(57)【要約】本発明は、ヒトＢ７−１のＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ−４に結合する能力またはヒトＢ７−１により生成されるＴ細胞増殖応答と比較してより大きい変更されたレベルのＴ細胞増殖応答を誘導するかもしくは阻害する能力よりも大きいかまたは小さいレベルで、ＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ−４レセプターに優位に結合するこのポリペプチドの能力を含む有利な特性を有するポリヌクレオチドおよびそれからコードされるポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、治療的および予防的な処置方法、遺伝子治療適用、ならびにワクチンにおいて有用である。
2004513878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ドメイン配列を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドであって、ここで、該細胞外ドメイン配列は、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５、および２９０〜２９３の少なくとも１つの細胞外ドメイン配列に対して、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性を有し、そして天然に存在する細胞外ドメイン配列ではなく、ここで、該ポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等しいかこれよりも大きいＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮特許出願番号６０／２１３，９４６（２０００年６月２３日出願）および同６０／２４１，２４５（２０００年１０月１７日出願）に対して優先権および利益を主張し、各開示は、本明細書中において、参考としてその全体が全ての目的のために援用される。
【０００２】
（著作権の通告）
３７　Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に準拠して、出願人らは、本開示の一部が著作権保護の対象となる材料を含むことを記述する。著作権所有者は、特許書類または特許開示の誰による複製に対しても、異議を持たない。これは、特許商標局の特許出願または記録において明らかであるがさもなくば、全ての著作権をいかなる場合においても留保する。
【０００３】
（連邦政府の支援による研究および開発についての記述）
本研究は、Ｄｅｆｅｎｓｅ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ　Ａｇｅｎｃｙ（ＤＡＲＰＡ）（助成金番号Ｎ６５２３６−９８−１−５４０１）からの助成金により部分的に支援を受けた。政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は一般に、ポリヌクレオチドおよびこれにコードされるポリペプチド、ベクター、細胞、抗体ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用方法および生産方法に関連する。
【０００５】
（発明の背景）
Ｔ細胞は、免疫系の重要な成分である。感染因子に対する全ての特異的な免疫応答に、Ｔ細胞活性化が必要とされるだけでなく、Ｔ細胞はまた腫瘍免疫ならびに自己免疫およびアレルギー疾患において重要な役割を果たす。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞がそれらの特定の抗原（Ａｇ）を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のからみで認識する場合に、開始される。Ｔ細胞活性化は、当業者に周知であり、例えば、サイトカイン合成、種々の活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５（インターロイキン２（ＩＬ−２）レセプター）の誘導などのようなことによって、特徴付けられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、これらの免疫原性ペプチドをＭＨＣクラスＩＩ分子のからみで認識するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、これらの免疫原性ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子のからみで認識する。Ｔ細胞活性化、サイトカイン合成またはエフェクター機能の誘導のためにＣＤ２８を介する第２のシグナルが必要とされる。ＣＤ２８に対する２つのリガンドは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）である。Ｂ７−１およびＢ７−２は、同時刺激分子と呼ばれ、典型的には専門化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される。ＣＤ２８に結合するレセプターを結合することに加え、Ｂ７−１およびＢ７−２はまた、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターを結合する。
【０００６】
Ｂ７分子は、Ｔ細胞に対して、ポジティブおよびネガティブの両方のシグナルを、Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）分子に結合することによって、媒介する。ＣＴＬＡ−４は、免疫系のネガティブ調節因子である。一般に、野生型（ＷＴ）Ｂ７−１（例えば、ヒトＢ７−１）は、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に、ＣＤ２８に結合するよりも強く結合する。典型的に、野生型Ｂ７−１（例えば、ヒトＢ７−１）は、ＣＴＬＡ−４に、ＣＤ２８に結合するよりも約１００倍の親和性を持って結合する。Ｂ７−１またはＢ７−２のＣＴＬＡ−４に対する結合は、Ｔ細胞の活性化を抑制し、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生の減少を生じる（例えば、Ｗａｌｕｎａｓ、Ｔ．Ｌ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１（５）：４０５−４１３；Ａｌｅｇｒｅ、Ｍ．Ｌ．ら（１９９８）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６１（７）：３３４７−３３５６を参照のこと）。Ｂ７−１またはＢ７−２とＴ細胞上に発現されるＣＴＬＡ−４の間の相互作用は、Ｔ細胞応答をダウンレギュレートし、ＣＤ２８による活性化に必要な閾値を上昇する。ＣＴＬＡ−４／リガンドの相互作用の阻害はまた、インビボ腫瘍免疫を増強し得る（Ｌｅａｃｈ、Ｄ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７１：１７３４−１７３６）。結果的に、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の調節に中心的な役割を果たし、これら両方は、免疫系の適切な機能に必須である。例えば、ＣＴＬＡ−４欠損マウスは、リンパ球増殖性疾患で死亡するが、ＣＤ２８欠損マウスは、重篤な免疫不全であり、Ｔ細胞応答に特異的な抗原をほとんど示さないで、ＣＤ２８シグナル伝達によって媒介されるＴ細胞増大を示し、Ｔ細胞レセプターシグナル伝達のダウンレギュレーションの欠損を有する。同時刺激分子Ｂ７−１またはＢ７−２による結合において、ＣＤ２８は、Ｔ細胞レセプターシグナル伝達と相乗する同時刺激シグナルを媒介して、例えば、増殖、サイトカイン産生およびエフェクター機能を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（増殖／活性化）の両方によって、誘導する。しかし、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１（ＣＤ８０）またはＢ７−２（ＣＤ８６）との結合は、ＣＤ２８を介した、ＣＤ８０またはＣＤ８６の活性化シグナルを、弱らせ、Ｔ細胞活性化のダウンレギュレーションを生じる。ＣＤ２８結合は、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達を通して媒介される阻害を減少する。ＣＴＬＡ−４結合は、耐性およびアネルギーを媒介する。
【０００７】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４は両方、遺伝子ワクチン接種（例えば、核酸ワクチン接種（ＮＡＶ）、ＤＮＡワクチン接種およびウイルスベクター）に対する免疫応答の生成に関連する。Ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（β−ｇａｌ）遺伝子をコードするプラスミドを用いてＣＤ２８欠損マウスを免疫した場合、ＣＤ２８欠損マウスは、Ｔ細胞また抗体応答を、β−ｇａｌに対して向けることが出来ず、ＣＴＬＡ−４結合は、免疫された野生型マウスにおいて、β−ｇａｌに対する抗体応答を抑制する（Ｈｏｒｓｐｏｏｌ、Ｊ．ら（１９９８）、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６０：２７０６−２７１４）。ヒト骨髄腫細胞におけるＢ７−１の発現（Ｗｅｎｄｔｎｅｒ、Ｃ．ら（１９９７）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４（７）：７２６−７３５）、マウス乳癌（Ｍａｒｔｉｎ　Ｆｏｎｔｅｃｈａ、Ａ．ら（２０００）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６４（２）：６９８−７０４）またはマウス肉腫（Ｉｎｄｒｏｖａら（１９９８）Ｉｎｔｌ　Ｊ　Ｏｎｃ　１２（２）：３８７−３９０）は、抗腫瘍免疫を促進する。さらに、ヒトＡＰＣの、Ｂ７−１および腫瘍抗原をコードするレトロウイルスベクターを用いたトランスフェクションは、腫瘍抗原のみをコードする同様のベクターでのトランスフェクションよりも強い細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導する（Ｚａｊａｃ、Ｐ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５８（２０）：４５６７−４５７１）。抗ウイルス応答はまた、同時刺激分子によって修飾される。例えば、チンパンジーおよびマウスの、ＨＩＶ抗原をＢ７−２と同時に注射するＤＮＡワクチン接種は、抗ウイルス応答を増大した（Ｋｉｍ、Ｊ．ら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ　１６（１９）：１８２８−１８３５；Ｔｓｕｊｉら（１９９７）Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２７（３）：７８２−７８７）。
【０００８】
Ｂ７−１およびＢ７−２の結合特性は、臨床的適用におけるこれらの有用性を限定した。本発明は、優先的にＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターのいずれかに結合、および／またはこれらを介したシグナル伝達する能力を変えられた分子に対する必要性、およびこれらの分子を用いて、Ｔ細胞応答の選択操作および差示的操作のインビトロ、エキソビボおよびインビボでの方法に対する必要性に取り組む。このような分子は、種々の適用（例えば、治療的ならびに予防的な処置およびワクチン接種を含む）において有用に使用される。本発明は、これらの必要および他の必要を満たす。
【０００９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、新規な同時刺激分子（「ＮＣＳＭ」として省略される）を提供し、この分子は、ポリペプチドおよびタンパク質、関連する融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質分子、またはこれらの機能的等価物、相同体、ならびにこのポリペプチドおよびタンパク質分子のフラグメント、またはこれらの等価物、類似体、もしくは誘導体を含む。本発明はまた、これらのポリペプチド、タンパク質、これらのフラグメントまたは改変体のいずれかをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、このような核酸を含むベクター、ならびにこのようなＮＣＳＭポリペプチドおよびＮＣＳＭ核酸の使用を提供し；他の特徴は、さらなる閲覧に基づいて明白である。
【００１０】
一般に、「同時刺激分子」は、第２の分子と関連するかもしく協力して作用するかまたは関係する分子をいうか、あるいは免疫応答に関して、同時刺激経路にある分子をいう。１つの局面において、同時刺激分子は、別の分子と関連するかもしく協力して作用するかまたは関係して、免疫応答を刺激または促進する免疫調節分子であり得る。別の局面において、同時刺激分子は、別の分子と関連するかもしく協力して作用するかまたは関係して、免疫応答を阻害もしくは抑制する免疫調節分子である。「同時刺激分子」は、第２の分子と同じ機構を用いて、または同じ機構により同時に作用する必要はない。
【００１１】
１つの分子の参考における用語「ＮＣＳＭ」は、この分子をポジティブな同時刺激特性を有する（例えば、Ｔ細胞増殖を刺激または増大する）分子にのみ限定することを意図しない。以下に記載される始めの組換え手順において、組換え分子のライブラリーは、本明細書中において議論されるようなもとの同時刺激分子（ＣＳＭ）のヌクレオチド配列の組換えによって生じた。本明細書中に示されるデータおよび分析によって示されるように、種々の特性を有する新規の組換え分子が同定および選択された。例えば、免疫応答を増大する（例えば、Ｔ細胞活性化または増殖によって）分子（例えば、アゴニスト）および免疫応答をダウンレギュレートまたは阻害する（例えば、Ｔ細胞活性化または増殖を阻害することによって）分子（例えば、アンタゴニスト）が同定および選択された。さらにＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターのいずれかもしくは両方を介して優先的に結合および／またはシグナル伝達する分子が同定および選択された。従って、用語「ＮＣＳＭ」は、元の配列の同時刺激特性を有する分子に限定されないが、本発明の全てのポリペプチドおよびこれらをコードする核酸，ならびに本明細書中に記載される他の実施形態を、特に記載のないかぎり集合的に示すことが意図される。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、単離または組換えされたＮＣＳＭポリペプチド、これらの改変体、相同体、誘導体、類似体およびフラグメントを含む。本発明は、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４レセプターに対する優先的な結合および／またはこれらを介したシグナル伝達についての改変された能力を有する組換えＮＣＳＭポリペプチドを含み、Ｔ細胞応答の選択的および差示的操作を、インビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて提供する。本発明はまた、上記される改変された能力および使用を有するポリペプチドをコードする、単離または組換えされたＮＣＳＭ核酸、これらの改変体、相同体、誘導体、類似体およびフラグメントを含む。このようなＮＣＳＭポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、種々の適用（例えば、以下に記載されるような治療的および予防的処置の方法、ワクチン接種および診断アッセイを含む）において、有用である。本発明はまた、ＮＣＳＭポリペプチドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の少なくとも１つに強くもしくは優先的に結合するが、シグナル伝達を達成しないポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し；このような分子は、内因性分子（例えば、内因性同時刺激分子）の潜在的なアンタゴニストとして用いる方法において有用である。さらに、本発明は、改善または改変されたレセプター／リガンド結合親和性を有するＮＣＳＭポリペプチドおよびこれらをコードするポリヌクレオチド、ならびに薬学的、予防的、治療的、ワクチン接種および診断的適用を含むこのような分子を使用する方法を提供する。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、細胞外ドメイン配列（この細胞外ドメイン配列は、少なくとも約７５％のアミノ酸配列が、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１，２８３〜２８５および２９０〜２９３の少なくとも１つの細胞外ドメイン配列または全長配列に対し同一性を有する）を含む、単離または組換えポリペプチドを提供し、ここでこの細胞外ドメイン配列は、天然に存在する細胞外ドメイン配列でなく、このポリペプチドは、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合に等しいかこれより大きい。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞活性化あるいはＴ細胞増殖およびＴ細胞活性化の両方を誘導する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化または増殖応答は、少なくともＷＴｈＢ７−１によるものに等しいか、もしくはこれより大きい。他のこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞活性化を調節するが、可溶性抗ＣＤ−３　ｍＡｂによって活性化した精製したＴ細胞の増殖を誘導しない。
【００１４】
別の局面において、本発明は、単離または組換えされたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、以下の群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる天然に存在しないアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号１〜２１および９５〜１４２またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）高いストリンジェント条件下でポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全長もしくはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここでこのフラグメントは、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合がヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きいポリペプチドをコードする；（ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、このポリペプチドは、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれか１つの少なくとも約１５０の連続したアミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む；および（ｆ）ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きいポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリヌクレオチド配列は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％の同一性を有する。
【００１５】
以下の式に従う配列を含む単離または組換えポリペプチド：ＭＧＨＴＭ−Ｘ６−Ｗ−Ｘ８−ＳＬＰＰＫ−Ｘ１４−ＰＣＬ−Ｘ１８−Ｘｌ９−Ｘ２０−ＱＬＬＶＬＴ−Ｘ２７−ＬＦＹＦＣＳＧＩＴＰＫＳＶＴＫＲＶＫＥＴＶＭＬＳＣＤＹ−Ｘ５５−ＴＳＴＥ−Ｘ６０−ＬＴＳＬＲＩＹＷ−Ｘ６９−ＫＤＳＫＭＶＬＡＩＬＰＧＫＶＱＶＷＰＥＹＫＮＲＴＩＴＤＭＮＤＮ−Ｘ１０１−ＲＩＶＩ−Ｘ１０６−ＡＬＲ−Ｘ１１０−ＳＤ−Ｘ１１３−ＧＴＹＴＣＶ−Ｘ１２０−ＱＫＰ−Ｘ１２４−ＬＫＧＡＹＫＬＥＨＬ−Ｘ１３５−ＳＶＲＬＭＩＲＡＤＦＰＶＰ−Ｘ１４９−Ｘ１５０−Ｘ１５１−ＤＬＧＮＰＳＰＮＩＲＲＬＩＣＳ−Ｘ１６７−Ｘ１６８−Ｘ１６９−ＧＦＰＲＰＨＬ−Ｘ１７７−ＷＬＥＮＧＥＥＬＮＡＴＮＴＴ−Ｘ１９２−ＳＱＤＰ−Ｘ１９７−Ｔ−Ｘ１９９−ＬＹＭＩＳＳＥＬ−Ｘ２０８−ＦＮＶＴＮＮ−Ｘ２１５−ＳＩ−Ｘ２１８−ＣＬＩＫＹＧＥＬ−Ｘ２２７−ＶＳＱＩＦＰＷＳＫＰＫＱＥＰＰＩＤＱＬＰＦ−Ｘ２４９−ＶＩＩＰＶＳＧＡＬＶＬ−Ｘ２６１−Ａ−Ｘ２６３−ＶＬＹ−Ｘ２６７−Ｘ２６８−ＡＣＲＨ−Ｘ２７３−ＡＲＷＫＲＴＲＲＮＥＥＴＶＧＴＥ　ＲＬＳＰＩＹＬＧＳＡＱＳＳＧ（配列番号２８４）、または細胞外ドメインを含むこれの部分配列をもまた提供され、ここで位置Ｘ６はＬｙｓもしくはＧｌｕ；位置Ｘ８はＡｒｇもしくはＧｌｙ；位置Ｘ１４はＡｒｇもしくはＣｙｓ；位置Ｘ１８はＴｒｐもしくはＡｒｇ；位置Ｘ１９はＰｒｏもしくはＬｅｕ；位置Ｘ２０はＳｅｒもしくはＰｒｏ；位置Ｘ２７はＡｓｐもしくはＧｌｙ；位置Ｘ５５はＡｓｎもしくはＳｅｒ；位置Ｘ６０はＧｌｕもしくはＬｙｓ；位置Ｘ６９はＧｌｎもしくはＡｒｇ；位置Ｘ１０１はＰｒｏもしくはＬｅｕ；位置Ｘ１０６はＬｅｕもしくはＧｌｎ；位置Ｘ１１０はＰｒｏもしくはＬｅｕ；位置Ｘ１１３はＬｙｓもしくはＳｅｒ；位置Ｘ１２０はＶａｌもしくはＩｌｅ；位置Ｘ１２４はＶａｌもしくはＡｓｐ；位置Ｘ１３５はＴｈｒもしくはＡｌａ；位置Ｘ１４９はＴｈｒ、Ｓｅｒ、もしくは欠損；位置Ｘ１５０はＩｌｅもしくは欠損；位置Ｘ１５１はＡｓｎもしくはＴｈｒ；位置Ｘ１６７はＴｈｒもしくは欠損；位置Ｘ１６９はＳｅｒもしくは欠損；位置Ｘ１６９はＧｌｙもしくは欠損；位置Ｘ１７７はＣｙｓもしくはＴｙｒ；位置Ｘ１９２はＶａｌもしくはＬｅｕ；位置Ｘ１９７はＧｌｙもしくはＧｌｕ；位置Ｘ１９９はＧｌｕもしくはＬｙｓ；位置Ｘ２０８はＧｌｙもしくはＡｓｐ；位置Ｘ２１５はＨｉｓはもしくはＡｒｇ；位置Ｘ２１８はＡｌａもしくはＶａｌ；位置Ｘ２２７はＳｅｒもしくはＬｅｕ；位置Ｘ２４９はＴｒｐ、Ｌｅｕ、もしくはＡｒｇ；位置Ｘ２６１はＡｌａもしくはＴｈｒ；位置Ｘ２６３はＶａｌ、Ａｌａ、もしくはＩｌｅ；位置Ｘ２６７はＡｒｇもしくはＣｙｓ；位置Ｘ２６８はＰｒｏもしくはＬｅｕ；および位置Ｘ２７３はＧｌｙもしくはＶａｌである。
【００１６】
なお別の実施形態において、本発明は、配列番号４８〜６８、１７４〜１８２、１８４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれかにおいて示されるアミノ酸配列の部分配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供し、ここでこの部分配列は、このアミノ酸配列の細胞外ドメインである。
【００１７】
本発明はさらに、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２、２８６〜２８９または細胞外ドメインを含むこれらの部分配列の少なくとも１つに少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供し、ここでこの配列は、（ａ）天然に存在しない配列であり、そして（ｂ）少なくとも以下の１つを含む：位置２においてＧｌｙ；位置４においてＴｈｒ；位置５においてＡｒｇ；位置８においてＧｌｙ；位置１２においてＰｒｏ；位置２５においてＭｅｔ；位置２７においてＣｙｓ；位置２９においてＰｒｏ；位置３１においてＬｅｕ；位置４０においてＡｒｇ；位置５２においてＬｅｕ；位置６５においてＨｉｓ；位置７８においてＳｅｒ；位置８０においてＡｓｐ；位置８７においてＴｙｒ；位置１２０においてＬｙｓ；位置１２２においてＡｓｐ；位置１２９においてＬｙｓ；位置１３５においてＭｅｔ；位置１５０においてＰｈｅ；位置１６０においてＩｌｅ；位置１６４においてＡｌａ；位置１７２においてＨｉｓ；位置１７４においてＰｈｅ；位置１７６においてＬｅｕ；位置１７８においてＡｓｎ；位置１８６においてＡｓｎ；位置１９４においてＧｌｕ；位置１９６においてＧｌｙ；位置１９９においてＴｈｒ；位置２１０においてＡｌａ；位置２１２においてＨｉｓ；位置２１９においてＡｒｇ；位置２３４においてＰｒｏ；位置２４１においてＡｓｎ；位置２４４においてＬｅｕ；位置２５０においてＴｈｒ；位置２５４においてＡｌａ；位置２６５においてＴｙｒ；位置２６６においてＡｒｇ；位置２７３においてＧｌｕ；位置２７５においてＬｙｓ；位置２７６においてＳｅｒ；位置２７６においてアミノ酸欠損；または位置２７９においてＴｈｒ。ここで位置番号は、ヒトＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置番号に対応し、ここでこのポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きい。
【００１８】
別の局面において、本発明は、以下から選択される、少なくとも１つの変異のある霊長類Ｂ７−１配列と異なる配列を含む、単離または組換えポリペプチドを提供する：Ｓｅｒ　１２　Ｐｒｏ；Ｌｅｕ　２５　Ｍｅｔ；Ｇｌｙ　２７　Ｃｙｓ；Ｓｅｒ　２９　Ｐｒｏ；Ｌｙｓ　４０　Ａｒｇ；Ｈｉｓ　５２　Ｌｅｕ；Ｔｙｒ　６５　Ｈｉｓ；Ｇｌｕ　１２２　Ａｓｐ；Ｇｌｕ　１２９　Ｌｙｓ；Ｔｈｒ　１３５　Ｍｅｔ；Ｔｈｒ　１６４　Ａｌａ；Ｓｅｒ　１７４　Ｐｈｅ；Ｇｌｕ　１９６　Ｇｌｙ；Ａｌａ　１９９　Ｔｈｒ；Ｔｈｒ　２１０　Ａｌａ；Ｌｙｓ　２１９　Ａｒｇ；Ｔｈｒ　２３４　Ｐｒｏ；Ａｓｐ　２４１　Ａｓｎ；Ｖａｌ　２５４　Ａｌａ；Ａｒｇ　２７５　Ｌｙｓ；Ａｒｇ　２７６　Ｓｅｒ；またはＡｒｇ　２７９　Ｔｈｒ；変異は、配列番号２７８に示されるアミノ酸配列を有するヒトＢ７−１と関連させて示し、ここでこの配列は、天然に存在せず、このポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きい。
【００１９】
配列番号２６３〜２７２またはこれらの配列の細胞外ドメインを含む部分配列の少なくとも１つに少なくとも約７５％の同一性を有する配列を含む、単離または組換えポリペプチドがまた含まれ、ここで、この配列は、天然に存在せず、このポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰの結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きい。
【００２０】
なお別の局面において、本発明は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる天然に存在しないアミノ酸配列を含む単離または組換えポリペプチドを含む：（ａ）配列番号２２〜４５、１４３〜１７３、２５３〜２６２またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、２８６〜２８９から選択されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）高いストリンジェント条件下でポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全長またはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここでこのフラグメントがＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の結合親和性の割合がヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きい；（ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、２８６〜２８９のいずれか１つの少なくとも約１５０の連続したアミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む；および（ｆ）ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の結合親和性の割合が、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８の結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きいポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリヌクレオチド配列は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に少なくとも約７０％の同一性を有する。
【００２１】
本発明はまた、以下の式に従う配列を含む単離または組換えポリペプチド：ＭＧＨＴＲＲＱＧＴＳＰ−Ｘ１２−ＫＣＰＹＬＫＦＦＱＬＬＶ−Ｘ２５−ＡＣＬ−Ｘ２９−ＨＬＣＳＧＶＩＨＶＴ−Ｘ４０−ＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＬＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＨＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹ−Ｘ１２２−ＫＤＡＦＫＲ−Ｘ１２９−ＨＬＡＥＶＭＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳＩＴＤＦＥＩＰＰＳＮＩＲＲＩＩＣＳ−Ｘ１６４−ＳＧＧＦＰＥＰＨＬＦＷＬＥＮＧＥＥＬＮＡＩＮＴＴＶＳＱＤＰＥＴ−Ｘ１９６−ＬＹＴＶＳＳＫＬＤＦＮＭＴＡＮＨＳＦＭＣＬＩ−Ｘ２１９−ＹＧＨＬＲＶＮＱＴＦＮＷＮＴＰＫＱＥＨＦＰ−Ｘ２４１−ＮＬＬＰＳＷＡＩＴＬＩＳＡＮＧＩＦＶＩＣＣＬＴＹＲＦＡＰＲＣＲＥＲＫＳＮＥＴＬＲＲＥＳＶＣＰＶ（配列番号２８７）、または細胞外ドメインを含むこれの部分配列を含み、ここで位置Ｘ１２はＳｅｒもしくはＰｒｏ；位置Ｘ２５はＬｅｕもしくはＭｅｔ；位置Ｘ２９はＳｅｒもしくはＰｒｏ；位置Ｘ４０はＬｙｓもしくはＡｒｇ；位置Ｘ１２２はＧｌｕもしくはＡｓｐ；位置Ｘ１２９はＧｌｕもしくはＬｙｓ；位置Ｘ１６４はＴｈｒもしくはＡｌａ；位置Ｘ１９６はＧｌｕもしくはＧｌｙ；位置Ｘ２１９はＬｙｓもしくはＡｒｇ；位置Ｘ２４１はＡｓｐもしくはＡｓｎである。
【００２２】
本発明はまた、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２および２８６〜２８９のいずれかにおいて示されるアミノ酸配列の部分配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供し、ここでこの部分配列は、これらのアミノ酸配列の細胞外ドメインまたは全長配列である。さらに、本発明は、配列番号６６、８１、８５、８６、８８、９０、９１、２８５、２８８、２８９、２９１、および２９４のいずれかの全長ポリペプチド配列およびこれらの任意の部分配列（例えば、シグナルペプチド、ＥＣＤ、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）ならびにこれらのアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を含む。
【００２３】
本発明は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号１〜２１および９５〜１４２またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）高いストリンジェント条件下でポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全長またはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここでこのフラグメントがＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合がヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４の結合親和性の割合に等しいかまたはこれより大きい。
【００２４】
本発明はまた、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸を含み、ここでコードされるポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：（ａ）実質的に配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれか１つのアミノ酸残基の少なくとも約１５０または２００の連続したアミノ酸残基にわたって同一であり、（ｂ）天然に存在しないアミノ酸配列。
【００２５】
さらに、本発明は、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３またはこれらの部分配列のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離または組換え核酸を含み、ここでこの部分配列は、これらのポリペプチドのシグナル配列、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメイン、およびこれらのポリペプチドの細胞質ドメインのうち少なくとも１つを含み、ここでこのアミノ酸配列または部分配列は、天然に存在しない配列である。同様に、ＮＣＳＭポリペプチド分子に実質的に等価または等価である結合活性を有し実質的に等価または等価なＮＣＳＭポリペプチド媒介性免疫応答（例えば、Ｔ細胞の活性化または増殖の誘導もしくは阻害、あるいはサイトカイン産生）を産生するポリペプチドをコードする上記ヌクレオチドのフラグメントが特徴である。
【００２６】
以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸もまた提供される：（ａ）配列番号２２〜４５、１４３〜１７３またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２８６〜２８９から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）高いストリンジェント条件下でポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたってハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全長もしくはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列；ここで（ｃ）または（ｄ）は、以下の少なくとも１つを含む天然に存在しない配列を有するポリペプチドをコードする：
２位のＧｌｙ；４位のＴｈｒ；５位のＡｒｇ；８位のＧｌｙ；１２位のＰｒｏ；２５位のＭｅｔ；２７位のＣｙｓ；２９位のＰｒｏ；３１位のＬｅｕ；４０位のＡｒｇ；５２位のＬｅｕ；６５位のＨｉｓ；７８位のＳｅｒ；８０位のＡｓｐ；８７位のＴｙｒ；１２０位のＬｙｓ；１２２位のＡｓｐ；１２９位のＬｙｓ；１３５位のＭｅｔ；１５０位のＰｈｒ；１６０位のＩｌｅ；１６４位のＡｌａ；１７２位のＨｉｓ；１７４位のＰｈｅ；１７６位のＬｅｕ；１７８位のＡｓｎ；１８６位のＡｓｎ；１９４位のＧｌｕ；１９６位のＧｌｙ；１９９位のＴｈｒ；２１０位のＡｌａ；２１２位のＨｉｓ；２１９位のＡｒｇ；２３４位のＰｒｏ；２４１位のＡｓｎ；２４４位のＬｅｕ；２５０位のＴｈｒ；２５４位のＡｌａ；２６５位のＴｙｒ；２６６位のＡｒｇ；２７３位のＧｌｕ；２７５位のＬｙｓ；２７６位のＳｅｒ；２７６位のアミノ酸欠失；２７９位のＴｈｒ、ここで、位置の番号は、ヒトＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置の番号に対応し、ここで、このポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性の比率以上の、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性の比率を有する。
【００２７】
本発明はさらに、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸または組換え核酸を提供する：（ａ）配列番号２５３〜２６２から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖ポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２６３〜２７２から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖ポリヌクレオチド配列；（ｃ）高度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にハイブリダイズし、かつ、天然に存在しない配列を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全体またはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここで、フラグメントは、（ｉ）天然に存在しない配列、および（ｉｉ）ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性の比率以上の、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性の比率を有するポリペプチドをコードする。
【００２８】
本発明はまた、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、および２８６〜２８９のいずれか１つの、少なくとも約１５０連続するアミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または組換え核酸を含む。
【００２９】
本発明はまた、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、および２８６〜２８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはこれらの部分配列を含む、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または組換え核酸を提供し、ここで、この部分配列は、このポリペプチドのシグナル配列、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つを含み、そしてこのアミノ酸配列または部分配列は、天然に存在しない配列である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性の比率以上の、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性の比率を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸または組換え核酸を提供し、この核酸は、上記の少なくとも１つの核酸を変異させるかまたは組み換えることによって産生される。細胞外ドメインを含む以下の定式を有する配列またはその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドもまた、含む：
【００３１】
【化１】
2004513878.tif 000003
、ここで、Ｘ５０位はＬｅｕまたはＰｒｏであり；Ｘ５５位はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｘ５６位はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘ１１３位はＳｅｒまたはＬｙｓであり；Ｘ１２０位はＩｌｅまたはＶａｌであり；Ｘ１２３位はＰｒｏであるかまたは欠失され；Ｘ１２４位はＶａｌ、Ａｓｎ、またはＡｓｐであり；Ｘ１２５位はＬｅｕまたはＧｌｕであり；Ｘ１２６位はＬｙｓまたはＡｓｎであり；Ｘ１２８位はＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｘ１２９位はＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘ１３０位はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘ１３１位はＬｅｕまたはＡｒｇであり；Ｘ１３５位はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘ１３８位はＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ｘ１４０位はＭｅｔまたはＳｅｒであり；Ｘ１７０位はＡｓｐまたはＧｌｙであり；Ｘ１９３位はＡｓｐであるかまたは欠失され；Ｘ１９４位はＧｌｎであるかまたは欠失され；Ｘ１９５位はＡｓｐであるかまたは欠失され；Ｘ２１１位はＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘ２５２位はＩｌｅまたはＶａｌであり；そしてＸ２５３位はＬｅｕまたはＰｒｏである。このポリペプチドは、配列番号５９、６２、１８０、１８４、１８８、１９５、１９６、２００、２０１、２０４、２１１、２１３、２１９、および２９１のうちのいずれかの配列を含み得る。
【００３２】
本発明の別の特徴は、細胞外ドメインを含む以下の定式に従う配列またはその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドである：
【００３３】
【化２】
2004513878.tif 000004
、ここで、Ｘ９位はＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘ３５位はＩｌｅまたはＴｈｒであり；Ｘ５５位はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｘ１１０位はＬｅｕまたはＰｒｏであり；Ｘ１２４位はＡｓｐまたはＶａｌであり；Ｘ１３５位はＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｘ１８３位はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ１９２位はＬｅｕまたはＶａｌであり；Ｘ２１１位はＭｅｔまたはＴｈｒであり；Ｘ２１５位はＨｉｓであるかまたは欠失され；Ｘ２１６位はＳｅｒであるかまたは欠失され；Ｘ２１７位はＰｈｅであるかまたは欠失され；Ｘ２３１位はＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘ２８８位はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ２９０位はＧｌｕまたはＧｌｎであり、そしてこの配列は、天然に存在しない配列である。
【００３４】
本発明は、配列番号９３もしくは配列番号９４の配列またはその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含み、ここで、この部分配列は、このポリペプチドのシグナル配列、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つを含む。以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または組換え核酸もまた、提供される：（ａ）配列番号４６もしくは配列番号４７から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖ポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号９３、配列番号９４から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖ポリヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号９３、配列番号９４から選択されるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖ポリヌクレオチド配列、ここで、この部分配列は、このポリペプチドのシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【００３５】
別の局面において、本発明は、少なくとも１つの抗原に対して惹起されたポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるポリペプチドを提供し、この抗原は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、２８３〜２９３のいずれかから選択されるポリペプチド配列またはそのフラグメントを含み、ここで、この抗血清は、以下のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号に示される配列のうちの１つ以上によってコードされる１つ以上（および必要に応じて全て）のポリペプチドが差し引かれる：
【００３６】
【化３】
2004513878.tif 000005
。
【００３７】
本発明はさらに、上記に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチドを哺乳動物に投与することによって産生される抗体または抗血清を含み、この抗体は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合し、この抗原は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで、この抗体は、以下のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号の配列のうちの少なくとも１つ（必要に応じて全て）によってコードされるポリペプチドに特異的に結合しない：
【００３８】
【化４】
2004513878.tif 000006
。
【００３９】
本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３のいずれかから選択される任意の配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗血清を提供し、ここで、この抗体または抗血清は、以下のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号のうちの少なくとも１つによってコードされる少なくとも１つ（必要に応じて全て）のポリペプチドに特異的に結合しない：
【００４０】
【化５】
2004513878.tif 000007
。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントなどであり得る。
【００４１】
別の局面において、本発明は、配列番号１〜４７、９５〜１７３および２５３〜２６２から選択される核酸中の特有な部分配列を含む核酸を提供し、ここで、この特有な部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号：
【００４２】
【化６】
2004513878.tif 000008
のいずれかに対応する少なくとも１つ（必要に応じて全て）の核酸と比較して、特有である。本発明はまた、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３から選択されるポリペプチド中の特有な部分配列を含むポリペプチドを含み、ここで、この特有な部分配列は、上記に示すＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号のいずれかによってコードされる少なくとも１つ（必要に応じて全て）のポリペプチドを比較して、特有である。
【００４３】
本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３から選択されるポリペプチド中の特有な部分配列をコードする特有なコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、標的核酸を含み、ここで、この特有な部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号：
【００４４】
【化７】
2004513878.tif 000009
のいずれかによってコードされる少なくとも１つ（必要に応じて全て）のポリペプチドと比較して、特有である。
【００４５】
本発明はまた、賦形剤中、好ましくは薬学的に受容可能な賦形剤中に本明細書中に記載される任意のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む、組成物も含む。１つの局面において、本発明は、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５、２９０〜２９３のアミノ酸配列もしくはその同時刺激フラグメントを含む単離されたＮＣＳＭポリペプチドまたは組換えＮＣＳＭポリペプチド、ならびにキャリアまたは賦形剤を含む、組成物を提供し、ここで、この同時刺激フラグメントは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性の比率以上の、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性の比率を有する。配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、２８６〜２８９のアミノ酸配列もしくはその同時刺激フラグメントを含む単離されたＮＣＳＭポリペプチドまたは組換えＮＣＳＭポリペプチド、ならびにキャリアを含む、組成物（ここで、この同時刺激フラグメントは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性の比率以上の、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性の比率を有する）もまた本発明の特徴である。
【００４６】
本発明はまた、列挙されるＮＣＳＭポリペプチド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１７５個連続するアミノ酸に実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または組換え核酸も含む。種々の実施形態において、コードされるポリペプチドは、列挙されるポリペプチド配列のいずれか１つの少なくとも１５０、１８０、１９０、２００、２１０、２２５、２３０、２４０、２５０、２７５、もしくは２８５またはそれより多くの連続アミノ酸残基、または列挙されるポリペプチド配列のいずれか１つの実質的に同一な改変体を含むか、あるいは列挙される任意の核酸によってコードされる。これらのポリペプチドは、別々に存在しても、より多く融合したタンパク質の１つの成分として存在してもよい。
【００４７】
本発明はまた、本明細書中に記載される任意の核酸を含む細胞、または本明細書中に示される任意のポリペプチドもしくは核酸を発現する細胞も含む。１つの実施形態において、この細胞は、本明細書中の核酸によってコードされるポリペプチドを発現する。
【００４８】
本発明はまた、本発明の任意の核酸を含むベクターも含む。このベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、もしくはウイルス（もしくはウイルスフラグメント）を含み得；このベクターは、例えば、発現ベクター、クローニングベクター、パッケージングベクター、組込みベクターなどであり得る。本発明はまた、このベクターによって形質導入された細胞も含む。本発明はまた、本明細書中に記載の任意の核酸、および賦形剤（好ましくは、薬学的に受容可能な賦形剤）を含む組成物も含む。例えば、このベクターの形質導入によって産生された本明細書中の任意のポリペプチドまたは核酸を含む、細胞またはトランスジェニック動物もまた、本発明の特徴である。
【００４９】
本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、もしくはＤＮＡｓｅを用いて本明細書中に記載される１つ以上の核酸を消化することによって産生される組成物；ならびに、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポリメラーゼ）の存在下で本明細書中に記載の１つ以上の核酸をインキュベートすることによって産生される組成物も含む。
【００５０】
本発明はまた、本明細書中に記載される２つ以上の核酸を含む組成物も含む。この組成物は、核酸ライブラリーを含み得、このライブラリーは、少なくとも５、１０、２０もしくは５０またはそれより多くの核酸を含む。
【００５１】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の任意の核酸によってコードされる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む。１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３のいずれかから選択される配列を含み得る。これらの配列およびそのフラグメントは、別々に存在しても、融合タンパク質のようなより大きなタンパク質の成分として存在してもよい。
【００５２】
本明細書中に記載される任意のポリペプチドは、必要に応じて、免疫応答をもたらすかまたは免疫応答を変更し得る（例えば、Ｔ細胞の増殖または活性化を誘導もしくは阻害するかのいずれか）。他の実施形態において、上記の任意のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のいずれか、またはＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方に優先的に結合し得る。他の実施形態において、本明細書中に記載される任意のポリペプチドは、必要に応じて、本明細書中に記載されるようにサイトカイン産生を増強または制限し得る。これらの特徴を有する任意のこのようなポリペプチドをコードするヌクレオチドもまた、本発明の特徴である。
【００５３】
１つの型の実施形態において、本明細書中に記載される任意のポリペプチドは、分泌シグナルまたは局在化シグナル配列（例えば、シグナル配列、オルガネラ標的化配列、膜局在化配列など）をさらに含み得る。本明細書中に記載の任意のポリペプチドは、精製を促進する配列（例えば、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧエピトープなど）、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合など）をさらに含み得る。ポリペプチドは、必要に応じて、Ｎ末端にメチオニンを含む。本明細書中に記載される任意のポリペプチドは、必要に応じて、１つ以上の修飾アミノ酸（例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｙｌａｔｅｄ）アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸など）を含む。本明細書中に記載される任意のポリペプチドは、さらに、融合タンパク質に組込まれ得る（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）配列との融合）。
【００５４】
本発明のポリペプチドを産生するための方法もまた、含まれる。１つのこのような方法は、細胞集団に、コードされるポリペプチドの産生に有効な調節配列に作動可能に連結された本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸を導入する工程、この細胞を培養培地中で培養してポリペプチドを産生する工程、ならびにこのポリペプチドを細胞もしくは培養培地から単離する工程を包含する。別のこのような方法は、細胞集団に、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸を含む組み換え発現ベクターを導入する工程；この発現ベクターを哺乳動物に投与する工程；ならびにこの哺乳動物またはこの哺乳動物の副産物からこのポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００５５】
本発明はまた、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチド（またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは発現ベクター）の有効量を自己免疫障害またはアレルギー障害の処置が必要な被験体に投与することによって、この被験体におけるこれらの障害を処置する方法も含む。種々の実施形態において、自己免疫障害は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、乾癬などであり得る。
【００５６】
本発明はまた、例えば、Ｔ細胞の増殖または活性化を誘導または阻害することのいずれかによってか、本明細書中に記載される少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドおよび／またはＮＣＳＭポリヌクレオチドを細胞集団に投与することによって、被験体中の免疫応答を増強または低減する方法を含む。核酸またはポリペプチドが投与される細胞集団は、インビボ、エキソビボまたはインビトロ（例えば、培養細胞）であり得る。
【００５７】
本発明はまた、ＮＣＳＭポリペプチド（またはそのフラグメント）またはＮＣＳＭポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）を被験体に投与することによって処置可能な障害または医学的状態を処置する方法において、本明細書中に記載されるポリペプチドおよび／または核酸（またはそのフラグメント）の有効量を被験体に投与することを含む改良を含む。ＮＣＳＭポリペプチドおよび／またはＮＣＳＭ核酸（またはこれらのフラグメント（可溶性ＮＣＳＭおよび融合タンパク質およびこれらをコードするベクターを含む））の投与によって処置可能な障害、疾患、または医学的状態は、例えば、慢性疾患、自己免疫障害、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、乾癬、ＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ関連合併症、同種性もしくは異種性の移植片または移植、種々の癌、ウイルス感染および／もしくは細菌感染などであり得るが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチドおよび疾患もしくは障害に特異的な免疫原を被験体に投与する工程を包含する、処置が必要な被験体における疾患または障害の治療的処置または予防的処置の方法もまた含まれ、ここで、ポリペプチドおよび免疫原の合わせた量は、その疾患または障害を予防的または治療的に処置するのに有効である。
【００５９】
なお別の局面において、本発明は、被験体における免疫応答を増強、減少、改変または強化する方法を含み、この方法は、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸配列（必要に応じて、この核酸配列の発現を制御するプロモーター配列に作動可能に連結されている）を含むポリヌクレオチドを被験体に直接投与する工程を包含し、このポリヌクレオチドは、被験体の１つ以上の細胞へのこのポリヌクレオチドの取り込みが生じるのに十分な量で存在し、そして、この核酸配列の十分な発現は、免疫応答を増強、減少または改変するのに有効なポリペプチド量を生じる。
【００６０】
別の局面において、本発明は、被験体中の抗原に特異的なＴ細胞応答を調節または変更する方法を提供し、この方法は、被験体に、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３またはこれらのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、および抗原またはその抗原性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を投与する工程を包含し、ここで、この少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の各々は、Ｔ細胞応答を調節または変更するのに有効な量でこの被験体中で発現される。
【００６１】
本発明はまた、被験体中の免疫応答を調節または変更する方法を包含し、この方法は、被験体の腫瘍細胞に、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３またはこれらのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリペプチド配列を導入する工程を包含し、ここでこのポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現する場合にＴ細胞レセプターと相互作用するかまたはＴ細胞レセプターに結合し、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、被験体中での発現のためにプロモーターに作動可能に連結され、そして発現した場合にＴ細胞応答を調節または変更するのに有効であるのに十分な量で存在する。
【００６２】
さらに、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３またはこれらのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリペプチド配列を含むベクターを含み、ここで、このポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現される場合、Ｔ細胞レセプターと相互作用するかまたはＴ細胞レセプターに結合し、この少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、被験体における発現のためにプロモーターに作動可能に連結され、かつ、発現した場合にＴ細胞応答を調節または変更するのに有効であるのに十分な量で存在する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３またはこれらのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、ならびに抗原またはその抗原性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、ここで、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現した場合に、Ｔ細胞レセプターと相互作用するかまたはＴ細胞レセプターに結合し、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の各々は、被験体中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、そして発現した場合にＴ細胞応答を調節または変更するのに有効であるのに十分な量で存在する。
【００６４】
一般的に、変異、循環的配列組換え（ＲＳＲ）または本明細書中の配列の他の改変によって誘導される核酸およびタンパク質は、本発明の特徴である。同様に、組換え（循環的配列組換えを含む）によって産生されるものは、本発明の特徴である。本明細書中に記載の核酸を用いる変異および組換え方法は、本発明の特徴である。例えば、本発明の１つの方法は、本明細書中に記載される１つ以上の核酸を、１つ以上のさらなる核酸（本明細書中に示される配列を含むが、これらに限定されない）、ＮＣＳＭポリペプチドをコードするさらなる核酸、同時刺激ホモログまたはこれらの部分配列と、組み換える工程を包含する。組み換え工程は、必要に応じて、インビボ、エキソビボ、またはインビトロで実行される。この方法によって産生される組換え核酸、組換え核酸を含む細胞、この方法によって産生される核酸ライブラリー（組換えポリヌクレオチドを含む）、ならびに組換えポリヌクレオチドを含むライブラリーを含む細胞集団もまた、本発明に含まれる。
【００６５】
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３）の３次元構造に基づき、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のアゴニストおよびアンタゴニスト（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を通してシグナル伝達を増強かまたは阻害するかのいずれか）を設計または同定する方法を包含する。
【００６６】
本発明はまた、可溶性ポリペプチドおよびタンパク質（融合ポリペプチドおよびタンパク質を含む）ならびにこのような可溶性ポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸を含む。本発明はまた、治療的処置ならびに／または種々の疾患および状態の予防における治療剤、予防剤、および診断剤としてのこのようなポリペプチドおよびタンパク質の使用を含む。可溶性ポリペプチドおよびタンパク質（ならびにそれらをコードする核酸）として、例えば、本明細書に記載される各ＮＣＳＭの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）アミノ酸配列（例えば、各ＣＴＬＡ−４結合タンパク質およびＣＤ２８結合タンパク質）（またはそれらのフラグメント）および同一物をコードする核酸、ならびに、例えば、融合タンパク質としてＩｇポリペプチド配列（またはそれらのフラグメントもしくは改変体）（および同一物をコードするヌクレオチド配列）と共に上記ＥＣＤの各々またはそれらのフラグメントを含む構築物が挙げられる。
【００６７】
別の局面において、本発明は、配列番号１〜２７２および２８３〜２９３のいずれかから選択される核酸またはタンパク質配列に対応する１つ以上の文字列を含む配列記録を含むデータベースを含むコンピュータまたはコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。本発明はさらに、各々が配列番号１〜２７２および２８３〜２９３のいずれかから選択される核酸またはタンパク質配列に対応する１つ以上の文字列を含む、１つ以上の配列記録を含むデータベースを含むコンピュータまたはコンピュータ読み取り可能媒体を含む統合システムを包含する。この統合システムはさらに、ユーザーが１つ以上の配列記録を選択的に見ることを可能にするユーザー入力インターフェースを備える。データベースに保存された複数の配列記録（この配列記録は各々、配列番号１〜２７２および２８３〜２９３のいずれかに対応する１つ以上の文字列を含む）のうちの少なくとも１つに関する情報を表示するためにコンピュータシステムを使用する方法もまた提供される。
【００６８】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に読めば、より明らかになる。
【００６９】
（発明の詳細な説明）
Ｂ７−１の発現が、哺乳動物（ヒトを含む）における免疫応答の重要なメカニズムであることが示されている。少なくとも２つのシグナルが、抗原保有標的細胞によるＴ細胞の活性化に必要とされると考えられる：１）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して送達される、抗原特異的シグナル；および２）リンホカイン産物の生成に導く抗原依存的シグナルまたは同時刺激シグナル（Ｈｏｄｇｅら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：５５５２−５５５５）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）において代表的に発現されるＢ７−１が、２つのＴ細胞表面抗原レセプター：ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のリガンドであることが決定された。両方のレセプターは、Ｔ細胞に存在するが、それらは異なる時に異なる量で発現される。Ｔ細胞活性化は、全ての特異的免疫応答についての必要条件である。しかし、１つのみのＴ細胞活性化シグナルが、Ｔ細胞により受け入れられる場合、活性化は、発生しない可能性があり、そしてアネルギーを生じ得る。例えば、多くの腫瘍細胞はＢ７−１を発現しない。その結果、腫瘍が潜在的な拒絶抗原を発現する場合でさえ、抗腫瘍Ｔ細胞応答を活性化し得る可能性がない。Ｉｄ。Ｔ細胞活性化および増強された免疫応答に関して、さらなる抗原依存的シグナル（例えば、Ｂ７−１）が、必要であると考えられる。
【００７０】
ヒトＣＤ２８レセプターおよびヒトＣＴＬＡ−４レセプターは、ヒト細胞においてＢ７−１により自然に活性化される。いくつかの研究において、ＷＴ　ｈＢ７−１に対するＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の報告された結合親和性は、それぞれ約０．２〜０．４×１０−６Ｍおよび約４×１０−６Ｍであることが見出された（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｒｗｅら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：３９３；Ｉｋｅｍｉｚｕら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１２：５１）。しかし、異なる研究が、異なる結合親和性を報告している。
【００７１】
全長ＷＴ　ｈＢ７−１のアミノ酸配列は、２８８アミノ酸を含む（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｃｃｅｓｓ．Ｎｏ．Ｐ３３６８１）。このシグナルペプチド（分泌形態では切断される）はアミノ酸残基１〜３４を含み、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はアミノ酸残基３５〜２４２を含み、膜貫通ドメインはアミノ酸残基２４３〜２６３を含み、そして細胞質ドメインはアミノ酸残基２６４〜２８８を含む。ｈＢ７−１の成熟形態（合計２５４アミノ酸を有する）は、アミノ酸残基３５〜２８８を含み（シグナルペプチドを除いた全長配列）、そしてアミノ酸配列：バリン−イソロイシン−ヒスチジン−バリンで始まる。所望の場合、成熟形態のアミノ酸は、Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ配列のＶａｌから番号付けされ、Ｖａｌを第１残基として表示され得る（例えば、アミノ酸残基番号１〜２０８）。別の局面において、上述のように、Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−ＶａｌのＶａｌから番号付けされる場合、ｈＢ７−１のＥＣＤは全長成熟ｈＢ７−１配列のアミノ酸残基１〜２０８を含み、膜貫通ドメインはアミノ酸残基２０９〜２３５を含み、そして細胞質ドメインはアミノ酸残基２３６〜２５４を含む。例えば、ＵＳ　６，０７１，７１６を参照のこと。これらはｈＢ７−１　ＥＣＤにおける８つの可能性のあるグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）である。膜貫通ドメインは、他のポリペプチドに結合することまたは脂質誘導体化に関与し得る少なくとも３つのシステイン残基を含む。Ｉｄ。
【００７２】
１つの研究に従い、ＷＴ　ｈＢ７−１の核酸配列は１４９１塩基対を含み、そしてこれは、米国特許第６，０７１，７１６号に示される（その中の配列番号１を参照のこと）。ｈＢ７−１核酸配列とその対応する全長アミノ酸配列とのアラインメントもまた、米国特許第６，０７１，７１６号に示される（その中の配列番号１を参照のこと）。
【００７３】
ヒトＢ７−１および他の選択された哺乳動物Ｂ７−１分子のヌクレオチド配列を用いて、本発明者らは、ＷＴ　ｈＢ７−１の特性と比較して変更された特性を有する組換えキメラ同時刺激ペプチド分子をコードする組換えヌクレオチドを作製した。この実施形態およびその他は、以下に詳細に記載される。図１は、（ＡＰＣ細胞において発現される）本発明のＮＣＳＭ分子と（Ｔ細胞において発現される）対応するレセプターとの間の相互作用を示す。
【００７４】
（定義）
本明細書中または本明細書中の以下の残りの部分に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語または科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００７５】
「ポリヌクレオチド配列」は、核酸残基またはヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇなど、または天然に存在するかもしくは人工的なヌクレオチドアナログ）のポリマーを含む核酸、または文脈に基づき核酸を表す文字列である。所定の核酸または相補的核酸のいずれかは、任意の特定のポリヌクレオチド配列から決定され得る。
【００７６】
「ポリペプチド配列」は、アミノ酸（アミノ酸残基を含む、タンパク質、ポリペプチドなど）のポリマーまたは文脈に基づきアミノ酸ポリマーを表わす文字列である。遺伝暗号の縮重性が与えられれば、特定のポリペプチド配列をコードする１つ以上の核酸またはそれらの相補的核酸が、このポリペプチド配列から決定され得る。
【００７７】
核酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、または他の成分は、それが通常関連する成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（ネイティブの配列に付随し得る複合体（例えば、ポリメラーゼおよびリボゾーム）を含む）、核酸、細胞、合成試薬、細胞夾雑物、細胞成分など）から（例えば、それが始めに獲得された細胞において通常関連する他の成分から）部分的にまたは完全に分離される場合、「単離」されている。核酸、ポリペプチド、または他の成分は、それがその天然の環境の他の成分から部分的にもしくは完全に回収または分離され、その結果、それが、成分の組成物、混合物、または収集物に存在する有意な種である（すなわち、モル基準で、それが組成物の任意の他の別個の種よりも、より豊富である）場合、単離される。好ましい実施形態では、調製物は、約７０％または約７５％を超える、代表的には約８０％を超える、または好ましくは約９０％を超える単離された種からなる。
【００７８】
１つの局面において、「実質的に純粋」または「単離された」核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、ポリペプチド、タンパク質または組成物はまた、目的の種（例えば、核酸またはポリペプチド）が、存在する全ての高分子種の（モル濃度基準で）少なくとも約５０、６０または７０重量％を含む場合も意味する。実質的に純粋であるかまたは単離された組成物はまた、この組成物に存在する全ての高分子種の少なくとも約８０、９０または９５重量％を含み得る。単離された目的の種はまた、本質的な均質性（夾雑物種は、組成物において、従来の検出方法により検出され得ない）まで精製され得、ここで、この組成物は単一の高分子種の誘導体から本質的に構成される。用語「精製された」は、一般的に、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることをいう。このことは、代表的に、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、少なくとも約５０％純粋、約６０％純粋、約７０％純粋、約７５％純粋であり、より好ましくは少なくとも約８５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋であることを意味する。
【００７９】
用語「単離された核酸」は、本発明の核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中において直接隣接する（すなわち、５’末端のものおよび３’末端の）両方のコード配列と直接隣接しない、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をいい得る。従って、この用語は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントを含む。このようなｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントは、ベクターに組み込まれるか、それが本来由来する生物（例えば、ウイルスを含む）と同じ種もしくは異なる種のゲノムに組込まれるか、さらなるコード配列に連結されてキメラポリペプチドをコードするハイブリット遺伝子を形成するか、あるいは任意の他のＤＮＡ配列から独立している。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖、センスまたはアンチセンスであり得る。
【００８０】
用語「組換え」は、例えば、細胞、ヌクレオチド、ベクター、タンパク質、またはポリペプチドに関して用いられる場合、代表的に、細胞、ヌクレオチドもしくはベクターが、異種（もしくは外来の）核酸の導入またはネイティブの核酸の変更により改変されているか、あるいはタンパク質またはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入により改変されているか、あるいは細胞がこのように改変された細胞に由来することを示す。組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）の形態において見出されない核酸配列（例えば、遺伝子）を発現するか、または低発現で異常に発現されるもしくは全く発現されないネイティブの核酸配列（例えば、遺伝子）を発現する。用語「組換え」は、細胞に関して用いられる場合、細胞が異種核酸を複製するか、異種核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内では見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、人為的手段により改変され、そして細胞に再導入された、ネイティブ形態の細胞で見出される遺伝子を含み得る。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された、この細胞に内因的な核酸を含む細胞を包含し；このような改変として、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技術により獲得された改変が挙げられる。
【００８１】
「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」は、天然に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、それぞれ、１つより多い供給源となる核酸またはポリペプチド由来の核酸またはアミノ酸配列を含み、この供給源となる核酸またはポリペプチドは、天然に存在する核酸またはポリペプチドであり得るか、供給源自体が、変異誘発もしくは他の改変に供され得る。核酸またはポリペプチドは、それが人工的であるかもしくは操作されている場合、または人工的であるかもしくは操作されたポリペプチドもしくは核酸に由来する場合、「組換え体」とみなされ得る。組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、代表的には一緒に含まれない配列、代表的には互いに関連しない配列、またはそうでなければ代表的に互いに分離されている配列の少なくとも２つのセグメントの組み合わせ（例えば、人工的な組み合わせ）により作製され得る。組換え核酸は、異なる供給源由来の核酸セグメントをひとつに連結するかもしくは組み合わることにより生成される核酸分子および／または人為的に合成された核酸分子を含み得る。「組換えポリペプチド」（または「組換えタンパク質」）は、しばしば、クローン化されたかまたは組換えの核酸または遺伝子から生じるポリペプチド（またはタンパク質）をいう。異なる核酸またはアミノ酸配列が獲得される供給源となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、時々、同質であり（すなわち、同一または類似の構造および／または機能をコードするポリペプチドを有するか、またはコードする）、そしてしばしば、生物の異なる単離体、血清型、菌株、種由来であるかまたは例えば、異なる疾患状態由来である。
【００８２】
用語「組換え的に産生される」とは、以下のいずれかによって通常達成される人工の組合せをいう：化学合成手段、核酸セグメントの循環的配列組換え、もしくはヌクレオチドの他の多様な生成方法（例えば、シャッフリングなど）、または核酸の単離されたセグメントの例えば、当業者に公知の遺伝子操作技術による操作。「組換え的に発現される」とは、代表的に、インビトロでの組換え核酸の産生、およびインビボ、インビトロ、もしくはエキソビボ（ここで、組換え核酸は発現され得るかもしくは増殖され得る）での組換え核酸の細胞への移行のための技術をいう。
【００８３】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、このような配列と適合性である宿主において構造遺伝子の発現をもたらし得る核酸エレメントを有する、組換え的にかまたは合成的に作製された核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび必要に応じて転写終結シグナルを含む。代表的には組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現をもたらすのに必要なまたは役立つさらなる要素もまた、本明細書中に記載されるように用いられ得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞からの、発現されたタンパク質の分泌を導くシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた、発現カセットに含まれ得る。
【００８４】
「免疫原」とは、免疫応答を惹起し得る物質のことをいう。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己抗原（これは、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす）、および癌細胞において発現される腫瘍関連抗原が挙げられる。免疫応答とは一般に、抗原（例えば、抗原もしくはそのフラグメントまたはこのような因子をコードする核酸）に対する細胞性応答または抗原媒介応答の発達をいう。いくつかの例では、このような応答は、目的の抗原を発現する抗原提示細胞に特異的に指向される、ＣＴＬ、Ｂ細胞または種々のクラスのＴ細胞のうちの少なくとも１つまたはそれらの組合せの産生を含む。
【００８５】
「寛容」とは、免疫学的応答性の減少または欠如の状態をいう。寛容は代表的に、通常は例えば、非免疫状態下での被験体と標的抗原との接触の結果として、被験体が、所定の抗原に対して免疫応答を開始する能力の非存在または減少もしくは低下を規定する。
【００８６】
「アネルギー」とは、１以上の抗原に対する反応性が減少した状態をいう。例えば、アネルギー状態はしばしば、特異的Ｔ細胞が、他の場合には刺激的な条件下で再刺激された場合のＴ細胞応答の減少（例えば、増殖またはＩＬ−２産生）によって特徴付けられる。
【００８７】
「抗原」とは、宿主における抗体の形成を惹起し得るか、またはこの物質と反応性の特異的リンパ球集団を作製し得る物質をいう。抗原は、代表的には、宿主に対して外来の高分子（例えば、タンパク質およびポリサッカリド）である。
【００８８】
「部分配列」もしくは「フラグメント」は、完全な配列までおよび完全な配列を含む、配列の全体の任意の部分である。従って、「部分配列」とは、それぞれ核酸（例えば、ポリヌクレオチド）またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の、より長い配列の一部を含む、核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００８９】
「アジュバント」とは、抗原の免疫刺激特異性を増強するかまたは薬物の薬理効果を増強する物質をいう。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し得る。例えば、「フロイント完全アジュバント」は、免疫原、乳化剤およびマイコバクテリアを含む、油および水の乳濁物である。別の例の「フロイント不完全アジュバント」は、マイコバクテリアを含まないこと以外は同じである。
【００９０】
所定のアミノ酸ポリマーまたはヌクレオチドポリマーの番号付けは、任意の所定のポリマー成分（例えば、アミノ酸残基、ヌクレオチド残基）の位置が、所定のポリマーにおけるこの成分の実際の位置によってというよりは、この選択されたアミノ酸ポリマーまたはヌクレオチドポリマーにおける同じまたは等価な残基の位置を参照して示される場合、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの「番号付けに対応する」。従って、例えば、所定のポリペプチド配列における所定のアミノ酸位置の番号付けは、参照配列として用いられる選択されたポリペプチド配列における同じまたは等価なアミノ酸の位置に対応する。
【００９１】
ベクターは、選択された核酸による細胞の形質導入もしくはトランスフェクション、または細胞中の核酸の発現を容易にするための成分または組成物である。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣ、細菌、ポリリジンなどが挙げられる。「発現ベクター」は、組換え的にまたは合成的に作製され、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、核酸構築物または核酸配列である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。発現ベクターは、代表的には、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。転写されるべき核酸は代表的に、プロモーターの指示下または制御下にある。
【００９２】
「ポリヌクレオチド配列の実質的に全体の長さ」または「ポリペプチド配列の実質的に全体の長さ」とは、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の長さ少なくとも約５０％、一般に少なくとも約６０％、約７０％、または約７５％、通常少なくとも約８０％、または代表的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくはより多くをいう。
【００９３】
物に対して適用される場合、「天然に存在する」とは、この物が、人間によって人工的に作製された物とは別個に天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然で供給源から単離され得、かつ人間によって実験室で意図的には改変されていない、生物（ウイルス、細菌、原生動物、昆虫、植物または哺乳動物組織を含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。物に適用される場合、天然に存在しないとは、その物が天然に存在しない（すなわち、その物が、人間によって人工的に製造された物と別個には天然に見出され得ない）ことを意味する。
【００９４】
用語「免疫アッセイ」は、抗原に結合するまたは特異的に結合する抗体または免疫原を用いるアッセイを包含する。免疫アッセイは、代表的には、特定の抗体の特異的結合特性を使用して、抗原を単離、標的化、および／または定量することにより特徴付けられる。
【００９５】
用語「相同性」とは、一般に、２つ以上の構造体間の類似性の程度をいう。用語「相同配列」とは、類似の単量体順序を有する高分子中の領域をいう。核酸配列に関して用いられる場合、用語「相同性」とは、２つ以上の核酸配列（例えば、遺伝子）またはそれらのフラグメント間の類似性の程度をいう。代表的には、２つ以上の核酸配列の間の類似性の程度とは、２つ以上の核酸配列の２つのヌクレオチド塩基（または他の遺伝子型特徴）の組成、順序、または配置の類似性の程度をいう。用語「相同核酸」とは、一般に、ヌクレオチド塩基の組成、配置、または順序においてある程度の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸をいう。２つ以上の核酸は、同じかまたは異なる種または群の核酸であり得る。用語「相同性％」とは、核酸配列に関して用いられる場合、一般に、２つ以上の核酸のヌクレオチド配列間の類似性の％の程度をいう。
【００９６】
ポリペプチド（またはタンパク質）配列に関して用いられる場合、用語「相同性」とは、２つ以上のポリペプチド（またはタンパク質）配列（例えば、遺伝子）またはそれらのフラグメント間の類似性の程度をいう。代表的には、２つ以上のポリペプチド（またはタンパク質）配列間の類似性の程度とは、２つ以上のポリペプチド（またはタンパク質）の２つ以上のアミノ酸の組成、順序、または配置の類似性の程度をいう。２つ以上のポリペプチド（またはタンパク質）は、同じかまたは異なる種または群のポリペプチド（またはタンパク質）であり得る。用語「相同性％」とは、ポリペプチド（またはタンパク質）配列に関して用いられる場合、一般に、２つ以上のポリペプチド（またはタンパク質）配列のアミノ酸配列間の類似性の％の程度をいう。用語「相同ポリペプチド」または「相同タンパク質」とは、一般に、類似するアミノ酸配列および機能を有する、それぞれ、ポリペプチドまたはタンパク質のことをいう。このような相同ポリペプチドまたは相同タンパク質は、類似するアミノ酸配列および機能を有することにより関連付けられ得るが、本明細書中に記載される技術を用いて、異なる種または同じ種から誘導または進化される。
【００９７】
用語「被験体」は、本明細書中で用いられる場合、以下の生物を含むがこれらに限定されない；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、オランウータン、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、または他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物脊椎動物（例えば、鳥類（例えば、ニワトリもしくはアヒル）またはサカナ）および非哺乳動物無脊椎動物を含む）。
【００９８】
用語「薬学的組成物」は、動物またはヒトを含む被験体における薬学的使用に適する組成物を意味する。薬学的組成物は、一般に、有効量の活性薬剤およびキャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリアを含む）を含む。
【００９９】
用語「有効量」は、所望の結果を生じるのに十分な投薬量または量を意味する。所望の結果は、その投薬量または量のレシピエントにおける客観的改善または主観的改善を含み得る。
【０１００】
「予防的処置」は、疾患、病状、または医学的障害の発症の危険性を減少、予防、または低下させる目的で処置が施されるような、疾患、病状、もしくは医学的障害の徴候もしくは症候を示さないか、または疾患、病状、もしくは障害の初期徴候もしくは初期症候のみを示す被験体に施される処置である。予防的処置は、疾患または障害に対する予防的処置として機能する。「予防的活性」は、病状の徴候も症状も示さないか、疾患も障害も示さないか、または病状、疾患もしくは障害の初期徴候もしくは初期症状のみを示す被験体に投与される場合、被験体が病状、疾患または障害を発症する危険性を減少、予防、または低下させる、薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組成物）の活性である。「予防的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸またはポリペプチド）とは、病状、疾患または障害の発症を減少、予防、処置、または低下させる際に有用である薬剤または化合物をいう。
【０１０１】
「治療的処置」は、病状、疾患または障害の症状または徴候を示す被験体に施される処置であり、ここで、処置は、病状、疾患または障害のこれらの徴候または症候を減少または排除することを目的としてこの被験体に行われる。「治療的活性」は、このような徴候または症状に罹っている被験体に投与される場合に、病状、疾患または障害の徴候または症状を排除または減少させる、薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質またはそれらの組成物）の活性である。「治療的に有用な」薬剤または化合物（例えば、核酸またはポリペプチド）は、薬剤または化合物が、病状、疾患または障害のこのような徴候または症状を減少、処置または排除する際に有用であることを示す。
【０１０２】
用語「遺伝子」とは、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントを、広範にいう。遺伝子は、これらの発現のために必要とされるコード配列および／または調節配列を含む。遺伝子はまた、（例えば、認識配列を形成する）発現されないＤＮＡ核酸セグメント（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは他の調節領域）を含む。遺伝子は、目的の供給源からのクローニングまたは既知もしくは予想される配列情報からの合成を含めて、種々の供給源から入手され得、そして所望のパラメーターを有するよう設計された配列を含み得る。
【０１０３】
一般に、本明細書中で以後使用される命名法および以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、およびタンパク質化学における実験手順は、周知の手順であり、そして当業者によって通常使用される。標準的技術（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版），第１−３巻，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９（本明細書では以後、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁会社（１９９４，１９９９を通しての補遺）（本明細書では以後、「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載される）は、組換え核酸方法、核酸合成、細胞培養方法、および導入遺伝子組み込み（例えば、エレクトロポレーション、注入、遺伝子銃、皮膚を通した圧刻（ｉｍｐｒｅｓｓｉｎｇ）、およびリポフェクション）に使用する。一般に、オリゴヌクレオチドの合成および精製の工程は、明細書に従って実施される。これらの技術および手順は、一般に、当該分野の従来の方法および種々の一般的な参考文献（これらは、この書類の全体を通して提供される）に従って実施される。それらの中の手順は、当業者に周知であると考えられ、そして読者の利便性のための提供される。
【０１０４】
