(57)【要約】医薬品もしくは装置がBMP結合タンパク質を含む、例えば骨および／または軟骨組織の組織再生のための医薬品または装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
BMP結合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２】
組織再生を促進するBMP結合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
ZFSTA2、
FSRP、
FLIK、
α−2−HS糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
からなる群より選択される、請求項1または2のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
ZFSTA2、
FSRP、
FLIK、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
エンドグリン、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
からなる群より選択される、請求項1、2または3のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【請求項５】
BMP結合タンパク質が:フォリスタチン、リストに記載されたアミノ酸配列(1)に記載のタンパク質、またはそれらの誘導体、断片および／またはアナログの群より選択される、前記請求項のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
BMP結合タンパク質がコラーゲンIIa、またはその誘導体、断片および／またはアナログである、請求項1〜4のいずれか1つに記載の医薬組成物。
【請求項７】
組織が骨である、請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項８】
組織が軟骨である、請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項９】
組織再生、例えば軟骨および／または骨の組織再生の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品の製造におけるBMP結合タンパク質の使用。
【請求項１０】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
ZFSTA2、
FLIK、
FSRP、
α−2−HS糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群より選択される、請求項9に記載のBMP結合タンパク質の使用。
【請求項１１】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
ZFSTA2、
FLIK、
FSRP、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
エンドグリン、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
からなる群より選択される、請求項9に記載のBMP結合タンパク質の使用。
【請求項１３】
組織が骨である、請求項9、10または11のいずれか1つに記載の医薬品の製造におけるBMP結合タンパク質の使用。
【請求項１４】
組織が軟骨である、請求項9、10または11のいずれか1つに記載の医薬品の製造におけるBMP結合タンパク質の使用。
【請求項１５】
BMP結合タンパク質を含む、組織発生を促進するための足場。
【請求項１６】
BMP結合タンパク質がコラーゲンIIaである、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項１７】
BMP結合タンパク質がフォリスタチンである、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項１８】
BMP結合タンパク質がコラーゲンIIaである、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項１９】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
ZFSTA2、
FLIK、
FSRP、
α−2−HS糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群より選択される、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項２０】
BMP結合タンパク質が:
フォリスタチン、
FLIK、
FSRP、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
エンドグリン、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、または前記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
からなる群より選択される、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項２１】
BMP結合タンパク質がエンドグリンである、請求項15に記載の組織発生を促進するための足場。
【請求項２２】
組織が骨である、請求項15〜21のいずれか1つに記載の足場。
【請求項２３】
組織が軟骨である、請求項15〜21のいずれか1つに記載の足場。
【請求項２４】
請求項1〜9のいずれか1つによる医薬品を含む、組織再生を促進するための装置。
【請求項２５】
BMP結合タンパク質で足場を被覆する工程を含む、組織発生を促進するための足場の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に骨および軟骨の生物学の分野に関し、組織、例えば骨および／または軟骨の形成を促進するための方法、医薬組成物/医薬品および装置、ならびにこのような組成物を含む人工器管のような構造物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨
体に機械的な支持を与える組織としての脊椎動物の骨は、骨芽細胞および破骨細胞の活性によりそれぞれ仲介されると広く考えられている骨の形成ならびに吸収を介して一定の再構築を受ける。骨再構築は、細胞と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で高度に編成された相互作用を含む。しかしながら、再構築の過程は、成長または習慣性の活動の要求に応じて順応性である。通常の健康な大人の骨格では、再構築として知られる過程を通じて、骨形成の速度は骨吸収の速度とほぼ等しい。骨の吸収または形成は骨格全体で同時に起こる一般化された特徴ではないが、静止性の骨の領域に囲まれているであろう別個の位置で起こる。吸収が過剰に起こるところでは、特異的な局部またはより広い骨格全体のいずれかにおいて、いくつかの臨床上の問題が発生する。
【０００３】
例えば、骨粗しょう症は、骨組織の量および構築配列の異常を特徴とする疾患である。骨粗しょう症は、最小の外傷のみに続く骨の破砕を導く主要な臨床上の状態である。骨粗しょう症は、骨の吸収と形成とのバランスが吸収の方へ移行して、合計で骨の損失が起こることに起因する。患者への苦痛に加えて、骨粗しょう症の病院への直接の経費は、米国のみで130億ドル、英国では7.5億ポンドに近いと見積もられている。「骨粗しょう症」の語は、実際は、骨組織の損失およびそれに伴う、海綿状骨空間で起こる構築異常に関する状態の群のことをいう。状態が閉経後の女性において進行する場合は、閉経後骨粗しょう症と呼ばれる。破砕は股関節、脊柱および遠位橈骨で通常起こり、多くの国で主要な公衆衛生問題であると考えられている(Lindsay R (1993)、Clinical Rheumatology Osteoporosis; V.7、No.3)。遺伝的特質、食餌および生活様式が疾患の病因における因子であるとみられるが、少なくとも閉経後骨粗しょう症においては、卵巣機能の喪失が重要な決定因子である。
【０００４】
骨粗しょう症における骨形成の低さの一つの理由は、活性な骨芽細胞の数が減少したことである。よって、これらの細胞の数を増加させ得る剤は、骨の質量が低いことを特徴とする状態において有用性を有する。
その他の骨粗しょう症関連疾患の状態は、骨の吸収が疾患の二次的指標となる、ステロイド誘発骨粗しょう症、特発性若年性骨粗しょう症および移植後骨粗しょう症を含む。
パジェット病として知られる疾患では、骨の骨破壊性吸収が過剰であり、それが過剰な骨芽細胞の形成となり、骨構造の異常を導く。
骨の疾患と必ずしも直接関係しているわけではない長期のベッドでの療養または作業不能は、骨損失および動作の再開またはリハビリテーションにおける骨折の危険性を導く。
【０００５】
癌においては、原発および続発性の腫瘍の形成は、しばしば吸収および／または形成、ならびにそれに続いて骨折もしくは機能の喪失の傾向の増加の原因となる。
腫瘍誘発骨溶解は、血清のカルシウムのレベルを病的に上昇させることを誘導することができ、これは、癌患者において死亡率を大きく上昇させると考えられている。
【０００６】
低い骨質量を治療するために、骨損失を減少させるかまたは阻害する、ビスホスホネートなどの抗吸収剤の使用に基づくいくつかのアプローチがとられているが、後続の骨形成の増加がゆっくりと起こるので、これらのアプローチのいずれも完全に満足できるものではない。
骨吸収を阻害するビスホスホネートの使用もまた、人によっては副作用の程度が許容できないほど高いとみなされ、その使用が個体群の多くの部分には良好に許容されないので、現実的ではない。
【０００７】
エストロゲンおよびその他のホルモンの置換は、単独または他の治療との組合せのいずれかとして、閉経後骨粗しょう症に歴史的に用いられている。しかしながら、骨粗しょう症の患者の大多数を形成する、個体群の初老女性の部分がしばしば歓迎しない、子宮内膜癌および乳癌の危険性の増加が示唆されること、ならびに月経の継続が、代替のアプローチの必要性を提供する。
骨破壊作用に影響する物質を用いる骨粗しょう症のその他の治療は、例えばカルシトニンまたは副甲状腺ホルモンを用いているが、ほとんど成功していない。
【０００８】
骨再生の速度に影響を及ぼす疾患および状態と同様に、物理的な打撲や事故もまた骨の破砕の原因となる。
米国のみにおける骨の破砕の割合は、年間600万人の個体であると見積もられる。
骨修復の最もよく確立された方法は機械的なもので、板、ピン、ねじなどの硬いインプラントおよびハードウェアを含む。硬いインプラントの範疇には、プラスチックのアレイ、有機ベースの合成セメントおよび金属人工器官がある。機械的ハードウェアおよびインプラントを用いる際には、2つの主な考慮と懸念がある。第一は、体の組織へのハードウェアの生理的な組込みの効率性に関し、第二は移植された非生物学的材料の長期にわたる耐久性に関する。これらの問題に関わらず、機械的インプラントは非常に普及しており、生体の骨組織を含んではいないが、骨の再建の補助に大きく貢献している。
【０００９】
骨が完全に破砕された場合、骨折の大部分は単純な固定（ギプス包帯固定）を超えた医療の介入を必要とする。このような場合の主要な問題は、2つの骨の末端が近接していないことである。これは、回復を妨げ得る、不適切で長期化した修復工程となるであろう。体が骨折を修復する時間の平均の長さは、適度な負荷の挙動のためには 25〜100日であり、完全修復には1年である。よって、単純な骨折および医学上複雑な破壊のどちらも、修復過程を促進および／または完了する新規の治療的理学療法の恩恵を享受するであろう。骨の菲薄化に帰着し、その一次的な症状が屡次衰弱骨折である、これらの骨疾患（骨粗しょう症またはオステオペニアと呼ばれる）にも、同様のことがいえる。
【００１０】
骨形成因子(BMP)のような外因性成長因子を用いたいくつかの研究が行われ、骨再生を促進する。この方法では、非常に大量のBMPなどの成長因子が損傷を受けた骨の部位に投与される。しかしながら、これは高い濃度の成長因子が生物学的平衡の変化の原因となり、成長因子の効力を低くする可能性があるという短所がある。
BMPのような成長因子を投与することの付加的な問題は、外因性成長因子の90％は最初の24時間で排出されることで、ほとんどの成長因子がその標的細胞に達しそこなっていることを示唆する。
【００１１】
BMPおよびBMP結合タンパク質、例えばフォリスタチンについての以前の研究では、フォリスタチンはBMPへの結合に際してBMPの活性を阻害すると考えられていた(Follistatin、Ketan Patel、The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 30 (1998) 1087〜1093；Direct binding of Follistatin to a complex of bone-morphogenic protein and its receptor inhibits ventral and epidermal cell fates in early xenopus embryo、Shar-Lchiro Iemuraら、Proc. Natl. Acs. Sci. USA. Vol. 95 pp 9337〜9342 August 1998 Developmental Biology)。BMP結合タンパク質、例えばフォリスタチンは、BMPに結合し、BMPの不活性体を作ると考えられていた。したがって、フォリスタチンなどのBMP結合タンパク質はBMPの活動を阻害することにより骨形成を阻害すると考えられていた。
【００１２】
しかしながら、我々は、驚くべきことに、確立された定説の教示に反して、欠損を特徴とする状態をBMP結合タンパク質、例えばフォリスタチンの直接投与により治療すると細胞の分化および／または増殖が促進されることを見出した。
我々は、BMP結合タンパク質、例えばフォリスタチンが間質幹細胞、筋原細胞および未分化の間質細胞の骨芽細胞への分化を増大させることを見出した。
【００１３】
軟骨
軟骨は、自己修復の能力が制限されている。
体の軟骨は、物理的な打撲により損傷を受ける。損傷を受けた軟骨はさらに変性し、即ち変形性関節症となる傾向がある。
関節軟骨の破壊を特徴とする変形性関節症疾患(OA)は、軽い外傷もなく発生し得る。これは少なくとも160万人のアメリカ人に影響を及ぼし、75歳を超える年齢の人口の80％の症状である。老齢人口ではその関係は増加しており、健康管理サービスの負担の多くを占めるようになっている。
【００１４】
軟骨の主な構成成分はコラーゲンである。
