115.0, 112.1, 105.6, 104.7, 44.2；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３７４(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ２０Ｈ１５Ｎ５Ｏ３・２ＨＣｌ)：Ｃ, ５３.８２；Ｈ, ３.８８；Ｎ, １５.６９；
実測値：Ｃ, ５３.９４；Ｈ, ３.９３；Ｎ, １５.８４ .
【００８３】
実施例９
２−[５(６)−{２−イミダゾリニル}−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−アミノフェニル)フランの製法
１３０mlのメタノール中の、上記のニトロ アナログの一塩酸塩(０.５ｇ, ０.００１３mol)と、０.２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃの混合物を、５０ｐｓｉで４時間水素化した。触媒をろ過助剤でろ過することによって除き、温メタノールで洗浄した。減圧下で溶媒の体積を約半分になるまで減らした。溶液を含んだフラスコを氷浴上に置き、ＨＣｌガスで飽和させた。混合物を室温で４時間攪拌し、乾燥エーテルで処理し、固体をろ過によって集めた。固体を真空下、７５℃で２４時間乾燥し、０.５５ｇ得た(８６％)。
ｍｐ  ＞３００℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ): 8.24 (d, J = 1.2 Hz 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.51(d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H),7.10 (dd, J = 1.2,3.6Hz, 1H), 4.0 (s,4H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６ ／Ｄ２Ｏ): 165.8, 156.4, 145.8, 142.0, 140.9, 137.9, 126.2, 123.7, 121.0, 117.0, 116.8, 115.3, 108.5, 44.6；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３４４(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ２０Ｈ１７Ｎ５Ｏ・３ＨＣｌ・２.１Ｈ２Ｏ)：Ｃ, ４８.９６；Ｈ, ４.９７；Ｎ, １４.２７；
実測値：Ｃ, ４８.５８；Ｈ, ４.３２；Ｎ, １４.２７ .
【００８４】
実施例１０
２−[５(６)−{Ｎ−イソプロピルアミジノ}−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−ニトロフェニル)フランの製法
４０mlのエタノール(窒素雰囲気下)中の、５−(４−ニトロフェニル)フルフラール(０.４３４ｇ, ０.００２mol)と、４−Ｎ−イソプロピルアミジノ−１,２−フェニレンジアミン塩酸塩水和物(０.４９３ｇ, ０.００２mol)と、１,４−ベンゾキノン(０.２１６ｇ, ０.００２mol)の混合物を、６時間還流した。反応混合物の容積を、減圧下、約１５mlまで減らし、混合物を冷却し、得られた固体をろ過によって集め、一塩酸塩０.６６ｇを得た(８０％)。一塩酸塩を１００mlのエタノールに溶解し、ＨＣｌ飽和エタノールで酸性にし、氷浴上で冷却した後、固体をろ過し、エーテルで洗浄し、真空下、７５℃のオーブンで、２４時間乾燥し、０.７ｇ得た(９１％)。
ｍｐ  ＞３００℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ):  8.26  (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 8.8 Hz 2H), 8.01 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.59 (dd, J =1.2, 8.8 Hz, 1H),7.50(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.6 Hz 1H),4.04 (septet, J = 6.8 Hz,1H), 1.3(d, J = 6.8 Hz,6H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 162.7, 153.8, 147.2, 145.2, 144.8, 140.7, 138.2, 135.2, 125.4, 124.7, 124.0, 123.5, 116.3, 115.9, 115.3, 112.6, 45.6, 21.4；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３７６(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ２１Ｈ１９Ｎ５Ｏ３・２ＨＣｌ・２.０Ｈ２Ｏ)：Ｃ, ４９.７１；Ｈ, ５.１６；Ｎ, １３.８０；
実測値：Ｃ, ４９.６５；Ｈ, ５.１１；Ｎ, １３.５０ .
