(57)【要約】本発明は、所与の受容体の信号対雑音比を最適化するためのさらなる方法を提供する。特に、本発明は、信号対雑音比が増大した変異型受容体を提供する。1つの好ましい態様として、本発明は、基礎活性のレベルが減少した変異型受容体を提供する。この態様の一部として、本発明は、それぞれ基礎活性が減少した変異型セロトニン受容体および変異型CCR-3受容体を提供する。もう一つの好ましい態様として、本発明は、リガンド誘導性シグナル伝達の最大レベルが増大した変異型受容体を提供する。そのような受容体は、受容体の信号対雑音比を最適化し、例えば、薬物の発見においてより感受性の高い選別のために提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大したサイレント受容体であって、野生型受容体と比較して基礎活性が減少したサイレント受容体。
【請求項２】
サイレント受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項1記載の受容体。
【請求項３】
Gタンパク質共役型受容体がセロトニン受容体である、請求項2記載の受容体。
【請求項４】
セロトニン受容体がセロトニン2A受容体である、請求項3記載の受容体。
【請求項５】
セロトニン2A受容体が配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有する、請求項4記載の受容体。
【請求項６】
Gタンパク質共役型受容体がCCR-3受容体である、請求項2記載の受容体。
【請求項７】
CCR-3受容体が配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有する、請求項6記載の受容体。
【請求項８】
サイレント受容体が核内受容体である、請求項1記載の受容体。
【請求項９】
核内受容体がステロイドホルモン受容体である、請求項8記載の受容体。
【請求項１０】
サイレント受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項1記載の受容体。
【請求項１１】
対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大した活性化された受容体であって、野生型受容体と比較してリガンド刺激活性が増大した活性化された受容体。
【請求項１２】
活性化された受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項13記載の受容体。
【請求項１３】
活性化された受容体が核内受容体である、請求項13記載の受容体。
【請求項１４】
活性化された受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項13記載の受容体。
【請求項１５】
対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大したサイレント受容体を含むキットであって、該サイレント受容体が、該野生型受容体と比較して基礎活性が減少したキット。
【請求項１６】
サイレント受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項17記載のキット。
【請求項１７】
Gタンパク質共役型受容体がセロトニン受容体である、請求項18記載のキット。
【請求項１８】
セロトニン受容体がセロトニン2A受容体である、請求項19記載のキット。
【請求項１９】
セロトニン2A受容体が配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有する、請求項20記載のキット。
【請求項２０】
Gタンパク質共役型受容体がCCR-3受容体である、請求項18記載のキット。
【請求項２１】
CCR-3受容体が配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有する、請求項22記載のキット。
【請求項２２】
受容体が核内受容体である、請求項17記載のキット。
【請求項２３】
受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項17記載のキット。
【請求項２４】
対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大した活性化された受容体を含むキットであって、該活性化された受容体が、該野生型受容体と比較してリガンド刺激活性が増大したキット。
【請求項２５】
活性化された受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項26記載のキット。
【請求項２６】
活性化された受容体が核内受容体である、請求項26記載のキット。
【請求項２７】
活性化された受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項26記載のキット。
【請求項２８】
以下の段階を含む、受容体に対するリガンドを同定するための信号対雑音比が増大した受容体の使用方法：
(a)信号対雑音比が増大した受容体をコードする核酸を含む発現ベクターと受容体活性化に感受性のレポーター構築物とを細胞に同時形質移入する段階であって、該レポーター構築物が、受容体、プロモーター、およびレポーター遺伝子による活性化に感受性がある機能的に連結された反応エレメントを含む段階；
(b)候補となるリガンドと細胞を接触させる段階；および
(c)レポーター構築物の基礎活性またはリガンド刺激活性の変化を測定する段階であって、リガンド非依存型シグナル伝達に比較して受容体のリガンド依存型活性化が増大または減少することが、それぞれアゴニストまたはアンタゴニストの存在を示す段階。
【請求項２９】
信号対雑音比が増大した受容体がサイレント受容体である、請求項30記載の方法。
【請求項３０】
信号対雑音比が増大した受容体が活性化された受容体である、請求項30記載の方法。
【請求項３１】
サイレント受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項31記載の方法。
【請求項３２】
Gタンパク質共役型受容体がセロトニン受容体である、請求項33記載の方法。
【請求項３３】
セロトニン受容体がセロトニン2A受容体である、請求項34記載の方法。
【請求項３４】
セロトニン2A受容体が配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有する、請求項35記載の方法。
【請求項３５】
Gタンパク質共役型受容体がCCR-3受容体である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
CCR-3受容体が配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有する、請求項37記載の方法。
【請求項３７】
サイレント受容体が核内受容体である、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
サイレント受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
活性化された受容体がGタンパク質共役型受容体である、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
活性化された受容体が核内受容体である、請求項32記載の方法。
【請求項４１】
活性化された受容体が一回膜貫通型受容体である、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般に、リガンドスクリーニングアッセイ法において有用である最適化された信号対雑音比(signal to noise ratio)を有する受容体を特徴とする。
【０００２】
アッセイ法において、信号対雑音比の最適化は、測定される活性を検出する上で重要な要素である。これは、たとえば、Gタンパク質共役型受容体、一回膜貫通型受容体、および核内受容体などの受容体の活性を検出するためのアッセイ法に特に適用される。特定の受容体の活性（たとえば、リガンド結合活性、またはシグナル伝達活性）は、典型的には、リガンドの結合に応答して特定の受容体によって伝達される細胞内のシグナルを検出するアッセイ法を用いて測定される。
【０００３】
