(57)【要約】完全長の、免疫抑制誘導分子ＣＤ２００の切断型、ＣＤ２００ｔｒをＣＨＯ細胞において発現させ、その形質導入された細胞を使用してＣＤ２００ｔｒに対するモノクローナル抗体を産生した。これらのモノクローナル抗体は、ＬＰＳで刺激された樹状細胞（ＤＣ）における完全長ＣＤ２００およびＣＤ２００ｔｒの同時発現を検出する。さらに、ＣＤ２００ｔｒ、加えて可溶性ＣＤ２００ｔｒを発現するＣＨＯ細胞およびＤＣは、培養でのＣＤ２００の可溶性型（ＣＤ２００：Ｆｃ）の添加の結果として起こるインビトロでの混合白血球培養反応の抑制を阻害することができ、ＣＤ２００ｔｒがＣＤ２００の生理学的アンタゴニストであることを実証している。2004513660.tif 000006
2004513660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質またはそれの類似体もしくは誘導体。
【請求項２】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質が以下のものを含む核酸配列によりコードされる、請求項１記載の単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質：
（ａ） ＴがＵでもありうる図１Ｂ（配列番号：２）もしくは図２Ｂ（配列番号：４）に示される核酸配列；
（ｂ） （ａ）の核酸配列に相補的である核酸配列；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）の核酸配列との実質的な配列相同性を有する核酸配列；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）の核酸配列の類似体である核酸配列；または
（ｅ） ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列。
【請求項３】
図３Ｂ（配列番号：６）もしくは図４Ｂ（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列を有する請求項１記載の単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質またはそれの類似体もしくは誘導体。
【請求項４】
請求項１、２、または３記載の単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質に結合する抗体。
【請求項５】
ＣＤ２００タンパク質の活性を調節する医薬品を製造するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の使用。
【請求項６】
ＣＤ２００タンパク質の活性を阻害するための請求項５記載の使用。
【請求項７】
免疫抑制を阻害するまたは免疫応答を増強する医薬品を製造するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の使用。
【請求項８】
流産を誘導するための請求項７記載の使用。
【請求項９】
腫瘍細胞増殖を阻害するまたは予防するための請求項７記載の使用。
【請求項１０】
感染症を治療するまたは予防するための請求項７記載の使用。
【請求項１１】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質が請求項１〜３のいずれか一項記載による、請求項５〜１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子が以下のものを含む、請求項５〜１０のいずれか一項記載の使用：
（ａ） ＴがＵでもありうる図１Ｂ（配列番号：２）もしくは図２Ｂ（配列番号：４）に示される核酸配列；
（ｂ） （ａ）の核酸配列に相補的である核酸配列；
（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）の核酸配列との実質的な配列相同性を有する核酸配列；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）の核酸配列の類似体である核酸配列；または
（ｅ） ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列。
【請求項１３】
免疫抑制を増強する医薬品を製造するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用。
【請求項１４】
薬剤が請求項４記載の抗体である、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
薬剤が請求項２記載の核酸配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３記載の使用。
【請求項１６】
移植片拒絶の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
自己免疫疾患の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１８】
アレルギーの予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
流産の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項２０】
対宿主性移植片病の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項２１】
炎症性状態の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項２２】
神経変性状態または疾患の予防または治療のための請求項１３〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項２３】
免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１３〜２２のいずれか一項記載の使用。
【請求項２４】
免疫抑制剤がＣＤ２００タンパク質またはそれのアゴニストである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
以下の段階を含む、ＣＤ２００ｔｒタンパク質と結合する物質を同定する方法：
（ａ） 複合体の形成を可能にする条件下で、ＣＤ２００ｔｒタンパク質および物質を反応させる段階、および
（ｂ） 複合体について、遊離物質について、および非複合化ＣＤ２００ｔｒタンパク質についてアッセイする段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫抑制誘導分子ＣＤ２００の切断型（ＣＤ２００ｔｒと名付けられる）に関する。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、ＣＤ２００のアンタゴニストである。
【０００２】
発明の背景
本発明者は、以前に、ＣＤ２００（ＯＸ２）が強力な免疫抑制剤であり、ＣＤ２００を投与することが、移植片拒絶を抑制し、かつ流産および自己免疫疾患を防ぐことができたことを示した（本発明者、Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉらの国際公開公報第９９／２４５６５号、１９９８， １９９９ａ， １９９９ｂ， ２０００）。特に、本発明者は、以前に、ＣＤ２００に対する抗体を投与することが、移植前の門脈（ｐｖ）免疫化後に一般的に見られる移植片生着を阻害したこと、およびＣＤ２００を投与することが移植片拒絶を抑制することを示した。ＣＤ２００のレベルと流産の危険との間に負の関係があることもまた示された。特に、ＣＤ２００を投与することが、流産率を低下させ、一方、ＣＤ２００を阻害することがその効果を逆にした。本発明者は、ＣＤ２００を投与することが、自己免疫を防ぐこともまた示した。さらに、ＣＤ２００は、細胞障害性細胞およびＩＬ−２の産生を抑制し、かつＩＬ−４の産生を誘導する。加えて、ＣＤ２００は、腫瘍転移を促進する原因であり、ＣＤ２００を阻害することが、腫瘍細胞増殖を低下させる。最近、フーク（Ｈｏｅｋ）ら、（２０００）は、ＣＤ２００ノックアウトマウスを調製し、骨髄分化経路の細胞の調節における、および中枢神経系内の炎症過程におけるＣＤ２００についての役割を推測した。これらの結果のすべてより、ＣＤ２００が免疫抑制に関与していることが実証されている。
【０００３】
ＣＤ２００の効果は、ＣＤ２００受容体（ＣＤ２００ｒ）を有する細胞の同時注入により増強され、これらのデータを統合すると、ＣＤ２００：ＣＤ２００ｒの相互作用が、ＴＣＲ：抗原遭遇の結果に影響を及ぼす新規の免疫調節性経路分子を意味することが示される。この免疫調節は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０ならびにＣＤ２８（およびＣＴＬＡ４）とＣＤ８０／ＣＤ８６とのような、他のリガンド：補助受容体の相互作用に起因する共刺激シグナルの送達後に誘導される免疫賦活性経路の逆を示すものと推定された。
【０００４】
ＣＤ２００の免疫抑制性効果を阻害することが望ましい多数の状況がありうり、例えば、免疫刺激（および抑制ではない）が必要とされる場合である。
【０００５】
発明の概要
本発明者は、本明細書でＣＤ２００ｔｒタンパク質と呼ばれる、ＣＤ２００の切断型をＣＤ２００の生理学的アンタゴニストであると同定した。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、完全長ＣＤ２００遺伝子のエキソン−２を欠損するスプライスバリアントである。従って、本発明は、単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質に関する。本発明はまた、ＣＤ２００を調節するまたはＣＤ２００により誘導される免疫抑制を阻害するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質のすべての使用を含む。それゆえ、切断型ＣＤ２００アンタゴニストを使用することによりＣＤ２００を調節することは、移植、流産、自己免疫、腫瘍免疫、炎症、神経変性疾患ならびに中枢神経系傷害および修復における広い適用範囲をもつ。
【０００６】
従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の有効量をそれらを必要としている細胞または動物へ投与することを含む、ＣＤ２００の活性を調節する方法を提供する。
【０００７】
一つの態様において、本発明の方法は、ＣＤ２００により誘導される免疫抑制を阻害するためのものである。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の有効量をそれらを必要としている細胞または動物へ投与することを含む、免疫抑制を阻害する方法を提供する。
【０００８】
もう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれらを必要としている動物へ投与することを含む、流産を促進する方法を提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれらを必要としている動物へ投与することを含む、免疫応答を増強する方法を提供する。
【００１０】
さらにもう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒの有効量をそれらを必要としている細胞または動物へ投与することを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１１】
もう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、免疫抑制を増強する方法を提供する。免疫抑制を増強する方法は、移植片拒絶、流産、自己免疫疾患およびアレルギー反応を防ぐことを含む状態の広い範囲を処置することにおいて有用である。
