(57)【要約】本発明は、高度の交叉反応性を有し；全身投与、又は粘膜投与したペプチド抗原に対する免疫反応性を高めることができ、本方法で得られる化学構造を有し、これから得られる処方に使用される抗原構造を得る方法、並びにその使用方法に関するものである。本発明に述べられている方法により、樹状体の選択及び合成から出発してこれを担体分子にカップリングさせ、新しい抗原構造を得ることができる。得られた構造を便利にアジュベートし、又は種々の抗原処方として、これを使用することができる。交叉反応性及び免疫付与性において、相乗効果を見いだすことができる。さらに、当該処方には安定剤及び保存剤を含めることもできる。本発明の抗原構造は、これを医薬品産業において、ヒト及び動物の病気を予防及び治療するためのワクチン処方として、並びに診断システムの開発のために、これを使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）対象エピトープを選択すること；
Ｂ）１）アスパラギン酸又はリシンの核上における合成、２）有機化合物の核上における合成、３）ペプチドの樹状核上における直接カップリング（Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープは同じ核上で混合することができる）；から選ばれる合成方法を使用して（Ａ）で選んだエピトープを有する樹状構造を得ること；
Ｃ）（Ｂ）で得られた１種類又は種々の樹状構造を、１）グルタールアルデヒドを使用する共役、２）無水琥珀酸を使用する共役、３）β−マレイミドプロピオン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド酸 （ＭＰＳ）のエステルを使用する共役、及び４）芳香族側鎖を有するスペーサー試薬の使用を避ける、何らかのカップリング方法で構成されるグループから選ばれたカップリング方法を使用して、１種類又は種々の担体分子に共役させること；
Ｄ）ＣＤ４−結合ペプチド又はそれを含む共役物の付加など、ステップ（Ｃ）で得られた共役物の混合物；並びに
Ｅ）得られる処方を明礬又はその他便利なアジュバント中においてアジュバント化すること；の各ステップで構成される、特定の交叉反応性を高めることのできる抗原構造を得る方法。
【請求項２】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがヒトの免疫不全ウィルス タイプ１又はタイプ２からの領域に属する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがヒトの免疫不全ウィルス タイプ１又はタイプ２からの可変部領域に属する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがヒトの免疫不全ウィルス タイプ１又はタイプ２からの第三可変部領域（Ｖ３）に属する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがＢ型肝炎ウィルスに属する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがＣ型肝炎ウィルスに属する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがデング熱ウィルスに属する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるオリゴマーが髄膜炎菌からの多糖領域に属する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドが抗原多糖類の模倣ペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドが微生物又は病原体からの抗原領域に属する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドが自己抗原に属する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（Ｂ）で得られた構造に含まれるペプチドがゴナドトロピン放出ホルモンに属する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（Ｃ）からの担体分子がＢ型肝炎の表面抗原、ＨＢｓＡｇである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（Ｃ）からの担体分子が髄膜炎菌からのｐ６４Ｋタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（Ｃ）からの担体分子がヒト免疫不全ウィルスからのコア タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（Ｃ）からの担体分子がＢ型肝炎のコア抗原又はＣ型肝炎のコア抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（Ｃ）からの担体分子が多糖類である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（Ｃ）からの担体分子がデキストランである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（Ｃ）からの担体分子及び樹状構造が、共役結合、静電気、又は疎水性によりカップリングした、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
担体タンパク質にカップリングした樹状抗原エピトープで構成される、特定の交叉反応性を高めることのできる抗原構造。
【請求項２１】
樹状領域からのエピトープがペプチド的又はオリゴ多糖類的な性格を有する、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項２２】
当該ペプチド的性格のエピトープが、サブタイプ、サブグループ、セロタイプ、又はその他集合状態から選ばれた可変部領域のコンセンサス ペプチドである、請求項２１記載の抗原構造。
【請求項２３】
当該ペプチド的性格のエピトープが微生物又は模倣ペプチドから選ばれたペプチド配列からのペプチド ライブラリである、請求項２１記載の抗原構造。
【請求項２４】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがヒト免疫不全ウィルス１又は免疫不全ウィルス２に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項２５】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがヒト免疫不全ウィルス１又は不全ウィルス２からの可変部領域に属する、請求項２４記載の抗原構造。
【請求項２６】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがヒト免疫不全ウィルス１又はヒト免疫不全ウィルス２からのＶ３可変部領域に属する、請求項２５記載の抗原構造。
【請求項２７】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがＢ型肝炎ウィルスからの領域に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項２８】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがＣ型肝炎ウィルスからの領域に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項２９】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがデング熱ウィルスからの領域に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項３０】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープが髄膜炎菌からの多糖類抗原に属する、請求項２１記載の抗原構造。
【請求項３１】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープが多糖類抗原又はタンパク質抗原からの模倣ペプチドである、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項３２】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープが微生物又は病原体に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項３３】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープが自己抗原に属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項３４】
当該樹状ペプチド領域からのエピトープがゴナドトロピン放出ホルモンに属する、請求項２１から請求項２３の中のいずれかに記載された抗原構造。
【請求項３５】
当該担体分子がＢ型肝炎表面抗原、ＨＢｓＡｇである、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項３６】
当該担体分子が髄膜炎菌からのｐ６４Ｋタンパク質である、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項３７】
