(57)【要約】本発明は、核酸分子を共有結合で連結する組成物、方法、およびキットを提供する。この方法は、鎖の侵入段階を含み、また組成物およびキットは、このような方法を実施する際に有用である。例えば２本鎖（ｄｓ）の核酸分子を共有結合で連結する方法は、一方の３’端に連結された状態のトポイソメラーゼを有し、また同じ末端に１本鎖の５’突出を有する第一のｄｓ核酸分子を、５’突出が第二の核酸分子の平滑末端の相補配列にハイブリダイズ可能で、またトポイソメラーゼがｄｓ核酸分子を共有結合で連結することが可能なように、平滑末端を有する第二のｄｓ核酸分子に接触させる段階を含むことができる。この方法は、核酸配列を共有結合で連結する従来の方法に比べて、より単純かつ効率的であり、また組成物およびキットは、２個もしくはそれ以上のｄｓ核酸分子を方向的に連結する方法を含む本方法の実施を容易にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法であって、
第一の５’突出に相補的なヌクレオチド配列が、第一の５’突出と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、
ａ）第一の末端またはその近傍において共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼ、第二の末端またはその近傍において共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含む、トポイソメラーゼをチャージした第一の２本鎖（ｄｓ）核酸分子（第一の末端が第一の５’突出をさらに含み、第二の末端が、平滑末端、３’チミジン突出、または第二の５’突出をさらに含む）；および
ｂ）第一の平滑末端および第二の末端を含む第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端がその５’端に第一の５’突出に相補的なヌクレオチド配列を含む）
を接触させる段階を含み、
それによって第一のトポイソメラーゼが、共有結合によって、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に連結させ、
第二のトポイソメラーゼが、共有結合によって、第一の核酸分子の第二の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端に連結することで、方向的に連結された核酸を作製する方法。
【請求項２】
第一のｄｓ核酸分子の第二の末端が平滑末端を含み、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端が平滑末端を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子の第二の末端が３’チミジン突出を含み、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端が３’アデノシン突出を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子が、第二の末端における第二の５’突出、および第二の末端において第二の５’突出に相補的なヌクレオチド配列を含む第二のｄｓ核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第一のｄｓ核酸分子がベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子がクローニングベクターである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子が発現ベクターである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
方向的に連結された組換え核酸分子を細胞に導入する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
細胞が真核細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が哺乳類細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項８記載の方法で作製される細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞から作製されるトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項１３】
細胞が細菌である、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
第二のｄｓ核酸分子が増幅産物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
トポイソメラーゼがＩＢ型トポイソメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
第二のｄｓ核酸分子が、複数の第二のｄｓ核酸分子のうちの一つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
複数の第二のｄｓ核酸分子が相互に異なる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
複数の第二のｄｓヌクレオチド分子がｃＤＮＡライブラリーを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
複数の第二のｄｓヌクレオチド分子がコンビナトリアルライブラリーを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
請求項１記載の方法で作製される組換え核酸分子。
【請求項２１】
方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法であって、トポイソメラーゼ活性を可能とする条件、および第一の５’標的配列と、標的配列に相補的なヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションにより、方向的に連結された組換え核酸分子を作製を可能とする条件下で、
ａ）５’端に第一の５’標的配列を含み、３’端にトポイソメラーゼ認識部位を含む、第一の末端を含む第一の前駆体２本鎖（ｄｓ）核酸分子；および３’端にトポイソメラーゼ認識部位を含む第二の末端；
ｂ）第一の平滑末端および第二の末端を含む第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端が５’端に、５’標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む）；ならびに
ｃ）トポイソメラーゼ認識部位に特異的なトポイソメラーゼ
を接触させる段階を含む方法。
【請求項２２】
第一の前駆体ｄｓ核酸の第二の末端がトポイソメラーゼで切断されることで平滑末端となり、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端が平滑末端である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端がトポイソメラーゼで切断されることで３’チミジン延長を含み、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端が、３’アデノシン突出を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子が、第二の末端に位置する第二の５’標的配列を含み、第二のｄｓ核酸分子が第二の末端において、第二の５’標的配列に相補的な核酸配列を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子がベクターである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが発現ベクターである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
方向的に連結された組換え核酸分子を細胞に導入する段階をさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子が発現制御領域を含み、第二のｄｓ核酸分子が読み枠を含み、方向的に連結された組換え核酸分子内に、発現制御領域が使用可能に読み枠に連結される、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
第二のｄｓ核酸分子が増幅産物を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
トポイソメラーゼがＩＢ型トポイソメラーゼである、請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
第二のｄｓ核酸分子が、複数の第二のｄｓ核酸分子のうちの一つを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
複数の第二のｄｓヌクレオチド分子がｃＤＮＡライブラリーを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
請求項２１記載の方法で作製される組換え核酸分子。
【請求項３４】
方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法であって、
第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第一の５’突出に選択的にハイブリダイズ可能な条件下で、
ａ）２本鎖（ｄｓ）核酸分子の第一の末端の３’端に共有結合で連結された第一のトポイソメラーゼを含み、第一の末端が第一の５’突出をさらに含む、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子；および
ｂ）第一の平滑末端および第二の末端を含む第二の核酸分子（第一の平滑末端が、第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む）
を接触させる段階を含み、それによって第一のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に共有結合で連結することができる方法。
【請求項３５】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子と、第三のｄｓ核酸分子を有する第二のｄｓ核酸分子を接触させる段階をさらに含み、
第三のｄｓ核酸分子の第一の末端が、５’突出および共有結合で３’端に結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含み、
第二のｄｓ核酸分子が、第二の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む第二の平滑末端をさらに含み、ならびに
接触させる段階が、第二のｄｓ核酸の第二の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’突出と選択的にハイブリダイズ可能な条件下で実施され、
それによって、第二のトポイソメラーゼが、第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第二の平滑末端の５’端に共有結合で連結可能である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
第一のｄｓ核酸分子が第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結され、その後、第三のｄｓ核酸分子が第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
第一のｄｓ核酸分子が、第二のｄｓ核酸分子に使用可能に連結される、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
第一のｄｓ核酸が発現制御領域を含み、第二のｄｓ核酸が読み枠を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
第一のｄｓ核酸分子が発現制御領域を含み、第二のｄｓ核酸分子が読み枠を含み、第三のｄｓ核酸分子がペプチドをコードし、
方向的に連結された組換え核酸分子内において、発現制御領域が読み枠に使用可能に連結され、第二のｄｓ核酸分子が第三のｄｓ核酸分子に使用可能に連結され、ならびに、
第二のｄｓ核酸分子が第三のｄｓ核酸分子に使用可能に連結されて、読み枠およびペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
ペプチドがタグを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
第一の末端の３’端に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼ、および第二の末端の３’端に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼ（第一の末端が第一の５’突出をさらに含み、第二の末端が平滑末端、３’チミジン突出、または第二の５’突出をさらに含み、第一の５’突出と第二の突出が異なる）を含む、単離された２本鎖（ｄｓ）核酸分子。
【請求項４２】
第二の末端が平滑末端を含む、請求項４１記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４３】
第二の末端が１か所の３’チミジン突出を含む、請求項４１記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４４】
第二の末端が第二の５’突出を含む、請求項４１記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４５】
第一の５’突出がヌクレオチド配列５’−ＧＧＴＧ−３’を含む、請求項４１記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４６】
ｄｓ核酸分子がベクターである、請求項４１記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４７】
ベクターがリコンビナーゼ部位をさらに含む、請求項４６記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４８】
ベクターがｌｏｘ部位をさらに含む、請求項４７記載のｄｓ核酸分子。
【請求項４９】
ｄｓ核酸分子がクローニングベクターである、請求項４６記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５０】
ｄｓ核酸分子が発現ベクターである、請求項４９記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５１】
第一の末端および第二の末端が、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の隣接配列である、請求項４８記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５２】
ベクターがｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡベクター（配列番号：１６）である、請求項４６記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５３】
第一の末端の５’突出が５’−ＧＧＴＧ−３’を含み、第二の末端が３’端にトポイソメラーゼ認識部位を含む平滑末端である、請求項５２記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５４】
ベクターがｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターである、請求項４６記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５５】
第一の末端の５’突出が５’−ＧＡＡＴ−３’を含み、第二の末端が３’端にトポイソメラーゼ認識部位を含む平滑末端である、請求項５４記載のｄｓ核酸分子。
【請求項５６】
以下を含む組成物：
ａ）第一の末端および第二の末端を含む第一のｄｓ核酸分子（第一の末端が５’突出、および３’端に共有結合で結合されたトポイソメラーゼを含む）、および
ｂ）第一の平滑末端および第二の末端を含む第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端が、第一の５’突出に相補的な第一の５’ヌクレオチド配列、および第一の５’ヌクレオチド配列に相補的な第一の３’ヌクレオチド配列を含む）。
【請求項５７】
第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の５’ヌクレオチド配列が、第一の核酸分子の第一の末端の第一の５’突出とハイブリダイズし、第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の３’ヌクレオチド配列が置換される、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
第一のｄｓ核酸分子が、第二の末端において第二の５’突出をさらに含み、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端が、第二の５’突出に相補的な第二の５’ヌクレオチド配列、および第二の５’ヌクレオチド配列に相補的な第二の３’ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５６記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１記載のｄｓ核酸分子を含むキット。
【請求項６０】
核酸分子がベクターである、請求項５９記載のキット。
【請求項６１】
発現制御領域をさらに含む、請求項５９記載のキット。
【請求項６２】
以下を含むキット：
ａ）第一の末端の３’端に共有結合で結合された第一のトポイソメラーゼ、および第二の末端の３’端に共有結合で結合された第二のトポイソメラーゼを含み、
第一の末端が、第一の５’突出をさらに含み、第二の末端が、平滑末端、３’チミジン突出、または第二の５’突出をさらに含み、第一の５’突出が第二の５’突出とは異なる、第一の２本鎖（ｄｓ）核酸分子；および
ｂ）複数の各ｄｓ核酸分子が第一の平滑末端を含み、第一の平滑末端が第一のｄｓ核酸分子の第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む、複数の第二のｄｓ核酸分子。
【請求項６３】
複数の第二のｄｓ核酸分子が、転写調節領域、翻訳調節領域、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
複数の第二のｄｓ核酸分子が、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、方向的または非方向的に核酸分子を連結する段階を含み、組換え核酸分子の構築を容易にする組成物および方法、より具体的には、方向的もしくは非方向的に核酸分子連結する段階を含む、２個またはそれ以上の核酸分子を共有結合で結合する段階に有用な組成物、および共有結合で連結されたこのような組換え核酸分子を作製する方法に関する。
【０００２】
背景情報
遺伝子配列および読み枠を含む多数のヌクレオチド配列をクローニングすることができれば、遺伝子発現、およびその調節に関する大量の情報が得られる。また、このような配列は、疾患条件の原因を理解する上で有用な場合があり、理想的には、疾患の診断および治療の手段を提供しうる。しかし、発現された多数のヌクレオチド配列をクローニングすることは比較的単純な操作であるが、例えば、このような配列の発現にかかわる調節領域の特性解析を行うこと、またこのような配列にコードされたポリペプチドを発現させることはやや困難である。特に核酸分子とクローニング用の核酸分子を連結して、機能性の組換え核酸分子となるような核酸分子をクローニングする改善された方法が求められている。特に所定の方向に挿入配列がベクターにクローニングされたり、または１個もしくは複数の他の核酸分子を連結されたりすることが可能な、方向的クローニング法が求められている。
【０００３】
トポイソメラーゼの使用は、クローニングおよび連結の方法を改善する上で簡便な手段となる。例えばトポイソメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のベクターへの迅速な連結を行うことで、煩雑な従来のクローニング法を、５分間で完了する手順に切りつめることができる。したがってトポイソメラーゼは、高スループットのクローニングへの応用に特に有用である。しかし読み枠（ＯＲＦ）をゲノムスケールの分子クローニング手段で発現させることが現在求められているので、２種またはそれ以上の核酸分子の連結方向を、発現可能なクローニングされた核酸分子などの機能性の組換え核酸分子が調製可能なように、より適切に制御することが求められている。
【０００４】
クローニングされたＯＲＦの発現には、ＰＣＲ産物がベクターに正しい方向で挿入されて、ベクター上に位置する機能性の発現ドメインと合わせて作用することが求められる。トポイソメラーゼを利用したクローニング分野の現状では、ＯＲＦが、さまざまなＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲで増幅される。校正機能がなく、固有の末端トランスフェラーゼ活性があるＴａｑなどのポリメラーゼが一般に使用されており、鋳型に由来しない一つの３’ Ａ突出を各末端に含むＰＣＲ産物が得られている。このような増幅産物は、一つの３’ Ｔ突出を各末端に含む、トポイソメラーゼで修飾したベクターに効率的にクローニングすることができる（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標） Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。これとは対照的に、固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性があるｐｆｕなどのポリメラーゼでは、平滑末端化されたＰＣＲ産物が得られる。平滑末端を含む、トポイソメラーゼで修飾したベクターは、校正機能をもつポリメラーゼで作製されたＰＣＲ産物のクローニングに利用することができる（Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（登録商標） ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＰＣＲ産物およびトポイソメラーゼで修飾された適切なベクターをインキュベートすることで連結が５分間で完了する。しかし、このクローニング法で得られる挿入配列の方向はランダムである。
【０００５】
トポイソメラーゼで修飾したクローニングベクターへＤＮＡ断片の挿入方向はランダムなので、使用者はスクリーニングを行うことで、挿入方向が適切なクローンを同定しなければならない。挿入配列の方向は、例えば制限酵素による解析、ベクターにコードされたプロモーター領域からのインビトロ転写、および例えば、挿入配列に特異的な１本のプライマーとベクターに特異的な１本のプライマーを用いたＰＣＲ、を含むさまざまな方法で決定することができる。しかし明らかなように、挿入配列の方向を決定する際の要件には、時間的な投資が必要であり、対象核酸分子を同定するためのコストが実質的に増えるおそれが、特に高スループットのクローニング法を用いる場合にはある。したがって複数の理由から、現在のクローニング法、特に高スループットの遺伝子発現の解析には大きな制限がある。なぜなら、正しい方向の挿入配列をもつクローンを選択するためには、数多くの煩雑な段階を実施しなければならないためであり、各クローンについて８個程度のスクリーニングを行うことで適切な方向を有するクローンを同定する必要があるからである。したがって、２個またはそれ以上の核酸分子を一定の方向に共有結合で連結するために有用な方法および試薬が求められている。本発明は、このようなニーズを満たし、他の利点を提供する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、２種またはそれ以上のｄｓ核酸分子を方向的または非方向的に連結する段階を含む、２種またはそれ以上（例えば２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種など）の２本鎖（「ｄｓ」）核酸分子を共有結合で連結するための組成物および方法を提供する。本発明に使用される核酸分子は、好ましくは、第一の末端および第二の末端を含む。このような分子の第一の末端、および／または第二の末端は、好ましくは、５’および／または３’の延長すなわち突出を有する。したがって、本発明に使用される核酸分子の一端または両端は、３’および／または５’の突出を有する場合がある。突出配列は、分子の両端において、配列が同じ場合もあれば異なる場合もあり、また種類が同じ場合もあれば異なる場合もある（例えば３’または５’の突出）。また、核酸分子の一端が３’の延長または５’の延長を有する場合がある一方で、分子の別の末端が延長を有する場合があるが、必ずしも有するとは限らない。いくつかの局面では、核酸分子の一端は、３’突出または５’突出を含む場合があるが、別の末端は平滑末端化されている場合がある（突出がない）。本発明では、任意の末端における３’および／または５’の延長配列（突出）の長さは任意の数（任意の数のヌクレオチド）である場合があり、また任意の配列を有する場合がある。したがって本発明は、１か所または複数のヌクレオチドの突出を有する核酸分子に関する。いくつかの局面では、核酸分子およびその末端は、修飾されたヌクレオチド、または標識されたヌクレオチドを含む場合がある。本発明の用途においては、核酸分子を融合もしくは結合または連結することが可能な酵素もしくはタンパク質を使用することができる。したがって、同じ場合もあれば異なる場合もある２個またはそれ以上の核酸分子を、このような酵素を用いて方向的に結合することができる。このような酵素またはタンパク質は、トポイソメラーゼ（ＩＡ型、ＩＢ型、ＩＩ型などを含む）、リコンビナーゼタンパク質（ＦＬＩＰリコンビナーゼ、Ｉｎｔインテグラーゼ、ｃｒｅリコンビナーゼなどを含む）、およびリガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどを含む）を含むがこれらに限定されない。
【０００７】
本発明の方法では、第一の核酸分子の一端の３’または５’の突出は、少なくとも第二の核酸分子の末端またはその近傍において、少なくとも一つの配列に相同性を有する（または相補的である）場合がある。したがって、３’もしくは５’の突出または延長と、第二の分子上の相同性のある鎖、または相補鎖との塩基対合、またはハイブリダイゼーションにより、本発明は、２種の異なる分子の方向性または非方向性の会合または連結が可能である。好ましい局面では、少なくとも第一の分子の一方の末端の３’または５’の突出は、その相補配列と、第二の分子の末端またはその近傍で会合させるか、またはハイブリダイズすることで、鎖の侵入に関与する場合がある。一つの局面では、このような鎖の侵入により、３’または５’の突出が、そのパートナー分子の所望の末端と、方向的に会合することができる。結合される分子の突出、および末端を設計することで、２個または多数のパートナー分子が、本発明により、リガーゼ活性を有する１種または複数のタンパク質もしくは酵素（例えばトポイソメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼなど）の存在下で結合可能となる。したがって本発明は、１個の分子の少なくとも１本の鎖と、別の分子の少なくとも１本の鎖を共有結合で連結する段階がかかわる、２個またはそれ以上の核酸分子（例えば２本鎖の核酸分子）をつなぐ方法を提供する。本発明は、本発明の方法でつながれた核酸分子の調製用の組成物、および本発明の方法で作成された組成物をさらに提供する。
【０００８】
本発明の諸段階は、トポイソメラーゼで触媒される異なる核酸分子の鎖の共有結合による連結が関与する、本明細書に記載された方法で例示される。したがって本発明は、第一の末端および第二の末端（第一の末端は、第一の５’突出、および３’端に共有結合的に連結された状態の第一のトポイソメラーゼを含み、また第二の末端は、３’端に共有結合的に連結された第二のトポイソメラーゼを含み、また第二の５’突出、平滑末端、または３’チミジン突出を含む）を有する単離されたｄｓ核酸分子に部分的に関する（第一の突出と第二の５’突出は異なる）。第一のトポイソメラーゼと第二のトポイソメラーゼは同じ場合もあれば異なる場合もある。第一の５’突出は、例えばヌクレオチド配列５’−ＧＧＴＧ−３’を含むヌクレオチド配列を有する場合がある。
【０００９】
