(57)【要約】本発明は、高い効率で腫瘍アンギオスクチン因子を発現し特異的腫瘍細胞内で増殖することのできるウイルス及びその使用を開示する。前記ウイルスは主として腫瘍細胞内で伝播し、腫瘍細胞を特異的かつ直接的に死滅させることができる。ウイルスゲノムの非増殖性必要領域の中に腫瘍アンギオスタチン因子をコードするヌクレオチド配列を付加することによる。腫瘍細胞内のウイルスの複製に伴って、腫瘍アンギオスタチン因子をコードするヌクレオチド配列は増加する。従って、それは、特異的腫瘍細胞内で高い効率で腫瘍アンギオスタチン因子を発現し、腫瘍血管の形成を抑止し、腫瘍の形成、発達及び転移を制御することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞内で特異的に伝播しかつ高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスにおいて、そのゲノムの非必須領域が、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とし、かつ
１）　腫瘍細胞内で特異的に伝播する野生型ウイルス；
２）　ウイルスの伝播のための必須遺伝子内のコーディング開始部位と転写開始部位の間に腫瘍細胞内で特異的に活性化されるシス作用性要素を含有する組換え型ウイルス；
３）　伝播のための必須領域内に少なくとも１つのタンパク質機能の喪失を含み、腫瘍細胞内で特異的に伝播する能力をもつウイルス、
から成る群から選ばれる前記ウイルス。
【請求項２】
ウイルスの伝播のための必須領域内のコーディング開始部位と転写部位の間に腫瘍細胞内で特異的に活性化される少なくとも１つのシス作用性要素を含むことを特徴とし、前記シス作用性要素が、α−胎児タンパク質のエンハンサ及びプロモータ、ガン胎児抗原のエンハンサ及びプロモータ、チロシナーゼのエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ２のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ３のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ４のエンハンサ及びプロモータ、ＤＦ３乳ガン関連抗原のエンハンサ、プロスタグランジン特異的抗原のエンハンサ及びプロモータ、腺状カリクレインのエンハンサ及びプロモータ、ＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及びＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータ、ＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータと組合わされたＥＢウイルス内のＯｒｉｐ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの塩基性プロモータ又はＳＶ４０の塩基性プロモータと組合わされたＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及び、ＥＢウイルスの感染を受けたか又は潜伏感染している細胞内で特異的に活性化されたシス作用性要素から成る群から選ばれる、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記ウイルスがアデノウイルスであり、アデノウイルスの伝播のための必須遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２又はＥ４というアデノウイルスの早期発現遺伝子のうちの１つであることを特徴とする、請求項２に記載のウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスは組換え型アデノウイルスであり、アデノウイルスのＥ１Ｂ５５Ｋｄａ遺伝子、Ｅ１Ｂ１９Ｋｄａ遺伝子及び／又はＥ１Ａ遺伝子によりコードされたタンパク質内の機能喪失が存在することを特徴とする、請求項１に記載のウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスが組換え型単純ヘルペスウイルスであり、単純ヘルペスウイルスの二重模写されたＩＣＰ３４．５遺伝子及び／又はＩＣＰ６遺伝子によりコードされたタンパク質内に機能の喪失が存在することを特徴とする、請求項１に記載のウイルス。
【請求項６】
血管形成阻害物質をコードする前記ヌクレオチド配列が、エンドスタチン、アンギオスタチン、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−５構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造にＫｒｉｎｇｌｅ５構造を加えたもの、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ２構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ３構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ５構造、インタフェロン−α、インタフェロン−β、インタフェロン−γ、トロンボスポンジンＩ、血小板第４因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質及びフィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス。
【請求項７】
前記アンギオスタチン抑制遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、分泌シグナルペプチドについてコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記分泌シグナルペプチドが、血管形成阻害物質のシグナルペプチド自体、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチド及び免疫グロブリンＫ鎖のシグナルペプチドの中から選ばれる、請求項６に記載のウイルス。
【請求項８】
前記血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列の発現がさらにプロモータにより制御され、前記プロモータが、ヒトサイトメガロウイルスのＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶＬＴＲプロモータ及び／又はＩＥプロモータから成る群から選ばれる、請求項６に記載のウイルス。
【請求項９】
請求項１に記載の前記ウイルスを用いて哺乳動物特にヒトの腫瘍を治療する方法において、１）前記ウイルスを用いて腫瘍にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで感染させるステップ、２）実質的に腫瘍細胞内に制限された状態でウイルスを選択的に複製させ伝播させ、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数及び腫瘍細胞内の血管形成阻害物質の発現量の増加を導き、かくして腫瘍の血管新生を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制するべく直接的に腫瘍細胞を特異的に死滅させるステップ、を含む前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のウイルスによる腫瘍細胞への感染に先立ち、及び／又はそれと同時に及び／又はその後に化学抗腫瘍薬を投与する段階をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞の成長を抑制するための請求項１に記載のウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生命科学の分野、特に、腫瘍細胞内で特定的に伝播し血管形成阻害物質を高レベルで発現する能力をもつウイルスに関する。
【０００２】
悪性腫瘍は、人間の生命及び健康を深刻な形で脅かす。現在、悪性腫瘍に対する定番の療法はなおも、手術、放射線療法及び化学療法である。この種の定番療法は、大部分の腫瘍にとって望ましい効果を達成できず、一般に、生命を危うくする骨髄抑制を含め明らかに有害な影響を伴う。過去数年間で、腫瘍の発生期の血管の研究には大きな進歩が見られている。Ｆｏｌｋｍａｎの研究グループは、腫瘍の開始及び発達中の「血管形成のオンオフメカニズム」を提案し、腫瘍の微細血管形成の分子メカニズムを明らかにした。腫瘍の半径が２ｍｍ未満である場合、その存在は主として細胞のまわりに拡散された酸素及び栄養物質に左右される。腫瘍サイズの拡大に伴い、腫瘍又は宿主組織は、新生物本体に栄養物を供給するべく、発生期血管網を作り上げることになる。
【０００３】
発生期血管網の形成は、腫瘍をとり囲む微環境内の発生期血管網の形成を誘発する因子と抑制する因子の間の相互作用の結果に依存している。腫瘍の開始及び転移病巣の形成中、繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−ａ）、血小板由来内皮成長因子（ＰＤＥＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）及びマトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）といったような再生中の血管網の形成を誘発し促進する因子が優勢であり、一方エンドスタチン、アンギオスタチン、インタフェロン−α、インタフェロン−β、インタフェロン−γ、トロンポスポンジン、血小板因子４遺伝子、プラスミノーゲン活性化阻害物質（ＰＡＩ）遺伝子及びフィブロネクチン遺伝子といったような、発生期血管の形成を抑制する因子は劣勢であり、かくして、腫瘍の発生期血管の形成を導く。発生期血管は腫瘍細胞の急速な伝播のため栄養物を輸送すると同時に、腫瘍の長距離転移を実現させる。腫瘍の発生期血管の形成を抑制することで、腫瘍の栄養物を遮断することができ、かくして栄養失調により腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍をあきらかに萎縮させさらには完全に削除するという結果をもたらすことになる。その間、腫瘍の発生期血管の形成を抑制することで、腫瘍転移のための通路を遮断することもできる。
【０００４】
現在、腫瘍の発生期血管形成を遮断する阻害因子が数多く存在しており、既に臨床試験に入っている。しかしながら、発生期血管形成の阻害因子の半減期が比較的短いことに起因して、処置を毎日施すことが必要となる。同時に、所要量は通常はるかに多く、例えば、エンドスタチン及びアンギオスタットの治療的用量は体重１ｋｇあたり一日１０〜２０ｍｇである。従来の生物工学技術ではこれを実現することは困難である。
【０００５】
長い間、腫瘍遺伝子療法の方法においては、遺伝子トランスフェクションの効率が比較的低く、抗癌遺伝子の発現量も比較的低いものであるということは、周知の事実である。しかしながら、腫瘍細胞内で特異的に伝播するウイルスに基づく処置では、この種のウイルスが腫瘍細胞内でのみ特異的に複製し伝播し、腫瘍細胞を溶解させ、腫瘍細胞中のウイルスを複製及び伝播と共にウイルス粒子を放出するという特性が利用されている。このとき、放出されたウイルス粒子は、その他の腫瘍細胞に再び感染し、伝播しそれらを溶解させる。かくして、増幅効果が生み出される。これにより、ウイルスは人体の全ての組織及び器官の中に拡散し得る。これらのウイルスは全ての腫瘍細胞を感染させ、局所的及び転移性の腫瘍を死滅させることができる。基本的に腫瘍内で特異的に伝播するウイルスは、正常な細胞内では伝播できない。従ってこれらのウイルスは、腫瘍細胞をとり囲む正常な細胞に影響を及ぼさない。現在、米国のＯＮＹＸ製薬会社は、腫瘍を治療するために単独でＥｌｂ５５ｋＤａタンパク質欠損ウイルス（ＯＮＹＸ−０１５）を利用しようと試みたが、その臨床実効比率は１５〜２０％にすぎない（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ， Ｊ． ｅｔ．ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０００，６０：（２２）６３５９；ＵＳ５６７７１７８；ＵＳ５８０１０２９）。
【０００６】
本発明者らは、腫瘍の血管を抑制する療法と腫瘍内に特異的に伝播するウイルスに基づく療法とを創造的に組合わせている。血管抑制−ウイルス治療の療法、すなわち血管形成阻害物質 遺伝子を運ぶため腫瘍内で特異的に伝播するウイルスを利用し腫瘍細胞内のウイルスの特定的複製及び伝播ならびに高濃度のウイルスの産生をうまく達成しかくして腫瘍細胞を直接破壊する療法を紹介するのは、これが初めてである。その一方で、腫瘍細胞内のウイルスの複製と共に、運ばれているＩＧＩ遺伝子は大規模に発現されて相乗効果を生み出した。本発明において記述されている血管抑制−ウイルス治療の療法は、血管形成阻害物質を大規模に産生するというむずかしい問題を克服し、その一方で、実効比は、治療のため腫瘍内で特異的に伝播するウイルスのみを用いる方法のものに比べて明らかに増大した。
【０００７】
発明の要約
本発明の１つの目的は、腫瘍細胞内で特異的に伝播しかつ高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスにおいて、そのゲノムの非必須領域が、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列を含んでいるウイルスを提供することにある。前記ウイルスは、
１）　腫瘍細胞内で特異的に伝播する野生型ウイルス；
２）　ウイルスの伝播のための必須遺伝子内のコーディング開始部位と転写開始部位の間に腫瘍細胞内で特異的に活性化されるシス作用性要素を含有する組換え型ウイルス；
３）　伝播のための必須領域内に少なくとも１つのタンパク質機能の喪失を含み、腫瘍細胞内で特異的に伝播する能力をもつウイルス、
から成る群から選択される。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、本発明に記述されているウイルスを用いて哺乳動物特にヒトの腫瘍を治療する方法を提供することにある。この方法には、以下の段階が含まれる：１）前記ウイルスを用いて腫瘍にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで感染させる段階、２）実質的に腫瘍細胞内に制限された状態でウイルスを選択的に複製させ伝播させ、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数及び腫瘍細胞内の血管形成阻害物質の発現量の増加を導き、かくして腫瘍の血管新生を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制するべく直接的に腫瘍細胞を特異的に死滅させる段階。本発明に記述されている方法には、ウイルスによる腫瘍細胞の感染に先立ち、及び／又はそれと同時に及び／又はその後に化学抗腫瘍薬を投与する段階がさらに含まれている。
【０００９】
