(57)【要約】以下の工程、・１から２％の最終アルデヒド希釈率のアルデヒド水溶液中で、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部をインキュベートする第一工程、・前記第一工程から得られた産物中に含まれる１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部を、アルデヒド水溶液の存在下で支持体に固定する第二工程を含む方法により得られるＵＣＴＡの生前スクリーニングのための試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程、
・１から２％の最終アルデヒド希釈率のアルデヒド水溶液中で、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部をインキュベートする第一工程、
・前記第一工程から得られた産物中に含まれる１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部を、アルデヒド水溶液の存在下で支持体に固定する第二工程
を含む方法により得られるＵＣＴＡの生前スクリーニングのための試薬。
【請求項２】
第一工程における、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体とアルデヒド水溶液との間のインキュベーション時間が、６０分以下であって、好ましくは１５分以上である、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
第二工程で用いられる水溶液のアルデヒド濃度が、０．０１から０．１Ｍの間に含まれる、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
第一工程で得られた産物を洗浄する工程が、第一工程と第二工程との間に導入されている、請求項１記載の試薬。
【請求項５】
支持体が、鳥類の赤血球または人工的な膜からなる、請求項１記載の試薬。
【請求項６】
アルデヒドがグルタルアルデヒドである、請求項１記載の試薬。
【請求項７】
請求項１ないし６記載の試薬と生物学的サンプルとのインキュベーション、および前記生物学的サンプル中における抗１４-３-３タンパク質抗体または１４-３-３タンパク質の存否の凝集および／または凝集阻害による検出からなる、ＵＣＴＡの生前スクリーニング方法。
【請求項８】
生物学的サンプルが、脳脊髄液、血液（血清、血漿、白血球濃縮物）、リンパ、尿または乳汁から選択される生物学的流体からなる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
関心のある生物学的サンプルを、請求項１ないし６記載の試薬と種々の濃度でインキュベートし、凝集および／または凝集阻害が生じるための希釈率を調べ、次いで、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の濃度を標準曲線との比較により導く、ＵＣＴＡの生前定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生前(ante-mortem)ＵＣＴＡスクリーニングのための試薬に関する。
【０００２】
また、前記試薬をベースとした、ＵＣＴＡの存在の生前検出方法にも関する。さらに、生物学的サンプル中におけるＵＣＴＡの生前定量方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
非通常伝播性成分(ＵＣＴＡ：unconventional transmissible agent)、すなわち“プリオン”は、ヒトおよび動物において、「伝播性海綿状脳症」（ＴＳＥ：transmissible spongiform encephalopathies）と呼ばれる疾患の原因である。これらの疾患の例は、ヒトのクロイツフェルト‐ヤーコプ病、ヒツジやヤギのスクラピー、およびウシの牛海綿状脳症（ＢＳＥ：bovine spongiform encephalopathy）を含む。
【０００４】
これらの疾患の正確な診断（未だ治療法が無いことから、その診断が出ることは致命的である）は、現在のところ、死後の検査で、生物学的サンプル、主に脳に対して行われるだけである。生前脳バイオプシーはヒトにおいて可能ではあるが、ヘルスケア職員に健康上のリスクを生じることから、行われていない。
【０００５】
それゆえ、伝播リスクの無い、ヒトの生前ＴＳＥ診断のための利用可能なテストは存在しない。
【０００６】
かくして、伝播リスクの無い、ＵＣＴＡの生前スクリーニングのための試薬が必要とされている。
【０００７】
ＨＳＩＣＨらは、ＮＥＪＭ（1996, 335, vol.13, 924-930頁“The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies”）において、ＴＳＥ患者の脳脊髄液、血液（血清、血漿、白血球濃縮物）、リンパ、尿または乳汁を含む種々の生物学的流体中における、脳の「１４-３-３タンパク質」として知られている抗原マーカーの全身的存在を開示した。
【非特許文献１】
ＨＳＩＣＨら、ＮＥＪＭ（1996, 335, vol.13, 924-930頁“The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies”）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の方法、すなわち
・１から２％の最終アルデヒド希釈率のアルデヒド水溶液中で、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部をインキュベートする第一工程、
・前記第一工程から得られた産物中に含まれる１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部を、アルデヒド水溶液の存在下で支持体に固定する第二工程
により得られるＵＣＴＡの生前スクリーニングに使用できる試薬を提案する。
