(57)【要約】本発明は新規細菌性フィターゼとその製造方法に関する。本発明は特にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来する新規フィターゼと前記フィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクターと、その組織中に前記フィターゼを発現する形質転換宿主生物にも関する。本発明は更に少なくとも１種のフィターゼ活性を含む新規細菌抽出物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２で表されるフィターゼをコードする単離ポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相同の単離ポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドのフラグメント
から構成される群から選択されることを特徴とするフィターゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で表されることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来することを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
最適活性ｐＨが４以下のフィターゼをコードすることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされることを特徴とするフィターゼ。
【請求項７】
（ａ）配列番号２で表されるフィターゼ、
（ｂ）（ａ）のフィターゼに５０％相同のフィターゼ、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のフィターゼのフラグメント
から構成される群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のフィターゼ。
【請求項８】
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来することを特徴とする請求項６又は７に記載のフィターゼ。
【請求項９】
最適活性ｐＨが４以下であることを特徴とする請求項８に記載のフィターゼ。
【請求項１０】
（ａ）宿主生物で機能的なプロモーターと、
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、
（ｃ）宿主生物において機能的な終結因子
を相互に機能的に連結して少なくとも含むキメラ遺伝子。
【請求項１１】
前記宿主生物において機能的なシグナルペプチド又はトランジットペプチドを更に含むことを特徴とする請求項１０に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のキメラ遺伝子を含む発現又は形質転換ベクター。
【請求項１３】
プラスミド、ファージ又はウイルスであることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換宿主生物。
【請求項１５】
微生物であることを特徴とする請求項１４に記載の宿主生物。
【請求項１６】
微生物が細菌、真菌、酵母及びウイルスから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の宿主生物。
【請求項１７】
微生物がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属から選択される細菌、特に大腸菌であることを特徴とする請求項１６に記載の宿主生物。
【請求項１８】
微生物がＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属から選択される真菌であることを特徴とする請求項１６に記載の宿主生物。
【請求項１９】
微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｉｃｈｉａ属から選択される酵母であることを特徴とする請求項１６に記載の宿主生物。
【請求項２０】
植物細胞、植物又は植物部分であることを特徴とする請求項１４に記載の宿主生物。
【請求項２１】
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来することを特徴とする少なくとも１種のフィターゼ活性を含む細菌抽出物。
【請求項２２】
前記フィターゼ活性の最適活性ｐＨが４以下であることを特徴とする請求項２１に記載の細菌抽出物。
【請求項２３】
フィターゼ活性が以下の特性：
（ａ）最適温度＝６５℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の細菌抽出物。
【請求項２４】
フィターゼ活性が以下の特性：
（ａ）最適温度＝７０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝４
をもつことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の細菌抽出物。
【請求項２５】
フィターゼ活性が以下の特性：
（ａ）最適温度＝６０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の細菌抽出物。
【請求項２６】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と
を含むことを特徴とする請求項２１から２５のいずれか一項に記載の細菌抽出物の製造方法。
【請求項２７】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階と
を含むことを特徴とする請求項６から９のいずれか一項に記載のフィターゼの製造方法。
【請求項２８】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、（ｂ）細菌を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階と
を含むことを特徴とする請求項６から９のいずれか一項に記載のフィターゼの製造方法。
【請求項２９】
（ａ）請求項１４から２０のいずれか一項に記載の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した形質転換宿主生物を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した形質転換宿主生物を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階と
を含むことを特徴とする請求項６から９のいずれか一項に記載のフィターゼの製造方法。
【請求項３０】
（ａ）請求項１４から２０のいずれか一項に記載の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）前記形質転換宿主生物を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階と
を含むことを特徴とする請求項６から９のいずれか一項に記載のフィターゼの製造方法。
【請求項３１】
請求項２１から２５のいずれか一項に記載の少なくとも１種の細菌抽出物を含むことを特徴とする酵素組成物。
【請求項３２】
請求項６から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のフィターゼを含むことを特徴とする酵素組成物。
【請求項３３】
請求項１４から２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種の形質転換宿主生物を含むことを特徴とする飼料組成物。
【請求項３４】
少なくとも１種のＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌を含むことを特徴とする飼料組成物。
【請求項３５】
上記細菌がＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ及びＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の飼料組成物。
【請求項３６】
請求項２１から２５のいずれか一項に記載の少なくとも１種の細菌抽出物を含むことを特徴とする飼料組成物。
【請求項３７】
請求項６から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のフィターゼを含むことを特徴とする飼料組成物。
【請求項３８】
単胃動物飼料における請求項３３から３７のいずれか一項に記載の飼料組成物の使用。
【請求項３９】
ブタ飼料に使用することを特徴とする請求項３８に記載の飼料組成物の使用。
【請求項４０】
家禽飼料に使用することを特徴とする請求項３８に記載の飼料組成物の使用。
【請求項４１】
（ａ）請求項１４から２０のいずれか一項に記載の宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した宿主生物を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した宿主生物を前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３３に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４２】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３４又は３５に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４３】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清を前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３６に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４４】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階と、
（ｇ）段階（ｆ）で精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３７に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４５】
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、（ｂ）細菌を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３７に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４６】
（ａ）請求項１４から２０のいずれか一項に記載の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した形質転換宿主生物を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した形質転換宿主生物を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階と、
（ｇ）段階（ｆ）で精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３７に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４７】
（ａ）請求項１４から２０のいずれか一項に記載の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）前記形質転換宿主生物を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する段階と
を含むことを特徴とする請求項３７に記載の飼料組成物の製造方法。
【請求項４８】
請求項６から９のいずれか一項に記載のフィターゼ又は請求項３１もしくは３２に記載の酵素組成物を前記動物の飼料に配合することを特徴とする植物性飼料のフィターゼに含まれる無機リン酸の単胃動物による同化の増進方法。
【請求項４９】
請求項３３から３７のいずれか一項に記載の飼料組成物を前記単胃動物に与えることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項３３から３７のいずれか一項に記載の飼料組成物を前記動物に与えることを特徴とする単胃動物飼料へのリン添加の低減方法。
【請求項５１】
請求項３３から３７のいずれか一項に記載の飼料組成物を前記動物に与えることを特徴とする単胃動物飼料からのリン廃棄物の低減方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規細菌性フィターゼとその製造方法に関する。本発明は特にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来する新規フィターゼとこれらのフィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はこれらのポリヌクレオチドを含むベクターと、その組織中に前記フィターゼを発現する形質転換宿主生物にも関する。本発明は更に少なくとも１種のフィターゼ活性を含む新規細菌抽出物にも関する。
【０００２】
特に、本発明の細菌抽出物とフィターゼは動物飼料に用いる飼料組成物で使用するのに特に適している。この適性はその特性、特に前記組成物の製造条件と動物の消化系における条件に対応する温度及びｐＨ条件下でのその活性に関係がある。
【０００３】
