(57)【要約】本発明は、皮膚関連疾患（例えば哺乳動物における頭髪及び腺関連疾患）の治療及び診断のための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン、並びに該サイトカインをコードする核酸の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における皮膚関連増殖疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断用の組成物を製造するための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン、又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分、並びに／あるいは該サイトカイン又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分をコードするヌクレオチド配列を有する核酸の使用。
【請求項２】
サイトカインが、ＧＤＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ、アクチビン及びＢＭＰからなる群より選択されるものである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
サイトカインがＭＰ５２である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
サイトカインがＭＰ１２１である、請求項２記載の使用。
【請求項５】
組成物が少なくとも１つの他のサイトカインを含むものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
他のサイトカインがＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
他のサイトカインが、ＮＧＦ、神経栄養因子（ＮＴ−３若しくはＮＴ−４など）、ＥＧＦ、ＥＧＦ様タンパク質、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ（ＦＧＦ−２、ＩＧＦ若しくはＫＧＦなど）、又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分である、請求項５記載の使用。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
皮膚関連増殖疾患が育毛疾患である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
皮膚関連増殖疾患が、腺疾患、好ましくは汗腺疾患である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
育毛疾患が、化学療法薬剤、パーキンソン病薬剤、潰瘍薬、抗凝血剤、痛風用薬剤、ビタミンＡから誘導した薬剤、てんかん用抗痙攣薬、抗鬱薬、βブロッカー、高血圧用薬剤、抗甲状腺剤、血液抗凝固剤、及びタンパク質同化ステロイドからなる群より選択される医薬剤に起因するものである、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
育毛疾患が甲状腺疾患に起因するものである、請求項９記載の使用。
【請求項１３】
育毛疾患が自己免疫疾患に起因するものである、請求項９記載の使用。
【請求項１４】
育毛疾患が真菌又は細菌感染症に起因するものである、請求項９記載の使用。
【請求項１５】
育毛疾患がホルモンバランスの不均衡に起因するものである、請求項９記載の使用。
【請求項１６】
育毛疾患が、即時型脱毛症、男性型禿頭症、晩期型脱毛症及び円形脱毛症からなる群より選択されるものである、請求項９及び１１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
育毛疾患が雄性脱毛からなる群より選択されるものである、請求項９及び１１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
哺乳動物における皮膚関連増殖疾患の治療及び／又は予防用の組成物を製造するための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインのアンタゴニストの使用。
【請求項１９】
哺乳動物における皮膚関連増殖疾患の治療及び／又は予防用の組成物を製造するための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインに対する抗体の使用。
【請求項２０】
哺乳動物における皮膚関連増殖疾患の治療及び／又は予防用の組成物を製造するための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの機能的活性の代替となるアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における毛髪及び腺関連疾患、特に、脱毛などの皮膚関連疾患の治療及び診断のための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン及び該サイトカインをコードする核酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＰ５２（ＧＤＦ−５としても知られる）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する、骨形成タンパク質分子であり、とりわけ、骨及び軟骨形成を刺激することが知られている。このタンパク質スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、ＭＰ５２も神経栄養機能に影響を与える（ＭＰ５２の様々な機能及び作用について詳しくは、例えば、ＷＯ−Ａ−９３／１６０９９号、ＷＯ−Ａ−９５／０４８１９号、ＷＯ−Ａ−９７／０３１８８号及びＷＯ−Ａ−９９／１５１９１号を参照されたい）。例えば、ＴＧＦβ−１、−２、及び３、並びに、アクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、−４、−６、−７、−１２、グリア細胞系由来の神経栄養因子様因子（ＧＤＮＦ様）、及びＭＰ５２は、すべて、様々な機構により、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することが証明されている。
【０００３】
ＭＰ１２１（アクチビンＣとしても知られる）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属する、アクチビン様分子（ＷＯ−Ａ−９３／１６０９９号、ＷＯ−Ａ−９６／０１３１６号及びＷＯ９８／２２４９２号を参照）であり、例えば、肝増殖及び神経栄養機能（例えば、ＷＯ−Ａ−９７／０３１８８号、ＷＯ−Ａ−９６／０１３１６号及びＷＯ９８／２２４９２号を参照）に影響を与えることが知られている。
【０００４】
