(57)【要約】ＫＩＭ−１遺伝子由来のシス作用性調節エレメントを開示する。このエレメントは、腎組織において、作動可能に連結される配列の発現を指向するために使用され得る。本発明は、特に、哺乳動物における作動化可能に連結した配列（例えば、遺伝子）の発現を指向するのに有用なシス作用性調節エレメントを提供する。このシス作用性ＫＩＭ−１調節配列をまた使用して、損傷組織または罹患組織に対する腎臓の応答を媒介するトランス作用性因子を同定し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む、単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
前記ＤＮＡが配列番号３を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記ＤＮＡが配列番号２を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記調節配列が、腎組織における作動可能に連結された配列の発現を優先的に指向する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
前記調節配列が誘導性である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
前記調節配列が、傷害によって誘導性である、請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
前記傷害が虚血性である、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、配列番号３に由来する少なくとも５つの連続するヌクレオチド、または配列番号３に相補的な配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
前記ＤＮＡが、配列番号３とハイブリダイズする配列に由来する少なくとも５つの連続するヌクレオチド、または配列番号３に相補的な配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、配列番号３に由来する５から３５の間の連続するヌクレオチド、または配列番号３に相補的な配列を含む、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、配列番号３とハイブリダイズする配列に由来する５から３５の間の連続するヌクレオチド、または配列番号３に相補的な配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが、ＫＩＭ−１アンチセンス核酸をコードする配列に作動可能に連結される、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡが、少なくとも１つのポリペプチドコード配列に作動可能に連結され、そして該ポリペプチドコード配列の腎組織特異的転写を調節する、ＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡが、前記ポリペプチドコード配列の腎組織特異的転写を調節するのに十分である配列番号３の一部分を含む、ＤＮＡ。
【請求項１５】
調節配列が誘導性である、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ポリペプチドコード配列が、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードする、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
前記ＫＩＭ−１ポリペプチドが、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ポリペプチドコード配列が、ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードしない、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
前記ポリペプチドコード配列が、治療ポリペプチドをコードする請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１３に記載のＤＮＡであって、前記ポリペプチドが、細胞生存促進因子、細胞増殖促進因子、創傷治癒因子、抗線維症因子、アポトーシス阻害因子、抗炎症性因子、最終分化促進因子、細胞増殖阻害因子、脈管内容積回復因子、キレート剤、アルキル化剤、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、エリトロポイエチン、サイトカイン、レセプター、抗凝固剤、酵素、ホルモン、抗体、および腎構造タンパク質からなる群から選択される、ＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１３に記載のＤＮＡであって、前記ポリペプチドが、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ＩＩ型レセプター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および内皮細胞接着分子ＩＣＡＭ−１からなる群から選択される、ＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項１のＤＮＡを含む、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２のベクターを含む、細胞。
【請求項２４】
前記細胞が単細胞生物である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞が酵母細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞が非ヒト哺乳動物胚の胚盤胞細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の細胞を含む前記胚盤胞の子宮内移植によって産生される、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３０】
請求項２９に記載のトランスジェニック哺乳動物の１以上の子孫であって、該子孫のＤＮＡが、請求項１に記載のＤＮＡ、またはそれらのフラグメントを含む、子孫。
【請求項３１】
ポリペプチドの発現を指向する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ）請求項１３に記載のＤＮＡを含む細胞を提供する工程；
ｂ）該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドコード配列を発現する工程；
を包含し、
それにより、該ポリペプチドの発現を指示する、方法。
【請求項３２】
前記細胞が腎細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
組織におけるポリペプチドコード配列の転写を増強する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ）請求項１３に記載のＤＮＡを含む細胞を、該組織に提供する工程；
ｂ）該ポリペプチドコード配列の転写を可能にする条件下で該細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドコード配列を発現する工程；
を包含し、
それにより、該組織における該ポリペプチドの転写の増強を提供する、方法。
【請求項３４】
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列に由来する発現を調節する試験化合物を同定する方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）該試験化合物と、請求項１に記載のＤＮＡに作動可能に連結されたレセプター遺伝子を含むレセプター構築物とを接触させる工程；および
ｂ）該レセプター遺伝子の発現レベルを検出する工程；
を包含し、
ここで、該試験化合物の非存在下での発現レベルに対するその発現レベルの変化は、該試験化合物が該ＫＩＭプロモーターの活性を調節することを示す、方法。
【請求項３５】
被験体の腎組織に、治療ポリペプチドを送達する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）請求項１３に記載のＤＮＡを含む細胞を、該腎組織に提供する工程；
ｂ）該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドコード配列を発現する工程；
を包含し、
それにより、該被験体の該腎組織に該治療ポリペプチドを送達させる、方法。
【請求項３６】
刺激が傷害である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記傷害が、虚血−再灌流傷害である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記傷害が、腎毒性傷害である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
腎組織傷害を処置または予防する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）請求項１３に記載のＤＮＡを含む細胞を提供する工程；
ｂ）治療ポリペプチドコード配列の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程；
ｃ）該治療ポリペプチドコード配列を発現する工程；および
ｄ）該組織を、該治療ポリペプチドコード配列を発現する該細胞に接触させる工程；
を包含し、
それにより、腎組織傷害を処置または予防する、方法。
【請求項４０】
被験体における核酸の転写を増強させる方法であって、該方法は、請求項４に記載のＤＮＡを、該被験体に投与する工程を含み、ここで、前記作動可能に連結されたＤＮＡは、該作動可能に連結された核酸の転写を増強させるのに十分な量が発現される、方法。
【請求項４１】
被験体における腎組織傷害を処置または予防する方法であって、該方法は、それらの必要のある該被験体に、請求項１３に記載のＤＮＡを投与する工程を含み、ここで、前記作動可能に連結されたＤＮＡは、該被験体における腎組織傷害を処置または予防するのに十分な量が発現される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の権益に関する記述）
本発明は、助成金番号ＤＫ３９７７３のもと連邦政府の支援によりなされた。米国合衆国政府は、本発明について特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸に関連し、より詳細には作動可能に連結した配列の腎組織における発現を指向するのに使用され得る核酸に特に関連する。
【０００３】
（発明の背景）
個体における腎機能の有意な停止は、不能または死さえを導き得る。疾患または損傷は、腎機能を害し得る。腎臓を損な得る損傷の例は、虚血性損傷である。この損傷の型において、腎組織は、腎臓への血流の停止の結果として生じる酸素欠乏に起因して損なわれる。
【０００４】
罹患したかまたは損傷を受けた腎組織の修復、およびその修復が生じる機構に関与する特定の薬剤が、記載されている。機構としては、遺伝子発現の誘導および罹患した腎組織への増殖因子の動員が挙げられる。細胞死および細胞増殖はまた、腎組織の修復に関連する。
【０００５】
腎組織修復に関与する薬剤としては、ポリペプチド（例えば、増殖因子（例えば、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および内皮細胞接着分子ＩＣＡＭ−１））が挙げられる。
【０００６】
最近、ポリペプチド性腎損傷分子（ＫＩＭ−１）が記載された。このＫＩＭ−１の発現は、損傷した腎組織において増加する。このタンパク質のラット形態およびヒト形態が、特徴づけられた。このＫＩＭ−１タンパク質は、新規の６システイン免疫グロブリン様ドメインおよびムチンドメインを含む、１型の膜タンパク質であることを、このＫＩＭ−１　ｃＤＮＡ配列は明らかにする。このＫＩＭ−１タンパク質は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり、粘膜アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ−１）に最もよく似ている。
【０００７】
（発明の要旨）
ヒトＫＩＭ−１遺伝子の近傍の核酸配列を使用して、連結した配列を腎組織で発現し得ることを発見した。従って、本発明は、特に、哺乳動物における作動化可能に連結した配列（例えば、遺伝子）の発現を指向するのに有用なシス作用性調節エレメントを提供する。このシス作用性ＫＩＭ−１調節配列をまた使用して、損傷組織または罹患組織に対する腎臓の応答を媒介するトランス作用性因子を同定し得る。