リンは全生物の生存に不可欠の元素である。特に、農場動物飼育者にとって成長と生育を最適にするために十分な量を動物に摂取させることは最も重要である。大半の農場動物は植物性飼料組成物で飼育されている。これらの植物は大量のリン酸を含んでおり、貯蔵化合物であるフィチン酸の形態で組織内に貯蔵している。平均すると、フィチン酸は植物に存在するリンの５０〜７０％を含有している。フィチン酸は自然動員され、フィチン酸に含まれるリン酸は大半の農場動物、特に反芻動物の体内で遊離する。しかし、フィチン酸はブタや家禽等の単胃動物では代謝されない。従って、これらの動物ではその栄養摂取量に含まれるフィチン酸は排泄物と共に廃棄され、飼育者は動物が十分な量のリンを摂取するようにこの栄養摂取量に無機リン酸を補充しなければならない。このアプローチは飼育者に余分な費用を生じると共に、同化されなかったフィチン酸が環境に廃棄されて汚染の原因となる。この汚染は集約飼育ゾーンでは一層増加する。
【０００４】
フィチン酸は栄養摂取量に含まれる主要栄養素（例えばマグネシウム、カルシウム、亜鉛又は鉄）のキレート剤であることも知られている。この特性は栄養摂取量の栄養品質を下げ、フィチン酸にアンチ栄養剤の特性を与えている。
【０００５】
単胃動物がフィチン酸を同化しないことに伴う種々の問題に対処するために、これらの家畜の栄養摂取量に酵素フィターゼを加えることが考えられている。フィターゼはフィチン酸を加水分解し、イノシトールと無機リン酸を遊離する。フィターゼとこれらのフィターゼをコードする遺伝子は多数の生物から単離されている。フィターゼは主に真菌から単離されている（ＨｏｗｓｏｎとＤａｖｉｓ，１９８３，Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５，３７７−３８２；　Ｗｙｓｓら，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５（２），３５９−３６６）。フィターゼを生産する真菌としてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、特にＡ．Ｆｉｃｕｕｍ（ＵｌｌａｈとＧｉｂｓｏｎ，１９８７，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７（１），６３−９１；　ＵｌｌａｈとＤｉｓｃｈｉｎｇｅｒ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９２（２），７４７−７５３）、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４３（Ｐｔ１），２４５−２５２）、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ｄｖｏｒａｋｏｖａら，１９９７，Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ），４２（４），３４９−３５２）、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓら，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（５），１６９６−１７００）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、特にＰ．ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、特にＭ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，１９９７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４３（Ｐｔ１），２４５−２５２）、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、特にＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、特にＮ．ｃｒａｓｓａ及びＮ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属、特にＴ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（Ｂｅｒｋａら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（１１），４４２３−４４２７）、又はＭｏｎａｓｃｕｓ属、特にＭ．ａｎｋａを挙げることができる。フィターゼは細菌でも発見されている。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＰｏｗａｒとＪａｇａｎｎａｔｈａｎ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５１（３），１０２−１１０８；　Ｓｈｉｍｉｚｕ，１９９２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（８），１２６６−１２６９；　Ｋｅｒｕｖｏら，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（６），２０７９−２０８５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，１９７０，Ａｕｓｔｒａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２３，１２０７−１２２０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特にＥ．ｃｏｌｉ（Ｇｏｌｏｖａｎら，２０００，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．４６，５９−７１）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｙｏｏｎら，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，４４９−４５４）、又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌が挙げられる。Ｓｃｈｗａｎｉｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓやＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母から酵母フィターゼも単離されている（Ｄｖｏｒａｋｏｖａ，１９９８，Ｆｏｌｉａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（４），３２３−３３８）。更に、植物、特にダイズ（ＵｌｌａｈとＧｉｂｓｏｎ，１９８８，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２６０（２），５１４−２０）、トウモロコシ（Ｍａｕｇｅｎｅｓｔら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，３２２（Ｐｔ２），５１１−７）；　Ｍａｕｇｅｎｅｓｔら，１９９９，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９（３），５０３−１４）、又はアラビドプシス（ＭｕｌｌａｎｅｙとＵｌｌａｈ，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１（１），２５２−５）でもフィターゼが発見されている。
【０００６】
フィターゼの特徴的な性質としてはフィチン酸に対するミカエリス定数（Ｋｍ）、最適活性ｐＨ及び温度、並びに所与ｐＨ及び温度におけるこの活性の安定性が挙げられる。分子量（ＭＷ）、等電点（ｐＩ）又はペプチド配列等のようにフィターゼの構造に関するデータも有用であると思われる。動物飼料に使用できるようにするためには、フィターゼはこの飼料に使用する材料に加えられる処理に適合可能な特性をもっていなければならない。特に、使用するフィターゼの活性が維持されなければならず、この活性は可能であるならば、これらの飼料の製造工程とこれらの飼料を摂取する動物の消化管における温度及びｐＨ条件下で最適でなければならない。これらの制約から、飼料組成物の製造工程で使用されるような高温条件と家畜の消化管内のような酸性ｐＨ条件に耐える活性をもつフィターゼが特に求められている。
【０００７】
これらの要件を満たすために、これらの要件に対応する温度及びｐＨ条件下の媒質中で生育する生物、特に微生物でフィターゼが求められている。このアプローチにより、例えばＷＯ９７／３５０１６又はＥＰ０６８４３１３等の特許出願に記載されているような高温耐性フィターゼや、例えば特許出願ＥＰ０９６０９３４に記載されているようなＫｍの低いフィターゼを単離できるようになった。また、有利な特性を付与するように部位特異的突然変異誘発により既知フィターゼの配列を人工的に変異させるというアプローチもある。このアプローチは特に特許出願ＷＯ９９／４８３８０、ＥＰ０８９７９８５及びＥＰ０８９７０１０に記載されている。
【０００８】
低い最適ｐＨで活性なフィターゼはほんの少数しか同定されていない。このようなフィターゼは特に真菌（例えば特許出願ＪＰ７０６７６３５に記載されているＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍのフィターゼや特許出願ＷＯ９８／１３４８０に記載されているＭｏｎａｓｃｕｓ　ａｎｋａのフィターゼ）と酵母（例えば特許出願ＥＰ６９９７６２に記載されているＳｃｈｗａｎｉｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのフィターゼ）で同定されている。しかし、最適ｐＨが低く、特に最適ｐＨが４未満のフィターゼはまだどの細菌からも単離同定されていない。
【０００９】
図面の説明
図１：温度の関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１のフィターゼの活性。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【００１０】
図２：ｐＨの関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１のフィターゼの活性。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【００１１】
図３：温度の関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４のフィターゼの活性。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【００１２】
図４：ｐＨの関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４のフィターゼの活性。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【００１３】
図５：実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼの温度の関数としての活性。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【００１４】
図６：実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼのｐＨの関数としての活性。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【００１５】
説明
本発明は配列番号２で表されるフィターゼをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。このフィターゼとこれをコードするポリヌクレオチドはいずれもＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株に由来することを特徴とする。
【００１６】
本発明によると、「ポリヌクレオチド」なる用語は天然又は人工塩基配列から構成される核酸分子を意味し、ＤＮＡ型でもＲＮＡ型でもよいが、特に２本鎖のＤＮＡ型が好ましい。前記ポリヌクレオチドが天然であると言うときには、当然のことながら本発明はその天然環境におけるこのポリヌクレオチドを意味するのではなく、このポリヌクレオチドが天然状態で存在する生体のゲノムから単離精製した同一ポリヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは抽出精製により直接得たものでもよいし、複製により間接的に得たものでもよい。また、本発明は天然状態で存在する生体以外のゲノムにこのポリヌクレオチドを人工的に組込んだ場合や、このポリヌクレオチドの起源である生体のゲノムに１コピー以上を人工的に再導入した場合も含む。このポリヌクレオチドはプローブである場合には一般に１本鎖である。
【００１７】
従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者に周知の通り、この定義は遺伝コードの縮重の結果として異なるヌクレオチド配列を含む場合もあるが、同一アミノ酸配列即ち配列番号２で表される同一フィターゼをコードする全ポリヌクレオチドを含む。
【００１８】
本発明は上記ポリヌクレオチドに相同のポリヌクレオチドも含み、前記相同ポリヌクレオチドは配列番号２で表されるフィターゼに相同のフィターゼをコードする。本発明によると、「相同」なる用語はフィターゼをコードするポリヌクレオチドであるが、配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに対して配列が変異しているものを意味する。相同ポリヌクレオチドは配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドと所定の一致度をもつことを特徴とする。２種の相同ポリヌクレオチドの一致度はそれらの配列を比較することにより得られ、一般にこれらの配列間で一致するヌクレオチドの百分率により表される。この一致度は所与配列長で測定し、比較する配列の短いほうの配列寸法に基づいて相同配列の一致度を決定する。従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに対して配列が１カ所以上変異しており、配列番号２で表されるフィターゼと等価の特性をもつフィターゼをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００１９】
