(57)【要約】本発明は、ジスルフィド架橋環化ペプチドと免疫原性キャリアー分子とをチオエーテル結合による共有結合でコンジュゲートさせてワクチン免疫原を形成させるための新規の化学的方法に関する。特に、この新規の化学的方法はチオール化したキャリアーを１個のジスルフィド結合を有する環状ペプチドと反応させることを含み、その方法では通常、環状ペプチド（ここではジスルフィド架橋環化ペプチドと呼ぶ）がキャリアーにリンカーを介して結合されるが、そのリンカーはキャリアーとの間にチオエーテル結合を形成することのできる官能基である。本発明はさらに、その方法の活性化ペプチド中間体、その方法によって製造される医薬、その医薬を含有する医薬組成物、その医薬組成物の医療における使用に関する。本発明方法はジスルフィド架橋環化ペプチドを含む高純度のワクチン用免疫原を調製するために特に有用である。また、新規の免疫原も提供され、それらはヒトＩｇＥの配列に由来するペプチドに基づいたものであり、アレルギーの免疫療法に有用である。従って、本発明は、ＩｇＥジスルフィド架橋環化ペプチドのキャリアーへのコンジュゲーション方法、その方法によって形成された免疫原、その免疫原を含むワクチンおよび医薬組成物、ならびにアレルギーの治療におけるそれらの使用にも関する。
2004514655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン免疫原を製造するための方法であって、ジスルフィド架橋環化ペプチドを免疫原性キャリアーとコンジュゲーションさせることを含んでなり、そのコンジュゲーションが、（ａ）ジスルフィド環化ペプチドに、チオールを含有するキャリアーとチオエーテル結合を形成することができる反応基を含む成分を付加すること、および（ｂ）このようにして形成された活性化環化ペプチドを、チオールを含有する免疫原性キャリアーと反応させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
チオール含有キャリアーとチオエーテル結合を形成することができる反応基がマレイミド基である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ジスルフィド架橋環化ペプチドがヒトＩｇＥ由来のものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヒトＩｇＥペプチドが配列番号１から３２８より選択されたいずれか１つである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記キャリアーがインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のプロテインＤ、ＢＳＡ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）などの不活化細菌性毒素、またはそれらの組換え断片（例えば、ＴＴのフラグメントＣのドメイン１、もしくはＤＴの転位ドメイン）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）から選択されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ジスルフィド架橋環化ＩｇＥペプチドマレイミド誘導体。
【請求項７】
アレルギー治療用の医薬の製造における、請求項６記載のペプチド誘導体の使用。
【請求項８】
ワクチンに使用するための、式（Ｉ）：
【化１】
2004514655.tif 000019
［式中、ＣＡＲＲＩＥＲは免疫原性キャリアー分子であり、Ｘはリンカーもしくは結合であり、Ｙはリンカーもしくは結合であり、Ｐはジスルフィド架橋環化ペプチドである］で表されるコンジュゲート。
【請求項９】
Ｐが、配列番号９９、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、および３２８からなる群から選択されたものである、請求項８記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法の生成物、および適切なアジュバントもしくは担体を含んでなるワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項８もしくは９に記載のコンジュゲート、および適切なアジュバントもしくは担体を含んでなるワクチン組成物。
【請求項１２】
ワクチンがアレルギー用ワクチンである、請求項１０もしくは１１記載のワクチン。
【請求項１３】
アレルギー治療用の請求項８記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の説明
本発明は、ジスルフィド架橋環化ペプチドと免疫原性キャリアー分子とをチオエーテル結合による共有結合でコンジュゲートさせてワクチン免疫原を形成させるための新規の化学的方法に関する。特に、この新規方法にはチオール化したキャリアーを１個のジスルフィド結合を有する環状ペプチドと反応させることを含み、その方法では通常、環状ペプチド（ここではジスルフィド架橋環化ペプチドと呼ぶ）がキャリアーにリンカー（キャリアーとの間にチオエーテル結合を形成することのできる反応基）を介して結合される。本発明はさらに、上記方法の活性化ペプチド中間体、上記方法によって製造される医薬、その医薬を含有する医薬組成物、その医薬組成物の医療における使用に関する。本発明方法はジスルフィド架橋環化ペプチドを含む高純度のワクチン用免疫原を調製するために特に有用である。また、新規の免疫原も提供され、それはヒトＩｇＥの配列に由来するペプチドに基づいたものであり、アレルギーの免疫療法に有用である。従って、本発明は、ＩｇＥジスルフィド架橋環化ペプチドのキャリアーへのコンジュゲーション方法、その方法によって形成された免疫原、その免疫原を含むワクチン及び医薬組成物、ならびにアレルギー治療におけるそれらの使用にも関する。
【０００２】
短いペプチドを含む免疫原は、ワクチンでの予防もしくは治療の分野でますます一般的になりつつある。多数の病態において、大型のタンパク質よりもむしろ短いペプチドを含むワクチンをデザインすることが可能であり、望ましいことが多い。免疫原として用いることのできるペプチドは、完全長の天然のタンパク質、例えばヒトペプチドホルモンとすることができ、またはある病原体由来、もしくは大きな自己タンパク質由来の大きな抗原の断片とすることができる。例えば、ＩｇＥの短いペプチドをアレルギーの予防に用いることができるが、ＩｇＥ自体を免疫原として用いるとアナフィラキシーショックを誘発する可能性がある。
【０００３】
ペプチドを用いるワクチン接種に伴う問題点の１つは、ペプチドそれ自体は免疫原として弱いものである、とこれまで考えられてきたことである。通常は、ペプチドの配列は、Ｂ細胞エピトープを含むように選択して、抗ペプチド抗体の応答を生じさせるための標的を提供するようにするが、そのサイズが小さいため、ワクチンの初回投与とブースター投与後の強い免疫応答の誘発に必要なサイトカインの助力を得るのに十分なＴ細胞エピトープを包含することはまれである。
【０００４】
この免疫原性の問題を克服するためのストラテジーとしては、そのペプチドを、強い免疫原性を有する大きなタンパク質キャリアーと結合させることが含まれる。そのキャリアータンパク質は多数のペプチド性Ｔ細胞エピトープを含有しており、それらのエピトープはＭＨＣ分子にロードされうるものであり、それによってバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）Ｔ細胞の助力が提供されるものであるが、かつ／または、強力なアジュバントをワクチン製剤中に用いることもできる。そのような強い免疫原性を有するキャリアーで、現在ペプチド免疫原の形成のために一般的に用いられているものとしては、ジフテリアおよび破傷風毒素（それぞれＤＴ及びＴＴという）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）が含まれる。
【０００５】
ある特定のワクチン免疫原中に用いられるペプチドは、しばしば、それが完全長の天然タンパク質中でそのペプチドが位置する部位に対する抗体応答を生じさせるように選択される。そのような選択された位置と結合する抗体を作成するためには、その免疫原中のペプチドは、それが完全長の天然タンパク質の隣接領域によって閉じこめられて存在していた場合には、それが存在するのと実質的に同じ形態をとらなければならない。しかし、直鎖状のペプチド配列を、従来の化学的技法でキャリアータンパク質と単にコンジュゲートさせても、そのような目的はめったに達成されない。それは、そのような免疫原としての直鎖状ペプチドのとりうるコンフォメーションの自由度があまりに多すぎて、そのペプチドが免疫系によって十分には認識されないような、もしくは完全長の天然タンパク質の隣接領域中にそのペプチドが置かれた形のコンフォメーションとは全く異なるような、ゆるい構造をとってしまう可能性があるからである。
【０００６】
