(57)【要約】本発明は、マラリアの治療または予防に使用するための以下の一般式で表される医薬化合物に関する。【化１】2004533418.tif 000011（式中、Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、ピペリジニル、ピペリジニル、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択され、Ｘが、クロロ、フルオロ、ヨード、ブロモ、トリフルオロメチル、メトキシおよびメチルからなる群から選択される。）
2004533418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリアの治療または予防に使用するための以下の一般式で表される化合物。
【化１】
2004533418.tif 000009
（式中、
Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、ピペリジニル、ピペリジニル、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択され、
Ｘが、クロロ、フルオロ、ヨード、ブロモ、トリフルオロメチル、メトキシおよびメチルからなる群から選択される。）
【請求項２】
上記Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、ピペリジニル、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択される、マラリアの治療または予防に使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択される、マラリアの治療または予防に使用するための請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
マラリアの治療または予防に使用するための以下の式で表される請求項３に記載の化合物。
【化２】
2004533418.tif 000010
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を活性成分として含む、マラリアの治療または予防のための医薬製剤。
【請求項６】
マラリアの治療または予防に用いる薬剤を製造するのに使用する請求項１〜４のいずれかに記載の化合物または薬学的に活性なその塩。
【請求項７】
マラリアのクロロキン耐性株の治療または予防に用いる薬剤を製造するのに使用する請求項１〜４のいずれかに記載の化合物または薬学的に活性なその塩。
【請求項８】
前記化合物が塩化水素塩として調製される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を活性成分として含む医薬製剤。
【請求項９】
前記化合物がリン酸塩として調製される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物を活性成分として含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗マラリア反応を引き起こす医薬化合物、その使用およびその合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗マラリア化合物は、マラリアを制御するために、何年間も使用されており、例えば、クロロキン（最も一般的に使用される化合物）、プリマキン、ピリメタミン、メフロキンおよびキニーネを含む。Plasmodium falciparum（熱帯熱マラリア原虫）マラリアにおけるクロロキン耐性は、開発途上国で健康への主要な懸念になってきている。この耐性により、増大する問題に取り組むように、耐性株に対し有効でありうる他の抗マラリア剤を薬理学的に再検討することが促された(World Health Org. Severe and Complicated Malaria W. H. O. Material Action Programme, Trans. Roy. Trop, Med. Hyg., 80, 1-50)。４−アミノキノリンは、以下のように同定された基本構造を有する。
【０００３】
【化１】
2004533418.tif 000003
【０００４】
この構造から誘導された多数の化学物質が公知であり、多くのものが抗マラリア剤と考えられている。マラリアの治療または予防に使用するための４−アミノキノリンおよびその誘導体に関する、本出願人のWO-A-00/50404中に、この技術が簡潔に概説されている。WO-A-00/50404は、最初の研究から、Plasmodium falciparumのクロロキン感受性および耐性株に対し特に良好な効力を示すと考えられる多数の化合物を開示している。
【０００５】
本発明者らは、WO-A-00/50404の発明者名の１人と共同で、J. Med. Chem. 1999, 42, 2747-2751に、４−アミノキノリンマンニッヒ塩基抗マラリア剤の使用に関連するある研究を発表した。
【０００６】
Ohtomo, Hiroshi等は、健康な日本人における抗マラリア剤ファンシダール(Fansidar)の薬物的動態に関する研究をChemical Abstracts, Vol.103, No.17に開示している。
【０００７】
Srivastava, Sandhya等は、７−クロロ−４−置換アミノキノリンの合成、および、それがインビトロでイヌ溶血物中にメトヘモグロビンを産生する能力に関する研究をChemical Abstracts, Vol.128, No.5に開示している。
【０００８】
Barlin, Gordon B.等は、４−［７−クロロ（および７−トリフルオロメチル）キノリン−４−イルアミノ］フェノールのマンニッヒ塩基誘導体の抗マラリア活性の可能性に関する研究を、Chemical Abstracts, Vol.121, No.21に開示している。
【０００９】
Barlin, Gordon B.等は、２−［７−クロロキノリン−４−イルアミノおよび７−ブロモ（および７−トリフルオロメチル）−１，５−ナフチリジン−４−イルアミノ］−４−クロロ（または４−または６−ｔ−ブチルまたは４−または４−フルオロ）フェノールおよび４（または６）−ｔ−ブチル−２−（７−トリフルオロメチルキノリン−４−イルアミノ）フェノールのマンニッヒ塩基誘導体の抗マラリア活性の可能性に関する研究をChemical Abstracts, Vol.121, No.15に開示している。
