(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）（式中、Ｒ１は水素、線状又は分岐状Ｃｌ−Ｃｌ５アルキル、Ｃ１−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、一、二、三、四、五置換アリール又はヘテロアリール、ＣＯＯＲ３、−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｎＲ３、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、又は未置換又は置換オキサジアゾールであり、Ｒ２は水素、線状又は分岐状Ｃ１−Ｃ１５アルキル、Ｃ１−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、一、二、三、四又は五置換アリール又はヘテロアリール、未置換又は置換ナフチル、１，３−ベンゾジオキソール、フッ素、インドール、イソキノリン、キノリン、ピリジン、ピリミジン、アントラセン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈであり、ヘテロアリールはアリール上にＮ、Ｏ、又はＳ、一個又は複数の置換基を含んでなり、又はヘテロアリールは独立してＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルケニル、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、ＮＨＲ、又は−ＯＲであり、ＲはＣ１−Ｃ７アルキルであり、Ｒ３はＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルケニル、ベンジル、置換アリール又はヘテロアリールであり、ｎ＝１−７である）の化合物のクラスに関する。これらの化合物は、ドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）及びノルエピネフリン阻害薬としての強力な阻害薬として見出され、合成され、確認されている。従って、これらの化合物は、ドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）及びノルエピネフリンに関連するモノアミン神経伝達物質系の調節が役割を果たしている疾病又は疾患の治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物が式（Ｉ）又は（ＩＩ） ：
2004506686.tif 000014
（式中、Ｒ１は水素、線状又は分岐状Ｃｌ−Ｃ１５アルキル、Ｃ２−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、一、二、三、四若しくは五置換アリール又はヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｎ−アリール、ＣＯＯＲ３、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｎＲ３、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、又は未置換又は置換オキサジアゾールであり、Ｒ２は水素、線状又は分岐状Ｃｌ−Ｃ１５アルキル、Ｃ２−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、一、二、三、四又は五置換アリール又はヘテロアリール、未置換又は置換ナフチル、１，３−ベンゾジオキソール、フルオレン、インドール、イソキノリン、キノリン、ピリジン、ピリミジン、アントラセン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈであり、Ｒ３はＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、ベンジル、置換アリール又はヘテロアリールであり、且つＲ１及びＲ２は独立して選択され、ｎ ＝ １−７であり、ヘテロアリールはアリール上にＮ、Ｏ、又はＳ、一個若しくは複数の置換基を含んでなり、あるいはヘテロアリールは独立してＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、ＮＨＲ、又は−ＯＲであり、ＲはＣ１−Ｃ７アルキルである）
である、化合物又はその薬学上許容可能な塩。
【請求項２】
化合物が式（Ｉ）を有し、（±）−、（＋）−及び（−）−異性体からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ） マンニッヒ反応条件下で第一の置換基を有するキヌクリジノンを調製し、
（ｂ） 段階（ａ）の生成物を反応させてキヌクリジノンに第二の置換基を付加することによって、化合物を生成する
ことを含んでなる、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【請求項４】
（ｃ） 段階（ｂ）で得た化合物を還元して、式（Ｉ）の二置換キヌクリジンを生成することをさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｃ）の生成物をキラル分割して、非ラセミ鏡像異性体の形態の式（Ｉ）の化合物を得ることをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
キラル分割によって（＋）−鏡像異性体又は（−）−鏡像異性体を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脳のドーパミン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする対象に請求項１に記載の化合物の有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項８】
セロトニン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする対象に請求項１に記載の化合物の有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項９】
脳のノルエピネフリン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする対象に請求項１に記載の化合物の有効量を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１０】
コカイン濫用の治療を必要とする対象におけるコカイン濫用の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１１】
鬱病の治療を必要とする対象における鬱病の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２】
不安の治療を必要とする対象における不安の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１３】
摂食障害の治療を必要とする対象における摂食障害の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１４】
パーキンソン病の治療を必要とする患者におけるパーキンソン病の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５】
アルコール中毒の治療を必要とする対象におけるアルコール中毒の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１６】
神経障害の治療を必要とする対象における神経障害の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
慢性的疼痛の治療を必要とする対象における治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８】
強迫性障害の治療を必要とする対象における強迫性障害の治療方法であって、上記対象に請求項１に記載の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、方法。
【請求項１９】
化合物が２−ブチル−３−フェニルキヌクリジンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
化合物が２−ブチル−３− （４−メチルフェニル） キヌクリジンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
化合物が２−ブチル−３− （４−クロロフェニル） キヌクリジンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２２】
化合物が実質的に純粋な（＋）−又は（−）−形態である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
化合物が実質的に純粋な（＋）−又は（−）−形態である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２４】
化合物が表２に示されている化合物１６又は化合物１７である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
実質的に純粋な（＋）−又は（−）−形態である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
化合物が表２に示される化合物から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２７】
ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリン流の少なくとも１つが役割を果たしている疾病の診断方法であって、体液の試料を、請求項１に記載の化合物であって、標識されているものと接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２８】
化合物が放射性薬品で標識されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化合物が蛍光性薬品で標識されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が電磁性残基で標識されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
化合物が抗体に抱合されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
化合物が放射性薬品及び蛍光性薬品からなる群から選択される標識で標識されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３３】
抗原に関連する疾病の治療方法であって、対象に請求項１に記載の化合物を投与することを含み、この化合物が抗原に結合する抗体に抱合されている、上記方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の化合物が標識されている、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．関連出願
