(57)【要約】本発明は、ヒトゲノムデータベースのようなデータベースにおいて入手可能な情報に基づく、コンピューターに従うポリヌクレオチドアセンブリによって、ゲノム配列情報の結果を使用するための新規の方法を概説する。特に、本発明は、標的ポリペプチドをコードする新規の合成標的ポリヌクレオチド配列を選択、合成、およびアセンブルするために用いられ得る。この標的ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードし得、この標的ポリペプチドは、天然（野生型）ポリヌクレオチド配列またはモデルポリヌクレオチド配列によってコードされるモデルポリペプチドと比較して増強または変更された生物学的活性を示す。
2004533228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該プラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じている工程；
ｃ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第２のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第２のポリヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドに連続し、そして該第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｄ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第３のポリヌクレオチドが、該開始配列に連続し、そして該第３のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該第２のポリヌクレオチドの突出部に相補的でない該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｅ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｂ）の開始ポリヌクレオチドとｃ）の第２のポリヌクレオチドおよびｄ）の第３のポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触が、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じ、該開始配列が、２方向に伸長される、工程；
ｆ）プライマー伸長の非存在下で、ライゲーションに適する条件下でｅ）の混合物とリガーゼを必要に応じて接触させる工程；および
ｇ）ｂ）からｆ）を必要に応じて繰り返し、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に付加する工程であって、標的ポリヌクレオチドが合成される、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、これによって、前記標的ポリヌクレオチド配列が、標的ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記標的ポリペプチドがタンパク質である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記タンパク質が、酵素である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチド配列が、コンピュータープログラムによって同定される、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記コンピュータープログラムが、以下のアルゴリズムを含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約１５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約２０ヌクレオチド長から約５００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約２５ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約１５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約２０ヌクレオチド長から約５００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約２５ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドが固体支持体に付着された、方法。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、以下：
１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；３）第１の連続する配列および第２の連続する配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチドであって、該第１の連続する配列が、該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該第２の連続する配列が、該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、マイナス鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、工程；
ｃ）ｂ）の該マイナス鎖オリゴヌクレオチドに該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該工程が、５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖の開始ポリヌクレオチドを生じる、工程；
ｄ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する、第２のポリヌクレオチド配列を同定する工程であって、該第２のポリヌクレオチド配列が、該開始ポリヌクレオチド配列に連続し、そして該第２のポリヌクレオチドが、１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；３）第１の連続する配列および第２の連続する配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチドであって、該第１の連続する配列が、該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該第２の連続する配列が、該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、マイナス鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、工程
ｅ）ｄ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドに該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、該工程が、部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチドを生じ、該第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｆ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第３のポリヌクレオチドが、該開始配列に連続し、そして該第３のポリヌクレオチドが、１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；３）第１の連続する配列および第２の連続する配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチドであって、該第１の連続する配列が、該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であり、該第２の連続する配列が、該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である、マイナス鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、工程；
ｇ）ｆ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドに該第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび該第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、該工程が、部分的に二本鎖の第３のポリヌクレオチドを生じ、該第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的でありかつ該第２のポリヌクレオチドの突出部に相補的でない、工程；
ｈ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｃ）の開始ポリヌクレオチドとｅ）の第２のポリヌクレオチドおよびｇ）の第３のポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触させる工程が、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じ、該開始配列が、２方向に伸長される、工程；ならびに
ｉ）プライマー伸長の非存在下で、ライゲーションに適する条件下で、ｈ）の混合物とリガーゼとを必要に応じて接触させる工程；ならびに
ｊ）ｂ）からｉ）を必要に応じて繰り返し、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に付加する工程であって、これにより標的ポリヌクレオチドが合成される、工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされた少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含む、工程；
ｃ）プライマーアニーリングに適する条件下で、該開始ポリヌクレオチドと第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有し、そして第２のオリゴヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有する、工程；
ｄ）プライマー伸長に適する条件下で、以下：
１）該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；２）該アニーリングされた第１のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；３）該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；および４）該アニーリングされた第２のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成
を触媒する工程であって、該開始配列が、２方向に伸長され、これにより、新生の伸長された開始ポリヌクレオチドを形成する、工程；
ｅ）プライマーアニーリングに適する条件下で、ｄ）の該伸長された開始ポリヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、該第３のオリゴヌクレオチドが、該伸長された開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有し、そして第４のオリゴヌクレオチドが、該伸長された開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有する、工程；
ｆ）プライマー伸長に適する条件下で、以下：
１）該伸長された開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；２）該アニーリングされた第３のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；３）該伸長された開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；および４）該アニーリングされた第４のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、
を触媒する工程であって、該伸長された開始配列が、２方向に伸長され、これにより、新生の伸長された開始ヌクレオチドを形成する、工程；
ｇ）所望の場合ｅ）からｆ）を必要に応じて繰り返し、標的ポリヌクレオチド配列の形成を生じる、工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、前記標的ポリヌクレオチド配列が、標的ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、前記標的ポリペプチドがタンパク質である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記タンパク質が、酵素である、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチド配列が、アルゴリズムによって同定される、方法。
【請求項２０】
標的ポリヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、少なくとも５’突出部または３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じている、工程；
ｃ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第２のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第２のポリヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドに連続し、そして該第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始ポリヌクレオチドの該突出部に相補的である、工程；
ｄ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｂ）の開始ポリヌクレオチドとｃ）の第２のポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触させる工程が、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じ、該開始配列が、１方向に伸長される、工程；
ｅ）プライマー伸長の非存在下で、ライゲーションに適する条件下で、ｅ）の混合物とリガーゼとを必要に応じて接触させる工程；および；
ｆ）ｂ）からｅ）を必要に応じて繰り返し、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に付加する工程であって、これにより標的ポリヌクレオチドが合成される、工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約１５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約２０ヌクレオチド長から約５００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記プラス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記プラス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記プラス鎖が、約２５ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約１５ヌクレオチド長から約１０００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約２０ヌクレオチド長から約５００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドの前記マイナス鎖、前記第２のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖または前記第３のポリヌクレオチドの前記マイナス鎖が、約２５ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長である、方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法であって、前記開始ポリヌクレオチドが固体支持体に付着された、方法。
【請求項２８】
標的ポリヌクレオチドによってコードされる標的ポリペプチドを単離するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該プラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じている、工程；
ｃ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第２のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第２のポリヌクレオチドが、該開始配列に連続し、そして該第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始配列の少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｄ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第３のポリヌクレオチドが、該開始配列に連続し、そして該第３のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該第２のポリヌクレオチドの突出部に相補的でない該開始配列の少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｅ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｂ）の開始ポリヌクレオチドとｃ）の第２のポリヌクレオチドおよびｄ）の第３のポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触させる工程が、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じ、該開始配列が、２方向に伸長される、工程；
ｆ）プライマー伸長の非存在下で、ライゲーションに適する条件下でｅ）の混合物とリガーゼを必要に応じて接触させる工程；
ｇ）ｂ）からｆ）を必要に応じて繰り返し、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して、伸長された開始配列に二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に付加する工程であって、これにより標的ポリヌクレオチドが合成される、工程；
ｈ）発現ベクター中に、ｇ）の標的ポリヌクレオチドを組み込む工程；
ｉ）適切な宿主細胞中に、ｈ）の発現ベクターを導入する工程；
ｊ）該標的ポリヌクレオチドによってコードされる該標的ポリペプチドの発現を促進するような条件で、かつそのような時間にわたり、ｉ）の細胞を培養する工程；ならびに
ｋ）該標的ポリペプチドを単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記標的ポリペプチドが、キメラタンパク質である、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記標的ポリペプチドが、融合タンパク質である、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記発現ベクターが、細菌性発現ベクターである、方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、前記発現ベクターが、動物細胞発現ベクターである、方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記発現ベクターが、昆虫細胞発現ベクターである、方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法であって、前記発現ベクターが、レトロウイルスベクターである、方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法であって、前記発現ベクターが、宿主細胞中に含まれる、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、原核生物細胞でる、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記宿主細胞が、真核生物細胞でる、方法。
【請求項３８】
請求項１、１４、１５または２７のいずれか一項に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、自動化されたＤＮＡ合成機での合成によって産生される、方法。
【請求項３９】
標的ポリヌクレオチドを合成するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）複数の一本鎖オリゴヌクレオチドを化学的に合成する工程であって、該複数の一本鎖オリゴヌクレオチドの各々が、複数存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに部分的に相補的であり、該複数のオリゴヌクレオチドの該配列が、該標的ポリヌクレオチドの連続する配列である、工程；
ｃ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｂ）の部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、該接触させる工程が、複数の部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じ、各々の二本鎖のポリヌクレオチドが、５’突出部および３’突出部を含む、工程；
