(57)【要約】生体該培地で哺乳細胞により生物活性ヒトＴＰＯを製造する方法が開示されている。鼠骨髄腫細胞は一般的にヒトスロンボポイエチンの遺伝子を、免疫グロブリンエンハンサーに関連する免疫グロブリンプロモータを含んだＤＮＡ構造体を通じて導入させることで改質された。得られたｈＴＰＯは生体該及び生体内で巨核球系の造血細胞の増殖または発展を刺激する方法で利用が可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳細胞内で複製可能な発現ベクターであって、適切で効率的な転写のために以下の要素を含んでいることを特徴とする発現ベクター：
ａ）ヒト免疫グロブリンの可変遺伝子に対応する転写プロモータ；
ｂ）信号ペプチド（分泌リーダー）を含んだ完全ｈＴＰＯポリペプチドをエンコードするＤＮＡ分節；
ｃ）ヒトカッパ遺伝子の免疫グロブリン転写エンハンサーＤＮＡ分節；
ｄ）転写ターミネータ；
ｅ）ポリアデニル化信号；
ｆ）抗体ネオマイシンタイプ薬に対する抵抗をエンコードする遺伝子；
ｇ）抗体アンピシリンに対する抵抗をエンコードする遺伝子；
ｈ）Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＣｏｌＥｌ ｏｒｉ）の複製由来体。
【請求項２】
Ｘ−６３（ＡＴＣＣ：ＰｅＸ６３Ａｇ８．６５３３、ＣＲＬ　１５８０）である鼠骨髄腫から得られる培養細胞ライン（系）であって、請求項１記載の発現ベクターによって安定的にトランスフェクト処理されたものであり、生物学的に活性な形態で培地中に成熟ｒｈＴＰＯポリペプチドを製造して分泌することができることを特徴とする培養ライン。
【請求項３】
請求項２記載の細胞ラインで製造されるｈＴＰＯに対応する組換えポリペプチドであって、生体内外の両方で生物活性であることが示された組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
発明の背景
全ての正常な大人の血液細胞は“造血”と呼称されるプロセスを通じて幹細胞から骨髄で造られる。増殖と分化のいくつかのステップを経過した後、それら子孫の多能性細胞は自身の分化を経ずに自動複製できるようになり（体内複製／自動転写）、または４種の基本的分化方法であるａ）赤血球（赤血球細胞）、ｂ）骨髄球（ポリ形態核白血球及び単球）、ｃ）リンパ球、並びにｄ）巨核球（巨核球／血小板の発生体）に群化された一連の子孫細胞を生成することができる。骨髄で製造される量と細胞タイプは膜結合受体を介して標的細胞に作用するサイトキンまたは成長因子の複雑なネットワークによって微調整されたプロセスで規制される。これらサイトキンはインターロイキン（ＴＮＦ−α， ＩＬ−３， ＩＬ−６， ＩＬ−８， ＩＬ−１１等）及び“コロニー刺激因子”（顆粒球コロニー刺激因子及び顆粒球／大食球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ ｙ ＧＭ−ＣＳＦ］）と呼称される糖蛋白質ホルモンを含んだ成長因子の異質群を含んでいる。エリトロポイエチンは赤血球子孫の刺激因子であり、トロンボポイエチンは血小板子孫である。
【０００２】
造血とその調整の増大する知識は医療において多様な造血サイトキンの使用を可能にしている。このように、医療は次のものに基いてきた。
−慢性腎臓障害の続発性貧血症治療のためのエリスロポイエチン（ＥＰＯ）
−化学治療を受けている癌患者または骨髄移植を受けている患者の免疫システムの回復を増進するコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ ｙ ＧＭ−ＣＳＦ）
−ＩＬ−２とインターフェロン−α：これらは化学治療剤と連携して幅広く使用されている。インターフェロンは慢性肝炎の治療に使用されており、ＩＬ−２は抗レトロウィルス剤に関連してＡＩＤＳに対して使用されている。
【０００３】
循環血液の血小板は骨髄で製造され、血液凝固に重要な役割を果たしている。血小板は組織患部に接着し、他の血小板と共同で凝固して“原発性止血プラグ”を形成する。さらに、凝固因子を活性化させてフィブリン凝塊を製造させるための表面として作用する。血小板が存在しなければこれら機能は作動せず、血液は凝固しない（１）。血小板の発生は骨髄幹細胞の巨核球細胞への増殖と分化を暗示する。巨核球細胞は末端血液で循環する成長血小板（栓球）を発生させる。
【０００４】
血小板が発生される生理学的プロセスは巨核球系（ｌｉｎｅａｇｅ）からの成長及び発達因子としての“トロンボサイトポイエチック”と呼称される因子の存在を必要とする。臨床医学においては、血小板数の減少（血小板減少症）は２つの状況である、ａ）血小板の通常の発生に影響を及ぼす病気（原発性血小板減少症）及びｂ）癌患者または骨髄移植を受けた患者の治療から発生する合併症（続発性血小板減少症）に関係する厄介な合併症状である。これらの患者における増加した出血リスクは関連する生物学的リスク（アレルギー、感染症、免疫性過敏症）の危険を伴うドナーからの血小板濃縮体の投与を必要とする。ケレメン他の血小板減少症の動物のトロンボポイエチン活性に関する１９５８年の論文（２）から、その因子を特定するのに１９９４年まで待たねばならなかった。その因子はいくつかのグループによって細胞受体Ｍｐｌ（鼠の脊髄増殖性白血病ウィルスが関与する腫瘍因子）を結合することができる糖蛋白質として純化され、クローン処理された（３）。それはトロンボポイエチン（あるいはｃ−Ｍｐｌリガンドと呼称）として特定された。メガポイエチンまたは巨核球成長及び発達因子（ＭＧＤＦ）はメガカリオサイトポイエシスまたはトロンボサイトポエシスを特に刺激することができる（４から８）。トロンボサイトポイエチン活性を有した他の因子は解説されている（９）。それにはＩＬ−６とＩＬ−１１が含まれる。しかし、それらは特定のものではなく、多相遺伝作用を有している。多量のＩＬ−１１とＩＬ−６を単独的に投与すると循環血小板の増分は減少する（１０）。ヒトのトロンボポイエチン（ｈＴＰＯ）の遺伝子は染色体３（３ｑ２６−２７）に対する単コピーとして分離された。
【０００５】