コラーゲンは最も豊富に自然界に存在する動物性タンパク質の一つである。これは、ヒトを含む全てのタイプの多細胞動物に存在し、ヒトの体の全タンパク質の約30％を占めると見積もられている。コラーゲンは、軟性結合組織（例えば皮膚、靭帯および腱）の繊維状成分を構成し、骨や歯質のような生体基質の石灰化組織の有機マトリックスの主要な成分である。その構造的な重要性に加えて、コラーゲンは発達および創傷治癒において重要な役割を演じ、老化およびある疾患の進行に関わっている。
【００１５】
いくつかの遺伝子的に明確なコラーゲンの型があり、I、II、III型などと呼ばれる。II型コラーゲンは軟骨の主なコラーゲンである。これは、軟骨細胞によりプロコラーゲン分子として、非コラーゲン性アミノプロペプチドおよびカルボキシペプチド伸展とともに合成される。これらの2つの伸展は、II型コラーゲンが原線維に組込まれる前に特異的ペプチダーゼにより除去される。
軟骨の語は、動物またはヒトの体の全ての軟骨を意味し：関節の軟骨、ヒアリンの軟骨、半月板の軟骨、および黄色弾性軟骨を含むが、これらに限定されない。
したがって、軟骨の成長、修復および再生を増大させる手段への要求がある。
【００１６】
本発明の更なる観点では、新規の組織再生法を提供することを目的とする。
本発明の更なる観点の目的は、組織再生を促進する組成物を提供することである。
本発明の目的は、骨の欠損および異常を治療するための、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン(PTH)ならびにその誘導体のような現行の提案された治療の代替である、骨形成を促進する組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、骨形成因子(BMP)の制御された放出のために、BMPに結合する足場を提供することである。
本発明の更なる目的は、結合したBMPの制御された放出方法を提供することである。
本発明の更なる観点の目的は、組織再生を促進する足場を提供することである。
【００１８】
本発明の目的は、新規の軟骨再生方法を提供することである。
本発明の目的は、軟骨再生を促進する足場を提供することである。
本発明の目的は、内因性および外因性BMPがその標的細胞に近づくのを促進する足場を提供することである。
本発明の目的は、モザイクプラスティー、自己由来軟骨細胞移植および生体組織工学のような現行の提案された治療の代替である、軟骨形成のための足場を提供する。
本発明によると、BMP結合タンパク質を含む医薬品が提供される。
本発明によると、組織再生を促進するBMP結合タンパク質を含む医薬品が提供される。
本明細書では、「医薬品」および「医薬組成物」は、同等の意味と解される。
【００１９】
BMP結合タンパク質の語により、BMPファミリーのタンパク質に結合し得る全てのタンパク質を意味する。好ましくは、BMP結合タンパク質は、BMPの活性を上昇させ、例えば組織再生を上昇させるBMPに結合する。BMP結合タンパク質の語は、タンパク質；フォリスタチン(Follistatin)、フォリスタチン関連タンパク質(FSRP)、FLIK、α−2−HS−糖タンパク質、コラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2、コルディン(Chordin)、ソグ(Sog)、クリム(Crim)、ネル(Nell)、結合組織成長因子(CTGF)、ダン(Dan)、グレムリン(Gremlin)、ケルベロス(Cerberus)、エンドグリン(Endoglin)、撚状原腸形成遺伝子(Twisted Gastulation gene)、ZFSTA2および上記タンパク質の誘導体、断片および／またはそのアナログを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
BMP結合タンパク質の典型的な群は、「フォリスタチン」群を含み、これはフォリスタチン、フォリスタチン関連タンパク質(FSRP)、ZFSTA2、FLIKおよび上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
BMP結合タンパク質の他の典型的な群は、「システイン豊富な」BMP結合タンパク質を含み、これはコラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2、コルディン、ソグ、クリム、ネル、結合組織成長因子(CTGF)および上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
【００２１】
BMP結合タンパク質の他の典型的な群は、「ケルベロス」BMP結合タンパク質を含み、これはケルベロス、グレムリン、ダンおよび上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
BMP結合タンパク質の適切な群は、フォリスタチン、コラーゲンIIa、コラーゲンIV、コルディン、ネル、クリムおよび上記タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
【００２２】
適切なBMP結合タンパク質は、フォリスタチン、FLIK、コラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2、エンドグリン、ダン、グレムリン、ケルベロス、コルディン、ソグ、クリム、ネルおよび上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
典型的なBMP結合タンパク質は、フォリスタチンもしくはコラーゲンIIaまたはフォリスタチンもしくはコラーゲンIIaの誘導体、断片および／またはそのアナログである。
適切なBMP結合タンパク質は、フォリスタチンである。または、本発明のある観点においては、BMP結合タンパク質はコラーゲンIIaであってもよい。本発明の更なる観点においては、BMP結合タンパク質はエンドグリンであってもよい。
【００２３】
本発明によると、
フォリスタチン、FSRP、FLIK、ZFSTA2、α−2−HS糖タンパク質、コラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2、コルディン、ソグ、クリム、ネル、結合組織成長因子(CTGF)、ダン、グレムリン、ケルベロス、エンドグリン、ノギン(Noggin)、撚状原腸形成遺伝子、ZFSTA2または上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択されるタンパク質を含む医薬組成物が提供される。
本発明によると、また、
フォリスタチン、FSRP、FLIK、α−2−HS糖タンパク質、コラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2、コルディン、ソグ、クリム、ネル、結合組織成長因子(CTGF)、ダン、グレムリン、ケルベロス、エンドグリン、ノギン、撚状原腸形成遺伝子、ZFSTA2または上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択されるタンパク質を含む医薬組成物が提供される。
【００２４】
本発明の好適なBMP結合タンパク質は：
フォリスタチン、
FSRP、
ZFSTA2、
FLIK、
α−2−HS糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
を含む。
【００２５】
典型的には、本発明のBMP結合タンパク質は、フォリスタチン、FLIK、α−2−HS糖タンパク質、ネル、クリム、エンドグリンおよび上記BMPタンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
本発明のBMPタンパク質の適切な群は、例えば、コラーゲン型タンパク質であるコラーゲンIIa、コラーゲンIV、コラーゲンV α1、コラーゲンV α2または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログである。
【００２６】
本発明のBMPタンパク質の他の適切な群は、例えば、エンドグリン、ダン、ソグ、クリム、ネルおよびコルディンまたは上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログである。
さらに本発明のBMP結合タンパク質の他の適切な群は、例えば、ソグ、クリム、ネルおよび上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログを含む。
さらに本発明のBMP結合タンパク質の他の適切な群は、例えば、ケルベロス、コルディン、FLIKおよびその誘導体、断片および／またはアナログである。
典型的には、BMP結合タンパク質はフォリスタチンである。
典型的には、BMP結合タンパク質はコラーゲンIIaおよびその誘導体、断片および／またはアナログである。
【００２７】
本発明のある観点では、BMP結合タンパク質はクリムまたはその誘導体、断片もしくはアナログである。本発明の別の観点では、BMP結合タンパク質はダンまたはその誘導体、断片および／またはアナログである。特に本発明の実施形態では、BMP結合タンパク質はZFSTA2またはその誘導体、断片もしくはアナログである。本発明の別の実施形態では、BMP結合タンパク質はエンドグリンまたはその誘導体、断片もしくはアナログである。同様に、本発明のBMP結合タンパク質は、ネルまたはその誘導体、断片もしくはアナログであってもよい。本発明の他の実施形態では、BMP結合タンパク質として、BMP結合タンパク質ネルまたはその誘導体、断片もしくはアナログを含むことができる。
【００２８】
BMPの語により、骨形成因子のBMPスーパーファミリーを意味し、これは：
BMP-2、
BMP-3、
BMP-3B/GDF-10、
BMP-4、
BMP-5、
BMP-6、
BMP-7/OP-1、
BMP-8/OP-2、
BMP-8B、
BMP-9、
BMP-10、
BMP-11、
BMP-12、
BMP-13、
BMP-14、
CDMP-1、
CDMP-2、
CDMP-3、
GDF-1、
GDF-2、
GDF-3、
GDF-4、
GDF-5/CDMP-1/BMP-14、
GDF-6/CDMP-2/BMP-13、
GDF-7/CDMP-3/BMP-12、
GDF-8、
GDF-9、
を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明のある観点においては、BMPは、例えば体内で天然に見出される内因性BMPであってもよく、治療部位に添加された天然のBMPであってもよい。本発明のほかの観点では、BMPは組換えBMPであってもよく、それを含んでいてもよい。
好適なBMPは、BMP-2、BMP-5、BMP-4、BMP-6およびBMP-7を含む。
BMPの典型的な群はBMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP8/OP-2およびBMP-8Bを含む。BMPの他の典型的な群はBMP-2およびBMP-4を含む。BMPの他の典型的な群はBMP-3およびBMP3B/GDF-10を含む。また、BMPの典型的な群はGDF-5/CDMP-1/BMP-14、GDF-6/CDMP-2/BMP13、GDF-7/CDMP-3/BMP-12を含む。典型的なBMPはGDF-9である。また、本発明のほかの実施形態では、BMPはGDF3であってもよい。適切には、本発明のBMPはBMP-2、BMP-4、BMP-6およびBMP-7を含むことができる。
【００３０】
特に、本発明の実施形態では、BMPは治療部位で見出される内因性BMPの混合物であってもよい。本発明のその他の観点では、組換えBMPを治療部位に添加してもよく、BMPの存在を確実にするために本発明による装置の作成に添加してもよい。BMPは、本発明のある実施形態ではBMP-2を含んでいてもよい。または、本発明のある実施形態では、BMP-4を含んでいてもよい。代わりに、本発明の他の実施形態では、BMPはBMP-7であってもよい。同様に、他の実施形態ではBMPはBMP-6であってよい。
【００３１】
本発明の実施形態によると、BMP結合タンパク質を含む医薬品が提供される。
本発明によると、
フォリスタチン、
FSRP、
FLIK、
ZFSTA2、
α−2−HS糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択されるBMP結合タンパク質を含む医薬品がある。
【００３２】
さらに本発明によると、
フォリスタチン、
FSRP、
ZFSTA2、
FLIK、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
エンドグリン、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択されるBMP結合タンパク質を含む医薬品が提供される。
このような医薬品は、組織再生、例えば骨および／または軟骨組織再生を治療することができる。
【００３３】
本発明によると、フォリスタチン、アミノ酸配列(I)で表されるタンパク質、またはその誘導体、断片および／またはアナログの群から選択されるタンパク質を含む医薬組成物が提供される。
本発明によるとまた、医薬組成物がフォリスタチン、以下に記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその誘導体、断片および／またはアナログの群から選択されるタンパク質を含む、組織発生を促進するための医薬組成物が提供される。
【００３４】
配列(I)は：
(I)
2004536818.tif 000002
【００３５】
好適には、組織は骨組織であってよく、よって本発明は骨成長を促進するのに用いることができる。組織はまた、中枢神経系の組織であってもよく、よって本発明は、例えば患者の卒中からの回復を促進する中枢神経系の成長および／または修復を促進するのに用いることができる。
組織はまた、軟骨細胞および／または軟骨組織であってもよく、従って本発明は軟骨の成長および／または修復を促進するのに用いることができる。
【００３６】
本発明によると、また、フォリスタチン、アミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択されるタンパク質を含む医薬品が提供される。
さらに、本発明によると、フォリスタチン、アミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、もしくはその断片から選択されるタンパク質を含む、骨欠損を特徴とする疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品が提供される。
【００３７】
本発明によると、また、組織再生、例えば軟骨および／または骨の組織再生の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品の製造における、BMP結合タンパク質の使用が提供される。
【００３８】
さらに、本発明によると、組織再生、例えば軟骨および／または骨の組織再生の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための薬剤の製造における、BMP結合タンパク質の使用が提供され、該タンパク質が