【０００８】
本発明は、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む、単離された核酸を提供する。この核酸は、例えば、配列番号１、配列番号２または配列番号３の核酸配列を含む、核酸配列であり得る。この核酸は、配列番号１、配列番号２または配列番号３、あるいは配列番号１、配列番号２または配列番号３と相補的な配列にハイブリダイズする配列からの、少なくとも５個連続するヌクレオチドを含む。例えば、この調節配列は、配列番号３からの５個〜３５個の連続したヌクレオチド、または配列番号３のこのような部分と相補的な配列を含み得る。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明に従ったシス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、作動可能に連結した配列（例えば、作動可能に連結したポリペプチドコード配列）の腎組織特異的転写を調節するに十分な、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の一部分を含む。本発明に従うシス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、細胞損傷（例えば、酸素欠乏症または活性酸素種（「ＲＯＳ」）への曝露）後の腎組織特異的転写、またはコフルエントな細胞集団に存在する細胞中の腎組織特異的転写を調節するのに十分な、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の一部分を含む。
【００１０】
本発明はまた、ＫＩＭ−１アンチセンス核酸をコードする配列に作動可能に連結された、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を提供する。このシス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、少なくとも１つのポリペプチドコード配列に作動可能に連結され得、そして、このポリペプチドコード配列の腎組織特異的転写を調節する。例えば、このポリペプチドコード配列は、ＫＩＭ−１ポリペプチド（例えば、ヒトＫＩＭ−１ポリペプチド）、または非ＫＩＭ−１ポリペプチドをコードし得る。このポリペプチドは、例えば、細胞生存促進因子、細胞増殖促進因子、創傷治癒因子、抗線維症因子、アポトーシス阻害因子、抗炎症因子、最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）促進因子、細胞増殖阻害因子、脈管内容積回復（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ−ｖｏｌｕｍｅ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）因子、キレート剤、アルキル化剤、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、エリスロポイエチン、サイトカイン、レセプター、抗凝固剤、酵素、ホルモン、抗体、または腎構造タンパク質であり得る。
【００１１】
本発明に従うシス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、例えば、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ＩＩ型レセプター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、または内皮細胞接着分子ＩＣＡＭ−１をコードする、核酸配列に連結され得る。
【００１２】
本発明はまた、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む核酸を含むベクター、ならびにこれらの核酸およびベクターを含む細胞を提供する。この細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。この細胞は、例えば、後生動物または単細胞生物であり得、そして例えば、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＣａｎｄｉｄａ　ｓｐｐ．）または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ネコ細胞もしくは齧歯類細胞）、または非ヒト哺乳動物胚性胚盤胞細胞）を含み得る。
【００１３】
本発明はまた、単離されたシス作用性ＫＩＭ１調節配列を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ブタ、ウシ、またはヒツジ）を提供する。このトランスジェニック動物は、例えば、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む未分化胚芽細胞の子宮内移植によって作製され得る。本発明はまた、このトランスジェニック非ヒト哺乳動物ＤＮＡの１つ以上の子孫を含み、ここで、この子孫は、このシス作用性ＤＮＡ、またはそのフラグメントを含む。
【００１４】
本発明はまた、ポリペプチドの発現を指向する方法を提供する。この方法は、目的のポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、単離されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む、細胞（例えば、腎細胞）を提供する工程、このポリペプチドの発現を可能にする条件下で、この細胞を培養する工程、およびこのポリペプチドコード配列を発現させる工程を包含する。
【００１５】
本発明はまた、組織内でのポリペプチドコード配列の転写を増大する方法を含む。この方法は、そのポリペプチドコード配列に連結したシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む組織中に細胞を提供する工程、およびこのポリペプチドコード配列の転写を可能にする条件下でこの細胞を培養する工程を包含する。次いで、このポリペプチドコード配列は発現され、この組織でポリペプチドコード配列の転写を生じる。
【００１６】
本発明はまた、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列からの発現を調節する試験化合物を同定するための方法を含む。この試験化合物は、単離されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むレポーター構築物と接触され得る。その組織中でのこのレポーター遺伝子の発現レベルが、検出（例えば、測定）される。試験化合物の不在下での発現レベルと比較した、試験化合物の存在下での発現レベルの変化は、この試験化合物がＫＩＭプロモーターの活性を調節することを、示す。
【００１７】
本発明はまた、被験体の腎組織に治療ポリペプチドを送達する方法を提供する。この方法は、腎組織内で、治療ポリペプチドに作動的に連結したシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞を提供する工程、およびこのポリペプチドの発現を可能にする条件下でこの細胞を培養する工程を包含する。このポリペプチドコード配列が発現され、これによって、その治療ポリペプチドがその被験体の腎組織に送達される。
【００１８】
本発明はまた、腎組織損傷を処置するかまたは予防する方法を含む。この方法は、ポリペプチドコード配列に作動可能に連結したシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞を提供する工程、および治療ポリペプチドコード配列の発現を可能にする条件下でこの細胞を培養する工程を含む。この治療ポリペプチドコード配列は、発現され、そしてこの発現されたポリペプチドは腎組織と接触し、これによって腎組織損傷を処置または予防する。
【００１９】
本発明はまた、被験体中の核酸の転写を増大する方法を包含し、この方法は、この核酸に作動可能に連結したシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を、被験体に投与し、そしてこの作動可能に連結された核酸を発現可能にすることによる。
【００２０】
本発明はまた、治療ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を、被験体内の腎組織損傷を処置するかまたは予防するのに十分な量で、それを必要とする被験体に投与することによって、この被験体内の腎組織損傷を処置するかまたは予防する方法を提供する。
【００２１】
別段定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および材料と、類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中で記載された、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、これらの材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであって、制限を意図するものではない。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明白である。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、特に、哺乳動物における、作動可能に連結した配列（例えば、遺伝子）の発現を指向するのに有用なシス作用性調節エレメントを提供する。ＫＩＭ−１由来のこのシス作用性調節配列はまた、損傷組織または罹患組織に対する腎臓の応答を媒介するトランス作用性因子を同定するために使用され得る。
【００２４】
（配列識別番号（配列番号）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ））
本明細書中で使用される配列識別番号としては、以下が挙げられる：
配列番号１は、ＫＩＭ−１遺伝子の５’領域からの８９３３ｂｐのヒトゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列に対応し、そして、図１Ａ〜図１Ｈに開示される。このフラグメントは、ＥＭＢＬ３ファージベクターのＢａｍＨｌ部位中のＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１挿入物として存在する。この構築物を、ＭＺ００７と命名する。
【００２５】
配列番号２は、ＭＺ００７中のヒトＫＩＭ−１挿入物のヌクレオチド３７９６〜８６１２を含む、４．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列に対応する。
【００２６】
配列番号３は、ＭＺ００７中のヒトＫＩＭ−１挿入物のヌクレオチド７３２２〜８６１２を含む、１．３ｋｂのＥｃｏＲ１−ＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列に対応する。
【００２７】
配列番号４は、ＭＺ００７中のヒトＫＩＭ−１挿入物を含むヌクレオチド８１１０−８６１２を含む、０．５ｋｂのＳａｃＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントのヌクレオチド配列に対応する。
【００２８】
（シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列）
本発明には、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む単離されたＤＮＡが含まれる。用語「単離された（される）」とは、この調節配列の天然供給源の中に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡ分子から分離された分子をいう。この用語はまた、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合に、細胞性物質、ウイルス材料、ももしくは培養培地から実質的に分離されている核酸またはペプチドをいい、または化学的合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質から実質的に分離されている核酸またはペプチドをいう。単離された核酸は、フラグメントとして天然に存在せずそして天然状態では見出されない、核酸フラグメントを含む。用語「単離された（される）」はまた、本明細書中使用される場合、他の細胞性タンパク質から単離されるポリペプチドをいい、この用語は、精製されたポリペプチドおよび組換えられたポリペプチドの両方を含むことを意味する。
