(57)【要約】本発明は、Brassica napus 植物から入手可能な優先的にカルス特異的なプロモーターを提供する。本発明によれば、カルス特異的プロモーターを収容するＤＮＡ断片が提供され、前記ＤＮＡ断片は、２００１年２月６日にＣＢＳ１０９２７１号及びＣＢＳ１０９２７３号の番号でカビ培養物中央管理局（バーン、オランダ）にそれぞれ寄託された、クローンｐＪＢ１１７８−２１又はクローンｐＪＢ１１７８−４３中に存在している。本発明によるＤＮＡ断片は、配列番号１又は配列番号２により表されるヌクレオチド配列、又は、それぞれ配列番号８又は配列番号９に示されるような全長配列又はその一部を含むことをさらに特徴とする。さらに、本発明は、配列番号１０及び配列番号１１にそれぞれ示されるような Arabidopsis thaliana 中の相同配列を含む。
2004534535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００１年２月６日にＣＢＳ１０９２７１号の番号でカビ培養物中央管理局（Centraal Bureau of Schimmelcultures）（バーン、オランダ）に寄託された、クローンｐＪＢ１１７８−２１のＥｃｏＲＩ断片内に存在するＤＮＡ断片であって、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に（predominantly）促進することが可能である、前記ＤＮＡ断片。
【請求項２】
２００１年２月６日にＣＢＳ１０９２７３号の番号でカビ培養物中央管理局（バーン、オランダ）に寄託された、クローンｐＪＢ１１７８−４３のＥｃｏＲＩ断片内に存在するＤＮＡ断片であって、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能である、前記ＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号１により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号２により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号８により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号９により表されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号１０により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号１１により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片。
【請求項９】
ヌクレオチド１、ヌクレオチド１５４、ヌクレオチド３１９、ヌクレオチド６３８、ヌクレオチド６６７、ヌクレオチド１４０２、ヌクレオチド１６４０、ヌクレオチド１８０２、ヌクレオチド１８８７、ヌクレオチド１９１９、ヌクレオチド１９８０、ヌクレオチド２２０３、ヌクレオチド２２５９、ヌクレオチド２４０７、ヌクレオチド２５７６、ヌクレオチド２５９８、ヌクレオチド２６７６、ヌクレオチド２８７１、ヌクレオチド２８７４、及びヌクレオチド３０９２からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり；そして、ヌクレオチド１５４、ヌクレオチド３１９、ヌクレオチド６３８、ヌクレオチド６６７、ヌクレオチド１４０２、ヌクレオチド１６４０、ヌクレオチド１８０２、ヌクレオチド１８８７、ヌクレオチド１９１９、ヌクレオチド１９８０、ヌクレオチド２２０３、ヌクレオチド２２５９、ヌクレオチド２４０７、ヌクレオチド２５７６、ヌクレオチド２５９８、ヌクレオチド２６７６、ヌクレオチド２８７１、ヌクレオチド２８７４、ヌクレオチド３０９２、及びヌクレオチド３１０８からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号８に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片。
【請求項１０】
ヌクレオチド１、ヌクレオチド１７２０、ヌクレオチド１８８９、ヌクレオチド１９０６、ヌクレオチド１９９１、ヌクレオチド２１３９、ヌクレオチド２３７５、ヌクレオチド２５２４、ヌクレオチド２５８５、及びヌクレオチド２６３４からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり；そして、ヌクレオチド１７２０、ヌクレオチド１８８９、ヌクレオチド１９０６、ヌクレオチド１９９１、ヌクレオチド２１３９、ヌクレオチド２３７５、ヌクレオチド２５２４、ヌクレオチド２５８５、ヌクレオチド２６３４、及びヌクレオチド２６５０からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号９に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片。
【請求項１１】
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片；及び、
ｂ）前記ＤＮＡの転写制御下に発現されるＤＮＡ配列であって、天然では前記ＤＮＡ断片の転写制御下にない該ＤＮＡ配列：
を転写の方向に含んでなる、キメラＤＮＡ配列。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキメラＤＮＡ配列を含んでなるレプリコン。
【請求項１３】
請求項１２に記載のレプリコンを含有する微生物。
【請求項１４】
請求項１１に記載のキメラＤＮＡ配列を含んでなる植物細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞を含んでなる植物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の植物から入手される、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、及び木部より選択される植物の部分。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片の、植物においてカルス特異的な発現を促進することが可能な相同体を同定することにおける使用。
【請求項１８】
請求項１１に記載のキメラＤＮＡ配列を使用する、植物を形質転換する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片が選択可能マーカー遺伝子の発現を推進していることを特徴とする、植物を形質転換する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記ＤＮＡ断片の断片又は相同体を使用する、ハイブリッド調節ＤＮＡ配列を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の植物プロモーター、より特別には、カルス特異的プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示の文脈において、用語「プロモーター」又は「プロモーター領域」は、通常,構造遺伝子のコード配列に対して上流（５’）にあり、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は他の因子が正確な部位から転写を始めるのに必要とする認識を提供することによってコード領域の発現を制御する、ＤＮＡの配列を意味する。
【０００３】
一般に、２つの種類のプロモーター、誘導プロモーター及び構成プロモーターが存在する。誘導プロモーターは、インデューサーに応答して１以上のＤＮＡ配列若しくは遺伝子の転写を直接的又は間接的に活性化することが可能であるプロモーターである。インデューサーの非存在下では、ＤＮＡ配列又は遺伝子は転写されない。典型的には、誘導プロモーターへ特異的に結合して転写を活性化するタンパク因子は不活性型で存在し、次いで、それがインデューサーにより直接的又は間接的に活性型へ変換される。インデューサーは、化学薬剤；環境条件により引き起こされる生理学的ストレスであり得るか、又は植物の生育における変化に応答して内因的に産生される化合物であり得る。
【０００４】
構成プロモーターは、植物の様々な部分全体で、そして植物の生育にわたって不断に、それが制御するＤＮＡ配列（遺伝子）の発現を指令する。しかしながら、本明細書で使用する用語「構成」は、ある遺伝子がすべての細胞種で同一のレベルで発現されることを必ずしも示すものではなくて、発生量においていくらかの変動がしばしば観察されるものの、この遺伝子が広範囲の細胞種において発現されることを示す。
【０００５】
植物タンパク質の発現の分野における最も早期の最も重要な発明の１つは、異種遺伝子の強力かつ構成的な発現を提供する（植物）ウイルス及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）由来プロモーターのトランスジェニック植物における使用である。これらプロモーターのいくつかは植物遺伝学の研究にごく集中的に使用されてきて、依然として、迅速、簡略、及び低リスクの発現試験で選択されるプロモーターとなっている。最も有名なのは、すでに１９８４年（ＥＰ  ０  １３１  ６２３）に実践的に有用であることが判明した、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、及びオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）のプロモーター（ＥＰ  ０  １２２  ７９１，ＥＰ  ０  １２６  ５４６，ＥＰ  ０  １４５  ３３８）のように、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡにおいて見出し得るプロモーターである。類似の特徴を有する植物由来プロモーターは、ユビキチンプロモーター（ＥＰ  ０  ３４２  ９２６）である。
【０００６】
誘導プロモーターの特定の群は、組織若しくは生育特異的なプロモーターである。これらのプロモーターは、それが制御する遺伝子の発現を、唯一又は少数の群の組織において優先的に、又は植物のある生育段階の間に優先的に推進するという特性を有する。当然ながら、生育段階特異的である組織特異的なプロモーターも存在するものである。
【０００７】