フォリスタチン、
FSRP、
ZFSTA2、
FLIK、
α−2−HS−糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択される。
【００３９】
さらに、本発明によると、組織再生、例えば軟骨および／または骨の組織再生の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品の製造における、BMP結合タンパク質の使用が提供され、該タンパク質が
フォリスタチン、
FSRP、
ZFSTA2、
FLIK、
α−2−HS−糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
エンドグリン、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択される。
【００４０】
したがって、骨形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品の製造における、BMPに結合可能なタンパク質の使用が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、ここに記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４１】
したがって、組織発生、例えば骨形成、軟骨形成もしくは中枢神経系の組織の形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療のための医薬品の製造における、BMPに結合可能なタンパク質の使用が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、以下に記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４２】
本発明の他の観点によると、BMPに結合可能なタンパク質の治療上の有効量を投与する工程を含む、骨形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療方法が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、ここに記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４３】
本発明の更なる観点によると、BMPに結合可能なタンパク質の治療上の有効量を投与する工程を含む、骨形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の予防方法が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、以下に記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４４】
本発明の更なる観点によると、BMPに結合可能なタンパク質の治療上の有効量を投与する工程を含む、骨形成の促進方法が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、以下に記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４５】
本発明の他の観点によると、BMPに結合可能なタンパク質の治療上の有効量を投与する工程を含む、組織形成、例えば骨、軟骨もしくは中枢神経系の組織の促進により緩和され得る疾患もしくは臨床上の状態の予防または治療方法が提供され、該タンパク質がフォリスタチン、以下に記載されたアミノ酸配列(I)に記載のタンパク質、またはその断片および／またはアナログの群から選択される。
【００４６】
本発明の他の観点によると、BMP結合タンパク質の治療上の有効量を投与する工程を含む、組織形成、例えば骨、軟骨もしくは中枢神経系の組織の促進により緩和され得る疾患もしくは臨床上の状態の予防または治療方法が提供される。
【００４７】
他の観点では、診断方法および診断キットが提供される。診断方法およびキットは、本発明のタンパク質またはその誘導体もしくは生体試料（例えば血液、尿、骨生検、骨髄細胞生検）中の分解産物のアッセイに基づく。
さらに、本発明において、個体の遺伝子型中の遺伝子多型、変異、欠失または他の変化を同定する、DNAに基づくスクリーニング技術（いわゆる「DNAフィンガープリンティング」）の使用における本発明のタンパク質の使用が、骨の疾患、例えば骨損失の危機にある人を同定するのに提供される。
【００４８】
本発明は骨の破砕の修復に有益であると考えられるが、他の臨床上の状態および疾患の治療に用いてもよい。
本発明により利益を得ると考えられる骨損失の臨床上の状態および疾患は、骨粗しょう症（非活動性骨粗しょう症、シュラー病、閉経後骨粗しょう症、外傷後骨粗しょう症、老人性骨粗しょう症を含む）、パジェット病、癌および腎臓疾患において役割を果たす、望まれない骨吸収、ならびにリウマチ性関節炎を含むが、これらに限定されない。
本発明は、骨修復を治療すること、または高い濃度のBMP結合成長因子を必要とすることなく骨の成長を誘導することに用い得ると考えられる。高い濃度の成長因子が（上述したように）生物学的平衡の変化の原因となり、成長因子の効力を低くする可能性があるという短所があるので、高い濃度の成長因子を用いることは、現在まで問題であった。
【００４９】
本発明は、BMPの、その標的細胞上へのよりよい標的を可能にする。
BMPのような成長因子の投与についての付加的な問題は、外因性成長因子の90％が最初の24時間で排出され得ることで、ほとんどの成長因子がその標的細胞に達しそこなっていることを示唆する。
本発明において好適に用いられるタンパク質は、フォリスタチンおよびその誘導体を含む。特に、本発明のタンパク質は下記のアミノ酸配列(I)に記載のアミノ酸および／またはその断片もしくはアナログを含む。
【００５０】
(I)
2004536818.tif 000003
【００５１】
また、本発明によると、組織発生を促進するための医薬組成物が提供され、該医薬組成物はコラーゲンIIa、以下に記載されたアミノ酸配列(II)に記載のタンパク質またはその誘導体、断片および／またはアナログの群から選択されるタンパク質を含む。
本発明において好適に用いられるタンパク質は、コラーゲンIIaおよびその誘導体を含む。特に本発明のタンパク質は、以下に記載されたアミノ酸配列(II)に記載のアミノ酸および／またはその断片もしくはアナログを含む。
【００５２】
配列(II)は：
2004536818.tif 000004
【００５３】
2004536818.tif 000005
【００５４】
本発明の典型的なタンパク質は、上記のアミノ酸配列(I)のアミノ酸配列を有する物質であり、剤はペプチドもしくはタンパク質自体；その機能的に活性な断片もしくはアナログ；保存の程度が高いホモログ、特にシステイン領域が保存されているもの、ならびにアミノ酸配列(I)に記載のアミノ酸配列を含むペプチドおよびタンパク質をエンコードするDNAベクター（プラスミドまたはウイルス）のようなベクターであってよい。
機能的に活性な断片およびアナログは、上記のアミノ酸配列(I)に記載のアミノ酸配列への、またはアミノ酸配列からの、1つ以上のアミノ酸残基の付加、挿入、修飾、置換もしくは欠失により作製することができる。
「アナログ」の語は、キメラタンパク質、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体、前駆体および他の機能的等価物または上記のものの模擬物を包含することを意図する。また、BMP結合タンパク質の活性を模倣した合成物質も含む。
上記のアミノ酸配列(I)またはその機能的に活性な断片もしくはアナログの使用もまた、骨形成を促進するための医薬品の製造において提供される。
【００５５】
BMPタンパク質を投与する工程を含む、組織再生、例えば骨および／または軟骨の再生の促進方法も提供される。
BMPタンパク質を投与する工程を含む、組織再生、例えば骨および／または軟骨の再生の促進方法も提供され、該BMP結合タンパク質が
フォリスタチン、
FSRP、
ZFSTA2、
FLIK、
α−2−HS  糖タンパク質、
コラーゲンIIa、
コラーゲンIV、
コラーゲンV α1、
コラーゲンV α2、
コルディン、
ソグ、
クリム、
ネル、
結合組織成長因子(CTGF)、
ダン、
グレムリン、
ケルベロス、
エンドグリン、
撚状原腸形成遺伝子、または上記BMP結合タンパク質の誘導体、断片および／またはアナログ
の群から選択される。
【００５６】
さらに、上記のアミノ酸配列(I)またはその機能的に活性な断片もしくはアナログの有効量を投与する工程を含む、好ましくは哺乳動物患者における骨形成の促進方法が提供される。
骨形成を促進するための、本発明のタンパク質またはその断片のcDNAを発現するDNAベクター、および該cDNAを発現する構築物でトランスフェクションされた細胞の使用もまた、本発明の観点を形成する。上記のcDNAおよびトランスフェクションされた細胞は、当業者に公知の標準的な技術に従って作製することができる。
さらに、本発明は、臨床上のその必要性がある、好ましくは哺乳動物患者における骨形成を促進するための遺伝子治療にまで達する。
本発明のタンパク質は、当業者に公知のように、標的特異性を向上させる、テトラサイクリンまたはビスホスホネートのような「骨検索」物質に結合させることができる。
【００５７】
本発明の機能操作剤は、好ましい適切な方法のいずれによっても製造することができる。このような方法は、合成もしくは組換え方法、または入手可能であれば天然資源からの精製方法を含む。
本発明の医薬組成物は、公知で、許容された医薬上のプラクティスにより要求される方法により製造することができる。本医薬組成物は、本発明のタンパク質とともに医薬上許容される担体を好適に含み、好適には投与量単位の形態である。本発明の医薬組成物は、受容個体宿主により代謝的に本発明の剤の活性形態に変換され得るプロドラッグの形態にある本発明のタンパク質を含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物は、例えばビスホスホネートなどのほかの療法と、例えば同時、逐次または別個に関連付けて用いることができる。本発明の医薬組成物は、ビスホスホネート、PTH、ビタミンD、BMPおよびエストロゲンなどのほかの活性薬剤を含むことができる。
【００５８】
他の観点によると、我々は、本発明のタンパク質を含む骨接触表面を有する、例えば骨ねじ(bone screw)、股義足などの内部人工器官、または髄内釘などの外傷用の釘のような医用装置をも提供する。
本発明のタンパク質は、層、例えば装置の骨接触表面上のコーティングとして存在することが適切である。好適には、本発明の医用装置は、本発明のタンパク質を担体物質に組込み、医用装置上を該担体で被覆することによって、本発明のタンパク質を例えば酸化チタンまたは金属表面もしくはポリマー表面の他の表面上、例えば骨ねじの上に吸収させることにより製造することができる。
本発明のこの観点の実施形態において、骨接触表面は、本発明のタンパク質が、適切に共有結合によって表面に直接結合するように、「派生」または修飾されている。
【００５９】
本発明の他の観点において、我々は、骨形成を促進するための人工足場物質を提供し、該足場は本発明のタンパク質と機能的に作用するように結合している。
本発明の足場は、例えば連続したフィルムやゲルのような三次元マトリックスまたは層の形態にあってよい。マトリックス構造は、繊維または適切な材料から製造することができ、これらは次いで紡織加工処理され（例えば、網目状にする、編む、織るまたは不織、メルトブローする、フェルトにする、水を含ませる）、さらに所望の三次元形状に処理される。マトリックス構造は、例えばスポンジ状や泡状などの他の形状を呈してもよい。
【００６０】
好適な足場物質は、生分解性であり、細胞の成長または増殖を阻害しないものが好ましい。典型的には、物質は患者の体から副作用を誘出するべきではなく、例えばエチレンオキサイド処理により滅菌可能であるべきである。典型的には、物質は骨伝導性である。
よって、適切な物質は、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリジオキサノン、ポリヒドロキシアルカノエート、例えばポリヒドロキシブチレート(ICI)、およびヒアルロン酸誘導体、例えばHYAFF (Fidia)のような生分解性ポリエステルを含む。さらに好適な物質は、本明細書に参照として組込まれる我々の特許出願WO 91/13638およびWO 97/06835に開示された、親水性ポリウレタン、ポリエーテルポリエステル、ポリエーテル  オキシド、ポリエーテルポリアミド、カルボキシメチルセルロース、エチレン−ビニルアセテートコポリマー、ポリブタジエン、スチレン−ブタジエン−スチレンブロックコポリマーなどのものを含む。
他の足場物質は、コラーゲンをベースとする、例えば架橋コラーゲン/エラスチン物質、酸溶解性I型ウシコラーゲン原料から製造された架橋コラーゲン、コラーゲンゲル（例えば商品名COLLASTATおよびCOLETICAの下に販売されているもの）である。天然または組換えの原料からのコラーゲンを用いることができる。
【００６１】
本発明からのタンパク質を組込み、医用生体材料としてのその組立、安定性および使用の促進を特徴とする、修飾またはキメラ組換え線維状コラーゲン（ここでは、「修飾コラーゲン」）も提供される。修飾コラーゲンは、上記の足場物質として用いることができる。アプローチは、三重らせんの形成を促進する、I型コラーゲンからのC末端球状ドメインの使用；分解を抑制する、コラゲナーゼ切断部位の除去または変更；架橋を促進する、付加的なリシンの包含、および成熟線維中でのN末端ドメインの保存を促進する、N末端球状ドメイン切断部位の変更を含む。例えば、コラーゲンIIaのコルディン/SOG配列は、タンパク質/ポリペプチド機能操作剤に取って代わることができた。相似ドメイン組み替えアプローチ(analogous domain shuffling approach)を、本発明のタンパク質を他の細胞外マトリックス成分（例えばフィブロネクチン連結タンパク質(fibronectin link protein)またはコラーゲンIV）またはECM結合分子もしくは配列（例えばヘパリン結合ドメイン）に組込むのに用いることができる。例えば、その全ての内容がここに参照として組込まれるWO97/08311参照。
【００６２】
他の特定の態様では、我々は、上記の足場物質のいずれか1つおよび本発明のタンパク質が組込まれた結晶相（例えばヒドロキシアパタイトのようなアパタイト）を含む複合物質を含む、骨代用物質を提供する。
本発明の適切な観点において、本発明のタンパク質は、ゲルの形態にある足場として得られる。典型的には、ゲルはトロンビン、フィブリノゲンおよびファクターXIII、またはゲルを架橋する他のトランスグルタミナーゼを含む。
