(57)【要約】安定化された脂質構築物であって、リポソームまたは重合小胞、標的指向物質、治療用物質および安定化用物質を含む安定化された脂質構築物、並びにそれらの製造方法および使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームまたは重合小胞、標的指向物質、治療用物質および安定化用物質を含む、安定化された脂質構築物。
【請求項２】
重合小胞が、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項３】
リポソームまたは重合小胞が、ＤＴＰＡ脂質誘導体Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ジオキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシンを含む、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項４】
リポソームまたは重合小胞が、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびＤＴＰＡ脂質誘導体Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ジオキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシンの混合物を含む、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項５】
安定化用物質が、天然ポリマー、半合成ポリマーおよび合成ポリマーから成る群より選択される、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項６】
安定化用物質が、デキストラン、修飾デキストランおよびポリ（エチレンイミン）から成る群より選択される、請求項５に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項７】
安定化用物質が、物理的安定性またはコロイド安定性を与える、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項８】
安定化用物質が、多価能を与える、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項９】
治療用物質が、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８から成る群より選択される、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１０】
前記治療用物質がＹ−９０である、請求項９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１１】
前記標的指向物質が、安定化された脂質構築物を細胞表面に標的指向させる、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１２】
標的指向物質が、安定化された脂質構築物と共有結合手段によって連結している、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１３】
標的指向物質が、安定化された脂質構築物と非共有結合手段によって連結している、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１４】
前記標的指向物質が抗体である、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１５】
前記抗体が、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、プレイオトロピン、Ｇタンパク質共役型受容体、エンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９を含めたマトリックスメタロプロテアーゼ、並びに前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）から成る群より選択される標的を有する、請求項１４に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１６】
前記標的指向物質が血管標的を有する、請求項１に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１７】
前記標的指向物質が、ＶｉｔａｘｉｎまたはＬＭ６０９である、請求項１６に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１８】
前記標的指向物質が、抗ＶＣＡＭ−１抗体、抗ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体および抗インテグリン抗体から成る群より選択される、請求項１６に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項１９】
リポソームまたは重合小胞、治療用物質および安定化用物質を含む、安定化された脂質構築物。
【請求項２０】
重合小胞が、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２１】
リポソームまたは重合小胞が、ＤＴＰＡ脂質誘導体Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ジオキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシンを含む、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２２】
リポソームまたは重合小胞が、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびＤＴＰＡ脂質誘導体Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ジオキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシンの混合物を含む、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２３】
安定化用物質が、天然ポリマー、半合成ポリマーおよび合成ポリマーから成る群より選択される、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２４】
安定化用物質が、デキストラン、修飾デキストランおよびポリ（エチレンイミン）から成る群より選択される、請求項２３に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２５】
安定化用物質が、物理的安定性またはコロイド安定性を与える、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２６】
安定化用物質が、多価能を与える、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２７】
安定化用物質が、デキストラン、アミノデキストランおよびポリ（エチレンイミン）から成る群より選択され、そして標的指向物質が、抗ＶＣＡＭ−１抗体、抗ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体および抗インテグリン抗体から成る群より選択される、請求項１９に記載の安定化された脂質構築物。
【請求項２８】
リポソームまたは重合小胞、治療用物質および安定化用物質を含む、治療剤を制御放出するための安定化された脂質構築物。
【請求項２９】
患者を処置する方法であって、処置を必要としている患者に十分な量の治療剤を投与することを含み、該治療剤は安定化された脂質構築物を含み、該安定化された脂質構築物は、リポソームまたは重合小胞、標的指向物質、治療用物質および安定化用物質を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的指向物質、治療用または処置用物質および連結用担体を含む、治療剤および撮像剤に関する。本発明の好ましい薬剤には、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームが含まれる。治療用または処置用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によってこの薬剤と連結することができる。ある場合には、この治療用または処置用物質は、放射性同位体、化学療法剤、プロドラッグ、毒素、または細胞毒性を示すタンパク質をコードしている遺伝子である。好ましくは、この薬剤は、治療剤または撮像剤に追加の利点を与える安定化用物質を更に含む。この安定化用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によってこの薬剤と連結することができる。好ましくは、この安定化用物質はデキストランであり、好ましくは、これが、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームの表面上にコーティングを形成する。好ましい態様において、連結用担体は、重合リポソームである。この連結用担体は、慣用的な連結方法によって与えられない追加の利点をこれら治療薬に与える。
【背景技術】
【０００２】
がんは、依然として産業化世界における主な死亡原因の１つである。米国において、がんは、心臓病に次いで２番目の最も一般的な死亡原因であり、１９９７年には死因の約４分の１となっている。がんに対する新規かつ有効な処置は、明らかに有意な健康上の恩恵を与えるであろう。がんについて考えられる広範囲の処置の中で、標的治療薬にはかなり将来性がある。細胞障害性薬をがん組織に特異的に標的指向させる場合、健康な組織は影響されてはならずまたは病変組織よりはるかに影響を小さくすべきであるため、患者は、原則としてはるかに高用量の細胞障害性薬に耐え得ると考えられる。
【０００３】
モノクローナル抗体の高い特異性のために、細胞障害性薬に共役した抗体は、標的がん処置療法として提唱されてきている。充実性腫瘍は、特に、腫瘍を含む形質転換細胞および腫瘍に供給する血管系の双方において、腫瘍の細胞および血管系に独特であるかまたは、正常な細胞および血管系と比較して、腫瘍の細胞および血管系で過剰発現するある種の抗原を発現する。したがって、腫瘍抗原または腫瘍血管系抗原に特異的な抗体を細胞障害性薬に連結することは、病変部位への高い特異性を提供するはずである。このような抗原の一群は、種々の病理学的および疾患過程中に内皮細胞によって発現される、細胞接着分子（ＣＡＭ）と称されるタンパク質ファミリーである。Reisfeld, "Monoclonal Antibodies in Cancer Immunotherapy," Laboratory Immunology II, (1992) 12(2):201-216 および Archelos et al., "Inhibition of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by the Antibody to the Intercellular Adhesion Molecules ICAM-1," Ann. of Neurology (1993) 34(2):145-154。ＣＡＭを含めた多数の内皮リガンドおよび受容体は、炎症および新形成のような種々の病変の際にアップレギュレートされることが知られているので、標的指向戦略にとって魅力的な候補である。
【０００４】
他の可能性のある標的はインテグリンである。インテグリンは、細胞接着を媒介する一群の細胞表面糖タンパク質であり、したがって、種々の生物学的過程を引き起こす細胞接着相互作用の媒介物質である。インテグリンは、非共有結合によって連結したαおよびβのポリペプチドサブユニットを含むヘテロ二量体である。現在、少なくとも１１種類の異なったαサブユニットが識別されているし、少なくとも６種類の異なったβサブユニットが識別されている。これら種々のαサブユニットは、種々のβサブユニットと一緒になって、別個のインテグリンを形成することができる。αｖβ３ として識別されるインテグリン（ビトロネクチン受容体としても知られる）は、腫瘍転移、充実性腫瘍増殖（新形成）、骨粗鬆症、パジェット病、悪性の体液性高カルシウム血症、腫瘍性血管形成を含めた血管形成、網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチを含めた関節炎、歯周病、乾癬および平滑筋細胞移動（例えば、再狭窄）が含まれるがこれらに限定されるわけではない種々の状態または疾患状態においてある役割を果たすインテグリンとして識別されている。更に、このようなインテグリン阻害性薬は、抗ウイルス薬、抗真菌薬および抗微生物薬として有用であろうということが判明している。したがって、選択的に αｖβ３ を阻害するかまたはそれに拮抗する治療薬は、このような状態を処置するのに有益であると考えられる。この αｖβ３インテグリンは、フィブリノーゲン（Bennett et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.80(1983)2417）、フィブロネクチン（Ginsberg et al., J.Clin.Invest., Vol.71(1983)619-624）およびフォンビルブラント因子（Ruggeri et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.79(1982)6038）のような多数のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有マトリックス巨大分子に結合することが分かっている。このＲＧＤ配列を含有する化合物は、細胞表面受容体に結合するように、細胞外マトリックスリガンドを模擬している。しかしながら、ＲＧＤペプチドは、概して、ＲＧＤ依存性インテグリンに選択的ではないということも知られている。例えば、αｖβ３に結合する大部分のＲＧＤペプチドは、αｖβ５、αｖβ１ および αIIｂβIIIａにも結合する。血小板 αIIｂβIIIａ（フィブリノーゲン受容体としても知られる）の拮抗作用は、ヒトの血小板凝集を阻止することが知られている。
【０００５】
多数の抗インテグリン抗体が知られている。Doerr, et al., J.Biol.Chem. 1996 271:2443 は、αｖβ５インテグリンへの遮断抗体が、in vitro で、ＩＧＦ−１からの刺激に応答したＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の遊走を阻害することを報告した。Gui et al., British J.Surgery 1995 82:1192 は、αｖβ５ および αｖβ１に対する抗体が、ヒト乳癌細胞株Ｈｓ５７８ＴおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１による in vitro 化学侵潤を阻害することを報告している。Lehman et al., Cancer Research 1994 54:2102 は、モノクローナル抗体（６９−６−５）が、αｖβ３を含めた数種類の αｖ インテグリンと反応し、そしてビトロネクチンを含めた多数の基質への結腸癌細胞接着を阻害したことを示している。Brooks et al., Science 1994 264:569 は、抗 αｖβ３ モノクローナル抗体でのインテグリン活性の遮断が、ヒトＭ２１−Ｌ黒色腫フラグメントによるニワトリ漿尿膜の腫瘍誘発血管形成を阻害することを示している。Chuntharapai, et al., Exp.Cell.Res. 1993 205:345 は、αｖβ３ 複合体を認識するモノクローナル抗体９Ｇ２．１．３およびＩＯＣ４．１．３を開示しているが、この後者のモノクローナル抗体は、破骨細胞を例外として、αｖβ３を発現する組織に弱く結合するかまたは全く結合しないと言われており、骨疾患の in vivo 療法に有用であると示唆された。前者のモノクローナル抗体は、あるがんの治療薬として可能性があると示唆されている。