本発明のさらにもう１つの目的は、腫瘍細胞の成長を阻害するための、本発明の中で記述されているウイルスの使用を提供することにある。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、血管形成阻害物質を高レベルで発現する能力をもつウイルスを提供する。血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列は、腫瘍細胞内で特異的に伝播するウイルスのゲノムの非必須領域内に挿入され、ウイルスは腫瘍細胞内に選択的に伝播するが、正常な細胞内では伝播しない。腫瘍細胞内のウイルスの複製及び伝播と共に、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数も増大させられ、かくして血管形成阻害物質の発現量も増大させられる。前記ウイルスは以下のものから成る群から選択される。
【００１１】
１）　腫瘍細胞内で特異的に伝播する野生型ウイルス；
２）　ウイルスの伝播のための必須遺伝子内のコーディング開始部位と転写開始部位の間に腫瘍細胞内で特異的に活性化されるシス作用性要素を含有する組換え型ウイルス；
３）　伝播のための必須領域内に少なくとも１種類のタンパク質機能喪失を含み、腫瘍細胞内で特異的に伝播する能力をもつウイルス。
【００１２】
本発明においては、それが単数又は複数の種類の腫瘍細胞内で特異的に伝播しうるかぎりにおいて、数多くの種類の野生型ウイルスを選択し、使用することができる。アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスを使用することが好ましい。
【００１３】
本発明の中で記述されているウイルスの伝播のための必須領域は、当業者であれば容易にわかるさまざまな使用ウイルスに応じて変動しうる。本発明のウイルスは、ウイルスの伝播のための必須領域内のコーディング開始部位と転写部位の間に腫瘍細胞内で特異的に活性化される少なくとも１つのシス作用性要素を含み、かつ、前記シス作用性要素が、α−胎児タンパク質のエンハンサ及びプロモータ、ガン胎児抗原のエンハンサ及びプロモータ、チロシナーゼのエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ２のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ３のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ４のエンハンサ及びプロモータ、ＤＦ３乳ガン関連抗原のエンハンサ、プロスタグランジン特異的抗原のエンハンサ及びプロモータ、腺性カリクレインのエンハンサ及びプロモータ、ＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及びＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータ、ＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータと組合わされたＥＢウイルス内のＯｒｉｐ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの塩基性プロモータ又はＳＶ４０の塩基性プロモータと組合わされたＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及び、ＥＢウイルスの感染を受けたか又は潜伏感染している細胞内で特異的に活性化されたシス作用性要素から成るグループの中から選択されている組換え型ウイルスであり得る。
【００１４】
本明細書中で使用される前記ウイルスがアデノウイルスである場合、ウイルスの伝播のための必須遺伝子はウイルス早期遺伝子であり、ウイルスの伝播のための前記必須遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２又はＥ４というアデノウイルスの早期発現遺伝子のうちの１つである。
【００１５】
本発明において記述されているウイルスは、さらに、伝播のため必須領域において少なくとも１種類のタンパク質機能の喪失を包含し、かつ腫瘍細胞内で特異的に伝播する能力をもつ組換え型ウイルスであり、ここで前記タンパク質機能の喪失は１つの遺伝子の点突然変異、欠失及び挿入突然変異によって達成され得、かくして前記タンパク質機能喪失が結果として得られる。本発明の１実施形態においては、前記ウイルスは、そのＥＩＢ５５Ｋｄａの遺伝子が、点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受けており、その結果ＥＩＢ５５Ｋｄａのタンパク質機能異常をもたらしている組換え型アデノウイルスである。本発明の１実施形態においては、前記ウイルスは、そのＥ１Ｂ １９ｋＤａの遺伝子が、点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、結果としてＥ１Ｂ１９ｋＤａのタンパク質機能異常をもたらしている組換え型アデノウイルスである。本発明の１実施形態においては、前記ウイルスは、そのＥ１Ａ遺伝子が、点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、結果としてＥ１Ａのタンパク質機能異常をもたらしている組換え型アデノウイルスである。
【００１６】
本発明の１実施形態においては、前記ウイルスは、組換え型単純ヘルペスウイルスであって、ここで、このアデノウイルスのＩＣＰ６遺伝子は、点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、結果としてＩＣＰ６のタンパク質機能異常を結果としてもたらしている。本発明の１実施形態においては、前記ウイルスは、その二重複写されたＩＣＰ３４．５遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、結果として二重複写されたＩＣＰ３４．５のタンパク質機能異常をもたらしている組換え型単純ヘルペスウイルスである。
【００１７】
本発明の前記ウイルスにおいては、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列は、エンドスタチン、アンギオスタチン（血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−４構造）、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−５構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造にＫｒｉｎｇｌｅ５構造を加えたもの、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ１構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ２構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ３構造、血漿プラスミノーゲン中のＫｒｉｎｇｌｅ５構造、インタフェロン−α、インタフェロン−β、インタフェロン−γ、トロンボスポンジンＩ、血小板第４因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害物質及びフィブロネクチンをコードする配列から成るグループの中から選択された配列を内含するが、これらに制限されるわけでない。一般に、タンパク質はそれが血管形成阻害物質としての機能を有するかぎりにおいて全て本発明で使用可能なものであるということは、当業者に一般に知られていることである。
【００１８】
血管形成阻害物質をコードする前記ヌクレオチド配列の発現効率を高めるためには、前記配列内で分泌性シグナルペプチドについてコードするヌクレオチド配列を使用することが好ましい。本発明の１実施形態においては、前記分泌性シグナルペプチドのためのヌクレオチド配列には、前述の血管形成阻害物質のシグナルペプチド自体、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチド、免疫グロブリンＫ鎖のシグナルペプチドが内含されるが、これらに制限されるわけではない。本発明において記述されている、相同の又は非相同の血管形成阻害物質を効率良く分泌する能力をもつシグナルペプチドが全て本発明において使用可能である。
【００１９】
さらに、本発明の中で記述されているウイルスの中の前記血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列はなお好ましいことに、プロモータの下で制御される。前記プロモータには、ヒトサイトメガロウイルスのＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶＬＴＲプロモータ及び／又はＩＥプロモータが内含されるが、これらに制限されるわけではない。本発明においては、相同の又は非相同の、本発明に記述されている血管形成阻害物質の発現を効率良く導く能力をもつプロモータが全て、使用可能である。
【００２０】
本発明においては、腫瘍細胞内では特異的に伝播し複製するが、正常な細胞内では伝播及び複製しないウイルスを結果としてもたらす、腫瘍特異的ウイルスの構築は、主として以下の方法によって達成されている。
【００２１】
（１）ウイルスの伝播のための必須遺伝子の選択的制御：
遺伝子転写の活性化の調節は、トランス作用性因子（例えば転写因子）とシス作用性要素の間の相互作用により影響される。一部の転写因子が不在であるか存在しているかにより、遺伝子転写レベルに影響がもたらされる可能性がある。本発明は、ウイルス組織内で特異的に活性化されたシス作用性要素（プロモータ又はエンハンサを含む）を利用して、標的遺伝子を制御し標的遺伝子に腫瘍細胞内で特異的に発現するものの正常な細胞内では全く又はより低いレベルでしか発現しないようにする。ウイルスの伝播及び複製のための必須遺伝子は、腫瘍組織特異的プロモータ及びエンハンサにより制御され、結果として、腫瘍細胞内のみでのウイルスの伝播及び複製のための遺伝子の発現がもたらされる；従ってウイルスは、腫瘍細胞内のみで伝播し、主として正常細胞内では伝播しない。
【００２２】
本発明の中で用いられる細胞特異的応答要素は、腫瘍細胞内で特異的に活性化されたシス作用性要素で構成されている。シス要素は、以下のもののうちのいずれか１つであり得る；肝癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるα−胎児タンパク質（ＡＦＰ）のエンハンサ及びプロモータ；胃癌細胞及び結腸癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータである癌胎児抗原（ＣＥＡ）のエンハンサ及びプロモータ；黒色腫細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるチロシナーゼのエンハンサ及びプロモータ；乳癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるＥｒｂＢ２のエンハンサ及びプロモータ；乳癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるＥｒｂＢ３のエンハンサ及びプロモータ；乳癌細胞及び胃癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるＥｒｂＢ４のエンハンサ及びプロモータ；乳癌細胞内で活性化されるエンハンサ及びプロモータであるＤＦ３乳癌関連抗原（ＭＵＣ１）のエンハンサ；プロスタグランジン特異的抗原のエンハンサがプロスタグランジン特異的抗原の転写開始部位に対しｎｔ−５３２２〜ｎｔ−３７３９のところにあり、プロモータがプロスタグランジン特異的抗原の転写開始部位に対しｎｔ−５４０〜ｎｔ＋１２のところに位置特定され、エンハンサ及びプロモータが前立腺細胞及び前立腺癌細胞内で特異的に活性化され得る、プロスタグランジン特異的抗原のエンハンサ及びプロモータ；前立腺細胞及び前立腺癌細胞内で特異的に活性化される腺状カリクレインのエンハンサ及びプロモータ；エプスタイン−バールウイルス（一般に省略してＥＢウイルス）内のＯｒｉｐ、ＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲ、ＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータ、ＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータと組合わされたＥＢウイルス内のＯｒｉｐ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの塩基性プロモータ又はＳＶ４０の塩基性プロモータと組合わされたＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲ及び、ＥＢウイルスの感染を受けたか又は潜伏感染している細胞内で特異的に活性化されたシス作用性要素。
【００２３】
本発明は、腫瘍細胞を特異的に死滅させる伝播性組換え型ウイルスを提供する。該ウイルスは、腫瘍細胞内で活性化されたウイルスの伝播のための必須遺伝子からの少なくとも１つのシス作用性要素を含み、ここで前記シス作用性要素は、ウイルス伝播のための必須遺伝子内の遺伝子の転写開始部位とコーディング開始部位の間の領域の中に挿入されている。前記シス作用性要素は、腫瘍細胞内で特異的に活性化され、転写活性を生成するが、正常な細胞中では活性化されず、転写活性を生成しない。シス作用性要素は以下の配列のうちの１つでありうる；α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）のエンハンサ及びプロモータ、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）のエンハンサ及びプロモータ、チロシナーゼのエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ２のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ３のエンハンサ及びプロモータ、ＥｒｂＢ４のエンハンサ及びプロモータ、ＤＦ３乳ガン関連抗原のエンハンサ（ＭＵＣ１）、プロスタグランジン特異的抗原のエンハンサ及びプロモータ、腺性カリクレインのエンハンサ及びプロモータ、ＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及びＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータ、ＥＢウイルスのＢａｍＨＩＣ−プロモータと組合わされたＥＢウイルス内のＯｒｉｐ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの塩基性プロモータ又はＳＶ４０の塩基性プロモータと組合わされたＥＢウイルスのＯｒｉｐ内のＦＲエンハンサ及び、ＥＢウイルスの感染を受けたか又は潜伏感染している細胞内で特異的に活性化されたシス作用性要素。ウイルス伝播のための上述の必須遺伝子は、ウイルスの早期発現遺伝子である。本発明の１実施形態においては、単純ヘルペスウイルスが使用され、そのウイルス伝播のための必須遺伝子には、早期発現遺伝子 ＩＣＰ４が内含される。本発明のもう１つの実施形態においては、上述のウイルスはアデノウイルスであってよい。そのウイルス伝播のための必須遺伝子には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２及びＥ４というアデノウイルスの以下の早期発現遺伝子のうちの少なくとも１つが内含される。
