(57)【要約】本発明は新規ＤＮＡ配列に関し、該配列は、今まで同定されていなかった、植物におけるシリンギルリグニンの生合成を調節するリグニン生合成経路酵素シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする。また、植物におけるシリンギル富化リグニンの遺伝子操作のために、この新規ＳＡＤ遺伝子配列又は実質的に類似の配列を植物ゲノムに組み込む方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）遺伝子。
【請求項２】
ＳＡＤをコードするヌクレオチド配列又はその機能的フラグメントを含むｃＤＮＡ。
【請求項３】
ＳＡＤと実質的に類似するアミノ酸配列を有し、ＳＡＤ活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１を含む請求項２に記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】
植物ＳＡＤ遺伝子の転写調節領域を有するＤＮＡセグメントを含む分離及び精製されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖、逆相補鎖及び逆配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で以下の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、
（ｂ）（ａ）の配列の相補鎖、
（ｃ）（ａ）の配列の逆相補鎖、及び
（ｄ）（ａ）の配列の逆配列。
【請求項８】
１つ又は複数の保存的欠失、挿入又は置換においてのみ以下の配列と相違するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、
（ｂ）（ａ）の配列の相補鎖、
（ｃ）（ａ）の配列の逆相補鎖、及び
（ｄ）（ａ）の配列の逆配列。
【請求項９】
以下の配列と少なくとも７０％の配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、
（ｂ）（ａ）の配列の相補鎖、
（ｃ）（ａ）の配列の逆相補鎖、及び
（ｄ）（ａ）の配列の逆配列。
【請求項１０】
ＳＡＤの配列を有するアミノ酸配列、ＳＡＤと実質的に類似するアミノ酸配列を有するその配列保存的変異体又はそれらの機能的フラグメントを含む請求項２に記載のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２を含む請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）ＳＡＤ又はＳＡＤと実質的に類似するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を導入する工程、ここで前記配列が植物宿主中で機能するプロモーター及び遺伝子終結配列と機能できるように結合されている、
（ｂ）植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る工程、及び
（ｃ）トランスジェニック植物の細胞においてＤＮＡ構築物を植物のリグニンモノマー組成を変化させるのに有効な量で発現させる工程を含む植物組織中のリグニンモノマー組成を変化させる方法。
【請求項１３】
植物組織が植物細胞、植物器官、又は植物全体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
植物組織が被子植物及び裸子植物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）植物細胞を請求項９に記載のポリヌクレオチドで形質転換してトランスジェニック植物細胞を得る工程、及び
（ｂ）再生及び成熟植物成長につながる条件下でトランスジェニック細胞を培養する工程を含む変化したリグニン構造を有する植物細胞の生成方法。
【請求項１６】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを植物のゲノムに安定に組み入れる工程を含む植物における酵素の活性を変化させる方法。
【請求項１７】
植物のゲノムに形質転換によって遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーターを含む組換えＤＮＡを安定に組み入れ、挿入される領域が内在性植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子と十分な配列類似性を有するＤＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含み、その結果前記ヌクレオチド配列が発現される場合、前記内在性植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制される工程を含む植物におけるリグニンの含有量又は組成を変化させる方法であって、前記ヌクレオチド配列が植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子又はその機能的フラグメントである前記方法。
【請求項１８】
植物の細胞の培養物のゲノムに形質転換によって遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーターを含む組換えＤＮＡを挿入し、挿入される領域がシナピルアルコールデヒドロゲナーゼを特定する内在性植物遺伝子と十分な配列類似性を有するヌクレオチド配列を含み、その結果前記ヌクレオチド配列が発現される場合、内在性シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大する工程；挿入された組換えＤＮＡを含む培養物から細胞を選択する工程；選択した細胞から植物全体を再生する工程；低減されたシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性によって特徴付けられる表現型を有する選択された細胞から再生された植物全体を選択する工程を含む植物におけるシナピルアルコールデヒドロゲナーゼの活性を増大する方法であって、前記ヌクレオチド配列が植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子又はその機能的フラグメントである前記方法。
【請求項１９】
そのゲノムにＳＡＤをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を組み入れた植物。
【請求項２０】
樹木である請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
ＳＡＤをコードするヌクレオチド配列がセンス配向である請求項１９に記載の植物。
【請求項２２】
植物が被子植物である、請求項１９に記載の植物。
【請求項２３】
植物が裸子植物である、請求項１９に記載の植物。
【請求項２４】
実質的に変化したリグニンモノマー組成を有するトランスジェニック植物であって、組換えＤＮＡ分子がプロモーターと機能できるように結合された植物ＳＡＤをコードするヌクレオチドを含み、組換えＤＮＡが植物のリグニンモノマー組成を変化させるのに効果的な量で発現される前記植物。
【請求項２５】
プロモーター配列、ＳＡＤのコード領域及び終結配列を有するＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項２６】
請求項２５のトランスジェニック植物細胞を含む植物及びその果実、種子及び子孫。
【請求項２７】
植物のゲノムに組み入れて植物のリグニンモノマー組成物を変化させるＤＮＡ構築物であって、機能できるように結合された遺伝子プロモーター配列、ＳＡＤをコードするヌクレオチド配列又はそれと実質的に類似する配列、及び植物細胞において機能する遺伝子終結を含む前記構築物。
【請求項２８】
請求項２７に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項２９】
植物が裸子植物である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
植物が被子植物である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
ＳＡＤをコードするヌクレオチド配列がセンス配向である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
ＳＡＤをコードするヌクレオチド配列がアンチセンス配向である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
プロモーターが構造的又は組織特異的である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
プロモーターが相同的又は非相同的である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
５’から３’の方向に以下のものを含むＤＮＡ構築物：
（ａ）遺伝子プロモーター配列、
（ｂ）請求項８又は９に記載の配列、配列番号１又は実質的に類似する配列のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、リグニン生合成経路に関係する酵素をコードする遺伝子を含む前記ポリヌクレオチド、及び
（ｃ）遺伝子終結配列。
【請求項３６】
非コード領域がセンス配向である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３７】
非コード領域がアンチセンス配向である、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３８】
遺伝子プロモーター配列が木部での転写を与える、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３９】
遺伝子プロモーター配列、及び遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ構築物であって、挿入される領域が内在性植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子と十分な配列類似性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチドが発現される場合、前記内在性植物遺伝子の発現が抑制され、前記内在性植物遺伝子がシナピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記ヌクレオチドが植物シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子又はその機能的フラグメントである前記構築物。
【請求項４０】
５’から３’の方向に以下のものを含むＤＮＡ構築物：
（ａ）遺伝子プロモーター配列、
（ｂ）リグニン生合成経路に関係する酵素の少なくとも１つの機能的部分をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、請求項８又は９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、及び
（ｃ）遺伝子終結配列。
【請求項４１】
植物細胞の少なくとも一部において、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物が植物ゲノムに組み入れられるのに効果的な量及び条件下で、前記構築物を植物のゲノムに組み入れる工程を含む植物におけるリグニン組成を変化させる方法。
【請求項４２】
変化したリグニン組成が、ＤＮＡ構築物をそのゲノムに組み入れない類似するコントロール植物に対するシリンギルモノリグノールの増加と相関する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
植物のゲノムに請求項２７に記載のＤＮＡ構築物を組み入れる工程を含む、植物におけるシナピルアルコールデヒドロゲナーゼの変化した発現を得る方法。
【請求項４４】
