(57)【要約】本発明は、自己免疫疾患に罹患している患者における自己免疫性特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体の存在を検出することによって、自己免疫疾患の活性を診断するための方法を記載する。このＭＨＣ−ペプチド複合体は関節リウマチに関連する。この方法のために使用されるモノクローナル抗体もまた記載される。抗体はまた治療目的のために使用することができる。
2004506901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を診断するための方法であって、ＭＨＣ−ＨＣ−ｇｐ３９由来ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合ドメインを用いて、自己免疫疾患に罹患している患者における自己免疫特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
複合体のＭＨＣ部が、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０７およびＤＲＢ１＊０１０１の各ＨＬＡタイプである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＨＣタイプがＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０４０１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＣｇｐ−３９由来ペプチドがＨＣ−ｇｐ３９２６３〜２７３またはＨＣ−ｇｐ３９２６３〜２７５を含む、請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＣｇｐ−３９由来ペプチドがＨＣ−ｇｐ３９２６３〜２７３またはＨＣ−ｇｐ３９２６３〜２７５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ、ＯＲＧ３８９４８　１２ＡまたはＯＲＧ３８９４８　０４Ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載される方法において使用される抗体。
【請求項８】
請求項７に記載される抗体の１つ以上と、検出剤とを含む診断組成物。
【請求項９】
治療において使用される請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
自己免疫障害を治療するための医薬調製物を製造するための、請求項７に記載される抗体の使用。
【請求項１１】
自己免疫性特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体を精製するための、請求項７に記載される抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患を診断するための方法、この方法において使用されるモノクローナル抗体、このような抗体を含む診断組成物、ならびに自己免疫異常を処置するための方法に関する。
【０００２】
自己免疫疾患はヒトの医療における主要な問題である。一部の自己免疫疾患は、１つの抗原または抗原性複合体に対する免疫学的プロセスの結果であり得るが、これに対して、複数の器官に存在し得る多くのタイプの抗原が自己免疫反応に関与し得る自己免疫疾患もある。
【０００３】
免疫系の主要な機能的役割は、異物（すなわち、非自己）の抗原を有する病原体の侵入から個体を守ることである。この機能を安全かつ効果的な方法で遂行するためには、異物抗原と、個体自身の身体に由来する自己抗原とを識別するための機構が必要である。一般に、ほとんどの個体は、自分自身の身体に存在する物質に対しては寛容である。
【０００４】
他方で、一部の個体は、その抗原を自己として認識することができず、内因性の物質、組織または構成成分に対して免疫応答を生じさせる。そのような免疫応答は、このような内因性物質を含有する器官に大きい損傷を引き起こす。関連した自己免疫疾患の発症は一般には非常に遅く（数年程度）、このため、時宜を得た臨床的診断および処置が大きく妨げられている。一般に、診断は、認識され得る損傷が既に身体に生じた後に行うことができるにすぎない。
【０００５】
関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患の診断は、初期の疾患、または比較的少数の関節が関わっているときには非常に困難であり、残念ながら、通常では症状の発現後、数ヶ月遅れて診断される。この時点において、例えば関節リウマチを慢性的な炎症性関節炎または一時的な滑膜炎症候群から区別することは困難である。持続性の未分化型多発性関節炎症候群の患者が頻繁に認められており、関節リウマチとの区別は初期には困難である場合がある。多くの患者は炎症性関節炎の徴候および症状を伴っているが、関節リウマチには罹っていない。
【０００６】
個体が自己免疫疾患を発症し得る可能性は、その遺伝的背景に密接に関連している。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体を認識する応答性のＴ細胞に、（自己）抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする遺伝子は、疾患の感受性に対する強い遺伝的連鎖を示している。初期の疾患では、病理発生はＴ細胞媒介であると考えられている。Ｔ細胞は、抗原性ペプチドと一緒になった特異的な主要組織適合複合体分子をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識する。ＭＨＣ／ペプチド／ＴＣＲ複合体により生じたシグナルによって、Ｔ細胞の活性化がもたらされる。この三分子複合体は、全身的な免疫応答および自己免疫性における重要な要素である。現在では、ＭＨＣに結合しているプロセシングされた自己抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲに提示することが多くの自己免疫疾患の病理発生に関与していると考えられている。
【０００７】
関節リウマチにおいて特定された自己抗原候補の１つがヒト軟骨糖タンパク質−３９（ＨＣｇｐ−３９）である（Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎら、１９９７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍ．、４０：１１１５〜１１２５）。このタンパク質によるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は慢性的な再発性関節炎の発症をもたらした。この免疫化の前にこのタンパク質を鼻内投与することにより、ｉ）ＤＴＨ応答の完全な阻害、およびｉｉ）疾患からの保護または発症の遅延がもたらされた。さらに、ＨＣｇｐ−３９による、半治療的治療を行い、ＤＢＡ／１マウスにおけるＩＩ型コラーゲン誘導の関節炎の、発生率および重篤度を低下させることができた（Ｊｏｏｓｔｅｎら、２０００、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４３：６４５〜６５５）。
【０００８】
ＨＣｇｐ−３９の数個のペプチドが潜在的な自己反応性であるとして同定された。これらのペプチドの少なくとも４つ（１０３〜１１６、２５９〜２７１、２６３〜２７５および３２６〜３３８）がＲＡ患者のＴ細胞によって認識される。興味深いことに、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５が、ＲＡ患者で、健康なコントロール者よりも顕著に認められた。このことは、このＴ細胞エピトープが、関節リウマチの開始および維持における役割を果たしていることを示唆する。従って、このペプチドはＲＡにおける治療目的および診断目的のために注目される。治療目的のために、このペプチドまたは修飾体を経鼻寛容化のために使用することができる。さらに、ＤＲＢ１＊０４０１とペプチドの複合体は静脈内寛容化のために使用することができる。
【０００９】
ＭＨＣ分子に対して複合体化されたペプチドは、診断目的のために利用することができる。特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する従来の方法は、関連するＴＣＲを有するＴ細胞の活性化に頼っている。しかし、そのような機能的アッセイは、組織切片におけるＴＣＲリガンド保有ＡＰＣを同定するためには使用することができない。
【００１０】
本発明により、自己免疫疾患（好ましくは関節リウマチ）に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異性を有する抗体が作製された。ＨＣｇｐ−３９に由来する複合体におけるペプチドが最も好ましい。
【００１１】
ＭＨＣ−ペプチド複合体は症候群特異的である。すなわち疾患は、ＭＨＣと自己抗原との特異的複合体の出現により特徴づけられる。
【００１２】
