(57)【要約】本発明は、擬似ＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を有する動物をスクリーニングするための、ポイント・オブ・ケア・デバイスおよび方法に関する。本発明は、簡単且つ迅速な、予備的な免疫学的検定評価を提供する。この予備的な免疫学的検定評価では、臨床上関連のあるアレルゲンの規定した混合物を用いて、サンプル中に存在するアレルゲン特異的ＩｇＥを捕獲し、続いて二次結合試薬がＩｇＥに選択的に結合する。本発明はさらに、ＩｇＥ媒介性疾患を有する動物に免疫療法処置を処方する方法を提供する。本発明の方法を実施するために有用なデバイスおよびキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物から採取されたサンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出するためのデバイスであって、該デバイスは、以下：
（ａ）サンプル受容領域を有する多孔性部材を含む、第１の部材；および
（ｂ）支持部材、
を含み、ここで、該多孔性部材が、アレルゲンの少なくとも１つの混合物、およびコントロールスポットによりスポットされる、デバイス。
【請求項２】
前記アレルゲンの混合物が、前記多孔性部材の１スポット上に置かれる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記アレルゲンの混合物が、前記多孔性部材の複数のスポット上に置かれる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記アレルゲンの混合物が、サンプル受容領域と分離された前記多孔性部材の１つの領域に置かれる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記動物が、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記サンプルが動物から採取された体液である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記体液が、全血またはそれらの構成成分、尿、あるいは粘膜の分泌物である、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記体液が、全血、血清、または血漿である、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記デバイスがさらに、多孔性の第１部材と毛細管連絡した吸収性部材を含み、ここで、該吸収性部材が、外的手段を使用しないで、第１部材中を通る液体の流れを誘導するように選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記コントロールスポットが精製されたＩｇＥを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
請求項１に記載のデバイスであって、ここで、前記アレルゲンの混合物が、ネコアレルゲン、イヌアレルゲン、ノミ唾液タンパク質、チリダニアレルゲン、スギ花粉、ブタクサアレルゲン、ドクムギアレルゲン、メドーフェスキュー、カモガヤ、ギョウギシバ、ヒメスイバ、ホウキギ、ロシアアザミ、イエロードック、オオアワガエリ、コヌカグサ、カバノキおよびイチゴツナギアレルゲンからなる群より選択される１つ以上の型のアレルゲンを含む、デバイス。
【請求項１２】
サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するための方法であって、該方法は以下の工程を包含する：
（ａ）請求項１に記載のデバイスのサンプル受容領域に該サンプルを加え、これにより、アレルゲン特異的ＩｇＥが該サンプル中に存在する場合、多孔性部材上にスポットされる、アレルゲンの混合物中の少なくとも１つのアレルゲンが、アレルゲン特異的ＩｇＥに結合する工程；
（ｂ）該アレルゲンの混合物をアレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｃ）結合したアレルゲン特異的ＩｇＥが該サンプル中に存在する場合、該結合したアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する工程。
【請求項１３】
前記試薬が標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識された試薬が、抗ＩｇＥ抗体またはＩｇＥレセプターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識された試薬が、抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体、抗ネコＩｇＥモノクローナル抗体、抗ウマＩｇＥモノクローナル抗体または抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが動物から採取された体液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記体液が、全血またはそれらの構成成分、尿、あるいは粘膜の分泌物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アレルギー疾患を有する動物に免疫療法処置を処方するための方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）該動物からサンプルを採取する工程；
（ｃ）請求項１２の方法に従ってサンプルを分析して、該サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出する工程であって、ここで、アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、陽性サンプルとして該サンプルを同定する、工程；
（ｃ）陽性サンプルを分析して、該アレルギー疾患の原因である１つ以上のアレルゲンを同定する工程；および
（ｄ）該動物のための適切な免疫療法を選択して、該アレルギー疾患を処置する工程。
【請求項１９】
インビトロの免疫アッセイまたは皮内検査が、前記陽性サンプルを分析するために使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のデバイス、および補助試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アレルギーまたはアトピー性疾患の徴候を示す動物をスクリーニングするためのポイント・オブ・ケア・テスト（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｔｅｓｔ）（ＰＯＣＴ）デバイスおよび方法に関する。さらに詳細には、本発明の免疫学的デバイスおよび方法は、臨床上関連のあるアレルゲンの規定した混合物を使用して、このような動物から採取されたサンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する。
【０００２】
（発明の背景）
マスト細胞に結合するアレルゲン特異的ＩｇＥのアレルゲンへの架橋は、Ｉ型アレルギー疾患（例えば、アトピー性皮膚炎およびアトピー性喘息）を誘導する。アレルギーおよびアトピーに関連する疾患は、人口のかなりの割合（ヒトの２０％までを含む）が罹患しており、年々増加している。
【０００３】
アレルギー関連疾患はヒトに限定されず、そして獣医業務においても同様に主要な問題であり得る。アレルギー／アトピーに類似した徴候を有する多くの他の疾患が存在し得る。従って、明確な診断は難しい。明確な診断は、詳細な病歴、臨床徴候の慎重な観察、ならびにインビトロおよびインビボの診断テストに依存している。
【０００４】
免疫アッセイの手順は、種々のアレルゲンの臨床的有意性のインビトロでの検出のための感度の良い診断用ツールを提供している。これらの手順はアレルゲンとＩｇＥ特異的検出試薬とを使用して、患者の血清中のアレルゲン特異的抗体を測定する。これらの過程は、特質上、アレルゲンと他の試薬の両方を伴う、インキュベーション時間を必要とする。そして、その結果として、時間がかかり得る。完了に至るまでに２４時間を必要とするアッセイ手順は珍しくない。さらに、インキュベーション工程および正確に測ったな試薬での複数回の洗浄の時間を順守する必要性は、大きな病院および照会臨床検査室（ここで、高度な訓練を受けている職員および高性能な設備が、アッセイを実施するために利用可能である）に対し、これらの手順を大いに限定する。さらに、特定の割合のアトピー患者は、照会検査室で使用される標準的なアレルゲンパネル中に存在しないアレルゲンに対するアレルギーがある。これらの場合、詳細な検査は、悪化させているアレルゲンを明らかにすることができず、結果としてこれらの患者に不必要な医療費を負担させる。
【０００５】
