(57)【要約】本発明は、アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）、そのような分子を修飾する酵素、及びＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドの何れかとの間の相互作用を変調させる化合物を、閃光近接効果を探索することにより、同定及び／又は定量するための新規な方法、アッセイ及びキットを記載する。アミノグリコシドをコートされた閃光支持体を利用する本発明は、高処理量のスクリーニングフォーマットに適合され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性標識されたアミノグリコシド結合分子（ＡＢＭ）をサンプル中で同定及び／又は定量する方法であり、以下の工程：
ａ）少なくともＡＢＭ及び酵素を含むサンプルを用意し；
ｂ）サンプル中に存在する放射性標識された官能基をＡＢＭに添加するか、又はＡＢＭ中に存在する放射性標識された官能基を分割することを、上記酵素に許容し；
ｃ）サンプルを、閃光化合物を含浸させてアミノグリコシドで覆った一つ又は複数の固相支持体とインキュベートし；そして
ｄ）上記支持体により生成した閃光近接シグナルを測定することを含む方法。
【請求項２】
工程（ｃ）及び（ｄ）の間にサンプルと支持体を分離する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）に従い用意される異なるサンプルが、等量のＡＢＭ、サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる、等量の酵素、及び一つ又は複数の化合物を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）に従い用意される異なるサンプルが、等量のＡＢＭ、サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる、等量の酵素を含むが、工程（ｃ）の前又は間に添加された一つ又は複数の化合物を伴うか又は伴わない、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）に従い用意される異なるサンプルが、等量のＡＢＭ、サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる酵素を含む可能性のある分子の異なる混合物を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）に従い用意される異なるサンプルが、サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる、等量の酵素、及びＡＢＭを含む可能性のある分子の異なる混合物を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
ＡＢＭと、サンプル中に存在する放射性標識あをＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる酵素の間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのアッセイであって、請求項３記載の方法により得られた支持体により生成した閃光近接シグナルを比較する、アッセイ。
【請求項８】
化合物が酵素の有力な阻害剤である、請求項７記載のアッセイ。
【請求項９】
ＡＢＭとアミノグリコシドの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのアッセイであって、請求項４記載の方法により得られた支持体により生成した閃光近接シグナルを比較する、アッセイ
【請求項１０】
化合物がアミノグリコシド修飾細菌酵素である、請求項９記載のアミノグリコシド。
【請求項１１】
サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる酵素を同定及び／又は定量するためのアッセイであって、請求項５記載の方法により得られた支持体により生成した閃光近接シグナルを比較する、アッセイ。
【請求項１２】
請求項６記載の方法により得られた支持体により生成した閃光近接シグナルを比較する、ＡＢＭを同定及び／又は定量するためのアッセイ。
【請求項１３】
アッセイに含まれる化合物の一つと競合するか、又は変更する化合物を添加する、請求項７乃至１２記載のアッセイ。
【請求項１４】
閃光支持体がビーズである、請求項７乃至１３記載のアッセイ。
【請求項１５】
アッセイがネオマイシンである、請求項７乃至１４記載のアッセイ。
【請求項１６】
ＡＢＭがモノ−又はポリリン酸化されたホスホイノシチドである、請求項７乃至１５記載のアッセイ。
【請求項１７】
ＡＢＭがＲＮＡ分子である、請求項７乃至１５記載のアッセイ。
【請求項１８】
酵素がホスホイノシチドキナーゼである、請求項１６記載のアッセイ。
【請求項１９】
サンプル中の放射性標識されたアミノグリコシド結合分子を同定及び／又は定量するための、アミノグリコシドでコートされた閃光固相支持体の使用。
【請求項２０】
アミノグリコシドでコートされた閃光固相支持体を含む、アミノグリコシド結合分子、そのような分子を修飾する酵素、又はＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドの何れかの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）を同定及び／又は定量するための新規な方法、アッセイ及びキット、そのような分子を修飾する酵素、又はＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドとの間の相互作用を変調させる化合物に関する。
【０００２】
発明の背景
高処理量スクリーニング技術の分野における最近の進展は、応用の範囲を広げ、そして材料、フォーマット、固定化方法及び検出システムの選択が、溶液ベースのアッセイ及び細胞ベースのアッセイの両方において今利用可能である（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，２０００）。
【０００３】
新規な分析技術及びスクリーニング技術は、反応物が固定化されて次に一つ又は複数の反応物に暴露される固相支持体（プレート、チューブ又はビーズの形態）をしばしば利用し、支持体自身の上又は反応溶液中において測定可能なシグナルを生じる。固定化工程は、異なる反応及び／又は試薬の間の分離を単純化する可能性を提供し、そして当該シグナルの増幅を可能にさせるかもしれない。そのような効果は、例えば、固定化された分子から放射された放射線により励起されて、標識グループのみにより生じたシグナルを複製するか又は堅実に変更させる、閃光を発する（scintillant）分子に固相支持体を飽和させる（impregnating）ことにより、得ることができる（Ｍｅｚａ，２０００）。
【０００４】
当節、様々な無機又は有機のポリマーコア組成物が多くのリガンドの有効な固定化、並びに閃光を発する分子の飽和（scintillant impregnation）を可能にさせ、分離及び／又は閃光及び波長−特異的蛍光又は吸光のような、感度の高い検出を促進させる。
【０００５】
これらの特性に基づく固相アッセイのうち、閃光近接アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）（ＳＰＡ）が、酵素基質、抗体、蛋白質又はＤＮＡのような放射性標識分子の使用を含む多くの生物学アッセイに広く適用されてきた。上記の技術は、弱い放射性同位元素（例えば、３Ｈ，１２５Ｉ，３３Ｐ，３５Ｓ）で標識された分子から放射されたβ線が、エネルギーが放散される前の水性環境においては限定された距離のみにしか移動しないとの発見に依存する。これらの放射は、放射性標識された分子が閃光化合物（例えば、２，５−ジフェニルオキサゾル）の極めて近傍に来て、それにより特定の放射を引き起こすならば、多大な感度をもって検出できる。溶液中に残ったままの放射性標識された分子は、それらが閃光固相支持体から遠く離れているために、検出されない。リガンドが固定化されるそのような支持体は通常はポリマー（ポリスチレン、ポリビニルトルエン、又はイットリウム−由来のポリマー類）であって、微小球（microspheres）（ＥＰ１５４７３４，ＵＳ４２７１１３９）又は９６−／３８４−ウエルマイクロプレート（ＥＰ５７６０９０）の形態で使用することができる。
