(57)【要約】本発明は、代謝症候群に関与する危険因子を減少する医薬、特に、血清中のＨＤＬコレステロールのレベルを増加する医薬、そしてＬＤＬ、インスリンおよびレプチンのレベルならびに高血圧を減少する医薬の調製のための、結腸において増加した量のプロピオン酸または酢酸を生じる、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９（ＤＳＭ６５９５）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３））の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸において増加した量のプロピオン酸または酢酸を生じるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用であって、血液中の高レプチンレベルおよび高インスリンレベル、増加したＬＤＬ、減少したＨＤＬ、増加した血圧を含む、代謝症候群に関与する危険因子の１つ以上を減少する医薬の調製のための、使用。
【請求項２】
血液中のレプチンレベルおよびインスリンレベル、ＬＤＬを減少する能力、並びにＨＤＬを増加する能力、血圧を減少する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ種に属する、請求項１または２に記載の株の使用。
【請求項４】
腸粘膜に結合する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ピアソンの積率相関係数(Pearson product moment correlation coefficient)および非加重群平均法(unweighted pair group algorithm with arithmetic average)（ＵＰＧＭＡ；ＧｅｌＣｏｍｐａｒｅ  ３．０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ，Ｋｏｒｔｒｉｊｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用することによって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９株（寄託番号ＤＳＭ６５９５）に対して５５％を超える制限エンドヌクレアーゼ分析類似性を有するクラスターに属するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株の使用であって、血液中の高レプチンレベルおよび高インスリンレベル、増加したＬＤＬ、減少したＨＤＬ、増加した血圧を含む、代謝症候群に関与する危険因子の１つ以上を減少する医薬の調製のための、使用。
【請求項６】
血液中のレプチンレベルおよびインスリンレベル、ＬＤＬを減少する能力、ＨＤＬを増加する能力、ならびに血圧を減少する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株の請求項５に記載の使用。
【請求項７】
腸粘膜に結合する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株の請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
前記株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が、食物繊維と組み合わせて使用される、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
血清中のＨＤＬコレステロールのレベルを増加する医薬の調製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
高い収縮期血圧を減少するための医薬の調製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
血清中のインスリンレベルを減少する医薬の調製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
血清中のレプチンレベルを減少する医薬の調製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
代謝症候群は、多数の代謝障害からなり、これらの多くは、アテローム性動脈硬化症の発生を促進し、そして心血管疾患の危険を増加させる。代謝症候群の主要な構成要素は、アテローム発生異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、増加した血圧、上昇した血漿グルコース、およびプロトロンボティック（ｐｒｏｔｒｏｍｂｏｔｉｃ）状態である。アテローム発生異常脂質血症は、上昇したトリグリセリド、増加した小さな低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）および減少した高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）として明らかにされる。代謝症候群の基礎をなす機構は、十分に知られていないが、この症候群を有するほとんどの患者は、高いインスリンレベルおよびインスリンの細胞作用に対する耐性を示す。
【０００２】
腹部肥満を有する患者は、しばしば、代謝症候群の複数の危険因子を現す。トリグリセリド濃度が１５０ｍｇ／ｄｌを超えるいずれの患者も、代謝症候群の疑いがある。１１０〜１２５ｍｇ／ｄｌの空腹時（ｆａｓｔｉｎｇ）グルコースのゆるやかな上昇は、代謝症候群の存在に対する別の手がかりである。しかし、代謝症候群の異常脂質血症を処置する際の最初の優先事項は、アテローム発生リポタンパク質（例えば、ＬＤＬ）を低下することであり、これは、現在、スタチン（ｓｔａｔｉｎ）を用いて最も効果的に行われる（Ｓｃｏｔｔ    Ｍ．Ｇｒｕｎｄｙ，Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ，ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９９；８３：２５Ｆ−２９Ｆ）。
【０００３】
（先行技術）
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを有する栄養補助食品は、コレステロール過剰血症患者における血液中のフィブリノゲンレベルならびにコレステロールレベルを効果的に減少することが以前に示されている。ＷＯ９９／０７８２７を参照のこと。
【０００４】