このようなコンフォメーションの自由度の問題点を克服するための方法としては、そのペプチドが完全長の天然タンパク質の隣接領域により保持された形態と考えられるカーブと非常によく似たカーブ構造に保持されるように、２つの離れたアミノ酸残基間の化学的相互作用によってペプチドを拘束させたやり方でデザインすることが知られている（米国特許第５，９３９，３８３号； Ｈｒｕｂｙら， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ２６８， ２４９−２６２）。このことを行うための最も一般的な方法は、２個のシステイン残基をペプチド配列中に組み入れ、ペプチドの希釈液の穏和な酸化を行ってそれらの残基間に所望の分子内ジスルフィド架橋を形成することである。
【０００７】
このようにして形成された環化ペプチドは、一般的には、いくつかある化学的方法の１つによってタンパク質キャリアーとコンジュゲートさせて、免疫原を形成させる。公知の化学的方法の例としては、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドなどのアミノ反応剤を用いた、ペプチドとキャリアー間のアミノ基のコンジュゲーション；もしくはカルボジイミド試薬を用いたカルボキシル基とアミノ基の縮合；あるいはまた、Ｎ末端のα−ヒドロキシル基を酸化反応によってアルデヒドに変換し、この基をアミノ成分もしくはオキサミノ成分とコンジュゲートすることが含まれる。しかし、これらの化学反応にはそれぞれ欠点があり、そのような欠点としては、比較的激しい酸化反応条件が必要であること、工業的規模で行うには制御が困難であること、多量体が形成されてしまうこと、もしくは、その化学反応を不適切な方法で妨害する可能性のある特定のアミノ酸（特に、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、チロシン、もしくはセリン）を内部に含んでいるペプチドには適さないことが挙げられる。
【０００８】
従って、ペプチドとタンパク質キャリアーとのコンジュゲーションにはチオエーテル結合を用いることが一般的である。このコンジュゲーションを行うための最も一般的な方法は、末端にチオール基を有するものをペプチドに付加することであり、最も一般的にはシステインを付加し、次いでその反応性のチオール基をマレイミド誘導体化したタンパク質キャリアーと反応させることである（Ｆｒｉｅｄｅら， １９９４， Ｖａｃｃｉｎｅ， １２， ７９１−７９７）。その概略図については図１を参照されたい。
【０００９】
しかし、分子内にジスルフィド結合を有しているペプチドの場合には、この一般的に用いられている化学反応では、分子内のジスルフィド結合の再構成が起こる可能性、もしくは２つの近接したペプチド間にジスルフィド結合が形成される可能性があるので問題となる。場合によっては３個目のシステインがジスルフィド結合形成に望ましくない干渉を起こすことがあり、チオール−ジスルフィドの交換の結果、得られる中間体の環化ペプチド生成物は３種の可能性のあるジスルフィド架橋環化ペプチドの混合物（組合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）中間体、図２参照）となってしまうか、もしくはさらにペプチドの二量体もしくは多量体が含まれてしまうことが起こりうる。
【００１０】
これらのペプチド中間体とマレイミドで活性化されたキャリアータンパク質とのコンジュゲーションの場合には、組合わせ中間体の各々は反応性のキャリアータンパク質と等しく反応し、そのためそれらの中間体は全てそのキャリアーとコンジュゲートする。その結果、所望の生成物の純度は低下し、このような免疫原の混合物を使用すると、そのペプチドが模倣すべく意図していた完全長の天然タンパク質上のエピトープと交差反応しないか、もしくはごく弱くしか交差反応しない免疫応答がもたらされる可能性がある。これらの問題点を克服するために、いくつかの論文の著者らは、ジスルフィド結合で安定化させた環状ペプチドをチオエーテル結合で置き換えた。例えば、Ｉｖａｎｏｖら， １９９５， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６， ２６９−２７７は、三官能性ブロモアセチルで誘導体化したアミノ酸で１個のシステインを置換して、不可逆性のチオエーテル結合で環化させた。しかし、そのようなチオエーテル環化ペプチドでは、その結果得られたペプチドは元のジスルフィド環化ペプチドとは根本的に異なっており、ジスルフィド環化ペプチドとは似ていない可能性のある構造となる。従って、そのチオエーテル環化ペプチドに対して形成された抗体は、ジスルフィド環化ペプチドに対して形成された抗体ほどは親のペプチドを効率よく認識しないかもしれない。
【００１１】
本発明は、環化ペプチド上の末端のチオール含有基を用いず、その代わりにペプチド上の別の反応基を用いて、その後それをチオール化キャリアータンパク質と反応させてチオエーテル結合を形成させる化学反応を提供することによって、ジスルフィド環化ペプチドとキャリアーとの間にチオエーテル結合を形成させる際の問題点を克服するものである。
【００１２】
従って、本発明は、ジスルフィド架橋環化ペプチドを免疫原性キャリアーとコンジュゲートさせることを含んでなるワクチン免疫原を製造するための方法であって、（ａ）チオール含有キャリアーとチオエーテル結合を形成することのできる反応基を含む成分をジスルフィド環化ペプチドに付加し、（ｂ）そのようにして形成された活性化環化ペプチドをチオール含有免疫原性キャリアーと反応させる、ことを含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法は分子内および外にジスルフィド結合が再構成されてしまう問題点を克服し、さらにジスルフィド環化ペプチドが所望のコンフォメーションをとっているコンジュゲートされた生成物を提供する。本発明の好ましい方法では、ペプチドは、ジスルフィド結合を形成しうる２個のシステイン残基を含んだ形で合成され、その後に反応基が付加される。次いで、このようにして得られた活性化されたペプチドを、チオール含有キャリアーと反応させる。
【００１４】
本発明で使用するのに適した反応基としては、チオール化したキャリアーとチオエーテル結合を形成することのできるどのような基でもよい。当業者には明白なものであろうが、好ましい反応基は、活性イミド（特にマレイミド）、ハロアルキル基（例えばヨードアルキル基もしくはブロモアルキル基）から選択することができる。好ましいブロモアルキル基はブロモアセチル基である。直鎖ペプチドをチオール化ポリマーに結合させるためのマレイミドの使用については、Ｖａｎ Ｄｉｊｋ−Ｗｏｌｔｈｉｕｓら， １９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １０， ６８７−６９２に述べられている。ペプチドをキャリアーに結合させるためのブロモアセチル基の使用については、Ｉｖａｎｏｖら， １９９５， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ６， ２６９−２７７および米国特許第５，４４４，１５０号に述べられている。診断アッセイ用のチオール化固相支持体へのペプチドのコンジュゲーションについては、ＥＰ ０３９６ １１６Ａに述べられている。
【００１５】
本発明の特に好ましい態様は、上記方法で反応基としてマレイミドを用いることである。従って、ジスルフィド架橋環化ペプチドをキャリアーとコンジュゲートさせるための好ましい方法は、（ａ）ジスルフィド環化ペプチドにマレイミド基を含む成分を付加し、（ｂ）そのようにして形成された活性化環化ペプチドをチオール含有キャリアーと反応させる、ことを含んでなる。この方法の生成物（ワクチンでの使用に適したコンジュゲート）は本発明の１態様を形成し、それは式（Ｉ）：
【化２】
2004514655.tif 000003
で表される。上記式において、ＣＡＲＲＩＥＲはキャリアー分子であり、Ｘはリンカーもしくは結合であり、Ｙはリンカーもしくは結合であり、Ｐはジスルフィド架橋環化ペプチドである。Ｘが結合である場合には、キャリアーは直接的にイオウ原子Ｓに結合していると理解すべきである。同様にして、Ｙが結合である場合には、ジスルフィド架橋環化ペプチドは窒素原子Ｎに直接的に結合していると理解すべきである。「リンカー」とは適切なリンカー基を意味する。Ｘがリンカー基である場合には、その例は−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２−基である。Ｙがリンカー基である場合には、その例は−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−である。また、当業者には自明なことであるが、式（Ｉ）は、イオウ原子（Ｓ）がイミド環上の隣接する２個の非カルボニル炭素原子のいずれかに結合しているコンジュゲートをカバーしており、そのコンジュゲートは下記の構造式のいずれかを含んでなる：
【化３】
2004514655.tif 000004
【００１６】