【００１０】
Natarajan, P. N.は、４−（７−クロロ−４’−キノリルアミノ）−  −フェニル−  −ピペリジノ−２−クレゾールの抗マラリア活性および分解分析に関する研究をChemical Abstracts, Vol.80, No.7に開示している。
【００１１】
Stephen J. Kesten等は、４−［（７−クロロ−４−キノリニル）アミノ］−２−［（ジエチルアミノ）メチル］−６−アルキルフェノールおよびそのＮW−酸化物の合成および抗マラリア効果に関する研究をJ. Med. Chem. 1987, 30, 906-911に開示している。
【００１２】
Leslie M. Werbel等は、４−アミノキノリン−１−オキシド化合物、その塩およびその製法に関する研究をUS-A-3136769（特許は、Parke, Davis & Companyに譲渡されている）に開示している。
【００１３】
F. Hoffmann-La Roche AGは、抗マラリア活性を有する特定のアミノキノリン誘導体をEP-A-0656353に開示している。
【００１４】
Eli Lilly and Companyは、特定のキノリン殺菌剤をEP-A-0326330に開示している。
【００１５】
P.falciparumのクロロキン耐性株に対し有効である１つの化合物は、４−アミノキノリン抗マラリア化合物であるアモジアキン(amodiaquine)である(Watkins,W.M.;Sixsmith,D.G.;Spencer,H.G.;Boriga,D.A.;Karjuki,D.M.;Kipingor,T.;Koech,D.K.Effectiveness of Amodiaquine as a Treatment for Chloroquin Resistant Plasmodium Falciparum. Lancet I, 1984, 357-359)。しかしながら、肝臓への毒性および顆粒球の減少を伴うので、その臨床での使用は厳しく限定されている(Neftel, K. A.; Woodtly, W.; Schmid, M. Amodiaquine Induced Agranulocytosis and Liver Damage Br. Med. J., 1986, 292, 721-723およびLind, D. E.; Levi, J. A.; Vincent, P. C. Amodiaquine Induced Agranulocytosis; Toxic Effects of Amodiaquine in Bone Marrow Culture In Vitro. Br. Med. J., 1973, 1, 458-460)。
【００１６】
パラセタモール（４−ヒドロキシアセトアニリド）は、P-450に触媒される酸化を受けて、化学的に反応性のキノンイミンになると考えられているｐ−ヒドロキシアニリノ基を含む。アモジアキンも、この官能性(functionality)を含み、酵素による酸化を受けて反応性代謝産物となると予期することができる。
【００１７】
本発明者による近年の研究により、ラットにおいて、アモジアキンは、もっぱら５’チオエーテル複合体（グルタチオンおよびシステイニル）として胆汁中に放出されることが示された(Harrison,A.C.;Kitteringham,N.R.;Clarke,J.B.;Park,B.K.The Mechanism of Bioactivation and Antigen Formation of Amodiaquine in the Rat.Biochem.Pharmac.,1992,43,1421-1430)。この発見から、親薬物が、インビボで広範な生理活性を受けて、アモジアキンキノンイミン（ＡＱＱＩ）またはセミキノンイミン（ＡＱＳＱＩ）を形成し、続いてグルタチオンの共役付加(conjugate addition)が生じることが示唆される(Maggs,J.L.;Kitteringham,N.R.; Park,B.K.Drug Protein Conjugates-XIV.Mechanism of Formation of Protein Arylating Intermediates From Amodiaquin a Myelotoxin and Hepatotoxin in Man. Biochem.Pharmac.,1988,37,303-311)。これらの反応種の１つがインビボで形成されること、および引き続いて細胞マクロ分子へ結合することが、直接に細胞機能に影響できる、または免疫機構を介して細胞機能に影響できると考えられる。実際、５’−システイニル基を認識するＩｇＧ抗体は、アモジアキンへの逆反応として、患者中に検出された(Clarke,J.B.; Maggs,J.L.;Kitteringham,N.R.; Park,B.K.Detection of IgG Antibodies in Ptients with Adverse Drug Reactions to Amodiaquine.Int.Arch.Allergy Immunol.,1990,1335-1342)。従来の研究により、パラセタモールの芳香核へフッ素を導入することにより、その分子の酸化電位が増加し、それによって、その分子が細胞毒性を有するキノンイミンへインビボで酸化されることが阻害されることが示された(Barnard,S.;Kelly,D.F.;Storr,R.C.;Park,B.K. The Effect of Fluorine Substitution On the Hepatotoxicity and Metabolism of Paracetamol in the Mouse. Biochem.Pharmac.,1993,46,841-849)。さらなる研究により、パラセタモールと同様の方法で、フッ素原子を、アモジアキンの４−ヒドロキシアニリノ側鎖へ導入すると、より大きな酸化および代謝安定性を備えた化合物を生じることを示された(O'Neill,P.M.;Harrison,A.C.;Storr,R.C.;Hawley,S.R.;Ward,S.A.,Park,B.K.,"The Effect of Fluorine Substitution on the Metabolism and Antimalarial Activity of Amodiaquine"Journal of Medicinal Chemistry,1994,37,1362-1370)。
