(57)【要約】本発明は、個体における乳癌を検出および処置するための広範囲の方法および組成物を提供する。詳細には、本発明は、標的乳癌関連タンパク質を提供し、このタンパク質は、好ましくは転移が生じる前の、乳癌の迅速な検出を可能にする。この標的乳癌関連タンパク質は、例えば、標識された結合部分（例えば、そのタンパク質に特異的に結合できる標識された抗体）とサンプルとを反応させることによって検出され得る。本発明はまた、個体における乳癌の検出において有用なキットを提供する。さらに、本発明は、乳癌を処置するための標的またはこのような処置の効力をモニターするための指標のいずれかとして標的乳癌関連タンパク質を利用する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された乳癌関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、乳癌を伴うヒトの血清において、乳癌のないヒトの血清においてよりも高い濃度で検出可能であること；ならびに
（ｉ）約１６ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオンイオン交換樹脂に結合しないこと、
（ｉｉ）約１７ｋＤ、約３０ｋＤまたは約３５ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の２５ｍＭの塩化ナトリウムの存在下でアニオンイオン交換樹脂から溶出すること、
（ｉｉｉ）約２０ｋＤ、約２４ｋＤまたは約３５ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で該イオン交換樹脂から溶出すること、
（ｉｖ）約３５ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の５０ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で該イオン交換樹脂から溶出すること、
（ｖ）約１８ｋＤまたは約７１ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下でイオン交換樹脂から溶出すること、
（ｖｉ）約１２ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の１５０ｍＭの塩化ナトリウムの存在下でイオン交換樹脂から溶出すること、
（ｖｉｉ）約４２ｋＤまたは約５６ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の２００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下でイオン交換樹脂から溶出すること、あるいは
（ｖｉｉｉ）約３５ｋＤの分子量を有し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の４００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下でイオン交換樹脂から溶出すること、
という特徴を包含する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記節（ｉ）、（ｉｉｉ）または（ｖｉｉ）のポリペプチドは、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する親和性を有するとさらに特徴づけられる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記節（ｉｉ），（ｉｖ）または（ｖ）のポリペプチドは、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する親和性を有するとさらに特徴づけられる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記節（ｖｉ）のポリペプチドは、ＳＡＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する親和性を有するとさらに特徴づけられる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記節（ｖｉｉｉ）のポリペプチドは、銅ＳＥＬＤＩチップに対する親和性を有するとさらに特徴づけられる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
非免疫グロブリンタンパク質であるというさらなる特徴を包含する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
非アルブミンタンパク質であるというさらなる特徴を包含する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
さらにエピトープを包含する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
個体における癌を診断する方法であって、該個体から単離されたサンプル中で、請求項１に記載のポリペプチドの存在を検出する工程であって、該ポリペプチドは、存在する場合、該個体における癌の指標である、工程、を包含する、方法。
【請求項１０】
前記癌は乳癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、乳房組織を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルは体液を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記体液は、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、腹腔液、リンパ液、膣分泌物、精子、髄液、腹水、唾液、痰、および乳房浸出物からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液は血清である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
個体における癌を診断する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該個体からのサンプルに、癌関連タンパク質と特異的に結合する結合部分と接触させて、結合部分−癌関連タンパク質複合体を生成する工程であって、該結合部分は、請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、工程；および
（ｂ）該複合体の存在を検出する工程であって、該複合体は、存在する場合、該個体における癌の存在の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記結合部分は抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体は、ポリクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は、検出可能な部分で標識される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出可能な部分は、放射能標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された結合部分。
【請求項２２】
前記部分は、抗体、該抗体の抗原結合フラグメントまたは生合成抗体結合部位である、請求項２１に記載の結合部分。
【請求項２３】
前記結合部分は、モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の結合部分。
【請求項２４】
請求項２１に記載の結合部分を薬学的に受容可能なキャリア中に含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
個体における癌を処置する方法であって、該方法は、請求項２４に記載の組成物の治療上有効な量を該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記癌は乳癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸配列またはそれに相補的な配列。
【請求項２８】
少なくとも１５ヌクレオチドを含み、かつ請求項２７に記載の核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、単離された核酸配列。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載の核酸を、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸を、薬学的に受容可能なキャリアと混合して含む、組成物。
【請求項３２】
個体における癌を処置する方法であって、該方法は、請求項２８に記載の核酸を該個体の細胞中に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
前記癌は乳癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ヒトにおける乳癌の存在を検出する方法であって、該方法は、
該ヒトの組織または体液のサンプル中の核酸分子の存在を検出して、それにより、該ヒトにおける乳癌の存在を示す工程であって、該核酸分子は、請求項１に記載の乳癌関連タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列または該乳癌関連タンパク質を認識しそして該乳癌関連タンパク質に特異的に結合され得る核酸配列を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記方法は、前記核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る標識されたハイブリダイゼーションプローブと前記サンプルとを反応させる工程を包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
個体における癌の存在を検出する方法であって、該方法は、
該個体からのサンプルを、請求項１に記載のポリペプチドをコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブに対して特異的ハイブリダイゼーション条件下で曝露する工程、および
該核酸プローブを含む二重鎖の存在を検出する工程であって、該二重鎖の存在は、該個体における癌の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記核酸プローブに前記サンプルを曝露する工程の前に、該サンプルにおける前記標的核酸を増幅する工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は乳癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸プローブは、検出可能な部分で標識される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出可能な部分は、放射能標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
乳癌の存在を検出するためまたは乳癌の治療処置の効力を評価するためのキットであって、該キットは、以下：
哺乳動物からの組織または体液のサンプルを受けるための容器；
請求項１に記載の乳癌関連タンパク質に特異的に結合する結合部分；
該乳癌関連タンパク質に結合した該結合部分を検出するための手段；および
参照サンプル、
を組み合わせて備える、キット。
【請求項４２】
前記参照サンプルは、正常な乳房サンプルの指標である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
哺乳動物における癌を診断する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該哺乳動物から単離されたサンプルを入手する工程；および
（ｂ）配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１：配列番号１２：配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７：配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１．配列番号２２；および配列番号２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質の存在を、該サンプル中において検出する工程であって、該タンパク質は、存在する場合、該哺乳動物における癌の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記癌は乳癌である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルは、乳房組織を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルは、体液を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記体液は、血液、血清、血漿、汗、涙液、尿、腹腔液、リンパ液、膣分泌物、精子、髄液、腹水、唾液、痰、および乳房浸出物からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物における癌を診断する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該哺乳動物に由来するサンプルを、癌関連タンパク質に特異的に結合する結合部分と接触させて、結合部分−癌関連タンパク質複合体を生成させる工程であって、該結合部分は、配列番号５、配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合する、工程；および
（ｂ）該複合体の存在を検出する工程であって、該複合体は、存在する場合、該哺乳動物における癌の存在の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記癌は乳癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記結合部分は、抗体、抗体フラグメントおよび生合成抗体結合部位からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記結合部分は、抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記結合部分は、検出可能な部分で標識される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質の検出可能な量が存在しないことは、癌の非存在の指標である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
以下のさらなる工程：
（ｃ）前記サンプル中に前記タンパク質の量を測定する工程；および
（ｄ）該サンプル中の該タンパク質の量と、哺乳動物における癌の指標である閾値とを比較する工程であって、該閾値以上の該サンプル中の該タンパク質の量は、該哺乳動物における該癌の存在の指標である、工程、
をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳動物における癌の存在を検出する方法であって、該方法は以下：
該哺乳動物の組織または体液のサンプルにおける核酸分子の存在を検出し、それにより該哺乳動物における癌の存在を示す工程であって、該核酸分子は、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１：配列番号１２：配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７：配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１．配列番号２２；または配列番号２３あるいはそれらのフラグメントに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記検出工程は、前記核酸分子に特異的にハイブリダイズし得る標識されたハイブリダイゼーションプローブと前記サンプルとを合わせることを包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物における癌の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）該哺乳動物からのサンプルと、特異的ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１：配列番号１２：配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７：配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；または配列番号２３に示されるアミノ酸配列をコードする標的核酸に特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブとを合わせる工程；および
