(57)【要約】本発明は人工血管グラフトおよびその作成方法を提供する。人工血管グラフトは、細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成管状要素を含む。
2004506418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成管状要素を含む人工血管グラフト。
【請求項２】
前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞の第１の部分は前記細胞増殖生育因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換され、そして更に前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞の第２の部分は前記細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換される請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項３】
前記管腔表面はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、膨張ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリエステル繊維、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（商標））および処理済動物血管よりなる群から選択される物質からなる請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項４】
前記合成管状要素は血管の内断面積に実質的に等価な内断面積のものである請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項５】
前記合成管状要素の前記内断面積は約７〜７００ｍｍ２の範囲である請求項４に記載の人工血管グラフト。
【請求項６】
前記複数の内皮細胞は静脈セグメント、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および循環内皮細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項７】
前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞は人工血管グラフトのレシピエントに由来するものである請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項８】
前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞はヒトまたは動物のドナーに由来するものである請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項９】
前記複数の内皮細胞は前記内管腔表面に全面生育した単層を形成する請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項１０】
前記細胞増殖生育因子少なくとも１種がＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦおよびＨＧＦよりなる群から選択される請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項１１】
前記細胞付着因子少なくとも１種がＵＰ５０、ＤＡＮＣＥ、ビトロネクチン、アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンである請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項１２】
前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞を更に遺伝子的に形質転換してマーカーポリペプチド少なくとも１種を発現できるようにする請求項１に記載の人工血管グラフト。
【請求項１３】
遺伝的に形質転換されて細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現する形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１４】
さらに遺伝的に形質転換されてマーカーポリペプチド少なくとも１種を発現する請求項１３に記載の形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１５】
前記内皮細胞は静脈セグメント、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞または循環内皮細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項１３に記載の形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１６】
前記内皮細胞または平滑筋細胞はヒトドナーおよび動物原材料よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項１３に記載の形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１７】
前記細胞増殖生育因子がＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦおよびＨＧＦよりなる群から選択される請求項１３に記載の形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１８】
前記細胞付着因子はＵＰ５０、ＤＡＮＣＥ、ビトロネクチン、アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンである請求項１３に記載の形質転換された内皮細胞または平滑筋細胞。
【請求項１９】
人工血管グラフトを作成する方法であって：
（ａ）細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように内皮細胞および／または平滑筋細胞を遺伝子的に形質転換すること；および
（ｂ）前記内皮細胞および／または平滑筋細胞での前記管腔表面の十分なコーティングが得られるまで管腔表面を有する合成管状要素内部に前記内皮細胞および／または平滑筋細胞を培養すること、
を包含する方法。
【請求項２０】
工程（ａ）は前記内皮細胞および／または平滑筋細胞の第１の部分を前記細胞増殖生育因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換し、そして前記内皮細胞および／または平滑筋細胞の第２の部分を前記細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換することによって実行される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ａ）は前記工程（ｂ）の前に行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程（ｂ）は前記工程（ａ）の前に行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記内皮細胞は静脈セグメント、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞および循環内皮細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記人工グラフトの前記管腔表面を流動力に供することを更に包含する請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記人工グラフトはバイパス手術に用いられる請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および
（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメント
を包含する核酸発現構築物。
【請求項２７】
前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１種を発現することを目的とするプロモーター配列少なくとも１種を更に包含する請求項２６に記載の核酸発現構築物。
【請求項２８】
前記第１のポリヌクレオチドセグメントは前記第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントは前記プロモーター配列少なくとも１種の単一のプロモーター配列の転写制御下にある請求項２７に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの間に介在するリンカー配列を更に包含する請求項２８に記載の核酸構築物。
【請求項３０】
前記リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項２９に記載の核酸構築物。
【請求項３１】
前記プロモーター少なくとも１種は真核細胞において機能する請求項２６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３２】
前記プロモーター少なくとも１種は構成プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項２６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３３】
（ｃ）前記第１のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的とする第１のプロモーター配列；および、
（ｄ）前記第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的とする第２のプロモーター配列を更に包含する請求項２６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３４】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターは構成プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項３３に記載の核酸発現構築物。
【請求項３５】
前記誘導プロモーターは同じエフェクター分子により調節可能である請求項３４に記載の核酸発現構築物。
【請求項３６】
マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種を更に包含する請求項２６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３７】
前記マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される請求項３６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３８】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種は前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの前記少なくとも１つに転写可能に連結されている請求項３６に記載の核酸発現構築物。
【請求項３９】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種はリンカーセグメントを介して前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている請求項３６に記載の核酸構築物。
【請求項４０】
前記リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項３９に記載の核酸構築物。
【請求項４１】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種は前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に融合されている請求項３６に記載の核酸構築物。
【請求項４２】
（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む第１の核酸発現構築物；および
（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む第２の核酸発現構築物、
を含む核酸発現構築物系。
【請求項４３】
前記第１および前記第２の核酸発現構築物の少なくとも１つはマーカーポリペプチドをコードする更に別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種を更に含む請求項４２に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４４】
前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１種を発現することを目的とするプロモーター配列少なくとも１種を更に包含する請求項４２に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４５】
前記プロモーター配列少なくとも１種は真核細胞において機能する請求項４２に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４６】
前記プロモーター配列少なくとも１種は構成プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項４２に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４７】
前記マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される請求項４３に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４８】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種は前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている請求項４３に記載の核酸発現構築物系。
【請求項４９】
管少なくとも１個に係合するスタンドを含むキットであって、前記管少なくとも１個は核酸発現構築物系を含み、前記核酸発現構築物系が：
（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の核酸発現構築物；および
（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の核酸発現構築物、
を含むキット。
【請求項５０】
管少なくとも１個に係合するスタンドを含むキットであって、前記管少なくとも１個は核酸発現構築物を含み、前記核酸発現構築物が：
（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチド、
を含むキット。
【請求項５１】
遺伝子的に形質転換された内皮細胞および／または平滑筋を製造する方法であって：
（ａ）哺乳類組織原材料から内皮細胞および／または平滑筋細胞を得ること；および
（ｂ）細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように前記内皮細胞および／または平滑筋細胞を形質転換すること、
を包含する方法。
【請求項５２】
個体の血管系の少なくとも一部を置き換えるかバイパス処置する方法であって、前記方法は血管系と人工血管グラフトとの間に流体連絡を形成するように人工血管グラフトを個体の血管系に移植することを包含し、前記人工血管グラフトは、細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成管状要素を含む方法。
【請求項５３】
前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞の第１の部分は前記細胞増殖生育因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換され、そして更に前記複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞の第２の部分は前記細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記合成管状要素は血管の内断面積に実質的に等価な内断面積のものである請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記合成管状要素の前記内断面積は約７〜７００ｍｍ２の範囲である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
内皮細胞および平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成管状要素を包含する人工血管グラフトであって、前記内皮細胞および平滑筋細胞の少なくとも１つが細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている人工血管グラフト。
【請求項５７】
ＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換されている複数の内皮細胞でコーティングされている管腔表面を有する合成管状要素を包含する人工血管グラフト。
【請求項５８】
ＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換されている複数の平滑筋細胞でコーティングされている管腔表面を有する合成管状要素を包含する人工血管グラフト。
【請求項５９】
ＵＰ５０および酸性または塩基性のＦＧＦおよびＨＧＦよりなる群から選択される細胞増殖生育因子を発現するように遺伝子的に形質転換されている複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされている管腔表面を有する合成管状要素を包含する人工血管グラフト。
【請求項６０】
人工血管グラフトを製造するための方法であって：
（ａ）前記内皮細胞および／または平滑筋細胞をＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換すること；および
（ｂ）前記内皮細胞および／または平滑筋細胞での前記管腔表面の十分なコーティングが得られるまで、管腔表面を有する合成管状要素内で前記内皮細胞および／または平滑筋細胞を培養すること、
を包含する方法。
【請求項６１】
人工血管グラフトを製造するための方法であって：
（ａ）内皮細胞および平滑筋細胞を準備すること、ただし前記内皮細胞および平滑筋細胞の少なくとも１つはＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換されていること；および
（ｂ）その後、または、同時に、前記内皮細胞および平滑筋細胞での管腔表面の十分なコーティングが得られるまで、管腔表面を有する合成管状要素内で前記内皮細胞および前記平滑筋細胞を培養すること、
を包含する方法。
【請求項６２】
複数の内皮細胞でコーティングされた管腔表面および複数の平滑筋細胞でコーティングされた外部表面を有する合成管状要素を包含する人工血管グラフト。
【請求項６３】
前記複数の内皮細胞が細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている請求項６２に記載の人工血管グラフト。
【請求項６４】
前記複数の平滑筋細胞が細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている請求項６２に記載の人工血管グラフト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は人工血管グラフトに関する。より詳しくは、本発明は遺伝子的に形質転換された細胞およびその作成方法に関し、これらの細胞は進歩した人工血管グラフトの作成において有用である。本発明は更に血管疾患の治療のための人工血管グラフトの使用方法に関する。
【０００２】
血管疾患：
血管疾患は先進国の罹患および死亡の主要原因であり、このため人口の大部分に影響する。静脈、動脈または合成導管グラフトを利用するバイパス手術は、遮蔽された、または損傷を受けた血管の周囲の血流を確保するか再開することにより上記疾患の臨床的後発症を軽減するために用いられる場合が多い。このような処置の１００万件以上が毎年先進国で実施されており、それらの介入処置のうち３０〜５０％が５〜７年以内に失敗している（１〜４）。
【０００３】
動脈グラフト：