【００１８】
アモジアキンは、原則的にヒト中で代謝されて、デスエチルアモジアキンとなるが、これは、クロロキン耐性株に対し著しく効果の少ない化合物である（この代謝経路が、クロロキン耐性寄生生物に感染した患者に対しアモジアキンが臨床的に不十分であることと関係があると示唆されていた）。事実、アモジアキンは、しばしば、Ｎ−デスエチルアモジアキンのプロドラッグと呼ばれている。
【００１９】
そのため、有毒代謝物質を形成しない好適なアモジアキン誘導体を提供する、代わりの方策が好ましいであろう。そのような誘導体については、インビトロでクロロキン耐性寄生生物に対し有力であると同時に、安価に合成でき、マラリアの治療および予防の双方に使用可能で有効な医薬品にできることも望ましい。
【００２０】
イソキン(isoquine)（５’−（７−クロロ−キノリン−４−イルアミノ）−２’ジエチルアミノメチル−フェノール）は、もともと、Bruckhalterおよび共同研究者により、1948年に合成された(J.Am.Chem.Soc.1948,70,1363-1373)。
【００２１】
さらに、最近、Barlin(Aust.J.Chem,1993,46,1685-1693)が、イソキンのピペリジニル類縁体を乏しい化学的な収率で調製した。これは、クロロキン感受性および耐性寄生生物に対し、比較的適正な活性を示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、医薬化合物およびその使用、特に抗マラリアとして作用できるもの、およびその合成法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の第一の側面によると、マラリアの治療または予防に使用するための以下の一般式で表される化合物が提供される。
【００２４】
【化２】
2004533418.tif 000004
（式中、
Ｒは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、ピペリジニル、ピペリジニル、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択され、
Ｘは、クロロ、フルオロ、ヨード、ブロモ、トリフルオロメチル、メトキシおよびメチルからなる群から選択される。）
【００２５】
本発明の好適な化合物は、Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、ピペリジニル、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択されるものを含む。
【００２６】
本発明による特に好適な化合物では、Ｒが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジ−Ｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジ−Ｎ−ブチルアミノ、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ、エチルアミノおよびｔｅｒｔ−ブチルアミノからなる群から選択される。本発明による特に好適な化合物は、マラリアの治療または予防に使用するための以下の式で表されるイソキンである。
【００２７】
【化３】
2004533418.tif 000005
【発明の効果】
【００２８】
イソキンは、優れた抗寄生生物特性に加えて、合成するのに極めて安価な抗マラリア剤であり、マラリアの予防および治療の双方で使用可能で、安価で有効な抗マラリア剤のための新規なリード化合物に相当する。
【００２９】
本発明による化合物は、減じられた毒性およびクロロキン耐性寄生生物に対する有効性と共に、予想外に高レベルの抗マラリア活性を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明を、以下の実施例およびテストデータを参照して、実施例を介してのみ記述することにする。
【００３１】
＜４−Ｎ−（３’−ヒドロキシ−４’−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル］）アニリノ−７−クロロキノリン（イソキン）およびそのリン酸塩の合成＞
合成は、以下の反応経路に基づいて行った。
【化４】
2004533418.tif 000006
【００３２】
［ステップ１］
エタノール（２０ｍｌ）中の３−アセトアミドフェノール（５ｇ）を含有する丸底フラスコに、ジエチルアミン（２．６ｇ）およびホルムアルデヒド（１．１ｇ）を添加した。生じた混合物を還流させながら２４時間撹拌した。この後、溶剤を蒸発させ、残分をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール８０：２０）により精製して、Ｎ−（４−ジエチルアミノメチル−３−ヒドロキシ−フェニル）−アセトアミドを得た（４．１ｇ、５３％）。1H NMR(250MHz、CDCl3)δH:7.05(1H,d,J=8.2)、6.89(1H,d,J=8.2)、6.80(1H,s)、3.70(2H,s)、2.60(2H,q,J=7.2)、2.12(3H,s,NHCOCH3)、1.10(3H,t,J=7.2)。IR(NEAT)CM-1;3500-2800(広幅-OHバンド)、1668、1614、1538、1454、1386、1273、1194、1166、1114、1032、863、773および736。正確な質量:237.16042gmol-1(C13H21O2N2は237.16029を要する);元素分析;C:64.07、H:8.62、N:10.88;(計算値;C:65.67、H:8.53、N:11.86)。MS;m/z=237で分子イオンピーク
【００３３】
［ステップ２］