（ｂ）該核酸プローブを含む二重鎖の存在を検出する工程であって、該二重鎖の存在は、該哺乳動物における癌の指標である、工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
前記サンプルと前記核酸プローブとを合わせる工程の前に、該サンプルにおける前記標的核酸を増幅する工程をさらに包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記癌は乳癌である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸プローブは、検出可能な部分で標識される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記検出可能な部分は、放射能標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群より選択されるメンバーを含む、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、代理人整理番号ＭＴＰ−０２４により識別される有用性特許出願（発明の名称「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ」、２０００年１１月１０日出願に対する優先権、および米国特許出願番号６０／１６５，６７３号（１９９９年１１月１６日出願）；米国特許出願番号６０／２０１，７２１号（２０００年５月３日出願）の利益を主張する。これらの開示は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、乳癌の検出および／処置のための方法および組成物に関する。より特定すると、本発明は、乳癌関連タンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸に関する。これらは、乳癌検出のための細胞マーカー、および乳癌治療のための分子標的を表す。
【０００３】
（発明の背景）
乳癌は女性における死因のトップである。乳癌の病因は明らかではないが、正常な乳房上皮の悪性表現型への形質転換は、特に３０歳未満の女性において遺伝的要因の結果であり得る（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６６：６６−７１）。しかし、他の非遺伝的要因がこの疾患の病因に対する有意な効果を有するようである。その起源に関わらず、乳癌の致死率は、それがその進行における早期に検出されない場合は、有意に増加する。従って、かなりの努力が、乳房組織における形質転換周囲の早期の細胞事象の解明に充てられてきた。そのような努力は、いくつかの可能な乳癌マーカーの同定をもたらした。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の遺伝子の対立遺伝子は、遺伝および早期発症の乳癌に関連づけられた（Ｗｏｏｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：２０８８−２０９０）。野生型ＢＲＣＡ１対立遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする。その対立遺伝子における欠失および／または他の改変は、乳房上皮の形質転換と関連づけられた。従って、変異したＢＲＣＡ１対立遺伝子またはその遺伝子産物の検出は、乳癌および卵巣癌を検出するための手段として提唱された（Ｍｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，前出）。しかし、ＢＲＣＡ１は、癌マーカーとしては限界がある。なぜなら、ＢＲＣＡ１の変異は、乳癌の大部分について説明できないからである（Ｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７２：８０５−８１２）。同様に、遺伝性乳癌の形態に関連付けされたＢＲＣＡ２遺伝子は、乳癌症例の全体のうちほんの小部分を説明するだけである（Ｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，前出）。
【０００４】
いくつかの他の遺伝子が乳癌に関連づけされ、そして直接またはその遺伝子産物を介するかのいずれかで、この疾患についてのマーカーとして働き得る。そのような可能なマーカーとしては、ＴＰ３５およびその遺伝子産物、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質が挙げられる（Ｍａｌｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：１２３３−１２３８）。失調、毛細管拡張症遺伝子のような遺伝子におけるヘテロ接合性の喪失もまた、発生中の乳癌の高危険性に関連づけられた（Ｓｗｉｆｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１８３１−１８３６）。これまでに提唱されたマーカーの多くに関連する問題は、そのオンコジーン表現型はしばしば、遺伝子欠失の結果であり、従って、形質転換の予想物としての野生型の非存在の検出を要求することである。
【０００５】
従って、特異的で信頼性のあるマーカーであって、正常乳房組織および形質転換された乳房組織において示差的に発現され、そして乳癌の診断、乳癌のその発症の予想または乳癌の処置において有用であり得るものに対する当該分野における必要性が存在する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）における乳癌の存在を検出するため、およびその疾患であると診断された哺乳動物における乳癌を処置するための種々の方法および組成物を提供する。本発明は、部分的に、その各々のメンバーが、乳癌を伴う哺乳動物（例えば、ヒト）からの血清において、正常な哺乳動物、すなわち乳癌を伴わない哺乳動物からの血清に比較して、より高い濃度で検出可能である、タンパク質のファミリーを発見したことに基づく。従って、これらのタンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸配列またはそれに相補的な配列は、乳癌を診断するにおいて、乳癌治療の効力をモニターするにおいておよび／またはそのような治療の標的として有用な乳癌マーカーとして使用され得る。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、単離された乳癌関連タンパク質マーカーを提供する。このタンパク質マーカーは、乳癌を伴う哺乳動物（特に、ヒト）の血清において、乳癌を伴わない哺乳動物の血清におけるよりも高い濃度で検出可能であることで特徴づけられる。
【０００８】
１つのマーカータンパク質は、それが、約１６ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に検出可能な量で結合しないことでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【０００９】
別のマーカータンパク質は、それが、約１７ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２５ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１０】
別のマーカータンパク質は、それが、約３０ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２５ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１１】
別のマーカータンパク質は、それが、約３５ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２５ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１２】
別のマーカータンパク質は、それが、約２０ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１３】
別のマーカータンパク質は、それが、約２４ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１４】
別のマーカータンパク質は、それが、約２８ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。マイクロ配列分析は、このマーカータンパク質が、小核リボヌクレオタンパク質Ｂ”として当該分野において知られるタンパク質であると同定された（Ｈａｂｅｔｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）ＰＲＯＣ　ＮＡＴＬ　ＡＣＡＤ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４，２４２１−２４２５）。このアミノ酸配列は、配列番号５として以下に示す。
【００１５】
別のマーカータンパク質は、それが、約３５ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１６】
別のマーカータンパク質は、それが、約３５ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１７】
別のマーカータンパク質は、それが、約１８ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中１００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００１８】
別のマーカータンパク質は、それが、約７１ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中１００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＷＣＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。マイクロ配列分析は、このマーカータンパク質が、切断刺激因子の６４ｋＤ三部ユニットとしてまたはそれに関連する、当該分野で公知のタンパク質であると同定した（Ｔａｋａｇａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９８７）ＰＲＯＣ　ＮＡＴＬ　ＡＣＡＤ　Ｓｃｉ，ＵＳＡ　８９，１４０３−１４０７）。このアミノ酸配列を、以下に、配列番号２２および配列番号２３として示す。
【００１９】
別のマーカータンパク質は、それが、約１２ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中１５０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ＳＡＸ−２　ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００２０】
別のマーカータンパク質は、それが、約４２ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００２１】
別のマーカータンパク質は、それが、約５６ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、ニッケルＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００２２】
別のマーカータンパク質は、それが、約３５ｋＤの分子量を有し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下でアニオン交換樹脂に結合し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中４００ｍＭ塩化ナトリウムの存在下でそのアニオン交換樹脂から溶出することでさらに特徴づけられる。このマーカータンパク質はまた、銅ＳＥＬＤＩチップに対する結合親和性を有する。
【００２３】
さらに、上記乳癌関連タンパク質は、非免疫グロブリンおよび／または非アルブミンタンパク質であるとしてさらに特徴づけられる。さらに、この乳癌関連タンパク質は、抗原性領域またはエピトープをさらに規定し得る。この抗原性領域またはエピトープは、結合部分（例えば、抗体（例えば、その抗原性領域またはエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはその抗体フラグメント、あるいは合成抗体結合部位））に特異的に結合し得る。さらに、本発明により、当業者は、上記乳癌関連タンパク質をコードする核酸またはその乳癌関連タンパク質をコードする核酸に対して特異的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る核酸を単離することを可能にする。さらに、当業者は、当該分野において現在利用可能な方法を用いて、単離されたマーカータンパク質全体またはそのフラグメントをコードする核酸配列を生成し得（例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）。例えば、本発明の乳癌関連タンパク質は、単離されるとき、従来のペプチド配列決定プロトコルを用いて配列決定され得る。このペプチド配列に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするにおいて有用なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを生成することが可能である。次いで、このｃＤＮＡライブラリーを、得られたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングして、その単離されたタンパク質をコードする全長または部分長のｃＤＮＡ配列を単離することができる。
【００２４】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における乳癌の存在を検出するための種々の方法（例えば、タンパク質または核酸をベースにした方法）を提供する。本発明の方法は、任意の関連する組織または体液のサンプルにおいて実施され得る。例えば、本発明の方法は、乳房組織において、より好ましくは乳房生検組織において行われ得る。あるいは、本発明の方法は、血液；血清；血漿；糞便；尿；膣分泌物；髄液；唾液；腹水；腹腔液；痰および乳房浸出物からなる群より選択される、ヒト体液サンプルにおいて行われ得る。しかし、本発明の方法はまた、他の組織または体液のサンプルにおける転移した乳癌細胞を検出するにおいて有用であり得る。乳癌の検出は、当該分野において周知でありそして使用される多数のアッセイ方法のいずれか１つを用いて達成され得る。
【００２５】
１つの局面において、個体における癌を診断する方法は、その個体からのサンプルに、乳癌関連タンパク質に特異的に結合する第一の結合部分を接触させて、第一の結合部分−癌関連タンパク質複合体を形成する工程を包含する。その第一の結合部分は、上記において示される乳癌関連マーカータンパク質の少なくとも１つに特異的に結合して、複合体を形成し得る。その後、次に複合体におけるマーカータンパク質の存在および／または量が、例えば、当該分野において周知の慣用方法論を用いて、検出可能な部分（例えば、放射性標識または蛍光標識）で検出される場合第一の結合部分を介して、または第一の結合部分に対して特異的に結合する検出可能な部分で標識された第二の結合部分を介して検出され得る。従って、そのマーカータンパク質の存在または量は、個体における乳癌の存在の指標であり得る。例えば、そのサンプルにおけるマーカータンパク質の量は、乳癌の存在または非存在を示すようにその前に較正された閾値に対して比較され得る。そのような方法は、組織（例えば、乳房組織）または体液（例えば、血清）に対して行われ得るが、体液が現在好ましい試験サンプルである。
【００２６】
上記の核酸分子の検出はまた、個体における乳癌および／または転移乳癌の存在の指標として作用し得る。従って、別の局面において、本発明は、ヒトにおける乳癌を検出するための別の方法を提供する。この方法は、組織または体液のサンプル中の核酸分子の存在を検出して、それにより、個体における乳癌の存在を示す工程を包含する。この核酸分子は、（ｉ）乳癌関連タンパク質によって特異的に認識および結合され得る配列を含む核酸分子、および（ｉｉ）本明細書において示される乳癌関連タンパク質の１つ以上のうちの少なくとも一部をコードする配列を含む核酸分子からなる群より選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、この方法は、その個体からのサンプルを、核酸プローブ（例えば、１０を超え、およびより好ましくは１５を超えるヌクレオチド長であり、本明細書において示される乳癌関連タンパク質の１つをコードする標的核酸にハイブリダイズして二重鎖を形成し得る）に対して、特異的なハイブリダイゼーション条件下で暴露する工程を包含する。その後、この二重鎖の存在は、当該分野において公知および使用される、種々の検出方法を用いて検出され得る。その標的核酸は、その核酸プローブとのハイブリダイゼーションの前に、例えば、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の方法論を介して増幅され得る。
