(57)【要約】本発明は、ＨＳＰを発現するオンコリティック微生物、これらを含む組成物または薬学的組成物、およびこれらを使用する局所性および転移性腫瘍を殺す方法に関する。この微生物はウイルスまたは細菌をいい、これらは腫瘍細胞を溶解するために腫瘍細胞内で選択的に増殖し得る。本発明に従う微生物又は組成物が腫瘍患者に投与される間に、オンコリティック微生物は腫瘍細胞を溶解し、そしてオンコリティック微生物によって発現されるかまたはその間に投与される熱ショックタンパク質は、溶解する腫瘍細胞によって放出される腫瘍抗原に接着し、そして腫瘍細胞に対する特定の免疫応答を誘導するように抗原提示細胞に結合し、次いで転移性腫瘍を殺す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添う（ｃｈａｐｅｒｏｎ）能力を有するタンパク質を発現し、腫瘍細胞中で選択的に複製して腫瘍細胞を殺す、オンコリティック微生物。
【請求項２】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添う能力を有する前記タンパク質が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）またはその改変体である、請求項１に記載のオンコリティック微生物。
【請求項３】
前記ＨＳＰが哺乳動物または微生物由来である、請求項２に記載のオンコリティック微生物。
【請求項４】
前記ＨＳＰがヒト起源であり、前記ヒトＨＳＰがＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９４、Ｈｓｐ９６、または他のＨＳＰを含む、請求項３に記載のオンコリティック微生物。
【請求項５】
前記ＨＳＰがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含む病原体起源である、請求項３に記載のオンコリティック微生物。
【請求項６】
前記オンコリティック微生物がオンコリティックウイルスである、請求項１に記載のオンコリティック微生物。
【請求項７】
前記オンコリティック微生物がオンコリティックウイルスである、請求項２に記載のオンコリティック微生物。
【請求項８】
前記オンコリティックウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ベシクロウイルス属、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス属および腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他のオンコリティックウイルスを含む、請求項６または７に記載のオンコリティック微生物。
【請求項９】
前記オンコリティックウイルスがアデノウイルスである、請求項８に記載のオンコリティック微生物。
【請求項１０】
前記オンコリティックウイルスがＨＳＶである、請求項８に記載のオンコリティック微生物。
【請求項１１】
前記オンコリティック微生物が細菌である、請求項１または２に記載のオンコリティック微生物。
【請求項１２】
前記細菌が、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、赤痢菌属、リステリア属、エルジニア属、およびクロストリジウム属を含む、腫瘍細胞中で選択的に複製し得る細菌である、請求項１１に記載のオンコリティック微生物。
【請求項１３】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む該ベクターで形質転換されたＡＰＣであって、前記ベクターが免疫増強分子をコードするＤＮＡ配列も同様に含み得る、ＡＰＣ。
【請求項１４】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得る前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＳＰまたはその改変体である、請求項１３に記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
以下を含む微生物組成物：
ａ）腫瘍細胞中で選択的に複製し、そして腫瘍細胞を選択的に溶解し得るオンコリティック微生物；および
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得るタンパク質およびそのフラグメントを発現し得るベクター；
ここで、該オンコリティック微生物が免疫増強分子をコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。
【請求項１６】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得る前記タンパク質およびそのフラグメントが、ＨＳＰまたはその改変体である、請求項１５に記載の微生物組成物。
【請求項１７】
前記オンコリティック微生物がオンコリティックウイルスまたはオンコリティック細菌である、請求項１５または１６に記載の微生物組成物。
【請求項１８】
前記オンコリティックウイルスが、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベシクロウイルス属、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス属および腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他のオンコリティックウイルスを含む、請求項１７に記載の微生物組成物。
【請求項１９】
前記オンコリティック細菌が、腫瘍細胞中で選択的に複製し得る、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、赤痢菌属、リステリア属、エルジニア属、およびクロストリジウム属を含む、請求項１７に記載の微生物組成物。
【請求項２０】
前記ベクターが、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドである、請求項１５に記載の微生物組成物。
【請求項２１】
前記ベクターが複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ベクターである、請求項１５に記載の微生物組成物。
【請求項２２】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得る前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＳＰまたはその改変体である、請求項２０または２１に記載の微生物組成物。
【請求項２３】
主に以下を含む薬学的組成物：
ａ）腫瘍細胞中で選択的に増殖し得るオンコリティック微生物；
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得るタンパク質またはそのフラグメント；および必要に応じて
ｃ）免疫増強因子がオンコリティック微生物によって発現され得る、免疫増強因子、免疫学的アジュバント、または薬学的担体。
【請求項２４】
前記微生物が、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベシクロウイルス属、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス属および腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他のオンコリティックウイルスを含む、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記微生物が、腫瘍細胞中で選択的に複製し得る、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、赤痢菌属、リステリア属、エルジニア属、およびクロストリジウム属を含むオンコリティック細菌である、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得る前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＳＰまたはその改変体である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオンコリティック微生物；請求項１３もしくは１４に記載のＡＰＣ；請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の微生物組成物；または請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を含む、癌免疫療法剤。
【請求項２８】
免疫増強因子、免疫学的アジュバント、または薬学的担体をさらに含む、請求項２７に記載の癌免疫療法剤。
【請求項２９】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターで、腫瘍患者のＡＰＣをトランスフェクションすることを包含する、腫瘍治療方法。
【請求項３０】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原性ペプチドに付き添い得る前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＳＰまたはその改変体である、請求項２９に記載の腫瘍治療方法。
【請求項３１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオンコリティック微生物；請求項１３もしくは１４に記載のＡＰＣ；請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の微生物組成物；請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物；または請求項２７もしくは請求項２８に記載の免疫療法剤の癌患者への投与を包含する、腫瘍治療方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が良性および悪性腫瘍を含む、請求項２９〜３１に記載の腫瘍治療方法。
【請求項３３】
前記悪性腫瘍が、黒色腫、乳、前立腺、肝細胞、肺、鼻咽喉、結腸、卵巣、頚部腫瘍、およびリンパ腫を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与が、腫瘍内、筋肉内、静脈内、もしくは腹腔内注射、または経口もしくは直腸投与を介して行われる、請求項３２に記載の治療方法。
【請求項３５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオンコリティック微生物；請求項１３もしくは１４に記載のＡＰＣ；請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の微生物組成物；請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の薬学的組成物；または請求項２７もしくは請求項２８に記載の免疫療法剤の抗腫瘍医薬の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、生物医学における腫瘍免疫療法の分野に関する。具体的には、本発明は、腫瘍治療の新規方法、すなわち、癌患者自身の腫瘍抗原を使用することにより癌患者自身の局所性および転移性腫瘍に対する抗腫瘍応答を誘導することに関する。本発明はまた、ある種のオンコリティック微生物、オンコリティック微生物を含む組成物、および腫瘍治療もしくは抗腫瘍薬物を製造するための薬学的製剤におけるオンコリティック微生物または組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