ｄ）該モデル配列から誘導された少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、ｃ）に示される複数の二本鎖ポリヌクレオチド中に存在する、工程；
ｅ）プライマー伸長の非存在下で、該開始ポリヌクレオチドおよび１）該開始配列の５’部分にアニーリングする、二本鎖ポリヌクレオチド；２）該開始ポリヌクレオチドの３’部分にアニーリングする、二本鎖ポリヌクレオチド；３）ＤＮＡリガーゼ、を含む混合物を、アニーリングおよびライゲーションに適する条件下に供する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、２方向に伸長される、工程；
ｆ）アニーリングの繰り返しサイクルを通して、該伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを連続的にアニーリングする工程であって、これによって、該標的ポリヌクレオチドが、産生される、工程；
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載される方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、自動化されたＤＮＡ合成機上での合成によって、産生される、方法。
【請求項４１】
標的ポリヌクレオチド配列を作製するための、コンピューター読みとり可能な媒体に保存された、コンピュータープログラムであって、該コンピュータープログラムが、以下のコンピューターシステムに以下：
ａ）該標的ポリヌクレオチド配列中に含まれる開始ポリヌクレオチド配列を同定する工程
ｂ）複合的には別であり、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドに該標的ポリヌクレオチド配列を解析する工程
ｃ）部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの連続的な付加により該開始ポリヌクレオチド配列の２方向の伸長を制御することによって、該標的ポリヌクレオチド配列のアセンブリを制御する工程であって、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じる、工程、
をさせるための指示を含む、コンピュータープログラム。
【請求項４２】
請求項４１に記載のコンピュータープログラムであって、前記解析が、アルゴリズムによって実施される、コンピュータープログラム。
【請求項４３】
請求項４２に記載のコンピュータープログラムであって、前記アルゴリズムが、以下：
【数１】
2004533228.tif 000019
を含み、
＄ｏｌｉｇｏｎａｍｅが、リストおよび各々の成分オリゴヌクレオチドについての識別名であり；
＄ＯＬが、各々の成分オリゴヌクレオチドの長さであり；
＄Ｏｖｅｒｌａｐが、各々の順方向のオリゴヌクレオチドと各々の逆方向のオリゴヌクレオチドとの間の塩基のオーバーラップの長さであり；
＄ｓｅｑｕｅｎｃｅが、ＤＮＡ塩基配列であり；
＄ｓｅｑｌｅｎが、該ＤＮＡ塩基配列の長さであり；
＄ｂａｓが、配列中の個々の塩基であり；
＄ｆｏｒｓｅｑが、順方向のオリゴヌクレオチドの配列であり；
＄ｒｅｖｓｅｑが、逆方向のオリゴヌクレオチドの配列であり；
＄ｒｅｖｃｏｍｐが、遺伝子の逆方向の相補的配列であり；
＄ｏｌｉｇｏｎａｍｅＦ−［］が、解析された順方向のオリゴのリストであり；
＄ｏｌｉｇｏｎａｍｅＲ−［］が、解析された逆方向のオリゴのリストである、
コンピュータープログラム。
【請求項４４】
請求項４３に記載のコンピュータープログラムであって、前記順方向の配列が、以下
【数２】
2004533228.tif 000020
を含むアルゴリズムを用いて、大文字に必要に応じて変換され；
ここで、
＄ｓｅｑｌｅｎが、前記ＤＮＡ塩基配列の長さであり；
＄ｂａｓが、配列中の個々の塩基であり；
＄ｆｏｒｓｅｑが、順方向のオリゴヌクレオチドの配列である、
コンピュータープログラム。
【請求項４５】
モデル配列から誘導された標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを合成するための、コンピューターに基づく方法であって、該方法が、プロセッサー、インプットデバイス、およびアウトプットデバイスを含むプログラムされたコンピューターを用い、該方法が、以下：
ａ）該インプットデバイスを介して、該プログラムされたコンピュータにデータをインプットする工程であって、該データが、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む、工程
ｂ）該プロセッサーを用いて、該標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドの配列を決定する工程
ｃ）該プロセッサーを用い、該標的ポリヌクレオチド配列中の該開始配列の位置に基づいて、該標的ポリヌクレオチド配列を合成するためのモデルを選択する工程であって、該工程が、生物学的系における該標的ポリペプチドの発現に必要な全ての配列パラメーターを用いる、工程；ならびに
ｄ）該アウトプットデバイスに、該少なくとも１つの決定の結果をアウトプットする工程；
を包含する方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記標的ポリヌクレオチドへの前記モデル配列の変化が、該標的ポリヌクレオチドによってコードされる前記標的ポリペプチドに効果を有するか否かを、該モデル配列の少なくとも１つの物理学的特徴、構造的特徴または系統発生的特徴に基づいて前記プロセッサーを使用して予想する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４７】
標的ポリヌクレオチド配列の自動化された合成のための方法であって、該方法が、以下：
ａ）使用者に、所望の標的ポリヌクレオチド配列と連絡をする機会を提供する、工程；
ｂ）該使用者の、サーバーへの該所望の標的ポリヌクレオチド配列の送信を可能とする工程；
ｃ）該使用者に、特徴的な指示を提供する、工程；
ｄ）該使用者によって提供された、該送信された標的ポリヌクレオチド配列を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、以下：
ｆ）ｅ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該プラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じている工程；
ｇ）ｅ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第２のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第２のポリヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドに連続し、そして該第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、該第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｈ）ｅ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する、第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、該第３のポリヌクレオチドが、該開始配列に連続し、そして該第３のポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされて、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じており、第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部が、該第２のポリヌクレオチドの突出部に相補的でない該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部に相補的である、工程；
ｉ）アニーリングに適する条件下かつそのような時間にわたりｆ）の開始ポリヌクレオチドとｇ）の第２のポリヌクレオチドおよびｈ）の第３のポリヌクレオチドとを接触させる工程であって、該接触させる工程が、連続的な二本鎖ポリヌクレオチドを生じ、該開始配列が、２方向に伸長される、工程；
ｊ）プライマー伸長の非存在下で、ライゲーションに適する条件下でｉ）の混合物とリガーゼを必要に応じて接触させる工程；および
ｋ）ｆ）からｋ）を必要に応じて繰り返し、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に付加する工程であって、これにより標的ポリヌクレオチドが合成される、工程をさらに包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法であって、以下：
ｆ）ｅ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程であって、該開始ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み、該プラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングされる工程；
ｇ）プライマーアニーリングに適する条件下で、該開始ポリヌクレオチドと該第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、該第１のオリゴヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有し、そして該第２のオリゴヌクレオチドが、該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有する、工程；
ｈ）プライマー伸長に適する条件下で、以下：１）該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；２）該アニーリングされた第１のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；３）該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；および４）該アニーリングされた第２のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、
を触媒する工程であって、該開始配列が、２方向に伸長され、これにより、新生の伸長された開始ポリヌクレオチドを形成する、工程；
ｉ）プライマーアニーリングに適する条件下で、ｈ）の伸長された開始ポリヌクレオチドと第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、該第３のオリゴヌクレオチドが、該伸長された開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有し、そして第４のオリゴヌクレオチドが、該伸長された開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’部分に対する部分的相補性を有する、工程；
ｊ）プライマー伸長に適する条件下で、以下：
１）該伸長された開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；２）該アニーリングされた第３のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；３）該伸長された開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成；および４）該アニーリングされた第４のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、
を触媒する工程であって、該伸長された開始配列が、２方向に伸長され、これにより、新生の伸長された開始ヌクレオチドを形成する、工程；ならびに
ｋ）所望の場合ｆ）からｊ）を必要に応じて繰り返し、該標的ポリヌクレオチド配列の形成を生じる、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５０】
ポリヌクレオチドの自動化された合成のための方法であって、該方法が、以下：
ａ）使用者に、モデルポリヌクレオチド配列に連絡するための機構を提供する、工程；
ｂ）使用者に、所望の場合、該モデル配列に対する少なくとも１つの所望の改変に連絡をする機会を必要に応じて提供する、工程；
ｃ）該使用者の、サーバーへの所望の改変および該モデル配列の送信を可能とする工程；
ｄ）使用者に、特徴的な指示を提供する、工程；
ｅ）該使用者によって提供された、該送信されたモデル配列および所望の改変を得る工程；
ｆ）インプットデバイスを介して、プログラムされたコンピュータにデータをインプットする工程であって、該データが、該モデルポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む、工程；
ｇ）該プロセッサーを用いて、該所望の改変を有する該モデルポリヌクレオチド配列の該配列を決定する工程；
ｈ）さらに、該プロセッサーを用いて、該モデルポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を決定する工程；
ｉ）該プロセッサーを用い、該モデルポリヌクレオチド配列中の該開始配列の該部分に基いて、該改変モデルポリヌクレオチド配列を合成するためのモデルを選択する工程；ならびに
ｊ）該アウトプットデバイスに、該少なくとも１つの決定の結果をアウトプットする工程；
を包含する、方法。
【請求項５１】
単離されたポリヌクレオチド組成物であって、以下：
ａ）プラス鎖およびマイナス鎖を含む開始ポリヌクレオチドであって、該プラス鎖または該マイナス鎖が、固体支持体に結合する部分を組み込むように改変された、開始ポリヌクレオチド；
ｂ）プライマー伸長に適する第１のプライマーであって、該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の該３’部分に部分的に相補性を有する、第１のプライマー；
ｃ）プライマー伸長に適する第２のプライマーであって、該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の該３’部分に部分的に相補性を有する、第１のプライマー；および
ｄ）固体支持マトリクス、
を含み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々が、約２５ヌクレオチドから約１０００のヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチド組成物。
【請求項５２】
単離されたポリヌクレオチド組成物であって、以下：
ａ）プラス鎖およびマイナス鎖を含む開始ポリヌクレオチドであって、該プラス鎖または該マイナス鎖が、固体支持体に結合する部分を組み込むように改変された、開始ポリヌクレオチド；
ｂ）プライマー伸長に適する第１のプライマーであって、該開始ポリヌクレオチドの該プラス鎖の該３’部分に部分的に相補性を有する、第１のプライマー；
ｃ）プライマー伸長に適する第２のプライマーであって、該開始ポリヌクレオチドの該マイナス鎖の該３’部分に部分的に相補性を有する、第１のプライマー；および
ｄ）固体支持マトリクス、
を含み、該第１のプライマーおよび該第２のプライマーの各々が、約２５ヌクレオチドから約１０００のヌクレオチドからなる、単離されたポリヌクレオチド組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概してバイオインフォマティクスの分野に関し、より具体的には、コンピュータ指向性のポリヌクレオチド構築のための方法、アルゴリズムおよび装置に関する。本発明はさらに、本発明によって構築されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
酵素、抗体、レセプターおよびリガンドは、ポリペプチドであり、生物体の環境の範囲内で、非常に特異的な生物学的機能をなすための選択圧によって進化してきた。特定の技術的適用のためのポリペプチドの使用においては、このポリペプチドが、進化的に選択されなかった環境中または基質に対して機能することを必要とし得る。極端な環境中で繁栄する微生物から単離されたポリペプチドは、これらの分子が、概して、構造および機能に関して適応力があることの十分な証拠を提供する。しかし、その自然な環境からポリペプチドを単離するためのプロセスは、費用がかかり、そして時間を浪費する。従って、所望の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝物質を合成的に進化させるための新しい方法が、必要とされる。
【０００３】
遺伝子工学操作のための遺伝物質を得るための２つの方法がある：（１）天然の供給源に由来するＤＮＡまたはＲＮＡの形態のポリヌクレオチドの単離および精製、または（２）種々の化学−酵素学的な方法を使用するポリヌクレオチドの合成。前者の方法は、特定の改変のために利用が容易ではない、天然に存在する配列に限定される。後者の方法は、より複雑で大きな労働力を必要とする。しかし、化学−酵素学的方法は、多くの魅力的な特徴を有し、任意の有意な限定なしに、任意の所望のポリヌクレオチド配列を調製する実現性を有している。
【０００４】
現在、オリゴヌクレオチドを長いポリヌクレオチドフラグメントにする合成的構築について２つの一般的な方法が存在する。第１として、合成される配列全体にわたるオリゴヌクレオチドを、はじめにアニールし、次いで、リガーゼでニックを修復する。次いで、フラグメントを、直接クローン化するか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した後クローン化する。続けて、ポリヌクレオチドを、より長い配列にするインビトロ構築のために使用する。遺伝子合成のための一般的な第２の方法は、オリゴヌクレオチドのアニールされたペアにおける１本鎖中のギャップを埋めるためにポリメラーゼを使用する。ポリメラーゼ反応の後、オリゴヌクレオチドの１本鎖領域は、２本鎖になり、そして制限エンドヌクレアーゼで消化した後、直接的にクローン化され得るかまたは異なる２本鎖フラグメントをライゲーションすることによって、より長い配列のさらなる構築のために使用され得る。代表的には、このポリメラーゼ反応に続き、長いＤＮＡフラグメントの合成を有意に遅らせ、そして、この方法の有効性を大きく減じるセグメントの各々を、クローン化しなければならない。
【０００５】
完全に新規のポリペプチドの生成、または存在するポリヌクレオチドの実質的な改変は、非常に時間を浪費し、費用がかかり、複雑な多数の工程を必要とし、そして場合によっては不可能なことがある。従って、任意の所望の配列のポリヌクレオチドを合成的に組み立てるための効果的な手段について、大きな必要性が存在する。このような方法は、広く適用され得る。例えば、この方法は、既知の配列中に特定の置換を有するポリヌクレオチドのアレイを効果的に作製するために使用され得、これは発現されそして機能の改善についてスクリーニングされる。本発明は、効果的でそして強力な方法ならびに標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドの合成のための組成物を提供することによって、これらの必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、核酸配列（遺伝子全体、染色体部分、染色体およびゲノムを含む）を生成するための迅速で、効果的な手段を提供することにより、現在の組換え核酸操作法における限界に取り組む。この手段は、完全に合成的方法に基づくので、核酸のさらに非常に大きなセグメントの構築を妨げる、存在する核酸の入手可能性のような、制限がない。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を合成する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する；ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）標的ポリヌクレオチド中に存在する、少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド（少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールした結果生じる、５’突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）と３’突出部を有する、部分的な２本鎖ポリヌクレオチドを含む）を同定する工程；ｃ）標的ポリヌクレオチド中に存在する第２のポリヌクレオチドを同定する工程であって、第２のポリヌクレオチドは、開始ポリヌクレオチドに連続し、そして少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールした結果生じる、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を有する、部分的な２本鎖ポリヌクレオチドを含み、ここで、第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補的である；ｄ）標的ポリヌクレオチド中に存在する第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、第３のポリヌクレオチドは、開始配列に連続し、そして少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールした結果生じる、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を有する、部分的な２本鎖ポリヌクレオチドを含み、ここで、第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補的であり、この開始ポリヌクレオチドの突出部は、第２のポリヌクレオチドの突出部と相補的ではない；ｅ）開始ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドとをアニーリングのために適切な条件の下で適切な時間接触させる工程であって、この接触は、結果として連続する２本鎖ポリヌクレオチドを生じ、結果として開始ポリヌクレオチドの双方向性の伸長を導く；ｆ）プライマー伸長がなかった場合、ライゲーションに適する条件下で、ｅ）の混合物とリガーゼとを必要に応じて接触させる工程；およびｇ）ｂ）からｆ）までの工程を必要に応じて繰り返して、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して、連続的に２本鎖ポリヌクレオチドを、伸長される開始ポリヌクレオチドに付加する工程であって、これによって標的ポリヌクレオチドが、合成される、工程。
