(57)【要約】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、どのような動物種のチトクロームb遺伝子の断片をも増幅して、未知の起源の任意の動物の生物材料の同一性を示すことができる新規の普遍的プライマー、および所与の生物試料に由来する特定の動物の同定のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
「mcb 398」および「mcb 869」と名づけられた普遍的プライマーであって、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、任意の動物種のチトクロームb遺伝子の断片を増幅して、未知の起源の任意の動物の生物材料の同一性を生物種および亜種レベルで明らかにすることができ、前記プライマーは：
プライマー名        配列（5'-3'）
mcb 398          「TACCATGAGGACAAATATCATTCT」
mcb 869          「CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG」、
の配列を有する、普遍的プライマー。
【請求項２】
請求項1に記載のプライマーであって、前記ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片は、異なった動物種の種々の進化の系統間で有意に区別することでことができるプライマー。
【請求項３】
請求項1に記載のプライマーであって、前記ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片は、広範な動物種間で高度に保存された配列に隣接して位置されるプライマー。
【請求項４】
請求項1に記載のプライマーであって、前記ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片は、種間では多形性であるが、供与源の種内では単形性であるプライマー。
【請求項５】
請求項1に記載プライマーであって、アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）種において、請求項1で述べた断片の配列が以下の通りであるプライマー：
アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子配列（398-869bp）：
「taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg」。
【請求項６】
生体試料から動物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程を含む方法：
a）請求項1に記載のプライマーを使用して、試験される生体試料からDNAを単離し、かつ増幅することと、
b）増幅産物のシーケンシングを行うことと、
c）BLASTプログラムを使用して、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のミト（mito）データベースに対して工程（b）で決定された配列のブラスティングを行い、前記生体試料の動物供与源の最も可能性の高いファミリを決定することと、
d）BLASTプログラムを使用してNational Center of Biotechnology Information（NCBI）の非重複（nr）データベースに対し、生体試料の動物供与源の最も可能性の高い属、生物種、またはより正確には、亜種を決定することと、
e）工程（c）および（d）においてそれぞれ同定された動物のチトクロームb遺伝子配列と決定された配列の最も有意なアラインメントを同定し、さらなる研究のために「参照動物」としてこれらの動物を選択することと、
f）請求項1に記載のプライマーを使用して参照動物の両方の鎖に由来するDNA配列を3回、単離し、増幅し、シーケンシングすることと、
g）CLUSTRALプログラムを使用して得られた配列をアライニングして、解析した試料間において変化しやすい部位を同定することと、
h）ヌクレオチド配列対を比較して、決定した動物間のバリエーションを決定し、生体試料のDNA配列が最大の類似性を持つヌクレオチド配列を、該生体試料の供与源動物として同定すること。
【請求項７】
請求項6に記載の方法であって、前記普遍的PCRプロトコルは、任意の未知の動物起源のDNAテンプレートで普遍的に機能し、また前記普遍的プライマーは、カラム4のもとに述べたものである方法。
【請求項８】
請求項6に記載の方法であって、前記増幅反応が約20ngのテンプレートDNA、100Lmの各dNTPs、1.25pmoleの各プライマー、1.5mMのMgCl2、0.5ユニットのAmpliTaq Gold（Perkin-Elmer-Cetus, USA）DNAポリメラーゼ、および1×PCR緩衝液（10mMトリス-HCI、pH 8.3、および50mMのKCI）を含む20μlの反応体積で行われるべきであり、続く前記増幅プロフィールは：95℃で10分間の初期変性、続いてそれぞれ95℃で45秒間の変性、51℃で1分間のアニーリング、および72℃で2分間の伸張を35サイクル行うべきであり、第35サイクルの伸張工程は、10分間保持されるべきである方法。
【請求項９】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、GenBank、NCBIその他などの公共のデータベースを使用して、解析した物質（すなわち、持ち込まれた未知の起源の動物残骸から分離したDNA）の種の同定を可能にする方法。
【請求項１０】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、合理的な疑いを超えて犯人による犯罪を証明するための動物同定のために使用される方法。
【請求項１１】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、動物密漁者から没収した皮膚、角、その他などの生物材料が絶滅危惧種のものである場合に、その同一性を証明するために使用される方法。
【請求項１２】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、野生生物源に対するヒトの違反を制御することができるように、動物の狩猟および関連した犯罪の分子的証明を作製する目的で、危険にさらされた動物種における持ち込まれた動物の部分および産物の同一性を法廷で証明するために使用される方法。
【請求項１３】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、発明した普遍的プライマーによって同定される密漁動物のチトクロームb遺伝子ハプロタイプに基づいて野生生物犯罪の関与の地理的位置についてのアイデアを有するめに使用される方法。
【請求項１４】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、食物栄養強化機関により、食物栄養強化の目的で菜食者の食品における動物の肉/産物の不純物混和を検出するために使用される方法。
【請求項１５】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、犯人が、犯罪調査機関および法医学科学者を人血と混乱させるために、あたかも犯行現場で普通に動物の血液を広げたかのように見える場合に、犯行現場で見出された血液の起源を証明するために、殺人、強姦等などの攻撃に関する犯行現場から回収された血液または血痕等の起源を検出するために使用される方法。
【請求項１６】
請求項6に記載の方法であって、該方法は、法医学において野生生物を同定するための（a）「分子キット」および（b）「DNAチップ」に基づいた適用のために変換し得るように使用される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で任意の動物種のチトクロームb遺伝子の断片を増幅することができ、任意の未知の動物起源の生物材料の同一性を、生物種および亜種供与源で示すことができる新規の普遍的プライマーの同定に関する。また、本発明は、未知起源の生物材料のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
進化生物学における多くの研究では、ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子から得られる系統学的情報を利用する。分子分類学において、ファミリ、属、および生物種について種々の系統の系統的深さを識別するための潜在的な分子が同定されている1-66。種々の動物種のチトクロームb遺伝子配列の巨大なデータベースは、GenBank、NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）等などの公共のデータベースに集積されている。我々は、動物の部分および産物の起源について、そのファミリー、属、および生物種の供与源の同一性を証明するために、このチトクロームb遺伝子の能力を利用した。開発された技術は、広範な動物種からチトクロームb遺伝子の小断片を増幅することができる一対の普遍的プライマーに基づく。
