(57)【要約】本発明は、植物細胞を形質転換する分野および植物ゲノムの改変に関する。本発明は、部位特異的組換え酵素活性を植物細胞に提供する段階を含む、植物細胞を形質転換するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導可能な部位特異的組換え酵素活性を細胞に提供する段階を含む、植物細胞を形質転換するための方法。
【請求項２】
組換え酵素活性がリガンド誘導可能である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組換え酵素活性を細胞の細胞質ゾルから核に移行させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
選択可能なマーカーをコードする核酸を細胞に提供する段階をさらに含む、請求項1、2、または3記載の方法。
【請求項５】
所望の機能的形質をコードする核酸を細胞に提供する段階を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法によって得ることが可能な形質転換植物または形質転換植物細胞。
【請求項７】
組換え酵素活性を誘導する段階を含む、請求項4記載の植物細胞から、その誘導可能な組換え酵素活性を失わせるための方法。
【請求項８】
部位特異的組換え酵素活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一の核酸、およびリガンド結合ドメインまたは核輸送ペプチドを含む第二のポリペプチドをコードする第二の核酸の構築物を含む植物形質転換ベクター。
【請求項９】
第一の核酸および第二の核酸が共に、リガンド結合ドメインおよび組換え酵素活性を含むポリペプチド、または核輸送ペプチドおよび組換え酵素活性を含むポリペプチドをコードする、請求項8記載のベクター。
【請求項１０】
第一の核酸が少なくとも45パーセント、より好ましくは少なくとも48パーセントのG/C含量を有する、請求項7、8、または9記載のベクター。
【請求項１１】
第二の核酸がステロイド結合ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項7〜10のいずれか一項記載のベクター。
【請求項１２】
構築物が第三の核酸をさらに含む、請求項7〜11のいずれか一項記載のベクター。
【請求項１３】
第三の核酸が選択可能なマーカーをコードする、請求項12記載のベクター。
【請求項１４】
選択可能なマーカーが、単機能性の正のマーカー、単機能性の負のマーカー、および／または二機能性マーカーを含む、請求項13記載のベクター。
【請求項１５】
単機能性の負のマーカーがシトシンデアミナーゼ活性を含む、請求項14記載のベクター。
【請求項１６】
二機能性マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII活性およびシトシンデアミナーゼ活性を含む、請求項14記載のベクター。
【請求項１７】
第一段階において、請求項7〜16のいずれか一項記載のベクターを用いて細胞を形質転換することによって、誘導可能な組換え酵素活性を植物細胞に提供する段階を含む、形質転換植物または形質転換植物細胞を得るための方法。
【請求項１８】
選択可能なマーカーをコードする核酸を細胞に提供する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
所望の機能的形質をコードする核酸を細胞に提供する段階を含む、請求項17または請求項18記載の方法。
【請求項２０】
細胞から活性を失わせる段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
請求項17〜20のいずれか一項記載の方法によって得ることが可能な形質転換植物または形質転換植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞を形質転換する分野および植物ゲノムの改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の植物の形質転換技術は、一般に、選択物質の存在下において選択的に成長するような利点を形質転換細胞に提供する、抗生物質耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子に依存しており、したがって、トランスジェニック組織の生産を行わせるものである。形質転換は一般に、限定はしないが、マイクロインジェクション、細胞膜透過法、遺伝子銃を用いた方法、または根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）もしくは毛根病菌（Agrobacterium rhizogenes）による感染を用いて、細胞に導入された核酸分子上にコードされる特性を、細胞／組織／植物体が獲得するような過程として認められる。
【０００３】
そのような、新たに導入された核酸は、それ自体が望ましい獲得特性に寄与するタンパク質をコードするコード領域を含むのみならず、プロモーター、RNAポリメラーゼ、ならびに／または、転写が正しい部位において開始するために必要とされる因子の認識部位を提供することによってそのコード領域の発現を調節する、通常コード領域の上流（5’）にあるヌクレオチド配列；ポリアデニル酸の付加および転写終結を調節する、通常コード領域の下流（3’）に位置するヌクレオチド配列である、ポリアデニル化シグナルもしくはターミネーター；または、転写開始、伸長および終結を調節する制御ヌクレオチド配列のような付加的な制御配列をも含むことが可能である。
【０００４】
形質転換植物におけるマーカーまたはその残留物の存在は、一般に望ましくないと考えられる。トランスジェニック植物における特定のマーカー遺伝子の存在が、その植物の後の改変のための、その同じマーカー遺伝子の使用を不可能にするため、別の観点から見ても、使用されたマーカーを除去することは非常に望ましい。理論的には、複数の望ましい遺伝子を用いてある種を共形質転換することでこの問題を解決することができ、その解決は、将来の市場の正確な予測を必要とするものである。しかし、栽培者が後の段階で、既に成功しているトランスジェニック作物に付加的な形質を導入できるよう望むことは大いに考えられる。あいにく、代替のマーカーを利用できる手段は限られている。
【０００５】
バクテリオファージP1からの、部位特異的組換えCre/lox系を用いた（マーカー）遺伝子の切り出しは、マーカー除去系の最初に報告された例の１つであった（Odellら, 1990；DaleおよびOw, 1991；Srivastavaら, 1999）。この系においては、マーカーおよび隣接する組換え部位の１つは、同じ方向にあるlox組換え部位がそれに隣接する場合、Cre組換え酵素の作用によって、正確におよび保存的に除去される。本方法の１つの大きな短所は、（マーカー）遺伝子を取り除くためには、組換え酵素遺伝子をトランスジェニック植物に導入するために付加的な骨折りが必要とされることである。このためには、第二のマーカーによる選択を使用した、組換え酵素遺伝子を含む構築物を用いた第二の形質転換が必要となる、または、標的とされるマーカーを用いた最初の形質転換サイクルからのトランスジェニック植物を、組換え酵素遺伝子を含むトランスジェニック植物と交配しなければならない。例えそれが成功したとしても、形質転換または交配からの後代は、２つの独立したトランスジェニック遺伝子座を分離するために、および、望ましいトランスジーンを有する、改変されたT-DNAのみを含む植物を得るために、なおも自家受粉させなければならない、または、非形質転換植物と交配しなければならない。
【０００６】
第二のアプローチは、トランスジェニックトマトにおける、転位仲介の再配置、およびその後のマーカー遺伝子の除去を特徴とする（Goldsbroughら, 1993）。この系においては、Ds因子に隣接されるマーカーが、シスに供給されるAcトランスポザーゼによって、望ましいトランスジーンから分離される。転位によって作製される、第一の挿入部位および第二の挿入部位の間の遺伝距離が十分な場合、自殖または交配を介したそれらの間の組換えによって、マーカーを含まない後代が生じ得る。したがって、必要となる有性交配によってゲノムがかき回されるため、双方の方法は栄養繁殖作物には適していないと考えられる（Flavellら, 1992）。しかし、第二の方法においては、Dsは時には再組込みしないため、交配を行わずに、マーカーと関心対象の遺伝子を分離することも可能であるが、これは転位事象の10％のみにおいて起こる。
【０００７】
Ebinumaら（1996；1997a）は、二機能性マーカーアプローチにおいてipt遺伝子を使用し、交配、二重形質転換または非生産的な転位事象に頼る必要なく、部位特異的組換え系によってそのマーカーが除去され得ることを初めて示した。彼らのMulti-Auto-Transformation（MAT）法の第一の局面においては、外植片から現れる形質転換シュートは、それらの矮性の表現型；T-DNA上に存在するipt遺伝子の過剰発現から生じる過剰なサイトカイニンによって引き起こされる表現型によって、非形質転換シュートから識別されることが可能である。非形質転換細胞の再分化は、少なくとも再分化のためにサイトカイニンを必要とする種においては、シュート再分化培地におけるこのホルモンの欠乏によって減少する。新しい培地に移した後、組換え酵素活性によってこのマーカーが失われた場合には、これらのもじゃもじゃしたシュートから正常なシュートが現れる。
【０００８】
意外なことに、R組換え酵素遺伝子およびマーカーはいずれも同じT-DNA上にあり、組換え酵素の生産は、マーカーおよび組換え酵素の両方を除去するために役立ち、したがって、この系を繰り返し使用することが可能になる。植物におけるこれらの系を利用した、より初期の報告では、常に、第二の形質転換サイクルにおいて、または交配を介して、別々におよびトランスに組換え酵素を供給していた（上記を参照のこと）。Ebinumaら（1996）によって行われたアプローチと他のものの間における、1つの他の決定的な違いは、負の選択のためのマーカーとしてipt遺伝子を使用することにもある。マーカーの喪失によって、それらが生じるもじゃもじゃした材料から識別できるような、正常な成長体が導かれる。
【０００９】
SR1組換え酵素を特徴とした、最も初期のMAT系においては、その活性は構成的に発現されたが、明らかに、組換え部位によって隣接される標的の除去に十分なレベルに達することはめったになかった。より最新の型のMAT系においては、R組換え酵素の上流のCaMV 35Sプロモーターが、safener誘導可能なGST-II-27プロモーターによって置き換えられ、その結果、ipt-シュート状の外植片の頻度における増加がもたらされる（Sugitaら, 2000）。しかし、逆説的に言えば、上記の方法の成功は、低い組換え酵素活性に依存するものである。
【００１０】
交配または自殖を必要としない、マーカーを含まない植物の生産へのその他のアプローチは、Gleaveら（1999）によって報告された。本方法においては、植物は最初に、除去されるDNAセグメントがlox組換え部位によって隣接されるような構築物を用いて形質転換された。続いて、2つのシングルコピー形質転換体を、Cre組換え酵素を有する構築物を含むアグロバクテリウムを用いて再形質転換した。しかし、構築物は、安定した組込みのために意図されたものではなく、部位特異的組換えを引き起こすために十分な組換え酵素活性を一過的に送達させるようなものであった。したがって、バイナリープラスミド上のhptマーカーは使用されず、再分化培地からハイグロマイシンが除かれた。loxに隣接するDNAセグメントがシトシンデアミナーゼ遺伝子を含んでいたため、フルオロシトシン耐性（FC；Stougaard, 1993）について調べることによって容易に除去の頻度を数えることが可能であった。組換え酵素仲介の欠失について試験されたシュートのほんの0.25％のみがFC耐性であることが分かった；それらの多くは組込まれたCre組換え酵素に起因すると考えられた。
【００１１】
マーカー除去のための全ての系が、欠失事象を誘導するために、組換え酵素のようなヘルパータンパク質を必要とする訳ではないと考えられる。Zubkoら（2000）は、バクテリオファージλに由来するattP領域の間の染色体内組換えを介した、マーカーを含まないトランスジェニックタバコの生産について報告した。しかし、切り出しの正確さおよび頻度は低かった。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、その各々が固有の特性を有し、形質転換プロトコールに対してその特定の適応付けを必要とするような代替のマーカーの必要性を減じさせるため、植物バイオテクノロジー全体にとって著しく重要であるような、マーカーの除去を特徴とする形質転換系を提供する。したがって、本発明は、本質的にマーカーを含まないが形質転換された植物細胞、植物または（根、シュート、分裂組織またはカルス材料のような）その部分、およびその後代を得るための方法を提供する、ならびに、本質的にマーカーを含まない該形質転換植物またはその部分を提供する。
