(57)【要約】本発明は、ヒト糖質関連タンパク質（ＣＲＢＡＰ）並びにＣＲＢＡＰを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はＣＲＢＡＰの発現に関わる疾患の診断、治療、又は予防の方法を提供する。
2004533201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びにそれらの断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する実質的に精製された変異体。
【請求項３】
請求項１のポリペプチド若しくはそれらの断片をコードする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列。
【請求項５】
ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルにおける少なくとも１つの核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８乃至１４及びそれらの断片のポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項１１】
請求項９のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１３の宿主細胞を培養する過程と、
（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
【請求項１８】
請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１５の医薬品組成物を投与する過程を含む方法。
【請求項２０】
ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１８のアンタゴニストを投与する過程を含む方法。
【請求項２１】
位置４２８においてＣによるＴの置換を伴う一塩基多型を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のポリヌクレオチド配列を含む請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
本発明は、ヒト糖質関連タンパク質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の核酸及びアミノ酸配列、並びに自己免疫／炎症性疾患及び胃腸障害、感染症、生殖障害、神経障害、眼の障害、癌を含む細胞増殖異常症におけるこれらの組成物の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は、種々の方法で糖に会合する。糖タンパク質は、分泌経路を通過する際に、タンパク質に付加される糖に共有結合する。タンパク質の中には、糖の分解、結合または修飾のために、糖含有巨大分子と非共有結合で会合するものもある。糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカンを含む糖含有巨大分子は、細胞表面及び細胞外マトリックスにみられる。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、反復二糖単位で構成される分枝のない直線の多糖類である。ＧＡＧは、１つ或いは複数のＧＡＧに結合したコアタンパク質からなる大きなタンパク質であるプロテオグリカンの一部として、或いは遊離して存在する（Ｌｏｄｉｓｈ， Ｈ．他 （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｉｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ．１１３６−１１４２）。
【０００３】
糖タンパク質、糖脂質及び膜貫通プロテオグリカンを含む細胞表面糖含有巨大分子は、他の細胞及び細胞外マトリックスの成分との接着を仲介する。細胞外マトリックスは、細胞表面から分泌されて細胞表面に密接に関連する組織化された網目構造に組み込まれる様々な糖結合タンパク質、糖タンパク質及びＧＡＧで構成される。細胞とその周囲のマトリックスとの相互作用によって、細胞の形状、強度、柔軟性、運動性、接着性に大きな影響を及ぼす。これらの動的な特性は、細胞増殖及び分化、組織の形成及び胚の発達を調節するシグナル伝達経路に密接に関連する。
【０００４】
ＧＡＧヒアルロン酸（ＨＡ）が、多くの細胞の細胞外マトリックスに見られ、特に結合軟組織に見られ、滑液中に多量に存在する（Ｐｉｔｓｉｌｌｉｄｅｓ， Ａ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｉ． ７４：２７−３４）。ＨＡは、細胞の調節、発達及び分化において重要な役割を果たすと思われる（Ｌａｕｒｅｎｔ， Ｔ．Ｃ． 及び Ｆｒａｓｅｒ， Ｊ．Ｒ． （１９９２） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ６：２３９７−２４０４）。ＨＡは、水及び血漿蛋白のホメオスタシスにおいて機能する（Ｌａｕｒｅｎｔ、前出）。ＨＡは、その産生が増殖細胞で増加すると、有糸分裂においてある役割を果たすと考えられる。ＨＡは、腫瘍細胞の接着及び移動を引き起こすとして知られ、その小断片は血管由来である。ＨＡは、マトリックス徐放性製剤、神経ガイド（ｎｅｒｖｅ ｇｕｉｄｅ）及び創傷包帯剤などの医療目的の生体材料として、化学的に修飾される（Ｚｈｏｎｇ， Ｓ．Ｐ． 他 （１９９４） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：３５９−３６５）。ＨＡの組織保護特性及び流体力学的な特性は、眼炎の手術（ｏｐｔｈａｌｍｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ）において有用であることが証明された。血清ＨＡは、肝臓疾患、及びリウマチ様関節炎などの様々な炎症の診断に役立つ。ＨＡの蓄積によって起こる組織間腔の浮腫（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｅｄｅｍａ）は、種々の器官に機能障害を起こし得る（Ｌａｕｒｅｎｔ、前出）。
【０００５】
ヒアルロン酸リアーゼは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸残基との間の１，４−結合のランダム加水分解を触媒して、ＨＡをオリゴ糖に分解する酵素である。ヒアルロン酸リアーゼは、細菌、昆虫、爬虫類及び哺乳動物の広範な生物に見られ、細胞接着、感染、脈管形成及びシグナル伝達において機能し得る。
【０００６】
哺乳動物の精巣で発現し、マウス及びヒトの精子の細胞膜に存在するタンパク質であるＰＨ−２０は、ヒアルロン酸リアーゼ活性を有する（Ｌｉｎ， Ｙ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２５：１１５７−６３）。ＰＨ−２０によって、高ＨＡの細胞外マトリックスに組み込まれた約３０００の卵丘細胞からなる哺乳動物の卵子の外側の層に精子が侵入することが可能となる。ＰＨ−２０はまた、幾つかの腫瘍細胞でも発現する。精巣のない哺乳動物のヒアルロン酸リアーゼも存在する。ＨＹＡＬ−１ヒアルロン酸リアーゼがヒト血清で発現し、一方、ＨＹＬＡ−２は多くの細胞で発現する（Ｌｅｐｐｅｒｄｉｎｇｅｒ， Ｇ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２２４６６−２２４７０）。ＨＹＬＡ−２は、脈管形成を誘発し得る固有のＨＡ断片の生成、並びに酸化窒素シンターゼなどのシグナル伝達経路に関与する酵素の発現においてある役割を果たすと考えられる。ライソソーム型のヒアルロン酸リアーゼは、サイトカイン調節性プロセスにおいて、肺線維芽細胞のＨＡを分解し得る（Ｓａｍｐｓｏｎ， Ｐ．Ｍ．他 （１９９２） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：１４９２−１５０３）。
【０００７】
ヘビ、ミツバチ、スズメバチ、オニダルマオコゼ、カモノハシ、サソリ及びトカゲを含む様々な動物の毒液には、ヒアルロン酸リアーゼが含まれている。ｗｈｉｔｅ ｆａｃｅ ｈｏｒｎｅｔ（顔などに顕著な白斑のある米国産クロスズメバチ属の一種）のヒアルロン酸リアーゼは、感受性の強いヒトにＩｇＥ応答を起こさせるアレルゲンである（Ｌｕ， Ｇ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４４５７−４４６５）。ヒアルロン酸リアーゼ毒は、毒の拡散を助ける「拡散因子」として作用すると思われる。トカゲ毒ヒアルロン酸リアーゼが、出血毒が注入されたマウスの出血領域の拡散を促進することを研究者が見出した（Ｔｕ， Ａ．Ｔ． 及び Ｈｅｎｄｏｎ， Ｒ．Ｒ． （１９８３） Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂ ７６：３７７−３８３）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロン酸リアーゼは、食中毒及びガス壊疽を引き起こす細菌の病原体として重要である（Ｃａｎａｒｄ， Ｂ． 他（１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４３：２１５−２２４）。このヒアルロン酸リアーゼは、宿主の結合組織を破壊し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｅを初期感染部位から拡散させてコロニー化し、周囲の組織を攻撃する。
【０００８】
ヒアルロン酸リアーゼは、生殖、癌及び炎症に関連する。ＰＨ−２０でモルモットのオス及びメスを免疫化して、効果的な避妊（１００％）効果が得られた（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ， Ｐ． 他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５４３−５４６）。これらの研究結果に基づき、研究者はヒトに適した抗精子ＰＨ−２０避妊ワクチンの研究を続けている（Ｚｈｕ， Ｘ． 及び Ｎａｚ， Ｒ．Ｋ． （１９９４） Ａｒｃｈ． Ａｎｄｒｏｌ． ３３：１４１−１４４）。ヒアルロン酸リアーゼ活性は、正常な前立腺及び良性前立腺過形成と比べて前立腺腫瘍組織において顕著な上昇がみられる（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ， Ｖ．Ｂ． 他 （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：６５１−６５７）。更に、組織におけるヒアルロン酸リアーゼのレベルは、腫瘍の進行と強い相関性がある。ヒアルロン酸リアーゼ及びビンデシン、シスプラチン及び放射線を組合わせた治療は、頭部及び頚部の進行扁平上皮癌に対して高い効果を示し、殆どの患者はその薬剤の作用に十分に耐えることができる（Ｋｉｏｃｋｅｒ， Ｊ． 他 （１９９５） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １８：４２５−４２８）。ヒアルロン酸リアーゼと化学療法薬剤であるビンブラスチンの組合わせは、ヌードマウスに移植されたＳＫ−Ｍｅｌ−３黒色腫細胞において、顕著な抗腫瘍効果が認められた（Ｓｐｒｕｓｓ， Ｔ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２１：１９３−２０２）。更に、ヒアルロン酸リアーゼは、実験動物ではその作用に十分に耐え、ビンブラスチンの皮下注入の後によく起こる局部性の炎症反応を防いだ。
【０００９】
Ｎ−アセチルグルコサミン受容体
多くの分泌タンパク質及び膜内在性タンパク質は、Ｏ−またはＮ−グリコシド結合によって付加されたオリゴ糖鎖を含む。Ｎ−結合オリゴ糖は、３個のマンノース及び２個のＮ−アセチルグルコサミン残基からなる一般的な五糖を含む。追加の糖が、追加マンノース残基、或いはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸及びＬ−フコースのアレイ複合体のどちらかとして、この共通のバックボーンに結合する場合が多い。様々な表面の糖の形態が可能であるため、機能の面で重要となり得る多くの情報を含み得る。
【００１０】
レクチンは、植物に見出されたのが最初の記述である糖結合タンパク質であり、オリゴ糖部分の情報を解釈する。肝細胞アシアログリコプロテイン受容体は、シアル酸残基を認識するレクチンである。末端シアル酸残基を含む免疫グロブリン及びペプチドホルモンは、肝細胞アシアログリコプロテイン受容体に結合してから血液から取り除かれ、エンドサイトーシスによって肝細胞の中に輸送される。セレクションには、リンパ節組織、内皮及び活性化血小板における糖部分と結合する好中球及びその他の白血球の細胞表面受容体がある。このセレクションは、炎症反応の際に傷の部分に白血球をターゲッティングする。細胞表面の糖はまた、ニューロン生成のガイドとして作用すると考えられる。
【００１１】
幾つかの細胞型のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）結合タンパク質の記載があり、様々な機能に関与する。ニワトリの肝臓のレクチン（ＣＨＬ）は、哺乳動物アシアログリコプロテイン受容体に対する鳥類の相同体であると考えられるが、シアル酸ではなくＧｌｃＮＡｃと高い親和性を有する。ＣＨＬはニワトリの肝細胞の細胞膜に存在するホモ三量体であり、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有する血清糖タンパク質のクリアランスを仲介する。リガンドがＣＨＬに結合するためにはＣａ２＋が必要であり、アシアログリコプロテイン、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びセレクチン細胞接着分子などのＣａ２＋依存性（Ｃ型）レクチンにそれが当てはまる（Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｌ． 他 （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２４：６７３−６８０）。
【００１２】
ＧｌｃＮＡｃ結合タンパク質は、ヒト骨髄性白血病細胞の核において同定された。これらのレクチンはＯ結合ＧｌｃＮＡｃに結合して核糖タンパク質に存在する。レクチンと核糖タンパク質の相互作用によって、核と細胞質との間の分子の輸送を阻害し、転写因子Ｓｐ１による転写活性を阻害する（Ｆｅｌｉｎ， Ｍ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｌｏｃｈｅｍ． ５６：５２７−５３５）。
【００１３】
ＧｌｃＮＡｃ結合タンパク質はまた、甲状腺のｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎの輸送を調節する。甲状腺ホルモンの前駆体であるｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎは、あるプロホルモンとして甲状腺小胞に蓄積される。プロホルモンの生成には、小胞体及びゴルジ体を通過する際の糖質の付加、並びに細胞外小胞のチロシン残基のヨウ素化が含まれる。プロホルモンの完全な成熟には、２４時間から３６時間かかり、ヨウ素化過程の間は連続したリサイクリングが必要である。甲状腺刺激ホルモン（ＳＴＨ）によって甲状腺が刺激され、瀘胞細胞が飲食作用によって濾胞性内腔（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｕｍｅｎ）からｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎを取り込む。プロホルモンがエンドソーム区画に移動し、そこで未成熟のｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎはエンドソーム受容体にピックアップされ、ゴルジ装置によって甲状腺ペルオキシダーゼ（ｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ヨウ素化部位に送り返される。成熟プロホルモンのみが、分解のためリソソームに送られ、甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ４）及びトリヨードチロニン（Ｔ３）を生成する。未成熟プロホルモンのｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を介してエンドソーム受容体と相互作用する。ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｉｎ受容体は、Ｎ−アセチルグルコサミン部分に特異的な内在性レクチンである（Ｍｅｚｇｒｈａｎｉ， Ｈ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２３３４０−２３３４６）。
【００１４】
循環する甲状腺ホルモン及びグリコシル化免疫グロブリンのレベルの調節は、正しい胚発達及び胎児発達に重要であり、この調節によって代謝活性が維持される。甲状腺ホルモンが代謝速度を調節する。甲状腺ホルモンは、腸での糖の吸収速度を上昇させ、脂質代謝を調節し、ミトコンドリア呼吸及び酸化的なリン酸化を高めることで代謝を活発化させる。甲状腺ホルモンはまた、胎児の体の成長及び神経系の発達に影響を及ぼす。末端ＧｌｃＮＡｃ残基を有する循環ＩｇＧのレベルの上昇は、リウマチ様関節炎、クローン病及びシェーグレン症候群に関連がると思われる（Ｂｏｎｄ，Ａ． 他 （１９９７） Ｊ． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ． １０：７７−８）。
【００１５】
ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎファミリータンパク質
糖タンパク質ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎは、嗅上皮細胞から分泌される細胞外粘液性マトリックスの主要な成分である（Ｓｎｙｄｅｒ， Ｄ． Ａ． 他 （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：９１４３−９１５３； Ｙｏｋｏｅ， Ｈ． 及び Ａｎｈｏｌｔ， Ｒ． Ｒ． Ｈ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：４６５５−４６５９）。ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎはｉｎ ｖｉｖｏではホモ二量体で存在し、そのサブユニットは細胞内ジスフィルド結合及び糖質の相互作用によって結合している。ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎは、粘液性の保護機能及び潤滑機能に寄与し、及び／または鼻の通路の臭気物質と嗅覚受容体との相互作用を促進する。
【００１６】
ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎと類似性を有する幾つかのタンパク質が最近同定され、それによってｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ及び関連タンパク質が、細胞外マトリックス糖タンパク質の固有のファミリーを構成し得ることが示された。ニューロンｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ関連糖タンパク質ＡＭＺ（ＮＯＲＧ−ＡＭＺ）及び−ＢＭＺ（ＮＯＲＧ−ＢＭＺ）という２つの糖タンパク質アイソフォームが、ラットの脳で同定された（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ， Ｐ． Ｅ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ３８：４６８−４７８）。ＮＯＲＧ−ＡＭＺ及びＮＯＲＧ−ＢＭＺのカルボキシ末端の１７５個のアミノ酸が、３３％のアミノ酸同一性を有し、ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎのＣ末端領域に１９％の保存的なアミノ酸の置換を有する。ＮＯＲＧ−ＡＭＺ及びＮＯＲＧ−ＢＭＺをコードするｍＲＮＡはそれぞれ、１つの遺伝子の別のプロモーターから転写されるため５’末端が異なる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びノーザン分析によって、これらのｍＲＮＡは脳でのみ発現し、とりわけ皮質及び海馬のニューロンで発現する。ＮＯＲＧ−ＡＭＺ及びＮＯＲＧ−ＢＭＺはそれぞれＮ末端にシグナルペプチドを含むと推定され、これら両方のタンパク質が分泌されたものであることを示唆する。更に、これらのタンパク質の相同体がマウスで見つかり、実質的にラットのタンパク質と同一であることが分かった（Ｎａｇａｎｏ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５３：１３−２３）。
【００１７】
別のｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ関連タンパク質が、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に関連する（Ｆｉｎｇｅｒｔ， Ｊ． Ｈ． 他 （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：３７７−３８４）。ＰＯＡＧは、治療をしないで放っておくと回復不能な失明を引き起こす疾患である緑内障の最も優勢なタイプである。米国だけでも、毎年約２３０万人が感染し、１２，０００人が失明している。ＰＯＡＧは、視神経の進行性の変性及び陥没、周辺視野の喪失及び眼圧の上昇という特徴を有する。遺伝性及び後天性のＰＯＡＧの発生は、ＧＬＣ１Ａ遺伝子の変異と相関性を有する。非疾患原因多型もまた、ＧＬＣ１Ａで同定された。ＧＬＣ１Ａはヒト及びマウスからクローニングされ、ｍｙｏｃｉｌｉｎと呼ばれるタンパク質をコードする。ヒトｍｙｏｃｉｌｉｎのＣ末端の２５０個のアミノ酸は、ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎのＣ末端領域と３５％の同一性を有する。ＧＬＣ１Ａは眼で発現する。特に、毛様体、網膜、紅彩及び小柱網で発現する。ＧＬＣ１Ａはまた、心臓、骨格筋、胃、甲状腺、気管、骨髄、胸腺、前立腺、小腸及び結腸を含む他の様々な組織で発現する。また、脳、胎盤、肝臓、腎臓、脾臓及び白血球ではＧＬＣ１Ａの発現が認められていない。
【００１８】
レクチン
レクチンは、細胞表面の糖に特異的且つ可逆的に結合して細胞を凝集させる細胞外糖タンパク質のファミリーを構成する（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｋ． 及びＴａｙｌｏｒ， Ｍ． Ｅ． （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：２３７−２６４を参照）。この機能は、特に免疫応答の開始に重要である。レクチンは、炎症部位のリンパ球の凝集及び分裂促進刺激を仲介する（Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５：１３９−１４６； Ｐａｉｅｔｔａ， Ｅ． 他 （１９８９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２８５０−２８５７）。
【００１９】
動物レクチンは、４つの異なったファミリーのグループに分類される。１）セレクチンを含むＣ型レクチン、２）Ｐ型レクチン、３）ｇａｌｅｃｔｉｎ（以前はＳ型レクチン或るいはＳ−Ｌａｃレクチンと呼ばれていた）、４）ペントラキシン（Ｂａｒｏｎｄｅｓ， Ｓ．Ｈ．他 （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２０８０７−２０８１０）。Ｃ型レクチンはＣａ２＋依存的に糖リガンドに結合し、その構造はアシアログリコプロテイン受容体に関連する。Ｃ型レクチンの小分類の１つであるセレクチンは、細胞間相互作用に関与する複合膜貫通分子である。セレクチンには、リンパ球ホーミング受容体、及び血小板／内皮細胞表面受容体が含まれる（Ｓｔｏｏｌｍａｎ， Ｌ．Ｍ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５６：９０７−９１０）。
【００２０】
Ｃ型レクチンには、Ｃａ２＋依存性糖認識ドメインが含まれる。原型のＣ型レクチンが内在性膜タンパク質（例えば、アシアログリコプロテイン受容体）であり、多くの可溶性Ｃ型レクチンが同定されている。Ｃ型レクチンの例には、肺表面活性タンパク質Ａ及びＢ（ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｂ）、哺乳動物Ｃ１ｑタンパク質、ウシｃｏｌｌｅｃｔｉｎ４３、ウシコングルチニン、マウスｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎ及びマンノース結合タンパク質がある。
【００２１】
ＳＰ−Ｄは、ｃｏｌｌｅｃｔｉｎと呼ばれる宿主防衛レクチンのファミリーメンバーである。ｃｏｌｌｅｃｔｉｎは、ウイルス、細菌及び真菌を含む潜在的な病原体から防御するために、肺及び循環器系の先天性免疫において機能する（Ｒｅｉｄ， Ｋ．Ｂ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９：２００−２０７）。ｃｏｌｌｅｃｔｉｎは、多数のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ反復、または頚部領域と呼ばれる内部領域及び糖結合Ｃ末端ドメインを含むコラーゲン様Ｎ末端ドメインを有する。ＳＰ−Ｄは、肺でのみ合成される（Ｌｉｍ 他 （１９９３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７８：１５９−１６５）。ＳＰ−Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト白血球のレクチン−及び抗−ＣＤ３刺激性増殖を阻害し、この阻害が細胞内のインターロイキン２の生成の低下に関連する（Ｂｏｒｒｏｎ， Ｐ．Ｊ． 他 （１９９８） Ｊ． ｌｍｍｕｎｏｌ． １６１：４５９９−４６０３）。
【００２２】
マウスｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎはカエル卵母細胞レクチンの相同体であり、マウスの小腸の腸パネート細胞で発現する。カエル卵母細胞レクチンは受精外被の形成に関与し、多精受精を防ぐ。Ｋｏｍｉｙａ 他 （１９９８， Ｂｌｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２５１：７５９−７６２）は、マウスｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎが微生物に対する宿主の防衛に関与し得ることを示唆した。
【００２３】
ｇａｌｅｃｔｉｎサブファミリーには、チオール依存的にβガラクトシド糖鎖に結合するレクチンが含まれる（Ｈａｄａｒｉ， Ｙ． Ｒ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３４４７−３４５３）。ｇａｌｅｃｔｉｎは広範に発現し、発生において調節される。全てのｇａｌｅｃｔｉｎはＮ末端シグナルペプチドが欠如していることから、ｇａｌｅｃｔｉｎは非定型の分泌機構を介して外部移行されると推定される。ｇａｌｅｃｔｉｎは、分子量及びオリゴマー化の特性によって２つのクラスに分類される。小さなｇａｌｅｃｔｉｎはホモ二量体を形成し、質量は約１４〜１６ｋＤａであり、一方、大きなｇａｌｅｃｔｉｎは単量体であって、その質量は約２９〜３７ｋＤａである。ｇａｌｅｃｔｉｎには、ｇａｌａｐｔｉｎとして知られる特徴的な糖認識ドメイン（ＣＲＤ）が含まれる。ＣＲＤは、アミノ酸１４０個分の長さであり、幾つかの保存された残基を有する。二次構造の推定から、ＣＲＤが幾つかのβシートを形成することが示唆された。既知のｇａｌｅｃｔｉｎは１つ或るいは２つのＣＲＤを含む（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００２７９ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅを参照）。
【００２４】
ｇａｌｅｃｔｉｎは、細胞間及び細胞とマトリックスとの相互作用に関連する疾患や症状において様々な役割を果たしている。例えば、あるｇａｌｅｃｔｉｎは炎症部位に関連し、細胞表面免疫グロブリンＥ分子に結合する。更に、ｇａｌｅｃｔｉｎは、癌の転移において重要な役割を果たし得る。ｇａｌｅｃｔｉｎの過剰な発現は、ヒト及びマウスの癌の転移の可能性に相関し得る。更に、抗ｇａｌｅｃｔｉｎ抗体は、細胞集合及び足場依存性増殖などの細胞の形質転換に関連するプロセスを阻害する。
【００２５】
前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１）として知られるｇａｌｅｃｔｉｎ−８は、癌の進行に関係する新規のｇａｌｅｃｔｉｎである（Ｓｕ， Ｚ．−Ｚ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７２５２−７２５７）。ｇａｌｅｃｔｉｎ−８は、初めは、前立腺腫瘍定方向（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）モノクロナール抗体であるＰｒｏ１．５によって認識される細胞表面抗原として同定された。ｇａｌｅｃｔｉｎ−８遺伝子は、ＣＲＤを２つ含んでいるアミノ酸３１７個のタンパク質をコードする。ｇａｌｅｃｔｉｎ−８は、浸潤性前立腺癌及び初期の前立腺癌において発現するが、正常な前立腺或いは良性の肥大性組織には発現しない。更に、ｇａｌｅｃｔｉｎ−８は、培養した前立腺癌細胞の表面から増殖培地の中に入る。これらのことから、ｇａｌｅｃｔｉｎ−８の検出は、初期の前立腺癌の診断に有用であり得、循環中のｇａｌｅｃｔｉｎ−８のレベルは疾患の進行に相関性を有し得る。更に、マウスにおける予備的な研究から、モノクロナール抗体Ｐｒｏ１．５それ自体が癌の進行に対して効果的な治療薬であることが示された。
【００２６】
新規のヒト糖関連タンパク質及びそらをコードするポリヌクレオチドの発見により、自己免疫／炎症性疾患及び胃腸障害、感染症、生殖障害、神経障害、眼の障害、癌を含む細胞増殖異常症の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。
【００２７】
発明の概要
本発明は、まとめて「ＣＲＢＡＰ」、個別には「ＣＲＢＡＰ−１」、「ＣＲＢＡＰ−２」、「ＣＲＢＡＰ−３」、「ＣＲＢＡＰ−４」、「ＣＲＢＡＰ−５」、「ＣＲＢＡＰ−６」及び「ＣＲＢＡＰ−７」と称される新規なヒト糖質関連タンパク質の発見に基づくものである。一実施態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
また、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更に本発明にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列が含まれる。
【００２９】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドだけでなく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
更に、本発明は核酸を含むサンプルにおけるポリヌクレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）サンプルの少なくとも１つのポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの相補配列とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とが含まれる。一実施態様において、その方法にはハイブリダイゼーション過程の前にポリヌクレオチドを増幅する過程が更に含まれる。
【００３１】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４及びそれらの断片のポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は位置４２８においてＣによるＴの置換を伴う一塩基多型を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４及びそれらの断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列を提供する。また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４及びそれらの断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片の断片の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを提供する。別の態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。
【００３３】
更に、本発明はポリペプチドの製造方法を提供し、その方法には、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含まれる。
【００３４】
更に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品成分を提供する。
【００３５】
更に、本発明には前記ポリペプチドの精製されたアゴニストおよび精製されたアンタゴニストだけでなく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体が含まれる。
【００３６】
更に、本発明はＣＲＢＡＰの活性又は発現の低下に関連する疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。
【００３７】
更に、本発明はＣＲＢＡＰの活性又は発現の増大に関連する疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な患者に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−７及びそれらの断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドのアゴニストを有効な量投与する過程が含まれる。
【００３８】
発明を実施するための形態
本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置、材料、及び方法に限定されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されたい。
【００３９】
請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそのような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１またはそれ以上の抗体及び当業者に周知のその等価物なども表している。
【００４０】
特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法、装置、及び材料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告された本発明に関して用いられ得る株化細胞、プロトコル、試薬、及びベクターを説明・開示するために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない。
【００４１】
定義
用語「ＣＲＢＡＰ」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製されたＣＲＢＡＰのアミノ酸配列を指す。
【００４２】
用語「アゴニスト」は、ＣＲＢＡＰと結合した場合にＣＲＢＡＰの効果を高めたり、その効果の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、ＣＲＢＡＰに結合してその作用を調節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得る。
【００４３】
用語「アレル変異配列」は、ＣＲＢＡＰをコードする遺伝子の対立形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し、変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化する場合と変化しない場合とがある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型の遺伝子には、アレル形がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列が生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独または他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で生じ得る。
【００４４】
ここで用いるＣＲＢＡＰをコードする「変異（ａｌｔｅｒｅｄ）」核酸配列には、結果として同一のＣＲＢＡＰまたはＣＲＢＡＰの機能的特徴の少なくとも１つを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、ＣＲＢＡＰの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出困難な多型と、またＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の位置とは別の所定の位置を有する、アレル変異配列に対する不適切な或いは予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク質もまた「変異」したものであり得て、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）を生ずるアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価ＣＲＢＡＰとなるものである。意図的なアミノ酸置換は、ＣＲＢＡＰの生物学的または免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電荷の極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【００４５】
ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり、自然発生又は合成の分子を指す。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」は、好ましくは約５〜１５個のアミノ酸の長さ（最も好ましくは１４個のアミノ酸の長さ）であってＣＲＢＡＰの生物学的活性または免疫学的活性を保持するＣＲＢＡＰの断片を指す。ここで「アミノ酸配列」は、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指すものとして挙げているが、「アミノ酸配列」や類似の用語は、列挙されたタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定する意味で用いられるわけではない。
【００４６】
ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実施される。
【００４７】
用語「アンタゴニスト」は、ＣＲＢＡＰに結合した場合にＣＲＢＡＰの生物学的又は免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはＣＲＢＡＰの作用を低下させる任意の他の分子が含まれ得る。
【００４８】
用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るＦａ、Ｆ（ａｂ）２、及びＦｖフラグメントのようなそれらの断片も指す。ＣＲＢＡＰポリペプチドに結合する抗体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原として関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳または化学的に合成されたものから得られ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００４９】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質の所定の領域または３次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００５０】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的な核酸配列を含む任意の成分を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して２重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げる。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。
【００５１】
用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＣＲＢＡＰ、若しくはその任意のオリゴペプチドの能力を指し、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する。
【００５２】
用語「相補的」または「相補性」は、任意の塩類及び温度条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合である。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は相補的配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、或いは一本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さに大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用において特に重要である。
【００５３】
ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤または水溶液が含まれ得る。ＣＲＢＡＰまたはＣＲＢＡＰの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。このプローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））及び他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させることができる。
【００５４】
用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分離された核酸配列か、ＸＬ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて５‘方向及び／又は３’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメントの組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、ＧＥＬＶＩＥＷＴＭ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｙｓｔｅｍ， ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した配列から組み合わせて作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長され、かつ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。
【００５５】
用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザン解析によるＣＲＢＡＰをコードする核酸配列と同一か又は関連する核酸の存在の検出が、サンプル内のＣＲＢＡＰをコードする核酸の存在を示しており、従ってＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、ということを表している。
【００５６】
ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠けることである。
【００５７】
用語「誘導体」は、ポリペプチド配列、又はポリヌクレオチド配列の化学修飾を指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。
【００５８】
用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な類似性と、完全な類似性の場合がある。用語「類似性」の代わりに「同一性」を用いることができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に類似な」ことを指す。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性のもとで、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に類似な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に類似（同一）な配列との結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味するわけではなく、緩やかな厳密性の条件では２つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないことを、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の類似性又は同一性）さえも有していない第２の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が存在しない場合、概ね類似な配列またはプローブは第２の非相補的な標的配列とハイブリダイズしない。
【００５９】
用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％」は、２以上のアミノ酸または核酸配列の比較において見出された配列の類似性の百分率を指す。同一性のパーセントは、例えばＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いることによって電子的に決定できる。ＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムは、例えばｃｌｕｓｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄのようなユーザーに選択された方法に従い、２以上の配列の間のアライメントを作成することができる（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．及びＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４を参照）。各方法のパラメータは、ＭＥＧＡＬＩＧＮによって与えられたデフォルトのパラメータか、或いはユーザによって規定されたものでもよい。ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズムは、全てのペアの間の距離を調べることによって配列をクラスターに分類する。クラスターはペアでアライメントされ、次にグループにおいてアライメントされる。２つのアミノ酸配列（例えば、配列Ａ及び配列Ｂ）の間の類似性のパーセンテージは、（配列Ａと配列Ｂとの間で一致する残基の総数）／（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基（ｇａｐ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）の数−配列Ｂにおけるギャップ残基の数）×１００によって計算する。２つのアミノ酸の間の低い類似性または非類似性のギャップは、類似性のパーセンテージの測定に含まれない。また、核酸配列の間の同一性のパーセントは、例えばＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄのような当業者に周知の他の方法により計算、即ちカウントできる（例えばＨｅｉｎ， Ｊ．（１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６２６−６４５参照）。更に配列間の同一性は、例えばハイブリダイゼーション条件を変更することによる当業者に周知の別の方法によって測定可能である。
【００６０】
「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含んでおり、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体である。
【００６１】
用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持しながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列を置換した抗体分子を指す。
【００６２】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する任意の過程を指す。
【００６３】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の水素結合形成の効力によって、２つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、Ｃ０ｔ又はＲ０ｔ解析）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メンブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。
【００６４】
ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対して、１個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
【００６５】
「免疫応答」は、炎症、心的外傷、免疫異常症、又は伝染性もしくは遺伝性の疾患に関連する容態を指す。これらの容態は、細胞および全身の防御系に作用する種々の因子（例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子）の発現によって特徴づけられる。
【００６６】
用語「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された個々のポリヌクレオチドを配列したものを指す。
【００６７】
用語「エレメント」或いは「エレメントアレイ」とは、マイクロアレイの文脈に於いて、基板上に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドを指す。
【００６８】
用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、ＣＲＢＡＰの活性の変化を指す。例えば、調節によって、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はＣＲＢＡＰの生物学的、機能的、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。
【００６９】
ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの任意の断片を指す。また、これらの用語は、一本鎖または二本鎖の、センス鎖又はアンチセンス鎖のゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様若しくはＲＮＡ様物質も指す。用語「断片（フラグメント）」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４を特別に同定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列（例えば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）を指す。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の断片は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、また、関連するポリヌクレオチド配列からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４を区別する類似性の測定にも有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の断片は、少なくとも約ヌクレオチド１５〜２０個の長さを有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４及びこの断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の領域の正確な長さは、断片の所期の目的に基づいた当業者に周知の一般的な技術の１つを用いてルーチン的に決定できる。或いは、断片が翻訳された際に、機能的特徴（例えば、完全長のポリペプチドの抗原性等）および構造的特徴（例えば、完全長のポリペプチドのＡＴＰ結合部位等）を保持したポリペプチドを形成し得る。
