(57)【要約】本発明の対象はプロアポトーシスおよび免疫調整特性を持つ抗体−サイトカインであり、サイトカインの一部のｐｒｉｏｒｉが非常に低いあるいは特定のレセプター特殊型に対しての活性を持っている。これらの物質は融合タンパク質が特異的細胞メンブレン発現標的細胞に抗体媒介結合した後にのみ、サイトカインレセプターに対して完全な細胞活性を発揮する。適切な抗体特異性を選択することで、サイトカイン活性は組織、例えば治療されるべき腫瘍組織へ方向づけられ、それぞれの指標／腫瘍構成要素のための治療薬が、特異的にデザインされる／最適化される。
2004508819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）特異的標的分子に対する生物活性を持つセグメント（１）、（ｉｉ）ペプチドリンカーであるセグメント（１）セグメント（２）のＮ末端、および（ｉｉｉ）細胞表面上の特異的標的分子を選択的に認識する抗体あるいはフラグメントを含み、生物活性を全く持たないあるいは制限された生物活性を持つ、および／またはセグメント（３）の標的分子への選択的結合を持つことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
セグメント（１）がサイトカインあるいはフラグメントのアミノ酸シーケンスを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
サイトカインは細胞外ドメインであり、細胞外ドメインの機能的変異体あるいはＴＮＦ系メンバーの細胞外ドメインの機能的フラグメントであることを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
サイトカインが細胞外ドメインであり、細胞外ドメインの系の機能的変異体あるいはＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ， ＡＡ ９５−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバーＡＡＣ５０３３２）あるいはＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバーＡＡＣ５０１２４）であることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが特異的標的分子として細胞メンブレン結合サイトカインレセプターを認識することを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
セグメント（２）がセグメント（３）と（１）とを結合し、セグメント（２）が内因性規定ポリマー化分子であることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリマー化分子が、三量化特性を持った天然あるいは合成されたペプチドであり、例えば、免疫グロブリンのヒンジ領域およびヒト免疫遺伝子（ＡＡ３６３−４８９， ヒトＩｇＧ１，ＮＣＢＩ アクセッションナンバー ＡＡＦ２１６１３）のＣＨ３ドメインであり、および／または内因性三量化特性、例えば、テネイシン分子のドメインおよび／または六量化特性、例えばテネイシン分子（ＡＡ ３４−１３９， Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ１００３９， チキン， Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ２４８２１， ヒト）の幅のあるドメインであることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
フラグメント（３）が抗原結合抗体あるいは抗原結合抗体フラグメントであることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
セグメント（３）が哺乳類の抗体あるいは抗体フラグメントであり、特にネズミあるいはヒト起源、あるいはヒト化した抗体あるいはヒト化した抗体フラグメントであることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
抗体フラグメントが、様々な抗体形、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、あるいは完全免疫グロブリンとして表現されることを特徴とする上記いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシーケンスを含んでいることを特徴とする上記いずれか１項に記載の核酸構造。
【請求項１２】
請求項１１の核酸構造を含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１１の核酸および／または請求項１２のベクターを含んでいることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１４】
（ａ）請求項１２のベクターまたは請求項１１の核酸構造を生産し、
（ｂ）工程（ａ）で得られたベクターあるいは核酸構造でもって細胞を形質移入し、
（ｃ）（ｂ）の形質移入された細胞を培養し、
（ｄ）適切な条件の下で発現したポリペプチドを宿主細胞および／または培養上清から分離することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの分離方法。
【請求項１５】
薬物の調整のための、請求項１〜１０のいずれか１項のポリペプチド、請求項１１の核酸構造、請求項１２のベクターあるいは請求項１３の宿主細胞の使用。
【請求項１６】
ガン治療、特に固体あるいはリンパ腺の腫瘍、伝染病、代謝病、炎症性状態、自己免疫病、特にリウマチ／関節炎病のための、請求項１〜１０のいずれか１項のポリペプチド、請求項１１の核酸構造、請求項１２のベクターあるいは請求項１３の宿主細胞の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項のポリペプチド、請求項１１の核酸構造、請求項１２のベクターおよび／または請求項１３の宿主細胞ならびに医薬的に容認される賦形剤、添加物および／またはキャリアーを含む構成。
【請求項１８】
薬物の調整、特にガン治療、特に固形またはリンパ腺腫瘍、感染症、代謝病、炎症性状態、自己免疫病、特にリウマチ／関節炎病のための、請求項１７の構成の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物活性を全く持たない、あるいは制限された生物活性を持っており、サイト特異性および抗体媒介結合（ａｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒｖｅｒｍｉｔｔｅｌｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ）による活性化に相応するときにのみ作用するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、ペプチドリンカーとなる領域を含み、さらに抗体領域あるいは抗体から誘導される領域を含み、上記領域は細胞表面上の特異的な分子を選択的に認識し、さらにそれ自身生物活性が全くない、あるいは生物活性の制限されたサイトカイン部分を含んでいる。さらに本発明はポリペプチドが基づく核酸シーケンス、本発明にかかるこれら核酸シーケンスを含むベクター、本発明にかかる核酸シーケンスあるいはベクターによって形質移入された（ｔｒａｎｓｆｉｚｉｅｒｔｅ）細胞、治療を目的とした本発明にかかる内容の利用、および本発明を応用した内容を含む構成に関する。