カルス組織において優先的に機能的であるプロモーターは、比較的稀である。こうしたカルス組織特異的プロモーターの貴重な応用は、選択可能マーカー遺伝子の推進にある可能性がある。植物形質転換の間、遺伝子導入（transgenics）の選択は、カルスが形成されてカルスが苗条及び／又は根組織へ分化する組織培養期の間に優先的になされる。従って、この段階で選択可能マーカーの発現が求められる。さらに、植物が成熟植物へ、そして成熟段階そのものにおいて生育しているときには、選択可能マーカーの発現はもはや何の役にも立たず、反生産的とさえみなされる場合がある。このアプローチの１例が、カルス優先性のアスパラガス（Asparagus）Ａｏｐｒ１−プロモーターを使用してｎｐｔＩＩ遺伝子の発現を推進した、Firek, S. et al. (1993, Plant Molecular Biology 22(1): 129-142) に明示されている。しかしながら、文献から利用可能なこの種の代替プロモーターの数は限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
故に、新規の植物由来カルス特異的プロモーターを提供することが本発明の目的である。
本発明によるプロモーターを含んでなるＤＮＡの断片を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００９】
本発明によるプロモーターを含んでなるトランスジェニック植物（又はその部分及び／又は種子）（前記トランスジェニック植物に由来する植物（又は植物の部分）及び種子が含まれる）を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、アブラナ（Brassica napus）植物から入手可能な優先的にカルス特異的なプロモーターを提供する。
本発明によれば、カルス特異的プロモーターを収容するＤＮＡ断片が提供され、前記ＤＮＡ断片は、２００１年２月６日にＣＢＳ１０９２７１号及びＣＢＳ１０９２７３号の番号でカビ培養物中央管理局（バーン、オランダ）にそれぞれ寄託された、クローンｐＪＢ１１７８−２１又はクローンｐＪＢ１１７８−４３中に存在している。
【００１１】
本発明によるＤＮＡ断片は、配列番号１のヌクレオチド１〜６７８又は配列番号２のヌクレオチド１〜６４４により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
本発明によるＤＮＡ断片は、配列番号８により表されるヌクレオチド配列又は配列番号９により表されるヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする。
【００１２】
本発明は、配列番号１０により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むこと；又は配列番号１１により表されるヌクレオチド配列又はその一部を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片をさらに提供する。
【００１３】
より特別には、本発明は、ヌクレオチド１、ヌクレオチド１５４、ヌクレオチド３１９、ヌクレオチド６３８、ヌクレオチド６６７、ヌクレオチド１４０２、ヌクレオチド１６４０、ヌクレオチド１８０２、ヌクレオチド１８８７、ヌクレオチド１９１９、ヌクレオチド１９８０、ヌクレオチド２２０３、ヌクレオチド２２５９、ヌクレオチド２４０７、ヌクレオチド２５７６、ヌクレオチド２５９８、ヌクレオチド２６７６、ヌクレオチド２８７１、ヌクレオチド２８７４、及びヌクレオチド３０９２からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり；そして、ヌクレオチド１５４、ヌクレオチド３１９、ヌクレオチド６３８、ヌクレオチド６６７、ヌクレオチド１４０２、ヌクレオチド１６４０、ヌクレオチド１８０２、ヌクレオチド１８８７、ヌクレオチド１９１９、ヌクレオチド１９８０、ヌクレオチド２２０３、ヌクレオチド２２５９、ヌクレオチド２４０７、ヌクレオチド２５７６、ヌクレオチド２５９８、ヌクレオチド２６７６、ヌクレオチド２８７１、ヌクレオチド２８７４、ヌクレオチド３０９２、及びヌクレオチド３１０８からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号８に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片を提供する。
【００１４】
なお別の態様において、本発明は、ヌクレオチド１、ヌクレオチド１７２０、ヌクレオチド１８８９、ヌクレオチド１９０６、ヌクレオチド１９９１、ヌクレオチド２１３９、ヌクレオチド２３７５、ヌクレオチド２５２４、ヌクレオチド２５８５、及びヌクレオチド２６３４からなる群より選択されるヌクレオチドから始まり；そして、ヌクレオチドヌクレオチド１７２０、ヌクレオチド１８８９、ヌクレオチド１９０６、ヌクレオチド１９９１、ヌクレオチド２１３９、ヌクレオチド２３７５、ヌクレオチド２５２４、ヌクレオチド２５８５、及びヌクレオチド２６３４、及びヌクレオチド２６５０からなる群より選択されるヌクレオチドで終わる、配列番号９に表されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、植物への再導入時に関連ＤＮＡ配列のカルス組織特異的な発現を優先的に促進することが可能なＤＮＡ断片を提供する。
【００１５】
本発明には、上記に記載されるような少なくとも１つのＤＮＡ断片と前記ＤＮＡ断片の転写制御下に発現される少なくとも１つのＤＮＡ配列を転写の方向に含んでなるキメラＤＮＡ配列がさらに含まれ、ここで、発現されるＤＮＡ配列は、天然では該ＤＮＡ断片の転写制御下にない。好ましくは、発現されるＤＮＡ配列は、選択マーカーをコードする。
【００１６】
本発明は、上記のキメラＤＮＡ配列を含んでなるレプリコンをさらに提供する。
本発明にまた含まれるのは、こうしたレプリコン、特にｐＪＢ１１７８−２１及びｐＪＢ１１７８−４３を含有する微生物、上記のようなキメラＤＮＡ配列をそのゲノムへ取込んだ植物細胞、並びに前記細胞から本質的になる植物である。こうした植物は、双子葉植物でも単子葉植物でもよい。また、種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、及び木部より選択される前記植物の部分も本発明の一部を形成する。
【００１７】
本発明のさらなる側面によれば、植物の形質転換におけるキメラＤＮＡ配列の使用と、本発明によるＤＮＡ断片の一部若しくは変異体の、ハイブリッド調節ＤＮＡ配列を作製するための使用が提供される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、主に、Brassica napus（アブラナ）において天然に存在するプロモーター又は調節配列に関する。これらのプロモーター又は調節配列の調節制御下にある遺伝子は、植物のカルス組織において優先的に発現されることが見出されている。
【００１９】
特に、本発明のプロモーターは、２００１年２月６日にＣＢＳ１０９２７１号及びＣＢＳ１０９２７３号の番号でカビ培養物中央管理局（バーン、オランダ）にそれぞれ寄託された、構築体ｐＪＢ１１７８−２１及びｐＪＢ１１７８−４３中のｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子を推進するプロモーターである。
【００２０】
はじめに、約６００塩基対の配列をそれぞれの系（一本鎖）（ｐＪＢ１１７８−２１では配列番号１のヌクレオチド１〜６７８、そしてｐＪＢ１１７８−４３では配列番号２のヌクレオチド１〜６４４）について決定し、ＢＬＡＳＴＮ検索により解析した。これにより、１１７８−２１系から単離した配列について、Arabidopsis（シロイヌナズナ）クローン、ＢＡＣＴ２２Ｃ５（２e-24）及び Brassica napus ｃＤＮＡクローン、ｐＭＢ６８−４Ｆ（３e-19）との有意な相同性が明らかになった。このｃＤＮＡは、真菌病原体 L. maculans による感染後の Brassica napus の防御応答に関与している。相同配列の開始部分を図４に示す。１１７８−４３系から単離した配列は、Arabidopsis クローン、ＢＡＣＦ１５Ｌ１２（２e-12）と相同性を有し、これは予測されるＤＯＦ６ジンクフィンガー様タンパク質のプロモーター領域であることが示された。
【００２１】
さらに、両方の構築体においてｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子を推進するプロモーターの全配列を配列決定し（配列番号８及び９）、対応する Arabidopsis 配列（それぞれ配列番号１０及び１１）と並置した。
【００２２】
本発明のプロモーターのヌクレオチド配列は、機能性、即ちこのプロモーターの特異性に有意に影響を及ぼすことなく変異を受ける可能性があることが強調される。該プロモーターを変化させる可能性の１つは、その特異性に必要である要素を維持しながら、該プロモーターのある断片を欠失させることである。このことは、該プロモーターのいくつかの欠失突然変異体を作製し、それらを構築体においてレポーター遺伝子（例、ｇｕｓ遺伝子、又は Aequoria のＧＦＰ遺伝子のような、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）に連結させること、及び前記構築体で形質転換した植物について発現試験を引き続き実施することによって達成することができる。従って、カルス特異的な発現を優先的に推進する、構築体ｐＪＢ１１７８−２１及びｐＪＢ１１７８−４３のプロモーター配列の断片も本発明の一部である。
【００２３】
さらに、構築体ｐＪＢ１１７８−２１及びｐＪＢ１１７８−４３のプロモーター配列のヌクレオチドの置換又は付加によるヌクレオチド配列中のわずかな変化により生じるプロモーター配列も本発明に含まれる。他の植物の種にも、本発明の配列と同じ機能性を有する相同配列を見出すことが可能であると想定される。
【００２４】
相同性又は同一性の度合いを決定する目的で核酸配列を比較するときには、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰ（いずれもウィスコンシン遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）のソフトウェア・パッケージ）のようなプログラムが使用可能である。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適アライメントを産生する。ＧＡＰは、配列の全長に沿ってそれを並置することを可能にし、いずれかの配列に適宜スペースを挿入することによって最適アライメントを見出す。好適には、本発明の文脈において核酸配列の相同性について論じる場合、この比較は、配列の全長に沿ったそのアライメントによりなされる。
【００２５】
好ましくは、実質的な相同性を有する配列は、前記配列と、好ましさの増加する順に、少なくとも５０％の配列相同性、望ましくは少なくとも７０％の配列相同性、より望ましくは、少なくとも８０％、９０％、又は少なくとも９５％の配列相同性を有する。ある事例において、配列相同性は９９％又はそれより多い場合がある。