ＴＧＦ−βは、広く分布していることから、発育及び細胞周期制御に顕著な役割を果たすサイトカインとして作用する。ＴＧＦ−βは、非常に多様な疾患、特に、創傷治癒、ニューロン生存及び組織修復と関連する疾患の治療に関して有用であることがわかっている。
【０００５】
哺乳動物身体の中で、皮膚の表皮細胞層は、最も大きな器官である。皮膚は、間葉区画及び上皮区画から構成される。さらに、表皮は、毛包や、数種の分泌腺を形成する。皮膚の２つの区画間の複雑な相互関係のために、増殖因子が、生化学的シグナル伝達に重要な役割を果たすため、増殖因子は、毛で覆われた皮膚の構造及び機能の両方の保存に寄与する。近年、皮膚細胞において数種のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１及びＨＧＦなど）を検出することに成功している。
【０００６】
現在まで、いくつかの皮膚関連疾患、例えば、脱毛や、その他の育毛疾患の治療は、医薬学的手段を用いてもわずかにしか実現可能ではなかった。これまでのところ、脱毛に関して最も成功している方法は、移植などの外科手術による方法であるが、これは、特に煩雑かつ費用がかかり、しかも患者に大きなストレスを与える手法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明が解決しようとする技術的課題は、これまで用いられてきた方法の欠点を解消し、皮膚関連疾患（例えば、脱毛やその他の育毛疾患）の治療、予防及び診断を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記問題は、特許請求の範囲に記載した本発明によって解決される。
【０００９】
特に、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、皮膚、腺及び毛髪関連疾患（例えば、脱毛や育毛疾患）、並びに腺関連疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断用の組成物を製造するための、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン、又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分、並びに／あるいは該サイトカイン又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分をコードするヌクレオチド配列を有する核酸の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
「ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカイン」という用語は、タンパク質性化合物、特に、このサイトカインファミリーのメンバーに特有の７個の保存システインノットモチーフを含むタンパク質又はポリペプチドを意味する。「機能的活性を有する誘導体」及び「機能的活性を有する部分」とは、対応するサイトカインの生物学的機能の少なくとも一部を示すタンパク質性化合物を意味し、これには、生合成した突然変異体又は誘導体も含まれる。このような有用な「誘導体」又は「部分」は、当業者であれば容易に検出することができる。誘導体の場合には、特に、保存的アミノ酸置換が起こる分子が、前記の定義に包含されると考えられる。このような保存的アミノ酸置換は、ほとんどの場合、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼさない。７個のシステイン領域を含む一般配列は、下記の式に対応する：
Ｃ（Ｙ）２５−２９ＣＹＹＹＣ（Ｙ）２５−３５ＸＣ（Ｙ）２７−３４ＣＹＣ
上記式中、Ｃはシステインを、Ｙ及びＸは任意のアミノ酸（システインを含む）を示す。二量体タンパク質が望ましい場合には、Ｘはシステインである。一量体タンパク質が望ましい場合には、Ｘはシステイン以外のアミノ酸である。上記一般的配列に対応するタンパク質又はポリペプチドは、一般に、本発明が関連する範囲内で適用可能である。また、７又は６個のシステイン領域を含む誘導体は、天然に存在するタンパク質形態の同領域に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％の相同性を示すことが特に好ましい。また、変異体に関しては、７個のシステイン領域のシステイン残基がすべて、天然に存在するタンパク質内のそれぞれ対応する位置で、すなわち、既知の間隔をあけて、保存されているのも好ましい。
【００１１】
特に、成熟した形態形成タンパク質のＮ末端部分においては、置換又は欠失は、もしあるとしても、わずかな程度までしか生物学的活性に影響を及ぼさない。従って、そのＮ末端部分に更なる欠失又は置換を含むタンパク質も、本発明に有用なタンパク質とみなされることを理解すべきである。
【００１２】
関心が寄せられるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー又はその活性変異体として、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５（米国特許第５，２８４，７６３号；欧州特許第０３７６７８５号、米国特許第４，８８６，７４７号；DNA 7（1988）pp. 1-8）、EMBO J.7（1988）pp. 3737〜3743）、Mol. Endo. 2（1988）pp. 1186〜1195）、J. Biol. Chem. 265（1990）pp. 1089〜1093）、ＯＰ１、ＯＰ２及びＯＰ３タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号、米国特許第５，６５２，３３７号、ＷＯ９１／０５８０２号）、並びにＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４（ＷＯ８８／００２０５号、米国特許第５，０１３，６４９号及びＷＯ８９／１０４０９号、Science 242（1988）pp. 1528〜1534）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６及びＢＭＰ７（ＯＰ１）（Proc. Natl. Acad. Sci. 87、（1990）pp. 9841〜9847、ＷＯ９０／１１３６６号）、ＢＭＰ８（ＯＰ２）（ＷＯ９１／１８０９８号）、ＢＭＰ９（ＷＯ９３／００４３２号）、ＢＭＰ１０（ＷＯ９４／２６８９３号）、ＢＭＰ１１（ＷＯ９４／２６８９２号）、ＢＭＰ１２（ＷＯ９５／１６０３５号）、ＢＭＰ１３（ＷＯ９５／１６０３５号）、ＢＭＰ１５（ＷＯ９６／３６７１０号）、ＢＭＰ１６（ＷＯ９８／１２３２２号）、ＢＭＰ３ｂ（Biochem. Biophys. Res. Comm. 219（1996）pp. 656〜662）、ＧＤＦ１（ＷＯ９２／００３８２号及びProc. Natl. Acad. Sci.88（1991）pp. 