(57)【要約】（ａ）組織または臓器から、あるいはその一部から、複数の細胞を取得および／または抽出し、（ｂ）スフェロイドを作製するのに十分な時間かつ第１の速度にて、前記細胞を流動性培地中で軌道回転させ、および（ｃ）前記第１の速度よりも遅い１以上の第２の速度にて、工程（ｂ）において作製された前記スフェロイドを流動性培地中でさらに軌道回転させること、を含むスフェロイドの作製方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェロイドの作製方法であって、
（ａ）組織または臓器から、あるいはその一部から、複数の細胞を取得および／または抽出し、
（ｂ）スフェロイドを作製するのに十分な時間かつ第１の速度にて、前記細胞を流動性培地中で軌道回転させ、および
（ｃ）前記第１の速度よりも遅い１以上の第２の速度にて、工程（ｂ）において作製された前記スフェロイドを流動性培地中でさらに軌道回転させること、
を含む、スフェロイドの作製方法。
【請求項２】
請求項１において、
工程（ｃ）における前記細胞を、８０ｒｐｍより遅い第２の速度で回転させる、スフェロイドの作製方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
工程（ｂ）における前記細胞を、少なくとも７７ｒｐｍである第１の速度で回転させる、スフェロイドの作製方法。
【請求項４】
請求項３において、
工程（ｂ）における前記細胞を、７７〜９０ｒｐｍである第１の速度で回転させる、スフェロイドの作製方法。
【請求項５】
請求項４において、
工程（ｂ）における前記細胞を、８３〜８７ｒｐｍである第１の速度で回転させる、スフェロイドの作製方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、
工程（ａ）における前記細胞の回転期間は１〜４日間である、スフェロイドの作製方法。
【請求項７】
請求項６において、
工程（ａ）における前記細胞の回転期間は１〜２日間である、スフェロイドの作製方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかにおいて、
工程（ｂ）における前記細胞の回転期間は２〜４５日間である、スフェロイドの作製方法。
【請求項９】
請求項８において、
工程（ｂ）における前記細胞の回転期間は２〜３５日間である、スフェロイドの作製方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかにおいて、
さらに、（ｄ）工程（ｃ）で作製された前記スフェロイドを低温保存すること、を含む、スフェロイドの作製方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかにおいて、
工程（ａ）における前記細胞は、哺乳類または鳥類の組織、臓器または細胞系から抽出されたものである、スフェロイドの作製方法。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記哺乳類の組織、臓器または細胞系は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ブタ、またはげっ歯類由来である、スフェロイドの作製方法。
【請求項１３】
請求項１１において、
前記鳥類の組織は、ニワトリのひなの組織である、スフェロイドの作製方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれかにおいて、
最終的に得られたスフェロイド個体群において、前記スフェロイドの少なくとも７５％が１００〜３５０μｍの直径を有する、スフェロイドの作製方法。
【請求項１５】
請求項１４において、
前記スフェロイドの少なくとも７５％が１５０〜２００μｍの直径を有する、スフェロイドの作製方法。
【請求項１６】
請求項１５において、
前記スフェロイドの少なくとも９０％が１００〜３５０μｍの直径を有する、スフェロイドの作製方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかにおいて、
前記スフェロイドの少なくとも９０％が１５０〜２００μｍの直径を有する、スフェロイドの作製方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれかにおいて、
前記スフェロイドはそれぞれ、少なくとも１０３個の細胞の再凝集体からなる、スフェロイドの作製方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれかにおいて、
前記スフェロイドは、形態学的に正規な形状である、スフェロイドの作製方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれかにおいて、
