(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に対する医学的介入のための潜在的ターゲットとしてのヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼに関する。更に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療に有用な化合物の検出のための方法、ならびに、個人または細胞におけるＣ型肝炎ウイルス感染の検出のための方法に関する。更に、ＨＣＶ感染の治療に有効なモノ−またはポリクローナル抗体を、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療またはＣ型肝炎ウイルス生成の制御のための方法であって、前記抗体が使用され得る方法とともに開示する。
2004533822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療に有用な化合物を検出するための方法であって、
ａ）試験化合物を、ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼと接触させ；そして、
ｂ）前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ活性を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
個人におけるＣ型肝炎ウイルス感染の検出のための方法であって、
ａ）前記個人からの試料を提供し；そして、
ｂ）前記試料中のヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項３】
細胞、細胞培養物、または細胞溶解物におけるＣ型肝炎ウイルス感染の検出のための方法であって、
ａ）前記細胞、細胞培養物、または細胞溶解物を提供し；そして、
ｂ）前記細胞、細胞培養物、または細胞溶解物におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼと結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項５】
個人におけるＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病の予防および／または治療のための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項６】
細胞または細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病の予防および／または治療のための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項７】
個人におけるＣ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項８】
細胞または細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法であって、細胞または細胞培養物において、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項９】
個人におけるＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病の予防および／または治療のための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に活性化するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１０】
細胞または細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病の予防および／または治療のための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に活性化するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１１】
個人におけるＣ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に活性化するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１２】
細胞または細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法であって、細胞または細胞培養物において、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に活性化するか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１３】
薬剤は、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼと結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡと結合するオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
個人におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１６】
細胞または細胞培養物におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で細胞または細胞培養物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記薬剤は、ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡと結合するオリゴヌクレオチドである、請求項５〜８、１５、または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
個人におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を少なくとも部分的に活性化する薬剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１９】
細胞または細胞培養物におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を少なくとも部分的に活性化する薬剤を、薬学的に効果的な量で細胞または細胞培養物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２０】
個人におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼと相互作用する薬剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２１】
細胞または細胞培養物におけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼと相互作用する薬剤を、薬学的に効果的な量で細胞又は細胞培養物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２２】
個人においてＨＣＶ感染細胞を選択的に殺すための方法であって、細胞内で人工的な酸化ストレス条件をもたらし得るラジカル開始剤を、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２３】
ＨＣＶ感染細胞を選択的に殺すための方法であって、人工的な酸化ストレス条件をもたらし得るラジカル開始剤を、薬学的に効果的な量で細胞または細胞培養物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２４】
ＧＩ−ＧＰｘのダウンレギュレーションを少なくとも部分的に補うことによって、個人におけるＨＣＶ感染を予防および／または治療するための方法であって、細胞内に存在するＧＩ−ＧＰｘの機能を補助し得る酸化防止剤を少なくとも１つ、薬学的に効果的な量で個人に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２５】
ＧＩ−ＧＰｘのダウンレギュレーションを少なくとも部分的に補うことによって、細胞におけるＨＣＶ感染を予防および／または治療するための方法であって、細胞内に存在するＧＩ−ＧＰｘの機能を補助し得る酸化防止剤を少なくとも１つ、薬学的に効果的な量で細胞または細胞培養物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２６】
薬剤は、５００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有する有機化合物である小型の化学的分子、インターフェロン、アプタマー、酸化防止剤、およびラジカル開始剤、を含む群から選択される、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｃ型肝炎ウイルスおよび／またはＨＣＶ感染に関連する疾病に苦しむ個人の予防および／または治療に有用な組成物であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を阻害し得るか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を低減し得る、請求項１３、１７、または２６に記載の少なくとも１つの薬剤を含む、前記組成物。
【請求項２８】
Ｃ型肝炎ウイルスおよび／またはＨＣＶ感染に関連する疾病に苦しむ個人の予防および／または治療に有用な組成物であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を増加し得るか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を活性化もしくは刺激し得る、請求項１３、１７、または２６に記載の薬剤を少なくとも１つ含む、前記組成物。
【請求項２９】