4250〜4254）、ＧＤＦ８（ＷＯ９４／２１６８１号）、ＧＤＦ１０（ＷＯ９５／１０５３９号）、ＧＤＦ１１（ＷＯ９６／０１８４５号）、ＧＤＦ５（ＣＤＭＰ１、ＭＰ５２）（ＷＯ９５／０４８１９号；ＷＯ９６／０１３１６号；ＷＯ９４／１５９４９号、ＷＯ９６／１４３３５号及びＷＯ９３／１６０９９号及びNature 368（1994）pp. 639〜643）、ＧＤＦ６（ＣＤＭＰ２、ＢＭＰ１３）（ＷＯ９５／０１８０１号、ＷＯ９６／１４３３５号及びＷＯ９５／１６０３５号）、ＧＤＦ７（ＣＤＭＰ３、ＢＭＰ１２）（ＷＯ９５／０１８０２号及びＷＯ９５／１０６３５号）、ＧＤＦ１４（ＷＯ９７／３６９２６号）、ＧＤＦ１５（ＷＯ９９／０６４４５号）、ＧＤＦ１６（ＷＯ９９／０６５５６号）、６０Ａ（Proc. Natl. Acad. Sci. 88（1991）pp. 9214〜9218）、ＤＰＰ（Nature 325（1987）pp. 81〜84）、Ｖｇｒ−１（Proc. Natl. Acad. Sci. 86（1989）pp. 4554〜4558）、Ｖｇ−１（Cell 51（1987）pp. 861〜867）、ドルサリン（Cell 73（1993、pp. 687〜702）、ＭＩＳ（Cell 45（1986）pp. 685〜698）、ｐＣＬ１３（ＷＯ９７／００９５８号）、ＢＩＰ（ＷＯ９４／０１５５７号）、インヒビンａ、アクチビンβＡ及びアクチビンβＢ（欧州特許第０２２２４９１号）、アクチビンβＣ（ＭＰ１２１）（ＷＯ９６／０１３１６号）、アクチビンβＥ及びＧＤＦ１２（ＷＯ９６／０２５５９号及びＷＯ９８／２２４９２号）、アクチビンβＤ（Biochem. Biophys. Res. Comm. 210（1995）pp. 581〜588）、ＧＤＮＦ（Science 260（1993）pp. 1130〜1132、ＷＯ９３／０６１１６号）、ニューチュリン（Neuturin）（Nature 384（1996）pp. 467〜470）、ペルセフィン（Persephin）（Neuron 20（1998）pp. 245〜253、ＷＯ９７／３３９１１号）、アルテミン（Artemin）（Neuron 21（1998）pp. 1291〜1302）、Ｍｉｃ−１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94（1997）pp. 11514〜11519）、ユニビン（Univin）（Dev. Biol. 166（1994）pp. 149〜158）、ＡＤＭＰ（Development 121（1995）pp. 4293〜4301）、ノーダル（Nodal）（Nature 361（1993）pp. 543〜547）、スクリュー（Screw）（Genes Dev. 8（1994）pp. 2588〜2601）。その他の有用なタンパク質として、２種以上の既知形態形成タンパク質に由来する配列を用いて設計された生合成タンパク質を含む、生物学的活性を有する生合成構築物を挙げることができる。生合成構築物の例は、米国特許第５，０１１，６９１号に開示されている（例えば、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７及びＣＯＰ１６）。
【００１３】
特許又は特許出願を含む、引用した文献の開示内容は、すべて本明細書に参照として組み込まれる。
【００１４】
上に定義した上記タンパク質の機能的部分及び誘導体もまた本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
これ以外にも、有用なサイトカイトンとして、例えば、ＮＧＦ、神経栄養因子（ＮＴ−３若しくはＮＴ−４など）、ＥＧＦ、ＦＧＦ様タンパク質、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＩＧＦ又はＫＧＦなどが挙げられる。これらのサイトカインは、ＴＧＦ−βファミリーのサイトカインと組み合わせれば、特に有用となり得る。
【００１６】
欧州特許第１，０７４，６２０号は、ＴＧＦ−βファミリーの一量体タンパク質について記載している。このような一量体タンパク質もまた、対応する二量体タンパク質の生物学的特性を少なくとも部分的に示すものであれば、本発明において用いることができる。
【００１７】
さらに、前記タンパク質及びその誘導体又は機能的部分のいずれかをコードする核酸も、本発明の範囲内で用いることができる。上に挙げたタンパク質をコードする核酸は公知である。しかし、遺伝的暗号の多様性のために、既知配列とは異なるが、同じタンパク質をコードする核酸も有用である。このような核酸は、天然に存在する核酸、又は組換えにより作製した核酸、並びに、プロセッシングを受けた核酸のいずれでもよい。また、このような核酸を用いて、タンパク質又はタンパク質誘導体若しくはそれらのいずれかの部分が得られるのであれば、上記核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。この実施形態は、形態形成タンパク質をコードする核酸が、作用部位で直接タンパク質を発現することができ、これにより、該タンパク質の完全な効果を獲得できるという驚くべき発見に基づいている。
【００１８】
本発明において使用するのに特に好ましいサイトカインは、ＭＰ５２である。
【００１９】
ＭＰ５２について、いくつかの改変物がすでに記載されており、特に、Ｎ末端で切断されたタンパク質がある。ＭＰ５２の成熟形態は、Ａｒｇ、Ａｌａ又はＰｒｏで開始していてよい。さらに、Ｎ末端部分での欠失は、７個のシステインを含む領域が存在し、この領域がＭＰ５２の天然配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％の相同性を保持する限り、生物学的活性に影響を及ぼすことはない。Ｎ末端での付加は、例えば、タンパク質の精製目的に有利となり得る。
【００２０】
本発明で使用するのに特に好ましい別のサイトカインは、ＭＰ１２１である。
【００２１】
ＭＰ１２１について、いくつかの改変物がすでに記載されており、特に、成熟タンパク質のＮ末端で切断されたタンパク質（ＷＯ９６／０１３１６号）がある。さらに、Ｎ末端部分での欠失は、７個のシステインを含む領域が存在し、この領域が、ＭＰ１２１の天然配列に対して少なくとも７０％、好ましくは、８０％の相同性を保持する限り、生物学的活性に影響を及ぼすことはない。Ｎ末端での付加は、例えば、タンパク質の精製目的に有利となり得る。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、上記組成物は、ＴＧＦ−βファミリーの少なくとも１つの別のサイトカイン又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分、例えば、上に定義した１以上のサイトカイン、並びに／あるいは該サイトカイン又はその機能的活性を有する誘導体若しくは部分をコードする１以上の核酸を含む。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、本発明を用いて、創傷治癒又は創傷修復のように皮膚関連疾患を改善することができる。
【００２４】