【０００３】
現在までに利用できる方法は、いずれもあまり効率的でなく、合理的な疑いを越えて動物遺骸の同一性を示すことができないので、持ち込まれた動物の部分および産物の同一性を証明することは、法執行機関にとって大きな挑戦である。いくつかの種について記載されている形態学的マーカーにより、完全な動物検体の同定が可能となる67。しかし、完全な検体は、調査機関によってまず持ち込まれることはなく；したがって、これらのマーカーは、野生生物法医学において実用的ではない。胆汁の特徴68、血液ヘム解析69,70などの生化学的形質も、個々の生物種の同定のために野生生物法医学において使用されている。これらのマーカーの問題は、これらのマーカーは数が限られており、かつこれらが特定の生物種の特徴として元々記載されたこれらの天然の形態では、まず見出されないということである。
【０００４】
マイクロサテライトに基づいた同定、ミトコンドリア遺伝子の制限断片長多型解析、またはPCRに基づいた種特異的STSマーカーなどの分子的方法は、同一性を証明するために種について事前の情報を必要とする72,73。また、これらの方法は、分析するDNA物質の有意な量を必要とする。我々は、法医学において、持ち込まれた動物の部分および産物の種の起源についての情報を事前に有していないかもしれず、したがって、これらの方法は、実際には有用でなく、また野生生物同定において実用的でない。我々が発明した技術は、普遍的であり、したがって、未知の持ち込まれたどのような遺骸のファミリー、属、および種の供与源の同一性を証明するためにも、いかなる背景情報も必要としない。PCRに基づいた手順により、任意の生物材料の量をトレースするためにもこれを適用することができる。アンプリコンの長さは短いので（472bp）；したがって、通常犯罪調査機関によって評価される切断された遺骸で、完全に作業をすることができ、これは、同一性を証明するための分析に大量の遺伝学的物質、すなわちDNAを必要とせず、それゆえ、食品中の微量の不純物混和を検出することができる。記載した手順は、簡単かつ非常に迅速である。前記利点のために、我々が発明した手順は、法医学の野生生物同定に最も適している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的
本発明の主要な目的は、異なった動物種の様々な進化の系統間で、有意に識別することでことができるミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片を同定することである。
【０００６】
もう一つの目的は、広範な動物種において、高度に保存された配列に隣接するミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片を同定することである。
【０００７】
さらにもう一つの目的は、種間では多形性であるが、供与源の種内では単形性であるミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片を検出することである。
【０００８】
さらにもう一つの目的は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の断片を増幅するための、普遍的プライマーを開発することである。
【０００９】
もう一つの目的は、任意の未知の起源の（すなわち全ての動物種の）DNAテンプレートで普遍的に機能するPCRプロトコルを開発することである。
【００１０】
さらにもう一つの目的は、GenBank、NCBIその他などの公共のデータベースを使用して、解析した物質（すなわち、持ち込まれた未知の起源の動物残骸から分離したDNA）の種を同定するための普遍的な方法を提供することである。
【００１１】
さらにもう一つの目的は、合理的な疑いを超えて、犯人による犯罪を証明するための動物同定の普遍的な方法を提供することである。
【００１２】
もう一つの目的は、動物密漁者から没収した皮膚、角、その他などの生物材料が、絶滅危惧種のものである場合に、その同一性を証明する普遍的な方法を提供する。
【００１３】
さらにもう一つの目的は、野生生物源に対するヒトの違反を制御することができるように、動物の狩猟および関連した犯罪の分子的証明を作製する目的で、危険にさらされた動物種における持ち込まれた動物の部分および産物の同一性を法廷で証明するための普遍的な方法を提供することである。
【００１４】
さらにもう一つの目的は、発明した普遍的プライマーによって同定される密漁動物のハプロタイプに基づいて、野生生物犯罪の関与の地理的位置についてのアイデアを有するための、普遍的な技術を提供することである。
【００１５】
もう一つの目的は、食物栄養強化機関により、食物栄養強化の目的で菜食者の食品における動物の肉/産物の不純物混和を検出するための、普遍的な動物同定の技術を提供することである。
【００１６】
さらにもう一つの目的は、犯人が、犯罪調査機関および法医学科学者に人血と混乱させるために、あたかも犯行現場で普通に動物の血液を広げたかのように見える場合に、犯行現場で見出された血液の起源を証明するために、殺人、強姦等などの攻撃に関する犯行現場から回収された血液または血痕等の起源を検出するための普遍的な技術を提供することである。
【００１７】
もう一つの目的は、上記の目的の要求を満たすために（a）「分子キット」および（b）「DNAチップ」に基づいた適用のために変換することができる普遍的な技術を発明することおよび確率することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
したがって、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で任意の動物種のチトクロームb遺伝子の断片を増幅することができ、任意の未知の動物起源の生物材料の同一性を、生物種および亜種供与源で示すことができる新規の普遍的プライマーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な記載
上記の目的をもくろみ、種々のファミリーを表す、わずかに関連した221の動物種のチトクロームb遺伝子配列（1140bp）（表1に一覧を示した）を、公共のデータベースNCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. oov）から得た。これらの配列を、ソフトウェアClustal X（1.8）（NCBI, USA）を使用してアラインして、「本発明の目的」の副題のカラム1、2および3のもとに上述した特徴の全てを有する遺伝子の断片（472bp、表2に示した配列）を同定した。この断片の同一性について、我々は、これがアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）およびフェリス・カタス（Felis catus）の398〜869間のヌクレオチドを含むが；ホモサピエンスサピエンス種では399〜870の間であることを言及しておきたい。
【００２０】
表2のわずかな部位（星型（*）としてマークした）を除いて、この断片のヌクレオチド配列は、動物種間で非常に変化しやすく、これらにユニークな分子的シグニチャを引き起こしいる。これらの分子的シグニチャは、その種の特徴であり、我々が発明した手順によって未知の動物起源の生物材料の同一性を明らかにする基礎を形成する。アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）を代表的な種と考えて、この断片の配列をこれと共に言及する：
アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のミトコンドリア・チトクロムb遺伝子配列（398〜869bp）：
「taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg」。
【００２１】
ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）でこの断片を増幅するように、一対の普遍的プライマーをデザインした。これらのプライマーは、本発明のための代表的な動物種であるアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のヌクレオチド398〜869間のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子領域を増幅するというその性質により、「mcb 398」および「mcb 869」と名付けられた。このような新規プライマーを開発するアイデアは、発明者の心に生じるが、彼らは、Center for Cellular and Molecular Biology, Hyderabad, Indiaでこの動物のゲノムについて仕事をしているので、我々は、代表的な種としてこの動物種を採用した。これらのプライマーは、その3'末端が広範な動物種間で高度に保存されているので（表2に示した）、普遍的に機能する。上述したように、これらのプライマーの標的としたDNA断片（その配列は上に示した）は、種間で非常に多形性であるが；しかし、これは同種の個体間では単形性である（それぞれ表6、7a、7b、7c、d、および8）。標的とした領域のこれらの独特な特徴により、これらのプライマーが個々の種の分子的シグニチャを作成することを可能にし；これにより、これらを異なった種の動物間で区別することが可能になる（図1cを参照されたい）。2匹の動物の進化の系統の距離が増大することにより、これらのプライマーによって増幅される断片のバリエーションが増加する（表8）。出願人が発明した普遍的プライマー「mcb 398」および「mcb 869」によって増幅される断片のこれらのユニークな特徴は、本発明の目的を満たす。
【００２２】
したがって、我々が発明した普遍的プライマーは、未知の動物起源のどのような生物材料からでも、分子的シグニチャを作成することができ、実際にこのシグニチャがそのファミリー、属、およびより正確には種の特徴である。これらのシグニチャを、BLASTソフトウェアを使用して、すでに公共のデータベース（すなわち、GenBank、NCBIデータベース等）において利用できるシグニチャとインシリコで比較した場合73、解析した物質のファミリー、属、または種の同一性が示され、次にプライマー「mcb 398」および「mcb 869」によるさらなる解析にこれらを含むことにより、ファミリー、属、または種の明らかとなった参照動物と実際に比較することによって確かめられる。解析に含まれる完全な手順（「解析」の語は、「発明の目的」の副題のもとにカラム1〜13で述べた、任意の未知の動物起源の生物学的遺骸の同一性を証明するための段階的手順であると理解されるべきである）は、それぞれ実施例5および6に説明し、並びに図1a、1b、および1cに図示した。
【００２３】
表1
221動物種のリストをインシリコ解析に使用して、普遍的プライマー「mcb 398」および「mcb 869」をデザインした。また、表は、種々のテンプレートについての「mcb 398」および「mcb 869」のP,Sスコアを示す。この表に使用した種々のシンボルの記載は、次の通りである：
シンボル（#）は、数を表し、
シンボル（*）は、被保護種（野生生物（保護）法、1972（1972年の中央法NO 53）に一覧が示されたもの）または危惧/まれな動物種を表し、
シンボル（SP,S/F）は、種々のテンプレートとのプライマー「mcb 398」のマッチの確率およびマッチの安定性を表す（すなわち、異なった種起源に由来するチトクロームb遺伝子）。より高いP,Sスコアは、プライマーによって特定のテンプレートがより高確率に有意に増幅されることを表す。これは、（Amplify1.2）ソフトウェアによって算出される。
【００２４】
シンボル（ΨP,S/R）は、種々のテンプレートについてのプライマー「mcb 869」のマッチの可能性およびマッチの安定性を意味する。より高いP,Sスコアでは、プライマーによって特定のテンプレートがより高確率に有意に増幅されることを表す。これは、（Amplify1.t）ソフトウェアによって算出される。
【００２５】
表2
表1に一覧を示した221動物種のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子（発明者により「本発明の目的」の副題のもとにカラム1、2、および3に記載した要求を満たすことが確認された）の472bp断片の多数の配列アライメント。また、アライメントには、普遍的プライマー「mcb 398」および「mcb 869」の結合部位を示す。シンボル（*）は、表1に一覧を示した221の動物種間で保存されたヌクレオチド塩基を意味する。アライメントは、ソフトウェアCLUSTAL X（1.8）を使用して行った。マークされていないヌクレオチドの位置は、解析した221の動物種間で変化しやすい。これらの変化しやすい部位は、ともに個々の種の分子的シグニチャを構成し、我々のプライマーによる種同定の分子的基礎を生じる。
【００２６】
表3
配列のブラスト解析の結果は、NCBIの「ミト」データベースにおいて「adil. flesh」から明らかとなった。チトクロームb配列（328bp）の最も有意なアライメントは、NCBIデータベースに登録されたフェリス・カタス（felis catus）チトクロームb遺伝子配列（genbank登録ナンバーNC001700.1、ビットスコア365、E値、e-101）と持ち込まれた皮膚片「adil. flesh」から明らかとなったことを示す（ビットスコア365およびE値e-101）。これは、解析した材料の種が家ネコに属することの指標を与える。また、これにより、「本発明の目的」の副題のもとに上述したカラム6の要求を満たす。
【００２７】
表4
配列のブラスト解析の結果は、NCBIの「ミト」データベースにおいて「adil. flesh」にから明らかとなった。NCBIデータベースに登録されたチトクロームb配列（328bp）の最も有意なアライメントは、パンセラ・パルダス（Panthera pardus）チトクロームb遺伝子配列（genbankアクセッション番号AY005809、ビットスコア603、E値、e-170）と持ち込まれた皮膚片「adil. flesh」から明らかとなったことを示す（ビットスコア365およびE値e-101）。これは、解析した物質の種が家ネコに属することの指標を与える。また、これにより、「本発明の目的」の副題のもとに上述したカラム6の要求を満たす。
【００２８】
表5
家ネコに属する参照動物を「adil. flesh」との比較のために選択し、BLAST解析の所見を確かめて、その結果をそれぞれ表3および4に述べた。SN1〜21に一覧を示した動物は、家ネコの種々の種を表す。SN22および23は、外集団比較のための霊長類種である。
【００２９】
表6
「adil. flesh」および参照動物から明らかとなったチトクロームb配列（328bp）の複数の配列アライメントを表5に一覧を示した。調査下で全ての動物種に共通のヌクレオチドを有する位置は、星（*）マークで示し：しかし、調査下の任意の動物中で変化しやすい部位は、マークしていない。これらの部位のヌクレオチドは、独特でその種に非常に特異的な個々の種の分子的シグニチャを構成する。これらのシグニチャは、我々のプライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用する個々の動物種の同定の分子的基礎である。
【００３０】
表7（表7a、7b、7c、および7d）
種々の動物種の分子的シグニチャの比較を、未知の動物起源の持ち込まれた皮膚「adil. flesh」と共に調査した。この表は、表5に一覧を示した動物から示される328bp断片のなかの変化しやすい部位（すなわち、表6において星印（*）シンボルでマークした位置）を示す。ドット（.）マークは、レーン1に一覧を示したもの、すなわちその位置の「adil. flesh」の配列と同様のヌクレオチドが存在することを表す。これは、それぞれの種のシグニチャが独特で、その種に特異的であることを示す。「adil. flesh」の分子シグニチャは、「gzlL」の分子シグニチャ、すなわち既知のヒョウ「パンセラ・パルダス（Panthera pardus）」に匹敵することから（位置37が「T」から「C」変化したことを除く）、ヒョウ「パンセラ・パルダス（Panthera pardus）」供与源と持ち込まれた皮膚「adil. flesh」の供与源の同一性が示される。ヌクレオチドのバリエーション（既知のヒョウ（すなわち、それぞれgzlL、gz2L、およびgz3L）のなかの位置153、198、223、264のもの）は、それぞれの動物の地理的な生育地についてのアイデアを与える。種々の動物種の分子進化に関する種々の研究では、この仮説を支持するが75；様々な地理的領域から参照動物を捕らえて、我々のプライマー「mcb 398」および「mcb 869」で分析することにより、これをさらに確認することができる。我々が動物種の種々のハプロタイプ（すなわち、生息地特異的な分子的シグニチャ）のデータベースを作製し得る場合、我々のプライマーは、野生生物犯罪の関係づけの地理的な位置を示すことを可能にするであろう。
【００３１】
表8
アラインしたヌクレオチド配列対比較によって算出されたパーセント類似性マトリックス（表6に例示した）。持ち込まれた材料から分離したDNAのチトクロームb遺伝子配列は、既知の通常のヒョウ供与源から得られた配列と最大の類似性（動物系統「gz2L」および「gz3」のそれぞれと99.7%および98.2%）を有したことから、ヒョウ起源のものとの同一性が示される。類似性マトリックスは、ソフトウェアPHYLIP（3.5）を使用して算出した。
【００３２】
表9
