(57)【要約】本発明は、機能的ＲｅｃＡを産生する能力を持たない、第一の弱毒化変異を含む弱毒化した生きたサルモネラ菌株に関する。本発明はまた、ワクチンに使用するためのこれらの細菌に関する。さらに本発明は、これらの細菌に基づくワクチン、ワクチンの製造における該細菌の使用、及び、該ワクチンの調製のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ＲｅｃＡタンパク質の産生を妨げる変異をさらに含むことを特徴とする、第一の弱毒化変異を含む弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項２】
上記菌株が、サルモネラ・ガリナルム種又はサルモネラ・ティフィムリウム種に属することを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項３】
サルモネラ・ガリナルム９Ｒ株に属することを特徴とする、請求項２に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項４】
上記菌株が、その標本が寄託番号ＣＢＳ１０８９６４でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されているサルモネラ・ガリナルム９Ｒ−ＲｅｃＡ−株であることを特徴とする、請求項３に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項５】
サルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１株に属することを特徴とする請求項２に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項６】
さらに家禽類に対して病原性を有するウイルス又は微生物の抗原をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項７】
上記微生物又はウイルスが、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス病（ガンボロ）、ニワトリ貧血因子、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、七面鳥鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、アイメリア種、パスツレラ・ムルトシダ、マイコプラズマ・シノビエ、サルモネラ種、オーニソバクテリウム・リノトラキアレ及びＥ．コリからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の弱毒化したサルモネラ菌株。
【請求項８】
請求項１から７に記載の弱毒化したサルモネラ菌株及び薬学的に許容できる担体を含むことを特徴とする、サルモネラ菌感染に対抗するワクチン。
【請求項９】
請求項１から７に記載のサルモネラ菌株及び薬学的に許容できる担体の混合を含むことを特徴とする、サルモネラ菌感染に対抗するワクチンの調製方法。
【請求項１０】
ワクチンに使用するための請求項１から７に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項１１】
サルモネラ菌感染に対抗するワクチンの製造における請求項１から７に記載の弱毒化サルモネラ菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、第一の弱毒化変異を含む弱毒化サルモネラ菌株、ワクチンにおけるその使用、この菌株に基づくワクチン、及びこのワクチンの調製のための方法に関する。
【０００２】
サルモネラ属の細菌は、ヒト及び動物の両方に対して病原性を持つことが良く知られている。米国のみで毎年サルモネラ感染を患う人の数は２００万件を超えている。最も多い症例では、感染は、汚染された食物によって引き起こされている。周知の感染源は、（アヒル及びニワトリ両方の）卵、卵を含む製品、及び十分に加熱していない鳥及び豚の肉である。特に幼児、小さい子供、高齢者及び免疫力の低下した患者では、このような感染に対抗する能力は低い。これらの集団では、サルモネラ感染に起因する年間の死亡率は高い。最近の数十年間で、より効率的な大規模畜産業が、動物の密集度の莫大な増加を引き起こしてきた。結果として、動物の感染数の増加、及びそれに続く汚染した食物によるヒトの感染の増加が見られる。動物が主なサルモネラ感染源であることは明らかである。この感染源は制御することが非常に困難である。第一に、最も多い症例でのサルモネラ感染は、健康な十分成長した動物において重篤な病気を引き起こさず、これらの動物は長期にわたって細菌を保持し得る。その期間中、彼らは糞中に細菌を噴出している。このことは、より脆弱な若い動物での感染を避けることを実質的に不可能にしている。第二に、多くのサルモネラ種は、いくつかの異なる宿主種においてコロニーを形成する。いくつかのサルモネラ種は特定の宿主において一次感染を引き起こすのに対して、他のサルモネラ種は全く制限されない。一次感染として、サルモネラ・ティフィ及びパラティフィは、しばしばヒトの感染に関連する。サルモネラ・ダブリンはウシに関連し、サルモネラ・アボルタス・エクイは馬の流産を引き起こす。サルモネラ・アボルタス・オヴィはヒツジの流産を引き起こす。サルモネラ・コレラエスイスは、若いブタにおける死に至る下痢の原因となる。サルモネラ・ティフィムリウム及びサルモネラ・エンテリティディスはヒト、家禽、ブタ、ウシ及びげっ歯類でのサルモネラ中毒を引き起こし、サルモネラ・アリゾナエは七面鳥において病気を引き起こし、サルモネラ・ガリナルムは家禽においてのみサルモネラ中毒を引き起こす。
