(57)【要約】分子の細胞内における腫瘍形成化学反応が、酵素やキナーゼによって引き起こされる化学反応のような化学反応に際して電気泳動度に変化を生じる蛍光標識付き基質を使用することによって、測定される。特定の腫瘍酵素にだけ反応する標識付き基質分子を使うことで、特異性が達成される。関心の持たれる時点で、このような基質分子の細胞内における存在が測定される。精度を保証するために、測定は、関心の持たれる時点に続いて起きる化学反応を最小限にすべく、タイムリーな方法で行われねばならない。レポーター基質分子が導入された前記細胞の含有物を得るためには、制御可能な急速レーザー溶解法が用いられる。次いで、細胞の含有物は、キャピラリー電気泳動に供され、腫瘍形成酵素の活性度は、電気泳動によって分離され、蛍光標識の存在によって識別された、変質されない基質分子の量と変質された基質分子の量とを比較することで測定される。
2004536586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における細胞内化学反応の腫瘍形成活性の有無を測定するための方法であって、
標識を含む、オンコプロテインのための基質分子を用意する工程であって、該標識化基質分子は活性度の測定対象である化学反応に対応していることを特徴とする工程；
前記基質分子を前記細胞の内部に配置する工程；
前記基質分子を前記細胞の内部で前記化学反応に参加させて変質基質分子を作り出す工程；
前記基質分子および前記変質基質分子を前記細胞から解放する工程；
前記基質分子および／または前記変質基質分子を前記細胞から識別するために前記標識を検出する工程；及び
改変された基質の存在から前記化学反応の存在を判定する工程
を含む方法。
【請求項２】
さらに、検出された変質基質分子および／または検出された非変質基質分子の量を定量する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞中における前記細胞内化学反応が、キナーゼによる酵素触媒作用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変質基質分子が、非変質基質分子と比べて、化学構造が変化していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非変質基質分子と前記変質基質分子との分離工程が、電気泳動を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出された変質基質分子および／または検出された非変質基質分子の量を定量する工程が、電気泳動による分離の後に蛍光による前記標識を検出することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記非変質基質分子を前記細胞の内部に配置する工程が、前記細胞の内部で自然発生する基質分子を用いる工程、前記細胞の内部で前記基質分子が作り出されるよう誘導する工程、または前記基質分子を前記細胞の外側から前記細胞の中へ導入する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非変質基質分子を前記細胞の外側から前記細胞の中へ導入する工程が、微量注入、電気穿孔、光穿孔、小嚢融解、飲作用取り込み、または前記基質分子と膜透過性ペプチドとの会合を含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を前記細胞から解放する工程に先立って、前記非変質基質分子が細胞内に存在している間に前記細胞を刺激する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記化学反応の活性度と、刺激されなかった前記細胞から決定された同様の活性度とを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記非変質基質分子および前記変質基質分子を前記細胞から解放する工程が、前記細胞の化学的破壊、前記細胞の力学的破壊、電気的破壊、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、蛍光標識、アイソトープ、光吸収を示す標識、および電子スピン共鳴標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質分子が、ポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ペプチド、多糖類および核酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、蛍光標識で改変されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、それぞれのペプチドの内部における特定のアミノ酸にリン酸成分を添加することで前記改変ペプチドを変質させるキナーゼのための基質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドが、蛍光性を有する官能基の共有結合的添加によって改変されていることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質分子が、炭水化物、リン脂質、完全長タンパク質、または細胞の内部に通常は発見されない有機化合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識を検出する工程が、ボルタンメトリーあるいは質量分光分析を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記諸過程のそれぞれを相異なる複数の基質分子で同時に遂行する工程を含み、ここでそれぞれの基質分子が前記細胞の内部における特定の化学反応について知らしめるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
数十ピコリットル以下の微小容積における化学反応の腫瘍形成活性度を測定するための方法であって、
標識を含む、オンコプロテインのための基質分子を用意する工程；
前記基質分子を前記化学反応が起きる前記微小容積の中に配置する工程であって、ここで前記化学反応によって前記微小容積の内部に変質基質分子が作り出されることを特徴とする工程；
前記化学反応を終了させる工程；及び
非変質基質分子および／または前記変質基質分子を識別して前記オンコプロテインに対応している化学反応の活性度を決定するために、前記標識を検出する工程
を含む方法。
【請求項２２】
さらに、前記非変質基質分子および／または前記変質基質分子の量の変化を定量する工程を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内分子の腫瘍形成化学反応の活性度を測定するための装置であって、
標識付きの基質分子を前記細胞の中へ配置して、前記細胞中に標識付き変質基質分子を形成するための手段；
前記基質分子および／または前記変質基質分子を前記細胞から解放するための手段；
前記基質分子および／または前記変質基質分子を互いから分離するための手段；及び
前記非変質基質分子および前記変質基質分子が実質的な他の変質を起こす前に、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を細胞から検出するための手段
を含む装置。
【請求項２４】
前記非変質基質分子および／または前記変質基質分子の量の変化を定量するための手段をさらに含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記検出手段が、キナーゼによる酵素触媒作用を検出する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
前記検出手段が、前記非変質基質分子対前記変質基質分子の電気泳動度の変化を検出する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２７】
前記分離手段が、キャピラリー電気泳動を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２８】
前記非変質基質分子および／または前記変質基質分子の量の変化を定量するための前記手段が、キャピラリー電気泳動によって前記非変質基質分子および／または前記変質基質分子を分離した後に前記非変質基質分子および／または前記変質基質分子の蛍光を定量するための手段を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
前記配置手段が、前記細胞の内部における前記基質分子の作成を誘導するための手段、または前記基質分子を前記細胞の外側から前記細胞の中へ導入するための手段を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項３０】
前記基質分子を前記細胞の外側から前記細胞の中へ導入するための前記手段が、微量注入手段、電気穿孔手段、光穿孔手段、小嚢融解手段、飲作用取り込み手段、または前記基質分子と膜透過性ペプチドとの会合手段を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記基質分子を配置するための前記手段が、自然発生化合物あるいは合成化合物から前記基質分子を用意するための手段を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項３２】
前記非変質基質分子および前記変質基質分子の検出に先立って、前記非変質基質分子が前記細胞内に存在している間に前記細胞を刺激するための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項３３】
前記検出手段が、前記細胞の含有物を得るための手段、及び前記含有物の一部または全部をキャピラリー電気泳動によって分離するための手段を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記含有物を得るための前記手段が、化学的破壊手段、物理的破壊手段、電気的破壊手段、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記配置手段が、細胞内における腫瘍形成化学反応に対応する基質分子を与えることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項３６】
前記配置手段が、蛍光性の基質分子をもたらす、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記配置手段が、改変ペプチドである基質分子をもたらす、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記改変ペプチドが、それぞれの前記ペプチドの内部における特定のアミノ酸にリン酸成分を添加することで前記改変ペプチドを変質させるキナーゼのための基質である請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記ペプチドが、蛍光による検出を可能にするために蛍光性を有する官能基の共有結合的添加によって改変された請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】
前記配置手段が、核酸、炭水化物、リン脂質、完全長タンパク質、または細胞の内部に通常は発見されない化合物からなる基質分子を与えることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項４１】
前記検出手段が、前記非変質基質分子および前記変質基質分子にボルタンメトリーを行うための手段、または質量分光分析を行うための手段を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項４２】
相異なる複数の基質分子を同時に配置し且つ検出するための手段をさらに含み、ここで、相異なるそれぞれの基質分子が、前記細胞の内部における化学反応について知らしめるものであることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項４３】
１００ピコリットル以下のオーダーの微小容積における分子の化学反応の活性度を測定するための装置であって、
変質基質分子を作り出すために、標識付きの基質分子を腫瘍形成化学反応のために前記微小容積の中へ配置する手段；及び
非変質基質分子および前記変質基質分子を識別して前記腫瘍形成化学反応の活性度を決定するために、前記標識を検出するための手段
を含む装置。
【請求項４４】
前記非変質基質分子および前記変質基質分子の量の変化を定量するための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の装置。
【請求項４５】
標識付き変質基質分子を形成するインビボ反応を可能にするために標識付きの基質分子が配置される細胞内における、分子の腫瘍形成化学反応の活性度を測定するための装置であって、
前記標識付き非変質基質分子および前記標識付き変質基質分子の検出器；及び
前記検出器に連結されている細胞試料採取装置
を含み、ここで前記細胞試料採取装置が、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を前記細胞から抽出すること、及び、別の実質的変質が起きる前に、前記細胞試料採取装置が、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を採集して前記検出器の中へ移送すること、を特徴とする装置。
【請求項４６】
前記検出器に連結されて前記非変質基質分子および前記変質基質分子の量の変化を定量するデータ処理装置をさらに含むことを特徴とする、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記検出器に連結されて前記非変質基質分子および前記変質基質分子の量の変化を定量するデータ処理装置をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項４８】
前記検出器に連結されて前記非変質基質分子および前記変質基質分子の量の変化を定量するデータ処理装置をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の装置。
【請求項４９】
細胞における細胞内化学反応の腫瘍形成活性が、ｂｃｒ−ａｂｌオンコプロテインに関するものであること、及び、前記キナーゼのための基質分子を用意する工程が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのための基質分子を用意する工程であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍形成活性度が、ｂｃｒ−ａｂｌオンコプロテインに関するものであること、及び、キナーゼのための基質分子を用意する工程が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのための基質分子を用意する工程を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項５１】
細胞内分子の腫瘍形成化学反応の前記活性度が、ｂｃｒ−ａｂｌオンコプロテインに関するものであること、標識付きの基質分子を前記細胞の中へ配置するための前記手段が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのための基質分子を配置するものであること、及び、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を検出するための前記手段が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのためのリン酸化基質分子を検出するものであることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項５２】
細胞内における腫瘍形成化学反応の前記活性度が、ｂｃｒ−ａｂｌオンコプロテインに関するものであること、及び、前記標識付き非変質基質分子および前記標識付き変質基質分子の前記検出器が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのためのリン酸化基質分子および／または非リン酸化基質分子を検出するものであることを特徴とする、請求項４３に記載の装置。
【請求項５３】
細胞内分子の腫瘍形成化学反応の前記活性度が、ｂｃｒ−ａｂｌオンコプロテインに関するものであること、標識付きの基質分子を前記細胞の中へ配置するための前記手段が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのための基質分子を配置するものであること、及び、前記非変質基質分子および前記変質基質分子を検出するための前記手段が、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのためのリン酸化基質分子および／または非リン酸化基質分子を検出するものであることを特徴とする、請求項４５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生化学および細胞生医学の領域における微量分析化学の分野に関するものであり、より詳細には、一つ又は選択された複数の細胞の中におけるオンコプロテインの活性度を検定する化合物、方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物学では、個々の細胞は生物の基本単位とみなすことができる。突き詰めれば、一つの細胞の内部で起きる化学過程は、我々が生体内において観察する全ての現象を引き起こしている。細胞内化学過程は多くの場合、タンパク質の影響を受ける。一般的には、これらのタンパク質は、特定の化学反応の速度を触媒作用で高める酵素である。細胞内酵素は、シグナル伝達経路として知られる化学反応のカスケードに加わる。これらのシグナル伝達経路のそれぞれは、キナーゼとして知られる部類から成ることが多い連続作用酵素から構成されている。これらの酵素は、同じ経路の内部で他のタンパク質と相互に作用し合ってそのタンパク質の性質を変えるだけでなく、他のシグナル伝達経路の働きにも影響を及ぼす。シグナル伝達分子のこれらの相互作用カスケードと化学反応生成物とによって、細胞成長、増殖、休止およびプログラム細胞死の過程を最終的に調整する複雑なネットワークが形成される。
