(57)【要約】本発明は、上皮組織にわたり（眼の組織へおよび眼の組織を横切ることを含む、薬物および他の薬剤の送達を増強するための組成物および方法を提供する。この組成物および方法はまた、内皮組織（血液脳関門を含む）にわたった送達に有用である。この組成物および方法は、非結合体化化合物と比較して、１つ以上の組織層にわたり、試薬に結合体化された化合物の送達を増強するために十分なグアニジノ側鎖部分およびアミジノ側鎖部分を有する、送達増強輸送体を使用する（図４参照）。この送達増強ポリマーとしては、例えば、好ましくは、約６残基長と約２５残基長との間であるポリ−アルギニン分子が挙げられる。
2004533414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の、動物の眼の組織へのかつ横切っての送達を増強する方法であって、該方法は、該化合物および送達増強輸送体を含む結合体を、該眼の組織に投与する工程を包含し、ここで：
ｉ．該化合物が、リンカーを介して該送達増強輸送体に結合され；そして、
ｉｉ．該送達増強輸送体が、５０未満のサブユニットを含み、そして、少なくとも５つのグアニジノ部分またはアミジノ部分を含み、これによって、該送達増強輸送体の非存在下での該化合物の輸送と比較して、該眼の組織への該結合体の送達増強される、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記眼の組織への送達が、前記送達増強輸送体の非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも２倍増大される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体の前記眼の組織への送達が、前記送達増強輸送体の非存在下における前記化合物の送達と比較して、少なくとも１０倍増大される、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記眼の組織が、上皮組織または内皮組織の１以上の層である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記眼の組織が網膜である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記眼の組織が視神経である、方法。
【請求項７】
前記リンカーが、放出可能なリンカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記リンカーが、ｐＨ７の生理食塩水中で安定であるが、細胞に輸送されると切断される、方法。
【請求項９】
前記サブユニットがアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化１】
2004533414.tif 000036
のような構造３、４または５からなる群より選択される構造を有し、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、生物学的活性化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成された結合であり；
Ａは、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
Ｒ３は、前記送達増強輸送体を含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；
ｋおよびｍは１および２から各々独立して選択され；ならびに
ｎは１〜１０である、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項１２】
前記結合体が構造３を含み、ＹはＮであり、そして、Ｒ２はメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ２はベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎが各々１であり、そして、Ｘが−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合体は構造４を含み；Ｒ５はＮＨＲ６であり；Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そして、ｋおよびｍは各々１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合体が、以下：
【化２】
2004533414.tif 000037
のような構造６を含み、ここで：
Ｒ１は、前記化合物を含み；
Ｘは、生物学的活性化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；
Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成された結合であり；
Ａｒは、オルト位またはパラ位に配置された結合化遊離基を有するアリール基であり、該アリール基は置換されてもよいし、置換されなくてもよく；
Ｒ３は、前記送達増強輸送体を含み、
Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；
Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、水素またはアルキルから独立して選択され；そして
ｋおよびｍは、１および２から各々独立して選択される、
方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、およびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、各々、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される、方法。
【請求項１８】
Ｒ４はＳであり；Ｒ５はＮＨＲ６であり；そして、Ｒ６は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合体が、少なくとも２つの送達増強輸送体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合体が、点眼剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合体が、注入として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記送達増強輸送体が、非ペプチド骨格を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記送達増強輸送体は、該送達増強輸送体分子が天然に存在するタンパク質中で結合されるアミノ酸配列に結合されない、方法。
【請求項２４】
前記送達増強輸送体が、５〜２５のグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記送達増強輸送体が、７と１５の間のグアニジノ部分を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記送達増強輸送体が、少なくとも６つの連続したグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、本質的に５〜５０のアミノ酸からなり、これらのアミノ酸の少なくとも５０％がアルギニンまたはそのアナログである、方法。
【請求項２８】
前記送達増強輸送体が、５〜２５のアルギニン残基またはそのアナログを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのアルギニンが、Ｄ−アルギニンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルギニンの全てがＤ−アルギニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記送達増強輸送体を含む前記アミノ酸の少なくとも７０％が、アルギニンまたはアルギニンアナログである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記送達増強輸送体が、７つの連続したＤ−アルギニンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、緑内障、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、視神経炎、星芒状網膜炎、網膜炎、偽腫瘍／筋炎、眼窩筋炎、血管腫／リンパ管腫、トキソカラ症、ベーチェット汎ブドウ膜炎、炎症性網脈絡膜症、脈管炎、眼乾燥症候群（シェーグレン症候群）、角膜浮腫、調節性内斜視、毛様体筋麻痺、散瞳、逆散瞳、および黄斑変性からなる群より選択される疾患のための治療薬である、方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は、抗菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗原生動物化合物、抗ヒスタミン剤、瞳孔を拡大する化合物、麻酔化合物、ステロイド系抗炎症剤、抗炎症性鎮痛薬、化学療法剤、ホルモン、抗白内障化合物、新生血管形成インヒビター、免疫抑制剤、プロテアーゼインヒビター、アルドースレダクターゼインヒビター、コルチコステロイド、免疫抑制剤、コリン作用薬、抗コリンエステラーゼ剤、ムスカリンアンタゴニスト、交感神経作用剤、αアドレナリン作動性アンタゴニスト、βアドレナリン作動性アンタゴニスト、ならびに抗脈管形成因子からなる群より選択される、方法。
【請求項３５】
前記化合物が、アシクロビルおよびシクロスポリンからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が、血液脳関門を横切って輸送される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、眼の上皮組織および内皮組織ならびに眼および眼瞼における他の組織を横切った薬物および他の組成物の送達を増強する、組成物および方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（背景）
眼の処置のための薬物の投与は、以下の少なくとも３つのカテゴリーに分けられる：局所投与、注射および全身投与。
【０００３】
点眼剤および眼軟膏剤は、極めて多数の眼障害および眼疾患を処理するために長年にわたって用いられてきた。しかし、局所投与は、眼の自然保護表面に起因して、必ずしも有効なわけではない。多くの環境では、活性薬剤の１％未満が標的部位に送達される。
【０００４】
眼注射は、より高濃度の活性薬剤を標的に送達するために有効であり得る。時々、薬物を眼の中の適切な部位に正確に注入することは困難であり得る。
【０００５】
全身投与を用いて薬剤を眼に送達し得るが、高用量を必要とする。なぜなら、投与された化合物のうちの極めて少量が実際に眼に入るからである。
【０００６】
本発明は、これらの課題および他の課題と取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（関連出願の引用）
本出願は、２００１年２月２３日に出願された米国特許出願第０９／７９２，４８０号の一部継続出願である。米国特許出願第０９／７９２，４８０号は、２０００年８月２４日に出願された米国特許出願第０９／６４８，４００号の一部継続出願である。米国特許出願第０９／６４８，４００号は、１９９９年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／１５０，５１０号に対する優先権を主張する。これらの出願の両方は、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の送達増強輸送体および送達増強方法は、薬物、診断剤および他の目的化合物を眼および他の眼組織へと送達するために有用である。いくつかの実施形態では、この方法は、化合物および送達増強輸送体を含む結合体を眼組織に投与する工程を包含する。送達増強輸送体（これもまた、本発明によって提供される）は、この送達増強輸送体の非存在下でのこの化合物の送達と比較して、眼組織へのこの結合体の送達を増大させるに充分なグアニジノ部分またはアミジノ部分を有する。いくつかの実施形態では、眼組織へのこの結合体の送達は、この送達増強輸送体の非存在下でのこの化合物の送達と比較して、少なくとも２倍増大する。いくつかの実施形態では、眼組織へのこの結合体の送達は、この送達増強輸送体の非存在下でのこの化合物の送達と比較して、少なくとも１０倍増大する。いくつかの実施形態では、眼組織は、眼上皮組織または眼内皮組織である。いくつかの実施形態では、眼組織は、網膜または視神経である。
【０００９】
送達増強輸送体と化合物とは代表的に、リンカーを介して結合している。さらに、結合体は、化合物に連結した２以上の送達増強輸送体を含み得る。
【００１０】
代表的には、送達増強輸送体は、５０個よりも少ないサブユニットを含み、そして少なくとも６個のグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む。いくつかの実施形態では、サブユニットは、アミノ酸である。いくつかの実施形態では、送達増強輸送体は、６個〜２５個のグアニジノ部分またはアミジノ部分を、そしてより好ましくは７個と１５個との間のグアニジノ部分を、そしてさらにより好ましくは少なくとも６個連続するグアニジノ部分および／またはアミジノ部分を有する。いくつかの実施形態では、送達増強輸送体は、本質的に、５個〜５０個のサブユニットからなり、このうちの少なくとも５０個は、グアニジノ残基またはアミジノ残基を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、サブユニットは、天然または非天然のアミノ酸である。例えば、いくつかの実施形態では、送達増強輸送体は、５個〜２５個のアルギニン残基またはそのアナログを含む。例えば、輸送体は、７個連続するＤ−アルギニンを含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、送達増強輸送体は、７個〜１５個のアルギニン残基またはアルギニンのアナログを含む。送達増強輸送体は、Ｄ−アルギニンである少なくとも１個のアルギニンを有し得、そしていくつかの実施形態では、全てのアルギニンがＤ−アルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸の少なくとも７０％は、アルギニンまたはアルギニンアナログである。いくつかの実施形態では、送達増強輸送体は、少なくとも５個連続するアルギニンまたはアルギニンアナログを含む。送達増強輸送体は、非ペプチド骨格を含み得る。さらに、いくつかの局面では、輸送体は、送達増強分子が天然に存在するタンパク質中で結合しているアミノ酸配列に結合していない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、結合体は、点眼剤として、または注射として投与される。結合体の化合物としては、以下からなる群より選択される疾患に関する治療剤が挙げられる：細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、緑内障、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎および後部ブドウ膜炎、視神経炎、レーバー視神経網膜炎、網膜炎、偽腫瘍（ｐｓｕｄｏｔｕｍｏｒ）／筋炎、眼窩筋炎、血管腫／リンパ管腫、トキソカラ症、ベーチェット汎ブドウ膜炎（ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｐａｎｕｖｅｉｔｉｓ）、炎症性網脈絡膜症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｏｒｉｓｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、脈管炎、眼乾燥症候群（シェーグレン症候群）、角膜水腫、調節性内斜視、毛様体筋麻痺、散瞳、逆散瞳および黄斑変質。いくつかの実施形態では、化合物は、抗細菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗原生動物化合物、抗ヒスタミン剤、瞳孔を拡張（ｄｉａｌａｔｅ）する化合物、麻酔性（ａｎｅｔｈｓｔｅｔｉｃ）化合物、ステロイド性抗炎症剤、抗炎症性鎮痛剤、化学療法剤、ホルモン、抗白内障剤、新生血管形成インヒビター、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）、プロテアーゼインヒビター、アルドースレダクターゼインヒビター、コルチコイドステロイド、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）、コリン作用性薬剤、抗コリンエステラーゼ剤、ムスカリン様（ｍｕｓｃａｒｉｃ）アンタゴニスト、交感神経作用性薬剤、αおよびβアドレナリン作用性アンタゴニスト、ならびに抗脈管形成因子からなる群より選択される。従って、化合物としては、抗細菌化合物、抗ウイルス化合物、シクロスポリン、アスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）およびコルチコステロイドが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、化合物は、アシクロビルおよびシクロスポリンからなる群より選択される。
【００１３】
上記で考察するように、送達されるべき化合物は、リンカーによって送達増強輸送体へと連結され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、化合物が上皮組織および／または内皮組織の１以上の層内におよび／または層を通って通過した後に、送達増強輸送体から、生物学的に活性な形態で化合物を遊離する、遊離可能リンカーである。いくつかの実施形態では、化合物は、溶媒媒介切断によってリンカーから遊離される。結合体は、いくつかの実施形態では、酸性ｐＨでは実質的に安定であるが、化合物は、生理学的ｐＨで送達増強輸送体から実質的に遊離される。いくつかの実施形態では、結合体の半減期は、皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織と接触してから５分間と２４時間との間である。例えば、半減期は、皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織と接触してから３０分間と２時間との間であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｐＨ７で生理学的食塩水溶液中で安定であるが、細胞中に輸送された場合、切断される。
【００１４】
本発明の結合体構造体の例としては、以下の通りの３、４または５のような構造を有する結合体構造体が挙げられる：
【００１５】
【化３】
2004533414.tif 000003
ここで、Ｒ１は、化合物を含み；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された結合であり；Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成された結合であり；Ａは、ＮまたはＣＨであり；Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；Ｒ３は、送達増強輸送体を含み；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；ｋおよびｍは、１および２から各々独立して選択され；そしてｎは、１〜１０である。
【００１６】
好ましくは、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネートおよびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、Ｈおよびアルキルからなる群より各々独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そしてＲ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、ベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎは、各々１であり、そしてＸは、Ｏである。いくつかの実施形態では、結合体は、構造３を含み、Ｙは、Ｎであり、そしてＲ２は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、ベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎは、各々１であり、そしてＸは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、結合体は、構造４を含み；Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そしてＲ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。いくつかの実施形態では、結合体は、構造４を含み；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そしてｋおよびｍは、各々１である。
【００１７】
本発明はまた、生物学的薬剤からのリンカーの遊離が、第一律速分子内反応、続いてリンカーの遊離をもたらす、より速い分子内反応を含む、結合体を提供する。律速反応は、リンカーの置換基の適切な選択によって、生理学的ｐＨよりも高いかまたは低いｐＨにおいて適切であるようになされ得る。しかし、一旦、結合体が上皮組織または内皮組織の１以上の層内におよび層を横切って通過すると、リンカーは、薬剤から切断される。この型のリンカーを有する化合物の例は、以下の通りの構造６である：
【００１８】
【化４】
2004533414.tif 000004
ここで、Ｒ１は、化合物を含み；Ｘは、生物学的に活性な化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間で形成された連結であり；Ｙは、輸送部分上の官能基と連結部分上の官能基との間で形成された結合であり；Ａｒは、オルト配置またはパラ配置に配置され結合された基を有するアリール基であって、このアリール基は、置換されていても置換されていなくともよく；Ｒ３は、送達増強輸送体を含み；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は、水素またはアルキルから独立して選択され；そしてｋおよびｍは、各々、１および２から独立して選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネートおよびＣＲ７Ｒ８からなる群より選択され、ここで、Ｒ７およびＲ８は、Ｈおよびアルキルからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そしてＲ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、溶媒媒介切断され得るリンカーを含む。例えば、好ましいリンカーは、酸性ｐＨで実質的に安定であるが、生理学的ｐＨで実質的に切断される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＰＢＳのような生理学的食塩水溶液中で安定である。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理学的食塩水溶液中で安定であるが、細胞中に輸送された場合、切断される。
【００２１】
（詳細な説明）
（定義）
「眼組織」とは、眼および眼瞼の組織をいう。眼の組織または層としては、例えば、強膜、角膜（これは、非角化扁平上皮の層を含む）、角膜支質、内皮（厚い基底膜（ｂａｓｅｍｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（デスメー膜）上に位置する細胞層を含む）が挙げられる。さらなる眼層としては、例えば、閉鎖帯（ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）、房水、虹彩（ｏｉｒｉｓ）、硝子体液／硝子体、脈絡膜、毛様体（毛様体上皮を含む）、網膜（杆細胞および錐体細胞を含む）、水晶体および視神経が挙げられる。例えば、ＧＲＡＹ’Ｓ  ＡＮＡＴＯＭＹ（Ｗｉｌｌｉａｍｓら編、１９９５）を参照のこと。
【００２２】
「上皮組織」は、身体の表面、間隙および内腔の表面領域を覆う基部組織である。上皮組織は、主に、互いに結合して、上皮細胞によって代表的に産生される細胞外マトリクス（基底膜）上に静止する上皮細胞から構成される。上皮組織としては、細胞の形状に基づいて、３つの一般的型が挙げられる：扁平上皮、立方上皮および円柱上皮。扁平上皮（これは、肺および血管、ならびに角膜を覆う）は、平らな細胞から構成される。立方上皮は、腎臓の細管を覆い、そして立方体形状の細胞から構成され、一方、円柱上皮細胞は、消化管を覆い、そして円柱状の外観を有する。上皮組織はまた、組織中の細胞層の数に基づいて分類され得る。例えば、単純上皮組織は、１層の細胞から構成されており、細胞の各々は、基底膜上に位置する。「重層」上皮組織は、互いに積み重なったいくつかの細胞から構成される；全ての細胞が基底膜と接触しているわけではない。「多列」上皮組織は、全てが基底膜と接触しているが、核が種々のレベルで存在するので重層しているようである細胞を有する。
【００２３】
用語「経上皮」送達または「経上皮」投与とは、局所投与による、体表面または組織（例えば、角膜、閉鎖帯、水晶体など）の１以上の層を通した透過による、薬剤の送達または投与をいう。送達は、例えば、組織のより深い層に対する送達、および／または血流へのもしくは血流からの送達であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用される「送達増強」、「浸透増強」または「透過増強」は、上皮もしくは内皮組織または他の眼組織の１以上の層内へとおよび１以上の層を横切って送達される化合物の送達の量および／または速度の増加に関する。送達の増強は、このような組織の１以上の層を通して通過する化合物の速度および／または量を測定することによって観察され得る。送達の増強はまた、化合物が送達される組織の深さおよび／または上皮もしくは他の組織の１以上の細胞型への送達程度の増大（例えば、角膜、視神経、水晶体または他の組織への送達の増大）を含み得る。このような測定値は、例えば、米国特許第５，８９１，４６２号に記載されるような拡散セル装置を用いて容易に得られる。
【００２５】
眼または他の上皮膜もしくは内皮膜を横切るおよび／あるいは眼または他の上皮膜もしくは内皮膜内への薬剤の送達の量または速度は、時々、所定面積の眼または他の組織を通過する化合物の量に関して定量される。この面積は通常、約０．１ｃｍ２〜約１００ｃｍ２の範囲、例えば、約０．１ｃｍ２〜約１ｃｍ２の範囲、または約０．５ｃｍ２〜約２ｃｍ２の範囲である。
【００２６】
用語「グアニジル」、「グアニジニル」および「グアニジノ」は、式−ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ（非プロトン化形態）を有する部分を言及するために交換可能に用いられる。一例として、アルギニンは、グアニジル（グアニジノ）部分を含み、そしてまた、２−アミノ−５−グアニジノ吉草酸またはα−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸といわれる。「グアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ）」とは、正に荷電した結合体の酸形態をいう。用語「グアニジノ部分」は、例えば、グアニジン、グアニジニウム、グアニジン誘導体（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＲ’）、一置換グアニジン、モノグアニド、ビグアニド、ビグアニド誘導体（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＲ’））などを包含する。さらに、用語「グアニジノ部分」は、任意の１以上のグアニド単独または異なるグアニドの組合せを包含する。
【００２７】
「アミジニル」および「アミジノ」とは、式−Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ２）を有する部分をいう。「アミジニウム」とは、正に荷電した共役酸形態をいう。