【０００３】
多様なサルモネラ種に対抗するための、良好な、安全で且つ有効なワクチンの必要性があることは明らかである。現在、いくつかの弱毒化サルモネラ生ワクチンが商業的に入手可能である。
【０００４】
生ワクチンにおける使用に適した菌株の多くは、それらを実質的に無毒にさせるレベルまで弱毒化される。このような無毒の菌株の二つの顕著な例は、サルモネラ・ガリナルム９Ｒ株及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１株である。
【０００５】
サルモネラ・ガリナルム９Ｒ株は、４４年も前にスミスによって記載されている（Ｊ．Ｈｙｇ．Ｃａｍｂ．，５４：４１９−４３２（１９５６））。この高度に弱毒化した菌株は、少なくとも、スムース型からラフ型変異をもたらす細胞のＯ−多糖類の合成に関与する遺伝子における変異を有することが知られている。それ以来、９Ｒ菌株はラフ型の参照菌株として使用されてきた（例としてＣａｍｅｒｏｎ，Ｃ．Ｍ等．，Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ　Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３９（３），１３９−１４６（１９７２））。１０３野生型細菌を含む用量は全ての動物を死なせるのに対し、この菌株は１０９細菌の用量でもニワトリを全く死なせることなくニワトリに投与することができる。
【０００６】
サルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１株は、Ｈｏｉｓｅｔｈ，Ｓ．及びＳｔｏｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．Ｄ．によって１９年前に記載され（Ｎａｔｕｒｅ　２９１：２３８−２３９（１９８１））、及び、寄託番号ＳＧＳＣ４３９、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｒｅ，カルガリー大学，アルバータ、カナダ　Ｔ２Ｎ　１Ｎ４から入手可能である。
【０００７】
この菌株は、芳香族経路合成において、高度の弱毒化変異を有することが知られている。この本菌株は、１０６細菌の用量でも動物を全く死なせることなく感染性の高いマウスに投与することができ、一方で、これらのマウスに対する親菌株のＬＤ５０は、２０細菌より低い。
【０００８】
このようなサルモネラ菌株は、それらの高度に弱毒化した特性により以前から評価されてきた。それらは重度に弱毒化していることから、非毒性のものとして文献に記載されている。従ってこれらは、弱毒化サルモネラ生ワクチンとして選択される菌株であった。
【０００９】
原則として、毒性のレベルと免疫誘導のレベルの間には明らかな関連性がある。一般的に、最も高い毒性を持つ菌株は最も高いレベルの免疫を誘導し、野生型サルモネラ菌株の感染から生き延びた動物は、しばしば長期間持続する免疫を形成する。一方で、ワクチンに使用するためには、病原を全く誘導しない菌株、非毒性の菌株が最も望まれるが、これらの菌株はしばしば十分に高いレベルの免疫を誘導する能力を持たない。前記の非毒性のサルモネラ菌株は、おおむね免疫系を十分なレベルに誘導する能力を持つ。
【００１０】
しかしながら全ての弱毒化生ワクチンに関する不利点は、原則としてそれらが、例えば野生型分野の菌株のような非変異遺伝子を持つ細菌由来のＤＮＡでの変異遺伝子の組換えを通して、野生型レベルの毒性に戻り得ることである。このような組換えの事象は、例えば核酸導入、形質導入、形質転換のようなさまざまな方法によって起こり得る。これらの組換え過程において役割を果たすことが知られている遺伝子は、ｒｅｃ−遺伝子として知られている。鍵となる重要なｒｅｃ−遺伝子の一つは、ｒｅｃＡ−遺伝子である。この遺伝子は、いくつかの組換え過程のステップに関与する酵素ＲｅｃＡをコードする。ｒｅｃＡ及び多くの他のｒｅｃ−遺伝子は、中でも、Ｌｌｏｙｄ．Ｒ．Ｇ．及びＬｏｗ，Ｋ．Ｂ．（「大腸菌及びサルモネラ」節、ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ編、ＩＳＢＮ　１−５５５８１−０−８４５、１１９段落、２２３６−２２５５頁）、Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｃ．（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：６０３−６４０（１９９２））、及び、Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ．Ｓ．Ｃ等（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｖ．５８：４０１−４６５（１９９４））に記述されている。
