(57)【要約】この発明は、各遺伝子、ＤＮＡフラグメントまたは所定の植物種の特定配列の機能研究を可能にする突然変異体のバンクまたはコレクションの生産方法及びその応用；突然変異体のバンク及び突然変異遺伝子の選択に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）　　 式：ｐｎ ＝ １−（（Ｎ−１）／Ｎ）ｎ （式１）
［ここで、ｐｎ は、所定の遺伝子が突然変異される確率を示し、かつ
Ｎ は、所定の生物について見積もられる全遺伝子数を示す］
を用いる、少なくとも１つの突然変異によって影響を受ける選択植物Ａのゲノムの各遺伝子に必要かつ十分な、電離放射線によって誘発される突然変異数ｎ の理論上の見積り；
（ｂ）　植物ｍごとに所望の突然変異密度及び遺伝子ｙｘでの所望の突然変異頻度が得られるように選択された照射線量 ｘでの野生型種子の照射（ｘ、ｍ及び ｙｘ の関係は、次式２ 及び ３によって示される：
ｍ＝ｎ／ｙｘ （式 ２）、
［ｎは式１と同じ意味で、ｍは植物ごとの突然変異数である］；
ｙｘ ＝ ａｘ ＋ ｆｓ （式３）：
［ａは突然変異誘発因子であり、ｆｓは自然突然変異の頻度である］）、およびＭ１世代の突然変異種子の生産；
（ｃ）　発芽及び培養による、（ｂ）で得たＭ１突然変異種子から得られる、Ｍ１世代の植物の生産、
（ｄ１）　各Ｍ１植物についてのＭ２兄弟種子の収穫、Ｍ２兄弟苗木からのＤＮＡの抽出、及び遺伝的転位の探索のためのマトリクスとして使用される幾つかのＭ２ファミリーに相当するバッチでの該ＤＮＡの貯留；及び
（ｅ１）　減少した大きさのＤＮＡのバッチで行われる、遺伝的転位を検出し得るＰＣＲ技術ベースのスクリーニングによる、（ｄ１）で得られるＤＮＡについて行われる、所定の遺伝子に突然変異を有するＭ２ファミリーの検出
からなることを特徴とする、選択植物Ａの各遺伝子の機能研究用突然変異体のコレクション又はライブラリーの生産方法。
【請求項２】
（ａ）　　 式：ｐｎ ＝ １−（（Ｎ−１）／Ｎ）ｎ （式１）
［ここで、ｐｎ は、所定の遺伝子が突然変異される確率を示し、かつ
Ｎ は、所定の生物について見積もられる全遺伝子数を示す］
を用いる、少なくとも１つの突然変異によって影響を受ける選択植物Ａのゲノムの各遺伝子に必要かつ十分な、電離放射線によって誘発される突然変異数ｎ の理論上の見積り；
（ｂ）　植物ｍごとに所望の突然変異密度及び遺伝子ｙｘでの所望の突然変異頻度が得られるように選択された照射線量 ｘでの野生型種子の照射（ｘ、ｍ及び ｙｘ の関係は、次式２ 及び ３によって示される：
ｍ＝ｎ／ｙｘ （式 ２）、
［ｎは式１と同じ意味で、ｍは植物ごとの突然変異数である］；
ｙｘ ＝ ａｘ ＋ ｆｓ （式３）：
［ａは突然変異誘発因子であり、ｆｓは自然突然変異の頻度である］）、およびＭ１世代の突然変異種子の生産；
（ｃ）　発芽及び培養による、（ｂ）で得たＭ１突然変異種子から得られる、Ｍ１世代の植物の生産、
（ｄ２）　各Ｍ１植物についてのＭ２兄弟種子の収穫、発芽及び培養によるＭ２世代植物の生産、及び個々のＭ２植物のＤＮＡの抽出；及び
（ｅ２）　オリゴヌクレオチドベース遺伝子型チップでの（ｄ２）で得た各ＤＮＡの標識とハイブリダイゼーション、又は定量的ＰＣＲによる、これらの植物で保持される転位の検出及び位置決定
からなることを特徴とする、選択植物Ａの各遺伝子の機能研究用突然変異体のコレクション又はライブラリーの生産方法。
【請求項３】
工程（ｂ）に先立って、照射線量 ｘの選択が、
−　０．０５ Ｇｙ〜２ ｋＧｙの線量でのＭ１種子試料の照射； 適用される線量は、対象の変異原のタイプ及び種による；
−　適当な媒体での種子の発芽；
−　少なくとも５０個の植物をプールしているバッチ中の植物からのＤＮＡの抽出、及びＤＮＡのバッチに相当するバッチにおける該植物のＭ２種子の収穫；
−　工程（ｅ）に述べた条件での該ＤＮＡの増幅、及び遺伝子における突然変異の有無を同定するための増幅配列の検出、及び幾つかの遺伝子についてのこれらの増幅ならびに検出工程の反復；
−　式１、２及び３を用いる、コントロール遺伝子について得られた突然変異数からの、植物ごとの平均的な突然変異数ｍの測定、及び
−　任意の、植物ごとの線量／突然変異数ｍについての曲線の作成
からなることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
方法の工程（ａ）と（ｂ）にしたがって算出される、コレクション中に存在する遺伝子ｙｘごとの平均的な突然変異数が有利に少なくとも２に等しいことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
