(57)【要約】本開示は、幹細胞由来の同種移植片と組織再生のために治療を受ける患者との間のＨＬＡミスマッチを克服するための系を提供する。幹細胞に由来する寛容化細胞の集団を投与することにより、患者における特異的な免疫寛容状態を誘導する。これにより患者は、同じ源に由来する分化細胞から構成される同種移植片を受容することが可能になる。本発明は、これにより、単一系統の幹細胞を、組織種にかかわらず、あらゆる患者における組織再生用の普遍的な供与源として役立てることが可能になることから、重要である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的用途のための細胞を調製するための方法であって、
ａ）ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を第１の細胞集団に分化させること；および
ｂ）ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を第２の細胞集団に分化させることを含み、
第１の細胞集団が第２の細胞集団とＭＨＣ適合性があり、個体に対する第１の集団の投与によって個体が第２の細胞集団に対して免疫寛容化される方法。
【請求項２】
個体における細胞機能を再構成する方法であって、
ａ）個体に対して請求項１記載の第１の細胞集団を投与し、それによって個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化すること；および
ｂ）個体に対して請求項１記載の第２の細胞集団を投与し、それによって細胞機能を再構成すること
を含む方法。
【請求項３】
第１の細胞集団および第２の細胞集団が同じｈＰＳ細胞またはその子孫から分化した、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
第１の細胞集団が中胚葉細胞を主として含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１の細胞集団が、造血前駆細胞、血液白血球、白血球前駆細胞、マクロファージ様細胞、樹状細胞または間葉幹細胞の特徴を有する、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１の細胞集団の表現型が以下のマーカーの１つまたは複数を発現する、前記の請求項のいずれかに記載の方法：ＣＤ３４、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＥＣ−２０５、Ｓ１００またはＣＴＬＡ−４。
【請求項７】
それが投与された個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する第１の細胞集団を調製するための方法であって、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を混合型細胞集団に分化させること、およびＣＤ３４、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＥＣ−２０５、Ｓ１００またはＣＴＬＡ−４を発現する混合型集団細胞を集積化することを含む方法。
【請求項８】
第２の細胞集団が、以下の細胞型またはその系譜に拘束された前駆細胞の一つを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法：肝細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、心筋細胞、軟骨細胞、骨原性細胞、膵島細胞、内皮細胞、骨格筋細胞または皮膚細胞。
【請求項９】
以下のものを別の容器に含む、薬学的化合物の組み合わせ：
ａ）それが投与された対象を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する表現型へとヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞から分化した第１の細胞集団；および
ｂ）第１の細胞集団とＭＨＣ適合性のある第２の細胞集団。
【請求項１０】
第１の細胞集団および第２の細胞集団が同じｈＰＳ細胞系から分化した、請求項９記載の薬学的化合物。
【請求項１１】
第１の細胞集団が中胚葉細胞を主として含む、請求項９〜１０記載の薬学的化合物。
【請求項１２】
第１の細胞集団が、造血前駆細胞、血液白血球、白血球前駆細胞、マクロファージ様細胞、樹状細胞または間葉幹細胞の特徴を有する、請求項９〜１１記載の薬学的化合物。
【請求項１３】
第１の細胞集団の表現型が以下のマーカーの１つまたは複数を発現する、請求項９〜１２記載の薬学的化合物：ＣＤ３４、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＥＣ−２０５、Ｓ１００またはＣＴＬＡ−４。
【請求項１４】
第２の細胞集団が、以下の細胞型またはその系譜に拘束された前駆細胞の一つを含む、請求項９〜１３記載の薬学的化合物：肝細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、心筋細胞、軟骨細胞、骨原性細胞、膵島細胞、内皮細胞、骨格筋細胞または皮膚細胞。
【請求項１５】
それが投与された個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する表現型へとｈＰＳ細胞から分化した第１の細胞集団の、手術または治療法によるヒトまたは動物体の治療のための医薬品製剤における使用。
【請求項１６】
それが投与された個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する表現型へとｈＰＳ細胞から分化した第１の細胞集団の、ヒトまたは動物体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化するための医薬品製剤における使用。
【請求項１７】
第２の集団が個体における細胞機能を再構成する表現型へとｈＰＳ細胞から分化しており、第１の集団が個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する、同種性である第１の細胞集団および第２の細胞集団のそれぞれの、ヒトまたは動物体に対する同時または逐次的な投与のための医薬品製剤のための使用。
【請求項１８】
第１の細胞集団が中胚葉細胞を主として含む、請求項１５〜１７記載の使用。
【請求項１９】
第１の細胞集団が、造血前駆細胞、血液白血球、白血球前駆細胞、マクロファージ様細胞、樹状細胞または間葉幹細胞の特徴を有する、請求項１５〜１８記載の使用。
【請求項２０】
第１の細胞集団が以下のマーカーの１つまたは複数を発現する、請求項１５〜１９記載の使用：ＣＤ３４、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＥＣ−２０５、Ｓ１００またはＣＴＬＡ−４。
【請求項２１】
第２の細胞集団が、以下の細胞型またはその系譜に拘束された前駆細胞の一つを含む、請求項１５〜２０記載の使用：肝細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、心筋細胞、軟骨細胞、骨原性細胞、膵島細胞、内皮細胞、骨格筋細胞または皮膚細胞。
【請求項２２】
第１の細胞集団が、循環中への投与用に製剤化される、請求項１５〜２１のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術の分野
本発明は一般に、胚細胞の細胞生物学および移植免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、患者において、彼らが多能性幹細胞から作製された同種移植片を受容するように、特異的な免疫寛容を生じさせるための技術を記載する。
【０００２】
関連出願の参照
本出願は、２０００年１１月２２日に提出された米国仮特許出願第６０／２５２，６８８号の優先権を主張するものである。米国における遂行を目的として、その優先出願は全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
背景
前駆細胞は、医学研究における最大の関心の的となっている。体内の多くの組織は、老化した細胞または損傷もしくは疾患によって障害を来した細胞の代わりとなりうる前駆細胞の補充用貯蔵庫を持っている。
【０００４】
米国特許第５，７５０，３９７号（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｓｙｓｔｅｍｉｘ）は、Ｔｈｙ−１＋、ＣＤ３４＋であり、リンパ系、赤血球系および骨髄単球性系譜に分化しうるヒト造血幹細胞の単離および増殖を報告している。米国特許第５，７３６，３９６号（Ｂｒｕｄｅｒら）は、適切な生物活性因子を用いた、単離したヒト間葉幹細胞の系譜指向的な分化のための方法を報告している。その後、派生した細胞を間葉組織の再生または修復のために宿主に導入することができる。
【０００５】
米国特許第５，７１６，４１１号（Ｏｒｇｉｌｌら）は、上皮自己移植片を用いて、熱傷または創傷の部位で皮膚を再生させることを提唱している。米国特許第５，７６６，９４８号（Ｆ． Ｇａｇｅ）は、動物脳組織から神経芽細胞を生成させるための方法を報告している。米国特許第５，６７２，４９９号（Ａｎｄｅｒｓｏｎら）は、胚組織からの神経冠幹細胞の入手を報告している。米国特許第５，８５１，８３２号（Ｗｅｉｓｓら、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、８〜１２週齡のヒト胎児からの神経幹細胞と推定される細胞の単離を報告している。米国特許第５，９６８，８２９号（Ｍ． Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）は、成人の初代中枢神経系組織由来のヒト神経幹細胞を報告している。
【０００６】
米国特許第５，０８２，６７０号（Ｆ． Ｇａｇｅ）は、中枢神経系の欠陥、疾患または損傷の治療を目的として遺伝子改変細胞を移植するための方法を報告している。アウエルバッハ（Ａｕｅｒｂａｃｈ）ら（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２：１６９６、２０００）は、動物の脳に移植した多能性ＣＮＳ細胞が電気活動性のある機能的に連結したニューロンを形成することを報告している。ブルストル（Ｂｒｕｓｔｌｅ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７５４、１９９９）は、胚性幹細胞由来の前駆細胞が脳内および脊髄内で宿主ニューロンと相互作用し、軸索を効率的に有髄化することを報告している。
【０００７】