現在のところ、ルーチンの腫瘍治療は、伝統的な手術、放射線療法および化学療法であり、これらの全てが癌患者に非常に大きな痛みおよび負荷をもたらす。さらに、転移を有する患者においては、手術によって腫瘍を完全に除去すること、または放射線療法もしくは化学療法によって全ての腫瘍細胞を殺すことはまれである。局所性腫瘍の切除は、患者の身体の他の部分における癌転移の危険を増加させ、そして腫瘍の蔓延を加速させる。
【０００３】
遺伝的特徴を変化させることを介して、いくつかのウイルスが、選択的に癌細胞に感染するように変更されてきた。いくつかの例は、ＨＳＶ−１およびＧ２０７のような１型単純ヘルペスウイルス；ＯＮＹＸ−０１５（すなわち、ｄｌ１５２０）、ＣＮ７０６およびＣＮ７８７のようなアデノウイルス；７３−Ｔのようなニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）；ベシクロウイルス属；およびレオリシン（ｒｅｏｌｙｓｉｎ）のようなレオウイルス属である[1-3]。これらのウイルスのうちのいくつかは、有意な抗腫瘍活性を有し、臨床試験において腫瘍を減少させるかまたは除去する際に比較的効果的であると証明されているが[3]、転移性腫瘍の抑制は明らかに存在していない。理由は、ウイルスは腫瘍細胞に対して直接的に細胞溶解性であり得、それによって腫瘍寛解に寄与するが、ヒト患者における腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答が特徴的に存在していない[4]。ＣＴＬ免疫応答の非存在は発生する。なぜなら、壊死後の少量を除いてほとんどの腫瘍抗原は腫瘍細胞中に存在し、めったに放出されないからである。従って、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）による腫瘍抗原の取り込みは非効率的である。ウイルスの存在は、「危険シグナル」を送達することによって、そして腫瘍細胞のウイルス媒介性破壊後にＡＰＣに対する腫瘍抗原の提示を増強することによって腫瘍特異的免疫を引き起こし得るが、免疫応答は非常に制限され、そしてさらなる機構が抗腫瘍免疫応答をさらに増強するために必要とされる。
【０００４】
癌ワクチン接種手法は、アジュバントまたはサイトカインと組み合わせて送達される殺された腫瘍細胞または溶解物の使用に焦点を合わせている。癌ワクチン接種が腫瘍に対する免疫応答を誘導し得ることは、癌治療研究における非常に大きな進歩を示す。しかし、多数の場合において、腫瘍抗原は弱い免疫原である（すなわち、腫瘍抗原に対する免疫応答は、免疫を付与するのに十分な規模ではない）。現在のところ、主な癌ワクチン接種としては、単離された腫瘍特異的抗原を用いる免疫化、またはインビボでの腫瘍細胞と樹状細胞との融合を用いる細胞療法が挙げられる。しかし、異なる腫瘍抗原が異なる癌患者において出現し、そして同一の患者における異なる腫瘍によって発現される抗原においてでさえバリエーションがみられる。さらに、腫瘍発生の特定の段階において、同一の患者の腫瘍細胞において異なる腫瘍抗原が存在し得る。これらの制限のために、現在の癌ワクチン接種は、多数の欠点を有する：多数の種類の腫瘍に対する共通の腫瘍抗原は存在しないので、個々の腫瘍抗原ワクチンは、異なる患者について設計されなければならない。この個々のそして複雑な手順は、混入を防ぐために注意深く行わなければならず、そして非効率的かつ高価である。複雑さ、費用および非効率に起因して、個々の癌ワクチンは、臨床試験において適用することが困難である。
【０００５】
結論としては、従来の手術、放射線療法および化学療法の癌治療は、患者の身体を傷つけ、そして転移性腫瘍を効果的に殺さない。ウイルスベクターを用いる遺伝子治療は、局所性腫瘍についてのみ有効である。インターロイキンおよびインターフェロンを用いる受動的な免疫療法は、免疫調節（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）応答を刺激するが、腫瘍特異的ＣＴＬ応答は、特徴として存在していない。新規な個々の「癌ワクチン」は高価であり、そしてまだ実用的でない。従って、現在まで、高い効率、低い毒性、および簡便な投与手段を有する抗腫瘍薬物は存在していない。本発明者らは、局所性および転移性腫瘍の両方に対して効率的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得るようなシステムを提案する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の目的は、局所性および転移性腫瘍に対する身体の免疫応答を誘発するように個々の患者の腫瘍抗原を使用するために、腫瘍免疫療法の新規な方法を提供することである。
【０００７】
目的を達成するために、本発明はある種のオンコリティック微生物を提供し、これは、腫瘍細胞において特異的に増殖および複製し得、そして腫瘍細胞の抗原に付き添うタンパク質を発現し得る。以下において、このタンパク質は、「抗原シャペロン」と名付けられ得る。
目的を達成するために、本発明はある種のＡＰＣを提供し、これは、抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされる。
【０００８】
目的を達成するために、本発明はある種の微生物組成物を提供し、これは以下を含む：
ａ）腫瘍細胞中で特異的に複製し、そして腫瘍細胞を選択的に溶解し得るオンコリティック微生物；および
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントを発現し得るベクター；
ここで、オンコリティック微生物が免疫機能を増強し得る分子をコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。
【０００９】
目的を達成するために、本発明はある種の薬学的組成物を提供し、これは主に以下を含む：
ａ）腫瘍細胞中で選択的に複製し得るオンコリティック微生物；
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメント；および
ｃ）必要に応じて、免疫増強因子がオンコリティック微生物によって発現され得る、免疫増強因子、免疫学的アジュバント、または薬学的担体。
【００１０】
目的を達成するために、本発明はある種の癌免疫療法剤を提供し、これは上記のオンコリティック微生物、またはＡＰＣ、または微生物組成物、または薬学的組成物を含む。
【００１１】
目的を達成するために、本発明は新規な腫瘍治療方法を提供し、ここで、ＡＰＣは、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされる。
【００１２】
目的を達成するために、本発明は腫瘍治療方法を提供し、これは免疫有効量の上記オンコリティック微生物、またはＡＰＣ、または微生物組成物、または薬学的組成物、または免疫療法剤を癌患者に投与することを包含する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、免疫有効量の抗原シャペロンを有するオンコリティック微生物が癌患者に投与される。具体的には、抗原シャペロンを有するオンコリティック微生物は、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントを発現する組換えオンコリティック微生物；またはオンコリティック微生物および前記抗原シャペロンもしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡプラスミド；またはオンコリティック微生物および上記の抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む複製不能ベクターである。オンコリティック微生物は、腫瘍細胞中で特異的に増殖および複製し得るオンコリティックウイルスまたは細菌である。これらの種類のオンコリティック微生物は、迅速な複製によって腫瘍細胞を溶解しそして殺し得る。その後、予めマスクされた腫瘍抗原が放出され、そして「危険」シグナルが免疫系に与えられる。同時に発現された抗原シャペロンは、放出された腫瘍抗原を捕獲し、そしてこれらをＡＰＣに移行させ得、これは局所性および転移性腫瘍に対する免疫応答を誘導する。同時に発現された抗原シャペロンおよび放出された腫瘍抗原によって形成された複合体はまたＡＰＣを刺激し得、患者の免疫系を活性化し、次いで局所性および転移性腫瘍を減少または除去する。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされたＡＰＣが適用される。抗原シャペロンは、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質である。抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするベクターを含むＡＰＣは抗原に対してより感受性であり、そしてＡＰＣによって発現される抗原シャペロンは抗原を捕獲し、そしてそれをＡＰＣに移行させ得る。このようにして、強化された免疫シグナルは、局所性および転移性腫瘍に対する免疫応答を刺激する。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施形態において、腫瘍細胞において選択的に複製しそして上記抗原シャペロンまたはその改変体を発現するオンコリティック微生物の組成物が、癌患者に投与される。オンコリティック微生物は腫瘍細胞中で迅速に複製し、腫瘍抗原が放出されるように腫瘍細胞を溶解し、殺す。一方、同時に投与される抗原シャペロンはＡＰＣとの親和性を有し、これにより抗原シャペロンはＡＰＣの周りでアセンブリし、そして危険シグナルを強化し、局所性および転移性腫瘍に対する免疫応答を誘導するためにＡＰＣ成熟を増加させる。
【００１６】
本発明のオンコリティック微生物は、好ましくは、腫瘍細胞中で選択的に複製するオンコリティックウイルスおよび細菌である。オンコリティック微生物のいくつかの例は、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＮＤＶ、ベシクロウイルス属、レオウイルス属および腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他のオンコリティックウイルスである。オンコリティック細菌のいくつかの例は、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、赤痢菌属、リステリア属、エルジニア属、およびクロストリジウム属[21]であり、これらは腫瘍細胞中で選択的に複製し得る。
【００１７】
ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得る抗原シャペロンは、好ましくは熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であり、これは哺乳動物または微生物由来である。哺乳動物種としては、ヒト、非ヒト霊長類およびげっ歯類が挙げられるがこれらに限定されない。微生物としては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。抗原シャペロン遺伝子を有するオンコリティック微生物は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）またはケモカインおよび免疫同時刺激分子（例えば、Ｂ７）などのような免疫増強因子をコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。
【００１８】
本発明において、オンコリティック微生物、ＡＰＣ、オンコリティック微生物の組成物、薬学的組成物、および免疫療法剤は単独でか、またはサイトカイン、免疫学的アジュバント、および中国の伝統的な医薬のような他の免疫調節因子と組み合わせて適用され得る。
【００１９】