【００２８】
用語「経障壁（ｔｒａｎｓ−ｂａｒｒｉｅｒ）濃度」または「経組織（ｔｒａｎｓ−ｔｉｓｓｕｅ）濃度」とは、特定の組成物が加えられた組織の側面に対して反対または「トランス」にある、上皮障壁組織または内皮障壁組織の１つ以上の層の側面に存在する化合物の濃度をいう。例えば、化合物が皮膚に適用される場合、皮膚の１つ以上の層を横切って引き続いて測定される化合物の量は、その化合物の経障壁濃度である。
【００２９】
「生物学的に活性な薬剤」または「生物学的に活性な物質」とは、低分子、高分子、または金属イオンのような化学物質をいい、これらは、細胞による取り込みの際に、その細胞の構造、機能または組成に観察可能な変化をもたらす。観察可能な変化としては、１つ以上のｍＲＮＡの増加または減少した発現、１つ以上のタンパク質の増加または減少した発現、タンパク質または他の細胞成分のリン酸化、酵素の阻害または活性化、結合対のメンバー間の結合の阻害または活性化、代謝産物の合成の増加または減少した速度、増加または減少した細胞増殖などが挙げられる。
【００３０】
用語「治療剤」、「治療組成物」および「治療物質」とは、限定はないが、哺乳動物種の利益のために使用され得る任意の組成物をいう。このような薬剤は、例えば、イオン、有機低分子、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびオリゴ糖の形態をとり得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「高分子」とは、大きい分子（１０００ダルトンよりも大きい分子量）をいい、生物学的起源または合成的起源のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにより例示されるが、これらに限定されない。
【００３２】
「有機低分子」とは、１０００ダルトン以下の分子量（ＭＷ）を有する炭素含有薬剤をいう。
【００３３】
用語「非ポリペプチド薬剤」および「非ポリペプチド治療薬剤」とは、送達増強輸送体を含まず、かつポリペプチド以外の生物学的に活性な薬剤である結合体の部分をいう。非ポリペプチド薬剤の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これは、ポリアルギニンペプチドと結合して、上皮組織もしくは内皮組織の１つ以上の層への、または上皮組織もしくは内皮組織の１つ以上の層を横切った増強された送達のための結合体を形成し得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「サブユニット」とは、結合してより大きなポリマー化合物を形成するモノマーユニットをいう。アミノ酸の組は、サブユニットの例である。各アミノ酸は、共通の骨格（−Ｃ−Ｃ−Ｎ−）を共有し、そして異なるアミノ酸はそれらの側鎖において異なる。この骨格は、ポリペプチドにおいて繰り返される。サブユニットは、ポリマー骨格中の要素の最も短い繰り返しパターンを表す。例えば、２つのアミノ酸のペプチドは、ペプチドとは考えられない。なぜなら、２つのアミノ酸は、ポリマー骨格中の要素の最も短い繰り返しパターンを有さないからである。
【００３５】
用語「ポリマー」とは、共有結合によって結合した２つ以上の同一または異なるサブユニットの直鎖をいう。ペプチドは、ポリマーの例である；ペプチドは、ペプチド連結（アミド結合）によって結合した同一または異なるアミノ酸サブユニットで構成され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって結合した、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物の単鎖から作製される化合物をいう。一般的に、ペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基を含み、そして約５０アミノ酸未満の長さである。本明細書中でＤ−アミノ酸は、小文字の１文字アミノ酸記号（例えば、Ｄ−アルギニンに対しては、ｒ）で表され、一方、Ｌ−アミノ酸は、大文字の１文字アミノ酸記号（例えば、Ｌ−アルギニンに対しては、Ｒ）で表される。ホモポリマーペプチドは、１文字アミノ酸記号、続いてそのペプチド中のそのアミノ酸の連続した出現の数によって表される（例えば、Ｒ７は、Ｌ−アルギニン残基で構成されるヘプタマーを表す）。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」とは、ペプチド結合によって連結した線形に配列されたアミノ酸で構成されるが、ペプチドとは対照的に、明確な高次構造を有する化合物をいう。タンパク質は、ペプチドとは反対に、一般的に５０以上のアミノ酸の鎖からなる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」とは、少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーをいい、これは１つ以上のペプチド結合を含む。「ポリペプチド」は、そのポリペプチドが明確な高次構造を揺するか否かに関わらず、ペプチドおよびタンパク質を含む。
【００３９】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、動物の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層へ、および動物の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を横切る、化合物（薬物および他の生物学的に活性な化合物を含む）の輸送を増強させる組成物および方法を提供する。この方法は、組織を、送達増強輸送体に連結した目的の化合物を含む結合体と接触させる工程を包含する。本発明によって提供される送達増強輸送体は、１以上のインタクトな上皮組織層および内皮組織層へ、および１以上のインタクトな上皮組織層および内皮組織層を横切る、この結合体の送達を増加させるために十分なグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む分子である。この方法および組成物は、薬物および他の生物学的に活性な分子の経上皮送達および経内皮送達のため、ならびにまた、画像分子および診断分子の送達のために有用である。本発明の方法および組成物は、それらの生物学的効果を示すために、経上皮輸送または経内皮輸送を必要とし、かつ（送達増強輸送体との結合も、いくつかの他の改変もなしで）それら自体では、このような組織を横切り、従って生物学的活性を示すことができないか、またはほとんどできない化合物の送達のために、特に有用である。
【００４０】
本発明の送達増強輸送体および方法は、目的の化合物の経上皮組織送達および経内皮組織送達を得るために以前に利用可能な方法に対して、有意な利点を提供する。この輸送体は、以前はその薬物を浸透させなかった組織を横切る、薬物および他の薬剤の送達を可能にする。例えば、皮膚を横切る薬物の送達は、２、３の化合物を除いて以前はほとんど不可能であったが、本発明の方法は、皮膚のような上皮組織の第１層の細胞へのみでなく、皮膚の１以上の層をも横切って化合物を送達し得る。血液脳関門はまた、薬物ならびに他の診断試薬および治療試薬の輸送に対して抵抗性があり；本発明の方法および輸送体は、このような輸送を得るための手段を提供する。
【００４１】
送達増強輸送体は、この送達増強輸送体の非存在下での化合物の送達と比較して、１以上のインタクトな上皮組織層または内皮組織層へ、および１以上のインタクトな上皮組織層または内皮組織層を横切る、結合体の送達を増加させる。いくつかの実施形態においては、この送達増強輸送体は、ＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質を用いて得られる送達増強輸送体（Ｆｒａｎｋｅｌら（１９９１）ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９５８）よりも、結合体の送達を有意に増加させる。送達はまた、ｔａｔ基本領域（配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する残基４９〜５７）を含むｔａｔタンパク質のより短いフラグメント（Ｂａｒｓｏｕｍら（１９９４）ＷＯ９４／０４６８６およびＦａｗｅｌｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：６６４−６６８）の使用よりも、有意に増加される。好ましくは、本発明の輸送体を用いて得られる送達は、ｔａｔ残基４９〜５７を用いて得られる送達よりも、２倍よりも多く増加され、なおより好ましくは、６倍よりも多く、なおより好ましくは、１０倍よりも多く、そしてなおより好ましくは２０倍よりも多く増加される。
【００４２】
同様に、本発明の送達増強輸送体は、培養されたニューロンによって容易にインターナライズされるＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来の１６アミノ酸のペプチド−コレステロール結合体（Ｂｒｕｇｉｄｏｕら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５−９３）と比較して、増加した送達を提供し得る。この領域（最小で残基４３〜５８）は、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する。Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘタンパク質ＶＰ２２は、ｔａｔおよびＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａドメインと同様に、細胞への輸送を増強させることが以前に知られていたが、上皮膜および内皮膜へ、ならびに上皮膜および内皮膜を横切る輸送を増強させることは知られていなかった（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−３３；Ｄｉｌｂｅｒら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２−２１；Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４０−３）。現在好ましい実施形態においては、この送達増強輸送体は、ＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインおよびＶＰ２２タンパク質と比較して、有意に増加した送達を提供する。
【００４３】
（送達増強輸送体の構造）
本発明の送達増強輸送体は、上皮組織（例えば、皮膚または粘膜）または内皮組織（例えば、血液脳関門）の１つ以上の層へ、およびこれらの１つ以上の層を横切る、この送達増強輸送体が結合した化合物の送達を、増加させるために十分なグアニジノおよび／またはアミジノ部分を有する分子である。この送達増強輸送体は、一般的に、グアニジノおよび／またはアミジノ側鎖部分が結合した骨格構造を含む。いくつかの実施形態においては、この骨格は、サブユニットのうちの少なくともいくつかがグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、サブユニット（例えば、繰り返しモノマーユニット）からなるポリマーである。
【００４４】
（Ａ．グアニジノ部分および／またはアミジノ部分）
この送達増強輸送体は、代表的に、少なくとも５グアニジノおよび／またはアミジノ部分、より好ましくは７以上のこのような部分を示す。好ましくは、この送達増強輸送体は、２５以下のグアニジノおよび／またはアミジノ部分を有し、しばしば１５以下のこのような部分を有する。いくつかの実施形態においては、この送達増強輸送体は、本質的に５０以下のサブユニットからなり、そして本質的に２５以下、２０以下、または１５以下のサブユニットからなり得る。この送達増強輸送体は、５サブユニット程度に短くあり得、この場合において、すべてのサブユニットは、グアニジノまたはアミジノ側鎖部分を含む。この送達増強輸送体は、例えば、少なくとも６のサブユニットを有し得、いくつかの実施形態においては、少なくとも７または１０のサブユニットを有し得る。一般的にこのサブユニットの少なくとも５０％は、グアニジノまたはアミジノ側鎖部分を含む。より好ましくは、この送達増強輸送体におけるこのサブユニットの少なくとも７０％、しばしばこのサブユニットの少なくとも９０％は、グアニジノまたはアミジノ側鎖部分を含む。
【００４５】
送達増強輸送体中のグアニジノおよび／またはアミジノ部分のいくつかまたはすべては、隣接し得る。例えば、この送達増強輸送体は、６〜２５の連続したグアニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットを含み得る。７以上の連続したグアニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットが、いくつかの実施形態において存在する。いくつかの実施形態においては、少なくとも６個の連続したアルギニン残基を含むポリマーによって例示されるように、グアニジノ部分を含む各サブユニットは連続している。
【００４６】
送達増強輸送体は、ペプチドによって例示される。アルギニン残基またはアルギニンのアナログは、グアニジノ部分を有するサブユニットを構築し得る。このようなアルギニン含有ペプチドは、全てＤ−アミノ酸、全てＬ−アミノ酸、または混合したＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸のいずれかから構成され得、そしてさらなるアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアルギニン残基間の他の分子を含み得る。必要に応じて、この送達増強輸送体はまた、非アルギニン残基を含み得、送達されるべき化合物は、直接またはリンカーを介してのいずれかで結合される。送達増強輸送体中の少なくとも１つのＤアルギニンの使用は、その生物学的標的への結合体の輸送の間、この輸送体の生物学的な安定性を増強し得る。いくつかの場合において、この送達増強輸送体は、少なくとも約５０％のＤアルギニン残基であり、そしてさらにより安定な輸送体（ここで、このサブユニットの全てがＤアルギニン残基である）が使用される。送達増強輸送体分子がペプチドである場合、この輸送体は、アミノ酸配列に結合せず、この送達増強輸送体分子は構成するアミノ酸は天然に存在するタンパク質に結合される。
【００４７】
好ましくは、この送達増強輸送体は、直鎖である。好ましい実施形態において、上皮組織の１以上の層中におよびその層を通過して送達されるべき薬剤は、送達増強輸送体の末端に結合される。いくつかの実施形態において、この薬剤は、単一の輸送ポリマーに結合され、結合体を形成する。他の実施形態において、この結合体は、１つの薬剤に連結した１より多いの送達増強輸送体、または単一の送達増強輸送体に連結された複数の薬剤を含み得る。
【００４８】
より一般的に、各サブユニットは、高度に塩基性の側鎖部分を含むことが好ましく、高度に塩基性の側鎖部分は、（ｉ）１１より大きい、より好ましくは、１２．５以上のｐＫａを有し、そして（ｉｉ）プロトン化状態において、共鳴安定化正電荷を共有する、少なくとも２個のジェミナルアミノ基（ＮＨ２）を含み、この部分に二座特性を提供する。
【００４９】
グアニジノまたはアミジノ部位は、側鎖リンカーによって骨格に連結されることによって骨格から離れて伸びる。この側鎖原子は、好ましくは、メチレン炭素原子として提供されるが、１以上の他の原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）がまた、提供され得る。例えば、グアニジノ部分を骨格に結合するリンカーは、以下に示され得る：
【００５０】
【化５】
2004533414.tif 000005
これらの式において、ｎは、好ましくは、少なくとも２であり、そして好ましくは、２と７との間である。いくつかの実施形態において、ｎは３（構造１のアルギニン）である。他の実施形態において、ｎは、４と６との間であり、最も好ましくは、ｎは、５または６である。例示された式中の側鎖は、ペプチド骨格（すなわち、側鎖が、カルボニル基に対してα位にある炭素原子に結合される繰返しアミド（サブユニット１））およびペプトイド骨格（すなわち、側鎖が、カルボニルに対してβ位にある窒素原子に結合される繰返しアミド（サブユニット２））に結合されるように示されるが、他の非ペプチド骨格がまた、本明細書中でより詳細に議論されるように適切である。従って、同様の側鎖リンカーが、非ペプチド骨格（例えば、ペプトイド骨格）に結合され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、送達増強輸送体は、連結されたサブユニットから構成され、これらの少なくともいくつかは、グアニジノおよび／またはアミジノ部分を含む。グアニジノおよび／またはアミジノ部分を有する適切なサブユニットの例が、以下に記載される。
【００５２】
（アミノ酸）  いくつかの実施形態において、この送達増強輸送体は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸残基から構成される。このアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸であり得る。アルギニン（α−アミノ−δ−グアニジノ吉草酸）およびα−アミノ−ε−アミジノ−ヘキサン酸（等配電子のアミノジアナログ）は、適切なグアニジノおよびアミノ含有アミノ酸サブユニットの例である。グアニジン中のグアニジニウム基は、約１２．５のｐＫａを有する。いくつかの好ましい実施形態において、この輸送体は、少なくとも６個の連続するアルギニン残基から構成される。
【００５３】
別のアミノ酸（例えば、α−アミノ−β−グアニジノ−プロピオン酸、α−アミノ−γ−グアニジノ−酪酸、またはα−アミノ−ε−グアニジノ−カプロン酸（それぞれ、２，３，または５個の側鎖リンカー原子を、骨格鎖とグアニジニウムの中心炭素との間に含む））がまた使用され得る。
【００５４】
Ｄ−アミノ酸はまた、送達増強輸送体に使用され得る。排他的にＤ−アミノ酸を含有する組成物は、酵素学的分解が減少するという利点を有する。しかし、Ｄ−アミノ酸はまた、標的細胞中で大部分、インタクトなままであり得る。このポリマーがさらに結合される場合、この薬剤が生物学的に活性であるとしても、このような安定性は、一般に問題がない。結合形態において不活性である薬剤に対して、作用部位において切断（例えば、細胞内での酵素または溶媒媒介切断）されるリンカーは、細胞または小器官中でこの薬剤の放出を促進するために結合体内に含まれるべきである。
【００５５】
さらに、輸送部分は、以下の式のアミノ酸オリゴマーである：（ＺＹＺ）ｎＺ、（ＺＹ）ｎＺ、（ＺＹＹ）ｎＺおよび（ＺＹＹＹ）ｎＺ。２００１年２月７日に出願された米国特許出願番号０９／７７９，６９３および２０００年２月１４日に出願された米国特許出願番号６０／１８２１６６を参照のこと。式中の「Ｚ」は、Ｄ−アルギニンまたはＬ−アルギニンである。「Ｙ」は、グアニジル部分またはアミジニル部分を含まないアミノ酸である。添え字「ｎ」は、２〜２５の範囲の整数である。
【００５６】
上記の輸送部分の式において、文字「Ｙ」は、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸を表す。このアミノ酸は、本質的に、アミノ基（ＮＨ２またはＮＨ−アルキル）およびカルボン酸基（ＣＯ２Ｈ）を（輸送部分への組込みの前に）有し、そしてグアニジル部分もアミジニル部分も含まない任意の化合物であり得る。このような化合物の例としては、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニン、Ｄ−システインおよびＬ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニンおよびＬ−フェニルアラニン、グリシン、Ｄ−ヒスチジンおよびＬ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシンおよびＬ−イソロイシン、Ｄ−リジンおよびＬ−リジン、Ｄ−ロイシンおよびＬ−ロイシン、Ｄ−メチオニンおよびＬ−メチオニン、Ｄ−アスパラギンおよびＬ−アスパラギン、Ｄ−プロリンおよびＬ−プロリン、Ｄ−グルタミンおよびＬ−グルタミン、Ｄ−セリンおよびＬ−セリン、Ｄ−スレオニンおよびＬ−スレオニン、Ｄ−バリンおよびＬ−バリン、Ｄ−トリプトファンおよびＬ−トリプトファン、Ｄ−ヒドロキシプロリンおよびＬ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−チロシンおよびＬ−チロシン、サルコシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸ならびにε−アミノカプロン酸が挙げられる。上記のそれぞれの式において、各Ｙは、輸送部分に存在する任意の他のＹから独立しているが、いくつかの実施形態において、全てのＹ基は、同じであり得る。
【００５７】
好ましい実施形態の１つの群において、輸送部分は、式（ＺＹＺ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から独立して選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、２〜５の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは３である。実施形態のこの群において、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が、組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。例えば、固相方法を用いて輸送部分が収集される実施形態において、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、輸送部分は式（ＺＹ）ｎＺを有し、ここで各「Ｙ」は、好ましくはグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である。特定の実施形態の上記の群と同様に、グリシンの使用は、輸送部分が、組成物全体が組換え方法によって調製され得るような、ポリペプチド生物学的薬剤に直接融合されるか、または共有結合される組成物にとって好ましい。輸送部分の溶液または固相構築物について、ε−アミノカプロン酸が好ましい。
【００５９】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくは、Ｌ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、各「Ｙ」は、グリシンまたはε−アミノカプロン酸であり、そしてｎは６である。
【００６０】
好ましい実施形態のなお別の群において、輸送部分は、式（ＺＹＹＹ）ｎＺを有し、ここで、各「Ｙ」は、好ましくは、グリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸およびε−アミノカプロン酸から選択され、「Ｚ」は、好ましくはＬ−アルギニンであり、そしてｎは、好ましくは、４〜１０の範囲の整数である。より好ましくは、「Ｙ」はグリシンであり、そしてｎは６である。
【００６１】
他の実施形態において、それぞれのＹ基は、輸送部分の特定の所望の特性を増強するように選択される。例えば、より疎水性の特徴を有する輸送部分が所望される場合、各Ｙは、代表的に疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、フェニルグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン）として一緒にグループ化される、天然に存在するアミノ酸から選択され得る。同様に、いくつかのまたは全てのＹ基が親水性アミノ酸（例えば、リジン、セリン、スレオニン、グルタミン酸など）である場合、より親水性の特徴を有する輸送部分が、調製され得る。
【００６２】
当業者は、輸送部分が、より大きいポリペプチド内のポリペプチドフラグメントであり得ることを理解する。例えば、輸送部分は、この部分に隣接するさらなるアミノ酸をなお有する式（ＺＹＹ）ｎＺ（例えば、Ｘｍ（ＺＹＹ）ｎＺ−Ｘｐ、ここで添え字ｍおよびｐは、０〜約１０の整数を表し、そして各Ｘは、独立して天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸である）であり得る。
【００６３】
（他のサブユニット）  アミノ酸以外のサブユニットがまた、輸送ポリマーを形成する際の使用に選択され得る。このようなサブユニットには、ヒドロキシアミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ酸、アミノアルデヒドなどが挙げられるが、これらに限定されない。このサブユニットにより、結果として、ポリマー中に減少したペプチド結合が得られる。次の節で議論されるように、選択された骨格の性質に依存して、他のサブユニット型が使用され得る。
【００６４】
（Ｂ．骨格）
送達増強輸送体中に含まれるグアニジノおよび／またはアミジノ部分は、一般に、線状の骨格に結合される。この骨格は、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリンを含む種々の原子型を含み得、この骨格鎖原子の大部分は、代表的に炭素からなる。末端グアニジノまたはアミジノ基を含む複数の側鎖部分は、骨格に結合される。隣接する側鎖部分間の間隔は、代表的に一定であるが、本発明において使用される送達増強輸送体は、この骨格に沿って側鎖部分間の種々の間隔を含み得る。
【００６５】
より詳細な骨格のリストとしては、Ｎ置換アミド（ＣＯＮＨ結合から置換されるＣＯＮＲ）、エステル（ＣＯ２）、還元されたケト−メチレン（ＣＯＣＨ２）またはメチレンアミノ（ＣＨ２ＮＨ）、チオアミド（ＣＳＮＨ）、ホスフィネート（ＰＯ２ＲＣＨ２）、ホスホンアミデートおよびホスホンアミデートエステル（ＰＯ２ＲＮＨ）、レトロペプチド（ＮＨＣＯ）、トランス−アルケン（ＣＲ＝ＣＨ）、フルオロアルケン（ＣＦ＝ＣＨ）、ジメチレン（ＣＨ２ＣＨ２）、チオエーテル（ＣＨ２Ｓ）、ヒドロキシエチレン（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２）、メチレンオキシ（ＣＨ２Ｏ）、テトラゾール（ＣＮ４）、レトロチオアミド（ＮＨＣＳ）、レトロ還元された（ｒｅｔｒｏｒｅｄｕｃｅｄ）（ＮＨＣＨ２）、スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ）、メチレンスルホンアミド（ＣＨＲＳＯ２ＮＨ）、レトロスルホンアミド（ＮＨＳＯ２）、およびペプトイド（Ｎ置換アミド）、ならびにマロネートおよび／またはｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する骨格（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３）により概説され、そして本明細書中で引用された参考文献により詳述される）が挙げられる。多くの上記の置換基により、α−アミノ酸から形成された骨格に対して、ほぼ等配電子のポリマー骨格が得られた。
【００６６】
上記のように、ペプトイド骨格中において、この側鎖は、炭素原子ではなく骨格窒素原子に結合される（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：５４３；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９２）Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ−Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．４：８０；およびＳｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７を参照のこと）。適切なペプトイド骨格の例は、ポリ−（Ｎ−置換）グリシン（ｐｏｌｙ−ＮＳＧ）である。ペプトイドの合成は、例えば、米国特許第５，８７７，２７８号に記載される。この用語が本明細書中で使用れる場合、ペプトイド骨格を有する輸送体は、「非ペプチド」輸送体と考えられる。なぜならば、この輸送体は、天然に存在する側鎖位置を有するアミノ酸から構成されないからである。非ペプトイド骨格（ペプトイド骨格を含む）は、増強した生物学的安定性（例えば、インビボでの酵素学的分解に対する耐性）を提供する。
