(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中にコード化されている、本発明のＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は特に、単離ペプチド及び核酸分子、ＧＰＣＲペプチドのオルトログ及びパラログの同定方法、及びＧＰＣＲペプチドのモジュレータの同定方法を提供するものである。
2004500113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項２】
下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズされることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動物。
【請求項８】
請求項５記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存在を検出する方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬とサンプルとを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１３】
サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとサンプルとを接触させ、サンプル中で該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。
【請求項１４】
請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドと試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判定する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記試薬は前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の何れかのペプチドに結合する試薬を同定する方法であって、ペプチドと試薬とを接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒトＧタンパク質共役受容体により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に有効な量、患者に投与する方法。
【請求項１９】
請求項２に記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトＧタンパク質共役受容体ペプチド。
【請求項２１】
請求項２０のペプチドにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２２】
ヒトＧタンパク質共役受容体ペプチドをコード化している単離核酸分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２の核酸分子において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写）又は３（ゲノム）に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の分野に属し、ケモカイン受容体サブファミリー、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質生成に関連するものである。本発明は特に、ヒトの治療及び診断用化合物や診断方法の開発に有用な、新規なＧＰＣＲペプチド、タンパク質、及びこれらのペプチド、タンパク質分子をコード化している核酸分子を提供するものである。
【０００２】
【背景技術】
Ｇタンパク質共役受容体
Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内での信号伝達を担うタンパク質の主要部を構成している。ＧＰＣＲは、アミノ末端の細胞外ドメイン、７つの膜貫通セグメントを含む膜貫通ドメイン及び３つの細胞外ループ及び３つの細胞内ループ、及びカルボキシ末端の細胞内ドメインといった３つの構造上のドメインを有する。ＧＰＣＲの細胞外部分にリガンドが結合する際に、細胞内で信号が伝達され、その結果細胞の生物学的又は生理的な性質が変化する。ＧＰＣＲ、及びＧタンパク質、効果器（細胞内酵素、Ｇ−タンパク質により変調されるチャネル）は、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力へと結びつけるモジュラー信号システムの構成成分である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子及び遺伝子生成物は、疾患を引き起こす原因薬剤となり得る（Ｓｐｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２：１１１９−１１２５ （１９９３）； ＭｃＫｕｓｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ３０：１−２６ （１９９３））。ロドプシン遺伝子及びＶ２バソプレッシン受容体遺伝子に特有の欠陥として、種々の色素性網膜炎を引き起こすこと（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２６：４０３−４２４（１９９２））、及び腎性尿崩症を引き起こすこと（Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ２：１２０１−１２０４ （１９９３））が示されている。これらの受容体は、中枢神経系及び末梢の生理的プロセスにおいて非常に重要である。進化解析においては、これらのタンパク質は元来、複雑な身体設計、神経系とともに発達してきたことが示唆されている。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、ファミリーＩ：ロドプシン及びβ２−プリン作動性受容体により代表される、現在までに２００以上の特有のメンバーが示されている受容体（Ｄｏｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：６５３−６８８ （１９９１））；ファミリーＩＩ：副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー（Ｊｕｐｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２４−１０２６ （１９９１）； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１０２２−１０２４ （１９９１））；ファミリーＩＩＩ：代謝性のグルタミン酸塩受容体ファミリー（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ５９７：６０３ （１９９２））；ファミリＩＶ：走化性、及びＤ． ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの発達に重要なｃＡＭＰ受容体ファミリー（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１４６７−１４７２ （１９８８））；ファミリーＶ：ＳＴＥ２のような菌類交接フェロモン受容体（Ｋｕｒｊａｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：１０９７−１１２９ （１９９２））、の５つのファミリーに分類することができる
【０００５】
ここには、推定７つの疎水性セグメントが存在し、ＧＰＣＲとは無関係と思われる少数の他のタンパク質も含まれており、これらはＧタンパク質との結合を示さなかった。ショウジョウバエは、光受容体に特有のタンパク質であるｂｒｉｄｅ−ｏｆ−ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ｂｏｓｓ）を発現し、この７つの膜貫通セグメントを持つタンパク質は広範囲にわたって研究されているが、ＧＰＣＲであるという証拠は示されていない（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０４７−５０５１ （１９９３））。ショウジョウバエ中のちぢれた遺伝子（ｆｚ）もまた、７つの膜貫通セグメントを持つタンパク質であると考えられる。ｂｏｓｓと同様に、ｆｚもＧ−タンパク質との結合を示さなかった（Ｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２６３−２６４ （１９８９））。
【０００６】
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドと結合するα、β、及びγサブユニットから成るヘテロ三量体タンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、通常、例えば７つの膜貫通セグメントを含む受容体のような細胞表面の受容体に結合している。リガンドのＧＰＣＲとの結合に引き続いて、立体配座の変化がＧタンパク質に伝達され、これによりαサブユニットに結合しているＧＤＰ分子がＧＴＰ分子と交換され、β、γサブユニットからの分離を引き起こす。αサブユニットのＧＴＰ結合様式は、典型的には、効果器変調部として機能し、ｃＡＭＰ（例えば、アデニルシクラーゼの活性化によって）、ジアシルグリセロール、イノシトールリン酸塩のような二次メッセンジャーの生成を導く。２０種類以上の異なるαサブユニットがヒトにおいて知られている。これらのサブユニットは、β、γサブユニットのより小さいプールと関連している。哺乳類のＧタンパク質の例としては、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｓ、及びＧｔが含まれる。Ｇタンパク質は、Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９５）に広範囲にわたって記載されており、その内容は参考文献としてここに折り込まれている。ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質結合効果器、及び二次メッセンジャーシステムについては、Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔ Ｂｏｏｋ， Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）に記述されている。
【０００７】
アミン作動性ＧＰＣＲ
ＧＰＣＲの１つのファミリーであるファミリーＩＩには、アセチルコリン、カテコールアミン、インドールアミンリガンド（以下、生体アミンと呼ぶ）の受容体が含まれる。生体アミン受容体（アミン作動性ＧＰＣＲ）はＧＰＣＲにおける大きなグループであり、これらは進化における祖先を共にしており、脊椎動物（新口動物）と無脊椎動物（旧口動物）の系統の両者に存在する。このＧＰＣＲのファミリーには、５−ＨＴ系、ドーパミン系、アセチルコリン系、アドレナリン系、メラトニン系のＧＰＣＲが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０００８】
ドーパミン受容体
脳の機能、及び疾患に関するドーパミン作用システムの理解は、数十年前、薬物治療後の３つの異なる観察がなされたことにより発展を遂げた。これらは、パーキンソン病を改善するためのドーパミン置換療法において、ドーパミン受容体をブロックする抗うつ病薬及び抗精神病薬に由来するレセルピンによってドーパミンや他のカテコールアミンが減少することが観察されたというものである。一般的な抗精神病薬のドーパミン受容体結合親和性が、それらの臨床効果に相互に関連しているという発見から、精神分裂症におけるドーパミン過活性の仮説が導かれた（Ｓｎｙｄｅｒ， Ｓ．Ｈ．， Ａｍ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １３３， １９７−２０２ （１９７６）； Ｓｅｅｍａｎ， Ｐ． ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｔ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １８８， １２１７−９ （１９７５））。今日、ドーパミン受容体は、精神分裂症、パーキンソン病、トゥレット症候群、遅行性顔面麻痺、ハンティングトン舞踏病の薬理療法における重要なターゲットである。ドーパミン作用システムには、黒質線条体系、中間皮質系、及び隆起漏斗系の経路が含まれる。黒質線条体系経路は線条体運動システムの一部であり、その退化はパーキンソン病につながる。中間皮質系経路は、増強及び感情表現において重要な役割を果たし、抗精神病性薬の作用において要求される部位である。隆起漏斗系経路は脳下垂体からのプロラクチン分泌を調節する。
【０００９】
ドーパミン受容体は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共に７つの螺旋形膜構造を有し、ヘテロ３量体グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（Ｇタンパク質）の結合を通じて信号を伝達するタンパク質の大きなグループである。ドーパミン受容体は、それらの異なるリガンド結合様式、信号伝達特性、配列相同性、ゲノム組織に基づいて、Ｄ１系（Ｄ１及びＤ５）、Ｄ２系 （Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）といったサブファミリーに分類される（Ｃｉｖｅｌｌｉ， Ｏ．， Ｂｕｎｚｏｗ， Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ｇｒａｎｄｙ， Ｄ．Ｋ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３３， ２８１−３０７ （１９９３））。Ｄ１系の受容体であるＤ１及びＤ５は、Ｇｓのようなタンパク質との結合を通じてｃＡＭＰ合成を活性化し、また、それらの遺伝子はタンパク質コード領域中にイントロンを含まない。他方、Ｄ２系の受容体である、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は、Ｇｉのようなタンパク質との相互作用を通じてｃＡＭＰ合成を阻害し、また、タンパク質コード領域中にイントロンを含む類似のゲノム組織を共有している。
【００１０】
セロトニン受容体
セロトニン（５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）は、最初に血清から単離され、そこでは血管収縮を促進することが示された（Ｒａｐｐｏｒｔ， Ｍ．Ｍ．， Ｇｒｅｅｎ， Ａ．Ａ． ａｎｄ Ｐａｇｅ， Ｉ．Ｈ．， Ｊ　Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７６， １２４３−１２５１ （１９４８）。ＬＳＤやプシロシビンのような幻覚剤が平滑筋調整物における５−ＨＴの作用を阻害するという観察により、５−ＨＴと精神的疾患との関係に対する関心が高められた（Ｇａｄｄｕｍ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｈａｍｅｅｄ， Ｋ．Ａ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９， ２４０−２４８ （１９５４））。この観察は、精神医学的障害において脳での５−ＨＴ活性が変化され得るという仮説を導くものである（Ｗｏｏｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｓｈａｗ，　Ｅ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ４０， ２２８−２３１ （１９５４）； Ｇａｄｄｕｍ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｐｉｃａｒｅｌｌｉ， Ｚ．Ｐ．， Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２， ３２３−３２８ （１９５７））。この仮説は、抗抑うつ剤、及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤が多くのうつ症状治療へと導入され、これらの製剤のノルアドレナリン、及び５−ＨＴの代謝への影響が観察されたことによって強化された。今日、セロトニン作用システムに作用する薬剤が、ガン化学療法や胃運動性障害により誘発する偏頭痛、嘔吐に対して効果があるのと同様に、不安症状、社会恐怖症としてまとめられている、うつ病、精神分裂症、強迫神経症、パニック症候群といった精神医学的な疾患の薬物療法において効果があることが証明されている。
【００１１】
セロトニン受容体は、神経伝達物質受容体における非常に大きく多様なファミリーである。現在までに哺乳類において、１３のＧタンパク質共役５−ＨＴ受容体タンパク質、１つのリガンドゲートイオンチャンネル受容体（５−ＨＴ３）が記述されている。この受容体の多様性は、神経伝達物質及びホルモンとしてのセロトニンの古代起源と同様に、哺乳類における５−ＨＴの多くの異なる役割を反映するものと考えられる。５−ＨＴ受容体は、それらの異なるリガンド−親和性プロフィール、分子構造、及び細胞内伝達機構によって、７つのサブファミリー又はグループに分類される（Ｈｏｙｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ４６， １５７−２０３ （１９９４））。
【００１２】
アドレナリン作動性受容体
アドレナリン作動性受容体は、Ｇタンパク質共役受容体「スーパーファミリー」において、最も大きく、最も広く特徴づけられたファミリーのうちの１つから成る。このスーパーファミリーには、アドレナリン作動性受容体だけでなく、ムスカリン系、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性受容体も含まれる。グルカゴン、ソマトスタチン、バソプレッシン受容体、同様に視覚（ロドプシン）、味覚、及び嗅覚のための感覚受容体といった多くのタンパク質受容体もまた、このファミリーに属する。信号分子の多様性にもかかわらず、Ｇ−タンパク質共役受容体の全てのプロセスは、推定７つのαへリックス構造膜に特徴付けられる初期の構造体と全く同様である（Ｐｒｏｂｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。最も基本的な理解としては、アドレナリン作動性受容体は、カテコールアミン、エピネフリン、及びノルエピネフリンの作用する生理的部位である。アドレナリン作動性受容体は、Ａｈｌｑｕｉｓｔによって最初にα又はβとして分類され、彼は２つの受容体サブタイプにおいて、生理的反応を引き起こす一連のアゴニストの効力が、両者で明らかに異なることを証明した（Ａｈｌｑｕｉｓｔ（１９４８））。機能的には、αアドレナリン作動性受容体は、血管収縮、瞳孔拡張、及び子宮の抑制を制御することが示され、一方でβアドレナリン作動性受容体は、血管弛緩、心筋刺激、及び気管支拡張に関係している（Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。結局のところ、薬理学者達は、これらの反応はいくつかの異なるアドレナリン作動性受容体サブタイプの活性化により生じるものであると認識した。心臓中のβアドレナリン作動性受容体はβサブ１として定義され、肺及び脈管系中のそれらはβサブ２と呼ばれている（Ｌａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９６７）。