遺伝的転位をスクリーニングする工程（ｅ１）で行われるＰＣＲ数を減少させるために、植物から得られるＭ２種子のバッチのＤＮＡがそれ自体スーパーバッチに貯留されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
コレクションを構築する各突然変異体が、植物Ａ、又は各要素が植物Ａのゲノム遺伝子について少なくとも１つの突然変異を含む群を形成する突然変異体のゲノムに少なくとも１つの欠失突然変異体を含み、少なくとも１倍、好ましくは５〜１０倍のゲノムを示すことを特徴とする、植物Ａから得られる突然変異体のコレクション。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の突然変異体のコレクションの生産方法を用いて得ることができることを特徴とする請求項６に記載のコレクション。
【請求項８】
Ｍ２世代の種子の代表的な画分を用いる、該種子及び／又はこれらの種子から抽出されるＤＮＡからなることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載のコレクション。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、所定の植物種の各遺伝子、ＤＮＡフラグメント又は所定の配列の機能研究に適した突然変異体のライブラリー又はコレクションの生産方法、及びその応用：突然変異体のライブラリー及び遺伝子の突然変異体の選択方法に関する。
【０００２】
モデル種（ヒト、細菌、酵母、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、コメ）のゲノムの系統的なシーケンシングが、ある量の情報を与え、それにより、基礎的な観点以上に、病状に関与する遺伝子をヒト及び幾つかの動物で同定でき、その結果新たな治療法を生み出すことになるかもしれない。一方、植物では、作物形質の原因である遺伝子の特徴付けにより、作物種の改良促進が可能になるであろう。ゲノム（トランスクリプトーム及びプロテオーム）の発現に関する全体的な解析とともに、生物学で発展されるべき他の重要な領域は、ゲノムの系統的な機能解析である。この場合、生物の発生と生理機能における遺伝子の役割を評価するため、各遺伝子について突然変異アレレ（ヌル又は部分突然変異）を有することを伴う。
【０００３】
植物又は動物の研究用モデルに現在使用されるゲノムの全体的な機能解析用手段は、本質的に
−　挿入突然変異誘発：挿入変異原（植物中のトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ）は、ＰＣＲ、 挿入剤からのプライマー及び遺伝子特異的なプライマーを採用して、簡単に検出できる（Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ， １９９８）。この方法は、特にショウジョウバエ（Ｋａｉｓｅｒら、１９９０）、 酵母（Ｓｍｉｔｈら、１９９５）、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ （Ｚｗａａｌら、１９９３）及び シロイヌナズナ（Ａｚｐｉｒｏｚ−Ｌｅｅｈａｎら、１９９７； Ｂｏｕｃｈｅｚら、１９９８）で開発された。しかし、挿入突然変異体のライブラリーは、構成しがたく、設定するのに多くの作業を要する；また、それらは遺伝的に改変された生物の閉じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）を強制する欠点がある；さらに、それらは作物種に容易に移動できない、
−　相同組換えによる標的化置換（ノック−アウト）、但し高等植物では型どおりには実行できない、及び
−　ＰＣＲによって検出される可能性のある、十分に大きい欠失のような転位
に基づいている。この方法は、ゼブラフィッシュにガンマ線で（Ｆｒｉｔｚら、１９９６）及び線虫に化学的な突然変異誘発で（Ｊａｎｓｅｎら、１９９７）で使用されている。これらの２種には、それぞれ、それらにおけるこの種の方法を利用可能にする特殊性がある。
【０００４】
．　まず、ゼブラフィッシュでは、単為生殖による半数体生物の生産可能性が利用されている。つまり、半数体生物での欠失は、野生型アレレがないために、ＰＣＲ産物の不在によって明らかにできる。ただし、ＤＮＡが個体ごとに分析される条件でである。これは、何千もの突然変異を分析しなければならない際には、比較的効率が悪い。