【００８５】
実施例１１
２−[５(６)−Ｎ−イソプロピルアミジノ−２−ベンゾイミダゾリル]−５−(４−アミノフェニル)フラン
１２０mlのメタノール中の、上記のニトロ アナログの一塩酸塩(０.４１１ｇ, ０.００１mol)と、０.３ｇの１０％ Ｐｄ／Ｃを、５０ｐｓｉで４時間水素化した。触媒をろ過助剤でろ過することによって除き、温メタノールで洗浄した。溶媒の体積を減圧下で約半分に減らした。溶液を含むフラスコを氷浴上に置き、ＨＣｌガスで飽和にした。混合物を室温で４時間攪拌し、乾燥エーテルで処理し、固体をろ過によって集めた。固体を真空下、８０℃で２４時間乾燥し、０.４１ｇ得た(８７％)。
ｍｐ  ＞３００℃；
１Ｈ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ):  8.04  (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz 2H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz 1H), 7.64 (dd, J =  1.6,8.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J =4.0 Hz, 1H),7.24(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 4.0 Hz 1H),4.05 (septet, J = 6.4 Hz,1H), 1.3(d, J = 6.4 Hz,6H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 162.4, 156.8, 144.4, 140.9, 138.8, 137.6, 135.0, 126.3, 125.4, 124.6, 124.1, 121.1, 118.0, 115.6, 114.9, 108.6, 45.6, 21.3；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３６０(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ２１Ｈ２１Ｎ５Ｏ３・３ＨＣｌ)：Ｃ, ５３.８０；Ｈ, ５.１５；Ｎ, １４.９３；
実測値：Ｃ, ５４.２２；Ｈ, ４.７５；Ｎ, １５.０５ .
【００８６】
実施例１２
２,５−ビス(２−ベンゾイミダゾリル−４−シアノフェニル)フラン
５０mlの乾燥エタノール中の、５−[４−シアノフェニル]−２−フランカルボキシアルデヒド(１.９７ｇ, ０.０１mol)と、１,２−フェニレンジアミン(１.０６ｇ, ０.０１mol)と、１,４−ベンゾキノン(１.０８ｇ, ０.０１mol)を、８時間還流した(窒素雰囲気下)。反応混合物を冷却し、エーテルで希釈し、ろ過した。固体を集め、ＥｔＯＨとエーテルの１：３混合物と共に、２０分間攪拌し、黄褐色の固体をろ過し、エーテルで洗浄し、真空下、７０℃で１２時間乾燥し、１.９６ｇ得た(６９％)。
ｍｐ  ２２７−８℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６): 8.06 (d, 2H, J = 8.8Hz), 7.91(d, 2H,J= 8.8Hz), 7.60 (dd, 2H, J = 3.2Hz, J= 6.4Hz), 7.38 (d, 1H, J= 3.6Hz), 7.32(d, 1H, J= 3.6Hz), 7.23 (dd, 2H, J= 3.2Hz, J= 6.4Hz)；
１３Ｃ−ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６): 152.1, 146.0, 142.7, 138.7, 133.2, 132.6, 124.1, 122.3, 118.4, 114.9, 112.5, 111.1, 109.8；
ＭＳ：ｍ／ｅ  ２８５(Ｍ＋)；
元素分析  計算値(Ｃ１８Ｈ１１Ｎ３Ｏ)：Ｃ, ７５.７９；Ｈ, ３.８６；Ｎ, １４.７３；
計算値：Ｃ, ７５.８８；Ｈ, ３.７７；Ｎ, １４.５５ .
【００８７】
２,５−ビス[２−ベンゾイミダゾリル−４−(アミジノ)フェニル]フラン二塩酸塩
６０mlのエタノール中の、上記のシアノ化合物(２.８５ｇ, ０.０１mol)を、０−５℃で、乾燥ＨＣｌガスで飽和にした。反応混合物を室温で１２日間攪拌した(ＩＲとＴＬＣでモニターした)。混合物をエーテルで希釈し、黄色のイミデート エステル塩酸塩をろ過し、エーテルで洗浄し、真空下で６時間乾燥し、３.７３ｇ得た(９２％)。その固体をさらに精製することなく次の段階に用いた。３５mlのエタノール中の、イミデート エステル塩酸塩(０.８０８ｇ, ０.００２mol)の懸濁液を、０−５℃で、アンモニア ガスで飽和にし、室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧下で１／３まで減らし、エーテルで希釈し、ろ過した。黄色の固体を１０mlのエタノールに再度懸濁し、４mlの飽和エタノール性ＨＣｌで処理し、３５℃で２時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残さをエーテルでトリチュレートし、ろ過し、エーテルで洗浄し、真空下、４５℃で２４時間乾燥し、０.６１ｇの黄色の固体を得た(８１％)。
ｍｐ  ＞２８０℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ): 8.15(d, 2H, J = 8.7Hz), 7.93 (d, 2H, J = 8.7Hz), 7.78 (d, 1H, J = 3.6Hz), 7.75 (dd, 2H, J = 3Hz, J = 6.3Hz), 7.50 (d, 1H, J = 3.6Hz), 7.49 (dd, 1H, J = 3Hz, J = 6.3Hz)；
１３Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６): 165.0, 155.9, 139.8, 139.7, 133.4, 132.4, 129.3, 127.8, 126.3, 125.2, 119.5, 114.3, 112.0；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３０３(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ１８Ｈ１４Ｎ４Ｏ・２ＨＣｌ)：Ｃ, ５７.６１；Ｈ, ４.２９；Ｎ, １４.９３；
実測値；Ｃ, ５７.４５；Ｈ, ４.４６；Ｎ, １４.６４ .
