(57)【要約】本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。本発明はまた、細胞内のＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法も提供する。本発明はまた、被験者の癌を治療する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸。
【請求項２】
長さが少なくとも１５個のヌクレオチドである請求項１に記載のヌクレオチド配列の断片を含んでなる、単離した核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸であって、核酸断片が
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列を含んでなる前記核酸。
【請求項４】
核酸が請求項３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも２つを含んでなる、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
核酸が請求項３に記載の３つのヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
断片がプロモーター活性を有する、請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
断片は目的の遺伝子と機能的に連結されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項８】
目的の遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
目的の遺伝子が癌抑制遺伝子、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である、請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つの核酸を含んでなるベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が腫瘍細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
腫瘍細胞が黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：
（ａ）  レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；
（ｂ）  細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および
（ｃ）  工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されるより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されるより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法。
【請求項１６】
細胞が、黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が約７キロダルトン以下の分子量を有する分子を含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤が配列番号１に示した配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンス核酸でありかつ長さが少なくとも１５ヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
薬剤がＤＮＡ分子、炭水化物、糖タンパク質、転写因子タンパク質または二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が、０．１キロダルトンから１０キロダルトンまでの分子量を有する合成ヌクレオチド配列、ペプチド模倣物、または有機分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
測定されるＰＥＧ−３プロモーター活性の発現が２．５〜３．５倍以上の増加または減少と同等かまたは大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＥＧ−３プロモーターが請求項１、２、３、４または５に記載の核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞に選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖を抑制または死滅してそれによって被験者の癌を治療する前記方法。
【請求項２５】
核酸が本質的に、
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、および
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸が少なくとも２５個のヌクレオチド長の配列番号１の少なくとも一部分と相補的な配列を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
癌が黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
投与が注射、経口投与、局所投与、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、被験者の細胞への局所応用、またはマイクロインジェクションを経由して実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
被験者が哺乳類である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳類がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
目的の遺伝子が、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子がＭｄａ−７遺伝子またはｐ５３遺伝子を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
目的の遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
抑制遺伝子がｍｄａ−７である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
目的の遺伝子が細胞傷害性遺伝子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞傷害性遺伝子が細胞死を引き起こす、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞傷害性遺伝子が、ＨＳＶ−ＴＫ、ｐ２１、ｐ２７、およびｐ１０からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に開示する発明は、米国健康福祉局（Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）からの国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）認可番号ＣＡ３５６７５およびＣＡ７４４６８のもとでの政府支援によってなされた。従って、米国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
本出願書全体にわたって、様々な出版物を著者と日付によって本文内で参照している。これらの出版物の全ての引用はアルファベット順に本明細書末尾に掲げられている。前後を問わず、本明細書に引用した全ての特許、特許明細書および出版物は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載しかつ請求した本発明の日付において当業者に公知である当技術分野の技術水準をさらに詳細に記載する目的で、これらの出版物の全体の開示がこれによって参照により本特許出願書中に組み入れられる。
【０００３】
発明の概要
本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。本発明はまた、細胞内のＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：（ａ）  レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；（ｂ）  細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および（ｃ）  工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不存在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されたより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されたより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。本発明は、被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞に選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖を抑制または死滅してそれによって被験者の癌を治療することを特徴とする、前記方法を提供する。
【０００４】
発明の詳細な説明
本明細書では次の複数の省略語を使用する：進行上昇遺伝子（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｅｎｅ）−３（ＰＥＧ−３）；ラット胚細胞（ＲＥ細胞）；ＰＥＧ−プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）；キロ塩基（ｋｂ）。本特許出願全体にわたって、特定のヌクレオチドに対する参照は、核酸のコード鎖上に存在するヌクレオチドに対するものである。本明細書全体にわたって次の標準略語を用いて特定のヌクレオチドを示す：
Ｃ＝シトシン  Ａ＝アデノシン
Ｔ＝チミジン  Ｇ＝グアノシン
本発明は、配列番号１の位置−２７０のグアノシン（Ｇ）で始まりかつ位置＋１９４のシトシン（Ｃ）で終わるヌクレオチド配列を含有するＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる、単離した核酸を提供する。
【０００５】
本発明はまた、少なくとも１５ヌクレオチド長の請求項１のヌクレオチド配列の断片を含んでなる、単離した核酸も提供する。
【０００６】
一実施形態においては、核酸断片は、
（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、
（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列を含んでなる。
【０００７】
他の実施形態においては、核酸は上記の３つのヌクレオチド配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも２つを含んでなる。
【０００８】
他の実施形態においては、核酸は上記の３つのヌクレオチド配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる。
【０００９】
他の実施形態においては、断片はプロモーター活性を有する。
【００１０】
他の実施形態においては、断片は目的の遺伝子と機能的に連結されている。他の実施形態においては、目的の遺伝子はレポーター遺伝子である。
【００１１】
他の実施形態においては、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする。
【００１２】
他の実施形態においては、目的の遺伝子は、癌抑制遺伝子、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子、または細胞傷害性遺伝子である。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの本明細書に記載の核酸を含んでなるベクターを提供する。本発明はまた、このベクターを含んでなる宿主細胞も提供する。
【００１４】
他の実施形態においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。他の実施形態においては、腫瘍細胞は黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である。
【００１５】
本発明はまた、細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法であって：
（ａ）  レポーター遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を含有する細胞を、薬剤と接触させること；（ｂ）  細胞内のレポーター遺伝子発現のレベルを測定すること；および（ｃ）  工程（ｂ）で測定した発現レベルを、薬剤の不存在下で同一細胞で測定したレポーター遺伝子発現レベルと比較することからなり、薬剤の存在下で測定されたより低い発現レベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を抑制する薬剤を示しかつ薬剤の存在下で測定されたより高いレベルはＰＥＧ−３プロモーター活性を増大する薬剤を示し、それによって細胞内でＰＥＧ−３プロモーター活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。
【００１６】
他の実施形態においては、細胞は、黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、大腸癌細胞、またはグリア芽細胞腫多型細胞である。
【００１７】
他の実施形態においては、薬剤は約７キロダルトン以下の分子量を有する分子を含んでなる。
【００１８】
他の実施形態においては、薬剤は、配列番号１に示した配列の少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンス核酸でありかつ長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。
【００１９】
他の実施形態においては、薬剤は、ＤＮＡ分子、炭水化物、糖タンパク質、転写因子タンパク質または二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００２０】
他の実施形態においては、薬剤は、０．１キロダルトンから１０キロダルトンまでの分子量を有する合成ヌクレオチド配列、ペプチド模倣物、または有機分子である。
【００２１】
他の実施形態においては、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼまたはアルカリホスファターゼをコードする。
【００２２】
他の実施形態においては、測定されるＰＥＧ−３プロモーター活性の発現は２．５〜３．５倍以上の増加または減少である。
【００２３】
本発明は、被験者の癌を治療する方法であって、目的の遺伝子と機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターを含んでなる核酸を投与することからなり、目的の遺伝子が被験者の癌細胞中で選択的に発現されかつその発現がＰＥＧ−３の発現を調節して癌細胞の増殖の抑制または死滅をもたらし、それによって被験者の癌を治療することを特徴とする、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明の一実施形態においては、核酸は本質的に、（ｉ）配列番号１の位置−１０５のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−１００のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＰＥＡ３タンパク質結合配列、（ｉｉ）配列番号１の位置−２９のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置−２４のアデノシン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＴＡＴＡ配列、および（ｉｉｉ）配列番号１に示したヌクレオチド配列の位置＋６のチミジン（Ｔ）で始まりかつ位置＋１２のチミジン（Ｔ）で終わるヌクレオチド配列からなるＡＰ１タンパク質結合配列からなる。
【００２５】
他の実施形態においては、核酸は、少なくとも２５ヌクレオチド長の配列番号１の少なくとも一部分と相補的な配列を有する。
【００２６】
他の実施形態においては、癌は、黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である。
【００２７】
他の実施形態においては、投与は、注射、経口投与、局所投与、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、被験者の細胞への局所応用、またはマイクロインジェクションを経由して実施する。
【００２８】
他の実施形態においては、被験者は哺乳類である。他の実施形態においては、哺乳類はヒトである。他の実施形態においては、目的の遺伝子は、発現すると細胞のアポトーシスを引き起こす遺伝子である。
【００２９】
他の実施形態においては、遺伝子はＭｄａ−７遺伝子またはｐ５３遺伝子を含んでなる。他の実施形態においては、目的の遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。他の実施形態においては、抑制遺伝子はｍｄａ−７である。他の実施形態においては、目的の遺伝子は細胞傷害性遺伝子である。他の実施形態においては、細胞傷害性遺伝子の発現は細胞死を引き起こす。
【００３０】
他の実施形態においては、細胞傷害性遺伝子は、ＨＳＶ−ＴＫ、ｐ２１、ｐ２７、およびｐ１０からなる群から選択される。
【００３１】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である通常の分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の技術を採用しうる。そのような技術は、全て文献に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」， Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ編、１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ． Ｋ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；「固定細胞と酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， 「分子クローニングへの実用的手引き（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（１９８４）；シリーズ「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（Ｓ． ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ． Ｋａｐｌａｎ 編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；ならびに「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， Ｖｏｌｓ． Ｉ−ＩＶ （Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照。