一つの態様では、ｄｓ核酸分子は、λベクターなどの線状ベクター、または直線化されたプラスミドなどの直線化されたベクターの場合があるベクターである。このようなベクターは、クローニングベクター、または発現ベクターの場合があり、また例えば１個もしくは複数のｌｏｘ部位、または１個もしくは複数のａｔｔ部位などの１か所もしくは複数（例えば１か所、２か所、３か所、４か所、５か所、６か所など）のリコンビナーゼ認識部位、１個もしくは複数の転写調節領域、１個もしくは複数の翻訳調節領域、１個もしくは複数の選択マーカー、または１個もしくは複数のタグなどの対象ペプチドをコードする１個もしくは複数のヌクレオチド配列、またはこれらの組み合わせを含む場合がある。例えばベクターは、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ（配列番号：１６）ベクター、またはｐＣＲ（登録商標）２．１（配列番号：１７）ベクターである。
【００１０】
本発明は、望ましいならば２個もしくはそれ以上の核酸分子を使用可能に連結する段階を含む、２個、３個、４個、またはそれ以上の核酸分子を方向的または非方向的に連結する方法にも関する。方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端に共有結合で結合された第一のトポイソメラーゼ、および第二の末端に共有結合で結合された第二のトポイソメラーゼを有し、また第一の末端に５’突出を、また第二の末端に平滑末端、３’ウリジン突出、３’チミジン突出、または第二の５’突出も含む、第一のトポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子；第一の平滑末端および第二の末端を有する少なくとも第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する）を接触させることで実施することができる。第一および第二のトポイソメラーゼは、例えば２個のワクシニアウイルスのＩＢ型トポイソメラーゼなどの２個のＩＢ型トポイソメラーゼのように同じ場合もあれば、または、異なる生物に由来する２個のＩＢ型トポイソメラーゼ、またはＩＢ型トポイソメラーゼ、およびＩＡ型もしくはＩＩ型トポイソメラーゼのように異なる場合もある。
【００１１】
本発明の方法を実施する際には、第一および第二（または他）のｄｓ核酸分子を、第二の核酸分子の第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第一の５’突出と選択的にハイブリダイズして、第一のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の５’端に共有結合で連結し、また第二のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端に共有結合で連結することで、方向的に連結された組換え核酸分子を作製することが可能な条件下で接触させる。したがって本発明は、このような方法で作製された、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明の方法を実施する際の一つの局面では、第一のトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子の第二の末端は平滑末端を有し、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は平滑末端を有する。別の局面では、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’チミジン突出を有し、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’アデノシン突出を有するか、またはトポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’ウリジン（もしくはその修飾型、例えばデオキシウリジン）突出を有し、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’アデノシン突出を有する。さらに別の局面では、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子は、第二の末端に第二の５’突出を有し、第二のｄｓ核酸の第二の末端は、第二の５’突出に相補的なヌクレオチド配列を有する。トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含むベクターである場合があるが、必ずしもその必要はない。
【００１３】
本発明の方法は、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を、細菌などの原核細胞の場合もあれば哺乳類細胞などの真核細胞の場合もある細胞に導入する段階をさらに含む場合がある。したがって本発明は、本発明の方法で作製される細胞、ならびにこのような細胞から作製される非ヒトトランスジェニック生物も提供する。
【００１４】
トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子はベクターである場合があり、また本発明の方法で使用される第二のｄｓ核酸分子は増幅産物である場合がある。また第二のｄｓ核酸分子は、例えばｃＤＮＡライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーに含まれる分子である、複数の第二のｄｓヌクレオチド分子の一つである場合がある。
【００１５】
方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端（第一の５’標的配列を５’端に、またトポイソメラーゼ認識部位を３’端に有する）および第二の末端（トポイソメラーゼ認識部位を３’端に有する）を有する第一の前駆体ｄｓ核酸分子：第一の平滑末端および第二の末端（第一の平滑末端は、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の５’標的配列に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する）を有する第二のｄｓ核酸分子；ならびにトポイソメラーゼ認識部位に特異的なトポイソメラーゼを接触させることでも実施することができる。第一のｄｓ核酸分子、第二のｄｓ核酸分子、およびトポイソメラーゼを、トポイソメラーゼ活性を可能とする条件、すなわちトポイソメラーゼがその認識部位に結合して切断して、トポイソメラーゼをチャージした３’端を生じることが可能な条件下で接触させることで、適切な５’端の３’端を連結することが可能である。このような条件では、トポイソメラーゼによる切断後に残る第一の５’標的配列の一部と、第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列（第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列は、５’標的配列の一部に相補的である）のハイブリダイゼーションが可能となる。
【００１６】
本発明の方法を実施する一つの局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端は、トポイソメラーゼによる切断後に平滑末端となり、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は平滑末端である。別の局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端は、トポイソメラーゼによる切断後に３’チミジンの延長を有し、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’アデノシン、または３’−ウリジン（例えばデオキシウリジン）の突出を含む。さらに別の局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、第二の５’標的配列を第二の末端に有し、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は、第二の５’標的配列の少なくとも一部に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する。
【００１７】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、クローニングベクターおよび発現ベクターを含むベクターであり、またベクターが一般に環状の状態で入手可能の場合は、トポイソメラーゼの作用で直線化可能であり、または例えばトポイソメラーゼとの接触によって、第一および第二のｄｓ核酸分子が本発明の方法により方向的もしくは非方向的に連結可能となるように、ベクター直線化する１種または２種の制限エンドヌクレアーゼを含めることで直線化することが可能である。本発明は、例えば方向的に連結された組換え核酸分子を細胞に導入する段階をさらに含む場合がある本発明の方法で作製される方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子も提供する。したがって本発明は、このような方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を含む細胞、ならびにこのような細胞から作製されるトランスジェニック非ヒト生物も提供する。
【００１８】
第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、相互に使用可能に連結可能な１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個など）の発現制御領域を含む場合があり、また第二のｄｓ核酸分子は、読み枠のすべてまたは一部をコードする場合がある（発現制御領域は、本発明の方法で作製された、方向的に連結された組換え核酸分子中の読み枠に使用可能に連結される）。また、第二のｄｓ核酸分子は、複数の第二のｄｓ核酸分子のうちの一つ、例えばｃＤＮＡライブラリーに含まれる分子である場合がある。
【００１９】
方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、第一の末端に第一の５’突出、および３’端に共有結合で結合された第一のトポイソメラーゼを有するトポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子と、第一の平滑末端および第二の末端（第一の平滑末端は第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む）を有する第二のｄｓ核酸分子とを接触させることでも実施することができる。この方法は、第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第一の５’突出と選択的にハイブリダイズすることで、第一のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に共有結合で連結することができる条件下で実施される。
【００２０】
このような方法はさらに、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子および第二のｄｓ核酸分子を、第三のｄｓ核酸分子（第三のｄｓ核酸分子の第１の末端は、５’突出、および３’端に共有結合で結合された第二のトポイソメラーゼを有し、また第二のｄｓ核酸分子は、第二の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む第二の平滑末端を有する）に接触させる段階を含む場合もある）。接触させる段階は例えば第二のｄｓ核酸の第二の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’突出と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下（第二のトポイソメラーゼは第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第二の平滑末端の５’端に共有結合で連結させることが可能である）で実施することができる。同様に、この方法は、第四の、第五の、第六の、またはそれ以上のｄｓ核酸分子を方向的または非方向的に連結する際に用いることができる（このようなｄｓ核酸分子の末端は本明細書で例示されるように選択される）。第一および第二（または他）のトポイソメラーゼは、同じ場合もあれば異なる場合もあり、また望ましいならば、第一または第三のｄｓ核酸分子は、トポイソメラーゼをチャージしたものではなく、トポイソメラーゼ認識部位を含む場合がある（この方法は、試薬をトポイソメラーゼに接触させる段階をさらに含む場合がある）。
【００２１】
本発明の方法は、同時に、または連続的に実施することができる。本発明の方法は例えば、第一のｄｓ核酸分子を第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結させ、次に異なる反応容器内で、第三のｄｓ核酸分子が第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結されるように連続的に実施することができる。または本発明の方法は、すべての反応物が同時にともに含まれるように、同時に実施することができる。
【００２２】
本発明の方法は、例えば発現制御領域を読み枠に使用可能に連結させたり、第一および第二の読み枠を使用可能に連結させて、１個または複数の発現制御領域に、さらに使用可能に連結可能な融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を作製する段階を含む、２個またはそれ以上（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個など）のｄｓ核酸分子を連結する段階に特に有用である。例えば本発明の方法を実施する際には、第一のｄｓ核酸分子に発現制御領域を含めることが可能であり、第二のｄｓ核酸分子が読み枠をコードすることが可能であり、また第三のｄｓ核酸分子がペプチドをコードすることが可能である（方向的に連結された組換え核酸分子内では、発現制御領域は読み枠に使用可能に連結され、第二のｄｓ核酸分子は第三のｄｓ核酸分子に使用可能に連結され、また使用可能に連結された第二および第三のｄｓ核酸分子は読み枠を含むタンパク質およびペプチドをコードする）。このようなペプチドは、任意の遺伝子産物、または他の読み枠、タグ（例えばアフィニティタグ）、検出用標識などを含む任意のペプチドまたはポリペプチドの場合がある。
【００２３】
本発明は、第一の末端および第二の末端を有する第一のｄｓ核酸分子（第一の末端は５’突出、および３’端に共有結合で結合されたトポイソメラーゼを有する）；ならびに第一の平滑末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は、第一の５’突出に相補的な第一の５’ヌクレオチド配列、および第一の５’ヌクレオチド配列に相補的な第一の３’ヌクレオチド配列を有する）を含む組成物にも関する。このような組成物では、第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の５’ヌクレオチド配列は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の５’突出とハイブリダイズすることが可能である（第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の３’ヌクレオチド配列が置換される）。このような組成物に含まれる第一のｄｓ核酸分子は、第二の末端に第二の５’突出をさらに有し、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は、第二の５’突出に相補的な第二の５’ヌクレオチド配列、および第二の５’ヌクレオチド配列に相補的な第二の３’ヌクレオチドをさらに含む場合がある。
【００２４】
本発明は、ｄｓ核酸分子を方向的に連結する際に有用な１種または複数の試薬を含むキットにも関する。一つの態様では、本発明のキットは、第一の末端および第二の末端（第一の末端は、第一の５’突出および３’端に共有結合で結合された第一のトポイソメラーゼを含み、第二の末端は、３’端に共有結合で結合された第二のトポイソメラーゼを含み、また第二の５’突出、平滑末端、または３’チミジン突出を含む）を有するｄｓ核酸分子を含む（第一の５’突出は、第二の５’突出と異なる）。このようなトポイソメラーゼは、同じ場合もあれば異なる場合もあり、またｄｓ核酸分子はベクターである場合があり、また発現制御領域を含む場合がある。
【００２５】
別の態様では、本発明のキットは、第一の末端の３’端に共有結合で結合された第一のトポイソメラーゼ、および第二の末端の３’端に共有結合で結合された第二のトポイソメラーゼを有する第一のｄｓ核酸分子（第一の末端は第一の５’突出も有し、また第二の末端は、平滑末端、３’チミジン突出、または第二の５’突出も有すし、第二の５’突出が存在する場合、これは第一の５’突出と異なる）；ならびに複数の第二のｄｓ核酸分子（複数の各ｄｓ核酸分子は第一の平滑末端を有し、第一の平滑末端は、第一のｄｓ核酸分子の第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む）を含む。複数の第二のｄｓ核酸分子は、複数の転写調節領域、翻訳調節領域、またはこれらの組み合わせである場合があるほか、ペプチドタグや細胞区画化ドメインなどの複数のペプチドをコードする場合がある。
【００２６】
本発明のキットは、１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個など）の、トポイソメラーゼをチャージした本発明のｄｓ核酸分子、例えば１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個など）の、トポイソメラーゼをチャージしたベクター；トポイソメラーゼに接触させて、トポイソメラーゼをチャージした本発明のｄｓ核酸分子を作製することが可能な１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個など）の前駆体ｄｓ核酸分子；またはこれらの組み合わせを含む場合がある。本発明のキットは、例えば増幅反応で１個または複数の第二のｄｓ核酸分子を調製するための１本または複数のプライマー、またはプライマー対；キットの成分を検討したり標準化したりするための１個または複数の対照のｄｓ核酸分子；例えば、本発明の方法で作製された組換え核酸分子を導入可能なコンピテント細胞の場合がある１個または複数の細胞；本発明の方法を実施するための１種または複数（例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種など）の反応緩衝液；この方法を実施するための指示書などを含む場合もある。
【００２７】
一つの態様では、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、１か所の１本鎖突出、および１か所のトポイソメラーゼ部位、またはこれに結合する１個のトポイソメラーゼを有する第一のｄｓ核酸分子を用いて実施される。別の態様では第三の核酸分子が含まれる。本発明のこの局面では、連結される異なるｄｓ核酸分子に対する固有の突出配列が、同核酸分子が、核酸分子が方向的、また任意の所望の順序で連結可能なように固有の突出を有するように調製される場合がある。同様に、この方法は、２個またはそれ以上の数の核酸分子を方向的に連結する段階を含む、任意の数の核酸分子を連結する際に用いられる場合がある。発現制御領域を含む、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子がかかわるある態様では、第三（または他）のｄｓヌクレオチド配列も、１個、２個またはそれ以上の発現制御領域、または他の対象配列を含む場合がある。
【００２８】
本発明は、ＤＮＡ断片を、クローニングベクターまたは発現ベクターに、容易に、またトポイソメラーゼを介したクローニングの効率で、方向的に挿入する方法を提供する。この方法は、現行のクローニングシステムより利益がある。というのは、所望の方向にクローニングされた挿入配列を同定する際に必要とされる煩雑なスクリーニング過程を減らせるからである。一つの局面では、この方法は、両方の３’端に共有結合で結合された１個のトポイソメラーゼ分子を有する、直線化された発現ベクターを使用する。直線化されたベクターの第一の末端は、５’の１本鎖突出を含む場合もあり、第二の末端は、いずれかが平滑である場合があり、Ｔ／Ａクローニング用の１か所の３’チミジン延長を有し、または、自身が第二の５’の１本鎖突出配列を含む場合がある。１本鎖突出配列は、利便性を考慮した任意の配列、または所望の配列の場合がある。
【００２９】
トポイソメラーゼをチャージしたクローニングベクターの構築は、ベクターをエンドヌクレアーゼで切断した後に、合成オリゴヌクレオチドの相補的アニーリング、およびワクシニアウイルスのトポイソメラーゼＩよるヘテロ２本鎖の部位特異的切断を行うことで達成することができる。適合性のあるエンドヌクレアーゼによるベクターの切断で特異的な付着末端が生じる。特別のオリゴヌクレオチドは付着末端とアニーリングし、トポイソメラーゼＩによる修飾により、ベクターの特別の末端を形成する配列をもつ。１本鎖突出の配列および長さは、使用者の希望に応じて変わる。
【００３０】
本発明で提供される、１本鎖配列の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸ベクターの好ましい用途では、ベクターに挿入されるＤＮＡ断片は、ＰＣＲ産物などの増幅反応産物である。特別のプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、増幅産物は、挿入部位の一端または両端に１本鎖配列を有する、トポイソメラーゼＩをチャージしたクローニングベクターに方向的に挿入することができる。このような特別のプライマーは、任意のプライマー対の少なくとも１本のプライマーが５’端に付加的配列を含むように設計することができる。付加された配列は、ベクター内の１本鎖突出の配列に相補的になるように設計される。ベクター内における５’の１本鎖突出と、ＰＣＲ産物の５’端間の相補性が、トポイソメラーゼを介したベクターへのＰＣＲ産物の方向的挿入にかかわる。具体的には、ベクターの一端のみと、ＰＣＲ産物の一端が相補的な１本鎖配列領域を有するので、この例のような産物の挿入は、方向的であり、またトポイソメラーゼはＰＣＲ産物とベクターの連結を触媒することができる。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、鎖の侵入により、２個またはそれ以上の２本鎖（ｄｓ）核酸分子を方向的または非方向的に連結するための組成物および方法を提供する。例えば本発明は、第一の末端および第二の末端を有するｄｓ核酸分子（第一の末端は、第一の５’突出、および３’端に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼを含み、また第二の末端は、３’端に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含み、また第二の５’突出、平滑末端、３’ウリジン突出、または３’チミジン突出）を含む（第一の５’突出と第二の５’突出は異なる）を提供する。第一のトポイソメラーゼおよび第二のトポイソメラーゼは、同じ場合もあれば異なる場合もある。第一の５’突出は、任意のヌクレオチド配列（例えばヌクレオチド配列５−ＧＧＴＧ）を有する場合がある。
【００３２】
本発明のいくつかの局面は、トポイソメラーゼを用いた連結によって提供される利点を保ちながら、ＰＣＲで得られた、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片が、クローニングベクターに方向的に挿入されることを可能とするように、トポイソメラーゼによるクローニングを修飾する。このシステムは、方向的クローニングの効率が常に９０％を越えることを可能とすることにより、スクリーニングを行って所望の方向の挿入配列を含むクローンを同定する際に要する作業量を大きく減らす。本発明は、高スループットの遺伝子発現操作を簡素化し、スクリーニング過程に関連した費用を節約し、他の利点を提供する。
【００３３】
本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子は一般に、１本鎖突出、および第一の末端の終端またはその近傍に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼを有する。また本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子は、第二の末端の終端またはその近傍に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含む場合がある。１本鎖突出は、５’突出である場合があり、また個々のトポイソメラーゼは、両方の３’端またはその近傍に結合した状態にある場合がある。トポイソメラーゼが３’端の一方、または好ましくは両端に結合する場合、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子の第二の末端は、典型的には平滑末端、３’チミジン突出、または第一の５’突出とは異なる第二の５’突出である。
【００３４】
本明細書で使用される、「第一の末端」および「第二の末端」を有する核酸分子と記載する場合、このような核酸分子は線状である。「１本鎖突出」または「突出」という表現は、ｄｓ核酸分子の相補鎖の末端を越えて伸長するｄｓ核酸分子の鎖を意味するように本発明では使用される。「５’突出」または「５’突出配列」という表現は、ｄｓ核酸分子の相補鎖の３’端を越えて５’方向に伸長するｄｓ核酸分子の鎖を意味するように本発明では使用される。「３’突出」、または「３’突出配列」という表現は、ｄｓ核酸分子の相補鎖の５’端を越えて３’方向に伸長するｄｓ核酸分子の鎖を意味するように本発明では使用される。利便性を考慮して、５’突出は、ＩＢ型トポイソメラーゼによる、ｄｓ核酸分子の部位特異的な切断の結果として作成される場合がある（実施例１および２を参照）。同様に、３’突出は、ＩＡ型トポイソメラーゼまたはＩＩ型トポイソメラーゼによる、ｄｓ核酸分子の切断によって生成される場合がある。
【００３５】
３’突出および５’突出は、任意のヌクレオチド配列を有する場合があり、また任意の長さ（例えば２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１０残基などのヌクレオチド）を有する場合があるが、一般には少なくとも２残基のヌクレオチドである。突出配列は、本発明の方法による、あるｄｓ核酸分子の所定の末端と、第二の核酸分子の所定の末端との連結を可能とするように選択することができる。２本鎖の核酸分子が方向的に連結される場合、３’または５’の突出は一般にパリンドロームではない。なぜなら、パリンドロームの突出を有するｄｓ核酸分子が相互に会合して、２個またはそれ以上のｄｓ核酸分子を所定の方向に含む、方向的に連結された組換え核酸分子の収率を下げる場合があるからである。突出は例えば、転写調節領域または翻訳調節領域（プロモーターなど）、コザック配列、開始コドンなど、またはこれらのヌクレオチド配列の相補配列を含む場合がある。
【００３６】
３’突出または５’突出は、突出のヌクレオチド配列の少なくとも一部が相補配列とハイブリダイズすることが可能であれば、相補的なヌクレオチド残基とハイブリダイズすることが可能な、事実上任意のヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体、または修飾型ヌクレオチドを含む場合がある。したがって、突出中のヌクレオシドは、プリン（グアノシン（Ｇ）もしくはアデノシン（Ａ））、またはピリミジン（チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、もしくはシチジン（Ｃ））などの天然のヌクレオチドを含む場合がある。また、突出は、ヌクレオシドの置換物、例えばイノシンなどのヌクレオシド、またはメチルグアノシン、もしくは５−ハロゲン化ピリミジンヌクレオシド（例えば５−ブロモデオキシウリジンもしくは５−メチルデオキシシチジン）などのヌクレオシドの修飾型を含む場合がある。望ましいならば、突出は比較的高いＧＣ含量を有する場合がある。例えば突出のＧＣ含量は５０％を上回る、例えば６６％のＧＣ含量、または７５％のＧＣ含量、または８０％のＧＣ含量、または１００％のＧＣ含量の場合がある。一つの態様では、突出は配列５’−ＧＧＴＧ−３’を有する。．
【００３７】
第一の核酸分子の５’または３’の突出は、例えば相補的なヌクレオチド残基が、連結される第二（もしくは他）のｄｓ核酸分子の実質的に平滑な末端またはその近傍において、相補的な配列内に存在しない、１個もしくは２個、または数個のヌクレオチド残基を、例えば突出の自由端に含む場合がある。それにもかかわらず、第一の核酸分子の末端における突出は、突出中の他のヌクレオチド残基のために、第二の核酸分子の相補的な配列と選択的にハイブリダイズすることが可能である。例えば５’突出が６個のヌクレオチドを含む場合、最も５’側の１個または２個のヌクレオチドは、第二の核酸分子内の相補的なヌクレオチド配列中の対応するヌクレオチドに対して相補的である必要はないが、残存する４個のヌクレオチド残基との相補性があるために、選択的なハイブリダイゼーションが生じる場合がある。突出中（または第二の核酸分子の「相補的な」配列中）に存在しうる非相補的なヌクレオチド残基の数または特定の位置は、ハイブリダイゼーションの特異性を実質的に低下させたり阻害したりすることなく、一般的なハイブリダイゼーション法で決定することができる。