エタノール性ＨＣｌ（６Ｍ、３０ｍｌ）中の３−アセトアミド−６−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノフェノール（２ｇ）を含有する丸底フラスコを、還流させながら２時間加熱した（２０％水性ＨＣｌが、また、この加水分解のために十分である）。溶剤を真空中で除去し、固体をエタノール（３０ｍｌ）中に溶解させた。４，７−ジクロロキノリンを添加し、混合物を還流下に２４時間撹拌した。この後、溶剤を除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／メタノール８０：２０）により精製して、所望の化合物が黄色固体として得られた（２．５ｇ、８３％）。融点;148-150℃:1H NMR(200MHz、CDCl3);δH:8.53(1H,d,J=5.5)、8.00(1H,s,より微細な分裂が観察された,J=2.2)、7.82(1H,d,J=8.78)、7.42(1H,d,J=8.78,より微細な分裂が観察された,J=2.2)、7.03(1H,d,J=5.48)、6.96(1H,d,J=7.7)、6.72(1H,s,微細分裂,J=1.92)、6.67(1H,d,J=7.68,追加的微細分裂)、3.77(2Hs,s)、2.64(4Hs,q,J=7.14)、1.12(6Hs,t,J=7.14)。IR(Nujol mull)cm-1;2930、2858、1668、1612、1575、1529、1459、1424,1378、1327,1277、1192、1178、1159、1115、1079、992、974、907、873、855、814および772。MS ACCURATE MASS:356.15169gmol-1(C20H23ClN3Oは356.15292を要する)
【００３４】
［ステップ３］
最終生成物の水溶性を改良するために、前記ステップ２の最終部分に代えて、文献の手順を使用して二リン酸塩を調製した。還流させながら、エタノール中の遊離塩基に、ジオキサン／エタノール中のリン酸を添加した。リン酸塩が溶液から沈殿し、これを濾過して、乾燥させた。
【００３５】
＜生物学的活性＞
［インビトロ試験プロトコル］
〔抗マラリア活性〕
P.falciparumの２つの株をこの試験に使用した。（ａ）ＣＱ耐性であることが公知であるＫｌ株、および（ｂ）全ての抗マラリア剤に感受性であるＨＢ３株。寄生生物をJensenおよびTragerの方法を使用して連続培養で培養した(J.Parasitol.,1977,63,883-886)。培養物は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３２ｍＭのＮａＨＣＯ3および１０％ヒト血清を補われたＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中に、１％〜１０％の範囲で懸濁された寄生生物血(parasitemeia)を有するヒト赤血球（２〜５％）を含有するフラスコ中で増殖させた。培養物に、Ｏ2３％，ＣＯ2４％およびＮ2９３％の混合物のガスを供給した。寄生生物の増殖の評価として、［3Ｈ］−ヒポキサンチンの導入を使用し、Desjardins et al.(Antimicrob.Agents.Chemother.,1979,16,710-718)の４８時間感受性アッセイを用いて、抗マラリア活性を評価した。貯蔵薬物溶液を１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製し、完全培地を使用して、適切な濃度に希釈した。アッセイを殺菌９６−ウエルマイクロタイタープレートで実施した。各プレートは、寄生生物培養（寄生生物血２％、ヘマトクリット０．５％）２００＿ｌを含有し、薬物希釈物１０＿ｌを含有する、または含有しない。各薬物は３回検査し、寄生生物の増殖を対照ウエル（寄生生物の増殖１００％と設定）と比較した。３７℃での２４時間インキュベーション後にヒポキサンチン０．５＿Ｃｉを各ウエルに添加した。培養物をさらに２４時間インキュベートし、その後、フィルターマット上に収穫し、５５℃で１時間乾燥させ、Wallac 1450 Microbeta Trilux liquid シンチレーションおよびルミネセンス計数管を使用して計数した。ＩＣ50値は、対数による投薬量−応答カーブのプロビット変換の内挿法により計算された。
【００３６】
［インビボ試験プロトコル］
１８〜２２ｇの体重の、無作為なオスのスイスアルビノマウスに、P.yoelji NS株を寄生させた赤血球１０7個を腹腔内に接種した。次いで、この動物に、感染の日から始めて４日続けて毎日、２経路（非経口または経口）で投薬した。化合物は、メタノール、リン酸塩緩衝生理食塩水およびＤＭＳＯ（２：５：３ｖ／ｖ）からなる溶媒溶液に溶解または懸濁させた。寄生生物血は、最後の処置の後に測定し、ＥＤ50（溶媒のみで処置された対照と比較した時の寄生生物の５０％抑圧）は、寄生生物血に対する対数による投薬量のプロットから計算された。
【００３７】
４−Ｎ−（３’−ヒドロキシ−４’−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル］）アニリノ−７−クロロキノリン（イソキン）は、アモジアキンに比べて、P. Falciparumのクロロキン感受性ＨＢ３単離物（ＩＣ50  １８ｎＭ±８に対し９ｎＭ±４、ｎ＝４）およびクロロキン耐性Ｋ１単離物（ＩＣ50  ２５ｎＭ±８に対し６ｎＭ±２、ｎ＝４）の両方に対し、優れたインビトロ活性を示す。
【００３８】
〔インビボ〕
この優れた活性は、P. yoelii NSげっ歯類マラリアモデルでの優れたインビボ活性に読み換えられる。標準の４日間の試験（２回繰り返す）での経口投与の結果は、アモジアキンについてのＥＤ50が、７．９および７．４ｍｇ／ｋｇであるのと比較して、４−Ｎ−（３’−ヒドロキシ−４’−［Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル］）アニリノ−７−クロロキノリンについてのＥＤ50は、１．６および３．７ｍｇ／ｋｇであった。このように、本発明の化合物は、改良された抗マラリア活性を有するが、クロロキンとの交差耐性(cross resistance)は有さない。
【００３９】
本発明の化合物の優れた活性により、薬剤として化合物を使用する際に、減じて薬剤に曝すこと、結果として毒性を示す可能性を減少させることが可能となる。特有の毒性を有する薬物（例えば、スルホンアミド、抗痙攣性剤）は、通常、非常に大量の投薬量で投与されることが広く認識されている。従って、効力の増加および投薬量の減少は、本発明の薬剤の毒性の可能性を減じるであろう。
