(57)【要約】本発明は、ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質共役レセプター８（ＬＧＲ８）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＬＧＲ８を生成するための選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法を提供する。本発明はさらに、ＬＧＲ８ポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態を診断、処置、改善、および／または予防するための薬学的組成物および方法を提供する。ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明により提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のいずれかに示すヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドに少なくとも約７０％同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のいずれかに示すヌクレオチド配列または（ａ）の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２２のいずれかに示すヌクレオチド配列、（ａ）、または（ｂ）の領域であって、該ポリペプチドフラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２２のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＬＧＲ８ポリペプチドを生成するプロセスであって、請求項５に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で培養する工程、および必要に応じて、該ポリペプチドを該培養物から単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって生成される、ポリペプチド。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＬＧＲ８ポリペプチドのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物が、ＬＧＲ８ポリペプチド活性またはＬＧＲ８ポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５〜７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞中でのＬＧＲ８ポリペプチド活性またはＬＧＲ８ポリペプチド生成を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、または配列番号２１のいずれかに示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、フラグメント；
（ｅ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列であって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示すポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記パーセント同一性が、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２３のいずれかに示すアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドについての特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識に結合している、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＬＧＲ８ポリペプチドの生物学的活性と拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＬＧＲ８ポリペプチドに関連する疾患、状態または障害を処置、予防または改善するための方法であって、請求項１８に記載の有効量の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
請求項１８に記載の抗ＬＧＲ８抗体またはそのフラグメントを用いてＬＧＲ８ポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項３７】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３８】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤または抗酸化剤である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、または配列番号２１のいずれかに示すアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変されている、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ウイルスベクターに含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合された請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
医学的状態を処置、予防または改善するための方法であって、請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１〜３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法
【請求項４９】
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適切な膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞
を備え、該細胞が、請求項１３〜１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌し、そして該膜が、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５１】
ＬＧＲ８ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３〜１５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ＬＧＲ８ポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記化合物に結合する場合、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５５】
化合物が、ＬＧＲ８ポリペプチド活性またはＬＧＲ８ポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５４に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物中でのＬＧＲ８ポリペプチド活性またはＬＧＲ８ポリペプチド生成を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項５６】
固体支持体に取り付けられた、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５７】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子の少なくとも１つを含む核酸分子のアレイ。
【請求項５８】
以下からなる群より選択される少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２に示すポリペプチドの活性を有する単離されたポリペプチド：２６位のイソロイシン；４１位のバリン；５５位のイソロイシン；７８位のアスパラギン酸；１２３位のアスパラギン酸；１３０位のアルギニン；１３５位のバリン；１４２位のメチオニン；１６６位のロイシン；１６７位のチロシン；２０１位のリジン；２０４位のバリン；２１６位のイソロイシン；２１７位のグルタミン酸；２２１位のロイシン；２４０位のロイシン；２５２位のロイシン；２７７位のイソロイシン；２８８位のメチオニン；２９０位のリジン；３２４位のイソロイシン；３４１位のイソロイシン；３４４位のイソロイシン；３５０位のアスパラギン酸；３７６位のロイシン；４２０位のバリン；４２５位のバリン；４２７位のバリン；４３４位のイソロイシン；４４２位のチロシン；４４４位のアルギニン；４５０位のチロシン；４６６位のイソロイシン；４７１位のイソロイシン；４７６位のロイシン；４７８位のフェニルアラニン；４８１位のグルタミン酸；４８５位のヒスチジン；５１５位のフェニルアラニン；５２１位のチロシン；５２２位のイソロイシン；５２６位のチロシン；５３１位のバリン；５４１位のバリン；５５１位のイソロイシン；５５２位のバリン；５６１位のグルタミン酸；５６２位のフェニルアラニン；５６６位のチロシン；５７７位のチロシン；５７９位のアスパラギン酸；５９７位のイソロイシン；６０３位のイソロイシン；６１６位のバリン；６２１位のイソロイシン；６２６位のイソロイシン；６３２位のリジン；６４９位のロイシン；６５４位のイソロイシン；６７５位のバリン；６８２位のイソロイシン；７００位のグルタミン酸；７０２位のイソロイシン；７０７位のチロシン；７０９位のチロシン；７２７位のイソロイシン；７２９位のバリン；７３７位のメチオニン；７４５位のメチオニン；および７４９位のロイシン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／２２４，４５５号による優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／２２４，４５５号の開示は、本明細書中に参考として明らかに援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ロイシン−リッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター−８（ＬＧＲ８）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞およびＬＧＲ８ポリペプチドを産生するための方法に関する。本発明はさらに、ＬＧＲ８ポリペプチドに関連した疾患、障害および状態の診断、処置、改善および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規な治療剤の発見を大いに加速した。迅速な核酸配列決定技術は、今や、空前の速度で配列情報を生成し得、そしてコンピュータ分析と結びついて、重複する配列の、部分的または完全なゲノムへのアセンブリおよびポリペプチドコード領域の同定を可能にし得る。公知のアミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定されたアミノ酸配列の比較によって、以前に同定された配列および／または構造的特徴に対する相同性の程度の決定が可能になる。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造解析または機能解析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用するために有利な特性を産物に付与し得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における顕著な技術的進歩にもかかわらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発についての可能性は、未だに大部分実現されていない。潜在的に有益なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子、または治療分子についての「標的」として作用し得るポリペプチドをコードする遺伝子は、未だに同定されていない。従って、本発明の目的は、診断的利益または治療的利益を有する、新規なポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子を同定することである。
【０００５】
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）／７回膜貫通ドメインレセプターの糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーのメンバーは、独特のロイシン−リッチリピート構造を含む、比較的大きな（３３０を超えるアミノ酸）リガンド結合Ｎ末端細胞外ドメインによって特徴付けられる（Ｄｕｆａｕ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．６０：４６１−９６）。このサブファミリーのメンバーの中でもとりわけ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプターおよび黄体形成ホルモン（ＬＨ）／絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）レセプターである。近年、糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーに対して顕著な相同性を有する多数のオーファンＧＰＣＲが記載されている。これらの新規メンバーとしては、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役レセプター（ＬＧＲ）４（Ｈｓｕら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８３０−４５；ＰＣＴ公開第ＷＯ　９９／１５５４５号）、ＬＧＲ５（ＭｃＤｏｎａｌｄら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：２６６−７０；Ｈｓｕら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：１８３０−４５；ＰＣＴ公開第ＷＯ　９９／１５６６０号）、ＬＧＲ６（欧州特許出願第ＥＰ　０　９５０　７１１　Ａ２号）およびＬＧＲ７（ＰＣＴ公開第ＷＯ　９９／４８９２１号；Ｈｓｕら，２０００，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：１２５７−７１）が挙げられる。
【０００６】
糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーのＮ末端細胞外ドメインは、膜貫通ドメインおよび細胞質Ｃ末端領域の両方の非存在下でリガンド結合能力を維持する。実際、ＬＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨのレセプターのＮ末端細胞外ドメインは、組換え発現された場合、ＬＨ誘導性シグナル伝達、ＦＳＨ誘導性シグナル伝達またはＴＳＨ誘導性シグナル伝達を選択的に中和することが示されている（Ｏｓｕｇａら，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１：１６５９−６８）。言い換えると、可溶性細胞外ドメインは、この細胞外ドメインを誘導したレセプターのシグナル伝達経路の機能的アンタゴニストとして作用することが示されている。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーのＧＰＣＲ／７回膜貫通ドメインレセプターに対して顕著な相同性を有するポリペプチドをコードする新規なＬＧＲ８核酸分子に関する。この糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーのこの新規なメンバーは、ＬＧＲ７に対して最も密接に関連している。
【０００８】
本発明はさらに、４つの異なるＬＧＲ８オルタナティブスプライシング改変体に関連する。ＬＧＲ８−Ａコード配列は、大きなＮ末端ロイシン−リッチリピート含有細胞外ドメイン、７回推定膜貫通ドメインおよび細胞質Ｃ末端領域をコードする、１８個のコードエキソンからなる。ＬＧＲ８−Ｂコード配列は、ＬＧＲ８−Ｂコード配列が、Ｎ末端細胞外ドメインをコードするエキソンのうちの１つを欠くこと以外は、ＬＧＲ８−Ａコード配列と同一である。ＬＧＲ８−Ｃコード配列は、ＬＧＲ８−Ｃコード配列が、Ｎ末端細胞外ドメインをコードするエキソンのうちの３つを欠くこと以外は、ＬＧＲ８−Ａコード配列と同一である。ＬＧＲ８−Ｄコード配列は、ＬＧＲ８−Ｂコード配列のＮ末端細胞外ドメインの約９０％をコードするエキソンからなるが、膜貫通ドメインおよび細胞質Ｃ末端領域をコードするエキソンを欠く。従って、ＬＧＲ８−Ｄは、分泌型のＮ末端細胞外ドメイン版のＬＧＲ８−Ｂであり、そしてＬＧＲ８シグナル伝達経路のアンタゴニストとして働くようである。ＬＧＲ８−Ｄは、停止コドンを含むさらなるエキソンが、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−ＢおよびＬＧＲ８−Ｃの第１の膜貫通ドメインをコードするエキソンのちょうど５’側にスプライシングされるという事実によって、Ｎ末端細胞外ドメインのＣ末端のごく付近で短縮化されている。ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、およびＬＧＲ８−ＣのＮ末端細胞外ドメインは、ＬＧＲ８シグナル伝達経路のアンタゴニストとして機能し得るようである。
【０００９】
本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９または配列番号２２のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドに少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２または（ａ）のいずれかに示されるとおりのヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２、（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、あるいは抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１１】
本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子をさらに提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメント含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１２】