【００６３】
本発明は、組織、例えば骨の異常の探索に有用な動物モデルの開発をも包含する。本発明のタンパク質の骨格システムにおける役割を非ヒト哺乳動物、例えばマウスで探索することができる。
好適には、タンパク質を固体マトリックスに結合させ、所望の身体的形態の異常な部位に移植する。この操作の外傷、タンパク質が結合したマトリックスの移植は、BMPの産生を引き起こし、これはBMPと本発明のタンパク質との相互作用により、マトリックス上に結合する。
好ましくは固体マトリックス上に結合した本発明のタンパク質は、体内で自然に産生された過剰のBMPが無駄にならない点で従来技術に対する長所を有する。過剰のBMPは、通常、体から迅速に排出される。本発明では、体内で自然に産生され、通常は迅速に排出されるBMPを濃縮する。
【００６４】
本発明によると、コラーゲンIIaを含む足場が提供される。
本発明によると、足場がBMP結合タンパク質を含む、組織発生を促進するための足場が提供される。
本発明によると、足場がコラーゲンIIaを含む、組織発生を促進するための足場が提供される。
適切には、足場装置は完全にまたは実質的にコラーゲンIIaで作られたか、またはコラーゲンIIaで実質的に被覆されている。
【００６５】
本発明によると、足場がBMPに放出可能であるように結合することができ、BMPの放出を制御することができる、コラーゲンIIaを含む足場が提供される。
よって、BMPの照準が向上される。
特定の態様において、結合したBMPは、一旦結合すると通常の細胞活動を介して、および／または結合したBMPを放出させることができる操作手段もしくは剤を介して放出され得る。BMPは、足場の分解によって放出され得る。
【００６６】
好適には、本発明は、溶解性のBMPが例えば欠損治癒部位にある標的細胞と相互作用することを可能にし、標的細胞が軟骨を形成することが可能な態様においては、これらの標的細胞が軟骨成分を発現し、合成することを可能にし、よって、欠損部位を治癒することを可能にする。
しかしながら、本発明の特定の態様では、BMPが結合した形態にあっても活性であるので、本発明では、BMPは作用するために必ずしも放出される必要はない。
【００６７】
BMPとみかけの軟骨型細胞との継続した相互作用は、骨形成に導くことができる。
骨は、まず軟骨が作られ、次に石灰化される軟骨内骨化の過程を通じて形成される。このように、骨は軟骨形成を通して形成され、よって、骨を治癒することがわかっている治療は全て、軟骨形成を刺激すると考えられ、逆も真であると仮定し得る。
【００６８】
本発明の他の観点では、治療上の有効量のコラーゲンIIaを含む足場を投与する工程を含む、軟骨形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の治療方法が提供され、該コラーゲンIIaは、BMPに結合し得る。
本発明のさらなる観点では、治療上の有効量のコラーゲンIIaを含む足場を投与する工程を含む、軟骨形成の促進により緩和され得る疾患または臨床上の状態の予防方法が提供され、該コラーゲンIIaは、BMPに結合し得る。
本発明のさらなる観点においては、治療上の有効量のコラーゲンIIaを含む足場を投与する工程を含む、軟骨形成の促進方法が提供され、該コラーゲンIIaは、BMPに結合し得る。
【００６９】
本発明は軟骨修復に有益であると考えられるが、他の臨床上の状態および疾患の治療にも用いることができる。
本発明により利益を得ることができる軟骨欠損の臨床上の状態および疾患は；変形性関節症、短脚症(branchypodism)およびハンター−トンプソン軟骨形成不全症を含む。軟骨内のもの、および軟骨下骨に浸透するものを含む関節軟骨における病変、ならびにOAの治療に用いることもできる。
【００７０】
本発明は、軟骨修復を治療すること、または高い濃度の成長因子を必要とすることなく軟骨の成長を誘導することに用い得ると考えられる。上記で記載のように、高い濃度の成長因子は生物学的平衡の変化の原因となり、成長因子の効力を低くする可能性があるという短所があるので、高い濃度の成長因子を用いることは、現在まで問題であった。
本発明は、BMPの、その標的細胞上へのよりよい標的を可能にする。
BMPのような成長因子の投与についての付加的な問題は、外因性成長因子の90％は最初の24時間で排出され得ることで、ほとんどの成長因子がその標的細胞に達しそこなっていることを示唆する。
【００７１】
本発明のコラーゲンIIaまたは足場は、例えば装置の軟骨接触表面上のコーティングのような層として存在することが適切である。好適には、本発明の医用装置は、例えば、本発明のコラーゲンIIaまたは足場を担体物質に組込み、医用装置上を該担体で被覆することによって、本発明のコラーゲンIIaまたは足場を例えば軟骨留めピン(cartilage anchor pin)の表面上に吸収させることにより製造することができる。
【００７２】
同様に、本発明の特定の観点のコラーゲンIIaまたは足場は、骨再生を促進するのに用いることができる。
足場をBMP結合タンパク質で被覆する工程を含む、生体組織工学を促進する足場の製造方法も提供される。
本発明のこの観点の実施形態において、軟骨接触表面は、本発明のコラーゲンIIaまたは足場が、適切に共有結合によって表面に直接結合するように、「派生」または修飾されている。
【００７３】
本発明の足場は、例えば連続したフィルムやゲルのような三次元マトリックスまたは層の形態にあってよい。マトリックス構造は、繊維または適切な材料から製造することができ、これらは次いで紡織加工処理され（例えば、網目状にする、編む、織るまたは不織、メルトブローする、フェルトにする、水を含ませる）、さらに所望の三次元形状に処理される。マトリックス構造は、コラーゲンIIaが足場の表面上に被覆されるか、または結合する、例えばスポンジ状や泡状などの他の形状を呈してもよい。
【００７４】
好適な足場物質は、生分解性であるものが好ましく、細胞の成長または増殖を阻害しないものである。好ましくは、材料は患者の体から副作用を誘出するべきではなく、例えばエチレンオキサイド処理により滅菌可能であるべきである。好ましくは、材料は骨伝導性である。
他の足場物質は、コラーゲンをベースとする、例えば架橋コラーゲン/エラスチン物質、酸溶解性I型ウシコラーゲン原料から製造された架橋コラーゲン、コラーゲンゲル（例えば商品名COLLASTATおよびCOLETICAの下に販売されているもの）である。天然または組換えの原料からのコラーゲンを用いることができ、例えばコラーゲンIIaである。
【００７５】
コラーゲンIIaを組込み、医用生体材料としてのその組立、安定性および使用の促進を特徴とする、修飾またはキメラ組換え線維状コラーゲン（ここでは、「修飾コラーゲン」）も提供される。修飾コラーゲンは、上記の足場物質として用いることができる。アプローチは、三重らせんの形成を促進する、I型コラーゲンからのC末端球状ドメインの使用；分解を抑制する、コラゲナーゼ切断部位の除去または変更；架橋を促進する、付加的なリシンの包含、および成熟線維中でのN末端ドメインの保存を促進する、N末端球状ドメイン切断部位の変更を含む。例えば、コラーゲンIIaのコルディン/SOG配列は、タンパク質/ポリペプチド機能操作剤に取って代わることができた。相似ドメイン組み替えアプローチを、本発明のタンパク質を他の細胞外マトリックス成分（例えばフィブロネクチン連結タンパク質またはコラーゲンIV）またはECM結合分子もしくは配列（例えばヘパリン結合ドメイン）に組込むのに用いることができる。例えば、その全ての内容がここに参照として組込まれるWO97/08311参照。
【００７６】
他の特定の態様では、我々は、上記の足場物質のいずれか一つおよびコラーゲンIIaなどのBMP結合タンパク質が組込まれたセラミックの骨伝導性または骨誘導性相（例えばヒドロキシアパタイトのようなアパタイト）を含む複合物質を含む、軟骨代用物質を提供する。
他の特定の態様では、我々は、上記の足場物質のいずれか一つおよびコラーゲンIIaなどのBMP結合タンパク質が組込まれたセラミックの骨伝導性または骨誘導性相（例えばヒドロキシアパタイトのようなアパタイト）を含む複合物質を含む、骨代用物質を提供する。
【００７７】
本発明の適切な観点において、本発明の足場は、ゲルの形態で得られる。一般的に、ゲルはトロンビン、フィブリノゲンおよびファクターXIII、またはゲルを架橋させる他のトランスグルタミナーゼを含む。
【００７８】
本発明は、軟骨の異常の探索に有用な動物モデルの開発をも包含する。本発明のタンパク質の骨格システムにおける役割を非ヒト哺乳動物、例えばマウスで探索することができる。
好適には、BMP結合タンパク質、例えばコラーゲンIIaは、固体マトリックスに結合させて本発明の足場を形成し、所望の身体的形態の異常な部位に移植する。この操作の外傷、本発明の被覆された足場に結合したBMP結合タンパク質コラーゲンIIaの移植は、BMPの産生を引き起こし、これはBMPと本発明の足場上のBMP結合タンパク質コラーゲンIIaとの相互作用により、マトリックス上に結合すると仮定される。BMPは通常の細胞活動により放出され、ここで溶解性BMPが増殖およびマトリックス産生を刺激する標的細胞と相互作用するのを許容する。
【００７９】
本発明の足場は、体内で自然に産生された過剰のBMPが無駄にならない点で従来技術に対する長所を有する。組織外傷において産生されたBMPは、局所的に存在せず、正しく細胞に提示される。損傷部位へのBMPの注射による現在のBMPの投与方法は、BMPが細胞に正しく提示されないので、この問題を克服しない。過剰のBMPは、通常、体から迅速に排出される。本発明では、体内で自然に産生され、通常は迅速に排出されるBMPを濃縮し、所望の領域でこれらのBMPの徐放を許容する。本発明のある観点において、本発明の足場への結合したBMPの徐放があってもよく、ここで、好ましくはコラーゲンIIa自体は、固体マトリックスに結合されるか被覆されており、これは体内で自然に起こる。BMPの結合は、BMPを不活性化せず、BMPの機能に何ら永続する損傷を与えないようである。
【００８０】
ここで、本発明を、次の実施例、表および図を参照することを例として説明する。
図1.1は、種々のコントロールに対して；フォリスタチンおよびBMP-2を含む細胞サンプルについて、細胞あたりの放出されたアルカリホスファターゼの棒チャートを示す。
図1.2aは、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
図1.2bも、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
図1.2cは、C2C12細胞におけるBMP-5活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
図1.2dは、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
図1.2eは、C2C12細胞におけるBMP-7活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【００８１】
図1.3aは、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.3bは、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.3cも、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.3dは、C2C12細胞におけるBMP-7活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.4は、C2C12細胞におけるBMP-4活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
図1.5は、C2C12細胞におけるBMP-4活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.7は、MC3T3EI細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
図1.8は、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチン288の影響（溶液）を示す。
図1.9は、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチン288の影響（結合）を示す。
【００８２】
図1.10aは、BMP-2のみで処理したラットのふくらはぎの筋肉中の石灰化組織を示す放射線写真を示す。
図1.10bは、ラットの下肢のふくらはぎの筋肉中の石灰化組織を示す放射線写真を示し、ここで、フォリスタチンおよびBMP-2の存在下では、図1.10aのコントロールより骨形成の増加が見られる。
図1.10cは、フォリスタチンおよびBMP-2とともに移植された組織をファン−コッサおよびヴァン−ギーソン対比染色により染色した組織学的断片の×50倍での鏡検写真を示す。
図1.10dは、フォリスタチンおよびBMP-2とともに移植された組織をファン−コッサおよびヴァン−ギーソン対比染色により染色した組織学的断片の×100倍での鏡検写真を示す。
【００８３】
図2.2aは、軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
図2.2bは、軟骨細胞によるコラーゲン産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
図2.2cは、軟骨細胞の増殖へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
図2.3aは、インビトロでの軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響（アスコルベート処理なし）を示す。
図2.3bは、細胞形態へのフォリスタチンの影響を示す。
図2.4は、軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびOP-1の影響を示す。
【００８４】
【表１】
2004536818.tif 000006
【００８５】
溶液および結合実験の一般的な方法
細胞溶解のための凍結融解法：細胞から培地を除き、細胞層を0.2Mカーボネートバッファーで洗浄した。Ragoら(DNA fluorometric assay in 96-well tissue culture plates using Hoechst 33258 after cell lysis by freezing in distilled water. Anal Biochem. 191: p31〜34 1990)から改変した凍結融解法を用いて細胞を溶解した。0.2Mカーボネートバッファー中の0.1% triton X-100 100μlをウェルに添加した。次いでプレートを液体窒素を用いて凍結し、37℃で融解することを合計3回行った。プレートを光学顕微鏡下で検査して、全ての細胞が溶解したことを確かめた。