【０００６】
Ginsberg et al., 米国特許第５，３０６，６２０号は、インテグリンと反応し、その結果、リガンドへのインテグリンの結合親和性を増加させる抗体を開示している。これらモノクローナル抗体はそのままで、黒色腫腫瘍を固定することによって転移を妨ぐのに有用であると言われている。Brown, 米国特許第５，０５７，６０４号は、ＲＧＤ配列含有タンパク質を認識する受容体に結合することによって、ＲＧＤに媒介される食作用増進を阻害する αｖβ３インテグリンへのモノクローナル抗体の使用を開示している。Plow et al., 米国特許第５，１４９，７８０号は、インテグリンβサブユニットのＲＧＤエピトープに相同なタンパク質、およびこの β３ サブユニットに結合することによってインテグリン−リガンド結合を阻害するモノクローナル抗体を開示している。その作用は、凝固のような、接着で開始されるヒト応答、および若干の炎症性応答の療法で有用であると言われている。
【０００７】
Carron, 米国特許第６，１７１，５８８号は、細胞接着、破骨細胞に媒介される骨再吸収、再狭窄、眼の新生血管形成および血管腫の増殖、並びに、新形成性細胞または腫瘍の増殖および播種のような、αｖβ３に媒介されるイベントを阻止する方法で用いることができるモノクローナル抗体を記載している。記載されている他の使用は、αｖβ３含有新生物および腫瘍関連血管床を破壊するかまたは死滅させるための治療薬の、抗体に媒介される標的指向および供給である。更に、この発明のモノクローナル抗体は、αｖβ３含有新生物または腫瘍関連血管床のＮＭＲまたはイムノシンチグラフィーによる可視化または画像化に用いることができる。
【０００８】
標的治療アプローチの例は、いろいろな特許公報および科学論文に記載されている。国際特許出願ＷＯ９３／１７７１５号は、腫瘍血管系関連抗原の認識によって充実性腫瘍塊の血管系に標的指向される診断薬または治療薬を有する抗体を記載している。国際特許出願ＷＯ９６／０１６５３号および米国特許第５，８７７，２８９号は、抗体を用いた凝固薬の部位特異的供給による、腫瘍血管系の in vivo 凝固のための方法および組成物を記載しているが、国際特許出願ＷＯ９８／３１３９４号は、凝固および腫瘍処置のための組織因子組成物の使用を記載している。国際特許出願ＷＯ９３／１８７９３号および米国特許第５，７６２，９１８号および同第５，４７４，７６５号は、血管内皮細胞に結合するポリアニオンポリマーに連結したステロイドを記載している。国際特許出願ＷＯ９１／０７９４１号および米国特許第５，１６５，９２３号は、腫瘍細胞に対する抗体に結合した、リシンＡのような毒素を記載している。米国特許第５，６６０，８２７号、同第５，７７６，４２７号、同第５，８５５，８６６号および同第５，８６３，５３８号も、腫瘍血管系を処置する方法を開示している。国際特許出願ＷＯ９８／１０７９５号および同ＷＯ９９／１３３２９号は、腫瘍ホーミング分子を記載しており、これは、腫瘍に薬物を標的指向させるのに用いることができる。
【０００９】
Tabata, et al., Int.J.Cancer 1999 82:737-42 では、抗体を用いて、増殖している血管に放射性同位体を供給している。Ruoslahti & Rajotte, Annu.Rev.Immunol. 2000 18:813-27; Ruoslhti, Adv.Cancer Res. 1999 76:1-20 は、血管形成性新生血管系に治療薬を標的指向させる戦略を概説しているが、Arap, et al., Science 1998 279:377-80 は、腫瘍血管床に標的指向するペプチドの選択を記載している。
【００１０】
このようなシステムで用いられる典型的な配置は、標的指向物質を単結合または比較的短い化学リンカーによって治療用物質に連結することであることに注目すべきである。このようなリンカーの例には、ＳＭＣＣ（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）または米国特許第４，８８０，９３５号に開示されたリンカー、およびオリゴペプチドスペーサーが含まれる。カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド試薬は、治療用物質および標的指向物質を適当な反応性化学基で直接的に連結するのに用いられてきている。
【００１１】
遺伝子治療法において異種遺伝子を供給するための陽イオン有機分子の使用が文献に報告されている。全ての陽イオン化合物が、ＤＮＡと複合体形成し且つ遺伝子導入を容易にするわけではないであろう。現在、基本的な戦略は、陽イオン分子の常套的スクリーニングである。過去に用いられてきた化合物のタイプには、ポリエチレンアミン、エチレンジアミンカスケードポリマーおよびポリブレンのような陽イオンポリマーが含まれる。実効陽電荷を有するポリリシンのようなタンパク質も用いられてきている。最大の化合物群である陽イオン脂質には、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−ｃｈｏｌおよびＤＯＳＰＡが含まれる。これら薬剤はいずれも、有効であると証明されているが、毒性および薬剤の製造費用のような潜在的な問題を抱えている。陽イオンリポソームは、現在、遺伝子トランスフェクション研究に最も普及しているシステムである。陽イオンリポソームは、ＤＮＡを分解から保護し、細胞に入るＤＮＡ量を増加させるという二つの機能を果たす。陽イオンリポソームがどのように機能するかを記載している機構は十分に説明されていないが、このようなリポソームは、in vitro および in vivo 双方の研究で有用であると証明されている。しかしながら、これらリポソームにはいくつか重要な限界がある。このような限界には、低いトランスフェクション効率、脂質の製造費用、ＤＮＡに複合体形成する場合の不十分なコロイド安定性、および毒性が含まれる。
【００１２】
比較的小さいリンカーによる治療用物質と標的指向物質の抱合体（conjugates）は、大いに注目されているが、大形粒子をリンカーとして用いることには、ほとんど注意が向けられていない。典型的には、このリンカーは、治療用物質と標的指向物質を連結するように単純に機能するので、リンカー性状の考察は、概して、連結した物質どうしの干渉を避けること、例えば、免疫グロブリンの抗原結合部位の連結点（linkage point）を避けることに集中している。
【００１３】
リポソームのような、生物学的に適合性のある物質の大形粒子集合は、薬物および常磁性造影剤の投与用担体として用いられてきている。米国特許第５，０７７，０５７号および同第５，２７７，９１４号は、水への溶解度が不十分な薬物の供給のための、規定サイズの粒子、具体的には、非プロトン性溶媒中に可溶性の脂質を有するリポソームまたは脂質粒子懸濁液の製造を示している。米国特許第４，５４４，５４５号は、予め選択された臓器にリポソームを一層特異的にさせるように修飾されたコレステロール誘導体が含まれている外層を有するリン脂質リポソームを示している。米国特許第５，２１３，８０４号は、薬物などの閉じこめられた薬剤を含有するリポソーム組成物を示しているが、これは、小胞形成性脂質と、親水性の生体適合性ポリマーで誘導体化され且つその生体分布および再循環半減期を調節するサイズに作られた１〜２０モル％の小胞形成性脂質とを含む。米国特許第５，２４６，７０７号は、タンパク質およびポリペプチドのような、閉じこめられた水溶性生体分子の放出速度を調節するための、生物活性物質のリン脂質で被覆された微結晶性粒子を示している。米国特許第５，１５８，７６０号は、ヘモグロビンのような、リポソームに被包された放射性標識タンパク質を示している。
【００１４】
米国特許第５，５１２，２９４号および同第６，０９０，４０８号および同第６，１３２，７６４号は、いろいろな生物学的用途のための重合リポソームの使用を記載している。これら特許、および本明細書中に挙げられる全ての他の特許および公報の内容は、本明細書中にそのまま援用される。一つ挙げられる態様は、限局処置の具体的な生物学的場所への指示される処置薬供給のために、治療的化合物（例えば、タンパク質、ホルモンまたは薬物）に連結されてよいまたはそれを被包してよい重合リポソームを標的指向させることである。リポソーム組成物を記載している他の公報には、米国特許第５，６６３，３８７号、同第５，４９４，８０３号および同第５，４６６，４６７号が含まれる。タンパク質および酵素の非共有結合固定のための重合脂質を含有するリポソームは、Storrs et al., "Paramagnetic Polymerized Liposomes: Synthesis, Characterization, and Applications for Magnetic Resonance Imaging," J.Am.Chem.Soc. (1995)117(28):7301-7306; および Storrs et al., "Paramagnetic Polymerized Liposomes as New Recirculating MR Contrast Agents," JMRI (1995)5(6):719-724 に記載されている。Wu et al., "Metal-Chelate-Dendrimer-Antibpdy Constructs for Use in Radioimmunotherapy and Imaging," Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1994)4(3):449-454 は、デンドリマー（dendrimer）を基剤とする化合物に関する公報である。
【００１５】
標的部位で必要な治療的作用をするのに十分な濃度を与えるための、生体内における治療薬の再循環への要求、すなわち、細網内皮系による速やかなエンドサイトーシスを免れることおよび腎臓による速やかな濾過を免れることは、理解されている。磁気共鳴造影剤での経験は、循環寿命に関する有用な情報を提供している。ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウムのような低分子量分子は、迅速な腎排出による限られた循環期間を有する傾向があるが、８００ｎｍを超える直径を有する大部分のリポソームは、細網内皮系によって速やかにクリアランスされる。これら問題を解決する試みは、ジエチレントリアミン五酢酸ガドリニウムに誘導される多糖、ポリペプチドおよびタンパク質などの巨大分子物質の使用を包含している。これら薬剤は、長い再循環期間および活性な標的指向の双方をもたらすための化学修飾の変化しやすさが達成されていない。
【００１６】
安定化
肝臓での迅速なクリアランスを免れるために、または他の安定化作用のために、ポリマー性化合物とリポソームの連結が記載されている。例えば、Dadey, 米国特許第５，９３５，５９９号は、リポソームを含有するポリマー連結リポソーム、および複数の陰イオン部分を塩の形で有するポリマーを記載した。このポリマーは、合成しても天然のものでもよい。このポリマー連結リポソームは、血管系内に長期間とどまる。
【００１７】
多糖は、ポリマー性安定化剤の一つのクラスである。Calvo Salve, et al., 米国特許第５，８４３，５０９号は、脂質−多糖複合体の形成によるコロイド系の安定化、および二つの成分、すなわち、水溶性で且つ陽電荷の多糖と、陰電荷のリン脂質との組み合わせを包含するコロイド系の製造法の開発を記載している。安定化は、アミノ多糖−リン脂質であるイオン複合体の界面における形成によって生じる。Calvo Salve, et al., によって利用された多糖には、キチンおよびキトサンが含まれる。
【００１８】
デキストランは、安定化する性質が研究されたもう一つの多糖である。Cansell, et al., J.Biomed.Mater.Res. 1999,44:140-48 は、デキストランまたは機能付加されたデキストランをコレステロールで疎水性にしたことを報告しているが、これがリポソーム形成中にリポソームの脂質二重層に固定されて、デキストランで被覆されたリポソームを生じる。これらリポソームは、培養中のヒト内皮細胞と特異的に相互作用した。Letourneur, et al., J.Controlled Release 2000,65:83-91 では、抗増殖性に機能付加されたデキストラン被覆リポソームを、血管平滑筋細胞への標的指向剤として用いた。Ullman, et al., Proc.Natl.Acad.Sci 91:5426-30(1994) および Ullman, et al., Clin.Chem. 42:1518-26(1996) は、ポリスチレンビーズのデキストランでの被覆、およびデキストラン−ポリスチレン複合体へのリガンド、核酸およびタンパク質の付着を記載している。
【００１９】
デキストランは、金属ナノ粒子を被覆するのにも用いられており、このようなナノ粒子は、主に撮像剤として用いられている。例えば、Moore, et al., Radiology 2000,214:568-74 は、齧歯類動物モデルにおいて、長期循環性のデキストランで被覆された酸化鉄ナノ粒子が、腫瘍細胞によって選択的に取り込まれたが、腫瘍関連マクロファージによっても、そしてはるかに少ない程度であるが、血管形成部位の内皮細胞によっても取り込まれたことを報告している。Groman, et al., 米国特許第４，７７０，１８３号は、撮像剤として用いるための１０〜５０００Åの超常磁性金属酸化物粒子を記載している。これら粒子は、デキストランまたは他の適当なポリマーで被覆されて、粒子の取り込みおよび標的器官内の滞留時間の双方を最適にすることができる。患者の血流中に注入されるデキストラン被覆酸化鉄粒子は、例えば、肝臓内に局在する。Groman, et al.は、デキストラン被覆粒子が、がん細胞中への取り込みより少ないが、健康な細胞によって選択的に吸収されることがあり得ることも報告している。
【００２０】
画像化
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、Ｘ線とは異なり、電離線を伴わない画像化技術である。ＭＲＩは、例えば、軸面、冠状面、矢状面または垂直面などのいろいろな走査パネルで身体の横断面画像を生じるのに用いることができる。ＭＲＩは、磁場、高周波エネルギーおよび磁場勾配を用いて、身体の画像を作る。組織間のコントラストまたはシグナル強度差は、主として、それら組織のＴ１（縦）およびＴ２（横）緩和値およびプロトン密度を反映している。造影剤の使用によって患者のある領域のシグナル強度を変化させるために、いくつか可能なアプローチが利用できる。例えば、造影剤は、Ｔ１か、Ｔ２かまたはプロトン密度を変化させるように設計することができる。
【００２１】
概して言えば、ＭＲＩは造影剤の使用を必要とする。造影剤を用いることなくＭＲＩを行った場合、得られた画像において目的の組織を周囲組織から区別するのは難しいかもしれない。かつては、主として、ＭＲＩ用の常磁性造影剤に注意が向けられていた。常磁性造影剤は、不対電子を含有する物質を含む。これら不対電子は、主要磁場内で小さい磁石として作用して、縦（Ｔ１）および横（Ｔ２）緩和速度を増加させる。常磁性造影剤は、典型的に、不対電子源を与える金属イオン、例えば、遷移金属イオンを含む。しかしながら、これら金属イオンは、概して、きわめて毒性でもある。例えば、フェライトは、しばしば、経口投与後の悪心、更には、膨満および血清鉄の一時的上昇の症状を引き起こす。ガドリニウムイオンは、複合体形成してＧｄ−ＤＴＰＡになるが、遊離型ではきわめて毒性である。増加した胃内酸性度（より低いｐＨ）および増加した腸内アルカリ性度（より高いｐＨ）を含めた胃腸管の様々な環境は、この複合体からの遊離イオンの脱共役および分離の可能性を増加させるかもしれない。毒性を低下させる努力において、典型的には、金属イオンをリガンドでキレート化させる。