組織再生は、修復過程に関与する細胞の移動及び増殖を調節する特定のペプチド因子によって制御されるようである（Barret, T. Bら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：6772〜6774（1985）；Collins, I.ら、Nature 316：748〜750（1985））。従って、増殖因子は、創傷、火傷及びその他の皮膚疾患の治療において、有望な治療薬である（Rifkin, D. B. 及びMoscatelli、J. Cell. Biol. 109：1〜6（1989）；Sporn, M. B.ら、J Cell. Biol. 105：1039〜1045（1987）；Pierce, G. F.ら、J. Cell. Biochem. 45；319〜326（1991））。
【００２５】
創傷治癒障害は、裂開、吻合破断及び非治癒創傷といった合併症を引き起こす恐れがある。治癒障害は、糖尿病、感染症、免疫抑制、肥満症及び栄養不良などの疾患と関連していることが多い（Cruse, P. J. 及びFoord, R., Arch. Surg. 107：206（1973）；Schrock, I. R. ら、Ann. Surg. 177：513（1973）；Poole, G. U., Jr.、Surgery 97：631（1985）；Irvin, G. L. ら、Am. Surg. 51：418（1985））。正常の創傷治癒については、３つの時期、すなわち急性炎症期、細胞外マトリックス及びコラーゲン合成、並びに再造形が報告されている（Peacock, E. E., Jr.、Wound Repair、第２版、W B Saunders、フィラデルフィア（1984））。この過程は、創傷部位でのケラチノサイト、繊維芽細胞及び炎症細胞の相互作用を含む。
【００２６】
治癒過程の順序は、急性炎症期中に、仮組織の沈着で始まる。これに続き、上皮再形成、コラーゲン合成及び沈着、繊維芽細胞増殖、並びに、新生血管形成が起こり、これらはすべて、最終的に再造形期を決定する（Clark, R. A. F.、J. Am. Acad. Dermatol. 13：701（1985））。これらの事象は、炎症細胞によって、又は創傷周縁部に局在化した細胞によって分泌される増殖因子及びサイトカインの影響を受ける（Assoian, R. K. ら、Nature（Lond）309：804（1984）；Nemeth, G. G. ら、“Growth Factors and Their Role in Wound and Fracture Healing”，Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing in Biological and Clinical Implications，ニューヨーク（1988）、pp.1〜17）。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、前記サイトカインの機能的活性の代替となるアゴニストに関する。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態では、皮膚関連増殖疾患は育毛疾患である。
【００２９】
毛周期は、３つの異なる時期、すなわち成長期（活発な毛髪成長）、退行期（移行段階、毛包の活性が低下する）、及び休止期（休止、細胞増殖は一切測定されない）を含む。
【００３０】
バルジ（bulge）幹細胞は、休止期の後期に、真皮乳頭によって活性化される。これは、「バルジ（bulge）活性化」と呼ばれる。真皮乳頭は、成長期の中間期で、マトリックスにより活性化される。マトリックス細胞は、実際には、ＴＡ細胞である。従って、マトリックス細胞には、限定された増殖能しかない。真皮乳頭の上方への移動は、毛幹細胞の活性化にとって重要である。これらの要素のいずれが欠けても、育毛異常又は脱毛が起こる可能性がある。
【００３１】
本発明に従って治療及び／又は予防及び／又は診断する対象となる育毛疾患は、好ましくは脱毛症（例えば、即時型脱毛症、ジョンストン脱毛症、男性型禿頭症、晩期型脱毛症及び円形脱毛症）である。
【００３２】
さらに、本発明に従って治療及び／又は予防及び／又は診断する対象となる育毛疾患は、好ましくは皮膚放線菌症のような真菌感染、又はクリプトコックス症若しくは表皮ブドウ球菌感染巣のような細菌感染によって引き起こされるものである。
【００３３】
さらに、本発明に従って治療及び／又は予防及び／又は診断する対象となる育毛疾患は、好ましくは、甲状腺疾患によって起こるものである。
【００３４】
さらにまた、本発明に従って治療及び／又は予防及び／又は診断する対象となる育毛疾患は、好ましくは医薬剤に起因するものである。脱毛を引き起こすことが知られている医薬剤の例として、癌化学療法薬剤；レボドーパ（Dopar、Larodopa）のようなパーキンソン病薬剤；シメチジン（Tagamet）、ラニチジン（Zantac）及びファモチジン（Pepcid）のような潰瘍薬；クマリン及びヘパリンのような抗凝血剤；アロプリノール（Loporin、Zyloprim）のような痛風用薬剤；ペニシラミン、オーラノフィン（Ridaura）、インドメタシン（Indocin）、ナプロキセン（Naprosyn）、スリンダク（Clinoril）のような関節炎治療薬；イソトレチノイン（Accutane）及びエトレチネート（Tegison）のようなビタミンＡから誘導した薬剤；トリメタジオン（Tridione）のようなてんかん用抗痙攣薬；三環系抗鬱薬及びアンフェタミンのような抗鬱薬；アテノロール（Tenormin）、メトプロロール（Lopressor）、ノドロール（Corgard）、プロプラノロール（Inderal）及びチモロール（Blocadren）のような高血圧用のβブロッカー；カルビマゾール、ロジン、チロシアネート、チオウラシルのような抗甲状腺剤、血液抗凝固剤、男性ホルモンなどが挙げられる。
【００３５】
さらに、本発明を用いて、育毛を阻害することも可能である。考えられる用途として、例えば、癌治療中の細胞傷害性薬剤によって起こる細胞死から毛包細胞を保護する場合が挙げられる。また、別の用途として、美的理由による脱毛の長期持続又は育毛の抑制などが考えられる。
【００３６】
好ましくは、育毛疾患の治療及び／又は予防用に製造される前記組成物は、薬学上許容される担体及び／又は希釈剤をさらに含み、好ましくは経口、局部、静脈内及び／又は非経口投与により投与する。従って、本発明に係る医薬組成物に用いることができる担体及び／又は希釈剤は、投与経路に応じて異なり、この経路は、最終的製剤（例えば、軟膏、滴剤、ゲル製剤若しくは注射液など）にも影響してくる。
【００３７】
本発明に従い製造される医薬組成物は、典型的に、担体及び／又は希釈剤のような１以上の薬学的及び生理学的に許容される製剤物質と組み合わせて、薬学上有効な量の前記サイトカイン、又はその機能的活性を有する誘導体及び／若しくは部分、並びに／あるいは該サイトカインをコードする前記核酸を含む。これ以外の製剤成分として、抗酸化剤、防腐剤、着色料、香味料及び乳化剤、懸濁剤、溶剤、充填剤、膨脹剤、緩衝剤、送達用ビヒクル、賦形剤及び／又は医薬用アジュバントが挙げられる。例えば、好適な担体又はビヒクルは、注射用の水、生理食塩水、又は血清アルブミンのような適当な担体タンパク質と混合した食塩水でありうる。本発明の組成物の製造に好ましい抗酸化剤は、アスコルビン酸である。