【０００１】
サイトカイン、例えばＴＮＦリガンド系のメンバー、例えばＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｅ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）またＡｐｏ２Ｌ（Ｗｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９５）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６： ６７３−６８２， Ｐｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １２６８７−１２６８９）ともいう、および、例えばＦａｓＬは、生体外研究において、動物およびヒト起源の多くの腫瘍細胞に強いアポトーシス活性を示す。ＴＲＡＩＬの場合には非悪性細胞は影響されないと思われる。その上、全臨床動物モデル研究（マウス、サル）においては、急性毒性あるいは治療に制限されてみられるＴＲＡＩＬの他の全身性副作用のための糸口は見出されていない（Ｗａｌｃｚａｋ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５： １５７−１６３， Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０４： １５５−１６２）。しかしながら、最近のヒト原発性肝細胞の生体外研究、例えば、組み換えによって生成したＴＲＡＩＬ生成物およびこのサイトカインから自然に発生するメンブレン結合ＴＲＡＩＬは、それぞれ強い細胞障害性活性を示した（Ｊｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６： ５６４−５６７， Ｉｃｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ７： ９５４−９６０）。それゆえ、これまでに利用可能なサイトカインの直接的な臨床的応用では、例えば、メンブレン結合ＴＲＡＩＬの活性を完全に模倣する組み換えＴＲＡＩＬ分子は除外されている。さらに、また同類の分子であるＦａｓＬ（ＦａｓＬレセプターのリガンド（Ｆａｓ， ＣＤ９５）、アポトーシスサイトカインのプロトタイプは、レセプターに対して反発的な抗体であるＦａｓが生体内で肝臓に極めて有害であるため、安全性の理由から臨床的応用は先験的に除外されている（Ｏｇａｓａｗａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４： ８０６−８０９）。最後に、可溶性型のＦａｓＬはまた、ＦａｓＬのメンブレン結合型とは対照的に、事実上生物活性を示さない（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７： １２０５−１２１３）。
【０００２】
したがって、従来技術において利用可能なＴＮＦリガンド系のメンバーは、生物活性の欠乏あるいは過度な毒性が原因となり、応用可能でない、あるいは治療方法の応用（例えばいわゆる”分離された肢灌流培養（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｉｍｂ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）”下でのＴＮＦの場合）が制限されている。
【０００３】
それゆえ本発明は、サイトカイン活性を高めて組織もしくは細胞特異性を広げ、それにより、臨床的応用において標的組織に属さない組織／細胞の、望ましくない潜在的な全身性副作用を避ける、あるいは制限する、という課題に基づいている。
【０００４】
この課題は本願の請求項１，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７および１８によって解決される。このとき本発明は自然にメンブレン結合が生じるサイトカインは、有機体から可溶性の細胞外ドメインに相当する形にタンパク質分解されると、例えば、あるメンブレンレセプター特殊型（Ｍｅｍｂｒａｎｒｅｚｅｐｔｏｒ−Ｓｕｂｔｙｐｅｎ）に対して生物学的に極めて不活性になるか、あるいは活性が限られるという事実に基づいている。このことはまた、それぞれのリガンドの細胞外ドメインに相当する、組み換えによって生成された誘導体にも適用される。本発明の発見は、例えば細胞メンブレン結合抗原への抗体媒介特異的結合によって、抗体サイトカイン融合タンパク質のためのサイトカインレセプターそれぞれに相応する細胞が発現するという条件で、標的細胞自身や標的細胞の近くの細胞に対して、サイトカインの（完全な）生物活性が不活性／活性が制限されているということである。
【０００５】
それゆえ、本発明の第１実施例では、（ｉ）特異的標的分子に対する生物活性を持つセグメント（Ａｂｓｃｈｎｉｔｔ）（１）、（ｉｉ）ペプチドリンカーであるセグメント（１）セグメント（２）のＮ末端、および（ｉｉｉ）細胞表面上のさらなる特異的標的分子を選択的に認識するセグメント（３）を含むポリペプチドを提供する。このときセグメント（３）は本発明にかかるポリペプチドのＮ末端にあり、まずＣ末端がセグメント（２）に続き、さらにＣ末端にセグメント（３）が位置する。本発明のこのようなポリペプチド（＝本発明にかかる融合タンパク質＝本発明にかかる構成）は、生物学的に不活性である／サイト特異性および／または標的分子へのセグメント（３）の選択的結合のない、制限された活性を持っている。
【０００６】
本発明の実施例では、ポリペプチドが、自身のセグメント（１）にサイトカインのアミノ酸シーケンスを含んでいるのが好ましく、そのことから本発明のポリペプチドはサイトカインシーケンスの機能的変異体またはフラグメントを含んでいることが好ましい。機能的変異体とは、少なくとも一部分に、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％の天然シーケンスを含み、例えば、欠失、挿入、および／または少なくとも１つの突然変異により天然シーケンスとは異なっている。本発明における機能性変異体は、これらの活性の範囲（Ｗｉｒｋｓｐｅｋｔｒｕｍ）もしくはこれらの機能性の大部分あるいはほとんどが自然な実施形態（Ａｕｓｆｕｅｈｒｕｎｇｓｆｏｒｍｅｎ）に一致している。このとき、少なくとも９０％、好ましくは９５％、そして最も好ましくは９７％の相同性シーケンスが、天然シーケンスと一致することが好ましい。機能的フラグメントは、Ｎ末端、Ｃ末端、あるいは内部が連続して（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｔｉｅｌｌ）短くなった天然のサイトカインシーケンスであり、特にあるセグメント、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは、天然の完全長シーケンスの細胞外セグメントである。また、これらフラグメントの生物活性な変異体も本発明で開示する。