薬学的に許容され得るキャリアー、賦形剤、および／または希釈剤を更に含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染に対する医学的介入のための潜在的ターゲットとしてのヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（human cellular protein glutathione peroxidase-gastrointestinal）に関する。更に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療に有用な化合物の検出のための方法、ならびに、個人もしくは細胞におけるＣ型肝炎ウイルス感染の検出のための方法に関する。更に、ＨＣＶ感染の治療に効果的なモノ−またはポリクローナル抗体を、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療またはＣ型肝炎ウイルス生成の制御のための方法（ここで、前記抗体の遺伝子が使用され得る）とともに開示する。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌の主な原因である。ＷＨＯは、世界人口の約３％、つまり、１億７千万人が、Ｃ型肝炎ウイルスに感染していると見積もっている。米国では、推定３９０万人のアメリカ人が、Ｃ型肝炎ウイルスに感染している（ＣＤＣファクトシート(fact sheet)、２０００年９月）。ＨＣＶに感染している人々の８０％以上が、自覚症状のないキャリアーの状態から、繰り返される肝臓の炎症および重い慢性肝臓病までの疾病状態に関連する、慢性肝炎を発症する。２０年以上の間、２０％を超える慢性的なＨＣＶ患者が、肝硬変の発症または肝細胞癌への進行の危険があると予想されている。慢性的なＣ型肝炎からの肝不全は、肝臓移植の主な指標(leading indicator)である。移植を除いて、ＣＤＣは、ＨＣＶのための医学的な労働損失コスト(medical and work-loss cost)は、年間約６億ドルであると見積もっている。ＨＣＶは、主に、血液および血液生成物によって伝染する。１９９２年中頃からの輸血用血液の日常的な(routine)スクリーニングにより、新たな輸血に関連するケースはきわめて稀になり、注射薬剤の使用が、ウイルスを取得する危険性が最も高い要因となった。効率的ではないが、性的な感染ルートもあり、感染した母親から彼女たちの子供への感染の割合は６％であり、ＨＩＶ重感染(co-infection)の場合より高い。ある割合の感染は、どのように感染したかが不明なままである。１９９０年代に発生率が顕著に低下したにもかかわらず、ＨＣＶによる死亡（米国において、現在のところ年間死亡数は推定８０００〜１０，０００）および深刻な疾病の数は、今後１０〜２０年間に３倍になると予想されている。（出典：CDCファクトシート(２０００年１２月１２日公表(accessed)); ホートン(Houghton) M. Ｃ型肝炎ウイルス(Hepatitis C Viruses). インＢＮフィールズ(In BN Fields)、ＤＭナイプ(Knipe)、ＰＭホーリー(HOWLEY) (編) フィールズ・バイロロジー(Fields Virology). 1996. リッペンコット−ラベンパブリック(Lippencott-Raven Pub.)、フィラデルフィア; ロゼンＨＲ(Rosen HR)およびグレッチ(Gretch) DR, モレキュラー・メディスン・トゥディ(Molecular Medicine Today) VOL5、393、１９９９年９月; サイエンス(Science) 285、26、July 99: ニュース・フォーカス(News Focus): ザ・サイエンティフィク・チャレンジ・オブ・ヘパティティスＣ(The scientific challenge of Hepatitis C);ウォン(WONG), JBら、Am J パブリック・ヘルス(Am J Public Health)、90、1562、2000年１０月: 米国における将来のＣ型肝炎疾病率、死亡率、およびコストの概算(Estimating future hepatitis C morbidity, mortality, and costs in the United States)）
【０００３】
Ｃ型肝炎に関するＥＡＳＬ（肝臓研究のための欧州連合（European Association for the Study of the Liver））国際合意協議（１９９９年２月２６−２８日、パリ、フランス）からの発表によれば、アルファインターフェロンとリバビリンとの併用療法は、投薬を受けたことがない(naive)患者に対して推奨される治療である。インターフェロンのみによる治療も、ＦＤＡによって承認されているが、持続応答率(sustained response rate)（ＨＣＶ  ＲＮＡが、治療終了後６ヶ月を越えて血清中で検出できないままである）は、併用療法では３５〜４５％であるのに対し、たった１５〜２０％である。インターフェロン(イントロン(Intron) A、シェリング−プロフ(Schering-Plough); ロフェロン（Roferon） A、ホフマン−ラロシェ(Hoffmann-LaRoche); ウェルフェロン(Wellferon)、グラクソ(Glaxo) ウェルカム(Wellcome); インフェルゲン(Infergen)、アムゲン(Amgen))は、１週間に３回皮下注射され、リバビリン(レベトール(Rebetol)、シェリング−プロフ(Schering-Plough))は、１週間に２回投与される経口薬である。推奨される治療期間は、ＨＣＶ遺伝型に応じて、６〜１２ヶ月である。実験形態の徐放性ペギレーテッド(pegylated)インターフェロン（ペガシス(Pegasys)、ホフマン−ラロシェ(Hoffmann-LaRoche); PEG-イントロン(Intron)、シェリング−プロフ(Schering-Plough)）は、近年の臨床的研究において、応答率の向上（リバビリンと組み合わせて４２から８２％）および適用（１週間に１回の注射）が示されている（ヘパトロジー(Hepatology) 32: 4、2のPt 2. ２０００年１０月; NEJM 343、1673. ２０００年１２月; NEJM 343、1666. ２０００年１２月）。インターフェロン治療の一般的な副作用は、例えば、疲労、筋肉痛、頭痛、吐き気、熱、体重減少、興奮性、鬱病、骨髄抑制、可逆的な脱毛、を含む。リバビリンの最も一般的な副作用は、貧血、疲労および興奮性、痒み、皮膚発疹、鼻づまり、副鼻腔炎、咳、である。２パーセント未満の患者に、単独治療および併用療法のより深刻な副作用が起こる(NIDDKインフォメーション: 慢性C型肝炎(Chronic Hepatitis C): 現在の疾病管理(Current Disease Management.) １９９９年１２月９日公表)。インターフェロンに対して禁忌を示すものは、精神病または深刻な鬱病；好中球減少および／または血小板減少；肝臓以外の臓器移植；症候性心臓病；非代償性肝硬変；制御されない発作、である。リバビリンに対する禁忌は、末期腎不全；貧血；異常血色素症；深刻な心臓病；妊娠；信頼できない避妊法、である（ＥＡＳＬ合意文書）。
【０００４】
インターフェロンの新形態ではない実験的治療は、マキサミン(Maxamine)（ヒスタミンジヒドロクロリド、マキシム・ファーマシューティカルズ(Maxim Pharmaceuticals)）であり、それは、第ＩＩＩ相研究(phase III studies)においてインターフェロンと、第ＩＩ相において、毒性の少ないリバビリン代替物として、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤であるVX-497(ベルテックス・ファーマシューティカルズ(Vertex Pharmaceuticals))と、そして、３剤併用(triple therapy)（第ＩＩ相）における第三成分として、承認されたインフルエンザ薬剤であるアマンタジン(amantadine)（エンドーラボズ(Endo Labs)と組み合わされるであろう。プロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ(helicase)阻害剤のようなＨＣＶ酵素に対する阻害剤、ならびに、リボザイムおよびアンチセンスＲＮＡ類は、臨床前の開発下にある（ベーリンガー・インゲルハイム(Boehringer Ingelheim）、リボザイム・ファーマシューティカルズ(Ribozyme Pharmaceuticals)、ベルテックス・ファーマシューティカルズ(Vertex Pharmaceuticals)、シェリング−プロフ(Schering-Plough)、ホフマン−ラロシェ(Hoffmann-LaRoche)、イムソル(Immusol)、メルク（Merck）等)。予防または治療的使用のための入手可能なワクチンはないが、いくつかの会社は、通常の、もしくはDNAワクチンまたは免疫刺激剤を開発しようとしている（例えば、チロン(Chiron)、メルク(Merck)／ビカル(Vical)、エピムン(Epimmune)、NABI、インノジェネティクス(Innogenetics）)。また、最近、HCVビリオンに対する抗体が開発され、臨床試験が開始されている（トリメラ社（Trimera Co.）、イスラエル）。
【０００５】
要約すると、慢性C型肝炎のための利用可能な治療は高価であり、ある割合の患者にしか効果的ではなく、不都合な副作用が珍しくない。
【０００６】
発明の説明
近年の研究から、細胞同士がどのように連絡し合って人体内の多数の組織の成長および維持を調整するかが明らかになった。この連絡ネットワークの重要な要素は、細胞の外からその核へのシグナルの伝達であり、それにより、特定の遺伝子が活性化されるか、または抑制される。このプロセスは、シグナル伝達(signal transduction)と呼ばれる。
【０００７】
細胞レベルでのシグナル伝達は、細胞の外側から内側へのシグナルの移動を意味する。シグナルの移動は、アセチルコリン類のレセプター分子に関連するように、単純であり得る：レセプターは、リガンド相互作用において、細胞内または細胞外へ、小さなイオンの移動の形でシグナルを通過させ得るチャンネルを構成する。これらイオン移動により、細胞の電位の変化が引き起こされ、順番に、細胞に沿ってシグナルが伝えられる。より複雑なシグナル伝達は、多くの細胞内イベントとのリガンド−レセプター相互作用の連結を含む。これらのイベントは、チロシンキナーゼおよび／またはセリン／トレオニンキナーゼによるリン酸化を含む。蛋白質のリン酸化は、酵素活性および蛋白質構造を変化させる。最終的な結果は、細胞活性の変化および応答細胞内で発現される遺伝子のプログラムの変化である。
【０００８】
シグナル伝達レセプターには、３つの一般的な種類がある：
１．血漿膜を貫通し、かつ、固有の酵素活性を有するレセプター：
固有の酵素活性を有するレセプターは、チロシンキナーゼ（例えば、PDGF、インシュリン、EGFおよびFGFレセプター）、チロシンホスファターゼ（例えば、Ｔ細胞およびマクロファージのＣＤ４５[クラスター決定基(cluster determinant)-45]蛋白質）、グアニル酸シクラーゼ（例えば、ナトリウム尿排泄高進ペプチドレセプター）、およびセリン／トレオニンキナーゼ（例えば、アクチビンおよびＴＧＦ−ベータレセプター）であるものを含む。固有のチロシンキナーゼ活性を有するレセプターは、自己リン酸化することができ、かつ、他の基質をリン酸化することができる。
【０００９】
更に、いくつかのレセプター群は、固有の酵素活性を持たないが、それでも、蛋白質同士の直接相互作用によって、細胞内チロシンキナーゼと結合する。この種のレセプターには、サイトカインレセプター（例えば、インターロイキン−２レセプター）、ならびに、Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８細胞表面糖蛋白質、ならびにＴ細胞抗原レセプターがすべて含まれる。
【００１０】
