(57)【要約】本発明は、哺乳動物の心臓のような固形器官を含む細胞に対して、核酸の効率的な送達を可能にする方法および組成物を提供する。この方法および組成物は、心臓のような固形器官全体の大部分の細胞に対する効率的な遺伝子導入および引き続きの発現を可能にする。本発明の方法および組成物は、好ましくは内皮細胞層に有意な劣化又は傷害を与えることなく、標的細胞への遺伝子導入を増進させる、脈管透過性の増大を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を投与して、目的の組織中の細胞にポリペプチドを提供するための方法であって、当該方法は以下：
ホスホジエステラーゼインヒビター化合物を用いて当該組織を処理する工程；および
当該組織に外来性の核酸を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記組織が、脈管透過性を増大するために前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織が、脈管透過性を増大するために前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物とは異なるさらなる試薬で処理される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が低カルシウムイオン濃度条件下で投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が低カルシウムイオン濃度溶液で処理される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が灌流によって投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸の灌流液が再循環され、次いで器官または細胞塊を通じて再投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記ホスホジエステラーゼ化合物に加えて、前記透過剤が投与され、そして当該透過剤がセロトニン、ブラジキニン、血小板活性化剤、プロスタグランジンＥ１、ヒスタミン、血管内皮増殖剤、閉鎖帯毒素、インターロイキン２、血漿キニン、Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン、またはＬ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステルである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここでさらなる透過剤が標準的な透過性アッセイにおいてブラジキニンの透過性活性の少なくとも約５％を示す、方法。
【請求項１０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物が、前記核酸の投与前に前記組織の脈管系を通じて灌流される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、ここで低カルシウムイオン濃度溶液が、前記核酸の投与前に前記組織の脈管系を通じて灌流される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで約５００μｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウムイオン濃度を有する流体を、前記組織の脈管系を通じて灌流することによって、低カルシウムイオン濃度条件が提供される、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記核酸が、約１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上の濃度で溶液中のウイルスベクターとして投与される、方法。
【請求項１４】
前記核酸が固形細胞塊に投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が固形器官に投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が心臓、肺、腎臓、精巣、卵巣、骨格菌、腎臓、脳、または脾臓の細胞に投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が心臓組織である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織が肝臓組織である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が悪性細胞を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が固形腫瘍に投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織が哺乳動物である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸がエキソビボで投与される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸がインビボで投与される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸がヒトに投与される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が家畜類、家禽類、またはイヌもしくはネコに投与される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
標的された組織において、悪性細胞中において、または悪性細胞に近接して遺伝子産物を生成するための方法であって、以下：
ホスホジエステラーゼインヒビター化合物を用いて当該組織を処理する工程；および
当該組織に外来性の核酸を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物処理が、前記処理された組織の脈管透過性を増大する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が低カルシウムイオン濃度条件下で投与される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
固形腫瘍が悪性細胞を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記悪性細胞が、被験体の肺、肝臓、前立腺、脳、精巣、または卵巣に存在する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸が、灌流によって投与される請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が哺乳動物に投与される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸が霊長類に投与される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸がヒトに投与される、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ドナー細胞に対して外来性である核酸を含む当該ドナー細胞を、レシピエント被験体に対して提供する方法であって、以下：
ホスホジエステラーゼ化合物を用いて当該ドナー細胞を含む組織を処理して、外来性核酸の脈管透過性を増大する工程；
当該組織に核酸を投与する工程；および
当該ドナー細胞を当該レシピエント被験体に導入して当該核酸の遺伝子産物を提供する工程；
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ドナー細胞を含む器官が、前記レシピエント被験体に移植される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ドナー細胞が、スワイン（ブタ類）の細胞または霊長類の細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記組織が、ホスホジエステラーゼ化合物とは異なる脈管透過剤を用いて処理されて、脈管透過性を増大される、方法。
【請求項３９】
請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法であって、前記組織が、低カルシウムイオン濃度溶液を用いて処理されて、脈管透過性が増大される、方法。
【請求項４０】
前記核酸が、低カルシウムイオン濃度条件下で投与される、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子産物が、前記レシピエント被験体の免疫系によるドナー細胞の認識を減弱する、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ドナー細胞が、哺乳動物に導入される、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ドナー細胞がヒトに導入される、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物が、シルデナフィル、ザプリナスト、またはＴ−１０３２である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物は、その一般式が下記に記載されている一般式Ｉ〜ＸＩＩのいずれか１つによって示される、方法。
【請求項４６】
一酸化窒素またはｃＧＭＰの活性化剤が投与される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＶＥＧＦ、ニトログリセリン、ニトロプルシド、または８−Ｂｒ−ｃＧＭＰが投与される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
核酸を投与して、目的の組織中の細胞にポリペプチドを提供するための方法であって、以下：
一酸化窒素またはｃＧＭＰの活性化剤を用いて当該組織を処理する工程；および
当該組織に外来性核酸を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項４９】
薬学的キットであって、以下：
ホスホジエステラーゼインヒビター化合物を含む透過剤と；
被験体への投与のための核酸と；
を備える、キット。
【請求項５０】
約５００μｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウムイオン濃度を有する溶液をさらに含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記核酸の送達のためのデバイスをさらに含む、請求項４９または５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記送達デバイスがカテーテルである、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記核酸が、ウイルスベクターとして前記キットに存在する、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記キットが、前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物に加えて透過剤をさらに含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
前記キットが、一酸化窒素またはｃＧＭＰの活性化剤を含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
請求項５４または５５に記載のキットであって、前記さらなる透過剤が、セロトニン、ブラジキニン、ＶＥＧＦ，血小板活性化剤、プロスタグランジンＥ１、ヒスタミン、血管内皮増殖剤、閉鎖帯毒素、インターロイキン−２、血漿キニン、Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン、Ｌ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステル、ニトログリセリン、ニトロプルシド、または８−Ｂｒ−ｃＧＭＰである、キット。
【請求項５７】
処理溶液であって、以下：
ａ）ホスホジエステラーゼインヒビター化合物と；
ｂ）核酸と；
を含む、溶液。
【請求項５８】
前記溶液が低いカルシウムイオン濃度を有する、請求項５７に記載の処理溶液。
【請求項５９】
前記溶液が約５００μｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウムイオン濃度を有する、請求項５７に記載の処理溶液。
【請求項６０】
前記処理溶液が、前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物に加えて透過剤をさらに含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の処理溶液。
【請求項６１】
前記処理溶液が、一酸化窒素またはｃＧＭＰの活性化剤を含む、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の処理溶液。
【請求項６２】
請求項６０に記載の処理溶液であって、前記さらなる透過剤が、セロトニン、ブラジキニン、ＶＥＧＦ，血小板活性化剤、プロスタグランジンＥ１、ヒスタミン、血管内皮増殖剤、閉鎖帯毒素、インターロイキン−２、血漿キニン、Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン、Ｌ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステル、ニトログリセリン、ニトロプルシド、または８−Ｂｒ−ｃＧＭＰである、処理溶液。
【請求項６３】
流体キャリア中の核酸、およびホスホジエステラーゼインヒビター化合物を含む、処理溶液。
【請求項６４】
前記キットが、前記ホスホジエステラーゼインヒビター化合物に加えて透過剤をさらに含む、請求項６３に記載の処理溶液。
【請求項６５】
前記キットが、一酸化窒素またはｃＧＭＰの活性化剤を含む、請求項６３、または６４に記載の処理溶液。
【請求項６６】
請求項６３に記載の処理溶液であって、前記さらなる透過剤が、セロトニン、ブラジキニン、ＶＥＧＦ，血小板活性化剤、プロスタグランジンＥ１、ヒスタミン、血管内皮増殖剤、閉鎖帯毒素、インターロイキン−２、血漿キニン、Ｌ−Ｎ−モノメチルアルギニン、Ｌ−Ｎ−ニトロ−アルギニンメチルエステル、ニトログリセリン、ニトロプルシド、または８−Ｂｒ−ｃＧＭＰである、処理溶液。
【請求項６７】
前記溶液が約５００μｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウムイオン濃度を有する、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の処理溶液。
【請求項６８】
前記溶液が、薬学的に許容される、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項６９】
前記溶液が、核酸に加えて１つ以上の治療薬を含む、請求項５７〜６８のいずれか１項に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１０月１３日出願の米国仮出願番号６０／２４０，２３１（この出願の開示は、本明細書において参照として取り込まれている）の利益を請求する。
【０００２】
米国政府の支援に関する記述
本発明についての資金の一部は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の助成により、合衆国政府によって提供された。従って、合衆国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
１．技術分野
本発明は、遺伝子導入方法の改善に、そしてより詳細には、心臓または肝臓のような固形器官に対する、ならびに固形腫瘍のような他の固形細胞塊に対する、選択された核酸の高度に効率的かつ広範囲の送達を可能にする方法に関する。本発明の好ましい方法としては、１つ以上のホスホジエステラーゼインヒビター化合物（例えば、シルデナフィル）を用いた核酸の送達のための組織および／または細胞の処理が挙げられる。
【０００４】
２．背景技術
高レベルの発現を伴う、細胞または組織への核酸の効率的な送達は、遺伝子送達技術の継続した目標である。しかし、現在までこれらの目標を達成することが一般に不可能であった結果として、遺伝子導入方法の臨床的な利用は限定されていた。
【０００５】
従って、例えば、いくつかの送達スキームがインビボの心筋遺伝子導入について検討されているが、心筋細胞の大部分を均質な様式で改変可能であると証明されたものはない。心筋への直接注射を包含する技術は、限定的な用途であると考えられる。なぜなら、遺伝子発現は、針の進路を大きく越えて拡大することはないからである。Ｒ．Ｊ．Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９３；７３：１２０２〜１２０７；Ａ．Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９３；９０：１１４９８〜１１５０２。１つの研究では、１０１０ｐｆｕのアデノウイルスの経皮的冠動脈内送達は、標的動脈によって供給されている領域中の筋細胞の約３分の１にしか感染を生じなかった。Ｅ．Ｂａｒｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９４，１：５１〜５８。
【０００６】
他の冠動脈送達方法（その場で、またはエキソビボのいずれか）では、感染細胞はごくわずかな割合でしか生成されなくそれも心臓全体に広がっている。Ｊ．Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９６；３：１４５〜１５３；Ｊ．Ｗａｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９６；６１：１７２６〜１７２９。現在まで、どのインビボ送達系も、インタクトな心臓における細胞の大部分に感染することはできなかった。
【０００７】
特定の遺伝子送達手順はまた、かなり侵襲的であって、そのため所望されない。例えば、１つの報告は、間に置かれた内皮層を全体に配置された細胞へ血管からの遺伝子導入を可能にする機械的方法またはタンパク質分解性の方法による、内皮細胞の本質的に完全な損失を記載している。
【０００８】
特定の遺伝子導入適用がまた、肝臓のような他の器官において検討されている。詳細には、エキソビボ戦略は、選択された肝臓細胞の外科的除去、培養中の細胞への遺伝子導入、次いで形質転換された細胞を再移植するというものであった。Ｍ．Ｇｒｏｓｓｍａｎら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９４，６：３３５〜３４１を参照のこと。しかし、このようなエキソビボアプローチは、例えば、肝細胞移植の必要性など、多数の欠点をかかえている。Ｍ．Ａ．Ｋａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６２：１１７〜１１９；およびＳ．Ｅ．Ｒａｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９９３、２：３８１〜４００。肝臓への遺伝子導入のためのインビボの戦略がまた検討されているが、この戦略は、標的組織に対する特異性が低いのみならず送達効率も低い。Ｎ．Ｆｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９１，８８：８３７７〜８３９１；Ａ．Ｌｉｅｂｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５，６：６２３０〜６２１４；Ａ．Ｌ．Ｖａｈｒｍｅｉｊｅｒら，Ｒｅｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  １９９５，８：２５〜３１。また、Ｐ．Ｈｅｉｋｋｉｌｉａら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９６，３（１）：２１〜２７も参照のこと。
【０００９】
遺伝子導入は一般に、さらなる適用においては不成功である。例えば、嚢胞性線維症の処置のための遺伝子導入療法は、不十分な数の細胞しか形質導入できなかったので、大部分は失敗であった。
【００１０】
従って、標的細胞および組織に対して核酸を効率的に送達するための改良された方法およびシステムが嘱望されている。固形器官、特に心臓、肝臓、肺など、ならびに固形腫瘍のような他の固形細胞塊への核酸の効率的な送達のための新しい方法およびシステムが嘱望されている。
【００１１】
発明の開示
本発明者らはこの度、標記の細胞（細胞の固形の塊を含む）、特に固形器官（例えば、哺乳動物の心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、脾臓、または前立腺）への、または悪性細胞（例えば、固形腫瘍）への核酸の効率的な送達を可能にする方法および組成物を見出した。これらの方法および組成物は、固形細胞塊全体にわたる細胞の大部分に効率的に遺伝子を導入でき、引き続き遺伝子産物を発現させ、ならびに／または固形腫瘍塊へ遺伝子を導入し、遺伝子産物を引き続き発現させることができる。