【００３２】
本明細書および付加した請求の範囲に使用している、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明白に他を規定しない限り、複数の参照を含む。
【００３３】
本発明は、本明細書に記載の組換え発現構築物を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００３４】
本発明の他の実施形態においては、宿主細胞は本明細書に記載の組換え発現構築物を用いて安定してトランスフォームされている。本発明の他の実施形態においては、宿主細胞は腫瘍細胞である。
【００３５】
本発明の他の実施形態においては、宿主細胞はメラニン形成細胞である。本発明の他の実施形態においては、細胞は不死化細胞である。
【００３６】
本発明の他の実施形態においては、腫瘍細胞は黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、星状細胞腫細胞、グリア芽細胞腫多型細胞、子宮頚癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞または前立腺癌細胞である。
【００３７】
本発明は、宿主細胞内で外来ＤＮＡを発現する方法であって：所望のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする外来ＤＮＡと機能的に連結されたＰＥＧ−３プロモーターヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子導入ベクターを宿主細胞中に導入して外来遺伝子を発現することを特徴とする前記方法を提供する。
【００３８】
本発明の他の実施形態においては、遺伝子導入ベクターはレポーター分子をコードしかつ発現する。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００４０】
本発明の他の実施形態においては、「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」は、アデノウイルス感染、リポソームを介する導入、細胞への局所応用、およびマイクロインジェクションからなる群から選択される方法によって実施される。
【００４１】
本発明の他の実施形態においては、癌は黒色腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫多型、子宮頚癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、骨肉腫または軟骨肉腫である。
【００４２】
本発明の他の実施形態においては、癌は被験者の中枢神経系の癌である。
【００４３】
本発明の他の実施形態においては、投与は注射、経口投与、または局所投与を経由して実施される。
【００４４】
本発明の他の実施形態においては、担体は水性担体、リポソーム、または脂質担体である。
【００４５】
定義
本明細書に使用される「治療遺伝子」は、癌細胞に治療効果を与えることができるかまたは細胞内で機能する遺伝子の発現に調節効果を有する機能性タンパク質に対応する、アミノ酸配列をコードするＤＮＡを意味する。
【００４６】
本明細書に使用される「核酸分子」はＤＮＡとＲＮＡの両方であって、他に規定しない限り、二本鎖および一本鎖核酸分子の両方を含む。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどのハイブリッドも含む。核酸配列への参照はまた、改変した塩基も、その改変が核酸とタンパク質などのリガンドとの結合またはワットソン−クリック塩基対合のいずれかを有意に妨害しない限り、含むことができる。
【００４７】
本明細書に使用される「エンハンサーエレメント」は、治療遺伝子または目的の遺伝子の転写速度を増加するがプロモーター活性を有しないヌクレオチド配列である。エンハンサーは、活性の有意な損失を伴うことなく、プロモーターの上流、下流、および反対側に移動することができる。
【００４８】
２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列が「実質的に相同的」であるというのは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくともほぼ８０％（好ましくは少なくともほぼ９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％〜９９％）が分子の特定の長さにわたって対合するときである。本明細書に使用される「実質的に相同的」はまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して同一性（１００％同一な配列）を示す配列も意味する。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系についての特定されたストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験によって同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は当技術分野の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」， ｖｏｌｓ Ｉ ＆ ＩＩ、前掲；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、前掲を参照。
【００４９】
ＰＥＧ−３プロモーター配列と「機能的に等価な」配列は、ＰＥＧ−３プロモーター配列と同じ様式で機能する配列である。従って、本明細書に記載のＰＥＧ−３プロモーターと「機能的に等価な」プロモーター配列は、ＰＥＧ−３プロモーター配列と実質的に類似した発現の時間枠でおよび実質的に類似の量でならびに実質的に類似した組織特異性をもって、下流コード配列の転写を指令できる配列である。
【００５０】
ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれるとｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されかつポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’−（アミノ）末端の開始コドンおよび３’−（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、限定されるものでないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）源からのゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ、およびさらに合成ヌクレオチド配列が挙げられる。転写末端配列は通常、コード配列の３’に位置するであろう。
【００５１】
ＤＮＡ「制御配列」は集合的にプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどの５’−ＵＴＲ（未翻訳領域）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域を意味し、宿主細胞においてコード配列の転写と翻訳を集合的に提供する。
【００５２】
「機能的に連結された」は、そこに記載された諸成分がその通常の機能を果たすように構成された、ヌクレオチド配列エレメントの配置を意味する。従って、コード配列と機能的に連結された制御配列は、コード配列の発現を果たすことができる。制御配列は、コード配列の発現を指令するよう機能するのであれば、コード配列に近接する必要はない。従って、例えば、介在する未翻訳であるが転写済みの配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在してもよく、プロモーター配列はまだコード配列と「機能的に連結されている」と考えることができる。
【００５３】
制御配列は細胞内のコード配列の「転写を指令」するとは、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列をｍＲＮＡに転写するときであり、次いでｍＲＮＡはコード配列がコードするポリペプチドに翻訳される。
【００５４】
細胞は外因性ＤＮＡによって「トランスフォーム」されているとは、その外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されているときである。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれて（共有結合で連結されて）いてもまたはいなくてもよい。原核生物および酵母においては、例えば、外因性ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントに維持されてもよい。真核細胞においては、安定してトランスフォームされた細胞は、一般的に外因性ＤＮＡを染色体に組込んでいて染色体複製を通して娘細胞に継承する細胞か、または安定して維持された染色体外プラスミドを含有する細胞である。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞集団からなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって実証される。
【００５５】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、他ＤＮＡ分子内にあるかまたは他分子と結合したＤＮＡの同定しうるセグメントであって、自然では該他分子と会合して見出されない前記セグメントである。例えば、ＰＥＧ−３タンパク質以外のタンパク質をコードする配列は、ＰＥＧ−３プロモーターと連結されると、異種配列とみなされる。異種コード配列の他の例は、コード配列それ自身が自然で見出されない構築物（例えば、自然の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、ＰＥＧ−３プロモーターと連結した異種遺伝子を含んでなるキメラ配列は、かかるキメラ構築物が通常自然で見出されないので、異種であると考えられる。対立遺伝子変異または自然に存在する突然変異事象は、本明細書に使用される意味での、ＤＮＡの異種領域を生じない。
【００５６】
ベクター
特に好ましいのはウイルス系のベクターである。真核細胞の場合には、レトロウイルスまたはアデノウイルス系のベクターが好ましい。そのようなベクターは、ウイルスゲノムの全体または一部分、例えば長末端反復配列（「ＬＴＲ」）、プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター）、エンハンサーその他を、含有する。宿主細胞が原核生物であれば、細菌ウイルス、すなわちファージが好ましい。そのようなベクターの例は、例えば、λファージ系のベクターである。いずれの場合もベクターは２以上のウイルスのエレメントを含んでなってもよい。
【００５７】
得られるベクターを、真核生物または原核生物のいずれであってもよい宿主細胞中にトランスフェクトまたはトランスフォームする。
【００５８】
本発明の遺伝子導入ベクターはさらに、ベクターの発現をより容易に追跡するためのマーカーまたはレポーター分子をコードする遺伝子を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明に使用しうる特定のレポーター分子は本発明においては重要でない。本発明に使用しうるそのようなレポーター分子の例は、当技術分野で周知であり、βガラクトシダーゼ（Ｆｏｗｌｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７４：１５０７ （１９７７））、ルシフェラーゼ（Ｔｕら， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １４：１９７０ （１９７５））、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｇｏｒｍａｎら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２：１０４４−１０５１ （１９８２））が挙げられる。
【００６０】
遺伝子導入ベクターは、同じもしくは異なる外来のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする２以上の遺伝子を含有してもよい。
【００６１】
遺伝子導入ベクターは、宿主細胞内で複製しうるいずれの構築物であってもよく、プラスミド、ＤＮＡウイルス、レトロウイルス、ならびに単離したヌクレオチド分子が挙げられる。遺伝子導入ベクターのリポソームを介する導入も、本発明で実施しうる。
【００６２】
本発明に使用しうる前記プラスミドの例は、ｐＧＬ３−系のプラスミド（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）が挙げられる。本発明に使用しうる前記ＤＮＡウイルスの例はアデノウイルスである。
【００６３】
アデノウイルスは、発現ベクター、特にヒト遺伝子治療用の発現ベクターとして一層注目されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：３９−６６ （１９９２））
本発明に使用しうる前記アデノウイルスの血清型の例は、当技術分野で周知であり、４０種を超えるさまざまなヒトアデノウイルス、例えば、Ａｄ１２（Ａ亜属）、Ａｄ３およびＡｄ７（Ｂ亜属）、Ａｄ２およびＡｄ５（Ｃ亜属）、Ａｄ８（Ｄ亜属）、Ａｄ４（Ｅ亜属）、Ａｄ４０（Ｆ亜属）が挙げられる（Ｗｉｇａｎｄら， 「アデノウイルスＤＮＡ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ）」， Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編， Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｂｏｓｔｏｎ， ｐｐ．４０８−４４１ （１９８６））。Ｃ亜属のＡｄ５が本発明において好適に使用されるアデノウイルスである。これは、Ａｄ５が、多くの生化学的および遺伝学的情報が既知であるヒトアデノウイルスであり、かつ歴史的にアデノウイルスをベクターとして使用する構築物の大部分において使用されてきたからである。また、アデノウイルスは市販されていて、例えばｐＣＡ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）がある。
【００６４】
アデノウイルスベクターを作製する方法は当技術分野で周知である（Ｂｅｒｋｎｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１：６００３−６０２０ （１９８３）；ｖａｎ Ｄｏｒｅｎら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４：１６５３−１６５６ （１９８４）；Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４７：９６４−９７３ （１９８７）；ＭｃＧｒｏｒｙら， Ｖｉｒｏｌ．， １６３：６１４−６１７ （１９８８）；およびＧｌｕｚｍａｎら， 「真核生物ウイルスベクター（Ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」， Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ．編， １８７−１９２頁， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２））。
【００６５】
誘導体核酸分子
誘導体分子はＰＥＧ−３プロモーターの機能的特性を保持しうる、すなわち、上記のような置換を有する分子であっても目的の遺伝子の組織特異的発現が可能でありうる。改変は、誘導体分子の効力がＰＥＧ−３プロモーター単独と比較して増加しており、かつ誘導体分子がその組織特異性を保持している限り、許容される。
【００６６】
治療遺伝子の例としては自殺遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子配列が発現すると、黒色腫腫瘍細胞増殖を抑制するかまたは黒色腫腫瘍細胞死を誘発するタンパク質または薬剤が産生される。自殺遺伝子としては、酵素をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。治療遺伝子の目的は皮膚癌細胞の増殖を抑制もしくは該細胞を死滅させるか、または直接もしくは間接に癌細胞の増殖を抑制するかもしくは該細胞を死滅させるサイトカインもしくは他の細胞傷害性薬剤を産生することである。
【００６７】
適当な酵素は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。
【００６８】
適当な癌遺伝子および癌抑制遺伝子は、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ、Ｋ、およびＮ ｒａｓを含む）、ｐ５３、網膜芽細胞腫抑制遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）、およびｎｍ２３が挙げられる。適当な毒素は、シュードモナス外毒素ＡおよびＳ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ毒素、志賀毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、サポリン（ｓｕｐｐｏｒｉｎ）、およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が挙げられる。
【００６９】