現在、医師または獣医師の職場で使用され得る、アレルゲン特異的ＩｇＥに対する免疫アッセイを行うための単純且つ迅速な手順についての、まだ対処されていない要求が存在する。本発明は、この要求を満たし、そしてさらに関連する利点も提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、動物（ヒト、イヌ、ネコ、およびウマが挙げられるが、これらに限定されない）におけるアレルギーの診断に役に立つ、迅速で簡単な検査をを提供する。より詳細には、本発明の装置および方法は、サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥについて、免疫学的な反応を用いてスクリーニングする。このようなサンプルは、ＩｇＥを含む動物の体液（例えば、尿、粘膜分泌物、乳、全血または、血漿、血清などを含むそれらの構成成分）から採取され得る。
【０００７】
本発明のデバイスは、サンプル受容領域を有する、多孔性部材を含む第１部材（例えば、メンブレンまたはフィルター）を含む。この多孔性部材は、アレルゲンの少なくとも１つの混合物（１スポットまたは複数のスポットにおいて）および少なくとも１つ以上のコントロールスポットによってスポットされ得る。コントロールスポットは、陽性コントロール（例えば、精製されたＩｇＥ）および／または手順のコントロール（例えば、ビオチン化されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））であり得る。このアレルゲンの混合物は、サンプル受容領域内または多孔性部材の別個の領域中のいずれかにスポットされ得る。
【０００８】
このデバイスは、外的手段を使用しないで多孔性部材を通る液体の流れを誘導するために、多孔性の第１部材と毛細管連絡した吸収性部材を、必要に応じて含み得る。サンプルの静水圧およびそれに続く試薬が多孔性部材通る流れを誘導するのに不十分な場合、この吸収性部材は、多孔性部材を通る液体の流れを誘導するような毛細管の細孔サイズを有するように選択される。
【０００９】
このデバイスはまた、第１の多孔性部材を支持または収容する支持部材を含む。この吸収性部材はまた、第１部材を支持する手段を備え得る。
【００１０】
サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するための方法は、本発明の単純なデバイスを使用し、そして、小容量で長期にわたるインキュベーション工程を必要としない。このような方法は、以下の工程によって達成される：
（ａ）本発明のデバイスのサンプル受容領域にサンプルを加える工程であって、それによって、アレルゲンがサンプル中に存在する場合、アレルゲンの混合物中の少なくとも１つのアレルゲンが、アレルゲン特異的ＩｇＥに結合するデバイスの多孔性部材上にスポットされる；
（ｂ）アレルゲンの混合物を、アレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する試薬と接触させる工程；および
（ｃ）結合したアレルゲン特異的ＩｇＥをサンプル中に存在する場合に検出する工程。
【００１１】
多孔性部材上にスポットするためのアレルゲンの有用な混合物としては、以下から選択される１つ以上の型のアレルゲンが挙げられ得るが、これらに限定されない：ネコアレルゲン、イヌアレルゲン、ノミ唾液タンパク質、チリダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）アレルゲン、貯蔵庫ダニ（ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）アレルゲン、スギ花粉、ブタクサアレルゲン、ドクムギアレルゲン、メドーフェスキュー（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）、カモガヤ（ｏｒｃｈａｒｄ  ｇｒａｓｓ）、ギョウギシバ（Ｂｅｒｍｕｄａ  ｇｒａｓｓ）、ヒメスイバ、ホウキギ（Ｋｏｃｈｉａ）、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｔｈｉｓｔｌｅ）、イエロードック（ｙｅｌｌｏｗ  ｄｏｃｋ）、オオアワガエリ（ｔｉｍｏｔｈｙ  ｇｒａｓｓ）、コヌカグサ、カバノキおよびイチゴツナギ（ｂｌｕｅ  ｇｒａｓｓ）アレルゲン。
【００１２】
サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する、有用な試薬は、例えば、抗ＩｇＥ抗体またはＩｇＥレセプター、あるいはこのような分子のミメトープを含む。検出が可能なように、このような試薬は検出可能なマーカーにより標識され得るか、または、試薬と結合、または試薬と会合する、検出可能なマーカーが別々に加えられ得る。
【００１３】
従って、本発明は、医師または獣医師の職場で簡単且つ迅速に実施し得る、低コストのポイント・オブ・ケア（すなわち、医院または現場において）テストを提供する。本発明の方法およびデバイスにより入手可能な迅速な結果は、医師または獣医師が、さらなる診断作業および／または治療計画の必要性を、素早く判断することを可能にする。さらなる診断作業は、正確なアレルゲン（このアレルゲンに対して、動物が陽性であり、そして免疫療法が適切である）を決定する検査するための、中央診断検査室へのサンプルの提出も含み得る。
【００１４】
従って、本発明はさらに、アレルギー疾患を有する動物の免疫療法処置を処方するための方法を提供する。手短に言えば、この方法は、以下：
（ａ）動物からサンプルを採取する工程；
（ｂ）本発明の方法に従ってサンプルを分析し、サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出する工程であって、ここでアレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、陽性コントロールとしてサンプルを同定する、工程；
（ｃ）陽性サンプルを分析してアレルギー疾患の原因である１つ以上のアレルゲン同定する工程；および
（ｄ）適切な免疫療法を選択して、アレルギー疾患を処置する工程、
によって成し遂げられる。
【００１５】
本発明はさらに、免疫アッセイを実施するための、抗ＩｇＥ抗体を含む新規の試薬、デバイスおよび付属の試薬を含むキットを提供する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般にアレルゲン特異的ＩｇＥの迅速な検出のためのＰＯＣＴ  デバイスおよび免疫アッセイ方法に関する。本発明のこのデバイスと方法は、動物におけるアレルギーの診断において予備的な補助として有用である。
【００１７】
本発明の免疫アッセイ方法は、第１の多孔性部材および支持部材を含むＰＯＣＴデバイスを使用する。特に適切なデバイスとしては、以下のエレメントを含む：（１）規定したアレルゲンの混合物が１つ以上のスポットにスポットされ得る、多孔性の固体表面；（２）アッセイされるサンプルを加えるための、サンプル受容領域；（３）多孔性の表面を通って液体を引き出すための手段；および（４）結果を表示するための領域。特定の実施形態において、１つのエレメントは、１つ以上の他のエレメントの機能を果たし得る。例えば、サンプル受容領域は同じ領域、または、規定のアレルゲンの混合物がスポットされた領域とは異なる領域でであり得る。
【００１８】
この多孔性の第１部材は、アレルゲンの混合物が結合または固定され得る一方で、液体の流れが固定されたアレルゲンの混合物を通過させるのに十分な多孔性であり得る、任意の適切な材料から作製され得る。適切な材料としては、膜、フィルターなどが挙げられる。このような膜およびフィルターは、種々の材料から製造され得る。この種々の材料としては、例えば、プラスチック、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、繊維、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース、綿、およびＰＶＤＦ（ポリビニリデンフッ化物）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知であるか、または以下の実施例で記載されるような任意の手段によって、このアレルゲンの混合物は多孔性部材上にスポット（すなわち、固定）され得る。
【００１９】
