(57)【要約】本発明は、細辛抽出物の分画が、記憶を刺激するだけではなく、AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)により誘発される脳細胞損傷に対し、神経保護を誘発する能力を有することを開示する。【選択図】図１１
2004525125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細辛抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用組成物。
【請求項２】
細辛抽出物の含量が組成物全重量に対して0.5から50重量%である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
細辛抽出物が炭素数約1から約4の低級アルコールで抽出された請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
低級アルコールがメタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、メチレンクロライド、エーテル、エチルアセテート及びこれらの混合物からなる群から選ばれたものである請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含む請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
経口製剤として剤形化された請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
経口製剤が散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、シロップ及びエアゾールである請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
外用剤として剤形化された請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
座剤として剤形化された請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
滅菌注射剤として剤形化された請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
細辛抽出物が下記の連続的な分画手段により得られる請求項1に記載の組成物：
請求項3に記載の方法で得られた細辛抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2―4に調整して、同量のクロロホルムで抽出し；
クロロホルムに不溶の分画を水酸化アンモニウムでpH9−12に調整して、同量のクロロホルム：メタノールの混合溶媒で抽出し；
このうち、クロロホルム：メタノールの混合溶媒に不溶の分画をメタノールでさらに抽出及び分画して、メタノールに溶解する細辛抽出物を得る。
【請求項１２】
下記の連続的な分画手段により得られる細辛抽出物のクロロホルム分画を含有する記憶力増進用組成物：
細辛をメタノール、エタノールのような炭素数1―4の低級アルコール或いはアセトン、クロロホルム、メチレンクロライド、エーテル、エチルアセテートのような有機溶媒で抽出し；
得られた細辛抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2―4に調整し、同量のクロロホルムでさらに抽出して、細辛抽出物のクロロホルム分画を得る。
【請求項１３】
分画の含量が組成物の総重量に対して0.5から50重量%である請求項12に記載の記憶力増進用組成物。
【請求項１４】
担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含有する請求項12に記載の記憶力増進用組成物。
【請求項１５】
散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、シロップ、エアゾールを含む経口製剤、外用剤、座剤及び滅菌注射剤に剤形化される請求項12に記載の記憶力増進用組成物。
【請求項１６】
請求項1に記載の組成物を含む食品。
【請求項１７】
請求項1に記載の組成物を含む飲料。
【請求項１８】
請求項12に記載の組成物を含む食品。
【請求項１９】
請求項12に記載の組成物を含む飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細辛抽出物を含有する脳細胞保護及び記憶力増進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳細胞の損傷に関与する重要な因子の一つは、グルタミン酸である。グルタミン酸は4種類の受容体、即ちNMDA受容体、AMPA受容体、カイニン酸受容体及び1S,3R-ACPD受容体に結合して作用する[Craig CR, Stitzel RE, Modern Pharmacology with clinical applications, 293-302, 1997]。脳虚血が起こると、脳細胞への酸素供給が減って嫌気性の解糖が増加する。このため細胞内のATP量が減って、細胞外カリウムイオン濃度が増加する。そして神経細胞膜が脱分極し、それに続いて、興奮性アミノ酸が分泌され、NMDA、AMPA、及びカイニン酸受容体の活性化により神経損傷をもたらす。  興奮性神経伝達物質による興奮性毒性は細胞ストレスを誘発するため、アルツハイマー病、パーキソン病、脳卒中及び筋萎縮性側索硬化症等の退行性神経疾患の発生機序において重要な役割を果たす[Haloween, B., J. Neurochem. 59, 1609-1623, 1992; Coyle, J. T.and Puttfarcken, P., Science 262, 689-695. 1993; Olanow, C. W., Trends Neurosci. 16, 439-444, 1993]。
【０００３】
中枢神経系の退行性神経疾患は、ときに認識力と記憶の低下を伴う。特に痴呆は現代のような高齢化社会の重大な問題である。痴呆は、遺伝、老化、脳損傷、喫煙および飲酒のような環境的要因、及びその他複合的要因により起こる。痴呆患者の海馬は損傷がひどく、これは脳のアセチルコリン含有量の減少と密接に関連している。
【０００４】
現在、アセチルコリンエステラーゼ抑制剤がアルツハイマー病に臨床で用いられている。近年、NMDA拮抗剤、AMPA拮抗剤、GABAアゴニスト、細胞内カルシウム減少剤、酸化窒素抑制剤、遊離ラジカル除去剤、ナトリウムチャンネル遮断薬、グルタミン酸遊離抑制剤、酸性化、低体温法、カリウムチャンネル活性剤等を用いた神経保護の方法が数多く研究されている[Gagliardi RJ, Neuroprotection, excitotoxicity and NMDA antagonists, Arq. Neuro-Psiquiatr. 58, 2000]。
【０００５】