適当なサイトカインは、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる（Ｗｏｎｇ Ｇら， 「ヒトＧＭ−ＣＳＦ：相補的ＤＮＡの分子クローニングならびに天然および組換えタンパク質の精製（Ｈｕｍａｎ ＧＭ−ＣＳＦ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５； ２２８：８１０）；ＷＯ９３２３０３４ （１９９３）；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ Ｍ． Ａ．ら， 「インターフェロン−βおよびウイルス誘導ヒトＭｘタンパク質のｃＤＮＡのクローニングと配列分析は、それらが推定グアニンヌクレオチド結合部位を含有することを示す：当該遺伝子プロモーターの機能性研究（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｕｍａｎ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｃｏｎｔａｉｎ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９０ Ｍａｒ， ６４（３）：１１７１−８１；Ｌｉ ＹＰら， 「前炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子−αおよびＩＬ−６はオステオカルシン遺伝子プロモーターをダウンレギュレートするが、ＩＬ−１はその機能をもたない（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ＩＬ−６， ｂｕｔ ｎｏｔ ＩＬ−１， ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｆｅｂ． １， １９９２， １４８（３）：７８８−９４；Ｐｉｚａｒｒｏ Ｔ． Ｔ．ら． 「同種移植拒絶の際のラット心臓移植体におけるＴＮＦαおよびＴＮＦβ遺伝子発現の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ ａｌｐｈａ ａｎｄ ＴＮＦ ｂｅｔａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）」， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９３ Ａｕｇ．， ５６（２）：３９９−４０４）；Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ Ｆら， 「内皮細胞中のインターロイキン−１誘導遺伝子：Ｃ反応性タンパク質および血清アミロイドＰ成分に関係する新しい遺伝子のクローニング（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｎｏｖ． ５， １９９２， ２６７（３１）：２２１９０−７；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｉ．ら， 「ヒト単球のＩＬ−２受容体サブユニット遺伝子の調節：ＩＬ−２とＩＦＮ−γの示差的作用（��ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＬ−２ ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖ． １，１９９２， １４９（９）：２９６１−８；Ａｌｇａｔｅ Ｐ．Ａ．ら， 「胎児肝由来のＦＬ５．１２細胞系における、ＩＬ−３によるインターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ （ＩＬ−３） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＩＬ−３ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＦＬ５．１２ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」， Ｂｌｏｏｄ， １９９４ Ｍａｙ １， ８３（９）：２４５９−６８；Ｃｌｕｉｔｍａｎｓ Ｆ． Ｈ．ら， 「ＩＬ−４は、ＩＬ−２−、ＩＬ−３−、およびＧＭ−ＣＳＦ−が誘導する末梢血単球におけるサイトカイン遺伝子発現をダウンレギュレートする（ＩＬ−４ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩＬ−２−， ＩＬ−３−， ａｎｄ ＧＭ−ＣＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）」， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９４ Ｊｕｎ．， ６８（６）：２９３−８；Ｌａｇｏｏ， Ａ． Ｓ．ら， 「スーパー抗原活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ遺伝子発現とそれに対するそれらの分泌  接着分子を介しての同時刺激シグナルの明確な必要性（ＩＬ−２， ＩＬ−４， ａｎｄ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｆｅｂ． １５，１９９４， １５２（４）：１６４１−５２；Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｏ．Ｍ．ら， 「肝同種移植片受容者およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、同種抗原に応答したＩＬ−２およびＩＬ−５遺伝子発現（ＩＬ−２ ａｎｄ ＩＬ−５ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， １９９３ Ｍａｙ， ５５（５）：１１５９−６６；Ｐａｎｇ Ｇら， 「リポ多糖、ＩＬ−１αおよびＴＮＦ−αにより刺激されたヒト十二指腸繊維芽細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１遺伝子発現とサイトカイン産生（ＧＭ−ＣＳＦ， ＩＬ−１ ａｌｐｈａ， ＩＬ−１ ｂｅｔａ， ＩＬ−６， ＩＬ−８， ＩＬ−１０， ＩＣＡＭ−１ ａｎｄ ＶＣＡＭ−１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ＩＬ−１ ａｌｐｈａ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）」， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９４ Ｊｕｎ．， ９６（３）：４３７−４３；Ｕｌｉｃｈ Ｔ． Ｒ．ら， 「内毒素誘導性サイトカイン遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現  ＩＩＩ  ＩＬ−６ ｍＲＮＡおよび血清タンパク質発現ならびにＩＬ−６のｉｎ ｖｉｖｏ血液学的作用（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． ＩＩＩ． ＩＬ−６ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＬ−６）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ａｐｒ． １，１９９１，１４６ （７）：２３１６−２３；Ｍａｕｖｉｅｌ Ａ．ら， 「Ｔ細胞産生サイトカインであるロイコレギュリンは、ＩＬ−８遺伝子発現およびヒト皮膚繊維芽細胞における分泌を誘導する。ヒト皮膚繊維芽細胞における実証と分泌。ＮＦ−κ Ｂ結合およびＮＦ−κ Ｂ−駆動プロモーター活性の実証。（Ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ， ａ Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＬ−８ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ−ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖ． １， １９９２，１４９ （９）：２９６９−７６）。
【００７０】
増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）およびβ（ＴＧＦ−β）、サイトカインコロニー刺激因子が挙げられる（Ｓｈｉｍａｎｅ Ｍ．ら， 「Ｇ−ＣＳＦ誘導性遺伝子ｃＤＮＡの分子クローニングと特性決定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ＣＳＦ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ）」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｆｅｂ．２８， １９９４， １９９（１）：２６−３２；Ｋａｙ Ａ． Ｂ．ら， 「アトピー被験者のアレルゲン誘導遅発型皮膚反応における、サイトカイン遺伝子クラスター、インターロイキン３（ＩＬ−３）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子のメッセンジャーＲＮＡ発現（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ， ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３ （ＩＬ−３）， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ， ｉｎ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｍａｒ．１，１９９１， １７３（３）：７７５−８；ｄｅ Ｗｉｔ Ｈら， 「単球細胞におけるＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６遺伝子発現の示差的調節（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ−ＣＳＦ ａｎｄ ＩＬ−６ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １９９４ Ｆｅｂ．， ８６（２）：２５９−６４；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ Ｅ．ら， 「ポリメラーゼ連鎖反応による、単純ヘルペスウイルス−１による感染の際のケラチノサイト、ランゲルハンス細胞および腹腔滲出細胞中のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６遺伝子転写物の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１β， ＴＮＦ−α， ａｎｄ ＩＬ−６ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ， Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｅｘｕｄａｔｅ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１）」， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９９２， １２６（１−４）：２５３−６９）。
【００７１】
本発明の方法に利用する好適なベクターは、アデノウイルス、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００７２】
選択されるウイルスベクターは次の判定基準に適合すべきである：１）ベクターは腫瘍細胞に感染できなければならないので、適当な宿主範囲を有するウイルスベクターを選択すること；２）導入した遺伝子は存続して長時間にわたり細胞内で発現すること；そして３）ベクターは宿主に対して安全であって最小限の細胞トランスフォームを起こすこと。レトロウイルスベクターとアデノウイルスは、効率的、有用、かつ現在最も良く特性決定された、外来遺伝子を効率的に哺乳類細胞に導入し発現させる手段を提供する。これらのベクターは、非常に広い宿主および細胞型範囲を有し、遺伝子を安定して効率よく発現する。これらのベクターの安全性は多くの研究グループによって証明されている。実際、多数が臨床試験に使われている。
【００７３】
障害を矯正するために細胞中への遺伝子導入に利用しうる他のウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）などのレトロウイルス；ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルスなどのパポバウイルス；エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）；乳頭腫ウイルス、例えばウシ乳頭腫ウイルスＩ型（ＢＰＶ）；ワクシニアおよびポリオウイルスならびに他のヒトおよび動物ウイルスが挙げられる。
【００７４】
アデノウイルスは、クローニング運搬体として魅力的ないくつかの性質をもつ（Ｂａｃｈｅｔｔｉｓら：「精製単純ヘルペスウイルスＤＮＡによる、チミジンキナーゼ欠損ヒト細胞への遺伝子導入（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ）」， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １９７７ ７４：１５９０；Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｋ．Ｌ．：「異種遺伝子発現用のアデノウイルスベクターの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ）」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９８８ ６：６１６；Ｇｈｏｓｈ Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｇ．ら， 「感染性細菌プラスミドに基づくヒトアデノウイルスクローニングベクター（Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ）」， Ｇｅｎｅ １９８６； ５０：１６１；Ｈａｇ Ａｈｍａｎｄ Ｙ．ら， 「ヘルパー非依存性ヒトアデノウイルスベクターの開発と単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の導入におけるその利用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｅｌｐｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ）」， Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８６； ５７：２５７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｍ．ら， 「ｉｎ ｖｉｖｏでの、肺上皮への組換えα１−アンチトリプシン遺伝子のアデノウイルスを介する導入（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ．ａｌｐｈａ．．ｓｕｂ．１ −ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｖｉｖｏ）」． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１； ２５２：４３１））。
【００７５】
例えば、アデノウイルスは、細胞核内で複製する中間サイズのゲノムを有し；多くの血清型は臨床的に無害であり；アデノウイルスゲノムは外来遺伝子を挿入しても安定と考えられ；外来遺伝子が損失または再配置なく維持されるようであり；そしてアデノウイルスは４週間〜数ヶ月間の発現期間をもつ高レベルの一過性発現ベクターとして利用しうる。広範な生化学的および遺伝学的研究は、７〜７．５ ｋｂの異種配列を天然のアデノウイルス配列と置き換えて、生存可能な条件付きのヘルパー非依存性ベクターを作製することが可能であることを示唆する（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．； 「アデノウイルス翻訳制御に必要な構成要素の同定とｃＤＮＡ発現ベクターにおけるそれらの利用（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １９８５ ８２：６８９）。
【００７６】
ＡＡＶは、ほぼ５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムをもつ小さいヒトパルボウイルスである。このウイルスは、複数のヒト細胞型に組み込まれたプロウイルスとして伝播することができる。ＡＡＶベクターはヒト遺伝子治療用にいくつかの利点がある。例えば、これらはヒト細胞に対し栄養依存性であるが、他の哺乳類細胞にも感染しうる；（２）ヒトまたは他の動物においてＡＡＶに関連する疾患はない；（３）組み込まれたＡＡＶゲノムはその宿主細胞内で安定であると思われる；（４）ＡＡＶの組込みが宿主遺伝子もしくはプロモーターの発現を改変するかまたはそれらの再配置を促進することは示されていない；（５）導入した遺伝子は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを用いる感染によって、宿主細胞からレスキューしうる。
【００７７】
ＨＳＶ−１ベクター系は、非分裂細胞中への実質的にすべての遺伝子の導入を容易なものにする（Ｇｅｌｌｅｒら， 「欠陥単純ヘルペスウイルスベクターのための効率的な欠失突然変異パッケージングシステム：ヒト遺伝子治療および神経生理学への応用可能性（ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， １９９０ ８７：８９５０）。
【００７８】
哺乳類遺伝子導入用の他のベクターは、ウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクターである（Ｓａｒｖｅｒ Ｎ，ら， 「ウシ乳頭腫ウイルスＤＮＡ：新規の真核生物クローニングベクター（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）」． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８１； １： ４８６）。
【００７９】
ワクシニアおよび他のポックスウイルスに基づくベクターは、哺乳類遺伝子導入系を提供する。ワクシニアウイルスは、１２０キロダルトン（ｋｄ）ゲノムサイズの大きな二本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｐａｎｉｃａｌｉ Ｄ，ら， 「クローニングベクターとしてのポックスウイルスの構築：単純ヘルペスウイルスから感染性ワクチンウイルスのＤＮＡ中へのチミジンキナーゼ遺伝子の挿入（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ａｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ）」， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２； ７９：４９２７；Ｓｍｉｔｈら 「Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を発現する感染性ワクシニアウイルス組換え体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）」， Ｎａｔｕｒｅ， １９８３ ３０２：４９０．）。