【００１３】
本発明によって提供される好ましい方法においては、組換え酵素活性が確実に調節され、誘導によって迅速に、挿入された選択可能なマーカーおよび組換え酵素遺伝子（の全て）を同時に除去するための高い活性が導かれる。一方、組換え酵素活性を誘導するための、より初期の試みでは、これらの利点を提供することは考えられなかった。例えば、国際公開公報第0136595号においては、組換え酵素活性は、（一続きの翻訳産物となるように融合されることはいうまでもなく）リガンド結合ドメイン（LBD）によって制御されておらず、マーカーを含まない植物または植物細胞を得るための負の選択は意図されていない。さらに、Lyznikら（Plant Journal 8:177〜186, 1995）においては、不都合なことに、FLP組換え酵素が、およびさらに不利なことに、FLP遺伝子の植物適応型の代わりに野生型形態が使用されている。また、組換え酵素活性は（一続きの翻訳産物となるように融合された）リガンド結合ドメインによって制御されておらず、マーカーを含まない植物（細胞）を得るための負の選択は本質的に可能ではなく、組換え酵素遺伝子はマーカー遺伝子と共に除去されない。
【００１４】
Sugita Koichiら（Plant Journal 22: 461〜469, 2000）においては、組換え酵素活性は化学的に誘導されたプロモーターによって調節されており、R組換え酵素の植物適応型の代わりに野生型形態が使用されている。それによって、本方法は抗生物質／除草剤耐性選択可能なマーカーの除去には適さないものとなり、それは、マーカーの存在による表現型異常の誘導、および、この特定のマーカーを失った植物における正常な表現型の再現に依存する。言い換えれば、マーカーの不在についてのある種の負の選択は確かに存在する。
【００１５】
Zuo Jianriら、Nature Biotech. 19:157〜161, 2000においては、組換え酵素活性は、一続きの翻訳産物となるように融合されたリガンド結合ドメインによっては制御されない。代わりに、LBDは、人工の転写アクチベ−ターに一続きの翻訳産物となるように融合される。本設定においては、誘導物質の添加により、それから組換え酵素遺伝子の転写を開始するような転写因子が活性化される。本発明は、直接制御、即ち翻訳後一続きの翻訳産物となるようなLBDによる組換え酵素活性の制御を提供する。一方、Zuoらの場合のように、間接制御、即ち転写制御では、植物細胞に存在するファイトエストロゲンによってそれが活性化される可能性があるため、マーカーを含まない植物（細胞）を得るための負の選択は本質的に不可能になる。
【００１６】
欧州特許第0716147号においては、組換え酵素活性は（低いが）35Sプロモーターによって構成的に調節されることから、本方法は抗生物質／除草剤耐性選択可能なマーカーを除去するためには適していない。なぜなら、本方法は、マーカーの存在による表現型異常の誘導、および、この特定のマーカーが失われた植物における正常な表現型の再現に依存するものであり、それによりマーカーの不在についてのある種の負の選択が確かに存在するためである。
【００１７】
各段階について異なるプロトコールを用いた複数の形質転換はいうまでもなく、形質転換を達成するためのいかなる努力の観点から見ても、本明細書において提供されるような系の重要性は、「抵抗性の」作物のためには一層大きい。本発明に従った形質転換系の提供は、後に続く形質転換において、1つの同じマーカーを反復使用することを可能にし、（以前のトランスジーンが形質転換に影響しない限り）同じプロトコールを用いて全てを実行することが可能なことを意味する。言い換えれば、抵抗性の作物のために適した形質転換系が一旦機能化すれば、マーカーおよび選択物質の新しい付加的な組み合わせの条件を最適化するために非常に長い試行錯誤を要する研究は、新たな形質転換体を得るためにはもはや必要とされない。
【００１８】
ある態様においては、本発明は、植物における部位特異的組換え酵素の誘導可能な活性化によって、トランスジェニック植物を選択した後に、選択可能なマーカーの誘導可能な除去を行うことが可能になるという洞察を提供する。言い換えれば、その存在がある時点でもはや望まれないような、および、好ましくは本発明に従って、該組換え酵素遺伝子またはその断片に対して特異的な組換え部位の間に位置するような、組換え酵素遺伝子、（選択可能な）マーカー遺伝子、および、任意の他の遺伝子または遺伝子断片は、該組換え酵素活性が誘導された後、形質転換植物細胞から除去され、それにより、本発明によって提供されるような本質的にマーカーを含まない形質転換植物細胞（ならびにそこから得られる植物体および後代）が残される。
【００１９】
マーカー遺伝子活性の低下が時期早尚であることによって、高い組換え酵素活性が形質転換効率を著しく減少させるため、Ebinumaら（1996）によって説明されるMAT系の相対的な成功は、比較的低い組換え酵素活性に依存する。しかし、本明細書において提供されるような、確実に制御される、または誘導可能な組換え酵素の、発現または局在化を利用する系においては、効率のよい組換えを達成するために望ましい高い酵素濃度が許容される。MAT系におけるR組換え酵素の比較的低い発現は、不都合なコドン使用および潜在的な不明の植物制御シグナルを導く、その比較的高いA+U含量による可能性が高い。例えば、Bacillus thuringiensis  cryLA(b)毒素−高いA+U偏向を有する遺伝子−については、トランスジェニックトマト植物およびトランスジェニックタバコ植物における強い発現を達成するためにはコード配列の完全な改変が必要とされることが示された（Perlakら, 1991）。最適化されたコドン使用を有する、ならびにATTTA配列および潜在的な植物ポリアデニル化部位を欠く合成遺伝子は、野生型遺伝子よりも100倍まで高いタンパク質レベルを生産した。T4リゾチームおよび肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のように、植物細胞において高いA+U偏向および低い発現を有する遺伝子の他の例によって、低い発現がB.thuringiensis遺伝子に特有ではないことが示される [16、39]。
【００２０】
本発明は、誘導可能な部位特異的組換え酵素活性を細胞に提供する段階を含む、植物細胞を形質転換するための方法を提供する。一般に、各々の部位特異的組換え酵素は、2つの同一の、酵素特異的な組換え部位の間の組換えを触媒作用する、即ち、個々の組換え酵素はその固有の部位を有する。加えて、幾つかの組換え酵素は、バクテリオファージP1のCre/lox系、Saccharomyces cerevisiaeのFLP/FRT系、およびZygosaccharomyces rouxiiのR/RS系のような天然のものの他に、変異組換え部位を使用することもできる。LBDコード配列は、動物のグルココルチコイド、エストロゲンまたはアンドロゲンの受容体遺伝子から得られることが可能である。加えて、本発明は、組換え酵素特異的な該組換え部位によって隣接される選択可能なマーカーをコードする核酸を該細胞に提供する段階をさらに含むような方法を提供する。好ましくは、組換え酵素特異的な該組換え部位は、組換え酵素遺伝子もしくはその断片をコードする核酸、および／または、それによって組換え酵素活性が誘導され得る、もしくはその上に増強され得るポリペプチドをコードする遺伝子断片に隣接し、本質的にマーカーを含まない形質転換植物細胞を、望ましい形質のみを含む形質転換植物またはその後代に再分化するために有用なものにする。選択可能なマーカーは、例えば、本明細書において添付される網羅的ではないマーカー一覧において提供される、または、当技術分野において見出すことができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様においては、発現を最大にするために、組換え酵素遺伝子は、好ましくはアミノ酸配列を変化させずに、そのG+C含量を増加するように、例えば41％から49％にするように、および／または、好都合なXXC/Gコドンのその頻度を41％から63％とするように再合成される。例えば、この詳細な説明においては、結果として生じる合成遺伝子は、リガンド結合ドメインまたは核輸送シグナルペプチドに融合された。
【００２２】
本発明は、植物細胞におけるDNAの誘導可能な部位特異的組換えをもたらすための方法を提供し、したがって、該方法によって得られることが可能な形質転換植物細胞を提供する。該植物細胞は、例えば、最初に、本明細書において説明されるような、リガンド誘導可能な部位特異的な組換え系を提供される。一般に、部位特異的な組換え系は、2つの因子：DNA配列（組換え部位）と特異的な酵素（部位特異的組換え酵素）の組からなる。部位特異的な組換え酵素は、2つの特定の組換え部位の間のみにおける組換え反応を触媒作用する。組換え部位を連結する配列は、組換え部位の方向に依存して、対応する組換え酵素の存在下において、切り出されるか、または、逆向きにされる。切り出されたDNAセグメントは、環状化され、組換え酵素の存在下において再組込みされることが可能である。しかし、組換え酵素の発現が制限された場合には、熱力学的に著しく好都合でない二分子による組込み反応を減少させることができる。
【００２３】
好ましい態様においては、本発明は、リガンド誘導可能な部位特異的組換え酵素活性を細胞に提供する段階を含む、植物細胞を形質転換するための方法であり、一続きの翻訳産物となるように融合されたリガンド結合ドメインによって該組換え酵素活性が制御されるような方法を提供する。
【００２４】
さらなる好ましい態様においては、本発明は、ステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）と融合することによって、組換え酵素の活性をほとんど完全に調節することができるという洞察を提供する。したがって、組換え酵素は、特定のリガンドの存在下においてのみ活性である。この特性によって、選択されたDNAセグメントの時期早尚の切り出しまたは逆位によってわずらわされずに、選択されたDNAセグメントによって分けられた少なくとも2つの組換え部位をコードするDNA配列と共に、組換え酵素を植物細胞に導入することが可能になる。
【００２５】
細胞はその後、使用されるマーカーについて示される、特定の選択圧力下において選択することができる。後の切り出しは、活性を誘導する段階を含む、該植物細胞からそのリガンド誘導可能な組換え酵素活性を失わせる段階、ならびに、その特定の組換え部位においてDNA構築物を切り出し、それにより、含まれるマーカー配列および誘導可能な組換え酵素活性をコードする核酸を切り出す段階によって調節される。好ましくは、該リガンドはステロイドを含み、好ましい態様においては、本発明は、これらの細胞によって取り込まれる特定のステロイドによって誘導される、植物細胞における部位特異的な組換えのための方法を提供する。
【００２６】
その他の態様においては、本発明は、トランスジェニック植物を選択した後の、選択可能なマーカーの誘導可能な除去を可能にする、植物における部位特異的な組換え酵素の活性化は、（一時的に）組換え酵素活性のほとんどを細胞質ゾルから核に移行させることによっても達成されることが可能であるという洞察を提供する。これは、ある態様においては、核輸送ペプチド、特に核外輸送シグナルペプチドを組換え酵素に提供することによって達成される。例えばレプトマイシンBによる処理によって、該核輸送シグナルペプチドと結合させた、または連結させた組換え酵素を発現する植物細胞を処理することから、核からの組換え酵素の輸送の減少がもたらされ、核においてより高いレベルの組換え酵素活性が生じ、それにより、その特異的な組換え部位におけるDNA構築物の切り出しが可能になり、および促進され、その結果、含まれるマーカー配列、および、関与する核輸送シグナルペプチドと共に組換え酵素をコードする核酸が切り出される。言い換えれば、組換え酵素の作用を調節する代替の方法は、その作用が必要とされるまでそれを細胞質局在性に変化させるものである。そのような誘導可能な細胞質-核における移行を提供するため、核外輸送シグナルは合成R組換え酵素のC末端に融合され、例えば組換え酵素構築物を含む形質転換細胞のレプトマイシン処理によって、移行が行われる。好ましい態様においては、該組換え酵素は、本明細書の詳細な説明において説明されるように、トマトの核外輸送シグナル（NES）を提供される。
【００２７】