【００１２】
本発明はまた、以下の段階を含む、ＣＤ２００ｔｒタンパク質と結合する物質を同定する方法を提供する：
（ａ）複合体の形成を可能にする条件下で、ＣＤ２００ｔｒタンパク質および物質を反応させる段階、および
（ｂ）複合体について、遊離の物質について、および非複合化ＣＤ２００ｔｒタンパク質についてアッセイする段階。
【００１３】
本発明はまた、ＣＤ２００ｔｒタンパク質、ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列、加えて、そのＣＤ２００ｔｒタンパク質または核酸分子を含有する薬学的組成物を含む。本発明はさらに、ＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびにその抗体またはオリゴヌクレオチドを含有する薬学的組成物を含む。
【００１４】
本発明の他の性質および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると思われる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものであるが、例示としてのみ提供されており、この詳細な説明から本発明の意図および範囲内の様々な変形および改変が当業者に明らかになるだろうことを理解されるべきである。
【００１５】
発明の詳細な説明
Ｉ． ＣＤ２００ｔｒ
本発明者は、門脈（ｐｖ）免疫されたマウスのリンパ組織から抽出されたｍＲＮＡが、完全長ＣＤ２００遺伝子のエキソン−２を欠損しているスプライスバリアントに対応する、より小さいＣＤ２００ ｍＲＮＡ種の同時の発現を示すことを観察した。このｍＲＮＡのシーケンシングより、このスプライスバリアントが翻訳におけるフレームシフトに関連していること、およびエキソン３（Ｖ−領域エキソン）の５’末端から２０ヌクレオチドでの中途での停止コドンの存在が明らかになった。本発明者によるＣＤ２００ｔｒタンパク質のｃＤＮＡ配列の詳細な調査により、代替スプライシングからのフレームシフトを修正する、この停止コドンの約１００ヌクレオチド下流にもう一つの共通コザック（Ｋｏｚａｋ）開始配列の存在が明らかになった。発明者は、この代替開始コドンからのＣＤ２００ｔｒタンパク質の発現が起こるかどうかをＣＨＯ細胞においてヒトまたはマウスのいずれかのＣＤ２００ｔｒタンパク質についてのｃＤＮＡ（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡに連結されている）を発現すること；ラットにおいてＣＤ２００ｔｒタンパク質に対するモノクローナル抗体を産生すること；およびＬＰＳで刺激されたＤＣをＰＥ−抗ＣＤ２００タンパク質およびＦＩＴＣ−抗ＣＤ２００ｔｒタンパク質で染色することにより、評価した。その結果は実施例１に詳述され、ヒトおよびマウスの両方の細胞において、ＣＤ２００ｔｒタンパク質の生理学的発現があるという決定的な証拠を提供する。
【００１６】
（ｉ） ＣＤ２００ｔｒタンパク質
一つの局面において、本発明は、単離されたＣＤ２００ｔｒタンパク質を提供する。
【００１７】
本明細書で用いられる「ＣＤ２００ｔｒタンパク質」という用語は、ＣＤ２００に拮抗することができるＣＤ２００タンパク質の切断型を意味する。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、一般的に完全長ＣＤ２００遺伝子のエキソン２を欠損している。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、任意の種由来でありうり、完全長ＣＤ２００の配列に基づいて、当業者により調製されうる。ヒトおよびマウスＣＤ２００ｔｒタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、図３Ｂ（配列番号：６）および図４Ｂ（配列番号：８）に示される。用語「ＣＤ２００タンパク質」または「ＣＤ２００ｔｒタンパク質」は、それぞれ、「ＯＸ２タンパク質」または「ＯＸ２ｔｒタンパク質」と同意語であることは留意されるべきである。ＯＸ２はＣＤ２００について用いられた以前の名前だったが、命名法の変更により、用語ＣＤ２００が現在ではより一般的に用いられている。
【００１８】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質はまた、既知の供給源から得られうる、または組換えＤＮＡもしくはペプチド合成技術を用いて調製されうる。そのタンパク質は、ＣＤ２００についての任意の公知の発表された配列を用いて調製されうる。その配列はゲンバンクから入手できる。ＣＤ２００のヒトの配列は、アクセッション番号Ｍ１７２２６ Ｘ０５２３をもつ；ラット配列は、アクセッション番号Ｘ０１７８５をもつ；およびＣＤ２００のマウス配列は、アクセッション番号ＡＦ０２９２１４をもつ。
【００１９】
「ＣＤ２００ｔｒタンパク質」という用語は、ＣＤ２００のアンタゴニストとして同じく機能するＣＤ２００ｔｒタンパク質の改変型を含む。ＣＤ２００ｔｒの改変型は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質の類似体および誘導体を含む。
【００２０】
「類似体」という用語は、一つまたは複数の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、かつ本明細書に記載されるようなＣＤ２００に拮抗する能力を示す、図３Ｂ（配列番号：６）または図４Ｂ（配列番号：８）に示されるＣＤ２００ｔｒタンパク質配列に実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有する任意のペプチドを含む。保存的置換の例には、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１個の非極性（疎水性）残基の別のものの代わりとしての置換、アルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間のような１個の極性（親水性）残基の別のものの代わりとしての置換、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンのような１個の塩基性残基の別のものの代わりとしての置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のような１個の酸性残基の別のものの代わりとしての置換を含む。「保存的置換」という表現はまた、そのようなポリペプチドがその必要な活性を示すとの条件で、誘導体化されていない残基の代わりに化学的に誘導化された残基の使用を含む。
【００２１】
「誘導体」という用語は、機能的側鎖の反応により化学的に誘導体化された１個または複数の残基を有するペプチドを指す。そのような誘導体化された分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子を含む。遊離のカルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステル、またはヒドラジドを形成しうる。遊離のヒドロキシル基は、誘導体化されてＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成しうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてＮ−イム−ベンジルヒスチジン（Ｎ−ｉｍ−ｂｅｎｚｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を形成しうる。また、誘導体として、２０個の標準アミノ酸の、１個または複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例として：４−ヒドロキシプロリンがプロリンの代わりに置換されうる；５−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに置換されうる；３−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに置換されうる；ホモセリンがセリンの代わりに置換されうる；およびオルニチンがリシンの代わりに置換されうる。本発明のＣＤ２００ｔｒタンパク質はまた、その必要な活性が維持される限りにおいて、図３Ｂ（配列番号：６）または図４Ｂ（配列番号：８）に示されるＣＤ２００ｔｒタンパク質の配列に関して、残基の１つまたは複数の付加および／または欠失をもつ任意のポリペプチドを含む。
【００２２】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、可溶性融合タンパク質として調製されうる。その融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域に連結されたＣＤ２００ｔｒタンパク質の細胞外ドメインを含みうる。ＣＤ２００ｔｒタンパク質融合体は、当技術分野において公知の技術を用いて調製されうる。一般的に、ＣＤ２００ｔｒタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＩｇのＦｃをコードするＤＮＡ配列に連結され、ＣＤ２００ｔｒタンパク質−ＦｃＩｇ融合タンパク質が産生される適当な発現系において発現される。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されうる。
【００２３】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、それをより治療的に効力のあるまたは適合するものにするために改変されうる。例えば、ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、環化によりペプチドがより有利な高次構造をとることが可能になるように、環化されうる。ＣＤ２００ｔｒタンパク質ペプチドの環化は、当技術分野における公知の技術を用いて達成されうる。特に、ジスルフィド結合は、遊離のスルフヒドリル基を有する２個の適当な間隔のあいた構成部分間に形成されうる。その結合は、アミノ酸、非アミノ酸構成部分、またはその２つの組み合わせの側鎖間に形成されうる。さらに、本発明のＣＤ２００ｔｒタンパク質またはペプチドは、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などを含む無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、およびトルエンスルホン酸を含む有機酸と反応させることにより、薬学的塩へ変換されうる。
【００２４】
（ｉｉ） ＣＤ２００ｔｒ核酸
もう一つの局面において、本発明はまた、本発明のＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードするすべての核酸配列を含む。ヒトおよびマウスのＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列は、それぞれ、図１Ｂ（配列番号：２）および図２Ｂ（配列番号：４）に示される。
【００２５】
好ましい態様において、ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子は、以下のものを含む：
（ａ） ＴがＵでもありうる図１Ｂ（配列番号：２）または図２Ｂ（配列番号：４）に示される核酸配列；
（ｂ） （ａ）の核酸配列に相補的な核酸配列；
（ｃ） （ａ）または（ｂ）の核酸配列との実質的な配列相同性をもつ核酸配列；
（ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸配列の類似体である核酸配列；