【０００３】
細胞内における不適切なシグナル伝達は、これらの過程のいずれかに欠陥を引き起こす惧れがあり、また、癌の多くの形態の比較基準として関連付けられている。さらに複雑なことに、個々の細胞は、それらの内部生化学シグナル伝達において高度の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示す。悪性腫瘍は概してそのような異質性細胞群からなっており、また、同一の腫瘍の内部における細胞は、異質かつ異常な成長シグナル伝達経路を利用することが多い。このような異質性によって、シグナル伝達における特有の誤差を解明するために個々の細胞を分析する必要性が生じる。一部の細胞だけが異常なシグナル伝達を示すときには、全細胞の分析によって、個々の異常細胞のいずれかよりも大部分の細胞をよく反映した平均シグナルが作り出される。このように、測定によって、検出のために求めている誤差の「平均化」が行われる。
【０００４】
不適切なシグナル伝達に関するシグナル伝達タンパク質の遺伝子には、変異の形態に遺伝子的な基本型（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ）が大抵存在する。シグナル伝達タンパク質の遺伝子における変異は、構造的に変化していて異常な作用をするシグナル伝達タンパク質が存在することになる。現在、一つの細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを分析してシグナル伝達タンパク質の変異の存在を検出し、それによって、変異したシグナル伝達タンパク質の存在を推測するいくつかの方法がある。しかしながら、遺伝子についての知識あるいは腫瘍の内部に生じる遺伝子の変異についての知識だけから、シグナル伝達の誤差を予測しあるいは理解することは現在では不可能である。例えば、１つの経路における変異したシグナル伝達タンパク質の異常活性度は、他の経路に含まれた、変異したあるいは正常な他のタンパク質の活性度によって、妨げられたり変化したりすることがある。このような事態はよく起こると考えられるが、それは、腫瘍細胞の内部が、大抵互いに影響を及ぼし合う経路の中で同時に存在し且つ関与する一般に数百から数千の相異なる種類のシグナル伝達タンパク質の複雑な混合体であるからである。あるシグナル伝達タンパク質における任意の一種類の機能を検定するためには、その実効活性度を１つの生体細胞の内部から測定しなければならない。
【０００５】
さらに、全体の経路の機能を完全に説明するためには、ある経路の内部に含まれた全てのシグナル伝達タンパク質の活性度を測定することが必要である。このような知識は、不完全な細胞内シグナル伝達に関係する疾患の個別の診断および治療において例外的に利用することのできるものであろうと考えられるが、それはシグナル伝達タンパク質が治療薬介在の主要標的であることが多いからである。
【０００６】
さらに、そのような可能性によって基礎細胞生理学についての研究を実施する能力に急激な変化がもたらされるであろう。上で述べたように、キナーゼは、細胞内シグナル伝達に重要な役割を一般に果たすタンパク質酵素の代表的な級別を表す。実際、成長促進キナーゼの異常な活性化は腫瘍細胞の一般的な特性である。したがって、タンパク質キナーゼは癌治療のための期待が持てる標的であり、また、キナーゼ拮抗薬の開発は真剣な研究の領域にある。これらの酵素は、共有化学結合がリン酸基と分子状基質分子、一般的には別のタンパク質との間に形成される速度を触媒作用で上昇させる。このような過程は「リン酸化」と称される。この基質自体が酵素であるときには、そのようなリン酸化は一般に、その基質酵素の化学活性の高揚又は抑制のいずれかに作用する。
【０００７】
キナーゼは一般に、一種類のキナーゼの好ましい基質が他の種類のキナーゼによって効果的にリン酸化されない、というような基質特異性を示す。通常は、あるキナーゼの好ましい基質はそれと異なるキナーゼであり、従って、一つのキナーゼの不適切な活性度によって、シグナル伝達経路の内部にある複数の下流側キナーゼの活性度が変化することになる。
【０００８】
細胞の内部におけるキナーゼの活性度を測定する一般的な方法は、多くの場合、シグナル伝達経路全体についての多量の情報をもたらす。しかしながら、このような測定を行うためには、厳しい基準が満たされなければならない。まず、キナーゼおよびキナーゼ基質のような多くの酵素タンパク質における細胞当たりの複製の数は、１ピコリットル（ｐｌ）の容積がある代表的な哺乳類細胞では１００〜１，０００，０００個の分子、あるいは、約１５０ｐＭ〜１．５μＭの濃度であるような少なさであってもよい。モル数で考えると、これはおよそ１．７×１０-18〜１．７×１０-22の必要限界範囲に等しい。
【０００９】
さらに、細胞の中におけるリン酸化された基質の濃度が秒単位の時間尺度で変化するので、細胞の含有物が得られる瞬間から生化学反応が終わる時刻までの時間分解能は秒以下でなければならない。従来の生化学検定は大抵、これらの一つの細胞測定に必要な時間分解能にも感度限界にも合致していない。時間分解能についての要件は、「電気泳動度を変化させる分子を用いて酵素活性を検出する方法および装置」という発明の名称が付けられた出願番号第０９／３５８，５０４号の一部継続出願である本発明に関連があって原出願が引用によりこの明細書の中に明確に組み込まれる、１９９８年３月６日に出願されて発明の名称が「分析のための細胞の制御可能な急速レーザー溶解」である出願番号０９／０３６，７０６号の出願に記載された装置の使用により満たすことができる。感度についての要件は、伝統的なキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法で達成することができる。現在まで、１つ以上のキナーゼ種あるいは他の酵素の細胞内活性度を正確に決定するための分子手段はなかった。
【００１０】
キナーゼ測定についての現在の技術は、一般に３つの方法論に分けることができる。第１の方法は、無傷細胞の内部で生じるキナーゼ活性度を概算するために細胞抽出によるキナーゼ基質のリン酸化を用いるものである。このような方法には大きい欠点がいくつかある。この方法は感度が良好でないために、多数の細胞の内部含有物を貯留しておかなければならない。またこれらの細胞はその活性化状態が同期していないので、キナーゼ活性度の時間平均化水準が実際に測定される。さらにまた、細胞抽出を行うために必要な時間の間、秒から分までの広がりを持ちうる時間に、多くの化学反応が引き続き進められる。その結果、実際の細胞の内部で生じる反応物質および生成物質の相対量が大きく歪曲され表示される。
【００１１】
これらの困難を克服するとしても、細胞の内部に生じる特有の化学的微環境を再現することは事実上困難であるため、抽出の際に観察された化学活性度は無傷細胞の内部に実際に生じる化学活性度から大きく異なることがある。
【００１２】
第２の方法は、特定の抗体、キナーゼ抑制因子あるいは蛍光標識がある細胞の内部でキナーゼに標識を付け、その細胞を蛍光顕微鏡で観察することによるものである。不活性および活性のキナーゼ分子の両方がこの方法によって標識付けされ、細胞の内部におけるその実際の位置からキナーゼの活性水準を推測するために、ある試みが行われる。しかしながら、酵素の活性の状態をその細胞内の位置だけから決定する試みは当たり外れが極めて大きいものである。このことは、細胞の中で自由であるときと細胞内構造に束縛されているときの両方とも活性であるいくつかのキナーゼに関して、確実に当てはまる。
【００１３】
第３の方法は、まだ開発中であるが、キナーゼ活性度を実際に測定するために、蛍光指示薬を使うものである。同じような方策が、さまざまな細胞内イオン濃度（すなわちＣａ2+）を測定するために使われてきたが、そのような方策は、これまでのところ、キナーゼ活性度の測定に広く適用することのできるものではなかった。この取り組みの１つの欠点は、検出の準備のための充分なシグナルを生じさせるためにレポーター蛍光体の過生理的濃度、すなわち、蛍光顕微鏡法による検出のための細胞の内部に普通は１０マイクロモルから１００マイクロモルの蛍光指示薬が必要である、ということである。この濃度は、通常の生理的キナーゼ基質の濃度の１０〜１，０００，０００倍である。このような高い濃度では、蛍光レポーター分子は、抑制因子として作用することがあり、あるいは、異常なシグナル伝達経路の活性化のような、意図しない他の細胞反応を引き起こすことがある。別の難点は、粘性があり高濃度の細胞内環境によって、レポーター分子の蛍光的性質が変わり、検出結果の信頼性がなくなることであった。
【００１４】
最後に、特定のキナーゼについての蛍光性環境感知プローブの設計は他のキナーゼに広く適用されないことを挙げる。特定の細胞あるいは細胞群に相異なる多数のキナーゼが含まれている場合があるため、このことは深刻な問題を引き起こしかねない。広く適用可能であり、正確で且つ高感度な細胞測定技術への要望は極めて大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
必要とされているのは、前記の取り組みに対する代替または補足的な方策である。さらに、この新しい取り組みは、キナーゼの測定に制限されるものではなく、全てではないが多くの他種類の細胞内の酵素活性度および化学活性度に広く適合することのできるものでなければならない。
【００１６】
ＬＭＳ検定系が計り知れない化学的、商業的価値を立証する生医学の領域は、分子的診断法および薬剤発見が含まれる癌生態学である。癌の同時観察によって、癌は一つの細胞における分子的欠陥から生じるということが示唆されている。これらの欠陥は、細胞増殖に含まれるシグナル伝達ネットワークが備わっている構成要素が過剰な活性度を示す結果をもたらす。確実に重要なものは、そのネットワークにおける酵素、とりわけキナーゼである。実際、およそ１２０の知られた腫瘍原のうち大多数のものが、キナーゼであるタンパク質のためにコード化されている。およそ２０００〜４０００のキナーゼについて、未知のまま残っている多くの機能は、癌生態学におけるそのような酵素の役割であると考えられるが、一層大きい重要性を呈するであろう。
【００１７】
現在、発癌現象を引き起こす分子機構の理解は未だ十分ではない。しかしながら、悪性腫瘍になりやすい重大な障害という点でよく特徴が調べられてきた慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）といわれる一種の癌がある。ＣＭＬは、成人の全ての白血病の約１５パーセントを占めるものであり、年齢が４５〜６５歳の間に発症することが多い。この年齢層になる「ベビーブーム世代の人々」の数が増えると、この病気の発生率は次の２０〜３０歳を上回ると予想することができる。
【００１８】
１９６０年代にＣＭＬ患者の染色体を分析したところ、フィラデルフィア染色体と呼ばれる異常染色体の存在が示された。その時から、その異常染色体は１つの染色体におけるＤＮＡ片が切断され、それが別の染色体に再付着するためであるということがわかった。このことは、２つの遺伝子、すなわち「ｂｃｒ」と「ａｂｌ」が融合する結果になる。ａｂｌ遺伝子はチロシンキナーゼをコード化し、また、ａｂｌ遺伝子とｂｃｒ遺伝子の融合によって、増大した無秩序なキナーゼ活性度のあるタンパク質をコード化する腫瘍遺伝子が作り出される。このｂｃｒ−ａｂｌ腫瘍遺伝子あるいはその対応タンパク質が正常細胞の中に存在していると、その細胞は癌性細胞に形質転換される。そのキナーゼの一定の活性化によって細胞の無秩序な増殖すなわち癌性状態に至る細胞内のシグナル伝達経路が開かれるということが現在わかっている。この理論的枠組は、他の癌の分子病因学についてのモデルであり、多くの取り組みが、ほとんど全ての癌におけるそのような障害を定義するために継続中である。大部分の腫瘍遺伝子のタンパク質生成物がそれらの関連腫瘍に重要な役割を演じることが予想できる。チロシンキナーゼをコード化する腫瘍遺伝子が、最も一般的な２種類の癌である乳癌および前立腺癌を含む多くの癌に存在している。
【００１９】
分子的異常に関するこのような情報は癌の治療に現在使われている。他の血液疾患からのＣＭＬの診断および判別は、フィラデルフィア染色体、ｂｃｒ−ａｂｌ腫瘍遺伝子および異常ｂｃｒ−ａｂｌ酵素の存在についての分子的研究にかかっている。中期分析、サザンブロット法、蛍光ハイブリッド形成法、ウェスタンブロット法およびＰＣＲが、ＣＭＬについて日常的に用いられており、また、医師にとって有益な情報をもたらす。しかしながら、これらの研究には全て、かなりの程度の人手、時間および技術的熟練が必要である。これらの試験はどこであっても、行うのに２日から２週間を要する。
【００２０】
ＬＭＳ検定は、独自の情報をもたらすとともに、これらの技術を超える別個の利点がある。ＬＭＳ検定によれば、無傷細胞におけるａｂｌチロシンキナーゼの活性度が測定される。より重要なことは、恐らく、その検定を１時間未満で事実上行うことができ、現在の方法よりも少ない人手で実施することができるという点である。
【００２１】
薬剤の発見の分野では、製薬会社は、全ての癌の細胞増殖特性を促進する特定の酵素および経路を阻止する薬剤の開発に強い関心を持っている。ＣＭＬの場合には、ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質が薬剤開発の標的であり、また、チロシンキナーゼ抑制因子が臨床試験に向けられる、ということは明白である。人手によるかなりの投資が必要であるチロシンキナーゼの抑制について選別するために、現在の検定は、非生理学的方法で行われるか、さもなければ、関心の対象である分子標的について直接測定を行うものではない。
【００２２】
ａｂｌ活性度についてのＬＭＳ検定によって、製薬工業に大きい利益をもたらしている現在の方法よりも労力、時間および費用が少ない、新しくて有益な情報がもたらされる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、腫瘍形成タンパク質の検出および薬剤抑制に関連する細胞内化学活性度を測定するための方法に関するものである。一般的には、関心の対象になる分子は、細胞内酵素、細胞の内部における生化学反応に触媒作用を及ぼすタンパク質、あるいはより詳しくはキナーゼである。酵素による触媒作用によって、基質分子の化学構造が変化することになる。本発明は、酵素によって化学活性度の細胞内レポーターとして作用するときに電気泳動度が変化する基質分子を使用することを含む。この方策によれば、癌性細胞微生物学に関連した基質分子の構造の変化を測定することによって酵素活性度を検出し且つ定量するための一般的な方法がもたらされる。電気泳動度の変化によって、腫瘍形成細胞の活性度に関連した、酵素により変質した基質分子を、後に行われる高感度の検出・定量方法を伴う電気泳動で、変質していない基質分子から分離することができる。化学構造のごく僅かな変化でさえも、電気泳動度の差として測定することができる。例えば、化合物の立体異性形態を分離するためにキャピラリー電気泳動法が日常的に用いられている。
【００２４】
最も一般的には、基質分子は、特定の酵素あるいは酵素類の活性度を知らしめる（ｒｅｐｏｒｔ）ために選ばれる。これらのレポーター基質分子は、細胞の内部で自然に発生し、オペロンあるいは同様な遺伝子制御機構の制御下にあるような細胞の内部で誘導され、あるいは、微量注入法、電気穿孔法、光穿孔法、小嚢融解法、飲作用取り込み法あるいは膜透過ペプチドとの会合による方法を含むが、これらに限定されない確立された様々な方法によって細胞の中に導入される。これらのレポーター基質分子は、自然発生化合物であってもよく、合成由来のものであってもよい。測定は、このような基質分子が細胞内に存在しているときに、関心の持たれる時点、通常は細胞が刺激にさらされた後、生物癌活性の発現開始時のような時点に行われる。該関心の持たれる時点では、一つの細胞又は複数の細胞群の一部あるいは全部の含有物が、キャピラリー電気泳動法による分離のために回収される。測定の精度を保証するためには、この方法は、関心の持たれるその時点に続いて起きる化学反応を最小限にするようにタイムリーなやり方で行わなければならない。実際には、このことは、測定が１％の精度範囲内で行われるためには、関心の持たれるその時点から化学反応が終わる時点までの時間が、１％の変化を生じる反応の進行に必要な時間よりも少ないものでなければならない、ということを意味している。化学反応は通常、界面活性剤による物理的破壊、乱流混合、希釈、または電気泳動によるかあるいはこれらの方法の組み合わせによる分子の分離によって終わる。制御可能な急速レーザー溶解は、レポーター基質分子が導入された一個の細胞の含有物を回収するための優れた方法である。
【００２５】
特定の細胞内反応に特有なレポーター分子は、予測可能な電気泳動度の変化を示すように設計することができる。これらの分子はまた、蛍光を発し、それによって、微量状態で且つ一個の細胞の微小容積の内部に生じる低濃度を検出することができるように、改変させることも可能である。示されたいくつかの実施形態において、改変ペプチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が代表的なレポーター分子として使われている。改変ペプチドは、いくつかの理由で、考え得るそのようなレポーター分子として確実に有用な種類である。第１に、ペプチドは、天然の内因性タンパク質基質に極めて類似しており、また、それらが加わり、そして該レポーター分子の知らしめる反応において、高度の特異性を示すことが多い。このことは、多くの場合において、これらのペプチドに特有の主要な連続構造の結果であると理解することができる。所定のペプチドからなるアミノ酸残基の特定の配列によって、特定の酵素によって基質として認識され且つ作用するのに関する特有の化学的性質がその分子へ伝達される。一般的には、天然の基質がタンパク質である酵素は、アミノ酸残基の特定の配列あるいはパターンを表示する分子が含まれるそれらの反応だけに効果的に触媒作用を及ぼす。