NMDA拮抗剤として、ドゾサイルピン(dozocyilpin)(MK 801)、セルフォテル(selfotel)、セレステイト(cerestat)、デクストロメトルファン(dextrometorfan)が開発されているが、これらの薬物は、低容量では知覚認知の変化、不快感、眼振症、低血圧等を誘発し、高容量では興奮、パラノイア、幻覚のような精神的副作用を引き起こすことが知られている。また、ＡMPA拮抗剤としてNBQXが開発されたが、深刻な腎臓毒性の原因となるため臨床応用に最適ではない。従って、天然物由来の物質からの、毒性がない神経保護剤の開発が必要とされている。
【０００６】
近年、AMPA受容体がアルツハイマー病の進展に重要な役割を果たすことが見出された。ＡＭＰＡ受容体の活性化による神経細胞損傷が、前脳基底コリン性ニューロン(BFCNs)に選択的に発生するということは、AMPA受容体拮抗剤を利用したアルツハイマー病治療剤の開発を試すことができることを示唆している[Weiss, J. H., et al., Basal forebrain cholinergic neurons are selectively vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated neurotoxicity. Neuroscience 60, 659-664, 1994]。
【０００７】
グリア細胞は、神経細胞の生存に必須である。中枢神経系の発達においては、グリア細胞は神経細胞の正確な移動と成長を調節し、発達後は神経細胞の恒常性とシナプス柔軟性に役割を持つ。また、グリア細胞は神経細胞の生存と死滅に必須の神経細胞のシグナル伝達を開始させることのできる受容体と神経伝達物質を含有している。従って、グリア細胞を外部の損傷から保護するのは、結局、神経細胞の柔軟性、恒常性および生存と関係している。
【０００８】
抹消組織でインシュリン受容体は、主にグルコース代謝に関与しているが、中枢神経系(CNS)での役割はグルコース代謝ではなく、記憶のような他の神経活動に関するものであるようである。事実、インシュリン受容体は、脳の異なる領域に分布し、海馬に多量に存在する。そのため、海馬は脳におけるインシュリン活動の重要なターゲットである。最近、記憶形成で脳インシュリンまたはインシュリン受容体の役割に関して、多くの証拠が提示されている。神経インシュリン受容体に対する実験的な損傷及びアルツハイマー脳はいずれも類似した代謝異常症を誘発したことが見出された[S., Muller, D, Plaschke, K. Desensitization of brain insulin receptor. Effect on glucose/energy and related metabolism. J. Neural Transm[Suppl] 44, 259-268, 1994]。
【０００９】
散発性アルツハイマー病は、脳タイプの非インシュリン依存性糖尿病であり得るという興味深い仮説が提案された(Hoyer, S. Is sporadic Alzheimer disease the brain type of non-insulin dependet diabetes mellitus  A challenging hypothesis. J. Neural Transm. 105, 415-422, 1998)。脳室インシュリンは、受動回避試験から記憶を増進させるということが示唆された。[Park, C. P., Seeley, R. J., Craft, S. and Woods S. C. (2000) Intracerebroventricular insulin enhances memory in a passive avoidance task. Physiol. Behav. 68, 509-514]。 散発性アルツハイマー疾病(SDAT)で、インシュリン受容体密度及びチロシンキナーゼ活性は著しく減少することが知られていた[Frolich, L., Blum-degen, D., Bernstein, H. G., Engelsberger, S., Humrich, J., Laufer, S., Muschner, D., Thalheimer, A., Turk, A., Hoyer, S., Zoching, R., Boissl, K. W., Jellinger, K., and Piederer, P. Brain insulin and insulin receptors in aging and sporadic Alzheimer's desease. J. Neural Transm. 105, 423-438, 1998]。興味深いことに、海馬インシュリン受容体のチロシンリン酸化は、空間記憶形成で必須の役割を果たすことが示された[Zhao, W., Chen, H., Xu, H., Moore, E., Meiri, N., Quon, M. J., Biol. Chem. 274, 34893-34902, 1999]。要約すると、インシュリン受容体活性剤はコリンエステラーゼ抑制剤に加えて記憶増進のために使うことができる。
【００１０】
最近、インシュリン受容体の重要な下流信号媒介物質のERK(Extracellular signal-Regulated Kinase or MAPK)Ｉ及びＩＩは、記憶と学習に関連することが発見された[Thiels, E, Klann, E. Extracellular signal-regulated kinase, synaptic plasticity, and memory. Rev. Neurosci. 12, 327-345, 2001; Sweat J. D. The neuronal MAP kinase cascade: a biochemical signal integration system subserving synaptic plasticity and memory. J. Neurochem. 76, 1-10, 2001]。回避学習を受けたラットでラット海馬のERKＩ及びＩＩの活性化された形態が著しく、明白に増加することもまた証明された[Cammarota, M., Bevilaqua, L. R. M., Ardenghi, P., Paratcha, G., de Stein, M. L., Izquierdo, I., Medina, J. H. Learning-associated activation of nuclear MAPK, CREB and Elk-1, along with Fos production, in the rat hippocampus after a one-trial avoidance learning: abolotion by NMDA receptor blockade. Mol. Brain Res. 76, 36-46, 2000]。
要約すると、インシュリン受容体及びERKＩ及びＩＩ活性剤は、コリンエステラーゼ抑制剤に加えて記憶力と学習増進のために使用できる。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の発明者は、各種ストレス、アルコール、喫煙等の環境的要因により脳損傷を受けている現代人の記憶力増進作用を有する神経保護剤の研究を長年行ってきた。多くの天然物の研究に基き、細辛抽出物が記憶力増進作用に加え、顕著な神経保護作用を有することを見出した。