変化した発現が、ＤＮＡ構築物をそのゲノムに組み入れない類似するコントロール植物に対するシナピルアルコールデヒドロゲナーゼの発現の増加と相関する、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本件出願は２０００年９月５日に出願された米国仮出願第６０／２３００８６号の利益を主張し、前記仮出願は本願に引用して援用する。
【０００２】
（連邦政府による委託研究又は開発に関する説明書）
本発明はエネルギー生物科学プログラム、及び農務省によって認められた合衆国政府の支援、研究費補助番号ＵＳＤＡ ９９−３５１０３−７９８６、ＵＳＤＡ ０１−０３７４９、及びＤＯＥ ＥＤ−ＦＧ０２−０１ＥＲ１５１７９により行われた。合衆国政府は本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明は新規なＤＮＡ配列に関し、該配列は今まで同定されていなかった植物におけるシリンギルリグニンの生合成を調節するリグニン生合成経路酵素シナピル（ｓｉｎａｐｙｌ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする。また、この新規なＳＡＤ遺伝子配列又はこのＳＡＤ遺伝子と類似する配列を植物ゲノムに組み入れる方法が、植物におけるシリンギル富化リグニンの遺伝子工学のために提供される。
リグニン（複合フェノールポリマー）は、紙及びセルロース製品を製造するための主たるファイバー源でもある被子植物及び裸子植物の樹木を含むほとんどの木本の支持構造の主要な部分である。リグニンは一般に木部の乾燥重量の約２５％を構成し、セルロースの次に地球上で最も豊富な有機化合物である。リグニンは、生化学的分解に対するその耐性のために非常に適している木部に剛性を与える。
植物の成長及び構造にとって重要であるにも関わらず、リグニンは多大な費用をかけてセルロースから除去又は分解されなければならないため、収穫後のファイバー、化学物質及びエネルギー生成のためのセルロースベース木部／農作物プロセシングに問題がある。グアイアシル成分のようなリグニンのある構造成分は、分解に対するリグニン耐性を増大するモノマー架橋反応を促進する（Ｓａｒｋａｎｅｎ， １９７１； Ｃｈａｎｇ及びＳａｒｋａｎｅｎ， １９７３； Ｃｈｉａｎｇ及びＦｕｎａｏｋａ， １９９０）。被子植物において、リグニンはグアイアシル及びシリンギルモノリグノール（ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ）の混合物を含み、ほとんどすべてがグアイアシル成分からなる裸子植物のリグニンよりもかなり低いエネルギー及び化学物質コストで分解できる（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ， １９６５）。推測されるように、遺伝子工学によるシリンギルリグニンを裸子植物のグアイアシルリグニン又は被子植物に組み込んでシリンギルリグニン含量を増大することができれば、野生型に対してそのような遺伝子改変植物のプロセシングにおける年間の節約は米国単独で６０億〜１００億ドルの範囲になるであろう。従って、遺伝子改変植物のシリンギルモノリグノールの生合成を理解してより多くのシリンギルリグニンを含有させるための長年の動機があり、それ故、木部／作物プロセシングを促進している（Ｔｒｏｔｔｅｒ， １９９０； Ｂｕｇｏｓら， １９９１； Ｂｏｕｄｅｔら， １９９５； Ｈｕら， １９９９）。
【０００４】
シリンギルリグニンはグアイアシルリグニンから誘導されることが知られているが、不完全なシリンギルモノリグノール経路及びその経路の工程を触媒する酵素をコードする遺伝子のみが明らかにされている。コニフェリルアルデヒド（ｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）でグアイアシル経路から分かれるこの不完全なシリンギルモノリグノール経路は、シナピアルデヒド（ｓｉｎａｐａｌｄｅｈｙｄｅ）を形成するために、酵素コニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼ（Ｃａｌｄ５Ｈ）（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９）及びＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）−依存性５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＡｌｄＯＭＴ）（Ｌｉら， ２０００）をそれぞれコードする遺伝子によって媒介される（図１を参照のこと）。しかし、シナピアルデヒドは、植物におけるシリンギルリグニンの生合成のために、シナピルアルコール（シリンギルモノリグノール）に酵素的に変換されなければならない（図１を参照のこと）。そのような酵素、すなわちシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする遺伝子は、まだ同定又はクローン化されておらず、植物におけるシリンギルリグニンの遺伝子工学に欠くことのできない、見つかっていない遺伝子である。従って、植物におけるシリンギルモノリグノールの生合成の遺伝的増加のために、このキー遺伝子（ＳＡＤ）の同定及び単離及びこのキー遺伝子の使用を含むそのような遺伝子操作のための方法の必要性がある。
【０００５】
（発明の要約）
本発明は、植物におけるシリンギルリグニンの生合成に必要不可欠であり、かつ、中心的な役割を果たす新規酵素シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする分離した完全ＤＮＡ配列を提供する。ＳＡＤはシナピアルデヒドのシナピルアルコール（シリンギルモノリグノール）への変換を触媒する。ＳＡＤの産生、従ってシリンギルモノリグノールの産生は、ＳＡＤ遺伝子の追加コピーを供給することによって増大され、又は必要に応じて、シナピルアルコールを触媒するＳＡＤの量が減らされるようにアンチセンス配向で、ＳＡＤ遺伝子又はその一部の植物ゲノムへの挿入によって減らされてもよい。
一の局面において、本発明は、シリンギルリグニンの産生を増大し、グアイアシルリグニンの産生を抑える遺伝子を含む裸子植物全体を提供する。従って、本発明は、パルプ化プロセスにおける脱リグニン化をより容易にする裸子植物種を提供することの問題に取り組む。
他の局面において、本発明は、細胞から誘導される裸子植物におけるシリンギルリグニンの形成を誘発する目的で裸子植物の細胞に挿入可能な発現カセットを作製する方法を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、グアイアシルリグニンの産生は抑制されるがシリンギルリグニンの産生は増大されるような裸子植物種におけるリグニン生合成に関係する遺伝子を改変する方法を提供する。
本発明は、シリンギルリグニンの産生の原因である被子植物のそれらの遺伝子を特定し、分離し、及び／又はクローン化するのに有利である。また、本発明は被子植物種由来のシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードするポリヌクレオチドの同定及び分離及び裸子植物におけるリグニン生合成を変化させるそのようなヌクレオチドの使用に対して有利に提供される。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、シリンギルモノリグノール生合成における最後のキー酵素であるシナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする遺伝子に関し、新規酵素ＳＡＤをコードする分離された完全ＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は、植物にＳＡＤ遺伝子を形質転換することによって、リグニン組成を変える、すなわち植物におけるシリンギル富化リグニンを産生する方法を提供し、ここで、該遺伝子は発現されて、リグニンポリマーのシリンギル含量を増大させる。
より高いシリンギルモノマー含量を含むリグニンは化学的脱リグニンに対してより敏感であるため、本発明は製紙業及びパルプ産業にとって特に価値がある。現在、膨大なエネルギー及び時間が脱リグニンプロセスにおいて消費される。活性なＳＡＤ遺伝子によって形質転換される木本は、従来の紙の供給原料に対して脱リグニンプロセスにおいて明らかな利点を提供する。同様に、非相同的ＳＡＤ遺伝子の挿入及び発現によって、イネ科草本（ｇｒａｓｓｅｓ）におけるリグニン組成の改変はイネ科草本の消化性を増大する独特の方法を提供し、農場及び農業にとって大きな潜在的経済的利益になる。
本発明は植物組織の形質転換に有用である遺伝子及びＤＮＡ構築物を提供して、リグニンモノマー組成を変える。本発明に従って、形質転換に適した植物は、シリンギルリグニンを必然的に欠く植物、又は高いグアイアシルシリンギル比を有するリグニンを蓄積する植物を含む。また、本発明に従って、形質転換に適した植物は、そのリグニンがアンチセンス形質転換構築物（そのような変化が所望される場合、トランスジェニック植物のリグニンのシリンギル含量を減らす）を用いて改変できる植物を含む。特に、適した植物としては裸子植物、被子植物、イネ科草本、マメ科植物、飼料作物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
本明細書で使用される用語は、一般にその技術における通常の意味、本発明の状況の範囲内での通常の意味及び各用語が使用される特定の状況における通常の意味を有する。ある特定の用語は以下に、又は本明細書の他の部分に記載して、さらに本発明の組成物及び方法及びそれらの生成及び使用方法の記載において、当業者へのガイダンスを提供する。当然のことながら、同じものであっても１つ以上の方法で呼ばれる場合がある。従って、他の言語及び同義語として、本明細書に記載される用語のうちのいずれか１つ又は複数を使用してもよく、用語が本明細書で詳細に述べられているかどうか、又は議論されているかどうかによって認識されるべき特別な重要性はない。ある用語の類義語が与えられる。１つ以上の類義語の詳述は他の類義語の使用を排除しない。本明細書で議論される任意の用語の例を含む本明細書のいずれかの例の使用は一例に過ぎず、決して本発明の範囲及び意味又は例示されたどんな用語の範囲及び意味を制限しない。同様に、本発明は好ましい実施態様に限定されない。
【０００８】
本明細書で使用される“遺伝子”は特定の蛋白質を発現し、コード領域に先行する調節配列（５’非コーディング）及びコード領域に続く調節配列（３’非コーディング）を含む核酸フラグメントを参照する。“未変性”遺伝子は、本来それ自身の調節配列によって見出される遺伝子を参照する。
“非コーディング領域”は、ポリペプチドを直接コードしない遺伝子の部分を参照する。非コーディング領域の境界は開始コドンの前及び終止コドンの後に配置される。非コーディング領域はゲノムＤＮＡの非翻訳領域を含む。
“内在性遺伝子”はゲノムにおけるその本来の位置で正常に見出される未変性遺伝子を参照する。
“導入遺伝子”は遺伝子導入によって宿主生物体に導入される遺伝子を参照する。
“コード配列”はポリペプチドをコードする情報を含む遺伝子の部分を参照する。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード領域としては、例えば原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられ、たとえ合成ＤＮＡ配列であってもよい。
“プロモーター”（又はプロモーター配列）は、与えられた遺伝子において、ＲＮＡポリメラーゼのために認識部位を提供し、固有の転写のためにその他の要求される因子を提供することによってコード配列の発現を制御するＤＮＡ配列を参照する。多くの遺伝子は遺伝子発現を調節するプロモーター配列であるＤＮＡ配列の領域を有する。プロモーター領域は原核生物及び真核生物細胞の両方のコード配列から上流の５’フランキングＤＮＡ配列において典型的に見られる。プロモーター配列は下流遺伝子配列の転写の調節を与え、典型的には約５０〜約２０００ヌクレオチド塩基対を含む。また、プロモーター配列は、遺伝子発現のレベルに影響を及ぼすことができるエンハンサー配列のような調節配列を含む。いくつかの分離されたプロモーター配列は、天然の相同的ＤＮＡと異なるＤＮＡである非相同的ＤＮＡの遺伝子発現を提供できる。また、プロモーター配列は、強い、又は弱い、あるいは誘導性であることで知られている。強いプロモーターは高レベルの遺伝子発現を提供するが、弱いプロモーターは非常に低レベルの遺伝子発現を提供する。誘導性プロモーターは外因的に加えられた媒介物（ａｇｅｎｔ）及び環境の刺激又は発育上の（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）刺激に応答して遺伝子発現をオン・オフすることを提供するプロモーターである。非相同的ＤＮＡのための強いプロモーターである分離されたプロモーター配列は、形質転換した細胞の容易な検出及び選択を可能にするのに十分なレベルの遺伝子発現を提供し、所望する場合、高レベルの遺伝子発現を提供するので、有利である。また、プロモーターは、生理学的又は発育上の条件に応答して転写開始の有効性を調節する蛋白質因子の結合に関連するＤＮＡ配列を含んでもよい。