【００２９】
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列（これは、また、本明細書中で「シス作用性調節エレメント」、「調節エレメント」、または「調節配列」と称される）は、基礎プロモーター（ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ならびにエンハンサーまたはサイレンサーから転写を調節することが可能である哺乳動物ＫＩＭ−１遺伝子の近傍の配列に由来する核酸配列エレメントを含む。用語「プロモーター」および「調節エレメント」は、「組織特異的」なプロモーターおよび調節エレメント、すなわち、特定の細胞（例えば、腎組織の細胞）において、作動可能に連結するＤＮＡ配列の優先的発現を生じる、プロモーターおよび調節エレメントをさらに含む。特定細胞型における発現が、他の細胞型における発現よりも有意により高い場合、遺伝子発現がこの細胞において優先的に生じる。用語「プロモーター」および「調節エレメント」はまた、所謂「漏出（ｌｅａｋｙ）」プロモーターおよび「調節エレメント」を含み、この漏出プロモーターおよび漏出調節エレメントは、主にある組織において、選択されたＤＮＡの発現を調節するが、同様に他の組織において、発現を引き起こす。用語「プロモーター」および「調節エレメント」はまた、非組織特異的プロモーターおよび調節エレメント、すなわち、ほとんどの細胞型において活性である、プロモーターおよび調節エレメントを含む。
【００３０】
プロモーターまたは調節エレメントは、構成的プロモーターまたは構成的な
調節エレメント、すなわち、構成的に転写を調節する、プロモーターまたは調節エレメントであり得るか、あるいは、プロモーターまたは調節エレメントは、誘導的であるプロモーターまたは調節エレメント、すなわち、刺激に対する応答で主に活性であるプロモーターまたは調節エレメントであり得る。刺激は、例えば、損傷（例えば、虚血）のような物理的刺激および／または分子（例えば、ホルモン、サイトカイン、重金属、ホルボールエステル、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）または、レチン酸）であり得る。
【００３１】
用語「エンハンサー」（これは、また本明細書中で「エンハンサーエレメント」ともいわれる）は、基礎的なプロモーターからの転写を増大、刺激、または増強することが可能な調節エレメントを含む。用語「サイレンサー」（これは、また本明細書中で「サイレンサーエレメント」ともいわれる）は、基礎的なプロモーターからの転写を減少、阻害、または抑制することが可能な調節エレメントを含むことが意図される。用語「プロモーター」および用語「調節エレメント」は、「組織特異的」プロモーターおよび調節エレメント、すなわち、特定細胞（例えば、特定の組織の細胞）において優先的に、選択されたＤＮＡ配列の発現をもたらす、プロモーターおよび調節エレメントをさらに含む。特定の細胞型における発現が他の細胞型の発現よりも有意により高い場合、遺伝子発現はこの細胞で優先的に生じる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、シス作用性調節エレメントの１つ以上のコピーは、ＫＩＭ−１遺伝子の転写された領域の中に存在する。他の実施形態において、このシス作用性調節エレメントは、ＫＩＭ−１遺伝子の転写開始部位の５’側に位置する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、シス作用性調節配列は、ネイティブのＫＩＭ−１遺伝子に由来しないプロモーター、および異種配列（例えば、ポリペプチドをコードする配列）に作動可能に連結した配列である。他の実施形態において、このシス作用性調節配列は、ＫＩＭ−１プロモーター配列および異種配列（例えば、ポリペプチをドコーするド配列）に作動可能に連結される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、このシス作用性調節配列は、配列番号３の１．３ｋｂの配列を含む（例えば、この調節配列は、配列番号１および配列番号２、ならびに配列番号３のヌクレオチドを含み得る）。他の実施形態において、このシス作用性調節配列は、作動可能に連結した配列の腎組織発現を与えるのに十分である（さもなければ、腎組織では発現しない）、配列番号３の一部分を含む。例えば、このシス作用性調節配列は、配列番号３または配列番号３に相補的な配列由来の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、１００、１２５、または１５０の連続したヌクレオチドを含み得る。従って、所望される場合、配列番号３の配列における、腎細胞特異的発現を与える原因となる配列が、より正確に位置付けられる。位置付けは、当該分野で周知の方法を使用して（例えば、構築物（例えば、ｐＧＬ３　Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））においてか、または当該分野で周知の多くの任意のレポーター遺伝子のいずれかにおいて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に配置される、配列番号３の１．３ｋｂフラグメントの長さが漸減する部分を含む、プラスミドを構築することによって実行され得る。次いで、この構築物は、腎細胞内にトランスフェクトされる。適切な腎細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＬＬＣ／ＰＫ１細胞、およびＭＤＣＫ細胞が挙げられる。出発構築物単独の発現と比較した腎細胞中でのレポーター遺伝子の発現の増大は、１．３ｋｂ　ＤＮＡのより小さい試験フラグメントが、腎組織発現を可能にすることを示している。他の細胞型（すなわち、線維芽細胞または非平滑筋細胞）と比較したときの腎組織中のこの試験フラグメントのより高い発現は、ＤＮＡがポリペプチド発現を腎組織特異的な様式で指向することを示す。
【００３５】
同様に、他の実施形態において、このシス作用性調節配列は、損傷腎組織において、（例えば、刺激に曝露される際）誘導的な発現および組織特異的発現の両方を与えるのに十分である。例えば、この配列は、このような発現に必要かつ十分な配列番号２の少なくとも一部分を含み得る。このような部分は、上記のように慣習的に位置付けられ得る。
【００３６】
本発明に従うＫＩＭ−１シス配列を使用して、損傷後、または様々な条件下で連結した配列の発現を指向し得る。例えば、配列番号２を含むヌクレオチド配列（４．８ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメント）を用いて、活性酸素種（「ＲＯＳ」）を使用する損傷を受けたか、または酸素欠乏症に起因する損傷を受けた細胞における、連結したポリペプチドの発現を指向し得る。配列番号２の少なくとも関連した部分を含むヌクレオチド配列もまた使用して、コンフルエントな細胞における目的の配列の発現を指向し得る。
【００３７】
別の実施形態において、この単離された核酸は、例えば、１つ以上の核酸残基を、付加するか、欠失させるか、または置換することによって改変された、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む。このような改変は、調節エレメントの調節または転写活性を調整し得る。例えば、改変は、プロモーターエレメントまたは調節エレメントの活性を上昇または低下し得る。改変はまた、プロモーターエレメントまたは調節エレメントの、組織特異的性または誘導可能性に影響を与え得る。
【００３８】
本発明に従う調節エレメントの所望の改変は、当該分野で周知の方法（例えば、変異誘発）に従って、実施され得る。次いで、改変されたプロモーターエレメントまたは調節エレメントの活性は、ＫＩＭ−１調節配列のシス作用性活性をアッセイするための本明細書中に記載の方法を使用して試験され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、この調節配列は誘導性である。本明細書中で使用される場合、「誘導性」とは、その調節配列が、刺激に応答して連結された配列の発現に影響を与えることを意味する。その刺激は、物理的（例えば、ストレス（例えば、熱ショック）、酸素欠乏、圧力）または化学的であり得る。化学的刺激の例としては、例えば、ホルモン、サイトカイン、重金属、ホルボールエステル、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）または、レチン酸が挙げられる、好ましい実施形態において、この調節配列は、損傷（例えば、虚血性損傷）また虚血によって誘導される。本明細書中で使用される場合、「虚血」は、休止状態または運動状態に測定した、同様のサイズおよび年齢の個体について正常な血流より少なくとも１０％低い血流を有することを意味する。成人のヒトにおいて、正常な休止血流（ｒｅｓｔｉｎｇ　ｂｌｏｏｄ　ｆｌｏｗ）は、約１ｍｌ／分／心筋の質量（ｇ）である。運動の間、血流は、代表的には、約３〜６ｍｌ／分／心筋の質量（ｇ）まで上昇する。虚血は、物理的な損傷（ｗｏｕｌｄ）または強打、血液容量の突発的な損失、毒性、あるいは物理的傷害（例えば、腫瘍）に関連する。
【００４０】
損傷の他の型としては、例えば、高血圧、化学療法（例えば、シスプラチンの損傷に起因する傷害）、慢性腎不全、自己免疫傷害（例えば、狼瘡）、または多嚢胞腎臓（ＰＣＫ）疾患に起因する損傷が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施敬形態において、この調節配列は、腎組織において作動可能に連結した配列の発現を優先的に指向する。用語「作動可能に連結される」とは、その調節配列が核酸と、その核酸の転写を容易にするような様式で、結合することを意味する。いくつかの実施形態において、この作動可能に連結された核酸は、アンチセンス核酸をコードしている。このアンチセンス核酸は、発現が腎組織中で減少されることが意図される遺伝子の、アンチセンス鎖の一部分であり得る。例えば、腎組織の望ましくない増殖によって特徴付けられる条件のために、このＤＮＡは、ＫＩＭ−１アンチセンス核酸であり得る。
【００４２】
他の実施形態において、このＤＮＡは、少なくとも１つのポリペプチドコード配列に作動可能に連結される。このポリペプチド配列は、例えば、ＫＩＭ−１　ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質であり得る。ラットおよびヒトのＫＩＭ−１　ｃＤＮＡをコードする核酸、およびそれらの対応するコードアミノ酸配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／４４４６０で提供される。
【００４３】
あるいは、このＤＮＡは、ＫＩＭ−１以外のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結される。例えば、このポリペプチドは、治療因子（例えば、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ＩＩ型レセプター（特に、ＴＧＦβレセプターの可溶性フラグメント）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および内皮細胞接着分子ＩＣＡＭ−１）であり得る。他の治療ポリペプチドとしては、細胞生存促進因子、細胞増殖促進因子、創傷治癒因子、抗線維症因子、アポトーシス阻害因子、抗炎症性因子、最終分化促進因子、細胞増殖阻害因子、脈管内容積回復因子、キレート剤、アルキル化剤、アンギオテンシン変換酵素阻害因子、エリスロポイエチン、サイトカイン、レセプター、抗凝固剤、酵素、ホルモン、抗体、および腎構造タンパク質が挙げられる。
【００４４】
ＫＩＭ−１由来調節エレメントから転写されるべき核酸はまた、レポーター遺伝子に連結され得る。レポーター遺伝子は、タンパク質をコードし、そのタンパク質の量が決定され得る、任意の遺伝子である。例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子（例えば、細菌性ルシフェラーゼ遺伝子（例えば、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に存在するルシフェラーゼ遺伝子））が挙げられる。他の適切なレポーター遺伝子としては、βガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、または、特定の薬物に対して耐性を提供するタンパク質をコードする任意の遺伝子が挙げられる。
【００４５】