【００８６】
p−ニトロフェニル−ホスフェート  アルカリホスファターゼアッセイ：Leboyらにより記載されたアッセイ(Dexamethasone induction of osteoblast mRNA's in rat marrow stromal cell cultures. 1991、J Cell Physiol. 146: p370〜378)を用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定した。反応は、着色物質である、p−ニトロ−フェノール(pNP)を与える、アルカリホスファターゼによるp−ニトロ−フェニル−ホスフェート(pNPP)からのホスフェート基の酵素的切断を含む。この物質の吸光はマイクロプレートリーダーを用いて405 nmで測定することができる。アルカリホスファターゼの活性を、0〜250 nM ml-1 pNPの範囲内での標準pNP溶液の用量作用曲線からの補間法により計算した。
【００８７】
ピコグリーンアッセイ：ピコグリーンアッセイを用いて細胞数を測定した。これは、二本鎖DNAに対するピコグリーンの高い感度に基づく蛍光分析である。各細胞が7.7 pgのDNAを含むことから、存在するDNA量から細胞数を算出することができる。DNA鎖は、0〜8 μg ml-1の範囲で調製した。マイクロプレートリーダーにおいて、蛍光波長485 nmおよび励起波長538 nmで吸光を測定した。マイクロプレートのデータを回帰モデルを用いて処理し、標準DNA溶液に由来する標準曲線を作成し、これよりDNA濃度を決定することができる。
【００８８】
実施例1.1 C2C12細胞へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響
用いたBMP-2の濃度は約1μg/mlであった。用いたフォリスタチンの濃度は約25μg/mlであった。フォリスタチンは、組織培養プラスチックプレートのウェルの表面に接着性であることが見出された。これを一晩、約16時間、4℃でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄して結合していないフォリスタチンを除去した。次いでBMP-2を、結合したフォリスタチンとインキュベートした。37℃で1時間インキュベーションした後、混液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄して、結合していないBMP-2を除去した。C2C12マウス筋原細胞をこのタンパク質の混合物とインキュベートした。これらの培養物のアルカリホスファターゼ活性を試験し、フォリスタチンを含まない培養物に比べて、かなり上昇したレベルのアルカリホスファターゼ活性を観察し、これはフォリスタチンがBMP-2活性を増加させることを示唆した。
【００８９】
1. フォリスタチン
2. フォリスタチンおよびBMP-2
3. 組織培養プラスチック(Tissue Culture Plastic; TCP)
4. BMP-2
5. ウシ血清アルブミン(BSA)
6. BSAおよびBMP-2
と、細胞サンプル(1.06 × 104 細胞 cm-2)とのアルカリホスファターゼアッセイを3回重複して測定した。
これらのサンプルの全DNA量も、pg/mlあたりのDNAとして測定した。各細胞が7.7pgのDNA/mlを含むことから、全DNA量を7.7で除して細胞の平均数を得る。次いで、細胞あたりのアルカリホスファターゼ pmol/mlを算出することができた。
明細書に含まれる表（表7.1）およびグラフ（図1.1）は、フォリスタチンおよびBMP-2で処理した細胞サンプルについて、アルカリホスファターゼ活性の実質的な増加を明らかに示す。よって、骨細胞形成が増大したことを示す。
【００９０】
実施例1.2: C2C12細胞へのフォリスタチンならびにBMP-2、5、6および7の影響−溶液
アンプルの内容物を無血清(SF)ダルベッコ調製イーグル培地(DMEM) 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-2およびBMP-7を調製した。これをさらにSFDMEMで5μg ml-1に希釈した。
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、20μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-6を調製した。これをさらにSFDMEMで5μg ml-1に希釈した。
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、50μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-5を調製した。これをさらにSFDMEMで5μg ml-1に希釈した。
アンプルの内容物をSFDMEM 3 mlで希釈し、8.3μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。
トリプシン/EDTAを用いて、C2C12細胞(ECACC ロット91031101)を組織培養フラスコから回収した。細胞数および細胞の生存力をトリプトファンブルーならびにノイバウエル血球計を用いて評価した。細胞を、細胞密度3.4×104 細胞 ml-1 (96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)で培養し、37℃/5% CO2で、加湿雰囲気中に2時間インキュベートした。
【００９１】
次いで、次の溶液を96ウェル組織培養プレートのウェルに添加した（ウェルあたり最少で4つの重複）：
BMP-2およびフォリスタチンについて
条件1−フォリスタチン40μl + SFDMEM 60μl
条件2−フォリスタチン40μl + BMP-2 20μl + SFDMEM 40μl
条件3−BMP-2 20μl + SFDMEM 80μl
条件4−SFDMEM 100μl
【００９２】
BMP-5およびフォリスタチンについて
条件1−フォリスタチン40μl + SFDMEM 60μl
条件2−フォリスタチン40μl + BMP-5 20μl + SFDMEM 40μl
条件3−BMP-5 20μl + SFDMEM 80μl
条件4−SFDMEM 100μl
【００９３】
BMP-６およびフォリスタチンについて
条件1−フォリスタチン40μl + SFDMEM 60μl
条件2−フォリスタチン40μl + BMP-6 22.6μl + SFDMEM 37.4μl
条件3−BMP-6 22.6μl + SFDMEM 77.4μl
条件4−SFDMEM 100μl
【００９４】
BMP-7およびフォリスタチンについて
条件1−フォリスタチン40μl + SFDMEM 60μl
条件2−フォリスタチン40μl + BMP-7 19.4μl + SFDMEM 40.6μl
条件3−BMP-7 19.4μl + SFDMEM 80.6μl
条件4−SFDMEM 100μl
【００９５】
37℃/5% CO2で、プレートを4日間インキュベートした。4日後、凍結融解法を用いて細胞を溶解した。一般的な方法の項で概説したように、pNPPアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いて細胞数を測定した。
結果は、表(7.2a〜7.2e)および図(1.2a〜1.2e)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【００９６】
実施例1.3: C2C12細胞へのフォリスタチンならびにBMP-2、6および7の影響−結合
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-2およびBMP-7を調製した。これをさらにSFDMEMで1μg ml-1に希釈した。
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、20μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-6を調製した。これをさらにSFDMEMで1μg ml-1に希釈した。
アンプルの内容物をSFDMEM 3 mlで希釈し、8.3μg ml-1の濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。
96ウェルプレートのウェル中で、最初に4つの条件を設定した（各条件について最少で4つの重複）：
カラム1）フォリスタチン 50μl
カラム2）フォリスタチン 50μl
カラム3）組織培養プラスチック(TCP)
カラム4）TCP
【００９７】
上記の溶液を96ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、放置して4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質溶液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。
条件2および3（上記）のウェルに、125.5μl/ウェルのBMP-2 (1μg ml-1)または142.5μl/ウェルのBMP-6 (1μg ml-1)または121.5μl/ウェルのBMP-7 (1μg ml-1)のいずれかを添加した。条件1および4（上記）のウェルに、100μl/ウェルのSFDMEMを添加した。これらの溶液を37℃/5% CO2で1時間インキュベートすることを許容し、その後、これらを除去してウェルをPBSで3回洗浄した。C2C12細胞(ECACCロット91031101)を、細胞密度3.4×104 細胞 ml-1 (96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)でウェル中に培養し、37℃/5% CO2で、加湿雰囲気中に約4日間インキュベートした。
4日後、一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.3a〜7.3d)および図(1.3a〜1.3d)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【００９８】
実施例1.4: C2C12細胞へのフォリスタチンおよびBMP-4の影響−溶液
アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-4を調製した。これをさらにSFDMEMで2.5μg ml-1に希釈した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。
96ウェルプレートのウェル中で、最初に4つの条件を設定した（各条件について最少で4つの重複）：
条件1−フォリスタチン20μl + PBS 80μl
条件2−フォリスタチン20μl + BMP-4 10μl + PBS 70μl
条件3−BMP-4 10μl + PBS 90μl
条件4−PBS 100μl
【００９９】
上記の溶液を37℃/5% CO2で、加湿雰囲気中に45分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、剤を除去せずに、3.4×104 細胞/ml (96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)のC2C12細胞(ECACCロット91031101) 100μlを添加した。37℃/5% CO2で、プレートを約4日間インキュベートした。
一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.4)および図(1.4)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１００】
実施例1.5: C2C12細胞へのフォリスタチンおよびBMP-4の影響−結合
アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-4を調製した。これをさらにSFDMEMで2.5μg ml-1に希釈した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。
96ウェルプレートのウェル中で、4つの条件を設定した（各条件について最少で4つの重複）：
条件1−フォリスタチン20μl + PBS 80μl
条件2−フォリスタチン20μl + PBS 80μl
条件3−TCP
条件4−TCP
【０１０１】
上記の溶液を96ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、放置して4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質溶液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。ウェルを200μl/ウェルのBSA (2 mg ml-1)で1時間ブロックし、その後、ブロッキング液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。
カラム2および3（上記のリスト参照）のウェルに、100μl/ウェルのBMP-2 (2.5μg ml-1)を、またはカラム1および4のウェルに、100μl/ウェルのSFDMEMを添加した。これらの溶液を、37℃/5% CO2で1時間インキュベートすることを許容し、その後、これらを除去してウェルをPBSで3回洗浄した。
【０１０２】
C2C12筋原細胞を、濃度3.4×104 細胞/ml (96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)で添加した。次いでプレートを37℃/5% CO2で、加湿雰囲気下に約4日間インキュベートした。4日後、一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.5)および図(1.5)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１０３】
実施例1.6: MC3T3E1細胞へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響−溶液
アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-2を調製した。これをさらにSFDMEMで1μg ml-1に要時希釈した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。
96ウェルプレートのウェル中に4つの条件を調製した（各条件について最少で4つの重複）：
条件1−フォリスタチン20μl + PBS 80μl
条件2−BMP-2 10μl +フォリスタチン20μl + PBS 70μl
条件3−BMP-2 10μl + PBS 90μl
