(57)【要約】本発明は、痴呆の予防及び治療のための生薬組成物に関し、前記組成物は、最小限の量で抗痴呆効果を最大限に発揮するために、従来の生薬組成物において、人参（ginseng）の代わりに何首烏(Polygoni multiflori Radix: Polygonum multiflorum Thunberg)を含み、遠志(Polygalae Radix: Polygala tatarinowi Regal)、丁香(Caryophili Flos: Eugenie caryophyllata Thunberg)及び生姜(Zingibreis Rhizoma: Zingiber officinale Rosc.)をさらに含むことを特徴とする。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
何首烏１０〜５０重量％並びに茯苓５〜２０重量％、陳皮２〜２０重量％、甘草１〜５重量％、半夏１〜１０重量％及び生姜１〜１０重量％の中から選ばれた３種以上の成分を含むことを特徴とする、痴呆の予防及び治療のための生薬組成物。
【請求項２】
遠志１〜１０重量％、丁香１〜１０重量％、南星１〜１５重量％、天麻１〜１５重量％、石菖蒲１〜１０重量％、姜黄または鬱金１〜１５重量％、竹茹または竹葉１〜８重量％、白彊蠶または蚕粉末１〜８重量％、枳實または枳殻の実１〜８重量％、香附子２〜２０重量％及び木香１〜１０重量％の中から選ばれた１種以上の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の生薬組成物。
【請求項３】
何首烏１０〜５０重量％、天麻１〜１５重量％、石菖蒲１〜１０重量％、姜黄または鬱金１〜１５重量％、竹茹または竹葉１〜８重量％、蚕粉末１〜８重量％、枳實または枳殻の実１〜８重量％、茯苓５〜２０重量％、陳皮２〜２０重量％、甘草１〜５重量％及び生姜１〜１０重量％の混合物を従来の抽出方法により抽出することを特徴とする、請求項２に記載の生薬組成物。
【請求項４】
何首烏１０〜５０重量％、遠志１〜１０重量％、丁香１〜１０重量％、生姜１〜１０重量％、南星１〜１０重量％、天麻１〜１０重量％、石菖蒲１〜８重量％、鬱金１〜１０重量％、竹葉１〜８重量％、蚕粉末１〜８重量％、枳殻の実１〜８重量％、茯苓５〜２０重量％、半夏１〜１０重量％、陳皮１〜１０重量％及び甘草１〜５重量％の混合物を従来の抽出方法により抽出することを特徴とする、請求項１に記載の生薬組成物。
【請求項５】
前記組成物を、水またはアルコールを用いる従来の方法により抽出することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つの請求項に記載の生薬組成物。
【請求項６】
痴呆の予防及び治療に効果的な成分としての、請求項１乃至４のいずれか一つの請求項に記載の生薬組成物。
【請求項７】
前記組成物は、丸剤、抽出液剤、散剤、顆粒、浸剤、煎剤、錠剤、カプセル剤または注射剤等の様々な剤型として製剤されることを特徴とする、請求項６に記載の生薬組成物。
【請求項８】
痴呆の予防及び治療に効果的な成分としての、請求項１乃至４のいずれか一つの請求項に記載の栄養補助食品。
【請求項９】
前記組成物は、丸剤、抽出液剤、散剤、顆粒、浸剤、煎剤、錠剤、カプセル剤または注射剤等の様々な剤型として製剤されることを特徴とする、請求項８に記載の栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、痴呆の予防及び治療のための生薬組成物に関するものであって、前記生薬組成物は、従来の生薬組成物における主成分である人参（ginseng）の代りに主成分として何首烏（Polygoni multiflori Radix: Polygonum multiflorum, Thunberg）、及び従来の製品に比べて副作用が最小限に抑えられているだけでなく、薬理学的、臨床学的効能を著しく向上させ、痴呆、特に老年性痴呆に対して最大限の活性を提供するのに最適な量の他の成分を含む。
【背景技術】
【０００２】
最近、老人性痴呆を初めとして痴呆疾患による社会問題が大きく台頭されており、東・西洋に限らず、痴呆を治療できる医薬品や機能性食品を開発するために様々な研究が進行しているが、極めて限られた効能を奏するいくつかの治療剤があるだけで、治療効果のはっきりした名薬はまだ開発されていない。
【０００３】
一般に、アルツハイマー病(AD)を始めとした老人性痴呆は、漸進的な認知機能の消失を特徴とする疾患であって、これに対して生化学的、遺伝的、医学的な様々な研究が進行している。さらに具体的に言うと、現在まで把握されている痴呆症状は、認知機能及び知的能力の減少による各種機能障害並びに言語障害、判断力低下及び深刻な習得障害などを伴い、その後まもなく、性格変化、情緒的不安定などの症状が現れ、結局は死亡に至る。
【０００４】
痴呆は、様々な要因から誘導される脳の基本的な生理的機能障害と関連した特有の症状であって、多くの場合、大脳の柔組織の消失による肉眼的に全般的な脳萎縮と脳室の拡張を伴い、大脳皮質細胞、小脳のプルキンエ(Purkinje)細胞、脊椎の真核細胞が相当数消失されて大脳固有機能に深刻な障害を招来するが、これらの症状の原因はまだよく知られていない。しかし、それらは、神経伝達物質のアセチルコリン濃度減少と関連があると認識されている。
【０００５】
これまで知られている抗痴呆治療剤として、アメリカのコグネクス(Cognex)、日本のドネペジル(Done Pezyl)などが商品化されているが、これら薬品は、脳神経細胞系に作用するアセチルコリンエステラーゼ(AChE)酵素の活性抑制を通じて神経伝達物質であるアセチルコリンの濃度を増加させることにより痴呆を含むコリン作用性の機能障害を改善し、治療することが知られている。
【０００６】
しかし、このようなAChE抑制薬物は大部分、末梢神経のコリン性副作用があり、半減期が短すぎて、肝毒性などの深刻な副作用があり(参照：Br. J. Psychiatry, 138, 46, 1981)、特に、コグネクス(Cognex)の有効成分化合物は、9-アミノ-1,2,3,4-テトラヒドロアクリジン(THA)であって経口投与時、知覚能力の向上の所見を見せるが(参照：N. Engl. J. Med., 315, 1241, 1986)、震え症、めまい症、肝毒性など、深刻な副作用を伴っており、広く活用できない実情である。従って、アセチルコリン分解酵素の活性を抑制することにより神経細胞内のアセチルコリンの含量を増加させようとする従来の薬理学的戦略に加えて、アセチルコリン合成経路を活性化させることにより大脳神経細胞内のアセチルコリン含量を増加させようとすることは、痴呆の予防及び改善のためのもう一つの薬理学的戦略であると考えられる。
【０００７】
一方、このようなAChE抑制薬物の短所を発現しないAChEの活性を阻害する生薬として、人参を主成分として数種の生薬を混合抽出した製品が韓国特許公開第99-85202号と米国特許第6,010,702号に提案されている。
【０００８】
しかし、このような生薬混合抽出物の場合、老人性痴呆にある程度の薬効を示してはいるが、副作用など、まだ確実且つ安定的な効果を保障することはできなく、従来の他の痴呆治療剤とは作用機転が異なるものとして推測されているだけで、確実な処方であるとは認められない不完全な組成物である。特に、人参成分が主成分になっており、心疾患患者の場合は心悸抗進のような副作用を招来したり、或いは人体の機能的な恒常性不均衡を招来したりする虞がある。このように人参は、人の元気を回復するのに最高の薬剤として知られているが、副作用も同時に有しており、抗痴呆治療剤として使用するに不適であるということは、次のような副作用及び使用禁忌事項が報告されている資料からも明らかである。
【０００９】
即ち、人参は、神経過敏や神経衰弱を患う患者に対し症状を悪化させる虞があり、また高血圧、動脈硬化のような疾患の症状を悪化させる。そして、肺結核、喘息、咳嗽患者に人参を使用するべきではないという東洋医薬理論が知られており(本草求眞；キンスンウン、木と土、1999（Bonchogujin, Tree and Soil 1999）; Professional’s Handbook of Complementary and Alternative medicines; Charles W. Fetrow and Juan R. Avila, Springhouse, 1999)、最近ではその使用に疑いをもつ臨床報告がある。
【００１０】
また、臨床漢医学的側面からみると、このような生薬抽出物は比較的過多な量で投与されており、服用量(使用量)の過多による予期しない毒性と副作用が発生する虞があり、特に一部の臨床では、半夏に含有された成分の毒性がひどい副作用を招来すると報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように従来の痴呆治療用組成物の場合、その副作用が最も大きい問題となっており、特に、前記生薬抽出物の場合、他の薬物に比べて副作用はかなり少ないが、その治療効果や副作用について十分な臨床研究がなされていない。従って、したがって、さらに効果的な生薬抽出物を開発がいまだ強く要望されている。しかも、生薬抽出物を一般人へ痴呆症の予防と治療のための健康食品として提供するために、薬の容量や副作用を最小化することがさらに重要である。
【００１２】