【００２４】
（２）正常細胞内でのウイルスの複製にとって必須であるものの腫瘍細胞内では必須ではない遺伝子によりコードされるタンパク質機能を選択的に枯渇させる：
正常な細胞と腫瘍の間で遺伝子の発現に幾分かの差異が存在する。正常な細胞内でのウイルスの複製のために必須ないくつかの遺伝子は、腫瘍細胞では必要とされない。従って、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質機能の枯渇が、腫瘍細胞内で特異的にウイルスの複製を結果としてもたらし、正常な細胞内ではこれをもたらさないということが予想される。
【００２５】
ウイルスのタンパク質機能の喪失は、以下のもののうちのいずれかでありうる：アデノウイルスのＥ１Ｂ５５ｋＤａの遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受けて、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａのタンパク質機能異常を結果としてもたらした。アデノウイルスのＥ１Ｂ１９ｋＤａの遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａのタンパク質機能異常を結果としてもたらした。アデノウイルスのＥ１Ａ 遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、Ｅ１Ａのタンパク質機能異常を結果としてもたらした。単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ６遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、ＩＣＰ６のタンパク質機能異常を結果としてもたらした。単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ３４．５の遺伝子が点突然変異、欠失突然変異及び挿入突然変異による突然変異を受け、ＩＣＰ３４．５のタンパク質機能異常を結果としてもたらした。
【００２６】
（３）　或る種のシグナル形質導入経路の異常に応じたウイルスの複製：
レオウイルス感染の後、その早期ウイルス遺伝子の転写は、二重ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化することができ、キナーゼは、ウイルスのその他の遺伝子の転写を抑制することができる。従って、ウイルスは効率良く複製することができない。しかしながら、Ｒａｓが細胞内で活性化状態にあるとき、それは、キナーゼを抑制することができ、その結果ウイルスの活発な複製がもたらされる。Ｒａｓ 遺伝子は、癌遺伝子であり、異常な形で活性化された時点で、癌性変化が発生することになる。レオウイルスの複製及び伝播は、異常に活性化されたＲａｓのシグナル経路により左右される。すなわちこのウイルスは、Ｒａｓを発現する腫瘍細胞の中で高レベルで複製し伝播する。
【００２７】
（４）選択的に腫瘍細胞に入る：
ウイルスは、その表面結合タンパク質を変更することによって幾つかの特定の腫瘍組織を結合させることができ、従って、ウイルスは、特定の腫瘍組織のみを感染させる。現在、この面における改革は、主として、アデノウイルス、ペントン及びヘキソンタンパク質の外皮タンパク質−フィブリン（繊維）に集中している。特に、フィブリンのヘッドＨＩリング又はＣ末端において、それは最も頻繁には、腫瘍の膜表面内に挿入された抗体のＦａｂ領域、短ペプチド及び或る種の高親和性リガンドを含んでいる。
【００２８】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、エンドスタチンを含有するものをコードするヌクレオチド配列である。
【００２９】
エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩの２０ＫｄａのＣ末端フラグメントであり、これは、その他の細胞に影響を及ぼすことなく血管の内皮細胞の伝播を特異的に抑制することができる。Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．によって実施された実験は、エンドスタチンが、腫瘍により誘発された血管形成に対して強い抑制活性を有し、かくして腫瘍の形成及び転移を抑制するということを実証した。さらに、反復投与の時点で生成される薬物耐性は全く存在せず、又治療用量の数百倍の量を用いた場合でさえ明らかな毒性は全く見られなかった。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端フラグメントであることから、それは分泌シグナルペプチドを有していない。遺伝子療法のためには、分泌シグナルペプチドを添加する必要がある。Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチド及び免疫グロブリンＫ鎖のシグナルペプチドは全て強力な分泌シグナルペプチドであり、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチド又は免疫グロブリンＫ鎖のシグナルペプチドがエンドスタチン内に添加された時点で、エンドスタチンは細胞の外側で分泌され得る。
【００３０】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、アンギオスタチンを含有するものをコードするヌクレオチド配列である。
【００３１】
アンギオスタチンは、血漿プラスミノーゲンの内部フラグメントである。血漿プラスミノーゲンは、Ｋｒｉｎｇｌｅ−５構造を含み、ここでＫｒｉｎｇｌｅ部位は、アニュレーションにおける３つのジスルフィド結合構造のうちの１つの構造である。各々のＫｒｉｎｇｌｅ構造は、約８０個のアミノ酸残基を含んで成る。Ｋｒｉｎｇｌｅ構造間では５０％の配列同一性が存在する。アンギオスタチンは、血管の形成を抑制する強い効果をもつ。一般に、アンギオスタチンというのは、Ｋｒｉｎｇｌｅ１−４構造を含む血漿プラスミノーゲンの３８ｋＤａのタンパク質フラグメントを意味している。最近になって、血管の内皮細胞に対する血漿プラスミノーゲンの加水分解フラグメント Ｋｒｉｎｇｌｅ１−４作用と、Ｋｒｉｎｇｌｅ１−３の作用を比較する研究が行なわれ、これは、Ｋｒｉｎｇｌｅ１−３の作用がＫｒｉｎｇｌｅ１−４の作用よりもはるかに強いことを示している。組換え型Ｋｒｉｎｇｌｅ１、Ｋｒｉｎｇｌｅ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ３及びＫｒｉｎｇｌｅ４の作用についての研究は、血管の内皮細胞に対する作用が、Ｋｒｉｎｇｌｅ１＞Ｋｒｉｎｇｌｅ３＞Ｋｒｉｎｇｌｅ２の順序にあり、一方Ｋｒｉｎｇｌｅ４は活性がほぼ皆無であることを示した。血管の内皮細胞に対するＫｒｉｎｇｌｅ５の活性は、Ｋｒｉｎｇｌｅ１−４のものに類似しているか又はそれよりも強い。
【００３２】
本発明におけるアンギオスタチンをコードするヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−４構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３３】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードする前記ヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−５構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３４】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードする前記ヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３５】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−３とそれに加えてＫｒｉｎｇｌｅ５構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３６】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３７】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ２構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３８】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ３構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００３９】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ５構造をコードするヌクレオチド配列である。
【００４０】
インタフェロンは、抗ウイルス療法のために広く用いられている。インタフェロンがｉｎ ｖｉｖｏ で腫瘍を抑制する明らかな効果を持つことを実証する研究が存在する。実験から、インタフェロンは、腫瘍の新生血管の形成を抑制することによって腫瘍の成長及び転移を抑制することが示された。
【００４１】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、インタフェロン−αをコードするヌクレオチド配列である。
【００４２】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、インタフェロン−βをコードするヌクレオチド配列である。
【００４３】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、インタフェロン−γをコードするヌクレオチド配列である。
【００４４】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、トロンボスポンジンＩをコードするヌクレオチド配列である。トロンボスポンジンＩは、３つの同一の１８０ｋＤａのサブユニットにより構成された糖たんぱく質ｂｅであり、新生微細血管の形成を抑制するため少なくとも２つの作用ドメインを含有する。
【００４５】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、血小板因子４をコードするヌクレオチド配列である。血小板因子４は、血小板α顆粒タンパク質であり、新生微細血管の形成を抑制するためのそのドメインは、へパリン結合ドメインであるＣ末端にある。
【００４６】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、プラスミノーゲン活性化物質阻害物質（ＰＡＩ）をコードするヌクレオチド配列である。
【００４７】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、血管形成阻害物質をコードするそのヌクレオチド配列は、フィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列である。フィブロネクチンは、数多くの正常な細胞の表面上の主要成分であり、潜在的な細胞拡散因子である。フィブロネクチンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの新生血管の形成を抑制する。
【００４８】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供し、ここで、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列はプロモータにより制御される。前記プロモータは、以下のプロモータのうちの１つでありうる：
シミアン・ウイルス４０のプロモータ（従来ＳＶ４０と省略）、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモータ（従来ＲＳＶと省略）、ヒトサイトメガロウイルスのＬＥプロモータ（従来ＨＣＭＶと省略）など。
【００４９】
本発明においては、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列は、上述の修飾されたウイルスのゲノムの非必須領域内に挿入される。本発明に記述されている血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列は、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドである分泌シグナルペプチド、及び免疫グロブリンＫ鎖のシグナルペプチドを含有するエンドスタチン遺伝子、アンギオスタチン遺伝子（血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−４構造）、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−５構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１−３構造プラスＫｒｉｎｇｌｅ５構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ１構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ２構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ３構造、血漿プラスミノーゲンのＫｒｉｎｇｌｅ５構造、インタフェロン−α 遺伝子、インタフェロン−β 遺伝子、インタフェロン−γ 遺伝子、トロンボスポンジン遺伝子、血小板因子４遺伝子、プラスミノーゲン活性化物質阻害物質（ＰＡＩ）及びフィブロネクチン遺伝子である。
【００５０】
腫瘍細胞内のウイルスの複製と共に、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数は増大し、腫瘍細胞は、高レベルで血管形成阻害物質を発現させられ、かくして腫瘍血管の形成を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制する。その一方で、この修飾されたベクターを、いくつかの細胞混合物内の一部の特定の標的細胞を死滅させるために使用することができる。修飾されたウイルスをこの特定の標的細胞内で選択的に伝播させることにより、この特定の標的細胞は、伝播されたウイルスによって選択的に死滅させられることになる。修飾されたウイルスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で又は動物の体内で細胞化合物と混合することにより、ウイルスは、標的細胞内でのみ伝播することができる。すなわち、標的細胞を除くそれ以外の細胞を、この種のウイルスによって死滅させることはできない。ウイルスは、標的細胞内で伝播し複製し、かくして、混合された細胞中の標的細胞は死滅させられる。ひとたび標的細胞が破壊されると、ウイルスは再び伝播できない。
【００５１】