本発明のオンコリティック微生物、その組成物または薬学的組成物が、以下の種類のアプローチの１つ以上によって転移性腫瘍を殺すことは、妥当であると思われる：Ａ）オンコリティック微生物は、腫瘍細胞中で特異的に複製および増殖し得、次いで細胞を溶解して腫瘍細胞抗原を放出する。同時に発現されたＨＳＰは放出された腫瘍抗原に付き添い、これによってＡＰＣ（主に患者自身の樹状細胞）の成熟化を誘導し、次いで免疫効果（ｅｆｆｅｃｔ）細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、ＣＴＬおよびＴヘルパー細胞）を活性化する。Ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質は、ＡＰＣとの親和性を有し、これにより抗原シャペロンはＡＰＣの周りでアセンブリし、危険シグナルを強化し、そして局所性および転移性腫瘍に対する免疫応答を誘導するためにＡＰＣ成熟を増加させる。Ｃ）抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされたＡＰＣは、放出された抗原に対してより感受性であり、そしてＡＰＣによって発現された抗原シャペロンは抗原を捕獲し得、そしてそれをＡＰＣに移行し得る。この強化された免疫シグナルは、局所性および転移性腫瘍に対する免疫応答を刺激する。
【００２０】
本発明の主要な利点は、腫瘍抗原における個々の差異に起因する「癌ワクチン」の主要な欠点を克服することである。これらの欠点は、患者の自己腫瘍細胞が前もって単離され、培養され、そしてインビトロで連続的に処理されなければならないという事実を含む。本発明は、患者自身のＡＰＣに対する各癌患者の腫瘍細胞の抗原にリアルタイムで簡便かつ効率的に付き添い得、そしてどの発生段階であるかに関わらず、またはどの種類の抗原が存在するかに関わらず、免疫応答を誘導し得る。すなわち、腫瘍患者自身の所有するＡＰＣを介して、特定の腫瘍抗原が提示され、そしてタイミングよくかつ劇的に処理され、このようにして特定の腫瘍抗原に対する特異的免疫応答を誘導する。例えば、本発明によって提供されるオンコリティック微生物は腫瘍細胞を溶解し得るが、同時に、オンコリティック微生物によって発現されるＨＳＰは、ＡＰＣに対する放出された腫瘍抗原に付き添う。次いでこれらのＡＰＣは、ＣＴＬ（これは腫瘍細胞を特異的に殺す）；Ｔヘルパー細胞；およびナチュラルキラー細胞を含む細胞を介して免疫効果を誘導する。活性化された免疫応答は、局所性腫瘍の細胞を溶解するだけでなく、転移性腫瘍を阻害または殺しさえする。オンコリティックウイルスのみを使用する腫瘍治療（これは局所的腫瘍のみを処置し得る）と比較して、本発明の方法は、局所性腫瘍だけでなく転移性腫瘍もまた処置し得、このようにしてオンコリティックウイルスのみを使用する腫瘍治療の制限を克服する。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明の文脈において使用される用語は、当該分野で公知の一般的な意味を有する。明確化のために、本発明において使用される特定の用語は、以下のように定義される。
【００２２】
用語「オンコリティック微生物」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞に侵入し得、そして腫瘍細胞中で選択的に複製しそして腫瘍細胞を破壊し得る微生物として定義される。このような微生物の例としては、オンコリティックウイルスおよびオンコリティック細菌が挙げられる。
【００２３】
用語「オンコリティックウイルス」は、本明細書中で使用される場合、変異を有するかまたは有さないｐ５３および他のタンパク質に関わらず、腫瘍細胞中で複製し得、そして腫瘍細胞を破壊し得るウイルスとして定義される。オンコリティックウイルスの例としては、複製可能ＨＳＶ−１、ＯＮＹＸ−０１５のようなアデノウイルス、ＮＤＶ、ベシクロウイルス属が挙げられる。
【００２４】
用語「オンコリティック細菌」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞中で複製し得、そして腫瘍細胞を破壊し得る操作された細菌として定義される。いくつかの細菌株は、遺伝子治療ベクターとして適用され得る[20]。例えば、サルモネラ属におけるｐｕｒまたはａｒｏＡの遺伝子が変異体である場合、この細菌はこれらの遺伝子の生成物（これらは生存に不可欠である）を合成し得ない。正常な細胞において、これらの物質は存在しないが、腫瘍細胞の変更された遺伝子特徴は、これらの物質の存在を生じ得る。従って、これらの依存性（「栄養要求性」）細菌株は正常な細胞中で生存することはできないが、腫瘍細胞中で選択的に複製し得、そして腫瘍細胞を溶解し得る。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＹＳ７２（ｐｕｒ−）が腫瘍を有するマウスに腹膜内接種された２日後、正常肝細胞と比較した腫瘍細胞中に存在する細菌の比は、９０００：１であった[20]。ＨＳＰ遺伝子は本発明における栄養要求性細菌株に導入され、このようにして、細菌は、それらの腫瘍細胞中で栄える能力に起因してオンコリティック細菌として機能し得、そして腫瘍細菌が溶解するのを引き起こし得る。
【００２５】
用語「抗原シャペロン」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質−抗原複合体を形成するために腫瘍特異的抗原を捕獲、接着または結合し得、次いで樹状細胞のようなＡＰＣに対する抗原に付き添い得る、ある種のタンパク質として定義される。抗原は、免疫応答を誘導するように処理され（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）そして提示される。このタンパク質の例としては、熱ショックタンパク質のような分子性シャペロンタンパク質が挙げられる。
【００２６】
用語「複製不能ベクター」は、本明細書中で使用される場合、複製する能力はないが、依然として外来タンパク質を発現し得る微生物（例えば、ウイルス）として定義される。
【００２７】
用語「熱ショックタンパク質」は、本明細書中で使用される場合、ＡＴＰａｓｅ活性を有する高度に保存された分子のファミリーとして定義される。これらは、全ての原核生物および真核生物細胞のほとんどの区画において見出される。ＨＳＰ発現は、ストレスおよび非ストレス条件下の両方でのタンパク質代謝における必須の役割（新規な（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質のフォールディングおよび膜トランスロケーションおよび誤って折り畳まれた（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）発現構築物の分解における関与を含む）を果たす。ＨＳＰタンパク質調製物（腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に由来するｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０およびｇｐ９４／ｇｐ９６を含む）は、細胞性免疫を誘発し得る。
【００２８】
用語「熱ショックタンパク質の改変体」は、本明細書中で使用される場合、１つもしくはいくつかのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換を含むがこれらに限定されない熱タンパク質のフラグメントまたは修飾物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、あるいは外来ペプチドと組み合わせた融合タンパク質として定義される。これらの種類の修飾は、ＨＳＰの抗原に付き添う能力を増強し得る。標的局在化配列（例えば、シグナルペプチドまたは核局在化配列）は、細胞中のＨＳＰの分布を変更するためにＨＳＰ配列に結合され得る。例えば、非分泌性ＨＳＰは分泌性ＨＳＰに変化され得、これは、抗原ペプチドを効率的に結合するように細胞の外側で機能し得る。
【００２９】
用語「熱ショックタンパク質を発現するプラスミド」は、本明細書中で使用される場合、インビボでＨＳＰまたはその改変体を発現し得るプラスミドＤＮＡとして定義される。ＤＮＡ発現配列は、プラスミドのプロモーター、ポリアデニル化およびエンハンサー配列に適切なコンテクストで配置される。
【００３０】
用語「抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む複製不能ベクター」は、本明細書中で使用される場合、複製する能力を有さないが、依然として外来タンパク質を発現し得る微生物（例えば、ウイルス）として定義される。
【００３１】
用語「アジュバント」は、本明細書中で使用される場合、抗原と組み合わせた場合に免疫を増強し得るか、または抗原自体として作用し得る物質として定義される。
【００３２】
用語「抗原」は、本明細書中で使用される場合、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答としては、抗体産生、特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化、またはその両方が挙げられ得る。抗原は、生物体、タンパク質/抗原のサブユニット、あるいは殺されたかもしくは不活化された全細胞または溶解物に由来し得る。
【００３３】
用語「癌」は、本明細書中で使用される場合、他の細胞に侵入する悪性の細胞性新生物（腫瘍）として定義される。例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌および肺癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
用語「癌ワクチン」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞と接触する腫瘍特異的分子または免疫細胞として定義される。腫瘍細胞によって発現され、腫瘍細胞を免疫原性にするタンパク質は、腫瘍特異的抗原である。抗原タンパク質またはエピトープはインビトロで調製され、または免疫細胞は、免疫細胞に抗原を認識させるために腫瘍細胞と共にインキュベートされ得る。上記のタンパク質またはペプチドまたは免疫細胞は、治療用癌ワクチンとして応用され得る。
【００３５】
用語「腫瘍細胞を殺す/殺すこと」または「腫瘍細胞を破壊する/破壊すること」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍の増加、濾過および転移が効率的に阻害されるかもしくは分解される、または腫瘍が良性腫瘍に変化する、プロセスあるいは結果として定義される。
【００３６】
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳として定義される。
【００３７】
用語「主要組織適合遺伝子複合体」、すなわち「ＭＨＣ」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の特定のクラスターとして定義され、そのうちの多数が、抗原提示に関与する細胞表面タンパク質をコードする。これらのうちで、組織適合性を決定するための２つの型が存在する。一方は、クラスＩ  ＭＨＣ（すなわちＭＨＣ−Ｉ）であり、ＣＤ８  Ｔリンパ球に対する抗原提示において主に機能する。他方は、クラスＩＩ  ＭＨＣ（すなわちＭＨＣ−ＩＩ）であり、ＣＤ４  Ｔリンパ球に対する抗原提示において主に機能する。
【００３８】
用語「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、特定のヌクレオチド配列の転写を調節するヌクレオチド配列の領域として定義される。用語プロモーターは、エンハンサー、サイレンサー、および他のシス作用性調節エレメントを含む。
【００３９】
用語「Ｔ細胞」は、本明細書中で使用される場合、種々の細胞媒介性免疫反応に関与する胸腺由来の細胞として定義される。
【００４０】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、本明細書中で使用される場合、その機能が抗原を処理しそしてＴ細胞およびＢ細胞（樹状細胞およびマクロファージを含む）に抗原を提示することである、ある種の細胞として定義される。