【００２２】
超音波は、例えば、組織微小血管系などの血管系を含めた身体のいろいろな部位を研究するためのもう一つの有効な診断用画像化技術である。超音波は、他の診断技術にまさる若干の利点を与える。例えば、核医学およびＸ線を伴う診断技術は、概して、電離電子線への患者の曝露を行う。このような放射線は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびタンパク質を含めた細胞下物質に損傷を引き起こすことがありうる。超音波は、このような潜在的に損傷を与える放射線を伴わない。更に、超音波は、精巧で且つ高価な装置を必要とするＣＴおよびＭＲＩを含めた他の診断技術に相対して費用がかからない。
【００２３】
超音波は、音波への患者の曝露を行う。概して、音波は、体組織による吸収のために消散し、組織を介して透過し、または組織から反射する。組織からの音波の反射は、概して、後方散乱または反射能として論及されるが、これは、超音波画像を生じるための基礎を形成している。これに関連して、音波は、異なった体組織から示差的に反射する。この示差的反射は、観察されている具体的な組織の構成成分および密度を含めたいろいろな因子のためである。超音波は、概して、１〜１０メガヘルツ（ＭＨｚ）の周波数を有する音波を検出することができる変換器での、示差的に反射する波の検出を行う。検出される波は、画像にまとめることができ、これを定量し、そして定量された波を、研究されている組織の画像に変換する。
【００２４】
上述の診断技術の場合と同様、超音波は、概して、造影剤の使用も伴う。代表的な造影剤には、例えば、固体粒子の懸濁液、乳化した液体粒子および気体封入バブルが含まれる（例えば、Hilmann et al., 米国特許第４，４６６，４４２号および公開された国際特許出願ＷＯ９２／１７２１２号および同ＷＯ９２／２１３８２号を参照されたい）。Widder et al.の公開された出願ＥＰ−Ａ−０３２４９３８号は、熱変性性の生体適合性タンパク質、例えば、アルブミン、ヘモグロビンおよびコラーゲンから製造される安定化されたミクロバブル型超音波撮像剤を開示している。
【００２５】
液体−気体界面からの音の反射は、極めて有効である。したがって、気体封入バブルを含めたリポソームまたは小胞は、造影剤として有用である。以下で更に十分考察するように、造影剤としてのリポソームの有効性は、例えば、バブルのサイズおよび／または弾性を含めたいろいろな因子に依存する。
【００２６】
先行技術で開示されたリポソームの多くは、望ましくない不十分な安定性を有する。したがって、先行技術リポソームは、in vivo で破裂して、例えば、その中に含有される治療薬および／または診断薬の時期尚早の放出を引き起こす可能性がある。様々な研究が、リポソーム安定性を改善する試みで行われてきた。このような研究には、例えば、膜またはその壁が、アルブミンのようなタンパク質を含んでいるリポソーム、または架橋によって明らかに強化されている物質の製造が含まれている。例えば、生分解性架橋剤で架橋されたタンパク質を含むリポソームが開示されている、Klaveness et al., ＷＯ９２／１７２１２号を参照されたい。紹介は、Moseley et al. によって、1991 Napa, California meeting of the Society for Magnetic Resonance in Medicine で行われたが、これは、"Microbubbles: A Novel MR Susceptibility Contrast Agent." という表題でアブストラクトに要約されている。Moseley et al. によって記載されたミクロバブルは、ヒトアルブミンのシェルで被覆された空気を含む。或いは、膜は、タンパク質ではない化合物であるが、生体適合性化合物と架橋されている化合物を含むことができる。例えば、Klaveness et al., ＷＯ９２／１７４３６号、ＷＯ９３／１７７１８号およびＷＯ９２／２１３８２号を参照されたい。
【００２７】
外膜でのタンパク質の使用を含めた、リポソームを安定化する先行技術技法には、様々な欠点がある。アルブミンのようなタンパク質の膜中での使用は、それらバブルの壁に剛性を与えることがありうる。これは、弾性を生じたバブルを生じ、したがって、変形し且つ細管を通過する能力を低下させる。したがって、タンパク質を含む先行技術造影剤では、血管が閉塞する可能性が一層大きい。
【発明の開示】
【００２８】
発明の要旨
本発明は、標的指向物質、治療用または処置用物質および連結用担体を含む、治療剤および撮像剤に関する。本発明の好ましい薬剤は、脂質構築物、小胞、リポソームまたは重合リポソームを含む。治療用または処置用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によって連結用担体と連結させることができる。ある場合には、この治療用または処置用物質は、放射性同位体、化学療法剤、プロドラッグまたは毒素である。好ましくは、この薬剤は、治療剤または撮像剤に追加の利点を与える安定化用物質を更に含む。この安定化用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によってこの薬剤と連結させることができる。好ましくは、この安定化用物質はデキストランであり、好ましくは、これが、共有結合手段または非共有結合手段によって薬剤の表面上にコーティングを形成する。最も好ましい態様において、連結用担体は小胞である。この連結用担体は、慣用的な連結方法によっては与えられない追加の利点をこれら治療剤に与える。
【００２９】
また、本発明は、標的指向物質、撮像用物質、安定化用物質、および場合により連結用担体を含む、血管標的撮像剤に関する。更に、本発明は、標的指向物質、検出用物質、安定化用物質、および場合により連結用担体を含む診断薬に関する。
【００３０】
また、本発明は、上述の治療剤および撮像剤の製造方法に関する。
また、本発明は、本発明の治療剤を含む治療用組成物に関する。
また、本発明は、本発明の治療剤を利用した処置方法に関する。
【００３１】
また、本発明は、本発明の撮像剤を含む撮像用組成物に関する。
また、本発明は、がんを診断する方法を含めた、本発明の撮像剤を利用する方法に関する。
【００３２】
また、本発明は、診断用アッセイで用いるための方法および試薬に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、安定化された治療剤および撮像剤に関し、この例は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄに図示されているが、これら薬剤は、脂質構築物１０、安定化剤１２、標的指向物質１４、および／または治療用または処置用物質１６を含む。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、標的指向物質および／または治療用物質は、脂質構築物または安定化用物質と連結することができる。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄは、治療剤または標的指向剤を含む例を示しているが、本発明の薬剤は、治療用物質、標的指向物質または双方を含有してよい。更に、この治療用物質は、脂質構築物中に被包されていても、脂質構築物または安定化剤の表面と連結していてもよい。
【００３４】
本明細書中で用いられる「脂質構築物」は、脂質、リン脂質、またはそれらの誘導体を含有する構造であり、この誘導体は、水性懸濁液中でとることが知られている種々の異なった構造配置を含む。これら構造には、脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルジョン、脂質リボンまたはシートが含まれるが、これらに限定されるわけではなく、これら構造は、薬学的に許容しうることが知られているいろいろな薬物および成分と複合体形成していてよい。好ましい態様において、この脂質構築物はリポソームである。通常のアジュバントには、特に、コレステロールおよびα−トコフェロールが含まれる。これら脂質構築物は単独で用いてもよいし、または具体的な用途に望まれる特性を与えることを当業者が認識していると考えられるいずれかの組み合わせで用いてもよい。更に、脂質構築物、小胞およびリポソーム形成の技術的側面は、当該技術分野において周知であり、この分野で通常実施されるいずれの方法も、本発明に用いることができる。治療用または処置用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によって薬剤と連結することができる。好ましくは、この薬剤は、慣用的な安定化用物質によっては与えられない追加の利点を治療剤または撮像剤に与える安定化用物質を更に含む。この安定化用物質は、共有結合手段または非共有結合手段によって薬剤と連結することができる。本明細書中で用いられる連結するとは、共有結相互作用合または非共有結合相互作用によって付着する意味である。安定化用物質が薬剤といったん連結すると、この薬剤は、「安定化された薬剤」と称されてよいし、または用いられる脂質構築物のタイプに依存したより具体的な様式では、すなわち、「安定化されたリポソーム」または「安定化された重合リポソーム」と称されてよい。
【００３５】
治療用物質
「治療用物質」という用語は、処置される対象に治療効果を有するいずれかの分子、分子集合体または巨大分子を意味し、ここで、治療対象は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「治療効果」という用語は、疾患状態を後退させる効果、疾患状態を停止させる効果、疾患状態の進行を遅らせる効果、疾患状態を改善する効果、疾患状態の症状を軽減する効果、または処置される対象に有益な他の結果を有する効果を意味する。治療用物質には、ドキソルビシンおよび他の化学療法剤のような薬物；低分子治療薬、リシンのような毒素；放射性同位体；細胞毒性を示すタンパク質をコードしている遺伝子、およびプロドラッグ（不活性型で体内に導入され、そして現場で活性化される薬物）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。治療用物質として有用な放射性同位体は、Kairemo, et al., Acta Oncol. 35:343-55 (1996) に記載されており、Ｙ−９０、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｂｉ−２１３、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｐｒ−１４２、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｈｏ−１６６、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｕ−１５２、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８が含まれる。
【００３６】
リポソーム
本明細書中で用いられる脂質とは、分子の疎水性部分が水性相から引き離されている組織化された構造を水中で自発的にとるようにさせる両親媒性を示す物質を意味する。本発明のこの意味での脂質は、脂肪または脂肪性物質の特徴に似た特徴を有するいずれかの物質である。原則として、このタイプの分子は伸長した無極性領域を有し、大部分の場合、水溶性で極性の親水性基である、いわゆるヘッド基も有する。リン脂質は、細胞膜の主要構成成分である脂質である。典型的なリン脂質親水性基には、ホスファチジルコリン部分およびホスファチジルエタノールアミン部分が含まれるが、典型的な疎水性基には、ジアチセレンを含めた種々の飽和および不飽和脂肪酸部分が含まれる。水中のリン脂質混合物は、用いられる条件に依存してリン脂質分子を自発的に組織化させて、種々の特徴的な相になる。これらには二重層構造が含まれるが、この場合、リン脂質の親水性基は、二重層の外側で水と相互作用し、疎水性基は、二重層の内側の隣接した分子上の類似の基と相互作用する。このような二重層構造は、全く安定であり、細胞膜の主要な基礎を形成することができる。
【００３７】
二重層構造は、小胞またはリポソームと称される密閉した球状のシェル様構造に形成されることもできる。本発明で用いられるリポソームは、種々の慣用的なリポソーム製造技術のいずれか一つを用いて製造することができる。当業者に容易に明らかであるように、このような慣用的な技法には、超音波処理、キレート透析、ホモジナイゼーション、押出と共役する溶媒注入、凍結融解押出、ミクロ乳化、及びその他が含まれる。これら技法及びその他は、例えば、米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願Ｇ．Ｂ．２１９３０９５Ａ号、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号、Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol.858, pp.161-168 (1986)、Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol.812, pp.55-65 (1985)、米国特許第４，５３３，２５４号、Mahew et al., Methods In Enzymology, Vol.149, pp.64-77 (1987)、Mahew et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol.75, pp.169-174 (1984)、および Cheng et al., Investigative Radiology, Vol.22, pp.47-55 (1987)、および１９８９年１０月２７日出願の米国出願第４２８，３３９号に考察されている。前述の各特許、出版物および特許出願の開示は、本明細書中にそのまま援用される。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号または１９８９年１０月２７日出願の米国出願第４２８，３３９号に記載されたものと似た無溶媒系は、リポソーム構築を行うのに用いることができる。これら手順に従うことにより、気体前駆物質または固体若しくは液体のコントラスト増強剤が中に被包されているリポソームを製造することができる。
【００３８】
本発明のリポソームを製造する場合に利用することができる材料には、リポソーム構築に適当であると当業者に知られているいずれかの物質またはそれらの組み合わせが含まれる。用いられる脂質は、天然由来でも合成由来でもよい。このような材料には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールを含めたヘッド基を有する脂質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。他の脂質には、リゾ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、グルコリピド、糖脂質、スルファチド、アミド含有脂質、エーテルおよびエステル連結脂肪酸、重合性脂質、並びにそれらの組み合わせが含まれる。更に、リポソームには、コレステロールのような親油性化合物が含まれてよい。当業者が理解するように、これらリポソームは、導入される糖脂質、複合糖質、タンパク質または合成ポリマーの非存在下または存在下において、慣用法を用いて合成することができる。リポソームの表面は、当業者に容易に明らかな手順を用いて、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーで修飾することもできる。脂質は、金属への付着のための表面官能基を含有してよく、これは、放射性同位体、または治療用物質として役立つ他の材料をキレート化させる。いずれの種の脂質も、この脂質または脂質の組み合わせおよびその脂質マトリックス中に導入される関連材料が、生理学的に妥当な条件下で二重層を形成するべきであるという唯一の条件で用いることができる。当業者が理解するように、これらリポソームの組成は、得られるリポソームの生体分布およびクリアランスを調節するように変更することができる。
