(57)【要約】本発明は新規なヒト網膜特異的タンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９、並びに、これらのタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。また、これらのヒトタンパク質を製造するための、ベクター、宿主細胞、抗体及び遺伝子組み換え方法が提供される。本発明は更に、網膜変性疾患、例えばＡＭＤの診断及び治療に有用な診断方法及び治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記分子：
（ａ）配列番号２４、２９、３１、３７または３８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号２〜２３、２６〜２８、３２〜３４、３５または３６に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）配列番号１、２５、３０または３９〜４５に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ）　その核酸配列が、遺伝コードの縮重のため（ａ）〜（ｄ）に記載した核酸配列から偏移した核酸分子；および、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載した核酸配列のフラグメント、誘導体または対立遺伝子変異体を示す核酸分子；
よりなる群から選択される網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４若しくはＦ３７９、又はＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４若しくはＦ３７９の生物学的特性を示すタンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含有する組み換えベクター。
【請求項３】
原核および／または真核の宿主細胞内において、翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を可能にするように、前記核酸分子が調節エレメントに作動的に連結された、請求項２記載の組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項５】
哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である請求項４記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分子によりコードされている、網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的特性を示す単離されたタンパク質。
【請求項７】
請求項６記載の単離されたタンパク質を発現する組み換え宿主細胞。
【請求項８】
網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的特性を示す単離されたタンパク質の調製方法であって、下記工程：
（ａ）前記タンパク質が発現される条件下で請求項６の組み換え宿主細胞を培養すること；および、
（ｂ）前記タンパク質を回収すること；
を含む上記方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法により作製されたタンパク質。
【請求項１０】
請求項１の核酸分子と、または、その相補鎖と特異的にハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子。
【請求項１１】
請求項１の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、該ｍＲＮＡまたはその一部と選択的に結合することができることを特徴とするアンチセンスＲＮＡであり、その配列は前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害することができる、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、該ｍＲＮＡまたはその一部と選択的に結合し、そしてこれを分解することができ、これにより前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害することを特徴とするリボザイムである、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項６のタンパク質の活性を抑制することができることを特徴とする阻害剤。
【請求項１４】
網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９、またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸を含有すると考えられる標的試料を、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９タンパク質、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸と反応する試薬と接触させること、および、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９タンパク質、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸を検出することを含む、黄斑変性または黄斑変性の素因を診断するための方法であって、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸内の突然変異、染色体転位、または、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９タンパク質、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードするｍＲＮＡの異常濃度の存在が黄斑変性または黄斑変性の素因を示す上記方法。
【請求項１５】
黄斑変性がＡＭＤである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬がＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９に特異的な核酸プローブである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬が抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４または抗Ｆ３７９抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が検出可能に標識されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
標識が放射性同位体、バイオルミネセンス化合物、ケモルミネセンス化合物、蛍光化合物、金属キレートまたは酵素よりなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の発現を低減、抑制または増大させる、或いは、生物学的に活性なＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の発現をもたらす試薬の治療有効量を哺乳類の治療対象に投与することを含む、黄斑変性または黄斑変性の素因を治療するための方法。
【請求項２１】
黄斑変性がＡＭＤである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記試薬が、請求項１記載の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、そして該ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合できることを特徴とするアンチセンスＲＮＡを含むヌクレオチド配列であり、該配列は前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害することができる、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
試薬が、請求項１記載の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、そして該ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合し、そしてこれを分解することができ、これにより前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害することを特徴とするリボザイムを含むヌクレオチド配列である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
試薬がＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の阻害剤である、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記阻害剤が抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４または抗Ｆ３７９抗体またはそれらのフラグメントである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記試薬が請求項２の組み換えベクターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬が請求項６の単離されたタンパク質である、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４若しくは抗Ｆ３７９抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４若しくはＦ３７９特異的核酸プローブを含有する、黄斑変性または黄斑変性の素因の検出のために有用な診断キット。
【請求項２９】
請求項１の核酸分子の少なくとも１つを含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３０】
Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９をコードする核酸分子の不活性型の少なくとも１つを含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３１】
マウスまたはラットである、請求項３０記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はヒト網膜組織における遺伝子発現、特に、加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性に関わる新しい網膜特異的タンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９、並びに、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
（背景技術）
１８５５年に最初に報告された加齢関連黄斑変性（ＡＭＤ）は現在では先進国における視覚障害の最も一般的な原因として認識されている。５２歳より高齢の人間におけるＡＭＤの罹患率は９％であることがわかっており、これは７５歳より高齢の人間では２５％を超えるまで増大する。予測される推定値によれば、２０２０年までに６５歳より高齢では７．５百万もの人がＡＭＤによる中枢性視覚消失に罹患すると考えられている。工業国における高齢者の人口増加に従い、それに伴う社会的および経済的なＡＭＤの影響は、予防または治療方法が考案されない限り、来世紀には増加する運命にある。
【０００３】
組織学的には、網膜色素上皮（ＲＰＥ）内の黄色リポフスチン様粒子の漸増蓄積が加齢と共に観察される。これは恐らくはＡＭＤの発症の早期の段階を示しており、その後、視力消失を伴う場合が多い二次的な合併症が起こる。しかしながら、リポフスチン様沈着物は未消化の貪食された光受容体の外側セグメントの膜の残存物を示しており、これは正常な生理学的過程においては基本的にはブルーフ膜を経由して脈絡毛細管板に排出される。経時的には、リポフスチン様粒子の不完全な消化および蓄積はブルーフ膜に影響し、膜の内側のコラーゲン層の異常な肥厚化として電子顕微鏡で観察されるとおり、その進行性の破壊をもたらす。ＲＰＥおよびブルーフ膜内の沈着は大部分は脂質よりなるが、その厳密な組成は個体間で異なり、一部の沈着物は更に極性の高いリン脂質であり、一部は非極性の中性脂質を含有することがわかっている。
【０００４】
このような結晶腔の組成の個体間の相違はＡＭＤにおける臨床上の異質性の根拠となると考えられる。一部の患者はブルーフ膜を通過する脈絡毛細管板からの血管の内生を伴って来院し、一部の患者はＲＰＥ下部の進出による色素上皮剥離を呈しており、更に別の患者集団ではＲＰＥおよび重層する感覚視神経網膜の萎縮性変化による視力消失の緩やかな減少を経験する。共通性はかなり低いが、ＡＭＤの滲出性／血管新生性の形態は視力≦２０／２００の視力消失症の８０％を超をしめる。
【０００５】
ＡＭＤは外因性および内因性の要因により誘発される複雑な疾患である。環境的要因に加えて、遠視、明色の皮膚と虹彩、高い血清中コレステロール濃度、高血圧または喫煙のような数種類の個人的な危険要因が示唆されている。ＡＭＤの遺伝的要素は数グループにより明らかにされており、遺伝的素因のある者では疾患は環境／個人的因子によりトリガーされるという仮説が唱えられている。突然変異した場合にＡＭＤへの易罹患性をもたらす可能性のある遺伝子の数は現時点では知られていない。光受容体特異的ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣＲ）遺伝子がＡＭＤの素因となる遺伝子の最初の例であると考えられるが、試験の設計における方法論的な問題点やデータの解釈により疑問が持たれている。
【０００６】
現在広範な研究が進行中であり、その目的はＡＭＤへの易罹患性をもたらす遺伝子の同定にある。しかしながら、７０歳代における一般的に遅い発症および臨床上そして恐らくは遺伝的な異質性により、ＡＭＤの素因となる遺伝子を同定するために従来の研究方法を適用することが困難となっている。
【０００７】
ＡＭＤのような黄斑変性の素因となる網膜特異的遺伝子、例えば黄斑変性の発症と相関する遺伝子の変異体や黄斑変性の発症と相関する異常発現を示す遺伝子を得るための従来技術の上記した制約や失敗により、この疾患の過程の全体に渡り、診断上、予後上および治療上で用いることができる遺伝子（マーカー）の必要性が生まれた。このような必要性は、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９、並びにＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９をコードする遺伝子を提供することで、本発明により満足される。Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９をコードする遺伝子は網膜組織中で発現されるが、試験した他の組織中では発現されない。該遺伝子の同定は、ヒト網膜に限定的または優先的に発現される遺伝子のゲノムワイドの同定を目的とし、公的に入手可能なＵｎｉＧｅｎｅのデータセットの発現配列タグ（ＥＳＴ）クラスター内に総括されたインシリコの発現情報を用いた新しいコンピューター支援方法を用いることにより達成された（Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（１９９７），６９４−６９８）。網膜において特別にまたは優勢に活性となる遺伝子はこの高度に分化した組織において重要な機能的役割を演じているはずであり、従って、ＡＭＤおよび他の網膜変性疾患の病因に関与しているであろう。
【０００８】
（発明の開示）
本発明はＡＭＤおよび他の網膜変性疾患の病因に関与していると考えられる遺伝子、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９の単離に基づいている。Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９のクローニングおよび配列決定は、網膜疾患における、考えられるその役割の分析、および、黄斑変性、例えばＡＭＤの診断および予防／治療のための方法の開発を促進するはずである。