ほとんどあらゆる種類の細胞に分化する能力があると考えられている胚性幹細胞の開発により、大きな関心が生じている。最近まで、胚性幹細胞が単離されていた哺乳動物はマウスのみであった。トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）らは最近、下等霊長類から多能性幹細胞を単離して増殖させ（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５；Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５：２５４、１９９６）、その後にヒトからも同じことを行った（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８）。ギアハート（Ｇｅａｒｈａｒｔ）らは、胎児性腺組織からヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞系を導き出した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８；および米国特許第６，０９０，６２２号）。国際特許公報・国際公開公報第９９／２０７４１号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）は、霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための方法および材料に言及している。
【０００８】
ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞はいずれも長い間探し求められてきたヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞の特徴を備えている。すなわち、それらはインビトロで分化せずに増殖を続けることができ、正常な核型を保つほか、分化してさまざまな種類の細胞を生成する能力がある。クローン由来のヒト胚性幹細胞系は、培養下で多分化能および増殖能を長期間にわたって維持する（Ａｍｉｔら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２２７：２７１、２０００）。
【０００９】
幹細胞をヒトの治療法に用い、遺伝的異常、外傷または疾病状態によって損なわれたほとんどあらゆる組織の再生のための貯蔵所として役立てることはかなり有望である。
【００１０】
発明の概要
本開示は、単一系統の幹細胞を、細胞種にかかわらず、あらゆる患者における組織再生用の普遍的な供与源として役立てることを可能にする系を提供する。幹細胞の供給源と患者との間のＨＬＡミスマッチは、幹細胞に由来する寛容化細胞を患者に投与することによって克服される。これにより、患者が、同じ源に由来する分化細胞を用いて組織再生を行うことが可能になる。
【００１１】
本発明の１つの面は、治療的用途のための細胞を調製するための方法であって、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を第１および第２の細胞集団に分化させることを含み、個体に対する第１の集団の投与によってそれらが第２の細胞集団に対して免疫寛容化される方法である。
【００１２】
第１の細胞集団は第２の集団とＭＨＣ適合性があり、このことはこれらの細胞がＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ遺伝子座で少なくとも１つのハプロタイプを共有していることを意味する。１つの好ましい態様において、２つの集団内の細胞は自家性であり、これは両方の集団を同じｈＰＳ細胞系から分化させることによって達成しうる。
【００１３】
第１の細胞集団内の個々の種類の寛容化細胞は、以下のセクションで説明する特定の表現型的または機能的な特徴を有しうる。第２の細胞集団は、治療を受ける患者による組織再生のために必要な任意の種類の細胞を含む。
【００１４】
本発明のもう１つの面は、それが投与された個体を、すでに述べたような第２の細胞集団に対して免疫寛容化する、第１の細胞集団を調製するための方法である。
【００１５】
本発明のもう１つの面は、すでに述べたような第１のおよび第２の細胞集団を投与することにより、個体における細胞機能を再構成する方法である。
【００１６】
本発明のもう１つの面は、薬学的組成物の調製のために、すでに述べたような第１の細胞集団および第２の細胞集団を用いることである。これには、キット形態として供給される、または別個に配布される、薬学的化合物の組み合わせが含まれる。この組み合わせの構成要素は、すでに述べたような、それが投与された対象を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する表現型へとヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞から分化した第１の細胞集団；および、第１の細胞集団とＭＨＣ適合性のある第２の細胞集団である。
【００１７】
本発明のその他の態様は以下の説明から明らかになると考えられる。
【００１８】
発明の詳細な説明
幹細胞技術は、組織再生のための幹細胞およびその子孫のバンクを作成する方向に向けて開発されている。本発明は、解決すべき重要な問題が、移植片の細胞と患者との間の組織適合性ミスマッチであることを認識している。幹細胞およびそれから分化した細胞はＭＨＣ抗原を発現すると考えられている。このような細胞の同種移植片は、免疫抑制剤がなければ、超急性的、急性的および慢性的な組織拒絶反応にさらされると予想される。
【００１９】
本発明は、細胞特異的な免疫寛容状態を誘導することにより、幹細胞同種移植片の適合性の問題を解決する。同種移植片に用いる細胞種に対する特異的な免疫学的不応答性を誘導する寛容化細胞を注入することにより、患者に準備を施す。
【００２０】
寛容誘導には、ＭＨＣクラスＩＩ提示細胞または寛容化細胞集団の他の構成要素との相互作用によるアロ特異的な宿主リンパ球の排除またはアネルギーを伴う、宿主の免疫系の順応が含まれると考えられている。宿主が、宿主において細胞キメラとして検出される、寛容化集団からの新たな免疫性構成要素（アロ特異的サプレッサー細胞またはベト細胞など）に順応してもよい。本明細書ではこれらの機序を、読者による本発明の理解を高める目的で提示している。これらの機序が理解されることも、本発明を実行に移すために証明されることも必要ではない。
【００２１】
本発明は、同一の系が寛容化細胞集団および組織再生に用いられる他の終末分化細胞（神経前駆細胞または肝細胞前駆細胞など）の両方に分化しうるという、幹細胞に特有の特性を利用する。幹細胞は高い複製能を持つため、それを治療に必要な量へと増殖させて分化させることが可能である。寛容化細胞の投与は、患者において、クラスＩおよびクラスＩＩアロ抗原に対してのみならず、移植片に無数に存在すると思われる副組織適合性抗原およびアロタイプの差異に対しても免疫学的アネルギーを誘導する。
【００２２】
本開示に述べる戦略は、再生医学における幹細胞の使用に対して極めて大きな可能性を提供する。幹細胞と治療を要する患者の細胞との間の組織適合性ミスマッチに直面したことにより、臨床医はこれまで、各々の患者に適合するアロタイプを有する細胞を保有するために多能性幹細胞の膨大なバンクを維持する、または移植片が受容されるまで過酷な免疫抑制療法を患者に行うといった困難な選択肢に直面してきた。
【００２３】
本発明により、単一系統の幹細胞を用いてあらゆる患者を寛容化し、その後に、患者の免疫系によって受容されると考えられる様式で組織を再生させることが可能である。
【００２４】
定義
原型となる「霊長類多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）とは、受精後の任意の時点にある前胚、胚または胎児組織に由来する多能性細胞のことであり、適切な条件下で、８〜１２週齡ＳＣＩＤマウスに奇形腫を形成させる能力といった当技術分野で標準的に認められた検査に従って、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてからの派生物である複数の異なる細胞種を子孫として生成しうるという特徴を有する。
【００２５】
ｐＰＳ細胞の定義には、トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８）によって記載されたヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；他の霊長類に由来する胚性幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５）、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４、１９９６）およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８）などを例とする、さまざまな種類の胚細胞が含まれる。他の種類の多能性細胞もこの用語に含まれる。胚の３つの層のすべてに由来する子孫を生じうる霊長類由来のあらゆる細胞が、胚組織、胎児組織または他の源のいずれに由来したかに関係なく含まれる。初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞のヒトでの相当物が含まれる（国際公開公報第９９／５３０２１号および国際公開公報第０１／５１６１１号、Ｂｒｅｓａｇｅｎ Ｌｔｄ．）。胚性癌（ＥＣ）細胞（Ｐｅｒａら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４０：３３４、１９８７）も含まれるが、核型が正常で、悪性由来でない細胞を用いることが一般に好ましい。
【００２６】
ｐＰＳ細胞の培養物は、集団内の幹細胞およびその派生物のかなりの割合が、胚または成体由来の分化細胞とは明らかに区別される未分化細胞の形態的特徴を示す場合、「本質的に未分化」であると記載される。未分化ｐＰＳ細胞は当業者によって容易に認識され、通常は二次元顕微鏡像で核／細胞質比が高く核小体が顕著な細胞のコロニーとして認められる。集団内の未分化細胞のコロニーはしばしば分化した隣接細胞によって取り囲まれることがあることは認識されている。しかし、未分化コロニーは集団を適切な条件下で培養または継代すると存続し、個々の未分化細胞は細胞集団のかなりの割合（＞２０％、好ましくは＞６０％）を占める。