【０００８】
本発明はさらに、標的ポリヌクレオチドを合成する方法を提供し、以下の工程を包含する：ａ）モデル配列由来の標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定する工程であって、ここで開始ポリヌクレオチドは：１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第１の連続配列、および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第２の連続配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む、工程；ｃ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドを、ｂ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程であって、その結果、５’突出部および３’突出部を含む開始ポリヌクレオチドの部分的な２本鎖を導く、工程；ｄ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列に存在する第２のポリヌクレオチド配列を同定する工程であって、ここで第２のポリヌクレオチド配列は、開始ポリヌクレオチド配列に連続し、そして：１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；および；３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第１の連続配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第２の連続配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む、工程；ｅ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドを、ｄ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程であって、その結果、第２のポリヌクレオチドの部分的な２本鎖を導き、ここで第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補的である、工程；ｆ）ａ）の標的ポリヌクレオチドに存在する第３のポリヌクレオチドを同定する工程であって、ここで第３のポリヌクレオチドは、開始配列に連続し、そして：１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド；２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと連続する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド；および；３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第１の連続配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第２の連続配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む、工程；ｇ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドを、ｆ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングさせる工程であって、その結果、第２のポリヌクレオチドの部分的な２本鎖を導き、ここで第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補的であり、そして第２のポリヌクレオチドとは相補的ではない、工程；ｈ）ｃ）の開始ポリヌクレオチドとｅ）の第２のポリヌクレオチドおよびｇ）の第３のポリヌクレオチドとをアニーリングのために適切な条件の下で適切な時間接触させる工程であって、この接触は、結果として連続する２本鎖ポリヌクレオチドを生じ、ここで、開始配列は、双方向に伸長される、工程；ｉ）プライマー伸長がない場合、ライゲーションに適する条件下で、ｈ）の混合物とリガーゼとを選択的に接触させる工程；およびｊ）ｂ）からｉ）までの工程を必要に応じてに繰り返して、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通して、連続的に２本鎖ポリヌクレオチドを、伸長される開始ポリヌクレオチドに付加する工程であって、これによって標的ポリヌクレオチドが、合成される、工程。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する；ａ）モデル配列から得られる標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定する工程であって、この標的ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニールされる少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含む、工程；ｃ）プライマーアニーリングのために適する条件の下で、開始ポリヌクレオチドと、開始オリゴヌクレオチドのプラス鎖の３’部分と部分的に相補性を有する第１のオリゴヌクレオチドおよび開始オリゴヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分と部分的に相補性を有する第２のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；ｄ）プライマー伸長に適する条件の下で触媒する工程であって、上記のプライマー伸長が、以下：１）開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；２）アニールした第１のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；３）開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；および４）アニールした第２のオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成であって、上記の触媒する結果として開始配列の双方向性の伸長を導き、これによって伸長した新生の開始ポリヌクレオチドを形成する、工程；ｅ）プライマーアニーリングのために適切な条件の下でｄ）の伸長した開始ポリヌクレオチドと、伸長した開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’部分に対して部分的な相補性を有する第３のオリゴヌクレオチド、および伸長した開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分に対して部分的な相補性を有する第４のオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；ｆ）プライマー伸長に適する条件の下で触媒する工程であって、上記のプライマーの伸長が、以下：１）伸長した開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；２）アニールした第３のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；３）伸長した開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成；および４）アニールした第４のオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルからのポリヌクレオチドの合成であって、上記触媒する結果として開始配列の双方向性の伸長を導き、これによって伸長した新生の開始ポリヌクレオチドを形成する、工程；そしてｇ）所望であれば、ｅ）からｆ）までの工程を必要に応じて繰り返して、結果として標的ポリヌクレオチドを形成する工程。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の方法によって産生される標的ポリヌクレオチドによってコードされる標的ポリペプチドを単離するための方法を提供し、以下の工程による；ａ）発現ベクター中に標的ヌクレオチドを組み込む工程；ｂ）発現ベクターを適切な宿主細胞の中に導入する工程；ｃ）標的ポリヌクレオチドによってコードされる標的ポリペプチドの発現を促進するための条件下でおよび期間の間、細胞を培養する工程；およびｄ）標的ポリペプチドを単離する工程。
【００１１】
本発明は、さらに標的ポリヌクレオチドを合成する方法を提供し、以下の工程を包含する；ａ）モデル配列から得られる標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）多数の１本鎖オリゴヌクレオチドを化学的に合成する工程であって、１本鎖オリゴヌクレオチドの各々は、大多数に存在する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに部分的に相補的であり、ここで、多数のオリゴヌクレオチドの配列は、標的ポリヌクレオチドの連続配列である；ｃ）部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを、アニーリングのために適切な条件の下で適切な時間接触させる工程であって、この接触は、結果として多数の部分的な２重鎖ポリヌクレオチドを生じ、ここで、各２本鎖ポリヌクレオチドは、５’突出部および３’突出部を含む、工程；ｄ）大多数の２本鎖ポリヌクレオチド中に存在するモデル配列由来の少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド同定する工程；ｅ）プライマー伸長がない場合、開始ポリヌクレオチドならびに以下を含む混合物、１）上記の開始配列の５’部分とアニールする２本鎖ポリヌクレオチド；２）開始ポリヌクレオチドの３’部分とアニールする２本鎖ポリヌクレオチド；および３）ＤＮＡリガーゼを、アニーリングおよびライゲーションのために適切な条件下に供する工程であって、ここで、開始ポリヌクレオチドは、双方向に伸長される、工程；ｆ）引き続いて、２本鎖ポリヌクレオチドを、アニーリングの繰り返しのサイクルを介して伸長した開始ポリヌクレオチドとアニーリングする工程であって、それによって標的ポリヌクレオチドが産生される、工程。
【００１２】
本発明はさらに、モデル配列由来の標的ポリヌクレオチド配列を生成するための、コンピュータで読みとり可能な媒体に保存された、コンピュータプログラムを提供し、このコンピュータプログラムは、コンピュータシステムを作動するための命令を包含し、この命令は以下：ａ）標的ポリヌクレオチド配列に含まれる開始ポリヌクレオチド配列を同定する工程；ｂ）標的ポリヌクレオチド配列を、多数の別個の、部分的に相補的な、オリゴヌクレオチドにして解析（ｐａｒｓｅ）工程；ｃ）部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを連続的に付加し、結果として連続する２本鎖ポリヌクレオチドを導くことによって、開始ポリヌクレオチド配列の双方向性の伸長を制御することによって、標的ポリヌクレオチド配列の構築を制御する工程。
【００１３】
本発明はさらに、標的ポリヌクレオチド配列を自動的に合成するための方法を提供し、以下の工程を含む：ａ）使用者に所望の標的ポリヌクレオチド配列を伝えるための機会を提供する工程；ｂ）使用者が、所望の標的ポリヌクレオチド配列をサーバーに送信する工程；ｃ）使用者に独自の名称を提供する工程；ｄ）使用者によって提供された送信された標的ポリヌクレオチド配列を、獲得する工程。
【００１４】
本発明はさらに、ポリヌクレオチド配列を自動的に合成するための方法を提供し、以下の工程を含む：ａ）使用者に、モデルポリヌクレオチド配列を伝達するための機構を提供する工程；ｂ）所望の場合、モデル配列について少なくとも１つの所望の改変を伝達する機会を、使用者に必要に応じて提供する工程；ｃ）使用者が、モデル配列および所望の改変をサーバーに送信することを可能にする工程；ｄ）使用者に、独自の名称を提供する工程；ｅ）使用者によって提供された、送信されたモデル配列および任意の所望の改変を獲得する工程；ｆ）入力デバイスを介して、プログラムされたコンピュータにデータを入力する工程であって、データは、モデルポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む、工程；ｇ）プロセッサーを使用して、所望の改変を含むモデルポリヌクレオチド配列の配列を決定する工程；ｈ）プロセッサーを使用して、モデルポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも一つの開始ポリヌクレオチド配列を、さらに決定する工程；ｉ）プロセッサーを使用して、モデルポリヌクレオチド中の開始配列の位置に基づき、改変されたモデルポリヌクレオチド配列を合成するためのモデルを選択する工程；ならびに、ｊ）少なくとも１つの決定の結果を、出力デバイスに、出力する工程。
【００１５】
他に規定がなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって共通して理解されるのと同一の意味を持つ。例えば、アミノ酸についての１文字表記および３文字表記ならびにヌクレオチドについての１文字表記は、共通して理解される。本明細書中に記載されるのと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示であり、それに限定されることを意図しない。本明細書中に言及される全ての刊行物および特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が、支配する。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面において示されそして以下に記載される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および図面からならびに特許請求の範囲から明らかにされる。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
ヒトゲノムを含む複雑なゲノムの完全な配列は、遺伝的可能性に対する大規模な機能的方法をもたらす。本発明は、ヒトゲノムデータベースのようなデータベースで利用可能な情報に基づくコンピューター指向性ポリヌクレオチドアセンブリによるゲノム配列情報の結果を利用する新規な方法を概説する。詳細には、本発明は、標的ポリペプチドをコードする新規な合成的標的ポリヌクレオチド配列を、合成、アセンブルおよび選択するために使用され得る。標的ポリヌクレオチドは、天然（野生型）またはモデルのポリヌクレオチド配列によってコードされるモデルポリペプチドと比較して、増強または変更された生物学的活性を示す標的ポリペプチドをコードし得る。続いて、標準的なアッセイは、発現された標的ポリペプチドの活性を調査するために使用され得る。例えば、発現された標的ポリペプチドは、対応するモデルポリペプチドの機能を果たすようなその活性を決定するためか、または標的ポリペプチドが産生された新たな機能を示すかどうかを決定するためにアッセイされ得る。従って、本発明は、コンピューター指向性の様式で、モデルポリペプチドに由来する標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することによって、モデルポリペプチドを合成的に進化させるための手段を提供する。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を提供すること、および少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールされて、５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを含有する部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じている、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含有する、標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定することによって、標的ポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、「標的ポリヌクレオチド配列」とは、本発明の方法によって合成され得る標的ポリペプチドをコードするために適切ないずれかの核酸配列を含む。標的ポリヌクレオチド配列は、核酸の配列をアセンブルし得る装置を使用して標的ポリヌクレオチドを生成するために使用され得る。一般に、標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖領域を有するＤＮＡの直鎖状セグメントであり；このセグメントは、相補領域を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって作製されるような十分に長い任意の長さであり得る。標的ポリヌクレオチドは、１００、２００、３００、４００、８００、１００、１５００、２００、４０００、８０００、１００００、１２０００、１８０００、２００００、４００００、８００００かまたはそれ以上の塩基対長であり得ることが企図される。さらに、本発明の方法は、公知の細菌、酵母、ウイルス、哺乳動物、両生類、爬虫類、または鳥類のゲノムと比較可能な長さの完全に人工的なゲノムを作製し得ることが企図される。より詳細な実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードする遺伝子である。標的ポリヌクレオチドは、さらに、複製起点、テロメア、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳の開始シグナルならびに停止シグナル、イントロン、エキソンスプライス部位、染色質骨格成分、そして他の調節配列のような、非コードエレメントを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、多重遺伝子、染色体のセグメント、染色体および完全なゲノムでさえも包含し得る。本発明のポリヌクレオチドは、細菌、酵母、ウイルス、哺乳動物、両生類、爬虫類、鳥類、植物、古細菌およびＤＮＡを含有する他の生物を含む、原核生物配列または真核生物配列に由来し得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、２つ以上、好ましくは３つより多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。その正確な大きさは、反応温度、塩濃度、変性剤（例えば、ホルムアミド）、およびオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするように企図される配列との相補性の程度のような、多くの因子に依存する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかに存在するヌクレオチドについて言及し得、従って、塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、デオキシリボースまたはリボースである糖部分を組込むヌクレオチドを含む。しかし、従来の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル）の１つと塩基対形成し得る他の改変された塩基は、本発明中で使用されるオリゴヌクレオチドに使用され得ることが理解される。このような改変された塩基としては、例えば、８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。所望される場合、ヌクレオチドが、プライマー伸長産物中への組込みの際に、これらは、例えば、固相上に捕獲するための、プライマー伸長産物に関連するシグナルを増強するような標識またはマーカーを保有し得る。
【００２１】
「プラス鎖」オリゴヌクレオチドとは、慣例により、配列を読む場合、左側が５’末端で始まる、短い、一本鎖のＤＮＡセグメントを含む。「マイナス鎖」オリゴヌクレオチドとは、配列を読む場合、左側が３’末端で始まる、短い、一本鎖のＤＮＡセグメントを含む。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｔｅ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）（本明細書中にその全体が参考として援用される）に見出される。固相合成技術は、例えば、多数の「ピン（ｐｉｎ）」（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．（１９８７）１０２：２５９−２７４（本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）における、いくつかのペプチド配列の合成のために提供されてきた。
【００２２】