このような状況下で、本発明者らは、前記米国特許第6,010,702号に登録されている痴呆治療のための生薬抽出物組成物を最初に開発し、さらに、いくつかの生薬を含む薬剤がいずれかの副作用を小さくする可能性があり、AChEの阻害作用を有するという判断の下で、AChEの作用を阻害して上記の副作用が少ない新規生薬剤を開発するために徹底的な研究をした。いくつかの補助的な生薬を、AChEの阻害作用を有する前記従来の生薬抽出物に追加した組成物においてその有効性のスクリーニング及び毒性試験を繰り返した結果、本発明の生薬抽出物は、血液循環の障害を改善して神経細胞におけるグルコース代謝を促進することにより痴呆の予防及び治療に優れた効果があることを確認して本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明は、人参を主成分とする従来とは異なる漢薬材混合抽出物、即ち、何首烏（Polygoni multiflori Radix: Polygonum multiflorum, Thunberg）を主成分とする新しい組成の混合抽出物からなっており、副作用と毒性がほとんどなく、従来に比べ薬理学的作用及び臨床的効能が大いに改善されて、優れた痴呆予防及び治療効能を奏する組成物を提供することにその目的がある。
【発明の効果】
【００１４】
前述のように、本発明による痴呆予防及び治療剤組成物は、人参を主成分とする従来の組成物と異なり、何首烏を主成分として含み、さらに従来の組成物に加えられていない成分である遠志、丁香及び生姜を含む新しい組成の混合抽出物から構成されており、痴呆治療効能に優れ、副作用と毒性がほとんどなく、従来に比べて、吸収及び作用効能を大いに改善し、痴呆治療及び予防に優れた効果を奏する。
【００１５】
また、本発明による組成物は、その生薬成分を効果的に組成して一般人が容易に利用できる製品として商品化して、副作用及び毒作用を起こさないので長期間服用及び/または多量で服用することができ、また、医薬品または健康食品として誰でも楽に服用して、痴呆が予め予防できると共に、持続的な痴呆治療を通じて確実な投与効果が得られる長所がある。
【００１６】
また、学習能力の向上と記憶力向上などの効果を奏するため、受験生と一般人のための機能性食品及び健康食品としても非常に有用な効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、生薬抽出物から構成された痴呆予防及び治療剤組成物であって、何首烏（Polygoni multiflori Radix: Polygonum multiflorum, Thunberg）１０〜５０重量％並びに茯苓（Poria, Poria cocos (Schw.) Wolf）５〜２０重量％、陳皮（Aurantii nobilis Pericarpium: Citrus unshiu Marco.）２〜２０重量％、甘草（Glycyrrhizae Radix: Glycyrrhiza uralensis Fischer）１〜５重量％、半夏（Pinelliae Tuber: Pinellia ternata Tenor et Breitenbach）１〜１０重量％及び生姜（Zingiberis Rhizoma: Aingiber officinale Rosc.）１〜１０重量％の中から選ばれた３種以上の成分を含む生薬抽出組成物を提供する。
【００１８】
本発明では前記成分以外に、遠志（Polygalae Radix: Polygala tatarinowi Regel）１〜１０重量％、丁香（Caryophylli Flos: Eugenia caryophyllata）１〜１０重量％、南星（Arisaematis Rhizoma: Arisaema japonicum BL.）１〜１５重量％、天麻（Gastrodiae Rhizoma: Gastrodia elata BL.）１〜１５重量％、石菖蒲（Acori Graminei Rhizoma: Acorus gramineus Soland）１〜１０重量％、姜黄または鬱金（Ostericum Koreanum or Curcuma Longae Rhizoma: Crucuma longa L.）１〜１５重量％、竹茹または竹葉（Caulis Phyllostachyos or Folium Phyllostachyos: Phyllostachys bambusoides Sieb）１〜８重量％、白彊蠶または蚕粉末（Bombycis Batryticatus: Bombyx mori L.）１〜８重量％、枳實または枳殻の実（Fructus immaturus ponciri: Poncirus trifoliata Raf）１〜８重量％、香附子（Cyperi Rhizoma: Cyperus rotundus L.）２〜２０重量％及び木香（Saussureae Radix: Saussurea lappa Clarke）１〜１０重量％の中から選択された１種以上の成分がさらに含まれてもよい。
【００１９】
このような本発明の望ましい生薬組成物は従来の方法によって抽出され、その抽出物は、何首烏１０〜５０重量％、天麻１〜１５重量％、石菖蒲１〜１０重量％、姜黄または鬱金１〜１５重量％、竹茹または竹葉１〜８重量％、蚕粉末１〜８重量％、枳實または枳殻の実１〜８重量％、茯苓５〜２０重量％、陳皮２〜２０重量％、甘草１〜５重量％、生姜１〜１０重量％及び任意で半夏１〜１０重量％を含む。
【００２０】
本発明のもう一つの望ましい生薬組成物も従来の方法によって抽出され、その抽出物は、何首烏１０〜５０重量％、遠志１〜１０重量％、丁香１〜１０重量％、生姜１〜１０重量％、南星１〜１０重量％、天麻１〜１０重量％、石菖蒲１〜８重量％、鬱金１〜１０重量％、竹葉１〜８重量％、蚕粉末１〜８重量％、枳殻の実１〜８重量％、茯苓５〜２０重量％、半夏１〜１０重量％、陳皮１〜１０重量％及び甘草１〜５重量％を含む。
【００２１】
これらのような抽出物は、現在、痴呆予防及び治療に卓越な効果があると考えられ、このため、薬剤組成物または健康食品として使用することができ、特に丸剤として服用することが最も望ましいが、必要に応じ、エキス、液剤、グラニュール、粉末、散剤、顆粒剤、浸剤、煎剤、錠剤またはカプセル剤として製造して服用してもよく、通常の方法に従って注射用蒸留水に溶解して注射剤として使用してもよい。
【００２２】
本発明による組成物は生薬成分から構成されており、特定の作用機転を明確に説明することは難しい。しかし、従来の痴呆治療用生薬組成物や漢薬基本書で規定している薬剤の特性を考慮し、数多い反復実験と比較実験を通じて選定した結果、前記のような成分構成と含量比率の範囲内で最も毒性と副作用が少なく、最適の効能を奏するということが確認された。
【００２３】
一般に、漢医学的理論によると、たとえ生薬組成物が類似していても、各組成物の期待される効能や副作用はかなり異なる。従って、本発明では、痴呆予防と治療に対しての治療効能を高め、その副作用を最小限にするために最適の組成を構成した。
【００２４】
従来の生薬組成物の場合は、臨床的な投与量を投与した場合に、薬剤成分の過剰な使用により副作用及び毒性が引き起こされるといういくつかの不利益が認められている。特に、主成分として使用された人参は、高血圧等の心疾患、肺結核、喘息及び咳嗽患者に動悸、血液循環障害等のいくつかの副作用を招来する虞があるので、身体全般的な恒常性の均衡が簡単に崩れる可能性が高いため、本発明の組成物に人参を加えないことが望ましいと考えられる。しかし、組成物の薬理学的作用や臨床的効能を最大に保持しながら副作用を最少化することが最も重要であるが、これに適合する新しい主成分を見つけ出すことは非常に難しいことである。従って、このような効果的な主成分を見つけ出して組成物に使用するということは、全体的に全く異なる組成物を構成するということを意味する。
【００２５】
本発明では、このような主成分として、従来の技術で用いられた人参の代わりに、従来の痴呆治療剤の組成として全く開示されたことがない何首烏を使用して、人参により発生する副作用を減らし、痴呆に対しての薬理学的、臨床的効能を著しく向上させた。
【００２６】
本発明で主成分として使用する何首烏の主成分は、クレソファノール(cresophanol)、レイン(rein)、エモジン(emodin)、ピシオン(physhion)とそれらの配糖体であって、一般に気と血に作用し強精、強壮、補血に特効があることが知られている。特に、何首烏は、従来の人参成分と違って、各種文献(Journal of Ethnopharmacology 75 (2001) 141-164など)に記載されているように、滋水補腎して髪の毛を黒くし、体を軽くするため、老化防止に卓越な効能があると言われている。即ち、止心痛、益精髓、延年不老、
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、治中風、癇證のような老人性神経系疾患や循環器系疾患に優れた効能があることが知られている成分であって、このような成分を他の成分と適切に混合して使用する場合、痴呆治療と予防に効果があると判断した。
【００２７】
本発明により、従来の文献及び臨床的根拠に基づき、最大限の抗痴呆効果及び主成分として何首烏を人参の代わりに使用することに伴う副作用の完全なる除去が具現化する。何首烏は、それ自体、肝機能の増進と血液循環の促進作用に優れており、他の生薬成分との相乗効果を持つ。しかし、このような何首烏成分の含量が多すぎると、心臓及び消化器系に副作用が生じて、少なすぎると、抗痴呆効果が期待できない。
【００２８】
本発明によると、主成分として使用する何首烏と共に使用できる成分として望ましいのは、天麻、石菖蒲、鬱金、竹葉、蚕粉末、枳殻の実、茯苓、陳皮、甘草、生姜であり、半夏を追加的に使用してもよい。
【００２９】
また、何首烏を主成分として、茯苓、陳皮、甘草及び半夏、そして任意で生姜を含む組成物も、本発明の目的を達成することができる。このように、本発明の組成物が、最小限の成分構成だけでも従来の組成物より優秀で副作用のない痴呆改善効果が得られるのは、主成分として何首烏を使用しているからである。