１つ以上のコントロールはまた、免疫アッセイの適切な操作を確実にするために、多孔性部材上にスポットされ得る。好ましくは、このコントロールスポットは、デバイス上の領域にあり、アッセイ試薬と接触し、そして生じたＩｇＥ検出試薬の結合を示す役目をする薬剤を含む。陽性コントロールとして有用な薬剤としては、例えば、精製された、ポリクローナルまたはモノクローナルＩｇＥ、ＩｇＥレセプター、あるいはそれらの活性フラグメント、抗ＩｇＥ免疫グロブリン、抗ＩｇＧ免疫グロブリン、プロテインＡ、上記分子のいずれかのミメトープ、または、ＩｇＥ検出試薬の多孔性部材への結合を生じる任意の他の分子が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「ミメトープ」とは、ＩｇＥに結合する抗ＩｇＥ抗体の能力を模倣し得る、任意の化合物をいう。ミメトープの１つの例は、分解に対する感受性を減少するが、なおもＩｇＥ検出試薬に結合する能力を維持するように改変されたペプチドであり得る。ミメトープの他の例としては、糖質ベースの化合物、脂質ベースの化合物、核酸ベースの化合物、天然の有機化合物、合成的に誘導した有機化合物、抗イディオタイプの抗体、および／または触媒作用抗体、あるいはそれらのフラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。ミメトープは、例えば、ＩｇＥ検出試薬に結合し得る化合物に関する合成化合物のライブラリーをスクリーニングすることにより入手し得る。当業者に公知の、手順のコントロール（例えば、ビオチン化ＢＳＡを含む）はまた、多孔性部材上にスポットされ得る。この多孔性の第１部材はさらに、サンプル受容領域も含む。既に記述されているように、このサンプル受容領域は、アレルゲンの混合物が、スポットされるのと同じ領域であり得るか、または、所望の形式に依存する多孔性部材上の異なる位置であり得る。プレフィルターは、必要に応じてサンプルに使用され得る。このプレフィルターは、サンプル受容領域に濾過サンプル（例えば、血清を採取するための全血を含む）を導入する前に好ましく濾過される。このようなサンプルは、プレフィルターデバイス中の本発明のデバイスから別々に濾過され得るか、または、プレフィルターデバイスがサンプル受容領域上に位置付けられ得、そして所望される場合、サンプルが予備濾過された後にプレフィルターが除去または処分され得る。
【００２０】
本発明のこのデバイスは、必要に応じて、液体が吸収性部材を横切ることを可能にする多孔性部材に接続された毛細管経路を有する吸収性部材を含む。従って、この吸収性部材は、多孔性部材と毛細管連絡しており、そして、外部手段を使用することなく第１の多孔性部材を通る液体の流れを誘導する大きさの毛細管の管孔を有する。この吸収性部材は、アッセイで使用されるサンプルとそれに続く試薬の静水圧がその第一部材を通る流れを誘導するに不十分である場合に、特に有用である。さらに、その吸収性部材はまた、第一部材の支持を提供し得る。
【００２１】
当業者は、吸収性部材および他の支持部材として有用な、適切な材料を容易に識別し得る。従って、本発明のこのデバイスは、当業者に公知の任意の標準的形式であり得、例えば、ラテラルフローデバイス（米国特許第５，０７３，４８４号または米国特許第５，６５４，１６２号に記載されている（これらの両方は、本明細書中で参考として援用される））、フロースルーデバイス（米国特許第４，７２７，０１９号に記載されている（本明細書中で参考として援用される））、または当業者に容易に認識または決定されるこのようなデバイスの任意の改変物が挙げられる。
【００２２】
動物から採取されたサンプル中でのアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するための本発明の方法は、一般に、上記のデバイスのサンプル受容領域にサンプルを最初に加えることにより達成される。サンプルがテストスポット（ここでアレルゲンの混合物が多孔性部材上にスポットされる）と接触した後、アレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する試薬が加えられ、そしてテストスポットと接触し得る。次いで、サンプル中に結合したアレルゲン特異的ＩｇＥが存在する場合、検出される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「動物」とは、検出可能な量のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在により引き起こされるアレルギー疾患有し得る任意の哺乳動物をいう。このような動物としては、好ましくは、ヒト、イヌ、ネコ、およびウマが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ネコは、飼い（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）ネコ、野生のネコ、および動物園のネコを含む、ネコのファミリーの任意のメンバーをいう（すなわち、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ））。ネコの例としては、飼いネコ、ライオン、トラ、ヒョウ（ｌｅｏｐａｒｄ）、ヒョウ（ｐａｎｔｈｅｒ）、クーガー、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チーター、およびサーバルキャットが挙げられるが、これらに限定されない。テストするための好ましいネコは、飼いネコ（家ネコ）である。本明細書中で使用される場合、イヌは、イヌ科（Ｃａｎｉｄａｅ）のファミリーの任意のメンバーをいい、飼いイヌ、野生のイヌ、キツネ、オオカミ、ジャッカル、およびコヨーテ、ならびにイヌ科のファミリーの他のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、ウマは、ウマ科の動物をいう。ウマ科の動物は有蹄類の哺乳動物であり、家畜の（ｄｏｍｅｓｔｉｃ）ウマおよび野生の馬（例えば、ウマ、ロバ（ａｓｓｅｓ）、ロバ（ｄｏｎｋｅｙ）、およびシマウマ）が挙げられるが、これらに限定されない。テストするための好ましいウマは、競走馬を含む家畜のウマである。
【００２４】
アッセイされるサンプルは、このような動物の体液から採取され得る。アレルゲン特異的ＩｇＥを含む任意の体液が使用され得、例えば、尿、粘膜の分泌物、乳、全血、またはその構成成分（例えば、血清および血漿）が挙げられる。体液のさらなる例は、米国特許第６，３０９，８３２号（本明細書で参考として援用される）中で見出され得る。体液はサンプルとして希釈されずに使用され得るか、またはサンプル受容領域にサンプルをアプライする前に適切な希釈剤中で所望されるように希釈され得る。当業者は、特定のアッセイに使用されるべき適切なサンプルを容易に決定し得る。
【００２５】
多孔性部材上に置かれた規定されたアレルゲンの混合物中で選択されるアレルゲンは、最少数のスポット（好ましくは１つのスポット）が、ＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を有する大部分の患者を同定するように、選択される。好ましくは、規定されたアレルゲンの混合物は、ＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を有する患者の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％を同定し得る。当業者は、関連する集団の所望の割合を同定し得る、規定されたアレルゲンの混合物を容易に決定し得る。例えば、所望の標的がＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を有する全ヒト患者の９０％である場合、当業者は、ヒトにおける全ＩｇＥ媒介性アレルギーの９０％を引き起こすことが集合的に公知であるアレルゲンの混合物を選択する。理想としては、アレルゲンの混合物は、最少数のアレルゲンが最大数の患者の同定を可能にするように選択される。本発明の種々の実施形態は、テストされるべき患者集団に基づいてアレルゲンの異なる混合物を有し得る。
【００２６】
アレルゲンは、抽出物、抽出物または原料（例えば、ダニもしくは花粉）より精製されたアレルゲンタンパク質、組換えアレルゲン、あるいは上記のそれらの組み合わせの形態であり得る。規定された混合物中における使用に適したアレルゲンの非限定的な例として、ネコアレルゲン（米国特許第５，３２８，９９１号；同第６，０１９，９７２号；同第６，０４８，９６２号；および同第６，１２０，７６９号）；イヌアレルゲン（米国特許第５，８４３，６７２号）；ノミ唾液タンパク質（米国特許第５，６４６，１１５号；同第５，７９５，８６２号；および同第５，８４０，６９５号）；チリダニアレルゲン（米国特許第５，４３３，９４８号；同第５，５５２，１４２号；同第５，７７０，２０２号；同第５，７７３，００２号；同第５，８２０，８６２号；同第５，９８６，５２６号；同第５，９７２，３５２号；同第６，０６０，０５７号；同第６，０７１，５２２号；同第６，０７７，５１８号；同第６，０８６，８９７号；同第６，１３２，７３４号；および同第６，０７７，５１７号）；日本スギ花粉（米国特許第６，０９０，３８６号）；ヒメモロコシアレルゲン（米国特許第５，４８０，９７２号；同第５，６９１，１６７号；および同第５，７３６，１４９号）；ブタクサアレルゲン（米国特許第５，６９８，２０４号）；ドクムギアレルゲン（米国特許第５，７１０，１２６号；同第５，８４０，３１６号；および同第５，９６５，４５５号）；メドーフェスキュー、カモガヤ、ギョウギシバ、ヒメスイバ、ホウキギ、ロシアアザミ、イエロードック、オオアワガエリ、コヌカグサ、およびイチゴツナギのアレルゲンが、挙げられる。さらなるアレルゲンを、米国特許第６，３０９，８３２号に見出し得る。上記の米国特許は、本明細書によって参考として援用される。
【００２７】