短時間で、オリゴヌクレオチドおよび他のポリマー配列の大きなアレイを形成するさらなる方法は、発明されてきた。特に注目すべき、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／１５０７０もまた参照のこと）、Ｆｏｄｏｒら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１００９２およびＷｉｎｋｌｅｒら、米国特許第６，１３６，２６９号（全てが、本明細書中に参考として援用される）は、例えば、光指向性合成技術を使用して、ポリマー配列の巨大なアレイを形成する方法を開示する。本明細書中にその全てが参考としてさらに援用される、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７もまた参照のこと。いくつかの研究は、ポリマーアレイの自動化合成に対してなされてきた。例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８９／１０９７７は、基板上の１２の異なる位置に３つの異なるモノマーを沈着するために従来のペンプロッターの使用を記載する。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「開始ポリヌクレオチド配列」は、標的ポリヌクレオチド配列中に含まれる配列であり、そして本発明のアルゴリズムによって同定される。「開始ポリヌクレオチド」は、開始ポリヌクレオチド配列の物理的な具体的表現である。標的ポリヌクレオチドのライゲーションアセンブリについて、開始ポリヌクレオチドは、開始ポリヌクレオチドに隣接する次のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのアンカーを提供することによってアセンブリを開始する。従って、ライゲーションアセンブリについて、開始ポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖の核酸であり、それによって隣接する二本鎖の核酸分子のアニーリングのための一本鎖のオーバーハングを提供する。標的ポリヌクレオチドのプライマー伸長アセンブリについて、開始ポリヌクレオチドは、開始ポリヌクレオチドに隣接する次のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのテンプレートを提供することによってアセンブリを開始する。従って、プライマー伸長アセンブリについて、開始ポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖であるか、または完全に二本鎖であり得る。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明の開始ポリペプチドヌクレオチドは、改善された効率で固体支持体に結合され得る。固相は、反応の他の成分からのアセンブルされた標的ポリヌクレオチドの効率的な分離を可能にする。異なる支持体が、この方法において適用され得る。例えば、支持体は、反応混合物から所望の産物が磁気的に分離され得る磁気ラテックスビーズまたは磁気コントロールポア（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｒｅ）ガラスビーズであり得る。このようなビーズに対する開始ポリヌクレオチドの結合は、種々の公知の方法（例えば、カルボジイミド処理）によって達成され得る（Ｇｉｌｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ７：２８０９−２８１３（１９６８）；ＭｉｚｕｔａｎｉおよびＴａｃｈｂａｎａ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３５６：２０２−２０５（１９８６）；Ｗｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：２９１１−２９２６（１９８７）；Ｍｕｓｓｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５３５３−５３７２（１９８７）；Ｌｕｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８６１−１０８８０（１９８８））。
【００２５】
固相に連結された開始ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの引き続く合成のためのアンカーとして作用し得る。アセンブリは、ライゲーションアセンブリのためのリガーゼを伴う隣接するポリヌクレオチドの添加によってか、またはプライマー伸長アセンブリのためのポリメラーゼを伴うオリゴヌクレオチドの添加によって、達成され得る。適切なインキュベーション時間の後、この方法の非結合成分は、洗い出され得、そして反応は、テンプレート利用の効率を改善するために再び繰り返され得る。代替的に、別のセットのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アセンブリを継続するために添加され得る。
【００２６】
合成のために効率的に使用される固相は、長い核酸分子の合成のための十分な空間を有する細孔を含み得る。この固相は、反応のいずれかの所望されない成分に非特異的に結合し得ない物質から構成され得る。この問題を解決するための１つの方法は、長いＤＮＡ分子に対して適切なコントロールポアガラスビーズを使用することである。開始ポリヌクレオチドは、長いコネクターを介してビーズに連結され得る。このコネクターの役割は、開始ポリヌクレオチドを固体支持体の表面から望ましい距離に配置することである。
【００２７】
本発明の方法は、さらに、標的ポリヌクレオチド中に存在する第２のポリヌクレオチド配列を同定することを包含し、これは、開始ポリヌクレオチドと隣接し、そして５’オーバーハング、３’オーバーハング、あるいは第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングが、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングに相補的である５’オーバーハングおよび３’オーバーハングから構成される、部分的に二本鎖のポリヌクレオチドを生じる、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドに対してアニールされる、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含有する。相補領域を有する２つ以上のオリゴヌクレオチドは、可能である場合、適切な条件下で、「アニール」（すなわち、塩基対形成）し、それによって二本鎖の領域を生成する。アニール（すなわち、ハイブリダイズ）するために、オリゴヌクレオチドは、少なくとも部分的に相補的でなければならない。用語「に対して相補的」とは、別の特定のヌクレオチドと塩基対形成するヌクレオチドを意味するために、ヌクレオチドに関連して本明細書中で使用される。従って、アデノシン三リン酸は、ウリジン三リン酸またはチミジン三リン酸に対して相補的であり、そしてグアノシン三リン酸は、シチジン三リン酸に対して相補的である。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、５’または３’「オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）」とは、一本鎖である（すなわち、塩基対形成していない）ポリヌクレオチドの末端、５’もしくは３’、もしくは５’および３’上の領域を意味する。オーバーハングは、隣接するポリヌクレオチドのオーバーハングに対して相補的であるオーバーハングを含有する、隣接するポリヌクレオチドの引き続くアニーリングのための手段を提供する。想定される適用に応じて、アニーリング選択性の程度の変更を達成するために、アニーリング条件の変更を使用することが所望される。
【００２９】
高い選択性を要求する適用について、代表的に、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件の使用が所望される。例えば、約５０℃〜約７０℃の温度にて約０．０２Ｍ〜約０．１０ＭのＮａＣｌによって提供されるような、比較的低塩条件および／または高温条件が選択される。このような高いストリンジェンシーな条件は、オリゴヌクレオチドおよびテンプレートまたは標的鎖との間のあったとしても、わずかなミスマッチを許容する。この条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントされ得ることが、一般的に理解される。
【００３０】
特定の適用について、例えば、部位特異的な変異誘発によるヌクレオチドの置換に対する類似性によって、低いストリンジェントな条件が使用され得ることが理解される。これらの条件下で、ハイブリダイゼーションは、プローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でないが、１つ以上の位置でミスマッチであるにもかかわらず生じ得る。条件は、塩濃度の増加および温度の減少によって、より低いストリンジェントを与えられ得る。例えば、中程度のストリンジェントな条件は、約３７℃〜約５５℃の温度にて約０．１Ｍ〜０．２５ＭのＮａＣｌによって提供され得るが、低いストリンジェントな条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度にて約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩によって提供され得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、所望される結果に依存して、容易に操作され得る。
【００３１】
特定の実施形態において、標識を用いることによりオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを決定することは有利である。広範な種々の適切な標識は、当該分野において公知であり、検出され得る、蛍光性、放射活性、酵素学的または他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む。好ましい実施形態において、放射活性または他の環境的に所望されない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ（例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ）を用いることが所望され得る。酵素タグの場合、比色定量の指示物質は、公知であり、これは、相補的オリゴヌクレオチドと特異的なハイブリダイゼーションを生じたか否かを同定するために、ヒトの眼に見える検出手段、または分光光度的な検出手段を提供するために用いられ得る。
【００３２】
固相に関する実施形態において、例えば、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、選択されたマトリクスまたは表面に対して、吸着されるか、またはさもなければ付着される。次いで、この固定化された一本鎖の核酸は、所望される条件下で、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに供される。選択される条件はまた、要求される特定の基準に基づく特定の環境に依存し、例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存する。非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去するためのハイブリダイズされた表面の洗浄に続いて、ハイブリダイゼーションは、標識によって、検出またはさらに定量化され得る。
【００３３】
本発明の方法は、さらに、標的ポリヌクレオチドに存在する第３のポリヌクレオチドを提供し、これは、開始配列と連続し、そして５’オーバーハング、３’オーバーハング、または５’オーバーハングおよび３’オーバーハングを提供し、ここで、第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングが、第２のポリヌクレオチドのオーバーハングに対して相補的でない、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングに対して相補的である。
【００３４】
この方法は、さらに、アニーリングに適切な条件および時間で、開始ポリヌクレオチドを、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドと接触させることを提供し、この接触が、隣接する二本鎖のポリヌクレオチドを生じ、その結果、開始ポリヌクレオチドの双方向の伸長を生じる。アニールされたポリヌクレオチドは、必要に応じて、ライゲーションに適切な条件下で、リガーゼと接触される。上記に議論された方法は、必要に応じて、アニーリングおよびライゲーションの繰り返しのサイクルを通じて、伸長された開始ポリヌクレオチドに対して、二本鎖のポリヌクレオチドを連続的に加えるように繰り返される。
【００３５】
標的ポリヌクレオチド配列は、新規に設計され得るか、または「モデルポリヌクレオチド配列」から誘導され得る。本明細書中に使用される場合、「モデルポリヌクレオチド配列」は、モデルポリペプチド配列をコードする任意の核酸配列を包含する。モデルポリペプチド配列は、標的ポリヌクレオチドが、合成される所望の改変を組込むような、改変ポリヌクレオチドを設計するための基礎を提供する。
【００３６】
本発明はまた、新規の遺伝子のセットをコードするポリヌクレオチド（人工的生物体および全ゲノムの特徴付けられた機能または寄与を行う、生物学的系の要素をコードする、天然のプロモーター構築物または人工的プロモーター構築物から発現される天然発生遺伝子か、あるいは合成ＤＮＡ配列から誘導された人工遺伝子のいずれか）を合成するために使用され得る方法を提供する。このような系およびゲノムの産生において、本発明は、複製コンピテント（二本鎖ポリヌクレオチド）の合成を提供し、ここでポリヌクレオチドは、複製起点第１コード領域、および第１コード領域の発現を指示する第１調節要素を有する。複製コンピテンントによって、ポリヌクレオチドは、それ自身の複製を指示し得ることを意味する。従って、ポリヌクレオチドは、それ自身の合成を促進するために必要な全シス作動性シグナルを有することが想定される。この点で、ポリヌクレオチドは、細胞内で一旦配置されると、プラスミドまたはウイルスと類似し、ポリヌクレオチドの機能および細胞機能の組み合わせによって複製可能である。
【００３７】
遺伝子、ゲノム、遺伝子配列またはタンパク質配列のセットを規定するポリヌクレオチドは、コンピューター補助様式で設計され得（以下に議論される）、そして配列のプラス（＋）鎖およびマイナス（−）鎖を含む１セットの解析されたオリゴヌクレオチドを生産するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「解析」は、標的ポリヌクレオチド配列が、コンピューター補助様式において描写され、その結果、一連の隣接するオリゴヌクレオチド配列が同定されることを意味する。オリゴヌクレオチド配列は、個々に合成され、そして標的ポリヌクレオチドを生産するための本発明の方法において使用される。オリゴヌクレオチドの長さは、完全に可変である。好ましくは、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、約１５塩基と約１００塩基の間、そしてより好ましくは約２０塩基と約５０塩基の間である。特定の長さは以下が挙げられるが、これらに限定されない：１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基および１００塩基。サイズに依存して、部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチドの間の重複部分は、オリゴヌクレオチド対あたり５塩基と７５塩基の間になるように設計し得る。
【００３８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて処理される。キナージング（ｋｉｎａｓｉｎｇ）は、オリゴヌクレオチドセットの混合の前、または後に、しかしアニーリングの前に行なわれ得る。アニーリングの後に、オリゴヌクレオチドは、ライゲーション機能を有する酵素を用いて処理される。例えば、ＤＮＡリガーゼは、代表的にこの機能のために使用される。しかし、５’側のリン酸化を必要としないトポイソメラーゼは、迅速であり、そして室温で操作され、そしてリガーゼの代わりに使用され得る。例えば、２５塩基によって重複される５０塩基対のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドアレイ合成機（ＯＡＳ）によって合成され得る。オリゴヌクレオチドの５’（＋）鎖セットは、１つの９６ウェルプレートで合成され、そして第２の３’側または（−）鎖セットは、第２の９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて合成される。合成は、反応サイズを最小化し、そして小さい反応容積および２〜５ｎｍｏｌの範囲における収率を生じるように、化学的に改変されたホスホラミダイトを用いて行われ得る。合成は、制御された気孔ガラスビース（ＣＰＧ）上で行なわれ、次いで完成したオリゴヌクレオチドは、逆ブロック化され、逆保護され、そしてビーズから取り外される。オリゴヌクレオチドは、凍結乾燥され、水中に再懸濁され、そしてライゲーション可能にするために、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて５’側がリン酸化される。
【００３９】
プレートにおいてアレイされたオリゴヌクレオチド配列のセットは、混合したプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）ストラテジーを用いて構築され得る。例えば、オリゴヌクレオチド成分の体系的なプーリングは、改変したＢｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ自動（化）ピペッティングロボットまたは他の自動（化）ラボワークステーションを用いて、行なわれ得る。このフラグメントは、緩衝液および酵素（例えば、Ｔａｑ  Ｉ  ＤＮＡリガーゼまたはＥｇｅａ  ＡｓｓｅｍｂｌａｓｅＴＭ）と組み合わされ得る。プーリングは、マイクロウェルプレート中で行なわれ得る。プーリングのそれぞれの工程の後、温度を、アニーリングおよびライゲーションを可能にするために勾配させ、次いで、さらなるプーリングを行う。
【００４０】
標的ポリヌクレオチドアセンブリは、１セットの中間体を形成する工程を包含する。１セットの中間体は、上記のような、マイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールしたプラス鎖オリゴヌクレオチドを含み得る。アニールした中間体は、シグナルマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニールしたシングルプラス鎖オリゴヌクレオチドを提供することによって形成され得る。
【００４１】
あるいは、２つ以上のオリゴヌクレオチドは、プラス鎖またはマイナス鎖を含み得る。例えば、本発明の標的ポリヌクレオチドを組みたてるために使用され得るポリヌクレオチド（例えば、開始ポリヌクレオチド）を構築するために、３つ以上のオリゴヌクレオチドがアニールされ得る。従って、第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、ならびに第１の隣接配列（第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である）および第２の隣接配列（第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的である）を有するマイナス鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二本鎖ポリヌクレオチドを形成するためにアニールされ得る。ポリヌクレオチドは、５’側のオーバーハング、３’側のオーバーハング、または５’側のオーバーハングおよび３’側のオーバーハングを含み得る。第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドは、隣接配列でり、その結果、それらはライゲーション可能である。マイナス鎖オリゴヌクレオチドは、両方のプラス鎖オリゴヌクレオチドと部分的に相補性であり、そして両方のオリゴヌクレオチドのアニーリングによって「橋（ｂｒｉｄｇｅ）」配列または「安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）」配列のように作用する。上記のようにアニールされた２つより多いオリゴヌクレオチドから成る部分配列のポリヌクレオチドは、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを生じる様式で、標的ポリヌクレオチドを組みたてるために使用され得る。
【００４２】
ポリヌクレオチドを組みたてるために用いられる、２つ以上のプラス鎖オリゴヌクレオチドの例は、図３に示される。約２５ｐによって重複する、それぞれが約５０ｂｐの３つのオリゴヌクレオチドの三重鎖は、「ニック（ｎｉｃｋｅｄ）」中間体を形成する。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、リガーゼによって結合されるライゲーション基質を提供し、そして第３のオリゴヌクレオチドは、最終ポリヌクレオチド構築物の１部分の形態を生じるアニーリングによって２つの特異的配列を一緒にもたらす安定剤である。この中間体は、ニック密着活性化を介して、単一の１００塩基一本鎖ポリヌクレオチドに２つの５０塩基対オリゴヌクレオチドを結合する、ＤＮＡリガーゼに対する基質を提供する。
【００４３】
最初のプーリングおよびアニールされた産物の形成に続いて、産物は、ますます大きなポリヌクレオチドへと組みたてられる。例えば、オリゴヌクレオチドの三重鎖形成に続いて、三重鎖のセットは、規則正しく結合され（ｊｏｉｎ）、ライゲーションされ（ｌｉｇａｔｅ）そして組みたてられる。それぞれの工程は、アニーリングおよび変性を成し遂げるために、機械的なプーリング、ライゲーションおよび熱循環によって媒介され得る。最終工程は、アレイにおいて全てのフラグメントを表す完全な配列中に組みたてた一片を結合する。それぞれの工程での収率の効率は、１００％よりも少ないので、最終混合物中の完成した産物の質量は、とても少ないかもしれない。必要に応じて、さらなる特異的オリゴヌクレオチドプライマー（通常１５〜２０塩基そしてアセンブリの最終末端と相補的）は、アニールされ得、そしてＰＣＲ増幅を行い、それによって最終全長産物を増幅し、そして精製する。