動脈グラフトは静脈および合成のグラフトと比較して長期に渡りより高度な耐性率を示す（５）。しかしなお、動脈グラフトは例えば大動脈冠動脈バイパス手術のような限られた臨床状況においてのみ使用できる。より長期に渡り使用できる高度な耐性を有する生体適合性のある表面を有する合成のグラフトがなお益々必要とされている。短径グラフトの必要性は大腿動脈より下の患部において、そして、怒張した静脈のような限定された自己静脈を有するか、または過去にバイパス手術を受けた患者において、特に高くなっている（２，３）。合成グラフトのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）および他の材料は材料そのものの生体適合性およびその耐久性のためにより多用されるようになっている。合成材料の修飾は多くの動物実験および数例のヒトにおける試験において報告されている（５−１０）。
【０００４】
合成グラフトの機能および耐久性を改善するために、移植前に自家内皮細胞（ＥＣ）グラフトに播種している。内皮細胞は最も生体適合性の高い表面を与え、その血栓溶解能により長期間血栓症から保護する（１１，１２）。更にまた、ＥＣ被覆により新内膜増殖やグラフトの炎症反応が抑制される（１３）。しかしながら、今日まで、無作為の大規模試験においてはＥＣ播種がグラフトの耐久性を改善できることは証明されていない（８−１０）。
【０００５】
移植前にグラフトに播種するために用いられる内皮細胞は典型的には短静脈断片または脂肪組織から採取される。他の原材料はヒトの特性を有するトランスジェニックな動物または個々の患者の自家ＥＣに由来の細胞である。更に別の可能なＥＣ原材料としては末梢血液または骨髄から単離した先駆細胞である。
【０００６】
ヒトの血管疾患の治療に用いる人工血管グラフトの効果を改善するために、新しい手法が人工グラフトの設計および調製の段階で試みられている。人工血管グラフト管腔表面の完全な内皮化はなお極めて遅延しており、グラフトの開存性に大きな影響を与えている。従って、重要な作業はグラフトの被覆およびグラフトマトリックスへの細胞の付着の双方を改善することである。ＥＣを合成グラフトに播種した以前の試みは不完全な内皮化並びに血流状態への曝露による細胞脱離をもたらしている。
【０００７】
グラフトの内皮化を改善する最も新しい手法の１つはこれを増殖能のより高い遺伝子的に形質転換された細胞でコーティングすることである（例えば米国特許５７８５９６５号参照）。
【０００８】
先駆骨髄細胞の分化を促進し、人工グラフトの調製において使用できるＥＣを作成するための短時間ですむ信頼性の高い方法を得るために、このような細胞は典型的には、細胞内で発現する際にＥＣの単離と生育の効率を高めることのできる血管内皮細胞生育因子（ＶＥＧＦ）発現ベクターで形質転換される。即ち、ＶＥＧＦのような特定のＥＣ有糸分裂促進因子は、ＶＥＧＦにより誘発される急速な増殖がより迅速なグラフト被覆をもたらすことから、細胞採取から播種までの時間を短くすることができ、そして、これにより使用する初期グラフト播種密度を低減できる。
【０００９】
内皮細胞の増殖および遊走はＶＥＧＦ受容体の活性化により開始される（１６）。３種類のＶＥＧＦ受容体が同定され、特性化されているが、増殖および遊走に関与しているものは血管形成スイッチにおいて重要な役割を果たすＫＤＲ受容体である（１６，１７）。
【００１０】
ＶＥＧＦはグラフトの内皮化を促進する可能性のある他のＥＣ特異性の低い生育因子よりも顕著な利点を与えるが、その理由はこれが他の血管細胞、特に平滑筋細胞（ＳＭＣ）に対して影響が小さく、このため望ましくない刺激作用の危険性を低減するためである。即ち、人工グラフトに播種された遺伝的に修飾された細胞により放出されるＶＥＧＦは吻合部位からＥＣを獲得するが、ＳＭＣは獲得しない。
【００１１】
ＶＥＧＦを過剰発現する遺伝子トランスフェクションＥＣは非形質転換ＥＣと比較して生育をより促進できるが、このような形質転換細胞を取りこんだ人工血管グラフトは、グラフトの管腔表面をコーティングしている形質転換細胞が移植後の流動力に耐えられないため、機能的に限定されている。
【００１２】
ＵＰ５０は組織培養プラスチックのような表面をコーティングするために用いられる場合にそこへのＥＣの付着能を増大することがわかっている新しい蛋白質である（５１）。この蛋白は６種のカルシウム結合ＥＧＦ様ドメインを含んでおり、その１つはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを含んでいる。このモチーフはＥＣ上において発現されるもののようなインテグリンの特異的結合に関与していることが知られており、このため、細胞マトリックスおよび他の細胞へのＥＣの付着の媒介に関与している（５２）。例えば、ＲＧＤ配列を含む合成ペプチドはインテグリン結合を拮抗し、これにより血管形成や血栓形成のような過程を抑制することがわかっている（５３）。
【００１３】
表皮生育因子（ＥＧＦ）様のモチーフは血管壁の広範な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白に認められ（５４）、血管壁に存在する数種のＥＣＭ蛋白におけるカルシウム結合に関与している（５５）。このモチーフは血液凝固の調節物質、低密度リポ蛋白受容体、ＴＧＦ−β−結合蛋白および細胞の分化に関与しているＮｏｔｃｈとそのリガンドにも存在している（５６）。
【００１４】
胚性血管ＥＧＦ様リピート含有蛋白（ＥＶＥＣ）、ヒトＵＰ５０のラット相同体は、胚性血管形成の間に発現することがわかっている。胚発生の間のこの蛋白の発現は、主に形成中の動脈の血管ＳＭＣの動脈血管形成において優勢に認められている。成熟マウスにおいて、この蛋白の発現は子宮の動脈を除いてダウンレギュレーションされることがわかっている。バルーン傷害ラットのモデルにおいて、頚動脈ＥＶＥＣ発現はアップレギュレーションされた（５７）。これらの所見はＥＣ−ＳＭＣ相互作用、ＥＣＭの成熟および生育の調節におけるＵＰ５０の可能な役割を示唆している。即ちＵＰ５０は、そのインテグリン受容体を介したＥＣの付着を媒介する血管リガンドとして使用してよく、そして、血管の形成とリモデリングを促進すると考えられる新しい付着分子である。しかしながら、合成血管グラフトの内皮化を促進することのできるこのような付着因子を発現するためにＥＣを遺伝子的に修飾するという手法は試みられていない。
【００１５】
即ち、移植後の血流を支援することのできる人工血管グラフトを保有し、なおかつ従来のグラフトの上記した制約を回避することは、広範に認知された要求であり、そして極めて好都合なことである。
【００１６】
発明の開示
本発明の１つの特徴によれば、細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成の管状要素を含む人工血管グラフトが提供される。
【００１７】
本発明の別の特徴によれば、個体の血管系の少なくとも一部を置き換えるかバイパス処置する方法が提供され、その方法は、血管系と人工血管グラフトとの間に流体連絡を形成するように人工血管グラフトを個体の血管系に移植することを包含し、その人工血管グラフトは、細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成の管状要素を含む。
【００１８】
本発明の更に別の特徴によれば、人工血管グラフトを作成する方法が提供され、その方法は（ａ）細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように内皮細胞および／または平滑筋細胞を遺伝子的に形質転換すること；および（ｂ）管腔表面の十分なコーティングが得られるまで管腔表面を有する合成管状要素内部に内皮細胞および／または平滑筋細胞を播種および培養すること、を包含する。
【００１９】
後に記載する本発明の更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞の第１の部分は細胞増殖生育因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換され、そして内皮細胞および／または平滑筋細胞の第２の部分は細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換される。
【００２０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、管腔表面はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、膨張ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリエステル繊維、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（商標））、処理済動物血管またはグラフト作成において用いられる何らかの人工的骨格を有する材料よりなる群から選択される物質からなる。
【００２１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、合成管状要素は血管の内断面積に実質的に等価な内断面積のものである。
【００２２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、合成管状要素の内断面積は約７〜７００ｍｍ２の範囲である。
【００２３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞は静脈セグメント、骨髄、末梢血液前駆細胞および循環内皮細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【００２４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の平滑筋細胞はヒト伏在静脈および左内乳動脈、骨髄および末梢血液前駆細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【００２５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞は人工血管グラフトのレシピエントに由来するものである。
【００２６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞はヒトまたは動物のドナーの胚性または成熟組織に由来するものである。
【００２７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞は内管腔表面に全面生育した単層を形成する。
【００２８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞増殖生育因子少なくとも１種がＶＥＧＦ、塩基性または酸性のＦＧＦ、ＨＧＦおよび他の内皮細胞生育因子よりなる群から選択される。
【００２９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞付着因子少なくとも１種がＤＡＮＣＥ、ＵＰ５０、ビトロネクチン、アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンまたはグラフト材料への細胞の付着を促進することのできる何らかの他の分子である。
【００３０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞および／または平滑筋細胞を更に遺伝子的に形質転換してマーカーポリペプチド少なくとも１種を発現できるようにする。
【００３１】
本発明の更に別の特徴によれば、（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを包む核酸発現構築物が提供される。
【００３２】
本発明の更に別の特徴によれば、（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む第１の核酸発現構築物；および（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む第２の核酸発現構築物を含む核酸発現構築物系が提供される。
【００３３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドをコードする更に別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種を更に含む第１および第２の核酸発現構築物である。
【００３４】
本発明の更に別の特徴によれば、管少なくとも１個に係合するスタンドを含むキットが提供され、その管少なくとも１個は核酸発現構築物系を含み、その核酸発現構築物は（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の核酸発現構築物；および（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２の核酸発現構築物を含む。
【００３５】
本発明の更に別の特徴によれば、管少なくとも１個に係合するスタンドを含むキットが提供され、その管少なくとも１個は核酸発現構築物を含み、その核酸発現構築物は（ａ）細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチド；および（ｂ）細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明の更に別の特徴によれば、遺伝子的に形質転換された内皮細胞および／または平滑筋細胞を製造する方法が提供され、その方法は（ａ）哺乳類組織原材料から内皮細胞および／または平滑筋細胞を得ること；および（ｂ）細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を同時または個別に発現するように内皮細胞を形質転換することを包含する。
【００３７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つを発現することを目的とするプロモーター配列少なくとも１種を更に有する核酸発現構築物である。
【００３８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１のポリヌクレオチドセグメントは第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントはプロモーター配列少なくとも１種の単一のプロモーター配列の転写制御下にある。
【００３９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの間に介在するリンカー配列を更に有する核酸構築物である。
【００４０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【００４１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも１種は真核細胞において機能する。
【００４２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも１種は構成プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【００４３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、（ｃ）第１のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的とする第１のプロモーター配列；および、（ｄ）第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的とする第２のプロモーター配列を更に有する核酸発現構築物である。
【００４４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは構成プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【００４５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、誘導プロモーターは同じエフェクター分子により調節可能である。
【００４６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種を更に有する核酸発現構築物である。
【００４７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される。
【００４８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種は第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている。
【００４９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種はリンカーセグメントを介して第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている。
【００５０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【００５１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１種は第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に融合されている。
【００５２】
本発明の更に別の特徴によれば、細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換された形質転換内皮細胞および／または平滑筋細胞が提供される。
【００５３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチド少なくとも１種を発現するように更に遺伝子的に形質転換された、形質転換内皮細胞および／または平滑筋細胞である。
【００５４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、内皮細胞は静脈、骨髄、末梢血液前駆細胞および循環内皮細胞よりなる群から選択される原材料に由来する。
【００５５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、内皮細胞または平滑筋細胞はヒトドナーおよび動物原材料の胚性または成熟組織よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【００５６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞増殖生育因子がＶＥＧＦ、酸性および塩基性のＦＧＦ、ＨＧＦおよび何らかの別の内皮細胞生育因子よりなる群から選択される。
【００５７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞付着因子はＤＡＮＣＥ、ＵＰ５０、ビトロネクチン、アルブミン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンまたはグラフト材料への細胞の付着を促進することのできる何らかの他の分子である。
【００５８】
本発明の更に別の特徴によれば、内皮細胞および平滑筋細胞でコーティングされた管腔表面を有する合成管状要素を有する人工血管グラフトが提供され、その内皮細胞および平滑筋細胞の少なくとも１つが細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている。
【００５９】
本発明の更に別の特徴によれば、人工血管グラフトを製造するための方法が提供され、その方法は、（ａ）内皮細胞および平滑筋細胞を準備すること、ただし内皮細胞および平滑筋細胞の少なくとも１つはＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換されていること；および（ｂ）その後、または、同時に、内皮細胞および平滑筋細胞での管腔表面の十分なコーティングが得られるまで、管腔表面を有する合成管状要素内で内皮細胞および平滑筋細胞を培養すること、を包含する。
【００６０】
本発明の更に別の特徴によれば、複数の内皮細胞でコーティングされた管腔表面および複数の平滑筋細胞でコーティングされた外部表面を有する合成管状要素を有する人工血管グラフトが提供される。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様によれば、複数の内皮細胞は細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている。
【００６２】
本発明の好ましい実施態様によれば、複数の平滑筋細胞は細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている。
【００６３】
本発明は血管交換物または血管バイパスに有用なグラフトである人工血管グラフトおよびその製造方法を提供することにより、現在知られている構造の難点を明確に指摘している。
【００６４】
図面の簡単な説明
