(57)【要約】ヒトＶＲ１レセプターをコードするＤＮＡがクローン化されかつ特徴づけられた。該組換えタンパク質は生物学的に活性なタンパク質を形成することが可能である。ｃＤＮＡが組換え宿主細胞中で発現され、それは活性の組換えタンパク質を産生する。該組換えタンパク質は組換え宿主細胞からもまた精製される。加えて、レセプター活性の調節物質の同定方法を確立するのに該組換え宿主細胞が利用され、そしてレセプター調節物質が同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードする単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号８）；（配列番号１０）および（配列番号１１）より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
ベクターがヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んで成る、組換え宿主中でのヒトＶＲ３レセプタータンパク質の発現のための発現ベクター。
【請求項５】
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ配列が：（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号８）；（配列番号１０）および（配列番号１１）より成る群から選択される、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
発現ベクターが、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項４記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
【請求項８】
発現ベクターが：（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号８）；（配列番号１０）および（配列番号１１）より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項７記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
発現ベクターが、ヒトＶＲ３レセプターをコードするゲノムＤＮＡを含んで成る、請求項７記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質として機能する、実質的に純粋な形態のタンパク質。
【請求項１１】
（配列番号７）（配列番号９）および（配列番号１２）より成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１３】
抗体がヒトＶＲ３レセプターの活性を封鎖する、請求項１２記載の抗体。
【請求項１４】
（ａ）請求項４記載の発現ベクターを適する宿主細胞に移入すること；および
（ｂ）発現ベクターからのヒトＶＲ３レセプタータンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含んで成る、組換え宿主細胞中でのヒトＶＲ３レセプタータンパク質の発現方法。
【請求項１５】
（ａ）ヒトＶＲ３レセプタータンパク質活性の調節物質をヒトＶＲ３レセプタータンパク質と組み合わせること、および
（ｂ）ヒトＶＲ３レセプタータンパク質に対する調節物質の影響を測定することを含んで成る、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１６】
タンパク質に対する調節物質の影響が、ヒトＶＲ３レセプターリガンドの結合を阻害するもしくは高めることである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質に対する調節物質の影響が、ヒトＶＲ３レセプター活性タンパク質の刺激もしくは阻害である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５記載の方法で活性な化合物。
【請求項１９】
化合物がヒトＶＲ３レセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストである、請求項１５記載の方法で活性な化合物。
【請求項２０】
化合物がヒトＶＲ３レセプターの発現の調節物質である、請求項１５記載の方法で活性な化合物。
【請求項２１】
請求項１５記載の方法で活性な化合物を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１５記載の方法で活性な化合物の投与を含んで成る、ヒトＶＲ３レセプターにより媒介される病状に対するような治療が必要な患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
有害な化学的、熱的および機械的刺激は、知覚神経節（例えば後根、節状および三叉神経節）中の小径知覚ニューロン（侵害受容器）の末梢神経端を興奮させ、そして疼痛として知覚されるシグナルを起こす。これらのニューロンは、炎症性もしくは虚血性の病状の間の細胞外空隙中での変化から生じる有害なもしくは潜在的に有害な刺激（熱）ならびに組織損傷（Ｈ＋（局所組織アシドーシス）および／もしくは伸長）の検出に決定的である（ＷａｌｌとＭｅｌｚａｃｋ、１９９４）。「辛い」トウガラシ（ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｐｅｐｐｅｒ）中の主刺激成分、バニロイドカプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネナミド）は、細くもしくは無髄の侵害求心性神経の非常に選択的な活性化物質である（Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９３；Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９６）。電気生理学的研究は、バニロイドが陽イオンに対し非選択的に浸透性である原形質膜チャンネルを活性化することにより小知覚ニューロンを興奮させることを示している（ＢｅｖａｎとＳｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９０；Ｏｈら、１９９６；Ｗｏｏｄら、１９８８）。ユーホルビア属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）植物からの超強力な三環性ジテルペンレシニフェラトキシン（ＲＴＸ；（Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉら、１９９１））は、ナノモル濃度の親和性でカプサイシン結合部位で結合し、そして、ラット体性および内臓の第一次感覚ニューロンへのカプサイシンレセプターの非常に局在化された分布を示している（Ｓｚａｌｌａｓｉ、１９９５）。
【０００２】
バニロイドレセプターＶＲ１（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７）は、その閾値がプロトンもしくはカプサイシンの存在下で低下される熱検出レセプターであると考えられている（Ｔｏｍｉｎａｇａら、１９９８）。カプサイシンおよびプロトンは、痛覚および神経原性炎症に関与する第一次感覚ニューロンによりほぼ独占的に発現される特定の膜認識部位（バニロイドレセプター）で相互作用する（ＢｅｖａｎとＳｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９０）。バニロイド（「カプサイシン」）レセプターＶＲ１はカプサイシンおよびＲＴＸにより活性化され、また、ＶＲ１の活性化はアンタゴニスト、カプサゼピン（ＣＰＺ；（Ｂａｖｅｎら、１９９２））およびルテニウムレッド（ＲＲ；（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７；Ｗｏｏｄら、１９８８））により封鎖（ｂｌｏｃｋ）される。
【０００３】
ＶＲ１のアミノ酸配列のハイドロパシシティ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）分析は、６個の潜在的な膜貫通領域（Ｓ１−Ｓ６）、およびＳ５とＳ６との間の１個の推定の孔ループ領域を示す。大型の細胞内ドメインは３個のアンキリンリピートドメインを含有する。（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７）。このチャンネルは推定の「貯蔵量に操作される（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ）」ＴＲＰカルシウムチャンネルファミリーとの有意の構造類似性を有する。ＶＲ１は、はっきりした外側への整流を示すリガンド依存性非選択的陽イオンチャンネルである（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７）。重要なことに、ＶＲ１は細胞機能の調節において非常に重要であることが既知のイオン、Ｃａ２＋に対し高度に浸透性である（（ＢｌａｃｋｓｔｏｎｅとＳｈｅｎｇ、１９９９；ＧｕｐｔａとＰｕｓｈｋａｌａ、１９９９；ｖａｎ　Ｈａａｓｔｅｒｅｎら、１９９９））。
【０００４】
ゲノムデータベースの検索は、ＶＲ１に構造上関係したサブユニットＶＲＬ−１を示した。ラットおよびヒトのＶＲＬ−１（それぞれＡＦ１２９１１３およびＡＦ１２９１１２）はラットＶＲ１（ＡＦ０２９３１０））に約４９％同一かつ６６％類似である（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９９）。Ｗｏｏｄらによりクローン化されたヒトＶＲＬタンパク質（ＡＦ１０３９０６）（未発表）はＶＲＬ−１（ＡＦ１２９１１２）に９９％同一である。最近、ＡＦ１２９１１２にほぼ同一である（唯一の差異はＱ４１８の欠失である）ｈＶＲＣＣ（ヒトバニロイドレセプター様陽イオンチャンネル）を記述したＰａｒｔｉｓｅｔｉとＲｅｎａｒｄによる特許出願が公開された。われわれはこれらの配列をＶＲ２と称することができる。全体として、ＶＲ１およびＶＲ２の予測される構造は、元はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からクローン化された一過性受容器電位（ＴＲＰ）チャンネル（光伝導である役割を演じているＣａ浸透可能なチャンネル）により規定されるイオンチャンネルの一ファミリーに特徴的である（ＬｕとＷｏｎｇ、１９８７；ＭｉｎｋｅとＳｅｌｉｎｇｅｒ、１９９６）。このレセプターはまた疼痛を生じさせる熱の知覚にも関与しているようである（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９９）。卵母細胞およびＨＥＫ細胞中でのＶＲ２の発現は、通常、侵害温度（＞５３℃）に対する細胞の感受性を与え、それはＣＰＺに対し感受性でなかったがしかし１０μＭのルテニウムレッドでほぼ完全に封鎖された。ＶＲ２の活性化はＣａ２＋に対する高い浸透性を伴う非選択的陽イオン電流を誘導する。興味深いことに、熱感受性の閾値は侵害刺激の反復適用とともに低下したが、しかし閾値以下の温度でしなかった（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９９）。
【０００５】
５２９アミノ酸によりコードされるラットＳＩＣ（伸長阻害性チャンネル；ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＢ０１５２３１）は伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる（Ｓｕｚｕｋｉら、１９９９）。ラットＶＲ１に相同な最初の３７９アミノ酸。ＳＩＣはＶＲファミリーの大型のＮ末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のＴＭ１の前のＡエキソンに相同な１配列を含有する。ラットＳＩＣの推定のＴＭ６の中央で開始する最後の１６３アミノ酸は本発明のヒトＶＲ３　Ａ＋Ｂ−の対応するアミノ酸配列に類似である。
【０００６】
本発明は新規バニロイドレセプターファミリーメンバーＶＲ３のクローニングおよび機能を記述する。この遺伝子は最低３種のアイソフォームを創製するように選択的にスプライスされるようである。
【０００７】
（発明の要約）
ヒトバニロイドレセプター３（ｈＶＲ３）の３種のアイソフォームをコードするＤＮＡ分子がクローン化されかつ特徴づけられた。これらのタンパク質の生物学的および構造的特徴を、アミノ酸およびヌクレオチド配列がそうであるように開示する。該組換えタンパク質はレセプターＶＲ３の調節物質を同定するのに有用である。本明細書で開示されるアッセイで同定される調節物質は治療薬として有用であり、これらは炎症性の病状の治療のため、ならびに、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、乳房摘出後疼痛、複合局所疼痛症候群、関節炎（例えば慢性関節リウマチおよび骨関節炎）、ならびに潰瘍、神経変性性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、過敏性腸症候群および乾癬に伴う難治性疼痛のための鎮痛薬としての使用のための候補である。用途は、中枢神経系疾患、腸管の疾患、異常増殖、ならびにとりわけ消化器系、前立腺および女性生殖器の癌、潰瘍、肝疾患、腎疾患の治療、後根神経節により刺激される内臓の制御、またはとりわけこれらのｈＶＲ３ポリペプチドの異常発現に関連するいかなる障害も診断もしくは治療することを包含する。別の局面において、本発明は、本発明により提供される物質を使用するアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、ならびにｈＶＲ３の不均衡を伴う病状を治療することに関する。組換えＤＮＡ分子およびその部分は、ＤＮＡ分子の相同物の単離、ＤＮＡ分子のゲノム同等物の同定および単離、ならびに突然変異体の形態のＤＮＡ分子の同定、検出もしくは単離に有用である。
【０００８】
（詳細な記述）
本発明はＶＲ３と命名されたヒトバニロイドレセプターの３種のアイソフォーム、すなわちＶＲ３Ａ＋Ｂ−、ＶＲ３Ａ−Ｂ−およびＶＲ３Ａ＋Ｂ＋を記述する。ヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれヒトＶＲ３　Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋の８７１（図３）、８１１（図５）および７４２（図８）アミノ酸をコードする約２６１６（図１）、２４３６（図４）および２２２９（図６）塩基対の単一の大きいオープンリーディングフレームを示した。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−のｃＤＮＡは図２に示されるとおり約３３７および約５４７ヌクレオチドの５’および３’非翻訳伸長を有し、ここで５’ＵＴＲは１−３３７であり、コーディング領域は３３８−２９５３であり、そして３’ＵＴＲは２９５４−３５００である。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ＋のｃＤＮＡは図７に示されるとおり約８３６および約９９４ヌクレオチドの５’および３’非翻訳伸長を有し、ここで５’ＵＴＲは１−８３６であり、コーディング領域は８３７−３０６５であり、そして３’ＵＴＲは３０６６−４０５９である。第一の同じフレーム内のメチオニンが、それぞれアイソフォームＡ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋について約９８，２４２Ｄａ、９１，２９４Ｄａおよび８３，３１０Ｄａの推定される分子量（Ｍｒ）をもつヒトＶＲ３レセプタータンパク質を予測する１個のオープンリーディングフレームの開始コドンと指定された。Ａ＋Ｂ−アイソフォームは８７１アミノ酸の１個のタンパク質をコードする。ＶＲ３　Ａ−Ｂ−はＶＲ３Ａ＋Ｂ−のアミノ酸３８２ないし４４１からの６０アミノ酸の欠失を含有する。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ＋は、アミノ酸７３６まで（その後に６個の不一致アミノ酸および１個の終止コドンが存在する）Ａ＋Ｂ−に同一である。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ＋アイソフォームは推定のＴＭ６の後２０アミノ酸伸長する。
【０００９】
予測されたヒトＶＲ３レセプタータンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列され、そしてバニロイドレセプターファミリー（ＶＲ１およびＶＲ２）と関係づけられる。大型の推定のＮ末端親水性セグメント（約４６７アミノ酸）、Ｎ末端領域中３個の推定のアンキリンリピートドメイン、６個の予測される膜貫通領域および１個の孔領域を包含する、レセプターのこのファミリー中で見出される数種の保存されたモチーフが存在する。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−はヒトＶＲ１に４３％同一、ヒトＶＲＬ−１（ＡＦ１２９１１２）およびヒトＶＲＬ（ＡＦ１０３９０６）双方に３９％同一である。従って、本明細書に記述されるＶＲ３レセプターは明らかにバニロイドレセプターファミリーの新規遺伝子である。
【００１０】
ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−およびＶＲ３Ａ−Ｂ−の形態はアミノ酸６９４から終わりまでラットの伸長阻害性チャンネルＳＩＣ［ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託ＡＢ０１５２３１］に類似である。５２９アミノ酸によりコードされるラットＳＩＣは伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられている。それはＶＲファミリーの大型のＮ末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のＴＭ１の前のＡエキソンに相同な１個の配列を含有する。
【００１１】
本明細書に記述されるＶＲ３コーディング領域の完全なゲノム配列は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）への３８０５１２塩基対配列提出（ヒトクローンＲＰＣＩ１−７Ｇ５（ＡＣ００７８３４）、Ｗｏｒｌｅｙ，Ｋ．Ｃ．による直接提出）中に見出されるようである。このジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）登録は、ＤＮＡ配列の多くのフラグメントおよび提案された隣接配列を列挙するが、しかし、核酸配列のいかなる分析も欠き、そしてＶＲ３核酸配列の特徴を特徴づけもしくはＶＲ３遺伝子の存在を記述できていない。