【００６７】
（Ｃ．送達増強輸送体の合成）
送達増強輸送体は、当該分野で公知の任意の方法によって構築される。例示的なペプチドポリマーは、好ましくは、ペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３）を使用して、合成的に生成され得るか、または当該分野で周知の方法により組換え合成され得る。組換え合成は、一般に、送達増強輸送体が目的のポリペプチドまたはタンパク質に融合されるペプチドである場合に使用される。
【００６８】
Ｎ−メチルおよびヒドロキシ−アミノ酸は、固相ペプチド合成における従来のアミノ酸と置き換えられ得る。しかし、減少したペプチド結合を有する送達増強輸送体の生成は、減少したペプチド結合を含むアミノ酸のダイマーの合成を必要とする。このようなダイマーは、標準的な固相合成手順を使用してポリマー中に取り込まれる。他の合成手順は周知であり、そして例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３，Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７、および本明細書中で引用された参考文献に見出され得る。
【００６９】
本発明の送達増強輸送体は、１以上の非グアニジノ／非アミジノサブユニット（例えば、グリシン、アラニン、およびシステイン）、またはリンカー（例えば、アミノカプロン酸基）によって隣接され得る。これは、結合体を含む対応する送達増強輸送体のトランス組織層の輸送速度に有意に影響を与えない。また、任意の遊離アミノ末端基は、保護基（例えば、アセチル基またはベンジル基）でキャップされ、インビボでのユビキチン結合を防止し得る。
【００７０】
この輸送体は、ペプトイドポリマーであり、１合成方法は、以下の工程を包含する：１）ペプトイドポリアミンを塩基およびピラゾール−１−カルボキサミジンで処理し、混合物を提供する工程；２）この混合物を加熱し、次いで冷却させる工程；３）この冷却した混合物を酸性化する工程；および４）この酸性化した混合物を精製する工程。好ましくは、工程１において使用される塩基は、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム）であり、そして加熱工程２は、約２４時間と約４８時間との間で約５０℃まで混合物を加熱する工程を包含する。この精製工程は、好ましくは、クロマトグラフィー（例えば、逆相ＨＰＬＣ）を含む。
【００７１】
（Ｄ．輸送体ポリマーの生物学的活性剤への結合）
輸送される薬剤は、複数の実施形態に従って送達増強輸送体に連結され得る。１実施形態において、この薬剤は、送達増強輸送体の末端への結合を介して単一送達増強輸送体へまたは適切な連結基を介して試薬内の内部サブユニットへのいずれかで、連結される。
【００７２】
第２の実施形態において、この薬剤は、上記と同じ方法で１以上の送達増強輸送体に結合される。この実施形態は、この薬剤は隣接細胞との架橋に導き得るので、いくらか弱いのが好ましい。
【００７３】
第３の実施形態において、この結合体は、送達増強輸送体の各末端に結合された２つの薬剤部分を含む。この実施形態において、この薬剤が１０ｋＤａ未満の分子量を有することが、現在好ましい。
【００７４】
まさに言及された第１および第３の実施形態に関して、この薬剤は、一般に、グアニジノまたはアミジノ側鎖のいずれの１つにも結合されず、その結果、これらの側鎖は、標的膜と自由に相互作用する。
【００７５】
本発明の結合体は、直接的な合成スキームによって調製され得る。さらに、この結合体生成物は、長さおよび組成において通常実質的に同質であり、その結果、この生成物は、異質な混合物よりも、それらの効果においてより大きな一貫性および再現性を提供する。
【００７６】
本発明の重要な局面に従って、単一の送達増強輸送体の、任意の種々の型の生物学的に活性な薬剤への結合は、結合体中に大きな疎水性部分の存在を必要としなくても、上皮組織および内皮組織の１以上の層へならびにその層を横切る試薬の取り込み速度を実質的に増強するのに十分であることが、本出願人によって見出された。実際に、大きな疎水性部分の結合は、上皮組織または内皮組織を構成する細胞の脂質二重層への疎水性部分の接着に起因して、層を横断する輸送を有意に防止または予防し得る。従って、本発明は、実質的に疎水性部分（例えば、脂質分子および脂肪酸分子）を含有しない結合体を含む。
【００７７】
本発明の送達増強輸送体は、化学的方法または組換え方法によって生物学的に活性な薬剤に共有結合され得る。
【００７８】
（１．化学結合）
生物学的に活性な薬剤（例えば、小さな有機分子および高分子）は、当該分野で公知の多数の方法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．編、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１）を参照のこと）を介して、直接的（例えば、カルボジイミドを用いて）または連結部分を介してのいずれかで、本発明の送達増強輸送体に連結され得る。特に、カルバメート結合、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、およびヒドラゾン結合は、一般に形成し易く、そしてほとんどの適用に対して適切である。エステル結合およびジスルフィド結合は、この結合が、細胞膜を横切る物質の輸送後に、サイトゾル中で容易に分解される場合に、好ましい。
【００７９】
種々の官能基（ヒドロキシル、アミノ、ハロゲンなど）は、生物学的に活性な薬剤を輸送ポリマーに結合するために使用され得る。特に、ポリペプチドまたはその任意の部分が、送達後にこの物質に結合されたままである場合、生物学的に活性な薬剤の活性部位の一部であることが公知でない基が、好ましい。
【００８０】
ポリマー（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号ＷＯ９８５２６１４）に記載されるように生成されたペプチド）は、アミノ末端保護基（例えば、ＦＭＯＣ）を用いて一般に生成される。合成樹脂からポリペプチドを切断し、側鎖を脱保護するために使用される条件に耐え得る生物学的に活性な薬剤に対して、このＦＭＯＣは、完全な樹脂結合ポリペプチドのＮ末端から切断され得、その結果、この薬剤は、遊離Ｎ末端アミンに結合され得る。このような場合、結合される薬剤は、代表的に、当該分野で周知の方法で活性化され、ポリマーアミノ基を有する、それぞれアミド結合またはカルバメート結合を形成するのに効果的な活性エステル部分または活性炭酸部分を生成する。当然、他の化学結合もまた、使用され得る。
【００８１】
副反応の最小化を助けるために、グアニジノ部分およびアミノ部分は、従来の保護基（例えば、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺ）、ジ−ｔ−ＢＯＣ、ＰＭＣ、Ｐｂｆ、Ｎ−ＮＯ２など）を使用してブロックされ得る。
【００８２】
カップリング反応は、溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、水など）の任意のアレイ中で公知のカップリング方法によって実施される。例示的なカップリング試薬としては、例えば、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。他の試薬としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが挙げられ得る。
【００８３】
（２．融合ポリペプチド）
本発明の送達増強輸送体は、当該分野で周知の方法に従って、目的のポリペプチドおよび送達増強輸送体を含む融合タンパク質のためのベクターを構築することによる組換え方法によって、生物学的に活性なポリペプチド薬剤に結合され得る。一般に、この送達増強輸送体成分は、必要に応じて短いペプチドリンカーを介して、目的のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端で結合される。
【００８４】
（３．放出可能なリンカー）
本発明の好ましい実施形態において、この生物学的に活性な薬剤は、特異的に切断可能かまたは放出可能である結合を使用して、送達増強輸送体に結合される。このような結合の使用は、結合された送達増強輸送体が放出されるまで不活性である生物学的に活性な薬剤について特に重要である。いくつかの場合において、送達増強輸送体に結合している薬物分子からなるこのような結合体は、プロドラックと呼ばれ得、ここで、この薬物からの送達増強輸送体の放出の結果、不活性形態から活性形態へのこの薬物の変換を生じる。本明細書中で使用される場合、結合体またはリンカーの「切断された」または「切断」とは、輸送体分子からの生物学的薬剤の放出、これによる活性な生物学的薬剤の放出を言う。「特異的に切断可能な」または「特異的に放出可能な」とは、輸送体が分解される（例えば、タンパク分解性の分解による）のではなく、輸送体と薬剤との間の結合が切断されることをいう。
【００８５】
いくつかの実施形態において、この結合は、容易に切断可能な結合であり、これは、インビボで見出される条件下での切断に対して感受性であることを意味する。従って、上皮組織および／または内皮組織の１以上の層へおよびその層を通って通過する際に、この薬剤は、送達増強輸送体から放出される。容易に切断可能な結合は、例えば、特異的な活性を有する酵素（例えば、エステラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼなど）によってかまたは加水分解によって切断される結合であり得る。この目的のために、カルボン酸エステルおよびジスルフィド結合を含むリンカーが、しばしば、好ましく、このカルボン酸エステル基は、酵素的にかまたは化学的に加水分解され、そしてジスルフィド結合は、ジスルフィド交換（例えば、グルタチオンの存在下）によって切断される。この結合は、上皮組織または内皮組織の１以上の層に存在することが公知である酵素活性によって切断可能であるように選択され得る。
【００８６】
特異的に切断可能なリンカーは、輸送体分子上に設計され得る。例えば、プロテアーゼ認識部位、または他のこのような特異的に認識される酵素切断部位を構成するアミノ酸は、輸送体をこの薬剤に結合するために使用され得る。あるいは、例えば、光または他の刺激に曝すことにより切断可能であるリンカーの化学的型または他の型を使用して、目的の薬剤に輸送体を結合し得る。
【００８７】
送達されるべき薬剤および送達増強輸送体が、特異的に切断可能なリンカーまたは特異的に放出可能なリンカーによって結合されている結合体は、半減期を有する。この文脈中で用語「半減期」は、結合体を上皮膜または内皮膜に適用後に、結合体の半分の量が分離され、遊離薬剤を放出するのに必要とされる時間量をいう。いくつかの実施形態についての半減期は、約５分と２４時間との間であり、そしていくつかの実施形態においては、３０分と２時間との間である。いくつかの実施形態において、結合体は、緩衝化生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）中で安定であるが、細胞中では短い半減期（例えば、１時間未満）を有する。結合体の半減期は、以下に記載されるように本発明に従って、「調整」または改変され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、このリンカーの切断速度は、ｐＨに依存する。例えば、リンカーは、酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ６．５以下、より好ましくは、約６以下、そしてなおより好ましくは、約５．５以下）において薬剤と送達増強輸送体との間で安定な結合を形成し得る。しかし、この結合体が、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７以上、好ましくは、約ｐＨ７．４）に置かれる場合、このリンカーは、切断を受けて、薬剤を放出する。このようなｐＨ感受性は、例えば、プロトン化（すなわち、酸性のｐＨにおいて）される場合、求核試薬として作用しない官能基を含むことによって得られ得る。より高い（例えば、生理学的な）ｐＨにおいて、官能基はもはやプロトン化されず、従って、求核試薬として作用し得る。適切な官能基の例としては、例えば、ＮおよびＳが挙げられる。自己切断が起こるｐＨを微調整するために、このような官能基を使用し得る。
【００８９】
別の実施形態において、この連結部分は、自己犠牲によって切断される。輸送部分−生物学的に活性な化合物の結合体におけるこのようなリンカー部分は、生物学的に活性な化合物に対して遠位の求核試薬（例えば、酸素、窒素および硫黄）およびこの生物学的に活性な化合物に対して近位の切断可能基（例えば、エステル、カルボネート、カルバメートおよびチオカルバメート）を含む。切断可能基上の求核試薬の分子内攻撃により、共有結合の切断が生じ、これによって、生物学的に活性な化合物から連結部分を放出する。
【００９０】
自己犠牲連結部分を含有する結合体（例えば、生物学的に活性な薬剤−Ｌ−輸送部分の結合体）の例は、構造３、４または５によって表される：
【００９１】
【化６】
2004533414.tif 000006
ここで：
Ｒ１は、生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、この生物学的に活性な化合物上の官能基と連結部分上の末端官能基との間に形成される連結であり；Ｙは、輸送部分上の官能基および連結部分上の官能基から形成される連結であり；Ａは、ＮまたはＣＨであり；Ｒ２は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ３は、輸送部分であり；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素またはアルキルであり；ｋおよびｍは、独立して、１または２のいずれかであり；そしてｎは、１〜１０の範囲の整数である。ＸおよびＹの連結の非限定的な例は、（いずれかの方向の）以下である：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−、ホスフェート、ホスホネートおよびホスフィネート。当業者は、生物学的薬剤がヒドロキシ官能基を有する場合、Ｘは、好ましくは、−ＯＣ（Ｏ）−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−であることを理解している。同様に、連結基が輸送部分のアミノ末端に結合される場合、Ｙは、好ましくは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＳＯＮＨ−または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−などである。上記に提供される各基において、ＮＨが、簡潔さのために示されているが、連結（ＸおよびＹ）の各々は、同様に、置換された（例えば、Ｎ−アルキルまたはＮ−アシル）連結を含み得る。
【００９２】
構造３によって例示される連結基にまず目を向けると、例および好ましい実施形態が、式３ａに例示される。
【００９３】
【化７】
2004533414.tif 000007
ここで、波線は、輸送部分および生物学的に活性な化合物への結合点を示す。この連結基を含有する結合体の調製が、実施例１０（図６）に例示される。この実施例および図６において、シクロスポリンＡは、クロロ酢酸無水物で処理されて、クロロ酢酸エステル６ｉ（図６中の番号）を形成し、このエステルは、次いで、ベンジルアミンと結合して、Ｎ−ベンジルグリシン結合体６ｉｉを形成する。このグリシン結合体の、Ｂｏｃ保護ジグリシン無水物との縮合により、酸６ｉｉｉが提供され、この酸は、より反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル６ｉｖに転換され、次いで、輸送部分のアミノ末端と結合して、アミド結合を形成する。当業者は、Ｎ−ベンジル基が他の基（例えば、アルキル、アリール、アリルなど）で置換され得るか、またはメチレン基が、例えば、エチレン、プロピレンなどで置換され得ることを理解する。好ましくは、このメチレン基は、３ａに示されるように保持されて、この連結がインビボで切断されるのを可能にする、適切な立体配向または空間配向を提供する（図６Ｂを参照のこと）。
【００９４】
従って、構造３について、以下の置換基が好ましい：Ａは、Ｎであり；Ｒ２は、ベンジルであり；ｋ、ｍおよびｎは、１であり、Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり、そしてＹは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【００９５】
構造４の連結は、式４ａによって例示される：
【００９６】
【化８】
2004533414.tif 000008
ここで、上記のように、波線は、各輸送部分および生物学的に活性な薬剤への結合点を示す。式４ａの連結基を有する結合体の調製は、実施例１０〜１２に示される。実施例１０（図３２のスキームを参照のこと）において、アシクロビルは、α−クロロ酢酸無水物（α−ｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）でアシル化されて、α−クロロ酢酸エステル３２ｉを形成する。３２ｉとＤ−アルギニンの七量体（これは、Ｎ末端のシステイン残基を有する）との反応により、チオエーテル生成物３２ｉｉが提供される。あるいは、アシクロビルは、アシクロビルα−クロロ酢酸エステル（α−ｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  ｅｓｔｅｒ）とＤ−アルギニンの七量体（これは、Ｃ末端のシステイン残基を有する）との間に形成される類似の連結を使用して、輸送部分のＣ末端に結合され得る。この例において、このシステイン残基は、Ｃ末端アミドのような、ｒ７輸送体部分上に提供され、そしてこの連結は、以下の形態を有する：
【００９７】
【化９】
2004533414.tif 000009
。
【００９８】
従って、好ましい実施形態の１つの群において、この結合体は、式５によって表わされ、この式中、Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＮＨＲ６であり；そして、下付きのｋおよびｍは、各々１である。好ましい実施形態の別の群において、この結合体は、式２によって表わされ、この式中、Ｘは、−ＯＣ（Ｏ）−であり；Ｙは、−ＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｒ４は、Ｓであり；Ｒ５は、ＣＯＮＨ２であり；そして、下付きのｋおよびｍは、各々１である。特に好ましい結合体は、Ｒ６が水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである結合体である。
【００９９】
式６に示される結合体によって表わされる連結基は、一般に、ヘテロ二官能性型（例えば、ε−アミノカプロン酸、セリン、ホモセリン、γ−アミノ酪酸など）の連結基であるが、適切に保護されたジカルボン酸またはジアミンもまた、特定の生物学的薬剤とともに有用である。
【０１００】
構造６について、以下の置換基が好ましい：Ｒ５は、ＮＨＲ６であり（ここで、Ｒ６は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである）；ｋは、２であり；Ｘは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そしてＹは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１０１】
自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ）は、代表的に、およそ７．４のｐＨで３７℃の水中で、約１０分と約２４時間との間の半減期で分子内切断を受ける。好ましくは、切断半減期は、およそ７．４のｐＨで３７℃の水中で、約２０分と約４時間との間である。より好ましくは、切断半減期は、およそ７．４のｐＨで３７℃の水中で、約３０分と約２時間との間である。
【０１０２】
構造３を有する結合体について、Ｒ２置換基を変化させることによって、切断半減期を調節し得る。増加したサイズまたは減少したサイズのＲ２を使用することによって、それぞれ、より長い半減期またはより短い半減期を有する結合体を得ることができる。構造３においてＲ２は、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリル、ベンジルまたはフェニルである。
【０１０３】
自己犠牲リンカー中に塩基性基または酸性基が存在する場合、結合体溶液のｐＨに従って、切断半減期をしばしば調節し得る。例えば、構造３の骨格アミン基は、酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）でプロトン化される。アミンは、プロトン化された場合には、分子内切断を誘導する求核試薬として作用し得ない。しかし、生理学的ｐＨ（７．４）にて、この結合体を媒体に導入する際に、アミンは、この時間の有意な部分を脱プロトン化される。この切断半減期は、それ相応に還元される。
【０１０４】
１つの実施形態において、自己犠牲リンカーの切断は、２工程で起こる：連結部分の一部の切断を生じる求核性基の分子内反応；およびこの連結部分の残存する部分の除去。この切断の第一工程は、律速であり、ｐＨ感受性および半減期について微調整され得る。
【０１０５】
構造６は、２工程の自己犠牲部分の例であり、この自己犠牲部分は、輸送部分−生物学的に活性な化合物の結合体に組み込まれている：
【０１０６】
【化１０】
2004533414.tif 000010
ここで：Ｒ１は、生物学的に活性な化合物であり；Ｘは、この生物学的に活性な化合物上の官能基と連結部分上の官能基との間に形成される連結を表わし；Ａｒは、置換または未置換のアリール基であり、ここで、メチレン置換基およびフェノール酸素原子は、互いにオルト位またはパラ位のいずれかであり；Ｒ３は、輸送部分であり；Ｒ４は、Ｓ、Ｏ、ＮＲ６またはＣＲ７Ｒ８であり；Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ６であり；Ｒ６は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アシルまたはアリルであり；Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素またはアルキルであり；そして、ｋおよびｍは、独立して、１または２のいずれかである。
【０１０７】
式６の結合体を生成するために適切な連結基の例は、以下である：
【０１０８】
【化１１】
2004533414.tif 000011
式６ａの連結基を含有する結合体の構造は、実施例１４（図３４もまた、参照のこと）に提供される。この実施例（および図）において、２，４−ジメチル−４−ヒドロキシメチルフェノール（３４ｉ）のα−クロロ酢酸エステルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を使用してレチノイン酸（３４ｉｉ）にカップリングされ、中間体３４ｉｉｉが提供される。その後の、３４ｉｉｉの、アルギニン七量体輸送部分のＮ末端上に存在するシステイン残基とのカップリングにより、標的結合体３４ｉｖが提供される。
【０１０９】
好ましくは、式６の結合体中に使用される連結基は、Ａｒが置換または非置換のフェニレン基であり；Ｒ４がＳであり；Ｒ５がＮＨＲ６であり（ここでＲ６は水素、メチル、アリル、ブチル、アセチルまたはフェニルである）；ｋおよびｍは１であり；Ｘは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり；そしてＹは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である、基である。より好ましくは、Ｒ６は水素またはアセチルである。
【０１１０】
上記の連結基はアルギニン七量体を含む結合体に関して記載されているが、当業者はこの技術が本発明の「間隙の空いた（ｓｐａｃｅｄ）」アルギニン輸送部分との結合体に容易に適用されることを理解する。
【０１１１】
本発明における使用に対して、なお他の有用な連結基は、同時係属のＰＣＴ出願中に記載されている。例えば、同様の組成物（例えば、生物学的に活性な薬剤および輸送オリゴマーの結合体）に対する連結基を記載する、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）およびＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）を参照のこと。これら出願中に記載される連結技術は、本発明の組成物において、同様の様式で使用され得る。
【０１１２】
従って、実施形態の１群において、連結部分は、生物学的に活性な化合物に対して遠位の第一の切断可能な基、および生物学的に活性な化合物に対して近位の第二の切断可能な基を含む。第一の切断可能な基の切断は、第二の切断可能な基と分子内で反応し得る求核剤を生成して、それによって生物学的に活性な化合物から連結部分を切断させる。第一の基が切断される方法の例として、光照射および酵素媒介性の加水分解が挙げられる。この方法論は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）中に論じられる、種々の関連低分子結合体に関して例示されている。
【０１１３】
１つのアプローチにおいて、結合体は、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）（ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号  ＷＯ９８５２６１４）もまた参照のこと）の図５Ａ中に図示されるように、ジスルフィド結合を含み得、この出願は、リンカーとして役立つＮ−アセチル保護されたシステイン基により、細胞傷害性薬剤の６−メルカプトプリンと連結された輸送ポリマーＴを含む、結合体（Ｉ）を示す。従って、この細胞傷害性薬剤はジスルフィド結合により６−メルカプト基と結合され、そしてこの輸送ポリマーはアミド結合を介してシステインカルボニル部分と結合される。還元またはジスルフィド交換によるジスルフィド結合の切断は、遊離した細胞傷害性薬剤の放出を生じる。ジスルフィド含有結合体を合成する方法は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ａ中に提供される。そこで記載される生成物は、Ｎ−アセチル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａリンカーにより６−メルカプトプリンと連結されるＡｒｇ残基の七量体を含み、ここでこのＡｌａ残基は、そのジスルフィドをチオールにより接近させるためのさらなるスペーサー、そして細胞内の切断のための還元剤として含まれる。この実施例におけるリンカーもまた、アミド結合の使用を例示し、そしてこの結合は細胞内で酵素的に切断され得る。
【０１１４】
別のアプローチにおいて、この結合体は、電磁照射への曝露で切断する、光切断可能なリンカーを含む。この方法論の適用は、メタ−ニトロベンゾエート連結部分を介して６−メルカプトプリンに連結される輸送ポリマーＴを含む結合体（ＩＩ）を示す、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号  ＷＯ０１／１３９５７）の図５Ｂ中で、関連の系について提供される。ポリマーＴはベンゾエートカルボニル基とのアミド結合によりニトロベンゾエート部分と連結され、そして細胞傷害性薬剤はその６−メルカプト基を介してｐ−メチレン基と結合される。この化合物は、ＮａＯＣＨ３／メタノールの存在下で加熱しながら、６−メルカプトプリンをｐ−ブロモメチル−ｍ−ニトロ安息香酸と反応させ、続いてそのベンゾエートカルボン酸の輸送ポリマー（例えば、ポリマーと結合したγ−アミノ酪酸リンカーのアミノ基（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｂもまた参照のこと））とのカップリングにより、形成され得る。結合体の光照射は、メルカプトメチル部分に対してオルトであるニトロ基により、６−メルカプトプリンの放出を生じる。このアプローチは、特に身体の選択した領域への局所的な薬物活性化のため、当該分野で公知の光療法における有用性を見出す。
【０１１５】