【０００９】
“調節配列”は、コード配列の上流（５’）、内部、及び／又は下流（３’）に位置するヌクレオチド配列を参照し、細胞の蛋白質生合成機構と協同してコード配列の転写及び／又は発現を制御する。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、転写終結配列及びポリアデニル化配列を含む。
“コード化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）”及び“コード化する（ｃｏｄｉｎｇ）”は、一連のアミノ酸が集まって特定のアミノ酸配列を構築して活性酵素を産生する情報を、遺伝子がそれによって（転写及び翻訳のメカニズムを介して）細胞に与えるプロセスを参照する。当然のことながら、特定のアミノ酸配列をコードするプロセスはコードされるアミノ酸の変化を生じない塩基置換を含んでもよいＤＮＡ配列、又は１個又は複数のアミノ酸が変化してもよい塩基置換を含むＤＮＡ配列を含むが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能特性に影響を及ぼさない。従って、当然のことながら、本発明は単に特定の具体的な配列を包含するにとどまらない。また、結果として得られる蛋白質分子の機能特性に実質的に影響を及ぼさないわずかな変更を生じる配列の欠失、挿入又は置換のような配列の改変は考慮される。例えば、遺伝コードの縮重を反映する、又は与えられた部位で化学的に等価なアミノ酸の産生を生じる遺伝子配列の変更は考慮される。このように、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのようなより小さい他の疎水性残基又はバリン、ロイシン又はイソロイシンのようなより大きい他の疎水性残基をコードするコドンによって置換されてもよい。また、同様に、結果としてグルタミン酸からアスパラギン酸への置換のような他の残基から１つの負の荷電残基への置換、又はアルギニンからリジンへの置換のような他の残基から１つの正の荷電残基への置換を生じる変化は、生物学的に等価な産物を産生することが期待できる。また、結果として蛋白質分子のＮ−末端及びＣ−末端部分の変更を生じるヌクレオチド変化は、蛋白質の活性を変えないことが期待される。一部の例では、実際に、蛋白質の生物学的活性の保持の効果を研究するために配列の変異体を生成することが望ましいかもしれない。これらの提案される各改変は、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定であるように、当業界における通常の技術の範囲内である。さらに、当業者は、本発明に包含される配列がストリンジェントな条件下で本明細書に例示される配列とハイブリダイズする能力によっても定義されることを理解する。
【００１０】
“発現”は、遺伝子によってコードされる蛋白質産物の産生を参照しなければならない。“過剰発現”は、正常又は形質転換されない生物体における産生のレベルを超えるトランスジェニック生物体における遺伝子産物の産生を参照する。
酵素の“機能的部分”又は“機能的フラグメント”又は“機能的等価物”は、１つ又は複数の反応物を結合する活性部位を含む部分、フラグメント又は等価物、又は反応速度を改善又は調節できる部分、フラグメント又は等価物である。活性部位は１つ又は複数のポリペプチド鎖に存在する別々の部分から構成される場合があり、一般に高い基質特異性を示す。
“ヌクレオチド配列によってコードされる酵素”は、部分的に分離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる酵素を含む。
“形質転換”は、外来性遺伝子の宿主生物体のゲノム及びその遺伝的に安定な遺伝形質への導入を参照する。
“％同一性”は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ （ＧＣＧ） パッケージ（バージョン９．０）（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から得られるＧＡＰのようなプログラムによって同定されるような、ポリヌクレオチド／ポリペプチドの他の配列のヌクレオチド／アミノ酸と同一である特定のポリヌクレオチド／ポリペプチドのヌクレオチド／アミノ酸のパーセンテージを参照する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３， １９７０）のアルゴリズムを使用して、一致する数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見出す。上記アルゴリズムを実行するために必要なパラメータが特定できない場合、そのプログラムによって提供されるデフォルト値が検討される。
“実質的な相同性”又は“実質的な類似性”は、７０％又はそれよりも高い類似性又は７０％の相同性を参照し、２つのポリペプチド配列の間の“％類似性”又は“％相同性”は、使用されるスコアリングマトリックスに基づいて２つの配列によって共有される類似する位置の数を比較される位置の数で割り、次いで１００を掛けた関数である。この比較は、２つの配列を並べて（必要な場合には、ギャップを導入して）最大の相同性を決定する場合に行われる。全米バイオテクノロジー情報センターによって提供されるＰｏｗｅｒＢｌａｓｔプログラムを使用して、ギャップを導入した最適のアラインメントを計算することができる。また、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ（バージョン９．０）（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のＧＡＰプログラムも使用できる。
【００１１】
“リグニンモノマー組成”は、リグニン化した植物組織で見出されるグアイアシルモノマーとシリンギルモノマーの相対比を参照する。
“植物”には、植物全体及び植物器官（例えば、根、茎、葉等）を含む植物の部分が含まれる。
“被子植物”は、子房で覆われた種子を生成する植物を参照する。被子植物の具体的な例はモミジバフウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ）（Ｌ．）［ｓｗｅｅｔｇｕｍ］である。
“裸子植物”は、裸の種子、すなわち子房で覆われていない種子を生成する植物を参照する。裸子植物の具体的な例はデーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）（Ｌ．）［ｌｏｂｌｏｌｌｙ ｐｉｎｅ］である。
核酸分子又はポリペプチドに関して“分離”及び／又は“精製”は、配列決定、複製及び／又は発現することができるように、その天然細胞の周囲及び細胞のその他の成分との関連から核酸又はポリペプチド分子をインビトロ分離することを参照しなければならない。
“ベクター”は、プラスミド、ファージ、ゲノム、ウイルスゲノム、コスミド、又は人工染色体のような組換え核酸構築物であり、本発明のポリヌクレオチドはそれに付着する場合がある。具体的な実施態様において、ベクターは、例えばクローニングベクターの場合、付着セグメントの複製を導く場合がある。
“シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ”又は“ＳＡＤ”は植物フェニルプロパノイド生合成経路における酵素を参照し、該酵素はシナピアルデヒドのシナピルアルコールへの変換を触媒し、シリンギルリグニンの産生を可能にする。本発明の例示された実施態様において、ＳＡＤ ＤＮＡ配列（図２Ａ）は、クェーキングアスペン（ｑｕａｋｉｎｇ ａｓｐｅｎ， Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）から同定された。当然のことながら、この配列は、技術的によく知られた技術（ＥＳＴ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、抗−ＳＡＤ抗体、抗−ＳＡＤポリペプチド抗体等）によって任意の植物種からその等価物（すなわち、本明細書において定義される実質的な相同性又は実質的な同一性を有する）をクローン化するためにプローブとして使用できる。ＳＡＤ ＤＮＡ配列は、本明細書に記載される酵素アッセイ方法に従ってシナピアルデヒドのシナピルアルコールへの変換を特異的に触媒することができる酵素をコードする任意のＤＮＡ配列として、本明細書において定義される。
【００１２】
（フェニルプロパノイド生合成経路）
各工程を触媒する役割を有する酵素と共にグアイアシルシリンギルリグニンの形成のための４−クマラート（ｃｏｕｍａｒａｔｅ）（１）からグアイアシル（コニフェリルアルコール（６））及びシリンギル（シナピルアルコール（９））モノリグノールへの生合成経路における種々の工程を示す図１を参照する。各反応工程で表示される酵素は以下のものである。４−クマラート（１）をカフェアート（ｃａｆｆｅａｔｅ）（２）に変換する４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、カフェアート（２）を、カフェオイル（ｃａｆｆｅｏｙｌ）−ＣｏＡ Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）によってフェルロイル（ｆｅｒｕｌｏｙｌ）ＣｏＡ（４）に変換されるカフェオイルＣｏＡ（３）に変換する４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、フェルロイルＣｏＡ（４）をコニフェリルアルデヒド（５）に変換するシンナモイル（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、コニフェリルアルデヒド（５）をグアイアシルモノリグノールコニフェリルアルコール（６）に変換するコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、コニフェリルアルデヒド（５）で経路は分かれ、コニフェリルアルデヒド（５）はコニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼ（ＣＡｌｄ５Ｈ）によって５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（７）にも変換され、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＡｌｄＯＭＴ）は５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（７）を、シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）によってシリンギルモノリグノール、シナピルアルコール（９）に変換されるシナピアルデヒド（８）に変換する。
【００１３】
シナピルアルコールの生成のためのこの最終工程がＣＡＤによって触媒されたことが、以前に報告された。本発明は、シナピアルデヒドからシナピルアルコールを生成する別個の酵素の最初の開示である。ＣＡＤ及びＳＡＤはグアイアシル−シリンギルリグニンの量及び組成を一緒に調節する。本発明は分離されたＳＡＤ蛋白質及びＳＡＤ ｃＤＮＡクローンを提供し、リグニン化を変更するために使用できる。配列番号１はクェーキングアスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）由来のＳＡＤ ｃＤＮＡの配列リストを与え、配列番号２は推論したＳＡＤポリペプチドの配列リストを与える。