（ｅ） ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列。
【００２６】
「実質的な配列相同性をもつ配列」という用語は、（ａ）または（ｂ）における配列からのわずかのまたは瑣末な配列変化をもつ核酸配列を意味する、すなわち、その配列が実質的に同じ様式で機能し、かつＣＤ２００の活性を阻害する能力があるタンパク質をコードする。その変化は、局所的突然変異または構造的改変に起因する場合がある。実質的な相同性をもつ核酸配列は、図１Ｂ（配列番号：２）または図２Ｂ（配列番号：４）に示される核酸配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも８５％、および最も好ましくは９０％〜９５％の同一性をもつ核酸配列を含む。
【００２７】
「ハイブリダイズする配列」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を意味する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者に知られている、または「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）， ６．３．１〜６．３．６に見出しうる。例えば、以下のものが用いられうる：約４５℃で６．０ ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃で２．０ ｘ ＳＳＣの洗浄。ストリンジェント性は洗浄段階において用いられる条件に基づいて選択されうる。例えば、洗浄段階の塩濃度は、５０℃で約０．２ ｘ ＳＳＣの高ストリンジェント性から選択されうる。さらに、洗浄段階の温度は、高ストリンジェント性条件で、約６５℃でありうる。
【００２８】
「類似体である核酸配列」という用語は、改変が本明細書に記載されるような配列の有用性（すなわち、ＣＤ２００を阻害するタンパク質をコードすることのような）を変えていない、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列と比較して改変されている核酸配列を意味する。その改変された配列または類似体が、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示される配列を超えて性質を向上させている場合もある。類似体を調製するための改変の一つの例は、図１Ｂ（配列番号：２）または図２Ｂ（配列番号：４）に示される配列の天然に存在する塩基（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミジン）の１個をキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシアデニンおよび他の８−置換型アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換型グアニン、他のアザおよびデアザのウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンのような改変された塩基に置換することである。
【００２９】
改変のもう一つの例は、図１Ｂ（配列番号：２）または図２Ｂ（配列番号：４）に示される核酸分子における、リン酸バックボーンの修飾された亜リン酸もしくは酸素ヘテロ原子、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式の糖間結合にを含むことである。例えば、核酸配列は、ホスホロチオネート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホロジチオネートを含みうる。
【００３０】
本発明の核酸分子の類似体のさらなる例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）におけるデオキシリボース（またはリボース）リン酸バックボーンがペプチドで見出されるものと類似したポリアミドバックボーンで置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｐ． Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１， ２５４，１４９７）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に抵抗性であり、インビボおよびインビトロでの寿命を延ばしていることを示された。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間に電荷反発がないため、相補性ＤＮＡ配列により強く結合する。他の核酸類似体は、ポリマーバックボーン、環式バックボーン、または非環式バックボーンを含むヌクレオチドを含みうる。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノバックボーン構造をもちうる（米国特許第５，０３４，５０６号）。類似体はまた、レポーター基、核酸配列の薬物動態学的または薬力学的性質を向上させるための基のような基を含みうる。
【００３１】
（ｉｉｉ）抗体
本発明は、さらに、ＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体を含む。本発明者は、実施例１に記載されるＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体を調製した。ＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体はまた、参照として本明細書に組み入れられている、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５（１９７５）により、ならびに米国特許第ＲＥ３２，０１１； ４，９０２，６１４； ４，５４３，４３９；および４，４１１，９９３号において記載されたもののような当技術分野において公知の技術を用いて調製されうる。（同じく参照として本明細書に組み入れられている、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析における新次元（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ）」、プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）、マックカーン（ＭｃＫｅａｒｎ）およびベクトール（Ｂｅｃｈｔｏｌ）（編）、１９８０、ならびに「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（編）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８８も参照）。本発明の関係の範囲内において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）および組換えで作製された結合パートナーを含むものと理解される。
（ｉｖ）アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明はまた、ＣＤ２００ｔｒタンパク質の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で用いられる場合の用語アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、その標的に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。
【００３２】
本発明の一つの態様において、本発明は、ＴがＵでもありうる図１Ｂ（配列番号：２）もしくは図２Ｂ（配列番号：４）に示される配列、またはそれの断片を有する核酸分子に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオチドもしくはヌクレオシドのモノマーのオリゴマーまたはポリマーを指す。その用語はまた、同様に機能する、天然に存在しないモノマーまたはそれらの部分を含有する改変されたまたは置換されたオリゴマーを含む。そのような改変されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、増強した細胞取り込み、またはヌクレアーゼの存在下での増加した安定性のような性質により、天然に存在する型以上に好ましい場合がある。その用語はまた、２つまたはそれ以上の化学的に性質が異なる領域を含むキメラのオリゴヌクレオチドを含む。例えば、キメラのオリゴヌクレオチドは、有益な性質（例えば、増加したヌクレアーゼ抵抗性、増加した細胞への取り込み）を付与する改変されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含みうる、または本発明の２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドが連結されてキメラのオリゴヌクレオチドを形成しうる。
【００３４】
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸バックボーンの修飾された亜リン酸、酸素ヘテロ原子、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含みうる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオネート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホロジチオネートを含みうる。発明の態様において、４個〜６個の３’−末端塩基間にホスホロチオネート結合の連結がある。もう一つの態様において、ホスホロチオネート結合はすべてのヌクレオチドを連結する。
【００３５】
アンチセンス核酸分子は、当技術分野において公知の手順を使用する化学的合成および酵素的連結反応を用いて構築されうる。本発明のアンチセンス核酸分子またはそれらの断片は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるためもしくはｍＲＮＡと形成される二重鎖もしくは未変性の遺伝子の物理的安定性を増加させるために設計された様々に改変されたヌクレオチド、例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換型ヌクレオチドを用いて、化学的に合成されうる。アンチセンス配列は、アンチセンス配列が高性能の調節領域の支配下で産生される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒性ウイルスの形で細胞へ導入される発現ベクターを用いて生物学的に産生されうり、その活性はそのベクターが導入される細胞型により決定されうる。
【００３６】
（ｖ）ＣＤ２００ｔｒリガンド
本発明はまた、ＣＤ２００ｔｒタンパク質に結合することができる他のリガンドまたは分子の単離を含む。生物学的試料および商業的入手可能なライブラリーは、ＣＤ２００ｔｒタンパク質に結合するタンパク質について試験されうる。さらに、上記のＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質結合親和性をもつ他のペプチドを単離するために使用されうる。例えば、標識された抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたは生物学的試料を探索するために使用されうる。
【００３７】
タンパク質複合体の形成を可能にする条件は、その物質およびそのタンパク質の性質および量のような要素を考慮して選択されうる。
【００３８】