前記スフェロイドは、滑らかな表面を有する、スフェロイドの作製方法。
【請求項２１】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の方法によって作製された、スフェロイド。
【請求項２２】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の方法によって作製されたスフェロイドを含む、インビトロモデル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［スフェロイドの作製］
本発明は、人工的に作製された細胞凝集体に関し、前記細胞凝集体は、スフェロイド (spheroid)、再凝集体 (reaggregate)、小器官 (organoid)、およびクリオイド (cryoid)として知られている３次元構造の形状を有する。
【０００２】
スフェロイドは、異なる種類の組織のインビトロ(in vitro)モデルとして使用される可能性が高く、特に、新規な化学的存在（ＮＣＥ’ｓ）および／または新規な治療薬を試験するためのモデルとして用いられる可能性を有する。
【０００３】
ＷＯ−Ａ−９８／３５０２１には、後に低温保存 (cryopreserve)されるスフェロイドの作製方法が記載されている。スフェロイドの作製方法の一つとして、第１の速度で所定期間軌道回転させた後、前記第１の速度よりも大きな第２の速度にて所定期間軌道回転させる方法がある。
【０００４】
従来のスフェロイドの作製方法では、大きさが均一でないスフェロイド個体群を生じる傾向がある。このことは、少なくとも３つの観点から望ましくない特性である。第１に、スフェロイドの大きさが異なる場合、生存期間が異なる傾向がある。一方、所定のバッチにおいて作製されたスフェロイドの個体群は、相対的に短い生存期間を有するスフェロイドと、相対的に長い生存期間を有するスフェロイドとを含む。このことは、薬の候補および／または新規な化学的存在を評価するための組織モデルとして用いられる材料中においては望ましくない。第２に、スフェロイドの大きさが異なる場合、薬の候補および／または新規な化学的存在に対する反応性（例えば、薬の候補および／または新規な化学的存在がスフェロイドを通過する度合いの点で）が異なることがある。このことは、結果の分析を困難にすることがある。第３に、不均一な大きさのスフェロイドは、引き続いて行なわれる薬への曝露 (exposure)に対して不安定な機能的反応を示すことがあり、このことはデータ分析を混乱させる。このデータ分析には、効能および／または毒性の評価が含まれる。
【０００５】
最終的に得られるスフェロイド個体群中において、大きさが均一であるスフェロイドを作製する方法を提供できることが望ましい（図１参照）。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、スフェロイドの作製方法であって、
（ａ）組織または臓器から、あるいはその一部から、複数の細胞を取得および／または抽出し、
（ｂ）スフェロイドを作製するのに十分な時間かつ第１の速度にて、前記細胞を流動性培地中で軌道回転させ、および
（ｃ）前記第１の速度よりも遅い１以上の第２の速度にて、工程（ｂ）において作製された前記スフェロイドを流動性培地中でさらに軌道回転させること、
を含む、スフェロイドの作製方法が提供される。
【０００７】
本発明にしたがって作製されたスフェロイドはインビトロモデルとして用いることができ、これにより、本発明にしたがって作製されたスフェロイドは生体動物の使用の有効な代替物となる。より好ましいモデルは哺乳類（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ブタ、げっ歯類）モデルまたは鳥類（例えば、ニワトリのひな）モデルである。
【０００８】
ここで用いられているように、スフェロイドは３次元構造を意味し、通常は回転楕円体 (spherical)の形状であり、自然に発生することはなく、細胞の再凝集体（通常は１０３またはそれ以上の細胞を含む再凝集体）からなり、前記細胞は、組織または臓器に由来するか、あるいは細胞系に由来するものの単独または組み合わせからなる。
【０００９】
本発明の方法の１つの特徴は、均一な個体数のスフェロイドを生産することができる点である。これにより、本発明の方法は、前記方法で作製されたスフェロイドのかなりの部分（例えば、スフェロイドの少なくとも７５％、より好ましくはスフェロイドの少なくとも９０％）が比較的狭いサイズ範囲内にある大きさを有し、形態学的には、各スフェロイドの形状は正規であり、かつ滑らかな表面を有する。
【００１０】