本方法は、例えば、それらが異なるゲノム位置において挿入されたものとなるように組換え部位を含む、2つのDNA配列を用いた植物細胞の形質転換を提供する。または、選択されたDNAセグメントは、組換え部位を含む2つのDNA配列を連結する。加えて、ステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）または核輸送シグナルペプチドをコードする遺伝子断片と一続きの翻訳産物となるように融合された部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含む第三のDNA配列を、形質転換によって植物細胞に導入することもできる。組換え酵素は、第一および第二のDNA配列として導入された組換え部位に対して特異的であること、または、少なくとも、選択的であることが必要である。限定はしないが、バクテリオファージP1のCre/lox系、Saccharomyces cerevisiaeのFLP/FRT系、およびZygosaccharomyces rouxiiのR/RS系を含む、植物細胞において機能する、幾つかの部位特異的組換え系について説明されている。LBDコード配列は、動物のグルココルチコイド、エストロゲンまたはアンドロゲンの受容体遺伝子から得られることが可能である。
【００２８】
本発明は、組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする第一の核酸、および、核ホルモン受容体に由来するリガンド結合ドメインを含むポリペプチドまたは核輸送シグナルペプチドに機能的に同等のペプチドをコードする第二の核酸の構築物を含む植物形質転換ベクターであり、本発明に従った方法において有用な、該構築物に隣接する少なくとも2つの組換え酵素特異的な組換え部位を含むようなベクターをも提供する。特に、本発明は、組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする該第一核酸にC末端もしくはN末端において連結される、リガンド結合ドメインまたはシグナルペプチドを含むポリペプチドを、該第二核酸がコードするようなベクターを提供する。好ましくは、リガンド結合ドメインまたは核輸送シグナルペプチドは、組換え酵素に一続きの翻訳産物となるように融合される、即ち、ハイブリッドタンパク質が形成される。好ましい態様においては、第一の該核酸は、少なくとも部分的には、Zygosaccharomyces rouxiiのR組換え酵素遺伝子に由来する（Arakiら, 1992）。発現を容易にするために、または最大にするために、本発明は、好ましくは、第一の該核酸が少なくとも45％、より好ましくは少なくとも48％のG+C含量を有するようなベクターを提供する。好ましいリガンド結合ドメインとして、本発明に従ったベクターはステロイド結合ドメインを提供される。
【００２９】
当然のことながら、（除去可能な）マーカーの選択が望ましい場合、本発明に従ったベクターは、単機能性の正のマーカー、単機能性の負のマーカー、および／または、二機能性マーカーのような、選択可能なマーカーをコードする核酸をさらに含む。ベクターは、単機能性の負の該マーカーまたは該二機能性マーカーがシトシンデアミナーゼ活性を含む場合が好ましく、好ましくは、該二機能性マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIおよびシトシンデアミナーゼ活性を含む場合が好ましい。原則として、マーカーを含まない細胞についての負の選択は、誘導可能なプロモーターによって調節される毒性タンパク質／ペプチドの産生からなる。しかし実際は、それ自体毒性であるタンパク質を調節するために、誘導可能なタンパク質を強制的に使用することは、正の（抗生物質耐性）マーカーとの融合体において負のマーカーを使用する可能性を事実上損なうものである。後者は、誘導までは活性とならない、即ち、トランスジェニック細胞の選択は不可能なものとなる。コードされるタンパク質が、酵素の作用によって毒素に転換される非毒性基質の存在下においてのみ、細胞に対して毒性となるため、本明細書において本発明により提供されるような、単機能性の負のマーカーまたは二機能性のマーカーにおいて使用されるシトシンデアミナーゼ（codA）遺伝子によって、構成的なプロモーターの使用が可能になる。
【００３０】
除去されるDNAセグメントがハイブリッド組換え酵素-LBD遺伝子を、またはハイブリッド組換え酵素-シグナルペプチド遺伝子を確かに含むことが好ましい。ある態様においては、例えばハイブリッド組換え酵素-LBDまたは組換え酵素-シグナルペプチド遺伝子をコードする核酸配列を含むベクターは、同じ方向を有する2つの組換え部位を連結し、植物細胞においてハイブリッド遺伝子の発現を行わせるプロモーター、およびポリアデニル化シグナルをさらに含む。ハイブリッド遺伝子の発現を調節するプロモーターおよびターミネーターの双方は、組換え部位に隣接される領域の外側に存在し得る。この場合、部位特異的組換えによって、2つの組換え部位を連結する第三のDNA配列の欠失が生じる。同じDNA配列によって、反対の方向を有する2つの組換え部位が連結される場合、部位特異的組換えによっては、植物細胞において活性をもつプロモーターおよびポリアデニル化シグナルによって制御される、ハイブリッド遺伝子をコードするDNA配列の逆位が導かれる。
【００３１】
その他の態様においては、同じ方向を有する2つの組換え部位を連結するDNA配列は、上記に説明されるように、ハイブリッド遺伝子ならびにそのプロモーターおよびターミネーターをコードするのみならず、後の段階において除去されなければならないようなマーカーまたは形質をコードする第二の遺伝子をも含む。プロモーターもターミネーターも組換え部位を連結する配列の部分である必要はない。第二の遺伝子の発現は、植物プロモーターの調節下にあり、転写はポリアデニル化シグナルによって終結される。部位特異的組換えは、双方の遺伝子、および、2つの組換え部位の間に存在する他の配列の切り出しを引き起こす。
【００３２】
より好ましくは、植物細胞に導入されるDNAは、同じ方向を有する組換え部位に隣接される、ハイブリッド組換え酵素-LBD遺伝子またはハイブリッド組換え酵素-シグナルペプチド遺伝子、マーカー遺伝子、および、それらの個々の制御配列を単に含むのではなく、組換え部位によって隣接される領域の外側に位置する、農学的にまたは園芸学的に重要な形質をコードする1つまたはそれ以上の遺伝子をも、それらの制御配列と共に含む。典型的なマーカー遺伝子は、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、スルホニル尿素およびホスフィノトリシンに対する耐性を与える。形質転換された細胞は、使用されたマーカーに依存する、選択物質に対する耐性について選択することによって得られる。形質転換細胞は、（レプトマイシンB処理のような）組換え酵素の活性化を目的とする処理を受ける以前に、器官または完全な植物体に再分化することが可能である。または、未分化の形質転換細胞を、形質転換ベクターにおいて使用されたLBDに対して特異的なリガンドと接触させる。
【００３３】
好ましい態様においては、LBDがラットのグルココルチコイド受容体に由来し、または、核シグナルペプチドがトマトの核外輸送シグナル（NES）に由来し、組換え酵素活性化処理のための開始材料が、望ましい形質を含むトランスジェニック植物である。様々な方法において、デキサメタゾンまたはレプトマイシンBを適用することができる。
【００３４】
詳細な説明
構築物
pBIN35Snos  組換え酵素遺伝子およびGUS遺伝子の挿入のための植物形質転換ベクターは、二重CaMV 35Sプロモーターおよびノパリン合成酵素遺伝子（nos）ターミネーター（Bevan, 1984）を導入することによって、pBIN19から誘導された。pBI221からのnosターミネーターを含む、2つのSacl-EcoRI断片を、SacIで切断されたpMTL23（Chambersら, 1988）にクローニングした。このクローンのBamHI-EcoRI二重切断によって、同様に切断されたpBIN19にライゲーションされた1つのnosターミネーターを含む断片が生じ、pBIN19nosが生み出された。重複されたエンハンサー領域を有するCaMV 35Sプロモーターは以下のように得られた：pRokIからのCaMV 35SプロモーターをpUC19にクローニングし、pPCaMVを得た（Baulcombeら, 1986；Yanisch-Perronら, 1985）。35Sプロモーターからのエンハンサー断片は、pBI121からのHindIII-EcoRV断片をpBluescript SK+（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）にサブクローニングすることによって得られ、pCaEH（Kayら, 1987）が与えられた。エンハンサーを含む断片および完全なプロモーターを、HindIII-EcoRIによって切断されたpCaEH、およびEcoRI-XbaIによって切断されたpPCaMVからの対応する断片を、HindIII-Xbalによって切断されたpBI121にライゲーションすることによって結合させ、増強されたプロモーターを生じた。増強された35Sプロモーターを、HindIII-BamHI二重切断によってこの構築物から単離し、pBIN19nosにクローニングし、pBIN35Snosを生み出した。
【００３５】
pAMV-1  pAMV-1は、そのBglIIおよびNcoI部位にクローニングされたアルファルファモザイクウイルス（AMV）の翻訳増強5’非翻訳領域（UTR）を含むpMTL23誘導体である（JoblingおよびGehrke, 1987）。pAMV-1は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ下記のリン酸化オリゴヌクレオチド
2004533251.tif 000002
および
2004533251.tif 000003
からなる二本鎖を、BglII-NcoIによって切断されたpMTL23にライゲーションすることによって得られた。その結果生じたベクターは、1つの突然変異を含む。即ち、下線を施したC残基がA残基によって置き換えられた。
【００３６】
pIVSAMV  ジャガイモの顆粒結合型デンプン合成酵素遺伝子からのイントロン5を、以下のオリゴヌクレオチドを用いたPCRによって、ジャガイモ（Solanum tuberosum、栽培種Bintje）から単離した：
2004533251.tif 000004
および
2004533251.tif 000005
（Van der Leijら, 1991）。精製された断片をBamHIおよびBglIIによって切断し、BglIIによって切断されたpAMV-1（Rouwendalら, 1997）にクローニングした。ALFシステム（Pharmacia Biotech）を用いたジデオキシ配列決定法によってクローニングされたイントロンの配列を確認した。
【００３７】
pREC  合成組換え酵素遺伝子を構築するための戦略は、開始材料として24ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いたオーバーラップ伸長PCR法に基づくものであった（Hoら, 1989）。第一段階は、各々が81 ntの平均サイズを有する（Rouwendalら, 1997）、オーバーラップセンス（奇数：1〜23）オリゴヌクレオチドおよびオーバーラップアンチセンス（偶数：2〜24）オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた12個の増幅反応からなっていた。反応は以下のように行った：最終容量25μlにおいて、20 pmolの各オリゴヌクレオチドおよび0.5 uのPfuを含む標準Pfu DNAポリメラーゼ緩衝液中において、94℃にて30秒間、45℃にて15秒間、72℃にて15秒間を10サイクル。反応産物を、Qiaquick抽出キット（Qiaquick extraction）（QIAGEN GmbH）によって精製し、pH 8.0、10 mMのTris-HCl、0.1 mMのEDTA（T10E0.1）中において再溶解した。第二段階においては、二重鎖反応産物のおよそ20％を、以下の条件下におけるPCRオーバーラップ伸長によって再度組み合わせた：最終容量25μLにおいて、10 pmolのオリゴヌクレオチド1+4（セグメントA；位置1〜275）、5+8（セグメントB；位置256〜527）、9+12（セグメントC；位置508〜779）、13+16（セグメントD；位置760〜1031）、17+20（セグメントE；位置1012〜1283）および21+24（セグメントF；位置1264〜1489）ならびに0.5μLのAdvantage KlenTaqを含む、Advantage KlenTaq DNAポリメラーゼ緩衝液（Clontech）中において、94℃にて30秒間、35℃にて1分間、72℃にて45秒間を25サイクル。産物を再度、Qiaquick extractionによって精製し、T10E0.1中に再溶解した。その後、XcmIによる切断によって作製された3’T-突出部を有するpGEM5Zf誘導体に挿入するために、付加的な3’アデノシンを使用することによって、PCR産物のクローニングを行った（Schutteら, 1997）。誤りなく同定するために、6個のセグメントの各々について、幾つかの独立したクローンを配列決定した。これは、セグメントBを除く全てのセグメントについて成功した。セグメントB における2つの誤りは、オーバーラップ伸長およびメガプライマー突然変異誘発法（SarkarおよびSommer, 1990）の組み合わせを用いて修復された。残りの5個のセグメントのクローンを、短い末端特異的オリゴヌクレオチドを用いたPCRに供し、その後、Pwo DNAポリメラーゼを用いた一連のオーバーラップ伸長反応において6個全てのPCR断片を融合した。その結果生じた全長の産物を、NcoIおよびBamHIによって切断し、pAMV-1にクローニングした。3つの異なるクローンの配列決定によって、1つのクローンが1つの誤りのみを有することが明らかになった。その誤りは、オーバーラップ伸長突然変異誘発によって修正され、産物はNcoIおよびBamHIによって切断され、pIVSAMVにクローニングされた。再度、ジデオキシ配列決定を用いて誤りを調べた。