もう１つの態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍、特にヒトの腫瘍を治療するために本発明の中で記述されているウイルスを用いる方法を提供する。この方法には、以下のような段階が含まれる：１）前記ウイルスを用いて腫瘍にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで感染させる段階、２）実質的に腫瘍細胞内に制限された状態でウイルスを選択的に複製させ伝播させ、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数及び腫瘍細胞内の血管形成阻害物質の発現量の増加を導き、かくして腫瘍の血管新生を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制するべく直接的に腫瘍細胞を特異的に死滅させる段階。本発明で記述されている哺乳動物には、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００５２】
もう１つの態様においては、本発明はさらに、哺乳動物の腫瘍特にヒトの腫瘍を治療するために本発明の中に記述されているウイルスを使用する方法において、腫瘍細胞内での本発明に記載のウイルスの感染に先立ち、及び／又はそれと同時に及び／又はその後に化学抗腫瘍薬を投与する段階をさらに内含する方法を提供する。
【００５３】
治療上の効力をさらに増強するため、本発明の中で記述されている腫瘍細胞内で特異的に伝播しかつ高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを、従来の化学療法薬（例えばシス−プラテン、５−フッ素ウリジン、マイトシン−Ｃなど）、生体毒素（例えばヘビ毒素）、モノクローナル抗体と合わせて、腫瘍療法のために使用することができる。それは、抗腫瘍薬に対しより優れた効果をもつ。本発明のもう１つの実施形態においては、本発明のウイルスをＸ線と組合わせることができ、これはさらに優れた抗腫瘍効果を生み出すことができる。
【００５４】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力を持つウイルスを提供し、該ウイルスは、腫瘍細胞内のウイルス自体の複製及び伝播を通して腫瘍細胞の成長を特異的に抑制することができる。
【００５５】
本発明は、腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させるための腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供する。ウイルスは、腫瘍細胞内で複製し伝播し、結果として、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数及び血管形成阻害物質の発現量を増大させる。
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供する。このウイルスは、腫瘍細胞内で選択的に複製し伝播し、血管形成阻害物質をコードするヌクレオチド配列のコピー数及び腫瘍細胞内の血管形成阻害物質の発現量の増加を導き、かくして腫瘍の血管新生を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制するために使用可能である。その一方で、ウイルスは、腫瘍細胞内で伝播でき、腫瘍細胞内にのみ制限され、又腫瘍細胞を直接特異的に死滅させることもできる。
【００５６】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、腫瘍細胞の成長を抑制するための本発明で記述されているウイルスの使用をも提供している。
【００５７】
現行の腫瘍療法と比べて、本発明の有利な効果は、以下のように示される：
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し、高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつ、腫瘍治療用のウイルスを提供する。動物実験は、組換え型ウイルスを腫瘍の治療のために使用できるということを確認した。
【００５８】
本発明は、腫瘍細胞内で特異的に伝播し高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを構築するための方法を提供する。この方法は容易に利用可能であり、腫瘍細胞内で特異的に伝播し高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを構築するために使用することができる。
【００５９】
本発明は、正常な細胞に影響を与えることなくｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で腫瘍細胞を死滅させ、さらにｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で腫瘍細胞内で高レベルで血管形成阻害物質を発現する能力をもつウイルスを提供する。化学抗腫瘍薬と組合わされた状態で、それは腫瘍細胞をより効果的に死滅させることになり、高い効率及び低い毒性で腫瘍療法のためにこのウイルスを用いるという目標を達成する。
【００６０】
ヒトアデノウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦという６つの異なる亜族に分類される。それらの宿主細胞向性、新形成ならびにウイルスによって誘発された疾病の性質は、同一ではない。本発明は、本発明をさらに詳述するための例示として、アデノウイルスＣ亜属５型（Ａｄ５）を利用する。本発明の全ての構築手段が、当業者には利用可能である。
【００６１】
実施例
本発明で有用な分子生物学方法、例えば、制限酵素消化、連結、形質転換、ハイブリダイゼーションなどといった従来の方法は、相反する規定のないかぎり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、分子クローニング、その実験室マニュアル（第２版）及びメーカーにより推奨される指示事項を参考にして実施される。
【００６２】
例１：ヒトエンドスタチン遺伝子のＥ１領域を担持するアデノウイルスベクターの構築
ベクターｐＣＡ１３は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（トロント、カナダ）から市販されていたものである。ｐＣＡ１３は、ｂｐ２２から５７９０までの５型アデノウイルス配列及びＥ１領域内の３４２ｂｐから３５２３ｂｐまでの欠失を含んでいる。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）及びＳＶ４０ポリアデニル化テイルシグナル配列を、Ｅ１の欠失領域内に挿入した。ヒトエンドスタチン遺伝子を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した。ヒト合計ＲＮＡを、新鮮な正常なヒト肝組織から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを用い（手順については、ＲＴ−ＰＣＲ、ＫｉｔのためのＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐＴＭ第１鎖合成システム、ＧＩＢＣＯＢＲＬ Ｃｏｍｐａｎｙの仕様を参照のこと）、ランダムプライマを使用してヒトエンドスタチン遺伝子を増幅した。２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（手順については、Ｗｈｉｔｅ ＢＡ． ｅｄ．，ＰＣＲプロトコルの現行の方法及び応用、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９３を参照のこと）により、遺伝子の前にＭ−オンコスタチンシグナルペプチドを添加し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂｓＩ制限酵素部位を遺伝子の前及び終りで導入した。
【化１】
2004513663.tif 000002
【００６３】
ここで、鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ産物を、プライマとしてプライマ２及びプライマ３を用いて、第１のＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ条件は、以下の通りである。逆転写産物１μｌ、１０×緩衝液５μｌ、２ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ ２μｌ、各プライマ０．１μｇ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ３ｕ。合計体積５０μｌとなるまで水を添加し、変性のため５分間９４℃、次に３０秒間９４℃、３０秒間５０℃、１分間７２℃、全３０サイクル、拡張のため１０分間７２℃、そして６１５ｂｐのフラグメントを回収した。ここで第２のＰＣＲ増幅を、プライマとしてプライマ１及びプライマ３を、鋳型として６１５ｂｐのフラグメントを用いて実施した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：第１の増幅からの産物１μｌ、１０×５μの緩衝液、２ｍｍｏｌ／ＬのＮＴＰ２μｌ、各プライマ０．１μｇ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ。合計体積５０μｌになるまで水を添加し、変性のため５分間９４℃、次に３０秒間９４℃、３０秒間５０℃、１分間７２℃、合計３０サイクル、拡張のため１０分間７２℃、そして６４７ｂｐのフラグメントを回収した。回収したフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、配列決定のため、ベクターｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ（＋）（ＡＴＣＣ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＵＳＡ）内に挿入し、配列番号４として示されているヌクレオチド配列が得られた。なおこの配列中、ｂｐ１０から８２までのヌクレオチド配列は使用されたＭ−オンコスタチンシグナルペプチドをコードし、ｂｐ８３から６３２までのヌクレオチド配列は、前記エンドスタチンをコードする。前記フラグメントは、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩによる消化からのものであり、ベクターｐＣＡ１３のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位内へと配向した状態で挿入され、ｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンと呼称した。
【００６４】
例２：　アンギオスタチン遺伝子のＥ１欠失を伴うアデノウイルスベクターの構築
ヒトアンギオスタチン遺伝子を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。合計ＲＮＡを、新鮮で正常なヒト肝組織から抽出した。ＲＴ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより、ランダムプライマを用いてアンギオスタチン遺伝子を増幅させた。２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（手順については、Ｗｈｉｔｅ ＢＡ ｅｄ， 前掲書を参照のこと）を用いることにより、遺伝子の終りにＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素の両方の部位を導入した。
【化２】
2004513663.tif 000003
【００６５】
第１のＰＣＲを、ＲＴ−ＰＣＲ産物及びプライマ４及び５、プライマ６及び７をそれぞれ用いて実施し、その後両方のＰＣＲ産物をプライマ４及び７を用いて第２のＰＣＲのために混合した。１１６８ｂｐフラグメントを回収し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、その後、配列決定のためにベクターｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ（＋）（ＡＴＣＣ　Ｃｏｍｐａｎｙ， ＵＳＡ）内に挿入した。結果は、配列番号９として示されており、ここでｂｐ１１から６６までのヌクレオチド配列は使用済みシグナルペプチドをコードし、ｂｂ６１から１１５５までのヌクレオチド配列は前記アンギオスタチンをコードする。前記フラグメントは、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩでの消化から得たものであり、ベクターｐＣＡ１３のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ内への配向で挿入され、ｐＣＡ１３−ヒトアンギオスタチンと呼称された。
【００６６】
例３：アデノウイルス Ｅ１ｂ５５Ｋｄａタンパク質遺伝子の部分的欠失及び欠失領域内に挿入された停止コドンを含有するベクターの構築
ベクターｐＸＣ．１は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ），Ｃａｎａｄｉａ から市販されているものであった。ｐＸＣ．１は、ｂｐ２２から５７９０までのアデノウイルス５配列を含有している。前記ベクターを、エンドヌクレアーゼＢｇＩＩでｂｐ３３２９において消化し、次にエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化した。９３７２−ｂｐ ＤＮＡフラグメントを回収し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを３′に充てんした。かくして、ｂｐ２８０９からｂｐ３３２９までの欠失領域を伴うｐＸＣ．１ベクターを得た。
【００６７】
２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、アダプタにした。ＤＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【化３】
2004513663.tif 000004
【００６８】
０．１μｇの各々のＤＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントを混合し、５分間１００℃で変性し、次にゆっくりと温度を低下させることにより再生させ、再生の後Ｔ４バクテリオファージポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化させた。リン酸化したアダプタは、ｂｐ２８０９からｂｐ３３２９までの欠失領域を伴うｐＸＣ．１ベクターと連結され、ｐＸＣ−ｄｅｌ ｔｈｅ Ｅ１ｂと呼称された。
【００６９】
アダプタが中に挿入された２つの端部の近くのプライマを合成し、これらはそれぞれ次の通りであった。
【化４】
2004513663.tif 000005
【００７０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための１つの鋳型として上述のｐＸＣ−ｄｅｌ Ｅ１ｂを用いてＰＣＲを実施し、ＰＣＲ産物を配列決定した。結果は配列番号１４として示されている。ここでｐＸＣ−ｄｅｌＥ１ｂはベクターｐＸＣ．１内に２８０９〜３３２９の欠失領域を有し、配列ＴＡＡＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは前記領域内に挿入され、ＢｇｌＩＩ 消化部位は２つの停止コドンの後に保持された。