当該担体分子がＨＩＶヌクレオカプシド抗原である、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項３８】
当該担体分子がＨＢＶヌクレオカプシド抗原 （ＨＢｃＡｇ）である、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項３９】
当該担体分子が多糖類である、請求項２０記載の抗原構造。
【請求項４０】
当該担体分子がデキストランである、請求項３９記載の抗原構造。
【請求項４１】
請求項２０から請求項４０までのいずれかの請求項に記載された抗原構造の診断システムにおける使用。
【請求項４２】
請求項２０から請求項４０までのいずれかの請求項に記載された抗原構造の予防ワクチン又は治療ワクチンにおける使用。
【請求項４３】
請求項２０から請求項４０までのいずれかの請求項に記載され、便利な方法で吸着又はアジュバント化された抗原構造で構成される、ワクチン製剤。
【請求項４４】
請求項４３に記載された、全身投与又は粘膜投与用のワクチン製剤。
【請求項４５】
請求項４３及び請求項４４のワクチン製剤の感染病、自己免疫、又は癌の予防目的における使用。
【請求項４６】
請求項４３及び請求項４４のワクチン製剤の感染病、自己免疫、又は癌の治療目的における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、医薬品の一部門、特に交叉反応性を可能にする、新しい抗原構造に基づくワクチン製剤に関するものである。
【０００２】
（従来の技術）
ペプチドの免疫原性は低いので、これを担体タンパク質にカップリングさせ、必要なＴ細胞が特定の抗体から引き出されるようにしなければならない （Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ａ．ら； １９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２８， ２５７−２５９）。ペプチドと担体タンパク質の共役過程において、非特定共役性のために、抗原性が失われてしまう可能性がある。当該ペプチドは、担体タンパク質の主要対象エピトープ部分にカップリングさせることができる。ペプチドの共役による問題発生を回避するために、免疫システムに対して、これと異なる方法を使用できることが報告されている。例えば、多価抗原ペプチド （ＭＡＰ）は、Ｂ細胞及びＴ細胞のエピトープをリシンの分枝コア内部に導入して調製する （Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ．ら； １９８８ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６， ５４０９−５４１３２−５）（Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ．； １９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １６８， ７−１５）（Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ． １９９０； ＷＯ ９０／１１７７８）（Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ． １９９３； ＷＯ ９３／０３７６６）。このシステムの主な利点は、その構造、明確に定義された組成、及び全分子に対して対象エピトープの割合が高いことにある。免疫性に関する幾つかの研究において、ＭＡＰはペプチド共役の場合より良い結果を与えている （Ｗａｎｇ， Ｃ．Ｙ．ら １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， ２８５−２８８）。他の研究においては、これと相反する結果も得られているので、この結果に常に再現性があった訳ではない （Ｒｉｌｅｙ， Ｅ．Ｍ．ら １９９６， Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５５， ２４３−２５３）。しかし、この差異は担体タンパク質に起因して生じた可能性もある。
【０００３】
交叉反応性及び中和性に関しては、前にも合成ペプチドについて報告されている （Ｗａｎｇ， Ｃ．Ｙ．ら １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， ２８５−２８８）。ＨＩＶ−１のＶ３領域に対する抗ペプチド抗体が、種々の異なる分野に対して交叉中和性を示すことについては、幾つかの研究結果が報告されている （Ｗａｎｇ， Ｃ．Ｙ．ら １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， ２８５−２８８）。以上を要約すると、交叉中和性及び交叉反応性は、ペプチド構造に関連して生じるものと考えられる。例えば、ＨＩＶ−１のＶ３ループのペプチドの場合がそうである。
【０００４】
ＭＡＰ戦略は、ヒトの体内でＶ３に対する中性反応抗を発生させるために使用されてきた （Ｇｅｏｆｆｒｅｙ， Ｊ．ら １９９６， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １７３， ３３０−３３９８）。この方法の不利な点は、効果を得るためには大過剰量 （ＭＡＰ ５００ μｇ）を接種しなければならず、後で余剰分を中和する必要があることであった ［Ｋａｈｎ， Ｊ．ら １９９４年８月７−１２日、第１０回ＡＩＤＳ国際会議（日本国横浜市）、第１巻］ （Ｌｉ， Ｄ．ら １９９７， Ｓｅｉｚｅｄ Ｐａｃ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５， １０５−１３）。種々の異なるＶ３を選択したこと、臨床アイソレーションの中和が非常に広範囲に渡ったこと、ＭＡＰ混合物の全必要量がマイクログラムのオーダーであったことのために、ＭＡＰ戦略は免疫付与における慣行にそぐわないことが明らかになった。
【０００５】
交叉反応性とは、「免疫原が関連リガンドと反応する能力」として定義される （Ｐａｕｌ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｗ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第４版）。交叉反応性の現象は免疫研究の初期から現在に到るまで長い間知られており、全てのワクチン製剤はその交叉反応性に基づくものであった。この事実は、免疫化プログラムで使用される大部分のワクチンが、その幾つかの臨床アイソレートの中で、病原体に対して無防備である理由を説明するものであると考えられる。
【０００６】
相同ペプチド中における交叉反応性は、各配列特有の性質である。この性質は、当該ペプチドの免疫システムに対する発現形態により、高められるものである。交叉反応性の高揚が、免疫性の増加により与えられるものであるのかどうかについては、まだ明らかにされていない。Ｔ−Ｂペプチドに関する一研究においては、交叉反応性又は中和性による抗体の誘発と免疫性との間には、相関関係が存在しないことが明らかになった （Ｋａｓｍｉ， Ｋ．Ｃ，ら １９９８； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５， ９０５−９１８）。
【０００７】
一つの病原体について多数の抗原変異体を認識できるような免疫反応を得るために、これと異なる戦略も用いられた。これらの戦略の一つに、これらの変異体の中で比較的に重要な変異体の組替え多エピトープ ポリペプチド （ＭＥＰｒ）の設計にこれを使用する戦略がある。ＭＥＰｒシステム中にＢエピトープを発現させる戦略は、必ずしも実行可能な選択肢ではなかった （Ｆｌｙｎｎ， Ｊ．Ｎ．ら １９９７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７１， ７５８６−９２）。第一に、キメラ ポリペプチドの発現は、必ずしも全てのエピトープを適切に発現させない、予測できないような三次元構造分子の生成を示唆している。この設計においては、ある種のエピトープに対する反応が特に起こり易くなり、又は他のエピトープに対する反応を完全に妨害する。他方、種々の異なるエピトープ中で課される支配性についても、これを予測することは困難である。その他の戦略として、免疫原としてペプチド ライブラリを発現させる戦略もある。当該ペプチド ライブラリは、高度可変部領域でこれを得ることができた。当該ペプチド ライブラリにおいては、非常に多くのペプチド配列が発現する。しかし、当該ペプチド ライブラリは、各エピトープを余り代表するものではないという問題があった。非常に多数に渡る種々の異なる配列の中にあって、対象配列が希釈されてしまい、必要水準の免疫反応の発生が予測できなくなってしまった （Ａｌｌｅｎ， Ｄ．ら １９９８； Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌ． ２７， ６５１−６５９）（Ｊｅｒｏｍｅ， Ｅ．ら １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４， ２７８９−２７９５）。
【０００８】
他の戦略として、ＨＩＶの場合に広範囲のＶ３配列を網羅する目的で、コンセント ペプチドを発生させる戦略がある。この戦略は、全てのアイソレーションの中で比較的に保存度の高いアミノ酸の各位置に落ちつかせることにより、フィールドアイソレーション又は臨床研究におけるエピトープの可変性に関する研究結果に基づいて立てられた戦略である （Ｈｏｌｌｅｙ， Ｌ．Ｈ．ら １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８， ６８００−６８０４）。