本発明の方法において、全てのアレルゲン特異的ＩｇＥと混合物中のアレルゲンのうちの１つ以上に結合可能にするために、スポットされたアレルゲンの混合物にサンプルが接触した後、次いでアレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する試薬を添加し、そしてその試薬を、どの結合したアレルゲン特異的ＩｇＥに対しても結合可能にする。語句「二次結合試薬」とは、「アレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する試薬」と互換可能に使用される。この二次結合試薬に結合したアレルゲン特異的ＩｇＥの検出は、サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を示す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、語句「アレルゲン特異的ＩｇＥに選択的に結合する」試薬とは、免疫アッセイの結果に実質的に影響する量では、その二次結合試薬がＩｇＧまたは別クラスの免疫グロブリンに結合しないように、その試薬が、ＩｇＧまたは別クラスの免疫グロブリンと比較して優先的にＩｇＥに結合することを意味する。例えば、適切な二次結合剤が、ＩｇＧより有意に大きな程度ＩｇＥに結合する（ＩｇＥに対して実質的により高い親和性を有する）。より好ましい実施形態において、この二次結合剤は、ヒトＩｇＥレセプターα鎖タンパク質により提示される特異性と同程度の特異性で、ＩｇＥに結合する。別の実施形態において、その二次結合剤は、既知の抗ＩｇＥ抗体がＩｇＥに結合する条件下では、ＩｇＧに結合不可能である。本発明の結合剤による免疫グロブリンの結合は、当業者に公知の手順（例えば、本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡ手順）を使用して測定され得る。特に好ましい実施形態において、その二次結合剤は、ＥＬＩＳＡにより測定した場合、３００、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、または１００未満の吸光度値でＩｇＧに結合する。適切な結合剤を選択する手引きは、以下の実施例において提供される。
【００２９】
この二次結合試薬は、ＩｇＥ、Ｆｃεレセプター１（ＦｃεＲ１）（本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，９４５，２９４号に記載される）、ＩｇＥ結合性アレルゲン、またはＩｇＥに選択的に結合する任意の分子に、選択的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。そのような抗体の一例は、肥満細胞および好塩基球に結合する抗体のみを認識する抗ＩｇＥ抗体である。本発明の好ましい抗体は、本明細書中に記載されるように、ヒトＦｃεＲＩα親和性精製されたＩｇＥを使用して生成される、ｍＡｂの特徴を有する。
【００３０】
好ましい実施形態において、その二次結合試薬は、ＩｇＥレセプター結合領域またはＩｇＥレセプター結合ドメインに選択的に結合する、モノクローナル抗体である。そのような抗体の非制限的な例としては、例えば、モノクローナル抗体であるＨ−２１９、Ｈ−１９５、Ｈ−２０２、Ｈ−２０３、およびＨ−２０７が挙げられる。種特異的抗体および種特異的レセプターは、その種より採取されたサンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出するために、特に有用である。例えば、イヌ抗ＩｇＥ抗体は、イヌより採取したサンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出するためのアッセイにおいて、二次結合試薬として有用である。
【００３１】
好ましい実施形態において、その二次結合試薬は、イヌ（Ｃａｎｉｎｅ）ＩｇＥに選択的に結合するモノクローナル抗体である。そのような抗体の非限定的な例としては、例えば、モノクローナル抗体であるＨ−２１９、Ｈ−２２０、Ｈ−１８９、Ｈ−１９０、Ｈ−１９５、Ｈ−１９７、Ｈ−２００、Ｈ−２０２、Ｈ−２０３、Ｈ−２０６、およびＨ−２０７が挙げられる。別の好ましい実施形態において、その二次結合試薬は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）ＩｇＥに選択的に結合するモノクローナル抗体である。そのような抗体の非限定的な例としては、例えば、モノクローナル抗体であるＨ−９９、Ｈ−１００、Ｈ−１０１、Ｈ−１０２、Ｈ−１０６が挙げられる。別の好ましい実施形態において、その二次結合試薬は、イヌＩｇＥおよびネコＩｇＥ両者に結合するモノクローナル抗体である。そのような抗体の非限定的な例としては、例えば、モノクローナル抗体であるＨ−２０１、Ｈ−１９２、Ｈ−１９８、Ｈ−１９９、Ｈ−２０８が挙げられる。別の好ましい実施形態において、その二次結合試薬は、ウマＩｇＥに選択的に結合するモノクローナル抗体である。そのような抗体の非限定的な例としては、例えば、モノクローナル抗体のＨ−３５７が挙げられる。
【００３２】
さらなる好ましい実施形態において、その二次結合試薬はＩｇＥレセプターである。語句「ＩｇＥレセプター」とは、全長のレセプター、およびその活性フラグメントが挙げられる。本明細書中で使用される場合、語句「その活性フラグメント」とは、規定された混合物中に含まれるアレルゲンによって捕捉されるアレルゲン特異的ＩｇＥに対して結合可能な結合部位を有する、全長のレセプター中のフラグメントを意味する。
【００３３】
一つの実施形態において、その二次結合試薬は、指示薬剤と直接的に結合され得るか、または指示薬剤で標識され得る。別の実施形態において、その二次結合試薬に結合可能または会合可能な指示薬剤は、別々に添加され得、そして検出され得る。当業者は、本発明における使用に適切な検出手段を、容易に同定し得る。
【００３４】
酵素、蛍光分子、放射性標識、または当業者に公知である他の検出可能なマーカーのような、任意の指示試薬または検出試薬が、使用され得る。酵素は、指示薬剤として特に有用である。標識が酵素である場合、結合していないレセプターを除去するための洗浄の後、酵素基質の溶液が添加される。そのデバイスが酵素に結合されたアレルゲン特異的ＩｇＥを有する場合、そのＩｇＥは、酵素に結合された、標識されたレセプターの一部を有する。その酵素は、基質を反応させ、そして適切に選択される場合、新規且つ容易に検出可能な酵素反応最終生成物を生じる。特に有用な最終生成物は、可視性の色の変化を生じる発色団である。酵素以外の標識が使用される場合、その手順は変わり得る。蛍光性標識が使用される場合、多孔性部材上の蛍光が、公知の方法により検出され得る。放射性核種標識（例えば、１２５Ｉ）が使用される場合、多孔性部材は取り外され得、そして計数され得る。
【００３５】
サンプル、二次結合試薬および所望される任意の洗浄緩衝液の添加の前に、アッセイの感度を増強させるために、サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥのより広範な結合を可能にするための、短いインキュベーション期間が行われ得る。しかし、本発明の好ましい方法において、そのようなインキュベーション工程は、不必要であるか、または非常に短い（すなわち、概して６０秒以下程度）。サンプルまたは二次結合試薬を含む溶液の流れは、流れの非存在下において観察されるよりも、実質的に速い結合速度を生じる。従って、試験の実施に要する合計時間は、約５分以下であり、好ましくは、約３分未満である。
【００３６】
本発明はまた、ＩｇＥ媒介性のアレルギー性疾患を有する動物において、免疫治療処置を処方する方法を提供する。そのような方法は、アレルギー性疾患の症状を有する動物よりサンプルを採取する工程、アレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するために、上記の免疫アッセイ方法に従いそのサンプルを分析する工程を包含する。アレルゲン特異的ＩｇＥがそのサンプル中で検出される場合、その後陽性サンプルがアレルギー性疾患の原因である１つ以上のアレルゲンを同定するためにさらに分析され、そして次いで適切な免疫治療がその動物に対して選択される。そのアレルギー性疾患の原因である特定のアレルゲンを同定するための、陽性サンプルのさらなる分析は、当業者に公知の任意の手段（例えば、基準研究機関において実施されるインビトロ免疫アッセイ、または皮内試験（例えば、従来の皮膚試験）を含む）により実施され得る。一旦、その特定のアレルゲンが同定されると、当該分野における熟達した診断医は、特定の患者に対して適切な免疫治療法を決定し得る。
【００３７】
本発明の方法を実施するためのキットもまた提供される。本発明のキットは、本発明のデバイスに加え、本発明の方法において使用される試薬を含む。そのような試薬は、洗浄緩衝液および検出試薬を含む。本発明の好ましい検出試薬としては、イヌＩｇＥに特異的に結合するモノクローナル抗体、ネコＩｇＥに特異的に結合するモノクローナル抗体、ウマＩｇＥに特異的に結合するモノクローナル抗体、およびヒトＩｇＥに特異的に結合するモノクローナル抗体が挙げられる。
【００３８】
以下の実施例は、例示を目的として提供され、そして本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００３９】
（実施例１）
本実施例は、スクリーニングのためのアレルゲンを選択する方法、およびそのデバイスを調製した方法を記載する。
【００４０】