【０００６】
生物学上関連のある分子をコートされたＳＰＡビーズは市販されている（アマシャム）。例えば、ＳＰＡビーズは、固定化されたプロテインＡを用いて放射性標識された抗体の感度の高い検出、固定化されたグルタチオンを用いて放射性標識されたＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合蛋白質の感度の高い検出、あるいは固定化されたストレプトアビジンを用いてビオチン化放射性リン酸化キナーゼの感度の高い検出を可能にさせ得る。別のＳＰＡ−に基づく市販の技術（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標），ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ）は、ウエルがポリスチレンビーズの閃光物質によりコートされたポリスチレンマイクロプレートを利用する。しかしながら、アミノグリコシドの固定化を実施することによりＳＰＡ−に基づくアッセイを確立し得ることは従来技術において知られていない。
【０００７】
アミノグリコシドは親水性の多電荷の化合物であって、糖質（carbohydrates）に極めて近親であり、そのバックボーン構造は、アミンで飽和したアミノシクリトール環及び特定の位置のヒドロキシル置換からなる。アミノグリコシドは、それらが含む塩基性の強い極性基のために、高い柔軟性、高い水溶性、及び脂質への相対的に低い溶解性を示す（Ｚｅｍｂｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【０００８】
アミノグリコシドは、それらのグリコシド結合の位置、並びに２−デオキシストレプトアミン基の存在及び置換に基づく構造種に分類できる。しばしばアミノグリコシドとして考えられる若干の化合物はアミノ糖を実際は含まず、よって、用語アミノシクリトールが、正確さの劣る「アミノグリコシド」なる用語よりも、分子のこの基全体を記載するために導入され、共通に受け入れられて、単一化のために今後は使用される。
【０００９】
ネオマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、カナマイシン、アミカシン及びストレプトマイシンのようなアミノグリコシドは、それらの抗生物質特性に関してよく知られている。これらの分子は、インビボ及びインビトロにおいて様々な生物学上の分子に結合することができる。
【００１０】
細胞膜レベルでは、アミノグリコシドは、膜二層のマイナー成分である陰性荷電したホスホリピッドであるポリホスホイノシチドに結合し、細胞壁の透過性及び他の生化学特性を摂動する（Ｍｉｎｇｅｏｔ−Ｌｅｃｌｅｒｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００１１】
細胞内レベルでは、増大する数の核酸構造、特にＲＮＡがアミノグリコシドによりそれらの作用において結合されて変調されることが示された。アミノグリコシドにより認識されて変化されたＲＮＡ標的の例は、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、及び他の非コーディングＲＮＡ配列である（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。アミノグリコシドは細菌の酵素により修飾でき、変化された分子の低下した抗微生物特性のために、これらの酵素を有する生物体に対して耐性の特性を提供する（Ｌｌａｎｏ−Ｓｏｔｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１２】
アミノグリコシド−ホスホイノシチド相互作用の特異性は、構造レベルにおいて研究されており、内耳及び腎臓細胞の患者への障害性作用をも決定する疎水性相互作用及び親水性相互作用の両方の関与を証明する（Ｓｃｈａｃｈｔ，１９８６）。
【００１３】
ネオマイシンは、同じファミリーの別の抗生物質のように、７０年代後半から、ホスホイノシチドにより有効に結合されることが知られている。そのような相互作用は、ネオマイシンが固定化された支持体上での親和性クロマトグラフィーによりポリホスホイノシチドを抽出及び精製するために活用された（Ｓｃｈａｃｈｔ，１９７８）。アミノグリコシドの固定化は、セファロース（ＷＯ９００８５８４，ＪＰ６１９７６４１８）、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｓａｃｈｅｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、又は医薬装置（ＥＰ３７２１３０）のような固相支持体上で達成された。同じ原理に基づく他の応用は、ポリホスホイノシチドを含むリポソームの選択的分離及び凝集（Ｒｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｖａｎ  Ｂａｍｂｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、又はポリホスホイノシチドの細胞膜及び細胞内小胞内での検出（Ａｒｂｕｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）である。
【００１４】
さらに、蛍光標識されたアミノグリコシドがＲＮＡ−結合化合物をスクリーニングするのに有用であることが知られている（ＷＯ９６３５８１１）。アミノグリコシド抗生物質の取り込みを促進し、そしてアミノグリコシドのようなホスホイノシチドポリホスフェート又は誘導体及び標識されたポリアミンを含む組成物が当業界において公知である（ＷＯ００１８９４９）。これらの組成物は、細胞内のカルシウムの流れを監視し、そしてホスホイノシチドと相互作用する蛋白質、特にキナーゼのアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするため、アミノグリコシドの取り込み及び局在性の可視化、哺乳類細胞に対するアミノグリコシド抗生物質の細胞障害性を最小にする化合物のスクリーニングを助けるものとして記載された。アミノグリコシド及びホスホイノシチドの何れかを蛍光化合物に共有結合させることができる。
【００１５】
アミノグリコシドの結合特性は、蛋白質合成を阻害し、メッセンジャーＲＮＡの翻訳の忠実度を低下させ、そして細菌の細胞膜の完全状態を破壊することにより、細菌の浄化を可能にする。アミノグリコシドの生物学上のリガンド類との相互作用は、即ち、顕著な生理学上の効果を有し、そしてアミノグリコシド結合分子（ＡＭＢｓ）を同定及び／又は定量する方法、そのような分子を修飾する酵素、及びＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドとの間の相互作用を変調させる化合物は、特に、高処理量フォーマットと適合可能ならば、多くの重要な応用を有する。
【００１６】
アミノグリコシドと生物学上のリガンドの間の相互作用を活用することにより研究できる生理学上の機構の例は、細胞膜ホスホイノシチドのリン酸化により構成される。