【００３９】
これら構造中の膜二重層は、典型的には、水性容量を被包し、そしてその被包された容量と外部溶液との間に透過障壁を形成する。水溶液中に分散した脂質は、内向きの炭化水素テイルと、水と相互作用するように外向きの極性ヘッド基とで、自発的に二重層を形成する。混合物の簡単な撹拌は、通常、直径１〜１０μｍ（１０００〜１０，０００ｎｍ）のタマネギ様形態の多数の二重層を有する構造である多重膜小胞（ＭＬＶ）を生じる。これら構造の超音波処理、または当該技術分野において公知の他の方法は、平均直径約３０〜３００ｎｍの単膜小胞（ＵＶ）を形成する。しかしながら、５０〜２００ｎｍの範囲が、例えば、in vivo の最大循環時間の見地から最適であると考えられる。実際の平衡直径は、主に、用いるリン脂質の性質およびコレステロールのような他の脂質の導入の程度によって決定される。リポソームの標準的な形成方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、リポソームの商業的製造方法は、Ronald C. Gamble の米国特許第４，７５３，７８８号および Kevin R. Bracken の米国特許第４，９３５，１７１号に記載されている。
【００４０】
ＭＬＶかまたはＵＶとしてのリポソームは、動物およびヒトにおける薬物送達用ビヒクルとして有効であると証明されている。低分子量親水性分子およびポリペプチドを含めた活性な薬物は、リポソームの水性コア中に捕捉することができるが、疎水性物質は、リポソーム膜中に溶解させることができる。放射性同位体は小胞の表面に付着させ、同位体−キレート剤複合体は小胞の内部に被包させることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡのような他の分子は、遺伝子治療用途のリポソームの外側に付着させることができる。このリポソーム構造は、容易に注射することができるし、徐放性及び特定の細胞タイプまたは身体部分への薬物送達の両方について基礎を形成することができる。ＭＬＶは、主に比較的大きいという理由で、通常は、細網内皮系（肝および膵臓）によって速やかに取り込まれる。本発明は、典型的には、循環系に何時間もとどまり且つ標的細胞による内部移行後に分解される小胞を利用する。これら必要条件のために、製剤は、直径が好ましくは２００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満のＵＶを利用する。
【００４１】
連結用担体
「連結用担体」という用語は、（Ａ）治療用物質および標的指向物質を連結するのに役立ち、しかも（Ｂ）単に治療用物質および標的指向物質をきわめて接近した状態にしておく以外に、血管標的治療剤に追加の好都合な性状を与えるいずれかの物質を意味する。これら追加の利点の例には、（１）多価性であって、（ｉ）複数の治療用物質を、標的治療剤に付着させる（すなわち、数単位の同じ治療用物質、または１単位以上の異なった治療用物質）能力であって、標的部位に送達される治療用物質の有効な「ペイロード」を増加させる能力；（ii）複数の標的指向物質を、標的治療剤に付着させる（すなわち、１単位以上の異なった治療用物質、または好ましくは、数単位の同じ標的指向物質）能力；または（iii）この文の項目（ｉ）および項目（ii）双方として定義されるもの；並びに（２）細網内皮系による比クリアランス速度を達成するように粒子サイズを調整することを含むことができる改善された循環寿命、が含まれるがこれらに限定されるわけではない。治療用物質の有効なペイロードは、標的への薬剤の結合イベントあたりの標的部位に送達される治療用物質の数である。このペイロードは、具体的な治療用物質および標的に依存するであろう。ある場合には、ペイロードは、薬剤の結合イベントあたりの送達される分子が約１個程度と少ないであろう。金属イオンの場合、ペイロードは、結合イベントあたりの送達される分子が約１〜１０３個であり得る。ペイロードは、結合イベントあたりの送達される分子が１０４個程度に高いことがあり得ると考えられる。ペイロードは、結合イベントあたり約１〜約１０４個分子であり得る。
【００４２】
好ましい連結用担体は、生体適合性ポリマー（デキストランなど）または生体適合性成分の巨大分子集合体（リポソームなど）である。連結用担体の例には、リポソーム、重合リポソーム、他の脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、キャップ付きポリリジン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、デキストランおよび被覆ポリマーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい連結用担体は、重合リポソームである。重合リポソームは、米国特許第５，５１２，２９４号に記載されている。他の好ましい連結用担体は、デンドリマーである。
【００４３】
この連結用担体は、関与する具体的な化学に依り、いろいろな方法で標的指向物質および治療用物質にカップリングさせることができる。このカップリングは、共有結合でも非共有結合でもよい。連結用担体への標的指向物質および治療用物質のカップリングに適したいろいろな方法は、Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press: New York, 1996；および S. S. Wrong による "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", CRC Press, 1993 に見ることができる。具体的なカップリング方法には、２機能リンカーの使用、カルボジイミド縮合、ジスルフィド結合形成、および特異的結合対の使用であって、結合対の一方のメンバーが連結用担体上にあり且つその対のもう一つのメンバーが治療用物質または標的指向物質上にあるもの、例えばビオチン−アビジン相互作用、が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００４４】
重合リポソームは、粒子サイズおよび表面化学に十分な可変性を与える脂質分子の自己集合凝集体である。重合リポソームは、本明細書中にそのまま援用される米国特許第５，５１２，２９４号および第６，１３２，７６４号に記載されている。重合性脂質の疎水性テイル基は、紫外線または他のラジカル性、陰イオン性または陽イオン性の開始種に曝露された場合、不可逆的に架橋するまたは重合するジアセチレン基のような重合性基で誘導体化されるが、リポソーム表面における官能基の分布は維持される。得られる重合リポソーム粒子は、細胞膜または他のリポソームとの融合に対して安定化され且つ酵素分解に対して安定化されている。重合リポソームのサイズは、押出または当業者に公知の他の方法によって調節することができる。重合リポソームは、重合性脂質を含んでいてもよいが、飽和脂質および非アルキン不飽和脂質を含んでいてもよい。重合リポソームは、親水性の露出表面上に異なった官能基を与える脂質混合物であり得る。例えば、若干の親水性ヘッド基は、表面官能基、例えば、ビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、α−ハロカルボニル化合物、α，β−不飽和カルボニル化合物およびアルキルヒドラジンを有することができる。これらの基は、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、核酸またはそれらの組み合わせなどの標的指向物質を付着させて、所望の細胞表面分子へ特異的に標的指向し且つ付着させるために、および薬物、治療効果を有する遺伝子をコードする核酸または放射性同位体などの治療用物質を付着させるために用いることができる。他のヘッド基は、重合リポソーム粒子が付着する特定の生体分子またはその付近にある生体部位との相互作用のために、例えば抗体、ホルモンおよび薬物などの付着されたまたは被包された治療用物質を有していてよい。他の親水性ヘッド基は、放射性同位体、または治療用物質として役立つ他の物質をキレート化させる金属へ付着させるために、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジニトリル四酢酸、テトラアゾシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ポルホリイン（porphoryin）キレートおよびシクロヘキサン−１，２−ジアミノ−Ｎ，Ｎ’−ジアセテート並びにこれら化合物の誘導体の表面官能基を有することができる。キレート化用ヘッド基を有する脂質の例は、本明細書中にそのまま援用される、米国特許第５，５１２，２９４号に記載されている。
【００４５】
標的表面へのin vivo接着のために数種類〜約１０００種類の標的指向物質を有していてもよい１つの重合リポソームに、きわめて多数の治療用物質を付着させることができる。複数の標的指向物質によってもたらされる改善された結合は、in vivoで内皮細胞受容体への細胞接着を治療的に阻止するのに利用することもできる。これら受容体を遮断することは、炎症および転移性がんの制御のような病理学的過程を制御するのに有用であり得る。例えば、多価シアリルLewis Ｘ誘導体リポソームは、好中球結合を阻止するのに用いることができ、重合リポソーム上のＶＣＡＭ−１に対する抗体は、リンパ球結合、例えば、Ｔ細胞を阻止するのに用いることができる。
【００４６】
重合リポソーム粒子は、非特異的接着および細網内皮系の取り込みを制御する基を含有することもできる。例えば、リポソームのＰＥＧ化は、循環寿命を延長させることが分かっている。国際特許出願ＷＯ９０／０４３８４号を参照されたい。
【００４７】
重合リポソームの成分脂質は、標準的な公知の技法を用いて個々に精製し且つ特性決定し、その後、制御された様式で組み合わせて、最終粒子を生ずることができる。これら重合リポソームは、天然細胞膜を模擬するように、またはエチレングリコール誘導体のような、それらの潜在的な免疫原性を低下させることができる機能性を示すように構築することができる。更に、これら重合リポソームは、透過型電子顕微鏡検査および原子力顕微鏡検査などの公知の物理的技法によって特性決定することができる明確な二重層構造を有する。
【００４８】
安定化用物質
本発明の薬剤は、好ましくは安定化用物質を含有する。本明細書中で用いられる「安定化」とは、治療剤または撮像剤に追加の利点、例えば、物理的安定性、すなわち、より長い半減期、コロイド安定性および／または多価の容量、すなわち、多数の標的指向物質付着部位のために増加したペイロード容量を付与する能力を意味する。本明細書中で用いられる「安定化用物質」とは、巨大分子またはポリマーを意味し、場合により、小胞表面へ安定化用物質を連結させるため、および／または治療用物質または標的指向剤を続いて連結させるための化学的機能性を含有していてもよい。このポリマーは、水溶液と生体適合性であるべきである。本発明のリポソームを安定化させるのに有用なポリマーは、天然由来、半合成由来（修飾された天然由来）または合成由来であってよい。本発明で用いることができる多数の安定化用物質が入手可能であり、これらにはキサンタンガム、アカシア、アガー、アガロース、アルギン酸、アルギネート、アルギン酸ナトリウム、カラゲナン、ゼラチン、グアーガム、トラガカントゴム、イナゴマメ、バソリン、カラヤ、アラビアゴム、ペクチン、カゼイン、ベントナイト、未精製ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマおよびコロイド状ベントナイトが含まれる。
【００４９】
他の天然ポリマーには、天然の多糖、例えば、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えば、イヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラクトカロロース、ペクチン酸、アミロースを含めたペクチン類、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストロース、デキストリン、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、デンプン、および以下の１種類以上のアルドース、ケトース、酸またはアミン（エリスロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリスルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸）を含有するような種々の他の天然ホモポリマーまたはヘテロポリマー、並びにそれらの天然の誘導体などが含まれる。他の適当なポリマーには、アルブミンなどのタンパク質、ポリアルギネート、およびポリラクチド−グリコリドコポリマー、セルロース、セルロース（微結晶性）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムが含まれる。
【００５０】
代表的な半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースおよびメトキシセルロースが含まれる。本発明で用いるのに適した他の半合成ポリマーには、カルボキシデキストラン、アミノデキストラン、デキストランアルデヒド、キトサンおよびカルボキシメチルキトサンが含まれる。
【００５１】
代表的な合成ポリマーには、ポリ（エチレンイミン）および誘導体、ポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール、ＢＡＳＦ（Parsippany, N.J.）から市販されているPluronics（登録商標）と称される化合物クラス、ポリオキシエチレンおよびポリエチレンテレフタレートなど）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコールなど）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニルおよびポリビニルピロリドンなど）、ナイロンを含めたポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素ポリマー、フッ素化炭素ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレンなど）、アクリレート、メタクリレートおよびポリメチルメタクリレートおよびそれらの誘導体、ポリソルベート、カルボマー９３４Ｐ、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、モノステアリン酸アルミニウム、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、ポリエチレングリコール、並びにプロピレングリコールが含まれる。ポリマーを用いて小胞組成物を安定化させる小胞製造方法は、本明細書中にその開示がそのまま援用される、Unger, 米国特許第５，２０５，２９０号に記載され且つ論及されたような、当該技術分野において公知の情報を一緒にした場合、本開示を考慮すると、当業者に容易に明らかであろう。
【００５２】