【００３８】
pLBD  下記のプライマー
2004533251.tif 000006
および
2004533251.tif 000007
ならびに、下記のプライマー
2004533251.tif 000008
および
2004533251.tif 000009
を各々用いて作製された２つのPCR断片のオーバーラップ伸長突然変異誘発によって、クローン6RGRから、ラットのGR（アミノ酸残基512〜795）に由来するLBDが得られた（Miesfeldら, 1986）。突然変異によって1つのEcoRI部位が除去された。産物をpMTL23にクローニングし、ジデオキシ配列決定によってその配列を確認した。
【００３９】
pCODNTP  大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子（codA）を、下記のプライマー
2004533251.tif 000010
および
2004533251.tif 000011
を用いたPCRによって、菌株JM109から単離した。NcoIおよびBamHIによって切断した後、pIVSAMVのNcoIおよびBamHI 部位にPCR産物をクローニングした。下記のプライマー
2004533251.tif 000012
および
2004533251.tif 000013
を用いたPCRによってpBIN19からnptII遺伝子を単離した。pMTL23のBglIIおよびBamHI部位にクローニングする以前に、このPCR断片をBglIIおよびBamHIによって切断した。ハイブリッド遺伝子の構築を続ける前に配列決定することによって、2つのクローンの配列を確認した。gbssイントロン、AMVエンハンサーおよびcodA遺伝子を含むBglII-BamHI断片を、nptII遺伝子の上流のBglII部位にクローニングすることによって融合遺伝子を作製した。
【００４０】
pMCODNPT  その発現増強5’UTRを有するハイブリッドcodA-nptII遺伝子を含むBglII-BamHI断片を、pMOG-EGUSnのBamHI部位に挿入した。エレクトロポレーション（Nagelら, 1990）によって、最終構築物pMCODNPTを根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）のLBA4404に導入した。
【００４１】
p35S  下記のプライマー
2004533251.tif 000014
および
2004533251.tif 000015
を用いたPCRによってpBIN35SnosからCaMV 35Sプロモーターを単離した。 BglIIおよびBamHIによる切断に続き、BglII-BamHIによって切断されたpMTL23に断片をクローニングした。配列決定を使用し、PCRの誤りを調べた。
【００４２】
pNOSt  pBIN35Snosを鋳型として使用し、下記のプライマー
2004533251.tif 000016
および
2004533251.tif 000017
を用いたPCRによってnosターミネーターを得た。BglII-BamHIによって切断された断片を、BglII-BamHIによって切断されたpMTL23にクローニングした。
【００４３】
pRsRECLBDnosRs  ラットのGRからのLBDを、BamHI によって切断されたpRECにBglII-BamHI断片として挿入することにより、合成R組換え酵素遺伝子のC末端に一続きの翻訳産物となるように融合した。PCRによって、正しい方向でLBDを含むクローンが見出され、pRECLBDと呼ばれた。融合によって、組換え酵素のC末端とLBDのN末端の間に2つの付加的なaa残基が作製された。pBIN35Snosを鋳型として使用し、下記のプライマー
2004533251.tif 000018
および
2004533251.tif 000019
を用いたPCRによってnosターミネーターが得られた。その結果生じた断片をBglIIおよびBamHIによって切断し、pRECLBDのBamHI部位にクローニングした。PCRによって、nosターミネーターを正しい方向で有するクローンを同定し、pRECLBDnosと呼んだ。下記のプライマー
2004533251.tif 000020
および
2004533251.tif 000021
を用いたPCRによって、Rsも単離した。この短いPCR産物をBglIIおよびBamHIによって切断し、pRECLBDnosのBamHI部位にクローニングした。PCRを用いて、Rsを正しい方向で有する構築物を選択した。BglII-BamHIによって切断されたRs PCR産物を同様に使用し、組換え酵素-LBDハイブリッド遺伝子の上流のBglII部位にRs配列を挿入した。ジデオキシ配列決定を使用し、nosターミネーターの配列およびRs配列を確認した、ならびに、Rs配列が直列反復しているかどうか調べた。
【００４４】
pBERL-GUS  BglII-BamHI切断によって、その隣接Rs配列を含む組換え酵素-LBDハイブリッド遺伝子をpRsRECLBDnosRsから単離し、pCeGNにおけるGUSの上流のBamHI部位にクローニングした。pCeGNは、CaMV 35SプロモーターがpBIN35Snos（Jefferson, 1987）からのその増強型と置き換えられた、pBI221誘導体である。PCRによって、正しい方向での挿入配列を有する構築物を選択した。次に、このクローンをEcoRIで処理し、組換え酵素-LBDハイブリッド遺伝子の上流のCaMV 35Sプロモーターとエンハンサーの間の1つの制限部位、および、元のpUC19マルチクローニング部位の末端におけるこの組み合わせの下流の第二の部位を切断した。プロモーター、ハイブリッド遺伝子およびGUSを含む断片を単離し、結果的にプロモーターおよびnosターミネーターを含む断片が切断後にはそこから除去されてしまっている、EcoRIによって切断されたpBIN35Snosに挿入した。大きな断片の正しい挿入をPCRおよび制限切断によって確認した。エレクトロポレーション（Nagelら, 1990）によって、最終構築物pBERL-GUSを根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404に導入した。
【００４５】
pMOG-EGUSn  pBIN35SnosベクターをEcoRIによって部分的に切断し、HindIIIによって完全に切断した。その結果生じた、増強された35Sプロモーターおよびnosターミネーターを含む断片を、植物の選択可能なマーカーとして、nptII遺伝子の代わりにCaMV 35Sによって転写が行われるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子を含む、pBIN19と同様のベクターである、HindIII-EcoRIによって切断されたpMOG22（MOGEN international b.v.より譲渡）にクローニングした。
【００４６】
pTOPORs  下記のプライマー
2004533251.tif 000022
および
2004533251.tif 000023
を用いたPCRによって、Zygosaccharomyces rouxiiから組換え部位Rsを単離した。TAクローニングキット（Invitrogen）を用いて、この短いPCR産物をpCR2.1に直接クローニングし、その結果生じるクローンを配列決定した。
【００４７】
pRCNG  ラットのGRからのLBDを、pLBDからBglII-BamHI断片として単離し、BamHIによって切断されたpRECに挿入することによって、合成R組換え酵素遺伝子のC末端に一続きの翻訳産物となるように融合した。PCRによって、LBDを正しい方向で含むクローンを見出し、pRECLBDと名付けた。融合によって、組換え酵素のC末端とLBDのN末端の間に2つの付加的なaa残基が作製された。次に、BglIIおよびBamHIによる切断によって、pNOStからのnosターミネーターを含む断片を得、pRECLBDにおけるLBDの下流のBamHI部位にクローニングした。PCRによって、nosターミネーターを正しい方向で有するクローンを同定し、pRECLBDnosと呼んだ。BglIIおよびBamHIを用いて、ハイブリッドCODNPTマーカー遺伝子を調節するために必要なCaMV 35Sプロモーターをp35Sから切り出し、pRECLBD nosにおけるnosターミネーターの下流のBamHI部位にクローニングした。再度、PCRを使用し、望ましい方向での挿入配列を有するクローンを同定した。同様に、pCODNPT からのCODNPT遺伝子を含む、および、AMV翻訳エンハンサーおよび植物のイントロン配列からなる5’UTRを含むBglII-BamHI断片を、CaMV 35Sプロモーターの下流のBamHI部位に挿入した。もう一度、BglII-BamHIによって切断されたpNOStからのnosターミネーター断片を使用し、今度はマーカー遺伝子の下流のBamHI部位に挿入した。pTOPORsから単離されたBglII-BamHI断片として2つの組換え部位を、一方は組換え酵素-LBD遺伝子の上流のBglII部位に、もう一方はnosターミネーターの下流のBamHI部位に挿入した。双方の場合において、配列決定を使用して2つの部位の方向を調べた。Rs配列によって隣接される組換え酵素およびマーカー遺伝子を含む大きなBglII-BamHI断片を、pMOG-EGUSnのBamHI部位に挿入することによって、pRCNGベクターを作製した。
【００４８】
植物の形質転換および組織培養
ジャガイモの形質転換  形質転換実験のために必要とされたジャガイモのシュート（Solanum tuberosum、栽培種SaturnaまたはBintje）、および結果的に生じたトランスジェニック植物は、ビタミン、0.8％（w/v）の寒天、および3％（w/v）のスクロースを含有するMS培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）上の組織培養において、23℃、16時間明条件／8時間暗条件下に維持した。トランスジェニック体を、カナマイシン（100 mg/L）およびセフォタキシム（200 mg/L）を添加した同じ培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）において成長させた。葉のディスクの代わりに茎の切片を使用すること、および、オーグメンチンの代わりにセフォタキシム（200 mg/L）を使用することを除いては、Edwardsら（1991）によって本質的に説明されているものと同様に、無菌的に成長しているジャガイモ植物（Solanum tuberosum、栽培種Bintje）の茎の外植片を、バイナリーベクターを有する根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404によって形質転換した。
【００４９】