ヒトＶＲ３レセプター核酸の単離
本発明は、ヒトＶＲ３レセプター産生細胞から単離されたヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡに関する。本明細書で使用されるところのヒトＶＲ３レセプターはヒトバニロイドレセプターとして特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【００１２】
ヒトＶＲ３レセプターの完全なアミノ酸配列は以前に知られておらず、また、既知のヒトＶＲ３レセプターをコードする完全なヌクレオチド配列も知られていなかった。広範な細胞および細胞型が記述されるヒトＶＲ３レセプターを含有することができることが予測される。
【００１３】
他の細胞および細胞系もまたヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡを単離するための使用に適するかもしれない。適する細胞の選択は、本明細書に記述される細胞抽出物もしくは全細胞アッセイでヒトＶＲ３レセプター活性についてスクリーニングすることにより行ってよい。これらのアッセイのいずれか１つでヒトＶＲ３レセプター活性を所有する細胞は、ヒトＶＲ３レセプターのＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適することができる。
【００１４】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用してヒトＶＲ３レセプターＤＮＡを分子クローン化してよい。これらの方法は、限定されるものでないが、適切な発現ベクター系中でのヒトＶＲ３レセプター含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒトＶＲ３レセプター遺伝子の直接機能的発現を挙げることができる。別の方法は、ヒトＶＲ３レセプターサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトＶＲ３レセプター含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトＶＲ３レセプター含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることより成る。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたヒトＶＲ３レセプタータンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトＶＲ３レセプターＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
【００１５】
別の方法は、ヒトＶＲ３レセプター産生細胞からＲＮＡを単離しかつ該ＲＮＡをインビトロもしくはインビボ翻訳系を介してタンパク質に翻訳することである。ペプチドタンパク質へのＲＮＡの翻訳はヒトＶＲ３レセプタータンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができ、それは例えば抗ヒトＶＲ３レセプター抗体との免疫学的反応性もしくはヒトＶＲ３レセプタータンパク質の生物学的活性により同定することができる。この方法において、ヒトＶＲ３レセプター産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。ＲＮＡのプールのさらなる分画を行ってヒトＶＲ３レセプターＲＮＡを非ヒトＶＲ３レセプターＲＮＡから精製することができる。この方法により製造されたペプチドもしくはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供してよく、それを順に使用してヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡの製造のためのプライマーを提供するか、もしくは、翻訳に使用されるＲＮＡを分析してヒトＶＲ３レセプターをコードするヌクレオチド配列を提供しかつヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡのこの製造のためのプローブを生じさせることができる。この方法は当該技術分野で既知であり、かつ、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．中、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９中に見出すことができる。
【００１６】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されたライブラリーがヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡを単離するのに有用であるかもしれないことが当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、他の細胞、ヒト以外の生物体のＶＲ３レセプター由来のｃＤＮＡライブラリー、ならびにＹＡＣ（酵母の人工染色体）を包含するゲノムＤＮＡライブラリーおよびコスミドライブラリーを挙げることができる。
【００１７】
適するｃＤＮＡライブラリーを、ヒトＶＲ３レセプター活性を有する細胞もしくは細胞系から調製してよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、最初にヒトＶＲ３レセプター関連の生物学的活性の測定もしくはリガンド結合アッセイを使用して細胞関連のヒトＶＲ３レセプター活性を測定することにより行ってよい。
【００１８】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）中に見出すことができる。
【００１９】
ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡもまた、適するゲノムＤＮＡライブラリーから単離してよいこともまた当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．中、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）中に見出すことができる。
【００２０】
上の方法によりヒトＶＲ３レセプター遺伝子をクローン化するために、ヒトＶＲ３レセプターのアミノ酸配列が必要であるかもしれない。これを達成するために、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質を精製しそして部分的アミノ酸配列を自動化シークエネーターにより決定してよい。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし、該タンパク質からの６ないし８アミノ酸の２領域の直鎖状配列を、部分的ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの製造のため決定する。
【００２１】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、特定の１アミノ酸をコードするのに１種以上のコドンが使用されているかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の１メンバーのみが、ヒトＶＲ３レセプター配列に同一であろうが、しかし、不適正をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトＶＲ３レセプターＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドはなお、ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡに十分にハイブリダイズしてヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。これらの方法により単離されたＤＮＡを使用して、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からの多様な細胞型からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングしかつ相同な遺伝子を単離することができる。
【００２２】
精製された生物学的に活性のヒトＶＲ３レセプターは数種の異なる物理的形態を有するかもしれず、ヒトＶＲ３レセプターは完全長の新生もしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在するかもしれない。完全長の新生ヒトＶＲ３レセプターポリペプチドは特異的タンパク質分解性切断事象により翻訳後修飾されてよく、それは完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす。１個のフラグメント、もしくはフラグメントの物理的会合がヒトＶＲ３レセプターに関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが、しかしながら、ヒトＶＲ３レセプター活性の程度は、個々のヒトＶＲ３レセプターフラグメントと物理的に会合されたヒトＶＲ３レセプターポリペプチドフラグメントとの間で変動するかもしれない。
【００２３】
遺伝暗号は縮重であるため、特定の１アミノ酸をコードするのに１種以上のコドンが使用されるかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の１メンバーのみが、ヒトＶＲ３レセプター配列に同一であろうが、しかし、適切な条件下で、不適正をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトＶＲ３レセプターＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。代替の条件下で、不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドはなお、ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡにハイブリダイズしてヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。
【００２４】
特定の生物体からのヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡを使用して、他の生物体からヒトＶＲ３レセプターの相同物を単離かつ精製してもよい。これを達成するために、第一のヒトＶＲ３レセプターＤＮＡを適切なハイブリダイゼーション条件下でヒトＶＲ３レセプターの相同物をコードするＤＮＡを含有するサンプルと混合してよい。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合体を単離してよく、そして、相同なＤＮＡをコードするＤＮＡをそれから精製してよい。
【００２５】
特定のアミノ酸をコードする多様なコドン中にかなりの量の冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが既知である。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含有するＤＮＡ配列にも向けられる。本明細の目的上、１個もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列を縮重変異（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）と定義することができる。発現されるタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変えないＤＮＡ配列もしくは翻訳されたタンパク質いずれか中の突然変異もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、もしくはグルタミンの代わりにアスパラギンの置換はポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。こうした置換は公知であり、そして例えばＷａｔｏｓｏｎらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第４版、ベンジャミン　カミングス　パブリッシング　カンパニー（Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．）中に記述される。
【００２６】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてもよいことが既知である。ＤＮＡ配列を変える方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発はサイレント突然変異、保存的突然変異、もしくは非保存的突然変異を生じるかも知れない１個もしくはそれ以上のＤＮＡ残基を変えるのに使用する。キメラ遺伝子は、類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換してヒトＶＲ３レセプター遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより調製する。同様に、遺伝子の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをヒトＶＲ３レセプター遺伝子に付加する融合遺伝子を調製してよい。例えば膜貫通ドメインを除去するもしくは該タンパク質の正常な輸送を変えるためのターゲッティング配列を付加する、またはヒトＶＲ３レセプター遺伝子に新たな翻訳後修飾配列を付加することにより、該タンパク質の可溶性バージョンを創製するように、ヒトＶＲ３レセプター遺伝子の領域を置き換える融合遺伝子を調製してもよい。変えられる特性の例は、限定されるものでないが基質に対する酵素もしくはリガンドに対するレセプターの親和性の変化を挙げることができる。
【００２７】
本明細書で使用されるところのヒトＶＲ３レセプターの「機能的誘導体」は、ヒトＶＲ３レセプターの生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性（機能的もしくは構造上のいずれか）を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ヒトＶＲ３レセプターの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」もしくは「化学的誘導体」を包含することを意図している。「フラグメント」という用語はヒトＶＲ３レセプターのいかなるポリペプチドサブセットも指すことを意味する。「変異体」という用語は、ヒトＶＲ３レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに構造および機能が実質的に類似の分子を指すことを意味する。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合に、ヒトＶＲ３レセプターに「実質的に類似」である。従って、２種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらはそれらの分子の一方の構造が他方で見出されない場合であっても、もしくは２種のアミノ酸配列が同一でない場合であっても変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、ヒトＶＲ３レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似の分子を指す。
ヒトＶＲ３レセプターの組換え発現
本明細書に記述される方法により得られたクローン化されたヒトＶＲ３レセプターＤＮＡは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節因子を含有する発現ベクター中への分子クローニングにより組換え的に発現させかつ原核生物もしくは真核生物宿主細胞に移入して組換えヒトＶＲ３レセプタータンパク質を産生させてよい。こうした操作の技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、上記に完全に記述され、また、当該技術分野で公知である。
【００２８】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主中での遺伝子のクローン化されたコピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義する。こうしたベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現するのに使用することができる。
【００２９】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞、または細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの運搬を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力および活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合しそしてＲＮＡ合成を開始することを指図するＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターは、限定されるものでないがクローニングベクター、改変クローニングベクター、とりわけ設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【００３０】
哺乳動物細胞中で組換えヒトＶＲ３レセプターを発現させるのに多様な哺乳動物発現ベクターを使用してよい。組換えヒトＶＲ３レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ　３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ　３７５６５）を挙げることができる。
【００３１】
細菌細胞中で組換えヒトＶＲ３レセプターを発現させるのに多様な細菌発現ベクターを使用してよい。組換えヒトＶＲ３レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがｐＥＴベクター（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））およびｐＱＥベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を挙げることができる。
