(57)【要約】骨粗鬆症におけるヒトＢＭＰ２遺伝子の役割が開示される。ＢＭＰ２遺伝子における多型を用いる臨床的進行の診断、予測、および骨粗鬆症に対する処置方法がまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列、該配列において表２に示される少なくとも１つの多型を含むヌクレオチド配列およびそれらの相補体；
ｂ）配列番号：２の配列において表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列から選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸およびその相補体；
ｃ）配列番号：１の配列において表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子
、およびその相補体；ならびに
ｄ）配列番号：２の配列において表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列から選ばれたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子およびその相補体、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
サンプル中の第１の核酸分子の存在をアッセイする方法であって、該サンプルと請求項１記載のヌクレオチド配列を含有する第２の核酸分子とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項３】
調節配列に作動可能に連結された、請求項１記載の単離された核酸分子を含有してなるベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含有してなる組換え宿主細胞。
【請求項５】
単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドの産生方法であって、該核酸分子の発現に適した条件下で請求項４記載の組換え宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項６】
ａ）表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列番号：２のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列に約９０％よりも多く同一であるアミノ酸配列；および
ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列に約９５％よりも多く同一であるアミノ酸配列、を含有してなる、ＢＭＰ２遺伝子によりコードされる単離されたポリペプチド、または該ポリペプチドの断片もしくはバリアント。
【請求項７】
請求項６記載の単離されたポリペプチドを含有してなる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項６記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項９】
サンプル中の請求項１記載の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在をアッセイする方法であって、該サンプルを、コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１０】
ＢＭＰ２遺伝子における多型を検出する工程を含む、個体における骨粗鬆症に対する罹病性を診断する方法であって、該遺伝子における多型の存在が骨粗鬆症に対する罹病性の指標である、方法。
【請求項１１】
対照サンプル中のＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成と比較して、試験サンプル中のＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成における変化を検出する工程を含む、骨粗鬆症に対する罹病性を診断する方法であって、試験サンプル中のポリペプチドの発現または組成における変化の存在が骨粗鬆症に対する罹病性の指標である、方法。
【請求項１２】
ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現または組成における変化が、対照サンプルで発現されるスプライシングバリアントポリペプチドとは異なる試験サンプルにおけるスプライシングバリアントポリペプチドの発現を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ａ）ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性のレベルを評価する工程；および
ｃ）該活性のレベルを因子の非存在下でのポリペプチドまたはその活性誘導体もしくは断片の活性のレベルと比較する工程、
を含み、因子の存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の活性のレベルが、因子の非存在下でのレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、因子がポリペプチドの活性を変化する因子である、
請求項６記載のポリペプチドの活性を変化させる因子を同定する方法。
【請求項１４】
ＢＭＰ２遺伝子レセプター；ＢＭＰ２遺伝子結合因子；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれるものである、ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる因子。
【請求項１５】
ポリペプチドと請求項１４記載の因子を接触させる工程を含む、ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる方法。
【請求項１６】
ａ）ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片、結合因子および試験対象の因子を接触させる工程；
ｂ）ポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と結合因子との相互作用を評価する工程；および
ｃ）該相互作用のレベルを、該因子の非存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片と結合因子との相互作用のレベルと比較する工程、
を含み、因子の存在下でのポリペプチドまたはその誘導体もしくは断片の相互作用のレベルが、該因子の非存在下での相互作用のレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、該因子はポリペプチドと結合因子との相互作用を変化させる因子である、請求項６記載のポリペプチドとＢＭＰ２遺伝子結合因子との相互作用を変化させる因子を同定する方法。
【請求項１７】
ＢＭＰ２遺伝子レセプター、第２のＢＭＰ２遺伝子結合因子；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれるものである、第１のＢＭＰ２遺伝子結合因子とのＢＭＰ２遺伝子ポリペプチドの相互作用を変化させる因子。
【請求項１８】
ＢＭＰ２遺伝子ポリペプチドおよび／またはＢＭＰ２遺伝子結合因子を請求項１７記載の因子と接触させる工程を含む、ＢＭＰ２遺伝子結合因子とのＢＭＰ２遺伝子ポリペプチドの相互作用を変化させる方法。
【請求項１９】
ａ）請求項１記載の核酸を含有する溶液またはその誘導体もしくは断片を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）核酸、誘導体または断片の発現のレベルを評価する工程；および
ｃ）該発現のレベルを、該因子の非存在下での核酸、誘導体または断片の発現のレベルと比較する工程、
を含み、該因子の存在下でのヌクレオチド、誘導体または断片の発現のレベルが、該因子の非存在下での発現とは統計学的に有意な量で異なる場合、該因子がＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子である、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子を同定する方法。
【請求項２０】
ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結されたＢＭＰ２遺伝子のプロモーター領域を含む核酸を含有する溶液を、試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現のレベルを評価する工程；および
ｃ）該発現のレベルを該因子の非存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルと比較する工程、
を含み、該因子の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが、因子の非存在下における発現のレベルとは統計学的に有意な量で異なる場合、該因子がＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子である、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子を同定する方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１記載の核酸を含有する溶液またはその誘導体もしくは断片を試験対象の因子と接触させる工程；
ｂ）前記核酸、誘導体または断片の発現を評価する工程；および
ｃ）該発現を、該因子の非存在下での核酸、誘導体または断片の発現と比較する工程、
を含み、該因子の存在下でのヌクレオチド、誘導体または断片の発現が、該因子の非存在下での発現とは統計学的に有意な量で異なる場合、該因子がＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子である、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子を同定する方法。
【請求項２２】
該因子の存在下でのヌクレオチド、誘導体または断片の発現が、該因子の非存在下での１つまたはそれより多くのスプライシングバリアントの発現とは種類または量において異なる１つまたはそれより多くのスプライシングバリアントの発現を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＢＭＰ２遺伝子に対するアンチセンス核酸；ＢＭＰ２遺伝子ポリペプチド；ＢＭＰ 遺伝子レセプター；ＢＭＰ２遺伝子結合因子；ペプチド模倣物；融合タンパク質；そのプロドラッグ；抗体；およびリボザイムからなる群より選ばれるものである、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる因子。
【請求項２４】
ＢＭＰ２遺伝子を含有する細胞を請求項２３記載の因子と接触させる工程を含む、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変化させる方法。
【請求項２５】
ＤＮＡ 結合ドメインおよびＢＭＰ２遺伝子ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸を含有する第１のベクター、および転写活性化ドメインをコードする核酸および試験ポリペプチドをコードする核酸を含有する第２のベクターを用いたツー酵母ハイブリッド系を使用する工程を含み、該試験ポリペプチドがＢＭＰ２ポリペプチドと相互作用するポリペプチドである、ＢＭＰ２遺伝子ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定する方法。
【請求項２６】
ＢＭＰ２遺伝子またはその断片もしくは誘導体；ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチド；ＢＭＰ２遺伝子レセプター；ＢＭＰ２遺伝子結合因子；ペプチド模倣物；融合タンパク質；プロドラッグ；抗体；ＢＭＰ２遺伝子発現を変化させる因子；ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を変化させる因子；ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドの転写後プロセッシングを変化させる因子； ＢＭＰ２ 遺伝子とＢＭＰ２遺伝子結合剤との相互作用を変化させる因子；ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるスプライシングバリアントの転写を変化させる因子；およびリボザイムからなる群より選ばれるＢＭＰ 遺伝子治療剤。
【請求項２７】
請求項２６記載のＢＭＰ 遺伝子治療剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項２８】
ＢＭＰ２遺伝子治療剤が、ＢＭＰ２遺伝子またはその断片もしくは誘導体を含有してなる単離された核酸分子である、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＢＭＰ２遺伝子治療剤が、ＢＭＰ２遺伝子によりコードされるポリペプチドである、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３０】
レセプターが、ＢＭＰ２Ｒ２、ＢＭＰＲ１ＡまたはＢＭＰＲ１Ｂである、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ＢＭＰ２遺伝子治療剤を治療有効量で個体に投与する工程を含む、個体における骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項３２】
ＢＭＰ２遺伝子治療剤が、ＢＭＰ２遺伝子アゴニストまたはＢＭＰ２遺伝子アンタゴニストである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
外来ＢＭＰ２遺伝子およびＢＭＰ２遺伝子ポリペプチドをコードする核酸からなる群より選ばれる核酸を含んでなるトランスジェニック動物。
【請求項３４】
ＢＭＰ２遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイする方法であって、
ａ）ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、該サンプルを、該ＢＭＰ２遺伝子核酸の配列の一部に少なくとも部分的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含有する核酸と接触させる工程、および
ｂ）ＢＭＰ２遺伝子核酸と該ＢＭＰ２遺伝子核酸の配列の一部に少なくとも部分的に相補的な連続したヌクレオチド配列を含有する該核酸との間にハイブリダイゼーションが存在するかどうかを評価する工程、
を含む、方法。
【請求項３５】
連続したヌクレオチド配列を含有する該核酸が該ＢＭＰ２遺伝子核酸の配列の一部に完全に相補的である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該ＢＭＰ２遺伝子核酸の少なくとも一部の増幅を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
該連続したヌクレオチド配列が、１００ またはそれより少ないヌクレオチド長であり、かつａ）表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列番号：１のヌクレオチドの連続した配列に少なくとも８０％同一であるか；ｂ）表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列番号：１のヌクレオチドの連続した配列の相補体に少なくとも８０％同一であるか；またはｃ）該ＢＭＰ２遺伝子核酸に選択的にハイブリダイズしうるかのいずれかである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
ＢＭＰ２遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的である、連続したヌクレオチド配列を含む核酸を含有してなる、ＢＭＰ２遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬。
【請求項３９】
核酸が、該ＢＭＰ２遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に完全に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む、請求項３８記載の試薬。
【請求項４０】
ａ）ＢＭＰ２遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多くの標識した核酸、および
ｂ）該標識の検出のための試薬、
を分離した容器に含む、ＢＭＰ２遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬キット。
【請求項４１】
標識核酸が、該ＢＭＰ２遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に完全に相補的である連続したヌクレオチド配列を含む、請求項４０記載の試薬キット。
【請求項４２】
該ＢＭＰ２遺伝子核酸のヌクレオチド配列の一部に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつプライマー伸長のための条件下で維持された場合、該ＢＭＰ２遺伝子核酸のプライマーとして作用しうる連続したヌクレオチド配列を含有する１つまたはそれより多くの核酸を含有する、ＢＭＰ２遺伝子核酸の存在についてサンプルをアッセイするための試薬キット。
【請求項４３】
ａ）アミノ酸１８９ 位にセリンを、かつアミノ酸３７位にアラニンを含有するＢＭＰ２タンパク質に特異的な抗体；およびアミノ酸１８９ 位にアルギニンおよびアミノ酸３７位にセリンを含有するＢＭＰ２タンパク質に特異的な抗体からなる群より選ばれる少なくとも１つの抗体；および
ｂ）参照ＢＭＰ２タンパク質サンプル
を含有してなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年９月１４日に出願された米国出願第０９／６６１，８８７号の優先権を主張し、一部継続出願である。上記出願の全体の教示が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
骨粗鬆症は、減少した骨ミネラル密度（ＢＭＤ ）により規定されるような、低い骨質量および骨組織の悪化により特徴づけられる消耗性疾患である。経験を積んだ微小構造的悪化の直接的な結果は、骨折および骨格脆弱性に対して罹病性であり、最終的に世界的に高い死亡率、罹患率および医学的支出を引き起こす。閉経期の女性は、他の者よりもより大きな危険がある。なぜなら、閉経期の間に経験されるエストロゲン欠乏および骨質量に関係する減少が、骨粗鬆症による骨折の確率および潜在的な骨折部位の数の両者を増大するからである。さらに、高齢化した女性だけが危険にある個体群統計学的グループであるわけではない。栄養不良、無月経（ａｍｍｅｎｏｒｒｈｅｉｃ）、または活動が不十分な若い女性は、早い年齢で骨質量発達を阻害する危険性がある。さらに、アンドロゲンは、思春期の間の骨質量の増加において役割を果たすので、高齢または性機能が低下した男性は、彼らの骨が十分に発達していない場合、骨粗鬆症の危険性に直面する。
【０００３】
この疾患の治療法を発見するために必要なことは、骨粗鬆症を引き起こす多くの寄与する因子が存在するという事実により複雑化される。栄養（特にカルシウム、ビタミンＤおよびビタミンＫの摂取量）、ホルモンレベル、年齢、性別、人種、体重、活動レベル、および遺伝因子の全てが個人間の骨ミネラル密度で見られる多様性の原因である。最近、骨粗鬆症を処置するために承認された薬物は、骨再吸収のインヒビターとして作用し、ホルモン補充療法（ＨＲＴ ）、選択的なエストロゲンレセプターモジュレーター、カルシトニン、およびビオホスホネート等の方法が含まれる。しかし、これらの治療は、一致する結果で危険性を個々に減少するわけではなく、一方、いくつかの治療が、同時に投与された場合、ＢＭＤ を改善し、他のものは、組み合わせて使用された場合、改善を示さないか、またはその効力を失う。明確に、平均余命が増大し、ならびに骨粗鬆症の健康および経済的な懸念が大きくなるので、この遅発性の疾患に付随する危険性の解決法は大いに需用がある。疾患または疾患に対する素因の早期の診断が望ましい。
【０００４】
発明の要旨
本明細書中に記載されるように、ヒト骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）に対する遺伝子における多型は、ヒト関連研究を通して多数の骨粗鬆症表現型に相関されることを発見した。特に、ＢＭＰ２遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列内の１つまたはそれより多くの単一ヌクレオチド多型が骨粗鬆症に相関することを発見した。従って、本発明は、少なくとも１つの変化したヌクレオチドを有する配列番号：１のＢＭＰ２遺伝子を含む単離された核酸分子、およびそれによりコードされる遺伝子産物（本明細書中で、「バリアントＢＭＰ２遺伝子」または「バリアントＢＭＰ２遺伝子産物」とも呼ばれる）に関する（表２）。
【０００５】
多数の多型が、表２に報告されるようなＢＭＰ２遺伝子において観察された。従って、好ましい態様では、本発明の単離された核酸分子は、これらのヌクレオチド多型の１つまたは組み合わせを有しうる。これらの多型は、骨粗鬆症の存在、非存在、または重篤度の一因となるＢＭＰ２遺伝子における他の多型の群の一部であり得る。特に好ましい態様では、核酸分子は、ヌクレオチド３７４７位で少なくとも多型を含み、遺伝子産物は、ヌクレオチド３７４７位で多型（セリンからアラニンへのアミノ酸変化）を含む。
【０００６】
本発明はさらに、サンプルにおけるＢＭＰ２の全てまたは一部を含む核酸分子の存在についてサンプルをアッセイする方法を提供し、該方法は、選択的なハイブリダイゼーションに適切な条件下で、該サンプルと、ＢＭＰ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１または配列番号：１の相補体および表２に示される少なくとも１つの多型を含む）；表２に示される少なくとも１つの多型を含む配列番号：２をコードするヌクレオチド配列、またはその断片または誘導体を含む第２の核酸分子とを接触させる工程を含む。特に好ましい態様では、核酸分子は、ヌクレオチド３７４７位で少なくとも多型を含み、遺伝子産物は、ヌクレオチド３７４７位で多型（セリンからアラニンへのアミノ酸変化）を含む。本発明はさらに、ＢＭＰ２ポリペプチド、その断片または誘導体の発現のレベルを検出（直接的または間接的に）する工程を含む、ＢＭＰ２ポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体の発現のレベルについてサンプルをアッセイする方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、調節配列に作動可能に連結された本発明の単離された核酸分子を含むベクター、ならびに該ベクターを含む組換え体宿主に関する。本発明はまた、本明細書中に記載される単離された核酸分子によりコードされるポリペプチド（ＢＭＰ２ポリペプチド）を調製する方法に関し、該方法は該核酸分子の発現に適切な条件下で本発明の組換え体宿主細胞を培養する工程を含む。