適切な狭いサイズ範囲は、測定されたスフェロイドの直径でいうと１００〜３５０μｍであり、この範囲の上限は、使用の際に生じる実用的な上限である。なぜなら、より大きな直径では、組織の種類に依存して、スフェロイドへと導入される栄養物の非効率的な拡散率と、スフェロイドから排出される老廃物の非効率的な拡散率とが原因で、スフェロイドの中心が壊死するからである。典型的には、これにより、本発明の方法は、スフェロイドの少なくとも７５％、好ましくはスフェロイドの９０％が１００〜３５０μｍの範囲内にある直径を有するスフェロイド個体群を作製することができる。
【００１１】
より好ましい狭いサイズ範囲は、大部分の組織の種類から作製されたスフェロイドに適用されるものであり、１５０〜２００μｍの直径であることが好ましい。本発明の方法は、スフェロイドの少なくとも７５％、好ましくは少なくともスフェロイドの９０％がこの範囲内にある直径を有するスフェロイド個体群を作製するのに適用されるのが好ましい。
【００１２】
本発明によって作製されたスフェロイドは、１またはそれ以上の異なる細胞の種類からなることができる。複数の異なる細胞の種類が存在する場合、これらは異なるスフェロイドの層を形成することがある。
【００１３】
ここで、「組織 (tissue)」という用語は、共通の機能を有する細胞からなる組織化された選択物 (selection)を意味する。「臓器 (organ)」という用語は、共通の機能を有する「組織」からなる組織化された集合体 (collection)を意味する。「細胞系 (cell line)」という用語は、細胞から抽出された継続的な細胞集団 (culture)を意味し、転換 (transformation)または継続的に分化する能力を取得したものに影響を受けやすい。
【００１４】
本発明において用いられる「組織」または「臓器」は完全に無傷である必要はない。なぜなら、組織全体または臓器全体（生体組織検査法を経て得られることがある）の部分は、再凝集される前に個々の細胞または細胞の小さなグループに分断されて、本発明にしたがってスフェロイドを作製することができるからである。
【００１５】
本発明にしたがってスフェロイドの生産のために使用される細胞は、適切であるいかなる組織源からも抽出可能であり、前記組織源は感染している組織を含んでいてもよい。ニューロンの細胞を含むスフェロイド（例えば、脳スフェロイド）には、胎児の組織が好ましい。他の細胞を含むスフェロイドには、胚／胎児および非胎児（例えば、成体源）の両方からの組織が一般に使用可能である。肝細胞は特に有用である。なぜなら、肝細胞は、肝機能（例えば、アルブミン分泌、尿素分泌、グルコース分泌）のいくつかを保持するスフェロイドを生産するために使用でき、かつ、肝臓内における物質の代謝をインビトロで模倣し、そして一般的な細胞毒性および特異的な肝毒性効果を探索するために使用できるからである。このことは、例えば、引き続く肝臓による代謝で特定の物質が毒性を発揮するか否か、および／または肝細胞に対して直接的な毒性を有するか否か（すなわち、肝臓毒素であるかどうか）、または一般的な細胞機能性を阻害するか否かを決定する点で有用である。
【００１６】
スフェロイドは原則として、あらゆる動物からの所望のあらゆる組織または臓器から、前記組織または臓器のサンプルを、好ましくは個々の細胞または細胞の小さなグループへと分断することにより生産することができる。例えば、パスツールピペットを貫通する穏やかな粉砕を介するような機械的な分断が、網膜組織および脳組織に適用可能である。あるいは、例えば肝細胞の分離には、酵素消化法 (enzyme digestion method)を使用することができる。
【００１７】
細胞系由来の細胞がまた使用可能である。細胞系由来の細胞はまず、単層として培養させて、より多くの細胞を生産させることができる。トリプシン化は、単層の細胞培養の細胞分離に用いることができる。
【００１８】
本発明にしたがってスフェロイドを作製するために適用される細胞サンプルは高い細胞生存能力を有することが好ましく、好ましくは７５％以上の細胞生存能力を有する。
【００１９】
本発明の方法においては、細胞の懸濁が第１の速度で軌道回転によりなされ、続いて、第１の速度より遅い１以上の第２の速度で軌道回転が所定期間行なわれる。回転速度の実際の値は細胞の種類によって異なると思われるが、典型的には、第１の回転速度は７７ｒｐｍより大きくすることができ、第２の回転速度は８０ｒｐｍより小さくすることができる。これにより、例えば、第１の回転速度を７７〜９０ｒｐｍ（好ましくは８３〜８７ｒｐｍ）にすることができ、第２の回転速度を７７〜９０ｒｐｍ（好ましくは８３〜８７ｒｐｍ）にすることができる。
【００２０】
軌道回転の第１および第２の期間それぞれにおける回転期間は、第１の速度で１〜４日間（好ましくは１〜２日間）であり、第２の速度および／または引き続く培養周期の残りのためにより低い速度を維持するためには、例えば２〜４５日間（好ましくは２〜３５日間）である。
【００２１】