【００７０】
用語「機能的に関連する」、即ち「機能的に結合する」は、機能的に関係した核酸配列を指す。プロモーターがコードされたポリペプチドの転写を制御する場合、プロモーターはコード配列と機能的に関連する、即ち機能的に結合する。機能的に関連した、即ち機能的に結合した核酸配列が、読み枠に存在あるいは近接する際に、所定の遺伝因子（例えば、リプレッサー遺伝子）は、コードされたポリペプチドには連続的に結合せずに、それでもポリペプチドの発現を制御するオペレーター配列に結合する。
【００７１】
ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリダイゼーションアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長さが少なくとも約６ヌクレオチドから約６０ヌクレオチド程度のもので、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを指す。ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用語「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と概ね同義である。
【００７２】
ここで用いる「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤（ａｎｔｉ−ｇｅｎｅ ａｇｅｎｔ）を指す。末端のリジンがその組成に溶解性を賦与している。ＰＮＡは相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、またＰＮＡをポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延ばすことが可能である。
【００７３】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ＣＲＢＡＰをコードする核酸、若しくはその断片、またＣＲＢＡＰ自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、組織や、組織プリントその他を含み得る。
【００７４】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体ならびにタンパク質もしくはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば、結合する分子が認識する抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識された遊離した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離し、標識されていないＡ）を含むポリヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識されたＡの量が低下する。
【００７５】
用語「厳密（ストリンジェント）な条件」は、ポリヌクレオチドと特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件を指す。厳密な条件は、塩濃度、有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当業者に周知の他の条件によって規定される。特に、塩の濃度を低下させることや、ホルムアミドの濃度を上昇させることや、ハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって厳密性が増す。
【００７６】
用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列又はアミノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から単離又は分離されて、その構成要素が６０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。
【００７７】
用語「置換」は、１個または２個以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸にそれぞれ置換することを指す。
【００７８】
ここで用いる「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気或いは非磁気のビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を含む適切な固体または半固体の支持体のことである。基板は、ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁、溝、ピン、チャンネル、及び孔などの様々な表面形態をとることが可能である。
【００７９】
用語「形質転換」の定義は、外来性のＤＮＡが入り込みレシピエント細胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を用いた天然または人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定はされないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡを自律的に複製するプラスミドとして、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞が含まれ、またそれは限られた時間で導入されたＤＮＡやＲＮＡを一過性に発現する細胞を指す。
【００８０】
ここで用いるＣＲＢＡＰポリペプチドの「変異体」は、１又は２以上のアミノ酸残基が変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この場合、例えばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシンがトリプトファンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合もある。類似した小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方が含まれる。例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のような周知のコンピュータプログラムを用いて、何れのアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除去可能であるということを決定するガイダンスを提供することができる。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、ＣＲＢＡＰに関連したポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば「アレル」（前述）、「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列も含まれる。スプライス変異配列は基準分子と有意な同一性を有し得るが、一般にｍＲＮＡプロセッシングの際のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が増減する。対応するポリペプチドは、付加的な機能的ドメインを有するか、或いはドメインを含まない。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。生じたポリペプチドは、一般に互いに有意なアミノ酸同一性を有する。多形性変異配列は、所定の個別の種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。また、多形性変異配列には、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が変化する「単一のヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）が包含され得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病状、又は病状の性向を表し得る。
【００８２】
発明
本発明は、新規なヒト糖質関連タンパク質（ＣＲＢＡＰ）、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド、並びに自己免疫異常／炎症性疾患、胃腸疾患、感染症、生殖障害、神経疾患、眼疾患、癌を含む細胞増殖障害の予防、治療又は診断のためのこれらの組成物の利用法の発見に基づくものである。
【００８３】
表１には、ＣＲＢＡＰをコードする完全長のヌクレオチド配列を得るために用いたインサイト社クローンを示す。第１列及び第２列には、アミノ酸及び核酸の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）をそれぞれ示す。第３列には、各ＣＲＢＡＰをコードする核酸が同定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示し、第４列には、これらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示す。第５列には、インサイト社クローン、それらに対応するｃＤＮＡライブラリー、並びにショットガン配列を示す。これらの配列は、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用であり、また各ＣＲＢＡＰのコンセンサスヌクレオチド配列の一部である。
【００８４】
ＣＲＢＡＰ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をコードするポリヌクレオチド配列には、位置４２８におけるＣによるＴの置換を伴う一塩基多型が含まれる。Ｃはクローンの１０％で位置４２８において見られ、一方でＴはクローンの９０％で位置４２８に見られた。
【００８５】
表２の各列には、本発明のポリペプチドの種々の特性を示す。第１列にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、第２列には各ポリペプチドのアミノ酸残基の数、第３列には潜在的リン酸化部位、第４列には潜在的グリコシル化部位、第５列にはサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列及びモチーフを含むアミノ酸残基、第６列には各タンパク質の識別、第７列に配列相同性及びタンパク質モチーフによって各タンパク質を同定するために使用した解析方法をそれぞれ示す。ＰＦＡＭ分析によって、ＣＲＢＡＰ−１がＧ５８からＤ６５までにおいて脊椎動物のガラクトシド結合レクチンに類似していることが示されている。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−１はヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８（ＧＩ ２８１０９９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−１及びヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８は、２８％の同一性を共有する。ＣＲＢＡＰ−１とヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８の第１のｇａｌａｐｔｉｎドメイン（残基１から１５３まで）とは２３％の同一性を共有する。ＣＲＢＡＰ−１とヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８の第２のｇａｌａｐｔｉｎドメイン（残基１８５から３１５まで）とは３４％の同一性を共有する。
【００８６】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ及び図２Ｅに示すように、ＣＲＢＡＰ−２はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−２及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼは、１４％の同一性を共有する。
【００８７】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−３はヒトＴＧＲ−ＣＬ１０Ｃ（ＧＩ １２４７１２４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−２及びヒトＴＧＲ−ＣＬ１０Ｃは、ＣＲＢＡＰ−３の長さにおいて３０％の同一性を共有する。更に、ＣＲＢＡＰ−３及びＴＧＲ−ＣＬ１０Ｃは、残基Ｐ１２８からＨ２２０までにおいて１００％の同一性を共有する。
【００８８】
図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−４（１６４８２１４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の残基Ｇ１４７から残基Ｋ４０２は、ラットＮＯＲＧ−ＡＭＺ（ＧＩ ４４２３６８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）のＣ末端の残基Ｇ２０４から残基Ｌ４５７と２５％のアミノ酸配列同一性を共有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−４の残基Ｔ２６８、Ｔ２９５及びＳ３５２における潜在的リン酸化部位及び推定されるシグナルペプチドが、ラットＮＯＲＧ−ＡＭＺにおいて保存されている。更に、ＣＲＢＡＰ−４のＣ末端の基Ｇ１４７から残基Ｋ４０２は、ｍｙｏｃｉｌｉｎ（ＧＩ ３０６５６７９； 配列は示さず）のＣ末端と２４％のアミノ酸配列の同一性を共有する。また、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−５のＣ末端の残基Ｔ１５９から残基Ｓ４０９は、ラットＮＯＲＧ−ＡＭＺのＣ末端の残基Ｇ２０４から残基Ｌ４５７と３３％のアミノ酸配列同一性を共有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−５の残基Ｓ２１５、Ｓ２７７及びＴ３８１における潜在的リン酸化部位が、ラットＮＯＲＧ−ＡＭＺにおいて保存されている。
【００８９】
図５Ａ及び図５Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−６はウシの肺のＳＰ−Ｄ（ＧＩ ４１５９３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−６及びウシの肺のＳＰ−Ｄは、シグナルペプチド配列、Ｃ型レクチン及びＣ１ｑドメインタンパク質配列、残基Ｃ１７０、Ｃ２４２、Ｃ２５６及びＣ２６４における４つの保存された残基並びにコラーゲン様ドメインを含めた３２％の同一性を共有する。
【００９０】
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＣＲＢＡＰ−７はｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎ（ＧＩ ３３５７９０９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＣＲＢＡＰ−７及びｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎは、カゼインキナーゼＩＩによる５つの潜在的リン酸化部位、プロテインキナーゼＣによる１つの潜在的リン酸化部位を含めた７９％の同一性を共有し、類似の等電点（それぞれ８．１、７．８）を有する。
【００９１】
表３の各列には、ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列に関連する組織特異性及び疾患を示す。表３の第１列にはポリヌクレオチド配列番号を示す。第２列には、ＣＲＢＡＰを発現する組織の種類並びに全組織におけるその組織の発現割合を示す。第３列には、ＣＲＢＡＰを発現する組織と関連する疾患の種類を示す。第４列には、ｃＤＮＡライブラリーのサブクローニングに用いたベクターを示す。注目すべきは、癌及び細胞増殖、炎症及び免疫反応、生殖組織並びに神経組織におけるＣＲＢＡＰ−１及びＣＲＢＡＰ−２の発現である。また、注目すべきは、生殖、神経及び胃腸の組織におけるＣＲＢＡＰ−３の発現、肝臓、腎臓、卵巣、腸、副腎及び分泌上皮におけるＣＲＢＡＰ−６の発現並びにクローン病並びに肺、卵巣、精巣及び分泌上皮におけるＣＲＢＡＰ−７の発現である。
【００９２】
また、本発明はＣＲＢＡＰの変異体を含む。ＣＲＢＡＰ変異体は、ＣＲＢＡＰアミノ酸配列に対して好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またＣＲＢＡＰの機能的もしくは構造的特徴の少なくとも１つを含む。
【００９３】
更に、本発明はＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施例において、本発明はＣＲＢＡＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。
【００９４】
更に、本発明はＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に、そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の態様には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の変異配列が含まれ、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。上記のポリヌクレオチドの変異配列は何れもＣＲＢＡＰの機能的または構造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。
【００９５】
遺伝暗号の縮重の結果、既知の遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオチド配列に対する最小の類似性を有する幾つかのものを含め、多数のＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組合せは自然発生のＣＲＢＡＰのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプレット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はここに明確に開示されると考えられたい。
【００９６】
ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳密性の条件下に於いて、自然発生のＣＲＢＡＰのヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能であることが好ましいが、それは非自然発生のコドンを含める等の実質的に異なるコドンの用法を有するＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。特定のコドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いてペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなしにＣＲＢＡＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。
【００９７】
また本発明は、ＣＲＢＡＰ及びＣＲＢＡＰの誘導体をコードするＤＮＡ配列、またはその断片を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によって周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入することが可能である。更に、合成化学を利用してＣＲＢＡＰをコードする配列又はそれらの任意のフラグメントに突然変異を導入し得る。
【００９８】
また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、また特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４及びそれらの断片に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７；Ｋｉｍｍｅｌ， Ａ．Ｒ．（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１参照）。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム及び約７５ｍＭ未満のクエン酸３ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナトリウム及び約５０ｍＭ未満のクエン酸３ナトリウムであり、最も好ましくは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム及び約２５ｍＭ未満のクエン酸３ナトリウムである。例えばホルムアミド等の有機溶剤の非存在下では厳密性の低いハイブリダイゼーションとなり、一方で約３５％以上のホルムアミド、最も好ましくは約５０％以上のホルムアミドの存在下において厳密性の高いハイブリダイゼーションとなる。厳密な温度条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。例えば、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の薬品濃度、キャリアＤＮＡの含有または排除等の変動する付加的なパラメーターは、当業者には周知である。これらの必要とする種々の条件を組合わせることによって、様々なレベルの厳密性が実現される。好適な実施例では、温度３０℃、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸３ナトリウム、及び１％のＳＤＳにおいてハイブリダイゼーションが実施される。より好適な実施例では、温度３７℃、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのクエン酸３ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）においてハイブリダイゼーションが実施される。最も好適な実施例では、温度４２℃、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸３ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいてハイブリダイゼーションが実施される。これらの条件の有益な変更については、当業者には容易に理解されるであろう。
【００９９】
ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程においても厳密性は変更し得る。洗浄の厳密な条件は、塩濃度および温度によって規定できる。前述のように、塩濃度を低下させるか、或いは温度を上昇させることで洗浄の厳密性が増大し得る。例えば、洗浄過程の厳密な塩濃度の条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリウム及び約３ｍＭ未満のクエン酸３ナトリウムであり、最も好ましくは約１５ｍＭ未満の塩化ナトリウム及び約１．５ｍＭ未満のクエン酸３ナトリウムである。洗浄過程の厳密な温度の条件は、通常は約２５℃以上であり、より好ましくは約４２℃以上であり、最も好ましくは約６８℃以上である。好適実施例では、洗浄過程は、温度２５℃、３０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのクエン酸３ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて実施される。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度４２℃、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸３ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて実施される。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度６８℃、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸３ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳにおいて実施される。これらの条件の更なる変更については、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１００】
ＤＮＡ塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても利用され得る。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）に於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。配列の準備は、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ２００（ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）等の装置によって自動化することが好ましい。次に、ＡＢＩ ３７３若しくは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）又は他の周知のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｉ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３を参照）。
【０１０１】
ＣＲＢＡＰをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に於いて周知の種々のＰＣＲ法をベースとした方法で伸長し、プロモータ及び調節エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別の方法では、多岐に伸長して環状化鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵素断片に由来する。（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．ら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６）。第３の方法として、キャプチャーＰＣＲ法（ｃａｐｔｕｒｅ ＰＣＲ）には、ヒト及び酵母菌の人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が含まれる（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．ら（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素の消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域に組換え二本鎖配列を挿入することができる。また、未知の配列を回収するのに用いられ得る他の方法が当業者に周知である（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． ら （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６を参照）。更に、ＰＣＲ法、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン移行部の発見に有用である。全てのＰＣＲ法をベースとした方法については、プライマーは、ＯＬＩＧＯＴＭ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＭＮ）のような市販のソフトウェア又は別の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、また約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計され得る。
【０１０２】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする場合には、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリーを用いることが好ましい。また、遺伝子の５’領域を配列を含むことが多いランダムプライムド（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）ライブラリーは、オリゴ ｄ（Ｔ）ライブラリーで完全な長さのｃＤＮＡを得られない場合に好適である。またゲノムライブラリーは、５’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。
【０１０３】
配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、４つの異なるヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、及び放射された波長の検出を行うＣＣＤカメラを使用し得る。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に限られた量だけしか存在しないこともあるＤＮＡの小片の配列決定に特に好適である。
【０１０４】
本発明の別の実施例では、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、ＣＲＢＡＰ、その断片またはその機能的等価物の適切な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によって、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が作り出され、ＣＲＢＡＰの発現のために用いることができる。
【０１０５】
限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改変すること等の種々の理由により、ＣＲＢＡＰをコードする配列を改変するために、本発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダムな断片化によるＤＮＡ混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生成する突然変異の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生成等が可能である。
【０１０６】
本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、ＣＲＢＡＰをコードする配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ．Ｍ．Ｈ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２参照）。或いは、化学的手法を用いて、ＣＲＢＡＰそのもの又はその断片を合成することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４参照）。また、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて合成の自動化を行なうことができる。更に、ＣＲＢＡＰのアミノ酸配列もしくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、並びに／又は他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と結合させることにより、変異体ポリペプチドを生成可能である。
【０１０７】
そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製することができる（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＲｅｇｎｉｅｒ． Ｆ．Ｚ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配列決定法により確認することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｖｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【０１０８】
生物学的に活性なＣＲＢＡＰを発現させるために、ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を、適切な発現ベクター（即ち、適切な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入する。これらのエレメントには、ベクター及びＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域等の調節配列が含まれる。このようなエレメントの長さ及び特異性は変化し得る。特定の開始シグナルを利用して、ＣＲＢＡＰをコードする配列のより効果的な翻訳を行なうことが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンや例えばコザック配列等の隣接する配列が含まれる。ＣＲＢＡＰをコードする配列、その開始コドン、及び上流の調節配列が、適切な発現ベクターに挿入された場合は、付加的な転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは不用となり得る。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、読み枠の中のＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターよって与えられなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の種々のものからなり得る。用いられる特定の宿主細胞株に適当なエンハンサーを含むことにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２を参照）。
【０１０９】
ＣＲＢＡＰをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換え技術が含まれる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ， ｃｈ．４，８，及び１６−１７；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｃｈ．９，１３，及び１６参照）。
【０１１０】
ＣＲＢＡＰをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））或いは細菌の発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１１１】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用の目的に応じて選択できる。例えば、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、及び増殖は、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）又はｐＳｐｏｒｔｌ ｐｌａｓｍｉｄ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の多機能性Ｅ．ｃｏｌｉベクターを用いて実施することが可能である。ベクターの多数のクローニング部位へのＣＲＢＡＰをコードする配列のライゲーションによりｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成に有用である（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ． Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９を参照）。例えば、抗体産生の目的等に多量のＣＲＢＡＰが必要な場合、ハイレベルなＣＲＢＡＰの発現をもたらすベクターが用いられ得る。例えば、強力な誘発性のＴ５又はＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが用いられ得る。
【０１１２】
ＣＲＢＡＰの生成に酵母の発現系を利用できる。酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモーターなどの構成型又は誘導型のプロモーターを含む多種のベクターを使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌若しくは細胞内保持の何れかを導き、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来性の配列を組込みを可能とする（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ， 前出； 及び Ｇｒａｎｔら（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４；Ｓｃｏｒｅｒ， Ｃ．Ａ．ら（１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０１１３】
植物系もＣＲＢＡＰの発現に使用できる。ＣＲＢＡＰをコードする配列の転写は、ウイルス性のプロモータ（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター単独、又はＴＭＶ由来のオメガリーダー配列との組合わせ）で促進され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．ら（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換または病原体媒介の形質移入によって、植物細胞中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【０１１４】
哺乳動物の細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、ＣＲＢＡＰをコードする配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域における挿入により、宿主細胞においてＣＲＢＡＰを発現する感染性のウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることができる。また、タンパク質の高レベルの発現のために、ＳＶ４０またはＥＢＶをベースとしたベクターを用いることができる。
【０１１５】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現され得るものに比べてより大きなＤＮＡの断片を供給することもできる。治療を目的とし、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ． Ｊ．ら（１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５）。
【０１１６】
哺乳類系の組換え型タンパク質の産生を長期間にわたり確保するためには、細胞株におけるＣＲＢＡＰの安定した発現が好ましい。例えば、発現ベクターを用いてＣＲＢＡＰをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能であり、その発現ベクターには、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性の発現エレメント並びに同一或いは個別のベクターの上の選択マーカー遺伝子が含まれる。ベクターの導入の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で細胞を１〜２日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選択的な媒介物に対して耐性を与えることであり、またその存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能とすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。
【０１１７】
形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれは、ｔｋ−及びａｐｒ−細胞において用いられる（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９７７）Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２；Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−７０；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． ら（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、代謝産物に対する細胞の必要性を変更するｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−８０５１参照）。例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、β−グルクロニダーゼ及びその基質β−グルクロニド、又はルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等の可視マーカーを利用できる。これらのマーカーは形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられる（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１参照）。
【０１１８】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆されるが、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばＣＲＢＡＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ＣＲＢＡＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、ＣＲＢＡＰをコードする配列とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。
【０１１９】
一般に、当業者に周知の様々な方法により、ＣＲＢＡＰをコードする核酸配列を含みＣＲＢＡＰを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、並びに核酸とタンパク質配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若しくはチップを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。
【０１２０】
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれかを用いるＣＲＢＡＰの発現を検出・測定するための免疫学的手法は、当業者に周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）及び蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＣＲＢＡＰ上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これらアッセイおよび他のアッセイは、当業者によって開示されている（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｒ．ら（１９９０）；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＶ；Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ．ら（１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪを参照）。
【０１２１】
多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びアミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作製するための手段には、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション法、末端標識（ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ）、或いは標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。或いは、ＣＲＢＡＰをコードする配列、又はその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そのようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例えばＴ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えることによってｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、及びＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ提供）を用いて実施することができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コファクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。
【０１２２】
細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／またはベクターに応じて分泌されるか、又は細胞内に保持され得る。当業者に理解されるように、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してＣＲＢＡＰ分泌を指向するシグナル配列を含むように設計することができる。
【０１２３】
更に、宿主細胞株は、挿入した配列の発現の調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって選択される。このようなポリペプチドの修飾には、以下に限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれる。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、タンパク質の標的、折り畳み及び／又は活性を特定することができる。翻訳後の活性のための特定の特徴的な機構及び細胞装置を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来性のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１２４】
本発明の別の実施例では、ＣＲＢＡＰをコードする天然の核酸、改変された核酸、又は組換えの核酸配列を、前述の任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させ得る。例えば、市販の抗体によって識別できる異種部分を含むキメラＣＲＢＡＰタンパク質が、ＣＲＢＡＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、市販の親和性の基質を用いて、異種タンパク質及びペプチド部分が、融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、以下に限定されるものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、及び６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物、カルモジュリン、及び金属キレート樹脂の各々で同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に識別する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性の精製が可能である。また、ＣＲＢＡＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置するタンパク質切断部位を融合タンパク質が含むように、融合タンパク質が操作されて、精製の後にＣＲＢＡＰが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法については、Ａｕｓｕｂｅｌの文献（１９９５， 前出， ｃｈ １０）に記載されている。また、融合タンパク質の発現及び精製の促進のために、種々の市販のキットを用いることができる。
【０１２５】
本発明の更に別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＣＲＢＡＰの合成を行なうことができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳を結びつける。転写は放射能標識されたアミノ酸前駆体（好ましくは３５Ｓ−メチオニン）の存在の下で起こる。
【０１２６】
組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、ＣＲＢＡＰの断片を作り出すことができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， 前出 ｐｐ．５５−６０を参照）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができる。自動化された合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことができる。ＣＲＢＡＰの種々の断片を個別に合成して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。
【０１２７】
治療
ヒト糖質関連タンパク質とＣＲＢＡＰの領域との間には、（例えば、配列およびモチーフの前後関係において）化学的および構造的類似性が存在する。更に、ＣＲＢＡＰの発現は、炎症性、胃腸、感染性、生殖、神経性、増殖性及び癌性の組織、眼の組織並びに腸及び分泌上皮の炎症と密接に関連する。従って、ＣＲＢＡＰは自己免疫異常／炎症性疾患、胃腸疾患、感染症、生殖障害、神経疾患、眼疾患、癌を含む細胞増殖障害において所定の役割を果たしていると考えられる。ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の増大に関連する腫瘍性疾患、自己免疫異常／炎症性疾患、胃腸疾患及び感染症の治療においては、ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性を低下させることが望ましい。ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性を増大させることが望ましい。
【０１２８】