【０００７】
よって、サイトカインのような機能的変異体あるいはセグメントがＴＮＦ形のメンバーとして好ましい。
【０００８】
さらには本発明のポリペプチドは、セグメント（１）としてサイトカインの細胞外ドメイン（あるいは細胞外シーケンス領域）、細胞外セグメント（あるいは細胞外シーケンス領域）の機能的変異体、あるいは細胞外セグメント（あるいは細胞外シーケンス領域）の機能的フラグメント、特に、サイトカインがＴＮＦリガンドの系であれば特にプロアポトーシス（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｓｃｈｅ）のメンバーであることが好ましい。好ましくは、本発明の誘導変異体は、選択的なレセプター結合特性を持つことによって、変異体が、例えば、特異的な生物活性あるいは他の特性（安定性）に関して最適化していることである。
【０００９】
特にセグメント（１）として好ましいのは、細胞外セグメント、細胞外セグメントの機能的変異体あるいはＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ， ＡＡ ９５−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバー ＡＡＣ５０３２ Ｕ３７５１８）の細胞外セグメントの機能的フラグメント、あるいはＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバー ＡＡＣ５０１２４ Ｕ１１８２１）である。
【００１０】
有効な原理（Ｗｉｒｋｐｒｉｎｚｉｐ）はこのような本発明の構成であり、例えば本発明の構成は、アポトーシス誘導因子ＴＲＡＩＬあるいはＦａｓＬをセグメント（１）として含んでおり、特定のレセプターに対して、メンブレン分子として専ら、あるいは特に高度に活性な、ＴＮＦリガンド系のすべてのメンバーに特に適用される。ＴＲＡＩＬの他に、ＴＮＦ（ＴＮＦ−Ｒ２に関与するＴＲＡＩＬに類似）や、例えば免疫モジュレーターＣＤ４０ＬおよびＣＤ３０Ｌもまたそれに属する。それゆえ、特に好ましいのは本発明のポリペプチドが特異性標的分子として細胞メンブレン結合サイトカインを認識することである。なおその上に非制限リスト、例えば次のリガンド：ＴＮＦＳＦ１（ＬＴａｌｐｈａ），ＴＮＦＳＦ２（ＴＮＦ），ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂｅｔａ），ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ），ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０Ｌ），ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ），ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７Ｌ），ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０Ｌ），ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ），ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ），ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ），ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ），ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ），ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬＹＳ），ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ），ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ），ＴＮＦＳＦ１６（ＣＤ３０Ｌ），ＴＮＦＳＦ１８（ＡＩＴＲＬ）およびＥＤＡに属すことである。これらあるいはこれらのフラグメント、あるいは上述した天然シーケンスの機能的変異体あるいはそのフラグメントに相当するものもまた、本発明の構成においてセグメント（１）となり得る。このことから、細胞学的活性のために、下位単位（Ｕｎｔｅｒｅｉｎｈｅｉｔｅｎ）の三量化有機体に依存するすべてのメンブレン結合２タンパク質（細胞外Ｃ末端）やそのフラグメントあるいは機能的誘導体を予め設けること（Ｖｏｒａｕｓｓｅｔｚｕｎｇ）を提示する（ｍｉｔｏｆｆｅｎｂａｒｔ）。
【００１１】
本発明にかかるポリペプチドの構成のセグメント（１）および（３）（それぞれサイトカインおよび抗体モジュール）との間のリンカーセグメント（２）は、本発明では、例えば、フレキシブル連鎖を表しているのが好ましいが、例示する構造（Ｃ），（Ｄ）および（Ｆ）（リンカーアミノ酸シーケンスＡＡＡＶＥＬＥ、図４を参照）に示すように、サイトカインに相当する三量化特性の負の影響がないことが好ましい。例えば多重らせん構造および／または共有結合となる分子間のジスルフィド架橋の形成によって、例えば多量化構造の安定性の増大を実現するために、内因性の（ｉｎｓｔｒｉｎ）二量化あるいは多量化特性（例えば三量体あるいは六量体）を持っているリンカーを選ぶことが好ましい。この場合、リンカー（セグメント（２））はポリマー化モジュールを表している。
【００１２】
三量化モジュール（リンカータイプ２ａ）として作用するリンカーは、例えば免疫グロブリンヒンジ領域およびヒト免疫グロブリン遺伝子（ＡＡ ３６８−４８９， ヒトＩｇＧ１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバー ＡＡＦ２１６１３）のＣＨ３ドメインであることが好ましい（例示の構造（Ａ）、図４参照）。リンカーとしての三量化モジュール（リンカータイプ２ｂ）は、例えば、テネイシン分子（ＡＡ １１０−１３９， Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ１００３９、チキン；あるいは、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ２４８２１， ヒト）のドメインから形成されていることが好ましい。最終的に、このように六量化特性を有する六量化リンカーは、リンカータイプ２ｂ（ＡＡ ３４−１３９， Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ１００３９、チキン；あるいはＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ． アクセッションナンバー Ｐ２４８２１， ヒト）と比べて幅のある（ｅｒｗｅｉｔｅｒｅ）テネイシン分子のドメインを含むことができる。いずれの場合にも、天然ポリペプチドのシーケンス、あるいはこれらの天然ポリペプチドのフラグメントは、本発明において、ポリペプチドのセグメント（２）のリンカーとして使用され、また、発明の意味および上述した定義から生物活性変異体の形として存在することができる。