今回、臨床的確定診断前に、これらの特異的複合体が、多くの場合、患者の組織において検出できることが見出された。従って、この免疫複合体により、どのような疾患が発症しつつあるかが予測される。
【００１３】
これらの免疫複合体が患者の組織、または血液において早期に検出されることはより重要である。なぜなら、その場合、患者の処置をより早く開始することができ、それにより、疾患の後期における、多くの場合に重篤である損傷を遅らせることができ、または損傷防止することさえできるからである。
【００１４】
従って、本発明の１つの態様により、自己免疫疾患を診断するための方法が提供される。この方法は、自己免疫疾患に罹患している患者における自己免疫特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体の存在の検出を含む。検出には、ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的に結合する抗体を利用する。
【００１５】
本明細書中で使用される抗体という用語は、関係する抗原に結合特性を有する単一抗体種または多重抗体種として定義される。抗体は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するのみであり、ペプチドまたはＭＨＣを単独では認識しない。従って、抗体は、ＭＨＣ分子の結合溝内に位置する特異的な自己免疫関連ペプチドを、認識することができなければならない。抗体は、そのような抗体を含有する血清から精製することができるが、好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは、マウスまたはヒトのモノクローナル抗体である。よって抗体は、自己免疫疾患に罹患している患者における、自己免疫特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する。この特異的複合体は、ＭＨＣ−ペプチド複合体としてさらに示される。
【００１６】
特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することが、依然として可能な抗体のフラグメントもまた、本発明の一部をなすことは当業者には明かである。それ故、フラグメントという用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖなどの可変ドメイン領域を含む抗体のそのような部分を意味する。また、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合することができる、単鎖抗体またはキメラ（例えば、二重特異性）抗体を含む抗体は、遺伝子操作によって作製できる。さらに抗体は、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体などのように、異なる種に由来する領域から構成され得る。
【００１７】
本発明に従って検出されるＭＨＣ−ペプチド複合体は自己免疫疾患に関連し、好ましくは関節リウマチに関連する。好ましくは、ＭＨＣ複合体は、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０７およびＤＲＢ１＊０１０１の各ＨＬＡタイプであり、ＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０４０１が最も好ましく、これに対して、複合体におけるペプチドは、好ましくはＲＡ関連抗原である。好ましくは、抗体は、ＨＣｇｐ−３９に由来するペプチドとの複合体を使用して調製される。好ましくは、ペプチドはＨＣｇｐ−３９のアミノ酸２６３〜２７３または２６３〜２７５（ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７３またはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５）を含むが、アミノ酸配列におけるわずかな変化は可能である。そのような抗体により、ＨＣｇｐ−３９と関連するＭＨＣ−ペプチド複合体が検出され、おそらくは、ペプチドがＨＣｇｐ−３９に由来するＭＨＣ−ペプチド複合体が検出される。
【００１８】
これらのペプチドはペプチドのいずれかの端または両端で伸長することができ、そして同じ免疫学的機能を依然として発揮し得ること（すなわち、ＭＨＣ関連複合体内において、抗体によって認識され得ること）は当業者には明かである。延長部は、タンパク質の天然の配列に類似するアミノ酸配列であってもよい。しかし、ペプチドはまた、非天然の配列によって延ばすこともできる。また、ペプチド自体の配列は、抗体によって依然として認識され得ながら、わずかに変化させることができる。
【００１９】
特により小さいペプチドの配列においては、配列全体におけるアミノ酸の違い（１つまたは複数）によって、または前記配列におけるアミノ酸（１つまたは複数）の欠失、置換、挿入、反転もしくは付加によって明らかにされ得る。生物学的活性および免疫学的活性を本質的に変化させないことが予想される様々なアミノ酸置換が記載されている。関連したアミノ酸同士のアミノ酸置換、または進化において頻繁に生じている置換には、中でも、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌがある（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．、タンパク質配列および構造の地図（Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．、１９７８、第５巻、増刊３）を参照のこと）。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、相同的ポリペプチド間の機能的類似性を明らかにするための迅速かつ高精度なタンパク質比較方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１４３５〜１４４１、１９８５）を開発した。
【００２０】
（より小さい）ペプチドは、例えば、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）およびＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．３５：１６１〜２１４（１９９０）に記載される固相ペプチド合成などの、周知の有機化学的ペプチド合成方法によって調製することができる。
【００２１】
ペプチドは、エキソペプチダーゼにより触媒される加水分解を低下させる、Ｃ末端および／またはＮ末端修飾によって安定化される。そのような修飾には、Ｃ末端のアシル化（例えば、アセチル化＝Ａｃ−ペプチド）、Ｎ末端へのアミド導入（例えば、ペプチド−ＮＨ２）、アシル化およびアミド導入の組合せ（例えば、Ａｃ−ペプチド−ＮＨ２）、ならびにＬ−アミノ酸に代わるＤ−アミノ酸の導入を挙げることができる（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８１：７３１〜７３５、１９９２）。
【００２２】
他の修飾は、エンドペプチダーゼによる加水分解の防止に集中している。このような修飾の例には、Ｌ−アミノ酸に代わるＤ−アミノ酸の導入、修飾アミノ酸、ペプチド内での環化、修飾型ペプチド結合（例えば、還元型ペプチド結合Ψ［ＣＨ２ＮＨ］）の導入、および例えばペプトイド（Ｎ−アルキル化グリシン誘導体）が挙げられる（Ａｄａｎｇら、Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ、１１３：６３〜７８、１９９４；Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９３６７〜９３７１、１９９２）。
【００２３】
モノクローナル抗体は標準的な手法に従って調製することができる。ＭＨＣ−ペプチド複合体含有調製物による動物の免疫化は、適切なアジュバントの存在下または非存在下のいずれかで行われる。その後、適切な融合技術、好ましくはＰＥＧ融合（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７、１９７５）または電気融合（Ｖａｎ　Ｄｕｉｊｉｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８３、４６３〜４７２、１９８９）を使用して、これらの免疫化動物に由来するＢ細胞をミエローマ細胞と融合することによって、ハイブリドーマを作製する。免疫化、融合、ハイブリドーマの選別、ハイブリドーマのクローニングおよびスケールアップ、ならびにモノクローナル抗体の精製に関する標準的な手法は、モノクローナル抗体の作製に関するハンドブックに十分に記載されている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）、またはＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．１９９２））。
【００２４】