本明細書中で用いられる場合、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にまたは部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質をいう。用語抗体は、抗体全体およびその結合フラグメントを意味するために用いられる。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、次いで、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。代表的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造単位としては、テトラマーが挙げられる。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【０１０５】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとしてか、または種々のペプチダーゼを用いる消化により産生される、多数の十分に特徴付けされたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で消化して、Ｆ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、それ自身がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に連結した軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド連結を破壊し、それによりＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体へと変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである。抗体分子のＦｃ部分は、免疫グロブリン重鎖の定常領域に大部分に対応し、そして抗体エフェクター機能を担う（他の抗体フラグメントのより詳細な記載については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、このようなＦａｂ’フラグメントが、化学的にかまたは組換えＤＮＡ方法論を利用することによるかのいずれかで、新規に合成され得ることを理解する。従って、用語抗体はまた、本明細書中で用いられる場合、完全な抗体の改変により生成されるか、または組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成されるかのいずれかの抗体フラグメントを含む。
【０１０６】
抗体としてはまた、単一アーム複合モノクローナル抗体、単鎖抗体（可変重鎖および可変軽鎖が（直接的にまたはペプチドリンカーを通して）一緒に連結されて連続したポリペプチドを形成する、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体を含む）、ならびにダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ））が挙げられる（Ｐａｃｋら（１９９５）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２４６：２８；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１１：１２７１；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：１５７９）。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントなどである。
【０１０７】
用語「エピトープ」は、抗体に対して特異的に結合し得るタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、分子の化学的に活性な表面グループ化（例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなっており、そして通常、特異的な三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。コンホメーションエピトープと非コンホメーションエピトープとは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合はそうではないという点で区別される。
【０１０８】
抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原を結合する抗体のペプチドまたはポリペプチドフラグメントである。抗原結合部位は、抗体のうちの、抗原の結合に寄与するか、関与するか、または影響を与えるアミノ酸により形成される。Ｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ａ．およびＭｅｒｃｅｒ，Ｅ．Ｉ．，Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ，第３版，１９９７）、およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ（第２版，１９９２）［本明細書では以下、「Ｗａｔｓｏｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ」］を参照のこと。これらの各々は、全ての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１０９】
用語「スクリーニング」は、一般的に、本発明の最適な分子（例えば、ＮＣＳＭポリペプチドならびにそのタンパク質、フラグメントおよびホモログ、ならびにこれらを含む、関連する融合ポリペプチドおよびタンパク質、全てのこのような分子をコードする核酸など）を同定するプロセスを記載する。以下を含むこれらのそれぞれの分子のいくつかの特性は、選択およびスクリーニングにおいて用いられ得る：例えば、それぞれの分子がレセプターに結合する能力、それぞれの分子が、試験システムまたはインビトロ適用、エキソビボ適用もしくはインビボ適用において免疫応答を変更する能力（例えば、所望の免疫応答を誘導もしくは阻害する能力）（例えば、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３の補助刺激に関連したＴ細胞増殖応答を（例えば、抗原もしくは抗ＣＤ３抗体によって）誘導もしくは阻害する能力）、あるいはコントロール分子の第一レセプター／第二レセプター結合親和性比と比較して、それぞれの分子の第一レセプター／第二のレセプター結合親和性比（またはその逆）によって測定した場合、第一および第二のレセプターへのコントロール分子（例えば、野生型Ｂ７−１または補助刺激分子）の結合親和性と比較して、第二のレセプターに対して第一のレセプターと等しい、より大きいもしくはより小さい結合親和性で結合する。抗原の場合、抗原のいくつかの特性は、抗原の発現、折り畳み、安定性、免疫原性およびいくつかの関連抗原由来のエピトープの存在を含む、選択およびスクリーニングにおいて用いられ得る。選択は、選択マーカー（これは、いくつかの遺伝的環境では、マーカーを発現する細胞が生存し、一方、他の細胞は殺傷される（またはその逆である）ことを可能にする）の発現によって同定および物理的分離が同時に達成される、スクリーニングのうちの一形態である。スクリーニングマーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質などが挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子などが挙げられる。一次免疫応答の研究における制限のために、インビトロ、インビボまたはエキソビボにおける研究は、特に有用なスクリーニング法である。これらの研究において、１以上のそれぞれのＮＣＳＭポリペプチドをコードする配列を含む遺伝子ワクチンまたは発現ベクターは、まず試験動物に導入され、続いて免疫応答が、防御免疫応答を分析することによってか、または免疫された動物に由来するリンパ系細胞を用いて、誘導された免疫応答の質もしくは強度を研究することによって研究される。あるいは、ＮＣＳＭポリペプチド自体またはそれらの可溶性形態（例えば、単独または融合タンパク質中の、このポリペプチドまたはそれらのフラグメントのＥＣＤ）は、試験動物に導入される。自然選択が、自然進化の過程で生じ得、そして生じているが、本方法において選択は、人によって行われる。
【０１１０】
２つの分子（例えば、リガンドおよびレセプター）の間の「特異的結合親和性」は、分子の混合物中での、別の分子への１つの分子の優先的結合を意味する。この分子の結合は代表的に、結合親和性が約１×１０２Ｍ−ｌ〜約１×１０７Ｍ−ｌ（すなわち、約１０−２〜１０−７Ｍ）であるかまたはそれより大きいのであれば、特異的と考えられる。
【０１１１】
「結合親和性比」とは、第一の分子（例えば、ＣＤ２８レセプターのような第一レセプター）への目的の分子（例えば、ＮＳＣＭポリペプチドのような組換えリガンド）の結合親和性の、第二の分子（例えば、ＣＴＬＡ−４レセプターのような第二レセプター）に対する、目的の同じ分子の結合親和性に対する、相対比をいう。１つの局面では、相対結合親和性比は、目視検査によって（例えば、両方のレセプターに対する目的の分子の結合親和性プロフィールを提示するＦＡＣＳ結合プロフィールを調べ、そして第一レセプターおよび第二レセプターの各々への目的の分子の相対結合の程度を評価することによって）決定され得る。この決定の結果は、両方のレセプターへのコントロール分子（例えば、ＷＴのヒト、霊長類または哺乳動物のＢ７−１のような野生型リガンド）の結合親和性を提示するＦＡＣＳ結合親和性プロフィールの類似の検査および評価を用いて比較され得、ここで、各々のレセプターに対するコントロール分子の相対的結合の程度が評価される。以下に記載されるこれらの手順および他の手順を用いて、本発明のＣＤ２８ＢＰポリペプチドについてのＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比および本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドについてのＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を決定し得る。あるいは、結合親和性比は、第一レセプターについての目的の分子（例えば、リガンド）の結合親和性の定量的尺度と、第二レセプターについての目的の分子の結合親和性の定量的尺度との間の比を、結合親和性を測定するための公知の手順を用いて作成することによって決定され得る。例えば、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターの各々についてヒト（または他の哺乳動物）のＢ７−１の結合親和性を測定するための公知の方法が用いられ得る。
【０１１２】
「外因性」核酸、「外因性ＤＮＡセグメント」、「異種配列」、または「異種核酸」は、本明細書中で用いられる場合、特定の宿主細胞に対して外来である供給源に由来するものであるか、または同じ供給源に由来する場合、元々の形態から改変されているものである。従って、宿主細胞中の異種遺伝子としては、特定の宿主細胞に対して内因性であるが改変されている遺伝子が挙げられる。本明細書中に記載される適用における異種配列の改変は代表的に、循環配列組換えを使用を通して生じる。この用語は、この細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメント、またはこの細胞に対して相同であるが宿主細胞の核酸中のこのエレメントが通常は見られない位置にある、ＤＮＡセグメントをいう。外因性ＤＮＡセグメントが発現されて、外因性ポリペプチドが得られる。
【０１１３】
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体のことをいう。特に制限しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有しかつ天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。そうではないと示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補的配列ならびに明白に示された配列を暗に包含する。詳細には、縮重コドン置換体は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１−９８）。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【０１１４】
「遺伝子由来の核酸」とは、核酸であって、その遺伝子、またはその部分配列の合成のために、テンプレートとして最終的に働く遺伝子をいう。従って、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、その増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡ、などは、全てが遺伝子に由来するものであり、そしてこのような誘導産物の検出は、サンプル中のもとの遺伝子、および／または遺伝子転写物の存在、および／または量を示す。
【０１１５】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合、「作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を増大する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が、代表的には、隣接しており、そして２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、隣接しかつリーディングフレームであることを意味する。しかし、エンハンサーは一般に、数キロベースまでプロモーターから離れており、そしてイントロン配列が可変である場合に、機能するので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結され得るが連続ではない。
【０１１６】
用語「サイトカイン」は、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血成長因子、腫瘍壊死因子、およびトランスフォーミング成長因子を含む。概して、免疫系の細胞の成熟、活性化、増殖、および分化を調節する低分子量タンパク質が存在する。
【０１１７】
種々のさらなる用語は規定されているか、さもなければ本明細書において特徴づけられている。
【０１１８】
（本発明のポリヌクレオチド）
（ＮＣＳＭポリヌクレオチド配列）
本発明は、ＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントの単離物または組み換え体、ならびにこのようなポリペプチドおよびそのフラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドを提供する。用語「ＮＣＳＭポリヌクレオチド」は、他に注記しない限り、本明細書において詳細に開示しているポリヌクレオチド配列の核酸フラグメント、ホモログ、および改変体を含むことを全体を通して意図する。
【０１１９】
１つの局面において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、以下に記載のＤＮＡ組み換え法およびＤＮＡ組み換え様式を用いて２ラウンドのリクルーシブ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）配列組み換えで作製した。このラウンドの前の準備として、例えば、霊長類（アカゲザル、ヒヒ、およびオランウータン）、ウシ、ネコ、およびウサギのＢ７−１関連配列をコードするｃＤＮＡを、それらの各々の種の細胞株か末梢血のいずれかからクローニングした。ヒヒＢ７−１およびオランウータンＢ７−１をコードする本発明のｃＤＮＡは、以前には未知のＷＴのＢ７−１ポリヌクレオチドの例である。ヒヒおよびオランウータンＢ７−１は、ｈＢ７の特性と類似の、ＣＤ２８結合特性およびＣＴＬＡ−４結合特性、ならびにＴ細胞増殖特性を有する（データ示さず）。ヒヒＢ７−１をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４６）およびオランウータンＢ７−１をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４７）、対応するヒヒＢ７−１ポリペプチド（配列番号９３）およびオランウータンＢ７−１ポリペプチド（配列番号９４）、ならびにそれらのホモログ（相同体）、フラグメント（例えば、ＥＣＤ）、融合タンパク質は、本発明の局面である。
【０１２０】
１ラウンド目で、ヒト、霊長類、ウシ、ネコ、およびウサギのＢ７−１をコードするｃＤＮＡをリクルーシブに組み換えて、２つ以上の組み換えポリヌクレオチドを含むライブラリーを形成する。組み換えポリヌクレオチド（ＮＣＳＭポリヌクレオチドを含む）のライブラリーを得るため、および／またはリクルーシブ配列組み換えのための基質として用いた核酸において多様性を得るための他の方法はまた、下に記載している。１ラウンド目のライブラリーを、３つの方法によって最初にスクリーニングした。最初のスクリーニングで、可溶性ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプター融合タンパク質に対して優先的に結合する能力に基づいて、プールした組み換えクローンを分別した。第二のスクリーニングによって、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のいずれかに結合する能力に基づいて個々のクローンを選択した。第三のスクリーニングによって、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３の同時刺激と組み合わせてＴ細胞増殖を誘導または阻害する能力に基づいて、第二のスクリーニング由来の個々のクローンを試験した（例えば、抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）。１ラウンド目からの代表的なＮＣＳＭ核酸であって、ＣＴＬＡ−４と比較したＣＤ２８に対するＷＴ　ｈＢ７−１の結合と比べて、ＣＴＬＡ−４と比較した、ＣＤ２８に対する優先的結合または類似の結合を有するＮＣＳＭポリペプチド（ＣＤ２８結合タンパク質（「ＣＤ２８ＢＰ」）と命名された）をコードするか、か、および／または（例えば、（例えば、抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）Ｔ細胞レセプターの刺激と組み合わせて）Ｔ細胞レセプター同時結合によりＴ細胞の増殖を誘導する能力を有する、ＮＣＳＭポリペプチドをコードする、ＮＣＳＭ核酸、を配列番号１〜４に示す。この核酸配列は、配列番号４８〜５１として本明細書に同定されるＮＣＳＭポリペプチドをコードする。１ラウンド目由来の代表的ＮＣＳＭ核酸であって、ＣＤ２８と比較したＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　ｈＢ７−１の結合と比べて、ＣＤ２８と比較した、ＣＴＬＡ−４に対する優先的結合または類似の結合を有するＮＣＳＭポリペプチド（ＣＴＬＡ−４結合タンパク質（「ＣＴＬＡ−４ＢＰ」）と命名された）をコードするか、および／または（例えば、（例えば）抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）Ｔ細胞レセプターの刺激と組み合わせて）Ｔ細胞レセプター同時結合によりＴ細胞の増殖を阻害する能力を有する、ＮＣＳＭポリペプチドをコードする、ＮＣＳＭ核酸を配列番号２２〜２６に示す。この核酸配列は、配列番号６９〜７３として本明細書に同定されるＮＣＳＭポリペプチドをコードする。
【０１２１】
１ラウンド目由来の代表的クローンを、２ラウンド目でさらに組み換え、組み換えポリヌクレオチドライブラリーを形成した。２ラウンド目で生成したポリヌクレオチドクローンに対して１ラウンド目と同様のスクリーニングを行った。代表的なリクルーシブに組み換えしたＮＳＣＭ核酸であって、ＣＴＬＡ−４と比較してＣＤ２８に対するＷＴ　ｈＢ７−１の結合と比べて、ＣＴＬＡ−４と比較して、ＣＤ２８に対する優先的結合または類似の結合を有するＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＣＤ２８ＢＰポリペプチド）をコードするか、および／またはＴ細胞レセプターの刺激と組み合わせてＴ細胞の増殖を誘導する能力を有する、ＮＣＳＭポリペプチドをコードする、ＮＣＳＭ核酸（配列番号５〜２１および配列番号９５〜１４２）は、配列番号５２〜６８、配列番号１７４〜２２１として本明細書に同定されるＮＣＳＭポリペプチドをコードする。同定されたさらなる同定された組み換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、配列番号２８３〜２８５、および配列番号２８９〜２９３を含む。
【０１２２】
２ラウンド目由来の代表的な核酸であって、ＣＤ２８と比較したＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　ｈＢ７−１の結合と比べて、ＣＤ２８と比較した、ＣＴＬＡ−４に対する優先的結合を有するＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド）をコードするか、および／またはＴ細胞レセプターの刺激と組み合わせてＴ細胞の増殖を阻害する能力を有する、ＮＣＳＭポリペプチドをコードする、ＮＣＳＭ核酸を配列番号２７〜４５、および配列番号１４３〜２６２に記載する。この核酸配列は、配列番号７４〜９２、および配列番号２２２〜２５２、および配列番号２６３〜２７２として本明細書に同定されるＮＣＳＭポリペプチドをコードする。同定されたさらなる組み換えＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、配列番号２８６〜２８８を含む。
【０１２３】
用語、「優先的な結合（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、本発明のＮＣＳＭポリペプチドが、ＣＤ２８レセプター、および／またはＣＴＬＡ−４レセプターに結合するかまたは特異的に結合する能力に関して、代表的には、これらの２つのレセプターの１つまたは両方に結合する（かまたは他に比べてこのようなレセプターの１つに結合する）ＷＴ　Ｂ７−１（例えば、ヒト、霊長類、または哺乳動物のＢ７−１）の能力に比べて、これらの２つのレセプターの１つまたは両方に結合する（かまたは他に比べてこのようなレセプターの１つに結合する）ＮＣＳＭポリペプチドの優先的な能力をいう。レセプターに対するリガンドの優先的結合とは、代表的に、レセプターに対するコントロール分子の結合に比べて、レセプターに対するリガンドの結合が大きいか、強化されているか、または改善されていることをいう。
【０１２４】
ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する各ＣＤ２８ＢＰポリペプチドの相対的な結合親和性の比を決定し、そしてＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比として規定した。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　ｈＢ７−１の相対的結合親和性の比をまた、比較のために決定した。ＣＤ２８ＢＰポリペプチドのＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と少なくともほぼ等しいかまたはそれよりも大きいことがそれぞれ見出された。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する各ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドの相対的結合親和性の比（すなわち、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比）も決定した。ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の各々についてのＷＴ　ｈＢ７−１の相対的結合親和性の比も決定した。ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドのＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性と少なくともほぼ等しいかまたはそれより大きいことがそれぞれ見出された。
【０１２５】
特定のサイトカインの産生を検出するためのアッセイをまた、下記に詳細に記載するように実施して、本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードする本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドを同定した。
【０１２６】
クローニングしたＷＴウシＢ７−１ポリペプチド（配列番号２８０）およびＷＴウサギＢ７−１ポリペプチド（配列番号２８１）をまた、本明細書に記載の結合アッセイおよびＴ細胞機能的アッセイにおいて使用した。ウシＢ７−１ポリペプチドおよびウサギＢ７−１ポリペプチドの両方ともヒトＴ細胞においてＴ細胞応答を誘導した。ＷＴウシＢ７−１ポリペプチドの相対的ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１の比よりも有意に大きいことが見出された。ＷＴウサギＢ７−１ポリペプチドの相対的ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１の比よりも大きいことが見出された（データ示さず）。
【０１２７】
本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドは主に、上記および下記した、細胞ベースの増殖アッセイ、レセプター結合アッセイ、およびサイトカイン産生アッセイを用いて同定された。別の検出手段に依存する他のアッセイも等しく適切である。例えば、レセプター結合による他の視覚的マーカーの導入を都合よく使用し得る。同様に、レセプターに対する直接結合（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅプラズモン共鳴による）が利用され得る。当該分野で周知であり、そしてＢ７−１分子の分析のために用いた他の特定のサイトカインアッセイがまた、使用され得る。
【０１２８】
可溶性ＮＣＳＭペプチド構築物（例えば、ＮＣＳＭポリペプチドの細胞外ドメイン、またはそのフラグメントもしくは部分配列を含む）をまた、単独でか、または免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチド配列と融合して、作製し、そしてレセプター結合、免疫応答を増強または減少する（例えば、Ｔ細胞増殖および／または活性化を阻害または増強する）能力、および特定のサイトカインを産生するかまたはそのレベルを変更もしくは増大する能力について分析した。これらの可溶性ＮＣＳＭペプチド構築物についてのヌクレオチドコード配列を決定した。以下に詳細に記載するように、このような可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、種々の治療、予防、および／または診断の適用および方法に有用である。
【０１２９】
ＮＣＳＭポリペプチドをコードする本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドは、以下に詳細に考察する種々の適用において有用である。例えば、ＮＣＳＭポリヌクレオチドは、遺伝子治療、ＤＮＡワクチン接種、および免疫療法に有用な発現ベクターに組み込まれ得る。ＮＣＳＭポリペプチドをコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドを含むこのようなベクターは、臨床および医療適用において有用であり、ここではその特定の抗原に遭遇したＴ細胞の特定の増殖／活性化、または抗増殖／不活性化を提供することが所望され得る。本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドを含むこのようなベクターはまた、耐性を破壊または回避するように設計した適用（例えば、ワクチンアジュバント、悪性疾患の処置、および慢性感染性疾患の処置）において（ここでは、強化された免疫応答が所望され得る）、または耐性を誘導するように設計した適用（例えば、自己免疫、重篤なアレルギー／喘息、および器官移植）において（ここでは、免疫反応の低下が所望され得る）、有用である。
【０１３０】
（ＣＤ２８ＢＰ　ポリヌクレオチド）
本発明は、ＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントをコードする核酸を提供する。ここでこのようなポリペプチドおよびそのフラグメントは、ＣＤ２８レセプターまたはＣＴＬＡ−４レセプターのいずれかまたは両方に結合する。分子の結合は、一般に、その結合親和性が約１×１０２Ｍ−１〜約１×１０７Ｍ−１（すなわち、約１０−２〜約１０−７Ｍ）以上である場合に特異的であるとみなされ得る。「ＣＤ２８結合タンパク質」または「ＣＤ２８結合ポリペプチド」（「ＣＤ２８ＢＰ」）とは、一般にＣＤ２８レセプターに結合するかまたは会合するタンパク質もしくはポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは部分配列（例えば、ＥＣＤまたはｔｒｕｎＥＣＤなど）をいう。「ＣＴＬＡ−４結合タンパク質」または「ＣＴＬＡ−４結合ポリペプチド」（「ＣＴＬＡ−４ＢＰ」）とは、一般にＣＴＬＡ−４レセプターに結合するかまたはＣＴＬＡ−４レセプターと会合するタンパク質もしくはポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは部分配列（例えば、ＥＣＤまたはｔｒｕｎＥＣＤなど）をいう。ＣＤ２８ＢＰポリヌクレオチドは、ＣＤ２８ＢＰアミノ酸配列をコードする核酸配列である。ＣＴＬＡ−４ＢＰポリヌクレオチドは、ＣＴＬＡ−４ＢＰアミノ酸配列をコードする核酸配列である。
【０１３１】
１つの局面において、本発明は、以下：（ａ）配列番号１〜２１および配列番号９５〜１４２から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４８〜６８、配列番号１７４〜２２１、配列番号２８３〜２８５、および配列番号２９０〜２９３から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的ポリヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の全てまたはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列（ここでこのフラグメントは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性と等しいか、またはそれより大きいＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有するポリペプチドをコードする）；から選択されるポリヌクレオチド配列をそれぞれ含む単離核酸または組み換え核酸を提供する。
【０１３２】
別の局面において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ含む単離された核酸または組み換え核酸を提供する。ここでこのコードされたポリペプチドは、以下：（ａ）配列番号４８〜６８、配列番号１７４〜２２１、配列番号２８３〜２８５、および配列番号２９０〜２９３のいずれか１つの少なくとも約１００連続するアミノ酸残基にわたって実質的に同一であり、そして（ｂ）天然に存在しない配列であるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、このコードされたポリペプチドは、配列番号４８〜６８、配列番号１７４〜２２１、配列番号２８３〜２８５、および配列番号２９０〜２９３のいずれか１つの少なくとも約１５０連続するアミノ酸残基にわたって実質的に同一である。
【０１３３】
なお別の局面において、本発明は、配列番号４８〜６８、配列番号１７４〜２２１、配列番号２８３〜２８５、および配列番号２９０〜２９３のいずれかに記載されたアミノ酸配列、またはその部分配列（ここでこの部分配列は、少なくとも１つのシグナル配列、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、およびこのポリペプチドの細胞質ドメインを含み、そしてここでこのアミノ酸配列または部分配列は天然には存在しない）を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含む、単離された核酸または組み換え核酸を提供する。
【０１３４】
上記のＣＴＬＡ−４ＢＰのうちのいくつかについて、この核酸によってコードされるポリペプチドは、以下の特性のうちの１つ以上を有する：１）ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性に等しいかそれより大きいＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比；２）ＣＤ２８について野生型同時刺激分子の結合親和性に比べて、ＣＤ２８について等しいかまたは増強されたかのいずれかの結合親和性；３）ＣＴＬＡ−４について野生型同時刺激分子の結合親和性に比べて、ＣＴＬＡ−４について減少したかまたは低下した結合親和性；Ｔ細胞増殖またはＴ細胞活性化またはその両方を誘導する；または４）Ｔ細胞活性化を調節するが、可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂによって活性化された精製したＴ細胞の増殖は誘導しない。
【０１３５】
（ＣＴＬＡ−４ＢＰ　ポリヌクレオチド）
本発明は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を各々が含む、単離された核酸または組み換え核酸を包含する：（ａ）配列番号２２〜４５、１４３−１７３から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２８６〜２８９から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の全てまたはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列；ここで、（ｃ）または（ｄ）は、以下：Ｇｌｙ（位置２において）；Ｔｈｒ（位置４において）；Ａｒｇ（位置５において）；Ｇｌｙ（位置８において）；Ｐｒｏ（位置１２において）；Ｍｅｔ（位置２５において）；Ｃｙｓ（位置２７において）；Ｐｒｏ（位置２９において）；Ｌｅｕ（位置３１において）；Ａｒｇ（位置４０において）；Ｌｅｕ（位置５２において）；Ｈｉｓ（位置６５において）；Ｓｅｒ（位置７８において）；Ａｓｐ（位置８０において）；Ｔｙｒ（位置８７において）；Ｌｙｓ（位置１２０において）；Ａｓｐ（位置１２２において）；Ｌｙｓ（位置１２９において）；Ｍｅｔ（位置１３５において）；Ｐｈｅ（位置１５０において）；Ｉｌｅ（位置１６０において）；Ａｌａ（位置１６４において）；Ｈｉｓ（位置１７２において）；Ｐｈｅ（位置１７４において）；Ｌｅｕ（位置１７６において）；Ａｓｎ（位置１７８において）；Ａｓｎ（位置１８６において）；Ｇｌｕ（位置１９４において）；Ｇｌｙ（位置１９６において）；Ｔｈｒ（位置１９９において）；Ａｌａ（位置２１０において）；Ｈｉｓ（位置２１２において）；Ａｒｇ（位置２１９において）；Ｐｒｏ（位置２３４において）；Ａｓｎ（位置２４１において）；Ｌｅｕ（位置２４４において）；Ｔｈｒ（位置２５０において）；Ａｌａ（位置２５４において）；Ｔｙｒ（位置２６５において）；Ａｒｇ（位置２６６において）；Ｇｌｕ（位置２７３において）；Ｌｙｓ（位置２７５において）；Ｓｅｒ（位置２７６において）；アミノ酸欠失（位置２７６において）；およびＴｈｒ（位置２７９において）、のうち少なくとも１つを含む天然には存在しない配列を有するポリペプチドをコードし、ここでこの位置番号は、ヒトＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置番号に相当し、そしてこのポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比以上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を有する。
【０１３６】
別の局面において、本発明は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸または組み換え核酸を提供する：（ａ）配列番号２５３〜２６２から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２６３〜２７２から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして天然に存在しない配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の全てまたはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列；ここで、このフラグメントは、（ｉ）天然に存在しない配列、および（ｉｉ）ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比以上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を有するポリペプチドをコードする。
【０１３７】
別の局面において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸または組み換え核酸を提供する（このコードされたポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、および２８６〜２８９のうちいずれか１つの少なくとも約１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０以上の連続するアミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む）。
【０１３８】
本発明はまた、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、および２８６〜２８９のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはその部分配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を各々が含む単離された核酸または組み換え核酸を提供する。ここでこの部分配列は、以下：このポリペプチドのシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうち少なくとも１つを含み、そしてこのアミノ酸配列または部分配列は、天然には存在しない。
【０１３９】
上記の各々のこのようなＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸について、それ由来のポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比以上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。さらに、このようなＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸のいくつかによってコードされたポリペプチドは、ＣＤ２８についての野生型同時刺激分子の結合親和性に比べて、ＣＤ２８について結合親和性が同じかまたは増強されているかのいずれかである。このようなコードされたポリペプチドのいくつかは、ＣＴＬＡ−４についての野生型同時刺激分子（例えば、ｈＢ７−１のような哺乳動物Ｂ７−１）の結合親和性に比べて、ＣＴＬＡ−４についての結合親和性が低下しているかまたは低い。このようなコードされたポリペプチドのいくつかは、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞活性化のいずれかまたは両方を阻害する。このようなコードされたポリペプチドのいくつかは、Ｔ細胞活性化を調節するが、可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂｓによって活性化された精製されたＴ細胞の増殖を誘導しない。
【０１４０】
さらに、本発明は、ヒヒおよびオランウータンのＢ７−１に対応する新規な単離された核酸または組み換え核酸を提供する。このような配列は、以下から選択されたポリヌクレオチド配列を含む：（ａ）配列番号４６、配列番号４７から選択されるポリヌクレオチド配列またはその相補的なポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号９３、配列番号９４から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号９３、配列番号９４から選択されるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチド配列、ここでこの部分配列は、以下：このポリペプチドのシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうち少なくとも１つを含む。
【０１４１】
（さらなる局面）
上記のＣＤ２８ＢＰ核酸およびＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸のいずれかは、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードし得る。この少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列は、Ｉｇポリペプチドを含む。このポリペプチドは、ＩｇＧポリペプチドのヒトＩｇＧポリペプチドまたはＦｃドメインを含み得、そしてＦｃヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み得る。例示的なＩｇＧ１ポリペプチドおよびその配列を、以下の実施例に示す。
【０１４２】
上記のＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰの核酸のいずれかによってコードされるポリペプチドは、少なくとも１つのシグナル配列、前駆ペプチド、およびエピトープタグ配列、またはヒスチジンタグを含み得る。
【０１４３】
別の局面において、本発明は、上記の　ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰの核酸の１つ以上を含む細胞を提供する。このような細胞は、本発明の核酸によってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現し得る。
【０１４４】
本発明はまた、上記のＣＴＬＡ−４ＢＰまたはＣＤ２８ＢＰの核酸のいずれかを含むベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、またはウイルスのフラグメントを含み得る。このようなベクターは、発現ベクターを含み得、そして所望の場合、ＣＤ２８ＢＰ、またはＣＴＬＡ−４ＢＰの核酸は、プロモーター（本明細書および以下に考察されるプロモーターを含む）に作動可能に連結されている。
【０１４５】
このようなベクターは、ＣＤ２８ＢＰ、またはＣＴＬＡ−４ＢＰをコードするヌクレオチド配列に加えて、導入遺伝子（例えば、抗原、マーカー、または他の同時刺激分子）をコードするヌクレオチド配列を含む二シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターであり得る。１つの実施形態において、この抗原は、癌抗原（例えば、ＥｐＣａｍもしくは下記の別の癌抗原）、またはウイルス抗原である。このような発現ベクターでは、核酸は第一のプロモーターに作動可能に連結され得、そしてこの抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結され得る。各プロモーターは、下記のいずれかのプロモーターを含み得る。１つの局面において、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター中の１つのプロモーターまたは両方のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはその改変体である。このベクターは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列番号またはＳＶ４０ポリＡ配列をさらに含み得る。
【０１４６】
好ましい「骨格（バックボーン）」発現ベクターは、図２１に示すベクターである；骨格ベクターに示す発現ベクター成分は、任意のＮＣＳＭ核酸配列とともに用いられ得る。使用され得る他の発現ベクターエレメントならびに他のベクター型および様式を以下に詳細に記載する。ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む好ましい発現ベクターを図２２Ａに示す。ＣＤ２８ＢＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、クローンＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするヌクレオチド配列）、およびＥｐＣａｍをコードする核酸配列を含む好ましい二シストロン性発現ベクターの成分を図２３Ａに示す。
【０１４７】
本発明はまた、本明細書に記載のＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【０１４８】
さらに、別の局面において、本発明は、賦形剤またはキャリア、およびＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰの核酸のいずれかの少なくとも１つを含む組成物、またはこのような核酸を含むベクター、細胞、もしくは宿主を提供する。このような組成物は、薬学的組成物であり得、そしてこの賦形剤またはキャリアは、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアであり得る。
【０１４９】
本発明はまた、本発明の２つ以上のＮＣＳＭポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを（例えば、組み換えのための基質として）含む組成物を含む。この組成物は、組み換え核酸のライブラリーを含み得る。ここでこのライブラリーは、上記の核酸を少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００以上含む。この核酸を、必要に応じて発現ライブラリーを提供する発現ベクター中にクローニングする。
【０１５０】
本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含むベクターは、安定なキャリア（例えば、薬学的キャリア）と組み合わせて治療用途または予防用途に使用され得る。このような組成物は、治療上および／または予防上有効な量の化合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアまたは賦形剤としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。処方物は、投与の様式に適合すべきである。核酸、ポリペプチド、およびタンパク質を投与する方法は、当該分野で周知であり、そしてこれを以下にさらに考察する。
【０１５１】
本発明はまた、（例えば、上記の特定の組換え形態において実施されるような）制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、またはＤＮＡｓｅを用いて上記の１以上のＮＣＳＭ核酸のいずれかを消化することによって生成される組成物；および機械的手段（例えば、超音波破砕、ボルテックスなど）による本発明の１以上のＮＣＳＭポリヌクレオチドを断片化または剪断することによって生成される組成物を含み、これらはまた、上記の方法における組換えのための基質を提供するために使用され得る。本発明はまた、上記のＣＤ２８ＢＰ核酸またはＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸の少なくともいずれか１つを切断することによって生成される組成物を提供する。この切断は、機械的切断、化学的切断、または酵素的切断を含み得、そして酵素的切断は、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、またはＤＮＡｓｅを用いる切断を含み得る。
【０１５２】
本発明はまた、リボヌクレオチド三リン酸またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下で、１以上の断片化核酸セットをインキュベートする工程を包含するプロセスによって生成された組成物を含む。この得られた組成物は、上記の多くの組換え形態のための組換え混合物を形成する。この核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であり得；これらのポリメラーゼは、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱなど）であり得る。
【０１５３】
同様に、本発明の１つより多いＮＣＳＭ核酸に対応するオリゴヌクレオチドのセットを含む組成物は、本発明の組換え基質として有用であり、そして本発明の特徴である。便宜のために、これらの断片化した混合物、剪断した混合物、またはオリゴヌクレオチド合成混合物は、断片化した核酸セットとして言及される。
【０１５４】
１つの局面において、本発明は、上記の少なくとも１つのＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸を変異させるかまたは組換えることによって生成された、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比以上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有するポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。別の局面において、本発明は、上記の少なくとも１つのＣＤ２８ＢＰ核酸を変異させるかまたは組換えることによって生成された、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比以上のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有するポリペプチドをコードする単離された核酸または組換え核酸を提供する。
【０１５５】
本発明はまた、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比以上のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有するポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの局面において、このようなコードされたポリペプチドは、哺乳動物Ｂ７−１改変体である。いくつかの局面において、このようなポリペプチドは、野生型ウシＢ７−１ポリペプチド、ヒヒＢ７−１ポリペプチド、ウサギＢ７−１ポリペプチド、およびヒトＢ７−１ポリペプチドのアミノ酸部分配列に対応する１つ以上のアミノ酸部分配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの局面において、このようなポリペプチドは、ウシＢ７−１、ウサギＢ７−１、およびヒトＢ７−１の能力よりも大きい（例えば、抗ＣＤ３抗体または抗原によって刺激された）Ｔ細胞増殖またはＴ細胞の活性化応答を誘導する能力を示す。これらからコードされるキメラポリペプチドまたは組換えポリペプチドはまた、本発明の１つの局面である（例えば、図８Ｂを参照のこと）。
【０１５６】
さらに、本発明は、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比以上のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有するポリペプチドをコードするキメラポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む。いくつかの局面において、このようなコードされたポリペプチドは、哺乳動物Ｂ７−１改変体である。いくつかの局面において、このようなポリペプチドは、野生型アカゲザルＢ７−１ポリペプチド、ヒヒＢ７−１ポリペプチド、ヒトＢ７−１ポリペプチド、オランウータンＢ７−１ポリペプチドおよびウシＢ７−１ポリペプチドのアミノ酸部分配列に対応する１つ以上のアミノ酸部分配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの局面において、このようなポリペプチドは、ヒトＢ７−１を誘導する能力と比較して、（例えば、抗ＣＤ３抗体または抗原によって刺激されたＴ細胞の）Ｔ細胞増殖または活性化応答を抑制または阻害する能力を示す。これらからコードされるキメラポリペプチドまたは組換えポリペプチドはまた、本発明の１つの局面である（例えば、図８Ａを参照のこと）。
【０１５７】
（ポリヌクレオチドを作製する）
本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸フラグメントを、公知の合成方法に従って、標準的な固相方法によって調製し得る。代表的に、約１００塩基までのフラグメントを、個々に合成し、次いで、連結して（例えば、酵素的連結方法または化学的連結方法、あるいはポリメラーゼ媒介組換え方法によって）、本質的に任意の所望の連続した配列を形成する。例えば、本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１８５９−６９によって記載される古典的なホスホラミダイト法、または例えば、代表的に、自動化合成方法において実施されるようなＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：８０１−０５によって記載される方法を使用する化学合成によって調製され得る。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドが、例えば、自動化ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中にクローニングされる。
【０１５８】
さらに、本質的に任意の核酸は、以下の種々の商業的供給源のいずれかから特注され得る：例えば、Ｔｈｅ　Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ　Ｇｒｅａｔ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ　Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）および多くの他の企業。同様に、ペプチドおよび抗体は、以下の種々の供給源のいずれから特注され得る；例えば、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃｎｅｔ．ｃｏｍ）、ＨＴＩ　Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ）、ＢＭＡ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ．（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，および他の多くの企業。
【０１５９】
本発明の特定のＮＣＳＭポリヌクレオチドはまた、ｃＤＮＡライブラリー（例えば、代表的な反復的配列組換え法と同じように相同的な核酸を組換えることによって生成されるライブラリー）を、オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリーニングすることによって得られ得る。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、ＮＣＳＭポリペプチドおよびこれらのポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るか、またはこのポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅し得る。ｃＤＮＡクローンをスクリーニングおよび単離するための手順は、当該分野で周知である。このような技術は、例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１５２巻、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ、前出において記載されている。本発明のいくつかのＮＣＳＭポリヌクレオチドは、天然に存在する骨格を、例えば、変異誘発、反復的配列組換え（例えば、シャッフリング）、またはオリゴヌクレオチド組換えによって、変更することによって得られ得る。他の場合において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に列挙される参考文献において記載されるように、インシリコでかまたはオリゴヌクレオチド組換え法を介して作製され得る。
【０１６０】
本明細書中により詳細に記載されるように、本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドとしては、ＮＣＳＭポリペプチド配列およびそのフラグメント（可溶性ＮＣＳＭポリペプチドおよび融合タンパク質の全ての形態を含む）をコードするポリヌクレオチド配列、これらのポリヌクレオチド配列およびそのフラグメントに相補的なポリヌクレオチド配列、本明細書中に定義されるＮＣＳＭ配列に少なくともストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、コード配列およびその相補的な配列の新規なフラグメント、ならびに上記の全ての改変体、アナログ、およびホモログ誘導体が挙げられる。コード配列は、特定のポリペプチドもしくはドメイン、領域、またはこのポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列をいう。コード配列は、上記のような、レセプターに結合する能力、例えば、抗原または抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞レセプターの刺激と組み合わせてＴ細胞増殖を誘導または抑制する能力、またはサイトカイン応答を誘導または刺激する能力のような、機能的特性を有するＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントをコードし得る。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、そして、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにｃＤＮＡを含む。これらのポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス、相補）鎖であり得る。ＮＣＳＭポリヌクレオチドは、必要に応じて、（ｉ）単離物として、（ｉｉ）１つ以上のさらなるコード配列と組み合わせて（例えば、融合タンパク質、プレタンパク質、プレプロタンパク質などをコードするように）、（ｉｉｉ）適切な宿主におけるコード配列の発現に効果的な、非コード配列（例えば、イントロン）、制御エレメント（例えば、プロモーター（例えば、天然に存在するプロモーター、組換えプロモーターまたはシャトルプロモーター））、ターミネーターエレメントまたは５’非翻訳領域および／もしくは３’非翻訳領域と組み合わせて、ならびに／あるいは（ｉｖ）ＮＣＳＭコード配列が異種遺伝子であるベクター、細胞または宿主環境下において、ＮＣＳＭポリペプチドのコード配列を含む。ＮＣＳＭポリヌクレオチドは、ＮＣＳＭポリヌクレオチドの成分のそれぞれのコード配列（例えば、シグナルペプチド、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、成熟領域およびこれらのフラグメント、ならびにこれらの改変体、アナログ、およびホモログ誘導体の各々についてのコード配列）を含む。ポリヌクレオチド配列はまた、当業者に周知である核酸の代表的な組成物処方と組み合わせにおいて（キャリア、緩衝液、アジュバント、賦形剤などの存在下を含む）見出され得る。ＮＣＳＭヌクレオチドフラグメントは、代表的に、少なくとも約５００ヌクレオチド塩基、通常少なくとも約６００、６５０、または７００塩基、そしてしばしば７５０以上の塩基を含む。ＮＣＳＭポリヌクレオチドのヌクレオチドフラグメント、改変体、アナログ、およびホモログ誘導体は、本明細書中に記載されるＮＣＳＭポリヌクレオチド配列またはホモログ配列に高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし得、そして／または少なくとも１つのレセプター結合特性（例えば、本明細書中に記載のＮＣＳＭポリペプチドのＴ細胞活性化／増殖、およびサイトカイン生成を介して免疫応答を変更する能力）を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１６１】
（ポリヌクレオチドの使用）
本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドならびにそのフラグメント、改変体、およびホモログは、例えば、代表的に、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＥＣＤドメイン）をコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現を介する、本発明のＮＣＳＭポリペプチドの組換え産生（すなわち、発現）において以下の種々の用途を有する：治療剤として；予防剤として；診断ツールとして；免疫原として；アジュバントとして；相補的核酸または部分的に相補的な核酸の存在について、さらなる反応（例えば、新規および／または改善したホモログの産生のための反復的配列組換え反応または変異反応）のための基質としての診断プローブ（天然のＢ７−１または関連した同時刺激性分子をコードする核酸の検出用を含む）として、など。
【０１６２】
（ポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現）
本発明に従って、本明細書中で、例えば、「ＮＣＳＭ」分子として総称される、新規な全長または成熟した、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのタンパク質、フラグメント、改変体もしくはホモログ、関連した融合ポリペプチドもしくはタンパク質、あるいはそれらの機能的等価物をコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドは、適切な宿主におけるＮＣＳＭポリペプチドの発現を指向する組換えＤＮＡ分子において使用される。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じアミノ酸配列または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列もまた、ＮＣＳＭポリペプチドを合成、クローニングおよび発現するために使用される。
【０１６３】
（改変されたコード配列）
当業者に理解されるように、コード配列を改変し、特定の宿主におけるその発現を増強することが有利であり得る。遺伝コードは、６４の可能なコドンで重複するが、ほとんどの生物は、これらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も頻繁に利用されるコドンを、最適コドンと呼び、そしてほとんど利用されていないコドンを、稀なコドンまたは低使用頻度コドンとして分類される（例えば、Ｚｈａｎｇ　Ｓ．Ｐ．ら（１９９１）Ｇｅｎｅ　１０５：６１−７２を参照のこと）。コドンは、宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するよう置換され得、このプロセスは、「コドン最適化」または「種に対するコドン偏向の制御」と呼ばれる。
【０１６４】
特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好ましいコドンを含む最適化されたコード配列（例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｅら、（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：４７７−５０８もまた参照のこと）を調製して、例えば、非最適化配列から生成された転写物と比べて、翻訳率を増加かし得るか、または所望の特性（例えば、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を生成し得る。翻訳終止コドンもまた、宿主の優先度を反映するよう改変され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物に好ましい終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物に好ましい終止コドンは、ＵＧＡであり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、優先的にＵＡＡを終止コドンとして使用する（Ｄａｌｐｈｉｎ　Ｍ．Ｅ．ら（１９９６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４：２１６−２１８）。
【０１６５】
本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を改変する変更を含むが、これらに限定されない）のために、本発明のＮＣＳＭコード配列を変更するために操作され得る。例えば、変更は、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先度の変化、スプラシング部位の導入などのために、当該分野で周知の技術（例えば、部位特異的変異誘発）を使用して導入され得る。サイレント置換および保存的置換に関するさらなる詳細は、以下に提供される。
【０１６６】
（ベクター、プロモーターおよび発現系）
本発明はまた、上記に広範に記載されるような、１以上の核酸配列を含む組換え構築物を包含する。これらの構築物は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などのようなベクターを含み、本発明の核酸配列（例えば、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列）は、順方向または逆方向でこれらに挿入されている。この実施形態の好ましい局面において、構築物はさらに、この核酸配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）をさらに含む。多くの適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、そして市販されている。
【０１６７】
本発明において有用な分子生物学的技術（ベクター、プロモーターおよび多くの他の関連トピックの使用を含む）を記載する一般テキストとしては、Ｂｅｒｇｅｒ、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌ、前出が挙げられる。例えば、本発明のホモログ核酸の生成のための、インビトロ増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む）を介して、当業者に指向するに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、全て前出、ならびに、Ｍｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（「Ｉｎｎｉｓ」）；Ａｒｎｈｅｉｍ　＆　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ　３６−４７；Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　ＮＩＨ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら、１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８；Ｌｏｍｅｌｉら、（１９８９）　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ　３５：１８２６−１８３１；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ　４：５６０−５６９；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０）Ｇｅｎｅ　８９：１１７−１２２ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：５６３−５６４に見出される。インビトロ増幅された核酸をクローニングする改良された方法が、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅する改良された方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　３６９：６８４−６８５およびその中の参考文献において要約され、ここでは、４０キロベース（ｋｂ）までのＰＣＲアンプリコンが生成される。当業者は、本質的に任意のＲＮＡが、制限消化、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用するＰＣＲ伸長および配列決定に適切な、二本鎖ＤＮＡに変換され得ることを認識する。Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て、前出）を参照のこと。
【０１６８】
本発明はまた、本発明のベクターを形質導入された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生を提供する。宿主細胞は、一般に、本発明のベクターで操作（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）され、これらのベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはＮＣＳＭ遺伝子の増幅のために適切なように改変された、従来の栄養培地中で培養され得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞を用いる以前に使用されている条件であり、これは、当業者および本明細書中に引用される参考文献（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ、ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋおよびその中に引用される参考文献を含む）において明らかである。
【０１６９】
本発明のＮＣＳＭポリペプチドはまた、非動物細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）において産生され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＢｅｒｇｅｒおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、細胞培養に関する詳細は、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｌａｂ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　ＮＹ）：ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬに見出される。
【０１７０】
ＮＣＳＭポリペプチド分子をコードする、本発明のポリヌクレオチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、ポリペプチドの発現のための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターとしては、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび他の多く））が挙げられる。遺伝物質を細胞に形質導入し、そして複製が所望される場合には、その関連する宿主において複製可能かつ生存可能である、任意のベクターが使用され得る。
【０１７１】
発現ベクター中の核酸配列は、ｍＲＮＡ合成を指向するための適切な転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの例としては、以下が挙げられる：ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージλＰＬプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよび原核生物細胞もしくは真核生物細胞または他のウイルスにおいて遺伝子の発現を調節することが公知の他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。ベクターは、必要に応じて、発現を増幅するための適切な配列（例えば、エンハンサー）を含む。さらに、発現ベクターは、必要に応じて、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための１以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核生物細胞培養物のためのデヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を含む。
【０１７２】
ＮＣＳＭポリペプチドをコードする適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含むベクターを使用して、適切な宿主を形質転換し、その宿主にタンパク質を発現させるのを可能にし得る。適切な発現宿主の例としては、以下が挙げられる：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）；昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。全ての細胞または細胞株が、十分に機能的なＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントを産生し得る必要がないことが理解される；例えば、ＮＣＳＭポリペプチドの抗原性フラグメントは、細菌発現系または他の発現系において産生され得る。本発明は、使用される宿主細胞によって限定されない。
【０１７３】
細菌系において、多くの発現ベクターが、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントに意図される用途に依存して選択され得る。例えば、多量のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントが、抗体の誘導に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが望ましくあり得る。このようなベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））（ここで、ＮＣＳＭヌクレオチドコード配列は、アミノ末端Ｍｅｔおよび引き続くβ−ガラクトシダーゼの７残基についての配列とインフレームでこのベクターに連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ　＆　Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）など。
【０１７４】
同様に、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む多くのベクターが、本発明のＮＣＳＭポリペプチドの産生のために使用され得る。総説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）、Ｂｅｒｇｅｒ（前出）およびＧｒａｎｔら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０１７５】
哺乳動物宿主細胞において、多数の発現系（例えば、ウイルスベースの系）が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用され得る場合、コード配列は、必要に応じて、後期プロモーターおよび３部構成のリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結される。ウイルスゲノムの非必須なＥ１領域またはＥ３領域における挿入は、感染した宿主細胞におけるＮＣＳＭ分子を発現可能な、生存可能なウイルスを生じる（ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）は、哺乳動物宿主細胞における発現を増加するために使用される。宿主細胞、培地、発現系、および産生の方法としては、種々の哺乳動物Ｂ７−１（例えば、ｈＢ７−１およびマウスＢ７−１）のクローニングおよび発現について公知のものが挙げられる。
【０１７６】
本発明のＭＣＳＭポリヌクレオチド配列を用いる使用のためのプロモーターとしては、同時係属中の共有に係る米国特許出願番号　、表題「Ｎｏｖｅｌ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」（ＬＪＡＱ弁護士書類番号０２−０３１９１０ＵＳとして２００１年６月２１日出願され、全ての目的についてその全体が参考として本明細書中に援用される）において記載されるような、組換えプロモーター、変異プロモーター、または反復的に組換えた（例えば、シャッフルした）プロモーター（最適化組換えＣＭＶプロモーターを含む）が挙げられる。このようなプロモーターは、例えば、ＮＣＳＭポリヌクレオチド、可溶性ＮＳＣＭ−ＥＣＤポリペプチド、またはＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質、またはＷＴ　ｈＢ７−１、あるいはこれらのいずれかのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて使用され得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ＮＣＳＭ分子を用いる特定の使用のための最適化された発現を有する組換えプロモーターまたはシャッフル化プロモーターが利用される。例えば、いくつかの治療的および／もしくは予防的な方法または適用において、（代表的に、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＷＴヒトＣＭＶプロモーター）で得られる発現よりも）より低いレベルのＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰの発現が所望される場合、減少されたかまたは抑制された発現レベルのＮＣＳＭおよび／または１つ以上の関連した抗原を提供するように最適化された、少なくとも１つの組換えまたはキメラのＣＭＶプロモーターヌクレオチド配列が使用される。このようなプロモーターは、ＮＣＳＭポリヌクレオチドおよび／または１つ以上の関連した抗原（例えば、ＥｐＣａｍ／ＫＳＡのような癌抗原）のいずれかまたは両方に、発現ベクター中で作動可能に連結される。他の実施形態において、特定の適用のために最適化された１つ以上の組換えまたはキメラのＣＭＶプロモーターが使用され得、ここで、１つ以上のベクター中のＮＣＳＭポリペプチドと少なくとも１つの関連抗原との間の差示的発現が所望される（例えば、これらのそれぞれの濃度がお互いに影響する（ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ）かまたは影響を与える（ａｆｆｅｃｔ）ために、種々の量の種々のＮＣＳＭポリペプチド分子もしくは同時刺激分子を発現することが所望される場合、そして／あるいは効果的な処置のために比較的より高いレベルの少なくとも１つの抗原を発現することが所望される場合）。例えば、いくつかの適用において、低い発現レベルのＮＣＳＭポリペプチドおよび相対的により高い発現レベルの抗原が所望される。なぜなら、このことは、特定の状態または疾患の首尾良い治療または予防処置のために特に有用であり得るためである。
【０１７８】
（付加的な発現エレメント）
特定の開始シグナルは、ＮＣＳＭポリヌクレオチドコード配列および／またはそのフラグメントの効率的な翻訳において助けとなり得る。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含み得る。ＮＣＳＭコード配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、付加的な転写制御シグナルは必要とはされ得ない。しかし、コード配列（例えば、成熟タンパク質コード配列）またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性核酸転写制御シグナルが提供されなければならない。さらに、この開始コドンは、インサート全体の転写を保証するために正確なリーディングフレーム中に存在しなければならない。外因性転写エレメントおよび開始コドンは、種々の起源であり得、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、使用される細胞系に適切なエンハンサーの包含によって増強され得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−６２；およびＢｉｔｔｎｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと）。
【０１７９】
（分泌／局在化配列）
ＮＣＳＭポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドおよびそのフラグメントはまた、所望の細胞性区画、膜もしくは細胞小器官に対してポリペプチド発現を標的化するためか、または、細胞質周辺腔もしくは細胞培養培地中にポリペプチドの分泌を指向するために、例えば、分泌／局在化配列をコードする核酸に対して、インフレームで融合され得る。このような配列は、当業者に公知であり、そして分泌リーダーペプチド、細胞小器官標的配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア移行配列、クロロプラスト移行配列）、膜局在化／係留配列（例えば、終止移行配列、ＧＰＩアンカー配列）などが挙げられる。
【０１８０】
（発現宿主）
さらなる実施形態において、本発明は、上記の本発明の核酸、ベクター、または他の構築物のいずれかを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、または植物細胞）であり得るか、あるいは、宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃もしくはワクチン銃、注入、または他の一般的な技術により行なわれ得る（インビボ、エキソビボまたはインビトロでの方法に関して、例えば、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。
【０１８１】
宿主細胞株は、必要に応じて、挿入された配列の発現を調節するかまたは所望の様式で発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択される。タンパク質のこのような改変は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むがこれらに限定されない。タンパク質の「プレ」または「プレプロ」形態を切断する翻訳後のプロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能について重要であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．、酵母、あるいはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ　２９３、ＷＩ３８などの哺乳動物細胞のような異なった宿主細胞は、このような翻訳後活性についての特異的な細胞性機構および特徴的な機構を有し、そして導入された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを保証するために選択され得る。
【０１８２】
組換えタンパク質の長期、高収率の産生のために、安定な発現が使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株を、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して形質転換する。ベクターの誘導後、細胞を選択培地に切り換える前に、濃縮培地で１〜２日間増殖させ得る。選択マーカーの目的は、選択に対して耐性を与えることであり、そして、その存在が、導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。例えば、安定して形質転換された細胞の耐性集団は、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０１８３】
本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、必要に応じて、細胞培養物からのコードされたタンパク質の発現および回収に適切な条件下で培養される。組換え細胞によって産生されたタンパク質またはそのフラグメントは、使用される配列および／またはベクターに依存して分泌され、膜結合され、または細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明の成熟ＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を介して成熟ポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を使用して設計され得る。
【０１８４】
本発明はまた、本明細書中に記載される２つ以上のＮＣＳＭポリヌクレオチド配列の比較に由来する、少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチドコンセンサス配列を含む（例えば、本発明のＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ、あるいはそのフラグメント（例えば、ＥＣＤまたはｔｒｕｎＥＣＤ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる）。本発明はまた、本明細書中に記載される２つ以上のＮＣＳＭポリヌクレオチド配列の比較に由来する、少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチドコンセンサス配列を含む。本明細書中において使用される場合、ＮＣＳＭポリヌクレオチドコンセンサス配列とは、本明細書中に記載される本発明の全ての組換えＮＣＳＭポリヌクレオチドに共通である核酸残基を優先的に含む、天然には存在しないかまたは組換えられたＮＣＳＭポリヌクレオチド配列を意味し、そして全てのサブタイプに共通の核酸残基が存在しない１つ以上の位置において、この位置に優先的に存在する核酸残基であって、いかなる場合においても、本発明の少なくとも１つの組換えＮＣＳＭポリヌクレオチドにおけるその位置に実在しないいずれの核酸残基をも含まない、核酸残基を含む。
【０１８５】
（付加的な配列）
本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、必要に応じて、例えば、コードされたポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列に対してインフレームで融合されたコード配列またはそのフラグメントを含む。このような精製を容易にするドメインとしては、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、グルタチオン（例えば、ＧＳＴ）に結合する配列、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ　３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系で利用されるＦＬＡＧエピトープ（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインとＮＣＳＭ配列との間のプロテアーゼ切断可能なポリペプチドリンカー配列の包含は、精製を容易にするために有用である。
【０１８６】
例えば、本明細書中において記載される組成物および方法における使用が可能な１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されるポリヒスチジン領域に融合される本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣに対する精製を容易にするが（Ｐｏｒａｔｈら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　３：２６３−２８１に記載されるような、固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からＮＣＳＭポリペプチドを分離するための方法を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）はまた、必要に応じて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用される。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合の場合におけるグルタチオン−アガロース）への吸着によって溶解細胞から簡単に精製され得、遊離リガンドの存在下での溶出が続く。
【０１８７】
本明細書中に記載される組成物および方法における、さらなる構築物は、例えば、本明細書中に記載されるように、Ｉｇ分子（例えば、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ（「結晶化可能なフラグメント」またはフラグメント相補的結合）ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（ならびにこれらをコードするヌクレオチド配列）に融合した、ＮＣＳＭポリペプチド（またはその１つ以上のフラグメント）を含む可溶性タンパク質、およびこれらのコード核酸を提供する。Ｆｃとは、細胞上の抗体レセプターおよび相補体のＣ１ｑ成分への結合を担う抗体の部分である。化学合成によって、または例えば、ＮＣＳＭポリペプチドの分泌形態をコードするプラスミドを真核生物細胞に導入することによって生成するような、ＮＳＣＭポリペプチドの分泌形態を含むＮＣＳＭポリペプチドの可溶性形態もまた含まれる。これらの発現されたかまたは分泌された可溶性ＮＣＳＭポリペプチドまたはそれらのフラグメント、および可溶性ＮＣＳＭ融合タンパク質（例えば、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質またはＮＣＳＭ−短縮型ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質）またはそれらのフラグメント、ならびにこれらをコードする核酸は、必要に応じて、予防薬および／または治療薬あるいは診断ツールとして有用である（例えば、Ｃｈａｌｌｉｔａ−Ｅｉｄ，Ｐ．ら（１９９８）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６０：３４１９−３４２６；Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌ，Ｋ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５９：４９６４−４９７２をもまた参照のこと）。
【０１８８】
（ポリペプチドの産生および回収）
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後、適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）によって、選択されたプロモーターは誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、そして得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持した。ＮＣＳＭタンパク質の発現において使用される真核生物細胞または微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知である他の方法を含む）によって破壊され得る。
【０１８９】
記載されるように、多数の参考文献が、多数の細胞（細菌、植物、動物（特に哺乳動物）および古細菌起源の細胞を含む）の培養および産生のために利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢｅｒｇｅｒ（すべて前出）、ならびに、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ，ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋおよびそこに引用された参考文献；Ｄｏｙｌｅ　ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，ＮＹ；Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９）Ａｎｉｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ；ならびにＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら（１９８９）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４を参照のこと。植物細胞培養および再分化については、例えば、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｌａｂ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）およびＰｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）Ｒ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒｏｙ編、Ｂｉｏｓ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．ＩＳＢＮ　０　１２　１９８３７０　６を参照のこと。一般的な細胞培養培地は、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．において開示される。細胞培養についてのさらなる情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＬｉｆｅ　Ｓｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）（「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）、および例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＴｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１９９７）（「Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ」）のような市販の文献において見出される。