【００４４】
本発明の方法は、存在するポリヌクレオチド合成技術にわたって様々な改良を提供する。例えば、合成は、非常に速い合成、非常に少ない反応容積および合成管としてより高密度のプレートを可能にする、マイクロ予製圧電力（ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ｐｉｅｚｉｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）またはマイクロソレノイド（ｍｉｃｒｏｓｏｌｅｎｏｉｄ）のナノディスペンサー（ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｏｒｓ）を利用し得る。この機器は、１５３６個までのウェルプレートを使用し、非常に高い用量の容積を生じる。さらに、制御プーリングは、制御方法において、マイクロチャネル（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ」）および混合／ライゲーションを介して、個々のオリゴヌクレオチドを移動させる、マイクロフルイディスク（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）マニフォールドによって行なわれ得る。これは、機械的ピペッティングならびにスピードおよび効率の上昇の必要性を除去する。従って、本発明の方法を達成する装置は、同時反応ためのより高い能力を有し、遺伝子の長さについて全体に大きい容積を与える。
【００４５】
一旦、標的ポリヌクレオチドが、本発明の方法を用いて合成されると、これは、機能の分析のために配列をスクリーニングする必要があり得る。本発明者によって意図された特性は、チップに基づくＤＮＡ技術である。手短に言えば、これらの技術は、多くの遺伝子の迅速および正確な分析のための定量的な方法を含む。オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子のタグ化または固定化プローブアレイの使用によって、高密度アレイとして、標的分子を分離するためのチップ技術を使用し得、そしてハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングし得る。
【００４６】
コンビナトリアル合成および高スループットスクリーニングアッセイの使用は、当業者に周知である。例えば、米国特許番号第５，８０７，７５４号；同第５，８０７，６８３号；同第５，８０４，５６３号；同第５，７８９，１６２号；同第５，７８３，３８４号；同第５，７７０，３５８号；同第５，７５９，７７９号；同第５，７４７，３３４号；同第５，６８６，２４２号；同第５，１９８，３４６号；同第５，７３８，９９６号；同第５，７３３，７４３号；同第５，７１４，３２０号；および同第５，６６３，０４６号（それぞれは、本明細書中に参考として同質的に援用される）は、標的ポリペプチドの活性を決定するために有用なスクリーニングシステムを記載する。これらの特許は、アセンブリに関する方法および組成物、ならびに異なるポリサブユニット（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）の高密度アレイの活性分析の様々な局面を教示する。従って上に列挙される特許に記載される方法および組成物は、本発明の標的ポリペプチドの活性性質のアッセイに有用であり得ることが意図される。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を提供すること、および標的ポリヌクレオチド配列中に存在する、少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定することによる、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供し、この開始ポリヌクレオチド配列は、二本鎖ポリヌクレオチドを生じる、少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドに、アニールさせた、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含む。開始ポリヌクレオチドを、プライマーのアニーリングにとって適切な状態下で、開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’部分に部分的な相補性を有する第１のオリゴヌクレオチド、および開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分に部分的な相補性を有する第２のオリゴヌクレオチドと接触させる。引き続き、以下の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成を用いて、プライマー伸長を行った：１）開始ポリヌクレオチドのプラス鎖；２）アニールされた第１のオリゴヌクレオチド；３）開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖；および４）アニールされた第２のオリゴヌクレオチド。この合成は、双方向に伸長された開始配列を生じ、それによって新生の伸長された開始ポリヌクレオチドを形成する。伸張された開始配列は、アニーリングおよびプライマー伸長の繰り返しサイクルによってさらに伸長され得る。
【００４８】
上記のように、オリゴヌクレオチドは、アニーリングおよびライゲーション反応を通して、ポリヌクレオチドを組みたてるための構築ブロックとして使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、アニーリングおよびプライマー伸長反応を通してポリヌクレオチドを製造するためのプライマーとして使用され得る。用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチド含む結合要素（制限消化で精製されるように自然に存在するか、または合成的に生産される）を言及して本明細書中に使用され、このプライマーは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（すなわち、重合のための適切なヌクレオチドおよび薬剤の存在下（例えば、適切な緩衝液（「緩衝液」は、ｐＨ、イオン強度、コファクターなどを含む）中のＤＮＡポリメラーゼおよび適切な温度にて））、合成の開始点として作用し得る。
【００４９】
プライマーは、好ましくは増幅の最大の効率のために一本鎖であるが、代替的に二本鎖でもあり得る。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を分離するために第1に処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための薬剤の存在下で、伸長産物の合成を準備するために十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度およびプライマーの供給源ならびに方法の使用を含む）に依存する。標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし得る、短い配列のみを有するプライマーは、一般に鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を要求する。
【００５０】
本明細書中のプライマーは、増幅されるべきそれぞれの特定配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするために、十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、正確な鋳型配列を反映する必要はない。しかし、通常、プライマーは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７（７）２５０３−２５１６（１９８９）に記載される方法に従ってもたらされる分析、あるいは比例増幅またはポリメラーゼ連鎖反応以外の増幅技術を使用する、対応する方法を除いて、正確な相補性を有する。
【００５１】
オリゴヌクレオチドのプライマー伸長のための薬剤は、酵素を含むプライマー伸長産物の合成を達成するために機能する、化合物または系であり得る。この目的のための適切な酵素としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および熱安定性酵素を含む他の酵素が挙げられる。用語「熱安定性酵素」は、本明細書中で使用される場合、熱に安定であり、そして耐熱であり、そして、それぞれの核酸鎖に対して相補的な、プライマー伸張産物を形成するために適切な様式において、ヌクレオチドの組み合わせを触媒する（促進する）、任意の酵素のことをいう。一般的に、合成が終わるまで、合成はそれぞれのプライマーの３’末端で開始され、そして鋳型鎖に沿っての５’方向に進む。本発明の工程において使用され得る好ましい熱安定性酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから抽出され得、そして精製され得る熱安定性酵素である。このような酵素は、約８６，０００〜約９０，０００ダルトンの分子量を有する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＹＴ１株は、ＡＴＣＣ  ２５，１０４としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  １２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．から制限なく利用可能である。
【００５２】
所望の標的ポリヌクレオチドを増幅するためのプロセスは、公知であり、そして文献中に記載されている。Ｋ．Ｋｌｅｐｐｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９７１），５６，３４１−３６１は、所望のＤＮＡ配列の増幅方法を開示する。方法は、一本鎖を形成するＤＮＡ二重鎖の変性を含む。変性段階は、所望のＤＮＡ配列に隣接している領域にハイブリダイズする、十分に多重な過剰の２つの核酸プライマーの存在下で実行される。２つの構造が冷却される際、適切にプライマーで複合体化された全長の鋳型鎖を含むそれぞれを得る。ＤＮＡポリメラーゼおよび十分な量の各々の必要とされるヌクレオシド三リン酸塩が、添加され、それによって、２分子のオリジナル二重鎖が得られる。所望の標的ポリヌクレオチドの適切なコピー数が得られるまで、変性、プライマー添加そして伸張の上述のサイクルが、繰り返される。
【００５３】
本発明は、さらに標的ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドの発現および単離の方法を提供する。この方法は、以下を包含する：本発明の方法によって合成された標的ポリヌクレオチドを発現ベクター中に組み込む工程；適切な宿主細胞中に発現ベクターを導入する工程；標的ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドの発現を促進させるような条件下でかつ、標的ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドの発現を促進させるような時間、宿主細胞を培養する工程；および標的ポリペプチドを単離する工程。
【００５４】
本発明は、変更された標的ポリペプチドを生じるモデルポリペプチドをコードするモデルポリヌクレオチドの特定の機能的特徴、構造的特徴または系統的発生特徴を改変するために使用され得る。モデルポリペプチドをコードする入力またはモデルポリヌクレオチド配列は、モデルポリペプチドの特定の部位または複数の部位で、アミノ酸の変化（あるいは変動）の効果の可能性を決定するために電子的に操作され得る。一旦、同定されると、新規の標的ポリヌクレオチド配列は、本発明の方法で組みたてられ、その結果、標的ポリヌクレオチドがモデルポリペプチドの特性と異なる特性を有する標的ポリペプチドをコードする。
【００５５】
本発明の方法は、公開の配列および構造データベースの使用に依存し得る。ますます配列および構造が加えられるので、これらのデータベースはよりしっかりしたものとなる。標的ポリペプチドおよびポリペプチドの３次構造のアミノ酸配列に関する情報は、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド中に組みたてられ得るオリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る。モデルポリペプチドは、ポリペプチドの機能に関するアミノ酸を分析するための十分な構造的情報を有するはずである。構造的情報は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、あるいはアミノ酸あるいは原子レベルのタンパク質構造を決定するための、他のいくつかの技術から誘導され得る。一旦、選択されると、モデルポリペプチドから得られた配列情報および構造的情報は、標的ポリペプチドを含む複数の種々のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドを生成するために使用され得る。従って、モデルポリペプチドは、標的タンパク質に対する全体的な配列類似性に基づいて、または標的ポリペプチドの一部分に対する配列類似性を有する部分の存在に基づいて選択され得る。
【００５６】
「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、モノマーがαアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合されるポリマーをいう。アミノ酸は、Ｌ光学異性体またはＤ光学異性体であり得る。ポリペプチドは、２以上のアミノ酸モノマー長であり、そしてしばしば２０以上のアミノ酸モノマー長である。アミノ酸の標準的な略語が使用される（例えば、Ｐはプロリン）。これらの略語が、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３編、１９８８、これは、本明細書中に全ての目的のために参考として援用される。ポリペプチドに関して、「単離された」とは、混合物の成分において主な成分を構成するポリペプチドをいう（例えば、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、９０重量％以上、または９５重量％以上）。単離されたポリペプチドは、代表的に、ポリペプチドが生産される生物体から精製によって得られるが、化学合成もまた可能である。ポリペプチド精製の方法としては、例えばクロマトグラフィーまたは免疫親和性技術が挙げられる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く、クマシーブルー染色または検出されるポリペプチドに対する結合親和性を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析によって、検出され得る。
【００５８】
本明細書中に使用される場合、「キメラポリペプチド」は、２つ以上の異なるタンパク質または通常隣接しない２つ以上の同じタンパク質の領域から誘導される、アミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである。
【００５９】
本明細書中に使用される場合、「リガンド」は、レセプターによって認識される分子である。本発明によって研究され得るリガンドの例としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない：細胞膜レセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルス性エピトープ、ホルモン、アヘン製剤、ステロイド、ペプチド、酵素基質、コファクター、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、ならびにタンパク質。
【００６０】
本明細書中に使用される場合、「レセプター」は、リガンドに対する親和性を有する分子である。レセプターは、天然に存在する分子または人工分子であり得る。これらは、それらの変更されない状態で、または他の種との集合体として使用され得る。レセプターは、結合メンバーに、直接的にかまたは特異的結合物質を介してのいずれかで、共有結合的にまたは非共有結合的に結合し得る。本発明によって使用され得るレセプターの例としては、以下が挙げられるが、これに制限されない：抗体、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体、および特定の抗原決定基と応答的な抗血清、ウイルス、細胞、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、コファクター、レクチン、糖、多糖、細胞膜、および細胞小器官。２個の分子が複合体を形成するために分子認識を通して結合する場合、「リガンドレセプター対」が形成される。
【００６１】
本発明によって合成され得るポリペプチドの具体例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
ａ）微生物レセプター：微生物レセプター（例えば、特異的輸送タンパク質または微生物の生存のために必須の酵素）に結合するリガンドの決定は、新しい分類の抗生物質を発見するための手段として有用である。特に価値のあるものは、昨今使用される抗生物質に耐性の日和見性の真菌類、原生動物、および細菌に対する抗生物質である。
【００６２】
ｂ）酵素：例えば、レセプターは、酵素（例えば、神経伝達物質の切断を担う酵素）の結合部位を含み得；神経伝達物質を切断する酵素の作用を調節するこの型のレセプターについてのリガンドの決定は、神経伝達の障害の処置において用いられ得る薬物の開発において有用である。
【００６３】
ｃ）抗生物質：例えば、本発明は、目的の抗原のエプトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位を含むレセプターの研究において有用であり得；抗原エピトープを模倣する配列を決定することは、ワクチンの開発を導き得、ここで、免疫原は、１つ以上のこのような配列に基づくか、または自己免疫疾患（例えば、「自己」抗体の結合をブロックすることによる）についてのような治療的処置において有用な関連する診断薬もしくは化合物の開発を導く。
【００６４】
ｄ）ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドの配列は、合成された配列についてレセプターとして作用するＤＮＡ結合配列またはＲＮＡ結合配列を確立するように合成され得る。
【００６５】
ｅ）触媒ポリペプチド：１つ以上の生成物への１つ以上の反応物の転換を含む化学反応を促進し得る、好ましくは抗体であるポリマー。このようなポリペプチドは、一般に、少なくとも１つの反応物または反応中間体に特異的な結合部位、および結合部位に近位の活性な機能性を含み、この機能性は、結合反応物を化学的に修飾し得る。触媒ポリペプチドなどは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／０５７４６、ＷＯ  ９０／０５７４９、およびＷＯ  ９０／０５７８５に記載され、これらは、本明細書中で全ての目的のために参考として援用される。
【００６６】
ｆ）ホルモンレセプター：レセプター(例えば、インスリンおよび成長ホルモンに対するレセプター）に高い親和性で結合するリガンドの同定は、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を軽減するために服用しなければならない毎日の注射の経口置換物、または成長ホルモンについての置換物の開発において有用である。ホルモンレセプターの他の例としては、血管収縮ホルモンレセプターが挙げられ；これらのレセプターに対するリガンドの決定は、血圧を制御する薬物の開発を導き得る。
【００６７】
ｇ）アヘン剤レセプター：脳におけるアヘン剤レセプターに結合するリガンドの決定は、モルヒネおよび関連する薬物についての中毒性の低い置換物の開発において有用である。
【００６８】
ポリペプチドに関して、用語「構造」は、タンパク質中の原子の３次元配列をいう。「機能」は、タンパク質の任意の測定可能な特性をいう。タンパク質の機能の例としては、触媒、他のタンパク質への結合、非タンパク質分子（例えば、薬物）への結合、および２つ以上の構造形態間での異性化が挙げられるが、これらに限定されない。「生物学的に関連するタンパク質」は、生物の生涯において役割を果たす任意のタンパク質をいう。
【００６９】
有意な構造モチーフを同定するために、モデルポリペプチドの配列は、認識されたドメインの１つ以上のデータベース（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースドメイン（Ｂａｉｒｏｃｈ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４：２１７，１９９７）またはｐｆａｍ  ＨＭＭデータベース（Ｂａｔｅｍａｎら，（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２８：２６３））における登録配列との一致について試験される。ＰＲＯＳＩＴＥデータベースは、代表的にタンパク質ドメイン全体を表す２つの型の配列シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）プロフィールの編集物であり、そして代表的に最も高く保存されたタンパク質ドメインの機能的局面または構造的局面のみを表すパターンである。
【００７０】
本発明の方法は、標的ポリペプチドの触媒活性、または標的ポリペプチドの非触媒活性（例えば、構造、安定性、第２のタンパク質またはポリペプチド鎖への結合、核酸分子への結合、低分子への結合、およびタンパク質でも核酸でもない高分子への結合）に対する効果を有する、多型を含むポリペプチドを生成するために使用され得る。例えば、本発明は、標的ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド配列を組立てる手段を提供し、その結果、コードされたポリペプチドは発現され得、そして特定の活性についてスクリーニングされ得る。標的ポリペプチドにおける特定の点で特定のアミノ酸を改変することによって、操作温度、作動ｐＨ、またはポリペプチドの任意の他の特徴が、操作され得、特有の活性を有するポリペプチドを生じる。従って、本発明の方法は、目的のポリペプチドの構造または機能を操作する（例えば、選択された活性を増加もしくは減少するか、または選択的活性を加えるかもしくは除く）ために作製され得るアミノ酸置換基を同定するために使用され得る。