【００７１】
例４：ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持しＥｌｂ５５Ｋｄａ 遺伝子内に部分的欠失を有するアデノウイルスベクターの構築
ｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチン及びｐＣＡ１３−ヒトアンギオスタチンをＢｇ１ＩＩでそれぞれ消化した。｛ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチドを含有するヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルを含有する｝１２３７ｂｐのフラグメント及び１７５８ｂｐのフラグメント｛ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル｝をそれぞれ回収した。回収したフラグメントをｐＸＣ−ｄｅｌＥＩｂのＢｇｌＩＩ部位内に挿入し、センス又はアンチセンス挿入配向を同定するためにＰＣＲを用いた：それぞれヒトエンドスタチンの５′及び３′−プライマ及びヒトアンギオスタチンの５′及び３′−プライマでの増幅のために、ＢｇｌＩＩの上流プライマ：ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＣＴＴＡ（配列番号１２）を使用した。
【００７２】
１）　この上流プライマ及びヒトエンドスタチン５′−プライマ及び３′−プライマを用いてＰＣＲを実施した：
【００７３】
プライマ１２、すなわちヒトエンドスタチン５′−プライマ（Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチド及びヒトエンドスタチン遺伝子の１１０〜１３１ｂｐにある）
【化５】
2004513663.tif 000006
【００７４】
プライマ１３、すなわちヒトエンドスタチン３′−プライマ（Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチド及びヒトエンドスタチン遺伝子の５７７〜６００ｂｐにある）
【化６】
2004513663.tif 000007
【００７５】
プライマ１０及び１３を用いた増幅により１０５６ｂｐのフラグメントを得、これはＰＣＲ産物がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）を含有することを表わし、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルが、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂ−エンドスタチン１と呼称されるセンス配向のｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂのＢｇｌＩＩ部位内に挿入された。
【００７６】
プライマ１０及び１２を用いた増幅により７５２ｂｐのフラグメントを得、これは、ＰＣＲ産物がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）を含有することを表わし、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルを、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂのＢｇｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入し、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂ−エンドスタチン２と呼称した。
【００７７】
２）　この上流プライマ及びヒトアンギオスタチン５′−プライマ及び３′−プライマを用いてＰＣＲを実施した：
【００７８】
プライマ１４、すなわちヒトアンギオスタチン５′−プライマ（ヒトアンギオスタチン遺伝子の１１〜３２ｂｐにある）
【化７】
2004513663.tif 000008
【００７９】
プライマ１５、すなわちヒトアンギオスタチン３′−プライマ（ヒトアンギオスタチン遺伝子の８２３〜８４２ｂｐにある）
【化８】
2004513663.tif 000009
【００８０】
プライマ１０及び１５を用いた増幅により１２９８ｂｐのフラグメントを得、これはＰＣＲ産物がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）を含有することを表わし、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルを、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂのＢｇｌＩＩ部位内にセンス配向で挿入し、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂ−アンギオスタチン１と呼称した。
【００８１】
プライマ１０及び１２を用いた増幅により１３７４ｂｐのフラグメントを得、これは、ＰＣＲ産物がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含有することを表わし、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルを、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂのＢｇｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入し、ｐＸＣ−ｄｅｌＥｌｂ−アンギオスタチン２と呼称した。
【００８２】
例５：ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持しＥｌｂ５５Ｋｄ〜遺伝子内に部分的欠失をもつ組換え型アデノウイルス
Ｅ１形質転換を受けたヒト胎児腎細胞系統すなわち細胞系統２９３は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（トロント）、カナダから市販されていたものであり、分割されたアデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換されたヒト胎児腎細胞から誘導された。この細胞系統は、アデノウイルス５型のＥ１領域を含有し、発現する。さらに、それは高いトランスフェクション効率でアデノウイルスのＤＮＡにより形質転換させることができる。２９３個の細胞を、アデノウイルス５型の右腕を含むもう１つのプラスミドと合わせてアデノウイルス５型の左腕を含む１つのプラスミドを用いて同時トランスフェクションに付し、かくして相同な組換え体による感染のための能力をもつアデノウイルスが得られた。細胞系統２９３を、例１〜４の、ｐＸＣ−ｄｅｌ Ｅｌｂ−エンドスタチン１、ｐＸＣ−ｄｅｌ Ｅｌｂ−エンドスタチン２、ｐＸＣ−ｄｅｌ Ｅｌｂ−アンギオスタチン１又はｐＸＣ−ｄｅｌ Ｅｌｂ−アンギオスタチン２のように誘導されたものとアデノウイルス５型の右腕を含むプラスミドｐＢＨＧ１０又はｐＢＨＧＥ３とのリポフェクタミンによる同時トランスフェクションに付した。詳細な手順については、ＧｌＢＯＣＯＢＲＬ社の取扱い説明書を参照のこと。ｐＢＨＧ１０及びｐＢＨＧＥ３は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ（オンタリオ）、カナダから市販されていたものであり、ｐＢＨＧ１０は、アデノウイルス５型の右腕を含むが、Ｅ３領域の欠失を有し、一方ｐＢＨＧＥ３は、アデノウイルス５型の右腕及びＥ３領域を含む。同時トランスフェクションから９〜１４日後に、ウイルスプラークが得られた。３回のウイルスプラークの精製により、組換え型アデノウイルスが得られ、ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−２、ＣＮＨ Ｋ−エンドスタチン２−１、ＣＮＨＫ−エンドスタチン２−２及びＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−２、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン２−１及びＣＮＨＫ−アンギオスタチン２−２と呼称された。細胞トランスフェクションのための詳細な方法については、Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ ｅｄ．， 遺伝子トランスファ及び発現のプロトコル、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９１、なおここで組換え型アデノウイルスの構築のための方法については、例１〜４を参照のこと。各々の獲得したウイルスのゲノム構造及び特定的名称は、それぞれ下表１に示されている。
【００８３】
【表１】
2004513663.tif 000010
【００８４】
アデノウイルスは、２９３個の細胞中で大規模に伝播しており、塩化セシウム勾配遠心分離によって大量に精製することができる（詳細な手順については、Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ ｅｄ， 前掲書を参照のこと）。
【００８５】
Ａｄ５−ｄｅｌ Ｅｌｂ−エンドスタチン１（ＣＮＨＫ−エンドスタチン−１−１）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、センス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００８６】
Ａｄ５−ｄｅｌ Ｅｌｂ−エンドスタチン２（ＣＮＨＫ−エンドスタチン−１−２）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、アンチセンス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００８７】
Ａｄ５−ｄｅｌ ＥｌｂＥ３−エンドスタチン１（ＣＮＨＫ−エンドスタチン−２−１）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、センス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入され、その間同時に２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）が欠失させられた。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００８８】
Ａｄ５−ｄｅｌ ＥｌｂＥ３−エンドスタチン２（ＣＮＨＫ−エンドスタチン−２−２）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、アンチセンス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入され、その間同時に２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）が欠失させられた。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００８９】
Ａｄ５−ｄｅｌ Ｅｌｂ−アンギオスタチン１（ＣＮＨＫ−アンギオスタチン−１−１）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、センス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００９０】
Ａｄ５−ｄｅｌ Ｅｌｂ−アンギオスタチン２（ＣＮＨＫ−アンギオスタチン−１−２）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、アンチセンス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００９１】
Ａｄ５−ｄｅｌ ＥｌｂＥ３−アンギオスタチン１（ＣＮＨＫ−アンギオスタチン−２−１）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、センス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入され、その間同時に２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）が欠失させられた。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００９２】
Ａｄ５−ｄｅｌ ＥｌｂＥ３−アンギオスタチン２（ＣＮＨＫ−アンギオスタチン−２−２）はアデノウイルス５型であり２８０９〜３３２９ｂｐ（Ｅｌｂ ５５Ｋｄａ遺伝子の部分的配列）の間に欠失突然変異領域を有する。２つの停止コドンを含有する配列ＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡＡは、前記欠失突然変異領域内に挿入され、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）を含む配列、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、停止コドンの後、アンチセンス配向でＢｇｌＩＩ部位内に挿入され、その間同時に２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）が欠失させられた。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同じである。
【００９３】
例６：　ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持しＥｌｂ５５Ｋｄａの遺伝子の部分的欠失をもつ組換え型アデノウイルスによる、腫瘍細胞内でのｉｎ ｖｉｔｒｏ複製及び伝播、ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンの高効率発現及び腫瘍細胞の特異的死滅
それぞれ、肝臓癌細胞系統ＨｅＰ３Ｂ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）及びＨｅＰ ＧＩＩ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、膵臓癌細胞系統 ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、結腸癌細胞系統ＨＴ２９（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、胃癌細胞系統 ＳＧＣ７９０１、頸癌細胞系統 Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、黒色腫細胞系統 Ａ３７５（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、肺癌細胞系統　Ａ５４９（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、乳癌細胞系統　ＭＢＤ−２３１（ＡＴＣＣ、ＵＳＡより市販のもの）、２９３及びヒト正常繊維芽細胞を感染させるために、例５のＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１及びＯＮＹＸ−０１５（ＵＳＡ、カリフォルニア大学のＢｅｒｋ ＡＪ教授より提供されたもの）と同じように構築された組換え型アデノウイルスを使用した。細胞を６ウェルの平板内で１ウェルあたり２×１０５個の細胞の割合で接種し、それぞれ４×１０５ｐｆｕの用量で組換え型アデノウイルスＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１−１、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１−１で感染させた。９６時間後に、細胞系統２９３を用いてウイルス力価を検定し、伝播倍数を計算した。（詳しい手順については、Ｍｕｒｒａｙ ＥＪ　ｅｄ． 前掲書を参照のこと）。結果は下表２に示されている。