軌道回転のための初期の細胞接種 (cell seeding)の密度は、細胞の種類によって異なると思われるが、典型的には、１ｍｌあたり３×１０５〜５×１０６個の細胞である。
【００２２】
本発明の一実施形態では、軌道回転は細胞を含む小体積の培地（例えば、単一ウエル内において２．５〜４．５ｍｌ）上で実行される。細胞の種類や細胞の代謝的な要求にもよるが、この体積には通常、適切な密度にて細胞のための最大２日分の十分な養分が含まれており、震振することがより効果的である。このようなウエルを複数（例えば６ウエル）含むプレートを用いることができる。
【００２３】
軌道回転工程の間、細胞を懸濁するのに用いられる流動性培地は、以下に示す成分を１またはそれ以上含むことができる：塩化ナトリウム、グルコース、血清 (serum)、抗生物質、規定の培地補助剤。用いられる前記培地は、細胞の種類によって変えることができる。しかしながら、あらゆる適切な標準的培地を用いることができる。典型的な培地は、調整された塩溶液およびグルコースを含むことができ、かつ、ｐＨがモニタされかつ調整される必要があると思われる。
【００２４】
本発明によって生産されるスフェロイドを、ＷＯ９８／３５０２１に記載されているように低温保存させてもよい。
【００２５】
ここで、低温保存工程においては、スフェロイドを低温保存剤とともに保存させてもよい。
【００２６】
種々の低温保存剤を用いることができるが、ＤＭＳＯが好ましい。
【００２７】
しかしながら、浸透性の低温保護剤を含む、ＤＭＳＯ以外の他の低温保存剤を用いることができる：例えば、グリセロール、１，２−プロパンジオール、アセトアミド、エチレングリコール、およびプロピレングリコール（カールソン (Karlsson）  Ｊ  Ｏ  Ｍ  および  トマー (Tomer)  Ｍ．，「低温保存における組織の長期保存」，クリティカル  イシューズ．バイオマテリアルズ (critical issues. Biomaterials) ，１９９６年，第１７巻，ｐ．２４３−２５６；チャオ (chao)  Ｎ  Ｈ、チャン (Chan)  Ｃ  Ｐ、シュ (Hsu)  Ｈ  Ｗ、サイ (Tsai)  Ｃ  Ｔ、リン (Lin)  Ｔ  Ｔ，「選択された低温保存剤に対する牡蠣胚の毒耐性」，アクアティック  リビング  リソース (Aquatic Living resource) ，１９９４年，第７巻，第２号，ｐ．９９−１０４)。非浸透性の低温保存剤（例えば、メチルセルロースポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ、および種々の糖誘導低温保存剤）もまた使用可能である。
【００２８】
低温保存の直前における、スフェロイドおよび低温保存剤を含む組成については、望ましくは、低温保存剤が少なくとも５％（体積／体積）（例えば、１０〜２０％（体積／体積））程度である。
【００２９】
スフェロイドを段階的に冷却する場合、最良の結果を得ることができると考えられている。したがって、本発明の好ましい方法によれば、スフェロイドを冷却し、次いでさらに冷却する前に所定の温度範囲内に維持する。理論的に証明されたわけではないが、この手順により、スフェロイドを生じる細胞が低い温度へと順応するために十分な時間を与えることができ、これにより、スフェロイドを生じる細胞に、生じるおそれがある細胞死あるいは細胞の損傷を防ぐために十分な時間を与えることができる。
【００３０】
スフェロイドは、１〜８℃（例えば、２〜６℃、好ましくは約４℃）の温度へと冷却することができ、そしてさらなる冷却の前に所定期間保持される。この期間は少なくとも１０分間であることができ、好ましくは少なくとも３０分間であり、典型的には４０〜６０分間である。このような冷却は、実験室の冷蔵庫を用いることによって便宜的に実行することができる。
【００３１】
スフェロイドは次いで０〜−５０℃（例えば、−１０〜−３０℃、好ましくは−１５〜−２５℃）の温度に冷却し、かつ、さらなる冷却の前に所定期間保持することができる。この工程は、実験室の冷凍庫を用いることによって便宜的に実行可能である。この期間は少なくとも３０分間であることができ、少なくとも１時間（例えば、１〜６時間）であることが好ましい。
【００３２】
冷却手順の最終工程は通常、−１００℃より低い温度（例えば、−１９０℃）への急速冷却であろう。この工程は、冷却媒として液体窒素を用い、スフェロイドおよび低温保存剤を含む弾性容器を液体窒素内に設置することにより実行可能である。
【００３３】
低温保存に引き続いて、スフェロイドが解凍される。この工程は、典型的には少なくとも２〜３分間、スフェロイドを含む容器を３７℃の水浴中に設置することにより実行可能である。一度解凍した後は、低温保存培地を例えば遠心分離により除去することができる。スフェロイドは次いで洗浄され、さらに微量の低温保存培地が除去される（例えば、遠心分離）。
