(57)【要約】ヒト末梢血単核細胞または多核白血球、または固定した組織細胞の炎症誘発応答の阻害方法を記載する。前記細胞を炎症誘発物質と接触させて炎症誘発応答を刺激する。次いで、前記細胞をＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質と接触させて、それによってＧ蛋白質によって媒介される炎症誘発応答シグナル伝達経路を阻害する。Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質が炎症誘発物質によって刺激されたヒト末梢血単核細胞または多核白血球の細胞表面受容体に結合した受容体複合体について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症誘発物質と接触したとき、ヒト末梢血単核細胞または多核白血球、または固定組織細胞の炎症誘発応答を阻害する方法であって、前記細胞をＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質と接触させ、それによってＧ蛋白質によって媒介される炎症応答シグナル伝達経路を阻害することを含む方法。
【請求項２】
前記ヒト末梢血単核細胞がリンパ球および単球、または顆粒球から選択された多核白血球から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト末梢血単核細胞または多核白血球が好酸球、好塩基球、および活性化したＴ細胞から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固定組織細胞が肥満細胞、樹状細胞、星状細胞またはマクロファージから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症誘発物質がサイトカイン、ケモタキシンおよびマイトジェンから選択された請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記炎症誘発物質がｆＭＬＰ、活性化した補体断片、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαから選択された請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
炎症誘発物質と接触したとき、ヒト末梢血単核細胞若しくは多核白血球または固定組織細胞の炎症誘発応答を阻害する方法であって、細胞表面受容体とＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質との複合体を形成し、それによって炎症誘発応答を阻害することを含む方法。
【請求項１０】
前記細胞表面受容体がホルミルペプチド受容体である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記炎症誘発応答が下流受容体を阻害することを含み、該下流受容体がイムノグロブリン、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαから成る群から選択されたサイトカイン、またはＣ５ａ、ＦＭＬＰ、ＰＡＦ、ＬＴＢ４から成る群から選択されたケモカインから選択された物質の受容体である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト末梢血単核細胞がリンパ球および単球または好酸球および好塩基球から選択された多核白血球から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト末梢血単核細胞または多核白血球が好酸球、好塩基球、および活性化したＴ細胞から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記固定組織細胞が肥満細胞、樹状細胞、星状細胞またはマクロファージから選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症誘発物質がサイトカイン、ケモカイン、ケモタキシンおよびマイトジェンから選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症誘発物質がｆＭＬＰ、活性化した補体断片、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαから選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕペプチドである請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅである請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質および炎症誘発物質によって刺激されたヒト末梢血単核細胞若しくは多核白血球、または固定した組織細胞の細胞表面受容体を含む受容体複合体。
【請求項２０】
前記ヒト末梢血細胞がリンパ球および単球から選択された単核細胞または好酸球および好塩基球から選択された多核白血球である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記固定組織細胞が肥満細胞、樹状細胞、星状細胞およびマクロファージから選択された請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕペプチドである請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅである請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症誘発物質がサイトカイン、ケモカイン、ケモタキシンおよびマイトジェンから選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症誘発物質がｆＭＬＰ、活性化した補体断片、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子またはＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαから選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の同定方法であって、
ａ）活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞を、サイトカイン、ケモカイン、ケモタキシン、およびマイトジェンから成る群から選択された公知の炎症誘発媒介物と接触させて炎症誘発応答を惹起する段階、
ｂ）段階ａ）にＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の候補物質を添加する段階、および
ｃ）（ｉ）前記候補アンタゴニストおよび前記炎症誘発媒介物と同時に接触した炎症誘発細胞と（ｉｉ）前記炎症誘発媒介物とのみ接触した炎症誘発細胞とを比較して調節Ｇ蛋白質キナーゼの増減を検出する段階を含む前記方法。
【請求項２７】
前記炎症誘発媒介物質がｆＭＬＰ、活性化した補体断片、ロイコトリエンＢ４、および血小板活性化因子、またはＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαから選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞の表面上の受容体と結合したＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質を含む細胞表面受容体複合体であって、それによって炎症誘発物質に対する炎症誘発細胞応答の阻害を提供する複合体。
【請求項２９】
Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の同定方法であって、前記方法が、
活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞を、三量体Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質候補と接触させる段階、および
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質候補と接触していない細胞と比較してＰＬＣγ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、およびＥＲＫ−１の量変化がなく、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、Ｒｅｆ、Ｒａｓ、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配を決定する段階を含む方法。
【請求項３０】
ヒト末梢血単核細胞または多核白血球の細胞表面受容体および
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質を含む細胞表面受容体複合体であって、
前記細胞表面受容体複合体を表さない細胞と比較して、前記細胞における蛋白質キナーゼの分配がＰＬＣγ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、およびＥＲＫ−１の量に変化がなく、ＰＩ３（１１３Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、Ｒａｆ、Ｒａｓ、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少しているようになっている細胞表面受容体複合体。
【請求項３１】
前記細胞表面受容体がＦＰＲ受容体である請求項３０に記載の細胞表面受容体複合体。
【請求項３２】
前記ヒト末梢血単核細胞または多核白血球のＩＬ−４による刺激によって、前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配が、前記受容体複合体を表さない刺激された細胞と比較して、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、ＲａｓおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している請求項３０に記載の細胞表面受容体複合体。
【請求項３３】
前記ヒト末梢血単核細胞または前記多核白血球の炎症誘発物質、ＩＬ−１３による刺激によって、前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配が、前記受容体複合体を表さない刺激された細胞と比較して、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１１３Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、Ｒａｆ、Ｒａｓ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少している請求項３０に記載の細胞表面受容体複合体。
【請求項３４】
前記ヒト末梢血単核細胞または前記多核白血球の炎症誘発物質、Ｃ５ａによる刺激によって、前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配が、前記受容体複合体を表さない刺激された細胞と比較して、ＰＩ３（８３Ｋｄ）およびＲａｆの量が増加しており、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１１３Ｋｄ）、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少している請求項３０に記載の細胞表面受容体複合体。