【００１２】
本発明者らは、１つ以上のＰＤＥ（ホスホジエステラーゼ）インヒビター化合物、特にＰＤＥ−５インヒビター化合物（例えば、シルデナフィル）の投与が、標的された組織への核酸送達を有意に増強することを見出した。
【００１３】
どのような理論にも束縛されないで、本発明者らは、ＰＤＥ−５インヒビター化合物の投与が内因性ｃＧＭＰを増幅し、これによって脈管透過性を増大させると考えている。
【００１４】
本発明者らはまた、ＰＤＥ−５インヒビター化合物（例えば、シルデナフィル）と、さらに別の例えばＶＥＧＦといった透過性増強剤とを併用して投与することにより核酸送達が増強されることを見出した。従って、ＰＤＥインヒビター化合物とさらに別の、例えばＶＥＧＦのような透過性増強剤の「カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）」が特に好ましい。
【００１５】
本発明の方法および組成物は好ましくは、標的された細胞への核酸送達の増大を可能にする脈管透過性の増強を提供する。詳細には、本発明の方法は、１つ以上のホスホジエステラーゼインヒビター化合物により処理された細胞の処理を提供する。特に好ましい透過性増強化合物としては、シルデナフィル、ザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）、およびＴ−１０３２（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ  Ｃｏ．）が挙げられる。
【００１６】
特定のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）インヒビターの例は、米国特許第６，１００，２７０号；同第６，００６，７３５号；同第６，１４３，７５７号；同第６，１４３，７４６号；同第６，１４０，３２９号；同第６，１１７，８８１号；同第６，０４３，２５２号；同第６，００１，８４７号；同第５，９８１，５２７号；および同第６，２０７，８２９号Ｂ１（それらの特許の開示は、本明細書において参照として取り込まれている）において報告されている。また、さらなる化合物については、ＰＣＴ／ＥＰ９５／０４０６５；ＷＯ−Ａ−９３／０６１０４；ＷＯ−Ａ−９３／０７１４９；ＷＯ−Ａ−９３／１２０９５；ＷＯ−Ａ−９４／００４５３；欧州特許０４６３７５６  Ｂ１；およびＷＯ−Ａ−９４／０５６６１も参照のこと。また、本発明の核酸送達剤として有用なさらなる化合物については、米国特許第４，７５３，９４５号；同第５，０１０，０８６号；同第６，１２１，２７９号；同第６，１５６，７５３号；同第６，０５４，４７５号；同第５，０９１，４３１号；同第６，１２７，３６３号、および６，０４０，３０９号も参照のこと。本発明における使用のためのさらなるＰＤＥインヒビター化合物は、Ｋｏｍａｓら，Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（１９９６）（Ｓｃｈｕｄｔ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに開示されている。
【００１７】
本発明での使用のために好ましいＰＤＥインヒビターは、以下が挙げられるがこれらに限定されるものではない：特定の二環式の複素環式ＰＤＥインヒビター、より好ましくはピラゾロ［４，３−ｄ］ピラミジン−７−オン類、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン４−オン類、キナゾリン−４−オン類、プリン−６−オン類、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン類；およびそれらの薬学的に許容される塩。
【００１８】
特に好ましいピラゾロ［４，３−ｄ］ピラミジン−７−オンは、５−［２−エトキシ−５−（４−メチルピペラジン−１−イルスルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジン−７−オンとしても公知のシルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎｆｉｌ）（ＶｉａｇｒａＴＭ）；およびそれらの薬学的に許容される塩である。
【００１９】
以下の例において実証されるとおり、ＰＤＥインヒビター化合物の使用によって、投与された核酸の標的細胞への導入が有意に増強される。ＰＤＥインヒビター化合物は、核酸を投与する前に標的組織の脈管系を通じて適切にに投与することができ、そして／またはＰＤＥインヒビター化合物および内因性核酸は、同時にも投与できる。標的組織の脈管系は、ＰＤＥ阻害剤で前処理されるのが好ましい。
【００２０】
本発明の好ましい態様においては、ＰＤＥインヒビターに加えて脈管系透過剤は、外来性核酸で処理される組織または細胞に投与される。適切なさらなる別個の透過剤としては、例えば、セロトニンおよびブラジキニンが挙げられる。他の適切なさらなる別の透過剤としては、血小板活性化剤（ＰＡＦ）、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、ヒスタミン、血管内皮増殖剤（ＶＥＧＦ）、閉鎖帯毒素（ＺＯＴ）、インターロイキン−２、およびブラジキンに加えて他の血漿キニンが挙げられる。一酸化窒素のアゴニストまたはプロモーター（活性化剤）（例えば、ニトログリセリンまたはニトロプルシド）。さらなる一酸化窒素シンターゼ活性化剤は、一酸化窒素活性の増大を検出する公知のインビトロアッセイによって容易に同定され得る。一酸化窒素シンターゼ活性化剤または一酸化窒素活性化剤または他の類似の用語に対する本明細書における言及は、このようなインビトロアッセイにおいて、一酸化窒素シンターゼを活性化する（例えば、コントロールに対して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％増大する）化合物をいう。
【００２１】
また、例えば、ラジオイムノアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されているアッセイなどを含む）によって決定されように、サイクリックグアノシン３’−モノホスフェート（ｃＧＭＰ）を増大させる透過剤が好ましい。ｃＧＭＰ活性化剤または他の類似の用語に対する本明細書における言及は、このようなインビトロアッセイにおいて増大（例えば、コントロールに対して少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％増大する）をもたらす化合物をいう。
【００２２】
他の適切な脈管系透過剤は、例えば、単に、候補透過剤が、この候補透過性化合物に曝露されていないコントロール組織サンプルに比べて、標的された組織による核酸の取り込みを増強するか否かを決定するために、この候補標的化合物を試験することによって、容易に同定される。
【００２３】
単一の透過剤または２以上の別個の透過剤の組み合わせが、特定の適用において投与される。これに関しては、最適の透過剤の選択、または複数の透過剤の最適の「カクテル」の選択によって、特定の適用が最適化される。このような最適な試薬は、慣用的な手順、例えば、インビボアッセイにおいて、選択された透過剤およびそれらの組み合わせを試験することによって、当業者により容易に同定できる。
【００２４】
脈管透過性を増強するためには、低い細胞外カルシウムイオン濃度条件もまた有用である。投与された核酸の標的された細胞への導入は、このような条件下で実質的に増強されることが見出されている。低カルシウム濃度条件は、特に、核酸が投与される組織の脈管系を通じて低カルシウムイオン濃度流体を灌流することによって、容易に提供される。適切な灌流液のカルシウムイオン濃度は、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、例えば、約４０または５０μｍｏｌ／Ｌ〜約５００μｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約５０μｍｏｌ／Ｌ〜約２００μｍｏｌ／Ｌにわたる範囲内であり得る。約５０μｍｏｌ／Ｌの灌流液カルシウム濃度が、特に好ましい。カルシウムイオン（例えば、Ｃａ２＋）濃度はまた、キレート剤（例えば、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、または１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ））のような適切な緩衝液を使用することにより低下させることができる。
【００２５】
上記に考察に加え投与条件がまた、標的された組織による核酸取り込みの効率に影響する。詳細には、投与された核酸の濃度、量、および曝露時間、ならびに標的された組織の温度が全て、遺伝子導入の率に影響する。流速および灌流圧もまた、遺伝子導入の率に影響する。
【００２６】
より詳細には、灌流投与プロトコールにおいて、遺伝子導入の率は、灌流中の投与された核酸の濃度、総量、および曝露時間の増大とともに、上昇する。灌流中の核酸の高い濃度は特に、遺伝子導入率を上昇させることができる。好ましい灌流濃度は、多数の因子（処理されている特定の器官または細胞塊、投与されている特定のクローニングビヒクルなどを含む）によって変化する。しかし、一般に、投与された灌流液中のウイルスベクターの好ましい濃度は、約１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上、より好ましくは、約５×１０８ｐｆｕ／ｍｌ以上の濃度である。投与された灌流液はまた、好ましくは、再循環されて投与された剤が供給不足である場合、例えば、標的に導入される総ウイルス負荷を制限するために、被験体に再投与することができる。しかし、特に他の送達パラメーターが最適である場合、効率的な遺伝子導入は、再循環なしに達成される。灌流液の流速または圧力のいずれかの増大によって一般に、遺伝子導入効率は、上昇するが、臨床的安全性については灌流液の圧力および流速の両方を制限することが望まれる。
【００２７】
遺伝子導入の率はまた、特に標的された組織の温度が約２０℃未満である場合、この標的された組織の温度の低下にともなって低下する。被験体の体温付近での核酸の送達が好ましく、例えば、ここで核酸は、約２８〜４５℃、より好ましくは約３４〜４０℃の温度で投与される。しかし、遺伝子導入は、広い温度範囲にわたって、例えば、約４℃で達成することができる。臨床的状況によっては、例えば、心臓手術の間の遺伝子導入に伴い、より低い温度が必要とされる。
【００２８】
本発明によって投与された核酸は、標記の治療薬を発現することができるか、または被験体の内因性遺伝子の発現もしくは機能を阻害することができる。核酸はまた、診断目的のために、例えば、マーカータンパク質を発現するために投与され得る。このような治療および診断法に加えて、本発明の方法および組成物はまた、インタクトな器官（例えば、被験体の心臓）における異種遺伝子の効果を試験するために、疾患の動物モデルを作製するために、そして種々の疾患状態に関する機構的な情報を提供するために、使用できる。
【００２９】
好ましい態様において、本発明は、異種移植のための方法を包含する。従って、例えば、異種組織の細胞、特に異種固形細胞塊の細胞は、本明細書に記載されるように、増強された脈管透過性の下で外来性核酸を投与することができる。次いで、外来性核酸を含むこれらの細胞は被験体に移植することができる。より詳細には、外来性核酸は、本発明に従って、ドナー細胞または器官（例えば、異種の心臓、肝臓、脾臓など）にインビボまたはエキソビボで投与でき、そしてこのドナー細胞または器官は、選択された宿主（例えば、哺乳動物、特にヒトのような霊長類）に移植できる。適切なドナー器官は、例えば、別の霊長類、またはスワイン（ブタ類）、特にブタから得てもよい。種々の外来性核酸が、ドナー細胞に投与され得る。例えば、表現型特性を促進できる遺伝子産物を発現する核酸を投与することができる。遺伝子産物の例としては、異種移植された細胞の免疫系認識を減じるものが挙げられる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、一酸化窒素シンターゼまたはキャンプ（例えば、ニトログリセリンまたはニトロプルシド）をプロモートするものである、脈管系の透過性を増強剤を用いて、すなわち、ＰＤＥインヒビター化合物の同時投与なしに単独で、標的された細胞に対する核酸送達を強化するための方法および組成物を提供する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法において有用な脈管系透過性溶液および遺伝子導入溶液を包含する。このような溶液は一般に、そのような層に対する核酸の投与の際に、処理された組織に対する透過性の増強を提供するように処方される。従って、適切な透過剤としては、本明細書に開示されるような１つ以上の透過剤、特に少なくとも１つのＰＤＥインヒビター化合物が挙げられ、並びに１つ以上のさらなる別個の透過剤および低カルシウムイオン濃度（例えば、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下）であってもよい。本発明の溶液はまた、被験体に投与されるべき１つ以上の治療薬、例えば、１つ以上の外来性核酸（例えば、１つ以上の組み換えアデノウイルス）、または血管痙攣を制御するための他の薬剤（例えば、ニトロプルシド）などを、心臓に投与される溶液に含むことができる。透過性溶液または遺伝子導入溶液は、投与のための形態で、例えば、適切なクローニングビヒクル（例えば、所望の薬学的に許容されるキャリア（例えば、クレブス液または他の緩衝化溶液）に溶解されたウイルスベクター）中に、核酸を安定に含み得る。本発明の透過性溶液または遺伝子導入溶液は好ましくは、薬学的に受容可能であり、例えば無菌であり、さもなければ被験体への投与に適切である。代表的には、脈管系透過性溶液または遺伝子導入溶液は、使用前は、シールされた（好ましくは、密閉してシールされた）容器に貯蔵される。透過性溶液または遺伝子導入溶液は、好ましくは、最適の投薬用量中に活性成分（すなわち、透過剤、カルシウムイオン濃度、核酸）を含む。本発明の溶液は適切には、種々の緩衝液、糖、塩などのような他の因子を有し得る。
【００３２】
本発明により広範な種々の細胞を処理することができる。投与に適切な細胞としては、別個の循環、またはいくつかの様式で分離することができる循環を有する細胞が挙げられる。従って、例えば、器官および他の細胞塊（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、前立腺、精巣、卵巣、骨格筋、腎臓、脳、脾臓、および固形腫瘍を含む）が、本発明に従う投与に適切である。本発明により治療することができる例示的な腫瘍としては、例えば、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、脳腫瘍、精巣癌、または卵巣癌が挙げられる。本発明により処理することができる細胞は、健康状態または疾患状態のいずれかである。広範な種々の被験体がまた、本発明により治療できる。代表的な被験体としては、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトが挙げられる。
【００３３】
本発明の別の態様を、以下に考察する。
【００３４】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、例えば、哺乳動物の心臓もしくは肝臓のような器官の細胞に対して（固形細胞塊の細胞に対してを含む）、または固形腫瘍のような他の固形細胞塊に対して、核酸の効率的な送達を可能にする方法および組成物を提供する。
【００３５】
本発明者らは、１つ以上のＰＤＥインヒビター化合物、特にＰＤＥ−５インヒビター化合物（例えば、シルデナフィル）の投与が、標的された組織への核酸送達を有意に増強することを見出した。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、核酸送達を増強するための単独の試薬として、または本明細書に開示されるような１つ以上の他の試薬（例えば、シルデナフィル、または他のＰＤＥ−５インヒビター化合物）、もしくは他の試薬（例えば、ＶＥＧＦ）と組み合わせて、サブスタンスＰ、ニトログリセリン、ニトロプルシド（例えば、ニトロプルシドナトリウム）、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、ザプリナスト、およびＴ−１０３２の使用または投与または封入を含む、本明細書に開示されたような方法および組成物を包含する。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法および組成物は、標的された細胞に対する遺伝子導入の増大を可能にする、微小血管透過性の増強を提供する。上記で考察されたように、これらの方法および組成物は、内皮層の一過性の透過性を生じ、そして固形細胞塊の内皮細胞層に対して有意な劣化または傷害を伴わない。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「内皮細胞の層に対して有意な劣化または傷害を伴わない（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒｓ）」という用語、または他の類似の句は、内皮細胞の２５％未満、より代表的には、１５もしくは１０パーセント未満が、被験体への核酸の投与の前に、処理された血管壁から失われることを意味する。これは、先行技術の方法の使用による結果である、機械的外傷またはタンパク質分解性酵素による内皮細胞の裸出および引き続く傷害とは対照的である。内皮細胞層の有意な劣化がないことは、例えば、この層の顕微鏡検査によって容易に決定される。また、内皮細胞層の有意な劣化のないことは、簡易な試験によって決定される。例えば、内皮層は、この層が特定の機能を維持したか否か、従って有意に劣化されたか否か（例えば、層が１０−７ｍｏｌ／Ｌのアセチルコリンに応答する可逆性の血管拡張応答を示す能力）を決定するために試験される。
【００３９】
上記で考察されたＰＤＥインヒビター化合物に加えて、本発明の方法における使用のための適切なＰＤＥインヒビター化合物を以下に考察している。この化合物としては、本発明を用いた使用に一般的に好ましい、以下の一般式Ｉ〜ＸＩＩＩの化合物が挙げられる。しかし、本発明は任意の特定のＰＤＥインヒビター化合物に限定されないこと、そして本発明は、現在公知であるか、または今後発見もしくは開発される、任意のこのようなＰＤＥインヒビター化合物に適用可能であることが理解されるべきである。
【００４０】
一般に、ＰＤＥ−５インヒビター化合物は、本発明の方法および組成物における使用に好ましい。
【００４１】
より詳細には、本発明の１実施形態において、投与された化合物の少なくとも１つは、米国特許第６，１００，２７０号に記載されるような二環式の複素環式ＰＤＥインヒビター、好ましくは以下の一般式Ｉ〜Ｖに示される、以下のピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン類、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピラミジン４−オン類、キナゾリン−４−オン類、プリン−６−オン類、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン類（それらの薬学的に許容される塩を含む）である。
【００４２】
適切なＰＤＥインヒビター化合物としては、以下の一般式Ｉの化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：
【００４３】
【化１】
2004534719.tif 000002
【００４４】
ここで、一般式Ｉにおいて、Ｒ１は、メチルまたはエチルであり；Ｒ２は、エチルまたはｎ−プロピルであり；そしてＲ３およびＲ４は各々独立して、Ｈ、またはＣ１−Ｃ６アルキル（Ｃ５−Ｃ７シクロアルキルまたはモルホリノで置換されていてもよい）である。
【００４５】
適切なＰＤＥインヒビター化合物としては、以下の一般式ＩＩの化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：
【００４６】
【化２】
2004534719.tif 000003
【００４７】
ここで、一般式ＩＩにおいて、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；Ｒ２は、Ｈ：メチル、またはエチルであり；
Ｒ３は、Ｃ２−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ４アルキル（ＮＲ５Ｒ６、ＣＮ、ＣＯＮＲ５Ｒ６、またはＣＯ２Ｒ７で置換されていてもよい）；Ｃ２−Ｃ４アルカノイル（ＣＮ、ＣＯＮＲ５Ｒ６、またはＣＯ２Ｒ７で置換されていてもよい）；Ｃ２−Ｃ４アルカノイル（ＮＲ５Ｒ６；ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６；ＣＯＮＲ５Ｒ６；ＣＯ２Ｒ７またはハロで置換されていてもよい）であり；
Ｒ５およびＲ６は各々独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか；またはそれらが結合する窒素原子と一緒になって、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基、４−（ＮＲ８）−１−ピペラジニル基または１−イミダゾリル基を形成し、ここでこの基は１または２つのＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよく；