【００３８】
突出のヌクレオチド塩基は、固定核酸類似体（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）（Ｐｒｏｌｉｇｏ；Ｂｏｕｌｄｅｒ ＣＯ）を含む場合がある。ＬＮＡの単量体は、リボヌクレオシドに構造的に類似した二環式化合物である。「固定核酸」という表記は、フラノース環の構造が、２’−Ｏ位を４’−Ｃ位につなぐメチレンリンカーによってＬＮＡで制限されることを強調するために作られた。本明細書で使用される、１個または複数のＬＮＡの修飾を含むすべての核酸分子はＬＮＡ分子と呼ばれる。ＬＮＡのオリゴマーは、ワトソン−クリック塩基対の法則に従い、相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。ＬＮＡは、いくつかの状況におけるＤＮＡおよび他の核酸誘導体と比較した場合に、ハイブリダイゼーションの大きな改善、安定性、高温安定性の上昇をもたらす場合がある（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７〜３０、１９９８；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２０：１３２５２〜５３、１９９８；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５６３３〜３８、２０００）。
【００３９】
ｄｓ核酸分子の第一の末端または第二の末端に関しては、核酸分子の任意の特定の方向を意味すると意図されず、相互に末端の相対的な重要性があることを意味しないと解釈される。第一の末端および第二の末端を有する核酸分子が２本鎖の核酸分子である場合、各末端は５’端および３’端を含む。したがって本明細書では、例えば第一の末端または第二の末端である場合がある、トポイソメラーゼ認識部位を３’端に含み、ヒドロキシル基を同末端の５’端に含む核酸分子に関して言及される。
【００４０】
核酸分子に結合した状態のトポイソメラーゼは一般に、ｄｓ核酸分子の「末端またはその近傍」に結合した状態となる。トポイソメラーゼをに関する「末端またはその近傍」という表現は、トポイソメラーゼが、結合される鎖の末端を第二の核酸分子（５’端に遊離のヒドロキシル基を含む）につなぐように、ｄｓ核酸分子の一方の鎖に共有結合で結合された状態を意味する。一般にトポイソメラーゼは、末端の一方の終端に共有結合で結合された状態にあることで、「末端またはその近傍」に位置する。例えばトポイソメラーゼが、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼなどのＩＢ型トポイソメラーゼである場合、トポイソメラーゼは、ｄｓ核酸分子の末端の３’端に結合した状態にある。しかし、末端の終端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを有する末端が、相補鎖に１本鎖突出配列を含むことで、トポイソメラーゼが結合されている終端を越えて伸長する場合もある。このようなトポイソメラーゼは、ｄｓ核酸分子の末端の近傍に位置するトポイソメラーゼの一例である。
【００４１】
ある分子を指して、本明細書で使用される「単離された」という表現は、分子が、天然に存在する状態ではない状態にあることを意味する。一般に、単離された核酸分子は、例えば細胞に含まれるゲノムの一部ではない任意の核酸分子である場合があるほか、同核酸分子を通常含む細胞から物理的に分離された任意の核酸分子である場合がある。本発明のさまざまな組成物は、単離されたｄｓ核酸分子の混合物を含むと解釈される。したがって、「単離された」という表現は、ある分子の天然の状態からの単離に関してのみ使用されると理解され、その分子が唯一の構成成分であることを意味しない。
【００４２】
トポイソメラーゼは、ＤＮＡ鎖の切断および再結合を介して、ＤＮＡの位相的な状態を修飾する酵素群である（参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｈｕｍａｎら、米国特許第５，７６６，８９１号）。トポイソメラーゼは、２本鎖核酸分子の１本鎖を切断するＩＡ型およびＩＢ型のトポイソメラーゼを含むＩ型のトポイソメラーゼ、および核酸分子の両方の鎖を切断するＩＩ型トポイソメラーゼ（ジャイレース）に分類される。本明細書で説明するように、Ｉ型およびＩＩ型のトポイソメラーゼ、ならびに触媒ドメイン、およびその変異型は、本発明の方法による、方向的に連結された組換え核酸分子を作製する上で有用である。ＩＩ型トポイソメラーゼは、組換え核酸分子の作製、またはクローニング法に一般に使用されていないが、ＩＢ型トポイソメラーゼは、さまざまな手法に用いられている。
【００４３】
ＩＡ型およびＩＢ型のトポイソメラーゼは、ｄｓ核酸分子の一方の鎖を切断する。ＩＡ型トポイソメラーゼによるｄｓ核酸分子の切断では、切断部位に５’リン酸と３’ヒドロキシルが生じ、ＩＡ型トポイソメラーゼは、切断された鎖の５’端に共有結合で結合されている。これとは対照的に、ＩＢ型トポイソメラーゼによるｄｓ核酸分子の切断では、切断部位で３’リン酸と５’ヒドロキシルが生じ、ＩＢ型トポイソメラーゼは、切断された鎖の３’端に共有結合で結合されている。ＩＡ型トポイソメラーゼは、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のトポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩＩ、真核生物のトポイソメラーゼＩＩ、および原始（ａｒｃｈｅａｌ）リバースジャイレースを含む（参照として本明細書に組み入れられる、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４００：３〜１８、１９９８を参照）。
【００４４】
ＩＢ型トポイソメラーゼは、あらゆる真核細胞に存在してワクシニアウイルス、および他の細胞性ポックスウイルスにコードされる、核のＩ型トポイソメラーゼを含む（参照として本明細書に組み入れられる、Ｃｈｅｎｇら、Ｃｅｌｌ ９２：８４１〜８５０、１９９８を参照）。真核生物の代表的なＩＢ型トポイソメラーゼは、酵母、ショウジョウバエ、および哺乳類の細胞（ヒト細胞を含む）で発現されるトポイソメラーゼである（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる、ＣａｒｏｎおよびＷａｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２９Ｂ：２７１〜２９７、１９９４；Ｇｕｐｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２６２：１〜１４、１９９５を参照；またＢｅｒｇｅｒ、前記、１９９８も参照）。ウイルス由来の代表的なＩＢ型トポイソメラーゼは、脊椎動物のポックスウイルス（ワクシニアウイルス、ショープ線維種ウイルス、ＯＲＦウイルス、鶏痘ウイルス、および伝染性軟属腫ウイルス）、および昆虫のポックスウイルス（アマサクタモーレイ（Ａｍａｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ）昆虫ポックスウイルスで産生されるトポイソメラーゼである（それぞれ参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｈｕｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４００：３２１〜３３７、１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３０：１９７〜２０６、１９９７；ＳｈｕｍａｎおよびＰｒｅｓｃｏｔｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４７８〜７４８２、１９８７；Ｓｈｕｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：３２６７８〜３２６８４、１９９４；米国特許第５，７６６，８９１号；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２３７２、を参照；またＣｈｅｎｇら、前記、１９９８も参照）。
【００４５】
ＩＩ型トポイソメラーゼは、例えば細菌由来のジャイレース、細菌由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＶ、真核生物由来のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ、およびＴ偶数ファージにコードされたＤＮＡトポイソメラーゼを含む（参照として本明細書に組み入れられる、ＲｏｃａおよびＷａｎｇ、Ｃｅｌｌ ７１：８３３〜８４０、１９９２；Ｗａｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：６６５９〜６６６２、１９９１；Ｂｅｒｇｅｒ、前記、１９９８）。ＩＢ型トポイソメラーゼと同様に、ＩＩ型トポイソメラーゼは、切断活性および連結活性の両方を有する。またＩＢ型トポイソメラーゼと同様に、基質となるｄｓ核酸分子は、ＩＩ型トポイソメラーゼが、切断部位における一方の鎖に対する共有結合による連結を形成可能なように調製することができる。例えば仔ウシ胸腺のＩＩ型トポイソメラーゼは、５’端から３つのヌクレオチドの位置にある、５’側が凹んだトポイソメラーゼ認識部位を含む基質ｄｓ核酸分子を切断し、切断部位の５’側に位置する３個の核酸分子を解離させ、トポイソメラーゼと、ｄｓ核酸分子の５’端との共有結合を形成する（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、前記、１９９１）。また、このようなＩＩ型トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子を、３’ヒドロキシル基を含む第二の核酸分子に接触させると、ＩＩ型トポイソメラーゼは、これらの配列を連結させた後に組換え核酸分子から離れることができる。したがって、ＩＩ型トポイソメラーゼも、本発明の方法を実施する際に有用である。
【００４６】
トポイソメラーゼの構造解析から、ＩＡ型、ＩＢ型、およびＩＩ型のトポイソメラーゼを含む個々のトポイソメラーゼファミリーの分子が、同ファミリーの他の分子と共通の構造上の特性をもつことが示されている（Ｂｅｒｇｅｒ、前記、１９９８）。また、さまざまなＩＢ型トポイソメラーゼの配列解析から、構造が特に触媒ドメインで高度に保存されていることが報告されている（Ｓｈｕｍａｎ、前記、１９９８；Ｃｈｅｎｇら、前記、１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、前記、１９９７）。例えば３１４アミノ酸からなるワクシニアウイルスのトポイソメラーゼのアミノ酸８１〜３１４を含むドメインは、他のＩＢ型トポイソメラーゼと実質的な相同性を有し、単離されたドメインは、代謝回転速度が遅く、また認識部位に対する結合親和力が低いものの、完全長のトポイソメラーゼと実質的に同じ活性を有する（Ｓｈｕｍａｎ、前記、１９９８；Ｃｈｅｎｇら、前記、１９９８を参照）。また、アミノ酸末端ドメイン（アミノ酸残基７０〜７２）に変異がある、ワクシニアウイルスの変異型トポイソメラーゼは、完全長のトポイソメラーゼと同じ特性を示す（Ｃｈｅｎｇら、前記、１９９８）。事実、ワクシニアウイルスのＩＢ型トポイソメラーゼの変異解析から、トポイソメラーゼの活性に影響を及ぼすことなく、また活性に必要な同じ複数のアミノ酸をもつ、変異が生じうる多数のアミノ酸残基の存在がわかっている（Ｓｈｕｍａｎ、前記、１９９８）。ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼの触媒ドメインと、他のＩＢ型トポイソメラーゼとの間に高い相同性があること、またワクシニアウイルスのトポイソメラーゼを対象とした詳細な変異解析から、ＩＢ型トポイソメラーゼ、およびさまざまなアミノ酸変異をもつＩＢ型トポイソメラーゼの単離された触媒ドメインが本発明の方法に使用可能であると解釈されており、このため本発明の目的に合うトポイソメラーゼとみなされている。
【００４７】
さまざまなトポイソメラーゼは、多様な配列特異性を示す。例えばＩＩ型トポイソメラーゼは、さまざまな配列に結合可能であるが、切断は高度に特異的な認識部位で起きる（参照として本明細書に組み入れられる、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：９２０３〜９２１０、１９９１を参照）。これとは対照的に、ＩＢ型トポイソメラーゼには、特定のヌクレオチド配列（「トポイソメラーゼ認識部位」）に結合して切断する部位特異的なトポイソメラーゼが含まれる。トポイソメラーゼ（例えばＩＢ型トポイソメラーゼ）によりｄｓ核酸分子が切断されると、ホスホジエステル結合のエネルギーは、トポイソメラーゼ中の特定のチロシン残基と、トポイソメラーゼ認識部位の３’ヌクレオチドとの間にホスホチロシル連結が形成されることで保存される。トポイソメラーゼ切断部位が核酸分子の３’端の近傍にある場合、下流の配列（切断部位に対して３’側）が解離して、新しく生成された３’端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを有する核酸分子が残される場合がある（図９参照）。
【００４８】
共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼは、逆の反応、例えばＩＢ型トポイソメラーゼがリン酸チロシル化結合および自由端の５’ヒドロキシル基を含む核酸分子を介して連結される、認識配列の３’ヌクレオチドの共有結合による連結を触媒する場合もある。したがって、ＩＢ型トポイソメラーゼを使用して組換え核酸分子を作製するための、いくつかの方法が開発されている。したがって、結合状態のＩＢ型トポイソメラーゼを含むクローニングベクターが開発されて市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）。このようなクローニングベクターは、直線化されると、共有結合で結合された状態のＩＢ型トポイソメラーゼを各３’端に含む（「トポイソメラーゼでチャージされた」状態）。このようなベクターにクローニングされる、ｃＤＮＡライブラリーに含まれるような核酸分子、または制限酵素切断断片、またはランダムに切断されたゲノムＤＮＡ配列を、例えばホスファターゼで処理することで、５’ヒドロキシル末端が得られ、次に、トポイソメラーゼが、ヒドロキシル基を含む５’端、および共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを含む３’端で核酸分子を連結可能とする条件下で、直線化されたベクターに加える。５’ヒドロキシル末端を含むように生成される、ＰＣＲ増幅産物などの核酸分子は、トポイソメラーゼをチャージしたベクターに、速やかな連結反応（室温で約５分）でクローニングすることができる。このようなトポイソメラーゼによる連結反応に特有の、速やかな連結および広い温度範囲により、トポイソメラーゼをチャージしたベクターは、一般に自動システムを用いて実施される高スループットの応用に望ましいものとなる。
【００４９】
ワクシニアウイルスは、２本鎖ＤＮＡに部位特異的な１本鎖のニックを形成すること、ならびに５’ヒドロキシルによって誘導される再連結を可能とする、３１４アミノ酸からなるＩ型トポイソメラーゼ酵素をコードしている、部位特異的なＩ型トポイソメラーゼは、ポックスウイルスのトポイソメラーゼなどのウイルス由来のトポイソメラーゼを含むがこれらに限定されない。ポックスウイルスのトポイソメラーゼの例には、ショープ線維症ウイルス、およびＯＲＦウイルスなどがある。他の部位特異的なトポイソメラーゼが当業者に知られており、本発明の実施に使用することができる。
【００５０】
ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼは、２本鎖ＤＮＡに結合し、高レベルの配列特異性を示しながら、一方の鎖のホスホジエステル主鎖を切断する。切断は、切断可能な鎖に含まれるペンタピリミジンからなるコンセンサス配列５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ↓、または関連配列で生じる。ある態様では、切断可能な結合は、２本鎖ＤＮＡの３’端から２〜１２ ｂｐに位置する。別の態様では、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼによる切断可能な複合体の形成には、切断部位の上流にある６個の２本鎖ヌクレオチド、および下流にある２個のヌクレオチドが必要である。ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼによって切断される配列の例には、
2004517608.tif 000002
などがあるがこれらに限定されない。
【００５１】
他の部位特異的なＩ型トポイソメラーゼのいくつかの例は当技術分野で周知である。このような酵素群は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、およびテトラヒメナを含むがこれらに限定されない多くの生物にコードされているが、これらの種のトポイソメラーゼＩ酵素は、コンセンサス配列に対する特異性が、ワクシニアウイルスに由来するトポイソメラーゼより低い（Ｌｙｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３５５９〜３５６３、１９８９；Ｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４：１３３７３〜１３３７６、１９８９；Ｂｕｓｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：６３８〜６４０、１９８７）。
【００５２】
本発明の組成物および方法は、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼなどのＩＢ型トポイソメラーゼの用途に関して一般に本明細書に例示されている。しかし本発明の方法が、単に成分を調節することにより、他のトポイソメラーゼを用いて実施可能であることも解釈される。例えば極めて詳しく後述するように、ｄｓ核酸分子の一方または両方の３’端にＩＢ型トポイソメラーゼ認識部位を組み入れる方法が開示されている。したがって本発明の開示に関しては、ＩＡ型またはＩＩ型のトポイソメラーゼのトポイソメラーゼ認識部位が、ｄｓ核酸分子に同様に組み入れ可能であることを当業者であれば理解すると思われる。
【００５３】
第一の末端に５’突出を含む、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子は一般に、第一の末端の３’端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを含む。第一の末端に５’突出および第一のトポイソメラーゼを含むｄｓ核酸は、第二の末端に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含む場合もある。第一の末端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼは、第二の末端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼと同じ場合もあれば異なる場合もある。したがって、ワクシニアウイルスのトポイソメラーゼは、第一の末端に共有結合で結合された状態の場合があり、別のポックスウイルス、または真核生物の核にあるＩＢ型トポイソメラーゼは、第二の末端に結合した状態の場合がある。一般に、各末端のトポイソメラーゼが異なる場合、これらは同じ一般ファミリー、例えばＩＡ型もしくはＩＢ型、またはＩＩ型のトポイソメラーゼである。
【００５４】
一つの態様では、本発明のトポイソメラーゼをチャージした２本鎖の核酸分子は、クローニングベクターまたは発現ベクターの場合があるベクターである。このようなベクターは、細菌由来の複製起点、真核生物由来の複製起点、抗生物質耐性遺伝子などの配列を含み、さらにトポイソメラーゼ認識部位、もしくはトポイソメラーゼをチャージした末端、またはこれらの組み合わせを含む場合がある。本発明のこのようなベクターは、利便性を考慮して、本明細書に開示されているように、キットにまとめることができる。本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、人工染色体（例えば細菌人工染色体、酵母人工染色体、哺乳類人工染色体など）、またはバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびアデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターの場合がある。いずれもよく知られており、いくつかの業者（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）から購入することができる。ウイルス由来の発現ベクターは、方向的に連結された組換え核酸分子を作製して、細胞（特に被験者の細胞）に導入する目的で本発明の方法を実施する際に特に有用な場合がある。ウイルスベクターには、比較的高い効率で宿主細胞に感染可能であり、また特定の細胞種に感染可能であったり、修飾することで宿主の特定の細胞感染可能であったりするという利点がある。
【００５５】
ウイルスベクターは、特定の宿主系において使用するために開発されており、例えば昆虫細胞に感染するバキュロウイルスベクター；哺乳類細胞に感染するレトロウイルスベクター、他のレンチウイルスベクター（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクター）、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどを含む（参照として本明細書に組み入れられる、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０、１９９２；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５〜３０、Ｓｕｐｐｌ．、１９９８；ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ、Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９〜２４２、１９９７；Ｗｉｌｓｏｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３３４：１１８５〜１１８７、１９９６を参照）。例えばＨＩＶを元にしたウイルスベクターはＴ細胞に感染させる際に使用することが可能であり、アデノウイルスを元にしたウイルスベクターは例えば、呼吸器の上皮細胞に感染させる際に使用することが可能であり、またヘルペスウイルスを元にしたウイルスベクターは、神経細胞に感染させる際に使用することが可能である。ＡＡＶベクターなどの他のベクターは、広い宿主細胞域をもつ場合があるので、さまざまな種類の細胞に感染させる際に使用することができるが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを特定の受容体またはリガンドで修飾することで、受容体を介した反応による標的特異性を変えることもできる。
【００５６】
トポイソメラーゼをチャージしたベクター、またはトポイソメラーゼ認識部位を含む、本発明の直線化されたベクターは、本明細書に開示された方法、または当技術分野で周知の方法で作製することができる。例えば環状ベクターは、直線化して、１個または複数のオリゴヌクレオチドと連結したりハイブリダイズしたりして修飾することで、トポイソメラーゼ認識部位、またはその切断産物、および標的となる５’配列すなわち５’突出を一端または両端に作製することができる（実施例１および２を参照）。このようなベクターは例えば、原核生物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、またはこれら両方における複製に必要な発現制御領域を含む場合もあり、また抗生物質耐性などもたらすポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合があり、または、このような配列を、本発明の方法でベクターに導入することができる。また、このようなベクターは、１か所または２か所、またはそれ以上の部位特異的な組込み認識部位（ａｔｔ部位やｌｏｘ部位など）を含む場合がある。例えばａｔｔＢ配列またはａｔｔＰ配列を、本発明の単離された核酸分子へ組み込むことで、ゲートウェイ（ＧＡＴＥＷＡＹ）（商標）クローニングシステム（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を用いる核酸分子の簡便な操作が可能となる。
【００５７】
本発明は、トポイソメラーゼをチャージした、突出のある１本鎖のＤＮＡ断片を有する修飾型クローニングベクターを提供する。このような修飾型ベクターでは、直線状のｄｓ核酸分子（例えば後に発現させる、ＰＣＲで増幅された分子、または適切なＯＲＦ）の方向性の挿入が可能であり、またトポイソメラーゼを用いたクローニングの効率を利用する。本明細書で使用されるドナーという用語は、５’−ＣＣＣＴＴ切断部位を３’端の近傍に含む２本鎖ＤＮＡなどの分子を意味する。また「アクセプター」という用語は、５’−ＯＨ末端を含む２本鎖ＤＮＡを意味する。トポイソメラーゼによって共有結合的に活性化されたドナーは、１本鎖配列の相補性があるアクセプターに移る。
【００５８】
本発明により、特定の態において、トポイソメラーゼで修飾したベクターを、少なくとも１個の、１本鎖の５’突出配列を含むようにさらに適合させて、ＤＮＡセグメントの方向的挿入を促進する。このようなベクターにクローニングされる核酸分子は、結果として得られる組換えベクターから発現可能なＯＲＦを含むＰＣＲ産物の場合がある。ＯＲＦの増幅に使用されるプライマーは、プライマー対の少なくとも１本のプライマーが付加的な配列をその５’端に含むように設計される。このような配列は、本発明の、トポイソメラーゼで修飾されたベクター内に存在する、１本鎖の５’突出の配列に相補的になるように設計される。
【００５９】
本発明は、鎖の侵入および連結を用いて、第一の核酸分子と、少なくとも第二の核酸分子を方向的または非方向的に連結することで、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法を一般に提供する。本明細書で使用される「鎖の侵入」という表現は、第一の２本鎖核酸分子の一方の鎖の、第二の核酸分子の１本鎖部分による置換を意味する（１本鎖は、置換鎖に実質的に同一なヌクレオチド配列を有し、また置換鎖に相補的な鎖とハイブリダイズすることが可能である）。
【００６０】
方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端において第一の鎖（例えば３’鎖または５’鎖）に第一の突出を有する第一のｄｓ核酸分子；ならびに第一の実質的に平滑な末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子を接触させることで実施することができる（第一の核酸分子の第一の末端の第一の突出に相補的なヌクレオチドは、第一の実質的に平滑な末端およびその近傍に存在する）。この方法は、第一の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズすることが可能であって、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端、および第二のｄｓ核酸分子の第一の末端が連結可能な条件下で実施される。第一の突出は、３’突出、または５’突出の場合がある。本発明はさらに、上述の方法の使用に適した分子を調製する際に使用可能な前駆体核酸分子を提供する。本発明は、上述の方法で調製される核酸分子も提供する。
【００６１】
図１は、共有結合で連結された組換え核酸分子の作製に使用することができる本発明の方法の例を示している。図１の四角および円は、鎖の置換が起こりうる、配列相補性のある領域を示す。置換に必ずしも関与しない（関与は可能）ｄｓ核酸分子の他の末端は、実質的に平滑末端を含む場合がある、または３’もしくは５’の突出を含む場合がある任意の構造をとりうる。第一のｄｓ核酸分子、第二のｄｓ核酸分子、第三のｄｓ核酸分子（以下同様）上における平滑末端、および／または突出の他の組み合わせは、本発明の方法で連結可能であり、また部分的には、図１に挙げられた例を元に当業者には明らかになると思われる。
【００６２】