物質−タンパク質複合体、遊離物質または非複合化タンパク質は、通常の単離技術、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、分画、吸収、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはそれらの組み合わせにより単離されうる。その成分のアッセイを容易にするために、その抗体、タンパク質または物質は、検出可能な物質で標識されうる。
【００３９】
いったん、可能性のある結合パートナーが単離されたならば、ＣＤ２００ｔｒペプチドに結合する分子がＣＤ２００の活性を調節するにおいて有用であるかどうかを決定するためにスクリーニング方法が設計されうる。
【００４０】
それゆえ、本発明はまた、ＣＤ２００ｔｒタンパク質に結合する能力がある物質を同定するための方法を提供する。特に、その方法は、結合してＣＤ２００ｔｒタンパク質の効果を増大させるもしくは弱める能力がある、またはＣＤ２００ｔｒタンパク質の効果を抑制する物質を同定するために用いられうる。従って、本発明は、以下の段階を含む、ＣＤ２００ｔｒタンパク質と結合する物質を同定する方法を提供する：
（ａ）複合体の形成を可能にする条件下で、ＣＤ２００ｔｒタンパク質および物質を反応させる段階、および
（ｂ）複合体について、遊離物質について、および非複合化ＣＤ２００ｔｒタンパク質についてアッセイする段階。
【００４１】
本発明のＣＤ２００ｔｒと結合することができる物質は、ＣＤ２００ｔｒに結合する可能性のある物質とＣＤ２００ｔｒを反応させ、そして複合体について、遊離物質について、または非複合化ＣＤ２００ｔｒについてアッセイすることにより同定されうる。タンパク質−タンパク質相互作用を検出する任意のアッセイ系または試験方法が、同時免疫沈降、架橋を含めて用いられうり、勾配またはクロマトグラフィーカラムを通しての同時精製が用いられうる。追加として、Ｘ線結晶学的研究が、物質と分子の相互作用を評価する手段として使用されうる。例えば、本発明の複合体における精製された組換え分子が適当な形に結晶化されている場合、Ｘ線結晶構造解析による分子内相互作用の検出を受け入れられる。分光分析法もまた相互作用を検出するために用いられうり、特に、Ｑ−ＴＯＦ計測手段が使用されうる。生物学的試料および商業的入手可能なライブラリーがＣＤ２００結合ペプチドについて試験されうる。さらに、本発明のペプチドに対して調製された抗体は、ＣＤ２００ｔｒ結合親和性をもつ他のペプチドを単離するために使用されうる。例えば、標識された抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたは生物学的試料を探索するために使用されうる。この点において、本発明のペプチドは、生物学的発現系を用いて発生させうる。これらの系の使用により、ランダムペプチド配列の大量ライブラリーの作成および特定のタンパク質に結合するペプチド配列についてのこれらのライブラリーのスクリーニングが可能になる。ライブラリーは、ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適当な発現ベクターへクローニングすることにより作成されうる。（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７： ７１１； Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ４０４； Ｃｗｉｒｌａら、１９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ６３７８を参照）。ライブラリーはまた、重複ペプチドの同時合成により構築されうる（米国特許第４，７０８，８７１号を参照）。
【００４２】
本発明の方法を用いてアッセイされうるアゴニストおよびアンタゴニストは、アゴニスト結合部位、競合的アンタゴニスト結合部位、非競合的アンタゴニスト結合部位またはアロステリック部位を含む、タンパク質または物質上の結合部位の１つまたは複数に作用しうることは理解されるものと思われる。
【００４３】
本発明はまた、ＣＤ２００ｔｒに結合する能力がある物質とのＣＤ２００ｔｒの相互作用のアゴニストの効果を阻害するアンタゴニストについてスクリーニングすることも可能にさせる。このように、本発明は、ＣＤ２００ｔｒの同じ結合部位について競合する物質をアッセイするために用いられうる。それとして、ＣＤ２００ｔｒに結合する能力がある細胞内物質を本明細書に記載される方法を用いて同定しうることも認識されるものと思われる。
【００４４】
ＣＤ２００ｔｒを作用または調節する物質および化合物を評価するための本発明の方法を適用するのに適した試薬は、適した容器へとパッケージ化された必要な材料を提供する便利なキットへとパッケージ化されうる。キットはまた、本発明の方法を行うにおいて有用な適した支持体も含みうる。
【００４５】
ＩＩ． 治療的方法
（ｉ）免疫抑制を防ぐ方法
本発明者は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質がＣＤ２００により誘導される免疫抑制に拮抗することができることを実証した。特に、本発明者は、実施例１において、ＣＨＯ細胞およびＤＣの両方が、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を発現するように形質導入されている場合、インビトロでの混合白血球培養物（ＭＬＣ）において、ＣＤ２００の相同である可溶性型（ＣＤ２００：Ｆｃ）により誘導される免疫抑制に拮抗することを実証している。これらのデータは、ＣＤ２００：ＣＤ２００ｒ相互作用により誘導される免疫抑制において、ＣＤ２００／ＣＤ２００ｔｒタンパク質の相対的発現の調節について可能性のある重要な役割を示唆する。
【００４６】
従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の有効量をそれを必要としている細胞または動物へ投与することを含む、ＣＤ２００の活性を調節する方法を提供する。
【００４７】
本明細書で用いられる「有効量」という用語は、所望の結果を達成する、例えば、ＣＤ２００により誘導された免疫抑制を調節する、低下させる、阻害するおよび／または防ぐために必要な複数回分の投与量および期間での量的有効分を意味する。
【００４８】
本明細書で用いられる「動物」という用語は、ヒトを含む動物界の全メンバーを含む。
【００４９】
「ＣＤ２００ｔｒタンパク質を投与すること」という用語は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質の投与、およびＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の投与の両方を含む。後者の場合では、ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、インビボでの細胞または動物において産生される。
【００５０】
好ましい態様において、ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、可溶性融合タンパク質として調製され、かつ投与される。可溶性融合タンパク質は、当技術分野において公知の技術を用いて調製されうる。例として、融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域または任意の他の細胞内ドメインに連結されたＣＤ２００ｔｒの細胞外ドメインを含みうる。ＣＤ２００：Ｆｃ融合は、当技術分野において公知の技術を用いて調製されうる。一般的に、ＣＤ２００ｔｒの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＩｇのＦｃをコードするＤＮＡ配列に連結されて、ＣＤ２００ｔｒ−ＦｃＩｇ融合タンパク質が産生される適当な発現系において発現される。
【００５１】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質はＣＤ２００のアンタゴニストであるから、ＣＤ２００の免疫抑制性効果を阻害するまたは相殺することが望ましい任意の状態を処置するために用いられることができる。一つの態様において、本発明の方法は、ＣＤ２００により誘導された免疫抑制を阻害するためである。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列の有効量をそれを必要としている細胞または動物へ投与することを含む免疫抑制を阻害する方法を提供する。本発明はまた、免疫抑制を阻害するため、または免疫抑制を阻害する薬物を調製するための、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【００５２】
当業者は、特定のＣＤ２００ｔｒがＣＤ２００を阻害することにおいて有効であるかどうかを容易に決定できる。例えば、ＣＤ２００ｔｒをＣＤ２００の機能または活性が阻害されているかどうかを測定するインビトロでのアッセイ法で試験することができる。
【００５３】
ＣＤ２００発現のレベルと流産との間に関連があることが実証された。特に、ＣＤ２００の低レベルは、流産と相互に関係している（本発明者による国際公開公報第９９／２４５６５号を参照）。結果として、ＣＤ２００ｔｒタンパク質でＣＤ２００を阻害することが流産を誘発させうる。従って、もう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、流産を誘発する方法を提供する。本発明はまた、流産を誘発するため、または流産を誘発する薬物を調製するための、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【００５４】
当業者は、特定のＣＤ２００ｔｒが流産を誘発することにおいて有用であるかどうかを決定することができる。上記で述べられているように、公知のインビトロでのアッセイ法を用いて、免疫応答を誘導するまたは免疫抑制を防ぐ能力についてＣＤ２００ｔｒを試験することができる。さらに、ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、それを妊娠した齧歯類のような非ヒト動物に投与する、動物モデルにおいての試験が可能である。
【００５５】
ＣＤ２００は強力な免疫抑制剤であるため、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を投与することは、免疫応答を増強するように作用しうり、感染症、免疫不全（ＡＩＤＳを含む）および癌を含むいくつかの疾患を治療するのに有用でありうる。ＯＸｔｒを投与することはまた、創傷治癒を促進することおよび中枢神経系に対する障害の修復において有益でありうる。従って、さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む免疫応答を増強する方法を提供する。本発明はまた、免疫応答を増強するためまたは免疫応答を増強する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【００５６】
「免疫応答」という用語は、非特異的および特異的応答の両方を含む免疫系の任意の応答を含む。特異的応答は、細胞性（例えば、Ｔ細胞）および体液性（抗体）の応答の両方を含む。
【００５７】
ＣＤ２００ｔｒは、免疫応答を誘導するその能力について、限定されるものではないが、細胞障害性Ｔ細胞応答を増強すること；インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を誘導すること；ＩＦＮγ産生を誘導すること；Ｔｈ１サイトカイン特性を誘導すること；ＩＬ−４産生を抑制すること；ＴＧＦβ産生を抑制すること；ＩＬ−１０産生を抑制すること；Ｔｈ２サイトカイン特性を抑制することおよび免疫活性化を検出するのに有用であることが当業者に知られているものと思われる任意の他のアッセイ法を含むインビトロでの免疫アッセイ法を用いて試験されうる。