すべての報告されたＣＡＤ様酵素のアミノ酸配列と本発明の新規のＳＡＤ酵素との比較は、下記表１に与えられる。ＣＡＤはいくつかの異なる種について特徴付けられている。表１に記載される値はアミノ酸の同一性の割合を示す。表１は、ＳＡＤがすべてのその他の知られたＣＡＤと５０％程度のアミノ酸配列同一性を示すことを示し、ＳＡＤがその他のＣＡＤと異なる生化学的機能を有する異なる新規の酵素であることを示す。従って、ＳＡＤ蛋白質配列は、現在知られているすべてのモノリグノールＣＡＤの配列と系統学的に識別できる。
【００１４】
【表１】
2004520015.tif 000002
１：  Ｍ． ｓａｔｉｖａ， ＡＦ０８３３３２；  ２：  ＰｔＣＡＤ， ＡＦ２１７９５７；  ３：  Ｐ． ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ， ｚ１９５６８；  ４：  Ａ． ｃｏｒａｄａ， Ｄ１３９９１；  ５：  Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ， ｘ６２３４３；  ６：  Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ， ｘ６２３４４； ７：  Ｅ． ｇｌｏｂｕｌｕｓ， ＡＦ０３８５６１；  ８：  Ｅ． ｇｕｎｎｉｉ， ｘ６５６３１；  ９：  Ｚ． ｍａｙｓ， ａｊ００５７０２；  １０：  Ｚ． ｍａｙｓ， ｙ１３７３３；  １１：  Ｓ． ｏｆｆｉｎｉｎａｒｕｍ， ＡＪ２３１１３５；  １２：  Ｐ． ｒａｄｉａｄａ， ｕ６２３９４；  １３：  Ｐ． ｔａｅｄａ， ｚ３７９９２；  １４：  Ｐ． ｔａｅｄａ，  ｚ３７９９１；  １５：  Ｐ． ａｂｉｅｓ，  ｘ２７６７５； １６：  ＰｔＸＡＤ （ＰｔＳＡＤと命名される）．
【００１５】
（ＤＮＡ構築物）
本発明に従って、プロモーター配列、コード領域及びターミネーター配列を有する植物ＤＮＡであるＤＮＡ構築物が提供される。コード領域はリグニン生合成に必須であるＳＡＤ酵素をコードする。コード領域は、適宜に５０塩基の最小サイズである。遺伝子プロモーターは、導入遺伝子発現を調節するために導入遺伝子（導入遺伝子はＳＡＤ単独であってもよく、又は下記のように植物モノリグノール由来の他の酵素と一緒のＳＡＤであってもよい）の５’−末端に位置し、遺伝子終結配列は導入遺伝子の転写の終わりを知らせるために導入遺伝子の３’−末端に位置する。
本発明のＤＮＡ構築物は、適宜に形質転換によって植物のゲノムに組み込まれて、リグニン生合成を変える（例えばシリンギル富化リグニンを与える）。ＤＮＡ構築物は、本明細書で提供されるクローン、すなわちＰｔＸＡＤ（後にＰｔＳＡＤと命名される）、以下に記載されるクローン、及び遺伝コード又はその機能的等価物の縮重によって許容されるようなその変異体を含んでもよい。
本発明のＤＮＡ構築物を植物に挿入してＳＡＤ酵素の産生を調節してもよい。該構築物の性質に応じて、植物の生涯の全体にわたって、又は特定の段階で、該蛋白質の産生を増大又は低減してもよい。例えば、ＤＮＡコード配列、プロモーター、及び終結配列の配向は、リグニン生成を抑制するか、又はリグニン生成を増幅するのに役立つことができる。リグニン合成の下方調節のためには、ＤＮＡはアンチセンス配向である。リグニン生合成の増幅のためには、ＤＮＡはセンス配向であり、これにより植物ゲノムのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを提供する。この場合、ＤＮＡは全長ｃＤＮＡコピーであるのがよい。また、表皮、木部、根等のような植物の特定の細胞型を狙って遺伝子を発現させることが可能である。本発明の構築物を使用して、技術的に知られた種々の方法で、単子葉植物及び双子葉植物の両方の細胞を形質転換してもよい。多くの場合、そのような植物細胞を培養して、遺伝的に改変された植物の連続的な産生を与えるために実質的に複製する植物全体を再生してもよい。本発明に従って、安定に遺伝的に改変された植物の例としては、アスペン、ポプラ、マツ及びユーカリのような樹木が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
（プロモーター及び終結配列）
種々の遺伝子プロモーター配列は技術的によく知られており、本発明のＤＮＡ構築物で使用することができる。本発明の構築物のプロモーターは結合されたＤＮＡセグメントの発現を提供できる。また、プロモーターは誘発性であり、その結果遺伝子発現は外来性付加剤によってオン・オフできる。また、所望のＤＮＡセグメントと、植物における組織特異的発現又は発育上調節される遺伝子発現を提供するプロモーターとを組み合わせることは好ましい。
プロモーターは植物において操作するために知られるプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ、ＧＰＡＬ２、ＧＰＡＬ３及びＳＡＤ酵素の発現を調節する外来性植物プロモーター、すなわちＳＡＤ遺伝子の外来性プロモーターから選択してもよい。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら， １９８５）、又はＣａＭＶ １９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎら， １９８７）のような構成プロモーターの使用は、ターゲット植物のすべての組織タイプにおける導入遺伝子の発現を促進するために使用できる。その他のプロモーターは、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら， １９８７）、Ａｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら， １９８７）、スクロースシンターゼ（Ｙａｎｇら， １９９０）、α−チューブリン、ユビキチン、アクチン（Ｗａｎｇら， １９９２）、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら， １９８９）、ＰＥＰＣａｓｅ（Ｈｕｄｓｐｅｔｈら， １９８９）又はそれらと結合したＲ遺伝子複合体（Ｃｈａｎｄｌｅｒら， １９８９）である。一方、組織特異的プロモーターの使用は、より選択的に調節されるべき機能を与える。組織特異的プロモーターの使用は、その作用が要求される組織内にのみＳＡＤ酵素が産生されるという利点を有する。導入遺伝の発現をリグニン化が生じる発育中の木部に限定するもののような組織特異的プロモーターは、適宜に本発明のＤＮＡ構築物で使用してもよい。
ＤＮＡセグメントは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ２ｎｄ ｅｄ．（１９８２）に記載される標準的な方法によってプロモーターと結合できる。簡単に説明すると、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターのようなプロモーターを含むプラスミドはＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）に記載される通りに構築することができ、又はＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得ることができる（例えば、ｐＢＩ１２１又はｐＢＩ２２１）。典型的には、これらのプラスミドは、プロモーターから下流の異なる制限酵素に対して特異性を有する複数のクローン部位を提供するために構築される。ＤＮＡセグメントは制限酵素を用いるプロモーターから下流にサブクローニングされて、ＤＮＡがプロモーターに関して適切な配向で挿入されることを保証でき、その結果ＤＮＡは発現できる。
遺伝子終結配列は転写されるべきＤＮＡ配列の３’に位置する。技術的に知られる種々の遺伝子終結配列は本発明の構築物で使用してもよい。このようなものとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子終結配列が挙げられる（例えば、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７０４ “Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”の参考文献を参照のこと）。
【００１７】
（マーカー遺伝子）
また、マーカー遺伝子は本発明のＤＮＡ構築物に組み込まれて、導入遺伝子のポジティブな組込みを有する植物組織の選択を助けることができる。“マーカー遺伝子”は、マーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現形を与える遺伝子であり、こうしてマーカーを有しない細胞と区別されるべきそのような形質転換された細胞を与える。適したマーカー遺伝子の多くの例は技術的に知られており、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）遺伝子を含まない形質転換されない植物組織を死滅させるカナマイシン又はハイグロマイシン抗生物質に対する耐性を与えるＮＴＰ ＩＩ遺伝子は、本発明の実施において使用できる（Ｂｅｖａｎら， １９８３）。多くのその他の具体的なマーカー遺伝子は、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７０４ “Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”に記載される（本願に引用して援用する）。
【００１８】
（形質転換）
本発明のＤＮＡ構築物を有する植物、例えば樹木由来の組織又は細胞の形質転換及び続くトランスジェニック植物の産生は、技術的に知られた種々の方法によって実施できる。例えば、ＤＮＡ構築物を宿主植物組織に導入するアグロバクテリウム及びマイクロプロジェクター（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）媒介方法は、樹木種に特に適している（Ｔｓａｉら， １９９４； Ｅｌｌｉｓら， １９９３； 及び共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７０４ “Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”に記載されるその他のもの（本願に引用して援用する））。形質転換後、例えばカナマイシンのような抗生物質に対して耐性を有するトランスジェニック植物組織を選択し、培養して、技術的によく知られた方法を用いて植物全体を再生できる（Ｔｓａｉら， １９９４； Ｅｌｌｉｓら， １９９３； 及び共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７０４に記載されるその他のもの（本願に引用して援用する））。
形質転換及び再生プロトコルは容易に多くの植物種に適応できる。多くの形質転換及び再生プロトコルは植物種について発表されている（共通の出願人による同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７０４を参照のこと（本願に引用して援用する））。
【００１９】
（ＤＮＡクローン）
クェーキングアスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）由来のコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ、図１）をコードするグアイアシル経路遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＦ２１７９５７）が最初にクローン化された。このｃＤＮＡはＰｔＣＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＦ２１７９５７）と呼ばれた。大腸菌発現組換えＰｔＣＡＤ蛋白質は、コニフェリルアルデヒド及びシナピアルデヒドと組み合わせたその触媒活性によって特徴付けられた。モノリグノール生合成経路中間体はリグニン化組織に共に存在するため（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９； Ｌｉら， ２０００）、コニフェリルアルデヒド及びシナピアルデヒドの混合物によるＰｔＣＡＤ酵素活性が評価された。図５（ａ）及び（ｃ）に示されるように、反応混合物は酵素反応後ＨＰＬＣで分離された。コニフェリルアルコールのみがコニフェリルアルデヒドから生成されることが質量分析法をベースとする化学構造分析によって確認され、ＰｔＣＡＤはシナピアルデヒドとの反応を示さなかった。このように、ＰｔＣＡＤはグアイアシルモノリグノール、コニフェリルアルコールの生合成のためにコニフェリルアルデヒドとの特異的触媒反応機能を有する（図１）。また、コニフェリルアルデヒドに対するＣＡＤの基質特異性は、図１に示すように、シリンギルモノリグノール、シナピルアルコールの生合成において、本発明の他の酵素ＳＡＤが必要であることを確信させる。