【請求項３５】
前記ヒト末梢血単核細胞または前記多核白血球の炎症誘発物質、ＴＮＦαによる刺激によって、前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配が、前記受容体複合体を表さない刺激された細胞と比較して、Ｒａｆ、ＥＲＫ−１、Ｒａｓ、Ｇ蛋白質αキナーゼ、Ｇ蛋白質βキナーゼおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が増加しており、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１１３Ｋｄ）、およびＰｐ６０　Ｓｒｃキナーゼの量が減少している請求項３０に記載の細胞表面受容体複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、末梢血細胞の表面上に見られるＮ−ホルミルペプチド受容体に関しており、特にこのような受容体とＧ蛋白質シグナル伝達経路を変更するか、または中断する薬剤、特にある種のＮ−ホルミルペプチドとの複合体、および炎症誘発物質による共同刺激によってシグナル伝達を変更する方法に関している。
【０００２】
発明の背景
人体は、細菌が産生するＮ−ホルミルメチオニンペプチドを食細胞、特に好中球および単球の化学誘因物質として使用した防御機構を発達させるように進化してきた。Ｎ−ホルミルペプチドの中でも、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰ）は、好中球を活性化し、好中球からのリソソーム酵素の放出を促進する能力が最も高いことが確認された（Ｓｈｏｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：１１５４〜１１６９、１９７６）。その後、合成したテトラペプチド、特にｆ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕおよびｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅはまた、好中球応答を誘発することが示された（Ｒｏｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ　８４：７９６７〜７９７１、１９８７）。これらのペプチドの能力は、当初は（１）Ｎ末端のホルミル基、（２）メチオニン側鎖、および（３）ロイシンおよびフェニルアラニン側鎖によるものとされた。
【０００３】
Ｎ−ホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ）ｃＤＮＡのクローニングに続いてＦＰＲ蛋白質の１次構造が明らかにされたことによって、Ｎ−ホルミルペプチドの作用機構が躍進的に理解された（Ｂｏｕｌａｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：１１１２３〜１１１３３、１９９０；Ｂｏｕｌａｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６８：１１０３〜１１０９、１９９０）。ＦＰＲは好中球および単球上で最初に発見されたが、その後ヒト脳、肝細胞、樹状細胞、および星状細胞でも発現していることが示された（Ｌａｃｙ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７１〜７８、１９９５；Ｓｏｚｚａｎｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２〜３２９５、１９９５）。その後、さらに２種のＦＰＲ遺伝子、ＦＰＲ２（ＦＰＲＬ１およびＦＰＲＨ１としても知られる）（Ｂｏａ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１３：４３７〜４４０、１９９２；Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７６３７〜７６４３、１９９２；Ｙｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８４：５８２〜５８９、１９９２）およびＦＰＲＬ２（Ｂａｏ他、前述）が単離された。ＦＰＲＬ１は、３５１個のアミノ酸から成り、ＦＰＲと７０％が同一であるが、ＦＭＬＰに対する親和性が最初のＦＰＲの４００倍であることが発見された（Ｋｄ＝１ｎＭ）。ＦＰＲＬ２はＦＰＲと５６％同一で、ＦＰＲＬ１とは８３％同一である。しかし、単球と好中球の両者に発現するＦＰＲＬ１とは異なり、ＦＰＲＬ２は単球では発見されたが好中球では発見されなかった（Ｄｕｒｓｔｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０：１７４〜１７９、１９９４）。
【０００４】
ＦＰＲには、原形質膜に広がり、細胞外空間または細胞内空間のいずれかに暴露した親水性配列が結合した７個の疎水性ドメインが含まれている（Ｍｕｒｐｈｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３〜６３３、１９９４）。第１および第３の細胞内ループは比較的小さくて、それぞれ５個および１６個のアミノ酸から成る。カルボキシ末端は細胞内空間にさらされており、一方Ｎ末端は細胞外空間にさらされている。細胞内配列にはさらに、Ｇ蛋白質結合ドメイン（以下に論じる様な受容体の機能に必須なドメイン）およびリン酸化を行うドメインが含まれる。
【０００５】
ＦＭＬＰ結合ドメインは、ＦＰＲの第１および第３の細胞外ドメインに位置するようである（Ｑｕｅｈｅｎｂｅｒｇｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８１６７〜１８１７５、１９９３）。さらに、ＦＭＬＰ結合に対する結合状態が高親和性と低親和性で交互するといったＦＰＲ状態の相互変換性が指摘されている（Ｋｅｒｍｏｄｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７６：７１５〜７２３、１９９１）。Ｇ蛋白質は、このような相互交換状態を調節するものと考えられる。Ｇ蛋白質の関与なしで、ＦＰＲだけでは親和性の状態は低く、一方ＦＰＲがＧ蛋白質に結合すると高い親和性の状態が示される。様々なペプチドに認められる様々な効果を説明するために、さらにＧ蛋白質結合ＦＰＲを３種の異なる状態にモデル分けした。状態Ｉは、ＦＰＲはＧ蛋白質とは関与せず、親和性の低い状態であるが、Ｇ蛋白質と結合することによって親和性の高い状態、状態ＩＩに変換することができる。状態ＩＩＩは受容体がリガンドと結合しながら、Ｇ蛋白質のＧαサブユニットを遊離する親和性の高い中間的な状態である。状態ＩＶは一時的に親和性の低い状態で、残存するＧ蛋白質サブユニット（ＧβおよびＧγ）が受容体から分離する。Ｇ蛋白質Ｇαサブユニットの分離によって、Ｇ蛋白質のエフェクター機能が引き起こされ、細胞活性化が生じる。同様のモデルがＳｋｌａｒ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８４８３〜８４８６、１９８９）によっても提案された。
【０００６】
前記モデルでは、ペプチドの効果は状態ＩＩＩでの滞留時間によって決定される（Ｋｅｒｍｏｄｅ他、前述）。著者等は、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨＢｚｌなどの最も効果の高いホルミルペプチドが状態ＩＩＩを一時的に安定化して維持すると直ちに脱顆粒応答の引き金となるが、この状態ＩＩＩの期間では走化応答のシグナルが持続して、最大限の移動が可能になることを提案した。効果の低いホルミルペプチドによっては、高親和性の状態ＩＩＩから低親和性の状態ＩＶへの変換が迅速に媒介される。状態ＩＩＩでの初期脱顆粒応答は影響を受けないが、走化性シグナリング能は最小限になり、したがって細胞移動は制限される。したがって、一般に、高い効果のリガンドは高い親和性状態のＦＰＲと結合することによって走化性応答をもたらし、低い効果のリガンドは親和性の低いＦＰＲと結合することによって脱顆粒応答をもたらすと言うことができる。
【０００７】
アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性はまた、このモデルを使用して定義することができる。アゴニストは活性化した受容体の状態ＩＩＩを安定化して、安定化の程度はその効果によって変わる。一方、アンタゴニストは受容体に結合するが、活性化した状態ＩＩＩを不安定にし、受容体を不活性化する。このようなモデルはＦＰＲに限定されるものではない。
【０００８】
さらに、脱顆粒はリガンドが受容体に結合したときに起こると言われており、同一または異なる受容体は同一または異なるリガンドによるその後の刺激に対して耐性になる。このような脱感作状態が通常の細胞活性化過程で受容体が占有された後に生じると、状態ＩＩＩの不安定化が起こり、または受容体占有前に生じると状態ＩＩＩは達成されない。無反応性状態または受容体不活性が１刺激物によって誘導され、複数のリガンドが結合していない受容体にも影響が及ぼされる場合、この状態を異種脱感作と呼ぶ。
【０００９】
最もよく研究されているＮ−ホルミルペプチドはｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ＦＭＬＰまたはｆＭＬＰ）である。しかし、より能力のあるペプチド、特にｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＮＨＢｚｌ（ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅベンジルアミド）、およびＮｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｎ−ホルミル−Ｌ−ノルロイシル−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ）（Ｋｅｒｍｏｄｅ他、前述）は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてウサギの好中球上に受容体があることが特徴である。これらは、最大の移動度（２０〜３５μｍの程度）および脱顆粒（１０−１０から１０−１１の程度のＥＤ５０）を示す。ごく最近の研究では、ホルミル化されていないペプチドもまたＦＰＲに結合することが可能で、好中球機能の効果的な活性化剤として作用できることが指摘された。たとえば、Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕは効果的なペンタペプチドで、ＦＭＬＰに匹敵する活性を有する（Ｃｈｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３３９８〜２３４０１、１９９５）。ペンタペプチドをＮ−ホルミル型へ変換するとその効果は１００〜５００倍に増大し、厳密に言えば生物学的活性はＮ−ホルミル化によって決定されないようであるが、Ｎ−ホルミル化がまだペプチドの効果に重要な役割を果たしていることが示された。
【００１０】