【０００９】
（発明の開示）
ここに提案する発明の技術的目標は、全身投与又は粘膜投与を行ったペプチド抗原の免疫性を高めることのできる、高度の交叉反応性を有する抗原構造を得るための方法を開発することにある。この方法は、担体タンパク質に適切な割合で共役した樹状構造を発生させるものである。他のＢエピトープを担持した、これと類似の構造を付加することにより、交叉反応性を増大させることができた。その他に、同時投与した抗原の免疫発現性を増大させることができる。その他の抗原及びアジュバントも、この製剤に加えることができる。
【００１０】
従って、本発明の目的の一つは、特定の交叉反応性を高めるような、抗原構造の合成方法を得ることにある。
【００１１】
上記の方法は、下記のステップで構成される。
Ａ）対象エピトープを選択すること。
Ｂ）リシン又はアスパラギン酸のコア上で合成する方法；有機分子のコア上で合成する方法；樹状コア上で合成する方法；樹状コア上でペプチド カップリングを行わせる方法；又は単一のＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、又はこれら両者のコア上で混合物を調製する方法など、種々の合成方法を使用してステップＡで選ばれたエピトープを有する樹状構造を得ること。
Ｃ）グルタールアルデヒド、無水琥珀酸、β−マレイミドプロピオン−Ｎ−ヒドロキシ琥珀酸 （ＭＰＳ）のエステル、又は芳香族側鎖の無いスペーサー剤（これらの基はカップリングした樹状構造の認識を回避することが分かっている）を使用して、ステップ（Ｂ）で得られた一つ又は幾つかの樹状構造を、一つ又は幾つかの担体分子へ共役させること。
Ｄ）ステップ（Ｃ）で得られた共役物に、ＣＤ４結合のペプチド又は当該ペプチドを有する共役物を加えて混合し、処方として確立すること（この操作により、得られた抗原構造の交叉反応性及び免疫付与性が高められる）。
Ｅ）アジュバント化すること。
【００１２】
本発明の方法において、ステップ（Ｂ）で得られた構造中のペプチドは、ＨＩＶ１又はＨＩＶ２からの領域であり、さらに詳しく言えばＶ３ループのような可変部領域であることが可能である。その中に他のウィルス（ＨＩＶウィルス、ＨＢＶウィルス及びデング熱ウィルス）からの可変性を有する幾つかの領域も、これを使用することができる。
【００１３】
髄膜炎菌の多糖類領域、或いは多糖類抗原からの模倣ペプチド、或いは微生物又は病原体からのその他領域に由来する他の抗原を使用することもできる。
【００１４】
さらに、本発明の方法においては、自己抗原又は癌ワクチン用の適切な抗原からの領域（例えばゴナドトロピン放出ホルモンからの領域）を使用することができる。
【００１５】
本発明の方法において使用可能な担体タンパク質の中には、Ｂ型肝炎ウィルスからの表面抗原 （ＨＢｓＡｇ）、髄膜炎菌からのｐ６４Ｋタンパク質、ＨＩＶからのコア抗原、Ｂ型肝炎ウィルスからのコア抗原がある。デキストランのような多糖類分子も同じ目的で使用することができる。
【００１６】
本発明の方法は、ステップ（Ｂ）で得られる１個又は幾つかの樹状構造を、１個又は幾つかの担体分子に、共有共役、又は静電気、又は疎水性相互作用により共役させることで構成される。
【００１７】
本発明の他の目的は、従来の方法により得られた、既に含まれているエピトープの特定交叉反応性を高めるための抗原構造を得ることにある。担体タンパク質にカップリングさせる樹状抗原（得られた構造物の１−３０％）として既に述べたエピトープにより、当該抗原構造は構成される。
【００１８】
選ばれたエピトープは、多糖類的性格のものであっても、又はペプチド的性格のものであっても良い。ペプチドとしては、サブタイプ、サブグループ、セロタイプ又はその他分類により選ばれた可変部領域からのコンセンサス ペプチドを使用することができる。さらに、これらのペプチドはペプチド ライブラリ、又は微生物からの模倣ペプチドであっても良い。
【００１９】
特に、樹状体中のペプチドとしては、ＨＩＶ１又はＨＩＶ２のＶ３ループ；及びある程度の可変性及び多様性を有する他のウィルス、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎及びデング熱ウィルスからの領域を使用することができる。
これらの構造は、髄膜炎菌からの多糖類領域の抗原、多糖類抗原の模倣ペプチド、又は微生物又は病原体からの領域により構成される。
【００２０】
さらに、本発明の抗原構造には、自己抗原又は癌ワクチンの該当抗原からの領域、例えばゴナドトロピン放出ホルモンからの領域を使用することができる。本発明の方法により使用できる担体タンパク質の中には、Ｂ型肝炎ウィルス （ＨＢｓＡｇ）、髄膜炎菌からのｐ６４Ｋタンパク質、ＨＩＶウィルスからのコア抗原、Ｂ型肝炎ウィルスから採取したコア抗原からの表面抗原がある。デキストランのような多糖類分子も、同じ目的で使用することができる。
【００２１】
本発明は、感染症、自己免疫症又は癌性症の診察用、予防用又は治療用のワクチン処方で既に報告された抗原構造の使用にも関し、これらの抗原物質を全身投与ルートで接種することができる。特に、Ｖ３ループに対しては、可変部領域からのペプチドに対して交叉反応抗体量を高めるために発現させた構造と同じ構造の上に、ＣＤ４結合ペプチドを有する共役物を追加することにより、交叉反応性及び交叉中和反応性を遙に増大させ得ることが証明された。
【００２２】
このような構造を追加することにより、同時投与した抗体の抗Ｖ３交叉反応性及び免疫付与性が増大する。事実本方法により、上記方法に基づくワクチン戦略において、交叉反応抗体の出現が容易になる。しかし、本方法を単に相同ペプチドに対する免疫付与性を増大させるようなワクチン戦略に使用する方法も、これを排除するものではない。
【００２３】
本発明は、可変微生物からのＢ細胞エピトープの時差発現に基づき、免疫システムに新しい化学構造を導入する方法を提供するものでもある。さらに、保護的免疫反応を引き出すことのできる、細胞抗原からのＢ細胞エピトープのような、非可変Ｂ細胞エピトープを使用することも可能である。担体タンパク質上の樹状構造中に存在するこれら全要素により、その交叉反応性及び免疫付与性を高めることができる。
【００２４】
本提案方法は、従来とは異なる、免疫発現性及び抗ペプチド交叉反応性を増大させる、従来のワクチンよりエピトープ密度の高い抗原ワクチンの製造を可能にするものである。本方法は、上に述べた新しい特徴とは別に、高抗体タイターを引き出す樹状構造の量を、時差発現により減少させることを可能にする方法でもある。
【００２５】
可変部領域からのペプチドは、例の中で示すように、その免疫付与性に対して影響を与えること無く交叉反応性を増大させ得る事実を指摘しておくことも重要である。
【００２６】
他方、本方法は、種々の異なる樹状構造を同じ担体に対してカップリングさせることを可能にするものである。同様に、類似のＣＤ４結合ペプチドを有する本発明の構造の混合物が、抗Ｖ３免疫付与性及び交叉反応性を増大させることも証明された。
【００２７】
当該担体がＴ細胞エピトープを提供できるように、この新しい構造をＢ細胞エピトープだけを有する樹状部分で構成することができる。ワクチン要素としてＭＡＰ構造を使用すると担体の使用を回避することができ、本構造のＴ細胞エピトープを合成部分又は担体に含めることも可能となる。ＭＡＰ構造はコンパクトなクラスターを形成していないので、この戦略によりＢ細胞エピトープの発現性が向上する。また、担体タンパク質にカップリングさせた樹状体を使用することにより、樹状体のみを使用する場合 （従来から使用されていたＭＡＰ）と比較して、少量の免疫原でも高い交叉反応性及び免疫付与性を得ることができる。
【００２８】
最後に、これら共役物の混合物中における免疫付与性と交叉反応性との間に、相乗効果が存在することも明らかになった。
【００２９】
本発明の処方は、粘膜ルートを通してこれを接種することができる。粘膜ルートは、今日では非常に重要な接種ルートとして使用されており、本発明は本ルートの使用を可能にするものでもある。
【００３０】
（例）
例１：抗原構造を得る方法
一般に、ペプチド、ＭＡＰ及び樹状体の合成については、既に報告されている （Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ．ら １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６， ５４０９−５４１３）（Ｓｈａｏ， Ｊ．ら １９９５， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７， ３８９３−３８９９）。抗原構造は、樹状体構造と担体タンパク質の間を架橋させることにより、これを得ることができる。本実験においては、スペーサー剤として無水琥珀酸 （ＳＡ）使用してこれを実施した。無水琥珀酸は、そのアミノ基を通して、両方の抗原に対して共有結合で架橋する。そのために、ｐＨ ８．５の緩衝タンポンの中で無水琥珀酸により担体タンパク質を３０分間活性化した。次にこの活性化物を透析し、樹状体分子 （ＭＡＰ）とペプチドの間に存在する不必要な架橋剤を除去した。タンパク質のカルボキシル基をＥＣＤＩ（可溶性ジイミド）で活性化することにより、共役反応を行わせた。その後で合成抗原を添加した。ゲル濾過を行うことにより、これらの共役物を分離した。最後に、マウスのＡｃＭ及び血清を使用して、ＥＬＩＳＡ法及びウェスタンブロット法により検定を行った。
【００３１】
例２：種々のスペーサー剤を使用して抗原構造を得る方法