【００３４】
軌道回転はまた、スフェロイドを解凍した後に実行されるのが望ましい。この工程は、少なくとも５０ｒｐｍ（例えば、５０〜７７ｒｐｍ）の１またはそれ以上の回転速度で実行可能である。２またはそれ以上の異なる軌道回転速度が用いられる場合、第１の速度にて回転を行なう期間は、第１の速度よりも大きい第２の速度にて回転を行う期間に引き続いて行うことができる。
【００３５】
好ましくは、スフェロイドは、５０〜７０ｒｐｍ（例えば、約６０ｒｐｍ）の回転速度にて（低温保存の後に）回転することができる。典型的には、この工程は少なくとも６時間（例えば、１２〜４８時間）実行可能である。この工程は、より大きな速度で（例えば、少なくとも７０ｒｐｍ）、好ましくは約７５ｒｐｍで所定期間回転させた後に行なうことができる。この工程は典型的には、少なくとも７〜１０日間またはそれより長い期間行なうことができる。
【００３６】
解凍されたスフェロイドは一般に、低温保存後の培地に数日間保持させることができる。
【００３７】
次に、下記の図面を参照しながら、主に実施例を用いて本発明の実施形態を説明する。
【００３８】
図１は、本発明にしたがって作製された均一なスフェロイド個体群を示す。
【００３９】
図２は、曝露後２４時間のラット肝スフェロイドにおいて、タンパク質含有量に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【００４０】
図３は、曝露後２４時間の肝細胞のＬＤＨ解離に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【００４１】
図４は、ラット肝スフェロイドによる尿素合成に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【００４２】
図５は、ラット肝スフェロイドによるアルブミン合成に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【００４３】
図６は、ラット肝スフェロイド中のグルタチオンの濃度に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【００４４】
図２〜図６に示されたデータの場合、結果は平均値 (mean)±ＳＥＭ、ｎ＝６．＊：ｐ＜０．０５である。
【実施例】
【００４５】
本実施例においては、本発明にしたがって成体ラットの肝スフェロイドを作製した。
【００４６】
（肝細胞スフェロイド培養）
肝スフェロイドは、２段階コラギナーゼ灌流法によって、オスのウィスターラットの肝臓から調製された。２段階コラギナーゼ灌流法は、セグレン (Seglen)  Ｐ．Ｏ．によって記載された（「単離されたラット肝細胞の調製」，メゾッツ  セル  バイオロジー（Methods Cell. Biol.），１９７６年，第１３巻，ｐ．２９−３８）、ならびにラザー(Lazer)  Ａ．による改良法；ペスワ (Peshwa)  Ｍ．Ｖ．，ウー (Wu)  Ｆ．Ｊ．，チ (Chi)  Ｃ．Ｍ．，セラ (Cerra)  Ｆ．Ｂ．，およびヒュー (Hu)  Ｗ．Ｓ．，「コラーゲンゲルによって捕捉されたブタ肝細胞スフェロイドの広範囲な肝特異的機能」，イン  ビトロ  セル  バイオロジー  アニマル （In Vitro Cell Biol Anim.），１９９５年，第３１巻，ｐ．３４０−３４６）。単離された肝細胞の生存期間は、トリパン (tyrpan)ブルー染料の染め抜き (exclusion)、すなわち単離された肝細胞のアリコートを同体積のトリパンブルー染料（１．０％（重量／体積）の等浸透圧塩溶液）と混合させ、少なくとも５分間室温でインキュベートした。単離された肝細胞調製物のうち生存率が８０％を超えるもののみを肝スフェロイドの調製に用いた。細胞の懸濁物は培地（１０％ＦＣＳ、２００ｍＭのＬ−グルタミン、２ｎｇ／ｍｌのインシュリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンで満たした肝細胞培地）を用いて希釈されて、細胞密度を５×１０５（細胞数／ｍｌ）とした。希釈された細胞懸濁物は、１ウエルあたり３ｍｌずつ６ウエルのプレートに取り分けた。これらのプレートはＣＯ２が５％のインキュベータに入れて、ジロータトリー (gyrotatory)攪拌機（ニュー  ブランスウィック (New Brunswick)製）上で８５ｒｐｍの初期回転速度で２４時間、その後７７ｒｐｍでインキュベートさせた。これらのプレートは生存期間を測定するためにこの速度で回転させた（最大４５日間であるが、典型的には２〜１０日間）。各ウエルにおいて、１．５ｍｌの古い培地を２．０ｍｌの新しい培地と１日おきに交換した。培地の交換は、生存期間の測定が終了しても行なわれた（最大４５日間であるが、典型的には２〜１０日間）。