【００１３】
一方で、αアドレナリン作動性受容体は、最初にシナプス前後（それぞれαサブ１、αサブ２）としての解剖学的位置に基づいて分類された（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７４）。しかしながら、この分類案は、αサブ２受容体が血小板のような明らかな非シナプス位置に存在していることによって混乱させられた。放射性リガンド結合技術の開発に伴い、αアドレナリン作動性受容体は、プラゾシン又はヨヒンビンアンタゴニストとの親和性に基づいて薬理学的に識別された。しかしながら、アドレナリン作動性受容体サブタイプの決定的な証拠としては、アドレナリン作動性受容体サブタイプの精製、及び分子クローニングが待たれた。１９８６年に、ハムスターのβサブ２１アドレナリン作動性受容体（Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）、及び七面鳥のβサブ１アドレナリン作動性受容体（Ｙａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）の遺伝子がクローン化され、配列決定された。そして、ハイドロパシー解析により、これらのタンパク質が、光受容体であるロドプシンに類似した７つの疎水性ドメインを含んでいることが明らかとなった。これ以降、アドレナリン作動性受容体ファミリーは、３つのβ受容体サブタイプ（Ｅｍｏｒｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、３つのαサブ１受容体サブタイプ（Ｓｃｈｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、及び３つの異なるβサブ２受容体（Ｌｏｍａｓｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０）を含むように拡大された。
【００１４】
動物組織由来のα受容体サブタイプのクローニング、配列解析及び発現から、α１受容体は、α１ｄ（以前、α１ａ又はα１ａ／１ｄとして知られていた）、α１ｂ、及びα１ａ（以前、α１ｃとして知られていた）サブタイプへと分類されるに至った。それぞれのα１受容体は、薬理学的特異性、及び組織特異性を示す。「α１ａ」という名称は、１９９５年の受容体及びイオンチャンネル命名補遺（Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｒｄｌｅｓｔｏｎｅ， １９９５）において概説されているように、以前「α１ｃ」と命名されていたサブタイプについて、近年、ＩＵＰＨＡＲＮ命名委員会により公認された名称である。本発明においては、α１ａという名称はこのようなサブタイプのことをいう。また、同時に、以前α１ａと称されていた受容体は、α１ｄと命名された。本発明においては新しい命名法が用いられている。これらのα１受容体を発現している安定な細胞系がここに記述されている（しかしながら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）では、これらの細胞系は古い命名法の下で記載されている）。α１アドレナリン作動性受容体サブタイプの分類については、Ｍａｒｔｉｎ Ｃ． Ｍｉｃｈｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． （１９９５） ３５２：１−１０に記述されている。
【００１５】
αアドレナリン作動性受容体サブタイプにおける相違は、病態生理学的な症状に関連している。良性の前立腺肥大又はＢＰＨとして知られている良性前立腺過形成は、典型的には５０歳以上の男性に発症し、年齢が増すに連れ病状は深刻なものとなる。症状の兆候としては、これに限られるものではないが、排尿の困難性増加や性的機能不全がある。これらの徴候は、前立腺の肥大又は過形成によって引き起こされる。前立腺が大きくなると、男性の尿道における自由流れを侵害する。これに付随して、肥大した前立腺のノルアドレナリン作動性神経刺激伝達が増大することにより、膀胱口及び尿道におけるアドレナリン作用が増大し、さらには尿道を通じての尿の流れが制限されるに至る。
【００１６】
αサブ２受容体は、β及びαサブ１受容体の両者よりも早く開散されると考えられる。αサブ２受容体は、その染色体位置に基づいて、αサブ２Ｃ２、αサブ２Ｃ４、αサブ２Ｃ１０と呼ばれる３つの異なる分子のサブタイプに分解される。これらのサブタイプはそれぞれ、薬理学的に定義されるαサブ２Ｂ、αサブ２Ｃ、αサブ２Ａサブタイプに対応していると考えられる（Ｂｙｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。全てのアドレナリン作動性受容体がエピネフリンにより認識されるとはいえ、それらは薬理学的に異なるものであり、個別の遺伝子によってコード化されているものである。これらの受容体は、一般的に異なる二次メッセンジャー経路（Ｇ−タンパク質を通じ結合される）に結合される。アドレナリン作動性受容体において、βサブ１及びβサブ２受容体はアデ二レートシクラーゼを活性化し、αサブ２受容体はアデニレートシクラーゼを阻害し、αサブ１受容体はホスホリパーゼＣ経路を活性化し、ポリホスホイノシチド分解を促進する（Ｃｈｕｎｇ， Ｆ． Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３：４０５２ （１９８８））。αサブ１及びαサブ２アドレナリン作動性受容体は、それらの薬剤としての細胞活性において相違する。
【００１７】
このタンパク質ファミリーのメンバーの有用性を開示している米国の特許としては、６，０６３，７８５号（良性前立腺過形成の治療に有用なフタルイミドアリールピペラジン）、６，０６０，４９２号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、６，０５７，３５０号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、６，０４６，１９２号（フェニルエタノールアミノテトラリンカルボキサミド誘導体）、６，０４６，１８３号（良性前立腺過形成の共同治療方法）、６，０４３，２５３号（β３アゴニストとしてのアリールスルホンアミド置換融合ピペリジン）、６，０４３，２２４号（神経病的障害及び神経変性疾患の治療のための組成物及び方法）、６，０３７，３５４号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、６，０３４，１０６号（糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ３ アゴニストとしてのオキサジアゾールベンゼンスルホンアミド）、６，０１１，０４８号（糖尿病及び肥満の処置のための選択的βサブ３アゴニストとしてのチアゾールベンゼンスルホンアミド）、６，００８，３６１号及び５，９９４，５０６号（アドレナリン作動性受容体）、５，９９４，２９４号（ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用）、５，９９０，１２８号（良性前立腺過形成の治療のためのαサブ１Ｃの特定化合物）、５，９７７，１５４号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、５，９７７，１１５号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト）、５，９３９，４４３号（選択的β３アドレナリン作動性アゴニスト）、５，９３２，５３８号（ニトロソ化、及びニトロシル化αアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト化合物、組成物及びその使用）、５，９２２，７２２号（α１ａアドレナリン作動性受容体アンタゴニスト２６）、５，９０８，８３０号及び５，８６１，３０９号（ヒトα１アドレナリン作動性受容体をコード化するＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００１８】
プリン作動性ＧＰＣＲ
プリン受容体Ｐ２Ｙ１
Ｐ２プリン受容体は、ＡＴＰゲートチャンネルであるＰ２Ｘ受容体、Ｇタンパク質共役受容体のファミリーであるＰ２Ｙ受容体、及びマスト細胞中で非選択的に孔を媒介するＰ２Ｚ受容体としておおまかに分類されてきた。それぞれのＰ２受容体において、多くのサブクラスが定義されている。Ｐ２Ｙ受容体は、ＡＴＰ及びその類似体に対する選択的な応答性によって特徴づけられる。これらのうちのいくつかは、ＵＴＰに対しても応答する。Ｐ２プリン受容体命名法の推奨に基づいて、Ｐ２Ｙプリン受容体はクローニングの順序により番号付けられる。Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、及びＰ２Ｙ３は、様々な種からクローン化された。Ｐ２Ｙ１は、ＡＤＰとＡＴＰに対して応答する。ヒトの骨及び２つの骨芽細胞系におけるＰ２Ｙ受容体サブタイプの発現についてＲＴ−ＰＣＲにより分析したところ、全ての既知のヒトＰ２Ｙ受容体、すなわちＰ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、及びＰ２Ｙ７が発現していることが示された（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９７）。対照的に、脳由来の細胞系の分析では、脳組織ではＰ２Ｙ受容体サブタイプの選択的な発現が起こっていることが示唆された。
【００１９】
Ｌｅｏｎらは、Ｐ２Ｙ１受容体の生理学的な役割を調べるためにＰ２Ｙ１−ｎｕｌｌマウスを生成した（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０４： １７３１−１７３７（１９９９））。これらのマウスは、血小板の発達、寿命、再生、形状等に影響する異常を生じることなく生存することができ、これらの血小板の計測数は野生型マウスのそれと同等だった。しかしながら、Ｐ２Ｙ１の不足したマウスから取り出した血小板は、形状の変化なしで血小板が凝集することによりＡＤＰが高濃度になったとしても、通常のＡＤＰ濃度に対する応答において凝集することができず、また他のアゴニストへの凝集も減少することを示した。加えて、ＡＤＰ由来のアデニリルシクラーゼの阻害は未だ生じており、Ｐ２Ｙ１とは別のＡＤＰ受容体の存在が示された。Ｐ２Ｙ１−ｎｕｌｌマウスは、自発的な出血の傾向は持たないが、ＡＤＰ又はコラーゲンとアドレナリンの静脈注射により引き起こされる血栓塞栓症に対する抵抗力があった。したがって、Ｐ２Ｙ１受容体は、血栓症状において重要な役割を果たし、抗血栓性薬剤としてのターゲットを示す。Ｓｏｍｅｒｓらは、Ｐ２ＲＹ１遺伝子を、染色体３上のフランキングマーカーＤ３Ｓ１２７９とＤ３Ｓ１２８の間の、短腕の末端のマーカーから１７３から１７４ｃＭまでの位置にマップした（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １２７−１３０ （１９９７）。
【００２０】
プリン受容体Ｐ２Ｙ２
嚢胞性線維症（ＣＦ）における欠陥である塩化物イオン分泌経路は、代替となる塩化物イオン輸送経路（細胞外ヌクレオチドにより活性化される）によってバイパスされる。このため、この影響を媒介するＰ２受容体はＣＦ患者における塩化物イオン分泌を改善するための治療ターゲットとなる。Ｐａｒｒらは、Ｐ２Ｙヌクレオチド受容体タンパク質をコード化しているヒト気道上皮細胞からクローンされたｃＤＮＡの配列及び機能発現を、その物性とともに報告した（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１： ３２７５−３２７９ （１９９４））。ヒトＰ２ＲＹ２遺伝子は、染色体１１上のｑ１３．５からｑ１４．１にマップされている。
【００２１】
プリン受容体Ｐ２Ｙ４
Ｐ２ＲＹ４受容体は、ＵＴＰ及びＵＤＰにより特異的に活性化され、ＡＴＰ及びＡＤＰでは活性化しないと考えられる。このウリジンヌクレオチド受容体の活性化により、イノシトールリン酸形成、及びカルシウム移動を生じる。ＵＮＲ遺伝子は染色体Ｘｑ１３上に位置している。
【００２２】
プリン受容体Ｐ２Ｙ６
Ｓｏｍｅｒｓらは、Ｐ２ＲＹ６遺伝子を多形マーカーＤ１１Ｓ１３１４、Ｄ１１Ｓ９１６との間の１１ｑ１３．５にマップした。４ｃＭ以下のＰ２ＲＹ６は、Ｐ２ＲＹ２マップにある（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １２７−１３０ （１９９７）。これは、この遺伝子ファミリーの群化について最初に記述したものである。
【００２３】
アデニン、ウリジンヌクレオチドは、細胞内エネルギー代謝、リン酸化、及び核酸合成といった既定の役割に加えて、重要な細胞外信号分子でもある。Ｐ２Ｙ代謝性受容体は、種々の生理的プロセスを調節している細胞外ヌクレオチドの影響を媒介するＧＰＣＲである。少なくとも１０のＰ２Ｙ受容体サブファミリーが確認されている。これらの受容体サブファミリーは、個々の配列、ヌクレオチドアゴニスト選択性、及び有効性において大きく異なっている。
【００２４】
脳においては、Ｐ２Ｙ１受容体が強く発現されることが証明されているが、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、及びＰ２Ｙ６受容体もまた存在している。神経細胞、神経膠細胞、脳脈管又は脳室上衣細胞における、これらのサブタイプの局在化は、ｉｎ ｓｉｔｕｍＲＮＡハイブリダイゼーション、及びこれらの培養細胞の研究において見出された。Ｐ２Ｙ１受容体は神経細胞に顕著に存在する。あるＰ２Ｙ受容体サブタイプが、Ｎ型Ｃａ２＋チャンネル、又は特定のＫ＋チャンネルへと結合することが実証された。
【００２５】
また、いくつかのＰ２Ｙ受容体が、細胞内経路を刺激することにより、平滑筋細胞に対する生育促進効果を媒介することも実証された。この細胞内経路はＧｑタンパク質、プロテインキナーゼＣ、及びチロシンリン酸化を含み、即時の遺伝子発現、細胞数、ＤＮＡの増加、及びタンパク質合成に至るものである。さらに。Ｐ２Ｙによる調節が、動脈硬化症の発展に応じて、分裂促進的な役割を果たすことが証明された。
【００２６】
さらにＰ２Ｙ受容体が、嚢胞性線維症において重要な役割を果たすことが示された。気道表面の液体の量及び構成物は、活発なイオン能動輸送（気道上皮を横切る）により調整されている。これは、基底外受容体に作用するアゴニスト、発光性受容体に作用するアゴニストの両者によって次々に調節される。特に、気道表面の液体中に存在する細胞外ヌクレオチドは、発光性Ｐ２Ｙ受容体において、Ｃｌ−分泌、及びＮａ＋吸収を制御するように作用する。ヌクレオチドは気道上皮細胞から調節されて放出されるため、オートクリン調節システムの一部をなしている気道上のイオン輸送制御が、発光性の気道上皮細胞に局在化していることが好ましい。この生理学的な役割に加えて、Ｐ２Ｙ受容体アゴニストは、ＣＦや上皮のイオン輸送障害の治療において非常に有益であるという可能性がある。ＣＦを有しているヒトの気道では、不完全なＣｌ−分泌及び異常高率のＮａ＋吸収が生じている。Ｐ２Ｙ受容体アゴニストは、これらのイオン輸送経路の両方を調節することができるため、これらはＣＦにおけるイオン輸送欠陥に対する薬理学的なバイパスとなる可能性を持っている。
【００２７】
ケモカイン受容体
ケモカインは、リンパ球及び食細胞の化学誘引物質、及び活性化剤として作用するタンパク質と構造的な関連がある。これらは、４つの保持されたシステイン残基のうちの最初の２つの位置の相違により、２つの別々のファミリーに分けられる。αファミリーは、最初の２つのシステインが１つのアミノ酸により分離されていることにより区別され（ＣＸＣ）、一方でβファミリーではシステインは隣接している（ＣＣ）。ＩＬ８を含むαケモカインの大部分は好中球をターゲットとし、一方でβファミリーのメンバーは主に単核細胞に作用する。βケモカインファミリーのメンバーとしては、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰＩ１α）、ＭＩＰＩ１β、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及びＩ−３０９が含まれる。クローン化されたケモカインの受容体は、Ｇタンパク質共役受容体の特徴を有している。
【００２８】
急性肺損傷及び成人呼吸窮迫症候群は、多くの疾患の症状を悪化させる。これらの症状のメカニズムはよく解っていないが、成人呼吸窮迫症候群に見られる症状の特徴としては、肺内の活性化炎症性細胞の滞留、肺微小血管の損傷、血管内流液の組織空間への漏出がある。齧歯動物においては、急性膵炎の始まりに依存するこれらのプロセスのモデルは、コレシストキニン類似体による膵臓の外分泌性腺房細胞への過度の刺激により生産される。Ｇｅｒａｒｄら（１９７７）は、ＣＣＲ１受容体の分解が、マウスにおける肺炎症、次いで急性膵炎からの保護に関連していることを実証した。肺損傷からの保護は、時間的なＴＮＦαの減少レベルに関連しており、これは全身性炎症反応症の初期の事象であるＣＣＲ１の活性化を示すものである
【００２９】
ＣＤ８細胞により生成される抑制性因子であるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１βといったＣＣケモカインが、特定のＨＩＶ−１の感染を妨げることが確認されたことによって、ＨＩＶ−１感染時のＣＤ４による細胞表面補受容体であるＣＸＣＲ４（又は融合）、ＣＣＲ５といった２つののケモカイン受容体の確認が容易にされた。さらに、ＣＣＲ２及びＣＣＲ３といった受容体もまた、特定の細胞タイプにおいて、ＨＩＶ−１補受容体として関連している。ＣＣＲ５、及びＣＸＣＲ４の発見は、疾患の進行を媒介するような他のケモカイン受容体遺伝子の多形に関する研究を促進させた。Ｓｍｉｔｈら（１９９７）は、コーカサス人及びアフリカ系アメリカ人において、ＣＣＲの最初の膜貫通領域のｖａｌ６４−ｔｏ−ｉｌｅ多形（６４Ｉ）の対立遺伝子頻度が１０〜１５％であることを確認した。エイズ患者における２つの研究では、ＣＣＲ２−６４Ｉ対立遺伝子はＨＩＶ−１の感染率には影響しないが、６４Ｉ対立遺伝子を有しているＨＩＶ患者は、より一般的な対立遺伝子を有しているヒトよりも進行が２〜４年間遅いことが示されている。ＡＩＤＳ患者のうちの３８〜４５％が、ＨＩＶ−１露出からＡＩＤＳ症状の徴候まで３年以内の急速な進行であると推測されており、これはそれらの野生型の位置に関連付けることができる。これに対して、１６年以上にわたりＡＩＤＳを発症しなかった長期生存者のうちの２８〜２９％は、ＣＣＲ２又はＣＣＲ５の変異遺伝子型によって説明することができる。
【００３０】