プライマー「mcb39S」および「mcb 869」による異なった起源のチトクロームb遺伝子の効率的な増幅のための、最小のP,Sスコアのバリデーションのために動物を選択した。これらの動物についてのプライマー「AFF」および「AFR」のP,Sスコアを示した。
【００３３】
表10
NCBIのnrデータベースにおけるプライマー「mcb 398」のBLAST解析。これは、このプライマーの3'末端が広範な動物種間で非常に保存されていることを示す。また、これは、プライマーおよびテンプレート（すなわち、種々の動物種のチトクロームb遺伝子断片）間で有意なホモロジーを示すことから、我々のプライマーの普遍的性質が確認される。
【００３４】
表11
NCBIのnrデータベースにおけるプライマー「mcb 869」のBLAST解析。これは、このプライマーの3'末端が広範な動物種間で非常に保存されていることを示す。また、これは、プライマーおよびテンプレート（すなわち、種々の動物種のチトクロームb遺伝子断片）間で有意なホモロジーを示すことから、我々のプライマーの普遍的性質が確認される。
【００３５】
表12
わずかに関連した動物種に属するその他の動物を調査して、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」の普遍的性質を確かめた。これらの動物からのPCRアンプリコンを示すゲル写真を図4に示す。
【００３６】
ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子は、分子生物分類学において非常に広く使用されている。これは、ファミリー、属、および種に特異的な方法で動物の種々の進化の系統を示す計り知れない能力を有する。また、その個体群統計学的分布に従って特定の種の個体群を分類することにも使用されている75。種々の動物種のチトクロームb配列の広範なデータベースは、GenbankおよびNCBIなどの公共のデータベースに蓄積されている。我々は、普遍的方法で広範囲にわたる動物種のチトクロームb遺伝子の小断片（472bp）を増幅することができる一対の新規プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を発明することにより、チトクロームb遺伝子のこれらの独特な特徴を探検して、任意の未知の動物の持ち込まれた遺骸の同一性を証明した。これらのプライマーは、その3'末端の高度に保存された領域内を標的とするので、普遍的に機能する。
【００３７】
同定されたチトクロームb遺伝子の断片は、「本発明の目的」の副題のもとにからむ1、2、および3に記載した全ての特徴を有した。我々は、表1に一覧を示した種々の221動物種のチトクロームb遺伝子配列（1140bp）をアラインすることにより、この断片を同定した。これらの配列は、NCBI DNAデータベースにおいて公的に利用できる。これらの配列は、ソフトウェアCLUSTAL X（1.8）を使用してアラインした。上述したとおり、我々によって、「本発明の目的」の副題もとにからむ1、2、および3に記載した特徴を有することが同定されたチトクロームb遺伝子の472bp断片は、アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）およびフェリス・カタス（Felis catus）の398〜869間のヌクレオチドを含むが；しかし、ホモ・サピエンス・サピエンス（Honro scipiens sapieiis）種の399〜870は含まない。表2に星型（*）としてマークしたいくつかの位置を除き、この断片のヌクレオチド配列は、動物種間で非常に変化しやすく、我々が発明した手順によって未知の動物起源のものに属する生物材料の同一性を示す。この断片の同一性については、我々は、代表的な種および配列としてアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）を考え、上記のアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のチトクロームb遺伝子の断片をここに記載する：
アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子配列（398-869bp）
「taccatgaggacaaatatctttttgagagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctatagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaacsccacaggaatctcatcagacgcagacaaaas：ccaticeacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcct ccgatcaattcctaacaaactaggagg。
【００３８】
表2は、221動物種のチトクロームb遺伝子の上記断片のアライメントを示す。表2のそれぞれの種は、ユニークなコードによって表示されており、これを表1にデコードした。我々は、遠い目の広範な動物ファミリーを表示するためにこれらの種を選択した。221種の中で、約65は、野生生物（保護）法、1972（1972年の中央法NO 53）に一覧が示されたものか、または危惧/まれな動物種であった。これらの種は、表1にシンボル（*）でマークする。NCBIアクセッション番号は、NCBIデータベースにおけるその登録番号を表し、肩付き文字の数字は、引例を表す。アラインされた種々の221動物種のチトクロームb配列に基づいてデザインしたプライマーを以下に示す：
プライマー名          配列（5'-3）
「mcb 398」「TACCATGAGGACAAATATCATTCTG」
「mcb 869」「CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG」。
【００３９】
表2、10、および11は、それぞれ、プライマーの3'末端がインシリコで解析した全ての動物種間（表1に一覧を示した総221の動物種、並びに表10および11にそれぞれ一覧を示した約500種において）で高度に保存されていたことを示す。また、プライマーの5'末端は、その標的配列（すなわち、上述したチトクロームb遺伝子の472bp断片）に対するプライマーのマッチの確率および安定性を改善するために、チトクロームb遺伝子の保存された領域内で選択した。プライマーは、種々のソフトウェア、すなわち「Amplify（1.2）」、「Primer3」（http：//www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi）、並びに手作業を使用して、内部安定性、ループ、または二量体形成を徹底的に点検した。我々は、ソフトウェアAmplify（1.2）を使用して、各テンプレートに対するプライマーにP,Sスコア（P=マッチの確率、S=マッチの安定性）を割り当てた。より高いPおよびSのスコアでは、他の全ての条件標準（これは、実施例3で述べた）が最適である場合、良好な増幅を保証する。「mcb 398」について最も高いスコアは、98.63（すなわち、プライマーがテンプレートと完全にマッチした状態）であるが；「mcb 869」において最も高いP,Sは、プライマーとテンプレート間の完全なマッチに対して98.68として記録された。「mcb 398」について観察された最も低いP,Sスコアは、テルパ・ヨーロパエ（Talpa europaea）種に対しての81,5であったが、「mcb 869」においては、この種に対して高P,Sスコアを有した（92、57）。2つのプライマーのうちの1つについて最も低いP,Sスコアを有するもう一つの種は、ユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）およびイクウス・アイナス（Equus ainus）であった。ユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）は、「mcb 398」および「mcb 869」に対して、それぞれ86,55および73,51のP,Sスコアを有したが；イクウス・アイナス（Equus ainus）では、「mcb 398」および「mcb 869」に対して、P,Sスコアは、それぞれ91、61および73,51と算出された。その他の全ての動物は、上述した種よりも高いP,Sスコアを有した。プライマーのうちの1つについて最も低いP,Sスコアを有する動物に由来するDNAテンプレートで、これらのプライマーが効率的に機能するであろうことを確認するために、我々は、PCRにおける効率的な増幅に充分な、2つのプライマーのうちの1つの下限を確認するためのもう一つの実験をデザインした。我々は、これらがアニーリングする部位（しかし、末端ではない）に、より多くの誤対合を有し、したがって、より低い内部安定性およびそのテンプレート（表9に一覧を示した）に対してより低いP,Sスコアを有するもう一つのプライマー対（AFF = 5'tagtagaatgaatctgag,gag3'およびAFR = 5'atgcaaataggaagtatcattc3'）をデザインした。