従って、一実施例においては、ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のためにＣＲＢＡＰ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与することができる。そのような疾患の例には、以下に限定しないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌障害−カンジダ症−外胚葉性ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋若しくは心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性血栓性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、ブルトン型の伴性無ガンマグロブリン血症、後天性免疫グロブリン血症（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺形成不全）、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血小板減少及び湿疹を伴う免疫不全（ウィスコット‐アルドリッチ症候群）、チェディアック‐東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全等のような免疫異常症や、癌、血液透析、及び体外循環の合併症や、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物、及び寄生虫様の感染症や、心的外傷等の自己免疫異常／炎症性疾患；並びに嚥下障害、消化性食道炎、攣縮食道炎、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振症、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、洞性浮腫または幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、膵臓炎、膵臓癌、胆管疾患、肝炎、ビリルビン過剰血症、硬変、肝臓受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ウィップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、エイズ腸症等の胃腸疾患；並びにアデノウイルス（急性呼吸器疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ性脈絡髄膜炎）、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱病）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、パピローマウイルス（癌）、パラミキソウイルス（はしか、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）、ポックスウイルス（天然痘）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトＴリンパ指向性ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、及びトガウイルス（脳炎、風疹）によるウイルス感染や、肺炎球菌及びブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、ｎｏｒｃａｒｄｉｕｍ、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマに分類される細菌病原体による感染症と、コウジカビ及びブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、ヒストプラスマ、及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染症と、プラスモディウムまたはマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ及びレーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物、住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症；並びにプロラクチン産生異常や、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症や、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生や、乳房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病（Ｐｅｙｒｏｎｉｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、男性の乳房および女性化乳房の癌等の生殖障害；並びにてんかん、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（ｎｅｕｒｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性及び代謝性、内分泌性の中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の分裂病性障害を含む精神障害と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病等の神経疾患；並びに結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、ＰＯＡＧを含む緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経障害、中毒性視神経症、ガラス状剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜の黒色腫、眼球後腫瘍及び視神経交叉腫瘍等の眼疾患；並びに日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、肝硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性の夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫や、特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等の細胞増殖障害が含まれる。
【０１２９】
別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、ＣＲＢＡＰ又はその断片もしくは誘導体を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。
【０１３０】
また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、適切な医薬用担体と共に精製されたＣＲＢＡＰを含む医薬品組成物を患者に投与してもよい。
【０１３１】
また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、ＣＲＢＡＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与してもよい。
【０１３２】
更に別の実施例においては、ＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療または予防のために、ＣＲＢＡＰのアンタゴニストを患者に投与してもよい。そのような疾患の例には、以下に限定はしないが、前述の自己免疫異常／炎症性疾患、胃腸疾患、感染症、生殖障害、神経疾患、眼疾患、並びに癌を含めた細胞増殖障害が含まれる。一実施態様では、ＣＲＢＡＰと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いるか、或いはＣＲＢＡＰを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲティングとして間接的に用いることができる。
【０１３３】
別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むＣＲＢＡＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療または予防のために、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。
【０１３４】
他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的配列またはベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与することもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するための適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることにより、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し得る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。
ＣＲＢＡＰのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる。詳細には、精製されたＣＲＢＡＰを用いて抗体を作り出したり、或いはＣＲＢＡＰに特異的に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングすることができる。ＣＲＢＡＰの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生することができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。
【０１３５】
抗体を産生するために、ＣＲＢＡＰか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いはそのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。ラット及びマウスは、モノクロナール抗体生成を含むダウンストリーム適用のための宿主として好ましい。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、以下に限定しないが、フロイントのアジュバント、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ及びジニトロフェノールが含まれる。ヒトで使用するアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０１３６】
ＣＲＢＡＰの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、またはその断片は、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。ＣＲＢＡＰアミノ酸の短い伸展部が、ＫＬＨのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の抗体が産生され得る。
【０１３７】
ＣＲＢＡＰのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．ら（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． ら（１９８５） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１ ：３１−４２；Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． ら（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． ら（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０参照）。
【０１３８】
更に、適切な抗原特異性および生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体」の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ． ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ， Ｓ． ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４参照）。或いは、当業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、ＣＲＢＡＰに特異的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって産生することができる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１０１３４−１０１３７参照）。
【０１３９】
抗体は、免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのｉｎ ｖｉｖｏの産生を誘導することにより産生することができる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら（１９８９）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．ら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９参照）。
【０１４０】
またＣＲＢＡＰに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことができる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントや、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａｂフラグメントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定可能なように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成し得る（例えば、Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１参照）。
【０１４１】
種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイムノアッセイには、一般にＣＲＢＡＰとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が含まれる。２つの非干渉ＣＲＢＡＰエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（ｔｗｏ ｓｉｔｅｓ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられ得る（Ｐｏｕｎｄ， 前出）。
【０１４２】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析等の種々の方法を用いて、ＣＲＢＡＰ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態におけるＯＰ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったものとして定義される。多数のＣＲＢＡＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体試薬に対して測定されたＫａは、ＣＲＢＡＰ抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＣＲＢＡＰエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬に対して測定されたＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａの値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高い親和性の抗体試薬は、ＣＲＢＡＰ抗体複合体が厳密な操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａの値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低い親和性の抗体試薬は、最終的にＣＲＢＡＰが活性化状態で抗体から解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ．及びＣｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１４３】
ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、ある一定のダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適合性を判定する。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬は、ＣＲＢＡＰ抗体複合体の沈殿を必要とする方法に使用することが好ましい。種々の適用における抗体の特異性、タイター、及び結合活性に対する処理、並びに抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である （例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出、及びＣｏｌｉｇａｎら， 前出を参照）。
【０１４４】
本発明の別の実施例では、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましい状況において、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、ＣＲＢＡＰの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子または断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、ＣＲＢＡＰをコードする配列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。
【０１４５】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に周知の方法を用いて、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するためのベクターを産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， 前出、及びＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， 前出 参照）。
【０１４６】
ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、ＣＲＢＡＰをコードする遺伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。ＤＮＡへ組み込みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアーゼにより無能となるまで、ＲＮＡ分子を転写し続け得る。一過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合にはさらに長い期間持続し得る。
【０１４７】
前述のように、ＣＲＢＡＰをコードする遺伝子の制御、５’、又は調節領域に対する相補配列、つまりアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計することによって、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から＋１０〜−１０の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせん体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能力を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ．ら（１９９４）Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．及びＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ，ｐｐ．１６３−１７７参照）。転写物のリボソームへの結合を阻止することによりｍＲＮＡの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセンス分子を設計し得る。
【０１４８】
リボザイム、つまり酵素ＲＮＡ分子を用いてＲＮＡの特異的切断を触媒することができる。リボザイム作用機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列の特異的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる。例えば、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、ＣＲＢＡＰをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。
【０１４９】
任意の潜在的なＲＮＡ標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続する配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドを動作不能（ｉｎｏｐｅｒａｂｌｅ）とする２次の構造的特徴について評価することができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接触性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の検査により評価することができる。
【０１５０】
本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含まれる。或いは、ＲＮＡ分子は、ＣＲＢＡＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことができる。或いは、構成的または誘導的に相補的なＲＮＡを合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。
【０１５１】
細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、ＲＮＡ分子は修飾することができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の５′末端及び／又は３’末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは２′Ｏ−メチルを使用を含む。この概念はＰＮＡ生成において固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく、イノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）のような従来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子に拡張可能である。
【０１５２】
細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様にｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用にも適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクションによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ．ら（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−４６６参照）。
【０１５３】
前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用することができる。
【０１５４】
本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、ＣＲＢＡＰ、ＣＲＢＡＰの抗体、ＣＲＢＡＰの模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような１以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホルモンと結合した形で患者に投与されうる。
【０１５５】
本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれ得る。
【０１５６】
有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤にするための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認められる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）の最新版に記載されている。
【０１５７】
経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められる担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。
【０１５８】
経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望により、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅ）を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えることができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤や、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０１５９】
糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらにはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣錠皮に加えることができる。
【０１６０】
経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる。軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。
【０１６１】
非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液、リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含みうる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂肪性の油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含まれる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。