【００３０】
また、本発明では、前記組成に加えて、遠志、丁香、南星、半夏、生姜などの成分を使用すると、従来に比べ、投与効果を改善すると共に、生薬毒性問題を漢薬特有の相互作用により解決することができる。しかし、本発明から使用可能な組成として提示した組成物の全ては使用上の毒性による問題はなく、主成分である何首烏の薬理学的特性と生薬特有の相互作用により、最小限の処方又は望ましい処方又はその両方とも、同質的で、類似な効果を奏するため、本発明の目的を達成することができる。従って、主成分として何首烏を使用する限り、副作用が無く、非常に効果的な痴呆改善効果を奏するため、前記多様な組成の例はすべて本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
本発明において、前記何首烏と共に新しい成分として、漢方の引経薬として知られている丁香を少量添加すると、薬剤の大脳神経に対する作用を向上することができる。薬理学的側面から丁香は、組成物の有効成分に対する誘導成分として作用し、大脳神経に対する薬理学的、臨床的作用を、従来の組成物より大いに向上することが考えられる。しかし、この成分が少なすぎると投与効果が劣り、多すぎると嘔吐及び腹痛の虞がある。
【００３２】
一方、石菖蒲は、痴呆、健忘のような脳障害に対して効能がある。従来の組成物において石菖蒲それ自体は抗痴呆効果が十分に現れないので、発明者らは、石菖蒲と混合可能な別の生薬成分を探した。その結果、発明者らは、遠志と石菖蒲を同時に使用することにより、漢医学の本草学理論に基づいて薬理学的な相乗効果が現れることを見出した。遠志を石菖蒲と共に少量加えることで、本発明の組成物は、薬理学的作用の向上に成功した。しかし、石菖蒲に対して遠志の使用量が多すぎると、血液循環の障害及び消化不良の虞があり、石菖蒲に対して少量の遠志を使用した場合は、石菖蒲との上昇作用が期待できないため抗痴呆効果が低下する問題がある。
【００３３】
また、本発明の組成物において生姜を使用することで、半夏などの成分の様々な毒性を緩和することが可能である。特に、半夏の成分はエフェドリンを初めとした多数のアルカロイド物質により毒作用が強いため、長期間又は過多の使用により血液循環障害や神経興奮などの副作用を起こす場合がある。従って、本発明の組成物は、半夏の使用により様々な毒性を除去することで、その抗痴呆効果を最大にすることが可能である。しかしながら、生姜を少量使用するとなんらかの毒性が発生する虞があり、過多量の半夏を使用した場合は、本発明の組成物の臨床的効能を低下させる憂慮がある。
【００３４】
鬱金は、他の成分との親和性が優秀であるため姜黄より望ましい。
【００３５】
特に、本発明による様々な生薬を適切に使用することにより、大脳の血行(血流、cerebral blood flow)を増進することができ、従って、糖を大脳神経細胞へエネルギー源として供給し、これにより大脳神経細胞の糖代謝(エネルギー代謝)を直接的に促進することができる。
【００３６】
また、このように改善されたエネルギー代謝は、大脳神経細胞の構造的恒常性の保持に寄与する一方で、神経伝達物質の分泌及び遊離を誘導することにより、大脳神経細胞の退行を遅延または予防する作用を効果的に行うことができる。
【００３７】
従って、本発明のこのような薬理学的作用機転は、認知機能の漸進的消失を特徴とする痴呆を予防し、治療することに大変効果的に作用することができる。
【００３８】
上記のように、本発明の抗痴呆組成物は、従来の痴呆治療組成物に適用されたことのない何首烏を活性成分として含む他にも、より望ましい効果のために、遠志、丁香、生姜などの他の生薬成分も含む。特に、本発明の組成物は、毒作用と予想される副作用がほとんどないため、一般人が適正量を長期間服用しても問題はなく、痴呆予防と治療目的の健康食品としての効率性が著しく改善されたという側面から非常に画期的な組成物である。
【００３９】
本発明の生薬組成物の重要な薬理学的特性は、活性成分としての何首烏の使用と最適化された各成分の含量の比率によるものである。適切な組成物を、様々な製造例および本発明の実施例で具体化し、副作用がない痴呆の予防及び治療における前記組成物の有効性を実験例により確認したことについて特に言及する。
【００４０】
本発明の生薬組成物の各成分は、通常の方法により水やアルコールで抽出する。例えば前記混合物に水を加えて加熱して、４〜１０時間還流して抽出するかエタノールで２〜５時間抽出した後、濾過して溶媒を除去し、粉末を回収して、通常の賦形剤を加えて製剤し、前記各種剤型から選択して、適切な投与剤型を構成することができる。
【００４１】
本発明の生薬組成物を、中期段階の老人性痴呆患者に対する望ましい治療効果のための丸剤として経口投与する場合、体重が６０kgである成人に対して抽出粉末を、1回５ｇ乃至１５ｇ、望ましくは７．５ｇ乃至１２．５ｇを一日２〜４回まで投与することができる。
【００４２】
このような投与量は、毒性や副作用を考慮して決定したものであり、従来の漢薬材痴呆治療組成物とは違って、過剰量を長期間投与しても深刻な副作用はほとんどなく、少量投与しても既存に比べて優秀な治療効果を奏するということが確認された。
【００４３】
特に、人参を主成分とする既存の生薬組成物を患者に投与する場合、大半の患者が高血圧を患っているため、その投与に特別な注意が必要だった。本発明の生薬組成物は、高血圧、その他の血液循環障害又は肝疾患を患う患者にも、副作用がはるかに少なく、安全に投与することが可能であるため、一般機能性健康食品として広く活用できる。
【００４４】
抗痴呆効果を有する従来の生薬組成物は規格化されず、また幅広く使用するために商品化されなかったので、それは単一の薬物の処方薬に限られ、高額な治療に限定されていた。しかしながら、本発明の生薬組成物は、効果的な組合わせのために規格化され痴呆の予防又は治療のために一般人に簡単に服用される。
【００４５】
さらに、本発明の生薬組成物は、痴呆治療の効果だけではなく、記憶力の増進と頭のさえに効果的であるため、それを、受験生や一般正常人の健康と記憶力増進のためにも効果的に服用することができる。この場合の投与量が、痴呆症患者に比べて約３０〜７０％程度の少ない量でも、投与効果が得られる。
【００４６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
特に、本発明の試験例１から１１では、実施例１と米国特許第6,010,702号(韓国特許公開第99-85202号)の実施例１である比較例１の組成物の有効性を比較するが、直接的に比較するために、米国特許第6,010,702号(韓国特許公開第99-85202号)の試験例と全く同一な方法により本発明の試験例１から１１の実験を行って、その結果を比較した。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
薬草は、韓国生薬協会(Korea Medicinal Herb Association)から購入し、園光大学校漢医学科の漢薬専門家にその真偽を検証してもらった。実施例１の組成物は、以下の１５種類の薬草、すなわち何首烏(Polygoni multiflori radix) 20g、遠志(Polygalae Radix) 3g、丁香(Caryophili Flos) 1g、南星(Arisaematis Rhizoma) 7g, 天麻(Gastrodiae Rhizoma) 8g、石菖蒲(Acori Graminei Rhizoma) 4g、姜黄(Ostericum Koreanum) 8g、竹茹(Caulis Phyllostachyos) 3g、白彊蠶(Bombycis Corpus) 3g、枳實(Fructus ponciri seu aurantii immaturus) 3g、白茯苓(Poria) 8g、半夏(Pinelliae Tuber) 8g、陳皮(Aurantii nobilis Pericarpium) 7g、甘草(Glycyrrhizae Radix) 2g 及び生姜(Zingibreis Rhizoma) 4gを混合して製造した。これらの成分は、各々次の植物、すなわちPolygonum multiforum Thunberg、Polygala tenuifola Willdenow、Eugenia caryophyllata Thunberg、Arisaema japonicum BL.、Gastrodia elata Blume、Acorus gramines Solander、Curcuma longa L.、Phyllostachys bambusoides Sieb.、Bambyx mori L.、Poncirus trifoliate L.、Poria cocos (Schw.) Wolf、Pinellia ternata Tenor et Breitenbach、Citrus ushiu Markovich、Glycyrrhiza uralensis Fischer及びZingiber officinale Roscoeの一部分に該当する。これらの混合物を、0.8Lの水に入れて徐々に加熱し、4〜10時間還流した。
【００４９】
次に、液相溶液を濾紙で濾過した後、濾液を凍結乾燥機で乾燥し、薄茶色の粉末10.0gを得た。
【００５０】
（実施例２〜７）
前記実施例１と同様な方法により組成物を製造するが、次の表１に示す組成比率で15種類の薬草を組み合わせて製造し、粉末状の組成物を得た。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
（実施例８〜１０）
実施例８〜１０の組成物を、表２に示した含量で、１５種類の薬草を混合して製造した。