【０００８】
本発明はさらに、本発明の単離された核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチド（例えば、ＢＭＰ２ポリペプチド）、ならびにその断片または誘導体を提供する。特定の態様では、前記ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列を含み、表２に示される少なくとも１つの多型を含み、特定の好ましい態様では、セリンからアラニンへのアミノ酸変化を生じる３７４７で少なくとも多型を含む。本発明はまた、配列番号：２のアミノ酸配列に約９０％より高く同一であるアミノ酸配列を含み、本明細書中に記載される少なくとも１つの多型を含む；好ましくは約９５％同一である単離されたポリペプチドに関する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに選択的に結合する、抗体、またはその抗原結合断片、および該サンプルと、該コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体とを接触させる工程を含む、サンプル中の本発明の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在をアッセイする方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、骨粗鬆症に対する素因を診断する方法に関する。個体において骨粗鬆症に対する素因を診断する方法は、ＭＢＰ２中の変異の存在を検出する工程、およびＢＭＰ２ポリペプチドの発現における変化、例えば、ＢＭＰ２ポリペプチドの異なるスプライシングバリアントの存在を検出する工程を含む。発現における変化は、定量的、定性的、または定量的および定性的の両方でありうる。本発明の方法は、疾患発症のときまたは前での骨粗鬆症の正確な診断を可能にし、それにより骨粗鬆症の衰弱させる影響を減少させるかまたは最小化する。
【００１１】
本発明は、さらに１つまたはそれより多くのＢＭＰ２ポリペプチドの活性または発現を変化（例えば、増強または阻害）させる因子を同定するためのアッセイに関する。例えば、細胞、細胞画分、またはＢＭＰ２ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を含有する溶液を、試験対象の因子と接触させ得、ＢＭＰ２ポリペプチド発現または活性のレベルを評価しうる。１つより多くのＢＭＰ２ポリペプチドの活性または発現が同時に評価されうる（例えば、細胞、細胞画分、または溶液が、ＢＭＰ２ポリペプチドの１つより多くのタイプ（例えば、異なるスプライシングバリアント）を含み得、異なるポリペプチドまたはスプライシングバリアントのレベルが評価されうる）。
【００１２】
別の態様では、本発明は、１つまたはそれより多くのＢＭＰ２ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するためのアッセイに関する。酵母ツーハイブリッド系では、例えば、ＤＮＡ 結合ドメインをコードする核酸およびまたＢＭＰ２ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体を含む第１のベクターが使用され、転写活性化ドメインをコードする核酸およびまた潜在的にＢＭＰ２ポリペプチド、スプライシングバリアント、またはその断片もしくは誘導体（例えば、ＢＭＰ２ポリペプチド結合因子またはレセプター）と相互作用するポリペプチドをコードする核酸を含む第２のベクターが使用される。適切な条件下での第１のベクターおよび第２のベクターの両方を含有する酵母のインキュベーションにより、ＢＭＰ２ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体と相互作用し、従ってＢＭＰ２ポリペプチドの発現の活性を変化させる因子でありうるポリペプチドの同定が可能となる。
【００１３】
ＢＭＰ２ポリペプチド発現または活性を増強または阻害する因子がまた本発明に含まれ、同様に、ＢＭＰ２またはポリペプチドの発現または活性を増強または阻害する因子と、ＢＭＰ２および／またはポリペプチドを含有する細胞を接触させることによって、またはＢＭＰ２ポリペプチドを接触させることによってＢＭＰ２ポリペプチド発現または活性を変化（増強または阻害）させる方法が本発明に含まれる。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の核酸を含有する医薬組成物、本発明のポリペプチド、および／またはＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変化させる因子に関する。本発明はさらに、ＢＭＰ２治療剤（例えば、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、ＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変化させる因子、またはＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変化させる核酸、ポリペプチド、および／または因子を含有する組成物）を投与することによって、骨粗鬆症を処置する方法に関する。特に好ましい態様では、ＢＭＰ２治療剤は、骨粗鬆症を有さない健康な個体に由来するヒトＢＭＰ２遺伝子またはその遺伝子産物である。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載されるように、出願人は、骨粗鬆症の種々の形態を有する患者においてゲノムワイドスキャンを完了し、骨粗鬆症に関連した第２０染色体上の領域を同定した。現在まで、染色体のこの領域への任意の関係を示すヒトにおける骨粗鬆症の関連研究は知られていなかった。行った関連研究に基づいて、本出願人は、ＢＭＰ２と骨粗鬆症との間の直接的な関係を見出した。正常な個体に由来するＢＭＰ２遺伝子は公知であるが、ＢＭＰ２および骨粗鬆症を直接調査する研究はなかった。また、骨粗鬆症に関連することが報告されたバリアント形態はなかった。関連研究は、異なる骨粗鬆症表現型、すなわち、股関節部、脊椎、その組み合わせおよび複合重症（例えば、脊椎圧迫骨折、股関節骨折、低衝撃骨折に関連する他の骨粗鬆症）を有する発症者を含む４つのゲノムワイドスキャンに基づく。関連研究において得られたデータから、第２０染色体上の領域、詳細にはＢＭＰ２遺伝子が同定された。バリアントＢＭＰ２遺伝子は、患者集団で観察されたヌクレオチド変化を以前には報告されていない。多型変化については表２を参照。
【００１６】
全てのヌクレオチド位は配列番号：１に関するものである。ヌクレオチド３７４７位での多型は、対照集団よりも骨粗鬆症試験集団で統計学的により頻繁に見られる。
【００１７】
本発明の核酸
従って、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチド変化を有するヒトＢＭＰ２遺伝子を含み、かつ骨粗鬆症の発生率に相関する単離された核酸分子に関する。本明細書中で使用される用語「バリアントＢＭＰ２」は、多数の骨粗鬆症表現型に対する罹病性に関連する少なくとも１つの変化したヌクレオチドを有する第２０染色体の単離された核酸分子、また変化を含有（例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子）し、かつバリアントＢＭＰ２ポリペプチド（例えば、配列番号：２を有するポリペプチド）をコードする単離された核酸分子の一部または断片をいう。好ましい態様では、単離された核酸分子は、ＢＭＰ２遺伝子の表２に示される多型のうちの任意の１つまたは組み合わせからなる群より選ばれる多型を含み、最も好ましくは少なくともヌクレオチド３７４７で多型を含む。治療目的の所定の態様では、例えば、核酸は健康な個体のヒトＢＭＰ２遺伝子を表す配列番号：１の配列を含む。
【００１８】
本発明の単離された核酸分子は、ＲＮＡ 、例えば、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ 等のＤＮＡ でありうる。ＤＮＡ 分子は、二本鎖または一本鎖であり得；一本鎖ＲＮＡ またはＤＮＡ は、コード、もしくはセンス鎖または非コード、もしくはアンチセンス鎖のいずれかでありうる。核酸分子は、前記遺伝子のコード配列の全てまたは一部を含み得、イントロンおよび非コード３’および５’配列等のさらなる非コード配列（例えば、調節配列を含む）をさらに含みうる。さらに、核酸分子は、マーカー配列、例えば、ポリペプチドの単離または精製において補助するためのポリペプチドをコードする配列に融合されうる。かかる配列としては、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ ）融合タンパク質をコードする配列およびインフルエンザ由来のヘマグルチン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎ）Ａ（ＨＡ）ポリペプチドマーカーをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書中で使用される「単離された」核酸分子は、前記遺伝子またはヌクレオチドに通常隣接する（ゲノム配列中のように）核酸から分離されるもの、および／または他の転写配列（例えば、ＲＮＡ ライブラリー中のような）から完全にまたは部分的に精製されたものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在する複雑な細胞環境、または組換え技術により作製される場合には培養培地、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学薬品に関して実質的に単離され得る。いくつかの場合、単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）を形成し、緩衝システムまたは試薬混合物の一部を形成する。他の環境では、材料は、必須な均一性（例えば、ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィによって測定されるような）まで精製され得る。好ましくは、単離された核酸分子は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０、８０または９０％（モルベースで）を含む。ゲノムＤＮＡ に関して、用語「単離された」はまた、ゲノムＤＮＡ が天然に会合する染色体から分離される核酸分子をいいうる。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムＤＮＡ において該核酸分子に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ または０．１ｋｂ 未満のヌクレオチドを含みうる。
【００２０】
核酸分子は、他のコード配列または調節配列に融合され得、まだなお単離されていると考えられうる。従って、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ は、本明細書中で使用されるような「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種宿主細胞中の組換えＤＮＡ 分子および溶液中の部分的にまたは本質的に精製されたＤＮＡ 分子を含む。「単離された」核酸分子はまた、本発明のＤＮＡ 分子のインビボおよびインビトロＲＮＡ 転写物を含む。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列は、化学的に合成されるか、または組換え手段による核酸分子またはヌクレオチド配列を含みうる。それゆえ、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ は、本明細書中で使用されるような「単離された」の定義に含まれる。また、単離されたヌクレオチド配列は、異種生物中の組換えＤＮＡ 分子、および溶液中の部分的または実質的に精製されたＤＮＡ 分子を含む。本発明のＤＮＡ 分子のインビボおよびインビトロＲＮＡ 転写物はまた、「単離された」ヌクレオチド配列に含まれる。かかる単離されたヌクレオチド配列は、相同性配列（例えば、他の哺乳動物種由来）を単離するための、遺伝子マッピング（例えば、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる）のための、またはノザンブロット解析等により組織（例えば、ヒト組織）における遺伝子の発現を検出するためのプローブとして、コードされるポリペプチドの製造において有用である。
【００２１】
本発明はまた、天然では必ずしも見出されないがＢＭＰ２ポリペプチド（例えば、配列番号：２のアミノ酸配列を有し、かつ表２に示される少なくとも１つの多型を含むポリペプチド）をコードする核酸分子に関する。従って、例えば、天然に存在するヌクレオチド配列とは異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重により本発明のＢＭＰ２ポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ 分子はまた、本発明の目的である。本発明はまた、ＢＭＰ２ポリペプチドの一部、アナログまたは誘導体をコードするもの等の本発明のヌクレオチド配列のバリアントを含む。かかるバリアントは、対立遺伝子バリエーションの場合のように天然に存在するか、または種々の変異原および変異原性プロセスにより誘導されるもの等の天然には存在しないものであり得る。意図されるバリエーションとしては、保存的または非保存的アミノ酸変化（付加および欠損を含む）を生じうる１つまたはそれより多くのヌクレオチド付加、欠損、および置換が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、ヌクレオチド（および／または生じるアミノ酸）変化は、サイレントまたは保存的である；すなわち、それらは、ＢＭＰ２ポリペプチドの特徴または活性を変化させない。一つの好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、１つまたはそれより多くの多型のミクロサテライトマーカーを含む断片である。別の好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、ＢＭＰ２遺伝子において１つまたはそれより多くの単一のヌクレオチド多型を含む断片である。
【００２２】
本発明の核酸分子の他の変化としては、例えば、標識、メチル化、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、垂下部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン）、キレーター、アルキレーター、および修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸）等のヌクレオチド間修飾が挙げられうる。また、水素結合および他の化学相互作用により、明示された配列に結合する能力において核酸分子を模倣する合成分子が含まれる。かかる分子としては、例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合を置換しているものが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、選択的なハイブリダイゼーションのため等の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で本明細書中に記載されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子（例えば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、任意にポリペプチドの活性を有する核酸分子）に関する。ある態様では、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）下で、表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列番号：１から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体、あるいは表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列番号：２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列にハイブリダイズする本明細書中に記載されるバリアントを含む。好ましい態様では、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション下でハイブリダイズするバリアントは、ＢＭＰ２の活性を有する。
【００２４】
かかる核酸分子は、特異的ハイブリダイゼーション（例えば、高ストリンジェンシー条件下で）により検出および／または単離されうる。本明細書中で使用される「特異的ハイブリダイゼーション」は、第１の核酸が第２の核酸以外の任意の核酸にハイブリダイズしない様式で第２の核酸にハイブリダイズする第１の核酸の能力をいう（例えば、第１の核酸は、ハイブリダイゼーションが行われるサンプル中の任意の他の核酸よりも第２の核酸に対して高い類似性を有する場合）。ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェンシー条件」は、特定の核酸の、第２の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするインキュベーションおよび洗浄の条件（例えば、温度および緩衝液濃度の条件）をいう当該分野の用語である；第１の核酸は、第２の核酸に完全に（すなわち、１００ ％）相補的であり得るか、または第１および第２の核酸は、完全よりも低い（例えば、７０％、７５％、８５％、９５％）ある程度の相補性を共有し得る。例えば、完全に相補的な核酸をより低い相補性のものと区別する所定の高ストリンジェンシー条件が使用されうる。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」「中程度なストリンジェンシー条件」および「低ストリンジェンシー条件」は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９８） の２．１０．１〜２．１０．１６ 頁および６．３．１ 〜６．３．６ 頁に説明される（これらの全体の開示が参考として本明細書中に援用される）。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度（例えば、０．２ＸＳＳＣ 、０．１ＸＳＳＣ ）、温度（例えば、室温、４２℃、６８℃）およびホルムアミド等の不安定化剤またはＳＤＳ 等の変性剤だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成物、ハイブリダイズする配列間のミスマッチパーセントおよび他の非同一配列内のその配列のサブセットの発生頻度に依存する。従って、等価な条件は、２つの核酸分子間の同一性または相同性の類似した程度を維持しながら、１つまたはそれより多くのこれらのパラメーターを変更することにより決定されうる。典型的には、互いに少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも９５％もしくはそれより高い同一である配列は、互いにハイブリダイズしたままであるような条件が使用される。ハイブリダイゼーションが生じないストリンジェンシーのレベルからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所定の配列がサンプル中の最も類似する配列と（例えば、選択的に）ハイブリダイズすることを可能にする条件が決定されうる。
【００２５】
例示的条件は、Ｋｒａｕｓｅ， Ｍ．Ｈ．およびＳ．Ａ． Ａａｒｏｎｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｘｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２００：５４６−５５６ （１９９１）に記載されている。また、Ａｕｓｕｂｅｌ ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９８） は、中程度または低いストリンジェンシー条件のための洗浄条件の決定を記載している。洗浄は、ハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように条件が通常設定される工程である。一般に、相同性ハイブリダイゼーションだけが生じる最低温度から開始して、最終洗浄温度を各℃毎に低下すること（ＳＳＣ 濃度を一定に保つこと）で、ハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大の程度において１％ずつの増大を可能にする。一般に、ＳＳＣ の濃度の倍加は、約１７℃のＴ ｍ の増大を生じる。これらのガイドラインを用いて、洗浄温度は、求められるミスマッチのレベルに依存して、高、中程度または低ストリンジェンシーについて経験的に決定されうる。
【００２６】
例えば、低ストリンジェンシー洗浄は、室温で１０分間、０．２ＸＳＳＣ／０．１ ％ＳＤＳ を含有する溶液中で洗浄することを含みうる；中程度のストリンジェンシー洗浄は、４２℃で１５分間、０．２ＸＳＳＣ／０．１ ％ＳＤＳ を含有する予め温めた（４２℃）溶液中で洗浄することを含みうる；および高ストリンジェンシー洗浄は、６８℃で１５分間、０．１ＸＳＳＣ／０．１ ％ＳＤＳ を含有する予め温めた（６８℃）溶液中で洗浄することを含みうる。さらに、洗浄は、当該分野で公知であるように所望の結果が得られるまで繰り返してまたは連続して行われうる。等価な条件は、類似した程度の標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性を維持しながら、当該分野で公知であるように、例として示したパラメーターの１つまたはそれより多くを変化させることにより決定されうる。
【００２７】
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のパーセント同一性は、最適な比較目的のために配列を整列すること（例えば、ギャップが第１の配列の配列中に導入されうる）により決定されうる。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸が比較され、２つの配列の間のパーセント同一性は、該配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の合計の数）。所定の態様では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは７０％、８０％または９０％である。２つの配列の実際の比較は、周知の方法、例えば、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。かかる数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７ （１９９３）に記載されている。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３８９−３４０２ （１９９７）に記載されているようなＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０ ）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用されうる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ を参照。ある態様では、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００ 、ワード長＝１２に設定されうるか、変化しうる（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。