【００２８】
１つの実施形態において、その標的核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ分子））は、１５ヌクレオチドを超え、より好ましくは５０ヌクレオチドを超え、そして最も好ましくは１００ヌクレオチドを超える長さであり、そして本明細書において示される乳癌関連タンパク質の一つにおいて存在するアミノ酸配列をコードする。次いで、そのような標的ｍＲＮＡは、そのサンプルに、そのマーカータンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズし得る、標識されたハイブリダイゼーションプローブ（例えば、３２Ｐされたオリゴヌクレオチドプローブ）を反応させることによって標識ノーザンブロット分析によって検出され得る。従って、乳癌関連タンパク質をコードするかまたは乳癌関連タンパク質によって特異的に結合され得る核酸分子の検出は、試験される個体において乳癌の存在の指標として働き得る。
【００２９】
別の局面において、本発明は、乳癌の存在を検出するため、または乳癌の治療的な処置の効力を評価するためのキットを提供する。このようなキットは、組み合わせて、以下を備える：（ｉ）試験される個体からのヒト組織または体液のサンプルを受けるための容器、（ｉｉ）乳癌関連マーカータンパク質におけるエピトープ、または乳癌関連タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列または乳癌関連タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列のいずれかに特異的に結合する、結合パートナー、および（ｉｉｉ）参照サンプル。１つの実施形態において、参照サンプルは、陰性および／または陽性のコントロールを含み得る。その実施形態において、陰性のコントロールは、正常な乳房細胞型の指標であり、そしてその陽性コントロールは、乳癌の指標である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、乳癌を処置するための方法および組成物を提供する。１つの局面において、本発明は、乳癌の処置において有用な、タンパク質またはヌクレオ塩基を含有する配列を提供する。治療タンパク質は、例えば、結合部分（例えば、本明細書において示される乳癌関連タンパク質に対して特異的に結合し得る抗体（例えば、モノクローナル抗体、その抗原性結合フラグメント、または整合性抗体結合部位））であり得る。この方法は、乳癌を伴う患者に、治療有効量の化合物（好ましくは、抗体、そして最も好ましくはモノクローナル抗体であって、標的乳癌関連タンパク質に特異的に結合するもの）を投与して、それにより、そのタンパク質の生物学的活性を不活化または減少させる工程を包含する。同様に、その化合物は、低分子（例えば、有機低分子）であって、標的乳癌関連タンパク質の生物学的活性を阻害または減少するものを包含し得ることが企図される。
【００３１】
別の局面において、本発明は、乳癌を処置するための別の方法を提供する。この方法は、乳癌を有すると診断される患者に、治療有効量の化合物を投与する工程を包含する。この化合物は、標的乳癌関連タンパク質の発現をインビボで減少させて、それにより標的タンパク質の発現をインビボで減少させる。好ましい実施形態において、その化合物は、本明細書において示される乳癌関連タンパク質の少なくとも一つの少なくとも一部をコードする核酸に結合およびその発現（例えば、転写または翻訳）を減少し得る、ヌクレオ塩基含有配列（例えば、アンチセンス核酸配列またはペプチド核酸（ＰＮＡ））である。投与後、アンチセンス核酸配列またはアンチセンスＰＮＡ分子は、標的タンパク質を少なくとも一部コードする核酸配列に結合し、それにより標的乳癌関連タンパク質のインビボ発現を減少させる。
【００３２】
従って、本発明は、個体における乳癌を検出および処置するための、広汎な方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、個体において乳癌の特異的かつ初期（好ましくは転移が生じる前）の検出を可能にする、乳癌関連タンパク質を提供する。さらに、本発明は、個体における乳癌の検出において有用なキットを提供する。さらに、本発明は、乳癌の処置のためおよびそのような処置の効力をモニターするための、標的および指標として、乳癌関連タンパク質を利用する方法を提供する。本発明のこれらおよび他の多数のさらなる局面および利点は、以下の図面、詳細な説明、および以下の特許請求の範囲を考慮して明らかになる。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、乳癌の検出および処置のための方法および組成物を提供する。本発明は、部分的に、乳癌関連タンパク質の発現に基づく。このタンパク質は、乳癌を伴うヒトの血清において、乳癌を伴わないヒトの血清に比較して、検出可能に高いレベルで存在する。
【００３４】
乳癌関連タンパク質またはそのようなタンパク質をコードする核酸は、乳癌の検出においてまたは乳癌の治療のための標的として有用であるマーカーとして作用し得る。例えば、そのマーカータンパク質およびそのマーカータンパク質に結合する結合部分（例えば、抗体）またはそのマーカータンパク質をコードする核酸配列に対してハイブリダイズする核酸プローブを使用して、個体における乳癌の存在を検出し得ることが企図される。さらに、当業者乳癌を処置するための新規治療剤を生成し得ることが企図される。この治療剤としては、例えば、以下が挙げられる：インビボで標的タンパク質の生物学的活性に結合および減少または除去する個体に投与され得る抗体；その標的タンパク質をコードする遺伝子または遺伝子転写物とハイブリダイズしてそれによりインビボで標的タンパク質の発現を減少させる核酸またペプチド核酸の配列；または標的タンパク質もしくはその標的タンパク質のための他の細胞部分（例えば、レセプター）と相互作用し、それにより標的タンパク質の生物学的活性を低減または除去する低分子（例えば、有機低分子）。
【００３５】
以下に示されるのは、乳癌関連タンパク質を単離するための方法、乳癌関連タンパク質をマーカーとして使用して乳癌を検出するための方法、および癌治療のための標的として乳癌関連タンパク質を用いて乳癌に罹患した個体を処置するための方法である。
【００３６】
（１．乳癌関連マーカータンパク質を検出するための方法）
本明細書中に開示されるような、本発明のマーカータンパク質が、乳癌を伴うと診断されたヒトの血清のタンパク質組成物を、乳癌を有さないヒトの血清のタンパク質組成物と比較することによって、同定される。本明細書中で使用される場合、用語「乳癌関連タンパク質」は、乳癌を伴うと診断された個体の組織または体液において、乳癌のない個体の対応する組織または体液と比較して高いレベルで検出可能である、任意のタンパク質を意味することが理解され、そしてそのタンパク質の種改変体および対立遺伝子改変体ならびにそれらのフラグメントを含む。本明細書中で使用される場合、用語「乳癌」は、乳房組織または乳房組織細胞に関連する任意の癌または癌性病変を意味することが理解され、そして乳癌に対する前駆体（例えば、異型（ａｔｙｐｉｃａｌ）導管過形成または非異型過形成）を含み得る。マーカータンパク質または標的分子は、乳癌に罹患した個体の乳癌細胞または体液に独特であることは必要はなく、むしろそのマーカータンパク質または標的分子は、乳癌の組織または体液に由来するサンプルと、正常な乳房の組織または体液に由来するサンプルとの間を識別するために十分に高い信号雑音比を有すべきである。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、タンパク質またはアミノ酸配列の、「部分（一部）」または「フラグメント」は、そのタンパク質またはアミノ酸配列からの少なくとも１０アミノ酸（例えば、そのタンパク質または配列のアミノ酸１〜１０、３４〜４３、または１２７〜１３６）を連続して含む、連続的ペプチドを意味する。好ましくは、そのペプチドは、そのタンパク質またはアミノ酸配列からの少なくとも２０アミノ酸を、連続して含む。より詳細には、そのペプチドは、そのタンパク質またはアミノ酸配列からの少なくとも４０アミノ酸を、連続して含む。
【００３８】
本発明の乳癌関連マーカータンパク質は、乳癌を伴う個体の血清において存在するタンパク質を、乳癌のない個体の血清において存在するタンパク質に対して比較することによって、同定された。アルブミンタンパク質および免疫グロブリンタンパク質が、この血清から除去され、そしてそのタンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーによって１２個の画分へと分離された。簡潔には、そのタンパク質が、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の存在下で強アニオン交換カラムにロードされ、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中の塩化ナトリウムの段階勾配を用いて溶出した。得られた１２個の画分は、フロースルー画分、２５ｍＭ塩化ナトリウムにて溶出する画分、５０ｍＭ画分、７５ｍＭ画分、１００ｍＭ画分、１２５ｍＭ画分、１５０ｍＭ画分、２００ｍＭ画分、２５０ｍＭ画分、３００ｍＭ画分、４００ｍＭ画分および２Ｍ画分を含む。
【００３９】
各画分は、ＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離およびイオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ））質量分光法によって、分析された。この１２個の画分の各々からのサンプルは、４つの異なるＳＥＬＤＩチップ表面のうちの１つに適用された。銅ＳＥＬＤＩ表面またはニッケルＳＥＬＤＩ表面が、エチレンジアミン三酢酸を含むチップに、銅塩溶液またはニッケル塩溶液を添加することによって生成され得る。他のＳＥＬＤＩチップ表面としては、カルボキシレート部分を含むＷＣＸ−２、ならびに四級アンモニウム部分を含むＳＡＸ−２が、挙げられる。従って、本発明の乳癌関連タンパク質は、乳癌のない個体と比較して乳癌を有する個体の血清におけるその増加した存在、その分子量、アニオン交換樹脂上での結合および溶出の特徴、ならびに特定のＳＥＬＤＩチップに対するそれらの親和性によって、特徴づけられ得る。例えば、本明細書中で使用される場合、用語、特定のＳＥＬＤＩチップに対する「親和性」は、本発明の乳癌関連タンパク質が、１つの型のＳＥＬＤＩチップ（例えば、銅ＳＥＬＤＩチップ）に対して、本明細書中に開示される他のＳＥＬＤＩチップ（例えば、ニッケルのＳＡＸ−２チップおよびＷＣＸ−２チップ）のうちの１つ以上に対してと比較して、優先的に結合することを意味するが理解される。実施例１に詳細に議論されるように、罹患個体由来の血清と健常個体由来の血清の比較は、罹患個体の血清において検出可能なレベルで頻繁に存在するが、健常個体の血清において匹敵するレベルではまれにしか存在しない、多数のタンパク質を明らかにした。
【００４０】
一旦この乳癌関連タンパク質が質量分光法によって同定されると、同定されたタンパク質は、標準的タンパク質単離方法によって単離され得、そして当該分野で公知でありそして使用されるタンパク質配列決定技術を使用して配列決定され得る。例えば、実施例５および実施例６を参照のこと。一旦そのアミノ酸配列が同定されると、その後、マーカータンパク質またはその部分をコードする核酸が、従来の組換えＤＮＡ方法を使用して同定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、単離された乳癌関連タンパク質は、従来のペプチド配列決定プロトコル、およびｃＤＮＡライブラリーを配列決定するために設計されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、配列決定され得る。次いで、ｃＤＮＡライブラリーが、得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、その単離されたマーカータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列または部分長ｃＤＮＡ配列を単離するためにスクリーニングされ得る。
【００４１】
本発明において有用なマーカータンパク質は、本明細書中で同定される特定の配列のみならず、マーカータンパク質としても機能するその対立遺伝子改変体および関連タンパク質もまた包含する。従って、例えば、選択的スプライス形態、翻訳後修飾、または遺伝子重複から生じる配列が、各々本発明によって包含される。種改変体もまた、本発明によって包含され、患者が非ヒト哺乳動物である。マーカータンパク質として機能し得る他の相同性タンパク質もまた、想定される。
【００４２】
好ましくは、改変体配列は、本明細書中に開示される配列のうちの１つの少なくとも一部に対して、少なくとも８０％類似または７０％同一、より好ましくは、少なくとも９０％類似または８０％同一、そして最も好ましくは、９５％類似または９０％同一である。
【００４３】
候補ペプチド領域が、参照ポリペプチドまたはペプチドオリゴマーに対して、必要とされる％の類似性または同一性を有するか否かを決定するために、候補アミノ酸配列と参照アミノ酸配列とを、まず、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）、「Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ」、ＰＮＡＳ（１９９２年１１月）８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載のＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスと組み合わせて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載の動的プログラミングアルゴリズム（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して整列させる。本発明のために、ギャップ挿入ペナルティー（ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）について適切な値は−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）について適切な値は−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムおよびＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して整列を実行するコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージソフト（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ））が市販されており、そして、当業者によって広範に使用されている。
【００４４】
一旦、候補配列と参照配列との間でアラインメントが作成されると、％類似性スコアが算出され得る。各配列の個々のアミノ酸を、互いに対するその類似性によって連続的に比較する。整列された２つのアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスでの値が０または負の数である場合、対様式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）の類似性スコアは０である；それ以外では、対様式の類似性スコアは１．０である。生類似性スコアは、整列されたアミノ酸の対様式の類似性スコアの合計である。次いで、この生スコアを、候補配列または参照配列のうちのより少数の方におけるアミノ酸数で除算することによって、この生スコアを正規化する。この正規化された生スコアが、％類似性である。あるいは、％同一性を算出するために、各配列の整列されたアミノ酸を、再度、連続的に比較する。アミノ酸が同一ではない場合、対様式の同一性スコアは０である；それ以外では、対様式の同一性スコアは１．０である。生同一性スコアは、整列された同一アミノ酸の合計である。次いで、この生スコアを、候補配列または参照配列のうちのより少数の方におけるアミノ酸数で除算することによって、この生スコアを正規化する。この正規化された生スコアが、％同一性である。％類似性および％同一性を算出する目的のためには、挿入および欠失は無視する。従って、ギャップペナルティーは、この計算においては使用されないが、最初のアラインメントにおいて使用される。
【００４５】