図１Ａに示されているように、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端において第一の鎖上に第一の突出を有する第一のｄｓ核酸分子；第一の実質的に平滑な末端、および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の実質的に平滑な末端は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）；ならびに核酸分子を連結するための試薬（例えばトポイソメラーゼ、リガーゼ、またはリコンビナーゼを含む試薬）を接触させることで実施することができる。この方法は、第一の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で実施することができる。また、この方法は、一つの核酸分子の５’鎖を、第二の核酸分子の３’鎖に連結可能な試薬の存在下で、また第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端と、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端が連結される条件下で実施することができる。上述の方法の変形形態、ならびに上述の他の方法において、第一の突出は、３’突出、または５’突出の場合がある。
【００６３】
図１Ｂに示されているように、連結された組換え核酸分子、例えば方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、第一の末端および第二の実質的に平滑な末端において第一の鎖に第一の突出を有する第一のｄｓ核酸分子；ならびに、第一の実質的に平滑な末端、および第二の突出を有する第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を有し、また第一の核酸分子の第二の実質的に平滑な末端は、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の第二の突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）に接触させることで実施することができる。この方法は、第一の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端に相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズし、また第二の突出が、第一のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端に相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズする条件下で実施される。また、この方法は、一つの核酸分子の３’鎖と、別の核酸分子の５’鎖との連結を触媒する試薬の存在下で、また、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に連結され、また第一のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端の３’端が、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端に連結される条件下で実施することができる。上述の方法のさまざまな変形形態において、第一の突出および第二の突出の一方または両方は、３’突出または５’突出の場合がある。したがってｄｓ核酸分子は、各末端における核酸の鎖の共有結合による連結が環状の組換え核酸分子の形成を導く、二つの別個の鎖の侵入を生じることができる。
【００６４】
図１Ｃに示されているように、連結された組換え核酸分子、例えば方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第二の突出を有する第一の末端および第二の末端において第一の突出を有する第一のｄｓ核酸分子；ならびに第一の実質的に平滑な末端、および第二の実質的に平滑な末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を有し、また第二の核酸分子の第二の実質的に平滑な末端は、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端の第二の突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）に接触させることで実施することができる。この方法は、第一の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能で、また第二の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で実施することができる。また、この方法は、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端に連結され、また第一のｄｓ核酸分子の第二の末端が、第二のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端に連結される条件下で実施することができる。上述の本発明のさまざまな変形形態において、第一の突出および第二の突出の一方または両方は、３’突出または５’突出の場合がある。したがってｄｓ核酸分子は、各末端における核酸の鎖の共有結合による連結が環状の組換え核酸分子の形成を導く、二つの別個の鎖の侵入を生じることができる。
【００６５】
図１Ｄに示されているように、連結された組換え核酸分子、例えば方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端の第一の鎖に第一の突出を有する第一のｄｓ核酸分子；第一の実質的に平滑な末端および第二の実質的に平滑な末端を有する第二のｄｓ核酸分子；ならびに第一の末端において第一の鎖に第二の突出を有する第三のｄｓ核酸分子（第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端は、第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を有し、第二のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端は、第二の突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）を接触させることで実施することができる。この方法は、第一の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能で、また第二の突出が、第二のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で実施することができる。また、この方法は、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端に連結され、また第三のｄｓ核酸分子の第一の末端が、第二のｄｓ核酸分子の第二の実質的に平滑な末端に連結される条件下で実施することができる。上述の方法のさまざまな変形形態において、第一の突出および第二の突出の一方または両方は、３’突出または５’突出の場合がある。
【００６６】
図１Ｅに示されているように、連結された組換え核酸分子、例えば方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の実質的に平滑な末端を有する第一のｄｓ核酸分子；第一の末端において第一の鎖に第一の突出を有し、また第二の末端において第二の鎖に第二の突出を有する第二のｄｓ核酸分子；ならびに第二の実質的に平滑な末端を有する第三のｄｓ核酸分子（第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端は、第二の核酸分子の第一の末端の第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を有し、また第二の実質的に平滑な末端は、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の第二の突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）を接触させることで実施することができる。この方法は、第一の突出が、第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能で、また第二の突出が、第二の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で実施することができる。また、この方法は、第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端に連結され、また第三のｄｓ核酸分子上に位置する第二の実質的に平滑な末端が、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端に連結される条件下で実施することができる。上述の方法のさまざまな変形形態において、第一の突出および第二の突出の一方または両方は、３’突出または５’突出の場合がある。
【００６７】
方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の実質的に平滑な末端およびその近傍に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼを有する第一のｄｓ核酸分子；ならびに、第一の末端において第一の鎖に第一の３’突出を有する第二のｄｓ核酸分子（第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端は、第一の３’突出に相補的なヌクレオチド配列を有する）を接触させることで実施することができる（図２参照）。この方法は、第一の３’突出が、第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端の相補的なヌクレオチド配列と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で実施することができる。また、この方法は、トポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に共有結合で連結可能なように実施することができる（参照として全体が本明細書に組み入れられる、ＣｈｅｎｇおよびＳｈｕｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２０：８０５９〜８０６８、２０００）。
【００６８】
第一のｄｓ核酸分子の第一の実質的に平滑な末端またはその近傍に、共有結合で連結された状態のトポイソメラーゼのもつ、第二のｄｓ核酸分子と３’突出とを共有結合で連結する能力（図２）は、共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼの、切断可能なホスホジエステルの５’側におけるＤＮＡとの接触に関する、これまで価値を認められていなかった構造的柔軟性を示す。スーパーコイルＤＮＡの弛緩が触媒されることで、共有結合で結合された状態のＩＢ型トポイソメラーゼは、下流の２本鎖と離れ、切断可能なリン酸の反対側のホスホジエステル結合の周囲における２本鎖の回転を可能とした後に、バックボーンを再び閉じることができる。
【００６９】
本発明の方法は、核酸分子の１本の鎖を実質的に置換することにより、相同性に依存した連結後に、残存するニックを修復するための追加的な反応を実施する必要性をなくすように実施することができる（図２参照）。例えば、この方法は、１個の核酸分子の突出配列が、全長を伸長するように、また鎖の侵入に伴って他のｄｓ核酸分子の鎖が置換されるように実施することができる。したがって、この態様では、トポイソメラーゼによって連結されなかった鎖にニックは必要ではない。
【００７０】
本発明の方法で連結されるｄｓ核酸分子の末端は、１個の核酸分子の５’端と、別の核酸分子の３’端との連結に有用な任意の試薬を用いることで、共有結合で結合されうる。したがって、末端を共有結合的に連結させるための試薬は例えばＩＡ型、ＩＢ型、またはＩＩ型のトポイソメラーゼを含むトポイソメラーゼ；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ；ＦＬＩＰリコンビナーゼ、Ｉｎｔインテグラーゼ、もしくはｃｒｅリコンビナーゼを含むリコンビナーゼ；または別のＩＮＴファミリーの酵素である（例えばＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ． ２６：３９１〜４０６、１９９８を参照）。また、一つのニックが一方の鎖の連結後に残る場合、ニックは、インビボ連結法によって、例えばニックの入ったｄｓ核酸分子を大腸菌などの細胞に導入することで閉じることができる場合がある。ある好ましい態様では、鎖の置換がかかわる２か所の末端の連結段階には、トポイソメラーゼによる連結が関与する。また、第一のｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子との連結段階に関して開示された方法では、第三の核酸分子を、鎖の置換に関与しない第一の核酸分子、または第二の核酸分子の末端に連結させることもできる。
【００７１】
本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子を、少なくとも第二のｄｓ核酸分子に、非方向的または好ましくは方向的に連結する際に実施することができる。しかし、この方法により、ｄｓ核酸分子の一方の両端の終端もしくはその近傍におけるヌクレオチド配列と、もう一方のｄｓ核酸分子の少なくとも一端の終端もしくはその近傍におけるヌクレオチドとの間に相補性が存在する態様において、第一の核酸分子と第二の核酸分子を非方向的に連結することができる。あるｄｓ核酸分子の両端の終端またはその近傍におけるヌクレオチド配列と、別のｄｓ核酸分子の少なくとも一方の鎖との間における、このような相補性は、例えば同一のヌクレオチド配列を、ｄｓ核酸分子の両端の同じ末端（５’または３’）に含めることにより達成することができる。これは例えば、同じ制限酵素で切断可能な標的配列、および同じヌクレオチド配列を含む標的配列を設計することで達成することができる。
【００７２】
本発明は、望ましいならば２個またはそれ以上（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個など）の核酸分子を使用可能に連結させる段階を含む、第一の核酸分子と、少なくとも第二の核酸分子を方向的または非方向的に連結する方法にも関する。方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の末端において共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼ、および第二の末端において共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを有し、第一の末端に５’突出を、また第二の末端に平滑末端、３’ウリジン突出、３’チミジン突出、または第二の５’突出も含む、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子；ならびに第一の平滑末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する）を接触させることで実施することができる。第一のトポイソメラーゼおよび第二のトポイソメラーゼは、例えばワクシニアウイルスの２個のＩＢ型トポイソメラーゼを含む２個のＩＢ型トポイソメラーゼのように同じ場合もあれば、異なる生物に由来する２個のＩＢ型トポイソメラーゼ、またはＩＢ型トポイソメラーゼ、およびＩＡ型トポイソメラーゼもしくはＩＩ型トポイソメラーゼを含むように異なる場合もある。
【００７３】
本発明の方法を実施する際には、第二の核酸分子の５’ヌクレオチド配列が、第一の５’突出と選択的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、第一のｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子を接触させ、それにより第一のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端に共有結合で連結し、また第二のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端の３’端を、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端に共有結合で連結することで、方向的もしくは非方向的に連結された組換え核酸分子を作製可能になる。したがって本発明は、このような方法で作製された、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を提供する。
【００７４】
本明細書で開示されるように、本発明の方法は、２個またはそれ以上のｄｓヌクレオチドを所定の方向に方向的に連結する手段を提供することができる。本明細書で使用される「方向的に連結する」という表現は、２個またはそれ以上の核酸分子の特定の所定の順序および／または方向における、共有結合による連結を意味する。したがって本発明の方法は、プロモーター発現制御領域を、コード配列の上流に共有結合により連結し、またポリアデニル化シグナルをコード領域の下流に共有結合により連結することで、機能性の発現可能な組換え核酸分子を得る手段；または２個のコード配列を、これらが同じ読み枠で転写および翻訳されるように共有結合により連結することで融合タンパク質を得る手段を提供する。本明細書で使用される「非方向的に連結する」という表現は、２個またはそれ以上の核酸分子のランダムな順序、すなわち核酸分子の第一の末端または第二の末端のいずれかが別の核酸分子の末端に連結可能とする、共有結合による連結を意味する。
【００７５】
ｄｓ核酸分子の末端に関して使用される「実質的に平滑である」という表現は、対象末端が平滑となりうること、または突出を有する第二の核酸分子によって鎖の侵入を低下させたり抑制したりしない短い突出をもちうること意味する。例えば実質的に平滑な末端は、実質的に平滑な末端における突出が鎖の侵入を阻害しないという条件で、１個、２個、または少数のヌクレオチドの突出を有する末端を含む場合がある。例えば第二のｄｓ核酸分子は、５’アデノシン、または５’イノシンの突出を有する場合がある。
【００７６】
本明細書における、「第一の核酸分子」、「第二の核酸分子」、「第三の核酸分子」などの記述は、複数の核酸分子のどれが言及されているかを示す手段を提供する際にのみ使用されると解釈される。したがって、特定の核酸分子に関して、何ら具体的に定義された特徴がない場合は、１個の核酸分子、または核酸分子の集団、もしくは複数の核酸分子に関して使用される「第一」、「第二」、「第三」などという表現は、対象核酸分子に関する任意の特定の順序、重要性、または他の情報を示すことは意図されない。したがって、例示的な方法が例えば、ＰＣＲを用いて、増幅産物がトポイソメラーゼ認識部位を一端または両端に含むように第一のｄｓ核酸分子を増幅するという場合は、同様に第二（または他）のｄｓ核酸分子も同じように増幅されうると解釈される。
【００７７】
ｄｓ核酸分子に関して使用される「少なくとも第二の」という表現は、第一のｄｓ核酸分子に加えて、１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）の核酸分子を意味する。したがって、この表現は、１津の第二の核酸分子のみを意味する場合があるほか、１つの第二の核酸分子および１つの第三の核酸分子（またはそれ以上）を意味する場合がある。したがって「第二（または他）のｄｓ核酸分子」、または「第二（および他）のｄｓ核酸分子群」という表現は、「少なくとも第二の核酸分子」という表現が、第二の、第三の、またはそれ以上の核酸分子を意味しうるという事実を意識して本明細書で使用される。特に示された部分を除き、「少なくとも第二の核酸分子」という表現の意味に含まれる核酸分子は、第一の核酸分子と同じか、または実質的に同じ場合があると解釈される。例えば第一および第二のｄｓ核酸分子は、これらの分子の一つだけの分子（例えば第一のｄｓ核酸分子）がトポイソメラーゼ認識部位を有することを除き、または相補的な５’突出配列を有すること（例えば第一および第二のｄｓ核酸分子が本発明の方法で方向的に連結されうるように、トポイソメラーゼによる切断によって生成されること）を除いて同じ場合がある。したがって本発明の方法により、例えば発現制御領域などの第三のｄｓ核酸分子によって任意選択で分散可能で、また所定の方向（例えば相互に５’→３’の方向）に方向的に連結された配列を含む場合がある、第一および第二のｄｓ核酸分子の連鎖状分子（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ）を作製することができる。
【００７８】
個々のｄｓ核酸分子、例えば第一のｄｓ核酸分子と呼ばれる配列は一般に、相互に同一な、または実質的に同一な、このような核酸分子の集団を含むと解釈される。したがって「異なる」という表現が、例えば第一の（または第一の集団の）ｄｓ核酸分子と、第二（および他）のｄｓ核酸分子とを比較する際に使用されることは明らかである。本明細書で使用される、本発明の組成物のｄｓ核酸分子に関して使用される「異なる」という表現は、ｄｓ核酸分子が、最適にアライメントしたときにそれぞれの配列同一性が９５％未満であること、一般には配列同一性が９０％未満であること、通常は配列同一性が７０％未満であることを意味する。したがって、例えば相互に多型異型であることのみが異なるｄｓ核酸分子、または異なる５’もしくは３’の突出配列を単に含むｄｓ核酸分子は、本発明の切断部位の目的上、「異なる」とはみなされない。これとは対照的に、異なるｄｓ核酸分子は、ポリペプチドをコードする第一の配列、および発現制御領域を含む第二の配列、または第一のポリペプチドをコードする第一の配列、および非相同のポリペプチドをコードする第二の配列によって例示される。
【００７９】
「組換え体」という用語は、少なくとも２個の核酸分子の連結によって生成される核酸分子を意味するように本明細書で使用される。したがって、本発明の方法に含まれる組換え核酸分子、または本発明の方法で作製される組換え核酸分子は、天然に（例えば減数分裂の過程で）生成される可能性のある核酸分子とは区別される。本発明の方法で作製される組換え核酸分子は、例えば２本鎖の核酸分子中のトポイソメラーゼ結合部位に対して極めて近傍、一般にはすぐ隣、また通常は３’側における相補的な核酸配列によって同定される場合がある。
【００８０】
本明細書で開示されるように、本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子を第二のｄｓ核酸分子に方向的または非方向的に連結する際に使用することができる。多くの態様では、本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子と第二（または他）のｄｓ核酸分子を方向的に連結する際に使用される場合がある。しかし、第一のｄｓ核酸分子と第二（または他）のｄｓ核酸分子を非方向的に連結する方法の使用には利点もある。非方向的に連結する段階は例えば、１）第二のヌクレオチド配列が、第二の突出の全体または一部を形成可能な、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端またはその近傍に存在して、第二のｄｓ核酸分子の５’の相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な場合；ならびに、２）ヌクレオチド配列が、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’突出とハイブリダイズすることが可能な第二のｄｓ核酸分子の第一の末端と第二の末端の両方の５’端またはその近傍に存在する場合に実施することができる。これらの態様では、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端、および第二のｄｓ核酸分子の第二の末端はいずれかが平滑であるか、または突出を含む。
【００８１】
別の態様では、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法は、例えば第一の５’標的配列を５’端に、またトポイソメラーゼ認識部位を３’端またはその近傍に有する第一の末端、およびトポイソメラーゼ認識部位を３’端またはその近傍に有する第二の末端を有する第一の前駆体ｄｓ核酸分子；第一の平滑末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は第一の前駆体ｄｓ核酸分子の５’標的配列に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する）；ならびにトポイソメラーゼ認識部位に特異的なトポイソメラーゼを接触させることで実施することができる。本明細書で使用されるように、「前駆体」ｄｓ核酸分子という呼称は、トポイソメラーゼ認識部位を含むｄｓ核酸分子、および同認識部位に特異的なトポイソメラーゼによる切断で、所望の５’端のヌクレオチド配列、３’端のヌクレオチド配列、またはこれら両方を有する末端を生じるｄｓ核酸分子を意味する。このような所望の末端は、部分的には、５’標的配列を含むｄｓ核酸分子の切断によって、このｄｓ核酸分子を第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結することを可能とする５’ヌクレオチド配列に変換される５’標的配列の存在によって作製される。
【００８２】
本発明の方法により、第一のｄｓ核酸分子、第二のｄｓ核酸分子、およびトポイソメラーゼは、トポイソメラーゼ活性を可能とする条件、すなわちトポイソメラーゼが認識部位に結合してこれを切断し、トポイソメラーゼをチャージした３’端を生じることを可能とする、および３’端を適切な５’端に連結可能とする条件下で接触される。このような条件により、トポイソメラーゼによる切断後に残る第一の５’標的配列の一部と、５’標的配列の同じ部分に相補的な第二のｄｓ核酸分子の５’ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能となる。
【００８３】
本発明の方法を実施するにあたって、前駆体ｄｓ核酸分子を、トポイソメラーゼおよび第二のｄｓ核酸分子と同じ反応容器中に同時にまとめることで、その後に、前駆体ｄｓ核酸分子が、第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結可能なトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子に変換される場合がある。トポイソメラーゼを、前駆体ｄｓ核酸および第二の核酸と同じ反応容器内にまとめることにより、本発明の方法は単純化される。または、第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、トポイソメラーゼによる切断および結合を可能とする条件下でトポイソメラーゼとまとめることが可能であり、続いて第二のｄｓ核酸分子を付加することができる。
【００８４】
前駆体ｄｓ核酸分子は、線状または環状（スーパーコイルを含む）の場合があり、また、１種または複数のトポイソメラーゼによる切断の結果、また望ましいならば、制限エンドヌクレアーゼによる切断の結果、トポイソメラーゼをチャージした線状の第一のｄｓ核酸分子が得られる。例えば相互に約１００ヌクレオチド以内で相補鎖内に、好ましくは相互に約２０ヌクレオチド以内で相補鎖内に、２か所のＩＢ型トポイソメラーゼ認識部位を含む環状ｄｓ核酸分子は、部位特異的なＩＢ型トポイソメラーゼに、各鎖が切断されて介在配列が解離することで各末端に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを有する線状のｄｓ核酸分子が得られるように接触させることができる。
【００８５】
一般に、第二の、または他のｄｓ核酸分子に方向的に連結可能な、トポイソメラーゼをチャージした２本鎖核酸は、トポイソメラーゼを、少なくとも１か所のトポイソメラーゼ認識部位を第一の標的配列の一方の末端またはその近傍に含む前駆体ｄｓ核酸分子に接触させることで得られる。本明細書で使用される「トポイソメラーゼ認識部位」という表現は、部位特異的なトポイソメラーゼが認識して結合する特定のヌクレオチド配列を意味する。例えばヌクレオチド配列
2004517608.tif 000003
は、ワクシニアウイルスのＤＮＡトポイソメラーゼＩを含むポックスウイルスのトポイソメラーゼの多くが特異的に結合して、認識部位の最も３’側のチミジンを鎖を切断して
2004517608.tif 000004
を含む核酸分子、すなわちトポイソメラーゼのチロシン残基を介して３’リン酸に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼの複合体を生じることが可能なトポイソメラーゼ認識部位である（参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｈｕｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１１３７２〜１１３７９、１９９１；ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＳｈｕｍａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ． ２２：５３６０〜５３６５、１９９４を参照；米国特許第５，７６６，８９１号；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６０９９；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２３７２も参照）。