【０００９】
即ち本発明はＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９タンパク質、並びに、該タンパク質をコードする各核酸、更に、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の発現または活性を阻害することができるアンチセンスＲＮＡ、リボザイムおよび阻害剤を提供する。
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は黄斑変性または該疾患の素因を検出するための診断方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は黄斑変性の（予防的）治療方法を提供する。
【００１２】
最後に、本発明は、プロモーターと作動的に連結されたＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９をコードするヌクレオチド配列または上記したアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを含む発現ベクターを治療対象の細胞に導入することを含む遺伝子治療の方法を提供する。
【００１３】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は下記分子：
（ａ）配列番号２４、２９、３１、３７または３８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
（ｂ）配列番号１、２５、３０、３５または３６に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｃ）配列番号２〜２３、２６〜２８、３２〜３４または３９〜４５に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に記載した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ）その核酸配列が、遺伝コードの縮重のため（ａ）〜（ｄ）に記載した核酸配列から偏移した核酸分子；および、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載した核酸配列のフラグメント、誘導体または対立遺伝子変異体を示す核酸分子；
よりなる群から選択される網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９もしくはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的特性を示すタンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。
【００１４】
本明細書においては、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的特性を示すタンパク質とは、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質とする。
【００１５】
本明細書においては、「単離された核酸分子」という用語は、それが本来結合している他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含有しない核酸分子を包含する。例えば、単離された核酸分子はベクターまたは物質の組成物の部分であり得、或いは、細胞内に含有されるものであってもよく、そして更に、ベクター、組成物または特定の細胞が核酸分子の本来の環境ではないために「単離されている」ことができる。
【００１６】
第１の実施態様において、本発明は配列番号３、６、８、１１ａまたは１１ｂに示すアミノ酸配列を含む網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、配列番号１、２５、３０、３５または３６（ｃＤＮＡ）または配列番号２〜２３、２６〜２８、３２〜３４または３９〜４５（ゲノムＤＮＡ）に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００１７】
本発明の核酸分子はＤＮＡおよびＲＮＡ分子のいずれであってもよい。適当なＤＮＡ分子は例えばゲノムまたはｃＤＮＡ分子である。Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の全体または一部をコードする全ての核酸分子もまた、それらが生物学的に活性であるタンパク質をコードする限りにおいて、包含するものとする。本発明の核酸分子は天然物から単離することができ、または、既知の方法に従って合成することができる。
【００１８】
本発明はまた上記した核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を提供する。本明細書において「ハイブリダイズする」という用語は、慣習的なハイブリダイゼーション条件下、好ましくは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されているストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。更にまたより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件においてＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も包含される。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変更は、主に、ホルムアミドの濃度（より低比率のホルムアミドがより低いストリンジェンシーをもたらす）、塩条件または温度の操作を介して達成される。例えば、より低いストリンジェンシーの条件では、一夜のインキュベートを３７℃において６Ｘ　ＳＳＰＥ（２０Ｘ　ＳＳＰＥ＝３Ｍ　ＮａＣｌ；０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含有する溶液中で行ない、次いで、５０℃の１Ｘ　ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。更により低いストリンジェンシーを達成するためには、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に行なう洗浄をより高い塩濃度（例えば５Ｘ　ＳＳＣ）において行なうことができる。上記した条件の変更は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑制するために用いる交互ブロッキング試薬の投入および／または代替を介して行なってよい。特定のブロッキング試薬の投入は適合性の問題から上記したハイブリダイゼーション条件の変更を要する場合がある。
【００１９】
本発明の分子とハイブリダイズする核酸分子は例えばヒトの細胞系または組織から作製されたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから単離することができる。このような核酸分子を同定及び単離するためには、本発明の分子またはこのような分子の部分、または、これらの分子の逆相補体を、例えば、常法に従ったハイブリダイゼーションにより使用することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、配列番号１、２〜２３、２５、２６〜２８、３０および３２〜３４にそれぞれ示すヌクレオチド配列またはそれらの配列の部分を厳密に、または、基本的に有する核酸分子を使用できる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用するフラグメントは常套的合成方法により作製できる合成フラグメントであり得、そしてその配列が基本的に本発明の核酸分子の配列に相当する。
【００２０】
本発明の核酸分子はまた遺伝コードの結果として縮重している配列を有する分子を包含する。
【００２１】
別の実施態様において本発明は、本発明のタンパク質をコードする上記した核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子変異体を含む核酸分子を提供する。「フラグメント」とは、前記タンパク質の１つをコードするのに十分長い核酸分子の部分を指すものとする。これらのフラグメントは本発明の核酸分子の転写物に特異的にハイブリダイズする核酸分子を含む。このような核酸分子は例えば診断アッセイおよび／または診断キット中のプローブまたはプライマーとして使用することができ、そして、好ましくは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の核酸分子およびオリゴヌクレオチドはまた例えばＰＣＲ反応のプライマーとして使用することができる。
【００２３】
ここで「誘導体」という用語は、これらの分子の配列が、１個所または数カ所において上記した核酸分子の配列とは異なるが、これらの配列と高い水準の相同性を有することを意味する。本明細書においては相同性とは、少なくとも４０％の配列同一性、特に少なくとも６０％、好ましくは８０％を超える、とりわけ好ましくは９０％を超える同一性を意味する。核酸分子によりコードされるこれらのタンパク質は配列２４、２９および３１にそれぞれ示したアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、特に好ましくは９０％、９５％、９７％および９９％を超える配列同一性を有する。上記した核酸分子の偏移は、欠失、置換、挿入または組み換えによりもたらされたものであってよい。
【００２４】
上記した分子と相同であり、これらの分子の誘導体となる核酸分子は、通常は同じ生物学的機能を有する修飾を呈するこれらの分子の変異型である。それらは天然の変異型、例えば他の生物由来の配列、天然に存在するか特定の突然変異誘発により導入された突然変異型であることができる。更にまた変異型は合成により作製された配列であることができる。対立遺伝子変異体は天然に存在する変異体であるか。合成により作製された変異体であるか、組み換えＤＮＡ法により作製された変異体であることができる。
【００２５】
一般的に常套的分子生物学的方法を用いることにより、本発明の核酸分子に種々の突然変異を導入することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。その結果、修飾された可能性のある生物学的特性を有するＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９関連タンパク質が合成される。１つの可能性は、コードＤＮＡ配列の５’または３’末端からの連続欠失により核酸分子が生成され、それに応じて短くなったタンパク質が合成されることになるような、欠失突然変異体の生成である。別の可能性は、アミノ酸配列の修飾が例えば酵素活性または酵素の調節に影響するような位置における点突然変異の導入である。この方法により、例えば変更されたＫｍ値を有する、または、例えばアロステリック調節または共有結合修飾に関する細胞に通常存在する調節機序の対象とはもはやならないような突然変異タンパク質が生成される場合がある。このような突然変異タンパク質もまた治療上有用なＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９の各々の阻害剤（拮抗剤）として価値あるものである。
【００２６】
遺伝子工学を用いた原核細胞における操作のためには、本発明の核酸分子またはその分子の部分をプラスミドに導入してＤＮＡ配列の組み換えにより突然変異誘発を行なうか配列の修飾を行なうことができる。常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、ＵＳＡを参照）により、塩基を交換し、天然または合成の配列を付加することができる。ＤＮＡフラグメントを相互に連結するためには、アダプターまたはリンカーをフラグメントに付加することができる。更にまた、適当な切断部位を与える、または、余分なＤＮＡまたは切断部位を除去するような操作を行なうこともできる。挿入、欠失または置換が可能である場合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発、プライマー修復、制限酵素処理またはライゲーションを行なうことができる。分析方法としては、通常は配列分析、制限酵素分析および他の生化学的または分子生物学的な方法が用いられる。
【００２７】
本発明の核酸分子の種々の変異体によりコードされるタンパク質は、酵素活性、分子量、免疫学的反応性またはコンホメーションまたは物理学的特性（例えば電気泳動における移動度、クロマトグラフィー挙動、沈降係数、溶解度、分光分析特性、安定性、最適ｐＨ、最適温度）のような、特定の共通の特性を示す。
【００２８】
本発明は更に、本発明の核酸分子を含有するベクターに関する。好ましくは、それらはプラスミド、コスミド、ウィルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学分野で通常使用されている他のベクターである。本発明において使用するのに適するベクターとしては、限定するものではないが、例えば細菌における発現のためのＴ７−系発現ベクター、哺乳類細胞における発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクターおよび昆虫細胞における発現のためのバキュロウィルス由来ベクターが挙げられる。好ましくは、本発明の核酸分子が本発明の組み替えベクターの調節エレメントと作動的に連結し、原核細胞または真核細胞内において転写されるＲＮＡの転写または合成を保証する。転写されるべきヌクレオチド配列はＴ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターに作動的に連結させることができる。
【００２９】
更に別の実施態様において、本発明は本発明の核酸分子またはベクターを一過性にまたは安定して含有する組み換え宿主細胞に関する。宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換えＤＮＡを取り込むことができ、そして適宜、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質を合成することができる生物である。好ましくは、これらの細胞は原核細胞または真核細胞、例えば哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である。本発明の宿主細胞は好ましくは、導入された本発明の核酸分子が形質転換された細胞に対して異種である、即ち、これらの細胞中には天然には存在しないか、または、相当する天然の配列の場合とは異なるゲノム中の場所に局在する、という事実を特徴とする。
【００３０】
本発明の更に別の実施態様はヒト網膜特異的タンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の生物学的特性を示し、そして本発明の核酸分子によりコードされている単離されたタンパク質、並びに、例えば本発明の宿主細胞をタンパク質合成可能な条件下に培養し、その後タンパク質を培養された細胞および／または培地から単離することができる、前記タンパク質の作製方法に関する。組み換えにより作製されたタンパク質の単離および精製はプリペラティブクロマトグラフィーおよび例えば抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗ＭＰＰ４、抗Ｃ１２ｏｒｆ７および抗Ｆ３７９抗体をそれぞれ用いるようなモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む親和性および免疫学的な分離方法を含む、常法により行なってよい。
【００３１】
本明細書において、「単離されたタンパク質」という用語は、それが本来結合している他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含有しないタンパク質を包含する。しかしながらこのようなタンパク質は組み換えにより作製されたタンパク質を含むのみならず、天然のタンパク質、合成により製造されたタンパク質、または、これらの方法の組み合わせにより製造されたタンパク質も包含する。このようなタンパク質を調製するための方法は当該分野でよく知られている。本発明のタンパク質は好ましくは実質的に精製された形態である。分泌タンパク質を包含するＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の組み換えにより作製された型はＳｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０（１９８８）に記載される１工程方法により実質的に精製することができる。