【００１２】
この点において、本発明は、細辛抽出物を含有する脳細胞保護及び記憶力増進用組成物に関するものである。本発明の組成物は、組成物の総重量に対し細辛抽出物を0.5〜50重量%含有することを特徴とする。
【００１３】
細辛(Asiasari Radix)は、ウスバ細辛(Asarum sieboldii F. MAEKAWA, Asarum sieboldii var. seoulense Nakai, Asarum sieboldii Miq.)、オクエゾ細辛(Asarum heterotropoides Schmidt, Asarum heterotropoides var. mandshuricum Kitagawa, Asiasarum heterotropoides F. MAEKAWA var. seoulensis F. MAEKAWA)の乾燥された全体植物、根茎または根である。細辛は多年生草で、横に伸びていく根茎は比較的短く、多くの節と、直径が1mm内外のひげ根がある。細辛は各々不均一で曲がった紐状で、直径3〜5mmの節がある根茎を有し、黄茶色である。根茎に長さが5〜20cm内外の根が多くついている。根茎の色は淡褐色で、長くて細く、非常に浅い縦しわがある。
【００１４】
細辛は、メチルオイゲノール(methyleugenol)、アサリルケトン(asarylketone)、シネオール(cineol)、サフロール(safrole)、リモネン(limonene)、オイカルボン(eucarvone)等の精油；N-イソブチル2,4,8,10-ドデカテトラエンアミド(dodecatetraenamide)、ペリトリン(pellitorin)等の酸アミド；(-)アサリン(asarinin)、セサミン(sesamin)等のリグナン(Zhou RH, Resource Science of Chinese Medicinal Materials. pp.202-211. Beijing: China medical & Pharmaceutical Sciences press, 1993)を含有する。また、ヒゲナミン(higenamin)を含む幾つかのアルカロイドも細辛中に存在する。細辛の抽出物は体温降下、鎮痙、抗ヒスタミン作用、強心作用を表すことが報告されており、局所麻酔、陣痛、解熱、鎮咳、去痰及び利尿に用いられている(Zhu Y, Chinese Materia Medica: Chemistry, Pharmacology and Application, pp66-69. Beijing: People'S Health Publisher, 1998)。しかし、今まで細辛抽出物が神経細胞保護及び記憶力に対して効果を持つか否かは知られていなかった。
【００１５】
本発明の細辛抽出物は、細辛をメタノール、エタノール等の炭素数1から4の低級アルコール；アセトン、クロロホルム、メチレンクロライド、エーテル、エチルアセテート等の有機溶媒；または上記低級アルコールと上記有機溶媒の混合物で、5℃から80℃、好ましくは30℃から55℃で15分から48時間、好ましくは30分から12時間抽出することにより得られる。また、得られた抽出物を減圧留去により粉末形態に作ることもできる。
【００１６】
また、本発明の細辛抽出物は次の方法でさらに分画することができる(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Edt. pp 6-7, 1998)。
本発明の細辛抽出物は、次の連続的な抽出及び分画工程により調製される：
上記の方法により得られた細辛抽出物をメタノール：水混合溶媒に溶解しpH2〜4に調整したあと同量のクロロホルムで抽出；
クロロホルムに不溶の分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出；
このなかで、クロロホルム：メタノール混合溶媒に不溶の分画をメタノールでさらに抽出して、細辛抽出物を得る。
【００１７】
このとき、クロロホルム：メタノール混合溶媒の混合比は1：0.1〜1の範囲が好ましい。上記クロロホルムに不溶の分画が、クロロホルム：メタノールでさらに分画される場合は、クロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解する分画は、大部分のアルカロイドを含有し、クロロホルム：メタノール混合溶媒に不溶の分画は4級アルカロイド及びN-オキシドを含有する。
【００１８】
細辛抽出物を含有する組成物は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、カルシウム、リン酸、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油等の適切な担体、賦形剤及び希釈剤を含有することができる。
【００１９】
本発明による組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳剤、シロップ、エアゾール等の経口製剤；外用剤；座剤とし用いることができる。また、滅菌注射剤として使用することができる。本発明の細辛抽出物は、一日0.1から500mg/kgの用量で投与することができ、その用量は１回でまたは分割して投与できる。しかし、実際の投与量は、疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別、体重、疾病の状態等の種々の関連する要因の見地から理解されなければならない。したがって、上記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定しない。
【００２０】
本発明の細辛抽出物を含む組成物は、神経保護及び記憶力増進のための薬剤、食品及び飲料等に広く利用することができる。細辛抽出物は、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類等の食品に添加できる。
【００２１】
また、本発明は下記の連続する分画工程で得られた細辛抽出物のクロロホルム分画を含有する記憶力増進用組成物に関するものである：
細辛を、メタノール、エタノール等の炭素数1から4の低級アルコール又はアセトン、クロロホルム、メチレンクロライド、エーテル、エチルアセテートでの抽出に供する；
得られた細辛抽出物をメタノール：水混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調整し、同量のクロロホルムでさらに抽出して細辛抽出物のクロロホルム分画を得る。
【００２２】
望ましいメタノール：水混合溶媒の混合比は1：0.2〜1.5の範囲であり、この分画にはテルペノイド及びフェノール性物質が含まれる。
本発明の記憶力増進用組成物は、上記分画の量が組成物総重量に対して0.5〜50重量%であることを特徴とする。