本発明は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８または配列番号２１のいずれかに記載されるとおりのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかのオルソログについてのアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、アミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれか、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列。
【００１４】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮化および／またはＮ末端短縮化を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮化およびＮ末端短縮化からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるとおりのアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００１５】
本発明はなおさらに、単離されたポリペプチドであって、以下：２６位のイソロイシン；４１位のバリン；５５位のイソロイシン；７８位のアスパラギン酸；１２３位のアスパラギン酸；１３０位のアルギニン；１３５位のバリン；１４２位のメチオニン；１６６位のロイシン；１６７位のチロシン；２０１位のリジン；２０４位のバリン；２１６位のイソロイシン；２１７位のグルタミン酸；２２１位のロイシン；２４０位のロイシン；２５２位のロイシン；２７７位のイソロイシン；２８８位のメチオニン；２９０位のリジン；３２４位のイソロイシン；３４１位のイソロイシン；３４４位のイソロイシン；３５０位のアスパラギン酸；３７６位のロイシン；４２０位のバリン；４２５位のバリン；４２７位のバリン；４３４位のイソロイシン；４４２位のチロシン；４４４位のアルギニン；４５０位のチロシン；４６６位のイソロイシン；４７１位のイソロイシン；４７６位のロイシン；４７８位のフェニルアラニン；４８１位のグルタミン酸；４８５位のヒスチジン；５１５位のフェニルアラニン；５２１位のチロシン；５２２位のイソロイシン；５２６位のチロシン；５３１位のバリン；５４１位のバリン；５５１位のイソロイシン；５５２位のバリン；５６１位のグルタミン酸；５６２位のフェニルアラニン；５６６位のチロシン；５７７位のチロシン；５７９位のアスパラギン酸；５９７位のイソロイシン；６０３位のイソロイシン；６１６位のバリン；６２１位のイソロイシン；６２６位のイソロイシン；６３２位のリジン；６４９位のロイシン；６５４位のイソロイシン；６７５位のバリン；６８２位のイソロイシン；７００位のグルタミン酸；７０２位のイソロイシン；７０７位のチロシン；７０９位のチロシン；７２７位のイソロイシン；７２９位のバリン；７３７位のメチオニン；７４５位のメチオニン；および７４９位のロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで、このポリペプチドは、配列番号２に示されるようなポリペプチドの活性を有する。
【００１６】
ＬＧＲ８アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドがまた、提供される。
【００１７】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＬＧＲ８ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００１８】
ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物がまた、本発明に含まれる。ＬＧＲ８核酸分子は、ＬＧＲ８ポリペプチドの発現およびＬＧＲ８ポリペプチドの増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＬＧＲ８核酸分子は、内因性ＬＧＲ８ポリペプチドの発現を阻害する様式で動物に導入される（すなわち、ＬＧＲ８ポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１９】
本発明のＬＧＲ８ポリペプチドの誘導体がまた、提供される。
【００２０】
本発明のＬＧＲ８ポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が、さらに提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストのものであってもアンタゴニストのものであってもよい。
【００２１】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子ならびに１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物がまた、本発明によって含まれる。薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００２２】
本発明のＬＧＲ８ポリペプチドおよびＬＧＲ８核酸分子は、疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００２３】
本発明はまた、ＬＧＲ８ポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＬＧＲ８ポリペプチドを試験分子と接触させて、この試験分子のこのポリペプチドに対する結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＬＧＲ８ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＬＧＲ８ポリペプチドの発現またはＬＧＲ８ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２４】
ＬＧＲ８ポリペプチドの発現を調整する方法およびＬＧＲ８ポリペプチドのレベルを調節する（すなわち、増加させるかまたは減少させる）方法がまた、本発明によって含まれる。１つの方法は、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＬＧＲ８ポリペプチドの発現を調整または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるように、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２５】
ＬＧＲ８ポリペプチドは、そのリガンドを同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」は、レセプターに対するリガンドをクローン化するために使用されている（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−６９を参照のこと）。これらおよび他のＬＧＲ８リガンドのクローニング実験は、本明細書中に非常に詳細に記載される。ＬＧＲ８リガンドの単離は、ＬＧＲ８のシグナル伝達経路の新規アゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定または開発を可能にする。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＬＧＲ８リガンド、抗ＬＧＲ８リガンド抗体およびその誘導体、小分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいずれかは、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に開示されるものを含む）を潜在的に処置するために使用され得る。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【００２７】
ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、およびＬＧＲ８−Ｃは、Ｎ末端細胞外ドメイン、複数の膜貫通ドメイン、およびＣ末端細胞質ドメインを有する膜結合ドメインであることが理解される。従って、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、およびＬＧＲ８−Ｃは、抗体、融合ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドのような）、または低分子量の有機分子を含むが、これらに限定されないアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子についての標的として有用である。
【００２８】
さらに、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、およびＬＧＲ８−ＣのＮ末端細胞外ドメインは、例えば、Ｎ末端細胞外ドメインが抗体のＦｃ部分に融合される場合、ＬＧＲ８シグナル伝達経路のアンタゴニストとして使用され得ることが理解される。
【００２９】
ＬＧＲ８−Ｄは、ＬＧＲ８−ＢのＮ末端細胞外ドメインの分泌形態であることがまた理解される。この点において、ＬＧＲ８−Ｄは、ＬＧＲ８−Ｂリガンドのアンタゴニストとして作用し得る。ＬＧＲ８−Ｄは、抗体、融合ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドのような）、または低分子量の有機分子を含むがこれらに限定されない、アンタゴニスト分子およびアゴニスト分子についての標的として使用され得る。例えば、ＬＧＲ８−Ｄに特異的なアンタゴニストは、ＬＧＲ８−Ｄのアンタゴニスト活性を阻害し、従って、ＬＧＲ８−Ｄリガンドの活性を強化し、そして／またはＬＧＲ８レセプターを介するシグナル伝達を強化する。逆に、ＬＧＲ８−Ｄに特異的なアゴニストは、ＬＧＲ８−Ｄのアンタゴニスト活性を強化し、従って、ＬＧＲ８−Ｄリガンドの活性を減少し、そして／またはＬＧＲ８レセプターを介するシグナル伝達を減少する。
【００３０】
（定義）
用語「ＬＧＲ８遺伝子」または「ＬＧＲ８核酸分子」または「ＬＧＲ８ポリヌクレオチド」とは、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２２のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むか、またはこれらからなる核酸分子をいう。
【００３１】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物体または生物体の集団の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの交替形態のうちの１つをいう。
【００３２】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるＬＧＲ８ポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００３３】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、または天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００３４】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−エチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００３５】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうように使用される。
【００３６】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で、隣接配列の配置をいうように使用され、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築される。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことが可能であり得る。例えば、コード配列は、このプロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在性非翻訳の、転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、依然としてこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３８】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうように使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３９】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連するポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、ＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント、ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ、ＬＧＲ８ポリペプチド改変体、およびＬＧＲ８ポリペプチド誘導体が挙げられ、これらは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。ＬＧＲ８ポリペプチドは、本明細書中で定義される成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００４０】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）での短縮化および／またはカルボキシル末端での短縮化を含むポリペプチドをいう。用語「ＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント」はまた、ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ、ＬＧＲ８ポリペプチド誘導体、またはＬＧＲ８ポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化、あるいはＬＧＲ８ポリペプチド対立遺伝子改変体またはＬＧＲ８ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化をいう。ＬＧＲ８ポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＬＧＲ８ポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００より多くのアミノ酸を含む。このようなＬＧＲ８ポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００４１】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ」は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるＬＧＲ８ポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＬＧＲ８ポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００４２】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチド改変体」は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＬＧＲ８ポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＬＧＲ８融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＬＧＲ８ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＬＧＲ８ポリペプチド対立遺伝子改変体、ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ、およびＬＧＲ８ポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＬＧＲ８ポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のいずれかに示されるＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００４３】
用語「ＬＧＲ８ポリペプチド誘導体」は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント、ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ、またはＬＧＲ８ポリペプチド改変体をいい、これらは、化学的に改変されている。用語「ＬＧＲ８ポリペプチド誘導体」はまた、本明細書中で定義されるＬＧＲ８ポリペプチド対立遺伝子改変体またはＬＧＲ８ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいい、これは化学的に改変されている。
【００４４】
用語「成熟ＬＧＲ８ポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＬＧＲ８ポリペプチドをいう。成熟ＬＧＲ８ポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化など）を含み得る。例示的な成熟ＣＨＬ２ポリペプチドは、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、または配列番号２１のアミノ酸配列によって示される。
【００４５】
用語「ＬＧＲ８融合ポリペプチド」は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント、ＬＧＲ８ポリペプチドオルソログ、ＬＧＲ８ポリペプチド改変体、またはＬＧＲ８誘導体のアミノ末端またはカルボキシ末端での、１つ以上のアミノ酸の融合（例えば、異種タンパク質またはペプチド）をいう。用語「ＬＧＲ８融合ポリペプチド」はまた、本明細書中で定義されるＬＧＲ８ポリペプチド対立遺伝子改変体またはＬＧＲ８ポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合をいう。
【００４６】
用語「生物学的に活性なＬＧＲ８ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの、少なくとも１つの活性特徴を有するＬＧＲ８ポリペプチドをいう。さらに、ＬＧＲ８ポリペプチドは、免疫原としての活性を有し得る；すなわち、このＬＧＲ８ポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４７】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然では連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたは天然の環境において見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００４８】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定されるように、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって焦点をあてられたギャップ整列（存在する場合）との間の一致の同一パーセントを評価する。