【００５３】
なお、実施例によっては、１５種類の薬草の一部を省略して、それ以外は同様な方法で下記のとおりに製造した。
【００５４】
前記薬草らを10倍の水(v/w)と混合して２時間煎じて、前記処方箋の抽出物を製造した。前記抽出物を濾過した後、残余物だけをさらに2時間煎じ、その濾液を先の濾過で生じた濾液と混合した後、凍結乾燥機（Labconco，Preezone）で乾燥し、使用前まで４℃で保管した。抽出物の収率は成分の乾燥重量の約16％に該当し、証拠用標本(HM2001−45)を園光大学校医学部薬理学科の植物標本箱に保管し、粗抽出物の化学成分は薄層クロマトグラフィ(thin layer chromatography)を使用して分析した。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
（比較例１）
人参50g、南星15g、天麻15g、石菖蒲10g、姜黄10g、竹茹10g、白彊蠶10g、枳實10g、白茯苓10g、半夏10g、陳皮6g、甘草6gから成る混合物を1Lの水に入れて徐々に加熱して6〜8時間還流した。その後、液相溶液を濾紙で濾過し、濾液は、凍結乾燥機で水分を完全に除去し、褐色粉末2.7gを得た。
【００５７】
（比較例２）
前記実施例１と同一の成分を同一の組成比で含む生薬混合物を、1Lのエタノールで3時間抽出した。その後、液相溶液を濾紙で濾過した後、濾液中のエタノール成分を凍結乾燥機で完全に除去し、褐色粉末3.0gを得た。
【００５８】
（試験例１：AChE酵素抑制効果試験）
本発明の抽出エキスのAChE酵素抑制効果試験のために、まず電気うなぎから抽出した酵素(AChE; Sigma Cat. No. C-2888)1000ユニットを1mlのPBS(phosphate buffer; 0.1M, pH 7.3)に溶解させた後、これに前記実施例１で製造した抽出エキスの粉末を各々0.025mg/ml、0.05mg/ml及び0.1mg/mlとなるよう溶解させた後、Ellman's coupled assayにより、各々のサンプルに対して、酵素の反応速度因子であるKm(ミカエリス常数)、Vmax(最大速度)を、カップリング剤として5,5−ジチオ−ビス−(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)を用い、紫外可視分光計で、460nmの波長で、各AChE活性を測定した。本発明の抽出物によるAChE抑制効果により、次の表２から分かるように、0.05mg/mlを使用した場合、酵素の活性が30.3%減少し、0.1g/mlを使用した場合、80.4%減少したことを確認した。
【００５９】
【表３】
2004520392.tif 000006
【００６０】
前記のような本発明の生薬抽出物のAChE酵素抑制効果(80.4%)は、市販中のTHA(商標名：Cognex)が最高40%のAChE抑制効果を示し(参考：Keio J. Med., 36, 381, 1987)、従来の米国特許第6,010,702号(比較例１)の生薬組成物が59.8%の効果を示したことを考慮すると、著しく改善されている。
【００６１】
（試験例２：AChE抑制効果試験）
本発明による抽出物の生体(ラットの脳)内でのAChE抑制効果を試験するために、20週齢のラットを投与開始前に7匹ずつ対照群と試験群に分けて、対照群には本発明の抽出物を投与せず、試験群には実施例２で製造した粉末0.5gを蒸留水100mlに溶解させた溶液を、一日に3mlずつ、連続して10日間経口投与した。10日後、ラットの脳を摘出して脳の重量を測定し、これにリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)5mlを加え、完全に粉砕し、３〜５時間ゆっくり攪拌した。攪拌している間に、さらに2mlのリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)を加えて、遠心分離機(Hettich Rotina 48R)を用い、4℃で10分間、1000rpmで遠心し、フィルター(CAMEO 25ES ニトロセルロース 孔径: 0.45mm)を使用して精製した。
【００６２】
精製した脳のAChE酵素活性を、紫外可視分光計を利用して、412nmの波長で、Ellman's coupled assay方法(参照: Ellman, G. L., Biochem. Pharmacol., 7, 88, 1961)により測定したが、この際、時間ごとに、全ての基質における酵素反応速度を、ミカエリス−メンテン反応式(Michaelis-Menten equation)によって計算した。1ml容量の石英キュベットの中にリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)790μl、基質(ATCh；アセチルチオコリン)5ml溶液60μl、カップリング剤としてはDTNB(ジチオニトロ安息香酸)5mM溶液120μlを入れて約3分間インキュベーションした後、対照群と試験群の脳から抽出した溶液10μlを各々入れてAChEの活性を評価した。その結果は次の表３に示した。
【００６３】
【表４】
2004520392.tif 000007
【００６４】
前記生体内試験から分かるように、実際に生体内で本発明の生薬抽出物をラットに10日間連続投与した場合、AChE活性は、投与していないラットの脳でのAChE活性に比べ、34.1%減少した。これは前記比較例１の活性の減少率が23.1%であったことに比べて、はるかに向上している。従って、この結果から本発明の抽出物は、アセチルコリン分解酵素の抑制効果を向上することが証明された。
【００６５】
（試験例３：神経伝達物質アセチルコリン濃度の比較）
3週齢のスプラグドーリー(Sprague Dawley)雌性ラット(pyrogen test free)を購入し、18℃、明暗サイクルで、本研究で使用するために20週齢(250〜350g)のラット（250から350g）になるまで飼育した。本発明の実施例3の生薬抽出物を試験例2と同様な方法で、7匹の個体を含む各実験ラット群に10日間経口投与した。5日間及び10日間投与後、全てのラットを解剖して脳の重量を測定した後、脳細胞を、0.2%トリトンX-100を含むリン酸塩緩衝溶液(リン酸バッファー：0.1M, pH 7.3)10mlを使用して、均質化した。均質化した脳細胞溶液を4℃で遠心分離(1000rpm)して、脳細胞溶液からアセチルコリンを分離し、分離したアセチルコリンを、電極(electrode)検出器を備えたHPLCによって定量分析した。
【００６６】
即ち、まずいくつかの正確な濃度のアセチルコリン標準グラフを作成した後、ラットの脳から抽出した各試料20μlを同一の条件下で分析した。この際、分析条件は、流速10ml/分、検出範囲3.9062nA、溶離液はリン酸塩緩衝溶液(0.1M, pH 7.3)であった。時間ごとに、7匹のラットを一群として、生薬抽出物を投与したラットの脳から生化学的方法によりアセチルコリンを分離し、正常ラットのアセチルコリン濃度と比較した結果を、次の表４に示した。
【００６７】
【表５】
2004520392.tif 000008
【００６８】
前記結果は、本発明の生薬抽出物を投与したラットで神経伝達物質であるアセチルコリンの濃度が実際に増加することを示しており、これは、そのような生薬抽出物のAChEにおける抑制効果が実際に生体で発現するということを反映している。前記結果を見ると、生薬抽出物を投与して5日が経過すると、アセチルコリン量は約53.3%増加し、10日後には123.9%増加した。このような効能は、他の天然物による薬剤の効能より卓越に優秀なものであって、本発明の生薬抽出物は、日本で発表された特許(参照：日本特許公開平7-25760号)の組成物に比べて5倍以上、比較例１の組成物のより約2倍強力なAChE抑制作用を有する一方で、痴呆の治療及び予防のための合成抗痴呆薬剤(参照：Keio J. Med., 36, 381, 1987)より4倍以上強力なAChE抑制作用を有する。特に、本研究で使用された天然生薬は、他の用途で数千年間臨床的に使用されてきた治療剤であって、従来の薬剤使用による薬物治療で発生するような副作用はほとんどなく(試験例１１参照)、特に血管系異常や肝機能などに対しての異常は発見されなかった。
【００６９】
（試験例４：丸剤の製造及びその効能のスクリーニング）
前記実施例４で製造した生薬粉末100gに蜂蜜5gを混合して丸剤にした後、乾燥機で乾燥した。この丸剤を毎日1gずつ10mlの水に溶かして20週齢のスプラグドーリーラットに10日間連続して経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法で、AChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、丸剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。。
【００７０】
（試験例５：散剤及びその効能のスクリーニング）
前記実施例５で製剤した生薬粉末100gを細かく粉砕して、18号標準ふるい(850μg)に通した後、希釈剤として乳糖200gを加えて散剤を製造した。この散剤を、毎日0.7gずつ10mlの水に溶かして、20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法で、AChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、散剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７１】