２．ＧＴＰ結合加水分解蛋白質（Ｇ蛋白質と呼ばれる）と細胞内部で結合するレセプター：
Ｇ蛋白質と相互作用する種類のレセプターは、すべて、７つのトランスメンブレンスパニングドメイン(transmembrane spanning domains)を特徴とする構造を有する。これらのレセプターは、ヘビ状(serpentine)レセプターと呼ばれる。この種の例は、アドレナリン作用性(adrenergic)レセプター、芳香性(odorant)レセプター、ならびに特定のホルモンレセプター（例えば、グルカゴン、アンジオテンシン、バソプレッシン、およびブラジキニン）である。
【００１１】
３．細胞内で見られ、かつ、リガンド結合においてリガンド−レセプター複合体が遺伝子転写に直接作用する核へ移動するレセプター：
ステロイド／甲状腺ホルモンレセプター上科（例えば、グルココルチコイド、ビタミンＤ、レチノイン酸、および甲状腺ホルモンレセプター）は、細胞質中に存在し、かつ、親油性ステロイド／甲状腺ホルモンと結合する種類の蛋白質である。これらのホルモンは、疎水性血漿膜を自由に通り抜けることができる。リガンド結合において、ホルモン−レセプター複合体は、核へ移動し、特異的ＤＮＡ配列と結合し、それにより、結合した遺伝子の転写速度を変化させる。
【００１２】
１つまたはいくつかの上記経路を介して、メッセージが核に届くと、特異的遺伝子の調節が開始され、その結果、ＲＮＡが生成され、最終的に、特異的な生物学的機能を果たす蛋白質が生成される。シグナル伝達分子の活性が分散されることにより、細胞の機能不全および疾病プロセスが引き起こされ得る。具体的には、ＨＣＶとホスト細胞との相互作用は、ウイルスが複製するために必要である。
【００１３】
本発明は、ＨＣＶに感染したホスト細胞におけるＨＣＶ複製の結果、ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｐ１８２８３）が特異的にダウンレギュレートされる(downregulated)という、驚くべき発見に基づいている。ここに記載した抗ウイルス治療研究のアプローチは、ウイルス感染に関連する細胞シグナル伝達経路の発見に注目している。ウイルス感染に重要なシグナル伝達分子の同定により、特に、新規診断法、例えば、アッセイおよびその結果有用な組成物、抗ウイルス治療のための新規ターゲット、新しい種類の抗ウイルス治療、ならびに、新規スクリーニング法（例えばアッセイ）、ならびに、新規抗ウイルス剤を発見するための材料、がもたらされる。
【００１４】
新しい薬学的に活性な化合物を開発するために、医学的介入のための潜在的ターゲットを同定しなければならない。よって、薬学的に効果的な化合物を見出すためのプロセスは、ターゲット同定を含む。
【００１５】
ターゲット同定は、基本的には、特定の生物学的成分、即ち、蛋白質、および、特定の疾病状態または制御システムとのその関連、の同定である。疾病またはその症状に作用し得る薬学的に活性な化合物（薬剤）に関する研究において同定された蛋白質は、ターゲットと呼ばれる。前記ターゲットは、生物学的システムの制御または調節に関連し、その機能は、薬剤によって阻害され得る。
【００１６】
疾病という語は、ここでは、後天的に得た(acquired)状態または遺伝的状態を表すために使用される。疾病は、体の正常な生物学的システムを変化させ得て、それにより、化合物の過剰(over abundance)または欠乏(under abundance)（化学的不均衡）が引き起こされる。これら化合物のための制御システムには、不均衡を検出するための、または、化学的不均衡を修復するために体で中和化合物生成を引き起こすための、体による特定の蛋白質の使用が含まれる。
【００１７】
体という語は、ここでは、何らかの生物学的システム、例えば、ヒト、動物、細胞、または細胞培養物、を表すために使用される。
【００１８】
本発明の目的は、医学的介入、ヒトを含む哺乳動物、および細胞または細胞培養物における、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療のための新規ターゲットを、個人、細胞培養物および細胞におけるＨＣＶ感染の検出のための方法、ならびに、ＨＣＶ感染の予防および／または治療に有用な化合物の検出のための方法とともに提供することである。本発明の目的は、独立項の教示によって解決される。本発明の更なる特徴、態様、および詳細は、本出願の従属項、説明、および実施例から明らかである。
【００１９】
発明の詳細な説明
ＨＣＶ感染の結果、ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼが、体内で特異的にダウンレギュレートされることは、今初めて明らかにされる。このヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼは、ＨＣＶ感染のための新規な診断的および治療的ターゲットとして同定された。
【００２０】
グルタチオンペルオキシダーゼ：
現在まで、哺乳動物において、４つの異なる種のグルタチオンペルオキシダーゼ、古典的な細胞酵素、リン脂質ヒドロペルオキシド代謝酵素、胃腸管酵素、および、細胞外血漿酵素、が同定されている。それらの一次構造は、関連性に乏しい。それらが、異なる遺伝子によってコードされ、かつ、異なる酵素的性質を有することが示された。ヒト血漿中のグルタチオンの減少は低レベルであり、かつ、この酵素の反応性は低いため、ヒト血漿酵素の生理学的な役割は、依然として不明なままである。
【００２１】
ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧI−ＧＰｘ）は、グルタチオンペルオキシダーゼ関連蛋白質２（ＧＰＲＰ）またはグルタチオン過酸化水素酸化還元酵素としても知られている。それは、登録番号Ｐ１８２８３およびＥＣ番号１．１１．１．９が付与されている。
【００２２】
ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＩ−ＧＰｘ）は、グルタチオン（ＧＳＨ）によって、水素ドナーとして、様々な有機ヒドロペルオキシド、ならびに、過酸化水素の還元に触媒作用を及ぼす(2 GSH + H2O2 → GS−GS + 2 H2O)。それは、８４，０００の分子量を有し、かつ、酵素１モル当たり４つのサブユニットを有する。その酵素は、脂質ヒドロペルオキシドの酵素決定に有用である。
【００２３】
ＧＩ−ＧＰｘは、セレノプロテイン(selenoproteins)の群に属し、かつ、還元基質としてグルタチオンを用いて、種々のヒドロペルオキシドの還元に触媒作用を及ぼすことによって、哺乳動物、鳥類、および魚の、酸化ダメージに対する防御メカニズムにおいて重要な役割を果たす。より多くの場合、この酵素が、過酸化物による(peroxidative)ダメージに対して細胞膜システムを保護するメカニズムとして機能することが提案されており、かつ、この提案された酵素の機能において、重要な微量元素としてセレニウムが重要な役割を果たし得ることが提案されている。ビタミンＥおよびＳｅの両方が、遺伝的変化の根本的な原因としての一般的な酸化ストレスメカニズムにおいても酸化防止剤として作用することが知られている。
【００２４】
セレニウムは、主に、セレノプロテインの形で哺乳動物システム内で機能する。セレノプロテインは、セレノシステインとしてセレニウムを含み、かつ、様々な生理学的役割を果たす。１７個のセレノプロテインが同定されている：細胞内または古典的なグルタチオンペルオキシダーゼ；血漿（または細胞外）グルタチオンペルオキシダーゼ；リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ；胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ；セレノプロテインＰ；１、２、および３型ヨードチロニンデアイオジナーゼ(iodothyronine deiodinase)；セレノプロテインW；チオレドキシンレダクターゼ（thioredoxin reductase）；およびセレノホスフェートシンセターゼ(selenophosphate synthetase)。これらの中で、細胞内および血漿グルタチオンペルオキシダーゼは、セレニウムの状態の評価のために用いられる機能的パラメーターである(D. H. ホルベン(Holben)、A. M. スミス(Smith)、J. Am. Diet. Assoc. 1999、99、836-843)。
【００２５】
ビタミンＥ（DL−α−トコフェロール）、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、コエンザイムＱ１０、亜鉛、およびセレニウムのほかに、N-アセチル-L-システイン、N-アセチル-S-ファルネシル-L-システイン、ビリルビン(Bilirubin)、コーヒー酸、CAPE、カテキン、セルロプラスミン（ceruloplasmin）、コエレンテラジン(Coelenterazine)、銅ジイソプロピルサリチレート、デフェロキサミンメシレート(deferoxamine mesylate)、R-(-)-デプレニル(deprenyl)、DMNQ、DTPA ジアンヒドライド(dianhydride)、エブセレン(Ebselen)、エラグ酸、(-)-エピガロカテキン(epigallocatechin)、L-エルゴチネイン(ergothioneine)、EUK-8、フェリチン(Ferritin)、グルタチオン、グルタチオンモノエチルエステル、α−リポ酸、ルテオリン(Luteolin)、マノアリド(Manoalide)、MCI-186、MnTBAP、MnTMPyP、モリンヒドレート(morin hydrate)、NCO-700、NDGA、p-ニトロブルー(Nitroblue)、プロピルガレート(propyl gallate)、レスベラトロール(Resveratrol)、ルチン、シリマリン(silymarin)、L-ステフォリジン(stepholidine)、タキソフォリン(taxifolin)、テトランドリン(tetrandrine)、トコフェロールアセテート(tocopherol acetate)、トコトリエノール(tocotrienol)、トロロックス(Trolox)（商標）、U-74389G、U-83836E、および尿酸(すべて、カルバイオケム(Calbiochem)、サンディエゴ、CA、米国、から入手可能) のような多くの更なる酸化防止剤を、ＧＩ−ＧＰｘのダウンレギュレーションを少なくとも部分的に補うことによりＨＣＶ感染を予防および／または治療するための開示された方法に適用することができる。
【００２６】
更なる酸化防止剤は、クエン酸のようなカルボン酸、ならびに、ＢＨＡ（ブチル基を導入したヒドロキシアニソール）、ＢＨＴ（ブチル基を導入したヒドロキシトルエン）、没食子酸プロピル、ＴＢＨＱ（ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン）、トコフェロール、レシチン、ゴムおよびグアヤク樹脂、ＴＨＢＰ（トリヒドロキシブチロフェノン）、チオジプロピオン酸、およびジラウリルチオジプロピオネートのようなフェノール化合物、ならびにグリシンの群から選択され得る。