【００４９】
用語「類似性」は、概念に関するが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性の基準をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、これらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００５０】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された材料をいう。
【００５１】
用語「有効量」および「治療有効量」は、各々、本明細書中に示されるＬＧＲ８ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８核酸分子の量をいう。
【００５２】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＬＧＲ８ポリペプチド、ＬＧＲ８核酸分子、またはＬＧＲ８選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方材料をいう。
【００５３】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００５４】
用語「選択的結合因子」とは、ＬＧＲ８ポリペプチドに対する特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＬＧＲ８ポリペプチドに結合し、かつ非ＬＧＲ８ポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間変形（例えば、マウスＬＧＲ８ポリペプチドおよびラットＬＧＲ８ポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００５５】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいう。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達をいう。
【００５６】
用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクトされ」ている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ　１３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、ＤＮＡの形質転換は、物理的に細胞の染色体に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００５８】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を包含すること、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。このような関連したＬＧＲ８ポリペプチドは、例えば、１以上のＮ連結もしくはＯ連結のグリコシル化部位の付加および／もしくは欠失、または１以上のシステイン残基の付加および／もしくは欠失を含み得る。
【００５９】
関連した核酸分子はまた、ＬＧＲ８核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかのＬＧＲ８ポリペプチドの少なくとも約２５連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、あるいは２００より多いアミノ酸残基のポリペプチドをコードする。
【００６０】
さらに、関連したＬＧＲ８核酸分子としてはまた、本明細書中で定義したような中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２のいずれかのＬＧＲ８核酸分子、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含む）をコードする分子、または本明細書中に定義したような核酸フラグメント、または本明細書中に定義したようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられる。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるＬＧＲ８配列を用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを、関連した配列についてスクリーニングして調製され得る。既知配列に対して顕著な同一性を示す、ＬＧＲ８ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００６１】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、かつ著しく不一致なＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００６２】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させるために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４すなわちＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００６３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって推定され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げられる。
【００６４】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中で５０℃の「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００６５】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）については、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕捉するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００６６】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ　ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃　＋　Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１））を参照のこと。
【００６７】
オリゴヌクレオチドについての高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中で、そのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６８】
別の実施形態において、関連した核酸分子は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチドに対して、少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２のいずれかに示されるようなヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるか、またはこのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連した核酸分子は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６９】
核酸配列における差異は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列に関連して、アミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る。
【００７０】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する、対応する改変）は、ＬＧＲ８ポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、ＬＧＲ８ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００７１】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、非ネイティブな残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００７２】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００７３】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７４】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーとの交換を含み得る。このような置換された残基は、非ヒトＬＧＲ８ポリペプチドと相同なヒトＬＧＲ８ポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同領域に導入され得る。
【００７５】
このような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシー指数を割り当てられている。ハイドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７６】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、一般的には、当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１）。特定のアミノ酸が、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指数に基づいて変更を行う際に、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００７７】
類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、この場合と同様に、免疫学的実施形態における使用が意図される）こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最も大きな局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００７８】
以下の親水性の値が、アミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変更を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。エピトープをまた、一次アミノ酸配列から、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７９】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＬＧＲ８ポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＬＧＲ８ポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【００８０】
【表１】
2004506425.tif 000002
2004506425.tif 000003
当業者は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。活性を破壊することなく変更され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合、当業者は、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、ＬＧＲ８分子の領域の変化が、ＬＧＲ８ポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えないようであることが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持しながら天然に存在する残基で置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００８１】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再検討し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要であるアミノ酸残基に対応する、ＬＧＲ８ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＬＧＲ８ポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基について、化学的に類似のアミノ酸の置換を選択し得る。
【００８２】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおけるその構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を作製し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変更が、破壊された活性、所望でなく減少した活性、または所望でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００８３】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、二次構造の予測を補助するために、コンピュータープログラムが、現在利用可能である。二次構造を推測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的なフォールディングの数を含む）の促進がもたらされた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質における限定された数のフォールディングが存在すること、および一旦構造の臨界の数が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進化学的結合（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）を包含する。
【００８４】
好ましいＬＧＲ８ポリペプチド改変体としては、グリコシル化改変体が挙げられ、ここで、グリコシル化部位の数および／または型は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるアミノ酸配列と比較して、変化している。１つの実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるアミノ酸配列よりも、多いまたは少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＬＧＲ８改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるアミノ酸配列と比較して、欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＬＧＲ８ポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性なコンホメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８５】
他の実施形態において、関連した核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列、または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチド（ここで、このポリペプチドは、カルボキシル末端切断および／またはアミノ末端切断を有し、そしてさらに、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。関連した核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端切断、およびアミノ末端切断からなる群より選択される少なくとも１つ改変を有する、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなポリペプチドをコードする核酸配列を含むかまたはこれらからなり、そしてここで、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する。
【００８６】
さらに、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＬＧＲ８ポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合してホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＬＧＲ８融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＬＧＲ８ポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８７】
融合は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＬＧＲ８ポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基である。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８８】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＬＧＲ８ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合する。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに相補的活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、および恐らく、胎盤移入さえものような機能を組み込み得る。同書。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８９】
【表２】
2004506425.tif 000004