広範囲の様々なアッセイ法は、当技術分野において、受容体活性を測定することに利用できる。たとえば、1つの一般的に用いられている方法において、選択された型の細胞は、特定の受容体をコードするDNAをインビトロで形質移入され、基礎活性および／またはリガンド刺激受容体の活性が測定される。典型的には、測定されたリガンド刺激受容体活性は、細胞内の二次メッセンジャーシグナルの誘導である。または、特定の遺伝子の転写活性化（受容体によって誘導される生化学的経路により活性化されると知られている）を、標準的なレポーターアッセイ法を用いて受容体の活性を転写的に読みとるものとして使用することができる。
【０００４】
本発明以前には、受容体アッセイ法は、細胞に形質移入するDNAの量を変更する、形質移入に使用される細胞を変更する、シグナル伝達の時間経過を変更する（たとえば、形質移入後、細胞が生育可能な時間経過を変更する、または細胞が受容体に対するリガンドに接触する時間経過を変更するなどによる）、異なる二次メッセンジャーを検討する、または転写的な読みとりを誘導する二次メッセンジャーを検討する（たとえば、転写性レポーターアッセイを用いることによる）というような、様々なアプローチによって最適化されてきた。そのようなアプローチは、実際に測定方法の信号対雑音比を最適化する、もしくは改善でさえもするという保証なしにさまざまなパラメーターを試験することが必要とされる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、特定の受容体の信号対雑音比を信頼性をもって減少させる受容体活性の最適化のアッセイ方法を提供し、また、最適化された信号対雑音比を有する変異型受容体も提供する。受容体活性測定法の信号対雑音比の最適化は以下によって達成される：（1）受容体のシグナル伝達の基礎レベルを減少させる（サイレント受容体）。または、（2）受容体のリガンド刺激性の二次メッセンジャーのシグナル伝達のレベルを増大させる（活性化された受容体）。
【０００６】
第一の局面において、本発明は対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大したサイレント受容体、野生型と比較して基礎活性が減少したサイレント受容体を特色とする。この局面の態様においては、サイレント受容体は、セロトニン受容体（たとえば、セロトニン2A受容体、これは配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有しうるものである）、またはCCR-3受容体（たとえば、配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有するCCR-3受容体）のようなGタンパク質共役型受容体である。この局面の他の態様においては、サイレント受容体は、核内受容体、ステロイドホルモン受容体、または一回膜貫通型受容体である。
【０００７】
第二の局面において、本発明は、対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大した活性化された受容体であって、野生型受容体と比較してリガンド刺激活性が増大した活性化された受容体を提供する。この局面の態様において、活性化された受容体は、Gタンパク質共役型受容体、核内受容体、または一回膜貫通型受容体である。
【０００８】
第三の局面において、本発明は、対応する野生型受容体と比較して信号対雑音比が増大したサイレント受容体であって、野生型と比較して減少した基礎活性を有する受容体を含むキットを提供する。この局面の態様において、サイレント受容体は、セロトニン受容体（たとえば、セロトニン2A受容体、これは配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有しうるものである）または、CCR-3受容体（たとえば、配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有するCCR-3受容体）のようなGタンパク質共役型受容体である。この局面の他の態様においては、サイレント受容体は、核内受容体、ステロイドホルモン受容体、または一回膜貫通型受容体である。
【０００９】
第四の局面において、本発明は、対応する野生型受容体と比較して増大した信号対雑音比を有する活性化された受容体であって、野生型受容体と比較して増大したリガンド刺激活性を有する活性化された受容体を含むキットを提供する。この局面の態様において、活性化された受容体は、Gタンパク質共役型受容体、核内受容体、または一回膜貫通型受容体である。
【００１０】
第五の局面において、本発明は、以下の段階によって、受容体に対するリガンドを同定するための増大した信号対雑音比を有する受容体の使用方法を提供する：増大した信号対雑音比を有する受容体をコードする核酸を含む発現ベクターと受容体活性化に感受性レポーター構築物とを細胞に同時形質移入する段階であって、このレポーター構築物が、受容体、プロモーター、およびレポーター遺伝子による活性化に感受性がある機能的に連結された反応エレメントを含む段階；候補となるリガンドと細胞を接触させる段階；ならびにレポーター構築物の基礎活性、またはリガンド刺激活性の変化を測定する段階であって、受容体のリガンド非依存型シグナル伝達に比較して受容体のリガンド依存型活性化が増大または減少することが、それぞれアゴニストまたはアンタゴニストの存在を示す段階。この局面の態様において、信号対雑音比が増大した受容体は、サイレント受容体または、活性化された状態であり、このどちらかは、Gタンパク質共役型受容体、核内受容体もしくは、一回膜貫通型受容体である可能性がある。サイレントなGタンパク質共役型受容体は、セロトニン受容体（たとえば、配列番号：1の323位でLysからGluへの変異を有するようなセロトニン2A受容体）または、CCR-3受容体（たとえば、配列番号：2の235位でTyrからGluへの変異を有するCCR-3受容体）である可能性がある。
【００１１】
「基礎」活性は、受容体特異的リガンド（たとえば、ポジティブなアゴニスト）による刺激がないときの受容体の活性のレベル（たとえば、特異的な生化学的経路の活性化または、シグナル伝達を行う二次メッセンジャーの活性化）を意味する。基礎レベルは野生型受容体のリガンド刺激活性のレベルより低くなりうる。しかしながら、いくつかの場合において、増大した基礎活性を有する受容体は、対応する野生型受容体のリガンド刺激活性のレベルに、近い、同等、または上回るシグナル伝達のレベルを示すことがある。
【００１２】
「サイレンシング変異」または「サイレント受容体」とは、対応する野生型受容体または他の陰性対照（たとえば、受容体ポリペプチドをコードする核酸を欠損しているベクター）の基礎活性より低いレベルまで受容体の基礎活性を減少させる変異を意味する。本発明によれば、サイレンシング変異は、結果的に、受容体のシグナル伝達を誘導するリガンドの減少とはならない。
【００１３】
「活性化された受容体」とは、リガンド刺激活性が増大する受容体を意味する。リガンド刺激活性の増大は、変異の結果として増大した発現レベルによると考えられる。
【００１４】
「陰性対照」とは、候補となる受容体のシグナル伝達の増大または減少を識別するのに使用される任意の構築物を意味する。所与の候補となるいかなる受容体にも適切な陰性対照は、アッセイ法およびシグナル伝達における変化の型に依存して様々であると考えられる。たとえば、サイレント受容体に対しては、適切な陰性対照は、野生型受容体ヌクレオチド配列を含むベクター、または構成的に活性のある受容体のヌクレオチド配列を含むベクターであってもより。サイレント受容体または活性化された受容体を同定するのに使用される適当な陰性対照は、当業者に明らかである。
【００１５】
「信号対雑音比」とは、リガンドの刺激がないときの受容体の測定可能な活性とリガンドの刺激があるときの受容体の測定可能な活性との間の正味の定量的な差を意味する。
【００１６】
「疾患」または「障害」とは、哺乳類で診断されうるいかなる病気または有害な状態も意味する。本明細書に用いられる場合、疾患または障害は、苦痛または痛みなどの肉体的な症状（たとえば、慢性的な背痛または関節炎など）を指すか、または、癌などの重篤な状態をさす。
【００１７】
本明細書に用いられる場合、「二次メッセンジャーのシグナル伝達活性」とは、受容体の活性化または受容体の活性化に応答したタンパク質の活性化に応答する細胞内刺激（cAMP、cGMP、ppGpp、イノシトールリン酸、またはカルシウムイオンを含むが、これに限定されない）の生産を指す。リン酸化酵素、脱リン酸酵素、または膜チャネルの活性化もしくは抑制を含むが、これに限定されない。