【００８０】
レトロウイルスはウイルス遺伝子を宿主細胞中に挿入するように設計したパッケージである（Ｇｕｉｌｄ Ｂら， 「ｉｎ ｖｉｖｏでの培養マウス胚細胞および造血細胞における遺伝子発現に有用なレトロウイルスベクターの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）」， Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８８； ６２：７９５；Ｈｏｃｋ Ｒ． Ａ．ら， 「ヒト造血前駆細胞における、薬物耐性遺伝子のレトロウイルスを介する導入と発現（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）」， Ｎａｔｕｒｅ １９８６； ３２０：２７５）。基本レトロウイルスは、プロウイルスタンパク質にパッケージされた２つの同一のＲＮＡ鎖からなる。そのコアはエンベロープと呼ばれる保護コートにより囲まれ、該エンベロープは先の宿主の膜に由来するがウイルスの寄与による糖タンパク質を用いて改変されている。
【００８１】
マーカーや増幅体も被験者発現系に使用することができる。トランスフォーム細胞系を選択するのに有用である様々なマーカーが知られていて、マーカーは一般的に、細胞が適当な選択培地で増殖されると発現してトランスフォーム細胞に選択可能な表現型を与える遺伝子を含んでなる。哺乳類細胞系に対するそのようなマーカーは、例えば、マイコフェノール酸およびキサンチンを含有する培地中で選択できる、細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎら， （１９８１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２−２０７６）、および哺乳類細胞に通常は毒性があるＧ４１８などのネオマイシン誘導体を含有する培地を用いて選択できる、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン／カナマイシン誘導体の抗菌作用を不活化するタンパク質を規定する）（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４）が挙げられる。他の真核生物発現系に有用なマーカーは、当業者に周知である。
【００８２】
感染はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施しうる。細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染は、遺伝子導入ベクターを細胞培養培地に加えることによって実施する。感染をｉｎ ｖｉｖｏで実施するときは、遺伝子導入ベクターを含有する溶液を、感染させる組織に依存して様々な方法で投与することができる。そのような投与方法の例は、遺伝子導入ベクターの皮膚への注射、皮膚上の局所適用、上皮表面への直接適用、または器官中への滴下注入（例えば、皮膚下または腫瘍中への経時放出パッチまたはカプセル）が挙げられる。
【００８３】
発現は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などの増幅可能な遺伝子をコード配列に隣接して配置することによって増幅してもよい。その後、細胞をｄｈｆｒ欠損細胞におけるメトトレキセート耐性に対して選択することができる。例えば、Ｕｒｌａｕｂら， （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０；Ｒｕｎｇｏｌｄら， （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． ａｎｄ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １：１６５−１７５を参照。
【００８４】
上記の系は、様々な原核生物性、真核生物性およびウイルスタンパク質の発現を指令するために利用することができ、例えば、ワクチン抗原として利用するのに適当なウイルス糖タンパク質、免疫応答を調節するための免疫調節物質、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子、ならびに他の生物医薬品の生産に有用であるタンパク質が挙げられる。
【００８５】
また、目的のタンパク質の突然変異体または類似体を作ることも所望されよう。突然変異体または類似体は、タンパク質をコードする配列の一部分の欠失によって、ある配列の挿入によって、および／またはその配列内の１以上のヌクレオチドの置換によって、作製することができる。位置指定突然変異誘発などのヌクレオチド配列を改変するための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 前掲；「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」， ＩおよびＩＩ巻， 前掲；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」， 前掲を参照。
【００８６】
本発明の目的にとって、宿主生物からポリペプチドの分泌をもたらすようにコード配列をさらに遺伝子操作することが特に望ましい。これはクローン安定性を増強しかつ宿主細胞内のタンパク質の有害なビルドアップを防止することにより、発現をさらに効率よく進行することができるようにする。この目的のために、相同シグナル配列を、シグナル配列と関連して通常見出されるタンパク質とともに利用することができる。さらに、タンパク質を分泌させる異種リーダー配列を構築物に加えることができる。好ましくは、プロセシング部位は、リーダー断片が、一緒に発現されるタンパク質から切断されるように含まれるであろう（例えば、そのような切断部位を導入する方法の考察については米国特許第４，３３６，２４６号を参照）。リーダー配列断片は、典型的には疎水性アミノ酸を含んでなるシグナルペプチドをコードする。
【００８７】
本発明の一実施形態においては、異種遺伝子配列、すなわち治療遺伝子を本発明の核酸分子中に挿入する。本発明の単離した核酸分子の他の実施形態としては、組織特異性を損なうことなく異種治療遺伝子の発現を増幅する単一エンハンサーエレメントまたは複数のエンハンサーエレメントの付加が挙げられる。
【００８８】
利用するトランスフォーム方法は、トランスフォームする宿主に依存する。哺乳類細胞をトランスフォームするのに利用できる好都合な方法は、例えばＤＥＡＥ−デキストランに基づく方法、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）、プロトプラスト融合、リポソームを介する導入、ポリブレンを介するトランスフェクション、および核中へのＤＮＡ直接マイクロインジェクションである。細菌細胞は、一般的に塩化カルシウムを用いて、単独でまたは他の２価カチオンおよびＤＭＳＯと組合せてトランスフォームしうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９））。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞中に導入することもできる。外因性ＤＮＡを酵母宿主中に導入する方法は、典型的にはスフェロプラストのトランスフォームまたはアルカリカチオンによって処理した無傷の酵母細胞のトランスフォームのいずれかが挙げられる。
【００８９】
構築物はまた、遺伝子治療または核酸免疫感作に利用して、発現構築物を被験者に直接投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで所望の遺伝子産物の産生を指令してｉｎ ｖｉｖｏでそれを翻訳させることもできる。例えば、ＥＰＡ公開番号第３３６，５２３号（Ｄｒｅａｎｏら、１９８９年１０月１１日公開）を参照。あるいは、遺伝子導入は、被験者の細胞または組織をｅｘ ｖｉｖｏで発現構築物を用いてトランスフェクトし、トランスフォームした材料を宿主中に再導入することによって実施してもよい。構築物を宿主生物中に直接、すなわち、注射によって導入してもよい（例えば、国際公開番号ＷＯ／９０／１１０９２；およびＷｏｌｆｆら， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８を参照）。リポソームを介する遺伝子導入は公知の方法を用いて実施してもよい。例えば、Ｈａｚｉｎｓｋｉら， （１９９１） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０６−２０９；Ｂｒｉｇｈａｍら， （１９８９） Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８−２８１；Ｃａｎｏｎｉｃｏら， （１９９１） Ｃｌｉｎ． Ｒｅｓ． ３９：２１９Ａ；およびＮａｂｅｌら， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−１２８８を参照。特定の細胞型上に発現される表面抗原に対する抗体などのターゲッティング薬剤は、核酸を特定の組織および細胞に送達して局所投与できるように、リポソーム表面と共有結合させてもよい。
【００９０】
ヒト遺伝子治療とベクターの診断利用
組換えＲＮＡ勧告委員会（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＡＣ）によって利用が承認されている複数のヒト遺伝子治療用プロトコルは、標的細胞感染およびトランスフェクト細胞投与の一般プロトコルと適合する（例えば、Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍら、１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．、１９９２；Ｃｕｌｖｅｒ，Ｋ．Ｗ．ら、１９９１参照）。さらに、米国特許第５，３９９，３４６号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．ら、１９９５年３月２１日、米国特許出願第２２０，１７５号）はレトロウイルス遺伝子導入の方法を記載する。これらの裏付けとなる参照文献の内容はその全文が本特許出願に組み入れられる。レトロウイルスを介する遺伝子導入は、安定した組込みを達成するために細胞分裂が進行中の標的細胞を必要とするので、被験者からしばしば血液または骨髄を採取することにより細胞を採集する。感染プロトコルで利用するために、元来集めた細胞の特定亜集団を選択する必要のあることがある。次いで、目的の遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを培地に混合する。ベクターは被験者の細胞の表面と結合して細胞に進入し、そして目的の遺伝子を無作為に染色体中に挿入する。目的の遺伝子は今や安定して組込まれ、定位置に残り、そして細胞数が増えると全ての娘細胞に受け継がれる。細胞は再注入まで培養して全９〜１０日間増殖させればよい（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９１）。標的細胞を培養させる時間が長くなるほど、異物混入の可能性も増加するので、プロトコルは短いほど好ましいであろう。
【００９１】
本発明は、遺伝子治療用途または診断利用のために、目的の遺伝子と連結したＰＥＧ−３プロモーターまたはその機能的等価物を含有するレトロウイルスベクターの構築を提供する。これらのベクターの形質導入効率は細胞培養系で試験することができる。
【００９２】
本発明の組成物の利用
本発明は、目的の遺伝子を癌細胞に標的化してその遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、そして直接または間接に病状を改善することを伴う。ＰＥＧ−３プロモーターは、癌進行中の癌細胞に特異的に活性があるので、組織特異的な（癌細胞に対して特異的な）プロモーターとして作用しうる。
【００９３】
感受性細胞に感染した後、ベクターの特異的プロモーターにより駆動されるトランスジーンはその遺伝子がコードするタンパク質を発現する。高度に特異的な遺伝子ベクターを利用すると、癌細胞における特異的遺伝子の選択的発現が可能になる。本発明の方法の基本的な仕事は、目的の遺伝子を単離し、目的の遺伝子を身体に送達するのに適当なベクター運搬体を選択し、目的の遺伝子を有するベクターを身体内に投与し、そして目的の遺伝子の適当な発現を達成することである。本発明は、それを必要とする患者の血流または関係器官中に直接注入しうる方法で、クローニングした遺伝子、すなわち目的の遺伝子のパッケージングを提供する。該パッケージングは、外来ＤＮＡを免疫系による排除から保護して適当な組織または細胞へ導く。
【００９４】
本発明の一実施形態においては、目的の遺伝子（所望のコード配列）は癌抑制遺伝子である。癌抑制遺伝子は、ｐ２１、ＲＢ（網膜芽細胞腫）またはｐ５３であってもよい。当業者であれば、他の癌抑制遺伝子にも精通しているであろう。癌抑制遺伝子に関する当技術分野の状況をさらに明白に記載するため、最近の米国特許第６，０２５，１２７号および第５，９１２，２３６号が本明細書に参照により組み入れられる。
【００９５】
ヒトまたは動物の目的の遺伝子とともに、他の遺伝子、例えば選択マーカーを挿入して、改変したレトロウイルスを組込んでいる細胞の同定を容易にすることができる。遺伝子治療の方法の最も重要な点は、新しい遺伝子を標的細胞内に適当なレベルで満足すべき発現期間にわたって発現しなければならないことである。
【００９６】
ベクターを改変しかつその改変ベクターを皮膚中に投与するための以下に記載した方法は、単に説明の目的のためでありかつ利用しうる方法の典型である。しかし、当技術分野で理解されている他の方法も使用することができる。
【００９７】
ベクターなどを構築するために利用するほとんどの技術は、当技術分野で広範に実施されていて、ほとんどの当業者は、特定の条件と方法を記載する標準的な資料を精通している。しかし以下の章は、便宜上、ガイドラインとなるであろう。
【００９８】
ベクター構築の一般的方法
所望の治療遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築は、当技術分野で十分理解されている標準のライゲーションと制限酵素技術を使用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）を参照）。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、仕立て、そして所望の形に再ライゲートする。
【００９９】
位置指定ＤＮＡ切断は、適当な１以上の制限酵素を用いて、一般的に当技術分野で理解されかつ個々については市販制限酵素の製造業者が規定する条件（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ 製品カタログ）のもとで処理することによって実施する。一般的に、ほぼ１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、ほぼ２０μｌのバッファー溶液中の１単位の酵素によって切断する。典型的には、過剰の制限酵素を利用してＤＮＡ基質の完全な消化を保証する。
【０１００】
３７℃にてほぼ１〜２時間のインキュベーション時間で処理できるが、変更もありうる。それぞれのインキュベーション後に、タンパク質をフェノール／クロロホルムを用いる抽出によって除去し、次いでエーテル抽出し、そして核酸を水性画分からエタノールを用いる沈殿によって回収する。もし所望であれば、切断断片のサイズ分離を、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により、標準技術を用いて実施してもよい。サイズ分離の一般的記載は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９−５６０ （１９８０）に見出される。
【０１０１】
制限酵素切断断片は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレノウ（Ｋｒｅｎｏｗ））を用いて、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の存在のもとで処理することにより平滑末端化することができ、この処理は、ほぼ１５〜２５分のインキュベーション時間、２０℃〜２５℃の条件を用いて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．６）５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２、６ ｍＭ ＤＴＴおよび５−１０μＭ ｄＮＴＰｓ中で実施する。４種のｄＮＴＰｓが存在しても、クレノウフラグメントは５’粘着末端を充填するが、３’突出一本鎖は削り込む。もし所望であれば、選択的修復を、ｄＮＴＰｓの１種を供給するかまたは選択したｄＮＴＰｓを用いて、粘着末端の特性により規定される制限内で実施してもよい。クレノウによる処理の後、混合物をフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈殿させる。適当な条件下でＳ１ヌクレアーゼまたはＢａｌ−３１を用いて処理すると、任意の一本鎖部分の加水分解が起こる。
【０１０２】
ライゲーションは、次の標準条件と温度のもとでＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、１０−５０μｌ容積で実施する。ライゲーションのプロトコルは標準である（Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ （編） 「遺伝子発現技術：酵素学の方法（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 （１９９１））。「ベクター断片」を使用するベクター構築において、ベクター断片は、５’リン酸を除去してベクターの再ライゲーションを防止するために、通常、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理する。代わりに、望ましくない断片を追加の制限酵素消化によって二重消化しておいたベクターで、再ライゲーションを防止してもよい。
【０１０３】
適当なベクターは、ウイルスベクターシステム、例えばＡＤＶ、ＲＶ、およびＡＡＶが挙げられる（Ｒ．Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ 「「哺乳類細胞における発現に用いるベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄ．Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編 （１９９１））。
【０１０４】
機能性ＤＮＡトランスジーンを細胞中に挿入する多数の方法が当技術分野では知られている。例えば、非ベクター法は、細胞中へのＤＮＡの非ウイルス性物理的トランスフェクション；例えば、マイクロインジェクション（（ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ６：６６２−６８０ （１９８８））；リポソームを介するトランスフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７ （１９８７）、ＦｅｌｇｎｅｒおよびＨｏｌｍ， Ｆｏｃｕｓ １１：２１−２５ （１９８９）ならびにＦｅｌｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｗｅｓｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｏｃ． ３２：１１５−１２１ （１９８９））、ならびに当技術分野で知られる他の方法が挙げられる。