【００３２】
更に別の好ましい実施態様において、本発明は上記した核酸分子またはその相補鎖と特異的にハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸分子に関する。特異的ハイブリダイゼーションは、好ましくはストリンジェントな条件下に行ない、そしてタンパク質をコードしない、または、実質的に異なるタンパク質をコードしているヌクレオチド配列との交差ハイブリダイゼーションは全く無いか極めて少ない。このような核酸分子はプローブとして、そして／または遺伝子発現の制御のために使用してよい。核酸プローブ法は当業者のよく知るものであり、このようなプローブの長さが多様であることは周知のとおりである。好ましいものは１７〜３５ヌクレオチド長の核酸プローブである。当然ながら、１００まで、またはこれより多いヌクレオチド長の核酸を用いてもよい。本発明の核酸プローブは種々の用途のために有用である。他方これらは本発明の核酸分子の増幅のため、または、該核酸分子内の突然変異の検出のためのＰＣＲプライマーとして使用してよい。或いは、ゲノムＤＮＡライブラリの相同性検索により本発明の核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。上記した核酸分子に相補的な本発明のこの好ましい実施態様の核酸分子はまた、例えばアンチセンスまたは三重螺旋作用によるこのような核酸分子を含む遺伝子の発現の抑制のため、または、本発明の核酸分子を含む遺伝子のｍＲＮＡ前駆体を特異的に切断する適切なリボザイムの構築のため（例えばＥＰ−Ｂ１０２９１５３３、ＥＰ−Ａ１０３２１２０１、ＥＰ−Ａ２０３６０２５７参照）にも使用してよい。適切な標的部位および相当するリボザイムの選択は、例えばＳｔｅｉｎｅｃｋｅ，Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５０，Ｇａｌｂｒａｉｔｈ等編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），４４９−４６０に記載のとおり行なうことができる。アンチセンス法に関する標準的な方法も報告されている（Ｍｅｌａｎｉ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５１（１９９１），２８９７−１９０１）。前記核酸分子は化学的に合成し、細胞内の該核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切なベクターにより形質導入してよい。このような核酸分子はまた上記したリボザイム配列を含んでいてもよい。
【００３３】
即ち、本発明はまた、（ｉ）本発明の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその部分に相補的であり、そして該ｍＲＮＡに選択的に結合することができることを特徴とするアンチセンスＲＮＡ配列であって、前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ配列、および（ｉｉ）本発明の核酸分子から転写されたｍＲＮＡまたはその一部に相補的であり、そして該ｍＲＮＡと選択的に結合し、そしてこれを切断することができ、これにより前記核酸分子によりコードされるタンパク質の合成を阻害することを特徴とするリボザイムに関する。好ましくは、本発明のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムは前記ｍＲＮＡのコード領域、例えばコード領域の５’部分に相補的である。本発明の核酸分子の配列を提供された当業者であれば、上記したアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを製造し、利用することができる。
【００３４】
本発明の核酸分子は「遺伝子ターゲティング」および／または「遺伝子置換」のため、突然変異遺伝子の修復のため、または、相同組み換えにより突然変異遺伝子を作り出すために使用でき、例えばＭｏｕｅｌｌｉｃ，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７（１９９０），４７１２−４７１６；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓを参照して行なうことができる。
【００３５】
更にまた、当業者の知るとおり、生物、特に哺乳類、好ましくはヒトに由来する試料中の本発明の核酸分子の存在を検出するため等の特定の用途のために、適切なマーカーを用いてこのような核酸プローブを標識することも可能である。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）およびＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　ＯＨ）のような多くの会社がこのような操作のための市販キットおよびプロトコールを供給している。適当なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学ルミネセンスまたは発色性の試薬、並びに基質、コファクター、阻害剤、磁性粒子等が包含される。このような標識を使用することを記載している特許には米国特許ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７；ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２，ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０；ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５；ＵＳ−Ａ−４，２２７，４３７；ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９およびＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が包含される。更にまた、組み換え免疫グロブリンも、引用によって本明細書に援用されるＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に記載のとおり製造してよい。
【００３６】
更にまた、いわゆる「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）法を用いて本発明の核酸分子の発現を検出または抑制することができる。例えば、相補的な、並びに種々の１重鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ核酸分子へのＰＮＡの結合は熱変性およびＢＩＡｃｏｒｅ表面相互作用法（Ｊｅｎｚｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６（１９９７），５０７２−５０７７）を用いて系統的に調べることができる。更にまた、上記した核酸分子並びにそれより誘導されるＰＮＡは、Ｇｏｔｏｈ，Ｒｉｎｓｈｏ　Ｂｙｏｒｉ　４５（１９９７），２２４−２２８を参照しながら、ＢＩＡｃｏｒｅのような親和性センサーを用いて、試料由来の核酸とのハイブリダイゼーションにより点突然変異を検出するために用いることができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーアレイ上でのハイブリダイゼーションにを使用したＤＮＡのスクリーニングは従来技術、例えばＷｅｉｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５（１９９７），２７９２−２７９９に記載されている。ＰＮＡの合成は当該分野で知られた方法、例えば、Ｋｏｃｈ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．４９（１９９７），８０−８８；Ｆｉｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２４（１９９６），３３５７−３３６３に記載のとおり行なうことができる。例えば制限酵素または核酸オリゴヌクレオチド合成用の鋳型として等のＰＮＡの別の考えられる用途は当業者の知るとおりであり、例えばＶｅｓｅｌｋｏｖ，Ｎａｔｕｒｅ　３７９（１９９６），２１４およびＢｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ　３７６　（１９９５），５７８−５８１に記載されている。
【００３７】
更に別の実施態様において、本発明は、上記したアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムと同様の目的、即ち、生物学的に活性なＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９分子の低減または排除を達成する、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の阻害剤に関する。このような阻害剤は例えばアンタゴニストとして作用する相当するタンパク質または突然変異タンパク質の構造的類縁体であることができる。更にまた、このような阻害剤は、組み換えにより作製されたタンパク質を使用することにより同定される分子を含み、例えば、組み換えにより作製されたタンパク質を用いて、例えば、適切な条件下にタンパク質に結合する潜在的阻害剤の能力を調べることにより、阻害剤を選別および同定することができる。阻害剤は例えば、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９がネイティブな立体配座となることができる適切な条件下で阻害剤候補をタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９とともにインキュベートする被験混合物を調製することにより同定することができる。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系は当該分野でよく知られた方法に従って確立することができる。阻害剤は例えば、まず組み換えにより作製されたＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質に結合する合成または天然の何れかの分子を選別することにより、そして次に第２段階において、生物学的活性の少なくとも１つの抑制により反映されるＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の抑制を調べる試験において上記選択された分子を試験することにより同定することができる。このようなＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質に結合する分子の選別は、例えば、合成および／または天然の分子のライブラリから候補分子を選別する事により容易に大スケールで行なうことができる。このような阻害剤は例えば合成有機化合物、天然の醗酵生成物、微生物、植物または動物から抽出された物質、またはペプチドである。阻害剤の別の例は特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。更にまた、本発明の核酸配列およびコードされるタンパク質は黄斑変性の発症および進行に関与する他の因子を発見するために用いることもできる。本発明のタンパク質は、例えば、タンパク質／タンパク質相互作用に基づくスクリーニング方法、例えば２ハイブリッド系を用いて、黄斑変性に伴う他の（未関連の）タンパク質を発見するために用いることができる。
【００３８】
黄斑変性、例えばＡＭＤは、（ｉ）Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする遺伝子の異常発現、（ｉｉ）低減されたまたは消失した生物学的活性を示すタンパク質の生成をもたらすＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする遺伝子内の突然変異、または、（ｉｉｉ）転座、逆位等による染色体位置の相違によるものと推定される。即ち、本発明の核酸分子はまた、例えば正常個体で得られた結果と罹患個体（または疾患のキャリア）で得られた結果とを比較することにより上記相違を検出するための試薬として多くの方法で用いられる。
【００３９】
即ち、本発明はまた、網膜特異的ヒトタンパク質Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９、またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸を含有すると考えられる標的試料を、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸と反応する試薬と接触させること、および、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９タンパク質、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードする核酸を検出することを含む、黄斑変性または黄斑変性の素因、好ましくはＡＭＤ、を診断するための方法であって、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする核酸内の突然変異、染色体転位、または、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９タンパク質、並びに／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／若しくはＦ３７９をコードするｍＲＮＡの異常濃度の存在が黄斑変性または黄斑変性の素因を示す上記方法を提供する。
【００４０】
標的細胞成分、例えば生物学的液体または組織中の、例えばＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする核酸は、ｉｎ ｓｉｔｕで直接、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出することができ、或いは、当業者の知る一般的な方法により他の細胞成分から単離した後にプローブに接触させてもよい。検出方法としては、ノーザンブロット分析、ＲＮａｓｅ保護、ｉｎ ｓｉｔｕ法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＱＲＮＡレプリカーゼまたはＲＮＡ−転写／増幅（ＴＡＳ，３ＳＲ）、ＥＰ−Ｂ１０２３７３６２に開示されているリバースドットブロット））、イムノアッセイ、ウエスタンブロットまたは当業者の知る他の検出方法があげられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法により得られる産物は、例えば産物をアガロースゲル上で分離することにより、そして、その後臭化エチジウムで染色することにより、確立された方法に従って検出することができる。或いは、増幅産物は増幅のための標識プライマーまたは標識ｄＮＴＰを用いて検出することができる。
【００４１】