「AFF」および「AFR」のP,Sスコアは、プラタニスタ・ガンゲチカ（Platanista gangetica）およびサス・スクロファ（Sus scrofa）に対して41および49と同程度に低く算出された。これらの種は、プライマー「AFF」および「AFR」を使用して効率的に増幅された（結果を図3に示した）（他の全ての条件標準、すなわち「実施例3」に記載した条件を保つ）。我々のプライマー「mcb 398」および「mcb 869」について、それぞれ最も低いP,Sスコアユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）について86,55および73,51）は、種サス・スクロファ（Sus scrofa）に対する「AFF」および「AFR」の組み合���せたP,Sスコア（87,52および87,41）の上記範囲よりも高く、プライマー「AFF」および「AFR」によって効率的に増幅された。プライマー「mcb 398」および「mcb 869」は、ユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）を含む全ての種で機能し、PCRにおいて期待される産物を効率的に生じるであろうことを示した。この実験では、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」が普遍的方法で大部分の動物種のチトクロームb断片を増幅することができることが確認された。
【００４０】
我々のプライマーの普遍的性質をさらに確認するために、我々は、BLASTソフトウェアを使用してNCBIのミトおよびnrデータベースに対して、我々のプライマーの配列をブラストした。これらの解析の結果を、それぞれ表10および11に示す。
【００４１】
最後に、我々の実験室において、表12に一覧を示したさらにいくつかの動物種でプライマーの普遍的性質を試験した。これらのプライマーは、効率的に全ての動物種を増幅し、期待される大きさ（472bp）のバンドを生じた。結果を図4に示す。この実験は、P,S解析およびその他のインシリコ解析の結果を実証し、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」が普遍的プライマーであることを示した。
【００４２】
プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用して未知の動物起源の生物材料の種の同一性を決定する流れ図。
【００４３】
未知の動物起源の生物材料
↓
DNA単離
↓
単離したDNAのプライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用するPCR増幅
↓
三つの両方の鎖をシーケンシング（ABI Prism3700, PE-Applied Bio-systemの使用などの標準的な手順のいずれかを使用）
↓
NCBIのミトデータベース（http:// www. ncbi. nlm. nih. izov/BLAST）においｔｒ明らかとなった配列のBLAST：（これにより、データベースに登録された配列と参照配列の最も有意なアライメントを生じることにより、解析した物質のファミリーについてのアイデアを得る）
↓
NCBIのnrデータベース（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/13LAST）において明らかとなった配列のBLAST：（これにより、データベースに登録された配列と参照配列の最も有意なアライメントを生じることにより、解析した物質の属、より正確には種についてのアイデアを得る）
↓
ミトおよびnr BLAST検索によって明らかとなったファミリー/属/および種に属する参照動物の選択
↓
既知の参照動物の血液からのDNAの単離；プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用するPCR増幅；同じプライマーを使用する、三つのPCR産物のシーケンシング
↓
オートアセンブラ（/CLUSTAL X（1.8）などのソフトウェアを使用して、既知の参照動物のミトコンドリアのチトクロームb遺伝子および未知の動物起源の生物材料の明らかとなった配列の多重配列アライメント
↓
未知の動物起源の生物材料から得られたDNAのチトクロームb遺伝子配列に相同的な（または、かなり類似する）アラインした配列からの配列の同定。
【００４４】
↓
相同配列の種が、調査下の生物材料の種であろう。
【実施例】
【００４５】
表題「発明の簡単な概要」の「発明の目的」の副題のもとにカラム1、2、および3の要求を満たすチトクロームb遺伝子の断片を同定するための実施例
チトクロームb分子は、分子生物分類学において非常に広く使用されている。遺伝子の進化は緩徐であり、そのヌクレオチド配列には、動物をそれらのファミリー、属、および種の供与源に区別するための相当な情報を有する1-65。種々の動物種のチトクロームb遺伝子の配列の巨大なデータベースは、NCBIのnrおよびミトデータベースに蓄積されている。我々は、持ち込まれた未知の動物起源の遺骸の、そのファミリー、属、および種の供与源に対して同一性を証明するために、これらのチトクロームb遺伝子の質を探検した。この目的のために、我々は、種間特異的に非常に多形性であるが、同種の個体間では単形性であるチトクロームb遺伝子の断片を同定し、したがって、未知の種で個体をこれが帰属する既知の参照種の個体により分類することができた。任意の未知の起源から単離されたDNA由来のこの断片を増幅するために、広範囲の動物ファミリー間で高度に保存された配列の側面に位置したままである必要があった。チトクロームb遺伝子内にこのようなユニークな断片を同定するために、我々は、ソフトウェアCLUSTAL X（1.8）を使用して、種々のファミリーを示す遠位の関連した221の動物種（表1に一覧を示した）の配列をアラインした。これらの配列は、公共のデータベースNCBIから得られた（http：//www. ncbi. nlm. nih. ov）。インシリコ解析において、含まれる全ての種間に保存された部位について慎重にアラインされたデータを検討した。また、我々は、上記並びに「発明の目的」の副題の1、2、および3段に記載の要求の全てを満たすチトクロームb遺伝子の断片（472bp）を同定した。
【００４６】
この断片の同一性に関して、我々は、これがアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）およびフェリス・カタス（Felis catus）では398〜869間のヌクレオチドを含むが；ホモサピエンスsapiens種では399〜870を含むことを言及しておきたい。表2に星型（*）としてマークしたいくつかの位置を除き、この断片のヌクレオチド配列は、動物種間で非常に変化しやすく、これらのユニークな分子的シグニチャが引き起こされる。これらの分子的シグニチャは、その種の特徴であり、我々が発明した手順によって未知の動物起源の生物材料の同一性を示す基礎を形成する。アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）を代表的な種として考え、この断片配列をここに記載する：
アンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子配列（398-869bp）
「taccatgaggacaaatatctttttgagagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctatagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaacsccacaggaatctcatcagacgcagacaaaas：ccaticeacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcct ccgatcaattcctaacaaactaggagg。
【００４７】
実施例2：
「実施例1」のもとで言及した同定された断片を増幅するための普遍的プライマーを開発についての実施例
以下の特徴を有する一対の普遍的プライマーをデザインした：
1.ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）でこれを増幅するための同定された（「実施例1」下で言及した）断片を標的とする。
【００４８】
2.高度に保存された（表2に星型（*）としてマークした）その3'および5'末端、広範囲の動物種間で断片の増幅を保証する普遍的方法における上述した断片の増幅。これらのプライマーによって増幅される断片のシーケンシングにより、解析材料の種の分子的シグニチャが明らかにされ、既知の参照動物の配列との比較により調査下の未知の生物材料の種の同一性が明らかとなる。
【００４９】