【００４７】
作製されたスフェロイドは図７１に示され、典型的には１７０μｍの均一な大きさを有し、このうち８０％を超えるものが１６０〜１８０μｍの範囲内であった。
【００４８】
本実施例において成体ラットの肝スフェロイドの培地から作製されたスフェロイドに対して、次に、肝臓毒素モデルの効果を調査するためのインビトロモデルとしての適合性を調査するために、以下のように試験が行なわれた。
【００４９】
（インビトロラット肝スフェロイドにおける肝臓毒素およびＤ−ガラクトサミンの効果）
Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）は通常、所定構造の多糖類中にインビボ(in vivo)でアセチル化物の形態で存在し、急性肝壊死を引き起こし得る肝臓毒性物質として広く知られている。したがって、Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）は肝臓損傷の研究において、肝臓毒素モデルとして広く使用されている。肝臓内のＧａｌＮはウリジン二リン酸ガラクトサミンへと変換され、急速でかつ広範囲のウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の減少およびＡＴＰの減少を引き起こし、続いて肝細胞中において、ＲＮＡ合成およびタンパク質合成の阻害を含む二次的な生化学的変化をもたらす。
【００５０】
｛化学物質および培地｝
Ｌ−グルタミンはギブコブリル (GibcoBril)から入手した。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）はインペリアル (Imperial)から入手した。肝細胞培地、Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、ペニシリン、および硫酸ストレプトマイシンならびに他の化学物質および試薬はシグマ (Sigma)から入手した。
【００５１】
｛統計｝
全ての生化学的アッセイから得られたデータはアノバ (ANOVA)および二段サンプルスチユーダントｔ−テストによって分析された。両試験において、Ｐ＜０．０５の場合が有意性ありと認められた。
【００５２】
｛スフェロイド官能試験に対する中毒｝
手順：６ウエルのプレート内の古い肝細胞スフェロイドの培地を全体的に、血清を含まない肝細胞培地（２００ｎＭのＬ−グルタミン、２ｎｇ／ｍｌのインシュリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンで満たした肝細胞培地）中で、０，５，１０，２０または４０ｍＭのＧａｌＮ溶液３ｍｌと交換し、各濃度に対して１つのプレートとした。プレートは、５／９５（％）のＣＯ２／Ｏ２内でかつ水蒸気が飽和した条件下で、３７℃のインキュベーター内において、７５ｒｐｍのジロータトリー攪拌機上で２４時間培養させた。
【００５３】
｛サンプル調製｝
６ウエルのプレートの各ウエル内のスフェロイドをＧａｌＮに曝露させた後２４時間凝集させ、次いでエペンドルフ管へと移動させた。このエペンドルフ管を９００Ｇで３分間遠心分離した後、得られた上澄みを尿素、アルブミン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の各アッセイ用に採取した。スフェロイドは次いで、１ｍｌのホモゲナイズ用緩衝液（この緩衝液はＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏを２ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４を２ｍＭ、ＥＤＴＡを０．５ｍＭ、および塩化ナトリウムを１４５ｍＭ含む）中でホモゲナイズされた。１００μｌの１０％ＴＣＡの各ホモジェネートは攪拌されて、グルタチオンのアッセイに使用された。残りのホモジェネートはタンパク質のアッセイに使用された。すべてのサンプルはアッセイを行なうまで−２０℃で保管された。
【００５４】
｛生化学的アッセイ｝
１．タンパク質
スフェロイドは、ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏを２ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４を２ｍＭ、ＥＤＴＡを０．５ｍＭ、および塩化ナトリウムを１４５ｍＭ含むホモゲナイズ用緩衝液中でホモゲナイズされた。総タンパク質については、ブラッドフォード (Bradford)（１９７６年）によって開発された方法にしたがって評価を行なった。ホモジェネートは１：２に希釈されて、９６ウエルからなるプレートの各ウエルに１０μｌずつ添加された。タンパク質含有量はマイクロプロテインキット (Micro Protein Kit)（商標）（シグマ、カタログＮｏ．６１０−Ａ）によって決定された。マイクロプロテイン試薬 (Micro Protein Reagent)（商標）は蒸留水で１：５に希釈された。希釈されたタンパク質試薬を２５０μｌずつ各ウエルに添加した。プレートは室温で５分間保持した。マイクロプレートリーダ（マルチスキャンＲＣ (Multiscan RC）（商標）、ラブシステム (Labsystem)製)にて、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５５】