配列番号１、２〜２３、２５、２６〜２８、３０、３２〜３４、３５、３６または３９〜４５に示す配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することにより配列を染色体にマッピングすることができる。プライマーがゲノムＤＮＡの１つの予測されたエクソンを超えて広がらないようにコンピューター分析を用いてプライマーを選択することができる。次にこれらのプライマーを個体別ヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに供する。ヒトＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９核酸分子を含有するハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。同様に、体細胞ハイブリッドは特定の染色体にポリヌクレオチドをマッピングする迅速なＰＣＲ法を提供する。一のサーマルサイクラーを用いて一日当たり３個以上のクローンを割りつけることができる。更にまた、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９遺伝子のサブローカリゼーションを特異的染色体フラグメントのパネルを用いて行なうことができる。使用することができるその他の遺伝子マッピング方法としては、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、標識されたフロー分類された染色体の予備スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択が挙げられる。Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９遺伝子の厳密な染色体位置はまた分裂中期の染色体スプレッドの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて行なうこともできる。この方法は５００または６００塩基もの短いポリヌクレオチドを使用するが、１０００〜４０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。この方法については、Ｖｅｒｍａ等のＨｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）を参考にすることができる。染色体マッピングのためには、本発明の核酸分子は、（その単一の染色体または染色体上の単一の部位をマークするために）個別に、または、（複数の部位および／または複数の染色体をマークするために）パネルとして、使用することができる。好ましい核酸分子はｃＤＮＡの非コード領域に相当するが、その理由はコード配列は遺伝子ファミリー内部で保存されている可能性がより高く、染色体マッピングの間の交差ハイブリダイゼーションの可能性がより高くなるためである。遺伝子が厳密な染色体位置にマッピングされた後は、遺伝子の物理的位置は連鎖分析に用いることができる。連鎖分析により染色体の位置と疾患の発生との間の同時遺伝性を明らかにできる。即ち、同時遺伝性が明らかになった後、罹患個体と未罹患個体との間でＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９遺伝子および相当する遺伝子に相違を調べることができる。第１に、欠失や転座のような染色体の目視可能な構造的変化を染色体スプレッドにおいて、または、ＰＣＲにより調べる。構造的変化が存在しない場合は、点突然変異の存在が確認される。一部または全ての罹患個体において突然変異が観察されるが、正常個体では観察されない場合は、突然変異が疾患を誘���することを示している。しかしながら、突然変異と多型を区別するためには、数人の正常個体に由来するＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９ポリペプチドおよび相当する遺伝子の完全な配列決定が必要であると考えられる。新しい多型が同定されれば、この多型ポリペプチドを用いて更に連鎖分析を行なうことができる。
【００４２】
更にまた、未罹患個体と比較した場合の罹患個体における遺伝子の発現の増大または低減を、本発明の核酸分子を用いて調べることができる。網膜組織におけるＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９それぞれの発現は、伝統的な免疫組織学的方法で調べることができる（Ｊａｌｋａｎｅｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１（１９８５），９７６−９８５；　Ｊａｌｋａｎｅｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５（１９８７），３０８７−３０９６；Ｓｏｂｏｌ等、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２４（１９８２），１３９−１４４；Ｓｏｂｏｌ等、Ｃａｎｃｅｒ　６５（１９８５），２００５−２０１０）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体を用いた方法としては、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。適当な抗体試験の標識は当該分野で知られており、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼ、および放射性同位体、例えばヨウ素（１２５Ｉ，１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、重水素（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、および蛍光標識、例えばフルオレセインまたはローダミン、および、ビオチンを挙げることができる。生物学的試料中のＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９を試験するほかに、タンパク質はまた画像化によりｉｎ　ｖｉｖｏで検出することもできる。タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ画像化のための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線写真、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが含まれる。Ｘ線写真の場合は、適当な標識としては、検出可能な放射線を発生するが検査対象に対して有害とならない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲに適するマーカーとしては、該当するハイブリドーマに対する栄養の標識により抗体内にとり込まれる重水素のような検出可能な特徴的スピンを有するものが包含される。放射性同位体（例えば１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線非透過性物質、または、核磁気共鳴により検出可能な物質のような適切な検出可能な画像化物質で標識されたタンパク質特異的抗体または抗体フラグメントを、哺乳類に（例えば非経腸、皮下または腹腔内に）導入する。当業者の知るとおり、治療対象の体格および使用する画像化システムにより診断用画像を得るために必要な画像化部分の量が決定される。ヒト対象の場合の放射性同位体物質の場合は、注射すべき放射能の量は通常は９９ｍＴｃ約５〜２０マイクロキュリーの範囲である。標識された抗体または抗体フラグメントはその後、特異的タンパク質を含有する細胞の位置に優先的に蓄積する。
【００４３】
Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の濃度もまた診断と関連する。標的がタンパク質である場合は、試薬は典型的には、抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４または抗Ｆ３７９抗体プローブである。「抗体」という用語は好ましくは、異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、並びに、個別のモノクローナル抗体調製物より本質的には構成される抗体に関する。モノクローナル抗体は当業者のよく知る方法により本発明のタンパク質のフラグメントを含有する抗原から調製する（例えばＫｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ　２５６（１９７５），４９５参照）。本明細書において、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、タンパク質に特異的に結合することができるインタクトの分子並びに抗体フラグメント（例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を包含するものとする。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントはインタクトの抗体のＦｃフラグメントを欠いており、循環系からより迅速に排出され、そして、インタクトの抗体よりも非特異的な組織結合が少ない。（Ｗａｈｌ等、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）。）即ち、これらのフラグメント並びにＦＡＢまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリの産物が好ましい。更にまた、本発明の抗体には、キメラ、一重鎖またはヒト化された抗体が包含される。
【００４４】
プローブは例えば放射性同位体、バイオルミネセンス化合物、ケモルミネセンス化合物、蛍光化合物、金属キレートまたは酵素で検出可能に標識することができる。生物分子を標識するために種々の方法が利用でき、これらは当業者が知るものであり、本発明の範囲内に包含される。このような方法は例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，”Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙｓ”，Ｂｕｒｄｅｎ，ＲＨ　ａｎｄ　ｖｏｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ（Ｅｄｓ），Ｖｏｌｕｍｅ　１５（１９８５），”Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ”；Ｄａｖｉｓ　ＬＧ，Ｄｉｂｍｅｒ　ＭＤ；Ｂａｔｔｅｙ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０），Ｍａｙｅｒ等，（Ｅｄｓ）”Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）または”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。当業者の知るとおり種々多様な標識および標識方法が存在する。一般的に使用されている標識は、特に、蛍光色素（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等）、酵素類（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、放射性同位体（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド状金属、ケモ−またはバイオルミネセンス化合物（例えばジオキセタン、ルミノールまたはアクリジニウム）である。標識方法、例えば酵素またはビオチニル基の共有結合、ヨウ素化、リン酸化、ビオチニル化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（末端トランスフェラーゼの使用）は当該分野でよく知られている。検出方法としては、例えばオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡観察、直接または間接の酵素反応等が挙げられるが、これに限らない。
【００４５】
上記した変化（変化した発現、染色体転位、または、突然変異）の何れも診断または予後のマーカーとして使用することができる。
【００４６】
本発明はまた、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の発現を低減、抑制または増大させる、または、生物学的活性のあるＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の発現をもたらす試薬の治療有効量を哺乳類の治療対象に投与することを含む黄斑変性または黄斑変性の素因、好ましくはＡＭＤを治療するための方法に関する。本方法はまた出生前診断も含む。
【００４７】
このような試薬の例は本発明の核酸分子、上記したアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは阻害剤、例えば特異的抗体である。例えば、タンパク質に対する抗体の投与により当該タンパク質に結合してその過剰生産を低減することができる。
【００４８】
即ち、核酸分子を用いることにより、三重螺旋の形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介した遺伝子発現の制御が可能になる。これらの方法は共にＤＮＡまたはＲＮＡへの核酸分子の結合に依存している。このような方法のためには、好ましいポリヌクレオチドは通常は２０〜４０塩基長であり、転写に関与する遺伝子の領域　（三重らせん−Ｌｅｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６（１９７９），３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１（１９８８），４５６；およびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１（１９９１），１３６０）またはｍＲＮＡそのもの（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６（１９９１），５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））の何れかと相補的である。三重らせんの形成は最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写のシャットオフをもたらすが、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子からポリペプチドへの翻訳をブロックする。これらの方法は共にモデル系では有効であり、本明細書に記載した情報を用いて疾患治療を意図したアンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオチドを設計することができる。更にまた、遺伝子発現の低減または抑制は上記したリボザイムを用いることにより、または、疾患におけるＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９機能を抑制する遺伝子治療によりＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の優性陰性突然変異株を作製することにより、達成することができる。最後に、黄斑変性がＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の過剰発現によるものである場合、上記したＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の阻害剤、例えば抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４または抗Ｆ３７９抗体を投与することができる。このような抗体はタンパク質と結合し、その過剰発現を低減することができる。
【００４９】
疾患がＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の低下した発現によるものである場合、治療効果はＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする核酸分子またはタンパク質そのものを投与することにより得ることができる。
【００５０】
本発明の核酸分子はまた遺伝子治療において有用である。遺伝子治療の１つの目的は遺伝子的欠損を是正することを意図して欠損遺伝子を有する生物に正常な遺伝子を挿入することである。本発明の核酸分子は高精度な方法でこのような遺伝子欠損をターゲティングする手段を提供する。もう１つの目的は宿主ゲノム内に存在していなかった新しい遺伝子を挿入することにより宿主細胞において新しい特性を生成することである。
【００５１】