【００３２】
酵母のような真菌細胞中で組換えヒトＶＲ３レセプターを発現させるのに多様な真菌細胞発現ベクターを使用してよい。組換えヒトＶＲ３レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。昆虫細胞中で組換えヒトＶＲ３レセプターを発現させるのに多様な昆虫細胞発現ベクターを使用してよい。ヒトＶＲ３レセプターの組換え発現に適することができる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００３３】
ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクターにクローン化してよい。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞系を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる原核生物もしくは真核生物であってよい。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないがＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）、Ｌ−細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）を挙げることができる。
【００３４】
発現ベクターは、限定されるものでないが形質転換、トランスフェクション、原形質融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか１つを介して宿主細胞に導入してよい。発現ベクター含有細胞をクローン的に繁殖させ、そして別個に分析してそれらがヒトＶＲ３レセプタータンパク質を産生するかどうか決定する。ヒトＶＲ３レセプターを発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが抗ヒトＶＲ３レセプター抗体との免疫学的反応性および宿主細胞関連のヒトＶＲ３レセプター活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行ってよい。
【００３５】
ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡの発現はまた、インビトロで産生された合成ｍＲＮＡを使用して実施してもよい。合成ｍＲＮＡもしくはヒトＶＲ３レセプター産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定されるものでないが小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができ、ならびに、限定されるものでないがカエル卵母細胞への微小注入法を挙げることができる細胞に基づく系で効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞への微小注入法が一般に好ましい。
【００３６】
至適レベルのヒトＶＲ３レセプター活性および／もしくはヒトＶＲ３レセプタータンパク質を生じるヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ配列（１種もしくは複数）を決定するために、限定されるものでないが以下：
遺伝子名　　　　　開始コドン　　終止コドン　　　総塩基対
ＶＲ３Ａ＋Ｂ＋　　８３７　　　　３０６５　　　　２２２９
ＶＲ３Ａ＋Ｂ−　　３３８　　　　２９５３　　　　２６１６
ＶＲ３Ａ−Ｂ−　　１　　　　　　２４３６　　　　２４３６
（これらの数字は第一のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）ならびにヒトＶＲ３レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含有する数種の構築物を挙げることができるヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ分子を構築することができる。全部の構築物は、ヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域の何も含有しないか、全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。ヒトＶＲ３レセプター活性およびタンパク質発現のレベルは適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独および組み合わせの双方での導入後に決定することができる。一過性アッセイでの至適の発現を生じるヒトＶＲ３レセプターＤＮＡカセットの決定後に、このヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる宿主細胞中での発現のため、多様な発現ベクターに移す。
ヒトＶＲ３レセプターのアッセイ方法
宿主細胞トランスフェクション体および微小注入された卵母細胞を使用して、以下の方法により機能的ヒトＶＲ３レセプター活性のレベルおよび総ヒトＶＲ３レセプタータンパク質のレベルの双方をアッセイしてよい。組換え宿主細胞の場合、これは１種もしくはそれ以上のフラグメントをコードするヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ、サブユニットまたは他の機能的遺伝子を含有する１種またはおそらく２種もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合、これはヒトＶＲ３レセプタータンパク質の合成ＲＮＡの共注入を必要とする。発現を見込むのに適切な時間の期間の後に、細胞タンパク質を例えば３５Ｓ−メチオニンで２４時間代謝的に標識し、その後細胞ライセートおよび細胞培養上清を収穫し、そしてヒトＶＲ３レセプタータンパク質に対し向けられたポリクローナル抗体を用いる免疫沈降にかける。
【００３７】
宿主細胞中のヒトＶＲ３レセプタータンパク質のレベルは、免疫親和性および／もしくはリガンド親和性技術により定量する。ヒトＶＲ３レセプター特異的親和性ビーズもしくはヒトＶＲ３レセプター特異的抗体を使用して、例えば３５Ｓ−メチオニン標識もしくは非標識ヒトＶＲ３レセプタータンパク質を単離する。標識されたヒトＶＲ３レセプタータンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。非標識ヒトＶＲ３レセプタータンパク質は、ヒトＶＲ３レセプター特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出する。
【００３８】
ヒトＶＲ３レセプター活性を検出するための他の方法は、ヒトＶＲ３レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトされた全細胞もしくはヒトＶＲ３レセプターｍＲＮＡを注入された卵母細胞中でのヒトＶＲ３レセプター活性の直接測定を必要とする。ヒトＶＲ３レセプター活性は、ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡを発現する宿主細胞の特異的リガンド結合もしくは生物学的特徴により測定する。ヒトＶＲ３レセプターを発現する組換え宿主細胞の場合、パッチボルテージクランプ技術を使用してチャンネル活性を測定しかつヒトＶＲ３レセプタータンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合、パッチクランプ法ならびに二電極膜電位固定技術を使用してカルシウムチャンネル活性を測定しかつヒトＶＲ３レセプタータンパク質を定量することができる。
細胞に基づくアッセイ
本発明はヒトＶＲ３レセプターの化合物調節を検出する全細胞の方法を提供する。該方法は、段階：
１）化合物、および機能的ヒトＶＲ３レセプターを含有する細胞を接触させること、ならびに
２）化合物による改変されたヒトＶＲ３レセプター機能に応答しての細胞中の変化を測定すること
を含んで成る。
【００３９】
化合物との細胞の接触に必要な時間の量は、例えば既知のヒトＶＲ３レセプター調節物質との時間経過を実施すること、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより経験的に決定する。
【００４０】
本発明の方法の測定手段は、化合物に曝露された細胞を該化合物に同様に曝露されていない同一の細胞と比較することによりさらに規定することができる。あるいは、２種の細胞、すなわち機能的ヒトＶＲ３レセプターを含有する１種および第一のものに同一しかし機能的ヒトＶＲ３レセプターを欠く第二の細胞を、双方を同一の化合物と接触させかつ２種の細胞間の差異を比較することができる。この技術はこれらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においてもまた有用である。当業者は、これらの制御機構が機能的ヒトＶＲ３レセプターの調節に応答する細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。
【００４１】
「細胞」という用語は最低１個の細胞を指すが、しかし検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は細菌、酵母もしくは真核生物であってよい。
【００４２】
機能的ヒトＶＲ３レセプターの化合物調節を決定するためのアッセイ方法は、慣習的な実験室の形式にあることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、同時に複数のサンプルの容易な分析およびロボット操作の受容能力を可能にするアッセイの設計を指す。高スループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するための試薬の使用を減少させるもしくは操作の数を最小限にするよう最適化されるアッセイの設計である。アッセイ形式の例は、限定されるものでないが、液体を取り扱う実験に使用される９６穴もしくは３８４穴プレート、浮遊液滴および「実験室チップ（ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ）」マイクロチャンネルチップを挙げることができる。プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進歩しているため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されているため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルを実施してもよいことが当業者により公知である。
【００４３】
本発明の方法に適する細胞の変化は、ヒトＶＲ３レセプターの活性、機能もしくは量の変化を直接測定すること、あるいはヒトＶＲ３レセプター機能の下流の影響を測定することにより、例えば二次メッセンジャー濃度もしくは転写の変化を測定することにより、またはヒトＶＲ３レセプターにより転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化により、または細胞中の表現型の変化を測定することによりを含んで成る。好ましい測定手段は、ヒトＶＲ３レセプタータンパク質の量の変化、ヒトＶＲ３レセプターの機能的活性の変化、ｍＲＮＡの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌型タンパク質の変化、またはＣａ＋２、ｃＡＭＰもしくはＧＴＰ濃度の変化を包含する。ヒトＶＲ３レセプターの量もしくは機能的活性の変化を本明細書に記述する。ｍＲＮＡのレベルの変化は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくは示差的遺伝子発現により検出する。免疫親和性、リガンド親和性、もしくは酵素的測定は、宿主細胞中での特定のタンパク質のレベルのＶＲ３に誘導される変化を定量する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は蛍光発生的もしくは比色分析の基質の切断によりモニターされる。
【００４４】
細胞表面タンパク質のための好ましい検出手段はフローサイトメトリーもしくは統計学的細胞画像化を包含する。双方の技術において、目的のタンパク質は細胞表面に局在化されており、特異的蛍光プローブで標識され、そして細胞の蛍光の程度を介して検出される。フローサイトメトリーにおいては細胞を溶液中で分析する一方、細胞画像化技術においては細胞の野を相対的蛍光について比較する。
【００４５】
本発明はまた、ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現ならびにインビボでヒトＶＲ３レセプタータンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも向けられる。
【００４６】
化合物は、ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトＶＲ３レセプタータンパク質の機能を増大もしくは減弱させることによりにより調節するかもしれない。ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトＶＲ３レセプタータンパク質の機能を調節する化合物は多様なアッセイにより検出してよい。アッセイは、発現もしくは機能の変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい／いいえ（ｙｅｓ／ｎｏ）」アッセイであってよい。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプル中の発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にしてもよい。この方法で同定された調節物質は治療薬として有用であり、そしてヒトＶＲ３レセプターである。
ヒトＶＲ３レセプタータンパク質の精製
組換え宿主細胞中でのヒトＶＲ３レセプターの発現後に、精製されたヒトＶＲ３レセプターを提供するためにヒトＶＲ３レセプタータンパク質を回収してよい。組換えヒトＶＲ３レセプターは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーならびに抗体／リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組み合わせもしくは個別の応用により、細胞ライセートおよび抽出物から精製してよい。
【００４７】
組換えヒトＶＲ３レセプターは、完全長の新生ヒトＶＲ３レセプター、ヒトＶＲ３レセプターのポリペプチドフラグメントもしくはヒトＶＲ３レセプターサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成された免疫親和性カラムの使用により他の細胞タンパク質から分離することができる。親和性樹脂はその場合、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、そして、ヒトＶＲ３レセプターもしくはヒトＶＲ３レセプターサブユニットを含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物をゆっくりとカラムを通過させる。その後、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに下落するまでカラムを該緩衝液で洗浄し、その後、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）のような緩衝液を使用してｐＨを低下させることによるような緩衝条件を変えることによりタンパク質を溶出する。精製されたヒトＶＲ３レセプタータンパク質をその後、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対して透析する。
ヒトＶＲ３レセプターに結合する抗体の産生および使用
ヒトＶＲ３レセプターに対する単一特異性抗体は、ヒトＶＲ３レセプターに対し反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、もしくは元はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）により記述された技術を使用してヒトＶＲ３レセプターと反応性のモノクローナル抗体として調製する。免疫学的技術は当該技術分野で公知であり、そして、例えばコールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにより出版されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、ＩＳＢＮ　０８７９６９３１４２中に記述される。本明細書で使用されるところの単一特異性抗体は、ヒトＶＲ３レセプターに対する均一の結合の特徴をもつ単一の抗体種もしくは複数の抗体種と定義する。本明細書で使用されるところの均一の結合は、上述されるところのヒトＶＲ３レセプターに関連するもののような特定の抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトＶＲ３レセプター特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物（ウサギが好ましい）を、免疫アジュバントを伴うかもしくは伴わないかのいずれかで適切な濃度のヒトＶＲ３レセプターで免疫化することにより生じさせる。
【００４８】
免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は許容できる免疫アジュバントを伴う約０．００１ｍｇと約１００ｍｇとの間のヒトＶＲ３レセプターを受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、明礬沈降物、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）およびｒＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは双方のいずれかで複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中のヒトＶＲ３レセプターより成る。各動物から定期的間隔で、好ましくは毎週採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫感作後に追加免疫の注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加免疫の注入を受領する動物には、一般に、同一経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を投与する。追加免疫の注入は最大力価が得られるまで約３週間隔で投与する。各追加免疫の免疫感作後約７日もしくは単回免疫感作後約１週間に、動物から採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００４９】