【００８６】
前駆体ｄｓ核酸分子を、例えば一端または両端から約２〜１５ヌクレオチド（例えば２残基、３残基、４残基、５残基、６残基、７残基、８残基、９残基、１２残基、１４残基、１５残基、または２０残基のヌクレオチド）にＩＢ型トポイソメラーゼの認識部位を含むように構築する上での利点は、部位特異的なトポイソメラーゼによるｄｓ核酸分子の切断によって５’突出が作製されることである。それぞれ２〜２０ヌクレオチドを含む場合がある、このような５’突出配列は、所望の任意の配列をもつように、本明細書に開示されたＰＣＲ法で設計される場合がある。したがって、切断された第一のｄｓ核酸分子が、選択された第二（または他）のｄｓ核酸分子に本発明の方法で方向的に連結される場合、また選択された配列が５’突出配列を有する場合、第一のｄｓ核酸分子上の５’突出は、２個（またはそれ以上）の配列が５’突出の相補性があるために所定の方向に方向的に連結されるように、選択された第二（または他）のｄｓ配列上の５’突出に相補的になるように設計することができる。上述したように、同様の方法を、ＩＡ型トポイソメラーゼまたはＩＩ型トポイソメラーゼによる切断によって生じる３’突出配列に関して行うことができる。
【００８７】
本明細書で使用されるように、トポイソメラーゼ認識部位に関して使用される「切断産物」という用語は、トポイソメラーゼにより通常その認識部位で切断されて、ＩＢ型トポイソメラーゼの場合であればトポイソメラーゼ認識部位中の３’端のヌクレオチドの３’リン酸基に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼの複合体、またはＩＡ型もしくはＩＩ型のトポイソメラーゼの場合であればトポイソメラーゼ認識部位中の５’端のヌクレオチドの５’リン酸基に共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼの複合体を含む核酸分子を意味する。共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを有する、トポイソメラーゼで切断されたｄｓ核酸分子を含む、このような複合体は本明細書では「トポイソメラーゼで活性化された」核酸分子、または「トポイソメラーゼをチャージした」核酸分子と呼ばれる。トポイソメラーゼで活性化されたｄｓ核酸分子は、未切断状態のトポイソメラーゼ認識部位およびトポイソメラーゼを含むｄｓ核酸分子（トポイソメラーゼはｄｓ核酸分子を認識部位で切断可能であり、共有結合で結合された状態となる）が可能なように本発明の方法に使用することができる。
【００８８】
本開示から容易に明らかになるように、本発明の方法で連結されるｄｓ核酸分子の末端は、さまざまな特徴をもちうる。例えば一つの局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸の第二の末端は、トポイソメラーゼによる切断後に平滑末端となり、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は平滑末端である。別の局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端は、トポイソメラーゼによる切断後に３’チミジンの延長を有し、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は３’アデノシン突出を有し、または同末端は３’アデノシンの突出、および３’デオキシウリジンの突出を含む場合がある（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，４８７，９９３号および第５，８５６，１４４号を参照）。さらに別の局面では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、第二の末端に第二の５’標的配列を有し、第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は、第二の５’標的配列の少なくとも一部に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する。第一の前駆体ｄｓ核酸分子は、クローニングベクターおよび発現ベクターを含むベクターである場合があり、また一般に環状形状で示される場合は、トポイソメラーゼの作用によって直線化されたり、または例えば、トポイソメラーゼと接触させることで第一および第二のｄｓ核酸分子が本発明の方法で方向的に連結可能なように、ベクターを直線化する１種または２種の制限エンドヌクレアーゼを含めることによって直線化されたりする場合がある。
【００８９】
本明細書で使用される、核酸分子の３’端（ＩＢ型）または５’端（ＩＡ型もしくはＩＩ型）に対するトポイソメラーゼ認識部位の近接性に関して使用される「末端またはその近傍」という表現は、３’端または５’端からそれぞれ約１〜１００ヌクレオチド以内にある部位、通常は末端から約１〜２０ヌクレオチド以内にある部位、また特に個々の末端から約２〜１２ヌクレオチド以内にある部位を意味する。トポイソメラーゼ認識部位を、末端の約１０〜１５ヌクレオチド以内に配置することの利点は、トポイソメラーゼによる切断後に、切断部位の下流にある配列の一部が、共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを含む残存する核酸分子から自然に解離する場合があることである（通常「自殺的切断」と呼ばれる；例えばＳｈｕｍａｎ、前記、１９９１；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、前記、１９９１を参照）。トポイソメラーゼ認識部位が、末端から約１２〜１５ヌクレオチドより長い場合は、切断部位の上流または下流にある核酸分子は、反応条件を改変すること（例えばトポイソメラーゼ切断部位を含む２本鎖の一部の溶解温度以上の温度におけるインキュベーション段階を加えること）によって、残存する配列からの解離が誘導される場合がある。
【００９０】
第一の末端および第二の末端に５’標的配列およびトポイソメラーゼを有する第一の前駆体ｄｓ核酸分子を用いる本発明の方法により、第一の前駆体ｄｓ核酸分子を第二のｄｓ核酸分子に方向的または非方向的に連結することができる。この方法は典型的には、第一の前駆体ｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子を方向的に連結する際に使用され、また第一の前駆体ｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子を非方向的に連結する際にも使用される場合がある。非方向的な連結は例えば、１）第二のヌクレオチド配列が、第二のｄｓ核酸分子の５’の相補的なヌクレオチド配列とのハイブリッドの形成を可能とするように、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端またはその近傍に存在する場合；ならびに、２）ヌクレオチド配列が、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第一の末端またはその近傍において５’標的配列とのハイブリッドの形成を可能とするように、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端と第二の末端の両方の５’端またはその近傍に存在する場合に実施することができる。これらの態様では、第一の前駆体ｄｓ核酸分子の第二の末端、および第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は、いずれかが平滑末端か、または突出を含む。
【００９１】
方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を作製する方法も、第一の末端に第一の５’突出を、また３’端に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼを有するトポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子と、第一の平滑末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は、第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む）を接触させることで実施することができる。この方法は、第一の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第一の５’突出と選択的にハイブリダイズすることが可能で、第一のトポイソメラーゼが、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端と、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’端とを共有結合で連結可能な条件下で実施することができる。
【００９２】
このような方法はさらに、トポイソメラーゼをチャージした第一のｄｓ核酸分子および第二のｄｓ核酸分子を、第三のｄｓ核酸分子に接触させる段階を含む場合がある（第三のｄｓ核酸分子の第一の末端は、５’突出および３’端に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを有し、また第二のｄｓ核酸分子は、第三の核酸分子の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む第二の平滑末端を有する）。この接触段階は例えば第二のｄｓ核酸の第二の平滑末端の５’ヌクレオチド配列が、第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の５’突出と選択的にハイブリダイズ可能で、第二のトポイソメラーゼが、第三のｄｓ核酸分子の第一の末端の３’端と、第二のｄｓ核酸分子の第二の平滑末端の５’端とを共有結合で連結させることが可能な条件下で実施することができる。第一のトポイソメラーゼおよび第二のトポイソメラーゼは、同じ場合もあれば異なる場合もあり、望ましいならば、第一のｄｓ核酸分子または第三のｄｓ核酸分子は、トポイソメラーゼをチャージしたものではなく、トポイソメラーゼ認識部位を含む場合がある（この方法は、反応物にトポイソメラーゼを接触させる段階をさらに含む場合がある）。本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子が、第二のｄｓ核酸分子に方向的に連結され、その後に第三のｄｓ核酸分子が、第二のｄｓ核酸分子に方向的または非方向的に連結するように、またはすべての反応物が同時に含まれうるように実施することができる。
【００９３】
本発明の方法は、ｃＤＮＡすなわち単離されたゲノムＤＮＡ配列の読み枠を、１個または複数の発現制御領域を推定コード配列に使用可能に連結することで発現可能とする手段を提供する。本発明に有用な発現制御領域の例は本明細書に開示されており、また転写発現制御領域、翻訳発現制御領域、また核酸分子またはポリペプチドの細胞内（または細胞外）における輸送または局在化を促進する配列や、検出可能な表現型をもたらす配列などを含む。転写発現制御領域には例えば、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、およびヘルペスウイルスに由来するプロモーターなどのプロモーター、ならびにメタロチオネイン、骨格アクチン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホグリセリン酸、ジヒドロ葉酸還元酵素、およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）などのウイルス由来のＬＴＲに由来するプロモーター；免疫グロブリンのエンハンサーなどの構成的に活性を示すエンハンサー、またはＳＶ４０のエンハンサーなどの誘導型のエンハンサーなどが含まれる。例えばメタロチオネインプロモーターは、銅、ニッケル、またはカドミウムのイオンなどの金属イオン曝露に応じた高レベルの発現も誘導可能な構成的に活性を示すプロモーターである。これとは対照的に、テトラサイクリン（ｔｅｔ）の誘導型プロモーターは、テトラサイクリン、またはテトラサイクリン類似体（通常は不活性な分子）に対する曝露に応じて誘導されるプロモーターの例である。
【００９４】
転写発現制御領域は、組織特異的な発現制御領域、例えば、コードされた産物の発現が個人の筋肉組織に制限されるような、または培養中、例えば器官培養に含まれる混合細胞集団の筋肉細胞に制限されるような、筋肉細胞に特異的な発現制御領域の場合もある。例えば、筋肉のクレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーター（参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８：２８９６〜２９０９、１９８８）、およびミオシン軽鎖遺伝子のエンハンサー／プロモーター（参照として本明細書に組み入れられる、Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５８４７〜５８５１、１９９１）を含む筋肉細胞に特異的な発現制御領域は当技術分野で周知である。他の組織特異的なプロモーター、ならびに細胞または生物体の特定の発生段階でのみ発現される発現制御領域は、当技術分野で周知である。
【００９５】
本発明の方法によるコンストラクトの作製に有用な発現制御領域、または他の領域は、さまざまな方法で得られる。特に多くの領域が市販のベクターに含まれており、またベクターから単離することが可能であり、また例えば、本明細書に開示されているＰＣＲ法を用いて一端または両端においてトポイソメラーゼ認識部位を含むように改変することができる。また、本明細書で有用な領域をコードする配列は一般によく知られており、諸文献に開示されている。多くの場合、このような配列、例えば転写および翻訳の発現制御領域、ならびに細胞区画化ドメインは比較的短い配列なので、このような配列、またはこのような配列をコードするヌクレオチド配列の化学合成に適している。したがって一つの態様では、本発明の方法による、または本発明のキットに含まれる、組換え核酸分子の作製に有用な本発明の組成物を含む配列は、化学合成することが可能であり、望ましくは、トポイソメラーゼ認識部位を同配列の一端もしくは両端に含むように合成することができるほか、またさらに部位特異的なトポイソメラーゼによる切断後に突出配列を含むように合成することができる。
【００９６】
ｄｓ核酸分子が本発明の方法で方向的に連結される場合、このような核酸分子は一般に、作製される組換え核酸分子が、所望の構造を有し、所望の機能を発揮し、また所望の発現産物をコードするなどといったように、使用可能に連結される。本明細書で使用される「使用可能に連結される」という表現は、２個またはそれ以上の核酸分子が、一方または両方の配列、またはこれらの組み合わせに由来する機能に影響するように一つの単位として作用するように、相互に配置されることを意味する。例えば読み枠を含む核酸分子は、細胞内で通常ゲノムに結びつけられている読み枠の発現に作用を及ぼすのと似た方法で読み枠の調節作用をもたらすようなプロモーターに使用可能に連結される場合がある。同様に、複数の読み枠を含む２個またはそれ以上の核酸分子は、転写および翻訳に伴い、キメラの融合ポリペプチドが生成されるように、同じ読み枠で使用可能に連結することができる。
【００９７】
読み枠を含む第一のｄｓ核酸分子は、任意の増幅法、例えばプライマー対を用いたＰＣＲで増幅して、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を有する増幅された第一のｄｓ核酸分子を作製することができる。増幅された第一のｄｓ核酸分子の両端が、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸上における二つの突出に相補的である場合、５’突出は相互に異なる。増幅された第一のｄｓ核酸分子は次に、第二の核酸分子が本発明の方法によりコード配列の５’端に使用可能に連結されるように、プロモーターなどの所望の発現制御領域を含むトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子と接触させることができる。
【００９８】
成分のさまざまな組み合わせを本発明の方法に使用することができる。例えば本発明の方法は、トポイソメラーゼで活性化された第一のｄｓ核酸分子；第一の末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の末端もしくは第二の末端、またはこの両方において、第二の核酸分子は、同じ末端の５’端においてヒドロキシル基を有する）；ならびに５’突出を接触させることで実施することができる。連結される一端または両端の５’端が５’リン酸基を有する場合、ホスファターゼも反応混合物の成分に接触させることができる。接触させることで、ホスファターゼは、必要であれば、５’ヒドロキシル基を同じ末端に作製することが可能であり、また第二のｄｓ核酸分子が次に、トポイソメラーゼで活性化された第一のｄｓ核酸分子に方向的に連結されうる。当業者であれば、成分の他の組み合わせが、本発明の方法を実施するうえで有用であることを理解すると思われる。
【００９９】
本明細書で使用される、第一の核酸分子と第二の核酸分子を「すべての成分が接触する条件下で」接触させる段階とは、反応条件が、第一のｄｓ核酸分子の、トポイソメラーゼにより切断される末端が、トポイソメラーゼがその酵素活性の作用を及ぼすのに十分近接して、第一のｄｓ核酸分子の３’端を、第二の核酸分子の末端における５’ヒドロキシル基に共有結合で連結するのに適切であることを意味する。このような条件の例には、例えば反応温度、イオン強度、およびｐＨなどが含まれる。また条件は経験的に決定される場合があるほか、当技術分野で周知であるように、核酸分子の特定のハイブリダイゼーションの条件を予測する公式を用いて決定されうる（例えばそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９を参照）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、１９８７、および１９９５年までの補遺を参照）。
【０１００】
本明細書で開示される、相補的なヌクレオチド配列を、増幅されたｄｓ核酸分子の一端または両端に取り込ませるように設計されたプライマーを用いるＰＣＲ法は、本発明の方法に有用なｄｓ核酸分子を作製する簡便な手法の例である。プライマー対の少なくとも１本のプライマーは、５’から３’の方向に、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子上にある第一の突出に相補的なヌクレオチド配列を含むように設計される。ＰＣＲプライマー対の第二のプライマーは、増幅対象の核酸分子の所望の配列に相補的な場合があり、また第二の相補配列を含む場合がある。
【０１０１】
プライマーは、例えばａｔｔ部位やｌｏｘ部位などの部位特異的な組込み認識部位を含む、他の任意の対象配列を含んだりコードしたりする場合もあれば、上述したように、トポイソメラーゼ認識部位を、上記対象配列を含むｄｓ核酸分子に導入する際に単に使用される場合がある。本発明の方法で作製される組換え核酸分子、および部位特異的な組込み認識部位（ａｔｔ部位やｌｏｘ部位など）を含む組換え核酸分子は、例えば必要とされる組込み部位（それぞれａｔｔ部位もしくはｌｏｘ部位）を含むベクターや遺伝子座などの所望の遺伝子座に特異的に組込み可能であり、また部位特異的な現象（例えば、それぞれλファージのＩｎｔタンパク質およびＩＨＦタンパク質、もしくはＣｒｅリコンビナーゼ）に必要な適切な酵素と接触させることで組込み可能である。例えばａｔｔＢ配列もしくはａｔｔＰ配列の、本発明の方法による方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子への組込みにより、ゲートウェイ（商標） クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いた核酸分子の簡便な操作が可能となる。本発明の方法に使用される第一のｄｓ核酸分子は、２か所の部位特異的な組込み部位を含む直線化されたベクター（例えば「エントリーベクター」（ゲートウェイ（商標）クローニングシステム）の場合があり、また本発明の方法により、第二（または他）のｄｓ核酸分子を部位特異的な組込み部位の間に挿入することができる。
【０１０２】
本発明の方法またはキットに使用されるｄｓ核酸分子は、任意の増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、相補的なヌクレオチド配列を５’端に含むように増幅することができる。ＰＣＲで例示されるが、他の増幅法により、増幅後の核酸分子が相補的な配列をその末端の一つの５’端にもつように核酸分子を増幅することもできる。相補的なヌクレオチド配列は、増幅された核酸が連結される、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸上の５’突出に相補的である。相補性の存在は核酸分子の所定の方向における会合を促し、分子は本発明の方法により、トポイソメラーゼによって連結される場合がある
【０１０３】
増幅用プライマーは、所望のｄｓ核酸分子、例えば転写もしくは翻訳の発現制御領域、またはエピトープタグもしくは細胞区画化ドメインなどの対象コード配列をコードするｄｓ核酸分子に特異的な特徴をもたらすように設計することができる。この局面では、増幅用プライマーは、増幅に伴ってｄｓ核酸分子が、５’相補配列を一端または望ましくは両端に含むように設計される。
【０１０４】
増幅用プライマーは、本発明の方法で作製された方向的に連結された組換え核酸分子を増幅するために使用することもできる。例えば本発明の方法は、プロモーター、コード配列を含む核酸分子、およびポリアデニル化シグナルを含む核酸分子を含む核酸分子を含む三種のｄｓ核酸分子から、発現可能な組換え核酸分子を作製することができる。このような核酸分子の作製は、相補的な５’（または３’）の配列を、連結されるｄｓヌクレオチド配列の末端に組込むことで促進される（好ましくは相補的な配列の一方は突出配列である）。
【０１０５】
したがって、プロモーターの上流にあるプロモーターを含む核酸分子の突出に特異的な第一のプライマー、およびポリアデニル化シグナルの下流にある同シグナルを含む核酸分子の突出に特異的な第二のプライマーを含むＰＣＲ用プライマー対を設計することで、プロモーター、コード配列、ポリアデニル化シグナルを正しい（所定の）方向で含む完全長の機能性の組換え核酸分子のみが増幅される。具体的には、部分反応産物、例えばコード配列に連結されたプロモーターのみを含む反応産物、およびニックを含む反応産物を含む反応産物は増幅されない。したがってＰＣＲにより、本発明の方法に有用なｄｓ核酸分子を選択的に設計すること、また所望の成分および特徴を有する反応産物のみを選択的に増幅することができる。
【０１０６】
本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子に方向的に連結される第二のｄｓ核酸分子が、複数の第二のｄｓ核酸分子の一つとなるように実施することができる。本明細書で使用される、第一の核酸分子、または少なくとも第二の核酸分子に関して使われる「複数」という表現は、核酸分子が関連するが異なることを意味する。本発明の目的では、複数の核酸分子は、複数の核酸分子のそれぞれが例えば第二のｄｓ核酸分子を方向的に連結される、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子上に存在する５’突出配列に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む意味において「関連する」。また複数の核酸分子は、これらが例えばｃＤＮＡライブラリー、核酸分子のコンビナトリアルライブラリー、核酸分子のさまざまな集団などを含む場合がある点において「異なる」。ｃＤＮＡライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、核酸分子のさまざまな集団を含むライブラリーなどを作製する方法は、当技術分野で周知である（例えばそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８３７，５００号；米国特許第５，６２２，６９９号；米国特許第５，２０６，３４７号；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０、１９９２；Ｍａｒｋｌａｎｄら、Ｇｅｎｅ １０９：１３〜１９、１９９１；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５８８３〜５８８７、１９９６；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５〜５１０、１９９０；Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３〜７９７、１９９５を参照）。
【０１０７】
第二のｄｓ核酸分子が、ｄｓ核酸分子の集団の一つである場合、本発明の方法はさらに、第一のｄｓ核酸分子の集団を使用することができる（それぞれは、異なりかつランダムに作製されたヌクレオチド配列を、第一の末端および／または第二の末端の３’端および／または５’端、もしくはその近傍に含む（例えばランダムに作製された３’もしくは５’の突出を第一の末端もしくはその近傍に含む）。末端の近傍にランダムに作製されたヌクレオチド配列の集団は、複数の第二のｄｓ核酸分子の多く、もしくはすべての末端もしくはその近傍におけるヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。したがって本発明により、複数の第二のｄｓ核酸分子中の多く、またはすべての核酸分子を含む、連結された組換え核酸分子を作製することができる。
【０１０８】
本発明の方法は、分子生物学分野における応用範囲が広い。以下に詳述するように、本発明の方法により、例えばＤＮＡプローブもしくはＲＮＡプローブを標識すること、センスＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡを作製すること、ツーハイブリッドアッセイ法に用いるベイトコンストラクトまたはプレイコンストラクトを調製すること、線状の発現配列を調製すること、共役インビトロ転写／翻訳アッセイ法に有用なコンストラクトを調製すること、また方向的なクローニングを実施することができる。
【０１０９】
本発明のこの局面で作製される方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子は、直線状の場合があるが、好ましくは環状であり、具体的には上述したベクターである。環状の組換え核酸分子は、ベクターの特徴をもつように、また例えば、原核生物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、またはこれら両方における複製に必要な発現制御領域を含むように作製することができる。また同分子は、抗生物質耐性などの表現型をもたらすポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合がある。
【０１１０】
本発明の方法はさらに、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子を、細菌などの原核細胞、もしくは哺乳類細胞などの真核細胞の場合がある細胞に導入する段階を含む場合がある。したがって本発明は、本発明の方法で作製された細胞、ならびにこのような細胞から作製された非ヒトトランスジェニック生物も提供する。このような方法の利点は、本発明の方法で環状化される、作製された組換え核酸分子が、コンストラクトが増幅される適切な宿主細胞を形質転換したり、トランスフェクトしたりすることである。したがって、宿主細胞を用いたインビボ法で、本発明の方法で作製される、大量の環状化産物が得られる。
【０１１１】
本発明の方法は部分的には、作製された連結後の組換え核酸分子が、トポイソメラーゼが連結される末端の３’端のみに結合しているためにニックを一方の鎖に含むか、または本発明の方法で連結された２個の核酸分子の１個のみに完全に由来する１本の鎖を含むことを特徴とすると解釈される。組換え核酸分子がニックを含む場合、望ましいならば例えば、ニックを含む組換え核酸分子にＤＮＡリガーゼを接触させることで、ニックを含む組換え核酸分子をニックを修復可能な細菌などの細胞に導入することにより、または文献に記載されている他の任意の方法により、ニックはホスホジエステル結合に変換される場合がある。したがって一つの態様では、本発明の方法は、鎖の侵入および連結を含む。
【０１１２】