抗原特異的なＢ細胞を、Ｂ細胞培養系（好ましくはＥＬ−４Ｂ細胞培養系）における限界希釈条件のもとで選別し、増殖させることができる。その後、個々のＢ細胞クローンは、例えば、欧州特許ＥＰ４４８４７０および米国特許第６，０２０，１７０号（これらは参考として本明細書中に含まれる）に記載されるように、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るために融合させることができる。
【００２５】
ヒトモノクローナル抗体または抗体フラグメントもまた、この分野で周知の技術に従って作製することができる。好適なマウスモノクローナル抗体のキメラ化またはヒト化により、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製することができる。ヒト抗体または抗体フラグメントを作製するための別の周知の技術として、ファージディスプレイ技術が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体はまた、インビボにて初回抗原刺激されたＢ細胞のＥＢＶ形質転換によって、またはインビトロにて免疫化されたＢ細胞の不死化によって、またはヒト免疫グロブリンレパートリーを発現する免疫化されたトランスジェニックマウスに由来するＢ細胞の不死化によって作製することができる。
【００２６】
適切な複合体による免疫化を、実施例１に記載されるように単離されるＭＨＣ−ペプチド複合体を用いて行うことができる。しかし、複合体の供給源として、適切なＭＨＣ複合体を有し、かつ例えば、ＡＰＣにＨＣｇｐ−３９を与えることによって特異的な自己抗原によって負荷された、単球、樹状細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）もまた使用しうる。ＡＰＣに目的とする複合体タンパク質を与えることの代わりとして、その部分配列を与えることもできる。そのような部分配列の長さは、関係するＭＨＣ分子により認識されるエピトープを含むならば重要ではない。好ましくは、このようなペプチドは９個〜５５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、ペプチドは９個〜３５個（特に９個〜２５個）のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。９個〜１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドがさらにより好ましい。最も好ましいペプチドはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７３またはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５である。
【００２７】
従って、自己免疫疾患（好ましくは、関節リウマチ）に関連するＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的である抗体を提供することも、また本発明の目的である。好ましくは、ＭＨＣ複合体は、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０７およびＤＲＢ１＊０１０１の各ＨＬＡタイプであり、ＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０４０１が最も好ましく、これに対して、複合体におけるペプチドは、好ましくはＲＡ関連抗原である。最も好ましいペプチドはＨＣｇｐ−３９に由来する。好ましくは、ペプチドはＨＣｇｐ−３９のアミノ酸２６３〜２７３または２６３〜２７５（ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７３またはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５）を含むが、アミノ酸配列におけるわずかな変化は可能である。最も好ましい抗体は、ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ、ＯＲＧ３８９４８　１２ＡまたはＯＲＧ３８９４８　０４Ｂである。
【００２８】
本発明の目的はまた、特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体と反応する抗体を提供することであり、この場合、ペプチドは、より小さいＲＡ関連ペプチドの多量体（例えば、二量体または三量体など）からなる。多量体は、多数の同じペプチドからなるホモマーか、または異なるペプチドからなるヘテロマーであり得る。
【００２９】
また、本発明の別の目的は、結合溝がペプチドにより占められるような、そのペプチドがＭＨＣ分子に結合している自己免疫性特異的複合体に対して反応し得る抗体を提供することである。柔軟なリンカー分子、好ましくはやはりアミノ酸配列からなり、ペプチドを連結することができる。また、ＭＨＣサブユニットは、直接的に、または柔軟なスペーサー分子を介して共有結合的に連結することができる。ＭＨＣサブユニットは、例えば、「骨格」としての単量体または二量体のＩｇ分子において組み立てることができる。ＭＨＣ分子はその定常ドメインを有する必要はなく、相互の直接的な共有結合により連結させて、または柔軟なリンカーを介して連結させて、その可変ドメインのみから構成されうる。そのような抗体またはそのフラグメントは従来の組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。骨格としてＩｇＧを有する、二量体のＭＨＣ／ペプチド複合体が、例えば、Ｌｅｂｏｗｉｔｚら（１９９９）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９２：１７５〜１８４などによって記載される。
【００３０】
四量体のＭＨＣ／ペプチドが、ＭＨＣＩについてはＤａｖｉｓら（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９４〜９９によって記載され、そしてＭＨＣＩＩについては、Ｇｕｔｇｅｍａｎｎら（１９９８）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、８：６６７〜６７３、およびＫｏｔｚｉｎら（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：２９１〜２９６によって記載される。
【００３１】
本発明の抗体は、例えば、組織切片でのＡＰＣにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５の自己免疫性特異的複合体を同定するために、および例えば個々のＡＰＣにあるＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体のような、ＭＨＣ−ペプチド複合体を定量するために使用することができる。特異的な抗体を用いてＭＨＣ−ペプチド複合体を定量することにより、疾患活性をモニターする機会が得られる。抗体はさらに、病理学的組織内のＡＰＣ所在を突き止めるために使用することができる。
【００３２】
抗体（すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体の特異性）に依存して、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬または関節リウマチなどのいくつかの自己免疫疾患を診断することができる。さらに、ＲＡ関連ＭＨＣ−ペプチド複合体に対する特異性を有する抗体を使用して、関節リウマチを、多発性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節症または変形性関節症などの慢性的な炎症性疾患の他の原因から区別することができる。
【００３３】
特異的なＭＨＣ−ペプチド複合体を検出するために抗体または抗体フラグメントを使用する技術がいくつかある。これらの技術には、免疫組織化学、ＦＡＣＳ、免疫沈降およびウエスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。抗体または抗体フラグメントは、非標識で、または酵素、放射性イソタイプ、蛍光色素、常磁性粒子もしくはビオチン分子に結合させて使用することができる。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製のような、ＭＨＣ−ペプチド自己免疫複合体の精製において使用される抗体を提供することである。この目的のために、抗体は、この分野で周知の技術を使用して固体マトリックス（例えば、セファロースビーズ、シリカビーズまたは常磁性ビーズ）に結合される。この目的のために使用される抗体は、本発明による診断方法のために記載される抗体である。
【００３５】
さらに、そのような抗体は、インビトロまたはインビボで自己抗原性ペプチドに対するＴ細胞の応答を阻害するために使用することができる。
【００３６】