【００２８】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ およびＭｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＣＧＣ 配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮ プログラム（バージョン２．０ ）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮ プログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ、４のギャップペナルティが使用されうる。配列解析のためのさらなるアルゴリズムは、当該分野で公知であり、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ （１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．， １０：３−５ に記載されるようなＡＤＶＡＮＣＥ およびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎ およびＬｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ， ８５：２４４４−８ に記載されるＦＡＳＴＡ を含む。
【００２９】
別の態様では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＣＧＣ ソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰ プログラムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６３マトリックスまたはＰＡＭ５０ マトリックスのいずれか、および１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび２、３、または４の長ウェイトを用いて達成されうる。さらに別の態様では、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、ＣＧＣ ソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｃ．ｃｏｍで入手可能）中のＧＡＰ プログラムを使用して、５０のギャップウェイトおよび３の長ウェイトを用いて達成されうる。
【００３０】
本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号：１のヌクレオチド配列、該配列において表２に示される少なくとも１つの多型を含むヌクレオチド配列およびそれらの相補体にハイブリダイズする、断片または一部を含む単離された核酸分子を提供し、また高ストリンジェントな条件下で配列番号：２から選ばれたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその多型バリアントにハイブリダイズする、断片または一部を含む単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１８、２０、２３または２５ヌクレオチド長であり、３０、４０、５０、１００ 、２００ またはそれより多くのヌクレオチド長でありうる。本明細書中に記載される抗原性ポリペプチドをコードするより長い断片（例えば、３０またはそれより多くのヌクレオチド長）は、下記に記載されるような抗体の産生のため等に特に有用である。
【００３１】
関連する局面において、本発明の核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるようなアッセイにおいて、プローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、塩基特異的様式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４， １４９７−１５００（１９９１） に記載されるように、ポリペプチド核酸が挙げられる。
【００３２】
典型的に、プローブまたはプライマーは、少なくとも約１５、典型的には約２０〜２５、より典型的には約４０、５０または７５個連続する核酸分子のヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。この核酸分子は、配列番号１から選択される連続ヌクレオチド配列、および該配列において表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列およびその補体、または配列番号２から選択されるアミノ酸をコードする配列もしくはその多型改変体を含む。好ましい実施形態において、プローブまたはプライマーは、１００ 個以下のヌクレオチド、好ましくは６〜５０個のヌクレオチド、好ましくは１２〜３０個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、プローブまたはプライマーは、隣接ヌクレオチド配列もしくは隣接ヌクレオチド配列の補体に少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、または隣接ヌクレオチド配列もしくは隣接ヌクレオチド配列の補体に選択的にハイブリダイズし得る。しばしは、プローブまたはプライマーは、標識（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子）をさらに含む。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」とは、周知の方法（例えば、ＰＣＲ 、ＬＣＲ が挙げられるが、本明細書中の記載に限定されない）を使用するテンプレート指向ＤＮＡ 合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、特定の使用に依存するが、典型的には約１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。
【００３４】
上記のような本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学技術および配列番号１において提供される配列情報を使用して同定され、単離され得る。例えば、核酸分子は、配列番号１において提供される１つ以上の配列（必要に応じて表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む）および／またはその補体に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、単離され得る。一般的に、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ， 編， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ＮＹ， １９９２ ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ ら， 編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０ ）；Ｍａｔｔｉｌａ ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １：１７（１９９１） ；ＰＣＲ （ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ら， 編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ ）；および米国特許第４，６８３，２０２ 号を参照のこと。核酸分子は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ を用いて増幅され、適切なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ 配列分析によって特徴付けられ得る。
【００３５】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４：５６０（１９８９）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：１０７７（１９８８） 、転写増幅（Ｋｗｏｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：１１７３（１９８９） を参照のこと）、および自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４（１９９０））、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ ）が挙げられる。後者の２つの増幅方法は、増幅産物としてそれぞれ約３０対１または１００ 対１の比で一本鎖ＲＮＡ （ｓｓＲＮＡ ）および二本鎖ＤＮＡ （ｄｓＤＮＡ ）の両方を生成する等温転写に基づく等温反応を含む。
【００３６】
増幅されたＤＮＡ は、放射線標識され、ヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、ｚａｐ 発現ベクター、ＺＩＰＬＯＸまたは他の適切なベクター中のｍＲＮＡをスクリーニングするためにプローブとして使用され得る。対応するクローンが単離され得、ＤＮＡ がインビボ切除の後に得られ、クローニングされた挿入物が当該分野で認識される方法によっていずれかの配位または両方の配位において配列決定され、適切な分子量のポリペプチドをコードする正確なリーディングフレームを同定し得る。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接分析は、市販される周知の方法を使用して達成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第二版， ＣＳＨＰ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９ ）；Ｚｙｓｋｉｎｄ ら， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， １９８８ ）を参照のこと。これらまたは類似の方法を使用して、ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするＤＮＡ は、単離され、配列決定され、さらに特徴付けられ得る。
【００３７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列および該配列において表２に示されるような少なくとも１つの多型を含むヌクレオチド配列および／またはその補体、および／または配列番号１の一部および表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む一部またはその補体を使用して設計され、当該分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成された二本鎖の物理的安定性を増加するように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学的に合成され得る。あるいは、センス核酸分子は、核酸分子がアンチセンス配位（すなわち、挿入された核酸分子から転写されたＲＮＡ が目的の標的核酸に対してアンチセンス配位である）でサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に産生され得る。
【００３８】
一般的に、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲル上の分子量マーカーとして、および関連する遺伝子位置をマッピングするように標識される染色体マーカーとして使用され得る。核酸配列はまた、使用されて、遺伝性障害（例えば、骨粗鬆症に対する疾病素因または骨粗鬆症に対する感受性）を同定するために患者における内因性ＤＮＡ 配列と比較し得、ならびに関連ＤＮＡ 配列をハイブリダイズし、発見するため、またはサンプルから既知の配列を控除するためなどのプローブとして使用され得る。核酸配列はさらに、遺伝的フィンガープリンティングのためのプライマーを誘導するため、ＤＮＡ 免疫化技術を使用して抗ポリペプチド抗体を惹起するため、および抗ＤＮＡ 抗体を惹起するかまたは免疫応答を顕在化するための抗原として使用され得る。本明細書中で同定されたヌクレオチド配列の一部またはフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で使用され得る。例えば、これらの配列は、（ｉ）染色体上にこれらの各遺伝子をマッピングし、それと共に遺伝性疾患に関連する遺伝子領域の位置を突きとめるため；（ｉｉ）微小な生物学的サンプルから個体を同定するため（組織タイピング）；および（ｉｉｉ ）生物学的サンプルの法医学同定を助けるため使用され得る。さらに、本発明のヌクレオチド配列は、分析、特徴付けまたは治療的使用のために組換えポリペプチドを同定して発現するため、または対応するポリペプチドが構成的に、組織分化の間に、または疾患状態においてのいずれかで発現される組織に対するマーカーとして使用され得る。核酸配列は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイおよび／または診断アッセイにおける試薬として使用され得、また本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイおよび／または診断アッセイにおいて使用するキット（例えば、試薬キット）の成分として含まれ得る。
【００３９】
本発明の別の局面は、配列番号１および該配列において表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列および配列番号１の補体（またはその一部）からなる群より選択される核酸分子を含む核酸構築物に関する。本発明のまだ別の局面は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子またはその多型改変体を含む核酸構築物に関する。この構築物は、本発明の配列がセンスまたはアンチセンス配位で挿入されているベクター（例えば、発現ベクター）を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」である。このプラスミドとは、さらなるＤＮＡ セグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡ ループをいう。ベクターの別の型は、さらなるＤＮＡ セグメントがウイルスゲノムへライゲーションされ得るウイルス性ベクターである。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞において自律複製し得る（例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入で宿主細胞のゲノムへ統合され、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクター（発現ベクター）は、作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。一般的に、組換えＤＮＡ 技術において利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。しかし、本発明は、このような発現ベクターの他の形態（例えば、等価な機能の要求を満たすウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））を含むことが意図される。
【００４０】
本発明の好ましい組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に適切な形態で本発明の核酸分子を含む。これは、組換え発現ベクターが発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列（発現される核酸配列に作動可能に連結される）を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能にまたは操作可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてまたはベクターが宿主細胞へ導入される場合は宿主において）可能にする様式で１つまたは複数の調節配列に連結されることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０）に記載される。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよび特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択および所望のポリペプチドの発現のレベルなどの因子に依存し得ることが当業者によって認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞へ導入され、それによって本明細書に記載されるような核酸分子によってコードされるポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を産生し得る。
【００４１】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞）における本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る。適切な宿主細胞は、さらに、Ｇｏｅｄｄｅｌ （前出）において考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写されて翻訳され得る。
【００４２】
本発明の別の側面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換性をもって用いられる。かかる用語は、特定の目的の細胞だけでなく、かかる細胞の継代物または潜在的な継代物もいうことは理解される。ある修飾は、突然変異または環境的な作用のいずれかにより世代を経るにつれて、発生し得るので、かかる継代物は、実際に親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いるこの用語の範囲内にさらに包含され得る。
【００４３】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。たとえば、本発明の核酸分子は、細菌細胞（たとえば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など）で発現され得る。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４４】
ベクターＤＮＡは、慣習的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書で用いられる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞内に外来の核酸分子（たとえば、ＤＮＡ）を導入するための種々の人工認識（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ） 技術を意味することが意図される。宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクトする適当な方法は、サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら（上記）、および他の研究所マニュアルに見られ得る。
【００４５】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小フラクションのみがそのゲノムに外来ＤＮＡを組み込みうることが知られている。これらの成分を同定し選択するために、一般的に、選択可能マーカー（たとえば、抗生物質に対する耐性について）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与えられたものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同じベクターで宿主細胞内に接して導入され得るか、または別のベクターで宿主細胞内に導入され得る。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（たとえば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存し、一方、他の細胞は死滅する）。
【００４６】
培地中で原核宿主細胞または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生する（すなわち、発現する）のに使用され得る。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いる、ポリペプチドの産生方法を提供する。一つの態様において、この方法は、ポリペプチドが産生されるような適当な培地中において、（本発明のポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターが導入されている）本発明の宿主細胞を培養する工程を含む。別の態様において、前記方法は、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
【００４７】
本発明の宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するのにも使用され得る。たとえば、ひとつの態様において、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子（たとえば、外因性ＢＭＰ２遺伝子、またはＢＭＰ２ポリペプチドをコードする外因性核酸）が導入されている受精卵母細胞または胚幹細胞である。次いで、かかる宿主細胞は、外因性ヌクレオチド配列がゲノムまたは内因性ヌクレオチド配列が改変されている相同組み換え動物に導入されている非ヒトトランスジェニック動物を作製するのに使用され得る。かかる動物は、ヌクレオチド配列およびこの配列によってコードされるポリペプチドの機能および／または活性を研究するのに、ならびにそれらの活性のモジュレーターを同定および／または評価するのに有用である。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、１以上の動物細胞がトランスジーンを含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯動物である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリおよび両生類が含まれる。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに統合され、かつ成熟動物のゲノムにあり、それによってトランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織中においてコード遺伝子産物の発現を導く外因性ＤＮＡである。本明細書で用いられる場合、「相同組み換え動物」は、内因性遺伝子と動物細胞内（例えば、動物の発生前の動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組み換えにより内因性遺伝子が改変されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