【００１３】
あるいは、他の天然由来のあるいは合成によって生成されるリンカーペプチドは、セグメント（２）に認識される。基本的に、リンカーはすべての有機体の天然あるいは（部分的に）変化したシーケンス、好ましくは脊椎動物由来、より好ましくは哺乳類由来、特に好ましくはヒト由来のシーケンスに相当することができる。さらに、例えばタンパク質のすべてのシーケンスセグメントは、例えば超２次構造、例えば”多重らせん”あるいはコラーゲン型（たとえば、ＣＭＰ，ＣＯＭＰ，コラーゲン，ラミニン）の典型的な三重らせん、の形成によって二量体あるいは多量体を生成するリンカーとして適切である。また、Ｃ１ｑ系あるいはそのコレクチネン（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｅｎ）のタンパク質のセグメントは、一般に二量化あるいは多量化として適切である。例えば、本発明にかかるポリペプチドのセグメント（１）としてのＴＮＦリガンド系のメンバーの細胞外ドメインは、リンカーセグメント（２）としてのＣＯＭＰのドメインの五量化ドメインに相当する組み換えによって五量体の形で表すことができる。本発明によれば、本発明にかかるポリペプチドのセグメント（１）としてのＴＮＦリガンド系のメンバーの細胞外ドメインは、本発明の単量体あるいはヘテロ二量体あるいはタンパク質融合となることができる。
【００１４】
さらに本発明では、セグメント（３）が抗原結合抗体あるいは抗原結合抗体フラグメントを含むポリペプチドであることが好ましい。このとき本発明のポリペプチドは、セグメント（３）が哺乳類の抗体あるいは抗体フラグメントであることが好ましく、ネズミあるいはヒト起源、あるいはヒト化したあるいはヒト化した抗体フラグメント、例えば哺乳類起源、であることがより好ましい。ヒト化の場合、セグメント（３）は一般的にネズミのｓｃＦｖから構成され、ＣＤＲグラフト重合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）によってヒト化される、あるいは完全にヒト化起源となり、従来の技術にしたがって生成される。
【００１５】
本発明にかかるセグメント（３）は、腫瘍組織において選択的あるいは優勢に表現される抗原への特異性を持っていることが好ましい。基本的に、この腫瘍抗原は悪性細胞自身あるいはまた腫瘍の非悪性部分のストロマ細胞あるいは腫瘍内皮で発現する。固形腫瘍（悪性腫瘍）の非悪性組織部のそのような抗体は、一方では、遺伝学的な変異体であり、他方では、多種多様な腫瘍物（Ｔｕｍｏｒｅｎｔｉｔａｅｔｅｎ）であり、それゆえ、普遍的な腫瘍マーカーである。抗体あるいは本発明にかかるポリペプチドのフラグメント（３）の抗体フラグメントが方向付けられるそのような腫瘍抗原の例は、ＶＥＧＦＲやＶＥＧＦＲ／ＶＥＧＦ複合体であり、それぞれ、インテグリンａｖβ３および主な腫瘍内皮の選択的標的構造のフィブロネクチンアイソフォームβＦｎであり、腫瘍ストロマの選択的マーカーとしての繊維芽活性タンパク質（ＦＡＰ）である。上述した例はすべて特異的ｓｃＦｖｓによって得られる。このことから、そのようなｓｃＦｖｓ（”単鎖Ｆｖ”）は、本発明における抗体におけるセグメント（３）として適切である。
【００１６】
それゆえ、本発明においてポリペプチドのセグメント（３）として好ましいのは、いろいろな形の抗体、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂあるいは完全免疫グロブリンである。
【００１７】
それゆえ、本発明におけるポリペプチド（例えば、図２および３を見よ）は、単量化、二量化、あるいは三量化融合タンパク質の組み換え型を表していることが好ましく、基本的には、定義されたシーケンス（単量体）に次の構造要素を含んでいることが好ましい：（セグメント（３））マウスＮ末端、ＶＨ−ペプチドリンカー−ＶＬからなる、ヒト化したあるいはヒトの単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）；（セグメント（２））共有性多重結合がある、またはないリンカーシーケンス、例えば、二量化（２ａ）、三量化（２ｂ）あるいは六量化ドメイン（２ｃ）；（（セグメント１））ＴＲＡＩＬ（ＡＡ ９５−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバー Ｕ３７５１８）のＣ末端ヒト細胞外ドメインあるいはＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１， ＮＣＢＩ アクセッションナンバー Ｕ１１８２１）。類似の例えばＣＤ４０ＬあるいはＴＮＦ形のサイトカインメンバーも、本発明ではポリペプチドのセグメント（１）に相当する。
【００１８】
本発明にかかる構造が全く同様に適用するリンカー（２）の特異的選択によって本発明にかかる構成からのすべての二量体あるいは多量体が開示される。本発明にかかるポリペプチドの二量体あるいは多量体は常に”本発明にかかるポリペプチド”として広い表現の下で提示される。
【００１９】
本発明のさらなる内容は、本発明（核酸構造）の上述したタイプのＤＮＡシーケンスコード化融合タンパク質、あるいは、本発明にかかるそのようなコード化ポリペプチド領域を含むことである。そのようなＤＮＡシーケンスは発現ベクターとして表現され、また発明の内容に属する本発明による融合タンパク質のためのＤＮＡシーケンスを含む発現ベクターとして表現される。好ましくは、本発明にかかるベクターは、発現可能であり／あるいは原核生物細胞および／または真核生物の細胞が増強したものである。特に、本発明はプラスミドベクター、例えば、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ、あるいはまたレトロウイルスベクター、特にまた、遺伝子治療に応用されるベクターシステム、例えばまたアデノウイルスベクターシステムに関係する。それゆえ、本発明においては、本発明にかかるベクターを使用した治療方法、あるいは本発明で開示される医療に適用した治療方法としての核酸構造もまた開示する。
【００２０】
さらに本発明は、本発明によるＤＮＡシーケンス（核酸構造）コード化融合タンパク質でもって形質移入された宿主細胞に付随する。このことにより、特には、発現ベクターによって形質移入された宿主細胞、あるいは、本発明による発現ベクターが再びＤＮＡシーケンスコードを本発明による融合タンパク質のために含む核酸構造であることが好ましい。核酸構造は前の請求項のいずれかによるポリペプチドのためのヌクレオチドシーケンスコードを含むことで特徴づけられる。
【００２１】