【００２７】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第２の種類の細胞が増殖しうる環境を提供するために、別の種類の細胞と共培養されるある種類の細胞を説明するために用いる用語である。例えば、ある種のｐＰＳ細胞は、本開示で後に説明するように、初代マウス胚線維芽細胞、不死化マウス胚線維芽細胞、またはｈＥＳ細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞による補助が可能である。ｐＰＳ細胞集団は、ｐＰＳの増殖を補助する新たなフィーダー細胞を加えない分割を少なくとも１回経た上で細胞が増殖している場合に、フィーダー細胞を「本質的に含まない」という。フィーダー細胞を本質的に含まない培養物はフィーダー細胞を約５％未満しか含まない。培養物または細胞集団が「フィーダーを含まない（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）」と本開示で言及する場合は常に、組成物が前記の定義によるフィーダー細胞を本質的に含まず、明示的に必要とするそれ以外の制約のみを受けることを意味する。
【００２８】
「胚様体」という用語は、当技術分野で「凝集体」と同義の用語である。この用語は、ｐＰＳ細胞を単層培養下で過成長させた場合、または懸濁培養下で維持した場合に出現する分化細胞および未分化細胞の凝集体のことを指す。胚様体は、形態的基準によって識別しうる、典型的には複数の胚葉に由来する、種々の細胞種の混合物である。
【００２９】
「分化能が決定された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆細胞」「系譜が限定された前駆細胞」および「発生的に限定された系譜細胞」という用語はいずれも、増殖能があって、３つの胚葉すべての子孫を生成しうる胚由来の多能性幹細胞よりは一般に限定された範囲の複数の異なる細胞種に分化しうる細胞のことを指す。分化能が決定された前駆細胞の非制限的な例には、以下に述べる造血系譜細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に関して多能性である肝細胞前駆細胞；ならびに間葉肝細胞が含まれる。別の例には、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトに分化するグリア細胞前駆細胞を生成しうる神経前駆細胞、ならびにニューロンに分化するニューロン限定細胞がある。
【００３０】
本明細書の目的に関して、「幹細胞」という用語は、いずれも以上に定義した、多能性幹細胞または分化能が決定された前駆細胞のいずれを指すこともできる。最低限、幹細胞は増殖して複数の表現型の細胞系を生成する能力を有し、さらに、同じ培養物の一部として、または異なる条件下で培養した場合に、自己再生を行うこともできる。幹細胞はテロメラーゼという酵素に関して陽性のものとして同定することができる。
【００３１】
「造血細胞」および「造血系譜細胞」という用語は、赤血球、リンパ球、単球、樹状細胞、好酸球、好塩基球および多形核白血球を含む複数の種類の血液細胞を指すために、本開示において互換的に用いられる。これに含まれるものには、骨髄内の赤芽球、リンパ節または脾臓内に区画化されたリンパ球、皮膚または肝臓内に局在するマクロファージといった、これらの細胞の循環性でない機能的相当物がある。この系譜の特性を有する子孫に分化するように決定された前駆細胞もこれに含まれる。この用語は例示の目的で以下の説明に用いられる。
【００３２】
特異的な免疫学的「寛容」とは、特定の外来物質に対して個体が起こす免疫応答が、類似した種類の他の物質に対するものよりも弱い状態のことである。本発明の文脈では、組織再生用に用いる同種移植片に対する免疫学的寛容が特に望まれる。患者が本発明に従って特異的に寛容化されると、同種移植片に対する免疫応答が、それを行わない場合に予想されるものよりも弱くなる。寛容は、以下に述べるように、特定組織に対して特異的な抗体、ＣＴＬまたはヘルパー／インデューサーＴの反応性を測定して、治療前の反応性と比較するか、またはアロタイプの異なる同様の組織と比較することによって判定しうる。
【００３３】
明示的に述べる場合を除き、請求する本発明を特定の表現型の寛容化細胞に限定するつもりはない。「寛容化細胞」は、上記の通り、（対象に投与されると）特異的な免疫学的寛容を誘導しうる細胞のことを単に意味する。多能性幹細胞から分化した、本発明に用いるのに適した寛容化特性を有する細胞集団は数多くあり、そのうち一部は間葉細胞または造血系譜細胞の形態的特徴またはマーカーを示すと考えられる。
【００３４】
明示的に述べる場合を除き、請求する本発明を免疫寛容の特定の機序に限定するつもりはない。機序には、特定の特異性を有するＢ細胞もしくはＴ細胞の枯渇、Ｂ細胞もしくはＴ細胞のアネルギー、またはサプレッサーＴ細胞もしくはベト細胞による不応答性もしくは能動的抑制が非制限的に含まれうる。関心の対象となるのは寛容の結果として生じる効果であり、これは本開示の別の箇所で述べるようにして検証することができる。
【００３５】
一般的な技法
本発明の実施に有用な一般的な技法のさらに詳細な説明に関して、実施者は細胞生物学、組織培養学および発生学の標準的な教科書および総説を参照することができる。これに含まれるものには、「奇形腫および胚性幹細胞：実践的アプローチ（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｅ．Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ． １９８７）；「マウスの発生における技法の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」（Ｐ．Ｍ． Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；「胚性幹細胞のインビトロ分化（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ）」（ＭＶ． Ｗｉｌｅｓ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２５：９００， １９９３）；「胚性幹細胞の特性および用途：ヒト生物学および遺伝子治療への応用の可能性（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（Ｐ．Ｄ． Ｒａｔｈｊｅｎら、Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． １０：３１， １９９８）が含まれる。幹細胞の分化については、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）（Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７５：１７３、１９９７）；およびペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）（Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． １０：３１、１９９８）に総説がなされている。
【００３６】
造血細胞系および免疫寛容に関する話題については、以下の刊行物が入手可能である：「健康および疾患における造血系系譜（Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ」（Ｎ．Ｇ． Ｔｅｓｔａら編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９９）；「免疫寛容（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」（Ｊ． Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅｓ ｅｔ Ｍｅｄｉｃａｌｅｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９６）；および「免疫学的寛容（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」（Ｇ． Ｂｏｃｋら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ Ｌｔｄ、１９９８）。
【００３７】
多能性幹細胞の源
本発明は任意の脊椎動物種の幹細胞を用いて実施することができる。これに含まれるものには、ヒト；ならびに非ヒト霊長類、飼いならした動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、家畜および他の非ヒト哺乳動物に由来する幹細胞がある。本発明における使用に適した幹細胞の中には、胚盤胞または妊娠期間中の任意の時点で採取した胎児組織もしくは胚組織などの妊娠後に形成される組織に由来する霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞がある。その非制限的な例には、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の初代培養物または樹立系がある。
【００３８】
胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類種に属する生物の胚盤胞から単離することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）ら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ ｆｆ．、１９９８）およびロイビノフ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：３９９、２０００に記載された技法を用いてヒト胚盤胞細胞から調製可能である。
【００３９】
簡潔に述べると、ヒト胚盤胞は、ヒトのインビボ着床前胚から得られる。または、体外受精（ＩＶＦ）胚を用いることもでき、または一細胞期のヒト胚を胚盤胞期まで発生させることもできる（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６、１９８９）。胚を胚盤胞期になるまでＧ１．２およびＧ２．２培地中で培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ． Ｓｔｅｒｉｌ． ６９：８４、１９９８）。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露させることによって胚盤胞から透明帯を除去する。１：５０に希釈したウサギ抗ヒト脾細胞抗血清に対して胚盤胞を３０分間曝露させた後にＤＭＥＭ中で５分ずつ３回洗浄し、１：５に希釈したモルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）に対して３分間曝露させる免疫手術法によって内部細胞塊を単離する（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２：５０９９、１９７５）。ＤＭＥＭ中でさらに２回洗浄した後、溶解した栄養外胚葉細胞を穏やかなピペッティングによって無傷の内部細胞塊（ＩＣＭ）から除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層の上にプレーティングする。