【００３８】
前述したように、本発明の医薬調製物は、育毛の促進又は阻害に用いることができるため、それ自体で、化粧組成物とすることができる。当業者には公知の化粧組成物（好ましくは、低アレルギー性かつｐＨ制御のもの）が特に好ましく、例えば、化粧水、パック、ローション、乳液又は乳液ローションがある。これらの調製物は、活性化合物の他に、このような調製物に通常用いられる成分を含んでいる。このような成分の例として、油、脂肪、蝋、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定剤、キレート化剤、緩衝剤、防腐剤、香料、染料、低級アルカノールなどが挙げられる。所望であれば、さらに別の成分を上記組成物に組み込んでもよく、このような成分として、例えば、抗炎症薬、抗菌薬、抗真菌薬、消毒薬、ビタミン類、日焼け止め薬、抗生物質、又はその他の抗ニキビ薬が挙げられる。
【００３９】
医薬組成物の溶剤又は希釈剤は、水性又は非水性のいずれでもよく、薬学上許容される賦形剤を含んでいてもよい。このような賦形剤は、製剤のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄度、比率、無菌度、安定度、溶解速度又は芳香を改変及び／又は維持することができる。同様に、その他の成分を本発明の医薬組成物に含有させることにより、薬学上有効な物質（ＭＰ５２タンパク質など）の放出速度を改変及び／又は維持する、あるいは、上皮及び／又は間質細胞を介した該物質の吸収又は透過を促進することができる。このような改変成分は、単位用量又は多用量の形態での非経口投与用剤形に製剤化するのに、当業界で通常使用されている物質である。
【００４０】
本発明に従って製造し、最終的に製剤化した医薬組成物は、溶剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、又は、脱水若しくは凍結乾燥させた粉剤の形態で、無菌バイアル中に保存することができる。これらの製剤は、その場で使用できる形態、又は、投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥粉末の場合）のいずれかで保存してもよい。
【００４１】
前記の、及びそれ以外の好適な医薬製剤は、当業者には公知であり、例えば、Gus Remington’s Pharmaceutical Sciences（第１８版、Mack Publishing Co.、Easetern、PA、1990、1435〜1712）に記載されている。このような製剤は、薬学上有効な成分（例えば、前記ＴＧＦ−β様タンパク質及び／又は核酸など）の物理的状態、安定度、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与え得る。
【００４２】
その他の有効な投与形態としては、非経口持続放出、すなわち、放出を遅延させた製剤、吸入ミスト、又は経口活性製剤がある。例えば、持続放出製剤は、ＭＰ５２及び／又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの別のメンバー、あるいはそれらの機能的活性を有する誘導体若しくは部分を含んでいてよく、これは、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）又はリポソームの粒状調製物に結合させる、又は組み込むことができる。本発明の好ましい別の実施形態によれば、薬学上有効な成分（例えば、ＭＰ５２）の担体としてヒアルロン酸を用いてもよく、これは、循環における持続保持を促進する作用があると考えられる。本発明に係る医薬組成物はまた、非経口投与（例えば、注入又は注射による投与）用に製剤化することもできるし、持続放出又は持続循環剤を含んでいてもよい。このような非経口投与用治療組成物は、典型的には、発熱物質を含まず、薬学上許容される担体及び／又は希釈剤中に薬学上有効な成分（例えば、ＭＰ５２）を含む、非経口投与に許容される水溶液の形態である。
【００４３】
育毛疾患を治療するのに特に好ましい医薬組成物の製剤は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、多糖類、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）、アクリルアミドポリマー及びそれらの誘導体又は塩からなる群より選択されるポリマーを含む、高分子ゲル製剤である。このようなゲル製剤は、例えば、米国特許第５，７０５，４８５号に記載されている。
【００４４】
水溶性の、薬学上混和可能な高分子材料を含むゲル製剤は、投与に応じて決定される可変の範囲内で、医薬組成物の粘度に影響を与えるものが有利である。というのは、このような製剤は、作用部位に対する薬学上活性の成分の放出及び接触時間増加を制御することができるからである。高分子材料を含むゲル製剤の特に好ましい例は、ヒアルロン酸ゲル製剤である。
【００４５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の二糖単位の繰返しから構成される直鎖構造を有するムコ多糖の１つである。ＨＡは、天然に、微生物、並びにヒト及び動物の結合組織における皮膚に見出される。ＨＡの分子量は、供給源、調製及び決定方法に応じて、５０，０００〜８，０００，０００の範囲内を変動する。ＨＡの粘稠溶液は、潤滑性と、優れた湿潤作用を有する。このような溶液は、関節の滑液、眼球の水晶体、臍帯、皮膚、血管及び軟骨に存在する。ＨＡは、潤滑剤及び衝撃吸収剤として極めて良好に機能するが、これはおそらく、その保水能力と、特定の特異的タンパク質に対する親和性によるものであろう。ＨＡは、特にヒトの身体内での、内部使用に対して非常に安全な分子であると考えられる。従って、脱毛などの育毛疾患の治療のために、本発明に係る医薬組成物にＨＡを用いることができる。さらに、ＨＡの優れた潤滑性及び湿潤作用は、例えば、育毛疾患の治療に用いられる本発明の医薬組成物にとって極めて有利である。好ましくは、ヒアルロン酸は、医薬組成物の全重量に対して、０．５〜５．０重量％の濃度で存在する。このような濃度範囲は、低粘度溶液の製剤化に適しており、これらの溶液は、好ましくは１〜１，０００ｍＰａｓの範囲内の粘度を有する液体として、並びに、浸漬包帯（soaking bandage）のような用途の他の形態（その場合、粘度は、１．０〜５，０００ｍＰａｓの範囲内にあるのが好ましい）で用いることができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態によれば、薬学上有効な成分（例えば、ＭＰ５２、好ましくは組換えヒトＭＰ５２など）は、例えば、ゲル製剤又は水若しくはエタノールに基づく製剤のような液体製剤の場合、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。