さらに本発明の内容は、本発明にかかるポリペプチドの生成（発現および分離方法）の方法であり、本発明にかかる分離方法は、（ａ）本発明にかかるベクターあるいは核酸構造を提供する、（ｂ）工程（ａ）で得られたベクターあるいは核酸構造で細胞を形質移入する、（ｃ）（ｂ）にかかる形質移入された細胞の培養、そして（ｄ）宿主細胞および／または培養浮遊物からの、適切な条件下で発現した本発明のポリペプチドの分離、によって特徴づけられる。融合タンパク質の発現は、一般には従来技術にかかる適切な発現システムで実施され、好ましくは、安定な形質移入体、例えばＣＨＯ細胞、あるいはＣｏｓ７やＳｆ９（昆虫細胞）のような他の動物細胞、あるいは他の真核生物細胞システム、例えばＰｉｃｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、の分泌生成物であることが好ましい。本発明にかかる発現したポリペプチドは、細胞システムにおける分泌に適切なそれぞれの始端部シーケンスを持っていることが好ましい。それゆえ、発現のために使用される本発明にかかるベクターはまた、例えばＢｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ． （Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１７３−１８４， １９９７）に記載されているように、哺乳類および昆虫の細胞、あるいはｐＰＩＣＺａｌｐａベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、およびイースト菌の分泌物Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを含んでいる。
【００２２】
本発明にかかるポリペプチドではまた、付随的に、核酸構造、ベクター、あるいは宿主細胞（これ以下の範疇では、”本発明にかかる物質”とまとめる）もまた、薬物あるいは薬物の調整として考慮される。本発明にかかる物質は、融合タンパク質の、細胞膜上に発現した抗体媒介結合の特異的標的分子への抗体媒介結合の後に、本発明にかかる物質が相当するサイトカインレセプターを経て完全な生物活性を発揮する場合に特に利用される。適切な抗体特異性を選択することで、本発明にかかる物質のサイトカイン活性は、治療されるべき組織、例えば腫瘍組織に方向付けられ、そしてそれぞれ指標（Ｉｎｄｉｋａｔｉｏｎ）／腫瘍構成要素（Ｔｕｍｏｒｅｎｔｉｔａｅｔ）で特別にデザインされた／最適化された治療薬が生産される。例えば腫瘍治療薬、特に固形腫瘍、またリンパ腺腫瘍（良性あるいは悪性）の応用では、まず初めに本発明にかかるポリペプチドは、腫瘍自身あるいは反応性腫瘍ストロマ／腫瘍脈管系（Ｔｕｍｏｒｇｅｆａｅｓｓｓｙｓｔｅｍ）によって形成されたメンブレンマーカーによる腫瘍領域の抗体部分が原因で特異的に高められて（ａｎｇｅｒｅｉｃｈｅｒｔ）おり、サイトカインレセプターポジティブ腫瘍細胞あるいは正常組織によって与えられる反応性腫瘍のサイトカインに反応する細胞を提供している。
【００２３】
本発明にかかる物質は、基本的にはまた常に治療に使用されるのが好ましく、例えば、ＴＮＦレセプター系によって、例えばシグナルカスケード、例えばアポトーシスシグナルカスケードが誘発される、シグナル伝達経路の治療として用いられる。それゆえ治療のための本発明にかかる物質の使用、あるいはすべての過剰増殖疾病（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｒ Ｅｒｋｒａｎｋｕｎｇｅｎ）の治療のための薬物の生産のための使用、例えばまた、過剰な免疫反応の場合の免疫系の標的細胞の除去、例えば多発性硬化症のような自己免疫疾患、関節リュウマチ、糖尿病、メリトス（ｍｅｌｌｉｔｕｓ）およびＴＥＭ、あるいは誤った免疫反応（細菌性（例えばミコバクテリアによる）、ウイルス性、あるいは原生動物的な）のための使用が挙げられる。さらには、代謝病あるいは一般的な過剰炎症性（ｈｙｐｅｒｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｉｓｃｈｅｎ）状態、特には慢性炎症、例えばまたアレルギーであるが、また異質組織に対する免疫系の拒絶反応の治療も考慮の対象になる。上述の場合には、本発明にかかるポリペプチドのそれぞれの抗原結合セグメント（３）は、標的細胞の表面の特徴的なマーカーを認識しなければならず、細胞死のためにアポトーシスシグナルカスケードが誘発されることが好ましい。それゆえ、異質組織の移植後の治療の場合には、例えば、拒絶反応の原因である移植患者の免疫系の内因性細胞は、標的細胞としての役割を果たす。
【００２４】
核酸構成、ベクターの発現あるいは宿主細胞といった本発明の内容は、上述したようにも、また例えば、上述した病気の治療とのための薬物として述べられる。この場合、形質移入されるべき細胞は、治療されるべき患者から採取されることが好ましく、上記の細胞は本発明にかかる発現ベクターによって生体外で形質移入され、培養され、そして、再移植されることが好ましい。形質移入は、核酸構成あるいは発現を制御可能なプロモーターと結びつける発現ベクターによって実施されることが好ましい。形質移入された固有移植（Ｅｉｇｅｎｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ）は、例えば局所的に注入されて（ｉｎｊｉｚｉｅｒｔ）いてもよく、特異的な疾患および特異的な標的細胞に依存する。局所的にすること（Ｖｅｒａｂｒｅｉｃｈｕｎｇ）は、例えば、腫瘍治療の場合に好ましい。このとき腫瘍細胞は患者から採取されていることが好ましく、生体外で移植され、それから、もし可能であれば、腫瘍内、例えば経皮腫瘍（例えば黒色腫）、神経系の腫瘍（例えば膠芽細胞種）に直接注入されることが好ましい。
【００２５】
さらなる本発明の内容は、ポリペプチドが、核酸構造、ベクターおよび／または宿主細胞、医薬的に適切な賦形剤、添加物および／またはキャリアー（例えばまた溶解剤）を含むことである。それゆえ、本発明では、医薬的に適切なキャリアー、賦形剤および添加剤とともに本発明による物質の組み合わせを開示する。生産に対応する方法は、”Ｒｅｍｉｎｈｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｓｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｈｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８０）に開示されている。非経口投与のためのキャリアーは、例えば、滅菌水、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアクリレングリコール、水素化ナフタレン、および特に生体適合性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコール共重合体、あるいは、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンラクチドポリマーである。本発明にかかるそのような構成は、上述したようにすべての医療適用のために予見される。さらに本発明にかかる構成は、ラクトースやマンニトールといった充填剤あるいは物質、例えばポリエチレングリコールといったポリマーを本発明の阻害剤に共有結合するための物質や、金属イオンとの複合体を形成するための物質や、材料を誘導するため、あるいは例えばポリアセチレン、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、あるいはリボソーム上、マイクロエマルジョン、ミセル、単層あるいは多層の頂嚢、赤血球フラグメントあるいはスフェロプラストといったポリマー化合物の特異的調整の材料に導入する物質、を含んでいてもよい。実施例の構成は、物理的性質、例えば溶解度、安定度、生物活性あるいは分解度、物理的性質をもとに選択する。本発明にかかる、制御されるあるいは活性物質の一定の解放は、親油性デポー（Ｄｅｐｏｔｓ）（例えば、脂肪酸、ワックスあるいは油）を含んでいる。本発明では、本発明にかかる、いわゆるポリマー（例えばポリオキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｅ）あるいはポリオキサミン（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ））のコーティングといった物質を含んでいる物質、あるいは構成物のコーティングも提示する。さらに本発明にかかる物質あるいは構成は、プロテアーゼ阻害剤あるいは透過性増強医薬品といった保護コーティングを含んでいてもよい。