【００２６】
ペプチドは、レポーター基質として使われるに際して極めて用途の広い化合物である。これらの化合物の広大かつ多種多様なライブラリーは、所定のペプチドからなるアミノ酸残基の順序および数を変えることで簡単に作り出すことができる。さらにまた、基本的なペプチド構造の改変はいくつかの方法で行うことができる。例えば、Ｄ−異性体アミノ酸は、より一般に見られるＬ−異性体の形態の箇所に組み入れることができる。また、一般的でない、又は代替として生じる、非自然発生的なアミノ酸も、ペプチドの中に組み入れることができる。これらの例には、アルギニンおよびリシンそれぞれの代替であるホモアルギニンおよびホモリシンが含まれる。バックボーンペプチド結合でさえ変えることができる。これらが行われたような改変の後に、結果として生じたペプチドが酵素反応のための基質として役立つことが立証された。
【００２７】
例示されたいくつかの実施形態では、改変されたペプチドは、そのペプチドの内部における特定のアミノ酸へリン酸成分を添加することでそのペプチドを変質（ａｌｔｅｒ）させるキナーゼとして知られた酵素についての基質である。リン酸化は、細胞のないときには生体外で行うことができ、また、ペプチドの化学構造および電気泳動度の明らかな変化をもたらすことができる。
【００２８】
さらに、例示されたいくつかの実施形態に使われたペプチドは、少なくとも１つの時点で、すなわち、多くはレーザー励起蛍光法による検出を可能とするため、フルオロセイン群（あるいは他の蛍光群）の共有結合的添加による終了時点で改変される。蛍光標識は、当業者によく知られた化学技術によって、アミノ末端かあるいはカルボキシル末端かのいずれかに、または特定のアミノ酸残基に添加することができる。容易に改変することのできる残基の例には、システインのスルフヒドリル基、アルギニンおよびリシンのアミノ基、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩のカルボキシル基が含まれる。スルフヒドリル基と反応する化学基の例には、マレイミド、インドアセトアミド、ハロゲン化アルキル、アジリジンおよびエポキシドが含まれる。アミンと反応する化学基には、琥珀酸エステル、スルホニルハライド、イソチオシアン酸エステルおよびアルデヒドが含まれる。カルボキシルと反応する化学基には、カルボジイミド、ヒドラジン、ハロゲン化アルキル、アミンおよびジアゾアルカンが含まれる。反応基のある相異なる蛍光体の産物は、これらの基でペプチドに共有結合するために市販されている。利用可能な相異なる蛍光体の例には、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社（米国、オレゴン州、ユージーン）によって製造されたオレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）のようなフルオレセイン誘導体、テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）やテトラメチルローダミンのようなローダミン誘導体、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オクサ−１，３，ジアゾール）誘導体、クマリン、ダンシル誘導体、ピレン、およびアマーシャム／ファーマシア−バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社（米国、ニュージャージー州、ピスカッタウェイ）によって製造されたシアニン染料（Ｃｙ−３／Ｃｙ−５）が含まれる。このような多様性によって、スペクトルの紫外線部分から可視光部分を経て赤外線部分に至る波長範囲で光を吸収し且つ放出するペプチドを準備することができる。このことは、スペクトルの性質を異にする多種類のレポーター基質ペプチドを作り出すために利用することのできるさらに別の達成方法である。
【００２９】
例示を含むものの、本発明は、改変ペプチド単独の使用や、その範囲において細胞内キナーゼ単独による反応のモニターに限定されることを意図するものではない。本発明は、細胞内化学反応のより広い範囲をこの取り組みによってモニターすることができるということを意図するものである。例えば、ペプチド基レポーター基質は、ホスファターゼ、グリコシラーゼ、アセチラーゼ、プロテアーゼ、カスパーゼおよびイソメラーゼの活性度に関して知らしめるために設計することができる。本発明は、分子レポーターが、核酸、炭水化物、リン脂質および完全長タンパク質（ｅｎｔｉｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のような細胞内に広く認められる他の化学種に基づくものでありうるということ、あるいは、細胞の内部に通常は発見されない化合物（大抵はポリマー）に基づくものでありうるということもまた意図している。レポーター分子に基づく核酸は、ヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼおよびヌクレオチド転移酵素のための優れた基質として作用する。レポーター基質に基づく脂質はリパーゼをモニターするために作用する。レポーターに基づく炭水化物は、オキシドレダクターゼ、グリコシラーゼ、加水分解酵素、リアーゼおよびイソメラーゼをモニターするために作用する。最後に、完全長タンパク質は細胞内反応のための天然の基質であるので、これらに基づくレポーターは細胞内生理学についての極めて正確な情報をもたらすことが保証されよう。
【００３０】
完全長タンパク質を含んでいるレポーター分子は、クラゲのエクオレアビクトリアからの生の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に由来するものであってよい。このタンパク質は、本質的に蛍光を発するものであり、基礎的な生物学研究に広範囲に使われてきた。このタンパク質の遺伝子は、特有の吸収スペクトルおよび放出スペクトルを有しているＧＦＰ様の多様な蛍光タンパク質を作り出すためにクローン化され且つ変異されている。ＧＦＰ様タンパク質の遺伝子は、ペプチドか完全長タンパク質かのいずれかについての遺伝子配列に連結させることができる。細胞の内部での発現の際に、そのようなキメラ分子には、連結したペプチドあるいはタンパク質の性質に沿ったＧＦＰの蛍光的諸性質がある。連結ペプチドあるいは連結タンパク質が基質であるときには、その成果はタンパク質基蛍光分子基質である。このようなキメラ分子は、バクテリアあるいは培養真核細胞の中で作り出すことができ、また、レポーター基質の内因性生成に関する関心の対象である細胞の中へ導入することのできる外因性レポーター基質あるいは遺伝子として使うために精製することができる。実際、そのような遺伝子を、ある細胞系の中に導入して、当該遺伝子を１つの世代から次の世代へ運ぶ新しい細胞系（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を作ることができる。細胞内転換（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ）と細胞下試料採取（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓａｍｐｌｉｎｇ）の後に、電気泳動法を用いて、ＧＦＰに連結され転換された基質分子を、転換されていない基質分子から分離することができる。蛍光タンパク質のための遺伝子が、エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）からのＧＦＰに一致していないレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のような他の有機体の中に存在しているということは明らかであり、また、これらの遺伝子がクローン化されると、それらは同様に利用されるであろうということが予想される。
【００３１】
細胞の内部から得られた分子状レポーター分子の検出は、蛍光法によってだけ達成されるものではない。蛍光法は、それによってもたらされる検出限度が極めて低いことから、広く利用されている。実際、蛍光を基にした方法は単分子の検出が可能であるという点で開発された。表１に示されたように、生理学的に正常な１μＭの濃度にある１ｐｌ（ピコリットル）の哺乳動物細胞に認められる基質の量を観察するために必要な検出限度は、１０-18モル、すなわち約６００，０００分子である。電気泳動あるいは化学発光に基づいた代替的な定量光学分光学的検出法によっても、このように低い検出限度を達成することができる。また、アンペロメトリーやボルタンメトリーのようないくつかの電解分析法もまた、一個の細胞から得られた改変および非改変のレポーター分子を検出し且つ定量するために用いるのに充分な感度を有している。高感度の検出および定量は、電子イオンスプレー質量分析法をキャピラリー電気泳動分離法と組み合わせることによってもまた達成された。生体系に稀な元素からか又は通常でない同位元素の形態においてかのいずれかである重原子の、レポーター分子の中への導入によって、このような質量分析法の利用度が極めて大きくなる。
【００３２】
【表１】
2004536586.tif 000003
それぞれが特定の化学反応について知らしめる複数のレポーター分子は、所定の細胞の内部で同時に利用可能であると予測される。
【００３３】
最後に、この明細書に開示されたようなレポーター分子の使用は、細胞内に限定されるものではないという点で有用であることが予想される。このような取り組みは、微小容積で低濃度で極めて少ない量が生じる環境における化学活性度の測定に広く適用することができるであろう。このようなレポーター分子で検定される非細胞容積の例は、リポゾームの内部あるいは小嚢、通常は脂質分子によって取り囲まれた、一つの細胞大あるいはそれより小さい区画である。
【００３４】
ここで概要が説明された本発明およびそのさまざまな実施形態は、類似の要素が類似の符号によって表された以下の図面を考慮することで一層よく理解することができるであろう。
【００３５】
本発明およびそのさまざまな実施形態は、好適な実施形態についての以下の詳細な説明を参照することによって、これから理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
例示された第１実施形態では、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）として知られた細胞内酵素の実効活性度が、ＰＫＣによるリン酸化のための基質である合成蛍光ペプチドを微量注入により約１ｐｌ（ピコリットル）、一つの哺乳動物細胞の中へまず導入することによって測定される。ＰＫＣによるリン酸化の際に、蛍光ペプチド基質の電荷が＋５〜＋３まで変換される。注目すべきは、そのペプチド基質の電荷対質量比は、この化学変換の結果として変化することである。
【００３７】
したがって、この一つの細胞の含有物が、制御可能な急速レーザー溶解によって得られ、キャピラリー電気泳動によって分離され、レーザー励起蛍光法によって検出されると、１つまたは２つの識別可能な分子群が観察されるとともに定量可能である。これらの分子群は、個々にキャピラリー電気泳動を受けると、それぞれの分子種について観察された特徴的な泳動時間を参照することで識別される。光電子増倍管によって励起蛍光のピークとして観察された、より迅速な泳動分子群は、リン酸化されない基質に相当している。励起蛍光のピークとしてまた観察された、より緩慢な泳動分子群は、リン酸化された基質に相当している。キャピラリー２２を通る泳動速度のこの差は、電気泳動度の変化と呼ばれる。２つの分子群同士間の電気泳動度の差は、それぞれの分子群における分子の電荷対質量比の差と電気泳動を実施するために使われた特別な条件とによる結果である。
【００３８】
この場合、一部の基質分子のＰＫＣリン酸化によって、それらの特徴的な電気泳動度が変化した。２つの分子群の内部における分子の相対量は、その一つの細胞の内部で溶解の時間までに生じた実効ＰＫＣ活性度の測定値がもたらされる。細胞がそのＰＫＣを活性化するための処理を受けないときには、検出可能な基質ペプチドの大部分は非リン酸化形態にある。細胞がＰＫＣの活性体である化学薬品に５分間さらされると、測定された基質ペプチドのおよそ半分はリン酸化形態になる。これらの測定値は、関連のない２つの哺乳動物細胞系の個々の細胞から、すなわち、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞、培養された顆粒性白血球細胞系、およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞、マウス（ハツカネズミ）線維芽細胞系の個々の細胞から得られた。さらに、この実施形態では、区別可能な２つのキナーゼの活性についてのレポーターである相異なる２つの蛍光ペプチドが一つのＲＢＬ細胞の含有物から同時に検出され且つ識別される、ということが示されている。
【００３９】
別の実施形態では、カエル（アフリカツメガエル）の単一の卵母細胞４６’、すなわち、直径がおよそ１ｍｍで容積が１μｌ（マイクロリットル）である非哺乳動物細胞の内部におけるＰＫＣの実効活性度が測定される。この場合において、その細胞の中へ、同じ合成蛍光ペプチド基質が注入によって導入される。その後、その細胞の含有物の一部が、圧電モーターによって案内された鋭利なキャピラリーの先端で引き出される。この場合、卵母細胞４６’の含有物がレーザー溶解によって回収される必要はないが、それは卵母細胞４６’が機械的に試料採取するのに充分大きいからである。その含有物の一部はキャピラリー２２の中へ入ると、卵母細胞における細胞質ゾル状成分の分離のために経験的に最適化された電気泳動条件の下で分離された。第１実施形態に比べて異なる細胞および電気泳動条件が用いられたが、識別可能でリン酸化されなかったＰＫＣ基質分子も得られる。多数の時点での卵母細胞４６’からの追加測定によって、刺激を受けた基質リン酸化の平均速度を、ＰＫＣの相異なる２つの化学活性度がある卵母細胞４６’を取り扱うために決定することができる。
【００４０】
最後に、この実施形態では、相異なる３つの区別可能なキナーゼの活性度のためのレポーターである相異なる３つの蛍光基質ペプチドをカエル単一の卵母細胞４６’の含有物の一部から検出し且つ識別することができることが示されている。
（例示された２つの実施形態に共通の態様）
好ましい２つの実施形態が示されている。その第１のものは、直径が通常は５〜１０μｍ（マイクロメートル）で容積が約１ｐｌである哺乳動物の小さい一つの細胞における細胞内化学活性度の測定に関するものである。これは、細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３の個々のラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞から、また、個々のハツカネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞から行われた測定によって示されている。第２のものは、比較的大きい一つの細胞における細胞内化学活性度の測定に関するものである。この第２の実施形態では、測定は、直径が約１ｍｍで容積が約１μｌである個々のアフリカツメガエル卵母細胞から行われている。示された両方の実施形態では、細胞内タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性度の測定は個々の細胞から行われている。両方の実施形態では、「ＰＫＣの蛍光基質」のためのＦｌ−ｓＰＫＣと呼ばれる同じレポーター基質分子が用いられている。ＰＫＣによるリン酸化の際に、Ｆｌ−ｓＰＫＣの実効電荷は＋５〜＋３に変わる。より重要なことには、電荷対質量比はこの化学変化の結果として変化する。その後、その一つの細胞の含有物がキャピラリー電気泳動によって得られ、分離され、且つ、レーザー励起蛍光法によって検出されると、非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣおよび／またはリン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応している１つまたは２つの識別可能な分子群の分子が、観察され且つ定量可能である。これらのＰＫＣ測定と従来のＸ線写真法とに含まれた量（検定容積、基質の濃度、および全量）の比較が、表１に示されている。
【００４１】