【００４７】
本発明に従って製造される組成物で治療することができる別の皮膚関連疾患は、腺疾患、例えば、汗腺疾患である。一般的な皮膚関連疾患、特に育毛疾患に関する医薬組成物についての前記開示内容は、異常な汗腺活性を有する患者にも同様に適用することができる。その他の腺疾患の治療及び／又は予防は、本発明の別の好ましい実施形態をなす。
【００４８】
サイトカインが皮膚細胞に影響を及ぼす正確な機構はまだ詳細には決定されていないが、サイトカイン、特にＭＰ５２が、幹細胞移動並びに／又は毛包における前駆幹細胞の分化及び増殖に作用することにより、毛繊維の生産に影響を与えているようだ。さらに、ＭＰ５２は、血管新生を誘導するため、毛髪及び皮膚関連細胞に対する血液供給を改善することができる。毛包の最も下の部分は、毛球領域と呼ばれる。これに、中間領域とバルジ（bulge）領域が続く。毛包の上部には、皮脂腺領域がある。毛髪は、最終的に、毛球領域に位置する分化した毛細胞から形成される。
【００４９】
さらに、毛包は、間質鞘に囲まれた上皮コアからなり、この鞘は、毛球中の毛包乳頭と連続している。上皮コア自体は、外毛根鞘（ＯＲＳ）、内毛根鞘（ＩＲＳ）、ＩＲＳキューティクル、毛キューティクル、皮質及び髄質と呼ばれる各層から構成されている。これらの層は、個別かつ特有の分化プログラムにより特徴付けられる。
【００５０】
毛包の上部バルジ領域は、多分化能性幹細胞及び／又は前駆細胞の集団を含み、これらの細胞は、増殖因子のような形態形成シグナルに応答する能力を有するため、毛で覆われた皮膚に存在するあらゆる上皮系統を産生することができる。新しい毛周期（毛形成過程）の開始時に、これらの幹細胞は、毛包の上部バルジ領域から、下部毛球領域へと移動し、発毛を開始する。ＭＰ５２は、毛包における幹細胞の移動及び／又は分化並びに／あるいは前駆幹細胞の増殖に作用することにより、毛繊維の生産に影響を与えることができる。
【００５１】
サイトカインは、毛包や、その他の皮膚細胞及び腺に悪影響を及ぼし得る。皮膚、特に育毛又は腺疾患として説明しうる状況では、細胞中に存在する又はそこで有効に作用するサイトカインが少なすぎると考えられる。このような状況では、本発明の前記実施形態と同様に、追加のサイトカインを投与するのが有用である。サイトカイン、特にＭＰ５２を皮膚に投与すれば、これは、細胞中の不足又は無効なサイトカインの代替となりうる。
【００５２】
しかし、別の状況では、過剰なサイトカインは、細胞内に調節異常を引き起こすことが考えられる。脱毛に影響すると思われるサイトカインの機構を以下に挙げる：
サイトカインは、ステロイド５α−レダクターゼ（ジヒドロテストステロンを産生する酵素）の調節に影響する可能性がある
サイトカインは、毛包におけるコラーゲンゲルマトリックスの溶解を促進する可能性がある
サイトカインは、乳頭細胞におけるメタロプロテイナーゼストロメリシンの生産を増強する可能性がある
サイトカインは、負の増殖因子サイトカインとして作用し、コラーゲンｍＲＮＡをアップレギュレートする可能性がある
サイトカインは、ケラチノサイト増殖を阻害する可能性がある
サイトカインは、ケラチノサイトアポトーシスを誘導する可能性がある
サイトカインは、既存の血管の拡大又は新生血管の形成により血液供給を改善する可能性がある
サイトカインは、毛関連細胞の有糸分裂を促進する可能性がある
サイトカインは、毛関連細胞の神経支配に影響する可能性がある。
【００５３】
また、以下に挙げるその他の表皮細胞型も、過剰なサイトカインの影響を受けると考えられる：
増殖中の表皮の基底上細胞
表皮の基底上ケラチノサイト
毛包内の毛球皮質の細胞
成熟毛包内の毛幹基部にある前皮質（precortex）細胞
毛包真皮乳頭細胞
真皮鞘細胞
間質真皮繊維芽細胞
腺細胞
神経細胞
上皮（血管）細胞
メルケル又はランゲルハンス型細胞。
【００５４】
これら状況のすべてについて、過剰なサイトカインを除去する、又はこのような過剰量の発生を阻止することが望ましい。
【００５５】
この問題を解決するため、本発明に関して、２つの可能性が提示される。
【００５６】
第１の可能性は、哺乳動物における腺又は育毛関連疾患などの皮膚関連疾患を治療又は予防するために、サイトカインアンタゴニストを使用し、これを投与することに関する。
【００５７】
従って、本発明はさらに、哺乳動物における皮膚関連増殖疾患の治療又は予防用の組成物を製造するための、サイトカインアンタゴニスト、特にＭＰ５２アンタゴニストの使用であり、その際、好ましくは、上記皮膚関連疾患は、育毛疾患、又は腺、特に汗腺疾患である。
【００５８】
サイトカインアンタゴニストは当業者には公知であり、例えば、ＷＯ００／２１９９８号にはＭＰ５２に対するものが記載されている。これらのアンタゴニストは、前述した本発明の範囲内で、サイトカイン自体の代替として用いることができる。
【００５９】
第２の可能性は、サイトカインに対する抗体に関する。このような抗体は、細胞に存在するサイトカインを不活性化することもできる。従って、本発明はまたさらに、前述した皮膚関連増殖疾患の治療及び／又は予防用の組成物を製造するための、抗体、好ましくはサイトカイン（好ましくは、ＭＰ５２）に対するモノクローナル抗体の使用である。サイトカインに対する抗体は当業者には公知である。例えば、ＭＰ５２に特異的なモノクローナル抗体が、ＷＯ９７／４３４０８号に記載されている。また、このような抗体は、前述したように、サイトカインの代替として、組成物中に用いることができる。
【００６０】
本発明に従い製造される組成物は、化粧品の用途に用いることもできる。
【００６１】
診断目的では、例えば、上に定義した核酸は、ＲＴ−ＰＣＲ、ブロッティング技法（ノーザンブロット、サザンブロット）、ＤＮＡチップ技法などにおける使用に好適な組成物の製造に用いることができる。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、本発明を例示してさらに詳しく説明するものであり、限定するものと考えるべきではない。
【００６３】
実施例１：ニワトリ抗ヒトポリクロナールＭＰ５２抗体の調製