【００８８】
２,５−ビス[２−ベンゾイミダゾリル−４−(２−イミダゾリノ)フェニル]フラン二塩酸塩
２０mlの乾燥エタノール中の、上記のイミデート エステル塩酸塩(０.８０８ｇ, ０.００２mol)と、エチレンジアミン(０.１２ｇ, ０.００２mol)を、１２時間還流した。溶媒の体積を減圧下で８mlまで減らし、エーテルで希釈した。得られた固体をろ過し 乾燥した。この固体を３５mlの熱エタノールに溶解し、室温でＨＣｌガスで飽和にした。混合物を５０℃で２時間攪拌し、減圧下で濃縮し、３０mlの乾燥エーテルを加えた。沈殿した黄色の塩をろ過し、エーテルで洗浄し、真空下、７０℃で２４時間乾燥し、０.６９ｇの黄色の固体を得た(８４％)。
ｍｐ  ＞３００℃  分解；
１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ): 8.06(d, 2H, J=8.7Hz), 7.91 (d, 2H, J=8.7Hz), 7.71 (dd, 2H, J=3Hz, J=6Hz), 7.64 (d, 1H, J=3.9Hz), 7.47(dd, 1H, J=3Hz, J=6.3Hz), 7.44 (d, 1H, J=3.9Hz), 3.94 (s, 4H)；
１３Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６): 164.6, 155.7, 140.3, 140.1, 133.9, 132.9, 129.7, 126.7, 125.4, 122.1, 119.2, 114.6, 112.5, 44.8；
ＦＡＢＭＳ：ｍ／ｅ  ３０３(Ｍ＋＋１)；
元素分析  計算値(Ｃ２０Ｈ１６Ｎ４Ｏ・２ＨＣｌ・０.５Ｈ２Ｏ)：Ｃ, ５８.５４；Ｈ,４.６７；Ｎ, １３.６５；
実測値；Ｃ, ５８.５４；Ｈ, ４.６７；Ｎ, １３.６６ .
【００８９】
実施例１３−２４
本発明の化合物の抗ＢＶＤＶ性
実施例１３
抗ＢＶＤＶ活性のための抗ウイルス性化合物のスクリーニング
２４ウェル プレート中の、２.０ｃｍ２のウェルを、１２mlのＭＥＭ−ｅｑ(１０％(v/v)のウマの血清, 炭酸水素ナトリウム(０.７５mg／ml), Ｌ−グルタミン(０.２９mg／ml), ペニシリン Ｇ(１００Ｕ／ml), ストレプトマイシン(１００μｇ／ml), およびアンホテリシン Ｂ(０.２５μｇ／ml))を加えた、Ｅａｒｌｅ'ｓ塩を加えた最少必須培地(ＭＥＭ)) からの５０μｌの培地に植え付けた。それは、コンフルエントな単層の Madin Darby Bovine Kidney (MDBK)細胞を、２５ｃｍ２のフラスコ中でトリプシン処理することによって得られた。細胞を、３８.５℃で、５％ ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。ウェル当たりの細胞の平均数を決定し、以後適切なＢＶＤＶウイルスの感染数（multiplicities of infection）(ＭＯＩ)を計算するのに用いた。
【００９０】
以下のように、試験抗ウイルス化合物(１２.５μＭ, 全量 ２００μＬ)を含む培地中で、細胞にＢＶＤＶを植え付けた。
２個のウェルはＢＶＤＶなし、かつ抗ウイルス化合物なし；
１個のウェルはＭＯＩ ０.０５のＢＶＤＶ, かつ抗ウイルス化合物なし；
１個のウェルはＭＯＩ １.０のＢＶＤＶ, かつ抗ウイルス化合物なし；
１０個のウェルはＭＯＩ ０.０５のＢＶＤＶ, かつ１２.５μＭの抗ウイルス化合物を含み；
１０個のウェルはＭＯＩ １.０のＢＶＤＶ, かつ１２.５μＭの抗ウイルス化合物を含む。
【００９１】
植え付けた細胞を、３８.５℃で、加湿空気中５％ ＣＯ２で、１時間インキュベートした。培地をウェルから除き、抗ウイルス試験化合物(１２.５μＭ)を含み(始めに抗ウイルス化合物で処理していない ウェル中の細胞は、試験化合物を含まない)、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで、細胞を一度洗浄した。１mlの抗ウイルス化合物(１２.５μＭ)を含むＭＥＭ−ｅｑを、抗ウイルス化合物で始めに処理したウェルに加え；抗ウイルス化合物で始めに処理していないウェルは、この段階でも抗ウイルス化合物を加えない。植え付けてから３日後、培地を除去し、アッセイするために−２０℃で保存した。全量 ２００μＬ(１２.５μＭ)の抗ウイルス化合物を含む１mlの新しい培地を、始めに抗ウイルス化合物で処理したウェルに加えた；始めに抗ウイルス化合物で処理しないウェルは、この段階で抗ウイルス化合物を加えない。植え付けてから７日後、培地を除去し、連続希釈およびアッセイのために−８０℃で保存した。