イチゴの形質転換  形質転換実験に必要とされたイチゴ植物（Fragaria x ananassa、栽培種Calypso）は、25℃、16時間明条件／8時間暗条件下にて、グロースチェンバーにおいて、BAPおよびIBAの双方を0.1 mg/Lの濃度で添加した、ビタミン（2.2 g/L）、3％（w/v）のスクロース、0.9％（w/v）の寒天を含むMS培地（pH 5.8）を含有する繁殖培地上の組織培養において4〜6週間成長させた。その後、形質転換のために、直径7 mmの葉のディスクを切り出し、共培養培地（ビタミン、3％のグルコース、0.4％のphytagel、0.2 mg/LのNAA、1.0 mg/LのTDZおよび100μMのアセトシリンゴンを含有する、pH 5.8、2.2 g/LのMS培地）を含むプレートに移した。28℃の回転培養機中にて、50 mLの試験管において、カナマイシン（50 mg/L）およびリファンピシン（50 mg/L）を添加した10 mLのLB培地において一晩培養することによって、バイナリープラスミドを有する根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株AGL0の懸濁液を得た。2,500 gにおける遠心分離によって細菌をペレット化し、上清をデカンテーションによって捨てた後、3％のグルコースおよび100μMのアセトシリンゴンを含有する40 mLのMS培地（pH 5.2、2.2 g/L）においてペレットを再懸濁した。感染のために、20 mLのアグロバクテリウム懸濁液を、共培養培地上に置いた葉のディスクを含むペトリ皿に注いだ。10〜20分後、葉のディスクを1枚のろ紙上にて置床乾燥し、ペトリ皿の中の新しい共培養培地を被覆するWhatmanろ紙のディスク（グレード1、径8.5 cm）の上に置いた。21℃、暗条件下における4日間の共培養後、葉のディスクを再分化培地、即ち、セフォタキシム（250 mg/L）およびカナマイシン（100 mg/L）を添加した共培養培地に移し、25℃、16時間明条件／8時間暗条件下において成長させた。4週毎に葉のディスクを新しいプレートに置き、再分化したシュートを、さらなる繁殖のために、3％のスクロースおよび0.9％の寒天およびカナマイシン（50 mg/L）およびセフォタキシム（250 mg/L）を含有するMS培地（4.4 g/L）を含む容器に入れた。この培地上においてよく成長し、根を生じたシュートを再度、同じであるが今度はカナマイシンおよびセフォタキシムを含まない培地に移した。
【００５０】
ゲノムDNAの単離および解析
最初の遠心分離の上清を精製するため、Sorvall SS34遠心機において、30,000 gにおける45分間の付加的な遠心分離段階を行いながら、Nucleon Phytopure植物DNA抽出キットを用いて、組織培養において成長させた植物の1 gのサンプルからジャガイモのゲノムDNAを単離した。0.8％アガロースゲルにおいてEcoRI切断DNAを分離し、以前に説明されたように、サザンブロット解析のためにゲルをブロットした（Allefsら, 1990）。（各々）100μMのdATP、dGTP、dCTP、および65μMのdTTP、35μMのDIG-11-dUTP（Roche Molecular Biochemicals）からなるDIG（ジゴキシゲニン）DNA標識ミックスの存在下において、特異的なプライマーを用いたPCRによってプローブを標識した。製造業者（Ambion）によって説明されるように、Ultrahyb緩衝液において、10 ng/mLのDIG標識プローブとのハイブリダイゼーションを42℃にて一晩行った。翌日、ブロットを最初に2×SSC、0.1％SDS中において、室温にて5分間、2回洗浄し、その後、0.5×SSC、0.1％SDS中において、65℃にてストリンジェントに15分間、2回洗浄した。ブロットをその後、説明されるようにDIG洗浄およびブロッキングセットを用いて、ハイブリッドの抗DIG-AP仲介の検出のために調製した。DIG標識ハイブリッドに結合された、アルカリホスファターゼ連結抗体の実際の可視化は、発光の検出のためにCDP-Star（Roche Molecular Biochemicals）およびBerthold NightOWLを用いて行った。
【００５１】
PCR解析のためのイチゴのゲノムDNAは、Haymes（1996）に従って組織培養された植物の葉から単離した。解析において使用されたプライマー対は以下の通りであった：
a）nptII遺伝子の検出：
2004533251.tif 000024
b）GUSの検出：
2004533251.tif 000025
c）virGの検出：
2004533251.tif 000026
d）組換え事象の検出：
2004533251.tif 000027
【００５２】
結果
改変されたR組換え酵素遺伝子の設計および合成
条件的な組換え酵素仲介のDNA除去系の効率のよい操作には、比較的高い酵素レベルが必要とされる。Z.rouxiiの野生型のR組換え酵素遺伝子を用いた以前の研究では、植物においてはそれが高度に発現されないことが示唆された（Onouchiら, 1991,1995）。これが遺伝子に存在する高いA+U偏向による可能性があるため、本発明者らは、G+C含量を41％から49％、即ち、RuDPカルボキシラーゼの小さなサブユニットをコードするもの（Rouwendalら, 1997）のような、双子葉植物に由来する高度に発現された植物遺伝子において認められるものにはるかに近い値に増加させることにした。組換え酵素遺伝子を合成するための戦略は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子のコドン使用を改変するために以前に使用されたもの（Rouwendalら, 1997）に非常に類似していた。それは、第一段階における長いオーバーラップオリゴヌクレオチドの結合、およびそれに続く、第二段階におけるオーバーラップ伸長増幅に関与していた。過去の報告とは反対に、4個の長いオリゴヌクレオチドを各々含む約250 bpの6個の中間産物を、合成手順を続ける前に、ここで最初にクローニングし、その後配列決定した。誤りを調べるために配列決定を使用し、必要であればそれらを修復した。選択されたクローンは、遺伝子全体に共に渡る、正しい配列を有する6個のPCR断片を得るために、鋳型として使用された。ほとんどの誤りが、開始材料として使用された長いオリゴヌクレオチドによるものであり、PCRそれ自体によるものではなかったと考えられたため、これらの増幅は、元の反応のために使用された長いオリゴヌクレオチドの代わりに短いオリゴヌクレオチドを用いて実行された。次に、PCR断片を利用し、一連のオーバーラップ伸長反応において全長の組換え酵素遺伝子を合成した。産物をクローニングし、幾つかを配列決定した。これらのクローンの1つにおける1つの 誤りは、再度オーバーラップ伸長突然変異誘発を用いて修復し、BamHI-BglIIによって切断された組換え酵素断片を、ジャガイモgbss遺伝子のイントロン5およびAMV翻訳エンハンサーをその5’UTRに配置してベクターpIVSAMVにクローニングした。結果的に生じる組換え酵素からのaa配列は、NcoI部位を都合よく含ませるため、開始点近くにおいて野生型R遺伝子から逸脱しており、ラットのGR LBDと一続きの翻訳産物となるような融合を可能にするため、停止コドンを有していなかった。
【００５３】
ステロイド誘導可能な組換え酵素活性を試験するための、植物の形質転換ベクターの構築
ステロイド受容体ファミリーからの様々な要素であるLBDは、組換え酵素の遺伝子のC末端に融合された場合、トランスフェクションされた哺乳動物細胞系において、条件的なこの組換え酵素の活性化を仲介することが可能である。形質転換植物細胞における転写因子のステロイド仲介の活性化は、通常、ラットのGRからのLBDによって達成されてきた（Lloydら, 1994；AoyamaおよびChua, 1997）。Lloydら（1994）は、エストロゲン受容体のLBDをも試験したが、それは、それが融合された転写因子の活性の不十分な調節をもたらした。おそらく、ファイトエストロゲンの存在によって、構成的な誘導が引き起こされた（KurzerおよびXu, 1997）。それにも関わらず、エストロゲン結合ドメインは、Zuoら（2000）によって、トランスジェニック植物においてトランス活性化因子の活性を調節するために非常に好都合に使用された。
【００５４】
植物における組換え酵素活性の、ステロイド受容体ドメイン仲介の活性化の適用可能性を試験するために、本発明者らは、この酵素をコードする遺伝子の組換え酵素に触媒される除去がGUS発現を導くような、RG構築物を構築することから開始した。pRECを開始材料とし、LBD、nosターミネーターおよびRs配列を、BglII-BamHI断片として、pRECおよびそれに続くもののBamHI部位に順々に加えた。第二のRs配列の、組換え酵素遺伝子の上流のBglII部位への挿入後、Rsによって隣接される全体のセグメントを、pBIN19に由来するベクターに、増強された CaMV 35SプロモーターとGUS遺伝子の間に挿入し、pBERL-GUSを作製した（図1）。
【００５５】
pBERL-GUSの試験
植物細胞における組換え酵素-LBD遺伝子の機能性は、pBERL-GUSを有する根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404によるジャガイモ栽培種Bintjeの形質転換から得られた形質転換体を用いて試験された。発根した再分化シュートから、5つの系統を無作為に選択した。非処理の葉組織および茎組織のGUS染色によって、系統RG2およびRG5が強くおよび均一にGUS陽性であり、系統RG1およびRG3は幾分GUS陽性であり、葉組織中に分散した細胞の10〜15％が青色に染色され、最後の1つ−RG4−は非常にかすかにGUS陽性であることが示された。強いGUS染色系統の存在は、細菌宿主における組換え酵素の時期早尚の切り出しによる可能性は低い。なぜなら、無作為に選択された20個のコロニーにおいて、そのような事象を検出できなかったためである（データ非表示）。したがって、GUS染色を引き起こす時期早尚の切り出しがトランスジェニックシュートの再分化の初期の段階で起こる可能性があると考えられる。系統RG1およびRG3のGUS染色された葉における青色のスポットは、これらの系統においても時期早尚の切り出しがある程度起こることを示唆する。非処理のRG1植物のサザンブロットは、組換えによって作製された断片に対応する、非常にかすかなバンドを示した（データ非表示）。同じサザンブロットにより、RG4におけるGUSシグナルが弱いことは、挿入配列が多コピー存在することによる可能性があることも示された。
【００５６】
系統RG1およびRG3からの葉をDEXで24時間処理することにより、強いおよび非常に均一なGUS染色が誘導され、それにより、組換え酵素が発現されていること、および、DEX誘導可能であることが示唆された。さらに、それは、組換え酵素が分裂活性のない細胞において機能し得ることを示す。
【００５７】
RG1ジャガイモシュートからの1つの節からなる切穂を、10μM DEXを含む液体MS30中において一晩インキュベートし、その後固体MS30に移した。腋芽をシュートに成長させ、これらのシュートの各々を別々に繁殖させ、サブ系統と呼んだ。サブ系統からの葉において行ったGUS染色は、ほとんど全ての植物体がキメラであることを示し、それにより、組換えが不完全であったことが示唆された。サブ系統および非処理のRG1の各々からゲノムDNAを単離し、組換えによって生じたゲノムの変化の性質および程度を特徴付けた。図2は、GUS染色が2.9 kbp断片の期待された欠失を伴うことを明らかに示す。ブロットは、3.0 kbpのEcoRI断片の量に反映されるように、組換えの程度がサブ系統間でかなり異なることをも示す。
【００５８】
大腸菌のcodAおよびTn5 nptII遺伝子からなる二重選択可能なマーカーの評価
ハイブリッドcodA-nptII遺伝子の構築は、使用された2つの遺伝子のコード配列における幾らかの変化を引き起こした。codA遺伝子においては、位置2におけるセリンがアラニンに変化し、nptII遺伝子においては、N末端のメチオニンおよびイソロイシンが、グリシンおよびセリンに各々突然変異した。
【００５９】
栽培種Bintjeのジャガイモの茎の外植片を、pMCODNPTによって形質転換し、カナマイシンまたはハイグロマイシンを選択物質として用いて形質転換体を選択した。形質転換によって多くのトランスジェニックシュートが生じた；カナマイシン上およびハイグロマイシン上の双方において、外植片の25％が1つまたはそれ以上のシュートに発達した。これは、ハイブリッド遺伝子のC末端部分によってコードされるNPTIIが生産され、活性があったことを強く示唆するものであった。
【００６０】
形質転換においてもたらされたシュートのカナマイシン耐性によって、ハイブリッドタンパク質のN末端部分も生産されていた可能性が非常に高まった。その活性を試験するために、双方の選択培地に由来する、無作為に選択された5個の独立した系統からの、1つの節からなる切穂3個を、5-FCを含む培地、および、5-FCを含まない培地に移した。
【００６１】