【００１１】
一見して、安全な弱毒化した生ワクチンを意図する場合にｒｅｃ−遺伝子の一つを除去することは、それゆえ魅力的であるように思われる。このような除去は、細菌ＤＮＡの組換え能力を大幅に損なう。それにもかかわらずｒｅｃ−遺伝子の除去は、除去された菌株の著しい弱毒化を引き起こすこともまた知られている。サルモネラにおける例えばｒｅｃ−Ａ遺伝子又はｒｅｃＢＣ−遺伝子の除去は、この変異体を、とりわけ著しいインビボでの成長抑制に導く、マクロファージによる酸化的破裂に対して感受性にする。このことは、例えばＢｕｃｈｍｅｉｅｒ，Ｎ．Ａ．等（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７：９３３−９３６（１９９３））によってサルモネラについて示されており、及び例えばコレラ菌のようなサルモネラと遠い類縁関係にある他の細菌の属についても同じことがいえる（Ｋｅｔｌｅｙ等．，Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ．５８：１４８１−１４８４（１９９０））。
【００１２】
従って、ｒｅｃ−遺伝子の除去が毒性の菌株にとって有利であり得る場合、サルモネラ・ガリナルム９Ｒ株及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１株のような非毒性の菌株にとって不利益であることが確実に想定されよう。これらの菌株は、既に高度に弱毒化していることが知られており、ｒｅｃ−遺伝子を除去した後は、いかなる免疫応答の誘因になることも期待できない。このことは、長い歴史があるにもかかわらず、サルモネラ・ガリナルム９Ｒ及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１のような、既に高度に弱毒化した非毒性の菌株からＲｅｃ−遺伝子を除去する試みがなされなかった理由を明らかにしている。
【００１３】
本発明の目的は、安全かつ有効な、弱毒化したサルモネラ生ワクチンを提供することである。驚くべきことに、毒性因子ＲｅｃＡの除去は、これらのＲｅｃＡ陽性の対照物と比べて、既に弱毒化したサルモネラ菌株が免疫系を適切に誘導する能力をさらに損なわないことが今見出された。
【００１４】
従って、本発明の一つの実施態様は、第一の弱毒化変異を既に含み、及びさらに、これらの菌株が機能的ＲｅｃＡタンパク質を産生することを抑制する変異を含む特性を持つ、弱毒化サルモネラ菌株を提供することである。
【００１５】
既に第一の弱毒化変異を含む弱毒化菌株は、既に存在する弱毒化によって、弱毒化生ワクチンの基礎原料として使用されるのに十分に弱毒化した特性を持つ菌株であると理解される。この第一の弱毒化の性質は問題ではない。この性質は、細菌を弱毒化生ワクチンの基礎原料として有用にするのに十分な弱毒化の特性を持つ任意の弱毒化変異、又は２もしくはそれ以上の変異の組み合わせであってよい。単なる例として、例えば、ラフ型変異、ヒスチジンもしくはプリン合成経路における変異、又は芳香族アミノ酸生合成経路における変異であってもよい。当該技術分野において知られる、ｃｒａ−遺伝子における変異及びｃｒｐ／ｃｙａ−変異もまた、適切な変異である。既知のサルモネラワクチン菌株もまた、本発明のＲｅｃＡ陰性細菌の産生の基礎原料として非常に適している。
【００１６】
機能的ＲｅｃＡを産生する能力を持たない菌株は、ＲｅｃＡ酵素を全く産生しないか又は、ＲｅｃＡ作動組換え事象を引き起こすのに本質的に不十分なレベルの菌株であると理解される。このＲｅｃＡを産生する能力が無いことは、特にｒｅｃＡ遺伝子、ｒｅｃＡプロモーター、又はｒｅｃＡ合成に関与する遺伝子の、一部分又は全部の変異又は除去の結果となり得る。
【００１７】
本実施態様の好ましい形態において、本発明のサルモネラ菌株は、サルモネラ・ガリナルム又はサルモネラ・ティフィムリウム種に属する。
【００１８】
この実施態様のより好ましい形態において、サルモネラ・ガリナルム株は、サルモネラ・ガリナルム９Ｒである。
【００１９】
本実施態様のさらにより好ましい形態は、その標本がＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｏｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ　１、３７４２　ＳＫ　Ｂａａｒｎ、オランダに、寄託番号ＣＢＳ１０８９６４で寄託されているサルモネラ・ガリナルム９Ｒ−ＲｅｃＡ−株に関する。
【００２０】