【０１６２】
局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。
【０１６３】
本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化処理、カプセル化処理、エントラップ処理（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）或いは凍結乾燥処理により製造される。
この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤としては、使用前に緩衝剤配合したｐＨ４．５〜５．５の範囲にある１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、２％〜７％のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結乾燥粉末でもよい。
【０１６４】
医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治療のためにラベル付けできる。ＣＲＢＡＰの投与の場合では、このようなラベルには、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。
【０１６５】
本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するために有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内で十分行うことができる。
【０１６６】
任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルまたは腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにおいて見積もることができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトにおける投与量や投与経路を決定することができる。
【０１６７】
治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるＣＲＢＡＰまたはその断片、ＣＲＢＡＰの抗体、ＣＲＢＡＰのアゴニスト、ＣＲＢＡＰのアンタゴニスト、又はＣＲＢＡＰのインヒビターの有効成分の量を指す。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬方法により、例えばＥＤ５０（母集団の５０％における治療的な有効投与量）またはＬＤ５０（母集団の５０％の致死投与量）統計量を計算することによって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０ ／ ＥＤ５０比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すことが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環する濃度の範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じて、投与量はこの範囲内で変化する。
【０１６８】
正確な用量は、治療が必要な患者に関連する要因を考慮して医師が決定する。投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な患者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬剤、反応感受性、および治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物は、半減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて３〜４日毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与してもよい。
【０１６９】
通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲であり、最大約１ｇの総投与量まで、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献において提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用することができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。
【０１７０】
診断
別の実施例においては、ＣＲＢＡＰに特異的に結合する抗体を、ＣＲＢＡＰの発現によって特徴づけられる疾患の診断や、ＣＲＢＡＰ又はＣＲＢＡＰのアゴニスト、アンタゴニスト若しくはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのものと同様の方法で作製することができる。ＣＲＢＡＰの診断のアッセイには、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＣＲＢＡＰを検出するために抗体および標識を用いる方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識することができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのうちの幾つかについては前述の通りである。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む、ＣＲＢＡＰを測定するための種々のプロトコルが当技術分野では周知であり、またこれによりＣＲＢＡＰ発現の変化や異常性のレベルを診断するための基礎が得られる。ＣＲＢＡＰの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な患者から得られる体液或いは細胞抽出物とＣＲＢＡＰの抗体を結合させることによって確立できる。標準の複合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いて定量化できる。患者の生検組織からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたＣＲＢＡＰの量を、標準値と比較する。標準値と患者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメータを確立する。
【０１７２】
本発明の別の実施例において、ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドを、診断の目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドは、ＣＲＢＡＰの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検出や定量のために用いられる。診断アッセイは、ＣＲＢＡＰが存在、非存在、過剰発現の何れの状態かを識別したり、治療の処置の際にＣＲＢＡＰレベルの調節をモニタリングするために用いることができる。
【０１７３】
一態様では、ＣＲＢＡＰまたは密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、ＣＲＢＡＰをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、５’調節領域）に由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存されたモチーフ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増幅の（最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブがＣＲＢＡＰをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列も同定するかが決定される。
【０１７４】
プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましくはＣＲＢＡＰをコードする任意の配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡか、またＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の配列に由来するものか、或いはＣＲＢＡＰ遺伝子のイントロン、エンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列に由来するものでもよい。
【０１７５】
ＣＲＢＡＰをコードするＤＮＡのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段には、ｍＲＮＡプローブを作り出すためにＣＲＢＡＰ又はＣＲＢＡＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。このようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、その標識は、３２Ｐや３５Ｓのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等である。
【０１７６】
ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＣＲＢＡＰの発現に関連する疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限定はしないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌障害−カンジダ症−外胚葉性ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋若しくは心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性血栓性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、ブルトン型の伴性無ガンマグロブリン血症、後天性免疫グロブリン血症（ＣＶＩ）、ディジョージ症候群（胸腺形成不全）、ＩｇＡ単独欠損症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血小板減少及び湿疹を伴う免疫不全（ウィスコット‐アルドリッチ症候群）、チェディアック‐東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経性浮腫、及びクッシング病に関連する免疫不全等のような免疫異常症や、癌、血液透析、及び体外循環の合併症や、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物、及び寄生虫様の感染症や、心的外傷等の自己免疫異常／炎症性疾患；並びに嚥下障害、消化性食道炎、攣縮食道炎、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振症、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、洞性浮腫または幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、膵臓炎、膵臓癌、胆管疾患、肝炎、ビリルビン過剰血症、硬変、肝臓受動性うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ウィップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、エイズ腸症等の胃腸疾患；並びにアデノウイルス（急性呼吸器疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ性脈絡髄膜炎）、ブニアウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱病）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、パピローマウイルス（癌）、パラミキソウイルス（はしか、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）、ポックスウイルス（天然痘）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトＴリンパ指向性ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、及びトガウイルス（脳炎、風疹）によるウイルス感染や、肺炎球菌及びブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、ｎｏｒｃａｒｄｉｕｍ、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマに分類される細菌病原体による感染症と、コウジカビ及びブラストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ｍａｌａｓｅｚｚｉａ、ヒストプラスマ、及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染症と、プラスモディウムまたはマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ及びレーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物、住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症；並びにプロラクチン産生異常や、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症や、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生や、乳房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病（Ｐｅｙｒｏｎｉｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、男性の乳房および女性化乳房の癌等の生殖障害；並びにてんかん、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（ｎｅｕｒｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性及び代謝性、内分泌性の中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の分裂病性障害を含む精神障害と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、妄想性精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病等の神経疾患；並びに結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、ＰＯＡＧを含む緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経障害、中毒性視神経症、ガラス状剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、脈絡膜の黒色腫、眼球後腫瘍及び視神経交叉腫瘍等の眼疾患；並びに日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、肝硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性の夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫や、特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等の細胞増殖障害が含まれる。ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の生検組織や体液を利用するサザンブロット法またはノーザン分析、ドットブロット法或いは他の膜をベースとした技術や、ＰＣＲ技術や、ディップスティック試験法（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン、及びマルチフォーマットＥＬＩＳＡ様アッセイや、マイクロアレイにおいて用いて、ＣＲＢＡＰ発現の変化を検出することができる。このような定性的または定量的試験法は当業者に周知のものである。
【０１７７】
特定の態様では、特に上述のような関連疾患の存在を検出するアッセイにおいて、ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、またハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることができる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、対照サンプルに比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもできる。
【０１７８】
ＣＲＢＡＰの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な患者から採取された体液或いは細胞抽出物をＣＲＢＡＰをコードする配列又はその断片と結合させることにより達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な患者から得られる値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験から得られる値とを比較することにより定量することができる。このように正常なサンプルから得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。
【０１７９】
一旦疾患の存在が確認されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者で観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価できる。連続的なアッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示すことができる。
【０１８０】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（不十分もしくは過剰に発現されたもの）の存在が、疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するための手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に癌の発生や更なる進行を予防することができる。
【０１８１】
ＣＲＢＡＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの更なる診断のための使用法には、ＰＣＲ法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成されるか、酵素を用いて作製されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで作製されてもよい。オリゴマーは、好ましくはＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドの断片、またはＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子或いは状態を同定するための最適化された条件の下で用いられる。また密接に関連するＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密性の条件で用いることができる。
【０１８２】
またＣＲＢＡＰ発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の利用、及び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．ら（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ． ら（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈溶液中に存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実施することによって加速することができる。
【０１８３】
別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並びに治療薬の開発およびその活性のモニタリングにおいて有用である。
【０１８４】
マイクロアレイが準備され、それを用いて当業者に周知の方法で分析してもよい（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ．ら（１９９５） Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ＮＯ． ５，４７４，７９６； Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ら（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（１９９５） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｍ Ｄ．ら （１９９５） ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９５／３５５０５： Ｈｅｌｌｅｒ． Ｒ．Ａ． ら（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 並びにＨｅｌｌｅｒ． Ｍ．Ｊ．ら（１９９７） Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６０５，６６２を参照）。
【０１８５】
本発明の別の実施例においては、ＣＲＢＡＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作り出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の部分、又は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１作製物又は一本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーがある（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ．ら（１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：Ｉ２７−１３４； 並びにＴｒａｓｋ． Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。
【０１８６】
蛍光性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術や遺伝地図データと関連し得る（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈら（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ．９６５−９６８を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、またはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）に見られる。物理的な染色体地図上のＣＲＢＡＰをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定の疾病の素因との関連性が、疾患に関係するＤＮＡの領域の範囲を定めるのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、また発症した個体との間の遺伝子配列の違いを検出することができる。
【０１８７】
遺伝地図を拡大するために、染色体作製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連するマーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新たな配列を染色体のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニングまたは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値ある情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域（例えば、１１ｑ２２−２３に対する毛細血管拡張性運動失調 ）への遺伝連鎖による不完全な位置ぎめがなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０参照）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャリア、又は発症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違いを検出することもできる。
【０１８８】
本発明の別の実施例においては、ＣＲＢＡＰや、その触媒作用性または免疫原性断片、又はそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなスクリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているものであり得る。ＣＲＢＡＰと試験する薬剤との結合複合体の形成を測定することができる。
【０１８９】
別の薬物スクリーニング技術によって、目的のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４） ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４参照）。この方法においては、多くの異なる小形の試験化合物が固体基板において合成される。試験化合物をＣＲＢＡＰ又はその断片と反応させ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合ＣＲＢＡＰを検出する。また、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製されたＣＲＢＡＰをプレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。