好ましい態様において、安定化用物質はデキストランである。他の好ましい態様において、安定化用物質は、アミノデキストランなどの修飾デキストランである。更に好ましい態様において、安定化用物質は、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）である。理論によって拘束されることなく、デキストランは、リポソームの循環時間をＰＥＧに類似した方式で増加できると考えられる。更に、各々のポリマー鎖（すなわち、アミノデキストランまたはスクシニル化アミノデキストラン）は、多数の標的指向剤付着部位を含有して、脂質構築物全体のペイロードを増加させる能力を与える。ペイロードを増加させるこの能力は、本発明の安定化剤をＰＥＧと区別する。ＰＥＧには、付着部位がたった１つしかないので、ＰＥＧ（１本鎖あたり１つの付着部位を有する）の標的指向剤負荷容量は、複数の付着部位を有するポリマー系に相対して制限される。
【００５３】
他の好ましい態様では、以下のポリマーおよびそれらの誘導体が用いられる。ポリ（ガラクツロン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸−Ｌ−チロシン）、ポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸］、ポリ（イノシン酸カリウム塩）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エタノールスルホン酸ナトリウム塩）、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルポリピロリドン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド）、ポリ（ラクチド−コグリコリド）およびヒアルロン酸。他の好ましい態様では、小胞または他の分子へコポリマーを付着させるために、少なくとも１つの反応性部位、好ましくは複数の反応性部位を有するモノマーを含めたコポリマー。
【００５４】
いくつかの態様において、ポリマーは、標的指向剤、治療用物質、タンパク質、またはＤＴＰＡおよびその誘導体のようなキレート剤を付着させるために、ヘテロ−またはホモ２官能性連結剤として作用することができる。
【００５５】
１つの態様において、安定化用物質は、共有結合手段によって小胞と連結している。他の態様において、安定化用物質は、非共有結合手段によって小胞と連結している。標的指向物質をリポソームに付着させる共有結合手段は、当該技術分野において公知であり、実施例の項に記載されている。
【００５６】
標的指向物質をリポソームに付着させる非共有結合手段には、水分子若しくは他の溶媒によって媒介される相互作用を含めた、イオン性、水素結合相互作用、疎水性相互作用、またはこれらのいずれかの組み合わせによる付着が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５７】
好ましい態様において、安定化剤はリポソームのコーティングを形成する。
標的指向物質
「標的指向物質」という用語は、生物学的標的に特異的に結合する分子、巨大分子または分子集合体を意味する。標的指向物質の例には、抗体（抗体に由来するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖなどの、特異的結合を保持する抗体フラグメントおよび他の抗体由来分子を含む）；受容体に特異的に結合するホルモンまたは他の分子などの受容体結合性リガンド；細胞機能に影響を与え且つ免疫、炎症または造血応答に関連した細胞間の相互作用を調節するポリペプチドであるサイトカイン；酵素阻害剤などの酵素に結合する分子；核酸リガンドまたはアプタマー、並びにビオチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンのような特異的結合相互作用の１種類以上のメンバーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい標的指向物質は、血管細胞上で見出される受容体または抗原に特異的に結合する分子である。より好ましいのは、血管形成性新生血管系の細胞上で見出される受容体、抗原またはマーカー、または腫瘍血管系に関連した受容体、抗原またはマーカーに特異的に結合する分子である。腫瘍血管系に関連したこれら受容体、抗原またはマーカーは、腫瘍内に入り込んだ若しくは位置している、または腫瘍の内側周辺若しくは外側周辺に限定されている血管の細胞上で発現することができる。１つの態様において、本発明は、腫瘍血管床からの既存のまたは誘発される漏出を利用するが；この態様の場合、腫瘍細胞抗原を、循環から腫瘍間隙容量中に通過する薬剤を用いて直接的に標的指向させることもできる。
【００５８】
他の標的指向物質は、内皮受容体、組織、または体液若しくは受容体を介して接近可能な他の標的、または体液に隣接するか或いは体液中の組織内若しくは細胞内でアップレギュレートされた他の標的を指向する。例えば、眼に薬物を送達するように設計された担体に付着された安定化用物質は、硝子体、脈絡膜または強膜中に注射することができ；関節に薬物を送達するように設計された担体に付着された標的指向剤は、滑液中に注射することができる。
【００５９】
重合リポソームまたは連結用担体に付着させる本発明の標的指向物質には、炭水化物のような低分子量分子リガンド、および米国特許第５，７９２，７８３号に開示されたような化合物（低分子量分子リガンドは、約１０００ダルトン以下の分子量を有する有機分子として定義されており、血管標的または血管細胞マーカーのリガンドとして役立つ）；抗体および成長因子などのタンパク質；ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、米国特許第５，８６６，５４０号に記載のもの）、ボンベシンまたはガストリン放出性ペプチドなどのペプチド、米国特許第５，４０３，４８４号に記載されるようなファージディスプレイ技術によって選択されるペプチド、および腫瘍発現受容体に相補的であるように de novo 設計されたペプチド；抗原決定基；または他の受容体標的指向基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらヘッド基は、重合リポソームの生体分布、非特異的接着および血液プール半減期を調節するのに用いることができる。例えば、β−Ｄ−ラクトースは、循環している血液プールと接触している肝細胞中に見出されるアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧ）に標的指向するように、表面上に付着されている。糖脂質は、標的指向物質として用いるために、市販の脂質（ＤＡＧＰＥ）またはＰＥＧ−ＰＤＡアミンをそのイソシアネートに変換後、トリエチレングリコールジアミンスペーサーで処理して、アミン末端チオカルバメート脂質を生じ、これを、炭水化物リガンドのパライソチオシアノフェニルグリコシドで処理することにより、所望の標的指向糖脂質を生じることによって誘導体化することができる。この合成は、リポソームの内部構造またはコアを形成する脂質と、細胞表面受容体に結合するリガンドとの間に間隔を置いた水溶性の可変性スペーサー分子を提供して、そのリガンドが、細胞表面上のタンパク質受容体に容易に接近可能であるようにする。これら炭水化物リガンドは、還元糖またはパラニトロフェニルグリコシドのようなグリコシドから誘導することができるが、その広範囲のものが、市販されているか、または化学的または酵素的方法を用いて容易に構築される。炭水化物リガンドで被覆された重合リポソームは、適当量の個々の脂質を混合後、上記のように、超音波処理、押出および重合および濾過を行うことによって製造することができる。適当な炭水化物を誘導体化した重合リポソームは、約１〜約３０モル％の標的指向糖脂質およびＰＤＡ、ＤＡＰＣまたはＤＡＰＥなどの充填用脂質を有し、その残余は金属キレート化脂質である。他の脂質を重合リポソーム中に含み、リポソーム形成を確実にし且つ高度のコントラストおよび再循環を与えてもよい。
【００６０】
ある態様において、標的指向物質は、リポソームを細胞表面に指向させる。治療剤または撮像剤の送達は、これらリポソームのエンドサイトーシスによって起こり得る。このような送達は、当該技術分野において公知である。例えば、Mastrobattista, et al., Immunoliposomes for the Targeted Delivery of Antitumor Drugs, Adv. Drug Del. Rev. (1999) 40:103-27 を参照されたい。
【００６１】
好ましい態様において、標的指向物質は、安定化用物質に付着される。１つの態様において、この付着は共有結合手段による。他の態様において、この付着は非共有結合手段による。例えば、抗体標的指向物質は、ビオチン−アビジン結合でビオチン化抗体をサンドイッチすることによって付着され、いろいろな市販のビオチン化抗体を被覆重合リポソーム上で用いることを可能にする。本発明で用いる具体的な血管系の標的指向剤には、抗ＶＣＡＭ−１抗体（ＶＣＡＭ＝血管細胞接着分子）；抗ＩＣＡＭ−１抗体（ＩＣＡＭ＝細胞間接着分子）；抗インテグリン抗体（例えば、国際特許出願ＷＯ８９／０５１５５号および Cheresh et al., J. BIol. Chem. 262:17703-11 (1987) に記載のＬＭ６０９、および国際特許出願ＷＯ９８／３３９１９号および Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6037-42 (1998) に記載の Vitaxin などの、αｖβ３インテグリンに対する抗体）；並びにＰ−およびＥ−セレクチン、プレイオトロピンおよびエンドシアリン、エンドグリン、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＭＭＰ、および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対する抗体が含まれる（これらに限定されるわけではない）。追加の標的は、E.Ruoslahti により、Nature Reviews: Cancer, 2,83-90 (2002) に記載されている。
【００６２】
本発明の１つの態様において、血管標的治療薬は、腫瘍細胞を直接指向する薬剤と組み合わされる。この態様は、腫瘍を取り囲む新生血管系が、しばしば、きわめて透過性または「漏出性」であり、腫瘍を取り囲む間隙空間中に血流から物質を直接的に通過させるという事実を利用している。或いは、血管標的治療剤自体が、腫瘍血管系に透過性をもたらすことができる。例えば、薬剤が放射性の治療用物質を有する場合、血管組織に結合し且つその組織に照射することで、血管内皮の細胞死が結果として起こり、血管系の完全さが危うくなるであろう。
【００６３】
したがって、１つの態様において、血管標的治療剤は、２つの標的指向物質、すなわち、血管マーカーを指向する標的指向物質および腫瘍細胞マーカーを指向する標的指向物質を有する。他の態様において、抗腫瘍剤は、血管標的治療剤と一緒に投与される。この抗腫瘍剤は、血管標的治療剤と同時に、または血管標的治療剤の投与に引き続いて投与することができる。具体的には、血管標的治療剤が、腫瘍部位の血管の完全さを危うくすることに依拠する場合、抗腫瘍剤の投与は、好ましくは、腫瘍血管系の最大損傷地点で行われる。
【００６４】
この抗腫瘍剤は、シスプラチンのような慣用の抗腫瘍療法；抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（例えば、Herceptin）のような腫瘍マーカーに対する抗体；または血管標的治療剤について本明細書中に記載されたものであるが、血管系よりもむしろ腫瘍細胞を指向するものなどの３部分薬剤であり得る。いろいろな腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体の概要は、本明細書中にそのまま援用される米国特許第６，０９３，３９９号の表Ｉに与えられている。概して、血管標的治療剤が、腫瘍部位の血管の完全さを危うくする場合、腫瘍細胞に直接作用する薬物の有効性も増強することができる。
【００６５】
小胞のサイズは、例えば、診断および／または治療用途を含めた具体的に意図する最終用途のために調整することができる。連結用担体のサイズは容易に操作することができるので、血管標的治療剤の全体のサイズは、薬剤がその所望の性状（例えば、循環寿命、多価性）を維持するのに十分なサイズを保持する限りにおいて、病変部位の透過性（「漏出性」）血管系を介する粒子の最適な通過のために適合させることができる。したがって、これら粒子は、望まれるように、３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍまたは３５０ｎｍのサイズに作ることができる。更に、粒子サイズは、透過性の血管系を通過できないサイズの粒子を最初に投与し、その後透過性の血管系を通過できるサイズの粒子を１回以上追加投与することを可能にするように選択することができる。小胞のサイズは、好ましくは直径約３０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲であり、この範囲の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせでもよい。より好ましくは、これら小胞は直径約１０ｎｍ〜約５００ｎｍであり、直径約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍがより一層好ましい。具体的な用途、例えば、血管系の磁気共鳴画像法を含めた血管内用途に関連して、これら小胞は直径が約５００ｎｍ以下であるのが好ましいが、より小さい小胞、例えば、直径が約１００ｎｍ以下の小胞が好ましい。より小さいこれら小胞は、微小血管系のような小さい血管チャンネルを灌流できると考えられるが、同時に、赤血球が小胞を越えて滑走するのを可能にする十分な空間または余地を血管チャンネル内に与える。
【００６６】
本発明の１つの主な焦点は、がんを治療するための、腫瘍の血管系に対する血管標的治療剤の使用であるが、本発明の薬剤は、新生血管形成または他の異常血管成長が病変に伴うかまたはその原因となるいずれの疾患でも用いることができる。血管新生成長に関連した疾患には、充実性腫瘍；白血病などの血液由来腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫；慢性関節リウマチ；乾癬；慢性炎症；眼血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；動静脈奇形；虚血性肢血管形成；Osler-Webber症候群；心筋血管形成；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；並びに創傷肉芽形成が含まれるが、これらに限定されるわけではない。内皮細胞の過剰なまたは異常な刺激の疾患には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、強皮症および過形成性瘢痕、すなわち、ケロイドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６７】
異なる投与用ビヒクル、投薬量および投与経路は、薬剤の最適な投与のために決定することができ；例えば、腫瘍部位近くへの注射は、充実性腫瘍を治療するのに好ましい。これら疾患状態の療法は、病変部位の間隙空間に血管標的治療剤を特異的に送達するために、上で考察されたように、病変部位の新生血管系の透過性を利用することもできる。
【００６８】
治療用組成物