上述の細辛抽出物を含有する脳細胞保護及び記憶力増進用組成物と同様に、本発明の記憶力増進用組成物は、適切な担体、賦形剤及び希釈剤を含むことができる。また、通常の方法により様々な形態に剤形化されることができ、記憶力増進のための薬剤、食品及び飲料に広く利用することができる。
【００２３】
本発明のさらなる修正及び改善はまた、当業者に自明である。よって、ここで記述説明される部分の特別な組み合わせは、単に本発明の一実施例を表すためのもので、本発明の趣旨及び範囲内の選択的な手段を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、次の実施例により詳しく説明されるが、本発明はこれらにより制限されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例：細辛抽出物の調製
細辛250gを小さく切り、ソックスレー装置を利用して70%メタノール(750ml)で3時間3回抽出した。抽出物をろ過した後、得られたメタノール抽出物をロータリーエバポレータで濃縮し、凍結乾燥した(分画1)。他の有機溶媒で分画するため、分画１、10gを200mlのメタノール：水(4：1)に再懸濁し、2M硫酸でpH3に調整した。同量のクロロホルムで3回抽出し、クロロホルム層をロータリーエバポレータで濃縮、その後凍結乾燥した(分画2)。
水溶性でクロロホルムに不溶の分画は、水酸化アンモニウムでpH10に調整した後、同量のクロロホルム：メタノール(3：1)で2回抽出した。クロロホルム：メタノール(3：1)に溶ける分画を濃縮及び凍結乾燥した(分画3)。水溶性でクロロホルム：メタノール(3：1)に不溶の分画は、同量のメタノールで3回抽出した。メタノール溶解性の分画(分画4)とメタノールに不溶性分画(分画5)を各々濃縮及び凍結乾燥した。
【００２６】
実験例1. グリースギャップ分析試験(Grease Gap recording assay)
1)実験方法
ラットの大脳皮質の“ウェッジ(wedges)”を調製して二区画のブレインバスに置き、Harrison and Simmonds(British J. Pharmacol. 84, 381-391, 1985)により記述されたように実験を行った。ラットの大脳皮質の“ウェッジ”は、雄性のウィスター(Wistar)ラット(200g)の脳から調製した。ラットの首を切り、すぐに脳をNaCl 122mM、NaHCO3 25mM、KCl 3.1mM、KH2PO4 0.4mM、CaCl2 1.3mM、MgSO4 1.4mM、及びD-glucose 10mMを(pH7.4)を含有する冷却酸化(95% O2/5% CO2)人工脳脊髄液(ACSF)に移した。500〜600μmの厚さの冠状切片を取って室温の酸化されたACSFに置き、カミソリで半分に切った。大脳皮質と脳梁を含有する背側皮質面が約1.5mm幅で腹側面の幅が約1mmになるように組織のウェッジを形成した。このウェッジをACSF内、室温で2時間さらに培養した。
【００２７】
皮質ウェッジを二区画のバスに置き、二区画間に高い抵抗力を有する密封が形成されるように位置された障壁に高圧シリコングリースを塗った。酸化されたACSFを二区画を通して各々1分当り2mlの速度で少なくとも1時間灌流させた。細辛抽出物(分画1、2、3及び4)はAMPA(40μM)を2分間適用する前に、10分間灌流させた。細辛抽出物とAMPAは皮質区画に適用した。二区画間のDC.電位をAg/AgCl電極でモニターした。シグナルを増幅し、メクラブソフトウェアー(Mclab software)で分析した。
【００２８】
2)実験結果
AMPAによる神経細胞の脱分極は、神経細胞の損傷による刺激の指標と判断される。AMPA 40μMを2分間処理すると、0.79mVまで脱分極が増加する。細辛抽出物(分画1)(10μg/ml)を予め10分間培養し、AMPAで2分間処理した場合、AMPAに誘発される脱電極の増加は著しく減った(図1A)。また、細辛抽出物の分画1による平均抑制効果は、対照群に比べて約54％程度だった（図1B）。これらの結果は、細辛抽出物（分画1）はAMPAに誘発される神経損傷に対する顕著な神経保護作用を有することを示唆している。
【００２９】
細辛のメタノール抽出分画のなかで、分画4はAMPAに誘発される脱電極に対してめざましい抑制作用を有する：AMPAに誘発された神経損傷に対し92％程度の保護であった（図２）。一方、分画2と分画3はAMPAに誘発される脱電極に対する阻害に無効果である。
分画4は、クロロホルム及びクロロホルム：メタノールに不溶の成分を含有しているため、クロロホルムのような有機溶媒に溶けるテルペノイド、フェノール性化合物及びセサミンを欠いている。従って、分画４の神経保護作用は、セサミン、テルペノイド及びフェノール性化合物等以外の成分によるものであることが示唆される。
【００３０】
実験例2. 細胞生存率試験(MTT assay)
1)実験方法
MTT試験は、ミトコンドリア酸化還元を比色計で測定する方法で、ミトコンドリア酸化還元電位や細胞生存を調べるのに主に利用される(Mosmann et al., 1983)。
PC12細胞とC6グリア細胞を37℃、5％の加湿されたCO2雰囲気下、10％の牛胎児血清を用いてDMEM培地で培養した。PC12細胞を神経成長因子(NGF)(100ng/ml)の添加により神経細胞への分化に誘導した。新鮮なNGFを48時間毎に添加し、7日間 NGF処理した後、実験を行った。
【００３１】
細胞を1×105細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに分養した。細胞をAMPA(40μM)で予め培養し、細辛抽出物分画(10g/ml)を24時間加えた。MTT試薬(Sigma, USA) (5mg/ml)をPBSに溶解し、ろ過した。その細胞をMTT(最終濃度、0.5mg/ml)で処理し、37℃で3時間培養した。活性ミトコンドリア含有細胞は、テトラゾリウム環を分解し、濃青色のホルマザンを形成する。培地を除去し、細胞を100μl DMSOと10μlソレンソングリシン緩衝液(Sorenson glycine buffer, 0.1M glycine, 0.1M NaCl, pH 10.5)の存在下に溶解した。分光光度計により570nmで吸光度を測定した。対照群の吸光度に対する実験群の吸光割合が%細胞生存率として示される。
【００３２】
2)実験結果
分化した神経PC12細胞では、AMPA(40μM)は、対照群に比べて細胞生存率を50%程度減少させた。一方、細辛抽出物(分画1；10μg/ml)で予め処理したことによりAMPAによる細胞の生存率の減少から90%以上回復した（図３）。分画2、分画3、分画4、及び分画5の細胞生存率における保護作用を検査したところ、分画4は分化したPC12細胞でのAMPAに誘導される神経損傷を、ほぼ対照群のレベルにまで保護し、神経保護を担う活性原理を有することを示唆した（図4）。