それは３５３のアミノ酸の蛋白質をコード化する（１０５９０塩基個のペアのオープン示度フレーム）。それは２１個のアミノ酸（ａａ）の信号ペプチド（６３個の塩基ペア（ｂｐ））を含んでいる。成熟蛋白質は３３２ａａ（９９６ｂｐ）と予測分子重量３８ｋＤａ（非グリコシレート化）を有している。それは７０から８０ｋＤａの完全グリコシレート化蛋白質と分裂部位とをアルギニン１５３と１５４の間で発生させるために６Ｎ−グリコシレート化部位を有している。そこでは蛋白質は２つの領域である、ａ）知られた蛋白質との相同なく高度グリコシレート化されたＣ−末端領域とｂ）ＥＰＯと２３％の同一性であるＥＰＯ状または１５３ａａのＮ−末端領域とに分割される。保存的アミノ酸（ａａ）置換をさせることで続発性保存率は５０％に近づく。非グリコシレート化形態が、低下した安定性と循環液中の急速純化のために生体内ではなく生体外（試験管）で完全活性を有していることを指摘することは重要である。天然分子（７０から８０ｋＤａ）とは別に、いくつかの形態の循環ＴＰＯが記述されてきた（３０、２５及び１８ｋＤａの形態で成るその部分的蛋白質分解の結果、Ｃ末端領域で全て切断）（９、１１及び１２）。現在、利用可能でＦＤＡ（合衆国食品及び薬品管理局）が承認したトロンボサイトポエチック活性を有した唯一の因子はヒトの組換えＩＬ−１１である。
【発明が解決する課題】
【０００６】
発明の概要
本発明は哺乳類の宿主細胞で転写可能な発現ベクターを提供する。このベクターは次の操作可能にリンクした要素で成る。１）転写プロモータ、２）分泌リーダーまたは天然ｈＴＰＯの信号ペプチドをエンコードしている第１ＤＮＡ分節、３）完全ｈＴＰＯポリペプチドをエンコードしている第２ＤＮＡ分節、４）転写エンハンサー、５）ポリアデニル化信号及び６）転写ターミネータ。
【０００７】
本発明はさらに前述のＤＮＡ構造を含んだ培養成熟核細胞ライン（系統）を提供する。好適細胞ラインは哺乳細胞である。
【０００８】
本発明はさらに前述の発現ベクターでトランスフェクトされた形質細胞由来の鼠細胞ラインを有したｈＰＴＯ製造法を提供する。よって、この細胞ラインは、その天然物と同一である生物学的に活性なヒトのリコンビナントｈＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）を合成及び分泌することができる。
【課題を解決する手段】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に本発明の理解を助けるため、本発明の説明に使用される用語を解説する。
【００１０】
−トロンボポイエチン（ＴＰＯ）：正常体内で主として肝臓及び腎臓細胞で製造される糖蛋白質。血小板製造を刺激し、特に同一種からのＭｐｌ受体を結合させることができる。Ｍｐｌ受体は主として多効幹細胞、巨核球及び血小板に存在する。“ｈ”はヒトのＴＰＯであることを示す（ｈＴＰＯ）。ｈＴＰＯは無傷分子の質的生物学的活性を示す全長トロンボポイエチン分子を含む（受体結合及び血小板製造の生体内刺激）。
【００１１】
−組換え蛋白質：通常は製造されない蛋白質を製造させるために内蔵からの細胞が組換えＤＮＡ技術で遺伝学的に修正されると組換え蛋白質となる。一般的に接頭文字“ｒ”は組換え生分子であることを示す。
【００１２】
−ｃＤＮＡ（補足デオキシリボ核酸）：反転転写と呼ばれるプロセスで得られるリボ拡散（ＲＮＡ）の補足複製である。それによってＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡを定型（リバーストランスクリプターゼ）として使用する。そのｃＤＮＡは単撚糸状または双撚糸状であり得る。
【００１３】
−発現ベクター：これは線形または円形ＤＮＡ分子であり、転写を提供する追加分節に操作可能にリンクされたポリペプチドをエンコードする分節を含んでいる。そのような追加分節はプロモータとターミネータ配列を含んでいる。発現ベクターは複製の由来体、選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化信号等々を含むこともできる。発現ベクターは一般的にプラズミドまたはウィルス性ＤＮＡから導かれるか、あるいは両方の因子を含む。“操作可能にリンク”とは分節が、例えば転写をプロモータで開始させ、ターミネータにまでコード化分節を介して進行させるという目的に則して機能するようにアレンジされることを言う。宿主有機体での発現ベクターの転写は自律的または宿主ゲノムへの一体化を通じて行われる。
【００１４】
−リーダーまたは信号配列：これは分泌ペプチドをエンコードするＤＮＡ配列である。信号配列もリーダーまたはプレプロ配列と呼ばれる。分泌ペプチドはアミノ酸配列であり、成熟ポリペプチドあるいは細胞からの蛋白質の分泌を指示するように作用する。分泌ペプチドは疎水性アミノ酸の中核部であり、典型的には新たに合成された蛋白質のアミノ端で見られる。しばしば分泌ペプチドは切断時の分泌中に成熟蛋白質から切断される。そのような分泌ペプチドは、分泌通路を通過するときに成熟蛋白質から分泌蛋白質を切断させる処理部位を含んでいる。
【００１５】
−プロモータ：遺伝子転写を開始させ、対応するメッセンジャーＲＮＡを発生させるためにＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＤＮＡ配列。
【００１６】
−トランスフェクション：これは、その細胞では通常は製造されない蛋白質を製造できるＤＮＡ構造の導入で成熟核細胞を遺伝学的に修正させる方法である。それら細胞は“トランスフェクトされた細胞”として解説される。
【００１７】
本発明は証明された生物学的活性を有し、その実験的設計が次のステップを有したヒトの組換えＴＰＯを得るための物質と方法を提供する。
【００１８】
１．全ＲＮＡは肝胆汁手術を受けた志願者から得られた正常なヒトの肝臓から単離された。
２．全ｃＤＮＡは反転転写によりＲＮＡから入手され、ｈＴＰＯの完全配列は特定プライマーを使用してｃＤＮＡから増大された（表２）。
３．ヒトトロンボポイエチンの発現と製造を促すために成熟核細胞に導入が可能な形態でｈＴＰＯの特定ｃＤＮＡを含んだ発現ベクターの構築が行われる。
４．そのベクターは生体外で培養できる哺乳細胞ラインにて通常のエレクトロポレーション技術により導入される。
５．ネオマイシン抗生物質が細胞が成長する人工媒地に加えられる。発現ベクターを成功裏に取り入れた細胞が選択される。なぜなら、それらは抗生物質ネオマイシンに抵抗をエンコードする遺伝子を有するからである。
６．限定された希釈法で、発現ベクターの宿主である個々の細胞が選択される。多量の組換えヒトトロンボポイエチンを製造する細胞は“クローン”と呼ばれる。
７．その生物学的活性は培養上澄を使用して生体外及び生体内分析により次の効果を提供する能力に関して試験される。ａ）生体外媒地での巨核球への造血先駆物質の分化、ｂ）ＴＰＯ依存細胞ラインの増殖、ｃ）トロンボサイトペンの動物の順間血液血小板の増加（血小板製造における生体内刺激）。
【００１９】