ケモカインは、白血球の化学親和力及び活性において機能する前炎症性サイトカインである。上記したウイルス性の疾患における機能に加え、ケモカインははアテローム性動脈硬化症の発病に関連している。ＣＣケモカインＭＣＰ１の発現は、ヒトのアテローム性動脈硬化プラーク、高コレステロール食における霊長類の動脈、血管内皮及び平滑筋細胞の最小限の修飾脂質への露出において上方調整を行う。ＭＣＰ１がアテローム性動脈硬化症の原因として関わっているかどうか調べるため、Ｂｏｒｉｎｇら（１９９８）は、ＭＣＰ１の受容体であるＣＣＲ２を欠落させたマウスを生成し、これと、アポリポタンパクＥ遺伝子（ＡＰＯＥ）を持っており深刻なアテローム性動脈硬化症に発展するマウスｎｕｌｌとの交雑を行った。彼らは、ＣＣＲ２の選択的な欠如によって、ａｐｏＥ−／−マウスにおける障害の形成を著しく減少させるが、これは血漿脂質、又はリポタンパク濃度に影響を及ぼさないことを見出した。これらのデータは、早期のアテローム性動脈硬化症障害の発展におけるＭＣＰ１の役割を明らかとし、最小限に酸化された脂質によるケモカインの上方調整が、高脂血症と脂肪筋形成との間の重要な関連であることを示唆した。
【００３１】
ケモカイン受容体、及び７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型ケモカイン受容体様タンパク質の説明については、Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，　Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００： ２０２２−２０２７， １９９７， Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７： ９５９−９６５， １９９７， Ｂｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３９４： ８９４−８９７，１９９８を参照されたい。
【００３２】
ＧＰＣＲ、特に本発明の７回膜貫通型ドメインを有するケモカイン受容体サブファミリーのメンバーは、薬剤の挙動、及び開発における重要なターゲットである。したがって、従来未知のＧＰＣＲを同定し特徴づけることは、製薬開発の分野において非常に有用である。本発明は、従来未確認のヒトＧＰＣＲを提供することによって、これらの技術の進展に寄与するものである。
【００３３】
【発明の要約】
本発明は、ヒトＧＰＣＲペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列同定に部分的に基づいたものであり、ケモカイン受容体サブファミリー、これらの対立遺伝子変異体、及び他の哺乳類におけるこれらのオルトログに関連するものである。これらの特異なペプチド配列、及びこれらのペプチドをコード化する核酸配列は、ヒト治療ターゲットの開発のためのモデルとして用いることができ、治療に用いるためのタンパク質同定に有用であり、ヒト治療薬剤の開発のターゲットとなり得る。
【００３４】
本発明にかかるタンパク質は、これらのタンパク質を発現する細胞中のケモカイン受容体サブファミリーにより媒介される信号経路に関連する。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。「信号経路」とは、ここで用いられる場合、リガンドのＧＰＣＲタンパク質への結合における細胞機能／活性の変調（例えば、促進又は阻害）のことを指す。これらの機能の例としては、例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）、アデニル酸シクラーゼのような信号伝達経路に関連する細胞内分子の可動化、形質膜の分極、分子の生成又は分泌、細胞成分の構造変化、ＤＮＡ合成のような細胞増殖、細胞移動、細胞分化、細胞生存が挙げられる。
【００３５】
受容体タンパク質によって媒介される応答は、発現される細胞のタイプに依存している。本発明のＧＰＣＲサブファミリーの他のメンバーを発現する細胞タイプに関する情報は、当該技術分野において既に公知である（背景技術、及び図２に示される相同性の高いタンパク質に関する情報を参照されたい。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している）。例えば、いくつかの細胞では、リガンドの受容体タンパク質への結合は、ホスファチジルイノシトール、又はサイクリックＡＭＰの代謝及び代謝回転を通じて、化合物の放出、チャネルのゲート制御、細胞癒着、細胞移動、細胞分化等のような活性を促進する。一方で、他の細胞においては、リガンドの結合により異なる結果を生じる。本発明の特定のＧＰＣＲにより変調される細胞の活性／応答に関わらず、ＧＰＣＲである受容体タンパク質が、発現された細胞又は組織における生物学的経路に導入されることによって、例えばホスファチジルイノシトール、又はサイクリックＡＭＰの代謝及び代謝回転を通じた種々の細胞内信号伝達経路において、１以上の二次信号を生成するためにＧタンパク質と相互作用することが当業者において良く知られている。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【００３６】
「ホスファチジルイノシトールの代謝回転及び代謝」とは、ここで用いられる場合には、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）の代謝回転及び代謝、及びこれらの活性に関係する分子のことを指す。ＰＩＰ２は、形質膜の細胞質内小葉に見られるリン脂質である。いくつかの細胞では、受容体へのリガンドの結合により、形質膜酵素であるホスホリパーゼＣを活性化し、ＰＩＰ２を次々に加水分解して、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、及びイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）を生成する。一旦生成されたＩＰ３は小胞体表面に拡散され、ここでＩＰ３結合部位を持つカルシウムチャネルタンパク質のようなＩＰ３受容体と結合され得る。ＩＰ３結合によってチャネルが開かれ、細胞質へのカルシウムイオンの放出をすることができる。また、ＩＰ３は、特定のキナーゼにより１，３，４，５−テトラホスフェート（ＩＰ４）へとリン酸化されることもでき、この分子は細胞外媒体から細胞質内へとカルシウムを流入させる。ＩＰ３及びＩＰ４は、それぞれ１，４−ビホスフェート（ＩＰ２）、イノシトール１，３，４−トリホスフェートといった不活性生成物へと、連鎖的に非常に早く加水分解される。これらの不活性生成物は、細胞におけるＰＩＰ２合成に再利用される。ＰＩＰ２の加水分解により生成する他の二次メッセンジャー、すなわち、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、細胞膜に残存し、ここで酵素プロテインキナーゼＣを活性化することができる。プロテインキナーゼＣは、通常、細胞中の細胞質に溶解しているが、細胞内のカルシウム濃度が上昇すると形質膜へと移動し、ここでＤＡＧにより活性化される。他の細胞でのプロテインキナーゼＣの活性化は、例えば、グリコーゲンシンターゼのリン酸化、又はＮＦ−ｋＢ等の各種転写因子のリン酸化のような種々の細胞応答の結果生じる。ここで用いられている「ホスファチジルイノシトール活性」という用語は、ＰＩＰ２又はそれ代謝産物のうちの１つの活性のことを指す。
【００３７】
受容体の関連することのできるもう１つの信号経路は、ｃＡＭＰ代謝回転経路である。ここで用いられている「サイクリックＡＭＰ代謝回転及び代謝」とは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の代謝回転及び代謝、及びこれらの活性に関係する分子のことを指す。サイクリックＡＭＰは、特定のＧタンパク質共役受容体のリガンド由来の刺激に対する応答において生成される二次メッセンジャーである。ｃＡＭＰ信号経路においては、リガンドのＧＰＣＲへの結合により、ｃＡＭＰ合成を触媒する酵素アデニルシクラーゼが活性化される。新しく合成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼを次々に活性化する。この活性化されたキナーゼは、電位−ゲートカリウムチャネルタンパク質、及びこれに関連するタンパク質をリン酸化し、これによって活動電位においてもカリウムチャネルを開くことができなくなる。そして、カリウムチャネルが開かないことによって、外部流体中のカリウムが増大し、通常再極化される神経細胞膜において、膜内での減極が持続されるに至る。
【００３８】
ＧＰＣＲを変調する薬剤をターゲットとすることにより、信号活性、及び受容体により媒介される生物学的プロセスを、特定の細胞及び組織においてアゴナイズ又はアンタゴナイズすることができる。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。このようなアゴニズム又はアンタゴニズムは、治療環境（哺乳類療法）、又は毒性環境（抗がん剤のような抗細胞療法）における生物学的活性の変調に基づいている。
【００３９】
【発明を実施するための最良の形態】
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野において、ケモカイン受容体サブファミリーに関連するＧＰＣＲタンパク質、又はその一部であると同定されるタンパク質／ペプチド／ドメインに対して、構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化する、ヒトゲノムの従来未確認のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築し、転写及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づいて、本発明は、ケモカイン受容体に関連するヒトＧＰＣＲペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらのＧＰＣＲペプチド及びタンパク質をコード化する転写形態の核酸配列、ｃＤＮＡ配列及び／又はゲノム配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のＧＰＣＲに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００４０】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるという点に基づいて選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、ケモカイン受容体サブファミリーにおける既知のＧＰＣＲタンパク質、及びその発現パターンに対して相同性及び／又は構造上の相関性を有していることに基づいて選択される。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。この技術は、本発明の遺伝子と類似した発現パターンを有するこのファミリーのタンパク質及びペプチドにおける商業的重要性を確立するものである。本発明のペプチドのより具体的な性質及びその使用に関しては、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記載され、及び／又は既知のケモカインファミリー又はＧＰＣＲタンパク質サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００４１】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明は、ＧＰＣＲファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されるタンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものであり、これらはケモカイン受容体サブファミリーに関連付けられる（図２にタンパク質配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）。図２に提供されるペプチド配列、同様に本明細書に記載される対立変異体、特に本明細書及び図３の情報を用いて同定される対立変異体のような明らかな変異体は、ここでは本発明のＧＰＣＲペプチド、本発明のＧＰＣＲペプチド、又はペプチド／タンパク質と呼ばれる。
【００４２】
本発明は、図２に示されるＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列から成る、あるいは実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供する（図１の転写／ｃＤＮＡ、又は図３のゲノム配列に示される核酸分子によりコード化される）とともに、本技術により調製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については以下で詳述する。
【００４３】
ここで用いられる場合、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは、均一、又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質は、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については、後述する）。
【００４４】
いくつかの例によると、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満のときには、実質的に培地は存在しないとすることができる。
【００４５】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満、又は、化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有するＧＰＣＲペプチド調製物を含む。
【００４６】
単離ＧＰＣＲペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組み換え）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。例えば、ＧＰＣＲペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる。これらの多くの技術については、以下で詳述する。
【００４７】
したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。タンパク質の最終的なアミノ酸配列がこのアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００４８】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）や、図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列が微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程度の付加残基、典型的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００４９】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含むタンパク質、例えば図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、又はタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基（コード化された配列と隣接する）や、非相同アミノ酸残基／ペプチド配列のように、付加的なアミノ酸を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明のＧＰＣＲペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【００５０】
本発明のＧＰＣＲペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、ＧＰＣＲペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、有効に結合されるＧＰＣＲペプチドを含む。「有効に結合される」とは、ＧＰＣＲペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを示す。非相同タンパク質は、ＧＰＣＲペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００５１】
いくつかの例では、融合タンパク質は、ＧＰＣＲペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。融合タンパク質には、例えば、βガラクトシダーゼ融合、イースト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、融合タンパク質はこれに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換えＧＰＣＲペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用いることにより増加させることができる。
【００５２】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。他の例では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２参照）。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業的に入手することができる。ＧＰＣＲペプチドをコード化した核酸は、融合部がフレーム中でＧＰＣＲペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングされることができる。
【００５３】
以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、非天然の組換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかしながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れのアミノ酸配列も含まれないものであると理解される。
【００５４】
このような変異体は、本発明に示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のＧＰＣＲペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的変異体であるか又は非機能的変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいている。
【００５５】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で、配列は整列される（例えば、最適な配列比較のために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じて整列される。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその配置上で同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、ギャップは２つの配列が最適な比較を行えるように導入される必要がある。
【００５６】