本発明の１態様は本発明の方法の中間体であり、それはチオール化したキャリアーとチオエーテル結合を形成することのできる反応基を有しているジスルフィド環化ペプチドである。好ましくは、その中間体は活性イミド基、特にマレイミド基に結合したジスルフィド架橋環化ペプチドからなるものである。分子内もしくは分子外でジスルフィド架橋とチオエーテル反応基との間に生じた再構成は不可逆的であり、その結果、それらの組合わせ中間体はチオール化キャリアータンパク質とは反応しないことから、最終コンジュゲート生成物は高純度のものが得られる。遊離の反応基を有し、所望の位置（すなわち、そのペプチド中に存在するシステイン間）にジスルフィド架橋を有する活性化ペプチド中間体のみがチオール化キャリアーとのコンジュゲーション反応に参加し、その反応によって所望のコンフォメーションを有する環化ペプチドを含む非常に高純度のコンジュゲートが形成される。
【００１７】
好ましいマレイミド誘導体化試薬は、γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ， 分子式：Ｃ１２Ｈ１２Ｎ２Ｏ６， Ｆｕｊｉｗａｒａ， Ｋ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ４５， １９５−２０３（１９８１）； Ｔａｎｉｍｏｒｉ， Ｈ．ら， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．， ４， ８１２−８１９（１９８１）； Ｔａｎｉｍｏｒｉ， Ｈ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２， １２３（１９８３）； Ｐａｒｔｉｓ， Ｍ． Ｄ．ら， Ｊ． Ｐｒｏｔ． Ｃｈｅｍ．， ２， ２６３（１９８３）； Ｍｏｒｏｄｅｒ， Ｌ．ら， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２，４８１（１９８３）； Ｈａｓｈｉｄａ， Ｓ．ら， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６， ５６（１９８４）； Ｉｎｏｕｅ， Ｓ．ら， Ａｎａｌ． Ｌｅｔｔ．， １７， ２２９（１９８４）； Ｗｕｎｓｃｈ， Ｅ．ら， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， ３６６， ５３（１９８５））であり、それはＳｉｇｍａ社もしくはＰｉｅｒｃｅ社から購入することができる。マレイミド誘導体化試薬は多数あり、それらを用いることができることは理解されることである。マレイミド基の環化ペプチドへの付加は、有機合成用の試薬を用いてペプチド合成の際に行うか、もしくはペプチド合成後にマレイミド基を用いるペプチドおよびタンパク質の誘導体化に一般的に用いられる試薬を用いて行うことができる。
【００１８】
本発明の方法、中間体、および生成物は好ましくはワクチン用の免疫原の製造に用いられる。コンジュゲーションのためのペプチドは、免疫応答を引き出すことが望まれるどのような抗原からでも選択することができる。そのようなペプチドはウイルス、細菌、寄生虫などの寄生生物のような病原体由来のものとすることができる。同様に、該ペプチドは自己タンパク質（例えば、癌もしくはアレルギーのワクチン療法で用いるもの）から選択することができる。
【００１９】
アレルギー反応において、アレルギーに一般的に伴う症状は、アレルギーのメディエーター（例えばヒスタミンなど）の免疫細胞から周囲の組織および血管構造への放出によってもたらされる。ヒスタミンは正常状態では、アレルゲン特異的ＩｇＥとの相互作用によってヒスタミン放出のトリガーが引かれるまで、肥満細胞および好塩基球中に貯蔵されている。アレルギー反応、例えば喘息、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、Ｉ型過敏症、およびアレルギー性鼻炎などを媒介する際のＩｇＥの役割はよく知られている。花粉もしくはチリダニ抗原などの抗原と遭遇すると、Ｂ細胞はアレルゲン特異的ＩｇＥの合成を開始する。次いでそのアレルゲン特異的ＩｇＥは好塩基球および肥満細胞上のＦｃεＲＩ受容体（高親和性ＩｇＥ受容体）と結合する。その後にアレルゲンとの何らかの遭遇があれば、隣接するＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の架橋によって肥満細胞もしくは好塩基球からのヒスタミン放出のトリガーが引かれる（ＳｕｔｔｏｎとＧｏｕｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ， １９９３， ３６６：４２１−４２８； ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１）。
【００２０】
ＩｇＥは、他の全ての免疫グロブリンと同様に、２本の重鎖と２本の軽鎖を含んでなる。ε重鎖は５個のドメインからなり、すなわち、１個の可変ドメイン（ＶＨ）および４個の定常ドメイン（Ｃε１からＣε４）である。ＩｇＥの分子量は約１９０，０００ Ｄａで、重鎖は約５５０個のアミノ酸の長さである。ＩｇＥの構造については、ＰａｄｌａｎとＤａｖｉｓ（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３，１０６３−７５， １９８６）、およびＨｅｌｍら（２ＩｇＥモデル構造は１９９０年２月１０日にＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂａｒｏｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ； ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂ−ｂｒｏｗｓｅｒｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）に寄託されている）に述べられている。ＩｇＥの各ドメインは、２つのβシートに分けられる、伸長したβ−ポリペプチドセグメントの７本の逆平行鎖（ａからｆと記す）の押しつぶされた樽形（バレル）となっている。第１のシートを形成している４本のβ鎖（ａ， ｂ， ｄ ＆ ｅ）は第２のシートの３本の鎖（ｃ， ｆ ＆ ｇ）に重なっている（図８参照）。各βシートの形状は、各シート内部で、隣接する逆平行鎖からのアミノ酸残基側鎖の横方向パッキングによって維持されている（また、さらにこれらの鎖間の主鎖水素結合によっても安定化されている）。非伸長（非β）コンフォメーションを形成している、残基のループは、１つのシート内もしくは相対するシート間で、逆平行β鎖を結びつけている。ａ鎖からｂ鎖への連結はＡ−Ｂループと記され、その他も同様である。Ａ−Ｂおよびｄ−ｅループは立体幾何学的には４本鎖シートに属し、ｆ−ｇループは３本鎖シートに属する。相対するシート対間の境界面は球状ドメインの疎水性内部領域を提供する。この、水が接近しえない、主として疎水性のコアは、相対するβシートから互いに面している残基側鎖の密なパッキングからもたらされるものである。
【００２１】
過去には、ＩｇＥ媒介ヒスタミン放出機作を妨害するようにデザインされた受動的もしくは能動的な免疫治療アプローチがいくつか研究されてきた。それらのアプローチとしては、ＩｇＥもしくはアレルゲン／ＩｇＥ複合体のＦｃεＲＩもしくはＦｃεＲＩＩ（低親和性ＩｇＥ受容体）受容体への結合を、受動的に投与される抗体によるか、もしくは該受容体と競合的に結合させるためのＩｇＥ由来ペプチドの受動的投与によるかして、妨げることを含む。さらに、何人かの論文執筆者らは、ＩｇＥ由来の特定のペプチドを、ヒスタミン放出を阻害する免疫応答を刺激するための能動免疫感作に使用することについて述べている。
【００２２】
従って、そのようなペプチドワクチンは、有効性のあるものとするためには、ＩｇＥの特定の部位を非常に効率的に模倣しうるものである必要がある。従って、本発明の好ましい免疫原は、ＩｇＥ由来のペプチドに基づいたものであって、好塩基球からのヒスタミンの放出を阻害する免疫応答を引き出すことのできるものである。
【００２３】
ＩｇＥ媒介アレルギー反応に対して何らかの有益な効果を有している特異的抗ＩｇＥ抗体を同定するために、多くの研究が行われてきた（ＷＯ ９０／１５８７８、ＷＯ ８９／０４８３４、ＷＯ ９３／０５８１０）。これらの有用な抗体によって認識されるエピトープを同定して、そのようなエピトープのペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）を作り、それらのミモトープを抗ＩｇＥ抗体産生のための免疫原として使用してみようとの試みも行われてきた。
【００２４】
ＷＯ ９７／３１９４８はそのような研究の一例を述べており、さらに、能動ワクチン接種目的でキャリアー分子とコンジュゲートさせたＣε３およびＣε４ドメイン由来のＩｇＥペプチドについて述べている。これらの免疫原はワクチン接種研究に用いることができ、ｉｎ ｖｉｖｏでヒスタミン放出を阻害しうる抗体を作成することができるとされている。この研究では、モノクローナル抗体（ＢＳＷ１７）について述べており、その抗体はＣε２ドメイン内に含まれているＩｇＥペプチドと結合することができ、能動ワクチン接種目的に有用であるとされている。