表1における結果は、全てのトランスジェニック系統がFCに対して感受性であることの明らかな証拠を提供し、10個全てのトランスジェニック系統においてシトシンデアミナーゼ活性が存在し、非形質転換栽培種Bintje対照切穂においては存在しないことを示す。言い換えれば、ハイブリッドマーカー遺伝子の双方の成分が活性である。
【００６２】
ステロイド誘導可能な組換え酵素活性を用いた選択可能なマーカーの除去のための植物形質転換ベクターの構築
組換え酵素-LBDハイブリッド遺伝子が植物細胞において機能することがここで明らかになったため、形質転換後に植物の選択可能なマーカーを除去するための系におけるその適性を評価した。加えて、潜在的に適している二重選択可能なマーカーも同定した。pBERL-GUSの構築と同様に、pRECを開始材料とし、そのBamHI部位に、そしてそれに続くものの各々のBamHI部位に、各因子をBglII-BamHI断片として続けてクローニングすることによって、マーカー除去を試験するために必要とされる新しい植物形質転換ベクターの因子の多く−即ち、LBD、nosターミネーター、CaMV 35Sプロモーター、CODNPT、nosターミネーターおよび1つのRs配列−を、再度順々に集合させた。それから、第二のRs配列を、キメラ組換え酵素-LBD遺伝子の上流の1つのBglII部位に挿入した後に、組換え酵素-LBD遺伝子をCaMV 35Sにより調節されるマーカー遺伝子と共に含む大きなBglII-BaｍHI挿入配列を、pMOG22に由来するベクターにおいて、増強されたCaMV 35SプロモーターとGUS遺伝子の間に配置した（図3）。
【００６３】
したがって、高い組換え酵素-LBDレベルを導くはずのプロモーターによって、ハイブリッド遺伝子の転写を行わせた。組換え酵素活性の誘導は、各Rsの半分を含むRsに隣接されるDNAセグメントの除去を引き起こすはずである。その結果、GUSが、増強されたCaMV 35Sプロモーターの直接の調節下に置かれることになる。
【００６４】
pRCNGの試験
構築物pRCNGの根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）仲介の形質転換のための宿主として、イチゴの栽培種Calypsoを使用した。アグロバクテリウムへの感染4週間後に、シュート形成の発生を示す125個の葉のディスクを、10μM DEXおよび150μg/mLのフルオロシトシン（FC）を添加した新しい再分化プレートに移す前に、10μMデキサメタゾン（DEX）を含む液体培地において一晩インキュベートした。次なる3〜4週間の過程において、より多くのシュート初期体がインキュベーション開始時に存在したと考えられた事実にも関わらず、ほとんどの葉のディスクはシュートを全く生じず、マーカーを含まないと推測される4つのトランスジェニックシュートのみが得られた。これらの系統およびカナマイシン耐性（KmR）対照系統の、マーカーの喪失およびトランスジェニックの性状を、virG、nptII、GUSおよび安定した組換え産物を検出するためのプライマーを用いたPCR解析を行うことによって試験した。35S-GUSプライマーを用いたPCRは、Rs配列によって隣接されるDNAセグメントが除去された場合に、ある（小さな）産物のみを生じると考えられた。
【００６５】
PCR解析により、FC選択において生き残る系統のうち、2つ、おそらく3つが、形質転換体であり、マーカーを失っており、CaMV 35Sプロモーターの調節下にあるGUS遺伝子を有する、期待されたDNA配列を含んでいることが明らかになった。virGプライマーについてシグナルが欠如していることは、陽性シグナルが、セフォタキシム処理を逃れたアグロバクテリウムによるものではなかったことを示唆する。したがって、本発明者らは、マーカーを含まないトランスジェニック植物が得られたと結論づけた。
【００６６】
最初の洞察として、植物細胞が、哺乳動物のグルココルチコイド受容体の制御機構を適合させることができることは、非常に注目に値するものであると考えられる。アデノウイルスE1A産物のグルココルチコイド依存性の活性は、ステロイド受容体ファミリーの一員であるLBDによって調節される異種制御因子の最初の例であった（Picardら, 1988）。数年後、この制御機構は、植物においては、ラットのグルココルチコイド受容体に由来するLBDと融合することによって、トウモロコシの転写因子Rの活性をシロイヌナズナにおいて調節するために利用された（Lloydら, 1994）。さらに、グルココルチコイド誘導可能な植物の転写のための新奇の系が、酵母の転写因子GAL4のDNA結合ドメイン、ヘルペスウイルスタンパク質VP16のトランス活性化ドメイン、およびラットのグルココルチコイド受容体のLBDを含むキメラ転写因子に基づいて開発された（Aoyamaら, 1995；AoyamaおよびChua, 1997）。ステロイド受容体は、ホルモンシグナルのLBDへの結合によって、特定の遺伝子の転写率を変化させるホルモン活性化形態が作製される、直接シグナル伝達系である（Yamamoto, 1985）。受容体の別々のドメインは、シグナル受容およびその後のDNAの結合に寄与する。LBDは、ホルモンの不在下において受容体の転写活性を抑制し、ホルモンに結合して、ホルモン依存性の転写活性化を決定する（総説については：Pratt, 1993）。ここで、ステロイド受容体が、hsp90、hsp70、p60、および、その幾つかが十分に保存されている他のタンパク質からなる、細胞質ゾルのマルチタンパク質複合体として存在することは明らかであり、このことにより、植物におけるこれらの機能的な複数のタンパク質からなる複合体におけるGRの会合が説明される（Stancatoら, 1996）。多成分のタンパク質複合体の性質についての最近の知見は、それらが、foldosomesと呼ばれる自己会合タンパク質フォールディング構造からなるシャペロン機構として作用し得ることを示唆する（Hutchisonら, 1994）。hsp90シャペロン系を含むタンパク質の量の多さ、ならびに、動物および植物の細胞における系の明らかな遍在性を考慮に入れると、この系は、細胞質内および核内におけるタンパク質のフォールディング、機能、および、おそらく輸送のために必須の役割を担うと考えられる。
【００６７】
本発明者らは最初に、RG構築物においてラットのGR LBDに融合されたSR1組換え酵素を用いて、植物におけるこのタイプのR組換え酵素制御を試験した（図1）。葉のGUS染色によって、リガンドDEXを用いない場合でさえも、RGに由来する幾つかのトランスジェニック系統が多数の小さな斑点のある葉を有することが明らかになった。これにより、低い頻度で、自然発生的および時期早尚の、Rs隣接DNAセグメントの喪失が生じていたこと、ならびに、LBDの制御能が期待されたよりも低かったことが示唆された。これに対して、リガンド制御部位特異的組換えについての最も初期の報告の1つは、およそ1％のバックグラウンド活性が示されたこと、即ち、リガンドの不在下において組換え酵素-LBD融合体が非改変組換え酵素のおよそ1％の活性を示したことを報告している。十分な時間が与えられると、そのような低レベルの活性によって、観察された染色パターンが確かに説明される可能性がある。
【００６８】
サザンブロット解析（図2）によって同様に、リガンドに制御される部位特異的組換え−この場合R組換え酵素およびラットのGR LBDを特徴とする−が、植物において可能であることの、明らかな証拠が提供される。それはまた、GUS染色された葉が斑入り状であること（データ非表示）と、2つの異なるゲノム断片；一方は組換え酵素-LBD融合遺伝子を有し、他方は組換え酵素-LBD融合遺伝子を有さない−の存在との間に明らかな相関があることを例証するものである。言い換えれば、さらなる選択のいずれかを行わないと、DEX処理組織はキメラとなる傾向がある、即ち、部位特異的組換えが生じた組織、または生じなかった組織の混合物からなる傾向がある。本発明者らの知る限りでは、これは、植物において、グルココルチコイドにより制御される組換え酵素について最初に示したものである。
【００６９】
形質転換を介して以前に導入された一連の配列から任意のDNA断片を選択的に除去できることの1つの主要な適用は、トランスジェニック材料の再分化後に、選択可能なマーカーを除去することといえる。この目的のために、マーカーは直接反復組換え部位の間に、好ましくは組換え酵素-LBD遺伝子と共に挿入されなければならない。形質転換、およびトランスジェニック植物の再分化後に、組換え酵素活性の誘導によって、組換え酵素およびマーカー遺伝子の双方の切り出しが導かれ、1つの完全な組換え部位、および、組換え部位に隣接される領域外の転移されたDNAの残りの部分が残される。
【００７０】
しかし、RG-トランスジェニック体についての研究の結果から明らかとなったように、最も複雑でない状況においてでさえも、即ち、シングルコピーの挿入配列のみが存在する場合にも、ほとんどの処理組織は完全な組換えを行わない。言い換えれば、DEX処理後に、マーカーを含まない細胞がマーカーを保持した細胞に囲まれること、およびその逆によって、キメラ組織の形成が導かれる。マーカーを含む細胞の成長を妨げ、純粋にマーカーを含まないトランスジェニック体を得るための1つの方法は、負のマーカーをも使用すること、および、組換え酵素によって除去されるセグメント上にそれを取り込むことである。優性致死表現型を与える、植物において機能する、幾つかの負の選択可能なマーカーについては説明されている（Depickerら, 1988；CzakoおよびAn, 1991；Stougaard, 1993；CzakoおよびMarton, 1994；Dotsonら, 1996）。興味深いことに、これらの負の選択可能なマーカーのうちの1つ−シトシンデアミナーゼをコードする大腸菌遺伝子（codA）−が、正の選択可能なマーカーとして適していることも示されており、したがってそれは二機能性のものに変えられる（WeiおよびHuber, 1996）。あいにく、この系は哺乳動物細胞においてのみ働き、植物細胞においては働かない（未公開の知見）。
【００７１】
動物界および植物界において多機能性の酵素が大量にあることから、よく知られた正および負の選択可能なマーカーのコード領域の、一続きの翻訳産物となるような融合が、人工の二機能性マーカー遺伝子を作製する簡単な方法であり得ることが示唆された。したがって、正の選択可能なマーカーおよびそれ自身の調節配列と共に、Ac因子、またはMAT様の形質転換系における組換え部位の間に挿入しなければならない負の選択可能なマーカーのために、別々のプロモーターおよびターミネーターを供給しなければならないことが避けられる。この目的のために、本発明者らは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子のコード領域を（例えば、必ずしも必要ではなく、程度の差はあっても合成変異体を提供する方がさらに好ましいが、大腸菌から得られた）シトシンデアミナーゼ遺伝子に融合し、ハイブリッド遺伝子を、増強されたCaMV 35Sプロモーターの調節下に置いた。nptII遺伝子またはその機能的断片がシトシンデアミナーゼの代わりにN末端酵素となるような、ハイブリッドマーカーを提供することが好ましい。
【００７２】
nptII遺伝子は以前に、ハイブリッド遺伝子の作製において好都合に使用された（Vaeckら、1987；Barnes、1990；Datlaら、1991）。同様に、本発明者らは以前に、ハイブリッド遺伝子の2つの成分のうちの1つとしてシトシンデアミナーゼを利用し、植物においてそれが5-フルオロシトシン（FC）に対する感受性を与えることを示した（未公開の知見）。
【００７３】
pMCODNPTを用いたジャガイモの形質転換によって、選択のために使用された抗生物質とは無関係に同等の数の形質転換体が生じ、それにより、双方のマーカーが同様に働いたこと、およびまた、機能したnptII遺伝子が融合遺伝子の状況内にあることが示唆される。表2において示される結果により、融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ部分が活性を有することも示される。
【００７４】
