(57)【要約】本発明は、一般に、分子生物学の分野および、特にＤＮＡ結合薬剤の処置および予防の分野に関する。本発明は、挿入する分子とポリヌクレオチドの複合体化を阻害する方法に指向される。好ましい実施形態に従って、本発明は、キサンチン分子と挿入分子とを複合体化する抗体を包含する方法に指向される。１つの実行に従って、キサンチンは、挿入する分子と接触され、ここでキサンチン分子は、Ｎ１、Ｎ３、Ｎ７、および／またはＮ９位で少なくとも１つのメチル基を含み得る。本発明の方法および／または化合物はまた、平面の多環芳香族炭化水素分子（例えば、ベンゾ（ザ）ピレンおよびジメチルベンズアントラセン）である挿入分子の阻害において有用である。
2004514741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドとインターカレート分子との複合体化を阻害する方法であって、
インターカレート分子にキサンチン分子を接触させる工程であって、該キサンチン分子は、少なくとも１つのＲ基を、Ｎ１位、Ｎ３位、Ｎ７位および／またはＮ９位に含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｒ基は、メチル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キサンチン分子は、Ｃ８位に酸素またはハロゲンをさらに含み、該ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インターカレート分子は、複素環式化合物からなる群より選択され、該複素環式化合物は、アクリジンオレンジ、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ノバントロン、エリプチシン、臭化エチジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８およびアフラトキシンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インターカレート分子は、平面状のポリ芳香族炭化水素分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記平面状のポリ芳香族炭化水素分子は、ベンゾ（ａ）ピレンおよびジメチルベンゾアントラセン（ｂｅｎｚａｔｈｒａｃｅｎｅ）からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記キサンチン分子は、水性媒体中に存在し、該キサンチンの溶液の濃度は、約１μＭ〜約１Ｍの範囲内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キサンチン分子は、水性媒体中に存在し、該キサンチンの溶液の濃度は、約１μＭ〜約０．１Ｍの範囲内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
キサンチンは、さらに水性媒体を含み、該キサンチンの濃度は、約１００μＭ〜約１０００ｍＭの範囲内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記キサンチン分子におけるＲ基置換の数は、５以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記キサンチン分子は、１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記キサンチン分子と前記インターカレート分子との間の結合親和性は、少なくとも１５０Ｍ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キサンチンの濃度は、前記インターカレート分子の濃度以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドとインターカレート分子との複合体化を阻害する方法であって、
インターカレート分子にインターセプター分子を接触させる工程であって、該インターセプター分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、ポルフィリンおよびポリヌクレオチドからなる群より選択される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
キサンチンの濃度は、前記インターカレート分子の濃度以上である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチド分子からインターカレート分子を除去する方法であって、
インターカレート分子にキサンチン分子を接触させてキサンチン−インターカレート分子複合体およびポリヌクレオチド分子を形成させる工程であって、該キサンチン分子は、少なくとも１つのＲ基を、Ｎ１位、Ｎ３位、Ｎ７位および／またはＮ９位に含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記Ｒ基は、メチル基である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記キサンチン分子は、Ｃ８位に酸素またはハロゲンをさらに含み、該ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記インターカレート分子は、複素環式化合物からなる群より選択され、該複素環式化合物は、アクリジンオレンジ、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ノバントロン、エリプチシン、臭化エチジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８およびアフラトキシンからなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記インターカレート分子は、平面状のポリ芳香族炭化水素分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記平面状のポリ芳香族炭化水素分子は、ベンゾ（ａ）ピレンおよびジメチルベンゾアントラセン（ｂｅｎｚａｔｈｒａｃｅｎｅ）からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キサンチン分子は、水性媒体中に存在し、該キサンチンの溶液の濃度は、約１μＭ〜約１Ｍの範囲内にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記キサンチン分子は、水性媒体中に存在し、該キサンチンの溶液の濃度は、約１μＭ〜約０．１Ｍの範囲内にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記キサンチンは、水性媒体中に存在し、該キサンチンの濃度は、約１００μＭ〜約１０００ｍＭの範囲内にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記キサンチン分子におけるＲ基置換の数は、５以下である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記キサンチン分子は、１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記キサンチン分子と前記インターカレート分子との間の結合親和性は、少なくとも１５０Ｍ−１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である、請求項１３に記載の方法。
【請求項３２】
前記キサンチン分子の濃度は、前記インターカレート分子の濃度以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
患者への抗新生物薬剤の効率よい送達のための組成物であって、該組成物は、
抗新生物薬剤、および
キャリア分子であって、該キャリア分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、尿酸、ポリヌクレオチド、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーを含む、キャリア分子、
から製造される、組成物。
【請求項３４】
前記キャリア分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記キャリア分子は、一本鎖、二本鎖、部分的な一本鎖、部分的な二本鎖、多重鎖、ループ状または架橋状である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記キャリア分子は、Ｒ基置換基を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記キャリア分子は、Ｎ１位、Ｎ３位、Ｎ７位またはＮ９位に置換されたＲ基を含むキサンチンである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記キャリア分子は、電気陰性のＲ基、電気陽性のＲ基、疎水性のＲ基および親水性のＲ基からなる群より選択される置換基を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
前記キャリア分子における前記置換基は、Ｃ２位、Ｃ４位またはＣ８位において存在する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗新生物薬剤は、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミトキサントロン、タキソテールおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４１】
患者へ抗新生物薬剤の効率よい送達のための組成物であって、該組成物は、
抗新生物薬剤、および
キャリア分子であって、該キャリア分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、尿酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーを含む、キャリア分子、
を含む、組成物。
【請求項４２】
前記キャリア分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記キャリア分子は、一本鎖、二本鎖、部分的な一本鎖、部分的な二本鎖、多重鎖、ループ状または架橋状である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記キャリア分子は、前記プリン、ピリミジン、キサンチンまたは尿酸の周囲にＲ基置換基を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｒ基置換基は、Ｎ１位、Ｎ３位、Ｎ７位またはＮ９位に存在する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記置換基は、電気陰性のＲ基置換基、電気陽性のＲ基置換基、疎水性のＲ基置換基および親水性のＲ基置換基からなる群より選択され、該置換基は、Ｃ２位、Ｃ４位またはＣ８位に存在する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗新生物薬剤は、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミトキサントロンおよびタキソテールからなる群より選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４８】
患者への抗新生物薬剤の効率よい送達のための方法であって、該方法は、
抗新生物薬剤およびキャリア分子を含む混合物を得る工程であって、該キャリア分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、尿酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーを含む、工程；ならびに
組成物を該患者に送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
患者への抗新生物薬剤の送達のための方法であって、該方法は、
抗新生物薬剤およびポリヌクレオチドを含む混合物を得る工程；ならびに
組成物を該患者に送達する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
前記抗新生物薬剤は、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ミトキサントロンおよびタキソテールからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者が、哺乳動物、鳥類、魚類、両生類、酵母、細菌、線虫、真菌、またはフルーツフライである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、フェレット、ウマ、ウシ、ブタおよびヤギからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリヌクレオチドが、二本鎖または一本鎖である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記送達工程が、経口投与、局所投与、経皮投与、ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与、エレクトロポレーションによるもの、吸入、またはリポソームによるものを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
発がん性インターカレート分子を、哺乳動物によって取り込まれ得る物質から除去する方法であって、該方法は、以下の工程：
インターカレート分子および物質によって形成される複合体にキサンチン分子を送達する工程であって、該物質は哺乳動物の身体に侵入し得、かつ、該インターカレート分子と複合体化し得る、工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記インターカレート分子がアフラトキシンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記物質がコーヒーである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記複合体が、前記哺乳動物の口、鼻、眼、耳、皮膚、肺、または肛門を介して前記身体に侵入する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物が、ヒト、げっ歯類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、または他の任意の真核生物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物の細胞性ＤＮＡから抗新生物性のインターカレート化合物を除去する方法であって、該方法は、以下の工程：
インターカレート分子と細胞性ＤＮＡとの相互作用によって形成される複合体にキサンチン分子を送達する工程；ならびに
キサンチン−インターカレート分子の複合体および細胞性ＤＮＡを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記インターカレート分子がドキソルビシンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物が、ヒト、げっ歯類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギまたはヒツジである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
抗新生物性のインターカレート化合物の細胞内濃度を減少する方法であって、該方法は、哺乳動物の細胞内媒体にキサンチン分子を送達する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
前記インターカレート分子がドキソルビシンである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記哺乳動物が、ヒト、げっ歯類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギまたはヒツジである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ポリ芳香族炭水化物の哺乳動物に対する毒性を減少する方法であって、該方法は、該ポリ芳香族炭水化物にキサンチン分子を送達する工程を包含する、方法。
【請求項６９】
前記ポリ芳香族炭水化物が、ベンゾ（ａ）ピレンまたはジメチルベンズアントラセン（ｂｅｎｚａｔｈｒａｃｅｎｅ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ポリ芳香族炭水化物がアフラトキシンである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７１】
二本鎖ＤＮＡからポリ複素環式色素および化合物を選択的に抽出する方法であって、該方法は、以下の工程：
インターセプター分子をインターカレート分子と接触させて、インターセプター−インターカレート分子複合体およびポリヌクレオチドを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記インターセプター分子が、プリン、キサンチン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｏｒｉｎ）、核酸およびこれらのポリマーからなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
二本鎖ＤＮＡからポリ複素環式色素および化合物を選択的に抽出する方法であって、該方法は、以下の工程：
多様な型のインターセプター分子をインターカレート分子と接触させて、インターセプター−インターカレート分子複合体およびポリヌクレオチドを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項７４】
前記インターセプター分子が、プリン、キサンチン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｏｒｉｎ）、核酸およびこれらのポリマーからなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
溶液中の化合物を濃縮する方法であって、該方法は、以下の工程：
因子をインターセプター分子と複合体化させる工程、
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記インターセプター分子が、ピリミジン、プリン、ポリヌクレオチド、キサンチン、尿酸およびポルフィリンからなる群より選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記インターセプター分子が、ピリミジン、プリン、ポリヌクレオチド、キサンチン、尿酸およびポルフィリンからなる群より選択されるモノマーの混合物からなるポリマーである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記因子が、固体相、液体相またはガス相にある、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記因子が、ポリ芳香族炭水化物、複素環式炭水化物、発がん物質、変異原および奇形発生因子からなる群より選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
ポリ複素環式色素を濃縮する方法であって、該方法は、以下の工程：
ポリ複素環式色素を、プリン、キサンチン、ピリミジン、ポリヌクレオチド、尿酸およびポルフィリンからなる群より選択されるインターセプター分子と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項８１】
前記インターセプター分子が、ピリミジン、キサンチン、尿酸およびポルフィリンからなる群より選択されるモノマーの混合物からなるポリマーである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ポリ複素環式色素を濃縮する方法であって、該方法は、以下の工程：
二本鎖ＤＮＡをポリ複素環式色素に接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項８３】
前記ＤＮＡが、１〜１０重量％である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＤＮＡが、０．１〜１重量％である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＤＮＡが、０．００１〜０．１重量％である、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の権利）
本発明は、歯科研究国際協会によって与えられた助成金番号ＤＢ００１５２の元で一部米国政府援助を用いて作成された。
【０００２】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２０００年１２月６日に出願され、そして「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　Ｘａｎｔｈｉｎｅｓ，Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ，ａｎｄ　Ｃａｆｆｅｉｎｅ」と題する米国規定特許出願番号第６０／２５１，９０６号（これは、全体が参考として本明細書中にはっきりと援用される）の利益を要求する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、一般に、分子生物学の分野および、特にＤＮＡ結合薬剤の処置および予防の分野に関する。
【０００４】