【００２６】
望ましくは、用語「実質的な同一性」は、前記配列が、本明細書に記載の配列のいずれとも、先行技術の核酸配列より大きい度合いの同一性を有することを意味する。
用語「調節配列」又は「調節領域」及び「プロモーター」は、本明細書において交換可能的に使用される。
【００２７】
さらに本発明は、本発明のＤＮＡ断片を含んでなるキメラＤＮＡ配列を提供する。本明細書において使用されるキメラＤＮＡ配列という表現には、天然には見出されないＤＮＡ配列を含んでなるどのＤＮＡ配列も含まれる。例えば、本明細書において使用されるキメラＤＮＡには、植物ゲノムが通常は調節配列のコピーをその天然の染色体位置において含有するという事実にもかかわらず、前記植物ゲノムの非天然位置において誘導可能である前記調節配列を含んでなるＤＮＡが含まれる。同様に、前記調節領域は、天然には見出されない植物ゲノムの部分の中へ、又は細菌プラスミド若しくはウイルスベクターのような、天然には見出されないレプリコン又はウイルス中に取込むことが可能である。本明細書において使用される用語「キメラＤＮＡ」は、宿主において複製可能であるＤＮＡ分子に限定されず、例えば特定のアダプター配列によって本発明による調節配列へ物理的に連結したレプリコンの中へ連結されることが可能なＤＮＡも含まれる。調節配列は、その天然の下流オープンリーディングフレームへ連結してもしなくてもよい。
【００２８】
その発現が本発明の調節領域により推進される遺伝子のオープンリーディングフレームは、ゲノムライブラリーから導くことが可能である。この状況において、それは、本明細書によるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを構成するエクソンを分離する１つ以上のイントロンを含有してもよい。オープンリーディングフレームはまた、１つの中断されないエクソンによるか、又はｃＤＮＡにより、本発明によるタンパク質をコードするｍＲＮＡへコードされてもよい。本発明によるキメラＤＮＡ配列はまた、１つ以上のイントロンが人工的に除去又は付加されたものを含む。これら変異体のそれぞれが本発明に含まれる。
【００２９】
本発明のプロモーターは、選択マーカーの発現を推進するのに特に有用である。形質転換実験における選択は主に組織培養の間になされるので、カルス組織における発現を優先的に示す本発明のプロモーターの発現特性は、特に適している。さらに、カルス組織におけるこの特異的な発現だけでなく、他の組織におけるより強くない発現も、選択マーカーを発現させるときに貴重である。なぜなら、形質転換体の選択に関与しない段階及び／又は組織におけるマーカーの発現も望ましいからである。
【００３０】
宿主細胞において発現されることが可能であるためには、本発明による調節領域は、通常、転写開始領域（選択される宿主細胞において発現されることが可能などんな遺伝子からも好適に導いてもよい）、並びにリボソームの認識及び付着のための翻訳開始領域を伴って提供される。真核細胞において、発現カセットは、通常、前記オープンリーディングフレームの下流に位置し、転写を終結させ、一次転写物のポリアデニル化を起こさせる、転写終結領域も含む。また、よくあるように、遺伝子発現産物の亜細胞性コンパートメントへの標的化の原因となるシグナル配列をコードしてもよい。選択される宿主細胞においてキメラＤＮＡ構築体の発現を支配する原理は、一般に当業者に理解されている。さらに、発現可能なＤＮＡ構築体の構築は、原核性であれ真核性であれ、どの種類の宿主細胞でも今や定型的である。
【００３１】
キメラＤＮＡ配列が宿主細胞において維持されるためには、それは通常、選択された宿主細胞により認識されて複製される、ＤＮＡへ連結した（本発明による）前記キメラＤＮＡ配列を含んでなるレプリコンの形態で提供される。従って、このレプリコンの選択は、選択される宿主細胞により主に決定される。特別に選択された宿主に適したレプリコンの選択を支配するような原理は、当業者の技術領域内にある。
【００３２】
特定の種類のレプリコンは、それ自身、又はその一部を、植物細胞のような別の宿主細胞へ転移し、それによりその植物細胞へオープンリーディングフレームを同時転移することが可能なものである。そのような能力を有するレプリコンを本明細書ではベクターと呼ぶ。そのようなベクターの例はＴｉプラスミドベクターであり、これは、Agrobacterium tumefaciens（アグロバクテリウム＝ツメファシエンス）のような好適な宿主中に存在する場合、それ自身の一部、いわゆるＴ−領域を植物細胞へ転移することが可能である。今日、様々な種類のＴｉプラスミドベクター（ＥＰ  ０  １１６  ７１８  Ｂ１を参照のこと）がキメラＤＮＡ配列を植物細胞又はプロトプラストへ転移するのに定型的に使用されていて、それから、前記キメラＤＮＡをそのゲノムに安定的に取込む新規の植物を産生することが可能である。特に好ましいＴｉプラスミドベクターの形態は、（ＥＰ  ０  １２０  ５１６  Ｂ１及びＵＳ４，９４０，８３８）に特許請求されるような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明によるＤＮＡを植物宿主の中へ導入するために使用可能である他の好適なベクターは、ウイルスベクター、例えば二本鎖の植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）及び一本鎖ウイルス、ジェミニ（gemini）ウイルス、等から誘導可能なような非組込み植物ウイルスベクターから選択してもよい。そのようなベクターの使用は、植物宿主を安定的に形質転換することを困難である場合に特に有利であるかもしれない。木本の種、特に低木及びつる植物の場合がそうであるかもしれない。
【００３３】
表現「本発明によるキメラＤＮＡ配列をそのゲノムに取込む宿主細胞」には、前記キメラＤＮＡをそのゲノム中へ安定的に取込み、それによりキメラＤＮＡを維持し、好ましくはそのようなキメラＤＮＡのコピーを有糸分裂又は減数分裂を介して子孫細胞へ伝播するような細胞を含んでなるか又は本質的にそれからなる細胞及び多細胞生物が含まれる。本発明の好ましい態様によれば、前記キメラＤＮＡの１つ以上のコピーをそのゲノム中へ取込む細胞から本質的になり、そして単数又は複数のコピーをその子孫へ好ましくはメンデル形式で伝播することが可能である植物が提供される。その植物の細胞のいくつか又は全部における本発明のキメラＤＮＡの転写及び翻訳により、前記調節領域を含む細胞は、創傷に対して応答し、この調節領域の制御下にあるオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質を産生する。本発明の特定の態様において、このタンパク質は、病原体感染症への耐性を与えることが可能な抗病原性タンパク質であろう。
【００３４】
当業者によく知られているように、植物遺伝子の調節配列は、遺伝子発現に関して興味深い特性を有する別個のサブ領域からなる。そのようなサブ領域の例には、転写のエンハンサーとサイレンサーが含まれる。これらの要素は、一般的な（構成的な）やり方でも、組織特異的な仕方でも作動してもよい。本発明による調節ＤＮＡ配列において欠失を作製することが可能であり、このサブ断片について関連ＤＮＡの発現パターンを試験することが可能である。このように入手される様々なサブ断片、又はその組み合わせさえも、異種ＤＮＡの植物中の発現に関わる方法又は応用において有用であるかもしれない。本発明によるＤＮＡ配列の、機能性サブ領域、特にカルス組織特異的な発現を与えるサブ領域を同定するための使用と、植物における遺伝子発現を促進又は抑制するためのその後続の使用も本発明に含まれる。
【００３５】
さらに、転写ターミネーター領域の使用は、植物細胞における転写の効率だけでなく信頼性を高めると一般に考えられている。故に、そのような領域の使用は、本発明の文脈において好ましい。
【００３６】
本発明の応用は、Brassica 及びジャガイモにおける実施例のみを含有するが、その応用は、有利にも、特定の植物種に限定されない。どんな植物種も本発明によるキメラＤＮＡ配列で形質転換可能である。
【００３７】
例えば、ある植物種は依然として遺伝形質転換へ抵抗するので、本発明の態様のいくつかは当面実施し得ないかもしれないが、そのような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題なのであって、原理の問題なのではない。なぜなら、そのような遺伝形質転換に従うかどうかは本発明の根底となる態様に無関係だからである。
【００３８】
植物種の形質転換は、今日、双子葉類並びに単子葉類の両方を含む、目覚しい数の植物種について定型的である。原則として、どの形質転換法を使用しても、本発明によるキメラＤＮＡを好適な先祖細胞へ、その細胞が全植物へ再生されることが可能である限りは、導入することが可能である。好適には、方法は、プロトプラストについてのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Krens, F. A. et al., Nature 296, 72-74, 1982; Negrutiu I. et al., Plant Mol. Biol. 8, 363-373, 1987）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Shillito R. D. et al., Bio/Technol. 3, 1099-1102, 1985）、植物材料へのマイクロインジェクション（Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986）、様々な植物材料のＤＮＡ（又はＲＮＡ被覆）粒子射撃（Klein T. M. et al., Nature 327, 70, 1987）、（非組込み）ウイルスでの感染、等から選択してもよい。本発明による好ましい方法は、アグロバクテリウム仲介性ＤＮＡ転移を含む。特に好ましいのは、ＥＰ  Ａ  １２０  ５１６及び米国特許第４，９４０，８３８号に開示されるようないわゆるバイナリーベクター技術の使用である。さらに好ましい形質転換の方法は、Clough 及び Bent (1998) Plant J. 16: 735-743 により本質的に記載されるような、花浸漬（floral dip）法である。
【００３９】
トマトの形質転換は、好ましくは、Van Roekel et al. (Plant Cell Rep. 12, 644-647, 1993) により本質的に記載される通りである。ジャガイモの形質転換は、好ましくは、Hoekema et al. (Hoekema, A. et al., Bio/Technology 7, 273-278, 1989) により本質的に記載される通りである。