【００９２】
ＭＤＢＫ細胞を、抗ウイルス化合物を含まないＭＥＭ−ｅｑに再度懸濁した。子宮管細胞(ＵＴＣ)を凍結−解凍し、アッセイするために−８０℃で保存した。ＵＴＣライセートは、７日目の培地から倍数希釈され、ＢＶＤＶの存在について免疫ペルオキシダーゼによってアッセイされた。
【００９３】
実施例１４
ＢＶＤＶの免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイ
A. Afshar  et al., Can J Vet Res ;55:91-93 (1991)に記載のように、免疫ペルオキシダーゼ単層アッセイを用いて、全ての試料をＢＶＤＶについてアッセイした。試料は、９６ウェル培養プレート中、約２.５×１０３個のＭＤＢＫ細胞を含む５０μＬのＭＥＭ−ｅｑを、５０μＬの新しいＭＥＭ−ｅｑを加えた５０μＬのそれぞれの試料に加え、３回アッセイした。免疫ペルオキシダーゼ標識法を行う前に、プレートを、３８.５℃で、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気中、７２時間インキュベートした。
【００９４】
免疫ペルオキシダーゼ標識法は、以下のように行う。
固定後、感染の可能性がある細胞を、ＢＶＤＶの主なエンベロープ糖タンパク質であるＥ２／ｇｐ５３(Xue W et al., Vet Microbiol 57,105-118 (1997))に特異的なモノクローナル抗体 Ｄ８９(M. L. Vickers et al.,  J Vet Diagn Invest 2, 300-302 (1990); Xue W et al., J Clin Microbiol 28,1688-1693 (1990))、および保存された非構造タンパク質であるＮＳ３−ｐ８０(W. V. Corapi et al., Am J Vet Res 51, 1388-1394 (1990))に特異的な２０.１０.６と共にインキュベートした。ＰＢＳと Tween 20 で洗浄し、非結合抗体を除去した後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ(Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA)を加えた。短いインキュベート時間後、非結合ペルオキシダーゼ結合抗体をＰＢＳと Tween 20 で洗浄することによって除去した。最後に、西洋ワサビ ペルオキシダーゼによって酸化した際に赤褐色が生じる、酵素の基質であるアミノエチルカルバゾール(Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA)を加えた。色の変化を光学顕微鏡で視認し、それぞれのプレート上で、既知のポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールと比較した。
【００９５】
実施例１５
組織培養継代
ウイルス保存アリコート以外の全ての試料は、ＢＶＤＶの単離を最適化する組織培養液中で継代した。始めの解凍で、２００μＬのそれぞれの試料は、２４時間前にＭＤＢＫ細胞をシードした２ｃｍ２ ウェルに植え付けられた。継代は、５％ ＣＯ２の加湿空気の雰囲気中で、３８.５℃で５日間(ｄ)培養した。継代は、保存するために−８０℃で凍結した。組織培養継代試料を解凍し、もとの試料からのＢＶＤＶの単離が成功していなければ、ウイルス単離によってアッセイした。それぞれの２つの連続した継代の後、ウイルスが検出されなかった場合のみ、試料はウイルスの単離によってＢＶＤＶを含まないと報告した。
【００９６】
実施例１６
逆転写ネステッドポリメラーゼ連鎖反応アッセイ(ＲＴ−ｎＰＣＲ)
ＢＶＤＶを検出するための逆転写ネステッドポリメラーゼ連鎖反応アッセイは、ウイルス保存アリコート以外の全ての試料で行った。始めに解凍し、QIAamp(登録商標) viral RNA mini kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて、製造者の指示に従って、ＲＮＡを試料から単離した。ＲＮＡ試料は、ＲＴ−ｎＰＣＲを行うまで−８０℃で保存した。