．　線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓは両性個体生物で、何万もの個体が容易に成長できる。この動物の研究は、低い頻度（１５％）の欠失を生じる化学的な突然変異誘発により、１０万個以上の個体のコレクションで行われている。欠失は、大きさが野生型アレレより小さいＰＣＲ産物の出現によって検出される。突然変異体のＤＮＡは、行われるＰＣＲ数を最小限にできるように、個々には抽出されないが、種々の大きさのバッチで抽出される。したがって、最初の反応は、１０００個の個体のバッチで、次いで１０のサブバッチで、最後に個体で行われる。
このような方法は、したがって、上記の特殊性を有しない生物には使用できない。
【０００５】
ここで、発明者らは、特に電離放射線を使用し、植物の全ゲノムの機能研究に適当な、実際の必要性により良く一致する方法を開発した。
電離放射線（ＩＲ） （Ｘ−線、ガンマ線、高速中性子、重イオン）は強力な突然変異原で、主として大きな転位、本質的には欠失を誘発する（＞７５％）。それは、ショウジョウバエ（Ｋｅｌｌｅｙら、１９８５）、メダカ（Ｋｕｂｏｔａら、１９９５）、ゼブラフィッシュ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、１９８３）、マウス（Ｃａｔｔａｎａｃｈら、１９９３； Ｔｕｒｋｅｒら、１９９７）及びハムスター又はヒト細胞（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９１； Ｇｉｖｅｒら、１９９５）を含むある数の動物、またトウモロコシ（Ｆｕｊｉｉ， １９７８）、コメ（Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍａｎ， １９６９）、マメ科植物Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ （Ｓａｇａｎら、１９９５）及びモデル植物シロイヌナズナ（Ｒｅｄｅｉ， １９７４； Ｓｈｉｒｌｅｙら、１９９２； Ｓｕｎら、１９９２）を含む多くの植物で使用されている。
ＩＲ−誘発突然変異の分子の性質は、本質的には、既知の遺伝子について得られた突然変異体を研究することによって、これらの幾つかの生物で分析されている （Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９６； Ｆｕｓｃｏｅら、１９９２）。認められた突然変異のタイプは、欠失、転位、逆位、挿入及び点突然変異である。これらのタイプは、必ずしも両立しないわけではない。例えば、欠失には挿入又は逆位が伴う場合がある（Ｓｈｉｒｌｅｙ ら、１９９２）。
【０００６】
どのような真核生物を研究しても、欠失は、約７０％の頻度を有する優勢なタイプである（Ｆｕｓｃｏｅら、１９９２； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９６； Ｃｅｃｃｈｉｎｉら、１９９８）。欠失の大きさは様々であるが、遺伝子の完全な欠失は突然変異の大多数（約５０％）を占め、部分欠失は１０〜２５％を占める。
シロイヌナズナのＨＹ４遺伝子（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９６）は、例えば４ ｋｂをカバーしている。単離された２０個のｈｙ４ 突然変異体のうち、１１個（５５％）は８ ｋｂを越える完全な欠失、１個（５％）は８ ｋｂ未満の完全な欠失、３個（１５％）は遺伝子の一方の端と遺伝子外のもう一方の端の欠失、２個（１０％）は遺伝子内に含まれる端の欠失である。残りの３個（１５％）は、ゲノムハイブリダイゼーションで検出可能な改変がない。
【０００７】
しかし、今日記載されるような電離放射線の使用は、既知遺伝子に対する突然変異の特徴づけ（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９６； Ｃｅｃｃｈｉｎｉら、１９９８）、又は突然変異遺伝子のサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによるクローニング（Ｓｕｎら、１９９２）に限定されている。
この理由のため、発明者らは、対象の種に関わらず、各遺伝子又はＤＮＡフラグメントの機能研究を可能にするために、電離放射線で誘発される植物の突然変異体の最適なコレクションを確立する方法を提供することを目的とした。
【０００８】
この発明の対象は、以下からなることを特徴とする、選択植物Ａの各遺伝子の機能研究用突然変異体のコレクション又はライブラリーの生産方法である。