【０１９０】
本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の多数の方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収および精製され得、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸性抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本明細書中で記載されるタグ化システムのいずれかを使用する）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む。所望のように、成熟ＮＣＳＭタンパク質またはそのフラグメントのコンフィギュレーションを完成する際、タンパク質再折り畳み工程が使用され得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終の精製工程で使用され得る。前記の参考文献に加えて、種々の精製方法が、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｏｎ　ＣＤ−ＲＯＭ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ．に開示される方法を含む。
【０１９１】
（インビトロ発現系）
無細胞転写／翻訳系はまた、本発明のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのフラグメントを用いてＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントを産生するために使用され得る。いくつかのこのような系が、市販されている。インビトロ転写および翻訳プロトコルに対する一般的なガイドは、Ｔｙｍｍｓ（１９９５）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３７巻、Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ．において見出される。
【０１９２】
（改変されたアミノ酸）
本発明のポリペプチドは、１つ以上の改変アミノ酸を含み得る。改変されたアミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチド血清半減期を増加する際、（ｂ）ポリペプチド抗原性を減少する際、または（ｃ）ポリペプチド貯蔵安定性を増加する際、有利であり得る。アミノ酸は、例えば、組換え体産生の間、翻訳と同時かまたは翻訳後に改変される（例えば、哺乳動物細胞における発現の間のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ連結グリコシル化）かまたは合成的手段によって改変される。
【０１９３】
改変されたアミノ酸の非制限的な例としては、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸などが挙げられる。アミノ酸改変の当業者をガイドするための適切な参考文献が、文献を通して充実している。例示的なプロトコルは、Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｏｎ　ＣＤ−ＲＯＭ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ．において見出される。
【０１９４】
（インビボでの使用および適用）
本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、あるいはこのポリヌクレオチドの相補体（例えば、アンチセンス分子またはリボザイム分子）は、必要に応じて、細胞に投与されて、治療的に有用なプロセスを達成するか、または治療的に有用な生成物を発現する。これらのインビボでの適用（遺伝子治療を含む）は、多数の技術を含み、これらの技術によって、遺伝子発現が細胞において変更され得る。このような方法としては、例えば、治療的および／または予防的に有用なポリペプチド（例えば、本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメント）の発現のための、遺伝子の導入が挙げられる。
【０１９５】
（インビボでのポリペプチド発現）
本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、当業者に周知の技術を使用する、インビボでの治療的適用のために特に有用である。例えば、培養された細胞は、少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）および／または例えば、抗原、サイトカイン、他の同時刺激分子、アジュバントなどの少なくとも１つをコードする他のポリヌクレオチド配列などを用いてエキソビボで操作され、次いでこの操作された細胞は、患者に戻される。細胞はまた、インビボでの１つ以上のポリペプチド（ＮＣＳＭポリペプチドおよび／または抗原性ペプチドが挙げられる）の発現のために、インビボで操作され得る。
【０１９６】
生物のインビボでの形質転換および発現のために適切な、多数のウイルスベクターは公知である。このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：１−２４；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｕｒｇ（１９９３）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：１２９−１４１；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２１７：５８１−５９９を参照のこと）およびアデノ随伴ベクター（Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：５３３−５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９において総説される）が挙げられる。使用される他のウイルスベクターとしては、例えば、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５１−６４；Ｌａｔｃｈｍａｎ（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１７９−１９５；およびＪｏｈａｎｎｉｎｇら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３：１４９５−１５０１において一般的に記載されるような、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびシンドビスウイルスベクターが挙げられる。
【０１９７】
１つの局面において、ポックスウイルスベクターが使用され得る。ポックスウイルスベクターは、本発明のＮＣＳＭポリペプチド（またはそのフラグメント）（例えば、ＣＤ２８ＢＰポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされており、そして免疫応答の増強（例えば、増強されたかまたは改善されたＴ細胞の増殖または活性化（あるいは、例えばＣＴＡＬ４−ＢＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合には、Ｔ細胞の増殖の阻害のような、免疫応答の阻害））が所望である予防的、治療的、および診断的適用において、有用である。例えば、Ｂｅｒｅｎｃｓｉら，Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ（２００１）１８３（８）：１１７１−９；Ｒｏｓｅｎｗｉｒｔｈら，Ｖａｃｃｉｎｅ　２００１年２月８日；１９（１３−１４）：１６６１−７０；Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６４（８）：４２０４−１１；Ｂｒｏｗｎら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　２０００　７（１９）：１６８０−９；Ｋａｎｅｓａ−ｔｈａｓａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１９（４−５）：４８３−９１；Ｓｔｅｎ（２０００）Ｄｒｕｇ　６０（２）：２４９−７１において議論されているウイルスベクターを参照のこと。このようなベクターおよび受容可能な賦形剤を含有する組成物もまた、本発明の特徴である。
【０１９８】
遺伝子治療および遺伝子ワクチンは、慢性感染性疾患（例えば、ＨＩＶ感染、ウイルス性肝炎）、ならびに癌を含む非感染性疾患および酵素欠乏症のような先天性欠損症のいくつかの形態と闘うための方法を提供し、そしてこのような方法は、本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチド（例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞が挙げられる）と共に使用され得る。インビボ、エキソビボおよびインビトロで核酸およびベクターを細胞に導入するためのいくつかのアプローチが使用されており、そしてＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントをコードするＮＣＳＭポリヌクレオチド（例えば、ＥＣＤドメインおよび融合タンパク質を含む）、ならびにＮＣＳＭ配列を含むベクター）と共に使用され得る。これらのアプローチとしては、以下が挙げられる：リポソームベースの遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ９３／２４６４０および米国特許第５，６４１，６６２号；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１４；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４：２０６−２０９；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７８５１−７８５５）；アデノウイルスベクター媒介遺伝子送達（例えば、癌を処置するため（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３０５４−３０５７；Ｔｏｎｇら（１９９６）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６１：１７５−１７９；Ｃｌａｙｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５：１−６；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：１０８０−１０８５；Ｈｗａｎｇら（１９９５）Ａｍ　Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７−１６；Ｈａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５（Ｐｔ．３）：２９７−３０６；Ａｄｄｉｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：８５２２−８５２６；Ｃｏｌａｋら（１９９５）Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．６９１：７６−８２；Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４０４−４１０；Ｅｌｓｈａｍｉら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．７：１４１−１４８；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８５：６４８−６５４を参照のこと）、および多くの他の疾患を処置するため）。レトロウイルスゲノムの一部として治療的ポリヌクレオチド配列を有する複製欠損レトロウイルスベクターもまた特に、単純なＭｕＬＶベクターに関して使用されてきた。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ　Ｒｅｓ．４：４３、およびＣｏｒｎｅｔｔａら（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２：２１５を参照のこと。リガンド特異的な、カチオンベースの輸送系と組み合わせた核酸輸送（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４）もまた使用されてきた。裸のＤＮＡ発現ベクターもまた記載されている（Ｎａｂｅｌら（１９９０）前出；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８）。一般に、これらのアプローチは、本明細書中のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸を適切なベクターに組み込むことによって、本発明に適応され得る。
【０１９９】
本発明の核酸を患者に導入することによって本発明に適応され得る、遺伝子治療プロトコルを記載する一般的なテキストとしては、例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＪおよびＪｏｙｎｅｒ（１９９３）Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄが挙げられる。
【０２００】
（アンチセンス技術）
本発明のＮＣＳＭ核酸の遺伝子置換核酸としての発現に加えて、この核酸はまた、一旦、この核酸の発現がもはや細胞内で所望されなくなると、（例えば、本発明の核酸の発現を下方制御するための）発現のセンスおよびアンチセンス抑制のために有用である。同様に、本発明の核酸、またはその部分配列もしくはアンチセンス配列はまた、天然に存在する相同な核酸の発現をブロックするために使用され得る。種々のセンス技術およびアンチセンス技術は、当該分野において公知であり、例えば、以下に記載される：ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＮｅｌｌｅｎ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、ならびにＡｇｒａｗａｌ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ、およびそこに引用される参考文献。
【０２０１】
（プローブとしての使用）
高ストリンジェント条件下で、ＮＣＳＭポリヌクレオチド配列、本明細書中に記載される改変体またはホモログ配列、あるいはそのフラグメントにハイブリダイズする、代表的には少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０塩基またはそれより多くの塩基を有するポリヌクレオチド（本明細書中では、オリゴヌクレオチドともいう）の使用もまた意図される。このポリヌクレオチドは、上記のような方法に従って、プローブ、プライマー、センスおよびアンチセンス薬剤などとして使用され得る。
【０２０２】
（配列変異）
（サイレント改変体）
遺伝コードの縮重に起因して、機能的の同一の多数の核酸配列は、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドン表（表１）の精査は、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵはすべて、アミノ酸アルギニンをコードすることを示す。従って、アルギニンがコドンによって特定される核酸配列中のすべての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記の対応するコドンのうちのいずれかに変更され得る。このような核酸改変体は、「サイレント改変体」であり、「保存的に変更された改変体」の１種である。ＲＮＡ配列中のＵは、ＤＮＡ配列中のＴに対応することが理解される。
【０２０３】
【表１】
2004513878.tif 000010
遺伝コードの縮重に起因して、本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードする多数の核酸配列が生成され得、これらのうちのいくつかは、本明細書中に明白に開示される核酸配列に対する最小の配列相同性を有し得ることが、当業者によって理解される。例として、配列番号１のヌクレオチド１〜１５に対応する核酸配列ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＡＴＧを使用すると、この配列のサイレント変異は、ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＡＴＧを含み、両方の配列は、アミノ酸配列ＭＧＨＴＭをコードし、この配列は、配列番号４８のアミノ酸１〜５に対応する。
【０２０４】
当業者は、核酸の各コドン（本来、それぞれ、メチオニンおよびトリプトファンのための唯一のコドンである、ＡＵＧおよびＵＧＣを除く）は、機能的に同一なポリペプチドをコードするための標準的な技術によって改変されることを理解する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント改変はそれぞれ、任意の記載される配列において暗黙である。本発明はまた、可能なコドンの選択に基づいて組合せを選択することによってなされ得る本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の各改変および全ての可能な改変を提供する。これらの組合せは、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントをコードする核酸配列に適用される場合、（例えば、表１に示されるような）標準的なトリプレット遺伝コード（コドン）に従ってなされる。本明細書中のあらゆる核酸の全てのこのような改変は、特に、遺伝コードと組み合わせて配列を考慮して提供され、そして記載される。当業者は、本明細書中で列挙される配列の任意のサイレントな置換を十分に作製し得る。
【０２０５】
（保存的改変）
特定の核酸配列の「保存的に改変された改変」または単なる「保存的改変」とは、同一のアミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列をいうか、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列をいう。当業者は、本発明のコードされる配列の単一の核酸または少しの割合（典型的には、５％未満、より典型的には４％、２％、または１％未満）のアミノ酸を変換、付加または削除する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に改変された改変」であり、ここで、この変化は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、および／または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を引き起こすことを認識する。
【０２０６】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的な置換表は、当該分野において周知である。表２は、お互いに「保存的置換」であるアミノ酸を含む６つの代表的な基を示す。
【０２０７】
【表２】
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アミノ酸のさらなる基もまた示され得る。例えば、アミノ酸は、類似の機能または化学構造もしくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）によって分類され得る。例えば、脂肪族基は、グリシン（Ｇ）、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンを含み得る。互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む他の基としては、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）が挙げられる。アミノ酸のさらなる分類については、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。
【０２０８】
従って、本発明のポリペプチド配列の「保存的に置換された改変」は、同じ保存的な置換基の保存的に選択されたアミノ酸による、少しの割合（典型的には、この配列のアミノ酸の５％未満、より典型的には４％、３％、２％、または１％未満）の置換を含む。
【０２０９】
例えば、本明細書中で配列番号４８として同定されたポリペプチドの保存的に置換された改変は、上に規定された６つの基に従って、２９６位のアミノ酸ポリペプチドにおいて約１５個までの残基（すなわち、アミノ酸の約５％）に「保存的置換」を含み得る。本明細書中のポリペプチドまたはタンパク質配列の一覧は、上記の置換表と組み合わせて、全ての保存的に置換されるポリペプチドまたはタンパク質配列の明確な一覧を提供する。
【０２１０】
さらなる例において、４つの保存的置換が、配列番号４８のアミノ酸残基６９〜９４位に対応する領域に位置した場合、この領域の保存的に置換された改変の例、ＱＫＤＳＫ　ＭＶＬＡＩ　ＬＰＧＫＶ　ＱＶＷＰＥ　ＹＫＮＲＴＩは、以下を含む：
ＮＫＤＳＫ　ＭＶＶＡＩ　ＬＰＧＫＶ　ＱＶＦＰＥ　ＹＫＮＫＴＩおよび
ＱＫＤＡＫ　ＭＶＬＡＩ　ＬＰＧＲＶ　ＱＭＷＰＥ　ＹＫＱＲＴＩなど。
ここで、保存的置換（上の例において、保存的置換は下線で示す）は、表２に示される。本明細書中のタンパク質配列の一覧は、上記の置換表と組み合わせて、全ての保存的に置換されるポリペプチドまたはタンパク質の配列の明確な列挙を提供する。
【０２１１】
本発明の核酸分子のコードされる活性を変更しない１つ以上の核酸または配列の付加（例えば、非機能的配列の付加）は、塩基性核酸分子の保存的改変であり、そして本発明のポリペプチドの活性を変更しない１つ以上のアミノ酸残基の付加は、塩基性ポリペプチドの保存的改変である。このようなタイプの付加の両方は、本発明の特徴である。
【０２１２】
当業者は、開示される核酸構築物の多くの保存的改変は、機能的に同一な構築物を与えることを理解する。例えば、上で論じられるように、遺伝コードの縮重に起因して、「サイレント置換」（すなわち、コードされたポリペプチドにおける変化を引き起こさない核酸配列における置換）は、核酸をコードする全ての核酸配列の与えられた特徴である。同様に、アミノ酸配列の１つのアミノ酸または数個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、高度に類似する特徴を有する異なるアミノ酸によって置換され、また、開示される構築物に高度に類似しているとして容易に同定される。各開示される配列のこのような保存的改変は、本発明の特徴である。
【０２１３】
（核酸ハイブリダイゼーション）
核酸は、典型的には液体中で結合する場合、「ハイブリダイズ」する。核酸は、種々の良く特徴付けられた物理化学力（例えば、水素結合、溶媒除去、および塩基スタッキングなど）に起因してハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションのための広範囲にわたる手引は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ　ａｓｓａｙｓ、」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（本明細書中以下、「Ｔｊｉｓｓｅｎ」）、およびＡｕｓｕｂｅｌ（前記）に見出され、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　１、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　１）、ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　２、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ　２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識化、検出ならびに定量化についての詳述を提供する。
【０２１４】
２つの核酸配列が実質的に同一であるという指標は、この２つの分子が、少なくともストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。成句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、この配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下における、特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイズをいう。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、そしてハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを減少して、標的ポリヌクレオチド配列の所望の欠失を達成することによって適応され得る小さなミスマッチを含む。
【０２１５】
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列依存性であり、そして異なる環境的パラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる手引書は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）（前記）、ならびにＨａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ１およびＨａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ２（前記）で見出される。
【０２１６】
通常、本発明の目的のために、「高度にストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より５℃以下だけ低くなるように選択される（以下に示されるように、高度にストリンジェントな条件はまた、比較用語において言及され得る）。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）５０％の試験配列が完全に合致するプローブにハイブリダイズする温度である。言い換えると、このＴｍは、核酸二重鎖が所定の条件下で５０％変性する温度を表し、そしてこれは、核酸ハイブリッドの安定性の直接的な指標を表す。従って、Ｔｍは、へリックスからランダムなコイルへの移行の中間点に対応する温度に相当し；これは、長さ、ヌクレオチドの組成、およびヌクレオチドの長い伸長のためのイオン強度に依存する。代表的には、「ストリンジェントな条件」下において、プローブは、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。「非常にストリンジェントな条件」は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。
【０２１７】
ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズされない核酸材料は、一連の洗浄によって除去され得、この洗浄のストリンジェンシーは、所望の結果に依存して調節され得る。低ストリンジェンシーの洗浄条件（例えば、より高い塩およびより低い温度の使用）は、感受性を増加させるが、非特異的なハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生成し得る。より高いストリンジェンシー条件（例えば、より低い塩およびハイブリダイゼーション温度により近いより高い温度の使用）は、典型的には特定のシグナルのみを維持して、バックグラウンドシグナルを低下させる。Ｒａｐｌｅｙ、Ｒ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）（本明細書中以下、「ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ」）（これは全ての目的のために、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０２１８】
ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の式１を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ。
ここで、Ｍは、一価のカチオン（通常はＮａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）ヌクレオチドおよびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミド（ｆｏｒｍａｌｉｚｅ）の割合であり、そしてｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である。ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ（前記）を参照のこと。
【０２１９】
ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、以下の式２を用いて推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ。
ここで、Ｍは、一価のカチオン（通常はＮａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）は、グアノシン（Ｇ）ヌクレオチドおよびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの割合であり、（％ｆ）は、ホルムアミドの百分率であり、そしてｎは、ハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち、長さ）である（同上）。上記の式１および２は、代表的に、約１００〜２００ヌクレオチドより長いハイブリッド二重鎖についてのみ正確である（同上）。
【０２２０】
５０ヌクレオチドより短い核酸配列のＴｍは、以下のように算出され得る：
Ｔｍ（℃）＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。
ここで、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）およびＧは、対応するヌクレオチドの数である。
【０２２１】
サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上に１００より多い相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルマリンであり、このハイブリダイゼーションは、一晩中行われる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェントな洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシーより前に行われる。低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の２×ＳＳＣ洗浄である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ　ＮａＣｌである。例えば、１００ヌクレオチドより大きい二重鎖についての中程度のストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドより大きい二重鎖についての低いストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について、ストリンジェントな条件としては、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３において、約１．０Ｍ未満の　Ｎａ＋イオンの塩濃度、代表的には、約０．０１〜１．０Ｍ　Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）が挙げられる、そして温度は、代表的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。
【０２２２】
一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の２倍または２．５倍〜５倍（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の状況において、２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に示される本発明の核酸に対する比較的強い構造類似性または相同性を示す。
【０２２３】
示されるように、「高度にストリンジェント」な条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃以下だけ低くなるように選択される。目的のヌクレオチド配列（例えば、プローブ）に密接に関連するかまたはこの配列と同一である標的配列は、高度にストリンジェンシーな条件下で同定され得る。低いストリンジェンシーな条件は、相補性が小さい配列に適切である。例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ（全て、前出）を参照のこと。
【０２２４】
比較ハイブリダイゼーションは、本発明の核酸を同定するために使用され得、そしてこの比較ハイブリダイゼーション法は、本発明の核酸を識別する好ましい方法である。本発明の状況において、２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に示される核酸に対する比較的顕著な構造類似性／相同性を示す。２つのヌクレオチド配列間の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって検出される類似性または相同性の程度よりも大きな、構造、ヌクレオチド塩基の組成、配置または順序の類似性または相同性の程度を証明する。特に、本発明の状況における高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中の配列表に示される核酸に対する顕著な構造類似性または構造相同性（例えば、ヌクレオチド構造、塩基組成、配置または順序）を示す。例えば、ストリンジェントな条件下で、本明細書中の代表的な核酸にハイブリダイズする試験核酸を同定することが所望される。
【０２２５】
従って、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの１つの指標は、高度にストリンジェントな条件（または非常にストリンジェントな条件、または超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、または超超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下で、本発明の列挙される核酸のうちの１つ（例えば、配列番号１〜４７、９５〜１７３および２５３〜２６２の核酸配列、およびその相補的ポリヌクレオチド配列）にハイブリダイズする能力である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、高度にストリンジェント、超高度なストリンジェンシー、または超超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を含む）および洗浄条件は、任意の試験核酸について実験的容易に決定され得る。
【０２２６】
例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を決定する際、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、基準の選択したセットが満たされるまで、徐々に増加される（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄において、温度を上げることによって、塩濃度を減少することによって、界面活性剤濃度を増加することによって、および／またはホルマリンのような有機溶媒の濃度を上げることによって）。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、配列番号１〜４７、９５〜１７３、および２５３〜２６２から選択される１つ以上の核酸配列ならびにその相補的ポリヌクレオチド配列を含むプローブが、一致していない標的に対するプローブのハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも２．５倍、必要に応じて５倍以上高いシグナル対ノイズ比で、完全に一致した相補的標的（また、配列番号１〜４７、９５〜１７３、および２５３〜２６２から選択される１つ以上の核酸配列ならびにその相補的ポリヌクレオチド配列）に結合するまで、徐々に増加される。この場合において、一致しない標的は、例えば、既知のＢ７−１または関連の既知の同時刺激性ホモログなどに対応する核酸（例えば、本願の出願時にＧｅｎＢａｎｋＴＭのような公的なデータベースに存在する（添付の配列表の核酸以外の）Ｂ７−１核酸）である。このような一致しない標的核酸の例としては、例えば、以下が挙げられる：Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３、およびＹ０９９５０。ここで、これらの数字は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応する。さらなるこのような配列は、当業者によってＧｅｎＢａｎｋで同定され得る。
【０２２７】
試験核酸は、完全に一致したプローブが、以下：Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３、およびＹ０９９５０（ここで、この数字は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応する）のような一致していない標的核酸のいずれか、またはＧｅｎＢａｎｋに示される既知のＢ７−１もしくは関連の同時刺激性配列などに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも２．５倍〜５倍、代表的には５倍〜１０倍高いシグナル対ノイズ比で、完全に一致した相補的標的に結合する条件下で、この試験核酸が完全に一致した相補的標的にハイブリダイズする場合の少なくとも２分の１程度、すなわち、この標的に対するプローブのハイブリダイゼーションにおけるシグナル対ノイズ比より少なくとも２分の１高いシグナル対ノイズ比で、プローブにハイブリダイズする場合に、プローブ核酸に対して特異的にハイブリダイズすると言われる。１つの局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３から選択されるポリペプチド中の特有の部分配列をコードする特有のコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする標的核酸を提供し、ここでこの特有の部分配列は、上記のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受託番号いずれかによってコードされるポリペプチドと比較して特有である。いくつかのこのような核酸について、ストリンジェントな条件は、コードオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、上記のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受託番号のいずれかに対応するコントロール核酸に対する完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのシグナル対ノイズ比より少なくとも約５倍高いシグナル対ノイズ比で、このコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように選択される。
【０２２８】
超高度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、完全に一致した相補的標的核酸に対するプローブの結合についてのシグナル対ノイズ比が、一致していない標的核酸（例えば、Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３、およびＹ０９９５０（この数字は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応する））のいずれか、またはＧｅｎＢａｎｋに示される他の類似のＢ７−１もしくは同時刺激性分子配列などに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍高くなるまで、増加される。このような条件下で、完全に一致した相補的標的核酸の少なくとも２分の１のシグナル対ノイズ比で、プローブにハイブリダイズする標的核酸は、超高度なストリンジェンシーの条件下でこのプローブに結合すると言われる。
【０２２９】
同様に、さらに高いレベルのストリンジェンシーは、関連のハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を徐々に増加することによって決定され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件のストリンジェンシーは、完全に一致した相補的標的核酸に対するプローブの結合に付いてのシグナル対ノイズ比が、一致していない標的核酸のいずれか（例えば、Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３、およびＹ０９９５０により表される核酸（ここで、数字は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号に対応する））、またはＧｅｎＢａｎｋに示される他の類似のＢ７−１もしくは同時刺激性配列などに対するハイブリダイゼーションについて観察されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または５００倍またはそれ以上高くなるまで、増加される。このような条件下で、完全に一致した相補的標的核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも２分の１のシグナル対ノイズ比で、プローブにハイブリダイズする標的核酸は、超超高度なストリンジェンシーな条件下でプローブに結合すると言われる。
【０２３０】
配列番号１〜４７、９５〜１７３、および２５３〜２６２により表される核酸に、高度な、超高度な、および超超高度なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする標的核酸は、本発明の特徴である。このような核酸の例としては、所定の核酸配列と比較して、１つまたは数個のサイレントな核酸置換または保存的核酸置換を有する核酸が挙げられる。
【０２３１】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。これは、例えば、以下の場合に生じる：核酸のコピーが、遺伝コードによって許容される最大のコドン縮重性を使用して作製される場合、あるいは、公知もしくは既存のＢ７−１または類似もしくは関連する同時刺激配列など（例えば、Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３およびＹ０９９５０（ここで、これらの番号は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する）、または、例えば、他の類似のＢ７−１、同時刺激配列など（例えば、ＧｅｎＢａｎｋに提示される）を含む）によってコードされるポリペプチドを使用して差し引かれた、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３の１以上に対して、抗血清が生成される場合。本発明のポリペプチドの免疫学的識別に対するさらなる詳細は、以下に見出される。さらに、約１００ヌクレオチド未満の配列を有する二重鎖間を区別するために、当業者に公知のＴＭＡＣ１ハイブリダイゼーション手順が使用され得る。例えば、Ｓｏｒｇ，Ｕら、１　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（Ｓｅｐｔ．１１，１９９１）１９（１７）（これは、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２３２】
１つの局面において、本発明は、配列番号１〜４７、９５〜１７３および２５３〜２６２のいずれかから選択される核酸中の固有の部分配列を含む核酸を提供する。この固有の部分配列は、例えば、以下のいずれかに対応する核酸と比較して固有である：Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３およびＹ０９９５０（ここで、これらの番号は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する）、または、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに提示される、他の類似のＢ７−１、もしくは同時刺激配列など。このような固有の部分配列は、配列番号１〜４７、９５〜１７３および２５３〜２６２のいずれかを、核酸（例えば、以下に対応する核酸）の完全なセットに対して整列することによって決定され得る：Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３およびＹ０９９５０、または、本出願の出願日時点で入手可能（例えば、公のデータベースにおいて）な他の配列。整列化は、デフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行われ得る。任意の固有の部分配列が、例えば、本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０２３３】
同様に、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかから選択されるポリペプチド中の固有のアミノ酸部分配列を含むポリペプチドを包含する。ここで、この固有の部分配列は、例えば、以下のいずれかに対応するポリペプチドまたはアミノ酸配列に対して比較した場合に固有である：Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３およびＹ０９９５０（ここで、これらの番号は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する）。ここでまた、このポリペプチドは、既存のポリペプチド（コントロールポリペプチド）に対して整列される。その配列が非翻訳化配列（例えば、偽遺伝子）に対応する場合、その対応するポリペプチドが、核酸からのアミノ酸配列へのインシリコ翻訳によって単純に生成されることに注意されたい。その場合、そのリーディングフレームが、相同なＮＣＳＭ核酸のリーディングフレームに対応するように選択される。このようなポリペプチドは、必要に応じて、合成アプローチまたは組換えアプローチによって作製されるか、またはポリペプチド生成に特化した会社に注文することさえも可能である。
【０２３４】
さらに、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかから選択されるポリペプチド中の固有の部分配列をコードする固有のコード配列に、少なくともストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件（または、より高いストリンジェンシーの条件）下でハイブリダイズする標的核酸を提供し、ここで、この固有の部分配列は、ＧｅｎＢａｎｋに示される公知のＢ７−１または関連する同時刺激性ポリペプチドのアミノ酸部分配列と比較してか、またはコントロールポリペプチドのいずれかに対応するポリペプチドと比較して、固有である。
【０２３５】
１つの例において、ストリンジェントな条件は、コードオリゴヌクレオチドに完全に相補的なオリゴヌクレオチドが、コントロールポリペプチドのいずれかに対応するコントロール核酸への完全に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについてのシグナル対ノイズ比よりも少なくとも約５〜１０倍高いシグナル対ノイズ比で、そのコードヌクレオチドにハイブリダイズするように選択される。使用される特定のアッセイにおいて、より高い（例えば、約１５倍、２０倍、３０倍、５０倍またはそれ以上の）シグナル対ノイズ比が観察されるように、条件が選択され得る。この例において、標的核酸は、コードオリゴヌクレオチドへのコントロール核酸のハイブリダイゼーションと比較して少なくとも２倍高いシグナル対ノイズ比で、固有のコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。また、より高い（例えば、約２．５倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍またはそれ以上の）シグナル対ノイズ比が、選択され得る。特定のシグナルは、関連するアッセイにおいて使用される標識（例えば、蛍光標識、比色標識、放射性標識など）に依存する。
【０２３６】
別の局面において、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかから選択されるポリペプチド中の固有の部分配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、この固有の部分配列は、公知のＢ７−１、同時刺激性ポリペプチドなどに対応するポリペプチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋに存在するＢ７−１または同時刺激性ポリペプチドの配列）と比較して、固有である。
【０２３７】
（配列同一性パーセント−配列類似性）
１つの核酸が別の核酸に類似する程度は、その２以上の核酸間の進化的関連性が存在するか否かの指標を提供する。特に、高レベルの配列同一性が観察される場合、これらの核酸が共通の祖先由来であること（すなわち、これらの核酸が相同であること）が推測される。さらに、配列類似性は、２以上の核酸およびそれらがコードする配列についての、類似する構造的特性および機能的特性を暗示する。従って、本発明の文脈下で、任意の所定の例示的配列に類似する配列を有する配列は、本発明の特徴である。特に、以下に定義されるような配列同一性パーセントを共有する配列は、本発明の特徴である。
【０２３８】
配列関連性を決定する種々の方法が使用され得、これらには、手動の整列化ならびにコンピューターによる配列の整列化および分析が挙げられる。この後者のアプローチは、コンピューターによる方法によって付与される高い処理能力に起因して、本発明における好ましいアプローチである。配列整列化を行うための種々のコンピュータープログラムは、入手可能であるか、または当業者によって作製され得る。
【０２３９】
上記のように、本発明において使用される核酸およびポリペプチド（ならびにそれらのフラグメント）の配列は、ＮＣＳＭのポリペプチド分子または核酸分子（またはそれらのフラグメント）あるいは関連する分子の対応する配列に必ずしも同一である必要はないが、実質的に同一であり得る（または、実質的に類似し得る）。例えば、これらのポリペプチドは、種々の変化（例えば、１以上のアミノ酸または核酸の挿入、欠失および置換（保存的または非保存的のいずれか））に供され得、ここで、例えば、このような変化は、それらの使用において（例えば、それらの治療的または予防的な、使用または投与、あるいは診断適用において）特定の利点を提供し得る。これらの核酸もまた、種々の変化（例えば、特定のコドンが、同じかまたは異なるアミノ酸をコードするような、１以上のコドンにおける１以上の核酸の１以上の置換（これは、保存的置換または非保存的置換のいずれかを生じる）、または配列中の１以上の核酸の１以上の欠失）に供され得る。これらの核酸はまた、発現系（例えば、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞発現系）において最適な発現を提供する１以上のコドンを含むように改変され得るが、所望の場合、その１以上のコドンは、同じアミノ酸をなおコードする。このような核酸の変化は、それらの治療的または予防的な、使用または投与、あるいは診断適用において特定の利点を提供し得る。これらの核酸およびポリペプチドは、それらが、それぞれ、ＮＣＳＭ核酸分子またはＮＣＳＭポリペプチド分子の配列に実質的に同一（以下に定義するような）である配列を含む限り、多くの方法で改変され得る。
【０２４０】
比較的短いアミノ酸配列（約３０残基未満）の整列化および比較は、代表的に、簡単である。より長い配列の比較は、２つの配列の最適な整列化を達成するためにより精巧な方法を必要とし得る。比較ウインドウを整列するための配列の最適な整列化は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ　Ａｐｐｌ　Ｍａｔｈ　２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３の相同性整列化アルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３−４１０を参照のこと））によってか、または目視によって行われ得、これらの種々の方法によって作成された最適な整列（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い配列類似性または配列同一性のパーセンテージを生じる）が選択される。
【０２４１】
２以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈下で、用語「同一性」または「同一性パーセント」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してかまたは目視検査によって測定されるような、最大一致について比較および整列された場合に、すべて同じであるかまたは特定のパーセンテージ同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチド残基を有する、２以上の配列または部分配列をいう。
【０２４２】
用語「配列同一性」または「同一性パーセント」（「同一性％」）とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、比較ウインドウにわたって同一（すなわち、それぞれ、ヌクレオチド毎またはアミノ酸毎に）であることを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」（あるいは「配列同一性パーセント」または単に「同一性パーセント」もしくは「同一性％」）または「配列類似性のパーセンテージ」（あるいは「配列類似性パーセント」または単に「類似性パーセント」もしくは「類似性％」）は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列されたポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在している位置の数を決定して、一致する位置の数を導き、その一致する位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージ（または配列類似性のパーセンテージ）を導くことによって計算される。従って、例えば、ポリペプチド配列について、用語「配列同一性」とは、２つのポリペプチド配列が比較ウインドウにわたって同一（アミノ酸毎に）であることを意味し、アミノ酸残基の配列同一性のパーセンテージ（またはアミノ酸残基の配列類似性のパーセンテージ）が計算され得る。配列比較のために、代表的には、１つの配列は、それに対して試験配列が比較される、参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、部分配列の座標が指定され（必要な場合）、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。最大一致は、本明細書中に記載される配列アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用することによってか、または目視検査によって決定され得る。
【０２４３】
２つの核酸またはポリペプチドの文脈下で、句「実質的に同一」または「実質的同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してかまたは目視検査によって測定されるような、最大一致について比較および整列された場合に、それぞれ、少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、好ましくは、８０％または８５％、より好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９０％、９９％、９９．５％またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性％を有する、２以上の配列または部分配列をいう。特定の実施形態において、実質的同一性は、少なくとも約５０残基長であるアミノ酸配列の領域にわたって、好ましくは、少なくとも１００残基長の領域にわたって存在し、そしてより好ましくは、それらの配列は、少なくとも約１５０アミノ酸残基、２００アミノ酸残基または２５０アミノ酸残基にわたって実質的に同一である。特定の局面において、実質的同一性は、少なくとも約５００残基の核酸配列領域にわたって、好ましくは、少なくとも約６００残基長の領域にわたって存在し、そしてより好ましくは、これらの配列は、少なくとも約７００核酸残基、８００核酸残基または８５０核酸残基にわたって実質的に同一である。いくつかの局面において、アミノ酸配列または核酸配列は、対応するコード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【０２４４】
ポリペプチドおよびペプチドに適用する場合、用語「実質的同一性」とは、代表的には、２つのポリペプチド配列またはペプチド配列が、最適に整列された場合（例えば、デフォルトギャップウェイト（以下に詳細に記載される）を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってか、または目視検査によって）、少なくとも約６０％または７０％、しばしば、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも約８０％または８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．５％以上のアミノ酸残基配列同一性またはアミノ酸残基配列類似性を共有することを意味する。同様に、２つの核酸の文脈下で適用する場合、用語実質的同一性または実質的類似性とは、２つの核酸配列が、最適に整列された場合（例えば、デフォルトギャップウェイト（以下に詳細に記載される）を使用するプログラムＢＬＡＳＴ、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってか、または目視検査によって）、少なくとも約６０％、７０％または約８０％の配列同一性または配列類似性、好ましくは、少なくとも約９０％のアミノ酸残基配列同一性またはアミノ酸残基配列類似性、より好ましくは、少なくとも約９５％以上の配列同一性または配列類似性（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％以上のヌクレオチド配列同一性または配列類似性を含む）を共有することを意味する。
【０２４５】
１つの局面において、本発明は、配列番号１〜４７、９５〜１７３および２５３〜２６２のいずれかの核酸と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を有するＮＣＳＭアミノ酸分子（例えば、全長ポリペプチド、シグナルペプチド、ＥＣＤ、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、成熟領域、または他のフラグメント）をコードする核酸、あるいはそのフラグメント（例えば、１以上のシグナルペプチド、ＥＣＤ、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、または成熟領域、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む）を提供する。いくつかのこのようなコードされるポリペプチドは、本明細書に記載されるＣＤ２８ＢＰ特性またはＣＴＬＡ−４ＢＰ特性を有する。
【０２４６】
別の局面において、本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかのポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、１以上のシグナルペプチド、ＥＣＤ、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、または成熟領域、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む）と少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を有する、ＮＣＳＭポリペプチド（例えば、全長ＮＣＳＭポリペプチド、シグナルペプチド、ＥＣＤ、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、成熟領域、または他のフラグメント）、およびそのポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。配列番号６９〜９２、２２２〜２７２および２８６〜２８８のこのようなフラグメントは、本明細書中に記載の少なくとも１つのＣＴＬＡ４ＢＰ特性（例えば、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）と共にＴ細胞の増殖または活性化を阻害する能力、および／またはｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比とおよそ同等またはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比のような）を有し得る。配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２８９〜２９３のこのようなフラグメントは、本明細書中に記載の少なくとも１つのＣＤ２８ＢＰ特性（例えば、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）と共にＴ細胞の増殖または活性化を誘導する能力および／またはｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と同等またはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比のような）を有し得る。配列番号９３〜９４のこのようなフラグメントは、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗原による）と共にＴ細胞の増殖または活性化を誘導する能力および／または霊長類Ｂ７−１（例えば、ｈＢ７−１）のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比とおよそ同等のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有し得る。
【０２４７】
なお別の局面において、本発明は、配列番号６９〜９２、２２２〜２７２および２８６〜２８８の少なくとも１つの、少なくとも約１５０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２５個、２３０個、２４０個、２５０個、２７５個または２８５個以上連続するアミノ酸にわたって実質的に同一であるかまたは実質的に類似する、ＮＣＳＭホモログポリペプチドを提供し；いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞の増殖または活性化を阻害する能力および／または本明細書に記載されるようなｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比とおよそ同等またはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有し得る。
【０２４８】
なお別の局面において、本発明は、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２８９〜２９３の少なくとも１つの、少なくとも約１５０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２５個、２３０個、２４０個、２５０個、２７５個または２８５個以上連続するアミノ酸にわたって実質的に同一であるかまたは実質的に類似する、ＮＣＳＭホモログポリペプチドを提供し；いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗原または抗ＣＤ３　Ａｂによる）と共にＴ細胞の増殖または活性化を誘導する能力、および／またはｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比とおよそ同等またはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有し得る。
【０２４９】
本発明は、配列番号９３〜９４の少なくとも１つの、少なくとも約１５０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２５個、２３０個、２４０個、２５０個、２７５個または２８５個以上連続するアミノ酸にわたって実質的に同一であるかまたは実質的に類似する、ＮＣＳＭホモログポリペプチドを提供し；いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗ＣＤ３　Ａｂまたは抗原による）と共にＴ細胞の増殖または活性化を誘導する能力、および／または霊長類ｈＢ７−１（たとえば、ｈＢ７−１）のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比とおよそ同等のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有し得る。
【０２５０】
本発明の特徴は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれか１つの少なくとも１７５個連続するアミノ酸を含むＮＣＳＭポリペプチドである。他の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれか１つの、約１７５個、２００個、２１０個、２２５個、２７５個またはそれ以上連続するアミノ酸残基を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、少なくとも約２８０アミノ酸長、そしてなおより好ましくは、少なくとも約２８５アミノ酸長である。
【０２５１】
あるいは、パラメーターは、本発明の１以上の配列が、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３から選択される問い合わせ配列に対する整列化によって同定されるが、無関係のポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって示される公知の核酸配列（例えば、公知のＢ７−１配列）によってコードされるポリペプチド）に対応する配列が同定されないように、設定される。
【０２５２】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の交換能力をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミン。
【０２５３】
比較的短いアミノ酸配列（約３０残基未満）の整列化および比較は、代表的に、簡単である。より長い配列の比較は、２つの配列の最適な整列化を達成するためにより精巧な方法を必要とし得る。比較ウインドウを整列するための配列の最適な整列化は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ　Ａｐｐｌ　Ｍａｔｈ　２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３の相同性整列化アルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によってか、または目視によって行われ得、これらの種々の方法によって作成された最適な整列（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い配列類似性または配列同一性のパーセンテージを生じる）が選択される。
【０２５４】
配列同一性パーセント（同一性パーセント）および配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（これは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆　Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：２４４４に記載される）である。Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６６：２２７−２５８もまた参照のこと。同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡ整列化において使用される好ましいパラメーターは、以下に最適化される：ＢＬ５０　Ｍａｔｒｉｘ　１５：−５、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２；連結（ｊｏｉｎｉｎｇ）ペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー＝１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；および幅＝１６。
【０２５５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの他の好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ　２．０　アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ　２．０を、本明細書中に記載されるパラメーターを用いて使用して、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中で同じ長さのワードと整列した場合に同じ正の値の閾値スコアＴを、一致するかまたは満たすかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値として参照される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積的整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（一致する残基対に関する見返りスコア（ｒｅｗａｒｄ　ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびパラメーターＮ（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスが、累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大に達成された値から量Ｘ落ちる場合；累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因して、０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、ワード長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ　２．０．１４；２０００年６月２９日）は、ワード長さ３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５を参照のこと）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。また、他の適切なアルゴリズムとして、プログラムが本明細書中の配列表の配列により密接に関連する配列のみ（すなわち、例えば、本明細書中に記載されるＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって表される核酸配列、および／または例えば、ＧｅｎＢａｎｋに見出される他の類似の分子のような他の類似の配列により密接に関連する配列以外の、配列番号１〜４７、９５〜１７３、および２５３〜２６２、あるいは配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３）を同定するまで、比較のストリンジェンシーが増加し得る。言い換えると、アルゴリズムの比較のストリンジェンシーは、全ての公知の先行技術（例えば、本明細書中に示されるＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって表されるもの、または例えば、ＧｅｎＢａｎｋに見出される他の類似の分子）が排除されるように、増加し得る。
【０２５６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の統計的な類似性分析または同一性を実行する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。このアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然生じる可能性の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較におけるこの最小合計確率が、約０．２未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に類似すると考えられる。
【０２５７】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行的対合整列を使用して、関連配列の群から複数の配列整列を作製して、関連性および配列同一性パーセントまたは配列類似性パーセントを示す。ＰＩＬＥＵＰは、この整列を作製するために使用されるクラスター関係を示す系図または樹状図もまた、プロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の進行的整列方法の単純化を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３によって記載される方法と類似する。このプログラムは、３００個までの各々最大長５，０００ヌクレオチドまたは５，０００アミノ酸の配列を整列し得る。この多重整列手順は、２つの最も類似した配列のペアでの整列で始まり、整列した２つの配列のクラスターを産生する。次いで、このクラスターは、その次の最も関連する配列または整列された配列のクラスターに、整列される。２つの配列クラスターは、２つの個々の配列のペアでの整列の単純な伸長によって整列される。最終的な整列は、一連の漸進性のペアでの整列によって達成される。このプログラムは、特異的配列および配列比較の領域に対するそのアミノ酸同格物またはヌクレオチド同格物を指定すること、およびプログラムパラメーターを指定することによって作動される。ＰＩＬＥＵＰを用いて、参照配列は、以下のパラメーター：デフォルトギャップ重量（３．００）、デフォルトギャップ長さの重量（０．１０）、および加重された末端ギャップを用いてパーセント配列同一性（またはパーセント配列類似性）関係を決定するために他の試験配列と比較される。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ（例えば、第７版）から得ることができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら（１９８４）Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１２：３８７−３９５）。
【０２５８】
複数のＤＮＡ配列整列およびアミノ酸配列整列に適しているアルゴリズムの別の好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９４）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２２：４６７３−４６８０）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列群の間の、多数のペアでの比較を実行し、そしてこれらを相同性に基づいて複数の整列に構築する。ＧａｐオープンおよびＧａｐ伸長ペナルティは、それぞれ、１０および０．０５であった。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムがタンパク質重量行列として使用され得る（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１０９１９）。複数のＤＮＡおよびアミノ酸配列の整列に適するアルゴリズムの別の例は、ＭｅｇａＬｉｎｅＴＭ　ＤＮＡＳＴＡＲ　パッケージ（ＭｅｇａＬｉｎｅＴＭ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０３、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．により製造される）内のＪｏｔｕｎ　Ｈｅｉｎ法、Ｈｅｉｎ（１９９０）であり、これは、製造業者の指示およびプログラムにおいて具体化されたデフォルト値に従って使用される。
【０２５９】
検索および整列のアルゴリズムについての上記議論がまた、ヌクレオチド配列を含む問い合わせ配列の置換、および適切な場合に、核酸データベースの選択とともに、ポリヌクレオチド配列の同定および評価に適用されることが当業者に理解される。
【０２６０】
（配列組換えのための基質および形式）
本発明のポリヌクレオチドおよびそれらのフラグメントは、例えば、所望の特性を有するポリペプチドおよびそのフラグメントをコードするさらなるＮＣＳＭポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを生成するための、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋに示されるような、標準的クローニング方法におけるそれらの使用に加えて、任意の種々の組換えおよび反復組換え反応のための基質として必要に応じて使用される。種々のこのような反応が、公知であり、これには、本発明者らおよびその共同研究者によって開発された反応が挙げられる。
【０２６１】
ＤＮＡ組換えは、新規なＮＣＳＭ分子を生成しそして同定するための方法であり、この新規なＮＣＳＭ分子には、例えば、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターのいずれかまたは両方に対する（例えば、ｈＢ７−１と比較した）変化した相対的結合能力、ならびに変化した機能的活性（例えば、Ｔ細胞活性化および／または分化を誘導または阻害する変化した能力、サイトカイン産生を誘導または阻害する変化した能力、ならびに／あるいは本明細書中に記載されるアネルギーおよび／または耐性を促進または阻害する変化した能力）を有する分子が挙げられる。
【０２６２】
本明細書中に記載される１つ以上の特性を有するＮＣＳＭ分子を生成および同定するための種々の多様性生成プロトコルが、当該分野で利用可能でありかつ当該分野において記載されている。この手順は、核酸もしくは核酸セットの１つ以上のＮＣＳＭ改変体、ならびにコードされるタンパク質の改変体を生成するために、別々に、そして／または組み合わせて、使用され得る。個々におよび集合的に、これらの手順は、例えば、新規な特徴および／もしくは改善された特徴を有する、核酸、タンパク質、経路、細胞および／または生物の、操作または迅速な進化のために有用な、多様化した核酸および核酸セット（例えば、核酸ライブラリーを含む）を生成する、強く広範に適用可能な方法を提供する。明確さのために、後の議論の間に区別および分類がなされるが、この技術は、しばしば、相互に相容れないわけではないことが認識される。実際、種々の方法が、多様な配列改変体を得るために、単独でかもしくは組み合わせて（並行してかまたは連続して）、使用され得る。
【０２６３】
本明細書中に記載される多様性生成手順のいずれかの結果は、１つ以上の核酸の生成であり得、それらの核酸は、所望の特性を有するかまたはその特性を付与するタンパク質をコードする核酸について、選択またはスクリーニングされ得る。本明細書中の方法または当業者に利用可能な別の方法の１つ以上による多様化の後、生成されるすべての核酸が、所望の活性または特性（例えば、Ｔ細胞増殖または活性化、サイトカイン産生を誘導または阻害する能力、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターの１つ以上に対する結合親和性を変える能力）について選択され得る。これは、例えば、自動形式または自動化可能な形式で、当該分野におけるアッセイならびに本明細書中および以下の実施例の節において議論される本発明のアッセイのいずれかにより検出され得る任意の活性を同定することを含み得る。種々の関連する特性が（または関連しない特性さえ）、実務家の裁量にて、並行してかまたは連続して、評価され得る。
【０２６４】
本明細書中に記載されるＮＣＳＭポリペプチドをコードする改変核酸配列を生成するための種々の多様性生成手順についての記載は、以下の出版物およびそこに引用される参考文献に見出される：Ｓｏｏｎｇ，Ｎ．ら、（２０００）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ　２５（４）：４３６−４３９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，ら、（１９９９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｔｕｍｏｒ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　４：１−４；Ｎｅｓｓら、（１９９９）「ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｏｆ　ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら、（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｆａｍｉｌｙ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：７９３−７９７；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｆｏｒ　ＡＺＴ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｆａｍｉｌｙ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９８）「ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ　３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９７）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｒｓｅｎａｔｅ　ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、（１９９７）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎら、（１９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｔｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９６）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓら、（１９９６）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｏｎ　ａ　ｌａｃ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　’ｈｅａｄｐｉｅｃｅ　ｄｉｍｅｒ’」、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）「Ｓｅｘｕａｌ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　ＰＣＲ」、Ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．ｐｐ．４４７−４５７；Ｃｒａｍｅｒｉ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｃｒｅａｔｅｓ　ａｌｌ　ｔｈｅ　ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄｔｙｐｅ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒら、（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｅｎｔｉｒｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｆｏｒｍ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｔｈｅ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｐａｃｅ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ　３７０：３８９−３９１；およびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｂｙ　ｒａｎｄｏｍ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１０７４７−１０７５１。
【０２６５】
用語「シャッフリング」は、非同一な配列間の組換えを示すために本明細書中において使用され、いくつかの実施形態において、シャッフリングは、相同組換えまたは非相同組換え（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔ系）による交差を含み得る。シャッフリングは、種々の異なる形態を使用することによって実行され得、これには、例えば、インビトロおよびインビボシャッフリング形式、インシリコ（ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ）シャッフリング形式、二本鎖または一本鎖テンプレートのいずれかを使用するシャッフリング形式、プライマーに基づくシャッフリング形式、核酸フラグメントに基づくシャッフリング形式、およびオリゴヌクレオチド媒介シャッフリング形式、ならびに他の類似の組換えに基づく形式が挙げられ、これらの全てが、非同一な配列間の組換え事象に基づき、本明細書中、以下にさらに詳細に記載されるかまたは参照される。
【０２６６】
多様性を生成するための変異方法としては、例えば、以下が挙げられる：部位特異的変異誘発（Ｌｉｎｇら、（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら、（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｒａｎｄｏｍ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　＆　Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ　Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ））；テンプレートを含むウラシルを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７）「Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２；およびＢａｓｓら、（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ　Ｔｒｐ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ　ｗｉｔｈ　ｎｅｗ　ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：２４０−２４５）；オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｎｙ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍｉｔｈ（１９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｍ１３　ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；およびＺｏｌｌｅｒ　＆　Ｓｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｗｏ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０）；ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、（１９８５）「Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｎｉｃｋｅｄ　ＤＮＡ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら、（１９８５）「Ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ　＆　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｎｃｉ　Ｉ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｂｙ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓら、（１９８８）「Ｙ−Ｔ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；およびＳａｙｅｒｓら、（１９８８）「Ｓｔｒａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）；ＤＮＡギャップ二重鎖（ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ）ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、（１９８４）「Ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ　＆　Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｖｉａ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ」、１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒら、（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：７２０７；およびＦｒｉｔｚら、（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ　ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９）。
【０２６７】
さらなる適切な方法としては、以下が挙げられる：点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ　Ｍｉｓｍａｔｃｈ　Ｒｅｐａｉｒ」、Ｃｅｌｌ　３８：８７９−８８７）、修復欠陥宿主株を使用した変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｍ１３　ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；およびＣａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｍ１３　ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３）、欠失変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ　＆　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ　（１９８６）「Ｕｓｅ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｌａｒｇｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：５１１５）、制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓら、（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ　３１７：４１５−４２３）、総遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、（１９８４）「Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒ　ａｎｄ　Ｋｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｏｄ　ｏｕｔｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｗｅｌｌｓら、（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｓｉｔｅｓ」、Ｇｅｎｅ　３４：３１５−３２３；およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ｇｅｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６）、２本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１；およびＡｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｆｏｒ　ｕｎｕｓｕａｌ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：４５０−４５５）。上記方法の多くのについてのさらなる詳細は、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕｍｅ　１５４に見出され得、種々の変異誘発方法を用いたトラブルシューティング問題についての有用なコントロールを記載する。