種々の異なるスペーサー剤を使用して、種々の抗原構造を得た。共役物が良好な免疫性を得るためには、タンパク質との結合がエピトープの重要残基から遠く離れた場所で行われることが必要である。この問題を解決するために、種々の異なるスペーサー剤（グルタールアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシイミド エステル （ＭＢＳ）、カルボジイミド、βマレイミドプロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシイミド エステル （ＭＰＳ）、無水琥珀酸、その他）を使用した。免疫化過程において、担体タンパク質に対する抗体又はカップリング剤を引き出すことができる。良好なカップリング剤の理想条件として、自己抗体反応を発生させるようなものは好ましくないと言える。
【００３２】
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシイミド エステル （ＭＢＳ）、又はβマレイミドプロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシイミド エステル （ＭＰＳ）、又は無水琥珀酸を使用して、２種類の異なる担体タンパク質に共役させたＨＩＶ−１， ＪＹ１アイソレートから誘発されたＶ３に基づいて合成多抗原ペプチド （ＭＡＰ）に対する抗体反応を行わせた結果、これらの抗体反応がそれぞれ異なる挙動を示すことが見いだされた。無水琥珀酸スペーサーの場合においては、カップリング剤に対して強い反応を示さない、優れた抗ＪＹ１反応が行われることが観察された。これとは異なり、ＭＢＳはカップリング剤に対して強く反応し、抗体反応を完全に妨害する。この結果から、文献中に報告されているスペーサー剤が全て同じ挙動を示す訳ではないことが明らかになった。この事実は、この種類の抗原構造を得る場合、既に最新技術として報告されているスペーサー剤の使用による効果が、実は未だに明らかになっていないことを示している。
【００３３】
例３：新しい樹状構造の設計、合成、及びＨＢｓＡｇへの共役
従来の抗原構造（例えばＭＡＰ−タンパク質共役物）が対象ペプチドに対して高タイター値を引き出したことを考慮して、新しい樹状構造を合成した。担体タンパク質がＴｈエピトープを提供するので、今回Ｔｈエピトープは使用しなかった。そのために当該構造の合成が簡単になり、従来より長いＢ細胞エピトープを合成して含めることが可能になり、Ｂ細胞とＴｈエピトープの間に共直線性が存在するために、不要な３Ｄ構造の生成を避けることができるようになった。例１で示したように、樹状体はＨＢｓＡｇに対して個々にカップリングさせた。ＭＡＰは、Ｊ． Ｔａｍらの方法 （１９８８）により合成した。その後、樹状構造及び共役物をゲル濾過クロマトグラフ法により分離し、コマシー法によりその濃度を測定した。
【００３４】
例４：免疫化性能の向上及び交叉反応性の高揚
ＭＡＰを担体タンパク質に共役させた場合における免疫付与性及び交叉反応性に及ぼす効果を調べる目的で、１０匹のメス マウス（Ｂａｌｂ／ｃ， 週齢６−８）から成る２グループにＦＣＡ／ＦＩＡ溶液を皮下注射してこれを免疫化させた。それぞれ、グループ１はＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）、グループ２はＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）であった。それぞれの接種量は、５０ μｇｙ及び１０ μｇであった。マウスは０、１４、２８、４０日目に免疫化し、３６日目及び５１日目に採血した。ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）は、例１と同様、スペーサー剤として無水琥珀酸を使用して測定した。ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）にはＴ細胞エピトープのコピー８個、破傷風毒素 （ＴＴ）からのアミノ酸 ８３０−８４４、及びＢ細胞エピトープのコピー８個、ＨＩＶ−１ ＪＹ１アイソレート ｇｐ１２０のＶ３領域からの１５個の中央アミノ酸が存在する （Ｃｒｕｚ， Ｌ．Ｊ．ら ２０００， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６， ２１７−２２４）。第３回目及び第４回目の投与を行った後、ＪＹ１エピトープ及びその他Ｖ３ペプチドに対する抗体反応について調べた。間接ＥＬＩＳＡ法により、ＢＳＡにカップリングさせたペプチドを使用して血清中におけるＩｇＧ反応を定量した （Ｇｏｍｅｚ， Ｃ．Ｅ．ら １９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１， ７−１６１８）。プールした血清を、１００−１に希釈して使用した。
【００３５】
ステューデント試験法により、統計学的な解析を実施した。「確からしさが０．０５より低い場合」は統計学的に「有意」、「確からしさが０．０１より低い場合」は「高度に有意」であると考えられた。
【００３６】
共役物の投与量が１／５という低い濃度であったにも拘わらず、第３回目の投与を行った後においても、相同ペプチドに対する免疫付与性に関して差異は認められなかった。
【００３７】
従って、共役物を使用することにより、抗原量を大幅に節約することが可能になる。これは大きな利点である（図１Ａ）。ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＪＹ１−ＴＴ）で免疫化したグループにおいては、他のＶ３ペプチドに対する交叉反応性は、ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）を接種したマウスの場合とは異なり、交叉反応性を示さず、同程度の抗体反応性が達成されたものと考えられた。第４回目の投与を行った後、ＨＢｓＡｇ ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）はＪＹ１エピトープに対して、ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）に対するよりも高い反応性を誘発させた。幾つかの交叉反応抗体がＭＰＡ８ （ＴＴ−ＪＹ１）基の中に誘発されたが、当該抗体の数は、ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＪＹ１−ＴＴ）の場合と比較してやや少なかった。免疫付与性の増加は、幾つかのエピトープに対する抗体を引き出すためにＭＡＰカクテルを使用した報告が存在することから、非常に重要であると言うことができる。しかし、場合によっては副作用が起こる可能性もあるので、要求される効果（即ち中和性など）を得るために必要な合計量の全量を、ヒトに接種することは許されない。結論として、少量の抗体で高度の抗体反応を誘発させることが非常に重要であると言うことができる。従って、本方法で述べた構造（即ちＭＡＰ−担体タンパク質共役物）に利点があるのは明らかである。少量の抗原を使用して広範囲の交叉反応を引き出せることを考慮すれば、カクテルにして投与する可変エピトープの量を結果的に減らすことができる。最後に、当該共役物を使用した場合、担体自体がＨＢｓＡｇのような保護免疫原となり得る場合には、これが２価ワクチン製造の手段ともなり得るものと考えられる。
【００３８】
例５：ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）及びＴＡＢ９で免疫化したマウスによる体液反応の研究
免疫システム （Ｉ．Ｓ．）にＪＹ１エピトープを発現させた場合の差異を調べる目的で、組替えタンパク質 ＴＡＢ９ （Ｄｕａｒｔｅ， Ｃ．Ａ．ら １９９４， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０， ２３５−２４３）を幾つかのＨＩＶ１アイソレートからのＶ３ペプチド（ＬＲ１５０， ＪＹ１， ＲＦ， ＭＮ， ＢＲＶＡ及びＩＩＩＢの順）で構成した。これらの長さは、Ｖ３ループの中央部分を含めて、アミノ酸１５個分であり、これとＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）との比較を１回の実験で実施した。ＴＡＢ９に含まれるＶ３ペプチドへの認識について調べ、ＪＹ１配列全体に渡るＡｌａ置換ペプチドを使用したエピトープ マッピング法により、差異を評価した。当該配列の中に１個のＡｌａ置換が存在した場合、これをさらにＧｌｙで置換した。１０匹のメス マウス （Ｂａｌｂ／ｃ；週齢６−８）から成る２つのグループを、ＴＡＢ９タンパク質 １００ μｇ及びＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１） １６．４ μｇを溶解したＣＦＡ／ＩＦＡ溶液を皮下注射して免疫化させた。両免疫原の量は、ＪＹ１エピトープの量が等しくなるように設定した。
【００３９】
マウスの免疫化を０、１４、２８、及び５６日目に、採血を６７日目に実施した。血清中における抗ＪＹ１ ＩｇＧ反応は、ＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４０】
ステューデント試験法により、統計学的解析を実施した。「確からしさが０．０５未満の場合」は「有意」、「確からしさが０．０１未満の場合」は「高度に有意」であると考えた。Ｖ３ペプチドに対する交叉反応性を調べるために、ＢＳＡにカップリングさせたエピトープを使用する間接ＥＬＩＳＡ試験法により、血清中におけるＩｇＧ反応を定量した （Ｇｏｍｅｚ， Ｃ．Ｅ．ら １９９８； Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１， ７−１６１８）。プールした血清を１００−１に希釈して使用した。