本明細書中で開示される調節エレメントをまた使用して、ＫＩＭ−１由来調節配列に基づいて、プローブおよびプライマーを調製し得る。これらのプローブおよびプライマーを使用して、例えば、被験体（例えば、ヒト）におけるＫＩＭ−１ゲノム領域を同定し得る。このプローブは、、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のいずれかの、少なくとも約６個、約８個、約１０個、または約１２個、好ましくは、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、または約７５個連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む、プローブまたはプライマーの形態で提供され得る。
【００４６】
このプローブは、検出可能である、結合した標識を必要に応じて含む。この標識は、例えば、放射性同位体、蛍光部分、酵素、および酵素補因子であ得る。
【００４７】
このシス作用性調節配列（プローブ分子またはプライマー分子を含む）を、診断試験キットの一部分として使用して、例えば、腎遺伝子または腎組織に関連する遺伝子の不完全な発現を生じる、このプロモーターにおける変異を検出し得る。
【００４８】
シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含むか、またはこれに由来する核酸（核酸フラグメントを含む）は、当該分野で周知であり例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ　：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された方法に従って、調製され得る。例えば、この調節エレメントの別個のフラグメントを、調製し得、制限酵素を使用してクローニングし得る。あるいは、別個のフラグメントを、適切な配列（例えば、配列番号１中の配列）を有するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して調製し得る。プロモーターフラグメントの活性は、トランスフェクションアッセイでインビトロにて試験され得るか、本明細書中にに記載のまたはトランスジェニック動物中でインビボにて試験され得る。上記の核酸の相同物または等価物である核酸は、本発明の範囲に入る。
【００４９】
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列は、ＫＩＭ−１　ｃＤＮＡを使用して、目的の生物中のゲノムＤＮＡ配列をスクリーニングすること、次いで、本明細書中に記載のようなプロモーター−レポーターアッセイにおいてゲノム配列を試験することによって他の生物から単離され得る。好ましくは、このスクリーニングに使用されるＫＩＭ−１　ｃＤＮＡは、同じ生物種由来であるか、または近縁の生物由来である。従って、マウスＫＩＭ−１由来シス調節配列を単離するために、このマウスＫＩＭ−１　ｃＤＮＡが使用され得る。好ましくは、このプローブは、ＫＩＭ−１　ｃＤＮＡの５’領域に由来する。
【００５０】
（シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含むベクターおよび細胞）
本発明はまた、ベクター（例えば、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む発現ベクター）を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、この発現ベクターは、ＫＩＭ−１または治療ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。このような発現ベクターを使用して細胞をトランスフェクトし得、それによりタンパク質を産生し得る。シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む構築物をまた、遺伝子治療プロトコールの一部として使用して、インビトロまたはインビボにおいて、核酸を特定の細胞型（例えば、腎臓）に送達し得る。
【００５２】
このベクターは、目的の細胞において所望の核酸を増殖するための、当該分野で公知の任意のベクターを含み得る。従って、このベクターは、原核生物宿主もしくは真核生物宿主、またはその両方において、シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む核酸を増殖させるために選択され得る。いくつかの実施形態において、このベクターはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）である。総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ　７６：２７１を参照のこと。組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコール、およびインビトロまたはインビボで、細胞をこのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｓｉａｔｅｓ，（１９８９）、９．１０〜９．１４節ならびに他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出され得る。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。
【００５３】
あるいは、ベクターは、アデノウイルス由来ベクター（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６８：１４３〜１５５に記載されるようなベクター）であり得る。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。
【００５４】
ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来し得る。アデノ随伴ウイルスは、別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損性ウイルスである。総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９を参照のこと。これはまた、そのＤＮＡを、非分裂細胞中に取り込み得、そして高頻度の安定な取り込みを示す、数少ないウイルスの１つである（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。また、米国特許第５，８７２，１５４号も参照のこと。他の適切なベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターが挙げられる。これらのベクターは、例えば、米国特許第５，６６５，５７７号および米国特許第５，９８１，２７６号に記載される。
【００５５】
ベクターは、当該分野で公知の方法を使用して、細胞中に導入され得る。上記に記載されるようなウイルス転移方法に加えて、非ウイルス的な方法もまた使用して、遺伝子を導入し得る。これらの方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿、微粒子媒介送達、および微粒子銃形質転換が挙げられる。いくつかの実施形態において、送達は、標的細胞によって遺伝子を取り込むためのエンドサイトーシス作用経路に依存し得る。この型の例示的な標的化手段としては、リポソームに由来する系、ポリリジン結合、および人工的なウイルスエンベロープが挙げられる。
【００５６】
送達は、その表面で正電荷を運ぶリポソームに包括され（例えば、リポフェクション）、そして（必要に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識される核酸を使用して、実行され得る。例えば、Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ　Ｓｈｉｎｋｅｉ　Ｇｅｋａ　２０：５４７〜５５１；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願１０４７３８１；および欧州特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５を参照のこと。例えば、細胞のリポフェクションは、肝臓細胞上に存在する任意の細胞表面抗原（例えば、アシアロ糖タンパク質レセプター）に対するモノクローナル抗体で標識化されるリポソームを使用して実行され得る。
【００５７】
本明細書中に記載のような、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列またはシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含むベクターを含む細胞は、当該分野で公知の任意の細胞であり得る。従って、これらとしては、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）または真核生物細胞が挙げられ得る。真核生物細胞としては、単細胞生物（例えば、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）のような生物）が挙げられ得る。あるいは、この細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞またはサル細胞）であり得る。いくつかの実施形態において、この細胞は腎臓細胞、または腎臓細胞から誘導された細胞株である。
【００５８】
（シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含むトランスジェニック動物）
本発明はまた、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物（例えば、哺乳動物および鳥類）を含む。
【００５９】
例えば、いくつかの実施形態は、本発明の宿主細胞は、外因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列が導入された受精卵または胚性幹細胞である。このような宿主細胞を使用して、外因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列がそのゲノム中に導入された、非ヒトトランスジェニック脊椎動物、または内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列が変更された相同組換え動物を作製し得る。このような動物は、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列の機能および／または活性を研究するため、ならびにシス作用性ＫＩＭ−１調節配列の調節因子を同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）を意味する。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、これは、トランスジェニック動物が発生する、細胞のゲノム中に取り込まれ、かつ成熟動物のゲノム中に保持され、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織中においてコード遺伝子産物の発現を指示する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列が、内因性遺伝子と、この動物の細胞（例えば、この動物の胚性細胞）に、この動物の発生の前に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更された非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスまたはラットである。
【００６０】