【００１８】
「自然に生じる」受容体は、動物に存在するような受容体の型または配列を指す。当業者は、「野生型」受容体が、その受容体の慣習的に受け入れられている「野生型」アミノ酸コンセンサス配列、またはリガンドの結合およびシグナル伝達の正常な生理的な型を持つ「自然に生じる」受容体をさすことを理解すると思われる。
【００１９】
「対応する野生型受容体」とは、サイレントな変異型受容体、または活性化された変異型受容体の「野生型」または「自然に生じる」型を意味する。
【００２０】
「変異型受容体」は、自然に生じる主な受容体（たとえば、自然に生じる野生型の受容体）における1つまたは複数のアミノ酸残基が、欠損または置換のいずれかを受けた受容体の型として理解されている。または、追加のアミノ酸残基が挿入されているものである。
【００２１】
「実質的に純粋な単離された核酸」とは、本発明のDNAが由来する生物の自然に生じるゲノム中で、隣接する遺伝子を取り出した核酸（たとえば、DNAまたは、RNA）を意味する。従って、この用語は、たとえば、ベクター中、自律的に複製したプラスミドもしくはウイルス中、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられた組換えDNA、または、他の配列とは無関係の分離した分子（たとえば、cDNA、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたゲノム断片もしくはcDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもまた含まれる。
【００２２】
「形質転換細胞」とは、組換えDNA技術によって、本明細書に記載のポリペプチド（たとえば、CCR-3受容体ポリペプチド）をコードするDNA分子（本明細書で用いられたように）を導入された細胞（またはその祖先）を意味する。
【００２３】
「プロモーター」とは、転写を誘導するのに十分な最小の配列を意味する。本発明に含まれるものはまた、細胞型に特異的、組織特異的、または外部のシグナルもしくは物質による誘導性に対して制御可能なプロモーター依存性の遺伝子発現を提供するのに十分であるプロモーターエレメントである。そのようなエレメントは、天然の遺伝子の5'または、3'領域に位置する。プロモーターエレメントは、DNA配列に隣接して位置する場合、発現のために位置され、その配列の転写を誘導することができる。
【００２４】
「機能的に連結された」とは、適切な分子（たとえば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合された場合に、遺伝子発現が可能になるように、遺伝子と調節配列が連結していることを意味する。
【００２５】
「レポーターアッセイ系」とは、典型的には転写の活性化を測定するのに使用されるベクターの任意の組み合わせを意味する。典型的なレポーターアッセイ系は、少なくともレポーター構築物と、レポーター構築物の発現を活性化する（たとえば、直接的に）または活性化を引き起こす（たとえば、間接的に）ポリペプチドをコードする発現ベクターとを含む。レポーターアッセイ系には、レポーター構築物の活性化に関与する他のポリペプチドをコードする別の発現ベクターも含まれる。
【００２６】
「発現ベクター」は、発現される遺伝子に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。
【００２７】
「レポーター構築物」は、レポーター遺伝子に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。そのようなレポーター遺伝子は、転写または翻訳を測定する任意のアッセイ法において使用され、直接的（たとえば、視覚的な検出方法によって）または間接的に（たとえば、レポーター遺伝子産物に抗体を結合させることによって、またはレポーター遺伝子産物に媒介される二次的な遺伝子産物の誘導によって）検出される。標準的なレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる（たとえば、参照として本明細書に組み入れられている、Sambrook,J.ら、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Press, N.Y.、およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Bioloby」, Greene Publishing Associate, New York, N.Y., V 1-3, 2000を参照されたい）。レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子のレベルまたは活性を直接的または間接的に測定するアッセイ法の使用によって検出することができる。好ましいレポーター構築物は反応エレメントも含む。
【００２８】
「反応エレメント」は、たとえば、二次メッセンジャーのシグナル伝達経路のような、特定のシグナル伝達経路に感受性のある核酸配列であり、プロモーターと協同してレポーター遺伝子の転写の誘導を助ける。本明細書で使用される場合、「反応エレメント」もまた特定の受容体を介したシグナル伝達に反応して活性化されるプロモーターを意味する。
【００２９】
発明の詳細な説明
現行の科学研究の主な焦点は、新規の受容体のリガンドを同定することである。この観点において、受容体は、リガンドが結合している新規の受容体を同定し、特定の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定することを目標とする大規模なスクリーニングアッセイ法に用いるための有用なツールである。特定のリガンド結合アッセイ法の検出能力を最大化するために、アッセイ法の信号対雑音比を最適化することは有利である。
【００３０】
本発明は、所与の受容体のシグナル伝達を変化させることで所与のアッセイ法の信号対雑音比を最適化するためのもう一つの方法を提供する。具体的には、本発明は信号と雑音の差において内因性の増大を有する変異型受容体を提供する。１つの態様として、本発明は、基礎活性のレベルが減少した変異型受容体を提供する。もう一つの態様として、本発明は、リガンド刺激シグナル伝達の最大レベルが増大した変異型受容体を提供する。この受容体の型は両方とも、これに相当する野生型の受容体と比べて、機能的に正常ではない受容体である。加えて、この受容体の型は両方とも、基礎活性とリガンド誘導性の活性の間の正味の差を最大にすることによってアゴニストまたはアンタゴニストに対するよりよい篩として働く。そのような受容体は、受容体アッセイ法の信号対雑音比を最適化し、薬物の発見を求めてより感受性の高い選別を提供する。
【００３１】
たとえば、受容体の基礎活性の減少は、受容体の活性化における閾値を効果的に下げ、従って、対応する野生型受容体を用いる別な方法では同定できなかったアゴニスト活性の検出が可能になる。同様に、リガンドで誘導される受容体のシグナル伝達の増大は、受容体のシグナルの出力を増幅することとなり、対応する野生型受容体を用いる別な方法では同定できなかったアンタゴニスト活性を示すリガンドの同定を可能にする。しかしながら、当業者には、受容体のいずれかの型（たとえば、減少した基礎活性を有する受容体、または増大したリガンド刺激活性を有する受容体）が、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するのに使用されることが理解されると思われる。さらには、当業者には、本発明の方法は、全クラスのGタンパク質共役型受容体（生体アミンおよびオーファン受容体を含む）、一回膜貫通型のドメイン受容体、および核内受容体（たとえば、ステロイドホルモン受容体）を含む、任意の受容体に対して使用されうるということが認識されると思われる。
【００３２】