本実施態様の他のより好ましい形態において、サルモネラ・ティフィムリウム株は、サルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１である。
【００２１】
ｒｅｃＡ遺伝子又はＲｅｃＡ生合成に関与する他の任意の既知の遺伝子を機能しなくする一つの可能な方法は、塩基類似体のような変異誘発物質を用いた野生型細菌の処置、紫外線を用いた処置、又は温度処置のような古典的な方法を用いる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．１９９５．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｐ３１−５８　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４８．Ｈ．Ｆ．Ｅｐｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｄ．Ｃ．Ｓｈａｋｅｓ（Ｅｄｓ））。その野生型がＲｅｃＡ陽性である多様な細菌のＲｅｃＡ陰性変異体を産生する他の方法は、中でも、Ｌｉｕ，Ｓ．Ｌ．等．（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８８　Ａｕｇ；５６（８）：１９６７−７３）、Ｈａａｓ，Ｒ．等．，（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３　Ｍａｙ；８（４）：７５３−６０）、及びＧｒａｆ，Ｊ．等．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４　Ｎｏｖ；１７６（２２）：６９８６−９１）に記載されている。
【００２２】
ＲｅｃＡ陰性変異体は、紫外線放射に対するそれらの非常に高度な感受性のために、容易に選択され得る。非変異細菌の中の変異体の検出の古典的方法は、レプリカプレート法によるものである。この方法は、変異処置の対象となった細菌のコロニーで覆われた寒天プレートを用いて開始する。このプレートのレプリカは、第二の寒天プレート上に作成される。このプレートはその後、高用量の紫外線放射にさらされる。放射処置後にもはや成長しないコロニーは、ｒｅｃ遺伝子内に変異を有するコロニーである。最初のプレート上のそれらの生息レプリカコロニーは、次いで選択され、例えばワクチンの目的のために培養される。
【００２３】
古典的な変異の手法による変異の正確な性質は、殆んど知られていない。これは、例えば、起こる可能性は低いが最終的に野生型に戻り得る点変異であり得る。従って、トランスポゾン変異誘発は好ましい代替方法である。トランスポゾン変異誘発による変異は、また、当該技術分野において良く知られた変異誘発手法である。これは染色体の局所的領域で達成する変異である。無作為であるよりもむしろ意図的に、あらかじめ定められた領域に変異を導入する実現性は、組換えＤＮＡ手法によってもたらされる。このような変異は、変異した遺伝子が機能的ＲｅｃＡをこれ以上コードしないという唯一の条件で、挿入、除去、一つの核酸の他のものとの交換、又はそれらの組み合わせであってもよい。このような変異は、例えばいくつかの塩基対の除去によって起こり得る。１０塩基対の伸長のような非常に小規模な除去でさえも、ｒｅｃＡ−遺伝子が非機能的ＲｅｃＡをコードすることを既に引き起こし得る。このような変異の結果として、他の塩基対がもはや正しいリーディングフレーム内に無いことから、一つの単独の塩基対の除去でさえも、非機能的ＲｅｃＡを既にもたらし得る。３分割できない幾つかの塩基対の除去又は挿入のそれぞれが、このようなフレームのシフトを引き起こす。より好ましくは、例えば１００塩基対のようなより長い伸長が除去される。さらにより好ましくは、ｒｅｃ−Ａ遺伝子全部が除去される。
【００２４】
ｒｅｃＡ陰性の変異体の構成のための組換えＤＮＡ手法は全てよく知られた標準的な手法である。それらはｒｅｃＡ遺伝子のクローニング、特定部位の変異誘発、制限酵素の消化、その後の再連結、又はＰＣＲ法による遺伝子配列の修飾に、及びそれに続く変異遺伝子との野生型ｒｅｃＡ遺伝子の置換（対立遺伝子の変換又は対立遺伝子の置換）に関する。宿主菌株における、プラスミド内のｒｅｃＡ遺伝子のクローニング、制限酵素を用いた遺伝子の消化、その後のエンドヌクレアーゼ処理、再連結、及び相同的組換えのような標準的な組換えＤＮＡ手法は、当該技術分野において全て既知であり、中でも、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。特定部位変異は、例えばクローンテックにより販売されているＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（登録商標）キットを用いたインビトロの特定部位変異誘発によって行われる。ＰＣＲ手法は、（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ０−８７９６９−４４７−５（１９９５））に詳細に記載されている。