本発明のトランスジェニック動物は、受精卵の雄性前核中に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染などによって、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を導入し、そしてこの卵母細胞を偽妊娠メス養母動物中で発育させることによって作製され得る。例えば、配列番号３の核酸配列を有するシス作用性ＫＩＭ−１調節配列、またはそれらの機能的フラグメントは、非ヒト動物のゲノム中に、導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトシス作用性ＫＩＭ−１調節配列の非ヒトホモログ（例えば、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列のような）は、ヒトシス作用性ＫＩＭ−１調節配列に対するハイブリダイゼーション（さらに上に記載される）に基づき、単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、導入遺伝子中に含まれ、導入遺伝子の発現の効率を上昇させ得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を産生する方法は、当該分野で慣習的であり、そして、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ，ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９６）に記載される。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｆｏｕｎｄｅｒ　ａｎｉｍａｌ）は、そのゲノム中のトランスジェニックシス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列の存在および／またはトランスジェニックシス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列に作動可能に連結された配列の発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を使用して、導入遺伝子を保有するさらなる動物を育種し得る。さらに、トランスジェニックシス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を保有する導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物にさらに育種され得る。
【００６１】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入され、それによってシス作用性ＫＩＭ−１調節配列が変更された（例えば、機能的に破壊された）、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。このシス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、ヒト配列（例えば、配列番号３）であり得るが、より好ましくは、ヒトシス作用性ＫＩＭ−１調節配列の非ヒトホモログである。例えば、配列番号３のヒトシス作用性ＫＩＭ−１調節配列のマウスホモログを使用して、マウスゲノムにおいてシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を変更するために適切な相同組換えベクターを構築し得る。
【００６２】
１つの実施形態において、このベクターは、相同組換えの際に、内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；または「ノックアウト」ベクターとも称される）ように設計され得る。
【００６３】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列が、変異されているか、またはさもなくば変更されているが、機能的なままである（例えば、上流の調節領域が変更され得、それによって内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列の発現が変更する）ように設計され得る。相同組換えベクターにおいて、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列の変更された部分は、５’末端および３’末端で、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列のさらなる核酸に隣接し、ベクターによって運ばれる外因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列と、胚性幹細胞中の内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列との間で相同組換えを起こさせる。さらなる隣接シス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、内因性遺伝子との首尾良い相同組換えのために十分な長さである。代表的に、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）は、ベクター中に含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そして導入されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列が、内因性シス作用性ＫＩＭ−１調節配列と相同組換えされている細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【００６４】
次いで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ　１９８７、ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ　ＡＮＤ　ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ　ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１１３〜１５２頁を参照のこと。次いで、このキメラ胚を、適切な偽妊娠メス養母動物中に移植し得、そして出産予定日まで生育させた。その生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを持つ子孫を使用して、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種し得る。相同組換えベクターを構築するための方法および相同組換え動物は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２：８２３〜８２９；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載される。
【００６５】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が、産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰｌのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ　８９：６２３２〜６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１〜１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要とされる。このような動物は、「二連」トランスジェニック動物の構築を介して（例えば、２匹のトランスジェニック動物（１匹は選択タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、そしてもう１匹は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交雑することによって）提供され得る。
【００６６】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０〜８１３に記載される方法に従って産生され得る。簡単にいうと、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）は単離され得、そして誘導されて増殖サイクルを抜け出し、そしてＧ０期に入る。次いで、静止期細胞を、例えば、電気パルスの使用を介してその静止期細胞が単離されたのと同じ種の動物由来の除核卵母細胞に融合し得る。次いで、この再構築卵母細胞を桑実胚または胚盤胞まで発育するように培養し、次いで、偽妊娠メス養母動物に移植する。このメス養母動物の産んだ仔は、この細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【００６７】
（シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列に結合するトランス作用性因子の同定）
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列に結合する化合物を同定する方法もまた、提供される。これらの化合物は、例えば、ポリペプチド（例えば、転写因子のような）を含み得るトランス作用性因子を含み、これは、優先的にシス作用性ＫＩＭ−１調節配列と、または低分子と相互作用する。
【００６８】
１つの実施形態において、化合物は、シス作用性ＫＩＭ−１核酸配列を、試験化合物と共にインキュベートするアッセイを実行することによって同定される。この核酸に対する化合物の結合は、核酸結合を評価するための当該分野で公知の方法を使用して検出される。例えば、結合は、電気泳動移動度変化アッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して測定され得る。ＥＭＳＡが準備され得る１つの方法は、ＤＮＡと共にインキュベートすることであり、このＤＮＡは、好ましくは標識され、ＫＩＭ−１由来シス作用性核酸配列および試験化合物を含む。次いでこの混合物は電気泳動に供され、そして試験化合物の存在における標識核酸の移動が、この試験化合物の存在しない標識核酸の移動と比較される。移動度の相違は、試験化合物が調節配列に結合したことを示す。
【００６９】
任意の適切な化合物が、試験化合物として使用され得る。いくつかの実施形態において、試験化合物はトランス作用性因子を含むか、または含むと疑われるとして知られる細胞抽出物から得られる。適切な細胞としては、腎臓細胞（例えば、Ｃｏｓ細胞）が挙げられる。
【００７０】
細胞ベースの方法をまた使用して、活性を調節する化合物を同定し得る。例えば、レポーター分子をコードする核酸に作動可能に連結されるシス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を含む細胞は、試験化合物およびレポーター分子ｍＲＮＡに接触されるか、または翻訳産物が測定される。ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルは、当該分野で公知の任意の方法を使用して（例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析、免疫沈降または免疫組織化学を使用して）決定され得る。
【００７１】
トランス作用性因子はまた、インビボアッセイを使用して同定され得る。例えば、レポーター遺伝子が本明細書中に開示される任意のシス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列の制御下にある、レポーター構築物が、構築され得る。
【００７２】
レポーター遺伝子は、安定に検出可能なタンパク質をコードする任意の遺伝子であり得る。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子であり得る。細胞は、シス作用性ＫＩＭ−１調節エレメントを含むレポーター構築物でトランスフェクトされる。トランスフェクションは、一過性または安定であり得る。この細胞は、１つよりも多いレポーター構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、このトランスフェクトされた細胞は、試験化合物の存在下または非存在下で、適切な時間インキュベートされ得、そしてレポーター遺伝子の発現のレベルが決定される。
【００７３】
同様のアッセイがまた、細胞または細胞の代わりの核抽出物を使用して実行され得る。従って、１つの実施形態において、本発明は、ＫＩＭ活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、本発明に従う任意の調節エレメントを含むレポーター構築物を、核もしくは細胞抽出物、または単離された核と共に、試験化合物の存在下または非存在下でインキュベートする工程を包含する。次いで、試験化合物の発現を、例えば、反応物中に標識ヌクレオチドを含めること、そしてレポーター構築物から転写された産物に取り込まれた標識の量を測定することによって、測定される。他の方法をまた使用して、この系におけるレポーター遺伝子発現の量を決定し得る（例えば、レポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の量の測定）。
【００７４】
さらに別の実施形態において、本発明の調節エレメントをインビボで調節する化合物は、非ヒト動物において同定され得る。本発明の１つの実施形態において、非ヒト動物（例えば、マウス）は、化合物（例えば、上に記載されるアッセイのうちの１つで同定される化合物）で処理される。適切な時間の後、活性のレベルが決定され、そして試験化合物を受けていないマウスにおけるその活性と比較される。
【００７５】
（シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む薬学的組成物）
シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む薬学的組成物は、生理学的に受容可能な１つ以上のキャリアまたは賦形剤を使用して、従来の方法で処方され得る。
【００７６】
投与は、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜後、頭蓋内、眼窩内、眼科的、心室内、包内、脊椎内、槽内、腹腔内、経粘膜、または経口的であり得る。核酸は、種々の方法において、対応する投与経路に従って処方される組成物中に提供され得る。例えば、液体溶液は、摂取または注射のために作製され得る。ゲルまたは粉末は、摂取、吸入、または局所適用のために作製され得る。このような処方物を作製する方法は周知であり、そして当該分野の標準的な参考文献（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒ，Ｐａ，第１５版（１９７５））に見出され得る。
【００７７】
この組成物は、デポー調製物として処方され得る。このような長期活性処方物は、移植によって（例えば、皮下的もしくは筋肉内）、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー性材料もしくは疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂と共に処方され得るか、あるいは、難溶性の誘導体として（例えば、難溶性の塩として）で処方され得る。
【００７８】
この組成物は、活性成分を含む１つ以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで、提示され得る。このパックは、例えば、金属箔またはプラスティック箔（例えば、ブリスタパック）を含み得る。このパックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示書を添付し得る。
【００７９】
治療的組成物はまた、キャリアまたは賦形剤を含み得る。有用な賦形剤としては、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。
【００８０】
（シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を使用するための方法）
ポリペプチドコード配列に作動可能に連結されるシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞を使用して、ポリペプチドの発現を指向し得る。例えば、ポリペプチドは、ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞を提供する工程、および必要な場合この細胞を培養する工程によって発現され得、ポリペプチドの発現を可能にする。任意の細胞型は、それがシス作用性調節配列に作動可能に連結するポリペプチドコード配列の発現を可能にする限り、使用され得る。好ましい実施形態において、この細胞は、腎臓細胞である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、発現されるポリペプチドが単離される。所望の場合、ポリペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を可能にするために、シグナル配列をコードする配列を含み得る。次いでこのポリペプチドは、細胞外培地から単離され得る。
【００８２】
このシス作用性ＫＩＭ−１調節配列をまた使用して、インビトロまたはインビボで（例えば、細胞、組織、もしくは被験体（例えば、ヒト）の中で）作動可能に連結された配列の転写を増加し得る。作動可能に連結された配列は、例えば、ポリペプチドコード配列またはアンチセンス核酸構築物であり得る。転写を増加するために、目的の配列に作動可能に連結されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞、またはこのような細胞の２つ以上を含む組織は、この細胞または組織中で作動可能に連結される配列に対応する転写物のレベルを増加させることを可能にするために、作動可能に連結される配列の発現を可能にする条件下で、培養される。本明細書中で使用される場合、「培養」は、哺乳動物細胞の生存度を維持するために必要な条件下でのインビトロ培養、または動物の身体内における細胞のインサイチュ培養を含み得る。
【００８３】
別の実施形態において、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を使用して、このような調節配列の制御下に通常は存在しない核酸配列の発現を指示し得る。シス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む核酸分子は、目的の遺伝子の近くにおける標的細胞のゲノム中に組み込まれる。目的の遺伝子は、好ましくは、通常は腎臓組織に存在しないか、または腎臓組織において低量で発現する遺伝子である。導入されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を目的の遺伝子付近に組み込むことは、ＫＩＭ−１調節配列の制御下における目的の遺伝子の発現を可能にする。好ましくは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、目的の遺伝子の５’領域の付近に導入される。
【００８４】
シス作用性ＫＩＭ−１調節配列の別の使用は、治療ポリペプチドを、被験体の腎臓組織に送達することである。ポリペプチドを送達するために、治療ポリペプチド−核酸配列に作動可能に連結されるシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞は、腎臓組織中に導入される。この配列は、例えば、連結されたポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養することによって発現され、被験体の腎臓組織への治療ポリペプチドの送達をもたらす。いくつかの実施形態において、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列に連結された治療ポリペプチドは、刺激後に発現する。この刺激は、例えば、障害（例えば、虚血障害もしくは虚血再灌流障害）、またはいくつかの他の腎毒性障害であり得る。
【００８５】
シス作用性ＫＩＭ−１調節配列はまた、被験体における腎臓組織の障害を処置または予防するための方法において使用され得る。この方法は、治療核酸（例えば、治療ポリペプチドコード配列）をコードする核酸に作動可能に連結される導入されたシス作用性ＫＩＭ−１調節配列を含む細胞を被験体に提供する工程を包含し得る。この核酸は、発現を可能にし、従ってこの遺伝子産物は、腎臓組織に導入されて、被験体中の腎臓組織の損傷を予防または処置する。シス作用性ＫＩＭ−１調節配列は、細胞中に核酸配列を導入するための、当該分野で記載される方法を使用して、被験体中に導入され得る。この核酸は、エキソビボまたはインビボで導入され得る。
【００８６】
遺伝子治療またはアンチセンス治療について、本願ＤＮＡは、動物（例えば、患者）の標的細胞中に、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系を使用して導入され得る。適切な遺伝子送達系は、リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のＤＮＡ、ならびにウイルスベクター（例えば、とりわけ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれ得る。遺伝子治療、またはアンチセンス治療のために、身体における特定の部位に対する核酸の送達は、微粒子銃送達系（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：２７２６〜２７２９によって記載されるような）を使用して、達成され得る。単離されたＤＮＡで細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、分子生物学の分野の当業者に周知である。腎臓疾患もしくは損傷の発症を予防または減少するための遺伝子治療およびアンチセンス治療は、本願ＤＮＡを患者に直接投与することによって、または腎臓細胞を、エキソビボにおいて本願ＤＮＡでトランスフェクトし、そして、このトランスフェクトした細胞を患者に注入することによって実行され得る。
【００８７】
治療的有効量は、処置される動物において医学的な所望の結果を生じ得る、本発明のＤＮＡの量である。医学分野において周知の通り、任意の１人の患者についての投与量は、多くの因子に依存し、これには、患者のサイズ、体表面面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、身体全体の健康状態、および同時に投与される他の薬物が挙げられる。投与量は変化するが、ＤＮＡの静脈投与のために好ましい投与量は、ＤＮＡ分子の約１０６〜１０２２コピーである。
【００８８】
核酸は、多くの任意の経路によって（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号および同第５，５８０，８５９号に記載されるように）、被験体に送達され得る。従って、送達としてはまた、例えば、静脈注射、局所投与、および全身投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ　９１：３０５４〜３０５７を参照のこと）が挙げられ得る。
【００８９】
遺伝子治療ベクターの薬学的調製物としてはまた、受容可能な希釈剤における遺伝子送達ベクターが挙げられ得るか、または、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリクスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）からインタクトに産生され得、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【００９０】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の特に限定しない実施形態を例示する。
【００９１】
（実施例１　ＫＩＭ−１由来配列のクローン化および特徴付け）
シス作用性ＫＩＭ−１由来調節配列を、ヒトＫＩＭ−１　ｃＤＮＡの５’領域に２２０ｂｐ　Ｎｏｔｌ−Ｋｐｎｌ　ＤＮＡフラグメントを含む配列を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。ヒトＫＩＭ−１　ｃＤＮＡは、ＰＣＴ公開Ｗ０９７／４４４６０およびＩｃｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１３５−４２，１９９８．に一般に記載される。
【００９２】
このスクリーニングは、８９３３ｂｐ（配列番号１）のゲノムフラグメントを同定した。この８９３３ｂｐ領域の配列を、図１Ａ〜１Ｈに示す。翻訳開始コドンは、ヌクレオチド８６５５で始まることを示す。
【００９３】
図１Ａ−１Ｈのヌクレオチド３７９６−８６１２に対応する４８１７ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメント（配列番号２）を、ルシフェラーゼコードｐＧＬ３ｂ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）にサブクローン化し、そしてｐ４．８ＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂと名づけた。ｐ４．８ＫＩＭ／ｐＧＬ３Ｋ構築物を、図２Ｂに模式的に示す。ｐＬＵＣ３における４８１７ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントの存在は、以下の実施例でより詳細に説明されるように、腎細胞において、コードされたルシフェラーゼレベルを増加させることで見出された。
【００９４】
腎細胞でのルシフェラーゼの発現を増強し得るより小さい配列を、図１のヌクレオチド７３２２−８６１２に対応する１２８９ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメント（配列番号３）をｐＬＵＣ３ベクターにサブクローン化することによって同定した。生じた構築物を、１．３ｐＫＩＭ−１と名づけ、図２Ｃに模式的に示す。
【００９５】
図１のヌクレオチド８１１０〜８６１２（配列番号４）のみを含むｐＬＵＣ３に基づく構築物である、０．５ｐＫＩＭと名づけられた構築物は、発現と比べてルシフェラーゼレベルは増加しなかった。しかし、８１１０〜８６１２領域だけが不活化であるとしても、それにもかかわらず、この領域内に存在する配列は、連結された配列の発現を腎細胞に与えるために他の配列とともに必要とされ得る。