ホエータンパク質を含む発酵乳の血清脂質に対する効果は、Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ２０００  Ｆｅｂ；８３（２）：２５５−６３において、研究および報告されている。消費の８週後、高密度リポタンパク質コレステロールレベルは、有意な上昇を示した。アテローム発生指標（すなわち、（総コレステロール−高密度リポタンパク質コレステロール）／高密度リポタンパク質コレステロール）に加えて、収縮期血圧は、有意に減少された。試験した株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであった。
【０００５】
ＷＯ９６／２９０８３は、マンノース特異的付着因子を発現する病原細菌の上皮細胞表面への結合を阻害する薬学的組成物の調製のために、マンノース特異的付着因子を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株（特に、ＲＥＡの観点で、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９（ＤＳＭ６５９５）に対して７０％を超える類似性を有するクラスターに属する株）を言及する。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）は、好ましい株として記載された。このクラスターは、ヒト腸粘膜から単離した全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株を包含するようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の説明）
本発明者らは、中程度に上昇したコレステロールレベルを有する患者において、ＰｒｏＶｉｖａ（フルーツジュース、発酵オート麦、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）を含む機能性食品）を有する食事の補充は、有意に、ＬＤＬコレステロールレベルおよびフィブリノゲンレベル、ならびにインスリンレベルおよびレプチンレベルを低下し、そしてまた収縮期血圧を低下し、そしてＨＤＬコレステロールレベルを増加する。これは、代謝症候群に関与するほとんどの危険因子が、正の様式で影響されることを意味する。
【０００７】
この効果は、腸における細菌の発酵に寄与し、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、酢酸およびプロピオン酸を生じ得ると考えられる。酢酸およびプロピオン酸は、血液中に吸収され、肝臓に通過し（ｐａｓｓ  ｉｎｔｏ）、そして代謝経路に入る。ＳＣＦＡ（主にプロピオン酸）は、おそらく血清中の遊離脂肪酸レベルの上昇を阻害することによって、そしてインスリン感受性を改善することによって、グルコース耐性を改善し、そして肝臓中のコレステロール合成を阻害すると仮定されている。前記ＳＣＦＡはまた、ＰＰＡＲの発現に影響を与えることが現在見出され、そしてＰＰＡＲのアップレギュレーションは、ＡｐｏＡ１（ＨＤＬの主要な構成要素）の生成を増加すると証明されている。
健常な成人ボランティアにおける以前の研究において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖを含むフルーツドリンクの投与（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４２（１９９８）２９−３８）は、糞便の短鎖脂肪酸、特にプロピオン酸および酢酸の濃度を有意に増加することが示された。この効果は、酢酸およびプロピオン酸を生成するために、２９９ｖが結腸において細菌叢を刺激するとして説明され得る。しかし、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が、短鎖脂肪酸においてこの増加を引き起こすわけではない。後者の研究（Ｍｏｌｉｎら、原稿で）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ２７１（ＤＳＭ６５９４）ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株は、糞便におけるＳＣＦＡのこの増加を生じないことが示されている。試験されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株もまた、増加を生じない。
【０００８】
プロピオン酸はコレステロールレベルに対して影響を与えることが、イブプロフェン（プロピオン酸誘導体）を用いる臨床試験において実証されている（Ｚａｐｏｌｓｋａ−Ｄｏｗｎａｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０００；３０：１−３）。細胞性酸化ストレス因子の減少および単球の内皮細胞への接着の阻害に加えて、ＨＤＬコレステロールレベルが増加することが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、血液中の高レプチンレベルおよび高インスリンレベル、増加したＬＤＬ、減少したＨＤＬ、増加した血圧を含む、代謝症候群に関与する危険因子の１つ以上を減少する医薬の調製のための、結腸において増加した量のプロピオン酸または酢酸を生じるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用に関する。
本発明は特に、血液中のレプチンレベルおよびインスリンレベル、ＬＤＬを減少する能力、ＨＤＬを増加する能力ならびに血圧を減少する能力、を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用に関する。
【００１０】
本発明に従って使用される好ましいＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍである。
【００１１】
本発明に従って使用される株の別の好ましい特性は、腸粘膜に結合する能力である。２つの因子が、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの生態学的効果の発揮のために重要であるようである。第１は、小腸にコロニーを形成する能力、すなわち、生きている細菌の最後の投与後に一定期間、多数で生存する能力である。この特性は、病原性細菌の成長（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を抑制するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの能力について重要であり得が、十分ではない。第２は、小腸上皮細胞またはムチンに直接結合する能力である。これは、コロニー形成を促進する因子の１つであり得るが、コロニー形成の必要条件ではない。