成熟ｈＴＯＰに対応するＮＭ０００４６０として特定されるヌクレオチド配列とＳＥＱ＃１として特定されるアミノ酸配列は表１に提供されている（５）。配列ＮＭ０００４６０とＳＥＱ＃１は、異なる対立物質変形体が存在するかも知れないｈＴＰＯの対立物質を表す。それら変形体はクローン細胞、ヒト細胞またはＤＮＡ生成物から得られよう。この配列は特定ＴＰＯ物質を増長させ、その後のクローン化及び純化に必要なプライマーの入手に使用された。本発明においては、クローン処理して、正常な肝組織からその信号ペプチドを含んだ完全ｈＴＰＯに対応するｃＤＮＡを入手する。本発明では同じ配列の部分的または修正断片は使用されなかった。
表１
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【００２０】
本発明で構築された発現ベクター（哺乳細胞内で再製可能）は順番に次を含む。ａ）ヒトＢリンパ球のゲノムライブラリーから得られたヒト免疫球素のカッパ鎖からの可変遺伝子から導かれた転写プロモータ、ｂ）ｈＴＰＯの特定信号ペプチドをエンコードするＤＮＡの第１分節、ｃ）全長成熟ｈＴＰＯポリペプチドをエンコードするＤＮＡの第２分節、ｄ）ヒトカッパ遺伝子からのイントロン領域から導かれた転写エンハンサー（ヒトＢリンパ球のゲノムライブラリーから入手）、ｅ）ポリデニル化信号、ｆ）転写ターミネータ、ｇ）バクテリア系での選択マーカーとしてのアンピシリンに対する抵抗遺伝子の完全配列、ｈ）成熟核系の選択マーカーとしてのネオマイシンに対する抵抗遺伝子の完全配列、及びｉ）バクテリアでの拡張を許すバクテリア転写由来物質。成熟ｈＴＰＯポリペプチドをコード化するＤＮＡ分節の転写及び変換の直接的生成物は、“Ｎリンクグリコシレート化またはＯリンクグリコシレート化”と呼ばれる化学結合を介して炭水化物の集合を含んだ異なる化学基を加える変換後の処理に依存するであろう。この変換後の修正の正確な特徴は組換えｈＴＰＯの製造に使用される宿主細胞の種類により決定されるであろう。
【００２１】
本発明で使用する適当な宿主細胞は非定型ＤＮＡを発現するように加工でき、培地内で成長でき、効率的な分泌通路を有した成熟核細胞を有している。好適な細胞は、米国種培養コレクション（メリーランド州ロックビル（ＡＴＣＣ））のごとき公共委託施設から入手できる鼠骨髄腫から得られる。参考までに、ラインＸ−６３（Ｐ６３Ｘ６３Ａｇ．５６３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８０）とＳＰ２（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１及びＣＲＬ−８２８７）が存在する。ｈＴＰＯポリペプチドを宿主細胞の分泌通路に導くために、分泌リーダーをエンコードするＤＮＡ配列がｈＴＰＯポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列と組み合わせて使用される。本発明においては、使用される信号ペプチドは天然ｈＴＰＯに対応したものであった（アミノ酸配列は表ＩのＳＥＱ１に太字で提供）。一般的には、免疫グロブリン、ＳＶ４０からのウィルスプロモーター、ここに含まれるアデノウィルスまたはサイトメガロウィルス等のごとき転写の強力なプロモーターが必要である。
【００２２】
薬剤選択は広く活用されている方法であり、発現ベクターを成功裏に取り入れた哺乳媒地細胞を選択させる。そのような細胞は一般的に“トランスフェクタント”と呼称される。選択剤の存在下で培養され、子孫にまで対象遺伝子を伝えることができる細胞は“安定トランスフェクタント”と呼称される。好適な選択可能マーカーは抗生物質ネオマイシンに対する抵抗をエンコードした遺伝子である。選択はＧ−４１８等のネオマイシンタイプ薬の存在下で実施される。選択システムは対象遺伝子の発現レベルを高めるのにも使用できる（増長）。増長は低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、導入遺伝子の高レベル生産を行う細胞の選択をする選択剤量を増加することで実施される。使用可能な他の薬剤抵抗遺伝子にはヒグロマイシン、多薬抵抗遺伝子、ジヒドロフォレートリダクターゼ及びピュロマイシンアセトリルトランスフェラーゼが含まれる。
【００２３】
哺乳細胞内に外遺伝子ＤＮＡを取り入れる多くの方法が存在する。例えば、ａ）燐酸カルシウム媒介トランスフェクション、ｂ）エレクトロポレーション（１４）、ｃ）ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション（オースベル他の「分子生物学の最新プロトコル」ジョン・ウィリーアンドサン社発行、ニューヨーク、１９８７年）、及びｄ）陰イオン脂質媒介トランスフェクションがある。本発明に好適な方法はエレクトロポレーションである。トランスフェクトされた細胞は通常媒地で培養される。これは、細胞成長に必須なえ異様と、取り入れられた外遺伝子ＤＮＡを有した細胞を選択するために必要な抗生物質とを含んだものである。
【００２４】
本発明に従って製造されたｈＴＰＯは、再生不良性貧血、骨髄性再生不良症候群、化学治療または先天性血小板減少症のごとき症状での血小板生産を増加させるのに望ましいときに治療薬として使用が可能である。
【００２５】
先天性血小板減少症は循環血液血小板数の減少を特徴とし、皮膚及び粘膜出血の増加で明確となる。減少した血小板数は、例えば、血小板生産の欠陥、異常血小板分配、大量輸血による希釈性消失または血小板の異常破壊等を原因とする。さらに、特定の悪性腫瘍が血小板生産及び分配を阻害することがある。悪性腫瘍細胞を殺すのに使用される放射線治療は血小板子孫細胞をも殺す。先天性血小板減少症は薬物、新生児異常免疫症または血小板輸血異常免疫症で誘発される種々な血小板自己免疫症状からも発症する。ｈＴＰＯポリペプチドは輸血の必要性を減少または排除することができるため、血小板異常免疫症の発症を抑えることができる。血小板の異常破壊は、１）血管移植または外傷組織の増加した血小板消費、または２）例えば、薬物誘導先天性血小板減少症、自然発症性先天性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫症、白血病やリンパ腫のごとき血液の病気、または骨髄が関与する転移性癌と関係する免疫メカニズムが原因となることがある。ｈＴＰＯの他の症状には、例えば、化学治療やＡＺＴでのＨＩＶ感染治療のごとき再生不良性貧血及び薬物誘導骨髄抑圧が含まれる。
【００２６】
ｒｈＴＰＯはＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１またはＧＭ−ＣＳＦ等の他の細胞質とも関連することがある。ｒｈＴＰＯの治療投薬量は１日当り０．１から１００μｇ／ｋｇ（好適には０．５から５０μｇ／ｋｇ）である。正確な投与量はケースバイケースで臨床的に決定されなければならない。ｒｈＴＰＯは化学治療または骨髄移植後の２８日間投与される。または血小板数が２０，０００／μｌ、好適には５０，０００／μｌ以上になるまで投与される。