好ましい実施形態の一群では、以下のアプローチによって例示されるように、切断可能なリンカーは、生物学的に活性な薬剤からオリゴマーを切断するように協同し得る第１および第２の切断可能な基を含む。すなわち、切断可能なリンカーは、この薬剤に対して遠位にある第１の切断可能な基、およびこの薬剤に対して近位にある第２の切断可能な基を含み、その結果、第１の切断可能な基の切断は、第２の切断可能な基を切断するために分子内で反応し得る求核性部分を含むリンカー−薬剤結合体を生じ、それによってリンカーおよびオリゴマーから薬剤を放出する。
【０１１６】
再度、共有に係る同時係属中のＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）を参照する。このＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０において、図５Ｃは、抗癌剤である５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に連結した輸送ポリマーＴを含む結合体（ＩＩＩ）を示す。この図において、連結は、改変されたリジル残基によって提供される。輸送ポリマーは、α−アミノ基に連結され、そして５−フルオロウラシルは、α−カルボニルを介して連結される。リジルε−アミノ基は、ｏ−ヒドロキシメチルニトロベンゼンのカルバメートエステルに修飾されており、ｏ−ヒドロキシメチルニトロベンゼンのカルバメートエステルは、結合体内に第１の光不安定で切断可能な基を含む。光照射は、結合体からニトロベンゼン部分を切断し、また迅速に分解して遊離α−アミノ基（有効な求核剤）を与えるカルバメートを残す。α−アミノ基の、５−フルオロウラシル基に対するアミド連結との分子内反応は、５−フルオロウラシル基の放出と共に環化を導く。
【０１１７】
本発明において有用なさらに他のリンカーが、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）において提供されている。特に、ＵＳ００／２３４４０の図５Ｄは、抗癌剤であるパクリタキセルの２’−酸素に連結した送達増強輸送体Ｔを含む結合体（ＩＶ）を例示する。この連結は、以下を含む連結部分によって提供される：（ｉ）送達増強輸送体に結合した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対してパラ位に位置するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対してメタ位のカルボキシメチル基であり、これは、カルボキシレートエステル結合によってパクリタキセルの２’−酸素に結合される。結合体からのリン酸基の酵素的切断は、遊離したフェノールヒドロキシル基を与える。次いで、この求核基は、カルボキシレートエステルと分子内反応し、その生物学的標的に完全に結合し得る遊離パクリタキセルを放出する。ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｃは、この型の結合体を調製するための合成プロトコールを記載している。
【０１１８】
さらに他の適切なリンカーが、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）の図５Ｅにおいて例示されている。ここで提供されるアプローチにおいて、送達増強輸送体は、生物学的に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）に、アミノアルキルカルボン酸によって連結される。好ましくは、リンカーアミノ基は、３〜５個の鎖原子（ｎ＝３〜５）、好ましくは、３個または４個のいずれかの鎖原子（これらは、好ましくは、メチレン炭素によって提供される）によって、リンカーカルボキシル炭素に連結される。図５Ｅに見られるように、リンカーアミノ基は、アミド連結によって送達増強輸送体に結合され、エステル結合によってパクリタキセル部分に結合される。アミド結合の酵素的切断は、送達増強輸送体を放出して、そして遊離した求核アミノ基を生成する。次いで、この遊離したアミノ基は、エステル基と分子内反応して、パクリタキセルからリンカーを放出し得る。
【０１１９】
別のアプローチにおいて、結合体は、あるｐＨで不安定であるが、別のｐＨでは安定であるリンカーを含む。例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ００／２３４４０（公開番号ＷＯ０１／１３９５７）の図６は、生理学的ｐＨでは切断されるが、酸性ｐＨで安定であるリンカーとの結合体を合成する方法を例示する。好ましくは、このリンカーは、約６．６〜約７．６のｐＨで水中において、切断される。好ましくは、このリンカーは、約４．５〜約６．５のｐＨで水中において安定である。
【０１２０】
他の切断可能なリンカーおよび結合体の合成は、例えば、２００１年１０月２３日に発行された米国特許第６，３０６，９９３号に記載されている。
【０１２１】
（送達増強輸送体の使用）
送達増強輸送体は、治療的適用、予防的適用および診断的適用における使用を見出す。この送達増強輸送体は、上皮組織（例えば、眼など）の１以上の層内に、またはそれらを横切って、診断的または生物学的に活性な試薬を運搬し得る。この特性により、この試薬は、それらの生物学的効果を発揮するために１層以上の組織層を横切って浸透しなければならない薬剤を送達することによって状態を処置するために有用となる。
【０１２２】
さらに、本発明の輸送体はまた、フリン（ｆｕｒｉｎ）インヒビターとして、単独でかまたは別の治療剤もしくは他の化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、種々のポリアルギニン輸送体に加えて、本明細書中に記載される合成輸送体（ペプトイド、および天然には存在しないアミノ酸を含有する輸送体を含む）が、フリンを阻害するために使用され得る。例えば、Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４７）：３６７４１−９を参照のこと。フリンは、種々のプロタンパク質をその活性成分へと変換するプロテアーゼである。フリンの阻害は、例えば、ビルレンスまたは複製についてフリン活性に依存するウイルスによる感染を処置するために有用である。例えば、Ｍｏｌｌｏｙら、Ｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２８−３５（１９９９）を参照のこと。
【０１２３】
同様に、本発明の輸送体は、カテプシンＣの有用なインヒビターである。例えば、特定のポリアルギニン化合物は、カテプシンＣのインヒビターである。例えば、Ｈｏｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７（１１）：３３３０−３３３６（２０００）を参照のこと。同様に、本発明の輸送体（合成アミノ酸を含む輸送体を含む）は、カテプシンＣを阻害するのに有用である。
【０１２４】
本発明の組成物および方法は、ヒトおよび獣医学的治療の分野において特に有用である。一般に、投与される投薬量は、ｐモル濃度からμモル濃度の治療組成物をエフェクター部位に送達するのに効果的である。適切な投薬量および濃度は、治療組成物または薬物、意図される送達部位、および投与経路のような因子に依存し、これら全ては、当該分野で周知の方法に従って経験的に導かれ得る。さらなるガイダンスは、当該分野で公知のような、投薬量を評価するための実験動物モデルを使用する研究から得られ得る。
【０１２５】
本発明の化合物の（必要に応じて、適切な薬学的賦形剤を伴う）投与は、承認された投与様式のいずれかを介して行われ得る。従って、投与は、例えば、眼内注入、静脈内、皮下、経皮的、筋内、経口、関節内、非経口的、腹膜内、鼻内によってか、または吸入による局所的なものであり得る。従って、適切な投与部位としては、眼、皮膚または胃腸管（例えば、口による）が挙げられるが、これらに限定されない。処方物は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体投薬形態の形態（例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾル、点眼剤、鼻噴霧剤など）をとり得、これらは、好ましくは、正確な投薬量の単純投与に適切な単位投薬形態である。例えば、ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＯＰＨＴＨＡＬＭＩＣ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ（Ｌｉｍｂｅｒｔｓ＆Ｐｏｔｔｅｒ編、１９８７）；ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ（Ｆａｕｃｉら編、１９９８）を参照のこと。
【０１２６】
組成物は、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含み得、そしてさらに、他の医療薬剤、キャリア、アジュバントなどを含み得る。好ましくは、組成物は、約０．１％〜７５重量％の本発明の化合物である（残りは、適切な薬学的賦形剤からなる）。適切な賦形剤は、当該分野で周知の方法（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））によって特定の組成物および投与経路に合わされ得る。
【０１２７】
本発明の水性懸濁液は、以下のような化合物を含み得る：例えば、緩衝剤（例えば、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、グルタミン酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸）、等張剤（例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ホウ酸）、安定化剤（例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン（６０）、硬化ヒマシ油、チロキサポール、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエステル、およびポリオキシエチレンアルキルエーテル、これらの混合物）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエートおよびそのアナログ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール）、ｐＨ調製剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸）、界面活性剤ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、および他の添加剤。
【０１２８】
点眼剤（例えば、本発明の結合体を含む）はまた、滅菌精製水に添加された等張剤を含み得、そして、必要に応じて、保存剤、緩衝剤、安定化剤、粘性ビヒクルなどが、溶液に添加され、そしてその溶液中に溶解される。溶解後、ｐＨは、ｐＨ調整剤で、眼用薬剤としての使用に適切な範囲（好ましくは、４．５〜８の範囲）内になるように調整される。
【０１２９】
塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトールなどは、等張剤として用いられ得；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウムなどは、保存剤として用いられ得；リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、ホウ酸などは、緩衝剤として用いられ得；エデト酸ナトリウムなどは、安定化剤として用いられ得；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などは、粘性ビヒクルとして用いられ得；そして水酸化ナトリウム、塩酸などは、ｐＨ調整剤として用いられ得る。
【０１３０】
経口投与のための、このような賦形剤として、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、持続性放出処方物などの形態をとり得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、丸剤、錠剤またはカプセルの形態をとり得、従って、この組成物は、生物学的に活性な結合体と共に、以下のいずれかを含み得る：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどのような希釈剤；デンプンまたはそれらの誘導体のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどのような潤滑剤；およびデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースおよびそれらの誘導体のような結合剤。
【０１３２】
処方物の活性化合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャリア（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に配置される、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含む坐剤中に処方され得る。
【０１３３】
液体組成物は、キャリア（例えば、生理食塩水（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に化合物（約０．５％〜約２０％）、および任意の薬学的アジュバントを溶解または分散することによって調製され、例えば、静脈内投与のための溶液または懸濁液を形成し得る。
【０１３４】
所望される場合、投与される組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、またはトリエタノールアミンオレアート）のような少量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１３５】
局所投与の場合、組成物は、ローションまたは経皮パッチのような任意の適切な形式で投与される。吸入による送達の場合、この組成物は、乾燥散剤（例えば、吸入治療剤）として、または噴霧器を介する液体形態で、送達され得る。
【０１３６】
このような投与形態を調製するための方法は、公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｎｃｅｓ、前出、および同様の公報を参照のこと。投与される組成物は、任意の場合において、本発明の教示に従って投与される際に処置される状態の軽減のために薬学的に有効な量で、一定量のプロドラッグおよび／または活性化合物を含む。
【０１３７】
一般に、本発明の化合物は、治療的に有効な量、すなわち、処置を実施するのに十分な用量で投与され、この用量は、処置される個体および状態に依存して変わる。代表的には、治療的に有効な１日の用量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｇの薬物である。ほとんどの状態が、１日あたり、体重１ｋｇあたり約１〜約３０ｍｇ、すなわち７０ｋｇのヒトの場合、１日あたり、約７０ｍｇ〜２１００ｍｇの総用量の投与に対応する。
【０１３８】
結合体の安定性は、組成および送達増強輸送体の骨格および側鎖の立体化学によってさらに制御され得る。ポリペプチド送達増強輸送体の場合、Ｄ−異性体は、一般に、内在性プロテアーゼに対して耐性があり、それ故に、血清および細胞内でより長い半寿命を有する。それ故に、Ｄ−ポリペプチドポリマーは、より長い期間の作用が所望される場合に適切である。Ｌ−ポリペプチドポリマーは、プロテアーゼに対するそれらの感受性に起因して、より短い半寿命を有し、それ故に、より短い作用効果を付与するために選択される。このことによって、副作用が観察されるとすぐに、治療を中止するこよによってより容易に副作用が回避され得る。Ｄ−残基およびＬ−残基の混合物を含むポリペプチドは、中間の安定性を有する。ホモ−Ｄ−ポリマーが、一般的に好ましい。
【０１３９】
（Ａ．眼投与）
本発明の送達増強輸送体を用いて、眼の組織および他の関連する組織（例えば、眼瞼）を介する、および血液−脳を横切る（例えば、視神経を介する）、薬物の投与を増強し得る。眼組織としては、角膜、虹彩、レンズ、硝子体、硝子体液、視神経および眼瞼が挙げられる。
【０１４０】
眼への投与のための例示的結合体としては、例えば、とりわけ、以下があげられる：抗細菌化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、抗原生動物化合物、抗ヒスタミン、免疫調節化合物、瞳孔を拡大する化合物、麻酔化合物、硝子体添加剤（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ａｄｄｕｃｔ  ａｇｅｎｔ）、ステロイド抗炎症剤、抗炎症鎮痛剤、化学療法剤、ホルモン、抗白内障剤、新生血管形成インヒビター、免疫抑制剤、プロテアーゼインヒビター、およびアルドースレダクターゼインヒビター、コルチコイドステロイド、免疫抑制剤、コリン作用薬、抗コリンエステラーゼ剤、ムスカリンアンタゴニスト、交感神経作用剤、αアドレナリン作用性アンタゴニストおよびβアドレナリン作用性アンタゴニスト、ならびに抗脈管形成因子。
【０１４１】
コルチコステロイドは、例えば、以下を処置するために有用である：炎症性緑内障、前子宮炎、中間子宮炎、および後子宮炎、視神経炎、レーバー視神経網膜炎、網膜炎、偽腫瘍／筋炎、眼窩筋炎、血管腫／リンパ管腫、トキソカラ症（ｔｏｘｏｃａｒｉａｓｉｓｌ）、ベーチェット全ほふく膜炎、炎症性ｃｈｏｒｉｓ網膜症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｏｒｉｓｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）、および脈管炎。例示的コルチコステロイドとしては、例えば、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、コルチゾン、アルドステロン、およびベタメタゾンが挙げられる。
【０１４２】
免疫抑制剤は、例えば、以下の処置に有用である：炎症性緑内障、前子宮炎、中間子宮炎、および後子宮炎、視神経炎、レーバー視神経網膜炎、網膜炎、偽腫瘍／筋炎、眼窩筋炎、血管腫／リンパ管腫、トキソカラ症、ベーチェット全ほふく膜炎、炎症性ｃｈｏｒｉｓ網膜症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈｏｒｉｓｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）、脈管炎、および眼乾燥症候群（シェーグレン症候群）。眼乾燥症、すなわち「シェーグレン症候群」は、口、眼、および他の粘膜の炎症および乾燥により特徴付けられる、免疫系障害であり、涙腺を損傷し、そしてこの損傷は、涙の産生に影響する。
【０１４３】
例示的免疫抑制剤としては、例えば、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、アスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）（例えば、ＦＫ−５０６）、および非ステロイド抗炎症剤（例えば、Ｃｏｘ−２インヒビター、ケトロラク、スプロフェン、およびアンタゾリン）が挙げられる。他の例示的免疫抑制剤としては、例えば、ラパマイシンおよびタクロリムスが挙げられる。
【０１４４】
抗細菌剤は、例えば、結膜炎、麦粒腫、眼眼瞼炎、および角膜炎の処置に有用である。結膜炎（時折、急性カタル性結膜炎と呼ばれる）は、結膜（強膜および眼瞼の内側を覆う膜）中の血管の炎症である。結膜炎は、細菌またはウイルスにより引き起こされ得る。
【０１４５】
麦粒腫は、眼瞼の皮脂線の１つの、非伝染性の細菌感染である。麦粒腫は、眼瞼かまたは眼瞼の縁のいずれかにおいて、小さな赤い瘤のように見える。
【０１４６】
例示的抗細菌剤としては、例えば、以下が挙げられる：βラクタム抗生物質（例えば、セフォキシチン）、ｎ−ホルムアミドイルチエナマイシンおよび他のチエナマイシン誘導体、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、カルベニシリン、コリスチン、ペニシリンＧ、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、セファゾリン、セファロリジン、チブロリファミシン（ｃｈｉｂｒｏｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、グラミシジン、バシトラシン、スルホンアミドエノキサシン、オフロキサシン、シノキサシン、スパルフロキサシン、チアンフェニコール、ナリジクス酸、トスフロキサシントシレート、ノルフロキサシン、ピペミド酸三水和物、ピロミド酸、フレロキサシン、クロロテトラサイクリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ノルフロキサシン、スルファセタミド、スルフイソキサゾール、トブラマイシン、およびレボフロキサシン。
【０１４７】
抗ウイルス剤は、例えば、以下の処置に有用である：単純ヘルペス性角膜炎、単純ヘルペス性結膜炎、眼部帯状疱疹、およびサイトメガロウイルス網膜炎。抗ウイルス剤としては、例えば、以下が挙げられる：アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、ジドブジン（ｄｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）、イドクスウリジン、トリフルリジン、ホスカネット、およびビダラビン。
【０１４８】
抗真菌剤は、例えば、真菌性角膜炎および真菌性眼内炎を処置するために有用である。抗真菌剤としては、とりわけ、以下が挙げられる：ポリエン（例えば、アンフォテリシンＢおよびナタマイシン）；イミダゾール類（例えば、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾールおよびエコナゾール）；ならびにピリミジン類（例えば、フルシトシン）。他の例示的抗真菌剤としては、例えば、イトラコナゾール、フルシトシンおよびピマリシンが挙げられる。
【０１４９】
抗寄生生物化合物および／または抗原生動物化合物としては、例えば、以下が挙げられる：イベルメクチン、ピリメタミン、トリスルファピジミジン（ｔｒｉｓｕｌｆａｐｉｄｉｍｉｄｉｎｅ）、クリンダマイシンおよびコルチコステロイド調製物。
【０１５０】
コリン作用性剤は、例えば、緑内障および角膜浮腫を処置するために有用である。例示的コリン作用性剤としては、例えば、アセチルコリン、カルバコールおよびピロカルピンが挙げられる。
【０１５１】
抗コリンエステラーゼ剤は、例えば、緑内障および調節性内斜視を処置するために有用である。例示的抗コリンエステラーゼ剤としては、例えば、フィゾスチグミン、デメカリウム、エコチオフェート、およびイソフルロフェートが挙げられる。
【０１５２】
ムスカリンアンタゴニストは、例えば、毛様体筋麻痺性網膜症および毛様体筋麻痺を処置するために有用である。これらはまた、拡大検眼鏡検査において有用である。例示的ムスカリンアンタゴニストとしては、例えば、アトロピン、スコポラミン、ホマトロピン、シクロペントレート、およびトロピカミドが挙げられる。
【０１５３】
交感神経作用剤は、例えば、緑内障および散瞳を処置するために有用である。例示的交感神経作用剤としては、例えば、以下が挙げられる：ジピベフリン、エピネフリン、フェニレフリン、アプラクロニジン（ａｐｒａｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、コカイン、ヒドロキシアンフェタミン、ナファゾリン、およびテトラヒドロゾリン。
【０１５４】
αアドレナリン作用性アンタゴニストおよびβアドレナリン作用性アンタゴニストは、例えば、緑内障および逆散瞳（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｙｄｒｉａｓｉｓ）を処置するために有用である。例示的αアドレナリン作用性アンタゴニストおよびβアドレナリン作用性アンタゴニストとしては、例えば、以下が挙げられる：ダピプラゾール（ｄａｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、ベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール、メチプラノロール（ｍｅｔｉｐｒａｎｏｌｏｌ）、およびチモロール。
【０１５５】
抗脈管形成因子は、例えば、黄斑変性症を処置するために有用である。例示的抗脈管形成因子としては、例えば、コルチコステロイド、サリドマイド、およびエストラジオールが挙げられる。
【０１５６】
抗ヒスタミン剤およびうっ血除去薬としては、例えば、以下が挙げられる：ピリラミン、クロルフェニラミン、テトラヒドラゾリン、アンタゾリンおよびそのアナログ；ヒスタミン放出の肥満細胞インヒビター（例えば、クロモリン）。
【０１５７】
抗炎症鎮痛剤としては、とりわけ、以下が挙げられる：アルクロフェナック、アルミノプロフェン（ａｌｕｍｉｎｏｐｒｏｆｅｎ）、イブプロフェン、インドメタシン、エピリゾール、オキサプロジン、ケトプロフェン、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、ナプロキセン、ピロキシカム、フェンブフェン、フルフェナム酸、フルルビプロフェン、フロクタフェニン、ペンタゾシン、メチアジン酸、メフェナム酸、およびモフェゾラク。
【０１５８】
他の鎮痛剤としては、例えば、以下が挙げられる：コカイン、エチドカインコカイン、ベノキシネート、塩酸ジブカイン、塩酸ジクロニン、ネパイン、塩酸フェナカイン、ピペロカイン、塩酸プロパラカイン、塩酸テトラカイン、ヘキシルカイン、ブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、およびプリロカイン。
【０１５９】
化学療法剤としては、とりわけ、以下が挙げられる：サルファ剤（例えば、サラゾスルファピリジン、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファメトピラジンおよびスルファモノメトキシン）。
【０１６０】
ホルモンとしては、とりわけ、亜鉛インスリン、プロピオン酸テストステロン、および安息香酸エストラジオールが挙げられる。
【０１６１】
抗白内障剤としては、とりわけ、ピレノキシンなどが挙げられる。
【０１６２】
新生血管形成インヒビターとしては、とりわけ、フマギリンおよびその誘導体が挙げられる。
【０１６３】
プロテアーゼインヒビターとしては、とりわけ、［Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−エトキシカルボニルオキシラン−２−カルボニル］−Ｌ−ロイシン（３−メチルブチル）アミド（Ｅ−６４−ｄ）などが挙げられる。
【０１６４】
アルドースレダクターゼインヒビターとしては、とりわけ、５−（３−エトキシ−４−ペンチルオキシフェニル）チアゾリジン−２，４−ジオンなどが挙げられる。
【０１６５】
上で議論される薬剤のいくつかのクラスは、緑内障を処置するために用いられ得る。緑内障は、眼内の正常な流体圧（眼内圧、すなわち、ＩＯＰ）が、流動性の眼房水の結果としてゆっくりと上昇している状態である。この眼房水は、通常、眼の内側および外側を流れ、適切に排出することができない。変わりに、この流体は集まり、そして視神経に対して、圧力による損傷を生じ、そして視覚を失う。緑内障、失明、および他の眼障害を処置するために有用な化合物は、例えば、チモロール、レボブノロールおよびフェニレフリンが挙げられる。神経成長因子（ＮＧＦ）のような成長因子（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ  １（６）：５０１−５（２０００）を参照のこと）もまた、緑内障および他の眼障害を処置するために有用である。抗緑内障剤としては、上で議論したものに加えて、例えば、以下が挙げられる：チマロール（ｔｉｍａｌｏｌ）およびそのマレイン酸塩、ならびにＲ−チモロール、ならびにチマロールもしくはＲ−チモロールとピロカルピンとの組み合わせ、ならびに多くの他のアドレナリン作用性アゴニストおよび／またはアンタゴニスト：エピネフリンおよびエピネフリン複合体、またはプロドラッグ（例えば、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、塩酸塩、およびジピベフリン誘導体）；カルボニックアンヒドラーゼインヒビター（例えば、アセタゾールアミド、ジクロルフェナミド、２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−チオチオフェンスルホンアミド、６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾールスルホンアミド、および６−ピバロイルオキシ−２−ベンゾチアゾールスルホンアミド）。