3. 両方のプライマーのTM（融解温度）は、ほとんど同じ（摂氏約58度）であり、そのテンプレートに対して両方のプライマーは有意にアニーリングし、したがって、PCRで目標とした領域の有意な増幅が確認された。
【００５０】
4.プライマーの内部安定性およびP,Sスコアは、より高いことが保証され、一方これをデザインする。また、内部ループ形成、二量体形成等の可能性を、そのユニークな配列を選択することによって除外した。これにより、プライマーが未知の動物起源からDNAを増幅するためのPCRで使用するために良好なプライマーであることが確認された。
【００５１】
5.プライマーの3'末端は、「G」または「C」を有し、その3'末端において、強く結合する可能性を増大させることが確認されたが、PCRでDNAテンプレートを効率的に増幅することが必要である。また、これは、プライマーの普遍的性質も強化する。
【００５２】
6.プライマーの配列は、PCRにおいて非特異的産物および偽産物を生じて混同を引き起こさないように、独特であることを確認した。これにより、我々が発明した技術の効率および質が改善された。
【００５３】
7.これらのプライマーは、本発明のための代表的な動物種であるアンチロープ・セルビカプラ（Antilope cervicapra）のヌクレオチド398〜869間のミトコンドリア・チトクロームb遺伝子領域を増幅するというその性質により、これらのプライマーは、「mcb 398」および「mcb 869」と名付けられた。このような新規のプライマーを開発するアイデアは、発明者の心に生じるが、彼らは、Center for Cellular and Molecular Biology, Hyderabad, Indiaでこの動物のゲノムについて仕事をしているので、我々は、代表的な種としてこの動物種を採用した。
【００５４】
8.発明した普遍的プライマーの配列は、次の通りである：
プライマー名        配列（5'-3）
「mcb 398」      「TACCATGAGGACAAATATCATTCTG」
「mcb 869」      「CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG」
実施例3：
PCRで任意の未知の起源のテンプレートの増幅を確認するための普遍的PCR条件を開発し、それゆえ、我々が発明した技術の普遍的性質を強化するための実施例
開発したPCR条件は、以下のユニークな特徴を有した：
1.これらにより、「実施例2」のもとに記載した普遍的プライマーを使用して、普遍的方法で任意の動物起源のDNAテンプレートを増幅することでことができる。
【００５５】
2.条件は、両方のプライマー、すなわち「mcb 398」および「mcb 869」について比較可能なアニーリング温度を保証するように選択した。
【００５６】
3.ここで標準化したPCR条件は、普遍的である；したがって、標準化されていない条件による未知起源のテンプレートでのPCRの失敗の可能性が除外される。これにより、法医学的に野生生物において使用するための我々の技術の普遍的性質が保証される。
【００５７】
4.記載した普遍的条件は、以下の通りである
増幅反応は、約20ngのテンプレートDNA、それぞれ100μmのdNTPs、1.25pmoleの各プライマー、1.5mMのMgCl2、0.5ユニットのAmpliTay Gold（Perkin-Elmer-Cetus, USA）、DNAポリメラーゼ、および1×PCR緩衝液（10mMトリス-HCl、pH 8.3および50mMのKCl）を含む20μlの反応体積で実行されるべきである。続く増幅プロフィールは：95℃で10分間の初期変性、続いて95℃で45s間の変性、51℃で1分間のアニーリング、および72℃で2分間の伸張をそれぞれ35サイクルで行われるべきである。35サイクルめの伸長工程は、10分間保持されるべきである。
【００５８】
実施例4：
我々のプライマーの普遍的性質の決定およびプライマーの普遍的性質を示すことの実験的証明：
プライマー「mcb 398」および「mcb 869」の普遍的性質は、以下の測定によって確認される：
（a）遠位の関連した種の221動物のアラインしたチトクロームb遺伝子配列から、プライマーを選択すること：
ソフトウェアCLUSTAL X（1.8）を使用して、チトクロームb遺伝子配列（1140bp）をアラインした。プライマーをデザインするために、221の動物種間で最も保存されているチトクロームb遺伝子の領域を選択した。
【００５９】
（b）チトクロームb遺伝子の高度に保存された部位においてプライマーの3'および5'末端を選択すること：
プライマーの3'および5'末端は、広範な動物ファミリーを示す221の動物種間で高度に保存された位置にアニーリングすることが保証された。これにより、PCRにおいて全ての種の効率的な増幅が保証された。これらの位置は、表2に星（*）マークで示す。
【００６０】
（c）プライマーの3'末端に「G」または「C」のいずれかを保証する：
これにより、プライマーは、3つの水素結合と共に互いに対をなし、プライマーの3'末端で強い結合を保証するヌクレオチドとして、その3'末端が「G」または「C」のいずれかを有することが保証される。3'末端の強い結合により、プライマーがそのテンプレートと適切にアニーリングするのを助け、PCRにおいて有意な増幅を生じることとなる。
【００６１】
（d）より高い内部安定性、より高いP,Sスコア、並びにプライマー二量体およびループ形成がないことを保証するように、プライマーの配列を選択すること：
プライマーの配列は、広範な動物種（表1に示した）において高いP,Sスコアを有するように選択した。PCRにおけるプライマーの効率を減少し得るループおよびプライマー二量体形成を排除するように注意した。
【００６２】
（e）比較可能な融解温度を有するプライマーの配列を選択すること：
プライマーの配列は、比較可能な融解温度を有するように選択され、その結果、一緒に機能することができ、PCRにおいて同様のアニーリング温度でDNAテンプレートを増幅する。両プライマーの融解温度は、約摂氏58度であり、PCRにおいて使用されるアニーリング温度は、摂氏51度である。
【００６３】
プライマーの普遍的性質を示すための実験的証明：
（I）インシリコ解析による証拠：
（a）ミトコンドリア・チトクロームb遺伝子の最も保存された領域内におけるプライマーの選択
上述したとおり、プライマーは、472bpのミトコンドリア・チトクロームb遺伝子断片の高度に保存された領域内でアニーリングするようにデザインした。表2は、上記の広範な動物ファミリーを示す221動物種のチトクロームb遺伝子断片のアライメントを示す。保存されたヌクレオチド配列部位を表2に星型（*）マークで示す。
【００６４】
また、表2は、プライマーの3'末端がインシリコで解析した全ての動物種間で高度に保存されていることを示す。アラインした配列において、保存されたヌクレオチドは、シンボル（*）でマークする。また、プライマーの5'末端は、チトクロームb遺伝子の保存された領域内で、これらの標的配列（すなわち、上記したチトクロームb遺伝子の472bp断片）に対するプライマーのマッチの確率および安定度を改善するように選択した。種々のソフトウェア、すなわち「Amplify（1.2）」、「Primer3」（http：//www.genome. wi. mit. edu/cei-bin/pnmer/primer3 cgi）を使用して、並びに手動で、内部安定性、ループ、または二量体形成についてプライマーを徹底的に点検した。
【００６５】
（b）P,S、スコア解析：
我々は、Amplify（1.2）ソフトウェアを使用して、それぞれのテンプレートに対するプライマーにP,Sスコア（P=マッチの確率、S=マッチの安定性）を割り当てた。PおよびSスコアがより高いことは、他の全ての条件標準（これは、「実施例3」で述べた）が最適である場合に、良好な増幅を保証する。「mcb 398」について最も高いスコアは、98,63（すなわち、プライマーがテンプレートと完全にマッチする状況）であるが；「mcb 869」において最も高いP,Sは、プライマーおよびテンプレート間の完全なマッチに対して98,68と記録された。「mcb 398」について観察された最も低いP,Sスコアは、種テルパ・ヨーロパエ（Talpa europaea）に対して81,50であったが、「mcb 869」は、この種に対して高いP,Sスコア（92,57）を有した。2つのプライマーのうちの1つについて最も低いP,Sスコアを有するするもう一つの種は、ユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）およびイクウス・アイナス（Equus ainus）であった。ユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）は、「mcb 398」および「mcb 869」について、それぞれP,Sスコア86、55および73,51を有したが；イクウス・アイナス（Equus ainus）のP,Sスコアは、「mcb 398」および「mcb 869」について、それぞれ91、61および73,51と算出された。