【００４１】
用語「免疫増強因子」は、本明細書中で使用される場合、免疫を増強し得る分子として定義される。例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）；ケモカインおよび免疫同時刺激分子（例えば、Ｂ７）などが挙げられる。
【００４２】
用語「免疫有効量」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍細胞を抑制または殺すために十分な免疫応答を誘導し得る薬学的用量として定義される。
【００４３】
本発明において、本発明者らの手法は、個々の腫瘍ワクチンの調製の必要なしで、インビボで腫瘍免疫療法を達成するためにまたは患者の個体特異的腫瘍抗原の知識を進めるために、自己腫瘍抗原およびＡＰＣを使用することである。
【００４４】
本発明の目的を達成するために、本発明者らは、特定の抗腫瘍免疫応答を誘導し得る抗原シャペロン遺伝子をオンコリティック微生物に提供する。オンコリティック微生物が患者腫瘍に適用される場合、これは、腫瘍細胞を溶解し得、ならびに腫瘍転移を抑制しそして殺す免疫応答を誘導するためにＡＰＣを刺激し得る。
【００４５】
１つの特定の実施形態において、本発明は、抗原シャペロンを発現し得る組換えオンコリティック微生物を提供し、これは、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得る。このオンコリティック微生物は腫瘍細胞に侵入し得、そして正常細胞中ではなく腫瘍細胞中で複製し得、一方また、ＡＰＣに対する腫瘍抗原に付き添い得る抗原シャペロンを発現する。オンコリティック微生物は、豊富に複製し、そして腫瘍細胞の溶解を引き起こすので、多数の抗原が放出される。これらの種類の抗原は、オンコリティック微生物によって発現される抗原シャペロンと結合し、抗原−タンパク質複合体を形成する。この複合体は、ＡＰＣによってさらに認識され得、これは抗原を処理し、そしてこれらを特定のＣＴＬに提示し、ならびに免疫応答を調節し得るヘルパーＴ細胞を活性化し、そして免疫を増強するためにナチュラルキラー細胞を活性化する。
【００４６】
本発明の別の特定の実施形態において、オンコリティック微生物は、腫瘍細胞の抗原に付き添い得る抗原シャペロン、または本発明の目的を達成するために抗原シャペロンを発現し得るベクターと組み合わせて適用される。微生物は、腫瘍細胞中で選択的に複製しそして腫瘍細胞を溶解して、腫瘍細胞抗原を放出し得る。これらの腫瘍細胞抗原は、抗原シャペロンによって結合され、タンパク質−抗原複合体を形成し得、次いで樹状細胞のようなＡＰＣに付き添われ、これは、ナチュラルキラー細胞、ＣＴＬおよびヘルパーＴ細胞のような免疫効果細胞をさらに活性化し、特異的免疫応答を刺激する。一方、抗原シャペロンは、ＡＰＣとの親和性を有し、このようにして、抗原シャペロンはＡＰＣのまわりにアセンブリし、そして危険シグナルを強化する。これは、ＡＰＣ成熟を増加し、腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導する。
【００４７】
本発明の別の特定の実施形態において、抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされたＡＰＣが適用される。本発明の目的はまた、インビトロでのＡＰＣのトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＡＰＣの患者への適用によって達成され得る。トランスフェクトされたＡＰＣは、放出された抗原に対してより感受性である。ＡＰＣによって発現された抗原シャペロンは、ＡＰＣに対する抗原に付き添い得、そして腫瘍に対する特異的免疫を活性化するために免疫シグナルをさらに強化し得る。
【００４８】
要約すると、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得る抗原シャペロンまたはそのフラグメントを発現し得るオンコリティック微生物に加えて、本発明は、以下の組成物を含むがこれらに限定されない；
１つの組成物は、以下を含む：
ａ）腫瘍細胞中で特異的に複製し、そして溶解し得るオンコリティック微生物；および
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメントを発現し得るベクター。
【００４９】
別の組成物は以下を含む：
ａ）腫瘍細胞中で選択的に複製し得るオンコリティック微生物；および
ｂ）上記抗原シャペロンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む複製不能ベクター。
【００５０】
別の組成物は以下を含む：
ａ）腫瘍細胞中で選択的に複製し得るオンコリティック微生物；および
ｂ）ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質またはそのフラグメント。
【００５１】
微生物は、免疫増強因子（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）；ケモカインおよび免疫同時刺激分子（例えば、Ｂ７）など）をコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。本発明の微生物または微生物組成物は、単独で、またはサイトカイン、アジュバント、および中国の伝統的な医薬のような他の種類の免疫療法剤と組み合わせて適用され得る。この微生物組成物は、薬学的担体をさらに含み得る。
【００５２】
本発明の「抗原シャペロン」または「抗原提示細胞に対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質」は、ＡＰＣとの親和性を有するタンパク質（例えば、ＨＳＰが例である、分子シャペロン）である。ＨＳＰは、腫瘍特異的抗原に結合してタンパク質−抗原複合体を形成し得、次いで樹状細胞のようなＡＰＣに対する抗原に付き添い得る。この抗原は処理され(processed)、そしてＡＰＣに提示され、次いでそれはナチュラルキラー細胞、ＣＴＬおよびヘルパーＴ細胞のような免疫効果細胞をさらに活性化し、特定の免疫応答を刺激する。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明者らは、インサイチュで局所性腫瘍を感染させるためにＨＳＰを発現する微生物を使用した。腫瘍抗原と組み合わせた局所性腫瘍中に発現されたＨＳＰは癌ワクチンとして作用し、次いで免疫調節効果を誘発することが見出されている。ＨＳＰの局所発現は、免疫応答の抗腫瘍活性を有意に増強し得る。結果として、局所腫瘍は殺されるかまたは破壊されるが、患者における転移性腫瘍もまた有意に抑制される。
【００５４】
熱ショックタンパク質は、ＡＴＰａｓｅ活性を有する高度に保存された分子のファミリーである。これらは、全ての原核生物および真核生物細胞のほとんどの区画において見出される。ＨＳＰ発現は、ストレスおよび非ストレス条件下の両方でのタンパク質代謝において必須の役割（新規な（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質の折り畳みおよび膜トランスロケーションおよび誤って折り畳まれた（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）発現構築物の分解における機能を含む）を果たす[5]。ＨＳＰタンパク質（腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に由来するｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０およびｇｐ９４／ｇｐ９６を含む）は、細胞性免疫を誘発し得る[6-7]。ＨＳＰは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍを含む病原体微生物；ならびに霊長類、げっ歯類などのような他の種に由来し得る。
【００５５】
ＨＳＰタンパク質の免疫原性は、ＨＳＰ発現構築物に結合したペプチドに起因する[8]。ＨＳＰおよび抗原性ポリペプチドで形成された複合体は、内因性抗原を発現しない特定の細胞を活性化する。次いで、活性化された特定の細胞は、Ｔリンパ球に対する抗原を提示し、これにより、腫瘍患者の免疫系を刺激する。これらの結果は、ＨＳＰがＡＰＣ（主に樹状細胞）に対する抗原性ポリペプチドに付き添い、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子に負荷するためにペプチドがＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路に入るのを潜在的に可能にし、ここで、抗原性ポリペプチドは、特異的免疫応答を誘導するために細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞およびヘルパーＴ細胞をさらに活性化し得る。
【００５６】
ＨＳＰまたはそのフラグメントもしくは改変体が抗原に結合し得るという条件で、全ての種類のＨＳＰもしくはそのフラグメント、または修飾（１つまたはいくつかのアミノ酸の付加、欠失または置換を含むがこれらに限定されない）によって得られた全ての種類の改変体は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明を実施するために適用される。
【００５７】
本発明の特定の実施形態において、ＨＳＰの抗原に付き添い得る能力を強化するために、１つまたはいくつかのアミノ酸の付加、欠失または置換のような修飾、および外来のペプチドと組み合わせた融合タンパク質が導入され得る。ＨＳＰ配列は、細胞中のＨＳＰの分布を変更するためにシグナルペプチドまたは核局在化配列のような標的局在化配列のコンテクストにおいて配置され得る。例えば、非分泌性ＨＳＰは、分泌性ＨＳＰに変化され得、これは、抗原ペプチドと効率的に結合するために細胞の外側で分布し得る。
【００５８】
本発明のオンコリティック微生物は、好ましくは、腫瘍細胞中で選択的に複製する天然または遺伝子改変されたオンコリティックウイルスおよび細菌である。オンコリティックウイルスのいくつかの例は、ＨＳＶ−１およびＧ２０７のようなＨＳＶ；ＯＮＹＸ−０１５（すなわち、ｄｌ１５２０）、ＣＮ７０６およびＣＮ７８７のようなアデノウイルス；７３−ＴのようなＮＤＶ；ベシクロウイルス属；レオリシン（ｒｅｏｌｙｓｉｎ）のようなレオウイルス属[1-3]；および腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他のオンコリティックウイルスである。細菌としては、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、赤痢菌属、リステリア属、エルジニア属、およびクロストリジウム属[21]および天然の環境におけるまたは変異による腫瘍細胞中で選択的に複製し得る他の種類の細菌が挙げられる。微生物が腫瘍細胞中で選択的に複製または増殖し得、そして腫瘍細胞の溶解を引き起こし得るという条件で、オンコリティック微生物は、上記ウイルスまたは細菌の改変体を含み得る。
【００５９】
本発明の目的を達成するために、オンコリティック微生物（例えば、ＨＳＶ−１またはｄｌ１５２０）が、ＡＰＣに対する腫瘍細胞の抗原に付き添い得るタンパク質（例えば、ＨＳＰ）をコードする遺伝子と共に適用される。遺伝子がオンコリティック微生物のゲノムに組み込まれているかまたはゲノムから遊離しているかに関わらず、遺伝子が調節配列（例えば、プロモーターおよびターミネーター配列）と正しく連結される場合、ＨＳＰのようなタンパク質をコードする遺伝子が本発明において適用され得ることが当業者に容易に明らかである。例えば、この遺伝子は、オンコリティック微生物中に含まれる他の発現ベクター中に提供され得る。種々の実施形態および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本願において開示される発明に対してなされ得ることもまた明らかである。
