(57)【要約】外科手術及び血管の補綴としてヒト又は哺乳動物への体内移植に適した自己、同種又は異種起源の、生体及び組織工学処理した生合成組織及び生体組織から、体内移植材料を創成する方法が開示される。得られる材料は、インビボ石灰化を阻害し、そして、血管新生及び組織の内部への伸展を受け付けず、付加的な細胞外マトリックスタンパク質被覆なしに、内皮細胞のような移植生細胞の接着及び保持に適した、非多孔性バイオマトリックスを提供する。室温で酸性からアルカリ性に徐々に変化するｐＨで、グルタルアルデヒドの濃度を０％から５％（重量／体積）以下まで徐々に増加させることを組み込んだ方法は、材料の微小構造及び細胞の内張りを保持する。更に、強度及び耐久性と共に、柔軟性、伸展性及び血液適合性を、最終用途によって変化させることができる。グルタルアルデヒドは、組織のコラーゲン成分を架橋しつつ、徐々にそして完全に、材料に浸透する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から、移植材料を創成する方法であって、
該組織が、２０重量％乃至８０重量％の間のコラーゲンを含み；
該方法が、該組織を架橋剤で３０分乃至６時間の間処理し；該処理時間の間、該架橋剤濃度を、０％〜０．２５％（重量／体積）の初期濃度から０．５％〜５％（重量／体積）の最終濃度まで変化させ；更に、該処理時間の間、ｐＨを、１〜３の初期ｐＨから５〜８の最終ｐＨまで変化させる；
ことを包含する方法。
【請求項２】
該組織が、およそ４０重量％のコラーゲンを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該処理時間が、およそ２．５時間である請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該架橋剤濃度及び該ｐＨを、該処理時間の間、次第に増加させることを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
該初期濃度が、およそ０％である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
該最終濃度が、およそ２．５％（重量／体積）である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
該初期ｐＨが、およそ１．５である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
該最終ｐＨが、およそ７．４である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
該組織が、自己、同種又は異種の材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
該組織が、ヒト、ヒツジ、ウシ及びブタの何れかの由来である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
該組織が、組織工学処理した生体材料、代理動物における耐久性又は分解性の骨格（scaffold）について組織工学処理された材料、又は実験室で組織培養系によって組織工学処理された材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
該組織が、天然に存在する生体材料である、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
該架橋剤が、グルタルアルデヒドである、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
該材料を、循環液槽又は回転ドラム中で処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
該材料が、尿細管状であり；
該方法が、該材料を循環液体槽又は回転ドラム中で処理し、該材料を、液体が該材料の管腔を１分間当たり２００〜４００ｍｌの速度で流れるような流系に付与する；
ことを包含する、請求項１乃至１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
液体が、該材料の管腔を１分間当たりおよそ３００ｍｌの速度で流れる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該処理時間の後に、更に、該組織を架橋剤で、０．５％〜５％（重量／体積）の濃度及び５〜８のｐＨで、２０℃〜２７℃の温度で、１時間〜５日間処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
該処理時間の後に、およそ２．５％（重量／体積）の濃度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該処理時間の後に、およそ７．４のｐＨで、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
該処理時間の後に、およそ２５℃の温度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７乃至１９に記載の方法。