（ａ）　　式：ｐｎ ＝ １−（（Ｎ−１）／Ｎ）ｎ （式１）
［ここで、ｐｎ は、所定の遺伝子が突然変異される確率を示し、かつ
Ｎ は、所定の生物について見積もられる全遺伝子数を示す］
を用いる、少なくとも１つの突然変異によって影響を受ける選択植物Ａのゲノムの各遺伝子に必要かつ十分な、電離放射線によって誘発される突然変異数ｎ の理論上の見積り。
ｑｎ ＝ １−ｐｎ、所定の突然変異について、ｑ１ ＝ （Ｎ−１）／Ｎ
突然変異が互いに独立していると思われる場合には、ｎ個の突然変異について、ｑｎ ＝ （（Ｎ−１）／Ｎ）ｎ。
２０，０００、２５，０００ 及び３０，０００個の遺伝子の仮想上のゲノムについての値を、表Ｉに示す。
【０００９】
【表１】
2004506404.tif 000002
【００１０】
（ｂ）　植物ｍごとに所望の突然変異密度及び遺伝子ｙｘでの所望の突然変異頻度が得られるように選択された照射線量 ｘでの野生型種子の照射（ｘ、ｍ及び ｙｘ の関係は、次式２ 及び ３によって示される：
ｍ＝ｎ／ｙｘ （式 ２）、
［ｎは式１と同じ意味で、ｍは植物ごとの突然変異数である］；
ｙｘ ＝ ａｘ ＋ ｆｓ （式３）：
［ａは突然変異誘発因子であり、ｆｓは自然突然変異の頻度である］）、およびＭ１世代の突然変異種子の生産。
突然変異種子及びそれから得られる植物を、Ｍ１世代と指定する。
したがって、植物ごとの所望の突然変異密度は、適用された照射線量による。この線量は植物ごとの突然変異数を決定するので、その選択は、ライブラリーの複雑性（＝ 個体の全数）を決定し、使用される照射での突然変異誘発の効率を反映する。
【００１１】
ｘ と ｙｘ の関係は比例していると考えられ、使用される照射での突然変異誘発の効率を反映する。
考えられるｙｘ の値に対し、ｆｓは無視できると考えられる。ａの値は、実験的に決定される。
ライブラリーの大きさは、突然変異ｎ（ｔ）の全数に相当して、ゲノムの各領域が少なくとも一度は突然変異されるような大きさであるべきである。したがって、 ｎ（ｔ） ＝ Ｒ．ｎである（Ｒはコレクションの重複性を示し、１より大きいかそれに等しく、ｎ は上記と同じ意味を有する）。用語「重複性」は、所定の遺伝子に対しコレクション中に存在する平均的な突然変異数を意味する。実際、突然変異の表現型の特徴は全て、独立したアレレによって確認されるために大きな価値を有する。したがって、少なくとも１倍、好ましくは５〜１０倍（５≦Ｒ≦１０）でゲノムを示すコレクションは、アレレについて十分な多様性を有すると考えるのが、現実的である。
【００１２】
（ｃ）　発芽及び培養による、（ｂ）で得たＭ１突然変異（照射）種子から得られる、Ｍ１世代の植物の生産。
その後の世代の種子と植物は自家受精によって得られ、例えばシロイヌナズナの場合には、Ｍ２、Ｍ３、…、Ｍｎと命名される。
同じ親から得られる種子又は植物は、用語「ファミリー」でグループ分けし、兄弟として記載する。
（ｄ１）　好ましくは個々に鉢植えした、各Ｍ１植物についてのＭ２兄弟種子の収穫、固体培地（堆肥又は寒天培地）又は液体培地で成長したＭ２兄弟苗木からのＤＮＡの抽出、及び遺伝的転位の探索のためのマトリクスとして使用される幾つかのＭ２ファミリーに相当するバッチでの該ＤＮＡの貯留；したがって、突然変異体のコレクションは、Ｍ２ファミリーの種子及びこれらのファミリーから抽出されるＤＮＡの双方によって代表される； 及び
【００１３】
（ｅ１）　減少した大きさのＤＮＡのバッチで行われる（転位に対するピラミッド状の研究）、遺伝的転位を検出し得る、ＰＣＲ技術ベースのスクリーニングによる、（ｄ１）で得られるＤＮＡについて行われる、所定の遺伝子に突然変異を有するＭ２ファミリーの検出；検出される転位の大きさとタイプは、使用される技術及びプライマーの位置による。この結果、遺伝子の一部もしくは全体又は幾つかの遺伝子に影響を及ぼす転位を検出することができる。
この方法の具体例によれば、遺伝的転位をスクリーニングする工程（ｅ１）で行われるＰＣＲ数を減少させるために、Ｍ１植物から得られるＭ２種子のバッチのＤＮＡが、それ自体、スーパーバッチに貯留される。
【００１４】
変形では、方法は、
（ａ）　　式：ｐｎ ＝ １−（（Ｎ−１）／Ｎ）ｎ （式１）
［ここで、ｐｎ は、所定の遺伝子が突然変異される確率を示し、かつ
Ｎ は、所定の生物について見積もられる全遺伝子数を示す］
を用いる、少なくとも１つの突然変異によって影響を受ける植物Ａのゲノムの各遺伝子に必要かつ十分な、電離放射線によって誘発される突然変異数ｎ の理論上の見積り、