【０２６８】
種々の多様性生成方法に関するさらなる詳細は、以下の米国特許、ＰＣＴ刊行物および出願、ならびにＥＰＯ刊行物に見出され得る：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｈａｖｉｎｇ　Ｄｅｓｉｒｅｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｂｙ　Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日）、「ＤＮＡ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０日）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；Ｍｉｎｓｈｕｌｌらに対する米国特許第５，８３７，４５８号（１９９８年１１月１７日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＷＯ　９５／２２６２５、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ、「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ　９６／３３２０７、「Ｅｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ　９７／２００７８、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｈａｖｉｎｇ　Ｄｅｓｉｒｅｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｂｙ　Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ　９７／３５９６６、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ　９９／４１４０２、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ　９９／４１３８３、「Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ　９９／４１３６９、「Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ　９９／４１３６８、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ　７５２００８、「ＤＮＡ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｙ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒによるＥＰ　０９３２６７０、「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　Ｕｐｔａｋｅ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ　９９／２３１０７、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｒｏｐｉｓｍ　ａｎｄ　Ｈｏｓｔ　Ｒａｎｇｅ　ｂｙ　Ｖｉｒａｌ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＡｐｔらによるＷＯ　９９／２１９７９、「Ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ｄｅｌ　ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ　９８／３１８３７、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｈｏｌｅ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ　９８／２７２３０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ　９８／２７２３０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、ＷＯ　００／００６３２、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｄｉｖｅｒｓｅ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ　００／０９６７９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｎｋｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ　９８／４２８３２、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｒａｎｄｏｍ　ｏｒ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ　９９／２９９０２、「Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｒｅａｔｉｎｇ　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＶｉｎｄによるＷＯ　９８／４１６５３、「Ａｎ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ」、ＢｏｒｃｈｅｒｔらによるＷＯ　９８／４１６２２、「Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、ならびにＰａｔｉおよびＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ　９８／４２７２７、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＰａｔｔｅｎらによるＷＯ　００／１８９０６、「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ　Ｇｅｎｅｓ」；ｄｅｌ　ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ　００／０４１９０、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｈｏｌｅ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ　００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ　ａｎｄ　ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ　００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｄａｔａ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖによるＷＯ　００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍａｋｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ　Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　＆　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｈａｖｉｎｇ　Ｄｅｓｉｒｅｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８、「Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ならびにＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」。
【０２６９】
いくつかの異なる一般的なクラスの配列改変方法（例えば、変異、組換えなど）は、本発明に適用可能であり、例えば、上記の参考文献および以下に記載される。以下は、本発明の文脈において、多様性生成のための異なる型の好ましい形式のうちのいくつか（例えば、多様性生成形式に基づく特定の組換えを含む）を例示する。
【０２７０】
核酸は、上記の参考文献に議論される種々の技術のいずれかによってインビトロで組換えられ得、これは、組換えられる核酸のＤＮＡｓｅ消化、続いて、核酸のライゲーションおよび／またはＰＣＲ再アセンブリを包含する。例えば、ＤＮＡ分子の無作為（または偽無作為、または無作為でない）フラグメント化が、インビトロで、異なるが関連するＤＮＡ配列とのＤＮＡ分子間での配列類似性に基づく組換えに従い、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応における伸長によって交差が固定される、有性ＰＣＲ変異誘発（ｓｅｘｕａｌ　ＰＣＲ　ｍｕｔｇｅｎｅｓｉｓ）が使用され得る。このプロセスおよび多くのプロセス改変が、上記参考文献のいくつかに記載される：例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１０７４７　１０７５１を参照のこと。
【０２７１】
同様に、例えば、組換えを細胞内の核酸の間で生じさせることによって、インビボで再帰的に組換えられ得る。多くのこのようなインビボ組換え形式が、上記の参考文献に記載される。このような形式は、必要に応じて、目的の核酸間での直接的な組換えを提供するか、またはベクター、ウイルス、プラスミドなど（目的の核酸を含む）の間で組換えおよび他の形式を提供する。このような手順に関する詳細は、上記参考文献に見出される。
【０２７２】
細胞または他の生物のゲノム全体が組換えられる全ゲノム組換え方法もまた、使用され得、この方法は、必要に応じて、ゲノム組換え混合物を所望のライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）を用いてスパイクする（ｓｐｉｋｉｎｇ）工程を包含する。これらの方法は、多くの適用を有し、これには、標的遺伝子の正体が公知でない適用を含む。このような方法の詳細は、例えば、ｄｅｌ　Ｃａｒｄａｙｒｅら、ＷＯ　９８／３１８３７「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｈｏｌｅ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；および例えば、ｄｅｌ　ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２（これも「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｈｏｌｅ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｂｙ　Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」と題される）に見出される。
【０２７３】
合成組換え方法もまた使用され得る。ここで、目的の標的に対応するオリゴヌクレオチドが、１つより多いパネルの核酸に対応するオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲまたはライゲーション反応において合成されそして再アッセンブリされ、これによって新規な組換え核酸を生成する。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド付加方法によって作製され得か、または例えば、トリヌクレオチド合成アプローチによって作製され得る。このようなアプローチに関する詳細は、上記参考文献に見出され、これには、例えば、以下が挙げられる：ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ　００／４２５６１、「Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＷｅｌｃｈらによるＰＣＴ／ＵＳ００／２６７０８、「Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ　００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍａｋｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ　Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｈａｖｉｎｇ　Ｄｅｓｉｒｅｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ　００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｄａｔａ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」。
【０２７４】
相同な核酸（または相同でない核酸すらも）に対応する配列ストリングを組換えるために遺伝子アルゴリズムがコンピューターで用いられる組換えのインシリコ法が、行われ得る。得られた組換え配列ストリングは、必要に応じて、この組換え配列に対応する核酸の合成によって（例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再アセンブリ技術と協同して）核酸に変換される。このアプローチは、無作為な改変体、部分的に無作為な改変体または設計された改変体を生成し得る。インシリコ組換えに関する多くの詳細（対応する核酸（および／またはタンパク質）の生成と組み合わせたコンピューターシステムにおける遺伝子アルゴリズム、遺伝子オペレーターなどの使用、ならびに設計された核酸および／またはタンパク質の組み合わせ（例えば、交差部位選択に基づく）、ならびに設計された偽無作為あるいは無作為組換え方法を含む）は、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．によるＷＯ００／４２５６０（「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍａｋｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒ　Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｈａｖｉｎｇ　Ｄｅｓｉｒｅｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」およびＳｅｌｉｆｏｎｏｖ　ａｎｄ　ＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００／４２５５９（「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　Ｄａｔａ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」）に記載される。インシリコ組換え法に関する広範な詳細は、これらの出願中に見出される。この方法論は、一般的に、対応する核酸またはタンパク質のインシリコおよび／または生成において同時刺激性分子およびＮＣＳＭ分子の組換えを提供することにおいて、本発明に適用可能である。
【０２７５】
天然の多様性を評価する多くの方法（例えば、多様な核酸または核酸フラグメントの１本鎖テンプレートへのハイブリダイゼーションを行い、続いて重合および／または連結して、全長の配列を再生し、必要に応じて続いてテンプレートの変性および得られた改変核酸の回収を行うことによる）は、同様に用いられ得る。１本鎖テンプレートを用いる１つの方法において、ゲノムライブラリー由来のフラグメント集団は、部分的、またはしばしば、対抗鎖に対応するほぼ全長のｓｓＤＮＡもしくはＲＮＡとアニールされる。次いで、この集団に由来する複雑なキメラ遺伝子のアセンブリは、ハイブリダイゼーションしなかったフラグメント末端のヌクレアーゼによる塩基除去、このようなフラグメント間のギャップを埋めるための重合、およびその後の１本鎖連結により媒介される。親ポリヌクレオチド鎖は、消化（例えば、ＲＮＡまたはウラシルを含む場合）、変性条件下での磁気分離（このような分離を行う様式で標識されている場合）、および他の利用可能な分離／精製方法により除去され得る。あるいは、親鎖は、必要に応じて、キメラ鎖と同時に精製され、引き続くスクリーニングおよびプロセシング工程の間に除去される。このアプローチに関するさらなる詳細は、例えば、ＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」に見出される。
別のアプローチにおいて、１本鎖分子は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、このｄｓＤＮＡ分子は、リガンド媒介結合により固体支持体に結合される。結合していないＤＮＡを分離した後に、選択されたＤＮＡ分子はこの支持体から遊離され、適切な宿主細胞に導入されて、プローブにハイブリダイズする配列を富化したライブラリーが生成される。このようにして生成されたライブラリーは、本明細書中に記載の手順のいずれかを用いたさらなる多様化のために望ましい基質を提供する。
【０２７６】
上述の任意の一般的組換えフォーマットは、反復様式で実施されて（例えば、変異／組換えまたは他の多様性生成方法の１回以上のサイクル、必要に応じて、続いて１以上の選択方法）、組換え核酸のより多様なセットが生成され得る。
【０２７７】
ポリヌクレオチド鎖終結方法を用いる変異誘発もまた、提唱されており（例えば、米国特許第５，９６５，４０８号（Ｓｈｏｒｔ）「Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ　ｂｙ　ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」および上記の参考文献を参照のこと）、本発明に適用され得る。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１以上の遺伝子に対応する２本鎖ＤＮＡが、この遺伝子に特異的なプライマーの存在下または非存在下で合わされ、変性される。次いで、１本鎖ポリヌクレオチドはアニールされ、ポリメラーゼおよび鎖終結試薬（例えば、紫外線、ガンマ線、Ｘ線の照射；エチジウムブロマイドまたは他の插入剤；ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、１本鎖結合タンパク質、転写活性化因子、またはヒストン）；多環式芳香族炭化水素；３価クロムまたは３価クロム塩；あるいは高温熱サイクルにより媒介される短縮重合など）の存在下でインキュベートされ、その結果、部分的二重鎖分子の生成を生じる。この部分的二重鎖分子（例えば、部分的に伸長した鎖を含む）は、次いで、変性され、その後のラウンドの複製または部分的複製において再アニールされ、配列類似性の種々の程度を共有し、かつＤＮＡ分子の出発集団に対して多様化されたポリヌクレオチドを生じる。必要に応じて、この産物、またはこの産物の部分的プールは、このプロセスにおいて１回以上の段階で増幅され得る。鎖終結方法（例えば、上記の方法）により生成されたポリヌクレオチドは、任意の他の記載された組換えフォーマットについての適切な基質である。
【０２７８】
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）「Ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｈｙｂｒｉｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　１７：１２０５に記載される「ハイブリッド酵素の作製のための増分短縮」（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｒｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ）（「ＩＴＣＨＹ」）とよばれる組換え手順を用いて核酸または核酸の集団において生成され得る。このアプローチは、必要に応じてインビトロもしくはインビボでの１以上の組換え方法についての基質として働き得る改変体の初期ライブラリーを生成するために用いられ得る。また、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｂｙ　Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ　Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ　Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ　ａｓ　ａ　Ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｎｏｖｅｌ　Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４を参照のこと。
【０２７９】
個々のヌクレオチドまたは連続するもしくは連続していないヌクレオチドの群の改変を生じる変異方法は、ヌクレオチド多様性を導入するために都合よく用いられ得る。多くの変異誘発方法は、上記の参考文献において見出される；変異誘発方法に関するさらなる詳細は、以下において見出され得、これらの方法はまた、本発明に適用され得る。例えば、エラープローンＰＣＲは、核酸改変体を生成するために用いられ得る。この技術を用いて、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下で行われ、その結果、高い割合の点変異がＰＣＲ産物の長さ全体にわたって得られる。このような技術の例は、上記の参考文献、ならびに、例えば、Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１：１１−１５およびＣａｌｄｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３において見出される。同様に、アセンブリＰＣＲは、小さなＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリを含むプロセスにおいて用いられ得る。多数の異なるＰＣＲ反応が同じ反応混合物内で並行して生じ、１つの反応の産物が、別の反応の産物をプライムする。
【０２８０】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、目的の核酸配列における部位特異的変異を導入するために用いられ得る。このような技術の例は、上記の参考文献、および例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４１：５３−５７において見出される。同様に、カセット変異誘発は、２本鎖ＤＮＡ分子の小さな領域を、ネイティブな配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットと置換するプロセスにおいて用いられ得る。このオリゴヌクレオチドは、例えば、完全におよび／または部分的に無作為化されたネイティブ配列を含み得る。
【０２８１】
反復集合変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、タンパク質変異誘発についてのアルゴリズムを用いて、表現型として関連した変異体の多様な集団を生成するプロセスであり、この集団のメンバーは、アミノ酸配列が異なっている。この方法は、コンビナトリアルカセット変異誘発の連続するラウンドをモニターするためのフィードバック機構を用いる。このアプローチの例は、Ａｒｋｉｎ＆Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７８１１−７８１５に見出される。指数関数的集合変異誘発（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、高い割合の独特かつ機能的な変異体を有するコンビナトリアルライブラリーを生成するために用いられ得る。目的の配列中の残基の小さな群が、並行して無作為化されて、各改変した位置で機能的タンパク質を導くアミノ酸が同定され得る。このような手順の例は、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ＆Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１：１５４８−１５５２である。
【０２８２】
インビボ変異誘発は、例えば、１以上のＤＮＡ修復経路において変異を有するＥ．ｃｏｌｉの株においてＤＮＡを遺伝させることによって、任意のクローニングされた目的のＤＮＡにおけるランダム変異を生成するために用いられ得る。これらの「ミューテーター」株は、野生型親より高いランダム変異割合を有する。これらの株のうちの１つにおけるＤＮＡの遺伝は、実際にＤＮＡ内でランダム変異誘発を生じる。このような手順は、上記の参考文献に記載される。
【０２８３】
ゲノム（例えば、細菌、真菌、動物または植物のゲノム）に多様性を導入するための他の手順は、上記および／または参照された方法とともに用いられ得る。例えば、上記の方法に加えて、種々の種への形質転換に適切な核酸マルチマーを生成する技術が提唱されている（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ（米国特許第５，７５６，３１６号）および上記の参考文献を参照のこと）。互いに関して相違する遺伝子（例えば、天然の多様性に由来するか、または部位特異的変異誘発、エラープローンＰＣＲ、変異原性細菌株を通じた継代などの適用を通じて）からなるこのようなマルチマーでの適切な宿主細胞の形質転換は、例えば、上記のように、上記のインビボ組換えプロセスによって、ＤＮＡ多様化のための核酸多様性の供給源を提供する。
【０２８４】
あるいは、部分的配列類似性の領域を共有する複数のモノマーポリヌクレオチドは、宿主種に形質転換され得、この宿主細胞によりインビボで組換えられ得る。その後のラウンドの細胞分裂は、ライブラリーを生成するために用いられ得、このライブラリーのメンバーは、単一の均質な集団、すなわち、モノマーポリヌクレオチドのプールを含む。あるいは、このモノマー核酸は、標準的な技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはクローニング）により回収され得、そして任意の組換えフォーマット（上記の反復組換えフォーマットを含む）において組換えられ得る。
【０２８５】
複数種の発現ライブラリーを生成するための方法が記載され（上記の参考文献に加えて、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）米国特許第５，７８３，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲ　ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ　ＡＮＤ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＮＯＶＥＬ　ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ　ＰＡＴＨＷＡＹＳ」およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．（１９９８）米国特許第５，８２４，４８５　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲ　ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ　ＡＮＤ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＮＯＶＥＬ　ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ　ＰＡＴＨＷＡＹＳを参照のこと）、そして目的のタンパク質活性を同定するためのそれらの使用が提唱されている（上記の参考文献に加えて、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９５８，６７２号「ＰＲＯＴＥＩＮ　ＡＣＴＩＶＩＴＹ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＯＦ　ＣＬＯＮＥＳ　ＨＡＶＩＮＧ　ＤＮＡ　ＦＲＯＭ　ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ　ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」を参照のこと）。複数種の発現ライブラリーとしては、一般に、適切な調節配列に作動可能に連結された、発現カセット中の複数の種もしくは株由来のｃＤＮＡ配列もしくはゲノム配列を含むライブラリーが挙げられる。このｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列は、さらに多様性を増大させるために、最適に無作為的に連結される。ベクターは、宿主生物の１を超える種（例えば、細菌種、真核生物細胞）における形質転換および発現に適切なシャトルベクターであり得る。いくつかの場合において、このライブラリーは、目的のタンパク質をコードするか、または目的の核酸にハイブリダイズする配列を予め選択することによって偏らせられる。任意のこのようなライブラリーは、本明細書中に記載の任意の方法のための基質として提供され得る。
【０２８６】
上記の手順は、主に、核酸および／またはコードされたタンパク質の多様性の増加に指向される。しかし、多くの場合、多様性の全てが有用（例えば、機能的）であるわけではなく、改変体のバックグラウンド（少数の有利な改変体を同定するためにスクリーニングまたは選択されなければならない）の増加に寄与するに過ぎない。いくつかの適用において、多様化する前に、例えば、組換えベースの変異誘発手順によって、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、正規化されたライブラリーなど）または他の基質核酸を予め選択または予めスクリーニングすること、あるいはそうでなければ、機能的生成物をコードする核酸に基質を偏らせることが望ましい。例えば、抗体操作の場合、任意の記載された方法により操作の前にインビボ組換え事象を利用することによって、多様性生成手順を機能的抗原結合部位を有する抗体へと偏らせることは可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来する組換えＣＤＲが増幅され得、そして本明細書中に記載の方法のいずれかに従って、多様化する前に、フレームワーク領域にアセンブルされ得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎｔｏ　ａ　ｍａｓｔｅｒ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ　２１５：４７１）。
【０２８７】
ライブラリーは、所望の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に対して偏らせられ得る。例えば、特定の活性を示すライブラリーからクローンを同定した後に、このクローンを、ＤＮＡ改変を導入するための任意の公知の方法を用いて変異誘発し得る。次いで、この変異誘発したホモログを含むライブラリーは、所望の活性についてスクリーニングされ、この活性は、最初に特定した活性と同じであり得るか、または最初に特定した活性と異なり得る。このような手順の例は、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９３９，２５０号（「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　ＯＦ　ＥＮＺＹＭＥＳ　ＨＡＶＩＮＧ　ＤＥＳＩＲＥＤ　ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ　ＢＹ　ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」）において提唱される。所望の活性は、当該分野で公知の任意の方法によって同定され得る。例えば、ＷＯ９９／１０５３９は、遺伝子ライブラリーが、この遺伝子ライブラリーからの抽出物と、代謝的にリッチな細胞から得られた成分とを組み合わせ、そして所望の活性を示す組み合わせを同定することによってスクリーニングされ得ると提唱する。所望の活性を有するクローンが、ライブラリーのサンプルに生物活性な基質を挿入し、そして蛍光分析器（例えば、フローサイトメトリーデバイス、ＣＣＤ、蛍光測定器、または分光光度計）を用いて、本明細書中に記載の所望のＮＣＳＭ活性の生成物に対応する生物活性な蛍光を検出することにより同定され得ることが提唱される（例えば、ＷＯ９８／５８０８５）。
【０２８８】
ライブラリーはまた、特定の特徴（例えば、選択された核酸プローブへのハイブリダイゼーション）を有する核酸に対して偏らせられ得る。例えば、出願ＷＯ９９／１０５３９は、所望の活性（例えば、酵素活性；例えば、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼまたはアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドが、以下の様式でゲノムＤＮＡ配列の中から同定され得ることを提唱する。ゲノムＤＮＡの集団からの１本鎖ＤＮＡ分子は、リガンド結合体化プローブにハイブリダイズされる。このゲノムＤＮＡは、培養された微生物または培養されていない微生物のいずれか、あるいは環境サンプルから得られ得る。あるいは、ゲノムＤＮＡは、多細胞生物またはこれらに由来する組織から得られ得る。第２鎖合成は、捕捉媒体からの事前の放出ありもしくは放出なしで、または当該分野で公知の他の広範な種々のストラテジーによって、捕捉で用いられるハイブリダイゼーションプローブから直接行われ得る。あるいは、単離された１本鎖ゲノムＤＮＡ集団は、さらなるクローニングなしでフラグメント化され得、そして例えば、上記の１本鎖テンプレートを用いる組換えベースのアプローチで直接使用され得る。
【０２８９】
核酸およびポリペプチドを生成する「非確率論的」方法は、Ｓｈｏｒｔ「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ００／４６３４４において主張されている。提唱された非確率論的ポリヌクレオチド再アセンブリおよび部位飽和変異誘発（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を含むこれらの方法は、同様に、本発明に適用され得る。ドープされた（ｄｏｐｅｄ）オリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを用いるランダム変異誘発または半ランダム変異誘発もまた、例えば、Ａｒｋｉｎ　ａｎｄ　Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｔｏ　ｅｎｃｏｄｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｕｂｓｅｔｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｆｏｒ　ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：２９７−３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６；Ｌｉｍ　ａｎｄ　Ｓａｕｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｐａｃｋｉｎｇ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９−７６；Ｂｒｅｙｅｒ　ａｎｄ　Ｓａｕｅｒ（１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　５１Ｆ　ｔｏ　ｌａｍｂｄａ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３５５−６０）；ならびに「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および同第５，７９８，２０８号、ならびにＥＰ特許第０５２７８０９　Ｂ１に記載される。
【０２９０】
多様化する前にライブラリーを富化するために適切な任意の上記の技術はまた、多様性生成方法により生成された生成物、または生成物のライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。
【０２９１】
変異誘発、ライブラリー構築、および他の多様性生成方法のためのキットもまた市販されている。例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ　部位特異的変異誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ　２本鎖部位特異的変異誘発キット）、Ｂｉｏ／Ｃａｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、上記のＫｕｎｋｅｌ法を用いて）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５プライム３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ　Ｉｎｃ、Ｌｅｍａｒｇｏ　Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．、Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ（例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ法を用いて）、ならびにＡｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を用いて）からキットが市販されている。
【０２９２】
上記の参考文献は、多くの変異形態（組換え、反復組換え、反復変異および組み合わせ、他の変異誘発形態との組換え、ならびにこれらのフォーマットの多くの改変を含む）を提供する。用いられる多様性生成フォーマットに拘らず、本発明の核酸が組換えられて（互いに、または関連した配列と（もしくは関連していない配列とでさえも））、組換え核酸の多様なセット（例えば、相同核酸のセットを含む）および対応するポリペプチドが生成され得る。
【０２９３】
本発明の１以上のポリヌクレオチド配列を、上記のフォーマット単独または組み合わせてのいずれかを用いて、１以上のさらなる核酸と組換えることにより生成される組換え核酸はまた、本発明の一部を形成する。１以上のさらなる核酸は、本発明の別のポリヌクレオチドを含み得る；必要に応じて、あるいは、またはさらに、この１以上のさらなる核酸としては、例えば、天然に存在するＢ７−１をコードする核酸、その同時刺激性ホモログまたは部分配列、あるいは任意の相同性Ｂ７−１、その同時刺激性配列または部分配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の入手可能な文献において見出される）、あるいは例えば、任意の他の相同性核酸もしくは非相同性核酸、またはそれらのフラグメント（上記の特定の組換えフォーマット、特に、合成によりもしくはインシリコで行われるものは、組換えのために相同性を必要としない）が挙げられる。
【０２９４】
（本発明のポリペプチド）
本発明は、単離されたＮＣＳＭポリペプチドもしくは組換えＮＣＳＭポリペプチド、またはそれらのフラグメント、ならびにそれらのホモログ、改変体および誘導体（他に特に述べられない限り、まとめて、本明細書中で「ＮＣＳＭポリペプチド」といわれる）を提供する。用語「ＮＣＳＭポリペプチド」は、他に述べられない限り、本明細書中で具体的に開示されるポリペプチド配列およびタンパク質配列のアミノ酸フラグメント、ホモログ、誘導体、改変体を含むことが全体を通して意図される。ポリペプチド改変体は、上記の保存的アミノ酸置換（「保存的に置換されたバリエーション」）を有するものを含む。ＮＣＳＭポリペプチドおよびＮＣＳＭタンパク質、キメラＮＣＳＭポリペプチド（本明細書中に記載される１以上のＮＣＳＭポリペプチドからの１以上のフラグメントを含む）を含む融合タンパク質もまた、本発明に含まれる。
【０２９５】
上記で議論されるように、本発明は、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドおよびＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド、ならびにＣＤ２８レセプターまたはＣＴＬＡ−４レセプターのいずれかまたは両方に結合する、それらのいずれかのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＣＤ２８ＢＰポリペプチド（それらのフラグメント（例えば、可溶性ＥＣＤおよび融合タンパク質）を含む）は、ＣＤ２８に対する結合親和性（ＣＤ２８に対するｈＢ７−１の結合親和性（これは、約４×１０−６Ｍである）にほぼ等しいか、またはこれより大きい）および／またはＣＴＬＡ−４に対する結合親和性（ＣＴＬＡ−４に対するｈＢ７−１の結合親和性（すなわち、約０．２〜０．４×１０−６Ｍ）にほぼ等しいか、またはこれより小さい）を有する。他の実施形態において、本発明のＣＤ２８ＢＰは、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比に等しいか、またはこれより大きいＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。このようないくつかの実施形態において、ＣＤ２８ＢＰに対する特異的結合親和性の比ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４は、少なくとも約０．５〜１ｘ１０−１である。
【０２９６】
他の実施形態において、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド（これらのフラグメント（例えば、可溶性ＥＣＤおよび融合タンパク質）を含む）は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比（ｈＢ７−１に結合親和性比に等しいか、またはこれより大きい）を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性（ＣＴＬＡ−４に対するｈＢ７−１の結合親和性（すなわち、約４×１０−６Ｍ）にほぼ等しいか、またはこれより大きい）および／またはＣＤ２８に対する結合親和性（ＣＤ２８に対するｈＢ７−１の結合親和性（これは、約０．２×１０−６Ｍ〜約０．４×１０−６Ｍの範囲）にほぼ等しいか、またはこれより小さい）を有する。他の実施形態において、ＣＴＬＡ−４ＢＰは、いずれかのレセプターに対するｈＢ７−１の結合親和性比未満のＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に対する結合親和性を有する；しかし、これらの結合親和性比（ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８）はなお、少なくともｈＢ７−１の結合親和性比と等しいか、またはこの結合親和性比より大きい。ＣＴＬＡ−４ＢＰについての他の実施形態において、特異的結合親和性比ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８は、少なくとも約１０である。
【０２９７】
（ＣＤ２８ＢＰポリペプチド）
１つの局面において、本発明は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列を含む単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドを提供し、ここで、このＥＣＤ配列は、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３の少なくとも１つの細胞外ドメイン配列に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ天然に存在する細胞外ドメイン配列ではなく、そしてここで、このポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。
【０２９８】
いくつかのこのようなポリペプチドについて、このポリペプチドは、配列番号４８〜６８、１７４〜１８２、１８４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれか１つの細胞外ドメインアミノ酸配列または全長アミノ酸配列を含む。いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号４８〜６８および１７４〜２０９のいずれか１つの細胞外ドメイン配列を含む。いくつかのこのようなポリペプチドについて、このポリペプチドは、以下の群より選択されるコードポリヌクレオチド配列によってコードされる細胞外ドメイン配列を含む：（ａ）配列番号１〜２１および９５〜１４２のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列のＥＣＤコード配列；（ｂ）配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれかから選択されるポリペプチドのＥＣＤをコードするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０２９９】
上記のいくつかのこのようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、ＣＤ２８に対する野生型の同時刺激分子の結合親和性と比較して、ＣＤ２８に対して等しいかまたは増強された結合親和性を有する。いくつかのこのようなポリペプチドは、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と少なくとも等しいかまたはこれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。１つの局面において、いくつかのこのようなポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４に対する野性型同時刺激分子の結合親和性と比較して、ＣＴＬＡ−４に対する減少または低下した結合親和性を有する。いくつかのこのようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、例えば、（例えば、抗原または抗ＣＤ３抗体による）Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３の同時刺激と関連するような、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞活性化あるいはＴ細胞増殖およびＴ細胞活性化の両方を誘導し得る。誘導されたＴ細胞増殖応答は、いくつかのこのようなポリペプチドに対するヒトＢ７−１のＴ細胞増殖応答と等しいかまたはそれより高くあり得る。別の局面において、上記のいくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞活性化を調節するが、可溶性抗ＣＤ３−ｍＡｂによって活性化される精製Ｔ細胞の増殖を誘導しない。
【０３００】
別の局面において、本発明は、以下の群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる天然に存在しないアミノ酸配列を含む、単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号１〜２１および９５〜１４２から選択されるポリヌクレオチド配列またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたって高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全てまたはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここで、このフラグメントは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列；（ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリペプチドは、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれか１つの少なくとも約１５０連続アミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド配列；ならびに（ｆ）ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等しいかまたはこれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリヌクレオチド配列は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド配列。１つの局面において、このようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれか１つの全長アミノ酸配列を含む。
【０３０１】
上記のポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。いくつかのこのようなポリペプチドは、ＴＣＲ刺激に関連するＴ細胞増殖を誘導する；この応答は、ヒトＢ７−１の応答と等しいかまたはそれより高くあり得る。
【０３０２】
なお別の実施形態において、本発明は、以下の式：
【０３０３】
【化８】
2004513878.tif 000012
（配列番号２８４）に従う配列または細胞外ドメインを含むその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、ここで、Ｘ６位はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ８位はＡｒｇまたはＧｌｙであり；Ｘ１４位はＡｒｇまたはＣｙｓであり；Ｘ１８位はＴｒｐまたはＡｒｇであり；Ｘ１９位はＰｒｏまたはＬｅｕであり；Ｘ２０位はＳｅｒまたはＰｒｏであり；Ｘ２７位はＡｓｐまたはＧｌｙであり；Ｘ５５位はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｘ６０位はＧｌｕまたはＬｙｓであり；Ｘ６９位はＧｌｎまたはＡｒｇであり；Ｘ１０１位はＰｒｏまたはＬｅｕであり；Ｘ１０６位はＬｅｕまたはＧｌｎであり；Ｘ１１０位はＰｒｏまたはＬｅｕであり；Ｘ１１３位はＬｙｓまたはＳｅｒであり；Ｘ１２０位はＶａｌまたはＩｌｅであり；Ｘ１２４位はＶａｌまたはＡｓｐであり；Ｘ１３５位はＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｘ１４９位はＴｈｒ、Ｓｅｒまたは欠失であり；Ｘ１５０位はＩｌｅまたは欠失であり；Ｘ１５１位はＡｓｎまたはＴｈｒであり；Ｘ１６７位はＴｈｒまたは欠失であり；Ｘ１６９位はＳｅｒまたは欠失であり；Ｘ１６９位はＧｌｙまたは欠失であり；Ｘ１７７位はＣｙｓまたはＴｙｒであり；Ｘ１９２位はＶａｌまたはＬｅｕであり；Ｘ１９７位はＧｌｙまたはＧｌｕであり；Ｘ１９９位はＧｌｕまたはＬｙｓであり；Ｘ２０８位はＧｌｙまたはＡｓｐであり；Ｘ２１５位はＨｉｓまたはＡｒｇであり；Ｘ２１８位はＡｌａまたはＶａｌであり；Ｘ２２７位はＳｅｒまたはＬｅｕであり；Ｘ２４９位はＴｒｐ、ＬｅｕまたはＡｒｇであり；Ｘ２６１位はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘ２６３位はＶａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅであり；Ｘ２６７位はＡｒｇまたはＣｙｓであり；Ｘ２６８位はＰｒｏまたはＬｅｕであり；そしてＸ２７３位はＧｌｙまたはＶａｌである。いくつかのこのようなポリペプチドは、本明細書中に記載のＣＤ２８ポリペプチドの１以上の特性を有し、この特性としては、免疫応答を増強する能力、Ｔ細胞の活性化応答および増殖応答を誘導する能力、ｈＢ７−１のＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比を示す能力、および／またはサイトカイン産生を変更する能力が挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドについて、誘導されたＴ細胞応答は、ｈＢ７−１のＴ細胞応答と等しいかまたはそれより高い。１つの実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号５１〜５６、５８、６１、６６、６７、１７４〜１７９、１８１、１８５〜１８７、１８９、１９２〜１９４、１９７、１９９、２０２、２０５、２０８、２１５、２１７、２２０および２８５のいずれか１つの細胞外ドメイン配列を含む。
【０３０４】
別の実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、以下のうちの２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個またはそれ以上を含む：Ｘ６位のＬｙｓ；Ｘ８位のＡｒｇ；Ｘ１４位のＡｒｇ；Ｘ１８位のＴｒｐ；Ｘ１９位のＰｒｏ；Ｘ２０位のＳｅｒ；Ｘ２７位のＡｓｐ；Ｘ５５位のＡｓｎ；Ｘ１０６位のＬｅｕ；Ｘ１１０位のＰｒｏ；Ｘ１１３位のＬｙｓ；Ｘ１２０位のＶａｌ；Ｘ１２４位のＶａｌ；Ｘ１３５位のＴｈｒ；Ｘ１５１位のＡｓｎ；Ｘ１７７位のＣｙｓ；Ｘ１９２位のＶａｌ；Ｘ１９７位のＧｌｙ；Ｘ１９９位のＧｌｕ；Ｘ２０８位のＧｌｙ；Ｘ２１５位のＨｉｓ；Ｘ２１８位のＡｌａ；Ｘ２４９位のＴｒｐ；Ｘ２６１位のＡｌａ；Ｘ２６３位のＶａｌ；Ｘ２６７位のＡｒｇ；Ｘ２６８位のＰｒｏ；およびＸ２７３位のＧｌｙ。好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、以下のうちの２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個またはそれ以上を含む：Ｘ８位のＡｒｇ；Ｘ１４位のＡｒｇ；Ｘ１８位のＴｒｐ；Ｘ１９位のＰｒｏ；Ｘ２０位のＳｅｒ；Ｘ１１０位のＰｒｏ；Ｘ１２０位のＶａｌ；Ｘ１２４位のＶａｌ；Ｘ１７７位のＣｙｓ；Ｘ１９２位のＶａｌ；Ｘ１９７位のＧｌｙ；Ｘ１９９位のＧｌｕ；Ｘ２０８位のＧｌｙ；Ｘ２１５位のＨｉｓ；Ｘ２１８位のＡｌａ；Ｘ２４９位のＴｒｐ；Ｘ２６１位のＡｌａ；およびＸ２６３位のＶａｌ。なお別の好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号６６または配列番号２８５の細胞外ドメイン配列を含む。なお別の好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号６６または配列番号２８５の配列を含む。
【０３０５】
別の局面において、本発明は、配列番号４８〜６８、１７４〜１８２、１８４〜２２１、２８３〜２８５および２９０〜２９３のいずれかに示されるアミノ酸配列の部分配列を含む、単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドを提供し、ここで、この部分配列は、このアミノ酸配列の細胞外ドメインである。
【０３０６】
本発明はまた、以下の式：
【０３０７】
【化９】
2004513878.tif 000013
（配列番号２９０）に従う配列または細胞外ドメインを含むその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、ここで、Ｘ５０位はＬｅｕまたはＰｒｏであり；Ｘ５５位はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｘ５６位はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘ１１３位はＳｅｒまたはＬｙｓであり；Ｘ１２０位はＩｌｅまたはＶａｌであり；Ｘ１２３位はＰｒｏであるかまたは欠失され；Ｘ１２４位はＶａｌ、ＡｓｎまたはＡｓｐであり；Ｘ１２５位はＬｅｕまたはＧｌｕであり；Ｘ１２６位はＬｙｓまたはＡｓｎであり；Ｘ１２８位はＡｌａまたはＳｅｒであり；Ｘ１２９位はＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘ１３０位はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘ１３１位はＬｅｕまたはＡｒｇであり；Ｘ１３５位はＡｌａまたはＴｈｒであり；Ｘ１３８位はＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ｘ１４０位はＭｅｔまたはＳｅｒであり；Ｘ１７０位はＡｓｐまたはＧｌｙであり；Ｘ１９３位はＡｓｐであるかまたは欠失され；Ｘ１９４位はＧｌｎであるかまたは欠失され；Ｘ１９５位はＡｓｐであるかまたは欠失され；Ｘ２１１位はＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘ２５２位はＩｌｅまたはＶａｌであり；そしてＸ２５３位はＬｅｕまたはＰｒｏである。いくつかのこのようなポリペプチドは、本明細書中に記載のＣＤ２８ポリペプチドの少なくとも１つの特性を有し、この特性としては、免疫応答を増強する能力、Ｔ細胞の活性化または増殖を誘導する能力、ｈＢ７−１のＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比を示す能力、ならびに／またはサイトカイン産生を変更する能力が挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドについて、誘導されたＴ細胞応答は、ｈＢ７−１のＴ細胞応答と等しいかまたはそれより高い。
【０３０８】
好ましい実施形態において、いくつかのこのようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、以下のうちの２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個またはそれ以上を含む：Ｘ５０位のＬｅｕ；Ｘ５５位のＡｓｎ；Ｘ５６位のＡｌａ；Ｘ１１３位のＳｅｒ；Ｘ１２０位のＩｌｅ；Ｘ１２３位のＰｒｏ；Ｘ１２４位のＶａｌ；Ｘ１２５位のＬｅｕ；Ｘ１２６位のＬｙｓ；Ｘ１２８位のＡｌａ；Ｘ１２９位のＴｙｒ；Ｘ１３０位のＬｙｓ；Ｘ１３１位のＬｅｕ；Ｘ１３５位のＡｌａ；Ｘ１３８位のＡｒｇ；Ｘ１４０位のＭｅｔ；Ｘ１７０位のＡｓｐ；Ｘ１９３位のＡｓｐ；Ｘ１９４位のＡｓｐ；Ｘ１９５位のＡｓｐ；Ｘ２１１位のＶａｌ；Ｘ２５２位のＩｌｅ；およびＸ２５３位のＬｅｕ。なお別の好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号５９、６２、１８０、１８４、１８８、１９５、１９６、２００、２０１、２０４、２１１、２１３、２１９および２９１のいずれか１つの配列を含む。
【０３０９】
別の局面において、本発明は、以下の式：
【０３１０】
【化１０】
2004513878.tif 000014
（配列番号２９２）に従う配列または細胞外ドメインを含むその部分配列を含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、ここで、Ｘ９位はＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘ３５位はＩｌｅまたはＴｈｒであり；Ｘ５５位はＡｓｎまたはＳｅｒであり；Ｘ１１０位はＬｅｕまたはＰｒｏであり；Ｘ１２４位はＡｓｐまたはＶａｌであり；Ｘ１３５位はＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｘ１８３位はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ１９２位はＬｅｕまたはＶａｌであり；Ｘ２１１位はＭｅｔまたはＴｈｒであり；Ｘ２１５位はＨｉｓであるかまたは欠失され；Ｘ２１６位はＳｅｒであるかまたは欠失され；Ｘ２１７位はＰｈｅであるかまたは欠失され；Ｘ２３１位はＴｈｒまたはＳｅｒであり；Ｘ２８８位はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ２９０位はＧｌｕまたはＧｌｎであり、そして、ここで、この配列は天然に存在しない配列である。さらに、いくつかのこのようなポリペプチドは、本明細書中に記載のＣＤ２８ポリペプチドの少なくとも１つの特性を有し、この特性としては、免疫応答を増強する能力、Ｔ細胞の活性化または増殖を誘導する能力、ｈＢ７−１のＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＳＡ−４結合親和性比を示す能力、ならびに／またはサイトカイン産生を変更する能力が挙げられる。いくつかのこのようなポリペプチドについて、誘導されたＴ細胞応答は、ｈＢ７−１のＴ細胞応答と等しいかまたはそれより高い。
【０３１１】
好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、以下のアミノ酸の２個、３個、４個、５個、６個、８個、１０個またはそれ以上を含む：Ｘ９位のＴｈｒ；Ｘ３５位のＩｌｅ；Ｘ５５位のＡｓｎ；Ｘ１１０位のＬｅｕ；Ｘ１２４位のＡｓｐ；Ｘ１３５位のＴｈｒ；Ｘ１８３位のＬｙｓ；Ｘ１９２位のＬｅｕ；Ｘ２１１位のＭｅｔ；Ｘ２１５位のＨｉｓ；Ｘ２１６位のＳｅｒ；Ｘ２１７位のＰｈｅ；Ｘ２３１位のＴｈｒ；Ｘ２８８位のＬｙｓ；およびＸ２９０位のＧｌｕ。なお別の好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号４８、１８２、１８３、２１２、２１４、２１６、２１８、２２１および２９３のいずれか１つの配列を含む。
【０３１２】
（ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド）
１つの局面において、本発明は、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２、２８６〜２８９、または細胞外ドメインを含むこれらの部分配列の少なくとも一つに対して、少なくとも約８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２＆、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上のパーセント同一性を有する配列を各々が含む、単離されたＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドまたは組換えＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドを提供し、ここで、この配列は、（ａ）天然に存在しない配列であり、そして（ｂ）以下のうち少なくとも１つを含む：２位のＧｌｙ；４位のＴｈｒ；５位のＡｒｇ；８位のＧｌｙ；１２位のＰｒｏ；２５位のＭｅｔ；２７位のＣｙｓ；２９位のＰｒｏ；３１位のＬｅｕ；４０位のＡｒｇ；５２位のＬｅｕ；６５位のＨｉｓ；７８位のＳｅｒ；８０位のＡｓｐ；８７位のＴｙｒ；１２０位のＬｙｓ；１２２位のＡｓｐ；１２９位のＬｙｓ；１３５位のＭｅｔ；１５０位のＰｈｅ；１６０位のＩｌｅ；１６４位のＡｌａ；１７２位のＨｉｓ；１７４位のＰｈｅ；１７６位のＬｅｕ；１７８位のＡｓｎ；１８６位のＡｓｎ；１９４位のＧｌｕ；１９６位のＧｌｙ；１９９位のＴｈｒ；２１０位のＡｌａ；２１２位のＨｉｓ；２１９位のＡｒｇ；２３４位のＰｒｏ；２４１位のＡｓｎ；２４４位のＬｅｕ；２５０位のＴｈｒ；２５４位のＡｌａ；２６５位のＴｙｒ；２６６位のＡｒｇ；２７３位のＧｌｕ；２７５位のＬｙｓ；２７６位のＳｅｒ；２７６位のアミノ酸欠失；または２７９位のＴｈｒ、ここで、位置数は、ｈＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置数に対応し、ここで、このポリペプチドは、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比と等しいかまたはこれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を有する。
【０３１３】
上記のこのようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４に対する野生型の同時刺激分子の結合親和性と比較してＣＴＬＡ−４および／またはＣＤ２８に対する変更された結合親和性を有する。いくつかのこのようなポリペプチドは、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。１つの局面において、いくつかのこのようなポリペプチドは、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４に対するｈＢ７−１の結合親和性と比較して、それぞれ、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４に対する減少した結合親和性を有する。このようなポリペプチドは、ＴＣＲ／ＣＤ３の（例えば、抗原または抗ＣＤ３抗体による）同時刺激に関連するＴ細胞増殖またはＴ細胞活性化の少なくとも１つを阻害し得る。誘導されたＴ細胞増殖応答は、いくつかのこのようなポリペプチドに対するｈＢ７−１のＴ細胞増殖応答よりも低くてもよい。別の局面において、上記のいくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞活性化を調節するが、可溶性ＣＤ３ｍＡｂによって活性化される精製Ｔ細胞の増殖を誘導しない。
【０３１４】
いくつかのこのようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドの各々は、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２および２８６〜２８９の少なくとも１つに対して、少なくとも約９８％の同一性を有する配列を含み、この配列は、以下のうちの少なくとも１つを含む：２位のＧｌｙ；８位のＧｌｙ；２７位のＣｙｓ；６５位のＨｉｓ；８０位のＡｓｐ；１２２位のＡｓｐ；１３５位のＭｅｔ；１５０位のＰｈｅ；１６４位のＡｌａ；１７４位のＰｈｅ；１８６位のＡｓｎ；１９４位のＧｌｕ；２１９位のＡｒｇ；２５０位のＴｈｒ；２６６位のＡｒｇ；２７５位のＬｙｓ；および２７６位のＳｅｒ、ここで、アミノ酸の位置数は、ｈＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置数に対応する。１つの局面において、このようなポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２および２８６〜２８９のいずれか１つのＥＣＤまたは全長アミノ酸配列を含み得る。
【０３１５】
好ましい実施形態において、いくつかのこのような上記のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２および２８６〜２８９の少なくとも１つの細胞外ドメインに対して、少なくとも約９８％の同一性を有する配列を含み、この配列は、以下のうちの少なくとも１つを含む：６５位のＨｉｓ；８０位のＡｓｐ；１２２位のＡｓｐ；１３５位のＭｅｔ；１５０位のＰｈｅ；１６４位のＡｌａ；１７４位のＰｈｅ；１８６位のＡｓｎ；１９４位のＧｌｕ；および２１９位のＡｒｇ、ここで、アミノ酸の位置数は、ｈＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置数に対応する。
【０３１６】
さらに、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２５２、２８６〜２８９の少なくとも１つのＥＣＤに対して、少なくとも約９８％の同一性を有する配列を含み、この配列は、以下のうちの少なくとも２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上を含む：６５位のＨｉｓ；８０位のＡｓｐ；１２２位のＡｓｐ；１３５位のＭｅｔ；１５０位のＰｈｅ；１６４位のＡｌａ；１７４位のＰｈｅ；１８６位のＡｓｎ；１９４位のＧｌｕ；および２１９位のＡｒｇ、ここで、アミノ酸の位置数は、ｈＢ７−１アミノ酸配列（配列番号２７８）の位置数に対応する。いくつかのこのようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、配列番号６９〜９２および２２２〜２４７のいずれか１つのＥＣＤアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、このようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、配列番号８１、８５、８６、８８、９０および９１のいずれか１つのＥＣＤ配列を含む。
【０３１７】
別の局面において、いくつかのこのような上記のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、コードポリヌクレオチド配列によってコードされるＥＣＤドメイン配列を含み、このコードポリヌクレオチド配列は、以下の群より選択される：（ａ）配列番号２２〜４５および１４３〜１７３のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列のＥＣＤコード配列；（ｂ）配列番号６９〜９２、２２２〜２５２および２８６〜２８９のいずれかから選択されるポリペプチドのＥＣＤアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列；ならびに（ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０３１８】
本発明はまた、以下から選択される少なくとも１つの変異で霊長類Ｂ７−１配列とは異なる配列を各々が含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する：Ｓｅｒ　１２　Ｐｒｏ；Ｌｅｕ　２５　Ｍｅｔ；Ｇｌｙ　２７　Ｃｙｓ；Ｓｅｒ　２９　Ｐｒｏ；Ｌｙｓ　４０　Ａｒｇ；Ｈｉｓ　５２　Ｌｅｕ；Ｔｙｒ　６５　Ｈｉｓ；Ｇｌｕ　１２２　Ａｓｐ；Ｇｌｕ　１２９　Ｌｙｓ；Ｔｈｒ　１３５　Ｍｅｔ；Ｔｈｒ　１６４　Ａｌａ；Ｓｅｒ　１７４　Ｐｈｅ；Ｇｌｕ　１９６　Ｇｌｙ；Ａｌａ　１９９　Ｔｈｒ；Ｔｈｒ　２１０　Ａｌａ；Ｌｙｓ　２１９　Ａｒｇ；Ｔｈｒ　２３４　Ｐｒｏ；Ａｓｐ　２４１　Ａｓｎ；Ｖａｌ　２５４　Ａｌａ；Ａｒｇ　２７５　Ｌｙｓ；Ａｒｇ　２７６　Ｓｅｒ；またはＡｒｇ　２７９　Ｔｈｒ。示されている変異は、配列番号２７８に示されるアミノ酸配列を有するヒトＢ７−１に対応し、この配列は、天然には存在せず、そしてこのポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を有する。いくつかのこのようなポリペプチドの配列は、これらの変異の少なくとも２つによって、霊長類のＢ７−１配列とは異なる。いくつかの局面において、この霊長類Ｂ７−１は、ｈＢ７−１（配列番号２７８）であり、そしていくつかの局面において、この配列は、少なくとも２つの変異によって、ｈＢ７−１の配列とは異なる。
【０３１９】
別の局面において、本発明は、配列番号２６３〜２７２の少なくとも１つまたはＥＣＤを含むこれらの部分配列に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上のパーセント同一性を有する配列を含む、単離されたＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドまたは組換えＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドを提供し、ここで、この配列は、天然に存在する配列ではなく、そしてこのポリペプチドは、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比を有する。
【０３２０】
なお別の局面において、本発明は、以下から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる天然に存在しないアミノ酸配列を各々が含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２２〜４５、１４３〜１７３、２５３〜２６２から選択されるポリヌクレオチド配列またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、２８６〜２８９から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、またはこれらに相補的なポリヌクレオチド配列；（ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）または（ｂ）の実質的に全長にわたって少なくともストリンジェントであるかまたは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の全てまたはフラグメントを含むポリヌクレオチド配列であって、ここで、このフラグメントは、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等しいかまたはそれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列；（ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２、２８６〜２８９のいずれか１つの少なくとも約１５０、１８０、２００、２２５、２５０またはそれ以上の連続アミノ酸残基にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド配列；ならびに（ｆ）ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等しいかまたはこれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、このポリヌクレオチド配列は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する、ポリヌクレオチド配列。いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２および２８６〜２８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０３２１】
このような上記のポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等しいかまたはこれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞増殖を阻害する。誘導されたＴ細胞応答は、ヒトＢ７−１のＴ細胞応答よりも小さくてもよい。
【０３２２】
なお別の局面において、本発明は、以下の式：
【０３２３】
【化１１】
2004513878.tif 000015
（配列番号２８７）に従う配列または細胞外ドメインを含むその部分配列を各々が含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含み、ここで、Ｘ１２位はＳｅｒまたはＰｒｏであり；Ｘ２５位はＬｅｕまたはＭｅｔであり；Ｘ２９位はＳｅｒまたはＰｒｏであり；Ｘ４０位はＬｙｓまたはＡｒｇであり；Ｘ１２２位はＧｌｕまたはＡｓｐであり；Ｘ１２９位はＧｌｕまたはＬｙｓであり；Ｘ１６４位はＴｈｒまたはＡｌａであり；Ｘ１９６位はＧｌｕまたはＧｌｙであり；Ｘ２１９位はＬｙｓまたはＡｒｇであり；そしてＸ２４１位はＡｓｐまたはＡｓｎである。好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号２８８または配列番号２８９のＥＣＤを含む。別の好ましい実施形態において、いくつかのこのようなポリペプチドは、配列番号２８８または配列番号２８９のアミノ酸配列を含む。１つの局面において、このようなポリペプチドは、ヒトＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等しいかまたはこれより高いＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を含む、上記のＣＴＬＡ−４ＢＰの特性の少なくとも１つを示す。いくつかのこのようなポリペプチドは、Ｔ細胞増殖を阻害する；いくつかのポリペプチドについて、誘導されたＴ細胞応答は、例えば、抗ＣＤ３Ａｂまたは抗原の存在下でｈＢ７−１によって誘導されるＴ細胞応答よりも低い。
【０３２４】
本発明はまた、配列番号６９〜９２、２２２〜２４７、２６３〜２７２および２８６〜２８９のいずれかに示されるアミノ酸配列の部分配列を各々が含む、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、ここで、この部分配列は、このアミノ酸配列のＥＣＤである。
【０３２５】
さらに、本発明は、ヒヒＢ７−１およびオランウータンＢ７−１に対応する新規な単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、配列番号９３または配列番号９４の配列あるいはそれらの部分配列を含む。ここで、この部分配列は、このポリペプチドのシグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの少なくとも１つを含む。
【０３２６】
（さらなる局面）
上記の任意の単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ポリペプチドあるいは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、さらに、以下の成分の少なくとも１つを含み得る：シグナル配列、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメイン。本明細書中に記載される種々のＮＣＳＭポリペプチド配列由来のこのようなシグナル配列、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインの種々の組み合わせが、作製され得る。１つの局面において、シグナル配列、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインシグナル配列は、それぞれ、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかに示される、シグナル配列、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインから選択される。
【０３２７】
上記の任意の単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドあるいは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、それぞれ全長ＣＤ２８ＢＰポリペプチドもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドあるいはそれらのフラグメント（例えば、短縮型ＥＣＤ）またはそれらの部分配列の可溶性細胞外ドメインを含み得る。任意のこのようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰ−ＥＣＤまたはそれらのフラグメントとＩｇポリペプチドを含み得る、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質を含み得る。Ｉｇポリペプチドは、Ｆｃヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧポリペプチドであり得る。
【０３２８】
上記の任意の単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドあるいは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドはまた、ポリペプチド精製部分配列を含み得る。ポリペプチド精製部分配列は、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合体から選択される。
【０３２９】
さらに、上記される単離されたＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドあるいは組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、改変されたアミノ酸を含み得る。改変されたアミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸および有機誘導化剤に結合したアミノ酸であり得る。
【０３３０】
本発明はまた、上記される任意のＣＤ２８ＢＰポリペプチドおよび／またはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドの少なくとも１つのポリペプチドと賦形剤またはキャリアとを含む組成物を提供する。１つの局面において、組成物は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントを含む単離されたかまたは組換えのＮＣＳＭポリペプチドとキャリアまたは賦形剤とを含む。ＣＤ２８ＢＰフラグメントは、ヒトＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と等価であるかまたはそれより大きいＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。ＣＴＬＡ−４ＢＰフラグメントは、ｈ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と等価であるかまたはそれより大きいＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含む薬学的組成物であり得る。例示的であり、そして好ましい組成物ならびに薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリアは、以下に記載される。
【０３３１】
（コンセンサス配列および部分配列）
本発明はまた、本明細書中に記載される２つ以上のＮＣＳＭポリペプチド配列の比較から導き出された少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドコンセンサス配列を含む。例えば、本発明は、本明細書中に記載されるそれぞれ、２つ以上のＣＤ２８ＢＰポリペプチド配列またはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド配列の比較から導き出される少なくとも１つのＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドコンセンサス配列を含む。本明細書中に使用されるＣＤ２８ＢＰポリペプチドコンセンサス配列は、本明細書中に記載される本発明の全てのＣＤ２８ＢＰポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される活性を有する全長ポリペプチドおよびＥＣＤポリペプチドならびにフラグメント）に共通するアミノ酸、そして位置において、その全てのサブタイプに共通するアミノ酸が存在しない１つ以上の位置では主に存在するアミノ酸を含み、そしていかなる場合においても、本発明の少なくとも１つのＣＤ２８ＢＰにおける部位において実在していないアミノ酸残基を含まない、天然に存在しないポリペプチドまたは組換えポリペプチドをいう。ＣＤ２８ＢＰポリペプチドコンセンサス配列は、本明細書中に記載されるようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドの少なくとも１つの特性（例えば、ｈＢ７−１のＣＤ−２８ＢＰ／ＣＴＬＡ４−ＢＰ結合親和性非ヒトと少なくとも等価であるかまたはそれかより大きなＣＤ２８ＢＰ／ＣＴＬＡ−４ＢＰ結合親和性比；免疫応答を増大する能力、Ｔ細胞増殖または活性化を刺激する能力）を有し得る。
【０３３２】
ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドコンセンサス配列は、本発明の全てのＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド（例えば、全長ポリペプチドおよびＥＣＤポリペプチド）に共通するアミノ酸残基を主に含み、そして１つ以上の全てのサブタイプに共通するアミノ酸が存在しない位置、その位置で主に存在するアミノ酸を含み、そしていかなる場合においても本発明の少なくとも１つのＣＴＬＡ−４ＢＰにおける部位において存在していないアミノ酸残基を含まない、天然に存在しないポリペプチドまたは組換えポリペプチドをいう。ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドコンセンサスは、本明細書中に記載されるようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドの少なくとも１つの特性（例えば、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４ＢＰ／ＣＤ２８ＢＰ結合親和性比と少なくとも等価であるかまたはそれより大きなＣＤ２８ＢＰ／ＣＬＴＡ−４ＢＰ結合親和性比；免疫応答の抑制、Ｔ細胞増殖または活性化の阻害）を有し得る。
【０３３３】
各Ｒ１およびＲ２　ＣＤ２８ＢＰアミノ酸配列との全長親ＷＴ　ｈＢ７−１のアミノ酸配列のアライメントを、図２Ａ〜２Ｈに示す。各Ｒ１およびＲ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰアミノ酸配列との全長親ＷＴ　ｈＢ７−１のアミノ酸配列のアライメントを、図３〜３Ｈに示す。両方の図はまた、シグナルペプチド、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよび成熟領域（矢印を参照のこと）に対応するｈＢ７−１の領域を示す。示されるように、多くのＣＤ２８ＢＰ配列およびＣＴＬＡ−４ＢＰ配列は、ｈＢ７−１とこれらの組換え（キメラ）ＮＣＳＭの比較によって示されるように推定シグナル配列に２つのさらなるアミノ酸残基を含む；従って、これらの配列についてのＥＣＤは、推定ではアミノ酸残基３７で開始する。再帰的な配列組換えに使用される７種の親種のうちウシアミノ酸残基のみが、推定シグナルペプチド配列に２つのさらなるアミノ酸配列を含む。
【０３３４】
１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載されるＣＤ２８ＢＯまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドの少なくとも１つの特質を有するＣＤ２８ＢＰコンセンサスポリペプチド配列（配列番号２８３）およびＣＴＬＡ−４ＢＰコンセンサスポリペプチド配列（配列番号２８６）ならびにそれらのそれぞれのフラグメントまたは部分配列を提供する。ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４コンセンサス配列の部分配列は、図２Ａ〜２Ｈおよび図３〜３Ｈにおけるアライメントに示される任意のそれぞれのＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドのそれぞれのＥＣＤ、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、シグナルペプチドまたは成熟領域に（アライメントの視覚的点検を介して）実質的に対応する配列を含む。
【０３３５】
本発明はまた、それぞれ、図２〜２Ｈおよび図３Ａ〜３Ｈに示される他のＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰアミノ酸配列のフラグメントおよび部分配列ならびに、このようなフラグメントおよび部分配列をコードする核酸を含む。いくつかのこのようなＣＤ２８ＢＰアミノ酸フラグメントおよびＣＴＬＡ−４ＢＰアミノ酸フラグメントならびにＣＤ２８ＢＰ部分配列およびＣＴＬＡ−４ＢＰ部分配列は、上記の記載されるように、それぞれ、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドに類似または等価（または改善された）少なくとも１つの特性を有する。
【０３３６】
特に、本発明は、それぞれ、図２Ａ〜２Ｈおよび３〜３Ｈに示されるＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰのアミノ酸フラグメントまたは部分配列ならびにこのようなフラグメントおよび部分配列をコードする核酸配列を含み、ここで、このフラグメントまたは部分配列は、図２Ａ〜２Ｈおよび３Ａ〜３Ｈに示されるＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ配列の成熟ドメイン、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、シグナルペプチドおよび／または細胞質ドメインの少なくとも１つを含む。これらのドメインは、機能分析、発現パターンまたはＷＴ　Ｂ７−１配列の対応ドメインとのアミノ酸（または核酸）アライメントによる比較によって同定され得る。
【０３３７】
例えば、ｈＢ７−１ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）配列は、等価な位置で整列化されるアミノ酸（または核酸）残基で、本発明のフラグメントまたは部分配列と整列化される。ＣＤ２８ＢＰフラグメントまたはＣＴＬＡ−４ＢＰフラグメントあるいはＣＤ２８ＢＰ部分配列またはＣＴＬＡ−４ＢＰ部分配列についての特定のドメイン（例えば、ＥＣＤ）におけるアミノ酸残基（または核酸残基）の番号付けは、対応するＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド（またはポリヌクレオチド）配列における残基の番号付け、または所望の場合、親またはＷＴ　Ｂ７−１ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）配列（例えば、ｈＢ７−１）におけるアミノ酸番号付けに基づく。本発明のＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドのシグナル配列、ＥＣＤ、成熟ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含むアミノ酸あるいは同一物をコードするポリヌクレオチドは、ＷＴ　Ｂ７−１（例えば、ｈＢ７−１）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの対応領域とのアライメントによって決定され得る。ＷＴ　Ｂ７−１（図２〜２Ｈおよび３Ａ〜３Ｈ）についての位置と等価の位置は、決定され得る。
【０３３８】
本発明はまた、配列番号４８〜６８、１７４〜２２１、２８３〜２８５および２８９〜２９３の少なくとも１つのから選択される単離されたかまたは組換えのＣＤ２８ＢＰポリペプチド配列の少なくとも１つのフラグメントを提供する。ここで、このフラグメントは、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４レセプターに結合または特異的に結合し、そして／またはＣＤ２８ＢＰポリペプチドについて本明細書中で記載されるように、Ｔ細胞レセプターの刺激（例えば、抗原によって）と組み合わせてＴ細胞増殖または活性化を誘導し、ただしこのフラグメント自体は、このような特性を有することが、当該分野において公知のアミノ酸フラグメントではない。
【０３３９】
さらに、本発明は、配列番号６９〜９２、２２２〜２７２および２８６〜２８８の少なくとも１つから選択される単離されたかまたは組換えのＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド配列の少なくとも１つのフラグメントを提供する。ここで、フラグメントは、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４レセプターに結合もしくは特異的に結合し、そして／またはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドについて本明細書中で記載されるように、Ｔ細胞活性化または増殖を阻害し、ただしこのフラグメント自体は、このような特性を有することが、当該分野において公知のアミノ酸フラグメントではない。ＣＴＬＡ−４ＢＰまたはＣＤ２８ポリペプチドのいずれかに記載されるようなこのような特性を有する配列番号９３〜９４のフラグメントもまた、含まれる。
【０３４０】
配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および／または２８３〜２９３のいずれかの以下の成分の少なくとも１つに対応するポリペプチド配列もまた提供される：シグナルペプチド、ＥＣＤ、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインまたは成熟領域あるいはこのような成分のそれらの任意の組み合わせ（例えば、シグナルペプチドおよびＥＣＤ）。少なくとも１つのさらなる配列におけるこれらの個々の成分の１つ以上を融合した、１つのこのような配列由来する１つ以上のこれらの個々の成分のいずれかを含む組換えポリペプチドはまた、本発明において意図される。
【０３４１】
（ポリペプチドの作製）
本発明のＮＣＳＭポリペプチドを産生および単離するための組換え方法は、上記される。組換え産生に加えて、このポリペプチドは、固相技術を使用して直接的なペプチド合成によって産生され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＷＨ　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４を参照のこと）。ペプチド合成は、手動の技術を用いてかまたは自動化によって実行され得る。自動化合成は、例えば、製造者らによって提供される指示書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて達成され得る。例えば、部分配列は、別々に化学合成されても、化学方法を用いて組み合わせて化学合成されてもよく、全長ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する。あるいは、このような配列は、ポリペプチドの産生に特定化される、任意の多くの会社から注文され得る。最も通常に、ＮＣＳＭポリペプチドは、例えば、本明細書中に記載されるようにコード核酸を発現することおよびポリペプチドを回収することによって産生される。
【０３４２】