その他の全ての動物では、上述の種よりも高い効果があった。これらのプライマーがプライマーのうちの1つについて最も低いP,Sスコアを有する動物に由来するDNAテンプレートと効率的に作用することを確認するために、我々は、PCRで効率的に増幅のために充分な2つのプライマーのうちの1つの下限を確認するためのもう一つの実験をデザインした。我々は、そのアニーリング部位に、多くのミスプライミングを有し、従ってより低い内部安定性およびそのテンプレート（表9に一覧を示した）に対するより低いP,Sスコアを有するもう一つのプライマー対（AFF= ctagtagaatgaatctaggaggおよびAFR= tatgcaaataggaagtatcattc）をデザインした。「AFF」および「AFR」のP,Sスコアは、プラタニスタ・ガンゲチカ（Platanista gangetica）およびサス・スクロファ（Sus scrofa）について41および49と同程度に低いと算出された。これらの種は、プライマー「AFF」および「AFR」を使用して効率的に増幅された（図3に示した結果）（その他の全ての条件標準、すなわち「実施例3」に掲げた条件を保持する）。我々のプライマー「mcb 398」および「mcb 869」について、最も低いP,Sスコア（種Eumeces egregiousに対して86、55および73,51）は、それぞれ種サス・スクロファ（Sus scrofa）に対する「AFF」および「AFR」を合わせたP,Sスコア（87,52および87,41）の上記範囲よりも高く、プライマー「AFF」および「AFR」によって効率的に増幅された。これは、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」がユーメセス・イグレギアス（Eumeces egregious）を含む全ての種で効率的に機能し、PCRにおいて期待される産物を生じるであろうという指標を与える。この実験では、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」が大部分の動物種のチトクロームb断片を普遍的方法で増幅することが確認された。
【００６６】
著作権BLAST解析：
プライマー「mcb 398」および「mcb 869」の配列をNCBIのミトおよびnrデータベースに対してブラストして、GenBankに登録された配列とのその有意なアライメントを見た。予想されたとおり、最も有意な配列のアライメントは、種々の動物種のチトクロームb遺伝子領域（「実施例1」で述べた472bp断片内）で見出された。また、この解析では、プライマーの3'並びに5'末端が、広範な動物種間で高度に保存されていることを示し、プライマー（それぞれ、表10および11）の普遍的性質を確認した。
【００６７】
（2）実験室条件においてなされた机上作業／実験からの証拠：
遠位の関連した種（表12で述べた）に属する種々の動物に由来するDNAを単離して、我々が発明したプライマー、すなわちプライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用するPCR増幅に供した。増幅されたPCR産物をアガロースゲルにおける電気泳動によって分離して、紫外線下で視覚化した。予想されるPCR産物のサイズ（472bp）が、全ての動物から得られ、我々のプライマーの普遍的性質が確認された。これらの結果を図4に示す。
【００６８】
実施例5：
普遍的プライマー「mcb 398」および「mcb8G9を使用する、持ち込まれた未知の動物起源由来の遺骸の同一性を証明するための実施例。
【００６９】
未知の動物供与源に由来する生物材料の同一性を証明するための段階的手順を以下に記載する：
未知の動物起源の生物材料DNAの単離
↓
プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用する単離したDNAのPCR増幅
↓
三つの両方の鎖をシーケンシング（ABI Prism3700, PE-Applied Bio-systemの使用などの標準的な手順のいずれかを使用）
↓
NCBIのミトデータベース（http:// www. ncbi. nlm. nih. izov/BLAST）において明らかとなった配列のBLAST：（これにより、データベースに登録された配列と参照配列の最も有意なアライメントを産生することにより、解析した物質のファミリーについてのアイデアを得る）
↓
NCBIのnrデータベース（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/13LAST）において明らかとなった配列のBLAST：（これにより、データベースに登録された配列と参照配列の最も有意なアライメントを産生することにより、解析した物質の属、より正確には種についてのアイデアを得る）
↓
ミトおよびnr BLAST検索によって明らかとなったファミリー/属/および種に属する参照動物の選択
↓
既知の参照動物の血液からのDNAの単離；プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用するPCR増幅；同じプライマーを使用する三つのPCR産物のシーケンシング
↓
オートアセンブラ/CLUSTAL X（1.8）などのソフトウェアを使用して、既知の参照動物のミトコンドリアのチトクロームb遺伝子および未知の動物起源の生物材料の明らかとなった配列の複数配列アライメント
↓
未知の動物起源の生物材料から得られたDNAのチトクロームb遺伝子配列に相同的な（または、かなり類似する）、アラインされた配列からの配列の同定。
【００７０】
↓
相同配列の種が、調査下の生物材料の種であろう。
【００７１】
↓
表題「発明の概要」の「発明の目的」の副題のもとにカラム7〜13で述べた目的に対する上記情報の適用
実施例6：
発明した技術の実際の実行
第一の適用として、および本方法の平易さおよび有用性を示すために、我々は、動物狩猟の証拠についての科学的な意見を探求するために我々の実験室で提出された法医学の同定の一例を調査した。この場合において、我々は、犯罪調査機関によって持ち込まれた未知の動物の半分火傷した遺骸を受けとった。標準的な方法に従って上記物質からDNAを分離して、上述したプライマー（すなわち、「mcb 398」および「mcb 869」）を使用してPCR増幅に供した。増幅反応は、約20ngのテンプレートDNA、100μmの各dNTPs、1.25pmoleの各プライマー、1.5mMのMgCl2、0.5ユニットのAmpliTay Gold（Perkin-Elmer-Cetus, USA）、DNAポリメラーゼ、および1×PCR緩衝液（10mMトリス-HCI、pH 8.3および50mMのKCI）を含む20μlの反応体積で実施した。続く増幅プロフィールは：95℃で10分間の初期変性、続いて95℃で45s間の変性、51℃で1分間のアニーリング、および72℃で2分間の伸張をそれぞれ35サイクル行うべきである。35サイクルめの伸長工程は10分間保持した。
【００７２】
得られたPCR産物では、両鎖に対してオートメーション化したワークステーション（ABI Prism 3700, PE-Biosystems）で三回シーケンスし、および明らかとなった配列（328bp、図laに示した）をBLASTプログラム73を使用するNCBIのミトデータベースに対してブラストした。この配列の最も有意なアライメント（ビット値365, E値e-101）は、フェリス・カタス（Felis cutu）sのチトクロームb遺伝子配列（表3）を生じたことから、解析した物質の種がネコ科ファミリーに属することを示している。さらに、持ち込まれた遺骸から示された上記の配列を、BLASTプログラムを使用するNCBIのnrデータベースに対してブラストした。この配列の最も有意なアライメント（ビット値603, E値e-l70）は、パンセラ・パルダス（Panthera pardus）のチトクロームb遺伝子配列（表4）を生じたことから、パンセラ・パルダス（Panthera pardus）供与源のものであると解析した物質の同一性を示した。この情報に基づいて、我々は種々の種およびネコ科の亜種を示す表5に一覧を示した参照動物を選択した。参照動物から分離したDNAを、上述したプライマー対を使用して両方の鎖について三回増幅し、シーケンスした。得られたコンセンサス配列を、プログラムCLUSTAL X（1.8）を使用してアラインした（表6）。配列比較により、解析した全ての動物間の全体で、113個の変化しやすい部位が同定された（表7）。調査した種々の動物間のバリエーションを発見するために、配列の段階的な比較を行った。調査した全ての種は、それらの独特なヌクレオチド配列によって区別することができる。種々の参照動物の分子的シグニチャを、持ち込まれた皮膚「adil. flesh」の分子的シグニチャと比較した。「gzl」、すなわち既知のヒョウ（パンセラ・パルダス（Panthera pardus））種と「adil. flesh」の最大の類似性を示す表7は、パンセラ・パルダス（Panthera pardus）起源のものとして、adil. flesh、持ち込まれた皮膚の同一性を示している。また、我々は、PHYLIPソフトウェアを使用して、調査下の動物種間の段階的な類似性を示す類似性マトリックスを算出した。このマトリックを表8に示した。これは、異なった種に属する動物が、より多くのバリエーションを有することを示すが；同じ種の動物では、これらのチトクロームb配列間に最大の類似性を有した。持ち込まれた物質から分離したDNAのチトクロームb遺伝子配列は、既知のヒョウ供与源（「gzll」および「gz21」について、それぞれ99.7%および98.2）から得られる配列と最大の類似性を有し；通常のヒョウ（Pentheru pardzxs）種のものとして持ち込まれた物質の供与源の同一性を証明した。上記解析に含まれる段階的手順を図1a、1b、および1cにそれぞれ例示する。