治療において使用される抗体を提供することは本発明の別の目的である。従って、本発明はまた、自己免疫性の複合体に対する抗体、より具体的にはＭＨＣ−ペプチド複合体に対する抗体、好ましくはＭＨＣ−ＨＣｇｐ−３９部分配列の複合体、より好ましくは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０１０１またはＤＲＢ１＊０４０７／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７３またはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５の複合体に対する抗体を投与することによって、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、乾癬、重症筋無力症および関節リウマチなどの自己免疫疾患（関節リウマチが最も好ましい）を治療する方法を提供する。ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ、ＯＲＧ３８９４８　１２ＡまたはＯＲＧ３８９４８　０４Ｂの抗体が最も好ましい抗体である。前記に記載されるような抗体の、様々な変異体もまた治療目的には有用である。従って、本発明によるモノクローナル抗体は、自己免疫障害（より好ましくは関節リウマチ）を治療するための医薬品を製造に使用することができる。本発明による抗体の投与により、Ｔ細胞の活性化を阻止することによって、炎症を低下させることができる。
【００３７】
抗体に対する抗原性応答を避けるために、ヒト抗体を使用することが好ましい。抗体がヒト由来ではない場合、ヒト化抗体が好ましい。ＣＤＲグラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）などの、抗体をヒト化するための方法が知られている（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５、１９８６）。
【００３８】
ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ、ＯＲＧ３８９４８　１２ＡまたはＯＲＧ３８９４８　０４Ｂの各抗体は、ＥＣＡＣＣ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　ＳＰ４　０ＪＧ、英国）に、それぞれ、９９０６１７２８、９９０６１７２９および９９０６１７３０の各アクセション番号で寄託されている。これらの寄託はブダペスト条約の条項に従って行われた。
【００３９】
【表１】
2004506901.tif 000003
【００４０】
【表２】
2004506901.tif 000004
【００４１】
【表３】
2004506901.tif 000005
【００４２】
下記の実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈すべきではない。
【００４３】
（図面の簡単な説明）
図１は、Ｏｒｇ３８９４８に対するモノクローナル抗体がＤＲＢ１＊０４０１分子と反応しないことを示す。
精製されたＯｒｇ３８９４８（ａ）またはＤＲＢ１＊０４０１（ｂ）でコーティングされたマイクロエライザプレートで、モノクローナル抗体の力価が測定された。次に、プレートをヤギ抗マウスＨＲＰでインキュベーションし、発色反応は、標準的なＥＬＩＳＡの手順を使用して行われた。
【００４４】
図２は、免疫沈降により明らかにされるように、抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂがＭＨＣクラスＩＩを認識する。
上段：ブロット１；ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下で行い、ブロットをＬ２４３で発色させた。下段：ブロット２；ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で行い、ブロットをＬ２２７で発色させた。
レーン１：分子量マーカー、レーン２：ＯＲＧ３８９４８　０１Ａ（ＩｇＧ１、κ）、レーン３：ＯＲＧ３８９４８　０４Ｂ（ＩｇＡ、κ）、レーン４：ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ（ＩｇＧ１、κ）、レーン５：ＯＲＧ３８９４８　０９Ａ（ＩｇＡ、κ）、レーン６：ＯＲＧ３８９４８　１１Ｂ（ＩｇＧ１、κ）、レーン７：ＯＲＧ３８９４８　１２Ａ（ＩｇＧ１、κ）、レーン８：ＺＰ（１９〜３８）１Ａ（ＩｇＧ１コントロール）、レーン９：Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、レーン１０：ＺＰ　１Ａ（ＩｇＡコントロール）。注：ＯＲＧ３８９４８　０９Ａは、ＯＲＧ３８９４８およびＤＲＢ１＊０４０１の両方と反応する抗体である。
【００４５】
図３ａは、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＢＳＭにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識することを示す。
ＢＳＭ細胞はＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷され（実線）、抗Ｏｒｇ３８９４８抗体による染色が、ＦＡＣＳ分析によって非負荷細胞の染色（破線）と比較された。抗ＨＬＡ／ＤＲのＬ２４３が、ＤＲ分子の存在に対する陽性コントロールとして使用された。イソタイプコントロール抗体は、陰性コントロール（点線）として使用された。
【００４６】
図３ｂは、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＰｒｉｅｓｓにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識すること示す。
Ｐｒｉｅｓｓ細胞はＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷され（実線）、抗Ｏｒｇ３８９４８抗体による染色が、ＦＡＣＳ分析によって非負荷細胞の染色（破線）と比較された。抗ＨＬＡ／ＤＲのＬ２４３が、ＤＲ分子の存在に対する陽性コントロールとして使用された。イソタイプコントロール抗体が陰性コントロール（点線）として使用された。
【００４７】
図４は、Ｏｒｇ３８９４８に対する抗体が、Ｏｒｇ３８９４８によるＴ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害することを示す。
Ｏｒｇ３８９４８複合体をコーティングして、漸増濃度のＭＡｂおよび当該Ｔ細胞ハイブリドーマをインキュベーションした。３７℃で２日間インキュベーションした後、ＩＬ−２の産生を測定した。それぞれの値は、３組みの培養物の平均カウントを表す。ａ）ハイブリドーマ５Ｇ１１、ｂ）ハイブリドーマ４Ｇ１１およびｃ）ハイブリドーマ８Ｂ１２。
【００４８】
図５は、Ｏｒｇ３８９４８に対する抗体が、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５でパルス処理されたＢＳＭ細胞によるＴ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害することを示す。
ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５でパルス処理されたＢＳＭ細胞を、１０μｇ／ｍｌのＭＡｂおよびＴ細胞ハイブリドーマ５Ｇ１１（左パネル）または１４Ｇ１１（右パネル）のいずれかと一緒にインキュベーションした。３７℃で２日間インキュベーションした後、ＩＬ−２の産生を測定した。それぞれの値は、３組みの培養物の平均カウント＋標準偏差を表す。
【００４９】
（実施例）
実施例１
Ｏｒｇ３８９４８の製造
Ｏｒｇ３８９４８は、ＨＣｇｐ−３９のアミノ酸２６３〜２７５を含むペプチドとＤＲＢ１＊０４０１（ＤＲＡ、ＤＲＢ１＊０４０１）二量体からなる複合体であり、これは０．０５％ドデシルマルトシド界面活性剤溶液で可溶化される。
【００５０】
ＤＲＢ１＊０４０１分子は、いくつかの軽微な改良を行った、Ｎａｇら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：１５５８〜１５６４）により記載された方法で精製した。簡潔には、ＥＢＶにより形質転換されたリンパ芽球細胞株ＢＳＭ（ＮＩＧＭＳ；ＧＭ０６８２１）を、１０％ＦＣＳ、２ｇ／ｌのグルコース、４ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞を回収後、ＤＲＢ１＊０４０１分子を０．５％トリトンＸ１００／ＰＢＳで抽出した。その後、溶解液をろ過によって清澄化し、１０ｋＤａ限外ろ過膜でさらに濃縮した。濃縮されたトリトンＸ１００溶解液をＬ２４３結合セファロース−４Ｂカラムにかけ、結合したＤＲＢ１＊０４０１をＰＢＳ／０．０５％ドデシルマルトシド（ｐＨ１１．３）で溶出した。分画物を２０％リン酸ナトリウム一塩基性緩衝液で直ちに中和し、そしてＤＲＢ１＊０４０１分子をＰＢＳ／０．０５％ドデシルマルトシド（ｐＨ７．３）中のＤＥＡＥイオン交換カラムに通して集めた。
【００５１】
ＨＣｇｐ−３９のアミノ酸残基２６３〜２７５に対応するペプチドは、ｆｍｏｃ化学を使用してＤｉｏｓｙｎｔｈにおいてＧＭＰ条件のもとで合成された。