その他の変更をペプチドに与えることによって、ペプチドの中には効果的なＦＰＲのアゴニストに変換できるものがあることが示された（Ｄｅｒｉａｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：１２６５〜１２６９、１９９６；Ｈｉｇｇｉｎｓ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１０１３〜１０１７、１９９６）。このような変更には、アミノ末端基のウレア置換およびカルバメート修飾が含まれる。さらに、スーパーオキシドアニオン放出および好中球の血管内皮への付着によって測定すると、ＭＬＦペプチドのアミノ酸組成を変更することによって、ＦＰＲのアゴニストがアンタゴニストに変換することも示された。
【００１１】
好中球のＦＰＲを介したＮ−ホルミルペプチドによって刺激される走化性はよく研究されている。Ｎ−ホルミルペプチドによって刺激される前であっても、好中球は一時的に内皮細胞に発現したＰ−セレクチンに結合する。炎症部位で発生するＮ−ホルミルペプチドによって媒介される好中球の活性化によって、この部位に好中球の蓄積が引き起こされる。Ｎ−ホルミルペプチドは好中球上のＬ−セレクチンを促進させ、好中球を内皮上でローリングさせ、続いて好中球の表面上でインテグリンを促進させる。インテグリンは、細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックス相互反応を媒介し、ラミニン、フィブロネクチン、ビクトロネクチン、並びにＩＣＡＭ（細胞内細胞接着分子）および内皮上に認められるＶＣＡＭ（血管細胞接着分子）と結合する。インテグリンとＩＣＡＭおよびＶＣＡＭが結合すると、細胞骨格との相互反応によって好中球の内部にシグナルが伝達される。次いで、好中球はＬ−セレクチンを発現し、内皮に沿って広がり始める。次いで、内皮細胞上でＥ−セレクチンおよびＩＣＡＭ−１が促進されると、好中球が内皮を横断して移動する（Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６１７〜１６２５、１９９１）。内皮バリアを突破すると、好中球はＮ−ホルミルペプチドの濃度勾配を感知して炎症部位に向かって移動する。高いペプチド濃度を含む最終目的地に到達すると、好中球は好細菌作用を一気に解き放つ。
【００１２】
刺激された好中球は迅速にレスピラトリーバーストオキシダーゼを活性化し、スーパーオキシドラジカルＯ２−の発生を触媒する。スーパーオキシドラジカルは他の分子と反応して、過酸化水素および次亜塩素酸を生じ、この両者は反応性の高い物質で、したがって効果的に微生物機能を妨害する。脱顆粒はまた、外来微生物の破壊に効果的な手段である。しかし、脱顆粒はまた、宿主の組織に損傷を与える。食作用は、外来微生物を排除する好中球の別の機構である。これらの機能の多くは、第２メッセンジャーとしてホスホリパーゼを使用したＧ蛋白質によって誘発され、３種類のホスホリパーゼが特徴付けられている。
【００１３】
ホスホリパーゼＣ、ＰＬＣβ２は２個の第２メッセンジャー、１，４，５−イノシトール三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＧ）を発生する。ＦＰＲ活性化中に発生したＧ蛋白質のβγサブユニットは、ＰＬＣβ２を活性化する。ＩＰ３はある種のカルシウムチャンネルに結合して、細胞内貯蔵所からのカルシウムの放出を促進し、化学誘引物質による刺激の最中に観察される細胞質ゾル中のカルシウム濃度の増加をもたらす。カルシウムの放出と相まって、ＤＧは蛋白質キナーゼ（ＰＫＣ）を活性化する。最近、Ｇ蛋白質活性化ＰＬＣキナーゼが、Ｃａ２＋増加に関連したラットの腹膜細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける肥満細胞脱顆粒の主要な経路であるとして文献で報告された（Ｂｅａｖｅｎ他、Ｊ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１６０：５１３６〜５１４４、１９９８）。
【００１４】
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、原形質膜の内面のリン脂質からアラキドン酸を生じさせる。アラキドン酸は、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンなどの炎症伝達物質の前駆体を形成する。ＰＬＡ２はマイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼによるリン酸化で活性化される。
【００１５】
第３のホスホリパーゼはホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）で、ホスファチジルコリンからホスファチジン酸およびコリンを生成する。ホスファチジン酸はＰＫＣを活性化するＤＧを産生する役割に加えて、レスピラトリーバーストオキシダーゼの活性化に関与することが可能である。しかし、ＰＬＤの活性化にはカルシウムが必要で、ＦＭＬＰはカルシウム喪失細胞ではＰＬＤを刺激することができない（Ｋｅｓｓｅｌｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３１５２〜２３１５６、１９９１）。さらに、Ｇ蛋白質ＡｒｆおよびＧ蛋白質ＲｈｏはＰＬＤ活性を調節するようである（Ｂｒｏｗｎ他、Ｃｅｌｌ　７５：１１３７〜１１４４、１９９３；Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：５２３〜５２６、１９９４；Ｓｉｎｇｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４９４４〜１４９５０、１９９５）。
【００１６】
蛋白質リン酸化は、ＦＭＬＰによって開始するシグナル伝達で中心的な役割を果たす。ＦＭＬＰ刺激の結果、３種の主要なキナーゼが蛋白質のリン酸化に関与する。
【００１７】
前述のように、ＰＫＣはＰＬＣによって産生されたＤＧによって活性化される。ＰＫＣはセリンおよびトレオニン残基をリン酸化するように作用する。ＰＫＣは、６個の異なるアイソフォームから成り、そのうち３種（α、βおよびγ型）は細胞内カルシウムに感受性で、３種（δ、εおよびζ型）は非感受性である。好中球には、α、βおよびζ型が含まれるが、γ型は含まれない。カルシウム依存性およびＤＧ依存性ＰＫＣ（ＰＫＣ−β）は、細胞質ゾルから膜に移動することによってＦＭＬＰおよびホルボールエステル刺激に応答する。次いで、レスピラトリーバーストオキシダーゼ系に関与するものなどのいくつかの細胞質ゾル蛋白質をリン酸化する。ＦＭＬＰはまた、カルシウム依存性、ＤＧ依存性およびホスファチジルセリン依存性ＰＫＣ型を活性化することができるが、その機能は明らかではない。
【００１８】
ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）はＲａｓおよびＲａｆの活性によるＧタンパク質のβγサブユニットによって活性化される。最近の文献で、高強度のＲａｓシグナリングがアポトーシス（Ｂａｒ−Ｓａｇｉ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９（９）：５８９２〜９０１、１９９９）並びに内皮細胞接着の促進（Ｆｉｎｋｅｌ他、．．．．．．．．）と関連があることが示唆された。Ｒａｆは、細胞の生存、増殖および分化を含めた増殖シグナルにおいて中心的な役割を担うことが今や明らかになった（Ｒａｐｐ他、．．．．．．．．）。このキナーゼの経路はまた、Ｃ５ａおよびＩＬ−８によって誘発される（Ｂｕｈｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９８２８〜１９８３２、１９９５；Ｋｎａｌｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８３２〜２８３８、１９９６）。ＭＡＰキナーゼはいくつかの調節蛋白質、たとえば細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）−１のチロシンリン酸化を誘導する。最近の文献で、ＭＡＰＫ経路はサイトカインの産生に深く関わっていることが示唆されている。しかし、ＴＨ−１およびＴＨ−２サイトカイン両者、並びにその他の炎症誘発分子、たとえばＣ５ａ、ＩＬ−８およびＦＭＬＰの活性化は、Ｇ蛋白質３量体のシグナル伝達に左右される。
【００１９】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、ＦＭＬＰによる刺激時に観察されるＰＩ三リン酸（ＰＩＰ３）の形成に重要である。ＰＩＰ３濃度の上昇は、明らかにレスピラトリーバーストオキシダーゼ系の活性化および好中球のアクチン重合化に関与しており、細胞骨格の変化および細胞移動の調節に重要であると考えられる。最近の文献で（Ｒａｎｋｉｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（９）：１６２１〜３２、１９９８）、ＰＩ３キナーゼ濃度が上昇するとまた、Ｇ蛋白質のシグナリングに基づくＩＬ−５の活性化に基づいて、好酸球の脱顆粒が促進される可能性があることが報告された。さらに、Ｓａｇｉ−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８．２８：３４６８〜３４７８は、Ｇ蛋白質シグナリングは、ＰＫＣおよびＰＩ３キナーゼの中間経路を使用して、ＩｇＥによるＦＣεＲ受容体を活性化することが可能で、ヒスタミンおよびアレルギー性気道過敏に関与するその他の炎症誘発性サイトカインを放出させることを示唆した。Ｕｃｋｕｎ他、Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２７４、Ｎｏ．３８、Ｓｅｐ．、１９９９、ｐｐ．２７０２８〜２７０３８は、ＩｇＥ／ＦＣεＲ１の架橋結合を介して、肥満細胞の脱顆粒を導くＪＡＫ３キナーゼ経路におけるＧ蛋白質シグナリングを報告している。Ｂｅａｖｅｎ他、Ｊ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６０：５１３６〜５１４４は、Ｇ蛋白質シグナリングはまた、ＰＫＣを活性化させ、Ｃａ２＋の取り込みをもたらして、肥満細胞の分泌および脱顆粒を導くことを報告している。したがって、Ｇ蛋白質は、ＩｇＥ抗原攻撃によるＦＣεＲ１の下流標的の活性化に必須である可能性があり、Ｇ蛋白質シグナリングを妨害する対応能力は、ＦＣεＲ受容体活性化の下流阻害の重要な基盤となることが可能である。
【００２０】
ウサギ好中球ＦＰＲのいくつかのアンタゴニストが同定されているが、分子がアンタゴニストであることを明確にする特性はまだ明らかになっていない。ＦＭＬＰのある種のブトキシカルボニル類縁体は、走化性ペプチド誘導細胞活性化と競合阻害することが示され、中でもＢｏｃＰＬＰＬＰが最も効果が高いことが発見された（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．１１７：１、１９８０；Ｆｒｅｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：２４０４、１９８０；Ｋａｎａｈｏ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ．４７：４２０、１９９０）。サイクロスポリンＨ、環状ウンデカペプチドおよびサイクロスポリンＡはまた、ホルミルペプチド受容体のアンタゴニストとしての活性を有することが示された（Ｗｅｎｚｅｌ−Ｓｅｉｆｅｒｔ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４５９１〜４５９９、１９９３）。天然に生じるホルミルペプチド受容体アンタゴニストもまた同定されており、レトロウイルス由来ヘキサペプチドがある（Ｏｏｓｔｅｎｄｏｒｐ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１０１０、１９９２）。しかし、これらのアンタゴニストはいずれも高親和性ではホルミルペプチド受容体に結合せず、したがって研究手段または抗炎症剤として実際的には使用されない。