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合し得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ＬＧＲ８ポリペプチドフラグメント（例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合し得る。
【００９０】
得られるＬＧＲ８融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００９１】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ　１，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　１９９４）；Ｇ．ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるために、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ　ＮＬＭ　ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００９３】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求されるポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９４】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ　２５０またはＢＬＯＳＵＭ　６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５　Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３　１９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ　６２比較行列）を参照のこと）。
【００９５】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ　６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
ギャップペナルティー：１２
ギャップレングスペナルティー：４
同一性の閾値：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００９６】
核酸分子配列比較についての好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、前出；
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップレングスペナルティー：３。
【００９７】
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメータである。
【００９８】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリクス、同一性の閾値などが使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ）；さらに、比較が所定の配列対の間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、一つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【００９９】
（核酸分子）
核酸分子は、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むが、これらに限定されない）で容易に獲得され得る。
【０１００】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，１９９４）に記載される方法である。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【０１０１】
ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が一つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部は、同じ種からのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）遺伝子または関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプライマーは、ＬＧＲ８ポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、または配列番号２２のいずれかに記載される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度または高いストリンジェンシーの条件がスクリーニングのために使用されて、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【０１０２】
ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現クローニング（これは、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表面において発現されそして提示されるクローン化タンパク質への抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、検出可能な標識を用いて修飾されて所望のクローンを発現する細胞を同定する。
【０１０３】
以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを作製し、そしてコードされるポリペプチドを発現させ得る。例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされるＬＧＲ８ポリペプチドは、大量に産生され得る。
【０１０４】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡの領域を増幅する。
【０１０５】
ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−７３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＬＧＲ８遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＬＧＲ８ポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＬＧＲ８ポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＬＧＲ８ポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度に関する「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．Ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの場合において、ＬＧＲ８ポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが、所望され得る。改変体をコードする核酸分子は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して産生され得、このプライマーは、所望の点変異を有する（変異誘発技術の記載に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学的合成を使用して、このような改変体を調製し得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０８】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入し得る。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＬＧＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＬＧＲ８ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０）を参照のこと。
【０１０９】
代表的に、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１１０】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＬＧＲ８ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ）（これらに対して市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＬＧＲ８ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＬＧＲ８ポリペプチドから続いて除去され得る。
【０１１１】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＬＧＲ８ポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１１２】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＬＧＲ８遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１１３】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子（単数または複数）を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１１４】
複製起点は、代表的に、市販で購入した原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＬＧＲ８ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点部位は、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０１１５】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはなおベクターの一部として市販で購入されるが、これはまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１１６】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１７】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の染色体の連続的な生成の内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＬＧＲ８ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１８】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＬＧＲ８ポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、原核生物ベクター中で使用され得る。
【０１１９】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＬＧＲ８ポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＬＧＲ８核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＬＧＲ８ポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列のいずれかが、ＬＧＲ８核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＬＧＲ８核酸分子に対して同種（天然）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＬＧＲ８ポリペプチドの分泌は、分泌されたＬＧＲ８ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＬＧＲ８核酸分子の一部であり得る。
【０１２０】
ＬＧＲ８ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＬＧＲ８ポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＬＧＲ８ポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＬＧＲ８ポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＬＧＲ８ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１２１】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＬＧＲ８ポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１２２】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＬＧＲ８遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＬＧＲ８遺伝子に関してイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＬＧＲ８ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ポリ−Ａ転写終結配列の５’側である。好ましくは、イントロン（単数または複数）は、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１２３】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）のうちの１つにグループ分けされる。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、それらの制御下でのＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＬＧＲ８遺伝子プロモーター配列は、ＬＧＲ８核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較してより多い転写および発現タンパク質のより高い産生が可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２４】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１２５】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２６】
ＬＧＲ８遺伝子発現を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ　２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域にもまた関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ　３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ　３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ　４５：４８５−４９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ　４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８��−２８６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−１３７８）。
【０１２７】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に依存しない。これらは、転写単位に対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化に対する例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＬＧＲ８核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０１２８】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される１つ以上の隣接配列がすでにベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。それぞれの隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２９】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１３０】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、およびＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなプラスミド、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１３１】
ベクターが構築され、そしてＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドついての発現ベクターを、選択された宿主細胞へ形質転換することは、以下を含む周知の方法によって達成され得る：例えば、トランスフェクション法、感染法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、またはＤＥＡＥ−デキストラン法あるいは他の公知の方法。選択された方法は、一部、使用される宿主細胞の型に依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、そしてこれらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に示されている。
【０１３２】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であっても、真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であってもよい。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＬＧＲ８ポリペプチドを合成し、これは、引き続き、培養培地から収集され得る（宿主細胞がＬＧＲ８ポリペプチドを培地に分泌する場合）か、またはこれを産生する宿主細胞から直接収集され得る（ＬＧＲ８ポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子（例えば、所望の発現レベル、活性に望ましいかもしくは必要とされるポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ）に依存する。