口部、吸引系、および他の組織について薬物および化学薬物の有害で、かつ発癌性の相互作用についての懸念は、癌の危険性の潜在的な減少を提供する系の研究を奨励し続ける。このようなアプローチの１つは、カフェインおよび他のキサンチン様化合物と多核性の芳香族炭化水素および関連する発癌性の物質との相互作用である。この相互作用は、おそらく分極拘束（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｂｏｕｄｉｎｇ）として公知の新規の機構を介して起こる。分極拘束は、安定な複合体を形成するようなサンドイッチ様積層（ｓｔａｃｋｉｎｇ）を介する２つの平面分子の相互作用である。この交互の極性化および極性可能な分子の平面対平面パッキングは、ファンデルワールス距離の短縮を生じ、それにより形成される複合体の安定性および強度を提供する。多核性の芳香族炭化水素（ＰＡＨ）（煙のないタバコおよび煙草の煙において見出される発癌物質のクラス）は、それぞれ口部癌および吸引系癌のインヒビターであると提唱される。図１−１は、同じＰＡＨの化学的構造を示す。キサンチンおよびＰＡＨは共に、平面分子であり、そして平面性は、ＰＡＨの発癌性および複合体化の要件として記載されていることが注目されるべきである。分極拘束の表現型（特に、キサンチン−ＰＡＨ複合体の形成において）は、観察されているが、癌予防の観点からはめったに研究されていない。ＰＡＨのデオキシリボ核酸との複合体化はまた、ＤＮＡのプリン塩基との分極拘束に起因し得る。
【０００５】
発癌および変異誘発への分極拘束の効果は、Ｍｅｄｌｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒｌｉｔコンピューターサーチに基づく文献に特に報告されていないが、多核性の芳香族炭化水素とカフェインおよび他のキサンチン様化合物との相互作用は、報告されている。例えば、カフェイン、ＴＭＵ、またはＤＮＡ溶液中のＰＡＨの可溶性および光学特性の測定は、複合体の形成において同様の機構を示す。ＰＡＨとデオキシリボ核酸との複合体化は、プリン塩基を含むＤＮＡに特に起因し得る。示したように、キサンチンおよびＰＡＨが平面分子であり、そして平面性は、ＰＡＨの発癌（性Ｐｕｌｌｍａｎ、１９５５，１９６４）および複合体化（ＪｏｎｅｓおよびＮｅｕｗｏｒｔｈ，１９４９；ＬｅｅｌａおよびＭａｓｏｎ，１９５７；ＰｕｌｌｍａｎおよびＰｕｌｌｍａｎ，１９５８；ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９６０，１９６１；Ｌｉｑｕｏｒｉら、１９６２；Ｖａｎ　ＤｕｕｒｅｎおよびＢａｒｄｉ，１９６３；Ｖａｎ　Ｄｕｕｒｅｎ，１９６４）に対する要件として記載されている。
【０００６】
いくつかの研究室は、キサンチンおよびキサンチンアナログと発癌性多環芳香族ＤＮＡインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）の相互作用について最近報告している（Ｌａｒｓｅｎら、１９９６；Ｔｒａｇａｎｏｓら，１９９１ａ，１９９１ｂ、１９９３；ＭａｃＬｅｏｄら、１９９１，１９９３；ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＫｉｍｍｅｌ，１９９３）。図１−２は、例示的なキサンチンの化学構造を示す。これらの同じキサンチンは、分極拘束という相互作用を介してＤＮＡインターカレータと結合する（ＭｃＫｅｏｗｎら、１９５１）。分極拘束は、π−π相互作用および２つの平面分子の積層であり、ここで１つは分極化（キサンチン）であり、他方は分極可能（ＤＮＡインターカレーター）である。これらの発癌物質と特定のキサンチンとの結合は、ｄｓＤＮＡへのその結合を阻害するかまたは減少することが示されている（ＢｏｏｔｈおよびＢｏｙｌａｎｄ，１９５３；Ｓｈｏｙａｂ，１９７９；Ｔｒａｇａｎｏｓら，１９９１ａ；ＭｃＬｅｏｄら，１９９１）。平面性は分極結合複合体化のために（ＭｃＫｅｏｗｎら、１９５１；ＨａｒｄｉｎｇおよびＷａｌｌｗｏｒｋ．１９５３，１９５５；Ｗａｌｌｗｏｒｋ，１９６１；Ｌｉｑｕｏｒｉら、１９６２；Ｍｉｌｌｅｒ，１９７０；Ｈｕｂｅｒｍａｎら，１９７６）、ならびにｄｓＤＮＡへの挿入のために（ＢｏｏｔｈおよびＢｏｙｌａｎｄ，１９５３；ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９６０，１９６１；Ｖａｎ　Ｄｕｕｒｅｎ，１９６４；Ｐｕｌｌｍａｎ、１９６４）必要な要件として記載されている。分極拘束は、発癌性多環芳香族炭化水素（例えば、ベンゾ（ザ）ピレンおよびジメチルベンズアントラセン（ｂｅｎｚａｎｔｈｒａｃｅｎｅ））のＤＮＡ内のプリン塩基のアデニンおよびグアニン、ならびに他のキサンチン様分子との拘束のための機構として提供されている（ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９６０，１９６１）。キサンチン様分子が、ｄｓＤＮＡへのインターカレータ由来の多環芳香族ＤＮＡ挿入性薬剤（ＤＮＡ−ＩＡ）を阻害する特定の機構は、キサンチンとＤＮＡ−ＩＡとの間の分極拘束複合体の形成に起因することが示唆されている（Ｔｒａｇａｎｏｕｓら、１９９９１ａ、１９９１ｂ；ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＫｉｍｍｅｌ，１９９３；Ｔａｃｈｉｎｏら、１９９４；Ｌａｒｓｅｎら、１９９６）。インビトロおよびインビボにおけるＤＮＡ−ＩＡのＤＮＡへの挿入の可逆性の程度は、達成されたままである。
【０００７】
（発明の要旨）
１つの実施形態に従って、本発明は、挿入する分子とポリヌクレオチドの複合体化を阻害する方法に指向される。好ましい実施形態に従って、本発明は、キサンチン分子と挿入分子とを複合体化する抗体を包含する方法に指向される。１つの実行に従って、キサンチンは、挿入する分子と接触され、ここでキサンチン分子は、Ｎ１、Ｎ３、Ｎ７、および／またはＮ９位で少なくとも１つのメチル基を含み得る。
【０００８】
本発明の別の実施形態に従って、キサンチン分子はまた、Ｃ８位で酸素基または塩素基の少なくとも１つの置換を含み得る。本発明は、種々の挿入する分子（アクリジンオレンジ、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ノバントロン、エリプチシン、臭化エチジウム、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３２５８、アフラトキシンおよび／またはそれらの混合物からなる群が挙げられるがこれらに限定されない）上で使用され得る。
【０００９】
本発明の方法および／または化合物はまた、平面の多環芳香族炭化水素分子（例えば、ベンゾ（ザ）ピレンおよびジメチルベンズアントラセン）である挿入分子の阻害において有用である。
【００１０】
別の実施形態に従って、キサンチンの代わりのポルフィリンが、使用されて、挿入分子と接触され得る。
【００１１】
まださらなる実施形態に従って、そしてインターカレータに依存して、キサンチン分子上のメチル基置換の数は、増加する。たとえば、本発明のキサンチン分子は、１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１、３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチン、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態に従って（そしてインターカレータに依存して）、挿入分子とキサンチンとの間の結合親和性は、好ましくは少なくとも１５０Ｍ−１である。本発明は、１つの実施形態に従って、有用な方法に指向される。ここで、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡからなる群より選択され、そしてポリヌクレオチドは１本鎖または二重鎖である。
【００１３】
本発明の方法の別の実施形態に従って、挿入分子は、キサンチン分子を送達し、そしてキサンチン−挿入分子複合体およびポリヌクレオチド分子を形成することによってポリヌクレオチド分子から除去され得る。使用される特異的なキサンチン分子および投薬は、環境および挿入分子の存在に依存する。好ましくは、キサンチン分子は、メチル基をＮ１、Ｎ３、Ｎ７、および／またはＮ９位で含む。
【００１４】
環境およびインターカレータの存在に依存して、キサンチン分子は、好ましくは、酸素またはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ）をＣ８でさらに含み得る。挿入分子は、アクリジンオレンジ、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ノバントロン、エリプチシン、臭化エチジウム、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３２５８、およびアフラトキシンからなる群より選択される。挿入分子は、平面多環芳香族炭化水素分子であり得る。平面多環芳香族炭化水素分子は、ベンゾ（ザ）ピレンおよびジメチルベンズアントラセンであり得る。
【００１５】
さらに、キサンチン分子上のメチル基置換の数は、５未満まで増加し得る。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態に従って、本発明は、抗腫瘍性の薬剤の患者への効果的な送達のための組成物を提供する。好ましくは、この組成物が、抗腫瘍性薬剤および少なくとも１つのキャリア分子から製造される。このキャリア分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、および／または尿酸（ｕｒｓｉｃ　ａｃｉｄ）からなる群より選択され得る。好ましくは、キャリア分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを含む。本発明のキャリア分子は、１本鎖、２本鎖、部分的に１本鎖、および部分的に２本鎖、多重鎖、ループ、ならびに／または架橋などであり得る。
【００１７】
本発明の組成物は、１つの実施形態に従って、プリン、ピリミジン、キサンチン、または尿酸の周りにＲ基置換を含むキャリア分子から製造され得る。この組成物はまた、Ｒ基置換をＮ１、Ｎ３、Ｎ７、またはＮ９位で含み得る。この組成物はまた、他の置換をＣ２、Ｃ４、またはＣ８位で含み得る。
【００１８】
本発明は、哺乳類、ヒト、鳥類、魚類、両生類、酵母、細菌、線虫、および昆虫の処置について有用である。本発明はまた、植物、真菌、糸状菌、藻類、ならびに／または核酸および／もしくはＤＮＡを含む他の実体の処置に適用可能である。
【００１９】
本発明の組成物は、吸入、経口投与、局所投与、経皮投与、ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与によってか、エレクトロポレーションによってか、またはリポソームによって送達され得る。
【００２０】
本発明の１つの実施形態のなお別の実施において、発癌性挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）分子を、哺乳動物によって摂取され得る物質から除去する方法が、提供される。本方法は、挿入分子および哺乳動物の身体に入り得る分子によって形成された複合体にキサンチン分子を送達する工程ならびに挿入分子と複合体化する工程を包含する。この挿入分子は、アフラトキシンであり得る。
【００２１】
本発明のなお別の実施において、哺乳動物の細胞のＤＮＡから抗腫瘍性挿入化合物を除去する方法が、提供される。本方法は、挿入分子および細胞のＤＮＡの相互作用によって形成された複合体にキサンチン分子（単数または複数）を送達する工程ならびにキサンチン−挿入分子複合体および細胞のＤＮＡを形成する工程を包含する。この挿入分子は、例えば、ドキソルビシンであり得る。
【００２２】
本発明の別の実施は、抗腫瘍性挿入化合物の細胞内濃度を減少させるための方法を含む。本方法は、好ましくは、キサンチン分子の挿入化合物への送達を包含する。この挿入分子は、好ましくはドキソルビシンであり得る。
【００２３】
本発明の１つの実施形態のなお別の実施において、多芳香族炭化水素の哺乳動物に対する毒性を低減する方法が提供される。本方法は、多芳香族炭化水素にキサンチン分子を送達する工程を包含する。この多芳香族炭化水素は、好ましくは、ベンゾ（ａ）ピレンまたはジメチルベンズアントランである。
【００２４】
本発明の別の実施は、二本鎖ＤＮＡから多複素環式色素および化合物を抽出し得る。本方法は、インターセプター（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ）分子に前述の色素および化合物を接触させる工程を包含する。この多複素環式色素とインターセプター分子との間の複合体の形成は、二本鎖ＤＮＡからのこの色素の除去に続く。これらのインターセプター分子は、好ましくは、プリン、ピリミジン、キサンチン、ポルフィリン（ｐｒｏｈｙｒｉｎ）、尿酸、ポリヌクレオチド、またはポリマー、あるいはそれらの混合物である。
【００２５】
別の実施形態において、本発明を用いて、多複素環式色素を濃縮し得る。本方法は、多複素環式色素分子にインターセプター分子を接触させる工程を包含する。インターセプター分子は、プリン、ピリミジン、キサンチン、尿酸、ポルフィリン、またはポリヌクレオチドである。好ましい実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、このインターセプター分子として用いられる。好ましくは、二本鎖ＤＮＡの濃度は、０．００１％〜１０％（ｗｔ／ｗｔ）の間であるべきである。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態において、インターセプター分子を用いて、媒介物中の活性因子を濃縮する。本方法は、インターセプター分子に除去されるべき因子を接触させる工程を包含する。このインターセプター分子の選択は、その周囲の状況に依存する。好ましくは、インターセプター分子は、ピリミジン、プリン、キサンチン、尿酸、ポルフィリン、ポリヌクレオチド、またはこれらの組み合せもしくはこれらの混合物であり得る。別の実施形態において、除去されるべき因子は、固相、液相、または気相中のいずれかに存在し、そして固相、液相、または気相中にある支持体に単に接触され得る。
【００２７】
別の特性および利点は、以下の説明および上記の特許請求の範囲から明白となる。
【００２８】
（詳細な説明）
本発明は、１つの実施形態に従って、ＤＮＡインターカレータのキサンチンベースの分子との複合体化に関する。本発明の１つの実施形態に従って、過剰のキサンチン分子は、このインターカレータ分子が他の分子（例えば、ＤＮＡ）に代わってキサンチン分子と結合するように、提供される。
【００２９】
１つの実施形態に従って、ＤＮＡインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）は、このＤＮＡインターカレータ分子がキサンチン分子に結合するように、キサンチンで処理され得る。キサンチン分子の存在量は、好ましくは、このインターカレータ分子の存在量よりも多いべきであり、そしてこのキサンチン分子は、このましくは、ＤＮＡインターカレータに対して十分な結合親和性を有する。ＤＮＡがこのキサンチンに添加され、そしてこのキサンチンがＤＮＡインターカレータに対する十分な結合親和性を有して、インターカレータ／キサンチン複合体が形成される場合、このＤＮＡインターカレータは、ＤＮＡに対して最小限でただ結合する。
【００３０】
以下の実施例で使用したキサンチンおよびプリンは、９８％以上の純度で商業的に得て（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、さらに精製することなく使用した。テトラメチル尿酸（１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチン）をＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏから別々に得た。アクリジンオレンジ（３，６−ビス［ジメチルアミノ］アクリジンハイドロクロライド）（＞９９％　純度）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を、５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（１．０Ｍ　溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中に５０ｍＭの濃度の保存溶液に調製した。アクリジンオレンジ（ＡＯ）を、その公知のスペクトル特徴、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの両方に対する蛍光発色団マーカーとしての広範な使用に起因して、代表的なＤＮＡインターカレータとして選択した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９７３；ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、１９８７、１９９０；ｖｏｎ　ＴｓｃｈａｒｎｅｒおよびＳｃｈｗａｒｚ，１９７９）。全ての保存溶液および以後の希釈は、適切な重量の化合物を、０．１Ｍ　ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整した５．０ｍＭ　ＨＥＰＥＳに溶解することによって調製した。ＡＯの分子構造およびＡＯと複合体を形成することが見出されたいくつかの選択されたキサンチンの例を、図２−１に示す。以下のキサンチンを、図２−１に示す：（Ａ）１−メチルキサンチン；（Ｂ）１，３−ジメチルキサンチン（テオフィリン）；（Ｃ）１，３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）；（Ｄ）１，３，７，９−テトラメチル−８−ヒドロキシキサンチン（テトラメチル尿酸）；および（Ｅ）３，６−ビス［ジメチルアミノ］アクリジン（アクリジンオレンジ）。
【００３１】
（実施例１）
実施例１は、キサンチンとインターカレータ分子との複合体化を示す。キサンチン−インターカレータ複合体の形成は、蛍光標識したインターカレータ分子の色シフトを介して実証し得た。特定のキサンチン添加の際の、ＡＯの光学吸光度の最大値における赤色スペクトルのシフトは、２つの化合物間で形成された複合体の可能性を示す。特定のシフトは、光学滴定によって測定され得る。
【００３２】
光学滴定（ＡＯの溶液への種々のキサンチンの連続添加）を、２．０ｍＬの１０μｍｏｌ　ＡＯ溶液を含む３ｍＬ（１ｃｍ光路）石英キュベットを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＤＵ−６００　Ｓｃａｎｎｉｎｇ分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ）で実施した。このＤＵ−６００分光光度計は、サンプル分析の前に、スキャンする全波長範囲にわたって、２ｍＬのｐＨ７．０で緩衝化された５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液を用いてブランクにした。これは、ＨＥＰＥＳ緩衝液からのバックグラウンド吸光度を差し引きする必要性を減じた。光学吸光度スキャンを、好ましくは４００ｎｍ〜５５０ｎｍの波長範囲にわたって実施した。４００ｎｍよりも長い波長での吸光度スペクトルは、試験したキサンチンに関して最小であった。１０μＭ　ＡＯ溶液を、各滴定の連続を開始する前にスキャンして、吸光度スペクトルにおける任意の変化を定量的にモニターした。光学吸光度実験を、調製したキサンチン保存溶液（５ｍＭ〜５０ｍＭ）からとった１：Ｌ〜２０：Ｌの容量で変化するアリコートを用いて実施し、２．０ｍＬの１０μＭ　ＡＯ溶液を含むキュベットに滴定した。次いで、このキュベット中の溶液を、スキャンする前に１０秒間振ることによって完全に混同した。全ての滴定を、室温（２５±１℃）で実行した。吸光度スペクトルを、１ｎｍ間隔で測定し、そしてデジタル形式で保存した。デジタル化したスキャンデータを、製造者ら（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）によって供給された変換プログラムを用いてＬｏｔｕｓ　Ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔファイル（＊．ｗｋｌ）に変換し、次いで、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ　９７ＴＭ　Ｗｏｒｋｂｏｏｋファイル（＊．ｗｌｓ）にインポートし、そしてさらなる分析のためにこのフォーマットで保存した。各滴定に関するスペクトルデータを合わせ、そしてＡＯを用いて滴定した各キサンチンに対してグラフ形式で示した（ＥｘｃｅｌＴＭ）（Ｘ軸＝ｎｍでの波長；Ｙ軸＝光学吸光度）。吸光度値に添加されたアリコートの容積によって決定される調整因子を乗算することによる、キサンチンの追加に起因して（Ｌａｒｓｅｎら、１９９６）、最初の吸光度データを希釈に関して補正した。この操作は、希釈効果を差し引きするために、吸光度値をわずかに増加させる。調整した吸光度値を、プロットし、そして複合体化していないＡＯからのスペクトルに対して比較した。これは、ＡＯがキサンチンと複合体を形成する場合に生じる、予想したスペクトルシフトの可視化を可能にした。
【００３３】
図２．２Ａは、テオフィリンの非存在下（Ｉ）および存在下（ＩＩ）でのテオフィリン−ＡＯ複合体の、光学吸光度スペクトルを示す。テオフィリン−ＡＯ複合体のスペクトルは、溶液中の５ｍＭのテオフィリンおよび１０μＭのＡＯの結果であり、希釈に関して調整した。特定のキサンチンの添加の際のＡＯの光学吸光度の最大値におけるスペクトルシフト（赤）（図２〜２Ａに示す）は、２つの化合物間で形成される複合体の可能性を示す。１０μＭでのＡＯの光学スペクトルを、図２〜２Ａに示し、約４９５ｎｍでの最大の可視領域における吸光度バンドを示す。例えば、１，３−ジメチルキサンチン（テオフィリン）の添加の際、この最大値は、約５０７ｎｍにシフトする。テオフィリンの存在下でのＡＯの吸光度最大値におけるこの赤色シフトは、Δ曲線を用いることによって（図２〜２Ｂ）、ＡＯとテオフィリンとの間で形成された複合体についての会合定数を決定するための簡便な方法を提供する。