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
そしてＲ８は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ３アルキルまたは（ヒドロキシ）Ｃ２−Ｃ３アルキルである。
【００４８】
さらなる適切なＰＤＥインヒビター化合物としては、以下の一般式（ＩＩＩ）の化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：
【００４９】
【化３】
2004534719.tif 000004
【００５０】
ここで、一般式ＩＩＩにおいて、Ｒ１がＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、またはＣ１−Ｃ４アルコキシである場合にはＲ４が、Ｈでないという条件下で、Ｒ１は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ４アルキル；Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、またはＣＯＮＲ５Ｒ６であり；Ｒ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ３は、Ｃ２−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ；Ｃ２−Ｃ４アルカノイル（ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよい）；（ヒドロキシ）Ｃ２−Ｃ４アルキル（ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよい）；ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ９；ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＲ７Ｒ８；ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ９；ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＲ７Ｒ８；ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８；ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ７Ｒ８、またはイミダゾリルであり；Ｒ５およびＲ６は各々独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ７およびＲ８は各々独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルであるか；またはそれが結合する窒素原子と一緒に、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基、または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し、ここでこのような基のいずれかがＣＯＮＲ５Ｒ６で置換されていてもよく；
Ｒ９は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ３アルキルまたは（ヒドロキシ）Ｃ２−Ｃ３アルキルであり；
そしてｎは、２、３、または４である。
【００５１】
適切なＰＤＥインヒビター化合物としては、以下の一般式ＩＶの化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：
【００５２】
【化４】
2004534719.tif 000005
【００５３】
ここで、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ２は、Ｃ２−Ｃ４アルキルであり；Ｒ３は、ＨまたはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５であり；Ｒ４およびＲ５は、それらが結合される窒素原子と一緒になって、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基、または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し、そしてＲ６は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルである。
【００５４】
さらなる適切なＰＤＥインヒビター化合物としては、以下の一般式（Ｖ）の化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：
【００５５】
【化５】
2004534719.tif 000006
【００５６】
ここで一般式Ｖにおいて、Ｒ１は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ４アルキル；ＣＮまたはＣＯＮＲ４Ｒ５であり；Ｒ２は、Ｃ２−Ｃ４アルキルであり；Ｒ３は、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＮＯ２；ＮＨ２；ＮＨＣＯＲ８；ＮＨＳＯ２Ｒ８またはＮ（ＳＯ２Ｒ８）２であり；Ｒ４およびＲ５は各々独立して、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルから選択され；Ｒ６およびＲ７は各々独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキル（ＣＯ２Ｒ９、ＯＨ、ピリジル、５−イソキサゾリン−３−オンイル、モルホリノ、または１−イミダゾリジン−２−オンイルで置換されていてもよい）から選択されるか、またはこのＲ６およびＲ７が結合される窒素原子と一緒になって、ピロリジノ基、ピペリジノ基、モルホリノ基、１−ピラゾリル基、または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し、ここでこのような基のいずれかがＣ１−Ｃ４アルキル、ＣＯ２Ｒ９、ＮＨ２およびＯＨから選択される１または２つの置換基で置換されていてもよく；
Ｒ８は、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはピリジルであり；
Ｒ９は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり；
そしてＲ１０は、Ｈ；Ｃ１−Ｃ３アルキルまたは（ヒドロキシ）Ｃ２−Ｃ３アルキルである。
【００５７】
上記の一般式Ｉの化合物の好ましい群としては、以下、ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる：ここで
Ｒ３は、Ｈ；メチルまたはエチルであり；
Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ６アルキル（シクロヘキシルかまたはモルホリノで置換されていてもよい）であり；そしてＲ１およびＲ２は、一般式（Ｉ）について前に定義したとおりである。
【００５８】
上記の一般式ＩＩの好ましい化合物としては、この式のＲ１が、ｎ−プロピルであり；Ｒ２が、Ｈまたはメチルであり；Ｒ３が、エチルまたはｎ−プロピルであり；Ｒ４が、Ｈ；エチル（ＣＯＮＲ５Ｒ６またはＣＯ２Ｒ７で置換される）；ビニル（ＣＯＮＲ５Ｒ６またはＣＯ２Ｒ７で置換される）；アセチル（ＮＲ５Ｒ６；ＳＯ２ＮＲ５Ｒ６；ＣＯＮＲ５Ｒ６；ＣＯ２Ｒ７、またはブロモで置換される）であり；Ｒ５およびＲ６は、このＲ５およびＲ６が結合される窒素原子と一緒になって、モルホリノ基、４−（ＮＲ８）−１−ピペラジニル基または２，４−ジメチル−１−イミダゾリル基を形成し；Ｒ７は、Ｈまたはｔ−ブチルであり；そしてＲ８は、メチルまたは２−ヒドロキシエチルである化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００５９】
上記の一般式ＩＩＩの好ましい化合物としては、この式のＲ１が、Ｈ、メチルまたはメトキシである場合は、この式のＲ４がＨでないという条件下で、この式のＲ１が、Ｈ；メチル；メトキシまたはＣＯＮＲ５Ｒ６であり；Ｒ２が、Ｈまたはメチルであり；Ｒ３が、エチルまたはｎ−プロピルであり；Ｒ４が、Ｈ；アセチル（ＮＲ７Ｒ８で置換されていてもよい）；ヒドロキシエチル（ＮＲ７Ｒ８で置換される）；ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ９；ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＲ７Ｒ８；ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ９；ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８；ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＲ７Ｒ８または１−イミダゾリルであり；Ｒ５およびＲ６が各々独立して、Ｈまたはエチルであり；Ｒ７およびＲ８は、このＲ７およびＲ８が結合されている窒素原子と一緒に、ピペリジノ基、４−カルバモイルピペリジノ基、モルホリノ基、または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し；Ｒ９は、Ｈまたはｔ−ブチルであり；そしてＲ１０は、Ｈ；メチルまたは２−ヒドロキシエチルである化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００６０】
上記の一般式ＩＶの好ましい化合物としては、この式のＲ１およびＲ２が各々独立して、エチルまたはｎ−プロピルであり；Ｒ４およびＲ５は、このＲ４およびＲ５が結合されている窒素原子と一緒になって、４−（ＮＲ６）−１−ピペラジニル基を形成し；そしてＲ３およびＲ６は、一般式ＩＶについて前に定義したとおりである化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００６１】
上記の一般式Ｖの好ましい化合物としては、この式のＲ１が、Ｈ；ｎ−プロピル；ＣＮまたはＣＯＮＨ２であり；Ｒ２が、エチルであり；Ｒ３が、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＮＯ２；ＮＨ２；ＮＨＣＯＣＨ（ＣＨ３）２；ＮＨＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２；ＮＨＳＯ２（３−ピリジル）またはＮ［ＳＯ２（３−ピリジル）］２であり；Ｒ６が、Ｈ；メチルまたは２−ヒドロキシエチルであり；Ｒ７は、メチル（２−ピリジルまたは５−イソオキサゾリン−３−オンイルで置換されていてもよい）；またはエチル（ＯＨ、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、モルホリノまたは１−イミダゾリジン−２−オンイルで二置換される）であるか；またはＲ６およびＲ７は、そのＲ６およびＲ７に結合される窒素原子と一緒になって、（４−ＣＯ２Ｒ９）ピペリジノ基、５−アミノ−３−ヒドロキシ−１−ピペラゾリル基または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し；Ｒ９は、Ｈまたはエチルであり；そしてＲ１０は、Ｈ；メチルまたは２−ヒドロキシエチルである化合物が挙げられる。
【００６２】
特に好ましい化合物の群は、上記の一般式ＩＩＩの化合物の群であり、ここで一般式ＩＩＩのＲ１が、メチル；ＣＯＮＨ２、またはＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ３であり；Ｒ２が、Ｈであり；Ｒ３が、エチルまたはｎ−プロピルであり；Ｒ４が、Ｈ；アセチル；１−ヒドロキシ−２−（ＮＲ７Ｒ８）エチル；ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３；ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＲ７Ｒ８；ＳＯ２ＮＲ７Ｒ８または１−イミダゾリルであり；Ｒ７およびＲ８は、このＲ７およびＲ８に結合する窒素原子と一緒に、４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し；Ｒ１０は、メチルまたは２−ヒドロキシエチルであり；ただしこれは、Ｒ１がメチルである場合は、Ｒ４がＨではないという条件下であり；ここでは一般式（ＩＶ）のＲ１が、ｎ−プロピルであり；Ｒ２が、エチルであり；そしてＲ３が、１−ピペラジニルスルホニルまたは４−メチル−１−ピペラジニルスルホニルであり；そしてここでは一般式（Ｖ）のＲ１が、ｎ−プロピルまたはＣＮであり；Ｒ２が、エチルであり；Ｒ３が、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＮＨＳＯ２ＣＨ（ＣＨ３）２；ＮＨＳＯ２（３−ピリジル）またはＮ［ＳＯ２（３−ピリジル）］２であり；Ｒ６が、Ｈまたはメチルであり；Ｒ７は，メチルまたはエチル（ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３、モルホリノまたは１−イミダゾリジン−２−オンイルで二置換される）であるか；またはＲ６およびＲ７は、このＲ６およびＲ７に結合する窒素原子と一緒に、（４−ＣＯ２Ｒ９）ピペリジノ基または４−（ＮＲ１０）−１−ピペラジニル基を形成し；Ｒ９が、Ｈまたはエチルであり；そしてＲ１０が、Ｈ；メチルまたは２−ヒドロキシエチルである。
【００６３】
本発明の特に好ましい個々の化合物としては、以下が挙げられる：
１−エチル−５−［５−（ｎ−ヘキシルサルファモイル）−２−ｎ−プロポキシ−フェニル］−３−メチル−１，６−ジヒドロ−７−Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
１−エチル−５−（５−ジエチルサルファモイル−２−ｎ−プロポキシ−フェニル）−３−メチル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］−ピリミジン−７−オン；
５−［５−（Ｎ−シクロヘキシルメチル−Ｎ−メチルサルファモイル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−ｌ−エチル−３−ｍ−エチル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン；
６−（５−ブロモ−２−ｎ−プロポキシフェニル）−３−メチル−１−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４ｄ］ピリミジン−４−オン；３−メチル−６−（５−モルホリノスルホニル−２−ｎ−プロポキシフェニル）−１−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；
６−［５−（２−カルボキシビニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−３−メチル−ｌ−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；
６−［５−（２−ｔ−ブトキシカルボニルビニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−３−メチル−ｌ−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；
３−メチル−６−［５−（２−モルホリノカルボニルビニル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−ｌ−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；
３−メチル−６−［５−（２−モルホリノカルボニルエチル）−２−ｎ−プロポキシフェニル］−１−ｎ−プロピル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；
２−｛２−エトキシ−５−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル−スルホニル］フェニル｝−８−メチルキナゾリン−４−（３Ｈ）−オン；
２−｛５−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルスルホニル］−２−ｎ−プロポキシフェニル｝−８−メチルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン；
８−メチル−２−｛５−［２−（４−メチル−１−ピペラジニルカルボニル）−エテニル］−２−ｎ−プロポキシフェニル｝キナゾリン−４（３Ｈ）−オン；
８−カルバモイル−２−｛２−エトキシ−５−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニルスルホニル］フェニル｝キナゾリン−４（３Ｈ）−オン；
８−エチルカルバモイル−２−（２−ｎ−プロポキシフェニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン；
２−［２−エトキシ−５−（４−エトキシカルボニルピペリジノ−スルホニル）フェニル］−８−ｎ−プロピルピリド［３，２ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン；
２−［５−（４−カルボキシピペリジノスルホニル）−２−エトキシフェニル］−８−ｎ−プロピルピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン；
２−｛２−エトキシ−５−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル−スルホニル］フェニル｝−８−ｎ−プロピルピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン；
および２−｛２−エトキシ−５−［（ビス−３−ピリジルスルホニル）アミノ］−フェニル｝−８−ｎ−プロピルピリド［３，２−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、投与された化合物の少なくとも１つは、米国特許第６，１４３，７４６号に記載される化合物、および以下の一般式ＶＩ−ＩＸに示される化合物（それらの化合物の薬学的に許容される塩を含む）などの、四環系ｃＧＭＰに特異的なＰＤＥインヒビターである。
【００６５】
より具体的には、適切な化合物としては、以下の一般式ＶＩの化合物；およびそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）が挙げられる：
【００６６】
【化６】
2004534719.tif 000007
【００６７】
ここで、一般式ＶＩにおいて、Ｒ０は、水素、ハロゲン、またはＣ１−６アルキルを表し；
【００６８】
Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ハロＣ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−３アルキル、アリールＣ１−３アルキル、またはヘテロアリールＣ１−３アルキルを表し；
【００６９】
Ｒ２は、ベンゼン、チオフェン、フラン、およびピリジンから選択される単環式芳香環で置換されていてもよい、または置換されていてもよい以下の二環式の環を表し；
【００７０】
【化７】
2004534719.tif 000008
【００７１】
この二環式の環は、このベンゼン環炭素原子の１つを介して一般式ＶＩの分子の他の部分に結合しており、ここでこの縮合された環Ａは、５員環または６員環であり、これは、不飽和であっても、部分的に水素化されていてもまたは飽和であってもよく、そして炭素原子、ならびに酸素、イオウ、および窒素から選択される２つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく；そして
【００７２】
Ｒ３は、Ｃ１−３アルキルの水素を表すか、あるいはＲ１およびＲ３はともに、３員もしくは４員のアルキル鎖、または３員もしくは４員のアルケニル鎖を表す。
【００７３】
適切な化合物としてはまた、以下の一般式ＶＩＩ：
【００７４】
【化８】
2004534719.tif 000009
【００７５】
で表される化合物、その薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）を包含する。ここにおいて、Ｒ０は、水素、ハロゲン、またはＣ１−６アルキルを表し；Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキルＣ１−３アルキル、アリールＣ１−３アルキル、またはヘテロアリールＣ１−３アルキルを表し；そして
Ｒ２は、ベンゼン、チオフェン、フラン、およびピリジンから選択される置換されていてもよい単環式芳香環、または置換されていてもよい以下の二環式の環を表し；
【００７６】
【化９】
2004534719.tif 000010
【００７７】