ホスホイノシチドは、イノシトール頭部基の１’位へのホスホジエステル結合により結合したジアシル−グリセロールからなる、ホスファチジルイノシトールと呼ばれる塩基性構造を有する。ジアシルグリセロール（典型的には、ステアリル−アラキドジル）のアシル鎖を膜の二層の内部の小葉に挿入する。サイトゾルのイノシトール頭部基は、３’，４’，５’又はそれらの組み合わせの上で、イノシトール環上の一カ所に特異的なホスホイノシチドキナーゼ（ＰＩＫｓ）と呼ばれる酵素により、さらにリン酸化してよい。そのような異なるリン酸化状態は、高度な特異性を有する化合物を特性決定する。特に、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋｓ）は、イノシトール環Ｉの３’位内で膜イノシトール脂質をリン酸化して、続いてホスホリピッド第２メッセンジャーを生成することにより、多くの細胞プロセス（例えば、運動性、増殖、分化、アポトーシス、膜輸送、及び糖質代謝）の制御において役割を担い、細胞内シグナルトランスダクションの主要な経路の一つを代表する、偏在して発現される酵素のファミリーを形成する（ＵＳ６０１７７６３；Ｌｅｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，２０００；Ｃｏｍｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｅｎｔ，２００２；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１７】
これまで、８つの哺乳類ＰＩ３Ｋｓが同定されて、配列相同性、構造、結合パートナー、活性化の様式、及びインビトロ基質選択性を基に、３つの主要なクラス（Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ）に分類された。全てのＰＩ３Ｋｓは当該酵素のＣ末端に向かって位置するキナーゼドメイン、骨格様らせん領域、及びホスホリピッドに結合することが知られているＣ２ドメインを共有する。当該酵素のＮ末端は、アダプターサブユニットと他の蛋白質の相互作用が起こると信じられており、高度に可変性である。それらの触媒ドメインがホスホイノシチド４−キナーゼ（ＰＩ４Ｋｓ）、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ及びｍＴＯＲキナーゼのように、ＰＩ３Ｋｓのそれらに似ている、多数の他の酵素が同定された。
【００１８】
リン酸化のために利用可能な３’基を有する他のホスファチジルイノシトールはＰＩ３Ｋｓにより修飾できるが、主要な細胞基質はホスファチジルイノシトール（４，５）−ビスホスフェート（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、ＰＩＰ２又はＰＩ（４，５）Ｐ２とも示される）である。いくつかのＧ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストによるＰＩ３Ｋｓの活性化に際して、成長因子又は炎症性サイトカイン類、ＰＩ（４，５）Ｐ２はホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリホスフェート（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３、ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３、ＰＩＰ３とも示される）に変換される。この後者の分子は、インビボにおいて、ＰＩ３Ｋのいくつかの下流のエフェクターのリン酸化及び活性化を含む広く様々なシグナリング事象に必須の第２メッセンジャーとして特性決定された。さらに、プレクストリン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同性（ＰＨ）又はフォクス（Ｐｈｏｘ）相同性（ＰＸ）ドメインを含み、そしてそれらの機能のために膜結合を必要とするいくつかの蛋白質は、異なるリン酸化部位に対する広い範囲の特異性及び親和性をもってホスホイノシチドに結合することにより、細胞膜に直接相互作用する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１９】
４つのクラスＩのＰＩ３Ｋｓ（α、β、γ及びδアイソフォーム）が、異なるか又はオーバーラップする細胞機能との関連においてヒト及び他の哺乳類において記載され、そしてＰＩ３Ｋｓは構造レベル及び機能レベルの両方において良好に特性決定された。ＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ及びＰＩ３Ｋδは広く発現されており、そしてＳＨ２ドメインを含むアダプター分子を通して成長因子受容体チロシンキナーゼ及び他の細胞内ホスホチロシン含有蛋白質に相互作用することにより、活性化される。対照的に、ＰＩ３Ｋγは造血細胞（特に、白血球）においてのみ発現され、そしてそれはＳＨ２ドメインを含まないアダプター分子を通して、Ｇ蛋白質βγ−サブユニットとの相互作用及び活性化を通して、Ｇ蛋白質共役受容体に応答することが示された唯一のアイソフォームである。興味を引くのは、ＰＩ３Ｋγを欠くマウスが他の表現型の間で白血球移動を明らかに欠損しており、そして隔壁ショックに感受性が低いことから、細胞移動におけるＰＩ３Ｋアイソフォームの役割が示唆される（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＰＩ３Ｋアイソフォームの機能上の特殊化は、受容可能な副作用によるアイソフォーム選択性の阻害が多くの症状において治療上有用であることを示唆する。ＰＩ３Ｋγは、悪性腫瘍疾患及び炎症性又は免役成分による他の疾患のように、白血球の移動を含む炎症性プロセスの治療のための引き付けられる薬剤標的候補のように思える。
【００２０】
２つの分子がＰＩ３Ｋｓの阻害剤として主として研究されており、呼吸器突発活性（respiratory-burst activity）の阻害剤として以前は知られていたウオルトマニン（Ａｒｃａｒｏ  ａｎｄ  Ｗｙｍａｎｎ，１９９３）とＬＹ２９４００２（Ｐｏｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）である。ウオルトマニンとＬＹ２９４００２は短期間のアッセイにおいて細胞レベルにてＰＩ３Ｋｓの活性化の生物学上の機能を解明するために広く使用されたが、これらの化合物はそれらの薬学上の能力を制限する特定の特性を有する。ウオルトマニンとＬＹ２９４００２の両者が乏しい選択性しか示さないのは、異なるクラスＩのキナーゼが匹敵する濃度において阻害されるからである（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，２０００）。さらに、ウオルトマニンはナノモラー濃度において不可逆的にＰＩ３ＫγＡＴＰ結合部位に結合するが、分子は全く不安定であるのに対して、ＬＹ２９４００２はナノモラー濃度において競合的にＰＩ３ＫγＡＴＰ結合部位に結合するが、それは溶解性の問題を有する分子である。ウオルトマニンとＬＹ２９４００２の多数の化学修飾がなされたが、ほんのわずかなものしか親化合物よりも顕著に能力のある分子を提供しなかった（Ｃｒｅｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００２１】
様々な技術がＰＩ３Ｋγ又は他のＰＩ３Ｋ関連キナーゼのスクリーニングの処理量を改善することに関して試験され、より有力且つ特異的な阻害剤を同定した。これらの方法の全ては、共通に、キナーゼと基質（通常は、ホスホイノシチド）、放射性標識された前駆体（［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ又は［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ）及び有力な阻害剤のインキュベーションを含むが、アッセイを確立するためにこれらの基本の成分がアレンジ又は修飾される方法は、アッセイの処理量及び感度に対して十分な効果を有することができる。
【００２２】