【００２７】
ｒｈＴＰＯポリペプチドは、細胞分化のメカニズムの解明や、成熟細胞の血統の決定のごとき造血細胞の分化と進化の生体外研究の有効な道具でもあり、細胞培養での増殖剤としての利用も図れる。
【００２８】
ｒｈＴＰＯポリペプチドは、オートロガス骨髄培地でのごとき体外でも使用できる。簡単に言えば、骨髄は化学治療に先立って患者から取り出され、ｒｈＴＰＯポリペプチドで治療される。オプションでは他の細胞質と組み合わされる。治療された骨髄は骨髄の回復速度を上げるために化学治療後に患者に戻される。さらに、ｒｈＴＰＯポリペプチドは骨髄または末梢血液子孫（ＰＢＰＣ）細胞の生体外増量のためにも使用が可能である。化学治療に先立って骨髄は幹細胞因子（ＳＣＦ）またはＧ−ＣＳＦで刺激され、末梢循環内に初期子孫細胞を放出する。これら子孫は末梢血液から収集濃縮され、ｒｈＴＰＯにより媒地内で治療される。オプションでは他の細胞質であるＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１等と組み合わされ、分化されて高濃度巨核球細胞培養内に増殖され、大量化学治療後に患者に戻される。
【００２９】
ｒｈＴＰＯの別な利用性は、抗ＴＰＯ抗生物質の存在を決定するために実施されるいくつかの診断に利用することである。それは自己免疫性先天性血小板減少症で実践されてきた。
【発明の実施の態様】
【００３０】
本発明を次の実施例を利用してさらに詳細に説明する。
実施例１
ｈＴＰＯの特定ｃＤＮＡを入手するために正常成人の肝組織から得られたｍＲＮＡ：正常成人の肝組織片（５０ｍｇ）が全ＲＮＡを単離するために処理された。このプロセスはグアニジン硫シアン塩酸フェノールクロロホルムで抽出する旧来方法を利用して行われた。全ＲＮＡの純度と濃度は２６０／２８０吸収率であった。
【００３１】
実施例２
ｈＴＰＯ特異ｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成（反転転写）：反転転写によるｃＤＮＡの第１ストランドの合成は合成オリゴ（ｄＴ）１２−１８と反転トランスクリプターゼ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ， ギブコＢＲＬライフテクノロジー社）を使用して５μｇの全ＲＮＡから実行された。検定評価は、４μｌバッファ５ｘ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、３５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ ＤＴＴ）、１μｌのオリゴ（ｄＴ）５００μｇ／ｍｌ、２μｌ ＤＴＴ ０．１Ｍ、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５μｇ 全ＡＲＮ及び２０μｌのＨ２Ｏを含有した総量２０μｌ内で実施された。
【００３２】
実施例３
完全ｈＴＰＯをエンコードする特異ｃＤＮＡの増長：対象の配列の“ネスト型ＰＣＲ”技術による増長（ポリメラーゼ鎖反応）。この処理は、高特異性と高厳密性とを有した成熟蛋白質をエンコードする配列を増長させるために双ペアのプライマーと熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの組合せを設計することで行われる。その意味で高厳密増長システムが使用された。このシステムはＴａｑポリメラーゼとＰｏｗ ＤＮＡポリメラーゼの適当な混合物で構成された（ＥＨＦ：ＥｘｐａｎｄＴＭ 高厳密ＰＣＲシステム、ボーリンジャー・マンハイム）。これら２つの増長工程のプライマー配列は表２に記載されている。増長反応は総量１００μｌ内に次を加えて実施された。
２μｌ（ｄＮＴＰｓ ２００ｍＭ）
３μｌ（１０ｍＭ 前進プライマー）
３μｌ（１０ｍＭ 反転プライマー）
１０μｌ（バッファ １０Ｘ）
０．７５μｌ（熱安定ポリメラーゼＥＨＦ）
５μｌ（ｃＤＮＡ）
７６．２５μｌ（Ｈ２Ｏ）
【００３３】
最初の増長処理は外部プライマーＴＰＯＥＸＴ−ＦＯＷ ｙ ＴＰＯＥＸＴ−ＲＥＶ（表２参照）で実施され、反応物は３０の増長サイクルで培養された（８５℃で２分間培養済み）。
サイクル１から１０：３０秒 ９５℃、３０秒 ５８℃、１２０秒 ７２℃
サイクル１０から２０：３０秒 ９５℃、３０秒 ５８℃、２５０秒 ７２℃
サイクル２０から３０：３０秒 ９５℃、３０秒 ５８℃、３６０秒 ７２℃
最終伸張化ステージ：１０分 ７２℃
【００３４】
第２ラウンドの増長処理は、同一条件ではあるが２μｌの第１増長反応物を第１ラウンドの５μｌのｃＤＮＡで置換し、内部プライマーＴＰＯＦＯＷ ｙ ＴＰＯＲＥＶで実施された（表２Ｂ参照）。反応条件は、前２分間、９５℃の培養で２０サイクルの増長処理であり、以下の通りである。
サイクル１から１０：３０秒 ９５℃、３０秒 ６２℃、１２０秒 ７２℃
サイクル１０から１５：３０秒 ９５℃、３０秒 ６２℃、２４０秒 ７２℃
サイクル１５から２０：３０秒 ９５℃、３０秒 ６２℃、３６０秒 ７２℃
最終伸張ステージ：１０分 ７２℃
表２
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【００３５】
実施例４
クローンを目的としたｈＴＰＯの増長ｃＤＮＡの純化及び生成：増長産物は低融点アガロースゲル（１％）で電気泳動により分離され、特定される。１１０７の塩基ペアのバンドを含んだゲル部分は切断され、ＤＮＡは単離されて純化された（ヌクレイクリーン、シグマ）。この処理は、同時にアガロースを溶解できる飽和ヨウ化ナトリウム媒質でＤＮＡを強力に結合させるためにファイバーグラス微小球の性能を活用する技術を利用して実施された（１６）。そのＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノールで洗浄され、エタノールに沈降され、最後に１０μｌのＨ２Ｏに再懸濁される。Ａ−Ｔベクターでクローン化するために３’ＯＨ極部でアデニンヌクレオチドを取り入れるため、純化された断片が１０分間７２℃で培養される（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、バッファ及びｄＡＴＰ使用）。その断片は再び抽出され、フェノール／クロロホルム抽出により純化され、エタノールに沈降され、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁される。ｃＤＮＡ断片は結紮の準備ができ、Ａ−Ｔクローンベクターシステムにクローン化される。
【００３６】
実施例５