この二環式の環は、このベンゼン環の炭素原子の１つを介して一般式ＶＩＩの分子の他の部分に結合しており、ここでこの縮合された環Ａは、５員環または６員環であり、これは、不飽和であっても、部分的に水素化されていてもまたは飽和であってもよく、そして炭素原子、ならびに酸素、イオウ、および窒素から選択される２つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の方法における使用に好ましい一般式ＶＩの化合物のさらなるサブグループは、以下の一般式ＶＩＩＩの化合物；およびそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）である：
【００７９】
【化１０】
2004534719.tif 000011
【００８０】
ここで一般式ＶＩＩＩにおいて：
Ｒ０は、水素、ハロゲン、またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ１は、水素またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ２は、以下の二環式の環を表し：
【００８１】
【化１１】
2004534719.tif 000012
【００８２】
この二環式の環は、水素およびＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の基によって置換されていてもよく；そして
Ｒ３は、水素またはＣ１−３アルキルを表す。
【００８３】
上記の一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ１に関して、アリールＣ１−３アルキル基の一部としての用語「アリール」とは、フェニル、または水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびメチレンジオキシから選択される１つ以上（例えば、１、２、または３）の置換基によって置換されるフェニルを意味する。ヘテロアリールＣ１−３アルキル基の一部としての「ヘテロアリール」という用語は、チエニル、フリル、またはピリジルであって、各々が、水素、Ｃ１−６アルキル、およびＣ１−６アルコキシから選択される１つ以上（例えば、１、２、または３）の置換基によって置換されていてもよいチエニル、フリル、またはピリジルを意味する。Ｃ３−８シクロアルキルＣ１−３アルキル基の基または一部としての「Ｃ３−８シクロアルキル」という用語は、３〜８の炭素原子を含む単環式環を意味する。適切なシクロアルキル環の例としては、Ｃ３−６シクロアルキル基類、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００８４】
上記の一般式ＶＩＩにおいて、Ｒ２に関して、任意のベンゼン環置換基が、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ＣＯ２Ｒｂ、ハロＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルコキシ、シアノ、ニトロ、およびＮＲａＲｂを含む１つ以上（例えば、１、２、または３）の原子または基から選択される。ここでＲａおよびＲｂは、各々水素またはＣ１−６アルキルであるか、またはＲａはまた、Ｃ２−７アルカノイル、またはＣ１−６アルキルスルホニルを表していてもよい。他の環系、上記に定義されるハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールＣ１−３アルキルを含む１つ以上（例えば、１、２、または３）の原子または基から選択される置換基で置換されていてもよい。
以下の二環式の環：
【００８５】
【化１２】
2004534719.tif 000013
【００８６】
は、例えば、ナフタレン、若しくはベンゾキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソキサゾール、ベンズイミダゾール、キノリン、インドール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン等の複素環、または以下のような複素環を表し：
【００８７】
【化１３】
2004534719.tif 000014
【００８８】
ここでｎは、１または２の整数であり、そしてＸおよびＹは各々、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、またはＮＨを表す。
【００８９】
他に示さない限り、上記一般式において、そして本明細書に記載されている他の一般式において、他に断らない限り基として、または基の一部としての「アルキル」という用語は、直鎖、または示された数の炭素原子を含む分枝鎖部分を意味する。例えば、この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、およびｔ−ブチルによって表されるようなＣ１−４アルキル官能基を表し得る。本明細書において用いる場合、「アルケニル」という用語は、示された数の炭素原子を含む直鎖状アルケニル基および分枝鎖状のアルケニル基（例えば、ビニル基およびアリル基）を包含する。本明細書において用いる場合、「アルキニル」という用語は、示された数の炭素原子を含む直鎖状アルケニル基および分枝鎖状のアルケニル基（適切には、アセチレン）を包含する。
【００９０】
他に示さない限り、上記の式および本明細書に開示される他の式において、「ハロゲン」という用語は、本明細書において、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。
【００９１】
他に示さない限り、上記の式、および本明細書に開示された他の式において、「ハロＣ１−６アルキル」という用語は、１つ以上（例えば、１、２、または３）のハロゲン原子によって１つ以上の炭素原子において置換された１〜６の炭素原子を含む、上記で定義されているとおりのアルキル基を意味する。同様に、ハロＣ１−６アルコキシ基は、酸素原子を介してＲ２ベンゼンに結合された上記で定義されているとおりのハロＣ１−６アルキル基である。ハロＣ１−６アルキル基の例としては、トリフルオロメチル、および２，２，２−トリフルオロエチルが挙げられる。ハロＣ１−６アルコキシ基の例は、トリフルオロメトキシである。「Ｃ２−７アルカノイル」という用語は、そのＣ１−６アルキル部分が上記で定義されているとおりである、Ｃ１−６アルカノイル基を意味する。適切なＣ２−７アルカノイル基の例は、Ｃ２アルカノイル基アセチルである。
【００９２】
他に示さない限り、上記の式、および本明細書に開示された他の式において、Ｒ０がハロゲン原子であるか、またはＣ１−６アルキル基である場合、この置換基は、四環式の環のフェニル部分上の任意の利用可能な位置に配置され得る。しかし、結合の特定の部位は、環の１０位である。
【００９３】
式ＶＩの化合物は、２つ以上の不斉中心を含み得、従って、エナンチオマー（鏡像異性体）またはジアステレオアイソマー（ジアステレオ異性体）として存在し得る。詳細には、上記の一般式ＶＩＩにおいて、２環の不斉中心（キラル中心）は、アスタリスクで示されている。本発明は、一般式（ＶＩＩ）の化合物の個々の異性体を混合して包含し、そして別々に包含する、その両方であることが理解されるべきである。
【００９４】
一般式ＶＩの化合物はまた、互変異性型で存在し得、そして本発明は、それらの個々の互変異性体を混合して包含し、そして別々に包含する、その両方である。
【００９５】
本発明の方法における使用のための特定の化合物の群は、一般式ＶＩのＲ０が、水素またはハロゲン（例えば、フッ素）、特に水素である化合物の群である。
【００９６】
本発明の方法における使用のための化合物の別の特定の群は、一般式ＶＩの化合物であって、ここで一般式ＶＩのＲ１が、水素、Ｃ１−４アルキル、ハロＣ１−４アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ３−６シクロアルキルメチル、ピリジルＣ１−３アルキル、フリルＣ１−３アルキル、または置換されていてもよいベンジルを表す、化合物の群である。この化合物の特定の群の内で、Ｃ１−４アルキル基の例は、メチル、、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、およびｎ−ブチルである。Ｃ３−６シクロアルキルメチル基の例は、シクロプロピルメチルおよびシクロヘキシルメチルである。置換されていてもよいベンジル基の例としては、ベンジルおよびハロベンジル（例えば、フルオロベンジル）が挙げられる。
【００９７】
本発明の方法における使用のための化合物のさらなる群は、一般式ＶＩの化合物の群であって、一般式ＶＩのＲ２が、置換されていてもよいベンゼン、チオフェン、フラン、ピリジン、もしくはナフタレン環、または置換されていてもよい以下の二環式の環を表す、化合物の群である：
【００９８】
【化１４】
2004534719.tif 000015
【００９９】
ここで、ｎは、１または２であり、そしてＸおよびＹは各々、ＣＨ２またはＯである。この化合物の特定の群の内で、置換されたベンゼン基の例は、ハロゲン（例えば、塩素）、ヒドロキシ、Ｃ１−３アルキル（例えば、メチル、エチル、またはｉ−プロピル）、Ｃ１−３アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、ＣＯ２Ｒｂ、ハロメチル（例えば、トリフルオロメチル）、ハロメトキシ（例えば、トリフルオロメトキシ）、シアノ、ニトロ、またはＮＲａＲｂのうちの１つで置換されたベンゼンである。ここで、ＲａおよびＲｂは各々、水素またはメチルであるか、あるいはＲａは、アセチル、またはジハロ（例えば、ジクロロ）によって置換されたベンゼン、またはＣ１−３アルコキシ（例えば、メトキシ）およびハロゲン（例えば、塩素）およびヒドロキシのうち１つによって置換されたベンゼンである。置換されたチオペン環の例は、ハロ（例えば、ブロモ）置換されたチオペン環である。
【０１００】
一般式ＶＩの化合物のなおさらなる特定の群は、一般式ＶＩのＲ３が、水素を表すか、またはＲ１およびＲ３がともに、３員のアルキル鎖を表す化合物の群である。
【０１０１】
本発明の化合物の好ましい群は、以下の一般式（ＩＸ）によって示される一般式ＶＩのシス異性体、およびそれらのシス光学エナンチオマーとそれらとの混合物の群である：
【０１０２】
【化１５】
2004534719.tif 000016
【０１０３】
この群には、これらの化合物のラセミ混合物、ならびに塩および溶媒和物（例えば、水和物）を含み、ここで、一般式ＩＸのＲ０は、水素またはハロゲン（例えば、フッ素）、特に水素であり、そしてＲ１、Ｒ２、およびＲ３は、前に定義したとおりである。
【０１０４】
一般式ＩＸによって表された単一の異性体、すなわち、６Ｒ，１２ａＲ異性体が特に好ましい。
【０１０５】
一般式ＩＸについての上記の定義において、Ｒ１は好ましくは、Ｃ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピル、およびｎ−ブチル）、Ｃ３−６シクロアルキル（例えば、シクロペンチル）、またはＣ３−６シクロアルキルメチル（例えば、シクロプロピルメチル）を表し得る。
【０１０６】
Ｒ２は好ましくは、Ｃ１−３アルコキシ（例えば、メトキシ）で置換されたベンセン、またはＣ１−３アルコキシ（例えば、メトキシ）およびハロゲン（例えば、塩素）、特に４−メトキシフェニル、または３−クロロ−４−メトキシフェニルで置換されたベンゼンのような置換ベンゼン環を表しもよく、またはＲ２は好ましくは、３，４−メチレンジオキシフェニルを表し得る。
【０１０７】
上記の式の化合物の特に好ましいサブグループは、Ｒ０が水素を表す化合物である。
【０１０８】
さらなる好ましいサブグループとしては、Ｒ１が水素、メチル、およびイソプロピルから選択される化合物が挙げられる。
【０１０９】
好ましくは、Ｒ２は、以下の不飽和の二環式の環を表す：
【０１１０】
【化１６】
2004534719.tif 000017
【０１１１】
一般式ＩＸの化合物のなおさらなるサブグループは、Ｒ３が水素またはメチルを表す化合物である。
【０１１２】
本発明は、本明細書における上記の特定の分類および好ましい分類の全ての適切な組み合わせを包含することが理解されるべきである。
【０１１３】
本発明の方法における使用に適切な特定の化合物としては、以下が挙げられる：
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−（４−ピリジル−メチル）−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，ｌ’；６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］フラン−５−イル）−２−メチルピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド−［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ブロモ−２−チエニル）−２メチルピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−ブチル−６−（４−メチルフェニル）−ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−イソプロピル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド−［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−シクロペンチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，ｌ’；６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−シクロプロピルメチル−６−（４−メトキシフェニル）ピラジノ［２’，ｌ’；６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−２−メチル−ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（５ａＲ，１２Ｒ，１４ａＳ）−１，２，３，５，６，１１，１２，１４ａ−オクタヒドロ−１２−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピロロ［１”，２”：４’５’］−ピラジノ［２’，ｌ；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−５−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ベンゾフラニル）−２−メチルピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ベンゾフラニル）ピラジノ［２’，ｌ；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（３Ｓ，６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ベンゾフラニル）−３−メチル−ピラジノ［２’，１’；６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（３Ｓ，６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ベンゾフラニル）−２，３−ジメチルピラジノ［２’，１’，６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ベンゾフラニル）−２−イソプロピル−ピラジノ［２’，１’，６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；およびそれらの薬学的に許容される溶媒和物（例えば、水和物）。
【０１１４】
本発明はまた、米国特許第６，１４０，３２９号において開示される特定のｃＧＭＰ  ＰＤＥインヒビター（その化合物の少なくともいくつかは、前出の米国特許第６，１４３，７４６号に記載されている）の投与と整合している。米国特許第６，１４０，３２９号の好ましい化合物は、以下の一般式Ｘ（その薬学的に許容される塩を含む）に示されており、そしてその薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）を含む：
【０１１５】
【化１７】
2004534719.tif 000018
【０１１６】
ここで、一般式Ｘにおいて：
Ｒ０は、水素、ハロゲン、またはＣ１−６アルキルを表し；
Ｒ１は、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ハロＣ１−６アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ３−８シクロアルキルＣ１−３アルキル、アリールＣ１−３アルキル、またはヘテロアリールＣ１−３アルキルを表し；
Ｒ２は、ベンゼン、チオフェン、フラン、およびピリジンから選択される置換されていてもよい単環式芳香環、または置換されていてもよい以下の二環式の環を表し：
【０１１７】
【化１８】
2004534719.tif 000019
【０１１８】
この二環式の環は、このベンゼン環の炭素原子の１つを介して一般式Ｘの分子の他の部分に結合されており、そしてここでこの縮合された環Ａは、５員環または６員環であり、この環は、不飽和であっても、部分的に水素化されていてもまたは飽和であってもよく、そして炭素原子、ならびに酸素、イオウおよび窒素から選択される２つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよく；そして
Ｒ３は、水素、もしくはＣ１−３アルキルを表すか、あるいはＲ１およびＲ３はともに、３員もしくは４員のアルキル鎖、または３員もしくは４員のアルケニル鎖を表す。
【０１１９】
処理における使用のための本発明のさらなる適切な個々の化合物としては、以下が挙げられる：
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−（４−ピリジルメチル）−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２−ヘキサヒドロ−６−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］フラン−５−イル）−２−メチル−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−メチルピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−ブチル−６−（４−メチルフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−イソプロピル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−シクロペンチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−シクロプロピルメチル−６−（４−メトキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−２−メチルピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（５ａＲ，１２Ｒ，１４ａＳ）−１，２，３，５，６，１１，１２，１４ａ−オクタヒドロ−１２−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピロロ［１”，２”：４’，５’］ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−５−１，４−ジオン；
シス−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−シクロプロピル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
（３Ｓ，６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−３−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；
およびそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）。
【０１２０】
本発明の方法における使用のために特に適切な化合物としては、以下：
（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（化合物Ａ）；および
（３Ｓ，６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２，３−ジメチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（化合物Ｂ）；ならびにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）が挙げられる。
【０１２１】
本発明の別の実施形態において、投与された化合物の少なくとも１つは、米国特許第６，０４３，２５２号、および同第６，１１７，８８１号に記載されたような、カルボリン誘導体またはＮ−シンナモイル誘導体、または（β）カルボリンである。このような好ましい化合物は、以下の一般式ＸＩおよびＸＩＩＩに示されており、これにはその薬学的に許容される塩を含む。
【０１２２】
式ＸＩの化合物は、以下の構造；ならびにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）によって表される：
【０１２３】
【化１９】
2004534719.tif 000020
【０１２４】