【０１０５】
改変したベクターの被験者への投与
ＤＮＡを標的細胞中に入れる１つの方法は、ＤＮＡをスフェロプラストもしくはリポソームなどの膜に囲まれた嚢もしくは小胞内に置くか、またはリン酸カルシウム沈殿（ＣａＰＯ４）による（Ｇｒａｈａｍ Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６ １９７３；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ Ｍ．ら， 「遺伝子担体としてのリポソーム：チミジンキナーゼ遺伝子によるマウスＬ細胞の効率的な形質導入（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ ： Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ Ｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ）」， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８２， ２１５：１６６；Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ Ｊ． Ｃ．ら， 「外因性ＤＮＡをウサギの骨髄赤芽球へｉｎ ｖｉｖｏ輸送するためのトランスフェリンコートしたリポソームの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｔｏ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ）」， Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９８６； １６４：５６８−５７２）。
【０１０６】
小胞は、その膜が標的細胞の外膜と融合するように構築することができる。小胞中の本発明のベクターは癌細胞中に辿り着くことができる。
【０１０７】
スフェロプラストは、ポリエチレングリコールなどの融合促進物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）を用いて哺乳類標的細胞へ融合されうるまで、高イオン強度バッファー中で維持する。
【０１０８】
リポソームは人工リン脂質小胞である。小胞はサイズが０．２〜４．０ミクロンであり、巨大分子を含有する１０％〜４０％のバッファー水溶液を封じこめることができる。リポソームはＤＮＡをヌクレアーゼから保護し、標的細胞中への導入を容易にする。トランスフェクションはまた、エレクトロポレーションによっても起こりうる。
【０１０９】
投与前に、改変したベクターを、完全ＰＢＳ中に注射のために選択した密度で懸濁する。ＰＢＳに加えて、任意に浸透圧を平衡化しかつ生理学的に被験者と適合しうる溶液を用いて懸濁し、その上で改変ベクターを宿主中に注入してもよい。
【０１１０】
注射には、細胞懸濁液を注射器内に引きこんで、そして麻酔した受給者に投与する。この方法を用いて多重注射を行うことができる。このようにして、ウイルス懸濁方法によって、遺伝子操作的に改変したベクターを皮膚の任意の予め決めた部位に投与することが可能であり、比較的傷付けることなく、同じウイルス懸濁液を用いて、複数の異なる部位または同じ部位に同時に多重投与することを可能にする。多重注射は治療遺伝子の混合物からなってもよい。
【０１１１】
このように投与した改変ベクターの生存
遺伝子の発現は、転写、翻訳または翻訳後のレベルで制御される。転写開始は、遺伝子発現における早期の重要な事象である。これはプロモーターおよびエンハンサー配列に依存しかつこれらの配列と相互作用する特定の細胞因子の影響を受ける。多くの原核生物遺伝子の転写単位はプロモーターおよび複数の事例ではエンハンサーまたはレギュレーターエレメントからなる（Ｂａｎｅｒｊｉら， Ｃｅｌｌ ２７：２９９ （１９８１）；Ｃｏｒｄｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４０６ （１９８０）；ならびにＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５０：３４９ （１９８１））。
【０１１２】
レトロウイルスでは、レトロウイルスゲノムの複製に関わる制御エレメントは長末端反復配列（ＬＴＲ）に存在する（Ｗｅｉｓｓら編， 「腫瘍ウイルスの分子生物学：ＲＮＡ腫瘍ウイルス（Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ： ＲＮＡ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ． （１９８２））
モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲは、プロモーターおよびエンハンサー配列を含有する（Ｊｏｌｌｙら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：１８５５ （１９８３）；Ｃａｐｅｃｃｈｉら， 「エンハンサーと真核生物遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」， ＧｕｌｚｍａｎおよびＳｈｅｎｋ編， ｐｐ．１０１−１０２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．）。
【０１１３】
複数の非ウイルスプロモーターのプロモーターとエンハンサー領域も記載されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８５ （１９８５）；Ｒｏｓｓｉおよびｄｅ Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：５５９０−５５９４ （１９８７））。
【０１１４】
ウイルスおよび非ウイルスのプロモーターを用いて治療遺伝子発現を駆動するのに加えて、エンハンサー配列を用いて治療遺伝子発現のレベルを増加してもよい。エンハンサーは、それらの天然の遺伝子の転写活性だけでなく複数の外来遺伝子の転写活性も同様に増加させることができる（Ａｒｍｅｌｏｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７０： ２７０２ （１９７３））。
【０１１５】
治療遺伝子発現はまた、プロモーター活性をモジュレートするサイトカインを用いて、注入後の長期間にわたる安定した発現を増加させることもできる。
【０１１６】
本発明の方法を、治療遺伝子を担持する改変したベクターを被験者の脳内に注入する好ましい実施形態によって例示する。
【０１１７】
本発明の分子に対する投与および投与量計画の最も効果的な様式は、治療する癌の正確な位置、癌の重篤度および経過、被験者の健康および治療に対する応答、ならびに治療医師の判断に依存する。従って、分子の投与量は個々の被験者に対して滴定すべきである。分子は、直接または他細胞を経由して間接に送達することができ、自己細胞が好ましいが、異種細胞も本発明の範囲に包含される。
【０１１８】
様々なサイズおよび種の動物ならびにヒトに対する投与量とそれが基づく表面積１ｍ２当たりのｍｇとの相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ， Ｅ． Ｊ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．， Ｒｅｐ． ５０ （４）：２１９−２４４ （１９６６）に記載されている。投与量計画を調節して、腫瘍細胞増殖を抑制および死滅させる応答を最適化してもよく、例えば、投与量を分割して日単位で投与するかまたは状況に応じて比例的に減少させた量で投与してもよい（例えば、複数に分割した投与量を毎日投与するかまたは特定の治療状況に応じて比例的に減少させて投与してもよい）。
【０１１９】
治癒を達成するのに必要な本発明の分子の投与量を、スケジュール最適化によってさらに削減しうることは明らかであろう。
【０１２０】
癌細胞における異種遺伝子の高発現を指令するためのＰＥＧ−プロモーターの利用
本発明の一実施形態は、癌細胞内で内因的に発現されない目的の遺伝子を発現する方法であって、ａ）目的の遺伝子と機能的に連結されているＰＥＧ−３プロモーターを含む核酸を構築し；ｂ）この核酸を、ＰＥＧ−３を発現する癌細胞中に導入し、それによって癌細胞内でＰＥＧ−３プロモーターに目的の遺伝子の発現を指令させることを含む前記方法を提供する。一実施形態においては、目的の遺伝子は、癌細胞に対して細胞傷害性をもつタンパク質をコードし、癌細胞のアポトーシスを引き起こし、癌細胞の増殖を遅延させ、または癌細胞の分裂を停止する。目的の遺伝子は、その発現が癌細胞内に、増殖の低減または癌表現型進行の低減もしくは抑制などの所望の生化学的または生理学的効果を起こしうるいずれの遺伝子であってもよい。
【０１２１】
本発明の核酸構築物を被験者の癌を治療する前記方法に利用する１つの利点は、核酸を癌細胞および正常細胞の両方に投与できることにある。しかし、ＰＥＧ−３プロモーターは癌細胞においてのみ活性があるので、正常細胞で目的の遺伝子は発現しないのに対して癌細胞では目的の遺伝子の高発現が起こる。従ってこの核酸構築物によって、目的の遺伝子の特異的発現を特異的に癌細胞に標的化することが可能になる。
【０１２２】
リポソームを送達薬剤として利用して核酸構築物を治療すべき被験者の細胞に導入することができる。勿論、そのような核酸構築物を送達する多数の方法が存在し、当業者にはそれらは周知である（例えば、マイクロインジェクション；局所適用；化学運搬体の利用；腫瘍中への直接注入；など）。
【０１２３】
本発明を次の実験の詳細の節において説明する。これらの節は本発明の理解を助けるために記載するものであって、本願の請求の範囲に記載した本発明をいずれの方法であれ限定すると解釈されるべきものではない。
【０１２４】
実験の詳細
実施例１：トランスフォーメーション進行中の示差発現の原因になる、進行上昇遺伝子−３プロモーター内の領域の規定
癌は進行性疾患であり、腫瘍細胞は、質的に新しいトランスフォーメーションに関係する表現型または現存トランスフォーメーションに関連する特性のさらなる生成を経時的に発生する。げっ歯類動物細胞培養モデル系を用いて癌進行に関連しかつ制御する遺伝子を規定する。サブトラクションハイブリダイゼーションによって、突然変異体アデノウイルス５型、Ｈ５ｔｓ１２５でトランスフォームした（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）ラット胚細胞におけるトランスフォーメーション進行の誘導に機能的に関わる新規遺伝子を同定し、これを進行上昇遺伝子−３（ＰＥＧ−３）と呼んだ。ほぼ２．１キロ塩基の５’−フランキングプロモーター領域、ＰＥＧ−プロモーターを単離し、クローニングして特性を決定した。ＰＥＧ−プロモーターの全長および様々な突然変異領域をルシフェラーゼレポーター構築物と連結して、癌進行中のプロモーター活性を一過性トランスフェクションアッセイを用いて評価した。これらの実験は、非進行性Ｈ５ｔｓｌ２５−トランスフォームラット胚細胞と対比して、ＰＥＧ−３発現増大に介在するＰＥＧ−３のＴＡＴＡボックス領域に隣接するＡＰ−１とＰＥＡ−３部位の必要性を実証した。ＰＥＧ−３調節に対するＡＰ−１およびＰＥＡ−３の関わりはまた、タンパク質ブロッティング、電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイならびにＰＥＡ−３およびｃ−Ｊｕｍ発現ベクターを用いたトランスフェクション研究によっても実証された。本発明者らの発見は、攻撃的かつ進行性癌表現型を提示するＨ５ｔｓｌ２５トランスフォームラット胚細胞における、ＰＥＧ−３発現上昇に介在するＡＰ−１とＰＥＡ−３転写因子の重要性を立証する。
【０１２５】
実施例２：進行上昇遺伝子−３（ＰＥＧ−３）プロモーター内のＡＰ−１とＰＥＡ−３部位間の協同作用が、トランスフォームしたラット胚細胞における腫瘍形成表現型進行中のＰＥＧ−３の基底および示差発現を調節する
発癌プロセスは、一連の細胞表現型の逐次変化に関わり、腫瘍細胞を発展することによって新しい特性またはトランスフォーメーションに関連する形質のさらなる生成をもたらす（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３）。広範囲の研究が行われているが、ほとんどのヒト癌発生中の腫瘍細胞進行の根底にある正確な遺伝機構は未だわかっていない。実験的確証は、多数の多様な作用をする遺伝子エレメントが癌発生とトランスフォーメーション進行に寄与しうることを示す（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；ＨａｒｔｗｅｌｌおよびＫａｓｔａｎ、１９９４；Ｋａｎｇら、１９９８ａ；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３；Ｓｕら、１９９７；１９９９）。これらのプロセスに関わる重要な標的遺伝子としては、発癌遺伝子、癌抑制遺伝子ならびにゲノム安定性、癌攻撃性および血管形成を調節する遺伝子が挙げられる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂｉｓｈｏｐ、１９９１；Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；Ｋｎｕｄｓｏｎ、１９９３；Ｌｅｖｉｎｅ、１９９３；ＨａｒｔｗｅｌｌおよびＫａｓｔａｎ、１９９４；Ｋａｎｇら、１９９８ａ；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、１９９３；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。最近、癌攻撃性に関連するかまたは特定の事例では直接調節するいくつかの新規の遺伝子エレメント、すなわち進行上昇（ＰＥＧｅｎ）および進行抑制（ＰＳＧｅｎ）遺伝子が同定された（Ｋａｎｇら、１９９８ａ；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。これらの異なる遺伝子が癌進行の複雑なプロセスを編成する正確な機構は重要な研究分野であって、癌に対する新しい診断および治療手法をもたらしうる新規の経路および標的分子を規定する可能性を有する。
【０１２６】
腫瘍進行に介在する遺伝的および生化学的変化を規定する有用なモデルは、Ａｄ５／初期継代ＲＥ細胞培養系である（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９、１９９０、１９９１；Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ａ，ｂ，ｃ；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９４、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。二次ラット胚（ＲＥ）細胞のＡｄ５によるトランスフォーメーションはしばしば逐次プロセスであって、非トランスフォーム細胞によって特異的表現型のさらなる生成の取得が起こる（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ ａ、ｂ、ｃ；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ａｄ５トランスフォーメーションモデルにおける進行は、足場非依存性増大および腫瘍形成能の発生（ヌードマウスにおける形成として）によって特徴づけられる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ａｄ５トランスフォームＲＥ細胞の進行表現型は、寒天における増殖またはヌードマウスにおける腫瘍形成についての選択（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７９ａ、ｂ、ｃ；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）により、Ｈａ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｒａｆまたはヒト乳頭腫ウイルス１８型のＥ６／Ｅ７領域などの発癌遺伝子を用いたトランスフェクション（Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）により、またはタンパク質キナーゼＣなどの特定のシグナル伝達遺伝子を用いたトランスフェクション（Ｓｕら、１９９４）により誘導することができる。
【０１２７】
自発性または遺伝子導入後に誘発した進行は安定な細胞形質であって、単層培養中で多回継代（＞１００）後でもＡｄ５トランスフォームＲＥ細胞内で消滅することなく残存する（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。しかし、脱メチル化剤５−アザシチジン（ＡＺＡ）を用いた１回の処理では、細胞クローンの＞９５％においてトランスフォーメーション進行の復帰が安定して起こる（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９４）。進行表現型はまた、正常もしくは非進行性トランスフォーム細胞と進行性細胞との間で形成された体細胞ハイブリッドでも抑制される（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０、１９９１；Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。これらの知見は、進行が特定の進行促進（進行上昇）遺伝子の活性化もしくは進行抑制（進行抑制）遺伝子の選択的阻害、または恐らく両方のプロセスの組合せにより生じうることを示唆する（Ｆｉｓｈｅｒ、１９８４；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｓｕら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。非進行性Ａｄ５トランスフォーム細胞と対比して進行性Ａｄ５トランスフォーム細胞において発現が上昇する潜在的進行誘導遺伝子を同定するために、本発明者らはサブトラクションハイブリダイゼーションおよび相互サブトラクションディファレンシャルＲＮＡディスプレイ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ；ＲＳＤＤ）手法を利用している（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ａ）。サブトラクションハイブリダイゼーション手法により、進行性細胞（自発性、癌遺伝子で誘導したまたは増殖因子関連遺伝子で誘導した）において、非進行性細胞（親Ａｄ５でトランスフォームした、ＡＺＡ−抑制した、および抑制された体細胞ハイブリッド）よりも上昇した発現を提示するＰＥＧ−３クローンを得た（Ｓｕら、１９９７）。これらの知見は、このラット胚モデル系におけるＰＥＧ−３発現と進行表現型の間の直接的な相関を立証する。