組換え酵素-LBD仲介のマーカー除去系における二機能性codA-nptIIマーカーの機能性を試験するために構築されたRCNG構築物においては、植物からの除去を予定されたRs隣接DNAセグメント上に双方の遺伝子が存在した。RG構築物を用いた形質転換に従って得られた、完全にGUS陽性のトランスジェニック体の存在によって、形質転換後の非常に早い段階におけるRs隣接領域の時期早尚の喪失の可能性が既に示された。非処理の、RGを含むトランスジェニック系統およびRCNGを含むトランスジェニック系統の葉上に、同様の斑点が認められたことから、たとえずっと後であろうとも、同様の時期早尚のRs隣接DNAセグメントの喪失があったことも明らかであった（データ非表示）。これにより、リガンドの不在下においてでさえも、ハイブリッド酵素の組換え酵素活性の調節はときに不十分であることが示唆される。それにも関わらず、カナマイシンを含む培地上でRCNG-トランスジェニック系統が容易に得られたという事実は、抗生物質耐性を除去してしまうはずであった時期早尚の部位特異的欠失が、たまにしか起こり得ないことを示唆する。これに対して、RCNG-形質転換体を用いた形質転換後の再分化培地におけるカナマイシンの存在は、RG-構築物を用いた形質転換後に認められたように、完全にGUS陽性のシュートの発生を本質的に不可能にした。さらに、全てのコピーが同時に完全に除去されるということの可能性は低いと仮定すると、多コピーの挿入配列を有するトランスジェニック体−一定の頻度で生じる−はより影響されにくいと考えられる。最後に、植物の染色体からのマーカーの喪失は、分裂活性のない細胞において生じた場合には、同様により有害でない可能性が高い。なぜなら、後に続く閉環状分子がマーカーをなおも発現し、抗生物質耐性を与え得るためである（AhmadおよびGolic, 1996）。
【００７５】
マーカーを含まないイチゴ植物の選択は、RCNGを用いた形質転換後の早期の段階、即ち、最初の小さなシュートが現れた時点で行った。一晩のDEX処理後、葉のディスクを即時にFC含有培地に移した。しかし、ゲノムから切り出されたエピソームの閉環状分子が、FCの存在下において有害でないにしても、成長を阻害し得る活性な二機能性マーカーをなおも含むため、これは最適な処理ではない可能性がある！少なくとも1回、しかし好ましくは2回または3回の細胞分裂を行わせるために、FC含有培地への移動を遅らせた方がより好ましかった。その後、染色体から切り出されたマーカーを含む閉環状分子をも失った、真にマーカーを含まない細胞がFC選択の開始時には存在したはずであった。それでもやはり、内部にて−少なくとも最初は−および周囲の細胞によって−生産される毒素があるにも関わらず、マーカーを含まない幾つかの細胞が分裂可能であり、マーカーを欠くFC耐性植物体に成長することが可能であった。
【００７６】
PCR解析を使用し、マーカーおよび組換え酵素の切り出しを確認した。明らかに、試験されたほとんどの系統がマーカーを含まないものであった。35SおよびGUSプライマーを含む、アッセイによって得られた、予測された小さな断片の存在は、nptII遺伝子の存在を示す断片の不在と併せて、組換えが確かに生じたのみならず、本質的に完全であったことをも示唆する。
【００７７】
したがって、組換え酵素活性のLBD仲介の抑制は、一般に、高い頻度の時期早尚の切り出しを妨げ、それにより選択条件下におけるトランスジェニックシュートの再分化を可能にするために十分であると考えられる。それでもやはり、改善型のLBDを自在に利用できることが有益である可能性がある。このようにして、時期早尚の切り出しの頻度をさらに一層低下させることが可能となり得る。本発明者らの実験において認められたGUS陽性の斑点が実際に、完全に調節できないような高い組換え酵素活性によるものであり、その高い組換え酵素発現が同じT-DNA上にある近接遺伝子の高い発現と正に相関する場合、関心対象の遺伝子の発現の最高レベルを有するRCNG-トランスジェニック体が形質転換の早期の段階において既に失われていることを考慮しない訳にはいかない。
【００７８】
形質転換後にマーカーを除去するための状況は、複数の挿入配列が同じ遺伝子座かまたは異なる遺伝子座において存在する場合、非常に複雑なものになり得、2つまたはそれ以上の逆向きのT-DNAが1つの遺伝子座において存在する場合には、特に複雑なものになり得る。後者の場合、どの組換え部位が相互作用するかに依存して、非常に複雑な一連の切り出しおよび逆位が起こり得、その過程の結果は全く予測できないものとなる。しかし、2つまたはそれ以上のT-DNAが順方向の配置で存在する場合、組換えの最終産物は、細胞当たり1つのT-DNAのみを有するトランスジェニック体に由来するものと見分けがつかない可能性がある。したがって、本方法の好都合なある思わぬ結果は、1つのコピーのみを保った、T-DNAの望ましくない直接反復多コピーの除去さえも導き得ることであるといえる。異なる遺伝子座にある2つの単一挿入配列に関して、組換え過程の望ましくない結果は、2つのマーカーのうちただ1つのみ、およびそれに付随する組換え酵素遺伝子のみが除去されることであり得る。これは、例えば、2つの組換え酵素遺伝子のうち1つのみが活性とみなされた場合、ならびに、不活性なマーカーおよび組換え酵素遺伝子がどうにかして切り出しを逃れた場合に起こり得る。
【００７９】
異なる遺伝子座において組み込まれたT-DNAの多コピーは、染色体断片の転座の原因となり得る（Qinら, 1994；van Deursenら, 1995）。異なる遺伝子座からの2つの相互作用する組換え部位がセントロメアに関して同じ方向に位置する場合、転座は相互に起き、検出不能となる可能性が高い。対照的に、セントロメアに関して反対方向の異なる遺伝子座からの組換え部位の間の組換えは、染色体の喪失によって、おそらく有害となる。これらの転座は、本過程を既に少なくとも1回は経た形質転換体が再度同じ系を用いて形質転換される場合にも起こり得る。多分、以前の形質転換の後に残された組換え部位を有するT-DNA断片は、最も新しい挿入配列とは別の染色体上に位置する。したがって、組換えは、以前に形質転換された遺伝子座の1つにおける単一の組換え部位と新しい遺伝子座における部位の1つの間において起こり得る。それが実際に生じる可能性は、例えば2つの遺伝子座の近接度、組換え酵素の濃度、および組換え酵素処理期間のような多くの因子に依存する。自然発生的な部位特異的組換えは、非相同染色体上に組換え部位を有する、異なるトランスジェニックタバコ系統間の交配からの後代においては稀であった（Qinら, 1994）。選択圧力が適用されるまでは、組換え頻度は上昇しなかった。同様に、評価された非相同マウス染色体の間の転座頻度は、Cre組換え酵素を発現する細胞のおよそ1,200〜2,400個について1個であった（van Deursenら, 1995）。
【００８０】
形質転換およびマーカー除去の後のサイクルにおいて潜在的な転座を減少させる1つの方法は、各形質転換について異なる組換え部位を使用するものである（Sauer, 1996）。loxP、RsまたはFRTのような組換え部位は、組換え酵素が結合する7〜8 bpのコアによって分けられた、2つまたはそれ以上の12〜13 bpの逆向き反復配列からなる。切断および鎖の交換は、コア配列において起こる。組換えは、非相同コア配列間においては起きづらい。
【００８１】
したがって、コア配列によって組換えの特異性が決定される。突然変異コア領域を有する変異組換え部位は、野生型部位と組換えることはできないが、（それ自身同志で）互いに組換えることはできる。しかし、全ての可能な部位が自己組換えできるわけではない（Hoessら, 1986）。例えば、loxPコアにおける中央のTpA ジヌクレオチドの突然変異によっては、組換えが起きなくなり、それらのコアの高いA+T含量があまりに減少させられる場合には、複数の突然変異はFRT部位の組換えに有害となる。
【００８２】
上記に説明された本発明者らの実験においては、期間、DEX濃度または処理された組織の性質に関して、DEX処理を最適化する試みはなされなかった。組織が十分長く処理されなかった場合、処理期間によって、組換え効率に影響が与えられ、およびしたがってキメラ組織が形成される可能性がある。または、キメラ体は、切り出されたDNAのゲノムへの再組込みによって生じ得る。再組込みの二分子性からして、それは一分子の切り出しよりも可能性の低い事象である。実際は、仮に起こった場合、それはおそらく切り出し直後に続くものと考えられる。より後期の段階においては、1つの切り出された分子はおそらく、核の中に拡散されており、したがって、ゲノムに再捕捉される可能性は低い。トランスジェニックマウスにおいては、そのようなエピソームの環状DNA断片が、休止細胞において、一月当たりおよそ50％の比率で失われたことが示された（Rohlmannら, 1996）。細胞が分裂した後、もし切り出された分子と組換え酵素が細胞分裂後も存在したとすれば、2つの娘細胞のうち1つのみにおいて部位特異的再組込みが可能となる。要約すると、再組込みがDEX処理の期間によって影響を受け得るかどうかは疑わしい。
【００８３】
当然のことながら、DEXの濃度は、処理に反応する組織における細胞の画分に影響を与える別の要因である。これまでのところ報告されている、植物においてDEXを用いた実験は、グルココルチコイド仲介の転写を誘導するために、0.1〜30μMの範囲に渡る濃度において行われてきた。しかし、DEXが与えられた状況は、振とう液体培養において実生の成長培地中に存在させるものから葉上にスプレーするものまで、著しく異なった。土壌に水遣りをすることによって、DEXを植物に供給することさえも行われた（Simonら, 1996）。この全ては、植物が容易にDEXを取り込むこと、および、組織の性質とは関係ない可能性があることを示唆する。
【００８４】
ジャガイモの腋芽およびイチゴのカルスを用いた本発明者らの実験においてはそのような種類の組織が使用されたが、活発に分裂する細胞が部位特異的組換えに必要とされるとは考えられない。CreおよびFLP組換え酵素に関わる、マウスおよびショウジョウバエにおける実験では各々、主に休止細胞からなる組織において組換えを達成できることが示される（Kuhnら, 1995；AhmadおよびGolic, 1996）。実際、幾つかのジャガイモRGトランスジェニック体およびRCNGトランスジェニック体から得た完全に成長した葉の、DEXを含む液体培地における一晩の処理は、翌日強いGUS染色を得るためには十分であった。実際に、本方法は、組換えが十分行われるトランスジェニック系統を選択するために使用することが可能であった。
【００８５】
MAT系においては、時期早尚の組換え酵素活性によって形質転換頻度が下がり、低い、および、調節されない組換え酵素活性によっては、マーカーを含まない形質転換体は比較的低い頻度でしか得られない（Ebinumaら, 1996）。対照的に、本報告において説明される系は、組換え酵素活性に関する調節、および、マーカーを含まない形質転換体の明確な選択を提供する。それでもやはり、負のマーカーを改善すること、および、組換え酵素のバックグラウンド活性を減少させることが、本系の効率を増加させる可能性がある。結局、これによって、植物（および細菌）の選択可能なマーカーをトランスジェニック植物から除去するための普遍的な系を開発することが可能になり、同じプロトコールを用いて、形質転換およびマーカー除去の複数のサイクルを行うことが可能になる。
【００８６】
LMB-誘導可能な組換え酵素活性を用いた選択可能なマーカー除去のための植物形質転換ベクターの構築
材料および方法
構築物
pMRECNESG  最終容量25μlにおいて0.5 UのPfuを含む標準Pfu DNAポリメラーゼ緩衝液中において下記のプライマー
2004533251.tif 000028
および
2004533251.tif 000029
を各20 pmol混合することによって、HsfA2をコードするトマト（Lycopersicon peruvianum）の遺伝子からの核外輸送シグナル（NES）が得られた。以下のように反応を行った：94℃にて30秒間、45℃にて15秒間、72℃にて15秒間を10サイクル。Qiaquick extraction（QIAGEN GmbH）によって反応産物を精製し、10 mM Tris-HCl、pH 8.5において再溶解した。それをBglII-BamHI断片として、BamHIによって切断されたpRECに挿入することによって、合成R組換え酵素のC末端に、一続きの翻訳産物となるように断片を融合した。PCRによって、NESを正しい方向で含むクローンが認められ、これをpRECNESと呼んだ。pNOStを鋳型として使用し、下記のプライマー
2004533251.tif 000030
および
2004533251.tif 000031