【００４１】
セルロース膜上におけるエピトープ マッピング法については、既にＲｏｎａｌｄ Ｆｒａｎｋ （Ｆｒａｎｋ， Ｒ． １９９２， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８， ９２１７−９２３２）が報告を行っている。
【００４２】
接種４回後のグループから採取してプールした血清を、幾つかのＶ３ペプチドに対して試験した。ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）で免疫化したマウスには、Ｖ３試験を行った５種類中の４種類 （ＬＲ１５０， ＲＦ， ＭＮ， ＢＲＶＡ）が検出されることが見いだされた。その中で、３種類 （ＲＦ， ＭＮ， ＢＲＶＡ）が、１．２５より高い吸光度 （Ａ４９２ ｎｍ）を与え、反応性が強いことが分かった。特にＲＦペプチドについては、Ａ４９２ ｎｍが２．５より高かった。前者の結果から、Ｉ．Ｓ．に対するＢ細胞エピトープの発現におけるＭＡＰの利点が明らかである。全ペプチドで構成されるＴＡＢ９タンパク質の場合、２種類のペプチド （ＲＦ及びＢＲＶＡ）に関してテストしたが、これらのペプチドを認識することはできなかった。ペプチド ＭＮ及びＩＩＩＢは非常に低いＡ４９２ ｎｍ値（０．７５未満）で検出された。ＪＹ１及びＬＲ１５０ペプチドだけが、非常に高いＡ４９２ ｎｍ値で認識された。以上より、ＭＡＰによるＩ．Ｓ．への発現が、当該免疫原には含まれない他のＶ３ペプチドへの交叉反応を可能にするものと我々は結論した。この理由により、無数に存在する相同配列を扱うために戦略に加えられる抗原の量を、最適化することができるものと考えられる。ＴＡＢ９タンパク質に関する結果は、組替えタンパク質の中に幾つかの配列を加えても、必ずしも技術的な解決策は得られないことを証明した。事実、ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）は、それより良好な反応性を示している。
【００４３】
免疫システムへのエピトープの発現に差異を見いだそうとして、オーバーラッピング及びＪＹ１配列からのＡｌａ置換ペプチドを使用するエピトープ マッピングを実施した。両グループから得られたプール血清が、同じアミノ酸配列（ＬＧＱＡＬＹ）を認識することが見いだされた。ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）グループに関して、アミノ酸 Ｌ−Ｑ−−ＹがＡｂｓとの相互作用に直接関与していた。これに対してＴＡＢ９においては、主に関与しているのはアミノ酸 Ｌ−Ｑ−ＬＹであることが明らかになった。唯一個のアミノ酸によるこの僅かな差異が、Ｖ３でテストしたペプチドに対する時差認識の原因になっているものと思われる。当該エピトープは、両免疫原中の種々の異なる３Ｄ構造の中に発現されるものと推定される。
【００４４】
結論として、ＴＡＢ９タンパク質中のペプチドがＭＡＰとの間に時差を置いて免疫システムに暴露されるものと考えられる。本実験により、当該時差暴露が、両免疫原における交叉反応プロフィールに影響を与えていることが明らかになった。
【００４５】
例６：免疫系へのペプチド発現方法における免疫付与性の比較
幾つかのペプチドが免疫システム上に発現することによる免疫付与性を評価する目的で、８匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスから成る９グループに対して接種を行った。これらのマウスを０、１４、２８日目に免疫化し、最後の免疫化日から１０日後に採血を行った。全てのデータを表２に纏めた。ＭＡＰ４ （ＴＴ−ＪＹ１）は４個のＢ細胞エピトープ （全てがＪＹ１）、及び４個のＴ細胞エピトープ （全てがＴＴ８３０−８４４）を持っている。当該ペプチド （ＴＴ−ＪＹ１）は、Ｂ細胞 （ＪＹ１）及びＴ細胞 （ＴＴ） エピトープをタンデムに並んだ状態で持っている。前者のエピトープの両側にＣｙｓを加え、これを重合させて直線状のポリマーを合成した （Ｃｒｕｚ， Ｌ．Ｊ．ら ２０００； Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄａ １７， ３５−３８）。また、デキストラン ビーズの表面上でペプチドを合成した。既に例１で述べたように、無水琥珀酸 （ＡＳ）をスペーサーとして使用し、これを共役させることにより、ＨＢｓＡｇ−ペプチド （ＴＴ−ＪＹ１）、 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４ （ＴＴ−ＪＹ１）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）が得られた。グループ ＨＢｓＡｇ（グループ９）をプラセボとして追加した。ＥＬＩＳＡ試験法により、血清中における抗ＪＹ１ ＩｇＧ反応性を測定した。
【００４６】
ステューデント試験法により、統計学的な解析を行った。「０．０５未満の確からしさ」は、統計学的に「有意」であり、「０．０１未満の確からしさ」は統計学的に「高い有意性」を示している。ＭＡＰ−ＨＢｓＡｇ共役物（グループ７及びグループ８）が、ＭＡＰｓ及びそのポリマーと比較して、ＪＹ１エピトープから著しく高い抗体反応を引き出すことが証明された。前者のグループはペプチド（グループ４）と比較して著しく優れていた。デキストラン−ペプチド（グループ５）（図３Ｂ）には、ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ共役物との間に差異は認められなかった。しかし、共役物の接種量が４分の１以下であることも考慮に入れるべきである。この実験により、ＭＡＰとＨＢｓＡｇが共役することにより、ＪＹ１エピトープに対する抗体反応性を、ＭＡＰ単独の場合と比較して著しく高めたことが明らかになった。ＭＡＰはペプチドと担体タンパク質との共役を避けるために発現したものと考えられたので、我々は共役後における免疫反応性と、４倍量の単独接種を行った場合の免疫反応性を比較して、共役後の抗体反応性の方が高いことを証明した。ＭＡＰ−担体タンパク質（即ちＨＢｓＡｇ）共役物が試験を行った中で最良の免疫原であるものと結論される。
【００４７】
例７：種々の異なる発現方法により引き出される合成ペプチドの免疫システムに対する交叉反応性に関する研究
種々の異なるＪＹ１ペプチドの発現方法により引き出される、交叉反応の水準を評価する目的で、種々の異なる免疫化スケジュールに対応するプール血清を約１０−５の抗ＪＹ１タイター値に設定し、種々の異なるＨＩＶ−１アイソレートから採取された５種類のＶ３ペプチドのパネルと交叉反応を行う能力について比較を行った。全ての場合において、メスのＢａｌｂ／ｃマウス１０匹のグループに対して、１００ μＬを皮下接種した。免疫化の一般的スケジュールは、０、１４、２８、５６、及び９９日目に免疫化接種を行い、最終投与の１０日後に採血した。全グループとも、５回目の接種は行わなかった。データを表３に纏めた。同じ実験から、同じスケジュール番号のグループを抽出した。
【００４８】
この実験の結果から、交叉反応性は、ＪＹ１ Ｖ３ペプチド自体が有する特徴であることが明らかになった。試験を行った全ての免疫システム（グループ２、３、８及び９）への発現方法に共通して交叉反応性の存在が認められたからである。さらに、このような交叉反応性は、試験を行った全てのペプチド（グループ１、２、３、８および９）で構成される免疫原により引き出される反応と比較しても大きい可能性がある（図４Ｂ）。交叉反応性に関して、ＭＡＰ４ （ＴＴ−ＪＹ１）， ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）， ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４ （ＴＴ−ＪＹ１）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）の間に差異は認められなかった。しかし、共役物による免疫化マウスの接種回数が４回だけで、ＭＡＰによる場合の５回より、その接種量が少なかった事実は重要である。ＭＡＰを４回接種した後における交叉反応性分析（例４）の結果は、共役物を接種した場合より低い水準を示している。この事実は、共役により効果が高まったことを示すものである。従ってこの実験は、例４で得られた結果を支持するものである。
【００４９】
例８：新しい樹状体−ＨＢｓＡｇ共役物の免疫学的評価；Ｖ３ペプチド パネルに対する血清の認識
ワクチン処方における種々の共役物間の相互作用を評価する目的、及び共役物混合物の免疫付与性及び交叉反応性の増大活性を証明する目的で、マウスを使用して実験を行った。
【００５０】
皮下ルートを使用して、メスのＢａｌｂ／ｃマウス１０匹から成る１０グループに、１００ μＬ接種した。免疫化グループの分布は、１．ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）；２．ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）；３．共役物 ＨＢｓＡＧ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物；４．ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）；５．共役物 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物であった。ペプチド配列を表５に纏めた。グループ１、２及び４には各共役物 １０ μｇを、グループ３及び５には５ μｇを接種した。マウスには、０、１４、２８、５６及び８４日目に免疫化を行った。最終免疫化後１０日目に採血した。データを表４に纏めた。