このレポーターペプチドが含まれているアミノ酸残基の配列は、ＰＫＣタンパク質配列の領域に由来している。このペプチド配列は、より大きいＰＫＣ配列に認められるように、Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌであり、この配列は酵素を抑制することが知られているが、その結果としての配列は、ＰＫＣについての比較的特別な基質として働くことが知られている。したがって、Ｆｌ−ｓＰＫＣの配列は、Ｆｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌであり、ここで、「Ｆｌ」は、標準ペプチド合成に従うペプチドのアミノ末端に共有結合状に結合したフルオレセイン成分を意味している。下線の付けられたセリン残基Ｓｅｒはリン酸化部位である。樹脂結合された非蛍光ｓＰＫＣペプチドは、スタンフォード・パン（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ）施設から得られ、従来の合成法によって生成された。フルオレセインでアミノ末端に共有結合状に結合されたペプチドは、樹脂結合された非蛍光ペプチド（３０ｍｇ／ｍｌペプチド）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５７ｍｇ／ｍｌ）、およびＮ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（５５ｍｇ／ｍｌ）からなる５−カルボキシフルオレセインコハク酸イミド状エステル（１００〜２００ｍｇ／ｍｌ、米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製）によって、ジメチルホルムアミドの中において回転混合機の上で１２時間インキュべートすることで、用意された。このペプチドは、ジメチルホルムアミドとエチルアセテートで洗浄され、前もってアルゴンあるいは窒素とともに噴霧されたトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／遊離基捕捉剤の混合物（トリフルオロ酢酸（８４容積／容積％）、フェノール（０．２重量／容積％）、チオアニソール（５容積／容積％）、エタンジオール（２．５容積／容積％）、水（８．５容積／容積％））で２時間インキュべートすることで、その樹脂から剥がされた。このペプチドは、焼結したガラスフィルターの通過によってその樹脂から分離された。このペプチドは次いで、氷結エーテルの添加によって沈殿され、酢酸（５％）の中に溶解され、次いで凍結乾燥された。このペプチドは、半予備用Ｃ１８カラム（米国、イリノイ州、ディアフィールドのアルテック（Ａｌｌｔｅｃｈ）社製）の上における逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製された。このフルオレセイン標識ペプチド、すなわち緩衝液Ａ（１３５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびｐＨ７．４のＮａＯＨで調整された２ｍＭのＣａＣｌ2）の中で溶解したＦｌ−ｓＰＫＣの濃度は、その蛍光を加水分解されたカルボキシフルオレセインコハク酸イミド状エステルの標準物質の蛍光と比較することによって決定された。Ｆｌ−ｓＰＫＣの純度は、分析用Ｃ１８カラム（アルテック社製）の上における逆相高圧液体クロマトグラフィーによって、また、キャピラリー電気泳動法によって検定された。このペプチドは、２μｌの部分標本の中に−７０℃で貯蔵された。
【００４２】
両方の実施形態において、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａおよび図４Ｂに示されたように、このレポーター基質ペプチドＦｌ−ｓＰＫＣと、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣとして表されるリン酸化形態との標準的分離は、緩衝液の中で行われた。この目的のためのＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの生成は生体外のリン酸化によって達成された。Ｆｌ−ｓＰＫＣ（４〜４０μＭ）は、ジオクタノイルグリセロール（２５μｇ／ｍｌ、米国、アラバマ州、アラバスターのアバンチ・ポーラー・リピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）社製）、ホスファチジルセリン（２５０μｇ／ｍｌ）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、トリスＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）、アデノシン３リン酸（１ｍＭ）およびＣａ2+（から１０μＭ）の存在下において、ラット脳ＰＫＣ（１．２μｇ／ｍｌ、米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）によってリン酸化された。遊離Ｃａ2+の濃度は、１０ｍＭのカルシウムに１０ｍＭのＥＧＴＡを添加することによって定められる。この反応混合物は室温で１時間培養され、また、リン酸化ペプチドはさらに精製することなく用いられた。
【００４３】
両方の実施形態における測定の一般的枠組は図１ＡからＨに示されている。図１ＡからＨは、本発明による細胞内キナーゼの測定を示している、諸段階における模式図である。図１Ａには、表された分子種を識別するために、説明が含まれている。図１Ａは、測定に先立つ可能状況における細胞４６の概略図であって、この細胞には不活性キナーゼ分子１１２が含まれている。
（測定）
一連の測定は、図１Ｂに示されたように関心の対象の中へのＦｌ−ｓＰＫＣの導入で始まる。この場合、レポーター基質１１４をマイクロピペット１１６によって微量注入することが示されている。
【００４４】
測定において、細胞４６が刺激剤１１８で処理されて細胞内ＰＫＣが活性化されると、刺激剤１１８は、図１Ｃに示されたように、細胞４６を取り巻く溶液１２０の中へ添加される。
【００４５】
図１Ｄは、活性キナーゼ分子によって引き起こされたレポーター基質のリン酸化の模式的表現図である。大抵は常に細胞４６の内部に存在するアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）１２４は、この反応のためのリン酸基の細胞内供給源である。活性キナーゼ１２２によって、非リン酸化レポーター基質１１４とＡＴＰ１２４との反応が引き起こされる。リン酸化の後に、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）１２６が、リン酸化レポーター基質１２８とともに放出される。
【００４６】
図１Ｄに一般的に示されているように、Ｆｌ−ｓＰＫＣのリン酸化は、刺激剤１１８で処理された細胞の中でかなりの程度起き、その結果、細胞４６は、図１Ｅに示されたように、内部含有物を有する細胞になる。図１Ｅは、ある量のレポーター基質がリン酸化された後における図１Ｃの細胞４６の概略図である。所定の時間間隔の後に、刺激剤による処理がある場合とない場合との両方の場合において、細胞４６における全てのあるいは一部の細胞内含有物が、分離と検出のためにキャピラリー３０の中へロードされる。図１Ｆは、図１Ｇにおけるキャピラリー２２の中での分析と分離のための細胞含有物を解放するために、破線で示された原形質膜が破壊された後における図１Ｅの細胞４６を示す図である。図１Ｇは、キャピラリー３０の内部における非リン酸化基質分子１１４とリン酸化基質分子１２８との間の分離の間隔によって象徴的に示されたキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）による非リン酸化基質分子１１４とリン酸化基質分子１２８との分離を表している。
【００４７】
キャピラリー３０の遠位端部での目視窓３８によって、図１ＦとＧとの組み合わせで表されたように、破壊された原形質のある細胞４６からキャピラリー３０の中ヘの物質の流れによって、レーザー（図示略）による呼びかけとレーザー励起蛍光の集束とが可能になる。
【００４８】
両方の実施形態において、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの存在と量を検出するためのアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）励起蛍光を集束させる光電子増倍管（ＰＭＴ）が使われている。使われたこれらの光集束系はわずかに相異なっているが、両方の実施形態において、光電子増倍管の電流は前置増幅器で増幅されてある電圧まで変換され、この信号はパーソナルコンピューターのデータ収集ボードによってディジタル化された。その出力値は図１Ｈに概略的に示されているが、この図は、非リン酸化レポーター基質分子１１４の分子群がリン酸化レポーター基質分子１２８から分離された、典型的な電気泳動図を示すものである。
【００４９】
図９は、急速に調整された細胞溶解がキャピラリー電気泳動法によって分析とともに行われる、図示された実施形態に使われた急速溶解装置の概略図である。このシステムは前記の組み入れられた特許出願に説明されているが、その基本的な説明を便宜のために再び記載する。現在知られているかあるいは後に考案される多くの構成要素を図１Ａのシステムの中で置き換えて、均等な機能を達成することができる。例えば、図示された実施形態は電気泳動カラムの中の検体をレーザー励起蛍光で検出することを意図しているが、検体の検出に適用することのできる任意の測定装置あるいは検出機構を、電荷あるいは電荷対質量比に基づいてレポーター分子を分離することのできる任意の分離システムとともに使うことができる。
【００５０】
参照符号１０で広く表されているこのシステムは、顕微鏡１２を含み、その顕微鏡にはビデオ接眼読出装置１４を具備し、この読出装置は、ＣＲＴスクリーン１６に表示されるか、あるいは、ビデオテープレコーダーかあるいはディジタルレコーダー（図示略）によって記録される。より詳しくは、以下に説明するように、自動細胞処理・分析のためのコンピューターシステムにおける画像・パターン処理のディジタル保存は本発明の範囲内にあるように確実に意図されている。ＣＣＤ（電荷結合素子）ビデオカメラシステム１４，１６によって、細胞４６のリアルタイム明視野画像が３３ミリ秒ごとに記録された。溶解は、レーザーパルスが出た後の細胞の出現から決定される。大抵の場合、細胞膜は全て破壊され、カバースリップ３６に取り付けられたその膜の残留物の後方にだけ、（前方の）細胞の直近に懸垂した細胞含有物が残る。例示された実施形態では、操作者が行った起動とその後の溶解との時点でレーザーにより送られた電圧パルスによって電気泳動が開始された。コンピューター制御パターン認識は操作者の観察に置き換えることができ、また、起動は同様に自発的に行うことができるということをはっきりと理解すべきである。
【００５１】
パルスＮｄ：ＹＡＧレーザー１８が顕微鏡１２の対物レンズ２０に導かれている。この細胞溶解実験のために使われたこのレーザーシステムには、米国、カリフォルニア州、サンタクララのコンティニウム（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）社製のスレリテル（Ｓｕｒｅｌｉｔｅｌ）として製造されたような周波数倍増Ｑスイッチ型Ｎｄ：ＹＡＧレーザーが含まれていた。このレーザーは、５ｎｓｅｃ（ナノ秒）パルス幅で５３２ｎｍ（ナノメートル）波長のレーザーパルスを１〜２５μＪで発生させるために使われた。レーザー１８からのレーザービームは、米国、ニューヨーク州、ソーンウッドのツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社によって製造されたアクシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）１３５からなる顕微鏡１２の中へ導かれた。レーザーパルスは、細胞チャンバーカバースリップ３６と緩衝液５４との界面における顕微鏡対物レンズ２０（倍率１００倍、開口数１．３、ツァイス社製）を使って、図１Ｂに示されたようにその腰部５０でおよそ０．３〜０．４μｍに焦点が合わされた。溶解される細胞４６は、そのレーザーパルスの焦点位置５０に対して１０〜２０μｍ横向きに置かれた。溶解、すなわち細胞の外部膜の破壊は、そのレーザーパルスによって発生した衝撃波の影響を受ける。しかしながら、別の実施形態では、レーザーパラメーターが細胞膜に穴を開けて細胞質含有物を抽出し、内部に核物質を残すようにだけ調整されるときには、直接の相互作用を定めることができる、ということをはっきりと理解すべきである。この明細書に図示されたもの以外の他の型のレーザーもまた、衝撃波を発生させるために使うことができるということがされねばならない。細胞の溶解に加えて、細胞から分離され、あるいは引き出された細胞の核は、そのＤＮＡあるいは他の核物質を再生するために、操作することができる。
【００５２】
石英ガラスキャピラリーカラム２２が、顕微鏡試料台３０に置かれたカバースリップあるいはスライド２８の上方におけるキャピラリー２２の近位入口２６を位置決めするマイクロマニピュレーター２４によって配置される。細胞の周りとカバースリップの上方とにおける緩衝液は電気的に接地されている。カラムあるいはキャピラリー２２の中で電気泳動を行わせるために、米国、ニューヨーク州、プレインビューのスペルマン（Ｓｐｅｌｌｍａｎ）社によって製造されたモデルＣＺＥ１０００Ｒの高電圧電源が使われた。石英ガラスキャピラリー２２は、内径が５０μｍで外径が３６０μｍである。キャピラリー２２の全長は９０〜１００ｃｍであった。検出窓３８は入口端２６〜約７５ｃｍであった。電気泳動は生体適合性緩衝液の中で行われた。図１０の細胞チャンバー１９９は、入口槽として機能するとともに、グラウンド電位に維持された。出口槽は１０〜１８ｋＶに維持された。キャピラリー２２の入口端２６は、細胞含有物を細胞溶解の後にキャピラリー２２の中へ導入するためのマイクロピペットとして使われた。
【００５３】
入口端２６の上方におけるキャピラリー２２〜５ｍｍのポリイミドコーティングを取り除いた後に、その入口端２６は、マイクロマニピュレーター２４におけるカバースリップ３６に対して垂直に取り付けられた。マイクロマニピュレーター２４によって溶解され、且つキャピラリー２２の中へ取り込まれる細胞４６に対するキャピラリー内腔５２の正確な位置決めができた。このキャピラリー２２は全ての作業の後に洗浄された。重力サイフォンの流体流動を用いて、キャピラリー２２にリン酸化／非リン酸化ペプチド標準物質が取り込まれた。取り込まれた容積はポアズイユの式から算出された。
【００５４】
キャピラリー２２には、アルゴンレーザー４０からの励起ビームが向けられる目視検出窓３８が含まれている。キャピラリー２２に対して、また、レーザー４０からのレーザービームに対して９０度の蛍光データが、米国、ニューヨーク州、メルビルのニコン（Ｎｉｋｏｎ）社によって製造された、倍率が４０倍で開口数が０．７５の顕微鏡対物レンズであるプラン・フルーア（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ）によって集束された。集束された光は、米国、ミシガン州、アン・アーバーのカイザー・オプティカル・システムズ（Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社によって製造された４８８ｎｍノッチフィルターと、米国、バーモント州、ブラットルボローのオメガ・オプティカル（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ）社によって作られた帯域通過フィルター５３５ＤＦ５５とによるスペクトル濾波の後に、米国、ニュージャージー州、ブジッジウォーターのハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）社によって作られた光電子増倍管で測定された。この光電子増倍管の電流は、前置増幅器で増幅されてある電圧まで変換され、次いで、パーソナルコンピューター４４のデータ収集ボードによってディジタル化された。このデータはプロットされ、ピーク面積が、米国、マサチューセッツ州、ノースハンプトンのマイクロカル（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）社によって書かれたオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）を使って算出された。励起された蛍光のデータは、図２ＡからＣ、３ＡからＣ、４ＡからＤ、５、７および１１の電気泳動図を作り出すために用いられた。浴３４は、電気泳動力をもたらしてキャピラリー３２の中における検体の分離を引き起こすために、高電圧電源３６に電気的に接続されている。
（第１実施形態に特有な条件および結果）
（使われた細胞）
図２ＡからＣおよび図３ＡからＣは、全てが同日に同一の電気泳動条件の下で行われたレポーター基質分子の分離を示す３つの積み重ね状電気泳動図のグラフである。図２ＡからＣおよび図３ＡからＣによって例示された第１実施形態では、腫瘍マスト細胞系ＲＢＬ−２Ｈ３からのラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞が使われた。これらの細胞は、１０％のウシ胎児血清とＬグルタミン（５８４ｇ／ｌ）とで補足されたダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、３７℃、５％の炭酸ガスで増殖させられた。この培地にペニシリン（１００単位／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されて、バクテリアの増殖が抑制された。細胞４６は、シリコーン製「Ｏ」リング（外径が１５／１６インチ−図示略）を２５ｍｍの第１番丸棒状ガラス製カバースリップ（図示略）に取り付けるために、シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）（米国、ミシガン州、ミッドランドのダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製）を用いることによって作られたチャンバー１９９の中で増殖させられた。ガラス表面への細胞付着は、細胞４６を細胞チャンバー１９９へ添加するのに先立って、セル・タック（Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ）（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォードのベックトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製）で前記カバースリップをコーティングすることによって増進された。細胞４６は、使用に先立って、細胞チャンバー１９９の中で平板培養された後に補足培地の中で１２〜２４時間、増殖させられた。細胞４６は、測定の当日に１００倍の視野当たりおよそ１つの細胞を作り出すために、経験的に決定された濃度で平板培養された。組織培養物質はギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（米国、メリーランド州、ガイザースバーグ）から得られた。図１２に用いられたハツカネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、セル・タックの使用が省略されたことを除いて同じ条件の下で増殖させられ、典型的には、細胞チャンバー１９９の中で平板培養された後に、２４〜４８時間、増殖させられた。ハツカネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、ＲＢＬ細胞とほぼ同じ寸法まで増殖させられた。