【００４０】
［代謝研究］
〔方法〕
「オスのウィスターラットへ投与後の、［3Ｈ］ＡＱおよび［3Ｈ］ＩＳＱの胆汁および尿への排泄の試験」
オスのウィスターラット（２００〜３００ｇ）をウレタン（０．９％生理食塩水２０ｍｌ中１．４ｇ／ｍｌ、２０ｍｌ／ｋｇ）で麻酔し、意識状態は、角膜反射テストおよび四肢引き込みテストにより決定した。ラットは、全手順にわたり注意深くモニターし、麻酔が持続されていることを確実にした。
【００４１】
喉に、小さな切開を施し、周囲の結合組織を鈍的剥離(blunt dissection)することにより、気管を固定した。１．５７ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）ポリテンチューブカニューレを挿入し、しっかりと留めた。頸静脈にも０．５８ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）チューブでカニューレ処置をし、化合物の静脈投与を可能にした。生理食塩水含有シリンジを頸静脈カニューレに取り付け、気泡が静脈に浸入するのを防ぐシールとして作用させた。腹中央線に沿って切開した。総胆管を突き止め、広げて、その後、０．５８ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）カニューレを挿入した。対照胆汁が得られた。陰茎を縛って、尿を実験の間収集した。
【００４２】
放射性標識された化合物が調製された溶媒は、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）−４９％水−１％クエン酸であった。頸静脈カニューレ内で、ＤＭＳＯは、生理食塩水に取り替えられ、投薬の間に溶液から薬物が沈殿するのを防いだ。
【００４３】
５００μｌのHamiltonシリンジに、［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱ（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５μＣｉ／ｋｇ）を充填し、カニューレに接続した。頸静脈を介して、放射性標識化合物を３０分にわたり注入し、ＤＭＳＯにより引き起こされる呼吸機能低下を防止した。投薬開始から５時間の間、１時間間隔で、胆汁フラクションを収集した。サンプル全てを計量し、その重量を記録した。
【００４４】
５時間後に、残留尿を膀胱から吸出し、ヘパリン処置されたチューブ中へヘパリン処置された針を用いて心臓に穴を開けて血液を収集した。サンプルを遠心分離して、血漿と赤血球に分離することができた（４０００ｒｐｍで５分間）。血漿容積を記録した。組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚）を動物から取り出し、生理食塩水で濯いで、その後、ガラス瓶に入れて計量した。サンプル全てを分析に必要となるまで−８０℃で保管した。
【００４５】
「投薬後に血漿中に残留する［3Ｈ］ＡＱおよび［3Ｈ］ＩＳＱの試験」
動物に麻酔をかけ、頸静脈に前記のようにしてカニューレ処置をした。血液サンプルを規則正しく取りうるように、頸動脈に０．５８ｍｍＩ．Ｄ．ポリテンチューブでカニューレ処置をした。カニューレを、ヘパリン処置をした生理食塩水のシリンジに取り付け、血液がカニューレから漏れることを防ぎ、気泡が血流に浸入するのを防いだ。動物に前記のようにして投薬し、投薬期間の最後に時計を作動させ始めた。投薬後、１５分、３０分および１時間毎に、血液サンプル（３００μｌ）を採取した。各採血後に、ヘパリン処置された生理食塩水をカニューレに勢いよく流し、チューブ内で凝固するのを防いだ。生理食塩水は、各採取時点の前にカニューレから排出させた。
【００４６】
５時間目にサンプルを採取した後、ラット中に残っている血液を全てカニューレからヘパリン処理されたチューブに排出させた。サンプルは全て収集直後に遠心分離し（５分間、４０００ｒｐｍ）、沈殿と上澄みとに分離した。血漿容積を記録した。組織も取り出し、計量した。サンプル全てを分析するまで−８０℃で保管した。血漿の活性成分は、ＬＣ／ＭＳ分析のためにエーテルで抽出して取り出した。
【００４７】
（２４時間代謝研究）
［3Ｈ］ＡＱ（５４μｍｏｌ／ｋｇ）をオスのウィスターラット（２００〜３００ｇ）に腹腔内投与した。各動物を餌と水に接近できるワイヤー底の代謝ケージにいれた。２４時間にわたり、尿を採取し、ケージは、採取期間の最後に蒸留水（１０ｍｌ）で濯いだ。２４時間後に、動物をフェノバルビトン（０．９％生理食塩水中６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、その組織を取り出し、ヘパリン処理された針で心臓に孔を開けて血液を収集した。サンプル全てを分析するまで−８０℃で保管した。予めＩＳＱデータがＡＱとの比較のために得られた。このデータは、ＡＱのために使用されたのと同じ手順に従い得られた。
【００４８】
（尿、胆汁および血漿中へ排泄された放射能の分析）
［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱを投薬した動物からの胆汁（２×１０μｌ）、尿（２×５０μｌ）および血漿（２×５０μｌ）のアリコートを液体シンチラント(scintillant)４ｍｌに採取し、充分に撹拌した。サンプルを暗所に１晩放置し、化学発光を防止した。次いで、放射能をPackard1500液体シンチレーション分析器を使用して測定した。
【００４９】
（［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱの５時間にわたる組織分布の試験）
各組織の１部（５０〜１００ｍｇ）および赤血球のアリコート（５０〜６０ｍｇ）を２通りとり、組織可溶化剤（０．５ｍｌ）を各サンプルに添加し、５０℃で１晩放置した。サンプルを室温まで冷却し、その後、過酸化水素（２００μｌ）で漂白し、１時間放置した。次いで、混合物を氷酢酸（３０μｌ）で中和し、シンチレーション液１２ｍｌを添加した。混合物を徹底的に混合し、暗所に１晩置いた。サンプルを放射能についてアッセイした（添加すべき化学薬品の全容積は、赤血球を可溶化するために２倍にした）。
【００５０】
「［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱを投薬したオスウィスターラットの尿、胆汁および血漿代謝物質の分析」