【００２５】
大量のワクチンが今日ペット及び家畜の両方に投与されることを考えると、単にワクチン接種のコストを減らす理由であれば、いくつかのワクチンの併用投与が望ましいであろうことは明らかである。従って、他の病原微生物又はウイルスから選ばれる抗原をコードする異種遺伝子の組換え担体として弱毒化した生きた細菌を用いることは非常に魅力的である。このような組換え担体の投与は、２又はそれ以上の病気に対する免疫が同時に誘導されるという利点を持つ。本発明のワクチンに用いられる弱毒化した生きた細菌は、異種の遺伝子に対して非常に適した担体を提供する。原則として、このような異種遺伝子は、細菌のゲノム中に、任意の非本質的な領域で挿入され得る。
【００２６】
従って、本実施態様のまたさらにより好ましい形態は、異種の遺伝子が挿入された本発明の細菌に関する。異種遺伝子は、前に記載されたように、例えば他の病原微生物又はウイルスから選ばれる抗原をコードする遺伝子であり得る。このような遺伝子は、例えば病原性ヘルペスウイルス（例えばヘルペスウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子）、レトロウイルス（例えばｇｐ１６０外被タンパク質）、アデノウイルス等から誘導され得る。異種遺伝子もまた病原細菌から得ることができる。例として、アクチノバシラス・プレウロニューモニア毒素、クロストリジウム毒素、膜外タンパク質等といった細菌毒素をコードする遺伝子は、非常に適した細菌の異種遺伝子である。さらに、例えばエイメリアのような多様な寄生生物由来の異種遺伝子は、本発明の弱毒化した生きたサルモネラのベクターでのクローニングにとって非常に魅力的な候補である。他の可能性は、インターロイキン、腫瘍壊死因子、又はインターフェロンのような免疫系の誘発に関与するタンパク質をコードする遺伝子、又は免疫調節に関与する他の遺伝子を挿入することである。本実施態様の最も好ましい形態において、異種遺伝子は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス病（ガンボロ）、ニワトリ貧血因子、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、七面鳥鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、エイメリア種、パスツレラ・ムルトシダ、マイコプラズマ・シノビエ、サルモネラ種、オーニソバクテリウム・リノトラキアレ、及びＥ．コリからなる群から選ばれる微生物又はウイルスの抗原をコードする異種遺伝子である。
【００２７】
挿入部位としてのｒｅｃＡの使用は、異種遺伝子のための新たな挿入部位を見つける必要がなく、及びｒｅｃＡ遺伝子が不活化されると同時に新たに導入された異種遺伝子が（異種の細菌遺伝子に合わせて）発現し得るという利点を持つ。このような組換え担体の構成は、対立遺伝子の変換のような標準的な分子生物学的手法を用いて、通常的に行われ得る。
【００２８】
従って、本実施態様の好ましい形態において、異種遺伝子は、ｒｅｃＡ遺伝子に挿入される。異種遺伝子は、ｒｅｃＡ遺伝子内のある場所に挿入することができ、又は、この遺伝子が部分的にもしくは完全に除去されていたとしても、ｒｅｃＡ遺伝子の部位に挿入することができる。
【００２９】
本発明の他の実施態様は、本発明の弱毒化したサルモネラ菌株及び薬学的に許容できる担体を含む、サルモネラ感染に対抗するためのワクチンに関する。薬学的に許容できる担体は、水のような単純なものであっても良いが、例えば細菌が培養されている培養液を含んでもよい。他の適当な担体は、例えば生理食塩水濃度の溶液である。
【００３０】
投与するために有用な用量は、年齢、体重及びワクチンを受ける動物、投与の形態及び経路、及び、それに対してワクチンが求められる病気の種類によって変わるであろう。ワクチンは、免疫応答を誘発するのに十分な任意の用量の細菌を含んでいてもよい。例えば１０３から１０１０細菌の範囲の用量は、非常に適した用量である。１０６から１０９細菌の用量がさらにより好ましい。
【００３１】
任意に、アジュバント作用を持つ１又は２以上の化合物がワクチンに添加されてもよい。アジュバントは免疫系の非特異的刺激物質である。それらは、ワクチンに対する宿主の免疫応答を高める。当該技術分野において既知のアジュバントの例は、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例として欧州特許ＥＰ１０９９４２を参照）、サポニン、鉱物油、植物油、及びカーボポールである。粘膜投与に特に適したアジュバントは、例えば大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）又はコレラ毒素（ＣＴ）である。他の適当なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、油性乳剤（例えばＢａｙｏｌ　Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ　５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥ可溶化剤である。従って、好ましい形態において、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