ここで、この一般式ＸＩにおいて：
Ｒ０は、水素、またはハロゲンを表し；
Ｒ１は、以下：
水素、ＮＯ２、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ハロゲン、シアノ、または酸素、窒素、およびイオウから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員複素環式基または６員複素環式基からなる群より選択され、そして−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａもしくはＣ１−４アルキルで置換されていてもよく、またはＯＲａ、Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｃ１−４アルキレンＣ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｏ−Ｃ１−４アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｃ１−４アルキレン−Ｏ−Ｃ１−４アルキレン−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＳＯ２Ｒｃ、Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−４アルキレンＨｅｔ、Ｃ１−４アルキレンＮＲａＲｂ、Ｃ２−６アルケニレンＮＲａＲｂ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｃ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＣ１−４アルキレンＯＲｂＣ（＝Ｏ）ＮＲａＣ１−４アルキレンＨｅｔ、ＯＲａＯＣ２−４アルキレンＮＲａＲｂ、ＯＣ１−４アルキレン−ＣＨ（ＯＲａ）ＣＨ２、ＮＲａＲｂ、Ｏ−Ｃ１−４アルキレンＨｅｔ、Ｏ−Ｃ２−４アルキレン−ＯＲａ、Ｏ−Ｃ２−４アルキレン−ＮＲａ−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、ＮＲａＲｂ、ＮＲａＣ１−４アルキレンＮＲａＲｂ、ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｎ（ＳＯ２Ｃ１−４アルキル）２、ＮＲａ（ＳＯ２Ｃ１−４アルキル）、ＳＯ２ＮＲａＲｂ、およびＯＳＯ２トリフルオロメチルによって置換されていてもよいＣ１−６アルキルで置換されていてもよい；Ｒ２は、以下：水素、ハロゲン、ＯＲａ、Ｃ１−６アルキル、ＮＯ２、およびＮＲａＲｂからなる群より選択されるか、またはＲ１およびＲ２は、一緒になって、少なくとも１つのヘテロ原子を含んでいてもよい、５員環または６員環の３員環もしくは４員環のアルキレン鎖部分、または３員環もしくは４員環のアルケニレン鎖部分を形成し；
Ｒ３は、以下：水素、ハロゲン、ＮＯ２、トリフルオロメトキシ、Ｃ１−６アルキル、およびＣ（＝Ｏ）ＯＲａからなる群より選択され；Ｒ４が、水素であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、少なくとも１つのヘテロ原子を含んでいてもよい、５員環または６員環の３員環もしくは４員環のアルキレン鎖部分、または３員環もしくは４員環のアルケニレン鎖部分を形成し；
Ｈｅｔは、酸素、窒素、およびイオウからなる群より選択される少なくともヘテロ原子を含む５員環または６員環の複素環基を表し、そしてこれはＣ１−４アルキルで置換されていてもよく；
ＲａおよびＲｂは、同じであっても異なってもよく、そして独立して水素およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒｃは、フェニルまたはＣ４−６シクロアルキルを表し、ここでこのフェニルまたはＣ４−６シクロアルキルは、１つ以上のハロゲン原子、１つ以上の−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、または１つ以上のＯＲａによって置換されていてもよく；
ｎは、１、２および３から選択される整数であり；
ｍは、１および２から選択される整数である。
【０１２５】
上記の一般式ＸＩにおいて、アルキルという用語またはアルキレンという用語は、本明細書において用いる場合、それぞれ、示された数の炭素原子を含み、そして直鎖状および分枝鎖状のアルキル基、または直鎖状および分枝鎖状のアルキレン基（代表的には、メチル基、メチレン基、エチル基、およびエチレン基、ならびに直鎖状および分枝鎖状のプロピル基、プロピレン基、ブチル基、およびブチレン基）を包含する。一般式ＸＩに関して用いる場合、Ｃ２−６アルケニレンという用語は、２〜６の炭素原子を含む基を意味し、そしてこれには、直鎖状および分枝鎖状のアルケニレン基、詳細にはエチレンなどを包含する。一般式ＸＩにおいて、Ｃ４−６シクロアルキルという用語は、４〜６個の炭素原子を含む環状の基、すなわち、シクロブタン、シクロペンタン、およびシクロヘキサンを意味する。一般式ＸＩにおいて、ハロゲンという用語は、本明細書において用いる場合、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を包含する。一般式ＸＩにおいて、５員環または６員環の複素環式基という用語は、本明細書において用いる場合、５員環または６員環のヘテロシクロアルキル基およびヘテロアリール基（例えば、テトラヒドロフラニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピロリジニル、モルホリニル、ピリジル、イミダゾリル、フリル、およびテトラゾリル）を包含する。一般式ＸＩにおいて、適切には、Ｒ０は、水素を表す。あるいは、Ｒ０は、ハロゲン、詳細にはフッ素を表し得る。一般式ＸＩにおいて、Ｒ１は、−ＯＲａ、−Ｏ−Ｃ２−４アルキレンＮＲａＲｂ、−Ｏ−Ｃ１−４アルキレンＨｅｔ、および−Ｏ−Ｃ２−４アルキレン−ＯＲａのうちのいずれかを適切に表し得る。具体的には、Ｒ１は、−Ｏ−Ｃ２−４アルキレンＮＲａＲｂを表し、ここでＣ２−４アルキレンは、エチレンを表し得、そしてＲａおよびＲｂは、独立してメチルを表し得る。特に適切には、Ｒ２は、水素を表す。あるいは、Ｒ１およびＲ２が一緒になって、本明細書において前に記載したように少なくとも１つのヘテロ原子を含んでいてもよく、５員環または６員環のうちの３員環もしくは４員環のアルキレン鎖部分、または３員環もしくは４員環のアルケニレン鎖部分を形成する場合は、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、メチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、エチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、プロピレン鎖、ブチレン鎖、または−ＮＲａエチレン−Ｏ−を形成する。適切には、Ｒ１およびＲ２は一緒に、メチレンジオキシ、プロピレン、または−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−Ｏ−を形成する。
【０１２６】
上記の一般式ＸＩにおいて、適切には、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、本明細書において前に記載したように少なくとも１つのヘテロ原子を含んでいてもよく、５員環または６員環のうちの３員環もしくは４員環のアルキレン鎖部分、または３員環もしくは４員環のアルケニレン鎖部分を形成する。詳細には、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、メチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、エチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、プロピレン鎖、ブチレン鎖、または−ＮＲａエチレン−Ｏ−を形成する。適切には、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、メチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、エチレンジオキシ鎖、エチレンオキシ鎖、またはプロピレン鎖を形成する。具体的には、Ｒ３およびＲ４は一緒になって、メチレンジオキシ、またはエチレンオキシ、最も具体的にはエチレンオキシを形成する。
【０１２７】
本発明の方法における使用のための化合物の特定のサブグループとしては、以下の一般式（ＸＩＩＩ）の化合物；ならびにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、それらの水和物）が挙げられる：
【０１２８】
【化２０】
2004534719.tif 000021
【０１２９】
ここで、Ｒ５は、−ＯＨ、ＯＣ２−４アルキレンＮＲａＲｂ、およびＯ−Ｃ１−４アルキレンＨｅｔからなる群より選択され、ここでＨｅｔは、本明細書において前に記載したとおりであり、そして
Ｒ６は、以下を表し：
【０１３０】
【化２１】
2004534719.tif 000022
【０１３１】
ここで、この一般式のＣは、５員環または６員環を表し、この環は不飽和であっても、部分的に水素化されていてもまたは飽和であってもよく、そして炭素原子、ならびに酸素、イオウおよび窒素から選択される１または２つのヘテロ原子（Ｃ１−４アルキルで置換されていてもよい）を含んでいてもよい。
【０１３２】
上記一般式ＸＩＩにおいて、代表的には、Ｒ５は、−ＯＣ２−４アルキレンＮＲａＲｂ、詳細には−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２を表す。あるいは、Ｒ５は、−Ｏ−Ｃ１−４アルキレンＨｅｔを表し得、ここでＨｅｔは、ピペリジニル、ピロリジニル（Ｃ１−４アルキル、例えば、メチルで置換されていてもよい）、またはモルホリニルであってもよい。
【０１３３】
具体的には、Ｒ６は、以下を表す：
【０１３４】
【化２２】
2004534719.tif 000023
または、
【化２３】
2004534719.tif 000024
特に、
【化２４】
2004534719.tif 000025
【０１３５】
本発明の方法における使用のためのさらなる特定の化合物としては、以下が挙げられる：
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−メトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−ｙｌ］−３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−ｙｌ）プロペニル］フェニル］アセトアミド；
（Ｅ）−１−［１−（４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−フェニル−１−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［ｌ−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−ホルミルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（４−ニトロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル］アセトアミド；
（Ｅ）−１−［１−（４−ニトロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−トリフルオロメトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−メチルフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−プロペニル］フェニル］アセトアミド；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（２−クロロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−ブロモフェニル）−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−クロロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−エトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］酢酸，フェニルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−ホルミルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−プロペニル］フェニル］−３−フェニル尿素；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４アミノフェニル）−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシ−フェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−ニトロフェニル）−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［（４−ビス（メチルスルホニル）−アミノフェニル］−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［Ｉ−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］フェニル］メタンスルホンアミド；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］ベンズアミド］；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−シアノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４トリフルオロメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−クロロフェニル）−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−トリフルオロメトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−メチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル］尿素；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４ヒドロキシメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−ベンジル−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２，４−ジクロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−フルオロフェニル）−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−インダン−５−イル−１−プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンゾイル］ベンゼンスルホンアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，４ジクロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，４ジメトキシフェノール）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−メチル−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル］アセトアミド；
（Ｅ）−２，２−ジメチル−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル］プロピオンアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，５−ジメトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｎ）−｛４−［３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−６−フルオロ−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−オキソプロペニル］−フェニル｝−アセトアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−［４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル］イソブチルアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−６−フルオロ−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−（２−メトキシエチル）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−メトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−（２−モルホリン−４−イルエチル）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−アミノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−シクロヘキシル−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−シアノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−（４−ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（４−ピペリジン−４−カルボン酸）−４−［３−オキソ−３−（Ｉ−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−３−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−（４メチルピペラジン−１−カルボニル）−フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−（２−ピペラジン−１−イルメチル）−３−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］酢酸エチルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−テトラゾロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−２−［３−オキソ−３−［ｌ−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−３−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−１−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−プロペニル］フェニル）ピペリジン−４−カルボン酸エチルエステル；
（Ｅ）−Ｎ−（１−エチルピロリジン−２−イル−メチル）−３−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，５−ジテルブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−３−［３−オキソ−３−［１−（４−メトキシカルボニルフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−２−［３−オキソ−３−［１−（３，４−（メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェノキシ）酢酸エチルエステル；
（Ｅ）−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル）酢酸；