従来技術は、ＰＩ３Ｋ関連キナーゼのリン酸化活性を干渉する化合物を同定するための異なるシステムを開示しており、有力な阻害剤に共役させたモイエティに特異的な抗体によるか（ＷＯ９８５５６０２）、有力な阻害剤に暴露された細胞の運動性の変化の分析によるか（ＷＯ９９３５２８３）、クロマトグラフィー分離に組み合わせた脂質の抽出によるか（Ｗａｒｄ，２０００）、直接標識されたアミノグリコシドによるか（ＷＯ００１８９４９）、又は薄層クロマトグラフィーによる（Ｆｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。そのようなアッセイは、実施するのが面倒であり、自動化が難しく、そして放射性の浪費による問題と出費の問題を生じる。
【００２３】
いくつかの高処理量のスクリーニング技術がホスホイノシチドを修飾する酵素を研究するために開発された。［３Ｈ］ＰＩ（４，５）Ｐ２によりコートされたＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）マイクロプレートは、この分子を共有結合により取り込むことによるか及び／又は疎水性相互作用により生成され、そしてホスホグリセリドのジアシルグリセロール及びリン酸化アルコールへの加水分解を触媒する酵素であるホスホリパーゼＣを試験するのに使用された。このアッセイは、しかしながら、水性相の中を移動してのちに除去される［３Ｈ］イノシトールの生成のために、マイクロプレート内の放射性の減少を測定する（ＷＯ９９３２６５５）。あるいは、ホスホイノシチドは、ポリエチレングリコール又はサクシニミドのようなリンカーモイエティを使用して閃光基質上に共有結合させて、ホスファチジルイノシトールキナーゼをアッセイしてこれらの酵素を阻害する化合物をスクリーニングするのに有用な組成物を提供する（ＷＯ００００５８４）。
【００２４】
しかしながら、アミノグリコシドで覆われた閃光性支持体が、アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）、そのような分子を修飾する酵素、ＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドの何れかの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するための一般的な手段として使用できるとの示唆はない。
【００２５】
発明の概要
今、結果として生じた閃光近接シグナルを測定することにより、閃光性固相支持体上に固定化されたアミノグリコシドが、アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭ）へ添加又は分割された適切に放射性標識された官能基の有効な固定化及び検出を可能にすることを証明した。
【００２６】
即ち、本発明の目的は、放射性標識されたアミノグリコシド結合分子（ＡＢＭ）をサンプル中で同定及び／又は定量する方法であり、当該方法は、以下の工程：
ａ）少なくともＡＢＭ及び酵素を含むサンプルを用意し；
ｂ）サンプル中に存在する放射性標識された官能基をＡＢＭに添加するか、又はＡＢＭ中に存在する放射性標識された官能基を分割することを、上記酵素に許容し；
ｃ）サンプルを、閃光化合物を含浸させてアミノグリコシドで覆った一つ又は複数の固相支持体とインキュベートし；そして
ｄ）上記支持体により生成した閃光近接シグナルを測定することを含む。
【００２７】
サンプルの調製において使用される基準及び／又は反応物に依存して、上記方法は様々な態様に適用することができ、その際、閃光支持体と放射性標識ＡＢＭの間の近接のために各サンプル中で生じた放射（emission）を測定することにより、同じ基準により調製されたサンプルを比較する。
【００２８】
好ましい態様において、本発明は、工程（ａ）に従い用意されて、等量のＡＢＭ、等量の上記酵素を含み、一つ又は複数の追加の化合物を含むか又は含まない、別々のサンプルと共にインキュベートされた、アミノグリコシドをコートされた閃光支持体により生じた閃光近接シグナルを比較することにより、サンプル中に存在する放射性標識された官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識官能基を分割できる酵素と、ＡＢＭの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するアッセイを提供する。
【００２９】
別の好ましい態様において、本発明は、工程（ａ）に従い用意されて、等量のＡＢＭ、等量の上記酵素を含み、工程（ｃ）の前か又は間に添加された一つ又は複数の追加の化合物を含むか又は含まない、別々のサンプルと共にインキュベートされた、アミノグリコシドをコートされた閃光支持体により生じた閃光近接シグナルを比較することにより、ＡＢＭとアミノグリコシドの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するアッセイを提供する。
【００３０】
別の好ましい態様において、本発明は、サンプル中に存在する放射性標識された官能基をＡＢＭに添加するか又はＡＢＭ中に既に存在する放射性標識された官能基を分割するすることができる酵素を、工程（ａ）に従い用意されて、等量の同じＡＢＭ及びそのような酵素を含む可能性のある分子の別の混合物を含む、別々のサンプルと共にインキュベートされた、アミノグリコシドをコートされた閃光支持体により生じた閃光近接シグナルを比較することにより、同定及び／又は定量するアッセイを提供する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、工程（ａ）に従い用意されて、等量の同じ酵素及びＡＢＭを含む可能性のある分子の別の混合物を含む、別々のサンプルと共にインキュベートされた、アミノグリコシドをコートされた閃光支持体により生じた閃光近接シグナルを比較することにより、ＡＢＭを同定及び／又は定量するアッセイを提供する。
【００３２】
前記のアッセイは、工程（ａ）及び（ｂ）において使用されたもの又はアミノグリコシド修飾酵素以外のＡＢＭのような、アッセイに含まれる成分の一つと競合するか又は変更する化合物を添加することにより、直接様式又は競合様式にて適用することができる。さらに、これらの方法は、例えばネオマイシンでコートされた閃光ビーズを利用するホスホイノシチド３−キナーゼの有力な阻害剤をアッセイするための高処理量フォーマットにおいて、サンプルの実行可能なアッセイを生じさせる。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、アミノグリコシドでコートされた閃光固相支持体及びサンプル中の放射性標識されたアミノグリコシド結合分子を同定及び／又は定量するためのそれらの用途を提供する。
【００３４】
最後に、本発明は、アミノグリコシドでコートされた閃光固相支持体を含む、アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）、そのような分子を修飾する酵素、又はＡＢＭｓと酵素又はアミノグリコシドの何れかの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのキットを提供する。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、β線を放射する同位体と閃光支持体の間の近接のために、分子の特定のクラスに対するアミノグリコシドの親和性に関する知見と、シグナル増幅に基づいた技術を組み合わせる。アミノグリコシド媒介性の相互作用の特異性及び強度は、適切に標識されたＡＢＭと、アミノグリコシドにより覆われた閃光固相支持体に接触して分析されるサンプルが一度取り付けられた支持体の間で生成された閃光近接シグナルの信頼できる同定を可能にさせる。基本的な原理を一度理解すれば、上記発明は、様々な分析方法に適用でき、そして関連するＡＢＭｓと、サンプル中に存在する放射性標識官能基をＡＢＭｓに添加するか、又はＡＢＭｓ中に既に存在する放射性標識官能基を分割することができる酵素を使用する。
【００３６】
本発明の方法は、放射性標識されたアミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）のサンプル中における同定及び／又は定量を可能にさせ、
ａ）少なくともＡＢＭ及び酵素を含むサンプルを用意し；