【００２１】
興味深いことに、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニンによって肥満細胞の脱顆粒が阻害されることがＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１、ｐｐ．１３〜１６（１９８１）で報告された。そこでは、２種の構造的に異なる走化性ペプチド、すなわちペプスタチンおよびＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニンが、４０／８０、好ラットＩｇＥ血清、またはウシ肺から単離された高分子アニオン透過性因子を皮下注射することによって生じたラット皮膚の血管透過性の増加を阻害することが報告された。これらのペプチドは直接肥満細胞に作用するようであることが報告された。ＦＰＲは肥満細胞上で発現することは報告されていないので、このような阻害の機構は明らかではない。
【００２２】
ＦＰＲの機能および機構に関して回答されていない疑問がたくさんあることは明らかである。さらに、ＦＰＲが非白血球細胞、たとえば脳細胞および樹状細胞で発現していることが発見されたことによって、ＦＰＲがその他の細胞種においてさらに解明されるべき新規の機能を遂行している可能性がある。したがって、細胞の炎症誘発応答を阻害する他の薬剤が、細胞の炎症誘発応答を研究する方法と共に必要とされている。
【００２３】
発明の概要
ここでは、ヒト末梢血単核細胞または多核白血球、または固定組織細胞を、炎症誘発物質（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｇｅｎｔ）でこのような細胞を刺激した後にＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質で処理すると、通常の炎症誘発応答、特に炎症誘発物質、たとえばＣ５ａ、ＦＭＬＰ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＴＮＦαまたはＦＣε受容体によって誘導される下流の炎症誘発応答（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が阻害されることが発見された。Ｇ蛋白質の細胞産生が変化すると、Ｇ蛋白質によって媒介される炎症応答シグナル伝達経路が阻害される。特に有用なＧ蛋白質キナーゼ伝達経路変更剤は、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　Ｘを有するＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル（「ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ」）ペプチドであって、式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒから成る群から選択されたペプチド、最も好ましくはｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅである。
【００２４】
ヒト末梢血単核細胞または多核白血球または固定した組織細胞は、リンパ球および顆粒球、好ましくは好酸球、好塩基球、および活性化したＴ細胞、および肥満細胞であることが可能である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路修飾剤は、炎症誘発物質が存在するとＧ蛋白質サブユニットγのリン酸化を阻害する、これらの細胞に存在する細胞表面受容体、好ましくはホルミルペプチド受容体（「ＦＰＲ」）との複合体を形成する。さらに、Ｇ蛋白質の下流リン酸化を阻害またはブロックすることによって、３量体Ｇ蛋白質成分に依存した様々な経路が細胞の炎症誘発物質に対する応答をブロックまたは抑制する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、ある濃度のＦＣε受容体（ＦＣεＲ）では、ＩｇＥが存在すると、このＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がＩｇＥによるＦＣεＲの活性化を阻害する。
【００２７】
本発明では、ヒト末梢血単核細胞または多核白血球または固定組織細胞の刺激に使用する炎症誘発物質は、サイトカイン、ケモタキシン、またはマイトジェンであることが好ましい。特に好ましい炎症誘発物質は、ＦＭＬＰなどのＮ−ホルミルペプチド、活性化した補体断片（Ｃ５ａ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、およびＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３などのサイトカイン、および抗原を架橋結合したＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＡである。
【００２８】
本発明の他の実施形態では、ヒト末梢血単核細胞または多核白血球細胞の炎症誘発応答を阻害する方法が提供され、この方法には細胞をＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質とを接触させること、およびこの薬剤を細胞の受容体に結合させることが含まれる。炎症誘発媒介細胞は、リンパ球または顆粒球であることが可能である。この細胞はまず前述のような炎症誘発物質によって刺激されていることが好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、リガンド結合受容体は、ホルミルペプチド受容体である。ＦＣεＲ受容体のＧ蛋白質活性化の下流をブロックすることによって同様の治療上の利益がもたらされる。
【００３０】
本発明はさらに、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の同定方法を提供し、この方法には、
ａ）活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞を、サイトカイン、ケモタキシン、およびマイトジェンから成る群から選択された公知の炎症誘発媒介物と接触させて炎症誘発応答を惹起する段階、
ｂ）段階ａ）にＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質候補を添加する段階、および
ｃ）Ｇ蛋白質キナーゼの量の減少またはＧ蛋白質キナーゼの失活を検出して、（ｉ）同時に前記候補薬剤および前記炎症誘発媒介物と接触した炎症誘発細胞を（ｉｉ）前記炎症誘発媒介物とのみ接触した炎症誘発細胞と比較して分離する段階が含まれる。
【００３１】
好ましいＧ蛋白質キナーゼはＧ蛋白質γキナーゼである。
【００３２】
本発明の他の実施形態では、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質と複合した受容体は、炎症誘発媒介細胞とＧ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質とを接触させ、それによって炎症誘発応答を阻害することによって、活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞の表面上に表れる。
【００３３】
本発明のさらに他の実施形態では、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の同定方法には、
活性化Ｔリンパ球、肥満細胞、好酸球および好塩基球から成る群から選択された炎症誘発媒介細胞を、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質候補物質と接触させる段階、および
前記細胞によって産生した蛋白質キナーゼの分配であって、Ｇ蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質候補と接触していない細胞とを比較すると、ＰＬＣγ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、およびＥＲＫ−１の量変化がなく、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、Ｒａｆ、Ｒａｓ、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少している分配を決定する段階が含まれる。
【００３４】
したがって、本発明はまた細胞表面受容体およびＧ蛋白質シグナル伝達経路変更物質を含むヒト末梢血単核細胞または多核白血球細胞の新規受容体複合体であって、前記受容体複合体を表していない細胞と比較して、細胞における蛋白質キナーゼの分配が、ＰＬＣγ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、およびＥＲＫ−１の量変化がなく、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、Ｒａｆ、Ｒａｓ、Ｇ蛋白質αキナーゼおよびＧ蛋白質βキナーゼの量が減少しているようになっている新規複合体を提供する。細胞表面受容体は、ＦＰＲ受容体であることが好ましい。ＦＣεＲ受容体のＧ蛋白質活性化の２次ブロックもまた好ましい。
【００３５】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球のＩＬ−４による刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）およびＰＩ３（８３Ｋｄ）の量が増加しており、ＲａｓおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００３６】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球のＩＬ−６による刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）、Ｒａｆ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、ＥＲＫ−１およびＧ蛋白質αキナーゼの量が増加しており、ＰＩ３（８３Ｋｄ）、Ｇ蛋白質βキナーゼおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００３７】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球のＩＬ−１０による刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）、ＥＲＫ−１およびＧ蛋白質γの量が増加しており、ＰＬＣγ、ＰＩ３（８３Ｋｄ）、Ｒａｓおよびキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００３８】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球の炎症誘発物質、ＩＬ−１３による刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）、ＰＩ３（８３Ｋｄ）、ＥＲＫ−１およびＲａｆの量が増加しており、Ｒａｓ、Ｐｐ６０　Ｓｒｃ、Ｇ蛋白質αキナーゼ、Ｇ蛋白質βキナーゼおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００３９】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球の炎症誘発物質、Ｃ５ａによる刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、Ｐｐ６０　ＳｒｃおよびＲａｆが増加しており、ＰＬＣγ、ＰＩ３（１０２Ｋｄ）、Ｇ蛋白質αキナーゼ、Ｇ蛋白質βキナーゼおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００４０】