【００４０】
一般には、形質転換の後で、本発明によるタンパク質をコードする核酸配列と同時転移される、植物発現可能遺伝子によりコードされる１つ以上のマーカーの存在について植物細胞又は細胞群を選択し、その後で、形質転換された材料を全体植物へ再生させる。
【００４１】
遺伝形質転換に対してややより抵抗性であるとみなされるものの、単子葉植物は形質転換に従い、形質転換された細胞若しくは胚、又は他の植物材料から、繁殖力のあるトランスジェニック植物を再生することが可能である。今のところ、単子葉植物の形質転換に好ましい方法は、胚、外植片又は懸濁細胞の微小発射体射撃、及び直接のＤＮＡ取込み又はエレクトロポレーションである（Shimamoto et al., Nature 338, 274-276, 1989）。トランスジェニックトウモロコシ植物は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤のホスフィノトリシンを不活性化する酵素）をコードする、Streptomyces hygroscopius のｂａｒ遺伝子を、微小発射体射撃によりトウモロコシ懸濁培養物の胚性細胞中へ導入することによって入手された（Gordon-Kamm, Plant Cell, 2, 603-618, 1990）。小麦及び大麦のような他の単子葉作物のアリューロンプロトプラスト中への遺伝物質の導入が報告されている（Lee, Plant Mol. Biol. 13, 21-30, 1989）。加齢した密集性かつ結節性胚性カルス組織だけを胚性懸濁培養物の確立のために選択することによって、胚性懸濁培養から小麦植物が再生された（Vasil, Bio/Technol. 8, 429-434, 1990）。上記作物についての形質転換系と組み合わせることにより、本発明を単子葉植物へ適用することが可能になる。
【００４２】
イネやトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物も、アグロバクテリウム系によるＤＮＡ転移に従う（ＷＯ９４／００９７７；ＥＰ  ０  １５９  ４１８  Ｂ１；Gould J. et al., Plant. Physiol. 95, 426-434, 1991 を参照のこと）。
【００４３】
ＤＮＡ転移と再生に続き、例えば本発明によるキメラＤＮＡの存在、コピー数、及び／又はゲノム組織をモニターするためにサザン分析を使用して、推定的に形質転換された植物を評価してもよい。追加的に、又は代替的に、当業者によく知られた技術であるノーザン及び／又はウェスタン分析を使用して、新規に導入されたＤＮＡの発現レベルを保証してもよい。
【００４４】
こうした評価に続き、形質転換植物を直ちに成長させてもよいが、通常は、新たな変異系の品種改良や雑種等の創製における親系としてそれらは使用可能である。
１つ以上のキメラ遺伝子を構成的に発現することが可能なトランスジェニック植物を得るために、以下を含むいくつかの代替法が利用可能である：
Ａ．選択可能マーカー遺伝子へ物理的に共役したいくつかの修飾遺伝子とともに、ＤＮＡ、例えばＴ−ＤＮＡをバイナリープラスミドで使用すること。この方法の利点は、キメラ遺伝子が物理的に共役しているので、単一メンデル遺伝子座として移動することである。
【００４５】
Ｂ．好ましくは選択可能マーカー遺伝子へ共役した１つ以上のキメラ遺伝子を発現することがすでに可能なトランスジェニック植物のそれぞれを、別の選択可能マーカーへ共役した１つ以上のキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物由来の花粉と交差授粉させること。この交雑により得られる種子は、２つの選択可能マーカーの存在に基づいてか、又はキメラ遺伝子それ自身の存在に基づいて選択可能である。次いで、選択された種子から得られる植物は、さらなる交雑のために使用可能である。原則として、キメラ遺伝子は単一遺伝子座にはないので、この遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【００４６】
Ｃ．いくつかの複数のキメラＤＮＡ分子、例えば、１つ以上のキメラ遺伝子と選択可能マーカーをそれぞれ有するプラスミドの使用。同時形質転換の頻度が高ければ、ただ１つのマーカーに基づいた選択で十分である。他の場合には、１つより多いマーカーに基づいた選択が好ましい。
【００４７】
Ｄ．第一、第二、等のキメラ遺伝子をすでに含有するトランスジェニックプラスミドを、場合により選択可能マーカー遺伝子を含んでなる新規キメラ遺伝子で連続的に形質転換すること。方法Ｂと同じように、キメラ遺伝子は、原則として、単一遺伝子座にはなく、故にキメラ遺伝子は、独立した遺伝子座として分離する場合がある。
【００４８】
Ｅ．上記戦略の組み合わせ。
実際の戦略は、親系の目的（直ちに成長させること、品種改良プログラムにおける使用、雑種を産生するための使用）のような、いくつかの容易に決定される考察に依存する場合がある。実際の戦略は、記載の発明に関して決定的ではない。
【実施例】
【００４９】
概論
植物材料
記載するすべての形質転換実験は、Brassica napus 変種「Westar」の胚軸切片を用いて実施した。組織培養条件は、本質的に、Bade 及び Damn（１９９５年、「植物への遺伝子導入」；Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、３２−３８頁）に記載される通りとした。種子の産生又は染色体ＤＮＡ単離のために、トランスジェニック植物を温室の鉢（直径１５ｃｍ）において以下の条件で成長させた：２１〜２４℃，６０〜８０％の湿度、及び１６時間の明期。
【００５０】
形質転換実験に使用したジャガイモ材料は、Solanum tuberosum 変種「Desiree」由来の in vitro 茎外植片であった。
菌株
大腸菌（Escherichia coli）株のＤＨ５α（クローンテク）及びＤＨ１０Ｂ（クローンテク）を菌クローニングに使用した。プラスミドの種類により、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、又はスペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ培地において、３７℃で菌株を増殖させた。非腫瘍原性ノパリンＴｉ−ヘルパープラスミドをＣ５８染色体バックグラウンド中に収容する Agrobacterium tumefaciens 株のＭＯＧ３０１（Hood et al., 1993, Transgenic Research 2: 208-218）を、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）及びリファンピシン（２０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬＢ培地において２９℃で増殖させた。
【００５１】
プラスミド構築
構築体ｐＭＯＧ２２は、Goddijn et al. (1993, Plant Journal 4(5): 863-873) により記載された。ベクターｐＭＯＧ４４８を２つの工程で作製した。第一の工程において、ｐ３５ＳＧＵＳ．ＩＮＴ（Vancanneyt et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 245-250）のＨｉｎｄＩＩＩ  ３５Ｓ−ｇｕｓイントロン断片をｐＭＯＧ２２中へクローニングした。次いで、ｐＧＨ１（Haughn et al., 1988, Molecular and General Genetics 211: 266-271）の５．８ｋｂ  ＸｂａＩ断片を、ｈｐｔ及びｇｕｓ−イントロン部分の間にクローニングした。この特別な断片は突然変異体の Arabidopsis（シロイヌナズナ）アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ｃｓｒ−１）を含有し、これが除草剤クロルスルフロンへの耐性を与える。突然変異体ａｌｓ遺伝子のコード領域には、それ自身の５’（２．５ｋｂ）及び３’（１．３ｋｂ）調節配列が依然として付随する。
【００５２】
タグ付け（tagging）構築体ｐＭＯＧ１１７８と対照のｐＭＯＧ９６４は、プラスミドレスキュー特性を含有する（Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471）が、Brassica napus 形質転換プロトコールにおける適用では特にいくつかの修飾を作製した。アグロバクテリウムを制御するための抗生物質としてのカルベニシリンの定型的な使用により、ａｍｐ遺伝子の機能性を壊して、その代わりにスペクチノマイシン耐性遺伝子を加えることを決定した。この構築体を以下のように作製した。
【００５３】
ｐＵＣ９（Vieira 及び Messing, 1982, Gene 19: 259-268）中のＥｃｏＲＩ部位を、オリゴＬＳ２１６（５’ＡＡＴＴＡＧＡＴＣＴ３’）（配列番号３）から作製したアダプターを挿入することによって修飾した。次いで、このＢｇｌＩＩ部位を、プラスミドＣｅｌ３６９（未公表、ライデン大学）から単離した細菌のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有する３ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片の挿入に使用した。ａｍｐ耐性遺伝子を、ＡｖａＩＩを用いた部分消化により壊した。スペクチノマイシンへの耐性とカルベニシリンへの感受性で陽性クローンを選択した。
【００５４】
ｐ３５Ｓ−ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ−ｔｎｏｓ融合遺伝子（Datla et al., 1991, Gene 101: 239-246）を、ｐＢＩ４２６（Charest et al., 1993, Plant Cell Reports 12: 189-193）からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片として単離し、我々のスペクチノマイシンベクターへ導入し、これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この中間ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて線状にし、バイナリーベクターｐＭＯＧ２２中にクローニングし、ｐＭＯＧ９６４と命名した。
【００５５】