【請求項２１】
該更なる処理時間が、およそ４８時間である、請求項１７乃至２０に記載の方法。
【請求項２２】
該組織及び架橋剤溶液を、２０℃から２７℃の温度で保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
該組織及び架橋剤溶液を、およそ２５℃の温度で保持することを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２４】
該組織の形状を、圧縮可能な型によって処理する間保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
該材料が動き得るように、該組織が該型上に固定されていないか、又は一端のみが固定されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該組織が架橋された後、該組織を滅菌することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
該組織を、滅菌する前に、およそ２％（重量／体積）の過酸化水素で３０分乃至１．５時間の間液浸することを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該組織を、滅菌する前に、およそ２％（重量／体積）の過酸化水素中に、およそ１時間浸すことを包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該組織を、化学的に滅菌することを包含する、請求項２６乃至２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
該組織を、１５乃至３０キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項２６乃至２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
該組織を、２５キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、２乃至２４時間、５％（重量／体積）のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項３０又は３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、およそ１２時間、５％（重量／体積）のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該材料を、移植する前に、最低限３週間、５０％（体積／体積）のエタノール中に保存することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３５】
該材料を、移植する前に、少なくとも３ヶ月間、５０％（体積／体積）のエタノール中に保存することを包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１乃至３５のいずれか一つの方法によって創成される移植材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、これのみに応用するものではないが、哺乳類由来の自己、同種又は異種の材料の処理への応用における、損傷した、疾病にかかった又は欠損した組織、構造又は器官を、置換又は増強するための、微細構造を維持し、且つインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での石灰化、組織の内部への伸展及び経壁性血管形成を阻害する、移植に適した生体材料及び生合成材料を創成する方法に関する。最終用途によって決定される一つの実施態様においては、移植された生細胞は、インビボ条件下で接着及び維持することができる。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
ヒトへの移植のために、組織に強度を与え、抗原部位を中和し、或いは生合成組織及び生体組織を滅菌して組織を安定化及び固定化する目的で、例えば、グルタルアルデヒドを使用することは、既に記載されている。米国特許第４，３１９，３６３号、第４，４６６，１３９号及び第４，６８１，５８８号（Ｋｅｔｈａｒａｎａｔｈａｎ）は、強度及び耐久性を与え、抗原部位を中和し、或いは材料を滅菌するために、静的な液体環境中、一定のグルタルアルデヒド濃度かつ一定のｐＨで、生合成及び生体材料を処理することを開示している。米国特許第３，９６６，４０１号（Ｈａｎｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｏｇａｒｔｙ）は、例えば心臓の弁のような組織を、グルタルアルデヒドのようななめし液を用いて生理的範囲内で組織を加圧し、次いで天然の組織が柔軟性を保持するように圧力を解放する方法を記載している。一方、米国特許第４，７９８，６１１号（Ｆｒｅｅｍａｎ）は、異種材料を、２乃至８メガラドでガンマ線照射し、その後、グルタルアルデヒドのような架橋剤で処理することによって、滅菌し、弾性を与え、抗原性を減少する方法を開示している。
【０００３】