【００２５】
ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１は、能動ワクチン接種による免疫予防に用いられる、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートさせたＩｇＥのＣε４ドメイン（残基４９７−５０６、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈデカペプチドとしても知られている）由来の免疫原について述べている。ＷＯ ９６／１４３３３はＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１に述べた仕事の延長上のものである。
【００２６】
その他のアプローチはＣε３もしくはＣε４由来のペプチドの同定に基づいたもので、それら自体が好塩基球もしくは肥満細胞上の高親和性もしくは低親和性受容体へのＩｇＥの結合について競合する（ＷＯ ９３／０４１７３、ＷＯ ９８／２４８０８、ＥＰ ０ ３０３ ６２５ Ｂ１、ＥＰ ０ ３４１ ２９０）。
【００２７】
従って、本発明の好ましい態様においては、該方法、ペプチド中間体、免疫原、およびワクチンは、ヒトＩｇＥから選択されたペプチドを含んでなる。好ましくは、本発明で用いられるジスルフィド架橋環化ペプチドは、表１に列挙したペプチド群からデザインされたものである。表１のペプチドは、免疫応答を生じさせることが望まれるＩｇＥ分子の特定の領域を反映したものである。それゆえに、そのようなペプチドは環化ペプチドがデザインされることとなる出発点となり、従ってこれらのペプチドはシステイン残基を含んでいないか、１個のシステインを含んでいるか、もしくはジスルフィド結合を形成することのできない２個のシステインを含んでいる。本発明の方法もしくは免疫原に用いるための適切なペプチドは下記のペプチドに少なくとも１個のシステイン残基を付加することによってデザインしうるものである：
【表１】
2004514655.tif 000005
2004514655.tif 000006
2004514655.tif 000007
2004514655.tif 000008
【００２８】
本発明に適した特定のジスルフィド架橋環化ペプチドとなるように修飾された、表１に列挙したペプチドの例を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2004514655.tif 000009
2004514655.tif 000010
2004514655.tif 000011
2004514655.tif 000012
2004514655.tif 000013
2004514655.tif 000014
2004514655.tif 000015
【００３０】
表１の修飾ペプチドもしくは表２の環状ペプチドを組み入れることのできる、本発明の方法で作成される免疫原は、本発明の好ましい態様を形成する。これらのペプチドと同じ特徴を有するミモトープ、およびＩｇＥ分子のＩｇＥエピトープと交差反応する免疫応答を引き出す、そのようなミモトープを含んでなる免疫原も本発明の一部を形成する。ミモトープの意味については、天然のＩｇＥペプチドを認識する抗体によって認識されうるように、表１もしくは表２に列挙されている天然のＩｇＥペプチドと十分に類似しているもの（Ｇｈｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．ら， １９８６， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｃｈｉｂａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ， １１９， ｐ１３０−１４９； Ｇｈｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．， １９８６， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２３， ７， ７０９−７１５）； もしくは適切なキャリアーにカップリングさせた場合に抗体を生じさせることができ、その抗体が天然のＩｇＥエピトープと交差反応することができるものと定義される。
【００３１】
本発明の方法もしくは免疫原中に用いられる好ましいペプチドは、ＩｇＥ構造の表面に露出された領域を模倣しているが、それらの領域内で本発明の発明者らが考えている主たる態様は、ループ構造と関係している表面に露出された面内の領域である。ＩｇＥのドメインの構造に関しては、「タンパク質構造入門」”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”（ｐ３０４， 第２版， ＢｒａｎｄｅｎとＴｏｏｚｅ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＩＳＢＮ ０ ８１５３ ２３０５−０）に述べられており、２つの向き合う逆平行βシートから作られているβバレルを形成している（図８参照）。その免疫原はＩｇＥドメインのループ由来の配列を持つジスルフィド架橋環化ペプチドを含むものとすることができる。この好ましい例としては、Ｃε３のＡ−Ｂループ、Ｃε４のＡ−Ｂループ、Ｃε３のＣ−Ｄループ、Ｃε４のＣ−Ｄループ、Ｃε２のＡ−Ｂループ、およびＣε２のＣ−Ｄループが挙げられる。
【００３２】
上記で同定したＩｇＥエピトープのペプチドミモトープは、選択したアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換によって特別な目的のためにデザインすることができる。従って、本発明のペプチドはタンパク質キャリアーとのコンジュゲーションを容易なものとする目的で修飾することができる。例えば、ＩｇＥエピトープの末端にシステインを含ませるためのいくつかの化学的コンジュゲーション方法は望ましいであろう。さらに、タンパク質キャリアーにコンジュゲートされたペプチドは、そのペプチドのコンジュゲートされた末端から離れた疎水性末端を含み、ペプチドのコンジュゲートされていない遊離の末端がキャリアータンパク質の表面に会合した状態で存在するようにすることが望ましいであろう。このことによってペプチドのコンフォメーションの自由度を減じ、そうすることによって、そのペプチドがＩｇＥ分子全体の中に位置している状態のコンフォメーションに非常に類似するようなコンフォメーションで提示されるという確率が増加する。例えば、そのペプチドを、Ｎ末端にシステインを持ち、Ｃ末端に疎水性のアミド化テイルを有するように変えることができる。あるいはまた、１個以上のアミノ酸のＤ−異性体の付加もしくは置換を、有益な誘導体を作るため、例えばペプチドの安定性を高めるために行うことができる。当業者であれば、そのような修飾されたペプチド、もしくはミモトープは、全てが非ペプチドのもしくは部分的に非ペプチドのミモトープとしうるもので、そのミモトープを構成する残基は２０種類の天然のアミノ酸には必ずしも限定されないことが理解されよう。さらに、これらを当業界では公知の技法によって環化して、ペプチド配列がＩｇＥ分子全体の中に位置する場合とその形状が非常に類似しているようなコンフォメーションにそのペプチドを拘束させることができる。ペプチドを環化するための好ましい方法は、一組のシステイン残基を付加してジスルフィド架橋を行えるようにすることである。
【００３３】
さらに、当業者であれば、本発明のミモトープもしくは免疫原は上記で同定したエピトープより大きくてもよく、それ自体が本明細書に開示した配列を含みうることが理解されよう。従って、本発明のミモトープは、いくつかの他の天然残基からなるＮ末端および／またはＣ末端伸長を一方もしくは双方の末端に付加したものからなるものであってよい。ペプチドミモトープはまた、天然ＩｇＥ配列のレトロ（ｒｅｔｒｏ）配列とすることもできる（その配列では、配列の方向が逆転している）；もしくは、その配列は全体もしくは少なくとも一部分がＤ−立体異性体のアミノ酸を含むもの（インベルソ配列）とすることができる。また、そのペプチド配列はその特性がレトロ−インベルソとすることができ、その配列では、配列の方向が逆であり、かつアミノ酸がＤ−立体異性体となっている。そのようなレトロもしくはレトロ−インベルソペプチドは非自己であるという利点があり、そのため、免疫系における自己寛容の問題点を克服することができる（例えばＰ１４ｃ）。
【００３４】
あるいはまた、ペプチドミモトープは、本発明のＩｇＥエピトープと結合することのできる抗体を用いて、ファージディスプレイ技法（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）などの技法によって同定することができる。この技法は、天然ペプチドの構造を模倣し、そのため抗天然ペプチド抗体と結合することができるが、それ自体が天然のＩｇＥペプチドと著しい配列相同性を有している必要は必ずしもないような、非常に多数のペプチド配列を作り出す。このアプローチは、高い免疫原性（例えば、ＩｇＥ受容体もしくは抗ＩｇＥ抗体とより高い親和性で結合しうる特性、またはＩｇＥに高い親和性で結合するポリクローナルな免疫応答を誘発しうること）を持ったペプチドを同定できるので著しい利点があり、または天然ペプチド配列の使用に伴いうる自己抗原寛容の問題点を克服することができる。さらにこの技法は、認識されるミモトープ配列中に共有される化学的特性の見地から、各天然ペプチドについての認識パターンの同定を可能にする。