本出願は、２０００年８月２１日出願の合衆国仮出願第６０／２２６，５８１号に基づいており、上記出願の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【０００２】
２．発明の分野
本発明は、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリン輸送体の強力な阻害薬としての化合物である２，３−二置換キヌクリジンの発見、合成及び鏡像異性体分割、及びこのような化合物の治療での使用に関する。
【０００３】
３．関連技術の概要
モノアミン神経伝達物質であるドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）及びノルエピネフリン（ＮＥ）のシナプス間隙からの特異的再取り込み（ｒｅｕｐｔａｋｅ）は、モノアミン作動性神経伝達の終結のための主要な生理学的機構である。取り込み（ｕｐｔａｋｅ）を遮断すると、神経伝達物質のシナプスでのアベイラビリティが増加し、これによりシグナルが増強される（Ｋｉｔａｙａｍａ， Ｓ． Ｄｏｈｉ， Ｔ． Ｊｐｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９６，７２，１９５−２０８）。これは、多くの神経障害の治療法の開発に生かされてきた。フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）のような選択的セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）阻害薬が、鬱病の治療に用いられている。選択的ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）阻害薬であるベンゾトロピンは、パーキンソン病の治療に臨床的に用いられている。ＲＴＩ−１１３及びＧＢＲ １２９０９のような他の強力で選択的なＤＡＴ阻害薬は、現在コカイン濫用の治療の臨床試験が行われている。デシプラミンのようなノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）阻害薬は、鬱病の治療に有効である。本発明は、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリン輸送体の強力な阻害薬としての新規なクラスの化合物である２，３−二置換キヌクリジン、及びそれらの治療上の使用に関する。
【０００４】
濫用の傾向がそれ自身は全く又はほとんどない強力で長時間作用性のＤＡＴ阻害薬を、コカイン濫用の治療に用いることができる。本発明の一態様を、コカイン濫用の治療のための新規治療薬として用いることができる。コカイン濫用は今日のアメリカ社会の最も大きな問題の一つであり、従って医学的、社会的及び政治的論議の的となっている。コカインは既知の最も常習性の強い物質の一つであり、コカイン常習者は、職場で又は個人間の関係において活動を行う能力を喪失することがある。コカインは、ノルエピネフリン（ＮＥ）及びセロトニン（５−ＨＴ）の再取り込みを強力に阻害するが、多くの系列の証拠は、強化因子として作用するその能力はドーパミン（ＤＡ）のドーパミン作動性ニューロン中への再取り込みを阻害するその能力に由来することを示している。コカインは、ＤＡ神経末端にあるＤＡ輸送体（ＤＡＴ）タンパク質（コカイン受容体）と特異的に相互作用することによってこの効果を発揮する。報酬介在脳中辺縁系（ｒｅｗａｒｄ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｍｅｓｏｌ ｉｍｂｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）におけるこのドーパミン作動性透過の増加は、コカイン作用のドーパミン仮説の本質である。
【０００５】
しかしながら、最近の研究は、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンの同時流がコカイン常習に関与する分子機構において重要な役割を果たすことを示している。ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンの流れに対する共通の分子的態様は、モノアミン輸送体に関与している。従って、小分子化合物のクラスを同定又はデザインしてモノアミン輸送体の活性を調節し、これによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンの取り込みをモノアミン輸送体によって同時に調節することができれば、極めて有益であろう。このような新規化合物、及びそれに基づく治療及び診断方法は、多くの神経障害の治療に極めて有益であろう。特に興味深いものは、コカイン作用の総て又は幾らかに拮抗することができるリード化合物である。
【０００６】
（本発明の概要及び目的）
本発明の目的は、ニューロンのシナプス空間での異常ドーパミンシグナル形成を阻害する化合物を提供することである。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、コカインと拮抗する化合物を提供することである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、脳ドーパミン流の制御を必要とする患者での脳ドーパミン流の調節方法を提供することである。この方法は、患者に上記の方法によって同定した化合物を投与することを含んでなる。
【０００９】
更にもう一つの本発明の目的は、コカイン作用の阻害を必要とする患者においてコカイン作用を阻害する方法であって、患者に上記の方法によって同定した化合物を投与することを含んでなる、方法を提供することである。
【００１０】
更にもう一つの本発明の目的は、ドーパミン再取り込み作用を必要とする患者においてこのような作用を促進する方法であって、上記患者に上記の方法によって同定した化合物を投与することを含んでなる、方法を提供することである。
【００１１】
一態様では、本発明は、化合物又はその薬学上許容可能な塩であって、化合物が式（Ｉ）又は（ＩＩ） ：
2004506686.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素、線状又は分岐状Ｃ１−Ｃ１５アルキル、Ｃ２−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、一、二、三、四若しくは五置換アリール又はヘテロアリール、−（ＣＨ２）ｎ−アリール、ＣＯＯＲ３、−ＣＯＯ−（ＣＨ２）ｎＲ３、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ３、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、あるいは未置換又は置換オキサジアゾールであり、Ｒ２は水素、線状又は分岐状Ｃ１−Ｃ１５アルキル、Ｃ２−Ｃ１５アルケニル、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル、一、二、三、四若しくは五置換アリール又はヘテロアリール、未置換又は置換ナフチル、１，３−ベンゾジオキソール、フルオレン、インドール、イソキノリン、キノリン、ピリジン、ピリミジン、アントラセン、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈであり、Ｒ３はＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、ベンジル、置換アリール又はヘテロアリールであり、ｎ＝１−７であり、ヘテロアリールはアリール上にＮ、Ｏ、若しくはＳ、一個又は複数の置換基を含んでなり、又はヘテロアリールは独立してＣ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニル、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ２、ＮＨＲ、又は−ＯＲであり、ＲはＣ１−Ｃ７アルキルである）
であるものを提供する。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは（±）−、（＋）−及び（−）−異性体からなる群から選択される鏡像異性体形態で調製され、単離される。
【００１３】
本発明のもう一つの態様では、本発明による化合物の調製方法であって、（ａ）マンニッヒ反応条件下で第一の置換基を有するキヌクリジノンを調製すること、（ｂ）段階（ａ）の生成物を反応させてキヌクリジノンに第二の置換基を付加することによって、化合物を生成することを含んでなる、方法を提供する。本発明の方法は、（ｃ）段階（ｂ）で得た化合物を還元して、式（Ｉ）の二置換キヌクリジンを生成することをも含んでなる。
【００１４】
本発明は、脳のドーパミン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要としている対象に上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる、方法も提供する。
【００１５】
本発明は、セロトニン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要としている対象に上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる、方法も提供する。
【００１６】
本発明は、脳のノルエピネフリン流が役割を果たしている疾病又は疾患の治療方法であって、このような治療を必要としている対象に上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の有効量を投与することを含んでなる、方法も提供する。
【００１７】
本発明の一つの特に有利な態様では、コカイン濫用の治療を必要とする対象におけるコカイン濫用の治療の方法であって、上記対象に上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することを含んでなる、方法が提供される。本発明の化合物は、ドーパミン、セロトニン及び／又はノルエピネフリンモノアミン伝達物質の再取り込みに関連する様々な神経障害の治療に極めて有利である。本発明の化合物は、臨床的鬱病、不安、アルコール中毒、摂食障害、及びパーキンソン病のような疾病の治療に特に有用である。
【００１８】
本発明の化合物は、対象に式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を投与することによってドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン伝達物質の少なくとも１個の再取り込みを調節することによる慢性的疼痛及び強迫性障害の治療にも有用である。
【００１９】
本発明による好ましい化合物としては、２−ブチル−３−フェニルキヌクリジン、好ましくは実質的に純粋な（±）−鏡像異性体形態でのもの、及び２−ブチル−３−（４−メチルフェニル）キヌクリジン、好ましくは実質的に純粋な（±）−又は（＋）−鏡像異性体形態のものが挙げられる。
【００２０】
本発明の他の好ましい化合物を、表２に示す。
【００２１】