【０００９】
言い換えれば、本発明は、主に、商業的に入手可能および人工的に合成された、抗１４-３-３タンパク質抗体の全てまたは一部、もしくは、１４-３-３タンパク質の全てまたは一部が固定された支持体からなる試薬に関する。アルデヒドは、それぞれ、各工程において別個の役割、すなわち、
−第一工程では、滴定効率を増加させ、抗体またはタンパク質の抗原特性を変更することなく試験感度を改善する、
−第二工程では、抗体またはタンパク質と支持体とのカップリングを助ける
という役割を有する。
【００１０】
１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の抗原特性を変更しないように、第一工程におけるこれらの成分とアルデヒド溶液との間のインキュベーション時間は、好ましくは１時間以下、好ましくは１５分以上である。
【００１１】
実際には、使用されるアルデヒドは、グルタルアルデヒドである。
【００１２】
実際には、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体が固定される支持体は、赤血球、特に鳥類に由来するもの、または人工的な膜である。
【００１３】
この方法の別の特徴によれば、第二工程で用いられる水溶液中のアルデヒド濃度は０．０１から０．１Ｍの間に含まれる。
【００１４】
好ましい実施態様では、第一工程から得られる産物を洗浄する工程が、第一工程および第二工程の間に導入される。
【００１５】
また、本発明は、生物学的サンプル中のＵＣＴＡの存在を生前検出する方法にも関する。
【００１６】
この方法は、上記試薬と生物学的サンプルとのインキュベーション、および前記生物学的サンプル中における抗１４-３-３タンパク質抗体の全部または一部もしくは１４-３-３タンパク質の全部または一部の存否の凝集および／または凝集阻害による検出からなる。
【００１７】
上述したように、生物学的サンプルは、好ましくは、脳脊髄液、血液（血清、血漿、白血球濃縮物）、リンパ、尿または乳汁を含む生物学的流体群から選択される。
【００１８】
支持体または人工的な膜が、マーカーすなわち１４-３-３タンパク質で含浸されている一部の実施態様では、生物学的サンプルとのインキュベーション後に、抗１４-３-３タンパク質抗体による凝集を検出することが、血液中の抗原の不在、すなわち感染が無いことを示す。反対に、凝集が起こらない場合は、生物学的サンプル中の抗原の存在、すなわち感染の存在を示す。
【００１９】
支持体または人工的な膜が、抗１４-３-３タンパク質抗体で含浸されている別の実施態様では、１４-３-３タンパク質による前記支持体の直接的凝集が、生物学的サンプル中の抗原の存在、すなわち感染を示す。
【００２０】
凝集の不在は、サンプル中のマーカーが不十分な量であることと関連づけることもできる。この場合、過剰量の１４-３-３タンパク質が生物学的サンプル中に加えられる。次いで、凝集の不在は、抗原の存在を示す。反対に、凝集の検出は、抗原の存在を示す。
【００２１】
また本発明は、生物学的サンプル中のＵＣＴＡを生前定量する方法にも関する。この方法によれば、関心のある生物学的サンプルを上記試薬と種々の濃度でインキュベートし、凝集および／または凝集阻害が生じるための希釈率を調べ、次いで、１４-３-３タンパク質または抗１４-３-３タンパク質抗体の濃度を標準曲線との比較により導く。
【００２２】
以下の例は、本発明とその利点を例示するためのものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
１４-３-３タンパク質で含浸させた鳥類の赤血球の調製
１４-３-３タンパク質を、１．５％の最終希釈率でグルタルアルデヒドを含むＰＢＳバッファー溶液中に調製した。タンパク質およびグルタルアルデヒド溶液を、２０分間インキュベートした。
【００２４】
並行して、七面鳥の赤血球を、１００ｍｌのＰＢＳに対して５ｍｌの赤血球の比率となるように、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー溶液中に懸濁させた。
【００２５】
この懸濁液に、０．０５Ｍの濃度のグルタルアルデヒドの水溶液と、第一工程から得られたタンパク質溶液とを加えた。
【００２６】
赤血球、グルタルアルデヒド、および前記タンパク質のインキュベーションを１０分間続けた。前記タンパク質で含浸させ、遠心して回収した赤血球を、洗浄し、ＰＢＳバッファー溶液に再懸濁した。この懸濁液に、リシン溶液を１５から３０分間添加した。
【００２７】
含浸および処理した赤血球を、遠心して回収し、洗浄し、０．７／１００００（重量／ボリューム）のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液に再懸濁した。
【００２８】
この試薬を、スクラピーが海綿状脳症の一形態を示しているヒツジに用いた。これは、死の直後にサンプリングした脳脊髄液に適用した場合、５つのケースのうちの４つに陽性反応をもたらした。２頭の健康な動物に対して行った並行試験では陰性であった。
【００２９】
本発明とその利点は、以上の記載から明確である。
【００３０】
伝播リスクを伴わない単純かつ信頼できる試験によりヒトおよび動物においてプリオン疾患を生前診断できることは注目すべきことである。
【国際公開パンフレット】
2004525364.tif 000002
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2004525364.tif 000004
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【国際調査報告】
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2004525364.tif 000011
2004525364.tif 000012
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