【００１２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、小腸ムチンの生成を増加することが示され、そして上記ムチンは、病原体を中和し、そして細菌の増殖を改善すると考えられる。本発明の好ましい局面において、本発明に従って使用されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株はまた、結腸におけるムチンの生成を増加する能力を有するはずである。
本発明はまた、血液中の高レプチンレベルおよび高インスリンレベル、増加したＬＤＬ、減少したＨＤＬ、増加した血圧を含む、代謝症候群に関与する危険因子の１つ以上を減少する医薬の調製のための、ピアソンの積率相関係数(Pearson product moment correlation coefficient)および非加重群平均法(unweighted pair group algorithm with arithmetic average)（ＵＰＧＭＡ；ＧｅｌＣｏｍｐａｒｅ  ３．０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ，Ｋｏｒｔｒｉｊｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用することによって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９株（寄託番号ＤＳＭ６５９５）に対して５５％を超える制限エンドヌクレアーゼ分析類似性を有するクラスターに属するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株に関する。５５％と７０％の類似性との間の境界は、不明瞭である。ヒト腸粘膜由来の株の大多数は、７０％以内の類似性を有するが、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ３８６（５５％以内の類似性を有する）もまた、ヒト小腸から単離され、そしてクラスターの他の株と同じ結合機構を示す。
【００１３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの上記好ましい株の例が、図面において示され、すなわち、以下である：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １０７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １０５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ７９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２７５およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ３８６。ＡＴＣＣ  １４９１７Tは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍについての型株を示す。
【００１４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９株および２９９ｖ株（これらは共に、健常ヒト腸粘膜から単離された）は、それぞれ１９９１年７月２日および１９９５年３月１６日に、ｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託され、そして寄託番号ＤＳＭ６５９５（２９９）およびＤＳＭ９８４３（２９９ｖ）を与えられている。
【００１５】
好ましい局面において、本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）株の使用に関する。
【００１６】
本発明に従って使用される細菌は、小腸に送達される医薬または食品について、従来のキャリア（例えば、問題の細菌によって発酵され得る生理学的に受容可能な培養基、ならびに特にデンプンまたはミルクに基づく種々の食材）、および不活性な固体物質または液体物質（例えば、生理食塩水または水）で投与され得る。適切な培養基は、胃腸管に再吸収されず、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓで発酵される場合にカルボン酸を形成する、液体繊維または固体繊維を含むはずである。適切なデンプン含有培養基の例としては、穀物（例えば、オート麦および小麦）、トウモロコシ、根菜（例えば、ジャガイモ）および特定の果実（例えば、緑色バナナ）が挙げられ得る。本発明に従う使用のための好ましい培養基（これはまた、組成物に優れた栄養価を与える）は、例えば、ＷＯ８９／０８４０５に記載されるような、オートミールに基づく栄養溶液である。食物繊維が（例えば、オートミールかゆまたはグルカンの形態で）提供される場合、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の効果が改善することが試験により示されている。
【００１７】
本発明は、食物繊維と組み合わせたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用に関する。
【００１８】
本発明に従って使用される細菌は、任意の適切な様式で、好ましくは例えば、浣腸の形態で直腸的にまたは経口的に投与され得る。これらはまた、小腸中に直接にまたは胃を介して小腸中に挿入されたカテーテルを通して経腸的に（ｅｎｔｅｒａｌｌｙ）投与され得る。
【００１９】
細菌は、治療的有効用量で提供されるべきであり、前記用量は、１０8から、好ましくは、１×１０10ＣＦＵ／ｄ以上であり得る。
【００２０】
本発明に従って、記載されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、血清中のＨＤＬコレステロールのレベルを増加する医薬の調製のため；または高い収縮期血圧を減少する医薬の調製ため；または血清中のインスリンのレベルを減少する医薬の調製のため；または血清中のレプチンレベルを減少する医薬の調製のために使用され得る。
【実施例１】
【００２１】
（実施例１．インビトロでのＰＰＡＲ遺伝子発現に対するプロピオン酸の効果）
ＰＰＡＲの生成に対する短鎖脂肪酸の効果を詳細に検討するために、この実験を行った。