（試験例６：錠剤及びその効能のスクリーニング）
前記実施例６で製造した生薬粉末100g、乳糖25g及び澱粉5gを混合し、タルク5gを加えてさらに混合した。混合物を錠剤機(tablet machine)で製剤して、フィルムコーティングした錠剤を製造した。この錠剤を、毎日0.7gずつ10mlの水に溶かして、20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法で、AChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、錠剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７２】
（試験例７：顆粒及びその効能のスクリーニング）
前記実施例７で製造した生薬粉末100g、乳糖25g及び澱粉5gを混合し、ふるい(12-45号)に通して、顆粒を製造した。この顕粒を、毎日1.0gずつ10mlの水に溶かして、20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法で、AChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、顕粒も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７３】
（試験例８：カプセル剤及びその効能のスクリーニング）
前記実施例１で製剤した生薬粉末100gをカプセル(3号、0.3ml)に充填した。このカプセル剤を、毎日0.7gずつ10mlの水に溶かして、20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法で、AChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。実験の結果、カプセル剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７４】
（試験例９：浸剤及びその効能のスクリーニング）
前記実施例１で使用したものと同一の成分と組成比を有する生薬混合物を細かく粉砕して、これに精製水200mlを加えて、3時間浸出した。これに熱精製水700mlを加えて、数回混合した後、冷却して布で濾過した。これに香味剤として蜂蜜を50g加えた。得られた浸剤を毎日3mlずつ20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法でAChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、浸剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７５】
（試験例１０：煎剤及びその効能のスクリーニング）
前記実施例１で使用したものと同一の成分と組成比を有する生薬混合物に、精製水900mlを加えて数回混合し、30分以上加熱して、温かいうちに濾過した。これに香味剤として蜂蜜を50g加えた。得られた煎剤を毎日3mlずつ20週齢のスプラグドーリーラットに10日間経口投与した。10日後、試験例2及び3と同様な方法でAChE酵素活性及び脳内のアセチルコリン濃度を測定した。この実験の結果、煎剤も、試験例2及び3と同様に、優れたAChE抑制効能及びアセチルコリン濃度増加効果を奏することが確認された。
【００７６】
（試験例１１：ラットの血清における肝機能検査）
20週齢のスプラグドーリーラットを偽薬群(placebo group)(8匹)及び実験群(9匹)に分けて、前記実施例1で製造した生薬粉末500mgを精製水100mlに溶解させた後、各溶液3mlを、毎朝10時に10日間連続して経口投与した。10日後、実験動物を屠殺して血液を採取した。採取した血液を4℃、1500rpmで10分間遠心分離して血清を取り、これに対して公知の方法により肝機能検査を行った。その結果、下記表５から分かるように、偽薬群と実験群でのAST、ALT、ALP、BUNの数値はほぼ同じであり、このことから本発明の生薬抽出物は、一次的な肝毒性がないことが確認された。特に、本発明の生薬抽出物は、比較例１の場合(対照群)と比較しても、著しく低い肝臓毒性数値を示した。
【００７７】
【表６】
2004520392.tif 000009
【００７８】
（試験例１２：痴呆治療効果確認のための卵巣摘出動物試験）
循環系及び神経系統の疾病を治療するために伝統的に使用されてきた従来の処方薬を改良して、本発明の痴呆予防及び治療剤組成物（実施例１０を例として使用する：ニューロクリーン（Neuroclean；NC））を製造し、卵巣を摘出した（ovariectomy, OVX）ラットにおける大脳のアデノシン３リン酸（ATP）及びアセチルコリン（ACh）の含有量に及ぼす効果を調べた。まず、雌のスプラグドーリーラットから卵巣を摘出して、この状態のまま12週間放置し、卵巣のステロイドホルモンを枯渇させた後、体重に比例して1日に体重1kg当たり500mgの本発明の組成物を14週間経口投与した。組成物の投与により、前記卵巣を摘出したラットにおける急速な体重増加率は顕著に減衰し、また卵巣摘出による大脳重量の減少も顕著に低下した(p＞0.05)。体重に比例して毎日50mg/kgのNCを静脈内灌流(superfusion)した場合、大脳の血流速度は著しく上昇したが、平均動脈血圧(mean arterial blood pressure)に変化はなかった。前記卵巣摘出により、大脳のATP、コリン及びAChの量は顕著に減少したが、前記卵巣が摘出されたラットに組成物を投与した時、このような減少は完全に回復した(p＞0.01)。さらに、NCは、卵巣摘出により減少した大脳コリンアセチルトランスフェラーゼ(cerebral choline acetyltransferase)の活性及びACｈの量を顕著に増加させた(p＞0.01)。前記の結果を総合すると、これらの結果は、本発明の組成物の薬理学的特性は、卵巣ステロイドホルモンの剥奪により減少した大脳ATP及びコリン性神経伝達物質(cholinergic neurotransmitter)の合成経路の改善に関係していることを示唆し、NCは、痴呆(dementia)を含む大脳神経機能の障害(cerebroneuronal dysfunction)を治療する有望な生薬治療薬(herbal remedy)になると考えられる。
【００７９】
アルツハイマー病(Alzheimer’s disease; AD)の原因について、既に数多い要素が関連していることが知られているが、最も一貫した減少の一つは、アセチルコリン（ACh）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）等のシナプス前性のコリン作動性マーカー(presynaptic cholinergic markers)の減少を特徴とする、中枢神経のコリン性システムの抑制(depressed cholinergic system)である(Coyleら 1983: Soininenら 1995)。このようなコリン性の機能低下(hypofunction)より誘導される記憶損傷との関連性及び発生(production)は、コリン性置換療法(cholinergic replacement)に対する相当な関心を集めている。さらに、大脳神経細胞のエネルギーであるATPを生産するグルコース代謝(glucose metabolism)の減少は、アルツハイマー病(AD)の患者に現れる異常な アミロイド(amyloid)形成、細胞膜損傷、神経細胞の退化および認知機能の損傷など多段階的障害(a cascade of disturbances)を誘発すると推測されている(Hoyer 1996: Meier-Rugeら 1994)。
【００８０】
従来の研究をみると、卵巣ステロイドホルモンは、特に大脳神経細胞の記憶及び認知機能と密接な関係があることが知られており、このような卵巣ステロイドホルモンの枯渇は、アルツハイマー病(AD)を始めとした神経退化的疾病の発生と関連があると考えられる(McEwenら 1997: Paganini-Hill and Henderson 1994)。動物実験において、卵巣摘出によって卵巣ステロイドホルモンを剥奪することは、ラットの海馬(hippocampus)及び前頭大脳皮質(frontal cerebral cortex)における高親和性のコリン吸収(high affinity choline uptake)の減少を招来し（O’Malleyら 1987）、ラットの学習及び記憶機能が低下をもたらすことが確認された(Singhら 1994: Toriizukaら 2000)。従って、大脳ATP及びコリン量の欠乏は、学習及び記憶機能の損傷を特徴とする漸進的な神経系統の退化の進行と関連があると考えられる。
【００８１】
他方では、漢方において、循環系(cardiovascular system)の障害と関連した疾病の処方薬としてたびたび使われている様々な伝統的な処方による治療薬がある。これらの治療薬の薬理学的な概念は、それらが、一般に末梢血管系に蓄積される生物学的に有害な物質を除去することにより大脳の血液循環を向上することにある。それらの薬理学的特性に注目して、本発明者らは、本発明による新しい生薬成分を開発したが、この薬理学的特性は、大脳血流(cerebral blood flow)の障害から引き起こされる大脳神経の機能障害(cerebroneuronal dysfunction)の治療または予防に効果があると考えられる。本発明の組成物は、多様な病理学的原因や老化により減少した大脳神経系の血液循環を向上させて、向上した大脳血液循環により大脳神経系のグルコース代謝及びコリン性経路が向上し、大脳ATP及びAChの量を増加させると予想した。この仮説を立証するために、本実験では、卵巣を摘出したラットにおいて、本発明の組成物が大脳神経ATP及びAChの量に及ぼす薬理学的特性について調査した。