もう一つの態様では、本発明は、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンモノアミン輸送体の少なくとも１つの再取り込みが役割を果たしている疾病の診断方法であって、体液の試料を、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物であって、標識されているものと接触させることを含んでなる、方法が提供される。好ましい標識剤としては、放射性薬品、蛍光性薬品、及び追跡可能な電磁性残基を含む標識剤が挙げられる。
【００２２】
（表の簡単な説明）
表１は、式（Ｉ）の典型的なモノアミン輸送体阻害薬、及び３つのモノアミン輸送体部位におけるそれらの活性である。
【００２３】
表２は、式（ＩＩ）の典型的なモノアミン輸送体阻害薬、及び３つのモノアミン輸送体部位におけるそれらの活性である。
【００２４】
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明によるリード化合物は、所定の疾病の治療に有用な同類の化合物（アナログ化合物）をデザインするための化学修飾の目的で選択した化合物である。リード化合物は、既知化合物又は新たにデザインされた化合物であることができる。
【００２５】
本発明によるファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）は、多数の結合要素を含む化学的モティーフである。要素は、リード化合物として同定される化合物の活性においてある役割を果たしていると想定されている。ファーマコフォアは、結合要素の化学的性質並びにそれらの要素の幾何学的配置によって定義される。
【００２６】
基本的には、本発明は、ドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）及びノルエピネフリンに関連するモノアミン神経伝達物質系の調節が有益な効果を有することがある疾病又は疾患、又はドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）及びノルエピネフリンに関連するモノアミン神経伝達物質系の調節が有益な効果を有することがある疾患に適用することができる。このような疾病の例としては、鬱病、不安、アルコール中毒、慢性的疼痛、摂食障害、強迫性障害、コカイン濫用が挙げられる。
【００２７】
本発明は、脳のドーパミン流を制御する目的で合理的にデザインされる化合物を包含する。これらの化合物は、ドーパミン輸送体阻害薬及び／又はコカイン拮抗薬であることができる。本発明の化合物の合理的なデザインは、脳のドーパミン流に関連した機構の同定を含む。次に、この機構に関する情報を解析して、このような機構の妨害において可能な活性を有する化合物の構造を処方する。特に、構造は「ビルディングブロック」に基づいて合成され、それぞれのビルディングブロックは、ドーパミン流に関連した特定の機構、特にドーパミン輸送体タンパク質（ＤＡＴ）によって伝達される機構を潜在的に妨害することができる特徴を有する。
【００２８】
次に、様々なビルディングブロックの組合せを有する化合物を合成し、同定した機構に関するそれらの活性を試験する。このような試験は、イン・ビトロ及び／又はイン・ビボで行われる。次に、このような試験によって得た情報を、合理的なドラッグデザインの新たなサイクルに組込む。デザイン−合成−試験サイクルを、目的とする治療、例えば、ドーパミン流の制御について所望の特性を有する候補化合物が得られるまで繰り返す。次に、この候補化合物を、臨床試験する。
【００２９】
コカイン常習の治療のための脳のドーパミン流を制御する方法は、ドーパミン取り込みに影響を与える可能性があるコカイン拮抗薬をデザインすることである。更に具体的には、この方法は、ＤＡＴへのコカインの結合を減少又は遮断するコカインの拮抗薬である化合物を合理的にデザインすることに基づいている。好ましくは、細胞のコカイン結合を減少又は遮断するがドーパミン輸送の他の態様には影響しないままである拮抗薬がデザインされる。デザインした拮抗薬は、ドーパミン輸送を選択的に制御し、それによって、脳のドーパミンの正常な流れを妨害することなくシナプスシグナル形成を制御することに基づいた治療プロトコールの基礎を提供するものである。
【００３０】
コカイン及びドーパミンはいずれもＤＡＴに結合するが、最近の突然変異誘発及び薬物動態の研究は、ドーパミンとコカインはＤＡＴ上の同一結合部位を共有しないことの証拠を提供している。従って、本発明の一つの目的は、結合部位でコカインと競合し、しかもドーパミンの輸送を有意には阻害しないやり方でＤＡＴに結合する分子を見出すことである。これらの分子は、ドーパミン取り込みの阻害が不完全であるようなやり方で結合する場合には、コカイン拮抗薬として又は部分的作動薬として機能することができた。このような化合物は、コカインの過剰投与の場合にコカインの有害効果を幾分か相殺し、又は患者にコカイン治療プログラムを保持させるのに有用である。
【００３１】
分子生物学の最近の進歩によってＤＡＴのアミノ酸配列が同定されたが、実験的な３Ｄ構造はＤＡＴについては得られていない。実験的構造がかけているため、コカイン拮抗薬としてのＤＡＴ阻害薬の発見についての構造に基づくデザインの方法を用いることは困難である。
【００３２】
一方、コカイン類似体及び他の種類のドーパミン輸送体阻害薬についての豊富なＳＡＲデーターが利用可能である。これにより、重要な化学構造上の特徴及び目的とする生物活性に重要なそれらの３Ｄ幾何学的関係の表現として定義される「推定３Ｄファーマコフォアモデル」を誘導することが可能になる。ファーマコフォアモデルを用いて、大きな化学データーベースを検索して、３Ｄ構造がファーマコフォア要件に合致する化合物を見つけだすことができる。
【００３３】
本発明によって同定されたリード化合物を用いて、多数のＤＡ阻害薬をデザインして、試験した。本発明者らの機能分析法で有望なコカイン拮抗作用を示す化合物を、同定した。
【００３４】
コカイン拮抗薬の合理的ドラッグデザインのためのファーマコフォアの同定
ＤＡＴ阻害において重要な特徴と想定されるファーマコフォアをデザインするため、コカイン及び類似体ＷＩＮ−３５０６５によって共有されている多数の官能基を考察した。コカイン及びＷＩＮ−３５０６５の化学構造を、図１に示す。
【００３５】
コカイン及びその類似体の構造−機能関係の広汎な解析に基づいて、コカイン及びその類似体の結合及び再取り込みに重要な役割を果たしていると考えられる３種類の結合要素、（１）トロパン環の３β−位の芳香族系、（２）この位置における２βエステル基又は小さな疎水性基、及び（３）８位の窒素を同定した。８位のこの窒素は、酸素に置換することができる。
【００３６】
上記結合要素に基づいてファーマコフォアを処方する次の段階は、コカイン及びその類似体でのこれらの結合要素の３Ｄ幾何学的関係を決定し、これらの関係をファーマコフォアモデルの幾何学的要件を定義する幾何学的パラメーターとして組込むことである。
【００３７】
コカインをベースとする化合物に対するファーマコフォアのデザインのための幾何学的パラメーターを決定するため、コカインとＷＩＮ−３５０６５について配座分析を行った。コカインのＸ−線結晶構造を、コカインのモデリングの出発点として用いた。ＷＩＮ ３５０６５の初期構造は、ＱＵＡＮＴＡ分子設計パッケージを用いてベンゾイルオキシ基をフェニル基に代えることによって構築した。いずれの化合物の構成も最小限に抑え、体系的配座検索をプログラムＱＵＡＮＴＡを用いて行った。
【００３８】
上記の結合要素は、それぞれ窒素原子、カルボニル酸素及び芳香族環によって表した。
【００３９】
ファーマコフォアの幾何学的要件の決定において、３種類の距離パラメーター、（ｉ）窒素及び酸素、（ｉｉ）窒素と芳香族環の幾何学的中心の距離、及び（ｉｉｉ）酸素と芳香族環の幾何学的中心の距離、を定義した。これらの距離パラメーターの範囲は、コカインとＷＩＮ３５０６５の配座プロフィールを生成することによって決定した。これらの範囲は、低エネルギーのコカインとＷＩＮ−３５０６５での２個の結合要素の間の距離附近に中心を置いた。次に、配座プロフィールを処理して、それぞれの範囲の限界を決定した。
【００４０】
図２は、ドーパミン流制御に用いることができる化合物、例えばコカイン拮抗薬のデザインのためのリード化合物の同定に用いられるファーマコフォアの化学構造及び距離要件を示す。
【００４１】
図２のファーマコフォアについて得た距離要件は、（ｉ）２．２Å−４．５Åの窒素と酸素の距離（ｄｌ）、（ｉｉ）５．０Å−７．０Åの窒素と芳香族環の幾何学的中心の距離（ｄ２）、及び（ｉｉｉ）３．４−６．１Åの酸素と芳香族環の幾何学的中心の距ｄ３である。これは、コカイン及びＷＩＮ ３５０６５におけるこれらの原子の可能な距離を本質的にカバーする。最低距離値（２．６Å）及び最大距離値（４．２Å）のいずれにも、幾分かのゆとりを与えた。
【００４２】
距離範囲の限界は、距離にかなり大きな許容範囲を与える目的で選択した。これは、同定したリード化合物はコカインの一般構造に基づくものであるが、リード化合物がコカイン拮抗薬のデザインにおいて有用であるには、ファーマコフォアの距離要件が多様な化学構造を有する化合物を同定することができるように十分な柔軟性を有するものであるべきであるという考察に由来している。このような大まかに定義されたファーマコフォアによって、ＤＡＴに対するコカインの結合と効果的に競合するだけでなく、コカイン及びＷＩＮ−３５０６５化合物とはかなり異なる結合様式を有することによって異なるプロフィールを示すこともある化合物を同定することができる。
【００４３】
ＮＣＩ ３Ｄ−データーベースの３Ｄ−データーベースファーマコフォア検索
上記のように、コカイン（１）及びそのＷＩＮ類似体、例えば２ （ＷＩＮ ３５０６５−２）の分子モデリングの研究に基づいて、本発明は、ＤＡＴへの結合に重要な役割を果たすと考えられる３種類の化学基を含む上記のファーマコフォアモデルに基づいてデザインされる分子の開発に関する。しかしながら、様々なクラスのＤＡＴ阻害薬が普通の及び独特な結合要素の組合せによりＤＡＴに結合することがあるので、２種類以上のファーマコフォアモデルが開発されることがある。
【００４４】
図２に示されるファーマコフォアモデルを用いて、本発明者らは約５００，０００種類の化合物の３Ｄ−データーベースを検索し、ファーマコフォアモデルにおいて特定される化学的及び３Ｄ幾何学的要件に合う１０００種類以上の小分子を同定した。これまでに、２００種類のＤＡＴ阻害薬として可能性のあるものの試験により、［３Ｈ］マジンドール結合及びＤＡ再取り込み（データーは示さず）の阻害で測定したところマイクロモルからナノモルで効力を有する２０種類の新規なクラスのＤＡＴ阻害薬を見出した。
【００４５】
具体的には、図２に示されるファーマコフォアモデルに基づき、ＮＣＩ ３Ｄ−データーベースの２０６，８７６種類の「オープン」化合物の化学構造をプログラムＣｈｅｍ−Ｘで解析した。検索工程の間、化合物を必要な結合要素、すなわち第二又は第三窒素、カルボニル基、及び芳香族環系の存在について最初に検討を行った。３種類の結合要素がデーターベースから回収した化合物に含まれているときには、次に、プログラムにより化合物がファーマコフォアの幾何学的要件を満たす配座を有するかどうかを検討する。ファーマコフォアの距離要件を満たす少なくとも１個の配座を有する化合物を選択して、更に処理を行った。３，０００，０００までの配座を、ファーマコフォアを定義する３種の結合要素を含むそれぞれの化合物について検討した。
【００４６】
図２に示されるファーマコフォアモデルに基づいて、４０９４種の化合物すなわち２０６，８７６種の２％を含む化合物の第一群を形成し、合理的ドラッグデザインの目的でリード化合物を同定するために更に処理した。