投与に際しては、上記した試薬を好ましくは安定な製薬用の担体と組み合わせる。適当な製薬用担体の例は当該分野でよく知られており、リン酸塩緩衝食塩水、水、乳液、例えば水中油型エマルジョン、種々の湿潤剤、滅菌溶液等が包含される。このような担体は、常法で調合することができ、そして適当な用量で治療対象に投与することができる。適当な組成物の投与は例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与のような種々の方法により行なってよい。投与経路は当然ながら、例えば医薬組成物中に含有される化合物の種類により変化する。用法は担当医師および他の臨床要因に応じて決定する。医療分野で周知のとおり、各患者に対する用量は多くの要因、例えば患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する特定の化合物、投与の時間および経路、疾患の種類および段階、全身状態および併用薬等により変動する。
【００５２】
本発明の核酸分子、本発明のアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの送達は直接投与によるか、または、好ましくはこれらの化合物を含有するキメラウィルスのような組み換え発現ベクターまたはコロイド状分散系を用いることにより行なうことができる。これらの核酸を所望の標的に送達することにより、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の細胞内発現、ひいては、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の濃度を増大または減少させることができる。
【００５３】
標的部位への直接の適用は、例えば弾丸送達により、コロイド状分散系として、または、動脈内の部位に対してカテーテルにより行なうことができる。上記した核酸の送達のために使用することができるコロイド状分散系としては、大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質系システム、例えば水中油型エマルジョン、（混合）ミセル、リポソームおよびリポプレックスが挙げられる。好ましいコロイド状システムはリポソームである。リポソームの組成は通常はリン脂質およびステロイド、特にコレステロールの組み合わせである。当業者は所望の核酸分子の送達のために適するリポソームを選択できる。網膜組織のみに送達するために、臓器特異的または細胞特異的なリポソームを用いることができる。リポソームのターゲティングは一般的に知られた方法を適用することにより当業者が実施することができる。このターゲティングには、受動的ターゲティング（洞様毛細血管を含む臓器におけるＲＥＳの細胞に分布しようとするリポソームの本来の傾向を利用）または能動的ターゲティング（例えばリポソームをよく知られた方法で、特異的リガンド、例えば抗体、受容体、糖、糖脂質、タンパク質等とカップリングさせることによる）が含まれる。本発明においては、特異的細胞−表面リガンドを介して特異的腫瘍にリポソームをターゲティングするためにはモノクローナル抗体が好ましく用いられる。
【００５４】
遺伝子治療に有用な好ましい組み換えベクターはウィルスベクター、例えばアデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアまたはより好ましくはレトロウィルスのようなＲＮＡウィルスである。更に好ましくは、レトロウィルスはマウスまたはトリのレトロウィルスの誘導体である。本発明において使用できるこのようなレトロウィルスベクタの例は、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウィルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）である。最も好ましくは、マウスベクターと比較してより広い宿主範囲を与えるテナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）のような非ヒト霊長類レトロウィルスベクタ−を用いる。組み換えレトロウィルスは欠損があるため、感染性粒子を作製するためには補助が必要である。このような補助は例えばＬＴＲ内部で調節配列の制御下、レトロウィルスの構造遺伝子全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系統を用いることにより得ることができる。適当なヘルパー細胞系統は当該分野でよく知られている。このようなベクターは更に形質導入された細胞を同定できるような選択性マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。更にまた、レトロウィルスベクタはそれらが標的特異的となるように修飾されることができる。このことは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより達成することができる。標的特異的ベクターを作製するための別の方法は当業者の知るとおりである。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための別の適当なベクターおよび方法は文献に記載されており、当業者の知るものであり、例えばＷＯ９４／２９４６９またはＷＯ９７／００９５７を参照できる。
【００５５】
標的臓器のみでの発現を達成するためには、例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする核酸を組織特異的プロモーターに作動可能に連結し、遺伝子治療に用いることもできる。このようなプロモーターは当業者のよく知るものである（例えばＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ等、（１９９４），Ｎｅｕｒｏｎ　１２，１１−２４；Ｖｉｄａｌ等、（１９９０）ＥＭＢＯ　Ｊ．９，８３３−８４０；Ｍａｙｆｏｒｄ等、（１９９５），Ｃｅｌｌ　８１，８９１−９０４；Ｐｉｎｋｅｒｔ等、（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．１，２６８−７６参照）。
【００５６】
診断研究に用いるためのキットもまた本発明により提供される。このようなキットは黄斑変性または黄斑変性の素因の検出のために有用であり、上記した核酸分子、ベクター、タンパク質、抗体または化合物の少なくとも１つおよび場合により適当な検出手段を含む。
【００５７】
本実施態様においては、上記のとおり同定された核酸分子、タンパク質、抗体または化合物は好ましくは上記したとおり検出可能に標識されている。
【００５８】
更にまた、上記した化合物等は固相に結合させてもよい。固相は当該分野で知られるとおりであり、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、動物の赤血球、または赤血球影、デュラサイトおよび反応容器のウェル壁、プラスチックチューブまたは他の試験管を含む。固相上に核酸、（ポリ）ペプチド、タンパク質、抗体等を固定化するための適当な方法は、例えばイオン性、疎水性、共有結合性の相互作用等を包含するがこれに限らない。固相は上記した領域を誘引して固定化する１つ以上の別の受容体を保有することができる。この受容体は試薬そのものに対し、または、捕獲試薬にコンジュゲートした荷電物質に対して逆に荷電しているか、または受容体は固相上に固定化（結合）され、そして上記した試薬を固定化することができる何れかの特異的な結合相手であることができる。
【００５９】
好ましくは該キットは抗Ｃ７ｏｒｆ９、抗Ｃ１２ｏｒｆ７、抗ＭＰＰ４または抗Ｆ３７９抗体またはそのフラグメントおよび／またはＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９特異的な核酸プローブを含む。
【００６０】
一般的に使用されている検出試験は放射性同位体または非放射性同位体による方法を含む。これらには、とりわけ、ＲＩＡ（放射性同位体試験）およびＩＲＭＡ（免疫ラジオムノメトリック試験）、ＥＩＡ（酵素免疫試験）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫試験）、ＦＩＡ（蛍光免疫試験）、およびＣＬＩＡ（ケモルミネセンス免疫試験）が包含される。当該分野で使用されている他の検出方法はトレーサー分子を利用しないものである。このような方法の１つのプロトタイプはある分子が少なくとも２つの粒子に結合する性質に基づいた凝集試験である。
【００６１】
臨床上および／または学術的な標本中の（ポリ）ペプチド、ポリヌクレオチド等の診断および定量のためには、上記したような免疫学的方法並びに分子生物学的方法、例えば当該分野でよく知られた核酸ハイブリダイゼーション試験、ＰＣＲ試験またはＤＮＡ酵素免疫試験（Ｍａｎｔｅｒｏ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７，（１９９１），４２２−４２９）が有用である。試料中の核酸分子の検出を可能とする別の診断方法は例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸ハイブリダイゼーションと組み合わせたサザンブロッティング、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）またはリプレゼンタティブディファレンス分析（ＲＤＡ）を含む。このような方法は例えば、治療対象の細胞からｍＲＮＡを獲得し、その獲得されたｍＲＮＡを安定な条件下（上述）本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズできる核酸分子を含むプローブ／プライマーと接触させ、そして、プローブ／プライマーにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出および／または濃度を測定することを含む、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在の検出により、本発明の核酸分子の発現を測定するために有用である。このような方法は当該分野で知られており、過度の実験を行なうことなく実施できる。上記した方法はまた、突然変異または染色体再編成の検出のために用いることもできる。
【００６２】
本発明のキットは例えば１種以上の本発明のプローブ（試薬）を充填した容器１個以上を含んでいてよい。キットの容器には医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管轄する当局により指定された形式の告知文を付すことができ、該告知文はヒトへの投与に関する製造、使用または販売の当局による許可を反映する。
【００６３】
本発明の核酸分子の提供により、例えば上記したタンパク質の濃度の低下したトランスジェニックな非ヒト動物を作製できる可能性が生じる。これを達成するための手法は当業者の知るとおりである。即ち、本発明はまた、生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵細胞、またはこれらから誘導した細胞内に本発明の核酸分子またはベクターを導入することを包含するトランスジェニックな非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックなマウスの製造方法に関する。非ヒト動物は非トランスジェニックな健常動物であることができ、或いは、Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の少なくとも１つの突然変異により誘発された障害を有していてよい。このようなトランスジェニックな動物は例えば上記したＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４およびＦ３７９タンパク質の突然変異型を用いた薬剤の薬理学的試験のために適している。トランスジェニックな胚の作製およびこれらのスクリーニングは、例えばＡ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓに記載されている。胚の胚膜のＤＮＡを例えば上述した適切なプローブを用いたサザンブロットにより分析することができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明の、または、上記した方法により得られた核酸分子またはベクターを含むトランスジェニックなマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギ、ブタ等のようなトランスジェニックな非ヒト動物に関し、ここで好ましくは該核酸分子またはベクターが、好ましくは該核酸分子またはベクターの存在が本発明のＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９タンパク質の発現をもたらすように、該非ヒト動物のゲノム内に安定に組み込まれている。前記動物はＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質またはこれらの突然変異型の１つまたは数個をコードする同じか異なる核酸分子の１つまたは数個のコピーを有してよい。この動物にはＡＭＤのような疾患を研究するための研究モデルを含む多くの用途があり、従って、例えばこのような疾患の治療法の開発における新しい価値ある動物となる。従って、この場合、哺乳類は好ましくは非ヒト、例えばマウスまたはラットのような実験動物である。
【００６５】
トランスジェニックな非ヒト動物はまた、例えば以下の特徴：
（ａ）Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする内因性遺伝子の破壊；
（ｂ）本発明の核酸分子を含む転写物に対するアンチセンスＲＮＡおよび／またはリボザイム少なくとも１つの発現；
（ｃ）本発明の核酸分子の翻訳不能なｍＲＮＡの発現；
（ｄ）本発明の抗体の発現；または、
（ｅ）Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９をコードする遺伝子の機能的または非機能的コピーの取り込み；
の少なくとも１つをもたらす外来性ＤＮＡの安定な、または一過性の存在により、野生型動物と比較してＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４および／またはＦ３７９の発現の不全を呈してよい。
【００６６】
好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は上記した核酸分子をコードするＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９の不活性化された型少なくとも１つを含む。この実施態様により、例えば、疾患の臨床徴候の発症に対するＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の種々の突然変異型の作用を研究することができる。トランスジェニック動物に関して前述した用途は全て、２つ、３つまたはそれ以上のトランスジーンを有する動物に適用することもできる。トランスジェニックな動物の発達および／または寿命の特定の段階においてＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の発現を不活性化することが望ましい場合がある。このことは例えば、前述したとおりＣ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスまたはリボザイム等の発現を起こさせる組織特異的、発達性、および／または細胞調節性および／または誘導性のプロモーターを用いることにより、達成することができる。適当な誘導系は例えばＧｏｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９　ＵＳＡ（１９９２），５５４７−５５５１）およびＧｏｓｓｅｎ等、（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４），５８−６２）に記載されるテトラサイクリン調節遺伝子発現である。同様に、突然変異Ｃ７ｏｒｆ９、Ｃ１２ｏｒｆ７、ＭＰＰ４またはＦ３７９タンパク質の発現はこのような調節エレメントにより制御してよい。
【００６７】
（実施例）
以下の実施例は本発明を説明するものであり、これを限定する意図はない。このような実施例は使用してよい典型的なものであって、当業者の知る他の方法も代替として使用してよい。
【００６８】
実施例１：ＭＰＰ４
（Ａ）ＭＰＰ４ｃＤＮＡの単離