生体内石灰化は、体内移植されたグルタルアルデヒド処理を施した生体組織人工器官、特に心臓弁人工器官において報告されている。石灰化が原因で材料がうまくいかなくなるということはなかったものの、米国特許第４，４６６，１３９号の材料の壁において、イヌにおける血管導管として使用されたとき、生体内微小石灰化が実証された。移植前に５０％アルコールに保存することにより、石灰化の程度は減少したが完全に解消はしなかった。石灰化を減少又は解消するための努力として多くの方法が研究されている。米国特許第４，６４８，８８１号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら）は、リン酸塩欠損溶液を使用して生体組織における石灰化を阻害する方法を記載している。そして米国特許第５，９３１，９６９号（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら）は、加熱された処理溶液中で少なくとも部分的に固定化された組織を処理し、１５乃至６０日の間、溶液中の組織の運動(tissue/solution movement)を誘発することを開示している。米国特許第５，８４３，１８１号（Ｊａｆｆｅ及びＨａｎｃｏｃｋ）には、生体組織を固定化する前に、ｐＨ５乃至８の範囲の少なくとも一つのバッファ溶液に曝すことによって、実質的に無細胞にする方法が開示されている。米国特許第５，７４６，７７５号（Ｌｅｖｙ及びＨｉｒｓｃｈ）は、組織を抗石灰化剤を含有する６０乃至８０％低級脂肪族アルコール水溶液で少なくとも２０分間処理し、次いでグルタルアルデヒドで前処理を行うことによる、生体内石灰化の阻害を開示している。
【０００４】
合成材料の表面に生きた移植細胞の増殖、接着及び保持を行うことを促進するために、タンパク質表面をまねた細胞外マトリックスをもった基材の前処理の種々の方法が報告されている。例えば、少なくとも５０％の集密度である合成血管移植片表面に内皮細胞を接着するために、ヒト血漿及びフィブリンゲルで、ポリエステル移植材料を被覆することが、米国特許第４，８２０，６２６号に開示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＪａｒｒｅｌｌ）。米国特許第５，６３２，７７８号（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）は、間質性コラーゲン中の生存細胞を殺傷し、潜在的な免疫活性可溶性分子を除去し、次いで無細胞組織を細胞外物質で処理し、そして移植片材料の体内移植の前に同種又は自己の細胞を移植する方法を記載している。
【０００５】
組織内部への伸展による修復又は生体化を促進する目的で移植される合成材料や、更に最近では、内皮細胞化を促進する貫壁性血管形成のための合成材料においては、その孔サイズを適切なものとすることに、相当な注意が払われてきた。好ましくない点として、特に内径６ｍｍ以下の血管導管においては、組織内部への伸展が制御不能であるという性質があり、そのような内径の血管導管は、その後の移植片の破壊とともに、管腔の狭小、血栓及び閉塞を引き起こしていた。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から移植材料を創成する方法であって、
該組織が、２０重量％乃至８０重量％、及び好ましくは４０重量％のコラーゲンを含み、
該方法が、該組織を架橋剤で３０分乃至６時間処理し、該処理時間の間、該架橋剤濃度を、０％〜０．２５％（重量／体積）の初期濃度から、０．５％〜５％（重量／体積）の最終濃度まで変化させ、更に、該処理時間の間、ｐＨを、１〜３の初期ｐＨから５〜８の最終ｐＨまで変化させる、
ことを包含する方法を提供する。
【０００７】
本発明の方法は、好ましくは、およそ２．５時間の間、該組織を該架橋剤で処理することを包含する。
【０００８】
本発明の方法は、好ましくは、該処理時間の間、該架橋剤の濃度及び該ｐＨが次第に増加することを包含する。
【０００９】
該初期濃度は、およそ０％であることが好ましく、該最終濃度は、およそ２．５％（重量／体積）であることが好ましくい。
【００１０】
該初期ｐＨは、およそ１．５であることが好ましく、該最終ｐＨは、およそ７．４であることが好ましい。
【００１１】
組織は、例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ及びブタ由来の、自己、同種又は異種の材料であってよい。組織は、組織工学処理した生体材料、或いは、代理動物における、又は実験室での組織培養系による、耐久性又は崩壊性の骨格について組織工学処理した材料であってよい。組織は、天然に存在する生体材料、例えば、尿管、胸膜及び血管であってよい。組織は、管状、シート状又は三次元構造を含むいずれの形状でもよい。
【００１２】
架橋剤は、グルタルアルデヒドが好ましい。
【００１３】
材料は、循環液槽又は回転ドラム中で処理されることが好ましいく、循環液槽において、管状材料は、液体が各管の管腔を通して１分間当たり２００乃至４００ｍｌ、好ましくは１分間当たり３００ｍｌの速度で流れるような流体系に置かれる。本発明の方法は、好ましくは更に、該処理時間後、該組織を、０．５％から５％（好ましくは、２．５％）（重量／体積）の濃度の架橋剤（好ましくは、新鮮な架橋剤）で、且つ５から８のｐＨ（好ましくは、７．４）で、２０℃から２７℃（好ましくは、２５℃）の温度で、更に１時間から５日間（好ましくは、４８時間）処理することを包含する。