【００２２】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｊａｆｆｅら（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｒｔｉｎｕｓ  Ｎｉｊｈｏｆｆ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８４，１〜１３頁）によって記載されるように、コラゲナーゼ消化によって臍帯から得た。手短には、臍帯の静脈を、ＰＢＳで灌流して、血球を除去し、０．１％コラゲナーゼ（Ｉａ型）で満たし、そして３７℃で１０分間静置した。懸濁したＨＵＶＥＣを、ＰＢＳで補充し、遠心分離し、そして大気中加湿した５％ＣＯ2下で、ゼラチンでコーティングした２５ｍｌフラスコおよび培地１９９で充填した６ウェル組織培養プレート中で３７℃で培養した。プロピオン酸を、０．１、１．０、および１０．０ｍｍｏｌ／ｌの量で培養培地に添加し、そしてＰＰＡＲの発現に対する酸の効果を決定した。
【００２３】
全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用するＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの方法によって細胞から抽出した。全ＲＮＡの単離後、サンプルを、臭化エチジウムで染色した１％アガロース中のゲル電気泳動によってチェックした。全ＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍ波長での分光光度計測定後に計算した。各ＲＮＡサンプル（５００ｎｇ）を、１ＵのＤＮＡｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に３７℃で１５分間インキュベートし、引き続きＤＮＡｓｅＩを、７５℃で３分間加熱することによって不活化した。このようなＤＮＡｓｅ処理したＲＮＡ（５００ｎｇ）を、２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（Ｐｒｏｇｍｅｇａ，ＵＳＡ）、２０ＵのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、１００ｐＭのランダムヘキサマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む２０μｌの反応混合液中に溶解した。インキュベーションを、３７℃で６０分間実行した；次いで、反応の温度を５分間９４℃に上昇させて、酵素を不活化し、そして最終的に４℃まで低下させた。ｃＤＮＡのアリコート（５μｌの室温混合液、１２５ｎｇ  ＲＮＡの転写から得られたｃＤＮＡ）を、１０×ＰＣＲ緩衝液（最終Ｍｇ2+濃度１．５ｍＭ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、１０ｐＭの上流プライマーおよび下流プライマー（それぞれＰＰＡＲおよびＧＡＰＤＨセット）ならびに１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む４０μｌの反応混合液中に溶解した。増幅プロフィールは、９４℃で３分間の最初の変性、続いて９４℃で３０秒間の変性、５７℃で１分間のアニーリング（共にＰＰＡＲおよびＧＡＰＤＨについて）および７２℃で１分間の伸長が続いた。半定量的分析のために、ＰＣＲサイクル数に依存するＰＰＡＲ  ｃＤＮＡおよびＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの増幅の直線性が、予備実験において確立された。
【００２４】
以下のプライマーセットを、ＰＣＲ増幅において使用した：
ＰＰＡＲ
センス        ５’−ＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＴＡＴＣ−３’
アンチセンス  ５’−ＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴ−３’
ＧＡＰＤＨ
センス        ５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ−３’
アンチセンス  ５’−ＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＧ−３’
ＰＣＲによって得られた増幅産物（４５４ｂｐ長のＰＰＡＲ  ｃＤＮＡおよび４８２ｂｐ長のＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ）を、３％アガロースゲル上で電気泳動によって分離した。ＰＰＡＲおよびＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡについて臭化エチジウム染色したバンドの画像を、ＤＳ−３４  Ｐｏｌａｒｏｉｄカメラで撮影した。バンドの強度を、ＮＩＨイメージをマクロ供給したゲル分析で濃度計測定した。全てのＰＰＡＲシグナルを、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対して正規化し、そして割合として表した。
【００２５】
結果を以下の表１に示す。
【００２６】
【表１】
2004520276.tif 000002
データは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（１００％）に対するパーセントとして表す。
【００２７】
上の実施例１においてプロピオン酸を酢酸と交換する場合、同様の結果が得られる。
【００２８】
（実施例２．健常な喫煙者における代謝性危険因子の研究）
ＰｒｏＶｉｖａ（Ｓｋａｎｅｍｅｊｅｒｉｅｒ，Ｍａｌｍｏ．Ｓｗｅｄｅｎ）、５×１０7ｃｆｕ／ｍｌの量でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖを含む（９５：５ｖ／ｖ  フルーツドリンク：発酵オートミールスープからなる）ローズヒップドリンクおよび０．０８ｇ／１００ｍｌの量のオート麦繊維の、血清中のフィブリノーゲン、コレステロール、レプチンおよびインスリンに対する効果を調査するために、研究を行った。１９人の男性および１９人の女性（中程度に上昇したフィブロノゲンレベルおよびコレステロールレベルを有する３５〜４５歳の健常な喫煙者）を、２つのＡ群（ｎ＝１８）およびＢ群（ｎ＝２０）に無作為に分けた。Ａ群に１日あたり４００ｍｌ  ＰｒｏＶｉｖａを与え（朝に２００ｍｌおよび夕方に２００ｍｌ）、そしてＢ群に同量のプラシーボ（すなわち、発酵オート麦を含まないローズヒップドリンク）を与えた。生活様式を変化せずに、実験を６週間続けた。
【００２９】
実験の開始前および６週後に血圧を測定し、血液を採った。
【００３０】
投与の６週後、収縮期血圧における有意な減少（ｐ＜０．００１）が観察された。表２を参照のこと。この減少は、より高いベースラインレベルの収縮期血圧を有する患者において最も明白であり、プラシーボ群において検出され得なかった。表において示されるデータは、平均値±ＳＤである。