【００５１】
セルロース膜上で合成した種々のＨＩＶ−１アイソレートから採取した５０種類のＶ３ペプチドから成るパネルに対して、交叉反応Ａｂｓの試験を行った。また、ＥＬＩＳＡ検定により、図１の例で既にテストを行った５種類のペプチドに対する交叉反応Ａｂｓを評価した。各グループから採取してプールした血清は、１／１００に希釈して使用した。
【００５２】
血清中における抗体反応をＥＬＩＳＡ試験法により測定し、コンセンサス ペプチド、ｇｐ１２０から採取したＣＤ４結合ペプチド、及びＶ３配列のペプチド ライブラリに対する抗ＩｇＧ反応を定量した。
【００５３】
ステューデント試験法により、統計学的解析を実施した。確からしさが「０．０５未満」の場合は統計学的に「有意」、確からしさが「０．０１未満」の場合は統計学的に「高度に有意」であると考えられる。
【００５４】
５回の接種を行った後、グループＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）中のコンセンサス ペプチドに対する抗体反応は、非常に弱かった（表６）。ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）で免疫化したマウスから採取してプールした血清が、試験を行ったＶ３ペプチドのいずれとも、又ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）とも、さらにＢＳＡに共役したコンセンサス ペプチドとも反応しなったことには興味が持たれる。しかし、ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）との混合物を接種したグループにおいては、コンセンサス ペプチド及びＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）に対する強い抗体反応が現れた。当該反応は、抗ＣＤ４結合ペプチドＡｂｓの結果現れたものではない。ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４ （ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）で免疫化したマウスから採取した血清が、これらのペプチドのいずれとも反応しなかったからである。従って、この共役混合物中の相乗効果により、コンセンサス ペプチド及びＶ３ライブラリに対する抗体反応が高められたものと結論される。そのために、ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）が、抗Ｖ３反応に対して、非常に強い（共役物を単独で投与した場合と比較して、混合物の重量は１／２で済む）免疫性増大効果を持ったものと考えられる。グループ ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）にも同じ相乗効果が認められた。
【００５５】
この実験から、共役混合物で免疫化したマウス（グループ３及び５）が、処方に含まれているＢ細胞エピトープに対してＡｂｓを発現することが明らかになった（表６）。これらの共役物は、個々の割合に差異を生じることを避けるために、先ず個々に調製し、次にこれらを混ぜ合わせたものである。そのために、３つの異なる共役混合物は、ほぼ同じレベルの抗ペプチド抗体反応を発現した。
【００５６】
抗コンセンサス ペプチド反応及び抗ペプチド ライブラリ抗体反応は、ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）を、ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチドとの混合物として接種した場合、単独で免疫化を行った場合と比較して著しく高かった。図５ｂ（グラフィック１及び２）に示すように、抗コンセンサス反応が増大し、抗ペプチド ライブラリが重要なレベルまで出現した。それにも拘わらず、混合物の場合においては、個々の共役物を別々に接種した場合と比較して、接種量は半分であった。この結果から、ＭＡＰ４（ｇｐ１２０ からのＣＤ４結合ペプチド）を有する処方により、抗Ｖ３反応を高められることが明らかになった（図５、グラフィック１及び２）。
【００５７】
交叉反応の増加は、抗Ｖ３ペプチドのＥＬＩＳＡ試験により証明された。この実験から採取した血清を、図１で既に述べたＴＡＢ９タンパク質中のＶ３ペプチド パネルに対してテストした。コンセンサス ペプチドとＣＤ４ペプチドの間の相互作用に関して、ＣＤ４ペプチドにより引き出された交叉反応Ａｂｓ、及びコンセンサス ペプチドの通常の反応性がＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の高揚効果により増加したために、当該混合物が高タイター値を引き出したことが観察された。さらに、Ｖ３ペプチドを５０種類含むパネルに対して４回及び５回投与した後に、グループ３及び５から採取してプールした血清を分析した。グループ５〔共役物ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物〕の場合には、４回接種後に、試験に供したペプチドの２６％ （１３／５０） が認識された。この割合は、５回接種後には３０％ （１５／５０）となった。４回接種後には認識されたペプチドの５３％ （７／１３）に、又５回接種後には４６％ （７／１５）に、非常に強い反応性が認められた。
【００５８】
グループ３〔ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）〕は、４回接種の後にはペプチドの７２％ （３６／５０）と、５回接種の後には９２％ （４６／５０）と反応した。４回接種後においては認識されたペプチドの５０％ （１８／３６）が、５回接種後においては４８％ （２２／４６）が、非常に強い反応性を持っていた。
【００５９】
ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）との混合物が、ペプチド ライブラリとの類似混合物と比較して、広範囲の交叉反応を引き出したものと結論された。当該コンセンサス ペプチドが５０種類のペプチドから成るパネルの全位置からアミノ酸をさらに頻繁に選択することにより創り出され、又当該ライブラリも同じパネルから発生させたものなので、交叉反応性抗体を引き出すための最良の戦術は、担体タンパク質とカップリングしたコンセンサス ペプチドのＭＡＰ＋相乗効果を有する他の共役物の混合物で構成される処方を作成することにあると、我々は結論する。
【００６０】
例９：直線状Ｖ３ （ＪＹ１）ペプチドによる免疫反応と、種々の担体タンパク質にカップリングしたＭＡＰによる免疫反応の比較
樹状構造（この場合はＭＡＰ）を種々の担体タンパク質に共役させることの免疫付与性及び交叉反応性に及ぼす効果を調べるために、直線状ＪＹ１ペプチド及びそのＭＡＰ構造を種々の担体タンパク質（ＨＢｓＡｇ， ＫＬＨ， ｐ６４Ｋ）にカップリングさせた。
【００６１】
ペプチド及びＭＡＰを、グループ５−９において使用した種々の担体タンパク質にカップリングさせるために、無水琥珀酸法を使用した。グループ１０のＭＡＰは、ＭＰＳをカップリング剤として使用してＨＢｓＡｇにカップリングさせた。
【００６２】
メス のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）８匹から成る９グループに対して、０、１４、２８、５６日目に接種を行い、最終接種後１０日目に採血を行った。免疫化グループ、投与量、及び使用したアジュバントの種類を、表８に示す。
【００６３】
ＪＹ１ペプチドに対する血清中のＩｇＧ抗体反応は、ＥＬＩＳＡ試験法によりこれを定量化した。交叉反応性についてもＥＬＩＳＡ試験法により、例５に示したペプチド パネルを使用してその評価を実施した。さらに、非関連ペプチドを比較対照として使用した。
【００６４】
変動均質性解析用のＦテストを実施し、次にステューデントｔテストを実施して、得られた結果を解析した。ｐ＜０．０５の値を、統計学的に異なる数値、ｐ＜０．０１の値を統計学的に高度の有意性を有する数値であると考えた。
【００６５】
タンパク質−ＭＡＰ共役物に対する抗体反応は、全ての場合において、ペプチド−タンパク質共役物により発生する反応と比較して優位にあった（図６Ｂ）。ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）に対する反応は、ＫＬＨ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）の反応とほぼ同等のレベルにあった。いずれの反応も、ｐ６４Ｋ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１） 共役物で得られる反応と比較して著しく優位にあった。他方、ＭＡＰの共役物に対する抗体反応も、単独のＭＡＰにより発生する抗体反応と比較して、著しく優位にあった（ｐ＜０．０５）。この共役物中の合計抗原量の方が低いことを指摘することは非常に重要ではあるが、ｐ６４Ｋ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）の場合は例外である。これらの結果は、担体タンパク質にカップリングした樹状構造を使用することにより、使用すべき合計免疫原量を最適化でき、さらに免疫反応性を著しく高められることを証明するものである。