【０１３３】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−４２２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株および齧歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ　Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株。これらの細胞株の各々は、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１３４】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．などの種々の菌株がまた本方法において使用され得る。
【０１３５】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３６】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３７】
グリコシル化ＬＧＲ８ポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳汁中に得ることができる。ＬＧＲ８ポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３８】
（ポリペプチド産生）
ＬＧＲ８ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／またはウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。
【０１３９】
代表的に、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出可能である。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１４０】
宿主細胞によって産生されるＬＧＲ８ポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１４１】
ＬＧＲ８ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＬＧＲ８ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１４２】
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかあるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＬＧＲ８ポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌について封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、それらに続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１４３】
ＬＧＲ８ポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内側および／または外側の細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下でアルカリ性のｐＨにて、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下で酸性のｐＨにて、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、ここでは可溶化形態にある、ＬＧＲ８ポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１４４】
いくつかの場合、ＬＧＲ８ポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「リフォールディングする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィドシャフリングを生成させる。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの例において、共溶媒が、リフォールディングの効率を増加するために使用され得るか、または必要とされ得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４５】
封入体がＬＧＲ８ポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４６】
溶液からのＬＧＲ８ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＬＧＲ８ポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグに高い親和性を有するアフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、１工程のプロセスで精製され得る。
【０１４７】
例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合する。従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＬＧＲ８ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ、１９９３）を参照のこと。
【０１４８】
さらに、ＬＧＲ８ポリペプチドは、ＬＧＲ８ポリペプチドを特異的に認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。
【０１４９】
精製に適切な他の手順としては、以下が挙げられるが、それらに限定はされない：アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）と続くゲル溶出、ならびに分取等電収束法（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。いくつかの場合、２つ以上の精製技術が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。
【０１５０】
ＬＧＲ８ポリペプチドもまた、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３２；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るか、またはこれを含まずに合成され得る。化学合成されたＬＧＲ８ポリペプチドは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。化学合成されたＬＧＲ８ポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＬＧＲ８ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＬＧＲ８ポリペプチドもしくは天然のＬＧＲ８ポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１５１】
ＬＧＲ８ポリペプチドを得る別の手段は、ＬＧＲ８ポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＬＧＲ８ポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＬＧＲ８ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１５２】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＬＧＲ８ポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｏｌ　３：２６８−２７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、このプールは、それぞれが、５’ランダム化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１５３】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成され、この細胞によって、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生される。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５４】
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０に記載される。これは、「Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えまたは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１５５】
これらの方法はまた、包括的なＬＧＲ８ポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１５６】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が組換え手段および他の手段によって作製され得ることが当業者に理解される。
【０１５７】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＬＧＲ８ポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＬＧＲ８ポリペプチド選択的結合因子は、ＬＧＲ８ポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＬＧＲ８ポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【０１５８】
ＬＧＲ８ポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナル抗体を含むポリクローナル抗体；モノクローナル抗体（ＭＡｂ）；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植）抗体；ヒト抗体；単鎖抗体；および／または二特異的抗体；ならびにそれらのフラグメント；改変体；または誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＬＧＲ８ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５９】
ＬＧＲ８ポリペプチドに対して指向されるポリクローナル抗体は、一般に、ＬＧＲ８ポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＬＧＲ８ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このキャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＬＧＲ８ポリペプチド抗体力価についてアッセイする。
【０１６０】
ＬＧＲ８ポリペプチドに対して指向されるモノクローナル抗体は、培地中の連続的な細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するのに適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＬＧＲ８ポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１６１】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、この重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種から誘導される抗体かまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、同一であるかまたは相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導される抗体かまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と、同一であるかまたは相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントもまた含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５を参照のこと。
【０１６２】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載される方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−３６）を使用して、げっし類の相補的決定領域の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施され得る。
【０１６３】
ＬＧＲ８ポリペプチドに結合するヒト抗体もまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＬＧＲ８ポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個連続するアミノ酸を有する）（必要に応じて、キャリアに結合される）を用いて免疫化することによって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（すなわち、この動物は、完全ではない改変体の相補体を有する動物）は、全ての所望の免疫系の改変体を有する動物を得るためにクロスブレッドされる。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウス以外）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および同第５４６０７３Ａ１号に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６４】
代替の実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらにより、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した模倣免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの続く選択を処理する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターについて、高い親和性および機能的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１６５】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植片化抗体、およびヒト化抗体は、組換え方法によって代表的に産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書に記載される材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書において記載されるように、宿主細胞において組換えＤＮＡの発現によってかまたはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０１６６】
本発明の抗ＬＧＲ８抗体は、以下の任意の公知のアッセイ方法において用いられ得る：例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドの検出および定量のための、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。これらの抗体は、用いられるアッセイ方法に適切な親和性でＬＧＲ８ポリペプチドに結合する。
【０１６７】
診断適用について、特定の実施形態において、抗ＬＧＲ８抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎもしくは６７Ｇａ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−６３））であり得る。
【０１６８】
競合的結合アッセイは、限られた量の抗ＬＧＲ８抗体と結合するために、試験サンプルの分析物（ＬＧＲ８ポリペプチド）と競合する標識された標準物（例えば、ＬＧＲ８ポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＬＧＲ８ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量の決定を容易にするため、これらの抗体は、代表的に、競合の前か後に不溶化され、その結果、これらの抗体に結合された標準物および分析物は、結合されていないままの標準物および分析物から、簡便に分離され得る。
【０１６９】
サンドイッチアッセイは、代表的に、２つの抗体（この各々が異なる検出および／または定量されるタンパク質の免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る）の使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプルの分析物は、代表的に、固体支持体上に固定化される一次抗体に結合し、その後、二次抗体がこの分析物に結合し、したがって、不溶性の３つの部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。二次抗体は、それ自体に検出可能な部分で標識されてもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０１７０】
選択的結合因子（抗ＬＧＲ８抗体を含む）はまた、インビボでの画像化に有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に、好ましくは、血流中に投与され得、そして宿主における標識された抗体の存在および位置が、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって動物において検出可能な、任意の部分で標識され得る。
【０１７１】