【００４８】
胚操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物、の製造方法は、当該技術分野で慣習的なものとなっており、たとえば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号やホーガン（Ｈｏｇａｎ） 、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６）に開示される。相同組み換えベクターおよび相同組み換え動物の構築方法は、さらにブラッドリー（Ｂｒａｄｌｅｙ） （１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：８２３−８２９やＰＣＴ公報である国際公開第９０／１１３５４号、同第９１／０１１４０号、同９２／０９６８号、および同第９３／０４１６９号に記載される。本明細書に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、ウィルムト（Ｗｉｌｍｕｔ）ら（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３やＰＣＴ公報である国際公開第９７／０７６６８号および同第９７／０７６６９号に記載される方法にしたがって作製され得る。
【００４９】
本発明のポリペプチド
本発明はまた、単離されたＢＭＰ２ポリペプチド、たとえば、タンパク質、およびそのバリアント、ならびに本明細書に記載のヌクレオチド配列でコードされるポリペプチド（たとえば、他のスプライシングバリアント）に関する。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さをいわず、したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。本明細書で用いられる場合、ポリペプチドは、組み換え細胞および非組み換え細胞から単離される際に細胞質物質から実質的に遊離する場合、または化学合成される際に化学前駆体または他の化学薬品から遊離する場合、「単離される」または「精製される」と言われる。ポリペプチドは、しかし、ある細胞に正常に会合されていない別のポリペプチドに結合され、さらに「単離」または「精製」され得る。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、均質になるまで精製され得る。しかし、ポリペプチドが均質になるまで精製されていない調製物も有用であることは理解される。大きな特徴は、この調整物が多量に他の成分が存在していても、ポリペプチドの所望の機能の余地があることである。したがって、本発明は、種々の純度を含む。ひとつの態様においては、「細胞質物質から実質的に遊離する」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満の他のタンパク質（すなわち、不純タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、または約５％未満の他のタンパク質を有するポリペプチドの調製物を包含する。
【００５１】
ポリペプチドが組み換え的に産生されると、培養培地からも実質的に遊離され得る、すなわち、培養培地はポリペプチド調製物の容量の約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満に相当する。「化学前駆体または他の化学薬品から実質的に遊離する」という言葉は、その合成に関する化学前駆体または他の化学薬品から分離されるポリペプチドの調製を含む。一つの態様において、「化学前駆体または他の化学薬品から実質的に遊離する」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満の化学前駆体または他の化学薬品、約２０％未満の化学前駆体または他の化学薬品、約１０％未満の化学前駆体または他の化学薬品、あるいは約５％未満の化学前駆体または他の化学薬品を有するポリペプチドの調製を含む。
【００５２】
一つの態様において、ポリペプチドは、配列番号：１、および該配列において表２に示される少なくとも一つの多型を含む配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列、ならびにそれらの相補体および部分を含む、核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。しかしながら、本発明は、配列バリアントも包含する。バリアントは、生物体の同じ遺伝子座でコードされる実質的な相同ポリペプチド、すなわち、対立遺伝子バリアント、並びに他のスプライシングバリアントを含む。バリアントは、生物体の他の遺伝子座に由来するが、配列番号：１、および該配列において表２で示される少なくとも一つの多型を含む配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列およびそれらの相補体もしくは部分を含む核酸配列によりコードされるペプチドに実質的な相同性を有するか、または配列番号：２をコードするヌクレオチド配列またはその多型バリアントからなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたポリペプチドに実質的な相同性を有するポリペプチドも包含する。バリアントは、これらのポリプペプチドに対して実質的に相同または同一であるが、別の生物体由来のポリペプチド、すなわち、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）も包含する。バリアントは、化学合成で作製されたこれらのポリペプチドに実質的に相同なまたは同一のポリペプチドも含む。バリアントは、組み換え法で作製されたこれらのポリペプチドに実質的に相同なまたは同一のポリペプチドも含む。
【００５３】
本明細書で用いられるように、２つのポリペプチド（またはポリペプチド領域）は、そのアミノ酸配列が少なくとも約４５〜５５％、一般的には少なくとも約７０〜７５％、より一般的には少なくとも約８０〜８５％、最も一般的には約９０％以上の相同または同一である場合、実質的に相同または同一である。本発明にしたがって、実質的に相同のアミノ酸配列は、より詳細に前記されたようなストリンジェントな条件下で、配列番号：１および該配列において表２に示される少なくとも一つの多型を含む配列、またはそれらの部分にハイブリダイズする核酸分子でコードされるか、より詳細に前記されたようなストリンジェントな条件下で配列番号：２をコードする核酸配列、その部分またはその多型バリアントにハイブリダイズする核酸分子でコードされる。
【００５４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性の割合または同一性の割合を測定するために、その配列は最適の比較目的に対して整列される（たとえば、あるポリペプチドまたは核酸分子の配列中に、他のポリペプチドまたは核酸分子との最適のアライメントについてギャップが導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。ある配列の位置が他の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置で相同である。本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と等しい。２つの配列間の相同性の割合は、その配列がもつ同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合は、同一の位置の数／位置の総数×１００に等しい）。
【００５５】
本発明は、より低い程度の同一性を有するが、本発明の核酸分子でコードされるポリペプチドが行うのと同じ機能を１つ以上行うのに充分な類似性を有するポリペプチドも包含する。類似性は、保存されたアミノ酸置換で測定される。かかる置換とは、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を同様な特性の別のアミノ酸で置換することである。保存的置換は、表現型的にサイレントであるのが適当である。保存的置換として一般的に見られるのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間であるものから別のものへの置き換え；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置き換えである。アミノ酸の変換が表現型的にサイレントであるのが適当であることに関連する手引きは、ボビィー（Ｂｏｗｉｅ） ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見られる。
【００５６】
バリアントポリペプチドは、１以上の置換、欠失、挿入、逆位、融合、および切端（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）またはこれらの任意の組み合わせによりアミノ酸配列で相違し得る。さらに、バリアントポリペプチドは、十分に機能的であり得るかまたは１以上の活性において機能を欠失し得る。十分に機能的なバリアントは、一般的に、保存的バリエーションまたは重要ではない残基または重要ではない領域のバリエーションのみを含む。機能的バリアントは、機能に変化のないまたはわずかな変化しか生じない類似のアミノ酸の置換も含み得る。かわりに、かかる置換は、ある程度、機能にポジティブにまたはネガティブに影響を与えうる。非機能的バリアントは、一般的に、１以上の非保存的アミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位、または切端、あるいは重要な残基または重要な領域での置換、挿入、逆位、または欠失を含む。
【００５７】
機能に必須のアミノ酸は、特定部位の突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの当該分野で公知の方法により同定され得る（カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手法は、分子中の残基毎に一つのアラニン突然変異を導入する。得られる変異分子は、次いで、インビトロの生物学的活性またはインビトロの増殖活性について試験される。ポリペプチド活性について重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴または光学アフィニィティー標識などの構造分析でも測定され得る（スミス（Ｓｍｉｔｈ） ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：８９９−９０４（１９９２）；デ・ボス（ｄｅ Ｖｏｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００５８】
本発明は、本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントも含む。フラグメントは、配列番号：１ および該配列において表２で示される少なくとも一つの多型を含む配列を含む核酸分子またはそれらの部分もしくは相補体でコードされるポリペプチドに由来し得る。しかし、本発明は、本明細書で記載するポリペプチドのバリアントのフラグメントも包含する。本明細書で用いられる場合、フラグメントは、少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む。有用なフラグメントは、そのポリペプチドの１以上の生物学的活性を保持するもの並びにポリペプチド特異的抗体を産生するために免疫原として使用され得るフラグメントを含む。
【００５９】
生物学的に活性は断片（たとえば、６、９、１２、１５、１６、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上の長さのアミノ酸であるペプチド）は、周知の方法を用いるポリペプチド配列の解析により同定されているドメイン、セグメント、またはモチーフを含み得る（たとえば、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、１以上の膜貫通型セグメントもしくはループ、リガンド結合領域、ジンクフィンガードメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、アクリル化部位、グリコシル化部位、またはリン酸化部位）。
【００６０】
断片は離散性（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合されない）であり得るか、あるいはより大きなポリペプチド内にあり得る。さらに、いくつかの断片は、単一のより大きなポリペプチド内に含まれ得る。一つの態様において、宿主における発現のために設計された断片は、ポリペプチド断片のアミノ末端に融合される異種プレポリペプチド領域およびプロポリペプチド領域ならびに該断片のカルボキシル末端に融合されるさらなる領域を有し得る。
【００６１】
したがって、本発明は、キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドを提供する。これらは、該ポリペプチドに実質的に相同ではないアミノ酸配列を有する異種タンパク質またはポリペプチドに作動可能に連結される本発明のポリペプチドを含む。「作動可能に連結される」とは、ポリペプチドおよび異種タンパク質が構造的に（ｉｎ−ｆｒａｍｅ） 融合されることを示す。異種タンパク質は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。一つの態様において、該融合ポリペプチドは、そのポリペプチド自体の機能に影響を与えない。たとえば、融合ポリペプチドは、ポリペプチド配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合ポリペプチドであり得る。他のタイプの融合ポリペプチドは、酵素融合ポリペプチド、たとえば、β−ガラクトシダーゼ融合、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合およびＩｇ融合を含むが、限定されない。かかる融合ポリペプチド、特にポリＨｉｓ融合は、組み換えポリペプチドの精製を容易にし得る。ある宿主細胞（たとえば、哺乳類宿主細胞）では、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることにより増大され得る。したがって、別の態様において、融合ポリペプチドは、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む。
【００６２】
欧州特許第０　４６４　５３３号には、融合タンパク質が免疫グロブリン定常領域の種々の部位を含むことが開示されている。Ｆｃは、治療および診断に有用であり、したがって、たとえば、薬物動力学的特徴を改良し得る（欧州特許第０２３２　２６２号）。薬物開発において、たとえば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを同定する高処理量スクリーニングアッセイのためにＦｃ部位で融合されている。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ） ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，８：５２−５８（１９９５）およびジョハンソン（Ｊｏｈａｎｓｏｎ）ら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７０，１６：９４５９−９４７１（１９９５）。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドおよび種々のサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常領域の種々の部分を含む可溶性融合ポリペプチドも包含する。
【００６３】
キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、標準的な組み換えＤＮＡ技術により作製され得る。たとえば、相違するポリペプチド配列についてコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って構造的に一緒にライゲートされる。別の態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成され得る。別のものとして、核酸断片のＰＣＲ増幅は、続いて、アニール化され、再増幅されてキメラ核酸配列を生じ得る２つの連続的核酸断片の間で相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を引き起こすアンカープライマーを用いて行われ得る（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ） ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、融合部位をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている（たとえば、ＧＳＴタンパク質）。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、かかる発現ベクターにおいてその融合部位がポリペプチドに構造的に連結されるように、クローン化され得る。
【００６４】
単離されたポリペプチドは、それを天然に発現する細胞から精製され得るか、それ（組み換え体）を発現するように改変されている細胞から精製され得るか、または公知のタンパク質合成方法を用いて合成され得る。一つの態様において、ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術により作製される。たとえば、該ポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクター内にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞でポリペプチドを発現させる。次いで、該ポリペプチドを、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームにより細胞から単離することができる。
【００６５】
一般に、本発明のポチペプチドは、当該分野で認識される方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子量篩ゲル濾過カラムで分子量マーカーとして用いられ得る。本発明のポリペプチドは抗体を惹起するためまたは免疫応答を引き出すために使用され得る。該ポリペプチドは、ポリペプチドまたは生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）中で結合する分子（たとえば、レセプターまたはリガンド）のレベルを定量的に測定するアッセイにおいて、試薬（例えば、標識試薬）としても使用され得る。該ポリペプチドは、対応するポリペプチドが組織分化の間、または疾患状態のいずれかにおいて構成的に好ましく発現される細胞または組織のマーカーとしても使用され得る。ポリペプチドは、対応する結合パートナー、例えば、レセプターまたはリガンド（たとえば、相互作用トラップアッセイにおけるような）を単離し、ペプチドまたは結合相互作用の低分子アンタゴニストもしくはアゴニストをスクリーニングするのに使用され得る。
【００６６】
本発明の抗体
一つの形態の遺伝子産物を特異的に結合するが、他の形態の遺伝子産物には結合しないポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体も提供される。多型の部位を含むバリアントまたは参考遺伝子産物のいずれかの部分を結合する抗体も提供される。本発明は、たとえば、配列番号：２、および該配列において表２で示される少なくとも一つの多型を有する配列でコードされたアミノ酸配列、またはそれらの部分を有するか、あるいは配列番号：１のすべてまたは一部、および該配列において表２で示される少なくとも一つの多型を含む配列を含む核酸分子でコードされたアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドおよびポリペプチド断片に対する抗体を提供する。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む分子、をいう。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、ポリペプチドまたはその断片に結合するが、試料、たとえば、ポリペプチドを天然に含む生物学的試料中の他の分子に実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することで生み出され得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２ 断片を含む。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で用いられる場合、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応可能な、抗原結合部位の唯一の種類を含む抗体分子の群をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、一般的に、免疫反応する本発明の特定のポリペプチドについて単独の結合アフィニティーを示す。
【００６７】