【００８２】
[実験動物の薬物投与及び動物組織の準備]
生後6週のスプラグドーリー（Sprague-Dawley）ラットの雌を韓国実験動物センター(韓国、天安)から購入し、24〜26℃で、昼と夜が各々12時間である周期で、1週間予備飼育した。このラットらは、実験期間の間、市販されている齧歯類規定食(韓国、三洋社)及び水を自由に摂取することが許されており、生後7週になった時、ペントバービタルナトリウム(pentobarbital sodium)麻酔剤(Nembutal、体重に比例して50mg/kgの濃度で投与)を使用して、各ラットの二つの卵巣を全部除去した後、12週間この状態のまま維持して、卵巣ステロイドホルモンを枯渇させた。対照群のラットには、偽手術を施行した。前記実施例10で製造し、水に溶解した本発明の組成物(ニューロクリーン（NeuroClean; NC）)を、体重に比例して一日あたり500mg/kgの量で、14週間経口投与した。対照群の動物は、前記生薬の代りに同量の水を経口投与した。投与量は、体重によって2mL/kgになるように調整した。実験を始めてから14週経った時、全ての動物をエチルエーテルで麻酔して致死させた。前記動物らの腹部静脈から血液を採取した後、直に脳を除去し、氷冷したリン酸緩衝溶液(PBS, pH 7.4)で洗浄した後、大脳の重量を測定した。大脳皮質はできるだけ速く氷上で切開し、使用前まで−80℃で貯蔵した。
【００８３】
[大脳血流(Cerebral Blood Flow: CBF)の観察]
実験動物を外科的に用意して平均動脈血圧を測定し、レーザードップラー流量計(laser-Doppler flowmetry)を使用してCBFを観察する方法は、従来の報告書に記載の技術を多少変更して使用した(Dirnaglら, 1989)。即ち、雄性のスプラグドーリー（Sprague-Dawley）ラット(200〜250g)をハロタン(halothane)を使用して麻酔した後、気管(trachea)に挿管(intubate)した。大腿部動脈(femoral arteries)の一つは、平均動脈血圧(MAP)を記録するために管を挿入して(cannulated)、また他の大腿部動脈は、生薬抽出物を投与するために管を挿入した。頭頂部皮質(parietal cortex)が見えるように、小規模の開頭術(2 x 2 mm craniotomy)を施行して硬膜(dura)を除去した後、その部位を点滴溶液で灌流した(37℃, pH 7.4)。皮質表面(cortical surface)に定位的(stereotaxic)に配置したレーザードップラー流量計(laser-Doppler flowmetry; vasamedic, St. Paul, MN)を使用して、灌流部位でCBFを持続的に観察した。CBF測定値は、休息段階時と対比して増加した比率を％で示した。実験終了後にハロタン(halothane)を過多投与して心臓が止まった後のCBF測定値は０であった。ここでのレーザードップラー流量計(laser-Doppler flowmetry)は、計量的なものではないが、CBFにおいての関連変化がかなり正確に観察できるようにする(Dirnaglら, 1989)。
【００８４】
[大脳ATP量の測定]
従来文献(Maら, 2000)に記載の微細化学発光法(microchemiluminescent method)を使用し、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)の細胞内ATPの量を測定した。全ての手順において、ラットのATPを測定は、最少二回以上繰り返して行われた。大脳ATPを、大脳組織0.1g当たり10%トリクロロ酢酸(trichloroacetic acid: TCA)を500μL添加して抽出した後、均質化して(homogenized)、抽出を完了するためにサンプルをボルテックス混合機(vortex mixer)で2分間混合した(Thermolyne 37600)。前記変性した(denatured)組織を含む溶液を4℃で何秒間か遠心分離した後、上清10μLを、0.5mM EDTAを含有するトリス/アセテート緩衝溶液(pH 7.75)が390μL入っているポリスチレンキュベット(BioOrbit, Sweden)に移して、発光器(luminometer, BioOrbit 1251)の中に入れた。自動分配器(autodispenser)を使用して100μLのATP観察用試薬を添加した後、コンピューター作動のシステムを用いて10秒間自動的に光の強度を測定した。本分析では、発光強度は、各チューブ当たり10-4〜10-11molのATPに対して直線の様態を示した。
【００８５】
[大脳コリン量の測定]
従来文献(Maら, 2000)に記載の化学発光法(chemiluminescent method)を使用し、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)の細胞内コリンの量を測定した。即ち、0.1gの大脳皮質を10倍(v/w)の7%過塩素酸(perchloric acid)に入れて、ガラス−テフロン（登録商標）ペッスル(pestle)を使用し均質化した後、遠心分離機(Beckman, Avanti 3000)を使用し3000rpmの速度で10分間遠心分離した。前記より得られた上清液を、2M K2CO3を使用して中和した後、何秒間か遠心分離して、過塩素酸カリウム(potassium perchlorate)沈殿物を除去した。総量で20μLの希釈したサンプルと380μLのグリシン(glycine)緩衝溶液(pH 8.6)に100μLの試薬を自動的に添加して、発光器を使用してコリンの量を分析した。使用する試薬は毎日新しく用意して、試薬には、グリシン(glycine)緩衝溶液(pH 8.6) に2mg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(horse radish microperoxidase) 1mLと10mMルミノール(luminol) 60μL及び50Uのコリン酸化酵素(choline oxidase)が含まれている。このシステムにおいて、試薬添加後5〜25秒間の発光強度は、チューブ当たり1pmol〜100nmolのコリン量に対して直線の様相を示した。各実験対象のラットの細胞内コリン量の測定は、少なくとも2回繰り返された。
【００８６】
[大脳コリンアセチルトランスフェラーゼ活性]
Fonnum(1975)の方法を多少修正して、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)の大脳コリンアセチルトランスフェラーゼの(ChAT)活性を測定した。即ち、大脳皮質100mgを、0.2% Triton X-100を含有する10mM EDTAに入れて、超音波発生装置(sonicator)を用いて均質化した後、遠心分離機(Beckman, Avanti 30)を使用し、1000gで10分間遠心分離した。前記より得られた上清液を、塩化ナトリウム(300mM)、燐酸緩衝溶液(40mM, pH 7.4)、エセリン硫酸塩(eserine sulfate; 0.1mM)、EDTA(10mM)、塩化コリン(10mM)、[3H]アセチル−補酵素A(100nCi, 0.2mM)及びTriton X-100(0.05%)の混合物300μL中に入れて、37℃で15分間培養し、培養終了後、Achを抽出するために前記培養液を、2.5mLの10mM燐酸ナトリウム緩衝溶液(pH 7.4)で希釈した後、15mgのテトラフェニルホウ酸ナトリウム(sodium tetraphenylborate)を含有するアセトニトリル(acetonitrile)3mLと10mLのトルエンを添加した。その結果、標識(labeled)Achと未標識(unlabeled) Achはトルエン層に分画されて、反応していない基質は水溶液層に残留した。放射能は、ベックマンシンチレーションカウンター(Beckman LS 6500 Scintillation Counter)により測定した。
【００８７】
[大脳アセチルコリン(ACh)量の測定]
以前に発表された文献(Israel and Lesbats 1982)に記載の化学発光法(chemiluminescent method)を使用して、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)のACh量を測定した。即ち、組織サンプルの抽出及び酸化は次のように行った。       
【００８８】
大脳皮質100mgを、1mLの5% TCAを使用して抽出した後、エーテルで洗浄して(ether washing)TCAを除去し、1,000gで10分間遠心分離した。残余のエーテルを蒸発させた後、水溶液層を中和し、緩衝した。サンプル(100μL)に、0.5% メタ過ヨウ素酸ナトリウム(sodium metaperiodate) 10μLを添加して酸化した。前記酸化したサンプル(50μL)と10mlの0.2M燐酸ナトリウム緩衝溶液(pH 8.6)、100μLのコリン酸化酵素(250U/mL)、50μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(horse radish microperoxidase; type II, 2mg/mL)及び100μLのルミノール(luminol, 1mM)を含有する反応混合物を共に混合した。最終的に、5μLのアセチルコリンエステラーゼ(1,000U/mL)を添加して、AChの加水分解反応を誘引し、発光器(luminometer; BioOrbit 1251)を使用して、光の発光を測定した。タンパク質は、Lowryらの方法(1951)により決定した。