これまで述べてきたように、本発明の受容体を、対応する野生型受容体に結合し、活性化するリガンド（ペプチド、非ペプチド、および低分子のリガンドを含む）を同定するためのハイスループット薬物スクリーニングアッセイ法に使用することができる。治療学的に関心対象となる受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるリガンドを同定することは、さらなる解析のための標的である候補となるリガンドのプールを狭める最初の段階である。このような解析の最終目的は、疾患または障害の治療のために有用な治療物質を同定および特徴づけることである。実際、本発明のサイレント受容体または活性化された受容体のような、改変されたシグナル伝達を持つ受容体は、多数の疾患および他の副作用が異常な受容体活性に起因しうるという事実のために薬物の発見にとって重要なツールである。これゆえ、本発明のサイレント受容体または活性化された受容体を用いて、治療学的に関心対象となる野生型受容体に対するリガンドは、治療物質の鍵として同定される。
【００３３】
セロトニン受容体
セロトニン2A受容体（5-ヒドロキシトリプタミン2A(5HT2A)受容体とも呼ばれる）は、ヒトの血小板および血管と同様に、鼻周囲皮質、梨状皮質、前前頭皮質、内側前背面扁桃体（medial anterodorsal amygdala）、および海馬のCA2-3領域を含む、脳の領域で主に発現されるGタンパク質共役型受容体である（Serresら、Eur Psychiatry 14(8):451-457(1999)；Katoら、Mol. Cell. Biochem. 199(1-2):57-61(1999)；Osterlundら、Brain Res Mol Brain Res 74(1-2):158-166(1999)；Hernandezら、J. Neurosci. Res. 59(2):218-225(2000)）。セロトニン受容体、特にセロトニン2A受容体によって調節されているセロトニンシグナル伝達における異常性は、たとえば、鬱病、双極性感情障害、情緒障害、不安、および統合失調症などの抑鬱障害の病態生理学に影響を与える（Massatら、Am J. Med. Genet. 96(2):136-140；Serrettiら、J. Psychiat. Res. 34(2):89-98(2000)；Bromidgeら、J. Med. Chem. 43(6):1123-1134(2000)；Serrettiら、Am J. Med. Genetic. 96(1):84-87(2000)；Serresら、前記）。たとえば、鬱病患者で発現されるセロトニン2A受容体の数が増加することが研究により示されている（Osterlundら、前記）。加えて、セロトニン2A受容体遺伝子の多形性が、神経性食欲不振および神経性過食症の患者で確認され、これらも抑鬱障害として分類される（Necamiasら、Neurosci Lett 277(2):134-136(1999)。
【００３４】
本発明は、野生型セロトニン2A受容体と比較して減少した基礎活性を有する変異型セロトニン2A受容体を提供する。この受容体は、サイレント受容体として分類される。特に、サイレントなセロトニン2A受容体は、配列番号:1の323位のアミノ酸においてLysからGluへの置換を有している。この変異体は配列番号:1の323位のアミノ酸（図1の「CWLP」のモチーフに関係のある-13位で示される）においてCys残基がヒトセロトニン2A受容体とラットセロトニン2A受容体の間で高度に保存されていることに基づいて同定された（Pauwewlsら、Biochem. 343 2:435-42(1999)；Eganら、J. Pharm. Exp. Therap. 286(1):85-90(1998)を参照されたい）。加えて、他の受容体において-13位での置換（特にアミノ酸電荷に変化をもたらす置換）は、しばしば増大した基礎活性（即ち、構成的活性）を有する受容体を生ずることが知られていた。従って、322位のアミノ酸およびその周囲の残基の電荷を変化させるアミノ酸置換は、これらの置換のうち任意の置換が変化した基礎活性を有する変異型受容体を生ずるのかどうか判定するために試験されてきた。これらの変異型受容体は、セロトニン2A受容体の基礎活性を測定できる転写レポーターアッセイ法を用いて試験された。細胞は、野生型セロトニン2A受容体、変異型セロトニン2A受容体、または陰性対照であるpcDNA1のいずれか1つと、セロトニン反応エレメント（SRE）とを含むルシフェラーゼレポーター構築物とともに同時形質移入された。以下の実施例1で示すように、Lys323Gluセロトニン受容体で、受容体で誘導された基礎転写活性の減少が生じた。
【００３５】
CCR-3受容体
CCケモカイン受容体3（CCR-3）は、アレルギー反応において炎症細胞の漸増において主要な役割を果たす胸腺細胞で発現される七回膜貫通型Gタンパク質共役受容体である。特に、CCR-3受容体は、好酸球輸送の調節に作用するポリペプチド、エオタキシンに結合する。CCR-3受容体はまた、ヒト免疫不全症ウイルスの細胞への侵入のための補助受容体としても役に立つ（Franz-Baconら、Blood 93(10):3233-3240(1999)；Zimmermannら、J. Immunol. 164(2):1055-1064(2000)；Zimmermannら、Biochim. Biophys Acta 1442(2-3):170-176(1998)を参照されたい）。
【００３６】
本発明は、対応する野生型受容体と比較して、減少した基礎活性を有する変異型CCR-3受容体を提供する。このサイレントなCCR-3受容体は、配列番号：2の235位のTyr残基がGluに置換されている。セロトニン受容体と同様に、この変異は、多くのGタンパク質共役受容体が見られる「CWLP」モチーフに関係する13位の周囲の位置に高レベルの相同性があること、ならびこの領域での変異はしばしば増大された基礎活性（すなわち、構成的活性）を有する受容体が生ずるということに基づいて同定された。235位のアミノ酸および周囲の残基の電荷を変えたアミノ酸置換は、これらの変異の任意の変異が基礎活性において変化を有する受容体を生ずるかどうか決定するために試験された。
【００３７】
Tyr235Glu CCR-3受容体は、CCR-3受容体のシグナル伝達の基礎レベルを測定可能な転写レポーターアッセイ法を用いて試験された。細胞は、セロトニン反応エレメント（serotonin response element：SRE）を含むルシフェラーゼレポーター構築物；Gq5iと呼ばれるキメラタンパク質（以下に詳細に述べる）をコードする発現ベクター；および野生型CCR-3受容体、Tyr235Glu CCR-3受容体、または陰性対照であるpcDNA１のいずれか1つと同時形質移入された。以下の実施例2で示すように、CCR-3受容体で、恒常的に、受容体で誘導される基礎転写活性の減少が生じた。
【００３８】
最適化された信号対雑音比を有する受容体の同定
本発明に基づいて、当業者は、最適化された信号対雑音比を有する追加の受容体を同定するために、基礎活性のレベルが減少した受容体、またはリガンド刺激活性のレベルが増大した受容体をスクリーニングできること明確に理解したと思われる。いくつかの受容体（たとえば、野生型受容体）は、天然においてはサイレントであり、即ち、基礎活性が特に低いレベル（すなわち、陰性対照の活性より低い）である。このような自然に生じるサイレント受容体は、野生型受容体の基礎活性を、陰性対照の基礎活性と単に比較することによって同定される。たとえば、適当な陰性対照は、天然の野生型受容体の発現を欠いている細胞（たとえば、空の発現ベクターを形質移入した細胞、または以前にサイレント受容体として確立された異なる受容体を形質移入した細胞（好ましくは、空の発現ベクターとサイレントではない受容体を含むベクターの両方が対照として一つの実験に用いられること））である。または、活性化された受容体を同定するために、リガンドで誘導されるシグナル伝達の最大のレベルが増大している受容体をスクリーニングすることができる。
【００３９】
当業者は、新規のサイレントな受容体、および活性化された受容体が通常のスクリーニング法を用いて同定できることを認識すると思われる。たとえば、サイレンシング変異を有する受容体は、以下のことによって系統的に同定されうる：1)特定のサイレントではない受容体と、受容体の基礎活性に変化を有する1つまたは複数の受容体（たとえば、基礎活性における減少（サイレント受容体）、または基礎活性における増大（構成的活性型受容体））の間の相同性領域を同定すること；2)同定されている相同性領域に基づいてサイレントではない受容体の1つまたは複数の領域で変異を誘導する段階；および3)活性の基礎レベルにおける減少について変異型受容体をアッセイする段階。当業者は、その変異が、当技術分野においていかなるランダムな突然変異誘発方法基準でも誘導できることを認識すると思われる。非常に様々なランダム突然変異のキットは実際に市販されている。一旦同定されれば、受容体の活性を、例えば哺乳類の発現系、特に酵母の発現系を使用して確認することができる。