【００２６】
基本的に、本発明にかかる物質、あるいは本発明にかかる構成のために置かれている本発明の範囲はすべて従来技術の処理経路で明らかにされる。好ましくは、上述した薬物の調整あるいは病気あるいは不調の治療は、非経口、すなわち、例えば、皮下、筋肉内、あるいは静脈内、経口あるいは鼻腔内の投与によって実施されることである。一般的に、本発明にかかる医薬構成は、固体、液体あるいはエアロゾル（例えばスプレー）である。
【００２７】
まとめると、本発明によれば、ｐｒｉｏｒｉメンブレン結合サイトカインの可溶性形を含むプロアポトーシスおよび免疫調整特性を持つ抗体サイトカイン融合タンパク質が提供される。特異的な細胞メンブレン結合標的分子の結合による、さもなければ生物活性を持たない、あるいは制限された生物活性を持ち、本発明にかかるポリペプチドに存在する抗体機能が、サイトカインレセプターによって完全な生物活性を発揮する。適切な抗体特異性を選択することで、サイトカイン活性は、例えば、治療されるべき組織、例えば腫瘍組織へ向けられ、治療薬は、それぞれの指標／腫瘍要素に特異的にデザインされた／最適化された構成要素である。まとめると、本発明にかかるポリペプチドのサイトカイン活性の選択性は２つの機構によって達成される：一方では抗体媒介、例えばｓｃＦｖ、腫瘍内のサイトカインの選択的増強であり、このサイトカインは非抗原結合状態で活性を示さないかあるいは活性の制限されており、他方では、十分な伝達が可能な分子を提示することによるサイトカインのサイト特異的活性と通して、特にまたアポトーシス誘導分子である。
【００２８】
本発明をさらに次の図で説明する。
【００２９】
図１は、本発明にかかる融合タンパク質の発現後の、ゲル電気泳動の分離の結果を示す（融合タンパク質の構造は実施例１のＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）をみよ、図１ではＭＢＯＳ４−ＴＲＡＩＬと略す）。ウエスタンブロッティング法は、融合タンパク質が非還元下状態で１４０ｋＤａであり、２×６５＝１３０ｋＤａのＣＨ３結合ダイマーの計算によるＭＷに相当している。
【００３０】
図２は、本発明にかかるいくつかのＡＭＡＩＺｅ−ポリペプチドによるＦＡＰ−ポジティブ腫瘍細胞のアポトーシスの選択的な誘導を示している。図２のすべての図（図２Ａから図２Ｆまで）は、ＡＭＡＩＺｅタンパク質の濃度に対する細胞活性（％）を示している。図２Ａで示される曲線（図２のリガンド）は、ＦＡＰ特異的抗体ｃＦ１０と共に前培養した後のＦＡＰ−ポジティブ（ＨＴ １０８０−ＦＡＰ）と、培養なしのＦＡＰ−ネガティブ（ＨＴ １０８０）の処理結果を示している。
【００３１】
すべてのさらなる場合（図２Ｂ−Ｆ）では、抗原発現細胞（ＨＴ １０８０−ＦＡＰ）、つまり抗体媒介によって本発明にかかるＡＭＡＩＺｅ構成に結合するこれらの細胞上では、異なるＡＭＡＩＺｅ構造の細胞毒性は常に抗原−ネガティブ親細胞（ＨＴ １０８０）の毒性よりも強い。
【００３２】
ＡＭＡＩＺｅ構造がＦＡＰへ結合したＦＡＰ発現細胞の感度を図２Ａに示す：ここでは、Ｆａｐ特異的抗体ｃＦ１９（ｃＦ１９，黒い四角）はＡＭＡＩＺｅ構造ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）とともに、細胞的に発現したＦＡＰを結合し、ＦＡＰ−ポジディブ細胞に対するＡＭＡＩＺｅ構造のサイトカイン活性は、Ｆａｐ−ネガティブ細胞の場合にもまた観測された。これに対して、ｃＦ１９の添加はＦＡＰ−ネガティブ細胞に対して全く影響を及ぼさなかった。このように、抗体媒介特異性は、ＦＡＰ特異的単クローン製抗体ｃＦ１９によるアポトーシスの増強を誘導する競争的阻害剤であることが明らかに実証された。
【００３３】
図３は、サイトカイン分子としてのＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬと本発明にかかるＡＭＡＩＺｅ構造、独立したＦＡＰ特異的抗体クローンＯＳ４およびクローン４０、そして抗体とサイトカイン分子（本発明にかかる（Ａ）−（Ｆ）の構造）との間の異なるリンカーを示す。本発明にかかるすべての構造は抗原依存誘導／アポトーシスの増強特性を持っている。
【００３４】
次に生産された構造を概略的に示す。特異的なＡＭＡＩＺｅ活性（抗原−ポジティブ細胞のアポトーシスの優先的誘導）を図２に示す。アミノ酸シーケンスとして選択されたコードは１文字コードである。フラグメント（２）（リンカー）は、本発明にかかる分子内のセグメント（３）（例えばｓｃＦｖ）およびサイトカインの部分（１）（例えば、示す構造のＴＲＡＩＬまたはＦａｓＬ）との間の結合を形成し、タイプ２ａ，２ｂあるいは２ｃは、生物発生の間にヒトタンパク質の共有結合を確実にする。
【００３５】
構造（Ａ）：ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）
ＮＨ２−［始端部］−［ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー１］−［ＣＨ３］−［リンカー２］−［ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）］−ＣＯＯＨ
ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
ＣＨ３：ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（ＡＡ ３６３−４８９）
リンカー１：Ｃ末端ポリ−Ｇｌｙリンカー（イタリック）を持つヒトＩｇＧ１（ボールド体）のヒンジ領域
（ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＡＶＦＡＡＡＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ）
リンカー２：ポリＧｌ−リンカー（ＧＧＧＧＴＧＧＧＳ）
ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）ヒトＴＲＡＩＬ（ＡＡ−９５−２８１）の細胞外ドメイン
構造（Ａ）のリンカー：ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）は、二量化特性を持っている。
【００３６】
構造（Ｂ）：ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＯＳ４）