２つの配列間における、配列の比較及び同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。好適な例としては、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１）：３８７（１９８４））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、８０と長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の一例としては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ・Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８９））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定される。
【００５７】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０ （１９９０）） を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップ配列を得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００５８】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質における、成熟プロセシングを受ける前後の形態の全長は、本発明のＧＰＣＲペプチドのうちの１つに対して完全な配列同一性を有し、本発明のＧＰＣＲペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているものとして、容易に同定することできる。図３のマッピング位置には、本発明のＧＰＣＲが、染色体１２上のマーカーＳＨＧＣ−６４１０３（ＬＯＤスコア６．１２）、ＳＨＧＣ−５６７７２（ＬＯＤスコア６．１２）、及びＳＨＧＣ−３４７５８（ＬＯＤスコア６．０６）の近接の遺伝子によりコード化されていることが示されている。
【００５９】
ＧＰＣＲペプチドの対立遺伝子変異体は、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であり、同様に本発明のＧＰＣＲペプチドと同じ遺伝子位置においてコード化されているものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図３に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。図３のマッピング位置には、本発明のＧＰＣＲが、染色体１２上のマーカーＳＨＧＣ−６４１０３（ＬＯＤスコア６．１２）、ＳＨＧＣ−５６７７２（ＬＯＤスコア６．１２）、及びＳＨＧＣ−３４７５８（ＬＯＤスコア６．０６）の近接の遺伝子によりコード化されていることが示されている。ここで用いられる場合、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５％、又はそれ以上の相同性を有する場合には、２つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００６０】
ＧＰＣＲペプチドのパラログは、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的に少なくとも約６０％以上、さらに典型的には７０％以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００６１】
ＧＰＣＲペプチドのオルトログは、ＧＰＣＲペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコード化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療ターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、ＧＰＣＲペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列によりコード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存している。
【００６２】
本発明のＧＰＣＲペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に生成することできる。このような変異体には、ＧＰＣＲペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、ＧＰＣＲペプチドにおける特定のアミノ酸が、同様の特徴をもつ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に述べられている。
【００６３】
変異ＧＰＣＲペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えばリガンド結合能、Ｇタンパク質結合能、信号伝達媒介能等のような活性の一つ以上において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体には、典型的には、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２には、タンパク質解析の結果が示されており、致命的なドメイン／領域を特定するのに使用することができる。機能的変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、機能に対してある程度プラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００６４】
非機能性変異体には、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００６５】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））等の当該分野において既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確認することができる。アラニンスキャニング突然変異誘発では、分子内の全ての残基において、単独のアラニン突然変異を行う。この結果生じた変異体分子は、その後、リガンド／効果器分子結合のような生物活性、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。リガンド／受容体結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４ （１９９２）； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００６６】
本発明はＧＰＣＲペプチドのフラグメントを提供し、さらにこれに加えて、該フラグメントを含む、及びから成るタンパク質及びペプチド、特に図２に同定された残基を含むタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むものとは見なされない。
【００６７】
フラグメントは、ここで用いられる場合、ＧＰＣＲペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。このようなフラグメントは、１以上のＧＰＣＲペプチドの生物活性を保持する能力によって選択されるか、あるいはリガンド、効果器分子との結合、又は抗原としての挙動等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラグメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えばＧタンパク質結合部位、膜貫通ドメイン、又はリガンド結合ドメインのような、ＧＰＣＲペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、抗原性構造含有フラグメントを含むが、フラグメントはこれに限定されるものではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【００６８】
ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。ＧＰＣＲペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である（これらの特性のいくつかは図２において確認される）。
【００６９】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されるものではない。
【００７０】
このような修飾は当業者に周知であり、科学文献において非常に詳細に記述されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）のような、殆どの基本テキストにおいて記述されている。この点に関する詳細な文献としては、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２ （１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）） ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２） のような多くの文献を利用することができる。
【００７１】
したがって、本発明のＧＰＣＲペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコード化されていない、置換基が含まれている、成熟ＧＰＣＲペプチドが例えばＧＰＣＲペプチドの半減期を長くする化合物のような他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているか又は付加アミノ酸が例えば成熟ＧＰＣＲペプチドの主、副配列、又は精製配列である、あるいは成熟ＧＰＣＲペプチドの前タンパク質配列のような成熟ＧＰＣＲペプチドと融合しているといった、誘導体又は類似体をも包含するものである。
【００７２】
タンパク質／ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面及び背景技術に示される機能情報に関連した、実質的且つ特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応を誘発させるための生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又は受容体）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、あるいは、対応するタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、他のタンパク質と結合するか又は結合し得る場合（例えば、受容体−リガンド間相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手を同定し、結合相互作用の阻害剤を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又は全てを使用することにより、試薬グレード、又は商業製品としてのキットフォーマットへの開発が可能となる。
【００７３】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２ｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， （１９８９） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， （１９８７）がある。
【００７４】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、第一に、タンパク質起源、及びタンパク質の分類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したＧＰＣＲ、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬、特に、ＧＰＣＲを発現する細胞又は組織中での生物反応又は病理学的反応の変調に用いられる医薬を発見するためのターゲットとして有用である。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。全ての医薬製剤のうちの約７０％がＧＰＣＲの活性を変調する。無脊椎動物及び哺乳類のオルトログの組み合わせは、無脊椎動物に特異的な薬剤を発見するための選択的スクリーニング法に用いることができる。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報は、特に図１の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。このような使用は、本発明で与えられる情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容易に決定することができる。
【００７５】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメントを含む）は、ケモカイン受容体サブファミリーに関連付けられるＧＰＣＲに関する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、公知のＧＰＣＲの機能、あるいは、特にこの受容体を発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属するＧＰＣＲサブファミリーに特異的に関連するＧＰＣＲ関連症状の診断及び治療に有用な、活性又は性質の何れかに関係している。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【００７６】
本発明のタンパク質は、細胞系、又は無細胞系における薬剤スクリーニングアッセイにおいても有用である。細胞系では、天然型、すなわち受容体タンパク質を正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖する。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。他の例では、細胞系アッセイは、受容体タンパク質を発現する組み換え宿主細胞に関係している。
【００７７】
ポリペプチドは、自然状態でタンパク質の受容体活性を変調する化合物、又は受容体に関連する特定の疾患又は症状を引き起こす変異型を同定するために用いることができる。本発明のＧＰＣＲと、適切な変異体及びフラグメントの両者は、受容体への結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらにこれらの受容体活性に対する影響を判定するために、機能性受容体に対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性／効果を判定するために試験することができる。化合物は、受容体を望ましい程度までに活性化（アゴニスト）又は不活性化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【００７８】
さらに、本発明のタンパク質は、受容体タンパク質と、受容体タンパク質と通常相互作用する分子、例えば、受容体タンパク質が通常相互作用する信号経路のリガンド又は構成成分との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物（例えば、Ｇタンパク質、又はｃＡＭＰに関連する他の相互作用物質、ホスファチジルイノシトール代謝回転及び／又はアデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣ活性化）をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、受容体タンパク質又はフラグメントがターゲット分子と相互作用するか、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又はＧタンパク質リン酸化、ｃＡＭＰ又はホスファチジルイノシトール代謝回転、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ活性化などの信号伝達に関連した効果のような、受容体タンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的な結果を検出することのできる条件で、受容体タンパク質と候補化合物とが結合される工程が含まれる。
【００７９】
候補化合物としては、例えば、１）最後部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４ （１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６ （１９９１）参照）、及びＤ−及び／又はＬ−型アミノ酸の組み合わせからできている化学誘導分子ライブラリを含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ。例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８ （１９９３）参照）、３）抗体（例えば、ポリクローン抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、４）小さな有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる。
【００８０】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼす変異体を含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。したがって、例えば、高い親和性を有するか、又はフラグメントがリガンドと結合し解離しないような、リガンドと競合するフラグメントが本発明に含まれる。
【００８１】
本発明はさらに、受容体活性を変調（促進又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に受容体活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、細胞増殖のような細胞プロセスや、受容体タンパク質依存信号カスケードに対する応答が促進又は抑制するよう調節される遺伝子発現についてのアッセイが行われる。ある１つの例では、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのような容易に検出することのできるマーカーと結合することができる。
【００８２】
受容体により媒介される生物学的又は生化学な機能は、何れもエンドポイントアッセイとして用いることができる。これらは、ここに記載されている全ての生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれらのエンドポイントアッセイのターゲットが折り込まれており、また、他の機能については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて、容易に確認することができる。特に、受容体を発現する細胞又は組織の生物学的機能についてのアッセイを行うことができる。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【００８３】