（顕微鏡検査および細胞試料採取）
第１実施形態では、細胞溶解のために使われた、図９の顕微鏡検査システムは、「分析のための細胞の制御可能な急速レーザー溶解」という発明の名称が付けられて組み入れられた出願において先に記載されたものと同様であった。周波数倍増Ｑスイッチ型Ｎｄ：ＹＡＧレーザー１８（米国、カリフォルニア州、サンタクララのコンティヌーム（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）社製のミニライト（Ｍｉｎｉｌｉｔｅ）ＩＩ、米国、カリフォルニア州、サニーベールのニュー・ウェーブ・リサーチ（Ｎｅｗ  Ｗａｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製のミニラーゼ（Ｍｉｎｉｌａｓｅ）ＩＩ−２０）が使われて、蛍光顕微鏡１２（米国、ニューヨーク州、ソーンウッドのツァイス社製のアクシオバート１３５）の中へ向けられた単一のパルス（５ｎｓｅｃパルス幅で５３２ｎｍ波長である１〜２５μＪのパルス）が発生させられた。このパルスは、顕微鏡対物レンズ２０（倍率１００倍、開口数１．３、ツァイス社製のフルオール（Ｆｌｕｏｒ））を使って、緩衝液との界面に隣接するカバースリップ３６の内部に焦点が合わされた（その腰部でおよそ０．３〜０．４μｍ）。これと同じ顕微鏡対物レンズ２０は、細胞の微量注入および選別時の目視観察のために使われた。溶解される細胞４６は、レーザービームと細胞４６との直接相互作用が起きないように、そのレーザーパルスの焦点に対して１０μｍ横に置かれた。溶解はＮｄ：ＹＡＧレーザーパルスの手動起動によって行われた。大抵の場合、細胞漠は、前記カバースリップに付着した細胞漠の残留物だけを残して、完全に破壊された。
（分離条件）
第１実施形態では、電気泳動は、ポリマイクロ・テクノロジーズ（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（米国、アリゾナ州、フェニックス）から市販されている長さが５０〜７５ｃｍの非コーティング石英ガラスキャピラリー２２（外径が３６０μｍ、内径が５０μｍ）の中で、緩衝液Ａ、すなわち、１３５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ2および２ｍＭのＣａＣｌ2からなり、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整された生理的融和性生体外緩衝液を用いて、行われた。細胞チャンバー１９９は、入口槽として機能するとともに、グラウンド電位に維持された。出口槽は、高電圧電源（米国、ニューヨーク州、プレインビューのスペルマン（Ｓｐｅｌｌｍａｎ）社製のＣＺＥ１０００Ｒ）で１０．８〜１３．４ｋＶ（キロボルト）の負電位に維持された。電気泳動電流は５０〜７０μＡ（マイクロアンペア）であった。キャピラリー２２の入口２６は、細胞溶解後に細胞の含有物をキャピラリー２２の中へ導入するためのマイクロピペットとして使われた。電気泳動は、レーザーパルスの電位差を電気的に引き起こすことによって、溶解と同時に開始された。キャピラリー２２の入口端２６および出口端３２は、重力による流れをなくすために、細胞溶解、取り込みおよび電気泳動の間に同じ高さに維持された。電気泳動作業の間に、キャピラリー２２は次の方法によって洗浄された。
１）  緩衝液Ａが、手動注射器で３０秒間、キャピラリー２２に手動で取り込まれた（およそ１０カラム容積）。
２）  二重蒸留され、逆浸透処理された水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）が、３０秒間取り込まれた。
３）  １規定ＮａＯＨが、５分間取り込まれた。
４）  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水が、３０秒間取り込まれた。
５）  ０．１規定ＨＣｌが、３分間取り込まれた。
６）  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水が、３０秒間取り込まれた。そして、
７）  緩衝液Ａが、１分間取り込まれた。
（検出）
検出の目的のために、キャピラリー２２の出口端３２〜１２．５ｃｍの箇所で、その外面から長さ５ｍｍにわたってポリイミドコーティングが除去されて、窓３８が作られた。このコーティングは使い捨てブタンガスライターによる簡単な加熱で除去され、次いで、７０％エタノール溶液で洗浄された。キャピラリー２２の内腔には、アルゴンイオンレーザー（米国、カリフォルニア州、サンホセのユニフェイズ（Ｕｎｉｐｈａｓｅ）社製の４８８ｎｍ型）の合焦ビームによって、目視窓３８から応答指令信号が送られた。このレーザービームは、焦点距離が３．８ｃｍのレンズ（図示略）（米国、ニューメキシコ州、アルバカーキのシー・ブイ・アイ（ＣＶＩ）社製）によって合焦された。蛍光データが、キャピラリー２２とそのレーザービームに対して９０度の位置にあり、顕微鏡対物レンズ（図示は省略するが、検出器４２に含まれている、米国、ニューヨーク州、メルビルのニコン社によって製造されたプラン・フルーアと呼ばれる、倍率４０倍、開口数０．７５のもの）が備わっている検出器４２によって集束されるとともに、その光が、４８８ｎｍのノッチフィルター（米国、ミシガン州、アン・アーバーのカイザー・オプティカル・システムズ社製）（図示は省略するが、検出器４２に含まれている）と、５３５ＤＦ５５型帯域通過フィルター（米国、バーモント州、ブラットルボローのオメガ・オプティカル社製）（図示は省略するが、検出器４２に含まれている）とによるスペクトル濾波の後に、光電子増倍管（図示は省略するが、検出器４２に含まれている、米国、ニュージャージー州、ブジッジウォーターのハママツ社製のＰＭＴ，Ｒ９２８型）によって測定された。この光電子増倍管の電流は、１２１２型前置増幅器（米国、ニューヨーク州、ドライデンのデイー・エル・インストルメンツ（ＤＬ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社製）（図示は省略するが、検出器４２に含まれている）で増幅されてある電圧まで変換された。次いで、パーソナルコンピューター４４（米国、サウスダコタ州、スーシティのゲイトウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）社製）のデータ収集ボード（米国、マサチューセッツ州、ターントンのキースリー・メトラバイト（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｍｅｔｒａｂｙｔｅ）社製のＤＡＳ−１８００型）によってディジタル化された。
【００５５】
このデータはプロットされ、ピーク面積が、オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）（米国、マサチューセッツ州、ノースハンプトンのマイクロカル社によるもの）を使って算出された。このシステムによって、Ｆｌ−ｓＰＫＣの６×１０-21モル（約３６００分子）までを、生理的関連測定に必要な検出限界のかなり下で容易に検出することができた（表１を参照のこと）。
（電気泳動の泳動基準）
図２Ａおよび図３Ａは、電気泳動図の２つのグラフであって、緩衝液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子および生体外リン酸化基質分子の分離を示しており、この分離はこれら両種の電気泳動度の比較基準として観察される。図２Ａおよび図３Ａに示されたような電気泳動の泳動基準を得るために、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの希釈混合物が重力流体流によってキャピラリー２２の中へ取り込まれ、その取り込まれた容積がポアズイユの式から算出された。これらの混合物は、図２Ａにおける両種の濃度がおよそ１ｎＭであり、図３Ａにおける両種の濃度がおよそ１００ｐＭであった。図２Ａおよび図３Ａは、比較基準のための非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣのピーク１３６およびリン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣのピーク１３８をそれぞれ示している。
【００５６】
図１１Ａもまた、電気泳動度のグラフであって、緩衝液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子および生体外リン酸化基質分子の分離を示す。図１１Ａに示されたような電気泳動の泳動基準を得るために、それぞれの濃度がおよそ１ｎＭであるＦｌ−ｓＰＫＣ、Ｆｌ−ｓＰＫＡおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの希釈混合物が重力流体流によってキャピラリー２２の中へ取り込まれ、その取り込まれた容積がポアズイユの式から算出された。図１１Ａは、比較基準のための非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣのピーク１３６、比較基準のための非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡのピーク１３７およびリン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣのピーク１３８を示す。
（図２ＡからＣにおける測定の技術的態様）
図２ＡからＣによって示された測定では、室温（２０℃から２３℃）での微量注入および分析のために顕微鏡試料台の上に搭載するのに先立って、それぞれの細胞チャンバー１９９は、緩衝液Ａの中に１０μｌの１０ｍＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）（米国、インディアナ州、インディアナポリスのベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）をピペットマン（Ｐｉｐｅｔｍａｎ（登録商標））（米国、マサチューセッツ州、ウォーバーンのレイニン（Ｒａｉｎｉｎ）社製）を使う穏やかな手動ピペット吸引混合で添加することによって処理された。
【００５７】
これによって、ペファブロックの最終濃度は２００μＭになった。ペファブロックは、可溶性で生理的に許容できる、セリンプロテアーゼの抑制因子、すなわち、ペプチドを分解する傾向がある細胞内酵素である。ペファブロックは、Ｆｌ−ｓＰＫＣの細胞内分解を最小限にするために含められた。図２ＣにおけるようにＰＫＣが活性化された場合には、２００μＭの保存溶液から新たに希釈された１０μｌの５μＭホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ、米国、ミズーリ州、セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入した）が、緩衝液Ａの中へ添加されて、ペファブロックといっしょに穏やかに混合された。この保存溶液はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中に溶かされたＰＭＡから構成されているものであった。細胞チャンバー１９９は、培養器（３７℃、５％ＣＯ2）へ５分間、戻された。顕微鏡試料台３０の上に搭載した直後に、細胞チャンバー１９９の中における培地は、添加された１０ｍＭのグルコースと２００μＭのペファブロックが入った室温（２０℃から２３℃）緩衝液Ａの連続流および連続除去（２ｍｌ／分、およそ４細胞チャンバー容積／分）によって置き換えられた。この流れは、微量注入および回収の間、維持された。これは、通常で２０〜３０分間続いた。この流れは、溶解が行われるしばらくの間停止され、溶解およびキャピラリー取り込みの１分後に再開され、電気泳動の間に継続された。
【００５８】
図２ＡからＣによって示された測定では、Ｆｌ−ｓＰＫＣは、緩衝液Ｂ、すなわち、１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１４０ｍＭのＫＣｌとからなるｐＨ７．４の生理的融和性生体内緩衝液の中で希釈された。Ｆｌ−ｓＰＫＣの最終濃度は、およそ８００μＭであった。Ｆｌ−ｓＰＫＣで混合されたのは、５００μＭの濃度にあるカルシウムオレンジ（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ）（米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）であった。この混合物は、フェムトティップ（Ｆｅｍｔｏｔｉｐ）Ｉ型ガラス微量注入針１１６、インジェクトマン（Ｉｎｊｅｃｔｍａｎ）５１７１型マイクロマニピュレーターおよびトランスジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ）５３４６型システムによって、同じ細胞チャンバーの中におけるいくつかの細胞の中へ８０ｈＰａ（ヘクトパスカル）の圧力で０．２秒間、微量注入された（フェムトティップ、インジェクトマンおよびトランスジェクターはドイツ、ハンブルグのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）社の製品である）。細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣが８μＭで、カルシウムオレンジが５μＭであった。この注入は、細胞の選択および分析のために使われたものと同じ顕微鏡１２、すなわちアクシオバート１３５（ツァイス）で行われた。連続的に微量注入された細胞４６は、Ｆｌ−ｓＰＫＣにおけるフルオレセイン成分の光による破壊を最小限にするために、一組のＴＲＩＴＣフィルター（米国、バーモント州、ブラットルボローのクロマ・テクノロジー・コーポレーション（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，）社製）（図示は省略するが、顕微鏡１２に含まれている）での内部カルシウムオレンジの上蛍光の目視観察によって識別された。均一に蛍光を発する均質の細胞質と平滑な原形質膜との存在を基準に健康と判断された細胞４６だけが、分析対象に選ばれた。微量注入された細胞の大部分は、このような要件を満たすことなく、膜欠陥、断続状蛍光あるいは異常に明るい細胞核を示している。
（図２ＡからＣにおける測定の結果）
図２Ｂは、電気泳動図のグラフであって、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されなかった（およそ１２００秒におけるピーク１４４が細胞内タンパク質分解の副産物であると考えられている）ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞４６の含有物からの分離を示している。とりわけ、図２Ｂは、先に説明したように、細胞外刺激剤のない状態で微量注入されたＲＢＬ細胞４６の含有物の電気泳動図である。図２Ｂは、図２Ａに示されたＦｌ−ｓＰＫＣ１３６への泳動時間に対応する、かなり大きい非リン酸化蛍光ピーク１４０を示す。これに対して、リン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣへの泳動時間に対応する、ごく小さいピーク１４２だけが観察される。処理細胞４６の内部では、細胞内実効ＰＫＣ活性は微量注入の時間から事実上、起きなかった。
【００５９】
図２Ｃは、電気泳動図のグラフであって、ＰＫＣが１００ｎＭホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）での処理によって特異的に活性化されたＲＢＬ細胞４６の含有物からの分離を示す。図２Ｂの結果とは異なり、細胞外の膜透過性刺激剤であるＰＭＡにさらされたＲＢＬ細胞４６の含有物についての図２Ｃの電気泳動図は、かなりの実効ＰＫＣ活性の証拠を示す。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１４６と、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応する１４８とは、ほとんど等しい大きさである。
【００６０】
明らかなことに、強力な薬理学的活性体による細胞内キナーゼの活性化は、この取り組みによって測定することができる。さらにまた、図２Ｂおよび図２Ｃにおける両方の電気泳動図は、すぐに識別することのできないピークの存在を示す。これらのピークは、細胞内プロテアーゼによって一部が分解するかあるいは他の細胞内非キナーゼ酵素によって共有結合的に改変されたＦｌ−ｓＰＫＣの形態に対応すると信じられている。これらの分子状生成物がはっきりした別々のピークとして出現することは、それらが、別々の分子種を表しているとともに、限られた数の特定副反応の生成物である、ということを示唆している。Ｆｌ−ｓＰＫＣ分子は、これらの副反応によってすっかり消費されるものではないが、それは、図２Ｂおよび図２Ｃの両方において、副生成物が集束した蛍光の約５０％だけからなるからである。ピーク１５２として示された、図２Ｃにおいて一番ゆっくり泳動する特有の種は、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの変形版に相当するかもしれない。
（図３ＡからＣにおける測定の技術的態様）
図３Ａは、電気泳動図のグラフであって、緩衝液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子および生体外リン酸化基質分子の分離を示しており、この分離はこれら両種の電気泳動度の比較基準として観察される。図３Ｂは、電気泳動図のグラフであって、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されなかったラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞４６の含有物からの分離を示す。図３Ｃは、電気泳動図のグラフであって、ＰＫＣが細胞外ＡＴＰによる細胞の処理の結果として活性化されたＲＢＬ細胞４６の含有物からの分離を示す。