【００４０】
９〜１５日後に、内部細胞塊由来の増殖物を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない１ｍＭ ＥＤＴＡ入りのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する曝露、ディスパーゼもしくはトリプシンに対する曝露、またはマイクロピペットによる機械的解離によって集塊に分離した後、新たな培地を入れたｍＥＦ上に再びプレーティングする。未分化形態を有する成長中のコロニーをマイクロピペットによって個別に選別し、機械的に解離して集塊とした上で再びプレーティングする。ＥＳ様形態は、核−細胞質比が高く、核小体が顕著な稠密なコロニーであることを特徴とする。続いて、この結果得られたＥＳ細胞を、１〜２週間毎に短時間のトリプシン処理、ダルベッコＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に対する曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）に対する曝露により、または個々のコロニーをマイクロピペットで選別することによってルーチン的に分割する。約５０〜１００個の細胞からなる集塊が最適である。
【００４１】
胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最終月経から約８〜１１週後に採取したヒト胎児中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適した調製法は、シャムブロット（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。
【００４２】
簡潔に述べると、生殖隆起を等張緩衝液ですすいだ後に、０．１ｍＬ ０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム溶液（ＢＲＬ）中に入れ、切り刻んで１ｍｍ３未満の塊にする。続いて１００μＬピペットチップによるピペッティングを行って組織をさらに細胞へと解離させる。これを３７℃で約５分間インキュベートし、続いて約３．５ｍＬのＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３；１５％ＥＳ用ウシ胎仔血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００Ｕ／ｍＬヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；１〜２ｎｇ／ｍｌヒト組換えｂＦＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）；および１０μＭフォルスコリン（１０％ＤＭＳＯ中）である。代替的な手法では、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／ＤＮアーゼを用いてＥＧ細胞を単離する。腸間膜を伴う性腺原基または生殖隆起を胎児材料から切り出し、生殖隆起をＰＢＳですすいだ後に０．１ｍｌ ＨＣＤ消化溶液（０．０１％Ｖ型ヒアルロニダーゼ、０．００２％ＤＮアーゼＩ、０．１％ＩＶ型コラゲナーゼ、すべてＳｉｇｍａ社、ＥＧ増殖培地中にて調製）に入れる。組織を細かく刻み、３７℃で１時間または一晩インキュベートした後に１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中に再懸濁し、フィーダー層に対してプレーティングする。
【００４３】
前もって９６穴組織培養プレートを、ＬＩＦ、ｂＦＧＦおよびフォルスコリンを含まない改変ＥＧ増殖培地中でフィーダー細胞（例えば、ＳＴＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５０３）を３日間培養してサブコンフルエント層を調製しておき、５０００ｒａｄのγ線照射を行う。ウェルのそれぞれに約０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を加える。第１の継代はＥＧ増殖培地中に７〜１０日間おいた後に行い、各ウェルを、照射したＳＴＯマウス線維芽細胞を前もって調製しておいた２４穴培養皿の１ウェルに移す。培地を毎日交換しながら細胞を培養することにより、一般には１〜４回の継代を経て７〜３０日間で、ＥＧ細胞に一致する細胞形態が観察されるようになる。
【００４４】
未分化状態でのｐＰＳ細胞の増殖
ｐＰＳ細胞は、分化を促すことなく増殖を促進する培養条件を用いて、培養下で連続的に増やすことができる。模範例となる血清含有ＥＳ培地は、８０％ＤＭＥＭ（Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏなど）、２０％規定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替物（国際公開公報第９８／３０６７９号）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールから構成される。使用の直前にヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｍＬとなるように添加する（国際公開公報第９９／２０７４１号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）。
【００４５】
伝統的に、ＥＳ細胞はフィーダー細胞、一般には胚組織または胎児組織に由来する線維芽細胞の層の上で培養する。胚を妊娠１３日のＣＦ１マウスから採取し、２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡを含む新たな１０ｃｍ培養皿に入れて細かく切り刻み、３７℃で５分間インキュベートする。１０％ＦＢＳを添加し、残渣を沈降させた上で、細胞を９０％ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン中で増殖させる。フィーダー細胞層を調製するためには、細胞に対して、増殖は阻害するがＥＳ細胞を補助する重要な因子の合成は許容する程度の線量を照射する（４０００ｒａｄ前後のγ線照射）。培養プレートに０．５％ゼラチンを一晩かけてコーティングし、１ウェル当たり３７５，０００個の照射ｍＥＦをプレーティングして、プレーティングから５時間〜４日後に用いる。ｐＰＳ細胞を播く直前に培地を新たなｈＥＳ培地に交換する。
【００４６】
ジェロン（Ｇｅｒｏｎ）社の研究者は、フィーダー細胞がなくてもｐＰＳ細胞を未分化状態で代替的に維持しうることを発見した。フィーダー細胞を含まない培養のための環境は、適した培養基質、特にマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）またはラミニンなどの細胞外マトリックスを含む。ｐＰＳ細胞を、１５，０００個・ｃｍ−２（９０，０００ｃｍ−２〜１７０，０００ｃｍ−２が最適である）を上回る密度でプレーティングする。一般的には、細胞が完全に分散する前に酵素消化を停止する（例えば、ＩＶ型コラゲナーゼで約５分間）。続いて、約１０〜２０００個の細胞からなる凝集塊を、それ以上分散させずに基質上に直接プレーティングする。
【００４７】
フィーダーを含まない培養物は、一般的には照射した初代マウス胚線維芽細胞、テロメラーゼ導入処理を行った（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ）マウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞由来の線維芽細胞様細胞を培養することによって馴化した栄養培地によって補助される。培地は、２０％血清代替物および４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＫＯ ＤＭＥＭなどの無血清培地中にフィーダーを約５〜６×１０４ｃｍ−２の密度でプレーティングすることによって馴化させることができる。１〜２日間にわたり馴化した培地にさらにｂＦＧＦを添加し、ｐＰＳ細胞培養物を補助するために１〜２日間用いる。
【００４８】
ＥＳ細胞は顕微鏡下では、核／細胞質比が高く、核小体が顕著であって、細胞間結合がほとんど識別できない稠密なコロニーを形成するものとして認められる。霊長類ＥＳ細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３および４、ならびにＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と命名された抗体を用いて検出可能なマーカーを発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８）。マウスＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１に関する陽性対照として、ならびにＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１に関する陰性対照として用いることができる。ＳＳＥＡ−４はヒト胚性癌（ｈＥＣ）細胞上に常に存在する。ｐＰＳ細胞がインビトロで分化するとＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の発現が低下し、ＳＳＥＡ−１の発現が増加する。ＳＳＥＡ−１はｈＥＧ細胞上にも認められる。
【００４９】
組織再生のためのｐＰＳ細胞の分化
ｐＰＳの分化は、まず胚様体を形成させることから開始することができる。胚様体の培養における一般的な原理は、オシェア（Ｏ’Ｓｈｅａ）、Ａｎａｔ． Ｒｅｃ．（Ｎｅｗ Ａｎａｔ．）２５７：３２３、１９９９に報告されている。ｐＰＳ細胞を、凝集体の形成が可能な様式で培養する（例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過成長による）。または、短時間のコラゲナーゼ消化を行い、解離させて塊にした上で、非接着性細胞培養プレートにプレーティングすることによってｐＰＳ細胞を収集する。凝集体には数日おきに新たな栄養分を与え、適した期間、通常は４〜８日後に収集する。続いて細胞を、特定の系譜の細胞の集積を促進する諸因子とともに、または基質上で培養する。胚様体は不均一な細胞集団を含み、これは外部に内胚葉を有し、内部に中胚葉および外胚葉を有する可能性がある。
【００５０】