【００３４】
（実施例２）
結合親和性において含まれるような系の動力学を、実施例２で調べた。会合定数（Ｋａｓｓｏｃ）を使用して、改変したキサンチンのＤＮＡインターカレータに対する結合能力を分析し得た。会合定数は、吸光度スペクトルにおける差次的なシフトに基づいて計算され得る。キサンチンの存在がスペクトルシフトを引き起こす場合、異なる吸光度プロットまたはΔプロットが得られる。Δプロットは、キサンチンの存在下でのＡＯの調整した吸光度スペクトルを、各波長におけるＡＯ単独の初期スペクトルから差し引きすることによって、そして滴定の各アリコートに対して構築された。この手順は、異なる吸光度値またはΔ吸光度値の作成を可能にする。この様式で得たΔ吸光度値（Ｙ軸＝Δ吸光度）を、波長（ｎｍ）に対して（Ｘ軸）プロットした。単一等吸収点（ｉｓｏｂｅｓｔｉｃ　ｐｏｉｎｔ）の出現は、溶液中に２種のみ（ＡＯおよびＡＯ複合体）しか存在しないことを示した。グラフで表示することによって、会合定数を決定するために最大の感度を有する波長の選択が可能になった。この波長を、ＡＯ溶液への各キサンテンアリコートの添加の際に観察されたΔ吸光度値における最も大きいポジティブ応答によって、特徴付けた。ＡＯ−キサンテン会合定数または結合定数を、以下の平衡式によって決定した：
式１：Ｉ＋Ｘ＝ＩＸ
ここで、Ｉは、インターカレーター（ＡＯ）を示し、Ｘは、インターセプター分子（キサンチン）を示し、そしてＩＸは、ＡＯ−キサンチン複合体をそれぞれ示す。これは、会合定数Ｋａｓｓｏｃについての以下の式（Ｃｏｎｎｏｒｓ、１９８７）を導く：
式２：ΔＡ＝ＫＤＰｏ［Ｘ］／（１＋Ｋ［Ｘ］）
ここで、ΔＡは、キサンテンの添加後の吸光度における変化であり（ΔＡ％［ＩＸ］）、ΔプロットのＹ軸になり；Ｄは、Δ吸光係数（以下に説明するように、適合した（ｆｉｔｔｅｄ）曲線から得られる）であり；［Ｘ］は、各アリコート添加後のキュベット中のキサンチン濃度（モル）であり；Ｐｏは、モルでのインターカレーター（ＡＯ）の濃度であり；そしてＫは、会合定数（Ｋａｓｓｏｃ）である。従って、Ｋを解くために、式２は、以下のようになる：
式３：ΔＡ＝Ｋ（ΔＡｍａｘ）［Ｘ］／（１＋Ｋ［Ｘ］）。
【００３５】
生じたΔＡ値（Ｙ−軸＝）Ａ）を、ＡＯ−キサンチン複合体の形成をモニターするための最大の感受性を示す８ｍａｘで、キサンチンの最終濃度（Ｘ−軸＝［Ｘ］）に対してプロットした。このΔＡｍａｘ値は、飽和（平衡で形成され得る複合体の最大の量）での複合体の最大の吸光度であり、そして基質（すなわち、ＡＯ）の濃度によって乗算されるΔ吸光係数と同等物であり、そしてＤ［Ｐｏ］として表現され得る。結合連結定数（等式３）を計算するために使用されるこのΔＡｍａｘ値を、以下に記載したような２つのアプローチによって最初のＡＯスペクトルから反復した。
【００３６】
等式３（ΔＡ＝Ｋ（ΔＡｍａｘ）［Ｘ］／（１＋Ｋ［Ｘ］））は、ＡＯのキサンチンへの結合によって表現されるような１：１の相互作用についての結合等温線である。この実験データは、リガンド（すなわち、キサンチン）濃度［Ｘ］の関数として得られたΔＡ値からなる。固定された波長を、最も可能なΔＡ値を与えるように選択する。このΔＡｍａｘ値は、基質（ＡＯ）が飽和するかまたは完全にリガンド（キサンチン）に結合する場合に生じ得る最大の吸光度である。分析されるキサンチン濃度［Ｘ］の範囲は、表１に表示され、そして好ましくは、結合等温線の少なくとも６０％または実験状況によって許される限り多くにわたるべきである（Ｃｏｎｎｏｒｓ、１９８７）。飽和率のパーセントを、式［Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］／（１＋Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］）］×１００を使用して、決定する。試験したキサンチンの多数による溶解性の制限に基因して、４種の化合物のみが６０％の飽和率を越え、２種の化合物が約５０％の飽和率であった。結合連結定数（等式３）を計算するために使用されるこのΔＡｍａｘ値を、２つのアプローチによって最初のＡＯスペクトルから反復する。
【００３７】
Ｋａｓｓｏｃを決定するための第一のアプローチは、実験データから推定されるΔＡｍａｘ値を選択し、次いでこのモデルから有意に逸脱しないで非線形分析の相関係数（Ｒ２）を最大化するように、この値の実験的な反復を行うことである。Ｋａｓｓｏｃを決定するための第二のアプローチは、ＫおよびΔＡｍａｘ値の両方が同時に変動することが可能である場合に適合する、２つのパラメータを使用した。この第二のアプローチからの結果は、ＫａｓｓｏｃおよびΔＡｍａｘ値両方について、標準的な誤差範囲を伴った平均値を得た。２つのアプローチの間の結果の比較は、Ｋａｓｓｏｃを決定するためにいずれかが使用され得ること、そして、全ての場合において、キサンチンについて約５０％の飽和率で得られたこの値および上記が有意には異ならなかったことを示す。
【００３８】
連結曲線への適合を決定し、ＰｒｉｓｍＴＭソフトウェア（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で非線形最小二乗分析によってグラフを作成した。標準的な誤差を伴った連結定数（Ｋａｓｓｏｃ）の値を、上記の両方のアプローチについて、このプロットから決定した。これら２つのアプローチからの結果を比較し、そして最高のＲ２値および最小の標準的な誤差を有するＫａｓｓｏｃ値を、表２−１に報告する。表２−１において、化合物を、プリン核構造の周囲での、増大する置換したカルボニル基の数に基づいて、グループ分けする。Δ曲線上での最大の可能な偏差のｎｍでの波長（λ）、最も適合するΔ吸光度データ（等式についての本文を参照のこと）の相関係数の二乗（Ｒ２）、およびキサンチンを分析した濃度範囲を、また示す。ゼロのＫａｓｓｏｃ（Ｍ−１）値は、計測可能な連結が検出されなかったことを示す。共鳴状態の数を、丸括弧中に示されるメチル基の数と共に、「Ｒ．Ｓ．」の下に、表の最も右に表示する。
【００３９】
（表２−１：アクリジンオレンジと置換されたキサンチンとの間の結合親和性（Ｋａｓｓｏｃ）についての、分光光度分析の結果（平均±標準偏差））
【００４０】
【表１】
2004514741.tif 000003
ａ　式：［Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］／（１＋Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］）］×１００によって計算された結合曲線のパーセント飽和率。
【００４１】
ｂ　１０％未満のパーセント飽和率。
【００４２】
ｃ　本発明者らの手順の検証として、ＣＡＦ−ＡＯ複合体のＫａｓｓｏｃ値が２５６Ｍ−１であることが見出され、この値は、Ｌａｒｓｅｎら（１９９８）ならびにＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＫｉｍｍｅｌ（１９９３）の両方によって報告された２５８Ｍ−１の値に密に対応する。
【００４３】
結合曲線の約５０％の飽和率を下回るキサンチン濃度でＫａｓｓｏｃが決定される各場合において、Ｒ２＞０．９９である場合、生じたΔＡｍａｘ値は、より広い濃度範囲にわたって、およびキサンチン濃度＞約５０％飽和率で取られたデータを使用して得られるΔＡｍａｘ値の、よい予測であることを示す証拠が存在した。これらのスペクトルは、キサンチン濃度が溶解性によって制限され、そして結合曲線の飽和率が実質的に５０％未満である場合にさえ、ＡＯとキサンチンとの間の複合体形成についての証拠を与える。しかし、これらの場合においては、結合定数を、より低い信頼性のレベルでのみ決定し得ることから、従って、これらの値は、本結果の考察において、重大な重要性を与えられない。１つの実施形態においては、ＣＡＦ−ＡＯ複合体のＫａｓｓｏｃ値は、２５６Ｍ−１であることが見出された。
【００４４】
表２−１に示したように、Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ７またはＮ９位でのメチル置換は、改変されたキサンチンについてのＤＮＡへの結合親和性を増大させ得る。さらに、Ｃ８位でのハロゲンはまた、そのＤＮＡへの結合親和性を増大させ得、その結果、この挿入剤分子は、ＤＮＡにあまり結合しそうにない。表２−１は、キサンチンが好ましくはメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、および１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチンからなる群より選択されるべきであることを、例示する。別の実施形態において、本発明を、キサンチン分子上の他の複数の置換を、キサンチンに適用し得る。
【００４５】
図２−２Ｂは、テオフィリンで滴定されたＡＯの異なる吸光スペクトルを示す。スペクトル分析を、一連のテオフィリンによるＡＯ滴定で実施した。吸光値を得、そして希釈の効果を考慮して適用した。最初の挿入剤（ＡＯ）濃度は、好ましくは、ｐＨ７．０で５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中に１０μＭである。テオフィリンを、５０ｍＭのストック溶液からの１μｌのアリコートのＡＯ溶液中にピペットで取った。生じたプロットは、単一の等吸収点の存在が、溶液中の２種のみにおいて示されることを示す。この結合定数Ｋａｓｓｏｃ（テオフィリンとＡＯとの間のＫａｓｓｏｃ値）の決定を、図２−２Ｃに示した曲線から決定する。溶液中のＡＯ−テオフィリン複合体の光学的な異なるスペクトルは、溶液中の２つの吸光種のみに特徴的である単一の等吸収点を提示する。等式ΔＡ＝Ｋ（ΔＡｍａｘ）［Ｘ］／（１＋Ｋ［Ｘ］）（等式３を参照のこと）を使用して、ＡＯ−テオフィリン複合体について計算されたＫａｓｓｏｃ値は、約１５７．０±＜０．１Ｍ−１である。他のキサンチンを同様に分析し、そしてそのＫａｓｓｏｃ定数を表２−１に報告する。
【００４６】
試験される２２個の異なるキサンチンのうち、６つが実質的な（∋１５０Ｍ−１）結合定数を有することが決定された。さらなる８つの化合物は、ＡＯとの複合体形成のいくつかの証拠を示した。これらの１４個の化合物は、結合定数が導かれる波長（ｎｍ）、試験されたキサンチンの濃度範囲（μＭ）、結合曲線の飽和の割合、Ｋａｓｓｏｃ（Ｍ−１）値、退行分析Ｒ２値、共鳴状態「Ｒ．Ｓ．」の数（後で議論する）、および置換されたメチル基（＃ＣＨ３）の数と共に表２−１に列挙される。試験された７つのプリンは、いずれも実質的なＡＯとの親和性を示さなかった。
【００４７】
別の実行において、ＡＯと実質的に結合することが見出された化合物は、３つの共通の構造的類似性を有した：（１）キサンチンのコア構造に対するＮ１またはＮ３は、メチル基と置換されねばならず、（２）Ｃ６での酸素もしくは塩素置換は、共鳴状態の数が変化せずに維持される場合、Ｋａｓｓｏｃを増加させ、そして（３）Ｋａｓｓｏｃは、メチル基置換の数の増加、一般には、第２オーダーの多項方程式に対する経験的なフィット（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ　ｆｉｔ）（Ｒ２≒０．９９）と共に増加する。
【００４８】
メチル基置換のない化合物（例えば、キサンチンおよび８−ヒドロキシキサンチン（尿酸））は、最適な滴定によって決定されたように、ＡＯと複合体化体を形成しなかった。有意なＫａｓｓｏｃ値を示す６つの化合物のうち、全てが、Ｎ１で置換されたメチル基、そしてＣ２およびＣ６で置換されたカルボニル基を有した。あるいは、キサンチンベース構造のＮ１でのメチル基を有さないが、しかし他の位置（３−メチルキサンチン、７−メチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、および７−メチル−８−オキシキサンチン）において置換されたメチル基を有する化合物は、３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）を除くＡＯとの複合体に対して親和性をわずかに示すか、または示さなかった。これらの化合物１−メチルキサンチン、１−メチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、および１，３−ジメチル−８−クロロキサンチンは、Ｃ２およびＣ６に置換されたカルボニル基を、そしてＮ１に置換されたメチル基を有すが、しかし、ＡＯについての有意な結合親和性をいずれも示さなかった。１−メチルキサンチン（これは７９．２±２．０Ｍ−１のＡＯについての結合親和性を有する）と１−メチル−８−オキシキサンチンとの間の１つの違いは、Ｃ８でのカルボニル基である。同様に、１，３−ジメチルキサンチン（テオフィリン）（１５７．０±＜０．１Ｍ−１の結合定数を有する）と、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチンもしくは１，３−ジメチル−８−オキシキサンチンとの間の１つの違いは、Ｃ８で置換された高い電子親和力（それぞれ酸素または塩素）を有する原子の存在である。Ｃ８でのカルボニル基の存在は、テトラメチル置換ＴＭＵを除くモノメチル置換キサンチンおよびジメチル置換キサンチンの結合親和性を、有意に減少し、これはアミノフィリンよりも低い結合親和性を示し；そしてまた４つのメチル基の全てを含む。
【００４９】
置換キサンチンに対するＡＯの結合が、以下に記載されるような体系的な経路における特異的な置換によって改変され得ることは可能である。さらに、ＡＯとキサンチン誘導体との間の複合体の形成が、その特定のキサンチンの理論的なエネルギー状態に基づいて予測され得る。最終的に、Ｋａｓｓｏｃといくつかのキサンチンの能力との間の相関は、別のＰＡＨの溶解性、ベンゾ（ア）ピレン、および他の潜在的な適用を増加させるようである。本発明は、いかなる方法においても、この提唱された機構によって制限されないことを述べておく。
【００５０】
任意の２つの分子との間の複合体の形成は、好ましくは、複合体が存在するために熱力学的に有利な場合に生じる（Ｗａｌｌｗｏｒｋ、１９６１）。複合体の形成が、分子の全体のエネルギー状態における減少を考慮するので、より低いエネルギーの分子は、複合体を形成するための、より高いエネルギーの分子よりも低い熱力学的な減少であった。従って、分子のエネルギーが減少するにつれて、複合体を形成するその分子の確立もまた減少する。このキサンチン分子の全体のエネルギー状態、そして従ってＡＯとの複合体を形成するその可能性は、好ましくは３つの重要な因子に起因する：（１）潜在的な共鳴状態の数、（２）Ｎ−メチル化の量および位置、そして（３）キサンチン環のＣ６位で置換されたＲ基の化学的特徴。これらの因子の全ては、π−軌道の電荷分布、この分子の疎水性、この電子エネルギー状態、そして従って複合体の形成のための熱力学的電位に影響を与え得る。
【００５１】
分子中の共鳴状態は、量子力学的に、電子密度が非局在化する異なる構造形態において、これらが同時に存在し得る場合に生じ得る。これはまた、キサンチンにおける５因環において見られるような「浮遊した」二重結合、または尿酸によって形成される互変異性化合物のような互変異性化合物における単結合と平衡にある二重結合と共に生じる。試験される分子についての共鳴状態が数えられた場合、１つの共鳴状態のみを有する分子は、より高いＫａｓｓｏｃ値を有することが見出された（表２−１を参照のこと）。逆に、４つ以上の共鳴状態を有する分子は、複合体形成をわずかに示すかまたは示さなかった。置換キサンチンおよび尿酸対共鳴状態の数（表２−１を参照のこと）の両方についてのＫａｓｓｏｃ値の検査は、共鳴状態の数が増加するにつれてＫａｓｓｏｃ値が減少することを示す。ジメチル置換キサンチンの間に、３つの潜在的な共鳴状態を有する３，７−ジメチルキサンチンは、１，７−ジメチルキサンチンもしくは１，３−ジメチルキサンチン（両方共２つのみの潜在的な共鳴状態を有する）よりも低い４１％のより低いＫａｓｓｏｃ値を有する。３，７−ジメチルキサンチンについてのより低いＫａｓｓｏｃ値は、より低いエネルギー状態は、より多くの数の潜在的な共鳴状態と関連があることを示唆する。１，３−ジメチルキサンチンおよび１，７−ジメチルキサンチンの両方は、２つの潜在的な共鳴状態を有し、そして類似するＫａｓｓｏｃ値を有する。構造的に、２つの分子は、キサンチンコアに対する第２置換メチル基の位置のみ（Ｎ３またはＮ７のいずれか）が異なり、これは第２メチル置換の位置は、この複合体の安定性が例えあったにしてもわずかにしか寄与しない。さらに、１，３−ジメチルキサンチンと１，３−ジメチル−８−クロロキサンチンとの間のＫａｓｓｏｃにおいて、２つのみの潜在的な共鳴状態の両方は、水素と塩素との間の化学的特徴における相違に起因するに違いない。分子が、Ｒ基の置換の化学的特徴に加えて存在する潜在的な共鳴状態の数は、実質的な影響をキサンチン分子のエネルギー状態に対しておそらく発揮する。結果的に、環状構造に対する置換の位置は、共鳴状態の数がＲ基の位置における変化によって変化しない場合、わずかな寄与しかされない。
【００５２】
プリンまたはキサンチンの電子ドナーの特徴を増加する１つの方法は、Ｎ−メチル化である。このようなメチル化がこれらの特徴を増加する程度は、化学的構造および、所定の化合物について、アルキル基の位置に依存する。分子軌道理論に基づいて、キサンチンコア構造のＮ−メチル化の位置は、Ｎ３＞Ｎ７≡Ｎ１の順で電子ドナーの特徴を増加するはずである。しかし尿酸において、その電子ドナー特徴の活性は、Ｎ−メチル化についてＮ７＞Ｎ３＞Ｎ９＞＞Ｎ１で起こるはずである。表２−１および表２−２に示されるように、置換キサンチンとＡＯとの間の増加するＫａｓｓｏｃ値のパターンは、増加するＮメチル化と共に起こる。それぞれのメチル基の、キサンチンコア構造に対する付加と共に、Ｋａｓｓｏｃはおよそ二重になる。結合親和性（Ｋａｓｓｏｃ）対メチル基置換は、指数関数式　Ｙ＝Ｓｔａｒｔ＊ｅｘｐ（Ｋ＊Ｘ）を使用してプロットされ、ここでこのプロットはＹ＝Ｓｔａｒｔで始まり、そして０．６９／Ｋの２倍に等しい定数Ｋの割合と共に指数関数的に増加する。退行分析は、指数関数方程式（Ｐ＝０．４２９）（Ｒ２値は０．９９）からの有意な偏差を生じない。従って、高い相関が、キサンチン環に対するメチル置換の数と生じるＫａｓｓｏｃ値との間に存在する。
【００５３】
表２−１に示される結果は、結合親和性（Ｋａｓｓｏｃ）がまた、キサンチンコアの周りのメチル化窒素の位置によって影響されることを示す。モノメチル化キサンチンの間で、１−メチルキサンチンおよび３−メチルキサンチンの両方が、分光光度的分析によって決定されるように、ＡＯに対する弱い結合親和性のいくつかの証拠を示すことが見出されたが、この結合は決定的ではなかった（すなわち、Ｋａｓｓｏｃ＜１５０Ｍ−１および制限された濃度範囲、すなわち飽和＜１０％）。しかし、Ｎ７での単一のメチル置換は、ＡＯ複合体生成についての検出可能な証拠を生じなかった（飽和＜１０％）。キサンチンコア構造の試験は、この環上のＮ１位が、２つの二重結合酸素基の間に位置するが、一方、Ｎ３は、Ｃ２での１つの二重結合酸素のみの近くであり、その上Ｎ７は近くに二重結合酸素を有さないことを示す。メチル基の電子配向効果は、おそらく、Ｎ７孤立電子対ｐ軌道の電子と隣接する酸素基との間の共鳴を増大し得る。これは、次いで、この環構造の近傍におけるπ電子雲の電子密度に寄与し得る。従って、ＡＯとモノメチル置換されたキサンチンとの間のπ−π結合の形成に対する寄与は、この最近接効果によって増大され得、メチル置換基は、Ｎ１＞Ｎ３＞Ｎ７≒Ｎ９でより大きな効果を有する。おそらく、メチル基の電子ドナー寄与に加えて、２つの共鳴状態の減少を介するコア分子の増大したエネルギー状態に起因する、この複合体の安定性に対するある程度の寄与が存在する。
【００５４】
１，３−ジメチルキサンチンエチレンジアミン（アミノフィリン）の場合において、エチレンジアミンによって結合された２つのテオフィリン基が存在する。アミノフィリンは、１，３−ジメチルキサンチン（テオフィリン）の２つの分子（各分子は、キサンチンコアのＮ７位で、このエチレンジアミンリンカー分子の各端部で窒素にイオン的に結合する）として溶液中に存在する。従って、溶液中のアミノフィリンの化学構造は、Ｎ７位でイオン的に結合したエチレンジアミンテオフィリンＲ基を有する１，３−ジメチルキサンチンとして最も良く記載され得る。得られたＫａｓｓｏｃ値は、Ｎ７でのＲ基の増大した電子ドナー能力と一緒に、共鳴状態の減少が、カフェイン（１，３，７−トリメチルキサンチン）の場合におけるＮ７でのメチル基の置換での６３％の増大と比較して、テオフィリンがＡＯと複合体形成する能力を、２８０％も有意に増大することを示唆する。
【００５５】
Ｋａｓｓｏｃに対するメチル基の数の影響は、Ｃ８炭素での酸素または塩素のいずれかの同時置換が存在する場合に、より明白ではない。表２−１において見られ得るように、Ｃ８でのカルボニル基の置換は、ＡＯがメチル置換キサンチンに結合する能力を有意に減少させる（例えば、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチンについてのＫａｓｓｏｃは、３８．５Ｍ−１である）。図２−１の試験によって、キサンチンコア構造において、Ｃ８での二重結合が、Ｎ７とＮ９との間、およびＣ８で水素置換した炭素と共鳴することが見られ得る。Ｃ８でのカルボニル置換の場合、Ｃ８とＮ７またはＮ９との間の二重結合の共鳴は増大され、そしてＣ８の酸素がカルボニル形態とヒドロキシル形態との間で互変異性化（ｔａｕｔａｍｅｒｉｚｅ）する場合に、さらなる共鳴状態の存在を可能にする。同時に、この分子の双極子モーメントが有意に減少され、そして六員環からＣ８の酸素に向かってシフトし、このコア構造にわたってより集中化する。Ｃ８での塩素の置換の場合、この二重結合は、依然としてＮ７とＮ９との間で共鳴し得るが、π電子雲は、このキサンチン平面環の上下で集中せず、従って、そのより高い電子親和性で塩素原子と置換する。これらの特徴は、Ｋａｓｓｏｃを約１０倍増大するようである。Ｎ７およびＮ９でのメチル基置換の追加は、Ｃ８でのカルボニルの電子親和性効果を相殺し、そして双極子モーメントにおける変化を生じる傾向があることに注意すべきである。従って、Ｃ８位でのカルボニル基の置換は、トリメチルキサンチンまたはテトラメチル尿酸分子にはおそらく存在しない、移動性または共鳴した水素（Ｎ７とＮ９との間に）を生じる。