肝スフェロイドのタンパク質含有量を図２に示す。ＧａｌＮが２０ｍＭ以下の群における総タンパク質含有量は影響を受けなかった。しかしながら、ＧａｌＮが４０ｍＭである場合、コントロール（ｐ＜０．０５）と比較してスフェロイドの総タンパク質含有量が大幅に減少した。この最大の濃度においては損傷を受けたスフェロイドが存在したことから、ＧａｌＮがこの濃度である場合に急性細胞壊死が引き起こされたと推測された。
【００５６】
２．アルブミン
培地中のアルブミン濃度は、アルブミン試薬キット (Albumin Reagent Kit)（商標）（ＢＣＧ，シグマ製）によって決定された。元来の試薬を蒸留水で１：６に希釈した。前記方法は、９６ウエルのプレート様式に適合させるために修正された。培地のアリコート２０μｌを各ウエルに添加し、次いで、希釈された前記試薬２００μｌを添加した。マイクロプレートリーダ（マルチスキャンＲＣ（商標）、ラブシステム製)にて、６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５７】
図５は、ＧａｌＮに曝露させた後の肝スフェロイドのアルブミン合成を示している。ＧａｌＮに曝露させた後の肝スフェロイドのアルブミン合成は、ＧａｌＮの濃度に依存して減少した。コントロール（ｐ＜０．０５）と比較すると、その減少は、ＧａｌＮの濃度が４０ｍＭのときに顕著である。
【００５８】
３．尿素
培地中の尿素の濃度は、尿素窒素キット (Urea Nitogen Kit（商標）)（カタログＮｏ．６４０−Ａ，シグマ製）を使用することにより決定された。この方法は９６ウエルのプレート様式およびマイクロプレートリーダを使用するアッセイに適合させるために修正された。サンプルはＰＢＳを用いて１：２に希釈された。各サンプルの総アンモニウム窒素は、２５μｌのウレアーゼ溶液を各セルに添加し、次いで希釈された前記培地を１０μｌ添加することにより決定された。このプレートを震揺して混合させ、室温で２０分間反応を進行させた。次いで、以下の試薬を各セルに添加した：５０μｌのフェノール塩化ニトロプルシド (phenol nitroprusside sodium)、５０μｌの次亜塩素酸アルカリ溶液、および２００μｌの蒸留水。前記プレートを震揺して混合させ、室温で３０分間保持した。青色に発色したら、マイクロプレートリーダ（マルチスキャンＲＣ（商標）、ラブシステム製）にて５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。ウレアーゼが含まれないＰＢＳを２５μｌ添加し、次いで１０μｌの培地を添加することにより、尿素ではない遊離の窒素が決定された。残りのアッセイの工程および試薬は、上述したように、総アンモニウム窒素のアッセイの通りである。各サンプルの尿素の濃度は、尿素ではない遊離の窒素を総アンモニウム窒素から差し引くことによって得られた。
【００５９】
尿素ではない遊離のアンモニアを差し引いた後において、肝スフェロイドの尿素合成は、ＧａｌＮを曝露させた後２４時間は濃度に依存して増加する。図４に示すように、ＧａｌＮの濃度が１０ｍＭ以上であるスフェロイド中の尿素の合成率は、コントロール（すべてｐ＜０．０５）におけるスフェロイド中の尿素の合成率と比較して、顕著に高かった。
【００６０】
４．グルタチオン（ＧＳＨ）
スフェロイド中のグルタチオンのレベルは、蛍光分析法（ヒシン (Hissin)  Ｐ．Ｊ．，およびヒルフ (Hilf)，「組織内で酸化されたグルタチオンおよび還元されたグルタチオンを同定するための蛍光分析法」，アナライズ  バイオケミストリー (Anal. Biochem.)，１９７６年，第７４巻，ｐ．２１４−２１６）によって決定された。各サンプルからスフェロイドのホモジェネートのアリコート１００μｌを、同体積の１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と混合させ、３０００Ｇで３分間遠心分離させた。７５μｌの上澄みまたは標品 (standard)を、２７７５μｌのリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（この緩衝液１リットルには１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４および１．８６ｇのＥＤＴＡが含まれ、かつｐＨが８である）に添加し、次いで、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＴ）の０．１％メタノール溶液１５０μｌを添加した。サンプルは穏やかに混合され、そして室温で３０分間保持された。励起波長が３５０ｎｍでかつ発光波長が４２０ｎｍにおいて、蛍光吸光計にて吸光度が測定された。