ジェロン（Ｇｅｒｏｎ）社の研究者は、ｐＰＳ細胞が、中間段階として胚様体または凝集体を形成することなく、分化能の決定された前駆細胞または終末分化細胞へと分化しうることを発見した。簡潔に述べると、未分化ｐＰＳ細胞の懸濁液を調製した後に、分化を促進する個体表面にプレーティングする。適した基質には、接着性のあるガラスまたは合成樹脂表面、例えば、例えばポリリジンなどの陽イオン性基質のコーティングによるものが含まれる。続いて細胞を、望ましい細胞系譜に向かう分化を促進するように適合化された適した栄養培地中で培養する。
【００５１】
状況によっては、血清もしくは血清代替物を培地から除去することにより、または分化を抑制する培地成分（例えば、ｂＦＧＦ）を除去することにより、分化をさらに促進させる。望ましい細胞系譜に向かう分化を促進する、または望ましくない特徴を有する細胞の増殖を抑制する培地成分を添加することにより、分化を促進させることもできる。例えば、分化能が神経またはグリア系譜に決定された細胞を作製するために、培地に以下の因子または培地成分の任意のものを有効な組み合わせとして含めることができる：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神径成長因子（ＮＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ＦＧＦ−８、アスコルビン酸、フォルスコリン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）。
【００５２】
多能性幹細胞から組織細胞を入手するための一般的な原理は、ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）（Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． ６：５４３、１９９４）および米国特許第６，０９０，６２２号に総説がなされている。関心の対象となる他の刊行物には以下のものが含まれる：神経前駆細胞、神経拘束細胞およびグリア細胞前駆細胞については、ベイン（Ｂａｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２００：１２５２、１９９４；トロヤノフスキ（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ）ら、Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １４４：９２、１９９７；ウォイシク（Ｗｏｊｃｉｋ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１３０５〜１３０；ならびに米国特許第５，８５１，８３２号、第５，９２８，９４７号、第５，７６６，９４８号および第５，８４９，５５３号を参照されたい。心筋および心筋細胞については、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｄｅｖ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ １９７：２１７、１９９３およびウォバス（Ｗｏｂｕｓ）ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４８：１７３、１９９１を参照されたい。米国特許第５，７７３，２５５号は、グルコース応答性インスリン分泌を行う膵β細胞系に関する。米国特許第５，７８９，２４６号は肝細胞前駆細胞に関する。関心対象の他の前駆細胞には、軟骨細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、皮膚細胞（ケラチノサイト、樹状細胞、毛包細胞など）、腎管上皮細胞、平滑筋および骨格筋細胞、ならびに血管内皮細胞が非制限的に含まれる。
【００５３】
ジェロン（Ｇｅｒｏｎ）社の研究者は、増殖因子受容体と結合するリガンドの存在下でｐＰＳ細胞または胚様体細胞を培養すると、神経前駆細胞の集積が促進されることを見いだした。この成長環境は、フィブロネクチンなどの神経細胞支持性細胞外マトリックスを含んでもよい。適した増殖因子には、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、およびこれらのリガンドの受容体に対する抗体が非制限的に含まれる。選択的には、その後に培養細胞を、Ａ２Ｂ５などのマーカーを発現するか否かに基づいて分離してもよい。Ａ２Ｂ５マーカーの発現に関して集積された細胞の集団は、適切な環境では、ニューロン細胞（成熟ニューロンを含む）およびグリア細胞（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む）の両方を生成する能力を持つと考えられる。選択的には、細胞集団を、例えば、ｃＡＭＰの活性化物質を含む培地中で培養することにより、さらに分化させる。国際特許公報・国際公開公報第０１／８１５４９号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照。
【００５４】
ジェロン（Ｇｅｒｏｎ）社の研究者は、ｐＰＳ細胞または胚様体細胞を肝細胞分化物質の存在下で培養すると、肝細胞様細胞の集積が促進されることを見いだした。この成長環境は、コラーゲンまたはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）などの肝細胞支持性の細胞外マトリックスを含んでもよい。適した分化物質には、ブチレートのさまざまな異性体およびそれらの類似体、例えばｎ−ブチレートが含まれる。選択的には、培養細胞を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような有機溶媒などの肝細胞成熟因子；レチノイン酸などの成熟補助因子；またはグルココルチコイド、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ヘパリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびＨＢＧＦ−１などのサイトカインもしくはホルモンとともに、同時または逐次的に培養する。国際特許出願・ＰＣＴ／ＵＳ ０１／１５８６１号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００５５】
ジェロン（Ｇｅｒｏｎ）社の研究者は、ｈＰＳ細胞を、心筋細胞または心筋細胞前駆細胞を含む高度に集積された集団に分化させることも可能であることを見いだした。心筋細胞系譜細胞は例えば、ＤＮＡメチル化に影響を及ぼす心臓栄養因子（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、例えば５−アザシチジンを含む成長環境でｈＥＳ細胞を分化させることによって入手可能である。続いて、自発的に収縮する細胞を、例えば密度遠心法により、集団内の他の細胞から分離することができる。それ以外の工程段階には、クレアチン、カルニチンまたはタウリンを含む培地中で細胞を培養することが含まれうる。または、ｈＰＳ細胞を、オステオカルシンおよびコラーゲン−１を発現する骨前駆細胞または骨芽細胞を含む高度に集積された集団に分化させることも可能である。これらの細胞は、骨形態形成タンパク質（特にＢＭＰ−４）、ヒトＴＧＦ−β受容体のリガンドまたはヒトビタミンＤ受容体のリガンドを含む培地中でｐＰＳ細胞を分化させることによって得ることができる。
【００５６】
分化した細胞は、形態的特徴、発現される細胞マーカーおよび酵素活性の検出または定量化、ならびに細胞のインビボでの機能的特性の決定によって特徴づけることができる。神経細胞を特定するマーカーには、ニューロンに特徴的なβ−チューブリンＩＩＩまたはニューロフィラメント；アストロサイトに特徴的なグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；オリゴデンドロサイトに特徴的なガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；未分化ｈＥＳ細胞に特徴的なＯＣＴ−４；神経前駆細胞および他の細胞に特徴的なネスチンが含まれる。グルタミン酸デカルボキシラーゼまたはＧＡＢＡは、ＧＡＢＡ分泌性ニューロンを特定する；ドーパデカルボキシラーゼ、ドーパミンまたはチロシンヒドロキシラーゼはドーパミン作動性ニューロンを特定する。
【００５７】
肝臓の細胞のマーカーには、α−フェトプロテイン（肝臓前駆細胞）；アルブミン、α１−アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、シトクロムｐ４５０活性、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質受容体およびグリコーゲン蓄積（肝細胞）；ＣＫ７、ＣＫ１９およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（胆管上皮）が含まれる。混合型細胞集団は以下のマーカーを用いて同定することができる。骨格筋の場合：ｍｙｏＤ、ミオゲニンおよびｍｙｆ−５。内皮細胞の場合：ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞接着分子）、Ｆｌｋ−１、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２およびＭＥＣ−１４．７。平滑筋細胞の場合：平滑筋アクチンおよび特定のミオシン重鎖。心筋細胞の場合：ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心筋トロポニンＩ、α−ミオシン重鎖、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。膵細胞の場合は、ｐｄｘおよびインスリン分泌。
【００５８】
免疫寛容を誘導する細胞へのｐＰＳ細胞の分化
ヒトＥＳ細胞を、前記のように胚様体を形成させることにより、または適した培地を用いる適した培養環境下での直接分化により、寛容化細胞に分化させることができる。
【００５９】
典型的な手順では、細胞を凝集体または単層として、懸濁液中またはメチルセルロースまたはアガロースなどの半固形培地中で培養する。増殖因子は通常、分化が始まってから１〜２週後に添加する。さまざまな造血細胞の集団の増生を、ＩＬ−３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（Ｋｉｔリガンド）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｍ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦを用いて促すことができる。考えられる添加物には、幹細胞因子、ＩＬ−２、ＩＬ−７、インスリン様増殖因子１、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子、内皮細胞増殖補助物質、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、抗Ｍ−ＣＳＦおよび抗ＴＧＦ−βが含まれる。共刺激分子の候補には、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、Ｃｏｎ Ａ、ＰＨＡおよびＬＰＳが含まれる。