【００５２】
ＭＨＣ−ペプチド複合体は、５０×モル過剰量のＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５を精製されたＤＲＢ１＊０４０１分子と３７℃でＰＢＳ／０．０５％ドデシルマルトシド（ｐＨ７．０）中にて、７２時間〜８０時間インキュベーションすることによって調製した。最後に、遊離ペプチドをＳ−３００／Ｓ−２００のタンデムサイズエクスクルージョンカラムクロマトグラフィーによって取除き、精製された複合体はＰＢＳ／０．０５％ドデシルマルトシド（ｐＨ７．２）中で保存された。
【００５３】
実施例２
Ｏｒｇ３８９４８に対するモノクローナル抗体の作製
６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを表Ｉに示されるスケジュールに従って免疫化した。免疫化スケジュールの４８日目に、血液サンプルを眼窩穿刺によって採取した。このときに、Ｏｒｇ３８９４８およびＤＲＢ１＊０４０１に対する抗体は、高力価（２２，０００〜４６，０００の範囲）であることがわかった。使用された免疫化スケジュール間で、著しい差は見出されなかった。最後の注射を行った５日後に、マウスを屠殺して、赤血球非含有脾臓細胞集団を（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５２：６９；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ、１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９：１２５）に、以前記載されたように調製した。これらの脾臓細胞集団は−１４０℃で凍結されたか、ＭＡｂを作製するためにすぐに使用された。
【００５４】
ＭＡｂを作製するために、マウス１、マウス２およびマウス３に由来する２×１０７個の赤血球非含有脾臓細胞をためておき、大部分の単球を除くために、プラスチック製の培養フラスコで、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｐａｉｓｌｙ、英国；カタログ番号０４１−９１８２５）、１０％ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、米国）において３７℃で１時間インキュベーションした。続いて、非接着性の細胞を、（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら（１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９：１２５）によって記載されるように、ＤＲＢ１＊０４０１でコーティングされた培養ディッシュで、３回連続したパニングを行った。そのような段階で、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１に対するＢ細胞が細胞懸濁物から除かれる。続いて、ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体に対するＢ細胞は、得られた細胞懸濁物をＯｒｇ３８９４８コーティング培養ディッシュにおいて、３７℃で９０分間インキュベーションすることにより選択された。結合していない細胞を慎重な洗浄によって除き、最後に、結合した細胞をトリプシン処理によって回収した。
【００５５】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、１９９４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９：１２５）に以前記載されたように、クローン増殖およびミニ電気融合によって、これらの選択されたＢ細胞から作製した。簡潔には、選択されたＢ細胞を、９６ウエル平底組織培養プレートにおいて、２００μｌ（最終容量）のＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２、１０％ウシ血清でＴ細胞上清および５０，０００個の放射線照射（２５００ｒａｄ）ＥＬ−４　Ｂ５細胞と混合した。上清を、ＤＲＢ１＊０４０１またはＯｒｇ３８９４８コーティングプレートのいずれかを使用するＥＬＩＳＡで、８日目に試験した。ＤＲＢ１＊０４０１とではなく、Ｏｒｇ３８９４８と反応し得るＭＡｂを産生するＢ細胞培養物を、ミニ電気融合法に付した。これらの培養物に由来する特異的Ｂ細胞を、１０６個のＮＳ−１ミエローマ細胞と混合し、そしてＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２で洗浄することによって血清を除いた。次に、細胞をプロナーゼ溶液で３分間処理し、続いて融合培地で洗浄した。電気融合は、５０μｌの融合チャンバーにおいて、３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場、続く１０μｓ３ｋＶ／ｃｍの矩形高電場パルスおよび再度の３０ｓ、２ＭＨｚ、４００Ｖ／ｃｍの交流電場によって行われた。最後に、融合チャンバーの内容物を選択培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２、１０％ＦＣＳ、１０−４Ｍヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、１．６ｘ１０−５Ｍチミジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、０．４μＭアミノプテリン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））、１％ヒト膀胱カルシノーマＴ２４条件培地（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ４）に移し、限界希釈条件で９６ウエルマイクロタイタープレートに置床した。融合後の１３日目に、培養物をハイブリドーマの増殖について調べ、ＤＲＢ１＊０４０１またはＯｒｇ３８９４８コーティングプレートのいずれかを使用するＥＬＩＳＡで、再びスクリーニングした。
【００５６】
Ｂ細胞の培養およびミニ電気融合の後、ＤＲＢ１＊０４０１とではなく、Ｏｒｇ３８９４８との反応性をＥＬＩＳＡにおいて示す５つの抗体（ＯＲＧ３８９４８　０１Ａ、ＯＲＧ３８９４８　０４Ｂ、ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ、ＯＲＧ３８９４８　１１ＢおよびＯＲＧ３８９４８　１２Ａ）が見出された（図１ａおよび１ｂ）。これらのＭＡｂもまた、ポリスチレン製プレートにコーティングされたＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５とは反応せず、Ｏｒｇ３８９４８に対する反応性が遊離ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５により阻害され得ないため、これらのＭＡｂは、ＤＲＢ１＊０４０１とＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５との混合エピトープに指向する。ペプチドＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５に対する結合がないことはＢＩＡｃｏｒｅ実験で確認された。
【００５７】
ＭＡｂの特異性をさらに裏付けるために、本発明者らは、Ｏｒｇ３８９４８を用いた免疫沈降を行った。簡潔には、１０μｇのＯｒｇ３８９４８を、１ｍｌのハイブリドーマ上清が事前に加えられた、６×１０６個のヒツジ抗マウスＩｇ結合常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）１１０．０２、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）と、３００μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにおいて４℃で２時間インキュベーションした。その後、免疫沈降物をＰＢＳで３回洗浄して、サンプル緩衝液で煮沸し、非還元条件下および還元条件下での１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質の電気泳動転写は、標準的な手法をで行った。ブロットにおける未結合部位をＰＢＳ／０．５％ツイーン２０（登録商標）／５％スキムミルクでブロッキングした後、ブロットをＰＢＳ／０．５％ツイーン２０（登録商標）／１％ＢＳＡ／１％正常ヤギ血清における抗ＤＲ　ＭＡｂ（２０ｍｌＬ２４３（２μｇ／ｍｌ）または１２．５ｍｌＬ２２７（１．１μｇ／ｍｌ）のいずれかと室温で１時間インキュベーションした。その後、ブロットを同じ緩衝液におけるアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇと１時間インキュベーションした。最後に、ブロットを、ＢＣＩＰ（登録商標）および発色色素基質としてのＮＢＴを使用して発色させた。これらの実験により、ＭＡｂは、還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥで泳動されたときに、３３ｋＤａおよび２８ｋＤａの２つの分子に解離する６０ｋＤａの分子を、免疫沈殿させ得ることが明らかにされた（図２）。これらの分子量は、２つの非共有結合的に結合しているポリペプチド鎖（３２ｋＤａのα鎖および２８ｋＤａのβ鎖）からなるＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＭＡｂの反応性を裏付けている。