ヒトＶＲ３レセプターと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをヒトＶＲ３レセプターで免疫化することにより調製する。マウスは、等量の上で論考されたところの許容できるアジュバント中に組み込まれた約０．１ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇのヒトＶＲ３レセプターを用いてＩＰもしくはＳＣ経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初期免疫感作を受領し、そして約２ないし約３０週間休ませる。免疫化されたマウスに、静脈内（ＩＶ）経路によりリン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝液溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇのヒトＶＲ３レセプターの１回もしくはそれ以上の追加免疫の免疫感作を投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を取り出すことにより得る。脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で混合することにより、ハイブリドーマ細胞を生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ　４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、約３０％から約５０％までの濃度のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたダルベッコの改変イーーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により選択する。上清液を、ほぼ第１４、１８および２１日に成長陽性のウェルから収集し、そして抗原としてヒトＶＲ３レセプターを使用する固相免疫放射アッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液はオークターロニー沈降アッセイでもまた試験してｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミック　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、１９７３中のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｓｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの軟寒天技術のような技術、もしくは限界希釈の技術によりクローン化する。
【００５０】
モノクローナル抗体を、初回抗原刺激後最低約４日に、プリスタンで初回免疫刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスの約１×１０６ないし約６×１０６個のハイブリドーマ細胞を含むマウスあたりおよそ０．５ｍｌの注入によりインビボで産生させる。細胞移入後およそ８〜１２日に腹水を収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００５１】
抗ヒトＶＲ３レセプターｍＡｂのインビトロ産生は、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを成長させることにより実施する。当該技術分野で公知の中空糸培養技術、エア・リフト反応器、ローラーボトル、もしくはスピナーフラスコ培養技術を使用して高密度のインビトロ細胞培養を実施して、大量の抗ヒトＶＲ３レセプターＭＡｂを製造してよい。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００５２】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。体液もしくは組織および細胞抽出物中のヒトＶＲ３レセプターの存在を検出するのに類似のアッセイを使用する。
【００５３】
単一特異性抗体の上述された産生方法を利用してヒトＶＲ３レセプターポリペプチドフラグメントもしくは完全長の新生ヒトＶＲ３レセプターポリペプチドもしくは個々のヒトＶＲ３レセプターサブユニットに特異的な抗体を産生してよいことが当業者に容易に明らかである。とりわけ、唯一のヒトＶＲ３レセプターサブユニットもしくは完全に機能的なヒトＶＲ３レセプタータンパク質に特異的である単一特異性抗体を生じさせてよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトＶＲ３レセプタータンパク質の正常な機能を阻害する単一特異性抗体を生じさせてよいこともまた当業者に明らかである。
【００５４】
ヒトＶＲ３レセプター抗体アフィニティーカラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を付加することにより作成する。好ましい共有結合は抗体上に含有されるアミン、アルデヒドもしくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上でのアルデヒドもしくは遊離スルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり；アミン基は例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。
ヒトＶＲ３レセプター特異的試薬を含有するキット組成物
ヒトＶＲ３レセプターのＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒトＶＲ３レセプターに対する抗体、またはヒトＶＲ３レセプタータンパク質を含有するキットを製造してよい。ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するか、またはサンプル中のヒトＶＲ３レセプタータンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するのにこうしたキットを使用する。こうした特徴づけは、限定されるものでないが法廷分析、診断の応用および疫学的研究を挙げることができる多様な目的上有用である。
【００５５】
本発明は診断試薬としての使用のためのヒトＶＲ３ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連する突然変異された形態のヒトＶＲ３遺伝子の検出は、ヒトＶＲ３の過小発現もしくは過剰発現から生じる疾患もしくはこうした疾患に対する感受性の診断に追加するもしくはそれを定義することができる診断ツールを提供することができる。ヒトＶＲ３遺伝子中に突然変異を担持する個体は、当該技術分野で公知かつ本明細書に記述される多様な技術によりＤＮＡレベルで検出してよい。
【００５６】
ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ、ヒトＶＲ３レセプターＲＮＡもしくはヒトＶＲ３レセプタータンパク質をスクリーニングしかつそのレベルを測定するのに、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用してよい。該組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ヒトＶＲ３レセプターの検出および型分類に適するキットの処方にそれら自身を適合させる。こうしたキットは、緊密な制限、最低１個の容器中に保持するのに適する区画化された担体を含むことができる。該担体は、ヒトＶＲ３レセプターを検出するのに適する組換えヒトＶＲ３レセプタータンパク質もしくは抗ヒトＶＲ３レセプター抗体のような試薬をさらに含むことができる。該担体はまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段も含有してよい。
遺伝子治療
ヒトＶＲ３レセプターをコードするＤＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス治療のため合成することができる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定誘導体、または他のヒトＶＲ３レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であってよい。ヒトＶＲ３レセプターアンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞に導入してよい。ヒトＶＲ３レセプターアンチセンス治療は、ヒトＶＲ３レセプター活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【００５７】
ヒトＶＲ３レセプター遺伝子治療を使用して、標的生物体の細胞中にヒトＶＲ３レセプターを導入してよい。ヒトＶＲ３レセプター遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によりヒトＶＲ３レセプターＤＮＡの移入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡを、リガンド−ＤＮＡ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体を使用するレセプターに媒介される標的を定められたＤＮＡ移入、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のため細胞中に移入することができる。これらの手順およびそれらの変形物はエクスビボならびにインビボのヒトＶＲ３レセプター遺伝子治療に適する。ヒトＶＲ３レセプター遺伝子治療は、ヒトＶＲ３レセプター活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。ヒトＶＲ３レセプター遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐａｕｌ　Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ編、ヒューマン　プレス（Ｈｕｍａｎ　ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トタワ、１９９６に記述されている。
製薬学的組成物
ヒトＶＲ３レセプターＤＮＡ、ヒトＶＲ３レセプターＲＮＡもしくはヒトＶＲ３レセプタータンパク質、またはヒトＶＲ３レセプター活性の調節物質を含んで成る製薬学的に有用な組成物を、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方してよい。こうした担体および処方方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓで見出すことができる。有効な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは調節物質を含有することができる。
【００５８】
本発明の治療的もしくは診断的組成物は、ヒトＶＲ３レセプターに関する活性の調節が指示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の病状、体重、性別および齢のような多様な因子に従って変動するかもしれない。他の因子は投与の様式を包含する。該製薬学的組成物は皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供してよい。
【００５９】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は基礎分子の溶解性、半減期、吸収などを改良するかもしれない。あるいは、該部分は、基礎分子の望ましくない副作用を減弱するもしくは基礎分子の毒性を減少させるかもしれない。こうした部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような多様な教科書に記述されている。
【００６０】
本明細書に開示される方法により同定された化合物は、いかなる潜在的な毒性も最小限にしつつヒトＶＲ３レセプターもしくはその活性の至適の阻害を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。
【００６１】
本発明はまた、本発明の新規治療方法での使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供するという目的も有する。ヒトＶＲ３レセプターの調節での使用のための有効成分として本発明で同定される化合物もしくは調節物質を含有する組成物は、投与のための慣習的ベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与することができる。例えば、化合物もしくは調節物質は、錠剤、カプセル剤（それぞれ調時放出および持続性放出製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口の投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内（ボーラスおよび注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）の双方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態でも投与してよく、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効しかし非毒性量の所望の化合物をヒトＶＲ３レセプター調節剤として使用することができる。
【００６２】
生成物の１日投薬量は１日あたり患者あたり０．０１から１，０００ｍｇまでの広範な範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、組成物は好ましくは、治療されるべき患者に対する投薬量の症候的調整のため、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線付きもしくは割線を付けられない錠剤の形態で提供する。薬物の有効量は、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重までである。ヒトＶＲ３レセプター調節物質の投薬量は、所望の効果を達成するために組み合わせられる場合に調整される。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は相乗的結果を達成するために独立して至適化しかつ組み合わせてよく、ここで病状はいずれかの作用物質を単独で使用する場合にそうであろうよりも抑制される。
【００６３】
有利には、本発明の化合物もしくは調節物質は単一の１日用量で投与してよいか、または総１日投薬量を１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与してよい。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介するもしくは経皮経路を介する鼻内の形態で、当業者に公知の経皮皮膚貼付剤のそれらの形態を使用して投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん投薬レジメンの間中間欠的よりむしろ連続的であることができる。
【００６４】
有効成分が別個の投薬製剤中にある１種以上の有効成分を用いる組み合わせ治療のためには、有効成分を同時に投与することができるか、もしくはそれらはそれぞれ別個のずらされた時点で投与することができる。
【００６５】
本発明の化合物もしくは調節物質を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態；治療されるべき病状の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、該病状の進行を予防、対抗もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度の達成における最適精度は、標的部位への薬物の生物学的利用性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【００６６】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくは調節物質は有効成分を形成することができ、そして、典型的には、意図される投与形態、すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関してかつ慣習的製薬学的実務と矛盾せず適して選択された適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（本明細書で集合的に「担体」物質と称される）との混合状態で投与される。
【００６７】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のために、有効薬物成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望のもしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色料もまた混合物中に組み込むことができる。適する結合剤は、制限なしにデンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしにオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしにデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００６８】
液体の形態のためには、有効薬物成分は合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して風味をつけられた懸濁化剤もしくは分散剤中で組み合わせることができる。使用してよい他の分散剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。適する保存剤を一般に含有する等張の製剤を、静脈内投与が望ましい場合に使用する。