【００７１】
さらに、本発明の方法は、医薬品もしくは診断薬による多型特異的標的化、薬理ゲノム学的適用についての候補多型の同定および分析、ならびにアミノ酸多型を示す薬学的標的の実験的な生物化学的分析および構造分析のために、候補多型の同定および分析において使用され得る。
【００７２】
複数の標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドのライブラリーが、本発明によって調製され得る。宿主細胞は、そのような形質転換を誘導する条件下での接種による、標的ポリヌクレオチドを含むベクターの人工的導入によって形質転換される。次いで、生じた形質転換クローンのライブラリーは、活性について表現型アッセイにおいて目的のポリペプチドについて活性を示すクローンについてスクリーニングされる。
【００７３】
本発明の標的ポリヌクレオチドは、適切なベクター中に組み込まれ（すなわちクローン化され）得る。発現の目的のために、本発明の標的ポリペプチドをコードする標的配列は、組換え発現ベクター中に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」は、本発明の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の挿入または組込みによって操作された、当該分野において公知のプラスミド、ウイルス、または他のビヒクルをいう。発現ベクターは、代表的に、複製起点、プロモーターおよび形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的な遺伝子を含む。本発明における使用に適切なベクターとしては、細菌における発現のためのＴ７ベースの発現ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ，５６：１２５，１９８７）、哺乳動物細胞における発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：３５２１，１９８８）、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクター、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
利用されるベクターに依存して、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。これらのエレメントは、当業者に周知である。
【００７５】
用語「作動可能に連結された」または「作動可能に結合された」は、調節配列と、調節配列によって調節されるポリヌクレオチド配列との間の機能的連結をいう。作動可能に連結された調節配列は、ポリヌクレオチド配列によって発現される産物の発現を制御する。あるいは、この機能的連結はまた、エンハンサーエレメントを含む。
【００７６】
「プロモーター」は、転写を指向するのに十分な核酸調節配列を意味する。プロモーター依存性のポリヌクレオチド配列の発現を、細胞型特異的、組織特異的、または外部シグナルもしくは外部因子によって誘導可能にするのに十分なプロモーターエレメントがまた、本発明に含まれ；このようなエレメントは、天然の遺伝子の５’領域もしくは３’領域、またはイントロン中に配置され得る。
【００７７】
「遺伝子発現」または「ポリヌクレオチド配列発現」は、ヌクレオチド配列が、首尾よい転写および翻訳を受け、その結果、検出可能なレベルの送達されたヌクレオチド配列が、機能的な生物学的効果が達成されるような量および時間点で発現されるプロセスを意味する。
【００７８】
酵母において、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む多数のベクターが、使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３，１９８８；Ｇｒａｎｔら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５３，５１６〜５４４頁，１９８７；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３，１９８６；「Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５２，６７３〜６８４頁，１９８７；ならびにＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ，１９８２）。酵母の構成的プロモーター（例えば、ＡＤＨもしくはＬＥＵ２）、または誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ）が、使用され得る（「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」Ｃｈ．３、Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，１９８６）。あるいは、外来ＤＮＡ配列を酵母染色体中に組み込むことを促進するベクターが、使用され得る。
【００７９】
特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列の末端にあるテロメアとして公知の特定化された領域を含むことが、所望され得る。テロメアは、染色体の末端で見出される繰り返し配列であり、そして短縮型の末端を有する染色体は、不安定で、他の染色体と融合する傾向があるか、さもなくば細胞分裂中に損失されることが長いこと公知である。
【００８０】
いくつかのデータは、テロメアが、核タンパク質複合体および核マトリックスと相互作用することを示唆する。テロメアについての１つの推定の役割としては、染色体の安定化および分解酵素からの末端の保護が挙げられる。
【００８１】
テロメアについての別の可能性のある役割は、複製における役割である。現在の学説に従うと、ＤＮＡの複製は、鋳型のＴ末端にアニーリングした短いＲＮＡプライマーからの開始を必要とする。この機構の結果は、ＲＮＡプライマーに対応する領域が、複製されない「末端複製問題」である。多くの細胞分裂にわたって、これは、染色体の進行性の短縮を生じる。テロメアは、少なくともそれ自体がこの効果によって除去されるまで、この効果に対する緩衝剤を提供し得ると考えられる。標的ポリヌクレオチドに関与し得るさらなる構造体は、セントロメアである。
【００８２】
本発明の特定の実施形態において、細胞における核酸の送達は、発現構築物中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このマーカーは、トランスフェクトされた細胞に対して、発現の容易な同定を可能にする識別可能な変化を生じる。
【００８３】
本発明の発現ベクターは、標的細胞を形質転換するために使用され得る。「形質転換」は、新しいＤＮＡ（すなわち、細胞に対して外来性のＤＮＡ）の組込みに続く、細胞において誘導された遺伝的変化を意味する。細胞が、哺乳動物細胞である場合、遺伝的変化は、一般に、ＤＮＡを細胞のゲノムに導入することによって達成される。「形質転換細胞」は、細胞を、組換えＤＮＡ技術によって導入された細胞（またはその先祖）を意味する。組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来技術によって実行され得る。宿主が原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である場合、ＤＮＡを取込み得るコンピテント細胞は、対数増殖期後に収集された細胞から調製され得、そして続いて当該分野において周知の手順によるＣａＣｌ２法によって処理され得る。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌが、使用され得る。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラスト形成後に実行され得るか、またはエレクトロポレーションによって実行され得る。
【００８４】
本発明の標的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする核酸の発現によって原核生物中で生成され得る。これらは、微生物（例えば、本発明のポリペプチドをコードする組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクター、または組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌）を含むが、これに限定されない。構築物は、インビトロアッセイのために大量にＥ．ｃｏｌｉ中で発現され得る。細菌からの精製は、配列が、ニッケル−キレートクロマトグラフィーによる１工程精製のためのタグを含む場合、簡略化される。構築物はまた、ポリペプチドの単離を簡略化するタグを含み得る。例えば、（例えば、６個のヒスチジン残基の）ポリヒスチジンタグは、タンパク質のアミノ末端、またはカルボキシ末端で組み込まれ得る。このポリヒスチジンタグは、ニッケル−キレートクロマトグラフィーによる単一工程でのタンパク質の単離を簡便化する。本発明の標的ポリペプチドはまた、タンパク質回収における助けのための切断部位を含むように操作され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、インサイチュでのアッセイについて所望される宿主細胞において直接的に発現され得る。
【００８５】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈降、従来の機械的手順（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションもしくは微粒子銃技術）、リポソームに入れられたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのようなＤＮＡのトランスフェクション法が、使用され得る。真核生物の細胞はまた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および選択可能な表現型（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）をコードする第２の外来ＤＮＡ分子を用いて同時トランスフェクトされ得る。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を使用して、真核生物細胞を一時的に感染または形質転換し、そしてタンパク質を発現することである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ編，１９８２）。好ましくは、真核生物の宿主は、本明細書中に記載されるように宿主細胞として利用される。
【００８６】
真核生物系、および好ましくは哺乳動物の発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の適切な翻訳後修飾が起きるのを可能にする。一次転写物の適切なプロセセシング、グリコシル化、リン酸化、および遺伝子産物の有利な分泌のための細胞機構、を有する真核生物細胞が、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として使用されるべきである。このような宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ，Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、およびＷＩ３８が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８７】
組換えタンパク質の長期間の高収率の生成のために、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御される本発明の標的ポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよび選択マーカーを用いて形質転換され得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、その染色体中にプラスミドを安定に組み込み、そして増殖して、次にクローン化され、細胞株へと展開され得る増殖巣を形成することを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、富化培地中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切替られ得る。多数の選択系が用いられ得、これらとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ，１１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，Ｃｅｌｌ，２２：８１７，１９８０）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、ａｐｒｔ細胞において用いられ得る。また、代謝拮抗剤耐性が、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：１５２７，１９８１）；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）；およびハイグロマイシン遺伝子への耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）についての選択の基礎として使用され得る。近年、さらなる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７，１９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）への耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）が、記載されている（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，編  １９８７）。
【００８８】
本発明の微生物で発現されたポリペプチドまたは真核生物で発現されたポリペプチドのいずれかの単離および精製のための技術は、任意の従来手段（例えば、調製用クロマトグラフィーによる分離および免疫学的分離（例えば、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗原の使用を含む免疫学的分離）によるものであり得る。
【００８９】
標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、リポソーム中に含まれ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水溶性媒体によって特徴づけられる小胞性の構造体である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された多脂質層を有し、そしてホスホリン脂質が、過剰の水溶液中に懸濁される場合、自然に生成する。脂質成分は、閉じた構造体の形成の前に自己再構成を受け、そして脂質二重層間に水および溶解された溶質を含む。このリポソームは、赤血球凝集（ｈｅｒｎａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ）ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、そしてリポソームにカプセル化されたＤＮＡの細胞移入を促進することが示されている。他の実施形態において、このリポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と組み合わせて複合体化され得るか、または用いられ得る。なおさらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と組み合わせて複合体化され得るか、または用いられ得る。このような発現構築物は、インビトロおよびインビボでの核酸の移入および発現において首尾よく用いられるので、これらは、本発明について適用可能である。細菌性プロモーターが、ＤＮＡ構築物において用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌性ポリメラーゼを含むこともまた所望される。
【００９０】
本発明は、情報だけに基づいた（すなわち、存在する遺伝子、ＤＮＡ分子またはゲノムを必要とすることなしに）標的ポリヌクレオチドの作製を可能にするための方法について記載する。一般に、コンピューターソフトウェアを使用して、コンピューター中で仮想のポリヌクレオチドを構築することが可能である。このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ塩基（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）の列からなり、例えば、直線状の列中の人為的なポリヌクレオチド配列全体を含む。配列の構築物に続いて、コンピューターソフトウェアは、次いで、１組の特定の長さの重複するオリゴヌクレオチドへ、この配列の構築物を分割する標的配列を解析するために、使用される。これは、重複するセットにおいて、標的ポリヌクレオチドの全長を覆うように、重複する１組のより短いＤＮＡ配列を生じる。
【００９１】
典型的に、１０００塩基対の遺伝子は、２０個の１００ｍｅｒへ分解され、これらの１０個が１本鎖を含み、そしてこれらの１０個が他の鎖を含む。これらは、２５塩基対〜５０塩基対まで各鎖が重複するように選択される。
【００９２】
遺伝暗号の縮重は、任意の特定のアミノ酸のためのコドンの選択を実質的に自由にし得る。トランスジェニック生物体（例えば、植物）は、頻繁に特定のコドンを好み、このコドンは、同じタンパク質をコードするが、遺伝子が誘導された生物体中のコドンとは異なり得る。例えば、Ａｄａｎｇらに対する米国特許第５、３８０、８３１号は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素遺伝子を発現する昆虫耐性トランスジェニック植物の作製を記載する。Ｂｔ結晶タンパク質（昆虫毒素）は、トランスジェニック植物中で不完全に発現される全長遺伝子によってコードされる。植物中での発現を改善するために、植物中で好まれるコドンを含むタンパク質をコードする合成遺伝子は、天然の配列と置き換えられた。その点で開示される本発明は、Ｂｔのネイティブ殺虫性タンパク質と頻繁に等価である殺虫性タンパク質をコードする化学的な合成遺伝子を含んだ。この合成遺伝子は、ネイティブＢｔ遺伝子よりも高いレベルで植物中で発現されるように設計された。
【００９３】
特定のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを設計する際に、アミノ酸のヒドロパシーインデックスが考慮され得る。タンパク質に相互作用的生物機能を与える際のヒドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、一般的に、当該分野において理解される。各アミノ酸は、それらの疎水性および変化特性に基づいて、ヒドロパシーインデックスを割り当てられ、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（４７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アルパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（４５）。
【００９４】
特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシーインデックスまたはヒドロパシースコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そして、類似の生物学的活性を有するタンパク質をなお生じ得る（すなわち、なお生物学的機能等価タンパク質を得る）ということは、当該分野で公知である。このような変化を作製する際、ヒドロパシーインデックスが±２内のアミノ酸の置換が好ましく、±１内のアミノ酸置換が特に好ましく、そして、±０．５内のアミノ酸置換がなおさらに、特に好ましい。
【００９５】
類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的に作製され得るということもまた、当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中に参考として援用される）は、タンパク質の最大の局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）（これは、その隣接したアミノ酸の親水性によって支配される）が、タンパク質の生物学的性質と関連することを述べる。
【００９６】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタル酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（４４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（４５）；ヒスチジン−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００９７】
アミノ酸が類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換され得、そして、生物学的等価でそして免疫学的等価なポリペプチドをなお取得し得るということは、理解される。このような変化において、親水性値が±２内のアミノ酸置換が好ましく、±１内のアミノ酸置換が特に好ましく、そして、±０．５内のアミノ酸置換がなおさらに特に好ましい。
【００９８】