【００９７】
相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)の生成および増幅の全段階は、McGoldrick らのプロトコル(Duffell SJ et al., Vet Rec 1985;117:240-245; Givens MD, et al., Theriogenology 2000;54:1093-1107; Lang-Ree JR, et al., Vet Rec 1994;135:412-413 参照)を修飾して用いて、単一閉管反応(single closed-tube reaction)中で行った。第１段階は、５μＬのトレハロース(２２％(w/v) ストック；Sigma, St Louis, MO, cat #T5251)を用いて、薄い壁の２００μＬのチューブのふたに、下記の混合物：それぞれ０.４μＬのインナー・プライマー ＢＶＤ １８０ および ＨＣＶ ３６８(５０μＭ), １μＬのｄＮＴＰ(１０ｍＭ), および０.２５μＬのＴａｑポリメラーゼ(１.２５U, Promega, Madison, WI)を保存し、維持した。チューブは、保存するまえに、室温で２時間乾燥させた。
【００９８】
第２段階で、始めの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、ふた中に乾燥したトレハロース混合物を含むチューブの底で行った。積層したミネラル・オイル膜(５０μＬ)を通して２μＬのＲＮＡを加え、下記の試薬(Promega)：５μＬの１０×緩衝液, ８μＬのＭｇＣｌ２(２５ｍＭ), ２μＬのｄＮＴＰ(１０ｍＭ), それぞれ１μＬのアウター・プライマー ＢＶＤ １００、およびＨＣＶ ３６８(５μＭ), １μＬの Triton X-100 (１０％保存液), ０.２５μＬのジチオスレイトール(１００ｍＭ), ０.２５μＬ(１０Ｕ)のＲＮＡｓｉｎ, ０.５μＬ(２.５Ｕ)のＴａｑポリメラーゼ, および０.５μＬ(１００Ｕ)のＭＭＬＶ(Moloney Murine Leukemia Virus)逆転写酵素を含む、始めの反応体積(４８μＬ)にした。次に、チューブを下記のサイクル・パラメーター：３７℃で４５分間、９５℃で５分間、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で１分間を２０サイクルにかけた。
【００９９】
７２℃で10分間の最後の伸長段階が、最初の増幅反応を完了させた。第３段階において、チューブを数回上下転倒させて中の試料を混合し、その底部でネステッドポリメラーゼ連鎖反応(ｎＰＣＲ)を開始させた。次にチューブは、１４,０００Ｇで１２秒間遠心分離した後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、そして７２℃で４５秒間を３０サイクル用いたｎＰＣＲの熱サイクルに戻した。７２℃で１０分間の最後の伸長段階が増幅過程を完了した後、４℃で反応を維持した。５μＬのＰＣＲ生成物のアリコートを、１.５％のアガロースゲル電気泳動によって分離した。０.５μｇ／mlのエチジウムブロマイドを含むアガロースゲルは、可視光透過装置を用いてＲＴ−ｎＰＣＲ生成物を可視化する。
【０１００】
アウター・プライマー ＢＶＤ １００ (5'-GGCTAGCCATGCCCTTAG-3') (配列番号１) および ＨＣＶ ３６８ (5'-CCATGTGCCATGTACAG-3') (配列番号２) は、２９０b.p.の配列のウイルスのゲノムの５'非翻訳領域を増幅した。インナー・プライマー ＢＶＤ １８０ (5'-CCTGAGTACAGGGDAGT CGTCA-3') (配列番号３) および ＨＣＶ ３６８ は、始めの単位複製配列中の２１３b.p.の配列を増幅した。新規の ＢＶＤ １８０ プライマーは、１４番目の塩基(Ｄ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ)で縮重し、違いを、ウイルスのストックからの始めのＰＣＲ生成物の automated dye terminator nucleotide sequencing (Nucleic Acid Resource Facility, Auburn University, AL) によって決定された本試験において用いられた、ウイルスの株の５'非翻訳配列に対応させた。