【００９４】
【表２】
2004513663.tif 000011
【００９５】
肝癌細胞系統　Ｈｅｐ３Ｂ及びヒト正常繊維芽細胞を以下の組換え型アデノウイルス、すなわちＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１、及びＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−２により１ＭＯＩでそれぞれ感染させ、１時間３７℃でインキュベートした。感染から７日後に、細胞を収集し、ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄミニキット（ＱＩＡＧＥＮ　Ｃｏｍｐａｎｙ， ドイツ）を用いて、ウイルスＤＮＡを抽出した。手順については、ＱＩＡＧＥＮ社の取扱い説明書を参照のこと。抽出したＤＮＡをＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化させ、０．８％のアガロースゲル内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、ウイルスコピーの対照としてｐＸＣ．１を用いてサザンブロットのため（アデノウイルスのｎｔ４６１１−５７８９にある）ＢｓｔＸＩ−ＸｈＩフラグメントの３２Ｐで標識づけされたヒトＡｄ５１１７８ｂｐでハイブリッド形成させた。ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１、ＣＮＨＫ−エンドスタチン−２、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１及びＣＮＨＣ−アンギオスタチン１−２の、肝癌細胞系統 Ｈｅｐ３Ｂ及びヒト正常繊維芽細胞の各細胞中でのコピー数は、それぞれ２×１０４、３×１０４、１×１０４、１×１０４及び＜１０、＜１０、＜１０、＜１０、＜１０である。
【００９６】
ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１及びＣＮＨＫ−エンドスタチン１−２から抽出された上述のＤＮＡを、それぞれＢｇｌＩＩで消化させ、１％のアガロースゲル電気泳動内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、ウイルスコピーの対照としてｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを用いてサザンブロットのためのプローブとしてのヒトエンドスタチンの（ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの両方でｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを消化し６３７ｂｐ−フラグメントを回収することで得た）３２Ｐ−標識付けされたｃＤＮＡ フラグメントとハイブリッド形成させた。肝癌細胞系統　Ｈｅｐ３Ｂ及びヒト正常繊維芽細胞の各細胞内のＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１、ＣＮＨＫ−エンドスタチン−２のコピー数は、それぞれ２×１０４、３×１０４及び＜１０、＜１０である。
【００９７】
ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１及びＣＮＨＫ−エンドスタチン１−２から抽出された上述のＤＮＡを、それぞれＢｇｌＩＩで消化させ、１％のアガロースゲル電気泳動内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、ウイルスコピーの対照としてｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを用いてサザンブロットのためのプローブとしてのヒトアンギオスタチンの（ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの両方でｐＣＡ１３−ヒトアンギオスタチンを消化し１１６８ｂｐ−フラグメントを回収することで得た）３２Ｐ−標識付けされたｃＤＮＡ フラグメントとハイブリッド形成させた。肝癌細胞系統　Ｈｅｐ３Ｂ及びヒト正常繊維芽細胞の各細胞内のＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン−２のコピー数は、それぞれ１×１０４、１×１０４及び＜１０、＜１０である。
【００９８】
例７：　ヌードマウスにおける、ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持しＥｌｂ５５Ｋｄａの遺伝子の部分的欠失を有する組換え型アデノウイルスについての研究結果
ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、Ｅｌｂ５５Ｋｄａの遺伝子の部分的欠失をもつ組換え型アデノウイルスを、ヌードマウスにおける移植された腫瘍の治療のために使用した。この研究は、前記ウイルスがヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを高いレベルで発現し、腫瘍の発生期血管の形成を抑制し、腫瘍の形成、成長及び転移を抑制できるということを実証した。その一方で、前記ウイルスは、腫瘍細胞内で伝播でき、腫瘍細胞内のみに限られ、又腫瘍細胞を特異的に直接死滅させることができる。
【００９９】
生後４〜５週目のヌードマウスに、結腸癌細胞系統 ＨＴ２９を１×１０７の用量で皮下接種し、２週間後に１×１０９のｐｆｕの用量の伝播性組換え型アデノウイルスＣＮＨＫ−エンドスタチン−１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１及びＯＮＹＸ−０１５で又は同じ用量の対照アデノウイルス Ａｄ５−ＬａｃＺで処置した。未処置の対照グループ及び対照Ａｄ５−ＬａｃＺで処置したグループの腫瘍は、４週間後に１０倍以上増大した。これに対して、ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１及びＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１での処置済みグループの腫瘍は増大せず、腫瘍の一部分は収縮し、治療効果はＯＮＹＸ−０１５のものよりも優れている。結果は図１に示されている。
【０１００】
生後４〜５週目のＳＣＩＤマウスに、肝臓癌細胞系統 Ｈｅｐ３Ｂを１×１０７の用量で皮下接種し、２週間後に１×１０９のｐｆｕの用量の伝播性組換え型アデノウイルスＣＮＨＫ−エンドスタチン−１−１、ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１で又は同じ用量の対照アデノウイルス Ａｄ５−ＬａｃＺで処置した。未処置の対照グループ及び対照Ａｄ５−ＬａｃＺで処置したグループの腫瘍は、４週間後に４倍以上増大した。これに対して、処置済みグループの腫瘍は明らかに収縮し、腫瘍の一部分は完全に消滅した。
【０１０１】
例８：　ＥＢウイルスのシス作用性要素を含有するベクターのための構築
基本ベクターとしてｐＣＡＴ−Ｂａｓｉｃを用い（Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販のもの）、ＳＶ４０（ミニ−ＳＶ４０）の基本プロモータと組合わせたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群（ＥＢウイルスの７３３７〜８１９０ｂｐにあるＦＲ）をｐＣＡＴ−Ｂａｓｉｃの多数のクローニング部位内に挿入した。ＥＢのＯｒｉｐのプロモータ及びミニ−ＳＶ４０プロモータを増幅するためにＰＣＲを使用した。前者のための鋳型、ＥＢウイルスＤＮＡを、リンパ腫細胞系統Ｂ９５−８から抽出した。ウイルスＤＮＡを抽出する方法については、ＱＩＡＧＥＮ社により提供されているＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄキットの取扱い説明書を参照のこと。後者のための鋳型は、ｐＣＡＴ−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社から市販されているもの）である。ＥＢウイルスのＯｒｉｐのＦＲ用のプライマは、以下の通りである：
【０１０２】
プライマ１６：　５′−プライマ（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＡｇｅＩ部位を含む）
【化９】
2004513663.tif 000012
【０１０３】
プライマ１７：　３′−プライマ（ミニ−ＳＶ４０プロモータの部分的配列を含む）
【化１０】
2004513663.tif 000013
【０１０４】
ミニ−ＳＶプロモータのためのプライマは以下の通りである：
プライマ１８：　５′−プライマ（Ｏｒｉｐの部分的ＦＲ配列を含む）
【化１１】
2004513663.tif 000014
【０１０５】
プライマ１９：　３′−プライマ（ＳａｌＩ及びＡｇｅＩ部位を含む）
【化１２】
2004513663.tif 000015
【０１０６】
次の条件で、２段階オーバーラッピングＰＣＲを使用した：プラスミド０．００１μｇ、１０×緩衝液５μｌ、２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ ２μｌ、各プライマ０．１μｇ、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ。合計体積５０μｌになるまで水を添加、変性のため５分間９４℃、次に３０秒間９４℃、３０秒間５０℃、１．５分間７２℃、合計３０サイクル、拡張のため１０分間７２℃。ＥＢウイルスのＯｒｉｐのＦＲ配列及びミニ−ＳＶ４０プロモータを融合して融合プロモータを生成した。融合プロモータのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌＩで消化させ、ｐＣＡＴ−ＢａｓｉｃベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位の中に挿入した。フラグメントについてのＤＮＡ配列決定により、融合プロモータの配列を、公開さらた配列と完全に対応させ、ＣＨＥＢ−ＦＲＳＶ４０と呼称した。
【０１０７】
基本ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ＡＴＣＣ社から市販のもの）を用い、ＨＳＶ−ＴＫ（ミニ−ＴＫ）の基本プロモータと組合わせたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群（ＥＢウイルスの７３３７〜８１９０ｂｐにあるＦＲ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）多数のクローニング部位内に挿入した。ＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群及びミニ−ＳＶ４０プロモータを増幅するためにＰＣＲを使用した。前者のための鋳型、ＥＢウイルスＤＮＡを、リンパ腫細胞系統Ｂ９５−８から抽出した。ウイルスＤＮＡを抽出する方法は、ＱＩＡＧＥＮ社により提供されているＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄキットの取扱い説明書を参照のこと。後者のための鋳型は、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているもの）である。
【０１０８】
ＥＢウイルスのＯｒｉｐのＦＲを増幅するためのプライマは、以下の通りである：
プライマ２０：　５′−プライマ（ＸｈｏＩ部位を含む）
【化１３】
2004513663.tif 000016
【０１０９】
プライマ２１：　３′−プライマ（部分的ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータの配列を含む）
【化１４】
2004513663.tif 000017
【０１１０】
ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータを増幅するためのプライマは以下の通りである：
プライマ２２：　５′−プライマ（Ｏｒｉｐの部分的ＦＲ配列を含む）
【化１５】
2004513663.tif 000018
【０１１１】
プライマ２３：　３′−プライマ（ＸｂａＩ部位を含む）
【化１６】
2004513663.tif 000019
【０１１２】
ＥＢウイルスのＯｒｉｐのＦＲ配列をミニ−ＴＫプロモータと融合させることにより、融合プロモータを生成するために２段階オーバーラッピングＰＣＲ（前出）を使用した。融合プロモータのＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）ベクタ（ＡＴＣＣ社、ＵＳＡから市販されているもの）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位の中に挿入した。ＤＮＡ配列を決定するために、該フラグメントを使用し、融合プロモータ配列を公開された配列に完全に対応させ、ＣＨＥＢ−ＦＲＴＫと呼称した。
【０１１３】
例９：　ＥＢウイルスのシス作用性要素の制御下でのＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を伴うエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持する減衰した伝播性アデノウイルスベクターの構築
ベクターｐＸＣ．１は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（トロント、カナダ）から市販されていたものであり、ｂｐ２２から５７９０までのアデノウイルス５型配列を含む。部位突然変異誘発２段階ＰＣＲ（手順については例１を参照のこと）によりベクターの５５２ｂｐにあるＥ１Ａ開始コドンに対し１２ｂｐのところに、新しく独特のＡｇｅＩ部位を導入した。プライマはそれぞれ以下の通りである：
【０１１４】
プライマ２４：　５′−プライマ（ＥｃｏＲＩ部位を含む）
【化１７】
2004513663.tif 000020
【０１１５】
プライマ２５：　３′−プライマ（ＡｇｅＩ部位を生成するべくＡを挿入する）
【化１８】
2004513663.tif 000021
【０１１６】
プライマ２６：　５′−プライマ（ＡｇｅＩ部位を生成するべくＴを挿入する）