【００２７】
酸化ダメージは、主にフリーラジカルによって、好ましくは、正常な細胞の呼吸および食細胞がバクテリアまたはウイルス感染細胞を破壊するときに生じる酸性破裂(burst)から生じる反応性酸素中間体によって、引き起こされる。潜在的にダメージを与える酸素ラジカルの連続的な発生に対処するために、真核生物は、多くの防御メカニズムを進化させてきた。これらには、フリーラジカルスカベンジャーとして作用し、かつ、ＧＩ−ＧＰｘと相互作用し得るか、ならびに／または、GI-GPxの発現および／もしくは生成を活性化、刺激、および／もしくは増加させ得る上記酸化防止剤が含まれる。細胞中で生成されるＧＩ−ＧＰｘの量へのラジカルの、この有利な効果は、ＨＣＶによって誘発されたＧＩ−ＧＰｘのダウンレギュレーションと競争し、そして、細胞を、それらのＣ型肝炎ウイルスとの戦いにおいて助ける。
【００２８】
ＨＣＶ感染研究：
唯一信頼できる実験的なＨＣＶ感染研究は、チンパンジーを用いて行われた。今までのところ、ＨＣＶに利用可能な簡単な細胞培養物感染システムはない。一次細胞および細胞系におけるＨＣＶのインビトロ伝播の試みを記載した多くの報告が公表されているが、再生、低レベルの発現、および適切に調節された検出法に関する疑問が残っている(J. Gen Virol. 81, 1631; 抗ウイルス化学および化学療法（Antiviral Chemistry and Chemotherapy） 10, 99に概説されている)。よって、バーテンシュレーガー(Bartenschlager)および協力者(ローマン(Lohmann)ら、肝臓癌細胞系におけるサブゲノムＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ類のレプリコン(Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.) サイエンス(Science) 285, 110. 1999)によって記載されたレプリコンシステムが、ここに開示された研究のために使用された。このレプリコンシステムは、ＨＣＶ感染をシミュレーションするためのシステムとして使用されるＨＣＶ複製サイクルの決定的な部分を再生する。バーテンシュレーガー(Bartenschlager)のグループは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子ならびに構造ＨＣＶ蛋白質に対する配列が削除されているタイプのＨＣＶゲノムを有するビシストロン(bicistronic)組み換え型ＲＮＡ類、いわゆる“レプリコン”を生成した。サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡ分子のヒト肝臓癌細胞系ＨｕＨ−７へのトランスフェクション後、ＮＰＴ遺伝子の共増幅およびその結果得られる抗生物質Ｇ−４１８への耐性に基づいて、ＨＣＶレプリコンの効率的なＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製を助ける細胞が選択される。細胞ゲノムへのコード情報の統合は、機能的レプリコンに対する排除規準(exclusion criteria)であった。ノーザンブロッティングによって検出され得る、自発的に複製するＨＣＶ  ＲＮＡ類によって、いくつかの系が、Ｇ−４１８耐性クローンから得られた。マイナス鎖(minus-strand)ＲＮＡ複製中間体が、ノーザンブロッティングまたは代謝性放射ラベリング(metabolic radio-labeling)によって検出され、代謝性ラベリングまたはウエスタンブロッティング後に、免疫沈降(immuno-precipitation)によって、非構造ＨＣＶ蛋白質の生成が示された。
【００２９】
ＨＣＶのＲＮＡ依存性複製およびホスト細胞転写への非構造蛋白質の起こり得る影響および／または依存性は、ここに記載の本発明の(inventive)方法において使用されるクロンテック(Clontech)ｃＤＮＡアレイによる分析に利用され得る。ＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ３細胞は、ＮＰＴ遺伝子保持プラスミド（ｐｃＤＮＡ３、インビトロゲン(Invitrogen)）の統合によりＧ−４１８に耐性を有するＨｕＨ７細胞であり、ネガティブコントロールとして役立つ。３つのレプリコン系の、対照系と比べた細胞ＲＮＡ発現パターンの変化を分析した：
・ＨｕＨ−９−１３：サイエンス(Science)１９９９、２８５、１１０−１１３に記載の永続型レプリコンI377/NS3-3’/wtを有する細胞系、
・ＨｕＨ−５−１５：サイエンス(Science)１９９９、２８５、１１０−１１３に記載の永続型レプリコンI389/NS3-3’/wtを有する細胞系。
・ＨｕＨ−１１−７：サイエンス(Science)１９９９、２８５、１１０−１１３に記載の永続型レプリコンI377/NS2-3’/wtを有する細胞系。
【００３０】
これらのＨＣＶレプリコン細胞は、ＨＣＶ感染細胞システムのシミュレーションのための、特に、ヒトを含むＨＣＶ感染哺乳動物をシミュレーションするためのシステムとして役立つ。細胞シグナル(signaling)イベントによるＨＣＶの干渉(interference)は、対照細胞における細胞シグナルと比べた場合の異なる遺伝子発現に反映される。この新規シグナル伝達マイクロアレイ分析からの結果から、ＧＩ−ＧＰｘの顕著なダウンレギュレーションが明らかになった。ＨＣＶレプリコン細胞ＨｕＨ−９−１３、ＨｕＨ−５−１５、およびＨｕＨ−１１−７からの放射性ラベル化コンプレックスｃＤＮＡプローブを、ｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ、かつ、ＨＣＶレプリコンを含まないＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ対照細胞からのｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションと比較した。
【００３１】
ここに報告された驚くべき結果に基づいて、本発明の１つの態様は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療に有用な化合物の検出のためのスクリーニング方法に関する。具体的には、この方法は、試験化合物を、ＧＩ−ＧＰｘに接触させ、そしてＧＩ−ＧＰｘを検出することを含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、診断方法、個人または細胞においてＣ型肝炎ウイルス感染を検出するためのアッセイに関する。この方法は、個人からの試料を提供すること、または細胞を提供すること、および、ＧＩ−ＧＰｘの活性を検出することを含む。
【００３３】
例えば、ＨＣＶに感染した肝臓または何らかの他の組織の血液、バイオプシー、細胞または細胞培養物を、試料として使用することができた。
【００３４】
従って、本発明の１つの態様は、上記方法において有用な新規化合物に関する。よって、本発明は、ＧＩ−ＧＰｘと結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に関する。
【００３５】
更に、本発明は、細胞においてＧＩ−ＧＰｘの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、個人におけるＣ型肝炎ウイルス感染の治療のための方法を開示する。
【００３６】
本発明の類似の態様は、ＧＩ−ＧＰｘの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、細胞または細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病の予防および／または治療のための方法に関する。
【００３７】
本発明の別の目的は、細胞においてＧＩ−ＧＰｘの活性を少なくとも部分的に阻害するか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成を少なくとも部分的に阻害する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、個人または細胞もしくは細胞培養物において、Ｃ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法を提供することである。ＧＩ−ＧＰｘに対する上記モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、前記方法において、薬学的に活性な薬剤として使用され得る。
【００３８】
上記方法のほかに、本発明は、細胞において、ＧＩ−ＧＰｘを少なくとも部分的に活性化するか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成を活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、個人においてＣ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病を予防および／または治療するための方法にも関する。
【００３９】
本発明の別の態様は、ＧＩ−ＧＰｘの活性を少なくとも部分的に活性化するか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で投与する段階を含む、細胞または細胞培養物において、Ｃ型肝炎ウイルス感染および／またはＨＣＶ感染に関連する疾病を予防および／または治療するための方法に関する。
【００４０】
“関連する疾病”という語は、例えば、日和見感染（opportunistic infections）、肝硬変、肝臓癌、肝細胞癌、または、ＨＣＶ感染を伴い得る何らかの他の疾病を表す。
【００４１】
ＧＩ−ＧＰｘの機能は、細胞において過酸化物を解毒し、細胞の酸化ダメージを防ぐことである。図３に示すように、好ましくは、パラコートまたは過酸化物から生成されたラジカルによって引き起こされる酸化ストレス条件にＨＣＶ感染細胞を付すことにより、未感染細胞と比べて、ラジカルの毒性に対するＨＣＶ感染細胞の耐性の低減が引き起こされる。よって、人工的に酸化ストレス条件を生み出すことにより、ＨＣＶ感染細胞を選択的に殺すことができる。
【００４２】
有用なラジカル形成化合物（ラジカル開始剤）の例は、パラコート、２，２’−ビピリジル(bipyridyl)および４，４’−ビピリジル誘導体、ビス−６−（２，２’−ビピリジル）−ピリミジン、トリス−２，２’−ビピリジル）−ルテニウムのようなビピリジル類、ベンゾイルペルオキシド、ジアセチルペルオキシド、過酸化水素、ジ−ｔｅｒｔ．−ブチルペルオキシドのような過酸化物類、または、ジアザイソブチロニトリルのようなジアザ化合物、である。
【００４３】
本発明の更に別の態様は、ＧＩ−ＧＰｘの活性を不活性化もしくは阻害し得るか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成および／もしくは発現を低減もしくは阻害し得る薬剤を少なくとも１つ含む、Ｃ型肝炎ウイルスおよび／または関連する疾病に苦しむ個人の予防および／または治療に有用な新規治療的組成物に関する。