上記中間ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位を、プライマーのＳＶ５（５’−ＡＧＣＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧ−３’）（配列番号４）及びＳＶ６（５’−ＡＧＣＴＣＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧ−３’）（配列番号５）から作製したアダプターを使用してＥｃｏＲＩへ変化させた。生じたベクターをＢｓｔＢＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、同様に消化したタグ付けベクターｐＭＯＧ５５３（Goddijn et al., 1993; ＥＭＢＬデータベース、寄託番号Ｘ８４１０５）へ連結した。このようにして、ｐＭＯＧ５５３中の１０３８塩基対のストレッチを、右境界配置（ｇｕｓ−イントロン及びオクトピン境界）を改変することなく、約８ｋｂの新規配列に置き換えた。この新規ベクターｐＭＯＧ１１７８は、大腸菌において、所望される配向では不安定に見えた。そこで、最終のクローニング工程は、アグロバクテリウムにおいて実施した。
【００５６】
トランスジェニック系の１１７８−２１、２９、及び４３から、プラスミドレスキュー（以下参照）により構築体ｐＪＢ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９、及びｐＪＢ１１７８−４３をそれぞれ入手した。これらのマルチコピープラスミドを線状にし（ＥｃｏＲＩ）、ｐＭＯＧ２２中の断片としてクローニングし、バイナリーベクターのｐＪＢｂｉｎ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９、及びｐＪＢｂｉｎ１１７８−４３をそれぞれ生じた。エレクトロポレーション（プロトコール、ギブコＢＲＬ）を使用して、バイナリーベクターをアグロバクテリウム株のＭＯＧ３０１に導入した。
【００５７】
植物形質転換
Bade 及び Damn（１９９５年、「植物への遺伝子導入」；Potrykus, I.; Spangenberg, G. 監修、Springer Verlag: ベルリン中、３２−３８頁）により記載される方法に従って、胚軸切片を形質転換した。以下のようにわずかな変更を含めた。カルス誘導培地（ＣＩＭ）からキネチンを割愛し、再生培地（ＳＩＭ）へＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を加えた。選択剤としてのカナマイシンの濃度は１５ｍｇ／Ｌであった。再生培地のスクロースレベルを１０ｇ／Ｌまで下げ、野生型とトランスジェニックカルスとの可視コントラストを高めた。苗条の伸長は非選択培地（ＳＥＭ）で行った。産生された植物のトランスジェニック性は、ヒグロマイシン（５ｍｇ／Ｌ）含有培地（ＳＥＭ）に根付かせることによって確かめた。
【００５８】
ジャガイモの in vitro 茎外植片を、アグロバクテリウム接種の１日前に単離した。液体カルス誘導培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン群、スクロース  ３０ｇ／ｌ、ゼアチンリボシド  ０．５ｍｇ／ｌ、及び２，４−Ｄ  １．０ｍｇ／ｌ）中でそれらを培養した。アグロバクテリウム接種（ＯＤ６００  ０．２，２０分）の後で、固化したカルス誘導培地（寒天  ８ｇ／ｌ）で外植片を２日間共培養し、引き続き、再生培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン群、スクロース  ３０ｇ／ｌ、セフォタキシム  ２００ｍｇ／ｌ、バンコマイシン  １００ｍｇ／ｌ、及びゼアチンリボシド  ３．０ｍｇ／ｌ）へ移した。形質転換から約１週後、ヒグロマイシン（１０ｍｇ／ｌ）又はカナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を補充した新鮮な再生培地へ外植片を移した。この培地は、２週ごとに補給した。８週後に苗条を採取し、選択根付け培地（１／２濃度のＭＳ塩、１／２濃度のＢ５ビタミン群、スクロース  １０ｇ／ｌ、ＩＢＡ  ０．１ｍｇ／ｌ、及びヒグロマイシン  ５ｍｇ／ｌ）に置いた。
【００５９】
ｇｕｓ組織化学アッセイ
Jefferson et al. (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5: 387-405) により記載されるような組織化学分析を使用して、トランスジェニック系の異なる植物部分のＧＵＳ活性を検討した。in vitro 及び in vivo 植物のサンプルを、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸−シクロヘキシルアンモニウム塩（０．５ｍｇ／ｌ）；Ｎａ−Ｐ−緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７）；Ｎａ２−ＥＤＴＡ（５ｍＭ  ｐＨ８．０）；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．０５％  ｖ／ｖ）；フェロシアン化カリウム（０．５ｍＭ）；フェリシアン化カリウム（０．５ｍＭ）を含有する溶液において５分間真空濾過した。サンプルを３７℃で３時間インキュベートし、引き続き、エタノール（７０％）で洗浄することによって葉緑素を取り除いた。青い染色の強度に基づいて、ＧＵＳ活性の分類（０〜５＝なし〜非常に高い）を行った。
【００６０】
カルス誘導アッセイ
in vitro 植物の小葉ディスク（５＊５ｍｍ）を、２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｌ）を補充した再生培地（ＳＩＭ）上に、軸側を上にして置いた。培地中のスクロースレベルは１０ｇ／Ｌに保った。３週間の培養の後で、切断先端に新たな緑のカルスが生じ、完全な外植片をＧＵＳ活性について組織化学的に染色した。
【００６１】
オーキシン誘導アッセイ
in vitro 植物の節切片を、ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を補充するか又は補充しないホルモンフリー培地（ＳＥＭ）で二次培養した。３週間の後で新たな葉と根が生じた。この時点で、完全な植物をＧＵＳ活性について組織化学的に染色した。
【００６２】
ＰＣＲ分析
Thompson 及び Henry (1995) により記載されるようなＤＮＡサンプル調製法を使用するＰＣＲにより、トランスジェニック植物を分析した。in vitro 成長させた苗木から小葉切片（±２ｍｍ２）を取り、ミクロ遠心分離管（１．５ｍＬ）に密封し、液体窒素中で凍結させた。２０マイクロリットルの抽出緩衝液（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ９．５；１Ｍ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、サンプルを９５℃で１０分間加熱した。氷上で冷やした後で、サンプルは直に使用するか、又は使用まで４℃で保存した。ＰＣＲプライマーは：５’−ＧＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧ−３’（３５Ｓ−Ｐ４）（配列番号６）及び５’−ＣＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’（ＳＱ−ＧＵＳ−１９２）（配列番号７）であった。プライマーアニーリング部位を図１に示す。５’９５℃，５’５５℃，５’７２℃の１回のＰＣＲサイクルの後に、１’９５℃，１’５５℃，１’７２℃の３０サイクルを続けた。最終サイクルは、１’９５℃，１’５５℃，１０’７２℃で行った。反応量は５０μｌであり、１μｌのＤＮＡサンプル、Ｔａｑ緩衝液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２*２５ピコモルのプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、及び２．５ユニットの白金Ｔａｑポリメラーゼを含有した。アガロースゲルでの電気泳動を使用してＰＣＲサンプルを分析した。
【００６３】
プラスミドレスキュー
個別トランスジェニック系の約５μｇのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを２５μｌのＨ2Ｏに溶かした。５μｌのＴ４リガーゼ（ギブコＢＲＬ）、６０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液、及び２１０μｌのＨ2Ｏを加え、この混合物を１４℃で２０時間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出法（Sambrook et al. 1989,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular cloning: A laboratory manual）」第２版；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を使用して連結ＤＮＡを１回洗浄し、その後で１０μｌのＴＥに溶かした。この溶液の１μｌを、Ｃｅｌｌポレーター（porator）システム（ギブコＢＲＬ）を使用する１つのサンプルのＤＨ１０Ｂエレクトロマックス（electromax）（ギブコＢＲＬ）コンピテント細胞のエレクトロポレーションに使用した。製造業者により提案されるような設定を使用した。ＳＯＣ培地での１時間の回復の後で、細胞をスピンダウンさせ、１００μｌ  ＬＢに溶かし、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢプレートでプレート培養した。３７℃で２４〜４８時間のインキュベーションの後で、コロニーが見えるようになった。プレート上と液体ＬＢ（スペクチノマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ）中での個別コロニーの二次培養を使用して、レスキューしたクローンの真の耐性を確認した。
【００６４】
配列決定
ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子から植物ゲノムへの遷移ゾーンを、ＡＢＩ配列決定キット（Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ）と単一プライマーとしての５’−ＣＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＣ−３’（ＳＱ−ＧＵＳ−１９２）（配列番号７）を使用して配列決定した。レスキューされたプラスミド若しくはバイナリーベクターを鋳型ＤＮＡとして使用した。製造業者により提案される条件を適用した。約５００〜６００ｂｐの配列を決定した。ＢＬＡＳＴＮコンピュータ検索を使用して配列データを解析した。