結合及び／又は活性化合物は、キメラ受容体タンパク質を用いることによりスクリーニングを行うこともでき、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、あるいは、７つの膜貫通セグメントの何れか又は細胞内又は細胞外ループの何れか、及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜貫通ドメイン全体あるいはサブリジョン又はその一部は、異種ドメイン又はサブリジョンにより置換され得る。例えば、Ｇタンパク質結合領域は、異なるＧタンパク質と相互作用するものとして用いられることができ、天然の受容体によって認識される。したがって、異なる一組の信号伝達成分を、活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。あるいは、膜貫通部全体又はサブリジョン（膜貫通セグメント、又は細胞内、細胞外ループ）は、アミノ末端細胞外領域及び／又はＧタンパク質結合領域の由来する宿主細胞とは異なる宿主細胞に特有の膜貫通部全体又はサブリジョンと置換することができる。これにより、受容体の由来する特定の宿主細胞以外のものにおいてアッセイを行うことが可能となる。あるいは、アミノ末端細胞外ドメイン（及び／又はリガンド結合領域）は、他のリガンドと結合するドメイン（及び／又は他の結合領域）と置換することができ、このため、異種のアミノ末端細胞外ドメイン（又は領域）と相互作用をするが、信号伝達の起こるようなテスト化合物のアッセイが提供される。最終的に、天然の信号伝達経路の一部である転写調整配列に結合され得る検出容易なコード領域を含むリポーター遺伝子により活性化が検出される。
【００８４】
本発明のタンパク質はまた、受容体と相互作用する化合物を発見するために設計される方法である競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物を受容体ポリペプチドと接触させる。可溶性受容体ポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト化合物が可溶性受容体ポリペプチドと相互作用する場合、受容体ターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは、特に受容体の特定領域と相互作用する化合物を模索する場合に有用である。このように、ターゲットとなる受容体領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００８５】
無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化するために、受容体タンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【００８６】
薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、融合タンパク質はタンパク質にマトリックスに結合することのできるドメインを付加することができる。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−ｌａｂｅｌｅｄ）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）の下で混合物がインキュベートされる。インキュベートの後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固定化して、放射性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量される。あるいは、複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクション中の受容体結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子のどちらかが、当業者に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。受容体結合タンパク質の組成物と候補化合物は、受容体タンパク質存在ウェル中でインキュベートされ、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、受容体タンパク質ターゲット分子に反応性のある抗体、又は、受容体タンパク質に反応性がありターゲット分子と争う抗体を用いた複合体の免疫検出法、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【００８７】
本発明のＧＰＣＲのうちの１つを変調する薬剤は、上述の分析方法を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初と最後に細胞系又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【００８８】
これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定される受容体タンパク質活性のモジュレータは、ＧＰＣＲを発現する細胞又は組織に処置することにより、受容体経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。これらの治療方法には、薬剤組成物中のＧＰＣＲ活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるようにして同定される。
【００８９】
本発明の他の観点では、ＧＰＣＲと結合又は相互作用する、又はＧＰＣＲ活性に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又は３−ハイブリッドアッセイ（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）において、ＧＰＣＲタンパク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。このようなＧＰＣＲ結合タンパク質は、例えば、下流因子としてのＧＰＣＲタンパク質、又はＧＰＣＲターゲットによる信号伝達に関与している。あるいは、このようなＧＰＣＲ結合タンパク質は、ＧＰＣＲ阻害剤であることがある。
【００９０】
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写調節因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造においては、ＧＰＣＲタンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未知のタンパク質（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が、既知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒｅｙタンパク質」が生体内で相互作用することができ、ＧＰＣＲ依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、ＧＰＣＲタンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得ることができる。
【００９１】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤に関する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された薬剤（例えばＧＰＣＲ変調薬剤、アンチセンスＧＰＣＲ核酸分子、ＧＰＣＲ特異抗体、又はＧＰＣＲ結合対象）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された薬剤が、このような薬剤の作用のメカニズムを決定するために、動物又は他のモデルで使われることができる。さらに本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【００９２】
本発明のＧＰＣＲタンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素質の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、タンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）の細胞、組織、又は生体中における存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。この方法は、生物サンプルと、受容体タンパク質との相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、ここでは相互作用が検出される。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのような、マルチディテクション形態で提供される。
【００９３】
サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、生物液体が含まれる。
【００９４】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者のタンパク質活性、疾患又は疾患素質の診断に用いるためのターゲット、特に現存するタンパク質ファミリーの他のメンバーとして知られているものの活性及び症状のターゲットを提供するものである。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これには、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング挙動の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾が含まれる。分析方法としては、変容電気泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞系又は無細胞系アッセイによる変容ＧＰＣＲ活性、リガンド又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接アミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、シングルディテクション形態、又は抗体チップアレイのような、マルチディテクション形態で提供される。
【００９５】
ペプチドのＩｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体、又は他のタイプの検出試薬を被験者に導入することにより、被験者のｉｎ ｖｉｖｏ検出を行うことができる。例えば、抗体は放射性マーカーをラベルすることができ、被験者中のこのマーカーの存在及び位置は、標準イメージング技術によって検出することができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【００９６】
ペプチドはまた、ゲノム薬理学分析においても有用である。ゲノム薬理学では、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常挙動に従って、薬剤に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． （Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）： ９８３−９８５ （１９９６））、及びＬｉｎｄｅｒ， Ｍ．Ｗ． （Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６ （１９９７））参照されたい。これらの変異の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤の作用の強度と期間に影響する。このように、個人のゲノム薬理学は、個人の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝形の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団の受容体機能の１つ以上が他の集団のそれと異なるような、受容体タンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性は、末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他のリガンド結合領域におけるリガンド結合活性及び受容体活性が、より高い、又はより低いことを引き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、リガンド投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【００９７】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害を治療することに有用である。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。したがって、治療方法としては、ＧＰＣＲタンパク質又はフラグメントの使用が含まれる。
【００９８】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである。ここで用いられる場合、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合には、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。抗体がターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【００９９】
ここで用いられる場合、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントのような抗体のフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１００】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Ｈａｒｌｏｗ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。
【０１０１】
一般に、抗体を生成するためには、単離プチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドフラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラグメントは、図２に特定されているような機能性ドメインをカバーするものであり、また、タンパク質配置方法及び図を使用して容易に確認することができるファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【０１０２】
抗体は、ＧＰＣＲタンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に調製される。抗体は、ここに記載されるペプチドの何れの領域からも調製することができる。しかしながら、好適な領域としては、機能／活性及び／又はＧＰＣＲ結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特定するのに用いることができ、配列配置は保持された特異な配列フラグメントを特定するのに用いることができる
【０１０３】
抗原性フラグメントは、一般的に、少なくとも８つの隣接するアミノ酸残基から成っている。抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基から成ることができる。このようなフラグメントは、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性領域に対応するフラグメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて選択することができる。
【０１０４】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例としては、ルミノールが含まれ、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１０５】
抗体の使用
抗体は、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって、本発明のタンパク質の１つを単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生成されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的状態の発展又は進行間における、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を確認するのに用いることができる。
【０１０６】
さらに抗体は、タンパク質機能に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人といった、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合、抗体は通常のタンパク質に対して調製される。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【０１０７】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。診断としての使用は、遺伝子のテストだけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするために用いることができる。
【０１０８】
さらに、抗体はゲノム薬理学分析において有用である。したがって、多形タンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するために用いることができる。抗体はまた、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される、異常タンパク質の免疫学的マーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【０１０９】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異である抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【０１１０】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、リガンドのような結合相手へのＧＰＣＲペプチドの結合をブロックする。これらの使用は、タンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【０１１１】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的サンプル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、；サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【０１１２】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のＧＰＣＲペプチド又はタンパク質をコード化する核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のＧＰＣＲペプチドの１つをコード化する核酸分子、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルトログ又はパラログから成る、実質的に成る、又は含んでいる。