上述のように、異なるクローン化戦略を立てて、ＣＡＤと区別できる配列をベースにして候補ＳＡＤ遺伝子を分離した。プローブとしてＰｔＣＡＤ ｃＤＮＡを用いて、クェーキングアスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）木部ｃＤＮＡライブラリーから１．８×１０４ｐｆｕの低及び高ストリンジェンシー特異的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）スクリーニング（本明細書の実施例２により詳細に記載される）により、配列分析に基づいて、ポジティブクローン（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）の２つのグループ、すなわちグループＩ配列及びグループＩＩ配列を分離した。１２のクローンのグループＩ配列はＰｔＣＡＤと同一であり、グループＩＩ ｃＤＮＡの配列は互いに同一であるが、ＰｔＣＡＤとは異なっていた。グループＩＩの８つのクローンのうち２つは全長ｃＤＮＡであり、ＰｔＳＡＤと命名した。ＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡ（配列番号１）は１，４４６−ｂｐの長さであり、３８，９９１の計算されたＭＷ及び６．６９のｐＩを有する３６２アミノ酸（配列番号２）のＯＲＦをコードする。共通のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨｓ）で同定された補助因子及び亜鉛結合配列（Ｊｏｒｎｖａｌｌら， １９８７； Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら， １９９２； Ｇａｌｌｉａｎｏら， １９９３）はＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡで見つかった。Ｚｎ１結合モチーフ及び構造Ｚｎ２コンセンサスは、それぞれアミノ酸残基７１〜８５及び残基９１〜１１７に位置していた。ＮＡＤＰ−結合部位は残基１９１〜１９６で同定された。
【００２０】
さらに、ＰｔＳＡＤは他の公知のすべての全長モノリグノールＣＡＤに対して約５０％のアミノ酸配列同一性のみを示した（上記表１を参照のこと）。しかしながら、病原体防御機能と関係があると考えられるＡＤＨ（Ｊｏｒｎｖａｌｌら， １９８７； Ｂｒｉｌｌら， １９９９）に対して明らかに低いアミノ酸配列同一性（１０〜４０％）を示した。これらの配列の特徴は、ＰｔＳＡＤが一般に公知のモノリグノールＣＡＤと区別できるＡＤＨの新しいクラスに属することを確信させる。これは、ＰｔＳＡＤの系統学的分析によって完全に支持され、入手可能な全長モノリグノールＣＡＤ蛋白質配列は、これらのモノリグノールＣＡＤ（図３）がＰｔＳＡＤと明らかに区別されるクラスターを形成することを示している。モノリグノールＣＡＤのこのクラスターは、グアイアシル特異的ＰｔＣＡＤ及びテーダマツ及びエゾマツ由来のＣＡＤを有するこれら遺伝子の広範なアミノ酸配列類似性（約８０〜９８％）の点でグアイアシル特異的であり、単一コピー遺伝子は裸子植物におけるグアイアシルモノリグノールの生合成に関係する（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら， １９９２； Ｇａｌｌｉａｎｏら， １９９３； ＭａｃＫａｙら， １９９５）。従って、系統学的分析は、グアイアシルＣＡＤ系統学的グループのより多くのシリンギル特定グループへの古代の分枝が反映され、ＰｔＳＡＤはそれに属している。ＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡプローブによるクェーキングアスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）木部ｃＤＮＡライブラリーからｐｆｕの独立した組の繰り返しのスクリーニングは、常にＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤと同一であるクローンの分離を生じ、リグニン化木部、ＣＡＤ及びＳＡＤの２つの主なモノリグノールを示している。
ＰｔＳＡＤ遺伝子の生化学的機能を示すために、ＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡを大腸菌で発現させてその組換え蛋白質を産生した。コニフェリルアルデヒドが単独でＰｔＳＡＤ組換え蛋白質と共にインキュベートされた場合、酵素反応産生のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、ＰｔＳＡＤがコニフェリルアルデヒドに対して７８６ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質の特異的活性を有することを示した。しかしながら、ＰｔＳＡＤはシナピアルデヒドに対して６９６４ ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ蛋白質の特異的活性を有し、シナピアルデヒドに対するＰｔＳＡＤの触媒効率はコニフェリルアルデヒドに対するものよりも９倍高いことを示している。従って、ＰｔＳＡＤはシナピアルデヒドに特異的であり、ＳＡＤシナピルアルコールデヒドロゲナーゼはシナピアルデヒドのシナピルアルコールへの変換を触媒する。
【００２１】
ＰｔＳＡＤのシナピアルデヒド特異性の証拠はコニフェリルアルデヒド及びシナピアルデヒドの混合物とのＰｔＳＡＤ組換え蛋白質反応に由来する。コニフェリルアルデヒド及びシナピアルデヒドの混合物とのＰｔＳＡＤの反応のＨＰＬＣ−ＭＳ分析（図５）は、シナピルアルコールがシナピアルデヒド由来の排他的な産物であり、インビボ状況でＰｔＳＡＤがコニフェリルアルデヒドと反応しないことを結論的に示した。
従って、まとめると、ＣＡＤはグアイアシルモノリグノール、コニフェリルアルコールの生成にグアイアシル特異的であり、ＳＡＤはシリンギルモノリグノール、シナピルアルコールの排他的生合成を触媒する。さらに、これらの結果は、グアイアシル及びシリンギルリグニンの細胞特異的生合成を組み合わせる場合に、ＣＡＤ及びＳＡＤ蛋白質について植物における異なる役割を示唆する。
このＳＡＤ酵素をコードするｃＤＮＡは、ここで初めてクローン化された。ＳＡＤ酵素の存在は植物におけるシリンギルリグニンの生合成に必須であり、ＳＡＤ遺伝子のトランスジェニック植物への組み込みは植物におけるシリンギルリグニンの成功した操作のための実効可能なメカニズムであることが結論付けられた。
本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明される。
【００２２】
実施例１：アスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）からのＳＡＤ ｃＤＮＡの分離
アスペン発育木部ｃＤＮＡライブラリーを製造者プロトコル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に従ってλｇｔ２２Ａベクターに構築した。アスペンＣＡＤ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＦ２１７９５７）をプローブとして使用し、高及び低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でｃＤＮＡライブラリーを分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）選別した。ｃＤＮＡライブラリーからの約６，０００ｐｆｕを４つの異なるナイロン膜に置いた。２つのそのようなブロット膜を低ストリンジェンシー条件（５０℃）下で、その他の２つを高ストリンジェンシー（６５℃）で 、３２Ｐ−標識ＣＡＤ ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズした。このようにして、合計１８，０００ｐｆｕを選別した。高又は低ストリンジェンシーのいずれかの条件下でプローブした膜で高密度ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。しかしながら、低密度シグナルは低ストリンジェンシー条件下でプローブした膜でのみ検出した。高ストリンジェンシー膜の高密度シグナルを低ストリンジェンシー膜の高密度シグナルと完全に並べて、低密度シグナルを有するポジティブクローンの分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）分離を可能にした。高密度クローンにより、アスペンＣＡＤ ｃＤＮＡであることを確認した。さらに、単一のクローンが分離されるまで、低密度シグナルを有するポジティブを選別した。次いで、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩクローニング部位を介して、精製したλｇｔ２２ＡクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ／Ｋプラスミドベクターにサブクローニングした。解読結果は、分離したｃＤＮＡクローンが１，４２５−ｂｐ長（配列番号１）であり、アスペンＣＡＤ蛋白質と５３％の配列同一性を示す３６２アミノ酸蛋白質（配列番号２）をコードすることを示した。このｃＤＮＡクローンは、始めにＰｔＸＡＤと命名され、次いでその生化学的機能が確認された後ＳＡＤと改名された。
低ストリンジェンシー条件下でのみプローブとハイブリダイズしたクローンの配列は互いに同一であったが、ＰｔＣＡＤとは異なっていた。これらの低ストリンジェンシープローブハイブリダイジングクローンの２つは全長ｃＤＮＡであることが分かり、それらをＰｔＳＡＤと命名し、両方向で配列決定（ＡＢＩ３１Ｏ； Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）した（ＢｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２７３２５６）。
【００２３】
実施例２：アスペン由来の新規アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＰｔＳＡＤのクローニング
被子植物におけるＣＡＤ及びＳＡＤ遺伝子が別個であるとの仮説を検証するために、ＣＡＤ ｃＤＮＡ、ＰｔＣＡＤをアスペンの発育する木部からクローン化し、使用して同じ種における関連した配列を選別した。アスペン木部ｃＤＮＡライブラリーから２．４×１０４プラーク形成単位の低及び高ストリンジェンシー分化選別して（Ｗｕら， ２０００）、その結果ポジティブクローンの２つのグループを分離した。グループＩには、ＰｔＣＡＤと同一の配列を有する１２のｃＤＮＡｇａ
含まれた。グループＩＩを構成する８のｃＤＮＡの配列は互いに同一であったが、ＰｔＣＡＤとは異なっていた。グループＩＩの８のクローンのうち２つは全長ｃＤＮＡであり、暫定的にＰｔＳＡＤと名付けた。