本発明によると、「等価フィターゼ」又は「等価特性をもつフィターゼ」なる用語はＫｍ、最適活性ｐＨ又は最適活性温度等の固有特性以外にフィターゼ活性をもつタンパク質を主に意味する。フィターゼ活性レベルは任意フィターゼ活性決定法により測定することができる。「フィターゼ」なる用語はフィチン酸を加水分解してイノシトールと無機リン酸を遊離する触媒活性をもつ酵素を意味する。しかし、大半のフィターゼは（六リン酸の）フィチン酸を完全には加水分解しないので、本発明のフィターゼの触媒活性は無機リン酸とミオイノシトールリン酸エステルを遊離するものであればよく、前記エステルはフィターゼの加水分解能に応じてミオイノシトール一、二、三、四又は五リン酸エステルのいずれでもよい。例えば、フィターゼ活性はＳｈｉｍｉｚｕ（１９９２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（８），１２６６−１２６９）の方法に従い、特に実施例２に記載するように測定することができる。その他、基質量の減少を測定したり、酵素反応生成物の蓄積を測定するなど、任意フィターゼ活性決定法を使用してフィターゼ活性を測定することができる。特に、類似方法で例えば別の基質又は他の試薬を使用しても前記フィターゼ活性を測定することができる。
【００２０】
相同ポリヌクレオチドに存在する配列変異はヌクレオチドの付加、欠失又は置換とすることができ、天然変異でもよいし、通常の突然変異誘発法により得られるものでもよい。等価機能のタンパク質をコードするこのような相同ポリヌクレオチドが異なる生物種のゲノムや、異なる品種、変種又は株に天然に存在することは知られている。従って、本発明の配列番号２で表されるペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの教示に基づき、周知分子ハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を使用してこのような相同ポリヌクレオチドを単離することは当業者にとって容易である。
【００２１】
分子ハイブリダイゼーションはそのヌクレオチド配列間に所定の一致度をもつポリヌクレオチドの相補鎖間で行われる対合反応である。従って、配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドを使用してハイブリダイゼーションを行うと、これらのポリヌクレオチドに相同であり、配列番号２で表されるフィターゼに等価の特性をもつフィターゼをコードするポリヌクレオチドをこれらのポリヌクレオチドの起源である生物以外の生物、例えば他の細菌、特に他のＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ株のゲノムで同定することができる。ポリヌクレオチド間の配列一致度が高いほど、これらのポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションは起こり易くなり、これらのポリヌクレオチドが等価特性のタンパク質をコードする確率も高くなる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション法は文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に詳細に記載されており、当業者に周知である。これらの方法は例えば生体又はこの生体の組織から作製したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに基づく。既知ポリヌクレオチド又はそのフラグメントから構成されるプローブを使用してスクリーニングし、前記プローブに相同のポリヌクレオチドをこれらのライブラリーで同定する。本発明によると、プローブは配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントから構成される。プローブがハイブリダイズするポリヌクレオチドを同定するためには、前記プローブを例えば３２Ｐ等の放射性元素で標識する。当業者に周知の市販非放射性標識を使用してもよい。
【００２２】
従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドの１種又はそのフラグメントに選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも含む。当然のことながら、これらのポリヌクレオチドは配列番号２で表されるフィターゼと等価のフィターゼをコードする場合のみに本発明に含まれる。従って、本発明によると「選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチド」なる用語は通常の分子ハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の１種に従い、配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドの１種又はそのフラグメントから構成される標識プローブと他の比較的非相同のポリヌクレオチド（特にプローブするポリヌクレオチドがｃＤＮＡライブラリーに由来する場合には他のｃＤＮＡ）との非特異的ハイブリダイゼーションよりも高レベルでこのプローブとハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションレベルはプローブの標識により発生されるシグナルにより測定される。選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドとプローブの相互作用により発生されるシグナルのレベルは一般にプローブと「バックグラウンドノイズ」を生じる他のポリヌクレオチドの相互作用により発生されるシグナルの１０倍、好ましくは１００倍である。選択的ハイブリダイゼーションは一般に通常のハイブリダイゼーション及び洗浄条件、好ましくはストリンジェント又は超ストリンジェントな条件（例えば少なくとも５×ＳＳＣと１％ＳＤＳを含有する緩衝液を用いて約５０℃〜６０℃でハイブリダイズし、０．１％ＳＤＳで洗浄後にＳＳＣ濃度を２×ＳＳＣから０．４×ＳＳＣまで漸減させながら洗浄すると同時に温度を２０℃から５０℃まで上昇）を使用することにより得られる。当業者はハイブリダイゼーション条件、即ち主にハイブリダイゼーション段階と洗浄段階に使用する緩衝液の温度と塩濃度を調節することができよう。これらの条件は特に使用するプローブの長さとこのプローブでスクリーニングするライブラリーに存在するポリヌクレオチドの一致度に応じて調節しなければならない。ハイブリダイズする相同配列により発生されるシグナルを最適にすると同時にバックグラウンドノイズを最少にするようにハイブリダイゼーション条件を調節することが必要である。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは例えば細菌株、特にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属株から作製したゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。このようなポリヌクレオチドの単離は標準ハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に従い、配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドのフラグメント、又はこれらに相補的なポリヌクレオチドをプローブとして使用して実施することができる。これらの方法によりポリヌクレオチドを単離した場合には、その配列を決定し、このポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の特性を同定することが必要であり、特にこのタンパク質が配列番号２で表されるフィターゼに等価のフィターゼであることを確認する必要がある。
【００２４】
従って、上記ハイブリダイゼーション法は配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに相同のポリヌクレオチドを単離することができる。このようなポリヌクレオチドとそれによりコードされるフィターゼは標準分子生物学技術を習得したバイオテクノロジー分野の当業者により容易に同定可能である。従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに相同のポリヌクレオチドを含む。配列番号２で表されるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに対する相同ポリヌクレオチドの一致度は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％とすると有利である。配列間の一致度の測定及び確認方法は当業者に周知である。例えばＰＩＬＥＵＰ、ＢＬＡＳＴ（特にＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）又はＢｅｓｔＦｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１でＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，１９８１，Ｎｏ．２，４８２−４８９に記載のＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用）等のプログラムを使用することができる。
【００２５】
このような相同ポリヌクレオチドは慣用突然変異誘発法により人工的に得ることもできる。
【００２６】
配列番号２で表されるフィターゼをコードする好適ポリヌクレオチドは配列番号１で表される。
【００２７】
本発明の特定態様によると、上記フィターゼをコードするポリヌクレオチドはＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来する。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは最適活性ｐＨが４以下のフィターゼをコードすると有利である。「最適活性ｐＨ」なる用語は本発明のフィターゼの活性が最大となるｐＨ値を意味し、この活性は上記方法により測定され、分解されるフィチン酸と生成される無機リン酸の量に対応する。
【００２９】
本発明の特定態様によると、本発明のポリヌクレオチドは以下の特性：
（ａ）最適温度＝６５℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつフィターゼをコードする。
【００３０】
本発明の別の特定態様によると、本発明のポリヌクレオチドは以下の特性：
（ａ）最適温度＝７０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝４
をもつフィターゼをコードする。
【００３１】
本発明の別の特定態様によると、本発明のポリヌクレオチドは以下の特性：
（ａ）最適温度＝６０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつフィターゼをコードする。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドはＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株に由来するフィターゼをコードすることが好ましい。
【００３３】
本発明は更に上記ポリヌクレオチドのフラグメントにも関する。「フラグメント」なる用語は特に少なくとも２０ヌクレオチド、特に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドのフラグメントを意味する。このようなフラグメントを一般にオリゴヌクレオチドと言う。これらのフラグメントは相同ポリヌクレオチドを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして、又はＡｕｓｕｂｅｌら，（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ編，第６．３〜６．４章に記載されているようなＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりこのような相同ポリヌクレオチドを同定及び増幅するためのプロライマーとして使用することができる。
【００３４】
「フラグメント」なる用語は配列番号２で表されるフィターゼのフラグメント又は配列番号２で表されるフィターゼに相同もしくは等価のフィターゼのフラグメントをコードする本発明のポリヌクレオチドのフラグメントも意味する。
【００３５】
本発明は更に上記のようなポリヌクレオチドの少なくとも１種を含むポリヌクレオチドにも関する。
【００３６】
上記全ポリヌクレオチドは配列番号２で表されるフィターゼ又は相同フィターゼ又はこれらのフィターゼの活性フラグメントをコードする。従って、本発明はこれらの全ポリヌクレオチドによりコードされる全フィターゼを包含する。従って、この定義は配列番号２で表されるフィターゼと、このフィターゼに相同のフィターゼと、これらのフィターゼの活性フラグメントを含む。
【００３７】
本発明の好適態様によると、フィターゼは少なくとも配列番号２で表されるペプチド配列を含むタンパク質である。配列番号２で表されるペプチド配列により表されるフィターゼはフィターゼ１分子上に存在する６個のリン酸のうち５個を加水分解する。
【００３８】