【００５８】
実施例３
Ｏｒｇ３８９４８に対するＭＡｂは、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５が負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＢＬＣＬにおけるＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を認識する。
【００５９】
ＦＡＣＳ分析を使用して、様々なペプチドでパルス処理された、ＭＨＣを発現する種々のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（ＢＬＣＬ）に対するＭＡｂの結合が明らかにされた。ペプチドは、自動化されたＭｉｌｌｉｇｅｎ９０５０合成機を使用する固相ペプチド合成によって合成され、逆相ＨＰＬＣによって精製された。
【００６０】
簡潔には、１０６個のＢＬＣＬを、５００μｌのＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２またはブランク培地において、４０μｇのペプチドと、３７℃で４時間、インキュベーションした。このインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムで洗浄した。約２×１０５個の細胞を、４℃で１時間、１３０μｌのＭＡｂ含有ハイブリドーマ上清および２０μｌのＰＢＳ／２０％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムとインキュベーションした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムで２回洗浄した後、細胞を、４℃で１時間、５０μｌのＰＢＳ／２０％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムおよび１０μｌのヤギ抗マウスＩｇ／ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓａｏｎ）とインキュベーションした。続いて、細胞をＰＢＳ／２０％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムで３回洗浄し、最後に４００μｌＰＢＳ／２％ｐ−ホルムアルデヒドに再懸濁した。ペプチド結合に対するコントロールとして、細胞をビオチン化ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５とインキュベーションして、ストレプトアビジン／ＰＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓａｏｎ）で染色した。ＨＬＡ−ＤＲ発現に対するコントロールとして、染色を、抗ＨＬＡ／ＤＲのＬ２４３（ハイブリドーマＡＴＣＣ　ＨＢ５５から精製されたＩｇ）を用いて行った。染色された細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｂｅｃｋｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓａｏｎ）を用いて分析された。すべての場合において、死細胞および細胞破片をさらなる分析から除くために、前方および側方の散乱分析が適用された。
【００６１】
ＤＲＢ１＊０４０１についてホモ接合性の２つのＢＬＣＬ（ＢＳＭおよびＰｒｉｅｓｓ）をＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷し、このペプチドで負荷されなかった細胞と、これらの細胞に対する抗体の反応性を比較した。図３ａおよび図３ｂは、ＯＲＧ３８９４８　１１Ｂを除くすべてのＯｒｇ３８９４８特異的抗体が、反応性においてペプチド負荷ＢＬＣＬと非負荷ＢＬＣＬとを、識別することを示している。ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体の最も良い染色がＯＲＧ３８９４８　０１ＡおよびＯＲＧ３８９４８　０８ＡおよびＯＲＧ３８９４８　１２Ａで得られた。しかし、これらの抗体のうち２つ（０１Ａおよび０８Ａ）はＢＬＣＬの１つ（ＢＳＭ）でバックグラウンドの染色を少し示した。このため、これらは有用性が低いと考えられる。
【００６２】
実施例４
Ｏｒｇ３８９４８に対するＭＡｂのエピトープマッピング
本発明者らはＤＲＢ１＊０４０１と関連するＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５の、様々な修飾ペプチドおよび切断されたペプチドに対する結合を調べることによって、抗体により認識されるエピトープをマッピングした。抗体の反応性を、マウスＴ細胞ハイブリドーマ８Ｂ１２（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１と関連するＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５を認識するマウスＴ細胞ハイブリドーマ）のＴＣＲによる認識と比較した。このハイブリドーマは、Ｃｏｐｅら（１９９９、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４２：１５９７〜１５０７）によって記載されるように、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で免疫化された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１＋／＋、ヒトＣＤ４＋／＋、Ｉ−Ａβ−／−トランスジェニックマウスから作製された。
【００６３】
ペプチド骨格および側鎖における様々な修飾が、ＯＲＧ３８９４８　１２Ａまたは８Ｂ１２による認識に影響を及ぼすことなく可能である（表ＩＩ）。抗体ＯＲＧ３８９４８　０１Ａおよび抗体ＯＲＧ３８９４８　０８Ａによる認識は、認識されるエピトープに関してより重大であるようである。これは、修飾体があまり認識されない（ＯＲＧ３８９４８　０８Ａ）か、または全く認識されない（ＯＲＧ３８９４８　０１Ａ）からである。ＯＲＧ３８９４８　１２Ａは、Ｎ末端において２アミノ酸が伸長しているペプチド（ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６１〜２７５）とは反応しない。
【００６４】
別の実験では、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５の多様な切断されたペプチド体が、ＯＲＧ３８９４８　１２Ａによって認識されるＤＲＢ１＊０４０１における最小エピトープを明らかにするために試験された。Ｃ末端では、２つのアミノ酸が、結合性を失わせることなく除くことができるが、これに対して、Ｎ末端では切断することは許されない（表ＩＩＩ）。従って、ＯＲＧ３８９４８　１２Ａによって認識される最小のエピトープはＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７３である。ＯＲＧ３８９４８　１２Ａによって認識されるエピトープは、ハイブリドーマ８Ｂ１２によって認識されるエピトープとは異なる。Ｃ末端での２アミノ酸の切断に加えて、ハイブリドーマ８Ｂ１２は、Ｎ末端での２アミノ酸の除去が可能である。
【００６５】
実施例５
Ｏｒｇ３８９４８に対するＭＡｂの微細な特異性
実施例３に記載されるのと同じ手順を使用して、１）抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが、１組の異なるペプチドを伴うＤＲＢ１＊０４０１と交差反応するかどうか、そして２）ＯＲＧ３８９４８　１２Ａの結合が、ＤＲＢ１＊０４０１と関連するＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５に限定されるかどうか、または他のＨＬＡ−ＤＲ／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体もまた認識されるかどうかを調べた。
【００６６】
１）に関して、Ｐｒｉｅｓｓ細胞は、ＤＲＢ１＊０４０１に対して十分に結合するペプチドでパルス処理された。表ＩＶにまとめられているデータは、ＤＲＢ１＊０４０１結合モチーフを達成する、他のＨＣｇｐ−３９由来ペプチドを伴うＤＲＢ１＊０４０１では、交差反応が認められなかったことを示している。また、インフルエンザ赤血球凝集素およびらい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｅｐｒａｅ）に由来する無関係なペプチドを伴うＤＲＢ１＊０４０１では交差反応は見出せなかった。