【０１９０】
別の実施例においては、ＣＲＢＡＰの結合のためにＣＲＢＡＰと結合可能な中和抗体が試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法において、抗体を用いて、１以上の抗原決定基をＣＲＢＡＰと共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
【０１９１】
さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含め現在周知のヌクレオチド配列の特性に基づくものであれば、ＣＲＢＡＰをコードするヌクレオチド配列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。
【０１９２】
当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用できるであろう。従って、以下に記す特定の実施例は、単なる例示であって本発明を限定するものではない。
【０１９３】
本明細書に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６０４Ｐ］（１９９８年１０月１日出願）、米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６０５Ｐ］（１９９８年１０月６日出願）、米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６３９Ｐ］（１９９８年１１月１３日出願）及び米国特許出願［代理人明細書番号ＰＦ−０６４６Ｐ］（１９９８年１２月３日出願）については、ここで言及することにより本明細書の一部とする。
【０１９４】
【実施例】
１  ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したものか、表４に示した組織から単離したもである。幾つかの組織をグアニジニウムイソチオシアネート溶液中にホモジナイズして溶解し、一方では別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液等の適切な変性剤の混合液に溶解した。結果として得られた溶解物をＣｓＣｌクッションでの遠心分離し、或いはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムの何れかとエタノールで、或いは別の通常の方法でこの溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０１９５】
ＲＮＡのフェノール抽出および沈殿を必要な回数繰り返してＲＮＡの純度を高めた。場合によっては、ＲＮＡをＤＮアーゼで処理した。殆どのライブラリーの場合、ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）結合常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、又はＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｐｏｌｙ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。或いは、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）等の別のＲＮＡ単離キットを用いてＲＮＡを組織溶解物から直接的に単離した。
【０１９６】
場合によっては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供してそれに対応するｃＤＮＡライブラリーを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又はＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当業者に周知の推奨された方法若しくは類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリーを作製した（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出， ｕｎｉｔｓ ５．１−６．６を参照）。ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ）又は無作為のプライマーを用いて逆転写を開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを２本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、適切な（複数の）制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、 ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、若しくはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、又は分離用のアガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。適切なプラスミド（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又はｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）等）のポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ、若しくはＳＯＬＲ、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、若しくはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含むコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。
【０１９７】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
細胞溶解によって宿主細胞からプラスミドを回収した。Ｍａｇｉｃ若しくはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、及びＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットのうちの少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿の後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１９８】
或いは、高スループットフォーマットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｌｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。サンプルを処理して３８４−ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１９９】
３  配列決定および分析
配列決定のためのｃＤＮＡは、ＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、又はＨＹＤＲＡ マイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、又はＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）システムとＰＴＣ−２０００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒｓ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とを組合せて用いて準備した。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３若しくは３７７ 配列決定システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）並びに標準的なＡＢＩプロトコル、塩基対呼び出しソフトウェア、及びキットを用いて配列決定した。一実施態様においては、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡ配列決定システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてｃＤＮＡの配列決定を実施した。別の実施態様においては、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｗｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてｃＤＮＡの増幅および配列決定を行った。また別の実施態様においては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の溶液及び色素を用いてｃＤＮＡの配列決定を実施した。ＥＳＴに対する読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７のレビュー）を用いて決定した。ＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で伸長した。
【０２００】
ｃＤＮＡ及び伸長物の配列決定から得られたポリヌクレオチド配列は、当業者に周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて用いて構築および分析した。表５は、利用したツール、プログラム、及びアルゴリズムの概要、並びに適切な説明、引用文献、及び閾値パラメータを示す。表５の第１列は用いたツール、プログラム、及びアルゴリズムであり、第２列はそれらの簡単な説明であり、第３列は引用文献（それらの全てはここで言及することにより本明細書の一部とする）であり、第４列は２つの配列間の一致の程度の評価に用いた適切なスコア、確率値、及び他のパラメータである（スコアが高いほど２つの配列間の相同性が高い）。配列は、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。
【０２０１】
ポリヌクレオチド配列の確証は、ＢＬＡＳＴ、動的計画法、及びジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー、及びポリＡ配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実施した。次に、配列をＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムを用いてＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、及び真核生物のデータベースやＢＬＯＣＫＳデータベース等の公共のデータベースでから選択した配列に対して問合わせて注釈を得た。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、及びＣｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて配列を完全長のポリヌクレオチドに構築し、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ、及びＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いて読取り枠に対してスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いてその完全長のポリヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、及び隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づくＰＦＡＭなどのタンパク質ファミリーデータベースに問い合わせることによって分析した。ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を解析する確率的アプローチである（例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。一塩基多型は、Ｃｏｎｓｅｄ ｓｏｆｔｏｗａｒｅ（Ｇｏｒｄｏｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１９５−２０２； Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２７４５−２７５１）を用いて発見した。
【０２０２】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築および分析のための上述のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用した。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約２０から約４０００までのヌクレオチドの断片については、前述の「発明」の部分で説明した。
【０２０３】
４  ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するＲＮＡが結合している膜と、標識されたヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出， ｃｈ．７；並びにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら前出， ｃｈ．４および１６参照）。
【０２０４】
ＢＬＡＳＴを使用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱＴＭ  データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は、多くの膜をベースとしたハイブリダイゼーションに比べてより高速である。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは類似の何れとして分類されるかを決定することができる。
検索の基準は、以下で定義される積スコア（ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｃｏｒｅ）である。
（配列同一性％×最大ＢＬＡＳＴスコア％）／１００
積スコアは、２つの配列間の類似度および配列一致の長さの両方を考慮に入れる。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内の正確さであり、積スコア７０の場合は正確な一致となる。類似の分子は通常１５〜４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでは関連した分子として同定される。
【０２０５】
ノーザン分析の結果は、ＣＲＢＡＰをコードする転写物が発生したライブラリーの割合の分布として報告される。分析には、器官／組織および疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類が含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾病／障害／症状のカテゴリーには、癌、炎症／心的外傷、細胞増殖、神経、及び貯留（ｐｏｏｌｅｄ）が含まれる。各カテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリーを数えて、カテゴリー全体にわたるライブラリーの合計数で割った。各組織に特異的な発現ならびに疾病、疾患、若しくは症状に特異的な発現の割合を表３に示した。
【０２０６】
５  ＣＲＢＡＰをコードするポリヌクレオチドの伸長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片を伸長してこの断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて作り出した。一方のプライマーは既知の断片の５’の延長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の延長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２〜３０個のヌクレオチドからなる長さであって５０％以上のＧＣ含有物を有し、且つ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにｃＤＮＡから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー２量体を生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸長も回避した。
【０２０７】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要であるか、又は望ましい場合には、プライマーの付加的或いはネスト化した組を設計する。
【０２０８】
当業者に周知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度の増幅を実施した。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ  （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルプレートにおいて行った。反応混合液には、ＤＮＡ鋳型、２００ｎｍｏｌの各プライマーと、Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とが含まれる。プライマーの組ＰＣＩ Ａ及びＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメータを用いた。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
或いは、プライマーの組Ｔ７及びＳＫ＋に対して以下のパラメータを用いた。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ生成物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配し、ＤＮＡが試薬と結合可能なようにして測定した。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測し、またＤＮＡ濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌの一定分量を１％のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって解析し、何れの反応物が配列の伸長に成功したかを決定する。
【０２０９】
伸長したヌクレオチドを脱塩および濃縮し、３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を実施した。ショットガン配列決定のために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長したクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、更にコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質を含む培地で選択し、個々のコロニーを選択してＬＢ／２Ｘ ｃａｒｂ培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で終夜培養した。
【０２１０】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下のパラメータでＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
前述のようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の低いサンプルは、上記の条件で再度増幅した。サンプルを２０％のジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプライマー並びにＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）若しくはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。
【０２１１】
同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８−１４のヌクレオチド配列を使用し、上記手順、５’伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲノムライブラリーを用いて５’調節配列が得られる。
【０２１２】
６  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８−１４から得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片にも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような当技術分野のソフトウエアを用いて設計し、５０ｐｍｏｌの各オリゴマー、２５０μＣｉの［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を結びつけることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超微細分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、以下のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１、又はＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の中の１つで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。
【０２１３】
各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜（ＮｙＣＲＢＡＰｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）をブロットに対して数時間露出してフィルムに写した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０２１４】
７  マイクロアレイ
化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ， 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定のアレイを用いて、熱、ＵＶ、化学的もしくは機械的結合プロシージャを利用して、基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメントを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレイ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。
【０２１５】
完全長ｃＤＮＡ、発現された配列タグ（ＥＳＴｓ）、又はそれらの断片は、マイクロアレイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者に周知のＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）のようなソフトウェアを用いて選択可能である。本発明のヌクレオチド配列の１つに対応する完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、若しくはそれらの断片を、又は本発明に関連するｃＤＮＡライブラリーから無作為に選択されたものを、例えばスライドガラスのような適切な基板に配置する。そのｃＤＮＡを、例えばＵＶ架橋の後に熱的および化学的に処置し、さらに乾燥することによって、スライドガラスに固定する（例えば、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０； 並びにＳｈａｌｏｎ， Ｄ．ら（１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５参照）。蛍光プローブを作製し、基板上のエレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は前述の方法によって解析する。
【０２１６】
８  相補的ポリヌクレオチド
ＣＲＢＡＰをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生ＣＲＢＡＰの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約１５〜約３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア及びＣＲＢＡＰのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な５’配列から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用いる。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してＣＲＢＡＰをコードする転写物へのリボソームの結合を防ぐ。
【０２１７】
９  ＣＲＢＡＰの発現
ＣＲＢＡＰの発現及び精製は、細菌またはウイルスに基づく発現系を用いて実施される。細菌におけるＣＲＢＡＰの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘発によりＣＲＢＡＰを発現する。真核生物の細胞におけるＣＲＢＡＰの発現は、昆虫または哺乳動物の細胞株に、一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺伝子転移の何れかによって、ＣＲＢＡＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのｃＤＮＡの転写が行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染にも用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が必要となる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．ら（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ．ら（１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０２１８】