すべての場合において、上記のような天然に存在する配列の改変体は、マーカータンパク質としてのその機能について試験されなければならない。詳細には、特定の形態または特定の生物学的画分におけるその存在または非存在が、個体における癌の存在または非存在の指標でなければならない。この慣用的な実験は、本明細書中以降に記載される方法によってか、または当該分野において公知の他の方法によって実施され得る。
【００４６】
組織または体液のサンプルにおけるマーカータンパク質は、結合アッセイ（ここで、マーカータンパク質に対する結合パートナーは、マーカータンパク質を含むことが疑われるサンプル中に導入される）を通して検出され得る。このようなアッセイでは、結合パートナーは、例えば、放射性同位体マーカーまたは蛍光マーカーで検出可能に標識され得る。標識された抗体が、選択されたマーカータンパク質を単離するために、類似の様式で使用され得る。マーカータンパク質をコードする核酸は、このマーカータンパク質をコードする配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有する核酸プローブを使用して検出され得る。ＰＣＲのような技術、そして特に、逆転写酵素ＰＣＲのような技術は、マーカータンパク質をコードする核酸を単離するために有用な手段である。以下に続く実施例は、乳癌関連タンパク質の単離および特徴付け、ならびに乳癌の検出および処置においてそれを使用する方法の詳細を提供する。
【００４７】
（２．乳癌の検出）
一旦、乳癌関連タンパク質が同定されると、そのタンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸をマーカーとして使用して、個体が乳癌を有するか否かを決定し得、そして有する場合には、適切な検出方法を使用して、疾患の状態をモニターし得る。
【００４８】
マーカータンパク質またはそのタンパク質をコードする核酸を使用して、当業者は、ヒトにおいて乳癌を検出するための種々の検出方法を作出し得る。この方法は、代表的に、いくつかの手段によって、ヒトの組織または体液のサンプル中において、１つ以上の乳癌関連タンパク質またはこのようなタンパク質をコードする核酸の存在を検出する工程を包含する。ヒトにおいて乳癌を検出する方法の正確性および／または信頼度は、予め選択された組織または体液のサンプル中において、複数の乳癌関連タンパク質および／または核酸の存在を検出することによって、さらに増強され得る。検出アッセイは、本明細書中以降に記載の１以上のプロトコールを含み得る。
【００４９】
（２．Ａ．タンパク質ベースのアッセイ）
サンプル中のマーカータンパク質は、例えば、このマーカータンパク質と、このマーカータンパク質を特異的に結合し得る結合部分とを組み合わせることにより検出され得る。この結合部分は、例えば、リガンド−レセプター対（すなわち、特異的結合相互作用を有し得る分子の対）のメンバーを含み得る。この結合部分は、例えば、抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質のような特異的結合対、または当該分野で公知の他の特異的結合対のメンバーを含み得る。結合タンパク質は、標的タンパク質に対する増強された親和性を有するように設計され得る。必要に応じて、この結合部分は、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、放射活性標識、リン蛍光標識または呈色粒子（ｃｏｌｏｒｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）標識）と連結され得る。この標識された複合体は、例えば、可視的に検出され得るか、または分光光度計もしくは他の検出器の補助により検出され得る。
【００５０】
マーカータンパク質はまた、当該分野で利用可能なゲル電気泳動技術を用いて検出され得る。二次元ゲル電気泳動において、このタンパク質は、それらの等電点に従って、最初にｐＨ勾配ゲルにおいて分離される。ついで、得られたゲルを、第２のポリアクリルアミドゲル上に配置し、そしてタンパク質を分子量に従って分離する（例えば、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１を参照のこと）。
【００５１】
１以上のマーカータンパク質は、乳癌を有すると疑われる個体から得られたサンプルからタンパク質を最初に分離し、次いで、このタンパク質を二次元ゲル電気泳動により分離して、特徴的な二次元ゲル電気泳動パターンを生成することにより検出され得る。次いで、このパターンは、正常細胞もしくは癌細胞から単離されたタンパク質を同じまたは類似の条件下で分離することにより生成された標準的ゲルパターンと比較され得る。この標準的なゲルパターンは、保存され、そして電気泳動パターンの電子データベースから検索され得る。二次元ゲル中の乳癌関連タンパク質の存在は、試験されたサンプルが乳癌を有する個体から採取したという指標を提供する。本明細書中で記載される他の検出アッセイを用いても同様に、例えば、二次元ゲル電気泳動パターンにおける２以上のタンパク質の検出により、このアッセイの精度がさらに増強される。複数の（例えば、２〜５）乳癌関連タンパク質が二次元ゲル上に存在することは、個体における乳癌の存在のさらによい強い指標を提供する。従って、このアッセイは、乳癌の早期検出および処置を可能にする。
【００５２】
乳癌関連マーカータンパク質はまた、当該分野で利用可能な広範なイムノアッセイのいずれかを用いて検出され得る。例えば、当業者は、体液サンプル中において乳癌を検出するためのサンドイッチイムノアッセイフォーマットを用い得る。あるいは、当業者は、１以上の標識された結合タンパク質を用いて、組織サンプル中の乳癌関連タンパク質の存在を検出するために、従来の免疫組織化学的手順を用い得る。
【００５３】
サンドイッチイムノアッセイにおいて、マーカータンパク質を結合し得る２つの抗体が一般に用いられ、例えば、１つは、固体支持体上に固定化され、そして１つは、溶液中で遊離しており、そして検出可能な化合物で標識されている。第２の抗体のために用いられ得る化学標識の例としては、放射性同位体、蛍光化合物、および酵素、または反応性基質もしくは酵素基質に曝された場合に、呈色産物または電気化学的に活性な産物を生成する他の分子が挙げられる。マーカータンパク質を含むサンプルが、この系におかれる場合、このマーカータンパク質は、固定化抗体および標識抗体の両方に結合して、支持体表面で「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。この複合体化したタンパク質は、非結合サンプル成分および過剰な標識抗体を洗い流し、そして支持体表面上のタンパク質に複合体化した標識抗体の量を測定することにより検出される。あるいは、溶液中で遊離した抗体（化学的部分（例えば、ハプテン）で標識され得る）は、遊離抗体を結合する検出可能な部分（すなわち、例えば、抗体に連結されたハプテン）で標識された第３の抗体により検出され得る。
【００５４】
サンドイッチイムノアッセイおよび組織免疫化学的手順の両方は、良好な検出限界を有する標識を用いれば、非常に特異的かつ非常に高感度である。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な総説は、当該分野における多くの教科書（「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．編（１９８４）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよび「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｈａｒｌｏｗら編（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが挙げられる）において見出され得る。
【００５５】
一般に、イムノアッセイ設計の考慮事項としては、標的タンパク質に対して十分に高い結合特異性を有して、非特異的相互作用の産物とは信頼性が高く区別され得る複合体を形成する抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）の調製が挙げられる。本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、結合タンパク質、例えば、標的タンパク質に対する適切な結合親和性および特異性を有する、抗体、または免疫グロブリン可変領域様結合ドメインを含む他のタンパク質を意味することが理解される。抗体結合特異性が高くなるほど、検出され得る標的タンパク質濃度は低くなる。本明細書中で使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、結合部分、例えば、結合タンパク質が約１０５Ｍ−１より高い、より好ましくは、約１０７Ｍ−１より高い標的タンパク質に対する結合親和性を有することを意味することが理解される。
【００５６】
個体における乳癌を検出するためのアッセイにおいて有用な、単離された標的乳癌関連タンパク質に対する抗体は、当該分野で周知であり、そして当該分野で示された標準的な免疫学的手順を用いて生成され得る。例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔ，Ｎ．Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９８４を参照のこと。簡潔には、単離された標的タンパク質は、外因性の宿主（例えば、マウス、ヤギ、または他の適切な哺乳動物）において抗体を惹起するために用いられる。このマーカータンパク質は、宿主における抗体生成を増強し得る適切なアジュバントと組み合わされ、そして例えば、腹腔内投与により宿主に注射される。宿主の免疫応答を刺激するために適切な任意のアジュバントが用いられ得る。一般に用いられるアジュバントは、フロイント完全アジュバント（殺傷および乾燥させた微生物細胞を含むエマルジョンであり、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏまたはＧｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能）である。複数回の抗原注射が望まれる場合、引き続く注射は、不完全アジュバント（例えば、細胞非含有エマルジョン）と組み合わせて抗原を含み得る。ポリクローナル抗体は、目的のタンパク質に対する抗体を含む血清を引き出すことにより抗体生成宿主から単離され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を生成する宿主細胞を単離し、これらの細胞を、免疫学分野で公知の標準的手順を用いてミエローマ細胞と融合し、そして標的タンパク質と特異的に反応し、かつ所望の結合親和性を有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることにより生成され得る。
【００５７】
抗体結合ドメインはまた、生合成により生成され得、そして結合ドメインのアミノ酸配列は、標的タンパク質上の好ましいエピトープとの結合親和性を増強するために操作され得る。特定の抗体方法論は、十分に理解され、かつ文献において記載されている。それらの調製のより詳細な記載は、例えば、「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（１９８４）（前出）に見出され得る。
【００５８】
さらに、遺伝子操作された生合成抗体結合部位（当該分野でＢＡＢＳまたはｓＦｖ’としても公知）は、本発明の実施において用いられ得る。以下を含むＢＡＢＳを作製および使用するための方法は、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第４，７０４，６９２号；および同第４，９４６，７７８号に開示される：（ｉ）非共有結合またはジスルフィド結合した合成ＶＨおよびＶＬダイマー、（ｉｉ）共有結合したＶＨおよびＶＬ単鎖結合部位、（ｉｉｉ）個々のＶＨおよびＶＬドメイン、または（ｉｖ）単鎖抗体結合部位。さらに、乳癌関連タンパク質に対する不可欠な特異性を有するＢＡＢＳは、コンビナトリアル遺伝子ライブラリーからのファージ抗体クローニングにより得られ得る（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８を参照のこと）。簡潔には、それらのコート表面上に、単離された乳癌関連タンパク質またはそれらのフラグメントで予め免疫されたマウスに由来する可変領域遺伝子配列によりコードされる免疫グロブリン可変領域を有するＢＡＢＳを発現するファージの各々は、固定化された乳癌関連タンパク質に対する結合活性についてスクリーニングされる。固定化された乳癌関連タンパク質に結合するファージが採取され、そしてＢＡＢＳをコードする遺伝子が配列決定される。次いで、目的のＢＡＢＳをコードする得れらた核酸配列は、従来の発現系で発現されて、ＢＡＢＳタンパク質を生成し得る。
【００５９】
単離された乳癌関連タンパク質はまた、組織サンプルまたは体液サンプル中のタンパク質のレベルをモニターするための診断および他の組織評価キットおよびアッセイの開発のために用いられ得る。例えば、このキットは、抗体または他の特異的結合タンパク質を含み得、これらの抗体または他の特異的結合タンパク質は、組織サンプルもしくは体液サンプル中で乳癌関連タンパク質に特異的に結合し、そして乳癌関連タンパク質の存在および／または濃度の検出および／または定量を可能にする。
【００６０】
乳癌関連タンパク質を検出するために適切なキットは、例えば、評価されるサンプルを捕捉するための容器または他の手段、および本明細書中に記載の１以上の乳癌関連タンパク質のサンプル中の存在および／または量を検出するための手段を含むことが意図される。本明細書中で記載される場合、「検出するための手段」は、１つの実施形態において、これらのタンパク質に特異的な１以上の抗体およびこれらのタンパク質に対する抗体の結合を検出するための手段（例えば、本明細書中で記載の標準的なサンドイッチイムノアッセイにより）を含む。例えば、組織サンプル由来のような、細胞内のタンパク質の存在が検出されるべき場合、このキットはまた、細胞内タンパク質を曝すように細胞構造を破壊するための手段を含み得る。
【００６１】
（２．Ｂ．核酸ベースのアッセイ）
個体における乳癌の存在は、組織サンプルまたは体液サンプル中で、乳癌関連タンパク質をコードする核酸分子を検出することにより測定され得る。当業者に周知の方法を用いて、本発明の乳癌関連タンパク質が配列決定され、次いで、この決定された配列に基づいて、ｃＤＮＡスクリーニングのためのオリゴヌクレオチドプローブが設計される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出を参照のこと）。
【００６２】
マーカー乳癌関連タンパク質をコードする標的核酸分子は、この標的核酸を特異的に結合し得る標識した結合部分を用いて検出され得る。この結合部分は、例えば、タンパク質、核酸またはペプチド核酸を含み得る。さらに、標的核酸（例えば、乳癌関連タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、例えば、標識したオリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸の少なくとも一部分に相補的、かつこの部分と特異的にハイブリダイズし得る核酸フラグメント）を用いたノザンブロット分析を行うことにより検出され得る。
【００６３】
より具体的には、乳癌関連ヌクレオチド配列もしくは乳癌関連タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ、または好ましくはＤＮＡを含む遺伝子プローブを、確立された組換え技術またはオリゴヌクレオチド合成を用いて生成し得る。このプローブは、試験標本に存在する相補的核酸配列とハイブリダイズし、そして最高の特異性を提供し得る。短く十分に規定されたプローブ（単一の独特の配列をコードする）は、大部分は、正確かつ好ましい。より長いプローブは、一般には、あまり特異的でない。任意の長さのオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得るが、代表的には、８〜１００ヌクレオチドの範囲内、好ましくは、１５〜５０ヌクレオチドの範囲内のオリゴヌクレオチドが、標準的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて最も有用であると想定される。プローブの長さおよび配列の選択は、所望の特異性の程度の選択を可能にする。ハイブリダイゼーションは、必要とされる相補性の程度を設定するための高塩緩衝溶液、ホルムアミドまたは他の薬剤中で５０〜６５℃で行われる。さらに、プローブが任意のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を本質的に認識するように製造され得ることは、技術水準である。さらなる詳細については、例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｅｒｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，１９８７を参照のこと。
【００６４】