本発明は本明細書においては例示のみを目的として添付図面を参照しながら説明している。特定の参照例をここでは図面にて詳述するが、記載した特定のものは例示のため、そして、本発明の好ましい実施態様を説明的に論じるためのものであり、本発明の原理と概念的特徴の最も有用で容易に理解できる説明であると考えられるものを与えるために示している。この点に関し、本発明の基礎的理解のために必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示すことは試みてはおらず、図面と組合せた説明は、本発明の幾つかの形態をどのようにして実際に実施するかを当業者に対して明らかにするものである。
図１は本発明の人工血管グラフトの見取り図である。
図２は本発明のハイブリッド生物学的合成血管グラフトを構築する手法を示すフローチャートである。
図３ａ−ｂはＶＥＧＦ−ＧＦＰの発現のためのアデノウィルスおよびレトロウィルスの構築物を模式的に説明している（各々図３ａおよび３ｂ）。
図４ａ−ｄは尿ｐ５０蛋白（ＵＰ５０）の発現のためのウィルス発現ベクターを模式的に示している。図４ａおよび４ｂはそれぞれＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰの発現のためのアデノウィルスベクターを示し、図４ｃおよび４ｄはそれぞれＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰの発現のためのレトロウィルスベクターを示す。
図５ａ−ｂは核標的ＬａｃＺ遺伝子（図５ａ）およびＶＥＧＦと緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子の双方（図５ｂ）をコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染したヒトＥＣを播種したＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）グラフトを示す顕微鏡写真である。
図６ａ−ｂは核標的ＬａｃＺ遺伝子（図６ａ）およびＶＥＧＦと緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子の双方（図６ｂ）をコードする組み換えレトロウィルスベクターで形質導入したヒトＥＣを播種したＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）グラフトを示す顕微鏡写真である。
図７ａ−ｄはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰに感染したＥＣ（図７ａ−ｂ）およびＳＭＣ（図７ｂ−ｄ）を示す顕微鏡写真である。細胞は光学顕微鏡（図７ａおよび７ｃ）または蛍光顕微鏡（図７ｂおよび７ｄ）の何れかにより可視化した。
図８ａ−ｄはＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＥＣ（図８ａおよび８ｂ）およびＳＭＣ（図８ｃおよび８ｄ）を示す顕微鏡写真である。細胞は光学顕微鏡（図８ａおよび８ｃ）または蛍光顕微鏡（図８ｂおよび８ｄ）の何れかにより可視化した。
図９ａ−ｂはＵＰ５０を発現するようにアデノウィルスを感染させたＥＣおよびＳＭＣにおけるＵＰ５０ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である（各々図９ａおよび９ｂ）。図９ａにおけるレーンは、１．プラスミドＵＰ５０ＤＮＡの陽性対照；２．逆転写反応の陰性対照；３．ＰＣＲ反応の陰性対照；４．Ａｄ．ＧＦＰ感染ＥＣ；５．Ａｄ．ＵＰ−ＧＦＰ感染ＥＣ；６．非感染ＥＣである。図９ｂにおけるレーンは、１．プラスミドＵＰ５０ｃＤＮＡの陽性対照；２．逆転写反応の陰性対照；３．Ａｄ．ＧＦＰ感染ＳＭＣ；４．Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＳＭＣ；５．非感染ＳＭＣである。
図１０ａ−ｂはレトロウィルスにより形質導入したＥＣおよびＳＭＣにおけるＵＰ５０ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である（各々図１０ａおよび１０ｂ）。図１０ａにおけるレーンは１．レトロ−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、２．ＵＰ５０を発現するようにレトロウィルス感染させたＥＣ、３．プラスミドＵＰ５０ＤＮＡの陽性対照である。図１０ｂにおけるレーンは１．マーカー、２．非形質導入ＳＭＣ；３．レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ；４．レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣである。
図１１はＵＰ５０を発現するようにアデノウィルス感染させたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０蛋白発現のウエスタンイムノブロット分析を示す写真である。レーンは、１−対照群の非感染ＥＣ、２−Ａｄ．ＧＦＰ−感染ＥＣ、３−Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣ、４−Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ−感染ＥＣ、５−対照群の非感染ＳＭＣ、６−Ａｄ．ＧＦＰ−感染ＳＭＣ、７−Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＳＭＣ、８−Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ−感染ＳＭＣ、９−ＵＰ５０−ＧＦＰを発現する２９３−ＦＬＹＡ安定形質転換体の陽性対照である。
図１２はレトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０蛋白発現のウエスタンイムノブロット分析を示す写真である。レーンは、１−非形質導入ＥＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、３−レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、４−非形質導入ＳＭＣ、５−レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、６−レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、７−ＵＰ５０−ＧＦＰを発現する２９３−ＦＬＹＡ安定形質転換体の陽性対照である。
図１３ａ−ｄはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図１３ｂおよび１３ｄ）または対照プラスミド（図１３ａおよび１３ａ）を感染させたＥＣ（図１３ａおよび１３ｂ）およびＳＭＣ（図１３ｃおよび１３ｄ）におけるＵＰ５０の表面発現の免疫組織化学的分析を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１４ａ−ｃはＡｄ．ＵＰ５０（図１４ａ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図１４ｂおよび１４ｃ）を感染させたＥＣを示す共焦点蛍光走査顕微鏡写真である。図１４ｂ−ｃはそれぞれ細胞−細胞の接触がある場合およびない場合に生育するＥＣにおけるＵＰ５０の染色結果を示す。緑色および赤色の蛍光はそれぞれＧＦＰおよびＵＰ５０の染色を示す。
図１５はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣにより生成されたＥＣＭにおけるＵＰ５０蛋白の免疫組織化学的分析を示す蛍光顕微鏡写真である。
図１６ａ−ｂはアデノウィルス感染したＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現（それぞれ図１６ａおよび１６ｂ）のウエスタンイムノブロッテイング分析を示す。レーンは、１−Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣ、２−Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣ、３−Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＳＭＣ、４−Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋Ａｄ．Ａｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣ、５−ＵＰ５０を発現する２９３−ＦＬＹＡ安定形質転換体の陽性対照である。
図１７ａ−ｂはレトロウィルス感染したＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現（それぞれ図１７ａおよび１７ｂ）のウエスタンイムノブロッテイング分析を示す。レーンは、以下の通りである。図１７ａ：１）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣ＋レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ；２）レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＥＣ＋レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣ；３）レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、４）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、５）レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、６）ＥＣ対照群、７）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ＋レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、８）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ＋レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、９）ＳＭＣ対照群、１０）組み換えＶＥＧＦ陽性対照。図１７ｂ：１）ＳＭＣ対照群、２）レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、３）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ＋レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＥＣ、４）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ＋レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、５）レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、６）ＶＥＧＦ対照群、７）ＵＰ５０対照群。
図１８はＵＰ５０−ＧＦＰ、ＶＥＧＦ−ＧＦＰまたはＧＦＰをコードするアデノウィルスベクターを感染させたＥＣの増殖を示すヒストグラムである。
図１９ａ−ｃはレトロＧＦＰ形質導入ＥＣ（図１９ａ）およびレトロＵＰ５０−ＧＦＰで形質導入され、その後Ａｄ．ＧＦＰまたはＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰを感染させたＥＣ（それぞれ図１９ｂおよび１９ｃ）のＧＦＰ発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
図２０ａ−ｂは後にアデノウィルスベクターを感染させたレトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣにおけるＶＥＧＦとＵＰ５０蛋白の発現（それぞれ図２０ａおよび２０ｂ）のウエスタンイムノブロッティング分析を示す写真である。レーンは、１−ＵＰ５０を発現する２９３−ＦＬＹＡ安定の陽性対照、２−対照群非感染ＥＣ、３−Ａｄ．ＧＦＰ感染ＥＣ、４−Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ、５−レトロＵＰ５０−ＧＦＰで形質導入したＥＣ、６−レトロ−ＵＰ５０−ＧＦＰで形質導入し、そしてＡｄ．ＧＦＰを感染させたＥＣ、７−レトロ−ＵＰ５０−ＧＦＰで形質導入し、そしてＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰを感染させたＥＣ、Ｃ−組み換えＶＥＧＦの陽性対照である。
図２１ａ−ｈはＡｄ．ＧＦＰ（図２１ａ−ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図２１ｅ−ｈ）を感染させたＥＣであって、１００ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦの非存在下（図２１ａ、２１ｂ、２１ｅおよび２１ｆ）のもの、および、存在下（図２１ｃ、２１ｄ、２１ｇおよび２１ｈ）のものの３次元のｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成を示す光学顕微鏡（図２１ａ、２１ｃ、２１ｅおよび２１ｇ）または蛍光顕微鏡（図２１ｂ、２１ｄ、２１ｆおよび２１ｈ）の顕微鏡写真である。各実験群の代表的試験例を示す。
図２２ａ−ｈはＡｄ．ＧＦＰ（図２２ａ−ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ＋Ａｄ．ＧＦＰ（図２２ｅ−ｈ）を感染させたＥＣであって、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣとの５０％同時培養を行なわなかったもの（図２２ａ、２２ｂ、２２ｅおよび２２ｆ）および行なったもの（図２２ｃ、２２ｄ、２２ｇおよび２２ｈ）の３次元のｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成を示す光学顕微鏡（図２２ａ、２２ｃ、２２ｅおよび２２ｇ）または蛍光顕微鏡（図２２ｂ、２２ｄ、２２ｆおよび２２ｈ）の顕微鏡写真である。各実験群の代表的試験例を示す。
図２３はＡｄ．ＵＰ５０感染（赤色棒グラフ）、Ａｄ．ＧＦＰ感染（青色棒グラフ）または非感染（黄色棒グラフ）のＥＣの付着試験を示すヒストグラムである。２つの異なる実験を３連で行なったものを示している。
図２４はＵＰ５０含有ＥＣＭへのＥＣの付着を示すヒストグラムである。結果はバックグラウンド値を差し引いた補正ＯＤ値として示す。
図２５ａ−ｇは連続剪断応力に曝露したＵＰ５０過剰発現ＥＣの付着を示す。対照群非感染（図２５ａおよび２５ｂ）、レトロＧＦＰ感染（図２５ｃおよび２５ｄ）、および、レトロＵＰ５０感染（図２５ｅおよび２５ｆ）のＥＣを示す無作為選択フィールドを２４時間ロッキングの前（図２５ａ、２５ｃおよび２５ｅ）および後（図２５ｂ、２５ｄおよび２５ｆ）に示す。図２５ｈは２４時間のロッキングの後に残存していた細胞数を示すヒストグラムである。実験２の前に、各群（ＵＰ５０−ＧＦＰ、ＧＦＰ、対照群）から２ウェルづつ計数した。結果はロッキング開始前に計数された総数に対する残存細胞数の％として示す。
図２６はｉｎ　ｖｉｔｒｏの層流条件下の細胞保持を調べるために本発明で用いられる系を示す模式図である。
図２７ａ−ｄはｉｎ　ｖｉｔｒｏの層流条件下の細胞保持を調べるために本発明で用いられる系の種々の要素を示す。図２７ａは流動系を含む組織培養インキュベーターを示し、図２７ｂは圧力と流動モニターを示し、図２７ｃはデータ獲得系およびポンプを示し、そして、図２７ｄは内皮細胞播種装置を示す。
図２８ａ−ｄは層流系においてパルス層流条件に曝露されたＧＦＰ（図２８ａおよび２８ｂ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（図２８ｃおよび２８ｄ）を発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣを播種したｅＰＴＦＥ合成血管グラフトを示す蛍光顕微鏡写真である。
図２９は遺伝子的に修飾されたヒトＥＣを播種した移植ｅＰＴＦＥ合成血管グラフトを担持した露出ヒツジ大腿動脈を示す写真である。
図３０ａ−ｂは左および右の大腿動脈（それぞれ図３０ａおよび３０ｂ）におけるＰＴＦＥグラフト動脈吻合部および移植グラフトの開存性の外科的視野を示す血管造影図である。
図３１ａ−ｆはＧＦＰ（図３１ａおよび３１ｂ）、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ（図３１ｃおよび３１ｄ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（図３１ｅおよび３１ｆ）を発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣを播種したｉｎ　ｖｉｖｏの移植グラフトの管腔表面上の細胞の保持を示す蛍光顕微鏡写真である。各試験条件につき２つの代表的視野を示す。
【００６５】
発明を実施するための最良の形態
本発明は損傷を受けた、および／または閉塞した血管を交換またはバイパス処置するために利用できる人工血管グラフトおよびその作成と移植のための方法に関する。特に本発明は現在使用されている天然および合成の血管グラフトの実用的な代替品となり得るグラフトである、哺乳類内皮細胞コーティング合成血管グラフトの作成方法である。
【００６６】
本発明の原理および作用は図面および附属の説明を参照することによりより良好に理解される。
【００６７】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に理解しておくべきことは、本発明は、以下の説明に記載した、または図面に示した要素の構築および配置の詳細への適用に限定されないことである。本発明は他の実施態様も可能であり、種々の方法で実施することができる。更にまた、本明細書において使用する表現や用語は説明を目的としたものであり、限定的な意味を有さない。
【００６８】
人工グラフトは現在でも外科的バイパス処置に広範に使用されている。現在使用可能な人工血管グラフト並びに幾つかの天然の血管グラフトで問題となっている制約事項の１つは、長期間に渡る耐久性が無い点である。内皮細胞の使用は、一般的には性能を向上させ、そしてとりわけ血栓溶解活性を向上させることにより、コーティング人工グラフトの品質を大きく向上させるものの、そのようなグラフトは典型的には、コーティングされた細胞が血流によりそれに与えられる剪断力に耐えることができないことから、血流力下における細胞コーティングが消失するという難点を有している。
【００６９】
グラフトの耐久性を向上させるために種々の試みが行なわれている。米国特許５７８５９６５号はＶＥＧＦを発現するように遺伝子的に形質転換された内皮細胞を播種した人工グラフトを記載している。このような細胞は後に記載する実施例において示すとおり進歩したグラフト播種特性を示すが、ＶＥＧＦを発現する内皮細胞を播種したグラフトは血流によりそれに与えられる力に耐えることができない。
【００７０】
グラフト播種法を検討する過程において、本発明者等は、ＵＰ５０のような細胞付着因子と共にＶＥＧＦのような細胞生育因子を同時に発現する内皮細胞および／または平滑筋細胞の遺伝子的に形質転換された集団、または、一方が細胞付着因子を発現し他方が細胞生育因子を発現する遺伝子的に修飾された内皮細胞および／または平滑筋細胞の２つのサブ集団の混合物が、人工血管グラフトを播種する際に用いると好都合であることを発見した。
【００７１】
後に記載する実施例の項において示した結果から明らかな通り、グラフト播種細胞内の細胞付着因子の発現は細胞増殖を遅延させなかったのに対し、それは人工グラフト基体の管腔表面への細胞の付着は大きく増大させ、これにより血管グラフトの耐久性が大きく向上する。更にまた、実施例の項で明らかにされる通り、細胞付着因子と細胞増殖因子の同時発現により内皮細胞によるグラフト管腔表面の完全なコーティングが得られ、これによりその内部での血流により与えられる力に耐えることができるようになるのである。
【００７２】
フィブロネクチンのような細胞付着因子を取りこむように前処理されている従来の血管グラフト（３５−３７および３９）とは明らかに対照的に、グラフト播種細胞からのＵＰ５０のような細胞付着因子の発現に伴った上記のものまたは他の播種細胞からのＶＥＧＦのような細胞増殖因子の発現により、細胞−細胞および細胞−グラフトの付着が大きく改善され、これにより、グラフトの耐久性が大きく改善される。
【００７３】