本発明の方法は、注意深く規定されたアレルゲン混合物を用心して使用する。その混合物を、最小アレルゲンのパネルを用いて殆どのアレルギー個体を同定するために選択した。
【００４１】
譲渡人の米国診断研究機関からのデータを、多くのイヌがアレルギー性であるアレルゲンを同定するために分析した。ポイント・オブ・ケア・テストを、その診断研究機関で、完全なパネルの中で陽性結果を与える動物の７０％〜９０％を検出し、一方でそのポイント・オブ・ケア・テストにおいてアレルゲンの総数を少なく保つように、設計した。
【００４２】
総数２０００個を超えるサンプルを、いくつかの異なる組で分析した。そのサンプルを、アレルゲンの完全なパネルの中で試験し、そして約８０％がパネル中の少なくとも１つのアレルゲンに対して陽性であると評価を得た。（完全なパネルに対して陰性と評価を得た動物は、パネル中にはないアレルゲンに対してアレルギー性である動物であり得るか、または全くアレルギー性ではないが、むしろアレルギーに類似した症状を有する別の疾患を有し得る）。
【００４３】
それら８０％のうち、約６０％は、ノミまたはチリダニのどちらかに陽性である。動物のさらに１５％を加えるために、他の重要なアレルゲンが加えられ得る。候補の追加されるアレルゲンは、メドーフェスキュー、カモガヤ、アカスギ、イエロードック、オオアワガエリ、コヌカグサ、およびイチゴツナギである。異なるアレルゲンの組は、異なる地理的範囲および／もしくは異なる気候において、ならびに／または、異なる動物に対して（上記データはイヌに対してである）、所望され得る。所望されるアレルゲンの組を、標準または基準の研究機関の試験において検出される、アレルゲン特異的ＩｇＥの分析により、再度測定する。
【００４４】
他の領域からのデータを、類似の手順で分析した。８００個近くのイヌ（ｄｏｇ）血清を、屋内アレルゲンに対する抗体について分析した。チリダニは、最も普通のアレルゲンであり、そして貯蔵庫ダニおよびノミ唾液がそれに続く。チリダニ、貯蔵庫ダニおよびノミ唾液を用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、屋内パネル中で陽性である動物の９８％を検出し得た。
【００４５】
５００個を超えるイヌ血清を、英国の一般的な花粉について分析した；そのイヌの７２％が、カモガヤに対して陽性であった。その次の最も有力な花粉アレルゲンは、ハンの木、ヘラオオバコ、シロザ、およびヒメスイバであった。チリダニ、貯蔵庫ダニ、およびカモガヤまたは近縁の草本に由来するアレルゲンを用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、完全なパネル中で陽性である動物の９１％を検出し得た。
【００４６】
約３０個のイヌ血清を、中央ヨーロッパパネルについて分析した；そのイヌの１００％がチリダニまたは貯蔵庫ダニに対して陽性であった。チリダニおよび貯蔵庫ダニを用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、完全なパネル中にて、陽性である動物の１００％を検出し得た。
【００４７】
約５６個のイヌ血清を、北部ヨーロッパパネルについて分析した；そのイヌの６５％が、チリダニに対して陽性であった。その次の最も有力な花粉アレルゲンは、貯蔵庫ダニであり、コヌカグサおよびシラゲガヤがそれに続いた。チリダニおよび貯蔵庫ダニを用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、完全なパネル中にて、陽性である動物の９８％を検出し得た。
【００４８】
約１２２個のイヌ血清を、英国拡張花粉について分析した；そのイヌの５８％が、メドーフェスキューに対して陽性であった。その次の最も有力な花粉アレルゲンは、アメリカオオモミであった。メドーフェスキューを用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、完全なパネル中にて、陽性である動物の５８％を検出し得た。
【００４９】
約１０４個のイヌ血清を、地中海地方パネルについて分析した；そのイヌの５９％がチリダニに対して陽性であった。その次の最も有力なアレルゲンは、貯蔵庫ダニおよびノミ唾液であった。チリダニ、貯蔵庫ダニおよびノミ唾液を用いるポイント・オブ・ケア・デバイスは、完全なパネル中にて、陽性である動物の９７％を検出し得た。
【００５０】
本発明のデバイスおよび方法で使用するための正確なアレルゲンを決定するために、そのようなアレルゲンをポイント・オブ・ケア様式にて評価し、単離されたサンプルとしてよりもむしろ混合物としてアレルゲンが存在する場合に、その血清がなお陽性という評価を得ることを決定することもまた必要である。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、ポイント・オブ・ケア・デバイスは、メドーフェスキューアレルゲン、チリダニ（ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）アレルゲン、およびノミ唾液アレルゲンを含む、１つのアレルゲン混合物を多孔性部材にスポットすることにより調製する。これらアレルゲンの各々は、粗抽出物、精製された抽出物、および／または、遺伝子操作され組換え発現された純粋なタンパク質として、存在し得る。そのアレルゲン抽出物または組換えタンパク質を、特定のアレルゲンに依存して、約１，０００〜５００，０００ＰＮＵ／ｍｌ；または１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌで、多孔性部材上にスポットする。試験に必要とされる抽出物の濃度は、実験的に決定されなければならないが、同じアレルゲンまたは同じ抽出物を用いたＥＬＩＳＡ様式において使用された濃度と同じ濃度で、開始し得る。そのアレルゲンを、ＢＳＡを含まないスポット緩衝液（ＴＲＩＳ  ６．０５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ８．５ｇ／ｌ；ＮａＮ３  ２０ｍｇ／ｌ；およびショ糖  １０ｇ／ｌ）を用いて、多孔性部材上にスポットする。
【００５２】
イヌＩｇＥのスポットを、陽性コントロールとして異なる位置に加える。これを、ＢＳＡを含むスポット緩衝液（ＴＲＩＳ  ６．０５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ８．５ｇ／ｌ；ＮａＮ３  ２０ｍｇ／ｌ；ショ糖  １０ｇ／ｌ；およびＢＳＡ  １ｇ／ｌ）中で、１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜１０μｇ／ｍｌの濃度でスポットする。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、イヌＩｇＥのコントロールスポットに加えて、デバイス上に２つの試験スポットが存在し、１つはメドーフェスキューおよびチリダニを含み、そしてもう１つはノミ唾液タンパク質を含む。
【００５４】
（実施例２）
本実施例は、本質的にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（本明細書中で参考として援用される）の方法による、マウス抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を記載する。
【００５５】
イヌＩｇＥを、イヌ血清をプールし、硫安沈殿により分画することにより、調製した。３０〜５５％飽和からの画分を収集し、そしてプロテインＧカラムを通過させた。フロースルー画分を、ｒＨｕｍａｎ  ＩｇＥ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｆｆｉｐｒｅｐ（Ｂｉｏｒａｄ）カラムに適用した。保持されたＩｇＥを高ｐＨ溶出液を用いてカラムより回収した。複緩衝液交換カラムは、ＩｇＥをさらに精製した。ｐＨ５．７〜４．９５で溶出する画分をプールした。
【００５６】
二匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、リン酸緩衝化サリン（ＰＢＳ）中に懸濁した３０μｇのイヌＩｇＥおよびフロイント完全アジュバントを用いて、足趾に免疫した。１４日目に、３０μｇのイヌＩｇＥのブーストを、ＰＢＳ／フロイント不完全アジュバント中で、足趾に投与した。２１日目に、抗イヌＩｇＥ抗体の存在について、血清を試験した。ＥＬＩＳＡによりイヌＩｇＥに対して最も高い力価を示すマウスを、４２日目にＰＢＳ中の５μｇのイヌＩｇＥを静脈内にブーストした。３日後に脾臓細胞を収集し、そしてＰＥＧを用いて、対数増殖期中期のマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。
【００５７】
細胞を、２０％ウシ胎仔血清、１０％胸腺馴化培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および６０μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地中で、培養した。ハイブリッドを、１００μＭのヒポキサンチン、１０μＭのチミジン、および０．４μＭのアミノプテリンを添加することにより、選択した。ハイブリドーマのコロニーを含むウェルを、ＥＬＩＳＡによりイヌＩｇＥ、イヌＩｇＧ、およびイヌＩｇＭに対する特異的なｍＡｂ生産物について試験した。抗原を５ｎｇ／ウェルでコートした。イヌＩｇＥに対して陽性のウェルを増殖させ、そして安定なｍＡｂ分泌細胞が同定されるまで、限界希釈により希釈クローン化した。