ｂ）サンプル中に存在する放射性標識された官能基をＡＢＭｓに添加するか、又はＡＢＭｓ中に既に存在する放射性標識官能基を分割することを上記酵素に許容し；
ｃ）閃光化合物を含浸させてアミノグリコシドで覆った一つ又は複数の支持体と上記サンプルをインキュベートし；
ｄ）上記閃光支持体により生じた閃光を測定することを含む。
【００３７】
工程（ａ）においてサンプルの用意において使用された基準及び／又は反応物を変え、そして異なるサンプルを比較することにより、本発明は、様々な分子の存在及び活性をアッセイするのに適用することができ、記載を通じて明らかとなる。
【００３８】
アミノグリコシド結合分子（ＡＢＭｓ）は、適切に標識された場合に、特定の閃光近接シグナルの生成を可能にするのに十分な親和性をもってあらゆるアミノグリコシドコート閃光支持体と相互作用する全ての化合物を意図する。このシグナルの特異性は、他の種類のモイエティにより閃光支持体を用いることにより得られるシグナルを比較することにより測定できるが、固定化されたアミノグリコシドに関する強い親和性を示して、閃光近接アッセイと和合性の放射性標識された官能基によりインビボ及びインビトロにおいて修飾できる生物学上の化合物の２つの主要なクラス：核酸（特にＲＮＡｓ）及びホスホリピッドが存在する。
【００３９】
様々な起源及び構造（リボザイム、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー及び非コーディングＲＮＡｓを含む）を有するＲＮＡ分子は、一つ又は複数のアミノグリコシドに関する強い親和性を示した（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。各ＲＮＡ種は同じ親和性及び同じ様式にて全てのアミノグリコシドにより結合されない。よって、ＲＮＡ及び／又はＲＮＡ修飾酵素（蛋白質又は別のＲＮＡ）が研究されようとすることに依存して、適切なＲＮＡがサンプル中に含まれて、適切なアミノグリコシドが閃光支持体上に固定化される。従来技術は、特定のＲＮＡ−アミノグリコシド複合体のいくつかの例を示す（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｃｈｏ  ａｎｄ  Ｒａｎｄｏ，１９９９）。
【００４０】
ホスホリピッド−アミノグリコシドの相互作用及びアミノグリコシドのホスホリピッド修飾酵素に対する作用が数年来研究されて探索されてきた（Ｓｃｈａｃｈｔ，１９８６；Ｍｉｎｇｅｏｔ−Ｌｅｃｌｅｒｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。化学官能基を添加又は分割することによりホスホリピッドを修飾できるいくつかの酵素（例えば、ホスホリピッドキナーゼ、ホスファターゼ、及びリパーゼ）が同定されており、重要な生物学上の機能に関連していた（Ｌｅｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，２０００）。ＲＮＡｓに関して記載されたとおり、ＲＮＡ及び／又はＲＮＡ修飾酵素が研究されようとすることに依存して、サンプル及び固定化されたアミノグリコシドの組成物は結果的に変更できる。
【００４１】
放射性標識された官能基は、化学合成又は適切な前駆体からそれを転位することができる酵素の何れかを用いることによりＡＢＭに添加することができる。放射性標識された官能基の化学的な添加は、閃光近接効果が完全に破壊される方法にてＡＢＭを分割する酵素を含むサンプルの用意に対して予備的であり得る。放射性標識された官能基の酵素による添加は、化学的添加に関して記載された反応に対して予備的であるか、又はアミノグリコシド−コートされた閃光支持体にサンプルを暴露する前に実際に実施されるかの何れかであり得る。
【００４２】
本発明にとっては、放射性標識された官能基を生成するための化学官能基中に含むことができる何れの放射性同位体も適しており、当該官能基はＡＢＭ，酵素及びＡＢＭ−アミノグリコシド相互作用と和合性である。ＡＢＭ中に取り込まれたら、当該放射性標識官能基は、ＡＢＭが固定化アミノグリコシドに結合したときに、閃光支持体を活性化する放射エネルギーを放射するべきである。放射性標識された官能基がＡＢＭ中に取り込まれないなら、放射活性エネルギーが閃光を活性化することを可能にするため、閃光支持体からはるか離れて除去されるのが一般的である。よって、特定の閃光近接シグナルの測定は、サンプルを支持体から分離することなしに実施することができる。しかしながら、例えば、支持体を遠心分離して液体相から取り出すことにより閃光近接シグナルを測定する前にあらゆる適切な手段を持いてサンプルから支持体を分離することができる。
【００４３】
ＲＮＡ及びホスホリピッドをＡＢＭｓの例として用いると、適切な放射性同位体は３３Ｐであり、核酸バックボーン又はイノシトール環の何れかに［γ−３３Ｐ］ＡＴＰから、放射性標識されたリン酸基として、容易に取り込まれる得る。しかしながら、閃光近接効果を提供することが知られている他の同位体（例えば、３Ｈ，１２５Ｉ又は３５Ｓ）も、放射性標識官能基を生成するのに使用することができる。
【００４４】
本発明は、アミノグリコシドの有効な固定化を可能にさせる如何なる種類の閃光固相支持体も使用することにより適用することができる。従来技術（ＥＰ１５４７３４，ＥＰ５７６０９０，ＵＳ４２７１１３９，ＵＳ３０１８１７８，ＥＰ５５６００５）及び製造者ら（アマーシャム、ＮＥＮ）は、様々な閃光化合物、通常はビーズ又はマイクロプレートの形態に形成したポリマー化合物（ポリビニルトルエン、ポリスチレン）を含浸させた固相支持体の多数の例を提供するが、他の如何なる適切な形態も適用可能である。前に記載したとおり、ビーズ又はマイクロプレートの使用は発明の方法の処理量を相当に改善し、特に、多数のサンプル（数千まで）の平行分析を実施するのに有用であるが、ＡＢＭｓを含む多数の酵素に関して実行できないアプローチである。
【００４５】
アミノグリコシド（及び、一般には、アミン化された生物学上のリガンド）の固相支持体上への有効且つ安定な固定化を可能にさせる方法及び試薬は、様々な支持体及びポリマーに関して従来技術において記載された（Ｓａｃｈｅｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ＷＯ９００８５８４；ＥＰ３７２１３０，ＥＰ３５０４０７）。一般に、これらの方法は、化合物又はバッファーが固相支持体又はアミン化リガンドを活性化するのと同時か又は後の、アミン化リガンドと固相支持体とのインキュベーションを含む。このカップリング反応は、次に、未反応の官能基をブロックするか及び／又はリガンドの固定化を安定化させる別の反応に続く。
【００４６】
従来技術（ＷＯ９９３３４９９）において記載されたとおり、アルデヒドモイエティ（支持体上に位置するＲＣＨＯ）を一次アミンモイエティ（アミノグリコシド上に位置するＲ’ＮＨ２）と反応させる場合、平衡が反応生成物により構成され、相対的に不安定なイミンモイエティ（Ｒ’Ｎ＝ＣＨＲ）である。この結合は、還元剤（即ち、安定化剤）、例えばホウ化水素ナトリウム又はシアンホウ化水素ナトリウムを使用したイミンモイエティの還元アルキル化により安定化され得て、即ち、第二アミン（Ｒ’ＮＨ−ＣＨ２Ｒ）を形成する。カップリング及び安定化の反応は、通常６から１０のｐＨ、及び４℃から３７℃の温度において実施され、そしてそれらは２４時間以内に完了する。全操作又は反応の間に閃光支持体上でアミノグリコシドの有効な共有（又は非共有）固定化を可能にさせる他の如何なる反応及びプロトコルも、本発明の方法及び使用のために適している。
【００４７】
放射性標識されたＡＢＭｓを含むサンプルをどれかの方法を用いて用意したなら、それらは、支持体への結合を達成するのに十分な時間、アミノグリコシド−コートされた支持体に暴露することができ、そして閃光近接シグナルを、従来技術において開示されて市販されているカウンター（Ｗａｌｌａｃ）に従い、各サンプルに関して測定する。任意に、酵素反応をブロックする化合物を、閃光支持体特にそれらをインキュベートする前にサンプルに添加することができるが、アミノグリコシドの存在は既にこれらの反応の多くを阻害する。異なるサンプルに関して得られた値の間の比較は、各サンプル中の酵素の有効性に関する情報を提供するべきである。