更にまた、本発明の播種細胞により発現される細胞付着因子は細胞−細胞および細胞−グラフトの相互作用を目的とした細胞外マトリックスの一部を構成するため、グラフト移植後の循環系への上記因子の放出が最小限に留められる。明らかに対照的に、従来の血管グラフトで行なわれていた血管グラフト材料中への上記因子の取りこみは、移植後の循環系への上記因子の放出およびこれら因子の急速な希釈をもたらし、これにより、活性が消失する。
【００７４】
このようなグラフト可動化付着因子の放出はまた、このような因子が凝固系を活性化するため血栓症をもたらしたり、そして／または局所的炎症を誘発し、この過程は、グラフトの寿命を大きく短縮化し、患者に重篤な身体的危険をもたらす。
【００７５】
即ち、本発明の１つの特徴によれば、そして図１に特に示すとおり、人工血管グラフトが提供され、これは以降、本明細書においてはグラフト１０と称する。
【００７６】
グラフト１０は管腔表面１４を有する合成管状要素１２を含む。好ましくは、合成管状要素１２は約７〜７００ｍｍ２の内断面積を有するか、または、血管の内断面積または直径と実質的に等価な何れかの内断面積または直径を有する。
【００７７】
管腔表面１４は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリエステル繊維、ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（商標））または動物またはヒト由来の処理済血管を含む物質から作成される。
【００７８】
管腔表面１４は好ましくはその上への細胞の播種を促進／改善できるピットおよび／または突起部または何らかの他の構造のような構造を含んでいる。
【００７９】
以下および後述する実施例の項において記載する通り、管腔表面１４は内皮細胞および／または平滑筋細胞を含む複数の細胞１６でコーティングされており、その少なくとも一部は細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている。
【００８０】
或いは、管腔表面１４は細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現するように遺伝子的に形質転換されている内皮細胞および場合により平滑筋細胞でコーティングされていることができ、管状要素１２の外表面１５は形質転換された，または形質転換されていない平滑筋細胞でコーティングされていることができる。このような構造はグラフトの耐久性および許容性を実質的に改善することができる。
【００８１】
本発明の好ましい実施態様によれば、細胞増殖生育因子は例えばＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２１２２１）、酸性または塩基性のＦＧＦ（各々ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ６７２９１およびＭ２７９６８）、または、ＨＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１４０１２）であり、細胞付着因子は例えばＵＰ５０（配列番号１）、ＤＡＮＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１２１５２）、ビトロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００６３８）、アルブミン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０００４７７）、Ｉ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００１１４）、ＩＶ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１５５２４）、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０２７６１）またはラミニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００５５６０）またはグラフト材料への内皮細胞／平滑筋細胞の付着を促進することのできる何らかの他の分子である。参考文献の項の参考文献３４〜４５は本発明のグラフト１０における上記増殖生育因子および細胞付着因子の利用可能性を裏付ける証拠を示すものである。
【００８２】
好ましくは内皮細胞と平滑筋細胞の両方を用いる場合は、細胞増殖生育因子は内皮細胞に特異的なものであり、これにより平滑筋細胞の望ましくない増殖を回避することができる。
【００８３】
本発明のグラフト１０を作成するためには、管腔表面１４のコーティングが十分な程度となるまで要素１２内部に細胞１６を播種／培養する。好ましくは細胞１６は管腔表面１４上に全面培養単層が形成されるように誘導できる条件下に培養する。
【００８４】
本発明のグラフト１０の管腔表面１４をコーティングするためには幾つかの播種方法を用いることができる。
【００８５】
内皮細胞と平滑筋細胞の両方を用いる場合は、管腔表面１４の逐次的播種が好ましい。そのような場合、形質転換されたまたは形質転換されない平滑筋細胞をまず播種し、その後形質転換された内皮細胞を播種するのが好ましい。
【００８６】
或いは、グラフト１０には形質転換された平滑筋細胞を播種し、その後、身体内部に移植することにより、循環している内皮細胞を管腔表面１４にコーティング（内皮細胞化）することも可能である。
【００８７】
細胞１６は細胞増殖生育因子および細胞付着因子の両方で形質転換することができ、また或いは、このような細胞の第１の部分を細胞増殖生育因子で形質転換し、このような細胞の第２の部分を細胞付着因子で形質転換することができる。
【００８８】
本発明で用いる内皮細胞および平滑筋細胞は種々の哺乳類組織原材料から得ることができる。
【００８９】
本発明の好ましい実施態様によれば、内皮細胞は例えば静脈セグメント、骨髄前駆細胞、末梢血幹細胞または循環内皮細胞から調製される。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、平滑筋細胞は例えばヒト伏在静脈および左内乳動脈、骨髄前駆細胞および末梢血幹細胞から調製される。
【００９１】
如何なる場合においても、本発明により使用される細胞は典型的にはグラフト１０の目的とするレシピエントまたは有性生殖ドナーの組織から回収される。
【００９２】
或いは、異種の組織もまた上記細胞の調製のために使用することができるが、但し、グラフト１０の作成の前または後に細胞の拒絶反応を回避できるように手段を講じる必要がある。拒絶反応を防止または軽減するための多くの方法が当該分野で知られており、このことについては特に記載しない。
【００９３】
後述する実施例の項で更に記載する通り、細胞付着因子と共に細胞生育因子を同時発現することにより、本発明のグラフト１０の細胞１６は、従来の人工血管グラフトの管腔表面から通常は細胞を消失させていた血流力に耐えることができるようになる。
【００９４】
即ち、従来の合成グラフトとは異なり、本発明のグラフト１０は損傷を受けたまたは閉塞した血管の交換またはバイパス処置を目的とした血管の外科的処置において良好に用いることができる。このような処置において、グラフト１０は個体の血管系内に移植され、これにより血管系とグラフト１０との間に流体連絡を形成する。
【００９５】
上記した通り、本発明の方法により形質転換された内皮細胞および／または平滑筋細胞は細胞増殖生育因子少なくとも１種および細胞付着因子少なくとも１種を発現する。
【００９６】
このような因子は、発現された因子が内皮細胞／平滑筋細胞内で機能できる限り、ヒトの細胞または何らかの他の哺乳類の細胞に由来する配列によりコードされるものであることができる。
【００９７】
このような因子は細胞内に導入された外因性ポリヌクレオチド配列から発現されるか、または、このような因子は細胞により自然に発現される内因性因子であることができ、このような場合、細胞は内因性因子の過剰発現をもたらすことを目的とした配列により形質転換される。
【００９８】
本明細書においては、「過剰発現」という用語は細胞内で通常みとめられる水準を超えた発現水準を指す。過剰発現は細胞に内因性遺伝子の過剰分のコピーを導入し、これにより細胞内で発現される内因性遺伝子のコピー数を増大させることにより行なうか、または、内因性遺伝子の転写または翻訳をアップレギュレートする要素であるエンハンサー配列要素を遺伝子ノックイン法により導入することにより行なうことができる。
【００９９】
細胞を遺伝子的に形質転換するために用いられる１種以上の核酸構築物に外因性ポリヌクレオチド配列を含めることが好ましい。
【０１００】
本明細書においては、「遺伝子的に形質転換された」という表現は細胞への外因性ポリヌクレオチド配列の導入を意味する。このような配列は細胞のゲノムに組み込むことができ、またあるいは、このような外因性配列は一過性の態様で細胞の核または原形質内に存在することができる。
【０１０１】
即ち、本発明の別の特徴によれば、本発明の細胞１６を作成するために有用な核酸発現構築物が提供される。構築物には、細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントおよび細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントが含まれる。
【０１０２】
本発明のこの特徴による構築物はまた、形質転換された細胞内の第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的とする１種以上のプロモーター配列を含む。このようなプロモーターは構成的、組織特異的または誘導的なものの何れかである如何なる哺乳類の機能的プロモーターであることもできる。
【０１０３】
実施例の項で更に記載する通り、細胞増殖生育因子および細胞付着因子は好ましくは異なる時間的パターンで発現される。
【０１０４】
即ち、構築物は２種のプロモーター配列を含むが、その各々は単一のポリヌクレオチドセグメントの発現を目的としている。好ましくは、このようなプロモーターは同じエフェクター分子により調節される誘導プロモーターである。好ましくは、プロモーター配列は１つのプロモーターがエフェクター分子によりアップレギュレートされ、第２のプロモーターが同じエフェクターによりダウンレギュレートされるように選択する。
【０１０５】
適当な誘導プロモーターの例は、化学（エフェクター分子）誘導されたプロモーター、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＴｅｔ−Ｏｎ（商標）およびＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）遺伝子発現システムに利用されているプロモーター、または、剪断応力誘導プロモーター、例えば［４６−５０］に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
上記と矛盾するわけではないが、単一のプロモーター配列を本発明の構築物が利用することもできるが、だだし、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントは転写可能に連結されることが必要であり、そして、転写されたポリシストロン性メッセージの第２のセグメントの翻訳を目的とした内部リポソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が含まれていなければならない。
【０１０７】
本発明のこの特徴による構築物の２種のポリヌクレオチドセグメントはまた、翻訳可能に融合されていることもできるが、ただし、プロテアーゼ切断部位はその間に存在することが必要であり、これにより発現細胞内での２種のポリペプチドの切断および分離が可能になる。
【０１０８】
更にまた、２種のポリヌクレオチドセグメントの各々が個別の核酸構築物内に含まれ、これらを細胞に同時導入することもできる。
【０１０９】
即ち、本発明の更に別の特徴によれば、本発明の細胞１６を作成する際に有用な核酸発現構築物系が提供される。本発明のこの特徴の構築物系は細胞増殖生育因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む第１の核酸発現構築物および細胞付着因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む第２の核酸発現構築物を包含する。
【０１１０】
本発明の構築物または構築物系は好ましくは、マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子等をコードする更に別のポリヌクレオチドセグメントを含み、これにより形質転換細胞の選択および／または細胞増殖生育因子および／または細胞付着因子の発現のモニタリングが可能になる。適当なレポーター遺伝子の例は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等が挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーの例には抗生物質耐性遺伝子などが包含される。
【０１１１】
細胞増殖生育因子および／または細胞付着因子の発現をモニタリングするためには、レポーター遺伝子を因子をコードするポリヌクレオチドセグメントへの転写または翻訳融合の際に与えるか、またはこれを因子の転写を目的とするものと同一のプロモーター配列の転写制御下におくことができる。
【０１１２】
細胞増殖生育因子および／または細胞付着因子をコードするポリヌクレオチドセグメントは哺乳類細胞の形質転換のため、および、形質転換細胞内での上記因子の発現を目的とするために適する市販の発現ベクター系に連結することができる。このような市販のベクター系は、既存のプロモーターまたはエンハンサー配列の置換、複製または突然変異のため，および／または何らかの別のポリヌクレオチド配列を導入するために通常用いられている組み換え技術により容易に修飾することができる。
【０１１３】
適当な哺乳類発現ベクターには、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、Ｐｒｏｍｅｇａより入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手可能なｐＴＲＥＳ、およびこれらの誘導体が包含されるが、これらに限定されない。
【０１１４】
上記した通り、本発明の形質転換細胞はまた、内因性にコードされた因子を過剰発現することを目的とした外因性ポリヌクレオチド配列も含むことができる。
【０１１５】
即ち、本発明の更に別の特徴によれば、内因性にコードされた因子の発現をアップレギュレートする作用のある核酸構築物または構築物系が提供される。このような構築物は細胞増殖生育因子および／または細胞付着因子をコードする内因性配列に対してシス位に与えられた場合にその転写をアップレギュレートすることのできる転写調節配列を含むことができる。
【０１１６】
或いは、このような構築物は、細胞増殖生育因子および／または細胞付着因子をコードする内因性配列に対してトランス位に与えられた場合にその翻訳をアップレギュレートすることのできる翻訳調節配列をコードすることができる。
【０１１７】
標準的な遺伝子ノックイン技術を用いて内皮細胞または平滑筋細胞のゲノム内にシス作用性の転写調節配列を導入することができる。遺伝子ノックイン方法については、例えば、米国特許５４８７９９２号、５４６４７６４号、５３８７７４２号、５３６０７３５号、５３４７０７５号、５２９８４２２号、５２８８８４６号、５２２１７７８号、５１７５３８５号、５１７５３８４号、５１７５３８３号、４７３６８６６号が参照でき、またＢｕｒｋｅ　ａｎｄ　Ｏｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２５１−２７０，１９９１；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９；Ｄａｖｉｅｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１）２６９３−２６９８，１９９２；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ等、Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２（８）：１２９９−１３０２，１９９３；ＤｕｆｆおよびＬｉｎｃｏｌｎ，“Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ａ　ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ（ヒトＡＰＰ遺伝子を含むコウボ人工染色体内への病原性突然変異の挿入およびＥＳ細胞における発現）”，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ´ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（アルツハイマー病および関連疾患における研究の進歩），１９９５；Ｈｕｘｌｅｙ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：７４２−７５０　１９９１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｓ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２６１，１９９３；Ｌａｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５：２２−２９，１９９３；ＰｅａｒｓｏｎおよびＣｈｏｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：１０５７８−８２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２８１−３０１，１９９１；Ｓｃｈｅｄｌ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５８−２６１，１９９３；Ｓｔｒａｕｓｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１９０４−１９０７，１９９３，ＷＯ９４／２３０４９，ＷＯ９３／１４２００，ＷＯ９４／０６９０８およびＷＯ９４／２８１２３もまた情報を提供する。
【０１１８】
本発明の核酸構築物は、如何なる標準的な哺乳類形質転換法を用いて内皮細胞／平滑筋細胞内に導入してもよい。このような方法には、直接ＤＮＡ取りこみ法およびウィルスやリポソームを介した形質転換（例えば“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
即ち本発明は、細胞生育因子および細胞付着因子を発現する内皮細胞および／または平滑筋細胞を包含する遺伝子的に形質転換された細胞で内部をコーティングされた進歩した人工血管グラフトを提供する。細胞生育因子に加えて細胞付着因子が発現することにより、形質転換された細胞はより大きい力で人工血管グラフトの管腔表面に付着することができるようになり、これにより、移植後に人工血管グラフトの管腔表面に与えられる流動力に対してより長期間耐えるられるような耐久性のある細胞コーティングが得られる。
【０１２０】
本発明の更に別の目的、利点および新しい特徴は限定する意図のない後述する実施例を検討することにより当該技術者には自明のものである。更にまた、上記した、および、請求項に記載した、本発明の種々の実施態様および特徴の各々は後述する実施例において実験的に裏付けられる。
【０１２１】
実施例
以下の実施例と上記した説明を参照することにより、非限定的な態様で本発明を説明する。
【０１２２】