【００６９】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して例えばアルコール性溶液、局所清浄剤、浄化クリーム剤、皮膚ゲル剤、皮膚ローション剤、およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプー剤を形成することができる。
【００７０】
本発明の化合物もしくは調節物質はまた、小型単層状小胞、大型単層状小胞および多層状小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成することができる。
【００７１】
本発明の化合物はまた、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用により送達してもよい。本発明の化合物もしくは調節物質はまた、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、薬物の制御放出の達成で有用な生物分解性ポリマーの一分類、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してもよい。
【００７２】
経口投与のために、該化合物もしくは調節物質は、カプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与してよいか、あるいはそれらは動物飼料に混合することができる。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルと組み合わせの有効成分から構成される。これらの単位投与剤形は、均一な混合物が得られるような、希釈剤、増量剤、崩壊剤および／もしくは結合剤を包含する適する微細に粉末にされた不活性成分と有効成分を緊密に混合することにより製造する。不活性成分は該化合物もしくは調節物質と反応することができずかつ治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の因子に依存して広範に変動する量の有効および不活性成分を含有してよい。有効成分はまた、飼料と化合物を単純に混合することにより、もしくは飼料の表面に化合物を塗布することにより、飼料への添加物として投与してもよい。あるいは、有効成分は不活性担体と混合してよく、そして生じる組成物をその後飼料と混合するかもしくは動物に直接給餌するかのいずれかであってよい。適する不活性担体は、コーンミール、シトラスミール、醗酵残渣、粗挽きダイズ、乾燥穀物などを包含する。有効成分は、最終組成物が０．００１から５重量％までの有効成分を含有するような、粉砕（ｇｒｉｄｉｎｇ）、攪拌、微粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）もしくは混転することによりこれらの不活性担体と緊密に混合する。
【００７３】
該化合物もしくは調節物質は、あるいは、不活性液体担体中に溶解された有効成分より成る製剤の注入を介して非経口で投与してもよい。注入は筋肉内、第一胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであってよい。注入可能な製剤は適切な不活性液体担体と混合された有効成分より成る。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマルなどのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性非経口製剤もまた使用してよい。植物油は好ましい液体担体である。該製剤は、最終製剤が０．００５から１０重量％までの有効成分を含有するような、液体担体中に有効成分を溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【００７４】
該化合物もしくは調節物質の局所適用は、本化合物もしくは調節物質を水性溶液もしくは懸濁液として含有する液体の飲薬もしくはシャンプー剤の使用により可能である。これらの製剤は一般にベントナイトのような懸濁化剤を含有し、そして通常は消泡剤もまた含有することができる。０．００５から１０重量％までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は０．０１から５重量％までの本化合物もしくは調節物質を含有するものである。
【００７５】
以下の実施例はどのような方法でもそれをそれに制限することなく本発明を具体的に説明する。
【００７６】
実施例１　ヒト前立腺および下垂体ｃＤＮＡライブラリーの生成
ｃＤＮＡ合成：
第１鎖合成：ヒト前立腺もしくは下垂体ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）約５μｇを、ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡを合成するために使用した。ＮｏｔＩプライマーアダプター２μｌを、ｍＲＮＡ５μｇに添加し、そして混合液を１０分間７０℃に加熱し、そして氷上に置いた。次の試薬を氷上で添加した：５ｘ第１鎖バッファー（２５０ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），３７５ｍＭ　ＫＣｌ，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）４μｌ、０．１Ｍ　ＤＴＴ２μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）混合液およびＤＥＰＣ処理水１μｌ。反応は、４２℃で５分間インキュベートした。最後に、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＲＴＩＩ　５μｌを添加し、そして４２℃でさらに２時間インキュベートした。反応を氷上で終結した。
【００７７】
第２鎖合成：第１鎖生成物を水で９３μｌに調整し、そして次の試薬を氷上で添加した：５ｘ第２鎖バッファー（１００ｍＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．９），４５０ｍＭ　ＫＣｌ，２３ｍＭ　ＭｇＣｌ２）３０μｌ，０．７５ｍＭβ−ＮＡＤ＋，５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭｄＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）３μｌ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（１０ユニット）１μｌ、ＲＮアーゼＨ（２ユニット）１μｌ、ＤＮＡｐｏｌ　Ｉ（１０ユニット）４μｌ。反応は、１６℃で２時間インキュベートした。第２鎖合成からのＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして１６℃に置いてＤＮＡ末端を平滑にした。二本鎖ｃＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム（１：１，ｖ：ｖ）混合液１５０μｌで抽出し、そして７．５Ｍ　ＮＨ４ＯＡｃ０．５容量および無水エタノール２容量で沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして３７℃で乾燥して残留エタノールを除去した。二本鎖ＤＮＡペレットは、水２５μｌに再懸濁し、そして次の試薬を添加した：５ｘＴ４ＤＮＡリガーゼバッファー１０μｌ、ＳａｌＩアダプター１０μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ５μｌ。成分を静かに混合し、そして１６℃で一夜連結した。連結混合液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、徹底的に撹拌し、そして室温で１４，０００ｘｇで５分間遠心して相を分離した。水相を新しいチューブに移し、そして容量を水で１００ｍｌに調整した。精製ＤＮＡは、ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ１０００カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上でサイズ選択して、比較的小さいｃＤＮＡ分子を除去した。二本鎖ＤＮＡは３７℃で３−４時間ＮｏｔＩ制限酵素で消化した。制限消化物は０．８％低融点アガロースゲルで電気泳動した。範囲１−５ｋｂのｃＤＮＡを切り離し、そしてＧｅｌｚｙｍｅ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。生成物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてＮＨ４ＯＡｃおよび無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして水１０ｍｌに再懸濁した。
【００７８】
ｃＤＮＡのベクターへの連結：ｃＤＮＡを５本のチューブに分配し（各２μｌ）、そして連結反応液を水４．５μｌ、５ｘ連結バッファー２μｌ、ｐ−ＳｐｏｒｔベクターＤＮＡ（ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断し、ホスファターセ処理した）１μｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌを添加することによって組み立てた。連結反応は４０℃で一夜インキュベートした。
【００７９】
エレクトロポレーションによる連結ｃＤＮＡの大腸菌への導入：
連結反応液容量は、水によって総容量２０μｌに調整した。酵母ｔＲＮＡ５ｍｌ、７．５ＭＮＨ４ＯＡｃ１２．５ｍｌおよび無水エタノール（−２０℃）７０ｍｌを添加した。混合液を十分に撹拌し、そして直ちに室温で１４０００ｘｇ２０分間遠心した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そして各ペレットを水５ｍｌに再懸濁した。全５個の連結物（２５ｍｌ）をプールし、そしてＤＨ１０Ｂエレクトロ・コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００μｌをＤＮＡ１ｍｌによりエレクトロポレーション処理し（全２０回のエレクトロポレーション）、次いで、アンピシリン平板に塗布して、１μｌ当たりの組み換え体数（ｃｆｕ）を決定した。全ライブラリーをＳｕｐｅｒ　Ｂｒｏｔｈ２リッター中に接種し、そしてｍａｘｉｐｒｅｐをＰｒｏｍｅｇａ　Ｍａｘｉ　Ｐｒｅｐキットを用いて作成し、そして塩化セシウム勾配で精製した。
【００８０】
実施例２：　ライブラリースクリーニング／ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ＋生成
ヒト下垂体ライブラリーのスクリーニング：
ヒト下垂体ライブラリーの１μｌ分量をＥｌｅｃｔｒｏｍａｘＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にエレクトロポレートした。容量をＳＯＣ媒質により１ｍｌに調整し、そして振盪しつつ３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、ＬＢを含有する１５０ｃｍ２平板に塗布して１プレート当たり密度２００００コロニーにした。これらの培養物を３７℃で一夜増殖させた。
【００８１】
ヒトＶＲ３受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された：
５’オリゴ（配列番号：１）：５’ＡＣＣＧＧＣＣＴＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＧＴＧ
３’オリゴ（配列番号：２）：５’ＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣ
プローブは、５’および３’プローブオリゴ（各１００ｎｇ）および希釈ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ１０ｎｇを用いる正規のＰＣＲ条件を使用するＰＣＲによって生成された。得られる４９３ｂｐフラグメントを１％アガロースゲル上で移動させ、そしてＱＵＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いる精製した。精製プローブ約１００ｎｇを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製オリゴ標識キットを用いてα３２Ｐで標識し、標識したＤＮＡをＳ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。
【００８２】
ライブラリーコロニーを、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌ）上に拾い上げ（ｌｉｆｔ）、そしてＤＮＡを１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＮａＯＨ中で変性した。フィルターディスクを１．５ＭＮａＣｌ，１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で中性にして、次にＵＶ−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してメンブランにＵＶ架橋結合した。フィルターを４２℃の洗浄溶液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；５ＭＮａＣｌ；０．５ＭＥＤＴＡ；２０％ＳＤＳ）中で数回洗浄した。次いで、ディスクを５０％ホルムアミドおよびせん断サケ精子ＤＮＡ（５’−３’Ｉｎｃ）１００ｕｇ／ｍｌを含有する１ｘサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー（５’−３’Ｉｎｃ）中で４２℃６時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド，標識プローブ（５ｘ１０５〜１ｘ１０６ｃｍｐ／ｍｌハイブリダイゼーションバッファー）の存在下のせん断サケ精子ＤＮＡ１００ｎｇを含有する１ｘハイブリダイゼーションバッファー（５’−３’）中で４２℃で一夜行った。
【００８３】
ディスクを、室温で２ｘＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ中で２回（各２０分）、そして３０分間５０℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、プラスチックラップ中に包み、そして−２０℃で一夜フィルムに露光した。
【００８４】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、３７℃で１時間ＬＢ中でインキュベートした。培養液の希釈液をＬＢ寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。２次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【００８５】
全長クローンは、鋳型で、ＫｐｎＩ（ＦＬ５’オリゴ配列番号：３）およびＮｏｔＩ（ＦＬ３’オリゴ配列番号：４）部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン１０ｎｇを使用するＰｆｕポリメラーゼによるＰＣＲによって生成した。
【００８６】
ＦＬ５’オリゴ（配列番号：３）：ＡＡＣＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧ
ＦＬ３’オリゴ（配列番号：４）：ＴＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＧＧＴＧＡＧＣＣＴＣＡＣ
ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ酵素によって消化し、そしてｐＳＰ６４Ｔ．ＧＣ発現ベクター中にクローン化した。ＤＮＡの大規模調製は、ＭＥＧＡｐｒｅｐキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して行った。
【００８７】
実施例３：　ライブラリースクリーニング／ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−およびヒトＶＲ３Ａ−Ｂ−生成
ヒト前立腺ライブラリーのスクリーニング：
ヒト前立腺ライブラリーの１μｌ分量をＥｌｅｃｔｒｏｍａｘＤＨ１０Ｂ細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にエレクトロポレートした。容量をＳＯＣ媒質により１ｍｌに調整し、そして振盪しつつ３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、ＬＢを含有する１５０ｃｍ２平板に塗布して１プレート当たり密度２００００コロニーにした。これらの培養物を３７℃で一夜増殖させた。
【００８８】
ヒトＶＲ３受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された：
５’オリゴ（配列番号：１３）：５’ＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＣＡＡＧ
３’オリゴ（配列番号：１４）：５’ＧＴＡＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡ
プローブは、５’および３’プローブオリゴ（各１００ｎｇ）および希釈ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ１０ｎｇを用いる正式のＰＣＲ条件を使用するＰＣＲによって生成された。得られる３８７ｂｐフラグメントを１％アガロースゲル上で移動させ、そしてＱＵＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いる精製した。精製プローブ約１００ｎｇを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製オリゴ標識キットを用いてα３２Ｐで標識し、標識したＤＮＡをＳ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。
【００８９】