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）の公的に利用できるＵｎｉＧｅｎｅのデータセット、リリース番号１１３（２０００年６月）を検索することにより、網膜ｃＤＮＡライブラリから排他的に誘導したＥＳＴよりなるヒトＥＳＴクラスター、または、全体の３０％を超える網膜ＥＳＴの部分により定義される網膜ＥＳＴの増量されたＥＳＴクラスターを選別した。これらの基準に合致する１２４１エントリー中の１つであるＨｓ．６０６７３は、Ｓｏａｒｅｓ網膜Ｎ２ｂ４ＨＲｃＤＮＡライブラリから単離された２個のほぼ同じｃＤＮＡクローン（ｚｅ３９ａ０４，ｚｅ３２ｂ０３）の５’および３’末端から生じるＥＳＴ配列を含んでいた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＯｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ．）。オリゴヌクレオチドＡ１２８Ｆ（５’−ＣＴＣ　ＡＣＡ　ＴＣＣ　ＴＴＣ　ＴＣＡ　ＧＣＧ−３’）およびＡ１２８Ｒ（５’−ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　Ｃ−３’）を用いてｃＤＮＡクローンの５’読み枠内の配列にプライミングしながら逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを行なうことにより網膜ＲＮＡ中の１９３ｂｐは増幅されたが、試験した種々の他の成熟ヒト組織中では増幅されなかった。
【００６９】
Ｈｓ．６０６７３由来のＥＳＴ配列を保有するゲノムクローンＮＨ０３０９Ｎ０８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００７２７９）の配列の検討により、網膜ｃＤＮＡクローン由来の別のＥＳＴとの明らかなアライメントが判明した（ｚｅ２７ｈ０５，ｚｅ３０ｆ１０，ｚｆ５８ａ０６，ｙｓ７２ｅ０９）。この別のｃＤＮＡの配列の情報に基づき、オリゴヌクレオチドプライマーＡ１２８Ｆ３（５’−ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ−３’）、Ａ１２８ａＦ（５’−ＴＴＡ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＧ−３’）、Ａ１２８ａＲ（５’−ＡＧＧ　ＣＴＣ　ＴＡＧ　ＧＴＣ　ＣＡＴ　ＧＡＣ−３’）およびＡ１２８Ｒ３　（５’−ＡＴＧ　ＴＧＡ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＡＡＧ　Ｇ−３’）を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ試験において網膜ＲＮＡを増幅するために用いた。ＲＴ−ＰＣＲフラグメントはＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）を用いてＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）上でウォーキングプライマー法により完全に配列決定した。重複する１３７５ｂｐのＡ１２８Ｆ３／Ａ１２８ａＲ−および７８６ｂｐのＡ１２８ａＦ／Ｒ３−増幅ｃＤＮＡフラグメント並びにｃＤＮＡクローンｚｅ２７ｈ０５の５’末端配列の４１４ｂｐおよび３’末端配列の４２ｂｐの組み立てにより、ヌクレオチド位置２４１６ｂｐに保存されたポリアデニル化シグナルを有する２４３５ｂｐの転写物が得られた。この完全長転写物は、不完全にスプライシングされたｍＲＮＡの前駆体分子から誘導されている可能性が最も高いｃＤＮＡクローンｚｅ３９ａ０４およびｚｅ３２ｂ０３（Ｈｓ．６０６７３）の５’末端ＥＳＴ配列は含んでいない点に留意しなければならない。
【００７０】
完全長２４３５ｂｐｃＤＮＡは６９ヌクレオチド下流から始まる第１の潜在的インフレーム翻訳開始コドンＡＴＧを有する１９８０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む（配列１参照）。従って、ＯＲＦから予測されるタンパク質は６３７アミノ酸残基よりなり、分子量計算値は７２．８ｋＤａ、等電点は５．４であった。
【００７１】
（Ｂ）発現分析
オリゴヌクレオチドプライマーＡ１２８Ｆ４（５’−ＣＧＴ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣ−３’）およびＡ１２８ａＲ（前記した配列）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によってヒト網膜中の８４４ｂｐの産物が同定された。小脳、脳幹、肝臓、肺、心臓、胸腺、胎盤、子宮、前立腺、網膜色素上皮（ｒｐｅ）および腎臓にはＰＣＲ増幅は観察されなかった。グアニジウムチオシアネート法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２（１９８７），１５６−１５９）を用いて単離した全ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析を行った。側頭皮質、筋肉、網膜および肝臓に由来する全ＲＮＡ１０μｇを含有する各レーンをホルムアルデヒドの存在下、電気泳動により分離した。プライマー対Ａ１２８Ｆ６（５’−ＡＡＣ　ＴＧＣ　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＴＡＣ　ＣＡＧ−３’）／Ａ１２６Ｒ６（前記した配列）を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により３’未翻訳領域（ＵＴＲ）から３２７ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られ、これをプローブとして用いて０．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；７％　ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５８℃のフィルターハイブリダイゼーションを行なった（Ｃｈｕｒｃｈ　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８１（１９８４），１９９１〜１９９５）。単一の３．８ｋｂの転写物が網膜のみに発見された。我々の発現分析の結果によれば、ＭＰＰ４はヒト網膜に特異的である証拠が得られた（図１）。
【００７２】
（Ｃ）ＭＰＰ４のゲノム構造および染色体位置
ＭＰＰ４のエクソン／イントロン構成を調べるために、２４３５ｂｐのｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてゲノムクローンのＮＨ０３０９Ｎ０８の最終配列にアライメントさせた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｂｌａｓｔ？ｆｏｒｍ＝１）。これにより１５ｂｐ〜４９３ｂｐに渡る合計２２個のエクソンが同定された。推定翻訳開始コドンＡＴＧはエクソン２に位置し、終止コドンＴＧＡはエクソン２２に位置している。
【００７３】
ゲノムクローンＮＨ０３０９Ｎ０８はＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４放射線照射ハイブリッドパネルをスクリーニングすることにより染色体２ｑ３１−２ｑ３３上のＤ２Ｓ１１５−Ｄ２Ｓ３０７区間にマッピングされているＤＮＡマーカーＳｔＳＧ２７３９およびｓｔｓ−ＡＡ０１５７７７を含んでいる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｃｔｇ．ｃｇｉ？ｔａｂｖｉｅｗ＝Ｍ＆ＢＰ＝１０００＆ＣＴＣ＝Ｈｓ２＿２２２９＆ＯＲＧ＝Ｈｓ）。
【００７４】
（Ｄ）ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベース分析
データベース中の相同なヌクレオチド配列を発見するために、ＭＰＰ４の完全長ｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＩＮプログラムを用いてホモロジーサーチに付した。注釈づけコード配列の全１３２５ｂｐ並びにｒＤＬＧ６に対するラットｍＲＮＡの５’ＵＴＲの２５０ｂｐと大きな配列同一性（８５％）が確認された（Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　受託番号　ＡＢ０３０４９９）。ヒトＭＰＰ４遺伝子の完全長ｃＤＮＡ転写物は既知のｒＤＬＧ６ｃＤＮＡとの比較において５’方向に２５３ｂｐ伸長している。ラットにおいて報告されているＯＲＦと比較して、これはヒトＭＰＰ４ＯＲＦを伸張させたものであり、更にＮ末端の１５１アミノ酸に達している。更にまた、ヒト転写物はエクソン１２〜１５および伸長したエクソン１７に相当するコード領域における９３ｂｐおよび３９ｂｐの２つの挿入部を示しており、更に４４アミノ酸の付加が起こっている。免疫学的分析によれば、ｒＤＬＧ６は主に脳において発現されるが、ラット眼における発現試験は行わなかった。
【００７５】
既知タンパク質とのＭＰＰ４の推定タンパク質配列の配列アライメントをＢａｙｌｏｒ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃｉｎｅのＢＬＡＳＴＰおよびＢＥＡＵＴＹプログラムを用いて行なった（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）。
【００７６】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ／ｉｐｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）のＩｎｔｅｒ　Ｐｒｏにおけるシグニチャー認識法のための組込みツールを用いて特異的モチーフがあるかどうかについてもタンパク質を分析した。ヒトＭＰＰ４タンパク質の６３７アミノ酸はラットｒＤＬＧ６の４４１アミノ酸と７５％同一であり、そしてｒＤＬＧ６に類似し、ＭＰＰ４はタンパク質のＮ末端、中央ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）モチーフにおける１つのＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０−Ｄｌｇ−ＺＯ−１（ＰＤＺ）ドメインおよびＣ末端グアニレートキナーゼ様（ＧＵＫ）ドメインを有するＭＡＧＵＫタンパク質スーパーファミリーの特徴的なコア構造を示す（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９６，（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６（１９９６），３８２−３８４）。種々のモチーフの各々はタンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　１９９６）。更にまた、ＭＡＧＵＫタンパク質ＣＡＳＫ／ＬＩＮ−２のＧＵＫドメインはラット脳において転写を調節することが最近わかった。ＭＡＧＵＫタンパク質のうち、ヒトＭＰＰ４はＤａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏのｐ５５−関連ＭＡＧＵＫタンパク質ＤＬＧ３（３９％、受託番号ＡＡＤ３９３９２）、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓのｄｉｓｃｓ　ｌａｒｇｅ相同体３（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（３７％、受託番号ＮＰ＿０３１８８９）およびＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓのＭＰＰ３（以前はＤＬＧ３と称していた）（３６％、受託番号ＮＰ＿００１９２３）と最も類似していた。局所的配列比較によれば、ＭＡＧＵＫファミリーメンバーのＰＤＺ、ＳＨ３およびＧＵＫドメインと３０〜５０％の同一性があった。
【００７７】
遍在性ＭＡＧＵＫタンパク質は種々の動物細胞の原形質膜に局在しており、そこで相互作用のシグナリング並びに膜の特殊構造を確立し維持することに寄与していると考えられる。ＭＡＧＵＫタンパク質の基本的役割の１つは上皮（例えばＺＯ−１，ＺＯ−２，ＺＯ−３）、中隔接合部（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　ｄｌｇ−１）およびシナプス（例えばＤＬＧ１，ＰＳＤ−９５／ＳＡＰ９０／ＤＬＧ４）のような特定の部位に膜貫通タンパク質を局在化させる能力である。例えば、ＭＰＰ１、即ちヒト赤血球のパルミトイル化された末梢膜リンタンパク質は、皮質アクチン細胞骨格に膜貫通タンパク質を連結させ、これにより細胞の形状を調節している。シグナリング経路における重要な役割の証拠は、当初は無脊椎動物におけるＭＡＧＵＫタンパク質の研究により得られていた。Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓのＬｉｎ−２は外陰細胞誘導をもたらすシグナル増幅に関与していることがわかっており、そして、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｄｌｇ−１における特定の突然変異は恐らくは増殖抑制シグナルの欠損による制御不能な細胞増殖を誘発する。
【００７８】
ＭＡＧＵＫタンパク質の既知機能の大部分は、膜貫通タンパク質および他のシグナル伝達タンパク質の原形質側のカルボキシ最末端に結合する８０〜１００アミノ酸のＰＤＺドメインにより、配列および構造依存的に媒介される。最近の研究によればＰＤＺドメイン５個を有するタンパク質であるＩＮＡＤがＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの視覚伝達の本質的要素であることがわかった。これは超分子シグナリング複合体への光伝達カスケードの最低７個のタンパク質を統括している。このシグナルプレックスは光応答の終了を誘発し、光伝達カスケードの急速な活性化および増幅を促進していると考えられる。ＰＤＺ含有スカホールドタンパク質はまた急速な活性化および不活性化並びに厳密な調節を同じく要する脊椎動物の光伝達のシグナリング経路も統括していると考えられる。網膜機能のためのＰＤＺ含有タンパク質の重要性は、聴覚の消失と網膜の変性を特徴とする遺伝的知覚疾患であるアッシャー症候群ＵＳＨ１Ｃの患者において突然変異しているＰＤＺドメイン含有タンパク質ハルモニンがより最近発見されたことによって明らかになった。
【００７９】
実施例２：Ｃ７ｏｒｆ９
（Ａ）Ｃ７ｏｒｆ９ｃＤＮＡの単離
公的に利用できるＵｎｉＧｅｎｅのデータセット、リリース番号１１３を検索することにより、網膜ＤＮＡライブラリから排他的に誘導したＥＳＴよりなるヒトＥＳＴクラスター、または、全体の３０％を超える網膜ＥＳＴの部分により定義される網膜ＥＳＴの増量されたＥＳＴクラスターを選別した。これらの基準に合致する１２４１エントリー中の１つであるＨｓ．６０４７３はＳｏａｒｅｓ網膜Ｎ２ｂ４ＨＲｃＤＮＡライブラリより単離した２種のｃＤＮＡクローン（ｚｅ３４ｆ０６，ｚｅ３７ｇ０５）の３’末端由来の高品質ＥＳＴ配列の約３５０ｂｐを含有していた。ｄｂＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＳＴ／ｄｂｓｅｔ＿ｑｕｅｒｙ．ｈｔｍｌ）から得られるｃＤＮＡクローンの５’末端の約２８０ｂｐの高品質ＥＳＴ配列は相当する３’末端ＥＳＴと重複していない。
【００８０】
この遺伝子を与えるｃＤＮＡクローンを更に単離するために、プライマーＡ１２９Ｆ（５’−ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＴＡＣ　Ｃ−３’）およびＡ１２９Ｒ（５’−ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＡＧＡ　ＧＧＣ　ＡＧＧ　ＴＴＧ−３’）を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた放射標識１９９ｂｐＤＮＡフラグメントを用いて網膜ラムダＴｒｉｐｌＥｘ２ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。０．５〜１．６ｋｂの範囲のインサートを有する１４種の陽性クローンを単離し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）を用いてＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）上でウォーキングプライマー法により配列決定した。
【００８１】