従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼに相同のフィターゼも含む。本発明によると、「相同フィターゼ」なる用語は配列番号２で表されるフィターゼに対して配列が変異しているフィターゼを意味する。相同ポリヌクレオチドと同様に、相同フィターゼはペプチド配列が所定の一致度を示すフィターゼであり、一致度は一般に同一アミノ酸の百分率により表される。従って、本発明は配列番号２で表されるフィターゼに対して配列が１カ所以上変異しており、配列番号２で表されるフィターゼと等価の特性をもつフィターゼを包含する。これらの変異はアミノ酸の付加、欠失又は置換とすることができ、天然変異でもよいし、通常の突然変異誘発法により得られるものでもよい。配列番号２で表されるフィターゼに対する相同フィターゼの一致度は少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％とすると有利である。配列間の一致度の測定及び確認方法は当業者に周知である。例えばＰＩＬＥＵＰ、ＢＬＡＳＴ（特にＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）又はＢｅｓｔＦｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　８　ｆｏｒ　Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐａｒｋ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１でＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，１９８１，Ｎｏ．２，４８２−４８９に記載のＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用）等のプログラムを使用することができる。
【００３９】
本発明の特定態様によると、本発明のフィターゼはＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来する。
【００４０】
本発明のフィターゼは最適活性ｐＨが４以下であると有利である。「最適活性ｐＨ」なる用語は本発明のフィターゼの活性が最大となるｐＨ値を意味し、この活性は上記方法により測定され、分解されるフィチン酸と生成される無機リン酸の量に対応する。
【００４１】
本発明の特定態様によると、フィターゼは以下の特性：
（ａ）最適温度＝６５℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつ。
【００４２】
本発明の別の特定態様によると、フィターゼは以下の特性：
（ａ）最適温度＝７０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝４
をもつ。
【００４３】
本発明の別の特定態様によると、フィターゼは以下の特性：
（ａ）最適温度＝６０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつ。
【００４４】
本発明の別の特定態様によると、本発明のフィターゼはＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株に由来する。
【００４５】
本発明は配列番号２で表されるフィターゼのフラグメント及び相同フィターゼのフラグメントも包含する。「フラグメント」なる用語は生体活性フラグメント、即ち実施例２に記載のアッセイ又は類似アッセイにより測定した場合に完全フィターゼに等価のフィターゼ活性をもつフラグメントを主に意味する。
【００４６】
本発明は宿主生物で機能的なプロモーターと、本発明のフィターゼをコードするポリヌクレオチドと、前記宿主生物で機能的な終結因子を少なくとも相互に機能的に連結したキメラ遺伝子にも関する。キメラ遺伝子に含むことができる因子はタンパク質の転写、翻訳及び成熟を調節する因子（例えばプロモーター、シグナルペプチドもしくはトランジットペプチドをコードする配列又はポリアデニル化シグナルを構成する終結因子）と、タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。「相互に機能的に連結」なる用語はキメラ遺伝子のこれらの因子の１種の機能が別の因子の機能に関連するようにこれらの因子を相互に連結することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に作用することができる場合に前記プロモーターは前記コーディング配列に機能的に連結している。本発明のキメラ遺伝子の構築とその各種因子の組立は当業者に周知の技術、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の技術を使用して実施することができる。キメラ遺伝子を構成する調節因子の選択はこれらが機能すべき宿主生物に主に依存し、当業者は所与宿主生物で機能的な調節因子を選択することができる。「機能的」なる用語は所与宿主生物で機能できることを意味する。
【００４７】
本発明のキメラ遺伝子に含むことができるプロモーターは構成的でも誘導的でもよい。例えば、細菌で発現させるために使用するプロモーターは以下のプロモーターから選択することができる。大腸菌で発現させる場合にはｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｄＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、Ｐｓｙｎ、ｃｓｐＡ、ＰＬ、ＰＬ−９Ｇ−５０、ＰＲ−ＰＬ、Ｔ７、γＰＬ−ＰＴ７、Ｔ３−ｌａｃ、Ｔ５−ｌａｃ、Ｔ４遺伝子３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、ＶＨｂ及びプロテインＡプロモーター（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，１９９６，Ｍｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２−５３８；　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：４９４−４９９）又はＰｔｒｐプロモーター（ＷＯ９９／６４６０７）を挙げることができる。ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍやＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ等のグラム陽性細菌で発現させる場合には、ＰｔｉｐＡ（Ｈｏｌｍｅｓら，１９９３，ＥＭＢＯ　Ｊ．１２：３１８３−３１９１）又はＰＳ１及びＰＳ２（ＦＲ９１／０９８７０）プロモーター又はヨーロッパ特許出願ＥＰ０６２９６９９Ａ２に記載されているプロモーターが挙げられる。酵母や真菌で発現させる場合には、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ　ＰＬＡＣ４プロモーター（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５−１３９）又はＫ．ｌａｃｔｉｓ　Ｐｐｇｋプロモーター（仏国特許出願ＦＲ９１／０５２９４）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｅｆ１又はｃｂｈ１プロモーター（ＷＯ９４／０４６７３）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｈｉｓ、ｃｓｌ又はａｐｆプロモーター（ＷＯ００／６８４０１）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｌａプロモーター（Ｇｗｙｎｎｅら，１９８７，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：７１３−７１９）を挙げることができる。
【００４８】
キメラ遺伝子は更にシグナルペプチド又はトランジットペプチドをコードする亜細胞輸送配列も含むことができる。このような配列はフィターゼをコードするポリヌクレオチドの上流又は下流に配置され、前記フィターゼを宿主生物の所定細胞区画に特異的に輸送するか、又は細胞外空間への分泌を促すことができる。例えば、キメラ遺伝子はフィターゼを細胞質の特定区画（例えばミトコンドリア、プラスチド、小胞体又は液胞）に輸送するためのシグナルペプチド又はトランジットペプチドをコードする配列を含むことができる。輸送配列はフィターゼをアポプラストや細胞外マトリックスに輸送するシグナルペプチドをコードすることが好ましい。
【００４９】
１態様によると、トランジットペプチドは葉緑体、液胞又はミトコンドリア輸送シグナルとすることができ、その後、開裂して葉緑体、液胞又はミトコンドリアとなる。このようなペプチドは文献（ＮｅｕｈａｕｓとＲｏｄｇｅｒｓ，１９９８，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３８：１２７−１４４）に詳細に記載されており、米国特許第５１８８６４２号にはＥＰＳＰＳトランジットペプチド、ＥＰ１８９７０７にはリブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットトランジットペプチドが記載されている。
【００５０】
別の態様によると、トランジットペプチドはｐａｃ（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：５７１３−５７２７）、ｏｍｐＡ（ＢｏｗｄｅｎとＧｅｏｒｇｉｏｕ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６７６１−１６７６６）及びｐｈｏＡ（Ｃｈａｎｇら，１９８６，Ｇｅｎｅ　４４：１２１−１２４）遺伝子のように細菌ペリプラズムに輸送するシグナルペプチドや、ＰＳ１及びＰＳ２遺伝子（ＦＲ９１／０９８７０）のように細菌の表面に接着するペプチドから構成することができる。
【００５１】
トランジットペプチドは単独でも二重でもよい。二重トランジットペプチドは場合により中間配列により分離される。葉緑体トランジットペプチドの例としては転写方向に向かってプラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列部分と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の第２のトランジットペプチドをコードする配列を含む二重トランジットペプチドを挙げることができる。このような二重葉緑体トランジットペプチドは例えばヨーロッパ特許出願ＥＰ０５０８９０９に記載されている。
【００５２】
１態様によると、トランジットペプチドは目的タンパク質の媒質分泌率を増加させる種々の因子から構成することができる。例えば輸送タンパク質と目的タンパク質に融合したタンパク分解部位の組合せ（米国特許第６１３００６３号）を挙げることができる。
【００５３】
本発明によると、キメラ遺伝子は更にプロモーターとコーディング配列の間に転写アクチベーター（エンハンサー）等の他の調節配列を含むことができる。
【００５４】
本発明は更に本発明のキメラ遺伝子を含むクローニング及び／又は発現ベクターにも関する。本発明のベクターは宿主生物を形質転換し、この生物でフィターゼを発現させるのに有用である。このベクターはプラスミド、コスミド、バクテリオフアージ又はウイルスとすることができる。本発明の形質転換ベクターはプラスミドが好ましい。一般に、このベクターの主な品質としては、自律しており、特に複製起点の存在により宿主生物の細胞で自己複製し、前記細胞でフィターゼを発現させることができなければならない。宿主生物を安定的に形質転換させるために、更にベクターをゲノムに組込んでもよい。こうすると、ベクターの構成要素をこれらの宿主でフィターゼを合成するために必要な因子のみに制限することができる。このようなベクターの選択と、このベクターに本発明のキメラ遺伝子を挿入する技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｎｏｌａｎ　Ｃ．編，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に詳細に記載されており、当業者に一般に知られている。本発明で使用するベクターは本発明のキメラ遺伝子に加え、選択マーカーをコードするキメラ遺伝子を含むと有利である。この選択マーカーは有効に形質転換された宿主生物即ちベクターを組込んだ宿主生物の選択を可能にする。本発明の特定態様によると、形質転換する宿主生物は植物又は真菌である。使用可能な選択マーカーとしては、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｒｉｔｚら，１９８３，Ｇｅｎｅ　２５：１７９−１８８；　Ｐｕｎｔら，１９８７，Ｇｅｎｅ　５６：１１７−２４）、ストレプトスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、フレオマイシン耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子、ベノミル耐性を付与する突然変異βチューブリン遺伝子（Ｇｏｌｄら，１９９４，Ｇｅｎｅ　１４２：２２５−３０）、又はビアラホスアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｖａｌｏｓら，１９８９，Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ，１６：３６９−７２）等の抗生物質又は殺菌剤耐性遺伝子を含むマーカーを挙げることができる。他のマーカーとしては、ｐｙｒＡ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒ４（ＢｕｘｔｏｎとＲａｄｆｏｒｄ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９０：４０３−４０５）、ａｒｇ４、ａｒｇＢ（Ｂｅｒｓｅら，１９８３，Ｇｅｎｅ　２５：１０９−１１７）及びｔｒｐＣ（Ｇｏｏｓｅｎら，１９８９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１９：２８２−８８）遺伝子、モリブドプテリンシンターゼ遺伝子（Ａｐｐｌｅｙａｒｄら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４８６９−７６；　Ｕｎｋｌｅｓら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１９２８６−９３）又はアセトアミダーゼ（ＢｅｒｉとＴｕｒｎｅｒ，１９８７，Ｃｕｒｒ　Ｇｅｎｅｔ，１１：６３９−４１）等の栄養要求性を相補する遺伝子が挙げられる。別種の選択マーカーはビアラホス耐性のｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅら，ＮＡＲ　１８：１０６２，１９９０）、グリホサート耐性のＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第５１８８６４２号）���イソキサゾール耐性のＨＰＰＤ遺伝子（ＷＯ９６／３８５６７）、又はグリホサートオキシドレダクターゼ遺伝子（米国特許第５４６３１７５号）等の除草剤耐性遺伝子から構成される。ＧＵＳ酵素等の容易に識別可能な酵素をコードする遺伝子や、色素又は形質転換細胞における色素生産を調節する酵素をコードする遺伝子も挙げられる。このような選択マーカー遺伝子は特に特許出願ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８、ＷＯ９６／３８５６７及びＷＯ９７／０４１０３に記載されている。