ＮＨ２−［始端部］−［ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー］−［ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）］−ＣＯＯＨ
ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
リンカー：ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＡＶＦＡＡＡＶＥＬＥ
ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）：ヒトＴＲＡＩＬ（ＡＡ ９５−２８１）の細胞外ドメイン
構造（Ｃ）：ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）
ＮＨ２−［始端部］−［４０−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー］−［ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）］−ＣＯＯＨ
４０−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
リンカー：ＡＡＡＶＥＬＥ
ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）：ＴＲＡＩＬ（ＡＡ ９５−２８１）
構造（Ｄ）：ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）
ＮＨ２−［始端部］−［４０−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー］−［ＦａｓＬ（１３９−２８１）］−ＣＯＯＨ
４０−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
リンカー：ＡＡＡＶＥＬＥ
ＦａｓＬ（１３９−２８１）：ヒトＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１）の細胞外ドメイン
構造（Ｅ）：ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＯＳ４）
ＮＨ２−［始端部］−［ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー］−［ＦａｓＬ（１３９−２８１］−ＣＯＯＨ
ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
リンカー：ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＡＶＦＡＡＡ
ＦａｓＬ（１３９−２８１）：ヒトＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１）の細胞外ドメイン
構造（Ｆ）：ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０−フラッグ）
ＮＨ２−［始端部］−［４０−ＶＨ／ＶＬ］−［フラッグ−タグ］［リンカー］−［ＦａｓＬ（１３９−２８１）］−ＣＯＯＨ
４０−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
フラッグ−タグ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ
リンカー：ＡＡＡＶＥＬＥ
ＦａｓＬ（１３９−２８１）：ヒトＦａｓＬ（ＡＡ １３９−２８１）の細胞外ドメイン
本発明は、実施例を用いてより詳細に説明される。
【００３７】
実施例１
本発明にかかる融合タンパク質の発現
本発明にかかる融合タンパク質はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞で発現する。この融合タンパク質はＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）構造であり、図１では、ＭＢＯＳ４−ＴＲＡＩＬと短縮し、（共有結合性二量体）、次の構造（図３も参照）を有している：
ＮＨ２−［始端部］−［ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ］−［リンカー１］−［ＣＨ３］−［リンカー２］−［ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）］−ＣＯＯＨ
ＯＳ４−ＶＨ／ＶＬ：ＦＡＰ特異的ヒト単鎖抗体フラグメント
ＣＨ３：ヒトＩｇＧ１のＣＨ３−ドメイン（ＡＡ ３６３−４８９）
リンカー１：Ｃ末端ポリ−Ｇｌｙリンカー（イタリック）をもつヒトＩｇＧ１（ボールド体）のヒンジ領域
（ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＡＶＦＡＡＡＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ）
リンカー２：ポリ−Ｇｌｙリンカー（ＧＧＧＧＴＧＧＧＳ）
ＴＲＡＩＬ（９５−２８１）：ヒトＴＲＡＩＬ（ＡＡ ９５−２８１）の細胞体ドメイン
実施例２
ポリペプチドＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）およびＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）の構造
融合タンパク質は次のようにして生成される：
１．ベクターｐＳＥＸ（Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：４６１−４６９； Ｍｅｒｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ９２：２４０−２４８を見よ）に存在するｓｃＦｖフェーズ発現ライブラリーからＦＡＰへの結合に基づく標準的な方法によって、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）Ｎｏ．４０（以下では４０と示す）が分離された。
【００３８】
２．ｓｃＦｖ４０はＰｖｕ２およびＮｏｔ１とともにｐＳＥＸから切除されており、小型体構造ｐＷ６（Ｗｕｅｅｓｔ， Ｔ．， Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， ２００１）に相当するサイトに挿入されている。このために、これらのサイトカンに位置するＤＮＡ領域は、ＤＮＡ溶出でもって制限ダイジェストおよび分離アガロースゲル電気泳動によってプラスミドｐＷ６から除去されている。このクローニング工程によって、ｓｃＦｖ４０は真核生物のＩｇ始端部シーケンス（４０の上流）とその反対のヒト抗体（ＩｇＧ１、４０の下流）の定常領域（Ｆｃ領域）との間でクローニングされ、その結果、Ｈｕ ｅｔ ａｌ， （Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｈ ５６： ３０５５）に開示されている二価の小型体の発現が可能になる。
【００３９】