本発明は、本発明の治療剤を含む治療用組成物にも関する。本発明の組成物には、薬学的に許容しうる賦形剤、アジュバントおよび／または担体のような他の成分も含まれ得る。例えば、本発明の組成物は、処置される動物が許容しうる賦形剤中で製剤化することができる。このような賦形剤の例には、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンクス液および他の生理学的に平衡化した水性塩溶液が含まれる。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水性ビヒクルを用いてもよい。他の有用な製剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような粘度増強剤を含有する懸濁剤が含まれる。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強させる物質などの少量の添加剤も含有することができる。緩衝液の例には、リン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリスバッファー、ヒスチジン、クエン酸塩およびグリシン、またはそれらの混合物が含まれるが、保存剤の例には、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的な製剤は、注射液かまたは、注射用の懸濁液または溶液として適当な液体中に入れることができる固体であり得る。したがって、非液状製剤の場合、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤等を含むことができ、それに、滅菌水または食塩水を投与前に加えることができる。
【００６９】
本発明の１つの態様において、この組成物には、アジュバントまたは担体のような免疫強化剤も含むことができる。典型的には、アジュバントは、概して、特定の抗原に対する動物の免疫応答を増強する物質である。適当なアジュバントには、フロイントアジュバント；他の細菌細胞壁成分；アルミニウム基剤塩；カルシウム基剤塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質；ウイルスコートタンパク質；他の細菌由来標品；γ−インターフェロン；Hunter's Titermax アジュバント（Vaxcel. T.M., Inc. Norcross, Ga.）のようなブロックコポリマーアジュバント；Ｒｉｂｉアジュバント（Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont. より入手可能）；並びにサポニンおよび Quli Ａ（Superfos Biosector A/S, Denmark より入手可能）のようなそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。担体は、典型的には、処置される動物中での治療用組成物の半減期を増加させる化合物である。適当な担体には、ポリマー性制御放出製剤、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステルおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
本発明の１つの態様は、本発明の組成物を動物中に徐々に放出することができる制御放出製剤である。本明細書中で用いられる制御放出製剤は、本発明の組成物を制御放出ビヒクル中に含む。適当な制御放出ビヒクルには、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフェアおよび経皮送達系が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の他の制御放出製剤には、動物への投与時に、固体またはゲルをin situで形成する液剤が含まれる。好ましい制御放出製剤は、生分解性（すなわち、生体侵食性）である。
【００７１】
概して、本発明で用いられる治療剤は、有効量で動物に投与される。概して、有効量は、（１）処置を必要とする疾患の症状を軽減するかまたは（２）処置を必要とする疾患を処置することに関係のある薬理学的変化を誘発するのに有効な量である。がんについては、有効量には、腫瘍のサイズを減少させる；腫瘍の増殖を遅らせる；転移を妨害若しくは阻止する；または罹患動物の余命を増加させるのに有効な量が含まれる。
【００７２】
治療剤の治療的有効量は、所望の作用を引き起こすのに十分な量または用量であり得るが、部分的には、がんの状態、種類および場所、患者の体格および状態、更には、当業者に容易に知られる他の因子に依存することがあり得る。投薬量は、単回用量として、または例えば、数週間の経過にわたって分割される数回用量として与えることができる。
【００７３】
本発明は、本発明の治療用組成物を利用した治療方法にも関する。この方法は、このような投与を必要としている対象に治療剤を投与することを含む。
本発明の治療剤は、例えば、注射またはエアゾルによる、非経口、局所、経口または皮内のような限局投与を含めたいずれか適当な手段によって投与することができる。本発明の好ましい態様において、薬剤は注射によって投与される。このような注射は、いずれの罹患部位にも限局投与することができる。治療用組成物は、投与方法に依って、いろいろな単位剤形で投与することができる。例えば、動物の経口投与に適した単位剤形には、散剤、錠剤、丸剤およびカプセル剤が含まれる。本発明の治療用組成物の好ましい送達方法には、例えば、注射または局所投与による静脈内投与および限局投与が含まれる。具体的な送達様式について、本発明の治療用組成物は、本発明の賦形剤中で製剤化することができる。本発明の治療剤は、いずれの動物にも投与することができ、好ましくは哺乳動物に、より好ましくはヒトに投与することができる。
【００７４】
具体的な投与様式は、処置される状態に依るであろう。本発明の薬剤の投与は、いずれかの体液、または体液を介して接近可能ないずれかの標的またはいずれかの組織を介してよいと考えられる。
【００７５】
本発明の細胞表面標的治療剤の好ましい投与経路は、静脈またはリンパ系への投与を含めた、静脈内、腹腔内または皮下注射による。本発明の主な焦点は、血管標的薬剤にあるが、原則として、標的薬剤は、他の体液、体組織および体腔、例えば、滑液、眼液または脊髄液中に存在するマーカーに集中するように設計することができる。したがって、例えば、抗体が、脊髄液から接近可能な病変部位に標的指向する場合、薬剤は脊髄液に投与することができる。脊髄内送達、すなわち、脊髄および脳を浸している脳脊髄液中への投与は、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）−血液障壁の脈絡膜叢内皮に存在する標的の場合に適当でありうる。
【００７６】
一つの処置例として、体液を介する投与経路は、処置される疾患が慢性関節リウマチである場合である。本発明のこの態様において、本発明は、慢性関節リウマチに罹患したヒトの、炎症を起こした滑液を処置する治療剤を提供する。このタイプの治療剤は、放射線滑膜切除薬である。慢性関節リウマチの個体は、可動関節または滑膜性関節の破壊を経験するが、これは、実質的な痛みおよび物理的無能力を引き起こす。この疾患は、大部分のこれら患者の手（中手指節関節）、肘、手根、足根関節および肩関節に影響するであろうが、過半数の膝関節が影響を受けるであろう。未処置では、それら関節内側がますます炎症を起こした状態になって、痛み、運動能力喪失および関節軟骨の破壊を引き起こす。化学薬品、外科手術および放射線を用いて、炎症を起こした滑膜を攻撃し且つ破壊しまたは除去しているが、いずれも欠点を有する。
【００７７】
放射線滑膜切除薬の濃度は、具体的な用途で異なるが、十分な量を与えて、納得のいく放射線滑膜切除を行う。例えば、股関節の放射線滑膜切除の場合、薬剤の濃度は、概して、手根関節の放射線滑膜切除に用いられる場合より高いであろう。放射線滑膜切除用組成物は、好ましくは、それが、同位体の２０半減期の期間、関節内に実質的に残存するが、その放射性核種の漏出が少なく且つ漏出する放射性核種が体内から速やかにクリアランスされる限りにおいて、より短い滞留時間が許容されうるように投与される。
【００７８】
放射線滑膜切除用組成物は、このような手順についての常法で用いることができる。例えば、膝関節処置の場合、適切な放射線滑膜切除を行うための十分な量の放射線滑膜切除用組成物を、膝関節中に注射する。用いることができるいろいろな技法は多数あるが、適当な技法は、処置されている関節で異なる。膝関節についての例は、例えば、Nuclear Medicine Therapy, J.C.Harbert, J.S.Robertson and K.D.Reid, 1987, Thieme Medical Publishers, pages 172-3 に見出されうる。
【００７９】
滑液を介する投与経路は、変形性関節症の処置にも有用でありうる。変形性関節症は、軟骨分解が、重症の痛みおよび罹患した関節の使用不能をもたらす疾患である。高齢は一つの最も有力な危険因子であるが、重大な外傷および反復した関節使用が追加の危険因子である。この疾患の主な特徴には、関節の菲薄化、軟骨の軟化、軟骨潰瘍および摩耗した骨が含まれる。炎症を軽減させるための、標的担体の注射による滑液への薬剤の送達は、分解性酵素を阻害し且つ痛みを減少させると、本発明のこの態様で考えられる。
【００８０】
もう１つの投与経路は、眼液を介する。眼の場合、網膜は、眼の後部内壁の内面となる光感受性組織の薄層である。光は、眼に入ると、角膜およびレンズによって網膜上に焦点を合わせる。次に、網膜は、光画像を電気インパルスに変換し、これが視神経によって脳に送られる。
【００８１】
黄斑は、中心視および色視に関与する網膜上のきわめて小さい区域である。この黄斑が、読むこと、運転すること、細かい作業を行うことを可能にする。黄斑を取り囲むのは、側視（side vision）および夜間視に関与している周辺網膜である。黄斑変性は、この黄斑、下にある組織または隣接した組織の損傷または破壊である。黄斑変性は、低下した視力、および読むことおよび細部「クローズアップ」視力の障害の主要原因である。加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）は、高齢者の法的盲の最も一般的な原因である。
【００８２】
黄斑変性の最も一般的な形態は、「乾性」または退行期黄斑変性と称され、黄斑領域の血管および他の網膜下にある構造的または栄養的組織の薄化によって生じる。より重症の形態は、「湿性」または滲出性黄斑変性と称される。この形態の場合、脈絡膜層（網膜のすぐ下の、網膜に栄養を与える層）の血管は、これら二つの組織の間の薄い保護層を突破する。これら血管は、網膜のすぐ下に、制御されない速さで異常に成長して、実質性毛細血管性出血、出血、または最終的に、重症の中心視喪失をもたらす黄斑の瘢痕組織形成を引き起こすことがありうる。この過程を、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）と称する。
【００８３】
ＣＮＶは、不十分な予後を有する状態であり；熱レーザー光凝固を用いた有効な処置は、病巣検出および結果として得られた辺縁の地図作成に頼っている。血管造影法は、障害となっている血管からの漏出を検出するのに用いられるが、しばしば、ＣＮＶは、それら血管が大きく、疾患画定床（ill-defined bed）を有し、網膜中へと下に突き出ていて、しかも色素沈着した上皮と連結しうることから、慣用的な血管造影図によって示されるよりも大きい。
【００８４】
新生血管形成は、血管新生性緑内障、眼ヒストプラスマ症候群、近視、糖尿病、翼状片、および伝染性および炎症性の疾患を含めた他の眼疾患で視覚喪失を引き起こす。ヒストプラスマ症候群の場合、一連のイベントは、眼の後部内面の脈絡膜層で起こり、脈絡膜の限局した炎症および結果としての瘢痕形成を引き起こし、関与した網膜の機能の喪失および盲点（暗点）を生じることを伴う。ある場合には、脈絡膜層が、正常な血管よりはるかに弱い新しい血管を生じさせる。それらは、更なる瘢痕形成と、上にある網膜の機能喪失を伴って出血する性質がある。糖尿病性網膜症は、脈絡膜血管よりもむしろ網膜に関与し、出血、血管不整および帯白色滲出液を生じる。網膜新生血管形成は、最も重症の形態を生じることがありうる。眼の血管系に標的指向する場合、標的を血管系の両側に与えてよいということは理解されるはずである。
【００８５】
眼組織への本発明の薬剤の送達は、静脈内、眼および局所を含めた多数の形態でありうる。眼局所投与には、本発明の薬剤は、水性懸濁点眼剤、粘稠点眼剤のような水性点眼剤、ゲル、水溶液、エマルジョン、軟膏等の形で製造することができる。このような製剤の製造に適した添加剤は、当業者に知られている。眼用徐放性デリバリーシステムの場合、この徐放性デリバリーシステムは、眼瞼の下に置かれてよいし、または結膜、強膜、網膜、視神経鞘中に、または眼内若しくは眼窩内の場所に注射されてよい。眼への薬剤の硝子体内送達も考えられる。このような硝子体内送達法は、当業者に知られている。この送達には、Avery による米国特許第６，２５１，０９０号に記載されたような装置による送達が含まれてよい。
【００８６】
もう一つの態様において、本発明の治療剤は、遺伝子治療に有用である。本明細書中で用いられる「遺伝子治療」という句は、遺伝性または後天性の疾患または状態を処置するまたは予防するための、宿主中への目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入を意味する。この目的の遺伝物質は、in vivo 生産が望まれる生成物（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をエンコードしている。例えば、目的の遺伝物質は、治療的価値のあるホルモン、受容体、酵素またはポリペプチドをエンコードしうる。具体的な態様において、本発明は、本明細書中にそのまま援用される、Hughes, et al., 米国特許第６，１６９，０７８号に記載のような、核酸と複合体形成しうる非ウイルス遺伝子療法で用いるための脂質分子クラスを利用するが、この場合、ジスルフィドリンカーを、脂質の極性ヘッド基と親水性テイル基との間に与える。
【００８７】
本発明のこれら治療的化合物は、ＤＮＡと有効に複合体形成し、そして異種ＤＮＡで形質転換される細胞の細胞内空間中への細胞膜を介するＤＮＡ導入を容易にする。更に、これら脂質分子は、細胞質中の異種ＤＮＡの放出を容易にし、それによって、ヒトまたは動物の遺伝子治療の際に、遺伝子トランスフェクションを増加させる。
【００８８】
陽イオン脂質−ポリアニオン巨大分子凝集体は、当該技術分野において知られている種々の方法によって形成されてよい。代表的な方法は、Felgner et al., 上記；Eppstein et al. 上記；Behr et al. 上記；Bangham,A. et al. M.Mol.Biol. 23:238,1965；Olson,F. et al. Biochim.Biophys.Acta 557:9,1979；Szoka,F. et al. Proc.Natl.Acad.Sci. 75:4194,1978；Mayhew,E. et al. Biochim.Biophys.Acta 775:169,1984；Kim,S. et al. Biochim.Biophys.Acta 728:339,1983；および Fukunaga,M. et al. Endocrinol. 115:757,1984 によって開示されている。概して、凝集体は、（１）陽イオン脂質かまたは（２）コリピド（colipid）と混合した陽イオン脂質から成る脂質粒子を製造後、ポリアニオン巨大分子をこれら脂質粒子にほぼ室温（約１８〜２６℃）で加えることによって形成されてよい。概して、保護された基の脱保護を促すことのない条件を選択する。一つの態様において、この混合物を、次に、約１０分間〜約２０時間にわたって凝集体を形成させるが、約１５〜６０分間が最も好都合に用いられる。他の時間は、特定の脂質タイプに適当であることがありうる。これら複合体は、より長い時間にわたって形成されてよいが、トランスフェクション効率の追加の増大は、より長い複合体形成時間によって常に得られるわけではないであろう。