【００５５】
本発明は更に本発明の少なくとも１種のキメラ遺伝子をそのゲノムに組込むか又は染色体外遺伝因子（例えばプラスミド）に担持した形質転換宿主生物にも関する。「宿主生物」なる用語は本発明のフィターゼを生産するために本発明のキメラ遺伝子を導入することが可能な任意下等又は高等単細胞又は多細胞生物を意味する。宿主生物は微生物、特に真菌（例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）、細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に大腸菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）、酵母（特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＰｉｃｈｉａ属）、バキュロウイルス、又は植物細胞が好ましい。宿主生物は植物又は植物部分でもよい。
【００５６】
「形質転換宿主生物」なる用語はそのゲノム又は染色体外遺伝因子（例えばプラスミド）に本発明の少なくとも１種のキメラ遺伝子を組込んでおり、従って、その組織又は培地にフィターゼを生産する宿主生物を意味する。本発明の宿主生物を得るために、当業者は多数の公知形質転換法の１種を使用することができる。
【００５７】
これらの方法の１例では、形質転換しようとする宿主生物の細胞又は組織をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び本発明のベクターと接触させる（ＣｈａｎｇとＣｏｈｏｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８（１），１１１−１１５；　ＭｅｒｃｅｎｉｅｒとＣｈａｓｓｙ，１９８８，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　７０（４），５０３−５１７）。別法としてエレクトロポレーションでは、形質転換しようとする細胞又は組織と本発明のベクターに電場を加える（ＡｎｄｒｅａｓｏｎとＥｖａｎｓ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６（７），６５０−６６０；　ＳｈｉｇｅｋａｗａとＤｏｗｅｒ，１９８９，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（１），５６−６２）。別法ではマイクロインジェクションにより細胞又は組織にベクターを直接注入する（ＧｏｒｄｏｎとＲｕｄｄｌｅ，１９８５，Ｇｅｎｅ　３３（２），１２１−１３６）。「パーティクルガン」法を使用すると有利である。この方法は本発明のベクターを粒子に吸着させて細胞又は組織に打込む（Ｂｒｕｃｅら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６（２４），９６９２−９６９６；　Ｋｌｅｉｎら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０（３），２８６−２９１；　米国特許第４，９４５，０５０号）。
【００５８】
細菌の形質転換法は大腸菌や他のグラム陰性細菌について数種の方法が文献に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｉｎｏｕｅら，１９９０，Ｇｅｎｅ　９６：２３−２８；　Ｃｈｕｎｇら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２１７２−２１７５）。接合も利用できる（Ｃａｍｅｒｏｎら，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：５４７−５５７）。グラム陽性細菌にはエレクトロポレーションを使用することができ、特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌にはプロトプラスト形質転換を使用できる（Ｂｏｎａｍｙら，１９９０，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｌｅｔｔ．６６：２６３−２７０；　Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ）。
【００５９】
真菌の形質転換法も数種の方法が文献に記載されている（Ｔａｌｂｏｔ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｉ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓについてはＰＥＧによるプラトプラスト形質転換がＥＰ０２６０７６２に記載されており、ＷＯ００／３６１２０にはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ種へのこの方法の応用が記載されている。制限酵素仲介型組込み即ちＲＥＭＩ（Ｓａｎｃｈｅｚら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５８：８９−９４）による形質転換や、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を使用したプラトプラスト形質転換（ｄｅ　Ｇｒｏｏｔら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６：８３９−８４２）も知られている。酵母の形質転換法も文献、特にＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）とＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５−１３９）に記載されている。
【００６０】
形質転換すべき宿主生物が植物起源である特殊な場合には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌を使用して植物細胞又は組織を形質転換するのが好ましく、前記植物の細胞又は組織にＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｋｎｏｐｆ，１９７９，Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，１４３−１７３；　Ｓｈａｗら，１９８３，Ｇｅｎｅ　２３（３）：３１５−３３０）又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＢｅｖａｎとＣｈｉｌｔｏｎ，１９８２，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３５７−３８４；　ＴｅｐｆｅｒとＣａｓｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ，１９８７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４（１），２４−２８）を感染させるのが好ましい。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる植物細胞又は組織の形質転換はＩｓｈｉｄａら（１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６），７４５−７５０）に記載のプロトコールに従って実施するのが好ましい。当業者は形質転換する宿主生物の種類に応じて適切な方法を選択できよう。
【００６１】
本発明は更にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来することを特徴とする少なくとも１種のフィターゼ活性を含む新規細菌抽出物にも関する。本発明によると、「細菌抽出物」なる用語は細菌を粉砕し、こうして遊離した細菌成分を遠心分離して固体フラクションと全可溶性細菌成分を含む液体フラクションに分離することにより得られる水溶性又は水溶液に可溶性のフラクションを意味する。フィターゼ活性は分解されるフィチン酸の量に対応し、一般に酵素反応により遊離する無機リン酸の定量により測定される。特に、フィターゼ活性はＳｈｉｍｉｚｕ（１９９２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（８），１２６６−１２６９）の方法に従い、特に下記実施例２に記載するように測定される。その他、基質量の減少を測定したり、酵素反応生成物の蓄積を測定するなど、任意フィターゼ活性決定法を使用して本発明の細菌抽出物のフィターゼ活性を測定することができる。
【００６２】
本発明の細菌抽出物はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌に由来することを特徴とする。Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属に含まれる細菌の特徴はＫｉｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５，Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８，８５−９１）に記載されている。
【００６３】
本発明の細菌抽出物は最適活性ｐＨが４以下であるフィターゼ活性を発現することが好ましい。最適活性ｐＨは本発明の細菌抽出物中で測定したフィターゼ活性が最大となるｐＨに対応する。
【００６４】
本発明の特定態様によると、細菌抽出物は以下の特性：
（ａ）最適温度＝６５℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつフィターゼ活性を含む。
【００６５】
本発明の別の特定態様によると、細菌抽出物は以下の特性：
（ａ）最適温度＝７０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝４
をもつフィターゼ活性を含む。
【００６６】
本発明の別の特定態様によると、細菌抽出物は以下の特性：
（ａ）最適温度＝６０℃
（ｂ）最適ｐＨ＝３．５
をもつフィターゼ活性を含む。
【００６７】
「最適温度」及び「最適ｐＨ」なる用語は本発明の細菌抽出物中で測定したフィターゼ活性が最大となる温度とｐＨを意味する。
【００６８】
本発明の特定態様によると、本発明の細菌抽出物はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株に由来する。
【００６９】
本発明は更に前記細菌抽出物の製造方法にも関する。この方法は
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階を含むことを特徴とする。
【００７０】
この方法によると、細菌の複製を可能にする適切な培地にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を加え、この細菌株が生育する天然媒質のｐＨ条件にｐＨを調節して培養する。多数の細菌用培地が文献に記載されており、当業者はこれらの培地を選択してそのｐＨ条件を調節することができる。例えば、好酸性細菌、特にＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌の培地の１例はＫｉｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５，Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８，８５−９１）に記載されている。
【００７１】
培養後、得られた細菌を濃縮する。細菌の濃縮は多数の手段で実施することができ、特に遠心分離又は濾過を使用する。濃縮後、細菌を粉砕する。細菌を粉砕して細菌細胞を破壊する。これは当業者に公知の種々の方法により実施することができる。細菌に超音波をかけて粉砕するのが好ましい。細菌粉砕物を次に遠心分離して不溶性細菌破片を分離した後、可溶性細胞因子、特にフィターゼ活性を発現する酵素を含む遠心分離上清を回収する。
【００７２】
本発明の特定態様によると、本発明の方法で使用する細菌株はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株である。
【００７３】
本発明は更に本発明のフィターゼの製造方法にも関する。本発明の１態様によると、この方法は、
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した細菌を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した細菌を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階を含むことを特徴とする。
【００７４】
この方法の段階（ａ）〜（ｅ）は上記細菌抽出物の製造方法の段階（ａ）〜（ｅ）と共通である。本発明のフィターゼのこの製造方法の段階（ｆ）は段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する。フィターゼの精製は任意タンパク質分離技術、特に当業者に周知の電気泳動及びクロマトグラフィー技術により実施することができる。精製フィターゼを得るために、当業者は上記フィターゼ活性測定法を使用して前記フィターゼを含む精製フラクションを同定することができる。
【００７５】