【００３５】
あるいはまた、ペプチドミモトープは、該ペプチドの免疫原性を、そのペプチドの抗ＩｇＥペプチドポリクローナル抗体への親和性を増大させることを目的にして作り出すことができ、その効果は当業界では公知の技法、例えばＢｉｏｃｏｒｅ実験などで測定することができる。このことを行うために、該ペプチド配列を次の一般側に従って選択的に変えることができる：
＊構造的な拘束を維持するために、プロリンおよびグリシンは置換すべきでない。
＊その他の位置は類似の物理化学的性質を有するアミノ酸で置換してもよい。
【００３６】
このように、各アミノ酸残基はそのアミノ酸残基と最もよく似たアミノ酸で置換することができる。例えば、下記の表３に記載するとおり、ＡはＶ、ＬもしくはＩと置換することができる。
【００３７】
【表３】
2004514655.tif 000016
【００３８】
従って、本発明は、本発明の方法によってコンジュゲートされたジスルフィド架橋環化ペプチドを含んでなるワクチンおよび新規の免疫原を製造するための方法、ならびに該免疫原の疾病の予防もしくは治療用の医薬組成物の製造における使用を提供する。好ましくは、本発明の方法および免疫原はアレルギーの免疫的予防もしくは治療のためのワクチンに用いられる。
【００３９】
本発明の方法で用いられるペプチドはサイズの小さなものであることを意図している。従って、ペプチドはその長さがアミノ酸１００個未満、好ましくはアミノ酸７５個未満、より好ましくはアミノ酸５０個未満、最も好ましくはアミノ酸４個から２５個の範囲の長さである。
【００４０】
本発明の方法およびコンジュゲートに用いるために最も好ましいペプチドは配列番号９９、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、および３２８である。
【００４１】
本発明の免疫原中に用いられる免疫原性キャリアーのタイプは当業者であれば容易に知りうるであろう。キャリアーの好ましい機能としては、ＩｇＥペプチドに対する免疫応答を誘導するためにサイトカインによる助けを提供することである。本発明で用いることのできるキャリアーのリスト、それは全てを網羅したものではないが、そのリストには次のものが含まれる：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、破傷風もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）などの不活化細菌性毒素、またはそれらの組換え断片（例えば、ＴＴのフラグメントＣのドメイン１、もしくはＤＴの転位ドメイン）、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）。あるいはまた、該方法は環状ペプチドを直接的にリポソームキャリアーにコンジュゲートさせるために用いることができ、そのリポソームキャリアーはさらにＴ細胞の助力を提供することのできるキャリアーを含んでいてもよい。好ましくはペプチドとキャリアーの比率は１：１から２０：１のオーダーであり、好ましくは各キャリアーが３〜１５個のペプチドを担持するものである。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、好ましいキャリアーはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）から得たプロテインＤである（ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。プロテインＤはインフルエンザ菌から得たＩｇＤ結合タンパク質で、Ｆｏｒｓｇｒｅｎが特許を取得している（ＷＯ ９１／１８９２６、ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１として特許取得）。場合によっては、例えば組換え免疫原発現系において、プロテインＤの断片、例えばプロテインＤ １／３ｒｄ（プロテインＤのＮ末端の１００〜１１０アミノ酸からなる断片（ＧＢ ９７１７９５３．５））を使用することが望ましい。
【００４３】
ペプチドは「Ｆｍｏｃ」法を用いてポリアミドもしくはポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）の支持体を利用し、完全自動装置で当業界では公知の技法で容易に調製することができる（固相合成法については、「固相ペプチド合成：実際的なアプローチ」”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｅ． ＡｔｈｅｒｔｏｎとＲ．Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊（１９８９）に述べられている）。その後、酸を用いた切断によって、直鎖状の脱保護された修飾ペプチドを得る。このペプチドは容易に酸化および精製を行うことができ、「分子生物学における方法」”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， 第３５巻「ペプチド合成プロトコール」”Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍ．Ｗ． ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎとＢ．Ｍ． Ｄｕｎｎ）， 第７章， ｐｐ９１−１７１， Ｄ． Ａｎｄｒｅａｕらに概説される方法論を用いて、ジスルフィド架橋修飾ペプチドを得ることができる。
【００４４】
あるいはまた、該ペプチドは組換え法によって産生させることができ、その方法にはミモトープをコードする核酸分子を細菌もしくは哺乳動物細胞系中で発現させ、次いでその発現されたミモトープを精製することを含んでいる。ペプチドおよびタンパク質の組換え発現の技法は当業界では公知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋら， 「分子クローニング：実験室マニュアル」”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）に述べられている。
【００４５】
ワクチンの１回投与量中に含まれるタンパク質の量は、典型的なワクチンで見られるような顕著な副作用を生じずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は用いられる特定の免疫原によって変わり、それをどのように提示するかによっても変わる。一般的には、１回投与量はタンパク質１〜１０００μｇ、好ましくは１〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇ、最も好ましくは１〜５０μｇの範囲であると予想される。個々のワクチンにとって最適な量は標準的な研究によって確認することができ、そのような研究としては、被験者における免疫応答が適切に生ずるか観察することが含まれる。被験者は初回のワクチン接種後、適当な期間をおいて１回から数回のブースター接種を受けることができる。
【００４６】
本発明のワクチンはまた、アジュバントを含むこともでき、それが好都合である。本発明のワクチンに適したアジュバントとしては、該免疫原に対する抗体産生の応答を増強することのできるアジュバントが含まれる。アジュバントは当業界ではよく知られている（「ワクチンデザイン−サブユニットおよびアジュバントを用いるアプローチ」”Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， 第６巻， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．とＮｅｗｍａｎ， Ｍ．Ｊ． 編， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原とともに用いるための好ましいアジュバントとしては：アルミニウムもしくはカルシウム塩（水酸化物もしくはリン酸塩）、水中油型乳剤（ＷＯ ９５／１７２１０、ＥＰ ０ ３９９ ８４３）、またはリポソームなどの粒子状キャリアー（ＷＯ ９６／３３７３９）が含まれる。南米のＱｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａという木の樹皮に由来する、アジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン画分（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）は特に好ましいものである。Ｑｕｉｌ Ａの誘導体、例えばＱＳ２１（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製画分誘導体）、およびその調製方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。ＱＳ２１（ＱＡ２１として知られている）の中でも、例えばＱＡ１７のような他の画分も開示されている。３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡは、ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社（Ｍｏｎｔａｎａ）によって製造された公知のアジュバントである。これはＧＢ ２１２２２０４Ｂに記載の方法によって調製することができる。３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、粒子の大きさが直径０．２μｍ未満と小さい乳剤の形態である（ＥＰ ０ ６８９ ４５４ Ｂ１）。