Ｇ蛋白質シグナル伝達経路変更物質と複合した細胞表面受容体を有するヒト末梢血単核細胞または多核白血球の炎症誘発物質、ＴＮＦαによる刺激によって、前記受容体複合体を表していない刺激された細胞と比較して、Ｒａｆ、Ｒａｓ、およびＰｐ６０　Ｓｒｃが増加しており、ＰＬＣγ、ＰＩ３（８３Ｋｄ）、Ｇ蛋白質αキナーゼ、Ｇ蛋白質βキナーゼおよびＧ蛋白質γキナーゼの量が減少している前記細胞によって産生された蛋白質キナーゼの分配がもたらされる。
【００４１】
図面の簡単な説明
図１は、ヒト末梢血有核細胞に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ（ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）の結合を示すグラフである。
【００４２】
図２Ａ〜図２Ｃは、活性化リンパ球に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ結合の点プロットである。図２Ａは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養２４時間後の６μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘなしで、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｃは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。
【００４３】
図３Ａ〜図３Ｂは、図２Ａ〜図２Ｃのリンパ球のＤＮＡ含量ヒストグラムである。図３Ａは、図２Ａの細胞のヒストグラムである。図３Ｂは、図２Ｂと図２Ｃの細胞のヒストグラムである。
【００４４】
図４は、全ヒト好中球ライゼートから回収された３５Ｓ−メチオニン標識化蛋白質と種々の樹脂とのオートラジオグラフである。
【００４５】
図５Ａ〜図５Ｂは、媒体（０．３％ＤＭＳＯ）で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図５Ａは、正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図５Ｂは、媒体（ＤＭＳＯ）のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【００４６】
図６Ａ〜図６Ｂは、ＨＫ−Ｘで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図６Ａは、ＨＫ−Ｘ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図６Ｂは、ＨＫ−Ｘのみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【００４７】
図７Ａ〜図７Ｂは、ＩＬ−８で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図７ＡはＩＬ−８処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図７Ｂは、ＩＬ−８のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【００４８】
図８Ａ〜図８Ｂは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図８Ａは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図８Ｂは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−８で処理したで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【００４９】
図９Ａ〜図９Ｂは、末梢血から新たに採取した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図９Ａは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図９Ｂは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明によれば、Ｇ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質は、炎症誘発物質または分子により刺激されたヒト末梢血細胞のある種の炎症誘発性反応を不活化することが見出された。
【００５１】
本発明による好ましいＧ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質は、リンパ球、特に活性化Ｔ細胞、好酸球、好塩基球などの顆粒細胞、肥満細胞などの固定組織細胞などの炎症誘発性媒介細胞上に見られるレセプターに結合することができる。
【００５２】
Ｇ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質がそのレセプターに結合すると、炎症誘発性反応が阻害される。本発明の好ましい実施形態により、Ｇ蛋白質のサブユニット、α、β、γが修飾され、これらのサブユニットのリン酸化もまた阻害される。薬剤−レセプター複合体により阻害され得る炎症誘発性反応は、レセプターを保持している細胞の分泌、脱顆粒、移動および他の炎症誘発性分子の合成および分泌である。
【００５３】
本発明のＧ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質は、炎症誘発性分子によって前もって刺激されたレセプターを不活化することができ、刺激されていない細胞には作用を及ぼさないことが好ましい。細胞刺激に有用な炎症誘発性物質の例としては、ＩＬ−８、Ｎ−ホルミルペプチド類、活性化補体断片（Ｃ５ａ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）および血小板活性化因子（ＰＡＦ）がある。本発明の薬剤−レセプター複合体は、同一の炎症誘発性剤による、または異なった炎症誘発性剤によるさらなる刺激からレセプターを脱感作することもできることが好ましい。
【００５４】
レセプター保持細胞に及ぼすＧ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質−レセプター複合体に認められる作用を、Ｇ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質の同定に用いることができる。このような薬剤のスクリーニングは、炎症誘発性媒介細胞を知られた炎症誘発性媒介物質と接触させることによって、炎症誘発性反応を誘導し、その後、候補となる薬剤を加え、候補となる薬剤と炎症誘発性分子とに同時に接触させた炎症誘発性細胞内のＧ蛋白質キナーゼ量の減少を、炎症誘発性分子のみと接触させた炎症誘発性媒介細胞内のその量と比較して検出することにより実施することができる。
【００５５】
特に有用なＧ−蛋白質キナーゼシグナル伝達経路変更物質は、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅである。他の有用な薬剤は、上記手順の１つを用いて、慣例的な試験により同定することができる。
【００５６】
本明細書で用いられている炎症誘発性反応は、炎症誘発性媒介細胞の分泌または脱顆粒およびロイコトリエン類、ヒスタミン類および他のサイトカインの放出を含む。このような反応はまた、リンパ球、好酸球、好塩基球、肥満細胞および好中球の走化性吸着、移動および凝集結果としての好酸球、好塩基球および肥満細胞の炎症組織への湿潤を含む。炎症部位の血管透過性とＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡの産生亢進、およびそれら各々のＦＣレセプターもまた、炎症誘発性反応に関与し得る。
【００５７】
このように炎症誘発性反応の阻害は、本発明によるペプチド−レセプター結合に引き続いての炎症誘発性媒介細胞による脱顆粒化およびロイコトリエン、ヒスタミンおよびその他のサイトカイン類放出の減少、または好ましい実施形態においては完全な停止を含む。炎症誘発性媒介細胞の湿潤および移動もまた、大きく減少または完全に阻害され得る。炎症部位における血管透過性およびＩｇＥ濃度もまた減少し得る。
【００５８】
本明細書に説明された本発明をさらに十分に理解できるように、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は説明の目的のためであって、いかなる様式においても本発明を限定するように解釈すべきでないことを理解する必要がある。
【００５９】
実施例１：末梢血有核細胞に対する標識ＨＫ−Ｘの結合
末梢血有核細胞上のＨＫ−Ｘ（「ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ」）のＫｄおよびＢｍａｘ（飽和結合）を測定した。密度勾配遠心分離により調製した種々のフラクション（単球、リンパ球、顆粒球）の１００μｌ溶液中２×１０５細胞を０．１％アジ化ナトリウムを含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で予め洗浄した。ＦＩＴＣ標識したＨＫ−Ｘ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中）の下記のモル濃度１００μｌを表１によるチューブの各セットに加えた。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
チューブを混合し、３０秒間混和させた。次にチューブを４〜８℃で３０分間保持した。次に１００μｌのＣａｌ−Ｌｙｓｅを加え、５分間温置または５００μｌの１％ホルムアルデヒドを加えた。Ｃａｌ−Ｌｙｓｅを加えた場合は、１ｍｌの水を加えてさらに５分間温置した。次に細胞をフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ　Ｅｌｉｔｅ）上で分析した。結合結果を図１に示す。Ｂｍａｘは４７．６６、Ｋｄ＝１．６７４×１０−１０Ｍと決定した。したがって、これらの結果は、単球、リンパ球、顆粒球などの末梢血有核細胞に対してＨＫ−Ｘが結合していることを示している。
【００６２】