これらのプローブもしくは抗体に連結される広範な種々の異なる標識は、アッセイにおいて用いられ得る。標識された試薬は、アッセイの設計に依存して、溶液中に提供され得るか、または不溶性支持体に結合され得る。種々の結合体は、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合され得る。共有結合された場合、特定の連結基は、結合される２つの部分の性質に依存する。多数の連結基および連結のための方法は文献中に教示されている。広範には、これらの標識は、以下のカテゴリーに分けられ得る：クロモゲン；触媒反応；化学発光；放射活性標識；およびコロイドサイズの呈色粒子。このクロモゲンとしては、呈色が観察され得るように特有の範囲で光を吸収する化合物、または特定の波長または波長範囲の光で照射されると光を発する化合物（例えば、蛍光剤）が挙げられる。酵素的触媒および非酵素的触媒の両方が用いられ得る。酵素の選択において、アッセイが設計される型のサンプル中にこの酵素が通常存在するか否かにかかわらず、酵素の安定性、基質の性質、および存在するならば酵素の特性に対する結合体の効果を含む多くの考慮事項が存在する。潜在的に有用な酵素標識としては、オキシドレダクターゼ（ｏｉｘｉｏｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、またはシンセターゼが挙げられる。相互に関係のある酵素系もまた用いられ得る。化学発光標識は、化学反応により電子的に励起される化合物を伴い、次いで、検出可能なシグナルとして働くか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する光を発し得る。放射活性標識としては、水素、ヨウ素、リンなどの不安定な形態のような一般的な使用において見出される種々の放射性同位体が挙げられる。コロイドサイズの呈色粒子は、概して、可視的に検出可能な特有の点（検出される物質の部位に対応する）を形成するコロイド金のような物質を含む。標識技術におけるさらなる情報は、例えば、米国特許第４，３６６，２４１号に開示される。
【００６５】
ヌクレオチドプローブのインビトロ標識の一般的方法は、非標識ＤＮＡプローブが、二本鎖フラグメントのいずれかの鎖内に遊離の３’ヒドロキシル末端を生じるようにエンドヌクレアーゼでニックが入れられたニックトランスレーションを含む。同時に、エキソヌクレアーゼは、ニックの５’ホスホリル側からヌクレオチド残基を除去する。置換ヌクレオチドの配列は、二重鎖の反対の鎖の配列により決定される。従って、標識されたヌクレオチドが供給される場合、ＤＮＡポリメラーゼは、標識されたヌクレオチドでニックを埋める。この周知の技術を用いると、分子の５０％までが標識され得る。より小さなプローブに関しては、３’末端標識を含む公知の方法が用いられ得る。さらに、蛍光分子、触媒、酵素または化学発光物質でＤＮＡを標識する、現在市販される方法が存在する。ビオチン標識キットは、商標Ｂｉｏ−Ｐｒｏｂｅのもとで市販される（Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．）。この型の系は、プローブがアビジンに連結されることを可能とし、続いてこのアビジンは、例えば、蛍光分子、酵素、抗体などで標識され得る。プローブ構築および技術に関するさらなる開示については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８２）を参照のこと。
【００６６】
標的核酸にハイブリダイズするために選択されたオリゴヌクレオチド（化学合成もしくは組換えＤＮＡ方法論のいずれによるかに拘わらず）は、標準的技術を用いて単離および精製され、次いで、好ましくは、標準的標識プロトコルを用いて、（例えば、３５Ｓまたは３２Ｐで）標識される。次いでＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に記載されるように、この標的核酸を含むサンプルを、電気泳動ゲル上で泳動し、分散した核酸をニトロセルロースフィルターに転写し、そして標識したオリゴヌクレオチドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、４２℃で５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．１％  ＳＤＳ）でフィルターに曝す。次いで、このフィルターを、６８℃で２×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、より好ましくは、６８℃で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳを用いて洗浄し得る。当該分野で公知の他の有用な手順としては、溶液ハイブリダイゼーション、ならびにドットハイブリダイゼーションおよびスロットＲＮＡハイブリダイゼーションが挙げられる。次いで、必要に応じて、サンプル中に存在する標的核酸の量を、ハイブリダイズしたフラグメントの放射活性を測定することにより、当該分野で公知の標準的手順を用いて定量する。
【００６７】
さらに、オリゴヌクレオチドはまた、標的タンパク質ファミリーのメンバーをコードする他の配列を同定するために用いられ得る。この方法論はまた、本明細書中に記載のタンパク質をコードする核酸配列と関連し、これらの遺伝子の発現において機能的役割を果たし得る遺伝子配列を同定するために（例えば、タンパク質コード配列の上流または下流に存在する非コード配列を同定するために）用いられ得る。さらに、結合アッセイは、例えば、タンパク質の遺伝子調節または遺伝子発現に関与し得る、乳癌関連タンパク質をコードする核酸と特異的に結合相互作用し得るタンパク質を同定および検出するために行われ得る。さらなる実施形態において、本明細書中に記載のアッセイは、乳癌関連タンパク質により特異的に認識され得、そして結合され得る配列を含む核酸分子を同定およに検出するために用いられ得る。
【００６８】
さらに、適切なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ（すなわち、１を超えるプライマー）を用いることにより、当業者は、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順により（例えば、定量的ＰＣＲにより）、インビボでの標的遺伝子の発現レベルを決定し得ることが理解される。従来のＰＣＲベースのアッセイは、例えば、Ｉｎｎｅｓら（１９９０）「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、およびＩｎｎｅｓら（１９９５）「ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにおいて議論される。
【００６９】
（３．インビボで乳癌関連タンパク質と相互作用するタンパク質の同定）
さらに、当業者は、本明細書中以下に記載されるような手順を用いて、本明細書中に記載の乳癌関連タンパク質とインビボで相互作用する他の分子を同定し得ることが意図される。このような分子はまた、化学療法についての可能な標的を提供し得る。
【００７０】
例示目的のために、乳癌関連タンパク質と相互作用し得るタンパク質またはペプチドをコードするｃＤＮＡは、Ｄｕｒｆｅｅら（１９９３）Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖｅｌｏｐ．７：５５５−５５９に報告されているように、ツーハイブリッドアッセイを用いて決定され得る。このツーハイブリッド系の原理は、２つのタンパク質の非共有結合的相互作用が、通常これらのタンパク質が直接役割を果たさないプロセス（転写）において機能するドメインに対するそれらの共有結合のために、このプロセスを誘発することである。例えば、ツーハイブリッドアッセイにおいて、レポーター遺伝子の検出可能な発現は、２つの融合タンパク質（一方は、ＤＮＡ結合ドメインを含み、もう一方は、転写開始ドメインを含む）が相互作用する場合に生じる。
【００７１】
当業者は、Ｄｕｒｆｅｅら（１９９３）前出に報告された、１以上のレポーター遺伝子を含む宿主細胞（例えば、酵母株Ｙ１５３）を用い得る。この株は、２つの染色体に位置したレポーター遺伝子を保有し、この遺伝子の発現は、Ｇａｌ４により調節される。第１のレポーター遺伝子は、Ｇａｌ４プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。第２のレポーター遺伝子は、選択可能なＨＩＳ３遺伝子である。他の有用なレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子が挙げられ得る。
【００７２】
２つのセットのプラスミドがツーハイブリッド系において用いられる。一方のセットのプラスミドは、乳癌関連タンパク質をコードするＤＮＡにインフレームで融合されたＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡを含む。他方のセットのプラスミドは、ヒトリンパ球から構築したヒトｃＤＮＡライブラリーの一部に融合されたＧａｌ４活性化ドメインをコードするＤＮＡを含む。第１のセットのプラスミドからの発現は、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインおよび乳癌関連タンパク質を含む融合タンパク質を生じる。第２のセットのプラスミドからの発現は、リンパ球ｃＤＮＡライブラリーからの発現産物に融合された転写活性化タンパク質を生じる。２つのプラスミドがＧａｌ４欠損宿主細胞（例えば、上記の酵母Ｙ１５３細胞）へ形質転換された場合、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの相互作用は、このＤＮＡ結合ドメインに融合した乳癌関連タンパク質が、転写活性化ドメインに融合したリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから発現されたタンパク質に結合した場合にのみ生じる。乳癌関連タンパク質とそのインビボでの結合パートナーとの間のタンパク質間相互作用の結果として、検出可能なレベルのレポーター遺伝子発現が生じる。
【００７３】
乳癌関連タンパク質とインビボで相互作用する分子を同定することに加えて、当業者はまた、分子、例えば、乳癌関連タンパク質とそのインビボでの結合パートナーとの間の特異的相互作用を改変または阻害する低分子をスクリーニングし得る。
【００７４】
例えば、宿主細胞は、上記で議論されるように、適切なＤＮＡ結合ドメイン／乳癌関連タンパク質ハイブリッドおよび翻訳活性化ドメイン／推定乳癌関連タンパク質結合パートナーをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ得る。この宿主細胞はまた、転写因子ＤＮＡ結合ドメインにより認識されるシス作用性転写活性化エレメントと作動可能に連結した適切なレポーター遺伝子を含み得る。この系において発現されるレポーター遺伝子のレベルがアッセイされる。次いで、この宿主細胞は、候補分子に曝され、そしてレポーター遺伝子発現のレベルが検出される。レポーター遺伝子発現の減少は、乳癌関連タンパク質とそのインビボ結合パートナーに関する複合体形成または安定性を妨害する候補の能力の指標である。コントロールとして、他の関連しないタンパク質−タンパク質複合体を妨害する候補分子の能力もまた試験される。乳癌関連タンパク質／結合パートナー相互作用を特異的に妨害し得るが、他のタンパク質−タンパク質相互作用は妨害し得ない分子は、生成およびさらなる分析のための候補として同定される。一旦潜在的な候補が同定されると、細胞周期および細胞複製を調節することにおけるその有効性は、標準的な細胞周期モデル系においてアッセイされ得る。
【００７５】
候補分子は、本明細書中以下に記載されるように生成され得る。例えば、この候補分子をコードするＤＮＡが、当該分野で十分に記載された従来技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）前出を参照のこと）を用いて任意の種々の発現ベクターに挿入され得、そして全長および短縮化形態の両方を含む組換えタンパク質を生成するために適切な宿主細胞にトランスフェクトされ得る。有用な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ、昆虫／バキュロウイルス細胞系、ミエローマ細胞および種々の他の哺乳動物細胞が挙げられる。このようなタンパク質の全長形態は、好ましくは、本明細書中で開示されるように、哺乳動物細胞において発現される。このヌクレオチド配列はまた、好ましくは、例えば、ラージＴ抗原（当該分野で十分に特徴づけされている）の８アミノ酸核標的化配列をコードする配列を用いて、翻訳された配列を核に標的化するための配列を含む。ベクターは、組換えタンパク質の正しい発現を促進するための種々の配列をさらに含み得る。これらの配列としては、転写プロモーターおよび転写終結配列、エンハンサー配列、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、好ましいタンパク質プロセシング配列、タンパク質分泌のための好ましいシグナル配列などが挙げられる。目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列はまた、潜在的阻害配列を除去するか、または望まれない二次構造形成を最小にするように操作され得る。当業者に理解されるように、この組換えタンパク質はまた、融合タンパク質として発現され得る。
【００７６】
翻訳後、このタンパク質は、細胞自体から精製され得るか、または培養培地から回収され得る。このＤＮＡはまた、組換えタンパク質の発現および／または精製を補助する配列を含み得る。このＤＮＡは、直接発現され得るか、または容易に切断可能な融合の接合部を有する融合タンパク質の一部として発現され得る。
【００７７】
このＤＮＡはまた、適切な哺乳動物宿主において発現され得る。有用な宿主としては、線維芽細胞３Ｔ３細胞（例えば、ＣＲＬ１６５８のＮＩＨ  ３Ｔ３）、ＣＯＳ（サル腎臓細胞ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５０）またはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）（例えば、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１、Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２２）、ミンク肺上皮細胞（ＭＶ１Ｌｕ）、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト神経膠芽腫細胞、および奇形癌細胞が挙げられる。他の有用な真核生物細胞系としては、酵母細胞、昆虫／バキュロウイルス系、またはミエローマ細胞が挙げられる。
【００７８】
候補分子を発現するために、このＤＮＡを、適切なプロモーター／エンハンサー配列および３’終結配列とともに、適切な市販のベクターの挿入部位にサブクローニングする。有用なプロモーター／エンハンサー配列の組み合わせとしては、例えば、ｐＣＤＭ８に存在するＣＭＶプロモーター（ヒトサイトメガロウイルス（ＭＩＥ）プロモーター）、およびラウス肉腫ウイルスＬＴＲエンハンサー配列（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）によりブーストされる乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）が挙げられる。有用な誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｚｎ２＋メタロチオネインプロモーター（Ｗｒａｎａら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１００３−１０１４）のようなＺｎ２＋誘導性プロモーターが挙げられる。他の誘導性プロモーターは、当該分野で周知であり、そして同様に首尾よく使用され得る。トランス作用性エンハンサー配列を用いて、発現もまたさらに増強され得る。プラスミドもまた、好ましくは、増幅可能なマーカー（例えば、適切なプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（ＡＴＣＣ＃３７１４８））の制御下でのＤＨＦＲ）を含む。トランスフェクション、細胞培養、遺伝子増幅およびタンパク質発現の条件は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８９）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．に記載されるような、当該分野で周知の標準的な条件である。簡潔には、トランスフェクトした細胞を５〜１０％の透析したウシ胎仔血清（ｄＦＣＳ）を含む培地で培養し、そして安定にトランスフェクトされた高発現細胞株を、増幅およびサブクローニングにより得て、そして標準的なウェスタンブロット分析およびノザンブロット分析により評価する。サザンブロットもまた、組み込まれた配列の状態およびそれらのコピー数の増幅の程度を評価するために用いられ得る。
【００７９】