一般的に、本明細書において使用した名称および本発明において用いた実験手法は分子学、生物化学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献に十分記載されている。例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ　Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｂｅｌ等、“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ等、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ等、（ｅｄｓ）、“Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許４６６６８２８号；４６８３２０２号；４８０１５３１号；５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ　Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ（１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ　Ｃｏｌｉｇａｎ　Ｊ．Ｅ．，ｅｄ（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ等、（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇｉ　（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照することができ、そして；使用できるイムノアッセイは特許および学術文献、例えば米国特許３７９１９３２号；３８３９１５３号；３８５０７５２号；３８５０５７８号；３８５３９８７号；３８６７５１７号；３８７９２６２号；３９０１６５４号；３９３５０７４号；３９８４５３３号；３９９６３４５号；４０３４０７４号；４０９８８７６号；４８７９２１９号；５０１１７７１号および５２８１５２１号を参照でき；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｌｕｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｅｈｔｏｄｓ　Ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ等、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）が参照され；これらは全て、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。その他の一般的な参考文献は本明細書を通じて示したものである。そこに記載される手法は当該技術者のよく知るものであり、読者の便宜のために示されている。そこに含まれる情報の全ては参考により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
本発明は特定の実施態様との関連において記載したが、多くの変法は当業者の知る通りである。従って、これらの変法は全て本発明とその請求項の精神および範囲に包含されるものである。全ての公報、特許、出願および明細書に記載した受託番号で認識される配列は、個々の公報、特許、出願および明細書に記載した受託番号で認識される配列が、参考により本明細書に組み込まれるべく特定して個々に示される場合と同様の程度にまで、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。更にまた、本出願中の参考文献の引用および確認のいずれも、その参考文献が本発明の先行技術として使用できることを受け入れたものと解釈してはならない。
【０１２４】
実施例１
血管グラフトの作成方法
本発明の進歩した合成血管グラフト（図１）の利点を明らかにするために、血管細胞の遺伝子的形質転換方法を規格化し、記載された方法の実用性を証明することを目的とした実験を設計する必要があった。従って、図２に示すフローチャートは向上した耐久性を有する血管グラフトを作成する本発明の方法の能力を明らかにするために実施された実験を説明するものである。
【０１２５】
実施例２
血管細胞の遺伝子的修飾のためのウィルスベクターの構築
２種のウィルスベクターを用いて血管細胞に遺伝子を転移させた。第１のベクターは高濃度のトランスジーン発現をもたらす高効率性の組み換えアデノウィルス系である。組み換えアデノウィルス調製物はアデノ関連ベクター（ＡＡＶ）およびレンチウィルス系ベクター（２１，２２）のような他のベクターの調製物よりも複雑でないという利点を有し、そして他のウィルスベクター系と異なり、アデノウィルスベクターは、細胞分裂がトランスジーンの発現に必須でないことからグラフトの細胞播種の後に使用することができる。使用される第２のベクターはＧＡＬＶ糖蛋白でシュードタイプレトロウィルスベクターである。このようなシュードタイプベクターはヒトおよびヒツジのＥＣおよびＳＭＣ（２３）に対して高い親和性を有しており、そして、アデノウィルスベクターとは異なり、レトロウィルスベクターによる形質導入は安定なトランスジーン発現および娘細胞における遺伝子発現の伝達を可能にする。
【０１２６】
従って、以下に記載する通り血管グラフトに播種するために用いるプロ内皮化因子を過剰発現する遺伝子的に修飾された血管細胞の製造のためにウィルスベクターを調製した。
【０１２７】
材料および方法：
ＬａｃＺ遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成：細菌核標的β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するための組み換えアデノウィルスベクターを、２９３−細胞系統において、通常の原核細胞クローニングおよび相同組み換え法よりなる数段階で構築した。細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む３７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＣＭＶ即時早期プロモーターの制御下の構成的発現のためにプラスミドｐＣＡ３に挿入した。得られたプラスミドをアデノウィルスＥ１遺伝子を構成的に発現する２９３細胞内にプラスミドｐＪＭ１７を用いてコトランスフェクトした。プラスミドｐＪＭ１７はＥ３領域を除き、ウィルスのＥ１領域内のインサート（ｐＢＲＸ）を含むアデノウィルスゲノムを含んでいる。トランスフェクション後のβ−ガラクトシダーゼをコードするｐＣＡ３とｐＪＭ１７との間の相同組み換えにより、ｐＪＭ１７のＥ１領域とｐＣＡ３由来のＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ発現カセットとが置き換えられた。プラークの形成はコトランスフェクション後２〜４週間起こり、その後個々のプラークを単離し、そこからウィルス抽出液を２９３細胞の感染により増幅させた。各ウィルス保存用液の価は２９３細胞におけるプラーク試験により測定し、ウイルス価〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌを得た。トランスフェクション体によるβ−ガラクトシダーゼの発現はＸ−ｇａｌ染色により確認した。
【０１２８】
ＶＥＧＦおよびＧＰＦ遺伝子をコードする組み換えビシストロン性アデノウィルスベクターの作成：ＶＥＧＦ１６５およびＧＦＰ遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターをシャトルベクターへの通常の原核細胞クローニング、その後の２９３細胞における相同組み換えにより構築した。分泌のためのシグナル配列（Ｄｒ．Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｓｃｉｏｓ　Ｎｏｖａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡより寄贈）を含むヒトＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２１２２１）を含む６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをシャトルベクターｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰ（ＱＢＩ，Ｃａｎａｄａ）のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、これにより、シャトルベクターＣＭＶ５−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図３ａ）を作成した。発現プラスミドｐＱＢＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰはＡｄ５ゲノムの左アーム（１６％）を含んでおり、ｈＣＭＶ５インサートを含むＥ１領域における欠失を有している。シャトルベクターＣＭＶ５−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰをプラスミドｐＪＭ１７とともにＥ１遺伝子を構成的に発現する２９３細胞にコトランスフェクトした。ｐＪＭ１７プラスミドはＥ３領域を除いた、そしてウィルスのＥ１領域内のインサート（ｐＢＲＸ）を含んだアデノウィルスゲノムを含んでいる。トランスフェクション後のＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰとｐＪＭ１７の間の相同組み換えによりＥ１領域とｐＢＲＸインサートとＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ由来の発現カセットとが置き換えられた。プラークの形成はコトランスフェクション後２〜４週間起こり、その後個々のプラークを単離し、そこからウィルス抽出液を２９３細胞の感染により増幅させた。各ウィルス保存用液の価は２９３細胞におけるプラーク試験により測定し、ウイルス価〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌを得た。トランスジーンの発現は感染細胞コンディショニング培地のウエスタンイムノブロッティング分析により確認した。
【０１２９】
ヒトＶＥＧＦおよびＧＦＰをコードするシュードタイプレトロウィルスベクターの作成：ＧＦＰおよびヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子をコードした組み換えレトロウィルスベクターを２段階でプラスミドｐＬＸＳＮ（＃Ｋ１０６０−Ｂ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）にクローニングすることにより構築した。第１の段階において、ＶＥＧＦ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２１２２１）をコードする６００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（＃６０２９−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位に挿入した。第２に、ＶＥＧＦ１６５、ＩＲＥＳおよびＥＧＦＰコード配列を含む２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＭｕｎＩフラグメントをｐＬＸＳＮのＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングし、これにより、ベクターＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ１６５−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図３ｂ）を得た。レトロウィルスベクター製造のために、２９３Ｅ３のエコトロピックパッケージング細胞をＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ１６５−ＥＧＦＰで一過性にトランスフェクトした。４８時間後、Ｇ４１８耐性プロデューサー細胞の全面培養物の上澄みを採取し、濾過（０．４５μｍ）し、ＰＡ３１７両栄養性パッケージング細胞に形質導入するために使用した。形質導入されたＰＡ３１７細胞はＧ４１８選択下（３００ｍｇ／ｍｌ）に生育させ、４８時間後、上澄みを採取し、そして、ＧＡＬＶエンベロープ糖蛋白を発現するＴＥＦＬＹＧＡパッケージング細胞を形質導入するために用い、ＥＣおよびＳＭＣを高い効率で形質導入できるシュードタイプウィルスを作成した。形質導入されたＴＥＦＬＹＧＡ細胞のＧ４１８選択（４００μｇ／ｍｌ）後、個々のコロニーを採取し、ＥＧＦＰおよびＶＥＧＦ１６５の発現があるかどうかスクリーニングした。各コロニーのウィルス価はＴＥ６７１細胞形質導入により測定し、１０５〜１０６ｐｆｕ／ｍｌの範囲であることがわかった。コロニーを形成する最も高い価を選択し、新しく採取した上澄みを用いて形質導入した。
【０１３０】
ＵＰ５０遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成：ヒトＵＰ５０遺伝子（Ｙ．Ｓｈａｕｌ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより入手）を発現する組み換えアデノウィルスベクターを上記した通り構築した。ヒトＵＰ５０ｃＤＮＡ（配列番号１）を含む１３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントをプラスミドｐＣＡ３に挿入した。トランスジーン含有プラスミドｐＣＡ３を２９３細胞にプラスミドｐＪＭ１７とコトランスフェクトした。トランスフェクション後の発現プラスミドとｐＪＭ１７との間の相同組み換えによりＥ１領域とｐＣＡ３プラスミド由来の発現カセットとが置き換わり、これによりシャトルベクターＣＭＶ５−ＵＰ５０（図４ａ）が得られた。プラークの形成はコトランスフェクション後２〜４週間起こった。個々のプラークを単離し、ウィルス抽出液を２９３細胞の感染により増幅させた。ウィルス保存用液の価は〜１０１１ｐｆｕ／ｍｌであった。トランスジーンの発現は感染細胞コンディショニング培地のウエスタンイムノブロッティング分析により確認した。
【０１３１】
ＵＰ５０およびＧＦＰ遺伝子の両方をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成：ヒトＵＰ５０とＧＦＰ遺伝子を同時発現する組み換えアデノウィルスベクターをＡｄＥａｓｙプロトコルの変法により構築した（２８）。ＵＰ５０ｃＤＮＡの１３６１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントをＣＭＶプロモーターの制御下のｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶシャトルベクターのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。シャトルベクターはトランスジーンの下流の別のＣＭＶプロモーターの制御下のＧＦＰをコードしている。インサートを含むシャトルベクターをＰｍｅＩ消化により線状化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製した。コンピテントＢＪ５１８３細胞をエレクトロポレーションによりインサート含有シャトルベクターおよびｐＡｄＥａｓｙ−１と共にコトランスフェクトし、ＵＰ５０−ＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスベクター（図４ｂ）を含有する陽性クローンをＰＣＲおよび制限地図分析により選択した。組み換えアデノウィルスプラスミドをＰａｃＩ消化により線状化し、精製し、リポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，ＵＳＡ）を用いて２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション７日後、細胞障害作用が生じ、細胞の１００％がＧＦＰを発現していることがわかった。各ウィルス保存用液の価を２９３細胞における連続希釈試験により測定し、〜１０１１ｐｆｕ／ｍｌの価を得た。トランスジーンの発現は感染細胞コンディショニング培地のウエスタンイムノブロッティング分析により確認した。
【０１３２】
ＵＰ５０発現またはＵＰ５０とＥＧＦＰの同時発現のためのレトロウィルスベクターの構築：ヒトＵＰ５０遺伝子をコードする組み換えレトロウィルスベクターＬＸＳＮ−ＵＰ５０（図４ｃ）は、Ｍｏ−ＭＵＬＶ５´長末端リピート（ＬＴＲ）の制御下にプラスミドｐＬＸＳＮ（＃Ｋ１０６０−Ｂ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ部位にヒトＵＰ５０ｃＤＮＡ１３６１ｂｐＢｇｌＩＩフラグメントを挿入することにより構築した。
【０１３３】
ＵＰ５０とＥＧＦＰの両方をコードするビシストロン性の組み換えレトロウィルスベクターを２段階工程においてプラスミドｐＬＸＳＮにクローニングした。即ち、先ずｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，＃６０２９−１）から切り出した１４００ｂｐのＩＲＥＳ−ＥＧＦＰＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメントを対照プラスミドｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの構築のためにＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ−消化ｐＬＸＳＮに挿入した。第２段階ではｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ部位にヒトＵＰ５０ＥｃｏＲＩフラグメント（１３６１ｂｐ）をクローニングすることによりｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図４ｄ）を構築した。これらの構築物の遺伝子の発現はＭｏ−ＭＵＬＶ５´長末端リピート（ＬＴＲ）により制御された。
【０１３４】
ＵＰ５０をコードするシュードタイプ組み換えレトロウィルスベクターの作成：レトロウィルスベクターの製造のために、ベクターｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０−ＥＧＦＰまたはｐＬＸＳＮ−ＵＰ５０をリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，ＵＳＡ）を用いて２９３ＦＬＹＡパッケージング細胞にトランスフェクトした。４８時間後、ウィルス産生細胞の全面培養物の上澄みを採取し、濾過（０．４５μｍ）し、そして２９３ＦＬＹ１０Ａまたは２９３ＦＬＹＧＡＬＶパッケージン細胞に添加した。形質導入された細胞をＧ４１８選択下（４００μｇ／ｍｌ）に生育させ、個々のコロニーを採取し、倒立蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰ発現があるものをスクリーニングし、そして、形質導入細胞コンディショニング培地のウエスタンイムノブロッティング分析によりＵＰ５０発現があるものをスクリーニングした。各コロニーのウイルス価をＴＥ６７１細胞の形質導入を介して測定し、〜１０６ｆｆｕ／ｍｌの価が得られた。ＥＣおよびＳＭＣの形質導入のために、より高いウイルス価を有するコロニーの上澄みを新たに採取した。
【０１３５】
結果：
ウィルスベクター生産：表１に示すベクターを用いてＥＣおよびＳＭＣにＵＰ５０およびＶＥＧＦ１６５遺伝子を転移させた。図３ａ、４ａおよび４ｂは構築されたアデノウィルスＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ、ＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰ発現ベクターを示し、図３ｂ、４ｃおよび４ｄは本発明のレトロウィルスＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ、ＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰ発現構築物を示す。
【表１】
2004506418.tif 000003
【０１３６】
実施例３
人工血管グラフトに播種するために用いる血管細胞におけるプロ内皮化因子の発現
生体適合性の表面と高い長期間の開存率を有する合成グラフトが益々必要になっている。合成ＰＴＦＥグラフトの使用は材料そのものの生体適合性とその耐久性のためにより多用されるようになっている。合成グラフトの耐久性および機能はＥＣで管腔表面をコーティングすることにより向上する。このような細胞は最適な生体適合性のある表面を構成し、その血栓溶解能により血栓症から長期間保護し（１１，１２）、そして、新内膜の増殖および合成グラフトの炎症性反応を防止する（１３）。
【０１３７】
播種人工グラフトの内皮化を至適化する強力な試みはプロ内皮化因子を過剰発現する遺伝子的に修飾された血管細胞を使用することである。従って、血管グラフトの播種を加速し、播種細胞の移植後の増殖を最大限にするために血管細胞を以下に記載する通り上記因子を過剰発現するように遺伝子的に修飾し、これにより血管細胞を有する合成グラフトの管腔表面のライニングを最大とした。
【０１３８】
一次ヒト血管細胞の組織培養：
材料および方法：