同様な方法によって、Ｈ−ＫＸは、は、好中球に対する知られた結合と同様、活性化Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、好塩基球に対して結合していることも確認された。
【００６３】
実施例２：活性化レセプターに対するＨＫ−Ｘの結合
末梢血リンパ球は、培養２４時間後、または１２０時間後にマイトジェンのコンカナバリンＡ（ＣｏＡ）によって刺激した。次に細胞を１００ｎＭ　ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘに曝露したか、または曝露しなかった。また、細胞を細胞サイクル期決定のため、ＤＡＰＩで染色した。次に細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【００６４】
図２Ａ〜図２Ｃは、ＣｏｎＡにより活性化したリンパ球と、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘの結合部位の発現との関係を示している。この４つの４分画区分は以下の特徴を表している：
左上の４分画区分は、ＤＮＡ含量が１ｎより高く、図１のプロフィルを用いて確立されたバックグラウンド濃度よりもＦＩＴＣ　ＨＫ−Ｘ結合濃度が上昇している細胞を表している；
右上の４分画区分は、ＤＮＡ含量が１ｎより高く、バックグラウンドより大きなＦＩＴＣ−リガンド結合を有した細胞を表している；
右下の４分画区分は、ＤＮＡ含量が１ｎよりも低いが、ＦＩＴＣ−リガンド結合はバックグラウンドより上である細胞を含んでいる；および
左下の４分画区分は、ＤＮＡ含量が１ｎでＦＩＴＣ−リガンドがバックグラウンド濃度である細胞を含んでいる。
【００６５】
図２Ｂと図２Ｃの検討から明らかなように、植物レクチンまたはマイトジェンに対する曝露は、細胞を刺激して細胞サイクルに入らせ、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘに対する結合部位を発現する。より長い１２０時間の培養時間によって、細胞の大部分が細胞サイクルに入ることが可能となった（図２Ａと比較して）。内在性蛍光バックグラウンド濃度の最も正確な測定は、ＣｏｎＡと共に培養し、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘで染色しなかった細胞（図２Ｂを参照）を用いて閾（四分画）を設定することにより得られた。
【００６６】
統計解析により、点プロットの検討により供された四分画の観察結果が確証された。図２Ｃの細胞のおよそ２５％がＤＮＡ含量１ｎ以上を含有し、ＦＩＴＣ−リガンド結合は、バックグラウンド濃度以上であった。これは図２Ａおよび２Ｂそれぞれの右上画分にある細胞数と著しく対照的である。
【００６７】
細胞サイクルの種々の期における細胞分配のさらに本格的な検討は、Ｐｈｏｅｎｉｘ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（アリゾナ州フェニックス）によるソフトウェアパッケージ「Ｍｕｌｔｉ　Ｃｙｃｌｅ」を用いて得られた。このソフトウェアは、ＤＮＡヒストグラムを巻き戻し、成分の適合度と有意性を統計的に解析する。
【００６８】
図３Ａは、図２Ａに含まれる同一のサンプルを示し、図３Ｂは、図２Ｂと図２Ｃに含まれる同一のサンプルを示す。二倍体（ＤＮＡ含量＞１ｎ）である細胞のパーセンテージの検討から明らかなように、フラクションは、図２Ａの２．２％から図２Ｂと図２Ｃの２９％へと上昇した。
【００６９】
このように、ヒト末梢血リンパ球のマイトジェンによる刺激は、それらのＤＮＡ複製を開始させ、この過程と同時にＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘに対する結合部位の発現を開始させると思われる。ＤＮＡ含量が１ｎである細胞、すなわち細胞サイクルがＧ０／Ｇ１期にある細胞フラクションのみがリガンドに対する結合部位の発現増加を示す。これと対照的に、二倍体ＤＮＡの含量（＞１ｎ）を有する全ての細胞は、リガンドに対する結合部位を含有する。
【００７０】
実施例３：ＨＫ−Ｘレセプターの同定および特性化
ＨＫ−Ｘおよび他のＮ−ホルミルペプチドに結合するレセプターを、マウス腹膜肥満細胞、ヒト多核白血球および単核細胞個体群より単離し特性化した。さらに、ＰＫＣ、ＰＩ３の増加、およびＣａ２＋移動の下流での結果としてのＦＣεＲレセプターのＧ蛋白活性化により、ＦＣεレセプターはＧ蛋白質を妨げる下流エフェクターのレセプターとなる。
【００７１】
ＨＫ−Ｘに結合する細胞としては、ＨＫ−Ｘへの曝露後に変化した生物学的反応性により、また蛍光または放射能標識ＨＫ−Ｘ結合により立証されたように、肥満細胞、好塩基球、好酸球が挙げられる。ＨＫ−Ｘに対するレセプター類は同定されていない。それに対し、好中球はその表面にホルミルペプチドレセプターを発現する。しかし、血液のリンパ球および単球とＨＫ−Ｘとの結合は、好中球の場合よりも少ないようである。
【００７２】
材料および方法の詳細：
１．細胞の単離−麻酔ラットの腹腔内へ３５ｍｌのタイロード液の注入によりラットの腹膜肥満細胞を単離した。その後、過剰麻酔剤の注入によりラットを殺処理した。腹膜細胞を採取し、１５ｍｌ遠心管に入れた。細胞を室温で１０分間、２５０×ｇでの遠心分離によりペレット化した。
【００７３】
ヒト末梢血の単核細胞および多核白血球を、正常ドナーから得た末梢血より単離した。血液はヘパリン中で採取した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上、室温、５００×ｇで遠心分離により種々の細胞種を単離した。各フラクションを採取し、別々にプールし、抗生物質を加えたＲＰＭＩ１６４０中で１回洗浄した。
【００７４】
２．３５Ｓ−メチオニンによる細胞の代謝的標識　−　細胞を、１０μＣｉの３５Ｓ−メチオニンを含有するメチオニンの少ないＲＰＭＩ１６４０培地の１ｍｌにつき１×１０７に調整し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩保持した。
【００７５】
３．細胞の採取および粗製膜の調製−細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、続いて０．３％ＮＰ４０とプロテイナーゼ阻害剤反応混液を含有するｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液中、音波処理によりライゼートした。その結果生じた細胞調製液を６００×ｇで１０分間遠心分離し、さらに分析するために上澄み液を採取した。
【００７６】
４．種々の細胞蛋白質のセファロースおよびサファロースＨＫ−Ｘクロマトグラフィ分離−セファロース未置換樹脂またはセファロースＨＫ−Ｘ樹脂のカラムに細胞調製液を通過させ、ＡとＢの２つの部分に分けた。
【００７７】
アリコートＡは、ＨＫ−Ｘ置換セファロースカラムを通過した。カラムを洗浄し、次にＨＫ−Ｘ（５ｍｇ／ｍｌ）、次いで０．１Ｍグリシンを含有する緩衝液ｐＨ２．５で溶出した。
【００７８】
アリコートＢは、溶解性ＨＫ−Ｘの存在下、ＨＫ−Ｘ置換カラムに結合させ、蛋白質を溶出した。各フラクションを濃縮し、凍結乾燥した。
【００７９】
本ステップで試みられた方法は、ＨＫ−Ｘをセファロース樹脂に結合してＨＫ−Ｘ置換樹脂を作製することを含む。ＨＫ−Ｘ置換樹脂に曝露する前に、標識された細胞蛋白質混合物を、ＨＫ−Ｘに置換されていない樹脂上を通して、天然樹脂と反応させ、いかなる蛋白質種をも除去した。したがって、レセプター蛋白質を含む細胞蛋白質を、適切なイオン環境下、ＨＫ−Ｘ置換樹脂を通すと、他の蛋白質の中でレセプター蛋白質（ＨＫ−Ｘレセプターに関する）が、ＨＫ−Ｘと堅固に結合した。樹脂を、中性ｐＨでリン酸緩衝液のような緩和剤と共に洗浄して、いかなる低親和性結合蛋白質をも除去した。引き続いて、樹脂を、過剰量の遊離ＨＫ−Ｘに曝露し、樹脂に結合したレセプター蛋白質を競合的に溶出した。これらの各ステップで遊離された放射活性蛋白質を濃縮して、次のステップに詳述する１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムにより分析した。
【００８０】
５．１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−２５０ｃｐｍから２０００ｃｐｍの放射活性を含む放射活性細胞調製物の２５μＬをゲルの各レーンに塗布した。着色標準品の良好な分解能が得られるまで、このゲルを３０ｍＡ、９０Ｖで作動させた。標準品は、ホスホリラーゼｂ（分子量＝９４，０００）；ウシ血清アルブミン（分子量＝６８，０００）；オボアルブミン（分子量＝４３，０００）；炭酸脱水酵素（分子量＝３０，０００）；および大豆トリプシン阻害剤（分子量＝２１，０００）である。
【００８１】
６．分解放射活性蛋白質の推定分子量−相対移動度は、標準品、およびゲル上に見られる各々区別される分子量種に対して計算した。標準品の分子量の対数プロットを各標準品の相対移動度に対してプロットした。このデータをＰＲＩＳＭソフトウェアに入力し、未知蛋白質の分子量を標準カーブプログラムから予測した。これらの結果を、文献（Ｇｏｅｔｚｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０：５７１７−５７２２、１９８１）に公表されたＦＰＲレセプター蛋白質と比較した。
【００８２】
図４は代表的な実験の結果を示す。細胞ライゼートに存在する全ての蛋白質がＡレーンに示される。Ｂレーンでは、ＨＫ−Ｘの置換なしのセファロースカラムからの非結合物質が、全細胞ライゼートと同様の蛋白質バンド分配パターンを示す。Ｃレーンは溶出前の物質を含む。Ｄレーンはブランクレーンである。Ｅレーンでは、カラムを１ｍｇのＨＫ−Ｘ（競合品）の存在下で溶出すると３本の蛋白質バンドを見ることができる。分子量は、それぞれ〜９４，０００、〜６８，０００および〜４０，０００Ｄｏｌｔｏｎと推定される。この実験条件は、結合の特異性を確証した。
【００８３】
本実験条件で溶出されたバンドのＧｏｅｔｚｌ他によって報告されたものに対する相対存在率の比較により、興味深い相違が明らかにされた（表２を参照）。レセプター類の標準化比率の検討により、ＦＭＬＰカラム（Ｇｏｅｔｚｌ）およびＨＫ−Ｘカラム（本実施例）から回収された３種の分配における本質的な相違が明らかにされる。６８Ｋｄ種は、ＦＭＬＰ親和性カラムからＧｏｅｔｚｌ他により回収された優性種であったが、一方、４０Ｋｄ種はＨＫ−Ｘ親和性カラムから回収された優性種であった。
【００８４】
【表２】
2004507441.tif 000003
【００８５】
１ｍｇのＨＫ−Ｘの添加によりラット腹膜肥満細胞から溶出された３種の分子種があることが、図４におけるラジオオートグラフから明白である。これらの蛋白質の計算された分子量は、Ｇｏｅｔｚｌ他によって報告された分子サイズと一致する。ＨＫ−Ｘとの競合後回収された蛋白質、またはラット腹膜肥満細胞および好中球からの酸の分子量は、ヒト好中球に関してＧｏｅｔｚｌにより報告されたものと同じであった。
【００８６】