【０１６６】
眼疾患の処置のための治療用化合物（例えば、上で議論したもの）は、当業者に周知である。代表的には、本発明の組成物の眼組織への投与は、点眼剤の形態である。あるいは、例えば、組成物は、眼に注入され得るかまたは軟膏として塗布され得る。
【０１６７】
（Ｂ．診断画像化および造影剤）
本発明の送達増強輸送体はまた、眼の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層に入りそして横切る、ならびに、一般に、眼および眼瞼内への、診断画像化剤および造影剤の送達のために有用である。診断剤の例としては、以下が挙げられる：放射能で標識された物質（例えば、９９ｍＴｃグルコへプトネート）、または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手順において使用される物質（例えば、ガドリニウムドープキレート剤（例えば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ））。診断剤の他の例としては、マーカー遺伝子（これは、細胞において発現された場合に、容易に検出可能であるタンパク質（β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むが、これらに限定されない）をコードする）、ならびに、網膜を検査するために用いられる化合物（例えば、フルオレセインナトリウム）；結膜、角膜および涙器を検査するために用いられる化合物（例えば、フルオレセインおよびローズベンガル）；ならびに異常な瞳孔応答を検査するために用いられるもの（例えば、メタコリン、コカイン、アドレナリン、アトロピン、ヒドロキシアンフェタミンおよびピロカルピン）。例えば、以下の広範な種々の標識が、使用され得る：放射性核種、蛍光物質（ｆｌｕｏｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特に、ハプテン）など。
【０１６８】
（送達増強輸送体について有用な生物学的に活性な分子および診断分子）
送達増強輸送体は、診断用途を有する、広範な種々の生物学的に活性な薬剤および分子に結合体化され得る。
【０１６９】
（Ａ．有機低分子）
有機低分子治療薬剤は、本明細書中に記載されるような、直鎖状ポリマー性組成物に有利に結合されて、上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切る輸送を促進または増強し得る。例えば、高度に荷電した薬剤（例えば、レボドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン；Ｌ−ＤＯＰＡ））の送達は、本明細書中に記載されるような、送達増強輸送体への連結によって利益を受け得る。ペプトイド薬剤およびペプチド模倣物薬剤もまた意図される（例えば、Ｌａｎｇｓｔｏｎ（１９９７）ＤＤＴ  ２：２５５；Ｇｉａｎｎｉｓら（１９９７）Ａｖａｎｃｅｓ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１）。また、本発明は、水性液体（例えば、血清および生理食塩水）中で乏しい溶解度を有する有機低分子を送達するために有利である。従って、低い溶解度によって治療効力が制限される化合物は、本発明によって、より高い投薬量で投与され得、そして細胞による、より高い取り込みレベルに起因して、非結合体形態に対して、結合体形態において、モル基準でより有効であり得る。
【０１７０】
低分子の位相学的表面の有意な部分が、しばしば生物学的活性に関与し、それゆえ、生物学的活性に必要とされるので、特定の場合の結合体の低分子部分は、標的上皮組織を横切った後に、低分子薬剤が生物学的活性を発揮するために、結合した送達増強輸送体、および（存在する場合）リンカー部分から切断される必要があり得る。このような状況では、結合体は好ましくは、上皮組織を通過した後に遊離薬物を放出するための切断可能なリンカーを含む。
【０１７１】
図５Ｄおよび図５Ｅは、本発明の別の局面の例示であり、対応する非結合体化形態に対して、増強されたトランス上皮組織輸送率を有する、タキサン抗癌結合体およびタキソイド抗癌結合体を含む。この結合体は、特に、癌細胞の増殖を阻害するために有用である。タキサンおよびタキソイドは、細胞機能に対して有害である程度まで、微小管の重合を促進し（および脱重合を阻害し）、細胞の複製を阻害し、そして最終的に細胞死をもたらすことによって、それらの抗癌効果を表すと考えられる。
【０１７２】
用語「タキサン」とは、パクリタキセル（図５Ｆ、Ｒ’＝アセチル、Ｒ”＝ベンジル）（商標「ＴＡＸＯＬ」としても公知である）、ならびに図５Ｇに例示されるような、パクリタキセルのＡ環、Ｂ環、Ｃ環およびＤ環を含む骨格コアを有する、天然に存在するアナログ、合成アナログまたは生体工学アナログをいう。図５Ｆはまた、「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝ＢＯＣ）の構造を示す。これは、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃによって販売される、パクリタキセルの、いくらかより可溶性の合成アナログである。「Ｔａｘｏｉｄ」とは、図５Ｈに示すような、パクリタキセルの基本的Ａ環、Ｂ環およびＣ環を含む、パクリタキセルの天然に存在するアナログ、合成アナログまたは生体工学アナログをいう。実質的な合成情報および生物学的情報は、Ｓｕｆｆｎｅｓｓ（１９９５）Ｔａｘｏｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２３７−２３９頁、特に第１２章〜第１４章に、ならびにその後のパクリタキセルの文献に概説されるように、種々のタキサン化合物およびタキソイド化合物の合成および活性について利用可能である。さらに、細胞株の宿主は、例えば、Ｓｕｆｆｎｅｓｓの第８章および第１３章に記載されるように、特定の癌の型に対するこれらの化合物の抗癌活性を予測するために利用可能である。
【０１７３】
送達増強輸送体は、タキサンまたはタキソイド中の任意の適切な結合部位を介してタキサン部分またはタキソイド部分に結合体化される。好都合なことに、輸送ポリマーは、上記のような、連結ストラテジーを用いて、Ｃ２’酸素原子、Ｃ７酸素原子を介して連結される。Ｃ７酸素を介した輸送ポリマーの結合体化は、その位置での結合体化にもかかわらず、抗癌活性および抗腫瘍活性を有するタキサン結合体をもたらす。従って、リンカーは、切断可能であっても切断可能でなくてもよい。Ｃ２’酸素を介した結合体化は、抗癌活性を有意に低下させ、その結果、切断可能なリンカーは、この部位への結合体化のために好ましい。他の結合部位（例えば、Ｃ１０）もまた用いられ得る。
【０１７４】
本発明のタキサン結合体およびタキソイド結合体が、タキソール（約０．２５μｇ／ｍＬ）およびタキソテレ（６〜７μｇ／ｍＬ）に対して改善された水溶性を有することが理解される。それゆえ、大量の可溶化剤（例えば、「ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ」（ポリオキシエチル化ヒマシ油）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、「ＴＷＥＥＮ  ８０」としても公知）およびエタノール）は必要でなく、その結果、これらの可溶化剤に代表的に関連した副作用（例えば、アナフィラキシー、呼吸困難、低血圧および紅潮）が減少され得る。
【０１７５】
（Ｂ．金属）
金属は、実施例によって例示されるように、本発明の送達増強輸送体に結合体化された、キレート剤（例えば、テキサフィリンまたはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））を用いて、眼の上皮組織および内皮組織の１以上の層内に、ならびに眼の上皮組織および内皮組織の１以上の層を横切って輸送され得る。これらの結合体は、画像化または治療のために金属イオンを送達するのに有用である。例示的な金属イオンとしては、Ｅｕ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｇｄ、Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６７、Ｉｎｌ１１、Ｙ９０、Ｃｕ６７およびＣｏ５７が挙げられる。結合体候補を用いての予備的な膜輸送研究は、以下の実施例の節に記載されるような、細胞ベースのアッセイを用いて行われ得る。例えば、ユーロピウムイオンを用いる、時間分解型蛍光測定によって、細胞取り込みがモニタリングされ得る。細胞傷害性である金属イオンについては、取り込みは、細胞傷害性によってモニタリングされ得る。
【０１７６】
（Ｃ．高分子）
本発明の増強輸送方法は、多数の高分子についての、上皮組織または内皮組織の１以上の層内への、および上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切る輸送を増強するために特に適切である。このような高分子としては、タンパク質、核酸、多糖類、およびこれらのアナログが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡから形成されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらのアナログが挙げられ、これらは、相補的標的（例えば、一本鎖標的または二本鎖標的についてのアンチセンス配列）へのハイブリダイゼーションのために、またはこれらの配列によってコードされる核酸転写物もしくはタンパク質の発現のために設計された、選択された配列が挙げられる。アナログとしては、荷電した骨格アナログ、そして好ましくは非荷電の骨格アナログ（例えば、ホスホネート（好ましくは、メチルホスホネート））、ホスホルアミデート（Ｎ３’またはＮ５’）、チオホスフェート、非荷電モルホリノベースのポリマーおよびタンパク質核酸（ＰＮＡ））が挙げられる。このような分子は、種々の治療レジメン（例えば、酵素置換治療、遺伝子治療、およびアンチセンス治療が挙げられる）において用いられ得る。
【０１７７】
例として、タンパク質核酸（ＰＮＡ）は、骨格がデオキシリボース骨格と構造的に同形であるＤＮＡのアナログである。この骨格は、核塩基が結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。４つの天然の核塩基の全てを含むＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合の法則に従って相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして塩基対認識に関する真のＤＮＡ模倣物である（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８）。ＰＮＡの骨格は、リン酸エステルよりもむしろ、ペプチド結合によって形成され、ＰＮＡをアンチセンス適用に十分に適合させる。骨格は荷電されていないので、形成するＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、通常よりも高い熱安定性を示す。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても認識されないというさらなる利点を有する。さらに、ＰＮＡは、標準的なｔ−Ｂｏｃ化学を用いて自動化ペプチド合成機で合成され得る。次いで、ＰＮＡは、本発明の輸送ポリマーに容易に連結される。
【０１７８】
上皮組織および内皮組織内への、ならびに上皮組織および内皮組織を横切っる輸送が、本発明の方法を用いて増強され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、例えば、米国特許第５，５９４，１２２号に記載される。このようなオリゴヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するために標的化される。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの輸送ポリマーの結合体化は、例えば、十分に確立された方法に従って、スクシネートリンカーを介して、ペプチドとオリゴヌクレオチドの５’末端との間にアミド結合を形成することによってもたらされ得る。ＰＮＡ結合体の使用はさらに、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０５７１の実施例１１に例示される。この出願の図７は、実施例１１に記載されるように、Ｔ細胞によるガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）の分泌を阻害するためのＰＮＡ配列を含む、本発明の結合体を用いて得られた結果を示す。理解され得るように、アンチセンスＰＮＡ結合体は、結合体が約１０μＭを超えるレベルで存在した場合、γ−ＩＦＮ分泌をブロックするために有効であった。対照的に、センスＰＮＡ結合体を用いたときも、非結合体化アンチセンスＰＮＡ単独で用いたときも、阻害は見られなかった。
【０１７９】
上皮組織または内皮組織の１つ以上の層を横切って輸送され得る高分子の別のクラスは、タンパク質で例示され、そして特に、酵素である。治療的タンパク質としては、置換酵素が挙げられるが、これに限定されない。治療的酵素としては、リソソーム（ｌｙｓｏｚｏｍａｌ）グルコセレブロシダーゼ欠損（ゴシェ病）を処置する際に使用するためのアルグルセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ムコ多糖症Ｉを処置する際に使用するためのα−Ｌ−イズロニダーゼ、サンフィリポＢ症候群を処置する際に使用するためのα−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ、膵臓不全を処置する際に使用するためのリパーゼ、重篤な複合免疫不全症候群を処置する際に使用するためのアデノシンデアミナーゼ、およびトリオースホスフェートイソメラーゼ欠損に関連する神経筋機能不全を処置する際に使用するためのトリオースホスフェートイソメラーゼが挙げられるが、これらに限定されにない。
【０１８０】
さらに、そして本発明の重要な局面によれば、タンパク質抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾル画分に送達され得、ここでこれらは、ペプチドに分解される。次いで、このペプチドは、小胞体へと輸送され、ここでこれらは、発生期ＨＬＡクラスＩ分子と会合し、そして細胞表面上に提示される。このような「活性化された」ＡＰＣは、クラスＩに制限された抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘発因子として作用し得、次いで、これが、特定の抗原を提示する細胞を認識および破壊し始める。このプロセスを実行し得るＡＰＣとしては、特定のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、タンパク質抗原は、腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起または促進するための腫瘍抗原である。ＣＴＬのその後の活性を伴う、ＡＰＣの細胞質ゾルへの単離されたタンパク質または可溶性タンパク質の輸送は、例外的である。なぜならば、ほとんど例外なく、単離されたタンパク質または可溶性タンパク質の注射は、ＡＰＣの活性化もＣＴＬの誘導も生じないからである。従って、本発明の輸送増強組成物に結合体化された抗原は、インビトロまたはインビボでの細胞性免疫応答を刺激するように作用し得る。
【０１８１】
別の実施形態において、本発明は、免疫特異的抗体または抗体フラグメントを細胞質ゾルに送達して、有害な生物学的プロセス（例えば、微生物感染）を妨害するのに有用である。最近の実験は、細胞内抗体が、植物細胞および哺乳動物細胞において有効な抗ウイルス剤であり得ることを示した（例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９；およびＳｈａｈｅｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３９２）。これらの方法は、代表的には、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用しており、ここで抗体の重鎖および軽鎖は、単一のポリペプチドとして合成される。この可変重鎖および可変軽鎖は、通常、可撓性リンカーペプチド（例えば、１５個のアミノ酸の）により分離されて、高親和性リガンド結合部位を保持する２８ｋＤａの分子を生じる。この技術の広範な適用に対する主な障害は、感染した細胞への取り込み効率である。しかし、輸送ポリマーをｓｃＦｖフラグメントに結合させることにより、細胞取り込みの程度は増大され得、免疫特異的フラグメントが重要な微生物成分（例えば、ＨＩＶ  Ｒｅｖ、ＨＩＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼタンパク質）に結合し、そしてそれを無効にし得る。
【０１８２】
（Ｄ．ペプチド）
本明細書中に記載される増強された輸送方法により送達されるペプチドとしては、エフェクターポリペプチド、レセプターフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されるべきではない。例としては、細胞内シグナルを媒介するタンパク質により使用されるリン酸化部位を有するペプチドが挙げられる。このようなタンパク質の例としては、プロテインキナーゼＣ、ＲＡＦ−１、ｐ２１Ｒａｓ、ＮＦ−κＢ、Ｃ−ＪＵＮ、および膜レセプタ（例えば、ＩＬ−４レセプター）の細胞質テール、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｖ７、およびＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣクラスＩＩ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
送達増強輸送体もまたペプチドである場合、上述のように、合成は、自動ペプチド合成機を使用してかまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが産生される組換え方法により達成され得る。
【実施例】
【０１８４】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を限定しない。
【０１８５】
（実施例１）
（輸送体結合体の眼送達）
本発明の輸送体の、眼の組織に浸透する能力を試験した。ビオチン化ｒ８を、ウサギの眼に注射し、そしてまた点眼薬として眼の外側に適用した。
【０１８６】
手短には、ビオチン化ｒ８の１ｍＭ  ＰＢＳ溶液の５滴を、ウサギの両目に適用して、１５分間インキュベートした。この動物を屠殺し、そして一方の眼を、隣接する組織は無傷なまま切開し、他方の眼を、その構成部分の各々に分離し、凍結し、そして別々に切片に切断し、ストレプトアビジン−フルオレセインで染色し、そしてヨウ化プロピジウムで対比染色した。結果は、角膜および眼瞼における染色を示していたが、水晶体の染色は示していなかった。
【０１８７】
ビオチン化ｒ８の１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液の５０マイクロリットルを、別の動物の硝子体液に注射し、そしてこの動物を、３０分後に屠殺し、そして注射した眼を切開した。再び、一方の眼窩は無傷のまま凍結しながら、他方の眼窩を切開し、その構成部分を別々に凍結した。注射実験からの結果は、眼窩の全ての内部表面が染色されたことを実証していた。
【０１８８】
（実施例２）
（アルギニンの短いオリゴマーおよびＣｓＡの放出可能結合体の合成、インビトロでの活性およびインビボでの活性）
シクロスポリンＡの２級アルコールの修飾は、その生物学的活性の有意な損失を生じる。例えば、Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６，５４４−７（１９８４）を参照のこと。結果として、細胞への輸送後のその結合体からの遊離シクロスポリンＡの放出を確実にするために、シクロスポリンＡを、図１０に示すように、ｐＨ感受性リンカーを介してオリゴアルギニン輸送体に結合した。得られた結合体は、酸性ｐＨでは安定であるが、ｐＨ＞７では、シクロスポリンＡに隣接するカルボニルへの遊離アミンの付加を含む分子内環化を受け（図６）、これは、修飾されていないシクロスポリンＡの放出をもたらす。
【０１８９】
放出可能結合体の設計における別の修飾は、Ｌ−アルギニン（Ｒ）の使用であり、輸送体中にＤ−アルギニン（ｒ）は使用しなかった。この結合体の最大の安定性、および蛍光によるその位置の決定における精度を確実にするために、組織学的実験にオリゴ−Ｄ−アルギニン輸送体が使用されるが、Ｌ−アルギニンのオリゴマーは、その生物学的半減期を最小にするために放出可能結合体の設計に組み込まれた。その設計と一致して、得られる放出可能結合体は、酸性ｐＨでは安定であるが、血清の非存在下での生理学的ｐＨでは不安定であることが示された。ｐＨ７．４のＰＢＳ中のこの放出可能シクロスポリンＡ結合体の半減期は、９０分であった。
【０１９０】
（結果）
シクロスポリンＡの放出可能グアニジノ−ヘプタマー結合体は、インビトロでＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激されたヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）によるＩＬ−２分泌を阻害することにより、生物学的に活性であることが示された。Ｒ．Ｗｉｓｋｏｃｉｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３４，１５９９−６０３（１９８５）を参照のこと。この結合体は、ＰＭＡ／イオノマイシンの添加の１２時間前に加えられ、そして用量依存性阻害が、放出可能Ｒ７  ＣｓＡ結合体により観察された。この阻害は、ｔ−Ｂｏｃ保護基（これは、環化および結果としての活性薬物の放出を防ぐ）を保持していることにより放出可能結合体と異なる、非放出性アナログ（図６）では観察されなかった。放出可能Ｒ７シクロスポリン結合体のＥＣ５０は、アルコールに溶解されて放出可能結合体と同時に加えられたＣｓＡより約２倍高かった。
【０１９１】
放出可能Ｒ７  ＣｓＡ結合体を、接触皮膚炎のマウスモデルを使用して機能的活性についてインビボでアッセイした。１％の放出可能Ｒ７  ＣＳＡ結合体での処理は、耳の炎症において７３．９％±４．０の減少を生じた（図７）。炎症の減少は、未処置の耳では全く見られず、処置された耳において見られた効果が、局所的でありかつ全身的ではないということを示していた。０．１％および０．０１％のＲ７−ＣｓＡで処置されたマウスの耳においてより低い阻害が観察され（それぞれ、６４．８％±４．０および４０．９％±３．３）、この効果が滴定可能であることを実証した。フッ素化コルチコステロイドポジティブコントロールでの処置は、耳腫大における減少（３４．１％±６．３）を生じたが、０．１％の放出可能Ｒ７  ＣｓＡについて観察された減少より有意に低かった（図７）。未修飾のシクロスポリンＡ、ビヒクル単独、Ｒ７、または非放出性Ｒ７  ＣｓＡで処置されたマウスのいずれにおいても炎症の減少は観察されなかった。
【０１９２】
（実施例３）
（銅−ＤＴＰＡ−ｒ７複合体およびガドリニウム−ＤＴＰＡ−ｒ７複合体の調製）
（方法）
１．金属錯体の調製
工程１−銅−ジエチレントリアミン五酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製
炭酸銅（１０ｍｍｏｌ）およびジエチレントリアミン五酢酸（１０ｍｍｏｌ）を、水（１５０ｍＬ）に溶解した（図８）。１８時間後、この溶液を、遠心分離していかなる固体をも除去した。この青色溶液を、デカントし、そして凍結乾燥して青色粉末を得た（収率＞９０％）。
【０１９３】
工程２−ＤＴＰＡ輸送体の調製
Ｃｕ−ＤＴＰＡを、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ  ４３３Ａ）を使用してアミノカプロン酸スペーサーを介して輸送体に連結した（図９）。この材料を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４０ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（１００μＬ）およびフェノール（１００μＬ）で１８時間処理することにより樹脂から切断した。この樹脂を、濾別し、そしてこのペプチドをジエチルエーテル（８０ｍＬ）を加えることにより沈殿させた。この溶液を遠心分離し、そして溶媒をデカントして除いた。粗製固体を、水／アセトニトリル勾配を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＴＦＡでの処理は、Ｃｕ２＋イオンの損失を生じ、これを再挿入する必要があった。
【０１９４】
ＤＴＰＡ−ａｃａ−Ｒ７−ＣＯ２Ｈ（１０ｍｇ、０．００６３ｍｍｏｌ）および硫酸銅（１．６ｍｇ、０．００６３ｍｍｏｌ）を、水（１ｍＬ）に溶解した。１８時間穏やかに攪拌させ、そして凍結乾燥して生成物を白色粉末（１０ｍｇ）として得た。
【０１９５】
（２．皮膚を横切る輸送の分析）
金属ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）錯体を、等モル量の金属塩とＤＴＰＡとを水中で１８時間混合することにより形成した。この時間の終わりに、この溶液を遠心分離し、凍結し、そして凍結乾燥した。乾燥した粉末を質量分析法で特徴付けし、そして固相ペプチド合成に使用した。この金属ＤＴＰＡ錯体を、ペプチド合成に使用される固相樹脂にまだ結合されているＤ−アルギニンまたはＬ−アルギニンのポリマーに結合させた。この金属−ＤＴＰＡ錯体を、アミノカプロン酸スペーサーを使用して結合した。
【０１９６】
ペプチドを、固相技術および市販のＦｍｏｃアミノ酸、樹脂、および試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡおよびＢａｃｈｅｍ  Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３ペプチド合成機で合成した。カップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＨＯＢｔに換えてＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）を用いて、Ｆａｓｔｍｏｃサイクルを使用した。ペプチドのアミノ末端へのビオチンの付加の前に、アミノカプロン酸（ａｃａ）を結合してスペーサーとして作用させた。このペプチドを、９６％トリフルオロ酢酸、２％トリイソプロピルシラン、および２％フェノールを１時間〜１２時間の間使用して樹脂から切断し、また金属も放出させた。アルギニンのポリマーからＰｂｆ保護基を完全に除去するためにはより長い反応時間が必要であった。続けて、このペプチドを、樹脂から濾過し、ジエチルエーテルを使用して沈殿させ、ＨＰＬＣ逆相カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｌｔｉｍａ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して精製し、そしてエレクトロスプレー質量分析法またはマトリックス支援レーザー脱離質量分析法（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のいずれかを使用して特徴付けした。
【０１９７】
ＨＰＬＣ精製およびペプチド−ＤＴＰＡ複合体の凍結乾燥後に金属を置換する。この金属の置換には、ペプチド−アミノカプロン酸−ＤＴＰＡ複合体と共に等モル量の金属塩をインキュベーションすること、およびその後の凍結乾燥が含まれる。
【０１９８】
（実施例４）
（ｐＨ放出可能リンカーを用いた、タキソールと送達増強輸送体との結合）