ＰｔＳＡＤのオープンリーディングフレームは１０８６ｂｐであり、６．６９のｐＩを有する３９−ｋＤ蛋白質をコードする。ＰｔＳＡＤの推定アミノ酸配列はＰｔＣＡＤの推定アミノ酸配列と５３％の同一性であり、その他の被子植物のモノリグノールＣＡＤの推定アミノ酸配列と約５０％の同一性であったが、病原体防御と関連したアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の配列とは、わずかな同一性（１０〜４０％）しか示めさなた（Ｂｒｉｌｌら， １９９９）。一方、ＰｔＣＡＤは、ポプルストリコカルパとポプルスデルタイデスの雑種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄｅｌｔａｉｄｅｓ）（９７％）（ＰｔＣＡＤＡ； Ｖａｎ Ｄｏｏｒｓｓｅｌａｅｒｅら， １９９５）、ユーカリグンニイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕｎｎｉｉ）（８１％）（ｐＥｕＣＡＤ２； Ｇｒｉｍａ−Ｐｅｔｔｅｎａｔｉら， １９９３）、タバコ（８２％）（ｐＴＣＡＤ１４； Ｋｎｉｇｈｔら， １９９２）、アルファルファ（ｌｕｃｅｒｎ）（７９％）（ＭｓａＣａｄ２； Ｂｒｉｌｌら， １９９９）、及びその他の報告された被子植物（約８０％）（Ｂｒｉｌｌら， １９９９）由来のＣＡＤと広範なアミノ酸配列同一性を示した。従って、ＰｔＳＡＤはＡＤＨの新規クラスに属する。
ＡＤＨにおいて保存される補助因子及び亜鉛結合配列（Ｊｏｒｎｖａｌｌら， １９８７）はＰｔＳＡＤに存在した（図１）。Ｚｎｌ結合モチーフ及び構造Ｚｎ２コンセンサス領域（Ｊｏｒｎｖａｌｌら， １９８７； ＭａｃＫａｙら， １９９５）は、それぞれアミノ酸残基７１〜８５及び９１〜１１７に位置していた。ＮＡＤＰ結合部位（Ｊｏｒｎｖａｌｌら， １９８７）は残基１９１〜１９６と同一であった。ＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡプローブによるアスペン木部ｃＤＮＡライブラリーの繰り返しの選別は、常にＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤのいずれかと同一であるクローンの分離を生じ、それらがリグニン化木部の２つの主要なモノリグノール関連ＡＤＨであることを示す。
ＰｔＳＡＤの系統学的分析及び入手可能な全長モノリグノールＣＡＤ蛋白質配列は、裸子植物及び被子植物のＣＡＤがＰｔＳＡＤを含まないクラスターを形成することを示した（図２）。このクラスターにおける被子植物のモノリグノールＣＡＤは裸子植物のＣＡＤと約７０％アミノ酸配列同一性を共有するが、ＰｔＳＡＤとは約５０％アミノ酸配列同一性を共有し、これらのすべての被子植物の推定モノリグノールＣＡＤがグアイアシル特異的であるかもしれないことを示唆する。また、これらの結果はグアイアシルＣＡＤ系統学的グループのよりシリンギル特異的なグループへの分岐を反映し、ＰｔＳＡＤはそれに属する。
【００２４】
実施例３：ＤＮＡ及びＲＮＡゲルブロット分析
種々のアスペン組織由来のアスペンゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡを記載される通りに分離した（Ｌｉら， １９９７； Ｈｕら， １９９８）。アスペンにおいてその他のＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ関連配列があるかどうかを決定するために、種々の制限酵素によって消化し、ＰｔＣＡＤ（図４Ａ）又はＰｔＳＡＤ（図４Ｂ）全長ｃＤＮＡプローブのいずれかでハイブリダイズしたアスペンゲノムＤＮＡについて、ゲルブロット分析を行った。ＤＮＡ及びＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションを高ストリンジェンシー条件下で行った（Ｈｕら， １９９８）。プローブは、ＤＥＣＡプライム（ｐｒｉｍｅ）ラベリングシステム（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）を用いてα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって標識化したＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤ ｃＤＮＡであった。
各レーンには強い単一のバンドがあったが、おそらく関連性の薄い配列である証拠の弱い単一のバンドも各レーンで検出された。我々のｃＤＮＡ選別結果と合わせて、これらのデータは、おそらくＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤがアスペンにおける小さな遺伝子ファミリーの主要なメンバーであることを示していると解釈される。
また、ＤＮＡゲルブロット分析は、明らかにＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤが互いにクロスハイブリダイズしないことを示した。従って、同じハイブリダイゼーション条件及びＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ全長ｃＤＮＡプローブを用い、ＲＮＡゲルブロット分析を行ってアスペンにおけるＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの組織特異的発現を調べた。最大ＰｔＣＡＤ発現は多量のリグニン化木部を含む組織タイプで見られるが、その発現は師部富化組織においてはより低い（節間１〜３；図４Ｃ）。ＰｔＳＡＤの強い発現は早い師部（節間１〜３；図４Ｄ）及び木部（節間４〜９；図４Ｄ）発育を経験する組織において検出された。ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの発現は維管束中間葉脈（ｖａｓｃｕｌａｒ ｍｉｄ−ｖｅｉｎｓ）が取り除かれた葉において観測されなかった。
また、蛋白質ゲルブロット分析を行って、ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの組織特異的発現を検証した。ポリクローナル抗血清を大腸菌で産生したアフィニティー精製ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ組換え蛋白質に対して得て、蛋白質ゲルブロットを使用してＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ組換え蛋白質に対するＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ抗体の特異性を検証した。テストした種々の組換え蛋白質量（７５ｎｇまで）の場合、ＰｔＣＡＤ抗体はＰｔＳＡＤ蛋白質と交差反応せず（図４Ｅ）、ＰｔＳＡＤ抗体はＰｔＣＡＤ蛋白質と交差反応しなかった（図４Ｆ）。ＰｔＣＡＤ蛋白質は約３９ｋＤの予想分子量を示し、師部組織由来よりも木部由来の蛋白質抽出物で豊富であった（図４Ｅ）。対照的に、ＰｔＳＡＤ抗体を用いる最も強いシグナルは師部蛋白質抽出物で検出された（図４Ｆ）。ＲＮＡ及び蛋白質ゲルブロット分析は、ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの両方がリグニン化と関係することを一貫して示した。シリンギルリグニン富化師部における強いＰｔＳＡＤ発現（Ｇｒａｎｄら， １９８２）はシリンギルモノリグノール生合成におけるＰｔＳＡＤの特定化された役割を示唆する。従って、本明細書において特徴付けられたものは、ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ遺伝子の生化学的機能である。
【００２５】
実施例４：酵素活性の決定
アミノ酸配列番号２を有するアスペンＳＡＤの酵素活性を決定するために、以下の実験を行った。
（ｉ）ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ組換え蛋白質の発現及び精製及び植物蛋白質抽出物の調製  ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤのコード配列を、その開始及び終止コドンのすぐ上流のＮｄｅｌ及びＮｏｔ１部位に導入するために設計されたプライマー、センスプライマー配列番号３（５’ＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＣＣＡＧＡＡ３’）及びアンチセンスプライマー配列番号４（５’ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＴＧＣＣＡＡ３’）を用いるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ２３ ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のＮｄｅｌ及びＮｏｔ１部位にクローン化して、クローン化配列のカルボキシル末端でＨｉｓ ｔａｇを融合した。配列確認後、操作されたｐＥＴ２３ ｂ＋構築物を大腸菌宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。組換えＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの誘導及び精製を記載された通りに行った（Ｌｉら， ２０００）。分化する茎木部（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｘｙｌｅｍ）をアスペン、アサダ（Ｏｓｔｒｙａ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、キハダカンバ（ｙｅｌｌｏｗ ｂｉｒｃｈ）（Ｂｅｔｕｌａ ａｌｌｅｇｈａｎｉｅｎｓｉｓ）、サトウカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、アメリカハナノキ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、モミジバフウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒ ｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ）、及びテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）から成長期の間に収集し、使用して記載される通りに粗蛋白質抽出物を分離した（Ｌｉら， ２０００）。
【００２６】
（ｉｉ）抗ＰｔＣＡＤ及び抗ＰｔＳＡＤ抗体の調製及び蛋白質ゲルブロット分析
アフィニティー精製ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ組換え蛋白質を使用してウサギを免疫した（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ， ＴＸ）。１：３０００に希釈した抗体を木部粗蛋白質の蛋白質ゲルブロット分析で使用した（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９）。蛋白質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイシステムで決定した。
【００２７】
（ｉｉｉ）ＳＡＤ酵素活性アッセイ
ＳＡＤ酵素反応を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５００μＭの基質シリンギルアルデヒド（又はコニフェリルアルデヒド）、１μｇの組換えＳＡＤ蛋白質、２．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び５００μＭのＮＡＤＰＨを含む最終容積３００μｌで、種々のｐＨ（５．４、６．０、６．４、７．０、７．４、８．０又は８．４）で行った。３０℃で１０分後、反応を終了して、０．５ｍｌの酢酸エチルで抽出した。抽出を４回繰り返し、混合した酢酸エチルを蒸発させて、以前に行った（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９； Ｌｉら， ２０００）反応生成物のＬＣ−ＭＳ同定及び定量化のためにＨＰＬＣ移動可能な相に溶解した。ＳＡＤ反応の場合、７．０のｐＨが最適であることが分かった。従って、混合した基質、シナピアルデヒド及びコニフェリルアルデヒドとのＳＡＤ反応を最適ｐＨ ７．０で、上述の条件下で行った。
【００２８】
（ｉｖ）酵素機能及び反応速度論のＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析