ポリクローナル抗体は、所望の免疫原、たとえば、本発明のポリペプチドまたはその断片、を用いて好適な被検体を免疫することにより、前記のようにして調製され得る。免疫された被検体中における抗体力価は、免疫化ポリペプチドを用いる酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により経時的にモニターされ得る。所望であれば、そのポリペプチドに対する抗体分子は哺乳類から（たとえば、血液から）単離され、かつさらにプロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技術で精製されて、ＩｇＧフラクションを得ることができる。免疫後の適当な時点で、たとえば、抗体力価が最も高い場合、抗体産生細胞は被検体から得られ、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７によって始めて開示されたハブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズボー（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（コール（Ｃｏｌｅ）ら、（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，社、ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術などの標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するのに使用され得る。ハイブリドーマ製造技術は、周知されている（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ） ら（編）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，社、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。簡単には、不死細胞株（一般的にはミエローマ）は前記のように免疫原で免疫された哺乳動物由来のリンパ球（一般的には膵臓球（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ））に融合され、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００６８】
リンパ球や不死化細胞株を融合するのに用いられる、多くの周知のプロトコールはいずれも、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生する目的に適用され得る（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記；ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ，２６６：５５０５２；Ｒ．Ｈ．ケネス（Ｋｅｎｎｅｔｈ） 、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびレーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）（１９８１）Ｙａｌｅ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照。さらに、当業者は、これらの方法の多くのバリエーションが存在し、それらも有用であることを認識するだろう。
【００６９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製にかわるものとして、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（たとえば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をポリペプチドでスクリーニングし、それによりポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより同定され、単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするためのキットは、市販されている（たとえば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 、組み換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングする場合に使用するための特に敏感に反応する方法や試薬の例としては、たとえば、米国特許第５，２２３，４０９号、ＰＣＴ公報である国際公開第９２／１８６１９号、同第９１／１７２７１号、同第９２／２０７９１号、同第９２／１５６７９号、同第９３／０１２８８号、同第９２／０１０４７号、同第９２／０９６９０号、同第９０／０２８０９号、ファッチス（Ｆｕｃｈｓ） ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７０−１３７２；ハイ（Ｈａｙ） ら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１−８５、ヒュース（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１、グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ） ら（１９９３）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１２：７２５−７３４に見ることができる。
【００７０】
さらに、標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体などの組み換え抗体は、本発明の範囲に入る。かかるキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野に公知の組み換えＤＮＡ技術により作製され得る。
【００７１】
一般に、本発明の抗体（たとえば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術により、本発明のポリペプチドを単離するために用いられ得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞に由来する天然のポリペプチドおよび宿主細胞において発現される組み換え的に産生されたポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの発現の発生量とそのパターンを評価するために、ポリペプチドを（例えば、細胞溶解物、細胞上清または組織試料中で）検出するのに使用され得る。抗体は、臨床試験手法の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニターするのに、たとえば、所定の治療養生法の効力を測定するために、診断的に使用され得る。検出は、検出物質に対する抗体のカップリングにより容易にされ得る。検出物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射線物質が含まれる。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適当な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適当な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、オーダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例にはルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。そして、適当な放射線物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【００７２】
本発明の診断アッセイまたはスクリーニングアッセイ
本発明は、個体中のＢＭＰ２遺伝子または遺伝子産物の存在と関連する変形性関節症の診断方法またはその診断の促進方法にも関する。診断アッセイは、ＢＭＰ２遺伝子発現を評価するように、または本発明のＢＭＰ２ポリペプチドの活性を評価するように設計され得る。一つの態様において、前記アッセイは、生物学的試料（たとえば、血液、血清、細胞、組織）の状況に応じて使用され、それによって個体が骨粗しょう症に罹患する、または骨粗しょう症を発症する（素因または感受性を有する）リスクがあるかどうかを決定する。本発明は、個体が骨粗しょう症を発症する可能性があるかどうかを決定する予知（または予測）アッセイについても提供する。たとえば、遺伝子の突然変異は、生物試料中でアッセイされ得る。かかるアッセイは、予知または予測目的で使用して、それにより骨粗しょう症に関連する徴候が始まる前に個体を予防的に治療することができる。本発明の別の面は、遺伝子発現または本発明のポリペプチドの活性において試薬（たとえば、薬剤、化合物または他の試薬）の影響をモニターするためのアッセイ、ならびに、ＢＭＰ２ポリペプチドに結合する試薬を同定するためのアッセイに関する。これらおよび他のアッセイや試薬については、以下の章でさらに詳細に説明される。
【００７３】
診断アッセイ
本明細書で記載される核酸、ポリペプチドおよび抗体は、骨粗しょう症の感受性の診断方法、ならびに骨粗しょう症の感受性の診断に有用なキットに使用され得る。
【００７４】
本発明の一つの態様において、骨粗しょう症の感受性の診断は、本明細書で記載するようにＢＭＰ２における多型を検出することにより行われる。多型は、フレームシフト変異を生じる１つのヌクレオチドまたは１以上のヌクレオチドの挿入や欠失などのＢＭＰ２における変異、コードされたアミノ酸に変化を生じる少なくとも１つのヌクレオチドの変化、未成熟の終止コドンの産生を生じる少なくとも１つのヌクレオチドの変化、ヌクレオチドでコードされた１以上のアミノ酸の欠失を生じるいくつかのヌクレオチドの欠失、遺伝子のコード配列の中断を生じる、不十分な組み換えまたは遺伝子変換などによる１つまたはいくつかのヌクレオチドの挿入、すべてまたは一部の遺伝子の複製、すべてまたは一部の遺伝子の転移、あるいはすべてまたは一部の遺伝子の再配列化であり得る。１以上のかかる変異は、一つの遺伝子にある。かかる配列の変化は、ＢＭＰ２遺伝子でコードされるポリペプチドでの突然変異を引き起こす。たとえば、変異がフレームシフト変異である場合、フレームシフトは、コードされたアミノ酸において変化が生じうるおよび／または未熟の終止コドンの発生が生じて切端ポリペプチド発生の原因となり得る。かわりに、骨粗しょう症の感受性に関連する多型は、１以上のヌクレオチドにおける同義の変異であり得る（すなわち、ＢＭＰ２遺伝子でコードされたポリペプチドに変化を生じない変異）。かかる多型は、スプライシング部位を変え、ｍＲＮＡの安定性または移動に影響を与えるか、逆に遺伝子の転写または翻訳に影響を与えるかもしれない。任意の前記変異を有するＢＭＰ２遺伝子は、本明細書において「変異遺伝子」と呼ぶ。
【００７５】
骨粗しょう症の感受性を診断する第一の方法において、サザン分析、ノザン分析、またはインサイチュハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法が、使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）， Ｆ． ら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、１９９９から全ての補遺を含む）。たとえば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡの被検体（「試験試料」）由来の生物試料は、骨粗しょう症を有する、感受性のあるまたは罹患しやすい、あるいは欠損を起こしていると推測される個体から得られる（試験個体）。個体は、成人、子供または胎児であり得る。試験試料は、血液試料、羊水試料、脳脊髄液試料、あるいは皮膚、筋肉、頬もしくは結膜性粘膜、胎盤、胃腸管または他の器官由来の組織試料などのゲノムＤＮＡを含むあらゆる原料由来のものであり得る。胎児の細胞または組織由来のＤＮＡ試験試料は、羊水穿刺または長期絨毛サンプリングなどの、適当な方法で得られうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ試料を、ついで、ＢＭＰ２において多型が存在するかどうかを決定するために試験する。多型の存在は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡにおける遺伝子の核酸プローブへのハイブリダイゼーションよって示され得る。本明細書で用いる場合、「核酸プローブ」は、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブであり得る。核酸プローブは、ＢＭＰ２において、少なくとも１つの多型を含む。該プローブは任意の前記核酸分子であり得る（たとえば、遺伝子、断片、前記遺伝子を含むベクターなど）。
【００７６】
骨粗しょう症の感受性を診断するため、ＢＭＰ２を含む試験試料を少なくとも一つの核酸プローブに接触させることにより、ハイブリダイゼーション試料が形成される。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましいプローブは、本明細書で記載されるｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズしうる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、たとえば、全長核酸分子、または長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００個のヌクレオチドであり、適当なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに充分なオリゴヌクレオチドなどの部分であり得る。たとえば、核酸プローブは、配列番号：１の全てまたは一部、および該配列において任意に表２で示される少なくとも一つの多型を含む配列であり得、あるいは配列番号：１の相補体、またはその一部である。本発明の診断アッセイでの使用に適当な他のプローブは、本明細書で記載される。
【００７７】
ハイブリダイゼーション試料は、核酸プローブのＢＭＰ２への特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で保持される。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いられる場合、精密なハイブリダイゼーション（たとえば、ミスマッチのない）を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、前記のような高ストリンジェンシー条件下または中程度ストリンジェンシー条件下で行われうる。特に好ましい態様において、特異的ハイブリダイゼーションについてのハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。
【００７８】
特異的ハイブリダイゼーションがもしあれば、ついで、標準的な方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが、試験試料中において核酸プローブとＢＭＰ２との間で生じれば、ＢＭＰ２は核酸プローブに存在する多型を有する。１以上の核酸プローブが、この方法において共に使用され得る。任意の核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ＢＭＰ２における多型を示し、したがって骨粗しょう症の感受性についての診断となる。
【００７９】
別のハイブリダイゼーション法において、ノザン分析（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ） Ｆ．ら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、上記）が、骨粗しょう症の感受性に関連する多型の存在を同定するのに使用される。ノザン分析については、ＲＮＡの試験試料が適当な手段により個体から得られる。前記のように、核酸プローブの、個体由来のＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションは、ＢＭＰ２における多型を示し、したがって、骨粗しょう症の感受性についての診断となる。
【００８０】
核酸プローブの代表的な使用例については、たとえば、米国特許第５，２８８，６１１号および第４，８５１，３３０号を参照のこと。
【００８１】
かわりになるべきものとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを、前記ハリブリダイゼーション法において核酸プローブのかわりに使用することができる。ＰＮＡは、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシンの窒素原子に結合した有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）をもつ、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などの、ペプチド様の、無機骨格を有するＤＮＡ模造物である（たとえばニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）Ｐ．Ｅ． ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，５，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｐ．１（１９９４）を参照）。ＰＮＡプローブは、骨粗しょう症の感受性に関連する多型を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。ＰＮＡプローブのＢＭＰ２へのハイブリダイゼーションは、骨粗しょう症の感受性についての診断となる。
【００８２】
本発明の別の方法において、遺伝子における変異または多型が制限部位の発生または除去を生じる場合、制限消化による変異分析は、変異遺伝子、または１つまたは複数の多型を含む遺伝子を検出するために使用され得る。ゲノムＤＮＡを含む試験試料は、個体から得られる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試験個体由来のゲノムＤＮＡの試験試料中においてＢＭＰ２（および必要であれば、フランキング配列）を増幅するのに使用され得る。ＲＦＬＰ分析は前記のように処理される（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記を参照）。関連したＤＮＡ断片の消化パターンは、ＢＭＰ２における突然変異または多型の有無を示し、したがって、この骨粗しょう症の感受性の有無を示す。
【００８３】
配列分析も、ＢＭＰ２において特異的な多型を検出するのにも使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡの試験試料は、試験個体から得られる。ＰＣＲまたは他の適当な方法は、遺伝子、および／または所望であればそのフランキング配列を増幅するのに使用され得る。ＢＭＰ２、またはその遺伝子断片、またはｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片、またはｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ断片の配列は、標準的な方法を用いて測定される。該遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ断片の配列は、適切なものとして、遺伝子、ｃＤＮＡ（たとえば、配列番号：１および該配列において表２に示される多型を少なくとも１つ含む配列）またはｍＲＮＡの既知の核酸配列と比較される。ＢＭＰ２における多型の存在は、個体が骨粗しょう症の感受性を有することを示す。
【００８４】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを用いる増幅オリゴヌクレオチドのドットブロットハイブリダイゼーションの使用を通じて、ＢＭＰ２における多型の存在を検出するのにも使用され得る（たとえば、サイキ（Ｓａｉｋｉ），Ｒ．ら（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：１６３−１６６参照）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書では「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」ともいう）は、ＢＭＰ２に特異的にハイブリダイズし、骨粗しょう症の感受性に関連する多型を含む約１０〜５０塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。ＢＭＰ２における特定の多型に特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記参照）を用いて調製され得る。骨粗しょう症の感受性に関連する遺伝子において多型を同定するため、ＤＮＡの試験試料は個体から得られる。ＰＣＲは、ＢＭＰ２のすべてまたは断片、およびそのフランキング配列を増幅するのに使用され得る。増幅ＢＭＰ２を含有するＤＮＡ（または遺伝子断片）は、標準的な方法を用いて、ドットプロットされ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、上記参照）、そのブロットはオリゴヌクレオチドプローブに接触させる。次いで、プローブの増幅ＢＭＰ２への特異的ハイブリダイゼーションの存在を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの、個体由来のＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションは、ＢＭＰ２における多型を示し、したがって、骨粗しょう症の感受性を示す。
【００８５】
別の態様において、個体由来の標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイは、ＢＭＰ２における多型を同定するのに使用され得る。たとえば、一つの態様において、オリゴヌクレオチドアレイを用いることができる。オリゴヌクレオチドアレイは、一般的には、相違する既知の位置で基質の表面にカップリングされる複数の相違するオリゴヌクレオチドプローブを含む。これらのオリゴヌクレオチドアレイは、「Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ．ＴＭ．」としても開示され、たとえば、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許出願番号である国際公開第９０／１５０７０号パンプレットおよび第９２／１００９２号パンプレットなどの当該分野においても一般的に開示されている。これらのアレイは、一般的に、自動的合成法または写真平板法と固相オリゴヌクレオチド合成法との組み合わせを組み込んだ光指向合成法を用いて作製され得る。フォーダー（Ｆｏｄｏｒ） ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７（１９９１）、ピラング（Ｐｉｒｒｕｎｇ） ら、米国特許第５，１４３，８５４号（また、ＰＣＴ出願である国際公開第９０／１５０７０号を参照）ならびにフォーダーら、ＰＣＴ出願である国際公開第９２／１００９２号および米国特許第５，４２４，１８６号を参照のこと、これらの教示は、参照としてすべて本明細書に取り込まれる。自動合成法を用いるこれらのアレイ合成についての技術は、たとえば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されており、その教示は参照として本明細書に取り込まれる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドアレイが調製されると、所望の核酸がそのアレイとハイブリダイズされ、多型についてスキャンされる。ハイブリダイゼーションおよびスキャニングは、本明細書や、たとえば、公開されたＰＣＴ出願である国際公開第９２／１００９２号および同第９５／１１９９５号、ならびに米国特許第５，４２４，１８６号に記載の方法（これらの教示は、参照としてすべて本明細書に取り込まれる）によって一般的に行われる。簡単には、１以上の以前に同定された多型マーカーを含む標的核酸配列は、周知の増幅技術、たとえば、ＰＣＲ、で増幅される。一般的に、これは、多型由来の上流および下流の両方の標的配列の２本鎖に相補的なプライマー配列の使用を含む。非対称ＰＣＲ技術も使用し得る。次いで、一般的には標識を組み込んた増幅標的を、適当な条件下で前記アレイにハイブリダイズさせる。アレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄の完了までに、アレイをスキャンして標的配列がハイブリダイズするアレイの位置を決定する。スキャンから得られたハイブリダイゼーションのデータは、一般的にはアレイの位置の関数として蛍光強度の形をとっている。