【００６５】
実施例１  タグ付け構築体を用いた Brassica の形質転換
Brassica napus の胚軸外植片をタグ付け構築体ｐＭＯＧ１１７８（図１）で形質転換し、耐性細胞クラスターと非トランスジェニック組織とを区別する最低濃度である１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する培地に置いた。形質転換実験においては、この外植片の部分をヒグロマイシン含有培地に置いて、３５Ｓ−ｈｐｔカセットの発現について選択した。ヒグロマイシン耐性カルスが得られる頻度を、特定の実験におけるＴ−ＤＮＡ組込みの効力の尺度として使用した。構築体ｐＭＯＧ４４８（図１）を、カナマイシン選択の陰性対照として使用した。同一の構築体と構築体ｐＭＯＧ９６４（図１）を、ヒグロマイシン選択の陽性対照として使用した。後者の構築体はまた、カナマイシン選択の陽性対照としても使用した。
【００６６】
一連の１５回の形質転換実験から、３回の典型的なタグ付け実験の結果を表１に示す。ｐＭＯＧ１１７８を用いた形質転換の後でヒグロマイシン耐性カルスが生じる頻度（耐性カルスの数／外植片＊１００％）は、５５〜９９パーセントに及んだ。陽性対照のｐＭＯＧ４４８及びｐＭＯＧ９６４のカルス頻度は、３７〜６６％に及んだ。カナマイシン選択の後で、陰性対照のｐＭＯＧ４４８のカルス頻度は０であった。陽性対照ｐＭＯＧ９６４で得られる頻度は８１〜１１９％であった。タグ付け構築体ｐＭＯＧ１１７８で形質転換した外植片では、低いがかなりの数（１．４〜３．５％）のカナマイシン耐性カルスが産生された。
【００６７】
相対タグ付け頻度は、あるタグ付け実験内でのカナマイシン及びヒグロマイシン耐性カルス形成間の比率である。この数は、カルス組織において活性であるゲノムプロモーター配列の後方に組込まれたＴ−ＤＮＡインサートの画分（fraction）を表す。相対タグ付け頻度は、異なる実験の間で２．６〜３．８％に及んだ。
【００６８】
【表１】
2004534535.tif 000003
【００６９】
すべてのタグ付け実験から８７のカナマイシン耐性カルスを得た。全部で３６のカルスが上首尾に再生した。このカルス再生頻度（４１％）は、通常得られる範囲内にある。苗条原基を単離し、カナマイシンのない培地で二次培養した。この非選択工程を使用して、分化の後でｎｐｔＩＩの発現が制限されているか又は皆無であるタグ系を生育させた。３６の再生植物のうち２０が、ヒグロマイシン（５ｍｇ／ｌ）含有培地で正常な根形成を示したが、このことは、３５Ｓ−ｈｐｔカセットの根における発現を示した。この観察により、プロモーターのないｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタグ付け構築体がカナマイシン選択を介して上首尾に導入されることが確かめられた。ヒグロマイシン感受系は以降の分析から除外した。
【００７０】
実施例２  分化した植物組織におけるＧＵＳ活性
３５Ｓ−ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ構築体（ｐＭＯＧ９６４）を含有するカナマイシン耐性の対照植物は、高レベルの構成的ＧＵＳ活性を示した（データ示さず）。従って、このトランスジェニックｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタグ系は、タグ付き（tagged）ゲノムプロモーターがある植物組織においてまだ活性であるときにＧＵＳ染色を示すと予測された。in vitro と温室で成長させた植物の葉、茎、及び根の組織を組織化学的にアッセイした（表２）。２０系のうち１５が、温室又は in vitro のいずれかの植物の１以上の部分において検出可能レベルの発現を示した。この青い染色は、通常非常に弱く、葉及び茎の葉脈組織にしばしば限定された。一般に、温室条件下での発現は in vitro 条件に比べて低かった。
【００７１】
４つの系（１１７８−１、２６、２９、及び４５）が葉、茎、及び根に中位〜高いレベルのＧＵＳ活性を示した。１つの系（１１７８−２６）だけが土壌へ移した後でも高い構成的な発現パターンを示した。一部の苗条（１１７８−２及び３０）又は根の分裂組織（１１７８−２１、２９、３３、４３、及び４５）において亢進された発現が観察された。
【００７２】
再誘導カルスにおけるＧＵＳ活性
対照として、一組の分析を行って、再誘導カルスにおけるＧＵＳ酵素活性を検討した。元のプロモーターのないｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ挿入がカナマイシン耐性カルスをもたらしたので、この相においてほとんどの系があるレベルのＧＵＳ活性を示すと予測された。２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｌ）を補充した苗条誘導培地にすべての系の葉ディスクを置くと、この外植片の先端に緑色の非再生性カルスの形成が生じた。２０系のうち１８が、この２，４−Ｄ含有培地での１４日間の培養の後で、検出可能レベルのＧＵＳ活性を示した。発現は、外植片の先端に新たに生じたカルス組織に主に局在化していた（図２ａ＋ｂ）。１２の系（１１７８−２、５、１０、１１、１８、２１、２２、３０、３７、４０、４３、及び４５）で、外植片の残り部分に比べて、カルスにおいて相対的にアップレギュレートされた発現を見出した。検討した他の植物組織においては、検出可能な酵素レベルを見出さなかった（以下参照）。
【００７３】
タグ系のＴ１胚軸切片を再生培地に置いたときも、カルスにおいてアップレギュレートされた発現を観察した（図２ｃ＋ｄ）。
【００７４】
【表２】
2004534535.tif 000004
【００７５】
オーキシン処置によりアップレギュレートされるＧＵＳ活性
Ｔ−ＤＮＡ組込みは活発に転写されるゲノムの領域で起こると考えられ（Koncz et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 8467-8471）、今回の場合では、プロモーターのないｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタグ付け構築体の組込みがオーキシン含有培地での培養（２，４−Ｄとの共培養とＮＡＡでの選択）の間に起きたので、我々は、タグ付きプロモーターのオーキシンによるアップレギュレーションをチェックすることを望んだ。それぞれの系の少なくとも１つの節切片は、ＮＡＡ（０．１ｍｇ／ｌ）含有培地で増殖した。この培地で成長した苗木は、ホルモンフリー培地で成長した対照クローンと比べて、有意により多くてより太い根を生育させたが、他の点ではそれと同等であった。二次培養から４週後に組織化学ＧＵＳアッセイを実施した。６つの系（１１７８−５、１８、２１、３３、４３、及び４５）が葉においてＮＡＡ誘導ＧＵＳ活性を示した。このＧＵＳ発現データの概略を表２に提示する。２つのトランスジェニック系（１１７８−３４及び１１７８−４２）では、ＧＵＳ染色が観察されなかった。
【００７６】
実施例３  ゲノム「プロモーター」配列の単離
タグ付け構築体の上流にあるゲノム配列を実際に単離する前に、すべての系をＰＣＲによりスクリーニングし、あり得るスクランブル状態のＴ−ＤＮＡ挿入を検出した。３５Ｓ−ｇｕｓプライマーセットを使用して、２つの系（１１７８−１及び２６）が、プロモーターのないｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子の上流に、おそらくは３５Ｓ−ｈｐｔカセットに由来する、３５Ｓプロモーターの少なくとも一部を含有することを見出した。このことは、増幅した断片を配列決定することによって確認した（データ示さず）。これらの系は以降の分析から除外した。
【００７７】
残る系のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し（図１）、サザンブロッティング分析に使用した。単一のＴ−ＤＮＡ挿入を１１７８−２１、２９、及び４３の系に検出した。Ｔ−ＤＮＡの右境界断片は約１２ｋｂのサイズであったが（データ示さず）、このことはＴ−ＤＮＡとＥｃｏＲＩ制限部位との間に±３ｋｂのゲノム配列が存在することを示す。他の系の結果は、ＥｃｏＲＩ断片のサイズが非常に大きいために解釈することが困難であった。
【００７８】
プラスミドレスキュー実験にも、消化したＤＮＡを使用した。サザンブロットで観察された大きな断片サイズにもかかわらず、スペクチノマイシン耐性コロニーは容易に入手された。レスキューされたプラスミドを制限酵素解析によりチェックした。これらの解析は、プラスミドを線状化すると予測されるＥｃｏＲＩを使用して行った。ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩの二重消化を使用して、新たに単離したゲノム配列から元の９ｋｂのＴ−ＤＮＡ（ベクター）を分離した（図１）。単一コピーＴ−ＤＮＡ系（１１７８−２１、２９、及び４３）からのプラスミドレスキューは系内で同一のクローンを生じたが、他の系は２以上の異なる制限パターンを示した（データ示さず）。これらの異なる制限パターンは、異なるＴ−ＤＮＡ挿入物のレスキュー断片を表した可能性がある。酵素の組み合わせで消化したレスキュープラスミドのいくつかの例を図３に示す。単一コピー系（１１７８−２１、１１７８−２９、及び１１７８−４３）からレスキューしたプラスミドを示し、起源となるタグ系に従って命名する（ｐＪＢ１１７８−２１（＝ｐＭＯＧ２００１）、ｐＪＢ１１７８−２９（＝ｐＭＯＧ２００２）、及びｐＪＢ１１７８−４３（＝ｐＭＯＧ２００３））。
【００７９】
線状の断片（ＥｃｏＲＩ）は、±１１ｋｂ（クローン１）〜±４０ｋｂ（クローン４及び５）のサイズに及ぶ。単一コピーＴ−ＤＮＡ系（ｐＪＢ１１７８−２１、ｐＪＢ１１７８−２９、及びｐＪＢ１１７８−４３）からのプラスミドの断片サイズ（±１２ｋｂ）は、サザンブロッティングにより得られた結果（上記参照）に一致する。ある事例では（クローン７、９、及び１１）、レスキューされたプラスミドをＥｃｏＲＩ消化により線状化することが不可能であると見られた。明らかに、ＥｃｏＲＩ部位が壊れていた。二重消化を用いたレーンから、ほとんどのクローンが予測される９ｋｂベクターのバンドを示すことが見られる（図３）。例外は、上記のようなＥｃｏＲＩ部位のないクローンとｐＪＢ１１７８−４３である。他のクローンはいずれも、この９ｋｂ断片以外に、単離された植物ＤＮＡに由来する１〜３の他のバンドを含有する。
【００８０】