【００６１】
ＧａｌＮに曝露させた後のグルタチオンの濃度を図６に示す。ＧａｌＮの濃度が２０ｍＭ以下の場合、グルタチオンの含有量は減少しなかったが、ＧａｌＮの濃度が４０ｍＭである場合、グルタチオンは顕著に減少した（ｐ＜０．０５）。
【００６２】
５．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の分離
培地中のＬＤＨは、コルゼニウスキ (Korzeniewski)およびカルレワート (Callewaert)によって開発された方法（コルゼニウスキ，Ｃ．，およびカルレワート，Ｄ．Ｍ．，「自然の細胞毒性に対する酵素放出アッセイ」，ジャーナル  オブ  イミュノロジー  メゾット (J Immun. Meth.），１９８３年，第６４巻，ｐ．３１３−３２０)を用いてアッセイされた。１００μｌのスフェロイドホモジェネートまたは培地を、１００μｌのＬＤＨ試薬とともに９６ウエルのプレートに添加した。このＬＤＨ試薬は５４ｍＭのＬ（＋）乳酸、１．３ｍＭのβ−ＮＡＤ、０．２８ｍＭのフェナジンメソスルフェート、および０．２Ｍトリス緩衝液中の０．６６ｍＭのｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを含み、ｐＨは８．２であった。マイクロプレートリーダ（マルチスキャンＲＣ（商標）、ラブシステム製)にて、４９０ｎｍにおける最終的な吸光度が１０秒間隔で１５分間検知された。
【００６３】
ＧａｌＮを曝露させた後２４時間における肝スフェロイドのＬＤＨ解離を図３に示す。コントロールと比較して、ＧａｌＮの濃度が２０ｍＭおよび４０ｍＭの場合おいて、曝露後４時間でＬＤＨの解離の増加が確認できた。曝露後２４時間の時点では、ＧａｌＮの濃度が１０ｍＭの場合においても、ＬＤＨの解離が顕著に増加した（ｐ＜０．０５）。ＬＤＨの解離は濃度に依存して増加することが示された。
【００６４】
［結論］
本研究によれば、ＧａｌＮの濃度が２０ｍＭの場合、機能的な変化が生じるが、タンパク質およびグルタチオンのレベルは減少しないことが明らかだった。一方、ＧａｌＮの濃度が４０ｍＭの場合、タンパク質およびグルタチオンのレベルが減少するとともに、他の毒性変化が引き起された。顕著なタンパク質の減少は、大部分の細胞が壊死したことを反映している。ＧａｌＮが最も高い濃度におけるグルタチオンの減少はＧａｌＮの肝臓毒性に寄与しているかもしれない。しかしながら、グルタチオンの減少がＧａｌＮによって引き起こされているか否か、またはグルタチオンの減少が細胞の壊死の結果であるか否かは明確ではない。ＧａｌＮの濃度が２０ｍＭの場合、機能変化が生じるがグルタチオンのレベルには影響を与えない。このことから、肝スフェロイド試験を用いた場合、グルタチオンがＧａｌＮによって誘導された細胞毒性の開始に関連している可能性は低いといえる。これにより、適切な濃度範囲を選択することがインビトロの研究にとって重要であり、特に、中毒(intoxication)後の生化学的評価については、適切な濃度範囲が選択されないと、毒性の過大評価または過小評価を引き起こすことがある。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明にしたがって作製された均一なスフェロイド個体群を示す。
【図２】曝露後２４時間のラット肝スフェロイドにおいて、タンパク質含有量に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【図３】曝露後２４時間の肝細胞のＬＤＨ解離に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【図４】ラット肝スフェロイドによる尿素合成に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【図５】ラット肝スフェロイドによるアルブミン合成に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【図６】ラット肝スフェロイド中のグルタチオンの濃度に対するＤ−ガラクトサミンの濃度変化の効果を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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