【００６６】
全ての共役物を使用し、少なくとも２種類を越える異種起源Ｖ３ペプチドに対する免疫化を実施することにより、交叉反応性が存在し、且つ当該交叉反応性が３回目及び４回目の接種で高められることが観察された（図６Ｃ）。さらに当該交叉反応において、カップリングさせたＭＡＰの方がカップリングさせないＭＡＰより、著しく優位にあることも証明できた。
【００６７】
例１０：樹状構造上の種々のＶ３アイソレートにより免疫化した後、血清中における免疫付与性及び交叉反応性を定量した結果
免疫付与性及び交叉反応性に関して見いだされる高揚効果が、Ｖ３配列の選択により左右されないことを証明する目的で、Ｖ３アイソレートに対応する種々のＶ３ペプチドの樹状構造により免疫化を実施した後で、免疫付与性及び交叉反応性の両方を測定した。ＲＦペプチドの配列を、表１及び図１に示した。
【００６８】
週齢８−１０のメス マウスに対して、０、１４及び２８日目に接種を行い、免疫化前及び３回目の接種後に採血を実施した。接種した抗原はＭＡＰ８ （ＴＴ−ＲＦ）であり、ＲＦベースのＭＡＰを無水琥珀酸カップリング剤（例１に記載済）でＨＢｓＡｇにカップリングさせて得られた、樹状構造であった。使用した接種量は、それぞれ４０及び１０ μｇであった。
【００６９】
図７においてはっきりと観察されるように、ＨＢｓＡｇにカップリングさせた樹状構造もＭＡＰも、いずれも著しいレベルの交叉反応性を発生させた。さらに、統計学的解析を実施することにより、樹状共役物ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＲＦ）免疫化グループから採取した血清について、免疫付与性及び交叉反応性が著しく増加することを証明することができた。
【００７０】
例１１：担体タンパク質に共役した種々のＭＡＰの免疫学的分析
担体タンパク質に結合した種々のＭＡＰに関して、その免疫付与効果を調べる目的で、ＭＡＰの四量体、及び対応する直線状ペプチドを合成した。ＭＡＰ４−（ＮＭ）及びＭＮペプチドは、ＯＭＰ Ｐ１．１５〔髄膜炎菌Ｂ３８５菌株（ＨＹＴＲＱＮＮＡＤＶＦＶＰＡＶＶＧ）〕から誘導されたループ４からの誘導エピトープを含んでいる。ＭＡＰ４−（Ｄ）及びＤペプチドには、デング熱２ウィルスｐｒｅＭ／Ｍタンパク質（ＬＴＴＲＮＧＥＰＨＭＩＶＳＲＱＥＫＧＫＳＬＬ ＦＫＴＧＤＧＶＧ）からの誘導エピトープが含まれている。
【００７１】
ＭＡＰ４−（ＮＭ）及びＭＮペプチドは、カップリング剤としてβ−マレイミドプロピオン−Ｎ−ヒドロキシスクシイミド酸 （ＭＰＳ）のエステルを使用し、担体タンパク質ＫＬＨ及びｐ６４Ｋに共役させたものである。濃度５０ ｍｍｏｌ／Ｌの燐酸塩緩衝液を使用してＤＭＦ溶液中、ｐＨ ６でタンパク質を過剰量のスペーシング剤で３０分間誘導体化し、これを共役させた。余分なＭＰＳは、透析を行ってこれを除去した。ＭＡＰ４−（ＮＭ）及びＭＮペプチドの合成過程で、Ｃ末端にシステインを付加して−ＳＨ基を発生させた。マレイミドで誘導体化したタンパク質は、各ペプチド及びＭＡＰの上に存在する遊離チオール基と、室温で３時間、これを自発的に反応させた。これら共役物の精製はゲル濾過クロマトグラフ法によりこれを実施した。
【００７２】
ＭＡＰ４−（Ｄ）及びＤペプチドの場合は、タンパク質ＫＬＨ及びｐ６４Ｋに、可溶性カルボイミドによる直接法を使用して共役させた。ＭＡＰ４−（Ｄ）及びＤタンパク質にはＣ末端にカルボキシル基が含まれており、これにより担体タンパク質（ＫＬＨ及びｐ６４Ｋ）からのアミン基に直接結合することができる。
【００７３】
種々の共役ＭＡＰの免疫付与性を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス８匹から成る１２グループを皮下接種により免疫化した。接種は０、１４、２８日目にこれを実施した。マウスの採血は、最終接種の１０日目に実施した。免疫化グループ、接種量、及び使用アジュバントの種類を、表８に示す。
【００７４】
抗体反応は、ＥＬＩＳＡ試験法によりこれを定量化し、血清中の対応タンパク質に対する合計ＩｇＧ値を定量した。
【００７５】
Ｆテストで変動均質性を解析し、次いでステューデントｔテストで定量を行い、これらの結果を解析した。ｐ＜０．０５における数値は統計学的に異なるものと考え、ｐ＜０．０１における数値はこれを高度に有意な数値と判断した。
【００７６】
図８Ｂで観察されるように、高いタイター値は共役物ＫＬＨ−ＭＡＰ４−（Ｄ）及びｐ６４Ｋ−ＭＡＰ４−（Ｄ）に対応している。全ての場合に、タンパク質−ＭＡＰ共役物のタイター値は、タンパク質−ペプチド共役物（ＭＡＰ単独で免疫化したグループとほぼ同程度の反応を達成した）のタイター値と比較して著しく高かった。この実験結果から、種々の病原体配列を含む樹状構造を担体タンパク質と共役させることにより、選ばれたペプチドに対する免疫付与性が著しく増大するものと、我々は結論した。
【００７７】
例１２：樹状共役物を使用する鼻腔免疫化後における交叉反応性の試験
鼻腔投与免疫化により高度の交叉反応性を有する抗体反応が発生することを証明する目的で、Ｂａｌｂ／ｃマウス８匹から成るグループ（週齢１０−１２）に、（ＴＴ−ＪＹ１） ＭＡＰ８にカップリングさせた１０ μｇのＨＢｓＡｇを接種した。比較対照として、我々は４０ μｇの（ＴＴ−ＪＹ１） ＭＡＰ８を接種したマウス８匹から成るグループを使用し、ＥＬＩＳＡ試験法により両免疫原に対する抗体反応を評価して、ＪＹ１ペプチドに対する合計ＩｇＧ値を求めた。我々は、さらに５Ｖ３ペプチドのパネルに対する交叉反応性に関する分析も行った。比較対照グループでは、検出可能レベルの高ＪＹ１反応を発生することは無かった。これに対して、共役物ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）で免疫化したグループでは、１００％の場合において、相同ペプチドに対して強い反応が発生した。パネル中の２種類を越えるペプチドに対して交叉反応を発生させ、その程度が接種回数とともに増大することも見いだされた。これらの結果から、反応性を得るために共役が果たす重要な役割が明らかになった。即ち、抗体粒子の特性がカップリングしたＭＡＰに対する免疫反応を改善した。さらに、血清中及び粘膜表面で粘膜免疫化を行うことにより強い免疫反応が発生することを初めて証明することができた。
【００７８】
例２及び３に従い、担体分子としてＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、及びデング熱ウィルスのコア抗原を使用した他の樹状体によっても、これと同じ結果を得ることができた。
【００７９】
さらに、ゴナドロトロピン放出ホルモンからのペプチドを、既に述べた抗原にカップリングさせた樹状構造の合成部分として使用した場合、ペプチド単独で免疫化した比較対照マウス、及び非免疫化マウスと比較して、性腺のサイズが著しく減少することが認められた。
【００８０】
例１３：高度交叉反応性血清による種々のＨＩＶ−１アイソレートに対する交叉中和性の分析
高交叉反応性血清のループＶ３に対する交叉中和性を評価する目的で、ＨＩＶ−１から採取した種々の試験室アイソレートを使用して、生体外分析を実施した。これらの分析において、その交叉反応性レベルを考慮に入れた上で血清プール：ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）（例４）、ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＲＦ）（例１０）、及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４ （ＣＤ４）とＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４ （コンセンサス）（例８）の混合物を選択した。
【００８１】
これらの試験結果は、各免疫原により誘発される抗体反応が、異種起源のアイソレートに対して中和効果を誘発する能力を有することを示している。
【００８２】
ＣＤ４との混合物が交叉中和反応性のレベルを増大させたことも明らかになった。単一ペプチド又はその共役物が、検出可能レベルの交叉中和反応性を発生させることは無い。
【００８３】
例１４：種々の核を使用する樹状構造の合成
１分子当たりのＢエピトープ数を増やす目的で、間接合成を実施した。当該合成法においては、先ず核及びペプチドを別々に合成する。このシステムによれば、大型配列の合成に固有の過ちを回避することができ、高濃度のＢエピトープ及びＴエピトープを、適切に官能化された核の中へ導入することが可能になる。
【００８４】
１，６−アミノヘキサノのアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジアミド （ＤＣＣ）を活性化剤として使用してアミノ酸Ｂｏｃ−Ｌｙｓ （Ｂｏｃ）−ＯＨのカルボキシル基と反応させることにより、樹状構造の核を合成した。その後で、トリフルオロ酢酸 （ＴＦＡ）の３７％−ジクロロメタン （ＤＣＭ）溶液で脱保護し、４個の官能端を有する核を得た。これにより４価の樹状構造が得られ、同じ反応サイクルを繰り返すことにより、第二レベル及び第三レベルのＢｏｃ−Ｌｙｓ （Ｂｏｃ）−ＯＨに対するカップリングを行い、１６個のアミノ官能端を有する核を得ることが可能となった。その後で、我々はこれらの基とブロモ酢酸のカルボキシル基との間で反応を行わせた。さらにＲＰ−ＨＰＬＣ法により、カラムＣ８を使用して核を精製した。既に、Ｃ末端にシステインを含むＪＹ１ペプチドが合成されており、当該ペプチドは得られた核と適切な比率で反応する。核のヘテロ原子基とシステインのチオール基が塩基性の条件下（ｐＨ ８−９）で反応してチオエーテルが造られる（図９）。その反応率をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過クロマトグラフ法により定量した。