３つの単一コピー系（１１７８−２１、１１７８−２９、及び１１７８−４３）のそれぞれについて、ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子の上流にあるＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯＧ１１７８の元の右境界及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（図１）は、３つの系でいずれも存在していなかった（図４）。１１７８−４３系では、ＢａｍＨＩ部位（図１）ももはや存在していなかったが、このことは、ＥｃｏＲＩ*ＢａｍＨＩ消化の後で予測される９ｋｂ断片が非存在であることを説明する（上記参照）。
【００８１】
タグ付き Brassica napus プロモーター配列の解析
１１７８−２１系及び１１７８−４３系のレスキューされた Brassica napus プロモーター配列（それぞれ、配列番号７及び配列番号８）を、Arabidopsis ゲノム配列（TIGR：www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/）に対するＢＬＡＳＴ（Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402）検索に使用した。いずれの Brassica napus 配列にも、Arabidopsis ゲノムの特定部分に対する広範な相同性を見出した。タグ付け系の１１７８−２１由来の３０７８ｂｐの Brassica 配列は、Arabidopsis 第１染色体のＢＡＣ  Ｔ２２Ｃ５の領域と高い相同性を示す。この相同性は、９つのエクソンを有する予想（predicted）ＯＲＦ  Ｔ２２Ｃ５．２２（未知のタンパク質）を表す Arabidopsis ＢＡＣ  Ｔ２２Ｃ５のほぼ全域をカバーする。Brassica 配列との相同性は、予想エクソンが位置する領域で最も強いが、相同性は、より限定されているが、（予想）イントロン領域でも存在する。Brassica １１７８−２１配列に相同な Arabidopsis 配列を配列番号９として収載する。Brassica タグ付け系の１１７８−４３から単離した配列は、Arabidopsis 第５染色体のＢＡＣ  Ｆ１５Ｌ１２に位置する領域に対して高い相同性を示す。この領域では、予想ＯＲＦ  Ｆ１５Ｌ１２．８（推定タンパク質）と予想ＯＲＦ  Ｆ１５Ｌ１２．１０（ジンクフィンガー様タンパク質）との間で、単離された Brassica 配列全体の長さにわたり相同性が見出される。この領域は、Arabidopsis 第５染色体のＯＲＦ  Ｆ１５Ｌ１２．１０のプロモーター領域に類似する。Brassica napus プロモーター１１７８−４３に相同なこの Arabidopsis 配列を配列番号１０として収載する。予想Ｆ１５Ｌ１２．１０の遺伝子は、Ｄｏｆ６ジンクフィンガー様転写因子に類似したジンクフィンガー様タンパク質を表す。
【００８２】
Arabidopsis thaliana 生態型 Columbia と Brassica napus 変種 Westar の染色体領域間に見出される広範な相同性は、これらの近縁植物種間に高いレベルのゲノム共直線性があることを示す。
【００８３】
両方のプロモーター配列を、オーキシン誘導性、病原体誘導性（植物防御ホルモン応答性）、及び構成的な遺伝子発現において調節的な役割を担うことが知られているプロモーターモチーフの存在について解析した。いずれのプロモーターもカルス組織において非常に活性であり、オーキシン処置へ応答する。この証明されたプロモーター活性の近くには、これら２つのプロモーター配列により推進される遺伝子発現の調節において病原体及び創傷への応答要素が関与する部分が存在している可能性がある。なぜなら、プロモーター捕捉実験において、創傷と A. tumefaciens 感染への曝露の間にそれらが同定されたからである。両方のプロモーターにおいて同定されたプロモーター要素を図６及び７に示す。ダイズＧＨ３プロモーター（Ulmasov et al., Plant Cell 1995 Oct; 7(10): 1611-1623）のオーキシン応答性に必要とされるオーキシン応答要素（ＡｕｘＲＥｓ）のコア配列（ＴＧＴＣＴＣ）を含有する要素が見出された。これらオーキシン応答要素の存在の近くには、ＲｏｌＢ腫瘍遺伝子プロモーターに見出されるタバコＤｏｆタンパク質ＮｔＢＢＦ１結合部位に同一の配列が、いずれのプロモーターにも存在する。ＮｔＢＢＦ１は、おそらく、植物における組織特異的でオーキシン誘導性のＲｏｌＢ発現を仲介することに関わるタンパク質である（Baumann et al., Plant Cell 1999 March; 11(3):323-334）。Ｄｏｆジンクフィンガータンパク質もオーキシン誘導性であると考えられている（Kang 及び Singh, Plant J. 2000; 21: 329-339）。病原体及び／又はストレス誘導性である遺伝子中に高頻度で存在する要素も両方のプロモーター配列において同定された。植物の転写因子のＷＲＫＹファミリーのメンバーへ結合することが可能であるＷ−ボックスモチーフが両方のプロモーター配列に存在する（それぞれ、８コピーと４コピー）。高頻度のＷ−ボックス配列（ＴＴＧＡＣｎ）の存在は、病原体、エリシター（elicitor）、及びサリチル酸への応答性に関連している（Eulgem et al., Trends Plant Sci. 2000; 5(5): 199-206）。Lois et al. (EMBO J. 1989; 8(6): 1641-1648) 及び Fischer（学位論文、ホーヘンハイム大学、１９９４年）により記載されるようなＨ−ボックスコンセンサス（ＣＣＴＡｎＣ）に非常に似た配列が見出され、これらのボックスは、植物の最小プロモーターへマルチマーとして融合されると、真菌エリシター及び創傷に誘導される発現をもたらすことが知られている（Takeda et al., Plant J. 1999; 18(4): 383-393）。また、いわゆるＧ−ボックス調節モチーフ（ＣＡｍＧＴＧ，Loake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 9230-9234）と、植物ホルモンのエチレン（ethylene）（Ohme-Takagi 及び Shinshi, Plant Cell 1995 Feb; 77(2): 173-182）によりアップレギュレートされる遺伝子の５’上流領域に主に見出されるＧＣＣ−ボックス（ＡＧＣＣＧＣＣ）に類似したボックスも同定された。Ｓ−ボックスは、非常に強いエリシター応答要素であり、非常に強い誘導能を与えることが可能である（ＷＯ００／２９５９２）。両方のプロモーター融合物における転写開始部位をマップしなかったので、これらプロモーター中の推定ＴＡＴＡボックスの位置を予想することは依然として困難である。それでも、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合部位として機能する可能性が非常に高い配列が存在している。
【００８４】
実施例４  単離「プロモーター」−ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩプラスミドの評価
単一コピーＴ−ＤＮＡ系（１１７８−２１、２９、及び４３）からレスキューした３つのプラスミドをプロモーター活性のさらなる解析のために選択した。二重選択戦略を使用することによってバイナリーベクターを構築した。レスキュープラスミドの線状断片（ＥｃｏＲＩ）を、バイナリーベクターのｐＭＯＧ２２（図１）の線状断片（ＥｃｏＲＩ）と連結し、大腸菌へ形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシン耐性についてコロニーを選択したところ、連結が成功したことを示した。しかしながら、ほとんどのバイナリーコロニーは、元の９ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩベクター断片のサイズが低下したことで裏付けられるように（データ示さず）、ある欠失部分を含有するようであった。この新規バイナリーベクターのプロモーター−ｇｕｓ融合物の配列解析は、ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子のすぐ上流にゲノム配列が改変されずに存在していることを示した。
【００８５】
レスキュープラスミドあたり３〜５のバイナリーベクターを選択した。この選択は、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを使用する予測制限パターンと最も似ていることに基づいた（データ示さず）。１２のクローン（４＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１、５＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９、及び３＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）をアグロバクテリウム株のＭＯＧ３０１へ導入し、引き続き、Brassica napus へ形質転換した。形質転換はいずれもそれぞれ±１００の胚軸外植片を使用して同一２検体で行った。ｐＭＯＧ９６４及びｐＭＯＧ１１７８（図１）での形質転換は、これらの実験において対照として役立った。形質転換から５日後、構築体につき約２０の外植片を一過性ＧＵＳ活性について評価した。１２クローンのうち５つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてＧＵＳ活性を示した。形質転換から３週後、１つの１１７８−４３バイナリークローンを除くすべての形質転換体において、ヒグロマイシン耐性カルスが産生した。この時点で１２クローンのうち８つがヒグロマイシン耐性カルスにおいてＧＵＳ活性を示した（図５）。特に、タグ系１１７８−２１及び２９由来のクローンは、組織化学ＧＵＳアッセイにおいて、暗青色の染色を示した。
【００８６】
６つのバイナリーベクター（２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１、２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９、及び２＊ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）をジャガイモの形質転換にも使用した。このうち４つが形質転換の後で早期に一過性のＧＵＳ活性を示した。６つのベクターのうち５つは、成長するヒグロマイシン耐性カルスにおいて安定したＧＵＳ活性を明らかにした。選択剤としてカナマイシンを使用する形質転換実験のために構築体につき約５０のジャガイモ外植片を使用した。推定トランスジェニック苗条を採取し、ヒグロマイシン含有根付け培地にそれを置くことによってその真のトランスジェニック性を試験した。活性のある３５Ｓ−ｈｐｔカセットをゲノムに組込んだ苗条だけが正常な根系を産生するはずであった。形質転換した６つの構築体のうち５つが１以上のトランスジェニックジャガイモ系を産生した。形質転換頻度（トランスジェニック植物の数／外植片＊１００％）は、２〜１１パーセントに及んだが、これは、陽性対照の構築体ｐＭＯＧ９６４で得られるレベル（５％）と同等である。