本発明のポリペプチドを産生するための方法はまた、含まれる。１つのこのような方法は、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸（これは、必要に応じて、コードされたポリペプチドを産生するのに有効な調節配列に作動可能に連結される）を細胞の集団に導入する工程、培養培地中で細胞を培養して、ポリペプチドを産生する工程、および細胞または培養培地からポリペプチドを単離する工程を包含する。細胞による取り込み（トランスフェクション）および／またはＮＣＳＭポリペプチドの発現を容易にするのに十分な量の核酸が、利用される。培養培地は、本明細書中および実施例に記載され任意の培養培地であり得る。核酸は、本明細書中に記載される任意の送達方法（例えば、注入、遺伝子銃、受動取り込み（ｐａｓｓｉｖｅ　ｕｐｔａｋｅ）などを含む）によってこのような細胞に導入される。ＮＣＳＭ核酸は、組換え発現ベクター（ＤＮＡプラスミドベクターまたは本明細書中に記載される任意のベクタークを含む）のようなベクターの一部であり得る。ＮＣＳＭ核酸を含む核酸またはベクターは、本明細書中（上記）および実施例（下記）に記載されるように調製および処方され得る。このような核酸または発現ベクターは、インビボで哺乳動物の細胞の集団に導入され得るか、または哺乳動物の選択された細胞（例えば、腫瘍細胞）は、哺乳動物およびコードされたポリペプチドの取り込みおよび発現が、生じるような十分な量において核酸発現ベクターが、このような細胞の集団にエキソビボで導入される。あるいは、核酸またはＮＣＳＭ核酸を含むベクターは、インビトロで培養された細胞を使用して産生される。１つの局面において、ＮＣＳＭポリペプチドを産生する方法は、ベクターの取り込みおよびＮＣＳＭポリペプチドの発現が生じるような量および処方において本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸を含む組換え発現ベクターを細胞の集団に導入する工程；本明細書中に記載される任意の導入／送達様式によって哺乳動物に発現ベクターを投与する工程；および哺乳動物または哺乳動物の副産物からポリペプチドを単離する工程を包含する。
【０３４３】
（ポリペプチド抗体の使用）
本発明の別の局面において、本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントは、抗体（これは、例えば、ＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントの活性、分布および発現に関する、例えば、診断的用途、治療的用途または予防的用途を有する）を産生するために使用される。本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対する抗体は、当該分野で周知の方法によって産生され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。抗体、例えば、レセプター結合をブロックする抗体は、治療的用途および／または予防的用途のために特に好ましい。
【０３４４】
抗体誘導のためのＮＣＳＭポリペプチドは、生物学的活性を必要としない；しかし、このポリペプチドまたはオリゴペプチドは抗原性である。特定の抗体を誘導するために使用されるペプチドは、少なくとも約１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約１５個または約２０個のアミノ酸または少なくとも約２５または３０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。ＮＣＳＭポリペプチドの短い伸長物は、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）およびキメラ分子に対して産生された抗体と融合され得る。
【０３４５】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知であり、そして多くの抗体が利用可能である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｃｏｌｌｉｇａｎら編，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９１年および２００１年，補遺）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、ならびにその中で引用された参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７を参照のこと。抗体の調製のために適切な他の技術は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択を包含する。Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４〜５４６を参照のこと。特定のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗血清は、通常、少なくとも約０．１μＭ、好ましくは少なくとも約０．０１μＭ以下、そして最も典型的かつ好ましくは０．００１μＭ以下のＫＤで結合する。
【０３４６】
キメラ（ヒト化）抗体を調製するための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号に見出され得る。ヒト化および他の抗体の産生、ならびに操作技術についてのさらなる詳細は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ））およびＰａｕｌ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（Ｐａｕｌ）に見出され得る。
【０３４７】
１つの有用な実施形態において、本発明は、本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントに対する完全にヒト化された抗体を提供する。ヒト化抗体は、この抗体がヒト患者における治療薬および／または予防薬としてインビボで使用される適用において特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から特徴的に構成される。本発明のヒト抗体は、広範な方法を使用する際に産生され得る（総説について、例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、米国特許第５，００１，０６５号、ならびにＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ　ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙおよびＰａｕｌ、前出を参照のこと）。一実施形態において、本発明のヒト抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞において最初に産生される。次いで、この抗体をコードする遺伝子は、クローン化され、そして他の細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）において発現される。トリオーマ技術によりヒト抗体を産生するための一般的なアプローチは、Ｏｓｔｂｅｒｇら（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　２：３６１〜３６７，Ｏｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号、およびＥｎｇｅｌｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号に記載される。この方法によって得られた抗体産生細胞株は、それらが３つの細胞（２つのヒト細胞および１つのマウス細胞）から下行するため、トリオーマと呼ばれる。トリオーマは、ヒト細胞から作製された従来のハイブリドーマよりも安定に抗体を産生することが見出された。
【０３４８】
（配列バリエーション）
（保存的に改変されたバリエーション）
本発明のＮＣＳＭポリペプチドは、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３およびそのフラグメントのいずれかの配列の保存的に改変されたバリエーションを含む。このような保存的に改変されたバリエーションは配列番号４８〜４９、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３のいずれかにおいて、単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸（典型的には約５％未満、より典型的には約４％、２％または１％未満）を変化、付加または欠失する、置換、付加または欠失を含む。
【０３４９】
例えば、配列番号４８として本明細書中で同定される２９６アミノ酸ポリペプチドの保存的に改変されたバリエーション（例えば、欠失体）は、約２８２アミノ酸、好ましくは約２８５アミノ酸、より好ましくは約２８８アミノ酸、さらにより好ましくは約２９１アミノ酸そしてなおさらに好ましくは約２９４アミノ酸またはそれより多い（ポリペプチド配列の約５％、４％、３％、２％、または１％未満の欠失に対応する）の長さを有する。
【０３５０】
配列番号４８として本明細書中で同定されるポリペプチドの保存的に改変されたバリエーション（例えば、「保存的に置換されたバリエーション」）の別の例は、２９６アミノ酸ポリペプチドの約１５残基まで（すなわち、約５％未満）において、表２（前出）に記載される６個の置換群に従う「保存的置換」を含む。
【０３５１】
例えば、４個の保存的置換が、配列番号４８のアミノ酸６９〜９４に対応する領域に位置する場合、以下のこの領域の保存的に改変されたバリエーションの例、
ＱＫＤＳＫ　ＭＶＬＡＩ　ＬＰＧＫＶ　ＱＶＷＰＥ　ＹＫＮＲＴＩは、以下を含む、
ＮＫＤＳＫ　ＭＶＶＡＩ　ＬＰＧＫＶ　ＱＶＦＰＥ　ＹＫＮＫＴＩおよび
ＱＫＤＡＫ　ＭＶＬＡＩ　ＬＰＧＲＶ　ＱＭＷＰＥ　ＹＫＱＲＴＩなど、ここで、保存的な置換基に、下線を付す。
【０３５２】
本発明のＮＣＳＭポリペプチド配列またはそのフラグメント（保存的に置換された配列を含む）は、タンパク質（例えば、ポリＨｉｓセグメント、ＦＬＡＧタグセグメントなど）を精製するための１つ以上のドメインが付加する際に生じるようなより大きなポリペプチド配列の一部として存在し得る。これらのさらなる機能的ドメインは、タンパク質のＮＣＳＭ部分の活性に対してほとんどかまたは全く影響を有さないか、またはさらなるドメインが、プロテアーゼを用いる処理（インテインの内包など）によるのような合成後の処理工程によって除去され得る。
【０３５３】
（免疫反応活性によるＮＣＳＭポリペプチドの定義付け）
２つの核酸配列またはポリペプチドが、実質的に相同であることのさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに免疫学的に交差反応性であるか、または特異的に結合することである。例えば、２つのペプチドが、保存的な置換基によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的に第２のポリペプチドに実質的に同一である。
【０３５４】
句「特異的（または選択的）に結合する」「特異的（または選択的）に結合される」あるいは「特異的（または選択的）に免疫反応性である」は、ポリペプチドについていう場合、ポリペプチドおよび他の生物製剤の異種の集団の存在下で、ポリペプチド由来のポリペプチドまたはエピトープの存在の決定因子である抗体との結合反応をいう。抗体または他の結合剤と抗原との間の特異的な結合は、一般に、少なくとも約１０５〜１０６Ｍ−１の結合親和性を意味する。
【０３５５】
従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特異的抗体は、特定のポリペプチドに結合し、そしてサンプルに存在する他のポリペプチドには有意な量で結合しない。多価の抗原性ポリペプチドに対して惹起される抗体は、一般的に１つ以上のエピトープが得られたポリペプチドに結合する。このような条件下での抗体に対する特異的結合は、特定のポリペプチドに対するその特異性に関して選択される抗体を要求し得る。種々の免疫アッセイフォーマットが用いられ、特定のポリペプチドに特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学は、慣用的に用いられ、タンパク質に特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択する。特定の免疫反応性を決定するために用いら得る免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（以後、「ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ」））を参照のこと。代表的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そしてより代表的には、バックグラウンドの２．５倍〜５倍または１０〜１００倍を超える。
【０３５６】
本発明のポリペプチドは、例えば、免疫学的アッセイにおいて認識され得る構造的特徴を提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（少なくとも１つの抗原について）を含む抗血清およびこのような抗血清によって結合されるポリペプチドの産生は、本発明の特徴である。本明細書中に記載される抗体を含む、好ましい結合剤は、少なくとも約１０６〜１０７Ｍ−１および好ましくは、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の親和性でＮＣＳＭポリペプチドおよびフラグメントに結合する。従来のハイブリドーマ技術を使用して、約１０９Ｍ−１そのまでの親和性を有する抗体を産生する。しかし、新規な技術（ファージディスプレイおよびトランスジェニックマウスを含む）を使用して、より高い親和性を達成し得る（例えば、少なくとも約１０１２Ｍ−１まで）。一般に、より高い親和性は、利点である。
【０３５７】
本発明は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３またはそれらのフラグメントの１つ以上から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの免疫原に対して産生された抗体またはポリクローナル抗血清と特異的に結合するかまたは特異的に免疫反応するＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントを含む。他のペプチドとの交差反応を回避するために、この抗体または抗血清は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３およびＹ０９９５０によって表される核酸によってコードされるポリペプチドを用いて減算される。このＧｅｎＢａｎｋ配列が核酸に対応する場合、この核酸によってコードされるポリペプチドが生成され、そして抗体／抗血清減算目的のために使用される。この核酸が非コード配列（例えば、偽遺伝子）に対応する場合、この核酸のリーディングフレームに対応するアミノ酸が生成され（例えば、合成的に）るか、または組換え産生のための開始コドンを含むように最小改変される。
【０３５８】
１つの代表的な形式において、この免疫アッセイは、以下のうちの１つ以上に対応する１つ以上の配列を含む１つ以上のＮＣＳＭポリペプチドに対して惹起されるポリクローナル抗血清を使用する：配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３あるいはその実質的な配列またはそのフラグメント（すなわち、提供される全長配列のうちの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のアミノ酸を含む）。配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２および２８３〜２９３由来の潜在的ポリペプチド免疫原の全セットは、本明細書中で集団的に「免疫原性ポリペプチド」と呼ばれる。得られる抗血清は、必要に応じて、コントロール（例えば、同時刺激性ホモログ）に対して低い交差反応性を有するように選択され、そして任意のこのような交差反応性は、免疫アッセイにおけるポリクローナル抗血清の使用の前に、コントロールポリペプチドのうちの１つ以上を用いる免疫吸着によって除去される。例えば、本明細書中および上に記載されるＢＬＡＳＴまたは他のアルゴリズムを使用して（例えば、デフォルトパラメーターを使用する）決定される場合、例えば、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上同一である、このような配列に実質的に同一な配列もまた、使用され得る。
【０３５９】
別の局面において、本発明は、本発明のＮＣＳＭポリペプチドを哺乳動物に投与することによって産生される抗体または抗血清を提供し、この抗体は、１つ以上の抗原、すなわち（配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む抗原に特異的に結合し、この抗体は、以下のうち１つ以上によってコードされるポリペプチドに特異的に結合しない：ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号Ａ９２７４９、Ａ９２７５０、ＡＡ９８３８１７、ＡＢ０２６１２１、ＡＢ０３０６５０、ＡＢ０３０６５１、ＡＢ０３８１５３、ＡＦ０１０４６５、ＡＦ０６５８９３、ＡＦ０６５８９４、ＡＦ０６５８９５、ＡＦ０６５８９６、ＡＦ０７９５１９、ＡＦ１０６８２４、ＡＦ１０６８２５、ＡＦ１０６８２８、ＡＦ１０６８２９、ＡＦ１０６８３０、ＡＦ１０６８３１、ＡＦ１０６８３２、ＡＦ１０６８３３、ＡＦ１０６８３４、ＡＦ２０３４４２、ＡＦ２０３４４３、ＡＦ２１６７４７、ＡＦ２５７６５３、ＡＨ００４６４５、ＡＨ００８７６２、ＡＸ０００９０４、ＡＸ０００９０５、Ｄ４９８４３、Ｌ１２５８６、Ｌ１２５８７、Ｍ２７５３３、Ｍ８３０７３、Ｍ８３０７４、Ｍ８３０７５、Ｍ８３０７７、ＮＭ００５１９１、Ｓ７４５４１、Ｓ７４５４０、Ｓ７４６９５、Ｓ７４６９６、Ｕ０５５９３、Ｕ１０９２５、Ｕ１９８３３、Ｕ１９８４０、Ｕ２６８３２、Ｕ３３０６３、Ｕ３３２０８、Ｕ５７７５５、Ｕ８８６２２、Ｘ６０９５８、Ｙ０８８２３、およびＹ０９９５０。
【０３６０】
配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３から選択される配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗血清もまた含まれ、ここで、この抗体は、上記のＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド登録番号の１つ以上によってコードされるポリペプチドに特異的に結合しない。
【０３６１】
免疫アッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、この免疫原性ポリペプチドのうちの１つ以上が、本明細書中に記載されるように産生および精製される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株において産生され得る。マウスの近交系（マウスの実質的な遺伝的同一性に起因して結果がより再現性であるため、このアッセイにおいて使用される）は、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）および標準的なマウス免疫化プロトコルと組み合わせて、免疫原性ポリペプチドで免疫される（抗体の産生、特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイの形式および条件の標準的な説明については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前述）を参照のこと）。あるいは、本明細書中で開示される配列由来の１つ以上の合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、キャリアタンパク質と結合体化され、そして免疫原として使用される。
【０３６２】
ポリクローナル血清は収集され、そして免疫アッセイ（例えば、固体支持体上に固定された免疫原性ポリペプチドのうちの１つ以上を用いる固相免疫アッセイ）において免疫原性ポリペプチドに対して力価測定される。１０６以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、プールされ、そしてコントロール共刺激ポリペプチドを引かれ、引かれてプールされて力価測定されたポリクローナル抗血清を生じる。
【０３６３】
この引かれてプールされて力価測定されたポリクローナル抗血清は、コントロールポリペプチドに対する交差反応性について試験される。好ましくは、免疫原性ＮＣＳＭポリペプチドのうちの少なくとも２つ（好ましくは、コントロールポリペプチドのうちの少なくとも２つと共に）がこの決定において使用され、免疫原性ポリペプチドによって特異的に結合される抗体を同定する。
【０３６４】
この比較アッセイにおいて、識別力のある結合条件は、引かれて力価測定されたポリクローナル抗血清について決定され、これは、力価測定されたポリクローナル抗血清の免疫原性ＮＣＳＭ分子への結合について、任意のコントロールポリペプチドへの結合と比較して少なくとも約５〜１０倍高いシグナル：ノイズ比を生じる。すなわち、この結合反応のストリンジェンシーは、非特異的競合物（例えば、アルブミンまたは脱脂乳）の添加によって、または塩の状態、温度などを調整することによって調整される。これらの結合条件は、試験ポリペプチドが、プールされて引かれたポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるか否かを決定するための引き続くアッセイにおいて使用される。特に、試験ポリペプチド（これは、識別力のある結合条件下で、コントロールポリペプチドよりも少なくとも２〜５倍高いシグナル：ノイズ比、および免疫原性ポリペプチドと比較して少なくとも約１／２のシグナル：ノイズ比を示す）は、公知のＢ７−１または関連する共刺激ポリペプチドと比較して、免疫原性ポリペプチドと実質的な構造的類似性または相同性を共有し、従って、これは本発明のＮＣＳＭポリペプチドである。
【０３６５】
別の例において、競合結合形式における免疫アッセイは、試験ポリペプチドの検出のために使用される。例えば、示されるように、交差反応する抗体は、コントロールポリペプチドを用いる免疫吸収によって、プールされた抗血清混合物から除去される。次いで、この免疫原性ポリペプチドは固体支持体に固定され、これは引かれてプールされた抗血清に暴露される。試験タンパク質は、このプールされて引かれた抗血清への結合について競合するために、このアッセイに添加される。固定されたタンパク質と比較して、このプールされて引かれた抗血清への結合について競合するこの試験タンパク質の能力は、結合について競合するためにこのアッセイに添加されたこの免疫原性ポリペプチドの能力と比較される（この免疫原性ポリペプチドは、プールされた抗血清への結合について、固定された免疫原性ポリペプチドと効率的に競合する）。試験タンパク質についての交差反応性のパーセントは、標準的な計算を使用して算出される。
【０３６６】
並行アッセイにおいて、プールされて引かれた抗血清への結合に対して競合するコントロールタンパク質の能力は、この抗血清への結合について競合する免疫原性ポリペプチドの能力との比較として決定される。重ねて、コントロールポリペプチドについての交差反応性のパーセントは、標準的な計算を使用して算出される。この交差反応性のパーセントが、試験ポリペプチドについて少なくとも５〜１０倍高い場合、この試験ポリペプチドは、このプールされて引かれた抗血清を特異的に結合するといわれる。
【０３６７】
一般に、免疫吸収されかつプールされた抗血清は、免疫原性ポリペプチドに対して任意の試験ポリペプチドを比較するために、本明細書中に記載されるような競合結合免疫アッセイにおいて使用され得る。この比較を行うために、２つのポリペプチドが各々広範な濃度でアッセイされ、そして、固定されたタンパク質への引かれた抗血清の結合の５０％を阻害するために必要な各ポリペプチドの量が、標準的な技術を使用して決定される。必要とされる試験ポリペプチドの量が、必要とされる免疫原性ポリペプチドの２倍未満の場合、この量がコントロールポリペプチドについて少なくとも約５〜１０倍高ければ、この試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質に対して産生される抗体に特異的に結合するといわれる。
【０３６８】
特異性の最終的な決定として、このプールされた抗血清は、免疫吸収において使用される免疫原性ポリペプチドへの、得られた免疫原性ポリペプチドを引かれてプールされた抗血清の結合がほとんどまたは全く検出されなくなるまで、必要に応じて免疫原性ポリペプチド（コントロールポリペプチドではなく）を用いて完全に免疫吸着される。次いで、この完全に免疫吸着された抗血清は、試験ポリペプチドとの反応性について試験される。ほとんどまたは全く反応性が観察されない場合（すなわち、免疫原性ポリペプチドへの完全に免疫吸着された抗血清の結合について、２倍以下のシグナル：ノイズ比が観察される場合）、この試験ポリペプチドは、免疫原性タンパク質によって誘発される抗血清によって特異的に結合される。
【０３６９】
（ＮＣＳＭ分子の増殖／活性化および抗増殖／不活性化の性質）
ＮＣＳＭポリペプチドおよびそのフラグメントの効果を、下記の実施例に記載されるように、Ｔ細胞上で検査した。その結果は、本発明のＮＣＳＭポリペプチドもしくはそのフラグメント、または可溶性ＮＳＣＭ−ＥＣＤおよびＮＳＣＭ−ＥＣＤ−Ｉｇを含む組成物を、本発明の方法において使用して、例えば、Ｔ細胞レセプターの刺激と共に（例えば、抗原もしくは抗ＣＤ３　Ａｂによって）、Ｔ細胞の増殖および／または活性化を誘導または抑制し得ることを示す。Ｔ細胞増殖／活性化を誘導または抑制する、ＮＣＳＭポリペプチドもしくはそのフラグメントの能力は、代表的に、例えば、Ｔ細胞レセプターの刺激と共に（例えば、抗原もしくは抗ＣＤ３　Ａｂによって）、Ｔ細胞の増殖もしくは活性化を誘導または抑制する野生型Ｂ７−１（例えば、ヒトＢ７−１、霊長類Ｂ７−１、またはウシＢ７−１）の能力に対して測定される。同様に、このようなＮＣＳＭポリペプチドもしくはそのフラグメント、または可溶性ＮＳＣＭ−ＥＣＤおよびＮＳＣＭ−ＥＣＤ−ＩｇをコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドを、本発明の方法において使用して、例えば、このようなＮＣＳＭ分子でトランスフェクトされ、そしてこのようなＮＳＣＭを発現または分泌する細胞を使用することによって、Ｔ細胞の増殖および／もしくは活性化を誘導または抑制し得る。ここで、また、Ｔ細胞の増殖および／もしくは活性化を誘導または抑制する、発現または分泌されたＮＣＳＭペプチド分子の能力を、同じ様式で測定する。
【０３７０】
Ｔ細胞の増殖／活性化を誘導または抑制することを、インビトロで（例えば、種々の増殖アッセイにおいて、もしくは、例えば癌患者に投与され得る癌抗原特異的Ｔ細胞の産生において有用であるように）、またはインビボで（例えば、治療的および／もしくは予防的に有用であるように）、実行し得る。
【０３７１】
本発明のＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ（およびそれらのフラグメント）、ならびにこのような本発明のＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ（およびそれらのフラグメント）をコードする核酸は、特異的抗原もしくは抗原の混合物の存在下または非存在下で、遺伝子ベースの治療剤／ワクチンとして使用される場合、または、例えば、可溶性ポリペプチド、タンパク質、もしくはそのフラグメントとして投与される場合のいずれかで、多くの適用において有用である。
【０３７２】
本発明の組成物を使用して、Ｔ細胞の増殖／活性化の刺激またはＴ細胞の増殖および／もしくは活性化の抑制が患者に対して有益である種々の状態を、予防的または治療的な処置、従って予防、緩和または回復し得る。このような使用としては、例えば、感染性疾患の予防、種々の慢性感染性疾患、癌、アレルギー、自己免疫疾患、敗血症性ショックの治療的および予防的処置、対宿主性移植片病などの予防および処置；ならびに器官移植拒絶などの予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７３】
本発明の産物をまた、遺伝子治療において使用して、導入遺伝子を発現する細胞の免疫系認識を減少させ、従って、この導入遺伝子の発現の寿命を延長し得る。本発明の産物を発現するトランスジェニック動物の産生は、必要に応じて、ヒトのための器官の供給源（例えば、この器官は、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰを発現し得、これは、この器官の表面上で、宿主Ｔ細胞の応答を下方調節し、従って拒絶の危険を減少させる）などとして使用され得る。
【０３７４】
ＣＴＬＡ−４ＢＰの開発における所望の目的は、ＣＴＬＡ−４を介して特異的に信号を送り、従って例えば、寛容を誘導し、活性化されたＴ細胞を抑制し、そしてＴ細胞の調節を誘導し得るＮＣＳＭ分子を作製することであった。免疫応答を改変する他の経路（例えば、シクロスポリンＡでの非特異的な免疫抑制、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇもしくは抗Ｂ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）でのＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用の妨害、または抗ＣＤ４０Ｌ　ＡｂでのＡＰＣ−Ｂ細胞活性化の妨害）は、欠陥を有し（例えば、これらは、一般的な免疫抑制を誘導するか、またはこれらは、Ｔ細胞の増殖を阻害する、など）、そして本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰの目的、すなわち、抗原特異的なＴ細胞の寛容の誘導を達成しない。遺伝子治療におけるＣＴＬＡ−４ＢＰの適用の例（しかし限定しない）は、例えば、ＣＴＬＡ−４ＢＰおよび導入遺伝子（あるいは、ＣＴＬＡ−４ＢＰおよび導入遺伝子は別々のプラスミド上にあり得る）をコードするベクターを使用することによって示され、そしてこの導入遺伝子は、標的細胞中に導入され、そしてその遺伝子産物は同じ細胞表面上に提示される。この導入遺伝子（ＭＣＨに関連する）は、Ｔ細胞上でＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と相互作用するが、ＣＴＬＡ−４ＢＰは、Ｔ細胞上でＣＴＬＡ−４と相互作用し、これらは全て、Ｔ細胞応答を阻害または減少し、そして導入遺伝子の延長された発現を誘導する。
【０３７５】
本発明の産物（すなわち、ポリペプチド、核酸およびそれらのフラグメント）は、ワクチンアジュバント（例えば、遺伝子ワクチン、タンパク質ワクチン、弱毒化または殺傷したウイルスワクチン）のようなものにおいて、有用であり得る。例えば、ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ（もしくはそれらのフラグメント）の核酸は、遺伝子ワクチンおよび遺伝子治療ベクター（例えば、ＤＮＡワクチン、ウイルスベクター）の成分であり得るか、または、これらは目的の細胞（例えば、腫瘍細胞、樹状細胞）において発現され得、これは次いで、ワクチンもしくは治療剤として使用され得る。さらに、本発明の産物は、増幅ができないようにされた後（例えば、照射によって）、細胞ベースのワクチンとして使用され得る腫瘍細胞にトランスフェクトされ得る。あるいは、このようなトランスフェクトされた細胞は溶解され、そして得られた溶解物は、ワクチンとして使用される。
【０３７６】
目的の抗原と共に、ＤＮＡワクチンにおける成分として野生型ヒトＢ７遺伝子を使用することは、Ｔ細胞に対して陽性および陰性の両方のシグナルを生じる。なぜなら、野生型ヒトＢ７は、Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方と結合するからである。しかし、本発明の産物（例えば、ＣＤ２８ＢＰまたはそのフラグメント）をコードするＤＮＡワクチンは、Ｔ細胞応答に合わせて選択的に応答し得、例えば、ＤＮＡワクチンにおけるＣＤ２８ＢＰは、Ｔ細胞に対する陽性のシグナル（例えば、Ｔ細胞の増殖／活性化を誘導するシグナル）を生じる。例えば、ＣＤ２８ＢＰは、黒色腫（ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および／またはチロシナーゼに関連する）のための処置ワクチンにおいて、必要に応じて使用される。例示的な、しかし限定しない例は：例えば、４サイクルの処置の間の例えば、２週間の期間での、ＤＮＡ（抗原）の皮内注射、続くタンパク質（ＣＤ２８ＢＰ）の皮下注射である。ＣＤ２８ＢＰは、生命を脅かす黒色腫の処置において、野生型と交差反応する低い危険性を示す。ＣＤ２８ＢＰをコードする核酸のフラグメントは、手順において必要に応じて使用される。別の例示的な、しかし限定しない例としては、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰまたはそのフラグメントが、必要に応じて、多発性硬化症のための処置ワクチンにおいて、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）と組み合わせて使用され、これは、例えば、３週間ごとに６ヶ月間の筋肉内注射として、または条件が正当化する場合に与えられる。
【０３７７】
ＮＣＳＭ（例えば、ＣＤ２８ＢＰもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰ）またはそれらのフラグメントを利用する遺伝子ベースのワクチンは、目的の抗原およびＮＣＳＭ（例えば、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰのいずれか）の両方をコードするプラスミドから必要に応じて構成される（あるいは、目的の抗原は、ＮＣＳＭ遺伝子（例えば、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ遺伝子）由来の別々のプラスミド上にあり得る）。このプラスミドの遺伝子の産物は、例えば、ＡＰＣの表面で発現される。Ｔ細胞の増殖／活性化を引き起こすＴ細胞上のＴ細胞レセプターおよびＣＤ２８それぞれとの相互作用は、目的の抗原（ＭＨＣに関連する）とＣＤ２８ＢＰとの間（両方共、例えばＡＰＣ上にある）で生じる。必要に応じて、Ｔ細胞のアネルギー／寛容を引き起こすＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＴＬＡ−４それぞれとの相互作用は、目的の抗原（ＭＨＣに関連する）とＣＴＬＡ−４ＢＰとの間（両方共、例えばＡＰＣ上にある）で生じる。
【０３７８】
ＣＤ２８ＢＰ適用の別の例は、ＣＤ２８ＢＰまたはそのフラグメントをコードするプラスミドの使用を介した特異的Ｔ細胞活性化の誘導によって示される。このプラスミドは、腫瘍細胞にトランスフェクトされ（例えば、エキソビボで）、これは、例えば、照射されて増殖が停止し、次いでワクチンとして使用される（または、必要に応じて腫瘍細胞溶解物（例えば、Ｍｅｌａｃｉｎｅ（登録商標））が使用される）。腫瘍抗原は、（ＭＨＣに関連して）Ｔ細胞に提示され、そしてＴＣＲと相互作用する。さらに、腫瘍抗原と共に細胞上で発現するＣＤ２８ＢＰは、Ｔ細胞に提示され、そしてＣＤ２８と相互作用し、従って、Ｔ細胞活性化を引き起こす。
【０３７９】
（可溶性ＮＣＳＭポリペプチドおよび核酸）
本発明は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチド（またはそれらのフラグメント）、およびそれらをコードする核酸を提供する。選択された領域（例えば、ＥＣＤ、短縮された細胞外ドメイン、ＮＣＳＭポリペプチドの分泌された部分配列）またはそれらのフラグメントが、ポリペプチドおよび核酸の両方の形式で提供される。これらの可溶性分子は、予防的、治療的、および／または診断的ツールとしての使用に適切であり、そして、本明細書中に記載される特異的な作用および種々の適用のために標的化または設計され得る。
【０３８０】
可溶性Ｂ７−１タンパク質およびフラグメントは、記載され、そして特徴付けられている。例えば、米国特許第６，０７１，７１６号を参照のこと。可溶性Ｂ７−１タンパク質およびそのフラグメントを発現し、このような分子を培地から回収し、例えば、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン産生についてこのような分子をスクリーニングして特徴付けするための、例えば、米国特許第６，０７１，７１６号に記載のような、標準的な手順が使用され得、そして本発明の可溶性ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントに適用され得る。
【０３８１】
「可溶性」ＮＣＳＭポリペプチド（例えば、本発明の可溶性ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ）は、ＮＣＳＭポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＥＣＤのフラグメント（例えば、短縮されたＥＣＤ）のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。この可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、代表的に、全長の細胞質ドメインまたは膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列を含まない。シグナルペプチドもしくはリーダー、またはそれらのフラグメントに対応するアミノ酸配列は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドに含まれても含まれなくてもよい。可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメント（例えば、ＮＣＳＭ　ＥＣＤもしくはそれらのフラグメントに連結するＩｇ（例えば、ＩｇＧ）のＦｃ部分）を、さらに含み得る。１つの局面において、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、ＮＣＳＭ　ＥＣＤまたはそれらのフラグメント、およびＩｇまたはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｃ部分を含む）を含む融合タンパク質を含む。Ｉｇは、ヒト、霊長類、または他の動物由来であり得る。可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、宿主細胞において組換え的に産生される場合、宿主細胞を囲む培地中に自由に分泌される。上またはこれ以降に記載される、このような可溶性ＮＣＳＭポリペプチド（またはそのフラグメント）のいずれかをコードする核酸もまた、本発明の局面である。
【０３８２】
本発明の各ＮＣＳＭ分子について、推定ＥＣＤポリペプチド配列（またはそのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列）は、ＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチド配列（またはＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を、ヒトＢ７−１または他の哺乳動物Ｂ７−１（例えば、霊長類）の類似のＥＣＤポリペプチド配列（またはそのＥＣＤポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と整列させることによって、決定され得る。それぞれの推定シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよび成熟領域に対応する、推定アミノ酸配列および推定核酸配列もまた、本発明の各ＮＣＳＭ分子について同様に決定され得る。このような整列比較によって決定されたＮＣＳＭポリペプチドおよびポリヌクレオチドのこれらのドメイン／領域のそれぞれは、推定であり、従って、それぞれ長さが１アミノ酸以上または１核酸以上変化し得ることが、当業者に容易に理解される。当業者は、当該分野で公知の他の分析（ｈＢ７−１において対応するドメイン／領域を決定するために使用される分析を含む）によって、このようなドメイン／領域を、容易に確認し得る。
【０３８３】
可溶性ＮＣＳＭ分子は、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８レセプターのいずれかに対する優先的な結合を示し得る。可溶性の野生型（ＷＴ）ヒトＢ７−１の、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する結合と比較した場合、可溶性ＣＤ２８ＢＰ（およびそれらのフラグメント）は、ＣＤ２８と優先的に結合し得、そしてＣＴＬＡ−４ＢＰ（およびそれらのフラグメント）は、ＣＴＬＡ−４と優先的に結合し得る。例えば、抗原が、Ｔ細胞上のＴＣＲとこの抗原とが相互作用する細胞の表面で（ＭＨＣに関連して）提示される場合、可溶性ＣＤ２８ＢＰは、必要に応じてＣＤ２８分子を介してＴ細胞と同時に相互作用し得、従って、Ｔ細胞増殖／活性化を引き起こす。逆に、抗原が、Ｔ細胞上のＴＣＲとこの抗原とが相互作用し、その上同時に、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰもまた、（ＣＴＬＡ−４分子を介して）Ｔ細胞と相互作用する細胞の表面で（ＭＨＣに関連して）提示される場合、Ｔ細胞アネルギー／寛容が生じ得る。
【０３８４】
必要に応じて、そしてさらに、本発明の可溶性ＮＣＳＭ分子もしくはそれらのフラグメントは、それぞれのＴ細胞レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る。可溶性ＣＤ２８ＢＰ分子は、必要に応じて、ＣＤ２８と結合することによってＴ細胞の増殖／活性化を刺激することによって、アゴニストとして作用し得るか、または、可溶性ＣＤ２８ＢＰ分子は、必要に応じて、Ｔ細胞の増殖／活性化を刺激することなくＣＤ２８と結合することによって、アンタゴニストとして作用し得る。さらに、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰ分子は、必要に応じて、ＣＴＬＡ−４と結合し、Ｔ細胞の増殖／活性化を阻害することによって（例えば、Ｔ細胞を刺激しないことによって）アゴニストとして作用し得るか、または、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰ分子は、ＣＴＬＡ−４と結合し、Ｔ細胞の増殖／活性化を阻害しないことによって、アンタゴニストとして作用し得る。
【０３８５】
これらの可溶性ＮＣＳＭ分子は、種々の形式によって、被験体へ送達され得る。例えば、可溶性ＮＣＳＭ分子は、ポリペプチドもしくはタンパク質（もしくはそれらのフラグメント）として、あるいは、このようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸（もしくはそのフラグメント）として送達され得る。
【０３８６】
本発明はまた、タンパク質の融合（例えば、本発明のＣＤ２８ＢＰもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰ）またはそれらのフラグメントを、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンの一部と共に含む、融合タンパク質を提供する。得られたタンパク質−Ｉｇ融合物（または免疫接着体もしくはＦｃ−融合タンパク質）は、改善された薬物動態（例えば、インビボでの延長した寿命、および増加した発現）を示し得る。このような融合タンパク質はまた、精製を単純化し得、そして特異的タンパク質のためのアイソタイプのエフェクター機能を増大させ得る。例えば、Ｉｇ−タンパク質融合物の使用および適用の総説について、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　９（２）：１９５〜２００を参照のこと。本発明のＮＣＳＭは、例えば、免疫グロブリンの多くの改変体に融合し得、そしてＮＣＳＭ融合物は、例えば、使用されるＩｇ分子の型によって限定されない。全長ＮＣＳＭ分子に加えて、ＮＣＳＭ分子のフラグメント（例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはＥＣＤのフラグメント）は、Ｉｇ分子に融合され得る。種々の配列（例えば、リンカー配列、タンパク質分解性切断部位（例えば、第Ｘａ因子切断部位）など）はまた、ＮＣＳＭ融合タンパク質に組み込まれ得る。このようなＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本発明の別の局面である。
【０３８７】
ヒトＩｇＧ　Ｆｃドメインに融合するＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質は、本発明の局面である（例えば、下記の実施例４を参照のこと）。ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、可溶性であり（従って、例えば、予防剤および治療剤としてのその使用が広がる）、そして融合のＩｇ部分によって安定化されるという利点を有する。本発明の可溶性ＮＣＳＭポリペプチド−ＩｇＧ融合タンパク質は、予防剤および／または治療剤としての使用に適している。なぜなら、これらは、特異的な作用および種々の適用に標的化または合わせられ得るからである。
【０３８８】
本発明のＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質およびポリペプチドは、例えば、本発明の（全体を通して示されるような）ＮＣＳＭタンパク質およびポリペプチドと類似の適用（例えば、本明細書中に記載される、治療的適用、予防的適用、および診断的適用を含む）のために使用され得る。本発明のこれらのＩｇ融合タンパク質はまた、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８のいずれかに対する優先的な結合を示す。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するヒトＢ７−１の結合と比較した場合、ＣＤ２８ＢＰ−Ｉｇ融合物（およびそれらのフラグメント）は、ＣＤ２８と優先的に結合し、そしてＣＴＬＡ−４ＢＰ−Ｉｇ（およびそれらのフラグメント）は、ＣＴＬＡ−４と優先的に結合する。例えば、抗原が、Ｔ細胞上のＴＣＲとこの抗原とが相互作用する細胞の表面で（ＭＨＣに関連して）提示される場合、可溶性ＣＤ２８ＢＰ−Ｉｇ融合タンパク質は、必要に応じてＣＤ２８分子を介してＴ細胞と同時に相互作用し得、従って、Ｔ細胞増殖／活性化を引き起こす。逆に、抗原が、Ｔ細胞上のＴＣＲとこの抗原とが相互作用し、その上同時に、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰ−Ｉｇ融合タンパク質もまた、（ＣＴＬＡ−４分子を介して）Ｔ細胞と相互作用する細胞の表面で（ＭＨＣに関連して）提示される場合、Ｔ細胞アネルギー／寛容が生じ得る。
【０３８９】
必要に応じて、可溶性ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ−Ｉｇ）、もしくはそれらのフラグメント、またはＮＣＳＭ（例えば、ＣＤ２８ＢＰもしくはＣＴＬＡ−４ＢＰ）に基づくタンパク質（もしくはタンパク質融合物）は、Ｔ細胞に対するそれぞれのレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストとして使用される。例えば、ＣＤ２８ＢＰもしくはＣＤ２８ＢＰ−Ｉｇ融合物は、ＣＤ２８に対する結合を介してＴ細胞の増殖／活性化を刺激することによってアゴニストとして、または、Ｔ細胞の増殖／活性化を誘導することなく、ＣＤ２８に対する結合によってアンタゴニストとして作用する。あるいは、ＣＴＬＡ−４もしくはＣＴＬＡ−４ＢＰ−Ｉｇ融合物は、ＣＴＬＡ−４に対する結合を介してＴ細胞の増殖／活性化を阻害する（または刺激しない）ことによってアゴニストとして、または、Ｔ細胞の増殖／活性化を阻害することなくＣＴＬＡ−４に結合することによって、アンタゴニストとして作用する。
【０３９０】
１つの局面において、ＩｇＧ　ＦｃヒンジドメインであるＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを、ＤＮＡシャッフリングのような再帰的配列組換え方法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または別の多様性生成方法を使用して、改変するかまたは進化させて、選択された親ＩｇＧ　Ｆｃ配列の群由来の、組換えＩｇＧ　ＦｃヒンジＣＨ２ドメイン、組換えＩｇＧ　ＦｃヒンジＣＨ３ドメインのライブラリーを生成し、次いで、適切なスクリーニング手順によって、このライブラリーはスクリーニングして、少なくとも１つのＦｃγレセプターに対する結合の減少を示す、少なくとも１つの組換えＦｃ定常ドメイン（例えば、ＦｃγＲＩＩおよびＲｃγＲＩＩＩ）を含むキメラＩｇＧ　Ｆｃを同定する。具体的には、組換え（シャッフリングされた）ＩｇＧ分子のライブラリーを、ＢｓｔｅＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして、少なくとも１つのＮＣＳＭ核酸配列を含むＢｓｔＥＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化プラスミドに連結して、ＦｃγＲ非結合ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質分子およびＦｃγＲ結合減少型ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質分子を生成する。このような発現プラスミドで一過的にトランスフェクトされた２９３細胞由来の上清が、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのいずれかを発現する２９３細胞と共にインキュベートされ、そして発現された組換えクローンの結合親和性は、ＦＩＴＣに結合体化したＮＣＳＭ特異的ｍＡｂを使用して、ＦＡＣＳ分析法により決定される。１つ以上のＦｃγＲに対して低かした結合を示すかまたは結合を示さないＩｇＧ　Ｆｃ改変体は、本発明の１つ以上の特異的ＮＣＳＭを有する融合パートナーとして使用され、そしてこれは上記の適用において有用である。
【０３９１】
Ｉｇ配列または領域との融合に加え、本発明の融合タンパク質は、ＮＣＳＭ分子と組み合わせて任意のタンパク質配列、またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、任意のこのような融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。例えば、本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントは、例えば、融合タンパク質の分類を可能にするポリペプチド配列（例えば、蛍光指示分子）と融合され得る。あるいは、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントは、例えば、特定の細胞型または特定の細胞に対するこの融合の標的化を可能にする融合タンパク質に導入され得る。
【０３９２】
本発明の融合タンパク質は、種々の様式（例えば、または本明細書中で詳細に記載されるような、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはこのようなポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸として）によって、被験体に送達され得る。
【０３９３】
（治療的処置方法および予防的処置方法）
本発明のＮＣＳＭポリヌクレオチドおよびＮＣＳＭポリペプチドは、種々の適用（例えば、タンパク質に基づくワクチン接種およびＤＮＡに基づくワクチン接種を含む）において、ならびに免疫応答の操作（例えば、誘導および抑制）、Ｔ細胞の活性化もしくは増殖、および／またはサイトカイン産生が望ましい、予防的疾患治療および治療的疾患治療において有益な用途である特性を有している。
【０３９４】
１つの局面において、本発明は、インビボまたはエキソビボで、上記のような本発明の、１つ以上の核酸もしくはそれらのフラグメント、またはポリペプチドもしくはそのフラグメント（あるいは、薬学的に受容可能な賦形剤および１つ以上のこのような核酸またはポリペプチドを含む、組成物、ベクター、または、形質転換された細胞）を、被験体またはこの被験体の細胞集団に投与することによって、疾患または障害を治療学的または予防学的に処置する方法を含む。この被験体としては、例えば、ヒト、霊長類、サル、オラウータン、ヒヒ、マウス、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジを含む哺乳動物、または鳥類のような非哺乳類脊椎動物（例えば、鳥類（ニワトリもしくはアヒル）または魚類）あるいは無脊椎動物が挙げられる。
【０３９５】
本発明の１つの局面において、エキソビボ方法で、１つ以上の細胞または被験体の目的細胞の集団（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頸部、膣、前立腺、口、舌など、の細胞）が、被験体から得られるかまたは取り出され、そして疾患、障害、または他の状態を予防的または治療的に処置するのに有効である量の本発明のポリペプチドと接触される。次いで、接触された細胞は、被験体に、戻されるかまたは送達される（その細胞が得られる部位か、または処置される被験体における目的の別の部位（例えば、上で定義された部位を含む））。所望の場合、この接触された細胞は、標準的移植技術および周知の移植技術を使用して、被験体における目的の、組織、器官、または系の部位（上記の全てを含む）に移植され得るか、または、例えば、標準的送達技術または輸血技術を使用して、血液またはリンパ系に送達され得る。
【０３９６】
本発明のＣＤ２８ＢＰポリペプチドおよび／または本発明の核酸は、エキソビボでＴ細胞を活性化する方法に使用され得、例えば、Ｔ細胞を被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）から得るかまたは取り出し、そしてＴ細胞を有効に活性化するのに十分な量の１つ以上の本発明のポリペプチドを被験体に投与すること（または、１つ以上のこのようなＴ細胞への核酸の取り込みが生じ、そして、この核酸の十分な発現が、結果としてＴ細胞を活性化するのに有効な量のポリペプチドを産生するように、プロモーターを有する十分な量の１つ以上の本発明の核酸を投与すること）によって行われ得る。次いで、活性化されたＴ細胞は被験体に戻される。Ｔ細胞は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、被験体の末梢血からＴ細胞を誘導するか、または、Ｔ細胞を被験体の腫瘍から直接的に得ること）によって、被験体から得られ、そして単離され得る。
【０３９７】
本発明のＣＤ２８ＢＰポリペプチドおよび／または本発明の核酸を使用して、例えば、細胞（例えば、抗原提示細胞）を被験体（例えば、ヒトのような哺乳動物）から得るかまたは取り出し、そしてＴ細胞を有効に活性化するのに十分な量の１つ以上の本発明のポリペプチドを、取り出した細胞に投与してすぐにこれらの取り出した細胞を被験体に戻すこと（または、１つ以上の取り出した細胞への核酸の取り込みが生じ、そして、この取り出した細胞を被験体に戻す際にこの核酸の十分な発現が、結果としてＴ細胞を活性化するのに有効な量のポリペプチドが産生されるように、プロモーターを有する十分な量の１つ以上の本発明の核酸を投与すること）によって、Ｔ細胞をエキソビボで活性化し得る。
【０３９８】
本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸が投与される被験体においてＴ細胞応答を阻害する（例えば、Ｔ細胞の活性化またはＴ細胞の増殖を阻害する）のに有用である。別の局面において、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸は、投与後にＴ細胞の増殖を完全に阻害することなしに、Ｔ細胞活性化を調整する。別の局面において、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチドをコードする核酸は、投与後の被験体におけるＴ細胞の活性化を調整するが、可溶性モノクローナル抗体（例えば、Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合する抗ＣＤ３モノクローナル抗体）によって活性化された精製Ｔ細胞の増殖を誘導しない。
【０３９９】
本発明はまた、被験体の目的の、少なくとも１つの細胞または細胞集団を、疾患、障害、または他の状態を予防学的または治療学的に処置するのに有効な、十分な量の本発明のＮＣＳＭポリペプチドと、直接的にまたは間接的に接触させる、インビボ方法を提供する。直接的な（例えば、局所的な）接触または投与の様式において、このポリペプチドは、代表的には、任意の種々の様式（局所投与、注射（例えば、ニードルまたはシリンジを用いる）、またはワクチンまたは遺伝子銃送達、あるいは組織、器官、または皮膚部位へのプッシング（ｐｕｓｈｉｎｇ）を含む）によって、処置されるべき細胞または目的の組織部位（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頸部、膣、前立腺、口、舌など、の細胞）に直接的に（例えば、局所的に）投与されるか、または移入される。
【０４００】
このＮＣＳＭ分子は、種々の経路（筋肉内、皮内、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経口、腹腔内、鞘内、静脈内）によって送達され得るか、または、体腔内（例えば、外科手術の間に）配置され得るか、あるいは吸入投与、または膣内投与、または直腸投与により送達され得る。
【０４０１】
インビボおよびエキソビボの間接的な接触／投与の様式において、ＮＣＳＭポリペプチドは、代表的に、本発明のＮＳＣＭポリペプチドを、処置を容易にし得る１つ以上の細胞または細胞の集団に直接接触させるかまたは投与することによって、処置されるべき細胞にかまたは目的の組織部位（上記の細胞または組織部位（例えば、皮膚細胞、器官系、リンパ系、または血液細胞系など）を含む）に間接的に投与または移入される。例えば、被験体の身体内の腫瘍細胞が、血液もしくはリンパ系、皮膚、または器官の細胞を十分量のポリペプチドと接触させることにより処置され得、その結果、目的の部位（例えば、目的の、組織、器官もしくは細胞、または身体内の血液もしくはリンパ系）へのポリペプチドの送達が生じ、そして結果として有効な予防的処理または治療的処置が、生じる。このような接触、投与、または移入は、代表的に、１つ以上の経路または上記の投与の方法を用いて行われる。
【０４０２】
別の局面において、本発明は、エキソビボでの方法を提供し、この方法において、被験体の目的の１つ以上の細胞または目的の細胞の集団（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頸、膣、前立腺、口、舌などの細胞）が、被験体から得られるかまたは取り出され、そして疾患、障害、または他の状態を予防的または治療的に処置するのに有効である目的の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）をコードする本発明の標的核酸配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド構築物と、この１つ以上の細胞または細胞の集団を接触させることにより形質転換される。１つ以上の細胞または細胞の集団が、この核酸配列の発現を制御するのに十分量のポリヌクレオチド構築物およびプロモーターと接触され、その結果、細胞へのポリヌクレオチド構築物（およびプロモーター）の取り込みが生じ、そして、結果として、本発明の標的核酸配列の十分な発現が、疾患、障害または状態を予防的または治療的に処置するのに有効な量の生物学的に活性なポリペプチドを産生する。このポリヌクレオチド構築物は、本発明のＮＣＳＭ核酸配列、および／あるいは、所望の場合、別のＮＣＳＭポリペプチド、サイトカイン、アジュバント、もしくは同時刺激分子、の少なくとも１つ、または目的の他のポリペプチドをコードする、１つ以上のさらなるヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーター配列（例えば、野生型、組換え、またはキメラのＣＭＶプロモーター配列）を含み得る。
【０４０３】
トランスフェクション後、形質転換された細胞が、被験体（それらの細胞が得られた組織部位もしくは系または被験体において処置されるべき別の部位（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、頸、膣、前立腺、口、舌などの細胞））に、戻されるか、送達されるか、または移入される。所望の場合、これらの細胞を、標準かつ周知の移植技術を使用して被験体における目的の組織、皮膚、器官または身体系に移植され得るか、または標準的送達技術かまたは輸血技術を使用した血液またはリンパ系に送達され得る。形質転換される細胞の、このような送達、投与、または移入は、代表的に上記の投与の１つ以上の経路または様式を使用することにより行われる。標的核酸の発現が、天然に存在するかまたは（以下により詳細に記載されるように）誘導され得、そしてコードされるポリペプチドの量が、部位または組織系で疾患または状態を処置するために十分かつ有効に発現される。
【０４０４】
別の局面において、本発明は、インビボ方法を提供する。この方法において、被験体の目的の１つ以上の細胞または細胞の集団（例えば、上記のそれらの細胞および細胞系および被験体を含む）が、細胞または細胞の集団を、疾患、障害、または他の状態を予防的または治療的に処置するのに有効である目的の生物学的に活性なポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチド）をコードする本発明の核酸配列を含むポリヌクレオチド構築物と接触させること（または１つ以上の上記の投与の経路もしくは様式を使用して、細胞または細胞の集団に投与または移入すること）により、被験体の身体において形質転換される。
【０４０５】
ポリヌクレオチド構築物は、（例えば、上記の投与経路または投与様式の１つ以上を使用して直接接触により）疾患または障害を示すかまたは有する細胞に直接投与または移入され得る。あるいは、このポリヌクレオチド構築物は、第１に、上記に記載の投与の１つ以上の経路または様式を使用して、非疾患細胞または他の疾患細胞を、生物学的に活性なポリペプチドをコードする核酸、およびこの核酸配列の発現を制御するプロモーターを含む十分量のポリヌクレオチド構築物と直接接触することによって、疾患また障害を示すかまたは有する細胞に間接的に投与または移入され得、その結果、細胞へのこのポリヌクレオチド構築物（およびプロモーター）の取り込みが生じ、そしてその結果、本発明の核酸配列の十分な発現が生じて、この疾患または障害を予防的または治療的に処置するのに有効な量の生物学的に活性なポリペプチドを産生し、そしてこれによって、ポリヌクレオチド構築物または得られた発現ポリペプチドが、自然にもしくは自動的に、被験体の身体の初めの送達部位、組織、または器官から、被験体の身体の疾患の部位、組織、器官または系（例えば、血液またはリンパ系を介して）移入される。標的核酸の発現が、（以下に詳細に記載のように）発現されたコードされたポリペプチドの量が、この疾患または状態を処置するのに十分かつ有効であるように天然に存在するかまたは誘導され得る。このポリヌクレオチド構築物は、本発明のＮＣＳＭ核酸配列、および／あるいは、所望の場合、別のＮＣＳＭポリペプチド、サイトカイン、アジュバント、もしくは同時刺激分子、の少なくとも１つ以上、または目的の他のポリペプチドをコードする１つ以上のさらなるヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーター配列（例えば、野生型、組換え、またはキメラのＣＭＶプロモーター配列）を含み得る。
【０４０６】
１つの局面において、患者の腫瘍細胞は、目的のＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＣＤ２８ＢＰ）をコードするＤＮＡプラスミドベクターでトランスフェクトされ、免疫応答の改善（例えば、増強されたＴ細胞応答または増大した抗体力価）を容易にする。この腫瘍細胞は、患者から取り出され得、エキソビボでトランスフェクトされ得、次いで、患者（好ましくは、この腫瘍部位）に再送達され得る。あるいは、この腫瘍の細胞は、目的のＮＳＣＭポリペプチド（例えば、ＣＤ２８ＢＰ）をコードするＤＮＡプラスミドを送達することによって、インビボでトランスフェクトされる。いずれの場合においても、この免疫応答は、本明細書中に記載の方法を使用してＴ細胞の増殖を測定することによってか、または標準的なプロトコルを使用して抗体レベルを測定することによって測定され得る。別の局面において、可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤまたは可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇをコードするＤＮＡプラスミドが、本発明に記載の任意の手段（全身的、皮下、ｉ．ｍ．、皮内などでの、ニードルまたは遺伝子銃あるいは本明細書中に記載の他の導入機構を介して）を用いて患者に投与される；所望される場合、このプラスミドは、患者の腫瘍細胞または腫瘍関連細胞に直接的に導入され得る。
【０４０７】
なお別の局面において、可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤポリペプチドまたは可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質が、本明細書中に記載の任意の手段（全身的、皮下、ｉ．ｍ．、皮内などでの、ニードルまたは遺伝子銃あるいは本明細書中に記載の他の導入機構を介して）によって患者に投与される；所望される場合、このポリペプチドまたは融合タンパク質は、患者の腫瘍細胞または腫瘍関連細胞に直接的に送達される。この可溶性ＮＣＳＭは、ワクチン接種プロトコルの一部分として抗原と共に（同時または連続のいずれかで）投与され得る。
【０４０８】
本発明のＮＣＳＭポリペプチドおよびこれらをコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドはまた、本明細書中に記載のようなワクチン適用におけるワクチンアジュバントとして有用であり、そしてこのような疾患を試験および診断するためのインビトロ適用に関して診断目的のために有用である。例えば、本発明のＮＳＣＭ（例えば、ＣＤ２８ＢＰ）またはＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（あるいは、それらのフラグメント（例えば、ＥＣＤ）または融合タンパク質）が、それぞれ、このＤＮＡワクチンによってコードされている抗原またはそのタンパク質抗原自体の免疫刺激特性を増強することによって、ＤＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンに対するアジュバントとしての役割を果たし得る。これらの様式のいずれかで、生じるＮＣＳＭ分子は、抗原に対する被験体の免疫応答を非特異的に増強し得る。
【０４０９】
上記のような、インビボおよびエキソビボ処置方法の各々において、賦形剤と本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはＮＣＳＭ核酸とを含む組成物が、投与され得るかまたは送達され得る。１つの局面において、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、ＰＢＳ）と本発明のＮＣＳＭポリペプチドまたはＮＣＳＭ核酸とを含む組成物は、疾患および障害を処置するための有効量で上記のような被験体に投与または送達され得る。
【０４１０】
別の局面において、上記のインビボおよびインビトロの処置方法の各々で、細胞または被験体に投与されるポリヌクレオチドの量は、被験体の１つ以上の細胞への上記ポリヌクレオチドの取り込みが生じ、そしてこの核酸配列の十分な発現が生じ、被験体内の免疫応答（免疫原（例えば、抗原）によって誘導された免疫応答を含む）を増大するのに有効な量の生物学的に活性なＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＥＣＤ）を産生するのに十分な量であり得る。別の局面において、各方法について、細胞または被験体に投与されたポリペプチドの量は、被験体内で免疫応答（免疫原（例えば、抗原）によって誘導された免疫応答を含む）を増大するのに十分な量であり得る。
【０４１１】
なお別の局面において、上記のような、インビボおよびエキソビボ処置方法の各々において、細胞または被験体に投与されるポリヌクレオチドの量は、被験体の１つ以上の細胞への上記ポリヌクレオチドの取り込みが生じ、そしてこの核酸配列の十分な発現が生じ、被験体内の寛容またはアネルギー応答を生じるのに有効な量の生物学的に活性なＮＣＳＭポリペプチドを産生するのに十分な量であり得る。別の局面において、このような方法の各々について、細胞または被験体に投与されたポリペプチドの量は、被験体内で寛容またはアネルギー応答を生じるのに十分な量であり得る。
【０４１２】
投与が注射によるこのような方法における使用のためのＤＮＡプラスミドの量は、約５０マイクログラム（μｇ）〜５ｍｇであり、通常は、約１００μｇ〜２．５ｍｇであり、代表的には、約５００μｇ〜２ｍｇであり、または、約８００μｇ〜１．５ｍｇであり、およびしばしば、１ｍｇである。これらの方法（ここで、投与は、遺伝子銃を介する）に使用するＤＮＡプラスミドの量は、約１０００分の１〜１００分の１以下であり；従って、注射を介するＤＮＡプラスミド投与について上記のように与えられた各範囲に関しては、遺伝子銃を介するＤＮＡプラスミド投与の範囲は、約１０００分の１〜１００分の１以下である。例えば、遺伝子銃送達について、上記の第１の範囲に対応するＤＮＡプラスミドの量は、約５０×１０−８〜約５×１０−５ｇ（１００分の１以下）であり、また約５０×１０−９〜約５×１０−６ｇである。ＤＮＡプラスミド量は、ＷＴ　ｈＢ７−１および／または抗原をコードするＤＮＡプラスミドベクターを用いて得られる動物モデルの応答に基づいてか、または哺乳動物のＢ７−１（例えば、ＷＴ　ｈＢ７−１）をコードするプラスミドベクターを使用する既知のＤＮＡワクチン接種研究に基づいて、当業者により容易に調整され得る。このようなＤＮＡプラスミド量は、所望の場合、実施例ＶＩの方法において使用され得る。
【０４１３】
さらに別の局面において、ポリヌクレオチド構築物（または、このポリヌクレオチド構築物を含む組成物）を使用して、生理学的に活性なポリペプチドを被験体に送達するインビボ処置方法またはインビボ処置方法において、このポリヌクレオチド構築物の発現は、誘導性のオン（ｏｎ）遺伝子およびオフ（ｏｆｆ）遺伝子発現系の使用によって誘導され得る。このようなオン遺伝子発現系およびオフ遺伝子発現系の例としては、それぞれ、Ｔｅｔ−ＯｎＴＭ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＳｙｓｔｅｍおよびＴｅｔ−ＯｆｆＴＭ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（例えば、このような各システムの詳細な説明についてはＣｌｏｎｔｅｃｈ　Ｃａｔａｌｏｇ　２０００，１１０〜１１１頁を参照のこと）が挙げられる。他の制御可能または誘導可能なオン遺伝子発現系およびオフ遺伝子発現系は、当業者に公知である。このような系を用いて、ポリヌクレオチド構築物の標的核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）の発現は、正確で可逆的かつ定量的な様式で調節され得る。標的核酸の遺伝子発現は、例えば、標的核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含有する安定トランスフェクト細胞が、目的の組織部位、器官もしくは系に送達もしくは転移されるかまたは接触された後に、誘導され得る。（例えば、手術および／または手術後の治癒の完了のための時間を可能にするため；標的核酸を含むポリヌクレオチド構築物が処置されるべき部位、細胞、系または組織に到達するための時間を可能にするため；この構築物で形質転換された細胞を含有する移植片が、その上もしくはその中に接合または付着された組織もしくは器官に組み込まれるようになるための時間を可能にするためなどに）標的核酸の発現を遅らせるかまたは正確に制御することが有利な処置方法または処置形式において、このような系は特に有益である。
【０４１４】
本発明はまた、癌に罹患する被験体内（例えば、この被験体が腫瘍を有している場合）におけるＴ細胞応答を活性化するか、または増大する治療方法を提供する。この方法は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および賦形剤を含む組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、ＮＣＳＭポリペプチドは、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞によって発現され、そしてＴ細胞応答がこの腫瘍に対して活性化されるか、または増強される。この組成物は、薬学的組成物物であり得、そしてこの賦形剤は、薬学的に受容可能な賦形剤であり得る。この薬学的組成物は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチド（または、少なくとも１つのＮＣＳＭ特性を有するこれらのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列および薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。このようなヌクレオチド配列は、ベクター内に取りこまれ得、そしてプロモーターに作動可能に連結されて、発現を容易にする。
【０４１５】
１つの実施形態において、可溶性ＮＣＳＭポリペプチド（または、少なくとも１つのＮＣＳＭ特性を有するこれらのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列および賦形剤を含む組成物が、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、もしくは、例えば、直接注射で、または遺伝子銃あるいは他のワクチン送達デバイスを介して、この被験体に投与される。この組成物は、種々の経路（既知の場合、腫瘍または腫瘍部位に対する直接投与、または直接注射または遺伝子銃などによる被験体への全身投与）によって、導入され得るか、または投与され得る。この組成物の十分な量が、ＮＣＳＭ−ポリペプチドコードヌクレオチド配列でのこの被験体の腫瘍細胞のトランスフェクションを生じ、Ｔ細胞応答またはＴ細胞活性化が生じるように送達される。上記のように、ヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミド発現ベクターは、「裸の」ＤＮＡとして送達され得るか、または、他の成分（例えば、リン酸カルシウム、脂質など）と一緒に処方され得、トランスフェクションを容易にする。このような処置について示唆された例示的な量の（このＮＣＳＭポリヌクレオチドおよびベクターについての）総ＤＮＡ（例えば、ミリグラムにて）は、本明細書中および以下に実施例に記載される。このＤＮＡプラスミドの量は、腫瘍のさらなる増殖を阻害するか、またはこの腫瘍を死滅させるための治療有効量であり得る。当業者はまた、遺伝子療法またはＤＮＡワクチン接種法およびＷＴ　ｈＢ７−１および哺乳動物モデルを使用する癌の治療のための既知の臨床試験に基づいて治療有効なＤＮＡプラスミドベクター量を決定し得る。
【０４１６】
別の局面において、腫瘍細胞が、被験体から得られる（または、代替的な同種異系腫瘍細胞が使用される）。この腫瘍細胞は、十分な量の発現ベクター（例えば、以下の実施例Ｖに記載の、ｐＭａｘ　Ｖａｘ　ベクター）を用いて本明細書中に記載の技術を使用してトランスフェクトされ、この発現ベクターは、ＮＣＳＭポリペプチド（全長）または可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤポリペプチド（もしくはＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質）をコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドを含み、その結果、発現が生じ、そして可溶性ペプチドの場合、この可溶性ペプチドは、分泌される。
【０４１７】
（遺伝子ベクター）
遺伝子療法および遺伝子ワクチンベクターは、種々の疾患および他の状態の処置および／または予防について有用である。以下の議論は、遺伝子治療および遺伝子ワクチン法は、代表的には、ベクターを使用するのでベクターの使用に主眼をおく。当業者は、本発明の核酸は、特定の適用に依存しつつも、ベクター配列なしで使用され得ることを理解する。従って、以下の議論におけるベクターに対する参照はまた、ベクター配列を欠く本発明の核酸に関連すると理解するべきである。
【０４１８】
ベクターは、免疫応答または多の治療的または予防的応答を誘導するため、患者に送達され得る。適切な被験体としては、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、サル、オランウータン、ヒヒ、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジを含む；あるいは鳥類（例えば、ニワトリもしくはアヒル）または魚類のような非哺乳類脊椎動物、あるいは無脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１９】
ベクターは、代表的には、局所（直接）投与または全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、肛門、膣、経口、頬側の経路、またはそれらは吸入される）による個々の患者への投与によってインビボで送達され得るか、またはそれらは、局所的適用によって投与され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで細胞（例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または万能供血者の造血幹細胞）に送達され得、続いて、これらの細胞は、通常、ベクターを組み込んだ細胞についての選択の後に、患者に再移植される。
【０４２０】
局所（直接）投与形式において、核酸またはベクターは、代表的に、処置される細胞または目的の組織部位（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、器官細胞、血球、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、首、膣、前立腺、口、舌などの細胞）に、種々の形式（局所投与、（例えば、針またはシリンジを使用することによる）注入、あるいはワクチンまたは遺伝子銃送達、組織、器官、または皮膚部位へのプッシングを含む）のいずれかによって、直接投与または移入される。標準的な遺伝子銃投与について、目的のベクターまたは核酸が、微視的な金属ビーズの表面に沈澱され得る。この微粒子は、衝撃波または拡張ヘリウムガスで加速され得、そして組織をいくつかの細胞層の深さまで貫通する。例えば、Ａｇａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ　ＷＩによって作製されたＡｃｃｅｌＴＭ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｄｅｖｉｃｅは、この実施形態における使用のために適する。核酸またはベクターは、例えば、筋肉内に、皮内に、皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経口的に、腹腔内に、鞘内に、静脈内に送達され得るか、または、体腔内に配置され得る（例えば、手術の間を含む）か、あるいは吸入または膣投与または直腸投与によって送達され得る。
【０４２１】
インビボでの間接的接触／投与形式において、核酸またはベクターは、代表的に、処置される細胞または目的の組織部位（上記のもの（例えば、皮膚細胞、器官系、リンパ系、または血球系など）を含む）に、本発明の核酸またはベクターを処置が促進され得る１つ以上の細胞または細胞の集団に直接接触または投与することによって、間接的に投与または移行される。例えば、被験体の身体内の腫瘍細胞は、血液またはリンパ系、皮膚、あるいは器官の細胞を、十分な量のポリペプチドと接触することによって処置され得、その結果、核酸またはベクターの目的の部位（例えば、身体内の組織、器官、または目的の細胞あるいは血液あるいはリンパ系）への送達が生じ、そして有効的な予防処置または治療処置をもたらす。このような接触、投与、または移入は、代表的に、上記のような投与の経路または様式の１つ以上を使用してなされる。
【０４２２】
多数の送達方法が、当業者に周知である。このような方法としては、例えば、リポソームに基づく遺伝子送達（ＤｅｂｓおよびＺｈｕ（１９９３）ＷＯ　９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ　米国特許第５，２７９，８３３号；Ｂｒｉｇｈａｍ（１９９１）ＷＯ　９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１４）、ならびにウイルスベクターの使用（例えば、アデノウイルス（例えば、総説として、Ｂｅｒｎｓら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５−１０４；Ａｌｉら、（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：３６７−３８４；およびＨａｄｄａｄａら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９（Ｐｔ３）：２９７−３０６を参照のこと）、パピローマウイルス、レトロウイルス（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、ならびにＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＦａｕｃｉ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｐａｕｌ（編）、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋおよび本明細書中の参考文献、ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）前出を参照のこと）、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（Ｗｅｓｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒら（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら　ＷＯ９３／２４６４１（１９９３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１およびＡＡＶベクターの概要についてＳａｍｕｌｓｋｉ（前出）を参照のこと；また、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：３２５１−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６−６４７０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：０３８２２−３８２８も参照のこと）などが挙げられる。
【０４２３】
遺伝子ワクチンを含む「裸の」ＤＮＡおよび／またはＲＮＡはまた、組織（例えば、筋肉）へ、針または他の類似のデバイスを使用する注射によって、直接導入され得る。例えば、米国特許第５，５８０，８５９を参照のこと。他の方法（例えば、「微粒子銃」または粒子媒介形質転換（例えば、Ｓａｎｆｏｒｄら、ＵＳＰＮ　４，９４５，０５０；ＵＳＰＮ　５，０３６，００６を参照のこと））はまた、本発明に従って、遺伝子ワクチンを哺乳動物の細胞へ導入するために適している。これらの方法は、インビボでのＤＮＡの被験体（例えば、哺乳動物）への導入のために有用であるのみならず、哺乳動物へ再導入するための細胞のエキソビボ改変のためにも有用である。ＤＮＡは、例えば、注入（例えば、針または「遺伝子銃」を介する）を使用して、哺乳動物または他の被験体の細胞に好都合に直接導入される。遺伝子ワクチンを送達する他の方法について、必要な場合、所望のレベルの免疫調節（例えば、Ｔ細胞活性化またはＴ細胞増殖のレベルまたは応答、あるいは抗体力価レベル）を維持するためにワクチン投与を繰り返す。あるいは、ヌクレオチドは、被験体の皮膚に導入され得る。
【０４２４】
少なくとも１つのＮＣＳＭ配列を含む遺伝子治療および遺伝子ワクチンベクター（例えば、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、アデノウイルス、リポソーム、パピローマウイルス、レトロウイルスなど）は、インビボでの細胞の形質導入のために被験体（通常は哺乳動物）に直接投与され得る。このベクターは、免疫療法処置、または他の予防的処置および／または治療的処置のために、任意の適切な様式での投与（非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）、局所投与、経口投与、直腸投与、膣投与、鞘内投与、頬内（例えば、舌下）投与、あるいは局所的投与（例えば、エアロゾルによるかまたは経皮的に）を含む）のための薬学的組成物として処方され得る。例えば、毛髪を除去する薬剤の使用による皮膚の前処置は、経皮的送達において有用であり得る。このようなパッケージされた核酸を投与するのに適切な方法が利用可能であり、そして当業者に周知である。そして、特定の組成物を投与するために１を越えるの経路が使用され得るが、特定の経路は、しばしば別の経路よりもより即時のそしてより有効な反応を提供する。
【０４２５】
さらに、少なくとも１つのＮＣＳＭをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む（および所望ならば、同じベクター上で同時発現される抗原または他の同時刺激分子をコードするヌクレチド配列をさらに含む）本発明のベクターを使用して、他の免疫学的障害または疾患を予防的にまたは治療的に処置し得るか、または他の免疫学的障害または疾患のこのような処置を補い得るか、あるいは障害、疾患、および例えば、タンパク質ワクチンおよびＤＮＡワクチン中の抗原（ＷＴおよび組換え抗原を含む）に対する保護を増強し得る。これらの障害および疾患としては、例えば、以下が挙げられるが、これらの限定されない：アレルギー／喘息、神経学的疾患、器官移植疾患（例えば、対宿主性移植片病、および自己免疫疾患）、悪性疾患、慢性感染性疾患（例えば、以下を含むが、これらに限定されない：ウイルス感染性疾患（例えば、アルファウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、マラリア、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）、西部ウマ脳脊髄炎（ＷＥＥ）、日本脳炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎などに関係するがこれらに限定されない疾患、ならびに細菌性感染性疾患（これらに限定されないが、例えば、ライム病、結核、およびクラミジア感染）；ならびに本明細書中に記載される他の疾患および障害。
【０４２６】
所望される場合、抗原または他の同時刺激分子をコードするヌクレオチド配列を含む別個のベクターが、本発明のＮＣＳＭ配列を含むベクターとともに同時に送達され得る。
【０４２７】
（組成物および処方物）
本発明また、本発明の任意のＮＣＳＭ核酸またはＮＣＳＭポリペプチドの組成物を含む。１つの局面において、本発明は、本発明の少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチド（またはそのフラグメント）または核酸（またはそのフラグメント）を含む治療組成物および／または予防組成物、ベクター、形質導入された細胞、または本発明の少なくとも１つのＮＣＳＭ核酸またはポリペプチド（またはフラグメント）を含むワクチンを提供する。このような組成物は、必要に応じて、疾患の適切なインビトロモデルおよびインビボ動物モデルにおいて、効力、組織代謝を確認するために、そして投薬量を評価するために、当該分野で周知の方法に従って試験される。特に、疾患または状態を処置または予防するための治療方法および予防方法についての投薬量は、関連アッセイおよび哺乳動物モデル（以下に記載されるものを含む）における類似の組成物を使用して、ＮＣＳＭ分子の他の既知の治療剤に対する活性比較によって決定され得る。
【０４２８】
投与は、必要に応じて、分子を血液または組織細胞と最大限接触させるために通常使用される経路のいずれかによるものである。前出を参考のこと。ＮＣＳＭポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにベクター、細胞、ならびにこのような分子を含む組成物が、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアとともに、任意の適切な様式で投与される。本発明の観点において、患者にこのようなＮＣＳＭ分子を投与する適切な方法が利用可能である。１より多い経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも、即時かつ有効な反応を提供し得る。好ましい経路は、当業者によって、容易に確認され得る。
【０４２９】
ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメント（ＥＣＤ）の少なくとも１つの全長形態を発現する細胞を含む組成物もまた、本発明の特徴であり得る。このような細胞はまた、意図された適用に特化された１つ以上の抗原（例えば、癌抗原）を発現し得る。このような細胞は、ＮＣＳＭポリペプチドおよび／または抗原の少なくとも１つをコードするＤＮＡプラスミドでのトランスフェクションによって、本明細書中に記載されるように、容易に調製され得る。ＮＣＳＭポリペプチドおよび抗原を各々コードする別個のベクターが、細胞をトランスフェクトするために使用され得るか、ＮＣＳＭポリペプチドおよび抗原の両方をコードする二シストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターが使用され得る。このような細胞の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む薬学的組成物であり得る。
【０４３０】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよいがが、必ず含む必要はない。薬学的に受容可能なキャリアは、部分的に、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、広範な種々の本発明の薬学的組成物の適切な処方物が存在する。種々の水性キャリア（例えば、緩衝化生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）など）が、使用され得る。これらの溶液は、滅菌性であり、そして一般に所望でない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって、滅菌され得る。これらの組成物は、生理学的条件を近似するために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。これらの処方物中の遺伝子治療または遺伝子ワクチンベクターの濃度は、広く変化し得、そして流体容積、粘度、体重などに基づいて、選択された投与の特定の様式および患者の必要性に従って主に選択される。
【０４３１】
ＮＣＳＭポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物、ならびにベクター、細胞、ならびに本発明のこれらの成分および他の成分を含む他の処方物が、以下を含むがこれらに限定されない、多くの経路オリゴヌクレオチドよって投与され得る：経口手段、鼻腔内手段、静脈内手段、腹腔内手段、筋肉内手段、経皮手段、皮下手段、皮内手段、局所手段、舌下手段、経膣手段、または直腸手段によって投与され得る。ポリペプチドおよび核酸組成物はまた、リポソームを介して投与され得る。このような投与経路および適切な処方物は、一般に、当業者に公知である。
【０４３２】
ＮＣＳＭポリペプチドまたはポリヌクレオチドあるいはそのフラグメント、もしくはＮＣＳＭ核酸を単独でまたは他の適切な成分と組合せて含むベクターはまた、吸入を介して投与されるエアロゾル組成物（例えば、これらは、「噴霧され得る」）にされ得る。エアロゾル組成物は、受容可能な加圧噴霧体（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に配置され得る。
【０４３３】
経口投与に適する処方物は、（ａ）液体溶液（例えば、有効量のパッケージされた核酸を希釈溶液（例えば、水、生理食塩水またはＰＥＧ４００）に懸濁したもの）；（ｂ）液体、固体、顆粒またはゼラチンとしてあらかじめ決められた量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁物；および（ｄ）適切な乳濁液、からなり得る。錠剤の形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、トラガカント、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカメルロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色料、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、膨潤剤、防腐剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性のキャリアの１つ以上を含み得る。活性成分に加えて、当該分野で公知のキャリアを含む、不活性基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースならびにアカシア乳濁液、ゲルなど）中に活性成分を含む錠剤と同様に、ロゼンジ形態は、香料中に活性成分、通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含み得る。経口的投与される場合、遺伝子治療ベクターおよび遺伝子ワクチンは消化から保護されなければならないことが認識される。このことは、代表的には、ベクターと、ベクターに酸および酵素的な加水分解に対する耐性を与える組成物との複合体化によるか、またはベクターをリポソームのような適切な耐性キャリア中にパッケージングすることによるかのいずれかで、達成される。ベクターを消化から保護する手段は、当該分野において周知である。この薬学的組成物は、例えばリポソーム中、または活性成分の徐放性を提供するための処方物中にカプセル化され得る。
【０４３４】
パッケージされた核酸は、単独でまたは他の適切な成分と共に、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物（例えば、それらは「霧状」であり得る）に作製され得る。エアロゾル処方物は、受容可能な加圧噴霧体（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に置かれ得る。
【０４３５】
直腸投与に適切な処方物は、例えば、座薬の基剤と共にパッケージングされた核酸からなる座薬を含む。適切な座薬の基剤は、天然のもしくは合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素を含む。さらに、パッケージングされた核酸と基材（例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を含む）との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することがまた、可能である。