大腸菌において生産した３００〜４００μｇの組換えＭＰ５２を各々筋内注射することにより、ニワトリの免疫感作を実施した。ニワトリは、約１年間、２〜３週間毎に、各々１５０〜３００μｇの抗原を用いて、追加免疫した。免疫感作の目的のために、トリス／尿素バッファー中に抗原を溶解させてから、製造者の指示に従って、ニワトリ用のアジュバントと混合した（ＬＥＳ＋ＳＴＭ、ＰＡＮＳｙｓｔｅｍｓ  ＃２５−０４０１）。抗体を卵黄から単離した。インタクトな卵黄を卵白から注意深く分離し、穏やかな蒸留水流で数回洗浄した後、かみそりで壊した。３〜４の連続した卵からの壊した卵黄を篩で漉し、プールした後、Thalley, B. S.及びCarrol、S. B.（Biotechnology 8、1990、934〜938）による記載とほぼ同様に、ＰＥＧ沈降により、抗体を精製した。これらを７容量の卵抽出バッファー（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）と混合した後、穏やかに攪拌しながら、氷上でＰＥＧ６０００をゆっくりと添加することにより、最終濃度を３．５％とした。ＰＥＧが完全に溶解したら、この溶液を遠心分離（９０００×ｇ、１０分、４℃）に付し、ペレットを廃棄し、上清をチーズクロスでろ過し、脂質層を除去した。ＰＥＧを最終濃度１２％まで添加し、前記と同様に遠心分離に付した。抗体を含むペレットを抽出バッファー（元の卵黄量の２倍）中に再溶解させ、前記と同様に、ＰＥＧを最終濃度１２％まで添加した。遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを２回遠心分離（２分、４℃、３００×ｇ）することにより、残留する微量のＰＥＧを除去した。０．０２％ＮａＮ３（元の卵黄量）含有のＰＢＳ中に、この抗体ペレットを再懸濁させ、ろ過（Ｎａｌｇｅｎｅ  ＃１５５−０４５）した後、ブラッドフォードの方法（クーマシータンパク質アッセイ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２３２００）によりタンパク質濃度を決定した。
【００６４】
大腸菌タンパク質に対する親和性を呈示する抗体を除去するために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳ株を増殖させ、音波処理により溶解させた後、単離したタンパク質をアミノリンクカラム（イムノピュア、アミノリンクキット、Ｐｉｅｒｃｅ  ＃４４８９０）に共役結合させた。その際、結合は、製造者の指示に従った（ＢＬ２１−カラム）。卵からのＰＥＧ精製抗体のアリコートを上記カラムにロードし、ＭＰ５２に対する抗体を含む溶出画分を回収した。ＭＰ５２に対し最も優れた応答を示した抗体をさらに精製するため、免疫感作から約２００〜２４０日後の最高値から数個の抗体を取得した。
【００６５】
具体的には、抗体は、その抗原に吸着させ、そこから溶離させることにより、精製することができ、そのためのいくつかの方法が知られている（例えば、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988、第８章を参照）。このような方法では、純粋な抗原を固相支持体に結合させ、ポリクローナルプール内の抗原特異的抗体だけが結合できるようにする。非特異的抗体を数回の洗浄工程により除去した後、特異的抗体を溶離することができる。この方法は、混合ポリクローナルプールから特異的抗体を単離する、又はＭＰ５２若しくは二量体ＭＰ５２の一部だけを認識する抗体を単離するのに有用である。本発明者らは、膜フィルターへの抗原の結合を利用した。ＭＰ５２をイモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ  ０００  １０）の切片に暴露させ、タンパク質をＵＶ光により、共有結合で架橋させた。０．２％Ｔｗｅｅｎ  ２０中で膜をブロッキングした後、ＰＥＧ沈降及びＢＬ２１−カラムですでに精製しておいた抗体と一緒に一晩インキュベートした。入念な洗浄工程の後、０．１ＭグリシンｐＨ２．８で抗体を溶離させた後、トリスｐＨ９で中和した。
【００６６】
実施例２：ウェスタンブロッティングによる抗体特異性の確認
ポリアクリルアミドゲル（１５％ＰＡＧＥ、１．５ｍｍ）をトランスファーバッファー（０．７Ｍグリシン、０．０２６Ｍトリス、１５％エタノール、１０ｍＭ  ＤＤＴ）において５〜１０分かけて平衡化させた。ＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ−トランスファーメンブラン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ  ０００１０）を切断して、ゲル（約８．５×５．５ｃｍ分離ゲル）と比較して同等のサイズにし、メタノールにさっと浸けてから、水ですすいだ後、トランスファーバッファー中で５〜１０分かけて平衡化させた。トランスファーは、Ｈｏｅｆｅｒ製の電気泳動チャンバー（ＴＥ２２Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ）において定電圧（１００Ｖ）を用いて、トランスファーバッファー中で１時間４℃で実施した。次に、室温で振盪しながら、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、膜を３回（各々５分）洗浄した。後の処理のために、ＴＲＯＰＩＸ／ＳＥＲＶＡ（ＷＬ１０ＲＣ）製のウェスタンライト（商標）ラビットキット（Western-LightTMRabbit Kit）の試薬を用いた。上記膜をブロッキングバッファー（０．２％  Ｉ−Ｂｌｏｃｋ、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０２％  ＮａＮ３、製造者の指示に従い調製）において、室温で１．５時間、あるいは、４℃で一晩かけてブロッキングした。抗体を認識するＭＰ５２をブロッキングバッファーで１００００倍希釈した。この膜を上記第１抗体と一緒に、１．５時間室温で、又は一晩４℃でインキュベートした。ブロッキングバッファー中で３回（各々１０分）洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼ結合２次抗体（ＳＩＧＭＡ  Ａ９１７１）をブロッキングバッファーで１００００倍希釈した後、上記膜と一緒に４５〜６０分室温でインキュベートした。この膜をブロッキングバッファー中で３回（各々１０分）洗浄した。検出のため、膜を、アッセイバッファー（０．１Ｍ  ジエタノールアミン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ１０．０）中で２回（各々５分）、ニトロ−ブロック（アッセイバッファーで２０倍希釈）中で５分間、アッセイバッファー中で再度２回（各５分）、基質溶液（アッセイバッファーで１００倍希釈した基質、各膜について約３ｍｌ）で５分間インキュベートした後、２枚の薄い透明なホイルで挟んだ。高性能ルミネッセンス検出フィルム（ハイパーフィルムＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＲＰＮ３１０３）への暴露時間は、シグナルの強さに応じて、数秒から数分の範囲内とした。
【００６７】
ＭＰ５２ニワトリ抗体は、一量体及び二量体ＭＰ５２を検出することができた。図１は、一量体（レーン２）及び二量体（レーン３）ＭＰ５２の陽性検出を示す。レーン１：分子量マーカー（１５．４／１８．３／２９．５／４９．５／７４．２５／１１１．４／２１４．２ｋＤ）。
【００６８】
実施例３：組織横断面における抗体特異性の証明