【００６１】
図３ＡからＣによって示された測定では、事象の順序は次のとおりである。まず、細胞チャンバー１９９が培養器から引き出され、その培地が、１０ｍＭの添加グルコースを含有している緩衝液Ａの手動ピペット分注による２つの置換物で置換され、チャンバー１９９の内部における細胞４６には、上記のように、緩衝液Ｂにおける１００μＭのＦｌ−ｓＰＫＣと５００μＭのロッド−２（米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）との混合物が微量注入された。細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣが１μＭで、ロッド−２が５μＭであったと概算される。チャンバー１９９は次いで、その培養器（３７℃、５％ＣＯ2）へ戻されて１５分間保持された。この回収期の後に、別の全てのマニピュレーションが室温（２０℃から２３℃）で行われた。細胞チャンバー１９９の内部の緩衝液は、１０ｍＭの添加グルコースを含有している緩衝液Ａの手動ピペット分注による５つの置換物で置換されて、細胞選択および分析のために顕微鏡試料台へ戻された。連続的に微量注入された細胞４６は、Ｆｌ−ｓＰＫＣにおけるフルオレセイン成分の光による破壊を最小限にするために、一組のＴＲＩＴＣフィルター（クロマ社製）での内部ローダミンの上蛍光の目視観察によって識別された。均一に蛍光を発する均質の細胞質と平滑な原形質膜との存在を基準に健康と判断された細胞４６だけが、分析のために選ばれた。先に説明したように、微量注入された細胞の大部分は、このような要件を満たすことなく、膜欠陥、断続状蛍光あるいは異常に明るい細胞核を示す。
【００６２】
図３ＣにおけるようにＰＫＣが活性化された場合には、緩衝液Ａの中における１０μｌの５００μＭアデノシン３リン酸（ＡＴＰ、米国、ミズーリ州、セントルイスのシグマ社製）が、関心の対象の細胞の上方に手で直接ピペット分注された。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞４６は、それらの上における膜貫通型プリン性受容体を示す。これらの受容体がＡＴＰを受け入れると、シグナル伝達カスケードに関連した細胞内Ｇタンパク質は、細胞内ＰＫＣ活性化を引き起こすことのできる活性化状態になる。最後に、細胞を選択し、図３Ｂにおけるように別の処理をしないかあるいは図３ＣにおけるようにＡＴＰで処理した後に、上記のように、溶解がＮｄ：ＹＡＧレーザー１８の手動起動によって引き起こされ、同時に電気泳動が始められた。
（図３ＡからＣにおける測定の結果）
図３Ｂは、上記のように微量注入され且つＡＴＰで処理されることなく受け入れられたＲＢＬ細胞４６の含有物の電気泳動図である。蛍光ピークの分布状態は、図２Ｂに見られるものと極めて似ている。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１５４は、Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク１５６よりも面積が６倍大きい。このことは、リン酸化されたものに比べてレポーター基質の６倍を超えるものが非リン酸化されたものであることを表している。図２ＢにおけるようにＰＫＣを活性化するために処理をしないときには、ＰＫＣの実効活性度は低い。
【００６３】
図３Ｃは、同じように微量注入されたがその後に２倍用量のＡＴＰにさらされたＲＢＬ細胞４６の含有物の電気泳動図である。これらの用量は、溶解に先立って最後の用量が約２分間添加されるのとは別に、３分間与えられた。図３Ｃは、ＰＫＣの生理的活性体であるＡＴＰでの細胞内処理の後に細胞４６の内部で生じたピーク１５８の下で積分されたＦｌ−ｓＰＫＣ１５８とピーク１６０の下で積分されたＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣとの比が、ほとんど１：１であることを示す。
（図１１ＡからＣにおける測定の技術的態様）
図１１Ａは、電気泳動図のグラフであって、緩衝液における混合物からの非リン酸化レポーター基質分子および生体外リン酸化基質分子の分離を示しており、この分離はこれらの種、すなわちＦｌ−ｓＰＫＣ、Ｆｌ−ｓＰＫＡおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣのそれぞれの電気泳動度の比較基準として観察される。この分析の時点では、生体外リン酸化Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣは泳動基準としての使用に利用できるものではなかった。図１１Ｂは、酵素ＰＫＣとタンパク質質キナーゼＡ（ＰＫＡ）が特異的に活性化されなかったＲＢＬ細胞４６における含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。図１１Cは、ＰＫＣが細胞外ＰＭＡによる細胞の処理の結果として活性化されたＲＢＬ細胞４６のグラフである。
【００６４】
図１１ＢからＣによって示された測定では、緩衝液Ｂの中で、次の混合物、すなわち１２０μＭのＦｌ−ｓＰＫＣ、約１００μＭのＦｌ−ｓＰＫＡおよび６５０μＭのカルシウムオレンジ（米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）が混合された。この混合物は、フェムトティップＩ型ガラス微量注入針１１６（ドイツ、ハンブルグのエッペンドルフ社製）、５１７１型マイクロマニピュレーターおよびトランスジェクター５２４６型システム（エッペンドルフ社製）によって、同じ細胞チャンバーの中におけるいくつかの細胞の中へ８０ｈＰａ（ヘクトパスカル）の圧力で０．２秒間、微量注入された。細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣが１．２μＭで、Ｆｌ−ｓＰＫＡが１μＭで、カルシウムオレンジが６．５μＭであった。この注入は、細胞の選択および分析のために使われたものと同じ顕微鏡１２、すなわちアクシオバート１３５（ツァイス）で行われた。連続的に微量注入された細胞４６は、Ｆｌ−ｓＰＫＣにおけるフルオレセイン成分の光による破壊を最小限にするために、一組のＴＲＩＴＣフィルター（米国、バーモント州、ブラットルボローのクロマ・テクノロジー・コーポレーション社製）（図示は省略するが、顕微鏡１２に含まれている）での内部カルシウムオレンジの上蛍光の目視観察によって識別された。均一に蛍光を発する均質の細胞質と平滑な原形質膜との存在を基準に健康と判断された細胞だけが、分析の対象に選ばれた。微量注入された細胞の大部分は、このような要件を満たすことなく、膜欠陥、断続状蛍光あるいは異常に明るい細胞核を示す。
【００６５】
図１１Ｃにおけるように、細胞がＰＭＡで刺激された場合には、注入に先立って、細胞チャンバー１９９の中における培地は、１０ｍＭグルコースを含有している緩衝液Ａの中で１μＭのＰＭＡによって置換された。この細胞チャンバーは培養器（３７℃、５％ＣＯ2）へ１０分間、戻された。
【００６６】
全ての場合において、その培養器から引き出された直後に、細胞チャンバー１９９が顕微鏡試料台３０の上に載せられ、また、細胞チャンバーの中における培地は、添加された１０ｍＭのグルコースが入った室温（２０℃から２３℃）緩衝液Ａの連続流および連続除去（２ｍｌ／分、およそ４細胞チャンバー容積／分）によって置換された。この流れは、微量注入および回収の間維持された。これは、典型的には５〜１５分間続いた。この流れは、溶解が行われるしばらくの間、停止され、溶解およびキャピラリー取り込みの１分後に再開され、電気泳動の間に継続された。
（図１１ＡからＣにおける測定の結果）
図１１Ｂは、酵素ＰＫＣおよびＰＫＳが特異的に活性化されなかったＲＢＬ細胞４６の含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。具体的には、図１１Ｂは、上記のように、細胞外ＰＭＡがないとき微量注入されたＲＢＬ細胞の含有物の電気泳動図である。図１１Ｂは、上記のように、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＦｌ−ｓＰＫＡへの泳動時間に対応する、かなり大きいピークを示す。レポーター基質ペプチドのリン酸化形態であるＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＡとして認識されるであろうピークは、この追跡では生じなかった。細胞４６の内部では、細胞内実効ＰＫＣ活性あるいは細胞内実効ＰＫＡは、微量注入の時間から生じなかった。
【００６７】
図１１Ｃは、酵素ＰＫＣがＰＭＡで特異的に活性化されたＲＢＬ細胞４６の含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。ＰＭＡは、ＰＫＡの特定活性体としてではなくＰＫＣの特定活性体として、よく特徴が調べられている。上記のように、この細胞は、ＰＭＡでの処理の後に微量注入された。図１１Ｃは、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＦｌ−ｓＰＫＡへの泳動時間に対応するかなり大きいピークと、泳動時間で集まった、Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＦｌ−ｓＰＫＡのリン酸化形態に合致する一群の小さいピークとを示す。図１１Ａにおける緩衝液の混合物から分離された全部で３つの化学種が、図１１Ｃにおける小哺乳動物細胞の含有物から分離されて示されている。Ｆｌ−ｓＰＫＡのリン酸化形態についての泳動基準がこの測定の時間では利用可能なものではなかったので、これらのピークのどれがＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＡに対応するかということは不確かである。上記からわかるように、ＰＭＡによる刺激がないときには、９１０秒近辺に集まった一群のピークに比較的大きいものは見られなかった。小さいが測定可能な程度のＰＫＣ活性化は、図１１Ｃにおいて分析された細胞の内部に生じた。
（図１２における測定の技術的態様）
図１２は、時間の関数としてのリン酸化度のグラフであり、１００ｎＭのＰＭＡと強力で特定の薬理活性体ＰＫＣとによるハツカネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞外処理に応じてＰＫＣによって行われたレポーター基質の細胞内リン酸化の経過を示す。それぞれの点は３つ以上の測定値の平均値を示しており、また、誤差帯は１つの標準偏差を示す。
【００６８】
図１２に示された測定では、３００μＭのＦｌ−ｓＰＫＣと９００μＭのカルシウムオレンジ（米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）とが、緩衝液Ｂの中に混合された。この混合物は、フェムトティップＩ型ガラス微量注入針１１６（ドイツ、ハンブルグのエッペンドルフ社製）、５１７１型マイクロマニピュレーターおよびトランスジェクター５２４６型システム（エッペンドルフ社製）によって、同じ細胞チャンバーの中におけるいくつかの細胞の中へ、室温（２０℃から２３℃）において、８０ｈＰａ（ヘクトパスカル）の圧力で０．２秒間、微量注入された。最終的な細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣが３μＭで、カルシウムオレンジが９μＭであった。この注入に続いて、細胞４６は、１０ｍＭグルコースを含有している緩衝液Ａの連続流（２ｍｌ／分）とともに顕微鏡試料台３０の上に室温で１０〜１５分間戻された。
【００６９】
ＰＭＡが刺激を受けたときには、ＰＭＡは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の中における保存溶液から、使用の直前に１０ｍＭグルコースが添加される緩衝液Ａの中へ溶解された。この保存溶液（およそ５００μｌ）は、手持ち型ピペットマン（Ｐｉｐｅｔｍａｎ（登録商標））（米国、マサチューセッツ州、ウォーバーンのレイニン社製）による手動操作で、細胞チャンバー１９９の内部の溶液と交換された。この操作は、交換用緩衝液の流れが一時停止された後に細胞チャンバー１９９を顕微鏡試料台３０の上に載せて行われた。緩衝液の流れは、ＰＭＡ含有溶液による培養の時間を通じて停止された。ＰＭＡによる刺激の時間中、カルシウムオレンジの上蛍光の観察によって、健常細胞が選択された。適切な時点、すなわち２．５分後かあるいは５分後かのどちらかで、その細胞が、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー１８の遠隔始動によって溶解させられ、次いで、電気泳動の同時開始によってキャピラリー２２の入口２６の中へ取り込まれた。
【００７０】
Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応するピーク面積が、ソフトウェア分析パッケージであるオリジン５．０（米国、マサチューセッツ州、ノースハンプトンのマイクロカル・ソフトウェア・インコーポレーテッド（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，）社製）を使って測定された。
（図１２における測定の結果）
図１２は、時間の関数としてのリン酸化度のグラフであって、ＰＫＣの強力な特定活性体であるＰＭＡでのハツカネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞の細胞外処理に応じたＰＫＣによるレポーター基質の細胞内リン酸化の時間的経過を示す。図１２は、室温（２０℃から２３℃）で１００ｎＭのＰＭＡにさらすことによる活性化に応じてＮＩＨ／３Ｔ３細胞における細胞内レポーター基質リン酸化の時間的経過を測定するために行われたいくつかの測定の定量的結果を示す。５分の時点での近似的一致から５０％のリン酸化水準まで、これらの条件下においてＮＩＨ／３Ｔ３細胞の内部で生じさせるために、６±２ｎＭ／秒のＦｌ−ｓＰＫＣリン酸化速度が概算される。この速度では、レポーター基質ペプチドのわずか０．００７％が、レーザー誘起細胞溶解と電気泳動分離の開始との間のコンサバティブに概算された３３ミリ秒の時間間隔でリン酸化された。このようにして、細胞の含有物が得られ且つ分離される速度によって、細胞内化学反応の並外れて正確なスナップショットを得ることができる。図１２はさらに、これらの測定を、ＲＢＬ細胞からと同様に、第２の哺乳細胞種、すなわちＮＩＨ／３Ｔ３細胞から行うことができる、ということも示す。
（第２実施形態に特有の条件および結果）
（概要）
図４Ａから図８Ｂによって示された第２実施形態では、アフリカツメガエルの卵母細胞４６’が対象の細胞として用いられた。図４Ａから図６Ｂによって示されたＰＫＣ活性化の測定では、Ｆｌ−ｓＰＫＣが卵母細胞４６’の中へ微量注入された。次いで、卵母細胞４６’からの細胞質（およそ２２ｐｌ）が、キャピラリー２２の中へ取り込まれて、電気泳動に供された。Ｆｌ−ｓＰＫＣおよびＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣが、分離されてそれらの蛍光から定量された。Ｆｌ−ｓＰＫＣに対するＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの比は、ＰＫＣの相対活性度、すなわちＰＫＣとホスファターゼとの間の細胞内バランスを評価するものである。ホスファターゼは、キナーゼによって引き起こされた反応の逆行―すなわち基質分子からのホスファターゼの分離を引き起こす。
【００７１】
図７は、時間の関数としてのリン酸化度のグラフであって、およそ１μＭのＦｌ−ｓＰＫＣ、およそ３３０ｎＭのＦｌ−ｓＰＫＡおよびおよそ１０ｎＭのＦｌ−ｓｃｄｃ２Ｋを含有させるために先に微量注入されたアフリカツメガエルの卵母細胞４６’の含有物からなる試料から相異なる３つの特定キナーゼレポーター基質を分離することを示す。タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性度に関する特定のレポーターであるＦｌ−ｓＰＫＡは、Ｆｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇの配列を有しており、また、ＣＲＥＢタンパク質に由来するものであった。ｃｄｃ２キナーゼ（細胞分割周期変異体２（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ２）に関する特定のレポーターであるＦｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、Ｆｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓの配列を有しており、また、いくつかのタンパク質に由来するコンセンサスリン酸化部位からなっている。下線の付けられたセリン残基はリン酸化部位である。これらのペプチドは、Ｆｌ−ｓＰＫＣについて説明されたようなフルオレセインで合成され且つ標識化されたが、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、カルボキシフルオレセインコハク酸イミド状エステル（１００〜２００ｍｇ／ｍｌ、米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）の混合５−６−異性体によって標識化され、かくして、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、２つの異性体状形態から構成されていた。ピーク１６２とピーク１７２とが、卵母細胞４６’の中へ１つずつ注入されたときに見られたように、それらの泳動時間によって識別された（図示略）。第１の二重線であるピーク１６２および１６４は、リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋかあるいは非リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋかのいずれかの２つの異性体に対応している。第２の二重線であるピーク１６６および１６８は、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの他の形態の異性体に対応している。１つのピーク１７０は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣを表し、１つのピーク１７２は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡを表している。