【０１２８】
核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ａｓｓａｙ）は、ＰＥＧ−３発現とこの遺伝子のＲＮＡ転写速度増加との間の直接的な相関を確証する（Ｓｕら、１９９７）。トランスフォーメーション進行中のＰＥＧ−３の示差的発現の根底にある機構を解明するために、該プロモーター（ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ）を含有するこの遺伝子の５’−フランキング領域を単離して特性を決定した。全長ほぼ２．０ｋｂ ＰＥＧ−ＰｒｏｍおよびＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中の様々な突然変異（欠失および点突然変異を含む）を構築して分析した。この究明の結果は、ＡＰ１とＰＥＡ３転写因子が進行性Ａｄ５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３発現上昇の主要な決定因子であることを実証する。この結論を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）ならびにｃ−ＪｕｎおよびＰＥＡ３発現ベクターを用いたトランスフェクション研究によって立証する。
【０１２９】
結果
ＰＥＧ３発現はトランスフォーメーション進行と直接的に相関する
ＰＥＧ−３発現とトランスフォーメーション進行との間の関係を評価するために、本発明者らは正常から高度進行性までの全範囲にわたる一連のげっ歯類動物細胞系を利用した（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８７；Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９；Ｒｅｄｄｙら、１９９３；Ｓｕら、１９９７，１９９９）。このげっ歯類動物モデルの進行表現型の特徴は、足場非依存性で増大した効率にて増殖しかつ腫瘍をヌードマウスにおいて短い腫瘍潜伏時間（それぞれ、３８〜４４日に対して１８〜２１日）で誘導する能力である（Ｂａｂｉｓｓら、１９８５；Ｓｕら、１９９９）。特定のＨ５ｔｓｌ２５でトランスフォームした二次スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ＲＥクローンであるＥ１１は寒天中で低効率（ほぼ２〜４％）で増殖する（進行性陰性）が、高度進行性ヌードマウス腫瘍から誘導したＥ１１サブクローンであるＥ１１−ＮＭＴは寒天中で高効率（ほぼ３０〜４５％）で増殖する（図１Ａ）。Ｅ１１細胞、代表クローンとしてＥ１１−ｒａｓ Ｒ１２中のＨＡ−ｒａｓ発癌遺伝子を強制発現させると、足場非依存性増殖（図１Ａ）とヌードマウスにおける腫瘍潜伏時間の両方により示される進行表現型を獲得する（Ｒｅｄｄｙら、１９９３）。ノーザンハイブリダイゼーション（図１Ｂ）によってＰＥＧ−３ ｍＲＮＡレベルを、およびウェスタンブロッティング（図１Ｃ）によってＰＥＧ−３タンパク質レベルを定量すると、ＰＥＧ−３発現（すなわち、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓ Ｒ１２における上昇ならびにＥ１１における低下）と進行表現型（足場非依存性増殖により示される）との間に直接的な相関を示す。
【０１３０】
ＰＥＧ−３発現と進行との間の関係をさらに究明するために、Ｅ１１、Ｅｌｌ−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓ Ｒ１２細胞で測定したのと同じ３つのパラメーターを用いて、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成した一連の体細胞ハイブリッドを比較した（図１）。ＣＲＥＦ細胞は、寒天中で増殖するとコロニーを形成しない不死ラット胚細胞であって、無胸腺ヌードマウス中に皮下接種しても腫瘍形成能力をもたない（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８２；Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。同様に、Ｆ１およびＦ２などの膨れた（ｆａｔ）形態を提示するＥ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成した体細胞ハイブリッドもヌードマウスにおいて腫瘍を形成しない（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）が、これらは寒天中でＥ１１細胞に類似した低い効率で増殖する（図１Ａ）。対照的に、Ｒ１およびＲ２などの円形の形態を示す特定のＥ１１−ＮＭＴ Ｘ ＣＲＥＦ体細胞ハイブリッドは寒天中で高効率で増殖してＥ１１−ＮＭＴの効率すら超え（図１Ａ）、そしてヌードマウスにおいて迅速に腫瘍を形成する（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。Ｅ１１細胞で観察されたように、Ｆ１とＦ２細胞においてＰＥＧ−３ ｍＲＮＡとタンパク質のレベルは低下するが、Ｒ１とＲ２はＥ１１−ＮＭＴおよびＥ１１−ｒａｓ Ｒ１２細胞（図１Ｂ、１Ｃ）に類似するＰＥＧ−３の上昇した発現を提示する。ＣＲＥＦ細胞の場合には、ＰＥＧ−３ ｍＲＮＡはノーザンブロッティング（図１Ｂ）により非常に低いレベルで検出されかつＰＥＧ−３タンパク質はウェスタンブロッティング（図１Ｃ）で辛うじて検出可能である。これらの結果は、Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３発現と進行表現型との間の直接的一致を示す。
【０１３１】
ＰＥＧ−３プロモーターの単離とその転写開始部位の同定
ＰＥＧ−３ ｃＤＮＡの配列に基づき、ＰＥＧ−３ ＣＤＮＡの５’領域からゲノムウォーキング手法を用いて、ＰＥＧ−３遺伝子の５’フランキング領域を表す２．０−ｋｂラットゲノム断片を同定した。推定ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの配列を図２に示す。ＰＥＧ−３遺伝子の転写開始部位を、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞から単離したＲＮＡを用いてプライマー伸長によりマッピングした（図３）。ＰＥＧ−ＰｒｏｍのＧＣＧソフトウエアを用いたコンピューター解析は、ＲＮＡキャップ部位の上流、位置−１０７１および−２４にそれぞれ位置する２つのＴＡＴＡボックスの存在を示す。−１０７１の配列はＲＮＡキャップ部位からの距離が大きく離れているので、恐らく非機能性である。２つのＰＥＡ３−結合部位、ＡＧＧＡＡＡおよびＴＴＴＣＣＴは、位置−１６４４および−１０１に位置する。位置−１０１のＰＥＡ３部位はＴＡＴＡボックスの７６ ｎｔ上流にある。ＡＰ１部位は位置＋８に存在する。さらなる潜在的ＤＮＡ結合エレメントもＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中に見られ、Ｓｐｌ、急性期反応エレメント、ＮＦκＢ１、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ａ、ＧＲＥ、ＴＲＥおよびＣＲＥＢが挙げられる。
【０１３２】
ＰＥＧ−３プロモーター中のＴＡＴＡボックスに隣接するＡＰ１とＰＥＡ３部位は、進行性および非進行性Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞における基底および増大したプロモーター活性に関わる。
【０１３３】
ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍルシフェラーゼ構築物の様々な細胞型へのトランスフェクションは、進行表現型の発現とプロモーター活性上昇との間の直接的関係を実証した（図４）。進行性細胞はルシフェラーゼ活性において２．５〜３．５倍増加を提示し、この値はＰＥＧ−３ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングデータ（図１Ｂおよび１Ｃ）と十分に匹敵する。Ｅ１１細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは、Ｆ１およびＦ２ ＣＲＥＦ Ｘ Ｅ１１−ＮＭＴ体細胞ハイブリッドで観察されたレベルと類似した。活性があって増殖しているＣＲＥＦ細胞の場合、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍは無視し得る活性しか示さなかった。
【０１３４】
Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォーム細胞のトランスフォームした表現型の進行中のＰＥＧ−３遺伝子の示差発現に関わるＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域を規定するために、一連のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物を遺伝子工学的に操作し、ルシフェラーゼ遺伝子の前に配置した（図５および６）。位置−１６４５のＰＥＡ３部位および位置−１０７２のＴＡＴＡボックスの欠失は、Ｅ１１またはＥ１１−ＮＭＴのいずれのＰＥＧプロモーター活性にも影響を与えず、このことはプロモーターのこれらの領域はＥ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの基底または増大した発現に寄与しないことを示唆した（図５）。位置−２７０でのさらなる欠失はＥ１１−ＮＭＴ細胞のプロモーター活性を僅かに阻害した（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性と対比してほぼ１９％低下）が、Ｅ１１細胞のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性を有意に改変することはなかった。対照的に、−１０４ｎｔのＰＥＡ３部位を除去して位置−２４のＴＡＴＡボックスと＋８ｂｐのＡＰ１部位を保持すると、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方において基底プロモーター活性が低下した。この突然変異体ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性は、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１細胞のＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの活性よりそれぞれ１５および４倍低かった。実際、このプロモーター欠失は、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ中のＰＥＧ−Ｐｒｏｍの増大した発現を消滅させ、このことは、−１０４のＰＥＡ３部位は進行性Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞におけるＰＥＧ−３の増大した活性の主要な決定因子であることを示した。位置−１１６７〜−５３６および−１２６７〜−５３６の内部欠失は、Ｅ１１−ＮＭＴおよびＥ１１細胞において位置−２７０での欠失を含有する欠失突然変異体で観察されたルシフェラーゼ活性と類似のレベルを与えた。−１１６７〜−１４２および−１５９０〜−１４２の間に遺伝子工学的に操作した内部欠失は、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方でさらなるプロモーター活性の低下を生じ、最も大きな影響はＥ１１−ＮＭＴ細胞に見られた（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと比較して活性がほぼ４１％低下）。対照的に、−１４２、−５３６または−１２８７からのプロモーター領域を欠失してＰＥＧ−Ｐｒｏｍの残りを保持すると、ＰＥＧプロモーター活性は完全に消滅した（図５）。これらの結果は、ＰＥＡ３転写部位（位置−１０４）、ＡＰ１転写部位（位置＋８）およびＴＡＴＡボックス（位置−２４）がＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の主要な決定因子であることを意味する。
【０１３５】
位置−１０４のＰＥＡ３部位、位置−２４のＴＡＴＡボックスおよび位置＋８のＡＰ１部位の、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞中のＰＥＧ−３プロモーター活性調節における役割をさらに検証するために、さらなる一連の突然変異体ＰＥＧ−３プロモータールシフェラーゼ構築物を作製した（図６）。ＡＰ１部位に突然変異があって野生型ＰＥＡ３およびＴＡＴＡ部位を保持すると、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞において等価のプロモーター活性をもたらした。この観察は、ＰＥＧ−３プロモーターの位置＋８のＡＰ１部位の、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞のＰＥＧ−３転写活性上昇を調節する上での重要性を強調するものである。位置−１０４のＰＥＡ３部位のＰＥＧプロモーター活性を規定する上での関わりはまた、−１０４に突然変異ＰＥＡ３部位を含有して野生型ＴＡＴＡ（位置−２４）とＡＰ１（位置＋８）部位をもつ構築物の分析によっても実証された（図６）。この突然変異体においては、プロモーターの活性レベルは基底レベルであり、その活性はＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞で類似した。類似の基底プロモーター活性はまた、２つの追加の突然変異体でも観察され、その１つは突然変異体ＡＰ１とＰＥＡ３部位ならびに野生型ＴＡＴＡボックスを含有するもので、他の１つは位置−１０４のＰＥＡ３部位を欠いて野生型ＴＡＴＡとＡＰ１部位を有する突然変異体であった。対照的に、位置−１０４のＰＥＡ３を欠いて突然変異ＴＡＴＡ部位と位置＋８の野生型ＡＰ１部位をもつ突然変異体はプロモーター活性を提示しなかった。これらの結果は、＋８に位置するＡＰ１部位と位置−１０４のＰＥＡ３部位の両方が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現に関わることを立証する。ＡＰ１とＰＥＡ３は、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現、ならびにＥ１１細胞およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の主要な決定因子である。
【０１３６】
進行性Ｅ１１−ＮＭＴ細胞は増大した核転写因子結合を提示する
ウェスタンブロッティング分析を実施して、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞中のＡＰ１／ｃＪｕｎおよびＰＥＡ３タンパク質レベルを決定した。両方のタンパク質のｄｅ ｎｏｖｏ発現レベルは、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞においてほぼ１．５〜２倍高かった（データは示してない）。ＥＭＳＡを実施し、ＡＰ１およびＰＥＡ３タンパク質のＤＮＡ結合可能性ならびにＥ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞において結合複合体レベルの差が存在するかを決定した（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。野生型ＡＰ１オリゴヌクレオチドを用いると、ＡＰ１との結合レベルはＥ１１と対比してＥ１１−ＮＭＴにおいてより高かった（図７Ａ）。このＡＰ１との結合の特異性は、１０および１００倍モル過剰の無標識競合体との競合ならびに突然変異体ＡＰ１オリゴヌクレオチドを用いたときのＤＮＡ−タンパク質複合体の不在によって実証された（図７Ａ）。核抽出物とＡＰ１との結合の直接的立証は、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）抗体を用いたスーパーシフトアッセイによって提供された（図７Ａ）。対照的にｃＪｕｎ（ＡＰ１）抗体の代わりに抗アクチン抗体を用いるとＤＮＡ−タンパク質複合体のスーパーシフトは観察されなかった。ゲル遅延アッセイでＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを用いると、類似の結果が得られた（図７Ｂ）。ＰＥＡ３との増大した結合が、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞からの抽出物に観察された。ＥＭＳＡにおいて、突然変異ＰＥＡ３オリゴヌクレオチドとの結合は観察されず、無標識ＰＥＡ３競合体はＰＥＡ３との結合を効果的に阻害し、かつＰＥＡ３特異的抗体はスーパーシフトＤＮＡタンパク質複合体を生じたが、抗アクチン抗体は生じなかった（図７Ｂ）。これらの実験は、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞がＰＥＧ−３のプロモーター内にそれぞれの部位と結合する能力をもつＡＰ１およびＰＥＡ３の上昇したレベルを含有することを実証する。
【０１３７】
Ｅ１１細胞におけるｃＪｕｎ（ＡＰ１）とＰＥＡ３の異所発現は、独立しておよび協同してＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性を増大する
上記の研究は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＡＰ１とＰＥＡ３部位が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるこのプロモーターの示差活性に関わることを示唆した。これらの転写因子によりコードされたタンパク質がＥ１１細胞中のＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの発現を改変しうるかを直接決定するために、一過性トランスフェクションおよびプロモータールシフェラーゼアッセイを実施した（図８）。ｃ Ｊｕｎを産生する発現ベクターによるＥ１１細胞のトランスフェクションは、Ｅ１１細胞において用量依存的にＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の増加をもたらした。得た最大の効果は小さく、ｃＪｕｎ発現プラスミドを発現しない細胞のほぼ１．５倍の増加に等しいだけであった。この刺激効果は、対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）または突然変異体ｃＪｕｎタンパク質をコードするベクター（ＴＡＭ６７）によりトランスフェクトした細胞では明らかではなかった。Ｅ１１細胞におけるＰＥＡ３の強制発現も、用量依存的にＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の増加をもたらし、再び、ほぼ１．５倍の最大値に到達した。プロモーター活性の増大は、対照ｐＲＣ／ＲＳＶベクターを用いてトランスフェクトしたＥ１１細胞では観察されなかった。Ｅ１１細胞をｃＪｕｎとＰＥＡ３を産生する発現ベクターの組合せを用いて同時トランスフェクトすると、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性はＥ１１−ＮＭＴ細胞で観察した活性に匹敵した。この効果は、対照ベクターの組合せをＥ１１細胞中にトランスフェクトしたときには見られなかった（図８）。これらの結果は、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現が進行性Ｅ１１−ＮＭＴ細胞におけるｃＪｕｎ（ＡＰ１）およびＰＥＡ３転写因子の発現上昇の結果であるという仮説を支持するものである。