【００７３】
したがって、我々が発明したプライマーは、未知の動物起源のどのような生物材料からでも、実際にそのファミリー、属、およびより正確には種の特徴である分子的シグニチャを生じることができる。これらのシグニチャを、BLASTソフトウエア73を使用して、公共のデータベース（すなわち、GenBank、NCBIデータベース等）においてすでに利用できるシグニチャとインシリコで比較した場合、これが解析した物質のファミリー、属、または種の同一性を示し、プライマー「mcb 398」および「mch869によるさらなる解析にそれらを含めることによって明らかとなったファミリー、属、または種の参照動物と比較することにより、実際に確かめられる。明らかとなった情報の適用により、表題「発明の概要」の「発明の目的」の副題もとにカラム7〜13で述べた目的の要求を満たす。
【００７４】
本発明の方法は、持ち込まれた動物部分の同一性を証明するために使用することができ、法医学において野生生物同定の要求の鍵の一つを生じる。これは、合理的疑問を越えて犯人による犯罪を証明し、野生生物資源のヒト違反を回避するために必要である。種々の形態的、生化学、および分子的な方法がこの目的のために供給されているが；しかし、最新の方法のいずれもが、未知の起源の切断された動物遺骸を検出するために普遍的に適用できない。我々は、種々の動物種間でファミリー、属、および種の供与源を区別するための莫大な情報を有するミトコンドリア・チトクロームb遺伝子中の断片を同定した。また、我々は、この断片が広範な動物種間に高度に保存された配列に隣接して位置することを見出した。我々は、未知の動物起源の生物材料から単離したDNA中のこの断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）で増幅して、種および亜種供与源でその同一性を示すことができる一対の普遍的プライマーを発明した。この新規発明は、野生生物の法医学における同定および犯罪調査の全体のシナリオに革命を起こすような大きな可能性を有する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７ａ】
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【表７ｂ】
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【表７ｃ】
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【表７ｄ】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】解析に含まれる段階的手順を示す。未知の生物材料、すなわち「adil. flesh」は、「実施例6」で述べた持ち込まれた皮膚に工程に関する。矢印は、含まれる段階的手順を示す。図laの概要は、次の通りである：生物材料、すなわち持ち込まれた皮膚「adil. flesh」をDNに供した。
【００７６】
標準的な手順を使用して単離する74。得られたDNAを、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用してPCRで増幅し、2%（w/v）アガロースゲルで分画し、Gel Documentation System（Syngene（USA））を使用して紫外線下で視覚化して写真を撮った。写真中にを示されたレーン「M」は、分子量マーカー（マーカーXIII（Boehringer mannheim）を表す。レーン1は、プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用して、「adil. flesh」から得られるPCRアンプリコン（472bp）を示す。
【００７７】
得られたPCRアンプリコンは、ABI Prism 3700 DNA Analyzes、PE-Applied Bioシステムを使用して両方の鎖をシーケンスした。クロマトグラムは、「adil. flesh」から得られた配列（約80bpの長さ、すなわち150〜230bp間の配列（328bp）は、472bpの長さのPCR産物から明らかとなった）を示す。
【図１ｂ】解析に含まれるさらなる工程を例示する。「adil. flesh」から明らかとなった配列（328bp）を、National center of Biological Information（NCBI）（USA）のnr（すなわち、非重複）データベースのホモロジー検索に供した。有意なアライメントを生じる配列が、そのビットスコアおよびE値とともに示される。これは、配列間のホモロジーの程度が調査されたこと（すなわち、adil. flesh由来の328bpの配列）、および配列がNCBIのnrデータベースに登録されたことを示す。BLAST解析では、Panthera pardus（ジーンバンクアクセッション番号「AY005809」）の配列と、「adil.flesh」から明らかとなった配列とに最も高いホモロジーを示したことから、ヒョウ（Panthera部分）起源のものとしてadil. fleshの同一性が示される。図lbは、「adil. flesh」から得られた配列と共に、参照動物（表5に一覧を示した）から得られた配列の多数のアライメントをさらに例示する。「adil. flesh」の配列は、「gz1L」の配列に似ており、Pztttltercz p（trb s起源）のものとして、持ち込まれた遺骸「adil. flesh」の供与源の同一性をさらに確認する。
【図１ｃ】CLUSTAL X（1.8）を使用して、配列「adil. flesh」および表5に一覧を示した参照動物の配列から構築したNu-tree（Neighbor Joining tree）を示す。同じ種に属する動物は、共にクラスター形成するが；しかし、異なった種の動物は、異なったクラスターに分類される。調査下で持ち込まれた物質（すなわち、「adil. flesh」）は、「gzlL」（すなわち、既知の正常ヒョウのPanthera pardus）とクラスタ形成することから、Panthera pardus供与源のものとして、「adil. flesh」の同一性が示される。
【図２】普遍的プライマー「mcb 398」および「mcb 869」を使用して、表5に一覧を示した参照動物の家ネコから得られたPCRアンプリコン（472bp）を示すアガロースゲル電気泳動を示す。種々のレーンの記載は、次の通りである：レーン1〜21：表5に一覧を示したそれぞれの動物1〜21のPCRプロフィール。
【００７８】
レーン22：持ち込まれた未知の動物起源、すなわち「adil. flesh」の皮膚から単離したDNAのPCRプロフィール。
【００７９】
レーン23：ネガティブコントロール（DNAでない）
Lane M：分子量マーカー（マーカーXIII, Boehringer mannheim）
【図３】表9に一覧を示した動物から得られるPCRアンプリコンを示す。PCRに使用したTbプライマーは、「AFF」および「AFR」である。種々の示したレーンの記載は、次の通りである：レーン1〜4：表9に一覧を示したそれぞれの動物1〜4のPCRプロフィールであり、354bpのアンプリコンを示す。
【００８０】
レーンM：分子量マーカー（マーカーXIII, Boehringer mannheim）
【図４】表12に一覧を示す動物から得られるPCRアンプリコンを示す。この実験は、動物種の広範な範囲の中の我々のプライマーの普遍的性質を示す。
【００８１】
示される種々のレーンの記載は、次の通りである：
レーン1〜23：表12に一覧を示したそれぞれの動物1〜23のPCRプロフィール。472bpのPCR産物は、解析した全ての動物種から普遍的に増幅される。
【００８２】
レーン24：ネガティブコントロール（DNAでない）
Lane M：分子量マーカー（マーカーXIII, Boehringer mannheim）
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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