【００４８】
しかしながら、異なる実験デザインを様々な種類の分子及び情報を特性決定するために本発明の方法を利用して詳しく調べることができる。
本発明の方法は、実質上純粋なＡＢＭと、実質上純粋な酵素又はアミノグリコシドの間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのアッセイにおいて適用できる。アミノグリコシド−コートされた閃光支持体に関連した閃光近接シグナルを比較することにより、異なる化合物、化合物の混合物（例えば、ライブラリー又はクロマトグラフィーフラクション）を、例えば特異的阻害活性を有するものとして、特性決定するか、及び／又は精製することができる。
【００４９】
実験デザインの第１の群において、各サンプルは、等量の、ＡＢＭ、ＡＢＭ上に放射性標識基を転位することのできる酵素、この放射性標識された基を含む前駆体、及び一つ又は複数の追加の化合物、例えば上記酵素の有力な阻害剤を含むべきである。あるいは、既に化学的又は酵素により放射性標識された等量のＡＢＭを、各サンプル中で、放射性標識された基がアミノグリコシドとの相互作用に必須のモイエティから分離される様式にて放射性標識されたＡＢＭを分割できる酵素と、そして当該酵素の有力な阻害剤である一つ又は複数の追加の化合物と、混合される。またこの場合には、対照サンプルとの比較が、発明の方法を用いてこれらの追加の化合物による上記酵素の阻害を同定及び／又は定量することを可能にさせる。
【００５０】
対照サンプルを他のサンプルと比較することにより、これらの追加の化合物による酵素の阻害を、閃光近接シグナルの低下として本発明の方法により同定及び／又は定量することができ、ホスホリピッド中の特定の位置をリン酸化するキナーゼを阻害する化合物の場合のような例が示すとおりである。あるいは、そのような化合物はホスホイノシチド結合蛋白質であり得る（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００５１】
実験デザインの第２の群においては、ＡＢＭとアミノグリコシドの間の相互作用を阻害するために追加の化合物を想定する。対照サンプルと、追加の化合物が添加されるサンプルを比較して、放射性標識反応が一度完了したら（工程（ｃ）の前又は間）、測定された閃光近接シグナルの低下は、ＡＢＭと、閃光支持体上に固定化されたアミノグリコシドの間の相互作用に当該化合物が影響することを示唆する。これは、工程（ａ）及び（ｂ）において使用されたもの以外のＡＢＭ又はアミノグリコシド−修飾酵素が添加される場合、又はアミノグリコシド−修飾細菌酵素を用いる場合、真実である（Ｌｌａｎｏ−Ｓｏｔｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００５２】
別の状況においては、ＡＢＭ又は酵素の何れかは実際には不十分な精製形態であってよいが、何故ならばそれらはライブラリー又はクロマトグラフィーフラクションに由来するからである。この場合、測定された閃光近接シグナルの増加又は低下は、特定のフラクションが特定の酵素（全てのサンプルにおいて標準化された放射性標識ＡＢＭを用いて）又は特定のＡＢＭ（標準化された酵素及び放射性標識された反応を用いて）に豊富であるかもしれないことを示唆する。
【００５３】
全ての前記の方法は、直接様式か又は競合様式において、サンプル中に存在する成分の全て又は一つと競合する化合物を添加することにより適用できる。そのような分子は、キナーゼ活性に対するそれらの効果、アミノグリコシドとの相互作用を評価するために、又はこれらの分子とそれらの特性を特性決定及び／又は定量する範囲で、アッセイに含ませることができる。
【００５４】
前記の方法は、高処理量のフォーマットにおいサンプルを分析するためのスクリーニングアッセイ及びキットにおいて構成され得る。本発明において開示されたアッセイでコートされた閃光固相支持体は、サンプル中の放射性標識されたアミノグリコシド結合分子を同定及び／又は定量するため、及びサンプル中の放射性標識されたアミノグリコシド結合分子、当該分子を修飾する酵素、又はＡＢＭｓと酵素又は放射性標識されたアミノグリコシド結合分子の間の相互作用を変調する化合物を同定及び／又は定量するためのキットにおいて使用することができる。
【００５５】
以下の実施例は、ネオマイシンコートされたＳＰＡビーズ（閃光支持体として）、ヒト組換えＰＩ３Ｋγ融合グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（酵素として）、ホスホイノシチド（アミノグリコシド結合分子として）、及び［３３Ｐ］γＡＴＰ（放射性標識された官能基を提供する前駆体として）を用いて、酵素を阻害する化合物なしに、発明を例示することを意図する。上記発明は、ＳＰＡビーズに基づいてＰＩ３Ｋｓ阻害剤に関するインビトロアッセイを実施するための手段を提供することを示し、特に高処理量のアッセイのための典型的なフォーマットにおいて強固且つ再現性がある（９６又は３８４ウエルマイクロタイタープレート）。
【００５６】
本発明は、特定の態様に関連して記載されたが、記載の内容は、特許請求の範囲の意味及び目的を超えることなく当業者により提供され得る全ての修飾及び置換を含む。実施例は、開示された発明の適用性及び有用性を如何なる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５７】
実施例
１．材料と方法
ネオマイシン−コートされたＳＰＡビーズの調製
ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（１００ミリリットルの１００ミリグラム／ミリリットル懸濁液；アマシャム）を４４００ｘ  ｇにて１０分間遠心分離する。上清を除去して、沈殿したビーズを１００ミリリットルの硼酸バッファー（ｐＨ８．５）に再懸濁する。ローラーミキサーを用いて１５分間混合した後に、懸濁液を４４００ｘ  ｇにて１０分間遠心分離して、同じｐＨを有する１００ミリリットルの硼酸バッファーに再懸濁することを２回行う。ビーズを次に１００ミリリットルの５０ミリモラーの硫酸ネオマイシン（ｐＨ８．５）に懸濁する。当該懸濁液を含むポットにフォイルをかぶせて一晩ローラーミキサー中で室温においてインキュベートする。次に、懸濁液をガラスのビーカーに移し、１５０ミリグラムのホウ化水素ナトリウムを加え、さらに３時間室温において混合し、そして最後に１７６００ｘ  ｇにおいて１５分間遠心分離する。２回蒸留した水１００ミリリットルに懸濁して、１７６００ｘ  ｇにて１５分間遠心分離を３回行い、そして１００ミリリットルの１％蔗糖と共に３回行い、ビーズを最後に５０ミリリットルの１％蔗糖に懸濁する。懸濁液中のビーズの濃度は重量測定アッセイにより測定し、そして次に５００ミリグラムアリコートに分配して凍結乾燥する前に、濃度を１００ミリグラム／ミリリットルに調節した。
【００５８】
上清のサンプルを、製造工程の間、硫酸ネオマイシンとの一晩のインキュベーションの後に取り出し、濾過し、そして存在するネオマイシンの量をフルオレスアミンアッセイを用いて蛍光により判断する（Ｌｏｒｅｎｚｅｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｄｙ，１９９３）。フルオレスアミンは、アミン基の存在下で素早く反応して、蛍光基を生じる分子である。標準曲線を、公知の量のネオマイシン（１．５ミリグラム／ミリリットル）をフルオレスアミンと反応させることによりプロットしたところ、この曲線を用いてビーズ上に実際に固定化されたネオマイシンの量は、ビーズのミリグラムあたり３６マイクログラムと判断される。
【００５９】
大量の硫酸ネオマイシン（１５０ミリモラー）及び／又は高いｐＨ（ｐＨ１０．０）の硼酸バッファーを用いる固定化の手法は、匹敵する量のネオマイシンの固定化を導く（１９−１２７マイクログラム／ビーズのミリグラム）。