【００５６】
ＡＯ−カフェイン系の場合において、スペクトルの変化は、ＡＯ−ＤＮＡインターカレーション複合体について観察されたものと非常に類似しており、発色団と芳香族化合物（例えば、カフェインまたはＤＮＡ塩基対）の疎水性表面との間の、匹敵する相互作用の発生を示唆する。弱い極性溶媒、α−シクロデキストリン、および界面活性剤のモノマー化（脱凝集）能力は、色素の溶媒和の程度の減少からもたらされる。これらの条件下で、積み重ねられた色素発色団（ｃｈｏｍｏｐｈｏｒｅ）（二量体）間の疎水性相互作用は、一般に消失し得、そして色素モノマーの吸収スペクトルの特徴が得られ得る。
【００５７】
有機溶媒、ならびにα−シクロデキストリンおよび界面活性剤ミセルの内部空間は、ある程度疎水性で弱極性の環境を提供し、これは核酸の挿入能力において生じる。最も単純な公式化、ＤＮＡ、ＡＯおよび平面キサンチンの間の疎水性相互作用は、積み重ねられた複合体として表され得る。
【００５８】
表２−２は、表２−１で見られるＫａｓｓｏｃ値とＷｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅ（Ｗｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅ，１９４６ａ，１９４６ｂ）によって報告される溶解度値とを比較する。
【００５９】
表２−２：キサンチン環上のメチル化の数、アクリジンオレンジを用いるＫａｓｓｏｃ値（本報告）およびＷｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅ（１９４６ａ，１９４６ｂ）によって報告される、水中でベンゾ（ａ）ピレンを可溶化するキサンチン化合物の能力：の間の関連性
【００６０】
【表２】
2004514741.tif 000004
ａ結合曲線の飽和パーセントは、１０パーセント未満であった。
ｂ１−メチルキサンチンについての比溶解度値の欠如に起因して、３−、７−、および９−メチルキサンチンについて報告された溶解度値の平均を使用した。
【００６１】
表２−２において、溶解度の単位は、カフェイン（これは、１００の値で与えられる）との比較に基づく。非線形回帰分析は、このキサンチン環上で置換されたメチル基の数と、Ｗｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅ（１９４６ａ，１９４６ｂ）によって報告されたベンゾ（ａ）ピランを用いるキサンチンについての溶解度値（Ｒ２＝０．９８）との間の指数関数的な式Ｙ＝Ｓｔａｒｔ×ｅｘｐ（Ｋ×Ｘ）への良好な一致を明らかにする。Ｋａｓｓｏｃ値およびＷｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅからの溶解度値の両方から得られる比較は、有意な直線関係（Ｐ＝０．００２，Ｒ２＝０．９０）を示す。
【００６２】
キサンチンのＡＯとの相互作用における構造変化の影響は、プリン塩基を用いる多重芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）炭化水素の可溶化における研究でＷｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅによって記載される影響に密接に従う。プリン、ヒポキサンチン、キサンチンおよび尿酸コア分子の間の構造的差異の１つは、プリン塩基構造のＣ２、Ｃ６またはＣ８で炭素原子に結合する酸素基の数および存在である。プリンは、置換酸素基を有さないが、一方、ヒポキサンチンは、Ｃ６で置換された酸素基を有し、キサンチンはＣ２およびＣ６で酸素を有し、そして尿酸はＣ２、Ｃ６、およびＣ８で酸素を有する。Ｗｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅは、ＰＡＨベンゾ（ａ）ピレンの可溶化が、増加するＮ−メチル化によって、そしてある程度までは、増加する置換基およびこのプリン環の周りのＣ２、Ｃ６またはＣ８でのＲ基の増加する電子親和性によって増大することを観察した。彼は、このプリン環の周りのカルボニル基の数の増加が、全ての場合においてベンゾ（ａ）ピレンの溶解度を増加したことを見出した。しかし、クロロ基、チオ基またはアミノ基の置換は、溶解度を増大するかもしれないし、減少するかもしれない。Ｎ−メチル化（Ｘ軸）と可溶化（Ｙ軸）との間の関連性は、経験的に、この指数関数的な式に一致し得る。
【００６３】
Ｙ＝Ｓｔａｒｔ×ｅｘｐ（Ｋ×Ｘ）（Ｒ２＝０．９８）。
【００６４】
この関連性は、ベンゾ（ａ）ピレンのようなＰＡＨの可溶化が、ＰＡＨとキサンチンとの間の複合体形成に起因し得、従ってＫａｓｓｏｃと直接関連することを示唆する。表２−２は、Ｋａｓｓｏｃ値およびＷｅｉｌ−Ｍａｌｈｅｒｂｅ（１９４６ａ，１９４６ｂ）からの溶解度値を比較し、そしてこの２セットのデータ値の間の有意な直線関係（Ｐ＝０．００２，Ｒ２＝０．９０）の存在を明らかにする。これらの結果に基づいて、可溶化は、潜在的な遮断分子を、ＤＮＡとπ−πスタッキング複合体を形成するその能力について篩分けるために使用され得る。ＤＮＡインターカレータとπ−π結合複合体を形成するその能力についての、潜在的な遮断分子の迅速な篩分けは、Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９７９）に記載される方法を利用する、ＢｏｗｍａｎおよびＢｅｒｏａ（１９６５ａ、１９６５ｂ、１９６５ｃ、１９６６ａ、１９６６ｂ）の分配値（Ｐ値）を使用して達成され得る。
【００６５】
選択されたキサンチンとＰＡＨとの相互作用の知識は、実際的な適用を有する。カフェインのようなキサンチンと抗新生物薬物ドキソルビシン（ＤＯＸ）との相互作用は、ＤＯＸの血液血漿レベルの減少および細胞内レベルにおける同時の増加を引き起こす。結合親和性、すなわち２つの相互作用するクラスの化合物間のＫａｓｓｏｃ値を最適化するための能力は、薬物治療および薬物送達に関係する新規なアプローチを作製する。例えば、ドキソルビシンのような抗新生物薬物の標的部位濃度を強化することは、腫瘍内の細胞性毒性を同時に増加し得るが、血液血漿レベルの減少による全体の全身性毒性を減少する。さらに、インターセプター分子は、非常に高い親和性を有する特定の発癌物質と結合するように潜在的に設計され得、従って、それらの生物学的効果を有意に減少する。最後に、質量作用の法則（これに分極結合は依存する）を使用することによって、選択的な保存のための化合物の作製および／またはＰＡＨによるＤＮＡインターカレーションの逆転のための可能性が存在する。
【００６６】
ＤＮＡ−インターカレータＡＯを用いる種々のキサンチンのスペクトル分析の結果は、特定のキサンチンがＡＯと複合体形成し得ることを実証する。この相互作用は、分極結合として公知のＢ−Ｂ電子軌道相互作用の型に寄与する。特定のＲ基置換を有するキサンチンは、少なくとも３つの全身的な方法でＡＯに対する結合親和性を改変する：（１）キサンチンの核心のまわりにＮ−メチル化の増加とともに増加する、（２）共鳴状態の数における減少によって証明されるように、キサンチン分子の潜在的エネルギーにおける増加によって増加し、そして（３）電子親和性および置換の他の化学的特徴は、Ｋａｓｓｏｃに影響するようである。このような複合体を形成する際の主要な影響は、ファンデルワールス相互作用であるようであり、２つの複合体分子、およびメチル基置換の疎水性効果との間に最小のＢ軌道重複を生じる。さらに、ドナー−アクセプター電荷移動状態との共鳴はまた、複合体の安定化に寄与し得る。疎水性効果は、水分子の排除に基づいたエンタルピー現象ではなくエントロピー現象である。これらの結果は、癌治療におけるインターセプター分子として、ＣＡＦおよび他のキサンチンについてのありうる役割を示唆し得る。
【００６７】
本発明のこれらの適用は、ＤＮＡインターカレーターアクリジンオレンジに限定されない。本発明は、ドキソルビシンのような他のヘテロ環式化合物および素の関連する塩、ノバトロン（ｎｏｖａｔｒｏｎｅ）、エリプチシン（ｅｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）、臭化エチジウム、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ　３３２５８、アフラトキシン、または他の類似の分子に適用され得る。他の実施において、ベンゾピレンのような極性の多芳香族化合物およびジメチルベンズアトラセンが使用され得る。さらに、本発明は、二重鎖ＤＮＡに制限されない。ＲＮＡ、ＰＮＡ、ならびにその一重鎖および二重鎖型のような他の化合物も使用され得る。
【００６８】
本発明は、インターセプター分子のようなキサンチンの使用に限定されない。例えば、クロロフィリン（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｒｌｌｉｎ）およびポルフィリンは、インターカレータ分子に対する結合剤として使用され得る。図２〜３は、アクリジンオレンジの漸増濃度での光学的吸光度スペクトル滴定クロロフィリンを示す。一連の滴定内で重要な遷移を示す選択されたスペクトルは、太字線で示される。０．１と３０との間のＡＯ；クロロフィリン比率で、一般的なピークは、クロロフィリンについて４１５ｎｍ、４７５ｎｍ、および４９２ｎｍのλａｂｓで発生する。これらの後者のピークは、１０μＭ以上の濃度で、ＡＯの濃度で見出される一般的な吸光度ピークに対応する。この数字は、クロロフィリンがアクリジンオレンジと複合体形成することを示す。従って、他の化合物が、例えば、ポルフィリン、プリン、ピリミジン、ポリヌクレオチドおよび尿酸に限定されないインターセプターとして使用され得る。
【００６９】
（実施例３）
塩の添加は、ポリヌクレオチドおよびインターカレータ分子の両方の形成に影響する。従って、改変されたキサンチンの使用は、イオン性環境の制御を介して、変更され得る。以前のサンプルにおけるように、改変されたキサンチンのインターカレートする分子と結合する能力は、結合親和性を介して記載される。
【００７０】
Ｚａｉｎｉら（１９９９）によって記載される方程式の改変を使用して、会合定数を計算し、吸光度分光光度法によって弱く結合した複合体についての平衡定数を決定する。Ｋ−Ｘｄ／（Ｘｍ＊Ｘｍ）（ここで、Ｋは、結合定数Ｋａｓｓｏｃである）を規定することによって、Ｘｄは、ＡＯ二量体の濃度であり、そして、Ｘｍは、ＡＯ単量体の濃度である。質量保存は、Ｘｔ＝Ｘｍ＋２＊Ｘｄ（ここで、Ｘｔは、溶液中のＡＯの総濃度である）を与える。質量保存方程式の再編成は、Ｘｍ＝Ｘｔ−２＊Ｘｄを与え、そして、Ｋａｓｓｏｃについての方程式に置換し、そして、再編成して方程式４を与える：
方程式４：Ｋａｓｓｏｃ（Ｘｔ＊Ｘｔ−４＊Ｘｔ＊Ｘｄ＋４＊Ｘｄ＊Ｘｄ）−Ｘｄ＝０
再編成は以下を与える：
方程式５：Ｘｄ＊Ｘｄ−（Ｘｔ＋１／（４＊Ｋａｓｓｏｃ））＊Ｘｄ＋Ｘｔ＊Ｘｔ／４＝０
二次式（Ｘ＝［−Ｂ±ＳＱＲＴ（Ｂ２−４ＡＣ］／２Ａ）を方程式３〜５に適用し、そして、物理的に合理的なルートを取り方程式３〜６を与える：
方程式６：Ｘｄ＝［Ｘｔ＋１／（４＊Ｋ）−ＳＱＲＴ（Ｘｔ／（２＊Ｋ）＋１／（１６＊Ｋ＊Ｋ））］／２
ここで、ＳＱＲＴ（）は、括弧の中の平方根を取ることを示す。λｅｍ５３０（Ｆ５３０）における蛍光値は、Ｘｔの関数であり、そして、Ｆ５３０＝Ｘｄ＊ε（ここで、「ε」は、二量体の蛍光収率）である。方程式は、ＰｒｉｓｍＴＭソフトウェアを使用して、非直線の少なくとも平方によって、そして結合定数を決定することによって解決される。反応物の濃度を希釈について調節し、ここで、ＡＯ濃度は、希釈についての調整なしで報告される。蛍光値（ｆｉ）は、大きさに対して正規化された生データとして報告され、そして、アリコート添加後に希釈因子におって調整されない。４６８ｎｍで取られた吸光度データをまた使用して、方程式６を使用して、ＡＯ−ＡＯ二量体についてのＫａｓｓｏｃを計算する。
【００７１】
なお別の実施において、ＡＯは、２つのλｍａｘ蛍光ピークを示すことが公知であり、それがそれ自身または他の化合物との相互作用の型に依存する。例えば、ＡＯがＤＮＡにインターカレートする場合、おそらくＢ−Ｂ相互作用またはスタッキング複合体を形成することによって、これは、約λｅｒｎ５２６ｎｍで特徴的な緑色蛍光最大値を有する。あるいは、ＡＯが、電荷移動を介して、他の化合物と静電気的に（イオン性）会合する場合、これは、約λｅｍ６５０ｎｍで特徴的な蛍光最大値を有する。２つの発光波長（λｅｍ６３５ｎｍおよびλｅｍ５３０ｎｍ）は、静電気的に他の化合物と会合する場合（６３５ｎｍ）およびそれ自身または別の化合物（単数または複数）とスタック（ｓｔａｃｋｅｄ）（Ｂ−Ｂ）会合する場合、ＡＯの蛍光発光についてのおおよそのλｍａｘを示す。
【００７２】
種々の濃度でのＡＯの光学的吸光度は、ｐＨ７．０で緩衝化された５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液中に溶解されたＡＯが、２つのスペクトルピークを有することを示す（図３〜１Ａ）。図３−１Ａにおいて示される実施例において、吸光度を、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液の５ｍＭ溶液中２．５μｍ〜２０μＭのＡＯ濃度の範囲にわたって、４００ｎｍと５５０ｎｍとの間でスキャンした。各スペクトラムについてのＡＯの濃度は、数ごとに説明文中に示す。４９２ｎｍ（Ａ４９２）における吸光度は、ＡＯ単量体の濃度の指標であるが、４６８ｎｍ（Ａ４６８）における吸光度は、ＡＯ−ＡＯ二量体の濃度の指標であることに注意する（ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＫｉｍｍｅｌ，１９９３）。２．５μＭの濃度におけるＡＯは、４９２ｎｍのλｍａｘと別のスペクトルを示す。ＡＯの漸増濃度において、４６８ｎｍにおける第２のスペクトルピークはより明確になり、そして、振幅が増加する。４６８ｎｍにおける吸光度値における変化に対する、４９２ｎｍにおける吸光度値における変化の比率が、２．５μＭ〜２０μＭまで変化するＡＯ濃度に対してプロットされる場合、ＡＯ濃度の関数としてのＡＯ二量体の形成の間の関係を示す有意な（Ｒ２＝０．９９）直線関係が得られた。
【００７３】
図３−１Ｂにおける実施例は、１５０ｍＭ　ＮａＣｌの添加を除いて同じ条件下で、種々の濃度におけるＡＯの同じ光学的吸光度を示す。この吸光度を、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で、ｐＨ７．０でＨＥＰＥＳ緩衝液の５ｍＭ溶液中で、１０μＭ〜４５μＭのＡＯ濃度の範囲にわたって、４１０ｎｍと５４０ｎｍとの間でスキャンした。各スペクトルのＡＯの濃度は、矢印によって示される。４９２ｎｍ（Ａ４９２）における吸光度の大きさが、ＡＯ濃度の関数として、４６８ｎｍ（Ａ４６８）における吸光度に関連して減少することに注意する。従って、溶液中の１５０ｍＭ　ＮａＣｌの存在が、生の吸光度値における全体の減少を引き起こす。さらに、生理学的な濃度のＮａＣｌの存在が、４６８ｎｍにおける吸光度ピークを有意に増加し、ＮａＣｌの存在下におけるＡＯ二量体の濃度における増加を示す。
【００７４】
低濃度［０．５〜１０μＭ］におけるＡＯの蛍光特性は、図３−２Ａの例において図示され、ここで、分光光度的分析を、λｅｘ４８５ｎｍで行い、そして発光を、λｅｍ５３０ｎｍおよびλｅｍ６３５ｎｍにおいて観察した。凡例記号（ｎ＝４）によって不明瞭でない場合、エラーバーは標準偏差を示す。この結果はまた、０．５μＭから１０．０μＭのＡＯ濃度範囲にわたる、λｅｍ５３０ｎｍ（緑）およびλｅｍ６３５ｎｍ（赤）の両方のＡＯ蛍光のＮａＣｌ［１５０ｍＭ］の生理的な濃度の影響を示す。５〜６μＭの間のＡＯ濃度において、λｅｍ５３０ｎｍでの緑色蛍光の振幅は、急激に増加する。赤色蛍光（λｅｍ６３５ｎｍ）もまた、５〜６μＭの間において急激に増加する。しかし、λｅｍ６３５ｎｍでの増加の大きさは、λｅｍ５３０ｎｍにおいて見出された大きさよりも比例的に小さい。ＡＯ濃度が５μＭから６μＭに増加するにつれて、平均蛍光値は、λｅｍ５３０ｎｍにおいて４５７±１６ｎｍから５，１９７±２８９ｎｍ、およびλｅｍ６３５ｎｍ（ｎ＝４）において１７４±４ｎｍから１，３７１±４１ｎｍ、に変化した。０．５〜５μＭのＡＯ濃度において、ＮａＣｌ［１５０ｍＭ］の添加は、λｅｍ５３０ｎｍにおける緑色蛍光を有意に増加するが、平均蛍光値における有意な変化を、λｅｍ６３５ｎｍにおいて観察しなかった（図３−２Ｂ）。図３−２Ｂに示される例は、ＮａＣｌの非存在下およびＮａＣｌの存在下において、それ自体を伴うＡＯの分子結合に関してλｅｍ５３０ｎｍにおいて算出した結合プロットを示す。これら２つのプロットに由来するＡＯについての結合定数（Ｋａｓｓｏｃ）は、ＮａＣｌの存在下において１１８，０００±１６，１２０Ｍ−１（Ｒ２＝０．９８）、およびＮａＣｌの非存在下において３７，４１０±４，７５８Ｍ−１（Ｒ２＝０．９７）である。エラーバーは、凡例記号（ｎ＝４）によって隠されない場合、標準偏差を示す。１５０ｍＭのＮａＣｌの存在は、６μＭ以上のＡＯ濃度において、λｅｍ５３０ｎｍまたはλｅｍ６３５ｎｍのいずれかでＡＯの蛍光輝度に有意に影響を与えない。
【００７５】
結合定数を、二量体形態の範囲を反射するλｅｍ５３０ｎｍにおいて得られた蛍光値を推定することによってＡＯ自己結合について算出した。この結合定数（Ｋａｓｓｏｃ）を、λｅｍ５３０ｎｍにおける平均蛍光値（デルタ蛍光）の変化から算出した（図３−２Ｂを参照）。０．５μＭ〜５μＭのＡＯ濃度において、Ｋａｓｓｏｃを、ＮａＣｌの非存在下において３７，４１０±４，７５８Ｍ−１（Ｒ２＝０．９７）、および１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下において１１８，０００±１６，１２０Ｍ−１（Ｒ２＝０．９８）であると決定した（図３−２Ｂ）。ＡＯ濃度が５μＭより大きい場合、結合定数を、ＡＯ単独については４６、７００±１，８０７Ｍ−１（Ｒ２＝０．９９）、およびＮａＣｌの存在下でのＡＯについては４１，８２０±３，６７１Ｍ−１（Ｒ２＝０．９９）であると決定した。これは、有意なＡＯ濃度が、低ＡＯ濃度（５μＭ未満）における１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下の結合定数における差異に依存するが、約５μＭのＡＯ濃度での有意な差異ではないことを示している。
【００７６】
０〜４．５ｍＭの範囲にわたるＣＡＦでの１０μＭのＡＯの光学滴定の結果を、図３−３に示す。図３−３の例に示されるこの分光光度的分析を、ｐＨ７．０における５ｍＭの緩衝化ＨＥＰＥＳ中の１０μＭのＡＯ溶液で実施した。ＣＡＦを、５０μＭのストック溶液から採取した２０μｌのアリコートにおけるＡＯ溶液を含むキュベット中で滴定し、従って、０．５μＭの増分におけるＣＡＦを増加した。吸光度値を、希釈の説明のために補正した。ＣＡＦ（Ａ）の存在下で、１０μＭのＡＯの初期スペクトルは、４９２ｎｍのλｅｍを得た。ＣＡＦ濃度の増加に伴って、ＡＯ−ＣＡＦスペクトルのλｅｍは、４．５ｍＭ（Ｂ）の最終ＣＡＦ濃度において５００ｎｍに変化した。
【００７７】
図３−３に示されるスペクトルは、４９２ｎｍの可視領域において最大吸収帯を示した。ＣＡＦの添加の際に、ＡＯの光学吸光最大値は、４９２ｎｍから５００ｎｍまで変化する。この赤色変化は、ＡＯとＣＡＦとの間に形成された複合体の結合定数（Ｋａｓｓｏｃ）を決定する方法の基礎を提供する。この方法は、図３〜４に示され、これはＡＯ−ＣＡＦ複合体の光学吸光差異スペクトル（デルタ吸光度）を示す図３〜４に示される例についてのデルタ吸光度値を、λｅｍ５１１ｎｍにおいて得た。５００ｎｍにおける単一の等吸収点の存在に注意のこと。この挿入は、ＣＡＦ濃度対デルタ吸光度のプロットを示し、ＡＯ−ＣＡＦ複合体の形態からの結合曲線を示す。ＡＯ−ＣＡＦ複合体についての結合定数を決定するために、デルタ吸光度値をλｅｍ５１１ｎｍにおいて獲得し、ＣＡＦ濃度に対してプロットした。このデルタ吸光度スペクトルは、溶液における２つだけの吸光種の単一の等吸収点特性およびλｅｍ５１１ｎｍにおける最大偏差ピークを示す。ＡＯ−ＣＡＦ複合体について算出したＫａｓｓｏｃを、２５５±５Ｍ−１（Ｒ２＝０．９９７）および１：１の化学量論において見出した。図３〜４のＩＮＳＥＴにおいて示されるＡＯ−ＣＡＦ結合プロットは、１：１複合体を形成するＡＯおよびＣＡＦのモデルとよく一致する。
【００７８】
分光光度的分析を２μＭのＡＯ濃度において行い、ＣＡＦの影響およびＡＯの蛍光スペクトルでのＮａＣｌの生理学的濃度を決定した。ＣＡＦを、ＣＡＦ種：ＡＯ分子比が２５００：１から０．５：１の範囲にわたって添加し、そして蛍光輝度をλｅｍ５３０ｎｍおよびλｅｍ６３５ｎｍにおいて決定した。この蛍光輝度を、最終濃度１５０ｍＭまでＮａＣｌを引き続き添加し、そしてＡＯとＣＡＦとの両方を含む試験を十分に各々行うようにｐＨ７．０まで添加した。
【００７９】
図３〜５Ａのデータは、０．５〜１０（１μＭから２０μＭのＣＡＦ）のＣＡＦ対ＡＯ分子比の範囲にわたって、１５０ｍＭのＮａＣｌの非存在下において、および１５０ｍＭのＮａＣｌ存在下において、ＣＡＦで、２μＭのλｅｍ５３０ｎｍにおける平均蛍光値を示す。図３〜５Ａに示される例は、λｅｍ４８５ｎｍに励起され、かつλｅｍ５３０ｎｍにおいてモニターされたＡＯの蛍光輝度対ＡＯの蛍光度およびＡＯ−ＣＡＦ複合体形態におけるＣＡＦおよびＮａＣｌの影響を示すためのＣＡＦ濃度のプロットである。２μＭのλｅｍＡＯ溶液を、ＮａＣｌ［１５０ｍＭ］を添加するかまたは添加しない種々のＣＡＦ濃度の存在下で、分光光度的分析を行うことによって分析する。エラーバーは、凡例記号（ｎ＝３）に隠れない場合、標準偏差を示す。１５０ｍＭのＮａＣｌを用いるかまたは用いない２μＭの濃度におけるＡＯについての初期蛍光値は、ＣＡＦで滴定する前に有意に異なる。詳細には、２μＭにおけるＡＯ溶液のＮａＣｌの存在は、約４００から約５００のＣＡＦ平均からλｅｍ５３０ｎｍにおける蛍光値を有意に増加させた。しかし、ＣＡＦのさらなる増加量によって、平均蛍光値は初期平均蛍光値にわたって有意に増加される。ＡＯ−ＣＡＦ溶液種への１５０ｍＭのＮａＣｌ添加は、１０００のＣＡＦ：ＡＯ比まで試験された、ＣＡＦ濃度の全範囲にわたる平均蛍光値を有意に影響しない（ｐ＞０．０５４）。しかし、５ｍＭ（分子比２，５００：１）のＣＡＦ濃度において、ＣＡＦおよびＡＯ単独について１５０ｍＭのＭａＣｌの添加に伴って、１，２４５±５３から１，１５０±３４の値を有する平均蛍光輝度における有意な変化が存在した。λｅｍ５３０ｎｍにおける蛍光輝度の漸進的な変化は、２，５００（５μＭ　ＣＡＦ）の分子比において１，２４５±５３の値に対して０．５（１μＭ　ＣＡＦ）のＣＡＦ：ＡＯ比が６７１±１０９（ｎ＝３）の平均値から生じた。ＣＡＦまたはＡＯ［２μＭ］までＮａＣｌを有するＣＡＦのいずれかの添加を生じる蛍光輝度における平均値は、大部分の試験状態についてλｅｍ６３５の平均蛍光値において、各々有意に異ならない。