（Ｅ）−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェノキシ）酢酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロ−４−クロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（５−ニトロ−２−クロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−３−クロロ−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンジルオキシ）酢酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（５−アミノ−２−クロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−３−クロロ−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（２−ジメチルアミノプロポキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−２−クロロ−５−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（２−ジイソプロピルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−２−クロロ−５−［３−オキソ−３−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ヒドロキシ−４−ニトロ−フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３，５−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−（２ジメチルアミノエトキシ）−４−ニトロ−フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−（２ジメチルアミノエトキシ）−４−アミノ−フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−クロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−メトキシ−フェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２，６ジクロロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−メチルアミノメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−メチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−メチル−（４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンゼンスルホンアミド；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ヒドロキシ−４−アセチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロ−２−ピペリジン−１−イルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−イソプロピルフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｓ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（４−メチルフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−クロロ−５−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−Ｎ−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−３−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシ）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］ベンズアミド；
（Ｅ）−１−［１−（インダン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−アセチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［１，４］−オキサジン−６−イル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［ｌ−（４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−１−［１−（ベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−３−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル）トリフルオロメタンスルホン酸フェニルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（ベンゾフラン−５−イル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−ジメチルアミノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−ピペリジン−１−イルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（ベンゾフラン−５−イル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−４−［３−（１−ベンゾフラン−５−イル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−オキソ−プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−（１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）プロペニル］フェニル）トリフルオロメタンスルホン酸フェニルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（２−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−［１−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ピロリジン−１−イルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４−ピロリジン−１−イルフェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４−イミダゾール−１−イルフェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−［１−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−オキソ−プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３（４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−［ｌ−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−イル］−３−オキソプロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｓ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−アミノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｓ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｓ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（１−（Ｓ）−メチルピロリジン−２−イル−メトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノ−１−メチルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−（１−フェニル−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４（１−（Ｓ）−メチルピロリジン−２−イル−メトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノ−１−メチルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノプロポキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−フルオロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸メチルエステル；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−（３−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２ジエチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノプロポキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−４−［３−オキソ−３−［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］プロペニル］安息香酸；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−アミノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−アミノフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４￣（２−ピロリジン−１−イルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（４￣（２−ジエチルアミノエトキシ）フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）］−３−（３−ニトロフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（３−トリフルオロメチルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（２−モルホリン−４−イルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（２−（エチルメチルアミノ）エトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（３−（ジメチルアミノ）プロペニル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（３−ジメチルアミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−（１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−ホルミルフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−プロピルアミノメチル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４（２−ジメチルアミノエチルアミノ）フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−（２−アミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４￣（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルプロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−メチルアミノメチル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−イソプロピルアミノメチル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４−ジメチルアミノメチル）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−［４（３−ジメチルアミノプロポキシ）フェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−（４（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン；
（Ｅ）−１−［１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル）−３−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］プロペン−１−オン；
（Ｅ）−（Ｒ）−［２−（４−｛３−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−β−カルボリン−２−イル］−３−オキソプロペニル｝−フェノキシ）エチル］メチルカルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル；
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−カルボリン−２−イル］−３−［４−（２−メチルアミノエトキシ）フェニル］プロペン−１−オン；
およびそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）。
【０１３６】
本発明の特定の化合物は以下である：
（Ｅ）−（Ｒ）−１−［１−（２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）−１，３，４，９−テトラヒドロ−（３−カルボリン−２−イル）］−３−（４−（２−ジメチルアミノエトキシ）フェニル）プロペン−１−オン、およびその薬学的に許容される塩および溶媒和物（例えば、水和物）。
【０１３７】
本発明の別の実施形態において、投与された送達化合物または試薬の少なくとも１つは、米国特許第６，１４３，７５７号、および同第６，００１，８４７号に記載の化合物である。このような好ましい化合物は、以下の一般式ＸＩＩＩに示されており、これにはその薬学的に許容される塩を含む。
【０１３８】
【化２５】
2004534719.tif 000026
【０１３９】
ここで一般式ＸＩＩＩにおいて：
Ｒ０は、水素、ハロゲン、またはＣ１−４アルキルを表し；
Ｒ１は、以下：
（ａ）水素、
（ｂ）Ｃ１−６アルキル（フェニル、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒａ、および−ＮＲａＮｂから選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい）、
（ｃ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｄ）フェニル、および
（ｅ）５員環または６員環の複素環式の環であって、酸素、窒素、およびイオウから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、そして１つ以上のＣ１−６アルキルで置換されていてもよく、そしてＲ１がＣ１−６アルキルを介して結合されている窒素原子に結合されていてもよい、複素環式の環；
からなる群より選択され；
Ｒ２は、以下：
（ｆ）Ｃ３−６シクロアルキル、
（ｇ）フェニル（必要に応じて、−ＯＲａ、ＮＲａＲｂ、ハロゲン、水酸基、トリフルオロメチル、シアノ、およびニトロから選択される１つ以上の置換基で置換される）、
（ｈ）酸素、窒素、およびイオウから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員環または６員環の複素環式の環；ならびに
（ｉ）以下の二環式の環であって、その環のベンゼン環炭素原子の１つを介して一般式ＸＩＩＩの分子の他の部分に結合されており、ここでＡは、（ｈ）に定義されているような５員環または６員環の複素環式の環である二環式の環：
からなる群より選択され；
【０１４０】
【化２６】
2004534719.tif 000027
【０１４１】
ＲａおよびＲｂは独立して、水素またはＣ１−６アルキルを表す。
【０１４２】
上記の一般式ＸＩＩＩにおいて、「Ｃ１−６アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子を含む任意の直鎖状または分枝鎖状のアルキル鎖を意味し、そしてこれにはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを包含する。「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を意味する。
【０１４３】
一般式ＸＩＩＩで表される特定の化合物の群とは、Ｒ０が、任意の水素、メチル、臭素、およびフッ素を表し、ただし一般式ＸＩＩＩの範囲におけるＲ０の定義は、その他のＣ１−６アルキルおよびハロゲン基を含む化合物である。
【０１４４】
上記の一般式ＸＩＩＩにおいて、Ｒ１は好ましくは、メチル、エチル（１つ以上の塩素原子と置換されていてもよい）、ブチル、シクロヘキシル、およびベンジルから選択される置換基を表し得る。他のＲ１置換基としては、水素；シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル）；Ｃ１−６アルキル（代表的にはエチルまたはプロピル）（−ＮＲａＲｂ置換基（例えば、ジメチルアミノ置換基）で置換される）；フェニル（Ｒ１がＣ１−６アルキル鎖（例えば、エチルなど）を介して結合されている窒素原子に、結合されていてもよい）；およびＣ１−６アルキル（例えば、メチル）（−ＣＯ２Ｒａ（例えば、−ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ（Ｅｔは、ＣＨ２ＣＨ３））で置換される）などが挙げられる。
【０１４５】
一般式ＸＩＩＩのＲ１の定義内の適切な複素環式の環としては、ピリジル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、およびピペリジニルが挙げられる。一般に、このような複素環式の環は、Ｒ１がＣ１−６アルキル鎖、より適切にはＣ１−４アルキル鎖を介して結合されている窒素原子に結合されている。
【０１４６】
Ｒ２によって表される特定の置換基は、以下である：
【０１４７】
【化２７】
2004534719.tif 000028
【０１４８】
他のＲ２置換基としては、チエニル、ピリジル、フリル、およびフェニルが挙げられ、ここでフェニルは、−ＯＲａ（例えば、メトキシ）、−ＮＲａＲｂ（例えば、ジメチルアミノ）、ハロゲン（詳細には、塩素またはフッ素）、水酸基、トリフルオロメチル、シアノ、およびニトロから選択される１つ以上の置換基で置換され得る。あるいは、Ｒ２は、Ｃ３−６シクロアルキル基（例えば、シクロヘキシルなど）を表し得る。
【０１４９】
塩基性中心を含む、一般式ＸＩＩＩの化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される酸で形成された酸付加塩である。例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩または重硫酸塩、リン酸塩またはリン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。式ＸＩＩＩの化合物はまた、薬学的に許容される金属塩、詳細には、アルカリ金属塩を、塩基性として提供し得る。例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。
【０１５０】
本発明は、本明細書における上記の特定の分類および好ましい分類の全ての適切な組み合わせを包含することが理解されるべきである。
【０１５１】
本発明に使用されるさらなる好ましいＰＤＥインヒビター化合物は、米国特許第６，１００，２７０号、ＷＯ−Ａ−９３／０６１０４号；ＷＯ−Ａ−９３／０７１４９号；ＷＯ−Ａ−９３／１２０９５号；およびＷＯ−Ａ−９４／００４５３号に開示されるような、ＰＤＥ阻害性作用またはＰＤＥ−５阻害性作用を決定するためのインビトロアッセイにおいて、約１０ｍＭ未満、好ましくは約１ｍＭ未満のＩＤ５０を示すことなどを簡便に試験することによって同定され得る。
【０１５２】
上記で考察されるように、ＰＤＥインヒビターとは異なるさらなる透過剤が、本発明に従って使用され得る。任意の特定のさらなる透過剤の適切性は、この試薬を試験して、この候補透過剤に曝露されていないコントロール組織サンプルに比べて、標的された組織による核酸の取り込みを、この候補剤が、増強するか否かを決定することによって容易に評価され得る。例えば、候補透過性は適切には、この候補透過剤に曝露されていないコントロール組織サンプルに対して、標的された組織による核酸の取り込みの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０パーセント大きい取り込みを提供し得る。ある態様においては、核酸のさらに大きい取り込みを有する透過剤の使用が好ましくあり得る。例えば、この場合、透過剤は、この候補透過剤に曝露されていないコントロール組織サンプルに対して、標的された組織による核酸の取り込みの少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、８００、または１０００パーセント大きい取り込みを提供する。種々の適用について適切である核酸取り込みのレベルは異なり得ることがまた理解されるべきである。従って、特定の態様においては、より低レベルの核酸取り込み（例えば、標的器官または細胞塊における細胞の２％における核酸取り込み）が、１つの適用については適切であり得る、しかし他の適用については、より高レベルの核酸取り込み（例えば、標的器官または細胞塊における細胞の９０％または１００％に達する核酸取り込み）が、最適であり得る。本明細書に記載された条件によって、例えば、適切な種々のタイプおよび量の透過剤、ウイルスの量または濃度、およびウイルス曝露時間による、段階的なレベルの核酸取り込みが可能になる。