条件4−PBS 100μl
【０１０４】
これらのタンパク質混合物を、室温で45分間インキュベートすることを許容し、その後、剤を除去せずにMC3T3E1細胞(DSMZ、ロット ACC210/3)を添加した。細胞を、細胞密度6.4×104 細胞 ml-1 (ウェルあたり100μl、すなわち96ウェルプレートのウェルあたり6.4×103細胞、すなわち2.0×104 細胞 cm-2)で培養した。37℃/5% CO2で、加湿雰囲気中にプレートを約4日間インキュベートした。
一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.6)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１０５】
実施例1.7: MC3T3E1細胞へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響−結合
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-2を調製した。これをさらにSFDMEMで1μg/mlに要時希釈した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチンを調製した。PBS中でBSAを希釈して最終濃度2 mg ml-1を得た。
96ウェルプレートのウェル中で、最初に5つの条件を設定した（各条件について最少で4つの重複）：
カラム1）50μlのフォリスタチン
カラム2）50μlのフォリスタチン
カラム3）50μl のBMP-2
カラム4）50μl のBSA
カラム5）50μl のBSA
【０１０６】
上記の溶液を96ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、放置して4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質溶液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。ウェルを200μl/ウェルのBSA (2 mg ml-1)で1時間ブロックし、その後、ブロッキング液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。
カラム2および5（上記のリスト参照）のウェルに、100μl/ウェルのBMP-2 (1μg ml-1)を、またはカラム1、3および4のウェルに、100μl/ウェルのSFDMEMを添加した。これらの溶液を、37℃/5% CO2で1時間インキュベートすることを許容し、その後、これらを除去してウェルをPBSで3回洗浄した。MC3T3E1細胞を、細胞密度6.4×104 細胞 ml-1 (ウェルあたり100μl、すなわち96ウェルプレートにウェルあたり6.4×103細胞、すなわち2.0×104 細胞 cm-2)で培養した。37℃/5% CO2で、加湿雰囲気中にプレートを4日間インキュベートした。
【０１０７】
一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.7)および図(1.7)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１０８】
実施例1.8: C2C12細胞へのフォリスタチン−288およびBMP-2の影響−溶液
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の最終濃度を得ることによりBMP-2を調製した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチン−288を調製した。
96ウェルプレートのウェル中で、最初に4つの条件を設定した（各条件について最少で4つの重複）：
条件1−フォリスタチン288 20μl + PBS 80μl
条件2−フォリスタチン288 20μl + BMP-2 10μl + PBS 70μl
条件3−BMP-2 10μl + PBS 90μl
条件4−BMP-2 100μl + PBS 70μl
【０１０９】
上記の溶液を96ウェル組織培養プレートのウェルに添加し、放置して37℃で45分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、剤を除去せずに3.4×104 細胞/mlのC2C12筋原細胞100μlを添加した(96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)。プレートを37℃/5% CO2で約3日間インキュベートした。
一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表(7.8)および図(1.8)に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１１０】
実施例1.9: C2C12細胞へのフォリスタチン−288およびBMP-2の影響−結合
アンプルの内容物を無血清SFDMEM 1 mlで希釈し、10μg ml-1の濃度を得ることによりBMP-2を調製した。これをさらにSFDMEMで1μg/mlに要時希釈した。アンプルの内容物をSFDMEM 1 mlで希釈し、25μg ml-1の最終濃度を得ることによりフォリスタチン-288を調製した。PBS中でBSAを希釈して最終濃度2 mg ml-1を得た。
96ウェルプレートのウェル中に4つの条件を調製した（各条件について最少で4つの重複）：
条件1−フォリスタチン288 20μl + PBS 80μl
条件2−フォリスタチン288 20μl + PBS 70μl
条件3−TCP
条件4−TCP
【０１１１】
上記の溶液を4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、タンパク質溶液を除去し、ウェルをPBSで3回洗浄した。プレートのウェルを200μl/ウェルのBSA (2 mg ml-1)で室温にて1時間ブロックした。このインキュベーション後、溶液を除去し、プレートをPBSで3回洗浄した。
100μl/ウェルのBMP-2 (1μg ml-1)を条件2および3に添加した。100μlのSFDMEMを条件1のウェルに添加し、条件4のものは空のまま放置した。これらの溶液を、37℃/5% CO2で1時間インキュベートすることを許容し、その後、これらを除去してプレートをPBSで3回洗浄した。
C2C12細胞を、濃度3.4×104 細胞/ml (96ウェルプレートのウェルあたり100μl、すなわち1.06×104 細胞/cm2)で添加した。次いで、プレートを37℃/5% CO2で4日間インキュベートした。
一般的な方法の項で概説したように、凍結融解法を用いて細胞を溶解し、pNPPアッセイを用いて培養物のアルカリホスファターゼ活性を評価し、ピコグリーンアッセイを用いてDNAレベルに標準化した。
結果は、表7.9および図1.9に示すとおりである。
これらの結果からわかるように、BMPのみで生育した培養物に比較した、フォリスタチンおよびBMPの条件下で生育した培養物により発現されるアルカリホスファターゼの増加は、これらの細胞が、刺激されて骨芽細胞系列に沿ってさらに分化したことを示す。
よって、この結果は、細胞がフォリスタチンおよびBMPに応答し、造骨組織再生のレベルをより高くしたことを示唆する。
【０１１２】
実施例1.10: 筋肉内インビボ研究
約285〜365 gの若い成体スプレーグ・ドーリーラット(Sprague Dawley rats)に麻酔をかけ、後肢の毛を剃った。タンパク質溶液(BMP-2およびフォリスタチン300) およびコントロールをコラーゲンスポンジ(10 mm×3 mm×3 mm、Duragen、Life Sciences)上に載せ、ふくらはぎの筋肉に移植した。8つの群に移植した（以下のリスト参照）：
群1    担体
群2    担体+ BMP (A)
群3    担体+ BMP (B)
群4    担体+ FS300 (A)
群5    担体+ FS300 (B)
群6    担体+ FS300 (A) +BMP (A)
群7    担体+ FS300 (B) +BMP (B)
群8    担体+ FS300 (A) +BMP (B)
(A= タンパク質20μg、およびB=タンパク質5μg)
【０１１３】
【表２】
2004536818.tif 000007
【０１１４】
【表３】
2004536818.tif 000008
【０１１５】
【表４】
2004536818.tif 000009
【０１１６】
【表５】
2004536818.tif 000010
【０１１７】
放射線写真分析
移植後17〜18日の間で放射線学的評価を行った（図1.10aおよび1.10b参照）。等しい倍率でスキャンして測定した場合、5μgのフォリスタチンおよびBMP-2で処理したラット内の石灰化組織（図1.10b）は、7.77 mm2の面積であり、BMP-2 5μgのBMP-2のみで処理したラット内の石灰化組織（図1.10a）は、3.0 mm2の面積であり、20μgのBMP-2のみのコントロールは、4.62 mm2の面積である（データ示さず）。したがって、フォリスタチンおよびBMP-2ではより多くの骨が形成された。ネガティブコントロール（担体のみ）では骨は観察されなかった。
【０１１８】
組織学
移植後4週間で動物を殺した。移植部位の周囲の皮膚をふくらはぎの筋肉の上で除去し、ふくらはぎの筋肉を切除した。サンプルを10％緩衝ホルマリンに一晩固定し、パラフィン包埋のために処理し、5μmに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、ヴァン−ギーソンで対比染色した。顕微鏡写真（図１.10cおよび1.10d、ここでBは濃赤に染色された骨であり、Oはピンクに染色された類骨であり、Mは黄色に染色された筋肉である）から、BMP-2およびフォリスタチンの群で発生した物質は骨であることが明確にわかる。
アルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含量を含む更なる試験により、骨再生のレベルはフォリスタチンおよびBMP-2のサンプルにおいてより高いことが示される。
【０１１９】
実施例1.11:
R+D Systems UKから購入したフォリスタチンは、固体マトリックス担体に接着性であることがわかった。用いたフォリスタチンの濃度は約25μg/mlであった。
フォリスタチンで被覆された担体を、28〜35日齢の雄マウスの皮下に移植した。フォリスタチンを用いない移植をコントロールとした。
動物を移植後21日で犠牲にし、移植部位での骨形成活性を定量した。BMP-2存在下で担体上のフォリスタチンについて行った試験の比較を、1/ 担体およびBMP-2、ならびに2/ 担体およびフォリスタチンとした。
BMP-2存在下に、フォリスタチンで被覆された固体マトリックス担体を含む動物は、移植部位での骨の形成がコントロールより多かった。
【０１２０】
実施例1.12
円柱形の内側の空間を有する、糸を通したチタンチャンバーからなる骨伝導チャンバーインプラントを、ラットの骨の中に移植した。チャンバーの内側は直径2 mm、長さ7 mmである。外側の直径は3.5 mm、全体の長さは13 mmである。
チャンバーの一端は、組織内植のための穴を有している。チャンバーを骨の中に移植するには、チャンバーを骨の中にねじ込む。
雄のスプレーグ・ドーリーラットを用いた（1動物当たり1チャンバー）。
【０１２１】
チャンバーの移植後、ラットをランダムに群に分配した。チャンバー内には、最初の群はフォリスタチンとともに適切なマトリックスが移植され、第二の群はマトリックスのみが移植され、第三の群は何も移植されなかった。
試験物質を移植後6週間でラットを犠牲にした。チャンバー内の組織から切片を切断し、骨の内植を評価した。フォリスタチンで処理した骨組織は、コントロールに比べて骨再生が向上されていた。
【０１２２】
実施例1.13
R+D Systems UKから購入したフォリスタチンは、固体マトリックス担体に接着性であることがわかった。用いたフォリスタチンの濃度は約25μg/mlであった。
フォリスタチンで被覆された担体を、28〜35日齢の雄ラットの筋肉内に移植した。フォリスタチンを用いない移植をコントロールとした。
動物を移植後21日で犠牲にし、移植部位での骨形成活性を定量した。BMP-2存在下で担体上にあるフォリスタチンについて行った試験の比較を、1/ 担体およびBMP-2、ならびに2/ 担体およびフォリスタチンとした。
BMP-2存在下に、フォリスタチンで被覆された固体マトリックス担体を含む動物は、移植部位での骨の形成がコントロールより多かった。
【０１２３】
実施例1.14
R+D Systems UKから購入したフォリスタチンは、固体マトリックス担体に接着性であることがわかった。用いたフォリスタチンの濃度は約25μg/mlであった。
フォリスタチンで被覆された担体を、ヒツジ腓骨部分楔状骨切り術に移植した。動物を移植後30日で犠牲にし、移植部位での骨形成活性を定量した。
フォリスタチンで被覆された固体マトリックス担体を含む動物は、担体のみのコントロールに比べて骨の形成がより高かった。
【０１２４】
実施例1.15
区域性欠損インビボモデル
橈骨/尺骨区域性欠損モデルは、発表された文献に詳細に記録され、無機質脱落骨基質および骨形成因子のような化合物の研究に用いられている。橈骨/尺骨モデルは、次の種：ラット、ウサギ、およびイヌにおいて最も一般的に用いられている。ウサギまたはラットより活性なイヌの性質は、欠損を支持する長骨の破砕を導き得る。したがって、ニュージーランドホワイトラビット（骨格的に成熟、すなわち成長板が融合されている）のウサギが、最も適した種として選択された。
獣医学の外科医の監督の下でのいずれの手術の前にX線写真を撮影して、融合した骨端軟骨板−よって骨格成熟を確認する。成長板が融合されていれば麻酔を維持し、外科的手法を続ける。
【０１２５】
外科的手法
毛を剃り、適切な外科スクラブ（例えばヒビテン、ペビジン(Pevidine)）で皮膚を洗浄することにより、無菌手術のための手術部位を準備した。
1.  尺骨の上に直接切開を行い、次いで周囲の筋肉の剥離により露出させる。
2.  尺骨点から遠位に3 cmの距離を測定し、位置決め装置を尺骨の中央骨幹に沿って置く。メスを用いて、装置のいずれかの端で尺骨に印をつける。
3.  振動のこぎりを用いて、各印の内側で完全な尺骨の骨切り術を行う。
4.  メスを用いて橈骨と尺骨との間の骨間靱帯を切断し、尺骨セグメントをはずす。
5.  橈骨にすぐ近接したセグメントの骨膜をメスで擦り取ることにより除去する。
6.  欠損部位を生理食塩水で洗浄して砕片を除去する。
7.  欠損部に移植骨片物質を移植するか、または代わりに欠損部を空で放置する。
8.  手術部位を縫合により閉じる。
【０１２６】
サンプル調製
各インプラントは、組換えBMP-2、フォリスタチンまたはこれらの組合せを含む。
分析