【０１１３】
ここで用いられる場合、「単離」核酸分子とは、核酸の天然起源における他の核酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸のフランキング配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特に１ＫＢ以上又はこれ以下、特に配列によりコード化された隣接ペプチドのようにいくつかのフランキングヌクレオチド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドはゲノム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマーの調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要でないフランキング配列から分離されているということである。
【０１１４】
さらに、例えば、転写／ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞物質、組み換え技術により製造される場合には培地、また化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、他のコード化又は調整配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１１５】
例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例としては、非相同的な宿主細胞に保持された組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離したＤＮＡ分子の、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物が含まれる。本発明により単離された核酸分子としてはさらに、合成的に製造された分子が含まれる。
【０１１６】
したがって、本発明は、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【０１１７】
本発明はさらに、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子において、最終的にこのようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【０１１８】
本発明はさらに、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列の少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法について、以下に簡単に述べる。
【０１１９】
図１及び３には、コード及び非コードの配列の両者が示されている。本発明のヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）より、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び非コード遺伝子間配列を含んでいる。一般に、図１と図３の両者に記載されているこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に確認することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、特に、ここに提供されるゲノム配列のフラグメントとしてクレームされている。
【０１２０】
単離した核酸分子は、成熟したタンパク質と付加的アミノ末端あるいはカルボキシ末端アミノ基、又は成熟ペプチド内のアミノ基（例えば、成熟形態が１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッセイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【０１２１】
上述したように、単離した核酸分子は、単独でＧＰＣＲペプチドをコード化している配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配列（例えば、ｐｒｅ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列、プラス付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード５´及び３´配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするようなペプチドをコード化した配列のマーカーと融合されることもできる。
【０１２２】
単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、あるいはクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１２３】
本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と同様に、上記したような本発明のＧＰＣＲタンパク質の明らかな変異体をコード化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に発生するか、あるいは組み換えＤＮＡ法又は化学合成によって生成され得る。このような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用される突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１２４】
本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な遺伝子発現の制御、及び遺伝子変調薬剤の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用であるプロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位において容易に確認される。
【０１２５】
フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用目的に基づく。例えば、フラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができるか、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラリ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【０１２６】
一般的なプローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１２７】
オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％、より典型的には、少なくとも９０−９５％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、モデレートな条件からストリンジェントな条件の下で、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対してハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置で、容易に決定されることができる。図３のマッピング位置には、本発明のＧＰＣＲが、染色体１２上のマーカーＳＨＧＣ−６４１０３（ＬＯＤスコア６．１２）、ＳＨＧＣ−５６７７２（ＬＯＤスコア６．１２）、及びＳＨＧＣ−３４７５８（ＬＯＤスコア６．０６）の近接の遺伝子によりコード化されていることが示されている。
【０１２８】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ここで用いられる場合、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０−７０％の相同性を有する程度にハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ＸＳＳＣ０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。低ストリンジェンシーのモデレートなハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１２９】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）に対応するゲノムクローンを単離するための、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
【０１３０】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、どんな配列とも対応することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたたように、フラグメントは本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見なされる。
【０１３１】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプライマーとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１３２】
核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を表現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば、細胞ゲノム中で、遺伝子及び／又は遺伝子生成物のｉｎ ｓｉｔｕ発現を変化させるために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換され得る。
【０１３３】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１３４】
核酸分子はまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体の位置を決定するためのプローブとしても有用である。図３のマッピング位置には、本発明のＧＰＣＲが、染色体１２上のマーカーＳＨＧＣ−６４１０３（ＬＯＤスコア６．１２）、ＳＨＧＣ−５６７７２（ＬＯＤスコア６．１２）、及びＳＨＧＣ−３４７５８（ＬＯＤスコア６．０６）の近接の遺伝子によりコード化されていることが示されている。
【０１３５】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１３６】
核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの一部又は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１３７】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を表現しているベクターの製造にも有用である。
【０１３８】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している宿主細胞の製造にも有用である。
【０１３９】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を表現している遺伝子組み換え動物の製造にも有用である。
【０１４０】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。したがって、プローブは、細胞、組織、生体中での核酸分子の存在の検出、又はレベルの決定に用いることができる。核酸のレベルはＤＮＡ又はＲＮＡとして決定される。したがって、ここに記載されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、生体中での発現及び／又は遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常の場合と比較して、ＧＰＣＲタンパク質が増加又は減少していることに関係する障害の診断に適している。
【０１４１】
ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、サザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１４２】
プローブは、ＧＰＣＲタンパク質を発現する細胞又は組織の判定を行う診断テストキットの一部として用いることができる。これは、例えば、被験者の細胞サンプル中の、ＧＰＣＲをコード化した核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡのレベルを測定するか、又はＧＰＣＲ遺伝子が変異していないか判定するものである。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【０１４３】
核酸発現アッセイは、ＧＰＣＲ核酸発現を変調する化合物を同定するための薬剤スクリーニングにおいて有用である。
【０１４４】
したがって、本発明は、ＧＰＣＲ遺伝子の核酸発現、特に、細胞及び組織においてＧＰＣＲを媒介する生物学的、病理学的プロセスに関連した障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供するものである。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。この方法は、典型的には、ＧＰＣＲ核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行い、その後、不必要なＧＰＣＲ核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定する。このアッセイは、細胞系及び無細胞系において行われることができる。細胞系のアッセイには、天然にＧＰＣＲ核酸を表現している細胞、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み換え細胞が含まれる。
【０１４５】
ＧＰＣＲ核酸発現のアッセイは、例えばｍＲＮＡレベルのような核酸レベル、又は信号経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連している。さらに、ＧＰＣＲタンパク質信号経路における応答性を向上、又は低下させる遺伝子の発現についてもアッセイされる。この例として、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に有効に結合されることができる。
【０１４６】
したがって、ＧＰＣＲ遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定されることができる。候補化合物の存在下でのＧＰＣＲｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下でのＧＰＣＲｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現の促進剤として同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として同定される。
【０１４７】
本発明はさらに、ＧＰＣＲ核酸発現を変調するための遺伝子モジュレータ、特にタンパク質を発現する細胞及び組織における活性を変調するための遺伝子モジュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物ををターゲットとして用いる治療方法を提供するものである。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。変調には、上方調整（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現が含まれる。
【０１４８】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中でＧＰＣＲ発現を阻害するものである限りは、ＧＰＣＲ核酸発現のモジュレータは、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であり得る。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【０１４９】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、ＧＰＣＲ遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、このようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１５０】
核酸分子はまた、ＧＰＣＲ核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイにも有用である。核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＧＰＣＲ遺伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、ＧＰＣＲ遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異には、欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化が含まれる。機能障害に関連するＧＰＣＲ遺伝子の変異体の検出は、疾患がＧＰＣＲタンパク質の過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１５１】
ＧＰＣＲ遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図３のマッピング位置には、本発明のＧＰＣＲが、染色体１２上のマーカーＳＨＧＣ−６４１０３（ＬＯＤスコア６．１２）、ＳＨＧＣ−５６７７２（ＬＯＤスコア６．１２）、及びＳＨＧＣ−３４７５８（ＬＯＤスコア６．０６）の近接の遺伝子によりコード化されていることが示されている。ゲノムＤＮＡは、直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析されることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６８３，１９５， 及び ４，６８３，２０２参照）、又は他のものとして、リゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０ （１９８８）； 及び Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４ （１９９４）参照）において、プローブ／プライマーの使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６７５−６８２ （１９９５）参照）。この方法には、患者から細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズさせた１以上のプライマーと、核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡと正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１５２】