【００４４】
本発明の更なる態様は、個人または細胞もしくは細胞培養物におけるＣ型肝炎ウイルスの生成を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を少なくとも部分的に活性化もしくは増加させるか、または、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの生成を少なくとも部分的に活性化もしくは刺激する薬剤を、薬学的に効果的な量で、個人または細胞に投与する段階を含む方法によって示される。
【００４５】
本発明の更なる態様は、個人または細胞もしくは細胞培養物のいずれかにおけるヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの発現を制御するための方法であって、ＧＩ−ＧＰｘをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を少なくとも部分的に刺激または増加させる薬剤を、薬学的に効果的な量で、個人または細胞もしくは細胞培養物のいずれかに投与する段階を含む方法に関する。
【００４６】
上記方法によれば、本発明の別の態様は、Ｃ型肝炎ウイルスおよび／または関連する疾病に苦しむ個人の予防および／または治療のための前記方法において有用な新規の治療的組成物に関する。前記組成物は、ＧＩ−ＧＰｘの活性を増加し得るか、または、ＧＩ−ＧＰｘの生成および／もしくは発現を活性化もしくは刺激し得る、少なくとも１つの薬剤を含む。
【００４７】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容され得るキャリアー、賦形剤、および／または希釈剤を更に含み得る。
【００４８】
ここで使用される“阻害剤”という語は、ＧＩ−ＧＰｘの量および／もしくは活性またはその発現を、ダウンレギュレートするか、減少させるか、不活性化するか、抑制するか、さもなければ制御することができる、何らかの化合物を表す。一般的に、ＧＩ−ＧＰｘ阻害剤は、蛋白質、オリゴ−およびポリペプチド、核酸、遺伝子、小型の化学的分子、または他の化学的部分であり得る。
【００４９】
小型の化学的分子は、例えば、典型的には５００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有し、好ましくは１０個未満のヘテロ原子も有する有機化合物である。
【００５０】
ここで使用される“活性化剤”という語は、ＧＩ−ＧＰｘの量および／もしくは活性またはその発現を、アップレギュレートするか、活性化するか、刺激するか、または増加させることができる、何らかの化合物を表す。一般的に、前記薬剤は、蛋白質、オリゴ−およびポリペプチド、核酸、遺伝子、小型の化学的分子、または他の化学的部分であり得る。グルタチオンペルオキシダーゼの活性化剤の例は、例えば、セレニウムおよびレチノイン酸である(ブリゲリウス−フロエ(Brigelius-Flohe), R.、1999、（生物学および医学におけるフリーラジカル(Free Radicals in Biology and Medicine)、27、951-965; チュウ(Chu)ら、1999、ジャーナル・オブ・ニュートリション(Journal of Nutrition) 129、1846−1854)。
【００５１】
“薬剤(agent)”という語は、ここでは、制御剤、阻害剤、および／または活性化剤の同義語として使用される。よって、“薬剤”という語は、ＧＩ−ＧＰｘの量および／もしくは活性ならびに／またはＧＩ−ＧＰｘの発現を、ダウンレギュレートまたはアップレギュレートするか、減少または増加させるか、抑制または刺激するか、不活性化または活性化するか、さもなければ、制御するか、または影響を及ぼす、何らかの化学的または生物学的化合物を表す。
【００５２】
１つの特別な種類の前記薬剤は、ＧＩ−ＧＰｘのような広範な細胞分子の活性の制御剤として機能するアプタマーである。アプタマーは、小型分子、ペプチド、または蛋白質と、高アフィニティーおよび特異性をもってインビトロで結合するように選択される核酸分子である。アプタマーは、高度に特異的な分子認識性を示すだけでなく、アゴニスティック(agonistic)またはアンタゴニスティック(antagonistic)なメカニズムによって、高度に特異的にそれらの同系のターゲットの機能を調節することもできる。最も有名なアプタマーの例は、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーである。ＤＮＡから蛋白質へ遺伝的情報を伝達する際の役割のほかに、ＲＮＡ分子は、多くの細胞  プロセスに活発に関与する。翻訳（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ）、細胞内蛋白質ターゲッティング（ＳＲＰ）、プレ−ｍＲＮＡの核接合(nuclear splicing)（ｓｎＲＮＰｓ）、ｍＲＮＡエディティング(editing)（ｇＲＮＡ）、およびＸ−染色体不活性化（Ｘｉｓｔ  ＲＮＡ）において例が見られる。これらＲＮＡ分子はそれぞれ、どんな蛋白質をコードすることもなく、それ自体で、機能的生成物として作用し得る。ＲＮＡ分子は、異なる構造的特徴を有する珍しい形に折りたたむことができるので、いくつかのＲＮＡは、特異的蛋白質または小型分子と結合し（ＡＴＰ結合アプタマーにおけるように）、一方、他のものは、特定の化学反応に触媒作用を及ぼす。よって、ＲＮＡアプタマーは、ＧＩ−ＧＰｘと相互作用することにより前記ペルオキシダーゼの活性および生物学的機能を調節、制御、活性化、または阻害するために使用され得る。
【００５３】
ここで使用される“発現および／または活性を制御する”という語は、一般に、細胞成分の量または活性（機能性）を制御または調節するために働く何らかの工程を表す。静的な制御は、発現および／または活性をある所定のレベルに維持する。アップレギュレーションは、発現および／または活性の相対的な増加を表す。従って、ダウンレギュレーションは、発現および／または活性の相対的な減少を表す。ダウンレギュレーションは、所定の細胞成分の活性の阻害と同義である。
【００５４】
本発明の更なる態様は、個人または細胞もしくは細胞培養物のいずれかにおいて、ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼの活性を制御するための方法であって、前記ヒト細胞蛋白質胃腸グルタチオンペルオキシダーゼをコードするＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を、少なくとも部分的に阻害または低減する薬剤を、薬学的に効果的な量で、個人または細胞もしくは細胞培養物のいずれかに投与する段階を含む方法に関する。
【００５５】
治療剤(therapeutics)、薬学的に活性な薬剤、もしくは阻害剤は、それぞれ、個人からの細胞へインビトロで投与することができ、または、個人へのインビボ投与を包含し得る。“個人(individual)”という語は、好ましくは、哺乳動物を表し、最も好ましくはヒトを表す。個人への薬学的調製物の投与ルートは、皮膚、皮内(intradermal)、胃内(intragastral)、皮内(intracutan)、管内、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内、膣内、口内(intrabuccal)、経皮的(percutan)、直腸(rectal)、皮下、舌下、局所、または経皮的(transdermal)適用を含む、経口および非経口適用を含み得るが、これらの投与方法に限定されない。例えば、好ましい調製物は、経口適用に適した投与可能な形態である。これらの投与可能な形態は、例えば、丸薬、錠剤、フィルム錠剤、コート錠剤、カプセル、粉末および沈殿物(deposits)を含む。個人への投与は、一回または繰り返し行うことができ、かつ、何らかの様々な生理学的に許容され得る塩の状態であることができ、ならびに／または、許容され得る薬学的キャリアー、結合剤、潤滑剤、賦形剤、希釈剤、および／もしくはアジュバントを含み得る。薬学的に許容され得る塩の状態および標準的な薬学的調製技術は、当業者に周知である。
【００５６】
ここで使用される、ＧＩ−ＧＰｘ活性剤またはＧＩ−ＧＰｘ阻害剤の“薬学的に効果的な量”は、インビトロで治療される細胞もしくは細胞培養物またはインビボで治療される患者のいずれかにおいて、所望の生理学的結果を得るために効果的な量である。具体的には、薬学的に効果的な量は、ある期間中、ウイルス感染に関連する、臨床的に定められた病理学的プロセスの１つ以上を阻害するのに十分な量である。効果的な量は、選択される特異的ＧＩ−ＧＰｘ阻害剤によって変わり得て、かつ、治療されるべき患者に関連する様々な因子および条件ならびに感染の過酷さ(severity)にも依存する。例えば、阻害剤が、インビボで投与されるならば、患者の年齢、体重、および健康のような因子、ならびに、臨床前の動物実験から得られた用量反応曲線(dose response curves)および毒性データが考慮されるであろう。阻害剤を、細胞または細胞培養物とインビトロで接触させるならば、接種、半減期、投与量、毒性等のようなパラメーターを評価するための様々な臨床前インビトロ研究も計画され得るであろう。所定の薬剤に対する薬学的に効果的な量の決定は、十分に当業者の能力内である。
【００５７】
検出が、検出ターゲットの存在、不存在、または量を示すのに有用な、当分野で既知の何らかの方法を含むことは、当業者に明らかである。そのような方法は、それらに限定されないが、ブロッティング技術および免疫アッセイを含むハイブリダイゼーションおよび／または結合技術；分光学的技術；沈降、電気泳動、クロマトグラフィー、遠心分離、限外濾過、細胞分別(cell sorting)を含む分離技術；ならびに、酵素的操作(enzymatic manipulations)（例えば消化）を含む、単独または組み合わせて使用される、何らかの分子的または細胞的技術を含み得るが、それらに限定されない。
【００５８】
Ｃ型肝炎ウイルスのウイルス感染に特異的に関連するＧＩ−ＧＰｘのダウンレギュレーションは、本開示によって初めて教示される。よって、本発明は、ＨＣＶ感染の予防および／または治療に有用な新規化合物の検出に有用な方法にも関する。
【００５９】
本発明の方法は、試験化合物または試験化合物のライブラリーの、細胞または個人内でのＨＣＶ成長およびＲＮＡ複製中、特異的にダウンレギュレートされることがここで同定されたＧＩ−ＧＰｘを阻害または活性化する能力をスクリーニングすることによって、ＨＣＶ感染の予防および／または治療に有用な化合物を同定する。様々なアッセイプロトコルおよび検出技術は、当分野で周知であり、熟練した専門家によって、この目的のために容易に適用され得る。そのような方法は、それらに限定されないが、ハイスループットアッセイ(high throughput assays)（例えば、マイクロアレイ技術、ファージティスプレイ技術）、ならびにインビトロおよびインビボの細胞および組織アッセイを含む。