【０４３６】
非経口投与（例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ　ｔｈｅ　ｊｏｉｎｔｓ）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路による）に適切な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および意図されたレシピエントの血液と等張である処方物にする溶質を含み得る、水溶性および非水溶性の等張性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る水溶性および非水溶性滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈注入、経口的、局所的、腹腔内、嚢内または鞘内によって投与され得る。本発明のパッキングされた核酸またはポリペプチドの処方は、アンプルおよびバイアルのような単用量または多用量の密封された容器中に存在する。
【０４３７】
非経口投与および静脈内投与は、好ましい投与の方法である。特に、既存の同時刺激治療剤および予防処置プロトコル（例えば、哺乳動物Ｂ７−１ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（例えば、ｈＢ７−１））を、現在の用途において薬学的組成物および処方物と共に現在使用されているもの）のために、既に使用されている任意の投与経路は、ＮＣＳＭポリヌクレオチドまたはポリペプチド（およびそのフラグメント）についての投与および処方の好ましい経路である。
【０４３８】
注射溶液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒および先に記載された種類の錠剤から調製され得る。パッケージされた核酸によって形質導入された細胞はまた、静脈内にまたは非経口的に投与され得る。
【０４３９】
エキソビボまたはインビボ治療の観点から、本明細書中に記載されるようなＮＣＳＭ核酸で形質導入された細胞はまた、静脈内にまたは非経口的に投与され得る。患者への細胞の送達（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、または腹腔内投与または他の一般的な経路を介する血液への細胞の送達）は、慣用的であることが理解される。
【０４４０】
患者に投与する用量は、本発明の状況において、患者において経時的に有益な効果（例えば、変更された免疫応答、あるいは他の治療的および／または予防的応答をもたらすために、あるいは例えば、適用に依存して、病原体による感染を防止するために十分であるべきである。用量は、特定の核酸、ポリペプチド、ベクター組成物または処方物の効力、形質導入された細胞、細胞型、および／あるいはそこに含まれるかまたは使用されるＮＣＳＭポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの活性、ならびに患者の状態、および処置される患者の体重、表面積、または血管表面積によって決定される。用量の大きさはまた、特定の患者における任意のこのような特定のポリペプチド、核酸、ベクター、処方物、組成物、形質導入された細胞、細胞型などの投与に伴う任意の有害な副作用の、存在、性質、および程度によって決定される。特定の疾患または障害の治療的または予防的処置のために使用される投薬量は、同じ疾患または障害についての既存の治療的または予防的処置プロトコルのために使用される投薬量との比較によって、当業者によって決定され得る。
【０４４１】
注射溶液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒および先に記載された種類の錠剤から調製され得る。パッケージされた核酸によって形質導入された細胞はまた、静脈内にまたは非経口的に投与され得る。
【０４４２】
医学的状態または疾患状態（例えば、癌またはウイルス性疾患）の処置または予防のために、患者に投与されるベクター、細胞型、組成物または処方物の有効量の決定において、医師は、患者について、例えば、循環血漿レベル、ベクター／細胞／処方物／ＮＣＳＭ分子の毒性、疾患または状態の進行、および抗ベクター／ＮＣＳＭポリペプチド抗体の産生、ならびに被験体の当業者に公知の他の因子への依存性を、評価する。
【０４４３】
１つの局面において、例えば、感染または他の状態の処置または予防において投与されるベクターの有効量の決定において（ここで、このベクターは、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭ核酸配列を含むか、または本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチドをコードする）、医師は、もしあれば、ベクターの毒性、疾患の進行、および抗ベクター抗体の産生を評価する。１つの局面において、ベクター由来の裸の核酸の等用量は、代表的には７０キログラムの患者に対し、約１０ｎｇ〜約１ｇ、約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ、約１μｇ〜約１０ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇ、または約３０〜３００μｇの範囲であり得る。その核酸を送達するために使用されるベクターの用量は、等量の治療用核酸を生ずるように計算される。投与は単回量または分割した量を介して達成され得る。
【０４４４】
別の局面において、例えば、７０キログラムの患者に投与される用量は、現在使用される同時刺激またはＷＴ　Ｂ７−１治療用または予防用タンパク質（ｈＢ７−１のような）などの任意の投薬量に等しい範囲であり得、そしてＮＣＳＭ配列を生成するベクターまたは細胞の用量は、必要に応じて、等量のＮＣＳＭ核酸または発現されたポリペプチドまたはタンパク質を生じるように計算される。少なくとも１つのＮＣＳＭをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（および、所望ならば、同じベクターに抗原または他の同時刺激分子のいずれかをコードするヌクレオチド配列をさらに含む）本発明のベクターは、種々の癌（例えば、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、癌、脳癌、白血病、黒色腫、頭部癌および頚部癌、胃癌、頸部癌、卵巣癌、リンパ腫、結腸癌、結腸直腸、ならびにウイルス媒介状態）を、任意の公知の従来の治療（細胞傷害性薬剤、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＨＩＶ感染の処置に使用される場合）、生物学的応答改変剤などを含む）によって、予防的にまたは治療的に処置するためか、またはこれらの種々の癌のこのような処置を補うために使用され得る。
【０４４５】
治療的適用において、組成物は、疾患（例えば、感染性疾患、癌または自己免疫疾患）に罹患している患者に、疾患およびその合併症の少なくとも１つを治癒するかまたは少なくとも部分的には静止させるかまたは改善するのに十分な量で投与される。これを達成するために十分な量は、「治療的有効用量」として定義される。この使用のための有効量は、疾患の重篤度および患者の一般的健康状態に依存する。この組成物の単回投与または複数投与は、患者が必要とし、そして寛容する投薬量および頻度に依存して投与され得る。いずれかの状況において、この組成物は、患者を有効的に処置するために、十分な量のタンパク質を提供するべきである。
【０４４６】
予防的適用において、組成物は、感染性疾患、癌、自己免疫疾患または他の状態の確立に対しての保護を補助し得る免疫応答または他の予防的応答を誘導するために、ヒトまたは他の哺乳動物に投与される。
【０４４７】
いくつかの適用において、特定の治療的または予防処置プロトコルまたはワクチン接種のために被験体に投与されるＮＣＳＭポリペプチドの量は、約１〜約５０ｍｇ／被験体の体重ｋｇの範囲である。このようなポリペプチドの量は、所望される場合、１回／週または３回まで／週で投与され得る。このようなＮＣＳＭポリペプチドは、可溶性分子（例えば、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ、またはＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤ−ＩｇまたはＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質を含む）として投与され得る。あるいは、このようなＮＣＳＭポリペプチドは、ＮＣＳＭ−ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で投与され得、これは、プロモーターの作動可能に連結され、その結果、このポリヌクレオチドは、被験体において、約１〜約５０ｍｇ／患者の重量ｋｇのこのようなＮＣＳＭポリペプチドを（例えば、標的細胞の表面に）発現するか、または発現された可溶性ＮＣＳＭポリペプチドとして発現する。このＮＣＳＭポリペプチド（またはこのポリペプチドをコードする核酸）は、インビボで被験体の細胞の集団に投与され得るか、または本明細書に記載されるようにエキソビボで被験体の細胞の集団に投与され得る。このような範囲の量の可溶性ＮＣＳＭポリペプチドを含むかまたは被験体においてこのような量を発現し得る核酸または発現ベクターを含む組成物もまた、意図される。
【０４４８】
本発明によって提供される組換え分子を含むベクターの毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順を使用して決定される。本明細書中に示される手順および当業者に公知の他の手順を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的に有効な用量）を決定し得る。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、融合タンパク質、形質転換した細胞、および他の処方物は、例えば、患者の主要部および全体の健康に適用される場合、処方物のＬＤ５０および種々の濃度におけるその副作用によって、決定された速度で投与され得る。さらに、投与は、単一用量または分配用量によって達成され得る。
【０４４９】
静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、１日当たり患者１人当たり約０．１〜１０ｍｇである。特に、薬物が隔離された部位に投与され、血流中（例えば、体腔中または器官の管腔中）に投与されない場合、１日当たり患者１人当たり０．１〜約１００ｍｇまでの投薬量が使用され得る。実質的により高い投薬量が、局所投与に可能である。高レベルにおける結合した導入遺伝子を発現する本発明の組換えプロモーターについて、より低用量（例えば、１日当たり患者１人当たり約１μｇまたは１０μｇのオーダー）を使用して、所望の効果を達成することが可能であり得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか、または当業者に明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のような刊行物に、より詳細に記載される。
【０４５０】
患者への組換えＮＣＳＭ核酸形質転換細胞の導入について、例示的であるが限定ではない例は、血液サンプルを、注入の前に得て、そして分析のためにとっておくことを含む。１×１０６個と１×１０１２個との間の形質転換された細胞を、例えば、６０〜２００分にわたり静脈内注入する。脈拍酸素測定により生命徴候および酸素飽和を厳密にモニタリングする。血液サンプルを、例えば、注入後５分および例えば、注入後１時間で得て、そして後の分析のためにとっておく。白血球搬出、形質転換および再注入を、例えば、１年間に合計４〜６回の処置のために、例えば、２〜３ヶ月ごとに必要に応じて繰り返す。最初の処置後、注入を、例えば、臨床医の判断に基づき外来患者で実施し得る。再注入を外来患者に与える場合、関係者は、治療後、例えば、少なくとも４時間、そして好ましくは、例えば８時間、モニタリングする。形質転換された細胞を、確立された方法に従って、再注入のために調製する。Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ　６：４８−５３；Ｃａｒｔｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｒｐｈｅｒｅｓｉｓ　４：１１３−１１７；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１１２：１−７；Ｍｕｕｌら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０１：１７１−１８１およびＣａｒｔｅｒら（１９８７）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　２７：３６２−３６５を参照のこと。培養において、例えば、約２〜４週間の期間後、この細胞は、例えば、１×１０６個と１×１０１２個との間の数に達するべきである。この点で、細胞の増殖特徴は、患者ごとおよび細胞型ごとに変化する。形質転換された細胞の再注入の、例えば、約７２時間前に、アリコートを、表現型および治療的因子を発現する細胞の百分率の分析のためにとる。
【０４５１】
ベクターもしくは形質転換された細胞またはタンパク質処方物の注入を受けた患者が、例えば、熱、悪寒または筋肉痛を発症する場合、彼／彼女は、例えば、適切な用量のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛み／熱制御薬を受ける。熱、筋肉痛、および悪寒のような注入に対する反応を経験した患者は、例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、または例えば、ジフェンヒドラミンなどのいずれかを今後注入する３０分前に、予め投薬される。メペリジンは、解熱薬および抗ヒスタミン薬に迅速に応答しない、より重篤な悪寒および筋肉痛に対して使用される。細胞注入を、例えば、反応の重篤度に依存して、遅延するか、または中断する。
【０４５２】
本発明のＮＣＳＭ分子を含む、ＮＣＳＭポリペプチド、ＮＣＳＭ核酸、ならびに細胞、ベクター、トランスジェニック動物および組成物は、パック、ディスペンサデバイス、および被験体（例えば、ヒト）に投与するためのキットに包装され得る。例えば、１以上の単位投薬形態を含むパックまたはディスペンサデバイスが提供される。代表的には、化合物を投与するための取扱説明書は、この化合物が、指向された状態を処置するのに適したラベル上の適切な指標と一緒に、パッケージングに提供される。例えば、このラベルは、パッケージング内の活性化合物が特定の感染性疾患、自己免疫障害、腫瘍を処置するため、あるいは被験体の免疫応答もしくは哺乳動物の免疫応答によって媒介されるか、またはそれらに潜在的に感受性の他の疾患または状態を予防または処置するために有用であることを言及し得る。
【０４５３】
本明細書中に記載される任意のこのようなＮＣＳＭ分子を含む、任意のＮＣＳＭ核酸、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、またはベクターおよび少なくとも１つのＮＣＳＭ核酸、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質または少なくとも１つのこのようなＮＣＳＭ分子を含むベクターもしくは細胞を含む任意の組成物が、本明細書中に記載される任意の方法および適用において使用され得る。１つの局面において、本発明は、任意のＮＣＳＭポリペプチドまたは核酸（または、ＮＣＳＭ核酸を含むベクターもしくは細胞）、あるいは、それらの組成物の、本明細書中に記載される疾患の１つの処置、または本明細書中に記載される疾患の１つの予防などのための医薬またはワクチンとしての使用を提供する。別の局面において、本発明は、任意のＮＣＳＭポリペプチドまたは核酸（または、ＮＣＳＭ核酸を含むベクターもしくは細胞）、あるいはその組成物の使用、本明細書中に記載されるような疾患または障害の処置に関連した任意の治療適用のための医薬またはワクチンの製造のための使用を提供する。
【０４５４】
１つの局面において、本発明は、被験体中の抗原に特異的なＴ細胞応答を調節または変更するための方法を提供する。いくつかのこのような方法は、本明細書中に記載されるＮＣＳＭポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜４７、配列番号９５〜１７３、および配列番号２５３〜２６２）、または配列番号４８〜９４、配列番号１７４〜２５２、配列番号２６３〜２７２および配列番号２８３〜２９３のいずれかを含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびにその抗原もしくは抗原性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を、被験体に投与する工程を包含する。少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の各々は、Ｔ細胞応答を調節または変更するのに有効な量で被験体中で発現される。いくつかのこのような方法において、ポリペプチドまたはそのフラグメントは、Ｔ細胞表面レセプターと相互作用するか、またはＴ細胞表面レセプターに結合する。いくつかのこのような方法において、Ｔ細胞応答は、本明細書中に記載されるアッセイによって測定されるように増強され、そしていくつかのこのような方法において、この増強したＴ細胞応答は、抗原またはその抗原性フラグメントを有する細胞を除去するのに十分である。他の方法において、Ｔ細胞応答は、本明細書中に記載されるアッセイによって測定されるように、抑制されるか、または阻害される。
【０４５５】
いくつかのこのような方法において、抗原またはその抗原性フラグメントは、感染性因子または癌の抗原またはその抗原性フラグメントである。コードされるポリペプチドは、本明細書中に記載される、任意のＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、配列番号６６または配列番号８６）、あるいは本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチドの細胞外ドメインアミノ酸配列、またはその融合タンパク質を含み得る。
【０４５６】
ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、ベクター（例えば、発現ベクターまたはＤＮＡプラスミド）中のプロモーターに作動可能に連結され得る。１つの局面において、抗原またはその抗原性フラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、同じベクター中に含まれ得、そしてこの同じベクター（例えば、ビシストロンベクター）中の第二プロモーターに作動可能に連結される。あるいは、ＮＣＳＭポリペプチドおよび抗原または抗原フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、別個のベクター中に存在し、そして、別々に、例えば、同時または連続的のいずれかで、投与される。従って、抗原またはその抗原性フラグメントは、第二ベクター中のプロモーターに作動可能に連結され得る。
【０４５７】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜４７、配列番号９５〜１７３、および配列番号２５３〜２６２）、または配列番号４８〜９４、配列番号１７４〜２５２、配列番号２６３〜２７２および配列番号２８３〜２９３のいずれかを含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、および抗原もしくはその抗原性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、を含むベクターを提供し、ここで、ＮＣＳＭポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現される場合、Ｔ細胞レセプターと相互作用するか、またはこのＴ細胞レセプターに結合し、そしてここで、この少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の各々は、被験体中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、そして発現される場合、Ｔ細胞応答を調節または変更するのに有効な十分な量で存在する。
【０４５８】
いくつかのこのような方法において、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜４７、配列番号９５〜１７３および配列番号２５３〜２６２のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む。少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の各々は、Ｔ細胞応答を増強するのに有効な量で被験体中で発現され得、その結果、抗原またはその抗原性フラグメントを発現する細胞が除去される。いくつかの方法において、少なくとも１つポリヌクレオチド配列の各々は、Ｔ細胞応答を阻害するのに有効な量で被験体中で発現される。
【０４５９】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチド配列、または配列番号４８〜９４、配列番号１７４〜２５２、配列番号２６３〜２７２および配列番号２８３〜２９３のいずれかを含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、を含むベクターを提供し、ここで、このポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現される場合、Ｔ細胞レセプターと相互作用するか、またはこのＴ細胞レセプターに結合し、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、被験体中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、そして、発現される場合、Ｔ細胞応答を調節または変更するのに有効な十分な量で存在する。
【０４６０】
さらに別の局面において、本発明は、被験体中の免疫応答を調節または変更する方法を提供し、この方法は、配列番号４８〜９４、配列番号１７４〜２５２、配列番号２６３〜２７２および配列番号２８３〜２９３のいずれかを含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、被験体の腫瘍細胞に導入する工程を包含し、ここで、このポリペプチドまたはそのフラグメントは、被験体中で発現される場合、Ｔ細胞レセプターと相互作用するか、またはこのＴ細胞レセプターに結合し、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列は、被験体中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、そして発現される場合、Ｔ細胞応答を調節または変更するのに有効な十分な量で存在する。
【０４６１】
本発明は、被験体中のＴ細胞応答を活性化または増強させるための治療方法を含み、ここで、被験体は腫瘍を有し得るか、または腫瘍が外科的に除去されている。このような方法は、ＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および賦形剤を含む組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここでＮＣＳＭポリペプチドは、被験体の腫瘍細胞または腫瘍関連細胞によって発現され、そしてＴ細胞応答は、この腫瘍に対して活性化または増強される。いくつかのこのような方法について、ポリヌクレオチド配列は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドをコードする。組成物は、ＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有し得る。さらに、腫瘍に対してＴ細胞応答を増強させるのに十分な組成物の治療的に有効な量が、投与され得る。ＮＣＳＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【０４６２】
本発明はまた、腫瘍を有するか、または腫瘍が外科的に除去されている被験体中のＴ細胞応答を活性化または増強させるための治療方法を含み、この方法は、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドおよび賦形剤を含む組成物を被験体に投与する工程を包含し、ここで、Ｔ細胞応答は、この腫瘍に対して活性化または増強される。このような被験体中のＴ細胞応答を活性化または増強させるための方法もまた含まれ、この方法は、賦形剤ならびにＮＣＳＭポリペプチドおよび抗原を発現する細胞集団を含む組成物の十分な量を、被験体に投与する工程を包含し、その結果、Ｔ細胞応答は、腫瘍に対して活性化または増強される。このような被験体中のＴ細胞応答を活性化または増強させるための方法もまた、考慮され、この方法は、賦形剤およびＮＣＳＭポリペプチドを発現する細胞集団を含む組成物の十分な量を、被験体に投与する工程を包含し、その結果、Ｔ細胞応答は、腫瘍に対して活性化または増強される。
【０４６３】
（使用および適用）
本明細書中に記載される全てのフォーマットにおいて、本発明の発展した新規のＮＣＳＭ分子（例えば、ＮＣＳＭ核酸、ＮＣＳＭポリペプチドおよびこのようなＮＣＳＭを含むベクター、細胞、組成物）は、広範な臨床的適用、治療適用および予防的適用において有用である。必要に応じて、ポリペプチド単独またはそのフラグメント（例えば、ＭＣＳＭポリペプチドまたは可溶性ＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＥＣＤ）、ＮＣＳＭ融合タンパク質（例えば、Ｉｇに融合されたＭＣＳＮ−ＥＣＤを含む））を使用して、免疫系を増強させる。例えば、これらの分子は、腫瘍免疫を増強させる際に有用であり、そして、例えば、特定の疾患に対する抗原と組み合わせたＤＮＡワクチンアジュバントとして有用である。これらはまた、種々の医療状態（例えば、慢性感染疾患、アレルギー、自己免疫疾患が挙げられる）を処置する際、ならびに臓器移植および敗血症性ショックの逆転の際に有用である。さらに、ＣＤ２８ＢＰおよび／またはＣＴＬＡ−４ＢＰを発現するトランジェニック動物（例えば、ブタ、マウスなど）は、当業者に公知の方法を使用して作製され得る。このような動物由来のタンパク質、組織または器官を使用して、組織移植または臓器移植を受ける患者中のＴ細胞応答を調節し得る。
【０４６４】
さらに、ＮＣＳＭ分子（例えば、本明細書中に記載されるＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ分子）は、多成分ワクチン中の成分として有用であり、これは、必要に応じて、例えば、多成分を有する単一ベクターまたは異なるベクター成分をコードする複数のベクターを含む。多成分ワクチンは、必要に応じて、例えば、１つ以上のＣＤ２８ＢＰおよび／またはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、少なくとも以下の成分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドベクター）を含む：少なくとも１つの抗原、サイトカイン、アジュバント、プロモーター（例えば、野生型ＣＭＶプロモーター（例えば、イントロンＡ配列を有するか、もしくはイントロンＡ配列を有さないヒトＣＭＶプロモーター）；または組換えイントロンＡ配列もしくはＷＴイントロンＡ配列を有するか、もしくは有さない組換えＣＭＶプロモーターもしくはキメラＣＭＶプロモーター）、および／または他の同時刺激性分子（これらの各々は、反復（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）配列組換えおよび選択／スクリーニング手順、ランダム変異誘発、または他の公知の変異誘発手順によって最適化され得る）、ならびにこのような種々の成分の組み合わせ。このような多成分ベクターは、２つ以上のこのような成分を発現し、そしてそのような発現のための適切な発現エレメント（例えば、実施例Ｖに記載される模範的な多成分ベクターを参照のこと）を含む。このような配置は、特定の処置レジメンまたは治療適用もしくは予防適用のための、種々の成分（再帰的に組み合わされる成分を含む）の同時送達を可能にする。このようなベクターは、所望される特定の処置レジメンまたは治療適用もしくは予防適用に従って設計される。上記のような、１つ以上のこのような単成分ベクターまたは多成分ベクターは、同時に使用され得るか、または本発明の治療処置方法もしくは予防処置方法における連続的な投与の際に使用され得る。
【０４６５】
また、免疫応答は、例えば、抗原と共に、１つ以上の新規なＣＤ２８ＢＰ（または、例えば、可溶性ＣＤ２８ＢＰもしくはその融合タンパク質を含む、そのフラグメント）、またはＣＴＬＡ−４ＢＰ（または、例えば、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰもしくはその融合タンパク質を含む、そのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸を投与することによって、必要に応じて、調節または増強される。あるいは、抗原応答は、抗原と共に、１つ以上のＣＤ２８ＢＰ（または、例えば、可溶性ＣＤ２８ＢＰを含む、そのフラグメント）、またはＣＴＬＡ−４ＢＰ（または、例えば、可溶性ＣＴＬＡ−４ＢＰを含む、そのフラグメント）を投与することによって、必要に応じて、調節または増強される。
【０４６６】
ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰは、種々の動物（例えば、哺乳動物（ヒトを含む））におけるインビボ、およびインビトロでの免疫応答を調節する際に有用である。これらの分子は、Ｔ細胞応答の調節が所望される場合、治療適用および／または予防適用において特に有用である。ＣＤ２８ＢＰおよび／またはＣＴＬＡ−４ＢＰ（または各々のそれらのフラグメント、または各々の可溶性バージョンおよび／もしくは融合タンパク質バージョン）のための有用な適用の例としては、増強されたＴ細胞応答から恩恵を受け得る状態または疾患、あるいは増強されたＴ細胞応答が所望される状態または疾患が挙げられる。これらはまた、例えば、Ｔ細胞増殖／活性化の阻害が所望される疾患を処置する際に有用である。（例えば、ＣＤ２８ＢＰ（またはそのフラグメント、可溶性バージョンおよび／または融合タンパク質バージョン）の使用による）増強されたＴ細胞の応答が所望される医療状態および／または疾患の例としては、例えば、癌、慢性感染症および予防接種が挙げられる。癌としては、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、鼻咽頭癌、癌、脳の癌、白血病、黒色種、頭頚部癌、胃癌、子宮頚癌、卵巣癌、およびリンパ種が挙げられるがこれらに限定されない。
【０４６７】
ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰは、例えば、アレルギー／喘息、神経学的臓器移植（例えば、対宿主性移植片病および自己免疫疾患）、悪性疾患、慢性感染症（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＩＶ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）など（これらに限定されない）に関連する疾患のようなウイルス感染症が挙げられるがこれらに限定されない）、および細菌感染症（例えば、ライム病、結核症およびクラミジア感染などが挙げられるがこれらに限定されない）を含む、疾患または状態の種々の治療処置および予防処置の際に有用である。
【０４６８】
さらに、ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰは、以下の実施例において議論されるものを含む、特定のサイトカインの産生を調節するための方法において有用である。これらの分子は、治療適用および／または予防適用において、特に有用であり、ここで、サイトカインレベルの調整、変更、または特定のサイトカイン産物の産生もしくは刺激が所望される。
【０４６９】
本発明のＣＤ２８ＢＰポリペプチド、またはそのフラグメントまたはその可溶性および／もしくは融合タンパク質は、Ｔ細胞の増幅または活性化を調節し、そして免疫応答を増加させる。１つの実施形態において、このようなＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、ＤＮＡワクチンベクターの成分として、全長ポリペプチドとして、所望ならば使用される、全長ＣＤ２８ＢＰポリペプチド（例えば、ＥＣＤ）の可溶性ポリペプチド部分配列として、ポリペプチドワクチンもしくはタンパク質ワクチンまたは「ブースト」ポリペプチドとして、あるいは全長ＣＤ２８ＢＰポリペプチドもしくはその部分配列を含む可溶性融合タンパク質（例えば、可溶性ポリペプチド部分配列（例えば、ＥＣＤ））として、処置プロトコールにおいて送達され得る；このようなフォーマットにおいて、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドは、アゴニストとして作用し得る。別の実施形態において、特定の抗原をコードする核酸配列、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドをコードする核酸配列と組み合わせた、このような遺伝ワクチンは、感染疾患または癌抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増加させる。
【０４７０】
本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰ、またはそのフラグメントまたはその可溶性および／もしくは融合タンパク質は、Ｔ細胞の増幅および／または活性化を調節し得、そして自己免疫疾患における免疫応答を阻害するか、または、可溶性分子の場合、アンタゴニストとして作用する。
【０４７１】
このようなＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、ＤＮＡワクチンベクターの成分として、全長ポリペプチドとして、所望ならば使用される、全長ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド（例えば、ＥＣＤ）の可溶性ポリペプチド部分配列として、ポリペプチドワクチンもしくはタンパク質ワクチンまたは「ブースト」ポリペプチドとして、あるいは全長ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドもしくはその部分配列を含む可溶性融合タンパク質として（例えば、可溶性ポリペプチド部分配列（例えば、ＥＣＤ）として）、処置プロトコールにおいて送達され得る；このようなフォーマットにおいて、ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドは、アゴニストとして作用し得る。
【０４７２】
上記で議論されるように、ＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドをコードする核酸配列および目的の少なくとも１つのさらなるポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを含む遺伝ワクチンもまた、本発明の特徴である。例えば、ＤＮＡワクチンにおいて、特定のアレルゲンと組み合わせて、ＣＴＬＡ−４ＢＰ（またはそのフラグメント、またはその可溶性および／もしくは融合タンパク質）は、アレルギーにおけるアレルゲン特異的Ｔ細胞応答を阻害し得る。同様に、特定の自己抗原（例えば、ミエリンベースの（ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ）タンパク質）と組み合わせて、ＣＴＬＡ−４ＢＰ（またはそのフラグメント、またはその可溶性および／もしくは融合タンパク質）は、自己免疫（例えば、多発性硬化症）における自己抗原特異的Ｔ細胞応答を阻害し得る。
【０４７３】
耐性を誘導することが重要であり、従って、ＣＴＬＡ−４ＢＰが有用である他の臨床的適用としては、自己免疫（例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬）、重篤なアレルギーおよび喘息、臓器移植、異物移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を可能にするトランジェニック組織の生成、対宿主性移植片病、ならびに外来性タンパク質を発現する細胞の生存基間を延ばすための遺伝子治療ベクターの成分が挙げられる。
【０４７４】
ＤＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドをコードする核酸配列を含むＤＮＡ発現ベクターとして、あるいは本明細書中に記載されるＣＴＬＡ−４ＢＰのフラグメント、またはその可溶性および／もしくは融合タンパク質のいずれかとして、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰを送達することによる下方制御または他の変更された型のＴ細胞機能が利点を有し得る、医療状態および／または疾患の例としては、アレルギー、望ましくない免疫応答、自己免疫疾患、敗血症性ショック、および臓器移植が挙げられる。
【０４７５】
本発明の方法における使用のための有用な病原体抗原、癌抗原、アレルゲンおよび自己抗原、ならびに／またはＮＣＳＭポリペプチドとの組み合わせの例は、以下の同一人に譲渡された特許出願において提供されている：Ｐｕｎｎｏｎｅｎら（１９９９）ＷＯ９９／４１３６９；Ｐｕｎｎｏｎｅｎら（１９９９）ＷＯ９９／４１３８３；Ｐｕｎｎｏｎｅｎら（１９９９）ＷＯ９９／４１３６８；およびＰｕｎｎｏｎｅｎら（１９９９）ＷＯ９９／４１４０２（これらの各々が、全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）。いくつかの他の有用な抗原は、文献に記載されているか、またはゲノムアプローチを使用して発見され得る。代表的な腫瘍抗原は、自己タンパク質であり、従って宿主耐性であるため、必要に応じて、自己腫瘍抗原に対してもまた交差反応を誘導する「非自己」腫瘍抗原を産生することが必要である。これは、必要に応じて、例えば、多様な種由来の存在する腫瘍抗原の再帰性配列組換えを介して達成され、キメラ腫瘍抗原を産生する。次いで、このようなキメラ抗原は、野生型腫瘍抗原もまた認識する抗原特異的Ｔ細胞を活性化させる抗原についてスクリーニングされる。任意のスクリーニングは、キメラ抗原が患者Ｔ細胞を活性化させるか否かを試験し（例えば、野生型抗原に特異的なＴ細胞株を産生し、そして再帰的に組み合わされた抗原を発現するＡＰＣによって誘導される活性化を分析する）、そしてキメラ抗原が野生型抗原を認識するＴ細胞を誘導するか否かを試験する（例えば、再帰的に組み合わされた抗原に特異的なＴ細胞株を産生し、そしてＷＴ抗原を発現するＡＰＣによって誘導される活性化を分析する）。
【０４７６】
本発明のＮＣＳＭポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、少なくとも１つの全長ＮＣＳＭもしくは可溶性ＮＣＳＭまたはそのフラグメントを投与する）、または細胞ベースのワクチン（例えば、少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドを発現または分泌する細胞）、または遺伝子ベースの治療的ポリペプチド（すなわち、ＮＣＳＭ遺伝子によって発現されるポリペプチド産物）として、被験体に投与される場合、上記で言及された疾患および障害のいずれかを処置または予防するための治療処置方法または予防処置方法において有用であり、ここで、このようなＮＣＳＭポリペプチドは、単独で送達されるかまたは１つ以上の抗原、別の同時刺激性分子もしくはアジュバントと共に、同時もしくは連続的に、同時投与される。ＮＣＳＭ分子はまた、少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドが、単独で、またはプラスミドベクターもしくは遺伝子治療フォーマット（すなわち、少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドをコードするベクター）において投与される遺伝ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）として、被験体に投与される場合、上記で言及された疾患および障害のいずれかを処置または予防するために有用である。または、所望ならば、少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチドは、抗原、同時刺激性分子および／またはアジュバントのうち少なくとも１つをコードする第二のＤＮＡベクターと共に同時投与される。あるいは、所望ならば、少なくとも１つのＮＣＳＭコードポリヌクレオチド配列および抗原、同時刺激性分子、および／またはアジュバントのうち少なくとも１つを含むベクターが調整され得、そして、処置プロトコールにおいて被験体に投与される；この例において、少なくとも１つのＮＣＳＭコードポリヌクレオチドは、抗原、同時刺激性分子、および／またはアジュバントのうち少なくとも１つと共に同時発現される。
【０４７７】
別の局面において、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、単独、あるいは１つ以上の抗原、別の同時刺激因子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）、および／またはアジュバントと組み合わせて同時にまたは連続的に被験体に投与される場合、上述の疾患または障害のいずれかを処置または予防するための方法において使用され得る。可溶性ＮＣＳＭは、ＮＣＳＭ−ＥＣＤまたはその部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得るか、または可溶性融合タンパク質として処方され得る。さらに、ＮＳＣＭまたは本明細書中に記載されるようなＮＣＳＭの任意の可溶性形態をコードするＮＣＳＭポリヌクレオチドは、単独、あるいは１つ以上の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、別の同時刺激因子、および／またはアジュバントと組み合わせて（同時または連続的に）被験体に投与される場合、上述の疾患または障害を処置または予防するための、治療的処置方法または予防的処置方法において有用である。所望の場合、ＮＣＳＭポリヌクレオチド配列および１つ以上の抗原をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列、別の同時刺激因子、ならびに／またはアジュバントは、被験体への送達ならびに結果としてのＮＣＳＭポリペプチド、抗原、別の同時刺激因子、および／またはアジュバントの同時発現のために１つのベクターに組み込まれ得る。
【０４７８】
上記のように、種々の抗原が、ＮＣＳＭ分子の送達と同時に、またはＮＣＳＭ分子の送達後に送達され得、この場合、ＮＣＳＭ分子は、ポリペプチドまたは核酸のいずれかの形式で被験体に投与される。抗原は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとして（ベクターを介して）送達され得る。抗原は、ＷＴ抗原または組換えもしくはキメラ抗原（例えば、シャッフル抗原または変異抗原を含む）であり得る。
【０４７９】
ＮＣＳＭ分子と共に使用され、かつ本明細書中に記載の本発明の方法において使用される癌抗原の例としては、以下が挙げられる：例えば、ＥｐＣａｍ／ＫＳＡ、水疱性類天疱瘡抗原２、前立腺粘素抗原（ＰＭＡ）（ＢｅｃｋｅｔｔおよびＷｒｉｇｈｔ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　６２：７０３−７１０）、腫瘍関連Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（Ｄａｈｌｅｎｂｏｒｇら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７０：６３−７１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（ＤａｎｎｕｌｌおよびＢｅｌｌｄｅｇｒｕｎ（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１：９７−１０３）、乳癌および膀胱移行細胞癌（ＴＣＣ）の管腔上皮抗原（ＬＥＡ．１３５）（Ｊｏｎｅｓら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１７：６８５−６８７）、癌関連血清抗原（ＣＡＳＡ）および癌抗原１２５（ＣＡ　１２５）（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄら（１９９５）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．５９：２５１−２５４）、上皮糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）（Ｋｉｅｖｉｔら（１９９７）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７１：２３７−２４５）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）（Ｌｏｚｚａら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１７：５２５−５２９）、カテプシンＥ（Ｍｏｔａら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：１２２３−１２２９）、黒色腫中のチロシナーゼ（Ｆｉｓｈｍａｎら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ　７９：１４６１−１４６４）、脳の癌（ｃａｖｅｒｎｏｍａ）の細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（Ｎｏｔｅｌｅｔら（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．４７：３６４−３７０）、ＤＦ３／ＭＵＣ１乳癌抗原（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７４：４５７−４６４；Ｐａｎｄｅｙら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：４０００−４００３）、癌胎児性抗原（Ｐａｏｎｅ　ら（１９９６）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２：４９９−５０３；Ｓｃｈｌｏｍら（１９９６）Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３８：２７−３９）、腫瘍関連抗原ＣＡ　１９−９（ＴｏｌｌｉｖｅｒおよびＯ’Ｂｒｉｅｎ（１９９７）Ｓｏｕｔｈ　Ｍｅｄ．Ｊ．９０：８９−９０；Ｔｓｕｒｕｔａら（１９９７）Ｕｒｏｌ．Ｉｎｔｌ．５８：２０−２４）、ヒト黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ２７−３５およびｇｐ１００（ＫａｗａｋａｍｉおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９７）Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１７３−１９２；Ｚａｊａｃら（１９９７）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７１：４９１−４９６）、ＴおよびＴｎ膵臓癌（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＣＡ）糖ペプチドエピトープ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．６：５７−８５）、乳頭状甲状腺癌における３５ｋＤ腫瘍関連自己抗原（Ｌｕｃａｓら（１９９６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１６：２４９３−２４９６）、ＫＨ−１腺癌抗原（ＤｅｓｈｐａｎｄｅおよびＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８７：１６４−１６６）、Ａ６０ミコバクテリア抗原（Ｍａｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２２：２９６−３００）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（ＢｌａｃｈｅｒｅおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ．６：３４９−３５５）、およびＭＡＧＥ、チロシナーゼ、ｍｅｌａｎ−Ａおよびｇｐ７５および変異体癌遺伝子産物（例えば、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＤｋ４、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＢｕｅｌｅｒおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：５４５−５５５；ＬｅｗｉｓおよびＨｏｕｇｈｔｏｎ（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ．６：３２１−３２７；Ｔｈｅｏｂａｌｄら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：１１９９３−１１９９７）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）Ｂａｎｇｍａ　ＣＨら（２０００）Ｍｉｃｒｏｓｃ　Ｒｅｓ　Ｔｅｃｈ　５１：４３０−５、ＴＡＧ−７２、ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ　ＲＰらＨｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ（１９９９）１０：１６５−７３、ならびにこれらの抗原の改変体、誘導体およびその変異形態および組換え形態（例えば、シャッフル形態）。
【０４８０】
例えば、進化したＮＣＳＭ分子を用いてワクチンを生成するために、臨床前研究が、最初に例えばマウスで行われ得る。マウスは、例えば、ＣＴＬＡ−４ＢＰの研究のために使用され得る。なぜならば、例えばタンパク質の効果は、インビトロではより研究がより困難であり、サルにおける作業は、マウスでの作業より費用効率が低く、自己免疫疾患のマウスモデルは、確立されて誘導および破壊耐性を研究するための優れた手段を与え、そして同じマウスモデルがＣＤ２８ＢＰの生物学的特徴づけにも使用され得るからである。臨床前マウス研究は、例えば、目的の特定の標的のためのベクター、薬物動態、薬物半減期、アジュバント安定性ならびにＤＮＡワクチンおよび可溶性たんぱく質投与のようなもののインビボ有効性の最適化を可能にし得る。必要に応じて、マウス研究の後に非ヒト霊長類における臨床前研究を行い得る。非ヒト霊長類試験は、例えば、先天的免疫系のブーストにおける有効性を最適化し得、そしてＮＣＳＭ分子のワクチンアジュバントとしての使用の有効性を最適化し得る。非ヒト霊長類試験は、必要に応じて、例えば、感染防御免疫を最適化し、それによりヒト臨床試験に最良のワクチンを同定することを補助するのに役立ち得る。
【０４８１】
限定的ではなく例示的な例として、ＮＣＳＭ（すなわち、ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ）もしくはそのフラグメントのいずれかまたは両方の型が、免疫応答を改変するためのブースト方法または形式において使用され得る。この方法は、代表的には、例えば、最初にＤＮＡワクチン（「プライムブースト」）を被験体に投与する工程、次いで、例えば、ポリペプチド形式または核酸形式のいずれかで、例えば１つ以上のＮＣＳＭポリペプチド分子を用いる第２の投与を包含する。
【０４８２】
さらに、本発明はまた、遺伝子治療ベクターを提供し、これは、少なくとも１つのＣＴＬＡ−４ＢＰまたはそのフラグメント、改変体もしくはホモログをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。１つの局面において、少なくとも１つのＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む遺伝子治療ベクター（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、形質導入された細胞の、特異的Ｔ細胞による認識を減少させる。ＣＴＬＡ−４ＢＰコード核酸配列の組込みは、遺伝子治療ベクターの生存を延長するのを補助する。遺伝子治療において、治療的導入遺伝子または予防的導入遺伝子が、宿主細胞により発現される場合、これらの細胞はまた、しばしば免疫系の細胞により認識され、そして細胞傷害性Ｔ細胞は、導入遺伝子を発現する細胞を破壊し、それにより遺伝子治療の有効性を制限し得る。導入遺伝子を発現する細胞が同時にＣＴＬＡ−４ＢＰを発現する場合、これは、その細胞傷害性Ｔ細胞の活性を減少し、それにより形質導入された細胞の生存を延長し、そして遺伝子治療の有効性を改善する。
【０４８３】
本発明はさらに、ＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子を介するシグナル伝達を増強するかまたは阻害するかのいずれかである低分子のアゴニストまたはアンタゴニストを設計または同定する方法を提供する。当業者に公知の方法（例えば、Ｘ線結晶学）は、タンパク質（すなわち、本発明のＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ）およびその各々のフラグメントの３次元構造を同定するために使用される。これらのおよびその他の方法を使用して、本発明のＮＭＣＳ分子（例えば、ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ）のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する優先的な結合に寄与するコンホメーションおよび構造を同定および決定し得る。得られる情報に基づいて、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４に特異的に結合する低分子が設計され得る。当業者に公知の機能的スクリーニングアッセイ（例えば、インビトロＴ細胞増殖／活性化アッセイ）を使用して、このような分子が特異的アンタゴニストまたは特異的アゴニストのどちらであるかを分析し得る。ＣＤ２８のアゴニストおよび／またはＣＴＬＡ−４のアンタゴニストである得られた低分子を使用して、例えば、Ｔ細胞依存性免疫応答を増強または改変し得る。同様に、ＣＤ２８のアンタゴニストおよび／またはＣＴＬＡ−４のアゴニストである低分子は、例えば、Ｔ細胞特異的免疫応答を下方調節または改変し得、かつ／または耐性および／もしくはアネルギーを誘導し得る。これらの種々の型の低分子を使用して、必要に応じて、例えば、ワクチンアジュバントとして、そして例えば、Ｔ細胞応答の操作が所望される場合に疾患を処置する際に有用である。
【０４８４】
本発明は、３次元構造の可視化および／または分析（例えば、Ｘ線結晶学）、ＣＤ２８結合および／またはＣＴＬＡ−４結合に関与する残基の分析、ならびに配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、２８３〜２９３、またはそのフラグメントにおいて見出される本発明のポリペプチドのいずれかのこのような残基の位置および種類に基づいて、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４分子のいずれかを介するＴ細胞のシグナル伝達を増強するかまたは阻害するＣＤ２８アゴニストを設計または同定する方法を包含する。
【０４８５】
本発明はまた、処置を必要とする被験体において、疾患または傷害を処置する方法を包含し、この方法は、その被験体に、本明細書中に記載される任意のＮＣＳＭポリペプチドを、上記の疾患または障害を処置するのに有効な量で投与する工程を包含する。別の局面において、本発明は、処置を必要とする被験体における疾患または障害の治療的または予防的処置のための方法を提供し、この方法は、この疾患または障害に特異的な任意のＮＣＳＭポリペプチドおよび免疫原を被験体に投与する工程を包含し、ここでポリペプチドおよび免疫原の合計量は、その疾患または障害を予防的または治療的に処置するのに有効である。いくつかのこのような方法において、ポリペプチドは、免疫原により誘導される免疫応答を増強するか、低減するか、または改変するのに十分な量で存在する。組成物は、ポリペプチド、免疫原および薬学的に受容可能な賦形剤を含み得、被験体に、疾患または障害を処置するのに有効な量で投与される。全てのこのような方法について、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒトを含む）であり得る。さらに、いくつかのこのような方法について、ポリペプチドは、インビボで被験体に、またはエキソビボでその被験体から得られた細胞の集団に投与される。別の局面において、本発明は、処置を必要とする被験体において本明細書中に記載される疾患または障害を処置するための方法を包含し、この方法は、その被験体に、ＮＣＳＭポリペプチドをその疾患または障害を処置するのに有効な量で投与する工程を包含する。
【０４８６】
本発明は、３次元構造の可視化および／または分析（例えば、Ｘ線結晶学）、ＣＤ２８結合および／またはＣＴＬＡ−４結合に関与する残基の分析、ならびに配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、２８３〜２９３、またはそのフラグメントにおいて見出される本発明のポリペプチドのいずれかのこのような残基の位置および種類に基づいて、ＣＤ２８分子またはＣＴＬＡ−４分子いのいずれかを介するＴ細胞のシグナル伝達を増強するかまたは阻害するＣＤ２８アゴニストを設計または同定する方法を包含する。
【０４８７】
（一体化システム）
本発明は、コンピュータ、コンピュータ読み取り可能な媒体、および一体化システムを提供し、これらは、本明細書中のポリペプチドおよび核酸（例えば、本明細書中に列挙される配列、およびその種々のサイレントな置換および保存的置換を含む）に関する本明細書中の配列情報に対応する文字列を含む。当該分野で公知の種々の方法および遺伝アルゴリズム（ＧＡ）を使用して、異なる文字列間の相同性または類似性を検出し得るか、あるいは、出力ファイルを制御する、配列を含む情報の提示を行うための基礎を提供するなどのような、他の所望の機能を実行し得る。例としては、上記で考察されたＢＬＡＳＴが挙げられる。
【０４８８】
従って、種々のストリンジェンシーおよび長さの異なる型の相同性および類似性は、本明細書中の一体化システムで検出および認識され得る。例えば、多くの相同性決定方法が、ワードプロセッシングにおけるスペルチェックおよび種々のデータベースからのデータ検索に関して、生体高分子の配列の比較分析のために設計されてきた。天然のポリヌクレオチドにおける４つの基本的な核酸塩基間の二重らせん対相補的相互作用の理解により、相補的相同ポリヌクレオチド鎖のアニーリングをシミュレートするモデルはまた、配列整列または本明細書中の配列に対応する文字列に対して代表的に実行されるその他の操作（例えば、ワードプロセッシング操作、配列または部分配列文字列、出力表などを含む図の構築）の基礎としても使用され得る。配列類似性を計算するためのＧＡを用いるソフトウエアパッケージの例は、ＢＬＡＳＴであり、これは、本明細書中の配列に対応する文字列を入力することにより本発明に適合され得る。
【０４８９】
同様に、標準的なデスクトップアプリケーション（例えば、ワードプロセッシングソフトウエア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＷｏｒｄＴＭまたはＣｏｒｅｌ　ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔＴＭ）およびデータベースソフトウエア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＥｘｃｅｌＴＭ、Ｃｏｒｅｌ　Ｑｕａｔｔｒｏ　ＰｒｏＴＭのようなスプレッドシートソフトウエア、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ　ＡｃｃｅｓｓＴＭもしくはＰａｒａｄｏｘＴＭのようなデータベースプログラム）は、本発明のＮＣＳＭポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはその両方もしくはいずれかのフラグメントに対応する文字列を入力することにより、本発明に適合され得る。例えば、この一体化システムは、適切な文字列情報を有する前述のソフトウエアを備え得、例えば、ユーザインターフェース（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）システム、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）システムまたはＬＩＮＵＸシステムのような標準的な操作システムにおけるＧＵＩ）と共に使用されて、文字列を操作する。上述のように、ＢＬＡＳＴのような専門化した整列プログラムはまた、核酸またはタンパク質（または対応する文字列）の整列のために本発明のシステムに組み込まれ得る。
【０４９０】
本発明における分析のための一体化システムは、代表的には、配列を整列するためのＧＡソフトウエアを有するデジタルコンピューター、ならびに本明細書中に記載される配列のいずれかを含む、ソフトウェアシステム中に入力されるデータセットを含む。コンピュータは、例えば、ＰＣ（Ｉｎｔｅｌ　ｘ８６またはＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）チップ互換性ＤＯＳＴＭ、ＯＳ２ＴＭ　ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）　ＮＴ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）　９５、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）　９８、ＬＩＮＵＸベースマシン、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベース（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）のマシン）または当業者に公知の他の市販のコンピュータであり得る。配列を整列するかまたはさもなければ配列を操作するためのソフトウェアは、入手可能であるか、またはＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）などのような標準的なプログラム言語を使用して、当業者により容易に構築され得る。
【０４９１】
必要に応じて、任意のコントローラーまたはコンピュータは、しばしば、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、平面パネルディスプレイ（例えば、アクティブマトリックス液晶ディスプレイ、液晶ディスプレイ）などであるモニターを含む。コンピュータ回路機構は、しばしばマイクロプロセッサー、メモリー、インターフェース回路などのような多くの集積回路チップを含むボックスに配置される。このボックスはまた、必要に応じて、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、書き込み可能なＣＤ−ＲＯＭのような高容量のリムーバブルドライブ、および他の共通の周辺機器を含む。キーボードまたはマウスのような入力デバイスは、必要に応じて、使用者からの入力および関連のコンピューターシステムにおいて比較されるかまたはさもなければ操作される配列の使用者の選択を提供する。
【０４９２】
コンピュータは、代表的には、パラメーターフィールドのセット（例えば、ＧＵＩの）中への使用者の入力の形態または予めプログラムされた命令の形態（例えば、種々の異なる特定の操作のために予めプログラムされた）のいずれかの使用者の命令を受け取るための適切なソフトウェアを含む。次いで、このソフトウェアは、これらの命令を、任意の所望の操作を実行するように流体方向および運搬コントローラの操作を命令するための適切な言語に変換する。
【０４９３】
ソフトウエアはまた、核酸合成を（例えば、本明細書中の配列かまたは配列の整列に基づいて）制御するため、または整列の下流で生じるほかの操作もしくは本明細書中の配列に対応する文字列を使用して実行される他の操作のために、出力要素を備え得る。
【０４９４】
本発明は、コンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な媒体を提供し、これらは、配列番号１〜２７２および２８３〜２９３から選択される核酸配列またはタンパク質配列に対応する１つ以上の文字列を含む配列記録を含むデータベースを含む。
【０４９５】
別の局面において、本発明は、配列番号１〜２７２および２８３〜２９３から選択される核酸配列またはタンパク質配列に対応する少なくとも１つの文字列を各々が含む、少なくとも１つの配列記録を含むデータベースを含むコンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な媒体を含む一体化システムを提供し、この一体化システムは、さらに、使用者が１つ以上の配列記録を選択的に見ることを可能にするユーザ入力インターフェースを備える。いくつかのこのような一体化システムについて、コンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な媒体は、文字列を、核酸配列またはタンパク質配列に対応する少なくとも１つのさらなる文字列と整列させる整列命令セットを含む。この命令セットは、以下の１つ以上を含み得る：局所相同性比較決定、相同性整列決定、類似性決定のための検索、およびＢＬＡＳＴ決定。いくつかのこのようなシステムは、整列命令セットにより生成される整列を表示する、ユーザ読み取り可能な出力要素をさらに備え得る。
【０４９６】
いくつかの局面において、コンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な媒体は、配列番号１〜４７、９５〜１７３、および２５３〜２６２から選択される配列を含む少なくとも１つの核酸配列を、アミノ酸配列に翻訳する命令セットをさらに含む。他の局面において、コンピュータまたはコンピュータ読み取り可能な媒体は、配列番号４８〜９４、１７４〜２５２、２６３〜２７２、および２８３〜２９３から選択される配列を含む少なくとも１つのアミノ酸配列を、核酸配列に逆翻訳するための命令セットをさらに含む。いくつかのこのようなシステムについて、命令セットは、コドン利用命令セットまたは配列同一性を決定する命令セットを試験核酸配列に適用することにより、核酸配列を選択する。
【０４９７】
コンピュータシステムを使用してデータベースに保存された複数の配列記録の少なくとも１つに関する情報を提示する方法もまた提供され、上記配列記録の各々が、配列番号１〜２７２および２８３〜２９３に対応する少なくとも１つの文字列を含み、この方法は、以下：配列番号１〜２７２および２８３〜２９３の１つ以上に対応する１つ以上の文字列またはその部分配列のリストを決定する工程；上記リストの１つ以上の文字列のどれがユーザにより選択されるかを決定する工程；およびその選択された文字列を表示する工程、またはその選択された文字列をさらなる文字列と整列させる工程、を包含する。いくつかのこのような方法は、選択された文字列とさらなる文字列との整列を表示する工程および／またはそのリストを表示する工程をさらに包含する。
【０４９８】
（キット）
本発明はまた、本発明のＮＣＳＭポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、ワクチン、方法、組成物、システム、および装置を備えるキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて本発明の以下のうちの少なくとも１つを備える：（１）本明細書中に記載されるような装置、システム、システム要素または装置要素；（２）ＮＣＳＭポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、可溶性ＮＣＳＭポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはそのフラグメント；ＮＣＳＭ−ＩｇまたはＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質；ＮＣＳＭポリペプチド、可溶性ＮＣＳＭポリペプチド、もしくはそのフラグメントをコードするプラスミド発現ベクター；ＮＣＳＭポリペプチド、可溶性ＮＣＳＭポリペプチド、もしくはそのフラグメントを発現する細胞；任意のこのような成分の少なくとも１つを含む組成物もしくはワクチン組成物；（３）本明細書中に記載される任意の方法（治療的方法または予防的方法を含む）を実施するための指示書、（２）で同定される任意の成分または任意のこのような成分の任意のワクチンもしくは組成物を使用するための指示書；および／または本明細書中に記載される任意の装置、システムまたは成分を操作するための指示書；（４）上記の少なくとも１つのこのような成分または組成物を保持するための容器、ならびに（５）パッケージング材料。
【０４９９】
さらなる局面において、本発明は、上記および本明細書中の任意の装置、要素、組成物もしくはキットの使用、本明細書中に記載の任意の方法またはアッセイの実施、ならびに／または本明細書中に記載の任意のアッセイもしくは方法を実施するための任意の装置、要素、組成物もしくはキットの使用を提供する。
【０５００】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、いかなる場合も本発明の精神または範囲を制限しない。
【０５０１】
（材料および方法）
（Ａ．ライブラリー構築のための哺乳動物親ｃＤＮＡの単離）
ヒト、アカゲザル、ヒヒ、オランウータン、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０９９５０）、ネコおよびウサギ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ４９８４３）の、野生型Ｂ７−１（ＣＤ８０）の親遺伝子を、逆トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によりクローン化した。ＲＡＪＩ細胞株、ＰＵＴＩ細胞株、ＬＣＬ８６６４細胞株、および２６ＣＢ−１細胞株を、ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ　ｐｙｇｍａｅｏｕｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１９８４０）およびヒヒ（Ｐａｐｉｏ　ｈａｍａｄｒｙａｓ）のＢ７−１遺伝子についての全ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の供給源として、Ｂ７−１　ｃＤＮＡの調製のために使用した。Ｂ７−１　ｃＤＮＡ調製のための、ネコ（Ｆｅｌｉｓ　ｃａｔｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕｓ）およびウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ　ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ　ｓｕｂ−ｓｐｅｃｉｅｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）のＢ７−１遺伝子をコードするｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを、それぞれの種由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た。ＰＢＭＣを、ネコ、ウシ、およびウサギの静脈内血を抜いたもの（ｄｒａｗ）からＦｉｃｏｌｌ勾配分離により単離した。これらの細胞を、次いで、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、５マイクログラム／ミリリットル（ｕｇ／ｍｌ）のリポ多糖類（ＬＰＳ）、０．２５ｇ／ｍｌのヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）および０．１ｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で２日間活性化した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で３７℃に維持した。
【０５０２】
これらの細胞株または活性化ＰＢＭＣを採取し、そしてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを、ＦａｓｔＴｒａｃｋ　２．０　ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＰｒｏｍｅｇａ　ＲＮＡｇｅｎｔｓ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をそれぞれ使用して単離した。それぞれの哺乳動物Ｂ７−１ｃＤＮＡをクローン化するために使用されるプライマーを、ヒト、ウシおよびウサギのＢ７−１遺伝子について公開された配列に基づいて設計した（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９８９）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：２７１４−２２；Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｋ．Ｒ．＆Ｈｏｗａｒｄ，Ｃ．Ｊ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４９：２３１−４；およびＩｓｏｎｏ，Ｔ．＆Ｓｅｔｏ，Ａ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４２：２１７−２０を参照のこと）（ヒトＢ７−１については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３３２０８、ＡＦ０２４７０３；ウシＢ７−１については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０９９５０；ウサギＢ７−１については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ４９８４３もまた参照のこと）。プライマー（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬから購入された）は、開始コドンのＢａｍＨＩ部位５’および終止コドンのＫｐｎＩ部位３’を含有していた。ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｃＤＮＡ　Ｃｙｃｌｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを使用して生成した。これらのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより生成した。このＲＴ−ＰＣＲを、製造者の指示書に従ってｃＤＮＡ　Ｃｙｃｌｅキットを使用し、そして標準の技術を使用して実行した。次いで各ｃＤＮＡを、例えば、各種に特異的なプライマー（単数または複数）を使用する二重鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ生成のためのテンプレートとして使用した。
【０５０３】
Ｂ＆−１（ＣＤ８０）ｃＤＮＡをクローン化するために使用された全てのプライマーは、種の開始コドンのＢａｍＨＩ部位５’および種の終止コドンのＫｐｎＩ部位３’を含んでいた。このＰＣＲ産物を、Ｂｉｏ１０１　ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩキットを使用してゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩまたはＡｓｐ　７１８で消化し、そしてＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩまたはＡｓｐ　７１８で消化したｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にライゲーションした。Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂを、ｃＤＮＡクローンを使用して形質転換し；コロニーを採取し、増殖し、そしてクローンをＱｉａｇｅｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して細菌から単離した。
【０５０４】
（Ｂ．組換え核酸ライブラリーの生成）
組換え（キメラ）核酸配列を含む組換えライブラリーを、上記のように単離された７種の哺乳動物ｃＤＮＡを使用して、配列組換え手順の繰り返しにより生成した。１つの局面において、シャッフルしたキメラ核酸配列を含むライブラリーを、ＤＮＡシャッフリング手順を、以前に記載されるように（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　３７０：３８９−３９１（１９９４）およびＣｒａｍｅｒｉ，Ａ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　３９１：２８８−９１ならびに繰り返しの配列組換えおよびシャッフリング方法を記載する節において上記で引用されるその他の参考文献）、７種の哺乳動物ｃＤＮＡ配列に適用することにより生成させた。シャッフルしたヌクレオチド配列を、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ　７１８で消化し、そして標準の技術を使用してゲル精製した。得られたキメラシャッフルヌクレオチド配列を、標準のクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと）を使用し、そして製造者の指示に従って、ｐｃＤＮＡ３．１−発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。このベクターを以下に記載のように、細胞をトランスフェクトするために使用した。
【０５０５】
ＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、ヒトＢ７−１クローンおよびＣＤ２８ＢＰクローン（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−１５）の各々について、シグナルペプチドをコードする配列および成熟ポリペプチドをコードする配列（例えば、成熟コード領域）を分離する接合部に、製造者の指示に従ってＥｘＳｉｔｅ　ＰＣＲ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して挿入した。シグナル配列および成熟コード領域に対応するヌクレオチド配列を、シャッフルされた各ヌクレオチド配列について、ｈＢ７−１のシグナル配列および成熟コード領域に対応する公知の配列と比較することにより決定した。変異誘発プライマーを、各クローンに特異的なシグナル配列および成熟コード配列の２４ヌクレオチドに隣接するＦＬＡＧ配列を有するように設計した。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８７）における標準の手順に従って、ｃＤＮＡライブラリーから精製した。
【０５０６】
（Ｃ．タンパク質の結合体化）
可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ（ｓＣＤ２８−Ｉｇ）は、ヒトＣＤ２８の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分との間の可溶性融合タンパク質である；可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇ）は、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとヒトＩｇＣγ鎖との間の可溶性融合タンパク質である（例えば、Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９１），Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７４：５６１−５６９を参照のこと）。可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ　Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分）融合タンパク質および可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ　Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分）融合タンパク質は、両方ともＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから得られた。ＮＨＳ−ビオチンを、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手し、フルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　Ｉｓｏｍｅｒ　Ｉ）（ＦＩＴＣ）をＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手した。
【０５０７】
ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ　Ｆｃ：ＦＩＴＣについて１：３８．５のモル比およびＣＤ２８−Ｉｇ　Ｆｃ：ビオチンについて１：３５のモル比を、結合体化の間使用した。１〜３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、ＦＩＴＣ結合体について０．１Ｍ炭酸緩衝液、およびビオチン結合体について０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液に対して透析した。１５５μｇのＦＩＴＣ／１ｍｇのＣＴＬＡ−４−Ｉｇ　Ｆｃの比および１２４μｇのビオチン／１ｍｇのＣＤ２８Ｆｃの比を、結合体化の間使用した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中２ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣまたはビオチンを、ボルテックス．させながら透析したタンパク質に滴下し、暗室で２５℃にて２時間インキュベートし、次いでＰＢＳに対して一晩透析して緩衝液を交換した。（さらなる方法については、Ｌｉｎｓｌｙら（前出）を参照のこと）。
【０５０８】
（Ｄ．結合活性アッセイおよびフローサイトメトリー）
可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質および可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質を、上記のように、それぞれ、ビオチンおよびフルオレセインイソチオシアネートと結合体化させた。トランスフェクト体を、ＰＢＳ／２％　ＦＣＳ中０．５ｍＭ　ＥＤＴＡで、１５〜３０分間処理した。いくつかの代表的なウェルをカウントして、１ウェルあたりの細胞数を決定した。等量の結合体化ｓＣＤ２８−Ｉｇ（Ｆｃ）または結合体化ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｆｃ）を、以下のように、適切な濃度で、トランスフェクトした２９３細胞またはＣＯＳ−７細胞に添加した。競合結合アッセイについて、トランスフェクトした細胞を、最初に、ビオチン結合体化ｓＣＤ２８−Ｉｇと共に室温にてインキュベートした。次いで、ＦＩＴＣ結合体化ＣＴＬＡ−４Ｉｇを、ビオチン結合体化ｓＣＤ２８−Ｉｇの添加後１５分（ｍｉｎ）で、このインキュベーション混合物に添加し、そしてその混合物全体を、さらに１時間４５分インキュベートした（あるいは、トランスフェクトした細胞を、ビオチン結合体化ｓＣＤ２８−ＩｇまたはＦＩＴＣ結合体化ＣＴＬＡ−４−Ｉｇと共に個々にインキュベートすることを除いて、同じ手順を用いて個々の結合アッセイを行い得る）。
【０５０９】
その後、これらの標識した細胞を、４℃で取り扱い、ＤＭＥＭ／１０％　ＦＣＳで２回洗浄し、そして１００μｌ中０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に１５分間インキュベートした。ビオチンは、この蛍光マーカーストレプトアビジン−ＰＥに結合する（Ｒ−ＰＥは、５６５ナノメーター（ｎｍ）の励起極大および５７８ｎｍの発光極大を有する。Ｂ−ＰＥは、それぞれ、５４５ｎｍおよび５７８ｎｍの励起極大および発光極大を有する。ＦＩＴＣは、それぞれ、４９４ｎｍおよび５１９ｎｍの励起極大および発光極大を有する）。再び、細胞を２回洗浄し、そして５μｇ／ｍｌ　ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を有する２００μｌの培地に再懸濁した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤＩＳ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。細胞選別を、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離）Ｖａｎｔａｇｅ　ＳＥセルソーター（ＢＤＩＳ）（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用する、フローサイトメトリーベースの細胞選別スクリーニング方法によって行った。染色濃度を、各標識したタンパク質について決定し、最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）および最小バックグラウンドシグナルを得た（例えば、最適な染色濃度は、１０６細胞あたりの濃度であった）。
【０５１０】
競合結合アッセイについての代表的な結合プロフィールを、図４Ａ〜４Ｄに示す。個々の結合アッセイについては、個々の結合プロフィールを、ビオチン結合体化ｓＣＤ２８−ＩｇまたはＦＩＴＣ結合体化ＣＴＬＡ−４−Ｉｇの各々へのトランスフェクトした細胞の結合について生成した（データは示さず）。
【０５１１】
当該分野で公知のフローサイトメトリー細胞選別方法の説明については、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１および２００１　補遺）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ（全て前出）（これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。
【０５１２】
（Ｅ．ライブラリーの選別／富化）
ライブラリーを、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に対する優先的な結合について、またはＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する優先的な結合について、ＦＡＣＳ選別によって予め富化した。ライブラリーの選別／富化を、以下のように行った。２９３細胞を、組換えライブラリー由来の組換えクローンのバルク集団でトランスフェクトし、そして各トランスフェクトしたライブラリーを、可溶性試薬ｓＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇの両方と共にインキュベートした（上記セクションＤを参照のこと）。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合の傾向を有するライブラリー由来のトランスフェクト体を、最適濃度のｓＣＤ２８−Ｉｇおよび最適よりも１０倍低い濃度のｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇと共にインキュベートした。ＣＤ２８−Ｉｇ結合の傾向を有するライブラリー由来のトランスフェクト体を、最適な量の両方の可溶性試薬で標識した。ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に優先的に結合した細胞を、ＣＤ２８−Ｉｇ結合の傾向を有するライブラリーのトランスフェクト体から選別し、そしてＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に優先的に結合した細胞を、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合の傾向を有するライブラリーのトランスフェクト体から選別した。
【０５１３】
プラスミドを、４００μｌのＨｉｒｔ溶液（０．６％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０ミリモル濃度（ｍＭ）　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））での０．５時間の溶解、その溶解物への１００μｌの０．５Ｍ　ＮａＣｌの添加、そしてその溶解物の一晩のインキュベートによって、それらの選別された細胞から回収した。溶解物を、スピン（例えば、１４，０００×ｇで６０分間遠心分離）し、等量のフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、そして１０μｌ　ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。単離されたプラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂに形質転換し、そして形質転換された細胞を、ＬＢ寒天プレート上にプレートした。全てのコロニーを回収しそして合わせて、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｑｕｉａｇｅｎ　Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して単離した。
【０５１４】
（Ｆ．ＤＮＡ精製およびトランスフェクション）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、上記のような、ＤＮＡシャッフリングまたは他の反復的な配列組換え手順によって生成された組換え（キメラ）核酸クローンを含むライブラリー由来の大量調製ＤＮＡを用いて形質転換した。これらの形質転換された細胞を、一晩プレートした。個々のコロニーを、プレートしたライブラリーから選択し、そして１．２ｍｌ　Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ−ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する９６ウェルブロックに播種した。各ブロックにはまた、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（コントロールベクター）およびヒトＣＤ８０も、各々１個のウェル中に播種した。この９６ウェルプレート培養物を、３７℃で２０時間増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。哺乳動物細胞株２９３またはＣＯＳ−７のいずれかの細胞（あるいは目的の他の細胞株）を、トランスフェクションの前日に２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレートした。これらの細胞を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をその製造業者の説明書に従って使用して、野生型Ｂ７−１またはキメラポリペプチドをコードするプラスミドでトランスフェクトした。
【０５１５】
以下の手順を、ラージスケールのトランスフェクションのために使用した。ラージスケールのトランスフェクションは、代表的には、予めの富化選別において、および治療的腫瘍ワクチンおよび／または予防的腫瘍ワクチン（例えば、ＮＣＳＭポリペプチド発現腫瘍細胞を含む組成物を含む）の生成のために、使用される。ヒト胚性腎臓２９３細胞（あるいは、例えば、サルＣＯＳ−７細胞または腫瘍細胞）を、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびＯｐｔｉＭＥＭ培地を使用して、ヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。２０ｃｍ２のプレートした２９３細胞あたり、２００マイクロリットル（μｌ）のＯｐｔｉＭＥＭ中の３マイクログラム（μｇ）のＤＮＡを、２００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中の１８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと合わせた。この混合物を、２５℃で１５〜３０分間インキュベートし、そして１．６ミリリットル（ｍｌ）のＯｐｔｉＭＥＭを添加し、そしてこの２ｍｌの混合物を、２０ｃｍ２のプレートした２９３細胞あたりに添加した。トランスフェクションを、６０〜８０％にコンフルエントな２９３を含むＴ２５〜Ｔ１７５フラスコ中で行い；細胞を、５％　ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて５〜７時間インキュベートした。等量のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／２０％　ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を、フラスコに添加し、そして一晩インキュベートした。細胞を、トリプシン処理し、再プレートし、そして２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＥＤＴＡ処理を使用してプラスチックから回収した。コントロールベクターｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）をコードするプラスミドベクターでそれぞれトランスフェクトされた細胞を、カウントし、そして２×１０６細胞／ｍｌに分けた。
【０５１６】