ＬＣ／ＭＳはＨＰＬＣと質量分析法とを組み合わせることで、高分子量の有機化合物を同定および分離をできる有力な分析技術が生み出される。我々のサンプルを、Mass Lynxソフトウエアを使用して分析した。胆汁、尿および血漿のエーテル抽出物のアリコート（５０〜１００μｌ）を、酢酸アンモニウム（５．０ｍＭ、ｐＨ３．８）中のアセトニトリルの緩慢な勾配（３０分に渡り１０〜５０％）を有するZorbaxSB-18カラムから、０．９ｍｌ／分で溶離させた。Jasco PU-980ポンプ２台を混合モジュールに接続し、流出液をFlo-One A250 eta放射能流検出器に到達する前にシンチレーション液と混合する、または、流出液をQuanttro II質量分析器に供給することができる。噴霧ガスおよび乾燥ガスをそれぞれ１３ｌ／時間および３００ｌ／時間の速度で供給した。ＬＣ／ＭＳインターフェースの温度は７０℃であり、毛管電圧(capillary voltage)は３．７×１０-2Ｖであった。フラグメンテーションの程度は、コーン電圧(cone voltage)を変化させることにより調整した。
【００５１】
〔材料〕
Opti-solv組織可溶化剤は、Wallac(Loughborough U.K.)の製品であった。Ultima-gold液体シンチレーション液は、Packard bioscienceから購入した。氷酢酸は、メルク(Merck)の製品であった。［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱは、リバプール大学(University of Liverpool)により合成された。ヘパリンは、CP pharmaceuticals(Wrexham UK)の製品であった。使用された他の全ての化学薬品は、Sigma(Poole,U.K.)から購入した。
【００５２】
〔統計〕
全ての値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として記載される。全ての統計的分析は、マン−ホイットニー検定法を使用して実施し、差は、ｐ＜０．０５で有意であると考えた。
【００５３】
これらの試験の結果を、添付図を参照して、以下に説明する。
【００５４】
＜結果＞
（［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱをオスのラットに投与した後の放射能の排泄）
アモジアキンおよびイソキンの静脈内投与後に、胆汁および尿中に排泄された放射能のレベルを、図１および２に示す。投与５時間後に、ＩＳＱの投薬量の１２．７３％±０．４７％と比較して、ＡＱの投薬量の１６．１３％±１．９７％が胆汁中に排泄された。これらの結果に、優位な差は示されなかった。
【００５５】
５時間にわたるＡＱの尿への排泄は、ラットに投与された投薬量の４．４９％±０．８９％であった。ＩＳＱの投薬量の３．３９％±１．０２％は、５時間にわたり腎臓により尿中へ取り除かれた。これらの結果には、顕著な差はない。
【００５６】
（［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱのオスのラットへの投与後５時間の放射能の組織分布）
［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱの投与後５時間のラット中の放射能の分布を、図３に示す。全ての結果は、５時間後にこの器官中に残存する投薬量の３２．９３％±２．９５％の割合として表される。同様に、［3Ｈ］ＡＱが投薬されたラットの肝臓に、投薬量の２０．８２％±２．０８％が残存した。ＩＳＱにおける５時間後の肝臓への蓄積に、ほぼ１０％の増加が見られたにもかかわらず、この結果は有意であるとは考えられなかった。
【００５７】
皮膚も、放射性標識化合物の蓄積の主要な場所であり、ＩＳＱおよびＡＱに関し、５時間後にそれぞれ投薬量の２１．４６％±１．８９％および２２．１２％±４．７３％が回収された。
【００５８】
心臓と血漿中に放射性標識化合物の蓄積の著しい差が見られた（ｐ＝＜０．０５）。ＩＳＱまたはＡＱの投与５時間後に、心臓中に残存する投薬量の割合は、それぞれ０．５８％±０．０１％および０．３４％±０．０４％であった。５時間後に、血漿中に残存する投薬量の割合は、ＩＳＱについては０．１３％±０．０３％およびＡＱについては０．０４％±０．０１％であった。５時間後に採取された血漿サンプルは統計的に有意であると思われるが、実験の間に採取された血漿サンプルは統計的に有意ではなかった。
【００５９】
［3Ｈ］ＩＳＱの投与の後、５時間後、投薬量の８７．１７％が、胆汁（１２．７３％）、組織（７０．９２％）、血漿（０．１３％）および尿（３．３９％）中に計上され、［3Ｈ］ＡＱの投与後、５時間後に、投薬量の７８．５６％（胆汁、６．１３％、組織５７．９１％、血漿０．０４％および尿４．４９％）が計上された。
【００６０】
（［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱのオスのラットへの投与後５時間の放射能の組織分布）
［3Ｈ］ＡＱまたは［3Ｈ］ＩＳＱの投与後２４時間のラット中の放射能の分布を、図４に示す。全ての結果は、全器官についての投薬量に対する割合として表されている。
２４時間後、［3Ｈ］ＡＱが与えられた動物の組織中には、投薬量の１６．１５％のみが残存し、同様に［3Ｈ］ＩＳＱが投薬された動物の組織中には、投薬量の１３．８７％のみが残存した。肝臓中にＡＱの投薬量の６．８５％のみが残存することは、投薬量の１３．９７％が、この器官から除去され、損失したことを意味する。２４時間後に肝臓にＩＳＱの投薬量の５．４８％が残存することは、投薬量の２７．４５％の除去および排泄された可能性を示唆する。
【００６１】
尿および血漿データは、ＩＳＱについては省略しているが、ＡＱの投薬量の８．４８％は、尿中に回収され、投薬量の０．０２％のみが血漿中に残存した。２４時間後、ＡＱの７．１８％が皮膚中に残存し、残りの組織は、投薬量の２．１２％を計上した。ＩＳＱ投薬量の５．６％は、ＩＳＱ投薬ラットの皮膚中に残存し、残りの組織は投薬量の２．９７％を計上した。
【００６２】
（［3Ｈ］ＡＱおよび［3Ｈ］ＩＳＱの投与後５時間の間に血漿および赤血球中に分布した放射能）