【００９６】
（実施例２　ＫＩＭ−１由来配列に作動可能に連結されたレポーター配列の腎細胞における発現）
ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来のヒトゲノム配列を、３つの腎誘導細胞株（アフリカミドリザルの腎線維芽細胞から誘導された細胞株であるＣＯＳ細胞；ブタの腎上皮細胞株から誘導された細胞株であるＬＣ／ＰＫ細胞；およびイヌの腎上皮細胞株から誘導された細胞株であるＭＤＣＫ細胞）において、レポーターポリペプチドの発現を指向するそれらの能力について試験した。
【００９７】
この細胞株に、レポータールシフェラーゼ遺伝子に連結されたヒトＫＩＭ−１遺伝子由来のＤＮＡの種々の領域を含む構築物で一過性にトランスフェクトした。これらの構築物を、トランスフェクション効率を標準化するために、β−ガラクトシダーゼベクターを制御するｐＣＭＶを同時にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。活性を、ルシフェラーゼ／β−ｇａｌの割合として算出した。相対的な活性を、陰性コントロール、すなわち、プロモーターを有さないルシフェラーゼベクター（ｐＧＬ３ｂ）に対する構築物活性の割合として算出した。
【００９８】
ＤＥＡＥ媒介トランスフェクションは、細胞株中に構築物を導入するために使用した（以下により詳細に記載する）。トランスフェクションを、細胞の播種して約２４時間後に８０％コンフルエンスで行った。
【００９９】
細胞から培地を吸引し、そして１０ｍｌの適切な培養培地（１０％　Ｎｕ血清，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，＃５１００４を含む）、４００μｌのＤＥＡＥ（１×ＰＢＳ＋１０ｍｇ／ｍｌ　ＤＥＡＥデキストラン＋２．５ｍＭクロロキン）、および２０μｇのＤＮＡ（１０μｇルシフェラーゼ構築物，２μｇ／β−ｇａｌベクター，８μｇ　ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　Ｖｅｃｔｏｒ）を混合することによって、ＤＮＡを細胞中に導入した。
【０１００】
細胞をＤＮＡに２〜４時間曝露し、その後ＤＮＡ溶液を吸引によって除去し、１０％　ＤＭＳＯを有する１×ＰＢＳ（５ｍｌ）で置換した。２分後、この溶液を除去し、そして細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。新鮮な培地を加え、そして細胞を４８時間後に採集した。
【０１０１】
細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで５００μｌの１×ＰＢＳでインキュベートした。細胞を収集し、そして２分間の遠心分離をし、その後上清を除去した。２００μｌの０．２５Ｍトリス、ｐＨ７．８に細胞を再懸濁し、そして凍結−融解サイクルの衝撃を３回与え、次いで１４，０００ｇで５分間、遠心分離した。この上清を、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼアッセイのために使用した。
【０１０２】
β−ガラクトシダーゼ活性を測定するために、２５μｌの上清、３０μｌの１０×Ｍｇ緩衝液（９０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　１．０２Ｍ　β−メルカプトエタノール）、６０μｌの４０ｍＭ　ＣＰＲＧ、および４８μｌの０．５リン酸ナトリウムｐＨ７．５を混合し、そして赤色に発色するまでインキュベートした。５００μｌの１Ｍ　Ｎａ２Ｃ０３を添加し、そして５７０ｎｍでＯＤを測定した。
【０１０３】
ルシフェラーゼの活性を測定するために、２５μｌ（ｐ１０）の上清を、製造者の指示書（Ｃａｔａｌｏｇ　＃Ｅ１５０２，Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って、５０μｌの２×アッセイ緩衝液と混合した。光照度計（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定を行った。
【０１０４】
構築物を生成するために使用したＫＩＭ−１ヒトゲノム領域を図２Ａに示す。トランスフェクションアッセイで使用した構築物を、図２Ｂ〜２Ｄに示す。８９３３ｂｐフラグメント（配列番号１）を、５’−３’方向で図２Ａに模式的に示す。ＫｐｎＩ部位は、図に示されるように３７９６位および８６１２位に位置する。参考のため、ヒトＫＩＭ−１のＡＴＧ挿入コドンは、８６５５位置に生じる。
【０１０５】
試験した配列を、図２Ｂ〜２Ｄに模式的に示す。一つの試験した配列は、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’隣接領域由来の４８１６ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを含んだ。このフラグメントは、ＭＺ００７の３７９６位および８６１２位でＫｐｎＩ部位によって境界を成された配列に対応する。図２Ｂは、４８１６ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＬＵＣ３　Ｂａｓｉｃ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に挿入することによって作製した構築物を示す。その生じた構築物を、４．８ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂと名づけた。
【０１０６】
４８１６ｂｐ　ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ領域由来のより短いフラグメントもまた、試験した。このフラグメントを、ＭＺ００７のヌクレオチド７３２２−８６１１を含むＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントによって規定した。このＫｐｎＩフラグメントを、ｐＬＵＣ３　Ｂａｓｉｃ発現ベクターおよび指定した１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂに挿入した。この構築物を、図２Ｃに模式的に示す。
【０１０７】
ＭＺ００７のヌクレオチド８１１０−８６１２を含むＳａｃＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントによって規定される、なお短いフラグメントもまた、試験した。この構築物を、０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂと名づけ、そして図２Ｄに模式的に示す。
【０１０８】
それぞれの試験される細胞株については、プラスミドなし（すなわち、「０」）、ｐＧＬ３　Ｂａｓｉｃベクター単独（「ｐＧＬ３」）、または構築物４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ、１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂおよび０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂを用いたトランスフェクションに続いて、ルシフェラーゼを測定することによって、相対的なルシフェラーゼ活性を算出した。
【０１０９】
ＣＯＳ細胞の形質転換では、培養培地としてＤＭＥＭを使用した。４．８ｐＫＩＭ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて４回試行を行った。ＲＡは３．８（ＳＤは２．８２）であった。１．３ｐＫＩＭ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて４回試行を行った。ＲＡは６．３（ＳＤは４．１９）であった。０．５ｐＫＩＭ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて２回試行を行った。ＲＡは３．３（ＳＤは１．５４）であった。ＣＯＳ細胞を用いたトランスフェクションアッセイの結果を、図３に示す。
【０１１０】
ＬＬＣ−ＰＫ細胞の形質転換では、培養培地としてＤＭＥＭを使用した。４．８ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて３回試行を行った。ＲＡは５．５（ＳＤは１．４３）であった。１．３ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて３回試行を行った。ＲＡは３．４（ＳＤは０．８９）であった。０．５ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて２回試行を行った。ＲＡは１．５（ＳＤは０．３４）であった。ＬＬＣ−ＰＫ細胞を用いたトランスフェクションアッセイの結果を、図４にまとめる。
【０１１１】
ＭＤＣＫ細胞の形質転換では、培養培地としてＭＥＭを使用した。４．８ｐＫＩＭ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて３回試行を行った。相対的活性（ＲＡ）は７．０であり、ＳＤは３．４６であった。１．３ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ構築物では、それぞれ２つのプレートを用いて３回試行を行った。相対的活性は３．４（ＳＤは０．８９）であった。ＭＤＣＫ細胞を用いたトランスフェクションアッセイの結果を、図５に示す。
【０１１２】
ＣＯＳ細胞（図３）、ＬＬＣ／ＰＫ１細胞（図４）、およびＭＤＣＫ細胞（図５）を用いたアッセイでは、ｐＧＬ３単独でトランスフェクトした細胞およびどの構築物でもトランスフェクトしなかった細胞と比較して、構築物４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂおよび１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂでトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性が、有意により高かった。
【０１１３】
これらの結果は、図１Ａ〜Ｈに示されるように、配列ヌクレオチド７３２２−８６１２が、腎組織において作動可能に連結された配列の発現を増強し得るシス作用性調節エレメントを含むことを示す。この活性を増強するさらなるエレメントは、以下の実施例３で議論されるように、図６に示される３７９６−７３２２領域にあり得る。
【０１１４】
試験した細胞型では、０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物は、ｐＧＬ３単独でトランスフェクトした細胞に対してルシフェラーゼの発現を増強しなかった。これらの結果は、これらＫＩＭ−１由来配列が、少なくとも使用した細胞株および条件下では連結された配列の発現を与えなかったことを示唆するが、これらの結果は、ＫＩＭ−１隣接領域のこの領域が、腎組織において連結された配列の発現を増強するために必要であるか、または重要なエレメントを含む可能性を除外しない。
【０１１５】
（実施例３　傷害後のＫＩＭ−１由来配列に作動可能に連結したレポーター配列の腎細胞における発現）
４．８ｐＫＩＭ、１．３ｐＫＩＭおよび０．５ｐＫＩＭによってコードされるルシフェラーゼの発現を、シアニドおよびデオキシグルコースを用いて化学的酸素欠乏症に供した、トランスフェクトしたＨＫ２細胞において測定した。ＨＫ２細胞を、ヒト腎臓に由来する近位尿細管上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｔｕｂｕｌｅ　ｃｅｌｌ）から誘導した。
【０１１６】
１２ウェルプレートシステム（ＭＵＬＴＩＷＥＬＬＴＭ　１２−ウェル、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ）を、これらの研究に使用した。培養培地には、ＥＧＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。形質転換に先立って、１ウェルあたり２ｍｌの培地を細胞に添加し、次いで吸引で除去した。ＨＫ２細胞を３０，０００／ウェルの密度で播種した。細胞は、１６〜２４時間後に８０％コンフルエントに達した。
【０１１７】