C6グリア細胞では、AMPAは、対照群に比べて細胞生存率を35%程度減少させた。一方、細辛抽出物(分画1)で予め処理したことによりAMPAによる細胞の生存率の減少から10%回復した（図５）。細辛抽出物は元々、AMPAにより誘導されたグリア細胞の損傷に対し相対的に弱い保護効果を有しているため、ZnCl2(100μM)でC6グリア細胞に酸化的な損傷の誘導を試みた（図６）。分画1、分画2、分画3、分画4及び分画5で予め処理したところ、分画1はZnによるグリア細胞の損傷を100%防御し、分画4は対照と比較して損傷を58%阻害した。
【００３３】
実験例3. 記憶試験
1. NaNO2試験
NaNO2 による脳の酸化的代謝欠乏と記憶及び学習と関連があるコリン性神経伝導は、互いに密接な関係があることが示唆されている。従って、NaNO2投与後の生存期間の延長が、記憶力増加効果を表す指標と見なされる[Schindler et.al.、Drug Develop. Res. 4: 567-576, 1984]。
【００３４】
1)実験方法
雄性マウスに細辛抽出物(分画1；100mg/kg、i.p.)を投与した。60分後にNaNO2を250mg/kg、s.c.で注射し、呼吸が停止するまでの時間を記録した。
対照群と処理群の生存時間延長を測定、比較し、記憶向上効果を分析した。
また、分画1をさらに分画した分画2、分画3、分画4、分画5を雄性マウスに投与し（100mg/kg、i.p.）、上記のNaNO2記憶試験を行った。
【００３５】
2)実験結果
元の細辛メタノール抽出物(分画1)投与(100mg/kg、i.p.)により生存期間が対照に比較して25%増加し、細辛メタノール抽出物が記憶力を増加させることを示した（図７）。分画2、3、4及び5の試験では、分画4は約25%生存期間を増加させ、分画2は試験を行った分画のなかで最も強い記憶力増進効果(50%増加)を示した(図８)。続いて、分画２につき、経口投与がi.p投与と同様の効果を生じるか否かをさらに試験した。分画2を経口投与し（10mg/kg）、60分後NaNO2を投与した。分画２の投与（10mg/kg.p.o.）により、記憶力が約50%増加した(図9)。
【００３６】
2. 8方向放射迷路記憶試験
分画1、分画2及び分画4が、記憶力増進作用を有することをさらに明らかにするために、Ikonenと Riekkinen [European Journal of Pharmacol. 382, 151-156, 1999] の記載に従って、8方向放射迷路(8 arm radial maze)試験を行った。
【００３７】
1)実験方法
8方向放射迷路の中央部位は直径20cmであり、アーム部分は長さ25cm、高さ15cm、幅6cmである。簡単に、餌が置かれている放射アーム迷路でマウスを2日間（一日5分ずつ）、予め練習させた。試験の期間中はセミ-ランダム方式で、餌を各マウス毎に異なる組み合わせで4個のアームに置いた。アームから中央に戻って来る度、ドアを5秒間閉めた。試験は4個の餌すべてが食べられるまで、又は15分まで続けた。試験は記憶機能の二つの媒介変数を含めた：１） 参照記憶エラー、餌を置いていないアームに行く場合。２） 実行記憶エラー、前に入ったアームに実験中再び行く場合[Gamoh et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 28, 266-270, 2001]。8方向放射迷路のために分画1、2及び4を各々毎日1回10mg/kgで、5日間経口投与した。
【００３８】
2)実験結果
参照記憶エラーは分画1、分画2及び分画4を投与した場合、対照群に比べてそれぞれ38%、50%及び50%減少し、実行記憶エラーは分画1、分画2及び分画4を投与した場合、対照群に比べてそれぞれ48%、63%及び74%減少した（図１０）。餌を全て食べるのにかかる時間は、分画1、分画2及び分画4を投与した場合、対照群に比べてそれぞれ55%、61%および58%減少した。
【００３９】
3. 受動回避試験
1)実験方法
実験は、基本的にJarvik及びKopp [Jarvik, M. E. and Kopp. R. An improved one-trial passive avoidance learning situation. Psychol. Rep. 21, 221-224, 1967]に記載された段階の通過方法に従って行った。ジェミニ回避システム（SD装置）を実験のために用いた。この装置は、明るい区画が自動ギロチンドアにより暗い区画に連結した二区画のアクリルボックスからなる。マウスを300秒間明るいボックスに置き、次いでギロチンドアを開けた。マウスが暗い区画に入るとすぐ、苦痛を与える電気的ショック(0.3ｍＡ.  1秒)を与えた。暗い区画に入る待機時間を訓練試験及び24時間後の記憶試験で測定した。記憶試験で許容された最大の進入待機時間は500秒だった。分画1、2及び4を各々毎日1回ずつ10mg/kgを３日間経口投与して、受動回避試験を行った。
【００４０】
2)実験結果
訓練期間において細辛抽出物の分画間に顕著な差はなかった。しかし、記憶期間において分画1、分画2又は分画4を投与すると、対照群と比較してそれぞれ8.1倍、2.2倍、及び2.7倍、段階通過時間が増加した(図11)。
【００４１】
実験例4. 海馬タンパク質のチロシンリン酸化
1)実験方法
1. 海馬溶質の調製
細辛抽出物投与の60分後に雄性スプラグドレー(Sprague Dawley)ラットの首を切断し、海馬を4℃の状態で分離した。海馬ホモゲネートを、先に開示された方法に[Zhao, W., Chen, H., Xu, H., Moore, E., Meiri, N., Quon, M. J., Alkon, D. L., Insulin receptors and spatial memory. J. Biol. Chem. 274, 37893-34902, 1999]に少し修正を加えた方法により調製した。分離された海馬を50mMトリスHCl、pH7.4、1mM  EDTA、1mM EGTA、150mM NaCl、1%トリトンX-100、0.5mM PMSF、1mM Na3VO4、ロイペプチン(leupeptin)及びアプロチニン1μｇ／mlを含有する緩衝液Aで再び懸濁させ、ポタ‐エルベジェム(Potter-Elvehjem)ホモゲナイザーを用いて均質化した。その溶質を10,000×gで２0分間回転させ、上清のタンパク質分析を行い、70℃で保管した。
【００４２】
2. 免疫沈降
免疫沈降を先に開示されたように行った[Kim S. J., Kahn. C. R. Insulin stimulates phosphorylation of c-Jun, c-Fos and Fos-related proteins in cultured adipocytes. J. Biol. Chem. 269, 11887-11892, 1994]。