本発明の方法で使用する細菌株はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株が好ましい。
【００７６】
特に本発明のフィターゼを培地に分泌させる場合の本発明の別の態様によると、この方法は、
（ａ）Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株を培養する段階と、
（ｂ）細菌を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階を含むことを特徴とする。
【００７７】
この方法によると、細菌を除去して培地を回収する段階は液体フラクションに含まれる固体フラクションを分離する任意手段により実施することができる。特に、この段階を実施するのに適した手段は濾過と遠心分離である。
【００７８】
本発明の別の態様によると、本発明のフィターゼの製造方法は本発明の形質転換宿主生物を使用し、
（ａ）本発明の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）段階（ａ）で培養した形質転換宿主生物を濃縮する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で単離した形質転換宿主生物を粉砕する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた粉砕物を遠心分離する段階と、
（ｅ）段階（ｄ）で得られたフィターゼ活性をもつ上清を回収する段階と、
（ｆ）段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する段階を含むことを特徴とする。
【００７９】
本発明のこの態様によるフィターゼ製造方法の段階（ｆ）は段階（ｅ）で回収した上清からフィターゼを精製する。フィターゼの精製は任意タンパク質分離技術、特に当業者に周知の電気泳動及びクロマトグラフィー技術により実施することができる。精製フィターゼを得るために、当業者は上記フィターゼ活性測定法を使用して前記フィターゼを含む精製フラクションを同定することができる。
【００８０】
この方法で使用する形質転換宿主生物は微生物が好ましい。特に、前記微生物は真菌（例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）、細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に大腸菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）、酵母（特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ又はＰｉｃｈｉａ属）、バキュロウイルス、又は植物細胞とすることができる。
【００８１】
特に本発明のフィターゼを培地に分泌させる場合の本発明の別の態様によると、この方法は、
（ａ）本発明の形質転換宿主生物を培養する段階と、
（ｂ）前記形質転換宿主生物を除去して培地を回収する段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で回収した培地からフィターゼを精製する段階を含むことを特徴とする。
【００８２】
この方法によると、形質転換宿主生物を除去して培地を回収する段階は液体フラクションに含まれる固体フラクションを分離する任意手段により実施することができる。特に、この段階を実施するのに適した手段は濾過と遠心分離である。
【００８３】
本発明は更に本発明の少なくとも１種のフィターゼを含む酵素組成物にも関する。特定態様によると、本発明の酵素組成物は本発明の細菌抽出物を含む。
【００８４】
「酵素組成物」なる用語はその安定性とその保存を助長する種々のアジュバントと共に本発明の少なくとも１種のフィターゼを含む組成物を意味する。本発明の酵素組成物は液体形態でも固体形態でもよく、前者の場合には前記組成物と組成物に含まれるフィターゼは水溶液状であり、後者の場合には前記組成物と組成物に含まれるフィターゼは凍結乾燥粉末状である。
【００８５】
本発明の特定態様によると、酵素組成物は本発明のフィターゼ以外に少なくとも１種の付加酵素を含む。この付加酵素はフィターゼ活性をもつものでもよいし、フィターゼ活性以外の活性をもつものでもよい。この付加酵素がフィターゼ活性をもつ場合には、前記フィターゼ活性は本発明のフィターゼのフィターゼ活性と相違し且つこれに相補的なものが好ましい。この付加酵素がフィターゼ活性以外の活性をもつ場合には、例えばキシラナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、プルラナーゼ、アミダーゼ、ホスファターゼ又はマンナーゼ活性をもつことができる。
【００８６】
前記酵素組成物は家畜、特に単胃動物、好ましくはブタ又は家禽の飼料への配合に用いることが好ましい。
【００８７】
本発明は更に本発明の少なくとも１種のフィターゼを含む飼料組成物にも関する。
【００８８】
「飼料組成物」なる用語は家畜、特に単胃動物、好ましくはブタ又は家禽の飼料を主に意味する。本発明の飼料組成物は本発明の酵素組成物を添加した家畜用飼料が理想的である。従って、本発明の飼料組成物は家畜用飼料に少なくとも１種の本発明の酵素組成物を加え、前記飼料と前記酵素組成物を混合して前記飼料組成物を得るものである。
【００８９】
本発明の特定態様によると、前記飼料組成物は少なくとも１種の本発明の形質転換宿主生物を含む。本発明の別の特定態様によると、前記飼料組成物は少なくとも１種のＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌を含む。Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株が好ましい。
【００９０】
本発明は更に本発明の少なくとも１種の細菌抽出物又はフィターゼを含む飼料組成物にも関する。
【００９１】
本発明の飼料組成物は単胃動物の飼料に使用すると有利である。本発明の特定態様によると、前記飼料組成物はブタの飼料に使用する。本発明の別の特定態様によると、前記飼料組成物は家禽の飼料に使用する。
【００９２】
本発明は更に上記飼料組成物の製造方法にも関する。
【００９３】
本発明の特定態様によると、前記方法は本発明の宿主生物又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌を培養し、前記宿主生物又は前記細菌を当業者に公知の任意濃縮法、特に濾過又は遠心分離により濃縮した後、濃縮した前記宿主生物又は前記細菌を飼料組成物に配合することからなる。本発明の方法がＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌を使用する場合には、前記細菌はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ種の細菌株、特にＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１株、又はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ種の細菌株、特にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株が好ましい。
【００９４】
本発明の別の特定態様によると、前記方法は本発明の細菌抽出物を上記のような製造方法により単離した後、上記方法の段階（ｅ）で得られた上清を飼料組成物に配合することからなる。
【００９５】
本発明の別の特定態様によると、前記方法は本発明のフィターゼを上記のような製造方法により製造した後、前記フィターゼを飼料組成物に配合することからなる。
【００９６】
本発明は植物性飼料のフィターゼに含まれる無機リン酸の単胃動物による同化の増進方法として、本発明のフィターゼ又は酵素組成物を前記動物の飼料に配合することを特徴とする方法にも関する。前記方法は前記単胃動物に本発明の飼料組成物を与えることを特徴とすることが好ましい。
【００９７】
本発明は単胃動物飼料へのリン添加の低減方法として、前記動物に本発明の飼料組成物を与えることを特徴とする方法にも関する。
【００９８】
本発明は単胃動物飼料からのリン廃棄物の低減方法として、前記動物に本発明の飼料組成物を与えることを特徴とする方法にも関する。
【００９９】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例により発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
実施例１：Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌の培養
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌は酸性ｐＨ媒質中で生育するグラム陰性好酸性細菌である。例えば、本発明を実施するためにはＡ．ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１及びＡ．ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４株の細菌を使用することができる。これらの細菌は類似の方法により培養することができる。特に、ペプトンとグルコースから構成した培地で３０℃、ｐＨ４の好気性条件下で培養する。標準培地は例えばＫｉｓｈｉｍｏｔｏとＴａｎｏ（１９８７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３，１１−２５）に記載されている。フィターゼを発現させるために使用する培地は無機リン酸を含まず、フィターゼ（０．４％）とＣａＣｌ２（２．２ｇ／ｌ）を補充する。
【０１０１】
実施例２：フィターゼ活性の測定
フィターゼ活性の測定は液体中で行う。測定は細菌培養サンプル即ち本発明の細菌抽出物又は本発明のフィターゼで行う。この測定はＳｈｉｍｉｚｕ（１９９２，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（８），１２６６−１２６９）の方法に準拠する。この方法の原理はフィターゼとその基質（１％フィチン酸ナトリウム溶液）の酵素反応中に遊離する無機リン酸の量を測定するものである。無機リン酸の遊離量は発色試薬（１０．８％硫酸鉄１容量とモリブデン酸アンモニウム／０．０１２Ｍ　Ｈ２ＳＯ４４容量を使用時に混合）との反応により測定する。この反応により、強酸性媒質では（Ｆｅ２＋の存在下に）着色リンモリブデン酸錯体が形成され、生成した着色溶液の７００ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定することにより形成された錯体の量を定量する。
【０１０２】
異なる２回の反応により活性を測定することができ、１回目の測定はサンプルを基質と接触させる時点（時間Ｔ０）で行い、２回目は６０分間インキュベーション後（時間Ｔ６０）に行う。（サンプルの代わりに緩衝液から構成した夫々のブランクに対する）時間Ｔ０〜Ｔ６０における吸光度の変動は酵素反応中に遊離する無機リン酸の量に比例する。
【０１０３】
所望緩衝液中０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ及び４ｍＭの濃度のＫＨ２ＰＯ４溶液２５０μｌをＴＣＡ２５０μｌと混合し、発色試薬４５０μｌで検出することにより標準検量線を作成する。１酵素単位は（所与温度及びｐＨで）無機リン酸１μｍｏｌ／分を遊離する酵素の量として定義する。
【０１０４】
実施例３：フィターゼ活性をもつ細菌抽出物の単離
培養後、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌を１５分間５０００ｇ、４℃で遠心分離して濃縮する。上清を除去し、こうして濃縮した細菌を次にｐＨ３．５のギ酸（１００ｍＭ）−ＣａＣｌ２（１ｍＭ）緩衝液に再懸濁し、培地中のその初期濃度の約１００倍に濃縮する。次に２．５ｋｂａｒ圧流中２パスの割合で「細胞破砕機」（Ｃｅｌｌ−ｄ）装置を使用して濃縮細菌を粉砕する。細菌粉砕物を次に１５分間５０００ｇ、４℃で遠心分離し、細菌抽出物を構成する上清を回収し、そのフィターゼ活性を測定する。
【０１０５】
実施例４：本発明の単離フィターゼの特性決定
４．１．温度の関数としてのフィターゼ活性
本発明のフィターゼの活性を種々の温度で測定した。細菌Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１（図１）及びＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４（図３）についてこれらの測定の結果を示す。細菌Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１及びＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４の最適活性温度は夫々７０℃と６０℃であった。
【０１０６】
４．２．ｐＨの関数としてのフィターゼ活性
本発明のフィターゼの活性を種々のｐＨで測定した。細菌Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１（図２）及びＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４（図４）についてこれらの測定の結果を示す。細菌Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１及びＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４の最適活性ｐＨは夫々４と３．５であった。
【０１０７】
実施例５：本発明のフィターゼの精製
５．１．粗抽出物の調製
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌株の細胞を遠心分離した後、１ｍＭ　ＣａＣｌ２を加えたＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ６．５で３回洗浄し、培地からのフィチン酸と（増殖中に蓄積した）無機リン酸を除去する。こうして得られた細胞懸濁液を次に「細胞破砕機」（１．５ｋｂａｒ）で破砕した後、（３．７％塩酸を加えて）ｐＨを５．５まで下げる。