【００１４】
組織及び架橋剤溶液は、２０℃から２７℃の温度であることが好ましく、およそ２５℃の温度で保持されることがより好ましい。
【００１５】
該組織の形状は、圧縮可能な型によって処理される間保持されることが好ましく、組織は、その材料が動き得るように、該型上に固定されていないか又は一端のみが固定されていることが好ましい。
【００１６】
このようにして、組織の微細構造上の配列が組織の損傷なしに保持される。
【００１７】
本発明の方法は、好ましくは該組織が架橋された後、好ましくは該組織を化学的又はガンマ線照射のいずれかで、好ましくは１５乃至３０キログレイ（ｋｇｙｓ）、より好ましくは２５キログレイで滅菌することを包含する。
【００１８】
本発明の方法は、所望により、組織を滅菌する前に、２％（重量／体積）の過酸化水素に３０分乃至１．５時間、好ましくは１時間の間液浸することを包含する。
【００１９】
本発明の方法は、所望により、組織をガンマ線照射で滅菌する前に、２乃至２４時間、好ましくは１２時間、５％（重量／体積）のグリシンでインキュベートすることを包含する。
【００２０】
該方法は、好ましくは、該材料を体内移植する前に最底限３週間、好ましくは３ヶ月間、５０％（体積／体積）のエチルアルコール（即ち、エタノール）中に保存することを包含する。
【００２１】
かくして、このような組織の処理によって、生体内石灰化、組織内部への伸展及び経壁性血管形成を阻害する、完全な微小構造と細胞性の内層とを持つ材料を提供するとともに、移植した生細胞が接着するための微小環境を提供する、ことを見出された。加えて、プロセスを実用に応じた範囲で変更すれば、血液適合性、伸展性及び柔軟性を、所望する最終用途に合わせて変化させることができる。
【００２２】
本発明は、又、上記した方法により創成される移植材料を提供する。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、自己、同種又は異種の、組織工学処理した生合成材料及び生体材料、又は天然に存在する生体材料を、動的液体環境と共同して、グルタルアルデヒドのような架橋剤の濃度を徐々に上昇させ、且つｐＨを酸からアルカリへと徐々に変化させて処理することにより、好ましくは、処理後に５０％（体積／体積）エタノール中において少なくとも３週間貯蔵することで、組織内部への伸展や血管新生に対して非浸透性で、生体内石灰化を阻害し、且つ移植生細胞の付着及び保持に適する完全な微小構造を有する非多孔性バイオマトリックスが提供されるという、驚くべき知見に基づいている。更に、柔軟性及び弾性は、処理工程中、圧縮性の型に固定されていないか又は一端が固定されているのみである生合成材料又は生体材料へ、架橋剤を段階的に浸透させることによって制御することができる。
【００２４】
耐久性の生物学的微小構造と、組織工学処理した材料上の繊維芽細胞や哺乳類の尿管内面を覆う尿路上皮細胞といった、安定化した細胞で覆われた内面とを有する合成材料は、移植された生細胞に対する親和性や、必要な生物学的条件で細胞を保持する能力を有している。移植された生細胞は、内皮細胞の接着を促進するためにポリエステルやポリテトラフルオロエチレンの材料を被覆するのに使用される単一の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）又はＥＣＭ誘導体よりも、それぞれ一以上のタンパク質リガンドを有する多くの細胞結合部位によって、各合成材料の細胞性の内層に本来的に存在するＥＣＭタンパク質と、より強く相互作用するようである。ＥＣＭ結合部位は、バイオマトリックスがグルタルアルデヒドで架橋されてしまっても、移植された細胞によって認識され細胞接着に利用される。生合成材料の場合には、組織工学処理した生物学的な界面が生体環境に提示され、合成した構成部分は、内部骨格構造のみであり、それは、生体構造物とは接触しない。
【００２５】
当該材料の特性は、実用に応じた範囲で、処理時間、グルタルアルデヒド濃度及びｐＨのパラメーターを変更することによって、特定の用途又は特定の材料に応じた変更が可能である。例えば、実験室で創成された自己組織の場合には、グルタルアルデヒドは、最適の濃度で、組織の増殖を阻止するのに利用されるが、非自己組織においては、グルタルアルデヒドは、材料を非免疫性にする。柔軟性、弾性及び耐久性の程度は、動的プロセスの程度及び強度によって変えることができる。
【００２６】
かくして、本発明の好適な実施態様による、自己、同種又は異種の組織（例えば、外科手術用の管状、平らなシート及び三次元構造における、組織工学処理した生合成材料及び生体材料及び天然に存在する生体材料）によって体内移植材料を創成する方法においては、最初に、過剰の組織が、組織の外面から除去される。
【００２７】
次いで、組織は、型上で組織の動きが制限されないような、圧縮性の型につなぎ止められる。管状組織の場合には、組織は、固定されずに圧縮可能なマンドレルに搭載される。