【０１３８】
考察
トランスフォームした表現型の増大した発現の取得、すなわちトランスフォーメーション進行は、癌パラダイムの重要な構成成分を表す。げっ歯類動物細胞におけるトランスフォームした表現型、腫瘍形成トランスフォーメーションおよびＤＮＡ損傷の進行の関数として示差発現を提示する新規のＣＤＮＡ、ＰＥＧ−３を、サブトラクションハイブリダイゼーション（Ｓｕら、１９９７）によって同定した。最近の研究はＰＥＧ−３が原因として癌進行に関係することを立証し、その理由はトランスフォームしたげっ歯類動物またはヒト腫瘍細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下注射すると、これらの細胞中のこの遺伝子が異所発現して攻撃的腫瘍表現型を生じることに因る（Ｓｕら、１９９９）。これらの観察は、ＰＥＧ−３がトランスフォーメーション進行にとって重要な一因であることを示唆する。非進行性（Ｅ１１）と対比した進行性（Ｅ１１−ＮＭＴ）Ａｄ５トランスフォームラット胚細胞におけるＰＥＧ−３の示差発現に介在する機構を規定するために、この遺伝子のプロモーター領域を同定し、単離しかつ試験した。プロモーター分析、ＥＭＳＡおよび一過性トランスフェクションアッセイを利用して、本発明者らは本明細書で、ＴＡＴＡ領域に隣接するＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＡＰ１およびＰＥＡ３転写因子部位の組み合わせが、Ｈ５ｔｓｌ２５トランスフォームＲＥ細胞の基底および増大したプロモーター活性に寄与することを実証する。
【０１３９】
プロモーター欠失アッセイは、ＰＥＧ−３遺伝子の−２７０／＋１９４を含有するＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域がＥ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−３転写活性に必須であることを示す（図５および６）。さらに、このＰＥＧ−Ｐｒｏｍの領域はまた、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差プロモーター活性にも関わる。配列分析は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍのこの部分がＡＰ１（＋８）、ＴＡＴＡ（−２４）およびＰＥＡ３（−１０４）エレメントを含有することを示す（図２）。＋８のＡＰ１部位に突然変異がある一方、野生型ＴＡＴＡおよびＰＥＡ３配列を保持すると、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（−２７０／＋１９４）の活性を低下する（図６Ｂ）。この知見は、＋８のＡＰ１部位が、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞におけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの示差発現の主要な決定因子であることを示唆する。ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性におけるＴＡＴＡおよびＰＥＡ３部位の重要性はまた、さらなる突然変異体を用いて立証される（図６Ｂ）。野生型ＴＡＴＡ（−２４）およびＡＰ１（＋８）部位の存在のもとでのＰＥＡ３部位（−１０４）の突然変異は、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴにおけるプロモーター活性を低下してＥ１１−ＮＭＴにおけるＰＥＧ−Ｐｒｏｍの増大した活性を効果的に消失させる。類似のレベルのＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性低下は、ＡＰ１（＋８）部位が単独でまたは突然変異ＰＥＡ３（＋８）部位と組合せて突然変異を受けたときに、Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞の両方において見られる。これらの背景において、ＡＰ１（＋８）とＰＥＡ３ （１０４）部位を単独でまたは組合せて改変すると、基底および増大したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性の両方に影響を与える。さらに、ＴＡＴＡ領域（−２４）の突然変異は、野生型ＡＰ１（＋８）部位が存在しても、プロモーター活性を消滅させる。これらの結果は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ内の無傷ＴＡＴＡ領域に隣接するＡＰ１とＰＥＡ３部位の両方が、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における基底プロモーター活性ならびにＥ１１−ＮＭＴ細胞における上昇したプロモーター活性の両方に寄与することを実証する。
【０１４０】
ＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍにおけるＡＰ１とＰＥＡ３部位の間の機能的相互作用および核タンパク質の結合を、ＥＭＳＡにより適当なオリゴヌクレオチドプローブおよびモノクローナル抗体を用いて確認した（図７）。Ｅ１１とＥ１１−ＮＭＴ細胞からの核抽出物を用いたＥＭＳＡは、ＡＰ１またはＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを用いてインキュベートしたときに、移動性のより遅いＤＮＡタンパク質複合体を生じた（図７Ａおよび図７Ｂ）。アッセイで１０または１００倍モル過剰の無標識オリゴヌクレオチドをそれぞれ加えると、これらの複合体の量は低下するかまたは消失した。突然変異したＡＰ１またはＰＥＡ３オリゴヌクレオチドを結合アッセイに用いると、ＤＮＡタンパク質複合体は観察されなかった。核タンパク質結合の特異性を、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）またはＰＥＡ３に特異的な抗体を用いてＥＭＳＡにおいて実証した。これらの実験においては、ＤＮＡタンパク質複合体との抗体相互作用からスーパーシフトした移動性の遅いＤＮＡタンパク質複合体が明らかに生じた。Ｅ１１−ＮＭＴ細胞内に存在するＡＰ１とＰＥＡ３複合体の量は、Ｅ１１細胞内に見出される量を超える（図７Ａおよび７Ｂ）。さらに、Ｅ１１細胞と対比したＥ１１−ＮＭＴ細胞のウェスタンブロッティングによって、ＡＰ１／ｃＪｕｎとＰＥＡ３タンパク質のレベルに、小さいが有意な増加（ほぼ１．５〜２倍）も検出された（データは開示してない）。ｃＪｕｎとＰＥＡ３発現ベクターの一過性トランスフェクションによって、進行性細胞内の上昇したＰＥＧ−３プロモーター活性の調節に対するＥ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞内の上昇したＡＰ１およびＰＥＡ３タンパク質の機能的意義を立証した（図８）。これらの実験は、一過性のｃＪｕｎ（ＡＰ１）とＰＥＡ３の異所発現は個々にＥ１１細胞内のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性を上昇させ、そして両方の転写因子を組合せるとさらなる効果をもたらし、Ｅ１１−ＮＭＴ細胞内で観察されたのと同様なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性まで達しうることを実証した（図８）。ＥＭＳＡにおける結合活性の増加、ウェスタンブロットにおけるタンパク質レベルの増加、および同時トランスフェクションアッセイに基づくと、ＰＥＧ−３発現とＡＰ１／ＰＥＡ３活性との間に強い相関があるようである。
【０１４１】
ＡＰ１転写因子は、規定の配列モチーフ（ＴＰＡ応答エレメント、ＴＲＥ）を含有する標的遺伝子プロモーターのサブセットの発現を調節する前初期応答遺伝子である（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１）。ＡＰ１複合体は、ＦｏｓファミリーのメンバーおよびＪｕｎファミリーのメンバーのヘテロ二量体またはＪｕｎファミリーのメンバーのホモ二量体を含む（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１、Ｋａｒｉｎら、１９９７）。ＡＰ１は、細胞増殖、トランスフォーメーション、腫瘍形成、分化およびアポトーシスを含む多くの重要かつ多様な生物学的プロセスに寄与する（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１；Ｋａｒｉｎら、１９９７；Ｏｌｉｖｅら、１９９７；Ｋａｎｇら、１９９８ｂ）。ｅｔｓ遺伝子ファミリーのメンバーである転写因子ＰＥＡ３も、細胞トランスフォーメーションおよび腫瘍形成に対する主要な一因である（ＢｒｏｗｎおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、１９９２）。ＰＥＡ３タンパク質は、標的遺伝子のプロモーター内のほぼ１０塩基対ＤＮＡ配列と相互作用して転写を調節する（Ｍａｃｌｅｏｄら、１９９２；Ｓｅｔｈら、１９９２；Ｗａｓｙｌｙｋら、１９９３）。推定の候補ＰＥＡ３標的遺伝子には、細胞外マトリックスの分解に必要なプロテイナーゼが含まれ、セリンウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（Ｎｅｒｌｏｖら、１９９２）ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼであるゼラチナーゼＢ、間質コラゲナーゼ、ストロメライシン−３およびマトリライシン（ＭａｔｒｉｓｉａｎおよびＢｏｗｄｅｎ、１９９０；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、１９９４；Ｈｉｇａｓｈｉｎｏら、１９９５）が挙げられ、これらは癌転移に寄与する重要な因子である（Ｌｉｏｔｔａら、１９９１；ＫｏｈｎおよびＬｉｏｔｔａ、１９９５）。これらの細胞外マトリックス分解遺伝子の多くはまた、それらのプロモーターにＡＰ１部位も含有する（ＡｎｇｅｌおよびＫａｒｉｎ、１９９１；Ｋａｒｉｎら、１９９７）。複数の細胞プロモーターを調節する上でＡＰ１とＰＥＡ３部位間の協同が立証されている。これらとしては、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）遺伝子の血清増殖因子応答（Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９２）ならびにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子の１２−Ｏテトラデカノイルホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）およびマクロファージコロニー刺激因子誘導が挙げられる（Ｎｅｒｉｏｖら、１９９２；Ｓｔａｃｅｙら、１９９５；Ｄｅ Ｃｅｓａｒｅら、１９９６；Ｄ’Ｏｒａｚｉｏら、１９９７）。さらに、ＰＥＡ３およびＡＰ１エレメントはまた、ストロメライシンおよびコラゲナーゼ遺伝子のプロモーター内にも存在し（ＧｕｔｍａｎおよびＷａｓｙｌｙｋ、１９９０；Ｓｉｒｕｍ−ＣｏｎｏｌｌｙおよびＢｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ、１９９１）、これらのエレメントは特異的トランスフォーミング発癌遺伝子による転写活性化に対する標的を提供する（Ｗａｓｙｌｙｋら、１９８９、１９９３）。これらの背景において、Ｅ１１細胞と対比してＥ１１−ＮＭＴ細胞内の増加したＡＰ１とＰＥＡ３の活性は、上昇したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性をもたらすことができ、それに��って癌攻撃性に直接寄与しうる増加したＰＥＧ−３タンパク質をもたらし、そして、ｉｎ ｖｉｖｏでヌードマウスにおける増大した腫瘍増殖、進行性腫瘍細胞をもたらす。またＥ１１−ＮＭＴ細胞内のＡＰ１とＰＥＡ３の活性増加は恐らく、癌表現型を促進しうるさらなる下流遺伝子も活性化するであろう。
【０１４２】
ＰＥＧ−３がトランスフォームした表現型の発現を促進する機構は現在判っていない。げっ歯類動物およびヒトの癌細胞の両方におけるラットＰＥＧ−３遺伝子の強制発現は、足場非依存性増殖と腫瘍形成可能性の増加をもたらす（Ｓｕら、１９９７、１９９９）。ＰＥＧ−３にとって１つの推定の標的は、血管形成誘導分子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である（Ｓｕら、１９９９）。Ｅ１１細胞におけるＰＥＧ−３の安定して上昇した発現は、ＶＥＧＦ ＲＮＡ転写、定常状態ｍＲＮＡおよび分泌タンパク質の増加をもたらす。さらに、ＰＥＧ−３を発現する細胞において、ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼレポーター構築物は増大した活性を提示する。さらにＶＥＧＦ発現の調節におけるＰＥＧ−３の機能的役割は、安定なアンチセンスＰＥＧ−３発現ベクターを用いてＥ１１−ＮＭＴ細胞内のＰＥＧ−３発現を阻害するとＶＥＧＦ ｍＲＮＡおよび分泌タンパク質が減少することによって実証される。ＶＥＧＦ発現の誘導におけるＰＥＧ−３タンパク質の必要性は、ＰＥＧ−３でトランスフェクトした細胞をタンパク質合成インヒビターであるシクロヘキシミドを用いて同時処理することにより実証された（Ｓｕら、１９９９）。この実験において、トランスフェクトしたＰＥＧ−３遺伝子はＰＥＧ−３ ｍＲＮＡとしては発現されたが、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡはシクロヘキシミドに曝されなかった細胞にだけ存在した。ＰＥＧ−３がＶＥＧＦプロモーターと直接結合するのかまたはＶＥＧＦ転写の活性化が追加の分子によって起こるのかは現在判っていないが、これらの研究はＰＥＧ−３発現、血管形成の誘導、および癌状態発現の促進の間の関連を示唆する。
【０１４３】
ＰＥＧ−３発現の結果としてモジュレートされる下流遺伝子のレパートリーを同定しかつ特性決定して、それらの癌攻撃性と血管形成の促進に果たす役割を決定するために、さらなる研究が必要である。これらの研究は重要であり、癌表現型の重要な決定因子である遺伝子エレメントを規定する可能性を提供する。この情報を用いて、可能性のある標的を識別しかつ癌発生と進行を阻害または防止するためのアンチセンスもしくは小分子アンタゴニストなどの適当な試薬を規定することが可能であろう。
【０１４４】
材料と方法
細胞培養物
Ｅ１１は、Ｈ５ｔｓｌ２５でトランスフォームしたスプラーグ・ドーリー二次ＲＥ細胞の単一細胞クローンである（Ｆｉｓｈｅｒら、１９７８）。Ｅ１１−ＮＭＴは、Ｅ１１細胞系に誘発されたヌードマウス腫瘍由来のＥ１１細胞のサブクローンである（Ｂａｂｉｓｓら、１９８５）。Ｒ１２はＨａ−ｒａｓ発癌遺伝子でトランスフォームしたＥ１１クローンである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９８９）。Ｆ１とＦ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞との間で形成された平たい形態をもつ抑制された体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。Ｒ１とＲ２は、Ｅ１１−ＮＭＴとＣＲＥＦ細胞を融合することによって作製した円形の形態をもつ進行性体細胞ハイブリッドである（Ｄｕｉｇｏｕら、１９９０）。ＣＲＥＦはフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ラット胚繊維芽細胞の特定の不死、非トランスフォームのかつ非腫瘍形成のクローンである（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８２）。全ての培養物は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５％ＦＢＳを補充した培地（ＤＭＥＭ−５）で、３７℃にて加湿した５％ＣＯ２で９５％空気のインキュベーター内で増殖させた。
【０１４５】
ノーザンブロッティングよびウェスタンブロッティングアッセイ
全細胞ＲＮＡを、グアニジニウム／フェノール抽出法によって単離し、ノーザンブロッティングを記載（Ｓｕら、１９９４、１９９７）の通り実施した。ＲＮＡ １５μｇを変性して３％ホルムアルデヒドを加えた１．２％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロンメンブランに転写し、続いて先に記載（Ｓｕら、１９９４、１９９７）の通り３２Ｐ標識したｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後に、フィルターを洗浄してオートラジオグラフィーに露出した。ウェスタンブロッティング分析（Ｓｕら、１９９５）によってｃＪｕｎ（ＡＰ１）、ＰＥＡ３、ＰＥＧ−３およびアクチンタンパク質を検出した。５００万個の細胞を１００−ｍｍプレートにまき、２４時間、３７℃にてインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ−５）を除去し、細胞を冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、次いでＲＩＰＣバッファー（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に溶解した。タンパク質レベルはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびそれぞれの抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて測定した。細胞溶解物はまた、Ｃ末端ペプチドに対するウサギ抗ＰＥＧ−３ポリクローナル抗体を用いて分析した。
【０１４６】
ＰＥＧ−３プロモーターの単離と分析