【００５８】
以前に述べられているように、その発明は、ＣＤ２００を阻害することが腫瘍増殖を抑制することを示した。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、腫瘍細胞増殖を抑制する、防ぐまたは低下させる方法を提供する。本発明はまた、腫瘍増殖を抑制するまたは低下させるためまたは腫瘍増殖を抑制するまたは低下させる薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【００５９】
「腫瘍細胞増殖を阻害することまたは低下させること」という表現は、腫瘍の増殖または転移において、ＣＤ２００ｔｒの非存在下で観察される増殖と比較して、抑制または低下を引き起こすことを意味する。ＣＤ２００ｔｒはまた、腫瘍細胞の増殖を防ぐように予防的に用いられうる。ＣＤ２００ｔｒの腫瘍細胞増殖を抑制する能力を当技術分野において公知のインビトロおよびインビボでのアッセイ法で評価することができる。例えば、ＣＤ２００ｔｒをインビトロの癌細胞へまたはインビボで癌をもつ動物へ投与することができ、かつＣＤ２００ｔｒの腫瘍増殖における効果を評価することができる。
【００６０】
限定されるものではないが、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、肉腫、固形組織の癌腫、低酸素性腫瘍、扁平上皮癌、子宮頚癌および膀胱癌のような尿生殖器の癌、造血性癌、頭頸部癌、ならびに神経系癌を含む、任意の型の癌を治療するために本方法を用いることができる。
【００６１】
もう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。感染症は、ウイルス、細菌、真菌類、マイコプラズマ、寄生虫のような病原体により引き起こされる任意の疾患でありうる。一つの態様において、感染症は敗血症である。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む創傷を治療する方法を提供する。本発明はまた、創傷を治療するためまたは創傷を治療する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を含む。
【００６３】
もう一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、神経系の損傷を治療する方法を提供する。本発明はまた、神経系の損傷を治療するためまたは神経系の損傷を治療する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の使用を含む。
【００６４】
（ｉｉ）免疫抑制を増強する方法
ＣＤ２００ｔｒタンパク質はＣＤ２００のアンタゴニストであるため、ＣＤ２００ｔｒタンパク質または遺伝子を阻害することは、ＣＤ２００により調節される免疫抑制を増強するのに有用でありうる。
【００６５】
従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている細胞または動物へ投与することを含む、免疫抑制を増強する方法を提供する。本発明はまた、免疫抑制を増強するためまたは免疫抑制を増強する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００６６】
「免疫抑制を増強すること」という用語は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の存在下において観察される免疫応答が、その薬剤の非存在下において観察される免疫より弱いことを意味する。免疫抑制が起こるかどうかを決定するための方法は当技術分野において知られており、本明細書に記載されている。
【００６７】
「ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤」という用語は、ＣＤ２００誘導性免疫抑制へのＣＤ２００ｔｒの拮抗性または阻害性効果を抑制する、防ぐまたは低下させることができる任意の薬剤を含む。ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤は、そのタンパク質の活性をブロックすることができる抗体、そのタンパク質の発現を阻害することができるアンチセンス分子および本明細書に記載されるスクリーニングアッセイ法を用いて同定される任意の他の分子またはリガンドを含む。ＣＤ２００ｔｒタンパク質に対する抗体およびアンチセンス分子は上に記載されている。
【００６８】
特定の薬剤がＣＤ２００ｔｒを阻害することにおいて有用であるかどうかを決定することは、当業者に公知の技術を用いて評価されうる。特に、ＣＤ２００媒介性免疫抑制へのＣＤ２００ｔｒの効果を阻害性活性について試験される薬剤の存在下におけるＣＤ２００ｔｒの効果と比較するアッセイ法を開発することができる。ＣＤ２００ｔｒがもはやＣＤ２００媒介性免疫抑制を防がない所において、その薬剤をＣＤ２００ｔｒを阻害すると言うことができる。ＣＤ２００がその免疫抑制性効果を発揮できるかどうかを決定することは、限定されるものではないが、混合白血球培養反応を抑制すること；細胞障害性Ｔ細胞応答を抑制すること；インターロイキン−２産生を抑制すること；ＩＦＮγ産生を抑制すること；Ｔｈ１サイトカイン特性を抑制すること；ＩＬ−４産生を誘導すること；ＴＧＦβ産生を誘導すること；ＩＬ−１０産生を誘導すること；Ｔｈ２サイトカイン特性を誘導すること；および免疫抑制を検出することにおいて有用であると当業者に知られていると思われる任意の他のアッセイ法を含む、公知のインビトロでの免疫アッセイ法を用いて評価されうる。
【００６９】
免疫抑制を増強することが望ましいと思われる状態は、免疫寛容の誘導および移植拒絶、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレルギー、流産、炎症、神経変性、関節硬化症、脈管炎、遅延型過敏症、脳卒中、脊髄損傷および虚血の治療または予防を含む。
【００７０】
特に、本発明者は、以前に、ＣＤ２００を投与することが移植片拒絶を抑制することを示した。従って、ＣＤ２００ｔｒの拮抗性効果を阻害することが、移植片生着を長くするのに有用でありうる。
【００７１】
一つの態様において、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をレシピエント動物へ投与することを含む、レシピエント動物における移植または移植片の拒絶を防ぐ方法を提供する。本発明はまた、移植片拒絶を防ぐためまたは移植片拒絶を防ぐ薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒを阻害する薬剤の使用を含む。
【００７２】
レシピエントは、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、反芻動物、非ヒト霊長類および好ましくはヒトを含む動物界の任意のメンバーでありうる。移植される器官または組織は、レシピエントと同じ種由来（同種移植片）でありうる、または別の種由来（異種移植片）でありうる。組織または器官は、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、膵島、脳組織、角膜、骨、腸、皮膚および造血細胞を含む任意の組織または器官でありうる。
【００７３】
免疫抑制を増強する本発明の方法はまた、移植片中の免疫細胞がレシピエントの免疫系に対して免疫攻撃を開始する対宿主性移植片病を予防するために使用されうる。これは、移植される組織が、例えば、白血病、再生不良性貧血、および酵素または免疫欠損を治療する時に骨髄またはリンパ組織が移植される場合のような免疫細胞を含む場合に起こりうる。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、対宿主性移植片病を防ぐまたは抑制する方法を提供する。本発明はまた、対宿主性移植片病を防ぐまたは抑制するためまたは対宿主性移植片病を防ぐ薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００７４】
免疫抑制を増強するための本発明の方法はまた、自己免疫疾患を治療するまたは予防するために用いられうる。本発明者は、以前に、ＣＤ２００を投与することが自己免疫疾患を防ぐのに有用であることを示した。それゆえ、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害することが、自己免疫疾患を治療するのに有用でありうる。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、自己免疫疾患を治療するまたは防ぐ方法を提供する。本発明はまた、自己免疫疾患を防ぐためまたは自己免疫疾患を防ぐ薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００７５】
本発明に従って治療されうるまたは予防されうる自己免疫疾患は、限定されるものではないが、１型インシュリン依存性糖尿病、成人性呼吸困難症候群、炎症性腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球付着欠損症、慢性関節リウマチ、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節炎、汎発性強皮症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性脈管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、エリテマトーデス、多発性筋炎、類肉腫症、肉芽腫症、脈管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性障害、抗原−抗体複合体媒介性疾患、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス病、習慣性流産、ルナール症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、小児脂肪便症、ＡＩＤＳの自己免疫性合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎およびアジソン病を含む。
【００７６】
免疫抑制を増強するための本発明の方法はまた、アレルギー反応を治療するまたは予防するために用いられうる。アレルギー反応において、免疫系が一般的に無害な非侵害性の抗原またはアレルゲンに対して攻撃を開始する。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、アレルギー反応を治療するまたは予防する方法を提供する。本発明はまた、アレルギー反応を治療するもしくは予防するためまたはアレルギー反応を治療するもしくは予防する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００７７】
本発明の方法を用いて予防または治療されうるアレルギーは、限定されるものではないが、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、加えて、ウルシ、ハウスダストダニ、ハチ粉、ナッツ、貝、ペニシリンおよびその他多数に対するアレルギーを含む。
【００７８】
一般的に、ＯＸｔｒタンパク質を阻害することは、免疫応答を抑制することが望ましい任意の炎症性状態を治療するために用いられうる。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、炎症性状態を治療する方法を提供する。本発明はまた、炎症性状態を治療するためまたは炎症性状態を治療する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００７９】