この実施例は、生理学的ｐＨへの曝露の際に送達増強輸送体から薬物を放出するリンカーにより薬物に連結される送達増強輸送体を有するプロドラッグを合成するための一般的なストラテジーの使用を実証する。一般的に、薬物の適切な部位が、α−クロロアセチル残基を保有するように誘導体化される。次に、この塩素は、保護されていないアミンを保有するシステイン残基のチオールと置換される。このスキームを図１６に示す。
【０１９９】
（方法）
タキソール−２’−クロロアセチルの合成
タキソール（８９．５ｍｇ、１０４．９μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３．５ｍＬ）に溶解した。この溶液をＮ２雰囲気下で０°に冷却した。無水α−クロロ酢酸（１９．７ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加し、次いでＤＩＥＡ（１４．８ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温まで昇温させた。薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）分析が出発物質の完全な消費を示した後、溶媒を真空で除去し、そして粗製物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（溶離液：ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ２０％〜５０％）、所望の物質（９９．８ｍｇ、定量的）を得た（図１８）。
【０２００】
【数１】
2004533414.tif 000012
送達増強輸送体へのタキソールの連結
ペプチド（４７．６ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＥＡ（２．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を添加した。タキソール−２’−クロロアセテート（２０．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液を添加した。室温での攪拌を６時間続けた。０．１％のＴＦＡを含む水（１．０ｍＬ）を添加し、このサンプルを凍結し、そして溶媒を凍結乾燥した。粗製物質をＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊０．１％ＴＦＡ：８５％〜１５％）により精製した。この反応の概略図を図１８に示す。
【０２０１】
関連結合体の合成
上記に概説した結合条件を使用して、示される３つのさらなる結合体を合成した。
【０２０２】
（細胞傷害性アッセイ）
タキソール結合体を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）色素還元において細胞傷害性について試験した。結果（図２０に示される）は、容易にｐＨ放出可能なリンカー（ＣＧ１０６２；図１９に示される構造においてＲ＝Ａｃ）を用いてｒ７に結合されたタキソールが、タキソール単独かまたはあまり容易にｐＨ放出可能でないリンカー（ＣＧ１０４０；図１９に示される構造においてＲ＝Ｈ）を用いてｒ７に結合されたタキソールのいずれかよりも、有意により細胞傷害性であることを実証する。
【０２０３】
（実施例５）
（Ｔａｔ４９〜５７由来の蛍光標識されたペプチドの構造−機能関係）
（方法）
一般。Ｒｉｎｋアミド樹脂およびＢｏｃ２Ｏを、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ジイソプロピルカルボジイミド、ブロモ酢酸、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＮＣＳ）、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、ｔｒａｎｓ−１，６−ジアミノシクロヘキサン、およびピラゾール−１−カルボキサミジンを、全てＡｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から購入した。全ての溶媒および他の試薬は、業者から購入し、そしてさらに精製することなく使用した。モノＢｏｃアミンを、市販のジアミンから文献の手順を使用して合成した（クロロホルム中１０当量のジアミンおよび１当量のＢｏｃ２Ｏ、その後、未反応のジアミンを除去するために水性後処理する）（３４）。
【０２０４】
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１，６−ｔｒａｎｓ−ジアミノシクロヘキサン。
【０２０５】
【数２】
2004533414.tif 000013
ペプチド合成の一般的手順。Ｔａｔ４９〜５７（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｔａｔ４９〜５７に由来する短縮されたアラニン置換ペプチド、アンテナペディア４３〜５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、およびアルギニンのホモポリマー（Ｒ５〜Ｒ９）およびｄ−アルギニン（ｒ５〜ｒ９）を、自動ペプチド合成機（ＡＢＩ４３３）を用いて、ペプチドカップリング試薬としてＨＡＴＵを用いる標準的な固相Ｆｍｏｃ化学（３５）を使用して調製した。フルオレセイン部分を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中１２時間フルオレセインイソチオシアネート（１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ）で樹脂結合ペプチド（１．０ｍｍｏｌ）を処理することにより、アミノヘキサン酸スペーサーを介して結合した。樹脂からの切断を、９５：５のＴＦＡ／トリイソプロピルシランを使用して達成した。真空での溶媒の除去により、粗製油状物を得、これを冷エーテルで粉砕した。このようにして得た粗製混合物を、遠心分離し、エーテルをデカンテーションにより除去し、そして得られた橙色固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）により精製した。この生成物を、凍結乾燥により単離し、そしてエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けした。このペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ中）により決定した場合＞９５％であった。
【０２０６】
合成された全てのペプチドおよびペプトイドは、アミノへキサン酸スペーサーのアミノ基に共有結合されたフルオレセイン部分（ＦＩ）と共に、Ｎ末端アミノ基に結合されたアミノヘキサン（ａｈｘ）酸部分を含む。全てのペプチドおよびペプトイドのカルボキシル末端は、カルボキサミドである。
【０２０７】
細胞取り込みアッセイ。アルギニンホモポリマーおよびグアニジン置換ペプトイドを、それぞれＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、そしてそれらの濃度を４９０ｎｍにおけるフルオレセインの吸収（ε＝６７，０００）により決定した。この濃度決定法の精度は、選択されたサンプルを秤量し、そしてそれらを既知量のＰＢＳ緩衝液に溶解することにより確立された。ＵＶ分光法により決定された濃度は、手動で秤量された量と相関していた。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞株）、マウスＢ細胞（ＣＨ２７）またはヒトＰＢＬ細胞を、１０％ウシ胎仔血清ＤＭＥＭ中で増殖させ、そしてこれらの各々を細胞取り込み実験に使用した。種々の量のアルギニン、およびグアニジン置換ペプトイドのオリゴマーを、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（合わせて合計２００μＬ）中の約３×１０６個の細胞に添加し、そしてマイクロタイタープレート（９６ウェル）中に置き、そして種々の時間２３℃または４℃でインキュベートした。このマイクロタイタープレートを、遠心分離し、そして細胞を単離し、冷ＰＢＳ（３×２５０μＬ）で洗浄し、０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡと共に３７℃で５分間インキュベートし、冷ＰＢＳで洗浄し、そして０．１％のヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞を、蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析し、そしてヨウ化プロピジウムによる細胞染色を、分析から除外した。示されるデータは、収集された５０００個の細胞についての平均蛍光シグナルである。
【０２０８】
アジ化ナトリウムを用いる細胞取り込みの阻害。使用される細胞を蛍光ペプチドの添加の前に２％ＦＣＳ／ＰＢＳ緩衝液中の０．５％アジ化ナトリウムで３０分間予めインキュベートし、そしてこの細胞をＰＢＳ緩衝液中の０．５％アジ化ナトリウムで洗浄したことを除いて、以前に記載したとおりにこのアッセイを実行した。全ての細胞取り込みアッセイを、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下で並行して行った。
【０２０９】
細胞取り込み速度論アッセイ。細胞をマイクロタイタープレート（９６ウェル）で２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５０μｌ）中３連で４℃にて、０．５分、１分、２分、および４分間インキュベートしたことを除いて、以前に記載したとおりにこのアッセイを実行した。反応を、このサンプルを２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５ｍＬ）中に希釈することによりクエンチした。次いで、このアッセイを後処理し、そして蛍光フローサイトメトリーにより、以前に記載したとおりに分析した。
【０２１０】
（結果）
短いアルギニンリッチなペプチドの細胞取り込みの構造的要件を決定するために、Ｔａｔ４９〜５７の一連の蛍光標識短縮アナログを、標準の固相化学を使用して合成した。例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ら、ＳＯＬＩＤ−ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（ＩＲＬ：Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌ．１９８９）を参照のこと。フルオレセイン部分を、アミノへキサン酸スペーサーを介してアミノ末端上に結合した。次いで、これらの蛍光標識ペプチドの、Ｊｕｒｋａｔ細胞に進入する能力を、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して分析した。試験したペプチド構築物は、Ｔａｔ４９〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）：Ｔａｔ４９〜５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ）、Ｔａｔ４９〜５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ）、Ｔａｔ５０〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ）、およびＴａｔ５１〜５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ）であった。細胞表面結合と内在化との間の区別は、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下におけるアッセイの並行セットを実行することにより全体にわたって達成された。アジ化ナトリウムは、エネルギー依存性細胞取り込みを阻害するが細胞表面結合を阻害しないので、２つのアッセイ間の蛍光の差異は、内在化から生じる蛍光の量を与えた。
【０２１１】
アミノ末端（Ｔａｔ５０〜５７）またはカルボキシル末端（Ｔａｔ４９〜５６）のいずれかからの１つのアルギニン残基の欠失は、親配列（Ｔａｔ４９〜５７）に比べて細胞内蛍光の８０％の損失を生じた。１つのアミノ酸を短縮されたアナログから、カルボキシル末端からＲ−５６をさらに欠失すると（Ｔａｔ４９〜５５）、細胞内蛍光のさらに６０％の損失をもたらすが、アミノ末端からのＫ−５０の欠失（Ｔａｔ５１〜５７）は、内在化の量をさらに減少させなかった。これらの結果は、Ｔａｔ４９〜５７の短縮アナログが、Ｊｕｒｋａｔ細胞内へのフルオレセインの経細胞送達において有意に有効でないこと、およびアルギニン残基が、リジン残基よりも細胞取り込みに寄与しているようであることを示している。
【０２１２】
個々のアミノ酸残基の細胞取り込みに対する寄与を決定するために、Ｔａｔ４９−５７の各部位にアラニン置換を含むアナログを、合成し、そしてＦＡＣＳ分析によりアッセイした（図２２）。以下の構築物を試験した：Ａ−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＡＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ）、Ａ−５３（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ）、Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＡＲＲＲ）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＡＲＲ）、Ａ−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ）、およびＡ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＡ）。Ｔａｔ４９〜５７の非荷電グルタミン残基のアラニンとの置換（Ａ−５４）は、細胞内在化において中程度の減少を生じた。他方、各々のカチオン性残基のアラニン置換は、個々に細胞取り込みの７０〜９０％の損失を生じた。これらの場合、リジンのアラニンとの置換（Ａ−５０、Ａ−５１）またはアルギニンのアラニンとの置換（Ａ−４９、Ａ−５２、Ａ−５５、Ａ−５６、Ａ−５７）は、取り込みの減少において同様の効果を有していた。
【０２１３】
輸送体ペプチドのキラリティが重要であったか否かを決定するために、対応するｄ−（ｄ−Ｔａｔ４９〜５７）、ｒｅｔｒｏ−ｌ−（Ｔａｔ５７〜４９）、およびｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ異性体（ｄ−Ｔａｔ５７〜４９）を合成し、そしてＦＡＣＳ分析によりアッセイした（図２３）。重要なことに、３つのアナログ全てが、Ｊｕｒｋａｔ細胞への進入においてＴａｔ４９〜５７よりも有効であった。これらの結果は、ペプチド骨格のキラリティが、細胞取り込みに重要ではないことを示していた。興味深いことに、ｒｅｔｒｏ−ｌ異性体（Ｔａｔ５７〜４９）（これは、Ｔａｔ４９〜５７に見出される１つのアルギニンおよび２つのリジンの代わりにアミン末端に位置する３つのアルギニン残基を有する）は、増強された細胞取り込みを実証した。従って、アミノ末端における残基は、重要であるようであり、そしてアルギニンは、内在化に関してリジンよりも有効であるようである。非天然のｄ−ペプチドの改善された細胞取り込みは、アッセイに使用される２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）中のタンパク質分解に対する増加した安定性に、最も起因しているようである。血清を排除した場合、ｄ−ペプチドおよびｌ−ペプチドは、予測されるとおり等価であった。
【０２１４】
これらの最初の結果は、アルギニン含量が、Ｔａｔ４９−５７の細胞取り込みの主な原因であることを示していた。さらに、これらの結果は、本発明者らが実証した本発明者らの以前の結果（アルギニンの短いオリゴマーが、リジン、オルニチン、およびヒスチジンの対応する短いオリゴマーよりも細胞への進入においてより有効であることを）と一致していた。確立されていないことは、どのアルギニンホモオリゴマーがＴａｔ４９〜５７よりも効果的であるかということである。この点に取り組むために、Ｔａｔ４９〜５７を、ｌ−アルギニン（Ｒ５〜Ｒ９）オリゴマーおよびｄ−アルギニン（ｒ５〜ｒ９）オリゴマーと比較した。Ｔａｔ４９〜５７は、８つのカチオン性残基を含むが、その細胞内在化は、Ｒ６とＲ７との間であり（図２４）、６つのアルギニン残基の存在が、細胞取り込みに最も重要な因子であることを実証する。意味深いことに、７〜９のアルギニン残基を含む結合体は、Ｔａｔ４９〜５７より良好な取り込みを示した。
【０２１５】
これらのアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９〜５７の細胞に入る能力を定量的に比較するために、ミカエリス−メンテン速度分析を行なった。細胞の取り込みの速度は、３０、６０、１２０および２４０秒間の、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるペプチドのインキュベーション（３℃）後に決定した（表１）。結果のＫｍ値は、ｒ９およびＲ９が、Ｔａｔ４９〜５９よりもそれぞれ、約１００倍および２０倍速い速度で、細胞に入ることを明らかにした。比較のために、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ４３〜５９をまた分析し、そして、Ｔａｔ４７〜５９より約２倍速く細胞に入るが、ｒ９およびＲ９よりも有意に遅いことを示した。
【０２１６】
【表１】
2004533414.tif 000014
（実施例６）
（Ｔａｔ４９−５７のペプチド模倣アナログの設計および合成）
（方法）
（ペプトイドポリアミン合成の一般的手順）
ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎによって開発された文献の手順に従って、樹脂を混合するために、フリッティングしたガラス器具および窒素の陽圧を使用して、手動で合成した。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１５１７−１５２２（１９９８）；Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４６−１０６４７（１９９２）を参照のこと。Ｆｍｏｃ置換Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．２ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）での３０分間（２×）の処理により、遊離樹脂結合アミンを得、これをＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）の溶液で３０分間処理した。この手順を繰り返した。次いで、この樹脂を洗浄し（３×５ｍＬ  ＤＭＦ）、そしてＤＭＦ（５ｍＬ）中のモノ−Ｂｏｃジアミン（８．０ｍｍｏｌ）の溶液で１２時間処理した。これら２つの工程を、必要とされる長さのオリゴマーが得られるまで繰り返した（注記：ＤＭＦ中のモノ−Ｂｏｃジアミンの溶液を、収率を明らかに低下させることなく再利用し得た）。次いで、この樹脂を、ＤＭＦ中のＮ−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸（２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（２．０ｍｍｏｌ）で１時間処理し、そしてこれを繰り返した。次いで、Ｆｍｏｃを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）で３０分間処理することによって、除去した。この工程を繰り返し、そしてこの樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。次いで、遊離アミン樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のフルオレセインイソチオシアネート（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）で１２時間処理した。次いで、この樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびジクロロメタン（５×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂からの切断を、９５：５  ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（８ｍＬ）を使用して達成した。減圧下での溶媒の除去により、粗製油状物を得、これを冷エーテル（２０ｍＬ）で粉砕した。このように得た粗製混合物を遠心分離し、エーテルをデカンテーションによって除去し、そして得られる橙色固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％  ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）により精製した。この生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして電子スプレー質量分析によって、そして選択された場合には１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって、特徴付けた。
【０２１７】
（ペプトイドポリアミンの過グアニジニル化（Ｐｅｒｇｕａｎｉｄｉｎｙｌａｔｉｏｎ）のための一般的手順）
脱イオン水（５ｍＬ）に溶解したペプトイドアミン（０．１ｍｍｏｌ）の溶液を、炭酸ナトリウム（１つのアミン残基あたり５当量）およびピラゾール−１−カルボキサミジン（１つのアミン残基あたり５当量）で処理し、そして２４〜４８時間５０℃に加熱した。次いで、この粗製混合物を、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）で酸性化し、そして逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）で直接精製した。この生成物を、電子スプレー質量分析によって特徴付け、そして凍結乾燥によって単離し、そしてさらに逆相ＨＰＬＣによって精製した。このグアニジン置換したペプトイドの純度は、分析逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ）によって決定した場合に、９５％より高かった。
【０２１８】
（結果）
Ｔａｔ４７−５９の細胞取り込みについて決定した構造−機能関係を利用して、本発明者らは、アルギニンオリゴマーの側鎖の１，４骨格間隔を保存するが、ステレオジェン中心が欠けているオリゴグリシン骨格を有するポリグアニジンペプトイド誘導体のセットを設計した。アルギニン様側鎖をアミド窒素に組み込むこれらのペプトイドを、これらのタンパク分解に対する予測される抵抗性、ならびに合成の潜在的な容易さおよび有意に低い費用に起因して、選択した。（Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６−１０６４７（１９９２））さらに、ラセミ化（頻繁に、ペプチド合成において遭遇する）は、ペプトイド合成においては問題ではない；そして「亜モノマー（ｓｕｂ−ｍｏｎｏｍｅｒ）」ペプトイドアプローチは、側鎖スペーサーの容易な改変を可能にする。Ｔａｔ４９−５７のオリゴウレア（ｏｌｉｇｕｒｅａ）およびペプトイド−ペプチドハイブリッド（Ｈａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３５４８−３５５３（１９９７））誘導体の調製は、以前に報告されているが、これらの細胞取り込みは、明白には研究されなかった。
【０２１９】
所望のペプトイドを、ペプトイドに対する「亜モノマー」アプローチ（Ｓｉｍｏｎら；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら）を使用して調製し、続いてアミノヘキサン酸スペーサーを介して、フルオレセイン部分をアミン末端に結合させた。固相樹脂からの切断の後に、このように得られた蛍光標識したポリアミンペプトイドを過剰のピラゾール−１−カルボキサミジン（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２４９７−２５０２（１９９２））および炭酸ナトリウムで処理することによって、良好な収率（６０〜７０％）でポリグアニジンペプトイドに転換した（図２５に示すように）。以前に報告された、単離されたＮ−Ａｒｇユニットを含むペプトイドの合成は、ペプトイド合成の前のＮ−Ａｒｇモノマーの合成（５〜７工程）および特殊化されかつ高価なグアニジン保護基（Ｐｍｃ、Ｐｂｆ）の使用に依存した（Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．４：１５７０−１５８０（１９９８）；Ｈｅｉｚｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．７：３２８−３３２（１９９４））。本明細書で報告される化合物は、過グアニジニル化工程を使用して調製される、ポリグアニジニル化ペプトイドの最初の例を提示する。この方法は、対応するポリアミンからのポリグアニジニル化化合物への容易なアクセスを提供し、そして過グアニジニル化ホモオリゴマーの合成について特に有用である。さらに、この方法は、高価な保護基（Ｐｂｆ、Ｐｍｃ）の使用を排除する。新規のトリフリル（ｔｒｉｆｌｙｌ）置換グアニル化剤を使用する、ペプチド基質の過グアニジニル化のさらなる例が、最近報告された（Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：８４３２−８４３９（１９９８））。
【０２２０】
蛍光標識されたポリグアニジンＮ−ａｒｇ５ペプトイド、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ７ペプトイド、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ９ペプトイドの細胞取り込みを、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＦＡＣＳ分析を使用して、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９（類似のタンパク分解性特性）と比較した。Ｎ−ａｒｇ５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒｇ９を含む細胞の内側で測定した蛍光の量は、ｒ５、ｒ７、ｒ９に関して見出される量に類似して、グアニジン残基の数に比例した：Ｎ−ａｒｇ９＞Ｎ−ａｒｇ７＞Ｎ−ａｒｇ５（図２６）。さらに、Ｎ−ａｒｇ５ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ７ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ９ペプトイドは、対応するペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９と比較して、わずかに低い量の細胞侵入のみを示した。これらの結果は、Ｔａｔ４９−５７またはアルギニンオリゴマーのペプチド骨格に沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要とされる構造的エレメントではなく、そしてオリゴマーのグアニジン置換ペプトイドが、アルギニンリッチなペプチドの代わりに、分子輸送体として利用され得ることを実証する。アジ化ナトリウムの添加は、内在化を阻害し、このことは、ペプトイドの細胞取り込みもまたエネルギー依存性であることを示した。
【０２２１】
（実施例７）
（細胞取り込みに対する側鎖長の効果）