【００８０】
平均分光蛍光分析値を、ＣＡＦ濃度に対してプロットし（図３−５Ｂを参照のこと）、１５０ｍＭのＮａＣｌの非存在下および存在下におけるＡＯ−ＣＡＦ複合体の会合定数（Ｋａｓｓｏｃ）を決定した。図３−５Ｂの例の会合曲線を、正味の蛍光値（バックグラウンド蛍光を引いた）対ＣＡＦ濃度からプロットした。このデルタ蛍光プロットを使用して、１５０ｍＭのＮａＣｌの非存在下および存在下での、２μＭのＡＯ濃度におけるＡＯ−ＣＡＦ複合体のＫａｓｓｏｃを決定した。２μＭのＡＯにおけるＡＯ−ＣＡＦ複合体のＫａｓｓｏｃは、１５０ｍＭのＮａＣｌの非存在下では、２５４±２７Ｍ−１（Ｒ２＝０．８９）であり、そしてＮａＣｌの存在下では、２１６±２０Ｍ−１（Ｒ２＝０．９３）であることが見出された。２μＭのＡＯ濃度におけるＡＯ−ＣＡＦ複合体の形成の会合定数を、ＮａＣｌの非存在下および存在下において、それぞれ、２５４±２７Ｍ−１および２１６±２０７Ｍ−１と決定した。これらの平均値の差違は、統計学的に顕著である。
【００８１】
生理学的濃度のＮａＣｌの非存在下および存在下における、ＤＮＡ塩基対（ｂｐ）対ＡＯのある範囲にわたる、ＡＯとＤＮＡとの相互作用を特徴付けるために、実験を行った。ｂｐ対ＡＯの比が約０．４から０．６５まで増加した場合、４５０ｎｍと５２５ｎｍの波長の間の吸光度値の全体的な低下が生じた（図３−６）。図３−６に示される例は、選択されたスペクトルのｄｓＤＮＡ　ｂｐ：ＡＯの比であり、これは滴定系内の重要な移行が太線で示されていることを示す。スペクトル系列のいくつかは、データの表示を簡潔にするために示されていない。０．０と０．７５との間のｂｐ：ＡＯ比において、一般的なピークは、４６８ｎｍおよび４９２ｎｍのδａｂｓにおいて生じる。これらのピークは、１０μＭ以上のＡＯ濃度で見出される一般的な吸光度ピークに相当する。０．７５より上のｂｐ：ＡＯ比の吸光度スペクトルは、２つの異なるピーク（一方は、４７５ｎｍにおけるピークであり、他方は、５０３ｎｍにおけるピークである）の同時生成を伴い、最終的に吸光度のレッドシフトを示す。
【００８２】
ＤＮＡのアリコートの連続添加による、４６８ｎｍ付近の吸光度ピークは、まだ明らかであり、一方で４９２ｎｍにおける最初の主要な吸光度ピークは、わずかに検出可能である。さらに、ＤＮＡのアリコートの連続添加およびｂｐ：０．６５より上のＡＯ比の連続増加によって、λａｂｓ４７５ｎｍにおける吸光度は、増大し、そして４６８ｎｍから４７５ｎｍまでの赤方偏移を表示し始めた。λａｂｓ４７５ｎｍにおけるこのスペクトルピークは、ｂｐ：３．０以上のＡＯ比における吸光度プラトーに達する前に、ＤＮＡ濃度の増大と共に大きさが徐々に増大した。さらに、約１．７２のＡＯ比において、λａｂｓ５０３ｎｍ付近におけるこの吸光度は、ＤＮＡの各さらなるアリコートによる振幅において増大した。λａｂｓ５０３ｎｍにおけるこの吸光度は、ｂｐ：１．７２〜９．１３のＡＯ比からの滴定の範囲の間を着実に増加した。表３−１は、ｄｓＤＮＡを用いた１００μＭのＡＯの滴定の間に観察された最適吸光度ピークの範囲および一連の滴定の間の観察されたこれらの吸光度ピークを超えるｂｐ：ＡＯ分子比の範囲の要約および記述である。表３−１に示されたデータを、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭにおけるさらなる連続滴定によって確認した。別の実施例において、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭのＡＯ濃度における滴定は、同様の結果を得た。
【００８３】
【表３ａ】
2004514741.tif 000005
ｄｓＤＮＡを用いた３μＭのＡＯの滴定からのスペクトルデータを、図３−７に示されるデルタ吸光度プロットを作製するのに使用した。この結果は、４７０ｎｍのおける単一アイソべスティオポイント（ｉｓｏｂｅｓｔｉｏ　ｐｏｉｎｔ）を示す。この会合定数を、５０４ｎｍのデルタ吸光度値対ＤＮＡ濃度のプロットから計算した（挿入した図３−７を参照のこと）。このＤＮＡ濃度は、３０μＭ〜７０μＭの範囲であった。このプロットからのＫａｓｓｏｃは、３７，６６０±４３１Ｍ−１であった。
【００８４】
別の実施形態において、λｅｘ４８５ｎｍならびにλｅｍ５３０ｎｍおよびλｅｍ６３５ｎｍにおけるｄｓＤＮＡとのＡＯの相互作用の分光蛍光分析をまた、実施した。より低い濃度のＡＯ（２μＭ）とのＤＮＡの相互作用は、ｂｐ：４：１以上のＡＯ比に対する２０μＭのより高いＡＯ濃度において見出された結果を模倣した。８から２５０μＭまでのＤＮＡの範囲の一連の着実に増加するＤＮＡ濃度を超えるＡＯに対する会合曲線を図３−８に示す。
【００８５】
２μＭのＡＯの蛍光におけるＮａＣｌの効果を例示する図３−８に示される実施例を、ｂｐ：４から６．２５までのＡＯの範囲にわたって決定した。励起波長は４８５ｎｍであり、一方で発光は、５３０ｎｍにおいて測定された。ＤＮＡを伴う２μＭＡＯに対する会合定数を、ＮａＣｌの非存在下で３１，９９０±３１０Ｍ−１（Ｒ２＝０．９８）と決定し、そしてＮａＣｌの存在下で３１，６９０±４９８Ｍ−１（Ｒ２＝０．９６）と決定した。エラーバーは、データポイントシンボルによって隠される限り９５％において信頼区間を示すことを示す。デルタ蛍光値を、ＤＮＡの非存在下で２μＭにおけるＨＥＰＥＳ緩衝化ＡＯのバックグランド蛍光を減算することによって得た。ＤＮＡとのＡＯの相互作用に対する会合定数を、３１，９９０±３１，９０Ｍ−１と決定した。また、図３−８において例示されるように、最初の２μＭのＡＯ溶液への１５０μＭのＮａＣｌの添加は、たとえＡＯと３１，６９０±４，９８０Ｍ−１の値を生じるｄｓＤＮＡとの間の結合定数における効果があったとしても、わずかである。
【００８６】
実験を、実施して、ＡＯ−ＤＮＡ複合体の蛍光強度におけるＮａＣｌも生理学的濃度の効果を決定した。図３−９は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下かまたは非存在下における２０μＭのＤＮＡを伴う０．５から１０．０μＭまでの範囲の濃度におけるＡＯの分光蛍光分析を示す。サンプルを、４８５ｎｍの波長において励起し、そして蛍光発光値を、λｅｍ５３０ｎｍおよびλｅｍ６３５ｎｍにおいて読み取った。示されるエラーバーは、レジェンドシンボル（ｎ＝４）によって隠される限り標準偏差を示す。０．５から３．０μＭまでの範囲にあるＡＯ濃度における２０μＭのＤＮＡの分光蛍光分析は、ＡＯのこの濃度範囲を超えてλｅｍ５３０ｎｍにおける蛍光値の増加を有意であるが、わずかに明らかにした。ＡＯおよびＤＮＡを含む環境へのＮａＣｌ（１５０μＭ）の添加は、ＡＮＯＶＡ統計によって決定される２μＭの超えるＡＯ濃度まで、λｅｍ５３０ｎｍまたはλｅｍ６３５ｎｍのいずれかにおける蛍光値に有意に寄与しなかった。３．５μＭより上のＡＯ濃度において、ＮａＣｌの非存在下かまたは存在下でのλｅｍ５３０ｎｍにおけるＤＮＡ溶液の蛍光値は、それぞれ４倍および５倍に増加した。ＮａＣｌの非存在下において、蛍光のプロットは、４．０〜７．０μＭの範囲にあるＡＯ濃度においてλｅｍ５３０ｎｍプラトーの値を示した。また、図３−９におけるデータは、４．０〜７．０μＭの範囲にあるＡＯ濃度を超えて１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下における蛍光値が、ＮａＣｌの非存在下におけるλｅｍ５３０ｎｍにおいて得られた値とは有意に異なった（増加した）ことを明らかにした。λｅｍ６３５ｎｍにおいて、蛍光値は、３．５〜４．０μＭのＡＯ濃度間でわずかに増加し、そしてＡＯの濃度の増加を徐々に上げ続けた。λｅｍ５３０ｎｍにおいて得られた結果とは異なり、ＮａＣｌの存在または非存在は、λｅｍ６３５ｎｍにおける蛍光に有意な効果を与えなかった。
【００８７】
塩の添加は、反応体の電荷の改変によって、および／または水分子の影響の軽減によって、ＡＯのＫａｓｓｏｃ値および他の反応体に影響を与える可能性がある。ＡＯの自己会合（すなわち、二量体化）を最小化するために、ＡＯ（２μＭ）の相対的な低濃度を使用し得る。反応体間の相互作用を、λｅｘ４８５ｎｍにおける分光蛍光分析方によって解析し、そしてλｅｍ５３０ｎｍにおいてモニタリングした（緑色）。
【００８８】
２μＭのＡＯ単独の溶液および１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＡＦ、２ｍＭのＤＮＡとの種々の組み合わせの溶液を研究した。表３−２は、その結果および平均間の差異に対する統計分析および結果を要約する。
【００８９】
【表３ｂ】
2004514741.tif 000006
表３−２において、蛍光（λｅｘ＝４８５ｎｍおよびλｅｍ＝５３０ｎｍ）を、ＮａＣｌ（１５０μＭ）の存在下および非存在下において、カフェイン（５ｍＭ）およびＤＮＡ（２ｍＭ）単独かまたは組み合わせてＡＯを測定した。有意な差異を、一元ＡＮＯＶＡ（ｐ≦０．０５）によって見出した。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）複数範囲試験は、表に示されるような、平均間で有意な差異が見出した（ｐ＜０．０５）。異なる文字指定を有する統計平均は、統計的に異なり（ｐ＜０．０５）、一方で同じレターを有するこれらの平均は、有意に異ならない（ｐ＞０．０５）。ｎ＝４を示す＊によって示されない限りｎ＝３を示す。
【００９０】
表３−２に示されるように、この結果を、統計的に異なる平均（ｐ＜０．０５）を有する、異なる大文字によってそれぞれ示される、４つの異なる群に分類した。最も低い平均蛍光値の５１４．０は、２μＭのＡＯ単独によって、産生された。２μＭのＡＯへの１５０ｍＭのＮａＣｌに添加は、５１４．０から６６１．０までの平均蛍光値における有意な増加を起こした。この６３５．５の値は、５ｍＭのＣＡＦの存在下のＡＯに対して決定される６６１．０の平均蛍光値か、または５ｍＭのＣＡＦと１５０ｍＭのＮａＣｌの両方の存在下におけるＡＯに対して決定された７０１．３の平均蛍光値かのいずれかとは有意に異ならない。２μＭのＡＯ溶液への２ｍＭのＤＮＡの添加は、最も高い平均蛍光値の９８８．０を生じ、これは、ＡＯ単独で決定された５１４．０の平均蛍光値の約２倍であった。なお、９８８．０のこの値は、ＡＯ−ＤＮＡ溶液への１５０ｍＭのＮａＣｌの添加によって得られた７９５．０の値よりも有意に高かった。
【００９１】
δｅｍ５３０ｎｍにおける２μＭのＡＯの蛍光は、２ｍＭのＤＮＡの添加によって９２％増加し、そして５ｍＭのＣＡＦの添加によって２９％増加した。１５０ｍＭのＮａＣｌの存在は、ＣＡＦの存在下におけるＡＯの蛍光強度をさらに増加した。ＮａＣｌの添加は、ＤＮＡの能力を有意に軽減して、ＡＯの蛍光強度を増加した。従って、ＤＮＡかまたはＣＡＦかのいずれかの添加は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在する場合、それぞれ、５４％および３６％までのＡＯの蛍光強度の増加を生じる。
【００９２】
以前に記載された実験からの結果は、それぞれの結合種（ＣＡＦまたはｄｓＤＮＡ）とのＡＯの特定の相互作用を個々に特徴付け、一方で、２μＭに固定されたＡＯの濃度を維持した。
【００９３】
λｅｘ４８５ｎｍおよびλｅｍ５３０ｎｍにおける分光蛍光分析を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含んで、および含まずに、５ｍＭのＣＡＦ、および２ｍＭのｄｓＤＮＡと組み合わせて、２μＭのＡＯの溶液で実施した。これらの結果の統計分析をまた、表３−２に示した。異なる文字指定を有する平均は、統計的に異なり（ｐ＜０．０５）、一方で、同じ文字指定を含む平均は、有意な差異のない平均を有する。５ｍＭのＣＡＴの添加によるＡＯ−ＤＮＡの操作は、９８８．０〜８８０．３までの平均蛍光値を有意に下げた（ｐ＜０．０５）。なお、８８０．３のこの値は、同じＡＯ−ＤＮＡ溶液への１５０ｍＭのＮａＣｌのみの添加によって得られた７９５．０の値よりも有意に高かった。ＮａＣｌが存在する場合（ＳＮＫ文字指定「Ｂ」）、ＣＡＦは、ＡＯ溶液の蛍光への有意な効果を有さないことに留意のこと。ＡＯを伴う２ｍＭのＤＮＡ、５ｍＭのＣＡＦ、および１５０ｍＭのＮａＣｌの組み合わせは、ＣＡＦは存在せず、２ｍＭのｄｓＤＮＡを含む１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で、ＡＯに対して得られた、７９５．０の平均値とは有意に異ならなかった７９３．７の平均蛍光値を与えた。
【００９４】
結合したＡＯは、生じる分子会合のタイプに基づいて、２つの別個の波長で蛍光を発することが知られている。ＡＯが化合物（例えば、ＲＮＡ）に静電的に結合する場合、これは６３５ｎｍのλｍａｘ発光を有する特徴的な赤色の蛍光を有する。あるいは、ＤＮＡを用いた場合に生じるようにＡＯが介在する場合、これは、５３０ｎｍのλｍａｘにおいて緑色の蛍光を発する（Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９４）。遊離の未結合のＡＯモノマーの蛍光は、低濃度（１〜１０μＭ）において弱く、従って、バックグラウンド蛍光にほとんど寄与しない。従って、ＡＯ自体の静電相互作用は、６３５ｎｍのλｅｍにおいてモニタリングされ得、一方、スタックされたダイマーの形成は、５３０ｎｍにおける蛍光放射のモニタリングにより追跡され得る。
【００９５】
１５０ｍＭまでのＮａＣｌ濃度の増加は、溶液中のダイマーの濃度の増加を示す４９１ｎｍにおける吸光度に関して、２６８ｎｍの光学吸光度の増加を生じた。また、１５０ｍＭのＮａＣｌの添加は、０．５μＭから５．０μＭの範囲のＡＯ濃度において、３７，４１０Ｍ−１から１１８，０００Ｍ−１のＫａｓｓｏｃの増加を生じた。
【００９６】
要約すると、ダイマーまたはスタックされたＡＯ凝集体の形成は、部分的に、ＡＯの濃度に依存する。塩をＡＯ溶液に添加することは、低いＡＯ濃度におけるダイマーの形成を促進するが、５μＭより上のＡＯ濃度における最小のさらなる影響を有する。５μＭのＡＯ濃度における緑色発光（λｅｍ　５３０ｎｍ）の急激な増加は、おそらく、ＡＯダイマーの形成へのＡＯ平衡の移動に起因する。この現象の臨界濃度は、約５〜６μＭのようである。この濃度より下において、ＡＯは、主にモノマーとして存在し、ＡＯの濃度が５μＭまで増加するにつれて、そのダイマー種の形成が増加する。５μＭより上の濃度において、分子ＡＯは、モノマー、ダイマーおよびおそらくスタックされていないダイマーの凝集体として溶液中に存在する。蛍光分析によって、ＡＯ分子のダイマー形態およびモノマー形態の明確な識別および特定のモニタリングが可能になった。
【００９７】
ＤＮＡ挿入ＡＯを用いるＣＡＦの光学滴定およびスペクトル分析研究は、ＣＡＦがＢ−Ｂ型相互作用を介してＡＯと複合化し得ることを示した。このような複合体の形成における重要な力は、この複合体の２つの分子間の最大環重なりを生じるファンデルワールス相互作用であるようである。ＣＡＦと脂肪族突然変異原との間の複合体化は、芳香族挿入物とのＣＡＦ複合体と比較してはるかに低い結合エネルギーを示す。ＣＡＦ−ＡＯ複合体の対応する結合定数は、２５０Ｍ−１程度である（表３−３）。表３−３において、吸光度は、４００ｎｍと５５０ｎｍとの間でスキャンされた。蛍光励起は、４８５ｎｍであり、一方、発光は、５３０ｎｍで観察した。
表３−３．　１５０ｍＭ　ＮａＣｌの非存在下および存在下における、アクリジンオレンジ（ＡＯ）と、ＡＯ、カフェイン（ＣＡＦ）、およびｄｓＤＮＡとの会合定数（Ｋａｓｓｏｃ）のまとめ
【００９８】
【表３ｃ】
2004514741.tif 000007
ａ　Ｋａｓｓｏｃは、吸光度データおよび数学モデルを使用して計算した。
ｂ　１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度。
【００９９】
本明細書中で報告されるＡＯ−ＤＮＡ結合の分光光度分析は、高いＤＮＡ対ＡＯの比における単結合種の存在、従って、結合のたった１つの様式を示唆する（単一の等吸収点が、５．０より上のＤＮＡ対ＡＯの分子比のみにおいて、分光光度分析の間に容易に同定され得る）。ＡＯ−ＤＮＡ系のこのような条件下における会合定数または「親和性」の測定は、吸光度研究および蛍光研究の両方によって評価され、そしてＫａｓｓｏｃ値は、類似していることが見出された（表３−３）。
【０１００】
光学滴定のデータは、ＡＯ−ＡＯの自己スタッキングまたはダイマー形成は、高いＤＮＡ対ＡＯ比において実際に排除されることを示唆する。これらのデータは、低い分子比におけるＡＯのＤＮＡへの結合プロセスが、アクリジン誘導体のほとんどについて記載されたように、以下の２つの異なるプロセスに分けられ得ることを示唆する：一方は、高親和性（タイプＩ）、もう一方は、低親和性（タイプＩＩ）。タイプＩのプロセスは、強く、そして低い結合比におけるＡＯからＤＮＡ二重螺旋への挿入に相当する。タイプＩＩのプロセスは、弱く、そして通常は、高い結合比における外部静電結合に寄与する。異なる蛍光放射波長の使用により、相互作用プロセスに関与する各種の結合の会合定数の算出が可能となる。従って、λｅｍ　５３０ｎｍにおいて得られたデータから決定された結合値は、ＡＯのＤＮＡに対する挿入またはＢ−Ｂ結合（スタッキング）に関するとみなされるべきである。低いＡＯ対ＤＮＡの比（挿入プロセス）において得られたＫａｓｓｏｃ値は、λｅｍ　５３０ｎｍにおける蛍光決定のみが、タイプＩの強い結合様式の会合定数の算出を可能にすることを示唆する。
【０１０１】
低いＤＮＡ対ＡＯの分子比において、ＡＯの蛍光強度の減少は、ＤＮＡと相互作用する場合に観察された。ＡＯは、特に、低いＡＯ濃度において、ＤＮＡに対する強い結合親和性を有する。この挙動は、アクリジン発光団の濃度に対して感受性である。なぜなら、ＡＯとＤＮＡとの間の強い結合は、ＡＯ対ＤＮＡ塩基対の低い比（ＡＯ濃度＜３μＭ）において見られるからである。
【０１０２】
１５０ｍＭまでのＮａＣｌ濃度の増加は、０．５μＭから５．０μＭまでの範囲のＡＯ濃度において、３７，４１０Ｍ−１から１１８，０００Ｍ−１のＡＯの二量化のＫａｓｓｏｃの増加を生じた（図３−２の挿入）。これは、ＡＯ上の窒素のプロトン化に起因する静電電荷と競合することにより、ＡＯモノマーの溶媒和に対する水分子の寄与を減少することによって、ＡＯ−ＡＯダイマーが安定化することに起因するようである。従って、１５０ｍＭ　ＮａＣｌの存在下における高いＫａｓｓｏｃ値は、モノマーのＡＯとダイマーのＡＯとの間の平衡をシフトして、ＡＯダイマーの形成を有利にすることが予測される。比較的低いＡＯ濃度［２μＭ］においてでさえ、ＮａＣｌの生理学的濃度は、λｅｍ　５３０ｎｍにおける蛍光値の２３％の増加を生じ、これは、ダイマー形成の増加を示す（表３−２を参照のこと）。
【０１０３】
ＡＯおよびＤＮＡを含む溶液は、ＡＯのみの蛍光値の約２倍の蛍光値を示し（表３−２）、これは、ＡＯがＤＮＡに高い程度で挿入されることを示す。ＡＯおよびＤＮＡを含む溶液に、１５０ｍＭのＮａＣｌを添加することによって、この溶液の蛍光の２０％の減少が生じた。ＮａＣｌを含む溶液において、イオン強度の増加によって、ＤＮＡは、ＡＯと静電結合を形成するその能力のいくぶんかを損失した。１０００：１の分子比（２ｍＭ　ＤＮＡ：２μＭ　ＡＯ）において、これは、あるとしても、ＡＯ−ＤＮＡ複合体の蛍光強度に対する影響をほとんど有さないべきである。ＮａＣｌを添加することによって、ＡＯ−ＡＯダイマーの濃度を増加することにより、ＤＮＡへの挿入のために利用可能な遊離ＡＯモノマーの量のシフトが生じる。ＡＯ−ＡＯダイマーの形成の増加は、形成されるダイマーごとに２：１の比だけ形成されるＡＯ−ＤＮＡ複合体の濃度を減少することによって、蛍光強度の減少を生じる。
【０１０４】
３つ全ての反応物を含む溶液において、ＡＯ−ＣＡＦ−ＤＮＡ系の平衡は、４つのパラメータ、すなわち、ＫＡＯ−ＡＯ、ＫＡＯ−ＣＡＦ、ＫＡＯ−ＤＮＡ（ｉ）、およびＫＡＯ−ＤＮＡ（ｅ）によって制御され、ここで、これらはそれぞれ、ＡＯ−ＡＯ、ＡＯ−ＣＡＦ、ＡＯ−ＤＮＡ（挿入）、およびＡＯ−ＤＮＡ（静電的）の会合定数（ＡＯ＞５μＭにおける）を表す。この系のＫｅｑは、以下のとおりである：
Ｋｅｑ＝ＫＡＯ−ＡＯ＋ＫＡＯ−ＣＡＦ＋ＫＡＯ−ＤＮＡ（ｉ）＋ＫＡＯ−ＤＮＡ（ｅ）　。
【０１０５】
ＡＯの任意の所定の濃度、一定の温度、ｐＨ、および圧力において、Ｋｅｑは、一定である。ＡＯ−ＡＯ、ＡＯ−ＣＡＦまたはＡＯ−ＤＮＡ（ｉ／ｅ）のＫａｓｓｏｃ値の変化は、この系の全Ｋｅｑに影響を与えないが、その代わり、他の反応物の間のＫａｓｓｏｃに影響を与える。ＮａＣｌの非存在下または存在下における３つ全ての反応物の相互作用の結果は、この概念を支持する。しかし、各反応物のＫａｓｓｏｃ値は、ＡＯモノマーとの分子相互作用を示し、そして溶液中のＡＯの濃度は、全体的にモノマー形態であると考えられる。５μＭ未満のＡＯ濃度において、これは妥当な仮定であり、そしてＡＯとｄｓＤＮＡとＣＡＦとＮａＣｌとの間の相互作用の蛍光定量的測定は、比較的簡単である。５μＭより高い濃度において、ＡＯがほとんどモノマー形態であるという仮定は無効である。５μＭより高いＡＯ濃度においてでさえ、次に議論するように、λｍａｘ　５３０ｎｍにおける分光光度データをさらに解釈し得る。
【０１０６】
図３−１０に示されるモデルは、２μＭおよび２０μＭにおけるＡＯの分子集団を例示する。２μＭの濃度において、ＡＯは、ほとんどがモノマー形態であり、一方、２０μＭの濃度において、これらは、モノマー形態とダイマー形態との間の動的平衡で存在する。モノマー形態のＡＯは、ＣＡＦと反応して、ＡＯ−ＣＡＦ複合体を形成し（図３−１０にもまた示される）、そしてモノマー形態のＡＯのみが、ｄｓＤＮＡに挿入され得る。モノマーＡＯのアベイラビリティは、ｄｓＤＮＡへの挿入および／またはそのＣＡＦとの複合体化に重要である。