増幅ｃＤＮＡ部分のＡ−Ｔクローン化ベクターシステムへのクローン処理。実験４の純化部分はｐＣＲ２．１プラズミドに結紮された（オリジナルＴＡクローンキット、インビトロゲン）。この結紮は以下のごとくＴ４ＤＮＡリガーゼ（ボエフリンゲル・マンハイム）、ｐＣＲ２ベクター及び純化ｃＤＮＡ ｈＴＰＯを使用して塩媒質内で実施された。
−実施例４で純化された２μｌのＴＰＯ断片
−１μｌの結紮バッファ １０ｘ
−２μｌのｐＣＲ２．１ベクター（２５ｎｇ／μｌ）
−１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（４ユニット）
−４μｌのＨ２Ｏ
酵素結紮は１６時間１４℃で培養された。
【００３７】
有効なＥ．コリストレイン（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０Ｆ、インビトロゲン）は結紮プラズミドで変換された。このベクターは次を実行した。ａ）アンピシリンに対する抵抗遺伝子の存在によるプラズミドを含んだバクテリアコロニーの獲得、ｂ）ｈＴＰＯをエンコードするｃＤＮＡインサートを含んだプラズミドでバクテリアコロニーの特定（これはベクター内のｌａｃＺα遺伝子の存在に依存し、それはＩＰＴＧイソプロピルチオ−β−ガラクトシドによて誘導可能であり、それらをトレース処理してＸ−Ｇａｌ加水分解に従ってバクテリアコロニー白／青の特定する）、及びｃ）配列を確認するためにＭ１３プライマーを使用してインサートの規制分析と配列性を実施するためにＬＢ（ルリア−ベルタニ）でミニ培地によって陽性バクテリアコロニーから多量のプラズミド（ミニプレップ）を単離。
【００３８】
規制分析後に１０の陽性コロニーが得られ、一括してｐＣＲ２ ＴＰＯ−１からｐＣＲ２ ＴＰＯ−１０と呼称される。
【００３９】
単離されたコロニーは次の３グループに分離された、
【００４０】
−ＴＰＯ２と呼称される前述のイソホルムと同一であるｈＴＰＯの対応配列にマッチするクローンｐＣＲ２−１、−２、−４及び−９（１２の塩基は削除（４ａａ））（１７）。
【００４１】
−アミノ酸置換を含まない、天然ｈＴＰＯの完全配列にマッチするクローンｐＣＲ２−５、−６、−７、−８及び−１０。
【００４２】
−前述のイソホルムＴＰ０３と同一である１１６ｂｐを削除したクローンｐＣＲ２−９はｈＴＰＯの対応配列にマッチする（１７）。
【００４３】
これらインサートはサンガー他が説明した方法に従って正確に特定するため配列処理された（１８）。この配列処理は両ＤＮＡストランドに跨って完全に実施された。
【００４４】
クローンｐＣＲ２ ＴＰＯ−５に従ったプラズミド生成が以下の実験ステップに従って継続するように選択された。
【００４５】
実施例６
成熟ｈＴＰＯ（ｐＫ−ｅＴＰＯ）をエンコードする配列でのベクター設計：以下の特徴に従って成熟核発現ベクターが構築された。
１．ネオマイシンを含有する媒質（Ｇ−４１８）内でトランスフェクト細胞を積極的に選択するネオマイシン抵抗遺伝子（Ｎｅｏｒ）
２．免疫グロブリン遺伝子のプロモータ配列
３．規制部位Ｃｌａ ＩとＮｏｔ Ｉを含んだクローン領域
４．ヒト免疫グロブリン転写のエンハンサー
５．Ｅ．コリ（ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）の原子核複製由来体
６．アンピシリン抵抗遺伝子（Ａｍｐｒ）
７．ＳＶ４０（ＳＶ４０ｏｒｉ）から誘導された原子核複製由来体
【００４６】
これら全てのセクターは対応するｒｈＴＰＯ遺伝子の転写と変換を確実にするために論理的にオーダーされる。発現ベクターの構築はｐＫとして特定され、図１にて示されている。
【００４７】
実施例７
成熟ｈＴＰＯ（ｐＫ−ｅＴＰＯ）をエンコードする配列を使用した成熟核発現ベクターの構築：ｈＴＰＯをエンコードし、その配列が全体的に確認されているＤＮＡ断片を有したｐＫ発現ベクターの構築はｐＫ−ｅＴＰＯと呼称された。全機能分節を含んだｐＫ−ｅＴＰＯ構造は図１に示されている。その構築は次の実験ステージで実施された。
ステージ１
まず、Ｃｌａ ＩとＮｏｔ Ｉ規制部位を含んだ発現プライマーが設計され（表ＩＩＣ参照）、Ｃｌａ−ｅＴＰＯＦＯＷとＮｏｔ−ｅＴＰＯＲＥＶと呼称された。それらは次を実行させた。
１）ｐＣＲ２ ＴＰＯ−５から得られたクローンベクターに含まれるｈＴＰＯをコードする配列の増長処理
２）酵素結紮反応後にｐＫベクターに信号ペプチドを含んだｈＴＰＯをエンコードする完全配列を導入するための２つの規制部位（Ｃｌａ ＩとＮｏｔ Ｉ）の導入
【００４８】
ｐＣＲ２ ＴＰＯ−５に含まれ、Ｃｌａ ＩとＮｏｔ Ｉ規制部位を含むように修正された増長ｈＴＰＯ断片はｅＴＰＯ−５と呼称された。増長反応は総量５０μｌで実施された（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット、ギブコ　ＢＲＬ−ライフテクノロジーズ社）。
−２．５μｌ（ｄＮＴＰｓ １０ｍＭ）
−２．５μｌ（１０ｍＭのＣｌａ−ｅＴＰＯＦＯＷ）
−２．５μｌ（１０ｍＭのＮｏｔ−ｅＴＰＯＲＥＶ）
−５μｌ（バッファ１０Ｘ）
−０．５μｌ（Ｔａｑポリメラーゼ）
−５μｌ（希釈 １／１００，０００のｐＣＲ２ ＴＰＯ−５）
−１．５μｌ ＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）
−３０．５μｌ（Ｈ２Ｏ）
培養条件：１回の４分サイクル、９５℃；２５サイクル、９５°、３０分；６５℃、３０分、７２℃、３０分；１回の１０分最終伸張サイクル、７２℃
【００４９】
ステージ２
増長生成物はアガローズゲル低溶融（１％）内で電気泳動技術を利用して分離され、特定される。１０９０ｂｐのバンドを含んだゲル部分は結紮され、ＤＮＡは単離されて純化された（ヌクレイクリーン、シグマ）。この処理は、同時にアガローズを溶解させることができる飽和ヨウ化ナトリウム媒質でＤＮＡを強力に結合させるため、ファイバーグラス微小球の性能を活用する技術により実施された（１６）。次に、そのＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、洗浄され、エタノールに沈降されて最終的に１５μｌのＨ２Ｏに再懸濁される。
【００５０】
ステージ３
純化ｅＴＰＯ断片は次の反応スキームに従ってその断片が天然ｈＴＰＯと完全一致することを確認する酵素規制分析とヌクレオチド配列処理を実施するためにｐＣＲ２−１に結紮される。
−１μｌ ｅＴＰＯ断片
−１μｌ 結紮バッファ １０Ｘ
−２μｌ ｐＣＲ２．１ベクター（２５ｎｇ／μｌ）
−１μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４ユニット）
−５μｌ Ｈ２Ｏ