本発明の選択的結合因子（抗体を含む）は、治療剤として用いられ得る。これらの治療剤は、一般に、以下の点において、アゴニストまたはアンタゴニストである：これらのいずれかが、ＬＧＲ８ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強するかまたは減少させる。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＬＧＲ８ポリペプチドに特異的に結合し得、そして、インビボまたはインビトロにおいてＬＧＲ８ポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％まで、そして好ましくは、少なくとも約８０％まで、ＬＧＲ８ポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これによって、インビボまたはインビトロにおいてＬＧＲ８ポリペプチド活性を阻害または排除する抗ＬＧＲ８ポリペプチド抗体であり得る。選択的結合因子（アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＬＧＲ８ポリペプチド抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１７２】
本発明はまた、ＬＧＲ８選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＬＧＲ８ポリペプチドのレベルを検出するのに有用な他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１７３】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の小型かつ高密度アレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションのための標的として働く単一の核酸種の多数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合した標識されたｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットかつ並列様式で定量化され得る。
【０１７４】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むが、これらに限定されない本発明のＬＧＲ８分子に関して、広い範囲の適用を有する：治療のための標的としてのＬＧＲ８疾患関連遺伝子の同定および検証；ＬＧＲ８分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定に役立つことによって向上するＬＧＲ８ポリペプチド関連低分子薬物開発。
【０１７５】
（化学的誘導体）
ＬＧＲ８ポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。ＬＧＲ８ポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然に結合した化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＬＧＴ８ポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７６】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくつかは少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａとの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７７】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含むタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＬＧＲ８ポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に包含される。
【０１７８】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化ポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）ポリペプチドと活性化ポリマー分子（例えば、反応性エステルまたはポリマー分子のアルデヒド誘導体）とを、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１もしくは配列番号２３のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＬＧＴ８ポリペプチドが、１つ以上のポリマー分子との結合を生じる条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応産物を得る工程、を包含する。最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比がより大きくなればなるほど、結合したポリマー分子の割合がより高くなる。１つの実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７９】
ポリペプチドのペグ化は、特に、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかを使用して実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０およびＥＰ　０１５４３１６；ＥＰ　０４０１３８４、ならびに米国特許第４，１７９，３３７号に記載される。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１８０】
別の実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合され得る。次いで、このビオチン／ＬＧＲ８ポリペプチド分子は、アビジンに結合され、その結果、四価のアビジン／ビオチン／ＬＧＲ８ポリペプチド分子を生じる。ＬＧＲ８ポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰ−ＩｇＭまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭとともに沈澱して１０の結合価の十量体の結合体を形成し得る。
【０１８１】
一般に、本発明のＬＧＲ８ポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、ＬＧＲ８ポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＬＧＲ８ポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０１８２】
（遺伝的に操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、もしくはヒツジ、または他の家畜）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子は、崩壊（すなわち、「ノックアウト」）されており、その結果、ＬＧＲ８ポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０１８３】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜）を含み、ここで、この動物についてのＬＧＲ８遺伝子のネイティブな形態または異種ＬＧＲ８遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰に発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０１８４】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、ここで、本発明の１つ以上のＬＧＲ８ポリペプチドについてのプロモーターは、１つ以上のネイティブＬＧＲ８ポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化されるかまたは不活性化されるかのいずれかである。
【０１８５】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングのために用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、ＬＧＲ８遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＬＧＲ８ポリペプチドの量は、薬物候補への動物の曝露後、測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病的状態を生じる得るか、またはこれに関連し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防または抑制する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病的状態を生じ得るか、またはこれに関連し得る。このような場合、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防するかまたは抑制する薬物候補の能力を試験し得る。
【０１８６】
（ＬＧＲ８ポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＬＧＲ８ポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射、または経口送達、移植デバイスなどによるインビボ様式のいずれかによって投与され得る。
【０１８７】
「試験分子」とは、ＬＧＲ８ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価中の分子をいう。最も一般的には、試験分子は、ＬＧＲ８ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、ＬＧＲ８ポリペプチド活性を（例えば、ＬＧＲ８遺伝子発現に影響することによってか、またはＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって）間接的に調節し得ることも考慮される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数で、ＬＧＲ８ポリペプチドと結合する。
【０１８８】
ＬＧＲ８ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチドは、試験分子とＬＧＲ８ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で試験分子とともにインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態においてかまたは粗混合物でスクリーニングされ得る。
【０１８９】
特定の実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、ＬＧＲ８ポリペプチドと相互作用し、その活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。ＬＧＲ８ポリペプチド発現を調節する分子は、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、またはＬＧＲ８ポリペプチドの発現を指向するかまたは制御する核酸配列に相補的である核酸を含み、そしてこれらの核酸は、発現のアンチセンス調節因子として作用する。
【０１９０】
一旦、試験分子が、ＬＧＲ８ポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、ＬＧＲ８ポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＬＧＲ８ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＬＧＲ８ポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＬＧＲ８ポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１９１】
試験分子とＬＧＲ８ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＬＧＲ８ポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１９２】
ＬＧＲ８ポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＬＧＲ８ポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、結合パートナーに対するＬＧＲ８ポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させる能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＬＧＲ８ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定される。次いで、放射標識したＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナー）および試験化合物は、このウェルに、一つずつ（いずれかの順序で）かまたは同時にかのいずれかで添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射能を計数し、結合パートナーがＬＧＲ８ポリペプチドに結合した程度を決定し得る。代表的に、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上のエレメントを欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替は、タンパク質の「位置」を逆にする工程、すなわち、マイクロタイタープレートウェルにＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーを固定し、試験分子および放射標識したＬＧＲ８ポリペプチドと共にインキュベートし、そしてＬＧＲ８ポリペプチド結合の程度を決定する工程、を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ　１９９５）を参照のこと。
【０１９３】
放射性標識に対する代替として、ＬＧＲ８ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジン（これらは、比色定量的に検出される）を使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーに対する抗体（こらは、ビオチンに結合されている）はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションの後に、検出の目的のために使用され得る。
【０１９４】
ＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補的タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＬＧＲ８ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムを通過する試験分子および相補的タンパク質を用いてカラム内に固定化され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドトとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９５】
ＬＧＲ８ポリペプチド結合タンパク質とＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補的タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面に物理的に会合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９６】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＬＧＲ８ポリペプチドとＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される。
【０１９７】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＬＧＲ８ポリペプチドとＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９８】
ＬＧＲ８ポリペプチドとＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少される化合物はまた、ＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＬＧＲ８ポリペプチドの、ＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＬＧＲ８ポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養物アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９９】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＬＧＲ８遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８ポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【０２００】
酵母ツーハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜８３）を使用して、ＬＧＲ８ポリペプチドに結合するかまたはこれと相互作用する、新規なポリペプチドを同定し得る。例として、酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインと融合されたＬＧＲ８ポリペプチドの細胞質ドメインをコードするＤＮＡを含むハイブリッド構築物は、ツーハイブリッドベイド（ｂａｉｄ）プラスミドとして使用され得る。スクリーニングから出現する陽性クローンは特徴付けられ、さらに相互作用タンパク質を同定し得る。
【０２０１】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号２５）（「タンパク質導入ドメイン」、またはＴＡＴ　ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識されたＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号２６）（これは、腹腔内投与の後に組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処置された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入後、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るためにある程度の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入に続いて、リフォールディングを必要とし得ると考えられる。