【００６０】
好ましい実施形態において、ＨＳＰ７０  Ａｄ−ＨＳＰ／Ｅ１Ａを発現する組換えオンコリティックアデノウイルスが作製された。ＨＳＰ７０遺伝子は、実施例２において記載されるように、ｐ５３欠損腫瘍細胞において選択的に複製し得るｄｌ１５２０[9-14]に組み込まれた。マウス腫瘍モデルにおいて、ＨＳＰ７０  Ａｄ−ＨＳＰ／Ｅ１Ａを発現する組換えアデノウイルスは、強力な抗腫瘍活性を有することが示された（以下の表を参照のこと）。この実験は、組換えアデノウイルスが、腫瘍サイズを効果的に減少させ得るかまたは腫瘍を除去し得ることを示す。ＨＳＰ７０タンパク質またはＨＳＰ７０発現ＤＮＡまたは複製欠損ＨＳＰ７０発現ウイルスとのオンコリティックアデノウイルスの組み合わせ使用の実験結果はまた、以下の表において列挙される。
【００６１】
【表１】
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表は以下を示す：
グループ１：Ａｄ−Ｈｓｐ／Ｅ１Ａ、本発明のＨＳＰ７０を発現する組換えオンコリティックアデノウイルス
グループ２：オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ΔＥ１ＢおよびＨｓｐ７０発現ベクタープラスミドＤＮＡの組成物
グループ３：オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ΔＥ１ＢおよびＨｓｐ７０を発現する複製欠損アデノウイルスの組み合わせ
グループ４：オンコリティックアデノウイルスＡｄ−ΔＥ１ＢおよびＨｓｐ７０タンパク質の組み合わせ
「ＣＴ２６／Ｂａｌｂ／ｃ」は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴ２６結腸癌モデルを示す。
「ＴＲＡＭＰ−ｃ２／ｃ５７」は、Ｃ５７マウスにおけるＴＲＡＭＰ−ｃ２前立腺癌モデルを示す。
「Ｂ１６／ｃ５７」は、Ｃ５７マウスにおけるＢ１６黒色腫モデルを示す。
【００６２】
腫瘍細胞（２×１０5）をマウスの両側の側腹（右側および左側）に皮下注射した。これらのマウスは、転移性腫瘍に罹患する動物モデルとみなす。皮下腫瘍が明らかに増殖したとき（腫瘍接種後約８〜１０日）、各動物は、約２×１０9ＰＦＵのＡｄ−Ｈｓｐ／Ｅ１Ａ；または約２×１０9ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１ＢおよびＨｓｐ７０発現ベクターＤＮＡ（５０μｇ）を含む組成物；または２×１０9ＰＦＵのオンコリティックウイルスＡｄ−ΔＥ１Ｂおよび約２×１０9ＰＦＵの複製欠損Ａｄ−ＨＳＰ７０の組み合わせ；または約２×１０9ＰＦＵのオンコリティックＡｄ−ΔＥ１Ｂおよび約１０〜２５μｇのＨＳＰ７０を含む組成物の片側の腫瘍内接種（右側の側腹）を受けた。腫瘍サイズは、３〜４日ごとに外部カリパスによって測定した。予備結果を表に示す。「＋」は、処置された腫瘍ならびに対側性の未処置の腫瘍に対する抑制活性を示す結果を表す。「−」は、終了していない実験を表す。
【００６３】
特定の実施形態において、オンコリティックウイルスは、ＨＳＶである。複製可能（ｒｅｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＨＳＶミュータントは、多数の動物モデルにおいて非病原性であることが見出され、原発性ヒト脳腫瘍の処置についての臨床試験に向かって進行している[16]。このミュータントＨＳＶは、結果として細胞死を伴い、分裂細胞において複製するが、非分裂細胞におけるその増殖は、高度に減衰される。マウスにおける確立された腫瘍のＨＳＶでの接種は、腫瘍選択的複製に起因して、局所性腫瘍増殖の抑制および延長された動物生存を導く[15-17]。ＨＳＰ７０をコードするアンプリコンプラスミドは、以下に記載される構築方法のいずれかを使用して、組換えＨＳＶを構築するためにＨＳＶウイルスに導入される。
【００６４】
１つの構築方法：ヒトＨＳＰ７０についてのｃＤＮＡを、ヒトｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲを使用して増幅し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントとともに満たされ、ＤＮＡシーケンスした。次いでＨＳＰ７０  ＤＮＡフラグメントを、ｐＨＳＶプラスミドのＳｐｅＩ部位に挿入して、ベクターｐＨＳＶ−ＨＳＰを作製した。このベクターおよびＨＳＰヘルパーウイルスを、宿主細胞に同時トランスフェクトし、パッケージングし、ＨＳＰタンパク質を発現する組換えＨＳＶウイルスを作製した。組換えＨＳＶの作製についての詳細な手順については実施例１を参照のこと。
【００６５】
別の構築方法：プロモーターの制御下でＨＳＰをコードする遺伝子を含むベクターを構築した。ベクターをＨＳＶアンプリコンにクローニングし、次いで当該分野における従来の手段を使用することによってＨＳＶゲノム中に組み込んだ。ＨＳＶのゲノムに組み込まれたＨＳＰをコードする遺伝子を有する得られた遺伝子組換えＨＳＶは、ＨＳＶヘルパーおよびプラスミドＤＮＡの同時トランスフェクションの必要なしで、処置について直接使用され得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、オンコリティックウイルスはアデノウイルスである。本発明において使用されるアデノウイルスミュータントは腫瘍細胞中で選択的に複製し、そして正常細胞において弱く複製するのみである[10]。このオンコリティックアデノウイルスはマウスにおいて選択的に複製し得、マウスにおける腫瘍異種移植片を抑制し、処置されたマウスの生存を延長する[9-11]。組換えオンコリティックアデノウイルスは、ｐＬＥＰおよびｐＲＥＰツープラスミド系を使用して作製した。ＨＳＰ遺伝子および腫瘍細胞中で複製し得るアデノウイルスに必要であるＡｄ  Ｅ１Ａ遺伝子をｐＬＥＰベクターにクローニングして、ｐＬＥＰ−ＨＳＰ７０−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａを作製した。得られたベクターおよびｐＲＥＰを消化して、そして共に連結し、そしてλファージにパッケージングし、次いでこれをＥ．ｃｏｉｉにトランスフェクトした。次いでＩ−ＣｅｕＩで切断した組換えｐＡｄ−Ｈｓｐ７０／Ｅ１Ａを２９３細胞にトランスフェクトして、ＨＳＰ７０を発現する組換えオンコリティックアデノウイルスを作製した。実施例２における詳細な手順を参照のこと。
【００６７】
好ましい実施形態において、ａｒｏＡ欠損であり腫瘍細胞（これはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのミュータントが増殖するための栄養を提供し得る[19]）中で選択的に増殖するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのミュータントを使用して、ＨＳＰを発現した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍミュータントは、腫瘍細胞中で選択的に増殖し、腫瘍細胞を溶解する。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍによって発現されるＨＳＰタンパク質を、ＡＰＣに対する抗原を提示するために殺された腫瘍細胞から放出する抗原性ペプチドと組み合わせて、ＣＴＬ媒介免疫応答の活性化およびマウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の抑制を導いた。マウスの生存は延長した。詳細については実施例３を参照のこと。
【００６８】
特定の実施形態において、ヒトｈｓｐ７０遺伝子をコードする核酸は、オンコリティックＨＳＶ中のプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入されたか、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要な、ＤＮＡ配列をいう。どのようにしてプロモーターが組織されるかについての見解についての多くは、いくつかのウイルスプロモーターの分析（ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、およびＳＶ４０初期転写ユニットについての分析を含む）に由来する。これらの研究（より最近の研究によって補われる）によって、プロモーターが別々の機能的モジュールから構成され、各々が約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含むことが示されている。さらなるプロモーターエレメント（すなわち、エンハンサー）は、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが近年、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、その結果、エレメントがお互いに反対になるかまたは移動する場合にプロモーター機能が保存される。チミジンキナーゼプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の空間が５０ｂｐまで離れて増加されると、活性が減少し始める。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために協力してかまたは独立してのいずれかで機能し得るようである。
【００６９】
プロモーターは、コード化セグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する５’非コード化配列を単離することによって得られ得るように、遺伝子または配列と天然に関連し得る。このようなプロモーターは、「内因性」として称され得る。同様に、エンハンサーは核酸配列（その配列の下流または上流のいずれかに位置する）と天然に関連し得る。あるいは、特定の利点が、組換えまたは異種プロモーター（これはその天然環境中の核酸配列に通常関連しないプロモーターをいう）の制御下にコード化核酸セグメントを配置することによって得られる。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その天然環境中の核酸配列と通常関連しないエンハンサーをいう。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核生物、ウイルス、または真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在しない」（すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび/または発現を変更する変異を含む）プロモーターまたはエンハンサーが挙げられ得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、組換えクローニングおよび/またはＰＣＲを含む核酸増幅技術を使用して作製され得る。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどのような非核小器官内の配列の転写および/または発現を指向する制御配列も同様に使用され得る。
【００７０】