【００４０】
本出願者らは、ヒト野生型セロトニン2A受容体、ラットセロトニン2A受容体および、他の多数の構成的活性型のクラスI Gタンパク質共役型受容体間で高度に保存されている領域を同定することによって、2)の段階を実際に示す。この情報は、野生型セロトニン2A受容体に特異的な残基を変異のための標的化するのに用いられた。以下で詳細に述べるように、標的化された一連の点変異は、セロトニン2A受容体に導入され、変異型受容体は、減少した基礎活性について解析された。1つの変異型受容体であるThy323Glu受容体は、対応する野生型受容体と比較して、実際にサイレントであった（実施例1を参照）。
【００４１】
サイレントではない受容体、野生型受容体、および保存領域を同定するための変更された基礎活性を有する受容体を比較する本方法は、上で述べた段階1)および2)のように、相同性領域を変異のために標的化するという目的で、関連する受容体の任意のファミリーにおいても繰り返されることが認識される。加えて、上で示されたように、当業者は、追加の活性化された受容体を同定するためにこれらの方法を容易に改変できる。
【００４２】
標準的な突然変異誘発の手順を、候補となるサイレント受容体または活性化された受容体を産生するために使用してもよい。1つの例であるが、受容体を、発現ベクター（たとえば、pcDNA1.1、これはCOS-7細胞およびHEK293細胞で高い発現レベルを保証する）にサブクローニングし、制限酵素および部分的DNA配列解析で確認してもよい。次に、突然変異誘発の鋳型を作製するために、BW313細菌を、ヘルパーファージを用いて、発現ベクターとともに形質転換し、突然変異誘発の一本鎖のウラシル鋳型を作製する。それぞれのウラシル鋳型は、単一の受容体を示し、少なくとも20個の対応する受容体の変種を産生するために十分な材料を提供する。オリゴヌクレオチドプライマーは、受容体に点変異を導入するように設計される。上で述べたように、導入されるアミノ酸の変化は、サイレントな状態または活性化された活性を与える可能性を最適化するために選択される。好ましくは、突然変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは、平行して、サイレントな制限酵素切断部位（すなわち、アミノ酸配列を変えないもの）を導入するために設計され、これゆえ、候補となる変異型受容体cDNAの迅速なスクリーニングが可能となる。この例示した技術は、PCRまたは他のプラスミドへのライゲーションのいずれも必要性ではなく、変異型受容体cDNAの迅速な産生を可能とする。
【００４３】
ひとたび産生されると、候補となる変異型受容体cDNAは、細菌に形質転換され、DNAミニプレップとして培養される。制限酵素解析を変異型クローンの同定に用い、その後、所望の変異の導入を確認するためにシークエンスする。同定された候補となるサイレント受容体または活性化された受容体をコードするcDNAは、COS-7またはHEK293細胞系へ形質移入される。細胞はその後、段階3)の調製で12または24ウェルプレートに分割される。
【００４４】
段階3)は、例えば、減少した基礎活性または増大したリガンド刺激活性などの、所望の活性のための変異型受容体のアッセイ法を含む。もちろん、特定の受容体の基礎活性またはリガンド刺激活性が、受容体の基礎活性および/またはリガンド刺激活性を測定するために標準的に使用されるいかなる方法でも測定できることが理解される。既知のリガンドを有する治療学的に関心対象となる任意の受容体にこのような関連アッセイ法がある。少数の例を挙げると、二次メッセンジャーシグナル伝達の基礎レベルまたはリガンド刺激レベルの変化が、cAMP、cGMP、ppGpp、イノシトールリン酸、またはカルシウムイオンの基礎レベルの変化を非制限的に含むサイレント受容体または活性化された受容体をそれぞれ同定することが認識される。1つの例であるが、メラノコルチン-4(MC-4)受容体のリガンド依存性活性は、cAMP形成における劇的な増加を測定することによってアッセイされる（Huszarら、Cell 88:131-141,(1997)）。cAMPの形成は、放射性免疫測定法を用いて定量化される。変異型受容体は、野生型対照受容体、空の発現ベクター（たとえば、pcDNA1.1、これは受容体をコードする核酸配列を欠いている）で形質移入された細胞、および形質移入されていない細胞と平行して研究される。加えて、既知のサイレント受容体または活性化された受容体は、それぞれのアッセイ法において陽性対照として平行して研究されうる。
【００４５】
これらの簡単な原理は、異なる型の追加のサイレント受容体または活性化された受容体（たとえば、核内受容体、一回膜貫通型受容体、またはGタンパク質共役型受容体）を同定するために容易に適用される。構成的活性型受容体を同定するのに用いられるアッセイ法は、基礎活性が増大するものよりむしろ、減少する受容体を同定する、またはリガンド刺激活性で増大が見られる受容体を同定するために改変できる。この点を説明するために、基礎活性の増大が見られる（すなわち、構成的に活性化している）Gタンパク質共役受容体に特異的である、以下の例が提供される。1つの例として、細胞内cAMPの増加を測定した研究が、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドI型受容体(PAC1)の構成的活性型変異体を同定するために行われた（Caoら、FEBS Lett., Mar 10；469(2-3):142-146 (2000)）。もう1つの例として、β2ブラジキニン(BK)受容体の構成的活性型変異体、ならびにAT1AアンジオテンシンIおよびII受容体の構成的活性型変異体が、イノシトールリン酸の生産を測定することによって同定された (Marieら、Mol. Pharmacol. 1:92-101(1999)； Groblewskiら、J. Biol. Chem., 272(3):1822-1826 (1997)； Fengら、Biochemistry, 37(45):15791-15798 (1998))。構成的活性型のCCK-BRもまた、基礎的なイノシトールリン酸の生産を測定することによって同定された（Beinbornら、J. Biol. Chem. 273(23):14146-14151 (1998)）。CCK-BRの変異体を、変異型CCK-BRが構成的に活性化しているかどうか決定するために、変異型CCK-BRのイノシトールリン酸の生産の基礎レベルと野生型CCK-BRのイノシトールリン酸の生産の基礎レベルとを単に比較することによって調べた。
【００４６】
他の型の受容体（たとえば、一回膜貫通型ドメイン受容体および核内受容体のような、非Gタンパク質共役型受容体）の活性もまた、これらが誘導する生化学的経路を経て測定することができる。たとえば、リガンドEPOとEPO受容体との結合は、JAK2-STAT5シグナル伝達経路を活性化する（例えば、Yoshimuraら、Curr. Opin. Hematol., 5(3)171-176, 1998を参照）。JAK2の基礎レベルおよび活性化されたレベル、ならびにSTAT5シグナル伝達は、サイレントなまたは活性化されたEPO受容体を同定するために、Yoshimuraら（前記）により記載されるように、当業者によって容易に評価できる。
【００４７】