ｃＤＮＡの完全な５’末端を単離するために、５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅）法を用いた（Ｆｒｏｈｍａｎ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８５（１９８８），８９９８−９００２）。第１鎖ｃＤＮＡ合成は遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ１２９Ｒを用いてプライミングした。ｃＤＮＡ合成の後、第１鎖産物を未取り込みｄＮＴＰおよび残りのプライマーＡ１２９Ｒから単離精製した。次にホモポリマー尾部を末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびｄＣＴＰを用いてｃＤＮＡの３’末端に付加した。ＰＣＲ増幅はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｃＤＮＡ分子内に位置する部位にアニーリングするｎｅｓｔｅｄ遺伝子特異的プライマーＡ１２９Ｒ５（５’−ＴＧＣ　ＴＧＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＴＣ−３’）およびＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡより入手したデオキシイノシン含有短縮アンカープライマーＡＡＰ（５’−ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＧＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＣＧ　ＧＧＩ　ＩＧＧ　ＧＩＩ　ＧＧＧ　ＩＩＧ−３’）を用いて行なった。特異的ｃＤＮＡ産物の量を増大させるために、元のＰＣＲを、ＧＩＢＣＯ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手した短縮ユニバーサル増幅プライマーＡＵＡＰ（５’−ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＧＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＣ−３’）、および、第２のｎｅｓｔｅｄ遺伝子特異的プライマーＡ１２９Ｒ４（５’−ＡＧＣ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　ＴＣ−３’）を用いて再増幅した。プライマーＡ１２９Ｒ４を用いて得られたＰＣＲ産物の配列決定によれば、より上流の配列は認められず、同定されたｃＤＮＡ配列が転写物の転写開始部位から始まる完全な５’配列を含んでいることが示唆された。
【００８２】
ｃＤＮＡ配列の組み立てにより４７ヌクレオチド下流から始まる第１の潜在的インフレームの翻訳開始コドンＡＴＧを有する６３８ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１１９０ｂｐのｃＤＮＡが得られた（配列番号２６〜２８）。コードされた推定タンパク質は１９６アミノ酸残基よりなり、分子量計算値は２２．３ｋＤａ、等電点は９．２６であった。
【００８３】
１４種の異なるｃＤＮＡ配列の比較によれば、推定タンパク質配列のコドン３２におけるイソロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換を起こす１４３ｂｐ位の一塩基多型（Ｃ／Ｇ）が存在していた。
【００８４】
（Ｂ）発現分析
オリゴヌクレオチドプライマー対Ａ１２９Ｆ／Ａ１２９ＲおよびＡ１２９Ｆ３（５’−ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＡＴＣ　ＴＴＣ　ＡＣＡ　ＧＣ−３’）／Ａ１２９Ｒを用いた逆転写ＰＣＲ分析によれば、ヒト網膜のみに特異的な１９９ｂｐおよび２４４ｂｐのｃＤＮＡフラグメントが確認された（図２）。ヒト小脳、肝臓、肺、心臓、胎盤、胸腺および腎臓にはＰＣＲ増幅は観察されなかった。ノーザンブロット分析は実施例１に記載の通り実施した。５’領域から得た２４４ｂｐのｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて、０．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；７％　ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５８℃のフィルターハイブリダイゼーションを行なった。約０．８５および１．２０ｋｂの２種の転写物が網膜のみに確認された（図２）。
【００８５】
（Ｃ）Ｃ７ｏｒｆ９のゲノム構造および染色体位置
Ｃ７ｏｒｆ９のエクソン／イントロン構成を調べるために、１１９０ｂｐのｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてゲノムＢＡＣクローンＣＴＢ−１３６Ｎ１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００４１２９）の完全配列にアライメントさせた。合計３個のエクソンが同定され、推定翻訳開始コドンＡＴＧはエクソン１に位置し、終止コドンＴＡＡはエクソン３に位置していた（配列番号２６〜２８）。
【００８６】
ＢＡＣクローンＣＴＢ−１３６Ｎ１７のこのゲノム配列はＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４放射線照射ハイブリッドパネルをスクリーニングすることにより染色体７ｐ１５−ｐ２１上のＤ７Ｓ２４９３−Ｄ７Ｓ５２９区間にマッピングされているＤＮＡマーカーｓｔＳＧ５１６８３を含んでいる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ）。
【００８７】
（Ｄ）ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベース分析
Ｃ７ｏｒｆ９のｃＤＮＡ配列をＢａｙｌｏｒ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）のＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてホモロジーサーチに付したところ、Ｃ７ｏｒｆ９のコード領域とＲＦアミド関連ペプチド前駆体のヒトｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４０２９０）との間には１００％の配列同一性が確認された。従って、Ｃ７ｏｒｆ９の推定翻訳産物はＲＦアミド関連ペプチド前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＢ１７６７４）と同一である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｔｅｒＰｒｏにおけるシグニチャー認識法のための組込みツールを用いた特異的モチーフに関する分析によれば、アミノ酸９９〜１０９および１３８〜１４８はＦＡＲＰ（ＦＭＲＦアミド関連ペプチドファミリー）シグニチャーに高い同様性を示すことがわかった。ＲＦアミド関連ペプチドは前駆体タンパク質の翻訳後プロセシングにより生成し、神経ホルモン機能、筋肉収縮および心興奮における役割を有することがわかっている。
【００８８】
実施例３：Ｆ３７９
（Ａ）Ｆ３７９ｃＤＮＡの単離
公的に利用できるＵｎｉＧｅｎｅのデータセット、リリース番号１１３を検索することにより、網膜ｃＤＮＡライブラリから排他的に誘導したＥＳＴよりなるヒトＥＳＴクラスター、または、全体の３０％を超える網膜ＥＳＴの部分により定義される網膜ＥＳＴの増量されたＥＳＴクラスターを選別した。これらの基準に合致する１２４１エントリー中の１つであるＨｓ．３５４９３はＳｏａｒｅｓ網膜Ｎ２ｂ４ＨＲｃＤＮＡライブラリ（ｙｓ８２ｈ０８．ｒ１，ｙｓ８２ｈ０８．ｓ１，ｙｓ６６ｅ１２．ｒ１，ｙｓ６６ｅ１２．ｓ１，ｙｓ８４ｇ０４．ｒ１，ｚｅ４０ｃ０３．ｒ１，ｙｓ８４ｃ０２．ｒ１，ｚｅ４２ｂ０７．ｓ１，ｚｅ４２ｂ０７．ｒ１）、Ｎａｔｈａｎｓヒト網膜ｃＤＮＡランダムプライミングサブライブラリ（３９ａ１２）、Ｓｏａｒｅｓ松果体Ｎ３ＨＰＧｃＤＮＡライブラリ（ｚｆ６７ｅ０４．ｒ１，ｚｆ６７ｅ０４．ｓ１，ｙｔ９０ｄ１１．ｒ１，ｙｔ９０ｄｌ１．ｓ１，ｙｔ８４ｇ０１．ｒ１，ｙｔ８４ｇ０１．ｓ１，ｙｔ８３ｇ０１．ｓ１，ｚｆ８２ｅ１０．ｓ１，ｚｆ８２ｅ１０．ｒ１，ｚｆ８６ｄ０８．ｓ１）、Ｓｏａｒｅｓ胎児心ＮｂＨＨ１８ＷｃＤＮＡライブラリ（ｚｄ７４ｄ０６．ｒ１，ｚｄ７４０６．ｓ１）およびＳｏａｒｅｓ精巣ＮＨＴ（ｏｔ３３ｄ０９．ｓ１）から単離される１５ｃＤＮＡクローンの５’および／または３’末端由来の２２ＥＳＴ配列を含んでいた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＯｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。Ｆ３７９の完全長ｃＤＮＡを同定するためにラムダＴｒｉｐｌＥｘ２およびラムダ−ｇｔ１０中に構築したヒト網膜ライブラリをスクリーニングした。各ｃＤＮＡライブラリについて、プライマー対Ａ０７１Ｆ（５’−ＴＧＴ　ＧＣＣ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ−３’）およびＡ０７１Ｒ（５’−ＴＡＧ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＴＣＧ　ＧＧＧ　Ｇ−３’）を用いた網膜ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られたアルファ３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識３２８ｂｐフラグメントを用いて約５Ｘ１０５個のプラークをプローブした。３個の陽性クローンを２回スクリーニングの後にラムダＴｒｉｐｌＥｘ２網膜ｃＤＮＡライブラリから単離し、ＳＭＡＲＴＴＭライブラリキットマニュアル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）の指示に従ってファージベクターからプラスミドとして切り出した。ラムダ−ｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリの場合は、ＰＣＲ増幅により１つのクローンを単離した。プライマーＡ０７１Ｆ（前述）およびラムダ−ｇｔ１０Ｆ（５’−ＡＧＣ　ＡＡＧ　ＴＴＣ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＡＧ−３’）を用いて陽性クローンを含有する混合ファージ溶解物からクローンを増幅した。更に、Ｆ３７９ｃＤＮＡの７５０ｂｐをプライマー対Ａ０７１Ｆ（前述）およびＡ０７１Ｒ２（５’−ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＧＧＧ−３’）を用いて網膜ｃＤＮＡから増幅した。全てのｃＤＮＡライブラリクローンおよびＰＣＲ産物をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）上で配列決定した。
【００８９】
Ｆ３７９の１１８８ｂｐの完全長コンセンサスｃＤＮＡ配列（配列番号７）はｃＤＮＡライブラリクローン、ＰＣＲ産物およびＨｓ．３５４９３のＥＳＴのＤＮＡ配列のコンパイレーションから調べた。これらの配列をＦ３７９のコンセンサスｃＤＮＡ配列にアライメントすることにより、１塩基対変異があることが判明した。この１塩基対変化を表１に総括する。完全長コンセンサスｃＤＮＡは完全長コンセンサスｃＤＮＡの５’側最末端から３４７塩基に始まる８５アミノ酸（配列番号３１）の推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいた。ｃＤＮＡ内の１塩基変化は終止コドンを導入することにより推定ＯＲＦをトランケートしておらず、むしろ、変異はアミノ酸置換を誘発するか、または推定ＯＲＦには影響しない（表１）。ＯＲＦはＡｌｕとＭＩＲの反復エレメントを含んでおり、これらは共に６８アミノ酸に相当する。予測されたタンパク質は分子量計算値９．２ｋＤａ、等電点は６．８１であった。
【表１】
2004514445.tif 000002
＊１塩基対変異は推定ＰＲＦの外側に位置する。
【００９０】
（Ｂ）発現分析
ｃＤＮＡクローンの５’読み枠内の配列にプライミングしながらオリゴヌクレオチドＡ０７１ＦおよびＡ０７１Ｒを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なう事により、ヒト網膜ＲＮＡから３２８ｂｐの転写物が増幅できたが、子宮、小脳、心臓、肝臓または肺のＲＮＡからは増幅できなかった。更にまた実施例１に記載のとおりノーザンブロット分析を行なった。プライマー対Ａ０７１Ｆ３（５’−ＴＴＣ　ＴＴＧ　ＴＣＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣ　ＣＴＣ−３’）およびＡ０７１Ｒ２（前記）を用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により遺伝子の３’領域由来の２１９ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて、０．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；７％　ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５８℃のフィルターハイブリダイゼーションを行なった。約１．１ｋｂの単一の転写物が網膜のみに確認された。発現分析の結果によれば、Ｆ３７９は網膜のみに存在していることがわかった（図３）。更にまた、ノーザンブロットにより検出された転写物の大きさは完全長ｃＤＮＡコンセンサス配列の大きさと相関している（１１８８ｂｐ）。
【００９１】
（Ｃ）Ｆ３７９のゲノム構造および染色体位置
Ｆ３７９のエクソン／イントロン構成を調べるために、１１８８ｂｐのｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＩＮプログラムを用いて最終または非最終のゲノム配列にアライメントさせた。Ｆ３７９の完全なｃＤＮＡ配列が染色体１９（ＬＬＮＬＲ−２２２Ａ１）、染色体２２（ＲＰ１１−３９５Ｌ１４）、染色体２（ＲＰ１１−５５９Ｈ１４）、染色体２１（ＲＰ１１−３４Ｐ１３）、染色体１０（ＲＰ１１−４３８Ｆ６）、染色体１２（ＲＰ１１−５９８Ｆ７）および染色体９（ＲＰ１１−１４２Ｍ１）を含む種々の染色体に由来するゲノムクローンにアライメントされた。部分的アライメントもまた染色体１５（１５ｑｔｅｌ＿ｃ１８４ａｔ３）、染色体１２（１２ＰＴＥＬ０５７，１２ＰＴＥＬ０５５，ＲＰＣＩ１１−５５Ｌ１４）および染色体１９（ＣＴＤ−２１０２Ｐ２３）由来のゲノムクローンに確認された。これらのアライメントにより２０５ｂｐ〜６２１ｂｐに渡る３個のエクソンが同定された。推定翻訳開始コドンＡＴＧはエクソン１に位置し、終止コドンＴＧＡはエクソン３に位置する。
【００９２】
２つの異なるヒト／げっ歯類体細胞ハイブリッドＤＮＡマッピングパネルのＰＣＲに基づいたスクリーニングによれば、やはり、Ｆ３７９のマルチコピー性が示された。市販のヒト／げっ歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネル（Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｐａｎｅｌ　２，Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＵＳＡ）をプライマーセットＡ０７１Ｆ（前記）およびＡ０７１Ｒ（前記）を用いてスクリーニングし、細胞系統ＤＮＡ含有染色体２、３、６、９、１２、１５、１９および２０の３２８ｂｐ産物を得た。この結果に基づいて、遺伝子名Ｄ２Ｆ３７９Ｓ１Ｅ、Ｄ３Ｆ３７９Ｓ２Ｅ、Ｄ６Ｆ３７９Ｓ３Ｅ、Ｄ９Ｆ３７９Ｓ４Ｅ、Ｄ１２Ｆ３７９Ｓ５Ｅ、Ｄ１５Ｆ３７９Ｓ６Ｅ、Ｄ１９Ｆ３７９Ｓ７ＥおよびＤ２０Ｆ３７９Ｓ８Ｅをゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／）によりそれぞれ染色体２、３、６、９、１２、１５、１９および２０に割りつけた。Ｆ３７９のマルチ染色体位置は２つの相補配列を有するＢＡＣクローン（ＲＰ１１−３９５Ｌ１４およびＬＬＮＬＲ−２２２Ａ１、上記参照）と重複するコスミドクローンＦ７５０１のものと合致していた。このコスミドは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析により明らかにされているとおり（Ｔｒａｓｋ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９（１９９８），１３２９−１３４９）１ｑ，２ｑ１３−１４，３ｑ，５ｑ，６ｐ，６ｑ，８ｐ，９ｐ，９ｑ，１１ｐ，１２ｐ，１５ｑ，１９ｐ，１９ｐ，２０ｐおよび２０ｑに存在するサブテロメアブロックの一部であることがわかっている。