【００８７】
単一の検出ブロック（たとえば、単一の多型の検出のための）に関して主として記載されるが、アレイは、複数の検出ブロックを含み得、したがって、複数の、特異的な多型を分析することが可能である。かわりの配列において、種々の至適条件が、標的物のアレイへのハイブリダイゼーションの間に使用され得るように、検出ブロックが単一のアレイ内または複数の分離したアレイにグループ化され得ることが一般的に理解されるだろう。たとえば、Ａ−Ｔリッチセグメントに含まれるものとは別に、ゲノム配列のＧ−Ｃリッチ伸長内に含まれるそれらの多型の検出について提供することが望ましいであろう。これは、各状態についてのハイブリダイゼーション条件の別々の至適化を可能にする。
【００８８】
多型検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの使用のさらなる開示は、たとえば、米国特許第５，８５８，６５９号および第５，８３７，８３２号に見ることができ、これらの教示は、参照としてすべて本明細書に取り込まれる。
【００８９】
核酸分析の他の方法は、ＢＭＰ２の多型を検出するのに使用され得る。代表的な方法には、たとえば、ダイレクト・マニュアル・シークエンス（チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）とギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ），（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：１９９１−１９９５；サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）， Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　７４：５４６３−５４６７；ビアビス（Ｂｅａｖｉｓ）ら、米国特許第５，２８８，６４４号）；自動蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型アレイ（ＳＳＣＰ）；強制変性ゲル電気泳動動（ＣＤＧＥ）；変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（シェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ），Ｖ．Ｃ．ら、（１９８９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２３２−２３６）；移動シフト分析（オリタ（Ｏｒｉｔａ）， Ｍ． ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２７６６−２７７０）；制限酵素分析（フラベール（Ｆｌａｖｅｌｌ） ら（１９７８）Ｃｅｌｌ　１５：２５；ゲーバー（Ｇｅｅｖｅｒ）ら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：５０８１）；ヘテロ二重鎖（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）分析；化学ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：４３９７−４４０１）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）， Ｒ．Ｍ． ら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２）；大腸菌ｍｕｔＳタンパク質などのヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；対立遺伝子特異的ＰＣＲなどが含まれる。
【００９０】
本発明の別の態様において、骨粗しょう症の感受性の診断は、酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を含む、種々の方法により、ＢＭＰ２ポリペプチドの発現および／または組成を検査することによっても行われ得る。個体由来の試験試料は、ＢＭＰ２にコードされたポリペプチド発現の変化および／または組成の変化の存在について評価される。ＢＭＰ２にコードされたポリペプチド発現の改変は、たとえば、定量的ポリペプチド発現（すなわち、産生されるポリペプチドの量）における変化であり得る。ＢＭＰ２にコードされたポリペプチドの組成の変化は、定量的ポリペプチド発現（たとえば、突然変異ＢＭＰ２ポリペプチドのまたは異なるスプライシングバリアントの発現）における改変である。好ましい態様において、骨粗しょう症の感受性の診断は、ＢＭＰ２にコードされた特定のスプライシングバリアント、または特定のバターンのスプライシングバリアントを検出することにより行われる。
【００９１】
かかる変化（定量的および質的）はいずれも存在し得る。ポリペプチド発現または組成における「変化」とは、本明細書で使用する場合、コントロール試料中のＢＭＰ２によるポリペプチドの発現または組成と比較した際の、試験試料中の発現または組成における変化をいう。コントロール試料は、試験試料に対応する（たとえば、同じ細胞型由来の）試料であり、かつ骨粗しょう症に罹患していない個体由来のものである。同様に、試験試料中の１以上の異なるスプライシングバリアントの存在、または試験試料と比較した際の試験試料中の異なるスプライシングバリアントの量の有意差の存在は、骨粗しょう症の感受性を示す。コントロール試料と比較した際の試験試料中のポリペプチドの発現または組成の改変は、骨粗しょう症の感受性を示す。分光学、比色定量分析、電気泳動、等電収束、および免疫ブロット（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，特に１０章も参照）などの免疫アッセイ（たとえば、デビッド（Ｄａｖｉｄ） ら、米国特許第４，３７６，１１０号）を含む、ＢＭＰ２にコードされたポリペプチドの発現または組成を検査する種々の手段が使用され得る。たとえば、一つの態様において、ポリペプチドに結合し得る抗体（たとえば、前記）、好ましくは検出可能な標識を有する抗体を使用することができる。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体、またはその断片（たとえば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２ ）が用いられ得る。プローブまたは抗体に関して、「標識した」という用語は、そのプローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応性による前記プローブまたは抗体の間接的な標識を包含することが意図される。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用い、蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出され得るようにビオチンでＤＮＡプローブを最終標識する一次抗体の検出が含まれる。
【００９２】
変異ＢＭＰ２にコードされたポリペプチドに特異的に結合する前記のような抗体、または非変異遺伝子にコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いるウエスタンブロット分析は、多型ＢＭＰ２または変異ＢＭＰ２にコードされたポリペプチドの試験試料中の存在、または非多型遺伝子または非変異遺伝子にコードされたポリペプチドの試験試料中の非存在を同定するのに使用され得る。多型遺伝子または変異遺伝子にコードされたポリペプチドの存在、あるいは非多型遺伝子または非変異遺伝子にコードされたポリペプチドの非存在は、骨粗しょう症の感受性についての診断となる。
【００９３】
本方法の一つの態様において、試験試料中のＢＭＰ２にコードされたポリペプチドのレベルまたは量は、コントロール試料中のＢＭＰ２にコードされたポリペプチドのレベルまたは量と比較される。その差が実質的に有意である、コントロール試料中のポリペプチドのレベルまたは量より高いまたは低い試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量は、ＢＭＰ２にコードされたポリペプチド発現の変化を示し、骨粗しょう症の感受性についての診断となる。かわりに、試験試料中のＢＭＰ２にコードされたポリペプチドの組成は、コントロール試料中のＢＭＰ２にコードされたポリペプチドの組成と比較される。コントロール試料中のポリペプチドの組成と比べた際の試験試料中のポリペプチドの組成の差は、骨粗しょう症の感受性についての診断となる。別の態様において、ポリペプチドのレベルまたは量と組成との両方が、試験試料およびコントロール試料中で評価され得る。コントロール試料と比較した試験試料中のポリペプチドの量またはレベルの差、コントロール試料と比較した試験試料中の組成の差、または量もしくはレベルの差と組成の差の両方は、骨粗しょう症の感受性を示す。
【００９４】
診断方法に有用なキットは、たとえば、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素（たとえば、ＲＦＬＰ分析用）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変異または非変異（ネイティブ）ＢＭＰ２ポリペプチド（たとえば、配列番号：２および該配列において表２に示される少なくとも一つの多型を有する配列）に結合する抗体、ＢＭＰ２を含む核酸増幅手段、あるいはＢＭＰ２の核酸配列の分析手段、またはＢＭＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析手段などを含む、本明細書で記載される任意の方法において有用な成分を含む。
【００９５】
スクリーニングアッセイおよびそれにより同定される試薬
本発明は、本発明の核酸にハリブリダイズするヌクレオチドの存在を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」ともいう）、ならびに本発明の核酸にコードされたポリペプチドの存在を同定する方法を提供する。一つの態様において、試料における目的の核酸分子（たとえば、本発明の核酸と有意なホモロジーを有する核酸）の存在（または非存在）は、試料を本発明の核酸（たとえば、配列番号：１の配列、および該配列において表２で示される少なくとも１つの多型を含む配列を有する核酸、もしくはそれらの相補体、または配列番号：２の配列を有するアミノ酸をコードする核酸、あるいはこれらの核酸の断片またはバリアント）を含む核酸と、前記のようなストリンジェントな条件下で接触させ、次いでハイブリダイゼーションの存在（または非存在）について前記試料を評価することにより評価され得る。好ましい態様において、高ストリンジェンシー条件とは、選択的ハイブリダイゼーションについて適当な条件である。別の態様において、所望の核酸分子を含む試料は、所望の核酸分子（たとえば、バリアントＢＭＰ２核酸）の一部と少なくとも部分的に相補的な連続するヌクレオチド配列を含む核酸（たとえば、前記されたようなプライマーまたはプローブ）と接触され、その接触された試料は、ハイブリダイゼーションの有無について評価される。好ましい態様において、連続するヌクレオチド配列を含む核酸は、所望の核酸分子の一部に完全に相補的である。
【００９６】
任意のこれらの態様において、所望の核酸のすべてまたは一部は、ハイブリダイゼーションを行う前に増幅に供され得る。
【００９７】
別の態様において、試料中における本発明のポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントなどの所望のポリペプチドの存在（または非存在）は、試料を、所望のポリペプチドに特異的にハイブリダイズする抗体（たとえば、前記のものなどの抗体）と接触させ、次いで、所望のポリペプチドへの前記抗体の結合の存在（または非存在）について前記試料を評価することにより評価され得る。
【００９８】
別の実施形態において、本発明は、因子（例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣物、プロドラッグ、レセプター、結合因子、抗体、低分子または他の薬物）または本明細書に記載されるポリペプチドの活性を変更する（例えば、増加するまたは減少する）か、またはさもなければ本明細書中のポリペプチドと相互作用するリボザイムを同定する方法を提供する。例えば、このような因子は、本明細書中に記載されるポリペプチドに結合する因子（例えば、ＢＭＰ２結合因子）；例えば、本発明のポリペプチドの活性に刺激性効果または阻害性効果を有する因子；あるいは本発明のポリペプチドがＢＭＰ２結合因子と相互作用する能力を変更する（例えば、高めるまたは阻害する）因子（例えば、レセプターまたは他の結合因子）；あるいはＢＭＰ２ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変更する因子（例えば、タンパク質分解プロセシングを変更して通常合成される場所から細胞表面などの細胞の別の場所へポリペプチドを指向する因子）；タンパク質分解プロセシングを変更し、その結果より多くのポリペプチドが細胞から放出される因子などであり得る。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド（またはその生物学的に活性な１つまたは複数の部分）に結合するかまたは本明細書中に記載されるポリペプチド（またはその生物学的に活性な１つまたは複数の部分）の活性を調節する候補因子または試験因子をスクリーニングするためのアッセイ、およびこのアッセイによって同定され得る因子を提供する。試験因子は、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法（生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が挙げられる）中の多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のポリペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ， Ｋ．Ｓ．（１９９７） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， １２：１４５）。
【０１００】
１つの実施形態において、ＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変更する因子を同定するために、ＢＭＰ２ポリペプチド（例えば、配列番号２および表２に示されるような多型を少なくとも１つ含む配列番号２）またはその活性フラグメントもしくは誘導体（上記のような）を含有するかもしくは発現する細胞、細胞溶解物、または溶液は、試験対象の因子と接触させられ得る；あるいは、ポリペプチドが試験対象の因子と直接接触させられ得る。ＢＭＰ２活性のレベル（量）が評価され（例えば、ＢＭＰ２活性のレベル（量）が直接的または間接的のいずれかで測定される）、対照における活性のレベル（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのＢＭＰ２ポリペプチドまたはその活性フラグメントもしくは誘導体の活性のレベル）と比較される。因子の存在下での活性のレベルが統計的に有意な量で因子の非存在下での活性のレベルと異なる場合、次いで因子は、ＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変更する因子である。対照と比較したＢＭＰ２活性のレベルにおける増加は、因子がＢＭＰ２活性を高める（ＢＭＰ２活性のアゴニストである）因子であることを示す。同様に、対照と比較したＢＭＰ２活性のレベルにおける減少は、因子がＢＭＰ２活性を阻害する（ＢＭＰ２活性のアンタゴニストである）因子であることを示す。別の実施形態において、試験対象の因子の存在下でのＢＭＰ２ポリペプチドまたはその誘導体もしくはフラグメントの活性のレベルは、以前に確立されている対照レベルと比較される。統計的に有意な量で対照レベルと異なる因子の存在下での活性のレベルは、因子がＢＭＰ２活性を変更することを示す。
【０１０１】
本発明はまた、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変更する因子（例えば、アンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣物、プロドラッグ、レセプター、結合因子、抗体、低分子または他の薬物）、またはこの遺伝子の発現（例えば、転写または翻訳）を変更する（例えば、増加するまたは減少する）か、またはさもなければ本明細書中に記載される核酸と相互作用するリボザイムを同定するためのアッセイ、およびこのアッセイによって同定され得る因子に関する。例えば、ＢＭＰ２ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＢＭＰ２遺伝子）を含有する溶液は、試験対象の因子と接触され得る。この溶液は、例えば、核酸を含む細胞または核酸を含む細胞溶解物を含み得る；あるいは、この溶液は、核酸の転写／翻訳に必要な要素を含む別の溶液であり得る。所望の場合、溶液に懸濁されない細胞がまた使用され得る。ＢＭＰ２発現のレベルおよび／またはパターン（例えば、異なるスプライシング改変体のレベルおよび／またはパターンなどのｍＲＮＡもしくは発現されたタンパク質のレベルおよび／またはパターン）が評価され、対照での発現のレベルおよび／またはパターン（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのＢＭＰ２発現のレベルおよび／またはパターン）と比較される。因子の存在下でのレベルおよび／またはパターンが統計的に有意な量または様式で因子の非存在下でのレベルおよび／またはパターンと異なる場合、次いで因子は、ＢＭＰ２の発現を変更する因子である。ＢＭＰ２発現の増加は、因子がＢＭＰ２活性のアゴニストであることを示す。同様に、ＢＭＰ２発現の阻害は、因子がＢＭＰ２活性のアンタゴニストであることを示す。別の実施形態において、試験対象の因子の存在下での１つまたは複数のＢＭＰ２ポリペプチド（例えば、異なるスプライシング改変体）のレベルおよび／またはパターンは、以前に確立されている対照レベルおよび／またはパターンと比較される。統計的に有意な量または様式で対照レベルおよび／またはパターンと異なる因子の存在下でのレベルおよび／またはパターンは、因子がＢＭＰ２発現を変更することを示す。
【０１０２】
本発明の別の実施形態において、ＢＭＰ２遺伝子の発現を変更するかさもなければ本明細書中に記載される核酸と相互作用する因子は、レポーター遺伝子に作動可能に連結されるＢＭＰ２遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸を含有する細胞、細胞溶解物、または溶液を使用して同定され得る。試験対象の因子と接触させた後、レポーター遺伝子の発現のレベル（例えば、ｍＲＮＡまたは発現されたタンパク質のレベル）は、評価され、対照での発現のレベル（すなわち、試験対象の因子の非存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベル）と比較される。因子の存在下でのレベルが統計的に有意な量または様式で因子の非存在下でのレベルと異なる場合、次いで、ＢＭＰ２遺伝子プロモーターに作動可能に連結される遺伝子の発現を変更する能力によって示されるように、因子は、ＢＭＰ２の発現を変更する因子である。レポーターの発現の増加は、因子がＢＭＰ２活性のアゴニストであることを示す。同様に、レポーターの発現の阻害は、因子がＢＭＰ２活性のアンタゴニストであることを示す。別の実施形態において、試験対象の因子の存在下でのレポーターの発現のレベルは、以前に確立されている対照レベルと比較される。統計的に有意な量または様式で対照レベルと異なる因子の存在下での活性のレベルは、因子がＢＭＰ２発現を変更することを示す。
【０１０３】
ＢＭＰ２によってコードされる、異なるスプライシング改変体の量を変更する因子（例えば、第一のスプライシング改変体の活性を高め、第二のスプライシング改変体の活性を阻害する因子）ならびに第一のスプライシング改変体の活性のアゴニストおよび第二のスプライシング改変体の活性のアンタゴニストである因子は、上記の方法を使用して容易に同定され得る。
【０１０４】
本発明の他の実施形態において、アッセイを使用して、ＢＭＰ２結合因子に関するポリペプチドの活性に対する試験因子の影響を評価し得る。例えば、ＢＭＰ２と相互作用する化合物（本明細書において、レセプターなどのＢＭＰ２と相互作用するポリペプチドまたは他の分子であり得る「ＢＭＰ２結合因子」として呼ばれる）を発現する細胞は、試験因子の存在下でＢＭＰ２と接触され、ＢＭＰ２とＢＭＰ２結合因子との間の相互作用を変更する試験因子の能力が決定される。あるいは、ＢＭＰ２結合因子を含有する細胞溶解物または溶液が使用され得る。ＢＭＰ２またはＢＭＰ２結合因子に結合する因子は、ＢＭＰ２結合因子に結合するか、会合するか、さもなければ相互作用するＢＭＰ２の能力を妨げるか、または高めることによって相互作用を変更し得る。ＢＭＰ２またはＢＭＰ２結合因子に結合する試験因子の能力を決定することは、例えば、試験因子を放射性同位体または酵素標識と結合することによって成し遂げられ得、その結果、試験因子のポリペプチドへの結合は、直接的または間接的のいずれかで１２５ Ｉ 、３５Ｓ 、１４Ｃ または３ Ｈ で標識されたもの、および放射能射出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出される放射線同位体を検出することよって決定され得る。あるいは、試験因子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ、および適切な基質の生成物への変換の決定によって検出される酵素標識で酵素的に標識され得る。ポリペプチドと相互作用する試験因子の能力を任意の反応体の標識化なしに決定することはまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用してＢＭＰ２またはＢＭＰ２結合因子と試験因子の相互作用を試験因子、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ２結合因子のいずれかの標識化なしに検出し得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｈ．Ｍ． ら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７：１９０６−１９１２ 。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、ＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＴＭ）は、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレス可能電位差センサー（ＬＡＰＳ）を使用して測定する分析装置である。この酸性化速度における変化は、リガンドとポリペプチドとの間の相互作用の指標として使用され得る。公知のＢＭＰ２結合パートナーの考察についての実施例節を参照のこと。従って、これらのレセプターを使用して、骨粗鬆症の治療に使用するＢＭＰ２レセプターアゴニストまたは骨粗鬆症を研究するためのＢＭＰ２レセプターアンタゴニストである化合物をスクリーニングし得る。本明細書中に提供される結合データは、初めてこのような骨粗鬆症に対する矯正を提供する。薬物は、ＢＭＰ２レセプター活性化を調節するように設計され得、次いでシグナル伝達経路および下流遺伝子の転写事象を調節するために使用され得る。