以下の手順を、Ｔ細胞アッセイおよび結合アッセイの両方においてライブラリークローンをスクリーニングするための、高スループット（ＨＴＰ）トランスフェクションのために使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＨＴＰトランスフェクションのために、プレートした２９３細胞またはＣＯＳ−７細胞を、２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、そして５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭを、各ウェルに添加した。ＤＮＡクローンの濃度を、１００ｎｇ／μｌ±３３ｎｇ／μｌに正規化した。このＤＮＡ調製物を、ＯｐｔｉＭＥＭ中、５ｎｇ／μｌ±３３％に希釈し、そして５０μｌを、空の９６ウェルＵ字底プレートの１ウェルあたりにプレートした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（０．０３μｌ／１μｌのＯｐｔｉＭＥＭ）を含む５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭを、希釈したＤＮＡ調製物を含む各ウェルに添加した。各ウェルは、５０ｎｇ　ＤＮＡ±３３％および０．３μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを含んだ。この混合物を、室温にて１５分間インキュベートし、次いで、１ウェルあたり２０μｌのこの混合物を、５０μｌ　ＯｐｔｉＭＥＭ中に２９３細胞またはＣＯＳ−７細胞を含む各ウェルに添加した。細胞を、３７℃で５〜７時間インキュベートし、７０μｌ　ＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳを、各ウェルに添加し、そしてプレートを、一晩インキュベートした。その後、ウェルを、トリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１０％　ＦＣＳで２回洗浄し、滅菌Ｖ字底プレート中に再プレートし、そして一晩インキュベートした。あるいは、トランスフェクションのためのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）ＨＴＰプロトコル、および同様のトランスフェクションプロトコルが、製造業者の説明書に従って使用され得る。
【０５１７】
（Ｇ．Ｔ細胞増殖アッセイ）
末梢血を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）にて収集した標準的なバフィーコート調製物として、健常な血液ドナーから得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（Ｆｉｃｏｌ勾配分離を使用する）上での遠心分離によって、ヒト血液から単離した。
【０５１８】
Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）で細胞を染色し、そしてＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ　ＳＥを使用してＣＤ２陽性（ＣＤ２＋）細胞について選別することによってか、またはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ９４に特異的なｍＡｂで染色した細胞を磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙｎａｌ，ＬＡｋｅ　Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）によって除去することによってかのいずれかで、単離および精製した；Ａｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｄｙｎａｌ　Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用するＴ細胞の磁気分離は、最初に、ＰＢＭＣを、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣＤ９４に対する純粋なモノクローナル抗体で標識し、次いで、これらの細胞を、ヒツジ抗マウスＤｙｎａｂｅａｄｓで標識することによって行った。非Ｔ細胞は、磁石の枯渇によって除去された。Ｔ細胞の純度は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した抗ＣＤ３ｍＡｂでの染色によって分析した場合、９６〜９９％であった。
【０５１９】
Ｔ細胞増殖を、３Ｈ−チミジンの組み込みによって測定した。手短に言うと、２９３細胞（またはＣＯＳ−７、あるいは目的の他の細胞）を、ｈＢ７−１（または他の哺乳動物Ｂ７−１）、キメラＣＤ２８ＢＰポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド（すなわち、ＣＤ２８−Ｉｇ／ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合スクリーニングアッセイから選択されたクローン）をコードするプラスミド（発現ベクター）、あるいはＢ７−１またはＮＣＳＭのいずれの核酸インサートも欠くコントロールベクターを用いて、ＨＴＰトランスフェクションについて上記に記載したようにトランスフェクトした（Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ　ＨＴＰ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）９６ウェルトランスフェクション方法（これもまた、プラスミドトランスフェクションのために使用され得る）を、製造業者の説明書に従って使用して、ラウンド　１ライブラリーから選択されたＣＴＬＡ−４ＢＰで細胞をトランスフェクトした）。トランスフェクションの２４時間後、５×１０４の精製されたＴ細胞を、Ｕ字底９６ウェルプレート（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）中の１０％　ＦＣＳを補充したＹｓｓｅｌ培地（２００μ１／ウェル）中、照射（５０００ラド）トランスフェクト体および可溶性抗ヒトＣＤ３　ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）の存在下、５％　ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で計３日間（７２時間）、３連で培養した。１マイクロキュリー（μＣｉ）／ウェルの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、培養期間の最後の８時間の間、これらの細胞培養物にパルスすることによって添加し、そしてこれらの細胞を、カウントするために、細胞収集器（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）によって濾紙上に収集した。これらの培養した細胞中の３Ｈ−チミジンの取り込み／組み込みを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、これらの乾燥させた濾紙上の放射活性を測定することによって決定した。Ｔ細胞の増殖を、３連のウェルの平均カウント／分（ｃｐｍ）として表す。示された結果は、主に、６回の実験の平均を表す。Ｔ細胞増殖を、ヒトＣＤ８０（ｈＢ７−１）を用いて観察されたレベルと同等のレベル、それより高いレベルまたはそれより低いレベルで誘導または阻害したキメラクローンを、さらなる特徴付けのために同定および選択した。
【０５２０】
（Ｈ．混合リンパ球培養物アッセイ）
精製したＴ細胞の増殖をまた、混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）において測定した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、刺激細胞として照射ＰＢＭＣおよびレスポンダーとして同種異系ＰＢＭＣを使用して行った。刺激細胞を、照射（２５００ラド）し、そして９６ウェル平底マイクロタイター培養プレート（ＶＷＲ）中で１：１の比の同種異系ＰＢＭＣ（１×１０５細胞／ウェル）と共に、計５日間共培養した。培養期間の最後の８時間の間、細胞を、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンでパルスし、そして細胞を、カウントするために、上記のように、細胞収集器によって濾紙上に収集した。３Ｈ−チミジンの組み込みを、精製したＴ細胞について上記に記載したように、測定した。Ｔ細胞の増殖を、３連のウェルの平均ｃｐｍとして表した。示された結果は、１回より多い実験の平均を表す。
【０５２１】
（Ｉ．培養上清中のサイトカインレベルの分析）
混合リンパ球反応からの細胞培養物の上清を、４８時間後に収集し、そしてこれらを種々のサイトカインの存在について分析するまで−８０℃で保存した。ＩＬ−１０レベルおよびＩＦＮ−γレベルを、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造業者の説明書（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に従って使用して、２連で測定した。コントロールは、そのキットに提供されている。
【０５２２】
（Ｊ．濃度依存性ＣＴＬＡ−４−ＩｇまたはＣＤ２８−Ｉｇ結合アッセイ）
各々特定のトランスフェクト体について、２×１０５個の細胞を、５％　ＦＣＳを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のＣＴＬＡ−４−Ｉｇの段階希釈物と共に、氷上で３０分間インキュベートした。次に、これらの細胞を、ＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄し、その後、飽和濃度のＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ　ｍＡｂ（Ｆｃ特異的）（Ｃａｌｔａｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共に、氷上でさらに３０分間インキュベートした。これらの細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤＩＳ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析し、そして上記のように、細胞選別を、ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ　ＳＥセルソーター（ＢＤＩＳ）を使用して行った。プラスミドを、上記のように、Ｈｉｒｔ調製によって、それらの選別された細胞から回収した。
【０５２３】
（実施例Ｉ：ライブラリー構築のための親ｃＤＮＡ配列のクローニング）
ヒト、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ウシ、ウサギおよびネコＢ７−１（ＣＤ８０）同時刺激性分子をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。これらの出発Ｂ７−１遺伝子は、Ｊｏｔｕｎ　Ｈｅｉｎの方法である、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＭｅｇａＬｉｎｅＴＭ　ＤＮＡＳＴＡＲパッケージ、ＭｅｇａＬｉｎｅＴＭ　Ｖｅｒ．４．０３における）（製造業者の説明書に従いそしてそのプログラムに指定されるデフォルト値を使用する）を使用する比較によって、約５８〜９８％のアミノ酸配列同一性の範囲のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド分子をコードした。ヒヒＢ７−１（配列番号４６）およびオランウータンＢ７−１（配列番号４７）のポリヌクレオチド配列は、以前にその配列が未知であったＷＴ　ＮＣＳＭポリヌクレオチドの例である。これらのヒヒＢ７１−およびオランウータンＢ７−１ポリヌクレオチド、ならびにそれら由来のホモログ、ならびにそれらにコードされるヒヒＢ７−１（配列番号９３）およびオランウータンＢ７−１（配列番号９４）ポリペプチドは、本発明のＮＣＳＭ分子として包含される。
【０５２４】
ＲＡＪＩ細胞株、ＰＵＴＩ細胞株、ＬＣＬ８６６４細胞株および２６ＣＢ−１細胞株を、以前に記載のように、霊長類Ｂ７−１　ｃＤＮＡ調製のためのメッセンジャーＲＮＡまたは総ＲＮＡの供給源として使用した。末梢血の静脈内吸引物を、以前に議論されたように、ネコ、ウシおよびウサギＢ７−１　ｃＤＮＡ調製のためのメッセンジャーＲＮＡまたは総ＲＮＡの供給源として使用した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌ勾配分離によってネコ、ウシおよびウサギ血液吸引物から単離した。
【０５２５】
ＰＢＭＣを、リポ多糖（ＬＰＳ）、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を含有する培地で、２日間活性化させた。細胞株および活性化されたＰＢＭＣを回収し、そしてｍＲＮＡまたは総ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｃＤＮＡ　Ｃｙｃｌｅキットを使用することによって、メッセンジャーＲＮＡまたは総ＲＮＡから生成した。各々の種について特異的なプライマーを使用することによって、二本鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって生成した。
【０５２６】
（実施例ＩＩ：ラウンド　Ｉ　ＮＣＳＭライブラリーの調製およびスクリーニング）
組換え核酸配列を含む核酸ライブラリーを、親配列としてこれらの７種のクローニングしたｃＤＮＡ野生型ＣＤ８０核酸配列を使用し、そしてこのような配列に対して上記のような反復的配列組換え方法を適用することによって、生成した。１つの局面において、キメラ核酸配列を含むライブラリーを、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　３７０：３８９−３９１（１９９４）およびＣｒａｍｅｒｉ，Ａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　３９１：２８８−９１（それらの各々は、全ての目的のためのその全体が参考として本明細書中に援用される）において以前に記載されるように、これらの７種の哺乳動物ｃＤＮＡ配列に対してＤＮＡシャッフリング手順を適用することによって生成した。組換えライブラリーのランダムに選択されたキメラクローンの配列決定は、１２個中１２個のクローンが、少なくとも２種の出発遺伝子由来のヌクレオチドフラグメントを含むことを示し、これは、効率的なキメラ現象を示す。
【０５２７】
得られたキメラＮＣＳＭクローンの最初のスクリーニングは、結合アッセイに基づき、ここでは、クローン核酸によってコードされそして発現されるポリペプチドの、２つのＢ７−１リガンドであるＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のうちの一方についてトランスフェクトされた細胞の表面上での結合を評価した。この結合アッセイの詳細な総説については、先の「材料および方法」の節を参照のこと。手短に言うと、ヒトＨＥＫ２９３細胞株由来の細胞を、この反復的に組換えられたＮＣＳＭポリヌクレオチドの得られた組換えライブラリーのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ライブラリーのトランスフェクト体を、蛍光指標を結合体化させた可溶性ＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４−Ｉｇと共にインキュベートし、そしてＦＡＣＳ選別によるそれらの蛍光および９６ウェル形式のＨＴＰトランスフェクションに従って選別した。本発明は、使用される蛍光指標分子の選択によって制限されない（すなわち、多くの指標分子が使用され得る）。
【０５２８】
フローサイトメトリーベースの細胞選別を使用して、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４への相対的結合が増加または減少されたクローンについて、ライブラリーをスクリーニングした（蛍光標識した可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ分子およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ分子を、競合結合アッセイまたは個々の結合アッセイにおいて、それぞれ、可溶性ＣＤ２８レセプターおよびＣＴＬＡ−４レセプターとして使用した）。個々の結合アッセイまたは競合結合アッセイにおいて（野生型同時刺激性Ｂ７−１分子（例えば、ｈＢ７−１のような）のＣＤ２８結合およびＣＴＬＡ−４結合と比較して）ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に優先的に結合したトランスフェクトされた細胞を、ライブラリーのトランスフェクト体から選別し、同様に、個々の結合アッセイまたは競合結合アッセイにおいて（再び、野生型Ｂ７−１分子（例えば、ｈＢ７−１のような）のＣＤ２８結合およびＣＴＬＡ−４結合と比較して）ＣＤ２８よりも優先的にＣＴＬＡ−４に結合した細胞を、選別した。細胞表面に提示されたシャッフリングされたキメラ分子の多くは、ｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇのいずれかへの結合を示した。ランダムに選択されたキメラのうち１０％未満が、ｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇのいずれに対する結合も示さなかった（データは示さず）。このことは、天然の野生型Ｂ７−１遺伝子のＤＮＡシャッフリングによって生成されたポリペプチドおよびタンパク質の高い機能的適応性を示す。
【０５２９】
反復的に組換えられたＮＣＳＭ分子をコードするプラスミドＤＮＡを、両方のカテゴリーの選別された細胞から回収し、そしてＤＮＡを、結合アッセイのために調製した。結合アッセイにおいて、個々のクローン由来のＤＮＡを、ヒトＨＥＫ２９３細胞（またはＣＯＳ、あるいは目的の他の細胞）にトランスフェクトし、そしてこれらの細胞を、蛍光標識したｓＣＤ２８−Ｉｇまたは蛍光標識したｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇへの野生型Ｂ７−１を発現する細胞の結合と比較して、その標識したｓＣＤ２８−Ｉｇまたは標識したｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇのいずれかを優先的に結合する（別々にかまたは競合的にかのいずれか）能力について分析した。次いで、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４への野生型（ＷＴ）Ｂ７−１の結合と比較してＣＤ２８またはＣＴＬＡへのいずれかに対する優先的な結合を示すクローンを、以下に記載のように、ＤＮＡ配列決定、アミノ酸配列決定、および機能アッセイによって分析した。
【０５３０】
選別した細胞から回収した１０００個の個々のクローンのその後の分析は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４への野生型Ｂ７−１の結合と比較して、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する変更されたリガンド結合プロフィールを有する、多くのクローンを同定した。（ｓＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ−４−ＩｇへのＷＴ　ｈＢ７−１の相対的結合と比較して）ｓＣＴＬＡ−４−ＩｇよりもｓＣＤ２８−Ｉｇに優先的に結合する４個のクローンを、より詳細な分析に供し；ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇへのこれらのクローンの結合の減少は、少なくとも２つの別々の実験において観察されたが、ｓＣＤ２８−Ｉｇへのそれらの結合は、インタクトなままであった（データは示さず）。ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇへのこれらのクローンの結合のレベルは、減少されたが、それは、依然として検出可能であった（データは示さず）。（ｓＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ−４−ＩｇへのＷＴ　ｈＢ７−１の相対的結合と比較した）ｓＣＤ２８−ＩｇよりもｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対する優先的結合が、フローサイトメトリーによって分析した１０００個の個々のラウンド　１クローンのうち、少なくとも１５個のクローンにおいて観察された（データは示さず）。ここでもまた、ｓＣＤ２８−Ｉｇへの結合の減少は、部分的にのみであった。
【０５３１】
このスクリーニングアッセイの結果に基づいて、（ＷＴ　ｈＢ７−１の結合親和性比と比較して）変更されたＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比またはＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比を含む所望の表現型を有する、例示的ＮＣＳＭ分子を同定した。これらの選択されたクローンのＮＣＳＭ分子をコードするプラスミドＤＮＡを回収し、そしてＤＮＡを、その後の結合アッセイおよびＴ細胞増殖機能アッセイのために調製した。
【０５３２】
Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、結合アッセイにおいて同定された各々の選択された例示的ＣＤ２８ＢＰクローンまたはＣＴＬＡ４ＢＰクローン由来のＤＮＡを、上記の手順を使用して、サル（ＣＯＳ−７）またはヒト胚性腎臓（ヒト２９３細胞株）細胞のいずれかにインビトロでトランスフェクトし、そしてヒト野生型Ｂ７−１と比較してＴ細胞増殖を誘導または阻害する能力について試験した。抗ＣＤ２８　ｍＡｂを、ポジティブコントロールとして使用し得る（代替的な機能試験は、以下に記載のように、選択されたクローン由来の核酸をヒト細胞または動物細胞にインビトロでトランスフェクトまたはワクチン接種することである）。２つのシグナル伝達経路を介してＴ細胞活性化を刺激するために、ヒトＴ細胞を、選択されたＮＣＳＭ分子を発現する細胞および抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートした。「材料および方法」の「Ｔ細胞増殖アッセイ」を参照のこと。例えば、抗ＣＤ３抗体および本発明のＣＤ２８ＢＰを発現する細胞と共にＴ細胞をインキュベートすることによって、細胞表面に発現されたＣＤ２８ＢＰは、Ｔ細胞上のＣＤ２８レセプターと結合し、そして抗ＣＤ３は、ＣＤ３　Ｔ細胞レセプターと結合した。この後、先に記載されるように、Ｈ３−チミジンを添加し、ＤＮＡ合成の増加（一般的に使用されている細胞増殖の指標）を測定した。図１０および図１２は、Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【０５３３】
ＷＴ　ｈＢ７−１によって誘導される増殖と同等またはそれより高いＴ細胞増殖を誘導したクローンを、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対して優先的に結合するクローンについてＦＡＣＳ選別することによって予め富化した組換え核酸ライブラリーから、さらなる特徴付けのために同定および選択した。ＣＤ２８への結合についての最も高い傾向、およびＷＴ　ｈＢ７−１によって誘導される応答と同等またはそれより高い細胞増殖応答を誘導する能力を有する４つの例示的クローンを同定し、そしてラウンド　１（Ｒ１）ＣＤ２８ＢＰ−７１、−８４、−１１８および−１２６クローンと名付けた。これらのＮＣＳＭクローンのアミノ酸配列および核酸配列を、上記の標準的な配列決定技術を使用して決定した。
【０５３４】
ＷＴヒトＢ７−１によって生成される増殖と比較してＴ細胞増殖を誘導または抑制したクローンを、ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に優先的に結合するクローンについてＦＡＣＳ選別することによって予め富化した組換え核酸ライブラリーから、さらなる特徴付けのために同定および選択した。ＣＴＬＡ−４への結合についての最も高い傾向、およびＷＴヒトＢ７−１によって誘導される増殖と比較してＴ細胞増殖を誘導または抑制する能力を示す５つの例示的クローンを同定し、そしてＲ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−５、−７、−１１、−１３および−２７クローンと名付けた。これらのＮＣＳＭクローンのアミノ酸配列および核酸配列を、上記の標準的な配列決定技術を使用して決定した。
【０５３５】
ラウンド　１クローンは、野生型Ｂ７−１配列とは異なる多様なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示した。例えば、Ｒ１　ＣＴＬＡ４ＢＰクローンは、野生型Ｂ７−１分子との９３．４〜９７．６％のアミノ酸配列同一性、およびヌクレオチドレベルで９７〜９８．５％の同一性を示した。ＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４−Ｉｇを使用する競合結合アッセイにおいて、Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰは、ＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４−Ｉｇに優先的な野生型Ｂ７−１結合と比較して、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇへの優先的結合を示した。
【０５３６】
（実施例ＩＩＩ：第２ラウンドＮＣＳＭライブラリーの調製およびスクリーニング）
Ｒ１　ＣＤ２８ＢＰ−７１、Ｒ１　ＣＤ２８ＢＰ−８４、Ｒ１　ＣＤ２８ＢＰ−１１８およびＲ１　ＣＤ２８ＢＰ−１２６クローンに対応するヌクレオチド配列（またはこれらのヌクレオチドセグメントもしくはフラグメント）を、第２ラウンドのＣＤ２８ＢＰ　ＮＣＳＭ組換え核酸ライブラリー作製における再帰的配列組換えのための親の配列として使用した。Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−５、Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−７、Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−１１、Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−１３、およびＲ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰ−２７クローンに対応するヌクレオチド配列（またはこれらのヌクレオチドセグメントまたはフラグメント）を、第２ラウンドのＣＴＬＡ−４ＢＰ　ＮＣＳＭ組換え核酸ライブラリー作製におけるＤＮＡシャッフリングのための親の配列として使用した。第１ラウンドのように、選択したＣＤ２８ＢＰクローンに対応するヌクレオチド配列を、互いに再帰的に組換えて、そして選択したＣＴＬＡ−４ＢＰを、平行した実験において、ＤＮＡシャッフリングによって互いに再帰的に組換えた。ライブラリーの２つの別個のセットを作製した（１つは、選択したＣＤ２８ＢＰ親クローン由来であり、１つは選択したＣＴＬＡ−４ＢＰクローン由来であった）。第２ラウンドにおいて作製した組換えライブラリーに対して、結合アッセイを上述のように行なった（例えば、再帰的配列組換えを含むライブラリーを、蛍光指示薬と結合体化した可溶性ＣＤ２８−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４−Ｉｇを用いてインキュベートし、そしてこれらの蛍光結合プロフィールに基づいて分類した）。
【０５３７】
両方のライブラリーからの１０００の別個のクローンのスクリーニングによって、ｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇのいずれかに強く偏った結合を示す多くのクローンを同定した。増幅の第２ラウンドは、それぞれ、ｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対する偏った（改変された）結合を示す多くの異なるクローンを生じた。例えば、多くの第２ラウンド（Ｒ２）ＣＤ２８ＢＰクローンは、Ｒ１　ＣＤ２８ＢＰクローンのＣＤ２８に対する結合よりもＣＤ２８に対してより優先的な結合を示した。同様に、多くのＲ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンは、Ｒ１　ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンのＣＴＬＡ−４に対する結合よりもＣＴＬＡ−４に対するより優先的な結合を示した。増殖第２ラウンドのシャッフルした組換えライブラリーから、増殖第１ラウンドから選択したクローン（データは示さない）と比較して、それぞれｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対するさらに偏った結合を有する多くのクローンを、第１ラウンドと同じ基準を用いて第２ラウンドライブラリーから選択した。このクローンは、ＷＴ　ｈＢ７−１トランスフェクト体と比較して、安定なトランスフェクト体上でのある範囲の発現を示した。選択したクローンに関するプラスミドＤＮＡを回収し、そしてＤＮＡをさらなる結合および機能的アッセイのために調製した。さらに、これらのクローンのアミノ酸配列および核酸配列は、当該分野で公知の標準的な手順を用いて決定した。
【０５３８】
（Ａ．優先的な結合特性を有する第２ラウンドクローン）
１７個のＲ２　ＣＤ２８ＢＰクローンが、これらのクローンを用いてトランスフェクトされた細胞と可溶性のＣＤ２８−Ｉｇ融合体および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合体との間の個々の結合アッセイおよび競合的結合アッセイによって示されるように、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する優先的な結合を有することを見出した。１７個のクローンに関する結合プロフィールを、図５に示す。これらのクローンを、クローン第２ラウンド（Ｒ２）ＣＤ２８−ＢＰ−１〜ＣＤ２８−ＢＰ−１７と命名し、これらのそれぞれのアミノ酸配列および核酸配列を決定した（表３を参照のこと）。３６個のＲ２　ＣＤ２８ＢＰクローンもまた、これらのクローンを用いてトランスフェクトされた細胞と可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ融合体および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合体との間の個々の結合アッセイおよび競合的結合アッセイの両方で示されるように、ＷＴ　ｈＢ７−１と比較してＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する優先的な結合を有することを見出した。これらのクローンを、クローンＲ２　ＣＤ２８Ａ１２−５〜ＣＤ２８Ｅ２−４と命名し、これらのそれぞれのアミノ酸配列および核酸配列を決定した（表３を参照のこと）。ＷＴ　ｈＢ７−１の結合プロフィールと類似の１２個のＲ２　ＣＤ２８ＢＰクローン結合プロフィールもまた、両方のＲ２ライブラリーから選択し、それぞれのアミノ酸配列および核酸配列を決定した。本明細書中で記載される他の組換えＣＤ２８ＢＰクローンに関する結合プロフィールをまた、作製した（データは示さない）。
【０５３９】
【表３】
2004513878.tif 000016
2004513878.tif 000017
2004513878.tif 000018
上記の表３は、図６Ｂ（１）〜６Ｂ（３）中に示す３個の例示的な結合プロフィールに基づく、これらの選択したＲ２　ＣＤ２８ＢＰ　ＮＣＳＭクローンの相対的な結合活性のまとめを示す。３個の例示的な結合プロフィールにおいて、Ｙ軸は、ＣＤ２８に対する結合を表わし、Ｘ軸は、ＣＴＬＡ−４に対する結合を表わす。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　Ｂ７−１の結合についての例示的な結合プロフィールを、図６Ｂ（１）に示し、ここでは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　Ｂ７−１の結合の結合親和性はほぼ等しいことが示される。ＷＴ　Ｂ７−１の結合プロフィールに対して、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する高い優先的な結合を示す結合プロフィールの例は、図６Ｂ（３）に示される；つまり、このクローンは、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比よりも顕著に大きなＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比を有する。ＷＴ　Ｂ７−１の結合プロフィールに対して、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する中程度に優先的な結合を示す結合プロフィールの例は、図６Ｂ（２）に示される（すなわち、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比よりも大きい）。
【０５４０】
スコアを、３個の例示的な結合プロフィールとの比較に基づいて各クローンに割り当てる。スコアゼロ（０）は、ＣＤ２８ＢＰクローンがＷＴ　Ｂ７−１と等しいかまたは実質的に等しい結合プロフィールを有することを示す。スコア１は、ＣＤ２８ＢＰクローンが、図６Ｂ（２）に示される結合プロフィールと類似した結合プロフィールを有することを示す（すなわち、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比よりも大きい）。スコア２は、クローンが、図６Ｂ（３）に示される結合プロフィールと類似の結合プロフィールを有することを示す（すなわち、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比は、ＷＴ　ｆＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比よりも顕著に大きい）。表３は、それぞれの選択したＲ２　ＣＤ２８ＢＰクローンに関するクローン識別番号（ＩＤ）名およびそのスコアを示す。
【０５４１】
Ｒ２　ＣＤ２８ＢＰクローン３、６、および９（それぞれ、核酸配列の配列番号７、１０、および１３、ならびにアミノ酸配列５４、５７、および６０に対応する）は、同一のアミノ酸配列および核酸配列を含む；これらのクローンに関する競合的結合アッセイおよびＴ細胞増殖アッセイを、機能的活性を確認するために繰り返しの様式で行なった。クローンの第２ラウンドのＣＤ２８ＢＰ−１およびＣＤ２８ＢＰ−１２は、同一のアミノ酸配列を含む（それぞれ、アミノ酸配列の配列番号５２および６３）；しかし、クローンＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−１およびＣＤ２８ＢＰ−１２の核酸配列（それぞれ、核酸配列の配列番号５および１６）は、両方の配列における８９４位で１つの核酸残基によって互いに異なる。クローン１は、８９４位に核酸残基Ｃを有する（得られるコドンＴＣＣは、Ｓｅｒをコードする）；クローン１２は、８９４位に核酸残基Ｔを有する（得られるコドンＴＣＴもまた、Ｓｅｒをコードする）。
【０５４２】
５０個のＲ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンが、これらのクローンを用いてトランスフェクトされた細胞と蛍光標識した可溶性のＣＤ２８−Ｉｇ融合体および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合体との間の個々の結合アッセイおよび競合的結合アッセイの両方で示されるように、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する優先的な結合を有することを見出した。選択したクローンに関する例示的な結合プロフィールは、図７Ａ〜７Ｈに示される。クローンのそれぞれのアミノ酸配列および核酸配列を決定した（表４）。表４は、図６Ａ（１）〜６Ａ（３）中に示す３個の例示的な結合プロフィールに基づく、これらの選択した５０個のＲ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンの相対的な結合活性のまとめを示す。３個の例示的な競合的結合プロフィールにおいて、Ｙ軸は、ＣＤ２８に対する結合を表わし、Ｘ軸は、ＣＴＬＡ−４に対する結合を表わす（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載される結合アッセイを参照のこと）。ＷＴ　Ｂ７−１のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する、結合の例示的な結合プロフィールは、図６Ａ（１）に示され、ここでは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対するＷＴ　Ｂ７−１の結合親和性はほぼ等しいことが示される。ＷＴ　Ｂ７−１の結合プロフィールと比較して、特定のクローンのＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に対する優先的な結合を示す例示的な結合プロフィールは、図６Ａ（３）に示される；このクローンは、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比よりも顕著に大きなＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。ＷＴ　Ｂ７−１の結合プロフィールと比較して、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する中程度の優先的な結合を示す例示的な結合プロフィールは、図６Ａ（２）に示される；このクローンは、ＷＴ　ｈＢ７−１のＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合親和性比よりも大きなＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合親和性比を有する。
【０５４３】
スコアを、３個の例示的な結合プロフィールに対する比較に基づいて各ＮＣＳＭクローンに対して割り当てる。スコアゼロ（０）は、ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンがＷＴ　Ｂ７−１の結合プロフィールと類似かまたは同等の結合プロフィールを有することを示す。スコア１は、ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンが図６Ａ（２）に示される結合プロフィールと類似かまたは同等の結合プロフィールを有することを示す（すなわち、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比がＷＴ　ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＣＤ２８結合親和性比より大きい状態）。スコア２は、ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンが図６Ａ（３）に示される結合プロフィールと類似かまたは同等の結合プロフィールを有することを示す（すなわち、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比がＷＴ　ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比より顕著に大きい状態）。選択したそれぞれのＣＴＬＡ−４ＢＰクローンに割り当てたクローン識別（ＩＤ）名およびスコアを表４に示す。本明細書中に記載される他のＣＴＬＡ−４ＢＰクローンに対する結合プロフィールもまた、作製した（データは示さない）。
【０５４４】
【表４】
2004513878.tif 000019
2004513878.tif 000020
ＷＴ　ｈＢ７−１の結合と比較して、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対して優先的な結合を示す３６個のクローンに対応するプラスミドを、回収した；それぞれの対応するＣＤ２８ＢＰ分子を回収し、そして核酸配列およびアミノ酸配列を決定した。これらのクローンに、観測した優先的な結合の大きさに依存して、表３に示すようにスコア２および１を割り当てた。
【０５４５】
ＷＴ　Ｂ７−１の結合と同じかまたはほぼ同等のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４結合プロフィールを示したＣＤ２８ＢＰ　Ｒ２ライブラリーからの１２個のＲ２クローンに対するプラスミドを、回収した；それぞれの対応するクローン分子を回収し、そしてその核酸配列およびアミノ酸配列を決定した。これらのクローンに、表３に示すように、スコア０を割り当てた。
【０５４６】
Ｒ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンの２つのグループ（第１のグループ（ＧｒｏｕｐＩ）の１９個、および第２のグループ（Ｇｒｏｕｐ　ＩＩ）の２６個）を、これらのクローンを用いてトランスフェクトした細胞と蛍光標識した可溶性ＣＤ２８−Ｉｇ融合体および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合体との間の競合的結合アッセイで示すように、ｈＢ７−１の結合と比較してＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に対する優先的な結合を有するものとして同定した。これらのクローンは、表４において同定しており、ここにはクローンのＩＤ名および結合スコアを示す（表３に関して説明したのと同じ）；それぞれのＣＴＬＡ−４ＢＰクローンに関するアミノ酸配列および核酸配列を決定した。一般的に、Ｒ２クローンは、Ｒ１クローンよりもさらに大きな程度のＣＴＬＡ−４結合優先を示した。さらに、ＷＴ　ヒトＢ７−１の結合プロフィールと同じかまたはほぼ同等の結合プロフィールを有するＣＴＬＡ−４　Ｒ２ライブラリーからの５個のＲ２クローンを同定した。全てのこのようなクローンに対するプラスミドを回収した；核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれのクローンに関して決定し、そしてそれぞれのクローンに結合スコアを割り当てた（表４を参照のこと）。
【０５４７】
ｈＢ７−１と比較して、ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する選択クローンの好ましい結合または増強された結合を、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と比較した、このクローンについてのＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比の観測における増加によって観測した。ＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に対する選択したクローンの好ましい結合または増強された結合を、ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と比較した、このクローンについてのＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比の観測における増加によって観測した。
【０５４８】
ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比と比較してＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比において最も大きい増加を示すＲ２の選択クローンは、クローンＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−１５であった。ｈＢ７−１のＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比と比較してＣＴＬＡ−４／ＣＤ２８結合親和性比においてもっとも大きい増加を示す同定したクローンは、クローンＲ２　ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃであった。図４Ａ〜４Ｄは、ヒトＢ７−１と比較したＣＤ２８ＢＰ−１５およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃの競合的リガンド結合性の特性付けを示す。ＣＤ２８ＢＰ−１５、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ、ｈＢ７−１またはネガティブコントロールベクター（これは、Ｂ７−１、ＣＴＬＡ４−ＢＰ、またはＣＤ２８ＢＰヌクレオチド配列の挿入を含まなかった）を用いてトランスフェクトした２９３細胞を、蛍光標識化ビオチンに接合体化したＣＤ２８−ＩｇまたはＦＩＴＣに接合体化したＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質を用いて染色した。代表的なフローサイトメトリー分析の結果を図４Ａ〜４Ｄに示す；同様の結果を５つの他の実験において得た。ＣＤ２８ＢＰ−１５またはＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃを発現し、かつ同一条件下で染色したトランスフェクト体は、同一の様式で染色したｈＢ７−１を発現するトランスフェクト体と比較して、劇的に改変されたリガンド結合プロフィールを示した。特に、ＣＤ２８ＢＰ−１５は、ＣＤ２８に対するｈＢ７−１の結合と比較して、ＣＤ２８に対して顕著に変化した結合プロフィールを示した。ＣＤ２８ＢＰ−１５はまた、ＣＴＬＡ−４に対するヒトＢ７−１の結合と比較して、ＣＴＬＡ−４結合の顕著な損失を示した。
【０５４９】
図８Ａ〜８Ｂは、ＣＤ２８ＢＰ−１２およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃの代表的なアミノ酸配列およびこれらの配列の系図を示す。ＣＤ２８ＢＰ−１２およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃそれぞれのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、組換え配列の親起源を同定するための出発遺伝子と一緒に整列させた。それぞれの組換えアミノ酸部分配列のキメラ性質を、特定の親種の配列から誘導したそれぞれのアミノ酸配列を設計する連続標識線（ｓｏｌｉｄ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｌｉｎｅ）によって示す。対応する（同等の）アミノ酸残基の位置におけるＷＴヒトＢ７−１配列中の残基と異なる任意のアミノ酸残基は、星印（＊）をつけて示す。出発親遺伝子のいずれからも誘導されなかったＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃにおける３点の変異を、黒三角で示す。予測した経膜的ドメイン（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｋ．Ｒ．＆Ｈｏｗａｒｄ，Ｃ．Ｊ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４９：２３１−４における哺乳動物Ｂ７−１分子に関する当量分析（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づく予測）は、点線で示す。
【０５５０】
ＣＤ２８ＢＰ−１５の配列分析は、主にヒト、ウシ、およびウサギ配列由来のキメラを含むアミノ酸配列を示す（図８Ｂ）。ＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対する優先的な結合を示す組換えの第２ラウンドから得られるライブラリーから選択した残りのクローンは、優先的な結合特性を有するクローンの相違を示す配列アラインメント比較（ＤＮＡＳＴＡＲまたは上述のデフォルトのパラメーターを用いたＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩアルゴリズムを用いる）に基づいて、ＣＤ２８ＢＰ−１５と約７４〜約９９％の配列相同性を共有する。このヌクレオチドおよびアミノ酸配列とＣＤ２８ＢＰ−１５およびヒトＢ７−１との相同性は、それぞれ、７３％および６１％であった（ＤＮＡＳＴＡＲまたはデフォルトパラメーターを用いたＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ　アルゴリズム）。アミノ酸配列アラインメントに基づいて、ｈＢ７−１と比較してＣＴＬＡ−４よりもＣＤ２８に対して優先的な結合を示す全ての選択したＣＤ２８ＢＰクローンは、「成熟」ＣＤ２８ＢＰ−１５アミノ酸配列のアミノ酸の４９位でイソロイシンがバリンで置換された（Ｉｌｅ４９Ｖａｌ）（これは、成熟ｈＢ７−１配列を用いたアラインメントと対応する）。この置換は、ＣＤ２８ＢＰ−１５の全長におけるアミノ酸８５位の置換およびヒトＢ７−１の全長におけるアミノ酸８３位の置換に対応する。なぜならば、ＣＤ２８ＢＰ−１５は、推定配列において２個のさらなるアミノ酸残基を含むからである。Ｉｌｅ４９は、Ｂ７−１とＣＴＬＡ−４との相互作用に直接関与するようには思われないが（例えば、Ｓｔａｍｐｅｒ，Ｃ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ　４１０：６０８−６１１を参照のこと）、Ｉｌｅ４９Ａｌａ置換は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方に対するＢ７−１の結合を完全に消すことが以前示され、このことは、この残基がリガンド結合に重要であることを示唆している（Ｐｅａｃｈ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９５）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２１１８１−７）。Ｉｌｅ４９Ｖａｌ置換はまた、保存的置換とみなされるが、本出願人のデータは、天然に存在する遺伝子から誘導された変異は、ウシＢ７−１遺伝子配列からの誘導の場合には、タンパク質における改変された機能的性質を探索するための改良法を提供することを示唆する。特に、ウシＣＤ２８レセプターは、１２個の異なる種から分析したＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターアミノ酸配列の中で唯一の例外であり、この中で、ヘキサペプチドＭＹＰＰＰＹおよびＧｌｙ−６６は、レセプター配列において完全に保存的ではない（すなわち、ＭＹＰＰＰＹはＬＹＰＰＰＹによって置換され、そしてＧｌｙ−６６はバリンによって置換される（Ｍｅｔｚｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｂｉｏｌ　４：５２７−３１を参照のこと））。ヘキサペプチドＭＹＰＰＰＹは、種々の哺乳動物種におけるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方のＦ−Ｇループにおいて保存されている。ＭＹＰＰＰＹ配列における任意の残基の変異は、Ｂ７−１およびＢ７−２に対する結合の減少を導き（同書を参照のこと）、そして全てのこれらの残基は、Ｐｒｏ１０１を除いて、直接Ｂ７−１と接触し（Ｓｔａｍｐｅｒ，Ｃ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ　４１０：６０８−６１１）、ウシＣＤ２８レセプターのこの領域における変化は、本明細書中に記載されるＣＤ２８ＢＰのインビトロでの進化にも役立つような特性を獲得するためにウシＢ７−１の天然進化の原動力となった。
【０５５１】
ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは、主にヒト、ヒヒ、アカゲザルおよびウシのＢ７−１遺伝子と対応するアミノ酸配列を含んでおり（図８Ａ）、そしてＣＴＬＡ−４ＢＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれｈＢ７−１のこれらの配列と９７％および９６％一致した。さらに、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは、出発遺伝子のいずれからも誘導されない３個のアミノ酸変異を含んでいた（図８Ａ）。結合アッセイにおいてｓＣＤ２８−ＩｇよりもｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対して優先的に結合する残りのクローンは、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃと９５〜９９％の同一性を示した（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲまたはデフォルトパラメーターを用いるＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩアルゴリズムを使用して）。
【０５５２】
ＣＴＬＡ−４に対して優先的に結合する多くの選択したクローンにおいて、ＣＴＬＡ−４　５×４−１２ｃの成熟配列におけるＴｙｒ−３１をヒスチジンと置換し（すなわち、Ｔｒｙ３１Ｈｉｓ）、一方、ＣＤ２８に対して優先的に結合する全ての選択したクローンは、その位置にチロシンを保持していた。Ｔｙｒ−３１はまた、全ての成熟親配列における同等の位置に存在した。成熟ＣＴＬＡ−４ＢＰ配列および成熟ｈＢ７−１配列のＴｙｒ−３１は、それぞれ、ＣＴＬＡ４−ＢＰの全長の配列およびｈＢ７−１配列のＴｙｒ−６５に対応する。興味深いことに、ヒトＢ７−２におけるＴｙｒ３１は、リガンド結合親和性を何ら明確に変化させることなくフェニルアラニンと置換され得（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：９０９−１１）；Ａｚｕｍａ，Ｍ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６６：７６−９を参照のこと）、一方、ｈＢ７−１におけるＴｙｒ３１Ａｌａ置換は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方に対するｈＢ７−１の結合を完全に消すようであること（Ｐｅａｃｈ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９５）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２１１８１−７を参照のこと）が、示唆されている。現在のデータは、Ｔｙｒ３１Ｈｉｓ置換は、少なくともシャッフルしたＣＴＬＡ−４ＢＰ配列との関連で存在する場合、ＣＴＬＡ−４との相互作用に顕著には影響を与えないことを示し、一方この変異は、ＣＤ２８に対する結合における損失に寄与するようであり、この残基がＢ７−１のリガンド結合において重要な役割を果たすことをさらに示唆する。ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰの三次元構造に関する情報は、２つのそれぞれのリガンドに対するＮＣＳＭの優先的な結合に寄与するアミノ酸残基および構造をさらに特徴付けするのに有用である。
【０５５３】
配列第２ラウンドＣＤ２８ＢＰクローンは、野生型Ｂ７−１分子からのアミノ酸多様性およびヌクレオチド多様性の範囲を示した。例えば、第２ラウンドＣＴＬＡ４ＢＰクローンは、ＷＴ　Ｂ７−１分子と９３．８〜９６．９％のアミノ酸同一性を有し、ヌクレオチドレベルで９６．２〜９７．７％同一性を有した。
【０５５４】
クローンＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−１５のアミノ酸配列は、同一のクローンＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−３、ＣＤ２８ＢＰ−６、およびＣＤ２８ＢＰ−９のアミノ酸配列と、１１０位での１個のアミノ酸残基のみによって異なる；ＣＤ２９ＢＰ−１５は、１１０位でプリン残基を有する；クローンＣＤ２８ＢＰ−３、ＣＤ２８ＢＰ−６、およびＣＤ２８ＢＰ−９は、１１０位でロイシン残基を含む。
【０５５５】
クローンＣＤ２８ＢＰ−１５およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃに対する標識した可溶性リガンドｓＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ４−Ｉｇの結合をさらに研究し、図９Ａ〜９Ｈに示した。詳細には、２９３細胞を一過性に（図９Ａ〜９Ｂ）または安定に（図９Ｃ〜９Ｄ）、ＣＤ２８ＢＰ−１５（黒丸）またはｈＢ７−１（白四角）とＦＬＡＧタグ有（点線）およびＦＬＡＧタグ無（実線）でトランスフェクトした。２９３細胞は、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ（黒三角）またはＷＴ　ｈＢ７−１（白四角）で安定にトランスフェクトされた（図９Ｄ〜９Ｅ）。ＷＴ　ｈＢ７−１、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸挿入を欠くベクターで一過性に（図９Ａ〜９Ｂ）または安定に（図９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ）トランスフェクトした細胞は、ネガティブコントロール（白菱形）として使用した。トランスフェクト体を、上述のように調製した標識化された可溶性のＣＤ２８−Ｉｇ（図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ）または可溶性のＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ）の濃度を増加させながら染色し、そしてこれらの細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ（灰色ヒストグラム）、ｈＢ７−１（灰色ヒストグラム）およびネガティブコントロールトランスフェクト体（白色ヒストグラム）を発現する安定な２９３トランスフェクト体を、抗ｈＢ７−１　ｍＡｂ（図９Ｇ〜９Ｈ）で染色し、そしてその発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。
【０５５６】
ｓＣＤ２８−ＩｇまたはｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇとの個々のトランスフェクト体の染色は、ＣＤ２８ＢＰ−１５トランスフェクト体が、ｈＢ７−１を発現するトランスフェクト体よりも高いレベルでｓＣＤ２８−Ｉｇに結合することを示し（ＭＦＩ値の増加によって示される）、一方、ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合は、顕著に低下するが、検出可能であった（図９Ａ〜９Ｄ）（ＭＦＩの低下によって示される）。一方、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃトランスフェクト体に対するｓＣＤ２８−Ｉｇの結合は、高いｓＣＤ２８−Ｉｇ濃度ですらほとんどまたは実質的に全く検出されず、一方、同じトランスフェクト体はｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに結合したが、ｈＢ７−１を発現するトランスフェクト体よりいくらか低いレベルであった（図９Ｅ〜９Ｆ）（ＭＦＩ値によって示される）。ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃに対するｓＣＤ２８−Ｉｇ結合の損失は、トランスフェクト体に対する抗−ｈＢ７−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合によって決定したように、発現の損失に起因しなかった（図９Ｇ〜９Ｈ）。ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃとは対照的に、ｈＢ７−１に対して特異的なｍＡｂはＣＤ２８ＢＰを認識しなかった（データは示さない）。
【０５５７】
トランスフェクトされた細胞上のＣＤ２８ＢＰ−１５の増加した発現がｓＣＤ２８−Ｉｇの改良された結合に寄与するかどうかを分析するために、本発明者らは、ＦＬＡＧタグをｈＢ７−１に融合し（Ｂｒｉｚｚａｒｄ，Ｂ．Ｌ．ら（１９９４）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１６：７３０−５によって参照のこと）、クローンをシャッフルし、そして対応するトランスフェクト体に対するＦＬＡＧ特異的ｍＡｂ　Ｍ２の結合を研究した（同書を参照のこと）。７個の別個の一過性トランスフェクト体において、ＣＤ２８ＢＰ−ＦＬＡＧおよびｈＢ７−１−ＦＬＡＧトランスフェクトされた２９３細胞の平均の蛍光強度（ＭＦＩ）は、それぞれ、５２±２０および５５±１２であった（平均±ＳＥＭ）。ＦＬＡＧ構築物の発現における顕著な違いは観測されなかったが、ＣＤ２８−Ｉｇの顕著な増強された結合をまた、ＦＬＡＧ構築体を用いて観測し（図９Ａ〜９Ｂ）、ＣＤ２８ＢＰ−１５によるｓＣＤ２８−Ｉｇの改善された結合がＣＤ２８ＢＰ−１５の改善された発現よりも改善された親和性に起因したことを強く示唆した。
【０５５８】
本発明者らはまた、ｓＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇを用いた二色分析によって全ての出発Ｂ７−１遺伝子のリガンド結合特性を分析して、ＣＤ２８ＢＰ−１４およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは、本当に新しい特性の証拠を示すことを示した。ヒト、アカゲザル、オランウータン、およびヒヒＢ７−１遺伝子でトランスフェクトした２９３細胞は、ＳＣＤ２８−ＩｇおよびｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対する本質的に同一の結合プロフィールを示し、一方、ネコＢ７−１は、ｓＣＤ２８−Ｉｇに対してもｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対してもほとんどまたは全く結合を示さなかった（データは示さない）。ウシおよびウサギＢ７−１トランスフェクト体は、ヒトおよび霊長類のＢ７−１に関して観測された同じ範囲におけるｓＣＤ２８−Ｉｇ結合を示したが、ｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇに対する結合のレベルは、いくらか低かった。しかし、ＣＤ２８ＢＰ−１５に対するｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇの結合レベルは、他の出発遺伝子のいずれかの結合レベルよりも一貫して低かった；ヒトＢ７−１（ｎ＝４）、ウシＢ７−１（ｎ＝４）、ウサギＢ７−１（ｎ＝２）、およびＣＤ２８ＢＰ−１５（ｎ＝２）に対するｓＣＴＬＡ−４−Ｉｇ結合の平均ＭＦＩは、それぞれ、２４７、１０２、２０５、および３０であった。従って、ＣＤ２８ＢＰ−１５およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは、出発遺伝子のいずれかと比較して固有な特性を示した。
【０５５９】
（Ｂ．機能アッセイ）
シャッフルしたＲ２　ＣＤ２８ＢＰ分子の機能特性を調査するために、代表的なクローンＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−１からＲ２　ＣＤ２８ＢＰ−１７に対応する核酸配列を、Ｂ７ネガティブ細胞株中にトランスフェクトし、ヒトＴ細胞を活性化する生じたトランスフェクト体の受容能力を（上記のように３Ｈチミジンの取り込みを用いるＴ細胞増殖アッセイを用いて）分析した。選択したクローンの代表的な結果を図１０に示す。可溶性抗ＣＤ３誘導増殖アッセイにおいてＴ細胞を同時刺激した場合、これらの選択したクローンは、わずかな誘導（潜在的なアンタゴニスト）からヒトＢ７−１を越える改善された誘導までの範囲の増殖応答を誘導した（図１０）。その範囲の１端で、ＣＤ２８に結合することが示されているクローンＣＤ２８ＢＰ−８（アミノ酸配列番号５９）は、野生型ｈＢ７−１と比較して低いＴ細胞増殖を誘導した。ＣＤ２８ＢＰ−８は、空のベクター（Ｂ７−１、ＣＤ２８ＢＰ、またはＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸挿入物を欠損する）でトランスフェクトした細胞によって誘導されるＴ細胞増殖レベルよりもわずかに強いＴ細胞増殖レベルを誘導した。対照的に、ＣＤ２８ＢＰ−１５は、ＷＴ　ｈＢ７−１によって誘導されたＴ細胞増殖応答よりも優位に強いＴ細胞増殖応答を誘導した（図１０）。他のＣＤ２８ＢＰクローンはＷＴ　ｈＢ７−１によって誘導されたＴ細胞増殖応答にほぼ等しいＴ細胞増殖応答を誘導した。
【０５６０】
クローンＣＤ２８ＢＰ−１５により精製したヒトＴ細胞の促進された同時刺激を、以下のようにさらに調査した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。２９３細胞を、ＣＤ２８ＢＰ−１５核酸、ｈＢ７−１核酸、あるいはｈＢ７−１またはＣＤ２８ＢＰ−１５核酸挿入物を欠いた空のコントロールベクターで、一過性（図１１Ａ）または安定に（図１１Ｂ）トランスフェクトし、そして照射したトランスフェクト体を上に記載のように精製したヒトＴ細胞および抗ＣＤ３ｍＡｂで（ＴＣＲによってＴ細胞の同時刺激を誘導するために）同時培養した。３回（図１１Ａ）または６回（図１１Ｂ）の独立した実験で得た１分あたりのカウント（Ｃ．Ｐ．Ｍ）（３Ｈチミジンの取り込み）の平均±ＳＥＭ（平均の標準偏差）を示す。
【０５６１】
ＣＤ２８ＢＰ−１５トランスフェクト体は、ｈＢ７−１でトランスフェクトした細胞と比較して、抗ＣＤ３ｍＡｂ存在下で培養した、精製したヒトＴ細胞で非常に増強された増殖を誘導した（図１１Ａ）。さらに、我々は、飽和濃度でｓＣＤ２８−Ｉｇの結合に基づくＮＣＳＭ分子の類似したレベルを発現したクローンを選択することによって、ＣＤ２８ＢＰ−１５およびｈＢ７−１の安定なトランスフェクト体を産生した。一過性トランスフェクト体に類似して、ＣＤ２８ＢＰ−１５を発現する安定なトランスフェクト体は、ｈＢ７−１を発現するトランスフェクト体のＴ細胞増殖よりも強力なＴ細胞増殖を誘導した（図１１Ｂ）。
【０５６２】
ＣＤ２８ＢＰ−１５またはｈＢ７−１を発現する照射した安定なトランスフェクト体および挿入物を欠くベクターでトランスフェクトしたネガティブコントロール細胞を、精製ヒトＴ細胞と共培養し、ＩＦＮ−γ産生のレベルを４８時間の培養期間の後に測定した。代表的な実験を図１１Ｃに示す；類似したデータが、３つの他の実験で得られた。ＣＤ２８ＢＰ−１５を発現しているトランスフェクト体に応じた、ＩＦＮ−γの産生は、ｈＢ７−１トランスフェクト体によって誘導されるＩＦＮ−γの産生よりも高かった（図１１Ｃ）。類似のヒトＴ細胞増殖レベルを得るために、ｈＢ７−１を発現するトランスフェクト体よりも、およそ１０倍少ないＣＤ２８ＢＰ−１５を発現する一過性または安定なトランスフェクト体を必要とする。重要なことに、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生の最大レベルもまた増大した（図１１Ｃ）。我々は、これらの結果が、おそらくＣＴＬＡ−４を介するネガティブシグナル伝達の欠損に起因すると考えている。増強したＣＤ２８に対する親和性および減少したＣＴＬＡ−４に対する親和性が、ＣＤ２８ＢＰ−１５媒介の改善されたＴ細胞応答に寄与していることは、明らかである。
【０５６３】
Ｔ細胞増殖アッセイにおいて精製したＴ細胞についての、ラウンド２のＣＴＬＡ−４ＢＰクローンの影響を調査した。上に記載のように実施した代表的なＴ細胞増殖の研究において、ＣＤ２８に対して弱い結合を有するが、ＣＴＬＡ−４に対して相対的に強い結合を有する、Ｒ２ライブラリーの１９の選択されたクローン（ＣＴＬＡ４ＢＰ−１〜ＣＴＬＡ４ＢＰ−１９として名付けた）が、可溶性抗ＣＤ３誘導Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、野生型ｈＢ７−１によって誘導したＴ細胞増殖と比較して、Ｔ細胞増殖を減少させることを見出した（図１２を参照のこと）。空のベクター（Ｂ７−１またはＣＴＬＡ−４ＢＰ核酸挿入物を欠く）でトランスフェクトした細胞を、コントロールとして用いた。これらの選択したＣＴＬＡ−４ＢＰクローンは、ｈＢ７−１誘導に比べてＴ細胞の減少誘導または抑制誘導からＴ細胞増殖の重大な阻害までの応答範囲を生じた（図１２）。
【０５６４】
精製したＴ細胞での例示的クローンＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃの影響ならびにＭＬＲにおいて誘導したＴ細胞増殖およびサイトカイン合成を、さらに調査した。代表的な結果を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。同時刺激実験において、精製Ｔ細胞を、可溶性抗ＣＤ３　ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）およびｈＢ７−１、ＣＤ２８ＢＰ−１５、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃを発現する一過性トランスフェクト体、または発現した配列を欠くベクターコントロールの存在下で、共培養した（図１３Ａ）；代表的な実験を示す。類似データを、他の２つの実験において得た。図１３Ｂに示すように、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ核酸（黒三角形）、ｈＢ７−１核酸（白抜き四角）、あるいはＢ７−１、ＣＴＬＡ−４ＢＰ、またはＣＤ２８ＢＰ核酸挿入物（白抜き菱形）を欠くコントロールベクターで安定にトランスフェクトした２９３細胞の漸増する数を、ＭＬＲ培養物に加えた。Ｃ．Ｐ．Ｍの平均±ＳＥＭを示すデータを、６つの別個のＭＬＲ培養物で得、それぞれ４〜６回継代したウェルを用て実施した。図１３Ｃ〜１３Ｄに示すように、ＭＬＲを、ｈＢ７−１、ＣＴＬＡ−４ＢＰ、５×４−１２ｃまたは挿入物を有さないコントロールベクターで安定にトランスフェクトした、２５０００個の照射した２９３細胞存在下で培養した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０レベルを、ＭＬＲを４８時間培養した後にＥＬＩＳＡによって測定した（図１３Ｃ〜１３Ｄ）。６回の独立した試験を実施し、そして１回の実験で得た評価を実線に結んでいる。ｈＢ７−１またはベクターコントロールと比較して、ＣＴＬＡ４ＢＰ　５×４−１２ｃでは、ＩＦＮ−γの産生レベルは有意に増加し（Ｐ＜０．０５）、ＩＬ−１０の産生レベルは有意に減少した（Ｐ＜０．０１）（対応スチューデントのｔ検定）。
【０５６５】
ＣＤ２８ＢＰ−１５、ｈＢ７−１およびコントロールベクターに関連して、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは可溶性抗ＣＤ３　ｍＡｂの存在下で培養したヒトＴ細胞を同時刺激する能力をほとんど示さなかった（図１３Ａ）。ヒトＴ細胞の同時刺激は、一過性または安定性のどのＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２トランスフェクト体によっても誘導されなかったが、トランスフェクト体表面上の分子の有効な発現を、抗Ｂ７−１　ｍＡｂを用いて得た（図９Ｇ〜９Ｈ、１３Ａを参照のこと、データは報告されていない）。実際に、ＣＤ２８を越えてＣＴＬＡ−４に優先的に結合することを示した、選択した１９のラウンド２クローン（組換えの第二ラウンドの群Ｉに由来する）のうちの２つのみが、ｈＢ７−１によって誘導されるＴ細胞応答のよりも、１０％多いＴ細胞応答を誘導する能力を有し（データは示していない）、このことは、ＣＤ２８を介するシグナル伝達の欠如に関連するこれらのクローンに結合するｓＣＤ２８−Ｉｇの欠損を説明する。
【０５６６】
さらに重要なことに、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃトランスフェクト体は、用量依存的な様式で混合した、リンパ細胞の応答（ＭＬＲ）で誘導されるＴ細胞増殖を阻害した（図１３Ｂ）。さらに、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃトランスフェクト体は、ＭＬＲでのＩＬ−１０産生を誘導するが、ＩＦＮ−γの産生を、ｈＢ７−１またはコントロールトランスフェクト体と比較して減少させ（それぞれ、図１３Ｄおよび１３Ｃ）、さらにＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃは、ｈＢ７−１と比較して劇的に変化した生物学的機能を有するというｎｏｔｉｏｎを支持する。いくつかの研究は、免疫寛容の誘導および維持における、ＣＴＬＡ−４の支持的役割を示唆する（ＭｃＡｄａｍ，Ａ．Ｊ．ら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ　１６５：２３１−４７；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：９８５−８；Ｐｅｒｅｚ，Ｖ．Ｌ．ら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　６：４１１−７；Ｓｈｒｉｋａｎｔ，Ｐ．ら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１１：４８３−９３；ｖａｎ　Ｅｌｓａｓ，Ａ．ら（１９９９）Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１９０：３５５−６６；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．ら（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１４：１４５−１５５）およびＩＬ−１０（例えば、Ｇｒｏｕｘ，Ｈ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８９：７３７−４２；Ｒｉｚｚｏ，Ｌ．Ｖ．ら（１９９９）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６２：２６１３−２２を参照のこと）。本発明の結果はまた、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰｓ（例えば、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃを含む）が、自己免疫疾患などに特異的なＴ細胞の機能をダウンレギュレートすることにおいて有益であり、従ってこのような疾患の処置のための治療方法および予防方法において有益であることを示唆する。
【０５６７】
Ｂ７変異体に関する先の研究は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する結合部位が広く重なることを示し、そして一方のリガンド（すなわち、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４）への結合に影響するＢ７の変異がまた、一般的に他方のリガンドへの結合にも影響したことを示した。しかし、制限された数の改変体のみを試験し、それらを一般的に予期したリガンド結合部位の情報に基づいて設計した。例えば、今回の結果と対照的に、構造的情報および予想したレセプター結合部位に基づいて以前に設計したヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）の変異は、一般的にＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４への結合に対して等価な影響を生じた（例えば、Ｐｅａｃｈ，Ｒ．Ｊ．らＪ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０，２１１８１−７（１９９５））。現在のデータは、変化されたリガンド結合特性を有する機能的な改変体の頻度は、所望の表現型を適当な選択基準およびスクリーニング手順を用いて容易に同定し得るのに非常に十分なことを示す。従って、既知の哺乳動物ゲノムの組換えによって産生した配列の適当なスクリーニングは、タンパク質のレセプター結合部位または構造についての詳細な知識を用いずに、新規の機能特性を有するそれらの組換え配列を同定する、効果的な手段として用いられる。これらの結果は、新規の機能特性を有するタンパク質を進化させる、異種の哺乳動物遺伝子の交雑育種の利点を示す。ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰはまた、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４がそれぞれ、Ｔ細胞にポジティブシグナルおよびネガティブシグナルを引き起こすメカニズムを、さらに推論することにおいて役立ち得る。Ｂ７−１およびＢ７−２がＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方に自然に結合するという事実は、それらの臨床的用途の潜在的な範囲を制限している。本明細書中に記載のキメラのＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ分子は、広範囲の臨床的用途を有する；例えば、それらは、種々の薬学的用途および医学的用途およびワクチン接種におけるインビトロおよびインビボでのＴ細胞応答の操作において有益である。
【０５６８】
（実施例ＩＶ：可溶性ＮＣＳＭのポリペプチドおよび融合タンパク質ならびにそれらをコードする核酸の産生）
本発明はまた、本明細書中に記載の種々の形態を含む可溶性ＮＣＳＭポリペプチド、ならびにその小配列およびフラグメントを提供し、例としては、ＮＣＳＭポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体もしくはホモログ、およびＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質またはそのフラグメント、改変体もしくはホモログの少なくとも１つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）；ならびに全てのこのようなポリペプチド、タンパク質、フラグメント、ホモログ、および改変体をコードするヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６９】
ＮＣＳＭポリペプチドの可溶性形態は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロの方法において有益であり、例としては、種々の免疫学的障害および疾患（例えば、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、耳鼻咽頭癌、癌、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ　ｃａｎｃｅｒ）、白血病、黒色腫、頭頸部の癌（ｈｅａｄ−ａｎｄ　ｎｅｃｋ　ｃａｎｃｅｒ）、胃癌、子宮頸部癌、卵巣癌、リンパ腫、結腸癌、結腸直腸が挙げられるがこれらに制限されない癌を含む）；アレルギー／喘息、自己免疫疾患、臓器移植（例えば、移植片対宿主の疾患、および自己免疫疾患）、慢性感染疾患（例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）単純疱疹（ＨＳＶ）、型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などに関連するウイルス感染疾患などが挙げられるが、これらに制限されない）、および細菌感染疾患（例として、ライム病、結核およびクラミジア感染症が挙げられるが、これらに制限されない）；ならびに本明細書中に記載の、本発明の非可溶性ＮＣＳＭに関する他の疾患を処置または予防するための、ＤＮＡプラスミド発現ベクター（例えば、ＤＮＡワクチン；遺伝子治療用途）またはタンパク質のいずれかとして、そして非可溶性ＮＣＳＭについて記載されるワクチン用途におけるワクチンアジュバントとして投与された治療的処置または予防的処置あるいは診断方法が挙げられる。
【０５７０】
この実施例において、可溶性ＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードする核酸に対応する調製のために、選択したＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰクローンを使用した。ＣＤ２８ＢＰ　ＥＣＤポリペプチドまたはそのフラグメントは、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比率と等価またはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比率、および下に記載する他の生物学的特性を有し得；そのフラグメントのＣＴＬＡ−４ＢＰ　ＥＣＤポリペプチドは、ｈＢ７−１のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比率と等価またはそれより高いＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合親和性比率、および下に記載する他の生物学的特性を有し得る。
【０５７１】
（Ａ．ＮＣＳＭポリペプチドの可溶性ｓＥＣＤをコードする発現ベクター）
ＮＣＳＭポリペプチド（またはそのフラグメント）の可溶性（非膜結合性）細胞外ドメイン（ｓＥＣＤ）をコードする哺乳動物の発現プラスミドを、選択した全長ＮＣＳＭ　ＤＮＡ配列を含むプラスミドから選択したＮＣＳＭ　ＥＣＤのｐｆｕ　ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いるＰＣＲ増幅によって構築した。ＰＣＲプライマーを、ＮＣＳＭ　ＥＣＤ（またはそのフラグメント）に対応する特定の核酸領域の最初または最後の２０〜２４ヌクレオチドで特異的にアニールするように設計し、制限部位ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによってそれぞれ５’末端および３’末端に隣接させた。別個のＥＣＤ（またはそのフラグメント）をコードする約７３０塩基対（ｂｐ）のアンプリコン（各クローンについての特異的塩基対数を表５において示す）を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって消化し、その後低融点のアガロースゲル電気泳動によって精製した（例えば、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載の手順を参照のこと）。骨格ベクターとして使用したｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、標準クローニング手順を用いて、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限酵素によって消化し、Ｅ−エピトープ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを含むカルボシキシル末端エピトープ融合タグをコードする核酸配列に対してインフレームで融合（連結）した。次いで、このベクターフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによって消化し、ベクター骨格およびＥ−エピトープ／ｈｅｘａ−Ｈｉｓタグ融合配列を含む約５４００ｂｐのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントにした。可溶性ＥＣＤ　ＮＣＳＭ発現プラスミドを産生するために、このベクターフラグメントをゲル精製し、それぞれ約７３０ｂｐのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ　ＮＣＳＭ　ＥＣＤポリヌクレオチドに連結した。野生型ヒトＢ７−１の可溶性ＥＣＤ形態をコードする哺乳動物発現プラスミドを、全長ＷＴヒトＢ７−１　ＤＮＡ配列を含むプラスミドから同じように調製した。
【０５７２】
【表５】
2004513878.tif 000021
。
【０５７３】
表５は、ヌクレオチド残基、シグナルペプチド配列ならびに選択したＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰクローンの各ＥＣＤドメインならびにＷＴｈＢ７−１　ＥＣＤでのそれに相当する位置に対応するアミノ酸残基、そして選択したＮＣＳＭクローンまたはＷＴ　ｈＢ７−１の各ＥＣＤの３’末端の最後３つのアミノ酸残基を示す。本発明は、各ＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチド（または上記ポリペプチドをコードする核酸）の最初の３４アミノ酸（または同じものをコードすする１０２核酸）が欠損するような、シグナルペプチド配列を欠いたＮＣＳＭポリペプチド（およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列）のＥＣＤドメインを提供する。
【０５７４】
図１４Ａは、Ｅエピトープアミノ酸配列およびｈｅｘａ−Ｈｉｓタグアミノ酸に融合したｈＢ７−１−ＥＣＤの模式的な図解を示す。Ｅエピトープおよびｈｅｘａ−Ｈｉｓタグに対応するアミノ酸配列、ならびにＥＣＤの選択したアミノ酸を示す。
【０５７５】
６０６３ｂｐを含み、可溶性ＮＣＳＭ　ＥＣＤをコードするｐＮＳＣＭｓＥＣＤと呼ばれる、上述の手順によって作製した代表的なプラスミド発現ベクターを、図１５に示す。このベクターとしては、とりわけ例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ＡＲ、およびウシ成長ホルモン（ｂＧｈ）ポリＡ末端配列を含むｐＣＤＮＡ３．１（＋）骨格の選択されたエレメント；Ｅ−エピトープ／ｈｉｓタグをコードする核酸配列；ＮＣＳＭ　ＥＣＤをコードする核酸配列；およびＣＭＶプロモーター（例えば、ヒトＣＭＶプロモーターあるいは組換えまたはキメラＣＭＶプロモーターのような公知のプロモーターまたはＷＴ　ＣＭＶプロモーター）が挙げられる。可溶性ｈＢ７−１−ＥＣＤまたはそのフラグメントをコードするプラスミドベクターを、図に示すＮＣＳＭ−ＥＣＤ配列に対するｈＢ７−１−ＥＣＤ配列またはそのフラグメントの置換によって作製し得る。
【０５７６】
可溶性ＮＣＳＭ短縮ＥＣＤ（例えば、ＮＣＳＭ　ＥＣＤフラグメント）または可溶性ＷＴ　ｈＢ７−１−ｔｒｕｎＥＣＤのいずれかをコードするプラスミド発現ベクターを、切断型ＮＣＳＭ　ＥＣＤ核酸配列または切断型ｈＢ７−１　ＥＣＤヌクレオチド配列をＮＣＳＭ　ＥＣＤヌクレオチド配列に対して置換することにより、上記の手順を用いて作製し得る。表６は、ヌクレオチド残基の位置、シグナルペプチド配列および選択したＣＤ２８ＢＰおよびＣＴＬＡ−４ＢＰクローンの例示的な短縮ＥＣＤドメインおよびＷＴ　ｈＢ７−１　ＥＣＤの対応するアミノ酸残基、ならびにＮＣＳＭクローンまたはＷＴ　ｈＢ７−１の各切断したＥＣＤの３’末端の最後の３つのアミノ酸残基を示す。
【０５７７】
【表６】
2004513878.tif 000022
。
【０５７８】
本発明はまた、シグナルペプチド配列を欠いたＮＣＳＭポリペプチド（およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列）のＥＣＤドメインを提供し；各ＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチド（またはＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸）の最初の３４アミノ酸（または同じ１０２核酸）は、欠損する。分泌型において、このシグナル配列は切断される。
（Ｂ．可溶性ＥＣＤおよびＮＥＣＭポリペプチドの発現および精製）
上に記載のＣＴＬＡ−４ＢＰ−ＥＣＤ、ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤおよびｈＢ７−１−ＥＣＤ発現ベクター由来の可溶性ポリペプチドを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＮＣＳＭ　ＥＣＤまたはそのフラグメントをコードする配列の発現を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞株の細胞へのこれらのベクターのトランスフェクションよって発現させた。それぞれの場合において、可溶性タンパク質を、製造者の指示書のとおりにＨｉ−Ｔｒａｐ抗ｅ−エピトープｍＡｂ親和性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて粗培養物上清から精製し、その後緩衝液をＰＢＳに変換した。回復した融合タンパク質の精製を、製造者の指示書のとおり、そして例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ；Ｃｏｌｌｉｇａｎ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，全て上記（データは示していない）に記載のように公知の方法を用いて実行したＳＤＳ−ＰＡＧＥの後のクマシー染色またはマウス抗ペンタ（ａｎｔｉｐｅｎｔａ）−Ｈｉｓ　ｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を用いる免疫ブロットのいずれかによって評価した。可溶性ｈＢ７−１−ＥＣＤおよび可溶性ＣＤ２８ＢＰ−１５　ｓＥＣＤについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、図１６に示すようにそれぞれ約５０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を示した。最も左のレーンの参照混合スポットは、比較のためのそれぞれ１８８キロダルトン（ｋＤａ）、９８ｋＤａ、５６ｋＤａ、および３ｌｋＤａの既知の分子量の化合物のバンドを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、約１４０ｋＤａのｈＢ７−１−Ｉｇ融合タンパク質２量体を示し；この２量体は、ＦｃのヒンジＣＨ２−ＣＨ３ドメインのシステイン残基間に共有結合を含むことを示す。従って、ｈＢ７−１−Ｉｇ単量体は、約７０ｋＤａのみかけの分子量を有する。ｈＢ７−１−Ｉｇ−δＣｙｓ変異融合タンパク質の約７０ｋＤａの単量体もまた、観察された（図１６を参照のこと）。欠損したシステイン（δＣｙｓ）変異が、２つの別個のＢ７−１−ＥＣＤ／ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（Ｉｇ）分子の共有結合２量化を防いでいると考えられる。
【０５７９】
（Ｃ．可溶性ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質をコードする発現ベクター）
溶性ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質および可溶性ＷＴ　ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質をコードする哺乳動物発現プラスミドを、上に記載のように、全長ＮＣＳＭ　ＤＮＡ配列およびｈＢ７−１　ＤＮＡ配列を含むプラスミド由来の選択されたＮＣＳＭ　ＥＣＤｓまたはｈＢ７−１−ＥＣＤのｐｆｕ　ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いるＰＣＲ増幅によって最初に構築した。ＰＣＲプライマーを、特異的なＮＣＳＭまたはｈＢ−１のＥＣＤに対応する特定の核酸領域の最初または最後の２０〜２４ヌクレオチドで特異的にアニールするように設計し、制限部位ＢａｍＨＩおよびＢｓｔｅＩＩによってそれぞれそれらの５’末端および３’末端に近接させた。いくつかの場合において、ＮＣＳＭ　ＥＣＤ（またはｈＢ７−１）とＩｇＧＩ　Ｆｃとの間のインフレームでの翻訳結合を形成する小さなペプチドリンカーは、バリン−スレオニン（ＶＴ）またはグリシン−バリン−スレオニン（ＧＶＴ）配列を包み、これは、ＮＣＳＭ　ＥＣＤの３’コドンのヌクレオチド配列互換性に依存する。この融合連結での、ＢｓｔｅＩＩ制限部位の取り込みは、インフレームのバリン−スレオニンリンカーを形成する。この因子Ｘａ切断部位（ＩＥＧＲ）を、ＦｃドメインのｓＥＣＤ間隙の産生を可能にするようにＮＣＳＭ　ＥＣＤ（またはｈＢ７−１　ＥＣＤ）の３’末端とＧＶＴまたはＶＴリンカーの５’末端との間に挿入した（図１４Ｂ）。
【０５８０】
ヒトＩｇＧ１　ＦｃをコードするＤＮＡ配列を、製造者の指示書のとおりにＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてヒト脾臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得、そして全体のヒトＩｇＧ１　Ｆｃヒンジドメインまたはそのフラグメントに対応する配列の最初または最後の２０〜２８ヌクレオチドに対して特異的なプライマー（例えば，Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ０１８５７およびＸ７０４２１のそれぞれに示されるタンパク質を参照のこと；他のＦｃ配列もまた使用し得る）を、それゆえそれらの５’末端および３’末端に制限部位ＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩに隣接させた（図１４Ｂ）。あるいは、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃヒンジドメイン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ０１８５７およびＸ７０４２１）に由来の改変体を、可溶性ＮＣＳＭに対する特定の望ましい生物学的特性および薬学的特性を与えるように調整し得た。
【０５８１】
ＩｇＧｌ−Ｆｃアンプリコン（約７３０ｂｐ）を、ＢｓｔＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（骨格ベクターとして用いる）中にクローニングした。ＮＣＳＭ−Ｉｇ発現プラスミドを、可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇＦｃ融合タンパク質発現ベクターを産生するために、低融点アガロースゲル精製したＮＣＳＭ　ＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩ　ＤＮＡフラグメント（約７３０ｂｐ）、Ｉｇ−Ｆｃ　ＢｓｔＥＩＩ−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメント（約７３０）およびｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡフラグメント（約５４００ｂｐ）を連結すること（インフレームで融合すること）によって構築した（図１７を参照のこと）。
【０５８２】
ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７０４２１またはＰ０１８５７に示す配列および２つのアミノ酸置換（Ｄ２３４ＥおよびＬ２４１Ｍ）を含むＩｇＧ　Ｆｃ改変体に対応するいずれかに対する配列相補性を、公知の方法を用いるＤＮＡ配列分析によってクローニングし、そして推論した。ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質は、融合パートナーとして、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号に示すＸ７０４２１またはＰ０１８５７に対応するＩｇＧ　Ｆｃ配列またはＩｇＧ　Ｆｃ改変体配列を含み得る。