【０２０２】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＬＧＲ８アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ８選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＬＧＲ８分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＬＧＲ８分子」は、本明細書中に記載されるような、ＬＧＲ８核酸分子およびＬＧＲ８ポリペプチドの両方をいう。所望ならば、ＬＧＲ８タンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０２０３】
（ＬＧＲ８ポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態によると、ＬＧＲ８ポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定することを可能にすることが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定の実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＬＧＲ８ポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＬＧＲ８ポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
【０２０４】
（ＬＧＲ８ポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＬＧＲ８ポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＬＧＲ８ポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２０５】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０６】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離もしくは放出の速度、吸着、または透過を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　１９９０を参照のこと。
【０２０７】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＬＧＲ８分子の物理的な状態、安定性、インビボでの放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０８】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本質的には、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料がおそらく補充される。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な代用物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＬＧＲ８ポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＬＧＲ８ポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０９】
このＬＧＲ８ポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的）のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内にある。
【０２１０】
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）でこの組成物を維持するために使用される。
【０２１１】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル中に所望のＬＧＲ８分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この中に、ＬＧＲ８分子は、滅菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物としては、その産物の制御された放出または持続した放出を提供する、注射可能なミクロスフェア、生分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームのような因子を有する、所望の分子の処方物が挙げられ得、これは、次いで、蓄積注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環中の持続時間を延長する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２１２】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドまたはＬＧＲ８核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２１３】
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた意図される。本発明の１つの実施形態において、この様式で投与されるＬＧＲ８ポリペプチドは、固体投薬形態（例えば、錠剤およびカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うかまたは伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化されそして前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合、胃腸管内にある時点でその処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＬＧＲ８ポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
【０２１４】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＬＧＲ８ポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム）；あるいは結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１５】
さらなるＬＧＲ８ポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これらには、持続送達処方物または制御送達処方物中にＬＧＲ８ポリペプチドを含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子もしくは多孔性ビーズおよび蓄積注射）の処方のための技術もまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御された放出を記載する）を参照のこと。
【０２１６】
持続性調製物のさらなる例としては、成形品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許１３３９８８号）が挙げられ得る。持続性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−３６９２；ならびに欧州特許０３６６７６号、欧州特許０８８０４６号、および欧州特許１４３９４９号を参照のこと。
【０２１７】
インビボ投与のために使用されるＬＧＲ８の薬学的組成物は、代表的に、滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
【０２１８】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体としてか、あるいは乾燥粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１９】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量の投与単位を生成するためのキットに関する。これらのキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。単一チャンバおよびマルチチャンバの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２２０】
治療的に使用されるＬＧＲ８の薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って、処置のための適切な投薬量レベルが、送達される分子、ＬＧＲ８分子が使用される指標、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面、または器官のサイズ）および患者の状態（年齢および全身的な健康状態）に部分的に依存して変化することが、当業者に理解される。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定（ｔｉｔｅｒ）し得、そして投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれを超える範囲にあり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にあり得る。
【０２２１】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＬＧＲ８分子の薬物動態学的パラメーターに依存する。代表的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、ある期間にわたる２回以上の投与（これは、同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる精密化は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者によって慣用的に実施される作業の範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２２２】
薬学的組成物の投与の経路は、公知の方法に従う：例えば、経口的にか；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内の経路による注射を介してか、あるいは持続系もしくは移植デバイスによる。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２２３】
あるいは、またはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化されている他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続投与を介し得る。
【０２２４】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＬＧＲ８ポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から取り出された細胞、組織または器官は、ＬＧＲ８ポリペプチドの薬学的組成物に曝露され、その後これらの細胞、組織または器官は、続いて患者に移植し戻される。
【０２２５】
他の場合において、ＬＧＲ８ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、ＬＧＲ８ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作された特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲の組織由来の他の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半透性ポリマーの包囲物または膜である。
【０２２６】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレントなＬＧＲ８遺伝子または過少発現される遺伝子を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＬＧＲ８ポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２７】
相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するように遺伝子を標的化するために元々開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、１９８９、Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。この基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノムの特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ　４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７、Ｃｅｌｌ　５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６−７８）開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、欧州特許第９１９３０５１号および第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９５５に記載される。
【０２２８】
相同組換えを介して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡにこのＤＮＡ配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖と接触させられる。共有される相同領域を介して内因性ＤＮＡの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込まれる。校正機能の結果として、この新たなＤＮＡ配列が、テンプレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたＤＮＡは、ゲノム内に組み込まれる。
【０２２９】
ＬＧＲ８ポリペプチドと相互作用し得るかまたはＬＧＲ８ポリペプチドの発現を制御し得るＤＮＡ領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの小片に結合される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外因性転写調節エレメントが、所望のＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、その意図される宿主細胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＬＧＲ８ポリペプチドの発現は、ＬＧＲ８遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ（その目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得、この調節セグメントは、ＬＧＲ８遺伝子の転写について認識可能なシグナルを、その内因性遺伝子配列に提供する。
【０２３０】
例示的な方法において、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望の内因性の細胞性遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入による、予め選択された部位でのその細胞ゲノムへの相同組換えを介して変更される。これらの成分は、実際に、これらの成分が、新たな転写単位の産生を生じる（ここで、そのＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位が、内因性遺伝子に作動的に連結される）ような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２３１】
本明細書中に記載されるように、変更された遺伝子発現は、得られたときの細胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または発現されるようにすること）、ならびに得られたときの細胞において生理学的に重要なレベルで発現されない遺伝子の発現を増大させることを包含する。この実施形態はさらに、得られたときの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得られたときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去することを含む）を包含する。
【０２３２】
相同組換えを用いて、細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からのＬＧＲ８ポリペプチド産生を増大させ得るかまたは生じさせ得る１つの方法は、第１に、相同組換えを用いて部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８９０−９００）由来の組換え配列を、細胞の内因性ゲノムＬＧＲ８ポリペプチドコード領域の上流に（すなわち、５’側に）配置することを包含する。ゲノムＬＧＲ８ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に相同な組換え部位を含むプラスミドは、この改変された細胞株に、適切なリコンビナーゼ酵素と共に導入される。このリコンビナーゼは、このプラスミドを、プラスミドの組換え部位を介して、その細胞株におけるゲノムＬＧＲ８ポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組み込ませる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−５５）。転写を増大させることが公知の任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド内に適切に配置された場合に、新たな転写単位または改変された転写単位を作製するような様式で組み込まれ、この細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からの新規ＬＧＲ８ポリペプチド産生または増大したＬＧＲ８ポリペプチド産生を生じる。
【０２３３】