【００４７】
また、アジュバントとしては、限定はされないが、ムラミルペプチドおよびＱｕｉｌ Ａなどのサポニン、３Ｄ−ＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）などの細菌性リポ多糖、またはＴＤＭが含まれる。さらに別の例としては、該タンパク質をリポソームなどの微粒子内に保持させることができ、また、ポリオキシエチレンエーテルの非微粒子性の懸濁液中に入れることができる（英国特許出願第９８０７８０５．８号）。特に好ましいアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組合わせ（ＥＰ ０ ６７１ ９４８ Ｂ１）、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１を含む水中油型乳剤（ＷＯ ９５／１７２１０、ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５７１４）、その他のキャリアーを用いて製剤化した３Ｄ−ＭＰＬ（ＥＰ ０ ６８９ ４５４ Ｂ１）、もしくはコレステロール含有リポソーム中に製剤化したＱＳ２１（ＷＯ ９６／３３７３９）、または免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（ＷＯ ９６／０２５５５）である。また別のアジュバントとしては、ＷＯ ９９／５２５４９中に記載されているものが含まれる。
【００４８】
本発明のワクチンは通常、初回投与およびブースター投与の双方で投与することができる。ブースターの投与は適切な間隔をあけ、または、好ましくは年１回もしくは循環中の抗体が所望のレベルを下回るまで下降したときに行われることとなる。ブースターの投与は、当初のキャリアー分子を含まないペプチドからなるものを用いて行うことができる。そのようなブースター構築物は別のキャリアーを含むものとすることができ、もしくはキャリアーを全く含まないものとすることができる。
【００４９】
本発明のさらに別の態様においては、本明細書に記載のとおり、医薬品製剤中に用いるための免疫原もしくはワクチンが提供される。
【００５０】
好ましくは、本発明のワクチン製剤は、それを全身もしくは粘膜経路を介して投与することによって、アレルギーに罹患しやすい、もしくは罹患している哺乳動物の防護もしくは治療のために用いることができる。そのような投与法としては、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路での注射；または口腔／消化管、気道、生殖管への経粘膜経路での投与を含んでいる。好ましい投与経路は経皮経路、例えば皮膚パッチである。このようにして、アレルギーの治療方法が提供され、それは、本発明のペプチド、免疫原、もしくはリガンドを、アレルギーに罹患しやすい、もしくは罹患している患者に投与することを含んでなる。
【００５１】
ワクチン製剤については、「ワクチンの新しい動向と開発」”Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”， Ｖｏｌｌｅｒら編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９７８に総説されている。タンパク質の巨大分子へのコンジュゲーションについては、Ｌｉｋｈｉｔｅ， 米国特許第４，３７２，９４５号、およびＡｒｍｏｒら， 米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００５２】
本発明は、限定はされないが、下記の実施例で説明される。
【００５３】
実施例１：　マレイミド活性化ペプチドを、キャリアーとしてのチオール化プロテインＤもしくはＢＳＡとコンジュゲートさせることによる、ジスルフィド環化ペプチドのキャリアーへのコンジュゲーション
本実施例においては、マレイミド誘導体化した環状ペプチドを、チオール含有キャリアーと反応させる。キャリアーとしてのプロテインＤ（ＰＤ）もしくはＢＳＡのいずれかに、そのキャリアーのＳＰＤＰ誘導体を還元することによってチオール基を生成させる。
【００５４】
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）はヘテロ二官能性の架橋剤であり、穏和な条件下でそのＮＨＳ−エステル基によってタンパク質のアミノ基と反応する（図３）（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９６）。ＮＨＳ−エステル架橋反応は、リン酸バッファー、重炭酸／炭酸バッファー、およびホウ酸バッファー中で最も一般的に行われる。他のバッファーも第１級アミンを含んだものでない限り、用いることができる。ＳＰＤＰで修飾されたタンパク質をＤＴＴ（ジチオスレイトール、もしくは別のジスルフィド還元剤）で処理すると、ピリジン−２−チオン脱離基が放出され、遊離のスルフヒドリルが形成される（図３Ａ）。この反応は通常はｐＨ ４．５で２５ｍＭ ＤＴＴを用いて行い、タンパク質のＳ−Ｓ結合の還元を避ける。Ｓ−Ｓ結合を含んでいないタンパク質では、ＤＴＴによる還元をｐＨ ７〜９で行うことができる。ペプチドに付加されたマレイミド基とキャリアー上に存在するスルフヒドリル基との反応によって、本発明の免疫原が形成される（図３Ｂ）。マレイミドで活性化されたペプチドは、ペプチド（Ｐ）とＧＭＢＳ（γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）のようなヘテロ二官能性架橋剤との反応によって得られたものである。
【００５５】
方法
ＳＰＤＰ修飾タンパク質
ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を５０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．２中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解する。ＳＰＤＰをＤＭＳＯ中に６．２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解した（２０ｍＭのストック溶液とする）。次いで十分量のＳＰＤＰストック溶液を修飾しようとするタンパク質に添加した（ＢＳＡではモル濃度でタンパク質に対して１５倍過剰のＳＰＤＰ、およびＰＤではモル濃度で２５倍過剰のＳＰＤＰ）。室温で１時間置いた後、この修飾タンパク質を５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ６．８に対しての透析、またはゲルろ過によって反応の副生成物から精製した。サンプルはリン酸バッファーｐＨ ６．８（または、次のステップでＳ−Ｓ結合含有タンパク質が還元される場合には、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ４．５）で平衡化した脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）にアプライする。１ｍＬの画分を集め、２８０ｎｍの吸光度をモニターする。ＳＰＤＰ修飾タンパク質を含む画分をプールする。
【００５６】
ＢＳＡ中に導入されるチオピリジル基の数は分光光学的に推測する：２００μＬの修飾ＢＳＡを分光光度計のキュベット中に移し、１００ｍＭ リン酸バッファーｐＨ ７中に５０ｍＭのメルカプトエタノールを含む液 ２００μＬを添加する。３４３ｎｍの吸光度をメルカプトエタノール添加前および添加後に測定する。Ａ３４３ｎｍ＝８０００ Ｍ−１ｃｍ−１を用いて放出されたチオピリドンの量を評価する。
【００５７】
ジスルフィド含有架橋剤を開裂させるためのＤＴＴの使用
ＤＴＴを最終濃度が１〜１０ｍＭとなるように添加した。室温で２時間インキュベートした。過剰のＤＴＴを除去するために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いてゲルろ過を行った。露出されたスルフヒドリル基の安定性を保つためにクロマトグラフィー用バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８）中に１０ｍＭ ＥＤＴＡを含めた。酸化されたＤＴＴの存在は溶出の間中、２８０ｎｍの吸光度を測定することによってモニターすることができる。