【化１９】
2004513663.tif 000022
【０１１７】
プライマ２７：　３′−プライマ（ＸｂａＩ部位を含む）
【化２０】
2004513663.tif 000023
【０１１８】
部位突然変異誘発２段階ＰＣＲを使用し、ＰＣＲ産物フラグメントを、ＤＮＡ配列決定のためのｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター内に挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅｌａと呼称した（手順については、Ｐｒｏｍｅｇａ社の取扱い説明書を参照のこと）。ＤＮＡ配列決定の結果は、塩基ＴがプラスミドｐＸＣ．１のｂｐ５５２に挿入され、かくして新しいＡｇｅＩ部位を生成し、もう１方の配列がｐＸＣ．１のものと同じであることを示した。
【０１１９】
プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＥｌＡ及びｐＸＣ．ＩをそれぞれＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＥｌＡから消化させたフラグメントをｐＸＣ．ＩのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位の中に挿入した。かくして塩基ＴがｐＸＣ．１の５５２ｂｐで挿入されて、Ｅ１Ａ開始コドンに対し１２ｂｐのところにＡｇｅＩ部位を生成した。結果としてもたらされたプラスミドはｐＸＣ．１−ＡｇｅＩと呼称した。
【０１２０】
ＣＨＥＢを、それぞれＡｇｅＩで消化し、消化したフラグメントをそれぞれにプラスミドｐＸＣ−ＡｇｅＩのＡｇｅＩ部位の中に挿入した。ＰＣＲ増幅をそれぞれにプライマ２４及び１９を用いて実施し、２０５０ｂｐのフラグメントを得、これは、ミニ−ＳＶ４０プロモータと組合わされたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群が、プラスミドｐＸＣ−ＡｇｅＩのＡｇｅＩ部位の内にセンス配向で、すなわちアデノウイルスのＥｌＡ開始コドンに対し上流側１２ｂｐのところに挿入され、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥｌＡと呼称されるということを表わしていた。ミニ−ＳＶプロメータと組合わされたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群がプラスミドｐＸＣ−ＡｇｅＩのＡｇｅＩ部位内にセンス配向で挿入されたことをさらに確認するため。
【０１２１】
ベクターｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａを、本研究においてＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、２８２３ｂｐのフラグメントを回収し、配列決定のためベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位内に挿入した。結果は、ミニ−ＳＶプロメータと組合わされたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群がプラスミドｐＸＣ−ＡｇｅＩのＡｇｅＩ部位内にセンス配向で挿入されたということを確認し、該配列は配列番号３１として記述されている。
【０１２２】
ベクターｐＸＣ．１は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（トロント、カナダ）から市販されていたものであり、ｂｐ２２から５７９０までのアデノウイルス５型配列を含んでいる。部位突然変異誘発２段階ＰＣＲによりベクターの１６８６ｂｐにあるＥ１Ｂの開始コドンと転写開始部位の間に、ＢａｇＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを内含する多数の制限酵素部位を導入した（手順については前掲書）。プライマはそれぞれ、以下の通りである：
プライマ２８：　５′−プライマ（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｐａＩ部位を含む）
【化２１】
2004513663.tif 000024
【０１２３】
プライマ２９：　３′−プライマ（４つの制限酵素部位を生成する）
【化２２】
2004513663.tif 000025
【０１２４】
プライマ３０：　５′−プライマ（４つの制限酵素部位を生成する）
【化２３】
2004513663.tif 000026
【０１２５】
プライマ３１：　３′−プライマ（ＫｐａＩ部位を含む）
【化２４】
2004513663.tif 000027
【０１２６】
部位突然変異誘発２段階ＰＣＲを使用し、ＰＣＲ産物をＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＫｐｎＩで消化し、（ＡＴＣＣ社、ＵＳＡから入手した）ベクターｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位内に挿入し、ｐＵＣ−Ｅ１Ｂと呼称した。フラグメントについてのＤＮＡ配列決定により、結果はＥ１Ｂの開始コドンと転写開始部位の間にＢａｇＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位が挿入され、その他の配列はｐＸＣ．Ｉと同じであったことを示していた。
【０１２７】
ＣＨＥＢ−ＦＲＴＫを、それぞれＸｈｏＩ及びＸｂａＩで消化した。消化したフラグメントを、プラスミドｐＵＣ−Ｅ１ＢのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位内に挿入した。すなわちミニ−ＳＶプロメータと組合わされたＥＢのＯｒｉｐの３０ｂｐの反復フラグメントの系統群をＥ１Ｂの開始コドンと転写開始部位の間にセンス配向で挿入し、ｐＵＣ−Ｅ１Ｂ−ＦＲＩＫと呼称した。その後プライマ２８及び２３を用いてＰＣＲ増幅を実施し、１１５９ｂｐ−フラグメントを得、これは、ミニ−ＴＫプロモータと組合わされたＥＢウイルスのＯｒｉｐのＦＲがプラスミドｐＵＣのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ部位内にセンス配向で挿入されたことを表わしていた。ＤＮＡ配列決定の結果は、配列番号３６として示されている。
【０１２８】
ｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチン及びｐＣＡ１３−ヒトアンギオスタチンを、それぞれＢｇｌＩＩで消化した。｛ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチドを含有するヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルを含有する｝１２３７ｂｐのフラグメント及び１７５８ｂｐのフラグメント｛ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル｝をそれぞれ回収した。回収したフラグメントをｐＵＣ−Ｅ１Ｂ−ＦＲＴＫのＢｇｌＩＩ部位内に挿入し、センス又はアンチセンス挿入配向を同定するためにＰＣＲを用いた。ＢｇＩＩＩの上流側のプライマは以下の通りである。
【化２５】
2004513663.tif 000028
【０１２９】
１）　この上流プライマ及びヒトエンドスタチン５′−プライマ及び３′−プライマを用いてＰＣＲを実施した：
プライマ１２、すなわちヒトエンドスタチン５′−プライマ（Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチド及びヒトエンドスタチン遺伝子の１１０〜１３１ｂｐにある）
【化２６】
2004513663.tif 000029
【０１３０】
プライマ１３、すなわちヒトエンドスタチン３′−プライマ（Ｍ−オンコスタチンシグナルペプチド及びヒトエンドスタチン遺伝子の５７７〜６００ｂｐにある）
【化２７】
2004513663.tif 000030
【０１３１】
結果は、以下の通りである：プライマ３２及び１３を用いた増幅により１１２２ｂｐのフラグメントを得、これはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルが、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫのＢｇｌＩＩ部位内にセンス方向に挿入され、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−エンドスタチン１と呼称されたということを表わしていた。
【０１３２】
プライマ３２及び１２を用いた増幅により８１８ｂｐのフラグメントを得、これは、産物がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９〜＋７２）、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルが、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫのＢｇｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入され、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫエンドスタチン２と呼称されたということを表わしていた。
【０１３３】
２）　それぞれこの上流プライマ及びヒトアンギオスタチン５′−プライマ及び３′−プライマを用いてＰＣＲを実施した：
【０１３４】
プライマ１４、すなわちヒトアンギオスタチン５′−プライマ（ヒトアンギオスタチン遺伝子の１１〜３２ｂｐにある）
【化２８】
2004513663.tif 000031
【０１３５】
プライマ１５、すなわちヒトアンギオスタチン３′−プライマ（ヒトアンギオスタチン遺伝子の８２３〜８４２ｂｐにある）
【化２９】
2004513663.tif 000032
【０１３６】
結果は以下の通りである：プライマ３２及び１５を用いた増幅により１３６４ｂｐのフラグメントを得、これはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルが、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫのＢｇｌＩＩ部位内にセンス配向で挿入され、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−アンギオスタチン１と呼称されたということを表わしていた。
【０１３７】
プライマ３２及び１４を用いた増幅により１４４０ｂｐのフラグメントを得、これはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナルが、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫのＢｇｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入され、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−アンギオスタチン２と呼称されたということを表わしていた。
【０１３８】
得られたｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−エンドスタチン１、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−エンドスタチン２、ｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−アンギオスタチン１及びｐＵＣ−ＥｌＢ−ＦＲＴＫ−アンギオスタチン２を、それぞれＨｐａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素の両方で消化させた。消化したフラグメントを回収し、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１ＡのＨｐａＩ−ＫｐｎＩ部位の中に挿入して、それぞれｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−エンドスタチン１、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−エンドスタチン２、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−アンギオスタチン１及びｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−アンギオスタチン２と呼称した。
【０１３９】
例１０：　ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、ＥＢウイルスのシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を有する減衰した伝播性アデノウイルスベクターの組合せ
細胞系統２９３は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（トロント、カナダ）から市販され、分割されたアデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換されたヒト胎児腎細胞から誘導されたものである。該細胞系統は、アデノウイルス５型のＥ１領域を含みこれを発現する。さらに、それは高いトランスフェクション効率でアデノウイルスのＤＮＡにより形質転換させることができる。２９３個の細胞を、アデノウイルス５型の右腕を含むもう１つのプラスミドと合わせてアデノウイルス５型の左腕を含む１つのプラスミドを用いて同時トランスフェクションに付し、かくして相同な組換えによる感染のための能力をもつアデノウイルスを生成させた。
【０１４０】
細胞系統２９３を、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−エンドスタチン１、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−エンドスタチン２、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−アンギオスタチン１、ｐＸＣ−ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＳＶＥ１Ｂ−アンギオスタチン２及びアデノウイルスＳ型の右腕を含むプラスミドＰＢＨＧ１０と、リポフェクタミンによって同時トランスフェクションに付した。詳細な手順については、Ｇ１ＢＯＣＯ ＢＲＬ社の取扱い説明書を参照のこと。ｐＢＨＧ１０は、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ（オンタリオ、カナダ）から市販されていたものであり、アデノウイルス５型の右腕を含むが、Ｅ３領域の欠失を有する。同時トランスフェクションから９〜１４日後に、ウイルスプラークが得られた。３回のウイルスプラークの精製により、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合されたＯｒｉｐＦＲ及びミニ−ＳＶプロモータと組合されたＥＢウイルスのＯｒｉｐ ＦＲといったシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を伴って、アデノウイルスが得られ、それぞれＥＢＶ ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＴＫＥ１Ｂ−エンドスタチン１、ＥＢＶ ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＴＫＥ１Ｂ−エンドスタチン２、ＥＢＶ ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＴＫＥ１Ｂ−アンギオスタチン１及びＥＢＶ ＦＲＳＶＥ１Ａ−ＦＲＴＫＥ１Ｂ−アンギオスタチン２と呼称され、それぞれＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン２、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２として記録された。