あるいは、ＧＰＣＲ遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１５３】
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在を評点することに用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化分析評価、又は融点の違いによって、不一致の配列から分離することができる。
【０１５４】
特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体ＧＰＣＲ遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ， Ｃ．Ｗ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）の実行において有用であり、これらには、マススペクトルによる配列解析（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９４／１６１０１； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６：１２７−１６２ （１９９６）， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１４７−１５９ （１９９３）参照）も含まれる。
【０１５５】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２ （１９８５）， Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８５：４３９７ （１９８８）， Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５ （１９９２））、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８６：２７６６ （１９８９）； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４ （１９９３）； ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９：７３−７９ （１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５ （１９８５））が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１５６】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量を選択するために、個人のＧＰＣＲ遺伝子の変異についての評価に用いることができる。
【０１５７】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがって、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１５８】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるＧＰＣＲ遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、転写に関連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、ＧＰＣＲタンパク質の生成と転写が防がれる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これによりＧＰＣＲタンパク質中でのｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１５９】
あるいは、ある種のアンチセンス分子は、ＧＰＣＲ核酸の発現を減少させる不活性化ｍＲＮＡに用いることができる。したがって、これらの分子は、異常、又は不必要なＧＰＣＲ核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、ｍＲＮＡの翻訳能力を減少させる、ｍＲＮＡの１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、リガンド結合のような、ＧＰＣＲタンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域が含まれる。
【０１６０】
核酸分子はまた、ＧＰＣＲ遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。組み換え細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞が含まれ、個人の体内に導入されてそこで個人の治療のために必要とされるＧＰＣＲタンパク質を生成する。
【０１６１】
本発明は、生物学的サンプル中のＧＰＣＲ核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する。図１に示す実験データは、本発明のＧＰＣＲタンパク質が、脳、心臓、肺等で発現することを示している。具体的には、仮想ノーザンブロット法では、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。例えば、キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中でＧＰＣＲ核酸を検出することのできる試薬を含み；サンプル中のＧＰＣＲ核酸量を決定する手段；標準サンプルのＧＰＣＲ核酸量と比較する手段、とを含むことができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらにＧＰＣＲタンパク質ｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用するための説明を含むことができる。
【０１６２】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図１及び３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１，３）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１６３】
ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような基盤の上で合成された別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。１つの例として、マイクロアレイは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２， Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／１１９９５ （Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．）， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １６７５−１６８０） 及び Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １０６１４−１０６１９ に記載される方法にしたがって調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８０７，５２２．に記載される方法により製造される。
【０１６４】
マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約６〜６０のヌクレオチド長さより好適には１５〜３０のヌクレオチド長、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットのためには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１６５】
マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は、典型的には、コンピュータアルゴリズムを用いて、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了する。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には、配列の中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて同一である。２つ目のペアのオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールとして用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１６６】
他方、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／２５１１１６ （Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。他の観点では、「格子」アレイではドット（又はスロット）ブロットとなるように、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に結合させることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４又はこれ以上、又は商業的に用いられる装置に効果的に使用される２から１００万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１６７】
マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスのＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増幅し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイ又は検出キットと共にインキュベートされ、そして、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。インキュベート条件は、正確に相補的に一致しているか、又は各種程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こりうるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度、及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、サンプル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１６８】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のＧＰＣＲタンパク質／ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の核酸分子とのインキュベートと、テストサンプル中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとを含む。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子及び／又は本発明のＧＰＣＲ遺伝子の対立変異体である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。
【０１６９】
テストサンプルと核酸分子のインキュベートの条件は様々である。インキュベート条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式を認識している当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるに当って、容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， Ｔ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｇ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ． １ （１ ９８２）， Ｖｏｌ． ２ （１９８３）， Ｖｏｌ． ３ （１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８５）に記載されている。
【０１７０】
本発明のテストサンプルには、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物が含まれる。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易に適用することができる。
【０１７１】
本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１７２】
特に本発明は、（ａ）ここに記載されるヒトゲノムのフラグメントと結合することのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０１７３】
詳細には、区分されたキットとしては、試薬が別々の容器に含まれているキットが含まれる。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラス又は紙、又は二酸化ケイ素のようなアレイ材料を含む。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブが含まれる容器、洗浄試薬（例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検出に用いられる試薬を含む容器が含まれる。当業者は、本発明にかかる従来未確認のＧＰＣＲ遺伝子を認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込んで用いることができる。
【０１７４】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを指し、好適には核酸分子であり、核酸分子の輸送をすることができるもののことである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点では、ベクターには、プラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡのウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲＭＡＣのような人工染色体が含まれる。
【０１７５】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１７６】
本発明は、核酸分子の保持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シャトルベクター）。
【０１７７】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と結合可能なｃｉｓ作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は、転写に影響を及ぼす核酸分子と分離されて、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供するものである。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供される。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかし、いくつかの例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は、無細胞系でも起こり得ることが理解される。
【０１７８】
ここに記載される核酸分子の調整配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含み有効に有効に結合されることができる。これらには、バクテリオファージλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉから得られたｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０から得られた初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイルスのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１７９】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサが含まれる。
【０１８０】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化信号と同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０１８１】
各種の発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクターが含まれ、これらは例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バクロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、バクシニアウイルス、アデノウイルス、ポクスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターである。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミドとファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０１８２】
調整配列では、１以上の宿主細胞の構成としての発現（すなわち組織特異性）、又は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０１８３】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、発現ベクターと１以上の限定酵素により、ＤＮＡ配列とが開裂し、フラグメントが共に結さつすることによって、発現ベクターと結合される。制限酵素の消化及び結さつの手順は、当業者において周知である。