【００５８】
モノクローナル抗体は、組織培養物上清、腹水、またはバイオリアクター上清のいずれかとして、粗製形態で提供される。特異的ｍＡｂを、これらの液体型のいずれかから、親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し得る。
【００５９】
ＥＬＩＳＡにより、イヌＩｇＥε鎖に反応性の２０種の抗体を、作製した。全てのｍＡｂは、ＥＬＩＳＡによって、イヌＩｇＥを認識し、そしてイヌＩｇＧもＩｇＭも認識しない。これらのうち、３種（Ｈ−１９８、Ｈ−１９９およびＨ−２０６）を除いた１５種が、ウエスタンブロットにより、７１ｋＤａのε鎖を認識する。そして２種（Ｈ−１９２およびＨ−２０４）が、さらに試験されるべきである。イヌＩｇＥを探索するためにこれらのｍＡｂを使用して、３種のウエスタンブロットのパターンが見られた；１つのｍＡｂの組（Ｈ−１９５、Ｈ−１９７、およびＨ−２０８）は、イヌＩｇＥの７１ｋＤａε鎖のみを認識する；第２のｍＡｂの組（Ｈ−１８９、Ｈ−１９０、Ｈ−１９１、Ｈ−１９３、Ｈ−２０３、Ｈ−２０７、Ｈ−２１９、およびＨ−２２０）は、イヌＩｇＥの７１ｋＤａε鎖、および色素の先端のちょうど上に泳動するバンド（約６ｋＤａに）を認識する；第３のｍＡｂの組（Ｈ−２００、Ｈ−２０１、Ｈ−２０２、およびＨ−２０５）は、イヌＩｇＥの７１ｋＤａε鎖、および５５ｋＤａにある広く拡散したバンドを認識する。この第３のｍＡｂの組は、イヌＩｇＧγ鎖を認識せず、このことは、余分なバンドがイヌＩｇＧの混入物ではないことを示唆する。この興味深い結合ドメインは、イヌＩｇＥε鎖といくらか関係を有するようである。１つのｍＡｂ（Ｈ−２０４）を除いた全てを評価した。そしてこれらｍＡｂのうち５つ（Ｈ−１９１、Ｈ−１９２、Ｈ−１９８、Ｈ−１９９、およびＨ−２０８）が、ＥＬＩＳＡによって、イヌＩｇＥよりもずっとよくネコＩｇＥを認識し、そしていくつかの場合では、イヌＩｇＥとの反応性が全く検出できなかった。１つのｍＡｂ（Ｈ−２０１）は、イヌＩｇＥと同程度によくネコＩｇＥを認識した。
【００６０】
抗体を、ＥＬＩＳＡの反応性パターンに基づいて、９つのカテゴリーにグループ化した。各々のグループ由来の最も高い力価のｍＡｂを精製し、そしてイヌＩｇＥ検出ＰＯＣＴ候補（Ｈ−１８９、Ｈ−１９９、Ｈ−２００、Ｈ−２０１、Ｈ−２０４、Ｈ−２０５、Ｈ−２０６、Ｈ−２０７、およびＨ−２０８）としてスクリーニングした。これらのｍＡｂより、Ｈ−２００、Ｈ−２０１およびＨ−２０７を選択した。これら３つのｍＡｂを用いたさらなる試験は、Ｈ−２０７が、ＰＯＣＴにおいて利用されるために好ましいｍＡｂであることを示した。
【００６１】
上に述べた抗体を、イヌ血清、ＰＢＭＣまたは血液でさえ有り得るような、複雑なサンプル中にて存在するイヌＩｇＥの様々なレベルを検出するために、様々なアッセイ形態にて利用し得る。これらの抗体は、総血清ＩｇＥを計算するために、ヒトＦｃεＲＩαと組み合わせてうまく機能する。適切な標準物を用いて、イヌＩｇＥレベルを容易に測定し得、そして免疫刺激、アレルゲン曝露などの様々な場に対して、比較し得る。抗イヌＩｇＥ  ｍＡｂのさらなる用途として、親和性クロマトグラフィー方法によるイヌＩｇＥの精製および／またはイヌＩｇＥ免疫複合体の精製を簡略化する用途が挙げられる。ε鎖特異的なｍＡｂの使用は、従来のクロマトグラフィー方法と比較した場合、血清のようなサンプル供給源からイヌＩｇＥを簡単に、そしてより直ちに除去する。他の使用としては、精製工程中のインタクトなイヌＩｇＥε鎖の分離をモニターすることが挙げられる。細胞表面ＩｇＥを位置付け、精製プロセスの間にインタクトなイヌＩｇＥε鎖を確認するためにこれらの抗体を使用することにより、フローサイトメトリー研究を実施し得る。細胞表面のＩｇＥを位置付けて、そしてＦｃεＲＩαベースの結果の妥当性を確認するために、これら抗体を使用して、フローサイトメトリー研究を実施し得る。さらに、抗イヌε鎖ｍＡｂを、アレルギー性イヌに対する免疫治療のために使用し得る。
【００６２】
マウス抗ネコＩｇＥｍＡｂ、マウス抗ウマＩｇＥｍＡｂ、およびマウス抗ヒトＩｇＥｍＡｂとは、上記と同じ方法にて作製する。そのｍＡｂをまた、上に記載した使用のためのモノクローナル抗体を調製するための標準的な方法によって、マウス以外の動物で調製し得る。
【００６３】
（実施例３）
本実施例は、抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体が、以下のプロトコールを使用して固相ＥＬＩＳＡによって測定されるように、抗原特異的なイヌＩｇＥまたはネコＩｇＥに結合する能力を開示する：
マイクロタイタープレートのウェルを、ＣＢＣ緩衝液（５０ｍＭ炭酸、ｐＨ９．６）に希釈した、Ｄｅｒ  Ｆタンパク質（３０タンパク質窒素単位（ＰＮＵ／ウェル））（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．）、ノミ唾液抗原（ＦＳＡ）（１００ｎｇ／ウェル）（米国特許第５，６４６，１１５号に記載されるように調製した）またはイヌＩｇＧ（１μｇ／ウェル）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）のいずれかでコートし、そのプレートを、４℃で、一晩保存し、カバーした（ＩｇＧでコートされたウェルは、非特異的イムノグロブリン結合のレベルを測定するために供する）。次の日、過剰の流体を、ウェルから除去し、そのウェルを水気をとって乾燥し、そして２００μｌのアッセイ緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の４％ウシ胎仔血清）を各々のウェルに添加した。室温（ＲＴ）での６０分のインキュベーションの後、そのウェルを、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）を用いて４回洗浄し、そして各々のウェルに１００μｌのイヌ血清またはネコ血清（アッセイ緩衝液に１：２０に希釈した）を添加した。いくつかのウェルに、使用前に５６℃で１時間加熱した血清（標識された「加熱血清」）を供した（この手順は、ＩｇＥ−Ｆｃレセプター結合領域を変性させ、実施者に、この領域内またはこの領域の近くで、どの抗体がＩｇＥに結合するかを決定させ得ることが知られている）。そのプレートを４℃で一晩インキュベートし、その後ウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして示されるようにアッセイ緩衝液に希釈した、抗イヌＩｇＥハイブリドーマ細胞（実施例２に記載されるように調製した）由来の１００μｌの上清を、各々のウェルに添加した。そのプレートを、室温で２時間インキューベートし、その後、そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そしてアッセイ緩衝液中に１：２０００で希釈した、１００μｌのＨＲＰ結合体化ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、各々のウェルに添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、各々のウェルに添加した。このプレートを、ウェル中に色が発生するまで（約１０分間）、室温でインキュベートし、その時点で、各々のウェルに、１００μｌの１．０Ｍリン酸を添加することによって、反応を停止させた。非特異的結合のバックグラウンドレベルを、イヌ（Ｃａｎｉｎｅ）血清またはネコ血清を添加しなかったこと以外は、上記のようにウェルを調製することによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、各々のウェルの最適な密度を、４５０ｎＭで測定し、その結果を、表１に示した。吸光度のバックグラウンドレベルを、表１に示された全ての値から引いた。１００より高い値を、陽性とみなす。
【００６４】
【表１】
2004521336.tif 000002
2004521336.tif 000003
（実施例４）
抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体が、固定化されたヒトＦｃ−εレセプターＩ−α鎖によって結合されているイヌＩｇＥまたはネコＩｇＥに結合する能力を、以下の捕捉アッセイプロトコールを用いて試験した。
【００６５】
マイクロタイタープレートのウェルを、ＣＢＣ緩衝液中のヒトＦｃ−εレセプターＩ−α鎖タンパク質の細胞外ドメイン（ｈｕＦｃεＲＩα）（米国特許第５，９４５，２９４号に記載されるように調製した）（４２．５ｎｇ／ウェル）でコートし、そしてそのプレートをインキュベートし、カバーし、４℃で一晩インキュベートした。さらに、複数のウェルも、熱処理したイヌＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（１μｇ／ウェル）でコートし、非特異的イムノグロブリン結合のバックグラウンドレベルを測定した。熱処理は、汚染ＩｇＥの活性を特異的に破壊すると考えられている。