（ｂ）　植物ｍごとの所望の突然変異密度及び遺伝子ｙｘでの所望の突然変異頻度が得られるように選択された照射線量 ｘでの野生型種子の照射（ｘ、ｍ及び ｙｘ の関係は、次式２ 及び ３によって示される：
ｍ＝ｎ／ｙｘ （式 ２）、
［ｎは式１と同じ意味で、ｍは植物ごとの突然変異数である］；
ｙｘ ＝ ａｘ ＋ ｆｓ （式３）：
［ａは突然変異誘発因子であり、ｆｓは自然突然変異の頻度である］）、および、Ｍ１世代の突然変異種子の生産、
【００１５】
（ｃ）　発芽及び培養による、（ｂ）で得たＭ１突然変異種子から得られる、Ｍ１世代の植物の生産、
（ｄ２）　各Ｍ１植物についてのＭ２兄弟種子の収穫、発芽及び培養によるＭ２世代植物の生産、及び個々のＭ２植物のＤＮＡの抽出；Ｍ２植物の代表的なＤＮＡ試料を抽出し、植物ごとに分析する；及び
（ｅ２）　オリゴヌクレオチドベース遺伝子型チップでの（ｄ２）で得た各ＤＮＡの標識とハイブリダイゼーションによる、これらの植物で保持される転位の検出及び位置決定
からなる。
【００１６】
この発明によれば、検出工程（ｅ２）は、ＤＮＡチップ上で行われる：電離放射線−誘発突然変異に対するＤＮＡチップの使用は、この発明による方法の実施をかなり容易にする。具体的には、大部分の電離放射線−誘発突然変異は欠失であるので、ＤＮＡチップが完全なゲノムをカバーしている時のＭｉ世代（ｉ≧２）の突然変異体のＤＮＡのハイブリダイゼーションは、欠失に一致するチップのドメインにおいて、野生型ＤＮＡと比較して、シグナルの損失又はその低下をもたらす。したがって、１回のハイブリダイゼーションにより、問題の突然変異体に存在し、検出される突然変異の位置を正確に決定することができる。つまり、コレクションに属するＭｉ世代（ｉ≧２）の一連の植物に対するこの方法の適用により、数、位置、及び任意に一連の植物に存在し、検出される突然変異の程度に関する関連情報を含むデータベースを構築することができるであろう。 所定の遺伝子に１以上の突然変異を有する植物コレクションの検索は、したがってそのデータベースを調べることによって行い得る（図３）。
【００１７】
変形として、遺伝的転位をスクリーニングする工程（ｅ２）は、定量的ＰＣＲ技術、好ましくはリアル−タイム定量的ＰＣＲを用いて行われる。
一例として、また非限定的な例として、Ｃｈｉａｎｇらにより１９９９年に記載されたロウ−タイム（ｒａｗ−ｔｉｍｅ）定量的ＰＣＲプロトコルが挙げられる。リアル−タイム定量的ＰＣＲは、野生型同型接合性個体から欠失についての個々の異型接合体を、さらには、野生型同型接合体から欠失についての個々の同型接合体を有利に識別することができる。この場合、選択された遺伝子に欠失を有する個体が直接同定され、突然変異の作用がこれらの個体の子孫で評価され得る。
この発明の目的のため、用語「遺伝子」は、コード化配列と非コード化配列の双方を含む。
【００１８】
また、この発明の目的のために、遺伝的転位による突然変異は、欠失、逆位、挿入又は転座の突然変異である； しかし、欠失突然変異がもっとも一般的である。
欠失範囲をできるだけ広く確保するために、高速中性子とガンマ照射が変異原として優先的に使用されるであろう。主として欠失を引起こす、重イオンのような他の物理的な剤も、変異原として使用することができる。
上記の条件下で電離放射線によって誘発される突然変異のコレクションの利点は、以下のとおりである：
−　使用される変異原のタイプが、遺伝子又はその制御配列の一部を除去しうる小さな欠失から、遺伝子クラスター又は染色体ドメインを除去し得る大きな欠失までにわたる、生じるアレレの非常な多様性を伴って、ゲノム全範囲を確保する。植物における染色体ドメインの機能解析は、このタイプの突然変異をとおしてのみ認識され得る；さらに、欠失により、非コード化ＤＮＡの役割解析が利用できるようになる。
【００１９】
−　トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）は、ライブラリーの展開に使用されない；この結果として、開始が容易で、迅速に構築される。ゲノムを数倍包含するコレクションは、シロイヌナズナでは１年以内に統合され得る。これに比べると、挿入突然変異のライブラリーは、中程度の期間（５年）で機能的に飽和状態になるだけであろう。さらに、放射性−誘発突然変異は、遺伝的に改変された生物の閉じ込めを強制するものではない； それらは、開放的な耕地及びＧＭＯ用の設備がない研究室で成長することができる。さらに、この発明による技術は、トランスジェネシスが依然として難しい作物種で直接使用することができる。この点において、コメが好ましい標的である。
【００２０】