【００８７】
初期の結果は、トランスジェニックジャガイモ系の葉サンプル中のＧＵＳ活性が０〜「相対的に高い」まで変動することを示した。トランスジェニック系の中には葉において低いＧＵＳ活性しか示さないものがあるが、このレベルは、葉外植片をカルス誘導培地に置くとアップレギュレートされる可能性があった（図５）。Brassica 及びジャガイモの形質転換結果の概略を表３に示す。
【００８８】
【表３】
2004534535.tif 000005
【００８９】
【表４】
2004534535.tif 000006
【００９０】
【表５】
2004534535.tif 000007
【００９１】
【表６】
2004534535.tif 000008
【００９２】
【表７】
2004534535.tif 000009
【００９３】
【表８】
2004534535.tif 000010
【００９４】
【表９】
2004534535.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】Brassica napus におけるプロモータータグ付けに使用する構築体中のＴ−ＤＮＡ構造の概略図。どのバイナリーベクターも、ｐＭＯＧ２２にあるように３５Ｓ−ｈｐｔ−ｎｏｓカセットを含有する（Goddijn et al., 1993）。選択制御（＋ヒグロマイシン、−カナマイシン）として、構築体ｐＭＯＧ４４８（３章）を使用した。構築体ｐＭＯＧ９６４が二重増強３５Ｓプロモーターと組み合ったｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ融合遺伝子（Datla et al., 1991）を含有するのに対し、タグ付け構築体ｐＭＯＧ１１７８は、同じコード領域のプロモーターのないバージョンを有する。ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ遺伝子は、Vancanneyt et al. (1990) により記載されるようにｇｕｓ部分にイントロンを含有する。プラスミドレスキュー特性としてスペクチノマイシン耐性とＣｏｌＥ１複製起点を含める。アグロバクテリウムのカルベニシリンへの耐性を避けるために、アンピシリン遺伝子を壊す（Δ）。サザンブロット解析とプラスミドレスキュー実験に使用する制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＢａｍＨＩ）をマップする。波線は、右境界に隣接する植物ゲノムＤＮＡを表す。ＬＢ：左境界、ＲＢ：右境界、ｐ：プロモーター、ｔ：転写終結配列、ｈｐｔ：ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ａｌｓ：アセト乳酸シンターゼ遺伝子、ｇｕｓ−１：ＧＵＳレポーター遺伝子＋イントロン、ｎｐｔＩＩ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む３ｋｂ断片、Δａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子（非機能性）、ＣｏｌＥ１：ＣｏｌＥ１複製起点。
【図２】タグ付け構築体ｐＭＯＧ１１７８を含有するトランスジェニック Brassica napus 系の植物部分におけるＧＵＳパターン。in vitro 葉切片又はＴ１胚軸外植片の上で誘導したカルスにおける高いＧＵＳ活性（Ａ＋Ｂ：１１７８−２１系；Ｃ＋Ｄ：１１７８−４３系）。
【図３】レスキューされたプラスミドの制限解析。ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩタグ付け領域の上流にあるゲノム配列の１１種の異なる断片を、プラスミドレスキューにより単離した（図１を参照のこと）。細菌培養物からＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ又はＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲルで分離した（１〜１１のセット）。１ｋｂマーカー（ギブコ−ＢＲＭ）の位置を示す。３つの単一コピー系（１１７８−２１、１１７８−２９、及び１１７８−４３）から単離したゲノム断片を、配列解析、バイナリーベクターの構築、及び野生型 Brassica napus への再形質転換に使用した。
【図４】タグ付け構築体ｐＭＯＧ１１７８と３つのトランスジェニック系（１１７８−２１、１１７８−２９、及び１１７８−４３）中のｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩコード領域の上流にあるヌクレオチド配列の比較。Ｔ−ＤＮＡ右境界、制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ）、及びｇｕｓ：：ｎｐｙＩＩの開始コドン（ＡＴＧ）に下線を施す。それぞれの系（一本鎖）について約６００塩基対の配列を決定し、ＢＬＡＳＴＮ検索により解析した。Arabidopsis の３つのＢＡＣクローンと Arabidopsis 及び B. napus のｃＤＮＡクローンとの相同性を見出した。相同配列の開始を示す（ダッシュ線）。
【図５】プロモーター活性を有する新規ゲノム配列により推進された、若いカルスのＧＵＳ活性。Brassica napus のゲノムに組込まれたｇｕｓ：：ｎｐｔタグ付け遺伝子（ｐＭＯＧ１１７８，図１）の上流の断片をプラスミドレスキューにより単離し、バイナリーベクターｐＭＯＧ２２（３５Ｓ−ｈｐｔ−ｎｏｓ，図１）中でクローニングし、Brassica napus 胚軸外植片へ再形質転換させた（表３）。ヒグロマイシン含有培地での３週間の培養後に組織化学ＸＧｌｕ染色（２４時間）を実施した。Ａ：３５Ｓ−ｇｕｓ：：ｎｐｔＩＩ対照構築体ｐＭＯＧ９６４の非常に高い発現；Ｂ：良好な発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２１）；Ｃ：良好な発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−２９）；Ｄ：適度の発現（ｐＪＢＢＩＮ１１７８−４３）。
【図６】１１７８−２１プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例７を参照のこと。
【図７】１１７８−４３プロモーターとプロモーター要素を含有する配列ボックスの略図。このボックスの説明については、実施例７を参照のこと。
【図１】
2004534535.tif 000012
【図４】
2004534535.tif 000013
【図６】
2004534535.tif 000014
【図７】
2004534535.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004534535.tif 000016
2004534535.tif 000017
2004534535.tif 000018
2004534535.tif 000019
2004534535.tif 000020
2004534535.tif 000021
2004534535.tif 000022
2004534535.tif 000023
2004534535.tif 000024
2004534535.tif 000025
2004534535.tif 000026
2004534535.tif 000027
2004534535.tif 000028
2004534535.tif 000029
2004534535.tif 000030
2004534535.tif 000031
2004534535.tif 000032
2004534535.tif 000033
2004534535.tif 000034
2004534535.tif 000035
2004534535.tif 000036
2004534535.tif 000037
2004534535.tif 000038
2004534535.tif 000039
2004534535.tif 000040
2004534535.tif 000041
2004534535.tif 000042
2004534535.tif 000043
2004534535.tif 000044
2004534535.tif 000045
2004534535.tif 000046
2004534535.tif 000047
2004534535.tif 000048
2004534535.tif 000049
2004534535.tif 000050
2004534535.tif 000051
2004534535.tif 000052
2004534535.tif 000053
2004534535.tif 000054
2004534535.tif 000055
2004534535.tif 000056
2004534535.tif 000057
2004534535.tif 000058
2004534535.tif 000059
2004534535.tif 000060
2004534535.tif 000061
2004534535.tif 000062
2004534535.tif 000063
2004534535.tif 000064
2004534535.tif 000065
2004534535.tif 000066
2004534535.tif 000067
2004534535.tif 000068
2004534535.tif 000069
2004534535.tif 000070
2004534535.tif 000071
2004534535.tif 000072
2004534535.tif 000073
2004534535.tif 000074
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534535.tif 000075
2004534535.tif 000076
【国際調査報告】
2004534535.tif 000077
2004534535.tif 000078
2004534535.tif 000079
2004534535.tif 000080
2004534535.tif 000081
2004534535.tif 000082