【００７２】
図７に示されたように、相異なるキナーゼ刺激剤の複数のペプチドあるいはペプチドの混合物が卵母細胞４６’の中へ取り込まれたときに、これらの相異なるペプチドは検出することができた。このことは、単一の卵母細胞４６’から、単一の経路の内部あるいは相異なる複数の経路の中の多数のキナーゼの活性化を同時に定量して、この技法を細胞シグナル伝達カスケードを研究するための強力な手段にすることができる、ということを意味している。
（使用された細胞）
卵母細胞４６’が、色素性アフリカツメガエルあるいは色素欠乏性アフリカツメガエルから得られ、先に説明したように培養された。卵母細胞４６’には、低倍率解剖顕微鏡（図示略）に取り付けられた注入器によって、緩衝液Ｂの中において５０ｎｌのレポーター基質ペプチド（０．５〜２００μＭ）が微量注入され、３０分間培養されて、卵母細胞４６’にペプチドの拡散が行われた。測定のために、卵母細胞４６’は緩衝液Ｃ（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＨｅｐｅｓからなり、ｐＨが７．６のもの）の中に置かれた。ＬＰＡ（米国、アラバマ州、アラバスターのアバンチ・ポーラー・リピッズ社製の１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）が卵母細胞４６’に添加されたときには、脂肪酸遊離型ウシ血清アルブミン（５％）が、先に説明したような担体として用いられた。
（分離条件）
卵母細胞４６’からの試料は全て、圧電式試料採取／高速変換／キャピラリー電気泳動法（ＰＥＲＴ  ＣＥ）と称される方法によって取得されるとともに電気泳動に供された。このＰＥＲＴ  ＣＥのために使われた装置は図８Ａおよび図８Ｂに示されている。図８Ａおよび図８Ｂは、一個のアフリカツメガエル卵母細胞４６’から細胞内酵素活性度の測位を行うために使われた装置の構成要素の概略図である。図８Ａは、卵母細胞４６’と電気泳動用緩衝液とのための注文設計型ホルダー１３０を示す。このホルダーは、卵母細胞の細胞質を自動的に試料採取してこの試料を基質分子の中での実質的な変化が起きる前に迅速に電気泳動に供するための完成装置の部品である。これは、高速変換システムに取り付けられた鋭利な電気泳動用キャピラリー２２を用意し、そのキャピラリーを同細胞の中へ突き刺して細胞質の「小片」を捕捉することによって達成される。その後、このキャピラリーは、その卵母細胞から自動的に引き出された後、余分な化学反応が起きる前にその「小片」の内部における基質分子の電気泳動が開始されるように、電気泳動用緩衝液の槽１３４との電気的接続のために高速で移動される。好ましい装置では、圧電性素子が、そのキャピラリーを上下に（垂直軸方向に）移動させてその細胞を試料採取し、リニアモーターがそのキャピラリーを水平方向に移動させてその卵母細胞から槽１３２への移行を行う。
【００７３】
図８Ａにおいて、矢印は、圧電性素子ＰおよびリニアモーターＬＭによるキャピラリー２２の移動軸を示す。卵母細胞４６’が入れられた槽１３２には生体適合性緩衝液Ｃ（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＨｅｐｅｓからなり、ｐＨが７．６のもの）が含まれており、第２槽１３４には電気泳動用緩衝液が含まれている。図８Ｂは、図９に類似した顕微鏡、キャピラリーおよび蛍光検出器の概略が示されている。図８Ａのホルダー１３０は縦型顕微鏡１７６の試料台１７４の上にあるいは解剖顕微鏡の下方に置かれた。簡略化のために、圧電性素子およびリニアモーターは示していない。卵母細胞４６’は槽１３２の「Ｖ」字形窪みの中に置かれているが、この窪みは、テフロン（登録商標）あるいはポリカーボネートからなるブロック１８０に穴あけされてできたものである。この槽１３２は生体適合性緩衝液である緩衝液Ｃで満たされた。分離用キャピラリー２２（内径が５０μｍ、外径が３６０μｍ）の先端１８２はフッ化水素酸による処理でおよそ７０μｍの外径にエッチングされた。キャピラリーの先端１８２は、図８Ａにおける方向Ｐによって示された先端１８２が制御された垂直移動をすることができるように、圧電性モーター素子（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジのピエゾ・システムズ（Ｐｉｅｚｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製、図示略）の縁部に載せられた。この圧電性装置とキャピラリー２２とを保持したマイクロマニピュレーター（図示略）が、図８Ａにおける方向ＬＭによって示された制御された水平移動をすることができるように、リニアモーター（図示略）の上に載せられた。マイクロマニピュレーターを使って、キャピラリー２２のエッチングされた先端が前記卵母細胞の原形質膜の上方および近傍に位置づけられた。
【００７４】
細胞質を得るために、キャピラリー２２は、前記圧電性素子によって卵母細胞４６’の中へ６０μｍだけ差し込まれた。これによって、キャピラリー２２の先端１８２が、試料採取された細胞質の「小片」で塞がれた。次に、キャピラリー２２はその細胞質から自動的に引き出された。卵母細胞４６’からキャピラリー２２が引き出された直後に、キャピラリー２２は、前記リニアモーターによって水平に（６ｃｍ／秒の速度で１．２ｃｍ）動かされ、前記圧電性素子によって電気泳動用緩衝液が含まれた第２槽１３４の中へ素早く下げられた。すぐに電気泳動が開始された。この全体シーケンスは、コンピューター制御されて、３５０ミリ秒で達成された。このリニアモーター（米国、カリフォルニア州、トランスのオリエンタル・モーター・カンパニー（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｍｏｔｏｒ  Ｃｏ．，）社製）は、ソリッドステート状リレーボードとアナログ式出力ボード（米国、オハイオ州、クレーブランドのキースリー（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ）社製）（図示略）によって制御された。
【００７５】
卵母細胞の細胞質からの電気泳動分離は、相異なる２組の条件の下に行われた。図４ＡからＤに示された測定では、独占権の下にある中性コーティング剤（米国、ペンシルベニア州、ベルフォンテのスーペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）社製）でコーティングされた複数のキャピラリーが使われた。図５および図６ＡからＢに示された測定では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でコーティングされた複数のキャピラリーが使用され且つ次のように用意された。石英ガラスからなる複数のキャピラリー２２（米国、アリゾナ州、フェニックスのポリマイクロ・テクノロジーズ社製）が、１ＭのＮａＯＨあるいはＫＯＨで３０分間連続して洗浄され、その後、水で１５分間洗浄された。これらのキャピラリー２２は次に、ＰＥＩ（５％）をそれぞれのキャピラリー２２に６０分間、連続して流すことによるか、あるいは、それぞれのキャピラリー２２にＰＥＩ（５％）を取り込んだ後にＰＥＩ取り込みずみキャピラリーを６０分間培養することによるかのいずれかでコーティングされた。ＰＥＩの溶液は窒素でキャピラリーから除去された。それぞれのキャピラリーは、水で１５分間洗浄され、次いで、電気泳動用緩衝液で１５分間洗浄された。
【００７６】
図４Ａから図７に示された電気泳動分離は全て、ミセル界面動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）を用いるいくつかの例として、もっともよく理解される。この術語は、再現可能で能率のよい分離の促進のために洗浄性ミセルが用いられる電気泳動用緩衝液を使用することを意味している。これらの分離におけるミセルの使用によって、その必要性が立証されたが、これは、アフリカツメガエルの卵母細胞の細胞質に比較的多量の両親媒性分子が、特に強く負に帯電したタンパク質であるホスビチンの形態で含まれているからである。電気泳動は長さが５０〜１００ｃｍであるキャピラリー２２（外径が３６０μｍ、内径が５０μｍ）の中で行われた。この電気泳動の電圧は１０〜１５ｋＶ（電流は３０〜６０ピコアンペア（ｐＡ））であった。この電気泳動は、緩衝液Ｄ（４５ｍＭのＮａＣｌ、１．６ｍＭのＫＣｌ、０．６ｍＭのＭｇＣｌ2、１％のトリトン−エックス１００、５ｍＭのＨｅｐｅｓからなり、ｐＨが７．４のもの）あるいは緩衝液Ｅ（緩衝液Ｄに６４５ｍｇ／ｍｌのコール酸が添加されたもの）の中で行われた。電気泳動が行われている間、キャピラリーは電気泳動用緩衝液で２５分間洗浄された。キャピラリー２２を通じて泳動する検体帯の蛍光が、先に説明したように、キャピラリー２２の出口端から１５〜２５ｃｍの箇所で測定された。ペプチド標準物質が重力流体流によってキャピラリー２２の中へ取り込まれ、その取り込まれた容積がポアズイユの式から算出された。
（検出）
検出の目的のために、キャピラリー２２の入口側先端１８２〜５０ｃｍの箇所で、その外面から長さ５ｍｍにわたってポリイミドコーティングが除去されて、窓３８が作られた。このコーティングは使い捨てブタンガスライターによる簡単な加熱で除去され、次いで、７０％エタノール溶液で洗浄された。キャピラリー２２の内腔には、アルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍで作動する）（米国、カリフォルニア州、サンホセのユニフェイズ社製）の合焦ビームによって、目視窓３８〜応答指令信号が送られた。蛍光が、キャピラリー２２とそのレーザービームに対して９０度の位置で集束レンズ（図示略）によって集束され、その光が、５３５ＤＦ５６型分光フィルター（米国、バーモント州、ブラットルボローのオメガ・オプティカル社製）（図示略）の備わったＲ９２８型光電子増倍管（ＰＭＴ）（米国、ニュージャージー州、ブジッジウォーターのハママツ社製）（図示略）によって測定された。この光電子増倍管の電流は、１２１２型前置増幅器（図示は省略するが、検出器４２に含まれている）で増幅されてある電圧まで変換された。この信号は、パーソナルコンピューター４４（米国、サウスダコタ州、スーシティのゲイトウェイ社製）のデータ収集ボード（米国、マサチューセッツ州、ターントンのキースリー・メトラバイト社製のＤＡＳ−１８０２ＳＴ−ＤＡ型あるいはＤＡＳ−１８０２ＨＲ−ＤＡ型）によってディジタル化された。このデータはプロットされ、ピーク面積が、オリジン（米国、マサチューセッツ州、ノースハンプトンのマイクロカル社によるもの）を使って算出された。この構成の検出限界は、およそ１０-19モルで約６０，０００分子であったが、これは、生理的関連測定に必要な検出限界のかなり下である（表１を参照のこと）。
（図４ＡからＤにおける測定の技術的態様）
図４Ａは、緩衝液におけるレポーター基質の非リン酸化形態のピーク１８４での泳動度を示す電気泳動図のグラフである。図４Ｂは、緩衝液におけるレポーター基質のリン酸化形態のピーク１８６での泳動度を示す電気泳動図のグラフである。図４Ａおよび図４Ｂでは、重力流体流によってキャピラリー２２の中にレポーター基質標準物質が取り込まれ、取り込まれた容積がポアズイユの式から算出された。図４Ｃおよび図４Ｄに示された測定では、個々の卵母細胞４６’には、説明にあるように５０ｎｌの２００μＭＦｌ−ｓＰＫＣが微量注入され、次いで、レポーター基質の拡散ができるように、緩衝液Ｃの中で３０分間培養された。レポーター基質の概算された最終細胞内濃度は、およそ１μＭであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥ試料採取法とその後のＭＥＫＣ法とによって、独占権の下にある中性コーティング剤（米国、ペンシルベニア州、ベルフォンテのスーペルコ社製）でコーティングされたキャピラリーに緩衝液Ｅを通すことで達成された。これらの測定では、卵母細胞４６’が含まれた槽１３２が緩衝液Ｃで満たされ、キャピラリー２２、電気泳動の入口として働く第２槽１３４および出口側槽３４が緩衝液Ｅで満たされた。
（図４ＡからＤにおける測定の結果）
図４Ｃは、レポーター基質をおよそ１０μＭ含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。この場合において、その卵母細胞４６’は細胞内ＰＫＣを活性化するための処理を受けなかった。図４Ｃは、細胞外刺激剤で処理されなかった卵母細胞４６’からの細胞質の試料に関する電気泳動図である。ピーク１８８での集束蛍光は、緩衝液から取り込まれたＦｌ−ｓＰＫＣの電気泳動図である図４Ａのピーク１８４を参照することでわかるように、非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣに実質的に全て対応している。
【００７７】
図４Ｄは、レポーター基質をおよそ１０μＭ含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。この場合において、その卵母細胞４６’は、細胞内ＰＫＣを特に活性化するために、試料採取に先立って、１０μＭのＰＭＡで１０分間の細胞外処理を受けた。図４Ｄは、１０μＭのＰＭＡに１０分間さらされた卵母細胞４６’からの試料の電気泳動図である。この場合において、ピーク１９０での集束蛍光は、緩衝液から取り込まれたＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣの電気泳動図である図４Ｂのピーク１８６を参照することでわかるように、Ｐ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに実質的に全て対応している。
【００７８】
これらの結果によれば、強力な薬理学的刺激剤であるＰＭＡに応じたＰＫＣの実効活性度を単一のアフリカツメガエル卵母細胞から測定することができる、ということが示されている。さらに、刺激剤がないときには、卵母細胞におけるＰＫＣの実効活性度が比較的低いということが示されている。
（図５および図６Ａ，６Ｂにおける測定の技術的態様）
図５は、レポーター基質をおよそ１０μＭ含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞４６’の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。この場合において、その卵母細胞４６’は、細胞内ＰＫＣを特に活性化するために、試料採取に先立って、１０μＭのＰＭＡで３分間の処理を受けた。レポーター基質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方が存在しているが、これらによると、３分後の基質転換が不完全であったことが示されている。
【００７９】
図６Ａは、強力な薬理学的特定活性体であるＰＫＣによる、１０μＭのＰＭＡでのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応じたレポーター基質のＰＫＣ細胞内リン酸化の時間的経過を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。それぞれの点は３つ以上の測定値の平均値を示しており、また、誤差帯は１つの標準偏差を示す。
【００８０】
図６Ｂは、生理学的活性体であるＰＫＣによる、１０μＭのＬＰＡ（米国、アラバマ州、アラバスターのアバンチ・ポーラー・リピッズ社製の１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）でのアフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応じたレポーター基質のＰＫＣ細胞内リン酸化の時間的経過を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。それぞれの点は３つ以上の測定値の平均値を示しており、また、誤差帯は１つの標準偏差を示す。
【００８１】
図５〜図７に示された測定では、個々の卵母細胞４６’には、説明されたように５０ｎｌの２００μＭＦｌ−ｓＰＫＣが微量注入され、次いで、レポーター基質の拡散ができるように、緩衝液Ｃの中で３０分間培養された。レポーター基質の概算された最終細胞内濃度はおよそ１０μＭであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥ試料採取法とその後のＭＥＫＣ法とによって、ＰＥＩでコーティングされたキャピラリーに緩衝液Ｄを通すことで達成された。これらの測定では、卵母細胞４６’が含まれた槽が緩衝液Ｃで満たされ、キャピラリー２２、電気泳動の入口として働く第２槽１３４および出口側槽３４が緩衝液Ｄで満たされた。
（図５および図６Ａ，６Ｂにおける測定の結果）
図５は、１０μＭのＰＭＡに３分間さらされた卵母細胞４６’からの細胞質の試料の電気泳動図である。２つの蛍光ピーク、すなわち、Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応しているピーク１９２とＰ−Ｆｌ−ｓＰＫＣに対応しているピーク１９４とが生じている。このことによって、中程度のレポーター基質リン酸化は刺激を受けた卵母細胞から測定することができる、ということが示されている。
【００８２】