【００６０】
関連する態様において、本発明は、ＨＣＶ感染および／または複製プロセスにおけるＧＩ−ＧＰｘの重要な役割を考慮して、個人、細胞培養物、または細胞におけるＨＣＶの検出に特に有用なアッセイ成分を提供する。好ましくは、アッセイ成分は、ＧＩ−ＧＰｘ活性を検出し得る固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、固体支持体は、上記ヒト細胞蛋白質のすべてを検出するのに十分な品質および量のオリゴヌクレオチドを含み得る（例えば、核酸マイクロアレイ）。
【００６１】
同様に、本発明の目的は、ＨＣＶ感染の予防および／または治療に有用な化合物のスクリーニングに特に有用なアッセイ成分を提供することである。１つの好ましいアッセイ成分は、固体支持体上に固定されたＧＩ−ＧＰｘをコードするオリゴヌクレオチドを含む。
【００６２】
遺伝子発現のポリペプチド生成物は、更に発現量を決定するために分析され得る。蛋白質を分析するための方法は、それらに限定されないが、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(radioimmuno assay)、免疫組織化学、および定序(ordered)アレイにおけるペプチド固定化を含む。但し、特異的な蛋白質またはｍＲＮＡ生成物を特異的かつ定量的に測定するための何らかの方法が使用され得ることが理解される。
【００６３】
本発明は、マイクロアレイ構成および分析の分野で周知の技術のすべてを、開示として援用する。これらの技術は、それらに限定されないが、生体高分子化合物のアレイおよびそれらの製造方法を記載した以下の特許および特許出願を含む：
米国特許第5,242,974号; 第5,384,261号; 第5,405,783号; 第5,412,087号; 第5,424,186号; 第5,429,807号; 第5,436,327号; 第5,445,934号; 第5,472,672号; 第5,527,681号; 第5,529,756号; 第5,545,531号; 第5,554,501号; 第5,556,752号; 第5,561,071号; 第5,559,895号; 第5,624,711号; 第5,639,603号; 第5,658,734号; 第5,807,522号; 第6,087,102号; WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287; およびEP 799 897。
【００６４】
それら技術は、それらに限定されないが、様々な用途においてアレイを用いる方法を記載した以下の特許および特許出願に記載の技術も含む：
米国特許第5,143,854号; 第5,288,644号; 第5,324,633号; 第5,432,049号; 第5,470,710号; 第5,492,806号; 第5,503,980号; 第5,510,270号; 第5,525,464号; 第5,547,839号; 第5,580,732号; 第5,661,028号; 第5,994,076号; 第6,033,860号; 第6,040,138号; 第6,040,140号; WO 95/21265; WO 96/31622;  WO 97/10365;  WO 97/27317; EP 373 203;およびEP 785 280。
【００６５】
ここに記載の本発明の組成物および方法の他の適当な修正および適応は明らかであり、かつ、本発明の範囲またはここに開示された態様を逸脱することなく行われ得ることが、当業者に容易に容易に理解され得る。ここに本発明を詳細に説明したが、説明目的のためだけに含まれ、本発明を制限するものではない、以下の実施例を参照することにより、本発明は、より明確に理解されるであろう。
【００６６】
図面の説明
図１：
レプリコン細胞は、対照ＨｕＨ７細胞よりＧＩ−ＧＰｘ ｍＲＮＡの発現が少ない：
ＨｕＨ７対照細胞（ｐｃＤＮＡ３）およびＨｕＨレプリコン細胞系５−１５、１１−７、および９−１３を、１０−ｃｍ培養皿において平板培養し（５×１０5細胞／５８ｃｍ2）、３日後、細胞周期が活発に進行しているときに(when cells were actively through the cell cycle)採取した。全ＲＮＡを単離し、１０μｇを１．２％アガロースゲルにおいて分離し、ノーザンブロット分析に用いた。
【００６７】
Ａ：ブロットを、ヒト胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＩ−ＧＰｘ）をコードするｍＲＮＡと相補的な、放射性ラベル化オリゴヌクレオチド（プローブ１：オープンバー(open bar)、プローブ２：塗りつぶしたバー(filled bar)）とハイブリダイズさせた。補力液(intensifier)スクリーンを用いて、−８０℃で１日、コダック(Kodak)X線フィルムに、膜を露出させた。フィルムを走査して、ＧＩ−ＧＰｘをコードするｍＲＮＡの密度を算出した。対照細胞（ｐｃＤＮＡ３）の値を１００％として、示したように、３つのレプリコン細胞系（±ＳＥＭ）の値と比較した。
【００６８】
Ｂ：ブロットを取り去り(stripped)、典型的なグルタチオンペルオキシダーゼ（ｃＧＰｘ）ｍＲＮＡを認識する２つのオリゴヌクレオチド（プローブ１：オープンバー、プローブ２：塗りつぶしたバー）と再度ハイブリダイズさせた。補力液スクリーンを用いて、−８０℃で２日間、コダック(Kodak)X線フィルムに膜を露出させた。デンシトメトリーを用いて膜を走査し、対照細胞系ｐｃＤＮＡ３のｃＧＰ ｍＲＮＡの強度（１００％とする）を、示したように、レプリコン細胞系と比較した。
示したデータは、３つの独立した実験の結果である。
【００６９】
図２：
グルタチオンペルオキシダーゼの細胞活性は、レプリコン細胞系において低減される：
下記実験部に記載したように、培養物を、平板培養して採取した。サイトソル抽出物の蛋白質１８０μｇを、材料および方法において記載するように、グルタチオンペルオキシダーゼ活性の評価のために用いた。各細胞系のグルタチオンペルオキシダーゼ活性を反映する、３４０ｎｍでの吸光度(extinction)の平均変化（±ＳＥＭ）を示す。
【００７０】
図３：
レプリコン細胞は、酸化ストレスの影響を受けやすい：
９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、細胞を平板培養し（５×１０3細胞／０．３５ｃｍ2）、３日後、記載した濃度のパラコートによって２４時間処理した。細胞生存能力を、アラマーブルー(Alamar-Blue)アッセイを用いて、４０５ｎｍで相対蛍光ユニット（relative fluorescence units；ＲＦＵ）によって反映させて測定した。３つの独立した実験のＬＤ50値（±ＳＥＭ）を、各細胞系について示す。
【００７１】
図４：
ＧＩ−ＧＰｘ、ＰＫＲ−、およびゲノムＨＣＶ−ＲＮＡレベルへのインターフェロンの効果：
ＨｕＨ７およびｐｃＤＮＡ３対照細胞ならびにレプリコン細胞系５−１５、１１−７、および９−１３を、図１の説明に記載のように平板培養し、３日後（０日）に、１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンα（ＩＦＮα）によって、２日間（２日）および４日間（４日）、処理した。その後、培養物を採取し、ＲＮＡを調製した。１０μｇの全ＲＮＡを、ノーザンブロット分析に使用した。ＧＩ−ＧＰｘ（Ａ）の検出のために、プローブ１を使用した（図１参照）。膜を取り去り、ＰＫＲ（Ｂ）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(ネオ)（C）に対するプローブと連続的にハイブリダイズさせた。
全ブロットに対する、補力液を用いた−８０℃での露出時間は、２日であった。オートラジオグラムを、デンシトメトリーを用いて走査し、それら値を、各実験において各プローブを用いて得られた最大値と比較した。示した値（±ＳＥＭ）は、３つの独立した実験から得られる。
【００７２】
図５および図６：
レプリコン細胞におけるＧＩ−ＧＰｘの過剰発現は、ＨＣＶのダウンレギュレーションを引き起こす：
レプリコン細胞系５−１５、１１−７、および９−１３を、６ウェルプレートのウェル当たり１０5細胞の密度で平板培養し、記載のように、ネガティブコントロールとして緑色蛍光蛋白質(green fluorescent protein；ＧＦＰ)を含むか、３’ＵＴＲを有さない（−ＵＴＲ）ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡを含むか、または、ＳＥＣＩＳを含む３’ＵＴＲを有する（＋ＵＴＲ）ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡを含む細胞当たり、１０3個のアデノウイルス粒子に感染させた。
【００７３】
４日（ｄ４）および７日（ｄ７）後、感染後培養物を採取し、１０μｇの蛋白質を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。ＮＳ５ａ抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行った（図５）。ＧＩ−ＧＰｘ特異的抗血清を用いて、形質導入(transduced)ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡの発現をモニターした（図６）。
【００７４】
Ｘ線フィルムをデンシトメトリーを用いて走査し、ＮＳ５ａ値を未感染対照細胞（１００％とする）と比較し（図５）、ＧＩ−ＧＰｘ値を、感染７日後に得られた形質導入ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡの最大発現（１００％とする）と比較した（図６）。
【００７５】
細胞が、ＧＩ−ＧＰｘ＋３’ＵＴＲウイルスに感染し、ＧＩ−ＧＰｘ−３’ＵＴＲウイルスによってＧＩ−ＧＰｘのわずかな過剰発現が観察されたきに、ＧＩ−ＧＰｘ蛋白質の多量の過剰発現が観察された（図６）。
データは、ＧＩ−ＧＰｘ＋３’ＵＴＲウイルスに感染したレプリコン細胞系すべてにおける、ＨＣＶ蛋白質ＮＳ５ａの強烈なダウンレギュレーションを示す（図５）。
【００７６】
蛋白質のローディング(loading)効率および完全性(integrity)を、チューブリン抗体によって制御した（データは示さず）。示した値（±ＳＥＭ）は、３つの独立した実験から得られる。
【００７７】
実施例
１．膜上のヒトｃＤＮＡアレイ
クロンテック(Clontech)（クロンテックラボラトリーズ(Clontech Laboratories)、パロアルト(Palo Alto)、CA 94303-4230、米国）からのアトラス(Atlas)（商標）ヒトストレスアレイ(Human Stress Array)（カタログ＃：７７４７−１）を使用した。このアレイは、ナイロン膜上の重複ドット(duplicate dots)に固定された２３４個のヒトｃＤＮＡ（ドット当たり１０ｎｇのｃＤＮＡ）を含む。
【００７８】
２．細胞ＨＣＶ  ＲＮＡ複製システム
ＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ３、ＨｕＨ−９−１３、ＨｕＨ−５−１５およびＨｕＨ−１１−７細胞を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の存在下で、１０％  ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および１×非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium)）において成長させた。細胞を、１：３または１：２に希釈し、１週間に３回、決まって通過させた(routinely passaged)。
【００７９】
３．細胞の溶解および全ＲＮＡの単離
ＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ３、ＨｕＨ−９−１３、ＨｕＨ−５−１５およびＨｕＨ−１１−７細胞を、Ｇ−１４８なしで、培地中に１０ｃｍプレート当たり５×１０5細胞で播種した。平板培養の３日後に培地を変え、４ｍｌのトリリエージェント(Tri-reagent)（モレキュラーリサーチセンター社(Molecular Research Center, Inc.)、米国）によってプレート上で細胞を直接分解することによって、平板培養の５日後に、細胞を採取した。室温で５分間、溶解物を保存し、次いで、４℃で１５分間、１２０００×ｇで遠心分離した。１ｍｌのトリリエージェント当たり０．１ｍｌの１−ブロモ−３−クロロプロパンと、上清を混合して、強く振った。室温で５分間、懸濁物を保存し、次いで、４℃で１５分間、１２０００×ｇで遠心分離した。無色の上層を、新しいチューブに移し、１ｍｌのトリリエージェント当たり５μｌのポリアクリルキャリアー（モレキュラーリサーチセンター社(Molecular Research Center, Inc.)、米国）、および０．５ｍｌのイソプロパノールと混合し、強く振った。室温で５分間、試料を保存し、次いで、４℃で８分、１２０００×ｇで遠心分離した。上清を取り除き、１ｍｌの７５％エタノールでＲＮＡペレットを２回洗浄した。ペレットを乾燥させ、初期１ｍｌ溶解物当たり２５μｌのＲＮａｓｅを含まないバッファー中に再懸濁させた。
【００８０】
４．ＲＮＡからの放射性ラベル化ｃＤＮＡプローブの調製
放射性ラベル化ｃＤＮＡプローブを得るために、放射性ラベル化ｄＡＴＰの存在下で、ＲＮＡをｃＤＮＡプローブへ転写した。クロンテック(Clontech)によって提供されたプロトコルに従って、６μｇの全ＲＮＡを、１００μＣｉ[33Ｐ]−ｄＡＴＰ（アマシャム(Amersham)、ＵＫ）によってラベルした。次いで、５μｌの０．５M  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）および２５μｌの０．６Ｍ  ＮａＯＨを添加することによって反応を停止させ、６８℃で３０分間インキュベートした。
【００８１】
プローブクァント(ProbeQuant) G-50 カラム（アマシャム(Amersham)、UK）を用いて、ラベリング反応から、組み込まれていない(unincorporated)ヌクレオチドを除去した。ボトムクロージャー(bottom closure)および蓋を取り除いた後に、適当な反応管中で、カラムを強く振り、そして７３５×ｇで１分間、遠心分離した。カラムを新たな反応管内へ配置し、プローブを、カラム材料の中央上へ置き、７３５×ｇで２分間、カラムを遠心分離した。貫流(flow-through)を、新たな反応管へ移し、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡで、１００μｌの容量に満たした。４μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、１μｌのポリアクリルキャリアー（モレキュラーリサーチセンター社(Molecular Research Center, Inc.)、米国）、および２５０μｌのエタノールを添加した後、１２０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、プローブを沈殿させた。上清を廃棄し、ハイブリダイゼーションの開始前に、ペレットを乾燥させた。
【００８２】
５．放射性ラベル化ｃＤＮＡプローブのｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション
１０μｌのＣ0ｔ−１（１μｇ／μｌ、ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）、ドイツ）、１０μｌの酵母ｔＲＮＡ（１μｇ／μｌ、シグマ(Sigma)、米国）、および１０μｌのポリA（１μｇ／μｌ、ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）、ドイツ）中に、ペレットを再懸濁させた。ニシン精液ＤＮＡを添加して最終濃度１００μｇ／ｍｌとし、５μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２５μｌの２０×ＳＳＣ（３ＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、および２回蒸留したＨ2Ｏによって、容量を１００μｌに満たした。混合物を９５℃に５分間置き、１００００×ｇで３０秒間遠心分離し、６５℃で６０分間強く振った。プローブの１μｌのアリコートを用いて、シンチレーションカウンターによって放射性ｄＡＴＰの取り込み(incorporation)を測定した。少なくとも合計２０×１０6ｃｐｍのプローブを使用した。ローラーボトルオーブンにおいて、ハイブリダイゼーション溶液中で６５℃で少なくとも３時間、アレイをプレハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション後、放射性ラベル化プローブを、ハイブリダイゼーション溶液へ添加し、ハイブリダイゼーションを２０時間続けた。プローブを廃棄し、洗浄溶液A（２×ＳＳＣ）に取り替えた。ローラーオーブンにおいて、室温で、洗浄溶液Ａ中で２回、アレイを洗浄した。その後、洗浄溶液Ａを、６５℃に予熱した洗浄溶液Ｂ（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）と取替え、６５℃で３０分間、アレイを２回洗浄した。次いで、洗浄溶液Ｂを、６５℃に予熱した洗浄溶液Ｃ（０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）と取替え、６５℃で３０分間、アレイを２回洗浄した。湿ったアレイを気密バッグで包み、８〜７２時間、イレースド・ホスホ−イメージャースクリーン(erased phosphor-imager screens)（富士フイルム(Fujifilm)、日本）上に露出させた。
【００８３】
６．ｃＤＮＡアレイの分析
露出したホスホ−イメージャースクリーンを、ＢＡＳ−１８００（富士フイルム(Fujifilm)、日本）を用いて、ピクセル当たり１００μｍおよび１６ビットの解像度で走査した。ファイルを、コンピュータプログラムアレイビジョン(ArrayVision)（イメージリサーチ(Imaging Research)、カナダ）に移した。プログラムの特徴を用いて、各ターゲットｃＤＮＡのハイブリダイゼーションシグナルを、数に変換した。ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、プローブ中に存在するＲＮＡ分子の量を反映していた。アレイの全強度に対して標準化した後に、それらのシグナル強度の比に応じて、特徴的に(differentially)発現された遺伝子を選択した。
【００８４】
７．結果
膜上のｃＤＮＡアレイを用いて、ＨＣＶレプリコン細胞ＨｕＨ−９−１３、ＨｕＨ−５−１５、およびＨｕＨ−１１−７、ならびに、ＨＣＶレプリコンを含まないＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ対照細胞中のシグナル伝達ｍＲＮＡの発現パターンを比較し、ヒト胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｐ１８２８３）遺伝子を、抗ＨＣＶターゲットとして同定した。ｍＲＮＡレベルは、未感染ＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ対照細胞と比べて、ＨｕＨ−９−１３細胞では２．８％、ＨｕＨ−５−１５細胞では８．３％、そしてＨｕＨ−１１−７細胞では６．１％、ダウンレギュレートされた。
【００８５】
８．ノーザンブロッティング
各細胞系の全ＲＮＡ１０μｇを、１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルにおいて分離し、ナイロン膜（アマシャム(Amersham)）上へ移し、そして２つの異なるオリゴデゾキシリボヌクレオチドとハイブリダイズさせた。それらの配列は、ヒト胃腸グルタチオンペルオキシダーゼ（P18283）遺伝子のコーディング(5’−TGG TTG GGA AGG TGC GGC TGT AGC GTC GGA AGG GC−3’)、および３’−非翻訳(5’−CCT CTC AGA CAC CAC CCA TGA GGG TTT AGG AAG GTG CCA T−3’)領域に由来していた。32Ｐ−ｄＣＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼ(ロシュ・ダイアグノスティクス社(Roche Diagnostics GmbH)、マンハイム(Mannheim)、ドイツ)によって、３’−末端テーリングでラベル化を行った。ノーザンブロッティング膜を、６５℃で一晩、ラベル化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、非特異的に結合したプローブを洗い流した。
【００８６】
最後の洗浄（１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６０℃で３０分）後、Ｘ線フィルム（フジ(Fuji)）を用いて、オートラジオグラフィーによって、−７０℃で１２時間、結合プローブを検出し、ホスホ−イメージャーによって定量した。
【００８７】
９．ノーザンブロッティングによる発現パターンの確認
ヒト胃腸グルタチオンペルオキシダーゼｃＤＮＡから得られた２つのオリゴヌクレオチドプローブによって、ノーザンブロット分析を行った。ハイブリダイゼーションにより、ＨｕＨ−ｐｃＤＮＡ３細胞において、約１ｋｂのＲＮＡが１つ検出されたが、ＨＣＶ−レプリコン保持細胞において、このバンドは検出されないか、または弱くしか検出されなかった。よって、ノーザンブロッティングシグナルの分析により、フィルターアレイハイブリダイゼーションにおいて前もって観察されるダウンレギュレーションが、正確に確認された（６参照；図１）。
【００８８】
１０．グルタチオンペルオキシダーゼ活性は、レプリコン細胞系において減少する。