【０１４１】
上述の方法によって構築された組換え型ウイルスは表３に示されている。
【０１４２】
【表３】
2004513663.tif 000033
【０１４３】
アデノウイルスは、２９３個の細胞中で大規模に伝播しており、塩化セシウム勾配遠心分離によって大量に精製することができる。ＥＢＶ　ＦＲＳＶＥＩＡ−ＦＲＴＫ　Ｅ１Ｂ−エンドスタチン１（ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１）は、アデノウイルス５型であり、ここでＥＢウイルスのシス作用性要素すなわち、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐＦＲ及びミニ−ＳＶ４０プロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂのコーディング開始部位と転写開始部位の間に挿入されている。さらに、ＢａＩＩＩ制限部位が、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲの上流側領域とＥ１Ａの停止コドンの後の領域の間に導入されており、ここで、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）の欠失と同時に、ＢａｌＩＩ部位内にセンス配向で挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同一である。
【０１４４】
ＥＢＶ　ＦＲＳＶＥＩＡ−ＦＲＴＫ　Ｅ１Ｂ−エンドスタチン２（ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン２）は、アデノウイルス５型であり、ここでＥＢウイルスのシス作用性要素すなわち、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐＦＲ及びミニ−ＳＶ４０プロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂのコーディング開始部位と転写開始部位の間に挿入されている。さらに、ＢａＩＩＩ制限部位が、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲの上流側領域とＥ１Ａの停止コドンの後の領域の間に導入されており、ここで、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、Ｍ−オンコスタチンのシグナルペプチドを含むヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）の欠失と同時に、ＢａｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同一である。
【０１４５】
ＥＢＶ　ＦＲＳＶＥＩＡ−ＦＲＴＫ　Ｅ１Ｂ−アンギオスタチン１（ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１）は、アデノウイルス５型であり、ここでＥＢウイルスのシス作用性要素すなわち、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐＦＲ及びミニ−ＳＶ４０プロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂのコーディング開始部位と転写開始部位の間に挿入されている。さらに、ＢａＩＩＩ制限部位が、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲの上流側領域とＥ１Ａの停止コドンの後の領域の間に導入されており、ここで、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、ヒトアンギオスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）の欠失と同時に、ＢａｌＩＩ部位内にセンス配向で挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同一であるＥＢＶ　ＦＲＳＶＥＩＡ−ＦＲＴＫ　Ｅ１Ｂ−アンギオスタチン２（ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２）は、アデノウイルス５型であり、ここでＥＢウイルスのシス作用性要素すなわち、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐＦＲ及びミニ−ＳＶ４０プロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂのコーディング開始部位と転写開始部位の間に挿入されている。
【０１４６】
さらに、ＢａＩＩＩ制限部位が、ミニ−ＨＳＶ−ＴＫプロモータと組合わされたＯｒｉｐ ＦＲの上流側領域とＥ１Ａの停止コドンの後の領域の間に導入されており、ここで、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（−２９９…＋７２）、ヒトエンドスタチン遺伝子及びＳＶ４０ポリＡテイルシグナル配列は、２８１３３−３０８１８ｂｐ（Ｅ３領域の部分的配列）の欠失と同時に、ＢａｌＩＩ部位内にアンチセンス配向で挿入された。ウイルスのその他の配列は、Ａｄ５のものと同一である。
【０１４７】
例１１：　ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、ＥＢウイルスのシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を有する減衰した伝播性アデノウイルスについての ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究
ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、ＥＢウイルスのシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を有する減衰した伝播性アデノウイルスについてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究は、前記ウイルスがＥＢによる感染又は潜伏感染を受けている腫瘍細胞の中で伝播し、複製し、高レベルでヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを発現でき、腫瘍細胞を特異的に死滅させることができるということを実証した。
【０１４８】
リンパ腫細胞系統 Ｊｉｊｏｙｅ、２９３及びＥＢウイルスによる感染を受けたヒト正常繊維芽細胞を、それぞれ、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン２、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２で感染させた。１ウェルあたり２×１０５個の細胞を６ウェル平板内に接種し、それぞれ４×１０６ｐｆｕの用量で組換え型アデノウイルス ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２、及び野生型アデノウイルス５型で感染させた。４８時間後に、細胞系統２９３を用いてウイルス力価を検定した。結果は、表４に示されている。
【０１４９】
【表４】
2004513663.tif 000034
【０１５０】
リンパ腫細胞系統 Ｊｉｊｏｙｅ及び感染性ＥＢウイルスによる感染を受けたヒト正常繊維芽細胞を、１ＭＯＩで、それぞれ、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン２、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２で感染させ、１時間３７℃でインキュベートした。感染から７日後に、細胞を収集し、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社、ドイツ）を用いてウイルスＤＮＡを抽出した。手順については、ＱＩＡＧＥＮ社の取扱い説明書を参照のこと。抽出したＤＮＡをＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化させ、０．８％のアガロースゲル電気泳動内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、ウイルスコピー数の対照としてｐＸＣ．１を用いてサザンブロットのため（アデノウイルスのｎｔ４６１１−５７８９にある）ＢｓｔＸＩ−ＸｈＩフラグメントの３２Ｐで標識づけされたヒトＡｄ５１１７８ｂｐでハイブリッド形成させた（手順については「分子クローニング実験室マニュアル」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、１９９２を参照のこと）。ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン−２、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン及びＣＮＨＣＥＢＶ−アンギオスタチン２の、Ｊｉｊｏｙｅ及び正常なヒト繊維芽細胞の各細胞中でのコピー数は、それぞれ５×１０４、５×１０４、４×１０４、１×１０４及び＜１０、＜１０、＜１０、＜１０、＜１０であった。
【０１５１】
ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン２から抽出された上述のＤＮＡを、それぞれＢｇｌＩＩで消化させ、１％のアガロースゲル電気泳動内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、サザンブロットのためのプローブとしてのヒトエンドスタチンの（ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの両方でｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを消化し６３７ｂｐ−フラグメントを回収することで得た）３２Ｐ−標識付けされたｃＤＮＡ フラグメントとハイブリッド形成させた。ウイルスコピーの対照としてｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを用いて、Ｊｉｊｏｙｅ及び正常なヒト繊維芽細胞の各細胞内のＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン−２のウイルスコピー数は、それぞれ５×１０４、５×１０４及び＜１０、＜１０であった。
【０１５２】
ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン２から抽出された上述のＤＮＡを、それぞれＢｇｌＩＩで消化させ、１％のアガロースゲル電気泳動内で走らせ、ナイロン膜上に移送し、サザンブロットのためのプローブとしてのヒトアンギオスタチンの（ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの両方でｐＣＡ１３−ヒトアンギオスタチンを消化し１１６８ｂｐ−フラグメントを回収することで得た）３２Ｐ−標識付けされたｃＤＮＡ フラグメントとハイブリッド形成させた。ウイルスコピーの対照としてｐＣＡ１３−ヒトエンドスタチンを用いて、（手順については「分子クローニング実験室マニュアル」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、１９９２を参照のこと）、Ｊｉｊｏｙｅ及び正常なヒト繊維芽細胞の各細胞内のＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１、ＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン−２のウイルスコピーは、それぞれ４×１０４、４×１０４及び＜１０、＜１０であった。
【０１５３】
例１２：　ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、ＥＢウイルスのシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を有する減衰した伝播性アデノウイルスについてのＳＣＩＤマウス内での研究
ヒトエンドスタチン又はアンギオスタチンを担持し、ＥＢウイルスのシス作用性要素の下で制御されたＥ１Ａ及びＥ１Ｂの発現を有する減衰した伝播性アデノウイルスについてのＳＣＩＤマウス内での研究は、ＥＢによる感染又は潜伏感染を受けている移植された腫瘍を治療するために実施された。
【０１５４】
生後４〜５週目のＳＣＩＤマウスに、ＥＢウイルス感染を受けたリンパ腫細胞系統 Ｊｉｊｏｙｅを５×１０７の用量で皮下接種し、２週間後に１×１０８ｐｆｕの用量の伝播性組換え型アデノウイルスＣＮＨＫＥＢＶ−エンドスタチン１及びＣＮＨＫＥＢＶ−アンギオスタチン１で又は同じ用量の対照アデノウイルス Ａｄ５−ＬａｃＺで処置した。未処置の対照グループ及び対照Ａｄ５−ＬａｃＺで処置したグループの腫瘍は、４週間後に３倍以上に増大した。これに対して、処置済みグループの腫瘍は明らかに収縮し、そのうちの一部は完全に消滅した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、エンドスタチン遺伝子を担持するＥ１ｂ５５ｋＤａのタンパク質遺伝子内の部分的欠失を伴う本発明の組換え型アデノウイルス（ＣＮＨＫ−エンドスタチン１−１、略してＣＮＨＫ−ｅｎｄｓ）、及びアンギオスタチン遺伝子を担持するＥ１ｂ５５ｋＤａのタンパク質遺伝子内の部分的欠失を伴う本発明の組換え型アデノウイルス（ＣＮＨＫ−アンギオスタチン１−１、略してＣＮＨＫ−ａｎｇｉｏ）を用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでの移植されたヒト結腸癌に対するヌードマウスの処置の結果であり、ここでこの治療時間は、Ｘ軸上に示され、腫瘍の物理的体積はＹ座標上に示されている。
【図１】
2004513663.tif 000035
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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