４０Ｋｄ分子におけるメチオニンの全平均残基数は５．１個であるが、１分子につきそれぞれ１１個および１４個の残基を含む６８，０００および９４，０００種のいずれよりも強いラジオグラフ画像を有する。本実施例において、回収された各蛋白質種の相対存在率は、３５Ｓ−メチオニンにより生合成的放射標識により決定された。親和性クロマトグラフィから回収された相対比率は、オートラジオグラフからの曲線下面積の積分により決定された。Ｇｏｅｔｚｌは、化学的方法による蛋白質の決定により各蛋白質の相対存在率を測定した。したがって、２つの研究において回収された蛋白質分配をより正確に比較するために、分配値を、各々の種の相対存在率をメチオニン残基数で割ることにより標準化した。この比率は、方法論における差による値の潜在的変化を修正する。この修正比率により、Ｇｏｅｔｚｌにより報告された値と本実施例において得られた値との間の結合および／または回収プロフィルの大きな差が明らかにされた。１つの可能性は、界面活性剤で解離されたレセプター複合体が、ＨＫ−Ｘ置換セファロースのものと異なる選択的な様式でＦＭＬＰ置換セファロースに結合することである。
【００８７】
要約すると、本実施例におけるＨＫ−Ｘは、蛋白質をｉｎ　ｖｉｔｒｏで３５Ｓ−メチオニンにより蛋白質標識後回収された細胞ライゼートにおける結合蛋白質を選択的に回収するために使用された。ＦＭＬＰレセプター複合体と会合したペプチドのサイズに関する以前の報告と一致する３種の分子量種が単離された。
【００８８】
また、ＨＫ−Ｘは、ヒト多形核白血球および単核細胞、特に活性化Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球および好塩基球のレセプターに結合することが、本実施例に使用される方法により示された。
【００８９】
実施例４：シグナル伝達および作用メカニズム
白血球は、大多数の化学誘引物質および他の炎症誘発媒介物質に応答する。幾つかの媒介物質は、化学走化性、酵素系の活性化および病理学上重要な媒介物質の遊離を引き起こす。典型的なＮ−ホルミルペプチド類（原型体−ＦＭＬＰ）、活性化補体断片（Ｃ５ａ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）および幾つかの走化性サイトカイン類（ＩＬ−８など）は、よく認識された走化性および炎症誘発物質である。これらの物質は、Ｇ蛋白結合レセプター類（ＧＰＣＲ）に結合し、引き続いて蛋白質キナーゼ系により媒介された複数のシグナル伝達の発生となる。最初の事象の結果生じるカスケードは、複雑且つ相互に関連付けられており、さらにすべての有核細胞の挙動全体に関与している。プログラム化細胞死（アポトーシス）、免疫応答の発生、自己認識Ｔ細胞の除去および細胞外マトリクス合成の制御は、シグナル伝達経路作用におけるわずかに少数の例である。
【００９０】
蛋白質キナーゼ類は、リン酸塩基をリン酸塩ドナーから蛋白質内に位置付けされたアクセプターアミノ酸上に移動する能力により同定された。通常は、ＡＴＰのγリン酸塩がドナーである。蛋白質内の３種の主要アクセプターアミノ酸残基は、チロシン、セリンおよびスレオニンである。１９９９年時点で、１１５種以上の蛋白質キナーゼが同定されており、文献に記載されている。
【００９１】
ＦＭＬＰによる刺激に応答する細胞挙動は、文献（Ｐｒｏｓｎｉｔｚ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７４：７３−１０２，１９９７）に記述されている。貪食細胞に結合するＦＭＬＰは、細胞外機能に関連するリン酸化を刺激する。ＦＭＬＰおよび他の化学誘引物質は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）を刺激し、次々に蛋白質キナーゼ類（ＰＫＣ）を活性化する。好中球において、ＦＭＬＰ結合は、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ類（ＭＡＰキナーゼ類）と称されるキナーゼ類一般ファミリーに属する細胞外の調節化されたキナーゼ、（ＥＲＫ−１）のリン酸化を開始する。ＭＡＰキナーゼファミリーのうちのメンバーには、Ｒａｆ−１およびＲａｓがある。
【００９２】
ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーは通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により１種ずつ分解できる程度に分子量が異なる。さらに、ホスホチロシン蛋白質は、ホスホチンエピトープのみを認識するモノクローナル抗体による細胞内蛋白質の全質量から検出できる（Ｒｏｓｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン））２９４：６５４，１９８１；Ｆｒａｃｋｌｅｔｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：１３４３，１９８３）。
【００９３】
ヒト末梢血単核細胞および多核白血球に対するＨＫ−Ｘの付加により媒介された蛋白質キナーゼ類における変化を、ＨＫ−Ｘの作用メカニズムを解明するために分析した。ＨＫ−Ｘを単独でおよび知られた走化性および炎症誘発性物質であるＦＭＬＰまたはＩＬ−８と共に付加させた。
【００９４】
物質および方法の詳細：
１．細胞の単離−ヒトの末梢血単核細胞および多形核白血球を、正常ドナーから得られた末梢血から単離した。種々の細胞種を、室温で６０分間５００−ｘ９でＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上の遠心分離により単離した。各フラクションを回収し、別々にプールし、抗生物質を有するＲＰＭＩ１６４０中で１回洗浄した。
【００９５】
２．細胞の培養と処理−培地１ｍｌにつき１０７細胞を、細胞をリン酸化蛋白質プール内に定常状態に到達させるために、刺激剤の付加前に、３７℃で３０分間保持した。次に以下の刺激物を細胞の各々のｍｌに加えた。
【００９６】
Ａ．１００μＬの媒体（培地中０．３％ＤＭＳＯ溶液）。
【００９７】
Ｂ．１００μＬのＨＫ−は、２０μｇのＨＫ−Ｘを含んだ。
【００９８】
Ｃ．１００μＬのＦＭＬＰは、０．１μｇのＦＭＬＰを含んだ。
【００９９】
Ｄ．１００μＬのＩＬ−８は、０．１μｇのＩＬ−８（組換え型ヒトＩＬ−８）
Ｅ．１００μＬのＨＫ−Ｘは、２０μｇのＨＫ−Ｘを含み、プラス１００μＬのＦＭＬＰは０．１μｇのＦＭＬＰを含んだ。
【０１００】
Ｆ．１００μＬのＨＫ−Ｘは、２０μｇのＨＫ−Ｘ含み、プラス１００μＬのＩＬ−８は０．１μｇのＩＬ−８を含んだ。
【０１０１】
Ｇ．いかなる刺激剤もない細胞培養培地。
【０１０２】
細胞を５％ＣＯ２中３７℃でさらに３０分間温置した。
【０１０３】
３．細胞の回収およびＳＤＳ−ＰＡＧ分析−細胞を室温で５分間２５０×ｇでペレットにした。上澄液を除き、２５μＬの２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ出発緩衝液を加えた。ペレットを１５分間沸騰させて、１０，０００×ｇで５分間遠心分離する。小サンプルを、１２％アクリルアミドゲル上のゲルの電気泳動用に除いた。
【０１０４】
４．リン蛋白質の免疫ブロット検出−一蛋白質を１３Ｖで３０分間ナイロン膜に移し、続いて１％ＢＳＡにより１２時間ブロックした。０．３％ＢＳＡ中ＨＲＰにより共役した抗体を６０分間加えた。膜を洗浄し、固定し、写真撮影した。
【０１０５】
５．データ解析−写真は専門的実験室にて撮られ、ネガコピーを、極めて高いコントラストの低粒子フィルムを用いて各ゲルから作製した。次の写真を６００ｄｐｉでスキャンし、デンシトメトリー分析は、画像プロプラス（Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ）ソフトウェア、ＳＰＳＳを用いて実施した。分子量を各バンドごとに計算した。
【０１０６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンに塗布した細胞蛋白質量を標準化するために、同数の細胞を各処理に用いて、ほぼ同容量のサンプルを各レーンに塗布した。図５から図９を通して、モノクローナル抗ホスホチロシン抗体により検出されたリン蛋白質の化学発光パターンを示す。化学発光画像のネガは、バンドの高解像度およびそれらの対応する化学発光強度を得るために、専門写真家により作製された。例えば、図５Ａでは、媒体に３０分間曝された細胞に存在する蛋白キナーゼは、ゲルのデンシトメトリー分析におけるピークにより示されるように９種の異なる蛋白種を明らかにした。明瞭にするために、デンシトメトリー分析にピークを矢印で示し、ゲル中の対応する分子種もまた、同じ矢印で示されている。（ゲル由来のものは、より大きな分子量種が位置付けされるゲルの右側にある）。
【０１０７】
図６において、ＨＫ−Ｘに対する蛋白キナーゼ応答が示される。およそ８３Ｋｄの分子量種における明らかな増加が検出され、それは他の処理において観察されなかった。著しい相違が、細胞の２０μｇ　ＨＫ−Ｘおよび０．１μｇ　ＩＬ−８、並びに２０μｇ　１ＨＫ−Ｘおよび０．１μｇ　ＦＭＬＰとの同時処理後に見られた（データは示していない）。より小さな分子量種は大きく減少して現れた（ゲルの左の大部分）。この減少は、ピーク面積により定量的に反映される。デンシトメトリーの追跡におけるこの面積を水平の２重頭矢により示す。蛋白キナーゼ含有量および新鮮な単核細胞の分配を図９に示す。これらの細胞のキナーゼ分配は、媒体処理細胞（図５）およびＨＫ−Ｘ処理細胞（図６）のものと著しく類似する。ＦＭＬＰ刺激単独およびＨＫ−ＸプラスＦＭＬＰ刺激に対するキナーゼ応答パターンは示していない。しかしながら、これらの各パターンは、それぞれＩＬ−８単独およびＨＫ−ＸプラスＩＬ−８により観察されたものと実質的に一致した。
【０１０８】
末梢血多核白血球に係る蛋白キナーゼのパターンと分配は、単核細胞のものと本質的に同一であった。２種の細胞種間の主要な相違は、単核細胞が多核白血球よりも代謝的に活性であることであった。
【０１０９】
デンシトメトリー分析法を用いて、各分子量種のピーク下面積を計算した。このように、各キナーゼの定量評価を全キナーゼ含有量のパーセントとし計算した。さらに、知られたキナーゼ類の分子量を、本実験における相対移動（Ｒｆ）計算から計算されたものと比較した。このようにして、本試験におけるキナーゼ類が同定できた。
【０１１０】
表３は、ＨＫ−Ｘに対する曝露後のヒト末梢血細胞からの蛋白キナーゼ類の分配における定量的変化を示す。
【０１１１】
【表３】
2004507441.tif 000004
【０１１２】
表４は、以前の定量データを確認し拡張した種々の実験におけるＧ蛋白質γキナーゼ定量を示す。各処理に同一細胞を用い、また回収された細胞内蛋白質のおよそ同一量を各レーンに塗布することを試みたが、キナーゼ類の全量は観察された面積に見られるように異なっていた。
【０１１３】
【表４】
2004507441.tif 000005
【０１１４】
表５は、（１）ＨＫ−Ｘおよび（２）ｆＭＬＰまたはＩＬ−８に対する共刺激曝露と比較してＨＫ−Ｘに対する曝露後のヒト末梢血細胞からの蛋白キナーゼ分配における変化を示す他の実験結果を示す。
【０１１５】
表６および表７は、１）ＨＫ−Ｘおよび（２）Ｃａ５、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３に対する共刺激曝露と比較してＨＫ−Ｘに対する曝露後のヒト末梢血細胞からの蛋白キナーゼ分配における変化を示したさらなる実験結果を示す。
【０１１６】
【表５】
2004507441.tif 000006
【０１１７】
【表６】
2004507441.tif 000007
【０１１８】
【表７】
2004507441.tif 000008
【０１１９】
多くの重要な事象が、ホルミルペプチドに係るレセプターを保持する細胞の刺激中に起こる。これらは以下のことを含む：