【００５８】
マレイミド修飾ペプチド
ペプチドを１００ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ ６．８中に溶解した。次いでＧＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）をペプチドサンプルに添加した。ペプチドに対してモル濃度で２．５倍過剰の架橋剤を用いた。室温で１時間置いた後、反応の副生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０（１００ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８）を用いるゲルろ過により除去した。１ｍＬの画分を採取し、２８０ｎｍの吸光度でモニターした。マレイミド基の存在はＥｌｌｍａｎ反応で確認した。
【００５９】
ＳＰＤＰ修飾タンパク質とマレイミド活性化ペプチドとの反応
過剰のマレイミド活性化ペプチド（タンパク質に対してモル濃度で約２２倍過剰のマレイミド活性化ペプチド）をＳＰＤＰ修飾タンパク質に添加し、室温で１時間攪拌した後、１００ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８に対して３回透析した。０．２μｍの孔径のフィルター（ミリポアフィルター）を通してろ過した後、タンパク質含量をＬｏｗｒｙ法で見積もった。
【００６０】
結果
１． ＳＰＤＰ修飾タンパク質の取得
ＢＳＡもしくはＰＤをキャリアーとして用いて、ＳＰＤＰの種々の濃度で何回かのアッセイを行った。
【００６１】
１ａ． ＰＤでのアッセイ
導入されたチオピリジル基の数は、メルカプトエタノール添加後に放出されたチオピリドンの測定を分光光学的に行うことによって概算した。ＰＤを６．６ｍｇ／ｍＬもしくは１０ｍｇ／ｍＬの濃度で用いて何回かのアッセイを行った。その結果、少なくとも１４個のチオピリジル基がＰＤ上に導入されていた（図４）。しかし、ＰＤ濃度が１０ｍｇ／ｍＬでは、わずかに４〜５個のチオピリジル基がＰＤ上に導入しうるのみである（図５）。実際、より多数のピリジル基を得るためのアッセイを行うと、ＰＤの沈殿が観察された。しかし、この沈殿は部分的にはＳＰＤＰ（６．２ｍｇ／ｍＬ）を溶解するために用いたＤＭＳＯによって誘発されるものである。この問題は水溶性のスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル ６−［２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート）を用いることにより解決しうる。
【００６２】
１ｂ． ＢＳＡでのアッセイ
ＢＳＡ上には最大で８〜１０個のチオピリジル基を付加しうる。ＢＳＡに対してモル濃度で２０倍過剰のＳＰＤＰを用いれば、より大きなチオピリジル数を得ることができる（図６）。しかし、反応中にわずかな混濁が観察され、それがＳＰＤＰ修飾ＢＳＡの収率の低下をもたらす。
【００６３】
ピリジルジスルフィドをＤＴＴで還元するアッセイは、酢酸ナトリウムｐＨ４．５（天然のジスルフィド結合の還元を避けるため）中、もしくはリン酸バッファー（ＳＰＤＰ修飾ＰＤの場合）中で行った。ＤＴＴの有効性はピリジン−２−チオンの放出で確認した。
【００６４】
２． 拘束のあるｐ１５ペプチドのコンジュゲーション
拘束のあるペプチド５種を、上述の化学反応を用いてＢＳＡにコンジュゲートさせた：
元の配列：ＥＤＧＱＶＭＤＶＤ （配列番号１）
ｐ１５ａ：ＧＧＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＣ （配列番号３２４）
ｐ１５ｂ：Ａｃ−ＣＬＥＤＧＱＶＭＤＣＧＳＫ−ＮＨ２ （配列番号３２５）
ｐ１５ｃ：Ａｃ−ＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＣＧＳＫ−ＮＨ２ （配列番号３２６）
ｐ１５ｄ：Ａｃ−ＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＣＰＲＥＡＡＥＧＤＫ−ＮＨ２ （配列番号３２７）
ｐ１５ｅ：Ａｃ−ＣＬＥＤＧＱＶＭＤＶＤＬＣＧＧＳＳＧＧＫ−ＮＨ２ （配列番号３２８）
【００６５】
得られたコンジュゲートは可溶性で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシーブルー染色）により特徴づけた（図７）。
【００６６】
３． 拘束のあるｐ１４ペプチドのコンジュゲーション
拘束のある３種のペプチドをコンジュゲートさせた：
元の配列：ＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴ （配列番号６３）
ｐ１４ｅ：ＡＣＰＥＷＰＧＳＲＤＲＣＴＬＡＧ−ＮＨ２ （配列番号３２３）
ｐ１４ｆ：Ａｃ−ＣＰＥＷＰＧＳＲＤＲＣＧＳＫ−ＮＨ２ （配列番号３０４）
ｐ１４ｉ：Ａｃ−ＣＷＰＧＳＲＤＲＲＣＧＳＫ−ＮＨ２ （配列番号３０５）
この結果得られたコンジュゲートは溶解性で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシーブルー染色およびウエスタンブロット）で特徴を調べた（図７Ｂ、レーン７、図８および図９）。
【００６７】
４． チオール−ジスルフィド交換
ジスルフィド基を含んでいる化合物は別のチオールとのジスルフィド交換反応に参加することができる。ジスルフィド交換方法にはジスルフィドへのチオールの攻撃、Ｓ−Ｓ結合の切断、その後の、元のジスルフィド化合物の一部を構成する新たな混合ジスルフィドの形成が含まれる。チオールが過剰に存在する場合には、その混合ジスルフィドは全てがチオール還元剤からなる対称性のジスルフィドを形成するようになる。チオールが大過剰で存在しない場合には、その混合ジスルフィド生成物が最終結果として得られるものとなる。
【００６８】
ＢＳＡ−ＳＨとマレイミド活性化ジスルフィド架橋環化ペプチドとの反応中にジスルフィドの相互交換が観察されうるか調べるために、ＢＳＡ−ＳＨと非修飾ｐ１４ｉペプチドとの間の反応を同じカプリング条件（バッファー、ｐＨ、ペプチド／キャリアー比、および温度）で行った。１時間後に、サンプルを透析するか、もしくはリン酸バッファーｐＨ６．８で平衡化した脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）上にアプライした。この結果得られた生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシーブルー染色）で分析した（図１０）。ＳＰＤＰ修飾ＢＳＡとｐ１４ａペプチド（ＡｃＡＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲＴＬＡＧＧＣ）との反応の結果得られた陽性対照を含めたが、このものではジスルフィドの相互交換が起こっている（図３Ａ）。得られたコンジュゲートを透析もしくはゲルろ過で精製した。
【００６９】
ＢＳＡ−ＳＨとｐ１４ｉとの反応の結果得られた生成物では分子の大きさの増大は認められなかった（図１０Ａ：レーン９）。さらに、ｍＡｂ３１で検出されるタンパク質はなく（図１Ｂ：レーン９）、このことは、少なくともこのカプリングに用いられた条件では反応中にジスルフィドの相互交換は起こっていないことを示唆している。
【００７０】
結論
拘束のあるペプチドとキャリアーとをコンジュゲートさせるために２種類の化学反応の組合わせを用いた。キャリアー上に６〜８個のペプチドを有する可溶性コンジュゲートが得られ、ｐ１４に対する抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴づけた。この結果得られたコンジュゲートは、ウエスタンブロットで確認すると、主としてＧＭＢＳ活性化ペプチドとＢＳＡ−ＳＨとの反応によって得られたものであり、ジスルフィドの相互交換によって得られたものではなかった。これらの結果は、拘束のあるペプチドをキャリアーにコンジュゲートさせるために、これらの化学反応を用いることができることを示している。上述の実施例においては、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬とリシン側鎖もしくはＮ末端アミノ基との反応を介して、マレイミドがペプチドに付加された。マレイミド基を付加する他の方法も容易に想定しうることは明らかである：とりわけエピトープ内にリシンを含んでいるペプチドには、側鎖の最終的な脱保護およびペプチドの切断に先立って、ペプチド合成の際にマレイミドを付加することができる。
【００７１】
実施例２：　種々のジスルフィド架橋ペプチド−ＢＳＡコンジュゲートによって誘導される免疫応答
実施例１で形成されたコンジュゲートの免疫原性を評価するために、１群１０匹のマウスを、２５μｇのコンジュゲートをＡＳ２アジュバント（油／水乳剤、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１）と混合したものを０日、１４日目、および２８日目に筋肉内注射して免疫した。Ｐ１４ペプチドに対する血清学的応答を２８日目と４２日目（３回目の投与後１４日目）にＥＬＩＳＡで分析した。結果を下記の表４に示す。