上記で概説したように、アミノ酸置換基は、一般に、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、荷電、大きさなど）に基づく。前述の種々の特性を考慮する例示的な置換基は、当業者に周知で、そして、以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタル酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００９９】
本発明の局面は、ハードウェアもしくはソフトフェア、または両方の組合せにおいて実行され得る。しかし、好ましくは、本発明のアルゴリズムおよびプロセスは、各々が少なくとも１つの処理装置、少なくとも１つのデータ記憶装置システム（揮発性メモリおよび非揮発性メモリならびに／または記憶素子を含む）、少なくとも１つの入力デバイスおよび少なくとも１つの出力デバイスを含むプログラム可能なコンピューターで行う１つ以上のコンピュータープログラムにおいて実施される。プログラムコードは、本明細書中に記載された機能を実行するために入力データに適用され、そして出力情報を生成する。出力情報は、公知の様式で、１つ以上の出力デバイスに適用される。
【０１００】
各プログラムは、コンピューターシステムと連絡を取るために、任意の所望されたコンピューター言語（マシンプログラミング言語、アセンブリプログラミング言語、高レベル手続型プログラミング言語、またはオブジェクティブ指向プログラミング言語）で実施され得る。いかなる場合でも、この言語は、コンパイル型言語またはインタープリタ型言語であり得る。
【０１０１】
このようなコンピュータープログラムの各々は、記憶媒体または記憶デバイスが本明細書中に記載された手順を実行するためにコンピューターによって読み取られる場合、コンピューターを設定しそして操作するために、好ましくは、一般のまたは特殊目的のプログラマブルコンピューターによって読み取り可能な記憶媒体または記憶デバイス（例えば、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、または磁気ディスケット）上に記憶される。本発明のシステムはまた、コンピューター読み取り可能記憶媒体（コンピュータープログラムによって設定される）として実行されることが考慮され、ここで、このように設定されたこの記憶媒体によって、コンピューターは、本明細書中に記載された機能を実行するような特定の様式および所定の様式において作動する。
【０１０２】
従って、別の実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を生成するために、コンピューター読み取り可能媒体に記憶されたコンピュータープログラムを提供する。このコンピュータープログラムは、コンピューターシステムに以下を行わせるための命令を含む：１）標的ポリヌクレオチド配列中に含まれる開始ポリヌクレオチド配列を同定する；２）標的ポリヌクレオチド配列を、複数の異なる、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドに解析する；および３）部分的に相補的オリゴヌクレオチドの経時的な添加による開始ポリヌクレオチド配列の双方向伸長を制御することによって、標的ポリヌクレオチド配列の構築を制御し、その結果、隣接した２本鎖ポリヌクレオチドを生じさせる。コンピュータープログラムは、ポリペプチド配列に対応するオリゴヌクレオチドのセットを生成することによって標的ポリヌクレオチドの配列を解析するために、アルゴリズムを含む。このアルゴリズムは、特定のコドン表を使用してＤＮＡ配列を生成するためのポリペプチド配列を利用する。次いで、このアルゴリズムは、以下の様式において、ＤＮＡ配列の（＋）および（−）鎖に対応する解析されたオリゴヌクレオチドのセットを生成する：
１．ＤＮＡ配列ＧＥＮＥ［］（塩基のアレイ）は、特定のコドン表を使用して、タンパク質配列ＡＡ［］（アミノ酸のアレイ）から生成される。Ｅ．ｃｏｌｉ型ＩＩコドンについてのコドンの例が、以下に記載される。
【０１０３】
ａ．パラメーター
ｉ．Ｎ  アミノ酸残基におけるタンパク質の長さ
ｉｉ．Ｌ＝３Ｎ  ＤＮＡ塩基における遺伝子の長さ
ｉｉｉ．Ｑ  各構成オリゴヌクレオチドの長さ
ｉｖ．Ｘ＝Ｑ／２  オリゴヌクレオチド間の重複する長さ
ｖ．Ｗ＝３Ｎ／Ｑ  Ｆセット中のオリゴヌクレオチドの数
ｖｉ．Ｚ＝３Ｎ／Ｑ＋１  Ｒセット中のオリゴヌクレオチドの数
ｖｉｉ．Ｆ［１：Ｗ］（＋）鎖オリゴヌクレオチドのセット
ｖｉｉｉ．Ｒ［Ｌ：Ｚ］（−）鎖オリゴヌクレオチドのセット
ｉｘ．ＡＡ［１：Ｎ］  アミノ酸残基のアレイ
ｘ．ＧＥＮＥ［１：Ｌ］  遺伝子を含む塩基のアレイ
ｂ．アミノ酸残基の列挙からなるタンパク質配列ＡＡ［］を取得するかまたは設計する
ｃ．タンパク質配列（ＡＡ［］）からＤＮＡ配列（ＧＥＮＥ［］）を生成する
ｉ．Ｉ＝１〜Ｎの間（Ｆｏｒ  Ｉ＝１  ｔｏ  Ｎ）
ｉｉ．コドン表からＡＡ［Ｊ］を翻訳し、ＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋２］を生成する
ｉｉｉ．Ｉ＝Ｉ＋３
ｉｖ．Ｊ＝Ｊ＋１
ｖ．ｉｉに戻る
２．重複するオリゴヌクレオチドの２つのセットは、ＧＥＮＥ［］から生成される；Ｆ［］は（＋）鎖を網羅し、そして、Ｒ［］は、（−）差を網羅する相補的で部分的に重複するセットである。
【０１０４】
ａ．オリゴのＦ［］セットを生成する
ｉ．Ｉ＝１〜Ｗの間（Ｆｏｒ  Ｉ＝１  ｔｏ  Ｗ）
ｉｉ．Ｆ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋Ｑ−１］
ｉｉｉ．Ｉ＝Ｉ＋Ｑ
ｉｖ．ｉｉに戻る
ｂ．オリゴのＲセットを生成する
ｉ．Ｊ＝Ｗ
ｉｉ．Ｉ＝１〜Ｗの間（Ｆｏｒ  Ｉ＝１  ｔｏ  Ｗ）
ｉｉｉ．Ｒ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｗ：Ｗ−Ｑ］
ｉｖ．Ｊ＝Ｊ−Ｑ
ｖ．ｉｉｉに戻る
ｃ．結果はＱの長さのオリゴＦ［］およびＲ［］の２セットである
ｄ．最後の２つの終了オリゴを生成する
ｉ．Ｓ［１］＝ＧＥＮＥ［Ｑ／２：１］
ｉｉ．Ｓ［２］＝ＧＥＮＥ［Ｌ−Ｑ／２：Ｌ］
続いて、オリゴヌクレオチドセットアセンブリは、以下のアルゴリズムによって確立された：
オリゴヌクレオチドの２つのセット  Ｆ［１：Ｗ］  Ｒ［１：Ｚ］  Ｓ［１：２］
３．工程１
ａ．Ｉ＝１〜Ｗの間（Ｆｏｒ  Ｉ＝１  ｔｏ  Ｗ）
ｂ．Ｆ［Ｉ］、Ｆ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ］をライゲーションする；Ｔ［］に置く
ｃ．Ｆ［Ｉ＋２］、Ｒ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ＋２］、Ｔ［Ｉ＋１］をライゲーションする
ｄ．Ｉ＝Ｉ＋３
ｅ．ｂに戻る
４．工程２
ａ．１回の反応のみが残るまで以下を行う
ｉ．Ｉ＝１〜Ｗ／３の間（Ｆｏｒ  Ｉ＝１  ｔｏ  Ｗ／３）
ｉｉ．Ｔ［Ｉ］、Ｔ［Ｉ＋１］をライゲーションする
ｉｉｉ．Ｉ＝Ｉ＋２
ｉｖ．ｉｉに戻る
【０１０５】
【化１】
2004533228.tif 000003
標的ポリヌクレオチドの構築に有用である本発明のアルゴリズムはさらに、以下に記載のＰｅｒｌスクリプトとして記載され得る。ＡＬＧＯＲＩＴＨＭ  １は、Ｅ．ｃｏｌｉコドンを使用して、タンパク質配列をポリヌクレオチド配列に変換するための方法を提供する：
【０１０６】
【数３】
2004533228.tif 000004
以下の一覧表は、Ｅ．ｃｏｌｉのためのＰｅｒｌにおけるクラスＩＩコドン優先度を提供する。
【０１０７】
【数４】
2004533228.tif 000005
ＡＬＧＯＲＩＴＨＭ  ２は、ポリヌクレオチド配列を、標的ポリペプチドをコードする完全な標的ポリヌクレオチドへ再構築され得る順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチド構成に解析するための方法を提供する：
【０１０８】
【数５】
2004533228.tif 000006
上記で生成された配列の逆方向相補体は、以下によって同定される：
【０１０９】
【数６】
2004533228.tif 000007
【０１１０】
【数７】
2004533228.tif 000008
本発明はさらに、処理装置、入力デバイスおよび出力デバイスを含むプログラムされたコンピューターを使用し、プログラムされたコンピューターに、入力デバイスにを介して標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドの少なくとも１部を含むデータを入力することによって、モデル配列から誘導される標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを合成するための、コンピューター支援法を提供する。続いて、標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドの配列は決定され、そして、標的ポリヌクレオチド配列の合成のためのモデルが誘導される。このモデルは、生物学的システムにおける標的ポリペプチドの発現に必要な全配列パラメーターを使用した、標的ポリヌクレオチド配列中の開始配列の位置に基づく。情報は、標的ポリヌクレオチドを合成し、そして構築するための手段を提供する出力デバイスへ出力される。
【０１１１】
ポリヌクレオチド合成に適した任意の装置が、本発明において使用され得ることが理解される。装置、成分、構築物および方法の様々な非限定的な例は以下に記載される。例えば、１つの実施形態において、１６個までの弁を有するナノ分配ヘッド（ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ｈｅａｄ）が、組立て容器中で合成薬物を沈着するために使用され得るということが意図される（図４）。薬品は、試薬リザーバからのシリンジポンプを使用して制御され得る。インクジェット方式の分配システムのスピードおよび能力に起因して、合成は、非常に小さくそして非常に迅速になされ得る。根底にある反応チャンバーは、微小流体工学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）によって流体を移動するマイクロチャンネルに連結された構築容器のセットである。チャンネルの配置は、例えば、ロボットデバイスを系統的に使用して、オリゴヌクレオチドの対および三重鎖をプールする。しかし、プールする工程は、部品を移動することなしに流体工学を使用して達成され得る。
【０１１２】
図５中に示すように、オリゴヌクレオチド合成、プーリングおよびアニーリングによるオリゴヌクレオチド構築、およびライゲーションは、微小流体工学の混合を使用してなされ得、アニーリング、ライゲーションおよびオリゴヌクレオチド接合のための基質として機能する、臨界三重鎖中間体の同一のセットを生じる。ＤＮＡリガーゼおよび他の成分は、機器ミクロチャンバー（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ）を介して移動する緩衝流体中に配置され得る。従って、合成および構築は、同一の機器において高度に制御された方法で実施され得る。
【０１１３】
図６に示されるように、プーリングマニホルドは、非多孔質プラスチックから製造され得、アレイ上で合成されたオリゴヌクレオチドの、連続的なプーリングを制御するように設計され得る。コンピューターで設計された遺伝子配列から解析されたオリゴヌクレオチドは、（＋）鎖および（−）鎖がアレイのウェルに交互に置かれるよう、合成に関してプログラムされる。この形式での合成に続いて、この遺伝子の１２列の配列は、重要な三重鎖構造を形成する、反応容器に３つのウェルを体系的に蓄えるプーリングマニホルドに指向される。アニーリングおよびライゲーションのための温度サイクルに続き、４セットの三重鎖は、２セットの６オリゴヌクレオチド生成物に蓄えられ、次いで、１セットの１２オリゴヌクレオチド生成物に蓄えられる。合成アレイの各々の列は、類似する集合体に関連し、各々１２オリゴヌクレオチドを示す、８セットのアセンブルされたオリゴヌクレオチドの第１の段階のアセンブリを得る。図７に示されるように、第２のプーリングマニホルド段階は、８列のアセンブリを単一の完全なアセンブリに蓄積する単一の集合体によって制御される。オリゴヌクレオチド成分の２つの集合体アセンブリ（第１の８および第２の単一）の通過は、アレイからの９６オリゴヌクレオチド全ての完全なアセンブリを与える。ＧｅｎｅｗｒｉｔｅｒＴＭのアセンブリモジュール（図８）は、合成容器よりも下に位置する単一のプラスチックブロックにおいて微小構築物を使用して、作製された７個のプーリングマニホルドの完全なセットを含み得る。プーリングマニホルドの種々の構成は、解析される成分オリゴヌクレオチドの９６，３８４または１５３６ウェルアレイのアセンブリを許容する。
【０１１４】
初期の構成は、予め規定されたアレイで合成された、４８対の重複する５０マーからなる９６オリゴヌクレオチドのアセンブリのために設計されている。ＤＮＡリガーゼおよび他の適切な緩衝液ならびに化学的成分の存在下、および、デバイスの適切な温度制御の下でのアセンブリデバイスを通した通過により、これらオリゴヌクレオチドは、単一の２４００塩基の二重鎖遺伝子アセンブリにアセンブルされる（図９）。
【０１１５】
基本的なプーリングデバイス設計は、表面にエッチングされた微小溝または微小流体チャネルおよび、チャネルの接合部の下に位置する、ペルチェ回路のような温度制御要素を有する、Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）または他の型のコポリマーから作られ得る。これは、１）２つの流れの混合、２）制御された温度維持または接合の部位の循環ならびに３）出口チャネルから次のプーリングチャンバおよびライゲーションチャンバのセットへのライゲーション混合物の排除のために、２つのチャネルの接合部に微小反応容器を与える。
【０１１６】
図１１に示されるように、アセンブリプラットホーム設計は、９６ウェル構成の８個の合成マイクロウェルプレートからなり得、１６チャネルのマイクロディスペンジングを有する。各々のプレートの下には：１）合成成分を除去するための排出マニホルド；および２）９６ウェルアレイ各々から成分オリゴヌクレオチドをアセンブルするための図９の概略図に基づくアセンブリマニホルドが存在する。図１２は、１５３６ウェルマイクロプレートを使用し、プレートあたり１５３６成分のオリゴヌクレオチドの合成が可能な、より大きな収容力のアセンブリフォーマットを示す。各々のプレートの下には：１）合成成分を除去するための排出マニホルド；および２）１５３６ウェルアレイ各々から、１５３６個の成分オリゴヌクレオチドをアセンブルするためのアセンブリマニホルドアセンブリが存在する。プーリング戦略およびアセンブリ戦略は、９６ウェルプレートに対して使用される概念に基づき得る。
【０１１７】
代替的なアセンブリフォーマットは、ＣＰＧガラスビーズ上での可溶性合成ではなく表面結合性オリゴヌクレオチド合成の使用を含む（図１３）。この構成において、オリゴヌクレオチドは、固相支持体への結合を可能にする炭化水素リンカーを用いて合成される。成分配列の解析および合成に続いて、合成されたオリゴヌクレオチドは、安定化剤が結合されるように固相支持体に共有結合し、そして、２個のライゲーション基質が表面を覆う溶液に加えられる。ライゲーションは溶液中のＤＮＡリガーゼによって媒介されて行われ、Ｔｍを超える温度上昇は、熱融解によって、連結したオリゴヌクレオチドを除去する。図１４に示されるように、解析された成分オリゴヌクレオチドのセットの固相支持体での体系的なアセンブリは、結合された安定化オリゴヌクレオチドのセットを使用したアレイに配列され得る。ライゲーション基質オリゴヌクレオチドのセットは、溶液中に入れられ、体系的なアセンブリは、連続的なアニーリング、ライゲーションおよび溶解によって、固相で実行され得、増殖したＤＮＡ分子を膜表面を通して移動させる。
【０１１８】
図１５は、成分オリゴヌクレオチドを、微小電極チップ上の金属電極のセットに結合することによって、オリゴヌクレオチドアセンブリに対する、さらなる代替的手段を示す。ここで、各々の電極は、電流および電圧に対して独立して制御され得る。このアレイは、マイナス鎖のオリゴヌクレオチドのセットを含む。電極上に正電荷を配置することにより、アニーリングが生じる表面上に、成分リガーゼ基質オリゴヌクレオチドを電気泳動によって移動させる。ＤＮＡリガーゼの存在は、成分の共有結合またはライゲーションを媒介する。次いで、この電極は止められ、または負電荷がかけられ、ＤＮＡ分子は、電極から放出される。解析されたセット由来の次の安定化オリゴヌクレオチドを含む次のアレイは、正電荷を印加され、このセット中の次のオリゴヌクレオチドとの第２のアニーリング、結合およびライゲーションが実行される。電圧制御、アニーリング、ライゲーションおよび変性の体系的なおよび反復的な適用によって、表面を横切る増幅鎖の移動および完全なＤＮＡ分子への成分のアセンブリが得られる。
【０１１９】
本発明はさらに、標的ポリヌクレオチドの自動化された合成に関する方法を提供する。例えば、所望の配列は、そのような配列を注文することを所望する使用者が利用できる任意の通信方法によって、注文可能である。本明細書で使用される場合、「使用者」は、所望のポリヌクレオチド配列をサーバーと通信することのできる任意の実体である。配列は、使用者が利用可能でサーバーが受け取り可能な任意の通信手段によって、伝達され得る。使用者は、合成の間、ポリヌクレオチドの合成に関する情報を得ることができるように、使用者は、独特の呼称（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を提供され得る。一旦、得られると、伝達された標的ポリヌクレオチド配列は、本発明に示す任意の方法によって合成され得る。
【０１２０】
本発明はさらに、使用者に、モデルポリヌクレオチド配列と通信する機構を提供することによって、および必要に応じて、使用者に、モデル配列の少なくとも１つの所望の改変を伝達する機会を提供することによって、ポリヌクレオチドの自動化された合成に関する方法を提供する。本発明は、使用者に、モデル配列およびモデル配列を改変する配列への所望の改変を提供することを構想する。標的ポリヌクレオチドまたはコードされる標的ポリペプチドの発現、機能または活性を改変する任意の改変は、本発明の方法に従って、改変されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドが合成または発現されるように、使用者によって伝達される。例えば、真核生物系で通常発現されるポリペプチドをコードするモデルポリヌクレオチドは、得られる標的ポリヌクレオチドのコドンが、原核生物系におけるポリペプチドの発現に対して助けとなるように、改変され得る。さらに、使用者は、モデルポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの所望の改変された活性を示し得る。一旦、提供されると、本発明のアルゴリズムおよび方法は、所望の改変された活性を有すると考えられる標的ポリペプチドをコードする、標的ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。本発明の方法は、さらに、標的ポリペプチドを発現し、所望の活性についてスクリーニングするために使用され得る。本発明の方法は、合成進化（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に関する方法を提供し、それによって、ポリヌクレオチドの発現および／またはポリペプチド活性の任意のパラメーターが所望のように改変され得ることが理解される。
【０１２１】
一旦、伝達されたモデル配列および所望の改変が、使用者によって提供されると、モデルポリヌクレオチド配列の少なくとも１部を含むデータは、入力デバイスを通して、プログラムされたコンピューターに入力される。一旦、入力されると、本発明のアルゴリズムは、所望の改変を含むモデルポリヌクレオチド配列の配列を決定するために使用され、改変を含む標的ポリヌクレオチドを得る。続いて、本発明のプロセッサーおよびアルゴリズムは、ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定するために使用される。標的ポリヌクレオチド（すなわち、改変モデルポリヌクレオチド）は、同定され、合成される。
【実施例】
【０１２２】
（実施例）
（核酸合成設計プロトコル）
標的ポリペプチドをコードする合成核酸配列をアセンブルする目的で、モデルポリペプチド配列またはモデル核酸配列を入手し、そして例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒまたはＤＮＡ  Ｓｔａｒのような適切なＤＮＡ分析パッケージを使用して分析する。標的タンパク質が、例えば細菌系で発現される場合、モデル配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ優先コドン（すなわち、タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩコドン優先性）を使用したポリペプチドをコードする配列に変換し得る。本発明は、変換プログラム、コドンＩ、コドンＩＩまたはコドンＩＩＩを提供する。本発明の核酸配列は、任意の原核生物体または真核生物体の任意のコドン優先性に適応するように設計され得る。
【０１２３】
上記コドン優先性に加えて、特定のプロモーター配列、エンハンサー配列、複製配列または薬剤耐性配列が、本発明の合成核酸配列に含まれ得る。構築物の長さは、配列の挿入（ｐａｄｄｉｎｇ）によって調節され、約２５〜１００ｂｐの合成に基いておよその数の塩基を与える。約２５〜１００ｂｐ長の配列の合成は、アレイ合成機システムを使用して作製され、アセンブルされ得、そして、さらなる精製をせずに使用され得る。例えば、１００マーを含む２つの９６ウェルプレートは、標的配列の９６００ｂｐ構築物を与え得る。
【０１２４】
標的配列のアセンブリに必要とされるオリゴヌクレオチドの設計に続いて、このオリゴヌクレオチドは、ＰａｒｓｅＯｌｉｇｏＴＭ、核酸配列アセンブリを最適化する独自のコンピュータープログラムを使用して解析される。配列アセンブリにおける任意の工程として、ヘアピン、リピートまたは他の困難な配列を生じ得る配列を同定し、そして削除する工程が挙げられる。解析されたオリゴヌクレオチドのリストは、合成機ドライバーソフトウェアに移される。個々のオリゴヌクレオチドは、ウェルに貼り付けられ、オリゴヌクレオチド合成が達成される。