【００６０】
状況によっては、培養環境に、フィーダー細胞、特にマウスまたはヒト由来の骨髄ストロマ細胞（例えばＳ１７、ＲＰ．０．１０、ＳＴ２、ＰＡ６、Ａｃ６または新たに単離した初代培養物）を含めてもよい。考えられるその他のフィーダー細胞には、胎児肝ストロマ細胞（例えば、ＦＬＳ４．１）、卵黄嚢細胞（例えば、Ｃ１６６）、胸腺ストロマ細胞、活性化脾細胞または内皮細胞が含まれる。または、細胞をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンもしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックス上、またはフィーダー細胞によって産生された基質上で増殖させることもできる。フィーダー細胞が存在しない場合には、馴化培地（例えば、ストロマ細胞からの上清）を用いることにより、それが提供する活性のいくつかを代替することができる。造血を促進させるために、細胞を正常酸素条件（１９％Ｏ２）または低酸素条件（５％Ｏ２）下で、例えば酸素含有量を調節可能なインキュベーター内で培養してもよい。具体的な増殖条件の選択は、一部には、培養の機構および希望する細胞サブポピュレーションに依存する。
【００６１】
細胞を、敷石様の外観を伴うコロニーが形成されるまで十分な時間にわたって培養する。続いてコロニーを継代し、フローサイトメトリー、免疫組織化学または固相酵素免疫アッセイによって表現型マーカーに関して検討することができる。マーカー特異的プライマーを用いる逆転写酵素−ＰＣＲにより、発現をｍＲＮＡレベルで検出することもできる（Ｍｏｏｒｅ、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １：３、１９９５）。
【００６２】
適切なマーカーは以下の通りである：ヒト造血前駆細胞または幹細胞の場合：ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、Ｔｈｙ＋、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ７１ ｌｏ、ローダミン１２３ ｌｏ、ＧＡＴＡ−１、ＡＣ１３３、β−主要グロブリン、β−主要グロブリン様遺伝子βＨ１。間葉幹細胞の場合：ＣＴＬＡ−４、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７１＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０６＋、ＣＤ１４−、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−。リンパ系細胞の場合：ＣＤ４５＋。Ｔ細胞の場合：ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔ細胞受容体、ＩＬ−２受容体。Ｂ細胞の場合：ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ１９＋、Ｉｇ遺伝子の再配列。樹状細胞の場合：ＤＥＣ−２０５＋、ＣＭＲＦ−４４＋、ＣＭＲＦ−５６＋、Ｓ１００＋。ナチュラルキラー細胞の場合：ＣＤ１６＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３−。マクロファージ／単球の場合：ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋。巨核球の場合：ＣＤ４１ｂ＋。赤血球系細胞の場合：グリコホリンＡ＋、ヘモグロビン。
【００６３】
造血前駆細胞のコロニー形成は、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＫＬ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＥＰＯなどの因子を含むメチルセルロース中に細胞をプレーティングし、その後に形成されたコロニーの数および種類（例えば、ＨＰＰ−ＣＦＣ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅ）を算定することによってアッセイ可能である。細胞を同種骨髄ストロマ細胞上にプレーティングし、生じたコロニーの数および大きさ、ならびにコロニー内の細胞の表現型によって長期的な増殖能を評価することも可能である。
【００６４】
造血細胞の分化能を、脾臓内にコロニーを形成する能力（ＣＦＵ−Ｓ）に関して動物モデルで評価することができる。分化した細胞を動物に静脈内注射し、脾臓内コロニーの形成を約２週間後に算定する。それらを、亜致死量の放射線照射を行ったマウスの造血系を再増殖させる能力、または致死量の放射線照射を行ったマウスを救命する能力に関して評価することもできる。細胞を静脈内注射し、ヒト特異抗体をＦＡＣＳ分析に用いてマウス血中のヒト骨髄系またはリンパ系細胞の割合を分析することにより、移植のモニタリングを行う。適したマーカーには、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）およびＣＤ１４／１５（骨髄系細胞）が含まれる。時には生命維持を補助するために骨髄全体を同時注入し、２つのドナー集団をＭＨＣタイプによって識別する。
【００６５】
選択的には、寛容化細胞を培養物中の他の系譜の分化細胞から分離すること、または特定の細胞サブセットを上に挙げたマーカーに対して特異的な抗体を用いて分離することができる。例えば、蛍光活性化細胞分取法または免疫磁気ビーズ分取法により、細胞を表現型ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋およびＴｈｙ＋に関して集積化することができる。この技法の変法は、求める細胞種を選択用に標識するプロモーター−レポーター構築物を用いることである。例えば、ＣＤ３４プロモーターまたはエンハンサー（Ｂｕｒｎら、Ｂｌｏｏｄ ８０：３０５１、１９９２；Ｒａｄｏｍｓｋａら、Ｇｅｎｅ ２２２：３０５， １９９８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４７３７３）は、薬剤耐性遺伝子のコード領域または緑色蛍光タンパク質などの蛍光性標識の発現をもたらすことができる（米国特許第６，１６６，１７８号、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）。混合型細胞集団におけるプロモーター−レポーターの一時的発現（例えば、アデノウイルスベクターを用いる）により、それぞれ、対応する抗生物質の存在下での培養または蛍光活性化細胞分取法により、ＣＤ３４＋細胞を選別することができる。
【００６６】
本発明に用いるために免疫寛容を誘導するのに適した細胞集団を調製する過程で、実施者は選択的には別のところに記載された補助的な方法を用いることができる。
【００６７】
例えば、国際公開公報第９３／１８１３７号（ＳｙＳｔｅｍｉｘ）は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地中で造血幹細胞を１２時間培養することを提唱している。米国特許第５，６３５，３８７号（ＣｅｌｌＰｒｏ）は、増殖因子を含む栄養培地を用いる、ヒト造血細胞およびその前駆細胞、特にＣＤ３４陽性細胞を培養するための方法および装置を概説している。米国特許第５，７３３，５４１号は、ＣＤ３４＋ｖｅ、ＨＬＡ−ＤＲ＋ｖｅ、Ｔｈｙ−１＋ｖｅおよびＬｉｎ−ｖｅである造血前駆細胞の増殖および維持のための工程を概説している。米国特許第６，０１５，５５４号（ＳｙＳｔｅｍｉｘ）号は、ＣＤ３４＋ｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ＋ｖｅおよびＣＤ１０＋ｖｅである前駆細胞が集積された造血細胞前駆細胞を得るための方法に関する。
【００６８】
ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７：８６２、１９９５；Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３：４７３、１９９３；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：７２５、１９９８）は、マウスＥＳ細胞から胚様体を形成させ、解離した上で、種々の増殖因子の組み合わせを含む半固形培地（１％メチルセルロース）または液体培養物に再プレーティングする、二段階式の分化プロトコールを概説している。
【００６９】
カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら（「幹細胞に関するキーストーンシンポジウム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」、２０００、要旨３１５）は、増殖因子を外因的に添加せずに、ヒトＥＳ細胞をマウス骨髄ストロマ細胞系Ｓ１７またはマウス卵黄嚢細胞系Ｃ１６６上で培養した。約７日後に敷石状コロニーが観察された；第１４〜２１日の時点で一部の細胞はＣＤ３４に関して陽性染色されたがＣＤ４５に関しては染色されなかった。
【００７０】
ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４は、マウスＥＳ細胞をＭ−ＣＳＦ欠損性ストロマ細胞系ＯＰ９と共培養した。ポトクニク（Ｐｏｔｏｃｎｉｋ）ら（ＥＭＢＯ Ｊ． １３：５２７４、１９９４）は、外的因子を添加せずに、マウスＥＳ細胞を低酸素（５％Ｏ２）空気下にて液体培地または半固形メチルセルロース中で胚様体として培養した。パラシオス（Ｐａｌａｃｉｏｓ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９１７１、１９９２；Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７５３０、１９９５）は、マウスＥＳ細胞を、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７などの増殖因子を加えたウシ胎仔血清中または胎児肝臓ストロマ細胞馴化培地中にある不活性化ストロマ細胞上にプレーティングした。
【００７１】