ライブラリーコロニーを、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌ）上に拾い上げ（ｌｉｆｔ）、そしてＤＮＡを１．５ＭＮａＣｌ，０．５ＭＮａＯＨ中で変性した。フィルターディスクを１．５ＭＮａＣｌ，１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５で中性にして、次にＵＶ−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してメンブランにＵＶ架橋結合した。フィルターを４２℃の洗浄溶液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；５ＭＮａＣｌ；０．５ＭＥＤＴＡ；２０％ＳＤＳ）中で数回洗浄した。次いで、ディスクを５０％ホルムアミドおよびせん断サケ精子ＤＮＡ（５’−３’Ｉｎｃ）１００ｕｇ／ｍｌを含有する１ｘサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー（５’−３’Ｉｎｃ）中で４２℃６時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド，標識プローブ（５ｘ１０５〜１ｘ１０６ｃｍｐ／ｍｌハイブリダイゼーションバッファー）の存在下のせん断サケ精子ＤＮＡ１００ｎｇを含有する１ｘハイブリダイゼーションバッファー（５’−３’）中で４２℃で一夜行った。
【００９０】
ディスクを、室温で２ｘＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ中で２回（各２０分）、そして３０分間５０℃で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、Ｓａｒａｎラップ中に包み、そして−２０℃で一夜フィルムに露光した。
【００９１】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、３７℃で１時間ＬＢ中でインキュベートした。培養液の希釈液をＬＢ寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。２次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【００９２】
全長クローンは、鋳型で、ＮｏｔＩ（ＦＬ５’オリゴ配列番号：１５）およびＸｂａＩ（ＦＬ３’オリゴ配列番号：１６）部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン１０ｎｇを使用するＰｆｕポリメラーゼによるＰＣＲによって生成した。
【００９３】
ＦＬ５’オリゴ（配列番号：１５）：５’ＡＡＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＧ
ＦＬ３’オリゴ（配列番号：１６）：５’ＡＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧ
ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩおよびＸｂａＩ酵素によって消化し、そしてｐＧｅｍＨＥ発現ベクター中にクローン化した。ＤＮＡの大規模調製は、ＭＥＧＡｐｒｅｐキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して行った。
【００９４】
実施例４−哺乳動物発現ベクター中へのヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡ（集団としてｈＶＲ３と呼ばれる）を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）中にクローン化した。クローン化ＰＣＲ生成物をカラム（Ｐｒｏｍｅｇａ製Ｗｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　ＤＮＡ精製キット）で精製し、そしてＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化して付着末端を生成した。生成物を低融点アガロースゲルで電気泳動によって精製した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクターをＮｏｔＩおよびＸｂａＩ（ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位中にクローン化したｈＶＲ３Ａ＋Ｂ＋を除く）酵素で消化し、続いて低融点アガロースゲルで精製した。線状ベクターを使用してヒトＶＲ３ｃＤＮＡインサートに連結した。組み換え体を単離し、ヒトＶＲ３受容体を指定し、そしてトランスフェクションキットに基づくＥｆｆｅｃｔｅｎｅ非リポソーム性脂質（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−７またはＣＨＯ−Ｋ１細胞）をトランスフェクションするために使用した。安定な細胞クローンをゼオシン存在下の増殖によって選択した。単一のゼオシン耐性クローンを単離し、そしてインタクトのヒトＶＲ３受容体遺伝子を含有することが示された。ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡを含有するクローンをｈＶＲ３タンパク質発現について解析した。ヒトＶＲ３コーディングＤＮＡを含有する組み換えプラスミドを使用して、哺乳動物ＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を形質転換した。
【００９５】
安定にまたは一時的に、ヒトＶＲ３受容体を発現する細胞は、ヒトＶＲ３受容体の発現および３Ｈ−ＲＴＸ結合活性について試験するために使用される。これらの細胞は、ヒトＶＲ３受容体を調節、阻害または活性化する能力および放射性３Ｈ−ＲＴＸ結合と競合する能力について、他の化合物を特定し、そして試験するために使用される。
【００９６】
プロモーターに関して正方向にヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡを含有するカセットは、プロモーターの適当な制限部位３’中に連結され、そして制限部位マッピングおよび／または配列決定によって同定される。これらのｃＤＮＡ発現ベクターは、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、または化学的操作（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含む標準的方法によって、繊維芽細胞性宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１　ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５（１９８７）］、２９３．Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）中に導入される。トランスフェクション細胞および細胞培養上澄液が収穫され、そして前記のようにヒトＶＲ３受容体発現について解析される。　哺乳動物の一過性発現のために使用されるベクターのすべては、ヒトＶＲ３受容体を発現する安定な細胞系を確立するために使用できる。発現ベクター中にクローン化された未改変ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡ構築物は、ヒトＶＲ３受容体タンパク質を生成する宿主細胞を計画するために期待される。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものではないがＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５（１９８７）］、ｔＫ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　１１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０、およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｓｈａｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１，（１９８２）］を含む。
【００９７】
限定されるものではないがＧ４１８、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ，キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを含む薬物選択プラスミドと、ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡを含有するすべてのベクターとのコ・トランスフェクションは、安定にトランスフェクションされたクローンの選択を可能にするであろう。ヒトＶＲ３受容体のレベルは、前記アッセイによって定量化される。
【００９８】
また、ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡ構築物は、最高可能レベルのヒトＶＲ３受容体を合成する哺乳動物細胞クローンの作成のために、増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクター中に連結される。これらの構築物の細胞への導入後、プラスミドを含有するクローンは適当な薬剤により選択され、そして高いコピー数のプラスミドをもつ過発現クローンの単離は、薬剤用量の増加における選択によって達成される。
【００９９】
組み換えヒトＶＲ３受容体の発現は、哺乳動物宿主細胞への全長ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのトランスフェクションによって達成される。
【０１００】
実施例５−アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるｐＶＲ３Ｒによってコードされている機能性タンパク質の特性決定
キセノパス・レエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞は、既に記述され、そして当該技術分野において既知である（Ｆｒａｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）標準的方法を用いて調製され、そして注射された。成メスのキセノパス・レエビスからの卵巣葉（Ｎａｓｃｏ，Ｆｏｒｔ　Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）を切り離し（ｔｅａｓｅｄ　ａｐａｒｔ）、名目上Ｃａ不含の生理食塩水（８２．５ｍＭＮａＣｌ，２．５ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ２，５ｍＭＨＥＰＥＳを含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した）（ＯＲ−２）で数回洗浄し、そして０．２％コラゲナーゼ１型（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）を含有するＯＲ−２中で２．５時間静かに振盪した。胞状層の約５０％を除去した場合、ＶおよびＶＩ期の卵母細胞が選択され、そして７５％ＯＲ−２および２５％ＮＤ−９６からなる媒質中で洗浄された。ＮＤ−９６は、１００ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＫＣｌ，１ｍＭＭｇＣｌ２，１．８ｍＭＣａＣｌ２，５ｍＭＨＥＰＥＳ，２．５ｍＭピルビン酸Ｎａ，ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）を含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整された。細胞外Ｃａ＋２を徐々に増加し、そして細胞は注射前２−２４時間ＮＤ−９６中に維持した。イン・ビトロ転写では、ヒトＶＲ３を含有するｐＧＥＭ　ＨＥ（Ｌｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）を、ＮｈｅＩで直線化し、そしてキャップ類似体ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。合成されたｃＤＮＡは、酢酸アンモニウムで沈殿させ、そしてヌクレアーゼ不含の水５０μｌ中に再懸濁した。ｃＤＮＡをホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１ｘＭＯＰＳ，３％ホルムアルデヒド）を用いてＲＮＡマーカー（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，０．２４−９．５ｋｂ）１．２および５μｌに対して定量した。
【０１０１】
卵母細胞は、ＶＲ１（２−３ｎｇ）の同時注射の有無の下でヒトＶＲ３受容体ＲＮＡ（０．３−５ｎｇ）５０ｎｌを注射された。対照卵母細胞は水５０ｎｌを注射された。卵母細胞は、ヒトＶＲ３の発現について解析する前に、ＮＤ−９６中で１−１３日間インキュベートされた。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化を室温で実施した。注射された卵母細胞は、１８℃において４８穴細胞培養クラスター（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で維持された。全細胞の作動剤−誘導電流が、注射後１−１４日目に、既に記述され、そして当該技術分野において既知である標準方法（Ｄａｓｃａｌ，１９８７）を使用して、慣用の２電極電圧クランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ５００，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｙｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて測定された。微小電極を３ＭＫＣｌで満たしたが、これは抵抗１および２ＭΩをもっていた。細胞は、指示されない限り室温で〜１０ｍｌ／ｍｉｎにおいてＮＤ−９６を連続的に潅流された。膜電圧は、指示されない限り−７０ｍＶで固定した。
【０１０２】
卵母細胞は、種々のリガンド、低ｐＨ、および減極ならびに超分極電圧段階によりチャレンジされたが、ヒトＶＲ３を発現している卵母細胞と対照卵母細胞との間の膜コンダクタンスにおいては検出可能な差はなかった［表１参照］。しかしながら、ヒトＶＲ３を注射した卵母細胞は、４つの点において対照とは異なる性質をもっていた。第１は、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−ｃＲＮＡの注射は卵母細胞を死滅させた。ＡインサートをもつＶＲ３イソ型を注射された卵母細胞の生存度は、注射後３−４日目のシスター対照に比べて有意に低下した（図９）。第２に、ＶＲ３の全３種のイソ型は、熱−誘導応答を増進した（図１０）。第３は、ヒトＶＲ１を同時に注射されたＡ＋Ｂ−は、ルテニウム・レッド感受性潅流−誘導電流（１ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を生じた（図１１）。第４に、ヒトＶＲｃＲＮＡとヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−ｃＲＮＡ同時注射は、カプサイシン、ＶＲ１受容体の作動剤、１ｕＭに対する卵母細胞の応答性を変化した（図１２）。
【０１０３】
【表１】
2004500085.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2004500085.tif 000003
【０１０５】
生存度
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトＶＲ３イソ型の機能的発現が示される：
２Ｃａ２＋を含有するＮＤ−９６において維持された卵母細胞の生存度は、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−（３．２５ｎｇ）およびＶＲ３Ａ＋Ｂ＋（５ｎｇ）では注射後４−６日に有意に低下したが、ＶＲ３Ａ−Ｂ−（１．５ｎｇ）ｃＲＮＡでは低下しなかった。ＶＲ３Ａ＋Ｂ−および対照の水を注射された卵母細胞のデータは、５回の別々の実験において類似しており、そして合体された。死滅卵母細胞は、Ｂａｕｃｈ　ａｎｄ　Ｌｏｍｂ解剖顕微鏡を使用して肉眼的に決定された。データは、カイ二乗解析を用いて解析された。ＶＲ３Ａ＋Ｂ−注射卵母細胞は、最低生存度であった：約９％の卵母細胞のみが注射後４−６日目に生き残っていた。ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ＋を注射された卵母細胞の約３３％が注射後４−６日目に生き残っていた。シスター水注射対照卵母細胞の約６７％が、本質的に同じ条件下で同じ期間生き残った。ＶＲ３Ａ−Ｂ−注射卵母細胞は、水注射対照と類似の生存度を示した。類似のデータは、ｃＲＮＡの２つの別々のバッチから得られた。
【０１０６】
熱応答性
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトＶＲ３イソ型の機能的発現が示される：
熱による活性化。ａ）．２５℃〜４６℃の熱ランプ（ｒａｍｐ）によって誘起され、そして４６℃において少なくとも１５秒間維持される平均ピーク電流が示される。電圧ランプは、サンプリング速度２秒において−１２０〜＋８０ｍＶを４００ｍｓｅｃにわたって印加された。示される電流は、＋８０ｍＶにおいて誘起される初発電流を超える電流の増大であった（（ｂ）において示される電流電圧曲線における最も右の点）。卵母細胞は、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋ｃＲＮＡ、それぞれ３．２５，１．５および５ｎｇを注射され、そして６日後まで記録された。黒色バー：水注射の対照（ｎ＝８）；白色バー：ＶＲ３Ａ＋Ｂ−イソ型（ｎ＝１１）；斜線バー：ＶＲ３Ａ−Ｂ−イソ型（ｎ＝８）；点彩バー：ＶＲ３Ａ＋Ｂ＋イソ型（ｎ＝５）。すべてのイソ型が水対照以上に有意な増加を示した（それぞれｐ＝０．００１，０．０３および０．００７）。熱誘導応答は、他の２つのイソ型に比べてＡ＋Ｂ−イソ型では約２倍大きかったが、差異は有意ではなかった（それぞれＡ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋に比べてＡ＋Ｂ−ではｐ＝０．０５１およびｐ＝０．１６）。データは、注射された卵母細胞２組から得られた。示されるデータは、平均値および平均値の標準誤差である。（ｂ）．電圧ランプで誘導される電流は、水（上段）、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−（上から２つ目）、ＶＲ３Ａ−Ｂ−（上から３つ目）およびＶＲ３Ａ＋Ｂ＋（下段）を注射された卵母細胞に対する増加する熱の適用中に記録された。卵母細胞は、Ｃａ２＋ＮＤ−９６を一定に潅流され、そして溶液はインライン（ｉｎｌｉｎｅ）ヒーター器具（ＳＨ−２７Ａラインヒーターと結合されたＴＣ−３２４Ｂ；Ｗａｒｎｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｒｐ．）によって加熱された。温度３７℃〜４６℃において得られるランプ誘導電流（ｙ軸に示されるようにミクロアンペアの）が表される；より高い温度における電流トレース（ｔｒａｃｅ）のみが、対応する温度で標識される。