反応物は１６時間、４℃で培養される。結紮産物は製造業者の技術仕様に従って有効Ｅ．コリストレイン（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０Ｆ、インビトロゲン）を変換し、それらを膨張させる。ｅＴＰＯインサートを有した適切なプラズミドを含んだ６つのバクテリアコロニーが特定され、単離された。それらはｐＣＲ２−ｅＴＰＯ１から６と呼称された。プラズミド物質を単離させるたにアンプシリンを含んだＬＢ媒質でのミニ培養が実施された（ミニプレップ）。
【００５１】
ステップ４
インサートｅＴＰＯ−１から６が特定され、配列処理された。これはＢａｍＨ Ｉ規制プロフィールを使用して実施され、配列処理されて、サンガー他により説明された方法（１８）により自動配列システム（ＡＬＦ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ファーマシア社）を使用して両ＤＮＡストランドでの完全ヌクレオチド配列が確認された。表Ｉは、配列ＮＭ０００４６０（サウベージ他、１９９４年）同様のｐＣＲ２−ｅＴＰＯ２プラズミドに対応する“ＥＴＰＯ”として特定されるヌクレオチド配列を示す。解説したように、得られた配列は基準として使用されたものと同一である。そのｐＣＲ２−ｅＴＰＯ２プラズミドはその後のステージを実行するように選択された。
【００５２】
ステージ５
成熟核ｐＫ発現ベクターは、ｅＴＰＯ断片に結紮される前にＣｌａ ＩとＮｏｔ Ｉを使用して酵素的に消化された。この消化を行うため、酵素反応物が次のように４時間、３７℃で次のように培養された。
−１０．０μｌのベクターｐＫプラズミド生産
−２．０μｌのＣｌａ Ｉ酵素生産（シグマ）
−１．５μｌのＮｏｔ Ｉ酵素生産（シグマ）
−５．０μｌのバッファ１０Ｘ
−３１．５μｌのＨ２Ｏ
酵素的消化後に直線状ベクターは低溶融アガローズゲル（１％）で電気泳動技術により分離され、特定される。ベクターが含まれる領域は結紮され、ＤＮＡは単離され、透析膜で電気溶出により純化される。そのＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、洗浄され、エタノールで沈降され、最後に１５μｌのＨ２Ｏに再懸濁される。
【００５３】
ステージ６
ｐＣＲ２−ｅＴＰＯ２はｅＴＰＯ２断片を得るためにＣｌａ ＩとＮｏｔ Ｉで酵素的に消化された。消化のため、次の４時間、３７℃での酵素反応が利用された。
‐５．０μｌのｐＣＲ２−ｅＴＰＯ２のプラズミド生産
‐２．０μｌのＣｌａ Ｉ（シグマ）の酵素生産
‐１．５μｌのＮｏｔ Ｉ（シグマ）の酵素生産
‐５．０μｌのバッファ１０Ｘ
‐３６．５μｌのＨ２Ｏ
酵素的消化後の線状ベクターは低溶融アガローズゲル（１％）で電気泳動技術を利用してｅＴＰＯ２部分から分離される。ｅＴＰＯ２分節が含まれるゲル領域は結紮され、そのＤＮＡは単離され、ファイバーグラス微小球の性能を利用した技術で純化された。同時にアガローズを溶解させることができる飽和ヨウ化ナトリウム媒質内でＤＮＡは強力に結合された（１６）。そのＤＮＡはフェノール／クロロホルムで抽出され、洗浄され、エタノールに沈降され、最後に１５μｌのＨ２Ｏで再懸濁される。
【００５４】
ステージ７
ｐＫベクターのｅＴＰＯ−２純化断片による結紮処理は所定の仕様に従ったＴ４ＤＮＡリガーゼ（ファーマシア社）を使用して実施される。この結紮生成物はｐＫ−ｅＴＰＯと呼称され、フェノール／クロロホルム抽出法で純化され、エタノールに沈降され、１５μｌのＨ２Ｏで再懸濁される。
【００５５】
ステージ８
構築されたｐＫ−ｅＴＰＯが電気泳動により処理される。１ｍｍのクベット中に４０μｌの電子適応ＸＬ−１ストレインが２μｌのステージ７の純化結紮と共に投入される。１２９Ωの抵抗、５０μＦの容量を有した１３８０ボルトパルスが５ミリ秒間提供された。そのパルス後、８００μｌのＬＢ媒質が加えられる。２００ｒｐｍでの軌道培養器での４５分間、３７℃での培養後にＬＢ寒天アンピシリンディッシュがシードされる。
【００５６】
２つの陽性コロニーが単離され、ＬＢアンピシリン内で一晩のミニ培養で膨張される。プラズミドは従来方法（ミニプレップ）で抽出され、増長と規制酵素分析によってインサートが確認された。このように、純化プラズミド片のｐＫ−ｅＴＰＯが得られた。
【００５７】
実施例８
Ｐｕｖ ＩによるｐＫｅＴＰＯベクター線状化とトランスフェクトされる哺乳細胞ラインの選択：ｐＫ−ｅＴＰＯが得られると、Ｘ−６３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５８０）として知られる鼠骨髄腫から得られた哺乳細胞ラインが選択された。但し、哺乳動物から得られたどのような細胞でもこの発現プラズミドで使用が可能である。異なる細胞ライン中でこの細胞ラインが次の利点により選択された。ａ）免疫グロブリン複製エンハンサーと関連する免疫グロブリン遺伝子のプロモータを含んでいるため、本発明の設計発現ベクターに完全に則した蛋白質（免疫グロブリン）の高効率合成と分泌システムを有している。さらに、胎児牛血清（ＦＢＳ）１０％が加えられたＲＰＭＩ−１６４０のごとき試験管培質で成長できる。ｐＫｅ−ＴＰＯベクターは次の反応によりＰｖｕ Ｉ（ボーリンゲル　マンハイム）で線状化された。
‐２０μｌのプラズミドｐＫｅ−ＴＰＯ断片
‐５μｌのバッファＨ（１０Ｘ）
‐２μｌのＰｖｕ Ｉ
‐２３μｌのＨ２Ｏ
反応物は４時間、３７℃で培養され、物質はフェノール／クロロホルム抽出を利用して純化され、エタノールに沈降されて１０μｌのＨ２Ｏで回収された。
【００５８】
実施例９
ｐＫｅＴＰＯベクターでのＸ−６３細胞のトランスフェクション：実施例８の哺乳細胞（Ｘ−６３）は１０％のＦＢＳでＲＰＭＩ−１６４０（ギブコＢＲＬ−ライフテクノロジーズ社）で試験管内にて膨張され、ＦＢＳを含有しないＲＰＭＩ−１６４０で洗浄された。それらは次の濃度液内で再懸濁された。ＦＢＳを含有しない８００μｌのＲＰＭＩ１６４０に１５０万個の細胞。次に８００μｌの細胞が２ｍｍエレクトロポレーションクベット内に入れられ、１０μｌのｐＫｅＴＰＯプラズミドが加えられた。エレクトロポレーション（ＢＴＸエレクトロポレーションシステム６００、ジェネトロニクスバイオケミカル社）が次の条件で１２μ秒間実施された。
Ｃ：１２００μＦ；Ｒ：４８Ω；Ｖ：２１０Ｖ；Ｅ：１．０５０ｋＶ／ｃｍ
エレクトロポレーション処理された細胞は３７℃及び５％のＣＯ２にて２０％のＲＰＭＩ１６４０内で２４時間培養された。
【００５９】
実施例１０