【０１０８】
こうして得られた抽出物を２０，０００ｇで１時間遠心分離する。次に上清を細孔寸法０．４５μｍのメンブレンで濾過する。
【０１０９】
５．２．アニオン交換クロマトグラフィー
上清をＰＯＲＯＳ　２０　ＨＱ型カラム（４．６／１００ｍｍ：ゲル１．７ｍｌ）にロードする。溶離は１ｍＭ　ＣａＣｌ２と１Ｍ　ＮａＣｌを加えたＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ５．５で行う。フィターゼ活性（注入活性の５０％）は死容量フラクションに検出される。
【０１１０】
５．３．疎水性相互作用クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィー後に回収したフラクションを１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４に加える。次に、１ｍＭ　ＣａＣｌ２と１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えたＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ５．５で予め平衡化しておいたＰＯＲＯＳ　２０　ＨＰ２型カラム（ＨＱ４．６／１００ｍｍ：ゲル１．７ｍｌ）にこの溶液をロードする。次に、２０カラム容量中１．５→０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配でタンパク質を溶離する。
【０１１１】
フィターゼ活性は２ｍｌフラクション３画分で０．９５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４で溶出する。これらのフラクションを集めた後、１ｍＭ　ＣａＣｌ２を加えた４℃のＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）、ｐＨ５．５で一晩透析する。
【０１１２】
５．４．カチオン交換クロマトグラフィー
１ｍＭ　ＣａＣｌ２を加えたＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）、ｐＨ５．５で予め平衡化しておいたＰＯＲＯＳ　２０　ＨＳ型カラム（４．６／１００ｍｍ：ゲル１．７ｍｌ）に透析溶液を注入する。２０カラム容量中０→１Ｍ　ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶離する。
【０１１３】
フィターゼ活性をもつタンパク質はＮａＣｌ濃度０．３５Ｍで溶出する。
【０１１４】
５．５．ゲル濾過
前段階で得られたフラクションを集めて濃縮し、１ｍＭ　ＣａＣｌ２と０．１Ｍ　ＮａＣｌを加えたＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ５．５で予め平衡化しておいたＳＵＰＥＲＯＳＥ　１２　ＨＲ　１０／３０（２４ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（登録商標））にロードした。タンパク質を流速０．５ｍｌ／分の緩衝液２４ｍｌで溶離した。０．５ｍｌフラクションを集めた。フィターゼ活性は溶離緩衝液１４〜１５ｍｌの３フラクションで検出される（表１）。
【０１１５】
【表１】
2004513635.tif 000002
【０１１６】
フィターゼ活性を示す３フラクションを濃縮し、１４．４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。このゲルは約６３ｋＤａの主バンドを検出する。
【０１１７】
実施例６：内部ペプチドのマイクロシーケンシング
目的バンド（約６３ｋＤａ）をポリアクリルアミドゲルから直接切出した。５０％アセトニトリル／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６で２回洗浄してゲルに含まれる色素を部分的に除去した。ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をエンドリシン−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ製品、シーケンシンググレード）０．４μｇの存在下に３５℃の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６／０．０３％　ＳＤＳ　４００μｌで１８時間消化した。
【０１１８】
得られたペプチドを直径２．１ｍｍのＤＥＡＥ−Ｃ１８インラインカラムでＨＰＬＣにより分離した。分離勾配は２→４５％アセトニトリル勾配／０．１％ＴＦＡとした。
【０１１９】
４種のペプチドを精製した後、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７３Ａシーケンサーを使用してＥｄｍａｎ法により配列決定した。
【０１２０】
【表２】
2004513635.tif 000003
【０１２１】
実施例７：フィターゼをコードする遺伝子のクローニング
７．１．プローブの決定
目的遺伝子のフラグメントをＰＣＲ増幅するために、内部ペプチドの配列に基づいて数種の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。
【０１２２】
【化１】
2004513635.tif 000004
【０１２３】
プライマーＯｌｉｇｏ１０及びＯｌｉｇｏ１２と３種のプライマーＯｌｉｇｏ２２、２３及び２５の組み合わせを試験した処、Ｏｌｉｇｏ１２及びＯｌｉｇｏ２２のプライマー対によりＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属株のゲノムＤＮＡから５００ｂｐフラグメントを単離することができた。精製後、このＤＮＡフラグメントを配列決定した。
【０１２４】
この配列を分析した処、このフラグメントからペプチド１をコードする核酸配列を検出することができ、配列決定したＰＣＲ産物はマイクロシーケンシングの対象である目的タンパク質に確かに対応すると思われた。
【０１２５】
約５００ｂｐのＰＣＲ産物から得られた配列に基づき、目的遺伝子に特異的な非縮重プライマー対が得られるように他のプライマーＯｌｉｇｏ２９及びＯｌｉｇｏ３０を決定した。
【０１２６】
【化２】
2004513635.tif 000005
【０１２７】
７．２．サザンブロッティング
プライマーＯｌｉｇｏ１２及びＯｌｉｇｏ２２を用いて増幅により得られた約５００ｂｐのＰＣＲ産物をサザンブロッティング実験でプローブとして使用した。
【０１２８】
プローブを標識するために、Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅラベリングキットを使用してランダムプライミングにより精製ＰＣＲ産物１０ｎｇを標識した。
【０１２９】
ゲノムＤＮＡ１０μｇを夫々ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ又はＢａｍＨＩで消化した後、１％アガロースゲルにロードした。泳動後、ＤＮＡを毛管現象によりナイロンメンブレン（ＢＩＯＤＹＮＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｐａｌｌ　Ｇｅｌｍａｎ）に転写した。
【０１３０】
５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性魚類ＤＮＡの緩衝液を使用して４時間６０℃でプレハイブリダイゼーションを行った。
【０１３１】
次に、プレハイブリダイゼーション緩衝液１０ｍｌと４．０８×１０８ｃｐｍ／μｇ（乾燥状態即ちシンチラントの不在下でシンチレーションカウンターにより計数）のプローブ１０ｎｇを含む緩衝液を用いて１６時間６０℃でハイブリダイゼーションを行った。
【０１３２】
次に、２０℃で３分間２×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄、２０℃で３分間０．５×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５０℃で１５分間０．４×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄からなる洗浄段階を実施した。
【０１３３】
−８０℃で２４時間露光後にフィルム上でゲルを検出した。
【０１３４】
これらの実験の結果、ＳａｃＩＩはプローブとして使用した遺伝子部分で切断するが、この配列にＥｃｏＲＩ部位やＢａｍＨＩ部位はないことを確認できた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化すると夫々約４ｋｂのフラグメントと９ｋｂよりも大きいフラグメントが遊離し、標的配列はこれらのフラグメントにハイブリダイズする。
【０１３５】
生化学研究によると目的タンパク質は約１．６ｋｂの遺伝子によりコードされるはずであるので、完全ＥｃｏＲＩ消化によるゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１３６】
７．３．ゲノムライブラリーの構築
Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属株のゲノムＤＮＡ約３０μｇをＥｃｏＲＩで消化した。０．７％アガロースゲル上で泳動後、ＱＩＡＴＥＸ　ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して３〜４ｋｂ寸法のフラグメントを精製し、脱塩した（Ｍｉｃｒｏ　Ｂｉｏｓｐｉｎ　６，Ｂｉｏｒａｄ）。２．５〜３ｋｂ寸法のフラグメントと４〜５ｋｂ寸法のフラグメントも精製した。
【０１３７】
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＱＢＩＯｇｅｎｅ）を使用して精製フラグメントをベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ　ＫＳ（ＩＩ＋）に挿入した。３〜４ｋｂ寸法のフラグメントで実施したライゲーションの産物を使用して大腸菌株ＭＣ１０６１をエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換後、細胞をＳＯＣ（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．０５％ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）に取り、１時間３７℃に保温した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地にプレーティングした。その後、ペトリ皿を一晩３７℃で培養した。
【０１３８】
７．４．ゲノムライブラリーのスクリーニング
次にＯｌｉｇｏ２９とＯｌｉｇｏ３０のプライマー対を使用して３８３個の各コロニーをＰＣＲによりスクリーニングした。
【０１３９】
これらのコロニーのうち、４個から約４００ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。予想寸法のフラグメントを増幅可能なクローンのうち２個を使用して（Ｑｉａｇｅｎキットを用いて）プラスミドミニプレップを作製した。
【０１４０】
７．５．ゲノムインサートの配列決定
２種の同定プラスミドをＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化した。そのインサートを配列決定した処、これらの２種のプラスミドは同一インサートをもつことが判明した。配列分析の結果、５５４アミノ酸のタンパク質に対応する１６６５ｂｐのオープンリーディングフレームを検出することができた。更に、実施例６で配列決定した４種の内部ペプチドをコードする配列がこのオープンリーディングフレームにも検出された。
【０１４１】
実施例８：同定遺伝子のサブクローニング
実施例７でクローニングしたゲノムインサートで同定したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２８１と言う）を含む配列をオリゴヌクレオチド５’ＯＲＦ２８１と３’ＯＲＦ２８１でＰＣＲ増幅した。
【０１４２】
【化３】
2004513635.tif 000006
【０１４３】
ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、同一酵素で消化したベクターｐＥＴＣｍにサブクローニングした。得られたベクターをｐＥＴＣｍ２８１と呼ぶ。ＯＲＦ２８１インサートを配列決定し、クローニングした配列が先にクローニングしたゲノムインサートから決定された配列と同一であることを確認した。
【０１４４】
ベクターｐＥＴＣｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。この遺伝子即ちクロラムフェニコール耐性を選択マーカーとして使用すると、カナマイシン耐性大腸菌株即ちＢＬ２１　ａｐｐＡ（フィターゼ−）株でｉｎ　ｖｉｖｏ発現させることができる。
【０１４５】
実施例９：大腸菌にサブクローニングした遺伝子の発現
９．１．組換え大腸菌株の作製
大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡでｉｎ　ｖｉｖｏ発現アッセイを行った。この株は大腸菌フィターゼをコードするａｐｐＡ遺伝子にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されているため、内在性フィターゼを発現しなくなっている。大腸菌β−ラクタマーゼをコードするＴＥＭ遺伝子を用いて対照ベクターも作製した。ＴＥＭ遺伝子もベクターｐＥＴＣｍにクローニングし、得られたベクターをｐＥＴＣｍＴＥＭと命名した。
【０１４６】
大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡをベクターｐＥＴＣｍＴＥＭ又はｐＥＴＣｍ２８１で形質転換した。カナマイシン６０ｍｇ／Ｌとクロラムフェニコール２０ｍｇ／Ｌを加えたＬＢ培地で単離コロニーを選択した。カナマイシンとクロラムフェニコールを同一濃度で加えたＬＢ培地で各種コロニーを１個ずつ培養した。これらの培養液を使用してグリセロールストック（４０％グリセロール１容量当たり細胞１容量）を調製し、このストックから発現アッセイ用培養液を播種するようにした。これらのグリセロールストックを−８０℃で保存した。