【０１０７】
潅流誘導電流（Ｉｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：図１１）：
バス潅流の開始は、図１１に示されるように、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−受容体ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡの有無の下、クローン化ヒトＶＲ１から転写されたＲＮＡを注射された卵母細胞において膜コンダクタンスの増加を誘起した。ＶＲ１ｃＲＮＡ（ａ）を注射された卵母細胞は、−１２０〜＋８０ｍＶ間の電圧ランプにより４００ｍｓｅｃにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度１０ｍｌ／ｍｉｎにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。まだ細胞外生理食塩水中にある卵母細胞からの対照ランプ誘導電流（Ｃ）は、Ｃａ２＋ＮＤ−９６のバス潅流の開始前に記録された。潅流の間、ランプ誘導電流は増加し、これはコンダクタンスにおける増加を示す（Ｐ）。１０ｕＭルテニウムレッド（ＲＲ）は、ＶＲ１発現卵母細胞における潅流誘導電流（Ｐ）をブロックしなかった。かくして、ＶＲ１のみを発現する卵母細胞において観察された潅流誘導電流は、１０ｕＭルテニウムレッドには非感受性であった（Ａ，「ＲＲ」）。しかしながら、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−およびＶＲ１を発現する卵母細胞において誘起される潅流誘導電流は、１０ｕＭルテニウムレッドによって劇的にブロックされた（Ｂ，「ＲＲ」）。この違いは、６個の卵母細胞において観察された。ブロックは部分的には可逆的であった（未掲載）。（ｂ）．ＶＲ３Ａ＋Ｂ−とともにＶＲ１ｃＲＮＡを注射された卵母細胞は、−１２０〜＋８０ｍＶ間の電圧ランプにより４００ｍｓｅｃにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度１０ｍｌ／ｍｉｎにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。潅流活性化電流は、卵母細胞の両セットにおいて類似の大きさを有した。ＲＲ阻止電流についてのＶｒｅｖは約−１３ｍＶであった（矢印）。両作動剤によって誘導される電流は、ラットＶＲ１について既に報告されたように（Ｃａｔｅｒｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）、強く外向きに整流していた。
【０１０８】
ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−の存在または不在下でヒトＶＲ１を発現する卵母細胞におけるカプサイシン誘導電流（図１２）
応答は、カプサイシン誘導電流の十分な外向きの整流のために、この電圧において最大であったので（Ｃａｔｅｒｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）、１ｕＭカプサイシンによって誘起される電流（図１２）が、＋５０ｍＶの保持電圧において測定された。ＶＲ１および水（ＶＲ３注射についての対照）を注射された卵母細胞（ａ）ならびにＶＲ１ｃＲＮＡおよびＶＲ３Ａ＋Ｂ−ｃＲＮＡを注射された卵母細胞（ｂ）の３例が示される。カプサイシンは、黒色の水平バーによって指示される時間中、バス（ｂａｔｈ）適用された。１ｕＭカプサイシンに対する１次応答の大きさは、ＶＲ１ｃＲＮＡがＶＲ３Ａ＋Ｂ−ｃＲＮＡとともに同じ比率で（各２．９ｎｇ）同時発現された場合は減少された。もっとも注目すべき差異は、２次応答、カプサイシンの洗浄開始において通常得られる第２次ハンプ（ｈｕｍｐ）、の大きさと減少速度であった。
【０１０９】
実施例６　哺乳動物細胞系におけるヒトＶＲ３の特性決定
ヒトＨＥＫ２９３、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＯＳ−７細胞が、ヒトＶＲ３イソ型ｐＶＲ３Ａ＋Ｂ−Ｒ、ｐＶＲ３Ａ−Ｂ−ＲもしくはｐＶＲ３Ａ＋Ｂ＋Ｒによりトランスフェクションされる。１００ｍｍディッシュ当たり１０６細胞当たりｐＶＲ３Ｒ　１μｇの一時的トランスフェクションが、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクションキット（Ｑｕｉａｇｅｎ：３０１４２５）を用いて実施される。トランスフェクション３日後、細胞は９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ，ポリ−Ｄ−リジン被覆ブラック／クリアプレート；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ｐａｒｔ＃３５４６４０）上に塗布される。１日後、ウェルをＦ１２／ＤＭＥＭにより洗浄し、次いで、室温で１時間、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−１２７（２０％，総容量２０ｍｌ中使用される４０μｌ）を含むＦｌｕｏ−４（２μＭ）中でインキュベートする。プレートは、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＦＬ−１０１）を用いてアッセイされる。細胞は、種々の浸透圧の溶液でチャレンジされる（５０μｌ／ｓｅｃの速度において８０μｌに添加された４０μｌ）。若干のウェルは、細胞外溶液による細胞の潅流増加を促進するために激しく混合される。ベクターのみのトランスフェクションが対照として使用される。
【０１１０】
３日後、細胞はネオマイシン（２００μｇ／ｍｌ）の存在下で選択され、そして約２週間、３回の１：１０希釈継代をとおして増殖される。個々のコロニーを採取し、そして６穴ディッシュにおいて増殖させる。次いで、細胞を９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ，ポリ−Ｄ−リジン被覆ブラック／クリアプレート；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ｐａｒｔ＃３５４６４０）上に塗布し、そして３日間集密まで増殖させる。ウェルをＦ１２／ＤＭＥＭにより洗浄し、次いで、室温で１時間、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（２０％，総容量２０ｍｌ中使用される４０μｌ）を含むＦｌｕｏ−４（２μＭ）中でインキュベートする。プレートは、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＦＬ−１０１）を用いてアッセイされる。細胞は、作動剤（５０μｌ／ｓｅｃの速度において８０μｌに添加された４０μｌ中３倍濃度において）でチャレンジされる。
【０１１１】
全細胞パッチ・クランプ（ｐａｔｃｈ　ｃｌａｍｐ）技術（Ｈａｍｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９８１）を使用して、１２ｍｍカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）上で＞２日間維持されたヒトＶＲ１受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３からのリガンド誘導電流を記録する。細胞は、ＤＩＣ　Ｎｏｍａｒｓｋｉ　ｏｐｔｉｃｓを有するＮｉｋｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ　３００を用いて可視化される。細胞は、別に指示しない限り、生理食塩水中で連続的に潅流される（〜０．５ｍｌ／ｍｉｎ）。標準生理食塩水（「Ｔｙｒｏｄｅｓ」）は、１３０ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ２、１．２ｍＭＭｇＣｌ２および１０ｍＭｈｅｍｉ−Ｎａ−ＨＥＰＥＳを含有する（ｐＨ７．３，Ｗｅｓｃｏｒ５５００　ｖａｐｅｒ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ（Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を用いて測定される２９５−３００ｍＯｓｍ）。記録用電極は、ボロシリケートキャピラリーチューブ（Ｒ６；Ｇａｒｎｅｒ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から製作され、チップは、歯科用ペリフェリーワックス（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ，ＩＮ）でコーティングされ、そして細胞内食塩水：１００ｍＭＫ−グルコン酸、２５ｍＭＫＣｌ、０．４８３ｍＭＣａＣｌ２、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭｈｅｍｉ−Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭＫ４−ＢＡＰＴＡ（１００ｎＭフリーＣａ＋２）；ｐＨ７．４（２９０ｍＯｓｍに達するまで添加されたデキストローズを有する）を含有する場合に１−２ＭΩの抵抗を有する。液間電位差は、両方とも経験的に決定された標準ピペットおよびバス溶液を用い、そしてコンピュータープログラムＪＰＣａｌｃ（Ｂａｒｒｙ，１９９４）を用いて−１８ｍＶである。示されるすべての電圧が液間電位差について補正される。電流および電圧シグナルが検出され、そしてＡｘｏｐａｔｃｈ　１Ｄパッチ・クランプ増幅器（ＡＸｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により２ｋＨＺにおいて濾過され、ＤｉｇｉＤａｔａ　１２００Ｂラボラトリーインターフェース（ＡＸｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＰＣ対応コンピューターシステムによりデジタルに記録され、そしてオフ・ライン解析のために磁気ディスクに保存される。データ取得および解析は、ＰＣｌａｍｐソフトウェアにより行われる。保持電流におけるゆっくりした変化が検出され、そして２ｋＨＺにおいて濾過され、そしてＬＰＦ２０２ＡＤＣ増幅器（Ｗａｒｎｅｒ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）およびＶＲ１０Ｂデジタルデータ記録機（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ，Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ，ＮＹ）によりビデオテープに記録される。シグナルは、その後、Ａｘｏｔａｐｅソフトウェアを用いて１０ＨＺにおいて解析される。
【０１１２】
総膜キャパシタンス（Ｃｍ）は、−６８ｍＶからの３０ｍＶ超分極電圧ランプが速度１０ｍＶ／ｍｓにおいて生成した後の最大電流と、最終電位（−９８ｍＶ）における定常状態電流との間の差異として決定される（Ｄｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。
【０１１３】
リガンド誘導コンダクタンス変化の見かけの反転電位（Ｖｒｅｖ）は電圧・ランププロトコール（Ｄｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）を用いて決定される。電圧ランプが１秒毎に印加され、そして得られる全細胞のランプ誘導電流が記録された。通常、電圧は、ネガティブからポジティブないしネガティブ値までランプされた。−６８ｍＶにおいて細胞をクランプするために必要な電流が連続的に追跡される。リガンド−誘導コンダクタンスは、リガンドの存在および不在下で電圧ランププロトコールによって誘起される全細胞電流から決定される。リガンド前（対照）およびリガンド存在下で測定された電圧ランプ誘導電流が比較されて、チャンネル電流出力を調節するためにチャンネルに及ぼすリガンドの影響を示す。正味のリガンド誘導電流が存在しない電圧が決定される（Ｖｒｅｖ）。
【０１１４】
実施例７−ヒトＶＲ３受容体タンパク質の１次構造
本発明は、ｈＶＲ３の３種のイソ型：Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋を記述している。ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋それぞれについて８７１，８１１および７４２アミノ酸をコードしている約２６１６，２４３６および２２２９塩基対の単一の大きい読み枠を示す。ＶＲ３Ａ＋Ｂ−のｃＤＮＡは、約３３７および約５４７ヌクレオチドの５’および３’−非翻訳エクステンションを有する。ＶＲ３Ａ＋Ｂ＋のｃＤＮＡは、約８３６および約９９４ヌクレオチドの５’および３’−非翻訳エクステンションを有する。最初の枠内メチオニンは、イソ型Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋それぞれについて約９８，２４２Ｄａ、９１，２９４Ｄａおよび８３，３１０Ｄａの概算分子質量（Ｍｒ）をもつヒトＶＲ３受容体タンパク質を予測する読み枠のための開始コドンとして指定された。Ａ＋Ｂ−イソ型は８７１アミノ酸のタンパク質をコードしてイル。ＶＲ３Ａ−Ｂ−はＶＲ３Ａ＋Ｂ−のアミノ酸３８２〜４４１の６０アミノ酸の欠失を含む。ＶＲ３Ａ＋Ｂ＋は、アミノ酸７３６まではＡ＋Ｂ−と同一であり、この後に、６個の相違するアミノ酸および終止コドンが存在する。ＶＲ３Ａ＋Ｂ＋イソ型は、推定ＴＭ６後に２０アミノ酸を延ばす。
【０１１５】
予想されるヒトＶＲ３受容体タンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースにより整列され、そしてヴァニロイド受容体ファミリー（ＶＲ１およびＶＲ３）に関連していることが分かった。大きい推定Ｎ末端親水性セグメント（約４６７アミノ酸）、Ｎ末端領域における３個の推定アンキリン反復ドメイン、６個の予想トランスメンブランドメインおよびポア領域を含む、この受容体ファミリーにおける数種の保存モチーフが見いだされる。ＶＲ３Ａ＋Ｂ−は、ヒトＶＲ１と４３％同一、両ヒトＶＲＬ−１（ＡＦ１２９１１２）およびヒトＶＲＬ（ＡＦ１０３９０６）と３９％同一である。かくして、本明細書に記述されるＶＲ３受容体は、明らかに、ヴァニロイド受容体ファミリーの新規な遺伝子である。　ＶＲ３Ａ＋Ｂ−およびＶＲ３Ａ−Ｂ−型は、アミノ酸６９４から末端までラットの緊張阻害性チャンネルＳＩＣ［ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＡＢ０１５２３１］に非常に類似している。５２９アミノ酸によってコードされているＳＩＣは、緊張によって阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる。それは、ＶＲファミリーの大きいＮ末端細胞質ドメインを欠くが、推定ＴＭ１の前にＡエクソンに相同な配列を含有する。
【０１１６】
本明細書に記述されるＶＲ３コーディング領域の完全ゲノム配列は、ジーンバンクへの３８０５１２塩基対配列寄託（ホモサピエンスクローンＲＰＣ１１−７Ｇ５（ＡＣ００７８３４）、Ｗｏｒｌｅｙ，Ｋ．Ｃ．による直接付託）において見いだされるようである。このジーンバンク登録は、ＤＮＡ配列の多くのフラグメントおよび提案される隣接配列を列挙しているが、核酸配列のいかなる解析をも欠き、そしてＶＲ３核酸配列の特徴を特性決定することも、またＶＲ３遺伝子の存在を記述することもしていない。
１　本発明の配列およびゲノム配列の比較は、ＶＲ３遺伝子が少なくとも１５エクソンからなることを示している。「Ａ」は、両下垂体および前立腺ｃＤＮＡライブラリーから得られるｃＤＮＡ中に見いだされる推定Ｎ末端細胞質ドメインにおける６０アミノ酸インサートである。ＡおよびＢインサートにおいてイントロン／エクソン・ボーダー配列が存在する。
【０１１７】
Ａ＋Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋イソ型は、アンキリン反復ドメイン保存配列に対して相同性をもつＮ末端推定細胞質領域におけるドメインを含有する。かくして、ＶＲ３Ａ＋イソ型は、ＶＲ１について予想されるものと類似の構成を有するようである。第１のドメインは、共通配列に有意に類似している（Ｅ＝２．６ｅ−５）。次の２ドメインは、それ自体では有意ではない（ｅ＝３７およびＥ＝２．７）が、全体として見ると、この領域は、３つのアンキリン結合ドメイン含有するようである。Ａ−イソ型は、推定第３アンキリン反復ドメインの２０アミノ酸を欠失しており、そして併置された配列はアンキリン反復ドメインと適合しない。
【０１１８】
ＶＲ３Ａ＋Ｂ−イソ型は、Ｎ末端中およびＴＭ４とＴＭ５の間に２個の潜在的なミリストイル化部位：［ＧＰＧＧＥ］をもつ。推定リン酸化部位は、７個のＰＫＣリン酸化部位：Ｔ１１２，Ｓ１３４，Ｔ１７５，Ｔ１９０，Ｔ３８０，Ｓ４０３，Ｓ６８８［しかし、Ｓ６８８は推定細胞外領域中にある］；１個の潜在的ＰＫＡおよびＰＫＧリン酸化部位：Ｔ１８１；１２個の潜在的カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位：Ｔ８９，Ｓ１６２，Ｔ１８１，Ｔ３９５，Ｓ４１６，Ｓ４２２，Ｓ４３２，Ｔ４２６，Ｓ４３２，Ｓ４４１，Ｔ７４０，Ｓ８３６；３個の潜在的乳腺カゼインキナーゼリン酸化部位（ＳｘＥ）：Ｓ４，Ｓ７２６，Ｓ７５８；１個の潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位：Ｙ４１１［「Ａ」インサート中に存在する］；および１個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位：Ｎ６５１［Ｎ２０１，Ｎ２０７は、推定細胞内Ｎ末端ドメイン中にあり、そしてグリコシル化されそうもない］を含む。本発明において記述されるいかなるイソ型中にも推定ＣａＭ結合ドメインは存在しない。
【０１１９】
「Ａ」インサート２ＰＫＣリン酸化部位を欠いているＡ−イソ型では、６個のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位および唯一の推定チロシンキナーゼリン酸化部位が欠失している。
【０１２０】