【００６７】
ＯＲＧ３８９４８　１２Ａはビオチン化ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５をも認識するが、これに対して、ＯＲＧ３８９４８　０１Ａ、ＯＲＧ３８９４８　０４ＢおよびＯＲＧ３８９４８　０８Ａの各抗体はこれを認識しない。ビオチンはペプチドのＮ末端に結合されているので、このことは、後者のＭＡｂは複合体内のペプチドのＮ末端に近いエピトープを認識することを示唆している。
【００６８】
２）に関して、ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５以外のＨＬＡ−ＤＲ／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体とのＯＲＧ３８９４８　１２Ａの交差反応性を調べるために、下記の十分に特徴付けられたホモ接合性ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株（ＢＬＣＬ）が使用された：
Ｐｒｉｅｓｓ：ＤＲＡ、ＤＲＢ１＊０４０１。
【００６９】
ＢＳＭ：ＤＲＡ＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ４＊０１０１、ＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０１０１２。
【００７０】
ＹＡＲ：ＤＲＡ＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０２、ＤＲＢ４＊０１０１、ＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０４０１。
【００７１】
ＳＡ９００１：ＤＲＡ、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＱ１、ＤＰ４。
【００７２】
ＢＭ９２：ＤＲＡ＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ４＊０１０１、ＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０４０２。
【００７３】
ＭＧＡＲ：ＤＲＡ＊０１０２、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ５＊０１０１、ＤＱＡ１＊０１０２、ＤＱＢ１＊０６０２、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０４０１。
【００７４】
ＪＨＡＦ：ＤＲＢ１＊０４０７、ＤＲＢ４＊０１０１、ＤＱＡ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０３０１。
【００７５】
ＡＭＡＬＡ：ＤＲＡ＊０１０２、ＤＲＢ１＊１４０２、ＤＲＢ３＊０１０１、ＤＱＡ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０４０２。
【００７６】
ＥＫ：ＤＲＡ＊０１０２、ＤＲＢ１＊１４０１、ＤＲＢ３＊０２０２、ＤＱＡ１＊０１０１、ＤＱＢ１＊０５０３、ＤＰＡ１＊０１、ＤＰＢ１＊０４０２。
【００７７】
これらのホモ接合性ＢＬＣＬはＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷され、続いてＯＲＧ３８９４８　１２Ａで染色された。一連の実験において、ＯＲＧ３８９４８　１２Ａにより、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５がＤＲＢ１＊０４０１およびＤＲＢ１＊０４０７の両方の存在下で染色される（表Ｖ）。抗体の濃度が正常なとき、ペプチドの染色は、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１４０２（ＲＡ感受性ハプロタイプ）、ＤＲＢ１＊０４０２、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１４０１（近縁の非ＲＡ感受性ハプロタイプ）、およびＤＲＢ１＊１５０１（より遠く離れている非ＲＡ感受性ハプロタイプ）の存在下では認められなかった。抗体の濃度が極めて高いとき、より弱い反応性が、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１３０１およびＤＲＢ１＊１４０１の存在下においてＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５でもまた検出された。これらの実験のコントロールでは、ｉ）ＯＲＧ３８９４８　１２Ａは非負荷ＢＬＣＬには結合しないこと、ｉｉ）ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５はＢＬＣＬに結合すること、そしてｉｉｉ）すべてのＢＬＣＬは高レベルのＤＲ発現（データ示さず）を示すことが明らかにされた。
【００７８】
実施例６
Ｏｒｇ３８９４８に対するＭＡｂは、Ｏｒｇ３８９４８およびＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５でパルス処理されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＢＬＣＬによる、Ｔ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害する。
【００７９】
抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂによるＴ細胞ハイブリドーマの抗原誘導活性化の阻害を、２つの異なるアッセイで測定した。一方のアッセイでは、Ｔ細胞ハイブリドーマがＭＨＣ／ペプチド複合体で刺激された。もう一方のアッセイでは、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマ５Ｇ１１、８Ｂ１２および１４Ｇ１１（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５を認識するマウスＴ細胞ハイブリドーマ；これらのハイブリドーマは、Ｃｏｐｅら（１９９９、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４２：１５９７〜１５０７）によって記載されるように、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で免疫化された、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１＋／＋、ヒトＣＤ４＋／＋、Ｉ−Ａβ−／−のトランスジェニックマウスから作製された）を刺激するために使用された。
【００８０】
ＭＨＣ／ペプチド複合体による刺激のために、平底マイクロウエルを、ＰＢＳ中において、濃度が２００ｎｇ／ｍｌである１００μｌのＯｒｇ３８９４８を用いて、４℃でコーティングした。過剰な複合体を、ＰＢＳで２回洗浄することによって除いた。その後ウエルを、１００μｌのＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２、１０％ＦＣＳにおいて様々な濃度のＭＡｂと、３７℃で１時間インキュベーションした。ＭＡｂとプレインキュベーションした後、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２、１０％ＦＣＳ中の、１００μｌのＴ細胞ハイブリドーマ懸濁物（２×１０４細胞／ウエルの５Ｇ１１および１４Ｇ１１；１０４細胞／ウエルの８Ｂ１２）を加えた。培養物を３７℃で２日間インキュベーションして、最後に上清を集め、マウスＩＬ−２を測定した。図４ａでは、すべてのＭＡｂが用量に関連してハイブリドーマ５Ｇ１１の活性化を阻害したことが示される。ＯＲＧ３８９４８　０１Ａを使用した場合、コントロールのＩｇＧ　ＭＡｂと比較して部分的な阻害が得られた。他方で、ＯＲＧ３８９４８　０８ＡおよびＯＲＧ３８９４８　１２Ａとのインキュベーションは、２５μｇ／ｍｌの濃度で完全な阻害をもたらした。これらの複合体特異的抗体は、抗ＨＬＡ／ＤＲ　ＭＡｂ　Ｌ２４３よりも強力でないＴ細胞ハイブリドーマ活性化阻害剤であった。これは、抗体の親和性が異なるためであると考えられる。同様の結果が、ハイブリドーマ１４Ｇ１１を使用して得られた（図４ｂ）。ハイブリドーマ８Ｂ１２はあまり阻害されなかった（図４ｃ）。これは、完全に刺激されるためにはこのハイブリドーマは複合体をほとんど必要としないという、本発明者らの以前の観測結果と一致している。
【００８１】