以前に報告された通り（２９）、コラゲナーゼ消化によりヒト伏在静脈の５ｃｍ長の静脈セグメントからヒト伏在静脈ＥＣ（ＨＳＶＥＣ）を採取した。単離したＨＳＶＥＣを２０％プールヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｉｓｒａｅｌ）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）および０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、１００μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）および２ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（Ｎｅｕｆｅｌｄ博士より寄贈）を添加したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，ＵＳＡ）を含有するゼラチンコーティングデイッシュ上で培養した。３〜９回継代培養した細胞を集めることにより表現型の安定性を確保し、このことはｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｚｙｍｅｄ，ＵＳＡ）の免疫組織化学的検出によりモニタリングした。ヒト伏在静脈ＳＭＣ（ＨＳＶＳＭＣ）は、ヒト伏在静脈および左内乳動脈（ＨＬＳＭＣ）からの外植体発芽後成長により培養した。細胞は１０％プールヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，ＵＳＡ）中で培養した。ＳＭＣは特異的抗平滑筋α−アクチン抗体（Ｚｙｍｅｄ，ＵＳＡ）を用いた免疫組織化学的分析により同定した。
【０１３９】
細胞系統の組織培養：
パッケージング細胞系統２９３−ＦＬＹＡ、２９３−ＦＬＹ１０Ａ、２９３−ＦＬＹＧＡＬＶおよびＴＥＦＬＹＧＡ（Ｄｒ．Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ−Ｌｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手）を１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、６μｇ／ｍｌブラスチシジン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）および６μｇ／ｍｌフレオマイシン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中で生育させた。
【０１４０】
パッケージング細胞系統ＰＡ３１７、２９３Ｅ３（Ｄｒ．Ｊ．Ｅｘｅｌｒｏｄ，Ｈａｄｄａｓａ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍより入手）を１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で生育させた。
【０１４１】
組み換えアデノウィルスベクターによるＥＣおよび血管ＳＭＣの感染：
材料および方法：
内皮細胞およびＳＭＣに以下に記載の通り組み換えアデノウィルスベクターを感染させた。即ち、インフェクションの２０時間前、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，　ＵＳＡ）を予備コーティングしたプレート（４．５μｇ／ｍｌ）上に７０％全面培養の密度で播種し、完全培地（Ｍ２０）中で生育させた。インフェクション日に培地を新しい血清非含有のＭ１９９培地と交換し、組み換えウィルスを３０００（即ち、３０００ウィルス粒子／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で添加した。２０分おきに穏やかに傾斜させながら９０分間細胞を培養し、その後、ウィルス含有培地を完全培地（Ｍ２０）と交換した。感染は蛍光ＧＦＰフィルター（ＧＦＰ−ＬＰ、Ｎｉｋｏｎ）を装着した倒立蛍光顕微鏡（ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いてＧＦＰ発現を可視化することによりモニタリングした。
【０１４２】
組み換えレトロウィルスによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入：
材料および方法：
レトロウィルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入は以下の通り行なった。即ちＥＣまたはＳＭＣ（４〜９回継代）を４．５μｇ／ｍｌフィブロネクチンをコーティングしたプレート中、１０５個／３５−ｍｍウェルの密度で播種し、２４時間完全培地中で生育させた。細胞を１時間予備コンディショニングした後、培地を０．１ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ，　ＵＳＡ）を含有する血清非含有のＭ１９９培地と交換することにより、形質導入を行なった。予備コンディショニングの後、細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。ウイルス産生パッケージング細胞から新たに採取して濾過（０．４５μｍ）した上澄みと共に細胞を４時間インキュベートすることにより形質導入を行なった。インキュベーション終了時にウィルス含有培地をＭ２０培地と交換した。
【０１４３】
実施例４
ＥＣのＰＴＦＥグラフトへの播種
材料および方法：
ヒトＥＣは形質導入前２０時間に５０〜６０％全面培養の密度で播種した。細胞を前述の通りＧＦＰまたはＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウィルスで形質導入し、Ｇ４１８選択（３００μｇ／ｍｌ）後にグラフト播種に用い、均質な細胞集団を得た。フィブロネクチン　（４．５μｇ／ｍｌ）を予備コーティングしたｅＰＴＦＥグラフトに細胞を播種した（２ｘ１０５個／１ｃｍ２）。播種操作は３７℃で４時間４５回転／時間で水平回転装置中で行い、その後、播種したグラフトを２００単位／ｍｌのペニシリンおよび０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＭ１９９培地中に入れた。グラフト播種の効率は播種細胞によるＧＦＰの生産を蛍光顕微鏡で検出することにより評価した。
【０１４４】
結果：
ウィルスベクターで形質転換し合成血管グラフトに播種したヒトＥＣにおけるＬａｃＺおよびＶＥＧＦ−ＧＦＰの発現：Ａｄ．ＬａｃＺを感染させたヒトＥＣを播種したＰＴＦＥグラフトはＸ−ｇａｌ比色計試験により測定したところ、β−ガラクトシダーゼを発現していることがわかった（図５ａ）。Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰを感染させたヒトＥＣを播種したグラフトはＧＦＰ−発現細胞の蛍光顕微鏡検出により測定したところトランスジーンを発現していることがわかった（図５ｂ）。トランスジーンの発現は感染後２４時間に分析した。
【０１４５】
核標的ＬａｃＺ（Ｆ．Ｃｏｓｓｅｔ氏より寄贈）をコードするレトロウィルスベクターを感染させたヒトＥＣを播種したＰＴＦＥグラフトはＸ−ｇａｌ比色計試験により測定したところ、β−ガラクトシダーゼを発現していることがわかった（図６ａ）。レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰを感染させたヒトＥＣを播種したグラフトはＧＦＰ−発現細胞の蛍光顕微鏡検出により測定したところ、トランスジーンを発現していることがわかった（図６ｂ）。トランスジーン発現はインジェクション後２４時間に分析した。
【０１４６】
従って上記した結果は、人工グラフト上に播種した一次ヒトＥＣにおいてプロ内皮化因子ＶＥＧＦのようなトランスジーンの発現を駆動する本発明のアデノウィルスおよびレトロウィルスベクターの能力を示している。
【０１４７】
実施例５
ＶＥＧＦコードベクターによる骨髄前駆細胞の感染
材料および方法：
骨髄前駆細胞は以前に記載されているとおり採取し（１７，３０）、ＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染させた。形態学的分析およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の免疫組織化学的検出により感染細胞における分化をモニタリングした。
【０１４８】
実施例６
播種後の遺伝子発現の調節
材料および方法：
エフェクター調節可能な発現系を用いることによりＥＣにおけるＶＥＧＦおよびＵＰ５０のようなトランスジーンの発現を調節する。例えば、テトラサイクリンを用いてＶＥＧＦ発現をダウンレギュレートし、そしてＵＰ５０発現をアップレギュレートするが、このことは、テトラサイクリンによりそれぞれアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるプロモーターの調節制御下にこれらの蛋白を発現することにより行なう。このような系を用いると、播種された細胞は細胞の増殖が必要である第１週にはＶＥＧＦのような１種の蛋白を発現するが、術後１週間のテトラサイクリンの使用によりＶＥＧＦ発現がダウンレギュレートされ、ＵＰ５０発現がアップレギュレートされるために、グラフトへの細胞の付着が促進されるのである（３１）。
【０１４９】
組み換え蛋白発現の分析：ＶＥＧＦ蛋白の濃度は播種グラフトがコンディショニングされた上澄みにおいて２４時間に渡りＥＬＩＳＡにより調べる。同様の方法を用いてＵＰ５０蛋白の濃度も測定する。
【０１５０】
実施例７
内皮細胞の定量的形態測定
材料および方法：
インキュベーション期間の終了時、グラフトを長手方向に切開し、蛍光顕微鏡下に観察し、写真撮影し、画像を画像分析システム（Ｉｍａｇｅ　ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ，Ｍｅｄｉａ　ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ＵＳＡ）で処理する。
【０１５１】
実施例８
ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの測定
材料および方法：
ｔ−ＰＡの濃度および活性を播種グラフトより採取した上澄み中で測定する。ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの濃度はＥＬＩＳＡで測定し、ｔ−ＰＡの活性は前に記載された通り測定する（３２）。
【０１５２】
実施例９
グラフトからの細胞の回収
材料および方法：
ＥＤＴＡ−トリプシン消化によりＰＴＦＥグラフトから細胞を回収する。細胞は消化後に計数し、フィブロネクチンを予備コーティングした組織培養ディッシュに再度プレーティングし、生存性を調べる。プレーティングから全面培養時までの時間を記録する。シュードタイプレトロウィルスベクターで形質導入された細胞において、ＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現をＥＬＩＳＡおよび本明細書に記載した種々の方法でモニタリングする。
【０１５３】
実施例１０
遺伝子的に修飾された血管細胞におけるトランスジーンの発現の検出
材料および方法：
ＵＰ５０ｍＲＮＡ転写のＲＴ−ＰＣＲ分析：ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ　ＲＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いてＵＰ５０をコードするアデノウィルスおよびレトロウィルスベクターによる形質転換後４８時間にＥＣおよびＳＭＣから総ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度から計算した。
【０１５４】
ｃＤＮＡ合成のために、１μｇのＲＮＡを５００ｎｇのランダムへキサマーと混合し、混合物を１０分間７０℃で加熱し、その後、氷上で冷却した。０．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５単位のＡＭＶ−逆転写酵素（ＲＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ｍＭ　ＤＴＴ、３２単位のＲＮＡｓｅ−ｏｕｔ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）およびＲＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する反応混合物を予備加熱したＲＮＡに添加した。反応混合物を３８℃で２時間、次いで９５℃で１５分間インキュベートした。ＰＣＲ反応は５０μｌの容量で、７μｌのＲＴ反応混合物、２０ｐｍｏｌｅのセンスプライマー：５´−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＡＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＣＴＣ−３´（配列番号２）および２０ｐｍｏｌｅのアンチセンスプライマー：５´−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＧ−３´（配列番号３）、２４０ｍｍｏｌのｄＮＴＰ、１ＵのＥｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）および製造元より提供された反応緩衝液を用いて行なった。ＰＣＲ反応は２分間９４℃でインキュベートし、その後９４℃／３０秒→５０℃／３０秒→７２℃／６０秒を１０サイクル反復することにより行なった。その後、９４℃／３０秒→６０℃／３０秒→７２℃／６０秒＋５秒／サイクル→７２℃／１０分間を２１サイクル反復した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル中の電気泳動により分析した。
【０１５５】
ＵＰ５０およびＶＥＧＦ蛋白の発現のウエスタンイムノブロット分析：アデノウィルスまたはレトロウィルスで形質転換されたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０およびＶＥＧＦの発現を形質転換細胞コンディショニング培地中のウエスタンイムノブロッティング分析により検出した。培地は形質転換後２４時間に血清非含有の培地と交換し、更に２４時間細胞を培養した。形質転換細胞コンディショニング培地（ＣＭ）の試料（３０μＬ）を還元条件下１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分離した。分離した蛋白をニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）。穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベーションブロッキング溶液（０．１％スキムミルクおよび０．３％ツイーン２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ））によりブロックした。その後、ブロットを２時間室温でブロッキング溶液中に希釈した一次抗体とともにインキュベートした。アフィニティー精製したポリクローナルウサギ抗ＵＰ５０抗体（＃９８５５、特注品、Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）（１：５０００）をＵＰ５０の検出のために用い、そしてポリクローナルウサギ抗ＶＥＧＦ１６５抗体（＃ＳＣ１５２、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）（１：７００）をＶＥＧＦの検出のために使用した。
【０１５６】
一次抗体とインキュベートした後、ブロットを３回ＴＢＳＴで洗浄し、室温で１時間ＴＢＳＴで希釈した抗ウサギパーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）でブロットを展開し、Ｘ線フィルムに曝露することにより特異的蛋白を可視化した。
【０１５７】
ＵＰ５０発現の免疫組織化学的分析：アデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣをフィブロネクチン（４．５μｇ／ｍｌ）で予備コーティングしたチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，ＵＳＡ）上に播種し、２４時間培養した。アデノウィルス感染４８時間後、４％パラホルムアルデヒド中で２０分間室温でインキュベートし、その後、２回ＰＢＳで洗浄することにより細胞を固定した。次に１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中で５分間電子レンジ中でスライドを加熱することにより細胞を変性した。Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｅｄ，ＵＳＡ）に添付されていたブロッキング溶液を用いて、製造元の指示に従って試料をブロッキングした。ブロッキング後、細胞を室温で１時間、アフィニティー精製抗ＵＰ５０（１：５０）と共にインキュベートした。試料をＰＢＳ−Ｔ（０．３％ツイーン２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、１時間ＰＢＳ−Ｔ中１：４００に希釈したローダミンコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（＃ＳＣ　２０９１，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、搭載用培地（Ｈ−１０００，Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）で被覆した。次に細胞中のＧＦＰおよびローダミンを蛍光走査共焦点（ＭＲＣ−１０２４，ＢｉｏＲａｄ）顕微鏡検出により可視化した。
【０１５８】
ＥＣＭ中のＵＰ５０の免疫組織化学的分析のために、ＵＰ５０遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染させた内皮細胞を生育培地中にデキストランを添加することによりＥＣＭを生成するように誘導した。２０ｍＭ　ＮＨ４ＯＨ溶液を用いてＥＣ層を裸出させた後、ＥＣＭを抗ＵＰ５０抗体を用いたローダミン系免疫染色に付した。
【０１５９】
結果
ＥＣおよびＳＭＣにおけるＵＰ５０発現の分析：ＵＰ５０−ＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスによるＥＣおよびＳＭＣの感染により、ＧＦＰの可視化による測定では、トランスジーンの発現が認められた（それぞれ図７ｂおよび７ｄ）。ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウィルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入もまたＧＦＰ蛋白の生産をもたらした（図８ｂおよび８ｄ）。
【０１６０】
ＵＰ５０　ｍＲＮＡの転写はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図９ａおよび９ｂ）において、そして、ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするレトロウィルスベクターで遺伝子的に修飾されたＥＣおよびＳＭＣに（それぞれ図１０ａおよび１０ｂ）おいてＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
【０１６１】
ＵＰ５０蛋白（６０ｋＤ）の発現はＵＰ５０−ＧＦＰをコードするアデノウィルス（図１１）およびレトロウィルス（図１２）のベクターによるＥＣおよびＳＭＣの感染後にウエスタンイムノブロッティング分析により検出した。
【０１６２】
ＵＰ５０蛋白は免疫組織化学的に測定したところＡｄ．ＵＰ５０−感染ＥＣおよびＳＭＣ中において検出された（それぞれ図１３ｂおよび１３ｄ）。原形質の染色はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染細胞では検出されたが、Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞では染色はみとめられず、ＵＰ５０の高水準の原形質発現が明らかになった。
【０１６３】
共焦点顕微鏡観察を用いて感染ＥＣ中のＵＰ５０の細胞下レベルの局在を分析した。ＵＰ５０の発現はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染内皮細胞においては原型質中および細胞膜（図１４ｂおよび１４ｃ）に検出され、そして全面培養細胞中のフィラメント様の構造物として認められた（図１４ｂ）。非全面培養細胞におけるＵＰ５０の原形質フィラメント様発現は、ＵＰ５０が細胞骨格に結合しており、細胞−細胞または細胞−ＥＣＭの相互作用において機能を有することを示唆している。
【０１６４】
ＵＰ５０−ＧＦＰをコードするアデノウィルスベクターに感染したＥＣにより生産されたＥＣＭ中のＵＰ５０蛋白の存在を、免疫組織化学的分析により検出した（図１５）。
【０１６５】
従って、上記した結果によれば、本発明のレトロウィルスおよびアデノウィルス発現ベクターは血管細胞において細胞付着因子ＵＰ５０の発現を誘導することができることがわかる。従ってこのような構造物を発現するＥＣおよびＳＭＣを使用してＵＰ５０を発現する血管細胞はそれを播種すれば進歩した合成血管グラフトを作成できる能力を有することを明らかにするための機能的分析を行なった。