次いで、発現された候補タンパク質は、標準的な手段を使用して精製される。現在好ましい方法は、アフィニティーカラム（例えば、リガンドアフィニティーカラムまたは抗体アフィニティーカラム）を使用する。次いで、カラムを洗浄し、そして漸増イオン強度の勾配下、ｐＨの変化下、または穏やかな界面活性剤の添加下で、候補分子を選択的に溶出する。乳癌関連タンパク質に結合する候補分子に加えて、乳癌関連タンパク質自体が、このような組換えＤＮＡ技術を使用して同様に産生され得ることが理解される。
【００８０】
（４．乳癌治療および治療をモニターするための方法）
当業者は、乳癌関連タンパク質および乳癌関連タンパク質と相互作用するタンパク質を同定した後、乳癌を処置するための種々の治療を開発し得る。本明細書中に記載のマーカータンパク質は、正常な乳房細胞と比較して、乳癌細胞においてより高レベルで検出可能に存在するので、当業者は、例えば、これらのマーカータンパク質および／またはこれらのマーカータンパク質をコードする核酸を、癌化学療法のための標的分子として使用し得る。
【００８１】
（４．Ａ．アンチセンスベースの治療剤）
想定される特に有用な癌治療剤は、マーカータンパク質をコードする遺伝子の一部または全部あるいはマーカータンパク質をコードする転写物の一部または全部に相補的でありかつ生理学的条件下でハイブリダイズし得る、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列であり、このハイブリダイズによって、このマーカータンパク質遺伝子の転写および／または翻訳を減少または阻害する。あるいは、同じ技術が、乳癌関連タンパク質と相互作用するタンパク質の転写および／または翻訳を減少または阻害するために、適用され得る。
【００８２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、正常細胞および異常な細胞において遺伝子発現を阻害するために広範に使用されている。アンチセンス理論及び確立されたプロトコルの適切な概論については、例えば、Ｓｔｅｉｎら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９−２６６８を参照のこと。さらに、アンチセンスベースの治療剤としてのペプチド核酸の合成および使用は、ＰＣＴ公開ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１２９１（１９９２年１１月２６日公開）、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０９２１（１９９３年６月２４日公開）、およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１３５２３（１９９５年６月１日公開）に記載される。従って、アンチセンスベースの治療剤は、単独でかまたは他の治療と組み合わせて、化学療法の部分として使用され得る。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸配列は、遺伝子および／またはｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし得、従って、本明細書中に記載のタンパク質の転写および／または翻訳を阻害するために使用され得る。しかし、オリゴリボヌクレオチド配列は、一般に、デオキシリボヌクレオチド配列よりも、リボヌクレアーゼによる酵素的攻撃に対してより感受性であることが理解されている。それゆえ、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、インビボでの治療的使用のためにはオリゴリボヌクレオチドよりも好ましい。ペプチド核酸は、通常の核酸配列とは異なり、ヌクレアーゼ分解に対して感受性でなく、そしてそれ故、インビボでより長い寿命を有するようであることが理解されている。さらに、ペプチド核酸配列は、対応するＤＮＡ配列よりも強く、相補的一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖を結合することが理解されている（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９２／２０７０２（１９９２年１１月２６日公開）を参照のこと）。従って、ペプチド核酸配列は、インビボでの治療的使用に好ましい。
【００８４】
治療上有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列は、当該分野で周知かつ広く記載されている、公知のオリゴヌクレオチド合成方法およびペプチド核酸合成方法のいずれかによって合成され得る。あるいは、天然のｍＲＮＡ配列の一部または全部に相補的な配列は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。
【００８５】
マーカータンパク質全体ならびにさらなる５’および３’非翻訳配列をコードする完全なヌクレオチド配列は、各マーカータンパク質配列について公知であり、そして／または当該分野で周知の技術を使用して容易に決定され得るので、このｍＲＮＡ転写物または非コード配列の任意の部分とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、従来のオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸合成方法を使用して調製され得る。
【００８６】
マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物の任意の部分に相補的でありかつハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、原理的には、本明細書中に記載の標的タンパク質の翻訳を阻害するために効果的である。例えば、米国特許第５，０９８，８９０号（１９９２年３月２４日発行）に記載されるように、翻訳開始コドン部位のｍＲＮＡまたは翻訳開始コドン部位の近辺のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが、翻訳を阻害するために使用され得る。さらに、潜在的なリボソームの「読み飛ばし（リードスルー）」（これによって、リボソームが、このアンチセンス／センス二重鎖を解離してメッセージの翻訳を可能にすると想定される、現象）に起因して、翻訳開始部位から３’方向に離れすぎた配列は、このｍＲＮＡ転写物のハイブリダイズにおいて、それほど効果的ではないかもしれないことが示唆されている。
【００８７】
種々の配列の長さのオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、ｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズさせるために使用され得る。しかし、非常に短い配列（例えば、８〜１５ヌクレオチド未満を含む配列）は、ほとんど特異性なく結合し得る。さらに、インビボでの使用のために、短いオリゴヌクレオチド配列は、酵素分解に特に感受性であり得る。上記のようなペプチド核酸は、おそらく、ヌクレアーゼ分解に耐性であり得る。オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸配列が、細胞に直接提供される場合、非常に長い配列は、その標的細胞による取り込みの減少に起因して、阻害においてそれほど効果的でないかもしれない。従って、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、標的細胞に直接提供される場合には、約８〜５０核酸塩基、およびより好ましくは１５〜３０核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸が、最も有利であると考えられる。
【００８８】
標的細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を提供するための代替手段は、遺伝子治療であり、ここで、例えば、ＤＮＡ配列（好ましくは、ベクターの部分としてそしてプロモーターに連結されている）は、その標的細胞内で構成的に発現される。Ｏｅｌｌｅｒら（Ｏｅｌｌｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｃｅ  ２５４：４３７−５３９）は、ＡＣＣシンターゼ酵素のインビボ阻害を記載し、これは、全長ＡＣＣシンターゼ転写物に対するアンチセンス配列をコードする、構成的に発現可能なＤＮＡ配列を使用する。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が、標的細胞に間接的（例えば、その細胞内で発現される発現可能な遺伝子配列の部分として）に提供される場合、長いオリゴヌクレオチド配列（このタンパク質コード配列の実質的に全部に相補的な配列を含む）が、有利に使用され得る。
【００８９】
最後に、想定される治療上有用なオリゴヌクレオチド配列はまた、天然に存在するヌクレオチドから構成されるネイティブオリゴマーのみならず、改変ヌクレオチドを含むオリゴマーを含み、例えば、安定性および脂質溶解性を改善し、それによって細胞の取り込みを増強する。例えば、脂質溶解性の増強および／またはヌクレアーゼ消化に対する耐性は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合中のリン酸基の酸素を、メチル基または硫黄原子に置換することによって生じることが公知である。ホスホロチオエート（「Ｓ−オリゴヌクレオチド」ここで、リン酸基酸素は、硫黄原子に置換されている）は、特に、ヌクレアーゼ切断に対して安定であり、脂質中で可溶性であり、そして特に、直接的なオリゴヌクレオチド投与に好ましい。Ｓ−オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知かつ広く記載されている従来の合成方法を使用して化学合成され得る。
【００９０】
好ましい合成ヌクレオシド間結合としては、ホスホロチオエート、アルカリホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルカリホスホノチオエート、ホスホラミダイト、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルが挙げられる。さらに、１以上の５’−３’リン酸基は、低分子量（例えば、１５〜５００Ｄａ）の有機基（たとえば、低級アルキル鎖基または低級脂肪族基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルを含む）、置換アルキル基および置換脂肪族基（例えば、アミノエチル、アミノプロピル、アミノヒドロキシエチル、アミノヒドロキシプロピル）、小サッカリド基またはグリコシル基を含む）に共有結合され得る。他の低分子量の有機改変は、アミノ基と末端リボースとの間の炭素残基の数の変化を伴う、ヌクレオシド間リン酸結合への付加（コレステロールまたはジアミン化合物）が挙げられる。これらの結合または他の改変を有するオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を使用して調製され得る（例えば、米国特許第５，１４９，７９８号を参照のこと）。
【００９１】
マーカータンパク質の転写および／または翻訳を阻害する適切なオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸配列は、当該分野でよく特徴付けられている標準的なインビボアッセイを使用して同定され得る。好ましくは、ある範囲の用量を使用して、阻害ならびにハイブリダイゼーションの特異性について効果的な濃度を決定する。例えば、オリゴヌクレオチドの場合、０〜１００μｇオリゴヌクレオチド／ｍｌの用量範囲をアッセイし得る。さらに、これらのオリゴヌクレオチドを、単回トランスフェクションで、または一連のトランスフェクションの部分として、細胞に提供し得る。アンチセンス効率を、トランスフェクション後に、標準的な細胞計数方法を使用してか、そして／またはマーカータンパク質の発現の減少についてアッセイする（例えば、免疫蛍光によって）ことによって、細胞増殖における変化を経時的にアッセイすることによって決定され得る。あるいは、細胞がチミジンを取り込みそして使用する能力は、細胞分裂についてアッセイする別の標準的手段であり、そして例えば、３Ｈ−チミジンを使用して、本明細書中で使用され得る。効果的なアンチセンス阻害は、チミジンの取り込みを減少し、細胞増殖を阻害し、そして／またはマーカータンパク質の検出可能なレベルを減少するのに十分に、細胞分裂を阻害する。
【００９２】
治療上有効なオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸の濃度は、新生物の性質および程度、使用する特定の核酸塩基配列、このオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列に対するその新生物の相対的な感受性、および他の因子に従って、変更し得る。所定の細胞型ならびにオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸に有用な範囲は、標準的な用量範囲実験を行うことによって決定され得る。用量範囲実験はまた、正常細胞および悪性細胞に対する毒性レベルを評価するために行われ得る。有用な濃度は、１０５細胞あたり約１〜１００μｇ／ｍｌの範囲にあり得る。
【００９３】
インビボ使用のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、適切な液体ビヒクルまたは賦形剤）および必要に応じて補助的な添加剤（単数または複数）と合わせられ得る。液体ビヒクルおよび賦形剤は、従来的なものであり、そして市販されている。これらの例としては、滅菌水、生理学的食塩水、水性デキストロース溶液などが挙げられる。インビボ癌治療のために、アンチセンス配列は、好ましくは、悪性細胞に直接提供され得る（例えば、腫瘍への直接注入によって）。あるいは、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、このアンチセンス配列が、標的悪性細胞にその配列を指向する手段と連結される場合に、全身的に投与され得る。
【００９４】
従来のキャリアを用いる投与に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列は、種々の特別なオリゴヌクレオチド送達技術によって投与され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：６８２、およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８９）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ  １１：２１に記載されるように、リポソームにカプセル化され得る。リポソーム処方物の生成に有用な脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。このようなリポソーム処方物の調製は、当業者のレベル内にある（例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと）。本発明の薬学的組成物は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を増強する化合物（例えば、シクロデキストリンなど）をさらに含み得る。組成物が、全身的に投与されず、むしろ標的細胞の部位で注射される場合、カチオン性界面活性剤（例えば、リポフェクチン）が、取り込みを増強するために添加され得る。さらに、再構成したウイルスエンベロープは、ＲＮＡおよびＤＮＡを細胞に送達するために首尾よく使用されている（例えば、Ａｒａｄら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ．８５９：８８−９４を参照のこと）。
【００９５】
インビボでの治療的使用のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはペプチド核酸配列は、治療的有効量、例えば、悪性細胞における標的タンパク質発現を減少または阻害するために十分な量で、個体に投与される。投与される実際の投薬量は、処置の性質が予防的であるかまたは治療的であるか、患者の年齢、体重、健康、投与経路、悪性疾患の大きさおよび性質、ならびに他の因子を考慮し得る。毎日の投薬量は、１日あたり約０．０１〜１，０００ｍｇの範囲にあり得る。必要な場合には、より多い量またはより少ない量のオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸配列が、投与され得る。医学分野（特に、化学療法分野）の当業者に理解されるように、インビボ投与のための適切な用量範囲は、臨床医の慣用的実験である。予備的指針として、標的分子のインビトロ阻害のための有効量が、最初に決定され得る。
【００９６】
（４．Ｂ．結合タンパク質ベースの治療剤）