ｒｈＴＰＯを生産するクローン処理細胞のスクリーニング及び選択：実施例９の細胞をトランスフェクト処理後に、それら細胞はネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）の３つの異なる培養グループ（培養体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）に分配された。ベース培質は１０％ＦＢＳとステプトマイシン−ペニシリン（５０ｍｃｇ／ｍｌと１００μｌ／ｍｌ）と、２ｍＭのＬ−グルタミン１ｕＭソジウムピルベートと１０ｍＭヘペス（成長媒質）であった。１５日間の培養後（毎週の媒質の交換）、上澄のｒｈＴＰＯの分泌物が抗ｈＴＰＯ抗体（ＲＤＩ：リサーチダイアグノスチックス社）を使用してウェスタンブロット方式で分析された。陰性コントロールとしてｐＫカッパベクターのＸ−６３トランスフェクト細胞が使用された。この処理はｒｈＴＰＯインサートの代りにカッパヒト鎖の免疫グロブリンを含んだＴＰＯのものと同一であった。
【００６０】
培養液ＩＩからの上澄はｒｈＴＰＯに対して弱陽性であり、クローン処理が限定希釈によって実施された（細胞希釈：２０％のＦＢＳと１ｍｇ／ｍｌのネオマイシンのＲＰＭ１６４０の９６穴プレートに入れられた０．３細胞／穴）。１５日後、５８個のネオマイシン−抵抗クローンが単離された。上澄は処理され、ウェスタンブロット方式によりｒｈＴＰＯの存在が評価された。この分析でｒｈＴＰＯを生成して分泌する１６個のクローンの存在が確認された。大量のｒｈＴＰＯが培養上澄で検出され、２Ａ４と呼ばれるクローンが単離され、クローン性を確認するために限定希釈によって再びクローン処理された。
【００６１】
図２に示すように、ウェスタンブロット方式による分析後、２Ａ４からのサブクローンが選択され、２４Ａ−１６と呼ばれた。サブクローン２４Ａ−１６を使用したｒｈＴＰＯの生産安定性は８週間の連続培養後にテストされた（図２参照）。２４Ａ−１６と呼ばれるＸ−６３細胞からのクローンと、安定した溶解性ｒｈＴＰＯの製造体はクローンＸ−６３ｅＴＰＯと呼ばれよう。
【００６２】
実施例１１
本発現システムで製造されるｒｈＴＰＯの存在と生物活性の分析：生物活性をテストする分析はＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳの存在下で０．６ｘ１０６細胞／培養液にてＸ−６３ｅＴＰＯ培養液の上澄を使用して試験管内で実施された。
【００６３】
‐ＥＬＩＳＡによるＴＰＯ濃度の決定：ＥＬＩＳＡテストがヒトＴＰＯキット（クワンチキン、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を使用して行われた。標準培養条件で、およその濃度は０．５μｇ／ｍｌであった。
【００６４】
‐Ｂａｆ−ｍｐｌ細胞ラインを使用した生体外バイオアッセイ：Ｂａｆ−ｍｐｌ細胞ライン（ブダペスト条約に従ってＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１７２３として１９９４年９月２８日に寄託）はＭｐｌ受体（ＴＰＯ受体）でトランスフェクトされた鼠ラインＢａｆ−ＢＯ３に対応する。親ラインのＢａｆ−ＢＯ３はＩＬ−３に依存し、トランスフェクトラインＢａｆ−ｍｐｌはＩＬ−３またはＴＰＯに依存する。このバイオアッセイは、異なる濃度のサイトキンまたは４８時間テストされている上澄の存在下で細胞を培養することで行われる。この期間の終了後、それらは［３Ｈ］チミジンで１２時間培養され、その後に細胞はフィルターで回収されて小瓶に入れられる。そこで放射性が液体シンチレーションカウンティングによってテストされる。２つの実験が９６穴プレートで実施され、異なる濃度で上澄がテストされた。１０％、３％、１％、０．３％、０．１％、０．０３％、０．０１％及び０．００３％であり、Ｂａｆ−ｍｐｌ細胞（３０，０００細胞／穴）で３回実施された。投与量に応じた曲線処理が１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ／ｍｌ及び０．０３ｎｇ／ｍｌ濃度で標準ＴＰＯを使用して実施された。ＩＬ−３による内部制御が、細胞ラインを分析サイトキンに対応させるように実行された。陰性コントロールが成長因子を介さずに実行された。テストされた上澄内でのＩＬ−３の影響を無効化するために同様なことが親ラインＢａｆ−ＢＯ３で実施された。実験はＸ−６３ｅＴＰＯ上澄培液内の０．４μｇ／ｍｌｒｈＴＰＯの同様な標準活性を示した。
【００６５】
‐ＣＤ３４骨髄細胞からの巨核球子孫の試験管内増殖及び分化：骨髄細胞ＣＤ３４＋がＦｉｃｏｌｌ＋Ｈｙｐａｑｕｅでの段階的密度遠心分離で得られ、免疫磁気的に選択された（ミルテニイ、ミニマックス）。これら細胞は巨核球線状化に向けて分化させるような条件下で液体媒質内にて培養される。これら条件とは、トランスフェリンが加えられたＦＢＳ無含有イスコーブ、インスリン、ボビン、セロアルブミン、リポゾーム及びＴＰＯの存在である。ＣＤ３４＋骨髄細胞は異なる希釈の標準ｒｈＴＰＯまたはＸ−６３ｅＴＰＯクローンの上澄を使用した２４穴プレート（１００，０００細胞／穴）で培養された。１０日後に細胞増殖がテストされ（細胞数）、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４１モノクローン抗体でそれらをマークすることで製造される巨核球の割合（％）（フローサイトメトリーで分析）が出された。４種の異なる濃度のｒｈＴＰＯが試験された（２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ）。７０％の細胞が巨核球線状（ＣＤ４１陽性細胞）であった。Ｘ６３ＴＰＯからの上澄は３種の異なる濃度でテストされた。１０％、５％、２５％。３倍、２倍及び１．５倍の細胞数の増加がそれぞれ観察された。巨核球細胞成長に関しては７５％のＣＤ４１＋細胞がそれら３ケースで得られた。よって、巨核球細胞の絶対数は細胞増殖に関連する上澄液濃度によって変わることが知られた。フローサイトメトリーにより分析された代表的結果は図３に示されている。２．５％の培養上澄液は５ｎｇ／ｍｌの標準ｈＴＰＯによって導かれるものと等しい発現レベルを提供することが理解されよう。
【００６６】
資料一覧
１．クータＤ．Ｊ．　１９９６年　トロンボポイエチン：生物及び臨床適用。腫瘍学者　１：９８
２．ケレメンＥ．、Ｉ．チェリハチ、Ｂ．タノス　１９５８年　血小板血病血清内のヒトトロンボポイエチンの実演及び特性。アクタヘマトール。（バーゼル）２０：３５０
３．ソウリＭ、Ｉ．ビゴン、Ｊ．Ｆ．ペンシオレリ、Ｊ．Ｈ．ハード、Ｐ．タンボーリン、Ｆ．ウェンドリング　１９９０年　骨髄増殖白血病ウィルスにより変換した推定結紮サイトキン受体遺伝子は造血子孫を不滅化する。細胞６３：１１３７