本発明の方法で作製された組換え核酸分子が、当初の核酸分子の一つのみに完全に由来する１本の鎖を含まない場合、本発明の方法は、置換されたヌクレオチド配列が産物から切断される切断段階をさらに含む。このような切断段階は、例えば置換鎖を含む組換え核酸分子に、５’→３’もしくは３’→５’（置換鎖の方向による）の１本鎖の核酸を対象とするエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を接触させる段階を含む、１本鎖ヌクレオチド配列を切断したり分解したりすることが知られている任意の方法で実施することができる。このような方法は、インビトロで簡便に実施することができる。または、このような組換えｄｓ核酸分子を、置換されたヌクレオチド配列が切断される細胞（例えば大腸菌細胞）に導入することができる。
【０１１３】
本発明の方法により、キメラの融合ポリペプチドをコードする、方向的に連結された組換え核酸分子を作製することができる。このような組換え核酸分子を作製する際には、第一のｄｓ核酸分子、および第二（または他）のｄｓ核酸分子はそれぞれ、読み枠のすべてまたは一部をコードすることが可能であり、また本明細書に記載されている第一の末端および／または第二の末端を有する第一のｄｓ核酸分子、および第二（または他）のｄｓ核酸分子が方向的に連結される。このようなキメラポリペプチドは、２個（またはそれ以上）のコードされたペプチド（またはポリペプチド）が１個の産物に翻訳される（すなわちペプチドがペプチド結合を介して共有結合により連結される）融合ポリペプチドを含む場合がある。
【０１１４】
例えば、第一のｄｓ核酸分子は、細胞区画化ドメイン（細胞膜局在化ドメイン、核局在化シグナル、ミトコンドリア膜局在化シグナル、小胞体局在化シグナルなど）、またはタンパク質トランスダクションドメイン（ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴタンパク質トランスダクションドメインなどの、同ドメインが連結したペプチドの細胞内への移行を促進可能なドメイン）をコードする場合がある（参照として本明細書に組み入れられる、Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９〜１５７２、１９９９；Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１８１８８、１９９６；Ｈａｎｃｏｃｋら、ＥＭＢＯ Ｊ． １０：４０３３〜４０３９、１９９１；Ｂｕｓｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８：３９６０〜３９６３、１９８８；米国特許第５，７７６，６８９号を参照）。これらのドメインは、本発明の方法で方向的に連結される、第二のｄｓ核酸分子にコードされたドメインおよびポリペプチドを含む融合ポリペプチドを、細胞内の特定の区画に選択的に向かわせる際に、または細胞から分泌させたり細胞内に侵入させたりする際に有用な場合がある。したがって本発明は、キメラポリペプチドをコードする、方向的に連結された組換え核酸分子を手段を提供する。
【０１１５】
本発明の方法で作製される方向的に連結された組換え核酸分子から発現される融合ポリペプチドは、発現される融合ポリペプチドの検出や単離などを可能とする検出用標識またはタグの特徴をもつペプチドを含む場合もある。例えば本明細書に記載される、トポイソメラーゼ認識部位を含む第一のｄｓ核酸分子、第二のｄｓ核酸分子、もしくは他のｄｓ核酸分子、またはこの切断産物は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、もしくは他の酵素などの酵素をコードする場合があるほか、ポリヒスチジン配列（例えばヘキサヒスチジン）、Ｖ５エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープなどのペプチドタグ、ヘマグルチニンエピトープ、ＦＬＡＧエピトープをコードする場合がある。検出用標識を含む融合ポリペプチドの発現の検出は、適切な試薬を用いて、例えばルシフェラーゼを含む融合ポリペプチドにルシフェリンを添加したときの発光を検出することで、またはポリヒスチジンタグを含む融合ポリペプチドに対するニッケルイオンの結合を検出することで行うことができる。
【０１１６】
ポリヒスチジンタグは、約２〜１０個の連続したヒスチジン残基（例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続ヒスチジン残基）を含む場合がある。このタグは、ニッケルイオン、ならびに他の金属イオン（例えば銅イオン）に結合するペプチドタグの場合もあり、また金属を用いたキレートアフィニティクロマトグラフィーに使用することができる。このようなタグの例には、以下の化学式を有するペプチドなどがある：Ｒ１−（Ｈｉｓ−Ｘ）ｎ−Ｒ２（式中、（Ｈｉｓ−Ｘ）ｎは金属キレート用ペプチドを意味し、ｎは２〜１０（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の数であり、またＸは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸である）。またＲ２は、金属キレート用ペプチドに共有結合で結合されたポリペプチドの場合があり、Ｒ１は水素または１個もしくは複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、５０個、６０個など）のアミノ酸残基のいずれかの場合がある。またＲ１は、金属キレート用ペプチドに共有結合的に結合されるポリペプチドの場合があり、Ｒ２は水素または１個もしくは複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、５０個、６０個など）のアミノ酸残基のいずれかの場合がある。このような性質をもつタグは、参照として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９４，１１５号に記載されている。
【０１１７】
同様に、タグを含む融合ポリペプチドの単離は、例えばｍｙｃエピトープを含む融合ポリペプチドを、抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体が結合した状態のカラムに通し、次に、結合状態の融合ポリペプチドを溶出するか、またはポリヒスチジンタグを含む融合ポリペプチドを、ニッケルイオンもしくはコバルトイオンのアフィニティカラムに通して、結合状態の融合ポリペプチドを溶出することで実施することができる。このような融合ポリペプチドを検出する方法、または単離する方法は、選択される検出用標識またはタグに関して当業者によく知られている（例えば参照として本明細書に組み入れられる、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８；米国特許第５，０１１，９１２号を参照）。
【０１１８】
一つの態様では、方向的に連結された組換え核酸分子は、ツーハイブリッドアッセイ法を実施する際に有用なキメラポリペプチドをコードする。この方法では、第一のｄｓ核酸分子は、１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）の他のポリペプチドと特異的に相互作用する能力を有することが疑われたり検討対象となったりするポリペプチド、またはその関連ドメインをコードする。本発明の方法により第一のｄｓ核酸分子が方向的に連結される第二のｄｓ核酸分子は、転写活性化ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインをコードする場合がある。例えば方向的に連結される第一のｄｓ核酸分子は、例えば第一の末端の５’突出を、またトポイソメラーゼ認識部位、またはその切断産物を第一の末端もしくはその近傍に含むように修飾される。連結される第二のｄｓ核酸分子は、第一のｄｓ核酸分子の第一の末端において５’突出に相補的な５’配列を含むか、または含むように修飾される。第一のｄｓ核酸分子および第二のｄｓ核酸分子とトポイソメラーゼとの接触により、方向的に連結された核酸分子は、ツーハイブリッドアッセイ法の実施に有用な第一のハイブリッドをコードする（例えば参照として本明細書に組み入れられる、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６、１９８９；米国特許第５，２８３，１７３号；Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７９５８〜７９６２、１９９２；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８〜９５８２、１９９１；Ｙｏｕｎｇ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ． ５８：３０２〜３１１（１９９８）を参照）。同様の方法で、第一のハイブリッドタンパク質のポリペプチド、またはそのドメインとの相互作用能力に関して検討される複数のポリペプチドを含む場合がある第二のハイブリッドタンパク質が作製される。この方法を同様に行うことで、リバース・ツーハイブリッドアッセイ法（参照として本明細書に組み入れられる、ＬｅａｎｎａおよびＨａｎｎｉｎｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：３３４１〜３３４７、１９９６）などの修飾型のツーハイブリッドアッセイ法、抑制トランス活性化因子システム（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，８８５，７７９号）、タンパク質動員システム（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，７７６，６８９号）などに有用な融合タンパク質をコードする方向的に連結された核酸分子を構築することができる。
【０１１９】
本明細書で開示されるように、第二のｄｓ核酸分子は、複数の核酸分子、例えばｃＤＮＡライブラリー、核酸分子のコンビナトリアルライブラリー、またはさまざまな核酸分子の混合集団の一つである場合がある。したがって本発明の方法は、ポリペプチド集団内で生じるタンパク質間相互作用を同定するための高スループットのツーハイブリッドアッセイ法の実施に使用されるキメラポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを作製する際に特に有用である（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第６，０５７，１０１号および米国特許第６，０８３，６９３号を参照）。このような方法では、ツーハイブリッドアッセイ法の各ハイブリッドタンパク質は、ポリペプチドをコードする核酸分子の二つの集団（多数）のうちの異なる一つ（その多数の各々が、関連しているが異なる数種の核酸分子から、このような分子の一万種という高い程度にまで至る複雑性を有する）を用いて作製される。本発明の方法を実施すること、例えば複数の各核酸分子を増幅するＰＣＲプライマー対を用いることで、キメラのベイトポリペプチド集団およびキメラのプレイポリペプチド集団をコードする方向的に連結された組換えポリヌクレオチドを容易に作製することができる。これらの集団は、増幅後の複数の核酸分子（それぞれ適切な末端を含む）を、トポイソメラーゼ、およびトポイソメラーゼ認識部位をその末端もしくはその近傍に含み、転写活性化ドメインもしくはＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸分子に接触させることで作製される。
【０１２０】
本発明の方法に有用な第一のｄｓ核酸分子は、例えばリボプローブ、アンチセンスの核酸分子、リボザイム、または三本鎖形成核酸分子として機能可能であったり、インビトロ翻訳反応で使用することが可能であったりするリボ核酸（ＲＮＡ）分子をコードする場合もあり、また第二のｄｓ核酸分子は、第一の核酸分子からＲＮＡを発現させる際に有用な発現制御領域をコードする場合がある。例えば大量のＲＮＡを産生させることが望ましい場合は、本発明の方法を実施するための第二のｄｓ核酸分子の成分は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む場合がある。ＲＮＡ分子を細胞内で発現させる場合、例えばアンチセンス分子を哺乳類細胞内で発現させる場合は、第二（または他）のｄｓ核酸分子は、哺乳類細胞内で活性のあるプロモーター（特に標的細胞内だけで活性のある組織特異的なプロモーター）を含むとよい。またＲＮＡ分子を、例えば共役したインビトロ転写／翻訳反応内で翻訳させる場合は、第一の核酸分子、もしくは第二（または他）の核酸分子は適切な翻訳発現制御領域を含むとよい。
【０１２１】
本発明の方法で作製された方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子は、方向的または非方向的に挿入された核酸分子を含む組換え体ベクターが一般に使用される、さまざまな目的に使用することができる。したがって、方向的または非方向的に連結された核酸分子を例えば、ポリペプチドを細胞内で発現させる際や、病的状態を診断したり治療したりする際などに使用することができる。生きている対象に投与する場合には、方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子は一般に、対象への投与に適した薬学的組成物中に製剤化される。したがって本発明は、本発明の方法で作製される方向的または非方向的に連結された組換え核酸分子、およびこのような核酸分子の発現産物を含む薬学的組成物を提供する。したがって、このような核酸分子は、病的な状態のみられる対象の治療に用いる薬物として有用である。
【０１２２】
薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、例えば、水または生理食塩水などの水性溶媒もしくは他の溶媒、またはグリコール、グリセロール、オリーブ油などの油、または注射用有機エステルなどの他の溶媒を含む。薬学的に許容される担体は、例えば複合物の吸収を安定化したり上昇させたりするように作用する生理学的に許容される化合物を含む場合がある。このような生理学的に許容される成分は、例えばグルコース、ショ糖、もしくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート化剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤もしくは賦形剤を含む。生理学的に許容される化合物を含む、薬学的に許容される担体の選択が例えば、経口的、または非経口的（経静脈的、および注射、挿管、または他の当技術分野で周知の方法など）の場合がある組成物の投与経路に依存することを当業者であれば理解すると思われる。このような薬学的組成物は、診断用試薬、栄養基質、毒素、または治療的薬剤（例えば癌の化学療法薬）などの別の試薬を含む場合もある。
【０１２３】
方向的に連結された組換え核酸分子は、水中油型乳濁液、マイクロエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、微粒子、または他の重合基質などのカプセル化材料と混合することができる（例えば参照として本明細書に組み入れられるＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ「リポソーム技術（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第１巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ １９８４）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、６：７７（１９８１）を参照）。リポソーム、例えばリン脂質または他の脂質を含む分子は、作製および投与が比較的容易な非毒性の担体、生理学的に許容される担体、および代謝可能な担体である。「ステルス」リポソーム（例えば参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，８８２，６７９号；５，３９５，６１９号；および５，２２５，２１２を参照）は、薬学的組成物を調製する際に特に有用なカプセル化材料の一例であり、また他の「マスク型」リポソームを同様に使用して、核酸分子が循環中に留まる時間を長くすることができる。例えば陽イオン性リポソームは、特定の受容体およびリガンドで修飾することもできる（参照として本明細書に組み入れられる、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、９１：２５８０〜２５８５（１９９３））。このような核酸分子も、アデノウイルス−ポリヒスチジン複合体と複合体を形成させることで細胞に導入することができる（例えば参照として本明細書に組み入れられる、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６８：６８６６〜６８６９ （１９９３）を参照）。このような組成物は、核酸分子を、インビボもしくはインビトロ（核酸分子を含む細胞が対象に再び投与されるエクスビボを含む）で細胞に導入する際に特に有用な場合がある（参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。本発明の方法で作製された核酸分子は、遺伝子銃を用いた方法で細胞に導入することもできる（例えばＳｙｋｅｓおよびＪｏｈｎｓｔｏｎ、前記、１９９９を参照）。
【０１２４】
本明細書で開示される、本発明の方法で作製された方向的に連結された核酸分子は例えばニックを含む。このような分子は例えば、ニックの入った組換え核酸分子にリガーゼを接触させることで解離しうる。このような、共有結合で両方の鎖に連結された、方向的に連結された組換え核酸分子は、ＰＣＲなどの増幅反応の鋳型として使用することができる。したがって大量のコンストラクトを作製することができる。また増幅反応は、部分反応産物を得ることなく、所望の産物だけを得るためのインビトロ選択法となりうる。例えば本発明の方法により、５’→３’方向に使用可能に連結された、第一のｄｓ核酸分子（プロモーターを含む）、第二のｄｓ核酸分子（コード鎖を含む）、および第三のｄｓ核酸分子（ポリアデニル化シグナルを含む）（作製された組換え核酸分子中のニックは連結される）を含む、方向的に連結された組換え核酸分子を作製することができる。
【０１２５】
プロモーター配列の上流のヌクレオチド配列に相補的な第一のプライマー、およびポリアデニル化シグナルの下流のヌクレオチド配列に相補的な第二のプライマーを含むＰＣＲプライマー対を選択することにより、プロモーター、コード領域、およびポリアデニル化シグナルを含む機能性増幅産物を作製することができる。これとは対照的に、第一のｄｓ核酸分子、または第三のｄｓヌクレオチドのいずれかを欠く部分反応産物は、第一のプライマーまたは第二のプライマーのいずれかが、部分産物にそれぞれハイブリダイズしないことから増幅されない。また、第二のｄｓ核酸分子を欠くコンストラクトは、第一のｄｓ核酸分子および第三のｄｓ核酸分子の５’突出配列と相補性をもなたいことから作製されないと思われる。したがって本発明は部分的に、所望の機能性の、方向的に連結された組換え核酸分子を得るための手段を提供する。
【０１２６】
ＰＣＲなどの増幅反応をこのように使用することは、対象コンストラクトを同定するために本発明の方法で作製される多数の核酸分子をスクリーニングする手段となる。自動化された高スループットの解析でＰＣＲに使用する方法は極めて一般的な方法で、またよく知られているので、本発明の方法は、高スループット系における用途に容易に適合できると解釈される。このような系を用いて、多数のコンストラクトを平行してスクリーニングすることができる。また、部分反応産物または不完全な反応産物を同定して廃棄することで、コンストラクトの特徴を決定したり、コンストラクトの機能をさらに別の実験で検討したりするために要する時間および費用を無駄にしないで済む。
【０１２７】
第一のｄｓ核酸分子が第一のトポイソメラーゼを含むものの、第二のトポイソメラーゼもしくはトポイソメラーゼ結合部位を含まない、本発明の方法で作製される組換え核酸分子は一般に線状であり、他の局面では本発明の方法で環状の組換え核酸分子を作製することができる。しかし線状分子として作製される、方向的に連結された組換え核酸分子は、例えばベクターとして使用する場合に環状化することができる。また本発明の方法で作製される線状の方向的に連結された組換え核酸分子は、プラスミドベクター、またはウイルスベクター（バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびアデノ関連ウイルスのベクターなど）の場合があるベクター（いずれもよく知られており、業者から購入することができる）にクローニングすることができる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）。
【０１２８】
本発明の方法により、検出目的で核酸分子を、核酸分子がプローブとして有用となるように、化合物、または低分子量の有機物質もしくは無機物質で標識することもできる。例えば３’端にトポイソメラーゼ認識部位、またはその切断断片を有する第一のｄｓ核酸分子は、アビジンもしくはストレプトアビジンを用いて検出可能なビオチン、蛍光化合物（例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｆａｍ、フルオレセイン、またはローダミン）、放射性核種（例えば硫黄３５、テクネチウム９９、リン３２、またはトリチウム）、常磁性スピン標識（例えば炭素１３）、化学発光化合物、認識抗体を用いて検出可能なエピトープ（例えばペプチド性エピトープ）などの検出用化合物に結合した状態とすることで、本発明の方法によって、方向的に連結される２本鎖の組換え核酸分子を作製することで、作製された核酸分子が標識される。核酸分子を上記のような化合物で検出可能に標識する方法は、当技術分野で周知である（例えば参照として本明細書に組み入れられる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「生物複合体技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を参照）。細胞区画化ドメインまたは検出用標識もしくはタグをコードする核酸分子、または転写もしくは翻訳の発現制御領域を含む核酸分子を含む、本明細書に開示された配列、または当技術分野で周知の配列は、本明細書に開示されたキットの有用な成分になると解釈される。
【０１２９】
第二のトポイソメラーゼもしくはトポイソメラーゼ認識部位ではなく、第一のトポイソメラーゼを有する第一のｄｓ核酸分子が使用される本発明の方法は、部位特異的に標的ＤＮＡ配列に挿入することができる、発現可能な組換え核酸分子の作製に特に有用である。標的ＤＮＡ配列は、任意のＤＮＡ配列、特にゲノムＤＮＡ配列、また好ましくは、ヌクレオチド配列の一部またはすべてが既知である遺伝子の場合がある。この方法は、第一の末端および第二の末端を有し、またポリペプチド（例えば選択マーカー）をコードする第一のｄｓ核酸分子（第一のｄｓ核酸分子は両端において相補的な配列を含む）を使用すること；ならびにコンストラクトが挿入される部位に対して上流および下流に位置する配列から作製される、第一のｄｓ核酸分子を、第一のＰＣＲ増幅産物および第二のＰＣＲ増幅産物（各増幅産物はそれぞれ、トポイソメラーゼ認識部位、および本開示に記載された配列を元に選択される５’標的配列を含む）に方向的に連結することにより実施することができる。例えば第一の増幅産物および第二の増幅産物は、トポイソメラーゼによる切断によって、それぞれが第一のｄｓ核酸分子の所定の末端に連結されるように、異なる５’標的配列を有する。
【０１３０】
第一の増幅産物および第二の増幅産物は、二組のＰＣＲプライマー対を用いて作製される。二組のＰＣＲプライマー対は、Ｔａｑポリメラーゼなどの適切なポリメラーゼ、および増幅対象配列を含むテンプレートの存在下において、同プライマーが、選択マーカーの挿入部位に対して上流にあって隣接する、また下流にあって隣接する標的ＤＮＡ配列の一部を増幅するように選択される。またＰＣＲプライマー対の組は、増幅産物がトポイソメラーゼ認識部位を含み、部位特異的なトポイソメラーゼによる切断後に、末端における５’突出配列が選択マーカーに方向的に連結されるように設計される。したがって第一のＰＣＲプライマー対は、１）増幅産物が方向的に連結される選択マーカーの末端の５’相補配列に相補的なヌクレオチド配列、トポイソメラーゼ認識部位に相補的なヌクレオチド配列、および挿入部位の上流に位置する標的ＤＮＡ配列の３’配列に相補的なヌクレオチド配列を５’→３’の方向に含む第一のプライマー；ならびに、２）第一のプライマーが相補的となる、３’配列の上流（すなわち挿入部位の下流）に位置する標的ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を含む第二のプライマーを含む。第二のＰＣＲプライマー対は、１）方向的に連結される選択マーカーの末端の５’相補配列に相補的なヌクレオチド配列、トポイソメラーゼ認識部位に相補的なヌクレオチド配列、および標的ＤＮＡ配列の５’配列のヌクレオチド配列（標的ゲノムＤＮＡの５’配列は、第一のＰＣＲプライマー対の第一のプライマーが相補的となる標的ＤＮＡ配列の３’配列の下流に位置する）を５’→３’方向に含む第一のプライマー；ならびに第一のプライマーに含まれる標的ゲノムＤＮＡの５’配列の下流に位置する標的ＤＮＡ配列の３’配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第二のプライマー対の第二のプライマーを含む。標的ゲノムＤＮＡに相補的なプライマーの配列が、標的ＤＮＡの配列をふまえて選択されることを当業者であれば理解すると思われる。
【０１３１】
選択マーカーを含む第一のｄｓ核酸分子、第一の増幅産物および第二の増幅産物（第二のｄｓ核酸分子および第三のｄｓ核酸分子）、およびトポイソメラーゼ（トポイソメラーゼをチャージした分子を除く）を接触させると、方向的に連結された組換え核酸分子が得られる。ニックの連結に続き、作製された組換え核酸分子は、望ましいならば、標的ゲノムＤＮＡの上流および下流の配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いてさらに増幅されることで、機能性コンストラクトのみが確実に増幅される。作製された方向的に連結された組換え核酸分子は、ゲノム中で相同組換えを起こさせて、例えば、細胞内における遺伝子の機能をノックアウトしたり、作製された組換え核酸分子を含む細胞に新しい表現型を加えたりする際に有用である。この方法はまた、ゲノム中に安定に維持された作製された組換え核酸分子を有するトランスジェニック非ヒト生物を作製する際に使用することができる。
【０１３２】
トポイソメラーゼまたはトポイソメラーゼ認識部位を、例えば第二の末端ではなく第一の末端に有する第一のｄｓ核酸が関与する本発明の方法は、アダプター配列またはリンカー配列を、複数の第二（または他）のｄｓ核酸分子のそれぞれを含む、対象となる第二のｄｓ核酸分子の一端もしくは両端に共有結合で連結する段階にも有用である。例えば、第一のｄｓ核酸分子の両端にリンカーを加えることが望ましい場合、本発明の方法は、トポイソメラーゼを、第二のｄｓ核酸分子および第三のｄｓ核酸分子のそれぞれの５’端に位置する突出配列に相補的な各５’端もしくはその近傍における５’の相補的な配列を有する第一のｄｓ核酸分子；およびそれぞれ、トポイソメラーゼ認識部位を適切な３’端に含み、また５’突出配列を、トポイソメラーゼ認識部位を含む末端もしくはその近傍に含む第二のｄｓ核酸分子および第三のｄｓ核酸分子に接触させることで実施することができる。適切な末端は、第一のｄｓ核酸分子にリンカーが方向的に連結される末端である。このような方法を実施する際に、第二の核酸分子、また少なくとも第三の核酸分子を含むリンカーの配列は同じ場合もあれば異なる場合もある。
【０１３３】
５’標的配列およびトポイソメラーゼを第一の末端にもつ第一のｄｓ核酸分子が関与する本発明の方法は、第一のｄｓ核酸分子を、少なくとも第二のｄｓ核酸分子に方向的または非方向的に連結するように実施することができる。この方法により典型的には、第一のｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子が方向的に連結される。しかし、この方法では、第一のｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子が以下の態様において、非方向的に連結される場合がある：１）第二のヌクレオチド配列が、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端もしくはその近傍に存在する場合、すなわち第二のｄｓ核酸分子の第二の末端において、５’の相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な場合；ならびに、２）ヌクレオチド配列が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端および第二の末端の両方の５’端もしくはその近傍に存在する場合、すなわち第一のｄｓ核酸分子の第一の末端において、５’突出とハイブリダイズ可能な場合。非方向的に連結する段階が関与するこれらの態様では、第一のｄｓ核酸分子の第二の末端、および第二のｄｓ核酸分子の第二の末端はいずれかが平滑末端であるか、または突出を含む。
【０１３４】