本明細書中に提示される実験例において例示されるプロモーター配列は、即時型ＣＭＶプロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動し得る強力な構成性プロモーター配列である。しかし、他の構成性プロモーター配列もまた使用され得、これらとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス長末端反復プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即時型プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター（例えば、これらに限定されないが、アクチン、ミオシン、ヘモグロビン、および筋肉クレアチン遺伝子）が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明は構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として意図される。本発明における誘導性プロモーターの使用は、ヌクレオチド配列（これは、このような発現が所望な場合に作動可能に連結している）の発現をオンにし得るか、または発現が所望でない場合に発現をオフにし得る分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）、グルココルチコイド、プロゲステロン、およびテトラサイクリンに応答するプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明は、組織特異的プロモーターの使用を含み、ここでプロモーターは所望の組織においてのみ活性である。組織特異的プロモーターは当該分野で周知であり、ＨＥＲ−２プロモーターおよびＰＳＡ関連プロモーター配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
ＨＳＰの発現については、転写物の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルを代表的に含む。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の首尾よい実施に重要であると考えられておらず、そして任意のこのような配列が使用され得る。好ましい実施形態としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、長末端反復ポリアデニル化シグナル、および/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられ、これらの全てが簡便であり、および/または様々な標的細胞において十分に機能することが公知である。転写終結部位を使用して転写を終結させ得ることがまた意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強するため、および/または他の配列中へのカセットからの読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を最小化するために機能し得る。
【００７２】
本発明において、適切なタンパク質発現のために宿主細胞のゲノム中にオンコリティックウイルスベクターが組み込まれることは必要でないことに注意することは重要である。むしろ、発現ベクターはまた、エピソーム分子の形態で所望の細胞中に存在し得る。例えば、発現ベクターが所望のタンパク質を発現するために複製することは必要でない特定の細胞型が存在する。これらの細胞は、筋肉細胞のように通常複製しない細胞であるが、なお十分に遺伝子発現し得る。発現ベクターは非分裂細胞に導入され得、そして発現ベクターの複製の非存在下でそれによってコードされたタンパク質を発現し得る。
【００７３】
本発明において、患者は、腫瘍細胞抗原に付き添い得るタンパク質、またはこのタンパク質を発現し得るベクター、または局所性および転移性腫瘍に対する特定の免疫応答を刺激するためのタンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトされたＡＰＣと組み合わせたオンコリティック微生物を受容する。この微生物またはオンコリティック微生物を含む組成物は、単独で、またはサイトカインまたは中国の伝統的な医薬のような他の免疫調節剤と組み合わせて適用され得る。実際には、アジュバントまたは免疫増強因子のような免疫モジュレーターが免疫を増強するために適用され得る。多数の研究によって、抗腫瘍免疫応答がサイトカイン発現プラスミドまたはサイトカインの同時投与によって増強され得ることが示された。当業者は、サイトカインについてのヌクレオチド配列およびＨＳＰについてのヌクレオチド配列が１つの発現ベクターに組み込まれ得、これにより２つの別々のベクターの使用を除去することを容易に理解する。さらに、当業者はまた、ＨＳＰの発現レベルを増加させるために、いくつかのコピーのＨＳＰ遺伝子が１つの発現ベクターに組み込まれ得ることを知っている。
【００７４】
適切な場合、オンコリティック微生物、微生物組成物、または薬学的組成物が、免疫療法剤に処方され得る。機能的遺伝子を有するこれらのオンコリティック微生物、オンコリティック微生物組成物、または薬学的組成物は、これらのそれぞれの投与経路について当該分野で公知の様式で固体、半固体、液体または気体形態の調製物に処方され得る。当該分野で公知の手段が、標的器官に達するまで組成物の放出および吸収を妨げるか、または組成物の制御された放出を保証するために使用し得る。本発明の組成物を無効にしない薬学的に許容される形態が使用されるべきである。薬学的な投薬形態において、組成物は、単独でかまたは適切に共同して（ｉｎ  ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、ならびに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用され得る。シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を含む十分な量のウイルスまたは細菌が、薬理学的に有効な量の遺伝子産物を提供するために投与されなければならない。このオンコリティック微生物は、単独で投与され得るかまたは種々のアジュバントと共に処方され得る。
【００７５】
通常、本発明の上記のオンコリティック微生物、微生物組成物、薬学的組成物、または免疫療法剤は、単独で、または当該分野で公知の従来のそして許容される手段のような他の治療剤と組み合わせて、免疫有効量で投与される。免疫有効量は、病気の程度、健康条件、患者の年齢、微生物の効力、および他の因子に依存して変化する。一般的に、当業者は、本発明の知識および開示に従って、腫瘍患者に投与されるべき免疫有効量を容易に決定し得る。
【００７６】
本発明の微生物と組み合わせて使用され得るアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リピド多糖（ＬＰＳ）、リピドＡアナログ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびそのアナログ、エンドトキシン（ＬＴ）ならびにコレラトキシン（ＣＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
本発明の薬学的組成物は、腫瘍内に、経口的に、鼻腔、皮膚および坐剤を介するような全身的に、または筋肉内注射、静脈内注射および皮下注射のような非経口的に投与され得る。当業者に公知の従来の技術に従って、本発明の薬学的組成物または免疫療法剤は、薬学的に許容される担体および/またはビヒクルと共に処方され得る。処方物の非制限的な例としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体（ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ）、顆粒剤、延長された放出用量、溶液、懸濁液、またはエマルジョン、エアゾール剤および他の許容される担体を含む。オンコリティック微生物は、少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて投与される。この薬学的に許容される賦形剤は、微生物の効力および他の活性成分の治療効果を実質的に損ない得ないか、または投与を補助し得る、無害の物質である。この賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル用量中の気体であり得、これらの全てが、当業者に容易に得られる。
【００７８】
固体賦形剤としては、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、サッカロース、グルチン、マルトース、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、スキムミルク粉末などが挙げられるがこれらに限定されない。液体および半固体賦形剤としては、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコールおよび石油、動物、落花生、大豆もしくはゴマ由来のような植物油、またはコンポーズトオイル（composed oil）に由来する油を含む全ての種類の油が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい液体キャリアは、水、食塩水、グルコース溶液、およびジグリコールを含む液体注入に適している。
【００７９】
本発明の薬学的組成物中に含まれる微生物の量は、薬学的形態、単位投薬量、賦形剤の種類、および当業者に公知の他の因子に依存して変化する。さらに、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるか否かに依存して、または薬物動力学、薬物体内動態、および代謝における個々の差異に依存して、変化し得る。さらに細胞当たり添加されるウイルスベクターの量は、ベクター中に挿入された治療遺伝子の長さおよび安定性、ならびに配列の性質と共に変化するようである。ベクターの量は、経験的に決定される必要があり、そして本発明の方法に固有でない因子に起因して変更され得るパラメーターである。当業者は、特定の状態の必要条件に従って任意の必要な調節を容易に行い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
（実施例）
本発明は、実施例によって詳細に記載される。これらの実施例は例示的であり、いかなる様式でも本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００８１】
（実施例１）
（ヒトＨＳＰ７０遺伝子増幅およびクローニング）
ヒトｃＤＮＡを、逆転写ＰＣＲによってＳＫＯＶ３細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）から増幅した。上流プライマーは、ＧＧＴ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＴＣであり、下流プライマーは、ＴＡ  ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧであった。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社からのＰＣＲ機械を使用し、そして反応条件は以下の通りであった：プライマーの最終濃度は、３０ｐＭ、ｄＮＴＰ  １００ｍＭ、鋳型ＤＮＡ  １００ｎｇ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５Ｕであった。他の反応条件は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＤＮＡキットの指示書に従い、ここで各反応容量は１００μｌであった。各反応を、７５μｌミネラルオイルで覆った。９２℃での変性１分間、５０℃でのアニーリング１分間、および７２℃での伸長２分間を含む３０増幅サイクルを使用した。次いでＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して精製した。
【００８２】
（組換えオンコリティックＨＳＶの作製）