海馬溶質からの同量のタンパク質を4℃で1時間インシュリン受容体抗体と培養し、プロテインA-セファロースを添加し、その免疫複合体を遠心分離機で沈殿させた。続いてそのペレットを緩衝液A(0.01Mトリス、pH7.4、1M  NaCl、1%Nonidet P-40)１ｍｌ、緩衝液B(0.01Mトリス、pH7.4、0.1M NaCl、0.01M EDTA、1% Nonidet P-40、0.3% SDS)及び緩衝液C(0.01Mトリス、pH7.4及び1% Nonidet P-40)1mlで洗浄した。最後のペレットをジチオトレイトール100mMを含有するラエミリ(Laemmli)緩衝液で可溶化し、5分間煮沸してマイクロ遠心分離機で遠心分離し、その上清につき抗-pTyr抗体を用いてSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析を行った。
【００４３】
3. ウェスタンブロット分析
海馬タンパク質の同量をSDSポリアクリルアミドゲルに適用した。ゲルからニトロセルロースペーパー(Schleicher & Schuell)への電気転写をトウビン等により記載されたように[Towbin H., Staehelin, J., Gordon, J. Electric transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 76, 4350-4354, 1979]100V(定電圧)で1時間行った。そのフィルターペーパーを0.1%ツイン20及3%牛血清アルブミンを含有するPBSを用いて23℃で1時間予め培養し、0.1%ツイン20を含有するPBSで各々10分間3回洗浄した。ブロットをpTyr又はｐＥＲＫ抗体を使用して23℃で1時間検査した。その後、ブロットをHRP接合抗ラビットIgGで30分間培養し、ツイン20を含有するPBSで各々10分間5回洗浄した。固定された特定の抗原の検出をECL(NEN)で行った。
【００４４】
3)実験結果
海馬インシュリン受容体のチロシンリン酸化は空間記憶において重要な役割を果たすことが示唆されていたため、我々は細辛抽出物が海馬タンパク質のチロシンリン酸化に影響を及ぼすか否かを試験した。分子サイズが〜180kDa、130kDa、95kDa、55kDa及び42kDaのタンパク質のチロシンリン酸化(図12)。我々はさらにインシュリン受容体が細辛抽出物によりチロシンリン酸化されたか否かを試験した。インシュリン受容体のリン酸化は、基本的な条件下では検出されなかったが、分画1及び分画2により著しく刺激された：分画1の影響は分画2の影響より大きかった(図13)。また、細辛抽出物の分画1、2及び4はERK１(44kDa)及びERK２(42kDa)を著しく刺激した(図14)。
これらの結果は、ERKI及びIIの活性化は記憶力と学習に必須であるため、細辛抽出物の分画が記憶力と学習の増進に重要な役割を果たすことを示唆している。
【００４５】
実験例5. 生体外のコリンエステラーゼ分析
1)実験方法
雄性SDラットにビヒクル(Vehicle)または細辛抽出物分画を経口投与した。ラットは、60分後に首を切断し、脳を迅速に摘出して海馬と線条体を切断し、上記のように重さを測定して均質化した。コリンエステラーゼ活性をエルマン等により記載された通りに測定した[Ellman,G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95, 1961]。簡単に、緩衝液I(100mMリン酸、pH8.0)、75mMのヨウ化アセチルチオコリン0.2ml及び緩衝エルマン試薬(DTNB 10mM、NaHCO3 15mM)0.1mlを混合し、25℃で10分間培養した。次いで、20μlの酵素サンプルを添加し、吸光度を30秒の間隔で測定した。パーセント抑制率をビヒクル対照群の酵素活性と比較して計算した。
【００４６】
2)実験結果
コリンエステラーゼ抑制が認知機能を向上させることが示されたのを考慮して、我々は細辛抽出物が海馬コリンエステラーゼ活性に対して何らかの抑制効果を有するか否かを試験した。分画1、2又は4の投与により、海馬コリンエステラーゼ活性は対照群と比較してそれぞれ39%、24%及び12%抑制された(図15)。
【００４７】
実験例6.  経口毒性試験
1)実験方法
ICRマウス（20g）を、相対湿度50%、照度150−300ルクス(Lux)明暗周期を12時間で、温度23℃に調整した動物室で、標準保証齧歯類食物及び水道水を自由に摂取できる状態で1週間飼育した。２５匹のマウスは5群に分けた。
細辛抽出物(分画1)を0.1%ツイン80に溶解し、5群のマウスにそれぞれ100、1000、3000、5000及び10000mg/kgの用量で経口投与した。投与後7日間、一般症状の変化及び死亡動物の有無を観察した。投与7日目、マウスを致死させ、解剖して内部臓器を検査した。
【００４８】
2)実験結果
細辛抽出物の投与により一般症状及び内部臓器の外形に変化はなく、細辛抽出物の分画1のLD50値は3,400mg/kgであった。
【００４９】
製剤例1. 錠剤
下記の組成で、定法に従って錠剤を調製した。
1-1.錠剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            500.0mg
乳糖                                                            500.0mg
タルク                                                          5.0mg
ステアリン酸マグネシウム                                        1.0mg
【００５０】
1-2.錠剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          50.0mg
乳糖                                                            50.0mg
タルク                                                          0.5mg
ステアリン酸マグネシウム                                        0.1mg
【００５１】
1-3.錠剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            50.0mg
乳糖                                                            50.0mg
タルク                                                          0.5mg
ステアリン酸マグネシウム                                        0.1mg
【００５２】
製剤例2. カプセル剤
下記の組成により、下記の方法でカプセル剤を調製した。
細辛抽出物を篩って賦形剤と混合し、ゼラチンカプセルの中に充填した。
【００５３】
2-1.カプセル剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            500.0mg
澱粉1500                                                        10.0mg