【００３２】
本発明に有用な、薬学的に許容できる担体又は希釈剤の他の例は、ＳＰＧＡ、炭化水素（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、ブドウ糖、デキストラン）、アルブミン又はカゼインのようなタンパク質、ウシ血清又はスキムミルクのようなタンパク質含有成分、及び緩衝剤（例えばリン酸緩衝剤）のような安定化剤を含む。このような安定化剤がワクチンに添加される場合は特に、ワクチンは、凍結乾燥又は噴霧乾燥に非常に適している。従って、より好ましい形態において、ワクチンは凍結乾燥又は噴霧乾燥の形態である。
【００３３】
動物又はヒトへの投与として、本発明のワクチンは、中でも、経鼻的に、スプレー剤により、経皮的に、皮下に、経口的に、エアゾール剤により、又は筋肉内に投与され得る。利便性の理由から好ましい方法は、スプレー剤による投与、経鼻投与、及び経口投与である。家禽類への投与として、翼膜の及び点眼の投与がさらに適当である。
【００３４】
本発明のさらに他の実施態様は、ワクチンに使用するための本発明の弱毒化サルモネラ菌株に関する。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様は、サルモネラ感染に対抗するためのワクチンの製造に使用するための本発明の弱毒化サルモネラ菌株に関する。
【００３６】
本発明はまた、本発明のワクチンの調製方法に関する。本方法は、本発明の弱毒化サルモネラ細菌もしくはそれらの抗原性物質、及び薬学的に許容できる担体を混合することを含む。
【００３７】
実施例１
サルモネラ・ガリナルム９Ｒ及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１のｒｅｃＡ変異体の構成
サルモネラ・ガリナルム９Ｒ及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１の約４ｋｂの完全なｒｅｃＡ遺伝子座及び側面領域を、クローニングし、配列決定した。（クローニングに用いた方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前述）に記載された標準的方法であり、ＲｅｃＡ遺伝子はＬｌｏｙｄ、Ｗｅｓｔ及びＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ（前述）によって記載されたように検出された。配列決定の方法は当該技術分野においてよく知られた標準的方法である）。この配列に基づいて、ｒｅｃＡ遺伝子の２つの側面領域が、ＰＣＲによって増幅された（ｒｅｃＡの１ｋｂ上流及びｒｅｃＡの１ｋｂ下流）。これらの２つのＰＣＲ断片は、ＰＣＲ重複伸長部によって、断片が正しい方向になるように、相互に連結した。ｒｅｃＡ遺伝子の大部分の除去を有するｒｅｃＡ遺伝子座である、このＰＣＲ断片を、大腸菌Ｓ１７．１ラムダ−ピラのサルモネラ自殺ベクターｐＬＤ５５（アンピシリン及びテトラサイクリン耐性）中にクローニングした。以下に記載されるように、この菌株を、汚染されていないマーカー無しのサルモネラ・ガリナルム９Ｒ及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１のｒｅｃＡ変異株を産生するために、対立遺伝子の変換に使用した。
【００３８】
接合によって、ｐＬＤ５５中のｒｅｃＡの除去構築物を、大腸菌からサルモネラ・ガリナルム９Ｒ及びサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１へと挿入した。このプラスミドがサルモネラにおいて複製されないことから、アンピシリン耐性サルモネラ・ガリナルム９Ｒ又はサルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１のコロニーは、ｒｅｃＡ遺伝子座において相同的組換えによってそれらの染色体中に組み込まれた除去構築物を有した。これは、異なるプライマーセットを用いたＰＣＲによって確認された。ｒｅｃＡＤＮＡ領域間の、２番目の自然発生的な染色体内の組換えステップにより、アンピシリン及びテトラサイクリン感受性コロニーをもたらす、及び同時に、ｉ）野生型ｒｅｃＡ遺伝子座又はｉｉ）上記の除去を含む変異したｒｅｃＡ遺伝子座の形成をもたらす、ｐＬＤ５５及び側面ＤＮＡが削除される。いくつかのアンピシリン及びテトラサイクリン感受性コロニーを、それらのｒｅｃＡ遺伝子座についてＰＣＲ法を用いて分析し、野生型ｒｅｃＡ遺伝子座は１．４ｋｂの断片を示し、及び除去されたｒｅｃＡ遺伝子座は０．４ｋｂの断片を示した。サルモネラ・ガリナルムとして、１６のコロニー中の２つは、除去されたｒｅｃＡ遺伝子座を示し、及びｒｅｃＡＰＣＲフラグメントの配列分析によって、及び紫外線照射に対するそれらの高められた感受性によって、ｒｅｃＡ変異体であると確認された。