【０１０１】
実施例１７
卵母細胞の収集と成熟
ウシの卵巣をネブラスカ州オマハの屠殺場で集め、近くの研究室に移すためにＰＢＳ中に置いた。１−１０ｍｍの卵胞の内容物を真空速度 ２１.５ml／分で吸引し、７０μｍのフィルター上に注いだ。プールされた卵胞吸引物の細胞の成分は、ＴＬ−ＨＥＰＥＳですすぎ、密集した卵丘細胞の多層によって とり囲まれた卵母細胞を探した。用い得る卵丘細胞−卵母細胞コンプレックス(ＣＯＣ)を、さらに２回ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中で洗浄し、前もって３８.５℃で、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気中で平衡化された ７.５mlの成熟培地中に置いた。次に、成熟培地を封じ、実験室に移して、３８.５℃で、２０から２２時間維持した。
【０１０２】
実施例１８
in vitro 受精／胎児 アッセイ
卵母細胞を１０％(v/v) 熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ；HyClone Lab., Inc., Logan, UT, USA)、ピルビン酸ナトリウム(１１μｇ／ｍｌ)、ウシのＦＳＨ(０.０１Ｕ/ml)、ウシのＬＨ(０.０１Ｕ/ml)、ペニシリン(１００Ｕ/ml)、およびストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)を加えたＥａｒｌｅ'ｓ塩(GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA)を有する細胞培地 １９９(ＣＣＭ １９９)中で成熟させた。
【０１０３】
成熟した卵母細胞は、ＢＳＡ(６mg/ml)、ヘパリン(１０μg/ml)、ペニシルアミン(０.３μｇ／ｍｌ)、ハイポタウリン(hypotaurine)(０.２μｇ／ｍｌ)、ペニシリン(１００U/ml)、およびストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)を有するＣＲ２培地中で受精させた。
【０１０４】
始めの３日の in vitro 培養物(ＩＶＣ)は、ＢＳＡ(６mg/ml)、ペニシリン(１００U/ml)、およびストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)を伴うＣＲ２培地中であった。後の４日のＩＶＣは、１０％(v/v) ＦＢＳ、ペニシリン(１００U/ml)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)を伴うＣＲ２培地中であった。
【０１０５】
実施例１９
牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の曝露
in vitro 成熟(ＩＶＭ)、ＣＯＣを３mlのＭＥＭ−ｅｑで５回洗浄した。洗浄後、ＣＯＣは、３mlのＭＥＭ−ｅｑで非細胞変形株のＢＶＤＶに曝露するか、またはネガティブ・コントロールとして、ＢＶＤＶを含まないＭＥＭ−ｅｑ中に維持した。曝露した および曝露していないＣＯＣを、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３８.５℃で１時間インキュベートし、次に３mlのＴＬ−ＨＥＰＥＳで３回洗浄した後、ＩＶＦを滴下した。
【０１０６】
本試験で用いた非細胞変形株のＢＶＤＶは、２つの異なる遺伝子型Ｉ株(ＳＤ−１ および ＮＹ−１)、および ２つの異なる遺伝子型 II 株(ＣＤ−８７ および ＰＡ−１３１)を含む。MD et al., Theriogenology 2000;54:1093-1107 参照。全てのストックは、ＭＥＭ−ｅｑ中で培養されたＢＶＤＶを含まないＭＤＢＫ細胞において繁殖された。ウイルスは、凍結されそして解凍されることによって集められ、必要となるまで−８０℃の冷却バイアル中で保存された。
【０１０７】
実施例２０
In vitro 受精
成熟したＣＯＣをミネラルオイルの下で４２μＬの受精培地中に置いた。１回で集めた冷却保存したウシの精液を受精に用いた。この精液は、ウイルス単離とＲＴ−ｎＰＣＲによって、ＢＶＤＶを含まないことが確認された。PERCOLL(登録商標)濃度勾配(４５から９０％)分離し、１.５×１０５個の精子をそれぞれの受精液滴に加え、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気中、３８.５℃で１８時間インキュベートした。