ステアリン酸マグネシウムBP                                      100.0mg
【００５４】
2-2.カプセル剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          50.0mg
澱粉1500                                                        1.0mg
ステアリン酸マグネシウムBP                                      10.0mg
【００５５】
2-3.カプセル剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            50.0mg
澱粉1500                                                        1.0mg
ステアリン酸マグネシウムBP                                      10.0mg
【００５６】
製剤例3. シロップ剤
下記の組成により、下記の方法でシロップ剤を製造した。
まず、精製水に白糖を溶解した。パラオキシベンゾエート、パラオキシプロピルベンゾエート及び細辛抽出物を加えた。得られた混合物を60℃で溶解した後、冷却した。最後に精製水を加えて150mlにした。
【００５７】
3-1.シロップ剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            5.0g
白糖                                                            95.1g
パラオキシベンゾエート                                          80.0mg
パラオキシプロピルベンゾエート                                  16.0mg
精製水                                                          to 150ml
【００５８】
3-2.シロップ剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          50.0g
白糖                                                            95.1g
パラオキシベンゾエート                                          80.0mg
パラオキシプロピルベンゾエート                                  16.0mg
精製水                                                          to 150ml
【００５９】
3-3.シロップ剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            50.0g
白糖                                                            95.1g
パラオキシベンゾエート                                          80.0mg
パラオキシプロピルベンゾエート                                  16.0mg
精製水                                                          to 150ml
【００６０】
製剤例4. 液剤
下記の成分を定法で製剤化して液剤を調製し、茶色瓶に充填した。
4-1.液剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            500.0mg
異性化糖                                                        20.0g
酸化防止剤                                                      5.0mg
メチルパラ安息香酸                                              2.0mg
蒸留水                                                          to 100.0ml
【００６１】
4-2.液剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          500.0mg
異性化糖                                                        20.0g
酸化防止剤                                                      5.0mg
メチルパラ安息香酸                                              2.0mg
蒸留水                                                          to 100.0ml
【００６２】
4-3.液剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            500.0mg
異性化糖                                                        20.0g
酸化防止剤                                                      5.0mg
メチルパラ安息香酸                                              2.0mg
蒸留水                                                          to 100.0ml
【００６３】
製剤例5. 散剤
下記の成分を散剤の通常の製法で混合し、紙袋に入れて完全に密封して、散剤を製造した。
5-1.散剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            50.0mg
乳糖                                                            100.0mg
タルク                                                          5.0mg
【００６４】
5-2.散剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          50.0mg
乳糖                                                            100.0mg