ＰＥＧ−３ ｃＤＮＡの５’配列に基づいて、配列ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧＧＡＧ（配列番号２）およびＴＣＧＧＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号３）をもつ２つのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーをゲノムウォーカーキット（Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともに用いてＰＥＧ−３の推定プロモーターを含有するゲノム配列を得た。この手法を用いて、同一かつ重複したヌクレオチド配列をもつそれぞれ２．０−、１．６−および１．０−ｋｂの３つのＤＮＡ断片を得た。プロモーター活性を分析するため、２．０−ｋｂ ＰＥＧ−３断片（ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと呼ぶ）をｐＧＬ３−基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの５’欠失突然変異は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化によりＥｒａｓｅ−Ａ−Ｂａｓｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて作製した。ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの３’欠失突然変異は、ＢｓｔＥｌｌ／Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌｌ／ＸｈｏｌおよびＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌをそれぞれ用いて消化して作製した。ＢｓｔＥｌｌ、ＳａｃｌｌおよびＮｄｅｌはＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍのＤＮＡ配列を認識する２０単一カット制限エンドヌクレアーゼであり、Ｘｈｏｌ制限部位はｐＧＬ３ベクターのＭＣＳ中でＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍの３’末端近くに位置する。内部欠失は、ＦＬ−ＰＥＧ−ＰｒｏｍをＮｄｅｌ／Ｓａｃｌｌ、Ｎｄｅｌ／ＢｓｔＥｌｌ、Ｓｔｕｌ／ＢｓｔＥｌｌおよびＢｓｔＸｌをそれぞれ用いて消化することによって実施した。ＡＰ１結合部位、ＰＥＡ３結合部位およびＴＡＴＡボックスの突然変異は、改変部位１１ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ 突然変異誘発システム（Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ １１ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用し、部位特異的突然変異誘発法を用いて作製した。ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体をｐＧＬ３−基本ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物の活性を評価するために細胞を２ Ｘ １０５／３５−ｍｍ組織培養プレートにまいて、ほぼ２４時間後に、様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ−ルシフェラーゼ構築物５μｇ＋ＳＶ４０−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｇをリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ）１０μｌと無血清培地２００μｌ中で混合したものを用いてトランスフェクトした。室温にて２０分後、無血清培地８００μｌを加えて最終容積を１ｍｌとした。トランスフェクション混合物を１４時間後に除去し、細胞を３回、無血清培地を用いて洗浄し、３７℃にてさらに４８時間、完全増殖培地中でインキュベートした。細胞を回収し、溶解して抽出物を作製し（Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎら、１９９９）、β−ｇａｌおよびルシフェラーゼレポーターアッセイに利用した。ルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌ活性のルミノメトリー（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）測定は市販キット（それぞれＰｒｏｍｅｇａおよびＴｒｏｐｉｘ）を用いて実施した。ルシフェラーゼアッセイでは、細胞溶解物１０μｌをルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）４０μｌと混合した。β−ｇａｌアッセイでは、��胞溶解物１０μｌを、希釈したＧａｌｅｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ １００μｌおよび促進剤（Ｔｒｏｐｉｘ）１５０μｌと混合した。プロモーター分析データは各実験点に対し三重サンプルを用いて最低限３回収集し、そのデータをβ−ｇａｌデータを用いて標準化した。
【０１４７】
Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ ｍＲＮＡのプライマー伸長
ＰＥＧ−３ ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列と相補的な配列５’ ＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧ ３’（配列番号４）をもつプライマーを、Ｅ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞からのポリＡ＋ ＲＮＡ ４μｇとアニーリングし、これを逆転写酵素によるプライマー伸長用の鋳型として利用した。簡単に説明すると、脱リン酸化オリゴＤＮＡ ２０ｐｍｏｌを、γ−３２Ｐ ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識した。標識したオリゴヌクレオチド（５ Ｘ １０５ ｃｐｍ）を、ポリＡ＋ ＲＮＡ ４μｇとインキュベートし、沈殿物をＤＥＰＣ処理したＨ２０中に再懸濁した。逆転写反応物は、２００ｕ／μｌのスーパースクリプト逆転写酵素ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、４０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有した。該混合物を４２℃にて１時間インキュベートし、次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８） １ｍｌを添加して反応を停止した。ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼによる処理の後、反応混合物を、同じプライマーと鋳型を用いたＤＮＡ配列決定反応物と平行して、５％尿素ポリアクリルアミド配列決定ゲル上にローディングした。
【０１４８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
核抽出物を、２〜５ Ｘ １０８の細胞からＤｉｇｎａｍら（１９８３）が記載した通り調製した。プローブの配列は次の通りであった：野生型ＡＰ１、５’ＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣ３’ （配列番号５）／５’ＧＣ ＧＴＣＴＡＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡＧＣＧ３’（配列番号６）；突然変異体ＡＰ１、５’ＣＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＴＡＣＧＴＴＣＧＣ３’（配列番号７）／５’ＧＣＧＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣＡＡＧＣＧ３’（配列番号８）；野生型ＰＥＡ３、５’ＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡ３’（配列番号９）／５’ ＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴ３’（配列番号１０）；および突然変異体ＰＥＡ３’、５’ＧＴＧＴＴＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡ３’（配列番号１１）／５’ＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧＴ３’（配列番号１２）。二本鎖オリゴヌクレオチドを、３２Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。次いで標識したプローブを室温にて３０分間、核抽出物とともにインキュベートした。反応混合物は、３２Ｐ−標識したデオキシオリゴヌクレオチド（＞ ５０００ｃｐｍ）、ポリ（ｄｌ−ｄｃ） ２μｇおよび核タンパク質抽出物 １０μｇ、ならびに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１２．５％グリセロールからなった。３０分間、室温にてインキュベーションの後、反応混合物を０．５ Ｘ ＴＢＥ を用いて５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した（１６０Ｖ、３時間）。ゲルを乾燥しオートラジオグラフィーに供した。核抽出物はまた、３２Ｐ標識プローブと一緒に、１０もしくは１００倍モル過剰の冷競合体オリゴヌクレオチドまたはｃＪｕｎ（ＡＰ１）、ＰＥＡ３もしくはアクチン抗体（１または５μｇ）とインキュベートした。
【０１４９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ−１Ｃ：正常、アデノウイルストランスフォームおよび体細胞ハイブリッドのげっ歯類細胞における、足場非依存性増殖ならびにＰＥＧ−３ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す。（図１Ａ）足場非依存性増殖アッセイは、５ Ｘ １０３または１ Ｘ １０４細胞を含有する０．４％寒天含有培地を、０．８％寒天含有培地基底層の表面にまいて測定した。２週後に、コロニー≧０．１ｍｍを倒立顕微鏡を用いて数えた。結果は、三重サンプルを用いた３つの独立実験の平均であり、実験値±ＳＤで表した。（図１Ｂ）ＰＥＧ−３ ｍＲＮＡレベルは、１５μｇの全細胞ＲＮＡを含む１．２％アガロースゲルを電気泳動することによって測定した。ＲＮＡをナイロンメンブランに移して３２Ｐ標識したＰＥＧ−３ ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズし、ブロットを剥がして次いで３２Ｐ標識したＧＡＰＤＨプローブと再ハイブリダイズした。（図１ｃ）ＰＥＧ−３とアクチンタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって測定した。それぞれの細胞型からのタンパク質１０μｇを１０％変性ポリアミドゲル上に供給して３時間電気泳動し、次いでニトロセルロースメンブランに移した。ＰＥＧ−３は抗ＰＥＧ−３抗体を用いて検出しかつアクチンタンパク質は抗アクチン抗体によって検出した。レーン記号：１ Ｅ１１；２ Ｅ１１−ＮＭＴ；３ Ｅ１１−Ｈａ−ｒａｓ Ｒ１２；４ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｘ ＣＲＥＦ Ｒ１；５ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｘ ＣＲＥＦ Ｒ２；６ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｘ ＣＲＥＦ Ｆ１；７ Ｅ１１−ＮＭＴ Ｘ ＣＲＥＦ Ｆ２；および８ ＣＲＥＦ。
【図２】２．０−ｋｂ ＰＥＧ−３プロモーターの配列を示す。（配列番号１）この断片は、材料と方法の項に記載の通り、５’ＤＮＡウォーキングによって同定した。ＰＥＡ−３およびＡＰ１エレメントおよびＴＡＴＡボックスの位置を示した。
【図３】ＰＥＧ−３プロモーターの転写開始部位の決定を示す。ＰＥＧ−３ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域と相補的なプライマー（下記の材料と方法の項を参照）を、Ｅ１１−ＮＭＴまたはＥ１１細胞からのポリＡ＋ ＲＮＡの４μｇとアニーリングし、プライマー伸長アッセイ用のテンプレートとして用いた。逆転写に用いた条件は材料と方法の項に記載の通りであった。同じプライマーを用いかつＰＥＧ−３プロモーターをテンプレートとしたＤＮＡ配列決定反応物を、プライマー伸長反応物と平行して同じゲルで電気泳動した。
【図４】正常、トランスフォームアデノウイルスおよび体細胞ハイブリッドのげっ歯類細胞における、全長ＰＥＧ−３プロモーター−ルシフェラーゼ活性を示す。様々な細胞型を、５μｇのＦＬ ＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを用いて同時トランスフォームし、４８時間後にルシフェラーゼ活性を材料と方法の項に記載の通り測定した。結果をβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化し、３つの独立実験の平均±ＳＤで示す。結果は、Ｅ１１と比較して、Ｅ１１を１倍活性とした倍数活性で表現した。
【図５】図５Ａ−５Ｂは、Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における、基底および増大したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ発現に必要なＰＥＧ−３プロモーターの領域のマッピングを示す。（図５Ａ）ＰＥＧ−Ｐｒｏの欠失突然変異体の模式図による表現である。突然変異体は材料と方法の項に記載の通り構築した。（図５Ｂ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ（レーン１）および様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体（レーン２〜１１）の倍数活性である。倍数活性は、ＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍと様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失突然変異体を、ＴＡＴＡボックスおよびＡＰＩエレメントを含有する特定のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（位置−４０にて欠失）と対比して、比較する。後者の欠失構築物は任意に１の値を与える。プロモーター−ルシフェラーゼアッセイは材料と方法の項に記載の通り実施した。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中のＰＥＡ３およびＡＰ１部位ならびにＴＡＴＡボックスの突然変異分析である。（図６Ａ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における活性について分析したＰＥＧ−Ｐｒｏｍ中の特異的突然変異体の模式図的表現である。点突然変異体は、材料と方法の項に記載した位置指定突然変異誘発を利用して実施した。（図６Ｂ）Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における様々なＰＥＧ−Ｐｒｏｍ突然変異体の倍数活性である。倍数活性は、ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ突然変異体（位置−１１８にて欠失した）ならびにさらにＰＥＡ３、ＡＰ１部位および／またはＴＡＴＡボックス領域に影響を与える点または欠失突然変異を有する突然変異体を、野生型ＴＡＴＡボックスおよびＡＰ１エレメントを含有する特定のＰＥＧ−Ｐｒｏｍ欠失構築物（位置−４０にて欠失した）と対比して比較する。後者の欠失構築物は任意に１の値を与える。プロモーター−ルシフェラーゼアッセイは材料と方法の項に記載の通り実施した。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、ＥＭＳＡによる、ＡＰ１およびＰＥＡ３エレメントへの核タンパク質結合の分析である。Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞における（図７Ａ）ＡＰ１および（図７Ｂ）ＰＥＡ３核タンパク質複合体を、ＥＭＳＡを用いて同定した。核抽出物は２つの細胞型から調製し、γ３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡキナーゼを使って３２Ｐにより標識したＡＰ１およびＰＥＡ３プローブとインキュベートした。反応混合物を、材料と方法の項に記載の５％未変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。Ｅ１１およびＥ１１−ＮＭＴ細胞において、矢印１はスーパーシフトしたＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体を示し、矢印２はＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）ＤＮＡタンパク質複合体を示す。全てのサンプルはＥ１１またはＥ１１−ＮＭＴ細胞のいずれか由来の核抽出物を含有する。Ｍｕｔ−オリゴサンプルは突然変異ＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）オリゴヌクレオチドを含有する。ＷＴ−オリゴサンプルは野生型ＡＰ１（図７Ａ）またはＰＥＡ３（図７Ｂ）オリゴヌクレオチドを含有する。競合体は、非標識競合体オリゴヌクレオチドの１０Ｘ（１０倍）または１００Ｘ（１００倍）モル過剰の存在を意味する。ｃＪｕｎ−Ａｂ（図７Ａ）およびＰＥＡ３−Ａｂ（図７Ｂ）サンプルはそれぞれの抗体の１または５μｇを含有する。Ａｃｔｉｎ−Ａｂは抗アクチン抗体５μｇを含有する。
【図８】Ｅ１１細胞における、ｃＪｕｎ（ＡＰ１）およびＰＥＡ３の単独および組合せでの異所発現がＦＬ−ＰＥＧ−Ｐｒｏｍ活性に及ぼす影響を示す。様々な量（５０〜５００ｎｇ）の野生型ｃＪｕｎ（ｗｔｃｊｕｎ）、突然変異ＴＡＭ６７ ｃＪｕｎ（ｍｕｔｃｊｕｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（対照ベクター）、ＰＥＡ３（ｐＥＡ３）、ｐＲＣ／ＲＳＶ（対照ベクター）、ＰＥＡ３および野生型ｃＪｕｎ（ｐＥＡ３＋ｗｔｃｊｕｎ）の組合せまたは対照ベクター（ｐＲＣ／ＲＳＶ＋ｐＣＤＮＡ３．１）の組合せを、５μｇのｐＧＬ３／ＰＥＧ−Ｐｒｏｍおよび１μｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼベクターとともにＥ１１細胞にトランスフェクトした。結果は、ベクターでトランスフェクトしたＥ１１細胞と比較して、２つの独立実験の三重サンプルについての平均倍数活性を実験値±ＳＤで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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