【０１０８】
実施例２１
In vitro 培養
ＩＶＦ終了後、接合子と仮定されるものを除去し、ＴＬ−Ｈｅｐｅｓで４回洗浄し、ＢＳＡを加えたＩＶＣ培地で平衡化し、ミネラルオイルの下でＢＳＡを加えたＩＶＣ培地の、３０μｌの液滴中の接合された卵母細胞(１滴当たり１０から１２個)と共に置いた。ＩＶＣプレートを３８.５℃で、５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下、３日間インキュベートした。ＩＶＣ中、始めの３日後、胎児をＴＬ−Ｈｅｐｅｓで３回洗浄し、卵丘細胞の大部分を、滅菌したピペット中に穏やかに吸引することによって除去した。ほぼ裸の胎児を卵割について調べ、５細胞段階またはそれ以上の段階の胎児を、ＩＶＣ培地中で１回以上洗浄した。ミネラルオイルの下で、１０％(v/v) ＦＢＳを有するＩＶＣ培地の６０μｌの液滴(１滴当たり２０から２５個)中の外した卵丘細胞の幾つかを置いた。
これらの成長した胎児をさらに４日間インキュベートした。ＩＶＣの最後の４日の後、胎児を３mlのＭＥＭ−ｅｑに移し、卵丘細胞から分離し、そして桑実期または胚盤期を記録した。
【０１０９】
実施例２２
胎児の洗浄およびトリプシン処理
７日目の胎児の洗浄およびトリプシン処理は、in vivo 由来 ウシの胎児の処理のための the International Embryo Transfer Society によって推奨される手順に従う (Stringfellow DA, et al., Manual of the International Embryo Transfer Society Third Edition., Savoy IL: International Embryo Transfer Society, 1998;79-84)。変性し展開した７日目の胎児は、２ｃｍ２のウェル中、１ｍｌのＭＥＭ−ｅｑで１２回洗浄した。
【０１１０】
トリプシン処理のために、３５ｍｍのペトリ皿中の １２回の３ｍｌの洗浄物を用いた。始めの５回と最後の５回の洗浄液は、０．４％ ＢＳＡ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＰＢＳであった。６回目と７回目の洗浄液は、３ｍｌのＣａ２＋とＭｇ２＋を含まないＨａｎｋ'ｓ平衡塩溶液で １：２５０希釈されたトリプシンであった。胎児をトリプシンで約９０秒間処理した（４５秒／洗浄）後、最後の５回の洗浄を続けた。
【０１１１】
実施例２３
ＢＶＤＶについてアッセイされた試料
１２個の試験用複製(４個の異なるＢＶＤＶ株の３個の複製)のそれぞれの間で、１４０から１８０個のＣＯＣをウイルスに曝露し、５０から８０個のＣＯＣをネガティブ・コントロールとして維持した。それぞれの複製において、試料は曝露された および曝露されていない培地から得られ、ＢＶＤＶについてアッセイされた。ウイルスのストックのアリコートを除く全ての試料を、(ａ)ウイルス検出のための免疫ペルオキシダーゼ・アッセイ；(ｂ)ウイルスを単離しウイルス検出を最適化する前の組織培養経路；および(ｃ)ＲＴ−ｎＰＣＲ；でのウイルスの単離を用いて、ＢＶＤＶについてアッセイした。
【０１１２】
試料は、以下を含む：
ウイルスのストックのアリコート
ＣＯＣを曝露するウイルスのアリコートは、順に希釈し、そして免疫ペルオキシダーゼ・アッセイを用いてウイルスの単離によってアッセイした。
【０１１３】
３日目の卵丘細胞
３日目のＩＶＣについての幾つかの分離された卵丘細胞を、ＴＬ−Ｈｅｐｅｓで３回洗浄して除去し、３ｍｌのＭＥＭ−ｅｑに移し、そして冷却バイアル中の５０μＬのＭＥＭ−ｅｑに置いた。細胞を−８０℃で凍結し解凍することによって溶解し、何れかの細胞内のウイルスを放出させた後、ＢＶＤＶについてアッセイした。
【０１１４】
７日目の卵丘細胞
７日目のＩＶＣについての、曝露された および曝露されていない培地からの卵丘細胞を、３ｍｌのＭＥＭ−ｅｑから、冷却バイアル中の５００μＬのＭＥＭ−ｅｑに移した。細胞を−８０℃で凍結し解凍することによって溶解し、何れかの細胞内のウイルスを放出させた後、ＢＶＤＶについてアッセイした。
【０１１５】
７日目の個々の胎児