ＤＮＡを、５０μｌの無血清培地、５μｇのＤＮＡ（２．５μｇ　ルシフェラーゼ構築物、０．５μｇ　β−ガラクトシダーゼベクター、２μｇ　ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター）および５μｌのＳＵＰＥＲＦＥＣＴ試薬（Ｑｉａｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．）と混合し、そして７分間インキュベートすることによって調製した。３００μｌの培地＋１０％　ＦＣＳを加え、次いでこの混合物を細胞に加えた。次いで、細胞を２時間インキュベートした。次にこのＤＮＡ溶液を吸引によって除去し、その後細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、その後細胞を１０％　ＦＳＣを含む培養培地中でインキュベートした。
【０１１８】
化学的酸素欠乏症を誘導するために、培地を吸引によって除去し、そして細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を５ｍＭシアン化ナトリウムおよび５ｍＭデオキシグルコースと一緒に、１ｍｌ　Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（「ＫＨＢ」）（６．７２ｍＭ　ＮａＣｌ、３．６ｍＭ　ＫＣｌ、１．３ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐｈ７．４、インキュベーター中）で、９０分間インキュベートした。次いで、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＫＨＢ＋ｌ０ｍＭデキストロース中で１５〜２０分間インキュベートし、次いで、以下の説明のように採集した。
【０１１９】
採集に関しては、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで２００μｌ　２５ｍＭ　ＧｌｙＧｌｙ、１５ｍＭ　ＭｇＳ０４、４ｍＭ　ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００、１ｍＭ　ＤＴＴで５分間インキュベートした。次いで、溶解物をウェルから除去し、そしてルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼアッセイに使用した。
【０１２０】
βガラクトシダーゼ活性のアッセイのために、５０μｌの細胞抽出液を、５０μｌのアッセイ緩衝液（カタログ＃Ｅ２０００、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と混合し、その後淡い黄色が発色するまで３７℃でインキュベートした。次いで、シグナルをＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。
【０１２１】
ルシフェラーゼ活性を、製造者の指示通り５０μｌの２×アッセイ緩衝液（カタログ＃Ｅ１５０２、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と混合することによって測定した。測定を光照度計を用いて行った。
【０１２２】
ルシフェラーゼの発現を、トランスフェクトしたＨＫ２細胞の３つの異なる集団において測定した。第一の群には、化学的酸素欠乏症を受けていない細胞を含めた。これらの細胞を、トランスフェクションの７２時間後に分析した。第二の群には、トランスフェクションの７２時間後および化学的酸素欠乏症を誘導して９０分後でアッセイした細胞を含めた。それぞれの細胞群に対して、細胞の別々の集団に、４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ、１．３ｐＫＩＭ／ＧＬ３ｂ、および０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂでトランスフェクトした。
【０１２３】
その結果を図６に示す。ベースラインの細胞に対して、４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物は、９．１のＲＡ（１．１のＳＥＭ）を生じた。１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物は、５．０のＲＡ（０．８のＳＥＭ）を生じた。０．５ｐＫＩＭ構築物は、１．６のＲＡ（０．２のＳＥＭ）を生じた。
【０１２４】
化学的酸素欠乏症を与えた細胞において、４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂは、１３．５のＲＡ（１．５のＳＥＭ）を生じた。１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物は、５．６のＲＡ（０．４のＳＥＭ）を生じた。０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物は、２．０のＲＡ（０．３のＳＥＭ）を生じた。
【０１２５】
これらのデータは、４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂ構築物に存在するＫＩＭ−１配列が、コントロール細胞と比較して酸素欠乏症を与えた細胞において、連結したルシフェラーゼ遺伝子のより高い発現レベルを引き起こすことを証明する。この影響は、この実験の１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３ｂおよび０．５ｐＫＩＭ／ｐＧｌ３ｂ構築物では見られなかった。
【０１２６】
（実施例４　ＫＩＭ−１由来配列に作動可能に連結したレポーター配列の、コンフルエントな腎細胞における発現）
４．８ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ、１．３ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂ、または０．５ｐＫＩＭ／ＰＧＬ３ｂに連結したルシフェラーゼ遺伝子の発現を、コンフルエント細胞において調査した。
【０１２７】
ＭＤＣＫ細胞を、播種して１６〜２４時間後で、指示された構築物を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、２４、４８、および７２時間後に採集し、次いで、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性を測定した。この結果を以下にまとめた：
【０１２８】
【表１】
2004500879.tif 000002
。
【０１２９】
これらの結果は、４．８ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３Ｂに存在するＫＩＭ−１配列が、細胞がコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達したとき、有意に高いレベルのルシフェラーゼを導くことを証明する。１．３ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３Ｂおよび０．５ｐＫＩＭ／ｐＧＬ３Ｂ構築物にのみ存在するＫＩＭ−１配列は、これらの研究においてルシフェラーゼの発現を増加しなかった。
【０１３０】
（実施例５　遺伝子治療におけるＫＩＭ−１由来シス作用性調節配列の使用）
本発明によるＫＩＭ−１由来シス作用性調節配列を、腎疾患の遺伝子治療処置に使用し得る。腎細胞において、ＫＩＭ−１シス作用性調節配列は、単独で使用され得るか、または異種の遺伝子（例えば、ＫＩＭ−１　ｃＤＮＡまたはＫＩＭ−１ポリペプチド以外のタンパク質）を発現するためのベクターの一部として使用され得る。
【０１３１】
目的のポリペプチドをコードする核酸に連結されたＫＩＭ−１シス作用性調節配列を含むＤＮＡまたはベクターを、腎細胞中に導入する。これは、目的のポリヌクレオチドを順に産生する。例えば、所望のポリペプチドをコードする配列は、本発明の腎細胞特異的プロモーター配列に作動可能に連結され得、そして腎細胞において発現され得る。
【０１３２】
（実施例６　アンチセンス治療におけるＫＩＭ−１由来シス作用性調節配列の使用）
ＫＩＭ−１シス作用性調節配列を、アンチセンス治療の方法に使用する。アンチセンス治療を、動物（例えば、ヒトの患者）に、ＤＮＡ配列（すなわち、アンチセンスＲＮＡに転写されるアンチセンステンプレート）に作動可能に連結された本発明の腎細胞特異的プロモーター配列を含むＤＮＡを投与することによって実行する。このアンチセンスＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡ配列の一部分に相補的であるように形成された短いヌクレオチド配列（一般的に、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１４のヌクレオチド、そして１００までまたはそれ以上）である。このアンチセンステンプレートを、好ましくは、本発明のプロモーター配列の下流に配置する。代表的に、ＡポリＡテイルエレメントを、配列の端を示すためにアンチセンス配列の端に配置する。アンチセンス技術に関連する標準方法が記載されている。例えば、Ｍｅｌａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１：２８９７−２９０１、１９９１を参照のこと。ＤＮＡ配列のアンチセンスＲＮＡへの転写後、このアンチセンスＲＮＡを細胞内の標的ｍＲＮＡ分子に結合し、それにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、そしてｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現をダウンレギュレートする。
【０１３３】
他の腎細胞タンパク質の発現もまた、同様の様式で阻害され得る。例えば、本発明のＤＮＡは、以下のタンパク質：ＴＧＦ−β、機能不全コラーゲン変異遺伝子、ＷＴ−１（ウィルムス腫遺伝子）および多発性嚢胞腎疾患（ＰＣＫ）に関連する遺伝子、の発現を阻害し得るアンチセンスＲＮＡに転写されるアンチセンステンプレートに作動可能に連結され得る。
【０１３４】
（他の実施形態）
本発明は、それらの詳細な説明に関連して記載されるが、前述の説明は例示のために意図され、本発明の範囲を制限しておらず、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利益、および改変は、上記の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｄ】
図１Ｄは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｅ】
図１Ｅは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｆ】
図１Ｆは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｇ】
図１Ｇは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図１Ｈ】
図１Ｈは、シス作用性ＫＩＭ−１調節配列（配列番号１）を含む核酸配列の概略図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列の概略図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列の概略図である。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列の概略図である。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列の概略図である。
【図３】
図３は、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列を含む様々なレポーター構築物のＣＯＳサル腎細胞における、ルシフェラーゼの相対的な発現を示す棒グラフである。
【図４】
図４は、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列を含む様々なレポーター構築物のＬＬＣＰＫ細胞における、ルシフェラーゼの相対的な発現を示す棒グラフである。
【図５】
図５は、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列を含む様々なレポーター構築物のＭＤＣＫ細胞における、ルシフェラーゼの相対的な発現を示す棒グラフである。
【図６】
図６は、活性酸素種（ＲＯＳ）に対する曝露または酸素欠乏症の後の、ＨＫ２細胞中のＫＩＭ−１調節配列に連結された配列の誘導能を示す棒グラフである。
【図７】
図７は、ヒトＫＩＭ−１遺伝子の５’領域由来の配列を含む様々なレポーター構築物を用いる、トランスフェクション後の種々の時点での、ＭＤＣＫ細胞におけるルシフェラーゼの相対的な発現を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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