ＯＸｔｒタンパク質はまた、神経変性疾患または状態を治療するために用いられうる。従って、本発明は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、神経変性疾患または状態を治療する方法を提供する。本発明はまた、神経変性疾患もしくは状態を治療するためまたは神経変性疾患もしくは状態を治療する薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。神経変性疾患または状態の例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、脳卒中、頭部外傷、ベル麻痺、脊椎および他の神経挫滅損傷、多発性硬化症、心筋症、腎障害、網膜症、糖尿病性合併症、緑内障、特発性腎障害、加えて、細胞の変性がある任意の状態を含む。本発明の方法はまた、早期の細胞の変性を防ぐように予防的に用いられうる。
【００８０】
本発明者は、以前に、ＣＤ２００を投与することが流産を防ぎうることを示した。それゆえ、免疫抑制を増強するための本発明の方法はまた、習慣性流産、子癇前症および早期分娩の治療を含む流産を治療するまたは防ぐために用いられうる。従って、本発明者は、ＣＤ２００ｔｒを阻害する薬剤の有効量をそれを必要としている動物へ投与することを含む、流産を防ぐ方法を提供する。本発明はまた、流産を防ぐためまたは流産を防ぐ薬物を調製するためのＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の使用を含む。
【００８１】
当業者はまた、ＣＤ２００ｔｒを阻害する特定の薬剤が流産を防ぐのに有用であるかどうかを決定することができる。例えば、当業者は、公知のインビトロでのアッセイ法を用いて免疫応答を抑制するＣＤ２００の能力を試験することにより、ＣＤ２００阻害を防ぐその能力について容易に薬剤を試験することができる。さらに、薬剤はまた、動物モデルにおいて流産を防ぐその能力についても試験されうる。例えば、流産しやすいＣＢＡ ｘ ＤＢＡ／２マウスにおいてサイトカイン誘発性流産を防ぐＣＤ２００ｔｒの能力が評価されるモデルを使用することができる。さらに、抗リン脂質で前免疫化されたマウスもまた使用されうる。
【００８２】
ＩＩＩ． 組成物
本発明はまた、免疫抑制を防ぐことに用いられるＣＤ２００ｔｒタンパク質または核酸を含む薬学的組成物、加えて、免疫抑制を増強することに用いられるＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤を含む薬学的組成物を含む。薬学的組成物はまた、本明細書に記載されているスクリーニング方法を用いて同定されるアゴニストまたはアンタゴニストを含むＣＤ２００ｔｒタンパク質に結合する分子を含む。
【００８３】
そのような薬学的組成物は、病巣内、静脈内、局所的、直腸、非経口、局部的、吸入用または皮下、皮内、筋肉内、くも膜下腔内、経腹膜、経口、および大脳内の使用向けでありうる。組成物は、液体、固体または半流動の形、例えば、ピル、タブレット、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐剤、軟ゼラチンカプセル、ゲル、膜、チューブレット、溶液または懸濁液でありうる。
【００８４】
本発明の薬学的組成物をヒトまたは動物への投与として意図することができる。投与される薬用量は、個々の必要度、所望の効果および選択された投与経路に依存する。
【００８５】
薬学的組成物は、患者に投与可能な薬学的に許容される組成物の製剤として、それ自体は公知の方法により調製されうり、例えば、活性のある物質の有効量が薬学的に許容される媒体との混合物として併用される。適する媒体は、例えば、レミングトンの薬学（「レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、マックパブリッシングカンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、Ｐａ．、ＵＳＡ １９８５）に記載されている。
【００８６】
これに基づき、薬学的組成物は、これに限らないが、１つまたは複数の薬学的に許容される媒体または希釈液と合わされている、ならびに適するｐＨおよび生理的体液との等浸透圧を有する緩衝溶液中に含まれている活性のある化合物または物質を含む。薬学的組成物は、免疫寛容を増強する免疫抑制剤もしくは抗体、または免疫応答を増強する免疫賦活剤のような他の薬剤を追加的に含みうる。
【００８７】
一つの態様において、免疫抑制を防ぐことに用いられる薬学的組成物は、薬学的に許容される希釈液または担体との混合物としてＣＤ２００ｔｒタンパク質またはＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸の有効量を含む。ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、好ましくは、患者へ投与可能な可溶性の形の免疫接着分子として調製される。ＣＤ２００ｔｒはまた、サイトカイン、アジュバント、ＣＤ２００ｒ、ＭＤ−１（本発明者による国際公開公報第０１／６８６９１号を参照）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、Ｂ７ｎ、ＬＩＧＨＴを含む他の免疫モジュレーターを含む免疫応答を増強する能力がある他の薬剤と共に、および／またはそれらの受容体に架橋結合リガンドまたは抗体を投与することにより、共投与されうる。
【００８８】
ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする本発明の核酸分子は、免疫抑制を防ぐまたは免疫応答を増強するための遺伝子治療において用いられうる。さらに、ＣＤ２００ｔｒに対するアンチセンス核酸分子は、免疫抑制を増強するための遺伝子治療において用いられうる。ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸配列またはＣＤ２００ｔｒに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組換え分子は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターのような送達媒体を用いて、インビボで細胞または組織へ直接的に導入されうる。それらはまた、微量注入法および電気穿孔法のような物理的技術または共沈殿およびリポソームへのＤＮＡの取り込みのような化学的方法を用いて、インビボで細胞へ導入されうる。組換え分子はまた、エアロゾルの形でまたは洗浄により送達されうる。本発明の核酸分子はまた、細胞への直接的注入によるような細胞外であてがわれうる。ＣＤ２００ｔｒタンパク質をコードする核酸分子は、好ましくは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域をコードする核酸分子との融合体として調製される。それとして、ＣＤ２００ｔｒタンパク質は、可溶性融合タンパク質としてインビボで発現されるであろう。
【００８９】
もう一つの態様において、免疫抑制を誘導することに用いられる薬学的組成物は、ＣＤ２００ｔｒタンパク質を阻害する薬剤の有効量を薬学的に許容される希釈液または担体との混合物として含む。薬学的組成物はまた、シクロスポリン、ＣＤ２００を含む免疫抑制分子およびＭＤ−１アンタゴニストを含む免疫賦活分子のアンタゴニストを含む、他の免疫抑制剤を含みうる。炎症状態を治療する場合、ＣＤ２００ｔｒを抗炎症剤、鎮痛剤またはステロイドと共投与することができる。
【００９０】
以下の非限定的実施例は、本発明の例証となるものである：
【００９１】
実施例
実施例１
材料および方法
マウス：オスＣ３Ｈ／ＨＥＪおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）研究所、バーハーバー、メインから購入した。マウスを５匹／ケージで場所を与え、食物および水を自由にさせた。すべてのマウスは８〜１２週間の年齢で使用された。ルイスラット（ＬＥＷ）は、スプレーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）から８週間の年齢で入手された。
【００９２】
モノクローナル抗体：以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、別な方法を述べられていない限りは、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手された：抗ＩＬ−２（Ｓ４Ｂ６、ＡＴＣＣ；ビオチン化ＪＥＳ６−５Ｈ４）；抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１、ＡＴＣＣ；ビオチン化ＢＶＤ６−２４Ｇ２）；抗ＩＦＮγ（Ｒ４−６Ａ２、ＡＴＣＣ；ビオチン化ＸＭＧ１．２）；抗ＩＬ−１０（ＪＥＳ５−２Ａ５；ビオチン化、ＳＸＣ−１）；抗ＩＬ−６（ＭＰ５−２０Ｆ３；ビオチン化ＭＰ５−３２Ｃ１１）；抗ＴＮＦα（Ｇ２８１−２６２６；ビオチン化ＭＰ６−ＸＴ３）；ＦＩＴＣ抗ＣＤ８０、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８６、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４０、Ｌ３Ｔ４（抗マウスＣＤ４）、抗ｔｈｙ１．２および抗Ｌｙ２．２は、シーダーレーンラボラトリーズ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）、ホーンビー、オンタリオから入手された。ＤＥＣ２０５（抗マウス樹状細胞）を産生するハブリドーマは、Ｒ． スタインマン（Ｒ． Ｓｔｅｉｎｍａｎ）博士からの親切な贈与であり、ＦＩＴＣで直接的に標識された；ＰＥ−結合型ラット抗マウスＣＤ２００（３Ｂ６）および抗ヒトＣＤ２００（Ａ９Ａ２）は、バイオスパーク社（ＢｉｏＳｐａｒｋ Ｉｎｃ．）、ミシソーガ、オンタリオ、カナダから入手された。ラット抗ＣＤ２００ｔｒのＦＩＴＣ結合は、標準的プロトコールに従って行なわれた。
【００９３】
ストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼおよび組換えマウスＧＭ−ＣＳＦは、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、ＣＡ）から購入された。
【００９４】
細胞の調製：単細胞脾臓懸濁液を飼育用マウスのプールから無菌的に調製し、遠心分離後、細胞を２−メルカプトエタノールおよび１０％ウシ胎児血清（αＦ１０）で補充されたα−最小必須培地（α−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に再懸濁した。ＤＥＣ２０５で染色された（＞９０％）、ＬＰＳ脾臓ＤＣは、スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）らにより記載されているように、接着新鮮脾臓細胞の一晩の培養（１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ）により得られた。ヒトＤＣは、ボランティアドナー由来の細胞のヒパーク精製に従って得られる接着ＰＢＬの同様の一晩の培養により得られた。
【００９５】
樹状細胞（ＤＣ）での門脈（ｐｖ）免疫化を以前に記載されているように行った：
ｐｖ免疫化のための骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）は、５００ Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦの存在下で、Ｌ３Ｔ４、抗ｔｈｙ１．２、抗Ｌｙ２．２処理されたマウス骨髄細胞の７日間の培養により得られた。ＦＩＴＣ結合ＤＥＣ２０５モノクローナル抗体で染色された試料の一定分量は、９１％ ± ８％のオーダーでの平均染色を示した。