フェアチャイルド（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ）ら（Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １０：１５１５、２０００）は、マウス胚性幹細胞からの未熟樹状細胞の長期培養物の樹立を報告している。このＤＣはマクロファージと共通した多くの特徴を持つが、成熟すると、アロ刺激能力、ならびにＣＤ１１ｃ、ＭＨＣクラスＩＩおよび補助刺激分子の発現を含む古典的ＤＣの表面表現型を獲得した。移植寛容に関するＤＣの可能性については、フェアチャイルド（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：５２８、２０００に総説がなされている。状況によっては、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含む培地中で培養し、次に低レベルのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０を含む培地中で培養することにより、寛容を誘導しうる樹状細胞を作製してもよい。
【００７２】
場合によっては、寛容化細胞を、同じ系由来の再生組織に対する要求に応じて患者を寛容化するためのバンクとして保存する。細胞の複製能を改善し、バンク業務を容易にするために、それらに適したベクターによるトランスフェクションもしくは形質導入、相同組換えまたは他の適切な技法によりテロメラーゼ導入処理（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）を行い、それらにテロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）を発現させることができる。特に適しているのは、国際公開公報第９８／１４５９２号に提供されているヒトテロメラーゼの触媒成分（ｈＴＥＲＴ）である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、ボドナー（Ｂｏｄｎａｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３４９、１９９８およびチャン（Ｊｉａｎｇ）ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２１：１１１、１９９９に記載されている。
【００７３】
テロメラーゼ導入処理（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の前後に、ｈＴＥＲＴ遺伝子産物のテロメラーゼ活性および発現を、市販の試薬および確立した方法を用いて判定することができる。例えば、ＴＲＡＰ活性アッセイを用いてｐＰＳ細胞をテロメラーゼに関して評価する（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１、１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：４９８、１９９７）。以下のアッセイキットが研究用に販売されている：ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）ＸＬテロメラーゼ検出キット（カタログ番号ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．、Ｐｕｒｃｈａｓｅ ＮＹ）；およびＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ（カタログ番号２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）。ｈＴＥＲＴ発現をＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで評価することもできる。以下のアッセイキットが研究用に販売されている：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ ｈＴＥＲＴ定量キット（カタログ番号３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【００７４】
治療的用途のためには、本発明の寛容化細胞集団が未分化ｐＰＳ細胞を実質的に含まないことが望ましい。集団から未分化幹細胞を欠乏させる１つの方法は、エフェクター遺伝子が未分化細胞における選好的発現を引き起こすプロモーターの制御下に置かれているベクターをそれらにトランスフェクトすることである。適したプロモーターには、ＴＥＲＴプロモーターおよびＯＣＴ−４プロモーターが含まれる。エフェクター遺伝子が細胞に対して直接溶解性があるもの、例えば、毒素またはアポトーシスのメディエーターをコードするものでもよい。アポトーシス遺伝子の例には、カスパーゼファミリーがある（Ｓｈｉｎｏｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：７３９、２０００；Ｋｏｇａら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１：１３９７、２０００）。選択的には、エフェクター遺伝子をさらに、誘導薬剤（テトラサイクリン）の存在下でのみ望ましくない細胞の死滅を引き起こす分子スイッチ（テトラサイクリン耐性因子など、Ｇｏｓｓｅｎら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５：５１６、１９９４；米国特許第５，４６４，７５８号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １：２１０、１９９７）と連結することもできる。または、エフェクター遺伝子に、抗体またはプロドラッグなどの外的因子の毒性作用に対する感受性を細胞に付与する作用があってもよい。その例には、それが発現された細胞にガンシクロビルに対する感受性を与える単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子がある。適したｐＴＥＲＴ−ｔｋ構築物は国際公開公報第９８／１４５９３号（Ｍｏｒｉｎら）に提供されている。
【００７５】
マッチさせた２つの細胞集団の組織再生における使用
個体において細胞機能を再構成するためには、ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞から、寛容化細胞集団のＨＬＡ組織型に対して個体を寛容化する表現型へと分化した、第１の細胞集団を投与する。組織再生用の同種移植片（寛容化細胞とマッチさせたもの）を同時に投与または移植することができるが、数週後に投与することがより一般的である。
【００７６】
本発明は、寛容化プロトコールの実行可能性を評価するための動物モデルを提供する。その第１のものは、確立された方法（前記）に従って調製したマウスＥＳ細胞を用いるマウスモデルである。マウスＥＳ細胞は、近交系ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３ＨまたはＣ５７ＢＬ系統から標準的な方法に従って調製する。それらを前のセクションで説明したように寛容化細胞に分化させる。続いて、寛容化細胞を、Ｈ−２型の異なる別の近交系のマウスの門脈内または尾静脈を介して注入する。初回の試験範囲はマウス１匹当たり細胞１０６および１０７個の間とする。平行した実験で、一部のマウスには１回目から約５日後に寛容化細胞の２回目の投与を行う。
【００７７】
１回目の寛容化処置から１週後に、皮膚全層の同種移植片を同一のドナー系統の背部から採取し、脱毛処理を行う。続いてこれをレシピエントマウスの右胸壁に６−０号ナイロン糸を用いて縫合する。その後の６週間またはそれ以上の期間にわたって移植片を観察し、移植面に正常な上皮が保たれているか否かを判定する。事前にテロメラーゼ導入処理を行わなければ、皮膚移植片は通常、約２週間以内に拒絶される。
【００７８】
血液の採取は皮膚の同種移植を行う前に行い、移植後には２週間毎に１回行う。
さまざまなアッセイを行うことができる。レシピエント血清を、新たな補体および５１Ｃｒで標識したドナー系統の標的細胞（培養した線維芽細胞またはＥＳ系から分化した細胞など）と混合することにより、アロ反応性抗体を測定する。アロ反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、５１Ｃｒで標識した標的細胞を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（登録商標）で分離したレシピエント由来の末梢血単核細胞と混合することによって測定する。ヘルパー／インデューサーＴ細胞は、レシピエントＰＢＭＣを放射線照射を行ったＰＢＭＣまたは脾細胞と混合し、［３Ｈ］チミジン取り込みを測定することによって測定する。混合リンパ球反応液からの上清を、細胞の免疫反応性の指標として、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦαまたはＩＬ−１０に対するサンドイッチＥＬＩＳＡにより（抗体はＧｅｎｚｙｍｅから入手可能）、サイトカイン分泌に関して測定することも可能である。
【００７９】
移植片を数日毎に、移植面の脱毛、壊死および正常上皮の消失といった拒絶反応の徴候に関して観察する。移植片が生着したマウスについては、同じドナー系統または第３のドナーからの第２の移植片を対側の横腹に縫合することにより、免疫寛容の程度および特異性を約６週間にわたって試験することができる。レシピエントのキメラ現象は、脾細胞または骨髄細胞を採取して、ドナーのＨ−２アロタイプ、レシピエントのＨ−２アロタイプならびにＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０およびＭａｃ−１などの造血マーカーに対する特異抗体で染色するＦＡＣＳ分析によって評価する。移植片の受容は、免疫学的アッセイにおけるアロ反応性の低さと相関すると予想されるほか、キメラ現象の所見とも相関すると思われる。
【００８０】
第２のモデルは、アカゲザルＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５）またはヒトＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８）を用いる霊長類モデルである。ＥＳ細胞を上記のようにして寛容化性のある細胞に分化させ、マウスモデルから決定した至適用量を適宜スケールアップした上でアカゲザルに静脈内注射する。約１週後にサルに２回目の投与を行ってもよい。同時に、同じＥＳ細胞系を以前に記載したようにして肝細胞様細胞または神経細胞に分化させる。
【００８１】