第三のｄｓ核酸分子を第二のｄｓ核酸分子に連結させる段階が関与する態様では、以上の方法で、方向的または非方向的に二つの核酸分子を連結することができる。この方法は典型的には、第二のｄｓ核酸分子と第三のｄｓ核酸分子を方向的に連結する際に用いられる。しかし、この方法では、第三のｄｓ核酸分子と第二のｄｓ核酸分子が以下の態様において、非方向的に連結される場合がある：１）第二のヌクレオチド配列が、第三のｄｓ核酸分子の第二の末端の５’端もしくはその近傍に存在する場合、すなわち第二のｄｓ核酸分子の第二の末端において、５’の相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な場合；ならびに、２）ヌクレオチド配列が、第二のｄｓ核酸分子の第一の末端および第二の末端の両方の５’端もしくはその近傍に存在する場合、すなわち第三のｄｓ核酸分子の第一の末端において、５’突出とハイブリダイズ可能な場合。非方向的に連結する段階が関与するこれらの態様では、第三のｄｓ核酸分子の第二の末端、および第二のｄｓ核酸分子の第二の末端はいずれかが平滑末端であるか、または突出を含む。
【０１３５】
本発明は、第一の末端および第二の末端を有する第一のｄｓ核酸分子（第一の末端は、５’突出、および共有結合で結合された状態のトポイソメラーゼを３’端に有する）；ならびに第一の平滑末端および第二の末端を有する第二のｄｓ核酸分子（第一の平滑末端は、第一の５’突出に相補的な第一の５’ヌクレオチド配列、および第一の５’ヌクレオチド配列に相補的な第一の３’ヌクレオチド配列を有する）を含む組成物も提供する。このような組成物では、第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の５’ヌクレオチド配列は、第一の核酸分子の第一の末端の第一の５’突出とハイブリダイズ可能である（第二のｄｓ核酸分子の第一の平滑末端の第一の３’ヌクレオチド配列が置換される）。このような組成物に含まれる第一のｄｓ核酸分子は、第二の５’突出を第二の末端にさらに有する場合があり、また第二のｄｓ核酸分子の第二の末端は、第二の５’突出に相補的な第二の５’ヌクレオチド配列、および第二の５’ヌクレオチド配列に相補的な第二の３’ヌクレオチド配列をさらに含む場合がある。
【０１３６】
本発明は、ｄｓ核酸分子を方向的または非方向的に連結する際に有用な１種または複数（例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種など）の試薬を含むキットも提供する。一つの態様では、本発明のキットは、第一の末端および第二の末端を有するｄｓ核酸分子を含む（第一の末端は、第一の５’突出および３’端に共有結合で結合された状態の第一のトポイソメラーゼを含み、また第二の末端は、３’端に共有結合で結合された状態の第二のトポイソメラーゼを含み、また第二の５’突出、平滑末端、３’ウリジン突出、もしくは３’チミジン突出を含む（第一の５’突出は第二の５’突出と異なる）。同じ場合もあれば異なる場合もあるトポイソメラーゼもキットの成分となりうる。キットに含まれるｄｓ核酸分子は、ベクターである場合があるが、必ずしもベクターである必要はなく、また１個または複数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個など）の発現制御領域、ならびにキットの成分を使用するための指示書を含む場合がある。
【０１３７】
本発明のキットは、複数の第二のｄｓ核酸分子も含む場合がある（複数の各ｄｓ核酸分子は、第一の平滑末端を有し、また第一の平滑末端は、第一のｄｓ核酸分子の第一の５’突出に相補的な５’ヌクレオチド配列を含む）。複数の第二のｄｓ核酸分子は、複数の転写調節領域、翻訳調節領域、またはこれらの組み合わせの場合があるほか、ペプチドタグや細胞区画化ドメインなどの複数のペプチドをコードする場合がある。
【０１３８】
キットのｄｓ核酸分子成分は例えば、クローニングベクター、または発現ベクターなどの直線化されたベクターの場合がある。望ましいならば、このようなキットは、異なる発現制御領域、またはタグもしくは他の検出用分子、もしくは細胞区画化ドメインをコードする配列などがあるがこれらに限定されない他の配列をそれぞれ含む複数のｄｓ核酸分子を含む場合がある。このような異なる領域は、異なる種類の特定の制御領域、例えば構成型もしくは誘導型のプロモーター、または組織特異的なプロモーターの場合があるか、または例えば転写および翻訳の発現制御領域やエピトープタグなどを含む異なる種類の領域の場合がある。このようなｄｓ核酸分子は、トポイソメラーゼで活性化されたものである場合もあれば、トポイソメラーゼで活性化される場合もあり、また５’突出配列、またはトポイソメラーゼによる活性化後に５’突出配列となる配列を含む。また複数のｄｓ核酸分子は、特定の発現制御領域に特有な、または複数の関連発現制御領域（例えば複数の異なるプロモーター領域）に共通した、５’突出配列を有する場合がある。ｄｓ核酸分子の５’突出配列は、ｄｓ核酸分子上に含まれる１個もしくは複数の発現制御領域が、使用可能に方向的に連結されて、有用な機能、例えばコザック配列を含む領域を含む配列を提供可能なように設計することが可能であり、また翻訳開始部位を含む領域は、同領域が本発明の方法で使用可能に方向的に連結可能なように、相補的な５’突出を有する場合がある。
【０１３９】
本発明は、本明細書に記載された方法に使用する核酸分子を連結するためのキットをさらに提供する。したがって本発明のキットは、本明細書に記載された方法を実施するための１種または複数の成分を含む場合がある。特定の態様では、本発明のキットは、キット成分の使用に関する指示書、１種もしくは複数の緩衝液、１種もしくは複数の核酸分子（例えば、５’突出、３’突出、５’突出と３’突出、２個の３’突出、２個の５’突出などを有する１種もしくは複数の核酸分子）、１種もしくは複数のトポイソメラーゼ、１種もしくは複数のリガーゼ、１種もしくは複数のリコンビナーゼ、５’突出および／または３’突出を有する分子を調製するための１種もしくは複数のアダプターリンカー、および／または本発明の方法を実施するための１個もしくは複数の容器からなる群より選択される１種もしくは複数の成分を含む場合がある。
【０１４０】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しており、制限する意図はない。
【０１４１】
実施例１
本発明の好ましい態様では、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸分子の作製は、最初に市販のクローニングベクターを入手することで開始される。このようなベクターの一つが、特異的に設計された領域を含む環状スーパーコイルベクターｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。このような領域は、真核生物宿主でｍＲＮＡの安定性を高めるためのＢＧＨポリアデニル化配列、Ｔ７転写終結領域、Ｒ６Ｋγ ＤＮＡ複製起点、ならびにカナマイシン耐性遺伝子および抗生物質耐性選択用のプロモーターを含む。またｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡは、一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする合成ＤＮＡ配列であるマルチクローニングサイトを含む。このマルチクローニングサイトは、ベクターの特定の位置にＤＮＡをクローニングするために作製される。また、ベクターのマルチクローニングサイト内には、エンドヌクレアーゼ認識部位に対して５’側に挿入されることでＣｒｅリコンビナーゼによるさまざまな他の発現ベクターへの融合を促進するｌｏｘＰ部位も存在する（Ｅｃｈｏ（商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。任意選択のＣ末端のＶ５エピトープタグは、発現される融合タンパク質の、抗Ｖ５抗体を用いた検出を容易にするために存在させる。任意選択のＣ末端のポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグも、発現されるタンパク質の迅速な精製および検出を可能とするために存在させる。ｌｏｘＰ部位の下流に存在する、細菌由来のリボソーム結合部位は、大腸菌における転写の開始を可能とする。諸領域の以上のような組み合わせは、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡクローニングベクターに特異的であるが、多くの類似したクローニングベクターおよび発現ベクターが市販されており、当技術分野で周知の方法で配列から組み立てることができる。ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡは、２．２ ｋｂの２本鎖プラスミドである（図３および５を参照）。
【０１４２】
ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡに由来する、トポイソメラーゼＩをチャージしたクローニングベクターの構築は、エンドヌクレアーゼによるベクターの切断と、それに続く合成オリゴヌクレオチドとの相補的アニーリング、およびワクシニアトポイソメラーゼＩによるヘテロ２本鎖の部位特異的な切断で達成される。ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩは、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡのマルチクローニングサイト内に存在する、多くある制限エンドヌクレアーゼ切断部位の二つである（図３参照）。ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡを、対応する制限酵素ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで切断すると、ベクター上に付着末端が生じる（５’−ＡＧＣＴ−３’および５’−ＡＡＴＴ−３’、図６）。これらの酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ． カタログ番号ＲＯ１５６Ｓ、ＳａｃＩおよびＲＯ１０１Ｓ、ＥｃｏＲＩ）を始めとする数多くの業者から容易に入手することができる。切断後のｐＵｎｉ／ＶＳ−Ｈｉｓ バージョンＡは、イソプロパノール沈殿法で、切断断片と容易に分離することができる。ＤＮＡを切断して単離する以上の方法および他の方法は当技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；５．２８〜５．３２．）。
【０１４３】
精製後の切断後のベクターを、２種の特異的なオリゴヌクレオチドアダプターおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼとインキュベートする。アダプターは、ベクターのＳａｃＩ末端およびＥｃｏＲＩの末端に適合する末端を含むオリゴヌクレオチドの２本鎖である。適切な配列の他のアダプターオリゴヌクレオチドを、異なる制限酵素切断部位を有する他のベクター用に作製することが可能であることを当業者であれば容易に理解すると思われる。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとのインキュベーションに続き、連結したアダプターを含むベクターをイソプロパノールで精製する。
【０１４４】
ＴＯＰＯ Ｄ１およびＴＯＰＯ Ｄ２とのアニーリングの結果得られるアダプター２本鎖は、１本鎖のＥｃｏＲＩの突出を一方の末端に有し、また１２ヌクレオチドの１本鎖突出をもう一方の末端に有する。
【０１４５】
第一のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｄ１）は、ＥｃｏＲＩの付着末端３’−ＴＴＡＡ−５’に相補性を有する。またＴＯＰＯ Ｄ１は、３’端の１６ ｂｐ上流に位置する、トポイソメラーゼのコンセンサスペンタピリミジン領域５’−ＣＣＣＴＴを含む付加的な２４ ｂｐを含む。ＴＯＰＯ Ｄ１アダプターオリゴの残りの配列および長さは多様であり、研究者の特定のニーズに合わせて修飾することができる。この態様では、使用アダプターの全配列は
2004517608.tif 000005
である。
【０１４６】
第二のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｄ２）は、ＴＯＰＯ Ｄ１に完全に相補的でなければならない。ＴＯＰＯ Ｄ２は、直線化されたベクターの下の鎖が延長している、ＥｃｏＲＩの付着末端ｆｌａｐの５’側とまさに相補的である。またＴＯＰＯ Ｄ２は、標的配列である配列３’−ＧＴＧＧ、およびトポイソメラーゼ切断後に、クローニング目的の１本鎖突出を含む。この態様では、１本鎖突出は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合の効率を高めることによって真核細胞におけるＯＲＦの発現を促すことが知られているコザック配列に相補的となるように選択されたが、配列および長さは、使用者の特定のニーズに合わせて大きく変動する。ＴＯＰＯ Ｄ２の全配列は
2004517608.tif 000006
である。
【０１４７】
上記と同様に、オリゴヌクレオチドＴＯＰＯ ４およびＴＯＰＯ ５とのアニーリングの結果得られるアダプター２本鎖は、１本鎖のＳａｃＩの突出を一方の末端に有し、また１２ヌクレオチドの１本鎖突出をもう一方の末端に有する。
【０１４８】
第三のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｄ５）は、ＳａｃＩの付着末端３’−ＴＣＧＡ−５’に対する相補性を有する。ＴＯＰＯ Ｄ１と同様に、ＴＯＰＯ Ｄ５は、１本鎖突出を生じる付加的な塩基を有する。長さおよび配列は、使用者のニーズに応じて変化する場合がある。この態様では、ＴＯＰＯ Ｄ５の配列は
2004517608.tif 000007
である。
【０１４９】
第四のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｄ４）は、ＴＯＰＯ Ｄ５に完全な相補性を有し、直線化されたベクターの上の鎖が延長している、ＳａｃＩの付着末端ｆｌａｐの５’側とまさに相補的である。ＴＯＰＯ Ｄ４は、トポイソメラーゼのコンセンサス配列５’−ＣＣＣＴＴも含む。ＴＯＰＯ Ｄ４アダプターオリゴの残りの配列およびサイズはさまざまであり、研究者の特定のニーズに合わせて修飾することができる。この態様では、ＴＯＰＯ Ｄ４の配列は
2004517608.tif 000008
であり、付加的な１２ ｂｐの１本鎖突出を含む。
【０１５０】
これらのアダプターオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７〜３１３、１９８７）を含む任意の数多くの手法で化学合成することができる。オリゴの化学合成に関するこの方法および他の方法は当技術分野で周知である。
【０１５１】
精製後の切断後のベクターとアダプターオリゴヌクレオチドとの相補的アニーリングは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下におけるＤＮＡのインキュベーションによって行われる。典型的な連結反応は、リガーゼおよび適切な反応緩衝液の存在下における、クローニングベクターと適切なＤＮＡ断片とのインキュベーションによって実施される。連結反応用の緩衝液は、反応のエネルギーとなるＡＴＰ、ならびにジチオスレイトールなどの還元試薬、およびトリス−ＨＣｌなどのｐＨ安定化剤を含む必要がある。クローニングベクターとＤＮＡ断片との濃度の比は、各反応によって変わり、決定するための公式は文献に多く記載されている（例えば「プロトコールと使用ガイド（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）」（１９９１）、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｐ．４５を参照）。Ｔ４リガーゼは、インキュベーション中に、隣接する５’リン酸と３’ヒドロキシル末端間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。付着末端は一般に１２〜１５℃で３０分で連結されるが、平滑末端の連結には室温で４〜１６時間が必要である（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）、第２版；「分子生物学における簡単なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３．１４〜３．３７）。しかし、パラメータの範囲は各実験で変動する。この態様では、精製後の切断後のｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ、およびアダプターオリゴは、Ｔ４リガーゼおよび適切な緩衝液の存在下で、１２．５℃で１６時間インキュベートされた。結果として得られた直線化されてアダプターが付加されたベクターは、塩基対の相補性およびＴ４リガーゼで触媒されたホスホジエステル結合を介してアダプターオリゴヌクレオチドに結合した、精製されたクローニングベクターを含む（図７参照）。
【０１５２】
アダプターを付加したベクターのトポイソメラーゼによる効率的な修飾には、ＴＯＰＯ Ｄ１およびＴＯＰＯ Ｄ４の１本鎖突出上に２本鎖ＤＮＡを作製するために、アニーリング用オリゴの付加が必要である。ワクシニアウイルスに由来するトポイソメラーゼＩは、最初に非共有結合的に２本鎖ＤＮＡに結合する。同酵素は次に２本鎖に沿って拡散し、この拡散は、コンセンサスのペンタピリミジン配列５’−ＣＣＣＴＴに至り、共有結合で結合して、トポイソメラーゼに適合させた複合体が形成されるまで続く（Ｓｈｕｍａｎら、米国特許第５，７６６，８９１号を参照）。アダプターが付加されたベクターの修飾は、ＤＮＡリガーゼの非存在下で進み、アダプターが付加されたベクターとアニーリング用オリゴとの間のホスホジエステル結合の形成を妨げる。これは、非切断可能な鎖におけるホスホジエステル結合が、切断時に脱離基の解離を妨げるためである（図８および９）。
【０１５３】
アニーリング用オリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｄ３）は、ＴＯＰＯ Ｄ１およびＴＯＰＯ Ｄ４の１本鎖のＤＮＡ突出に対する相補性をもっていなくてはならない。この態様では、突出はいずれも以下の配列を有する：
2004517608.tif 000009
。したがってＴＯＰＯ Ｄ３は、アダプターオリゴの１本鎖突出に対する完全な相補性をもつ配列
2004517608.tif 000010
、および付加的な３ ｂｐの突出３’−ＡＡＣ−５’をもつ。
【０１５４】
トポイソメラーゼの存在下における、アダプターが付加されたベクターとアニーリング用オリゴとのインキュベーションにより、トポイソメラーゼが非共有結合により結合可能な２本鎖のＤＮＡが得られる（図１０）。結合した状態のトポイソメラーゼは、促進型の拡散機構により、５’−ＣＣＣＴＴ認識モチーフを見つけるまで２本鎖ＤＮＡを探索する。このモチーフの３’側にある切断可能な鎖のホスホジエステルバックボーンの切断は、好ましいオリゴヌクレオチド切断配列５’−ＣＣＣＴＴ↓の３’リン酸原子に対する求核攻撃で触媒されて、３’ホスホチロシル結合による、ＤＮＡと酵素との共有結合が生じる（Ｓｈｕｍａｎら、（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６、９７９３〜９７９６を参照）。切断可能な鎖の切断により、５’−ＣＣＣＴＴモチーフの下流の３’端のアダプターオリゴを含む２本鎖の脱離基、およびアニーリング用オリゴＴＯＰＯ Ｄ３が生じる。脱離基は、ホスホチロシル結合の５’ヒドロキシルを介した攻撃を介して、ベクターのトポイソメラーゼで修飾された末端に再連結可能であるが、この反応は、脱離基がベクターに共有結合で結合しない場合には望ましくない。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを切断／再連結反応へ添加すると、平衡が、捕捉されたトポイソメラーゼが蓄積する側に向かってさらにシフトする。これはキナーゼが、脱離基の５’ヒドロキシルをリン酸化して再結合を妨げるためである（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）、第２版；「分子生物学における簡単なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ、３．１４〜３．３０）。結果として生じた直線化されたベクターは、ＴＯＰＯ Ｄ４／Ｄ３の脱離基に由来する平滑末端、およびＴＯＰＯ Ｄ１／Ｄ３の脱離基に由来する末端を有する１本鎖突出を含む（図１１）。直線化されたクローニングベクターの末端はいずれも、トポイソメラーゼがチャージされると、迅速で効率的かつ方向的なトポイソメラーゼを介したアクセプター分子の挿入が可能となる。
【０１５５】
上記の例では、トポイソメラーゼで修飾された方向的クローニングベクターを作製するｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡの修正について詳述したが、このような方法を、任意のプラスミド、コスミド、ウイルス、または他のＤＮＡに適用する方法を当業者であれば理解すると思われる。この例が、配列５’−ＧＧＴＧ−３’を含む５’の１本鎖突出を含むベクターを示していることは重要である。しかし、アダプター２本鎖およびアニーリング用オリゴヌクレオチドを設計することで、任意のベクターの一端または両端における任意の配列または長さの突出を特別設計することが当業者であれば可能になると思われる。
【０１５６】
具体的には、任意のプラスミド、コスミド、ウイルス、または他のＤＮＡを修飾して、利便性を考慮した任意の配列および長さをもつ１本鎖突出をもたせることが可能である。基本的な段階は以下の通りである：最初にベクターを対象に、対象ＤＮＡを直線化することが明らかな処理を行う。共通の手順には、制限酵素による切断、およびトポイソメラーゼＩＩ処理などがあるがこれらに限定されない。直線化した後に、特別の１本鎖突出を添加する。上記の例では、相補的なオリゴヌクレオチドを、制限酵素切断物の付着末端に添加して、所望の１本鎖突出を得る。しかし、１本鎖突出を形成するオリゴヌクレオチドを、Ｔ４リガーゼによる平滑末端の連結により添加することもできる。この１本鎖突出配列を対象に、トポイソメラーゼＩにより、１本鎖にニックを入れる。次に、この１本鎖突出を用いて、１種または複数の相補的なヌクレオチド配列を含むＰＣＲ産物を方向的に挿入することができる。
【０１５７】
同様に、トポイソメラーゼによる修飾は、任意の２本鎖プラスミド、コスミド、ウイルス、または他のＤＮＡ断片に適用可能である。トポイソメラーゼＩを２本鎖ＤＮＡに結合させる方法は当技術分野で周知である（Ｓｈｕｍａｎら、米国特許第５，７６６，８９１号を参照）。２本鎖ＤＮＡ断片上におけるトポイソメラーゼの戦略的な配置は、トポイソメラーゼＩのコンセンサス配列を組込むことで決定される（Ｓｈｕｍａｎら、米国特許第５，７６６，８９１号を参照）。トポイソメラーゼＩが２本鎖ＤＮＡに結合し、切断可能な鎖にニックを入れることで、所定の１本鎖突出配列が明らかとなり、侵入してくるＰＣＲ産物を正しい１本鎖突出を介した方向に連結する。
【０１５８】
実施例２
別のプラスミドに対する、本発明の応用の一例として、ｐＣＲ（登録商標）２．１（図４および１２）を修飾して、特別の１本鎖配列をもつトポイソメラーゼＩに適合させたベクターを作製した。
【０１５９】
ｐＣＲ（登録商標）２．１プラスミドは３．９ ｋｂのＴ／Ａクローニングベクターである。このベクターの配列には、特別に設計されたいくつかの領域が含まれる。領域群には、ｆ１複製起点、ＣｏｌＥ１複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ＬａｃＺ−α断片、およびＬａｃＺ−α断片内に位置して組換えプラスミドの青色−白色による選択を可能とするマルチクローニングサイトなどがある。ｐＣＲ（登録商標）２．１プラスミドのマルチクローニングサイトの配列（図４）は以下の配列を含む；ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、およびＥｃｏＲＩを含むがこれらに限定されない多くの制限酵素の切断部位；Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター。
【０１６０】
特別の１本鎖配列を有するトポイソメラーゼＩをチャージしたベクターの構築は、エンドヌクレアーゼによる切断と、これに続く、合成オリゴヌクレオチドを用いた相補的アニーリング、およびワクシニアウイルスのトポイソメラーゼＩによるヘテロ２本鎖の部位特異的な切断を含む。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、およびＥｃｏＲＩによりｐＣＲ（登録商標）２．１プラスミドを切断すると、ベクター上にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの付着末端が残される（図１３）。ｐＣＲ（登録商標）２．１のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の下流にある解離断片は、サイズを小さくするためにさらにＳｐｅＩで切断される。断片のサイズを小さくすることで、切断後のベクターの精製を容易にして、より小さな切断片をイソプロパノール沈殿法で除くことができる。以上の酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を始めとする多くの業者から容易に入手できる（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、カタログ番号；ＲＯ１０４Ｓ、ＨｉｎｄＩＩＩ；ＲＯ１３３Ｓ、ＳｐｅＩ；ＲＯ１０１Ｓ、ＥｃｏＲＩ）。ＤＮＡの切断および単離の方法は当技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記、１９８９）。
【０１６１】
精製された切断後のベクターを、４種のアダプターオリゴヌクレオチドおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼとインキュベートする。アダプターオリゴヌクレオチドは、ＨｉｎｄＩＩＩの付着末端、ＥｃｏＲＩの付着末端、または相互に相補性をもつように設計する。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとのインキュベーションに続き、アダプターが付加されたベクターをイソプロパノールを用いて精製する。
【０１６２】
第一のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ Ｈ）は、ＨｉｎｄＩＩＩの付着末端３’−ＴＣＧＡ−５’に対する相補性を有する。またＴＯＰＯ Ｈは、３’端の１９ ｂｐ上流に位置する、トポイソメラーゼのコンセンサスペンタピリミジン配列５’−ＣＣＣＴＴを含む付加的な２４ ｂｐを有する。ＴＯＰＯ Ｈアダプターオリゴの残りの配列および長さはさまざまであり、改変することで研究者の特定のニーズに合わせることができる。この態様では、使用されるアダプターの全配列は、
2004517608.tif 000011
である。
【０１６３】
第二のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ １６）は、ＴＯＰＯ Ｈに完全に相補性でなければならない。ＴＯＰＯ １６は、直線化されたベクターの下の鎖が延長している、ＨｉｎｄＩＩＩの付着末端の５’側とまさに相補的である。またＴＯＰＯ １６は、方向的クローニング用に選択される１本鎖配列である配列３’−ＴＡＡＧを含む。ＴＯＰＯ １６の全配列は、
2004517608.tif 000012
である。
【０１６４】
第三のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ １）は、ＥｃｏＲＩの付着末端３’−ＴＴＡＡ−５’に相補性を有する。ＴＯＰＯ Ｈと同様に、ＴＯＰＯ １は、３’端の１２ ｂｐ上流に位置するトポイソメラーゼＩのコンセンサス配列ＣＣＣＴＴを含む付加的な塩基を有する。ＴＯＰＯ １の長さおよび配列は、使用者のニーズに応じて変動することがある。この態様では、ＴＯＰＯ １の配列は、
2004517608.tif 000013
である。
【０１６５】
第四のアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ ２）は、ＴＯＰＯ １に対して完全な相補性を有し、直線化されたベクターの上の鎖が延長している、ＥｃｏＲＩの付着末端の５’側とまさに相補的である。この態様では、ＴＯＰＯ ２の配列は、
2004517608.tif 000014
である。
【０１６６】