【００９６】
ＣＤ２００ｔｒを発現するＣＨＯ細胞の安定的形質導入および抗ＣＤ２００ｔｒモノクローナル抗体の産生：
ＬＰＳで刺激された脾臓接着細胞から抽出されたＲＮＡおよび完全長ＣＤ２００ ｃＤＮＡについての５’／３’プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより、それぞれ、〜８００ ｂｐ（完全長ＣＤ２００をコードする）および〜７００ ｂｐの２つのｍＲＮＡ種が明らかになる（図５参照）。後者は、完全長ｍＲＮＡ種のエキソン２を欠損するスプライスバリアントをコードし、エキソン１での翻訳の開始に続いて、エキソン３での中途での停止コドンと関連している。しかしながら、約１００ ｂｐ下流の第二のＡＴＧ開始コドンが、理論上、このｍＲＮＡ（ヒトおよびマウス、それぞれについて、図１（配列番号：１および配列番号：２）および図２（配列番号：３および配列番号：４））からＣＤ２００の切断型（ＣＤ２００ｔｒ）の発現へと導く。完全長および推定上の切断型の５’末端のｃＤＮＡ配列は、中途での（ＣＤ２００についてフレーム外）停止コドン（太字）および下記の下線の引かれたＣＤ２００ｔｒにおける代替の翻訳ＡＴＧ開始コドンで示されている。
【００９７】
マウスＣＤ２００リーダー配列（配列番号：９）
2004513660.tif 000003
【００９８】
ヒトＣＤ２００リーダー配列（配列番号：１０）
2004513660.tif 000004
【００９９】
ヒトおよびマウスのＣＤ２００ｔｒの両方のスプライスバリアントについてのｃＤＮＡは、末端にＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１のクローニング部位を導入するように選択された５’／３’プライマー対で構築された。単位複製配列をＰＥＧＦＰ−Ｎ２クローニングベクター（クロンテック（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ））へ連結し、ＤＨ５α細胞の形質転換後、カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを１μｇ ｃＤＮＡおよび２．５μｌ リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））を用いてＣＨＯ細胞のトランスフェクションのために抽出した。ＧＦＰ融合タンパク質発現は、蛍光顕微鏡により評価され、トランスフェクション効率は通常、〜５０％から７０％である。トランスフェクション後４８時間、細胞を５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））で選択した。１０日目で、細胞を区分けしてＧＦＰ陽性細胞を選択し、挿入断片をＲＴ−ＰＣＲにより確認し、そしてＧＦＰ融合タンパク質を発現しているＣＤ２００ｔｒ−陽性細胞を再クローニングした。９８％〜１００％の蛍光細胞をもついくつかのクローンを同定した。ヒトまたはマウスのＣＤ２００ｔｒを発現しているクローンの各１個由来の細胞を用い、０．２ ｍｌ完全フロイントアジュバント中において各グループの３匹のルイスラットを腹腔内（１０ ｘ １０６ 細胞／注入） ｘ ３、２週間間隔で免疫した。その後、２つの異なる免疫されたラットのグループ内での脾臓細胞をプールし、以前に記載されているように、各細胞の一定分量をラットハイブリドーマ親細胞系ＹＢ２／０と融合させた。細胞を分泌するハイブリドーマの上清をヒトまたはマウスのＣＤ２００ｔｒで形質導入されたＣＨＯの染色についてＦＡＣＳによりスクリーニングした。陽性ハイブリドーマ細胞を再クローニングし、一定分量を液体窒素中で凍結し、そしてその上清をさらなる特徴づけのために用いた（下記参照）。
【０１００】
細胞障害性およびサイトカインアッセイ法：
同種間のマウスにおいて、サイトカイン産生Ｃ３Ｈレスポンダー細胞を評価するために用いられる混合白血球培養物（ＭＬＣ）をαＦ１０において３連で、マイトマイシン−Ｃ処理された（３７℃で４５分間）Ｃ５７ＢＬ／６脾臓スティミュレーター細胞の等量で刺激した。上清を同型ウェルから４０時間でプールし、下記のように、リンホカイン産生についてＥＬＩＳＡアッセイ法またはバイオアッセイ法において３連でアッセイした。
【０１０１】
すべてのサイトカインを上記のように、捕獲およびビオチン化検出モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイ法で測定した。上清の様々な容量を１００ ｎｇ／ｍｌモノクローナル抗体でプレコーティングされたプレートに４℃、３連で結合させ、３回洗浄し、そしてビオチン化検出モノクローナル抗体を加えた。洗浄後、プレートをストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（シーダーレーンラボラトリーズ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ））とインキュベートし、適当な基質で展開し、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ４０５を測定した。標準化用組換えサイトカインは、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手された。すべてのアッセイは、４０ ｐｇ／ｍｌ〜４０００ ｐｇ／ｍｌの範囲で感受性を示した。細胞障害性をアッセイするにおいて、細胞を５日目にＭＬＣから収集し、５１Ｃｒ標識化ＥＬ４腫瘍標的細胞の死滅（３７℃で４時間）について異なるエフェクター：標的比で滴定した。
【０１０２】
ヒトＭＬＣを使用する場合、３連の培養物の各グループを１ ｘ １０６ レスポンダーＰＢＬおよび５ ｘ １０５ マイトマイシン−ｃ処理化同種スティミュレーターＰＢＬで構成した。培養物を６日目にプールし、ＭＬＣにおいてスティミュレーターとして用いられたのと同じドナー由来の５１Ｃｒ標識された、７２時間のＣｏｎＡ活性化標的ＰＢＬ芽細胞の溶解について滴定した。
【０１０３】
マウスＣＤ２００ＦｃおよびＣＤ２００ｔｒＦｃの調製
ＣＤ２００の細胞外ドメインがマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域へ遺伝子的に連結されているマウスＣＤ２００Ｆｃをバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）ベクターへクローニングし、他の場所で記載されているように、Ｓｆ９昆虫細胞において発現させた。培地における可溶性産物の収量は、〜１μｇ／ｍｌであった。材料を抗Ｆｃアフィニティカラム上でのＭｇＣｌ２を用いる溶出で濃縮した。切断された産物の可溶性型（ＣＤ２００ｔｒＦｃ）の産生は、同様のプロトコールに従い、切断された分子の代替の開始部位から増幅するために選択された代替の５’プライマー（上記参照）、（ＣＤ２００Ｆｃ分子について用いられたのと）同一の３’プライマーを用いて、完全長ＣＤ２００ ｃＤＮＡを除去するための制限酵素消化後、ＣＤ２００Ｆｃ ｃＤＮＡを含むベクターへ直接的にクローニングおよびライゲーションを行った。クローニング後、その新しいベクター構築物をカセットへのＣＤ２００ｔｒのライゲーションを確認するためにシーケンシングした。
【０１０４】
結果
ＣＤ２００およびＣＤ２００ｔｒに対するモノクローナル抗体は、ウエスタンゲルにおいて別個の分子を認識する：
ＬＰＳで刺激された脾臓ＤＣは、ＬＰＳでの一晩のインキュベーション後の３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスからプールされた細胞から得られた（材料および方法を参照）。ヒト接着ＰＢＬは、同様に、ＬＰＳで一晩、インキュベートされた。各試料からの細胞をウエスタンゲル分析のためにトリス緩衝液で抽出し、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動およびＰＶＤＦ膜へ転写した（ノベックス社（Ｎｏｖｅｘ Ｃｏ．）、サンディエゴ、ＣＡ）。膜を抗ＣＤ２００モノクローナル抗体および材料および方法において記載されているようにＦＡＣＳスクリーニングにより選択された推定上の抗ＣＤ２００ｔｒでスクリーニングした。アイソタイプ適合型ラットＩｇを対照として使用した。対照レーンはまた、対照ＣＨＯ細胞および完全長ヒトまたはマウスのＣＤ２００またはＣＤ２００ｔｒのいずれかを発現するように形質導入された細胞からの等価のタンパク質抽出物を含んだ。膜を抗ラット西洋わさびペルオキシダーゼおよび基質を用いて展開し、典型的なブロットとしてのデータを図６に示した。
【０１０５】
マウス細胞抽出物を用いた場合の上部パネルでのデータより、抗ＣＤ２００は脾臓抽出物からの４５ Ｋｄ〜４８ Ｋｄ分子のみを検出し、完全長ＣＤ２００で形質導入されたＣＨＯ細胞において、他のバンドが見られなかったことが示された。対照的に、推定上の抗ＣＤ２００ｔｒ抗体は、ＣＤ２００でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の抽出物と反応する一方で、脾臓ＤＣおよびＣＤ２００ｔｒで形質導入されたＣＨＯ細胞の両方の抽出物においてより低分子量のバンド（〜３５ Ｋｄから４０ Ｋｄ）もまた検出した。これらのデータは、プレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ）らの予測と一致している、つまり、完全長ＣＤ２００分子において抗ＣＤ２００モノクローナル抗体により検出される免疫原性エピトープはその分子のＮＨ２−末端領域にある（だから、おそらくＣＤ２００ｔｒに存在しないものと思われる）。
【０１０６】
この図の下部パネルでの同様のデータは、ＬＰＳで刺激されたＰＢＬまたは完全長または切断型のヒトＣＤ２００についての各ｃＤＮＡで形質導入されたＣＨＯ細胞の抽出物を用いる、ヒト抗ＣＤ２００モノクローナル抗体および抗ヒトＣＤ２００ｔｒモノクローナル抗体の特異性を示す。またしても、抗ＣＤ２００はＤＣにおいて単一のバンドのみを検出したが、抗ＣＤ２００ｔｒは２つのバンドを検出した。
【０１０７】
抗ＣＤ２００および抗ＣＤ２００ｔｒによるＬＰＳで刺激されたマウスの脾臓ＤＣまたはヒトＰＢＬ ＤＣの染色：
それぞれ上記のように調製された、新鮮なＬＰＳで刺激されたマウスの脾臓ＤＣまたはヒトＰＢＬ ＤＣの一定分量を相同的なＰＥ−抗ＣＤ２００またはＦＩＴＣ−抗ＣＤ２００ｔｒで、単独または逐次（最初抗ＣＤ２００で、次に抗ＣＤ２００ｔｒ）のいずれかで、染色した。図７のデータ（３研究のうちの１つ）は、ＣＤ２００＋ ＤＣもまたＣＤ２００ｔｒを発現していることを示し、結果は、ＤＣ組織試料に見出された２つのｍＲＮＡ種と一致している。
【０１０８】
ＣＤ２００ｔｒを発現するＣＨＯ細胞は可溶性ＣＤ２００Ｆｃにより誘導されるＭＬＣにおける阻害に拮抗する：
可溶性（相同的）免疫接着、ＣＤ２００Ｆｃの１５０ ｎｇ／ｍｌの存在下において惹起されるヒトまたはマウスＭＬＣ培養物は、インビトロで、ＣＴＬ誘導、増殖および１型サイトカイン産生の阻害を示す。この抑制は、ＦＩＴＣ結合型ＣＤ２００Ｆｃにより染色されうる（すなわち、ＣＤ２００Ｒ＋個体群）ＬＰＳで刺激された脾臓マクロファージ（Ｍｐｈ）のマウスのＭＬＣでの含有により増強される。上記に示されるデータは、ＬＰＳで刺激されたＤＣがＣＤ２００およびＣＤ２００ｔｒの両方を発現していることを示しているが、これらのデータは、ＣＤ２００ｔｒの発現が何らかの機能的関連性をもつことを示してはいない。従って、本発明者らは、マウスおよびヒトの両方の細胞について同種刺激されたＭＬＣ培養物を設定し、外来性ＣＨＯ細胞、またはＣＤ２００もしくはＣＤ２００ｔｒのｃＤＮＡで形質導入されたＣＨＯの存在下または非存在下において、ＣＤ２００Ｆｃにより誘導される抑制を評価した。図８ａ／ｂのデータは、ＣＴＬの誘導（ヒト）またはＣＴＬ、増殖およびＩＬ−２産生の両方（マウスＭＬＣ）の阻害を評価する、ヒト／マウス細胞のそれぞれについてのそのような研究の典型的結果である。