【００６６】
次の日、過剰の流体を、ウェルから除去し、２００μｌのアッセイ緩衝液を各々のウェルに添加し、そしてそのプレートを室温で１時間インキュベートした。そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして各々のウェルに精製したイヌＩｇＥまたはネコＩｇＥ（実施例２に記載されるように調製した）を添加した（１００μｌのアッセイ緩衝液中の５０ｎｇ／ウェル）。室温での２時間のインキュベーションの後、そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして記載されるようにアッセイ緩衝液中に希釈した、１００μｌの抗イヌＩｇＥハイブリドーマ細胞上清（実施例２に記載されるように調製した）を、各々のウェルに添加した。そのプレートを、室温で１時間インキュベートし、そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そしてアッセイ緩衝液中に１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ結合体化ロバ抗マウスＩｇＧを、各々のウェルに添加した。そのプレートを、室温で１時間インキューベートし、その後、そのウェルを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして１００μｌのＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、各々のウェルに添加した。そのプレートを、ウェル中に色が発生するまで（約１５分間）、室温でインキュベートし、その時点で各々のウェルに、１００μｌの１．０Ｍリン酸を添加することによって反応を停止させた。各々のウェルの最適な密度を、４５０ｎＭでＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定し、その結果を、表２に示した。バックグラウンドの吸光度を、いずれのｍＡｂも添加せずに、上記のようにいくつかのウェルを調製することによって測定し、バックグラウンドレベルを、表１に列挙される全ての値から引いた。１００より高い値を、陽性とみなす。
【００６７】
【表２】
2004521336.tif 000004
（実施例５）
本実施例は、抗ネコＩｇＥモノクローナル抗体が抗原特異的なイヌＩｇＥまたはネコＩｇＥに結合する能力を開示する。抗ネコＩｇＥを産生するハイブリドーマ細胞株を、マウスをイヌＩｇＥのかわりにネコＩｇＥを用いて免疫することを除いて、実施例２に記載される手順を用いて産生した。ＥＬＩＳＡを、実施例３に概説される固相ＥＬＩＳＡプロトコールを用いて実施し、そして抗イヌＩｇＥハイブリドーマの上清に代わり、抗ネコＩｇＥハイブリドーマの上清を使用した。さらに、非特異的イムノ（免疫）グロブリン結合のバックグラウンドレベルを測定するために、イヌＩｇＧの代わりにネコＩｇＧを用いて、いくつかのウェルをコートした。これらのＥＬＩＳＡの結果を表３に示す。吸光度のバックグラウンドレベルを表に示される全ての値から引いた。１００より高い値を、陽性とみなす。
【００６８】
【表３】
2004521336.tif 000005
本実施例は、これらの全てのｍＡｂがネコＩｇＥを認識することを示す。８種類のｍＡｂのうち５種類は、ネコＩｇＥに特異的であるが、一方、２種類のｍＡｂはネコＩｇＥおよびネコＩｇＧの両方を認識し、そして１種類のｍＡｂは、ネコＩｇＥ、ネコＩｇＧ、およびイヌＩｇＥに結合する。
【００６９】
（実施例６）
本実施例は、抗ネコＩｇＥモノクローナル抗体がｈｕＦｃεＲＩα固定化された、イヌＩｇＥまたはネコＩｇＥに結合する能力を開示する。本実施例は、抗イヌＩｇＥハイブリドーマ細胞上清の代わりに抗ネコＩｇＥハイブリドーマ細胞上清を用いることを除いて、実施例４に記載される捕捉アッセイプロトコールを用いる。このアッセイの結果を、以下の表４に示す。
【００７０】
【表４】
2004521336.tif 000006
（実施例７）
本実施例は、組換え産生されたウマＦｃＲεＲＩα（ＥｑＦｃＲεＩα）の精製のための方法を開示する。組換えＥｑＦｃＲεＩαを発現する培養物を米国特許第６，０５７，１２７号に記載されるように産生し、そしてその上清を収集し、そして２．２ｍｖの導電率および６．０のｐＨに調整した。そのサンプルを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＮａ−ＰＯ４、ｐＨ  ６．０）を用いて事前に平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉ−Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ、ＮＪ）にアプライした。サンプルのアプライの後に、そのカラムを緩衝液Ａを用いて洗浄し、そして結合されているタンパク質を、緩衝液Ａ中の０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および１．０Ｍ  ＮａＣｌの段階勾配を用いて、溶出した。０．２Ｍで溶出した、ＥｑＦｃεＲＩαを含む画分を、プールし、濃縮し、そしてＰＢＳで平衡化されているＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３０カラムにアプライした。０．５ｍｌの画分を収集し、そして製造者の指示に従って、Ｎｏｖｅｘ  １４％  ＳＤＳ−ＰＡＧｅ  ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて分析し、ＥｑＦｃεＲＩαを含む画分をプールした。
【００７１】
（実施例８）
本実施例は、固相ＥＬＩＳＡを用いて、抗ウマＩｇＥモノクローナル抗体Ｈ３５７が抗原結合ウマＩｇＥを認識する能力を開示する。マウスをイヌＩｇＥの代わりにウマＩｇＥで免疫することを除いて、ｍＡｂ  Ｈ−３５７を、実施例２に概説される手順を用いて産生した。その後、Ｈ−３５７は、ウマＩｇＥに特異的であることが示された。ＥＬＩＳＡを、以下のプロトコールを用いて実施した：  マイクロタイタープレートのウェルを、示されたアレルゲンでコートし、そのプレートを、４℃で、一晩インキュベートした（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｓより得、そして３０アレルギー単位（ＡＵ）／ウェルでコートした）を除いて、全てのアレルゲンを、Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｌｅｎｏｉｒ、Ｎ．Ｃ．から得、３０ＰＮＵ／ウェルでコートした）。次の日、過剰の流体を除去し、各々のウェルに２００μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そしてそのプレートを、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。そのプレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして各々のウェルに１００μｌのウマ血清（アッセイ緩衝液中に１：２０で希釈した）を添加し、そのプレートを、４℃で、一晩インキュベートした。次の日、そのプレートを洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そしてそのウェルに、ビオチン化抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂ  Ｈ３５７（１０ｎｇ）、ビオチン化組換えヒトＦｃεレセプターＩα鎖（ｈｕＦｃεＲＩα）（１３ｎｇ）（米国特許第５，９４５，２９４号に記載されるように調製した）またはビオチン化組換えウマＦｃεレセプターα（ＥｑＦｃεＲＩα）（１３ｎｇ）（実施例７に記載されるように調製した）のいずれかを添加した（全ての分子を、ビオチン−ＬＣ−ヒドラジンを用いる標準的な手順に従いビオチン化した）。そのプレートを、室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化ストレプトアビジン（５０ｎｇ／ウェル）（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ）を各々のウェルに添加し、そしてこのプレートを室温で１時間インキュベートした。コントロールウェルを、抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂもＩｇＥレセプターも用いなかったこと以外は、上記のように調製した。そのプレートを、洗浄緩衝液を用いて洗浄し、各々のウェルに１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｍｏｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）を添加し、そしてこのプレートを室温で１時間インキュベートした。呈色反応を、各々のウェルに、５０μｌの２０ｍＭ  Ｌ−システインを添加することによって停止し、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎＭで吸光度を測定した。バックグラウンド値を引いた、その結果を、表５に示す。