本発明者らは、複製可能な変異した１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）[15-18]を使用し、ここで、γ３４．５遺伝子は欠失していた。この変異体ＨＳＶ−１は、細胞死を伴い分裂細胞において複製するが、非分裂細胞におけるその増殖は高度に減衰される[16]。マウスにおける確立された腫瘍のＨＳＶでの接種は、腫瘍選択的複製に起因して、局所性腫瘍増殖の抑制および延長した動物生存を導く[16]。ＨＳＶミュータントを使用してＨＳＰ７０を腫瘍に送達した。ヒトＨＳＰ７０についてのｃＤＮＡをヒトｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅し、そしてＤＮＡシーケンスした。ＰＣＲ増幅したＤＮＡをＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して満たされ、次いでプラスミドｐＨＳＶ（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．およびＢｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｘ．Ｏ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９）のＳｐｅＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをｐＨＳＶ−ＨＳＰと命名する（図１）。γ３４．５遺伝子欠失ＨＳＶをヘルパーとして使用して組換えＨＳＶ−ＨＳＰウイルスを作製した。ｐＨＳＶ−ＨＳＰプラスミドおよびγ３４．５遺伝子欠失ＨＳＶを宿主細胞にトランスフェクトして、組換えＨＳＶ−ＨＳＰウイルスを作製した。ヘルパーウイルスＨＳＶ[17]を用いて、ＨＳＰ７０  Ｐｈｓｖ−ＨＳＰをコードするアンプリコンプラスミドをパッケージングし、これによりＨＳＰ７０を発現する組換えＨＳＶウイルスを生成する。各ウイルス粒子は、高い効率で分裂および非分裂細胞の両方を形質導入し得る約１５コピーのＨＳＰ７０遺伝子を含む。ウイルスＤＮＡは、感染された細胞ゲノムには組み込まれず、ＣＭＶプロモーターはＨＳＰ７０を駆動し、発現は強力であるが一過性である。ｐＨＳＶ−ＨＳＰを配列決定し、そしてそれに関するデータを配列表において提示する。
【００８３】
（組換えＨＳＶ−ＨＳＰのタイタリング）
Ｖｅｒｏ細胞を、製造業者によって記載されるように、ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製されたアンプリコンプラスミドＤＮＡ（ｐＨＳＰ７０）およびＨＳＶウイルスＤＮＡで同時トランスフェクトし、次いで細胞が完全な細胞傷害効果を示すまで３４．５℃で培養した。次いでウイルスをＶｅｒｏ細胞から収集し、そしてヘルパーウイルス複製の阻害が観察されるまでＶｅｒｏ細胞中で１：５の希釈度で継代した。一般的に、５〜６継代が、ヘルパーウイルス複製の阻害を観察するのに必要であった。ＨＳＰ７０含有ＨＳＶウイルスをＨＳＶ−ＨＳＰと称する。組換えウイルスストックを、凍結乾燥/超音波処理レジメンおよび低速遠心分離（２０００×ｇ、４℃で１０分間）による細胞破片の除去後に力価測定した。ＨＳＶ力価を、３４．５℃におけるＶｅｒｏ細胞に対するプラークアッセイ後にＰＦＵの数として表した。ＨＳＶ−ＨＳＰについては、ＨＳＰ７０発現を測定し、そして最も高いレベルの力価を有する継代物を使用した。ウイルス力価はＨＳＶ−ＨＳＰについて約５×１０7ＰＦＵ／ｍｌであり、ヘルパーＨＳＶについて約６×１０7ＰＦＵ／ｍｌであった。
【００８４】
（インビトロでのＨＳＶ−ＨＳＰウイルスのオンコリティック活性）
ＨＳＶ−１は、広範な種々の腫瘍細胞型において複製するが、マウス結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６は、ＨＳＶ感染に対して感受性であることが見出された。この細胞株は、免疫原性が乏しく、そして検出可能な腫瘍特異的ＣＴＬを誘導しない。ＣＴ２６腫瘍はサイトカイン処置に対していくらか無反応性である。ＣＴ２６についての免疫優性ＭＨＣクラスＩ制限抗原は、内因性エコトロピックマウス白血病プロウイルスのエンベロープタンパク質（ｇｐ７０）に由来するノナマータンパク質として同定された。養子免疫伝達（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）研究により、腫瘍特異的ＣＴＬの誘導と確立された皮下ＣＴ２６腫瘍に対する抗腫瘍効果との間の相互関係が確立された。マウス腫瘍細胞ＣＴ２６を２４ウェルプレート（１ウェル当たり１×１０5細胞）中で培養した。次いでＣＴ２６細胞を０．０１〜１０の感染多重度でＨＳＶ−ＨＳＰまたはＨＳＶで感染した。ＣＴ２６細胞のＨＳＶ−ＨＳＰまたはＨＳＶでの感染は、０．１の感染多重度で感染４日後までに細胞の７０％の死を生じる。１の感染多重度でのＨＳＶ−ＨＳＰまたはＨＳＶの感染は、感染４日後までに９９％の細胞傷害性を生じた（図２）。ＨＳＰ７０の発現を放射標識および免疫沈降、次いで培養物中の腫瘍細胞の感染後のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。これらのデータは、ＨＳＰ７０の挿入がＨＳＶ複製および細胞傷害性を減少しないことを示す。
【００８５】
（マウスモデルにおける遠位の腫瘍増殖の抑制）
組み合わせＨＳＶ−ＨＳＰ治療の抗腫瘍効力を、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６腫瘍モデルにおいて評価した。このマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。全ての動物手順は、ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。マウスを３つのグループに分けた；グループ１および２は治療試験用であり、そして第３のグループはコントロール用であった。ＣＴ２６腫瘍細胞（１×１０5）をマウスの両側の側腹に皮下注射した。ＣＴ２６腫瘍細胞の接種を受けたこれらのマウスは、転移性腫瘍に罹患する動物モデルとみなした。皮下腫瘍が明白に増殖したとき（最大直径約５ｍｍ）、グループ１の各動物は、右側の側腹腫瘍中にＨＳＶ−ＨＳＰストック（１×１０6ＰＦＵ）の片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種を続けた。次いでグループ２の各動物は、右側の側腹腫瘍中にＨＳＶ−１ストック（１×１０6ＰＦＵ）の片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種が続いた。ＨＳＶ−１は、ウイルス因子における差異が説明されるようにＨＳＶ−ＨＳＰ接種についてのコントロールとして使用した。ＨＳＰ自体の効果を評価するために、グループ３の各動物は、右側の側腹腫瘍中にＨＳＰの片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種が続いた。腫瘍サイズを、外部カリパスによって測定し、そして腫瘍体積を計算した（Ｖ＝ｈｘｗｘｄ）。動物が死にかけているか、またはそれらの皮下腫瘍の直径が１８ｍｍに達した場合、これらを殺し、そしてこれを生存研究のための死亡の日付として記録した。統計学的差異をＳｔａｔＶｉｅｗ  ４．５（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して計算し、ここで平均腫瘍体積を対応のない２群のｔ検定によって評価した。ＨＳＶ−ＨＳＰでの接種は非常に明らかな抗腫瘍効果を誘導し、接種された腫瘍およびそれらの非接種の対側性対応物の両方は腫瘍増殖における有意な減少を示す（図３）。ＨＳＶ−ＨＳＰの注射の際に、接種された腫瘍だけでなく非接種の対応腫瘍（遠位腫瘍）もまた検出可能でないサイズまで減少した。ＨＳＶのみでの接種が、接種された腫瘍の腫瘍増殖における有意な減少を生じたが、非接種腫瘍においては効果が小さかった（図３）。ＨＳＰで注射したコントロールグループは、ＨＳＰ自体は接種された腫瘍および非接種腫瘍の腫瘍サイズの減少にほとんど影響していないことを示した。これらの結果は、ＨＳＶによるＨＳＰ７０の発現が遠位の腫瘍増殖をブロックするために強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す。
【００８６】
（実施例２）
（組換えアデノウイルスの構築）
組換えアデノウイルスをツープラスミド系、ｐＬＥＰおよびｐＲＥＰ  Ａｄ系によって構築する。
【００８７】
塩基５５９〜２２６２の２型アデノウイルスＥ１領域を、テンプレートとしてアデノウイルスＡｄ１０５５野生型を使用してＰＣＲによって作製した。得られた１７１５ｂｐフラグメントは、５’末端においてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、および３’末端においてＸｈｏＩ部位、ならびに塩基２２５３（Ｃ−Ｔ）および２２６２（Ｇ−Ｔ）における２つの突然変異を含み、それぞれコドン７９および８２の５５ｋＤ  Ｅ１ｂリーディングフレーム中にプレ成熟（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ）翻訳停止コドンを生成した。このＤＮＡフラグメントをＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化して、ＮｈｅＩ/ＸｈｏＩ消化したｐＢＳ−（ＩＲＥＳ）（Ａｌｅｘｅ  Ｖ  Ｇｏｒｄａｄｚｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００１，７５：５８９９−５９１２）中にクローニングして、ｐＢＳ−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａを作製した。ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ  ＤＮＡフラグメントをＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ消化によって切断し、フラグメント（ＩＲＥＳ）−Ｅ１Ａを放出した。ヒトＨＳＰ７０  ｃＤＮＡを実施例１に記載されるようにＳＫＯＶ３のｃＤＮＡから作製した。ＰＣＲによって得られたＤＮＡフラグメントは、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、および３’末端にＳｐｅＩ部位を含んだ。３片のＤＮＡフラグメント：ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ切断ＨＳＰ７０、ＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ切断ＩＲＥＳ−Ｅ１ＡおよびＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＬＥＰを連結して所望のｐＬＥＰ−ＨＳＰ−Ｅ１Ａを作製した（図４）。
【００８８】
次いで得られたｐＬＥＰ−ＨＳＰ−Ｅ１ＡプラスミドをＰｉ−ＰｓｐＩで切断し、１６℃で一晩、Ｐｉ−ＰｓｐＩ切断ｐＲＥＰと共に連結した。連結した生成物を、λファージ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｉｎｃ）でパッケージングし、次いで３７℃で３０分間、ＬＢ中のＥ．ｃｏｌｉ．ＤＫ１またはＤＨ５αと共にインキュベートした。感染したＥ．ｃｏｌｉをアンピシリン/テトラサイクリン寒天プレートにプレートし、そしてコロニーをスクリーニングし、制限酵素分析によって確認して、組換えプラスミドｐＡｄ−Ｈｓｐ７０／Ｅ１Ａを同定した。次いでｐＡｄ−Ｈｓｐ７０／Ｅ１ＡプラスミドをＩ−ＣｅｕＩで切断し、そしてＨＥＢＳ緩衝液（これは２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を含む）に添加し、２９３細胞のトランスフェクションのためのＤＮＡ／Ｃａ3（ＰＯ4）2混合物を形成した。ＣＯ2インキュベーター中での６〜７日間のインキュベーション後、透明なプラークが細胞菌叢上に現れ、組換えアデノウイルスが作製されたことを示す。プレートが透明なプラークで満たされたとき、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離によって収穫した。組換えアデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ／Ｅ１Ａを３回反復した凍結解凍サイクル後に収穫した。組換えアデノウイルス力価は、１０7〜１０8ＰＦＵであった（図５）。