【００４７】
第一群の化合物の処理における第一段階は、１０００より大きな分子量を有する総ての化合物を除去することによる第一群の剪定を伴った。これは、ドラッグデザインを、変更を行う部位の数が限定されているより小さな化合物に集約するためである。
【００４８】
化合物の群を、例えば化合物の窒素原子の化学的環境のためにファーマコフォアの窒素原子が水素結合を受け容れることができない化合物を除去することによって更に剪定した。
【００４９】
最後に、上記の２回の剪定段階によって得られた化合物の群の構造的多様性を犠牲にすることなく比較的少数の化合物を提供するため、剪定した群の化合物を構造上の類似性による集団であって、それぞれの集団が次の段階、すなわちイン・ビトロ試験のために選択される１個の化合物によって表される化合物のクラスを提供するものに分類した。
【００５０】
ファーマコフォア要件によって同定された４０９４種の化合物の上記剪定段階に基づいて、３８５種の化合物を最終的に選択して、［３Ｈ］マジンドール及び［３Ｈ］ ＤＡ再取り込み分析における試験を行った。
【００５１】
［３Ｈ］マジンドール及び［３Ｈ］ＤＡ分析における化合物のスクリーニング
スクリーニングの最初のバッチでは、３８５種の選択された候補からの７０種の化合物を［３Ｈ］マジンドール結合分析で評価した。１３種の化合物が、［３Ｈ］マジンドール結合分析において１０μＭで５０％を上回る阻害を示した。更に２３種の化合物は１０μＭで３０％〜５０％の阻害活性を示し、更に８種の化合物は［３Ｈ］マジンドール結合分析において１０μＭで２０％〜３０％の阻害活性を示した。全般的に見て、７０種の化合物の６３％（４４／７０）が、［３Ｈ］マジンドール分析において１０μＭで有意な活性を示した。これらの結果は、３Ｄファーマコフォア検索に用いたファーマコフォアモデルが、ＤＡＴ上のコカイン部位への［３Ｈ］マジンドール結合と効果的に競合することができる多様な化学構造を有する化合物の同定に意外なほど有効であることを示している。
【００５２】
ＤＡＴ結合活性を有する化合物の群を、コカインの［３Ｈ］ＤＡ取り込みの阻害に拮抗するそれらの能力について更に試験した。４種類の化合物クラスが、有意な機能上の拮抗作用を示すことが分かった。
【００５３】
コカイン活性及びＤＡ再取り込みの妨害を目的とする新規な分子の合理的ドラッグデザインのためのリード化合物の選択では、数種類の方法又は方策を採用する。一つの方法は、比較的高い（初期）結合親和性及びＤＡ再取り込み特性の阻害を示すリード化合物の選択に基づいている。次に、リード化合物を、リード化合物の（初期）特性と比較して有意に改良された結合親和性及びＤＡ再取り込み特性を有する新規な分子のデザインに利用する。この方法では、リード化合物はかなり良好な開始又は初期結合特性を示し、これは次に合理的ドラッグデザインによって有意に改良される。
【００５４】
本発明の主題である第二の方法は、リード化合物の化学構造とファーマコフォアの処方に用いるコカイン又はその類似体の化学構造との間の変動の程度に基づくリード化合物の選択に集中している。すなわち、コカインとかなり異なる化学構造を有するリード化合物がコカイン拮抗薬として幾らかの活性を示す限り、この化合物がコカイン活性に拮抗する強い潜在力を示す結合特性を持たなくとも、この化合物を選択して更にドラッグデザインを行う。この方法に基づいた新規な分子のデザインには一層広汎な研究を要することがあるが、コカインとは非常に異なるコア化学構造又は骨格を有する分子のデザインにより、有意なコカイン拮抗薬特性を有するリード化合物に基づいてデザインしたものより強力であるだけでなく、リード化合物の同定又はデザインに利用されるファーマコフォアの処方に用いられるコカイン又はその類似体と余り異なっていない化学構造も有する新規分子を提供することができる。
【００５５】
本発明は、図１にその構造を示した化合物３であって、新規な構造骨格を有する新規なクラスのＤＡＴ阻害薬を表しているものの選択に基づいている。２，３−二置換キヌクリジンとして分類することができる化合物３は、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害におけるＫｉ値がそれぞれ７２７０及び８９１０ｎＭであることが分かった（表１）。その活性は極めて弱く、コカインの約３０分の１の効力にすぎないものの、本発明は、化合物３は他のクラスの既知のＤＡＴ阻害薬と異なる構造骨格を有するので、新規なクラスのＤＡＴ阻害薬のデザインにおける有望なリードとなり得るという仮説に基づいている。すなわち、本発明は、化合物３のコア骨格構造を含みしかも化合物３と比較して著しく改良されたＤＡＴ結合親和性及びＤＡ再取り込み特性を示す化学構造を有する新規分子のデザインに基づいている。
【００５６】
本発明は、合理的にデザインした２，３−二置換キヌクリジンが新規な種類のドーパミン輸送体阻害薬を提供することを見出したことに基づいている。下記に説明するように、化合物３と関連したコア骨格構造を含む化学構造を有する本発明の分子を合成し、薬理試験により試験した。本発明の分子は、強力なＤＡＴ阻害薬である新規なクラスのキヌクリジンを提供する。具体的には、下記に説明するように、本発明によってデザインされ、合成され、試験を行ったキヌクリジン化合物は、その一層活性な鏡像異性体形態では結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害におけるＫｉ値がそれぞれ１４及び３２ｎＭであることによって示されるように、優れたＤＡＴ結合及びＤＡ再取り込み特性を示した。
【００５７】
リード化合物３は、２個の塩基性窒素原子、１個のカルボニル基及び２個の同等なフェニル基を有する。従って、化合物３とコカインの間では、２種類の異なるオーバーラップが、図２で定義した３個のファーマコフォア要素、すなわち第三窒素、カルボニル基及びフェニル環を参照点として用いて可能である。リード化合物３は、３種類の重要なファーマコフォア要素に関してコカインとかなり良好なオーバーラップを有することを見出した。４個の参照点（窒素原子、カルボニル基及び芳香族環中心）を用いると、３の最低エネルギー配座とコカイン（１）のＸ線構造との間のこれら２種類の異なるオーバーラップ（図３（Ａ）及び（Ｂ））における最低二乗平均偏差値（ＲＭＳＤ）は、それぞれ１．１２及び０．９５Åである。
【００５８】
リード化合物３及びコカインは図２で定義したファーマコフォア要素に関してかなり良好なオーバーラップを有するが、化合物３及びコカインの間の２つのオーバーラップ（図３）を詳細に検討したところ、これらの２つの分子の間には大きな排除体積があることを示していた。化合物３及びコカインは、それぞれ図３（Ａ）及び（Ｂ）に示される重ね合わせにより１５９及び１７４Å３のオーバーラッピング体積を有するが、それらはそれぞれ２１２及び１９８Å３の排除体積を有する。
【００５９】
ファン・デル・ワールス（立体）相互作用は、薬剤分子のその受容体への結合様式の決定において唯一の最も重要な因子であると思われる。従って、同様な結合様式で同一結合部位へ結合する２個の化合物は、特に結合部位が受容体表面上にないときには排除体積が最小となることが多い。分子モデリング及び突然変異誘発分析は、ＤＡＴにおけるコカインの結合部位は表面にはないことを示した。従って、図３に示された２つのオーバーラップは、コカインと比較してリード化合物３の「真の」結合様式を表さないことがある。
【００６０】
化合物３に基づいた一層強力な分子のデザインでは、化合物３とコカインのオーバーラップを更に検討した。コカインと補助的オーバーラップを有する化合物３に基づく新規な分子をデザインする一つの方法は、コカインの２位におけるエステル基を小さなアルキル基に置換することにより極めて強力なＤＡＴ阻害薬を生じるという観察に基づいている。
【００６１】
例えば、２□位にブチル基と３□位にｐ−Ｃｌ−フェニル基を有する化合物４は、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害において低いナノモル効力を有する極めて強力なＤＡＴ阻害薬である。図２のファーマコフォアモデルで定義したカルボニル基は、アルキル基を包含するように変更することができると考えられる。この変更したファーマコフォアモデルにより、化合物３の小さなＮ，Ｎ−ジメチルメチルアミノ基はコカインの２□位のエステル基を模倣することができ、３位の２−ヒドロキシル−２，２−ジフェニルアセテート基はコカインの３□位のベンゾエート基を模倣することができると推定される。リード化合物３の低エネルギー配座とコカインのＸ線構造との間で得られた最低ＲＭＳＤ値は、化合物３のキヌクリジン環の窒素及びコカインのトロパン環の窒素、及び化合物３及びコカインにおけるキヌクリジン環及びトロパン環、及び芳香族環中心の２位の３個の相当する原子を参照点として用いると、０．５０Åである。リード化合物３とコカインの間のオーバーラップを、図４に示す。良好なオーバーラップがこれら２個の分子の間に見られることが分かる（図４）。キヌクリジン環の３位の２−ヒドロキシ−２，２−ジフェニルアセテート基はコカインの３□位のフェニルエステル基と同じ領域に位置し、キヌクリジン環の２位のＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基はコカインの２□位のメチルエステル基と良好にオーバーラップしている。しかしながら、キヌクリジン環の３位の２−ヒドロキシル−２，２−ジフェニルアセテート基は、コカイン及びその類似体の構造−活性関係（ＳＡＲ） に基づいて最適効力を達成するには嵩が大きすぎると思われた。実際に、分子体積の計算では、図４に示されるオーバーラッピング法では、化合物３及びコカインは１７９Å３のオーバーラッピング体積及び１９４Å３の排除体積を有することが示された。排除体積は図３に示されているものより極僅か良好なだけであるが、嵩高い２−ヒドロキシル−２，２−ジフェニルアセテート基がこの排除体積の多くを占めていることが分かった。コカインでは、その３□位のベンゾエート基をフェニル基で置き換えることによって、ＤＡＴ部位においてコカインより４倍良好な結合親和性を有する化合物２ （ＷＩＮ ３５０６５−２）を生じた。
【００６２】
従って、３におけるキヌクリジン環の３位の嵩高い２−ヒドロキシ−２，２−ジフェニルアセテート基は、単純なフェニル基に置き換えてオーバーラッピング体積、従って、活性を向上させることができる。コカインの２□位の小さなエステル又は単純なアルキル基はＤＡＴ部位での高親和性にとって望ましいので、３のキヌクリジン環の２位におけるＮ，Ｎ−ジメチルメチルアミノ基を単純なアルキル基で置き換えてＤＡＴ部位における強力な活性を達成することができる。キヌクリジン環の２及び３位の２個の置換基は、トランス又はシス配置のいずれであることもできる。分子モデリングは、シス配置を有する類似体がコカイン（１）及びＷＩＮ ３５０６５−２ （２）と一層良好なオーバーラップを有することを示した。
【００６３】