ＡＯのダイマー形態とモノマー形態との間の平衡に影響する条件（例えば、ＮａＣｌ）が、モノマーＡＯの全体的な濃度および利用能をもたらす。表３−２は、ＡＯ−ＤＮＡ系へのＣＡＦの添加が蛍光の有意な減少を生じ、ＮａＣｌの添加に際して有意な減少を生じないことを示す。これは、比較的高い濃度のＣＡＦ（５ｍＭ）が、質量作用の法則に基づいて、モノマーＡＯの競合的複合体化を介して、ＤＮＡにインターカレートされるＡＯの量を減少し得ることを示唆する。ＡＯ−ＤＮＡ−ＮａＣｌ系へのＣＡＦの添加は、蛍光における有意な変化を生じない。なぜなら、ＣＡＦは、非荷電状態であるからであり、かつＡＯ−ＤＮＡ複合体についてのＫａｓｓｏｃ値は、ＡＯ−ＣＡＦのそれよりもはるかに高く、従って、主なが、モノマーＡＯの平衡および利用能を制御するからである。
【０１０７】
これらの実験の結果は、漸増ＡＯ濃度とのＣＡＦの相互作用が、蛍光がＡＯ濃度の増加に対して比例的に増加するという点で、質量作用の法則に従うことを明らかにする。ＡＯ−ＣＡＦ系へのｄｓＤＮＡの添加は、蛍光応答における有意な減少を引き起こす。これは、ＤＮＡ骨格へのＡＯの静電結合に起因し、従って、ＡＯ−ＡＯダイマー化およびＣＡＦとの複合体化に利用可能なＡＯモノマーの減少が、このような蛍光強度の低下を生じる。この系へのＮａＣｌの添加は、一連の漸増ＡＯ濃度に沿って蛍光の量をわずかに増加し、そしてこれは、モノマーＡＯを遊離するＤＮＡ骨格上のリン酸基の荷電中和およびＡＯ−ＡＯダイマーを安定化するＮａＣｌの能力に起因し得る。ＤＮＡのリン酸骨格の荷電中和はまた、より多くの利用可能なモノマーＡＯへの平衡シフトを生じ、従って、これが、より高い蛍光強度を生じる、ＡＯ−ＣＡＦ複合体および／またはＡＯ−ＤＮＡインターカレーションの形成に寄与する。
【０１０８】
キサンチンの使用は、遊離のＤＮＡインターカレータへの単なる結合に限定されない。キサンチンはまた、ＤＮＡにインターカレートされる化合物の遮断剤（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ）として使用され得る。先に議論されるように、質量作用の法則は、ＤＮＡインターカレータの結合を阻害するために利用され得る。同様の様式で、ＤＮＡインターカレータは、ポリヌクレオチドと動的平衡にあるので、質量作用の法則は、結合されたインターカレータを除去するために利用され得る。さらに、遮断剤分子の使用は、改変キサンチンに制限されない。質量作用の法則を介してＤＮＡインターカレータと結合する任意の分子が、使用され得る。例としては、プリン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
本発明の別の実施において、カチオン性蛍光色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ；３，６−ビス［ジメチルアミノ］アクリジン塩酸塩、＞９９％純度）を、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手し、そしてＨＥＰＥＳ緩衝液を、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡから入手した。高度に重合化されたニシン精子デオキシリボ核酸ナトリウム塩を、ＡＣＲ＿Ｓ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから入手し、これは、さらなる精製を用いずに使用した。カフェイン（ＣＡＦ；１，３，７−トリメチルキサンチン、Ａｌｄｒｉｃｈ）、および３つの他のメチル化キサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、テオフィリン（３，７−ジメチルキサンチン、ＡＣＲ＿Ｓ）、１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチン（ＴＭＵ；テトラメチル尿酸、ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）、アミノフィリン（テオフィリンエチレンジアミン）もまた、９９％純度で購入し、そしてさらなる精製を用いずに使用した。ＣＡＦおよびＡＯのストック溶液を、５０ｍＭの濃度で調製した。ニシン精子ＤＮＡのストック溶液を、使用日に新鮮に調製した。このｄｓＤＮＡの濃度は、４つ全てのヌクレオシド塩基の平均分子量に基づき、３４０ｇ／モル（１塩基）または６８０ｇ／モル（一塩基対すなわち「ｂｐ」）のおよその式量を得た。この方法は、各塩基が、そのＤＮＡ内に等しく存在することを仮定した。３４０ｇ／モルの式量を使用して、ＤＮＡのストック溶液を、５ｍＭの濃度に調製した。全ての溶液およびその後の希釈物を、５．０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（これは、０．１Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ　７．０に調整した）中にその正確に測った量を溶解することによって調製した。ＡＯを、５ｍｍｏｌ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（１．０Ｍ　溶液、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中に５０ｍｍｏｌの濃度でストック溶液中に調製した。ＡＯを、その公知のスペクトル特性およびＤＮＡおよびＲＮＡの両方についての蛍光発色マーカーとしての広範なその用途に起因し（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９７３；Ｋａｐｕｓｃｉｎｓｋｉ，１９９０；ＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉおよびＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｅｚ，１９８７，１９９０；ｖｏｎ　ＴｓｃｈａｍｅｒおよびＳｃｈｗａｒｚ，１９７９）、代表的なＤＮＡインターカレータとして選択した。特に、ＡＯは、２つのλｍａｘ蛍光ピークを示し、これらは、それ自体または他の化合物との相互作用の型に依存する（Ｌａｒｓｅｎら、１９９５；Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９４；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｅｚら、１９９６）。例えば、ＡＯが、ＤＮＡにインターカレートする場合（おそらく、Ｂ−Ｂ相互作用またはスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）複合体を形成することによって）、これは、約λｅｍ　５２６ｎｍ（緑色）での特徴的な緑色の蛍光最大値を有する。あるいは、ＡＯが、ＲＮＡまたは他の化合物と、電荷移動を介して静電的（イオン的）に会合する場合、これは、約λｅｍ　６５０ｎｍ（赤色）での特徴的な蛍光最大値を有する。本研究において使用した２つの放出波長λｅｍ　６３５ｎｍおよびλｅｍ　５３０ｎｍは、他の化合物と静電��に会合した場合（６３５ｎｍ）およびそれ自体または別の化合物（単数または複数）とのスタック（Ｂ−Ｂ）会合にある場合（５３０ｎｍ）の、ＡＯの蛍光放出についてのおよそのλｍａｘを表す。
【０１１０】
全てのストック溶液およびその後の希釈物を、５．０ｍｍｏｌ　ＨＥＰＥＳ（これは、０．１Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ　７．０に調整した）中にその正確に測った量を溶解することによって調製した。
【０１１１】
（実施例５）
本発明の別の実施において、脱プリン化ヌクレオチドを、インターカレーターアクリジンオレンジを最小にしか結合しない部位として使用し得る。
【０１１２】
ニワトリ赤血球を、本発明の１つの実施として選択した。これらの核を有する細胞は、ＲＮＡを有さない成熟赤血球である。血液を、成熟ニワトリから採取した。血液を、翅脈から５０ｍｌのガラスヘパリン含有チューブに抜き取り、凝固を防止した。この血液を使用して、顕微鏡スライド上でスミアを作製した。これらの血液のスミア化スライドを室温で乾燥し、そして顕微鏡ボックスに保存した。
【０１１３】
ニワトリ赤血球の核クロマチン内のｄｓＤＮＡの脱プリン化を、Ｆｅｕｌｇｅｎ法（ＦｅｕｌｇｅｎおよびＲｏｓｓｅｎｂｅｃｋ、１９２４）の改変を使用することによって達成した。詳細には、核を有するニワトリ赤血球スライド調製物を、１ＮのＨＣｌ溶液中で、室温にて６０秒間リンスした。この後、スライドを、予熱した（５５℃）１Ｎ　ＨＣｌ溶液中に１０分間静止状態で配置し、その後、蒸留水中で室温にて数回リンスした。スライドを室温で乾燥し、次いで、２つの異なる濃度５ｍＭおよび１０μＭのＡＯで、それぞれ、１５分間および２分間染色した。ＤＮＡの脱プリン化は、ＡＯのインターカレートが生じ得るＤＮＡポリマーの部位を除去することが予測された。
【０１１４】
ＡＯの溶液を、蒸留水中５ｍＭおよび１０μＭの濃度で調製した。ニワトリ赤血球でスミア化した顕微鏡スライドを、このスライドを、５０ｍＭのＡＯ溶液を含有するガラススライドホルダー内に、２分〜３０分間静止状態で配置し、その後、蒸留水中で３×１０秒リンスし、その後、室温で乾燥した。ＤＮＡに対する高いＡＯ比でのニワトリ赤血球の核クロマチンｄｓＤＮＡの染色は、ｄｓＤＮＡへのＡＯのインターカレーションおよび核クロマチンｄｓＤＮＡ鎖のリン酸骨格へのＡＯの静電結合の両方を可能にした。あるいは、ＤＮＡに対する低いＡＯ比での染色は、ｄｓＤＮＡへのインターカレーションのみを可能にした。コントロールスライドは、ニワトリ赤血球スミア化スライド（これは、その後、純粋な蒸留水（染色なし）に配置し、その後、乾燥した）（ネガティブコントロール）およびブランクスライド（赤血球なし）（これは、ＡＯ染色溶液に配置し、その後、乾燥した）からなった。処理したスライドを、暗所で保存し、次いで、光脱色を避けるために暗所から取り出した直後に、読み取りそして顕微鏡写真を撮った（Ｚｅｉｓｓ　Ｍｏｄｅｌ　６３　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，１６００　ＡＳＡ　Ｋｏｄａｋフィルム）。
【０１１５】
表４−１は、酸加水分解して無プリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）酸（ａｐ）を生成する前後の、２つの異なる濃度のＡＯでのニワトリ赤血球核クロマチンの染色に際して観察された結果を列挙する。これらの実験からの結果は、プリン塩基が、核クロマチン中のｄｓＤＮＡから除去された場合には、λｅｍ　５３０ｎｍでの緑色蛍光を欠くことによって明らかにされるように、ＡＯは、複合体を形成しないようであることを示す。しかし、λｅｍ　６３５ｎｍでの赤色蛍光が継続して存在することによって明らかなように、静電結合は、生じ続ける。
表４−１：蛍光顕微鏡で決定された無プリン酸（ａｐ）へのｄｓＤＮＡの酸加水分解前後のアクリジンオレンジでのニワトリ赤血球核クロマチンの染色に際して観察された色
【０１１６】
【表４ａ】
2004514741.tif 000008
表４−１に示された例において、ニワトリ赤血球をスミア化し、そして顕微鏡スライド上で乾燥し、その後、２つの異なる濃度のＡＯ（１０μＭおよび５ｍＭに曝露し、蒸留水でリンスし、そして乾燥させた。赤血球を、蛍光顕微鏡で試験し、核の色を記録した。１０μｍ　ＡＯおよび５ｍＭ　ＡＯについてのキサンチン曝露時間は、それぞれ、１５分および２分であった。脱プリン化ヌクレオチド（ａｐクロマチン）は、１０μＭ　ＡＯの存在下では緑色を実質的に示さず、これは、それに対する結合が実質的に存在しないことを示す。
【０１１７】
（実施例６）
本発明の別の実施形態において、修飾されたキサンチンを使用してＤＮＡインターカレータの結合を阻害する。ＤＮＡインターカレータと比較して過剰なキサンチンを提供することによって、これらのインターカレータの結合を、１０分を超えて阻害し得る。
【０１１８】
ニワトリ赤血球で覆った顕微鏡スライドを上記のように顕微鏡スライド上の３つの別々の領域に１０μＭ　ＡＯで染色した。スライドを、４つの異なるモル比の５つの異なるキサンチンに３つの異なる期間にわたって曝露した。キサンチン、テフィリン、カフェイン、１，３，７，９−テトラメチル尿酸、およびアミノフィリンを１０μＭ　ＡＯを用いて蒸留水中のＡＯに対して５０：１、５００：１、２５００：１、５０００：１のキサンチンのモル比で調製した。ニワトリ赤血球で覆った顕微鏡スライドを、１０分、１分、および１０秒の期間にわたって各モル比のキサンチン／ＡＯ混合物に静置（攪拌なし）条件下で曝露した。また、スライドをｄｓＤＮＡ／ＡＯ溶液の混合物を用いて、キサンチンよりもＡＯで有意に高いＫａｓｓｏｃ値を有する競争的ＤＮＡの影響を研究するのと同じ条件下で処理した。キサンチン／ＡＯまたはＤＮＡ／ＡＯ溶液への曝露に引続き、これらのスライドを、蒸留水でリンスし、室温で乾燥させ、蛍光顕微鏡で検査し、そして核の色を記録した。結果を以下のように記録した：０＝遮断効果なし；１＝わずかな遮断；２＝中程度の遮断；３＝ほとんど全遮断（非常にわずかな緑色蛍光が検出可能）；４＝完全遮断（緑色蛍光検出不可能）。
【０１１９】
ＡＯに対して既知の結合親和性を有する異なるキサンチンおよび純粋なｄｓＤＮＡのＡＯがニワトリ赤血球クロマチンへインターカレーションすることを阻害する能力を試験する実験を行った（結果は、表４−２に要約した）。１０μＭのＡＯ濃度でＡＯに最も高い結合親和性を有するキサンチンは、これらの結合親和性およびＡＯに対するモル比に比例してインターカレーションを遮断する傾向にあった。例えば、５９６．２Ｍ−１のＫａｓｓｏｃ値を有するアミノフィリンは、ＡＯのインターカレーションを遮断し、そして１０分間の曝露でさえ阻害を維持する顕著な能力を示した。遮断の効率は、ＡＯに対するアミノフィリンのモル比に対応した。ＡＯに対するアミノフィリンのモル比が５０：１〜５０００：１の２桁の規模にまで増加すると、阻害の効率もまた比例的に増加した。１６０．８Ｍ−１の結合親和性を有するテオフィリンは、１０秒の曝露時間でさえ最小の効果を有した。ＡＯ（〜４０００Ｍ−１）に対する最も高い結合親和性を有するｄｓＤＮＡへの曝露は、核クロマチン染色からＡＯを遮断において試験したどのキサンチンよりも効果的であった。
【０１２０】
（表４−２：アクリジンオレンジに対して増加するＫａｓｓｏｃ値を有するキサンチンの蛍光顕微鏡で決定されるニワトリ赤血球核クロマチンへのアクリジンオレンジのインターカレーションを遮断する能力への曝露時間の増加およびキサンチン濃度の増加の影響）
【０１２１】
【表４ｂ】
2004514741.tif 000009
＊緑黄色に見える色を有する移行性の赤色〜緑色蛍光
表４−２に示される実施形態において、赤色遮断フィルター（≧６００ｎｍ）を用いる緑色蛍光色（λｅｘ３６０ｎｍ）の相対強度を、染色強度の指標として使用した。モル比を１０μＭ　ＡＯに対するキサンチン濃度の比として示す。結果を以下のように記録した：０＝遮断効果なし；１＝わずかな遮断；２＝中程度の遮断；３＝ほとんど全遮断（非常にわずかな緑色蛍光が検出可能）；４＝完全遮断（緑色蛍光検出不可能）。キサンチンについての＊Ｋａｓｓｏｃ値を表２−１から選び、そしてＤＮＡについてのＫａｓｓｏｃ値を表３−２から選んだ。
【０１２２】
本発明の適用は、試験した修飾キサンチンまたは使用された濃度に限定されない。本発明は、以下に挙げられる広範な範囲の修飾キサンチンに適用可能であるがこれらに限定されない：１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、および１，３，７，９−トリメチル−８−オキシキサンチン。さらに過剰量のキサンチンは、表４−２に示された量に限定される必要はない。インターカレータ比に対するキサンチンのバリエーションは、本発明の範囲内含まれる。さらに、ポリヌクレオチド（それがＤＮＡ、ＲＮＡ，もしくはＰＮＡであっても）は、単鎖、二本鎖、またはより高いオーダーの鎖状構造のいずれであっても使用され得る。さらに、インターセプター分子の使用は、修飾されたキサンチンに限定されない。ＤＮＡインターカレータに質量作用の法則を介して結合する任意の分子が使用され得る。例として、プリン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明はまた、以前に論じられたようにインターカレータ分子の二量体形成の安定化のために塩濃度を変化することを含む。
【０１２３】
（実施例７）
なお別の実施形態において、修飾キサンチンを使用して、ＤＮＡ複合体に結合されたインターカレータを妨害および除去し得る。本発明のこの局面について、過剰量の修飾キサンチンは、ＤＮＡ／インターカレータ複合体に送達される。インターカレータ分子は、ＤＮＡと動的平衡にあるため、過剰量の修飾キサンチンを使用して、ＤＮＡ／インターカレータ複合体からインターカレータ分子を除去し得る。
【０１２４】
ＡＯに対する既知の結合親和性を有するキサンチンが、ＡＯへの結合について核ＤＮＡと競合し、そして従って、核クロマチン内のインターカレーション位置からＡＯを除去し得るか否かを決定する実験を行った。蛍光顕微鏡を使用して、５μＭと５ｍＭの両方のＡＯを有するニワトリ赤血球核クロマチンの染色に続いてＡＯ−ＤＮＡ複合体によって生成される蛍光色を観察した。ＡＯの量が可能性のあるインターカレーション部位の数をはるかに超えている場合に、より高いＡＯ：ｂｐ比で赤色蛍光を観察した。この赤色蛍光は、ＤＮＡ分子のリン酸骨格の荷電した基に静電気的に結合し、インターカレートしたＡＯの緑色蛍光を完全にマスクすることに起因する。あるいは、ＡＯの量が利用可能なインターカレーション部位より少ないか、または等しい場合、低いＡＯ：ｂｐ比で、ｄｓＤＮＡのプリン塩基対の間のＡＯインターカレーションの特徴である緑色蛍光が主に生じる（Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９４）。ＡＯインターカレーション（緑色蛍光）の結合親和性は、静電気的な結合（赤色蛍光）を形成する親和性よりも有意に高いので、ＡＯはインターカレーションを介してｄｓＤＮＡと結合することを好む。図４−２は、ニワトリ赤血球を塗布し、次いで核クロマチンの示差的な蛍光色を示すように１０ｍＭ　ＡＯを用いて２回の曝露で染色した顕微鏡スライドを撮影した２枚の顕微鏡写真を示す。核（上）は、１０分間ＡＯ溶液に曝露し、次いで水で蛍光赤色（静電気的結合）をリンスした。一方、核（下）は、１０秒間ＡＯに曝露し、次いで水で蛍光緑色（インターカレーション）をリンスした。５０ｍＭのＣＡＦでの１０分間のスライドのリンスは、バックグラウンドレベルに対する蛍光強度を減少した。
【０１２５】
表４−３は、ＡＯについての異なる結合親和性を有する異なるキサンチンを用いてニワトリ赤血球をリンスした結果を列挙する。最低のＫａｓｓｏｃ値を有する２つのキサンチンは、ＡＯ染色した核クロマチンによって生成された観察される蛍光にほとんど有意な影響を有さなかった。しかし、ＣＡＦで見られるようにキサンチンのＫａｓｓｏｃ値が〜２５６Ｍ−１まで増加すると、ＡＯ（低いＡＯ：ｂｐ比）で軽く染色された赤血球における緑色蛍光、およびわずかではあるが、ＡＯ（高いＡＯ：ｂｐ比）で強く染色された赤血球について観察可能な赤色蛍光の減少の両方の消失によって証明されるようにｄｓＤＮＡに対する可逆性のＡＯ染色が生じた。１，３，７，９−テロラメチル尿酸（Ｋａｓｓｏｃ　５５２Ｍ−１）とアミノフェリン（Ｋａｓｓｏｃ　５９６Ｍ−１）の両方でリンスした場合、蛍光顕微鏡下で観察されるほとんどの（全てではないにしても）緑色および赤色の除去が生じた。これらの結果は、キサンチンのＫａｓｓｏｃ値が高いほど、ニワトリ赤血球核クロマチンからのＡＯの除去がより効率的であることを示す。
【０１２６】
（表４−３：５μＭまたは５ｍＭいずれかのアクリジンオレンジでニワトリ赤血球核クロマチン染色後、キサンチンでのリンス前後、およびアクリジンオレンジでの再染色後の蛍光顕微鏡によって観察される核色）
【０１２７】
【表４ｃ】
2004514741.tif 000010
本発明は、ニワトリ赤血球ＤＮＡに限定されない。本発明の適用は、試験された改変キサンチンまたはその使用した濃度に限定されない。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない広範な改変キサンチンに適用可能である：１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−オキシキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、および１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチン。さらに、キサンチンの過剰量は、表４−２に与えられたものに限定される必要はない。インターカレータの割合に対するキサンチンの変化は、本発明に範囲に含まれる。さらに、ポリヌクレオチド（これは、ＤＮＡであるか、ＲＮＡであるか、またはＰＮＡである）は、一重、二重、またはそれ以上のストランド構造で使用され得る。さらに、インターセプター分子（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の使用は、改変キサンチンに限定されない。質量作用の法則を介してＤＮＡインターカレータ（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）に結合する任意の分子が使用され得る。実施例としては、以下を含むがこれらに限定されない：プリン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびこれらの組合せ。さらに、本発明はまた、インターカレータ分子の二量体形成を安定させる、上で議論されたような塩濃度の変化を含む。
【０１２８】
（実施例８）
本発明はまた、ＤＮＡの染色および／または標識に適用し得る。ニワトリ赤血球を、ＤＮＡを標識する用途を説明するためのシステム例として使用した。
【０１２９】