Ａ＋Ｂ＋イソ型は、Ｃ末端の推定細胞内領域において２個のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を欠く推定タンパク質をコードしている。
【０１２１】
実施例８−組織におけるヒトＶＲ３の発現
ＤＮＡアレー（Ｌｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）を用いる発現、ＤＮＡアレー分布解析は、ヒトＶＲ３ｍＲＮＡが種々の組織で発現され、そして全組織レベルにおいてＶＲ１と若干の発現の重複があることを示している［図１３］。左欄において示される組織タイプからのｃＲＮＡは、ヒトＶＲ３をコードしている配列を含有した（中欄）。ヒトＶＲ１の発現は、右欄において示され、そしてほとんどの場合、ＶＲ３発現と重複した。註：ＮＳはヒトＶＲ１の有意な発現がなかった。ＤＮＡアレー上に固定されたヒトＶＲ３ＤＮＡの配列は、（配列番号：１７）ＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＣＧＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＡＴＡＣＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣであった。
このＤＮＡ配列は、Ａ＋Ｂ＋、Ａ＋Ｂ−およびＡ−Ｂ−イソ型には存在しない。ｃＤＮＡ種は前立腺からはクローン化されたことに注目（＊；図１３）。
ノザンブロット解析は、全脳、胎盤、肺、腎臓、膵臓および前立腺においてＶＲ３の発現を表した。
【０１２２】
実施例９−大腸菌発現ベクター中へのヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのクローニング
組み換えヒトＶＲ３受容体を、限定するものではないがｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む、大腸菌発現ベクター中へのヒトＶＲ３受容体発現カセットのトランスファー後に、大腸菌において生産する。ｐＥＴベクターは、緊密に調節されるバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にヒトＶＲ３受容体を発現させる。誘導性ｌａｃプロモーターによって作動するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌宿主へのこの構築物のトランスファー後、ヒトＶＲ３受容体の発現は、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）が培養物に添加される場合に誘導される。発現されるヒトＶＲ３受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【０１２３】
ヒトＶＲ３受容体の完全な読み枠をコードしているｃＤＮＡがｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして発現宿主株ＢＬ２１を形質転換するために使用される。次に、形質転換株が使用されてヒトＶＲ３受容体タンパク質の生産のための培養物に接種される。培養物は、製法が当業者には既知であるＭ９もしくはＺＢ培地において増殖されてもよい。ＯＤ６００＝１．５まで増殖後、ヒトＶＲ３受容体の発現が、３７℃で３時間１ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導される。
【０１２４】
実施例１０−昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクター中へのヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムから得られるバキュロウイルスベクターが、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ＃１７１１）において高レベル発現を与えるために設計される。ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡを発現する組み換えバキュロウイルスは、次の標準方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｍａｘｂａｃ　Ｍａｎｕａｌ）によって作成される：ヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡ構築物が、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクターを含む、種々のバキュロウイルストランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるポリヘドリン遺伝子中に連結される。組み換えバキュロウイルスは、バキュロウイルストランスファーベクターおよび直線化したＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］のＳｆ９細胞中への同時トランスフェクション後の相同組み換えによって生成される。組み換えｐＡＣ３６０ウイルスは、感染細胞における封入体の不在によって同定され、そして組み換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスは、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定される（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５）。プラーク精製に続いて、ヒトＶＲ３受容体発現が、本明細書に記述されるアッセイによって測定される。
【０１２５】
ヒトＶＲ３受容体の完全な読み枠をコードしているｃＤＮＡがｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして線状ＡｃＮＰＶマイルドタイプＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクションするために使用される。
【０１２６】
真の、活性ヒトＶＲ３受容体が感染細胞の細胞質中に見い出される。活性ヒトＶＲ３受容体は、低浸透圧または洗剤溶解によって感染細胞から抽出される。
【０１２７】
実施例１１−酵母発現ベクター中へのヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡのクローニング
組み換えヒトＶＲ３受容体を、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くために設計された発現ベクター中への最適なヒトＶＲ３受容体ｃＤＮＡシストロンの挿入後に、酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において生産する。細胞内発現の場合、ベクター、例えばＥｍＢＬｙｅｘ４または類似のものは、ヒトＶＲ３受容体シストロンに連結される［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現では、ヒトＶＲ３受容体シストロンは、分泌シグナル（酵母または哺乳動物ペプチド）をヒトＶＲ３受容体タンパク質のＮＨ２末端に融合する酵母発現ベクター中に連結される［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ　８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ　Ｌ．ａｎｄ　Ｂｅｌｌｏｎ　Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
【０１２８】
これらのベクターは、限定されるものではないが、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合しているｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ　Ｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：４２−４６（１９９０）］、および発現されるｃＤＮＡにヒト・リゾチームシグナルを融合しているベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ．Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８−２７３２）］を含む。さらに、ヒトＶＲ３受容体は、ベクターｐＶＥＰを利用してユビキチンに複合された融合タンパク質として酵母において発現される［Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９８９），Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：７０５−７０９（１９８９）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ　Ｄ．Ｐ．，Ｂｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）］。発現されるヒトＶＲ３受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【０１２９】
実施例１２−組み換えヒトＶＲ３受容体の精製
組み換え法により生産されるヒトＶＲ３受容体は、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【０１３０】
ヒトＶＲ３受容体抗体アフィニティーカラムは、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（ｂｉｏ−Ｒａｄ）、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより予め活性化されているゲル支持体、に抗ヒトＶＲ３受容体抗体を付加することによって作成される。次いで、抗体はスペースアームをもつアミド結合をとおしてゲルに結合される。次いで、残りの活性エステルが１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）により失活される。カラムは水、続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄されて、すべての非複合抗体または外来のタンパク質を除去する。次いで、カラムは、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤とともにリン酸バッファー食塩水（ｐＨ７．３）において平衡化され、そして可溶化されたヒトＶＲ３受容体を含有する細胞培養上澄液または細胞抽出物が徐々にカラムを通過される。次いで、カラムを、光学濃度（Ａ２８０）がバックグラウンドまで落ちるまで洗剤とともにリン酸バッファー食塩水により洗浄し、次いで、タンパク質を洗剤とともに０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。精製されたヒトＶＲ３受容体タンパク質は、次に、リン酸バッファー食塩水に対して透析される。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】発明にかかる、配列番号５。コーディング領域のヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−ヌクレオチド配列（２６１６ｂｐ）。
【図２】発明にかかる、配列番号６。ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−のヌクレオチド配列を、３３７ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴ）および５４７ｂｐの３’ＵＴを包含して示す（３５００ｂｐ）。
【図３】発明にかかる、配列番号７。ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ−のコーディング配列（８７１アミノ酸）
【図４】発明にかかる、配列番号８。コーディング領域のヒトＶＲ３Ａ−Ｂ−ヌクレオチド配列（２４３６ｂｐ）。
【図５】発明にかかる、配列番号９。ヒトＶＲ３Ａ−Ｂ−のコーディング配列（８１１アミノ酸）
【図６】発明にかかる、配列番号１０。コーディング領域のヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ＋ヌクレオチド配列（２２２９ｂｐ）。
【図７】発明にかかる、配列番号１１。ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ＋のヌクレオチド配列を、８３６ｂｐの５’ＵＴおよび９９４ｂｐの３’ＵＴを包含して示す（４０５９ｂｐ）。
【図８】発明にかかる、配列番号１２。ヒトＶＲ３Ａ＋Ｂ＋のコーディング配列（７４２アミノ酸）
【図９】発明にかかる、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのＶＲ３アイソフォームの機能的発現を示す。すなわち、２　Ｃａ２＋を含むＮＤ−９６中で維持された卵母細胞の生存率は、３．２５ｎｇのＶＲ３　Ａ＋Ｂ−およびＶＲ３　Ａ＋Ｂ＋（５ｎｇ）の注入４〜６日後に有意に減少したが、しかしＶＲ３　Ａ−Ｂ−（１．５ｎｇ）ｃＲＮＡではしなかった。ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−および水を注入された卵母細胞のデータは５回の異なる実験から得た。死亡卵母細胞は視覚的に決定した。データはχ２解析を使用して解析した。
【図１０】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、ＶＲ３アイソフォームは熱により活性化される。Ａ．２５℃から４６℃までの熱傾斜により導き出されかつ４６℃で最低１５秒間維持される平均ピーク電流を示す。電流は＋８０ｍＶで初期電流を上回る増加である。電圧の傾斜を２秒ごとに４００ｍ秒にわたって−１２０から＋８０ｍＶまで適用した。卵母細胞に、３．２５、１．５および５ｎｇのそれぞれＶＲ３　Ａ＋Ｂ−、Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋　ｃＲＮＡを注入し、そして６日後まで記録した。黒色の棒：水を注入された対照（ｎ＝８）；白色の棒：ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−アイソフォーム（ｎ＝１１）；斜線を付けられた棒：ＶＲ３　Ａ−Ｂ−アイソフォーム（ｎ＝８）；点を付けられた棒：ＶＲ３　Ａ＋Ｂ＋アイソフォーム（ｎ＝５）。全部のアイソフォームは水対照を上回る有意の増加を示す（それぞれｐ＝０．００１、０．０３および０．００７；スチューデントのｔ検定）。熱に誘導された応答は、Ａ＋Ｂ−アイソフォームにおいて他の２アイソフォームに比較して約２倍より大きいが、しかし差異は有意でない（Ａ−Ｂ−およびＡ＋Ｂ＋に比較してＡ＋Ｂ−についてそれぞれｐ＝０．０５１およびｐ＝０．１６）。データは２組の注入された卵母細胞から得た。示されるデータは平均および平均の標準誤差である。Ｂ．電圧傾斜に誘導された電流を、水（上）、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−（上から２番目）、ＶＲ３　Ａ−Ｂ−（上から３番目）およびＶＲ３Ａ＋Ｂ＋（一番下）を注入した卵母細胞への増大する熱の適用の間に記録した。卵母細胞はＣａ２＋　ＮＤ−９６で絶えず灌流し、また、溶液はインライン加熱装置（ＳＨ−２７ＡインラインヒーターとともにのＴＣ−３２４Ｂ；ワーナー　インストゥルメント　コーポレーション（Ｗａｒｎｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐ．））により加熱した。３７℃から４６℃までの温度で得られた傾斜に誘導された電流（ｙ軸上で示されるとおりμＡで）を表し；より高温での電流の軌跡のみを対応する温度で印をつける。
【図１１】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、ＶＲ３Ａ＋Ｂ−は、細胞外生理的食塩水溶液による細胞灌流により誘導されるＶＲ１を発現する卵母細胞にて観察される灌流活性化電流（Ｉｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）に、１０μＭルテニウムレッドに対する感受性を与える。増大された灌流によるＩｐｅｒｆｕｓｉｏｎの活性化は、ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−　ｃＲＮＡを注入されたＶＲ１を発現する卵母細胞中でのみルテニウムレッドにより封鎖され、そしてＶＲ１のみを発現する卵母細胞中でされなかった。（ａ）．ＶＲ１　ｃＲＮＡ［４ｎｇ］を注入された卵母細胞を、−７０ｍＶの保持電位から４００ｍ秒にわたって−１２０と＋８０ｍＶとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流開始後に１０ｍｌ／分の速度で増大した。０．５分間の１０μＭルテニウムレッドでの前インキュベーションは電流を封鎖した。この封鎖は部分的に可逆的であった（示されない）。（ｂ）．ＶＲ３　Ａ＋Ｂ−［１．３ｎｇ］と一緒にＶＲ１　ｃＲＮＡ［４ｎｇ］を注入された卵母細胞を、−７０ｍＶの保持電位から４００ｍ秒にわたって−１２０と＋８０ｍＶとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流の開始後に１０ｍｌ／分の速度で増大した。０．５分間の１０μＭルテニウムレッドとの前インキュベーションはＩｐｅｒｆｕｓｉｏｎに対しほとんど影響を有しなかった。Ｉｐｅｒｆｕｓｉｏｎは双方の組の卵母細胞で類似の大きさを有した。ＲＲ阻害電流についてのＶｒｅｖは約−１３ｍＶ（矢印）であった。
【図１２】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、ＶＲ１と一緒のＶＲ３Ａ＋Ｂ−。１μＭカプサイシンに対する応答の大きさおよび減衰の動力学は、ＶＲ１　ｃＲＮＡを等しい比［それぞれ２．９ｎｇ］でＶＲ３　Ａ＋Ｂ−　ｃＲＮＡと共発現させた場合に減少した。
【図１３】発明にかかる、ＤＮＡアレイ分布分析は、ｈＶＲ３　ｍＲＮＡが多様な組織中で発現され、また、全組織レベルでＶＲ１との発現の若干の重なり合いが存在することを示す。ＤＮＡアレイ上で使用されたＤＮＡ配列はＡ＋Ｂ＋中に存在せず、Ａ＋Ｂ−およびＡ−Ｂ−アイソフォームのみに存在する。これらのｃＤＮＡ種が下垂体および前立腺からクローン化されたことに注意されたい。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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