これらの解析により、２位に単純なブチル基と３位にフェニル基を有し、それらがシス配置を有する化合物１２がデザインされた。図５（Ａ）に示されるように、１２とコカインとの間にはかなり良好なオーバーラップが見出され、１２の低エネルギー配座とコカインのＸ線構造を用いて図５（Ａ）に示された５個の参照点を用いる最低ＲＭＳＤ値は１．０７Åであった。重要なことには、１２とコカインより強力な類似体であるＷＩＮ ３５０６５−２ （２）との間に図４（Ｂ）で示されるように優れたオーバーラップが見出され、最低ＲＭＳＤ値は重ね合わせについて図４（Ｂ）に示される５個の参照点を用いるそれらの低エネルギー配座間では０．３０Åであった。化合物１２とＷＩＮ ３５０６５−２ （２）のオーバーラッピング体積は１７９Å３であり、排除体積は５４Å３であり、それらの全般的形状について優れたオーバーラップがあることを示している。１２とＷＩＮ ３５０６５−２ （２）の窒素原子の位置は０．１Å以内であるが（図４（Ｂ））、これら２種類の化合物の窒素孤立電子対の配向は約６０°だけ異なることに注目することは興味深いことである。以前の研究は、コカイン及びその類似体における窒素孤立電子対の配向が３種類のモノアミン輸送体の中のそれらの選択性にとって重要であることを示していた。総合すると、本発明者らの分子モデリングは、１２が強力なＤＡＴ阻害薬となることを示唆していた。
【００６４】
１２及び他の２，３−二置換キヌクリジンのラセミ形態での合成は、工程図Ｉに示される合成手順を用いて行った。簡単に説明すれば、３−キヌクリジノン（５）から出発して、２−メチレン−３−キヌクリジノン（６）をマンニッヒ反応を用いて調製した。５を水性ジメチルアミン及び水性ホルムアルデヒドとエタノール−水混合物中で７０℃で反応させてマンニッヒ塩基を得て、これを蒸留条件下で脱アミノして、化合物６を８６％の収率で得た。−７８℃でＣｕＩ・Ｍｅ２Ｓ及びＭｅ３ＳｉＣｌの存在下にて６を臭化アリルマグネシウムと反応させたところ、１２％の収率の１，２−付加生成物（構造は図示せず）と共に共役付加生成物７を４７％の収率で得た。アリールグリニャール付加を０℃でＴＨＦ中にて臭化アリールマグネシウムを用いて行って、化合物８を得て、これを次にＥｔＯＨ及び６Ｎ ＨＣｌの１：１混合物で還流条件下にて処理して、脱水化合物１０を得た。二重結合の還元は、標準的水素化条件（Ｐｄ／Ｃ， Ｈ２， ＥｔＯＨ， ６０ Ｐｓｉ）を用いて行い、化合物１２をほぼ定量的収率で得た。
【００６５】
化合物１２を、ＤＡＴ阻害薬として評価した。２個の中間体７及び８も試験して、このクラスの化合物のＳＡＲについて更に情報を得た。［３Ｈ］マジンドール結合及びＤＡ再取り込みの阻害における１２のＫｉ値は、それぞれ２１０及び２３７ｎＭ（表１）であり、リード化合物（３）と比較して３１及び３２倍改良されており、コカインと同じ効力であり、このようにして本発明者らのデザイン方法が確認される。化合物７はＤＡ再取り込みの阻害において１０□Ｍでは測定可能な活性を示さず（表１）、３位におけるフェニル基の重要な役割及び／又はケトン基の有害な効果を示唆している。化合物８の３１．２□ＭでのＫｉ値は１２の１３１分の１の効力であり（表１）、ＤＡＴ部位の活性に対して３位のヒドロキシル基が有害な効果を示すことを示唆している。
【００６６】
これまでの研究は、フェニル環にｐ−メチルのように更に置換することにより効力が更に向上することがあることを示した。従って、追加のｐ−メチル基を有する化合物１３は、図４に示されるように同様な１２の低エネルギー配座を採用することができるときには、活性が向上するであろう。分子モデリングは、１３が低エネルギー配座を有するＷＩＮ ３５０６５−２ （２）及び１２と優れたオーバーラップを有することを示した。ラセミ形態の化合物１３を、工程図Ｉに示されるように１２についてと同じ手順を用いて合成し、ＤＡＴ阻害薬として評価した。１３のＫｉ値は、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害ではそれぞれ２０及び４９ｎＭであり、リード化合物３と比較して結合及び取り込み活性がそれぞれ３６５及び１８１倍改良され、１３と比較して１１倍及び５倍改良されることを見出した。
【００６７】
１３の２及び３位の置換基がシス配置であること及び分子モデリング結果を確かめるため、１３のＸ線構造を得た（図５）。これから分かるように、２位のブチル基及び３位のｐ−メチルフェニルは、実際に所望なシス配置を採っている。コカインのＤＡＴへの結合は立体特異的であるので、ＤＡＴへの結合における化合物１３の立体特異性を検討することは興味あることであった。鏡像異性体（＋）−１３及び（−）−１３を、半分取用キラルＨＰＬＣカラム（Ｃｈｉｒｅｘ ３０１８）であって、キラル固定相（ＣＰＳ）がγ−アミノプロピルシラン化シリカゲルに共有結合した（Ｓ）−プロリン及び（Ｒ）−１−α−ナフチルエチルアミンからなるもの、及びヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＨ−ＴＦＡ （２０−１）が８３／１５／２の比であるものを溶離剤として用いて得た。（＋）−１３の旋光度が［α］Ｄ＝＋１０４ （ｃ ０．５，アセトン）であり、（−）−１３の旋光度は［α］Ｄ＝−１０４ （ｃ ０．５，アセトン）であった。（−）−１３は、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害でのＫｉ値はそれぞれ１４及び３２ ｎＭであり、（＋）−１３はＫｉ値がそれぞれ３４３及び３５４ ｎＭであることを見出した。従って、（−）−１３は（±）−１３より２倍効力が大きく、その鏡像異性体より１１倍強力である。
【００６８】
要約すれば、本発明者らは３Ｄ−データーベースファーマコフォアサーチングによりリード（３）を見出したがその活性は結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害においてコカインの約３０分の１の効力であった。分子モデリングを用いた合理的デザイン及び化学修飾により、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害におけるＫｉ値がそれぞれ１４及び３２ ｎＭであり、リード化合物（３）と比較して結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害において５１９及び２７８倍に向上した（−）−１３が速やかに最適化され、同定された。化合物（−）−１３は、結合親和性及びＤＡ再取り込みの阻害においてコカインより１７及び９倍強力である。以前には、三環性トロパン類似体のクラスのもの（トロパキヌクリジン）がコカインに基づいてデザインされ、セロトニン及び／又はノルエピネフリン輸送体に対して活性を有する強力なモノアミン輸送体阻害薬であることが示された。３（リード化合物）、１２及び１３のキヌクリジン環は三環性トロパキヌクリジンに埋設されているが、本明細書で報告される２，３−二置換キヌクリジンは、それらの塩基性環構造及び置換パターンがトロパキヌクリジンとは異なっている。予備的評価も、１２及び１３がＤＡＴ部位に対して活性を有することを示していた（データーは示さず）。従って、化合物１２及び１３は、塩基性キヌクリジノン環及び２，３−二置換基を有する新規な種類の強力なＤＡＴ阻害薬である。
【００６９】
化学：
一般的方法。ＴＨＦを、窒素雰囲気下にてベンゾフェノンナトリウムから新たに蒸留した。
【００７０】
１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、それぞれ３００及び７５．４６ＭＨｚのＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｏｖａ装置で得た。１Ｈ化学シフト（δ）は、内部ＴＭＳから低磁場のｐｐｍで記録されている。１３Ｃ化学シフトは、ＣＤＣｌ３（中心ピーク，δ＝７７．０ ｐｐｍ）を基準としたものである。
【００７１】
融点は、Ｔｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ Ｕｎｉｍｅｌｔ装置を用いてパイレックス（Ｒ）毛管中で測定したものであり、未補正である。質量スペクトルは、イオン化電位が７０ ｅＶでＥＩ方式で測定した。ＴＬＣは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレート上で行い、カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル（６０−２００メッシュ）を用いて行った。下記の略号を用いる：ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン； ＤＣＭ＝ジクロロメタン； エーテル ＝ ジエチルエーテル。
【００７２】
２−メチレン−３−キヌクリジノン（６）： ３−キヌクリジノン（５）， （６．０ ｇ， ４８．０ミリモル）、４０％水性ジメチルアミン（１０．０ｍｌ， ７２．０ミリモル）、３７％水性ホルムアルデヒド（６．０ｍｌ， ７２．０ミリモル）、エタノール２０．０ｍｌ及び水８．０ｍｌの溶液を還流温度で１時間攪拌した後、７０℃で１７時間攪拌し、室温まで冷却した。溶媒及び過剰の試薬を真空で留去し、油状残渣を分別蒸留して、標題化合物５．７ｇ （８６％）を明黄色油状生成物として得た。沸点９１−９２°／７ｍｍ。
【００７３】
2004506686.tif 000003
【００７４】
２−ブタ−３−エニルキヌクリジン−３−オン（７）： ＣｕＩ・Ｍｅ２Ｓ錯体［０℃でＣｕＩ （１．４ ｇ， ７．３ミリモル）にＭｅ２Ｓ （０．８ｍｌ， １０．９ミリモル）を添加することによって調製］を−７８℃でＴＨＦに溶解したものに、２０分間攪拌した臭化アリルマグネシウム（９．５ｍｌ）及びＨＭＰＡ （２．５ｍｌ， １５．６ミリモル）の１Ｍ溶液を加えた。これに、２−メチレン−３−キヌクリジノン（６） （１．０ ｇ， ７．３ミリモル）とＴＭＳ−Ｃ１ （１．０２ｍｌ， ８．０ミリモル）をＴＨＦに溶解したものを徐々に加え、同じ温度で２時間攪拌した後、ＮＨ４Ｃｌ水性溶液で反応を停止した。有機層を分離し、水性層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて、粗製化合物を得た。これを、エーテル／アセトン／トリエチルアミンを８５：１０：５の比で用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、標題化合物を無色油状生成物として得た（６１０ ｍｇ， ４７％）。
【００７５】
2004506686.tif 000004
【００７６】
アリールグリニャール付加の一般的手順： ０℃の乾燥ＴＨＦに溶解したケトンに、適当なグリニャール試薬（１．１当量）を加えた。混合物を同じ温度で３０分間攪拌し、水性ＮＨ４Ｃｌで反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下にて濃縮した。生成する粗製化合物を、エーテル／アセトン／トリエチルアミンを溶離剤として用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、下記の化合物を得た：
【００７７】
２−ブタ−３−エニル−３−フェニルキヌクリジン−３−オール（８）： 無色の粘稠なシロップ； 収率７０％；
2004506686.tif 000005
【００７８】
２−ブタ−３−エニル−３−（４−メチルフェニル）キヌクリジン−３−オール（９）： 無色シロップ； 収率７４％；
2004506686.tif 000006
【００７９】
脱水の一般的手順： ヒドロキシ化合物をＥｔＯＨに溶解したものに、６Ｎ ＨＣｌを加えて一晩還流し、室温まで冷却した。反応混合物に固形ＮａＨＣＯ３を徐々に加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して、粗製化合物を得て、これをアセトン／エーテルを溶離剤として用いてシリカゲルカラムを通過させることによって精製した。