【０５８３】
図１４Ｂは、可溶性ＷＴヒトＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ配列の代表を示し、これはシグナルドメイン、ＥＣＤ、因子Ｘａ（ＩＥＧＲ）、ＶＴまたはＧＶＴリンカー、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０１８５７に示す配列に対応するＩｇＧ１のＦｃ領域のヒトＢ７ヒンジＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。代表的なＥＣＤドメインの開始および末端ならびにヒトＢ７ヒンジＣＨ２−ＣＨ３ドメインの５’末端に位置したアミノ酸残基を示す。ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ配列は、図１４ＢにおいてｈＢ７−ｌＥＣＤ−Ｉｇについて示される配列に匹敵する。
【０５８４】
切断したＮＣＳＭ　ＥＣＤｓまたは切断したｈＢ７−１ＥＣＤｓをコードするヌクレオチド配列をまた、それぞれＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤ−ＩｇおよびｈＢ７−１−ｔｒｕｎ　ＥＣＤ−Ｉｇ発現構築物ならびに融合タンパク質を作製するために使用した。切断したＮＣＳＭ　ＥＣＤｓは、代表的に全長ＮＣＳＭ　ＥＣＤよりも少なくとも１つ少ないアミノ酸残基を包含した；切断したＮＣＳＭ　ＥＣＤｓをコードするヌクレオチド配列は、対応するわずかなヌクレオチドを包含した。
【０５８５】
この融合タンパク質をコードする発現プラスミドの構築のために使用した選択したＮＣＳＭクローンまたはｈＢ７−１の例示的な全長ＥＣＤまたは切断したＥＣＤのヌクレオチド位置、および対応するアミノ酸位置を、表５および表６に示す。表５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０１８５７に示す、ｈＩｇＧ１　Ｆｃ配列のヌクレオチド位置および対応するアミノ酸残基、ならびにこのＦｃ領域の５’末端のアミノ酸残基を示す。表６は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７０４２１のｈＩｇＧ１　Ｆｃのヌクレオチド位置および対応するアミノ酸位置、ならびにこのＦｃ領域の５’末端のアミノ酸残基を示す。本発明はまた、ＮＣＳＭポリペプチド（およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列）のＥＣＤドメインがシグナルペプチド配列を欠く融合タンパク質を提供し；この局面において、各ＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチド（またはＮＣＳＭ　ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸）の最初の３４アミノ酸（または同じものをコードする１０２核酸）が欠損する。分泌型において、このシグナル配列は切断される。
【０５８６】
可溶性ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質、ｐｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇをコードする代表的なプラスミドベクターを図１７に示す。このベクターとしては、とりわけ、アンピシリン耐性遺伝子、ＡＲ、およびウシ成長ホルモン（ｂＧｈ）ポリＡ終止配列を含むｐＣＤＮＡ３．１（＋）骨格の選択されたエレメント；ｈＢ７−１−ＥＣＤ／ＩｇＧ１　Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列；およびＣＭＶプロモーター（例えば、ヒトＣＭＶプロモーターもしくは組換えもしくはキメラＣＭＶプロモーターのような公知のＣＭＶプロモーターまたはＷＴ　ＣＭＶプロモーター）が挙げられる。可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇＧ１融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするプラスミドベクターを、図１７に示すベクター中のｈＢ７−１　ＥＣＤ配列に対するＮＣＳＭ−ＥＣＤ配列またはそのフラグメントの置換によって作製し得る。ｈＢ７−１−ｔｒｕｎＥＣＤ−ＩｇまたはＮＣＳＭ　ｔｒｕｎＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするプラスミドベクターをまた、同様の手順を用いて作製し得る。
【０５８７】
別の局面において、非２量体化Ｉｇ−Ｆｃドメイン（ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ→ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ）を、隣接するＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇまたはｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ分子のヒンジＣＨ２システイン間のジスルフィド結合によって共有結合される、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇまたはｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇのホモダイマーの形成を防ぐために、Ａｂヒンジ領域内のシステイン残基をセリン残基に変異させるＰＣＲ突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって操作した。この非２量体化Ｉｇ−Ｆｃドメインを、上に記載のように調整したＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇまたはｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質のＩｇの一部分として代替的に使用し得る。システインを変異させた（ΔまたはδＣｙｓによって表す）Ｉｇに融合したｈＢ７−１−ＥＣＤを含む、親和性精製したｈｕＢ７−１−ＥＣＤ−ＩｇδＣｙｓは、約７０ｋＤａの分子量（Ｆｃ融合単量体に連結した非ジスルフィド結合の分子量の大きさ）を有することが示された（図１６）。本発明は、同様に調整したＣｙｓ変異Ｉｇ融合タンパク質、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇδＣｙｓまたはＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤ−ＩｇδＣｙｓ、およびこのようなタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【０５８８】
（Ｄ．可溶性ＮＣＳＭ　ＥＣＤ−Ｉｇタンパク質の発現および精製）
ＣＴＬＡ−４ＢＰ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合およびＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合発現ベクター由来の可溶性タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）用いる、ヒトＨＥＫ２９３細胞株の細胞へのこれらのベクターのトランスフェクションによって発現させ、そして製造者の指示書のとおりにＨｉ−Ｔｒａｐ抗タンパク質Ａ親和性カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて粗培養物上清から精製し、その後緩衝液をＰＢＳに変換した。回復した融合タンパク質の精製を、製造者の指示書のとおり、そして例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＣｏｌｌｉｇａｎ、（全て前出）に記載のような、公知の方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に銀染色またはヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ｍＡｂ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いる免疫ブロットのいずれかによって評価した。
【０５８９】
１つの例として、可溶性野生型ヒトＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、一部にＥＣＤフラグメント、「切断した（短縮型）ＥＣＤ」またはｈＢ７−１の全長ＥＣＤを含む）を、ｐｈｕＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ発現プラスミドでトランスフェクトしたヒトＨＥＫ２９３細胞から、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。連続的な希釈の可溶性ヒトＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な形態の可溶性ＷＴヒトＢ７−１−ＥＣＤ−ＩｇまたはＢ７−２−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質と同時に移動したバンドを示し、従って、可溶性ＷＴｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質についての正確な分子量のタンパク質を、インビトロで産生したことが証明される（データは示していない）。この結果は、ＷＴ　ｈＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質が主にＥＣＤ−Ｉｇホモダイマー融合タンパク質であることを示した。（可溶性ｈＷＴ　ｈＢ７−１　ＥＣＤ単量体は、約５０ｋＤａのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量を有することが示された。）図１８に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、親和性精製したＣＤ２８ＢＰ−１５　ＥＣＤ−ＩｇおよびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２Ｃ　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＷＴヒトＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質と同時に移動し、従って、ＷＴ　ｈＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質の分子量とほぼ等しいか、または少なくとも近い分子量を有することが示された。最も左に入れた参照混合物は、既知のＭＷの化合物のバンドを示す（図１８）。
【０５９０】
本発明の種々のＣＴＬＡ−４ＢＰｓおよびＣＤ２８ＢＰｓ、ＷＴ　ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇの可溶性（例えば、切断したまたは全長ＥＣＤ）融合タンパク質形態、またはｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターコントロールのいずれかをコードする発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの粗上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、公知のウエスタンブロット法を用いて（例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、全て上記）ニトロセルロースに転写し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ特異的ＨＲＰ　ｍＡｂでハイブリダイズした。その結果は、図１９に示すように、ＮＣＳＭ融合タンパク質の２量体および単量体の予想した分子量に対応した主要なバンドおよび弱いバンドの、それぞれ約１４０ｋＤａおよび約７０ｋＤａを示した。ＥＣＤに、８つの潜在的なＮ−グリコシル化部位が配置された。このタンパク質はグリコシル化され得るので、ＭＷはおおよその重さであることに注意のこと。可溶性ＷＴｈＢ７−１ＥＣＤ−Ｉｇと同時に移動したバンドを、すべてのＣＴＬＡ−４ＢＰ　ＥＣＤ−ＩｇおよびＣＤ２８ＢＰ　ＥＣＤ−Ｉｇ融合物について視覚化した。ＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤ−Ｉｇｓもまた、ｈＢ７−１−ｔｒｕｎＥＣＤ−Ｉｇｓと類似した結果を示した。ネガティブコントロールトランスフェクション（ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ　２９３細胞）からの上清は、検出可能なバンドを産生しなかった。オリゴマー形態または多重結合形態（ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ２量体、３量体など）を、ＣＴＬＡ−４ＢＰｓ（クローン５×４−１１Ｄ、Ｓ×４−１２Ｃ、Ｓ×５−２Ｅ、５×８−１Ｆ）およびＣＤ２８ＢＰｓ（クローン８および１１）について観察した。
【０５９１】
（Ｅ．可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤおよびＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇを発現する安定な細胞株の構築）
可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ（ＮＣＳＭ−ｓＥＣＤ）ポリペプチドまたは可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質を発現する安定な２９３細胞株を、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ともに上記に記載されるような公知の方法に従って、このようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含むＤｒａＩＩＩ消化した発現プラスミドでＨＥＫ２９３細胞にエレクトロポレーションすることによって産生した。安定な要素を、１０％　ＦＣＳおよび２ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８抗生物質（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを用いて選択した。プロテインＡカラムからのＮＣＳＭ−Ｉｇ融合物を含む溶出液を除いて上に記載のように実施した精製を、非ＮＣＳＭタンパク質を除去するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１０／３０（２４ｍｌ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（製造者の指示書に従い）を使用して、標準ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）（例えば、ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ともに上記を参照のこと）によってさらに精製した。このゲル濾過分析によって決定した、精製した可溶性ＮＣＳＭのおおよそのみかけの分子量（Ａｐｐ　ＭＷ）を、以下の表７に示す。
【０５９２】
【表７】
2004513878.tif 000023
。
【０５９３】
ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇおよびＮＣＳＭ−ｔｒｕｎ−ＥＣＤ−Ｉｇの単量体に加えて、本発明は、例えば、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−ＩｇおよびＮＣＳＭ−ｔｒｕｎ−ＥＣＤ−Ｉｇのような、本発明の可溶性ＮＣＳＭポリペプチドの凝集体および多量体を含み、ここでＩｇ部分は、上に記載のようにＦｃ領域またはその改変体を含む。
【０５９４】
（Ｆ．生物学的活性のインビトロでの特徴づけ）
１．可溶性ＮＣＳＭ融合タンパク質を用いるＴ細胞増殖アッセイ
可溶性ＮＣＳＭを、上に記載のように産生し、そして精製した。ヒト野生型Ｂ７−１をまた、同様の方法を用いて発現させた。さらに、市販のヒト野生型Ｂ７−１−Ｉｇ融合タンパク質を、Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから得た（表７をまた参照のこと）。これらの分子の生物学的特性を特徴付けるために、２つの異なる形態を、この分子の機能に関する架橋の影響をさらに分析するために使用した。より具体的に言うと、本発明者らは、標準の可溶性分子としての融合タンパク質およびヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的なｍＡｂとともにプレインキュベーション（架橋）後の融合タンパク質の両方を分析した。架橋は、以前に野生型ヒトＢ７−１（Ｒｅｎｎｅｒｔら、Ｉｎｔｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７　Ｊｕｎ；９（６）：８０５−１３）の機能に影響することが示されている。
【０５９５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製したヒトＴ細胞のいずれかを、これらの研究に使用した。ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７で遠心分離することによってヒト血液から単離した。末梢血Ｔ細胞を、Ｍｏｆｌｏｗフローサイトメトリーを用いてＰＢＭＣから精製した。ＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１×１０５細胞／ウェルで使用した。１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ）を、培養物に添加した。Ｔリンパ細胞を、上記の「材料および方法」の部分の「Ｔ細胞増殖アッセイ」に先に記載した方法によって分離し、９６ウェル型に１×１０５細胞／ウェルで使用した。Ｔ細胞を、最初のシグナルを伝えるために、可溶性抗ＣＤ３（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下で培養した。精製したＩｇ融合タンパク質（例えば、ＷＴ　ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ、ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤ−Ｉｇ、またはＣＴＬＡ−４ＢＰ−ＥＣＤ−Ｉｇ）を、種々の濃度で添加し、そして抗ＣＤ２８ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を、ポジティブコントロールとして使用した。架橋したＩｇ融合分子を得るために、精製したＩｇ融合タンパク質を、５倍過剰の親和性精製したヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ部分（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とともに使用前３０分間（ｍｉｎ）、氷上でプレインキュベートした。次いで、この架橋複合体を、１０％　ＦＢＳを補充した総体積２００ｕｌのＴ細胞を含むＹｓｓｅｌ培地を含む、９６ウェル皿に添加した。アッセイプレートを、計３日間インキュベートした。この培養物を、１μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で、インキュベーションの終わり８時間の刺激し、次いで採集した。３Ｈチミジンの取り込み（ｃｐｍ）を、３つの培養から算出した。
【０５９６】
架橋した融合タンパク質および精製したヒトＴ細胞を用いた代表的な実験を、図２０Ａに示す。ｈＢ７．１（黒四角）、ＣＤ２８ＢＰ−１５（白抜き三角）およびコントロール抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ（白抜き丸）の可溶性Ｉｇ融合タンパク質の漸増する濃度（ｃｏｎｃ）を、示すように培養物に添加した。固定濃度（１２５ｕｇ／ｍｌ）のヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃを、使用する前に可溶性Ｉｇ融合タンパク質でプレインキュベートした。このデータを、Ｃ．Ｐ．Ｍ．の平均±ＳＴＤで示す。この架橋したＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質およびＷＴ　ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質は、抗ＣＤ３　ｍＡｂの存在下で培養した、精製したヒトＴ細胞について強い増殖効果を誘導した。
【０５９７】
ＣＤ２８ＢＰ−１５またはＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃの可溶性分子を、先の架橋を伴わない標準の可溶性分子として培養した場合、Ｔ細胞活性は、昆虫細胞由来の市販の野生型Ｂ７−１−Ｉｇの場合を除いて観察されなかった（表７を最初のこと）。ｈＢ７．１（黒四角）およびコントロール抗体ヒトＩｇＧ（白抜き三角）のＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質、ならびに市販で得た昆虫細胞由来ヒトＢ７−１−Ｉｇ融合タンパク質（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（黒三角）の漸増する濃度を、ＰＢＭＣの培養物に添加し、そして、増殖を、上に記載のように測定した（図２０Ｂ）。この昆虫細胞由来のヒトＢ７−１−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＰＢＭＣの増殖を誘導した。ところが、２９３細胞でのｈＢ７−１発現は、Ｔ細胞増殖を誘導しなかった。これらのタンパク質をゲル濾過によって分析した場合、昆虫細胞におけるタンパク質発現は、２９３細胞でのｈＢ７−１−Ｉｇ融合発現よりも２倍高い分子量を有することが明らかであった（表７）。これらのデータはさらに、より高い分子量の集合体が、それらそれぞれのリガンドを介するこれらの可溶性ＮＣＳＭポリペプチドシグナルの能力を改善するという結論を支持する。
【０５９８】
可溶性ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤ−ＩｇまたはＣＴＬＡ−４ＢＰ−５×４−１２Ｃ−ＥＣＤ　Ｉｇ融合タンパク質を、先の架橋を伴わない可溶性分子として培養した場合、これらは、用量依存性の様式でヒトＰＢＭＣのＰＨＡ誘導増殖を阻害した（図２０Ｃ）。野生型ｈＢ７−１は、同様の培養条件下でヒトＰＢＭＣのＰＨＡ−誘導増殖に影響しなかった（図２０Ｃ）。ｈＢ７．１（黒四角）、ＣＤ２８ＢＰ−１５（白抜き三角）、ＣＴＬＡ４ＢＰ−５×４−１２Ｃ（白抜き四角）のＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質および、先に記載のように作製されたコントロール抗体ヒトＩｇＧ（白抜き円）の漸増する濃度を、図２０Ｃに示すように添加した。このデータは、４つの実験の代表的な平均±ＳＥＭを示し、それぞれ３連のウェルを用いて実施した。
【０５９９】
さらに、我々は、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ上での可溶性ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤ（Ｉｇ融合を伴わない）の影響を検討した。図２０Ｄに示すように、可溶性ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤは用量依存性の様式で増殖を阻害し、そしてその阻害は可溶性ｈＢ７−１−ＥＣＤによって誘導されるよりも強かった。これらのデータは、架橋した可溶性ＣＤ２８ＢＰ１５−ＥＣＤ−Ｉｇとは対照的に、可溶性ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤが、ＣＤ２８シグナル伝達のアンタゴニストとして働くという結論に一致する。言い換えると、架橋および多量体化のレベルは、可溶性ＮＣＳＭがそれらのレセプターＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を介するポジティブシグナル伝達を誘導するか否か、またはそれらがそのレセプターの活性化を優位に誘導することなしにレセプターに結合することによって（そして、これらのレセプターと内在性リガンドの相互作用を防ぐことによって）アンタゴニストとして働くか否かを決定する。
【０６００】
これらのデータは、可溶性ＮＣＳＭ融合タンパク質のこの構成／多量体化が、それらの生物学的特性に優位に影響することを示す。架橋を伴わない可溶性分子を試験した場合、可溶性ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤ−ＩｇおよびＣＴＬＡ４ＢＰ−５×４−１２Ｃ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＰＢＭＣのＰＨＡ誘導増殖を阻害した。しかし、ＣＤ２８ＢＰ−１５の膜結合型と類似した架橋した可溶性分子は、可溶性抗ＣＤ３の存在下での精製したＴ細胞の増殖を強く促進した。これらのデータは、可溶性形態のＮＣＳＭポリペプチドの架橋形態または集合体形態（例えば、可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ、ＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤ−Ｉｇ、ＮＣＳＭ−ＥＣＤ、ＮＣＳＭ−ｔｒｕｎＥＣＤならびに他のタンパク質およびその融合タンパク質改変体）が、免疫系を活性化するのに有望な薬物であることを示し、これらが、悪性疾患（例えば、癌）、感染性疾患、および免疫不全の処置において有益であることが期待される。この架橋は、インビトロ（例えば、上にアッセイにおいて記載のように）またはインビボ（例えば、抗原提示細胞上のＦｃレセプターに高い親和性で結合することを通して）生成され得る。さらに、細胞に基づくワクチンを使用する場合、この架橋を、ワクチンとして使用する細胞中にヒトＩｇＧに対するレセプター（Ｆｃレセプター）をトランスフェクトすることによって引き起こし得る（そしてＮＣＳＭ−Ｉｇ融合は、ワクチンとして使用する細胞上に発現したＦｃレセプターに結合する）。対照的に、先の架橋を伴わない可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、ヒトＰＢＭＣのＰＨＡ誘導増殖を阻害し、これはそれらがヒトＴ細胞機能に関して阻害的な影響を有することを示す。さらに、可溶性ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤ（Ｉｇ部分を伴わない）は、インビトロでのＴ細胞増殖を強く阻害した。それゆえ、これらの可溶性ＮＣＳＭポリペプチドは、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、および臓器移植のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置に対して有望な薬物である。
【０６０１】
（Ｇ．可溶性ＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質および関連する核酸配列の変化）
本発明の任意のＮＣＳＭポリペプチドホモログ（相同体）を、Ｉｇ融合タンパク質およびそれらをコードする核酸の構築において必要に応じて利用した。本発明の全長ＮＳＣＭポリペプチドを使用し得る。さらに、各ＮＣＳＭポリペプチドの種々のフラグメントを、融合タンパク質の構築において利用し得、例として、ＮＣＳＭポリペプチドの全体のＥＣＤ（ＣＤ２８ＢＰ−１５またはＣＴＬＡ−４　５×４−１２ｃのような）；ＮＣＳＭポリペプチドのＥＣＤの種々の長さまたは部分配列（例えば、切断した領域またはフラグメント）；ＮＣＳＭポリペプチドの細胞質領域（ならびに切断した領域およびその部分配列またはフラグメント）；ＮＣＳＭの膜貫通型ドメイン（ならびに切断した領域およびその部分配列またはフラグメント）などが挙げられる。
【０６０２】
種々のさらなる配列をまた、ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質に添加し得、例としては、種々のリンカー配列（例えば、Ｖａｌ−Ｔｈｒのような）、種々のタンパク質分解切断部位（例えば、Ｘａ因子切断部位（ＩＥＧＲ）、スブチリシンなどのような）、種々のＩｇドメイン（またはその一部分）、マーカー、精製配列、制限酵素切断部位などが挙げられる。全体を通して注記するように、非Ｉｇ配列もまた、融合タンパク質を産生するために所定のＮＣＳＭ配列に融合され得る。
【０６０３】
例えば、上に説明するように、本発明のＮＣＳＭポリペプチド配列を、リンカー（Ｖ−ＴおよびＧ−Ｖ−Ｔ）およびＸａ因子切断部位の両方を組み込んでいるＩｇ融合タンパク質を構築するために利用した。例えば、図１４Ａ−１４Ｂ、表５−６を参照のこと。これらの融合タンパク質のＮＣＳＭ部分は、本明細書中の他に記載するように、融合タンパク質を構築するために使用した切断したＮＣＳＭ配列よりも長かった。ＮＣＳＭの種々の配列の長さ（アミノ酸およびヌクレオチドの両方）を、Ｉｇ融合およびミリアド（ｍｙｒｉａｄ）（例えば、リンカーおよび他の配列など）を構築することに利用し得る。リンカー、ＮＣＳＭ長などの種々の構成は、全て本発明の局面である。本明細書中に記載の任意のＮＣＳＭ配列は、本質的に同様のストラテジーを用いて融合され得る。
【０６０４】
本発明はまた、改変可溶性ＮＳＣＭポリペプチドおよび上に記載の融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれかをコードする核酸も提供する。このような核酸を含むベクターおよび発現カセットもまた誘導される。
【０６０５】
（実施例Ｖ：発現カセットの構築）
（Ａ．ベクターｐＭａｘＶａｘ１０．１の構築）
本実施例は、哺乳動物細胞での発現のためのベクターの構築を記載する。この哺乳動物発現ベクターｐＭａｘＶａｘｌ０．１（例えば、図２１を参照のこと）は、とりわけ、以下を含む：（１）哺乳動物細胞での導入遺伝子の発現を駆動するためのプロモーター；（２）１つ以上の導入遺伝子のクローニングのためのポリリンカー；（３）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）：および（４）Ｅ．ｃｏｌｉでの増幅のための原核生物複製起点および抗生物質耐性遺伝子。
【０６０６】
（１．Ｅ．　ｃｏｌｉでの増幅のための最小プラスミドの構築）
最小プラスミドＣｏｌ／Ｋａｎａは、複製起点ＣｏｌＥ１およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎａｒ）を含む。ＣｏｌＥ１複製起点は、高い複製数のプラスミド増幅を調節する。あるいは、ｐｌ５Ａ（プラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ．）のような低い複製数の複製起点を使用し得る。
【０６０７】
ＣｏｌＥ１起点を、当該分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって、ベクターｐＵＣ１９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ．）から単離した。ＣｏｌＥ１起点をＫａｎａｒ遺伝子、ＮｇｏＭＩＶ（または「ＮｇｏＭＩ」）およびＤｒａＩＩＩ認識配列と連結させるために、それぞれ５’および３’ＰＣＲプライマーに加えた。ＮｇｏＭＩＶおよびＤｒａＩＩＩは、ベクター中の特有のクローニング部位である。引き続く哺乳動物転写単位のクローニングのために、５’正方向プライマーは、ＮｇｏＭＩＶ部位の下流にさらなる制限部位ＮｈｅＩを含み、そして３’逆方向プライマーはＤｒａＩＩＩの上流にさらなるＥｃｏＲＶおよびＢｓｒＧＩのクローニング部位を含む。全てのプライマーは、最適な制限消化のためのさらなる６〜８塩基対のオーバーハングを含む。５’正方向プライマーについての配列は：ａｃａｃａｔａｇｃｇｃｃｇｇｃｇｃｔａｇｃｔｇａｇｃａａａａｇｇｃｃａｇｃａａａａｇｇｃｃａである。３’逆方向プライマーは、ａａｃｔｃｔｇｔｇａｇａｃａａｃａｇｔｃａｔａａａｔｇｔａｃａｇａｔａｔｃａｇａｃｃａａｇｔｔｔａｃｔｃａｔａｔａｔａｃである。通常、ＰＣＲ反応を、製造者の推薦に従って、Ｔｔｈ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｆｕ、ＰｆｕＴｕｒｂｏおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、またはＰｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）のようなプルーフリーディングポリメラーゼで実施する。代表的なＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼについてのＰＣＲ反応は、１０ｍＭごとに、１μｌのテンプレートプラスミドＤＮＡ（１〜１０ｎｇ／μｌ）、５μｌ　１０×緩衝液、１μｌｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）、１μｌ正方向プライマー（２０μＭ）、１μｌ逆方向プライマー（２０μＭ）、４０μｌ脱イオン化滅菌水および５０μｌ反応中に０．５μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応を１サイクルあたり、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間で、総計２５サイクル実施した。ＰＣＲ産物を、Ｐｈａｓｅ　ｌｏｃｋ　ＧｅｌＴＭＴｕｂｅ　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いたフェノール／クロロホルムで精製し、標準のエタノール沈殿に供した。精製したＰＣＲ産物を、製造者の推薦に従って（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）制限酵素ＮｇｏＭＩＶおよびＤｒａＩＩＩで消化し、そして製造者の指示書に従ってＱｉａＥｘＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。
【０６０８】
カナマイシン耐性遺伝子（トランスポゾンＴｎ９０３）を、標準の公知の手順を用いてプラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）からＰＣＲによって単離した。Ｋａｎａｒ遺伝子を、インビボまたはインビトロでの研究に使用する。あるいは、アンピリシン、テトラサイクリンおよびブラストシジンのような抗生物質耐性遺伝子を、インビボまたは種々の細胞培養におけるインビトロでの研究のために使用し得る。
【０６０９】
５’ＰＣＲプライマーは、ＤｒａＩＩＩクローニング部位およびさらなる単一な制限部位、ＡｓｃＩをその下流に含む。３’ＰＣＲプライマーは、ＮｇｏＭＩＶクローニング部位を含む。５’正方向プライマー配列は：ｇｇｃｔｔｃｔｃａｃａｇａｇｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇｔｇｔｃｔｃａａａａｔｃｔｃｔである。３’逆方向プライマーの配列は：ｔｔｇｃｔｃａｇｃｔａｇｃｇｃｃｇｇｃｇｃｃｇｔｃｃｃｇｔｃａａｇｔｃａｇｃｇｔである。ＰＣＲ反応、生成物精製、ならびにＤｒａＩＩＩおよびＮｇｏＭＩＶの消化を、上に記載のように実施した。２つのＰＣＲ産物のそれぞれ約２０ｎｇを、１０×緩衝液および１Ｕリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含む２０μｌの反応中で連結した。Ｅ．ｃｏｌｉでの増幅を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記に記載のように標準手順を用いて実施した。プラスミドを、製造者の指示書に従ってＱｉａＰｒｅｐ−ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、引き続く哺乳動物転写単位（プロモーターおよびポリＡ）の連結のために、ＢｓｒＧＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。
【０６１０】
（２．発現ベクターｐＭａｘＶａｘｌ０．１）
この実施例において、ＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅプロモーターを、哺乳動物細胞でのトランスジーンの発現を駆動するために使用した。あるいは、他のＣＭＶプロモーターまたは非天然に生じる組換え体またはキメラＣＭＶプロモーターを、使用し得る：例えば、同時係属中の一般的に割り当てられるＵＳＳＮ　、２００１年６月２１日出願の「新規のキメラプロモーター」と題されたＬＪＡＱ　Ａｔｔｏｒｎｅｙ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．０２０３１９１０ＵＳに記載のような、最適なＣＭＶプロモーターを含むキメラまたは組み換え体プロモーターを、使用し得る。ＣＭＶの異なる系を、ＡＴＣＣから入手し得る。ＡＤ１６９系（ＶＲ−５３８；Ｒｏｗｅ，Ｗ．（１９５６）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１４５：７９４−８０１）およびＴｏｗｎｅ系（ＶＲ−９７７；Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．（１９７５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１２：５２１−２７）を、ＣＭＶ感染を有するヒト患者から単離し、一方、６８−１系（Ａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｍ．（１９６９）Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｐｒｏｃ．２６９：９１）およびＣＳＧ系（Ｂｌａｃｋ，Ｈ．（１９６３）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１１２：６０１）を、アカゲザルおよびベルベットザルからそれぞれ単離した。他のウイルスプロモーター（例えば、ＲＳＶおよびＳＶ４０ウイルス由来）、および細胞プロモーター（アクチンおよびＳＲａプロモーターのような）など、ならびに当業者に公知の他のプロモーターは、哺乳動物細胞と同様に広範な転写を付与する。細胞型特異的転写のために、筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、ケラチノサイト特異的なプロモーター、および当業者に公知の他のプロモーターのような、細胞特異的プロモーターを使用し得る。
【０６１１】
ＣＭＶ　Ｔｏｗｎｅプロモーターを、一般に公知のＰＣＲ法によってＣＭＶウイルスＴｏｗｎｅ系のＤＮＡから単離した。クローニング部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを、ＰＣＲの正方向プライマーおよび逆方向プライマー中に組み込んだ。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化したＰＣＲフラグメントを、増幅のためにｐＵＣ１９中にクローニングした。ベクターｐＭａｘＶａｘｌ０．１の構築のために、ＣＭＶプロモーターを、ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧｌを用いる制限消化によってｐＵＣ１９プラスミドから単離した。ＢｓｒＧＩ部位を、ＣＭＶプロモーター開始の５’末端の１６８ｂｐ下流に配置し、生じた１５９６ｂｐフラグメントを、引き続く連結のためにゲル精製によって単離した。
【０６１２】
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からのポリアデニル化シグナルを、本実施例で用いた。哺乳動物細胞でうまく作用する他のポリＡシグナルとしては、例えば、ＳＶ４０、単純疱疹ＴｋおよびウサギβグロビンなどのポリＡシグナル配列ならびに当業者に公知の他のシグナルが挙げられる。ＢＧＨポリＡを、一般的に公知のＰＣＲ法を用いてｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から単離した。５’ＰＣＲ正方向プライマーは、ポリリンカーの一部分を形成する、制限酵素ＰｍｅＩおよびＢｇＩＩＩにとっての認識部位を含む付加的な１４ｂｐ配列を包含した。３’逆方向プライマーは、最少プラスミドＣｏｌ／Ｋａｎａについてクローニングするための制限部位ＤｒａＩＩＩを包含する。５’正方向プライマー配列は：ａｇａｔｃｔｇｔｔｔａａａｃｃｇｃｔｇａｔｃａｇｃｃｔｃｇａｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃである。３’逆方向プライマーは：ａｃｃｔｃｔａａｃｃａｃｔｃｔｇｔｇａｇａａｇｃｃａｔａｇａｇｃｃｃａｃｃｇｃａである。生じたＰＣＲ産物を、１：１００で希釈し、同じの３’逆方向プライマーおよび新しい５’正方向プライマーを用いて第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートととして、１μｌを使用した。このプライマーは、テンプレートの５’末端の２０ｂｐまで重複し、そして後のポリリンカーを形成するためのＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限配列を含む別の４０ｂｐの５’末端を包含した。５’延長プライマーの配列は：ｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃｔｃｔａｇａｇａａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｔｇｔｔｔａａａｃｃｇｃｔｇａである。代替的なＰＣＲ産物を、改変したポリリンカーを有するベクターを生成するために、異なる５’正方向ＰＣＲプライマーで生成し、ｐＭａｘＶａｘｌ０．ｌｍｐと名付けた（図２１は上に記載の改変ポリリンカー伴う）。このポリリンカーにおける制限部位の指向は５’〜３’：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、Ｋｐｎｌ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＢｒｌＩＩおよびＰｍｅＩである。このポリリンカー配列は：ｇｇａｔｃｃａｃｔｃａｔｃｔａｇａａｃａａｔｇｇｔａｃｃａａｔａｃｇａａｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｇａｔｃｔｇｔｔｔａａａｃｃである。このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、そしてゲル精製した。
【０６１３】
最終的な連結反応は、５μｌ　１０×リガーゼ緩衝液および２Ｕリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いる５０μｌの反応において、それぞれ約２０ｎｇのＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨで消化したＣＭＶプロモーター、ＢａｍＨＩおよびＤｒａＩＩＩで消化したポリリンカーおよびＢＧＨポリＡ、ならびにＤｒａＩＩＩおよびＢｓｒＧＩで消化した最小プラスミドＣｏｌ／Ｋａｎａを含む。連結、増幅およびプラスミド精製を上に記載のように実施した。
（Ｂ．ＮＣＳＭポリヌクレオチド配列を伴うベクターｐＭａｘＶａｘの構築）
ＮＣＳＭポリペプチド（例えば、ＣＤ２８ＢＰまたはＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチドあるいはそのフラグメント（例えば、ＥＣＤドメイン））または他の任意の免疫調節性分子をコードするヌクレオチド配列を、上に記載のようにＰＣＲ正方向プライマーおよび逆方向プライマーにおけるＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩの制限酵素認識配列を用いるＰＣＲによって単離し得る。この実施例において、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−１５ポリペプチド（配列番号１９））を、ｐＭＡｘＶａｘ　１０．１ベクター中に組み込む。ＰＣＲ産物の正確な配列を確認するために、このフラグメントを、製造者のプロトコルに従って配列決定用のＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に都合よくクローニングする。ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ消化およびゲル精製の後、これらの遺伝子を、遺伝子の発現を確認するために哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。ｐＭａｘＶａｘのポリリンカー中にこれらの遺伝子をクローニングするために、このベクターｐＭａｘＶａｘ　１０．１ｍｐ（上に記載のように改変したポリリンカーを示す図２１）を、上に記載のようにＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、ゲル精製し、そしてそれぞれの遺伝子に連結した。ＣＤ２８ＢＰをコードするヌクレオチド配列（ここで、例えば、配列番号１９）を含む構築物ｐＭａｘＶａｘ−ＣＤ２８ＢＰ（図２２Ａを参照のこと）を、ヒトおよび他の哺乳動物細胞、ならびに非哺乳動物細胞などを含む他の培養細胞におけるインビボおよびインビトロでの発現でのために使用し得る。
【０６１４】
インビトロでの発現のために、免疫刺激分子もまた、哺乳動物細胞における薬物選択下での安定な発現にとって適切である市販の任意のベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ３．１＋／−、ｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし得る。分泌が望ましい形態である場合、これらの遺伝子を、分泌シグナルに対して発現したタンパク質に連結するベクター（例えば、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＢＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローニングし得る。調節された発現のために、ＴｅｔＴＭＳｙｓｔｅｍ由来のベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはエクジソン調節ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し得る。細胞培養における高い発現のために、免疫刺激分子はまた、レトロウイルス、アデノウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃ）、およびシンドビスウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構築したウイルスベクター、またはＥＢＶウイルス、ＢＰＶウイルス、ＨＰＶウイルスおよびＳＶ４０ウイルスから構築した複製ウイルスベクターにクローニングし得る。インビボでの研究のために、アデノウイルス、レンチウイルス、アルファウイルスなどから構築したウイルスベクターを使用し得る。異なるベクターにクローニングするために、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ以外の制限部位を必要とする場合、ポリリンカー由来の隣接する制限部位を使用し得る。あるいは、それらの遺伝子を、上に記載のようにＰＣＲプライマー中に位置する望ましい制限部位を用いたＰＣＲによって単離し得る。
【０６１５】
（Ｃ．二重シストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターｐＭａｘＶａｘ−ＣＤ２８ＢＰ−Ｅｐ−ＣＡＭ／ＫＳＡ）
免疫治療の研究では、例えば、癌抗原と同じ細胞において、免疫刺激分子を発現することが望ましい。ｐＭａｘＶａｘ−ＥｐＣａｍ／ＫＳＡベクターを生成するために、ＥｐＣａｍ／ＫＳＡのような癌抗原をコードするヌクレオチド配列を、ｐＭａｘＶａｘベクター骨格にＣＤ２８ＢＤポリヌクレオチド配列をクローニングするための上に記載した手順と類似の手順を用いて、ｐＭａｘＶａｘベクター（図２１）にクローニングし得る。次いで、２つの発現構築物、例えばｐＭａｘＶａｘ−ＣＤ２８ＢＰベクター（図２２Ａ）（または他のｐＭａｘＶａｘ−ＮＣＳＭベクター）およびｐＭａｘＶａｘ−ＥｐＣａｍ／ＫＳＡベクター（または抗原をコードするヌクレオチド配列を含む他のｐＭａｘＶａｘベクター）を、細胞培養物中で同時トランスフェクトし得るか、あるいはこのような治療処置または予防処置を必要とする被験体に対してインビボで同時投与し得る。
【０６１６】
代替的な（これは、形態いくつかの治療用途または予防用途に対して最適な形態であり得る）において、ＥｐＣａｍ／ＫＳＡ遺伝子およびＣＤ２８ＢＰ遺伝子（あるいは異なる抗原遺伝子および／またはＮＣＳＭポリヌクレオチド）は共に、同じベクターから発現し得る。１つの形態において、生じた抗原およびＮＣＳＭタンパク質を、内部のリボソームエントリー部位によって連結した単一のプロモーターから同時発現させ得る（例えば、ＩＲＥＳ２重シストロン発現ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃ）。この実施例は、少なくとも１つのＮＣＳＭポリペプチドおよび少なくとも１つの抗原または抗原フラグメント（あるいは異なる同時刺激分子）の発現のための例示的な二重シストロンベクターの構築を記載し、ここでＮＣＳＭポリヌクレオチドおよび抗原または抗原フラグメントをコードするヌクレオチド配列は、２つの別個の発現単位を形成する。特に、この実施例は、ＣＤ２８ＢＰ（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−１５）および癌抗原Ｅｐ−ＣＡＭ／ＫＳＡの発現のための二重シストロンベクターの構築を記載し、ここでＣＤ２８ＢＰポリヌクレオチドおよび癌抗原または抗原フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、２つの別個の発現単位を形成し、それ自身のそれぞれのプロモーターおよびポリＡシグナルによってそれぞれ調節される。当業者は、この手順がまた、本発明の少なくとも１つのＮＣＳＭポリヌクレオチド（その核酸フラグメントならびに本明細書中に記載の可溶性ＮＣＳＭポリペプチド、そのペプチドフラグメント、およびその融合タンパク質をコードする核酸を含む）および異なる抗原または抗原フラグメント（あるいは異なる同時刺激分子）を含む二重シストロンベクターの構築に容易に適応され得ることを理解する。
【０６１７】
ＣＤ２８ＢＰ遺伝子を、上に記載のように、ｐＭａｘＶａｘベクターのポリリンカーに挿入し、第一の発現単位を形成させる。癌抗原の核酸配列（ここで、このポリヌクレオチドはＥｐＣＡＭ／ＫＳＡの細胞外ドメインをコードする）を、第二の哺乳動物発現プロモーター（例示的プロモーターは、この実施例において上記および他の箇所に示すものを含む）および第二のポリＡシグナル（例示的シグナルは、この実施例において上記および他の箇所に示すものを含む）に連結し、第二の発現単位を形成させる。この第二の発現単位を、構築物ｐＭａｘＶａｘ−ＣＤ２８ＢＰの３つの異なる部位に、正方向向きまたは逆向きの両方でクローニングし得る：（ｉ）ｐＭａｘＶａｘ１０．１の単一のクローニング部位のＤｒａＩＩＩおよびＡｓｃＩを用いて第一の発現単位（ＣＭＶプロモーター−ＣＤ２８ＢＰ−ＢＧＨポリＡ）の下流；（ｉｉ）単一制限部位ＮｇｏＭＩおよびＮｈｅＩを用いてＣｏｌＥｌ遺伝子とＫａｎａｒ遺伝子との間；（ｉｉｉ）単一制限部位ＥｃｏＲＶおよびＢｓｒＧＩ中のＫａｎａｒ遺伝子とＣＭＶプロモーターとの間（この実施例において上記のベクターの説明を参照のこと）。第二の発現単位の配置とは独立して、これは、第一の発現単位の下流に終止配列を添加することが望ましい。コンセンサス終止配列５’ＡＴＣＡＡＡＡ／ＴＴＡＧＧＡＡＧＡ３’は、Ｍｉｎｇ−Ｃｈｅｉ　Ｍａａら（１９９０）ＪＢＣ　２５６（２１）：１２５１３−１２５１９に記載されている。構築物ｐＭａｘＶａｘ、ＣＤ２８ＢＰにおいて、その配列を、ＢＧＨポリＡの下流の単一のＤｒａＩＩＩ部位に配置し得る（図２２Ｂを参照のこと）。
【０６１８】
この実施例は、配置（ｉｉ）に関する第二の発現単位のクローニングストラテジーを記載する。第二のプロモーター（例えば、ヒトＣＭＶプロモーターのようなＷＴ　ＣＭＶプロモーターまたは発現活性を改善した組換えＣＭＶプロモーター）、Ｅｐ−ＣＡＭ／ＫＳＡ癌抗原、および第二のポリＡ（この実施例ではＳＶ　４０ポリＡ）を、ＰＣＲによってそれぞれのテンプレートプラスミドから単離する（この実施例において上のように）。ＰＣＲプライマーを、最終ベクター中に３つのフラグメントの部分的な部位指向性のクローニングをし得る、単一の制限部位を含むように設計する。シャッフルしたＣＭＶプロモーターの単離のための５’正方向ＰＣＲプライマーは、単一ＮｇｏＭＩＶ（ＮｇｏＭＩともいう）クローニング部位を含む。３’逆方向プライマーは、ＮｇｏＭＩＶ部位および少なくとも１０塩基対のスペーサーによって離したその上流にある他のベクター単位のどれにおいても切断しない別の制限酵素部位（すなわち、ＡｃｃＩ、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓＵ３６１、ＭｌｕＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｌＩ）を含む。本実施例において、ＡｃｃＩを、さらなるクローニング部位として選択する。そのＰＣＲ産物を、ＮｇｏＭＩＶで消化し、ゲル精製に供し、そしてＮｇｏＭＩＶで線状にして、かつゲル精製したｐＭａｘＶａｘ、ＣＤ２８ＢＰ中にクローニングする。連結後の第二のＣＭＶプロモーターの正確な向きは、３’逆方向プライマーおよびＣＭＶプロモーター配列においてこの逆方向プライマーの約５００〜６００ｂｐ上流に位置する任意の選択した正方向プライマーを用いて、ＰＣＲによって、細菌コロニーから決定する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌに記載の通り）。次いで、第二のプロモーターを含むプラスミドを、癌抗原のクローニングのためにＡｃｃＩおよびＮｈｅＩで消化する。Ｅｐ−ＣＡＭ／ＫＳＡ癌抗原についての５’プライマーは、単一のＡｃｃＩ部位を含み、３’プライマーは、単一のＮｈｅＩ部位および少なくとも１０塩基対のスペーサーによって離した上流にさらなる単一の制限部位ＡｇｅＩを含む。このＰＣＲ産物を酵素ＡｃｃＩおよびＮｈｅＩで消化し、同様に消化したベクターにクローニングする。生じる構築物を、ＳＶ　４０ポリＡ／終止フラグメントのクローニングのためにＡｇｅＩおよびＮｈｅＩで消化する。このＰＣＲ産物のための５’正方向プライマーは、単一のＡｇｅＩ部位を含み、そして３’逆方向プライマーは、終止配列に続く単一のＮｈｅＩ部位を含む。次いで、生じるＡｇｅＩ／ＮｈｅＩフラグメントを、同様に消化したベクターにクローニングした。このクローニングストラテジーを、以下に要点をまとめる。
【０６１９】
【表８】
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。
最終構築物ｐＭａｘＶａｘ、ＣＤ２８ＢＰ、Ｅｐ−ＣＡＭ／ＫＳＡを図２２Ｂに示す。
【０６２０】
当業者は、類似の手順が、（図２２Ａの上記ＣＤ２８ＢＰをコードする配列に代わって）本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するために使用し得ることを理解する。このようなベクターは、所望であれば、図２２Ｂに示すように、上記の抗原によって占められる位置に含まれる、目的の第二のヌクレオチド配列（例えば、抗原または別の同時刺激分子をコードする）を伴う、二重シストロンベクターを含み得る。当業者はまた、上記の手順を、異なるプロモーター、シグナル配列、終止配列、複製開始配列、耐性遺伝子またはマーカー配列のような異なるベクター構成成分を含む発現ベクターを構築するために、容易に適応させ得ることを理解し得る。
【０６２１】
（実施例ＶＩ：ＣＤ２８ＢＰポリペプチドによって誘導される増強免疫応答）　この実施例は、本発明のＣＤ２８ＢＰ分子（またはそのフラグメント）の、異種抗原（腫瘍関連抗原（Ａｇ）のような（例えば、Ｅｐ−Ｃａｍ／ＫＳＡ（Ｓｔｒａｎｄら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４９：３１４−３１７；Ｓｚａｌａら（１９９０）８７：３５４２−３５４６；Ｂａｌｚａｒら（１９９９）Ｊ　Ｍｏｌ　Ｍｅｄ　７７：６９９−７１２に記載のような））、またはカニクイザルにおける病原性抗原（例えば、Ｂ型肝炎表面Ａｇ（ＨｅｐＢｓＡｇ）のような））の免疫応答を増強する能力を証明する。この実施例においては、全長クローンＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを使用する。所望であれば、代替的に、ＣＤ２８ＢＰ−１５のフラグメント（例えば、ＥＣＤのような）をコードするヌクレオチド配列または融合タンパク質（例えば、ＥＣＤ−Ｉｇ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、使用し得る。例えば、本発明の可溶性ＮＣＳＭをコードする配列（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−１５ＥＣＤ、ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤ−Ｉｇ，またはｔｒｕｎＥＣＤを伴うなど）を使用し得る。ＷＴ　Ｂ型肝炎表面抗原（ｈｅｐＢｓＡｇ）（またはそのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよびＥｐ−Ｃａｍ（またはそのフラグメント）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、抗原配列として使用する。この手順を、本明細書中に記載の任意のＮＣＳＭ分子および／または目的の任意の抗原（例えば、ウイルス抗原または下に記載の他の癌抗原を含む）を使用するために適応させ得る。
【０６２２】
以下の実施例において、別個のベクターを、ＥｐＣａｍ、ＷＴ　ｈＢ７−１、ＣＤ２８ＢＰ−１５、および抗原のそれぞれをコードするように調製する。別個のコントロールベクターもまた、調製する。実施例Ｖを参照のこと。しかし、下記および実施例Ｖに記載するように、抗原（例えば、ＥｐＣａｍ）およびＢ７−１をコードする二重シストロンベクター、または抗原（例えば、ＥｐＣａｍ）およびＣＤ２８ＢＰ−１５をコードする二重シストロンベクターを、代替的に使用し得る。他の抗原および／またはＮＣＳＭ分子、サイトカイン、同時刺激配列などをコードする配列、また他のベクターエレメントを含むベクターを、上に記載のベクター構築手順を用いることによって構築し得る。当業者は、このような抗原のいずれかをコードする配列もまた含むか、または含まない、このようなＮＣＳＭ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築するために、これらの手順をどうやって改変／適応するかを容易に理解する。
【０６２３】
この分析において、５群のカニクイザル（１群あたり３匹のサル）を、以下の表８にまとめたように、ＣＤ２８ＢＰ−１５単独、ｈＢ７．１単独、抗原（Ａｇ）単独、Ａｇを伴うＣＤ２８ＢＰ−１５またはＡｇを伴うｈＢ７．１のいずれかを有するＤＮＡプラスミド発現ベクター（１接種あたりそれぞれ総用量１ｍｇのＤＮＡ）を用いて、皮内（ｉ．ｄ．）（例えば、遺伝子銃または針を用いた注射）で接種する。ＣＤ２８ＢＰ−１５、ｈＢ７−１、またはＡｇをコードする核酸挿入物を欠くＤＮＡプラスミドコントロールベクターを、それぞれの注射において使用するＤＮＡの総量と等しくするために使用する。ｐＭａｘＶａｘプラスミドベクター単独（コントロールベクター）およびＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターを構築するための手順を、上の実施例Ｖに記載する。表８に示すように、類似した手順を、ヒトＢ７−１、Ａｇ、またはＨｅｐＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列を含む別個のｐＭａｘＶａｘベクターまたは類似物を構築するために使用し得る。あるいは、別のプラスミドに基づく哺乳動物発現ベクターまたはウイルスベクター（明細書中の上に記載の任意のそれらを含む）を、以下の手順で使用し得る。免疫動物を、任意の局所性反応および全身性反応について、毎日監視する。
【０６２４】
【表９】
2004513878.tif 000025
。
【０６２５】
（動物）
それぞれ体重約４ｋｇの３匹の雄のカニクイザル５群（計１５匹）を、使用する。動物を番号付けを用いて、群にランダムに割り当てる。さらに、それぞれの動物に、群内で特定の番号を割り当てる。
【０６２６】
（接種材料）
表８にまとめたように、０．５ｍｇのそれぞれの（別個の）ベクター構成要素を含むためのプラスミドＤＮＡの混合物を、調製する。送達される総プラスミドＤＮＡは、それぞれの場合で１ｍｇである。それぞれのＤＮＡ発現プラスミドを、接種材料あたり１ｍｌの標的濃度を達成するために、貯蔵溶液からｐＨ７．４のＰＢＳ中に希釈する。
【０６２７】
（あるいは、二重シストロン形態を使用し、ここで以下のプラスミドベクターを、この手順において作製し、そして置換する：１）ＥｐＣａｍ（をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター総ＤＮＡプラスミド用量は、１ｍｇ）（抗原コントロールベクター）；２）ＥｐＣａｍおよびＷＴ　ｈＢ７−１の両方をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター（総ＤＮＡプラスミド用量は、１ｍｇ）（抗原／ＷＴ　ｈＢ７−１コントロールベクター）（ＡｇおよびｈＢ７−１を同時発現する二重シストロンベクター）；３）ＥｐＣａｍおよびＣＤ２８Ｂｐ−１５（または可溶性形態を含む、そのフラグメント）の両方をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクター（総ＤＮＡプラスミド用量は、１ｍｇ）（ＥｐＣａｍおよびＣＤ２８ＢＰ−１５を同時発現する二重シストロンベクター）。二重シストロンベクターを、上記の実施例ＶにおけるＣＤ２８ＢＰおよびＥｐＣａｍの両方をコードするｐＭａｘＶａｘ二重シストロンベクターについて記載されるように調製する。
【０６２８】
（接種）
動物に、接種に先立って麻酔をする。その動物の背中を、最初に毛皮を剃って準備し、そしてその動物に、複数部位で１．０ｍｌの１ｍｇ　ＤＮＡプラスミド（または以下に記載の代替量）を皮内注射によって接種する。このサルに、３週間隔で３回、同じ接種用量を用いて追加免疫した。
（観察および監視）
それぞれの接種部位を、任意の遅発型過敏症（ＤＴＨ）反応について、開始１日目から毎日試験する。動物を、この接種に対する全身性反応の徴候について、毎日観察する。これらの観察としては、体重、体温、食習慣、皮膚および毛、目、粘膜、呼吸器系、循環器系、中枢神経系、身体運動活動性（ｓｏｍａｔｏｍｏｔｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）、排泄、行動、および振せん、痙攣、唾液過多、下痢、傾眠、または昏睡の任意の発生における変化が挙げられるが、これらに制限されない。
【０６２９】
（血液の採集）
サルより、免疫の１日前およびその後毎週、２〜５ｍｌの全血を得るために採血する。血液を凝固させ、血清を分離し、さらなる分析まで−２０℃で凍結保存する。しかし、交互の週で、５〜１０ｍｌの血液を、Ｔ細胞アッセイ分析のためのヘパリン添加チューブに入れる。
【０６３０】
（組織採集）
接種部位のパンチ生検材料を、３週ごとに一回、標準的な公知の手順に従って採取する。
【０６３１】
（サンプル分析）
この動物の血清におけるＥｐ−ＣａｍおよびＨｅｐＢｓＡｇのそれぞれに対する抗体力価を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｍｏｓｏｌｉｔｓら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈ　４７：３１５−３２０；Ｓｔａｉｂら（２００１）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　９２：７９−８７；Ｃｈｏｗら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１６９−１７８）を用いて、それぞれ決定する。さらに、これらの抗原の１つに対応するＴ細胞増殖を、１０５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養物に対して１０ｇ／ｍｌの抗原を添加することによって分析する。この細胞を３日間インキュベートし、培養の最後の８時間に３Ｈチミジンの取り込みを、シンチレーション集計によって測定する（Ｐｕｎｎｏｎｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１０９４−１１０２に記載の通り）。上に記載のＴ細胞増殖方法を参照のこと。より高いＴ細胞増殖応答は、ワクチン接種の結果のように、より活発な免疫応答を示す。
【０６３２】
例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３産生のようなサイトカインの産生を、製造者の指示書に従って実施される、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて、特異的抗原に応じて検討する。例えば、単一細胞懸濁液における、ＩＦＮ−γ分泌細胞の訂数を、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手するキットを用いて実施する（製造者の指示書を参照のこと）。次のプロトコルを使用する。５０μｌの希釈したコーティング抗体を、それぞれのウェルに添加し、続いて５０μｌのＰＢＳを添加する。それぞれのウェルを、４℃で一晩インキュベートする。次いで、サンプルを吸引し、５回〜１０回洗浄緩衝液で洗浄する。２００μｌのポストコーティグ溶液を、各ウェルに添加し、そしてウェルを、３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートする。ウェルを吸引し、洗浄はしない。ウェルには、ウェル中に添加した１００μｌの予備刺激した単一細胞調製物が存在する。このプレートをプレートの蓋で覆い、７％ＣＯ２を含む加湿された空気において、３７℃で５時間インキュベートする。ウェルを吸引し、２００μｌの氷冷の脱イオン水を添加し、そしてそのプレートを、とけかかっている氷上に１０分間置く。そのウェルをＰＢＳで１０回洗浄する。１００μｌの希釈したビオチン化抗体溶液を添加し、プレートを覆い、そして３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートする。このウェルを吸引し、そしてＰＢＳで５回〜１０回洗浄する。５０μｌの希釈した標識抗ビオチン抗体溶液（ＧＡＢＡ）を、各ウェルに添加する。このプレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。このウェルを吸引し、そして５回〜１０回洗浄する。３０μｌのアクチベーター溶液を各ウェルに添加する。スポットの発生を、光学顕微鏡にて追跡する。明瞭なスポットが発生する場合、蒸留水でウェルをすすぐことによって、この反応を停止させる。その結果を、ＣＤ２８ＢＰ−１５を有するか、または有さない抗原で免疫した動物間で比較する。
【０６３３】
抗原を有する、および有さない、ＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするこのようなプラスミド発現ベクターは、上に記載のように、治療処置または予防処置のプロトコルにおいて有益である。ＣＤ２８ＢＰ−１５およびＥｐＣａｍ／ＫＳＡをコードするプラスミド発現ベクターは、上に記載のように、種々の癌を、治療的および／または予防的に処置する方法において有益である。霊長類モデルを、ヒトに対して密接であると認められたモデルと考えれば、当業者によって、このような方法は、ヒトについての治療的および／または予防的なワクチン接種プロトコルに対して容易に適応させ得る。
【０６３４】
上に記載の手順と類似の手順が、被験体における免疫応答を阻害するか、あるいはＴ細胞増殖またはＣＴＬ応答を阻害する、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰの能力を、本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰをコードするヌクレオチド配列を、ＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするヌクレオチド配列のかわりに用いること、および機能的アッセイ（例えば、Ｔ細胞活性化について）を用いることによって評価するために用いられ得る。例えば、上に記載のように、Ｔ細胞活性化を、増殖、サイトカイン産生、ＣＴＬ活性、あるいはＩＬ−２レセプター、ＣＤ６９またはＨＬＡ−ＤＲ分子のような活性化抗原の発現を測定することによって分析し得る。ＣＴＬＡ−４を通して効率的に作用するＣＴＬＡ４−ＢＰ遺伝子を有するベクターは、例えば、アレルゲンまたは自己抗原特異的Ｔ細胞の寛容およびアネルギーを誘導する場合に、有益である。いくつかの状況（腫瘍細胞または自己免疫反応を誘導する細胞のような）では、この抗原は、すでに標的細胞の表面に存在し得、そしてＣＴＬＡ−４ＢＰ分子をコードするベクターは、さらなる外因性抗原遺伝子の非存在下でトランスフェクトさせ得る。
【０６３５】
（追加免疫）
Ａｇ、ｈＢ７−１またはＣＤ２８ＢＰのそれぞれをコードする別個のベクター、あるいはＡｇおよびＣＤ２８ＢＰ、またはＡｇおよびｈＢ７−１をコードする二重シストロンベクターのいずれかを用いる、本明細書中に記載の方法において、ＤＮＡプラスミドベクターの１つ以上の追加用量（例えば、１ｍｇ）を、１つ以上の続く間隔（例えば２回）で、動物に対して引き続いて投与し得、それぞれ免疫応答を増強するか、または「追加免疫する」。所望であれば、１つ以上の追加的ＤＮＡプラスミドベクター用量のこのような投与を伴う免疫応答の追加免疫後、ＥｐＣａｍタンパク質の少なくとも１用量（約０．１〜約１ｍｇのタンパク質用量）（「タンパク質追加免疫」）を動物に投与して、免疫応答をさらに増強し得るか、または「追加免疫」し得る。
（実施例ＶＩＩ：ＥＡＥの発症をブロックする）
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルは、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）に多くの類似性を有し、ヒトＭＳのモデルとして広く使用されている（例えば、Ａｌｖｏｒｄ、Ｇ．Ｃ．Ｊｒ．，ｅｄ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｌｌｅｒｇｉｃ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：Ａ　Ｕｓｅｆｕｌ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）を参照のこと）。ＥＡＥを、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）そしてプロテオリピド−タンパク質（ＰＬＰ）またはそれらのペプチドによって、ＳＪＬ／Ｆマウスに誘導し得る。
【０６３６】
本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰ分子のＥＡＥを防ぐための効力を実証するために、次の予防処置ワクチン接種プロトコルを用いる。以下のように、ＣＴＬＡ−４ＢＰまたはＭＢＰ（もしくはＰＬＰ）のいずれかをコードするＤＮＡ発現プラスミドを、同時に送達するか、または同じベクター内にＣＴＬＡ−４ＢＰおよびＭＢＰ（もしくはＰＬＰ）のための２つの遺伝子を共発現し、送達する。この実施例において、クローンＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４　１２ｃをコードするヌクレオチド配列を使用する。ｐＭａｘＶａｘプラスミドベクター単独（コントロールベクター）またはＣＤ２８ＢＰおよび／または第二のポリペプチド（ＥｐＣａｍ）をコードするヌクレオチド配列を有するｐＭａｘＶａｘプラスミドベクターを構築するための手順を、上の実施例Ｖに記載する。当業者は、別個のベクター上に単独で発現するか、または１つのベクター上に共発現する、ＣＴＬＡ−４ＢＰおよび／またはＭＬＰ（もしくはＰＬＰ）をコードするヌクレオチド配列を含むｐＭａｘＶａｘベクターを構築するためにこのような手順を容易に適応し得る。
【０６３７】
あるいは、別のプラスミドに基づく哺乳類発現ベクターまたはウイルスベクター（本明細書中で上述した任意のそれらを含む）を、以下の手順で使用し得る。１００μｌ　ＰＢＳ中の１００μｇのＤＮＡプラスミドを、ＳＪＬ／Ｆ雌のマウスに筋内注射または皮内注射する。ＣＴＬＡ−４ＢＰ、ＭＢＰ、またはＰＬＰヌクレオチド配列を欠くコントロールＤＮＡプラスミドを、コントロール群のマウスに同様に投与する。
【０６３８】
ＥＡＥを誘導するために、マウスに、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中の１ｍｇ／ｍｌのウサギ脳ミエリン塩基性タンパク質（ＭＰＢ）の１００μｌを、皮内注射する。マウスを、尾麻痺、続いて後肢麻痺を目視検査することによりＥＡＥの発症について分析する（この時点で、動物を人道的理由のために屠殺する）。
【０６３９】
ＣＴＬＡ−４ＢＰおよび／またはＭＢＰ（もしくはＰＬＰ）をコードするＤＮＡプラスミドのＥＡＥをブロックする能力は、コントロールＤＮＡプラスミドを受けたマウスとの比較として、ＥＡＥを発症するマウス数およびこの疾患の重症度によって実証される。
【０６４０】
（実施例ＶＩＩＩ：癌の処置のために改善した細胞に基づくワクチン）
種々の癌の免疫治療処置または予防処置のための、細胞に基づくワクチンとして使用する腫瘍細胞の免疫原性を強めるために、患者の腫瘍細胞を、本発明のＣＤ２８ＢＰ核酸（ＮＡ）配列でトランスフェクトし得る。この実施例において、クローンＣＤ２８ＢＰ−１５に対応する配列を使用する；しかし、本発明の他のＮＡ配列を、容易に使用し得る。一例として、特定の免疫治療は、ＣＤ２８ＢＰ−１５をコードするＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした多価の照射した全細胞黒色腫細胞による黒色腫患者の免疫を包含する。
【０６４１】
１つのこのような方法において、黒色腫患者の黒色腫腫瘍細胞株由来の腫瘍細胞（すなわち、患者から取り出した細胞）の集団を、ＣＤ２８ＢＰ−１５（あるいは、そのフラグメント、例えば、ＣＤ２８ＢＰ−１５−ＥＣＤまたは発現した可溶性ＣＤ２８ＢＰ）をコードするＤＮＡ発現プラスミドベクターｐＭａｘＶａｘを細胞上でのＣＤ２８ＢＰ−１５ポリペプチドの取り込みおよび発現を促進するのに十分な有効量で用いて（例えば、エレクトロポレーションによって）トランスフェクトする；ＤＮＡプラスミドの量は、代表的には、黒色腫瘍を処置またはこの癌のさらなる発達を防ぐための、治療的または予防的な有効量あるいは投薬量を構成する。ｐＭａｘＶａｘプラスミドを、上記実施例Ｖに記載する。あるいは、別のプラスミドに基づく哺乳動物発現ベクター、またはウイルスベクター（本明細書中および全体にわたって記載のそれらを含む）を、この手順に使用し得る。
【０６４２】
これらのトランスフェクトした腫瘍細胞を、放射線照射（５０グレイ）によって不活性化し、そして細胞に基づくワクチンとして使用するために凍結保存する。処置（患者への送達）の前に、ワクチンとして使用する細胞を融解し、そしてリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄する；所望であれば、ワクチンとして使用する細胞を、例えば、薬学的に受容可能な賦形剤（例えばＰＢＳ）のような賦形剤と共に組成物として処方する。（代替的な形態において、同種異系の黒色腫腫瘍細胞を、ＣＤ２８ＢＰ−１５の発現のために、ＣＤ２８ＢＰ−１５（あるいはそのフラグメント（例えば、ＣＤ２８ＢＰ−ＥＣＤ））をコードするｐＭａｘＶａｘ　ＤＮＡプラスミドベクターの十分な量でトランスフェクトする。）発現したＣＤ２８ＢＰ−１５の有効量をコードするトランスフェクトされた腫瘍細胞（またはこのような細胞を含む組成物）−−特定の患者の細胞株由来の細胞または同種異系細胞のいずれか−−３ヶ月間２週間ごとに１回用量を増加させながら、特定の患者の補助領域および鼡径領域に皮内注射する。ワクチンの第一および第二の注射は２×１０６細胞、続く第三および第四の注射は６×１０６細胞、次いで、第五および第六の注射は１８×１０６細胞を含む。
【０６４３】
それぞれの患者の免疫応答を、腫瘍細胞特異的Ａｂｓのレベル、および腫瘍細胞上に発現した抗原または抗原性フラグメントに対するＴ細胞応答のレベルを測定すること、腫瘍細胞溶解物に応答したＴ細胞増殖を分析すること、および遅発型過敏症（ＤＴＨ）反応を測定することによって分析する。癌抗原に対するＴ細胞応答を、上に記載の標準的な方法を用いて分析する（例えば、実施例ＶＩを参照）。患者の血清中の腫瘍細胞特異的Ａｂｓのレベルを、標準的なプロトコルを用いるＥＬＩＳＡによって測定する（Ｃｏｌｌｉｇａｎ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；ＲａｐｌｅｙおよびＷａｌｋｅｒ（全て前出）を参照のこと）。ＤＴＨを分析するために、腫瘍溶解物を、患者の背中に皮内注射する。応答を、注射後の１日目、２日目、４日目、および７日目に評価する。硬化の平均直径を、（最も長い直径＋垂直の直径）／２として算出する。ポジティブ反応を、平均硬化直径５ｍｍとして規定する。ポジティブ反応の４ｍｍのパンチ生検を、選択された承諾を得た被験体に対して実施し、上記のようにフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア，ＢＤＩＳ）を用いて浸潤細胞の表現型を分析する。次いで、単一の細胞懸濁液を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ２０のモノクローナル抗体で染色し、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、単球およびＢ細胞のそれぞれの割合を測定する。
【０６４４】
見積もった統計的な生存率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法（Ｋａｐｌａｎら、Ｊ　Ａｍ　Ｓｔａｔ　Ａｓｓｏｃ（１９５８）５３：４５７を参照のこと）（例えば、統計的分析ソフトウェアＪＭＰ（ｖｅｒ．３．１　ｆｏｒ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ；ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して）によって分析する。対数−ランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）試験を、危険因子の異なるレベルによって規定した亜群に由来する患者の生存の差異を決定するために使用する。生存時間を、皮膚および軟部組織転移に関して、局所部位（ＡＪＣＣ段階ＩＩＩＡ）、または遠位部位（ＡＪＣＣ段階ＩＶ）のいずれかに対する転移性疾患の診断後に、特定の患者がなお生存している時間の長さとして規定する。
【０６４５】
前述の発明は、明瞭さおよび理解の目的のためにいくぶん詳細に記載されるが、形態および詳細における種々の変化が、本発明の真の範囲から逸脱することなしになされ得ることは、この開示を読むことから、当業者に明らかである。本明細書中に記載の実施例および実施形態は、説明目的のみであり、その教示内の種々の改変または変化は、当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲および添付の請求項の範囲内に含まれるべきであることが理解される。例えば、上に記載の全ての技術および装置は、種々の組み合わせにおいて使用され得る。本出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類は、本出願で引用したそれぞれの個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類が、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用されることを個々に示したのと同程度に、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０６４６】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、１）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の溝（ｇｒｏｏｖｅ）に提示された抗原性ペプチドとの間の例示的な相互作用、ならびに２）抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現された本発明の組換えＣＤ２８ＢＰポリペプチドとＴ細胞上のＣＤ２８レセプターとの間の例示的な相互作用の概略図である。図１Ｂは、１）ＴＣＲＭＨＣ分子の溝に提示された抗原性ペプチドとの間の例示的な相互作用、ならびに２）ＡＰＣの表面で発現された本発明の組換えＣＬＴ４−ＢＰポリペプチドとＴ細胞上のＣＴＬＡ−４レセプターとの間の例示的な相互作用の概略図である。これらの図は、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターに優先的に結合する本発明の組換えポリペプチドが増強されたＴ細胞活性化または抑制されたＴ細胞活性化を達成する原理を説明する。
【図２】
図２Ａ〜２Ｈは、天然に存在する（すなわち、野生型）ヒトＢ７−１ポリペプチド配列（配列番号２７８）および本発明の例示的なＣＤ２８ＢＰポリペプチド配列（配列番号４８〜６８、配列番号１７４〜２２１、および配列番号２８３）のアラインメントを示す。シグナルペプチド領域、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、および細胞質ドメイン（ＣＤ）の間の推定の境界線を、ｈＢ７−１配列における対応する境界線に基づき、上部に示す。配列番号２７８のアミノ酸残基３４〜３５に相当するアミノ酸残基間に位置する矢印は、ｈＢ７−１配列との比較に基づく、シグナルペプチド領域と成熟ポリペプチド領域との間の推定の境界線を示す。配列番号２８３は、これらの整列したＣＤ２８ＢＰ配列の「コンセンサス配列」を示す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｈは、天然に存在する（すなわち、野生型）ｈＢ７−１ポリペプチド配列（配列番号２７８）および本発明の例示的なＣＴＬＡ−４ＢＰポリペプチド配列（配列番号６９〜７３、配列番号７４〜９２、配列番号２２２〜２５２、および配列番号２８６）のアラインメントを示す。シグナルペプチド領域、ＥＣＤ、ＴＭＤ、およびＣＤの間の推定の境界線を、ｈＢ７−１配列における対応する境界線に基づき、上部に示す。配列番号２８６は、これらの整列した本発明のＣＴＬＡ−４ＢＰ配列の「コンセンサス配列」を示す。図２Ａ〜２Ｈおよび３Ａ〜３Ｈに示されるアラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬＷ複数配列アラインメントプログラム（Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩバージョン６配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｆｏｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の一部）を用いて作製した。ＣＬＵＳＴＡＬＷは、最初に配列の群の間の複数の対の（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較を実施し、次いで対アラインメントを相同性に基づく複数アラインメントに確立した。最初の対アラインメントについて、Ｇａｐ　ＯｐｅｎおよびＧａｐ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎペナルティーは、それぞれ１０および０．１であった。複数アラインメントについて、Ｇａｐ　Ｏｐｅｎペナルティーは１０であり、そしてＧａｐ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎペナルティーは０．０５であった。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスは、タンパク質重量マトリクス（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｔｒｉｘ）であった。
【図４】
図４Ａ〜４Ｄは、可溶性ＣＤ２８−Ｉｇレセプターおよび可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇレセプターの各々に対する、ｈＢ７−１、クローンＣＤ２８ＢＰ−１５、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２、およびベクターコントロールの競合的ＦＡＣＳ結合プロフィールを表わすグラフを示す。
【図５】
図５は、可溶性ＣＤ２８−Ｉｇレセプターおよび可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇレセプターの各々に対する、１７のラウンド２　ＣＤ２８ＢＰクローンの競合的ＦＡＣＳ結合プロフィールを表わすグラフを示す。
【図６】
図６Ａは、可溶性ＣＤ２８−Ｉｇレセプターおよび可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇレセプターに対する、ＣＴＬＡ−４ＢＰクローンについての例示的な競合的ＦＡＣＳ結合プロフィールの概略図である。図６Ｂは、可溶性ＣＤ２８−Ｉｇレセプターおよび可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇレセプターに対する、ＣＤ２８４ＢＰクローンについての例示的な競合的ＦＡＣＳ結合プロフィールの概略図である。
【図７】
図７Ａ〜７Ｈは、可溶性ＣＤ２８−Ｉｇレセプターおよび可溶性ＣＴＬＡ−４−Ｉｇレセプターに対する、ＷＴヒトｈＢ７−１（ＣＤ８０）、５つのＣＴＬＡ−４ＢＰクローン、およびＨＥＫ２９３細胞（コントロール）の競合的ＦＡＣＳ結合プロフィールを示すグラフである。
【図８】
図８Ａ〜８Ｂは、ＣＤ２８ＢＰ−１２およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃのアミノ酸配列ならびにこれらの配列の系統の概略図を示す。
【図９】
図９Ａ〜９Ｆは、クローンＣＤ２８ＢＰ−１５およびＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃに対する標識可溶性リガンドｓＣＤ２８−Ｉｇおよび標識可溶性リガンドｓＣＴＬＡ−４Ｉｇの結合により生成される、平均蛍光強度を表わすグラフである。図９Ｇ〜９Ｆは、抗ｈＢ７−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ（灰色のヒストグラム）、ｈＢ７−１（灰色のヒストグラム）、およびネガティブコントロールトランスフェクト体（白抜きのヒストグラム）を発現する安定な２９３のトランスフェクト体の染色からのヒストグラムを表わすグラフを提供する。発現レベルを、フローサイトメトリーにより分析した。
【図１０】
図１０は、抗ＣＤ３ｍＡｂと共に培養した、１７のＣＤ２８ＢＰクローン、ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）、または空のコントロールベクターのうちの１つを用いてトランスフェクトした細胞の同時刺激から生じた、３Ｈチミジン取り込みにより測定された、Ｔ細胞増殖応答を示すグラフを表わす。
【図１１】
図１１Ａ〜１１Ｃは、クローンＣＤ２８ＢＰ−１５、ｈＢ７−１、またはコントロールベクターを用いて一時的に（Ａ）かまたは安定（Ｂ）にトランスフェクトした、精製ヒトＴ細胞が観察された（精製Ｔ細胞および抗ＣＤ３ｍＡｂとの）同時培養照射２９３細胞の改善された同時刺激を示すグラフを表わす。図１１Ｃは、ＣＤ２８ＢＰもしくはｈＢ７−１を発現する、精製ヒトＴ細胞との同時刺激照射安定トランスフェクト体または「空」のベクターを用いてトランスフェクトしたネガティブコントロール細胞により産生されたＩＦＮ−γのレベルを示すグラフを表わす。
【図１２】
図１２は、可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂと共に培養した、１９のＣＴＬＡ−４ＢＰクローン、ＷＴヒトＢ７−１（ＣＤ８０）、または空のコントロールベクターのうちの１つを用いてトランスフェクトした細胞の同時刺激から生じた、３Ｈチミジン取り込みにより測定された、Ｔ細胞増殖応答を示すグラフを表わす。
【図１３】
図１３Ａ〜１３Ｄは、可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂの存在下で精製Ｔ細胞と共にトランスフェクト体を同時刺激することにより誘導されたＴ細胞増殖および混合リンパ球反応アッセイにおけるサイトカイン合成に対する、クローンＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２ｃ、ｈＢ７−１、またはコントロールベクターを用いてトランスフェクトした培養した細胞の効果を示すグラフを表わす。
【図１４】
図１４Ａ〜１４Ｂは、ヒトＢ７−１分子の例示的な可溶性形態の概略図である。発現プラスミドを、ＷＴ　ｈＢ７−１のシグナル配列および細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（またはＥＣＤフラグメント）をコードするヌクレオチド配列と、Ｅエピトープおよび／もしくはＨｉｓ　ＴａｇまたはヒトＩｇ　Ｆｃドメインをコードするヌクレオチド配列とを並列させることにより構築し、ＩｇＧ融合タンパク質を作製した。図１４Ａは、可溶性ＷＴヒトＢ７−１−ＥＣＤを含む１つのこのようなプラスミドにより発現された融合タンパク質の代表を示す（シグナル配列ペプチド（アミノ酸残基１〜３４）、ＥＣＤ（アミノ酸残基３５〜２４２）、およびＥエピトープタグ（アミノ酸残基２４３〜２５９）およびＨｉｓタグ（アミノ酸残基２６０〜２６８）を含む）。番号付けは、ＡＴＧまたはＭｅｔと一致する。例示的なＥＣＤアミノ酸配列の始めおよび終わりに位置するアミノ酸残基を示す。図１４Ｂは、可溶性ＷＴ　ｈＢ７−１−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質を含む１つのこのようなプラスミドにより発現される融合タンパク質の図示である（シグナルドメイン（アミノ酸残基１〜３４）、ＥＣＤドメイン（アミノ酸残基３５〜２４２）、第Ｘａ因子（ＩＧＥＲ）、バリン−スレオニン（ＶＴ）または（ＢｓｅｔＩＩ）グリシン−バリン−スレオニン（ＧＶＴ）リンカー、およびＩｇＧ１のＦｃドメインのヒンジＣＨ２−ＣＨ３（定常／重）領域を含む）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓ．Ｎｏ．Ｐ０１８５７またはＸ７０４２１）（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ７０４２１に示される核酸配列に対応する最初のアミノ酸残基を示す）。例示的なＥＣＤアミノ酸配列の始めおよび終わりに位置するアミノ酸残基を示す。必要に応じて、他のＩｇ分子、またはそれらのＩｇ　Ｆｃフラグメントが、ＮＣＳＭ−Ｉｇ融合タンパク質を構築するために使用され得る。同様の発現プラスミドを、ｈＢ７−１　ＥＣＤドメインをコードする配列を本発明のＮＣＳＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することにより構築し、そしてＮＣＳＭ−ＥＣＤ配列を含む融合タンパク質をこのようなプラスミドから作製した。ｈＢ７−１またはＮＣＳＭポリペプチドの短縮ＥＣＤドメインをコードするヌクレオチド配列もまた置換され得る。シグナル配列は、ＷＴ　ｈＢ７−１シグナル配列または組換えＮＣＳＭポリヌクレオチド由来の組み換えシグナル配列であり得る。Ｂ７−１−またはＮＣＳＭ−ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質は、第Ｘａ因子切断部位を含み得る。
【図１５】
図１５は、Ｅエピトープタグおよび／またはヒスチジンタグと共に、ＮＣＳＭポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、ｐＮＣＳＭｓＥＣＤプラスミド発現ベクターの例を示す。
【図１６】
図１６は、種々の可溶性形態のＷＴ　Ｂ７−１（ＥＣＤおよび融合タンパク質ならびにΔＣｙｓ変異体）およびクローンＣＤ２８ＢＰ−１５のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の写真である。分子量標準を、比較のために左側に示す。
【図１７】
図１７は、ヒトＢ＆−１／ＩｇＧ１　Ｆｃドメイン融合タンパク質の可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、ｐｈＢ７−１ＥＣＤ−Ｉｇプラスミド発現ベクターの例を示す。ＮＳＣＭポリペプチド（またはそのフラグメント）の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ヒトｈＢ７−１ＥＣＤ配列と置き換えられ得る。
【図１８】
図１８は、アフィニティー精製したＣＤ２８ＢＰ−１５　ＥＣＤ−Ｉｇ、ＣＴＬＡ−４ＢＰ　５×４−１２Ｃ　ＥＣＤ−Ｉｇ、およびＷＴヒトＢ７−１　ＥＣＤ−Ｉｇ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析の写真である。分子量標準を左側に示す。
【図１９】
図１９は、ウェスタンブロット分析の写真である。
【図２０】
図２０Ａ〜Ｄは、可溶性抗ＣＤ３の存在下で精製Ｔ細胞を用いて、同時培養した種々の架橋および非架橋可溶性ＮＣＳＭ融合タンパク質ならびにｈＢ７−１融合タンパク質により生じたＴ細胞増殖応答を示すグラフである。
【図２１】
図２１は、ｐＭａｘＶａｘ１０．１プラスミド発現ベクターを示す。
【図２２】
図２２Ａは、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｐＭａｘＶａｘ１０．１プラスミド発現ベクターを示す。図２２Ｂは、ＣＤ２８ＢＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および癌抗原ＥｐＣａｍ／ＫＳＡをコードするヌクレオチド配列を含む二シストロンｐＭａｘＶａｘ１０．１プラスミド発現ベクターを示す。ベクターの種々の構成要素（プロモーター、カナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１複製起点、ＢＧＨポリＡアデニル化配列、および制限部位を含む）の位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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