塩基性酵素反応混合物は、５００μＬの最終容積中に５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５００μＭのＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰ、精製組換え蛋白質（煮沸した蛋白質をコントロールとして使用した。）、及びフェノール基質を含む。基質特異性テストのために、５００μＭのアルデヒド基質及び１μｇの精製組換えＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤ蛋白質（約２５ｐｍｏｌ）を使用した。酵素ｐＨの最適条件を表すために、上述の基質及び組換えＰｔＣＡＤ又はＰｔＳＡＤ蛋白質濃度をｐＨ ５〜８．５のリン酸ナトリウム緩衝剤で使用した。すべての反応を３０℃で１０分間行った。
正常な抑制運動の分析の場合、反応時間は４分であり、ｐＨはＰｔＣＡＤ（１．２μｇの精製組換え蛋白質）で８．０、ＰｔＳＡＤ（０．１μｇ）で７．０である。速度論のために、種々の濃度（０．５〜２００μＭ）のｐ−クマルアルデヒド、カフェアルデヒド（ｃａｆｆｅａｌｄｅｈｙｄｅ）、コニフェリルアルデヒド、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド、又はシナピアルデヒドを使用してＫｍ、Ｖｍａｘ、及び酵素代謝回転数ｋｃａｔを測定した。抑制速度論のために、シナピアルデヒド（１〜２００μＭ）のＰｔＣＡＤ−媒介還元を１〜５μＭのコニフェリルアルデヒドの存在下で分析し、コニフェリルアルデヒド（１〜２００μＭ）のＰｔＳＡＤ−触媒反応を１〜５μＭのシナピアルデヒドの存在下で分析した。すべての反応を１０μＬの６Ｎ ＨＣＩ（ｐＨを２にするため）及び５００ｎｇの内部標準ｏ−クマル酸の添加により終結させ、ＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳにより分析した。
１００μＬの反応混合物の一定分量を、直接Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−ＡＢＺカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ×５μｍ； Ｓｕｐｅｌｃｏ， Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）に、自動試料注入により注入し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）１１００液体クロマトグラフィーシステムによって４０℃及び０．２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で定組成（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）で分離した。勾配プログラムは１０ｍＭのギ酸中の２０％アセトニトリル、ｐＨ ２．５、１２分間、２０〜１００％のアセトニトリル、１２〜１６分であり、１００％のアセトニトリルに５〜１０分間保持し、検出はＨＰ １１００ダイオードアレイ検出器及び気圧電離エレクトロスプレー（ｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）源を有するＨＰ １１００液体クロマトグラフィー−ＭＳ検出器システムにより陰イオンモードで行った。生成物及び標準試料（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄ）のイオン断片化パターンをＭＳスキャンニングモード７０Ｖで比較することにより、反応生成物を同定し、確認した。生成物の量及びＫｍ、Ｖｍａｘ、ｋｃａｔ、及び見掛け上の抑制定数（Ｋｉ）値（平均±ＳＥ）を記載される通りに決定した（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９； Ｌｉら， ２０００）。種々の基質を用いるＣＡＤ酵素（すなわち、表２）及びＳＡＤ酵素（すなわち、表３）の両方について、抑制速度論の結果を以下に記載する。
【００２９】
【表２】
2004520015.tif 000003
【００３０】
【表３】
2004520015.tif 000004
【００３１】
実施例５：アスペン茎モノリグノール組成の化学合成及びチオ酸分解（ｔｈｉｏａｃｉｄｏｌｙｓｉｓ）分析
以下のものを除いて、すべてのアルデヒド及びそのアルコール誘導体をＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ｐ−クマルアルデヒド、ｐ−クマリルアルコール、カフェアルデヒド、カフェイルアルコール、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド、及び５−ヒドロキシコニフェリルアルコールを記載される通りに対応するベンズアルデヒド誘導体から化学的に調製した（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９； Ｌｉら， ２０００）。これらの化合物の構造的同一性は１Ｈ−ＮＭＲによって確認した。ｐ−クマルアルデヒド： δ （アセトン−ｄ６； 標準炭素数を使用した。） ６．４８（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ１ ＝ １５．９， Ｊ２ ＝ ７．８， Ｃ８Ｈ）， ６．８０ （２Ｈ， ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ７．４６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．８， Ｃ７Ｈ）， ７．４８ （２Ｈ， ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ９．５０ （１Ｈ， ｄ， Ｃ９Ｈ）； ｐ−クマリルアルコール： δ （アセトン−ｄ６） ４．１８ （２Ｈ， ｄｄ， Ｊ１ ＝ ４， Ｊ２ ＝ １， Ｃ９Ｈ）， ６．１９ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ１ ＝ １５．９， Ｊ２ ＝ ５．５， Ｃ８Ｈ）．  ６．４９ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９， Ｃ７Ｍ）， ６．７８ （２Ｈ， ｍ， Ａｒ−Ｈ）， ７．２６ （２Ｍ， ｍ， Ａｒ−Ｈ）； カフェアルデヒド： δ （アセトン−ｄ６） ６．５３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ１ ＝ １５．７， Ｊ２ ＝ ７．６， Ｃ８Ｈ）， ６．９０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．９， Ｃ５Ｈ）， ７．１０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ１ ＝ ７．９， Ｊ２ ＝ ２．１， Ｃ６Ｈ）， ７．２０（１Ｈ， ｄ， Ｊ ２．１， Ｃ２Ｈ）， ７．５１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．７， Ｃ７Ｈ）， ９．６１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６， Ｃ９Ｈ）； カフェイルアルコール： δ （アセトン−ｄ６） ４．１７ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ５．５， Ｃ９Ｈ）， ６．１４ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ１ ＝ １５．９， Ｊ２ ＝ ５．５， Ｃ８Ｈ）， ６．４３ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ１ ＝ １５．９， Ｊ２ ＝ １．５， Ｃ７Ｈ）， ６．７５ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．５， Ｃ５Ｈ， Ｃ６Ｈ）， ６．９２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．５， Ｃ２Ｈ）； ５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド： δ （アセトン−ｄ６） ３．８８ （３Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ６．６０ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ１ ＝ １５．６， Ｊ２ ＝ ７．８， Ｃ８Ｈ）， ６．８８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．７， Ｃ６Ｈ）， ６．９５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．７， Ｃ２Ｈ）， ７．５０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．６， Ｃ７Ｈ）， ９．６１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．８， Ｃ９Ｈ）； ５−ヒドロキシコニフェリルアルコール： δ （アセトン−ｄ６） ３．８７ （３Ｈ， ｓ， ＯＣＨ３）， ４．２８ （２Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ５．５， Ｃ９Ｈ）， ６．２０ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ１ ＝ １５．９， Ｊ２ ＝ ５．５， Ｃ８Ｈ）， ６．４７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １５．９， Ｃ７Ｈ）， ６．５１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．８， Ｃ６Ｈ）， ６．６４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ １．８， Ｃ２Ｈ）。モノリグノール組成の分析のために、アスペン茎節間をベンゼン／アルコールで抽出し、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＭＳ）ベースチオ酸分解に供した（Ｒｏｌａｎｄｏら， １９９２； Ｔｓａｉら， １９９８）。
【００３２】
実施例６：組織化学的リグニン分析、免疫局在性、及び顕微鏡観察
リグニンの組織化学的局在性のために、４月齢の温室成長アスペン植物（クローン２７１）の茎節間から新しいハンドカット部分（約２０μｍ厚）を、新たに調製した飽和塩素処理水で１０分間４℃で直ちにインキュベートした。水で３回洗浄した後、その部分を４％の亜硫酸ナトリウムで室温で５分間インキュベートし、５０％のグリセロールで固定し、Ｎｉｋｏｎ（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）Ｅｃｌｉｐｓｅ ４００蛍光顕微鏡を用いて写真を撮った。組織化学的分析で使用した同じ節間由来のセグメント（約１ｍｍ厚）をＷｉｔｔｉｃｈら（１９９９）のプロトコルに基づいて、改変して免疫局在性で使用した。セグメントを０．１ＭのＰＢＳ（４ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．４、及び２００ｍＭのＮａＣｌ）中の４％のパラホルムアルデヒドに１２時間４℃で固定した。ＰＢＳで２時間４℃で洗浄した後、セグメントをエタノール系で脱水し、浸潤し、ブチルメチルメタクリレートで包埋した。