【０１０９】
これらのデータは、可溶性ＣＤ２００Ｆｃにより生じる抑制がＣＨＯまたはＣＤ２００で形質導入されたＣＨＯ細胞の培養物での含有により減少しないが、ＣＤ２００ｔｒで形質導入されたＣＨＯ細胞の含有により、著しく減少することを明らかに示している。このように、ＣＨＯ細胞の表面上に発現されるＣＤ２００ｔｒは、これらの培養において、ＣＤ２００Ｆｃの免疫抑制剤機能のアンタゴニストとして機能している。
【０１１０】
ＣＤ２００ｔｒの可溶性型、ＣＤ２００ｔｒＦｃは、可溶性ＣＤ２００Ｆｃにより媒介される免疫抑制に拮抗する：
ＣＤ２００ｔｒの可能性のあるアンタゴニストの性質を調べるための最後の研究として、バキュロウイルス発現系において調製された可溶性型マウスＣＤ２００ｔｒ（ＣＤ２００ｔｒＦｃ）の様々な量を免疫抑制剤ＣＤ２００Ｆｃの一定量（１５０ ｎｇ／ｍｌ）の存在下で惹起されたＭＬＲ培養へ添加することの効果を調べた。この研究についてのデータ（３実験のうちの１つ）は図９に示されている。
【０１１１】
このデータより、抑制を減少したＩＬ−２産生またはＣＴＬによる標的の溶解のいずれにより評価しても、可溶性型ＣＤ２００ｔｒはＣＤ２００Ｆｃにより誘導される抑制に対する競合的阻害剤であることが確認される。
【０１１２】
考察
抗原特異的門脈の前移植または周囲移植の免疫化後のドナー腎臓の同種移植片に対する非応答性は、１型サイトカイン産生細胞よりむしろ、２型の優先的活性化に関連している。Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ経由のシグナル伝達および抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの共刺激シグナルの適当な送達に依存している。本発明者は、同種応答性の調節におけるもう一つの分子、ＣＤ２００についての役割を実証し、および抗ＣＤ２００モノクローナル抗体が、門脈免疫化後の増加した移植片生着を逆転させ、かつＩＬ−２産生を増加させることを示した。ＣＤ２００分子における任意の細胞内シグナル伝達ドメインの欠損に基づいて、ＣＤ２００の（抑制性）シグナル伝達は、標的細胞表面上の受容体、ＣＤ２００Ｒの結合の結果として起こることが以前に仮定されており、最近、ＣＤ２００Ｆｃ（ＣＤ２００の可溶性型）およびＣＤ２００Ｒ＋細胞の混合物を用いて移植片拒絶の最適な抑制が示された。
【０１１３】
ＣＤ２００＋発現リンパ造血性組織から抽出されたＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ研究により、２つの別々のｃＤＮＡバンドが明らかになり、その１つは、エキソン２（ＣＤ２００のリーダー配列の一部をコードする）が欠損しているスプライスバリアントに対応している。これは翻訳される配列におけるフレームシフト、および早期の停止コドンに関連している。従って、この切断されたＣＤ２００（ＣＤ２００ｔｒ）からの発現は生じないと仮定された（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏら、１９９８）。しかしながら、下流にもう一つのＡＴＧ開始コドンの存在があり、この代替スプライシングに従ってフレームシフトを修正するだろうとすれば、実際、この代替配列の翻訳を検出することが可能ではないかと考えた。ＣＤ２００ｔｒの計画的な構築およびＣＨＯ細胞における発現後、ヒトおよびマウスのＣＤ２００ｔｒの両方に対するモノクローナル抗体を産生させ、両方の種においてＣＤ２００ｔｒ発現が見られることを示した。
【０１１４】
このＣＤ２００の切断型の可能性のある機能を評価するために、ＣＤ２００ｔｒをＣＨＯ細胞において（表面分子として）、およびマウスのＩｇＧ２ａ Ｆｃ領域に連結された可溶性の形（ＣＤ２００ｔｒＦｃ）で発現させた。マウスまたはヒトＭＬＣ培養物は、その後、ＣＤ２００Ｆｃの存在下において、単独または形質導入されていないＣＨＯもしくはＣＤ２００（ＣＤ２００ｔｒ）で形質導入されたＣＨＯの添加で、惹起された。同様の培養物は、ＣＤ２００Ｆｃに対するアンタゴニストとして可溶性ＣＤ２００ｔｒＦｃを用いてマウス細胞で設定された。図８および図９に示されるデータは、リンパ球機能（ＣＴＬの誘導、ＩＬ−２の産生）のアッセイにより実証されているように、ＣＤ２００ｔｒが、細胞表面上にまたは可溶性の形のいずれで発現されても、ＣＤ２００の天然のアンタゴニストであることの証拠を提供している。
【０１１５】
ＣＤ２００／ＣＤ２００ｔｒの組織発現において明らかな差がある。ほんの１つの例として、脳組織はＣＤ２００ｔｒをコードするスプライスバリアントｍＲＮＡをほとんどか全く、発現しない。ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒの相互作用は免疫調節において重要であるため、従って、所定の組織におけるＣＤ２００／ＣＤ２００ｔｒの相対的発現レベルの調節は、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒの相互作用による免疫調節に、さらにもう一つの複雑性のレベルを加えている可能性が高いように思われる。本発明者は、移植（同種および異種移植の両方）において、および自己免疫疾患、膠原誘導性関節炎の動物モデルにおいてのＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒの相互作用についての重要な役割をすでに確証した。ＣＤ２００ノックアウトマウスの研究から、フーク（Ｈｏｅｋ）ら、（２０００）は、骨髄の分化経路の細胞、および中枢神経系内の炎症過程における調節においてのＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒの相互作用についての役割を推測した。限定された組織発現を示す多様なアイソフォームをもつ、ＣＤ２００Ｒファミリーにおける不均一性に関する最近のデータ（ＧｏｒｃｚｙｎｓｋｉおよびＭａｒｓｄｅｎ、未発表）を考慮すれば、この分子系による炎症および／または免疫過程の全体的調節が、多くの臨床的疾患において決定的な重要性をもつであろう。
【０１１６】
本発明は、好ましい実施例であると現在考えられることに関して記載されてきたが、本発明が開示された実施例に限定されないことは、理解されるべきである。それと反対に、本発明は、添付された特許請求の範囲の意図および範囲内に含まれる様々な改変および等価の組み合わせを網羅するものである。
【０１１７】
あらゆる刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が詳細にかつ個々に示されて参照として完全に組み入れられているのと同程度まで完全に、参照として本明細書に組み入れられている。
【０１１８】
本明細書において参照される参考文献に関する完全引用
2004513660.tif 000005
【図面の簡単な説明】
本発明は、ここにおいて、図面に関して記載される：
【図１Ａ】図１Ａおよび配列番号：１は、ヒトＣＤ２００の核酸配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂおよび配列番号：２は、ヒトＣＤ２００ｔｒの核酸配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび配列番号：３は、マウスＣＤ２００の核酸配列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂおよび配列番号：４は、マウスＣＤ２００ｔｒの核酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび配列番号：５は、ヒトＣＤ２００のアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂおよび配列番号：６は、ヒトＣＤ２００ｔｒのアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび配列番号：７は、マウスＣＤ２００のアミノ酸配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂおよび配列番号：８は、マウスＣＤ２００ｔｒのアミノ酸配列を示す。
【図５】ＬＰＳで刺激されたマウス脾臓細胞由来のｃＤＮＡを用いるＣＤ２００のスプライスバリアントのＰＣＲ検出を示す。第１レーンにおいて、５’プライマーおよび３’のプライマーは、ＣＤ２００ ｃＤＮＡのエキソン１およびエキソン３由来であった。第２レーンにおいて、同じ領域由来のネステッドプライマーが使用された。レーン３において、５’プライマーおよび３’プライマーの両方ともエキソン３由来だった−従って１つのバンドのみが見られる。
【図６】ヒトまたはマウスの抗ＣＤ２００または抗ＣＤ２００ｔｒによる、対照ＣＨＯ細胞および形質導入されたＣＨＯ細胞における固有の分子量バンドの検出を示すウエスタンゲルを示す。新鮮な組織抽出物は、ＬＰＳで刺激されたヒトＰＢＬまたはマウス脾臓から、または、対照ＣＨＯまたはヒトもしくはマウスＣＤ２００／ＣＤ２００ｔｒで形質導入されたＣＨＯからであった。
【図７】ＬＰＳで刺激されたマウスの脾臓ＤＣまたはヒトのＰＢＬ由来ＤＣのＦＡＣＳ分析によりＰＥ−抗ＣＤ２００およびＦＩＴＣ−抗ＣＤ２００ｔｒでの細胞の二重染色が表されていることを示す。
【図８】相同ＣＤ２００ｔｒを発現するＣＨＯ細胞によるヒト培養物（パネルａ）またはマウス培養物（パネルｂ）における、ＣＤ２００：ＦｃによるＭＬＣ反応性の阻害の拮抗作用を示すグラフである。パネルａのデータは、ＣＴＬ応答についてのみである；パネルｂにおいて、ＣＴＬの阻害、増殖（３ＨＴｄＲ）およびＩＬ−２産生が示されている。すべての場合において、ＭＬＣ培養物は、１ ｘ １０６レスポンダー細胞および５ ｘ １０５マイトマイシン−ｃ処理化同種スティミュレーター細胞を含んだ。実験的培養物は、５ ｘ １０４ＣＨＯ細胞の含有または非含有（対照細胞、または示されるようにＣＤ２００／ＣＤ２００ｔｒ ｃＤＮＡで形質導入された）において、さらに、１００ ｎｇ／ｍｌ ＣＤ２００：Ｆｃ（マウスまたはヒトのいずれか）を含んだ。ＣＴＬは６日目で、増殖は培養の３日目で、およびＩＬ−２産生は培養の４８時間目でアッセイされた（より詳細については材料および方法を参照）。
【図９】ＣＤ２００ｔｒＦｃの力価量（０ ｎｇ／ｍｌ〜１５０ ｎｇ／ｍｌ）による、ＭＬＣ培養物におけるＣＤ２００Ｆｃ（１５０ ｎｇ／ｍｌ）によるＣＴＬ誘導およびＩＬ−２産生の抑制の拮抗作用を示す棒グラフである。培養物は、５ ｘ １０６ Ｃ３Ｈレスポンダーおよび２．５ ｘ １０６ Ｃ５７ＢＬ／６スティミュレーター脾臓細胞を含んだ。ＩＬ−２産生は、培養の４０時間目に上清において測定された（ＥＬＩＳＡ）。１ ｘ １０４ ＥＬ４標的細胞（５０：１ エフェクター：標的比）の溶解は、培養の５日目に５１Ｃｒアッセイにおいて評価された。データは、１５０ ｎｇ／ｍｌのＣＤ２００ＦｃまたはＣＤ２００ｔｒＦｃの単独の存在下において、またはＣＤ２００ｔｒＦｃを追加したＣＤ２００Ｆｃを用いて、対照応答（１４±１．９％溶解；１０５０±１９０ ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−２）の平均阻害（±ＳＤ）を示す。＊ｐ＜ ０．０５；＊＊， ｐ＜０．０２、ＣＤ２００Ｆｃ単独を含む培養物との比較による。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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