【００８９】
[試薬]
コリン酸化酵素(choline oxidase)、マイクロペルオキシダーゼ(microperoxidase)、ルミノール(luminol)、ATP及び塩化コリン(choline chloride)はシグマ社(Sigma, St. Louis, MO, USA)から購入し、ATP観察用試薬と[アセチル-3H]アセチル-補酵素A(1.6 Ci/mmol)は、各々BioOrbit(Sweden)及びNEN DuPont (Boston, MA, USA)から購入した。その他の全ての化学物質は、市販されているもののうち最高級品を使用した。
【００９０】
[統計分析]
本発明から得られた数値を、平均値±S.E.（mean ±S.E.）で表し、統計学的有意性(statistical significance)を求めるためにアノーバ(ANOVA)及びステューデントのｔ−検定(student’s t-test)を施行し、差は、確率＜0.05(p＜0.05)の範囲で有意であるとみなした。
【００９１】
[結果(Results)]
（体重及び大脳重量の変化）
図1に示したように, 本実験を通して、卵巣摘出(OVX)したラットの体重は偽手術したラット(sham animals)の体重に比べて持続的に増加し、卵巣摘出後26週の時点で、卵巣摘出(OVX)したラットの体重と偽手術したラット(sham animals)の体重には顕著な差があった(p＜0.01)。卵巣摘出したラットに、体重に比例して500mg/kgの本発明の組成物を14週間経口投与したところ、卵巣摘出したラットの体重増加率が著しく減少することが分かった。前記14週後に組成物を投与した卵巣摘出ラットと組成物を投与していない卵巣摘出ラットとでは体重に顕著な差があったが(p＜0.05)、偽手術したラット(sham animals)の体重には特に影響を及ぼさなかった。 驚くべきことに、本発明の組成物を投与した卵巣摘出ラットでは、活動(behavioral activity)及び皮膜状態(coat condition)等の体表面の状態が目立つほど向上した。
【００９２】
図２は、卵巣摘出したラットと卵巣摘出していないラットにおいて、本発明の組成物を投与した場合と投与していない場合の大脳重量の変化を示している。卵巣摘出したラットにおいて、体重に対する大脳重量比率は、偽手術したラット(sham animals)のものに比べて非常に低いことが分かるが(p＜0.05)、このような卵巣摘出したラットにおける体重に対する大脳重量比率の減少は、組成物を14週間投与することで部分的に回復したが(p＜0.05)、偽手術したラット(sham animals)では、組成物を投与しても何の影響も及ぼさなかった。
【００９３】
（大脳血流(Cerebral Blood Flow)）
本実験では、レーザードップラー計(laser-Doppler system)及び電気的マイクロ変換機(electric microtransducer)を使用して、本発明の組成物が、CBF及び平均動脈血圧(MABP)に及ぼす影響を調査した。その結果、図３から分かるように、CBFは一般点滴(ringer)を使用して灌流した時、安定に維持された。本発明の組成物(10-200 mg/kg体重)を使用して灌流した時には休息期のCBF(resting CBF)が増加した。50、100及び200 mg/kgの組成物における増加率は、平均して、各々休息期のCBF(resting CBF)の110.5±1.74%、118.3±2.28%及び127.6±3.35%となり、このような増加は、休息期のCBF(resting CBF)の数値との間で顕著な差があった(p＜0.05 - 0.001)。また、本発明の組成物のみを200 mg/kgの濃度で投与した場合、MABPが多少増加したが(休息期 CBFの105.4±0.03%)、大部分の本実験に使用された投与量に対してのMABPの変化は微々たるものであった。
【００９４】
（大脳のATP量）
本実験では、卵巣摘出(OVX)したラットと偽手術したラット(sham animals)において、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)の 細胞内ATPの量を測定した。図４から、卵巣摘出後26週の時点で、卵巣摘出したラットにおける大脳ATPの量(21.2±1.45 x 10-9 mol/mg タンパク質)は、偽手術したラット(sham animals)のもの(27.9±1.24)に比べて非常に低いことが分かる(p＜0.05)。卵巣摘出したラットにおける卵巣ステロイドホルモンの枯渇により顕著に減少した大脳ATPの量は、組成物を14週間投与した時、完全に回復したが(p＜0.01)、偽手術したラット(sham animals)においては何の影響も及ぼさなかった。
【００９５】
（大脳コリンの量）
図５から分かるように、偽手術したラット(sham animals)において、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)の細胞内コリンの量(1.17±0.058 x 10-7 mol/mgタンパク質)は、卵巣ステロイドホルモンを26週間枯渇させることにより顕著に減少した。卵巣摘出したラットにおいて、このような大脳コリンの量の顕著な減少(0.85 ± 0.034)は、前記26週間の最後の14週間に組成物を投与することにより、相当回復(restored)したが(p＜0.01) 、偽手術したラット(sham animals)においては、組成物の投与は、大脳のコリン量の増加に何の影響も及ぼさなかった。
【００９６】
（大脳コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)の活性）
図６は、卵巣摘出(OVX)したラット及び偽手術したラット(sham animals)においての、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)におけるChAT活性を示している。卵巣摘出後26週の時点で、卵巣摘出したラットにおける大脳皮質のChAT活性(32.6±1.50 nmol/時間/mgタンパク質)は、偽手術したラット(sham animals)のもの(41.5±1.53)と比べて非常に低いことが分かる(p＜0.05)。卵巣摘出したラットにおける大脳ChATの活性の減少(0.85±0.034)は、本発明の組成物を14週間投与することにより完全に回復したが(p＜0.01)、偽手術したラット(sham animals)では、本発明の組成物の投与は、コリン量の増加に何の影響も及ぼさなかった。
【００９７】
（大脳アセチルコリンの量）
図７から、卵巣摘出後26週の時点で、卵巣摘出したラットにおける大脳AChの量(369.4±23.27 pmol/mgタンパク質)は、偽手術したラット(sham animals)のもの(438.4±15.24)と比べて非常に低いことが分かる(p＜0.05)。卵巣摘出したラットにおける大脳ACh量の顕著な減少は、本発明の組成物を14週間投与することにより完全に回復したが(p＜0.01)、偽手術したラット(sham animals)では、大脳のAChの量に変化がなかった。
【００９８】
（考察(Discussion)）
本実験では、本発明により新しく調剤された生薬である実施例10の組成物が、更年期性疾患(climacteric behavior)の一つのモデルとして提示された卵巣摘出したラットにおける大脳エネルギーの代謝性経路(metabolic pathways)とコリン性神経伝達物質の生産に及ぼす影響について調査した。体重に比例して50 mg/kgの組成物を静脈内投与した場合、CBFは顕著に増加したが、MABPは増加しなかった。卵巣ステロイドホルモンを枯渇させた場合、大脳ATP、コリン及びAChは顕著に減少し、卵巣摘出したラットの前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)のChATの活性においても類似な様態を示した。ここで注目する点は、このような卵巣摘出したラットに体重に比例して1日当たり500mg/kgの本発明の組成物を14週間投与した場合、前記の減少現象が明白に回復したということである。従って、これらの結果は、本発明の組成物が、性ホルモンの枯渇から引き起こされるCBF、細胞内ATPとコリンの量及びChATの活性の減少を回復する薬理学的機作を有していることを示している。
【００９９】