【００３１】
実験の間、両方の群において、ＢＭＩは、おおよそ同じレベルであった。
【００３２】
【表２】
2004520276.tif 000003
血清におけるコレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルを、酵素キット（ＣＨＯＤ−ＰＡＰ、ＧＰＯ−ＰＡＰ）を使用して測定した。ＨＤＬコレステロールを、Ｍｇ2+の存在下で燐タングステン酸と共にａｐｏＢを含むリポタンパク質の沈殿後に測定した。ＬＤＬ−コレステロールを、ポリビニルサルフェートと共にＬＤＬの沈殿後に測定した。実験手順は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからの試験キットに基づいた。グルコースを、Ａｎａｌｃｏ（ＰＡＰ）からのグルコースオキシダーゼおよび試験キットを使用して測定し、そして血漿フィブリノゲン測定は、トロンビン時間に基づくＣｌａｕｓｓの方法（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘからの試験キット）に従った。インスリンを、Ａｂｂｏｔｔ  Ｉｍｘ  Ｉｎｓｕｌｉｎアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって測定し、そしてレプチンを、Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｐｔｉｎ  Ｒｉａキット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＤ，ＵＳＡから）によって血清中で定量した。
【００３３】
全コレステロール、トリグリセリドの血漿レベルにおける変化はみられなかった。しかし、Ａ群の患者は、ＬＤＬコレステロールにおける１２％の減少およびＨＤＬコレステロールにおける１０％の増加を示した。表３を参照のこと。
【００３４】
フィブリノゲンレベルは、約１０％減少した。
【００３５】
インスリンレベルにおける有意な減少およびレプチン濃度における３７％の減少もまた、見出された。
【００３６】
【表３】
2004520276.tif 000004
（実施例３．乾癬患者における代謝危険因子の研究）
この研究において、再発する乾癬を有する６人の患者の群へのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）で発酵した濃縮したオートミールかゆの投与の、種々の因子に対する効果を詳細に調べた。患者は、未処置であった。すなわち、１×１０9ｃｆｕ／ｍｌ  Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを含む濃縮オートミールかゆの投与の開始前に、少なくとも６週間投薬なしであった。各患者は、１２週間、５０ｍｌ／ｄで与えられた。
【００３７】
投与前および６週後のＨＤＬおよびＬＤＬのレベルを測定した。結果を、以下の表４に示す。
【００３８】
【表４】
2004520276.tif 000005
一般に、乾癬患者は、低ＨＤＬ値を有し、従って、代謝症候群に罹患する危険が大きい。この研究は、この危険が細菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖの摂取によって減少され得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図は、ピアソンの積率相関係数(Pearson product moment correlation coefficient)およびＵＰＧＭＡに基づいて、ＲＥＡ方法によって特徴づけられた、試験された異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株間の類似性（％）を示す系統樹である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月3日(2003.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸において増加した量のプロピオン酸または酢酸を生じるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用であって、血清中のレプチンレベルを減少する医薬の調製のための、使用。
【請求項２】
結腸において増加した量のプロピオン酸または酢酸を生じるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の使用であって、血液中の高レプチンレベルおよび高インスリンレベル、増加したＬＤＬ、減少したＨＤＬ、増加した血圧を含む、代謝症候群に関与する危険因子を減少する医薬の調製のための、使用。
【請求項３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ種に属する、請求項１または２に記載の株の使用。
【請求項４】
腸粘膜に結合する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ピアソンの積率相関係数(Pearson product moment correlation coefficient)および非加重群平均法(unweighted pair group algorithm with arithmetic average)（ＵＰＧＭＡ；ＧｅｌＣｏｍｐａｒｅ  ３．０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ，Ｋｏｒｔｒｉｊｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用することによって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９株（寄託番号ＤＳＭ６５９５）に対して５５％を超える制限エンドヌクレアーゼ分析類似性を有するクラスターに属するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株の請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
該株がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が、食物繊維と組み合わせて使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【国際調査報告】
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