尺骨および橈骨の構造物を、橈骨および尺骨に過剰な曲げ外力が働かないように注意しながら、上腕骨−尺骨/上腕骨−橈骨関節、ならびに橈骨手根関節において単離する。皮膚の除去後、サンプルをホルマリン中に入れる。
区域性欠損の骨修復を放射線写真および組織学の分析により評価する。コントロールに対して、フォリスタチンおよびBMPでは骨成長が増大したことが示されている。
【０１２７】
実施例2.1:
適切なサイズの足場の製造により実験的装置を製造し、続いて滅菌し、コラーゲンIIa（タンパク質全体、またはBMP結合部位を含むコラーゲンIIaプロペプチドのいずれか）で被覆する。
直径3 mm、深さ3 mmの骨軟骨欠損をホワイトニュージーランドラビットの膝蓋骨溝に創る。欠損は、空のまま放置するか、または足場で満たすか、または上記の装置で満たすかのいずれかである。ウサギを1、3および6ヶ月で犠牲にし、欠損部位を組織学的に検査した。
経験のある組織学者により、オドリスコルの評点システムを用いて軟骨修復の格付をブラインドで行う。全ての時点において、軟骨修復は、いずれのコントロール群よりもコラーゲンIIaで被覆された足場で処理した欠損において、かなり向上されている。
このデータは、コラーゲンIIaが骨軟骨欠損の修復に効果的であることを示し、この効果を自己由来BMPの結合および提示を通じて有していると考えられる。
【０１２８】
インビトロでの軟骨形成におけるフォリスタチンの影響の測定方法
実施例2.2: 単層での軟骨細胞の影響
初代軟骨細胞を、新たに殺したヒツジの後膝関節から単離した。関節軟骨を膝蓋骨溝および膝蓋骨の後ろから剥離し、組織を切断（約: 1〜4 mm3）して0.25％ゲンタマイシン溶液中で洗浄した。ゲンタマイシン溶液を除去し、切断した軟骨をコラゲナーゼ溶液（0.2％）中、37℃で一晩、静かに振とうした。ワージントンのII型コラゲナーゼを用い、培地中で希釈し、ろ過滅菌した。培地は、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％非必須アミノ酸および1％L-グルタミンを含む、標準DMEM (4.5 g/l グルコース)であった。細胞培養実験の全てにわたって、言及しない限りはこの培地を用いた。
【０１２９】
一晩のコラゲナーゼ処理に続いて、得られた消化物を70μmナイロンセルストレーナーに通し、ろ液を遠心チューブに移し、等容量のPBSおよび培地で洗浄した。これを1000 rpmで10分間回転させた。培地を除去し、1000 rpmで5分間再回転させる前にペレットを培地で洗浄した。細胞のペレットを適切な容量（最小5 ml）の培地に再懸濁し、少量のアリコートを、細胞計測を行うのに採取した。
軟骨細胞を24ウェルプレートのウェルにウェル当たり1×105の密度で播種した。BMP-2 (R&D systemsより調達)を、ml当たり50 ng〜1000 ngの間の濃度で用いた。フォリスタチン(同じくR&D systemsより調達)を同様の濃度で用いたが、2つのファクターの比を変動させた。アスコルビン酸を50 ng/mlの濃度で培地に添加した。適切なコントロールを設定した、すなわちBMPのみ、フォリスタチンのみ、および成長因子による処理なしである。細胞を37℃、5% CO2で4日〜1ヶ月の間培養した。細胞に、追加の培地を適切であれば2〜3日ごとに供給した。期間の最後にサンプルを生化学的分析により分析した：
【０１３０】
生化学的分析：GAG分析では、細胞に供給するか、または停止に際しては培地を維持した。細胞単層をパパイン消化に付した。パパインバッファーは、リン酸水素ナトリウム1.42 g; システイン塩酸塩0.0788 gおよびエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA) 0.1861 gを混合することにより製造した。UHQ水90 mlを添加して溶解するまで攪拌し、pHを6.5に調整した。パパインバッファー25 mlにパパイン0.0264 gを溶解することによりパパイン溶液を製造した。この溶液0.5 mlを各ウェルに添加し、力価のトップを各プレートにおいた。プレートをハイブリダイゼーションオーブン中に、60℃でインキュベートした。
【０１３１】
GAGアッセイ: 次いで細胞消化物について、GAGアッセイを行った。1,9-ジメチルメチレンブルー(DMB)溶液を、1.9-ジメチルメチレンブルー16 mg;ぎ酸ナトリウム2 g; 100%エタノール5 mlおよびぎ酸2 mlを混合し、UHQ水に溶解し、最終容量1000 mlにすることにより製造した。
UHQ水中のコンドロイチン-4-サルフェートの1 mg/mlストック溶液（コンドロイチン  サルフェートA、ウシ気管）を調製し、ブランクのパパイン溶液で1:10に希釈して100μg/mlにした。一組のスタンダードを、0〜75μg/mlの範囲で調製した。
スタンダードまたはサンプル20μlを96ウェルプレートのウェルに入れた。DMB溶液200μlを添加し、プレートを540 nm（測定）および595 nm（参照）の2波長で、プレートリーダーで直ちに読み取った。
GAGアッセイは、培地のサンプルについても行ったが、スタンダードはブランクのパパイン溶液ではなく10％ DMEMで作成した。
【０１３２】
DNAアッセイ: 細胞消化物について、Hoechst DNAアッセイも行った。Tris 1.211 g、EDTA 3.802 gおよびNaCl 5.844 gをUHQ水800 mlに添加し、溶解するまで攪拌することによりHoechst希釈バッファーを製造した。pHをpH 7.0に調整し、UHQグレード水で最終容量1000 mlにした。Hoechstの1 mg/mlストック溶液を希釈バッファーで1:2000に希釈した。DNAスタンダードをサケ精巣DNA 1 mg/mlストック溶液から作成し、希釈して0〜100μg/mlのスタンダードの範囲を得た。スタンダードまたは細胞消化物75μlをキュベット（四方透明）に入れた。Hoechst溶液1.5 mlを添加し、続いてさらに希釈バッファー1 mlを添加した。サンプルを混合し、約5分間インキュベートし、その後、励起波長355 nmおよび蛍光波長460 nmの蛍光計で読み取った。
【０１３３】
コラーゲンアッセイ: ヒドロキシプロリンアッセイを用いてサンプル中のコラーゲンの全量を測定した。コラーゲンはヒドロキシプロリン14.3%で構成されており、したがって存在するヒドロキシプロリンの量を算出することによりコラーゲン全量が算出される。これらの実験の目的は、サンプルの間での直接の比較を行うことであり、したがってヒドロキシプロリンの値を全コラーゲンに変換することは必須ではない。ヒドロキシプロリンアッセイストック溶液を、クエン酸50 gおよび酢酸ナトリウム120 gを混合してUHQ水650 ml中に溶解することにより製造した。UHQ水250 ml中の水酸化ナトリウム34 gの第2溶液を製造し、最初の溶液に添加した。氷酢酸12 mlを添加し、UHQ水で容量を1000 mlにした。トルエン10滴を添加した。ヒドロキシプロリンアッセイ使用液を、イソプロパノール150 mlをヒドロキシプロリンストック溶液500 mlに添加することにより製造した。溶液をよく混合し、塩酸を用いてpH 6.0に調整し、UHQ水で最終容量750 mlにした。
クロラミンT溶液を、ヒドロキシプロリン使用液20 mlにイソプロパノール2.5 mlおよびクロラミンT 0.3525 gを添加することにより製造した。全ての固体が溶液になるまで混液を攪拌し、室温にてガラスの容器に貯蔵した。p-ジメチルアミノベンズアルデヒド(p-DAB)溶液を、p-DAB 3.75 gをイソプロパノール15 mlおよび過塩素酸6.5 mlに添加することにより製造した。
【０１３４】
アッセイ自体は、次のようにして行った。パパイン消化物250μlを、パイレックス（登録商標）(Corning) 13 mlねじ蓋ガラスチューブ中の濃塩酸250μlに添加し、ヒートブロック上に、120℃で一晩インキュベートした。次の日に、内容物を小さいガラスのバイアルに移し、蓋をせずに90℃で乾燥するまでインキュベートした。サンプルを室温に冷却し、残渣を0.25Mリン酸ナトリウムバッファー1 mlに溶解した。加水分解パパイン溶液(HPS)は、コントロールについての代表的なブランクとなるとともに、サンプルおよびスタンダードの希釈剤ともなった。
【０１３５】
スタンダードを、ヒドロキシプロリンの1 mg/mlストック溶液から、0〜30μg/mlの範囲で調製した。スタンダードまたはサンプル50μlを、96ウェルプレートのウェルに添加した。クロラミン-T溶液50μlを添加し、プレートを室温で20分間インキュベートした。p-DAB溶液50μlを添加し、プレートを60℃で30分間インキュベートした。プレートを放冷して、その後、540 nmの単一波長にてプレートリーダーで読み取った。
【０１３６】
結果: 表8.2は、これらの結果の未処理のデータを示す。
図2.2a、2.2bおよび2.2cは、GAG産生、コラーゲン産生ならびに増殖をそれぞれ示す。
これらの結果は、BMP-2と組み合わせたフォリスタチンが増殖を刺激したことを示す。細胞数の増加は、ともに軟骨産生のマーカーである、GAGおよびコラーゲン産生の増加に合致する。これらの実験では、μg DNA当たりで表される細胞外マトリックス成分は、フォリスタチンの存在下で増加しなかった。これは、ある状況ではコラーゲンおよびGAGの増加は、これらの分子を産生する細胞の数が増加したことによることを示唆する。増殖の増大は通常、分化、すなわちGAGおよびコラーゲン産生の減少に関連するので、これらの結果は特に重要である。フォリスタチンに刺激された増殖は分化の減少にはならず、フォリスタチンが軟骨修復を刺激するために好適な分子であることを示唆する。
【０１３７】
実施例2.3:アスコルビン酸非存在下での単層の軟骨細胞への影響
第二の実験は、アスコルビン酸なしでの影響を調査する以外は上記の作業を繰り返した。この実験では、細胞当たりのGAG産生が増大した。フォリスタチンの存在下では増殖は増加せず、アスコルビン酸の非存在下ではフォリスタチンは分化のみを刺激することを示唆する。この実験には、フォリスタチン単独も含めた。図2.3aのグラフより、フォリスタチン単独ではコントロールのレベルを超える刺激効果はなく、したがって効果を有するのはBMP-2とフォリスタチンとの組み合わせであることがわかる。μg DNA当たりのGAG産生は、BMP単独に対してBMP+フォリスタチンのサンプルにおいて統計学的に増加している(p=0.02)。アスコルベートなしでは明らかにコラーゲンは産生されず、したがって測定可能なデータはない。この実験のデータは、表8.3に含まれる。グラフは図2.3aである。
【０１３８】
図2.3bは、細胞形態へのフォリスタチンの影響を示す。フォリスタチンおよびBMP-2で処理されたこれらの細胞は、明らかに丸い形態を有し、これらが、他の細胞には見られない、軟骨細胞の表現型を維持していることを示唆する。よって、フォリスタチンおよびBMP-2で処理された細胞は、軟骨細胞タイプの特徴を維持している。
【０１３９】
実施例2.4:フォリスタチンおよびBMP-7 (OP-1)の影響
成長因子BMP-7、または造骨タンパク質-1(osteogenic protein-1)をBMP-2の代わりに用いた以外は、実施例2.2を繰り返した。成長因子はR&D systemsから調達し、BMP-2について記載した濃度で用いた。表8.4にこの実験の結果を示す。図2.4に結果をグラフで示す。BMP-2と一緒のように、軟骨細胞によるGAG産生へのOP-1の効果は、フォリスタチンの存在下で増加される。効果は有意である(p=0.093)。
【０１４０】
実施例2.5:骨髄幹細胞へのフォリスタチンの影響
骨髄幹細胞(BMSC)を用いて実施例2.2を繰り返した。新しく殺した羊の脛骨から細胞を単離した。骨から肉を剥離し、滅菌した弓のこで骨を切断して開く。骨髄を骨小腔から滅菌スパチュラを用いてかき出し、ファルコンチューブに移す。培地をチューブに添加し、1000 rpmで10分間回転させる。培地の表面に蓄積した脂肪の層は、いずれも除去する。細胞を再懸濁し、再び回転させる。再び脂肪を除去し、細胞を再懸濁する。細胞計数を行い、細胞を175 cm2当たり2×106の密度で組織培養フラスコに移す。BMSCが沈殿するのを2日間許容する。骨髄中にも存在する血液細胞は組織培養プラスチックに接着せず、よってBMSCから分離することができる。コンフルエンスに達したところで細胞をフラスコの表面からトリプシン処理し、計数し、5×104の密度で24ウェルプレートに入れる。軟骨細胞について記載したようにしてこれらを処理し、同一の方法で分析を行った。
【０１４１】
BMPの非存在下では、BMSCはコラーゲンまたはGAGのいずれも発現しない。BMPの存在下では、比較的低いレベルで産生される。これはフォリスタチンとともに増加し、ここでも、フォリスタチンがBMP活性を増加させ、軟骨形成を刺激することを示す。
【０１４２】
実施例2.6:細胞単層での免疫組織化学
培養中で軟骨細胞がその分化した表現型を保持しているかを測定するために、II型コラーゲン、アグリカン(aggrecan)およびコラーゲンIの存在を免疫細胞化学的方法を用いて評価する。
実施例1に記載のようにして軟骨細胞を単離し、12ウェルのガラスマルチテストスライド上で成育する。成長因子による処理は、すでに記載したことと同様である。培養期間1週間後、スライドをメタノール:アセトンの1:1混液で固定し、空気乾燥する。
【０１４３】
免疫組織化学は、間接ストレプトアビジンABCイムノペルオキシダーゼ法(Dako、Ely、UK)を用いて行う。Tris緩衝生理食塩水(TBS)を希釈液および洗浄バッファーとして用い(DDW中に、0.15M NaCl、0.05M Tris-(ヒドロキシメチル)アミノメタン pH 7.6)、全てのインキュベーションを周囲温度で行う。
非特異的バックグラウンド染色を、10％ウサギ血清でのブロッキングにより消去し、切片をアビジン/ビオチンブロッキングキット(Vector Labs)で処理することにより、内因性アビジン結合部位をブロックする。切片を一次抗体で1時間、ビオチン化ウサギ抗-Ig抗体(F(ab')2断片)で30分間、およびストレプトアビジン/HRP ABC複合体(Vectastain elite ABC kit、Vector Labs.)で30分間、連続してインキュベートし、各工程の間に洗浄を行う。H2O2により触媒される3,3'-ジアミノベンジデン基質(DAB)反応により、結合した抗体を視覚化する。切片をヘマトキシリンで対比染色し、その後、脱水し、透明にし、スライドガラス上に載せる。標識プロトコルから一次抗体を省略して、ネガティブコントロールとする。細胞IIおよびアグリカンについての染色は、BMP-2およびフォリスタチンで処理したサンプルで増加する。
【０１４４】
実施例2.7:ペレット培養