４．バートレイＴ．Ｄ．、Ｊ．ボーゲンベルガー、Ｐ．ハント、Ｙ．Ｌ．リー、Ｆ．マーチン、Ｍ．Ｓ．チャン、Ｂ．サマイ、Ｊ．Ｌ．ニコール、Ｓ．スイフト、Ｍ．Ｊ．ジョンソン、Ｒ．Ｙ．シュー、Ｖ．Ｐ．パーカ、Ｓ．サッグズ、Ｊ．Ｄ．シュクリン、Ｌ．Ａ．ミアウェザー、Ｃ．クログストン、Ｅ．ハウ、Ｍ．Ｍ．ホコム、Ａ．ホーンコール、Ｅ．チョイ、Ｍ．パンゲリナン、Ｙ．スン、Ｖ．マー、Ｊ．マクニンチ、Ｌ．シモネット、Ｆ．ヤコブセン、Ｃ．クサイ、Ｊ．シャッター、Ｈ．シュート、Ｒ．バス、Ｌ．セランダー、Ｄ．トロリンジャー、Ｌ．シーウ、Ｄ．パディラ、Ｇ．トレイル、Ｇ．エリオット、Ｒ．イズミ、Ｔ．コベイ、Ｊ．クラウズ、Ａ．ガルシア、Ｗ．ジュ、Ｊ．デルカスティーロ、Ｊ．バイロン、Ｓ．コール、Ｈ．ＭＣ．Ｔ．、Ｒ．パシフィシ、Ｉ．ポンティン、Ｃ．サリス、Ｄ．ウェン、Ｙ．Ｐ．ユング、Ｈ．リン、Ｒ．Ａ．ボセルマン　１９９４年　サイトキン受体Ｍｐｌのリガンドである巨核球成長及び発展因子の識別及びクローン処理。細胞７７：１１１７
５．ドソウバージ、Ｆ．Ｊ．、Ｐ．Ｅ．ハース、Ｓ．Ｄ．スペンサー、Ｂ．Ｅ．マロイ、Ａ．Ｌ．ガーニー、Ｓ．Ａ．スペンサー、Ｗ．Ｃ．ダーボン、Ｗ．Ｊ．ヘンゼル、Ｓ．Ｃ．ウォング、Ｗ．Ｊ．クワング、Ｋ．Ｊ．オールズ、Ｂ．ハルトグレン、Ｌ．Ａ．ソルバーグジュニア、Ｄ．Ｖ．ゴーデル、Ｄ．Ｌ．イートン　１９９４年　ｃ−Ｍｐｌリガンドによる巨核球ポイエシスとトロボポイエシスの刺激。ネーチャ　３６９：５３３
６．カウシャンスキーＫ．、Ｓ．ロック、Ｒ．Ｄ．ホリー、Ｖ．Ｃ．ブラウディ、Ｎ．リン、Ｍ．Ｃ．ベーリー、Ｊ．Ｗ．フォルストロム、Ｍ．Ｍ．バドル、Ｐ．Ｊ．オート、Ｆ．Ｓ．ハーゲン、Ｇ．Ｊ．ロス、Ｔ．パパヤノパウロー、Ｄ．Ｃ．フォスター　１９９４年　ｃ−Ｍｐｌリガンドトロンボポイエチンによる巨核球子孫増長及び分化の増進　ネーチャ　３６９：５６８
７．ロクＳ．、Ｋ．コーシャンスキー、Ｒ．Ｄ．ホリー、Ｊ．Ｌ．クイジュパー、Ｃ．Ｅ．ロフトン−デイ、Ｐ．Ｊ．オート、Ｆ．Ｊ．グラント、Ｍ．Ｄ．ヘイペル、Ｓ．Ｋ．バークヘッド、Ｊ．Ｍ．クラマー、Ｌ．Ａ．ベル、Ｃ．Ａ．スプレッチャー、Ｈ．ブランバーグ、Ｒ．ジョンソン、Ｄ．プランカード、Ａ．Ｆ．チング、Ｓ．Ｌ．マシューズ、Ｍ．Ｃ．ベイリー、Ｊ．Ｗ．フォルストラム、Ｍ．Ｍ．バドル、Ｓ．Ｇ．オズボーン、Ｓ．Ｊ．エバンス、Ｐ．Ｏ．シェパード、Ｓ．Ｒ．プレスネル、Ｐ．Ｊ．オハラ、Ｆ．Ｓ．ハーゲン、Ｇ．Ｊ．ロス、Ｄ．Ｃ．フォスター　１９９４年　鼠トロンボポイエチンｃＤＮＡのクローン処理と発現及び生体内の血小板製造刺激　ネーチャ　３６９：５６５
８．ウェンドリングＦ．、Ｅ．マラスコブスキー、Ｎ．デビル、Ｃ．フロリンド、Ｍ．ティープ、Ｍ．ティテウクス、Ｎ．メシア、Ｊ．ブレトン−ゴリウス、Ｄ．コスマン、Ｗ．バインケンカー　１９９４年　ｃＭｐｌリガンドは巨核球ピエシスの液素性レギュレータである。ネーチャ　３６９：５７１
９．カウシャンスキーＫ．　１９９５年　トロンボポイエチン：血小板製造の主レギュレータ。血液　８６：４１９
１０．レオバルドＪ．Ｐ．、Ｃ．Ｍ．キント、Ｍ．Ｋ．コジッタ、Ｔ．Ｙ．ネベン、Ｓ．Ｊ．ゴールドマン　１９９４年　組換えヒトインターロイキン−１１は致死量以下の放射とカルボプラチンの脊髄抑制養生後の鼠の多系造血回復を刺激する。血液　８３：１４９９
１１．フォスターＤ．Ｃ．、Ｃ．Ａ．スプレッチャー、Ｆ．Ｊ．グラント　１９９４年　ヒトトロンボポイエチン：遺伝子構造、ｃＤＮＡ配列局部化及び保存代用接合形態のトロンボポイエチン。血液　８５：９８１
１２．ガーニーＡ．Ｌ．、Ｗ．Ｊ．クワング、Ｍ．Ｈ．ジー、Ｂ．Ｅ．マロイ、Ｄ．Ｌ．イートン、Ｆ．Ｊ．ドサウベージ　１９９５年　ゲノム構造、クロモゾーム局部化及び保存代用接合形態のトロンボポイエチン。血液　８５：９８１
１３．ウィグラーＭ．、Ａ．ペリサー、Ｓ．シルバースタイン、Ｒ．アクセル　１９７８年　ドナーとして全細胞ＤＮＡを使用した単複製ユーカリオティック遺伝子の生物化学移植。細胞　１４：７２５
１４．ニューマンＥ．、Ｍ．シェーファ−リッダー、Ｙ．ワング、Ｐ．Ｈ．ホフシュナイダー　１９８２年　高電界内でのエレクトロポレーションによる鼠ライオマ細胞内への遺伝子移植。細胞　１４：７２５
１５．チョムチンスキーＰ．、Ｎ．サッチ　１９８７年　酸グアニジニウムチオシラネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の単ステップ法。分析生物化学　１６２：１５６
１６．ボゲルスタインＢ．、Ｄ．ギレスピー　１９７９年　アガローズからのＤＮＡの製造及び分析的純化　ナショナルアカデミー科学　ＵＳＡ　７６：６１５
１７．クータＤ．Ｊ．、Ｐ．ハント、Ｗ．シェリダン、Ｄ．ズッカー−フランクリン　１９９７年　トロンボポイエシスとトロンボポイエチン：分子、細胞、前臨床及び臨床生物学。ヒューマナプレス社
１８．サンガーＦ．、Ｓ．ニッケレン、Ａ．Ｒ．カウルソン　１９７７年　鎖終結インヒビターでのＤＮＡ配列。ナショナルアカデミー科学　ＵＳＡ　７４：５４６３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年12月30日(2002.12.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳細胞内で複製可能な発現ベクターであって、適切で効率的な転写のために以下の要素を含んでいることを特徴とする発現ベクター：
ａ）ヒト免疫グロブリンの可変遺伝子に対応する転写プロモータ；
ｂ）信号ペプチド（分泌リーダー）を含んだ完全ｈＴＰＯポリペプチドをエンコードするＤＮＡ分節；
ｃ）ヒトカッパ遺伝子の免疫グロブリン転写エンハンサーＤＮＡ分節；
ｄ）転写ターミネータ；
ｅ）ポリアデニル化信号；
ｆ）抗体ネオマイシンタイプ薬に対する抵抗をエンコードする遺伝子；
ｇ）抗体アンピシリンに対する抵抗をエンコードする遺伝子；
ｈ）Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＣｏｌＥｌ ｏｒｉ）の複製由来体。
【請求項２】
Ｘ−６３（ＡＴＣＣ：ＰｅＸ６３Ａｇ８．６５３３、ＣＲＬ　１５８０）である鼠骨髄腫から得られる培養細胞ライン（系）であって、請求項１記載の発現ベクターによって安定的にトランスフェクト処理されたものであり、生物学的に活性な形態で培地中に成熟ｒｈＴＰＯポリペプチドを製造して分泌することができることを特徴とする培養ライン。
【請求項３】
請求項２記載の細胞ラインで製造される、ｈＴＰＯに対応する生物学的に活性な組換えポリペプチドを得る方法。
【国際調査報告】
2004507269.tif 000039
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