【０１０５】
本発明の別の実施形態において、アッセイは、本明細書中に記載されるような１つ以上のＢＭＰ２ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用され得る。例えば、酵母ツーハイブリッド系（例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．およびＳｏｎｇ， Ｏ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される）は、１つ以上のＢＭＰ２ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを同定するために使用され得る。このような酵母ツーハイブリッド系において、ベクターは、２つの機能的ドメイン（ＤＮＡ 結合ドメインおよび転写活性化ドメイン）を有する転写因子の順応性に基づいて構築される。この２つのドメインが分離されるが互いに相互作用する２つの異なるタンパク質に融合される場合、転写活性化が達成され得、特異的マーカー（例えば、Ｈｉｓ およびＡｄｅ などの栄養性マーカー、またはｌａｃＺなどの着色マーカー）の転写は、相互作用および転写活性化の存在を同定するために使用され得る。例えば、本発明の方法において、ＤＮＡ 結合ドメインおよびまたＢＭＰ２ポリペプチド、スプライシング改変体、またはそのフラグメントもしくは誘導体をコードする核酸を含む第一のベクターが使用され、転写活性化ドメインをコードする核酸およびまた潜在的にＢＭＰ２ポリペプチド、スプライシング改変体、またはそのフラグメントもしくは誘導体と相互作用し得るポリペプチド（例えば、ＢＭＰ２ポリペプチド結合因子またはレセプター）をコードする核酸を含む第二のベクターが使用される。第一のベクターおよび第二のベクターを含む酵母の適切な条件下（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製ＭａｔｃｈｍａｋｅｒＴＭ系に使用される条件などの交配条件）でのインキュベーションは、目的のマーカーを発現するコロニーの同定を可能にする。これらのコロニーは、ＢＭＰ２ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体と相互作用する１つまたは複数のポリペプチドを同定するために試験され得る。このようなポリペプチドは、上記のようなＢＭＰ２ポリペプチドの発現の活性を変更する因子として有用であり得る。
【０１０６】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ポリペプチドの１つまたは両方の非複合体形態と複合体形態との分離を容易にするために、ならびにアッセイの自動化を適応するために、固体支持体上にＢＭＰ２、ＢＭＰ２結合因子またはアッセイの他の成分のいずれかを固定することが所望され得る。試験因子のポリペプチドへの結合、または試験因子の存在および非存在下でのポリペプチドと結合因子との相互作用は、反応物を含むのに適切な任意の容器において成し遂げられ得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、ＢＭＰ２またはＢＭＰ２結合因子がマトリクスまたは他の固体支持体に結合されるのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ融合タンパク質）が、提供され得る。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明の核酸分子の発現のモジュレーターは、ＢＭＰ２をコードする核酸を含有する細胞、細胞溶解物、または溶液が試験因子に接触され、そして細胞、細胞溶解物、または溶液における適切なｍＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、１つまたは複数のスプライシング改変体）の発現が決定される方法において同定される。試験因子の存在下での適切なｍＲＮＡまたは１つまたは複数のポリペプチドの発現のレベルは、試験因子の非存在下でのｍＲＮＡまたは１つまたは複数のポリペプチドの発現のレベルと比較される。次いで、試験因子は、この比較に基づいて発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が試験因子の非存在下よりも存在下のほうが多い（統計的に有意に多い）場合、試験因子は、ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質またはエンハンサーとして同定される。あるいは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が試験因子の非存在下よりも存在下のほうが少ない（統計的に有意に少ない）場合、試験因子は、ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターとして同定される。細胞におけるｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための本明細書中に記載される方法によって決定され得る。
【０１０８】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規因子に関する。従って、本明細書中に記載されるように同定された因子を適切な動物モデルにおいてさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように同定された因子（例えば、調節因子、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、またはポリペプチド結合因子である試験因子）は、このような因子を用いる治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書に記載されるように同定された因子は、このような因子の作用の機構を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるような治療のための、上記スクリーニングアッセイによって同定された新規因子の使用に関する。さらに、本明細書中に記載されるように同定された因子を使用して、本明細書中に記載されるように同定された因子とポリペプチドまたは遺伝子を接触させる（あるいはポリペプチドまたは遺伝子を含有する細胞を接触させる）ことによって、ＢＭＰ２によってコードされるポリペプチドの活性を変更し得るか、またはＢＭＰ２の発現を変更し得る。
【０１０９】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸、特に本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチドを含有し；本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、配列番号２）を含有し；および／または本明細書に記載されるＢＭＰ２ポリペプチド活性を変更する（例えば、高めるまたは阻害する）因子を含有する医薬組成物に関する。例えば、ポリペプチド、タンパク質、フラグメント、融合タンパク質もしくはそれらのプロドラッグ、または本発明のヌクレオチドを含有するヌクレオチドもしくは核酸構築物（ベクター）、またはＢＭＰ２ポリペプチド活性を変更する因子は、医薬組成物を調製するために薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とともに製剤化され得る。キャリアおよび組成物は、滅菌され得る。製剤は、投与の形態に適応するべきである。
【０１１０】
適切な薬学的に許容可能なキャリアとしては、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、乳糖、アミロースもしくはデンプン）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。所望の場合、医薬調製物は、活性因子と有害に反応しない補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、香味物質および／または芳香物質など）と混合され得る。
【０１１１】
所望の場合、組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝化剤を含み得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤であり得る。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのキャリアとともに坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なキャリアを含み得る。
【０１１２】
これらの組成物の導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口および鼻内が挙げられるが、これらに限定されない。導入の他の適切な方法としてはまた、遺伝子治療（下記のような）、再充填可能または生分解性デバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）および徐放性ポリマーデバイスが挙げられ得る。本発明の医薬組成物はまた、他の因子との組み合わせ治療の一部として投与され得る。
【０１１３】
組成物は、人間への投与に適切な医薬組成物として慣用的な手順に従って製剤化され得る。例えば、静脈内投与用の組成物は、典型的に滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげる局所麻酔剤を含み得る。一般的に、成分は、例えば、活性因子の量を表示するアンプルまたはサシェットなどの密封して封じた容器に乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として単位投与形態で別々にかまたは一緒に混合されてのいずれかで供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬グレード水、生理食塩水またはデキストロース／水を含む注入ボトルで提供され得る。組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水のアンプルまたは生理食塩水が提供され得、その結果、成分は投与前に混合され得る。
【０１１４】
局所適用について、スプレー不可能形態、局所適用に適合するキャリアを含有し、かつ好ましくは水よりも大きな動粘性率を有する半固体または固体に比べて粘性な形態が、使用され得る。適切な製剤としては、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、散剤、浣腸、ローション、ゾル、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅ ）、エアロゾルなどが挙げられるが、それらに限定されない。所望の場合、これらは滅菌されるか、または補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤または浸透圧に影響を及ぼす塩など）と混合される。因子は、化粧品製剤に組み込まれ得る。局所適用について、スプレー可能なエアロゾル調製物がまた適切であり、ここで、好ましくは固体または液体不活性キャリア物質と組み合わせた活性成分は、圧搾ボトルにパッケージングされるか、または加圧揮発性物質、通常ガス状推進剤（例えば、加圧空気）と混合される。
【０１１５】
本明細書中に記載される因子は、中性形態または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩としては、遊離アミノ基とともに形成されるもの（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のもの）および遊離カルボキシル基とともに形成されるもの（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のもの）が挙げられる。
【０１１６】
この因子は、治療的に有効な量で投与される。特定の障害または状態の治療において治療的に有効な因子の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロまたはインビボアッセイは、最適な投薬範囲を同定するのを助けるために任意に使用され得る。製剤において使用される正確な用量はまた、投与の経路、および骨粗鬆症の症状の重篤度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿され得る。
【０１１７】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１つ以上で充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。任意にこのような１つまたは複数の容器は、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知に関連し得る。この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売機関による許可を表す。パックまたはキットは、投与の形態、薬物投与の順序（例えば、別個に、連続してまたは同時に）などに関する情報のラベルを貼られ得る。パックまたはキットはまた、患者に治療を受けることを思い出させる手段を含み得る。パックまたはキットは、組み合わせ治療の単一単位投薬であり得るか、または複数の単位投薬であり得る。特に、因子は分離され、任意の組み合わせとともに混合され、単一バイアルまたは錠剤に存在し得る。ブリスターパックまたは他の投薬手段に集められた因子が好ましい。本発明の目的のため、単位投薬は、各因子の個々の薬力学に依存し、標準的な時間経過内にＦＤＡ 許可投薬で投与される投薬を意味することが意図される。
【０１１８】
治療の方法
本発明はまた、ＢＭＰ２治療因子を用いる骨粗鬆症に対する治療の（予防のおよび／または治療の）方法に関する。「ＢＭＰ２治療因子」は、本明細書中に記載されるように、ＢＭＰ２ポリペプチド活性および／またはＢＭＰ２発現を変更する（例えば、高めるまたは阻害する）因子（例えば、ＢＭＰ２アゴニストまたはアンタゴニスト）である。
【０１１９】
ＢＭＰ２治療因子は、種々の手段によって（例えば、さらなるＢＭＰ２ポリペプチドを提供することによって、またはＢＭＰ２遺伝子の転写もしくは翻訳をアップレギュレートすることによって；ＢＭＰ２ポリペプチドの翻訳後プロセシングを変更することによって；ＢＭＰ２スプライシング改変体の転写を変更することによって；またはＢＭＰ２ポリペプチド活性を妨げることによって（例えば、ＢＭＰ２ポリペプチドに結合することによって）、またはＢＭＰ２遺伝子の転写もしくは翻訳をダウンレギュレートすることによって）ＢＭＰ２ポリペプチド活性または遺伝子発現を変更し得る。代表的はＢＭＰ２治療因子としては、以下が挙げられる：
本明細書中に記載される核酸またはそのフラグメントもしくは誘導体、特に、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチドおよびこのような核酸（例えば、ＢＭＰ２ポリペプチドまたはその活性フラグメントもしくは誘導体、またはオリゴヌクレオチドをコードする核酸（例えば、配列番号１および表２に示されるような少なくとも１つの多型を任意に含む配列番号１）、あるいは配列番号２および表２に示されるような少なくとも１つの多型を任意に含む配列番号２をコードする核酸、またはそのフラグメントもしくは誘導体などの遺伝子、ｃＤＮＡ、および／またはｍＲＮＡ）を含有するベクター；
本明細書中に記載されるポリペプチド（例えば、表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列番号２、および／あるいはＢＭＰ２、またはそのフラグメントもしくは誘導体によってコードされる他のスプライシング改変体）；
他のポリペプチド（例えば、ＢＭＰ２レセプター）；ＢＭＰ２結合因子（ＢＭＰ２Ｒ２、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂが挙げられるが、これらに限定されない）；ペプチド模倣物；融合タンパク質またはそのプロドラッグ；抗体（例えば、本明細書中に記載されるような、変異ＢＭＰ２ポリペプチドに対する抗体、または非変異ＢＭＰ２ポリペプチドに対する抗体、またはＢＭＰ２によってコードされる特定のスプライシング改変体に対する抗体）；リボザイム；他の低分子；
ならびに、ＢＭＰ２遺伝子発現またはポリペプチド活性を変更する（例えば、高めるまたは阻害する）、あるいはＢＭＰ２スプライシング改変体の転写を調節する他の因子（例えば、スプライシング改変体が発現されることに影響を及ぼすか、または発現される各スプライシング改変体の量に影響を及ぼす因子）。
【０１２０】
ＢＭＰ２Ｒ２、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂは、Ｂｍｐ２タンパク質を結合する細胞表面レセプターである；ｂｍｐ２タンパク質はこれらのレセプターに結合し、次いで特定の細胞内応答を刺激する（Ｆｕｊｉｉ， Ｍ． ら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ， １０（１１）：３８０１−１３（１９９９） ；Ｍａｓｓａｇｕｅ， Ｊ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７：７５３−９１ （１９９８） ；Ｃｈｅｎ， Ｄ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４２（１）：２９５−３０５（１９９８） ；およびＫｉｒｓｃｈ， Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７（６）：４９２−４９６（２０００））。ＢＭＰ２の公知の直接インヒビター、ノッジン（ｎｏｇｇｉｎ）およびコーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ ）がまた存在する（少なくともノッジン；コーディンは他のｂｍｐ の公知のインヒビターであり、ｂｍｐ２を阻害するかどうかは明確に知られていない）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ， Ｌ．Ｂ． ら、Ｃｅｌｌ， ８６：５９９−６０６（１９９６）；Ａｓｐｅｎｂｅｒｇ， Ｐ． ら、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．， １６（３）：４９７−５００（２００１） ；およびＤａｌｅ．， Ｌ． ら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ， ２１（９）：７５１−６０（１９９９） ）。
【０１２１】
１つより多いＢＭＰ２治療因子は、所望の場合、同時に使用され得る。
【０１２２】
核酸であるＢＭＰ２治療因子は、骨粗鬆症の治療において使用される。本明細書中で使用される場合、用語「治療」とは、疾患に関連する症状を改善するだけではなく、疾患の開始を予防または遅延させ、疾患の症状の重篤度または頻度を減らすこともいう。治療は、個体においてＢＭＰ２ポリペプチドの活性を変更する（例えば、阻害するまたは高める）か、交換するかまたは補うために設計される。例えば、ＢＭＰ２治療因子は、ＢＭＰ２遺伝子もしくはＢＭＰ２の特異的スプライシング改変体の発現または有効性をアップレギュレートするかまたは増加するため、あるいは逆にＢＭＰ２遺伝子もしくはＢＭＰ２の特異的スプライシング改変体の発現または有効性をダウンレギュレートするかまたは減少するために投与され得る。ネイティブＢＭＰ２遺伝子もしくは特定のスプライシング改変体の発現または有効性のアップレギュレーションまたは増加は、欠損遺伝子もしくは別のスプライシング改変体の発現もしくは活性を妨げ得たかまたは補い得た；ネイティブＢＭＰ２遺伝子もしくは特定のスプライシング改変体の発現または有効性のダウンレギュレーションまたは減少は、欠損遺伝子もしくは特定のスプライシング改変体の発現もしくは活性を最小化し、それにより欠損遺伝子もしくは特定のスプライシング改変体の影響を最小化し得た。特に好ましい実施形態において、ＢＭＰ２治療因子は、健常な遺伝子または遺伝子産物（配列番号２）（すなわち、骨粗鬆症に関連しないＢＭＰ２遺伝子および遺伝子産物）である。
【０１２３】
１つまたは複数のＢＭＰ２治療因子は、治療的有効量（すなわち、例えば、疾患に関連する症状を改善する、疾患の開始を予防または遅延させる、および／あるいはまた疾患の症状の重篤度または頻度を減少することによって疾患を治療するのに十分な量）で投与される。特定の個体の障害または状態の治療における治療的に有効な量は、疾患の症状および重篤度に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロまたはインビボアッセイが、最適投薬範囲を同定するのを助けるために任意に使用され得る。製剤に使用される正確な用量はまた、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存し、医師の判断および各患者の状態に従って決定されるべきである。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿され得る。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明の核酸（例えば、配列番号１および表２に示されるような少なくとも１つの多型を任意に含む配列番号１などのＢＭＰ２ポリペプチドをコードする核酸、あるいは配列番号２および表２に示されるような少なくとも１つの多型を含む配列番号２をコードする核酸などのＢＭＰ２ポリペプチドまたはそのスプライシング改変体、誘導体もしくはフラグメントをコードする別の核酸）は、単独でまたは上記の医薬組成物中でのいずれかで使用され得る。例えば、それ自身またはベクター内に含まれるかのいずれかであるＢＭＰ２またはＢＭＰ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、細胞へ（インビトロまたはインビボのいずれかで）導入され得、その結果、細胞はネイティブＢＭＰ２ポリペプチドを産生する。必要な場合、遺伝子またはｃＤＮＡまたはこの遺伝子もしくはｃＤＮＡを含むベクターで形質転換されている細胞は、疾患に罹患している個体に導入（または再導入）され得る。従って、天然にネイティブＢＭＰ２発現および活性を欠くか、または変異ＢＭＰ２発現および活性を有するか、または疾患関連ＢＭＰ２スプライシング改変体の発現を有する細胞は、ＢＭＰ２ポリペプチドまたはＢＭＰ２ポリペプチドの活性フラグメント（またはＢＭＰ２ポリペプチドの異なる改変体）を発現するように操作され得る。好ましい実施形態において、ＢＭＰ２ポリペプチドまたはその活性フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸は、ウイルス性ベクターなどの発現ベクターに導入され得、このベクターは、動物の適切な細胞へ導入され得る。他の遺伝子移動系（ウイルス性および非ウイルス性移動系が挙げられる）が使用され得る。あるいは、リン酸カルシウム共沈、機械的技術（例えば、マイクロインジェクション）；リポソームを介する膜融合媒介移動；または直接ＤＮＡ 取り込みなどの非ウイルス性遺伝子移動方法がまた、使用され得る。