【００３９】
実施例２
ワクチン接種試験
９Ｒ親株及び９ＲｒｅｃＡ変異体ＣＢＳ１０８９６４のサルモネラ・エンテリティディスに対する効力を、産卵型ニワトリにおけるチャレンジ実験で試験した。事前にワクチンを接種していない１５羽のニワトリの３つの群を使用した。１つの群に９Ｒ菌株（１．３×１０７　ＣＦＵ／用量）を筋肉内にワクチン接種し、１つの群にｒｅｃＡ変異体（８．４×１０６　ＣＦＵ／用量）をワクチン接種し、及び３番目の群は対照として用いた。全てのニワトリに、１０週齢で、経口経路で（１．０×１０８　ＣＦＵ）、ナラジクス酸耐性サルモネラ・エンテリティディスＰＴ４株を用いて惹起感染させた。
【００４０】
チャレンジの２週間後、全てのニワトリを検死し、脾臓、排泄スワブ及び盲腸の内容物をチャレンジ菌株として培養した。ナラジクス酸含有ブリリアント・グリーン寒天プレート（ＢＧＡ）上への直接的接種し、及び、ナラジクス酸含有緩衝化ペプトン水中で富化し、平板培養を行った。サルモネラ・エンテリティディス分離株の同定を、鞭毛特異的抗血清を用いた凝集反応によって確認した。
【００４１】
動物
６週齢の市販の産卵ニワトリをサルモネラ非感染群から得た。
【００４２】
結果
表１に示すように、ワクチン非接種の対照と比較して、脾臓及び排泄腔のサルモネラ・エンテリティディスのコロニー形成率は、９Ｒ及び９ＲｒｅｃＡ群の両方において高度に減少した。従って、９Ｒ及び９ＲｒｅｃＡの両方に基づくワクチンの効力は十分に両立することが結論づけられる。
【００４３】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月19日(2003.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ＲｅｃＡタンパク質の産生を妨げる変異をさらに含むことを特徴とする、野生型株と比較して少なくとも５０，０００倍ＬＤ５０を減少させる第一の弱毒化変異を含む弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項２】
上記菌株が、サルモネラ・ガリナルム種又はサルモネラ・ティフィムリウム種に属することを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項３】
サルモネラ・ガリナルム９Ｒ株に属することを特徴とする、請求項２に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項４】
上記菌株が、その標本が寄託番号ＣＢＳ１０８９６４でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されているサルモネラ・ガリナルム９Ｒ−ＲｅｃＡ−株であることを特徴とする、請求項３に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項５】
サルモネラ・ティフィムリウムＳＬ３２６１株に属することを特徴とする請求項２に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項６】
さらに家禽類に対して病原性を有するウイルス又は微生物の抗原をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項７】
上記微生物又はウイルスが、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス病（ガンボロ）、ニワトリ貧血因子、トリレオウイルス、マイコプラズマ・ガリセプティカム、七面鳥鼻気管炎ウイルス、ヘモフィルス・パラガリナルム（コリーザ）、ニワトリポックスウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、アイメリア種、パスツレラ・ムルトシダ、マイコプラズマ・シノビエ、サルモネラ種、オーニソバクテリウム・リノトラキアレ及びＥ．コリからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の弱毒化したサルモネラ菌株。
【請求項８】
請求項１から７に記載の弱毒化したサルモネラ菌株及び薬学的に許容できる担体を含むことを特徴とする、サルモネラ菌感染に対抗するワクチン。
【請求項９】
請求項１から７に記載のサルモネラ菌株及び薬学的に許容できる担体の混合を含むことを特徴とする、サルモネラ菌感染に対抗するワクチンの調製方法。
【請求項１０】
ワクチンに使用するための請求項１から７に記載の弱毒化サルモネラ菌株。
【請求項１１】
サルモネラ菌感染に対抗するワクチンの製造における請求項１から７に記載の弱毒化サルモネラ菌株の使用。
【国際調査報告】
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