【００２８】
搭載された組織は、１０から２０ｒｐｍの間で、好ましくは１２ｒｐｍで回転するドラム中に、又はおよそ２５℃の循環槽中に置かれる。循環槽中に置かれる場合は、管状組織は、例えば液体が１分当たりおよそ３００ｍｌで管腔を通過して流れるような、流系に置かれる。
【００２９】
グルタルアルデヒドの形態の架橋剤は、ドラム又は槽に加えられ、その濃度は０％から予め決められた最大２．５％（重量／体積）まで徐々に増加され、溶液のｐＨは１．５から７．４まで、２．５時間にわたって徐々に増加される。
【００３０】
グルタルアルデヒド溶液が予め決められた最終濃度及びｐＨに達すると、組織は回転ドラムから除かれ、２．５％（重量／体積）の濃度、ｐＨ７．４及び温度２５℃に保たれた、グルタルアルデヒドの新鮮溶液の回転槽に置かれる。これに代え、組織が循環槽に既にある場合は、溶液を上記のように新しくし、組織が流系に置かれている場合は、流系を除去して、溶液を上記のように置き換える。組織は循環槽におよそ４８時間保持される。組織は、次いで、２％（重量／体積）の過酸化水素に１時間浸漬される。
【００３１】
次いで、組織（又は、ここでは、移植材料）は、１％（重量／体積）グルタルアルデヒド溶液及び５０％（体積／体積）エタノール中で１８時間未満の時間で化学的に滅菌される。代わりに、１５乃至３０キログレイ、好ましくは２５キログレイのガンマ線照射により滅菌することもできる。
【００３２】
所望により、組織は、滅菌前に５％（重量／体積）のグリシンで、２乃至２４時間、好ましくは１２時間インキュベートされる。
【００３３】
最後に、組織は、５０％（体積／体積）のエタノール中で最低３週間、好ましくは３ヶ月間貯蔵される。
【実施例】
【００３４】
本発明をより明白に確認するために、好ましい実施態様について、付属する図面を参照しながら実施例により説明する。
【００３５】
（実施例１）
本発明の実施態様による組織を処理する方法を、以下のようにして、血管の人工器官として使用するためのウシ尿管に応用した。
【００３６】
ウシ尿管は、衛生的条件下で採取され、実験室に４℃で搬送された。生理食塩水を尿管の骨盤端を経由して送った。遠位又は膀胱端は、一時的に閉塞され、管腔内の生理食塩水の圧を１１５ｍｍＨｇに増加した。中間点での尿管の直径を記録した。尿管より少し小さい直径を有する、先端を丸くしたスチール製導入器に搭載された圧縮可能なシリコーン製マンドレルを、加圧した尿管に非外傷的に挿入した。尿管は、一端をシリコーンに固定され、シリコーンに沿って多少動けるようにした。装着された尿管は、１２ｒｐｍ、２１℃の温度の回転ドラム内に置かれた。グルタルアルデヒドの濃度を、０から予め決められた濃度の２．５％（重量／体積）に徐々に増加し、溶液のｐＨを、３時間にわたってリン酸バッファを添加して１．５から５．９に上昇した。グルタルアルデヒド溶液が予め決められた濃度及びｐＨに達したら、尿管を回転ドラムから取り出し、２．５％（重量／体積）のグルタルアルデヒドの循環槽に、ｐＨ７．４で２４時間置いた。
【００３７】
材料をグルタルアルデヒドから取り出し、緩衝食塩水で軽く洗い流し、５０％（体積／体積）のエタノール中に置いた。圧縮可能なマンドレルを取り除き、材料に欠損がないことを圧力試験で確認した。
【００３８】
得られた材料を、１％グルタルアルデヒドの５０％（体積／体積）エタノール溶液中で、１８時間以上浸すことにより化学的に滅菌し、その材料を５０％（体積／体積）エタノールの滅菌溶液で洗い流し、最低３週間５０％（体積／体積）エタノール中に貯蔵した。
【００３９】
（実施例２）
石灰化のインビボ阻害を、グレーハウンド犬で以下のように評価した。
上記した当該実施態様によって、ウシ尿管から調製した内径６ｍｍで長さ１０ｃｍ以上の移植片を、結紮された基部の吻合部に対して遠位の大動脈で大動脈腸骨動脈の位置に移植した。
内径４ｍｍで、長さ６ｃｍ以上の移植片を、大腿中間部移植片として移植した。
【００４０】
抗凝固療法又は抗血小板療法は、使用しなかった。
【００４１】
開存性を実証し、動脈瘤、拡張又は狭窄を検出するために、定期的な血管造影を予め決められた間隔で行った。動物を、予め決められた間隔で、或いは移植片の閉鎖又は動物の苦痛時に殺処分した。最後に、外植片の肉眼的及び顕微鏡的検査を行った。
【００４２】
本発明により処理した移植材料の開存性、壁の完全さ及び管腔の完全さを米国特許第４，４６６，１３９号のそれらと比較したところ、何れも欠陥は認められなかった。しかしながら、顕微鏡的に検査すると、本実施態様の方法によって処理され、１乃至１８ヶ月において外植した１３の人工器官では、石灰化は認められなかった。図１は、本発明の好ましい実施態様の方法により処置し、ネコモデルに、代用血管として１２７日間体内移植した、ウシ尿管のヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）の顕微鏡写真である。移植片の壁には、外植片では微小石灰化が認められない。示した図では、流動表面ＦＳは右側である。
【００４３】