【００８５】
当該樹状構造は、既に例２で述べたカップリング剤を使用して、種々の担体タンパク質とカップリングさせた。得られたタンパク質及びＭＡＰで構成される樹状構造を、次に種々の免疫化スケジュールで使用した。この実験により、免疫付与性及び交叉反応性におけるその優位性が明らかになった。
【００８６】
本システムは、種々の利点、例えば別々に調製した種々のペプチドＢ又はペプチドＴを、適切に官能化されたユニークなマトリックスの内部へ導入できる方法を提供した（４−６Ｈ）。当該抗原ペプチドは、必要に応じて、そのＣ末端及びＮ末端を通してこれを合成し、共役させ、個々の決定基の精製を可能にし、長い配列を合成する場合に固有のエラーを回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａ）３回接種及び４回接種後における免疫付与試験の結果。グループ：１．ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）；２．ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）。接種量はそれぞれ５０及び１０ μｇであった。
Ｂ）３回接種及び４回接種後における交叉反応性Ａｂｓの試験結果。両グループから採取したプール血清を、固定希釈率（１００−１）でテストした。Ｖ３−ＢＳＡ共役物で被覆し、間接ＥＬＩＳＡ試験を実施した。
Ｃ）表１．試験対象のＨＩＶ−１から採取したＶ３ペプチドのアミノ酸配列。
【図２】
４回接種後におけるプール血清のＶ３ペプチドに対する認識試験の結果。グループ：１．ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＪＹ１）；２．ＴＡＢ９。接種量は、それぞれ１６．４及び１００ μｇであった。
【図３】
Ａ）表２：免疫化スケジュールのまとめ。
Ｂ）免疫システムに対するＪＹ１エピトープの種々の発現方法における免疫付与性の比較。
【図４】
Ａ）表３．免疫化スケジュールのまとめ。
Ｂ）Ａｇｓ接種後における血清Ｖ３エピトープに対する認識（ＪＹ１エピトープを種々の方法で免疫システムに発現する）試験の結果。
【図５Ａ】
表４．免疫化スケジュールのまとめ。
表５．ｇｐ１２０、Ｖ３から採取したコンセンサス ペプチド、及びＨＩＶ−１から採取したＶ３配列のペプチド ライブラリから採取したＣＤ４結合ペプチドのアミノ酸配列。
表６．４回接種及び５回接種後における免疫付与性試験の結果。
【図５Ｂ】
グラフィック１．グループ２、３及び６（表３参照）から採取した血清を５回接種し、その後に交叉反応性Ａｂｓを試験した結果。
グラフィック２．グループ４、５及び６（表３参照）から採取した血清を５回接種し、その後に交叉反応性Ａｂｓを試験した結果。
【図５Ｃ】
表７．セルロース膜上で合成したＶ３ペプチドのパネルに対する認識試験の結果。品質プロフィールは、４回接種及び５回接種後におけるプール血清認識の相対強度を示している。１及び２：共役物 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物。３及び４：共役物 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物。５：５回接種後のＨＢｓＡｇ。６：５回接種後のＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）。４段階の色強度は、ペプチドに対する抗体相互作用の質を示している。白：認識せず。淡灰色：軽度の認識。暗灰色：認識。黒：高度の認識。
【図５Ｄ】
表５の結果に対応する写真。１及び２：共役物 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３配列のペプチド ライブラリ）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物。３及び４：共役物 ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（Ｖ３からのコンセンサス ペプチド）及びＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）の混合物；それぞれ４回接種及び５回接種後。５：５回接種後のＨＢｓＡｇ。６：５回接種後のＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ４（ｇｐ１２０からのＣＤ４結合ペプチド）。全てのグループから採取したプール血清は、固定希釈率、１００−１ においてテストした。
【図６】
Ａ）表８．免疫化スケジュールのまとめ。
Ｂ）３回接種後における種々のグループに関する免疫付与性の定量結果。
Ｃ）グラフィック１．グループ４−１０（表３参照）から採取した血清を３回接種した後、交叉反応性を試験した結果。プール血清の分析は、１／１００の固定希釈率で実施した。ＢＳＡとカップリングさせた種々のペプチドでプレートを被覆し、間接ＥＬＩＳＡ試験を実施した。
グラフィック２．グループ４−１０（表３参照）から採取した血清を４回接種した後に交叉反応性を試験した結果。プール血清の分析は、１／１００の固定希釈率で実施した。ＢＳＡとカップリングさせた種々のペプチドでプレートを被覆し、間接ＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【図７】
Ａ）３回接種後のプール血清に含まれる種々のＶ３ペプチドに対する認識試験の結果。グループ１：ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＦＲ）。グループ２：ＨＢｓＡｇ−ＭＡＰ８ （ＴＴ−ＲＦ）。接種量は、それぞれ４０及び１０ μｇであった。
【図８】
Ａ）表８．免疫化スケジュールのまとめ。
Ｂ）３回接種後におけるＥＬＩＳＡ法による免疫付与性の評価結果。
【図９】
樹状ペプチド及び抗原構造の合成方法。
【図１】
2004513897.tif 000002
【図２】
2004513897.tif 000003
【図３】
2004513897.tif 000004
【図４】
2004513897.tif 000005
【図５Ａ】
2004513897.tif 000006
【図５Ｂ】
2004513897.tif 000007
【図５Ｃ】
2004513897.tif 000008
【図５Ｄ】
2004513897.tif 000009
【図６】
2004513897.tif 000010
2004513897.tif 000011
【図７】
2004513897.tif 000012
【図８】
2004513897.tif 000013
【図９】
2004513897.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004513897.tif 000015
2004513897.tif 000016
2004513897.tif 000017
2004513897.tif 000018
2004513897.tif 000019
2004513897.tif 000020
2004513897.tif 000021
2004513897.tif 000022
2004513897.tif 000023
2004513897.tif 000024
2004513897.tif 000025
2004513897.tif 000026
2004513897.tif 000027
2004513897.tif 000028
2004513897.tif 000029
2004513897.tif 000030
2004513897.tif 000031
2004513897.tif 000032
2004513897.tif 000033
2004513897.tif 000034
2004513897.tif 000035
2004513897.tif 000036
2004513897.tif 000037
2004513897.tif 000038
2004513897.tif 000039
2004513897.tif 000040
2004513897.tif 000041
2004513897.tif 000042
2004513897.tif 000043
2004513897.tif 000044
2004513897.tif 000045
2004513897.tif 000046
2004513897.tif 000047
2004513897.tif 000048
2004513897.tif 000049
2004513897.tif 000050
2004513897.tif 000051
2004513897.tif 000052
2004513897.tif 000053
2004513897.tif 000054
2004513897.tif 000055
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513897.tif 000056
2004513897.tif 000057
【国際調査報告】
2004513897.tif 000058
2004513897.tif 000059
2004513897.tif 000060
2004513897.tif 000061