タルク                                                          5.0mg
【００６５】
5-3.散剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            50.0mg
乳糖                                                            100.0mg
タルク                                                          5.0mg
【００６６】
製剤例6. 注射剤
下記の成分を用い通常の注射剤の製法で、注射剤を調製した。2.0mlの容量のアンプルに充填し、滅菌した。
6-1.注射剤組成物
細辛メタノール抽出物                                            50.0mg
酸化防止剤                                                      1.0mg
ツイン80                                                        1.0mg
注射用蒸留水                                                    to 2.0ml
【００６７】
6-2.注射剤組成物
細辛メタノール抽出物のクロロホルム分画                          50.0mg
酸化防止剤                                                      1.0mg
ツイン80                                                        1.0mg
注射用蒸留水                                                    to 2.0ml
【００６８】
6-3.注射剤組成物
細辛メタノール抽出物のメタノール分画                            50.0mg
酸化防止剤                                                      1.0mg
ツイン80                                                        1.0mg
注射用蒸留水                                                    to 2.0ml
【産業上の利用可能性】
【００６９】
細辛抽出物を含む組成物は、脳細胞の損傷による退行性神経疾患の予防及び治療効果だけではなく、記憶力向上誘発効果を表す。細辛抽出物を含む組成物は、記憶力向上用だけではなく、各種ストレス、飲酒、喫煙などにより脳に損傷を受けている現代人の脳細胞保護を通して、退行性神経疾患の予防及び治療用製剤或いは健康食品として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ラットの大脳皮質の切片で、AMPAによる脱分極を抑制する細辛抽出物の分画１を表す。値は平均ＳＤ(n=5)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05である。
【図２】ラットの大脳皮質の切片で、AMPAによる脱分極を抑制する細辛抽出物の分画４を表す。値は平均ＳＤ(n=5)で表され、対照群に対して  **：ｐ＜0.01である。
【図３】分化したPC12細胞でのAMPAによる神経細胞損傷に対する抑制効果を有する細辛抽出物の分画1を表す。値は平均ＳＤ(n=5)で表され、対照群に対して  ***：ｐ＜0.001である。
【図４】分化したPC12細胞でのAMPAによる神経細胞損傷に対する細辛抽出物の分画２，３，４及び５の効果を表す。値は平均ＳＤ(n=5)で表され、対照群に対して  ***：ｐ＜0.001である。
【図５】C6グリア細胞でのAMPAによる細胞損傷に対する抑制効果を有する細辛抽出物の分画1を表す。値は、平均ＳＤ(n=5)で表されている。同一な文字を付していないものは、ダンカン多重範囲試験(Duncan's multiple range test)によりｐ＜0.05で異なる。
【図６】C6グリア細胞でのZnCl2により誘導されたグリア細胞損傷に対する抑制効果を有する細辛抽出物の分画1、分画2、分画3、分画4及び分画5を表す。値は平均ＳＤ(n=５)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05、  ***：ｐ＜0.001である。
【図７】NaNO2試験で記憶力増進効果を有する細辛抽出物の分画1を表す。値は、平均SD(n=8)で、対照群に対して  **：ｐ＜0.01である。
【図８】NaNO2試験での細辛抽出物の分画2、分画3、分画4及び分画5の記憶力に対する効果を表す。値は平均ＳＤ(n=8)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05、**：ｐ＜0.01である。
【図９】NaNO2試験で、記憶力を顕著に増加させる細辛抽出物の分画2の経口投与を表す。値は、平均SD(n=8)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05である。
【図１０】8方向放射迷路試験で、記憶力増進を刺激する細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4を表す。値は平均ＳＤ(n=10)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05、  **：ｐ＜0.01である。
【図１１】受動回避試験で、記憶力増進を刺激する細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4を表す。値は平均ＳＤ(n=10)で表され、対照群に対して  *：ｐ＜0.05である。
【図１２】ラットの海馬タンパク質でチロシンリン酸化を刺激する細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4を表す。
【図１３】ラットの海馬での細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4によるインシュリン受容体のチロシンリン酸化を表す。
【図１４】ラットの海馬でERKＩ及びERKＩＩを活性化する細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4を表す。
【図１５】ラットの海馬でコリンエステラーゼ活性を抑制する細辛抽出物の分画1、分画2及び分画4を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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