比較として、同じ時間の期間に、米国特許第４，４６６，１３９号の方法により処理した２５の人工器官では、１１例（即ち、４４％）人工器官が、吻合部位に初発的に壁内に微小石灰化の領域を有していた。図２は、米国特許第４，４６６，１３９号に従って処理したウシ尿管で、代用血管としてネコモデルにおいて９０日間体内移植したもののヘマトキシリン−エオシン染色の顕微鏡写真である。外移植片で、微小石灰化（Ｃａ）の領域は、遠位吻合において壁に実証されている。移植片は、外植片において開存していた。示した図では、流動表面（ＦＳ）は右側である。
【００４４】
（実施例３）
処理したウシ尿管の表面に移植したヒト伏在静脈内皮細胞の付着と接着を以下のように評価した。
【００４５】
ヒト伏在静脈内皮細胞を、文献記載の又は改良した技術を用いて単離し、育種し、播種した。ヒト伏在静脈内皮細胞は、手術室から得た反転静脈瘤ヒト伏在静脈から単離し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２．５ｍＭ）及び重炭酸ナトリウム（０．２３％）を含有する冷却ハンクス均衝塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）に入れて、実験室に輸送された。静脈の端は外科用絹糸で結紮した。改良酵素育種技術を利用し、静脈を２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎタイプＩＶ、Ｓｉｇｍａ社）１０ｍｌに、１０分間、３７℃にて浸漬し、次いで自動速度で１分間、１０秒間隔でボルテックス処理した。集めた細胞懸濁液は、８００ｇで、５分間、４℃で遠心分離し、得られた細胞ペレットを、加熱不活化ウシ胎仔血清又はウシ血清（ＦＣＳ、ＣＳＬ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）、ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）及び内皮細胞補助剤（Ｓｉｇｍａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）を含有するＭ１９９（Ｓｉｇｍａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）に再懸濁した。次いで、細胞をゼラチンで被覆した直径１０ｃｍのペトリ皿に播種し、５％ＣＯ2、９５％空気加湿インキュベーター（ＮｕＡｉｒｅ社、Ｕ．Ｓ．Ａ．）内で３７℃にてインキュベートした。細胞は、集密するまで増殖させ３回継代した。
【００４６】
内皮細胞は、０．２５％トリプシン／０．２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）含有トリプシンを用いて１分間、組織培養皿から分離した。トリプシンの活性を２０％ＦＣＳ及びＭ１９９で不活化し、細胞懸濁液を４℃、８００ｇで、５分遠心分離した。細胞ペレットは、細胞濃度１×１０6細胞／ｍｌまで培地に再懸濁した。
【００４７】
内径４ｍｍ、長さ１０ｃｍ以上の導管を、細胞溶液で満たし、３７℃のインキュベーターで１時間回転した（１６回転／時間）。播種後、導管を５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベートした。導管試料（１ｃｍ）は、細胞被覆率及び細胞密度を評価するために、インキュベーション０、２４、４８及び７２時間後に取り出した。
【００４８】
ヒト伏在静脈内皮細胞を播種された導管は、７２時間インキュベーション後、５０％を超える融合性被覆を有していた。導管は、４８０ｍｌ／分の流速で、媒体のインビトロ流に付与され、平行した流出ラインに接続した３つの播種された導管に、１時間の間、血液モニターポンプ（ＧａｍｂｒｏＢＭＭ１０−１／３）からなるインビトロ流系によって、剪断応力１１．４ダイン／ｃｍ2が加えられた。
【００４９】
流動前及び後の内皮細胞の被覆は、抗ＣＤ３１抗体（ＰＥＣＡＭ）で細胞を標識した後に定量された。標識細胞は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）色素体（Ｄａｋｏ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社）を用いた、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン／ビオチン系で検出した。
【００５０】
（結果）
内皮細胞の集密単層は、尿路上皮細胞からなるバイオマトリックス表面に緊密に接着しており、１１．４ダイン／ｃｍ2のインビトロ剪断応力で接着したままであった。図３は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴクロマゲンを用いた、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン／ビオチン系で検出した抗ＣＤ３１標識細胞の顕微鏡写真である。図３は、１１．４ダイン／ｃｍ2のインビトロ剪断応力をかけて１時間後の、本発明の実施態様に従って処理したウシ尿管の流通表面に付着した、ヒト伏在静脈内皮細胞（ＥＣ）の単層を示す。この図では、粘膜固有層はＬＰで、尿路表皮はＵＲＯで表示されている。
【００５１】