図６Ａは、強力な薬理学的特定活性体であるＰＫＣによる、アフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応じたレポーター基質のＰＫＣ細胞内リン酸化の時間的経過を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。図６Ａは、１０μＭのＰＭＡにさらすことによる活性化に応じて卵母細胞４６’における細胞内レポーター基質リン酸化の時間的経過を測定するために行われたいくつかの測定の定量的結果を示す。
【００８３】
図６Ｂは、生理学的活性体であるＰＫＣによる、アフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応じたレポーター基質のＰＫＣ細胞内リン酸化の時間的経過を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。図６Ｂは、１０μＭのＬＰＡにさらすことによる活性化に応じて卵母細胞４６’における細胞内レポーター基質リン酸化の時間的経過を測定するために行われたいくつかの測定の定量的結果を示す。中間の時点から、Ｆｌ−ｓＰＫＣは、ＰＭＡおよびＬＰＡにそれぞれさらされた後に、図６Ａにおいては点１９６で示されたように２５±１５ｎＭ／秒の平均速度で、図６Ｂにおいては点１９８で示されたように４３±１５ｎＭ／秒の平均速度で、卵母細胞４６’の内部においてリン酸化された。これらの速度では、ペプチドのおよそ０．１％だけが、細胞質の試料採取の開始と電気泳動の開始との間における３５０ミリ秒の時間間隔で、リン酸化された。
（図７における測定の技術的態様）
図７は、前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料からの、相異なる３つの特定キナーゼレポーター基質の分離を示す電気泳動図である。図７に示された測定では、個々の卵母細胞４６’に５０ｎｌのレポーター基質ペプチドの混合物が微量注入された。この混合物は、緩衝液Ｂにおいて、２０μＭのＦｌ−ｓＰＫＣ、７μＭのＦｌ−ｓＰＫＡおよび５００μＭのＦｌ−ｓｃｄｃ２Ｋからなるものであった。タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性度に関する特定のレポーターであるＦｌ−ｓＰＫＡは、Ｆｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇの配列を有しており、また、ＣＲＥＢタンパク質に由来するものであった。ｃｄｃ２キナーゼ（細胞分割周期変異体２（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ２）に関する特定のレポーターであるＦｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、Ｆｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓの配列を有しており、また、いくつかのタンパク質に由来するコンセンサスリン酸化部位からなっている。下線の付けられたセリン残基はリン酸化部位である。これらのペプチドは、Ｆｌ−ｓＰＫＣについて説明されたようなフルオレセインで合成され且つ標識化されたが、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、カルボキシフルオレセインコハク酸イミド状エステル（１００〜２００ｍｇ／ｍｌ、米国、オレゴン州、ユージーンのモレキュラー・プローブス社製）の混合５−６−異性体によって標識化され、かくして、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋは、２つの異性体状形態から構成されていた。それぞれの卵母細胞４６’は、レポーター基質の拡散ができるように、緩衝液Ｃで３０分間、培養された。レポーター基質の概算された最終細胞内濃度は、Ｆｌ−ｓＰＫＣがおよそ１μＭ、Ｆｌ−ｓＰＫＡがおよそ３３０ｎＭ、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋがおよそ１０ｎＭであった。分離は、ＰＥＲＴ  ＣＥ試料採取法とその後のＭＥＫＣ法とによって、ＰＥＩで内側コーティングされたキャピラリーに緩衝液Ｄを通すことで達成された。これらの測定では、卵母細胞４６’が含まれた槽が緩衝液Ｃで満たされ、キャピラリー２２、電気泳動の入口として働く第２槽１３４および出口側槽３４が緩衝液Ｄで満たされた。
（図７における測定の結果）
図７は、アフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料からの、相異なる３つの特定キナーゼレポーター基質の分離を示す。これらのピークは、卵母細胞４６’の中へ個々に注入されたときに観察されたように（図示略）、それらの泳動時間によって識別された。第１の二重線であるピーク１６２およびピーク１６４は、非リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの２つの異性体形態に対応している。第２の二重線であるピーク１６６およびピーク１６８は、リン酸化Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの２つの異性体形態に対応している。ピーク１７０は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＣであり、ピーク１７２は非リン酸化Ｆｌ−ｓＰＫＡである。この測定によれば、多数のキナーゼの実効活性度を単一の卵母細胞４６’から測定することができる、ということが示されている。さらに、この場合には、Ｆｌ−ｓｃｄｃ２ＫおよびＰ−Ｆｌ−ｓｃｄｃ２Ｋの異性体形態の観察可能な分離によって立証されたように、申し分のない分離度がＭＥＫＣによって達成された。最後に、この測定によれば、刺激を受けなかった卵母細胞４６’には実質的な程度のｃｄｃ２Ｋ活性度が存在し、ＰＫＣおよびＰＫＡは比較的不活性な状態に残る、ということが示されている。
【００８４】
本発明は、癌の検出と癌抑止薬の試験とに用いるために、図１３Ａから１３Ｃに概略的に示されたように、さらなる例示を含む。図１３Ａおよび図１３Ｂに示された、癌の検出のために用いられた第１実施形態では、ＣＭＬを診断するためにＬＭＳ検定をどのように用いることができるかということについての一例である手順が示されている。ＣＭＬ細胞では、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのためのペプチド基質が、図１３Ｂに示されたようにリン酸化されるであろう。正常細胞には、図１３Ａに示されたように、実質的にほとんどリン酸化されなかった基質があると考えられる。
【００８５】
抗癌剤を試験するために用いられた本発明の第２実施形態が図１３Ｃの手順によって示されているが、この実施形態では、薬剤の分子標的を検出するためのＬＭＳ検定の特性が強調されている。ＣＭＬ細胞にはｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼのための基質が取り込まれる。これらの細胞は次いで、ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質の抑制因子のように検査するために混合物にさらされる。これらの細胞はその後、ＬＭＳ検定で分析される。ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼの抑制因子は、電気泳動図が図１３Ｃに示されたように非リン酸化基質を顕著に表示するように、基質のリン酸化を抑制するであろう。
【００８６】
図１３Ａから１３Ｃの例示は本発明の範囲内に含まれるように最終的に引き合いに出されるであろう数千の例の１つにすぎないということは、当然理解されよう。癌に至るシグナル伝達ネットワークの詳細に関係なく、また、薬剤がそのシグナル伝達ネットワークをどのように妨害しあるいは抑制するかに関係なく、本発明は、癌検出および抗癌剤試験に役立てるために、関心の対象のシグナル伝達ネットワークにおける特定の性質によって決定付けられるような変形例とともに、用いることができる。かくして、本発明は、ＣＭＬにも図１３Ａから１３Ｃの簡単な手順にも限定されるものではなく、これまでに知られたあるいはその後に考案された手順および基質キナーゼ群衆の全てを含むものである。
【００８７】
当業者によれば、多くの改変例および変形例を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく作り出すことができる。したがって、例示されたいくつかの実施形態は例示の目的でだけ説明されたものであることと、これらの実施形態は特許請求の範囲によって定義されたように本発明を限定するものとみなすべきではないこととを、理解しなければならない。
【００８８】
本発明とその様々な実施形態とを説明するためにこの明細書で使われたいくつかの用語は、普通に定義された意義の範囲内における意味にだけ理解すべきではなく、普通に定義された意義の範囲外にある、この明細書で特別に定義された構造、物質あるいは行為も含むものと理解すべきである。したがって、ある要素をこの明細書の文脈の中で１つ以上の意味を含むものとして理解することができるときには、ある請求項におけるその使用は、この明細書によって且つその用語自体によって支持された可能な全ての意味に当てはまるように理解しなければならない。
【００８９】
したがって、特許請求の範囲における用語あるいは要素の定義は、文言で説明された要素の組み合わせだけではなく、実質的に同じ結果を得るために実質的に同じ方法で実質的に同じ機能を達成する均等な構造、物質あるいは行為を全て含むために、この明細書で規定されている。それゆえ、この意味では、いくつかの請求項における諸要素のいずれか１つに対して２つ以上の要素で置換することができるということが、あるいは、ある請求項における２つ以上の要素に対して単一の要素で置換することができるということが、意図されている。
【００９０】
これまでに知られあるいはその後に考案された、当業者によって考察されたような、特許請求の範囲における主題からの非現実的な変化は、請求項の範囲の中に均等に含まれている、ということがはっきりと意図されている。したがって、当業者にこれまでに知られあるいはその後に知られた明らかな置換が、定義された諸要素の中に含まれるように規定されている。
【００９１】
これらの請求項は、これまでに特別に例示され且つ説明されたもの、明確に置換されたもの、および本発明の基本的概念を本質的に組み込んでいるものも含んでいる、ということを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１ＡからＨは、本発明による細胞内キナーゼの測定を示す諸段階における模式図である。図１Ａには、示された分子種を識別するために説明が含まれている。  図１Ａは、測定に先立つ可能状況における細胞の概略図であって、この細胞には不活性キナーゼ分子が含まれている。  図１Ｂは、レポーター基質分子の導入後における図１Ａの細胞の概略図である。  図１Ｃは、細胞内キナーゼの活性化をもたらす刺激剤で細胞外処理を行う際における図１Ｂの細胞の概略図である。  図１Ｄは、活性キナーゼ分子によって引き起こされたレポーター基質のリン酸化の模式的表現図である。  図１Ｅは、キナーゼ分子がある程度リン酸化された後における図１Ｃの細胞の概略図である。  図１Ｆは、図１Ｇにおける分析のための含有物を得るためにその原形質膜が破壊された後における図１Ｅの細胞を示す図である。  図１Ｇは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）による非リン酸化基質分子とリン酸化基質分子との分離を表している。  図１Ｈは、非リン酸化レポーター基質分子の分子群がリン酸化レポーター基質分子の分子群から分離された典型的な電気泳動図を示す。
【図２】図２ＡからＣは、全てが同日に同一の電気泳動条件の下で行われたレポーター基質分子の分離を示す３つの積み重ね状電気泳動図のグラフである。  図２Ａは、緩衝液の混合物から非リン酸化レポーター基質分子と生体外リン酸化レポーター基質分子とを分離することを示しており、両方の種の電気泳動度を参照して観察される電気泳動図のグラフである。  図２Ｂは、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞、すなわち、微量注入され且つタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されなかった（図３Ｂが類似した処理を示す）腫瘍細胞における含有物の電気泳動図のグラフである。  図２Ｃは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が特異的に活性化されたＲＢＬ細胞の含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図３】図３ＡからＣは、全てが同日に同一の電気泳動条件の下で行われたレポーター基質分子の分離を示す３つの積み重ね状電気泳動図のグラフである。  図３Ａは、緩衝液の混合物から非リン酸化レポーター基質分子と生体外リン酸化レポーター基質分子とを分離することを示しており、両方の種の電気泳動度についての比較基準を確立する電気泳動図のグラフである。  図３Ｂは、ＰＫＣが特異的に活性化されなかったラット好塩基球性白血病細胞における含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。  図３Ｃは、ＰＫＣが特異的に活性化されたＲＢＬ細胞の含有物からの分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図４】図４ＡからＤは、全てが同日に同一の電気泳動条件の下で行われたレポーター基質分子の分離を示す４つの積み重ね状電気泳動図のグラフである（電気泳動条件は、図２ＡからＣで用いられた条件および図３Ａから図３Ｃで用いられた条件とは異なる）。  図４Ａは、緩衝液におけるレポーター基質の非リン酸化形態の泳動度を示す電気泳動図のグラフである。  図４Ｂは、緩衝液におけるレポーター基質のリン酸化形態の泳動度を示す電気泳動図のグラフである。  図４Ｃは、レポーター基質を含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。  図４Ｄは、特異的に活性化されたレポーター基質を含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図のグラフである。
【図５】図５は、レポーター基質を含有させるために前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料の分離を示す電気泳動図である。この卵母細胞は中程度の活性化を示すように処理された。
【図６Ａ】図６Ａは、強力な薬理学的特定活性体による細胞外処理に応じたレポーター基質の細胞内リン酸化を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、生理学的活性体によるアフリカツメガエル卵母細胞の細胞外処理に応じたレポーター基質の細胞内リン酸化の時間的経過を示す、時間の関数としてのリン酸化のグラフである。
【図７】図７は、前もって微量注入されたアフリカツメガエル卵母細胞の含有物からなる試料からの、相異なる３つの特定キナーゼレポーター基質の分離を示す電気泳動図である。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、細胞内酵素活性度の測定を行うために使われる装置における諸構成要素の概略図である。  図８Ａは、卵母細胞（あるいは同様な細胞）を試料採取して、その試料を迅速に電気泳動に供するための装置の概略図である。  図８Ｂは、図８Ａの装置を用いている、顕微鏡、キャピラリーおよび蛍光検出設備の概略図である。
【図９】図９は、図示された実施形態に使われた急速溶解装置の概略図である。
【図１０】図１０は、図示された実施形態における急速溶解装置とともに使われた、哺乳動物細胞および電気泳動緩衝液を保持するための細胞チャンバーの概略図である。
【図１１】図１１ＡからＣは、全てが同日に同一の電気泳動条件の下で行われたレポーター基質分子の分離を示す３つの積み重ね状電気泳動図のグラフである。  図１１Ａは、レポーター分子における全ての種の電気泳動度についての参考用に、緩衝液の混合物から非リン酸化レポーター基質分子と生体外リン酸化レポーター基質分子とを分離することを示す電気泳動図のグラフである。  図１１Ｂは、ＰＫＣが特異的に活性化されなかったＲＢＬ細胞における含有物の電気泳動図のグラフである。  図１１Ｃは、ＰＫＣが活性化されたＲＢＬ細胞における含有物の電気泳動図のグラフである。
【図１２】図１２は、ＰＫＣの強力な薬理学的特定活性体による細胞外処理に応じた、個々のハツカネズミ線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３におけるレポーター基質の細胞内リン酸化を示す、時間の関数としてのリン酸化百分率のグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、関心の対象の低リン酸化を示す電気泳動図を得るために正常細胞に作用し、次いで本発明によって迅速に溶解されるａｂｌ基質を概略的に示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、関心の対象の高リン酸化を示す電気泳動図を得て、それによって、癌の検出を実現するために、ガン細胞あるいはＣＭＬ細胞に作用し、次いで本発明によって迅速に溶解されるａｂｌ基質を概略的に示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、非リン酸化基質を示す電気泳動図を得るために、関心の対象である腫瘍形成キナーゼの薬剤抑制因子で処理されたガン細胞あるいはＣＭＬ細胞に作用し、次いで本発明によって迅速に溶解されるａｂｌ基質を概略的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004536586.tif 000103
【国際調査報告】
2004536586.tif 000104
2004536586.tif 000105
2004536586.tif 000106