【００９３】
（Ｄ）ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベース分析
完全なコンセンサスｃＤＮＡの配列の配列アライメントをＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行なった。上記したＥＳＴおよびゲノム配列およびＡｌｕまたはＭＩＲリピートエレメントへのマッチの他は、検索された遺伝子への有意なマッチは観察されなかった。
【００９４】
既知タンパク質への推定ＯＲＦの照合をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行なった。他のタンパク質への配列アライメントはＡｌｕリピートによりコードされるアミノ酸の領域に局在していた。他の有意なマッチは観察されなかった。タンパク質はまたＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｔｅｒＰｒｏにおけるシグニチャー認識法のための組込みツールを用いた特異的モチーフに付いて分析した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｉｍ．ｈｕ／ｈｍｍｔｏｐ／）。モチーフやパターンは認められなかった。ＯＲＦはＨＭＭＴＯＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｉｍ．ｈｕ／ｈｍｍｔｏｐ／）やＴＭＨＭＭプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０／）による分析では予測された膜貫通領域を有していない。ＮｅｔＯＧｌｙｃ２．０Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）により測定したところ、アミノ酸２３および２７に２つの潜在的ＧａｌＮＡｃＯ−グリコシル化部位がある。Ｎ−グリコシル化部位は９０％の同様性でＰＲＯＳＩＴＥ　ＳＣＡＮプログラムを用いてアミノ酸５１において予測された（ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）。
【００９５】
実施例４：Ｃ１２ｏｒｆ７
（Ａ）Ｃ１２ｏｒｆ７ｃＤＮＡの単離
公的に利用できるＵｎｉＧｅｎｅのデータセット、リリース番号１１３を検索することにより、網膜ｃＤＮＡライブラリから排他的に誘導したＥＳＴよりなるヒトＥＳＴクラスター、または、全体の３０％を超える網膜ＥＳＴの部分により定義される網膜ＥＳＴの増量されたＥＳＴクラスターを選別した。これらの基準に合致する１２４１エントリー中の１つであるＨｓ．２８４１１は１０個のＥＳＴ配列を含んでいた。８個のＥＳＴはＳｏａｒｅｓ網膜Ｎ２ｂ４ＨＲｃＤＮＡライブラリより単離した４種のｃＤＮＡクローン（ｚｆ５０ｇ０６，ｚｅ４４ｇ０８，ｙｔ７２ｃ０７，ｚｆ５２ｈ０５）の５’および３’末端を示し、２個はＳｏａｒｅｓ胎盤Ｎｂ２ＨＰｃＤＮＡライブラリより単離した２種のｃＤＮＡクローン（ｙｉ０８ｆ０３．ｓ１，ｙｉ７５ａ０７．ｓ１）の３’末端であった。
【００９６】
Ｃ１２ｏｒｆ７の完全長ｃＤＮＡ転写物を同定するために、プライマー対Ａ０３８Ｆ３（５’−ＣＧＧ　ＡＡＣ　ＣＧＣ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＴＧＣ−３’）およびＡ０３８Ｆ（５’−ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＧ−３’）を用いたｃＤＮＡクローンｚｆ５０ｇ０６クローンのＰＣＲ増幅により得られたアルファ３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識８６３ｂｐフラグメントを用いてラムダ−ｇｔ１０網膜ｃＤＮＡライブラリをプローブした。ＡＢＩ３１０自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）上のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてウォーキングプライマー法により１１個の陽性クローンのインサートを配列決定した。
【００９７】
１１個のｃＤＮＡ配列のコンパイレーションにより２種の異なるｃＤＮＡ分子種が判明した。１つのｃＤＮＡ分子は１４２８ｂｐよりなり、２つ目のｃＤＮＡ配列はヌクレオチド位置５４９に３０ｂｐのインサートを含んでいる。ｃＤＮＡの完全な５’末端を単離するために５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅）法を実施例２に記載したとおり用いたが、ただしここでは第１鎖ｃＤＮＡ合成は遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドＡ０３８Ｆを用いてプライミングし、ＰＣＲ増幅は遺伝子特異的プライマーＡ０３８Ｒ３（５’−ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＧＧＣ　ＴＴＧ　ＴＡＧ−３’）および第２のｎｅｓｔｅｄ遺伝子特異的プライマーＡ０３８Ｒ４（５’−ＧＴＧ　ＣＡＡ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＣＴＣ　ＴＴＣ−３’）を用いて行なった。プライマーＡ０３８Ｒ４を用いて得られたＰＣＲ産物の配列決定により、更に８６ｂｐの５’配列が判明した。５’−ＲＡＣＥ配列およびｃＤＮＡクローンから得られたｃＤＮＡ配列の組み立てにより、１５１４（配列番号３５）および１５４４ｂｐの転写物（配列番号３６）が得られた。
【００９８】
ｃＤＮＡ配列の比較により、配列番号３５および３６の４０ｂｐ（Ａ／Ｔ）と８８ｂｐ（Ｃ／Ｔ）の位置に２つの一塩基多型の存在が判明した。
【００９９】
両方のｃＤＮＡ変異体は３４５アミノ酸（ａａ）（配列番号３７）および３５５ａａ（配列番号３８）のタンパク質をコードする同じ推定オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。推定タンパク質はｃＤＮＡ配列の５’側最末端の１５４ヌクレオチド下流に位置する同じ潜在的インフレーム開始コドンＡＴＧを共有している。推定タンパク質配列Ｎｏ．１１ａおよびＮｏ．１１ｂは分子量計算値３７．１ｋＤおよび３８．０ｋＤを有し、等電点はそれぞれ５．５９および５．４９であった。
【０１００】
（Ｂ）発現分析
オリゴヌクレオチドＡ０３８ＦおよびＡ０３８Ｒ（５’−ＴＧＣ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＡＧＴ　ＧＣＣ−３’）を用いてｃＤＮＡ配列の３’末端をプライミングした逆転写ＰＣＲでは、ヒト網膜ＲＮＡの２３１ｂｐのｃＤＮＡフラグメントが増幅され、ヒト脳、心臓、肝臓、肺または子宮のＲＮＡでは増幅されなかった。プライマーＡ０３８Ｆ４（５’−ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＡＣＧ　ＧＣＴ　ＴＣＣ−３’）およびＡ０３８Ｒ３を用いたＲＴ−ＰＣＲではヒト網膜ＲＮＡからは３７９ｂｐと４０９ｂｐのフラグメントが増幅されたが、ヒト小脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤または胸腺のＲＮＡからは増幅されなかった（図４の実施例）。
【０１０１】
（Ｃ）Ｃ１２ｏｒｆ７のゲノム構造および染色体位置
Ｃ１２ｏｒｆ７のエクソン／イントロン構成を調べるために、ｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてクローンＲＰ１１−１１００Ｌ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ０２５２５９）の非最終のゲノム配列にアライメントさせた。１４３ｂｐ〜４７７ｂｐに渡る６個のエクソンが同定された（配列番号３９〜４５）。推定翻訳開始コドンＡＴＧはエクソン２に位置し、終止コドンＴＡＡはエクソン６に位置する。ｃＤＮＡ配列Ｎｏ．１０ｂ中のインサートは代替スプライスドナーコンセンサス配列を用いて作製したエクソン４の３０ｂｐ伸長物として同定された。両方のスプライスドナー部位は同様のスプライシングスコアを有している。
【０１０２】
Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルを用いた放射線照射ハイブリッドマッピングによれば、Ｈｓ．２８４１１は染色体１２ｑ１１．１−１３．２上のマーカーＤ１２Ｓ３３３−Ｄ１２Ｓ３２５の間に局在化されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｔｓ／ｓｔｓ．ｃｇｉ？ｕｉｄ＝９２７１０）。更にまた、ゲノムクローンＲＰ１１−１１００Ｌ３は染色体１２にマッピングされている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ０２５２５９）。
【０１０３】
（Ｄ）ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベース分析
既知ヌクレオチド配列に対するＣ１２ｏｒｆ７ｃＤＮＡ配列の配列アライメントをＢＣＭのＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行なった。既知遺伝子配列への有意なマッチは認められなかった。ＬＩＮＥ／Ｌ１リピートが１２８１−１４０３ｂｐ（配列番号５）および１３１１−１４３３ｂｐ（配列番号３６）の位置の３’未翻訳領域中に確認された。
【０１０４】
ＢＣＭのＢＬＡＳＴＰおよびＢＥＡＵＴＹプログラムを用いてタンパク質データベースに対するＣ７ｏｒｆ９の推定翻訳産物の比較を行なった（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）。タンパク質はまたＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｔｅｒＰｒｏにおけるシグニチャー認識法のための組込みツールを用いてモチーフおよびパターンに付いて分析した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ／ｉｐｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）。より長いタンパク質イソフォーム（配列番号３８）内の１１２−１４４ａａおよび１４７−１７９ａａの位置に２個のアンキリンリピートが確認されたのに対し、より短いタンパク質イソフォーム（配列番号３７）の１１２−１４４ａａの位置には僅か１個のみアンキリンが確認された。約３３残基のアンキリンドメインは多くの機能的に関連のないタンパク質に確認され、タンパク質−タンパク質相互作用において役割を果たしていることがわかっている。既知のタンパク質配列との有意な相同性は観察されなかった。ＨＭＭＴＯＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｉｍ．ｈｕ／ｈｍｍｔｏｐ／）やＴＭＨＭＭプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０／）では膜貫通領域は予測されなかった。
【０１０５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＭＰＰ４の発現分析を示す。（Ａ）３’ＵＴＲから始まるＭＰＰ４特異的プローブによりプローブされたノーザンブロットである。（Ｂ）ＭＰＰ４遺伝子のエクソン１９および２０にそれぞれ位置するオリゴヌクレオチドプライマー対Ａ１２８ａＦ／Ａ１２８ａＲを用いたヒト組織におけるＲＴ−ＰＣＲ分析である。ベータグルクロニダーゼ遺伝子を対照として用いることによりＲＮＡの品質および同等の負荷量を確保した。
【図２】図２はＣ７ｏｒｆ９の発現を示す。（Ａ）遺伝子の５’末端から始まるＣ７ｏｒｆ９特異的プローブによりプローブされたノーザンブロットである。（Ｂ）Ｃ７ｏｒｆ９遺伝子のエクソン１および２にそれぞれ位置するオリゴヌクレオチドプライマー対Ａ１２９Ｆ３／Ａ１２９Ｒを用いたヒト組織におけるＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図３】図３はＦ３７９の発現を示す。（Ａ）遺伝子の３’末端から始まるＦ３７９特異的プローブによりプローブされたノーザンブロットである。（Ｂ）Ｆ３７９遺伝子のエクソン１に位置するオリゴヌクレオチドプライマー対Ａ０７１Ｆ／Ａ０７１Ｒを用いたヒト組織におけるＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図４】図４はＣ１２ｏｒｆ７の発現を示す。Ｃ１２ｏｒｆ７遺伝子のエクソン３および５に位置するオリゴヌクレオチドプライマー対Ａ０３８Ｆ４／０３８Ｒ３を用いたヒト組織におけるＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図５】図５は配列番号１である。ＭＰＰ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図６ａ】図６ａは配列番号２〜５である。ＭＰＰ４遺伝子のエクソン１〜４のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図６ｂ】図６ｂは配列番号６〜９である。ＭＰＰ４遺伝子のエクソン５〜８のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図６ｃ】図６ｃは配列番号１０〜１４である。ＭＰＰ４遺伝子のエクソン９〜１３のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図６ｄ】図６ｄは配列番号１５〜１９である。ＭＰＰ４遺伝子のエクソン１４〜１８のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図６ｅ】図６ｅは配列番号２０〜２３である。ＭＰＰ４遺伝子のエクソン１９〜２２のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は配列番号２４〜２５である。予測されるＭＰＰ４タンパク質のアミノ酸配列；およびＣ７ｏｒｆ９ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は配列番号２６〜２８である。Ｃ７ｏｒｆ９遺伝子のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は配列番号２９〜３１である。予測されるＣ７ｏｒｆ９タンパク質のアミノ酸配列を示し；Ｆ３７９ｃＤＮＡのコンセンサスヌクレオチド配列を示し；そして、予測されるＦ３７９タンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は配列番号３２〜３４である。Ｆ３７９遺伝子のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す（ゲノムクローンＲＰ１１−３９５Ｌ１４へのアライメントに基づく）。
【図１１】図１１は配列番号３５〜３６である。Ｃ１２ｏｒｆ７ｃＤＮＡ変異体のヌクレオチド配列；および、Ｃ１２ｏｒｆ７ｃＤＮＡ変異体２のヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２は配列番号３７〜４３である。Ｃ１２ｏｒｆ７タンパク質（変異体１）の推定アミノ酸配列を示し；そしてＣ１２ｏｒｆ７タンパク質（変異体２）の推定アミノ酸配列を示し；そしてＣ１２ｏｒｆ７遺伝子のエクソン１〜４変異体２のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３は配列番号４４〜５５である。Ｃ１２ｏｒｆ７遺伝子のエクソン５、６のエクソン／イントロン構成体のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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