【００８０】
２−ブタ−３−エニル−２，３−ジデヒドロ−３−フェニルキヌクリジン（１０）： 無色シロップ；収率 ６１％；
2004506686.tif 000007
【００８１】
２−ブタ−３−エニル−２，３−ジデヒドロ−３−（４−メチルフェニル）キヌクリジン（１１）： 無色シロップ；収率 ６６％；
2004506686.tif 000008
【００８２】
水素化の一般的手順： オレフィンと触媒量のＰｄ／ＣをＥｔＯＨ中で混合したものを、Ｈ２ ６０ ｐｓｉ下にて２５℃で２４時間水素化した。触媒を濾去し、濾液を濃縮して、粗製化合物を黄色シロップとして得て、これをエーテル／トリエチルアミンを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、飽和化合物を無色粘稠なシロップとして定量的収率で得た。
【００８３】
２−ブチル−３−フェニルキヌクリジン（１２）： 無色シロップ；
2004506686.tif 000009
【００８４】
２−ブチル−３−（４−メチルフェニル）キヌクリジン（１３）： 無色シロップ；
2004506686.tif 000010
【００８５】
（±）−１３のＨＰＬＣ分割
キラルＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１ ＯＡ−ＶＰ装置で室温にて５ｍｌ／分の流速及び２５４及び２８０ｎｍでのＵＶ検出で行った。注入用試料は、ラセミ化合物（５ ｍｇ／ｍｌ）を移動相に溶解することによって調製し、分割は２５０ｘ１０ ｍｍキラルカラムに３０μｌを注入することによって行った。
【００８６】
薬理学：
［３Ｈ］マジンドール結合
結合分析は、上記の方法で行った。簡単に説明すれば、通常のＰ２膜ペレットを、ラット線条（ｓｔｒｉａｔｕｍ）から示差遠心分離によって調製した。Ｐ２ペレットを、ＮａＣｌ （１２５）、ＫＣｌ （４．８）、ＭｇＳ０４ （１．２）、ＣａＣｌ２ （１．３）、ＫＨ２ＰＯ４ （１．２）、グルコース （５．６）、ニアラミド （０．０１）、及びＨＥＰＥＳ （２５） （括弧内の数字はｍＭ） （ｐＨ ７．４）からなるクレブス−リンゲル−ＨＥＰＥＳ （ＫＲＨ）緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離した。最後に、ペレットを３０容積の緩衝液に再懸濁し、１５，０００ ｘ ｇでペレット化し、使用まで−８０℃で冷凍した。線条体ホモジェネートを７５−１２５□ｇタンパク質／ｍｌで上記緩衝液に再懸濁することによって融解し、［３Ｈ］マジンドールと共に、競合薬剤と共に、又はなしで４℃の低温室で６０分間インキュベーションした。非特異的結合は、３０□Ｍコカインを用いて決定した。結合及び遊離［３Ｈ］マジンドールをＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃ濾紙上でＢｒａｎｄｅｌ Ｍ２４Ｒセルハーベスターを用いて迅速真空濾過の後、低温緩衝液５ ｍｌで２回洗浄することによって分離した。次に、濾紙上の放射能を、シンチレーション試薬５ ｍｌと共に一晩放置することによって抽出した。バイアル瓶を攪拌し、カウントした。ＩＣ５０値を、コンピュータープログラムＬＩＧＡＮＤを用いて決定した。
【００８７】
［３Ｈ］ＤＡのシナプトソーム取り込み
ドーパミンの高親和性取り込みに拮抗する候補化合物の効果を、前に用いた方法を用いて決定した。［３Ｈ］ＤＡ取り込みについては、新たに切り取ったラット線条を氷冷した０．３２ Ｍスクロース中でテフロン（Ｒ）−ガラス乳棒を用いてホモジナイズし、１０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上清を、１７，５００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。このＰ２シナプトソームペレットを３０容積の氷冷した改良ＫＲＨ緩衝液に再懸濁した。シナプトソーム懸濁液の一部を緩衝液及び薬剤と共に３７℃で３０分間予備インキュベーションし、［３Ｈ］ドーパミン（５ｎＭ，最終濃度）を添加することによって取り込みを開始した。５分後、ＮａＣｌの代わりにグルコサミンを含む低温緩衝液５ ｍｌを加えて取り込みを停止した後、最後にＧＦ−Ｃガラス繊維濾紙上で迅速真空濾過によって、５ ｍｌ容積の氷冷したナトリウム不含緩衝液で２回洗浄した。濾紙上に保持された放射能は、液体シンチレーションスペクトル分析法によって測定した。特異的取り込みは、３０□Ｍコカインによる阻害に感受性であるものとして定義される。これは、０℃でインキュベーションした同一試験管の平均を差し引くことによって計算されるものと同一である。
【００８８】
ＩＣ５０値は、コンピューターを用いる４パラメーターＳ字状方程式への反復適合 （ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ， ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｆｉｔ ｔｏ ａ ｆｏｕｒｐａｒａｍｅｔｅｒ ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ） （ＡＬＬＦＩＴ）によって決定した。次に、これらの値を、古典的競合阻害を仮定してＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの式によってＫｉ値に転換した。薬剤とシナプトソームの３７℃での３０分間の予備インキュベーションを用いて、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆの式の要件を満たすのに必要な平衡条件に近似させた。
【００８９】
分子モデリングの研究
化合物６のイン・ビボ試験
本明細書に記載の実験で用いる手法、手順及び材料、及びコンピュータープログラムは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで公表の目的で提出されたＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．の「３Ｄ−データーベースファーマコフォアサーチング、構造活性関係及び分子モデリング研究によるコカイン拮抗薬として可能性のある新規なドーパミン輸送体阻害薬の発見」という論文に詳細に記載されている。この論文及びそこに引用されている文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００９０】
３Ｄ−データーベース検索
Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｄｉｇｏ２ Ｒ１００００上で走るＣｈｅｍ−Ｘプログラム（９６年７月版）を用いて、３Ｄ−データーベースファーマコフォアサーチングを行った。このプログラムはＮＣＩ−３Ｄ データーベースを構築するのに用いられ、３Ｄデーターベースファーマコフォアサーチングを行う目的で良好に用いられた。このプログラムを選択する第一の理由は、データーベースで柔軟性を有する化合物について複数の配座を生成し、検索する能力を有することであった。
【００９１】
柔軟性を有する化合物について複数の配座を有することの問題点は、３Ｄ−データーベースの構築及びサーチングに極めて重要であることが分かったが、これは、柔軟性を有する化合物がその環境によって多くの異なる配座を採ることができるからである。ある化合物がエネルギー差の少ない複数の配座を採ることができる場合には、どの配座が生物学的に活性であるかを正確に知ることが困難なことが多い。生物学的に活性な配座は、それが異なる受容体に結合するときには同一化合物について異なることがある。従って、この状況に対処する最善の方法は柔軟性を有する化合物について複数の配座を生成し、検索することである。Ｃｈｅｍ−Ｘプログラムが柔軟性を有する化合物について多数の配座を生成し検索することができることは、これまで行ってきた幾つかのプロジェクトにおける構造上多様な多数のリード化合物を同定することができたことの重要な要因であることが分かった。
【００９２】
本発明者らは、柔軟性を有する化合物について１個だけの配座が検索される場合には、多くの同定されたリード化合物が見逃されることになることを見出した。従って、柔軟性を有する化合物について複数の配座が必要である。しかしながら、配座の生成において６０°のステップサイズ（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅ）を用いる１０を上回る単結合を有する柔軟性を有する化合物について、可能な配座の総数は６千万を上回ることになる。実際には、本発明者らは、３百万の配座を任意の単一化合物について検討を行う最大数として設定した。
【００９３】
最新版のＮＣＩ ３Ｄデーターベースを、９４年７月版のＣｈｅｍ−Ｘプログラムを用いて構築した。これは、２０６，８７６個の「オープン」化合物からなっている。Ｃｈｅｍ−Ｘプログラムを用いると、ファーマコフォアモデルにおいて特定される要件を満たす構造について２０６，８７６個の「オープン」化合物のＮＣＩ ３Ｄデーターベースを検索することは簡単である。定義されたファーマコフォアモデルを、ファーマコフォアモデルに記載の総ての仕様、例えば基礎構造要件、及びこれらの重要なファーマコフォア成分間の距離及び距離範囲、を含むファーマコフォアの質問（ｑｕｅｒｙ）に組込んだ。化合物がカルボニル基、芳香族環、及び少なくとも２個の炭素原子及びもう１つの炭素又は水素に結合した窒素を有するときには、Ｃｈｅｍ−Ｘプログラムを最初にチェックした。化合物がこの基礎構造チェックをパスした後、これに配座分析を行う。この段階では、配座を生成させて、ファーマコフォアの質問（ｑｕｅｒｙ）において特定されるの幾何学的要件に関して評価した。幾何学的要件を満たす少なくとも１種類の配座を有する化合物を、「ヒット」したと考えた。「ヒット」したものは、生物学的試験について可能性のある候補と考えられるだけである。リード化合物を見出すのに最大効率を得る目的で生物学的評価を行う化合物の選択に多くの追加基準を用いた。これらの基準としては、単純な化学構造、小分子、非ペプチド及び化学構造の多様性が挙げられる。
【００９４】
実験の部
分子モデリング
配座分析は、ＱＵＡＮＴＡプログラムの配座分析モジュールを用いて行った。一般に、化合物が５個未満の回転可能な単結合を有するときには、グリッドスキャン配座検索プロトコールを用いた。このプロトコールでは、それぞれの回転可能な結合を体系的に回転させて、出発配座を生成させ、これを次にＱＵＡＮＴＡ中でＣＨＡＲＭｍプログラムを用いて最小にした。化合物が５個を上回る回転可能な結合を有するときには、ランダムサンプリングプロトコールを用いて配座を生成した。５０００までの配座を生成し、最小化した。それぞれの配座のエネルギー最小化を、５０００回の繰り返しにより又は収束するまで計算し、０．００１ ｋｃａｌモル−１Å−１以下のエネルギーグラディエントとして定義した。ＣＨＡＲＭｍプログラムで実行される採用した基礎Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎアルゴリズムを用いて、エネルギーを最小化した。一定の比誘電率（１に等しい）を、総ての計算に用いた。配座生成及びエネルギー最小化を完了したならば、最も安定な配座を同定した（真空における包括的最小値）。しかしながら、最低エネルギー配座は、以前に示したように、生物活性配座ではないことがある点が注目される。このため、他の低エネルギー配座、典型的には包括的最小値の５ｋｃａｌ／モル内のものを同定した。クラスター分析を行って、ＱＵＡＮＴＡプログラムで利用可能なクラスター分析モジュールを用いて真に独特な配座（クラスター）の数を決定した。これらの低エネルギー配座クラスターは、共に化合物の生物活性配座を包含すると思われる。