【０１８４】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及び Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が好適である。したがって、本発明はペプチドの生成が可能な融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上することができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によって、タンパク質精製を向上することができる。タンパク質分解性開裂部位は融合部分との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、エンテロキナーゼが含まれるが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａのそれぞれをターゲット組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）、ｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））が含まれる。
【０１８６】
組み換えタンパク質の発現は、宿主細胞において、組み換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能力を持つ遺伝子背景を提供することによって宿主バクテリアにおいて最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１８７】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が含まれる。
【０１８８】
核酸分子はまた、例えば、バクロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で表現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３））、及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））が含まれる。
【０１８９】
本発明のある実施例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で表現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））、及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））が含まれる。
【０１９０】
ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。ここに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現において、好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている。
【０１９１】
ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクターは、アンチセンスＲＮＡを転写する調整配列に結合可能であるが、本発明はまた、このようなベクターをも包含するものである。このように、アンチセンス転写は、コード、非コード領域の両方が含まれている、ここに記載されている核酸分子配列の、全部又は一部を生成することができる。そして、このアンチセンスのＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０１９２】
本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連するものである。したがって、宿主細胞には、原核生物細胞、酵母のような低真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核生物細胞が含まれる。
【０１９３】
組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、ここに記載されるように構成されるベクターを細胞中に導入することによって調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９４】
宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を与えるような、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０１９５】
バクテリオファージ及びウィルスベクターの場合、これらは標準的なインフェクション及びトランスダクションの操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウィルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０１９６】
ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーは、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性が含まれる。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーは何れの場合にも有効である。
【０１９７】
成熟タンパク質は、適切な調整配列の制御下で、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞で生成されることができるが、無細胞系転写及び翻訳システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、これらのタンパク質を生成するために用いることができる。
【０１９８】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、これがＧＰＣＲのようなタンパク質を含むマルチ膜貫通ドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクター中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプチドに非相同であり得る。
【０１９９】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはＧＰＣＲの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精製されることができる。
【０２００】
また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造における宿主細胞に依存して、ペプチドは種々のグリコシル化パターンを有し、細胞に依存してバクテリア内で製造される際にグリコシル化されないかもしれないことが理解される。さらに、ペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０２０１】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載されているペプチドを表現している組み換え宿主細胞には、種々の使用用途がある。第一に、この細胞はＧＰＣＲタンパク又はペプチドの生成に有用であり、ＧＰＣＲタンパク質又はフラグメントを必要量生成するために、さらに精製を行うことができる。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生成に有用である。
【０２０２】
宿主細胞は、ＧＰＣＲタンパク質又はＧＰＣＲタンパク質フラグメントに関連している細胞系のアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然のＧＰＣＲタンパク質を表現している組み換え宿主細胞は、ＧＰＣＲタンパク質機能を促進又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０２０３】
宿主細胞はまた、機能的な影響を受けるＧＰＣＲタンパク質変異体を同定するために有用である。変異が自然に生じて病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のＧＰＣＲタンパク質の効果を示さずに、ＧＰＣＲタンパク質変異体に要求される効果（例えば、機能を促進、又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０２０４】
遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのような齧歯動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、ＧＰＣＲタンパク質の機能の研究、及びＧＰＣＲタンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、及び両生類が含まれる。
【０２０５】
遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞は偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れのＧＰＣＲタンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組み換え遺伝子として導入されることができる。
【０２０６】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列の一部分を形成することができる。イントロン配列及びポリアデニル化信号が、すでに含まれていない場合には、これも含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対しＧＰＣＲタンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に有効に結合されることができる。
【０２０７】
受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化されており、例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，７３６，８６６、及び ４，８７０，００９， ｂｙ Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８７３，１９１ ｂｙ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ ｉｎ Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６） に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繁殖するために用いられることができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さらに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることができる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織を含む。
【０２０８】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである （Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質をコード化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成することによって提供される。
【０２０９】
ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７）及び、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ ９７／０７６６８ ａｎｄ ＷＯ ９７／０７６６９に記載されている方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞は、単離されて、成長サイクルから出てＧ０相に入れられるように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、単離された静止細胞と同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するように培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０２１０】
ここに記載されているペプチドを表現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換え動物は、ｉｎ ｖｉｖｏの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、リガンド結合、ＧＰＣＲタンパク質活性化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞系又は細胞系のアッセイでは明らかにならないかもしれない。このため、これらは、リガンド相互作用、ＧＰＣＲタンパク質機能及びリガンド相互作用に対する特定の変異体ＧＰＣＲタンパク質の影響、及びキメラＧＰＣＲタンパク質の影響を含むＧＰＣＲタンパク質機能を、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に一つ以上のＧＰＣＲタンパク質機能を除去する突然変異である、ｎｕｌｌ変異の影響を評価することも可能である。
【０２１１】
本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考として折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
2004500113.tif 000003
2004500113.tif 000004
2004500113.tif 000005
2004500113.tif 000006
2004500113.tif 000007
2004500113.tif 000008
2004500113.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のＧＰＣＲをコード化するｃＤＮＡ分子又は転写配列のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）。さらに、ここにはＡＴＧ開始、終止、及び組織分布のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。図１に示す実験データは、ヒトの脳、心臓、肺、子宮、胎盤、甲状腺で発現することを示している。
【図２】
図２は、本発明のＧＰＣＲの予測アミノ酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）。さらに、ここにはタンパク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。
【図３】
図３は、本発明のＧＰＣＲタンパク質をコード化している遺伝子領域のゲノム配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）。さらに、ここにはイントロン／エクソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。
【図１】
2004500113.tif 000010
【図２】
2004500113.tif 000011
2004500113.tif 000012
2004500113.tif 000013
2004500113.tif 000014
【図３】
2004500113.tif 000015
2004500113.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004500113.tif 000017
2004500113.tif 000018
2004500113.tif 000019
2004500113.tif 000020
2004500113.tif 000021
2004500113.tif 000022
2004500113.tif 000023
2004500113.tif 000024
2004500113.tif 000025
2004500113.tif 000026
2004500113.tif 000027
2004500113.tif 000028
2004500113.tif 000029
2004500113.tif 000030
2004500113.tif 000031
2004500113.tif 000032
2004500113.tif 000033
2004500113.tif 000034
2004500113.tif 000035
2004500113.tif 000036
2004500113.tif 000037
2004500113.tif 000038
2004500113.tif 000039
2004500113.tif 000040
2004500113.tif 000041
2004500113.tif 000042
2004500113.tif 000043
2004500113.tif 000044
2004500113.tif 000045
2004500113.tif 000046
2004500113.tif 000047
2004500113.tif 000048
2004500113.tif 000049
2004500113.tif 000050
2004500113.tif 000051
2004500113.tif 000052
2004500113.tif 000053
2004500113.tif 000054
2004500113.tif 000055
2004500113.tif 000056
2004500113.tif 000057
2004500113.tif 000058
2004500113.tif 000059
2004500113.tif 000060
2004500113.tif 000061
2004500113.tif 000062
2004500113.tif 000063
2004500113.tif 000064
2004500113.tif 000065
2004500113.tif 000066
2004500113.tif 000067
2004500113.tif 000068
2004500113.tif 000069
2004500113.tif 000070
2004500113.tif 000071
2004500113.tif 000072
2004500113.tif 000073
2004500113.tif 000074
2004500113.tif 000075
2004500113.tif 000076
2004500113.tif 000077
2004500113.tif 000078
2004500113.tif 000079
2004500113.tif 000080
2004500113.tif 000081
2004500113.tif 000082
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500113.tif 000083
【国際調査報告】
2004500113.tif 000084
2004500113.tif 000085
2004500113.tif 000086
2004500113.tif 000087