重合はＵＶ照射下（３６５ｎｍ）で４０時間−２０℃でＵＶＣ２ ＣＲＹＯチャンバー（ＰＥＬＣＯ， Ｒｅｄｄｉｎｇ， ＣＡ）中で行った。Ｌｅｉｃａ（ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）ＲＭ ２１５５ミクロトームによりセクション（３μｍ厚）を調製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／ｐｌｕｓ（Ｆｉｓｈｅｒ）スライドに固定した。スライドをアセトンですすいでセクションからブチルメチルメタクリレートを取り除き、エタノール系で再水和させ、最初に０．１Ｍのヒドロキシアンモニウムクロリドにより５分間、次いで１％のＢＳＡにより３０分間室温でブロックした。抗ＰｔＣＡＤ抗体、抗ＰｔＣＡｌｄ５Ｈ抗体（Ｏｓａｋａｂｅら， １９９９）、抗ＰｔＡｌｄＯＭＴ抗体（Ｌｉら， ２０００）、又は抗ＰｔＳＡＤ抗体（１：５００の希釈で）により２時間３７℃でのインキュベーション後、スライドを０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、アルカリホスファターゼ（１：１００； Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共役したヤギ抗ウサギ抗体により１．５時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、抗ＰｔＳＡＤ抗体、抗ＰｔＣＡｌｄ５Ｈ抗体、又は抗ＰｔＡｌｄＯＭＴ抗体でインキュベートしたスライドをｐＨ ９．５でジメチルホルムアミド及びニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートの混合物と反応させ、抗ＰｔＣＡＤ 抗体によりインキュベートしたそれらをＦａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。両処理は２０〜３０分間室温で行った。免疫前の血清をコントロールとして使用した。次いで、スライドを５０％のグリセロールに固定し、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ４００顕微鏡で観察し、Ｓｏｎｙ（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）ＤＫＣ−５０００デジタル写真カメラを用いて像を撮影した。
【００３３】
実施例７：アスペン茎脈管組織におけるグアイアシル及びシリンギルリグニン分布の組織化学的及び化学的検出
ＰｔＣＡＤ／ＰｔＳＡＤとグアイアシルシリンギルリグニン生合成の間のインサイツ関係を、アスペン茎の脈管システムにおけるグアイアシル及びシリンギルリグニンの分布を分析することによって同定した。シリンギルリグニンをグアイアシルリグニンからインサイツでＣｒｏｓｓ／Ｂｅｖａｎ又はＭａｕｌｅ呈色反応によって色素生産的に区別できる（Ｎａｋａｎｏ及びＭｅｓｈｉｔｓｕｋａ， １９９２）。これらの２つの方法におけるリグニンベース発色団形成メカニズムは同じである。シリンギル環の塩素処理により、ピンク色（リグニン化する細胞）又は赤色（リグニン化した細胞）を誘導し、グアイアシル環では淡褐色（リグニン化する細胞）から暗褐色（リグニン化した細胞）を生成する（Ｂｌａｎｄ， １９６６； Ｗａｒｄｒｏｐ， １９８１）。その緩やかな反応条件のために、Ｃｒｏｓｓ／Ｂｅｖａｎ法をこれらの実験で使用し、Ｍａｕｌｅ呈色反応の際にしばしば生じる薄組織断片破壊の問題を回避した。
１次脈管組織において、茎節間１及び４の間の原生木部及び後生木部の褐色の染色によって明らかなように（図７Ａ及び７Ｂ）、木部においてのみグアイアシルタイプであるリグニンを観測した。さらに、これは、グアイアシルモノマーの排他的な検出を示す茎リグニンのチオ酸分解分析によって確認された（図７Ｄ）。１次木部は純粋なグアイアシルリグニンを含む茎組織のみとして残る（図７Ｅ〜７Ｇ）。茎節間５及びそれ以上の化学分析によって示されるように、グアイアシルシリンギルリグニンは２次脈管システムの分化の際に見られる（図７Ｈ）。しかし、２次木部におけるシリンギルリグニンの堆積は、発育、部分的リグニン化、及び広範なリグニン化２次木部成分における明るい淡褐色からピンクへ、次いで赤への色変化によって明らかなように、グアイアシルリグニンの堆積を伴う（図７Ｇ）。これは、被子植物の木部細胞におけるグアイアシルリグニン、続くシリンギルリグニンの報告された連続的な堆積と一致する（Ｔｅｒａｓｈｉｍａら， １９８６； Ｓａｋａ及びＧｏｒｉｎｇ， １９８８）。
凝集した原生篩部柔細胞、１次篩部繊維の前駆物質（Ｅｓａｕ， １９６５）は１次成長組織に存在したが（図７Ａ〜７Ｃ）、これらの細胞は、おそらく２次壁肥厚の欠如のために、リグニンについて染色されなかった。また、それらは、一旦リグニン化し、２次肥厚が開始すると、グアイアシルリグニンについて染色しなかった（図７Ｉ）。代わりに、シリンギルポジティブピンク（図７Ｉ）から赤色（図７Ｅ及び７Ｆ）への呈色は、それらが繊維へと分化されるこれらの細胞において優性である。実際、篩部繊維はシリンギルリグニンにおける濃縮で知られているが、それらはグアイアシルシリンギルリグニンを蓄積する（Ｇｒａｎｄら， １９８２）。共に、これらの観測は２次木部成分におけるリグニン化結果と正反対に、シリンギルリグニンの生合成は、１次篩部繊維におけるグアイアシルリグニンの生合成に優先し、圧倒する。
免疫局在性を使用して、ＰｔＣＡＤがグアイアシルリグニン合成１次木部と関連するかどうか、及びＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの分布が篩部及び木部成分におけるグアイアシル及びシリンギルリグニン堆積パターンに従っているかどうかを検証した。他のシリンギル経路蛋白質ＰｔＣＡｄ５Ｈの分布も分析した。
【００３４】
実施例８：アスペン茎節間におけるＰｔＣＡＤ、ＰｔＣＡｄ５Ｈ、及びＰｔＳＡＤの免疫局在性
ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ抗体の特異性を検証した（図４Ｅ及び４Ｆ）蛋白質ゲルブロット分析の際の条件と同じ条件を細胞免疫局在性に適用した。ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート基質との抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ反応後、ＰｔＳＡＤ及びＰｔＣＡｌｄ５Ｈを細胞切片において可視化した。ＰｔＣＡＤシグナルをＦａｓｔ Ｒｅｄ基質で可視化した。連続切片を分析した。抗ＰｔＣＡＤ、抗ＰｔＳＡＤ、又は抗ＰｔＣＡｌｄ５Ｈ抗血清が免疫標識シグナルを与えないため（データは示さない。）、免疫前の血清を同じ蛋白質濃度で使用した。３次節間で、ほぼ例外なく発育する後生木部導管においてＰｔＣＡＤを検出した（図８Ａ）。ＰｔＳＡＤは後生木部導管で検出されなかったが、原生篩部柔細胞及び柔組織貯蔵組織、髄冠において最も目立っていた（図８Ｂ）。
ＰｔＣＡｌｄ５Ｈの細胞分布（図８Ｃ）はＰｔＳＡＤの細胞分布と一致した。３次節間で、リグニン化及び２次壁肥厚は後生木部導管で始まるが、原生篩部柔細胞では始まらない（図７Ａ〜７Ｃ）。ＰｔＳＡＤ及びＰｔＣＡｌｄ５Ｈのこれらの細胞における検出にもかかわらず（図８Ｂ及び８Ｃ）、一貫して、原生篩部柔細胞ではリグニン呈色反応を観測しなかった（図７Ａ）。しかし、節間６で、シリンギルリグニン堆積（図７Ａ）及びＰｔＳＡＤシグナル（データは示さない。）の両方が１次篩部繊維への分化を起こすこれらの細胞で観測された。第８節間で、ＰｔＳＡＤシグナルはこれらの分化繊維細胞で減少し（図８Ｅ）、これらの細胞におけるシリンギルモノリグノール生合成が完了に近づくことを示している（図７Ｅ）。
この段階で、ＰｔＣＡＤはこれらの成熟繊維におけるＰｔＳＡＤよりも目立っており（図８Ｄ）、グアイアシルモノリグノールの活発な生合成を示している。１次篩部が分化の求心過程を継続したため、新しい原生篩部柔細胞は茎の中心に向かって成熟繊維に隣接して見られる。これらの新しい１次篩部繊維前駆物質（Ｅｓａｕ， １９６５）はＰｔＳＡＤによって標識されたが（図８Ｅ）、ＰｔＣＡＤではされなかった（図８Ｄ）。節間１２で、ＰｔＳＡＤシグナルは１次篩部繊維で見られず（図８Ｉ）、これらの細胞におけるシリンギルモノリグノール生合成の完了を示唆する。しかし、ＰｔＣＡＤシグナルはこれらの成熟繊維において強く残った（図８Ｈ）。節間１５で、ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤのいずれも完全にリグニン化されたこれらの繊維において検出されなかった（データは示さない。）。これらの結果は、シリンギルリグニンの生合成が１次篩部繊維におけるグアイアシルリグニンの生合成を進めることを示す組織化学的リグニン局在性の結果と一致する。
しかし、これらの前形成層誘導１次篩部成分及び２次木部は対照的なリグニン化結果を示す。ＰｔＣＡＤは、ＰｔＳＡＤの前に木部紡錘状始原細胞において見られ（図８Ｈ及び８Ｉ）、シリンギルリグニンの生合成が２次木部においてグアイアシルリグニンの生合成に遅れることの化学的及び組織化学的証拠と一致する。さらに、分化２次木部において、ＰｔＣＡＤシグナルは成熟導管において最も目立っているが（図８Ｆ及び８Ｈ）、また発育繊維及び放射組織細胞においても強い。ＰｔＳＡＤシグナルはシリンギルリグニン富化放射及び軸方向組織細胞において最も強く（図８Ｇ）（Ｗａｒｄｒｏｐ及びＤａｄｓｗｅｌｌ， １９５２； Ｍｕｓｈａ及びＧｏｒｉｎｇ， １９７５）、成熟繊維細胞において目立っているが、発育導管にはほとんどなかった（図８Ｇ及び８Ｉ）。２次木部におけるこれらの蛋白質分布パターンはより古い節間を介して維持された（データは示さない。）。これらの結果及び組織化学的観測は、ＰｔＣＡＤがグアイアシルリグニン合成に特定化する細胞と関連し、ＰｔＳＡＤ及びＰｔＣＡｄ５Ｈが富化シリンギルリグニンを含む脈管成分と関連することを一貫して示した。
【００３５】
実施例９：形質転換植物におけるシリンギル富化リグニンの産生
以下の形質転換は植物におけるシリンギル富化リグニンの産生を説明する。
Ａ．被子植物におけるシリンギル富化リグニンを産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって、及び任意の適した形質転換システムを介して誘導されるセンスＳＡＤ遺伝子で形質転換される。
Ｂ．裸子植物におけるシリンギル富化リグニンを産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって、及び任意の適した形質転換システムを介して誘導されるセンスＳＡＤ遺伝子で形質転換される。
本発明は、ある特異性によって本明細書で説明及び例示され、当業者は、本明細書に記載される本発明において行ってもよい、変異、付加及び脱落を含む種々の変更を理解するであろう。従って、これらの変更も本発明によって包含され、本発明の範囲は特許請求の範囲で適法に与えられる広範な解釈によってのみ限定されることを意図する。
【００３６】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【図１】コニフェリルアルコール及びシナピルアルコール産生の植物モノリグノール経路の概略図である。
【図２Ａ】ＳＡＤポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２Ｂ】対応するＳＡＤアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】アスペンＳＡＤ及び植物ＣＡＤの系統発生分析である。
【図４】アスペンＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの分子キャラクタリゼーションを示す。
【図５】組換えＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤ反応のＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析を示す。
【図６】ＰｔＣＡＤ及びＰｔＳＡＤの抑制速度論を示す。
【図７】アスペンの茎のグアイアシル及びシリンギルリグニンの位置を示す。
【図８】アスペンの茎のＰｔＣＡｌｄ５Ｈ及びＰｔＳＡＤ蛋白質の免疫局在性を示す。
【図９】種々の植物のＣＡＤ及びＳＡＤ蛋白質の免疫反応性を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
2004520015.tif 000008
【図４】
2004520015.tif 000009
【図５】
2004520015.tif 000010
【図６】
2004520015.tif 000011
【図７】
2004520015.tif 000012
【図８】
2004520015.tif 000013
【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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