Ａ．ＦＭＬＰまたは他の類縁物質を結合する際、ＦＰＲは、ＬＴＢ４およびＣ５ａレセプターなどの他の化学誘引物質レセプター類に共通するＧ蛋白プールと相互作用する（Ｊａｃｏｂｓ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５７：６７９−６８６，１９９５；ＭｃＬｅｉｓｈ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３６：３８４−３９０）。
【０１２０】
Ｂ．ＦＭＬＰまたは他の化学誘引物質による刺激後、細胞は、同一または他の化学誘引物質に対し、さらなるまたは引き続く応答に対して御しにくくなる。この御しにくい状態すなわちレセプターの不活化が、１種の刺激剤により誘導され、複数の未結合レセプターに影響をあたえる場合、この状態は異種の脱感作である。脱感作のこの形態は、ＦＣεＲレセプターとのように、下流活性化キナーゼによる未結合レセプター類のリン酸化から生じ得ると推測されている。
【０１２１】
Ｃ．ＩＬ−８、Ｃ５ａおよびＦＭＬＰは、各々他のレセプターを脱感作した。これらの研究は、ＰＡＦおよびＬＴＢ４レセプター類などに拡張された。この過程が開始され得るメカニズムは、ＰＫＣによるレセプターリン酸化に関与していると思われる。しかしながら、ＦＰＲは、ＰＫＣによりリン酸化できる細胞内ドメインを含まないが、他のキナーゼが原因となっているようである。
【０１２２】
Ｄ．下流ＦＰＲ応答の脱感作は、ＦＰＲリン酸化の欠いた状態に生じる。
【０１２３】
ＨＫ−Ｘ単独処理は、キナーゼ類を特異的にダウンレギュレーションをしない。ＨＫ−ＸおよびＩＬ−８による、またはＨＫ−ＸおよびＦＭＬＰによる単核細胞の同時刺激後、選択的かつ有意にＧ蛋白γキナーゼは減少した。これらの観察は、次のＨＫ−Ｘの作用メカニズムを示唆するが、それを以下に説明する。
【０１２４】
ＨＫ−ＸおよびＩＬ−８およびＦＭＬＰなどの潜在的な炎症誘発性分子は、共に存在できる。トリマーＧ蛋白複合体の中の１種のダウンレギュレーションがある。特異的に、Ｇ蛋白γリン酸化は定常状態下で減少した。したがって、ＩＬ−８またはＦＭＬＰ存在下、ＨＫ−Ｘは、Ｇ蛋白γサブユニットのリン酸化を直接または間接的に阻害するレセプターの脱感作を開始すると思われる。
【０１２５】
本明細書に提示されたデータおよび以前に報告のデータから引き出すことができる多くの結論があるがそれらは以下のことである。
【０１２６】
１．ＨＫ−Ｘは、特異的炎症誘発性レセプター類により媒介される炎症誘発性刺激に対応できる細胞特異性を明示する。
【０１２７】
２．ＨＫ−Ｘが炎症事象中、系に維持される場合、ＨＫ−Ｘは、潜在的な応答細胞の脱感作を維持するはずである。
【０１２８】
３．本報告書に記載されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系を用いると、他の細胞標的および他の炎症誘発性媒介物質を、ＨＫ−Ｘの作用に対する感受性に関してスクリーンできる。したがって、簡便なアッセイが、潜在的治療の有効性に関して迅速にスクリーンするために、および治療予測性を確立するために使用できる。
【０１２９】
ある程度、ＨＫ−Ｘは、炎症誘発性媒介物レセプターの脱感作を介して治療有効性を実現すると思われる。この事象から下流で、炎症細胞の不活化がＧ蛋白γサブユニットのリン酸化阻害を介して直接または間接的に媒介され維持される。
【０１３０】
本発明を、その好ましい実施形態を含んで詳細に記載した。しかしながら、当業者は、請求項に記載された本発明の意図と範囲内で変更または改善し得ることを理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト末梢血有核細胞に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ（ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ）の結合を示すグラフである。
【図２Ａ】活性化リンパ球に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ結合の点プロットである。図２Ａは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養２４時間後の６μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘなしで、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｃは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。
【図２Ｂ】活性化リンパ球に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ結合の点プロットである。図２Ａは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養２４時間後の６μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘなしで、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｃは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。
【図２Ｃ】活性化リンパ球に対するＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘ結合の点プロットである。図２Ａは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養２４時間後の６μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｂは、ＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘなしで、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。図２Ｃは、１００ｎＭＦＩＴＣ標識ＨＫ−Ｘを添加して、培養１２０時間後の６μｇＣｏｎＡで刺激化されたリンパ球を示す。
【図３Ａ】図２Ａ〜図２Ｃのリンパ球のＤＮＡ含量ヒストグラムである。図３Ａは、図２Ａの細胞のヒストグラムである。図３Ｂは、図２Ｂと図２Ｃの細胞のヒストグラムである。
【図３Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃのリンパ球のＤＮＡ含量ヒストグラムである。図３Ａは、図２Ａの細胞のヒストグラムである。図３Ｂは、図２Ｂと図２Ｃの細胞のヒストグラムである。
【図４】全ヒト好中球ライゼートから回収された３５Ｓ−メチオニン標識化蛋白質と種々の樹脂とのオートラジオグラフである。
【図５Ａ】媒体で（０．３％ＤＭＳＯ）で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図５Ａは、正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図５Ｂは、媒体（ＤＭＳＯ）のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図５Ｂ】媒体で（０．３％ＤＭＳＯ）で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図５Ａは、正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図５Ｂは、媒体（ＤＭＳＯ）のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図６Ａ】ＨＫ−Ｘで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図６Ａは、ＨＫ−Ｘ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図６Ｂは、ＨＫ−Ｘのみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図６Ｂ】ＨＫ−Ｘで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図６Ａは、ＨＫ−Ｘ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図６Ｂは、ＨＫ−Ｘのみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図７Ａ】ＩＬ−８で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図７ＡはＩＬ−８処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図７Ｂは、ＩＬ−８のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図７Ｂ】ＩＬ−８で処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図７ＡはＩＬ−８処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図７Ｂは、ＩＬ−８のみで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図８Ａ】ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図８Ａは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図８Ｂは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−８で処理したで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図８Ｂ】ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａで処理した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図８Ａは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−Ａ処理細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図８Ｂは、ＨＫ−ＸおよびＩＬ−８で処理したで処理した正常細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図９Ａ】末梢血から新たに採取した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図９Ａは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図９Ｂは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図９Ｂ】末梢血から新たに採取した単核細胞内のリン酸化蛋白質の存在を、ホスホチロシンに対するモノクロ−ナル抗体によって検出したものを示す。図９Ａは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリーであり、図９Ｂは、新たに採取した細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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