基質としてｔｅｒｔブチルヒドロペルオキシドを用いたグルタチオンペルオキシダーゼ活性の測定により、レプリコン細胞が、低い(reduced)グルタチオンペルオキシダーゼ活性を含むことが明らかになった（図２）。
【００８９】
方法：
細胞のグルタチオンペルオキシダーゼ活性の測定のために、キットの製造者（カルバイオケム(Calbiochem)）の説明に従った。簡単に言えば、細胞を、氷冷したPBS（ホスフェートで緩衝液処理した食塩水）で洗浄し、ラバーポリスマン(rubber policeman)を用いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン−ヒドロクロライド）、ｐＨ  ７．５中に採取し、凍結と解凍のサイクル３回によって溶解した。１０，０００×ｇ（４℃）で１５分間回転させた後、ＢＣＡ試薬(ピエルス(Pierce)、ブルフザル(Bruchsal)、ドイツ)によって、上清の蛋白質濃度を決定した。アッセイ当たり１８０μｇの蛋白質を使用した。
【００９０】
基質として、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いて、ＧＩ−ＧＰｘ活性を間接的に評価した。ＧＩ−ＧＰｘによる過酸化物の還元において生成された、酸化グルタチオンを、グルタチオンレダクターゼによって、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ+のＮＡＤＰ+への酸化により、その還元状態へ再生処理した。ＮＡＤＰＨの酸化とともに、３４０ｎｍでの吸光度（Ａ340）の低下が起こり、これにより、ＧＩ−ＧＰｘ活性の分光学的測定手段が提供される。よって、Ａ340の低下速度（図２中のデルタＥ）は、試料中のＧＩ−ＧＰｘ活性と正比例する。
【００９１】
１１．パラコートに対するレプリコン細胞の感受性（sensitivity）
擬似トランスフェクトし(mock transfected)、細胞内でラジカルを生成する化合物であるパラコートの量を増加させてレプリコン細胞を処理すると、この薬剤に対するレプリコン細胞の感受性（susceptibility）が強化されることが示された。
パラコートは、レプリコン細胞の生存能力を、ｐｃＤＮＡ３対照細胞よりも激しく弱める（図２）。３つの独立した実験から算出された、パラコートについて評価されたＬＤ50値は、ＨｕＨ９−１３について２６０±５０μＭ、ＨｕＨ５−１５について２７０±７５μＭ、そしてＨｕＨ  ｐｃＤＮＡ３について１２５０±１２０μＭであった（図３参照）。
【００９２】
方法：
レプリコン細胞系および対照細胞を、様々な濃度のパラコート（メチルバイオロゲン）とともに、２４時間インキュベートし、培養物の生存能力を、アラマーブルー(Alamar Blue)アッセイを用いて測定した。
【００９３】
細胞培養物中の細胞死の程度を定量するために、我々は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性による、テトラゾリウム塩のホルマザンへの還元に基づく生存能力アッセイを用いた。既に記載されているように（T. ヘルゲト(Herget)ら、J. Neurochem. 1998、70、47−58）、但し、ＭＴＴに代えてアラマーブルー(Alamar Blue)(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)、ドイツ)を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（グレイナー(Greiner)、フリケンハウゼン(Frickenhausen)、ドイツ）において、アッセイを行った。全因子を含むが細胞を含まない培地の４０５ｎｍでの吸光度を決定し、細胞を含む場合の吸収の測定値から、差し引いた。サンプルポイント当たり８個のウェルを分析し、各実験を、少なくとも３回、独立して繰り返した。
【００９４】
１２．ＨＣＶ複製およびＧＩ−ＧＰｘ発現の逆制御(inverse regulation)
レプリコン細胞を、インターフェロンα（ＩＦＮ）とともに、２日間および４日間インキュベートした。１０μｇの全ＲＮＡを用いて、ノーザンブロット分析を行った。ＩＦＮ処理（１０００Ｕ／ｍｌ）により、ＨＣＶレプリコンＲＮＡおよびＨＣＶ蛋白質ＮＳ５ａの時間および投与量に依存するダウンレギュレーションが引き起こされた。ＧＩ−ＧＰｘについて、逆相関発現が観察された。即ち、ＧＩ−ＧＰｘは、インターフェロン処理の４日以内にアップレギュレートされた。インターフェロンは、擬似トランスフェクトされたＨｕＨ７細胞の発現に対する効果はなかった（図４参照）。
【００９５】
１３．レプリコン細胞系におけるＧＩ−ＧＰｘの転位(ectopic)発現
ＧＩ−ＧＰｘをコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨｕＨ７細胞からクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＩ−ＧＰｘ蛋白質の一時的な発現により、その機能性を示す、グルタチオンペルオキシダーゼ活性の増加が引き起こされた。構成物(construct)を、アデノウイルスのゲノム内へ再度組み込んだ。ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡを有するアデノウイルスが生成され、ＧＩ−ＧＰｘ ｃＤＮＡのＨｕＨ７およびレプリコン細胞への形質導入のために使用された。形質導入の４日後および７日後に行われたウエスタンブロット分析により、ＨＣＶ蛋白質ＮＳ５ａの強烈なダウンレギュレーションが示された。そのようなダウンレギュレーションは、‘空の’またはＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子含有アデノウイルスを並行して用いた場合には観察されなかった（図５および６参照）。
【００９６】
方法：
ここで使用されたアデノウイルスは、すべて、アデノウイルスタイプ５のＥ１、Ｅ３不完全誘導体であった（W.C. ルッセル(Russell)、J. Gen. Virol. 2000、81、2573-2604）。ＧＩ−ＧＰｘに対するコード領域を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ認識部位を含む上流プライマー(5’−GCG CAA GCT TAT GGC TTT CAT TGC CAA GTC CTT C−3’, 開始コドンに下線を付す)、および、ＸｂａＩ部位を含むが、停止コドンを含まない下流プライマー(5’−GTT CAT CTA GAT ATG GCA ACT TTA AGG AGG CGC TTG−3’)を用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＨＩＳ−およびＶＳＶ−タグを含む融合蛋白質を発現させた。XhoI認識部位を含む上流プライマー  5’−GCC CTC GAG ATG TGA ACT GCT CAA CAC ACA G−3’、および、ポリアデニル化部位（ＡＡＵＡＡＡ）を包含し、NotI制限部位を含む下流プライマー  5’−CCA CGC GGC CGC TTT ATT GGT CTC TTC TAG CAG AGT GGC−3’をクローニングのために用いて、ＳＥＣＩＳ（セレノシステイン挿入配列）を含む、ＧＩ−ＧＰｘ ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ（０．３ｋｂ）を増幅した。ＨｕＨ７細胞から単離されたＲＮＡを、逆転写し、ＰＣＲのための鋳型として使用した。ヒトＧＩ−ＧＰｘをコードするｃＤＮＡを、トランスファープラスミド（ｐＰＭ７）内のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）即時初期(immediately early)プロモーター／エンハンサーとウサギベータグロブリンイントロン／ポリアデニル化シグナルとの間にクローニングした。この発現カセットを、バクテリア中で組換えを用いてバクテリアプラスミド保持アデノウイルスゲノムへ挿入した（C. シャルティエ(Chartier)ら、J. Virol. 1996、70、4805-4810）。クローニングされた新しいタイプのゲノムを同定し、ウイルスゲノムを、制限酵素消化によってプラスミドから放出し、修正版ＰＥＩトランスフェクション法(A.-I. ミチョウ(Michou)ら、J. Virol. 1999、73、1399-1410)を用いて、ゲノムをＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトすることによって、ウイルス複製を開始した。改質したＨＥＫ２９３細胞中でウイルスを増幅し(F.L. グラハム(Graham)ら、J. Gen. Virol. 1977、36、59-74)、記載されているように(M. コッテン(Cotton)ら、アデノウイルスポリリシンＤＮＡコンジュゲーツ(Adenovirus polylysine DNA conjugates.)  カレントプロトコルズ(Current Protocols)、ヒューマンジェネティクス(Human Genetics); ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley and Sons, Inc.)、ニューヨーク、1996 pp. 12.3.1-12.3.33)、ＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離を用いて、細胞溶解物から精製した。換算係数、１ｍｇ／ｍｌの純粋なビリオン蛋白質＝３．４×１０12ウイルス粒子／ｍｌ、を用いて、蛋白質含有量によって、ウイルスを定量した(P. レメイ(Lemay)ら、バイロロジー(Virology) 1980、101、131-143)。対照ウイルスＡｄＪ５およびＡｄＬｕｃは、既に記載されていた(J.B. グロッツァー(Glotzer)ら、J. Virol. 2001, 75, 2421-2434；J.B. グロッツァー(Glotzer)ら、ネイチャー(Nature) 2000、407、207-211)。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】レプリコン細胞は、対照ＨｕＨ７細胞よりＧＩ−ＧＰｘ ｍＲＮＡの発現が少ないことを示す。
【図２】グルタチオンペルオキシダーゼの細胞活性が、レプリコン細胞系において低減されることを示す。
【図３】レプリコン細胞は、酸化ストレスの影響を受けやすいことを示す。
【図４】ＧＩ−ＧＰｘ、ＰＫＲ−、およびゲノムＨＣＶ−ＲＮＡレベルへのインターフェロンの効果を示す。
【図５】レプリコン細胞におけるＧＩ−ＧＰｘの過剰発現は、ＨＣＶのダウンレギュレーションを引き起こすことを示す。
【図６】レプリコン細胞におけるＧＩ−ＧＰｘの過剰発現は、ＨＣＶのダウンレギュレーションを引き起こすことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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