サイレント受容体または活性化された受容体を同定するために直接シグナル伝達経路における分子を測定することに代わるものとして、レポーターアッセイ系を確立してもよい。これは、特定の受容体を介したシグナル伝達に反応する反応エレメントが、転写プロモーターと組み合わされてレポーター遺伝子に接合させるものである。具体的には、レポーター遺伝子の発現は、選択された受容体の活性によって制御されている。この方法は、以下の段階を含む：1)特定の受容体ポリペプチドによるシグナル伝達に感受性のある反応エレメントを同定する段階（たとえば、受容体活性化による遺伝子発現の増大または減少を誘発することによる）；2)反応エレメントおよびプロモーターとレポーター遺伝子とを連結する段階；ならびに3)推定されるサイレントなレポーターの基礎レベルのレポーター活性と陰性対照とを比較する段階。このアッセイ法において陰性対照と比較して基礎レベルのレポーター活性が減少したことは、サイレント受容体の同定を示している。サイレント受容体は、適切な陰性対照と比較して、基礎活性に対して少なくとも25%の減少、基礎活性に対して少なくとも50%の減少、基礎活性に対して少なくとも75%の減少、または基礎活性に対して100%を超える減少を示す。ごくまれに、サイレント受容体は、統計分析の受け入れられた方法を使用して、統計学的に有意であると考えられる適切な陰性対照に関して基礎シグナル伝達の減少を示す。または、受容体のリガンド刺激活性の増大は、活性化された受容体の同定を示している。活性化された受容体は、適切な陰性対照と比較したすべてで、リガンド刺激活性において、少なくとも5%の増大、少なくとも10%、15%、20%もしくは25%の増大、または少なくとも50%、60%もしくは75%の増大、または100%を超える増大をみせた。ごくまれに、活性化された受容体は、統計分析の受け入れられた方法を使用して、統計学的に有意であると考えられる適切な陰性対照に関して、リガンド刺激活性の増大を示す。
【００４８】
受容体が、候補となるサイレント受容体または活性化された受容体として同定された任意の受容体でありうることが理解されると思われる。加えて、当業者は、このアッセイ法で使用された反応エレメントは、同定された候補となるサイレント受容体または活性化された受容体を介したシグナル伝達に感受性がある反応エレメントでありうることを認識すると思われる。たとえば、異なるGタンパク質と共役しているレポーターアッセイ法を行うために、Gタンパク質共役受容体を介したシグナル伝達に感受性のある反応エレメントを選択することとなる。好ましい反応エレメントの例には、ソマトスタチン(SMS)プロモーターの一部（これは、多くの異なる反応エレメントを含んでいる）、血清反応エレメント(SRE)、およびcAMP反応エレメント(CRE)が含まれ、これらは、Gタンパク質共役型受容体のシグナル伝達に感受性のある反応エレメントである。特定の例において、SMSは、GαqまたはGαsのどちらかに対する受容体の共役によって活性化する。SREはGαqと共役している受容体によって活性化し、CREはGαsと共役する受容体によって活性化し、Gαiとの共役によって抑制される。これらの反応エレメントそれぞれは、特異的なGタンパク質共役受容体の基礎レベルおよびリガンド刺激活性に関する読みとりを作製するレポーターアッセイ法に使用されうる。
【００４９】
加えて、受容体シグナル伝達を検出するためのレポーター構築物は、特定の受容体を介したシグナル伝達に感受性があるプロモーターである反応エレメントを含む。たとえば、上皮成長因子、ガストリン、またはfosをコードする遺伝子のプロモーターは、Gタンパク質共役型受容体のシグナル伝達の検出のためのレポーター遺伝子に機能的に連結されうる。他の例には、TPA反応エレメントが含まれ、これはホルボールエステル誘導に感受性があり、Gαqと共役する受容体によって活性化される。
【００５０】
特定の受容体を介したシグナル伝達によって誘導される種々のシグナル伝達経路のいずれにも感受性がある幅広い様々なレポーター構築物が作製されることが認識されると思われる（例えば、二次メッセンジャーシグナル伝達経路）。従って、このアッセイ系は、単に特定の受容体に感受性のある反応エレメントを選択し、レポーター構築物のレポーター遺伝子の上流に反応エレメントを置くことによって、一回貫通型受容体または核内受容体のような受容体を含むサイレント受容体または活性化された受容体の他の型を同定するために用いてもよい。たとえば、AP-1、NF-κb、SRF、MAPキナーゼ、p53、c-jun、TAREなどのエレメントは、レポーター遺伝子の発現を得るために、すべてレポーター遺伝子の上流に置くことができる。追加の反応エレメント（プロモーターエレメントを含む）は、ストラタジーン社のカタログ（PathDetect（登録商標）「in Vivo Signal Transduction Pathway cis-Reporting Systems Induction Manual」、またはPathDetect（登録商標）「in Vivo Signal Transduction Pathway trans-Reporting Systems Induction Manual」、Stratagene, La Jolla, CA）に見出すことができる。
【００５１】
典型的なGタンパク質共役型レポーターアッセイ系は、1)特定のGタンパク質を介したシグナル伝達に感受性のある反応エレメントとレポーター遺伝子に機能的に連結したプロモーターとを含むレポーター構築物を含み、好ましくは、2)受容体をコードする核酸と機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターであって、この受容体が、Gタンパク質または選択された反応エレメントが感受性である下流の他の媒介物と共役する発現ベクターと組み合わされる。本発明のサイレント受容体を同定するのに用いられたアッセイ法は、特異的な反応エレメントとして、Gαqを介したシグナル伝達に感受性がある血清反応エレメント(SRE)の使用を実際に示している（表1〜5を参照）。
【００５２】
本発明において、Gタンパク質共役型レポーターアッセイ法のいくつかの変形物を使用してもよい。たとえば、細胞内cAMPのGαiで媒介される減少は、以下の段階によって測定することができる：1)アデニル酸シクラーゼの受容体非依存型の活性化を誘導し、細胞内cAMPプールを作製するフォルスコリンで細胞を刺激する段階；2)リガンドで細胞を刺激する段階；および3)細胞内cAMPのプールにおけるリガンド誘導性、受容体依存性、Gαi媒介型の減少を測定する段階(たとえば、放射性免疫アッセイ法を使用（たとえばNew England Nuclear社、Boston, MA））。
【００５３】
または、Gαi共役は、陰性アッセイ法（即ち、受容体活性化で活性に減少が見られたもの）の代わりに、陽性アッセイ法（即ち、受容体活性化で活性に増大が見られたもの）を使用することによっても測定することができる。このアッセイ法は、シグナルの出力をより検出可能にし、且つアッセイ間の差異を少なくする。そのようなアッセイ法では、GαqのC末端に結合するGαi由来の5つのC末端のアミノ酸を有する完全なGαqタンパク質を含むキメラGタンパク質（Gq5i、BroachおよびThorner、Nature 384(Suppl.):14-16 (1996)）が使用される。このキメラGタンパク質は、Gαi共役型受容体によってGαiとして認識されるが、受容体で誘導されるシグナル伝達をGαiからGαqに切り替える。これにより、Gαi受容体の共役が、Gαｑ反応性SMS-LucまたはSRE-Luc構築物（ストラタジーン社、La Jolla、CA）の使用による陽性アッセイ法を使用して検出することができる。SMSおよびSREは、好ましくは、Gαqに媒介されるイノシトールおよびカルシウム生産に反応する。さらに、検出はフォルスコリン非存在下で、刺激前の細胞で行うことができる。これらの型の測定法は、以下の実施例2で示される。
【００５４】
出願
好ましい態様として、サイレント受容体または活性化された受容体、たとえば、Lys323Gluセロトニン2A受容体およびTyr235Glu CCR-3受容体は、増大された信号対雑音比を有し、受容体特異的リガンドを同定するための大規模なスクリーニングアッセイ法に使用される。1つの好ましい態様として、同定されたサイレント受容体および活性化された受容体は、ペプチド、非ペプチド、および低分子のリガンドを含む、所与の受容体のリガンドを同定するためのツールとして用いられる。たとえば、特定のサイレント受容体または活性化された受容体に結合するリガンド（たとえば、ホルモンまたは薬物）を、（1）受容体の活性化に感受性がある反応エレメントおよびプロモーターと、受容体の活性に感受性のあるレポーター構築物を作製するためのレポーター遺伝子とを機能的に連結させる段階；（2）レポーター構築物と、サイレント受容体または活性化された受容体をコードする核酸を含む発現ベクターとを同時形質移入する段階；(3)細胞と候補となるリガンドを接触させる段階；ならびに(4)レポーター構築物の基礎活性またはリガンド刺激活性の変動について測定する段階により、レポーターアッセイ系を用いて同定してもよく、サイレント受容体または活性化された受容体において、リガンド非依存型シグナル伝達に比較してリガンド依存型の活性化が増大または減少することは、それぞれアゴニストまたはアンタゴニストの存在を示している。受容体活性を増大または減少させることによって特定の受容体を活性化するリガンドまたは阻害するリガンドは、候補となる治療的薬物として有用であり、または、治療学のための化合物を導く。