【０１４７】
９．２．発現アッセイ
Ｍ９８培地（１リットル当たりバクトトリプトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４９．４ｇ及びＫＨ２ＰＯ４２．２ｇを含む改変Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地（グルコースで改変）、ｐＨ７．２を高圧蒸気滅菌し、使用前に培地１リットル当たりグルコース（５０％）２０ｍＬを添加）で大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１と大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍＴＥＭを培養した。発現は０．２５ｍＭ　ＩＰＴＧを加えて誘導し、３０℃と３７℃の２種類の温度で行った。
【０１４８】
３時間誘導後に培養液を遠心分離した。乾燥細胞５ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるようにギ酸緩衝液に再懸濁した各ペレットでフィターゼ活性を定量した。培養条件に関係なく、ｐＥＴＣｍ２８１を含む株にもｐＥＴＣｍＴＥＭを含む株にも活性は全く検出されなかった。
【０１４９】
次に、ｐＥＴＣｍ２８１を含む誘導培養液と非誘導培養液のアリコートを超音波処理した後、遠心分離した。上清が可溶性タンパク質フラクションであり、ペレットが不溶性タンパク質である。これらの２フラクションを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。
【０１５０】
ＩＰＴＧで誘導した大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１からの不溶性フラクションにはＭＷ６３ｋＤａのタンパク質バンドがはっきりと現れる。非誘導陰性対照に対応するバンドは全く検出されない。従って、ＯＲＦ２８１は確かに大腸菌で発現される。しかし、対応するタンパク質は不溶性であり、この形態では不活性であると思われる。
【０１５１】
９．３．封入体の可溶化と再生
ＯＲＦ２８１によりコードされるタンパク質の可溶化と再生を目的とする一連の工程を実施し、このタンパク質がフィターゼ活性をもつか否かを調べた。
【０１５２】
大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１をＭ９８培地で培養した後、６００ｎｍのＯＤが０．４に達したら０．２５ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導する。３時間誘導後に培養液を遠心分離する（最終ＯＤ約１）。培養液１００ｍＬ当たり４ｍＬの割合で２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０にペレットを取る。５００ワット電力を１０秒間ずつ４サイクル加えて細胞を４℃で超音波処理する。ＯＤ６００は１４から３まで低下する。次に、懸濁液を１０分間１６，０００ｇで遠心分離した後、上清を除去する。
【０１５３】
培養液１００ｍｌ当たり５ｍｌの可溶化緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、８Ｍ尿素、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　２−メルカプトエタノール）にペレットを再懸濁する。５００ワット電力を１０秒間ずつ４サイクル加えて懸濁液を超音波処理した後、周囲温度で１時間撹拌する。次に、０．５Ｍ　ＮａＣｌと１ｍＭメルカプトエタノール（カットオフ１０ｋＤａ）を加えた２５ｍＭ　ＭＥＳからなる再生緩衝液３リットルを使用してこの懸濁液３０ｍｌを４℃で１６時間透析する。０．５Ｍ　ＮａＣｌと１ｍＭメルカプトエタノール（カットオフ１０ｋＤａ）を加えた２５ｍＭ　ＭＥＳからなる再生緩衝液３リットルで５時間２回目の透析を行う。次に懸濁液を１０分間１６，０００ｇで遠心分離した後、酵素アッセイ時まで４℃で保存する。
【０１５４】
大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍＴＥＭにも同一の培養、可溶化及び再生プロトコールを適用した。
【０１５５】
９．４．封入体の活性
大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１及びｐＥＴＣｍＴＥＭにより生産された再生タンパク質の懸濁液をＮａｎｏｓｅｐ（登録商標）１０Ｋ　Ｏｍｅｇａ（Ｐａｌｌ）で１０倍に濃縮した。これらの濃縮溶液で標準プロトコール（ｐＨ３．５）に従ってフィターゼ活性を測定した。このアッセイを２回ずつ実施した。
【０１５６】
【表３】
2004513635.tif 000007
【０１５７】
フィターゼ活性は大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１でしか検出されない。この活性をｐＭＵＦアッセイにより確認する。このアッセイは一般に使用されている比色法の５倍の感度であるが、この蛍光光度法で大腸菌ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍＴＥＭに活性は検出されない。
【０１５８】
９．５．封入体の精製
１ｍＭ　ＣａＣｌ２を加えた２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５で予め平衡化しておいたＰＯＲＯＳ　２０　ＨＳカラム（４．６／１００ｍｍ：ゲル１．７ｍｌ）に大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１の再可溶化封入体フラクションをロードした。２０カラム容量中０→１Ｍ　ＮａＣｌ勾配でタンパク質を溶離する。
【０１５９】
フィターゼ活性は０．３５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出する。この結果は天然フィターゼを使用して実施例５．４で得られた結果と完全に一致する。
【０１６０】
同時に、大腸菌株ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍＴＥＭの完全抽出物（可溶性タンパク質と不溶性タンパク質）を同一カラムにロードし、同一条件下でタンパク質を溶離した。０．１５〜０．４５Ｍ　ＮａＣｌで溶出したフラクションにフィターゼ活性は検出できなかった。
【０１６１】
９．６．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
カチオン交換カラムからのフィターゼ活性を示すフラクションをＮａｎｏｓｅｐ（登録商標）で１０倍濃縮後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）にロードした。大腸菌ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１及び大腸菌ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍＴＥＭの細胞溶解液（ＩＰＴＧで誘導）も同一ゲルにロードした。
【０１６２】
この場合も大腸菌ＢＬ２１　ａｐｐＡ　ｐＥＴＣｍ２８１溶解液はＭＷ６３ｋＤａのバンドを含むことが明白である。フィターゼ活性を示すカラム精製フラクションにはＭＷ６１〜６３ｋＤａの主要バンドが存在する。
【０１６３】
従って、これらの結果から明らかなように大腸菌ＢＬ２１　ａｐｐＡにサブクローニング後にＯＲＦ２８１は確かにフィターゼをコードする。
【０１６４】
実施例１０：精製組換えフィターゼの特性決定
１０．１．温度の関数としてのフィターゼ活性
実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼの活性を種々の温度で測定した。これらの測定結果を図５に示す。最適活性温度は６０℃である。アッセイはｐＨ３で実施した。
【０１６５】
１０．２．ｐＨの関数としてのフィターゼ活性
実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼの活性を更に種々のｐＨで測定した。これらの測定結果を図５に示す。最適活性ｐＨは３．５である。アッセイは６０℃で実施し、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２〜２．５）、ギ酸（ｐＨ２．５〜４）、酢酸（ｐＨ４〜５）及びＭＥＳ（ｐＨ５〜６）の各緩衝液を順次使用した。
【０１６６】
実施例１１：相同配列探索
実施例７でクローニングしたゲノムフラグメントで同定したオープンリーディングフレームを含む配列をプローブとして使用し、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ及びＡｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属の微生物から相同配列を探索した。
【０１６７】
試験した株はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ　ａｎｇｕｓｔｒｕｍ及びＡｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ種に属する株とした。
【０１６８】
Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅラベリングキットを用いてランダムプライミングにより精製ＰＣＲ産物１０ｎｇを標識した。各種試験株のゲノムＤＮＡ１０μｇを夫々ＥｃｏＲＩ又はＥｃｏＲＶで消化した後、２枚の１％アガロースゲルにロードした。泳動後、ＤＮＡを毛管現象により２枚のナイロンメンブレン（ＢＩＯＤＹＮＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｐａｌｌ　Ｇｅｌｍａｎ）に転写した。
【０１６９】
５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性魚類ＤＮＡの緩衝液を使用して４時間６０℃でプレハイブリダイゼーションを行った。
【０１７０】
次に、プレハイブリダイゼーション緩衝液１０ｍｌとメンブレン１（ＥｃｏＲＩ）及びメンブレン２（ＥｃｏＲＶ）について夫々７×１０８及び９×１０８ｃｐｍ／μｇ（乾燥状態即ちシンチラントの不在下でシンチレーションカウンターにより計数）のプローブ１０ｎｇを加えた緩衝液で１６時間６０℃でハイブリダイゼーションを行った。
【０１７１】
次に、２０℃で３分間２×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄、２０℃で３分間０．５×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄、５０℃で１５分間０．４×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄からなる洗浄段階を実施した。
【０１７２】
−８０℃で６５時間露光後にフィルム上でメンブレンを検出した。
【０１７３】
２つのオートラジオグラフに顕著な差は認められなかった。
【０１７４】
この結果、実施例７で同定したオープンリーディングフレームを含むプローブの選択的ハイブリダイゼーションが試験した全Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ属株に存在することが判明した。これらの結果はＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ属細菌の遺伝子とフィターゼをコードする同定されたオープンリーディングフレームの間に有意配列相同が存在することを示唆している。更に、これらの遺伝子もフィターゼをコードすることを強く示唆している。
【０１７５】
他方、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属の微生物ではプローブとのハイブリダイゼーションは全く得られなかった。この知見はこの属の微生物で微生物学的方法によりフィターゼ活性が検出されなかったことに一致する。
【０１７６】
【図面の簡単な説明】
【図１】
温度の関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１のフィターゼの活性を示す。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【図２】
ｐＨの関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ａｍｉｎｏｌｙｔｉｃａ　ＡＴＣＣ５１３６１のフィターゼの活性を示す。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【図３】
温度の関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４のフィターゼの活性を示す。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【図４】
ｐＨの関数としてのＡｃｉｄｏｃｅｌｌａ　ｆａｃｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ３５９０４のフィターゼの活性を示す。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【図５】
実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼの温度の関数としての活性を示す。相対活性の１００％値は所与温度のフィターゼの最適活性に対応する。
【図６】
実施例５．５で精製したフラクションに含まれ、ＯＲＦ２８１によりコードされるフィターゼのｐＨの関数としての活性を示す。相対活性の１００％値は所与ｐＨのフィターゼの最適活性に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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