精製後の切断ベクターとアダプターオリゴヌクレオチドとの相補的アニーリングは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下におけるＤＮＡのインキュベーションによって行われる。Ｔ４リガーゼは、インキュベーション中に、隣接する５’リン酸と３’ヒドロキシル末端間におけるホスホジエステル結合の形成を触媒する。この態様では、精製後の切断後のｐＣＲ（登録商標）２．１およびアダプターオリゴを、Ｔ４リガーゼおよび適切な緩衝液の存在下で１６時間かけて１２．５℃でインキュベートした。結果として得られた、直線化されてアダプターが付加されたベクターは、塩基対の相補性、およびＴ４リガーゼが触媒するホスホジエステル結合によってアダプターオリゴヌクレオチドに結合した、精製後のクローニングベクターを含む（図１３）。連結法は文献に多く記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）、第２版；「分子生物学における簡単なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３．１４〜３．３７を参照）。
【０１６７】
アダプターが付加されたベクターにトポイソメラーゼをチャージする際には、アニーリング用オリゴヌクレオチドを付加して、ＴＯＰＯ ＨおよびＴＯＰＯ １の１本鎖突出上に２本鎖ＤＮＡを作製することが必要である。アダプターが付加されたベクターに対するチャージをＤＮＡリガーゼの非存在下で行うと、アダプターが付加されたベクターとアニーリング用オリゴとの間におけるホスホジエステル結合の形成が妨げられる。これは、非切断可能な鎖のホスホジエステル結合が、切断に伴う脱離基の解離を妨げるからである（図９参照）。
【０１６８】
アニーリング用オリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ １７）は、ＴＯＰＯ Ｈの１本鎖ＤＮＡ突出に対する相補性を有していなければならない。この態様では、突出の配列は
2004517608.tif 000015
である。したがってＴＯＰＯ １７の配列３’−ＧＣＴＡＴＣＡＣ−５’は、アダプターオリゴヌクレオチドの１本鎖突出に対して完全な相補性を有する。
【０１６９】
アニーリング用オリゴヌクレオチド（ＴＯＰＯ ３）は、ＴＯＰＯ １の１本鎖ＤＮＡの突出に対する相補性を有していなければならない。この態様では、突出の配列は
2004517608.tif 000016
である。したがってＴＯＰＯ ３の配列
2004517608.tif 000017
は、アダプターオリゴヌクレオチドの１本鎖突出、および付加的な３ ｂｐの突出５’−ＣＡＡ−３’に対して完全な相補性を有する。
【０１７０】
トポイソメラーゼの存在下における、アダプターが付加されたベクターとアニーリング用オリゴとのインキュベーションにより、トポイソメラーゼが非共有結合的に結合可能な２本鎖ＤＮＡが得られる（図１４）。結合した状態のトポイソメラーゼは、促進型の拡散機構により、５’−ＣＣＣＴＴ認識モチーフを見つけるまで２本鎖ＤＮＡを探索する。このモチーフの３’側にある切断可能な鎖のホスホジエステルバックボーンの切断は、ＤＮＡと同酵素との３’−ホスホチロシル結合による共有結合を生じる（Ｓｈｕｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６：９７９３〜９７９６、１９８９）。切断可能な鎖の切断により、５’−ＣＣＣＴＴモチーフおよび相補的アニーリング用オリゴヌクレオチドの下流にアダプターオリゴの３’端を含む２本鎖の脱離基が生じる。脱離基は、トポイソメラーゼが付加されたベクターに、ホスホチロシル連結の５’ヒドロキシルに対する攻撃により再び連結することがある（この攻撃もトポイソメラーゼにより触媒される）。平衡反応へＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加すると、キナーゼによる脱離基の５’ヒドロキシルのリン酸化によって逆反応が妨げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）、第２版；「分子生物学における簡単なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、３．１４〜３．３０）。結果として得られた直線化されたベクターは、ＴＯＰＯ １／３の脱離基に由来する平滑末端、およびＴＯＰＯ Ｈ／１７の脱離基に由来する１本鎖の配列末端を含む（図１５）。直線化されたクローニングベクターの末端のいずれも、トポイソメラーゼをチャージすることで、アクセプター分子への迅速で効率的かつ方向的なトポイソメラーゼ介在型の挿入が可能となる。
【０１７１】
本発明の方向的クローニング
本発明は、ＤＮＡの方向的クローニングの方法も提供する。以下の例では、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡから構築された、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸ベクターを、ジーンストーム（ＧｅｎｅＳｔｏｒｍ）（商標） 発現レディクローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｄｙ Ｃｌｏｎｅｓ） （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に由来するＯＲＦの方向的挿入に使用した。修飾型ｐＵｎｉベクターを、これらのＯＲＦのクローニング用として選択した。というのは、トポイソメラーゼによるベクターの切断により１本鎖突出となる付加された標的配列には、ＯＲＦの発現を促進することが知られているコザック配列に対する相同性があるためである。しかしこの前に、任意のプラスミド、コスミド、ウイルス、または他のＤＮＡを修飾することで、必要な１本鎖配列をもたせることができることに注意されたい。同様に、任意のＤＮＡ断片を修飾して、ベクターの任意の１本鎖突出に対して相同な配列をもたせることが可能である。重要な点は、１本鎖突出の配列が、方向的クローニングの効率に影響を及ぼしうることである。例えばＧＣ含量が低い１本鎖突出は、アニーリングの安定性が低く、またクローニングされるＤＮＡ断片の両端に対して高い相補性を有する１本鎖突出は、ＤＮＡ挿入配列の方向を一定にする能力を弱める。したがって、１本鎖突出の配列は、以上の問題や似たような問題を避けるように慎重に設計すべきである。
【０１７２】
実施例３
本発明は、ＰＣＲ産物を、本発明の方法で構築されたベクターへ方向的に挿入する際に特に有用である。所望の挿入配列のＰＣＲ増幅では、ＰＣＲプライマーの設計は、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸ベクターに方向的にクローニングされる、同定された挿入配列に相補的になるように行う。ＤＮＡのコード鎖の上流に結合するように設計されるプライマーは、５’端にある付加的な相補的ヌクレオチド配列で修飾される。結果として得られるＰＣＲ産物は、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターへの、１本鎖突出を介した方向的挿入と、これに続く産物の発現を可能とする相補的な配列をもつ。
【０１７３】
一つの態様は、ドナーの２本鎖ＤＮＡ基質に、ドナーの２本鎖ＤＮＡ分子に、１本鎖突出を含む５’オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ドナーの２本鎖ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅により、１本鎖突出部位を導入する段階を含む。ＤＮＡの任意の領域のＰＣＲ増幅は、所望の領域の外部の既知の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計することで達成される。好ましい態様では、ＤＮＡの２本鎖領域のコード鎖に相同性を有するプライマーは、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターの１本鎖突出に相補的な付加的なヌクレオチド配列をもつ。
【０１７４】
本発明を高スループットのフォーマットに用いることで、発明者らは、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターへの方向的クローニングを目的として、ジーンストーム（商標）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から８２個の既知のＯＲＦを選択したが、各使用者により、どのＤＮＡの配列も望ましいものとして選択される可能性がある。これらのＯＲＦのそれぞれについて、コード鎖および非コード鎖に相同性を有するプライマーを設計する。ＰＣＲ産物を、実施例１に記載された、トポイソメラーゼをチャージした本発明のｄｓ核酸ベクターの修飾型ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡに方向的にクローニングするために、所定のプライマー対のうち１本のプライマーが、ベクターに含まれる１本鎖突出に相補的なヌクレオチド配列を含むように修飾した。この実施例では、コーディングプライマーは、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターの１本鎖突出の配列３’−ＧＴＧＧ−５’に相補的な、付加的な配列５’−ＣＡＣＣ−３’を含むものを使用した。上記のＯＲＦを対象に、各プライマーを用いたＰＣＲ増幅を行うと、１本鎖突出を５’端に有する２本鎖ＤＮＡ断片が得られる（図１６）。発明者らは、ＰＣＲ増幅にｐｆｕポリメラーゼを使用したが、ＰＣＲ反応が、ｐｆｕなどの非好熱性ポリメラーゼを用いるか、またはＴａｑなどの好熱性ポリメラーゼのいずれかを用いて実施した後に、平滑末端化を行って、これらの酵素がＰＣＲ産物の末端に残した非テンプレートヌクレオチドを除くことができることはよく知られている。
【０１７５】
この実施例では、０．１ μｇの各プライマーを、ＯＲＦを含む０．０５ μｇのＤＮＡと、総容量５０ μｌのＰＣＲ反応混合物中に混合した。プライマーおよびベクター以外に、反応混合物には、水、ＰＣＲ用緩衝塩、１０ ｍＭのｄＮＴＰ、および１．２５単位のｐｆｕポリメラーゼも含めた。以下の熱サイクル温度を用いた：９４℃における最初の変性；次に９４℃における２５回の変性、５５℃におけるプライマーのアニーリング、７２℃における伸長（各１分）；最後に７２℃で１５分間の伸長反応。しかし、これらのパラメータは、増幅対象の各ＤＮＡ断片によって変動する。ＰＣＲ増幅法は当技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９２）、第２版；「分子生物学における簡単なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１５．３〜１５．４、また３’突出の平滑末端への変換に関しては、「プロトコールと使用ガイド（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．；Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、４３〜４４、１９８９）。
【０１７６】
相補的なヌクレオチド配列を含む、ＰＣＲで増幅されたドナーの２本鎖ＤＮＡと、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸ベクター（修飾型ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ）とのインキュベーションにより、ドナーＤＮＡの方向的クローニングが達成される。例えばジーンストーム（商標）クローンコレクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から８２個のＯＲＦを、相補的なヌクレオチド配列を含むアダプターを付加したプライマーを用いて増幅した。記載の修飾型プライマー対による、８２個のジーンストーム（商標）ＯＲＦの増幅で、相補的なヌクレオチド配列を５’端に有するＰＣＲ産物が得られた。このＯＲＦのＰＣＲ産物を、１０ ｎｇの本発明のトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターと、滅菌水または塩溶液中に混合した。この反応液を緩やかに攪拌し、５分間室温（２２〜２３℃）でインキュベートした。５分後、発明者らは反応液を氷上に移し、ワンショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ）（登録商標）化学的形質転換（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、またはエレクトロポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号はそれぞれＣ４０４０−１０およびＣ４０４０−５０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を行った。トポイソメラーゼは、連結反応の触媒により、ベクターの隣接する鎖と産物を結合していた（図１７）。したがって、５’端において相補的なヌクレオチド配列とともに構築されたＤＮＡ断片は、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターに高い効率で正しく挿入された。
【０１７７】
本発明の特定の態様による、相補的な５’配列を含むＤＮＡ断片の、ｄｓ核酸クローニングベクターへの方向的挿入は、形質転換された宿主細胞の複数のコロニーを対象とした配列決定でみた場合に、９０％を超える効率で生じる。この実施例では、ジーンストーム（商標）のＯＲＦを含む、本発明の、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターを、形質転換にコンピテントな大腸菌宿主細胞とインキュベートした。７４回の形質転換反応で、ＯＲＦの、本発明のトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターへの方向的クローニングが、選択した８個のコロニーのうち少なくとも７個でみられ、これらのクローニング反応の５９回が、選択された８個のすべてのコロニーに方向性が認められた。全体的な方向的クローニングスコアは６５６個中６０９個であったので、方向的挿入が、選択されたクローンの９３％以上でみられたことになる（表１参照）。
【０１７８】
実施例４
同様の例において、上述の、本発明の、トポイソメラーゼをチャージした本発明のｄｓ核酸ベクターの修正型（ｐＣＲ（登録商標）２．１）を用いて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする、ＰＣＲで得られたＯＲＦが、ベクター上に存在するｌａｃＺのα断片と同じ読み枠で方向的にクローニングされた（図４参照）。ＧＦＰ遺伝子の増幅に使用したプライマーは、不可欠な相補的なヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＣ−３’、およびメチオニンから翻訳を開始するための既知配列５’−ＡＴＧ−３’を含む。上述した、必要なクローニング段階を用いて、ＰＣＲで増幅されたＧＦＰをベクターに挿入し、形質転換細胞を固体寒天プレート上で生育させた。生育するコロニーはＰＣＲ産物が正しく挿入されたコロニーである（表２参照）。
【０１７９】
以上のデータは、クローニング分野に関する現状に比べて実質的な改善を意味し、また、高スループットの手法に高度に適合するクローニングにおける発明を示す。９０％を越える方向的クローニングの効率が得られれば、使用者は、個々のクローニングされたＤＮＡ断片について２個のコロニーをスクリーニングするだけで済む。したがって９６ウェルプレート上で、４８個の異なるクローンを、方向的挿入についてスクリーニングするとよく、これは現行のクローニング法の４００％を超えるものである。本発明は、多くの高スループットの遺伝子発現操作を簡素化し、現在のコストの数分の一で達成することができる。
【０１８０】
【表１】本発明のトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターを用いた、ＯＲＦの方向的クローニング
2004517608.tif 000018
【０１８１】
【表２】本発明のトポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクター（修飾型ｐＣＫ２．１）へのＧＦＰの読み枠の合う方向的クローニング
2004517608.tif 000019
【０１８２】
本発明は、上記の実施例に関して記載されているが、修正および変更が本発明の精神および範囲に含まれることが理解される。したがって本発明は、添付された特許請求の範囲のみに制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のさまざまな局面の実施に使用可能ないくつかのｄｓ核酸分子。図中、円および四角で囲んだ領域は、相互に鎖の侵入が生じるのに十分なヌクレオチド配列相補性を含む領域を示す。図１Ａは、第二の分子の末端との鎖の侵入を起こさせる一つの末端をそれぞれ含む２つのｄｓ核酸分子（「第一の」の分子および「第二の」分子）（四角で囲った部分を参照）。各分子の鎖を共有結合で結びつける（例えば連結する）際にトポイソメラーゼを使用する際は、第一の分子の末端の３’側の凹んだ鎖に通常、トポイソメラーゼがチャージされる。さらにトポイソメラーゼは通常、第一の分子の末端の３’側の凹んだ鎖と、鎖の侵入が生じる第二の分子の５’鎖との共有結合による連結を触媒する（すなわち四角で囲まれて示される第二の核酸分子の５’端）。図１Ｂは、それぞれが、他の分子の末端との鎖の侵入を可能とする二つの末端を含む、２個のｄｓ核酸分子（「第一の」分子および「第二の」分子）。さらに、二つの核酸分子はそれぞれ、平滑末端、および５’に１本鎖突出を有する末端を有する（円および四角を参照）。したがって図に示す核酸分子は、二つの別個の鎖の侵入を、各末端における核酸の鎖の共有結合による連結によって生じることが可能であり、単一の環状核酸分子が得られる。共有結合による末端の連結は、例えば図１Ａに記載されたように実施することができる。図１Ｃは、それぞれが、他の分子の異なる末端との鎖の侵入を可能とする二つの末端を含む、２個のｄｓ核酸分子（「第一の」分子および「第二の」分子）。さらに、これらの分子の一つは２か所の平滑末端を有し、またもう一つの分子は各末端の５’に１本鎖突出を有する。したがって図に示す分子は、二つの異なる鎖の侵入を生じることが可能であり、各末端における核酸の鎖の共有結合による連結によって環状核酸分子が形成される。共有結合による末端の連結は、図１Ａに記載されたように実施することができる。図１Ｄは、３種のｄｓ核酸分子（「第一の」分子、「第二の」分子、および「第三の」分子）。３種のうち２種（「第一の」分子および「第三の」分子）は、他の分子（「第二」の分子）の異なる平滑末端との鎖の侵入を可能とする、１本鎖の５’突出を有する。したがって図に示す分子は、２種の異なる鎖の侵入を生じて、３種すべての分子を含む線状の核酸分子を作製する。共有結合による末端の連結は、図１Ａに記載されたように実施することができる。図１Ｅは、図１Ｄに記載された分子に似た核酸分子（核酸分子の一つ（「第二の」分子）が両端に５’突出を有し、また他の二つの核酸分子（「第一の」分子および「第二の」分子）のそれぞれが２か所の平滑末端をもつ点を除く）。
【図２】トポイソメラーゼ認識部位の上流に５’尾部を含む第一の鎖の３’端にトポイソメラーゼを含む実質的に平滑末端を有する第一のｄｓ核酸分子；および５’尾部に相補的な３’突出を有する第二のｄｓ核酸分子の鎖の侵入が関与する本発明の一つの局面（ＣｈｅｎｇおよびＳｈｕｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２０：８０５９〜８０６８、２０００を参照）。図中、四角で囲まれた領域は、相互に鎖の侵入を生じるための十分なヌクレオチド配列相補性を含む領域を示す。
【図３】ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ（配列番号：１８）マルチクローニングサイトのヌクレオチド配列および制限エンドヌクレアーゼ認識配列の位置、およびこの２．３ ｋｂの長さをもつベクターのプラスミドマップ。ＥｃｏＲＩクローニング部位は、ヌクレオチド４７１に位置し、ＳａｃＩクローニング部位は、ヌクレオチド５２８に位置する。
【図４】ｐＣＲ ２．１のマルチクローニングサイトの制限エンドヌクレアーゼ認識配列のヌクレオチド配列および位置、および同ベクターのプラスミドマップ。ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位は、ヌクレオチド２３４に位置し、ＳｐｅＩクローニング部位はヌクレオチド２５８に位置し、またＥｃｏＲＩクローニング部位はヌクレオチド２８３およびヌクレオチド２９９に位置する。このベクターの長さは３９０６ヌクレオチドである。ＬａｃＺα断片：１〜５８７塩基；Ｍ１３リバースプライミング部位：２０５〜２２１塩基；マルチクローニングサイト：２３４〜３５５塩基；Ｔ７プロモーター／プライミング部位：３６２〜３８１塩基；Ｍ１３フォワード（−２０）プライミング部位：３８９〜４０４塩基；Ｍ１３フォワード（−４０）プライミング部位：４０８〜４２４塩基；ｆ１複製起点：５４６〜９６０塩基；カナマイシン耐性遺伝子のＯＲＦ：１２９４〜２０８８塩基；アンピシリン耐性遺伝子のＯＲＦ：２１０６〜２９６６塩基；ＣｏｌＥ１複製起点：３１１１〜３７８４塩基。図示されたベクターは、ＴＡクローニング（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）により挿入されたＰＣＲ産物を含むｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターである。挿入されたＰＣＲ産物が、ＥｃｏＲＩ切断部位に挟まれていることに注意されたい。矢印は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始点を意味する。
【図５】ベクターｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡ配列のヌクレオチド配列（配列番号：１６）。
【図６】ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ バージョンＡのＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩによる切断、ならびに結果として得られる付着末端の配列を示す。ｌｏｘＰ領域近傍の、図の左側に示す、結果として得られる付着末端は、ＥｃｏＲＩによる切断の結果として得られる付着末端である。Ｖ５領域近傍の、図の右側に示す、結果として得られる付着末端は、ＳａｃＩによる切断の結果として得られる付着末端である。ｌｏｘＰ領域、Ｖ５領域、および６×Ｈｉｓ領域、ならびに停止コドンを同じ読み枠で含むベクターの領域群を示す。
【図７】ＤＮＡリガーゼの存在下における、切断後のベクターに対するアダプターオリゴヌクレオチドの付加。この反応によって、図示された直線化された、アダプターが付加されたベクターが得られる。アダプターの配列には下線を引いてある。４種類のアダプターオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
2004517608.tif 000020
Ｔ４による連結反応により、図示された直線化されたクローニングベクターが得られる。アダプター配列には下線を引いてある。
【図８】切断可能な鎖のトポイソメラーゼによる切断により、非切断可能な鎖のリン酸結合が維持されてベクターに結合した状態の脱離基が残される、トポイソメラーゼによる切断反応。図示した反応では、ｄｓ核酸分子にトポイソメラーゼが添加されている。トポイソメラーゼは、ＣＣＣＴＴ配列に結合し、隣接するホスホジエステル結合を切断する。非切断可能な鎖における、アダプターが付加されたベクターと、アニーリング用オリゴとの間のホスホジエステル結合が、切断後における脱離基の解離を妨げる。図示した２本鎖ＤＮＡモデルでは、Ｘとｘは相補的なヌクレオチド塩基を示す。
【図９】切断可能な鎖のトポイソメラーゼによる切断により、非切断可能な鎖にリン酸結合がないことが、脱離基のベクターからの解離を可能とする、トポイソメラーゼ切断反応。図示した反応では、図示したｄｓ核酸分子にトポイソメラーゼが添加されている。トポイソメラーゼは、ＣＣＣＴＴ配列に結合し、隣接するホスホジエステル結合を切断する。非切断可能な鎖において、アダプターが付加されたベクターと、アニーリング用オリゴとの間にホスホジエステル結合が存在しないことから、切断に伴い脱離基が解離する。図示した２本鎖ＤＮＡモデルでは、Ｘとｘは相補的ヌクレオチド塩基を示す。
【図１０】ＤＮＡリガーゼの非存在下において、アニーリング用オリゴヌクレオチドを、アダプターが付加された直線化されたベクターへ添加することで、図示したような、直線化され、アダプターが付加され、またアニーリングが生じたベクターが得られる。アニーリング用オリゴヌクレオチドが、ベクターとリン酸結合で結合していないために、トポイソメラーゼを介した切断により解離が可能となる点に注意されたい。アダプターが付加されたオリゴヌクレオチドには１本線を、アニーリングしているオリゴヌクレオチドには２本線を引いてある。いずれかのＴＯＰＯ Ｄ３と、これに隣接するオリゴヌクレオチドＴＯＰＯ Ｄ２およびＴＯＰＯ Ｄ５との間にホスホジエステル結合はない。アニーリング用オリゴヌクレオチドは以下の配列を有し、ＴＯＰＯ Ｄ１の１本鎖突出、およびＴＯＰＯ Ｄ４の１本鎖突出の両方に相補的である：
2004517608.tif 000021
【図１１】本発明の、直線化された、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターの例。１本鎖突出は、コザック転写配列に対応する。このベクターは、直線化されたＴＯＰＯ ｆｌａｐクローニングベクター（修飾型ｐＵｎｉ／Ｈｉｓ バージョンＡ）である。
【図１２】ベクターｐＣＲ ２．１配列のヌクレオチド配列（配列番号：１７）。
【図１３】ｐＣＲ２．１（登録商標）ベクターの形状。図１３Ａは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断後のｐＣＲ２．１（登録商標）（付着末端が結果的に生じている点に注意）。４種類のアダプターオリゴヌクレオチドが連結されて、直線化されたベクターとなっている。オリゴヌクレオチド上のＴＯＰＯ結合部位の配列はＣＣＣＴＴ（下線部）である。付着末端の相補的な塩基を太字で示す。４種類のアダプターオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：
2004517608.tif 000022
ＴＯＰＯ ＨおよびＴＯＰＯ １は、それぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの付着末端に相補的な５’端を有する。図１３Ｂは、Ｔ４リガーゼの存在下における、アダプターオリゴとのインキュベーションによりアダプターが付加されたｐＣＲ２．１（登録商標）のバージョン。
【図１４】アダプターが付加されたｐＣＲ２．１（登録商標）ベクターへのアニーリング用オリゴヌクレオチドの付加と、それに続く、トポイソメラーゼＩの結合、およびトポイソメラーゼによる２本鎖ベクターの切断。結果として得られるベクターは線状で、トポイソメラーゼＩが両端にチャージされている。また、このベクターの一端は、特別の４ ｂｐの１本鎖配列を有し、もう一端は平滑である。図示した最初の反応において、結合状態のアダプターおよびアニーリング用オリゴヌクレオチドを含むｐＣＲ２．１（登録商標）の末端近傍に位置する共有結合の結合部位の２本鎖ＤＮＡの５’端にトポイソメラーゼが結合して切断する。この段階は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で実施される。このアニーリング用オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：
2004517608.tif 000023
ＴＯＰＯ ３とＴＯＰＯ ２との間に、またはＴＯＰＯ １７とＴＯＰＯ １６の間とには、ホスホジエステル結合は形成されていない。このアニーリング用オリゴヌクレオチドには二本線を引いてある。
【図１５】本発明の、直線化された、トポイソメラーゼをチャージしたｄｓ核酸クローニングベクターの別の例。この例では、１本鎖突出配列は、３’−ＴＡＡＧ−５’である。このベクターは、直線化された、ＴＯＰＯをチャージしたＦＬＡＰベクター（修飾型ｐＣＲ２．１（登録商標））である。
【図１６】方向的クローニング用に設計されたプライマーを用いたＰＣＲによる対象遺伝子の増幅。結果として得られる産物は、本発明のベクターを用いた方向的クローニングに必要な１本鎖突出を有する。上の図に示したプライマーＣＡＣＣは、対象遺伝子のコード鎖に相同であり、その５’端に付加された「ＦＬＡＰ」配列を有する。プライマーを含むＣＡＣＣ配列を含む、適切なプライマーの存在下における、対象遺伝子の標準的なＰＣＲ増幅を行うことで、下の図に記載された産物が得られる。この産物は、ｆｌａｐ配列を５’端に有する、２本鎖の対象遺伝子の単位複製配列である。
【図１７】１本鎖突出を有する、ＴＯＰＯ ＦＬＡＰクローニングベクターを含む、本発明の２本鎖の核酸ベクターが、増幅されたＤＮＡの適切な方向における挿入を促進可能であること。正しく挿入された場合、トポイソメラーゼは産物をベクターに連結する。
【図１】
2004517608.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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