【００５５】
当業者は、特定の薬学的組成物に対する投与計画が容易であり、日常的に決定されることを理解すると思われる。たとえば、本明細書に記載の受容体を用いて同定されたいずれのリガンドも、薬学的に許容される担体と組み合わせて、個体（たとえば、哺乳類、好ましくは、家畜、動物園の動物、ペットもしくはヒト）の疾患を治療もしくは予防するため、または健康を改善するために、これらの個体に投与することができる（「Remington's Pharmaceutical Science」, 15th Ed. Easton: Mack Publishing Co. pp. 1405-1412および1461-1487(1975)、および「The National formulary XI.」, 14th Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)、これらの内容は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００５６】
もう一つの態様として、本発明のサイレント受容体または活性化された受容体は、特定の受容体によって誘導されるシグナル伝達経路（たとえば、cAMP、イノシトールリン酸の産生）を同定するために、異なるシグナル伝達経路に感受性のあるレポーター遺伝子構築物（たとえば、SRE-Luc、SMS-Luc、およびCRE-Luc）パネルと共に使用される。この情報は、同族の内在性リガンドの同定（すなわち、受容体の脱オーファン化）およびオーファン受容体で作用する薬物の発見（たとえば、ハイスループットスクリーニングアッセイ系に本発明のサイレント受容体または活性化された受容体を用いることによって）の両方を促進させ、加速させる。これにより、薬物スクリーニングの試みにより集中し、低いコストの実施が可能となる。加えて、内在性のリガンドのいかなる認識も、薬物スクリーニングに必須なものとして必要とされることはない（競合的結合アッセイ法にもあてはまる）。
【００５７】
関連した態様において、本発明のサイレント受容体または活性化された受容体は、特定の受容体がGαq、Gαs、またはGαiを媒介するシグナル伝達に反応するレポーター構築物の形で共役しているGタンパク質を同定するのに用いられる。本発明のサイレント受容体または活性化された受容体は、特定の受容体が共役していて、Gαq、Gαs、およびGαiから選択されたGタンパク質を決定可能なレポーター構築物パネルに用いられる。アッセイ系には、（1）特定のGタンパク質に感受性があり、Gαq、Gαs、およびGαiから選択された特定のGタンパク質に感受性のある反応エレメントを含むレポーター構築物パネル（たとえば、SMS-Luc、SRE-Luc、およびCRE-Luc）およびレポーター遺伝子に機能的に連結しているプロモーター；(2)サイレントなまたは活性化されたGタンパク質共役型受容体をコードする発現ベクター；ならびに(3) (1)および(2)の成分を送達する細胞が必要である。
【００５８】
または、サイレント受容体または活性化された受容体が共役するGタンパク質を、(1)サイレントなまたは活性化されたGタンパク質共役型受容体を選択する段階；(2)選択されたサイレントなまたは活性化されたGタンパク質共役型受容体をコードする発現ベクターを、Gαq、Gαs、またはGαiとの共役を検出可能にするレポーターアッセイパネル（上述したような）と組み合わせて使用する段階；ならびに(3)それぞれのアッセイ法でリガンド刺激に反応して生じたシグナルを比較する段階によって同定してもよく、1つのレポーターアッセイ法でレポーター活性が増加し、残りの二つは増加しないということは、レポーターアッセイ法に感受性のあるGタンパク質が共役していることを示す。ある特定の場合には、野生型よりも、受容体のシグナル伝達が異なる経路に切り替わることが可能なキメラGタンパク質（たとえば、キメラGタンパク質Gq5i(BroachおよびThoner、前記)）が有利または望ましい可能性がある。好ましくは、このシグナル伝達経路は、レポーターアッセイ法で負のシグナルと反対に、正のシグナルを産生する。
【００５９】
キット
本発明はさらに、増大された信号対雑音比を有する受容体を含む治療キットを提供する。1つの好ましい態様として、キットは、サイレント受容体または活性化された受容体（たとえばLys323Gluセロトニン2A受容体またはTyr235Glu CCR-3受容体）をコードする核酸を提供する。好ましくは、核酸分子は、サイレント受容体または活性化された受容体をコードする核酸と機能的に連結されたプロモーターを含むベクターである。もう1つの好ましい態様として、キットは、細胞、たとえば真核細胞、好ましくは細胞の表面でサイレント受容体または活性化された受容体が発現する哺乳類細胞を提供する。
【００６０】
本発明によって、キットは、受容体に対する新規のリガンドを同定するための大規模なスクリーニングアッセイ法に使用されうるサイレント受容体または活性化された受容体を提供する。1つの好ましい態様として、キットは、たとえば、適当な緩衝液中のベクターのような、サイレント受容体または活性化された受容体をコードする核酸を含む第1の容器手段を含む。もう一つの好ましい態様として、第1の容器手段は、消費者へこのキットを届けるのに必要な期間、細胞が生存可能な培養液中で、細胞の表面でサイレント受容体または活性化された受容体を発現する細胞を含む。本キットはまた、細胞が届き次第、第3、第4などの容器手段として、細胞が生育するのに必要な試薬および溶液を含んでもよい。特に好ましい態様として、サイレント受容体または活性化された受容体は、Lys323Gluセロトニン2A受容体またはTyr235Glu CCR-3受容体を含む。さらにもう一つの好ましい態様として、キットは、たとえば受容体に対するリガンドを同定するなどの研究目的でサイレント受容体または活性化された受容体を用いるために、細胞（たとえばコンピテントセルまたは非コンピテントセル）を含む第1の容器手段；細胞に形質移入させるためのサイレント受容体または活性化された受容体をコードする核酸を含む第2の容器手段；ならびに細胞の生育および／または細胞へのDNAの形質移入に必要な追加の試薬を含む第3、第4などの容器手段を提供する。
【００６１】
容器手段は、ガラス、プラスティック、または箔でつくられ、バイアル、瓶、ポーチ、管、袋などでありうる。キットはまた、受容体のリガンドを同定するためにベクターを用いる方法、または試薬の量（たとえば、核酸のモル数もしくは質量または細胞数）などの分析上の情報のような、書面にした指示書も含む。書面の情報は、第1、第2および／もしくは第3などの容器手段のいずれにつけてもよく、ならびに／または別シートとして第1、第2および／もしくは第3などの容器手段と共に第4の容器手段に含まれてもよい。第4の容器手段は、たとえば箱または袋であってもよく、第1、第2、および第3の容器手段を含んでもよい。このキットは上述されたまたは当技術分野において既知の使用のための、いかなる試薬も含むように改変できることが理解されると思われる。
【００６２】
全ての参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。
【００６３】
実施例
本発明は、以下の非制限的な実施例を考慮することにより、さらに理解することができる。
【００６４】
実施例1：セロトニン2A受容体
本実施例は、基礎活性の減少のため、信号対雑音比が増大したセロトニン2A受容体の同定を示す。
【００６５】
変異型セロトニン2A受容体の産生
多数のGタンパク質共役型受容体とセロトニン2A受容体の間で高度に保存されている残基を図1に示す。ヒトとラットのセロトニン2A受容体の間で保存されている配列番号:1の322位のCys残基の周囲の領域（「CWLP」モチーフ(-13)であるN末端13番目のアミノ酸）は特に興味深かった。たとえば、322位のCysからLysへの変異により、構成的に活性化している受容体が生じる。ヒト、ラットおよび他の構成的に活性化している受容体（たとえば、1Aアドレナリン受容体、α2Cアドレナリン受容体、β2アドレナリン受容体、コレシストキニン-B受容体、血小板活性化因子受容体、および甲状腺刺激ホルモン受容体）で-13位の周囲の領域が高度に保存されていること、ならびに構成的活性を誘導する多数の変異が領域内の特定の残基の電荷を変化させるという観察に基づいて、本発明者らは、-13位のアミノ酸の周囲のアミノ酸の電荷を変化させる点変異を有するヒトセロトニン2A受容体を作製することを選択した。これらの点変異の1つは、ヒトセロトニン2A受容体におけるLys323Glu変異であった。この変異を、標準的な分子生物学の技術を使用して導入し、発現ベクターpcDNA1にサブクローニングした（Sambroodら、前記）。