Ｎ−ａｒｇペプトイドが効果的に細胞膜を横切ることを確立した後に、細胞取り込みにおける側鎖長（メチレンの数）の効果を研究した。所定の数のグアニジン残基（５、７、９）については、細胞取り込みは、側鎖長に比例した。より長い側鎖を有するペプトイドは、より効率的な細胞取り込みを示した。グアニジンヘッド基と骨格との間にメチレンが６つのスペーサーを有する９マーペプトイドアナログ（Ｎ−ｈｘｇ９）は、対応するｄ−アルギニンオリゴマー（ｒ９）よりも顕著により高い細胞取り込みを示した。取り込みの相対的順序は、Ｎ−ｈｘｇ９（６メチレン）＞Ｎ−ｂｔｇ９（４メチレン）＞ｒ９（３メチレン）＞Ｎ−ａｒｇ９（３メチレン）＞Ｎ−ｅｔｇ９（２メチレン）であった（図２７）。注記として、Ｎ−ｈｘｇペプトイドは、対応するｄ−アルギニンオリゴマーよりさらに大きな、顕著に高い細胞取り込みを示した。対応するヘプタマーおよびペンタマーの細胞取り込みもまた、同じ相対的傾向を示した。Ｎ−ｈｘｇペプトイドに含まれる側鎖がより長いほど、内在化の量がさらに１つ多いグアニジン残基を含む対応するｄ−アルギニンオリゴマーに匹敵するような程度まで、細胞取り込みが改善された（図２８）。例えば、Ｎ−ｈｘｇ７ペプトイドは、ｒ８に匹敵する細胞取り込みを示した。
【０２２２】
細胞取り込みの増加が、増加した側鎖の長さに起因したのか、またはそれらの疎水性の性質に起因したのかを確認するために、シクロヘキシル側鎖を含むペプトイドのセットを合成した。これらを、Ｎ−ｃｈｇ５ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ７ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ９ペプトイドと呼ぶ。これらは、Ｎ−ｈｘｇペプトイドと同じ数の側鎖炭素を含むが、異なる程度の自由度を有する。興味深いことに、Ｎ−ｃｈｇペプトイドは、以前にアッセイされたペプトイド（Ｎ−ｅｔｇペプトイドを含む）の全てよりも、ずっと低い細胞取り込み活性を示した（図２９）。従って、直鎖アルキルスペーサー基（ｓｐａｃｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）の、配座の可撓性および立体的に妨害されない性質が、効率的な細胞取り込みのために重要である。
【０２２３】
（考察）
ノナペプチドＴａｔ４９−５７は、以前に、原形質膜を介して効率的に転座することが示された。この研究の目的は、この効果のための構造的基礎を決定すること、およびこの情報を使用してより単純かつより効果的な分子輸送体を開発することであった。この目的のために、フルオレセイン標識に結合体化した、Ｔａｔ４９−５７の短縮型誘導体およびアラニン置換誘導体を調製した。これらの誘導体は、Ｔａｔ４９−５７と比較して非常に減少した細胞取り込みを示し、このことは、Ｔａｔ４９−５７のカチオン性残基の全てが、効率的な細胞取り込みのために必要とされることを示す。カチオン性オリゴマーの短いオリゴマーについての本発明者らの以前の研究と比較した場合に、これらの知見は、アルギニンのオリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７より優れており、そして確かにより容易かつ費用効率的に調製され得ることを示唆した。短いアルギニンオリゴマーとＴａｔ４９−５７との比較は、前者のメンバーが、実際に、より効率的に細胞に取り込まれることを示した。これは、初めて、ミカエリス−メンテンの速度論分析によって、さらに定量され、この分析は、Ｒ９およびｒ９オリゴマーが、Ｔａｔ４９−５７について見出される値より３０倍および１００倍高いＫｍ値を有することを示した。
【０２２４】
本発明者らのペプチドの研究において明らかとなった、グアニジノヘッド基の重要性およびオリゴマーキラリティーの明らかな不感受性を考慮して、本発明者らは、新規な一連のポリグアニジンペプトイドを設計し、そして合成した。アルギニン側鎖を組み込むペプトイドであるＮ−ａｒｇ５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒｇ９は、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９に匹敵する細胞取り込みを示した。このことは、ペプチド骨格に沿った水素結合および骨格キラリティーが、細胞取り込みのために必須ではないことを示す。この観察は、これらのペプトイド、アルギニンオリゴマー、およびＴａｔ４９−５７（これらは全て、深く埋め込まれた骨格およびグアニジニウム優性表面を有する）の分子モデルと一致する。分子モデルは、これらの構造的特性が、ペプトイド骨格とグアニジノヘッド基との間に異なるアルキルスペーサーを有するオリゴマーにおいて、様々な程度で保持されることを、さらに明らかにする。従って、骨格と側鎖との間に２−（Ｎ−ｅｔｇ）、４−（Ｎ−ｂｔｇ）、および６−原子（Ｎ−ｈｘｇ）のスペーサーを組み込む一連のペプトイドを調製し、そして細胞取り込みについて、Ｎ−ａｒｇペプトイド（３原子スペーサー）およびｄ−アルギニンオリゴマーと比較した。側鎖の長さは、細胞侵入に対して、劇的な影響を有した。細胞取り込みの量は、Ｎ−ｈｘｇ＞Ｎ−ｂｔｇ＞Ｎ−ａｒｇ＞Ｎ−ｅｔｇの順で、側鎖の長さに比例した。細胞取り込みは、グアニジンヘッド基と骨格との間のアルキルスペーサーユニットの数が増加する場合に、改善された。重要なことに、Ｎ−ｈｘｇ９は、ｒ９より優れており、後者は、Ｔａｔ４９−５７より１００倍良好であった。この結果により、本発明者らは、グアニジノ基と骨格との間により長いオクチルスペーサー（Ｎ−ｏｃｇ）を含むペプトイド誘導体を調製した。溶解度に関する問題点に起因して、本発明者らは、これらの化合物を試験しなかった。
【０２２５】
過グアニジニル化ペプチドと過グアニジニル化ペプトイドとの両方が、効率的に細胞に侵入するので、グアニジンヘッド基（骨格とは独立している）は、明らかに、細胞取り込みの重大な構造的決定因子である。しかし、いくつか（６より大）のグアニジン部分が分子の足場に存在することは、細胞内への能動的な移送のためには十分ではない。なぜなら、Ｎ−ｃｈｇペプトイドは、細胞内に効率的に転座しなかったからである。従って、グアニジンヘッド基の重要性に加えて、細胞取り込みのために重要な構造／配座要件が存在する。
【０２２６】
要約すると、この研究は、Ｔａｔ４９−５７が細胞に侵入する能力に影響を与える、一連の構造的特徴（配列の長さ、アミノ酸組成、およびキラリティーを含む）を同定した。これらの特徴は、一連の新規ペプトイドの設計のための設計図を提供し、これらのうちの１７のメンバーを合成し、そして細胞取り込みに関してアッセイした。重要なことには、Ｎ−ｈｘｇ９輸送体は、細胞取り込みが、ｒ９より優れており、これは、Ｎ−ｂｔｇ９に匹敵することが見出された。従って、これらのペプトイド輸送体は、Ｔａｔ４９−５７より実質的に良好であることが示された。この研究は、ペプチド骨格およびその骨格に沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要ではないこと、グアニジノヘッド基が、他のカチオン性サブユニットより優れていること、ならびに最も重要なことには、骨格とヘッド基との間のアルキル鎖の伸長が、優れた輸送体を提供することを、確認した。より良好な取り込み性能に加えて、これらの新規ペプトイドは、Ｔａｔ４９−５７より優れたいくつかの利点（費用効果、アナログの合成の容易さ、およびプロテアーゼ安定性を含む）を与える。これらの特性は、それらの有意な水溶性（＞１００ｍｇ／ｍＬ）とともに、これらの新規ペプトイドが、薬物、薬物候補および他の薬剤の、細胞内への分子送達のための効果的な輸送体として働き得ることを示す。
【０２２７】
（実施例８）
（イトラコナゾール−輸送体結合体の合成）
本実施例は、送達増強輸送体をトリアゾール構造を含む化合物へ結合するための、一般的なストラテジーの１つの適用を提供する。一例として、アルギニン（ｒ７）送達増強輸送体へのイトラコナゾールの結合を使用する、このスキームを、図３０中に示す。本スキームにおいて、ＲはＨまたはアルキルであり、ｎは１または２であり、そして、Ｘはハロゲンである。
【０２２８】
この反応は、トリアゾール環中の窒素の４級化を利用してハロゲン（例えば、Ｂｒ、Ｆｌ、Ｉ）またはメチルエステルを有するアシル基に結合させることに関する。化合物３は、ＨＰＬＣによって単離された。Ｄ２Ｏ中のプロトンＮＭＲは、イトラコナゾールおよび輸送体のピークを示した。
【０２２９】
メチルエステルは、７０％よりも高い収率を提供したが、Ｂｒ−プロピオン酸／エステル対を使用して取得した収率は、４０％〜５０％であった。次いで、アシル誘導体を、送達増強輸送体のアミンと反応させ、結合体を形成した。あるいは、ハロゲン化アシル基を、アミド結合を介して、輸送体分子にまず結合させ得、その後、薬物化合物との反応を実施する。
【０２３０】
（実施例９）
（ＦＫ５０６結合体の調製）
本実施例は、ＦＫ５０６が送達増強輸送体に結合される結合体の調製を記載する。２つの異なるリンカーを使用し、これらの各々は、生理学的ｐＨ（ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５）でＦＫ５０６を放出したが、より酸性のｐＨでは、より長い半減期を有した。これらのスキームを、図３１Ａおよび図３１Ｂ中に図示する。
【０２３１】
（リンカー１：６−マレイミドカプロン酸ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔａｔｅ）（スキームＩおよびＩＩ））
無水メタノール（５ｍＬ）中のＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、６−マレイミドカプロン酸ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩（２）（０．１２６ｇ、３７３．２μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒的、１μＬ）の溶液を、室温で３６時間撹拌した。この反応を薄層クロマトグラフィーによって測定し、開始物質のほぼ完全な消失を示した［ＴＬＣ溶媒系−ジクロロメタン（９５）：メタノール（５）、Ｒｆ＝０．３］。この反応混合物を濃縮乾固させ、そして、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に溶解した。有機層を水および１０％の重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。残渣を、ジクロロメタン（９６）：メタノール（４）を溶出剤として使用するカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヒドラゾン３（０．１１６ｇ、９２％）を得た。
【０２３２】
無水ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中の上記のヒドラゾン（３）（０．０２５ｇ、２４．７μｍｏｌ）、輸送体（１×、Ｂａｃａｒ９ＣＣＯＮＨ２．９ＴＦＡ、Ｂａｃａｒ７ＣＣＯＮＨ２．７ＴＦＡ、ＢａｃａＣＣＯＮＨ２、ＮＨ２ｒ７ＣＣＯＮＨ２．８ＴＦＡ、ＮＨ２Ｒ７ＣＣＯＮＨ２．８ＴＦＡ）およびジイソプロピルエチルアミン（１×）の溶液を、室温で３６時間（この時点で、ＴＬＣが開始ヒドラゾンの完全な消失を示した）、窒素下で撹拌した。溶媒を、この反応混合物からエバポレートし、そして、残渣を、トリフルオロ酢酸で緩衝化した水およびアセトニトリルを使用して、逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０２３３】
様々な輸送体を用いた結合体の収率：
【０２３４】
【化１２】
2004533414.tif 000015
全ての生成物の構造を、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＴＯＦ  ＭＳ分析によって確認した。
【０２３５】
（リンカー２：２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（スキームＩＩＩおよびＩＶ））
無水メタノール（５ｍＬ）中のＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（９）（０．０９１ｇ、３７３．２μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒的、１μＬ）の溶液を、室温で１６時間撹拌した。この反応を薄層クロマトグラフィーによって測定し、開始物質のほぼ完全な消失を示した。［ＴＬＣ溶媒系−酢酸エチルＲｆ＝０．５］。この反応混合物を濃縮乾固させ、そして、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に溶解した。有機層を、水および１０％の重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。残渣を、ジクロロメタン（９７）：メタノール（３）を溶出剤として使用するカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヒドラゾン１０を得た（０．０９１ｇ、７１％）。
【０２３６】
（実施例１０）
本実施例は、ｐＨ感受性連結基を使用して、輸送部分へのシクロスポリンの結合体化を説明する（図６Ａおよび図９Ｂを参照のこと）。
【０２３７】
本実施例において、シクロスポリンを、無水クロロ酢酸を使用して、そのα−クロロ酢酸エステルに転化し、６ｉを提供する（図６を参照のこと）。次いで、エステル６ｉを、ベンジルアミンで処理し、６ｉｉを提供する。Ｂｏｃ−保護イミノジ酢酸無水物とこのアミンの反応により、酸６ｉｉｉを提供し、これを次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化エステル（６ｉｖ）に転化する。Ｌ−アルギニンンヘプタマーと６ｉｖとのカップリングにより、ＢＯＣ−保護結合体６ｖを提供し、これを、確立された方法に従って、ＢＯＣ保護基の除去により、結合体６ｖｉに転化し得る。
【０２３８】
例えば、グリシン、ε−アミノカプロン酸、またはγ−アミノ酪酸により分離されたアルギニン基を有する輸送部分を、オリゴアルギニン輸送基を示す本実施例および以下の実施例において、アルギニンヘプタマーの代わりに使用し得る。
【０２３９】
（実施例１１）
本実施例は、アシクロビルの輸送部分への結合体化を説明する。
【０２４０】
（ａ．アシクロビルのｒ７ＣＯＮＨ２への結合体化）
本実施例は、連結基を介するアシクロビルのｒ７ＣＯＮＨ２への結合体化を説明する：
【０２４１】
【化１３】
2004533414.tif 000016
ｉ）アシクロビルα−クロロエステルの調製
【０２４２】
【化１４】
2004533414.tif 000017
ジメチルホルムアミド（９ｍＬ）中のアシクロビル（１００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（５．４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（２２６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレーションによって除去した。粗製の生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５％〜２５％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍＵＶ検出）により精製し、そして凍結乾燥した。この生成物を、白色粉末として得た（６２ｍｇ、４７％）。
【０２４３】
【化１５】
2004533414.tif 000018
ｉｉ）アシクロビルα−クロロエステルのＨ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２への結合体化
【０２４４】
【化１６】
2004533414.tif 000019
ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のアシクロビルα−クロロエステル（７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２（５０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（６．４μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレーションにより除去した。粗製の生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５％〜２５％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）により精製し、そして、凍結乾燥した。所望の生成物を、白色粉末として得た（２４ｍｇ、６９％）。
【０２４５】
【化１７】
2004533414.tif 000020
収率を、１．５モル当量ではなく、１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンを使用して、増加させ得た。生成物を、再度、白色粉末として得た（７９％）。
【０２４６】
【化１８】
2004533414.tif 000021
（ｂ．アシクロビルのｒ５−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２のビオチン含有誘導体への結合体化）
【０２４７】
【化１９】
2004533414.tif 000022
反応を、上記で説明したように、上記の実施例中で提供した合成技術を使用して、実施した。
【０２４８】
ｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ５−Ｃｙｓ（アシクロビル）−ＣＯＮＨ２を、白色粉末として得た（３６％）。
【０２４９】
【化２０】
2004533414.tif 000023
同様に、
ｉｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ７−Ｃ（アシクロビル）−ＣＯＮＨ２−を、白色粉末として得た（３３％）。ＴＯＦ−ＭＳ（ｍ／ｓ）：７２２．１［（Ｍ＋３  ＴＦＡ）／３］，６８４．６［（Ｍ＋２  ＴＦＡ）／３］，６０７．１［（Ｍ＋Ｈ）／３］，４５５．５［（Ｍ＋Ｈ）／４］，３６４．８［（Ｍ＋Ｈ）／５］，３０４．３［（Ｍ＋Ｈ）／６］。
【０２５０】
（実施例１２）
本実施例は、ヒドロコルチゾンの輸送部分への結合体化を説明する。
【０２５１】
（ａ．ヒドロコルチゾンのｒ７ＣＯＮＨ２への結合体化）
ｉ）ヒドロコルチゾンα−クロロエステルの調製：
【０２５２】
【化２１】
2004533414.tif 000024
乾燥ＴＨＦ中のヒドロコルチゾン（５００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、スカンジウムトトリフレート（ｓｃａｎｄｉｕｍ  ｔｒｉｆｌａｔｅ）（４０８ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（７０８ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルアミノピリジン（５０６ｍｇ、４．１４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は、ジメチルアミノピリジンの添加の際に、山吹色に変化した。３０分後、溶媒をエバポレートし、そして、粗製の物質を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解した。酢酸エチル層を、１．０ＮのＨＣｌおよびブラインで洗浄した。有機相を回収し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、そして、エバポレートし、白色固体として生成物を得た（５３３ｍｇ、８８％）。
【０２５３】
【化２２】
2004533414.tif 000025
ｉｉ）Ｒ’ＮＨ−Ｃｙｓ−ｒ７−ＣＯＮＨ２へのカップリング
【０２５４】
【化２３】
2004533414.tif 000026
ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のヒドロコルチゾンα−クロロエステル（３１ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ７−ＣＯＮＨ２（１５０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１５μＬ、０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドをエバポレートした。粗製の生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｃ−１８カラム、０．１％のトリフルオロ酢酸を用いた５％〜３０％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍ  ＵＶ検出）によって精製し、凍結乾燥した。所望の生成物を、白色粉末として得た（２５ｍｇ、１４％）。
【０２５５】
【化２４】
2004533414.tif 000027
１．２モル当量ではなく、１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンの等価物を使用して、所望の生成物を黄色粉末として得た（５２％の収率）。
【０２５６】
【化２５】
2004533414.tif 000028
（ｂ．ヒドロコルチゾンのｒ５−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２のビオチン含有誘導体への結合体化）
【０２５７】
【化２６】
2004533414.tif 000029
反応を、上記で説明したように、上記の実施例中で提供された合成技術を使用して、実施した。
【０２５８】
ｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ５−Ｃ（ヒドロコルチゾン）−ＣＯＮＨ２−  １．２モル当量ではなく、１０モル当量のジイソプロピルエチルアミンの等価物を使用した。白色粉末を生成した（６５％）。
【０２５９】
【化２７】
2004533414.tif 000030
ｉｉ）ビオチン−アミノカプロン酸−ｒ７−Ｃ（ヒドロコルチゾン）−ＣＯＮＨ２−１．２Ｍ等価物ではなく、１０Ｍのジイソプロピルエチルアミンの等価物を使用した。白色粉末を生成した（３６％）。
【０２６０】
【化２８】
2004533414.tif 000031
（実施例１３）
本実施例は、タキソールの輸送部分への結合体化を説明する。
【０２６１】
（ａ．タキソールのｒ７−ＣＯＮＨ２への結合体化）
本実施例は、タキソール結合体の調製についての、上記で説明された方法の適用を説明する（図１２を参照のこと）。
【０２６２】
ｉ）タキソールα−クロロ酢酸エステルの調製
【０２６３】
【化２９】
2004533414.tif 000032
タキソールを、α−無水クロロ酢酸で処理して、本質的に定量的な収率で、Ｃ−２’クロロアセチル誘導体１２ｉを得た。
【０２６４】
ｉｉ）タキソール結合体の形成
【０２６５】
【化３０】
2004533414.tif 000033
クロロ酢酸エステルのハロゲン原子を、Ｎ末端（Ｌ）システインを含むアルギニンのヘプタマーのチオールによって置換した。インビボでのプロテアーゼによる輸送体要素の分解を回避するために、Ｄ−アルギニンを基礎単位として使用した。結合体化反応を、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、室温、ＤＭＦ中で実施した。最終生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって単離し、そして、白色粉末まで凍結乾燥した。ネイティブ結合体（Ｒ＝Ｈ）を、システイン第１級アミンにおけるそのＴＦＡ塩として単離することを記述することは、重要である。この結合体は、一般に、非常に吸湿性であり、そして、容易に水中に溶解される。
【０２６６】
Ｒ＝Ｈであるこの結合体は、Ｃ２’エステルカルボニル上へのＮ末端窒素の求核攻撃を介して、親薬物を放出するように設計されたものである。この窒素のプロトン付加状態は、この機構に重要である。なぜならば、遊離アミンのみが、この放出をし得るからである。さらに、両方の結合体は、それらを単純なエステル加水分解を受けやすくする共通のα−ヘテロ原子で置換されたアセテート部分を共有する。これは、さらなる放出経路を提供する。
【０２６７】
（実施例１４）
本実施例は、活性剤を輸送部分に連結する２つの方法を説明する。説明を、ポリ−Ｄ−Ａｒｇ誘導体に連結されたレチン酸誘導体について提供するが、他の生物学的薬剤と本発明の輸送部分との間の結合に適用し得る。
【０２６８】
（ａ．アルデヒド官能基を有する生物学的薬剤間の結合）
本実施例は、Ｄ−アルギニン（Ｈ２Ｎ−ｒ９−ＣＯ２Ｈ・１０ＴＦＡ）の九量体と、オールｔｒａｎｓ−レチナールかまたは１３−ｃｉｓ−レチナールのいずれかとの間の結合体の調製を説明する。図３３では、この反応の概略の提示を提供する。図３３中に見られるように、４Åモレキュラーシーブの存在下で、室温で４時間の、ＭｅＯＨ中のＨ２Ｎ−ｒ９−ＣＯ２Ｈ・１０ＴＦＡと、いずれかとのレチナールとの縮合は、レチナールアルデヒドとアミノ末端基との間に、Ｓｃｈｉｆｆ塩基型結合の形成を生じる。結合体の精製を、モレキュラーシーブをろ過すること、および減圧下でメタノールを除去することによって達成し得る。
【０２６９】
（ｂ．レチン酸のｒ７−ＣＯＮＨ２への結合体化）
本実施例は、連結基を使用する、レチン酸とｒ７−ＣＯＮＨ２との間の結合体の調製を説明する。
【０２７０】
【化３１】
2004533414.tif 000034
ここで、結合体の調製は、図３４中に説明されたスキームに従う。このスキームにおいて、レチン酸（３４ｉｉ）を、最初に、４−ヒドロキシメチル−２，６−ジメチルフェノール（３４ｉ）のクロロ酢酸エステルと組合わせ、３４ｉｉｉとして示す結合体を得る。ジシクロへキシルカルボジイミドおよび触媒量の４−ジメチルアミノピリジンの存在下で、３４ｉとレチン酸とを塩化メチレン中で合せることで、レチノイド誘導体３４ｉｉｉを５２％〜５７％の収率で得た。ジイソプロピルエチルアミンの存在下での、Ｈ２ＮＣｙｓ−ｒ７ＣＯＮＨ２・８ＴＦＡとの３４ｉｉｉの縮合（ＤＭＦ、室温、２時間）により、所望の結合体化生成物３４ｉｖを得る。
【０２７１】
（実施例１５）
（Ｄ−アルギニンのビオチン化５量体、７量体、および９量体に結合されたシクロスポリンの合成）
（方法）
（Ａ．送達増強輸送体へのシクロスポリンの連結）
（１．α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製）
α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体を、図１に示されるように調製した。シクロスポリンＡ（１５２．７ｍｇ、１２７μｍｏｌ）およびクロロ酢酸無水物（２２１．７ｍｇ；１３００μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で乾燥フラスコ中に配置した。ピリジン（１．０ｍＬ）を、添加し、そしてこの溶液を５０℃（油浴）まで加熱した。１６時間後、この反応系を、室温まで冷却して、水（４．０ｍＬ）でクエンチした。得られた懸濁液を、ジエチルエーテル（Σ１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、ＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下での溶媒の濾過およびエバポレーションは、黄色オイルを与え、これを、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：４０％〜８０％）によって精製し、１３６ｍｇ（１０６．４μｍｏｌ、８３％）の所望の生成物を得た。
【０２７２】
（２．輸送体分子へのカップリング）
システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体へのカップリングについての一般的手順を図２に示す。
【０２７３】
（ａ．標識ペプチド）
シクロスポリンＡ誘導体および標識ペプチド（１当量）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦ（約１０ｍｍｏｌのシクロスポリンＡ誘導体／１ｍＬ  ＤＭＦ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を添加し、そして室温での攪拌を、全ての出発物質が消費されるまで（通常１６時間後）続けた（図３）。溶媒を真空で除去し、そして粗製反応生成物を水に溶解し、そして逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）により精製した。生成物を以下の収率で得た
【０２７４】
【化３２】
2004533414.tif 000035