ニワトリの赤血球を塗付けた顕微鏡スライドが、５μＭまたは５ｍＭのいずれかのＡＯを用いて、３０分間で染色した後、蒸留水による１０秒間リンスを乾燥する前に３回行った。スライドは、次いで、キセノン光源蛍光エミッタを用いるＺｅｉｓｓ　Ｍｏｄｅｌ　６３　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ使用して蛍光顕微鏡検査法により検査した。いくつかの例では、ブロッキングフィルター（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ）を使用して、赤より高い波長の蛍光発光を除外した。顕微鏡写真は、Ｋｏｄａｋ　Ｇｏｌｄ　３５ｍｍ　ＡＳＡ　１６００スピードフィルムを使用して撮影し、現像して、そしてカラープリントを得た。かなりの顕微鏡写真を、同じ倍率および同じ露出時間で撮影した。選択された顕微鏡写真を、デジタルにてスキャニング（Ｈｅｗｉｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｏｄｅｌ　４Ｌ　Ｓｃａｎｎｅｒ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）して、そして１００ＭＢのＺＩＰカートリッジに記憶した。
【０１３０】
スライドを、次いで、テオフィリン（５０ｍＭ）、カフェイン（５０ｍＭ）、１，３，７，９−テトラメチル尿酸（５０ｍＭ）、およびアミノフィリン（５０ｍＭ）の５０ｍｌ溶液に、１時間の静置条件下で、曝露し、蒸留水でリンスし、そして室温で乾燥した。スライドを再度、蛍光顕微鏡検査法によって検査し、核の蛍光色を記録した。スライドは、再度、５ｍＭ　ＡＯを用いて染色し、その後、蛍光顕微鏡によって再度検査し、そして核の蛍光色を記録した。
【０１３１】
表４−３で示した例において、ニワトリ赤血球を、顕微鏡スライド上に塗付け、乾燥して、その後、これらをＡＯ溶液に３０分間曝露し、次いで過剰なＡＯを除去するために水でリンスした。乾燥後、各スライドは蛍光顕微鏡で観察され、その後キサンチン溶液（５０ｍｌ容積）のうちの１つの中に１時間静置し、水でリンスし、次いで乾燥して、その後ブロッキングフィルターを用いず蛍光顕微鏡検査法で観察した。最後に、各スライドを、最初の染色手順に従って、再度染色し、そして再び蛍光顕微鏡検査法で観察した。Ｋａｓｓｏｃ値は、表２−１で得られ、これはＭ−１で表現される。
【０１３２】
ｄｓＤＮＡが、ニワトリ赤血球の核クロマチンと同じ蛍光発色結果を提供することを示すために、蒸留水中のｄｓＤＮＡを顕微鏡スライド上に置き、そして乾燥させた。さらに本発明を使用して、インターカレータの結合を阻害するだけではなく、実際に、質量作用の法則を使用してＤＮＡからインターカレータを除去し得る。
【０１３３】
別の実施において、巨大な多糸染色体を、スカッシュ（ｓｑｕａｓｈ）技術によって、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｇａｓｔｅｒの幼虫の唾液腺から、調製した。唾液腺を顕微鏡スライド上に置き、ガラスカバースライドによりスカッシュし、酸性の酸で固定し、蒸留水でリンスし、そして乾燥した（Ｌｉｎｄａ　Ｃｈａｄｗｅｌｌ、ＵＩＨＳＣＳＡ−ＩＢＴの厚意により提供された）。３つの既知のＤＮＡインターカレータ、エチジウムブロマイド（純度９８％、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｋｅｅ、ＷＩ）、ドキソルビシン（９８％、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、およびアクリジンオレンジ＋マイナーグルーブ結合のＤＮＡ染色液　ヘキスト３３２５８（９８％、ＡＣＲＯＳ　Ｃｈｅｍｉａｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ）が蒸留水で、１ｍＭの濃度で調製された（化学構造については、図４−１参照のこと。ここで、アクリジンオレンジ（３，６−ｂｉｓ［ジメチルアミノ］アクリジン）が、パネルＡで示され、エチジウムブロマイドがパネルＢに示され、ドキソルビシンが、パネルＣにしめされ、ヘキスト３３２５８はパネルＤで示される）。調製した染色体のスライドを、これらの染色液に３０分間浸し、蒸留水でリンスし、そして室温で乾燥した。蛍光顕微鏡分析を、λｅｘが３６０ｎｍで実施し、顕微鏡写真を、キセノン光源蛍光エミッタを用いたＺｅｉｓｓ　Ｍｏｄｅｌ　６３　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで取った。顕微鏡写真を、Ｋｏｄａｋ　Ｇｏｌｄ　３５ｍｍ　ＡＳＡ　１６００スピードフィルムを用いて取り、スライド上の１つの個々の染色体の位置を書き留めた。染色したスライドは、次に、１００ｍＭのカフェインまたは１００ｍＭアミノフィリンに供して、１５分間静置し、蒸留水でリンスして、室温で乾燥した。視野内にある同じ個体の染色していない染色手体の存在が、位相差顕微鏡によって確認された。この染色体を、再び、λｅｘが３６０ｎｍで蛍光顕微鏡によって観察して、色を記録した。スライドを１ｍＭの染色液に３０分間浸すことにより染色し、蒸留水でリンスし、そして室温で乾燥し、同じ個々の染色体を、蛍光顕微鏡検査法によって検査し、そして蛍光色を記録した。
【０１３４】
ニワトリ赤血球で覆った顕微鏡スライド（スライド）を、このスライドを蒸留水で調製したＡＯの１ｍＭ溶液で満たした５０ｍｌビーカーの中に、約１０秒間置き（静置）、その後３回の連続した、蒸留水による１０秒間のリンスをし、そして室温で乾燥することによって染色した。使用しないときに、光退色をすることを避けるために全てのスライドを暗い中に格納するように配慮した。染色したスライドを乾燥し、その後ＣＡＦまたはアミノフィリン（ＡＭ）のいずれかの１００ｍＭ溶液の５０ｍｌに、指定時間で静置するように曝露した。キサンチン溶液への曝露の後、１０秒間の蒸留水によるリンスを３回行い、そしてスライドを暗い中で乾燥して、その後蛍光分析を行った。コントロールスライドは、（染色液なしの）蒸留水のみの中に置き、乾燥した赤血球で覆ったスライド、ＡＯ染色溶液の中に置き、その後乾燥してネガティブコントロールとして供給したブランクスライド（赤血球なし）、およびＡＯで細胞染色したが、蒸留水のみに曝露しキサンチン溶液には曝露していない、陽性コントロールとして供給したスライドからなる。染色した顕微鏡スライドは、ついでテープにより、プラスチックフレーム（アップサイドダウン９６−ウェルプレートカバー）に付着し、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　ＨＴＳ　７０００Ｂｉｏ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｄｅｒを用いて、λｅｘを４８５ｎｍ、λｅｍを５３０ｎｍとし、ゲインを４０に設定して、蛍光を決定した。ＡＯに対して曝露したブランクスライドと、蒸留水に曝露した、赤血球で覆ったスライドのどちらも、蛍光検出可能であった。
【０１３５】
これらのＤＮＡで覆ったスライドを、次いで、ニワトリ赤血球で覆ったスライドと同じキサンチン溶液洗浄液で処理した。ニワトリ赤血球について使用したのと同じＡＯ染色条件およびキサンチン曝露条件を使用した、これらのＤＮＡで覆ったスライドの検査は、赤血球核クロマチンで見られた同じ色の蛍光顕微鏡検査での変化を生じなかった。キサンチン処理後のこれらのＤＮＡで覆ったスライドのＡＯ溶液を用いた再染色によって、染色可能なＤＮＡがスライドにまだ残っていることを確認した。
【０１３６】
図４−３は、同一のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　多糸染色体の３つの顕微鏡写真を示す：ＤＮＡのマイナーグルーブへの結合剤であるヘキスト３３２５８色素（パネルＡ）による染色後、１５分間のＣＡＦによるリンス後（パネルＢ）、およびＣＡＦリンス後の染色体の存在の位相差の変化（パネルＣ）。表４−４は以下ＤＮＡインターカレータを、多糸染色体中のこれらの結合部位からの除去するためにカフェインおよびアミノフィリン（ＡＭ）を使用した実験からの結果をまとめる：ドキソルビシン、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、およびＤＮＡマイナーグルーブ結合剤ヘキスト３３２５８。この結果は、インターカレートしたＡＯをｄｓＤＮＡ多糸染色体から引抜くＣＡＦの能力またはＡＭの能力を示している。ＡＯは、ＡＭ洗浄によって、完全に除去されたようであるが、ＣＡＦ洗浄への曝露は、これらの実験条件下において染色体から染料を完全に除去しなかった。他のＤＮＡインターカレータを使用した試験は、アミノフィリンまたはカフェインのいずれかを使用して、これらのＤＮＡインターカレータを染色体バンドから除去し得ることを示す。ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤ヘキスト３３２５８色素を用いた結果は、明らかに、ＣＡＦまたはＡＭのいずれかを加えることによる、完全なヘキスト３３２５８の染色体からの除去を示す。ドキソルビシンは、カフェインと結合複合体を形成することが公知であり、ドキソルビシンはまた、ＣＡＦに対して曝露した場合に染色体から完全に除去されたように見える。しかし、ＡＭに対する曝露は、穏やかにドキソルビシンを染色体から除去した。最後に、エチジウムブロマイドのインターカレータとしての使用は、ＡＭがエチジウムブロマイド分子を染色体から除去する能力は、ＣＡＦに比べて非効率的であることを解明した。全てのＤＮＡインターカレータを用いて、染色体のバンドを染色することは、キサンチンリンスの前に激しく、そして再染色後においても激しい。
【０１３７】
表４−４：
１００ｍＭのアミノフィリンまたは１００ｍＭのカフェインにより１５分間洗浄処理、その後の蒸留水によるリンスによる、ＤＮＡインターカレータであるエチジウムブロマイド、ドキソルビシン、アクリジンオレンジ、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤ヘキスト３３２５８の、多糸染色体バンドからの除去
【０１３８】
【表４ｄ】
2004514741.tif 000011
蛍光顕微鏡を用いた実験に由来する観察物および結果を確かめるため、蛍光プレートリーダーを用いて、キサンチンカフェイン（ＣＡＦ）およびアミノフィリン（ＡＭ）を用いて、インターカレートしたＡＯのＤＮＡからの除去を定量することを行った。図４−４は、露出時間の長さ（混合または撹拌しない）と核クロマチンからのＡＯの除去におけるキサンチンのＫａｓｓｏｃ値の間の関連を示す。図４−４において示される例は、ＡＯ染色された（１０秒間　１ｍＭ　ＡＯ）ニワトリの赤血球を塗沫したスライドを静置し、１００ｍＭカフェイン（ＣＡＦ）（ｎ＝３）または１００ｍＭアミノフィリン水溶液（ＡＭ）（ｎ＝３）のいずれかを水溶液に晒す。蒸留水は、溶媒コントロール（ｎ＝８）として提供された。ＡＭおよびＣＡＦに対する蛍光の減少（λｅｘ４８５ｎｍ；λｅｍ５３０ｎｍ）は、指数関数的減衰モデル（Ｒ２ＣＡＦ＝０．９９８、Ｐ値（実施試験）＝０．９０；Ｒ２ＡＭ＝０．８７９、Ｐ値（実施試験）＝１．００）に有意に一致する１次減衰反応速度に従った。蛍光値の平均（コントロールの割合）対キサンチン溶液への露出時間のプロットは、ＣＡＦ（Ｒ２ＣＡＦ＝０．９９８）およびＡＭ（Ｒ２ＡＭ＝０．８７９）の両方に対する１次減衰モデルの式によく一致する。両方のキサンチン定数の濃度を保持することによって、これらの結果は、核クロマチンＤＮＡからのＡＯの除去が、キサンチンの質量作用およびＫａｓｓｏｃ値によって予測されるように、１次減衰反応速度に従い、そして露出時間に依存することを示す。
【０１３９】
酸に対する不安定性は、ＤＮＡの特性である。穏やかな酸化加水分解の下で、
ほとんどのプリン塩基は、非常に簡単にＤＮＡ分子から除去され、プリン塩基が結合していた部位に陽性のアルデヒド基の機能が生じる。この遊離されたアルデヒド基は、アルデヒド試薬に反応するはずである。選択的にプリン塩基を除去するフォイルゲンの方法の脱プリンの部分を用いて、ＡＯの相互作用に有用なＤＮＡポリマーにおける活性部位が除去される。リン酸骨格およびピリミジン塩基は、無傷で残され、そしてＡＯ分子のＤＮＡへの静電的結合をなお容易にし得る。
【０１４０】
（実施例９）
本発明の別の実施において、修飾キサンチンのＤＮＡインターカレータとの増大した結合活性によって、修飾キサンチンは、ＤＮＡインターカレータの阻害因子として用いられる。修飾キサンチンの使用は、非結合インターカレータに限らず、同様にポリヌクレオチドへの結合インターカレータに適用され得る。インターカレータ除去の程度は、インターカレータ分子に対するキサンチンの割合に関する。
【０１４１】
ニワトリの赤血球核クロマチンへのＡＯの相互作用を阻害するための増大したＫａｓｓｏｃ値を有するキサンチン能力においての、増大した露出時間および増大した相対的キサンチン濃度（キサンチンのＡＯに対する分子比）の影響は、核クロマチンへのＡＯ相互作用のブロッキングが、キサンチンのＡＯに対する分子比が増大することによって制御され得、そしてさらにより高いＫａｓｓｏｃ値を有するキサンチンが、より低いＫａｓｓｏｃ値を有するブロッキング効果を有するために、より低い分子比（ＡＯに対するキサンチン）を必要とする。ＡＯおよびキサンチンの間の相対的濃度（分子比）のブロッキング効果およびそれぞれのＫａｓｓｏｃ値は、ｄｓＤＮＡの露出時間によって相殺され得る。これは、ｄｓＤＮＡのＡＯとのより高いＫａｓｓｏｃ値（〜４０００Ｍ−１、ＬｙｌｅｓとＣａｍｅｒｏｎ、２０００）に基づいて予測された。
【０１４２】
露出時間および分子比を一定に保つことによって、核クロマチンのＡＯ染色の除去が、キサンチンのＫａｓｓｏｃ値に直接関連した。実験条件下においてＣＡＦが遷移状態にある時のＫａｓｓｏｃ値は、２５６Ｍ−１であって、表４−３に挙げられる。再染色される核クロマチンの能力は、ＡＯのｄｓＤＮＡへの結合が、動的平衡にあり、そして核ＤＮＡへのＡＯのインターカレーションが可逆的であることを、さらに示す。
【０１４３】
図４−４における定量の結果を蛍光顕微鏡を用いての観察で確かめられた。分子比（濃度）を一定に保つことによって、露出時間の影響は、定量的根拠に基づいて評価される。核クロマチンにおけるインターカレーション部位からのＡＯの除去は、ＣＡＦ（Ｋａｓｓｏｃ　２５６Ｍ−１）よりＡＭ（Ｋａｓｓｏｃ　５９６Ｍ−１）を用いた核クロマチンからのＡＯのより早い除去によく一致する、指数関数的減衰モデルによく一致する。
【０１４４】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ唾液腺多糸染色体を用いた実験は、染色体ＤＮＡ内の既知のＰＡＨ−ＤＮＡインターカレータの結合が可逆的であることを示す。異なるＰＡＨを除去するＣＡＦおよびＡＭの能力試験は、ＣＡＦおよびＡＭが核クロマチンにおいてｄｓＤＮＡからＰＡＨインターカレータを除去し得ることを示す。ＡＯに対してＫａｓｓｏｃ＞１５０Ｍ−１を有するキサンチンは、濃度依存性においてＡＯ分子を阻害し得て、核クロマチン内のインターカレータの阻害または一旦インターカレートした核クロマチンからＡＯを除去することのいずれかを生じる。既知のインターカレータの染色体ＤＮＡとの結合は可逆的である。ニワトリの赤血球核クロマチンおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ多糸染色体核クロマチンからのＡＯの解離の効果は、１）キサンチン濃度、２）ＡＯ濃度、３）ＡＯ−キサンチン複合体に対するＫａｓｓｏｃ値、および４）キサンチンへの露出時間に、依存することが見出された。
【０１４５】
この結果は、クロマチンにおける結合部位由来の平面のＰＡＨ−ＤＮＡインターカレータの阻害剤およびスカベンジャーとしてのＤＮＡインターカレータに対する相対的に高いＫａｓｓｏｃ値を有する、特定のメチル置換されたキサンチンの一般的役割を支持する。したがって、選択されたメチルキサンチンは、ジスムターゼとして提供され得る。この結果はまた、阻害分子（例えば、薬学動態学、薬物送達、および特定の平面の多環式芳香族発癌物質および抗新性物薬物による細胞毒性効果の減少におけるＣＡＦ）についての潜在的役割を示唆する。
【０１４６】
ＡＯとこれ自身およびＤＮＡとの相互作用は、恐らく非共有結合である。したがって、キサンチン、ＡＯ、およびｄｓＤＮＡは、動的平衡にあり、したがって、ｄｓＤＮＡ内のインターカレーションから阻害されるか、または一旦ｄｓＤＮＡにインターカレートしたものを除去し得る。
【０１４７】
本発明の適用は、試験された修飾キサンチンまたは使用される濃度に限定されない。本発明は、以下の広い範囲の修飾キサンチンに適用可能であるが、これらに限定されない；１−メチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、３，７−ジメチルキサンチン、１，７−ジメチルキサンチン、１，３，７−トリメチルキサンチン、１，３−ジメチルキサンチン、１，３−ジメチル−８−クロロキサンチン、および１，３，７，９−テトラメチル−８−オキシキサンチン。さらに、過剰量のキサンチンは、限定される必要なく表４−２に提供される。インターカレータに対するキサンチンの割合のバリエーションは、本発明の範囲に含まれる。さらにポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡ）は、一本鎖、二本鎖、またはそれより多い鎖状構造において使用される。さらに、阻害分子は、修飾キサンチンに限定されない。低い質量作用を通してＤＮＡインターカレータと結合する分子が、用いられ得る。例として、以下が含まれるが、これらに限定されない；プリン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびこれらの組み合わせ。さらに、本発明はまた、上に議論した様にインターカレータ分子の２量体形成を安定化する塩濃度を変化させることを含む。
【０１４８】
（実施例１０）
本発明は、他のＤＮＡインターカレータを標的にすることに適用される。例えば、ＣＡＦ−ＡＯモデルは、特定のＤＮＡインターカレータと複合体を形成するため平面の阻害分子を設計するために用いられる。例として、平面のアフラトキシン分子（多くの種子および子実に混在している強力なＤＮＡインターカレータ発癌物質の部類）を複合体を形成するために阻害分子を設計する。アフラトキシンは、特定の部位においてｄｓＤＮＡにインターカレートすることが既知であり、そして第３世界において肝癌の主な原因である。これらの分子を選択的に複合体形成する能力は、食材からこの分子を除くための洗浄として、または偶然の接食のための処置として、危険な影響を有意に減少させ得る。したがって、本発明の他の実施は、患者に入ったインターカレート（患者の口、鼻、目、耳、皮膚、肺、または肛門から入り得る）した分子を除くことである。
【０１４９】
本発明の１つの実施形態にしたがって、キサンチンまたは他の複合体因子は、食材からアフラトキシンを除くために使用され得る。３％重量の複合体因子を含むメチル置換キサンチンの水溶液は、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ　ｎｉｇｅｒ由来のアフラトキシンを混在する種子および子実に適用され、複合体因子に晒して、アフラトキシン混在量が顕著に減少した、非毒性の種子または子実が提供される。この方法は、アフラトキシンに限定されず、ヌクレオチド、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｏｒｉｎｓ）、キサンチン、プリン、尿酸、これらの単独または複合、モノマーまたはポリマーが含まれるがこれらに限定されず適用される。
【０１５０】
（実施例１１）
ドキソルビシンならびに他の抗新生物医薬の細胞傷害性副作用は、十分に文献で示されている。血流および非新生物細胞からドキソルビシンを除去するためのインターセプター分子の設計および使用は、ドキソルビシンおよび他の抗癌薬の反復使用からの極度の副作用を被る患者に有益であり得る。さらに、ドキソルビシンへの連続した曝露は、心筋毒性を引き起こす。従って、インターセプター分子との複合体化によって心筋細胞からドキソルビシンを除去する能力は、この有害な副作用を大きく減少させ得る。首尾良い抗癌療法に続くこれらの薬物の細胞間濃度を除去するかまたは減少させる能力は、他の非新生物細胞に対する連続した毒性を有意に減少させ得る。
【０１５１】
図５−２に示される実施形態は、カフェインがドキソルビシンと結合することを示す。図５−２は、増加する濃度のカフェインで滴定した１０μＭドキソルビシンの吸光度結合スペクトルを示す。従って、カフェインはドキソルビシンに結合する。別の実施において、ドキソルビシンは、図５−３に示されるように、クロロフィリン（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ）に結合し得る。図５−３の選択されたスペクトルは、滴定シリーズの重要な遷移を示す。普及したピーク（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ　ｐｅａｋ）は、４７５ｎｍおよび５００ｎｍのλａｂｓに生じた。これらのピークは、１０μＭおよびそれ以上の濃度のドキソルビシン濃度で見出される普及した吸収度ピークに対応する。吸収度は、複合体化が生じることを示す吸光度で決定的な赤方移動を示す。本発明は、カフェインまたはクロロフィリンに限定されず、限定しないが他のキサンチンおよびポルフィリンを含む。
【０１５２】
（実施例１２）
多くの抗新生物医薬の水溶性を増加するだけでなく、この分子の増加した細胞間濃度の促進剤として、キャリア分子としての選択されたキサンチンの使用は、新規な考えである。このようなキャリアから利益を得ることができる強力な抗新生物薬の良い例は、パクリタキセルであり、このパクリタキセルは、水中において非常に低い溶解度を有し、従って、プラスチックのチューブに付着し、溶液から自己沈殿する傾向がある。この平面的な薬物とインターセプター分子の複合体化は、その薬物の水溶性ならびにその輸送動力学を変化させる。理論的には、これは、この薬物の細胞間濃度を増加しながら、細胞内のＤＮＡに結合するこの抗癌薬の能力を妨害しない。これは、キャリア分子−薬物複合体が動的平衡であり、従って、この薬物が、薬物およびキャリア分子と薬物およびＤＮＡとの間のＫασσｏχ値の差に基づいて、ＤＮＡへのインターカレーションに利用可能であるという事実に起因する。