【００８９】
本発明の化合物および方法は、例えば、ポリヌクレオチドのような所望の分子を標的細胞に細胞内送達するのに用いることができる。この所望のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはその類似体を含んで成ることができる。本発明を用いて送達される所望のポリヌクレオチドは、調節機能を有するヌクレオチド、例えば、プロモーター配列のように、異なった機能または活性を与える、またはポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含んで成ることができる。所望のポリヌクレオチドは、細胞中の他のヌクレオチド配列にアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供することもできる。例えば、細胞中で転写された場合の所望のポリヌクレオチドは、細胞中の他のヌクレオチド配列にアンチセンスである配列を有するポリヌクレオチドを提供することができる。これらアンチセンス配列は、細胞中でセンス鎖配列にハイブリッド形成することができる。アンチセンス配列を与えるポリヌクレオチドは、熟練者によって容易に製造することができる。細胞中に送達される所望のポリヌクレオチドは、細胞中で二本鎖ＤＮＡと三重らせん複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むこともできる。
【００９０】
画像化
本発明は、医学的診断に重要な性状を表示する撮像剤に関する。より詳しくは、本発明は、ガドリニウムのような磁気共鳴画像法用造影剤、超音波用撮像剤、またはＴｃ９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｈ−１０５、Ｉ−１２３、Ｎｄ−１４７、Ｐｍ−１５１、Ｓｍ−１５３、Ｇｄ−１５９、Ｔｂ−１６１、Ｅｒ−１７１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８およびＴｌ−２０１のような核撮像剤に関する。
【００９１】
本発明は、更に、in vivo の異常な病変を診断する方法であって、その異常な病変と接触している体液中に、異常な病変に関与する分子に指向する複数の標的指向画像増強重合粒子であって、異常な病変に関与する分子に付着しているこの標的指向画像増強重合粒子を導入し、そしてこの異常な病変に関与する分子に付着している標的指向画像増強重合粒子を in vivo で画像化することを含む方法を提供する。
【００９２】
診断薬
本発明は、更に、診断目的の方法および試薬を提供する。本発明によって考えられる診断用検定には、受容体結合検定、抗体検定、免疫組織化学的検定、フローサイトメトリー検定、ゲノムおよび核酸検出検定が含まれるが、これに制限されるわけではない。高処理スクリーニングアレイおよび検定も考えられる。
【００９３】
本発明は、いろいろな in vitro 検定の方法を提供する。例えば、本発明による抗体抱合重合リポソームは、溶液中の特異的抗原についての超感受性診断用検定を提供する。分光学的に異なるイオンにキレート化するキレート剤ヘッド基を有する本発明の重合リポソームは、免疫検定、並びにリガンドおよび受容体に基づく検定に高い感受性を与える。発蛍光団ヘッド基を有する本発明の重合リポソームは、細胞表面上の糖タンパク質の検出方法を提供する。
【００９４】
診断用検定で有用なリポソームは、本明細書中に各々そのまま援用される、「Use of Polymerized Lipid Diagnostic Agents」という表題の米国特許第６，０９０，４０８号および「Targeted Polymerized Liposome Diagnostic and Treatment Agents」という表題の米国特許第６，１３２，７６４号に記載されている。
【００９５】
本発明の一つの態様において、標的指向重合リポソーム粒子は、複数のリポソーム形成性脂質であって、その各々が、二機能リンカー部分によってこのリポソーム形成性脂質に連結する活性親水性ヘッド基と、この複数のリポソーム形成性脂質の内の一つからの隣接した疎水性ヘッド基の重合性官能基と重合する重合性官能基を有する疎水性テイル基とを有し、その親水性ヘッド基の少なくとも一部分は、特定の生物学的分子に付着させるための、付着された標的指向活性剤を有している、この複数のリポソーム形成性脂質の集合を含む。もう一つの態様において、標的指向重合リポソーム粒子は、画像コントラスト増強剤に付着される表面官能基を含む親水性ヘッド基の第二部分を有して、標的指向画像増強重合リポソーム粒子を形成する。なおもう一つの態様において、親水性ヘッド基の一部分は、粒子が付着する特定の生物学的分子またはその付近にある生物学的部位との相互作用のための、処置薬に付着されているまたはそれを被包している表面官能基を有して、標的指向送達重合リポソーム粒子または標的指向画像増強送達重合リポソーム粒子を形成する。
【００９６】
本発明は、in vitro の異常な病変を検定する方法であって、その異常な病変と接触している体液中の異常な病変に関与する分子に、本発明の複数のリポソームを導入し、これら標的指向重合リポソーム粒子は、異常な病変に関与する分子に付着していて、そしてこの異常な病変に関与する分子に付着した標的指向重合リポソーム粒子を in vitro で検出することを含む方法を提供する。
【００９７】
代表的な脂質構築物および用途
安定化された小胞
実施例１および２に記載のように製造される小胞は、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＢｉｓＴ−ＰＣ，１）（図２）およびジエチレントリアミン三酢酸（ＤＴＴＡ）脂質誘導体（２）（図２）を含有する。ジアセチレン脂質は、紫外線への暴露の際に架橋されて、交互に二重および三重の炭素−炭素結合から成る高度に共役した主鎖を生じることがありうる（D.S.Johnston, S.Sanghera, M.Pons, D.Chapman, Biochim Biophys Acta 602,57-69.(1980)）。デキストラン基剤のポリ（エチレンイミン）安定化剤を、非重合リポソームまたは重合小胞の表面に、実施例２および８に記載のＥＤＡＣ化学を用いて付着させた。
【００９８】
小胞への抗体の付着
ヒトαｖβ３インテグリンを各々結合する、ネズミ抗体ＬＭ６０９（P.C.Brooks, et al., J.Clin.Invest 96,1815-22(1995)）またはヒト化抗体 Vitaxin（H.Wu, et al., Proc Natl Acad Sci USA 95,6037-42(1998)）を含めた抗体を、重合小胞の表面カルボキシル基に、実施例２Ｃに記載のＥＤＡＣ化学を用いて付着させるが、これは、主に、タンパク質またはペプチド上に存在するＮ末端アミノ基上のアミンまたはリシンなどの求核基と、アミド結合を形成する（G.T.Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, San Diego, 1996)）。
【００９９】
小胞への金属の付着
イットリウム９０を、実施例１および２に記載のような、反応性脂質誘導体の三酢酸ＤＴＴＡまたはＤＰＴＡヘッド基へのキレート化によって、重合小胞またはリポソームに付着させる。従来の研究では、ＰＶおよび Vitaxin−ＰＶの金属結合容量は区別できないことが分かっているので、ＥＤＡＣの使用は、抗体およびペプチドを付着させるのに用いられる条件下においてキレート化基の濃度を有意に変更させない。
【０１００】
インテグリン標的小胞の in vitro 標的指向
Vitaxin−ＰＶ抱合体は、これもイットリウム９０を高い効率で結合するが、実施例７に記載のように行われる放射分析結合検定において、in vitro のαｖβ３インテグリンに標的指向する。従来の研究は、２７０対１までのシグナル対バックグラウンド比率での小胞濃度の関数としてシグナルの直線応答を示している。これら結果は、デキストラン被覆小胞が、未安定化小胞より８倍まで高い、一層高い送達可能性を与えるということを示している。
【０１０１】
安定化された抱合体の in vitro 安定性
血清中での抱合体の安定性を評価するために、安定化されたおよび未安定化小胞複合体を、ウサギ血清中において３７℃でインキュベートし、比較した。従来の研究は、Vitaxin−ＰＶ抱合体は、より長い半減期およびより高い９０Ｙシグナルを有する該当する未重合リポソームより有意に安定であるということを示している。これら結果は、デキストラン被覆小胞が、未安定化小胞より５〜６倍多く９０Ｙを保持して一層安定化していることを示している。
【０１０２】
これら研究は、デキストラン被覆小胞が、増大したコロイド安定性を示すということも示している。すなわち、デキストランで安定化された小胞は、加えられる塩の存在下において有意にサイズ変化することはないが、未安定化小胞の平均直径は、加えられる塩の存在下において３０分以内に３倍に増加する。
【０１０３】
ネズミ腫瘍モデルにおける黒色腫の処置
実施例１０は、本発明の安定化された治療剤での黒色腫ネズミ腫瘍モデルの処置を記載している。実施例７は、安定化された脂質構築物が腫瘍増殖を減少させることを示している。
【実施例１】
【０１０４】
リポソームまたは重合小胞の製造手順。
Ａ．重合小胞の製造手順。
小胞は、押出によってまたは Microfluidics ホモジナイザーを用いたホモジナイゼーションによって製造した。１００ｍＬフラスコに、クロロホルム（３ｍＬ）中のジエチレントリアミン三酢酸（ＤＴＴＡ）脂質誘導体３（１５ｍｇ）と、クロロホルム（１１ｍＬ）中の１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＢｉｓＴ−ＰＣ２（２２０ｍｇ）を加えた。溶媒を・６０℃でロータリーエバポレーションによって除去した。水（１０ｍＬ）を加え、その溶液を、ドライアイス／アセトン混合物上で固体になるまで凍結させた。溶液を６０℃で融解させ、そして２０μＬの０．５Ｍ  ＮａＯＨを加えることによってｐＨを８に調整した。この凍結・融解工程を、半透明溶液が得られるまで繰り返した。この溶液を、押出機（Lipex Biomembranes, Inc.）中の３０ｎｍポリカーボネートフィルターを介して８０℃で通過させ、アルゴンで７５０ＰＳＩに加圧した。小胞サイズは、動的光散乱（Brookhaven Instruments）によって決定した。ジアセチレン脂質の重合は、これら小胞を、１０ｘ１ポリスチレン皿（ＶＷＲ）中において約２〜１０℃に冷却し且つ取っ手付き紫外線イルミネーターを用いて約３．８ｍＷ／ｃｍ２で照射して、６５ｎｍの直径の小胞を生じることによって達成した。
【０１０５】
Ｂ．リポソームの製造手順。
リポソームは、小胞を紫外線で重合したことを除き、実施例１ａに記載されたのと全く同様に製造した。
【実施例２】
【０１０６】
抗体−デキストラン−小胞および抗体−小胞の抱合体を製造する手順
Ａ．重合小胞の被覆：
９５モル％の１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロホスホコリン、ＢｉｓＴ−ＰＣ１（Avanti Polar Lipids）および５モル％のＤＴＰＡ脂質誘導体Ｎ，Ｎ−ビス［［［［（１３’，１５’−ペンタコサジイナミド−３，６−ジオキサオクチル）カルバモイル］メチル］（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシン２（Journal of the American Chemical Society (1995),117,pp7301-7306）で製造される重合小胞（ＰＶ）を、アミノデキストランで次のように被覆した。ＰＶ（１０ｍｌ，２５０ｍｇ）を、５ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８中で撹拌されているアミノデキストラン（アミン修飾された１０，０００ＭＷデキストラン，Molecular Probes，製品Ｄ−１８６０，５００ｍｇ，３アミノ基／デキストランポリマー）に滴加した。２００iｌの水中のＥＤＡＣ（Aldrich １６１４６−２，エチルジメチルアミノジプロピルカルボジイミドＨＣｌ塩，６ｍｇ）を、被覆用混合物に撹拌しながら滴加した。この混合物を室温で一晩撹拌した。透明な反応混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で平衡した Sepharose ＣＬ４Ｂカラム（２．５ｘ３０ｃｍ，Amersham Pharmacia Biotech ＡＢ製品１７−０１５０−０１）上で精製した。被覆されたＰＶが溶離し始めた時点で、４ｍｌ画分を集めた。ピーク画分（２〜６まで）をプールし、０．４５iフィルター（Nalgene ２５ｍｍシリンジフィルター，製品１９０−２５４５）、次に０．２iフィルター（Nalgene ２５ｍｍシリンジフィルター，製品１９０−２５２０）を介して濾過した。被覆ＰＶの濃度は、試料を、９０℃で維持されたオーブン中において恒量まで乾燥させることによって決定した。
【０１０７】
Ｂ．アミノデキストランで被覆された重合小胞のスクシニル化：
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の実施例２Ａより得られるアミノデキストラン−ＰＶ（１５ｍｌ，４６５ｍｇ）を、等量の２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し、そして１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８に調整した。無水コハク酸（Aldrich 製品２３，９６９−０，２７８ｍｇ）を、１ｍｌ  ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（Aldrich 製品２７６８５−５））中に溶解させ、そして１００iｌアリコートを、被覆ＰＶ懸濁液に急速撹拌しながら加えた。ｐＨを監視し、必要に応じて調整して、１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって７．５〜８のｐＨを維持した。無水コハク酸の最終添加後、混合物を室温で１時間撹拌後、透析用カセットに移し、そして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に対してｐＨ７．４で透析した。
【０１０８】
Ｃ．デキストラン被覆ＰＶへの抗体の共役：
実施例Ｂより得られるスクシニル化デキストラン−小胞抱合体（２０ｍｌ，ｐＨ８の５０ｍＭホウ酸緩衝液中に１９２ｍｇ）と、ＬＭ６０９、Vitaxin、およびＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体およびＶＥＧＦ受容体２に対する抗体などの抗体（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．５中に約４．６７ｍｇ／ｍｌで，１．０３ｍｌ，４．８ｍｇ）とを、かき回しながら急速混合した。４００iｌの水中のＥＤＡＣ（４ｍｇ）をかき回しながら加え、その混合物を室温で一晩放置した。共役反応混合物をＮａＣｌ中で２００ｍＭとし、混合物を室温で１時間撹拌した。この混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７．４において平衡した Sepharose ＣＬ４Ｂカラム上で精製した。画分（４ｍｌ）を集め、抗体についてＥＬＩＳＡによって検定した。フリーの未結合抗体は、これら画分中で検出されなかった。ＰＶ含有画分をプールし、５ｍＭクエン酸塩を含有する５０ｍＭヒスチジン中にｐＨ７．４で透析した。
【０１０９】
Ｄ．デキストラン−リポソーム抱合体の製造：