殆どの発現系において、ＣＲＢＡＰは、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧ若しくは６−Ｈｉｓ等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質として合成され、粗製の細胞溶解物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に１段階で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素のＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条件の下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後に、特定の操作部位においてＣＲＢＡＰからＧＳＴ部分をタンパク分解的に切断可能である。８個のアミノ酸のペプチドであるＦＬＡＧにより、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫親和性の精製が可能となる（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）。６個の連続したヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）における精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法については、Ａｕｓｕｂｅｌが（１９９５年， 前出， ｃｈ １０ ａｎｄ １６）論じている。これらの方法によって得られた精製されたＣＲＢＡＰを、以下のアッセイで直接用いることができる。
【０２１９】
１０  ＣＲＢＡＰ活性の実証
（ＣＲＢＡＰ−１）
ＣＲＢＡＰ−１の活性は、βガラクシド糖に結合する能力として実証される。ＣＲＢＡＰ−１をラクトシル−セファロースカラムに適用し、そのカラムを０．１Ｍのラクトースで溶離させる。溶出物中のＣＲＢＡＰ−１の存在は、ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出する。その存在は、βガラクシド糖に対するＣＲＢＡＰ−１の結合能力を示す。
（ＣＲＢＡＰ−２）
ＣＲＢＡＰ−２の活性は、ＨＡを加水分解する能力として実証される（Ｌｅｐｐｅｒｄｉｎｇｅｒ， 前出）。放射性標識されたＨＡを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で微量定量プレートに固定化する。ＣＲＢＡＰ−２とのインキュベーションの後に可溶化された放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定する。その放射活性は、開始のサンプルにおけるＣＲＢＡＰ−２に比例する。
（ＣＲＢＡＰ−３）
ＣＲＢＡＰ−３の活性は、Ｎアセチルグルコサミン関連タンパク質に対する認識、結合及び輸送能力に関連する。従って、ＣＲＢＡＰ−３活性はアフィニティークロマトグラフィーを用いてＮアセチルグルコサミン関連ペプチドの結合レベルとして測定される。ＣＲＢＡＰ−３を固相（例えば、アガロース）に付着させ、また１２５Ｉ−Ｎ３標識されたＮアセチルグルコサミン含有ペプチド（例えば、ウシ血清アルブミン；ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ）をカラムに入れ、相互作用可能とする（１時間）。次に、そのカラムを添加液で洗浄し、結合ペプチドを０．５Ｍの標識していないＮアセチルグルコサミンを含むバッファーの添加によって溶離させる。γカウンターを用いて放射活性についてのフラクションを収集及び測定する。ＣＲＢＡＰ−３の活性は、結合した放射性ペプチドの量に直接的に比例する。
（ＣＲＢＡＰ−４及びＣＲＢＡＰ−５）
ＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５についてのアッセイは、ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎの生化学的性質に基づくものである（Ｓｎｙｄｅｒ， 前出）。翻訳後のグリコシル化は、ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎに対する糖質成分の付着に帰着する。グリコシル化されたｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎモノマーが糖質に結合する植物タンパク質、レクチン・トウゴマ・アグルチニンＩ（ＲＣＡ）と高い親和性で結合し、一方で他の糖タンパク質がＲＣＡと結合しなことは、ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎの糖質成分が独特のものであることを示している。従って、ＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５の活性は、ＲＣＡに対する高い親和性の結合によって実証される。ＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５を還元剤で処理することによってモノマー化（ｍｏｎｏｍｅｒｉｓｅ）し、更にＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化する。この溶液に不活性な樹脂に結合させたＲＣＡを添加する。適切なインキュベーション時間が経過した後に、混合物を遠心分離して非結合のフラクションとＲＣＡ樹脂及びそれに結合した全ての物質とを分離する。ＲＣＡ樹脂を界面活性剤の存在下において還元剤で洗浄する。高い親和性で結合した物質を、Ｄ−ガラクトース、ＲＣＡの糖質結合部位に対して競合する糖で、ＲＣＡ樹脂から特異的に溶離させる。溶離及び液非結合のフラクションにおけるＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５の量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロットによってＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５に対する特異的抗体を利用して分析される。非結合のフラクションにおけるＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５に対する溶離液におけるＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５の割合は、ＲＣＡに結合したＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５の量に比例し、それはＣＲＢＡＰ−４若しくはＣＲＢＡＰ−５の活性の直接的な尺度である。
（ＣＲＢＡＰ−６及びＣＲＢＡＰ−７）
ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７は、糖質に対するＣ型レクチンの結合能力によって測定される。糖質は、糖質（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯから入手可能なラクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース）を含むアフィニティーカラムに対する組換え型のＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の結合能力を調査することによって、或いはＣｈｒｉｓｔａらに開示されたアッセイ（１９９４， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３７：１１４−１１８）を用いて実証され得る。ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の可溶性の形態（即ち、膜貫通ドメインが欠如している）が発現され、アフィニティーカラムに適用されることが好ましい。
【０２２０】
幾つかのＣ型レクチンは、細菌を凝集させることが知られている。ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の細菌を凝集させる能力は、Ｉｏｖａｎｎａらによって開示されたアッセイ（１９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４６６４−２４６６９）を用いて調査する。要するに、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地において細菌（例えば、Ｅ． ｃｏｉｌ系ＫＨ８０２又はＪＭ１０１）を３７℃で静止期まで成長させる。次に、その細菌を遠心分離によって収集し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において洗浄する。洗浄した細菌を０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／ ＣａＣｌ２）において再懸濁させ、微量定量プレートのウェル内に２００μｌの ＰＢＳ／ ＣａＣｌ２当たり約５×１０７の細菌の濃度で配置する。次に、ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７（好ましくは可溶性の形態）を種々の濃度（例えば、１〜５０μｇ／ｍｌ）で添加し、２５℃における３時間のインキュベーションの後で巨視的な凝集の存在をモニターする。５０μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ 及びアルブミンを正の対照及び負の対照としてそれぞれ用いることが出きる。
【０２２１】
或いは、ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の活性についてのアッセイでは、ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の過剰発現によって誘発される細胞集合の量を測定する。このアッセイにおいて、ＮＩＨ３Ｔ３等の培養される細胞は、強力なプロモータの調節下において適切な哺乳類の発現ベクターに含まれるＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７をコードするｃＤＮＡを形質移入される。緑色蛍光性タンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの蛍光性のマーカータンパク質をコードするｃＤＮＡでの同時形質移入は、安定な形質移入体の識別に有用である。形質移入された細胞に関連する細胞集合の量、即ち凝集塊を形質移入していない細胞のそれと比較する。細胞集合の量は、ＣＲＢＡＰ−６若しくはＣＲＢＡＰ−７の活性に比例する。
【０２２２】
１１  機能的アッセイ
ＣＲＢＡＰの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのＣＲＢＡＰをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでｃＤＮＡを発現する強力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選り抜きのベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）及びｐＣＲ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、その各々にはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。５〜１０μｇの組換えベクターを、リポソーム製剤或いは電気穿孔法によって、好ましくは内皮若しくは造血由来のヒト細胞株に一過性に形質移入する。また、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇの付加的なプラスミドを同時形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別することができ、また組換えベクターからのｃＤＮＡの発現を確実に予測できる。選り抜きの標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４、又はＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。自動化されたレーザー光学に基づいた技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰ又はＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、また細胞の特性（例えば、アポトーシスの状態）を評価する。ＦＣＭによって、先行する或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取込みを検出及び定量化する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって測定される核ＤＮＡ内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取込み量の低下によって測定されるＤＮＡ合成の下方制御、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面および細胞内のタンパンク質の発現の変化、並びにフルオレセイン結合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって測定される原形質膜組成の変化が含まれる。フローサイトメトリーの方法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．の （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記載されている。
【０２２３】
遺伝子発現におけるＣＲＢＡＰの影響は、ＣＲＢＡＰをコードする配列並びにＣＤ６４若しくはＣＤ６４−ＧＦＰの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価することができる。ＣＤ６４及びＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、ヒトＩｇＧ若しくはＣＤ６４の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転換されていない細胞から分離することができる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ， ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ＣＲＢＡＰ及び目的とする他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で解析することが可能である。
【０２２４】
１２  ＣＲＢＡＰ特異的抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５参照）、或いは他の精製技術を使用して実質的に精製されたＣＲＢＡＰを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して抗体を生成する。
【０２２５】
或いは、ＣＲＢＡＰのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。Ｃ−末端付近または親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細については当業者の文献に記載されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５， 前出， ｃｈ．１１参照）。
【０２２６】
通常、１５残基の長さのオリゴペプチドを、ｆｍｏｃ法の化学作用を利用するＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて合成し、ＭＢＳ（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ前出 参照）。ウサギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化する。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、１％ＢＳＡでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。
【０２２７】
１３  特異的抗体を用いる自然発生ＣＲＢＡＰの精製
ＣＲＢＡＰに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより、自然発生或いは組換えＣＲＢＡＰを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＲＢＡＰ抗体を、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。
【０２２８】
ＣＲＢＡＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＣＲＢＡＰを優先的に吸着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファー）でそのカラムを洗浄する。抗体／ＣＲＢＡＰ結合を分裂させる条件下（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ））でカラムを溶出させ、ＣＲＢＡＰを回収する。
【０２２９】
１４  ＣＲＢＡＰと相互作用する分子の同定
１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いて、ＣＲＢＡＰ或いはその生物学的に活性な断片を標識する（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９参照）。マルチウエルプレートのウエル内に予め配置した候補分子を、標識したＣＲＢＡＰと共にインキュベートし、洗浄し、標識したＣＲＢＡＰ複合体を有する任意のウエルをアッセイする。種々のＣＲＢＡＰ濃度で得られたデータを用いて、ＣＲＢＡＰと候補分子との会合、親和性、及び数についての値を計算する。
【０２３０】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。
【０２３１】
表の簡単な説明
表１には、ＣＲＢＡＰをコードする完全長の配列を構築するために用いたポリペプチド配列およびヌクレオチド配列のＩＤ番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）、クローンＩＤ番号、ｃＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ断片を示す。
【０２３２】
表２には、潜在的モチーフ、及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、及びＣＲＢＡＰの同定に用いた方法及びアルゴリズムを示す。
【０２３３】
表３には、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、障害、又は症状と、各ＤＮＡがクローニングされたベクターとを示す。
【０２３４】
表４には、ＣＲＢＡＰをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリーを作製するのに用いた組織を示す。
【０２３５】
表５には、ＣＲＢＡＰの分析に用いたツール、プログラム及びアルゴリズム並びにそれらの説明、引用文献及びパラメーター閾値を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＣＲＢＡＰ−１（７１４０２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８（ＧＩ ２８１０９９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用した。
【図１Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−１（７１４０２９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−８（ＧＩ ２８１０９９４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【図２Ａ】
ＣＲＢＡＰ−２（１４５０７７５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図２Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−２（１４５０７７５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図２Ｃ】
ＣＲＢＡＰ−２（１４５０７７５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図２Ｄ】
ＣＲＢＡＰ−２（１４５０７７５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図２Ｅ】
ＣＲＢＡＰ−２（１４５０７７５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓヒアルロニダーゼ（ＧＩ １４４８６１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図３Ａ】
ＣＲＢＡＰ−３（３３６９３５０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びヒトＴＧＲ−ＣＬ１０Ｃ（ＧＩ １２４７１２４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用した。
【図３Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−３（３３６９３５０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びヒトＴＧＲ−ＣＬ１０Ｃ（ＧＩ １２４７１２４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【図４Ａ】
ＣＲＢＡＰ−４（１６４８２１４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の残基１４７から残基４０２、ＣＲＢＡＰ−５（２７４３２９５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の残基１５９から残基４０９、及びラットＮＯＲＧ−ＡＭＺ（ＧＩ ４４２３６８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の残基２０４から残基４５７の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用した。
【図４Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−４（１６４８２１４； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の残基１４７から残基４０２、ＣＲＢＡＰ−５（２７４３２９５； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の残基１５９から残基４０９、及びラットＮＯＲＧ−ＡＭＺ（ＧＩ ４４２３６８； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）の残基２０４から残基４５７の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【図５Ａ】
ＣＲＢＡＰ−６（２８２１０１１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）及びウシの肺のＳＰ−Ｄ（ＧＩ ４１５９３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用した。
【図５Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−６（２８２１０１１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）及びウシの肺のＳＰ−Ｄ（ＧＩ ４１５９３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【図６Ａ】
ＣＲＢＡＰ−７（２９２１９２０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎ（ＧＩ ３３５７９０９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【図６Ｂ】
ＣＲＢＡＰ−７（２９２１９２０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｌｅｃｔｉｎ（ＧＩ ３３５７９０９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成にはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエアのマルチシーケンス・アライメントプログラムを使用した。
【表１】2004533201.tif 000003
【表２】2004533201.tif 000004
【表３】2004533201.tif 000005
【表４】2004533201.tif 000006
【表５】2004533201.tif 000007
【表６】2004533201.tif 000008
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533201.tif 000129
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533201.tif 000131
【国際調査報告】
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