【００６６】
信号対雑音比の増大に関する変異型セロトニン受容体の解析
Lys323Gluヒトセロトニン2A受容体の活性のサイレンシングを、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて評価した（LucLite Luciferase Assay Kit, Packard）。ヒトセロトニン2A受容体は、Gαq共役型受容体である。これゆえ、本発明者らは、SREを有するレポーター構築物を使用することを選択した。HEK293細胞に、レポーター構築物SRE-Lucと、野生型またはLys323Glu変異型ヒトセロトニン2A受容体のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを形質移入した。変異型受容体の基礎およびリガンドの刺激によるルシフェラーゼの活性が測定された。このアッセイ法に用いられたリガンドはセロトニンであった。陰性対照として、HEK293細胞をpcDNA1（空のベクターDNA）とSRE-Lucで形質移入した。
【００６７】
形質移入された細胞は、以下のように刺激された。受容体に対するリガンド（セロトニンまたは非ペプチドのリガンドのいすれか）を、望ましい濃度に希釈し、形質移入された細胞に加え、その後、最適な刺激時間は用いられる特定の受容体に依存して様々であるが、望ましい時間（標準的には一晩）、37℃、5％のCO2でインキュベートした。最適なインキュベーション時間を、インキュベーション時間の範囲の検定、および最も高いレベルの刺激を生じさせるインキュベーション時間の測定によって系統的に決定することができる。二つのリガンドの付随する評価（たとえば、リガンドはフォルスコリンの刺激によるCRE活性の阻害を誘導する）のために、それぞれの刺激は、2度、望ましい最終濃度で調製され、細胞に加える前に等量で混合した。ルシフェラーゼ発現のためのアッセイ法は、製造者の説明書に従って行われた（Packard, Meridin, CT）。
【００６８】
結果：セロトニン受容体
以下に示すように、Lys323Gluヒトセロトニン2A受容体は、構成的に基礎シグナル伝達の減少を示した。従って、Lys323Gluヒトセロトニン2A受容体は、最適化された信号対雑音比を有する受容体として分類される。結果は次の通りである。
【００６９】
表1は、図3で示すように、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて受容体の刺激を測定した、野生型に関する15個の別々の実験、変異型に関する8個の別々の実験、および陰性対照に関する15個の別々の実験を総計した平均値を示している。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
表2は、イノシトールリン酸の生産による測定について、図4に示した野生型および変異型セロトニン受容体、ならびに陰性対照の7個の別々の実験の総計の平均値を示している。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
表3は、表2で示された値をパーセンテージで示したものである。
【００７４】
【表３】
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【００７５】
実施例2：CCR-3受容体
本実施例は、基礎活性の減少のために信号対雑音比が増大したCCR-3受容体の同定を示す。
【００７６】
変異型CCR-3受容体の産生
多数のGタンパク質共役型受容体とCCR-3受容体の間で高度に保存されている残基を図2に示す。セロトニン2A受容体と同様に、配列番号：2の235位のIle残基の周囲の領域（「CWLP」モチーフ(-13)であるN末端13番目のアミノ酸）が特に興味深い領域であった。これは、多数のGタンパク質共役型受容体の間で保存されている。
【００７７】
CCR-3受容体における13位の周囲の領域と、他の構成的に活性化しているGタンパク質共役型受容体との間で高度に保存していること、ならびに構成的活性を誘導する多数の変異が-13領域内の特定の残基の電荷を変化させるという観察に基づいて、本発明者らは、-13位の周囲のアミノ酸の電荷を変化させる点変異を有するCCR-3受容体を作製することを選択した。この点変異の1つは、CCR-3受容体におけるTyr235Glu変異であった。これらの変異を、標準的な分子生物学の技術を使用して導入し、発現ベクターpcDNA1へサブクローニングした(Sambrookら、前記)。
【００７８】
信号対雑音比の増大のための変異型CCR-3受容体の解析
Thy235Glu変異型CCR-3受容体の基礎活性を、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて評価した。CCR-3受容体はGαi共役型受容体である。これゆえ、本発明者らは、上述した（BroachおよびThorner、前記）SRE-Luc＋Gq5iレポーター系を使用することを選択した。これは、信頼性のある正の読みとりのために、シグナル伝達経路をGαiからGαqに切り替えるものである。ルシフェラーゼアッセイ法は、セロトニン2A受容体に関して上述したように行われた。
【００７９】
結果：CCR-3受容体
図5に示され、以下の表4に要約されるように、Tyr235Glu CCR-3受容体は、基礎活性においておよその減少がみられた。従って、Tyr235Glu CCR-3受容体は、最適化された信号対雑音比を有する受容体として分類される。表4は、野生型、変異体、および陰性対照のベクターについての5つの別々の実験の総計の平均値を示している。
【００８０】
【表４】
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【００８１】
他の態様
本明細書で言及された全ての刊行物および特許出願は、それぞれ独立した刊行物または特許出願が具体的且つ個々に示され、参照として組み入れられたのと同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８２】
本発明を特定の態様と関連して記載してきたが、さらなる改変が可能であることが理解され、本出願は、本発明のいかなる変形物、使用、または応用をも含むことが意図され、通常、本発明の原理、および本開示からの逸脱は、本発明が属し、上記の重要な特徴に適用されうる当技術分野の範囲内で既知または通常の実施内で行われ、従って添付の特許請求の範囲内であることが理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】
ラットとヒトセロトニン2A受容体の間で保存されている「DRY」モチーフと-13および-20位に「CWLP」モチーフに関係のある残基とを示す、ヒトのセロトニン2A受容体の模式図である。この図はまた、配列番号:1の323位にあるLys残基がGluになる特定の変異も示し、これによりセロトニン2A受容体の基礎シグナル伝達の減少が引き起こされる。
【図２】
「DRY」のモチーフ、ならびに-13位および-20位に「CWLP」モチーフに関係のある残基を示す、ヒトCCケモカイン3（CCR-3）受容体の模式図である。。さらに、この図は配列番号:2の235位にあるTyr残基がGluになる変異を示し、これによりCCR-3受容体の基礎シグナル伝達の減少が引き起こされる。
【図３】
ルシフェラーゼ活性をアッセイすることによってセロトニン受容体の刺激を測定した実験結果の表である。
【図４】
イノシトールリン酸生産をアッセイすることによってセロトニン受容体の刺激を測定した実験結果の表である。
【図５】
ルシフェラーゼ活性をアッセイすることによってCCR-3受容体の刺激を測定した実験結果の表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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