を用いたPCRによって、nosターミネーターを得た。PCRによって、nosターミネーターを正しい方向で有するクローンを同定し、pRECNESnosと呼んだ。BglIIおよびBamHIを用いて、ハイブリッドCODNPTマーカー遺伝子を調節するために必要とされるCaMV 35Sプロモーターをp35Sから切り出し、pRECNESnosにおけるnosターミネーター下流のBamHI部位にクローニングした。再度、PCRを用いて、挿入配列を望ましい方向で有するクローンを同定した。同様に、pCODNPTからのCODNPT遺伝子を含む、および、AMV翻訳エンハンサーおよび植物イントロン配列からなる5’UTRを含むBglII-BamHI断片を、CaMV 35Sプロモーターの下流のBamHI部位に挿入した。もう一度、pNOStからBglII-BamHIによって切断されたnosターミネーター断片を使用し、今度はマーカー遺伝子の下流のBamHI部位に挿入した。2つの組換え部位を、pTOPORsから単離されたBglII-BamHI断片として、一方は組換え酵素-LBD遺伝子の上流のBglII部位に、もう一方はnosターミネーターの下流のBamHI部位に挿入した。双方の場合において、配列決定を使用し、2つの部位の方向を調べた。Rs配列によって隣接される組換え酵素およびマーカー遺伝子を含む大きなBglII-BamHI断片を、pMOG-EGUSnのBamHI部位に挿入することによって、pMRECNESGベクターを作製した。
【００８７】
結果
組換え酵素の作用を調節する代替の方法は、その作用が必要とされるまでそれを細胞質局在性に変えるものである。そのような誘導可能な、細胞質-核における移行を提供するために、トマトの核外輸送シグナル（NES）を合成R組換え酵素のC末端に融合した。核タンパク質へのこのNESドメインの融合は、哺乳動物のCHO細胞において、および、タバコの葉肉のプロトプラストにおいて、結果的に生じるハイブリッドタンパク質の細胞質への局在化を引き起こすことが示された（Heerklotzら, 2001）。同研究者らは、核エクスポーチン1（exportin1）依存性輸送経路の阻害剤であるレプトマイシンB（LMB）を添加することにより、この効果が逆転することをも示した（Kudoら, 1999）。最近、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）において機能的なCRM1/エクスポーチン1相同遺伝子が同定され、LMB感受性であることが示された（Haasenら, 1999）。
【００８８】
pMRECNESGの試験
構築物pMRECNESGの根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefaciens）仲介の形質転換のために、イチゴ栽培種Calypsoを使用した。pMRECNESGを含む根頭癌腫病菌への感染1ヶ月後、最初の小さなシュートを現している200個の葉のディスクを、20 ng/mLのレプトマイシンB（LMB）を含む液体培地において5時間インキュベートし、その後、150μg/mLのフルオロシトシン（FC）を添加した新しい再分化プレートに移した。翌月中に、少数の葉のディスクが総計10個のシュートを生じた。マーカーおよび組換え酵素の除去は、これらの植物体からのゲノムDNAのPCR解析によって確認された。
【００８９】
参考文献
2004533251.tif 000032
2004533251.tif 000033
2004533251.tif 000034
2004533251.tif 000035
2004533251.tif 000036
2004533251.tif 000037
【００９０】
網羅的ではないマーカー一覧
トランスジェニック植物において使用される、単機能性の正のマーカー（括弧内は選択物質）：
□hpt遺伝子（ハイグロマイシン）
□nptII遺伝子（カナマイシン）
□枯草菌（Bacillus subtilis）protox遺伝子（オキシフルオルフェン）
□Tn5に由来する遺伝子（ブレオマイシン）
□als遺伝子（スルホニル尿素）
□pat遺伝子またはbar遺伝子（ホスフィノトリシン）
□Aspergillusのbsd遺伝子（ブラストサイジン）
□マウスまたはカンジダ（Candida albicans）のdhfr遺伝子（メトトレキサート）
□リン酸マンノースイソメラーゼ（PMI；マンノースを炭素源とした成長を可能にする）
□キシロースイソメラーゼ（キシロースを炭素源とした成長を可能にする）
□epsps遺伝子（グリホサート）
□dhps遺伝子（スルホンアミド）
□細菌のニトリラーゼ遺伝子（ブロモキシニル）
□psbA遺伝子（アトラジン）
□spt遺伝子（ストレプトマイシン）
□2-DOG-6Pホスファターゼ（2-デオキシグルコース）
【００９１】
トランスジェニック植物において使用される単機能性の負のマーカー：
□大腸菌のシトシンデアミナーゼ（フルオロシトシンをフルオロウラシルに転換する酵素）
□Xanthobacter autotrophicus GJ10からのdhlA遺伝子は、1,2-ジクロロエタン（DCE）のような二ハロゲン化アルカンを、ハロゲン化アルコールおよび無機ハロゲン化物に加水分解するデハロゲナーゼをコードする
□HSV-1チミジンキナーゼ（ガンシクロビル）
□Barnase
□StreptomycesのシトクロムP450モノオキシゲナーゼ遺伝子（スルホニル尿素化合物、R7402の、細胞毒性スルホニル尿素への脱アルキルを触媒する）
□硝酸レダクターゼ（塩素酸塩を亜塩素酸塩に転換する酵素）
□IaaH遺伝子またはtms2遺伝子（オーキシン前駆体を活性なオーキシンに転換する酵素）
□PehA遺伝子（グリセリルグリホスファートをグリグリホスファートに）
□リシン（リボソーム不活性化タンパク質）
□ジフテリア毒素A
【００９２】
植物において使用される二機能性マーカー：
□ipt
□GUS（GUS陽性細胞において、培地に添加されたサイトカイニン-グルクロニド連結体がサイトカイニンに転換され、ipt過剰発現の表現型がもたらされる）
【００９３】
動物において使用される二機能性マーカー：
□HSVtk-hpt融合体
□HSVtk-nptII融合体
□HSVtk-bsd融合体
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】pBERL-GUSの図。Enh＝CaMV 35Sエンハンサー；35S＝CaMV 35Sプロモーター；Rs＝組換え部位；IVS-AMV＝ジャガイモ顆粒結合型デンプン合成酵素遺伝子のイントロン5に先行されるアルファルファモザイクウイルス翻訳エンハンサー；recombinase＝合成R組換え酵素；LBD＝ラットのグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン；T＝nosターミネーター； npt II＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII；GUS＝β-グルクロニダーゼ；LBおよびRB＝左側境界配列および右側境界配列
【図２】DIG標識GUS断片をプローブとした、非処理（レーンC）およびDEX処理（レーン1.1〜1.6）のpBERL-GUS形質転換ジャガイモ系統からのEco RI切断ゲノムDNAのサザンブロット。
【図３】RCNG構築物の図。Enh＝CaMV 35Sエンハンサー；35S＝CaMV 35Sプロモーター；Rs＝組換え部位；IVS-AMV＝ジャガイモgbssイントロン5に先行されるアルファルファモザイクウイルス翻訳エンハンサー；recombinase＝合成R組換え酵素；LBD＝ラットのグルココルチコイド受容体リガンド結合ドメイン；T＝nosターミネーター；cod A＝シトシンデアミナーゼ；npt II＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII；GUS＝β-グルクロニダーゼ；hpt＝ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ；LBおよびRB＝左側境界配列および右側境界配列
【図４】pMRECNESG構築物の図。Enh＝CaMV 35Sエンハンサー；35S＝CaMV 35Sプロモーター；Rs＝組換え部位；IVS-AMV＝ジャガイモgbssイントロン5に先行されるアルファルファモザイクウイルス翻訳エンハンサー；recombinase＝合成R組換え酵素；NES＝核外輸送シグナルペプチド；T＝nosターミネーター；cod A＝シトシンデアミナーゼ；npt II＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII；GUS＝β-グルクロニダーゼ；hpt＝ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ；LBおよびRB＝左側境界配列および右側境界配列
【図５】＝表1
【図６】＝表2
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月24日(2003.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的組換え酵素活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一の核酸とリガンド結合ドメイン(LBD)を含むポリペプチドをコードする第二の核酸とを有する構築物であって、第一および第二の核酸が共に部位特異的組換え酵素活性を含む融合ポリペプチドおよび機能性リガンド結合ドメインをコードする構築物を細胞に提供する段階を含む、植物細胞を形質転換するための方法。
【請求項２】
組換え酵素活性がリガンド誘導可能である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
選択可能なマーカーをコードする核酸を細胞に提供する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
所望の機能的形質をコードする核酸を有する細胞をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
部位特異的組換え酵素活性を有する第一のポリペプチドをコードする第一の核酸とリガンド結合ドメイン(LBD)を含むポリペプチドをコードする第二の核酸とを有する構築物を含む植物形質転換ベクターであって、第一の核酸および第二の核酸が発現により部位特異的組換え酵素活性を含む融合ポリペプチドおよび機能性リガンド結合ドメインを形成するベクター。
【請求項６】
第一の核酸が少なくとも45パーセント、好ましくは少なくとも48パーセントのG+C含量を有する、請求項5記載のベクター。
【請求項７】
第二の核酸がステロイド結合ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項4または5記載のベクター。
【請求項８】
第一の核酸がZygosaccharomyces rouxiiのR組換え酵素タンパク質をコードする、請求項5〜7のいずれか一項記載のベクター。
【請求項９】
構築物が、選択可能なマーカーをコードする第三の核酸をさらに含む、請求項5〜8のいずれか一項記載のベクター。
【請求項１０】
選択可能なマーカーが、単機能性の正のマーカー、単機能性の負のマーカー、および／または二機能性マーカーを含む、請求項9記載のベクター。
【請求項１１】
単機能性の負のマーカーがシトシンデアミナーゼ活性を含む、請求項10記載のベクター。
【請求項１２】
二機能性マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはシトシンデアミナーゼ活性を有するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼもしくはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸配列である、請求項10記載のベクター。
【請求項１３】
リガンド誘導可能部位特異的組換え酵素活性および好ましくは選択可能なマーカーならびに所望の機能的形質が、請求項5〜12のいずれか一項記載のベクターの導入によって植物細胞に提供される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
請求項5〜12のいずれか一項記載のベクターを含む形質転換植物細胞。
【請求項１５】
翻訳後に組換え酵素活性を誘導する段階を含むことにより、請求項14記載の植物または植物細胞から、その誘導可能な組換え酵素活性および好ましくはその選択可能マーカーをも失わせるための方法。
【請求項１６】
活性を誘導する段階が、ステロイド、好ましくはデキサメタゾンの適用を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項15または16記載の方法によって得られる形質転換植物細胞または形質転換植物。
【請求項１８】
部位特異的組換え酵素活性および機能性リガンド結合ドメイン、好ましくはステロイド結合ドメインを含む融合ペプチド。
【国際調査報告】
2004533251.tif 000095
2004533251.tif 000096
2004533251.tif 000097
2004533251.tif 000098
2004533251.tif 000099
2004533251.tif 000100
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