【００９５】
３Ｄデーターベース検索
Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｄｉｇｏ２ Ｒ１００００上で走るＣｈｅｍ−Ｘプログラム（９６年７月版）を用いて、３Ｄ−データーベースファーマコフォアサーチングを行った。このプログラムを選択する第一の理由は、データーベースで柔軟性を有する化合物について複数の配座を生成し、検索する能力を有することであった。柔軟性を有する化合物について複数の配座を有することの問題点は、３Ｄ−データーベースの構築及びサーチングに重要であることが分かったが、これは、柔軟性を有する化合物がその環境によって多くの異なる配座を採ることができるからである。ある化合物がエネルギー差の少ない複数の配座を採ることができる場合には、どの配座が生物学的に活性であるかを正確に知ることが困難なことが多い。生物学的に活性な配座は、それが異なる受容体に結合するときには同一化合物について異なることがある。従って、この状況に対処する最善の方法は柔軟性を有する化合物について複数の配座を生成し、検索することである。Ｃｈｅｍ−Ｘプログラムが柔軟性を有する化合物について多数の配座を生成し検索することができることは、これまで行ってきた幾つかのプロジェクトにおける構造上新規で、多様な多数のリード化合物を同定することができたことの重要な要因であることが分かった。本発明者らは、柔軟性を有する化合物について１個だけの配座が検索される場合には、多くの同定されたリード化合物が見逃されることになることを見出した。従って、柔軟性を有する化合物について複数の配座が必要である。しかしながら、配座の生成において６０°のステップサイズ（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅ）を用いる１０を上回る単結合を有する柔軟性を有する化合物について、可能な配座の総数は６千万を上回ることになる。実際には、本発明者らは、３百万の配座を任意の単一化合物について検討を行う最大数として設定した。
【００９６】
Ｃｈｅｍ−Ｘプログラムを用いて、総数が４０９４個の化合物を「ヒット」するもの、すなわちファーマコフォアモデルにおいて特定される要件を満たす化合物として同定した（図１）。多数の追加の基準を用いて生物学的評価のための化合物を選択し、最大効率でリード化合物を見出した。これらの基準としては、単純な化学構造、小分子量、非ペプチド、及び化学構造の多様性が挙げられる。
【００９７】
配座分析
配座分析は、ＱＵＡＮＴＡプログラムの配座分析モジュールを用いて行った。一般に、化合物が５個未満の回転可能な単結合を有するときには、体系的なグリッド配座検索プロトコールを用いた。このプロトコールでは、それぞれの回転可能な結合を体系的に回転させて、出発配座を生成させ、これを次にＱＵＡＮＴＡ中でＣＨＡＲＭｍプログラムを用いて最小にした。化合物が５個を上回る回転可能な結合を有するときには、ランダムサンプリングプロトコールを用いて配座を生成した。５０００までの配座を生成し、最小化した。それぞれの配座のエネルギー最小化を、５０００回の繰り返しにより又は収束するまで計算し、０．００１ ｋｃａｌモル−１Å−１以下のエネルギーグラディエントとして定義した。ＣＨＡＲＭｍプログラムで実行される採用した基礎Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ（ＡＢＮＲ）アルゴリズムを用いて、エネルギーを最小化した。一定の比誘電率（１に等しい）を、総ての計算に用いた。配座生成及びエネルギー最小化を完了したならば、最も安定な配座を同定した（包括的最小値）。
【００９８】
しかしながら、最低エネルギー配座は、以前に示したように、生物活性配座ではないことがある点が注目される。このため、他の低エネルギー配座、典型的には包括的最小値の５ｋｃａｌ／モル内のものを同定した。クラスター分析を行って、ＱＵＡＮＴＡプログラムで利用可能なクラスター分析モジュールを用いて真に独特な配座（クラスター）の数を決定した。これらの低エネルギー配座クラスターは、共に化合物の生物活性配座を包含する可能性が高いと思われる。
【００９９】
リード化合物３及びその類似体の合成
１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、それぞれ３００及び７５．４６ ＭＨｚのＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｏｖａ装置を用いて得た。１Ｈ化学シフト（δ）は、内部ＴＭＳから低磁場のｐｐｍで記録されている。１３Ｃ化学シフトは、ＣＤＣｌ３（中心ピーク， δ＝７７．０ ｐｐｍ）を基準としたものである。ＮＭＲの割り当ては、ＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ及びＨＥＴＣＯＲ実験を用いて行った。
【０１００】
融点は、Ｔｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ Ｕｎｉｍｅｌｔ装置を用いてパイレックス（Ｒ）毛管中で測定したものであり、未補正である。質量スペクトルは、イオン化電位が７０ ｅＶでＥＩ方式で測定した。ＴＬＣは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプレート上で行い、カラムクロマトグラフィーは、Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル（６０−２００メッシュ）を用いて行った。下記の略号を用いる：ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン； ＤＣＭ＝ジクロロメタン； ＣＨ３Ｎ＝アセトニトリル； エーテル＝ジエチルエーテル。
【０１０１】
化合物３の合成のの一般的手順
イン・ビトロでの［３Ｈ］マジンドール結合分析
結合分析のため、尾状核を０．３２Ｍスクロース中でポリトロンを用いてホモジナイズし、１０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上清を冷スクロースに再懸濁し、１７，５００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、ＮａＣｌ （１２５）、ＫＣｌ （４．８）、ＭｇＳ０４ （１．２）、ＣａＣｌ２ （１．３）、 ＫＨ２ＰＯ４ （１．２）、グルコース （５．６）、ニアラミド （０．０１）、及びＨＥＰＥＳ （２５） （括弧内の数字はｍＭ） （ｐＨ ７．４）からなるクレブス−リンゲル−ＨＥＰＥＳ （ＫＲＨ）緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離した。最後に、ペレットを３０容積の緩衝液に再懸濁し、１５，０００ ｘ ｇでペレット化し、使用まで−８０℃で冷凍した。線条体ホモジェネートを７５−１２５μｇタンパク質／ｍｌで上記緩衝液に再懸濁することによって融解し、［３Ｈ］マジンドールと共に、競合薬剤と共に、又はなしで４℃の低温室で６０分間インキュベーションした。非特異的結合は、３０μＭコカインを用いて決定した。結合及び遊離［３Ｈ］マジンドールをＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃ濾紙上でＢｒａｎｄｅｌ Ｍ２４Ｒセルハーベスターを用いて迅速真空濾過の後、低温緩衝液５ ｍｌで２回洗浄することによって分離した。次に、濾紙上の放射能を、シンチレーション試薬５ ｍｌと共に一晩放置することによって抽出した。バイアル瓶を攪拌し、カウントした。ＩＣ５０値を、コンピュータープログラムＬＩＧＡＮＤを用いて決定した。
【０１０２】
［３Ｈ］ドーパミンのシナプトソーム取り込み
ドーパミン高親和性取り込みの拮抗における候補化合物の効果を、前に用いた方法を用いて決定した。［３Ｈ］ＤＡ取り込みについては、切り取ったラット線条を氷冷した０．３２ Ｍスクロース中でテフロン（Ｒ）−ガラス乳棒を用いてホモジナイズし、１０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上清を、１７，５００ ｘ ｇで２０分間遠心分離した。このＰ２シナプトソームペレットを３０容積の氷冷した改良ＫＲＨ緩衝液に再懸濁した。シナプトソーム懸濁液の一部を緩衝液及び薬剤と共に３７℃で３０分間予備インキュベーションし、［３Ｈ］ドーパミン（５ｎＭ，最終濃度）を添加することによって取り込みを開始した。５分後、ＮａＣｌの代わりにグルコサミンを含む低温緩衝液５ ｍｌを加えたて取り込みを停止し、最後にＧＦ−Ｃガラス繊維濾紙上で迅速真空濾過し、５ ｍｌ容積の氷冷したナトリウム不含緩衝液で２回洗浄した。濾紙上に保持された放射能は、液体シンチレーションスペクトル分析法によって測定した。特異的取り込みは、３０μＭコカインによる阻害に感受性であるものとして定義される。これは、０℃でインキュベーションした同一試験管の平均を差し引くことによって計算されるものと同一である。［３Ｈ］５−ＨＴ及び［３Ｈ］ＮＥ取り込みは、それぞれラット中脳及び頭頂／後頭部皮質から調製したシナプトソームを用いて全く同様の方法で測定した。また、［３Ｈ］５−ＨＴ及び［３Ｈ］ＮＥの特異的取り込みは、それぞれ１０μＭフルオキセチン及び１μＭデシプラミンの存在下で定義した。
【０１０３】
機能的拮抗作用分析法（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ Ａｓｓａｙ）
最初に、コカインによる［３Ｈ］ドーパミン取り込みの阻害に対する候補化合物のおよそのＩＣ１０−ＩＣ５０濃度の効果を測定した。次に、拮抗薬の存在下でのコカインのＩＣ５０値を、コカイン単独でのＩＣ５０値と比較した。ＩＣ５０値の有意差を、「同一部位」での拮抗作用のモデルから予想される理論的ＩＣ５０値と比較した。「同一部位」での拮抗作用について予想されるより大きなＩＣ５０値は、機能的拮抗作用の証拠として採用される。化合物立証拮抗作用（Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）をより低濃度で試験し、それらの最小有効濃度を決定した。この試験は、上記の予備インキュベーション条件下で行い、化合物を平衡に到達するように徐々に平衡化した。更に、温度、緩衝剤などの差異によるＫｉでの任意の人工的差は、コカイン及び推定拮抗薬のコカイン結合部位及び輸送体への結合は同一条件下で起こったので、この分析ではないものとした。これにより、同一部位で作用する２種類の薬剤について予想される範囲を超えたコカイン阻害曲線の右シフトは機能的拮抗作用の真の尺度であることが保証される。
【０１０４】
イン・ビボ試験
運動活性試験