【０１５３】
この送達系は、組織、真核生物細胞または酵母または真菌への生物活性薬剤（特に、抗新生物剤）の局所的送達、経口的送達、腹腔内送達または静脈内送達のために使用され得る。キャリアは、プリンおよび／またはピリミジン、ならびに／あるいはキサンチンならびに／あるいは尿酸の単数あるいは全てまたは１つの改変との組み合わせのポリマーからなる。キャリアは、単鎖、二本鎖であり得るか、または複数鎖、ループ、架橋または他のこのような改変（キャリアの二次構造、三次構造、四次構造を変更し得る）を含み得る。キャリアは、プリン、ピリミジン、キサンチン、または尿酸の基本構造の周りのＲ基置換を含み得る。Ｒ基置換は、Ｎ−１位、Ｎ−３位、Ｎ−７位、Ｎ−９位で与えられ得、電気供与性基、電気求引性基、電気陰性基、電気陽性基、親水性基、疎水性基、有機または無機化学基が挙げられ得る。さらに、置換は、Ｃ−２位、Ｃ−４位、またはＣ−８位で起こり得る。
【０１５４】
別の実施例において、プリン、ピリミジン、キサンチンまたは尿酸のモノマーまたはポリマーを、ＤＮＡまたはＤＮＡ様化合物を使用して、不溶性生物活性薬剤の送達のため、あるいは生物活性薬剤の可溶化のために使用し得る。
【０１５５】
抗新生物薬は、種々の癌の処置に有用であることが公知である。抗新生物剤の代表的な性質は、水中での低い溶解度である。この性質は、ヒトまたは他の動物患者への投与に適した処方物を作製するときに、困難にする。一般に、低濃度の界面活性剤、オイル、リポソーム、または他の可溶化手段が使用される。
【０１５６】
タキソール（パクリタキセル）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ　Ｃｏｍｐａｎｙによって、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ（ポリエチル化ヒマシ油）および脱水アルコール中の混合物として供給される。パクリタキセル６ｍｇ毎につき、５２７ｍｇのオイルおよび４９．７％のアルコールが使用される。バイアルは、液体５ｍＬ中３０ｍｇ、１６．７ｍＬ中１００ｍｇ、および５０ｍＬ中３００ｍｇ（全て６ｍｇ／ｍＬ）で供給される。
【０１５７】
ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）（酒石酸ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）を、切除不能な進行した非小細胞肺癌を患う外来の患者の最初のラインの処置のために、単独の薬剤としてまたはシスプラチンと組み合わせて使用する。これは、保存剤も添加剤も含まない、水１ｍＬ中１０ｍｇで、Ｇｌａｘｏ　Ｗｅｌｌｃｏｍｅによって供給される。
【０１５８】
理想的には、患者に対して外因性の非ネイティブな物質の導入なしに高い可溶性を生じる抗新生物薬の可溶化のための方法が、利用可能である。従って、抗新生物薬についての新規な投与方法の必要性がある。
【０１５９】
核酸は、患者への抗新生物剤の送達に効果的なキャリア薬剤であることが分かっている。核酸−抗新生物剤組成物は、代表的な水不溶性薬物の溶解度および臨床的適用を改善する。
【０１６０】
核酸は、患者への抗新生物剤の送達を助けるのに効果的なキャリア薬剤であることが見出されている。１つ以上の抗新生薬剤および核酸を含む組成物が形成される。次いで、この組成物は、患者に投与される。核酸が患者内で分解するので、抗新生物剤はより利用可能になる。
【０１６１】
一般的に、任意の抗新生物剤が本発明と組み合わせて使用され得る。核酸に結合し、そして水に低いかまたは無視し得る溶解度を有する抗新生物剤が特に魅力的である。このような状況において、核酸は、可溶化剤として役立つ。得られる組成物は、核酸を欠く類似の組成物よりも高い濃度の抗新生物剤を有し得る。抗真生物剤の例としては、ＴＡＸＯＬ（パクリタキセル、ＴＡＸＯＬは、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ　Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標である）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（ドキソルビシン塩酸塩、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　＆　Ｕｐｊｏｈｎの登録商標である）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥは、Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標である）、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（酒石酸ビノレルビン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥは、登録商標である）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（ドセタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥは、Ａｖｅｎｔｉｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの登録商標である）が挙げられる。さらなる化学療法薬物としては、アクチノマイシンＤ、アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、マイトマイシン、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモゾロミド（Ｔａｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、チオグアニン、チオテパ、トムデックス（Ｔｏｍｕｄｅｘ）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレブリンが挙げられる。これらの化合物の大部分がある程度水中に可溶であるが、ＤＮＡの添加は、インターカレーションまたは静電引力またはその両方によって結合した否かに関わらず、生物学的活性薬剤または薬物の溶解度および構造的安定性を有意に増強する。
【０１６２】
抗新生物剤の文脈で記載したが、核酸は、核酸に結合するかまたは核酸と複合体化する薬物の低い水溶解度の溶解度を改善するために改善するために使用され得る。
【０１６３】
核酸は、一般的に、任意の核酸であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または他の合成核酸であり得る。好ましくは、核酸は、ＤＮＡである。核酸は、単鎖または二本鎖であり得、好ましくは、二本鎖である。核酸は、一般的に任意の大きさである。核酸は、少なくとも約４ｂｐ（または塩基）、８ｂｐ、１０ｂｐ、１２ｂｐ、１４ｂｐ、１６ｂｐ、１８ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、１ｍｂ、または複数ｍｂであり得る。溶解性を増加させるためにより長い核酸が望ましいが、より短い核酸が、容易な調製および患者での分解に望ましくあり得る。核酸は、化学的に修飾され得る。核酸は、アレイのサイズの混合物（例えば、サケ精巣またはウシ胸腺のような天然供給源から単離された核酸）であり得る。
【０１６４】
組成物は、緩衝液、矯味矯臭薬、糖、薬物、グリセロール、安定化剤、酸化防止剤、または任意の他の薬学的に受容可能な物質を含み得る。
【０１６５】
本発明の組成物の抗新生物剤の溶解度は、好ましくは、核酸を欠く同じ組成物の少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、または１０００倍である。
【０１６６】
患者は、哺乳動物、トリ、サカナ、または両生類動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、フェレット、ウマ、ウシ、ブタ、またはヤギであり得る。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０１６７】
抗腫瘍剤−核酸組成物は、任意の薬学的または医学的に受容可能な方法で患者に投与され得る。例えば、この組成物は、経口、局所、経皮的に、ＩＶにより、吸入により、ＩＰ注入により、ＩＭ注入により、エレクトロポレーションにより、またはリポソームにより送達され得る。
【０１６８】
例として、抗腫瘍剤のドキソルビシンまたはパシタキソール（ｐａｓｉｔａｘｏｌ）を、第１に、１：１のモル比の１０マーからなるオリゴヌクレオチドまたはより具体的には、５０％の結合曲線（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ）以上の量を含む、水性ＬＶ溶液に溶解させ、一方で、このオリゴヌクレオチドは、二重螺旋において、ポリアデノシン−チミジンである。
【０１６９】
質量作用の法則が、以下の式に従って、インターセプター（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ）化合物またはキャリア化合物の必要とされる濃度を決定するために、利用され得る。
【０１７０】
式Ｉ：［Ｘ］＝Ｋａｓｓｏｃ［Ｙ］／（１＋Ｋａｓｓｏｃ［Ｙ］）
または
式ＩＩ：［Ｚ］＝Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］／（１＋Ｋａｓｓｏｃ［Ｘ］）＊１００。
【０１７１】
ここで、Ｋａｓｓｏｃは、複合体化されるべき化合物または生物活性剤に対する、インターセプター剤または複合体化剤の結合親和性であり；［Ｘ］は、インターセプター剤または複合体化剤の活性部位の濃度または量であり；［Ｙ］は、複合体化されるべき薬剤の活性部位の濃度または量であり；そして［Ｚ］は、結合無から無限の結合もしくは完全な結合までの結合曲線の割合である。好ましくは、［Ｚ］は、０．１と９９との間の値を有し、そしてより好ましくは、［Ｚ］は、４０と９９との間であるべきであり、そしてさらにより好ましくは、［Ｚ］は、５０以上であるべきである。理想的には、複合体化剤または結合剤の濃度は、結合剤の溶解度およびこの結合剤の毒性を最も大きな可能な範囲と考えられるまで、結合曲線の飽和に到達させるべきである。
【０１７２】
本発明の別の実施形態において、他の分子がキャリアとして使用され得る。例えば、キサンチンおよびクロロフィリンは、実施例１２に例示されるように、ドキソルビシンに対して結合親和性を示すことが示されている。
【０１７３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証することを含む。表している技術に従う実施例に開示される技術は、本発明の実施の際に良好に機能するように本発明者によって発明され、従って、実施のための好ましい形態を構築すると考えられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示に照らし合わせて、多くの改変が、開示される特定の実施形態において成され得ること、および本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果がさらに得られることを理解する。
【０１７４】
（実施例１３）
ヒトに曝露する前に、これらのＰＡＨと共に複合体化するために特定化されたキサンチンの使用は、予防様式としての利点を提供する。例えば、ＰＡＨ（例えば、ベンゾ（ベンザ）ピレンおよびジメチルベンズアントラセン）の環境曝露からの潜在的に危険な効果は、ＰＡＨが、特定のＰＡＨの対して高いＫａｓｓｏｃ値を有するキサンチンに対して第１に曝露される場合に、顕著に減少され得る。例えば、種々の発癌物質ＰＡＨに対して職業的に曝露される煙突掃除は、これらの発癌物質への曝露の危険性を顕著に減少させ得る。清掃の前に煙突の壁に選択されたキサンチンを添加することによって、これらのＰＡＨへの曝露からの生物学的災害を減少させ得る。さらに、プラナー発癌物質への曝露に曝される多くの機会は、曝露される前の予防処置またはさらなる曝露に続く治療処置のいずれかに対して利点を有し得る。
【０１７５】
１実施形態において、複合体化剤または結合剤の有効量を含む溶液が、ヒトの皮膚に適用され得る。この溶液は、液体またはゲルであり得る。例えば、ｄｓＤＮＡの３％の溶液は、煙突掃除者の皮膚に塗布され、生物学的活性剤および発癌物質への曝露を防止するか、または皮膚癌の予防のための処置として曝露後に塗布される。
【０１７６】
１つの実施において、改変されたキサンチンまたはポルフィリンは、ＰＡＨの内受容器として使用され得る。この内受容器は、患者においてＰＡＨと結合したＤＮＡ領域に送達されることのみ必要とする。一旦、内受容器をモル過剰のインターカレータ分子に送達し得、質量作用の法則により、この反応を駆動し、インターカレータのＤＮＡへの結合が減少する。
【０１７７】
（実施例１４）
ＤＮＡコーティングからなるタバコ充填物質が、一次喫煙および二次喫煙の両方において、ＰＡＨを除去するための良好なビヒクルである。活性なＤＮＡ表面を含むタバコフィルターは、ポリ芳香族炭水化物だけでなく、ＤＮＡと相互作用することが公知である他の毒性化合物もまた抽出し得る。本発明の１つの実施において、タバコフィルターは、ｄｓＤＮＡ物質から構成される。煙がフィルタ中のＤＮＡを通過する際に、とりわけ、ＰＡＨが、ＤＮＡに結合する。
【０１７８】
（実施例１５）
本発明の別の実施形態は、ＤＮＡから結合したインターカレートされた色素を除去するための方法である。例えばＡＯのような多くのインターカレータは、ＤＮＡに結合されるインターカレータを検出するために使用され得る蛍光標識を有する。選択した化合物（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、または同様の分子）への１以上の特定の色素または化合物の添加は、この基質に対する特異的な結合親和性Ｋａｓｓｏｃを有する。一旦、基質に結合すると、色素に対して既知の親和性（すなわち、Ｋａｓｓｏｃ）を有する１以上の化合物を含む溶液が、静的懸濁液もしくは動的懸濁液のいずれか中の基質に添加されるか、洗浄、リンス、または他の手段であり得、結合化合物により、質量作用の法則に従う様式で色素もしくは化合物を除去、抽出、もしくはマスクし得、そして抽出化合物と抽出されるべき化合物との間のＫａｓｓｏｃに関連して、一般的な結合親和性と特定の結合親和性との間のモル比および／またはＫａｓｓｏｃの範囲が決定され、そして特定および／または一般的な決定（ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が、活性部位、遺伝子構造、化学的組成、二次構造、三次構造、および四次構造ならびに種々の他の問題に関して成され得る。
【０１７９】
インターセプター分子は、とりわけ、プリン、キサンチン、ピリミジン、尿酸、ポルフィリン、およびポリヌクレオチド、ならびにそれらのポリマーおよび混合物から選択され得る。このポリヌクレオチドは、好ましくは、二重鎖ＤＮＡである。培地中でのＤＮＡの濃度は、０．００１％と１０％（ｗｔ／ｗｔ）との間であるべきである。
【０１８０】
（実施例１６）
本発明の別の実施形態は、スクリーニングデバイスまたは診断デバイスである。診断またはスクリーニング研究において、インターセプター分子または複合体化分子が、ゲルまたは他の固体状態の形態で化学的または物理学的に配置され、十分な結合親和性を有する生物学的に活性な化合物を優先的に抽出するために、これらを固定化して、選択した生理活性薬剤を含む溶液または気体の流れを、濃縮させるかまたはこの媒体から抽出され得る。
【０１８１】
さらに、定常形態または静的形態で一旦複合体化されると、選択された生理活性薬剤は、薬剤を複合体化させる有効な量を含む溶液または気体にさらにさらすことによって結合親和性に基づいて優先的に抽出され得、Ｋａｓｓｏｃ−濃度に依存した様式で、静的または固体状態の系からこの生理活性薬剤を除去する。
【０１８２】
本明細書中で開示され、そして特許請求される組成物および／または方法の全ては、本発明の開示に照らし合わせて、過度の実験をすることなく達成および遂行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態において記載されているが、本発明の観念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および／または方法、ならびに方法の工程もしくは一連の工程に適用され得る。さらに詳細には、化学的および物理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤と置換され得るが、同一または類似の結果が達成されることは、明らかである。このような類似の置換および改変の全ては、本発明の精神、範囲および観念内であることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１ａ（図１−１）は、代表例の平面の多核芳香族炭化水素の化学構造を示す。
【図１ｂ】
図１ｂ（図１−２）は、選択されたキサンチン化合物の化学構造を図示する。
【図１ｃ】
図１ｃ（図１−３）は、ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９６０、１９６１によって提唱されるような多芳香族炭化水素ピレンおよびキサンチン１，３，７，９−テトラメチル尿酸の分子スタッキング複合体についてのモデルである。
【図２ａ】
図２ａ（図２−１）は、ＤＮＡインターカレータのアクリジンオレンジおよびＡＯと複合体を形成することを見出された選択的キサンチンの構造図（ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｄｉａｇｒａｍ）を図示する。
【図２ｂ】
図２ｂ（図２−２）は、テオフィリン−ＡＯ複合体についてのスペクトル分析およびＫａｓｓｏｃ測定である。
【図２ｃ】
図２ｃ（図２−３）は、アクリジンオレンジを用いたクロロフィリンの一連の滴定から得られた光学吸収スペクトルである。
【図２ｄ】
図２ｄ（図２−４）は、キサンチンとアクリジンオレンジとの複合体中の本来の結合電子状態および非結合電子状態の共鳴から生じる位置エネルギー曲線を示す。
【図３ａ】
図３ａ（図３−１）は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下および非存在下での種々の濃度のアクリジンオレンジの光学吸収スペクトルのプロットである。
【図３ｂ】
図３ｂ（図３−２）は、１５０ｍＭのＮａＣｌの非存在下および存在下での０．５μＭ〜１０．０μＭの範囲の濃度のアクリジンオレンジの分光蛍光分析のプロットである。
【図３ｃ】
図３ｃ（図３−３）は、カフェインで滴定されたアクリジンオレンジの光学吸収スペクトルを示す。
【図３ｄ】
図３ｄ（図３−４）は、カフェインで滴定された３μＭのアクリジンオレンジの光学結合吸収スペクトルである。
【図３ｅ】
図３ｅ（図３−５）は、アクリジンオレンジの蛍光およびアクリジンオレンジ−カフェイン複合体の形成における、カフェインおよびＮａＣｌの影響を示す。
【図３ｆ】
図３ｆ（図３−６）は、異なる濃度のｄｓＤＮＡを用いた３μＭのアクリジンオレンジの一連の滴定から得られた光学吸収スペクトルである。
【図３ｇ】
図３ｇ（図３−７）は、３０μＭ〜１７０μＭの範囲の濃度のニシン精子ｄｓＤＮＡを用いて滴定された３μＭのＡＯのΔ吸光度プロットを示す。
【図３ｈ】
図３ｈ（図３−８）は、ＮａＣｌ［１５０ｍＭ］の存在下または非存在下での種々の濃度のｄｓＤＮＡを用いたアクリジンオレンジ［２μＭ］の分光蛍光分析のプロットである。
【図３ｉ】
図３ｉ（図３−９）は、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下または非存在下での、０．５μＭ〜１０．０μＭの範囲の濃度のアクリジンオレンジ存在下での２０μＭのｄｓＤＮＡの分光蛍光分析のプロットである。
【図３ｊ】
図３ｊ（図３−１０）は、２μＭおよび２０μＭの濃度でのアクリジンオレンジ単量体および二量体の相対的集団、ならびにアクリジンオレンジの単量体の個々のカフェイン分子への結合を示す概略図である。
【図４ａ】
図４ａ（図４−１）は、多芳香族ｄｓＤＮＡ結合因子の化学的構造の例を図示する。
【図４ｂ】
図４ｂ（図４−２）は、核のクロマチンの微分蛍光色を示すために１０ｍＭのアクリジンオレンジの２回の曝露で染色したニワトリ赤血球塗沫標本の顕微鏡写真である。
【図４ｃ】
図４ｃ（図４−３）は、ＤＮＡ副溝（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）結合剤Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ唾液腺多糸染色体の染色、それに続く１５分間の１００ｍＭのカフェインへの曝露による除去を示す顕微鏡写真である。
【図４ｄ】
図４ｄ（図４−４）は、水、カフェイン、およびアミノフィリンで種々の時間にわたってリンスしたアクリジンオレンジ染色されたニワトリ赤血球の蛍光強度の変化を示す。
【図５ａ】
図５ａ（図５−１）は、分極化結合複合体内でのカフェインおよびアクリジンオレンジの配向を示す概略図である（Ｌａｒｓｅｎら、１９９６より）。
【図５ｂ】
図５ｂ（図５−２）は、種々の濃度のカフェインを用いて滴定したドキソルビシンの吸収結合スペクトルをプロットする。
【図５ｃ】
図５ｃ（図５−３）は、種々の濃度のクロロフィリンを用いたドキソルビシンの一連の滴定から得られた光学吸収スペクトルを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図３ｊ】
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【図４ｄ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514741.tif 000129
2004514741.tif 000130
【国際調査報告】
2004514741.tif 000131
2004514741.tif 000132
2004514741.tif 000133
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