３．始端部＋ｓｃＦｖ４０＋Ｆｃはプライマー１および２を用いたプルーフリーディングＰＣＲによって増強された。そしてプライマー１およびｓｃＦｖ４０とＦｃ領域との間にあるＮｏｔ１制限サイトによって導入されたＫｐｎ１制限サイトによって、ｓｃＦｖフラグメントが真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）の制限サイトに挿入された。
【００４０】
４ａ．ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）の最後の調整として、プライマー３と４とプルーフリーディングＰＣＲとを用いてヒトＦａｓＬのＡＳ１３９から２８１＋ストップコドンが増強され、３．で得られたｐｃＤＮＡ３．１クローニング媒介物の切断位置Ｎｏｔ１およびＸｂａ１に挿入された。これにより、Ｘｂａと互換性のＮｏｔ１およびＮｈｅ１、制限サイトが、使用されたプライマーによってＦａｓＬ単位複製配列の中へ導入された。このようにして得られた最終構成は融合タンパク質ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）を発現する。
【００４１】
４ｂ．ＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）の最後の調整として、ヒトＴＲＡＩＬのＡＡ９５から２８１＋ストップコドンがプライマー５および６を使用したプルーフリーディングＰＣＲによって増幅され、３．で得られたｐｃＤＮＡ３．１クローニング媒介物のＮｏｔ１およびＸｂａ１制限サイトに挿入された。このため、使用されたプライマーによってＮｏｔ１およびＸｂａ１はＴＲＡＩＬ単位複製配列の中へ導入された。このようにして得られた最終構成は、融合タンパク質ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）を発現する。
【００４２】
５．ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）およびＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅ（４０）のそれぞれから採取するために、４．で示す構成のＨＥＫ２９３細胞は、製造者の指示によりリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）によって形質移入される。形質移入４８時間後、ＡＭＡＩＺｅ構成浮遊物は滅菌濾過され、次に使用されるまで４℃で保管された。
【００４３】
すべてのクローンおよびＰＣＲ増強工程は次のプライマーを使用した通例の標準的な手順によって実施される。すべての構成はｃＤＮＡシーケンスの証明のためにシーケンス化される。
【００４４】
プライマー１
５’ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＣＧ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＴＧＧ　ＡＣＣ　ＴＧＧ　ＣＧＣ　ＧＴＧ　３’
プライマー２
５’ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＣＡＣ　ＡＧＣ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＣ　３’
プライマー３
５’ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＧＴＧ　３’
プライマー４
５’ＣＴＡ　ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＡ　ＴＡＡ　ＧＣＣ　３’
プライマー５
５’ＧＴＣ　ＴＴＣ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　ＡＣＡ　Ｇ３’
プライマー６
５’ＴＧＣ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＧＣＣ　ＡＡＣ　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＣ　３’
実施例３
ＦＡＰ−特異的ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）による抗原依存活性の実例（図２も見よ）
実施例２と同様に、ＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）が与えられた。
続いて、ＦＡＰ−ポジティブ（ＨＴ １０８０−ＦＡＰ）のほうをＦＡＰ−特異的抗体ｃＦ１９で（１時間）前保温し、ＦＡＰ−ネガティブ（ＨＴ １０８０）は、前保存処理をしなかった。細胞はＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）の望ましい濃度で、ＣＨＸ（２．５μｇ／ｍｌ）の存在下、オーバーナイトで前保温された。残存している細胞の定量化はクリスタルバイオレット染色によって実施された。図２Ａは、融合タンパク質（ＦＡＰ−ポジティブＨＴ １０８０）の抗体部分によって特異的に認識される標的細胞上のＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅ（ＭＢＯＳ４）の活性を表している。
【００４５】
実施例４
ＦＡＰ−ポジティブ腫瘍細胞内のＴＲＡＩＬ−ＡＭＡＩＺｅおよびＦａｓＬ−ＡＭＡＩＺｅによるアポトーシスの優先誘導（図２Ａ−Ｆを見よ）
９６ウェルプレートのウェル（ｗｅｌｌ）当たり１５×１０３ＨＴ１０８０あるいはＨＴ１０８０ＦＡＰ細胞がオーバーナイトで培養された。翌日、細胞はさらに異なる濃度で１４〜１８時間、２．５μｇ／ｍｌのＣＨＸの存在下で処理された（死レセプター媒介アポトーシスの導入に関する細胞の感作のため）。最後に、クリスタルバイオレット染色によって細胞の生存度が決定された。処理されていないグループのそれぞれの値はすべての場合において７００から８５０ｍＯＤの間であった。すべての細胞が死細胞になりがちである制御されたグループでは１００から１５０ｍＯＤの値を示した。ポジティブ制御グループに相当する細胞死は、フラッグ特異的抗体Ｍ２（シグマ）による可溶フラッグ標識ＦａｓＬ構成（５００ｎｇ／ｍｌ）の二次クロスリンクによって完成された。またこの場合、培養液には２．５μｇＣＨＸが加えられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明にかかる融合タンパク質の発現後の、ゲル電気泳動の分離の結果を示す図である。
【図２】
本発明にかかるＡＭＡＩＺｅ−ポリペプチドによるＦＡＰ−ポジティブ腫瘍細胞のアポトーシスの選択的な誘導であり、２Ａから２Ｆまでは、ＡＭＡＩＺｅタンパク質の濃度に対する細胞活性（％）を示す図である。
【図３】
サイトカイン分子としてのＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬと本発明にかかるＡＭＡＩＺｅ構造、独立したＦＡＰ特異的抗体クローンＯＳ４およびクローン４０、そして抗体とサイトカイン分子（本発明にかかる（Ａ）−（Ｆ）の構造）との間の異なるリンカーを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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