この発明による方法の有利な具体例によれば、工程（ｂ）に先立って、照射線量 ｘの選択は、
−　０．０５ Ｇｙ〜２ ｋＧｙの線量でのＭ１種子試料の照射； 適用される線量は、対象の変異原のタイプ及び種による。例えば、同一線量での高速中性子は、６０Ｃｏガンマ線より５〜１０倍効率的である。
−　適当な媒体（固体又は液体培地）での種子の発芽；
−　少なくとも５０個の植物をプールしているバッチ中の植物からのＤＮＡの抽出、及びＤＮＡのバッチに相当するバッチにおける該植物のＭ２種子の収穫；
−　工程（ｅ）に述べた条件での該ＤＮＡの増幅、及び遺伝子における突然変異の有無を同定するための増幅配列の検出、及び幾つかの遺伝子（以降、コントロール遺伝子と称する）についてのこれらの増幅ならびに検出工程の反復；
−　式１、２及び３を用いる、コントロール遺伝子について得られた突然変異数からの、植物ごとの平均的な突然変異数ｍの測定、及び
−　任意の、植物ごとの線量／突然変異数ｍについての曲線の作成
からなる。
【００２１】
こうして、植物ごとの線量／突然変異数ｍについての曲線をプロットでき、これは、線量を選択するための基準として使用されるであろう。
この発明による方法の別の有利な具体例によれば、コレクション中に存在する遺伝子ｙｘごとの平均的な突然変異数 （この方法の工程（ａ） と （ｂ）にしたがって算出）は、各遺伝子に対して十分なアレレ数になるように少なくとも２に等しいことが有利である。
【００２２】
有利には、トランスジェネシスに比較して利点を有する、この発明による方法は、いずれかの植物、特にトランスジェネシスが難しいか、もしくは未だ可能ではない種に応用することができる：
−　特に、得られる突然変異体のコレクションは、研究される植物ゲノムの各遺伝子に対し少なくとも１つの突然変異を有効に含有する限りは、十分代表的である；この発明による方法の工程（ａ）及び（ｂ）にしたがって評価される、得られる突然変異数は、研究される植物における全遺伝子数及び個体ごとの突然変異数（それ自体、変異原及び使用される変異原の用量に依存する）に依存する。
−　使用される変異原（照射）のタイプにより、ＰＣＲによる突然変異（欠失）の検出を容易にでき、検出されたコレクションの突然変異体を研究するために、それらを単離することができる。
【００２３】
上記方法は、特に、遺伝子数が２０，０００個と見積もられるシロイヌナズナに応用することができる（Ｂｏｕｃｈｅｚ 及び Ｈｏｆｔｅ， １９９８）； この場合、約６０，０００個の突然変異が、０．９５の確率で所定の遺伝子に突然変異を有するために必要である。
他の種に関して、種が両性個体で自家受精が容易であれば、用いられる方法は、照射線量を除いて上記の方法と同じである。線量は、遺伝子数として示されるゲノムの大きさ、及び所定の遺伝子に対して誘発される突然変異の頻度による。この頻度は、上記と同じプロトコルにしたがって評価される。自家受精が不可能な種であれば、Ｍ１世代の植物は、Ｍ２種子を生じるように同種の他花受精が容易な植物と交雑される。この操作は、その後の世代の種子を得るために、繰り返されるであろう。
【００２４】
また、この発明の対象は、コレクションを構築する各突然変異体が、植物Ａのゲノムに少なくとも１つの欠失突然変異を含み、該突然変異体の全てが、各要素が植物Ａのゲノム遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む群を形成し、該コレクション（種子又はＤＮＡ）が少なくとも１倍、好ましくは５〜１０倍でゲノムを示すことを特徴とする、植物Ａから得られる突然変異体のコレクションである。
このコレクションの有利な具体例によれば、それは、上記の突然変異体のコレクションの生産方法を用いて得ることができる。
コレクションの別の有利な具体例によれば、それは、Ｍ２世代の種子の代表的な画分を用いる、該種子及び／又はこれらの種子から抽出されるＤＮＡからなる。
Ｍ２ファミリーそれぞれについて、ＤＮＡは、このファミリーの種子の代表的な画分から抽出される。
【００２５】
上記のアレンジのほかに、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の取り合わせも含む。
−　図１は、ＰＣＲ及びそれに続く電気泳動による欠失の検出原理を例証する。
−　図２は、突然変異体のコレクションでの欠失についてのピラミッド状の検索を例証する。図１に記載されるタイプの増幅は、探索される欠失を有する個体が同定されるまで、減少した大きさのバッチに応用される。