軟骨細胞およびBMSCを用いて、次の成分を含む培地内でペレット培養を設定する: DMEM (4.5 g/l グルコース) + ピルベート; ITS + プレミックス(培地100 ml当たり1 ml); アスコルベート-2 ホスフェート(100μM);デキサメタゾン(10-7M); HEPES (20μl/ml)。培地にはまた、50〜1000 ng/mlの範囲の濃度のBMP-2、および同じ範囲のフォリスタチンを補充する。BMP-2単独、フォリスタチン単独、および成長因子なし、のコントロールを設定する。培地0.5 ml中の500,000細胞（軟骨細胞およびBMSCの両方）のアリコートを滅菌した2 mlの丸底遠心マイクロチューブに入れ、2500 rpmで10分間遠心分離する。これによりチューブの底で細胞がペレットを形成する。ペレット培養物を37℃、5% CO2で2週間インキュベートする。この期間中、培地を3〜4日毎に換えた。
【０１４５】
2週間の期間の最後に、ペレット培養を回収して分析する。分析は、全ての生化学的分析、または免疫組織化学および組織学染色のいずれかで行う。
生化学的分析:実施例に記載のようにして、これらのサンプルについて生化学的分析を行う。パパイン消化に先立ち、サンプルを凍結乾燥に付す。凍結したサンプルを穴の開いたチューブに入れ、一晩凍結乾燥する。次いで密閉したエッペンドルフチューブ内で、消化を一晩行う。次いで、消化物について生化学的分析を行う。
【０１４６】
免疫組織化学:ペレット培養を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、続いてパラフィンワックスに包埋する。免疫標識に先立ち、組織切片(5μm)からワックスを除き、アルコールから水への勾配により再び水和する。実施例1に記載のようにして免疫組織学的染色を行う。
組織学的分析:免疫組織化学的分析のために処理した切片を、伝統的な組織学的染色に付す。グリコサミノグリカン(GAG)についての組織化学的染色を、アルシアンブルー染色法を用いて行う。切片を3％酢酸中でリンスし、60℃で10分間、アルシアンブルー溶液（3％氷酢酸中の1％(w/v)アルシアンブルー）に入れる。スライドを0.5％水性ナチュラルレッドで対比染色し、無水エタノールでリンスし、キシレンで透明にしてスライドグラス上に載せる。この方法を用いて、GAGは青に染色される。組織の構築を評価するために、H&E染色も行う。サファリンO染色法をサンプル中の軟骨を同定するのに用いる。
結果は、フォリスタチンおよびBMP-2で処理したサンプルにおいて軟骨産生が増加した証拠を示す。
【０１４７】
実施例2.8:三次元フェルト培養
三次元マトリックス中の細胞へのフォリスタチンの影響を測定するため、ポリグリコール酸(PGA)フェルト上での培養を設定する。PGAフェルトはS&Nで製造され、滅菌はエチレンオキシド処理による。細胞（軟骨細胞およびBMSCの両方）を、FCSであらかじめ湿らせた、24ウェルプレート中のフェルト上に播種する。標準10% FCS DMEMおよびアスコルベート100μl中の100万の細胞を各足場上に播種する。1時間後、既に記載した成長因子の組合せを含む培地を足場に注ぐ。足場を37℃、5% CO2で旋回振とう装置上で2週間培養し、3〜4日毎に培地を供給した。
培養期間の完了に際し、サンプルを回収し、すでに記載したようにして生化学的、免疫組織化学的、および組織学的分析に供する。
結果は、フォリスタチンおよびBMPで処理したサンプルにおいて軟骨産生が増加した証拠を示す。
【０１４８】
実施例2.9:インビトロでのGDF-5の試験
今までに記載した実験を、GDF-5 (CDMP-1)を用いて繰り返す。成長因子はR&D systemsより調達し、BMP-2について記載した濃度で用いる。記載された全ての実験において、BMP-2で検出された様式をGDF-5を用いて繰り返す。
結果は、フォリスタチンおよびBMPで処理したサンプルにおいて軟骨産生が増加した証拠を示す。
【０１４９】
実施例2.10:ウサギインビボ研究
動物実験を30のニュージーランドホワイトラビットについて行う。ウサギは全て雄であり、約8ヶ月齢、すなわち骨格の成熟に達している。
直径3 mmおよび深さ3 mmの左右全層性欠損を、両方のちょうつがい関節の大腿骨の滑車溝にあける。欠損は、関節について90°で創り、溝の中央に配置する。
動物を4つの処理群に分配する：
・空の欠損
・足場のみ
・フォリスタチン30μg
・フォリスタチン30μg + BMP-2 10μg
【０１５０】
足場は直径3.5 mmおよび深さ3 mmのPGAフェルトからなるので、創製した欠損中に押してうまくはめることができる。PBS中の、BMP-2およびフォリスタチン、またはフォリスタチン単独の溶液をフェルト上に注入する。フェルト当たり合計30μlを注入する。足場のみの欠損には、PBS 30μlを注入する。
合計30の動物が表に挙げられた欠損を有し、3および6ヶ月の2回の時点で評価された。
【０１５１】
【表６】
2004536818.tif 000011
【０１５２】
分析
研究期間の最後に、動物に麻酔をかけ、次いで致死量の麻酔薬を用いて殺す。動物の後脚を除き、処理領域を同定する。欠損部位について肉眼の調査を行い、観察結果を記録し、写真を撮影する。周囲の無傷の軟骨とともに欠損部位を除去し、直ちに組織学的固定に移す。インビトロサンプルについて記載したようにして、サンプルを組織学的および免疫組織化学的に分析する。
【０１５３】
処理していない欠損は、未編成の繊維状組織で満たされている。免疫組織化学により、修復組織は、大部分がI型コラーゲンで構成されていることを明らかにする。足場のみを含む欠損は、よりよい組織の編成を示すが、まだI型コラーゲンが多く、インプラントと元来の組織との間の統合が乏しい。フォリスタチンおよびフォリスタチン＋BMP-2で処理した欠損は両方とも、両方の時点において高いレベルのII型コラーゲンならびにGAGを有している。欠損の縁および軟骨下骨における組織の統合の証拠があり、組織は非常に高度に編成されている。したがって、治癒関節へのフォリスタチンの組み込みは、BMP活性の増加を介して軟骨修復となることを結論付けることができる。
【０１５４】
【表７．１】
2004536818.tif 000012
【０１５５】
【表７．２ａ】
2004536818.tif 000013
【０１５６】
【表７．２ｂ】
2004536818.tif 000014
【０１５７】
【表７．２ｃ】
2004536818.tif 000015
【０１５８】
【表７．２ｄ】
2004536818.tif 000016
【０１５９】
【表７．２ｅ】
2004536818.tif 000017
【０１６０】
【表７．３ａ】
2004536818.tif 000018
【０１６１】
【表７．３ｂ】
2004536818.tif 000019
【０１６２】
【表７．３ｃ】
2004536818.tif 000020
【０１６３】
【表７．３ｄ】
2004536818.tif 000021
【０１６４】
【表７．４】
2004536818.tif 000022
【０１６５】
【表７．５】
2004536818.tif 000023
【０１６６】
【表７．６】
2004536818.tif 000024
【０１６７】
【表７．７】
2004536818.tif 000025
【０１６８】
【表７．８】
2004536818.tif 000026
【０１６９】
【表７．９】
2004536818.tif 000027
【０１７０】
【表８．２】
2004536818.tif 000028
【０１７１】
【表８．３】
2004536818.tif 000029
【０１７２】
【表８．４】
2004536818.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１．１】図1.1は、種々のコントロールに対して；フォリスタチンおよびBMP-2を含む細胞サンプルについて、細胞当たりの放出されたアルカリホスファターゼの棒チャートを示す。
【図１．２ａ】図1.2aは、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．２ｂ】図1.2bは、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．２ｃ】図1.2cは、C2C12細胞におけるBMP-5活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．２ｄ】図1.2dは、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．２ｅ】図1.2eは、C2C12細胞におけるBMP-7活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．３ａ】図1.3aは、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．３ｂ】図1.3bは、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．３ｃ】図1.3cは、C2C12細胞におけるBMP-6活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．３ｄ】図1.3dは、C2C12細胞におけるBMP-7活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．４】図1.4は、C2C12細胞におけるBMP-4活性へのフォリスタチンの影響（溶液実験）を示す。
【図１．５】図1.5は、C2C12細胞におけるBMP-4活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．７】図1.7は、MC3T3EI細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチンの影響（結合実験）を示す。
【図１．８】図1.8は、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチン288の影響（溶液）を示す。
【図１．９】図1.9は、C2C12細胞におけるBMP-2活性へのフォリスタチン288の影響（結合）を示す。
【図１．１０ａ】図1.10aは、BMP-2のみで処理したラットのふくらはぎの筋肉中の石灰化組織を示す放射線写真を示す。
【図１．１０ｂ】図1.10bは、ラットの下肢のふくらはぎの筋肉中の石灰化組織を示す放射線写真を示す。
【図１．１０ｃ】図1.10cは、フォリスタチンおよびBMP-2とともに移植された組織をファン−コッサおよびヴァン−ギーソン対比染色により染色した組織学的断片の×50倍での鏡検写真を示す。
【図１．１０ｄ】図1.10dは、フォリスタチンおよびBMP-2とともに移植された組織をファン−コッサおよびヴァン−ギーソン対比染色により染色した組織学的断片の×100倍での鏡検写真を示す。
【図２．２ａ】図2.2aは、軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
【図２．２ｂ】図2.2bは、軟骨細胞によるコラーゲン産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
【図２．２ｃ】図2.2cは、軟骨細胞の増殖へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響を示す。
【図２．３ａ】図2.3aは、インビトロでの軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびBMP-2の影響（アスコルベート処理なし）を示す。
【図２．３ｂ】図2.3bは、細胞形態へのフォリスタチンの影響を示す。
【図２．４】図2.4は、軟骨細胞によるGAG産生へのフォリスタチンおよびOP-1の影響を示す。
【図１．１】
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【図１．２ａ】
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【図１．２ｂ】
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【図１．２ｃ】
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【図１．２ｄ】
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【図１．２ｅ】
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【図１．３ａ】
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【図１．３ｂ】
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【図１．３ｃ】
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【図１．３ｄ】
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【図１．４】
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【図１．５】
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【図１．７】
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【図１．８】
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【図１．９】
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【図１．１０ｃ】
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【図１．１０ｄ】
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【図２．２ａ】
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【図２．２ｂ】
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【図２．２ｃ】
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【図２．３ａ】
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【図２．３ｂ】
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【図２．４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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