【０１６６】
実施例１１
アデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＵＰ５０およびＶＥＧＦ蛋白の発現
材料および方法：アデノウィルス感染ＥＣの同時培養物およびアデノウィルス感染ＥＣとＳＭＣの混合培養物を血清添加培地中での感染後２４時間培養し、更に血清非含有培地中で更に２４時間培養した。上澄みの蛋白を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離し、分離した蛋白をニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。ブロットを抗ＶＥＧＦまたは抗ＵＰ５０抗体と共にインキュベートした。パーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体への曝露の後、ブロットをＥＣＬ試薬で展開し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１６７】
結果：
Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染物およびＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染したＥＣまたはＳＭＣの何れかの同時培養により、同じ濃度のＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現がみとめられた（それぞれ図１６ａおよび１６ｂ）。
【０１６８】
これらの結果によれば、本発明の方法はＥＣの有糸分裂促進物質であるＶＥＧＦとＥＣの付着因子であるＵＰ５０を同時生産し、更にまた、遺伝子的に修飾されたＥＣおよびＳＭＣの同時培養によりこれらの蛋白を生産する能力を有することがわかった。従って、本発明は内皮細胞を人工血管グラフトに播種する進歩した方法を提供する。
【０１６９】
レトロウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０蛋白発現のウエスタンイムノブロッティング分析
材料および方法：種々のレトロウィルスにより感染させたＥＣの同時培養物または感染ＥＣおよびＳＭＣの混合培養物を感染後２４時間血清添加培地中で培養し、その後細胞を血清非含有培地中で更に２４時間培養した。生育培地の試料（３０μＬ）を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロットは抗ＶＥＧＦまたは抗ＵＰ５０抗体の何れかと共にインキュベートした。パーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体に曝露した後、ブロットをＥＣＬ試薬で展開し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１７０】
結果：
ＵＰ５０およびＶＥＧＦを発現するようにそれぞれレトロウィルスを感染させたＳＭＣおよびＥＣの同時培養物の分析によれば、ウエスタンイムノブロッテイング分析で測定したところ、ＶＥＧＦとＵＰ５０蛋白の同時発現が認められた（図１７ａおよび１７ｂ）。
【０１７１】
従って、これらの結果およびアデノウィルスベクターを用いた場合の上記した結果は、本発明のウィルス発現ベクターはＶＥＧＦとＵＰ５０蛋白の発現を効率的に駆動することができることを示している。これらの結果は更に、レトロウィルスまたはアデノウィルスベクターの何れかで遺伝子的に修飾した血管細胞の同時培養においてＶＥＧＦとＵＰ５０の両方が過剰発現できることも示している。即ち、本発明のアデノウィルスおよびレトロウィルス発現ベクターの使用および有糸分裂促進物質と付着誘発分子の両方を発現する遺伝子的に修飾した血管細胞の混合培養物の使用は、長期の耐久性と開存性を有する合成血管グラフトの製造のために極めて適している。
【０１７２】
実施例１２
血管細胞における過剰発現された組み換えＶＥＧＦおよびＵＰ５０の機能的分析　ＥＣの増殖試験：
材料および方法：
内皮細胞（５〜１１回継代）をアデノウィルス感染の２４時間前に４．５μｇ／ｍｌのフィブロネクチンで予備コーティングした２４穴のプレートに３０％全面培養（１０４個／ウェル）の密度で播種した。細胞をＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ、Ａｄ．ＧＦＰまたはＡｄ．ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰに感染させた。３７℃でアデノウィルスベクターに９０分間曝露した後、血清含有培地を添加し、１６−１８時間後、培地を２％ヒト血清および２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＭ１９９培地と交換した。試験は３連で行ない、増殖は感染後７日目にＸＴＴ比色分析により測定した。
【０１７３】
結果：
原形質ＧＦＰ発現により検出したところ、感染によりほぼ１００％のトランスジーン発現が起こった。結果は非感染細胞に対する相対値で示す。図１８に示すとおり、ＵＰ５０のトランスジーン過剰発現は細胞の生育速度に対して阻害作用や増殖作用は示さなかった。アデノウィルス感染群（Ａｄ．ＧＦＰ、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ）において測定した数値は非感染対照群より僅かに高値であったものの、ＵＰ５０発現の作用は有意ではなかった。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰに感染したＥＣと比較してＡｄ．ＧＦＰに感染したＥＣには有意差は無かった。Ａｄ．ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰによる感染は他の感染ＥＣ群と比較して有意な増殖をもたらした。
【０１７４】
ＵＰ５０過剰発現ＥＣにより生じたＥＣＭへのＥＣの付着：
材料および方法：
ＥＣによるＥＣＭ生成の誘導：感染２４時間前にフィブロネクチン予備コーティング４８穴プレートにＥＣを播種した（１０４個／ウェル）。細胞は前述の通り、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰに感染させた。感染後、細胞を７日間４％デキストラン４２０００（Ｓｉｇｍａ　ＵＳＡ）を添加したＭ２０培地中で生育させた。この感染期間の後、培地を感染細胞から除去し、約５分間２０ｍＭのＮＨ４ＯＨを添加することによりマトリックス生産細胞を裸出させた。細胞溶解後、ＥＣＭコーティングウェルをＰＢＳで３回洗浄し、４℃でＰＢＳ中に保存した。
【０１７５】
細胞外マトリックス付着試験は以下の通り行なった。即ち、ＥＣを１０ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液中でインキュベートすることにより脱着させ、マトリックスをＭ１９９培地で洗浄し、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰ感染または非感染のＥＣに由来するＣＭ中でそれぞれ１５分間インキュベートした。このインキュベートの後、ＥＣをＥＣＭコーティングウェルに播種した（２ｘ１０４個／ウェル）。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣにより生成されたＥＣＭ上に播種された細胞をＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染細胞由来のＣＭ中でインキュベートした。Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞により生成されたＥＣＭ上に播種された細胞をＡｄ．ＧＦＰ感染細胞から採取したＣＭと共にインキュベートし、非感染細胞により生成されたＥＣＭ上に播種された細胞の対照群は非感染細胞コンディショニング培地中でインキュベートした。細胞を更に３０分間インキュベートすることにより、細胞を付着させ、その後ＰＢＳで洗浄した。残存する付着細胞の定量はＸＴＴ比色試験により行った。
【０１７６】
レトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣの生成したＥＣＭを用いて同じ実験を行なった。
【０１７７】
細胞の生理学的特徴および同時培養物に対するＵＰ５０の影響：ＵＰ５０およびＶＥＧＦの同時発現が可能であることが仮定されている。従って、ＶＥＧＦかＵＰ５０の何れかを発現するように感染しているＥＣの同時培養物を、以下に記載する通り、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣにＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染細胞を混合した後の両蛋白の発現濃度について試験した。
【０１７８】
ＵＰ５０−ＧＦＰ，ＧＦＰをコードするレトロウィルスベクターで形質導入された内皮細胞または対照群の非形質導入細胞を４８時間インキュベートした後にアデノウィルス感染させた。感染はＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰを用いて行なった。細胞をウィルス含有培地中で２４時間インキュベートし、その後、培地を血清非含有の培地と交換し、細胞を更に２４時間インキュベートした。生育培地の試料（３０μｌ）を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、分離した蛋白をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットし、ブロットを抗ＶＥＧＦまたは抗ＵＰ５０抗体の何れかと共にインキュベートした。パーオキシダーゼコンジュゲート二次抗体に曝露した後、ブロットをＥＣＬ試薬で展開し、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１７９】
結果：
レトロウィルスおよびアデノウィルスベクターで順次遺伝子的に修飾したＥＣによるＵＰ５０とＶＥＧＦの発現の分析：ＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウィルス形質導入され、その後ＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードするアデノウィルスベクターを感染させた内皮細胞は、蛍光顕微鏡による測定によれば、ＵＰ５０−ＧＦＰのみをコードするレトロウィルスベクターを感染させた細胞と比較して、より高値のＧＦＰ発現を示した（それぞれ図１９ｂおよび１９ａ）。
【０１８０】
ＵＰ５０を発現するようにレトロウィルスで形質導入され、その後ＶＥＧＦ遺伝子をコードするアデノウィルスベクターを感染させたＥＣのウエスタンイムノブロッティング分析によれば、この細胞はＶＥＧＦとＵＰ５０蛋白を同時発現で切ることがわかった（それぞれ図２０ａおよび２０ｂ）。
【０１８１】
従ってこれらの結果はＥＣ有糸分裂促進蛋白および付着誘発蛋白である、それぞれＶＥＧＦおよびＵＰ５０の両方を同時発現するためのＥＣの逐次的なレトロウィルス形質導入とアデノウィルス感染は長期の耐久性と開存性を有する合成血管グラフトの製造に極めて適していることを示している。このようなＥＣの二重ウィルス遺伝子修飾の利用性はまた前述した通り、これにより生産されるＧＦＰの濃度の上昇によっても裏付けられる。
【０１８２】
３次元コラーゲン培養におけるＥＣの生育に対するＵＰ５０の作用−ｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成：有糸分裂促進性および前付着因子であるそれぞれＶＥＧＦおよびＵＰ５０を過剰発現するＥＣを合成血管グラフトに播種することは、長期間の耐久性および開存性を有する合成血管グラフトの作成に極めて望ましいことである。従って、ＥＣの増殖の誘導に対するこれらの因子の複合的作用を以下の通り調べた。
【０１８３】
材料および方法：コラーゲンゲルのｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成をアデノウィルス感染ＥＣスフェロイドを用いて定量した。ＥＣスフェロイドの作成は前に報告されている通り行なった（３３）。内皮細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースを含有する培地に懸濁し、３７℃５％ＣＯ２の条件下２４時間、非組織培養処理丸底９６穴プレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で培養し、その間、懸濁した細胞は所定の大きさと細胞数のウェル当たり単一のスフェロイドを形成した（〜７５０個／スフェロイド）。次に発生したスフェロイドをコラーゲンゲルに包埋した。使用に先だって、８容量の酸性ラット尾部コラーゲン抽出液（２ｍｇ／ｍｌで平衡化、４℃）、１容量の１０ｘＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，ＵＳＡ）を混合することによりコラーゲンの保存溶液を予め調製した。０．３４Ｎ　ＮａＯＨを添加することによりｐＨを７．４に調節した。コラーゲンゲルの重合前にスフェロイドが沈降することを防止するために、コラーゲン保存溶液１容量を４０％ヒト血清および０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース含有室温Ｍ１９９培地１容量と混合した。スフェロイド含有ゲル（２０〜３０スフェロイド／ゲル）を急速に予備加温した２４穴プレートに移し、重合させた。ゲルを５％ＣＯ２条件下３７℃でインキュベートし、ゲル中のＥＣの増殖をデジタルビデオカメラ（ＤＸＭ１２００　Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて写真顕微鏡観察により測定した。各群から少なくとも４０スフェロイドの発芽を分析した。
【０１８４】
結果：
Ａｄ．ＧＦＰまたはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰを感染させたＥＣのスフェロイド（それぞれ図２１ｂおよび２１ｆ）は低いベースライン発芽活性を有していたが、これは外因性ＶＥＧＦの添加により強く促進された（それぞれ図２１ｄおよび２１ｈ）。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣのスフェロイド（図２１ｆ）はＡｄ．ＧＦＰ感染ＥＣよりも高いベースライン発芽活性を有することがわかった（図２１ｂ）。
【０１８５】
Ａｄ．ＧＦＰおよびＡｄ．ＧＦＰ＋Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣのスフェロイド（それぞれ図２２ｂおよび２２ｆ）は低いベースライン発芽活性を有していたが、これはＡｄ．ＧＦＰおよびＡｄ．ＶＥＧＦ感染ＥＣとの５０％同時培養物において促進された（それぞれ図２２ｄおよび２２ｈ）。発芽最高値はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰおよびＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣの同時培養物中で観察された（図２２ｈ）。
【０１８６】
従って、ＵＰ５０とＶＥＧＦの同時過剰発現はＶＥＧＦ単独の媒介するものと比較して、ＥＣの発芽の相乗作用的増大をもたらすと結論できる。
【０１８７】
従ってこれらの結果は、ＥＣにおけるＵＰ５０とＶＥＧＦの同時過剰発現は、このように因子を組合せて発現するＥＣは高度に増強された増殖能力を示すことから、長期間の耐久性および開存性を有する合成血管グラフトの製造に極めて適していることを示している。
【０１８８】
実施例１３
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける合成グラフトへのＥＣの付着に対するＵＰ５０過剰発現の影響
増強された付着特性を有するＥＣを播種した合成血管グラフトは、従来技術のＥＣ播種グラフトの主要な問題点はこれらが播種された細胞を効率的に維持できない点であったことから、極めて望ましいものである。従って、ＥＣの付着性を増強するためにＥＣプロ付着因子ＵＰ５０を過剰発現することの有効性を以下に記載する通り分析した。
【０１８９】
トリプシン処理後のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養ＥＣの付着に対するＵＰ５０の過剰発現の影響：
材料および方法：
Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣの生物学的活性をトリプシン処理後の細胞保持率により調べた。内皮細胞をアデノウィルス感染２４時間前に１２穴プレートに７０〜８０％全面培養の密度（６〜７．５ｘ１０４個／ウェル）で播種した。前記したとおり細胞をＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰで感染させ（３ｘ１０３ｐｆｕ／細胞）、未感染の細胞を対照群とした。感染後、細胞を４日間Ｍ２０培地中で生育させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．００１％ＥＤＴＡ含有０．００２５％トリプシンを用いて細胞をトリプシン処理することにより付着試験を行った。室温で３分間インキュベートした後、完全培地（Ｍ２０）を添加することによりトリプシンを中和した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にＭ２０（３００μＬ）培地を細胞に添加した。残存する付着細胞の定量は、対照群の非トリプシン処理細胞の％として、比色ＸＴＴ試験により行なった。
【０１９０】
結果：
組み換えアデノウィルス感染後のＵＰ５０の発現はＡｄ．ＧＦＰ感染細胞（４０％）または対照群の非感染細胞（２０％）と比較して細胞保持を有意に増大させた（６０％）（図２３）。
【０１９１】
ＥＣＭへの細胞の付着に対するＵＰ５０の過剰発現の影響
材料および方法：
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液でＥＣを脱着させ、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含有するＭ１９９培地で洗浄し、Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰ感染または非感染のＥＣ由来のＣＭと共にそれぞれ１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＥＣＭコーティングウェルに播種した（２ｘ１０４個／ウェル）。Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣの生成したＥＣＭ上に播種した細胞はＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染細胞由来のＣＭ中でインキュベートした。Ａｄ．ＧＦＰ感染細胞の生成したＥＣＭ上に播種した細胞はＡｄ．ＧＦＰ感染細胞から採取したＣＭとともにインキュベートし、非感染細胞の生成したＥＣＭ上に播種した対照群は非感染細胞コンディショニング培地とともにインキュベートした。細胞を更に３０分間インキュベートして付着させ、その後ＰＢＳで洗浄した。残存する付着細胞の定量は比色ＸＴＴ試験により行なった。
【０１９２】
結果：
以前に示した分泌ＵＰ５０およびＥＣＭ結合ＵＰ５０への曝露（図１５）により、対照群と比較してＥＣの付着は３０％より大きい増大がもたらされた（図２４）。
【０１９３】
連続剪断応力下のＥＣの保持に対するＵＰ５０過剰発現の影響：ＥＣに対するＵＰ５０の付着促進活性を、以下に記載する通り、振動テーブル上の連続剪断応力誘発振とう培養皿における細胞の保持により調べた。
【０１９４】
材料および方法：
ヒト伏在静脈ＥＣ（８〜１１回継代）をＭ２０に播種（１０５個／３５ｍｍウェル）し、６０〜８０％全面培養となるまで生育させた。細胞を前述の通りＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＡｄ．ＧＦＰに感染させ（ＭＯＩ３０００）、非感染細胞を対照群とした。細胞を更に３０時間生育させることにより、剪断応力への曝露の前にトランスジーンが発現されるようにした。実験の前に各群（Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ、Ａｄ．ＧＦＰ、対照群）から２ウェルをトリプシンＥＤＴＡで回収し、細胞を計数した。振動中に細胞を完全に被覆できるように、各ウェルにＭ２０培地を５ｍｌづつ添加した。プレートをＣＯ２インキュベーター内の振動テーブル上におき、強力な振動（約１４０サイクル／分）のもとに２０〜２４時間インキュベートした。振動後、細胞をＰＢＳで５回洗浄した。細胞をトリプシンＥＤＴＡで回収し、血球計で計数した。それぞれレトロウィルスベクターで形質導入した細胞を用いて試験を平行して行った。
【０１９５】
結果：