【００７２】
【表４】
2004514655.tif 000017
【００７３】
種々のＰ１５−ＢＳＡコンジュゲートで誘導される免疫応答
実施例１で形成されたＰ１５ペプチドコンジュゲートも１群１０匹のマウスを免疫するために用いられたが、その免疫は２５μｇのコンジュゲートをＡＳ２アジュバント（油／水乳剤、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１）と混合したものを０日、１４日目、および２８日目に筋肉内注射して行った。抗ペプチドおよび抗ＩｇＥ抗体応答は表５に示してある（３回目の投与後１４日目）。環状Ｐ１５ペプチドの全てについて非常に均一な応答が得られた。抗ＩｇＥ抗体応答はモノクローナル抗体ｍＡｂ１１と比較してアッセイしたが、このモノクローナル抗体はＰ１５標的部位（Ｃε２のｃ−ｄループ）を認識し、ヒト好塩基球アッセイにおいてヒスタミンの放出を阻害することが知られている。抗ＩｇＥのレベルはμｇ／ｍＬ（ｍＡｂ１１当量）として表した。
【００７４】
【表５】
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【００７５】
ヒト好塩基球アッセイ
ヒト好塩基球（ＨＢＡ）を用いて２種類のアッセイを行ったが、その１つはワクチンによって誘導された抗体のアナフィラキシー原性（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の測定で、それはその抗体を単離したＰＢＭＣに添加することからなるものである；２番目のものは、Ｌｏｌ Ｐ Ｉ（強力なアレルゲン）によって誘発されるヒスタミンの放出の、ＨＢＡとワクチン誘導抗体とのプレインキュベーションによる阻害を測定するものである。
【００７６】
４例のアレルギーを有するドナーから静脈穿刺によって血液を０．１容の２．７％ ＥＤＴＡ， ｐＨ７．０を含有する試験管中に採取した。次いで、０．１％ヒト血清アルブミンを含有するＨＢＨ培地（ＨＢＨ／ＨＳＡ）を等量用いて、採取した血液を１／２に希釈する。この結果得られた細胞の懸濁液を５０％容のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、４００ｇで３０分間室温で遠心した。境界面の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を採取し、ペレットを捨てる。その細胞をＨＢＨ／ＨＳＡ中で１回洗い、計数し、ＨＢＨ／ＨＳＡ中に２．０ ｘ １０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を、１００μＬの希釈した試験サンプルもしくはワクチン誘導抗体を含有しているＶ底の９６ウエルプレートのウエルに添加する。各希釈につき６ウエルを用いてある範囲の希釈率で各試験サンプルを調べる。ウエルの内容物をプレート振盪機を用いて軽く混合した後、１２０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃で３０分間インキュベートする。
【００７７】
各血清希釈物について、３ウエルに１０μＬのＬｏｌ ｐ Ｉ抽出物（最終希釈率は１／１００００）を添加することによって誘発させ、３ウエルに１０μＬのＨＢＨ／ＨＳＡを添加してアナフィラキシー原性の評価を行う。ウエルの内容物を、再度、プレート振盪機を用いて軽く混合した後、１２０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃で３０分間インキュベートする。インキュベーションは５００ｇで５分間遠心することによって終了させる。上清を取り、市販のヒスタミンＥＩＡ測定キット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）を用いてヒスタミンアッセイを行う。試験サンプルを含まず細胞を含んでいる対照のウエルは、自発的なおよび誘発された放出を測定するためにアッセイの際につねに含めて行う。細胞＋０．０５％ Ｉｇｅｐａｌ界面活性剤を含有しているウエルも細胞のヒスタミンの全量を測定するために含める。
【００７８】
結果は下記のとおり表される：
アナフィラキシー原性アッセイ
試験サンプルによるヒスタミン放出＝
試験サンプルで処理された細胞からのヒスタミン放出％−自発的ヒスタミン放出％
【００７９】
ブロッキングアッセイ
ヒスタミン放出の阻害の程度は次の式を用いて計算できる：
阻害％
＝１−（試験サンプルで処理された細胞からのヒスタミン放出＊）／（抗原で刺激された細胞からのヒスタミン放出＊）×１００
値は自発的放出について補正されたものである。
【００８０】
結果
本発明の化学反応を用いてＢＳＡキャリアーにコンジュゲートさせたＰ１５ジスルフィド架橋環化ペプチドのヒスタミン放出活性の結果を図１１から１４に示す。
【００８１】
図１１， ＡおよびＢは、Ｐ１５ｃ、Ｐ１５ｄ、およびＰ１５ｅによって誘導された抗血清のヒスタミン放出をブロックする活性を、陽性対照である１０７９ ＢＳＡ、ＰＴ１１、およびｍＡｂ００５、ならびに陰性対照であるＢＳＡ−ＢＡＬ（活性化キャリアーのみ）、抗−ＢＳＡ、非特異的アイソタイプの対照（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ）と比較して示している；また、ヒスタミンの自発的放出、およびアレルゲンで誘発された後のヒスタミン放出、ならびに細胞の総ヒスタミン含量（界面活性剤で放出させたもの）のデータも示している。
【００８２】
図１２， ＡおよびＢは、Ｐ１５ｃによって誘導された抗血清のヒスタミン放出をブロックする活性を、図１１と同じ対照にさらに陽性対照として１０７９ ＨＢＣ、および陰性対照としてＨＢＣ ｗｔを加えて比較して示したものである。
【００８３】
図１３は、図１１（Ｐ１５ｃ、Ｐ１５ｄ、およびＰ１５ｅ）で述べたものと同じ試験サンプル（アレルゲンのない状態でＨＢＡに抗血清を添加）のアナフィラキシー原性を示している。図１４は、図１２で述べたものと同じ試験サンプルのアナフィラキシー原性を示している。
【００８４】
要約すると、Ｐ１５ｃ、Ｐ１５ｄ、およびＰ１５ｅは、アレルゲンで誘発させた後のヒト好塩基球からのヒスタミン放出を阻害する抗血清を誘導したが、抗血清それら自体がアナフィラキシー原性を示すことはない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
マレイミド基との反応による、活性化タンパク質とペプチドのシステインとのカップリングを示した図である。
【図２】
望ましい環化ペプチド（１）、および従来のチオエーテル化学反応を用いてコンジュゲートさせた場合の同じペプチドのその他の２種の可能な形態（２および３）を示した図である。
【図３】
ＳＰＤＰとマレイミドの化学反応を用いた拘束のあるペプチドのコンジュゲーションを示した図である。
【図４】
用いたＳＰＤＰ濃度によるＰＤ活性化レベルの推移（ＰＤは６．６ｍｇ／ｍＬ）を示した図である。
【図５】
用いたＳＰＤＰ濃度によるＰＤ活性化レベルの推移（ＰＤは１０ｍｇ／ｍＬ）を示した図である。
【図６】
用いたＳＰＤＰ濃度によるＢＳＡ活性化レベルの推移（ＢＳＡは１０ｍｇ／ｍＬ）を示した図である。
【図７】
４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中でのクーマシーブルー染色したＢＳＡ−ｐ１５コンジュゲートの検出を示した図である。
【図８】
４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中でのクーマシーブルー染色したＢＳＡ−ｐ１４コンジュゲートの検出を示した図である。
【図９】
抗ｐ１４抗体（ｍＡｂ３１）を用いたウエスタンブロットによるＢＳＡ−ｐ１４コンジュゲートの検出を示した図である。
【図１０】
Ａ．　４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中でのクーマシーブルー染色したＢＳＡ−ｐ１４コンジュゲートの検出を示す。Ｂ．　抗ｐ１４抗体（ｍＡｂ３１）を用いたＢＳＡ−ｐ１４コンジュゲートの免疫的検出を示す。
【図１１】
抗Ｐ１５ｃ、抗Ｐ１５ｄ、および抗Ｐ１５ｅ抗血清のヒスタミン放出ブロッキング活性を示した図である。
【図１２】
抗Ｐ１５ｃ抗血清のヒスタミン放出ブロッキング活性を示した図である。
【図１３】
抗Ｐ１５ｃ、抗Ｐ１５ｄ、および抗Ｐ１５ｅ抗血清のアナフィラキシー原性を示した図である。
【図１４】
抗Ｐ１５ｃ抗血清のアナフィラキシー原性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004514655.tif 000080
【国際調査報告】
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2004514655.tif 000082
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