（ｂ．非標識ペプチド）
ペプチド（３４．７ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）およびシクロスポリンＡ誘導体（１９．６ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した（図４）。ジイソプロピルエチルアミン（１９．７ｍｇ、１５３μｍｏｌ）を添加し、そして室温での攪拌を続けた。１２時間後、溶媒を真空で除去した。粗製物質を水に溶解し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）で精製し、純粋な生成物（２４．１ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ、４４％）を得た。
【０２７５】
（実施例１６）
（Ｄ−アルギニンのビオチン化５量体、７量体、および９量体に結合されたヒドロコルチゾンの調製）
（方法）
（Ａ．送達増強輸送体へのヒドロコルチゾンの連結）
工程１−無水クロロ酢酸を用いたヒドロコルチゾンのアシル化
ヒドロコルチゾン（２００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（１１３ｍｇ、０，６６ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液を、室温で２時間攪拌した（図１０）。溶媒を留去し、そして粗生成物を、溶離液として５０％ヘキサン／酢酸エチルを使用してシリカでクロマトグラフした。白色固体として生成物（１３９ｍｇ、５８％）を単離した。
【０２７６】
（工程２−輸送体への連結）
ヒドロコルチゾンのクロロ酢酸エステル（０．０１３７ｍｍｏｌ）、システイン残基を含む輸送体（０．０１３７）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．０２７４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）溶液を、１８時間室温で撹拌した（図１１）。この物質を水／アセトニトリル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して白色粉末を得た。
【０２７７】
ｒ５結合体−１２ｍｇ獲得（２９％単離収率）
ｒ７結合体−２２ｍｇ獲得（５５％単離収率）
Ｒ７結合体−１３ｍｇ獲得（３３％単離収率）
（実施例１７）
（Ｄ−アルギニンのビオチン化５量体、７量体、および９量体に結合体化したタキソールのヌードマウスの皮膚への浸透）
（方法）
（１．Ｃ−２’活性化タキソール誘導体のビオチン標識ペプチドへの結合体化）
（Ｃ−２’誘導体の合成）
タキソール（４８．７ｍｇ、５７．１μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２（３．０ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却した。ベンジル−（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）（２００ｍｍｏｌ（２．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中）、ベンジル−（ｐ−ヒドロキシベンゾエート）およびジホスゲンから新しく調製した）のクロロホルメートのストック溶液を、０℃で添加し、そして、その温度での撹拌を５時間続け、その後、溶液を室温まで温めた（図１２）。撹拌をさらに１０時間続けた。溶媒を真空中で除去し、そして、粗物質を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３０％〜７０％）、所望のタキソールＣ−２’炭酸塩（３６．３ｍｇ、３２．８μｍｏｌ、５７．４％）を得た。
【０２７８】
（ビオチン標識ペプチドへのカップリング）
ビオチン化標識ペプチドへのカップリング手順を図１３に示す。タキソール誘導体およびビオチン標識ペプチド（１．２当量）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（約１０μｍｏｌ／ｍＬ  ＤＭＦ）中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＭＦ中１．２当量）およびＤＭＡＰ（ＤＭＦ中０．３当量）のストック溶液を添加し、そして、全出発物質が消費されるまで室温での撹拌を続けた。１６時間後、溶媒を真空下で除去した。粗反応物混合物を水に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、示される収率の結合体を得た：
Ｂ−ａｃａ−ｒ５−Ｋ−タキソール：３．６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、２０％。
【０２７９】
Ｂ−ａｃａ−ｒ７−Ｋ−タキソール：９．８ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ、４４％。
【０２８０】
Ｂ−ａｃａ−ｒ９−Ｋ−タキソール：１９．４ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ、６７％。
【０２８１】
（未標識Ｃ−２’カルバメート：）
タキソール誘導体（１２．４ｍｇ、１１．２μｍｏｌ）および未標識ペプチド（２７．１ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した（図１４）。ジイソプロピルエチルアミン（１．７ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）をＤＭＦ中のストック溶液として添加して、次いで、ＤＭＦ中のストック溶液としてＤＭＡＰ（０．６８ｍｇ、５．６μｍｏｌ）を添加した。室温での撹拌を、全ての出発物質が消費されるまで続けた。１６時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質を水中に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、所望の生成物を得た（１６．５ｍｇ、５．９μｍｏｌ、５３％）。
【０２８２】
（他のＣ−２’結合体）
タキソール誘導体（８．７ｍｇ、７．８５μｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、４．０ｍｇ）を添加し、反応フラスコをＨ２で５回パージした（図１５Ａ）。水素雰囲気下で撹拌を７時間続けた。Ｐｄ／Ｃをろ過し、そして、溶媒を真空下で除去した。この方法で獲得された粗物質（６．７ｍｇ、６．５８μｍｏｌ、８４％）は、純粋であって、次の工程でさらなる精製なしで使用した。
【０２８３】
遊離酸タキソール誘導体（１８．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）に溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．３ｍｇ、２１．３μｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（０．１ｍＬ）中のストック溶液として添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１ｍＬ）のストック溶液として添加した（図１５Ｂ）。室温での撹拌を１４時間続けた。この溶媒を真空下で除去し、そして得られた粗物質をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４０％〜８０％）、所望の生成物を得た（１３．６ｍｇ、１２．２μｍｏｌ、６９％）。
【０２８４】
活性化タキソール誘導体（１４．０ｍｇ、１２．６μｍｏｌ）およびペプチド（３０．６ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下で、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解した（図１５Ｃ）。ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のストック溶液として、ジイソプロピルエチルアミン（１．９４ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を添加して、次いで、０．１ｍＬのＤＭＦ中のストック溶液としてＤＭＡＰ（０．７６ｍｇ、６．３μｍｏｌ）を添加した。室温での撹拌を、全ての出発物質が消費されるまで続けた。２０時間後、溶媒を真空下で除去した。粗物質を水に溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶離液：水／ＭｅＣＮ＊ＴＦＡ）、１：６の比率（それぞれ、カーボネート対カルバメート）で２種類の示されるタキソール結合体を得た。
【０２８５】
（実施例１８）
この実施例は、輸送部分に、アシクロビルのような活性薬剤を連結する方法を説明する。図３５を参照のこと。
【０２８６】
アシクロビル（１当量）を、窒素雰囲気下で、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。無水クロロ酢酸（１当量）、ピリジン（１当量）およびＤＭＡＰ（０．２５当量）を、撹拌しながら反応系に引き続き添加した。この反応系を、室温にてさらに４時間撹拌させた。この反応系を、減圧下、溶媒の除去によって停止した。この残渣を、塩化メチレン中に溶解し、そして飽和塩化アンモニウム水溶液、続いて飽和重炭酸アンモニウムおよびブラインで洗浄した。有機層を、真空中で濃縮し、そして残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、アシクロビルクロロアセチルエステルを得た。
【０２８７】
得られたクロロアセチルエステルを、窒素雰囲気下で、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、Ｈｕｎｉｇ塩基（１当量）およびＡｃＨＮ−Ｃ−ａｃａ−Ｒ８−ＣＯＮＨ２＊８ＨＣｌを、急速に撹拌しながら添加した。この反応系を、ＴＬＣ分析により、全ての開始物質が消費されることが同定されるまで続けた（約２時間）。この反応系を、減圧下、溶媒の除去によって停止した。この残渣を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、所望のアシクロビル結合体を得た。
【０２８８】
（実施例１９）
この実施例は、輸送部分に、アシクロビルのような活性薬剤を連結する方法を説明する。図３６を参照のこと。
【０２８９】
ジスホスゲン（０．５当量）を、乾燥塩化メチレン中に溶解し、そして１０℃まで冷却した。この溶液に、塩化メチレン溶液としてトリエチルアミン（１当量）を添加した。この混合物を、１５分間撹拌し、この時点でアシクロビルを塩化メチレン溶液としてこの反応系に添加した。この反応系を、室温にてさらに４時間、撹拌した。この反応系を、飽和塩化アンモニウム水溶液でクエンチし、続いて飽和重炭酸アンモニウムおよびブラインで洗浄した。有機層を、真空中で濃縮し、そして残渣をシリカゲルでの急速濾過によって精製し、アシクロビルクロロホルメートを得た。
【０２９０】
このクロロホルメートを、窒素雰囲気下で、乾燥塩化メチレンに溶解した。メルカプトエタノール（１当量）を、乾燥塩化メチレン溶液として、反応系に添加した。この反応系を、窒素雰囲気下で１０時間撹拌した。この溶液を、減圧下で濃縮し、高真空下に２４時間配置し、残りのメルカプトエタノールを除去した。この得られたメルカプトエチルカーボネートを、さらに精製せずに使用した。
【０２９１】
このカーボネート（１当量）を、ＤＭＦ／水に溶解した。この溶液に、活性化ペプチドＮＰＹｓ−ＣＲ＊−ＣＯＮＨ２＊８ＨＣｌ（１当量）を、急速に撹拌しながら添加した。淡黄色が即時に発生し、そしてこの反応系を室温にてさらに５時間撹拌した。この反応物を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって直接的に精製し、所望のアシクロビル結合体を得た。
【０２９２】
（実施例２０）
この実施例は、輸送部分に、コルチコイドステロイドのような活性薬剤を連結する方法を説明する。図３７を参照のこと。
【０２９３】
プレドニゾロンα−クロロエステル  乾燥ＴＨＦ中のプレドニゾロン（１．３８ｍｍｏｌ）、スカンジウムトリフレート（０．８３ｍｍｏｌ）および無水クロロ酢酸（４．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルアミノピリジン（４．１４ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液は、ジメチルアミノピリジンの添加で淡黄色に変化した。３０分後、この溶媒をエバポレートし、そして粗物質を酢酸エチル（１００ｍＬ）へと取り上げた。この酢酸エチル層を、１．０Ｎ  ＨＣｌおよびブラインで洗浄した。この有機相を回収し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そしてエバポレートし白色固体として生成物を得た。
【０２９４】
Ｈ２Ｎ−Ｃ（プレドニゾロン）−ｒ８ＣＯＮＨ２：  ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）中のプレドニゾロンα−クロロエステル（１当量）、Ｈ２Ｎ−Ｃ−ｒ８−ＣＯＮＨ２（１当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１．２当量）の溶液を、１８時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを、エバポレートした。この粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（２２ｍｍ×２５０ｍｍＣ−１８カラム、５〜１０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配（０．１％トリフルオロ酢酸含有）、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍのＵＶ検出）によって精製し、そして凍結乾燥し、９ＴＦＡ塩を得た。次いで、この物質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、プレドロニゾン結合体（９  ＨＣｌ塩）を黄褐色固体として得た。
【０２９５】
本明細書中に記載される実施例および実施形態が、例示的目的に過ぎず、これに鑑みて、様々な改変または変更が当業者に示唆され、そして本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および権利範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１】図１は、α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製のための反応スキームを示す。
【図２】図２は、システイン含有ペプチドの、α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体へのカップリングのための一般的手順を示す。
【図３】図３は、シクロスポリンＡ誘導体の、ビオチン標識ペプチドへのカップリングのための反応スキームを示す。
【図４】図４は、シクロスポリンＡ誘導体の、未標識ペプチドへのカップリングのための反応スキームを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ａは、ジスルフィド結合の例を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｂは、電磁照射に曝露した際に切断される、光切断可能なリンカーを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｃは、切断可能リンカーとして用いられる改変リシル残基を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｄは、送達増強輸送体Ｔが、抗癌剤であるパクリタキセルの２’−酸素へと連結されている結合体を示す。連結部分は、（ｉ）送達増強輸送体に結合した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対してパラ位に存在するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対してメタの、カルボキシルメチル基（これは、カルボン酸エステル結合によってパクリタキセルの２’−酸素に連結されている）を含む。
【図５Ｅ】図５Ｅは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｅは、アミノアルキルカルボン酸による、生物学的に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）への送達増強輸送体の連結である；リンカーアミノ基は、アミド結合によって送達増強輸送体へと連結されており、そしてエステル結合によってパクリタキセル部分へと連結されている。
【図５Ｆ】図５Ｆは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｆは、パクリタキセルおよび「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝ＢＯＣ）に関する化学構造および構成要素骨格原子の従来の番号付けを示す。
【図５Ｇ】図５Ｇは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。図５Ｇは、パクリタキセルおよび「ＴＡＸＯＴＥＲＥＴＭ」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝ＢＯＣ）に関する化学構造および構成要素骨格原子の従来の番号付けを示す。図５Ｇは、タキソイド（ｔａｘｏｉｄ）化合物に関する一般的化学構造および環原子番号付けを示す。
【図５Ｈ】図５Ｈは、送達増強輸送体を生物学的に活性な薬剤または目的の他の分子へと連結するために用いられ得る種々の型の切断可能リンカーを示す。
【図６】図６は、Ｌ−アルギニンのへプタマーとシクロスポリンＡとの間の化学結合体に関する合成スキーム（パネルＡ）およびそのｐＨ依存性化学物質遊離（パネルＢ）を提示する。α−クロロエステル（６ｉ）を、ヨウ化ナトリウムの存在下でベンジルアミンで処理して置換をもたらして、二級アミン（６ｉｉ）を得た。アミン（６ｉｉ）を無水物（６）で処理し、そして得られる粗製の酸（６ｉｉｉ）を、その対応するＮＨＳエステル（６ｉｖ）へと変換した。次いで、エステル（６ｉｖ）を、ヘプタ−Ｌ−アルギニンのアミノ末端とカップリングさせて、Ｎ−Ｂｏｃ保護ＣｓＡ結合体（６ｖ）を得た。最後に、ギ酸でのＢｏｃ保護基の除去によって、ＨＰＬＣ精製後、結合体（６ｖｉ）をそのオクタトリフルオロ酢酸塩として提供した。
【図７】図７は、遊離可能なＲ７  ＣｓＡによる、マウスの接触性皮膚炎における炎症の阻害を提示する。Ｂａｌｂ／ｃ（６〜７週）マウスの腹部に、アセトンオリーブオイル（９５：５）中の０．７％  ＤＮＦＢ（１００μｌ）を塗布した。３日後、この動物の両方の耳を、アセトン中の０．５％  ＤＮＦＢで再刺激した。マウスを、再刺激の１時間後、５時間後および２０時間後に、ビヒクル単独、１％  Ｒ７ペプチド単独、１％  ＣｓＡ、１％非遊離可能Ｒ７  ＣｓＡ、０．０１％／０．１％／１．０％遊離可能Ｒ７  ＣｓＡ、およびフッ化ステロイドポジティブコントロールである０．１％トリアムシノロンアセトニドのいずれかで処置した。耳の炎症を、再刺激の２４時間後に、バネ付きカリパスを用いて測定した。炎症低減パーセントを、以下の式を用いて算出した：（ｔ−ｎ）／（ｕ−ｎ）（ここで、ｔ＝処置した耳の厚さ、ｎ＝正常な未処置耳の厚さ、そしてｕ＝何の処置もしない、炎症した耳の厚さ）。Ｎ＝各群において２０動物。
【図８】図８は、銅−ジエチレントリアミン五酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製のための手順を示す。
【図９】図９は、アミノカプロン酸を介してＣｕ−ＤＴＰＡを輸送体へと連結するための手順を示す。
【図１０】図１０は、クロロ酢酸無水物でのヒドロコルチゾンのアシル化のための反応を示す。
【図１１】図１１は、アシル化ヒドロコルチゾンを輸送体へと連結するための反応を示す。
【図１２】図１２は、タキソールのＣ−２’誘導体の調製のための反応を示す。
【図１３】図１３は、タキソール誘導体の、ビオチン標識ペプチドへのカップリングのための反応の模式図を示す。
【図１４】図１４は、未標識ペプチドの、タキソールのＣ−２’誘導体へのカップリングのための反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反応スキームを示す。
【図１６】図１６は、薬物または他の生物学的薬剤がｐＨ遊離可能リンカーによって送達増強輸送体へと連結している結合体の合成のための一般的ストラテジーを示す。
【図１７】図１７は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体を合成するためのプロトコルの模式図を示す。
【図１８】図１８は、タキソールの２’−クロロアセチル誘導体がアルギニンへプタマー送達増強輸送体へと連結されるストラテジーを示す。
【図１９】図１９は、図１８に図示される反応条件を用いて作製され得る３つのさらなるタキソール−ｒ７結合体を示す。
【図２０】図２０は、タキソールおよび２つの異なるリンカーを用いた３日ＭＴＴ細胞傷害性アッセイの結果を示す。
【図２１】図２１は、Ｔａｔ４９−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）：Ｔａｔ４９−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ）、Ｔａｔ４９−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ）、Ｔａｔ５Ｏ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ）およびＴａｔ５１−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ）という短縮型アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１５分間にわたってインキュベートした。
【図２２】図２２は、Ｔａｔ４９−５７のアラニン置換アナログ：Ａ−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＡＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ）、Ａ−５３（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ）、Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＡＲＲＲ）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＡＲＲ）、Ａ−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ）およびＡ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＡ）のＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で１２分間にわたってインキュベートした。
【図２３】図２３は、Ｔａｔ４９−５７のｄ−異性体およびレトロ−異性体（ｄ−Ｔａｔ４９−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｋｋｒｒｑｒｒｒ）、Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）およびｄ−Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ））のＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃にて１５分間にわたってインキュベートした。
【図２４】図２４は、一連のアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ４９−５７（Ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲ）、Ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒ）、ｒ６（ＦＩ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒ）、ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ））のＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で４分間にわたってインキュベートした。
【図２５】図２５は、グアニジン置換ペプトイドの調製を提示する。
【図２６】図２６は、ポリグアニジンペプトイドおよびｄ−アルギニンオリゴマーのＦＡＣＳ細胞取り込みを提示する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間にわたってインキュベートした。
【図２７】図２７は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびポリグアニジンペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを提示する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識ペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間にわたってインキュベートした。
【図２８】図２８は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｈｘｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを提示する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（６．３μＭを示す）の蛍光標識ペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間にわたってインキュベートした。
【図２９】図２９は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｃｈｇペプトイドのＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）の蛍光標識ペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間にわたってインキュベートした。
【図３０】図３０は、送達増強輸送体を、トリアゾール環構造を含む薬物へと結合するための一般的ストラテジーを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＦＫ５０６が送達増強輸送体へと結合している結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強輸送体へと結合している結合体を作製するための合成スキームを示す。
【図３２】図３２は、Ｎ末端システイン基を介した、アシクロビルの、ｒ７−アミドへの結合体化を図示する。ビオチン含有輸送体を用いた結合体化もまた示す。
【図３３】図３３は、レチナールとｒ９との間で形成された結合体を図示する（スペーシングアミノ酸なしで示す）。
【図３４】図３４は、レチン酸−ｒ９結合体を調製する際の切断可能リンカーの使用を図示する。
【図３５】図３５は、活性薬剤（例えば、アシクロビル）を輸送部分へと連結する方法を図示する。
【図３６】図３６は、活性薬剤（例えば、アシクロビル）を輸送部分へと連結する方法を図示する。
【図３７】図３７は、活性薬剤（例えば、コルチコイドステロイド）を輸送部分に連結する方法を図示する。
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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