二次抗体によって起こる非特異的染色からＭＰ５２特異的染色を識別するために、ヒト皮膚の横断片を実施例４に記載したように用意し、一次ニワトリ抗ヒトポリクローナルＭＰ５２抗体及び二次ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ニワトリ抗体と一緒にインキュベートした。二次抗体により生成されたバックグラウンド染色を視覚化するために、０．５又は１μｇの一量体ＭＰ５２の添加（２時間、室温、中程度の振盪）により、一次ＭＰ５２抗体を吸収させ、ＭＰ５２特異的免疫蛍光を大幅に低減させる。残った弱い着色は、結合組織成分との非特異的二次抗体交差反応により起こった。図２Ａ〜Ｃは、非吸収ＭＰ５２抗体（２Ａ）を含む横断面を、０．５μｇ（２Ｂ）又は１μｇ（２Ｃ）の一量体ＭＰ５２のいずれかによるニワトリ抗ヒトポリクローナルＭＰ５２抗体の吸収と比較して示す。
【００６９】
実施例４：様々な皮膚サンプル（非頭皮）の調製及び免疫染色
通常のサンドイッチ免疫染色方法を用いて、ヒト皮膚領域のパラフィン切片をＭＰ５２発現について分析した。免疫組織化学は基本的な技法であり、無数の刊行物、例えば、Johnstone A.及びThorpe R（Immunochemistry in Practice、第２版  1987、Blackwell Scientific Publications、オックスフォード）により、さらに詳細に記載されている。ＢＳＥ（１％）で１５分、及び１００ｍＭのＤＴＴで５分のプレインキュベーション後、サンプルを一次抗体（ニワトリ抗ヒトポリクローナルＭＰ５２抗体、５０倍希釈）で処理し、一晩４℃でインキュベートした。次に、非結合抗体を除去し、ヘキストビスベンズイミド（２ｎｇ／ｍｌ）を用いて、二次ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ニワトリ抗体で１時間室温で処理した。
【００７０】
数種の皮膚関連細胞構造、例えば、表皮、毛根鞘及び毛包、並びに、種々の腺において、強度のＭＰ５２発現を検出することができた。
【００７１】
図３Ａ〜Ｄは、様々なヒト皮膚：表皮（Ａ１、Ｃ６）、毛根鞘（Ａ２）、皮脂腺（Ａ３）、汗腺（Ｂ４、Ｄ７）及び毛包（Ｂ５）の横断面の陽性免疫染色を示す。
【００７２】
実施例５：マウス抗ヒトモノクローナルＭＰ５２抗体の調製
ＭＰ５２に対して生成されたモノクローナル抗体を通常の方法に従って単離した。上記抗ヒトモノクローナルＭＰ５２抗体の調製及び特性決定についての完全な説明は、欧州特許第０  ９１９  ６１７号にみいだすことができる。モノクローナル抗体生産の一般的技法についてさらに詳しくは、下記に記載されている：Peters, J. H.及びBaumgarten, H.（1990、Monoklonale Antikorper-Herstellung und Charakterisierung、Springer Verlag, 2. Auflage）、並びにHarlow, E. 及びLane, D.（Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988、第６章）。
【００７３】
実施例６：ヒト頭皮におけるＭＰ５２の検出
マウス抗ヒトモノクローナルＭＰ５２抗体（実施例４）を用いて、ヒト頭皮の低温切片においてＭＰ５２を検出した。低温切片を５％脱脂乳／０．０２％トリトンで１５分かけてブロッキングした。ＭＰ５２抗体を７５倍希釈した後、３０分室温で塗布した。その後、スライドをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーで洗浄して（２×１０分）、二次抗体（ＣＹ３抗マウス（赤色蛍光）、５０００倍希釈）と一緒に３０分インキュベートした。サンプルを蒸留水にさっと浸けた後、純粋エタノール中に５分浸漬し、最後に空気乾燥させた。
【００７４】
ＭＰ５２発現を数種の表皮細胞型、毛包、ニューロン及び血管中に検出することができた。
【００７５】
図４Ａ〜Ｆは、様々なヒト皮膚：表皮（Ａ）、血管（Ｂ）、ニューロン（Ｃ、Ｄ）、毛包上部／漏斗部（Ｅ、Ｆ）の横断面の陽性（赤色）免疫染色を示す。
【００７６】
実施例７：上皮成長に対するＭＰ５２の作用
皮膚関連組織に対しＭＰ５２が及ぼす正の成長促進作用を証明するために、上皮形成／増殖について、表皮様構造を刺激するヒトケラチノサイト及び繊維芽細胞の有機栄養培養により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。
【００７７】
ヒト繊維芽細胞を１型コラーゲンゲルマトリックス（３．２ｍｇ／ｍｌ）中に包理した。加えて、ケラチノサイトをゲルマトリックスの上部で増殖させた。これら細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、ＦＣＳを含まない細胞培地を２日毎に取替えながら、９日間実施した。考えられる成長促進作用を確認するため、１００ｎｇ／ｍｌ（活性）の二量体ＭＰ５２を培地に添加した。（活性）二量体ＭＰ５２の代わりに、１００ｎｇ／ｍｌ（不活性）の非再生一量体ＭＰ５２をサンプルの培地に添加し、これを負の対照として用いた。
【００７８】
二量体ＭＰ５２を添加して成長させた上皮培養物は、負の対照培養物と比較して、有意に多くの細胞層から構成されていた。さらに、ＭＰ５２中和抗体を有機栄養細胞培養物に添加すると、上皮成長の阻害が起こった。
【００７９】
図５は、培養８日の有機栄養細胞培養物の横断面を示し、これらは、１００ｎｇ／ｍｌの（不活性）非再生一量体ＭＰ５２（Ａ、負の対照）又は１００ｎｇ／ｍｌの（活性）二量体ＭＰ５２（Ｂ）のいずれかを用いて生育させた。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ニワトリにおいて作製したポリクローナル抗体による、一量体（レーン２）及び二量体（レーン３）組換えＭＰ５２の検出を示す。レーン１：分子量マーカー（１５．４／１８．３／２９．５／４９．５／７４．２５／１１１．４／２１４．２ｋＤ）。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、非吸収ＭＰ５２抗体（２Ａ）を用いた横断面を、０．５μｇ（２Ｂ）及び１μｇ（２Ｃ）の一量体ＭＰ５２のいずれかによるニワトリ抗ヒトポリクローナルＭＰ５２抗体の吸収と比較して示す。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、様々なヒト皮膚：表皮（Ａ１、Ｃ６）、毛根鞘（Ａ２）、皮脂腺（Ａ３）、汗腺（Ｂ４、Ｄ７）及び毛包（Ｂ５）の横断面の陽性免疫染色を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、様々なヒト皮膚：表皮（Ａ）、血管（Ｂ）、ニューロン（Ｃ、Ｄ）、毛包上部／漏斗部（Ｅ、Ｆ）の横断面の陽性（赤色）免疫染色を示す。また、図４Ｇは、負の対照（青色の対比染色）を示す。
【図５】培養８日目の有機栄養細胞培養物の横断面を示し、これらは、１００ｎｇ／ｍｌの（不活性）非再生一量体ＭＰ５２（Ａ、負の対照）又は１００ｎｇ／ｍｌの（活性）二量体ＭＰ５２（Ｂ）のいずれかを用いて生育させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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