デキストラン−リポソーム抱合体は、抗体−デキストラン−重合小胞抱合体の製造について記載のように製造した。実施例１Ｂより得られるリポソームを、実施例２Ａに記載のようにアミノデキストランで被覆し、アミノデキストラン−リポソーム抱合体を、２Ｂに記載のようにスクシニル化した。
【０１１０】
Ｅ．抗体−重合小胞抱合体の製造：
Vitaxin を、１ａより得られる小胞に、実施例２Ｃに記載のように付着させた。
【実施例３】
【０１１１】
抗体−小胞抱合体のＥＬＩＳＡによる特性決定。
デキストラン−小胞抱合体上の抗体の存在は、ＥＬＩＳＡによってこの実施例に記載のように証明した。９６ウェルプレートを、ヤギ抗ヒトＦｃ（γ）抗体（ＫＰＬ）または精製αｖβ３インテグリンで、ＰＢＳ緩衝液中に２iｇ／ｍＬで一晩被覆した。これらウェルを、３００iＬの洗浄液（Wallac Delfia Wash）で３回洗浄し、そして２００iＬの遮断用乳溶液（ＫＰＬ）で室温において１時間遮断した。抗体−小胞抱合体（５０iＬ）を、ｐＨ７．４の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に１〜１００iｇ／ｍＬの濃度で加えた。室温で１時間インキュベーション後、ウェルを３回洗浄した。遮断用乳溶液中に１iｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃ（γ）抗体−ＨＲＰ抱合体（ＫＰＬ）を加えた。室温で１時間インキュベーション後、ウェルを２回洗浄し、Lumiglo 化学発光物質（ＫＰＬ，５０iＬ）を加えた。１分間インキュベーション後、Wallac Victor ルミネセンスリーダーを用いてシグナルを監視した。非インテグリン認識抗体について、適当な抗体で被覆されたプレートを用いて、抗体抱合体を捕捉した。例えば、抗マウス抗体で被覆されたプレートを用いて、マウス抗体から製造される抗体−小胞抱合体を捕捉した。
【実施例４】
【０１１２】
安定化された小胞のコロイド安定性。
デキストランで安定化された小胞と未安定化小胞とのコロイド安定性を比較した。各々の抱合体を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中にｐＨ７．４で、２００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の不存在下および存在下において室温で３０分間懸濁させた。図３は、デキストランで安定化された小胞の平均直径が、２００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下では有意に変化しないが、被覆されていない小胞のサイズは、３０分以内に３倍に増加するということを示している。
【実施例５】
【０１１３】
抗体−小胞複合体への９０Ｙの付着
５ｍＭクエン酸塩を含有するｐＨ７．４の５０ｍＭヒスチジン緩衝液中の、実施例２Ｃで製造される抗体−小胞複合体を、次の手順によって塩化イットリウム９０を希釈することにより、９０Ｙで標識した。５０ｍＭ  ＨＣｌ中の塩化イットリウム９０（ＮＥＮ Life Science Products）を希釈して、約２０ｍＣｉ／ｍｌを含有する使用液とし、１００μＬを、５ｍＬの抗体−小胞複合体に、５ｍＭクエン酸塩を含有するｐＨ７．４の５０ｍＭヒスチジン緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬで加えた。この混合物を室温で３０分間インキュベートし、そして結合した９０Ｙパーセントを、実施例１に記載のように決定した。
【０１１４】
実施例２Ｃより得られる１００iＬの Vitaxin−デキストラン−小胞（０．１〜５０ｍｇ／ｍＬ）に、約１００〜２５０iＣｉの塩化イットリウム９０（ＮＥＮ Life Science Products）を加え、渦ミキサーを用いて混合し、室温で３０分間インキュベートした。二重試験において、治療的小胞に結合した９０Ｙパーセントは、１００iＬの９０Ｙ−小胞複合体を１００ｋ  ＭＷＣＯ NanosepＴＭ（Pall Filtron）フィルターに加えることによって決定した。このフィルターアセンブリーを、ミクロフュージ中において４００ｒｐｍで１時間、またはその溶液が全てフィルターを介して通過するまで回転させた。このアセンブリー中の「全９０Ｙ」を、Capintec ＣＲＣ−１５Ｒ線量計で決定した。アセンブリーのフィルター部分を取り出して捨てた。線量計を用いて、フィルターを通過した「未結合９０Ｙ」を含有するアセンブリーの残り部分を計数した。「結合９０Ｙ」は、「全９０Ｙ」から「未結合９０Ｙ」を差し引くことによって決定した。結合９０Ｙパーセントは、「結合９０Ｙ」を「全９０Ｙ」で割り、１００を掛けることによって決定した。９０Ｙ結合は、７５％を超えることが判明した。
【実施例６】
【０１１５】
インテグリン−標的小胞−９０Ｙ抱合体の安定性の in vitro 比較。
簡単に言うと、αｖβ３ インテグリン（Chemicon International, Inc.）で被覆された９６ウェルプレートを、ＢＳＡで遮断した。Vitaxin−重合小胞−イットリウム９０抱合体（実施例２Ｅ）または該当する Vitaxin−デキストラン−リポソーム−イットリウム９０抱合体（実施例２Ｃ）を、ウサギ血清中で０〜３時間インキュベートした。０〜１００マイクログラム／ｍＬの Vitaxin−小胞−９０Ｙ抱合体を含有するウサギ血清試料を加え、室温で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、そして Microbeta シンチレーション計数計（Wallac）を用いてイットリウム９０を測定した。図５に示されるように、デキストランで安定化された抱合体は、未安定化抱合体の場合よりも７〜６倍多く９０Ｙを保持している。
【実施例７】
【０１１６】
インテグリン−標的小胞−９０Ｙ抱合体の９０Ｙ送達の in vitro 比較
標的指向は、抗体または他のインテグリン標的指向リガンド、小胞およびイットリウム９０から成る無傷の三部分複合体を必要とする αｖβ３ インテグリンに特異的な放射分析結合検定を用いて、in vitro で証明した。実施例６に記載されるような、デキストランで安定化された Vitaxin 抱合体と未安定化 Vitaxin 抱合体とを、この研究で用いた。この研究では、９０Ｙ負荷量は同一であり、同一脂質濃度で比較を行った。抗体負荷量は、正規のものと、デキストランで安定化されたリポソームとにそれぞれ、脂質１ｍｇにつき４iｇおよび６iｇの抗体であった。デキストランで安定化された抱合体の９０Ｙ送達は、図４に示されるように、未安定化抱合体の場合より８倍まで高かった。
【実施例８】
【０１１７】
抗体−ＰＥＩ−小胞抱合体の製造。
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中１００ｍｇ／ｍｌの溶液ポリエチルアミンイミン（ＰＥＩ，７０ｋ分子量）を、３グラムのＰＥＩを約２０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中に溶解させ、濃ＨＣｌでｐＨを７．３に調整し、そして追加の緩衝液で３０ｍｌの最終容量まで希釈することによって調製した。ＰＶ（２０ｍｌ，０．５グラム）を、ＰＥＩ（１５ｍｌ，１．５グラム）にかき回しながら加えた。２ｍｌの水中のＥＤＡＣ（５０ｍｇ）を滴加した。その混合物を室温で一晩撹拌した状態にした。過剰のＰＥＩを、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１リットル）を用い、次に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４（３００ｍｌ）を用いるタンジェンシャルフロー濾過（tangential flow filtration）によって除去した。この懸濁液を２５ｍｌに濃縮した。ＰＥＩ−小胞抱合体のシンチレーションは、次のように行った。２ｍｌの０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液をｐＨ７．４で、２０ｍｌのＰＶ−ＰＥＩ（約２０ｍｇ／ｍｌ，全４００ｍｇ）に加え、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを８に調整した。１５０ｍｇの無水コハク酸を、０．５ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ中に溶解させた。無水コハク酸の５０μｌアリコートを、ＰＶ−ＰＥＩ懸濁液にマグネチックスターラーで撹拌しながら加えた。ｐＨは７．８５に降下し、これを、数滴の１Ｎ  ＮａＯＨで８に調整し戻した。無水コハク酸の次のアリコートを加え、ｐＨを８に調整し戻した。この手順を、無水コハク酸が全て加えられるまで繰り返した。スクシニル化ＰＶ−ＰＥＩを、連続したタンジェンシャルフロー濾過によって精製した。抗体共役は、実施例２Ｃに記載のように行い、そして抗体−ＰＥＩ−小胞抱合体上の抗体の存在は、実施例３に記載の手順を用いて確認した。
【実施例９】
【０１１８】
抗体−デキストラン−小胞複合体の投与
処置用に選択されたウサギは、ウサギ用保定具を用いて固定し、辺縁耳静脈による試験試料の静脈内投与のために、その耳をアルコール（７０％イソプロピル）で準備する。２２ゲージカテーテルを、試験品投与を容易にするために用いてよい。抗体−デキストラン−小胞複合体を含有する試験試料、または９０Ｙで標識されているこの複合体を含有する試験試料を、滅菌注射器で適切に吸引し、小針（２２〜２４ゲージ）を用いて注射する。静脈内注射は、０．２ｃｃ／秒以下の速度で行う。送達したら、ガーゼを当てて圧迫して、出血を最小限にする。
【実施例１０】
【０１１９】
マウス黒色腫モデルにおける充実性腫瘍の処置
Ｋ１７３５−Ｍ２（Li et al., Invasion Metastasis (1998),18,1-14）腫瘍細胞を、組織培養フラスコ中の１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ培地中で増殖させた。細胞を、Trypsin−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン含有）を用いて採取し、ＰＢＳ中に１０，０００，０００／ｍｌで再懸濁させ、氷上で保持した。マウスを、Nebutal（７００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。背部を剃毛し、アルコール溶液で準備した。Ｋ１７３５−Ｍ２黒色腫細胞を、背部への皮下注射によって２７ゲージ針で植込んだ。約１００万個／マウスの細胞を注射した。マウスは、十分に覚醒し且つ動き回る時点で、それらのケージに戻した。各々のマウスを毎日監視した。異常な挙動または不健康状態の兆候を記録した。異常な状態は、適当な注意を払うために研究指導者に報告した。腫瘍サイズを週に３回測定した。研究中の動物は、毎日検査した。瀕死状態または過度のストレスを経験していると見られる被験動物は、人道的にＣＯ２室で安楽死させた。腫瘍のある被験動物は、次の判定基準、すなわち、腫瘍が増殖し、１００〜２００ｍｍ３であるという基準で処置用に選択した。マウスを、処置の当日と、処置から１週間後に秤量した。処置当日に被験動物全ての平均体重を２０％超えるまたはそれ未満の体重の被験動物を、研究から除去した。被験動物を、表１に要約されるように、単回静脈内注射（約２００μＬ／マウス）で処置した。Ｈｉｓｔ／Ｃｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒは、５０ｍＭヒスチジンおよび５ｍＭクエン酸塩をｐＨ７で含有する。他の試料には、抗マウスＶＥＧＦＲ−２抗体、この抗体および上に記載のスクシニル化したデキストラン被覆重合小胞から成る抱合体（抗ＶＥＧＦＲ−２抗体−ｄｅｘＰＶ）、並びにイットリウム９０を含有する抗体抱合体（抗ＶＥＧＦＲ−２抗体−ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）、デキストラン被覆重合小胞およびイットリウム９０から成る抱合体（ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）、および抗体、重合小胞およびイットリウム９０から成る抱合体（抗ＶＥＧＦＲ−２抗体−ＰＶ−Ｙ９０）が含まれる。
【０１２０】
【表１】
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図６および表２は、この実験の結果を示している。
【０１２１】
【表２】
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ａ６日目の腫瘍増殖データの Tukey's Ｗ法での統計的分析。０．０５未満のＰ値を有する群の比較は、統計的有意性を示す。したがって、腫瘍増殖を減少させる場合の抗ＶＥＧＦＲ２  Ａｂ−ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０の作用は、統計的に有意である。
【０１２２】
ネズミ腫瘍モデルにおける黒色腫の処置は、対照に相対して、抗体−デキストラン−重合小胞抱合体で示された。図６は、抗ＶＥＧＦＲ２抗体（Ａｂ）、抗ＶＥＧＦＲ２  Ａｂ−デキストラン−重合小胞抱合体（抗ＶＥＧＦＲ２−ｄｅｘＰＶ）、デキストラン−重合小胞−イットリウム９０複合体（ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）および抗ＶＥＧＦＲ２  Ａｂ−デキストラン−重合小胞−イットリウム９０複合体（抗ＶＥＧＦＲ２−ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）での処置を示す。
【０１２３】
類似した投与計画を、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦＲ  Ａ（ＰＤＧＦＲα）、ＰＤＧＦＲ  Ｂ（ＰＤＧＦＲβ）、ｂＦＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２を認識する抗体を含有する他の抗体−デキストラン−重合小胞−イットリウム９０抱合体（Ａｂ−ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）で行った。結果の比較を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本発明の代表的な脂質構築物の略図を示す。
【図２】図２は、本発明の安定化された脂質構築物の製造に用いられる脂質を示す。
【図３】図３は、２００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下および非存在下における重合小胞の小胞タイプに対する平均小胞直径を示す。
【図４】図４は、ウサギ血清中の治療用の安定化された重合小胞と未安定化重合小胞についてのイットリウム９０の in vitro 送達の比較を示す。
【図５】図５は、ウサギ血清中の治療用の安定化された重合小胞と未安定化重合小胞との安定性の比較を示す。
【図６】図６は、ネズミ腫瘍モデルにおける、抗ＶＥＧＦＲ２抗体（Ａｂ）、抗ＶＥＧＦＲ２Ａｂ−デキストラン−重合小胞抱合体（抗ＶＥＧＦＲ２−ｄｅｘＰＶ）、デキストラン−重合小胞−イットリウム９０複合体（ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）および抗ＶＥＧＦＲ２Ａｂ−デキストラン−重合小胞−イットリウム９０複合体（抗ＶＥＧＦＲ２−ｄｅｘＰＶ−Ｙ９０）を用いた黒色腫の処置結果を示す。
【図７】図７は、ネズミ黒色腫腫瘍モデルにおける各種の抗体−デキストラン−重合小胞−イットリウム９０抱合体の作用の比較を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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