【００６０】
ヒト組換えＰＩ３Ｋγの調製
実施例において用いた酵素は、前に記載されたとおりに（ＷＯ９６１２０２４）、バキュロウイルス／Ｓｆ９昆虫細胞系を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；親和性クロマトグラフィーによる迅速且つ有効な精製を可能にさせるモイエティ）との組換え融合蛋白質として発現させたが、唯一、ベクターｐＡｃＧ２Ｔ内にクローン化されたｃＤＮＡ断片がヒトＰＩ３Ｋγ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ４８７３６）の最初の３６アミノ酸をコードするセグメントを欠き、３７位のイソロイシンから始まるという相違がある。組換え蛋白質の発現と精製は、ＧＳＴ融合蛋白質に関する標準プロトコルを用いて実施する。この酵素の別の形態は公知であり、使用することができる（ＷＯ９７４０１７３，ＷＯ９６２５４８８）。
【００６１】
ホスホリピッドの調製
ＰＩがＰＩ（４，５）Ｐであっても、当該分子はインビボにおいてＰＩ３Ｋγによりシグナリング分子ＰＩ（３，４，５）Ｐの中で変換され、ＰＩのＰＩ（３）Ｐへの変換速度は、上記酵素のインビトロ活性の指標であると一般には考えられる（図１）。
【００６２】
ホスホリピッド基質は、１００マイクロモラーのホスファチジルイノシトール（ＰＩ；Ｆｌｕｋａ）及び２５０マイクロモラーのホスファチジルセリン（ＰＳ；Ｆｌｕｋａ）の混合物を含むミセルとして調製する。ホスホリピッドを硼珪酸塩ガラス管の中で窒素流の下で乾燥するまで脱水する。次に、脂質をＨｅｐｅｓの４０マイクロモラー（ｐＨ７．４）に２０分間のボルテックス撹拌により懸濁し、次に、水浴中（Ｂｒａｎｓｏｎ  ２５００）で１５分間音波処理する。
【００６３】
キナーゼ阻害剤
ネオマイシンをコートしたＳＰＡに基づく方法の信頼性を確かめるために試験された非特異的及び特異的キナーゼ阻害剤（ウオルトマニン、ＬＹ２８２４００２，ラパマイシン）は、市販されている（Ｕｐｄａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００６４】
２．ネオマイシンをコートされたＳＰＡビーズを用いたＰＩ３Ｋγアッセイ
この種のアッセイは主に高処理量スクリーニングにおいて探索されるから、標準の３８４−／９６−ウエルマイクロタイタープレートないで当該アッセイが実施されるのを可能にするように、プロトコルが開発された。ＰＩ３Ｋγを阻害する化合物に関する高処理量スクリーニングの特定の場合、サンプルは、ヒト組換えＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγ、ホスホリピッドミセル、放射性標識されたＡＴＰ及び、任意に上記酵素の阻害剤として試験される化合物を含み、全ての化合物は適切なバッファーに混合される。上記反応は、ミセルに凝集したホスホリピッドの多かれ少なかれ重要な放射性標識フラクションを導く（図２）。ネオマイシンコートされたビーズを次に加えて、反応をブロックして、それらをそれらの表面上に固定化するのに十分強く全てのホスホリピッドと相互作用させる（図３）。ビーズ上に固定化された標識ＰＩ（３）Ｐから得られた閃光近接シグナルの定量は、別のサンプルの中のキナーゼ活性の評価を可能にする。
【００６５】
マイクロプレートウエルの面積に依存して、反応の全容量を調節することができる。９６−ウエルのマイクロプレートのフォーマットは５０マイクロリットルまでの容量の操作を可能にするから、３８４−ウエルのマイクロプレートのフォーマットはサンプル容量を３０マイクロリットルにまで減らすことを可能にする。表１は、３つの異なる最終容量を得るために混合される各反応成分の容量を示す（全ての容量をマイクロリットルで表す）。
【００６６】
【表１】
2004533832.tif 000002
【００６７】
酵素を４０ミリモラーのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ミリモラーのＤＴＴ（ジチオスレイトール）及び５％のエチレングリコールに溶解する各サンプルにおいて添加された酵素の量は放射性標識基質の量に明らかに影響するが、それはサンプルあたり７．５から１００ナノグラムの間からなるのが普通である。
【００６８】
キナーゼバッファー成分の最終濃度は、１０から４０マイクロモラー／２００ナノキューリー［３３Ｐ］γ−ＡＴＰ，１０マイクロモラーのＭｇＣｌ２，１マイクロモラーのＤＴＴ、１ミリモラーのβ−グリセロホスフェート、１００マイクロモラーのＮａＶＯ４，０．１％のコール酸ナトリウム、４０ミリモラーのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）である。ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）を阻害化合物の溶解性を改善するために存在させてもよいが、キナーゼに対する疑似の阻害効果を回避するために、１％の最終濃度を超えるべきではない。
【００６９】
穏やかな撹拌を伴う４５から１８０分間の室温におけるインキュベーションの後に、６０マイクロリットル（等容量の３０マイクロリットル）又は１８０マイクロリットル（等容量の５０又は１００マイクロリットル）の、未標識の１０ミリモラーのＡＴＰ（まだ存在する標識したものと非特異的結合に関して競合する），５ミリモラーのエチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ，キナーゼを阻害する化合物）及び１００マイクログラム（５０又は１００マイクロリットルの反応容量に関して２５０マイクログラム）のネオマイシンコートしたポリビニルトルエンＳＰＡビーズを含むリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）バッファーの添加により反応を停止する。
【００７０】
６０分間、室温及び穏やかな撹拌のインキュベーションの後に、ネオマイシン−ＳＰＡビーズを次にプレートを５分間１５００ｘ  ｇにて遠心分離することにより回収して、上清を除去する。各ウエル中で形成された放射性標識されたＰＩ（３）Ｐの量をＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭプレートカウンター（Ｗａｌｌａｃ）中での閃光計数により定量する。ベータカウンターが分解事象を測定することにおいて１００％の効率を有するなら、ｃｐｍが正確にｄｐｍのみに対応する事実を参酌するため、ｐｍ（分あたりのカウント）に代えてｄｐｍ（分あたりの分解（desintegration））にて定量を実施した。これが約束され得ないなら、相関の因子を計算に含ませるが、その際１キューリーは２．２２  ｘ  １０１２ｄｐｍに相当する。
【００７１】
上記検出方法の効率を証明するため、上記アッセイの処理量を改善するため、そしてマイクロプレートに基づくフォーマットにおいてシグナル／バックグラウンド比を増加させるために、異なるアッセイ成分を滴定することにより、様々な条件を試験した。
【００７２】
［３３Ｐ］γ−ＡＴＰ濃度の４０から１０マイクロモラー／２００ナノキューリーへの減少は、特に少量のキナーゼの存在下で、シグナル／バックグラウンド比を２倍増加させることがわかった（図４）。２つの異なる量のキナーゼのを用いて得られたカウントを比較することにより示されるとおり、特異的シグナルは酵素濃度に比例する。１００マイクロリットルから５０マイクロリットルへの容量の減少は、そのような比をさらに改善する（図５）。
【００７３】
ネオマイシン−コートされたＳＰＡビーズは、ウエルあたりビーズ７５０マイクログラムまで、回収された放射活性基質の直線的増加を可能にさせることも証明された（図６）。後者の２つの実験は、公知のウオルトマニンと呼ばれるＰＩ３Ｋγ阻害剤（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が添加されたサンプルも含み、これらのＳＰＡビーズの手段により検出されたキナーゼ活性の特異性を確認する。ビーズ自体が非特異的に標識基質に結合するかもしれない可能性も除外されたが、なぜならば、ＰＩ３Ｋγを不活性化する９５℃における熱処理がシグナルをバックグラウンドレベルにまで完全に戻すからである（図７）。