もう一方のアッセイでは、１．２×１０６細胞を１ｍｌのＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２中、ペプチド１０μｇとともに、３７℃で５時間インキュベーションすることによってＢＳＭ細胞に、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５が負荷された。その後、過剰なペプチドを洗浄して除き、細胞には、１５，０００ｒａｄの線量が照射された。続いて、２×１０４個のペプチド負荷ＢＳＭ細胞を、３７℃で１時間、丸底マイクロウエルにおいて、１００μｌのＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２中、１０μｇ／ｍｌ（最終容量）のＭＡｂとプレインキュベーションした。その後、２×１０４個のＴ細胞ハイブリドーマを、１００μｌＤＭＥＭ／ＨＡＭ　Ｆ１２、２０％ＦＣＳとして加えた。３７℃で２日間インキュベーションした後、上清が集められ、マウスＩＬ−２について試験された。図５から推定され得るように、すべての抗体は、ハイブリドーマ５Ｇ１１および１４Ｇ１１のペプチド誘導による活性化を、１０μｇ／ｍｌ（濃度）で阻害することが見出された。ここでも、より強い阻害が抗ＨＬＡ／ＤＲ　ＭＡｂ　Ｌ２４３で得られた。
【００８２】
注：マウスＩＬ−２は、捕捉用の抗マウスＩＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ　１８１６１Ｄ）および第２抗体としての抗マウスＩＬ−２／ビオチン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ　１８１７２Ｄ）を使用するダブルサンドイッチＥＬＩＳＡで測定された。ユーロピウムに結合させたストレプトアビジン（Ｗａｌｌａｃ（登録商標）１２４４−３６０）は、時間分解蛍光光度計でＩＬ−２結合を検出するために使用された。
【００８３】
実施例７
ＤＲＢ１＊０４０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体はＲＡ患者の滑液内のＡＰＣにおいて提示される
Ｂａｅｔｅｎら（２０００、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４３：１２３３〜１２４３）記載の方法で、滑膜切片に対する免疫組織化学を実施した。簡潔には、滑膜生検物を液体窒素で急速凍結し、５μｍのクリオスタット切片を作製した。アセトン中で１０分間固定し、１％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした後、切片を、３つの異なる抗ＨＣｇｐ−３９ＭＡｂ（０６Ａ、０８Ｂおよび１０Ｂ）、またはＯＲＧ３８９４８　１２Ａと、３０分間インキュベーションした。対応する切片は、陰性コントロールとして、イソタイプが一致する関連性のないＭＡｂとインキュベーションされた。切片は、続いて、ビオチン化抗マウス二次抗体とインキュベーションし、その後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）とインキュベーションした。３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）発色性基質を使用して、発色反応させた。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色した。染色された滑膜切片は盲検下で、２名の観測者によって独立的にスコア化された。
【００８４】
１９名のＲＡ患者、１０名のＳｐＡ患者、３名のＰｓＡ患者、２名のＯＡ患者、１名の軟骨石灰化症患者、および未だ確定診断されていない３名の患者の滑膜切片をＨＣｇｐ−３９発現について試験し、３つの抗ＨＣｇｐ−３９ＭＡｂの１組およびＯＲＧ３８９４８　１２Ａをそれぞれ使用する免疫組織化学によってＯＲＧ３８９４８　１２Ａで染色した。ＤＲ４／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体またはＤＲＢ１＊０１０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体が１５名の共有エピトープ陽性ＲＡ患者のうち１０名で検出された（表ＶＩａ）。ＤＲＢ１＊０４０４／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５およびＤＲＢ１＊０１０１／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５との反応性は、ＯＲＧ３８９４８　１２ＡもまたＤＲＢ１＊０４０４およびＤＲＢ１＊０１０１との関連においてＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５を認識するという観測結果と一致している（表Ｖ）。ＯＲＧ３８９４８　１２Ａによる染色は、リンパ様浸潤物内またはその近くに存在する個々の樹状様細胞に限定されていた（データ示さず）。この位置は、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５発現細胞の位置とは明らかに異なる。このことは、ＭＨＣ／ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５発現細胞がＨＣｇｐ−３９産生細胞ではないことを示唆している。ＯＲＧ３８９４８　１２ＡのＭＡｂによる染色は、様々な疾患を有する１９名のコントロール患者では見出されなかった（表ＶＩｂ）。これらの患者のうち５名は、共有エピトープ（ＤＲ４またはＤＲ１）が発現することによる関連性のあるコントロールであり、６名は共有エピトープが陰性であり、そして残りのＨＬＡ−ＤＲタイプは依然として不明である。イソタイプのコントロール抗体による染色は常に陰性であった。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
【表５】
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【００８７】
【表６】
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【００８８】
【表７】
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【００８９】
【表８】
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【００９０】
【表９】
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【００９１】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｏｒｇ３８９４８に対するモノクローナル抗体がＤＲＢ１＊０４０１分子と反応しないことを示す。
【図２】免疫沈降により明らかにされるように、抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂがＭＨＣクラスＩＩを認識する。
【図３ａ−１】ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＢＳＭにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識することを示す。
【図３ａ−２】ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＢＳＭにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識することを示す。
【図３ｂ−１】ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＰｒｉｅｓｓにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識すること示す。
【図３ｂ−２】ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５で負荷されたＤＲＢ１＊０４０１陽性ＰｒｉｅｓｓにおけるＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５複合体を抗Ｏｒｇ３８９４８ＭＡｂが認識すること示す。
【図４】Ｏｒｇ３８９４８に対する抗体が、Ｏｒｇ３８９４８によるＴ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害することを示す。
【図５】Ｏｒｇ３８９４８に対する抗体が、ＨＣｇｐ−３９２６３〜２７５でパルス処理されたＢＳＭ細胞によるＴ細胞ハイブリドーマの活性化を阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ−１】
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【図３ａ−２】
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【図３ｂ−１】
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【図３ｂ−２】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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