約２週後の時点で、寛容化処置を行ったサルに対して、置換組織の同種移植片を移植する。肝細胞様細胞および神経前駆細胞を以前に記載した通りに同じＥＳ細胞系から作製する。分化した細胞を、ＢｒｄＵにより、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子をコードする発現ベクターにより、内因的に標識する。肝細胞様細胞は腎被膜または脾臓の内部に移植する。マウスモデルと同じく、血液を定期的に採取してアロ抗原に対する免疫応答に関してアッセイするとともに、キメラ現象についてもアッセイする。２、４または６週後に移植部位から生検標本を採取する。生検標本を、内因性標識の測定、および肝臓特異的、ＭＨＣ特異的またはヒト特異的マーカー（ＥＳ系がヒト由来の場合）に対する免疫組織化学により、移植細胞の生着の所見に関して検査する。
【００８２】
アロ特異的免疫寛容を誘導するのに適した条件を決定した上で、確立した動物モデルを用いて組織再生プロトコールの有効性を評価するために追加実験を行うことができる。例えば、神経細胞移植片の有効性は、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１４１０、１９９９）により記載された通りに、脊髄に急性損傷を加えたラットモデルで評価することができる。移植が成功すれば、損傷端から脊髄に沿って移動した移植片由来の細胞が２〜５週後に損傷部に認められ、それに伴い、ラットの歩行、協調性および体重負荷の改善がみられると考えられる。肝細胞の置換は、肝損傷を修復する能力に関して動物モデルで評価することができる。このような例の１つは、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって起こる損傷である（Ｄａｂｅｖａら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４３：１６０６、１９９３）。本発明に従って調製した心筋細胞の有効性は、治療を行わなければ左室壁組織の５５％が瘢痕組織化する原因となる心冷凍障害の動物モデルで評価することができる（Ｌｉら、Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ６２：６５４、１９９６；Ｓａｋａｉら、Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ８：２０７４、１９９９、Ｓａｋａｉら、Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １１８：７１５、１９９９）。
【００８３】
同種移植を受ける対象における免疫寛容を誘導するために本発明を用いる際に、実施者は選択的には、別のところに記載された補助的技法を用いることができる。
【００８４】
例えば、国際公開公報第９９／５１２７５号（Ｏｓｉｒｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、特異的Ｔ細胞アネルギーを誘導するために膜結合抗原を提示する間葉幹細胞を用い、それによって免疫抑制を誘導することを提唱している。国際公開公報第９３／１３７８５号（Ｓａｃｈｓら）、国際公開公報第９５／２１５２７号（Ｓａｃｈｓら）、国際公開公報第９７／４１８６３号（Ｓｙｔｅｓら）および米国特許第６，００６，７５２号（Ｓｙｔｅｓら）は、第１の種のドナー動物の造血幹細胞を第２の種のレシピエントに投与する、免疫寛容を誘導するための方法を提唱している。これはレシピエントに混合キメラ現象を生じさせ、それによって第１の種からの移植片を受容することを可能にする。
【００８５】
米国特許第５，８４３，４２５号（Ｓａｃｈｓら）は、寛容化性のある造血細胞調製物に存在するＴ細胞を、特異抗体を用いて欠乏させるやり方を説明している。国際公開公報第９９／３９７２７号（Ｓｙｔｅｓら）は、造血細胞を、ＣＤ４０のリガンドとの相互作用を抑制する何らかの物と組み合わせて投与することを提唱している。米国特許第５，８７６，７０８号（Ｓａｃｈｓら）によれば、レシピエント体内のＴ細胞を不活性化し（例えば、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体を用いる）、免疫抑制薬（シクロスポリンＡなど）を投与することにより、造血細胞の寛容化作用を補強することが可能である。
【００８６】
米国特許第５，８５８，９６３号、米国特許第５，８６３，５２８号および国際公開公報第９７／４１８６３号（Ｓａｃｈｓら）は、骨髄細胞を幹細胞因子、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０などのサイトカインと併用することによって動物モデルにおける寛容を誘導するやり方を概説している。国際公開公報第９３／０９８１５号（Ｓａｃｈｓら）は、レシピエント動物において移植組織に対する寛容を付与するために、ＭＨＣ抗原をコードする核酸を骨髄造血細胞にトランスフェクトすることを提唱している。国際公開公報第９５／０３０６２号（ＣｅｌｌＰｒｏ）は、臓器ドナーから細胞を採取し、造血細胞（ＣＤ＋ｖｅ細胞など）を集積化した上でそれらを移植の前にレシピエントに注入することにより、実質臓器の移植に対してレシピエントが寛容化されることを示唆している。
【００８７】
モリタ（Ｍｏｒｉｔａ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６９４７、１９９８）は、臓器同種移植のために寛容を誘導するための戦略を概説している。レシピエントマウスの門脈内に同種ドナーからの脾細胞を注入し、１週後に同じドナーからの皮膚移植片を移植した。一部のマウスでは、移植片は移植１年後も生着しており、これに付随して微小キメラ現象の成立が認められた。投与した組成物中のドナーＴ細胞は生着を促し、細胞傷害性Ｔリンパ球はドナー特異的アネルギーを誘導するように思われた。同じ源からの骨髄細胞の静脈内投与により、５日後に寛容誘導が有意に増強された。
【００８８】
シュタルツ（Ｓｔａｒｚｌ）ら（Ｌａｎｃｅｔ ３３９：１５７９、１９９２；Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：７４５、１９９３）は、肝臓移植片を受容したヒト患者には、同種移植片からレシピエントのリンパ節に移動したドナー由来の樹状細胞およびマクロファージがあることを観察している。キメラ現象および免疫寛容の誘導に関する他の刊行物は以下に列挙している。
【００８９】
前記のように、個体を第２の細胞集団に対して免疫寛容化する表現型に分化したヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞の第１の細胞集団を投与することにより、ヒト患者を本発明に従って処置することができる。静脈内投与が現時点では好ましい経路であるが、他の経路も考えている（脾臓内注射など）。予想される投与量は、約１０９〜１０１１個の細胞が寛容化能力を有する細胞懸濁液である。必要に応じて、造血空間を作り出し、移植細胞とのキメラ現象が可能になるように、患者に破壊的もしくは部分的に破壊的なγ線照射療法、または化学療法を行うことができる。
【００９０】
ＰＢＭＣを採取して、照射を行ったクラスＩＩ提示性ｈＰＳドナー細胞を用いる一方向混合リンパ球反応を行うことにより、患者を免疫寛容の成立に関してモニタリングすることができる（迅速な読み取りのためにはアクリジンオレンジまたはサイトカイン分泌を用いる）。必要に応じて追加的な投与サイクルを行う。
【００９１】
寛容が起こるのに十分な時間および処置の後に、患者に対して、寛容化細胞と同種の（またはＨＬＡをマッチさせた）再生組織を投与する。同種寛容の度合いによっては、移植片が生じ、移動してその機能的役割を果たすまで、患者に対して免疫抑制薬を継続することが有益と思われる（シクロスポリンＡまたは抗ＣＤ４抗体）。患者にあらかじめ寛容化処置を行うことが不可能な場合でも、寛容化細胞を再生細胞と同時または逐次的に投与することが有益な可能性はある。治療プロトコール、投与量およびモニタリングの最終的な選択は、管理を行う臨床医に責任がある。
【００９２】
本発明に従って特異的な免疫寛容を誘導するのに有用な細胞を、選択的には、ヒト投与用に十分な無菌条件下で調製された等張添加剤を含む薬学的組成物として提供することができる。医薬製剤に関する一般的な原理については、「細胞療法：幹細胞移植、遺伝子治療および細胞免疫療法（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」、モースチン（Ｇ． Ｍｏｒｓｔｙｎ）およびシェリダン（Ｗ． Ｓｈｅｒｉｄａｎ）編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６；ならびに「造血幹細胞療法（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ボール（Ｅ．Ｄ． Ｂａｌｌ）、リスター（Ｊ． Ｌｉｓｔｅｒ）およびロー（Ｐ． Ｌａｗ）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００を参照されたい。
【００９３】
寛容化組成物を、細胞の寛容誘導に用いるために書面による指示とともにパッケージ化してもよい。造血細胞は通常、組織再生のために用いられるＨＬＡ適合性組織とマッチさせたものであり、２つの組成物を合わせてキット形態として出荷することができる。
【００９４】
本明細書に提供した組成物および手順を、以下の特許請求の範囲に具体的に示した本発明の精神を逸脱することなく、当業者が有効に修正しうることは認識されると考えられる。
【国際公開パンフレット】
2004521877.tif 000002
2004521877.tif 000003
2004521877.tif 000004
2004521877.tif 000005
2004521877.tif 000006
2004521877.tif 000007
2004521877.tif 000008
2004521877.tif 000009
2004521877.tif 000010
2004521877.tif 000011
2004521877.tif 000012
2004521877.tif 000013
2004521877.tif 000014
2004521877.tif 000015
2004521877.tif 000016
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2004521877.tif 000018
2004521877.tif 000019
2004521877.tif 000020
2004521877.tif 000021
2004521877.tif 000022
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521877.tif 000023
【国際調査報告】
2004521877.tif 000024
2004521877.tif 000025
2004521877.tif 000026
2004521877.tif 000027