このように、本実施態様の方法は、損傷した、疾病にかかった、又は欠損した組織、構造又は器官を置換又は増強するために、ヒト又は哺乳動物用の体内移植材料を創成するための、自己、同種又は異種の組織に応用することができる。本方法は、特定用途の移植片用の生体組織又は生合成組織に必要とされる特性を与えるために、調節することができる。得られる材料は、心臓血管環境、例えば、小血管環状又は末梢バイパス移植、人工組織心臓弁又は組織の内方伸展、即ちインステント狭窄を防止するための、ステントバイオバリアーに内部移植することができる。処理した材料の非多孔性及び組織不透過性の性状は、小直径の合成バイパス移植片における障害の主要原因の一つである、壁を通して組織の内部への伸展及び血管新生を阻害する。材料は、例えば、人工皮膚、ヘルニア修復パッチ又は人工靱帯のような非心臓血管環境にも体内移植することができる。材料の機能は、体内移植の前に、生細胞を加えることによって、更に増強することができる。例えば、小血管置換の流通表面に内皮細胞を添加すると、血液凝固を防止する抗凝固機能を付与することができる。
【００５２】
当業者には明らかなように、本発明に対して改良を加えることができる。これら及びその他の改良は、本発明の範囲、及び上記の記載及び図面から明らかにされるであろう性質から離れることなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施態様の方法により処理したウシ尿管であり、代用血管としてネコモデルにおいて１２７日体内移植したものの、ヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）の顕微鏡写真である。
【図２】図２は、米国特許第４，４６６，１３９号の方法により処理したウシ尿管であり、代用血管としてネコモデルにおいて９０日体内移植したものの、ヘマトキシリン−エオシン染色の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、好ましい実施態様の方法により処理したウシ尿管の、流動面に接した単層抗ＣＤ３１標識ヒト伏在静脈内皮細胞の顕微鏡写真である。
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月4日(2002.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から、移植材料を創成する方法であって、
該組織が、２０重量％乃至８０重量％の間のコラーゲンを含み；
該方法が、該組織を架橋剤で３０分乃至６時間の間処理し；該処理時間の間、該架橋剤濃度を、０％〜０．２５％（重量／体積）の初期濃度から０．５％〜５％（重量／体積）の最終濃度まで変化させ；更に、該処理時間の間、該架橋剤のｐＨを、１〜３の初期ｐＨから５〜８の最終ｐＨまで変化させる；
ことを包含する方法。
【請求項２】
該組織が、およそ４０重量％のコラーゲンを含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該処理時間が、およそ２．５時間である請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該架橋剤濃度及び該ｐＨを、該処理時間の間、次第に増加させることを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
該初期濃度が、およそ０％である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
該最終濃度が、およそ２．５％（重量／体積）である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
該初期ｐＨが、およそ１．５である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
該最終ｐＨが、およそ７．４である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
該組織が、自己、同種又は異種の材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
該組織が、ヒト、ヒツジ、ウシ及びブタの何れかの由来である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
該組織が、組織工学処理した生体材料、代理動物における耐久性又は分解性の骨格（scaffold）について組織工学処理された材料、又は実験室で組織培養系によって組織工学処理された材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
該組織が、天然に存在する生体材料である、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
該架橋剤が、グルタルアルデヒドである、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
該材料を、循環液槽又は回転ドラム中で処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
該材料が、尿細管状であり；