人間の頭脳の正常的且つ生理学的な老化は、脳萎縮(cerebral atrophy)と脳細胞の死滅と関連しており、神経系における老化に係わる変化は、部分的にはホルモンの変化と関連していると推測されている(Birge 1997)。本実験から、卵巣摘出が脳重量の減少を招来するということが分かり、このような結果は、従来の研究結果と一致するものである(Maら、2000)。卵巣摘出したラットにおいて、前記減少した脳重量は、本発明の組成物を投与することにより部分的に回復することが明かされた。最近の研究結果では、男性より女性の方がアルツハイマー病(AD)により脆弱であると提起している(Gibbs 1998)。比較的遅く発病するアルツハイマー型老人性痴呆(senile demantia of Alzheimer type; SDAT)の初期には、大脳皮質の全ての部位において、大脳のグルコースの利用(utilization)と血流(blood flow)が減少する(Hoyer 1996; Wolf and Grotta 2000)。このような事実に基づいて、本発明では、まず本発明の組成物のCBFに対する影響を測定して、本発明の組成物の灌流によるCBFの増加を観察した(図2)。卵巣摘出したラットにおいて、本発明の組成物の投与により血清のグルコースの量はあまり増加しなかったが、大脳のグルコースの量は大いに増加した(p＜0.05)。このような結果から、関連する生化学的機作を正確に明かすことは難しいが、それは、このような結果は、増加した血流によるグルコース供給及び/または細胞のグルコース摂取及び利用に係わる複雑な生化学的機作により引き起こされる可能性もあるからである。しかし、本発明では、大脳のグルコース量の増加は、細胞膜を通じてのグルコースの増加した摂取と関係があると推定し、このような推定は間接的ではあるが、本発明の組成物が、卵巣摘出により減少した大脳ATPの量を確実に増加させたことを示している図４により立証された。
【０１００】
低いグルコース転換(turnover)は生命を保存するのに必要な最小限のATPを合成できるようにする(Meier-Rugeら、1994)。一般に、グルコース転換が低いほどATP生産は少なくなり、痴呆性脳疾患の症状がさらに酷くなると推測されている(Erecinska and Silber 1989; Hoyer 1991)。本研究では、卵巣摘出したラットの大脳ATPの量が、偽手術したラット(sham animals)のものに比べて24%も減少したことを観察して(図4)、このような減少現象は、卵巣ステロイドホルモンを枯渇させることにより大脳グルコースの転換が減少し、その結果、大脳ATPの生産が減少することと関連していると考えられている(Brige 1997; Erecinska and Silber 1989; Hoyer 1991)。ここで注目する点は、卵巣摘出したラットに本発明の組成物を投与した場合、減少したATPの量が顕著に増加したということであり、従って、このような結果は、組成物の投与によるCBF及びグルコース転換の増加に起因するものであり、またこのような本発明の組成物の誘導による大脳ATPの増加の病理生理学的役割は、卵巣摘出したラットにおいて大脳皮質の多様な細胞機能を維持することと関連があると考えられる。さらに、本発明の組成物の投与により、卵巣摘出したラットにおいて減少したATPの量が顕著に増加するという事実は、グルコースの利用/転換を増大する可能性を暗示するものであり、これに続いて、AChの生産に必須的な基質であるアセチル補酵素Aの生産を増加させると考えられている(Simsら、1981)。
【０１０１】
さらに、細胞内コリン量の減少はACh生産の減少に繋がるため(Soininenら、1995)、大脳コリン量の病理学的変化は、学習及び記憶喪失と関連があることが明かされている(Wurtman 1992)。Ehrensteinら(1997)は、アルツハイマー型老人性痴呆症(SDAT)患者の脳におけるAChの喪失がコリンの漏れによるものであるという仮説を提示し、Simpkinsら(1997)も、卵巣ステロイドホルモンの欠乏が、高親和性のコリンの吸収及び前皮質(frontal cortex)と海馬(hippocampus)におけるChATの活性の減少を招来すると報告した。このような研究結果は、前記したコリンの喪失による大脳AChの量の減少及びChATの活性の減少現象が老人性痴呆症(SDAT)の発病において主要な過程の一つであるということを示している。本発明では、卵巣摘出したラットから26週間、卵巣ステロイドホルモンを枯渇させた場合、大脳のコリン及びAChの量が顕著に減少したことを観察し、大脳ChATの活性でも類似した減少現象を観察したが、これらの結果は従来の研究結果と一致するものである(Maら、2000)。卵巣摘出したラットにおいて、大脳のコリン、AChの量及びChATの活性の減少は、本発明の組成物を14週間投与することにより顕著に回復したが、これは、性ホルモンの枯渇により引き起こされる大脳コリン性経路の代謝性転換の減少が本発明の組成物によって回復するということを意味する。
【０１０２】
図８に示したように、本発明では、卵巣摘出したラットにおいて、本発明の組成物が、脳機能障害(cerebral dysfuction)に及ぼす薬学的特性について、次のような四つの場合を仮定した。第一に、正確に説明することは難しいが、本発明の組成物はCBFを増加し、このことは、大脳のグルコースの代謝性転換及び/またはコリン性経路に影響を与えると推定される。これに対する根拠として、本発明の組成物は、大脳グルコース量を増加させるが、血液内グルコースを増加しないということが挙げられるが、このような仮説をさらに明確に立証するためにはさらに深化した研究が必要である。第二に、大脳のコリン量の減少は、高親和性のコリンの摂取(Simpkinsら 1997)及び/または細胞膜を通じたコリンの漏れの増加によるものとして考えられている(Ehrensteinら 1997)。大脳のコリンの量を枯渇させるこのような病理学的変化は、部分的には、本発明の組成物により誘導される大脳のATP量の増加により回復すると考えられるが、これに対する根拠は、細胞内ATPの絶対濃度が、細胞膜構造、受容体(receptor)及び輸送体(transporter)の活性などの細胞の生理学的過程を維持するために重要な役割を果たすことが考えられるからである(Erecinska and Silber 1989)。第三に、本発明の組成物は、卵巣ステロイドホルモンの枯渇により減少したChATの活性に直接的に影響を与えるか、または神経内分泌過程を間接的に活性化することにより、前頭頭頂部の大脳皮質(frontoparietal cerebral cortex)のAChの量を増加させると考えられる。第四に、卵巣摘出による大脳AChの量の減少は、大脳のグルコースの転換及びコリン量の減少によるものであると考えられる。このような判断は、グルコース転換の減少による大脳のコリン及びアセチル補酵素Aの量の減少がAChの減少に繋がるということに基づく(Hoyer 1996; Soininenら 1995)。従って、本発明の組成物は、大脳ATPを生産するためのグルコース代謝を加速化させるだけではなく、コリン性神経伝達物質であるAChの合成に必須的に使用される細胞内基質の濃度を増加させると考えられる。
【０１０３】
結論として、前記結果から、ラットで卵巣ステロイドホルモンを枯渇させると、大脳のATP、コリン、AChの量及びChATの活性が減少し、このような減少は、NCを投与することにより回復できるということが分かった。従って、本発明の組成物は、閉経期による変化及び大脳血液循環の障害により引き起こされる学習及び記憶損傷に係わる痴呆症状を好転させる、有用な薬剤の一つとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.（治療したOVXに対する*p＜0.05）で表した、卵巣摘出(OVX)及び偽手術(sham operation)したラットの体重変化を示すグラフである。
【図２】図２は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05)、卵巣摘出(OVX)及び偽手術(sham operation)したラットに対しての該当大脳の重量変化を示すグラフである。
【図３】図３は、７匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.001)、本発明の組成物が、大脳血流(CBF)及び平均動脈血圧(MABP)に及ぼす効果を測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.001)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳ATPの増加を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.001)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳コリン(cerebral choline)量の増加を測定した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.001)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳コリンアセチルトランスフェラーゼ(cerebral choline acetyltransferase；ChAT)の活性増加を測定した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、１０匹の実験ラットから得られた結果を平均値±S.E.で表した(*p＜0.05  **p＜0.001)、卵巣摘出(OVX)したラットにNCを投与することによる大脳アセチルコリン(cerebral acetylcholine；ACh)量の増加を測定した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、大脳神経細胞にて大脳ATP及びアセチルコリンの量を増加させる本発明の組成物の予想される薬理学的機作を示す図であって、本発明の組成物による脳血流(CBF)量の増加がグルコースの代謝及びコリン性神経伝達物質の合成経路に直接・間接的に影響を及ぼすと考えられる経路を概念的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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