血漿レベルは、実験が継続している間、かなり一定のままであり（図５）、実験継続期間を通じて血漿中にＡＱの投薬量のほぼ０．０３４％が保持される。ＩＳＱについての血漿レベルは、ＡＱで観察されたものより３倍大きく、平均血漿レベルは投薬量の０．０９５％に保持される。しかしながら、これは、統計的分析に従って、有意であるとは示されなかった。
【００６３】
ＡＱ放射能のレベルは、赤血球中で５時間にわたりゆっくりと下降していき、血漿中に回収された放射能が少し減じることが判明した（図６）。最初、投薬量の０．１２％が、血漿中に残存し、５時間後には、血漿中に投薬量の０．０９％のみが残存した。ＩＳＱが投薬されたラットの赤血球中に残存する放射能のレベルは、実験を通して、０．１２％で一定に保持されるようにみえる。
【００６４】
（インビボでのＡＱの胆汁代謝物質）
オスのウィスターラットへ［3Ｈ］ＡＱを静脈投与した後、ＡＱを投薬したラットからの胆汁を分析すると同時に、胆汁代謝物質を表す放射能クロマトグラムの分析は、完全に分かれていない２つのピークを示した。これらのピークのＬＣ／ＭＳ分析は、ＡＱ（Ｒｔ＝１１．９３分）のグルタチオン複合体を示し、これは、ｍ／ｚ  ６６３／６６１でクロリン原子の存在を示すプロトン化分子ピーク［Ｍ＋１］+と、グルタチオン複合体のマンニッヒ側鎖の損失を示すピーク［ｍ＋１−ＨＮ（Ｅｔ）2］+ｍ／ｚ  ５８８も生じた。
【００６５】
（インビボでのＡＱの尿代謝物質）
ＡＱを投薬したラットから収集した尿サンプルに実施した放射クロマトグラフィーは、４ピークを示した。イオン電流クロマトグラムおよびエレクトロスプレーデータの分析は、尿中に排泄された主化合物は、未変化ＡＱであることを示唆した。これは、ジエチルアミノ側鎖の損失を示すフラグメントｍ／ｚ  ２８３と一緒に見られる分子イオンピーク［Ｍ＋１］+をｍ／ｚ  ３５６で生じた（Ｒｔ＝１８．１３分）。
【００６６】
ｍ／ｚ  ５１７の［Ｍ＋１］+ピークは、ＡＱメルカプチュレート(mercapturate)代謝物質を示し、ジエチルアミノ側鎖の特有の損失は、フラグメントｍ／ｚ  ４４４を生じた（Ｒｔ＝２０．８５分）。デスエチルＡＱ代謝物質は、ｍ／ｚ  ３２８での［Ｍ＋１］+イオンにより同定された。この代謝物質は、デスエチル側鎖の損失を表すフラグメントｍ／ｚ  ２８３でも見られた（Ｒｔ＝１６．３５分）。
【００６７】
ＡＱの安息香酸代謝物質は、ｍ／ｚ  ３１５での分子イオンおよびフラグメントｍ／ｚ  ２９７を生じ、後者はこのマイナーな代謝物質からの水の損失に相当する（Ｒｔ＝２５．３分）
【００６８】
（インビボでのＩＳＱの胆汁代謝物質）
放射クロマトグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを使用して、ＩＳＱの胆汁代謝物質４つが同定された。この化合物と結合した主胆汁代謝物質は、イソキンアルデヒドグルクロニド代謝物質であり、保持時間２１．０２分、ｍ／ｚ  ４７５での［Ｍ＋１］+ピークおよびデヒドログルクロン酸（ＤＧＡ）の損失を示すフラグメントｍ／ｚ  ２９９を有する。
【００６９】
イソキンアルコールグルクロニド代謝物質は、４７７でのｍ／ｚピークおよびＤＧＡの損失に相当するフラグメントｍ／ｚ  ３０１により検出された（Ｒｔ＝２１．０２分）。
【００７０】
イソキン安息香酸グルクロニド誘導体も、ｍ／ｚ  ４９１でのピークおよびフラグメントｍ／ｚ  ３１５により表されるＤＧＡの損失に相当して立証された（Ｒｔ＝１８．９８分）。これらの代謝物質から、グルクロニドがフェノール上かまたはアルコール／カルボン酸基上に位置するのかは不明である。
【００７１】
非複合化イソキン安息香酸代謝物質も胆汁内に排泄される。ｍ／ｚ  ３１５での［Ｍ＋１］+ピークおよび代謝物質からの水の損失を示すフラグメントｍ／ｚ  ２９７を有する（Ｒｔ＝２４．２５分）。
【００７２】
デスエチルイソキングルクロニドは、ｍ／ｚ  ５０４でのピークおよびデスエチル側基の損失に相当するｍ／ｚ  ４５９でのフラグメントおよびまたＤＧＡの損失を示すｍ／ｚ  ２８３でのピークにより表される（Ｒｔ＝１８．３０分）。
【００７３】
（インビボでのＩＳＱの尿代謝物質）
放射クロマトグラムは、５つのピークを示した。主ピークは保持時間１９．４９分を有した。これは、親化合物イソキンに相当し、ｍ／ｚ  ３５６で［Ｍ＋１］+ピークおよびマンニッヒ側鎖の損失を示す特有のフラグメントｍ／ｚ  ２８３を生じた。
【００７４】
イソキン安息香酸代謝物質は、２４．２５分の保持時間で発見された。これは、ｍ／ｚ  ３１５での［Ｍ＋１］+ピークおよび水の損失を示すフラグメントｍ／ｚ  ２９７と関連する。ＩＳＱに関する可能な尿代謝物質として示唆される他のマイナーな代謝物質は、ｍ／ｚ  ５０４でのピーク（Ｒｔ＝１４．９０分）およびデスエチル側基の損失を表すフラグメントｍ／ｚ  ４５９およびデヒドログルクロン酸の損失を表すｍ／ｚ  ２８３により表されるデスエチルイソキングルクロニドを含む。イソキングルクロニドは、ｍ／ｚ  ５３２での［Ｍ＋１］+ピークおよびジエチルアミノ側鎖の損失を示唆するフラグメント（ｍ／ｚ  ４５９）およびデヒドログルクロン酸の損失を示唆するフラグメント（ｍ／ｚ  ２８３）を形成する（Ｒｔ＝１７．８８分）。
【００７５】
デスエチルイソキンも、３２８のｍ／ｚピークおよび分子からのデスエチル側基の損失を示唆するｍ／ｚ  ２８３フラグメントを有する代謝物質として同定された（Ｒｔ＝１８．２２分）。
【００７６】
〔血漿代謝物質〕
血漿中を循環する主化合物は、親化合物、ＩＳＱであった。ＡＱについて検出された主代謝物質は、デスエチルＡＱであった。極微量は示されなかった。イソキンとアモジアキンとの代謝特性の差は、次の２つの代謝経路にまとめられる。あきらかに、ＩＳＱは、非常に異なる代謝特性を有し、この特性は当分野の熟練者に明白ではないし、または予期できるものではない。ＡＱに関する経路は、有毒代謝物質、アモジアキンキノンイミン（ＡＱＱＩ）から誘導された代謝物質を明白に示す。
【００７７】