−　図３は、コレクションから得られる突然変異体における染色体の転位及び欠失を検出し、位置決定するためのオリゴヌクレオチド−ベースチップの使用を例示する 図である。これにより、まず、表現型に基づいて単離された突然変異体で影響を受けた遺伝子のクローニングを促進し、次にコレクションの突然変異体における欠失の系統的な位置決定をすることができるであろう。この情報はデータベースで記録され、このデータベースの審議により、上記のＰＣＲ−スクリーニング工程を介さずに所定の遺伝子における突然変異体を直接利用できるであろう。
しかし、これらの実施例がこの発明の対象の例示にすぎず、その限定を構成するものではないことは、明らかに理解されるべきである。
【００２６】
実施例１： 植物ごとに誘導される線量／突然変異数の曲線
−　少なくとも１０００個の野生型種子試料の ０．０５ Ｇｙ〜 ２ ｋＧｙの線量での照射；
−　適当な基質（例えば堆肥）での該種子の発芽；
−　以下のプロトコルによる葉又は花部のいずれかを用いる１００個のバッチにおける種子の発芽から得られる植物由来ＤＮＡの抽出：
１）　新鮮な組織、葉又は花部を除き、液体窒素でそれらを凍結する、
２）　凍結組織を遊星ボールミル（モデルＰＭ４００、ブランドＲＥＴＳＣＨ、ドイツ）ですりつぶし、適当な大きさのチューブにつぶした物質を移す、
３）　新鮮な組織１ｇ当り５ｍｌで抽出緩衝液を加え、３７℃で１５分攪拌する、
【００２７】
４）　等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）を加え、フェノールを５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８で緩衝し、３７℃で１０分攪拌する、
５）　混合物を２，５００ ｇで５分遠心分離する、
６）　水相を回収し、それを清潔なチューブに移し、１／１０容量の３ Ｍ 酢酸ナトリウム溶液ｐＨ ５．２、次いで１容量のイソプロパノールを加え、簡単に攪拌して均質化し、全混合物を１０，０００ ｇで３分遠心分離する、
７）　上清を除き、１容量のＴＥ （１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ ８．０； ５ ｍＭ ＥＤＴＡ）にペレットを溶解する。１／１０ 容量の３ Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ ５．２、次いで１容量の１００％エタノールを加える。攪拌し、５分１０，０００ ｇで遠心分離する、
８）　上清を除き、ペレットを１／１０容量のＴＥ緩衝液に溶解する。得られた濃度は、１００〜５００ ｎｇ／μｌの範囲である。
【００２８】
−　標準的な条件下でのプライマー間のギャップに適当なプライマー、つまり遺伝的転位を示し得るプライマーを用いる該ＤＮＡのＰＣＲ増幅、遺伝子における突然変異の有無を同定するための電気泳動（図１）による増幅配列の明示及び幾つかの遺伝子についてのこの増幅工程の反復（１〜１０）、及び
−　式１、２及び３を用いるコントロール遺伝子について得られる突然変異数からの植物ごとの平均的な突然変異数 ｍ の測定、及び
−　任意の、植物ごとの線量／突然変異数ｍ の曲線の形成。
【００２９】
ＰＣＲ溶液は以下のとおりである：反応は、１〜２ユニットのＴａｑポリメラーゼ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、０．２ ｍＭの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ 及び ｄＴＴＰ）、 ０．２μＭの各プライマー及び１０〜２０ ｎｇのマトリクスとして使用されるＤＮＡを含む２５〜５０μｌ容量で行われる。２分９４℃での初期変性のあと、それぞれ３０ ｓ ９４℃での変性工程、プライマーに応じて４５〜６５℃の温度範囲での３０ ｓのプライマーアニーリング工程、及び増幅されるフラグメントの大きさに応じて３０ ｓ 〜 ４ 分の７２℃での伸長工程からなる３０サイクルが続く。大きさが大きい（４ ｋｂより大きい）フラグメントの場合、Ｔａｑポリメラーゼは、ユニット中１：１００の比のＰｗｏ ポリメラーゼとＴａｑ ポリメラーゼの混合物で置換される。この場合、伸長温度は６８℃で、期間は、必要なら５分以上とされる。
【００３０】
実施例２： シロイヌナズナにおけるライブラリーの構築
シロイヌナズナの場合、実施例１により、６０Ｃｏ 源で照射線量ｘとして３００ Ｇｙを選択することができる（ＣＩＧＡＬ 照射器）。