【０１５３】
適切な透過剤およびその量（透過剤としては、ＰＤＥインヒビター化合物およびセロトニンのようなさらなる別個の透過剤が挙げられる）は、一般的に、標準的なインビトロ脈管系透過性アッセイにおいて良好な活性を示す。例えば、少なくとも多くの適用に好ましい透過剤としては、標準的な脈管系透過性アッセイにおいて、ブラジキニンの等価なモル濃度によって示される透過性活性の少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２５％または５０％を示す化合物が挙げられる。このアッセイは詳細には、Ｒ．Ｊ．Ｍｕｌｌｉｎｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ  １９８９，２９（６）：１０５３〜１０６３に開示されている。その開示されたアッセイは、特定の時間、試験動物の特定の脈管系を通じて透過剤を含む溶液を灌流させた後に、皮膚リンパ流（ＬＹＭ  ＦＬＯＷ  μｌ／分）を測定する工程を包含する。標準的な透過性アッセイに対する本明細書における言及は、そのプロトコールでありＲ．Ｊ．Ｍｕｌｌｉｎｓ（前出）に開示されるとおりである。
【０１５４】
特定のホスホジエステラーゼインヒビター（ＰＤＥ）化合物および他の異なる透過剤の好適な量は、以下の実施例において示されており、簡易な試験、例えば特定のＰＤＥインヒビター化合物および必要の応じて他の透過剤のどの濃度で、最適の遺伝子導入が実現されるかを決定するために、以下の実施例に示されるようなアッセイを実施することによって、決定される。
【０１５５】
また、最適な透過剤および適用条件は、多数の因子（例えば、投与される核酸、処理される固形細胞塊など）によって変化する。従って、ヒスタミンは本発明の多くの態様において適切であるが、ヒスタミンは特定の適用については適切性が劣るかもしれないので本発明の特定の局面からは除外される。この場合もやはり、特定の剤の適性は、上記で考察したような簡易な試験によって容易に決定される。
【０１５６】
本発明に従って投与された核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含む任意の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。これらの構造は、目的の遺伝子産物、例えば、治療剤または診断剤をコードし得る。広範な種々の公知のポリペプチドが、本発明に従って患者に適切に投与されることが公知である。
【０１５７】
例えば、心筋細胞への投与については、血管作動性因子をコードする核酸が、血管収縮または血管攣縮を処置するために使用され得る。脈管形成性増殖因子をコードする核酸は、血管再生を促進するために使用され得る。適切な脈管形成性増殖因子としては、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、および脈管（血管）内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；米国特許第５，３３２，６７１号、および同第５，２１９，７３９号を参照のこと）が挙げられる。Ｙａｎａｇｉｓａｗａ−Ｍｉｗａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２，２５７：１４０１〜１４０３；Ｐｕら、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  １９９３，５４：５７５〜８３；およびＴａｋｅｓｈｉｔａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９４，９０：２２８〜２３４を参照のこと。虚血性の心臓状態、または他の虚血性の器官に対して投与され得るさらなる因子としては、例えば、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α、および腫瘍壊死因子βをコードする核酸が挙げられる。本発明に従って投与され得る適切な血管作動性因子としては、例えば、心房性ナトリウム利尿因子、血小板由来増殖因子、エンドセリンなどが挙げられる。心房性不整脈または心室性不整脈の予防のために投与され得るさらなる因子としては、イオンチャネルタンパク質、ならびに／または心臓において特定のイオン流を過剰に発現するかまたは阻害するかのいずれかに機能し得る、イオンチャネルタンパク質の機能的に有効なサブユニットおよび／もしくはフラグメントが挙げられる。さらなる制御配列（例えば、プロモーターエレメント）が、心臓のような器官の特定の領域に対して発現を制限するために投与され得る（例えば、心房性ナトリウム利尿因子プロモーターは、心室に対してよりも心房において優先的な発現を生じる）。あるいは、制御配列が付加され、その結果、投与された化合物または内因性の化合物（例えば、ホルモン）によって、発現が上方または下方に調節される。
【０１５８】
悪性腫瘍、特に固形腫瘍の処置のために、種々の抗癌剤をコードする核酸（例えば、ジフテリア毒素、チミジンキナーゼ、百日咳毒素、コレラ毒素などをコードする核酸）が使用され得る。抗血管形成剤（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼなど）をコードする核酸がまた使用され得る。Ｊ．Ｍ．Ｒａｙら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  １９９４，７：２０６２〜２０７２を参照のこと。
【０１５９】
他の治療適用については、投与された核酸によって転写されるポリペプチドとしては、増殖因子（成長因子）、または他の調節性タンパク質、膜レセプター、構造タンパク質、酵素、ホルモンなどが挙げられ得る。
【０１６０】
また、上記のように、本発明は、被験体の内因性遺伝子の発現または機能の阻害を提供する。これは、いくつかの別のアプローチによって達成され得る。例えば、アンチセンス核酸が、本発明に従って被験体に投与され得る。代表的には、このようなアンチセンス核酸は、抑制されるべき、標的された内因性遺伝子のｍＲＮＡに相補的であるか、またはこの内因性遺伝子の逆相補体をコードする核酸に相補的である。Ｊ．Ｈ．Ｉｚａｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，２２９：３４５〜３５２；およびＬ．Ｊ．Ｍａｔｈｅｒ  ＩＩら，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １９８７，２５３：２１４〜２２０を参照のこと。標的された内因性遺伝子の発現のアンチセンス調節は、遺伝子制御配列に作動可能に結合されたアンチセンス核酸を含み得る。
【０１６１】
あるいは、選択された内因性遺伝子（例えば、リボザイム）の発現を拮抗するか、またはそうでなければ内因性遺伝子もしくは遺伝子産物の機能を妨害する核酸が投与され得る。
【０１６２】
投与されるべき核酸は、公知の方法、例えば、天然の供給源から核酸を単離すること、または公知の合成方法（例えば、リン酸トリエステル方法）によって獲得され得る。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチド合成）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照のこと。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて調製され得る。また、公知のとおり、投与されるべき核酸がｍＲＮＡである場合、そのｍＲＮＡは、リボヌクレオシド三リン酸の存在下でＤＮＡからｍＲＮＡを調製するために、例えば、ファージＲＮＡポリメラーゼであるＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６を利用して、対応するＤＮＡから容易に調製され得る。上記で考察されたペプチドを含む多数の治療用ペプチドおよび診断用ペプチドのヌクレオチド配列は、文献およびコンピューターデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）に開示されている。このような情報に基づき、ＤＮＡセグメントは、化学的に合成され得るか、または他の公知の慣用的手順（例えば、ＰＣＲ）によって獲得され得る。
【０１６３】
投与されるべき核酸の操作および取り扱いを容易にするために、核酸は好ましくは、カセットに挿入され、このカセットがプロモーターに作動可能に結合されている。このプロモーターは、所望の細胞において発現を駆動し得るはずである。適切なプロモーターの選択は、容易に達成され得る。いくつかの適用については、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような高発現のプロモーターが好ましい。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９３，４：１５１）およびＭＭＴプロモーターもまた適切であり得る。さらに、特定のタンパク質が、そのタンパク質のネイティブなプロモーターを用いて発現され得る。選択された細胞に特異的であるプロモーターはまた、所望の細胞における転写を制限するためにも使用され得る。ｔａｔ遺伝子またはｔａｒエレメントのような、高い発現レベルを生じるエンハンサーまたは系などの、発現を増強し得る他のエレメントがまた、含まれ得る。クローニングビヒクルはまた、発現の一時的制御または状況的制御を提供するように、プロモーターを結合して使用する選択的なレセプターによって設計され得る。
【０１６４】
次いで、このカセットがベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ワクシニアウイルス、パポバウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ハイブリッドウイルスなどのようなウイルスベクター）に挿入され得る。上述のように、アデノウイルスが一般に好ましい。特に悪性細胞（例えば、固形腫瘍の細胞）への投与のためには、溶解性ウイルスベクターおよび半溶解性ウイルスベクターがまた使用され得る。複製欠損組み換えアデノウイルスベクター、および他の適切なベクターが、公知の手順によって生成され得る。Ｑｕａｎｔｉｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２，８９：２５８１〜２５８４；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２，９０：６２６〜６３０；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  １９９２，６８：１４３〜１５５を参照のこと。このベクターはまた、選択マーカー、例えば、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはＧＦＰを含み得る。一般に、被験体への投与に所望される核酸を含むベクターの調製は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｆｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ  １９９２）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ＥＪ  Ｍｕｒｒａｙ編，Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ  １９９１）に開示されるような公知の手順に従う。例示的な手順については以下の実施例も参照のこと。
【０１６５】
薬学的に許容されるキャリアとともに代表的に処方された裸の核酸がまた、本発明に従って投与され得る。例えば、ポリヌクレオチド（薬学的に許容される塩として存在していてもよい）は、油性のビククルまたは好ましくは水性のビヒクル（好ましくは無菌かつ発熱物質なし）中に懸濁液、溶液、エマルジョン（乳濁液）のような形態で存在し得る。薬学的に許容される塩は、有機塩基または無機塩基（例えば、ナトリウム塩もしくはカリウム塩、または一級アミン、二級アミン、もしくは三級アミンの塩）から適切に調製され得る。投与溶液は、溶液のｐＨを調節するための緩衝液、張度を調節するための非イオン性材料、例えば、スクロースのような糖を適切に含み得る。
【０１６６】
核酸はまた、ＤＮＡ−リポソーム複合体またはＲＮＡリポソーム複合体として投与され得る。このような複合体は、脂肪粒子または脂質の混合物を含み、この混合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合して、疎水性のコーティングされた送達ビヒクルを提供する。適切なリポソームは、天然の供給源（例えば、卵、植物または動物の供給源）由来のリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチシルセリン、またはホスファチジルイノシトール）を含む、任意の従来の合成または天然のリン脂質リポソーム材料を含み得る。合成リン脂質はまた、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、および対応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールが用いられ得る。コレステロールまたは他のステロール、コレステロールヘミスクシナート、糖脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、および他の陽イオン性脂質がこのリポソームに組み込まれ得る。
【０１６７】
治療適用のために核酸が投与される代表的な被験体としては、哺乳動物、詳細には霊長類、特にヒト、および異種移植適用のための被験体（例えば、霊長類またはスワイン（ブタ類）、特にブタ）が挙げられる。獣医学分野の適用については、広範な種々の被験体、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、スワイン（ブタ類）などのような家畜類；ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどのような家禽類；ならびにイヌおよびネコのようなペットが適切である。診断または研究適用については、広範な種々の哺乳動物が適切な被験体であり、これにはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、およびスワイン（ブタ類）（例えば、近交系ブタ）などが挙げられる。
【０１６８】
核酸の有効用量は、特定の発現されたタンパク質、標的組織、被験体（種、体重、性別、一般的健康状態などを含む）、およびこの被験体の臨床状態の関数である。核酸の有効用量はまた、透過性カクテルの関数であり、これは一般に、送達されるべき総ウイルス粒子を少なくさせる。投与の所定のプロトコールについての最適投与速度は、従来の投与量決定試験を用いて当業者に容易に確認され得る。さらに、所定の治療のための投与の頻度は、当業者によって理解されるように、詳細には、外来性核酸を含有する細胞が所望のポリペプチドを生成することを継続する時間に伴って変化し得る。また、特定の治療においては、治療結果を最適化するために２つ以上の異なるタンパク質を使用することが所望され得る。
【０１６９】
核酸は、種々のプロトコールによって、選択された組織に投与され得る。好ましい投与方法は、固形器官（例えば、心臓または肝臓）、または他の固形細胞塊（例えば、固形腫瘍）を通じた、核酸の液体処方物の灌流である。器官または細胞塊（これが、とりわけ、標的された細胞への核酸の送達を制限し得る）を通じた灌流液を再循環することが好ましくあり得る。好ましい灌流プロトコールは、以下の実施例に記載されている。また、適切な灌流手順については、Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７，９４：４６６４〜４６６８を参照のこと。
【０１７０】
アデノウイルスベクターが使用される場合、この核酸は好ましくは、アデノウイルスを吸着する赤血球細胞を本質的に含まない（容積の約５％未満）か、または完全に含まない処方物中で投与される。クレブス溶液は特に好ましいキャリアである。好ましくは、この液体キャリアは、上記のような低カルシウムイオン濃度を有する。しかし、他の溶液、生理学的レベルの赤血球細胞およびカルシウムを有するネイティブな血流も使用でき、ある態様、例えば遺伝子導入を強化するための主要な介入が脈管透過性の変更である場合においては適当であろう。
【０１７１】
液体キャリア内の核酸の濃度は変更できるが、上記で考察されたように、核酸取り込みの効率をよくするためには、高濃度であることが好ましい。より詳細には、好ましくは、クレブス溶液のような液体キャリア中の投与される核酸を含有するウイルスベクターの濃度は、約１×１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌ以上、好ましくは、約５×１０８、より好ましくは、約１．０×１０９または１．５×１０９ｐｆｕ／ｍｌ以上の濃度である。
【０１７２】
核酸を含有する灌流溶液の流速は変更できるが、好ましくは、核酸取り込みを増加させるためには、送達導管（血管）における正常な血流に比べて速い方がよい。例えば、送達導管における正常な血流に比べて少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、または７５パーセント以上迅速な灌流速度が適用できる。ある態様においては、さらに速い流速（例えば、正常な血流に比べて少なくとも約１００、２００、３００、４００、または５００パーセント以上迅速な灌流速度）が好ましい。被験体の正常な血流速度に比べて６００、７００、８００、９００、または１０００パーセント以上速い流速が好ましい態様である。
【０１７３】
本発明の特定の適用は容易に最適化され得ることが理解されるべきである。例えば、最適透過剤は、コントロールに対する簡易な試験によって上記で考察したように容易に選択される；低カルシウム条件の使用は、コントロールに対して試験することによって容易に評価され得る；灌流液の流速、核酸の灌流液濃度などもまた全て、コントロールに対する試験によって容易に最適化され得る。最適条件および試薬は、例えば、種々の器官または異なる種の哺乳動物に対する投与について、適用ごとに変更できる。
【０１７４】
核酸は、種々の灌流方法によって投与できる。従って例えば、インビボ投与においては、カテーテル送達プロトコールが使用される。このようなその場での投与は、単に核酸を送達するための手順において、または末梢心臓バイパスのような別の外科的手順と組み合わせて、適切に使用され得る。好ましい送達カテーテルおよび系（システム）は、ＷＯ９９１８７９２Ａ１に開示されている（その特許広報の図を参照のこと）。
【０１７５】
核酸はまた、例えば、冠動脈バイパス手術および大動脈弁置換手術中に実施されるような体外循環の手順での灌流によって適切に投与される。臨床的には、灌流処方物を送達、回収、場合によっては再循環するのに動脈血管および静脈血管の両方が用いられ、心臓への遺伝子導入を標的化し、遠隔の器官または組織への送達を最小限にしている。
【０１７６】
特定の透過剤の利用可能性（バイアビリティー）および効率性、カルシウム濃度条件、クローニングビヒクル、および灌流条件（例えば、流速）投与される核酸の量、灌流液中の核酸の濃度などを見極めるために、エキソビボ灌流システムがまた、特に試験動物（例えば、ウサギ、げっ歯類など）において、使用され得る。エキソビボ手順はまた、治療剤送達手順に使用され得、その後器官が患者へ移植され得る。適切なエキソビボ系は、ＷＯ  ９９１８７９２Ａ１の図２に示されている。
【０１７７】
別のエキソビボ方法としては、インタクトな器官の取り出しを伴わないが、器官の選択された組織を取り出し、外来性核酸でその組織の細胞を形質転換し、次いでこの組織を再移植する。しかし、上記で考察したように、このようなアプローチは、実質的な外科的介在が必要であること、および遺伝子的に改変された細胞を効率的に移植（接合）することが困難であることから、一般には好まれない。
【０１７８】
さらに、他の治療薬（非ペプチド治療剤を含む）を、外来性核酸の遺伝子産物と一緒に投与してもよい。１例としては、血管攣縮を制御するためにニトログリセリンを同時に投与してもよいし、または悪性の細胞の処置中に抗癌剤を同時に投与してもよい。
【０１７９】
本発明はまた、被験体の治療用の薬学的キットを提供する。本発明のキットは好ましくは、上記で考察したような、カテーテルのような外来性核酸を投与するための送達システムまたは送達デバイス、上記で考察したようなエキソビボ投与系、注射投与のためのシリンジ（注射器）などを備える。このキットは投与される核酸を、本発明に基づいて、好ましくは低カルシウム濃度の、薬学的に許容される、例えばクレブス溶液または他の緩衝化溶液キャリアに溶解したウイルスベクターのような適切なクローニングビヒクルに含まれている投与に適した形態で包含するか、また例えば種々の緩衝液、糖、塩などの他の因子を有していてもよい。あるいはこの核酸は、凍結乾燥され、液体キャリアとは別にパッケージングされていてもよい。キット中には最適な用量の核酸およびキャリアが含まれている事が好ましい。本発明の薬学的なキットは、上記で考察された外来性遺伝子産物と同時に投与できる他の治療薬を備えていてもよい。