【００７２】
【表５】
2004521336.tif 000007
このデータは、ＩｇＥを検出するためにＨ−３５７が用いられた場合に得られた吸光度が、ヒトＦｃεＲＩαまたはウマＦｃεＲＩαのいずれかが用いられた場合に観察された吸光度と類似することを示す。
【００７３】
（実施例９）
本実施例は、ウマＩｇＥに対する抗ウマＩｇＥモノクローナル抗体Ｈ−３５７の特異性を開示する。マイクロタイタープレートのウェルを、ＣＢＣ緩衝液中のウマＩｇＥ、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥまたはヒトＩｇＥを５０ｎｇ／ウェルで用いてコートし、そしてこのプレートを、４℃で一晩インキュベートした。過剰の流体を、除去し、各々のウェルに２００μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そしてこのプレートを、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、そして各々のウェルに、５０μｌの連続希釈した（アッセイ緩衝液中に、４００〜３．１ｎｇ／ｍｌ）ビオチン化抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂ（ビオチン−ＬＣ−ヒドラジンを用いる標準的手順によってビオチン化した）を添加した。このプレートを、室温で、２時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液を用いて、４回洗浄した。各々のウェルに、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジン（ＫＰＬ  Ｌａｂｓ）を添加し（１０ｎｇ／ウェル）、そしてこのプレートを、室温で１時間インキュベートした。コントロールウェルを、抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂの添加しなかったこと以外は、上記のように調製した。このプレートを、洗浄緩衝液を用いて洗浄し、各々のウェルに１００μｌのＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍを添加し、そしてこのプレートを室温で、５分間インキュベートした。この呈色反応を、各々のウェルへの１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の添加によって停止し、そしてその吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎＭで読み取った。その結果を、表６に示す。バックグラウンドレベルを、示した値から引き、１００より高い全ての値を、陽性とみなす。
【００７４】
【表６】
2004521336.tif 000008
本実施例は、ｍＡｂ  Ｈ−３５７がイヌＩｇＥ、ネコＩｇＥまたはヒトＩｇＥよりも、ウマＩｇＥに対して非常に高い特異性を有することを示す。
【００７５】
（実施例１０）
本実施例は、ｈｕＦｃεＲＩαが種々の種由来の表面結合ＩｇＥに結合する能力を開示する。このアッセイを、表面結合ＩｇＥを検出するために、抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂの代わりにビオチン化ｈｕＦｃεＲＩαを用いることを除いて、実施例９に概説される基本的なプロトコールを用いて実施した。さらに、各々のウェルを、５０ｎｇのＩｇＥの代わりに１００ｎｇのＩｇＥを用いてコートし、レセプターの濃度を、変化させ、そしてｈｕＦｃεＲＩαを伴うインキュベーション時間を、１時間に短縮した。バックグラウンドレベルを、ｈｕＦｃεＲＩαを除く全ての試薬を用いてコントロールウェルを調製することによって測定した。このアッセイの結果を、表７に示す。バックグラウンド値を、表に示される値から引いた。
【００７６】
【表７】
2004521336.tif 000009
このデータは、ｈｕＦｃεＲＩαがヒト由来ＩｇＥ、イヌ由来ＩｇＥ、ネコ由来ＩｇＥ、およびウマ由来ＩｇＥを等しい親和性で認識し得ることを示した。
【００７７】
（実施例１１）
本実施例は、本発明の種々のモノクローナル抗体のアイソタイプを開示する。アイソタイプを、製造者の指示に従い、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｋｉｔ（マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて決定した。これらの試験の結果を、以下の表８に示す。
【００７８】
【表８】
2004521336.tif 000010
（実施例１２）
本実施例は、ＥｑＦｃεＲＩαが、種々の種由来の表面結合ＩｇＥに結合する能力を開示する。このアッセイを、表面結合ＩｇＥを検出するために、抗ウマＩｇＥ  ｍＡｂの代わりにビオチン化ＥｑＦｃεＲＩαを用いることを除いて、実施例９に概説される基本的なプロトコールを用いて実施した。さらに、各々のウェルを、５０ｎｇのＩｇＥの代わりに１００ｎｇのＩｇＥを用いてコートし、レセプターの濃度を、変化させ、そしてＥｑＦｃεＲＩαを伴うインキュベーション時間を、１時間に短縮した。バックグラウンドレベルを、ＥｑＦｃεＲＩαを除く全ての試薬を用いてコントロールウェルを調製することによって測定した。このアッセイの結果を、表８に示す。バックグラウンド値を、表９に示される値から引いた。
【００７９】
【表９】
2004521336.tif 000011
このデータは、ＥｑＦｃεＲＩαが、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ、およびウマＩｇＥと高い親和性で結合するが、ヒトＩｇＥに対しては、非常に低い親和性を有することを示す。
【００８０】
（実施例１３）
本実施例は、本発明のイムノアッセイを実施するための一般的なプロトコールを提供する。
【００８１】
使用の直前に、そのデバイスを、２滴の洗浄緩衝液（ＴＲＩＳ  ６．０５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ８．５ｇ／ｌ；ＮａＮ３  ２０ｍｇ／ｌ；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２．５ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ  ２０  ５．０ｍｌ／ｌ；そして濃ＨＣｌで７．５±０．１にｐＨ調整した）で湿潤させる。その２滴を、連続的に添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る（ｐｒｏｃｅｅｄ）前に吸収され得る。
【００８２】
次いで２滴のサンプル（未希釈）を、続けて添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。次いで、２滴の洗浄緩衝液を一度に添加し、そしてその滴下は、実施前に吸収され得る。
【００８３】
次いで、２滴のビオチン化マウス抗イヌＩｇＥを続けて添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。次いで２滴の洗浄緩衝液を、一度に添加し、その滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。
【００８４】
次いで２滴のストレプトアビジン−アルカリホスフェートを続けて添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。次いで２滴の洗浄緩衝液を一度に添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。
【００８５】
次いで、２滴の酵素基質を続けて添加し、そしてその滴下は、次の工程に移る前に吸収され得る。最短で３０秒待機し、次いで、４滴の洗浄緩衝液を続けて添加する。結果は、すぐに読み取ることができ、そして２時間安定である。
【００８６】
本発明の代替的な実施形態において、その検出試薬は、イムノゴールド、または蛍光化合物もしくは放射性化合物のような別の指示試薬であり、そしてその結果を読み取る方法は、適切に変化する。
【００８７】
本発明は、現在の好ましい実施形態に関連して記載されたが、種々の改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に理解され得る。従って、本発明は、上記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【国際公開パンフレット】
2004521336.tif 000012
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004521336.tif 000048
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