上記のように、癌マーカータンパク質または癌マーカータンパク質と相互作用するタンパク質は、化学療法の標的として使用され得る。例えば、マーカータンパク質に本質的に可逆的に結合するように設計された結合タンパク質は、例えば、細胞に特異的でありかつその細胞に吸収されることが公知のリガンドとの結合によって、悪性細胞に提供され得る。特定の細胞および細胞型へ分子を標的化するための手段は、化学療法の分野において十分記載されている。
【００９７】
結合タンパク質は、当該分野で周知の技術を使用して獲得および試験され得る。例えば、抗体の結合部分は、有利に使用され得る。しかし、インタクトな抗体またはＢＡＢＳ（好ましくは、ヒト化されている）が、本発明の実施において使用され得ることが意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化」とは、非ヒト免疫グロブリン可変領域のフレームワーク領域配列を、対応するヒトフレームワーク配列によって置換するプロセスを意味することが理解される。従って、このようなヒト化結合タンパク質が、それらの非ヒト化対応物よりも弱い免疫応答を誘発することが意図される。標的タンパク質に対する高い親和性（例えば、約１０９Ｍ−１より大きい）を有することが同定される結合タンパク質が、特に有用である。あるいは、結合タンパク質をコードするＤＮＡは、標的細胞内で発現される発現可能な遺伝子の部分として標的細胞に提供される。これは、当該分野で十分に記載される遺伝子治療プロトコルに使用される手順に従う。例えば、米国特許第４，４９７，７９６号および「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｖｉｊａｙ  Ｒ．Ｂａｉｃｈｗａｌ編（１９８６）を参照のこと。一旦結合タンパク質に結合されると、標的タンパク質が不活性化されるか、またはその生物学的活性が減少され、それによって、細胞分裂を阻害または遅延させることが意図される。
【００９８】
上記のように、インビボ使用のための適切な結合タンパク質は、適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理学的食塩水または医学分野でよく特徴付けられている他の有用なキャリア）と合わせられ得る。これらの薬学的組成物は、例えば、直接注入によって、悪性細胞に直接提供され得るか、または結合タンパク質が標的細胞にそのタンパク質を標的化するための手段と結合されている場合に、全身的に提供される。最後に、適切な用量範囲および細胞毒性レベルは、標準的な用量範囲実験を使用して評価され得る。治療的有効濃度は、１日あたり約０．０１〜１，０００ｍｇの範囲にあり得る。上記のように、投与される実際の投薬量は、例えば、悪性疾患の性質、個体の年齢、体重および健康、ならびに他の因子に依存して、変更し得る。
【００９９】
（４．Ｃ．低分子ベースの治療剤）
乳癌関連タンパク質を単離した後、当業者は、当該分野で周知の方法を使用して、低分子ライブラリー（ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリーのいずれか）をスクリーニングし、乳癌関連タンパク質の生物学的機能を減少または阻害する候補分子を同定し得る。これらの低分子は、好ましくは、標的分子のインビボ発現を減少することによって、または標的分子と相互作用して、これによって、標的分子の生物学的活性または標的分子とそのインビボ結合パートナーとの間の相互作用を阻害することによって、この機能を達成する。
【０１００】
一旦候補低分子が明らかにされると、当業者が、当該分野で周知の理論的な薬物設計方法を使用して、その低分子の効力を増強し得ることが意図される。あるいは、当業者は、さらなる候補分子の新規な設計をさらに補助する定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）を開発するために、当業者を補助する種々のコンピュータープログラムを使用し得る。一旦同定されると、これらの低分子は、商業的な量で生成され得、そして適切な安全性および効力の研究に供され得る。
【０１０１】
これらのスクリーニングアッセイが自動化され得、これによって、同じ時間で多くの低分子のスクリーニングを容易にすることが意図される。このような自動化手段は、薬物スクリーニングの当業者のレベル内にあり、従って、本明細書中では議論しない。
【０１０２】
候補ペプチドベースの低分子は、宿主細胞における適切な核酸配列の発現によってまたは合成有機化学を使用して生成され得る。同様に、非ペプチドベースの低分子は、当該分野で周知の従来の合成有機化学を使用して生成され得る。
【０１０３】
上記のように、インビボ使用のために、これらの同定された低分子は、適切な薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理学的食塩水または医学分野でよく特徴付けられている他の有用なキャリア）と合わせられ得る。これらの薬学的組成物は、例えば、直接注入によって、悪性細胞に直接提供され得るか、または結合タンパク質が標的細胞にそのタンパク質を標的化するための手段と結合されている場合に、全身的に提供される。最後に、適切な用量範囲および細胞毒性レベルは、標準的な用量範囲実験を使用して評価され得る。上記のように、投与される実際の投薬量は、例えば、悪性疾患の性質、個体の年齢、体重および健康、ならびに他の因子に依存して、変更し得る。
【０１０４】
（４．Ｄ．個体における乳癌の状態をモニターするための方法）
乳癌の進行または化学療法の治療的効力は、当該分野で周知の手順を使用して測定され得る。例えば、特定の化学療法剤の効力は、細胞死を起こしている乳癌細胞から放出される乳癌関連タンパク質の量を測定することによって決定され得る。米国特許第５，８４０，５０３号および同第５，９６５，３７６号に報告されるように、可溶性核基質タンパク質およびそれらのフラグメントが、細胞死中の細胞によって放出される。このような可溶性核基質タンパク質は、体液において定量され得、そして組織中の細胞死の程度または速度をモニターするために使用され得る。同様に、１以上の乳癌関連タンパク質のレベルは、個体の乳癌の状態の指標として使用され得る。
【０１０５】
例えば、細胞から放出される乳癌関連タンパク質またはそのフラグメントの濃度は、健常な未処置の組織からの標準に対して比較される。液体サンプルを、処置の間の別々の間隔で収集し、そして標準と比較する。例えば、乳癌関連タンパク質のレベルにおける変化が、処置の効力（すなわち、癌細胞死の速度）を示すことが意図される。可溶性乳癌関連タンパク質の放出は、血液、血漿、尿、精液、膣分泌物、ならびに乳房滲出液および他の体液において測定され得る。
【０１０６】
このアッセイを使用して、組織生存度または乳癌の進行をモニターする場合、目的のサンプル中のマーカータンパク質またはその転写物の存在および量を検出する工程を、間隔を開けて繰り返し、次いで、これらの値を比較して、検出された濃度における変化は、組織の状態における変化を反映する。例えば、１以上の乳癌関連タンパク質の増加は、乳癌の進行に相関し得る。このアッセイを使用して、治療の効力を評価する場合、これらのモニタリング工程は、治療剤または治療的手順の投与後（例えば、化学療法剤の投与後または放射線処置後）に行う。同様に、乳癌関連タンパク質のレベルにおける減少は、乳癌の後退に相関し得る。
【０１０７】
従って、乳癌は、本明細書中に教示されるように、乳癌関連タンパク質の存在によって同定され得る。一旦同定されると、乳癌は、これらの乳癌関連タンパク質の発現および／または生物学的活性をインビボで減少する化合物を使用して処理され得る。さらに、本明細書中に提供される方法は、疾患の進行および／または処置をモニターするために使用され得る。以下の非限定的な実施例は、乳癌関連タンパク質の単離および特徴付け、ならびに乳癌の検出におけるそれらの使用のための方法の詳細を提供する。
【０１０８】
（実施例１−乳癌マーカーの同定）
乳癌についてのマーカーを同定するために、表面増強レーザー脱離およびイオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法によって、乳癌を有する個体の血清を、正常な個体の血清と比較した。手短には、個体から収集した０．５ｍＬアリコートの血清を解凍した。次いで、１μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）溶液および１μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ロイペプチン溶液を、各アリコートに添加した。脂質を除去するために、３５０μＬの１，１，２−トリフルオロトリクロロエタンを、各サンプルに添加した。次いで、これらのサンプルを５分間ボルテックスし、そして４℃で５分間、微量遠心分離機で遠心分離した。得られた上清を、プロテインＧを結合したアガロースの１ｍＬカラム（Ｈｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）にアプライし、免疫グロブリンタンパク質を除去した。次いで、カラムを、ＳＢＴＩおよびロイペプチンを含有する、３ｍＬの５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）（「結合緩衝液」）でリンスし、そして得られたフロースルーを、Ｃｉｂａｃｒｏｎブルーを結合した６％  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの５ｍＬカラム（Ｈｉｔｒａｐ  ｂｌｕｅ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）に直接アプライし、アルブミンタンパク質を除去した。このＨｉｔｒａｐブルーカラムを、２０ｍＬの結合緩衝液でリンスした。得られたフロースルーを、１０ｋＤカットオフを有する遠心分離ベースの濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を４回用いて、約０．７ｍＬの最終濃度に濃縮した。
【０１０９】
得られた血清（免疫グロブリンおよびアルブミンを実質的に含まない）を、イオン交換クロマトグラフィーによって、ほぼ等価量のタンパク質を含有する１２個の画分に再分割した。詳細には、血清を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）中のＭｏｎｏ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）イオン交換カラム（四級アンモニウム基を有する強力なアニオン交換体）にアプライし、そしてタンパク質を、段階様式で塩化ナトリウム濃度を増加することによって、カラムから溶出した。従って、血清は、溶出で使用した塩化ナトリウムの濃度に基づく１２個の画分に分けられた。従って、これらの画分を、フロースルー、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭおよび２Ｍ  塩化ナトリウムと表示した。溶出後、各画分を、約１００μｇ／ｍＬに濃縮し、そして緩衝液を、結合緩衝液に交換した。
【０１１０】
次いで、各１２個の画分から４〜１０μｌを、４個のＳＥＬＤＩチップ表面の各々にアプライしてそして結合させた（各表面は、８個のサンプルを維持する）。チップ上の各サンプルの意図される位置を、パパニコラウスミアにおいて使用したマーカーと同様の疎水性マーカーを使用して引いた円で区分した。本明細書中で使用したＳＥＬＤＩチップは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入し、そして以下に記載のように使用した。
【０１１１】
銅またはニッケル表面について、エチレンジアミン三酢酸部分を含むチップ（ＩＭＡＣ，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、５μＬの銅塩溶液またはニッケル塩溶液の２回の５分間の適用で前処理し、そして脱イオン水で洗浄した。５μＬの結合緩衝液での５分の処理後、次いで、２〜３μＬのサンプルを、３０〜６０分間、その表面に適用した。次いで、別の２〜３μＬのサンプルを、さらに３０〜６０分間、その表面に適用した。次いで、チップを、結合緩衝液で２回洗浄し、結合されなかったタンパク質を除去した。０．５μＬのシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を、２回添加し、そして各回で乾燥させた。シナピン酸の存在は、質量分析法の際のその結合したタンパク質の蒸発およびイオン化を増強する。
【０１１２】
カルボキシル部分を含有するチップ表面（ＷＣＸ−２，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）について、疎水性ペンの使用の前に、表面を、３０分間、１０ｍＭ  ＨＣｌで洗浄し、そして脱イオン水で５回リンスした。ペンの使用後、表面を、５μＬの結合緩衝液で５回洗浄し、そして脱イオン水で１回洗浄した。２〜３μＬのサンプルを、各３０〜６０分間で２回適用した。表面を、５μＬの結合緩衝液で２回洗浄し、そして０．５μＬのシナピン酸を、２回適用した。
【０１１３】
四級アンモニウム部分を含有するチップ表面（ＳＡＸ−２，Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）について、ペンの使用後に、表面を５μＬの結合緩衝液で５回洗浄し、そして脱イオン水で１回洗浄した。サンプルの適用、洗浄、およびシナピン酸の適用は、上記と同じように行った。
【０１１４】
次いで、このチップを、ソフトウェアプログラム「ＳＥＬＤＩｖ．２．０」を走らせてＣｈｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＳＥＬＤＩ  ＰＢＳ  Ｏｎｅ（Ｃｈｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を利用する質量分析法に供した。全てのチップについて、「高質量」を２００，０００ダルトンに設定し、「出発検出器感度」を９（１０が最も高い感度である１〜１０の範囲から）に設定し、ＮＤＦ（中性密度フィルター（ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ））を「ＯＵＴ」に設定し、データ収集方法を「Ｓｅｌｄｉ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ」に設定し、ＳＥＬＤＩ収集パラメータを５の増加で２０に設定し、そして強さ５０（１００の中から）で２ショットでの加温を含んだ。ＩＭＡＣチップについて、質量を、３０００ダルトン〜３００１ダルトンに最適化し、出発レーザー強さを８０（１００の中から）に設定し、そして遷移を５（すなわち、１部位あたり５レーザーショット）に設定した。ピークをコンピューターによって自動的に同定した。ＷＣＸ−２チップについて、質量を、３，０００ダルトン〜５０，０００ダルトンに最適化し、出発レーザー強さを８０に設定し、そして遷移を８に設定した。ピークをコンピューターによって自動的に同定した。ＳＡＸ−２チップについて、質量を、３，０００ダルトン〜５０，０００ダルトンに最適化し、出発レーザー強さを８５に設定し、そして遷移を８に設定した。ピークをコンピューターによって自動的に同定した。
【０１１５】
１０個の血清サンプル（正常な個体から５個および乳癌を有する個体から５個）を質量分析法によって分析し、上記の６０画分に存在するタンパク質を同定した。質量分析法痕跡において生じたピークを比較して、乳癌を有する個体由来の血清サンプルに存在するが、正常なサンプルには存在しないこれらのピークを同定した。異なるサンプルにおけるピークが、わずかに１％の質量差を有する場合、このピークを同じものとして仮定した。ちょうど１１，０００Ｄａ以上〜約１０３，０００Ｄａのサイズの範囲で１１個の質量分析法ピークを、同定した。これは、乳癌を有する個体由来の全ての５個の血清サンプルに存在し、そして正常な個体由来のサンプルには存在しなかった。次いで、これらのピークの存在または非存在を、追加の３０血清サンプル（正常な個体由来の１５個および乳癌を有する個体由来の１５サンプル）について決定した。最初の５つの乳癌血清サンプルの４つに存在するが、正常のサンプルのいずれにも存在しなかった７個のピークをまた、分析した。これは、これらが、すでに評価の元の１１個のピークの１つ以上として同じ画分および同じＳＥＬＤＩ表面に存在するからである。研究した１８個のピークの１５個は、２０個の乳癌血清サンプルの１５個以上に存在したが、正常血清サンプルの１５個以上に存在しなかった。
【０１１６】
前述の分析の結果を、表１に要約する。表に列挙される質量を正確に１％以内と予測する。
【０１１７】
【表１】
2004500056.tif 000002
（実施例２　乳癌マーカータンパク質の配列決定）