【００８９】
（インビトロ細胞傷害およびインビボ腫瘍抑制）
実施例１に記載されるのと同じ手順を使用して、インビトロにおけるウイルス細胞傷害性およびマウスモデルにおける抗腫瘍活性を試験した。上記の実験結果と一致して、ＨＳＰ７０を発現する組換えアデノウイルスは、遠位腫瘍を抑制するための強力な免疫応答を誘導する能力を有することが示された。
【００９０】
（実施例３）
（ＨＳＰを発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの作製）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ３２６１[19]はａｒｏＡ変異（これは腫瘍細胞の選択的増殖および死を生じる）を含む。なぜなら、正常な細胞ではなく、腫瘍細胞のみが細菌が増殖するための栄養を提供し得るからである。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰを、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ヒトＨＳＰ７０  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングすることによって作製した。ＣＭＶプロモーターによって駆動される発現は強力であるが一過性である。
【００９１】
（抗腫瘍活性）
同系ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してＨＳＰを発現する組換えＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ３２６１の抗腫瘍活性を評価した。マウスを３つのグループに分けた；グループ１および２は治療試験用であり、そして第３のグループはコントロール用であった。ＳＭＭＣ７７２１腫瘍細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）（１×１０5）をマウスの両側の側腹に皮下注射した。ＳＭＭＣ７７２１腫瘍細胞の接種を受けたこれらのマウスは、転移性腫瘍に罹患する動物モデルとみなした。皮下腫瘍が明白に増殖したとき（最大直径約５ｍｍ）、グループ１の各動物は、右側の側腹腫瘍中にｐｃＤＮＡ−ＨＳＰを含む組換えＳＬ３２６１（１×１０7ＰＦＵ）の片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種を続けた。次いでグループ２の各動物は、右側の側腹腫瘍中にＳＬ３２６１（１×１０6ＰＦＵ）の片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種が続いた。グループ２において使用されるＳＬ３２６１は、細菌因子における差異が説明されるように組換えＳＬ３２６１接種についてのコントロールとして使用した。ＨＳＰ自体の効果を評価するために、グループ３の各動物は、右側の側腹腫瘍中にＨＳＰの片側の腫瘍内接種を受け、７日後に第２の接種が続いた。腫瘍サイズを、外部カリパスによって測定し、そして腫瘍体積を計算した（Ｖ＝ｈｘｗｘｄ）。動物が死にかけているか、またはそれらの皮下腫瘍の直径が１８ｍｍに達した場合、これらを殺し、そしてこれを生存研究のための死亡の日付として記録した。統計学的差異をＳｔａｔＶｉｅｗ  ４．５（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して計算し、ここで平均腫瘍体積を対応のない２群のｔ検定によって評価した。ｐｃＤＮＡ−ＨＳＰを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ３２６１での接種は顕著な抗腫瘍効果を誘導し、接種された腫瘍およびそれらの非接種の対側性対応物の両方は腫瘍増殖における有意な減少を示す（図７）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでの接種のみが接種された腫瘍の腫瘍増殖における有意な減少を生じたが、非接種腫瘍においては効果が小さかった（図７）。この結果は、ｐｃＤＮＡ−ＨＳＰを含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＬ３２６１での処理が、遠位の腫瘍増殖をブロックするために強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す。
【００９２】
以下の参考文献の開示は、本明細書中に参考として本願に援用される。
【００９３】
【数１】
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2004521658.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、熱ショックタンパク質を発現する構築されたＨＳＶ−１組換えプラスミドの概略図である。アンプリコンプラスミドｐＨＳＶ−ＨＳＰは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化配列［ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）］の制御下でＨＳＰ７０遺伝子を含む。アンプリコンプラスミドはまた、選択マーカー；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡ複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）；ＨＳＶ−１切断/パッケージングシグナル（ＨＳＶα）；およびＨＳＶのＤＮＡ複製起点（ＨＳＶｏｒｉ）を含む。
【図２】図２は、インビトロにおけるＨＳＶ−ＨＳＰ細胞傷害性を示す図である。ＣＴ２６マウス腫瘍細胞（１×１０5/ウェル）を２４ウェルプレートで培養し、そして０．０１〜１０の異なる感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で組換えＨＳＶ−ＨＳＰまたはＨＳＶウイルスで感染させた。細胞傷害性（％）は、製造業者の指示書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａキットを使用することによって感染４日後に測定した。感染多重度が１に等しい場合、細胞傷害性は９９％を超えた。
【図３】図３は、ＨＳＶ−ＨＳＰが局所的な腫瘍注射によって遠位の腫瘍増殖を阻害するより優れた能力を有することを示す。肋骨領域の各側に両側性のＣＴ２６腫瘍を含む同系のＢＡＬＢ／ｃマウスは、一方の腫瘍において接種を受け、他方の（対側性の）腫瘍では受けなかった。両側性の皮下腫瘍が最大直径約５ｍｍに達したとき、マウスはＨＳＶ−ＨＳＰウイルス（１×１０6プラーク形成単位、ＰＦＵ；「黒四角」）、ＨＳＶベクター（１×１０6プラーク形成単位、ＰＦＵ；「黒菱形」）、またはＨＳＰ７０タンパク質（疑似；「黒三角」）での右側の腫瘍中へ一側性の腫瘍内接種を０日目（７日目に第２の接種が続く）を受けた（ｎ＝６/グループ）。接種された腫瘍およびこれらの非接種の対側性の対応部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）は、疑似と比較して、ＨＳＶ−ＨＳＰでの感染後に有意な腫瘍増殖の減少を示した（感染２５日においてｐ＜０．００１；対応のない２群のｔ検定）。ＨＳＶ−ＨＳＰでのワクチン接種は、ＨＳＶまたはＨＳＰタンパク質のいずれかでのワクチン接種よりも、両側性の腫瘍増殖を阻害する際により効果的であった（感染２５日においてｐ＜０．００１；対応のない２群のｔ検定）。
【図４】図４は、構築されたアデノウイルスプラスミドｐＬＥＰ−ＨＳＰ７０−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａの概略図である。二重プラスミド（ｄｏｕｂｌｅ−ｐｌａｓｍｉｄ）方法を使用して組換えアデノウイルスを構築するために、ＨＳＰ遺伝子および腫瘍細胞におけるアデノウイルスの複製に不可欠であるＥ１Ａ遺伝子をプラスミドｐＬＥＰのマルチクローニングサイトに連結した。これにより、組換えプラスミドｐＬＥＰ−ＨＳＰ７０−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａを作製した。
【図５】図５は、構築された組換えアデノウイルスＡｄ−ＨＳＰ／Ｅ１Ａの概略図である。組換えプラスミドｐＬＥＰ−ＨＳＰ７０−ＩＲＥＳ−Ｅ１ＡをプラスミドｐＲＥＰに連結し、そして得られた生成物をファージγによってパッケージングし、そしてパッケージングされた生成物をＥ．ｃｏｌｉを感染するために使用した。得られた組換えプラスミドｐＡｄ−Ｈｓｐ７０／Ｅ１ＡをＩ−ＣｅｕＩによって切断し、次いで２９３細胞にトランスフェクトし、Ｈｓｐ７０を発現し得る組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＨＳＰ/Ｅ１Ａ）を得た。
【図６】図６は、熱ショックタンパク質を発現する構築されたプラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰの概略図である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅から得られたＨＳＰ遺伝子を、平滑末端の連結によって真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に挿入した。得られた組換えプラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰは、ＣＭＶプロモーター制御下でＨＳＰ７０遺伝子およびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列［ＢＧＨｐｏｌｙ（Ａ）］、選択マーカーおよびＳＶ４０のＤＮＡ複製起点を含む。
【図７】図７は、ＨＳＰを発現し得るサルモネラ属が、局所性腫瘍注射によって遠位の腫瘍増殖を阻害する優れた能力を有することを示す。同系のＢＡＬＢ／ｃマウスは、２つの側の肋骨領域にＳＭＭＣ７７２１での接種を受けた。両側性の皮下腫瘍が最大直径約５ｍｍに達したとき、マウスはプラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰ（ａｒｏＡ−）を含むサルモネラ属（１×１０7ＰＦＵ；「黒四角」）、プラスミドを含まないサルモネラ属（１×１０7ＰＦＵ；「黒菱形」）、またはＨＳＰ７０タンパク質（疑似コントロール；「黒三角」）での右側の腫瘍中へ一側性の腫瘍内接種を０日目（７日目に第２の接種が続く）を受けた（ｎ＝６/グループ）。接種された腫瘍およびこれらの非接種の対側性の対応部分の両方は、疑似と比較して、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰ（ａｒｏＡ−）を含むサルモネラ属での感染後に有意な腫瘍増殖の減少を示した（感染２５日においてｐ＜０．００１；対応のない２群のｔ検定）。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＨＳＰ（ａｒｏＡ−）を含むサルモネラ属でのワクチン接種は、プラスミドを含まないサルモネラ属またはＨＳＰタンパク質のいずれかでのワクチン接種よりも、両側性の腫瘍増殖を阻害する際により効果的であった（感染２５日においてｐ＜０．００１；対応のない２群のｔ検定）。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号１の人工配列はプライマーである。
配列番号２の人工配列はプライマーである。
【図１】
2004521658.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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