欠失範囲をできるだけ広く確保するために、高速中性子とガンマ照射が、変異原として優先的に用いられるであろう。ライブラリーの大きさ （突然変異の全数ｎに相当する）は、ゲノムの各領域が数倍に突然変異されるような大きさでなければならない（式１、２ 及び ３参照）。具体的には、突然変異表現型の特徴は全て、独立したアレレによって確認されるためにかなり価値がある。ゲノムの５〜１０倍を示すコレクションは、したがって、アレレの十分な多様性を有するために形成される。例えばシロイヌナズナでは、遺伝子の全数は２０〜２５，０００と見積もられ、３００ Ｇｙ （ガンマ）で照射される種子における平均的な突然変異数が約１００であるので、突然変異体のコレクションは、５〜１０，０００個の植物を含まなければならないであろう。
【００３１】
この発明による方法によれば、ｐｎ ＝ ０．９５ かつ２０，０００ ≦ Ｎ ≧ ２５，０００である。
Ｍ２種子は、各Ｍ１植物について個々に収集される（＝Ｍ２ｉ．ｓｅ）。ＤＮＡは、Ｍ１植物ごとに１００個の種子で液体培地で成長し、１０個のＭ１植物から得られる種子を貯留したＭ２苗木から、実施例１に記載されるプロトコルにしたがって抽出される （＝１０Ｍ２ｉ．ＤＮＡ）。
遺伝的転位（欠失）をスクリーニングする工程（ｅ）で行われるＰＣＲ数を減少させるため、１０個のＭ１植物から得られるＭ２種子のバッチのＤＮＡｓ （＝１０Ｍ２ｉ．ＤＮＡ）は、スーパーバッチを構成するＤＮＡを等量で混合することにより、１０個のスーパーバッチにそれ自体貯留される（＝１００Ｍ２ｉ．ＤＮＡ） （図２）。
さらに、Ｍ２種子を１０ｘ１０ マトリクスに組織化する。ここで、マトリクスの各ます目はＭ１植物から得られるＭ２種子に相当し、ＤＮＡはこれらのマトリクスの双方の次元（縦列及び横列）に対して抽出される。したがって、１０Ｍ２ｉ．ＤＮＡバッチは、これらのマトリクスの縦又は横に相当し、１００Ｍ２ｉ．ＤＮＡスーパーバッチは全マトリクスに相当する。
【００３２】
したがって、１０，０００個のＭ１植物からなるコレクションについては、１００個の １００Ｍ２ｉ．ＤＮＡ スーパーバッチがある。したがって、全ライブラリーをスクリーンするように、１００回ＰＣＲを行う必要があるだろう（スーパーバッチ当り１回）。 陽性のスーパーバッチに対しては、マトリクスの１０縦列と１０横列に相当する２ｘ１０ 回のＰＣＲが、検出される突然変異を有するＭ１植物から得られるＭ２ｉ種子を同定するために行われるであろう。
見出された突然変異を有する個体植物を少なくとも１つ同定するために、 ５０〜１００個の Ｍ２ｉ種子を検分して、個々に植物についてＤＮＡを抽出し、同じプライマーでＰＣＲを行う必要がある。
【００３３】
実施例３： シロイヌナズナについて選択されたＰＣＲスクリーン
ヒト遺伝子ＡＴＭ （Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）と相同のシロイヌナズナ遺伝子についてスクリーンを行った；遺伝子は、ＢＡＣクローンＴ２４Ｃ２０、ＥＭＢＬ Ｎｏ． ＡＬ０９６８５６の配列に含まれる。使用したコレクションは、実施例２に記載される条件下で得られる５，０００個の Ｍ１ラインに基づく。使用したプライマーは、以下の配列を有する：
ＡＴＭ２ｑ： ５’−ＧＡＴＴＧＡＴＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＧＣ−３’
ＡＴＭ４０： ５’ＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＧＴＴＡＣＡ−３’
増幅反応は、ＴａｑとＰｗｏのポリメラーゼ混合物を用いて、５５℃のプライマーアニーリング温度、５分の伸長時間及び３０以上のサイクルで、上記条件下で行った。野生型ゲノムＤＮＡから増幅されるフラグメントの大きさは、５７１４ ｐｂである。２，３００ と １，６００ ｐｂの２つの欠失は、それぞれ２つの異なるバッチで検出され、これらの欠失を有する植物が単離された。
【００３４】
上記から明らかであるように、この発明は、より詳細に記載したにすぎない実施方法、生産及び応用にいかなる方法でも限定されない； 逆に、発明は、この発明の関連又は範囲から逸脱しない限り、当業者に行い得る全ての変形を包含する。
【００３５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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2004506404.tif 000029
【国際調査報告】
2004506404.tif 000030
2004506404.tif 000031
2004506404.tif 000032
2004506404.tif 000033