該方法が、該材料を循環液体槽又は回転ドラム中で処理し、該材料を、液体が該材料の管腔を１分間当たり２００〜４００ｍｌの速度で流れるような流系に付与する；
ことを包含する、請求項１乃至１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
液体が、該材料の管腔を１分間当たりおよそ３００ｍｌの速度で流れる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該処理時間の後に、更に、該組織を架橋剤で、０．５％〜５％（重量／体積）の濃度及び５〜８のｐＨで、２０℃〜２７℃の温度で、１時間〜５日間処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
該処理時間の後に、およそ２．５％（重量／体積）の濃度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該処理時間の後に、およそ７．４のｐＨで、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
該処理時間の後に、およそ２５℃の温度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項１７乃至１９に記載の方法。
【請求項２１】
該更なる処理時間が、およそ４８時間である、請求項１７乃至２０に記載の方法。
【請求項２２】
該組織及び架橋剤溶液を、２０℃から２７℃の温度で保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】
該組織及び架橋剤溶液を、およそ２５℃の温度で保持することを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２４】
該組織の形状を、圧縮可能な型によって処理する間保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
該材料が動き得るように、該組織が該型上に固定されていないか、又は一端のみが固定されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該組織が架橋された後、該組織を滅菌することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２７】
該組織を、滅菌する前に、およそ２％（重量／体積）の過酸化水素で３０分乃至１．５時間の間液浸することを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該組織を、滅菌する前に、およそ２％（重量／体積）の過酸化水素中に、およそ１時間浸すことを包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該組織を、化学的に滅菌することを包含する、請求項２６乃至２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
該組織を、１５乃至３０キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項２６乃至２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３１】
該組織を、２５キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、２乃至２４時間、５％（重量／体積）のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項３０又は３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、およそ１２時間、５％（重量／体積）のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該材料を、移植する前に、最低限３週間、５０％（体積／体積）のエタノール中に保存することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３５】
該材料を、移植する前に、少なくとも３ヶ月間、５０％（体積／体積）のエタノール中に保存することを包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１乃至３５のいずれか一つの方法によって創成される移植材料。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から移植材料を創成する方法であって、
該組織が、２０重量％乃至８０重量％、及び好ましくは４０重量％のコラーゲンを含み、
該方法が、該組織を架橋剤で３０分乃至６時間処理し、該処理時間の間、該架橋剤濃度を、０％〜０．２５％（重量／体積）の初期濃度から、０．５％〜５％（重量／体積）の最終濃度まで変化させ、更に、該処理時間の間、該架橋剤のｐＨを、１〜３の初期ｐＨから５〜８の最終ｐＨまで変化させる、
ことを包含する方法を提供する。




【国際調査報告】
2004534559.tif 000025
2004534559.tif 000026