【００７４】
発明の方法の信頼性は、２つの公知のＰＩ３Ｋ阻害剤（ウオルトマニン及びＬＹ２９２４００２）及び、対照として、ＰＩ３Ｋγにより制御される経路中の下流の別のキナーゼであるｍＴＯＲを阻害するラパマイシンを用いて得られたＩＣ５０曲線を比較することにより、試験した。ウオルトマニン又はＬＹ２９２４００２の濃度を増加させてヒトＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγ及び脂質小胞に添加する。ウオルトマニン及びＬＹ２９２４００２に関するＩＣ５０値（それぞれ、２．６ナノモラー及び２ナノモラー）はそれらの公表された値に一致するが（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ，２０００）、ラパマイシンは顕著な効果を有さない（図８）。これらのＩＣ５０値は、阻害剤及び脂質小胞の添加の順番により影響されない。上記酵素のＡＴＰ及びＰＩに関するＫｍ値も計算されたが、それらは慣用の方法を用いて計算された値と顕著に異ならない。９６ウエルマイクロプレート／５０マイクロリットル又は３８４ウエルマイクロプレート／３０マイクロリットルフォーマットの何れかを用いて計算された、シグナル／バックグラウンド比、Ｋｍ、及びウオルトマニン及びＬＹ２９２４００２に関するＩＣ５０値は、それ以上関連する際を示さなかった。
【００７５】
【表２】
2004533832.tif 000003
【００７６】
【表３】
2004533832.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、実施例において実施されたＰＩ３Ｋｓにより推進された（driven）反応を示す。これらの酵素は、基質ＡＴＰに結合して加水分解して、ＡＤＰと遊離のリン酸基を生じ、リン酸基はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のイノシトール環の３’位に転移して、ＰＩ（３）Ｐを生じる。ＡＴＰが実際は［３３Ｐ］γ−ＡＴＰの形態で提供されるなら、放射性標識された末端のリン酸基がホスホリピッド上に転移する。上記反応はインビボにおいてはＰＩ（４，５）Ｐ２上で実施されて、シグナリング分子ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を生じる。
【図２】図２は、標識されたホスホイノシトール及び非標識のホスホイノシトールの凝集により形成された脂質ミセルを示す。
【図３】図３は、ＳＰＡビーズと、標識されたか又は標識されていないホスホイノシトールの間の相互作用を示し、但し、後者のみが検出可能な放射を生じる。非標識又は標識ＰＩ（３）Ｐの単一の分子を表すとしても、上記相互作用は、ビーズと、図２に示すミセルの相互作用によっても測定することができる。
【図４】図４は、ネオマイシン−ＳＰＡビーズを用いて測定され、そして異なる濃度の［３３Ｐ］γ−ＡＴＰ及びヒト組換えＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγを用いて得られた、放射性標識ＰＩ（３）Ｐを示す。サンプルの最終容量は１００マイクロリットルである。ネオマイシン−コートされたＳＰＡビーズを６０分間インキュベートして、その後反応を４５分間進行させた。
【図５】図５は、ＰＩ（３）Ｐバックグラウンド／シグナル比形成に対するアッセイ容量の効果を、１マイクロモラーのウオルトマニンの不在下又は存在下で示す。組換えＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγの量は２５ナノグラムである。
【図６】図６は、［３３Ｐ］γ−ＡＴＰ及びＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγを用いたネオマイシン−コートＳＰＡビーズの滴定を、阻害剤ウオルトマニンの不在下又は存在下で示す。サンプルは、２５ナノグラムのＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγを最終容量５０マイクロリットル中に含む。室温において４５分間インキュベート後に、ネオマイシン−コートされたＳＰＡビーズを量を増加させながら各ウエルに加える。
【図７】図７は、酵素の熱不活性化が如何にしてＰＩ（３）Ｐの形成を阻害するかを示す。５０マイクロリットルの反応物は、脂質小胞とインキュベートされる前に９５℃において５分間処理された（あるいは処理されなかった）組換えＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγを１２．５マイクログラム、５マイクロモラーのウオルトマニンの不在下又は存在下で含む。
【図８】図８は、ネオマイシン−ＳＰＡビーズ及び非特異的（ラパマイシン）又は特異的（ウオルトマニン、ＬＹ２９２４００２）阻害剤を用いて得られたＰＩ３Ｋγの阻害曲線を示す。ウオルトマニン又はＬＹ２９２４００２を濃度を増加させながら、１２．５ナノグラムのＧＳＴ−ＰＩ３Ｋγ及び脂質小胞を含む５０マイクロリットル反応物に加える。
【図３】
2004533832.tif 000005
【図４】
2004533832.tif 000006
【図５】
2004533832.tif 000007
【図６】
2004533832.tif 000008
【図７】
2004533832.tif 000009
【図８】
2004533832.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004533832.tif 000011
2004533832.tif 000012
2004533832.tif 000013
2004533832.tif 000014
2004533832.tif 000015
2004533832.tif 000016
2004533832.tif 000017
2004533832.tif 000018
2004533832.tif 000019
2004533832.tif 000020
2004533832.tif 000021
2004533832.tif 000022
2004533832.tif 000023
2004533832.tif 000024
2004533832.tif 000025
2004533832.tif 000026
2004533832.tif 000027
2004533832.tif 000028
2004533832.tif 000029
2004533832.tif 000030
2004533832.tif 000031
2004533832.tif 000032
2004533832.tif 000033
2004533832.tif 000034
2004533832.tif 000035
2004533832.tif 000036
2004533832.tif 000037
2004533832.tif 000038
2004533832.tif 000039
2004533832.tif 000040
2004533832.tif 000041
2004533832.tif 000042
2004533832.tif 000043
2004533832.tif 000044
2004533832.tif 000045
2004533832.tif 000046
2004533832.tif 000047
2004533832.tif 000048
2004533832.tif 000049
2004533832.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533832.tif 000051
【国際調査報告】
2004533832.tif 000052
2004533832.tif 000053
2004533832.tif 000054