図２５ａ−ｇ（形態測定）および図２５ｈ（細胞計数）に示した結果によれば、レトロウィルス形質導入によるＵＰ５０過剰発現は連続剪断応力に曝露したＥＣの付着性を増大させた。ＵＰ５０発現細胞のうち、細胞の９８％がＧＦＰ発現（７２％±１％）および非形質導入ＥＣ（６９±２％）とは対照的にプレートに付着して残存していた。同様の結果はＵＰ５０発現のためにアデノウィルス感染させたＥＣにおいても観察された（データ示さず）。
【０１９６】
実施例１４
流動条件に曝露した場合の合成血管グラフトに播種された遺伝子的に修飾された血管細胞の付着
長期間の耐久性と開存性を有するグラフトを得るためにＥＣ有糸分裂促進因子を発現するように遺伝子的に修飾された血管細胞を合成血管グラフトに播種することができる。本発明によれば、長期の耐久性と開存性が更に向上した血管グラフトを得るためにＥＣ付着促進因子を用いて血管グラフトの播種を行なう。即ち、このような細胞のグラフトへの播種およびパルス流動条件下のその試験は以下の通り実施した。
【０１９７】
パルス流動下のｅＰＴＦＥグラフト上のヒトＥＣの保持
材料および方法：
グラフトへの播種：ＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣをフィブロネクチン（４．５ｍｇ／ｍｌ）フィブロネクチン予備コーティングしたｅＰＴＦＥグラフトに播種（２ｘ１０５個／１ｃｍ２）した。播種の操作は４５回転／時間で回転する水平回転装置中４時間３７℃で行った。次に播種したグラフトを抗生物質を添加したＭ１９９培地中２０時間培養した。
【０１９８】
流動装置の説明：図２６に模式的に示す流動システムはパルス血流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　ａｐｐａｒａｔｕｓ，＃１４２１，ＵＳＡ）、フレキシブルタイゴンチューブ、補助タンクおよび合成グラフトより成り、その形態は図２７に示すとおりである。システム圧力は圧力モニター（＃７４２　Ｍｅｎｎｅｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてモニタリングした。グラフトを通過する流動はＤｏｐｐｌｅｒ系流動システム（＃Ｔ１０６　Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてモニタリングした。流動および圧力の両方をモニタリングし、オンラインで記録した。圧力と流動のデータは、グラフト内部の剪断力計算値をオンライン提示するデータ獲得システムで分析した。流動のために使用したｅＰＴＦＥグラフトは長さ５〜１２ｃｍ、直径６ｍｍのものであった（ＧＯＲＥ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）。
【０１９９】
流動条件：播種したグラフトを層流流動条件下に曝露した。６０ポンプストローク／分としながら流量１５０〜２００ｍｌ／分で４５分間１２０／７５（平均９０ｍｍＨｇ）の生理学的血圧となるように流動を調節した。顕微鏡観察および形態測定分析によりグラフトを評価した。実験の第２段階では、グラフトを合計３０分間種々の流動条件下に曝露した。流動条件への曝露の後、グラフトを長手方向に切開し、管腔表面の無作為に選択した視野を蛍光顕微鏡で観察する事によりＧＦＰ発現細胞数の保持を評価した。
【０２００】
結果：
パルス層流流動条件下に曝露する前のレトロＧＦＰおよびレトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入細胞（それぞれ図２８ａおよび２８ｂ）の蛍光顕微鏡観察ではほぼ完全なグラフトの被覆が観察されたが、パルス層流流動条件下に曝露した後はＵＰ５０−ＧＦＰを発現する様にレトロウィルス形質導入されたＥＣをコーティングしたグラフトは、同じ流動条件に曝露されたＧＦＰを発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣでコーティングされたグラフトと比較して、より高値の細胞保持を示した（それぞれ図２８ｂおよび２８ｄ）。
【０２０１】
ＵＰ５０遺伝子転移後の細胞付着の向上が上記の通りみとめられたことは、流動条件下の細胞の被覆を向上させるためにＵＰ５０を過剰発現する細胞を播種されたグラフトを用いる本発明の方法を肯定するものである。
【０２０２】
実施例１５
ｉｎ　ｖｉｖｏの流動条件下の人工血管グラフトに播種した遺伝子的に修飾されたＥＣの保持
ヒツジ動脈における遺伝子的に修飾されたヒトＥＣでコーティングされたｅＰＴＦＥグラフトの短期移植：合成血管グラフトへ播種されたプロ内皮化因子を発現するように遺伝子的に修飾されたヒトＥＣの付着を試験するための現実的モデルとして、このような因子を過剰発現するヒトＥＣを播種したグラフトを以下に記載する通りヒツジ動脈においてｉｎ　ｖｉｖｏで試験した。
【０２０３】
材料および方法：
移植前３６時間にＧＦＰ、ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰを過剰発現するようにレトロウィルス形質導入により遺伝子的に修飾したヒトＥＣを小径のｅＰＴＦＥグラフト（６ｍｍ）に播種した。
【０２０４】
絶食（１２時間）成熟ヒツジに１０ｍｇのジアゼパムの筋肉内注射および５００〜６００ｍｇのナトリウムペントバルビタールの静脈内投与によりにより予備投薬し、挿管した。１％〜２％のイソフルラン吸入により麻酔を維持した。アスピリン（６００ｍｇ）を術前投与した。実験中のモニタリングシステムは血圧測定、パルス酸素測定、およびＥＣＧを含むものとした。曝露後の全身抗凝固処置およびグラフト移植のための動脈の準備のため、ヘパリン（３００Ｕ／ｋｇ）を静脈内注射した。処置中３０分おきに血液を採取し、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を測定することによりヘパリン投与の有効性を調べた。
【０２０５】
播種したグラフトは図２９に示すとおり熟練した心臓外科医によりヒツジの大腿動脈内に近位および遠位に端部と側面を接触させて移植した。グラフトを２時間血流に曝露した後に回収した。
【０２０６】
次に播種したグラフトをヒツジ大腿動脈内に端部と側面を接触させて両側性に移植した。大腿動脈の片側には、移植グラフトはレトロＧＦＰ形質導入ＥＣを播種したものであり、もう一方の側には、移植グラフトはレトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣを播種したものとした（大腿動脈）。一方の大腿動脈では、移植グラフトはレトロＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ形質導入ＥＣを播種したものであり、もう一方の側には移植グラフトはレトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣを播種したものとした。移植したグラフトの開存性は血流への移植グラフトの曝露の３０分後およびグラフト採取前に、直接触診により、Ｄｏｐｐｌｅｒ流動計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いた流量測定、および選択的血管造影術を行なう事により評価した（図３０）。
【０２０７】
大腿動脈グラフトを通る流速は左右で同様であった（〜５０ｍｌ／分、大腿血流の３８％）。実験開始時には高値であった大動脈グラフトを通過する流量は吻合部位における局所的血栓症（外科的合併症に二次的なもの）のため２時間の終了時には両側性に消失していた。大腿動脈および大動脈のグラフトを移植２時間後に回収した。次に両グラフトを回収し、グラフトの管腔表面上の細胞の保持を蛍光顕微鏡観察により分析した。
【０２０８】
グラフト除去後、ヒツジは静脈内塩化カリウム投与により屠殺した。
【０２０９】
全ての実験はＩｓｒａｅｌ，　ＨａｉｆａのＴｅｃｈｎｉｏｎ　ＩＴＴの動物取扱実験規則に従って実施した。
【０２１０】
結果：
ＵＰ５０−ＧＦＰまたはＶＥＧＦ−ＧＦＰの何れかを過剰発現する細胞を播種したグラフトは、ＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡可視化によれば、ＧＦＰのみを過剰発現する細胞と比較した場合、ｉｎ　ｖｉｖｏ血流への曝露後のグラフトに付着している細胞数が明らかに高値であった（図３１）。ＵＰ５０を過剰発現する細胞を播種したグラフトはＧＦＰまたはＶＥＧＦを過剰発現する細胞を播種したグラフトよりの付着細胞数が高値であった。
【０２１１】
これらの結果は、前述の通り静的または流動条件下の何れかで行なったｉｎ　ｖｉｔｒｏの付着試験で得られた結果と組み合わせると、結果として、ＥＣ付着誘発因子ＵＰ５０を過剰発現する様にＥＣを遺伝子的に修飾することはこれらの細胞の付着を大きく向上させる事を証明している。従って、合成血管グラフトに播種するためにこのような遺伝子的に修飾された細胞を用いることは長期間の耐久性と開存性を有するグラフトを作成するために極めて好ましい。
【０２１２】
ヒツジにおける遺伝子的に修飾された自家ＥＣを播種した人工血管グラフトの長期間移植：
材料および方法：
ドナーヒツジの後肢の短静脈セグメントから採取した内皮細胞を実験室で培養し、ウィルスベクターで遺伝子的に修飾する。遺伝子的に修飾した細胞をグラフトに播種しこれらを自家ドナーヒツジの大腿動脈内に近位および遠位に端部と端部を接触させて移植する。遺伝子的に修飾した細胞を播種したグラフトを大腿動脈の片側に移植し、マーカー遺伝子のみを発現する細胞を播種したグラフトを大腿動脈のもう一方の側に移植する。短期間および長期間の実験（３、７、３０日間）を行なうことにより細胞の付着および局所的な血栓症および炎症を検出できるようにする。長期間のグラフトの耐久性および開存性はＤｏｐｐｌｅｒ流量計（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて流量を外部から測定する事により７日、３０日および１８０日に測定する（ＶＥＧＦにつきｎ＝５、ＵＰ５０につきｎ＝５）。フォローアップ期間終了時に、グラフトを回収し、断面の形態学的測定により新内膜形成について調べ、播種細胞の付着性はマーカー遺伝子の発現の検出により試験する。
【０２１３】
本発明は特定の実施態様との関連において記載したが、多くの変法は当業者の知る通りである。従ってこれらの変法は全て本発明とその請求項の精神および範囲に包含されるものである。全ての公報、特許、出願およびそこに開示される。そして／または明細書に記載したＧｅｎｂａｎｋ受託番号で認識される配列は、個々の公報、特許、出願または配列が、参考により本明細書に組み込まれるべく特定して個々に示される場合と同様の程度にまで、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。更にまた本出願中の参考文献の引用および確認のいずれも、その参考文献が本発明の先行技術として使用できることを受け入れたものと解釈してはならない。
【参考文献】
2004506418.tif 000004
2004506418.tif 000005
2004506418.tif 000006
2004506418.tif 000007
2004506418.tif 000008
2004506418.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の人工血管グラフトの見取り図である。
【図２】
本発明のハイブリッド生物学的合成血管グラフトを構築する手法を示すフローチャートである。
【図３】
ＶＥＧＦ−ＧＦＰの発現のためのアデノウィルスおよびレトロウィルスの構築物を模式的に説明している（各々図３ａおよび３ｂ）。
【図４】
尿ｐ５０蛋白（ＵＰ５０）の発現のためのウィルス発現ベクターを模式的に示している。図４ａおよび４ｂはそれぞれＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰの発現のためのアデノウィルスベクターを示し、図４ｃおよび４ｄはそれぞれＵＰ５０およびＵＰ５０−ＧＦＰの発現のためのレトロウィルスベクターを示す。
【図５】
核標的ＬａｃＺ遺伝子（図５ａ）およびＶＥＧＦと緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子の双方（図５ｂ）をコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染したヒトＥＣを播種したＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）グラフトを示す顕微鏡写真である。
【図６】
核標的ＬａｃＺ遺伝子（図６ａ）およびＶＥＧＦと緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子の双方（図６ｂ）をコードする組み換えレトロウィルスベクターで形質導入したヒトＥＣを播種したＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）グラフトを示す顕微鏡写真である。
【図７】
Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰに感染したＥＣ（図７ａ−ｂ）およびＳＭＣ（図７ｂ−ｄ）を示す顕微鏡写真である。
【図８】
ＵＰ５０−ＧＦＰを発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＥＣ（図８ａおよび８ｂ）およびＳＭＣ（図８ｃおよび８ｄ）を示す顕微鏡写真である。
【図９】
ＵＰ５０を発現するようにアデノウィルスを感染させたＥＣおよびＳＭＣにおけるＵＰ５０ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である（各々図９ａおよび９ｂ）。
【図１０】
レトロウィルスにより形質導入したＥＣおよびＳＭＣにおけるＵＰ５０ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である（各々図１０ａおよび１０ｂ）。
【図１１】
ＵＰ５０を発現するようにアデノウィルス感染させたＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０蛋白発現のウエスタンイムノブロット分析を示す写真である。
【図１２】
レトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣによるＵＰ５０蛋白発現のウエスタンイムノブロット分析を示す写真である。
【図１３】
Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図１３ｂおよび１３ｄ）または対照プラスミド（図１３ａおよび１３ａ）を感染させたＥＣ（図１３ａおよび１３ｂ）およびＳＭＣ（図１３ｃおよび１３ｄ）におけるＵＰ５０の表面発現の免疫組織化学的分析を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】
Ａｄ．ＵＰ５０（図１４ａ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図１４ｂおよび１４ｃ）を感染させたＥＣを示す共焦点蛍光走査顕微鏡写真である。
【図１５】
Ａｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ感染ＥＣにより生成されたＥＣＭにおけるＵＰ５０蛋白の免疫組織化学的分析を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】
アデノウィルス感染したＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現（それぞれ図１６ａおよび１６ｂ）のウエスタンイムノブロッテイング分析を示す。
【図１７】
レトロウィルス感染したＥＣおよびＳＭＣの同時培養によるＶＥＧＦおよびＵＰ５０の発現（それぞれ図１７ａおよび１７ｂ）のウエスタンイムノブロッテイング分析を示す。
【図１８】
ＵＰ５０−ＧＦＰ、ＶＥＧＦ−ＧＦＰまたはＧＦＰをコードするアデノウィルスベクターを感染させたＥＣの増殖を示すヒストグラムである。
【図１９】
レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ（図１９ａ）およびレトロＵＰ５０−ＧＦＰで形質導入され、その後Ａｄ．ＧＦＰまたはＡｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰを感染させたＥＣ（それぞれ図１９ｂおよび１９ｃ）のＧＦＰ発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】
後にアデノウィルスベクターを感染させたレトロＵＰ５０−ＧＦＰ形質導入ＥＣにおけるＶＥＧＦとＵＰ５０蛋白の発現（それぞれ図２０ａおよび２０ｂ）のウエスタンイムノブロッティング分析を示す写真である。
【図２１】
Ａｄ．ＧＦＰ（図２１ａ−ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ（図２１ｅ−ｈ）を感染させたＥＣであって、１００ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦの非存在下（図２１ａ、２１ｂ、２１ｅおよび２１ｆ）のもの、および、存在下（図２１ｃ、２１ｄ、２１ｇおよび２１ｈ）のものの３次元のｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成を示す光学顕微鏡（図２１ａ、２１ｃ、２１ｅおよび２１ｇ）または蛍光顕微鏡（図２１ｂ、２１ｄ、２１ｆおよび２１ｈ）の顕微鏡写真である。
【図２２】
Ａｄ．ＧＦＰ（図２２ａ−ｄ）またはＡｄ．ＵＰ５０−ＧＦＰ＋Ａｄ．ＧＦＰ（図２２ｅ−ｈ）を感染させたＥＣであって、Ａｄ．ＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣとの５０％同時培養を行なわなかったもの（図２２ａ、２２ｂ、２２ｅおよび２２ｆ）および行なったもの（図２２ｃ、２２ｄ、２２ｇおよび２２ｈ）の３次元のｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成を示す光学顕微鏡（図２２ａ、２２ｃ、２２ｅおよび２２ｇ）または蛍光顕微鏡（図２２ｂ、２２ｄ、２２ｆおよび２２ｈ）の顕微鏡写真である。
【図２３】
Ａｄ．ＵＰ５０感染（赤色棒グラフ）、Ａｄ．ＧＦＰ感染（青色棒グラフ）または非感染（黄色棒グラフ）のＥＣの付着試験を示すヒストグラムである。
【図２４】
ＵＰ５０含有ＥＣＭへのＥＣの付着を示すヒストグラムである。結果はバックグラウンド値を差し引いた補正ＯＤ値として示す。
【図２５】
連続剪断応力に曝露したＵＰ５０過剰発現ＥＣの付着を示す。対照群非感染（図２５ａおよび２５ｂ）、レトロＧＦＰ感染（図２５ｃおよび２５ｄ）、および、レトロＵＰ５０感染（図２５ｅおよび２５ｆ）のＥＣを示す無作為選択フィールドを２４時間ロッキングの前（図２５ａ、２５ｃおよび２５ｅ）および後（図２５ｂ、２５ｄおよび２５ｆ）に示す。
【図２６】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏの層流条件下の細胞保持を調べるために本発明で用いられる系を示す模式図である。
【図２７】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏの層流条件下の細胞保持を調べるために本発明で用いられる系の種々の要素を示す。図２７ａは流動系を含む組織培養インキュベーターを示し、図２７ｂは圧力と流動モニターを示し、図２７ｃはデータ獲得系およびポンプを示し、そして、図２７ｄは内皮細胞播種装置を示す。
【図２８】
層流系においてパルス層流条件に曝露されたＧＦＰ（図２８ａおよび２８ｂ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（図２８ｃおよび２８ｄ）を発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣを播種したｅＰＴＦＥ合成血管グラフトを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２９】
遺伝子的に修飾されたヒトＥＣを播種した移植ｅＰＴＦＥ合成血管グラフトを担持した露出ヒツジ大腿動脈を示す写真である。
【図３０】
左および右の大腿動脈（それぞれ図３０ａおよび３０ｂ）におけるＰＴＦＥグラフト動脈吻合部および移植グラフトの開存性の外科的視野を示す血管造影図である。
【図３１】
ＧＦＰ（図３１ａおよび３１ｂ）、ＶＥＧＦ−ＧＦＰ（図３１ｃおよび３１ｄ）またはＵＰ５０−ＧＦＰ（図３１ｅおよび３１ｆ）を発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣを播種したｉｎ　ｖｉｖｏの移植グラフトの管腔表面上の細胞の保持を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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