上で提供した生物学的および質量分析法データに基づく乳癌関連タンパク質は、周知の技術を使用してよりよく特徴付けし得る。例えば、血清のサンプルは、例えばカラムクロマトグラフィーおよび／または電気泳動を使用して画分され得、表１において同定される各タンパク質に対応する精製タンパク質サンプルを生成し得る。次いで、単離されたタンパク質の配列を、通常のペプチド配列決定方法論（実施例５および６を参照のこと）を使用して決定し得る。上記の開示を考慮して当業者は、本明細書中に記載される方法によって同定される任意の乳癌関連タンパク質に対する抗体を生成し得ることを正しく認識する。さらに、上記の開示を考慮して当業者は、上記のフラグメントをコードする核酸配列およびそれらの核酸配列相補体を生成し得る。さらに、当業者は通常の組み換えＤＮＡ方法論（例えば、このような核酸配列を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって）を使用して、標的乳癌関連タンパク質をコードする全長核酸配列を単離し得る。このような全長核酸配列、またはそれらのフラグメントを使用して、核酸ベースの検出システムまたは治療を作製し得る。
【０１１８】
（実施例３　乳癌関連タンパク質に特異的に結合する抗体の生成）
一旦同定された場合、乳癌関連タンパク質を、当業者に対して周知の多数の結合アッセイを使用して組織または体液サンプルにおいて検出し得る。例えば、上記のように、乳癌関連タンパク質を、抗体（例えば、乳癌関連タンパク質に配列するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体）を使用して組織サンプルまたは体液サンプルのいずれかにおいて検出し得る。このような検出システムにおいて、抗体を好ましくは検出可能な部分で標識化する。
【０１１９】
下に提供するものは、抗乳癌関連モノクローナル抗体の生成のための例示的なプロトコールである。他のプロトコールをまた構築する。従って、タンパク質を標的とする抗体を生成する特定の方法を、本発明の局面であることを想定しない。
【０１２０】
免疫化されたマウスが適切な血清力価を得るまでＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のＢａｌｂ／ｃを、腹腔内に標的タンパク質と共に２週間毎に注射する。それ以後、マウスを３連続静脈ブーストで注射する。フロイント完全アジュバント（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ）をはじめの注射に使用し、不完全フロイントアジュバントを次の注射に使用し；そして生理食塩水を、連続静脈注射のために使用する。次いで、動物を屠殺して、そしてその脾臓を取り出す。次いで脾臓細胞（またはリンパ節細胞）をマウス骨髄腫株と融合する（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５の方法を使用して）。次いで、標的タンパク質と反応する抗体を生成するハイブリドーマをクローニングして、腹水として増殖する。ハイブリドーマを、任意の所望のアッセイにおいて免疫原に対する反応性によってスクリーニングする。スクリーニングプロトコール、腹水生成および免疫アッセイの詳細な記載もまた、１９９３年５月１３日公開ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９２２０号に開示される。
【０１２１】
（実施例４　個体において乳癌を検出するための抗体ベースアッセイ）
以下のアッセイを、組織サンプルのために開発している：しかし、試験液サンプルに対する同様のアッセイをはなはだしい実験なしに開発し得ることを考慮する。代表的なアッセイは、市販される免疫検出キット（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されるＡＢＣ　Ｅｌｉｔｅ　ｋｉｔ）を使用し得る。
【０１２２】
生検サンプルを、適切な医学的ガイドラインの従う研究下で患者から取り出す。次いで、このサンプルをガラス顕微鏡スライドに塗布してそしてこのサンプルを１０分間冷却アセトン中で固定する。次いで、このスライドを蒸留水でリンスして過酸化水素含有溶液（２ｍＬ　３０％Ｈ２Ｏ２および２０ｍＬ冷却メタノール）で前処理する。次いで、このスライドを緩衝液Ａ（０．１％Ｔｗｅｅｎおよび０．１％Ｂｒｉｊと共にＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）を含有する）中でリンスする。緩衝液Ａ中のマウス抗乳癌関連タンパク質モノクローナル抗体を、スライドに添加して、次いでこのスライドを室温で１時間インキュベートする。次いで、このスライドを緩衝液Ａで洗浄し、そして緩衝液Ａ中の二次抗体（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）をこのスライドへ添加する。次いで、このスライドを３７℃で１５分間湿度チャンバ内でインキュベートする。このスライドを再び緩衝液Ａで洗浄して、次いでシグナルの増幅のためにＡＢＣ試薬（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）をこのスライドに添加する。次いで、このスライドをさらに３７℃で１５分間湿度チャンバ内でインキュベートする。
【０１２３】
次いで、このスライドを蒸留水で洗浄し、そしてジアミノベンゼジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）基質をスライドに４〜５分間添加する。次いで、このスライドを蒸留水でリンスし、ヘマトキシリンで後染色し、９５％エタノールでリンスし、１００％エタノールでリンスし、次いでキシレンでリンスする。次いで、カバーガラスをスライドにつけ、そして光学顕微鏡で結果を観察する。
【０１２４】
（実施例５  ２８．３ｋＤ乳癌タンパク質の精製および特徴付け）
実施例１で同定した２８．３ｋＤ乳癌タンパク質を、単離してそしてさらに以下のように特徴付けした。
【０１２５】
約３０ｍＬの血清（複数の乳癌患者由来を組み合わせた）からプロテインＧクロマトグラフィーおよびＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅアガロースゲルクロマトグラフィーを使用して（それぞれ、標準的な方法論（実施例１に記載される方法論）で）免疫グロブリンＧおよび血清アルブミンを除去した。次いで血清から除去したアルブミンおよび免疫グロブリンを、モノＱイオン交換親和性クロマトグラフィーによって分画した。簡単には、この血清タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中の５ｍＬのモノＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）に適用し、フロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）画分を収集した。その後、この血清タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を使用するカラムから塩化ナトリウムの濃度を増加して段階的に溶出した。この様式において、各異なる量の塩化ナトリウムを含有する１２個の血清画分を得た。この画分は、フロースルー、ならびに２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、および２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の溶出緩衝液を含む。
【０１２６】
目的のタンパク質を含む５０ｍＭ塩化ナトリウム画分は、続いて５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で交換される緩衝液であり、そしてメーカーの指示に従ってＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の手段によって濃縮した。次いで、生じたサンプルを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有するアイソクラチック緩衝液を使用するＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。カラムから溶出した画分を、実施例１に記載するようにＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＳＥＬＤＩ質量分析法を使用して２８．３ｋＤタンパク質の存在について評価した。２８．８ｋＤタンパク質を含む画分をプールして、５０ｍＭ  ＮｉＣｌ２を使用して事前インキュベートすることでＮｉ＋２で前もってロードしたＩＭＡＣカラム（Ｓｉｇｍａ）に適用した。次いで、ＩＭＡＣカラムを１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を含有する溶液の６倍の容量で洗浄し、そして結合タンパク質画分を１００ｍＭイミダゾールを含む同じ溶液で溶出した。次いで、溶出した画分を、Ｍｉｎｉｃｏｎ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の手段によって濃縮し、次いでドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって１２％ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画した。タンパク質画分のサンプルを、ゲルの２つの平行レーンに適用した。電気泳動後、次いで得られたゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ色素で染色し、そして汚れを除き、タンパク質の存在を示した。約２８．３ｋＤの３つのバンド（最も重い分子量タンパク質、中間分子量タンパク質、および最も軽い分子量タンパク質として特徴付ける）を、２つのレーンの１つから切除し、そしてアクリルアミド薄片から溶出した。
【０１２７】
このタンパク質を以下のようにゲルから溶出した。簡単には、ゲル薄片を、ＨＰＬＣ階級の水を用いて勢いよく渦状に５回洗浄した。次いで、洗浄した薄片を、１２０μＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ８．５、０．１％ＳＤＳ中に小片に切断し、３７℃で一晩インキュベートした。上清を新鮮なチューブに静かに注ぎ、そして急速真空（ｓｐｅｅｄｖａｃ）で乾燥した。次いで生じたペレットを３７μＬのＨＰＬＣ階級の水において再構成した。次いで、約１４８０μＬの冷却エタノールを添加し、そして生じた混合物を−２０℃で一晩インキュベートした。サンプルを４℃、１５分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、そして生じたペレットを５μＬの水において再構築した。生じたタンパク質溶液をＳＥＬＤＩ上に走らせ、２８．３ｋＤタンパク質を３つの調製物の１つにおいて同定した（最も重い２８ｋＤタンパク質に対応する図１Ａを参照のこと）。次いで、この対応するバンドを、ゲル上の第２の２レーンから切除した。トリプシンでタンパク質分解後、トリプシンのフラグメントをゲルから溶出し、そして質量分析法を介するマイクロ配列（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）分析として提起した。
【０１２８】
４つの個々の質量を、質量分析法で検出した。４つの質量を使用してＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅを探索する場合、全ての４つの質量を見出し、当該分野でＵ２核内低分子リボヌクレオチドＢ’’（Ｕ２  ｓｎＲＮＰ  Ｂ’’）（Ｈａｂｅｔｓら（１９８７）上記、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ受託番号４５０７１２３）として呼ばれるタンパク質において存在するアミノ酸配列に一致した。この結果を、表２にまとめる。
【０１２９】
【表２】
2004500056.tif 000003
Ｕ２　ＳｎＲＮＰ　Ｂ’’タンパク質のＮ末端方向〜Ｃ末端方法におけるアミノ酸配列は、一次アミノ酸コードにおいて以下である：
【０１３０】
【化１】
2004500056.tif 000004
（実施例６　７１ｋＤ乳癌タンパク質の精製および特徴付け）
実施例１において同定された７１ｋＤ乳癌タンパク質を、単離し、そしてさらに、以下のように特徴付けした。
【０１３１】
４人の個体のそれぞれ由来の５０ｍＬ血清をプールして、２００ｍＬの単一のアリコートを与えた。この２００ｍＬアリコートを各３３ｍＬの６個のアリコートにさらに分けた。各アリコートを、実施例１に記載のように１０ｍＬのトリフルオロトリクロロエタンで処理した。フロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）（約５００ｍＬ／アリコート）においてタンパク質を含む画分をプールして、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮機を使用して約１０ｍＬ／アリコートまで濃縮した（計６０ｍＬ）。
【０１３２】
３ｍＬアリコートを、５ｍＬモノＱセファロースカラム上へロードした（６０ｍＬ／３ｍＬ＝２０アリコート）。分別を、全ての容積を５倍することを除き実施例１に記載のように実施した。１００ｍＭ塩化ナトリウムで各画分から溶出した画分を単一の２００ｍＬ画分にプールし、そして緩衝液を実施例１に記載のように結合緩衝液へ交換した。
【０１３３】
２００ｍＬ画分を、一連の抗体カラムへ適用して、５０〜７０ｋＤの過剰なタンパク質を除去した。これらのタンパク質（α−１抗トリプシン、セルロプラスミン、カリクレイン、およびＧＣグロブリン）のそれぞれを同定し、そして予備試みの間配列決定して７１ｋＤタンパク質を単離した。このタンパク質に対する市販される抗体を購入して、通常のＮＨＳエステル化学的作用（Ｐｉｅｒｃｅ　Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ　Ｐｌｕｓ　ｋｉｔ−部分番号４４８９４）を使用して固体支持（アガロース）に結合した。当のタンパク質がＷｅｓｔｅｒｎブロット分析によってフロースルーにおいてもはや見え得なくなるまで２００ｍＬ画分を順番に各カラムに適用した。
【０１３４】
フロースルーを、Ｓ２００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーに供した。７１ｋＤピークを含む画分を、実施例１に示すようにＳＥＬＤＩによって同定した。これらの画分はまた、Ｃｉｂａｃｒｏｎブルーカラムに結合しないヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のフラグメントを含むことが明らかなため、画分を、ＨＳＡに対する２つのマウス抗体を有するＨＳＡ親和性カラムに適用して、残存ＨＳＡをサンプルから除去した。サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、銀染色によって７１ｋＤの範囲に単一のバンドを示した。残存サンプルを、２つのアリコートに分割し、そして１０％ｔｒｉｓ−グリシンゲルの２つのレーン上に走らせた。このゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ色素で染色した。２つのレーンの１つ由来の７１ｋＤバンドを切除して、そして実施例５に記載のようにゲルから溶出した。その同一性を７０．９７２ｋＤマーカータンパク質としてＳＥＬＤＩによって確認した。他のレーン由来の７１ｋＤバンドを切除して、そしてトリプシンで処理した。生じたペプチドをゲルから溶出して、そして質量分析法によってマイクロ配列分析に供した。１６個の切断刺激因子の６４ｋＤサブユニットの予測されるトリプシンフラグメントは、７１ｋＤタンパク質の質量スペクトルにおいて同定したものに対応する質量を有する。この１６個の配列を表３に示す。切断刺激因子に対する２つの報告した配列を、並列表中に配列番号２２および配列番号２３として示す。
【０１３５】
【表３】
2004500056.tif 000005
（等価物）
本発明は、他の特定の形態においてその趣旨または本質の特徴からそれずに具体的に表現され得る。従って上記実施形態は、本明細書中に記載の本発明の限定よりもむしろ実例となる全ての点において考慮されるべきである。従って、本発明の範囲は、上の記載よりもむしろ添付の請求の範囲によって示され、請求の範囲の等価な意味および範囲における全ての変化は、その中に参考として包含されることが意図される。
【０１３６】
（参考による援用）
前述の特許および上に引用される科学的文献のそれぞれの全体的開示は、本明細書中に参考としてはっきりと援用される。
【０１３７】
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−１Ｃは、トリプシン消化に供され、そしてポリアクリルアミドゲルから溶出された、２８ｋＤタンパク質の質量スペクトルを介した特徴付けから得られたスペクトルである。図１Ａは、ゲルから単離された最も重い２８ｋＤタンパク質のスペクトルであり、図１Ｂは、ゲルから単離された中程度の２８ｋＤタンパク質のスペクトルであり、そして図１Ｃは、ゲルから単離された最も軽い２８ｋＤタンパク質のスペクトルである。
【図１】
2004500056.tif 000006
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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