十分な数のＢＶＤＶ曝露 Ｍ／Ｂを、７日目の各々の試験複製によって展開し、１０個のＭ／Ｂのグループを以前に記載したように洗浄し、１０個のＭ／Ｂのグループを以前に記載したように、トリプシン処理した。ウイルスに曝露し洗浄したＭ／Ｂを、それぞれ５００μＬのＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり４から５個）中に置くか、または冷却保存し、ＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり４から５個）に入れる前に解凍した。ウイルスに曝露しトリプシン処理したＭ／Ｂを、それぞれ５００μＬのＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり３から５個）、またはそれぞれ冷却保存し、ＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり４から５個）に入れる前に解凍した。全ての試料をバイアルアッセイする前に超音波破砕した。
【０１１６】
十分な数の曝露していないＭ／Ｂを、７日目の複製によってそれぞれ展開した場合は、１０個のＭ／Ｂのグループを以前に記載した通りに洗浄した。曝露していない、洗浄したＭ／Ｂを、それぞれ５００μＬのＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり５個）に直接入れるか または冷却保存し、ＭＥＭ−ｅｑ（複製１つ当たり５個）に入れる前に解凍した。試料はバイアルアッセイする前に超音波破砕した。
【０１１７】
実施例２４
統計的分析および結果
曝露アリコートの組織培養物感染用量 ５０％(ＴＣＩＤ５０)／ｍｌを、Reed and Muench (L. J. Reed and H. Muench,  Am J Hygiene 27, 493-497 (1938))の方法によって決定した。ウイルス検出アッセイの結果を、Pearson Chi-square test statistic (J. Sall and A. Lehman, JMP Start Statistics (Duxbury Press, Belmont, California (1996),195-211)を用いて比較した。
【０１１８】
表２は、ＭＯＩ ０.０５のＢＶＤＶに曝露した後、示された時間、１２.５μＭの示された抗ウイルス化合物で処理された、in vitro 培養培地、および細胞のライセートの分析結果を示す。
【表２】
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【０１１９】
表３は、ＭＯＩ １.０のＢＶＤＶに曝露した後、示された時間、１２.５μＭの濃度で、示された抗ウイルス化合物で処理された、in vitro 培養培地および細胞のライセートの分析結果を示す(実施例１２参照)。
【表３】
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【０１２０】
表４は、ＭＯＩ ０.５のＢＶＤＶに曝露した後、１２.５μＭの濃度で、示された抗ウイルス化合物で処理された、３日目の in vitro 培養培地、および３日目の細胞のライセートの分析結果を示す(実施例１２参照)。
【表４】
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【０１２１】
表５は、ＭＯＩ ０.０５のＢＶＤＶに曝露された後、示された濃度の示された抗ウイルス化合物で３日間処理された３日目の細胞のライセートの分析結果を示している。
【表５】
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【０１２２】
明細書および実施例において、本発明の典型的な好ましい具体的態様は、公開されている。特定の用語を用いたが、それらは一般的な説明の意味で用いられているのみであり、請求項に示した本発明の範囲を制限することを目的としたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、本発明の化合物の合成に有用な ４個の化学スキームを表している。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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