アモジアキンが、特有の逆反応の原因となる反応性代謝物質を製造できるのは、アモジアキン中の１−４，ヒドロキシアミノ配置の作用であり、これによって、ＧＳＨ複合体の形成によりモニターできる代謝物質の形成が可能となる。本発明の化合物中の置換基の配置は、生体活性化のこの経路を不可能にする。さらに、ラットモデルでの調査では、ＬＣＭＳを使用して、胆汁、尿または血液中にいかなるＧＳＨ複合体も同定されなかった。アモジアキンに関して観察されたＧＳＨ複合体およびデスエチル代謝物質と比較して、本発明の化合物に関する代謝経路は、デスエチル、ビスデスエチルおよび脱アミノ化代謝物質のグルクロニド複合体の形成を含む。従って、このような構造の修飾により、生物学的活性を何ら損失せずに、反応性代謝物質を形成する可能性が除去された。
【００７８】
有毒代謝物質を形成しないアモジアキン誘導体を、単純な酸化により提供する研究方法であって、ヒドロキシル基およびマンニッヒ側鎖の位置の交換を含むものが用いられた。この方法により製造された、そのようなアモジアキン誘導体の１つは、アモジアキン位置異性体であるイソキンであった。もう１つの研究は、イソキンが有毒代謝物質を形成せず、インビボでクロロキン耐性奇生虫に対し有効であると結論を下した。さらに、この化合物は、マウスモデルで、P. bergheriに対し優れたインビボ活性を有することが判明した。
【００７９】
マラリアのクロロキン耐性株での活性に向けられた可能な抗マラリア化合物の活性は、容易には予知されない。予想外にも、実験により、ジエチルアミノマンニッヒ側鎖の存在がクロロキン耐性寄生生物に対し高い効能を与えることが示された。さらに、実験により、これらのイソキンおよびその誘導化合物の活性は、マウスモデルで、投与経路に関係なく、インビボでアモジアキンより一層有効であり、マラリア寄生生物のげっ歯目株に対しインビボで改良された経口活性を有することが示された。
【００８０】
投与されたアモジアキンの代謝活性を考慮して、イソキンの代謝結果を試験するために、研究が始められた。これらの研究から、イソキンも、Ｎ−脱アルキル化されていることが発見されたが、アモジアキンと対照的に、イソキンに関するデスエチル代謝物質は、グルクロン酸抱合用基質(substrate for glucuronidation)であり、これは、アモジアキンで観察されないフェーズIIクリアランス機構(Phase II clearance mechanism)である。この情報は、放射性標識されたイソキンの投与後、幾つかのグルクロニド代謝物質（ラットの胆汁中にグルタチオン代謝物質は完全に欠損）の存在により示された。観察は、グルタチオン代謝物質が観察される類似の代謝研究におけるアモジアキンと直接に比較された。イソキンを用いて観察される主たる他の代謝物質は、その全てが、Ｎ−ジエチルアミノ基が酸化により除去された、側鎖開裂生成物である。
【００８１】
イソキンのＮ−ジエチルアミノ側鎖の代謝除去により、減じられた抗マラリア活性を有する代謝物質が提供され、従って、Ｎ−ジエチルアミノ側鎖が、インビボ活性に必須であると確認され、薬学的反応は、血漿中の親薬物の濃度に関係し、代謝物質に関係しないことが、実験により示された。前記のように、これは、Ｎ−デスエチル代謝物質が、インビボ抗マラリア活性を仲介するアモジアキンと直接に対比させている。
【００８２】
環状マンニッヒ側鎖を含む抗マラリア剤を用いる研究により、この研究で観察されるように、このクラスの化合物が、側鎖開列を受けないことが示された。例は、アモピロキン、４−アミノキノリンビスピロキンおよびアザアクリジン誘導ピロナリジンを含む。
【００８３】
明細書中に前記したこれらの研究から、イソキンおよびその誘導体の使用は、クロロキン耐性および感受性寄生生物において、インビトロで、アモジアキンおよびクロロキンにまさるその活性（投与経路に無関係）のために、臨床で使用された抗マラリアアモジアキンを超える明らかな利点を有することが明白である。化学的に反応性で有毒な可能性のある代謝物質へとインビボで代謝されることは、実施された実験で発見されなかったので、Ｎ−ジエチルアミノマンニッヒ側鎖を含む化合物は、哺乳類モデルにおいて完全に異なった代謝経路を有するため、抗マラリア化合物として投与するのに安全であることも明白である。
【００８４】
関係するイソキン類縁体ＩＳＱ１〜５が、一連の操作の第一段階で適切なアミンを使用することで、イソキンと同じ手順により合成された。全ての類縁体はその遊離塩基として調製され、以下の表に、その分析データをリストした。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
化合物を、クロロキン耐性K1 P. falciparumに対してテストし、結果を表２に示した。化合物の全部は、この耐性株に対する有力な活性を、ＩＣ５０値で表示し、これは模範化合物イソキンと非常に類似する。
【００８７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５μＣｉ／ｋｇ）の投与後５時間の間のラットの胆汁中への放射能の累積排泄を示す。各点は、累積％投薬量±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４  ＩＳＱおよびｎ＝３  ＡＱ）を表す。
【図２】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５μＣｉ／ｋｇ）の投与後５時間の間の尿中への放射能の排泄を示す。各カラムは、排泄％投薬量±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）を表す。
【図３】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５＿Ｃｉ／ｋｇ）の投与後５時間の、ラット中の放射能の分布を示す（投薬量の％として示す）（ｎ＝４）。
【図４】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５＿Ｃｉ／ｋｇ）の投与後２４時間の、ラット中の放射能の分布を示す（投薬量の％として示す）。
【図５】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５μＣｉ／ｋｇ）の投与後５時間の間の、ラットの血漿中の放射能の分布を示す。
【図６】［3Ｈ］アモジアキンおよび［3Ｈ］イソキン（５４μｍｏｌ／ｋｇ、２５＿Ｃｉ／ｋｇ）の投与後５時間の間の、ラットの赤血球中の放射能の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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