試験化合物を、運動効果について雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを用いて試験した。運動活性を刺激するための試験化合物の有効性及び効力［報告しない］を測定し、コカインの効果と比較した。マウスをアクリル製チャンバーに入れ、これを次に２枚の垂直な壁に沿って配設された赤外線感受性検出器を備えた活動モニター（Ｔｒｕｓｃａｎ， Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， コロンブス， オハイオ）の中に入れた。試験環境に１時間慣らした後、試験化合物、食塩水又はコカインを１ｍｌ／１００ｇ体重の容量で腹腔内注射し、直ちに活動モニターに戻した。データーを最低２時間記録した。それぞれの用量は最低１０匹のマウスで検討を行い、それぞれのマウスは１回だけ使用した。食塩水対照群の応答を試験化合物応答から差し引いた後、水平距離での用量−効果関数を構築した。３０分間の応答を、２時間データーから計算した。最大応答が起こる３０分間を用いて、用量−応答関数をプロットする。データーを、分散の標準的分析及び直線回帰法を用いて分析した。ＥＤ５０値は、用量−効果曲線の直線的上昇部分を用いてデーターから決定した。
【０１０５】
治療用途
これまでに合成された化合物を用いて得た結果に基づいて、これらの化合物は重要な治療上の用途を有することが予測される。表１及び２に示される２，３−二置換キヌクリジンは、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリン輸送体に対する強力な阻害薬であると決定された。更に、これらの化合物の選択性を、特定のモノアミン輸送体に対してデザインすることができる。従って、これらの化合物は、神経伝達物質の取り込みを遮断し且つ神経伝達物質の利用可能性を増加させることにより有益な効果を得ることができる多数の神経障害の治療のための治療薬として用いることができる。このような薬剤の使用は、鬱病（Ｂｒｏｋｅｋｋａｍｐ， Ｃ． Ｌ． Ｅ．； Ｌｅｙｓｅｎ， Ｄ．； Ｐｅｅｔｅｒｓ， Ｂ． Ｗ． Ｍ． Ｍ．； Ｐｉｎｄｅｒ， Ｒ． Ｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９５， ３８， ４６１５−４６３３）、不安（Ｆｒａｎｃｅｓ， Ａ．； Ｍａｎｎｉｎｇ， Ｄ． Ｍａｒｉｎ， Ｄ． Ｋｏｃｓｉｓ， Ｊ．； ＭｃＫｉｎｎｅｙ， Ｋ．； Ｈａｌｌ， Ｗ．； Ｋｌｅｉｎ， Ｍ． Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒａｍａｃｏｌ． ｓｕｐｐｌ． １９９２， １０６， Ｓ８２−Ｓ８６）、アルコール中毒（Ｋｒａｎｚｌｅｒ， Ｈ． Ｒ．； Ａｍｉｎｅ， Ｈ．； Ｍｏｄｅｓｔｏ−Ｌｏｗｅ， Ｖ．； Ｏｎｃｋｅｎ， Ｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｒｅａｔ． Ｄｒｕｇ． Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｐｅｎｄ． １９９９， ２２， ４０１−４２３）、慢性的疼痛（Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ｊ． Ｒｅｅｓｏｒ， Ｋ． ； Ｍｉｋａｉｌ， Ｓ．； Ｆｉｓｈｅｒ， Ｒ． Ｐａｉｎ， １９９３，５２，２９４）、摂食障害（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｃ． Ｂ．； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ， １９９９， ５５， ６８５−６９７）、強迫性障害（Ｂｒｏｄｙ， Ａ． Ｌ． Ｓａｘｅｎａ， Ｓ．； Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｊ． Ｍ．； Ｓｔｏｅｓｓｅｌ， Ｐ． Ｗ．； Ｍａｉｄｍｅｎｔ， Ｋ．； Ｐｈｅｌｐｓ， Ｍ． Ｅ． Ｂａｘｔｅｒ， Ｌ． Ｒ． Ｊｒ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８， ８４， １−６）、コカイン濫用（（ａ）． Ｓｉｎｇｈ， Ｓ． コカイン拮抗薬の化学、デザイン、及び構造−活性の関連性。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２０００， １００， ９２５−１０２４ 文献７ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． Ｐ．； Ｈｏｅｐｐｉｎｇ， Ａ．； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ． Ｍ．； Ｔｒｚｃｉｎｓｋａ， Ｍ．； Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ， Ａ． Ｐ． コカイン濫用の治療のためのドーパミン作用性薬。Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， １９９９， ７， ３２２−３３２）、及びパーキンソン病の治療において明確に確立されている。しかしながら、本発明は、これらの分野に限定されない。基本的には、本発明は、ドーパミン（ＤＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）、及びノルエピネフリンなどのモノアミン神経伝達物質系を調節することによってこれらの分野で明確に確立された技術によって有益な効果を得ることができる広汎な神経障害、疾病又は疾患に応用することができる。
【０１０６】
2004506686.tif 000011
2004506686.tif 000012
ａ　２−３回の実験の平均値±標準誤差又は範囲、それぞれ、６段階の濃度の薬剤を用いて３回行った。
【０１０７】
2004506686.tif 000013
【０１０８】
本発明の治療法は、本発明による少なくとも１種類の化合物又は薬学上許容可能なその塩を治療応答、例えばコカイン活性の阻害及び／又はコカインの存在下でのドーパミン再取り込み活性の促進、を誘発するのに十分な量で投与することを含んでなる。
【０１０９】
化合物は、任意の薬学上許容可能な手段によって、全身又は局所投与によって投与することができる。適当な投与方式としては、経口、皮膚、例えば経皮パッチ、吸入、輸液、鼻内、直腸、膣、局所、及び非経口（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下注射）が挙げられる。
【０１１０】
典型的には、経口投与又は注射による投与が好ましい。本発明の化合物は、特定の疾患、患者の症状、化合物の毒性、及びこの化合物が単独で又は他の治療法と組み合わせて用いられるかどうかによって単回投薬量で又は長期間にわたって投与することができる。長期又は反復投与が、他の化学療法に基づいて好ましいと思われる。
【０１１１】
本発明の化合物は、薬学上許容可能な処方物又は組成物で投与される。このような処方物の例としては、注射可能な溶液、錠剤、乳剤、又は懸濁液、クリーム、水中油型及び油中水型エマルション、マイクロカプセル、及びマイクロベシクルが挙げられる。
【０１１２】
これらの組成物は、通常の医薬用賦形剤、及び薬剤処方物に典型的に用いられるキャリヤー、例えば、水、食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水、緩衝液、及び界面活性剤を含んでなる。
【０１１３】
本発明の化合物は、遊離であることも、又はマイクロカプセル中又はリポソーム、マイクロエマルション及びマクロエマルションのようなコロイド状薬剤送達系に閉じ込められていてもよい。医薬処方物を調製するのに適当な材料及び方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬化学， 第１６版， （１９８０年）に開示されている。また、本発明の化合物を含む固形処方物、例えば錠剤及びカプセル処方物も、調製することができる。
【０１１４】
その適当な例としては、造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態を採ることができる本発明の化合物を含む固形の疎水性ポリマーの半導性材料、並びに当該技術分野で知られている様々な他のポリマー及びコポリマーが挙げられる。
【０１１５】
本発明による化合物の投薬有効量は、特定の化合物、毒性、及び阻害活性、治療する疾病、及び化合物を単独で又は他の治療薬と共に投与するかどうかなどの要因によって変化する。典型的には、投薬有効量は約０．０００１ｍｇ／ｋｇ − １５００ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは１ − １０００ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは約１ − １５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは約５ − ５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。
【０１１６】
治療を受ける対象は、典型的には哺乳類を含んでなり、最も好ましくはヒト対象、例えばヒトコカイン常習者である。
【０１１７】
本発明の化合物は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて用いることができる。また、この化合物は他の種類の治療法と共に用いて、相乗的結果を生じることができる組合せ療法を提供することができる。
【０１１８】
特に断らない限り、本明細書で用いられる総ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野で通常の技術を有する者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているのと同様の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。
【０１１９】
本発明を好ましい態様について記載してきたが、熟練技術者であれば、本発明の精神から離反することなく様々な修飾、置換、省略、及び変更を行うことができることを理解されるであろう。従って、本発明の範囲は特許請求の範囲と同等なものを含む特許請求の範囲によってのみ制限されるものと解釈される。
【図面の簡単な説明】
【図１】コカイン、ＷＩＮ ３５０６５−２、リード化合物（３）、及び強力なコカイン類似体の化学構造である。
【図２】リード化合物３の同定を行った３Ｄ−データーベースファーマコフォアサーチングで用いたファーマコフォアモデルである。
【図３】図２で定義した３種類のファーマコフォア要素を用いるリード化合物３（緑色）とコカイン（黄色）との間の２種類の可能なオーバーラップである。
【図４】増加ファーマコフォアモデルを用いるリード化合物３（緑色）とコカイン（１， 黄色）との間の代替オーバーラップである。
【図５】デザインした類似体１２（緑色）とコカイン（黄色） （Ａ）、及び１２（緑色）とＷＩＮ ３５０６５−２（２， 黄色） （Ｂ）との間のオーバーラップである。
【図６】類似体１３のＸ線構造。
【図７】一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）を有する化合物の合成経路を示す工程図Ｉ。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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