【０１２５】
あるいは、本発明の別の実施形態において、本発明の核酸；本発明の核酸に相補的な核酸；またはこのような核酸の一部（例えば、下記のオリゴヌクレオチド）は、「アンチセンス」治療に使用され得る。ここで、ｍＲＮＡおよび／またはＢＭＰ２のゲノムＤＮＡ に特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が投与されるかまたはインサイチュで生じる。ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ に特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、ＢＭＰ２ポリペプチドの発現を、例えば、翻訳および／または転写を阻害することで阻害する。アンチセンス核酸の結合は、従来の塩基対相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ 二本鎖に結合する場合、二重らせんの深いほうの溝における特異的相互作用を介し得る。
【０１２６】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上記のような発現プラスミドとして送達され得る。プラスミドが細胞において転写される場合、ＢＭＰ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ の一部に相補的なＲＮＡ を産生する。あるいは、アンチセンス構築物は、エキソビボで産生され、細胞へ導入されるオリゴヌクレオチドプローブであり得；次いで、ＢＭＰ２のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ とハイブリダイズすることによって発現を阻害する。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に耐性である修飾オリゴヌクレオチドであり、それにより、インビボでそれらを安定にする。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的な核酸分子は、ＤＮＡ のホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチルホスホネートアナログである（ 米国特許第５，１７６，９９６ 号； 同第５，２６４，５６４ 号； および同第５，２５６，７７５ 号をまた参照のこと） 。さらに、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチはまた、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６ ；およびＳｔｅｉｎ ら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８ に記載される。アンチセンスＤＮＡ に関して、翻訳開始部位（例えば、ＢＭＰ２配列の−１０ 〜＋１０ 領域）由来のオリゴデオキシヌクレオチドが好ましい。
【０１２７】
アンチセンス治療を実施するために、ＢＭＰ２をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ 、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ）が、設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ２ ｍＲＮＡ 転写物に結合し、翻訳を妨げる。絶対的な相補性は好ましいが、必要ではない。本明細書中でいう、ＲＮＡ の一部に「相補的な」配列は、配列がＲＮＡ とハイブリダイズし、安定な二本鎖を形成し得るのに十分な相補性を有することを示し；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡ のうちの一本鎖が試験され得るか、または３本鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、上記に詳細に記載されるように、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、ＲＮＡ との塩基ミスマッチが多ければ多いほど、安定な二本鎖（または場合により３本鎖）を含みさらに形成し得る。当業者は、標準的な手段の使用によって、許容できるミスマッチの程度を突き止め得る。
【０１２８】
アンチセンス治療に使用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ 、ＲＮＡ 、またはキメラ混合物またはその誘導体もしくは修飾バージョン、一本鎖もしくは二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（ 例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的するため） 、または細胞膜 （例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ら、（１９８７）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６４８−６５２； ＰＣＴ国際公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと） もしくは血管−脳関門 （例えば、ＰＣＴ 国際公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと） を横切る輸送を容易にする因子、またはハイブリダイゼーション誘発切断因子（ 例えば、Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６ を参照のこと） またはインターカレート因子（ 例えば、Ｚｏｎ，（１９８８），Ｐｌａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと） などの他の追加基を含み得る。終わりに、オリゴヌクレオチドは、別の分子（ 例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋因子、輸送因子、ハイブリダイゼーション誘発切断因子） と結合体化され得る。
【０１２９】
アンチセンス分子は、インビボでＢＭＰ２を発現する細胞に送達される。多くの方法が、アンチセンスＤＮＡ またはＲＮＡ を細胞へ送達するために使用され得る； 例えば、アンチセンス分子は、組織部位へ直接注射され得るか、または所望の細胞を標的するために設計された修飾アンチセンス分子（ 例えば、レセプターもしくは標的細胞表面に発現された抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されるアンチセンス） は、全身に投与され得る。あるいは、好ましい実施形態において、組換えＤＮＡ 構築物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩ またはｐｏｌ ＩＩ）の制御下に配置されて利用される。患者における標的細胞をトランスフェクトするためのこのような構築物の使用は、内因性ＢＭＰ２転写物を用いて相補的な塩基対を形成し、それによりＢＭＰ２ ｍＲＮＡ の翻訳を防止するのに十分な量の一本鎖ＲＮＡ の転写を生じる。例えば、ベクターは、インビボで導入され得、その結果、細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡ の転写を指向する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡ を産生するために転写され得る限り、エピソームのままであるかまたは染色体に組み込まれるようになり得る。このようなベクターは、当該分野で標準的であり、かつ上記される組換えＤＮＡ 技術方法によって構築され得る。例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ またはウイルス性ベクターは、組織部位へ直接導入され得る組換えＤＮＡ 構築物を調製するために使用され得る。あるいは、選択的に所望の組織に感染するウイルス性ベクターが、使用され得る。この場合、投与は、別の経路（例えば、全身性）によって達成され得る。
【０１３０】
内因性ＢＭＰ２発現はまた、標的化相同組換えを使用してＢＭＰ２またはそのプロモーターを不活化するかまたは「ノックアウトする」ことによって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４ ；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２ ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１を参照のこと）。例えば、内因性ＢＭＰ２（ＢＭＰ２のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡ に隣接する、変異、非機能性ＢＭＰ２（または完全に無関係なＤＮＡ 配列）が、選択可能マーカーおよび／または陰性選択可能マーカーを用いて、あるいは用いずに使用され、インビボでＢＭＰ２を発現する細胞をトランスフェクトし得る。標的化相同組換えを介するＤＮＡ 構築物の挿入は、ＢＭＰ２の不活化を生じる。組換えＤＮＡ 構築物は、上記されるような適切なベクターを使用して、インビボで必要とされる部位へ直接投与されるかまたは標的化され得る。あるいは、非変異ＢＭＰ２の発現は、類似の方法を使用して増加され得る：標的化相同組換えが使用されて、上記のように、非変異、機能性ＢＭＰ２（例えば、配列番号１を有する遺伝子）、またはその一部を含むＤＮＡ 構築物を細胞中の変異ＢＭＰ２の位置に挿入し得る。別の実施形態において、標的化相同組換えが使用されて、細胞中に存在するものとは異なるＢＭＰ２ポリペプチド改変体をコードする核酸を含むＤＮＡ 構築物を挿入し得る。
【０１３１】
あるいは、内因性ＢＭＰ２発現は、ＢＭＰ２の調節領域（ すなわち、ＢＭＰ２プロモーターおよび／またはエンハンサー） に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することによって減少されて、身体内の標的細胞においてＢＭＰ２の転写を妨げる三重らせん構造を形成し得る（一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ， Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ． ら、（１９９２） Ａｎｎ， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０：２７−３６； およびＭａｈｅｒ， Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を参照のこと）。同様に、本明細書中に記載されるアンチセンス構築物は、１つのＢＭＰ２タンパク質の正常な生物学的活性を拮抗することで、組織の操作（例えば、組織分化、インビボでのおよびエキソビボ用の組織培養の両方）に使用され得る。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、またはその転写物がＢＭＰ２ ｍＲＮＡ または遺伝子配列に関するアンチセンスであるプラスミドを用いるトランスフェクション）が使用されて、発育事象におけるＢＭＰ２の役割および成人組織におけるＢＭＰ２の正常な細胞性機能を研究し得る。このような技術は、細胞培養において利用され得るが、またトランスジェニック動物の作製にも使用され得る。
【０１３２】
本発明のさらに別の実施形態において、本明細書中に記載されるような他のＢＭＰ２治療因子はまた、骨粗鬆症の治療または予防に使用され得る。治療因子は、上記のようにまたはそれ自身によって組成物中に送達され得る。これらは、全身性で投与され得るか、または特定の組織に対して標的化され得る。治療因子は、種々の手段（化学合成；組換え産生；インビボ産生（ 例えば、Ｍｅａｄｅ ら、米国特許第４，８７３，３１６ 号などのトランスジェニック動物） が挙げられる）によって生成され得、例えば、本明細書中に記載されるような標準的な手段を用いて単離され得る。
【０１３３】
治療の上記方法のいずれかの組み合わせ（ 例えば、変異ＢＭＰ２ ｍＲＮＡ を標的化するアンチセンス治療と組み合わせた非変異ＢＭＰ２ポリペプチドの投与；ＢＭＰ２によってコードされる第二の改変体を標的化するアンチセンス治療と組み合わせたＢＭＰ２によってコードされる改変体の投与） がまた、使用され得る。
【０１３４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。本明細書中に引用される全ての刊行物の教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１３５】
例示　骨粗鬆症に関連するＢＭＰ２遺伝子の同定
表現型および家族構成
低衝撃骨折を有し、および／または骨粗鬆症の治療のためにビスホスホネートを摂取する患者を、自動的に罹患者として治療する。低い骨質量密度（ＢＭＤ） 測定値を有する人を、骨粗鬆症であるとみなし、骨折の危険性が実質的に増加することを示している。ＢＭＤ 測定値を、股関節部および脊柱の両方について取得する。ＢＭＤ 測定値を有する各人について、標準化ＢＭＤ スコアを計算する（平均０、母集団に対して標準偏差１）。標準化ＢＭＤ スコアを、性別、年齢、体重およびホルモン充填治療（ＨＲＴ ）に対して調節する。組み合わせ分析のために、２つの測定値をまとめる。アイスランドおよびアメリカ合衆国からの母集団ＢＭＤ データを標準化および調節のために使用する。例えば、正ＢＭＤ スコアを有する人は、彼／彼女の年齢、体重およびおそらくＨＲＴ について平均より上であり、負スコアを有する人は、平均より下である。おおよその正規性を想定すると、−１のスコアは、おおよそ１６より低いパーセンタイルなどに対応する。
【０１３６】
分析のため、本発明者らは、主たる人（ＢＭＤ 測定値を有し、および／または重篤に罹患し、本発明者らが遺伝子型を有する人）の現在のリストで開始する。次いで本発明者らは、遺伝子アロジー（ｇｅｎｅａｌｏｇｙ ）データベースを使用して、５つの減数分裂事象の限界距離を使用してこれらの主たる人を関連付ける家族クラスターを作成する。この手順は、総計１２１５人の主たる人について、１９０ 個の潜在的に有益なクラスターを作成した。
【０１３７】
関連データ
４つのゲノムワイドスキャン（ＧＷＳ ）を、異なる骨格部位での骨粗鬆症表現型；股関節部表現型、脊柱表現型、および複合表現型を使用して実施した。全てのＧＷＳ 分析は、Ｃｈｒ２０ 上の２０ｃＭ領域（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄマップに基づく１０ｃＭ〜３０ｃＭ）に位置した。
【０１３８】
全ての分析を、ｄｅＣＯＤＥで開発されたＡｌｌｅｇｒｏ 連鎖プログラムを使用して実施した（Ｇｕｄｂｊａｒｔｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５：１２−１３，２０００ 年５ 月）。対立遺伝子共有分析は、ＧＥＮＥＨＵＮＴＥＲ（Ｋｒｕｇｌｙａｋ ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４６：１３４７−１３６３，１９９６）のＳ ｐａｉｒｓ スコア付け関数を使用するが、家族に等しく重み付けをすることと罹患夫婦に等しく重み付けをすることとの間の折衷案であるスキームを使用して、家族に重み付けをした。対立遺伝子共有ＬＯＤ スコアを、ＫｏｎｇおよびＣｏｘ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６１：１１７９−１１８８（１９９７）に記載される「指数モデル」を使用して計算した。
【０１３９】
股関節部
使用した表現型は、股関節部（全股関節部）で年齢、性別、体重およびＨＲＴ 補正ＢＭＤ ＜−１ＳＤである。股関節部骨折の場合およびビスホスホネート使用者をまた、値が−１ＳＤより大きい場合でさえ、罹患しているとみなす。総計３４６ 人の罹患者を本分析に使用した。ＧＷＳ は、本研究者らの標準的なセットのマーカーを使用して、３．１ のＬＯＤ スコアを生じた。１０個の余分なマーカーを目的の領域（１１ｃＭ〜３９ｃＭ）に付加することで、３．３ のＬＯＤ スコアを生じた。
【０１４０】
脊柱
表現型は、腰椎脊柱（Ｌ２〜Ｌ４）で年齢、性別、体重およびＨＲＴ 補正ＢＭＤ ＜−１ＳＤである。椎骨圧迫骨折の場合およびビスホスホネート使用者をまた、値が−１ＳＤより大きい場合でさえ、罹患しているとみなす。総計４０２ 人の罹患者を本分析に使用した。ＧＷＳ は、本研究者らの標準的なセットのマーカーを使用して、股関節部分析と同じような位置で２．４ のＬＯＤ スコアを生じたが、余分なマーカーセットを使用することで、２．９ のＬＯＤ スコアを生じた。
【０１４１】
複合
使用した表現型は、補正ＢＭＤ ＜−１．５ＳＤの合計であった。椎骨圧迫骨折、股関節部骨折、他の骨粗鬆症関連低衝撃骨折（少なくとも２箇所の骨折）およびビスホスホネート使用者（利用可能であれば、治療開始前のＢＭＤ 測定値を使用する）を、全て罹患しているとみなす。総計５２２ 人の罹患者を本分析に使用した。ＧＷＳ は、標準的なマーカーセットを使用して、２．５ のＬＯＤ スコアを生じたが、この領域において余分なマーカーを使用することで、３．９ のＬＯＤ スコアを生じた。
【０１４２】
複合重症
使用した表現型は、年齢、性別、体重およびＨＲＴ 補正ＢＭＤ ＜−２．３ ＳＤ の合計であった。椎骨圧迫骨折、股関節部骨折、他の骨粗鬆症関連低衝撃骨折（少なくとも２箇所の骨折）およびビスホスホネート使用者は罹患していた。本分析における罹患者数は２９０ 人であった。ＧＷＳ は、標準的なセットを使用して、３．８ のＬＯＤ スコアを生じたが、１０個の余分なマーカーを添加に使用することで、４．７ のＬＯＤ スコアを生じた。
【０１４３】
コルチコステロイド使用者および早期閉経の女性を、全ての分析において罹患者として除外した。
【０１４４】
ＢＭＰ２遺伝子
ＢＭＰ２遺伝子は、この領域に位置する。マーカーＤ２０Ｓ８４６ （最も高いＬＯＤ スコアを与える）とこの遺伝子の３’末端との間は、たった５ｋｂ である。この遺伝子を配列決定し、エキソン／ イントロン構造、プロモーター領域および転写開始部位によって特徴付けている。この情報は、公に利用可能である。
【０１４５】
多数のヌクレオチド変化が、アイスランド母集団において観察される。これらの変化は、本発明者の知る限りでは、以前に記載されていない。表２を参照のこと。
【０１４６】
ＢＭＰ２は、レセプターＢＭＰＲ−ＩＡ またはＢＭＰＲ−ＩＢ 、およびＢＭＰＲ−ＩＩ に結合し、レセプター複合体ヘテロダイマーの形成およびＢＭＰＲ−ＩＡ またはＢＭＰＲ−ＩＢ レセプターのリン酸化をもたらす。一旦活性化されると、これらのレセプターは、その後ＳＭＡＤ１ 、ＳＭＡＤ５ またはＳＭＡＤ８ をリン酸化し、次いでＳＭＡＤ４ とともに複合体を形成し、特異的遺伝子の転写に影響を及ぼす核へ転移する（Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：７５３−７９１（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｄ． ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４２（１） ：２９５−３０５（１９９８） ）。ＳＭＡＤ６ および７ は、ＢＭＰ２レセプターによるＳＭＡＤ１ 、ＳＭＡＤ５ またはＳＭＡＤ８ の活性化を妨げることによって、シグナルをブロックし、骨芽細胞分化を阻害することが示されている（Ｍｉｙａｚｏｎｏ，Ｋ．，Ｂｏｎｅ，２５（１）：９１−９３（１９９９）；Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１０（１１）：３８０１−３８１３（１９９９））。ＢＭＰ２は、ＢＭＰＲ−ＩＢ を介して、Ｃｂｆａｌ 、アルカリホスファターゼおよびＩ型コラーゲン（ 骨芽細胞特異的タンパク質） 発現を刺激する（Ｃｈｅｎ，Ｄ． ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４２（１）：２９５−３０５（１９９８） ）。Ｃｂｆａｌ は、オステオプロテゲリン （ＯＰＧ）の発現を調節する。オステオプロテゲリンは、骨芽細胞分化および骨吸収の強力なインヒビターとして機能する骨芽細胞分泌糖タンパク質である（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋｋａｒａｓｕ，Ｋ． ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２０００） ）。Ｃｂｆａｌ は、骨芽細胞分化および骨形成を制御する。ヒト骨芽細胞の細胞性老化の間、Ｃｂｆａｌ ｍＲＮＡの有意な減少（５０％まで） が存在する（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｍ．，ら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５５（４）：Ｂ１９４−２００ （２０００））。
【０１４７】
結果および考察
関連研究の結果として、この分析は、この位置が複数の骨粗鬆症表現型に関連することを示す。さらに、ヒトＢＭＰ２遺伝子内の変異は、これらの家族における表現型を解明するようである。骨粗鬆症の散発的な発生、すなわち、家族性の関係のない発生をまた、本明細書中に含まれる情報を使用して決定し得る。
【０１４８】
骨粗鬆症は、以下のようなＢＭＰ２遺伝子の欠損によって引き起こされ得た：ＢＭＰ２遺伝子における変異（転写、スプライス、タンパク質改変体など）は、ＢＭＰＲ−ＩＢ を介するＣｂｆａｌ およびその後のシグナル伝達経路への作用の減少をもたらし得、より少ない活性骨芽細胞による減少した骨形成ならびにより少ないＯＰＧ およびより多い破骨細胞による多くの骨再吸収をもたらす。これが、骨減少をもたらす。Ｃｂｆａｌ レベルの有意な減少は、骨芽細胞の老化に関連するので、この影響は、高齢者にとってより重要になり得た。
【０１４９】
本発明は、その好ましい実施形態を参考にして詳しく示され、記載されているが、形態および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明においてなされ得ることは当業者によって理解される。
【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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