【０１２５】
（２段階ＰＣＲ反応を使用した、解析されたオリゴヌクレオチドのアセンブリ）
各５０塩基で、約２５塩基対（ｂｐ）の重複を有する、解析された重複オリゴヌクレオチドの一連のセットを得る。オリゴヌクレオチド濃度は、２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍｌ）からである。５０塩基のオリゴは、７５〜８５℃のＴｍ、６〜１０ｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇを与える。５０〜１００μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、２５０ｎＭ／ｍｌにする。各々のオリゴヌクレオチドを等量混合し、２５０μＭ（２５０ｎＭ／ｍｌ）の最終濃度にする。各々１μｌを加え、１９２μｌを与える。８μｌのｄＨ２Ｏを加え、２００μｌにする。最終濃度は、２５０μＭ混合オリゴである。１０μｌの混合オリゴを取り、２５０倍に希釈し、１ｍｌの水に加える（１／１００；２．５μＭ）。次いで、これの１μｌを取り、２４μｌの１×ＰＣＲ混合液に加える。ＰＣＲ反応液は、以下を含む：
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣ１２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭ  各ｄＮＴＰ
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。
１ＵのＴａｑＩポリメラーゼを、この反応液に加える。反応は、以下の条件下で熱サイクルされる。
ａ．アセンブリ
ｉ．５５サイクルの
１．９４℃、３０秒
２．５２℃、３０秒
３．７２℃、３０秒。
アセンブリ増幅に続いて、このアセンブリ混合物を、２．５μｌ取り、１００μｌのＰＣＲ混合液に加える。（４０倍希釈）。２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０、２５０ｎｍｏｌ／μｌ）の１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を取ることによって、外側プライマーを調製し、１００μｌのＰＣＲ反応液に加える。これは、最終濃度２．５μＭの各オリゴを与える。１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを加え、以下の条件で熱サイクルする：
３５サイクル（または、オリジナルのプロトコール、２３サイクル）
９４℃、３０秒
５０℃、３０秒
７２℃、６０秒。
フェノール／クロロホルムで抽出する。エタノールで沈殿する。１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁し、アガロースゲルで分析する。
【０１２６】
（Ｔａｑ１ライゲーションを利用する解析されたオリゴヌクレオチドのアセンブリ）
約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重複を有する、約２５〜１５０塩基長の解析された重複オリゴヌクレオチドのアレイセットを得る。このオリゴヌクレオチドの濃度は、２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍｌ）からである。例えば、５０塩基のオリゴは、７５〜８５℃のＴｍ、６〜１０ｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇを与える。５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、２５０ｎＭ／ｍｌにする。
【０１２７】
ロボットのワークステーションを使用して、等量の順方向オリゴおよび逆方向オリゴを対にして組合わせる。１０μｌの順方向オリゴおよび１０μｌの逆方向オリゴを取り、新規の９６ウェルｖ底プレート中で混合する。これは、表１のプーリングスキーム工程１に従う、２５０μμの二重鎖オリゴヌクレオチドのセットを有する１つのアレイを与える。２μｌの各オリゴマー対を取り、各々のウェルに１００μｌのライゲーション混合液を含む新規のプレートに加えることによって、アセンブリプレートを調製する。これは、２．５μＭまたは２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度を与える。各々のウェルの２０μｌを新規のマイクロウェルプレートに移し、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰを各々のウェルに加える。各々の反応液は、５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌのＡＴＰを有する。３７℃で３０分間インキュベーションする。
【０１２８】
表１の工程２〜７に従って、アセンブリを開始する。各連続するウェルを隣のウェルと混合して、プーリング工程２を実行する。１μｌのＴａｑ１リガーゼを各混合されたウェルに加える。９４℃、３０秒；５２℃、３０秒；次いで、７２℃１０分のサイクルを、一度実施する。
【０１２９】
上記の温度スキームに従って、工程３（表１）のプーリングスキームおよびサイクルを実行する。上記の温度スキームに従って、工程４および５のプーリングスキームおよびサイクルを実行する。プーリングスキーム工程６を実行し、各混合液の１０μｌを取り、新規のマイクロウェルに加える。残りの３個のウェルをプーリングすることによって、工程７のプーリング工程を実行する。反応液の容積は、以下のとおりである：
初期のプレートは、ウェルあたり、２０μｌ有する。
工程２  ２０μｌ＋２０μｌ＝４０μｌ
工程３  ８０μｌ
工程４  １６０μｌ
工程５  ２３０μｌ
工程６  １０μｌ＋ｌ０μｌ＝２０μｌ
工程７  ２０＋２０＋２０＝６０μｌ（最終反応容量）。
【０１３０】
次いで、最終のＰＣＲ増幅は、２μｌの最終ライゲーション混合液を取り、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣ１、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０μｌのＰＣＲ混合液に加えることによって実行される。
【０１３１】
２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−、０．２５０ｎｍｏｌ／μｌ）の１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を取ることによって、外側プライマーを調製し、１００μｌのＰＣＲ反応液に加える。これは、最終濃度２．５μＭの各オリゴを与える。１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを加え、以下の条件で３５サイクルする：９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；および７２℃、６０秒。この混合液をフェノール／クロロホルムで抽出する。エタノールで沈殿する。１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁し、アガロースゲルで分析する。
（表１ライゲーションアセンブリに対するプーリングスキーム。ライゲーション方法−ウェルプーリングスキーム）
【０１３２】
【表１】
2004533228.tif 000009
2004533228.tif 000010
2004533228.tif 000011
（ＴａｑＩ合成およびＴａｑＩアセンブリを使用する解析されたオリゴヌクレオチドのアセンブリ）
長さが各々約２５〜１５０塩基であり約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重複を含む、解析された重複するオリゴヌクレオチドの整列された組を、得る。このオリゴヌクレオチド濃度は、２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍｌ）からである。５０塩基オリゴは、７５℃から８５℃までのＴｍ、６〜１０のｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇを示す。２５０ｎＭ／ｍｌを生成するために５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１３３】
本発明は、核酸アセンブリを実施するためにロボットワークステーションを使用することを想定する。本実施例において、２．５ｍＭでＰＣＲ混合物中に順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドを含む、２つの作業プレートを調製し、そして１μｌの各オリゴを、新しいマイクロウェル中の１００μｌのＰＣＲ混合物に添加して、アレイ状の順方向オリゴのひとつのプレートおよび逆方向オリゴのひとつのプレートを提供する。次いで、サイクリングのアセンブリを、表１で概要を述べられたプールスキームに従い以下の通りに開始する。本実施形態において、９６サイクルのアセンブリを、このスキームに従い実施し得る。
【０１３４】
新しいウェルにウェルＦ−Ｅ１の２μｌを移し；新しいウェルにＲ−Ｅ１の２μｌを移し；１８μｌの１×ＰＣＲ混合物を加え；１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを加える；
サイクル１回：
９４℃  ３０秒
５２℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
続いて、反応容器にウェルＦ−Ｅ２の２μｌを移し；反応容器にウェルＲ−Ｄ１２の２μｌを移す。上記の温度に従いサイクルを一回行なう。約９６サイクルの間、表１で概要を述べられたスキームに従いプールおよびサイクリングを繰り返す。
【０１３５】
次いで、ＰＣＲ増幅を、２□ｌの最終反応混合物を取り、そして以下：
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
を含む２０μｌのＰＣＲ混合物にそれを加えることにより実施する。
【０１３６】
外部プライマーを、２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌｅ／ｍｌ）で１μｌのＦ１および１μｌのＲ９６を取ることにより調製し、そして１００μｌのＰＣＲ反応物に加える。これは、最終濃度２．５μＭの各オリゴを示す。続いて、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを、加え、そして反応物を、以下の条件下で約２３〜３５サイクルの間でサイクリングする：
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ６０秒
続いて、この反応物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで調製し、そしてアガロースゲル上での分析のために１０ｍｌのｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【０１３７】
等量の順方向オリゴおよび逆方向オリゴの対での、１０μｌの順方向オリゴおよび１０μｌの逆方向オリゴを取り出すことにより添加し、そして新しい９６−ウェルのＶ底プレート内で混合する。これは、表１におけるプールスキームの工程１に従い、２５０ｍＭの二重鎖オリゴヌクレオチドの組を１つのアレイに提供する。アセンブリプレートを、２μｌの各オリゴマー対を取りだすこと、そして各ウェルに１００μｌのライゲーション混合物を含むプレートにそれらを添加することにより調製した。これは、２．５μＭ／ｍｌまたは２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度を示す。各ウェルの約２０μｌを、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰに加えて、新しいマイクロウェルプレートに移す。各々の反応物は、５０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌｅのＡＴＰを有する。これを３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１３８】
核酸アセンブリを、表１の工程２〜７に従い開始した。工程２のプールを、連続して各ウェルをその次のウェルと混合することにより実行する。１μｌのＴａｑ１リガーゼを、混合された各ウェルに添加し、以下のように一回サイクルする：
９４℃  ３０秒
５２℃  ３０秒
７２℃  １０分
プールスキームの工程３を、実行し、そして上記の温度スキームに従いサイクルする。プールスキームの工程４および５を実行し、そして上記の温度スキームに従いサイクルする。プールスキーム工程６を実行し、１０μｌの各混合物を新しいマイクロウェル中に取り入れる。工程７のプールスキームを、残りの３つのウェルをプールすることにより実行する。反応物容積は、以下：
工程２  ２０μｌ＋２０μｌ＝４０μｌ
工程３  ８０μｌ
工程４  １６０μｌ
工程５  ２３０μｌ
工程６  １０μｌ＋１０μｌ＝２０μｌ
工程７  ２０＋２０＋２０＝６０μｌ
の最終反応物容積である（開始プレートは、１ウェルにつき２０μｌを有する）。
【０１３９】
最終ＰＣＲ増幅を、最終ライゲーション混合物の２μｌを取り、そして以下：
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
を含む２０μｌのＰＣＲ混合物にそれを加えることにより実施する。
【０１４０】
外部プライマーを、２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ナノモル／ｍｌ）の１μｌのＦ１および１μｌのＲ９６を取ることにより調製し、そして１００μｌのＰＣＲ反応物にそれらを加え、各オリゴについて２．５μＭの最終濃度を示す。続いて、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを加え、そして以下の条件下で約２３〜３５サイクルの間サイクルする：
９４℃  ３０秒
５０℃  ３０秒
７２℃  ６０秒
生成物を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁し、そしてアガロースゲル上で分析する。
【０１４１】
【表２】
2004533228.tif 000012
2004533228.tif 000013
2004533228.tif 000014
【０１４２】
【表３】
2004533228.tif 000015
2004533228.tif 000016
2004533228.tif 000017
（核酸分子のアセンブリ）
表４で記載された核酸分子は、本明細書中で記載された方法を使用して産生した。各核酸分子の特徴および特性をまた、表４にも記載する。
【０１４３】
表４に記載されるように、長さ４８００ｂｐの合成プラスミドを、アセンブルした。このプラスミドは、１９２オリゴヌクレオチドを含む（９６個の重複する５０マー２組、２５ｂｐの重複）。このプラスミドは、本質的に、アンピシリン耐性の代わりにカナマイシン耐性を含むｐＵＣである。その合成プラスミドはまた、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉ細菌のルシフェラーゼ遺伝子由来のｌｕｘＡ遺伝子およびｌｕｘＢ遺伝子もまた含む。ＳｙｎＰｕｃ１９プラスミドは、長さ２７００ｂｐであり、正確に２７００ｂｐにまで短縮されただけのｐＵＣ１９と本質的に同一の配列を含む。９６個の５０マー２組を、このプラスミドをアセンブルするために使用した。Ｓｙｎｌｕｘ４  ｐＵＣ１９プラスミドを、短縮し、そしてｌｕｘＡ遺伝子を、加えた。２７オリゴヌクレオチドの２組を含む５４個の１００マーオリゴヌクレオチドを、このプラスミドをアセンブルするために使用した。２４００ｂｐを含むｍｉｎｉＱＥ１０プラスミドを、４８個の５０マーオリゴヌクレオチドを使用してアセンブルした。ＭｉｎｉＱＥ１０は、６×Ｈｉｓタグおよび高レベルポリペプチド発現のための細菌プロモーターを含む、発現プラスミドである。ＭｉｎｉＱＥ１０を、本発明のＴａｑ１ポリメラーゼ増幅方法を使用してアセンブルおよび合成した。ｍｉｃｒｏＱＥプラスミドは、アンピシリン遺伝子、複製起点およびｐＱＥプラスミドのリンカーだけを含む、最小のプラスミドである。ＭｉｃｒｏＱＥを、２４個の５０マーまたは、チューブＰＣＲ増幅のいずれかを用いる組み合わせライゲーションを使用して、アセンブルした。ＳｙｎＦｉｂ１核酸配列、ＳｙｎＦｉｂＢ核酸配列、ＳｙｎＦｉｂＧ核酸配列は、原核生物発現系において発現を最適化するＥ．ｃｏｌｉコドンを使用して産生された、合成ヒトフィブリノーゲンである。
【０１４４】
【表４】
2004533228.tif 000018
本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を示すことを意図し本発明の範囲を制限しないこと、そしてこの本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定されていることが、理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１４５】
参考文献のように、種々の図面中の同じ参照符号は、同じ要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、Ｆ（すなわち、「順方向」または「プラス鎖」）オリゴヌクレオチド合成、Ｒ（すなわち、「逆方向」または「マイナス鎖」）オリゴヌクレオチド合成のための９６ウェルプレート、およびＦオリゴヌクレオチドおよびＴオリゴヌクレオチドのアニーリングのためのＴ（すなわち、「温度」）プレートを示す。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドのプーリングプランを示し、ここで、ＦオリゴヌクレオチドおよびＲオリゴヌクレオチドは、隣接するポリヌクレオチドを形成するためにアニールされる。
【図３】図３は、遺伝子、ゲノム、遺伝子のセットまたはポリペプチド配列を規定する標的ポリヌクレオチド配列のアセンブリの模式図を示す。この配列は、コンピューターにより設計され、そして標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の＋鎖および−鎖をカバーする解析されたオリゴヌクレオチドフラグメントのセットを作製するために使用される。
【図４】図４は、ポリヌクレオチド合成モジュールの模式図を示す。複数のバルブを有するナノ分配（ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅ）ヘッドが、合成化学物質をアセンブリ容器中に沈着する。試薬レザバからの化学物質の分配は、シリンジポンプを使用して制御され得る。下にある反応チャンバーは、ミクロフルイディクスによって流体を動かすミクロチャンネルに連結されたアセンブリ容器のセットである。
【図５】図５は、オリゴヌクレオチド合成、プーリングおよびアニーリングによるオリゴヌクレオチドアセンブリを示し、そしてライゲーションは、ミクロ流体混合を用いて達成され得る。
【図６】図６は、アレイ中で合成されたオリゴヌクレオチドの連続したプーリングを示す。
【図７】図７は、アレイから全てのオリゴヌクレオチドの完全なアセンブリをもたらすマニホルドアセンブリを介するオリゴヌクレオチド成分のプーリングステージを示す。
【図８】図８は、一単位における微小組立（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）を使用して作製されたプーリングマニホルドの完全なセットを包含するアセンブリモジュールの例を示す。プーリングマニホルドの種々の配置は、解析された成分オリゴヌクレオチドの増加した数のウェルアレイのアセンブリを可能にする。
【図９】図９は、予め定義されたアレイ中で合成されたオリゴヌクレオチドのアセンブリについての配置を示す。ＤＮＡリガーゼならびに他の適切な緩衝液および化学成分の存在下、アセンブリデバイスを通じる流路は、二本鎖のポリヌクレオチドアセンブリを促進する。
【図１０】図１０は、プーリングデバイス設計の例を示す。ミクログルーブまたはミクロ流体チャンネルは、プーリングデバイスの表面にエッチングされる。このデバイスは、１）２つの流れの混合、２）接合部位での制御された温度の維持または循環、および３）流出チャネルから次のセットのプーリングチャンバーおよびライゲーションチャンバーへのライゲーションされた混合物の排出、のための２つのチャンネルの接合部にミクロ反応容器を提供する。
【図１１】図１１は、ミクロ分配のための複数のチャンネルを処理するミクロウェルプレートを含むポリヌクレオチド合成プラットホームの設計を示す。
【図１２】図１２は、１プレートあたり１５３６成分を越えるオリゴヌクレオチドを合成し得る高密度ミクロウェルミクロプレートを用いる高容量ポリヌクレオチド合成プラットホームの例を示す。
【図１３】図１３は、可溶性合成よりも表面結合オリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドアセンブリ型式を示す。この配置において、オリゴヌクレオチドは、固体支持体への連結を可能にするリンカーを用いて合成される。
【図１４】図１４は、固体支持体上の系統的なポリヌクレオチドアセンブリの図を示す。解析される成分オリゴヌクレオチドのセットは、付着したスタビライザーオリゴヌクレオチドを用いてアレイ中に配列される。ライゲーション基質オリゴヌクレオチドのセットは、溶液中に配置され、そして系統的なアセンブリが、連続的なアニーリング、ライゲーションおよび融解によって固相中で実施される。
【図１５】図１５は、超小型電子チップ上の金属電極のセットに結合した成分オリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドアセンブリを示す。各電極は、独立して、電流および電圧に対して制御され得る。
【図１６】図１６は、本発明の一般的なプライマー伸長アセンブリ法を示す。
【図１７】図１７は、本発明のシステム図を示す。
【図１８】図１８は、本発明の装置の透視図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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