【０１８０】
本発明のキットはまた、好ましくは、１つ以上のＰＤＥインヒビター化合物に加えて、さらに任意の脈管系透過剤を含み、これらは被験体の選択された領域を通じて１つ以上の試薬を灌流するための液体処方物とは別々に、または一緒にパッケージングされていてもよい。このキットはまた、被験体の選択された領域において、カルシウム濃度を所望のレベルに低下させるためのカルシウム「ウオッシュアウト（洗い出し）」処方物を含んでいてもよい。例えば、このような「ウオッシュアウト」溶液は、本発明に基づく、低カルシウム濃度のクレブス溶液または他の液体であり得、そして上記で考察したように、外来性核酸の投与の前に投与され得る。キット中には、外来性核酸の送達前に投与する１つ以上の透過剤が前記の処方物とは別にパッケージングされているか、またはこのような低カルシウム濃度溶液とともに事前処方されているかのいずれかで存在している。本発明のキットの各々の材料、または被験体、特にヒトに投与される本発明の組成物は、無菌であるか薬学的に許容されるものでなければならない。投与されるキット材料の各々は、適切な容器中に貯蔵され、各々の容器は、密封してシールされるのが好ましい。このキットには、キット材料の用法・用量に関する書面の説明書を備えられているのが好ましい。
【０１８１】
上記で考察したように、本発明はまた、レシピエント被験体に形質転換したドナー細胞を導入して、このレシピエントにおいて所望の遺伝子産物を発現するための方法を提供する。本明細書記載されているように、核酸は、脈管系透過性を強化することによって、ドナー細胞に導入される。これらの異種移植方法のための代表的なレシピエント被験体としては、上記で開示した被験体、すなわち、哺乳動物、特に霊長類、好ましくはヒトが挙げられる。ドナー細胞は、上記で開示された種々の供給源に由来する。ブタのようなスワイン（ブタ類）、またはヒトのような霊長類由来のドナー細胞が一般に好ましい。外来性核酸を含有する細胞を有する固形のドナー器官が、レシピエント被験体に移植され得る。異種移植手順は通常、米国特許第５，６５０，１４８号、および同第５，６５８，５６４号などのような文献に記載されている。
【０１８２】
本明細書において言及される全ての文書は、参照として本明細書に取り込まれている。
【０１８３】
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。
【０１８４】
全般的解説
下記の材料および条件を、以下の実施例１において使用した。
【０１８５】
方法：脈管透過性メディエータに対する曝露の効果の数量化は、元来のＲＯＩで報告された方法、およびＷＯ９９１８７９２Ａ１に開示されたような特許出願で報告された方法を用いて、実施した。この方法は、脈管化合物を用いた、およびＡｄｇａｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ−ガラクトシダーゼをコードする組み換えアデノウイルス）を用いたウサギ心臓のエキソビボ灌流、それに続く心筋細胞の酵素消化および単離、この心筋細胞の４８時間の細胞培養、および遺伝子導入を実証するためのＸ−ｇａｌ染色を包含する。具体的な方法は以下のとおりである：
【０１８６】
アデノウイルスベクター。Ａｄｇａｌは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターによって駆動されたＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子を含んだ。ウイルスのストックを前に記載された７ように増殖させ、小容積にアリコートし、そして１０％グリセロールを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に−８０℃で貯蔵した。伝統的な方法７を用いて実施した２種のプラークアッセイの平均値によってウイルス力価を決定した。１０９個の組み換えウイルス中の１個の複製コンピテントなウイルスを検出する感度を有する上清レスキューアッセイ（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｒｅｓｕｃｕｅ  ａｓｓａｙ）８を用いて試験した場合、ウイルスストックは、複製コンピテントなウイルスを含まなかった。
【０１８７】
ランゲンドルフ感染。ウサギの心室筋細胞を、以前に記載された６ように感染させた。成体のニュージーランド白色ウサギ（２〜３ｋｇ，Ｎ＝４８）に、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ（静脈内））の前に、ヘパリン抗凝血（１０００単位、ＩＶ）を投与した。各心臓を摘出し、そして１３８．２ｍｍｏｌ／ＬのＮａ＋、５．４ｍｍｏｌ／ＬのＫ＋、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇ２＋、１．０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、１４４．４ｍｍｏｌ／ＬのＣｌ−、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＳＯ４２−、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＨ２ＰＯ４−、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、および１５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースを含有する、氷冷した改変クレブス緩衝液（ｐＨ７．４でＯ２で飽和した）中で２回リンスした。次に、大動脈にカニューレを挿入し、そして３５〜３７℃で断熱チャンバ（ｉｎｓｕｌａｔｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）中に心臓を吊るした。その後の実験操作の間、心拍数、冠血流、および大動脈内圧を、１０分間隔でモニターした。
【０１８８】
ランゲルドルフ灌流は、上行大動脈中のカニューレから冠動脈への逆向き流によって生じた。最初に２０ｍｌのクレブス緩衝液を用いて、約３０ｍｌ／分で各心臓を灌流した。最初の灌流後、以下のうち１つを用いて心臓を前処理した：（１）１×１０−７ｍｏｌ／ＬのサブスタンスＰを含有する１５ｍｌの標準的クレブス緩衝液（３０秒以上）、（２）１×１０−９ｍｏｌ／ＬのＶＥＧＦを含有する６０ｍｌの標準的クレブス緩衝液（２分以上）、（３）９×１０−５ｍｏｌ／Ｌのニトログリセリンを含有する６０ｍｌの標準的クレブス緩衝液（２分以上）、（４）９×１０−５ｍｏｌ／Ｌのニトロプルシドナトリウムを含有する６０ｍｌの標準的クレブス緩衝液（２分以上）、（５）１×１０−４ｍｏｌ／Ｌの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを含有する６０ｍｌの標準的クレブス緩衝液（２分以上）、（６）３×１０−１０ｍｏｌ／ＬのＶＥＧＦ（２分間）の前に、１×１０−５ｍｏｌ／Ｌのザプリナスト（Ｓｉｇｍａ）、１×１０−５ｍｏｌ／Ｌのシルデナフィル（Ｐｆｉｚｅｒ）、または１×１０−６ｍｏｌ／ＬのＴ−１０３２（Ｔａｎａｂｅ）（１５分間）。
【０１８９】
前処理後、前述の濃度の前処理化合物およびＡｄｇａｌ  １×１０８ｐｆｕ／ｍｌを含有するクレブス緩衝液で２分間、心臓を感染させた。感染後、灌流液を収集して、再循環し、流速を蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ  Ｃｏ．）によって制御した。感染の間隔期の終わりの時点で、総ランゲルドルフ時間１８０分の間、循環していない、ウイルスを含まないクレブス緩衝液を用いて、心臓を灌流させた。実験の感染およびウオッシュアウト（洗い出し）相の後、筋細胞を、１０〜１５ｍｌ／分で５分間、名目上カルシウムを含まないクレブスを用いた灌流によって培養し、その後の２５ｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ（ＸＩＶ画分、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、６０ｍｍｏｌ／Ｌのタウリン、８．０ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン酸、および２．０ｍｍｏｌ／Ｌのｄ，ｌ−カルニチンを含有するクレブス緩衝液からなる酵素溶液で単離した。消化後、心室を切除し、細かく刻み、そしてパスツールピペットによる反復吸引によって攪拌した。得られた細胞懸濁液を、２００ｍのナイロンメッシュフィルターを通して濾した。心室は均一に消化され、そしてこのフィルター上に残った残滓は、心筋は最小限しか含まず、弁および腱の構造由来であった。カルシウムを４段階で徐々に増やし、その後この細胞を１９９培地（ｍｅｄｉｕｍ  １９９）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）（５．０ｍｍｏｌ／Ｌのクレアチン、５．０ｍｍｏｌ／Ｌのｄ、ｌ−カルニチン、５．０ｍｍｏｌ／Ｌのタウリン、１００ｕ／ｍｌのペニシリン、および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した）に添加し、そしてラミニンでコーティングしたシャーレに入れ、３７℃インキュベータに入れた。形態学的に正常な筋細胞をカウントすることによって定量した、各々の単離についての心筋消化および生存細胞の数は、いずれの実験操作によっても影響されなかった。別のコントロール実験において、心臓を偽感染させた（Ｎ＝２）。これらの実験由来の細胞でガラクトシダーゼ活性に関してポジティブに染色された細胞はなかった。培養した成体ラット心室筋細胞において、同様のネガティブなコントロールデータが報告されている７。本研究において用いた動物は、実験動物に関する米生理学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）の指導方針に従って維持した。実験プロトコールは、ジョンホプキンス大学（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の施設内の動物管理および取り扱い委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１９０】
レポーター遺伝子アッセイおよびデータ分析。Ａｄｇａｌへの曝露の４８時間後、筋細胞を、室温で５分間、０．０５％のグルタルアルデヒド中で固定した。次いで、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、そして１．０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ，４−クロロ，３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）、１５ｍｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム、および１ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ中で３７℃で一晩染色した。各実験について、四百個の細胞をカウントした。４８時間での筋細胞生存は、ウイルス濃度または実験プロトコールにおける変化にともなって変化することはなかった。
【０１９１】
統計的分析。他に述べない限り、全ての実験を三連で実施し、そしてデータを平均±ｓ．ｄ．（標準偏差）として示す。独立スチューデントｔ検定を用いて、５％レベルで統計的有意差を決定した。
【０１９２】
実施例１：
サブスタンスＰおよびＶＥＧＦの投与。Ａｄｇａｌを用いた感染の前に、１×１０−７ＭのサブスタンスＰ、または１×１０−９ＭのＶＥＧＦのいずれかを用いてエキソビボで灌流させるという心臓の処理によって、感染細胞のパーセンテージの有意な増大が生じる（図１）。これらの試薬は、ブラジキニンまたはセロトニンのいずれかよりも早く、微小血管透過性を増大し、そして１５分間のセロトニン曝露を必要とする前処理の２分以内に感染の同程度の増強を達成し得る。
【０１９３】
ニトログリセリン、ニトロプルシド、または８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを用いた処理。ＶＥＧＦ曝露またはサブスタンスＰ曝露後の脈管透過性の増大を媒介する細胞内経路は、一酸化窒素およびｃＧＭＰの生成を含む１−５。ニトログリセリンまたはニトロプルシドの外来性の投与は、局所的な一酸化窒素の増大を生じる。同様に、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ｃＧＭＰよりも緩徐に代謝されるｃＧＭＰアナログであり、細胞内のｃＧＭＰの有効濃度の増大を生じる。Ａｄｇｅｌ前に、これらの試薬のいずれかに対してエキソビボで灌流した心臓を曝露することで、ＶＥＧＦ投与またはサブスタンスＰ投与によって生じる感染効率の増大が再現される（図２）。
【０１９４】
ＶＥＧＦ曝露の前のシルデナフィル、ザプリナスト、またはＴ−１０３２の前処理。血管（脈管）内皮細胞は、ホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ−５）を用いてｃＧＭＰを代謝する５−６。感染効率に対する効果を評価するために、ＶＥＧＦ曝露およびＡｄｇａｌ曝露の前に、ＰＤＥ−５インヒビターの投与を実施した。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを用いた結果と同様、ＰＤＥ−５の阻害、その後のＶＥＧＦ処理によって、感染した細胞のパーセンテージが増大される（図３）。ＶＥＧＦの非存在下では変化はみられず、このことは、その効果が実際にＰＤＥ−５阻害由来であり非特異的な知見ではないことを示した。
【０１９５】
これらのデータは、インタクトな心筋に対する遺伝子送達の増大を示す。さらに、透過性効果を担うシグナル伝達経路の成分の細胞内濃度を増加させれば、遺伝子送達が改善される。微小血管透過性の増大を担う細胞内シグナル伝達経路に関するこの理解を利用して、ＰＤＥ−５インヒビターの使用が特に送達をもたらし得ることが示される。ＶＥＧＦ、サブスタンスＰ、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、ニトログリセリン、またはニトロプルシドに必要な曝露時間は、わずか２分であり、そしてＰＤＥ−５インヒビターは、この手順の前に経口的にまたは静脈内に投与され得るので、本発明の革新によって、遺伝子送達前の前処理時間が劇的に短縮される。
【０１９６】
結果はまた、本明細書において参照として取り込まれる、Ｎａｇａｔａら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏ，３３：５７５〜５８０（２００１）に開示されている。
【０１９７】
以下の特定の参考文献がまた、参考として援用されており、それは、カッコ中の数字（上付き数字）によって上記の実施例および考察に示されている。
【０１９８】
１．Ｗｕ，Ｈ．Ｍ．、Ｈｕａｎｇ，Ｑ．、Ｙｕａｎ，Ｙ．、およびＧｒａｎｇｅｒ，Ｈ．Ｊ．ＶＥＧＦ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＮＯ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｎｕｌｅｓ．Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１：Ｈ２７３５〜Ｈ２７３９，１９９６．
２．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｓ、Ｖｉｌｌａｂｌａｎｃａ，Ａ．Ｃ．、およびＲｕｔｌｅｄｇｅ，Ｊ．Ｃ．Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｖｉａ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．
Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｌ０６０−Ｒｌ０６９，１９９５．
３．Ｗｕ，Ｈ．Ｍ．、Ｙｕａｎ，Ｙ．、Ｚａｗｉｅｊａ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖｅｎｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏ  ２７６：Ｈ５３５−Ｈ５４２，１９９９．
４．Ｘｉａ，Ｐ．、Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｐ．、Ｉｓｈｉｉ，Ｈ．ら．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ’ｓ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，ｉｔｓ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ，ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：２０１８−２６，１９９６．
５．Ｈｏｏｄ，Ｊ．およびＧｒａｎｇｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｇ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒａｆ  １  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２３５０４−８，１９９８．
６．Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｃｏｒｂｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｓ．Ｈ．、およびＥｌｌｉｓ，Ｐ．Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ  ｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｂｅｃｌａｅ  ｃａｒｎｅａｅ  ａｎｄ  ａｏｒｔｉｃ  ｒｉｎｇｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ８３：３Ｃ−１２Ｃ，１９９９．
７．Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ、Ｐｒｅｖｅｃ  Ｌ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｕｒｒａｙ  ＥＪ（編）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９１，第１０９〜１２８頁．
８．Ｄｉｏｎ  ＬＤ、Ｆａｎｇ  Ｊ、Ｇａｒｖｅｒ  ＲＩ、Ｊｒ．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｒｅｓｃｕｅ  ａｓｓａｙ  ｖｓ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｔｏｃｋｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９６；５６：９９〜１０７。
【１９９】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳細に記載されている。しかし、当業者は、本開示の考慮に基づき、本発明の趣旨および範囲内で改変および改善をなし得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、ＰＤＥインヒビターの使用（サブスタンスＰ）にともなって著しく遺伝子導入が増強された、実施例１の結果を示す。
【図２】
図２は、図２（ａ）および図２（ｂ）を含む。図２（ａ）は、脈管透過性および遺伝子導入の増大を媒介する細胞内経路の略図を示す。図２（ｂ）は、アデノウイルス媒介遺伝子導入に対する、ニトログリセリン（ＴＮＧ）もしくはニトロプルシド（ＳＮＰ）を用いた、または５−Ｂｒ−ｃＧＭＰを用いた灌流の効果を示す。ＴＮＧおよびＳＮＰは、細胞内ＮＯを増大し、そして５−Ｂｒ−ｃＧＭＰは細胞内ｃＧＭＰを増大する。図２（ａ）について、略号は以下のとおりである；ＰＬ−Ｃγ：ホスホリパーゼＣ−γ；ＮＯＳ：硝酸シンターゼ；ＰＤＥ−５：ホスホジエステラーゼ  ５；ＧＣ：グアニレートシクラーゼ；ＰＫ−６：プロテインキナーゼＧ。
【図３】
図３は、実施例、特に遺伝子導入の結果を示す。エキソビボで灌流した心臓を、ＶＥＧＦ（０．３×１０−１０Ｍ、２分）単独に対して曝露するか、またはＰＤＥ−５インヒビターであるシルデナフィル（１×１０−５Ｍ）、ザプリナスト（１×１０−５Ｍ）、もしくはＴ−１０３２（１×１０−６Ｍ）に対する１５分の曝露後にＶＥＧＦに曝露した。次いで、心臓をＡｄβｇａｌ（１×１０−８ｐｆｕ／ｍｌ、２分）に曝露し、そして導入遺伝子を受け取った細胞の割合を定量した。Ｔ−１０３２についてのｎ＝１を除いて、各々についてｎ＝３であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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