部位特異的な組換え配列がその細胞の内因性ゲノムＬＧＲ８ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、相同組換えを使用して、第２の組換え部位を、この細胞株のゲノムの他の箇所に導入することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、この２組換え部位の細胞株に導入されて、これが、組換え事象（欠失、逆位および転座）を引き起こす（Ｓａｕｅｒ、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２２５：８９０−９００）。この組換え事象は、新たな転写単位または改変された転写単位を作製し、このことから、この細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からの新規ＬＧＲ８ポリペプチド産生または増加したＬＧＲ８ポリペプチド産生が生じることとなる。
【０２３４】
細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からのＬＧＲ８ポリペプチドの発現を増加させるかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からの新規ＬＧＲ８ポリペプチド産生または増加したＬＧＲ８ポリペプチド産生を生じる様式で、ある遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増加させるかもしくは引き起こすこと、および／またはある遺伝子（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、細胞の内因性ＬＧＲ８遺伝子からの新規ＬＧＲ８ポリペプチド産生または増加したＬＧＲ８ポリペプチド産生が生じるように、天然には存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）をその細胞に導入することを包含する。
【０２３５】
本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スプライスドナー部位。このＤＮＡ構築物における標的化配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の取り込みを、エレメント（ｂ）〜（ｄ）がその内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるように、指向する。別の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位、ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の取り込みを、（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、指向する。この標的化配列は、相同組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡにおける所定の部位に相同である。この構築物において、エキソンは、一般に、調節配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側である。
【０２３６】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中に提示されるＬＧＲ８ポリペプチドの核酸配列）が既知である場合には、この遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡ小片は、合成され得るか、またはさもなければ、例えば、その目的の領域に結合する特異的な認識部位でのネイティブＤＮＡの適切な制限によって、得られ得る。この小片は、細胞への挿入時に標的化配列として作用し、そしてゲノム内のその相同領域とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ小片およびこのＤＮＡ小片に結合した任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そして新たに合成されたＤＮＡの娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２３７】
ＬＧＲ８ポリペプチド細胞治療（例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた意図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＬＧＲ８ポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植することを包含する。このようなＬＧＲ８ポリペプチド産生細胞は、ＬＧＲ８ポリペプチドの天然の産生者である細胞であり得るか、または所望のＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはＬＧＲ８ポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換することによってそのＬＧＲ８ポリペプチドを産生する能力が増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子を送達するため、ならびにその発現および分泌を促進するために適したベクターによって、達成され得る。ＬＧＲ８ポリペプチドを投与される患者において、外来種のポリペプチドの投与によって生じ得るような潜在的な免疫学的反応を最小化するためには、ＬＧＲ８ポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源でありかつヒトＬＧＲ８ポリペプチドを産生することが、好ましい。同様に、ＬＧＲ８ポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが、好ましい。
【０２３８】
移植される細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、ＬＧＲ８ポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半透過性のポリマー包囲物または膜内で、患者に移植され得る。あるいは、ＬＧＲ８ポリペプチドを産生するようエキソビボで形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしに、患者に直接移植され得る。
【０２３９】
生存細胞をカプセル化するための技術は、当該分野において公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製および患者へのこれらの移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のための、遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。これらのカプセルは生体適合性であり、そして容易に回収可能である。これらのカプセルは、プロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、これらのプロモーターは、哺乳動物宿主への移植の際に、インビボでのダウンレギュレーションに供されない。このデバイスは、生存細胞からレシピエント内の特定の部位への分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するための系は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２、ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２４０】
ＬＧＲ８ポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結され得るＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＬＧＲ８遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内因性ＬＧＲ８遺伝子に対して同種であっても異種であってもよいが、但し、この構築物が挿入される細胞または組織型において、活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的なプロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、ベクターによる発現を増強する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２４１】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、細胞に（エキソビボまたはインビボでのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによる。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質内に残る。
【０２４２】
なお他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＬＧＲ８遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して、オンにされる。このようにして、治療ポリペプチドは、所望のときに発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化するための、低分子二量体化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５；ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）の使用を包含する。このタンパク質の二量体化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
【０２４３】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、その細胞の内側で凝集体またはクラスターとして貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質は、条件的凝集ドメインを含み、このドメインは、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を生じる。貯蔵されたタンパク質は、細胞内で安定かつ不活性である。しかし、これらのタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去し、これによってこの凝集体またはクラスターを特異的に破壊する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、その結果、これらのタンパク質は、その細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２４４】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニストに対する、改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインの結合は、２つの転写因子の二量体を形成し、次いで、これらの転写因子が、核に入り込んでＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、そのレセプターがその天然のリガンドに結合する能力を排除するよう改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、米国特許第５，３６４，７９１号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に、さらに記載されている。
【０２４５】
なお別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエのステロイドホルモン）を使用し、これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこのレセプターを活性化する。次いで、このレセプターは、核に移行して、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）を結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、米国特許第５，５１４，５７８号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている。
【０２４６】
別の制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン制御可能トランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化させるポリペプチドに連結された、変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランスアクチベータータンパク質（すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下で、ｔｅｔオペレーターに結合する）を生じる変異ｔｅｔ　Ｒ−４アミノ酸変化）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０２４７】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号に記載されている。
【０２４８】
インビボ遺伝子治療は、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＬＧＲ８核酸分子の局所的注射を介してかまたは他の適切なウイルス送達ベクターもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ　１９９４、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　２５：１４１８−３５。例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結されたＬＧＲ８ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４９】
代替の適切なウイルスベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスおよびパピローマウイルスのベクター。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、インビトロで治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが挿入されるように処理されたヒト細胞の送達によって治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第５，６３１，２３６号（これは、アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（これは、レトロウイルスを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（これは、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）。
【０２５０】
非ウイルス送達方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：リポソーム媒介性移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介性移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）。遺伝子治療材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親の細胞よりも選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全手段）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強させるための転写因子ならびにベクター製造の方法も包含し得る。遺伝子治療技術の実施のためのそのようなさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第４，９７０，１５４号（これは、エレクトロポレーション技術を含む）；米国特許第５，６７９，５５９号（これは、遺伝子治療のためのリポタンパク質含有系を記載する）；米国特許第５，６７６，９５４号（これは、リポソームキャリアを含む）；米国特許第５，５９３，８７５号（これは、リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）；および米国特許第４，９４５，０５０号（ここでは、生物学的に活性な粒子は、その粒子が細胞の表面に浸透し、そしてその細胞の内部へと取り込まれるようになる速度で細胞に噴霧される）、ならびにＰＣＴ公開番号　ＷＯ９６／４０９５８（これは、核リガンドを含む）。
【０２５１】
ＬＧＲ８遺伝子治療またはＬＧＲ８細胞治療がさらに、同一細胞または異なる細胞への１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることもまた、意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のようなカプセル化膜）に含まれ得るか、または細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２５２】
遺伝子治療を介して細胞中の内因性ＬＧＲ８ポリペプチド発現を増大させるための手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをＬＧＲ８ポリペプチドプロモーターに挿入し、ここで、このエンハンサーエレメントは、ＬＧＲ８遺伝子の転写活性を増大させるようにはたらき得る。使用されるエンハンサーエレメントは、その遺伝子を活性化しようと望む組織に基づいて選択され、その組織においてプロモーター活性化を与えることが公知のエンハンサーエレメントが、選択される。
例えば、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「ターン−オン（ｔｕｒｎ　ｏｎ）される場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いてＬＧＲ８ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として公知のこの構築物が、エキソビボまたはインビボのいずれかで所望の細胞に導入され得る。
【０２５３】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、ＬＧＲ８ポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、代表的に相同組換え方法を介して達成される。例えば、不活性化について選択されたＬＧＲ８遺伝子のプロモーター全体またはこのプロモーターの一部を含むＤＮＡ分子が操作されて、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換し得る。例えば、プロモーターのＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位は、標準的な分子生物学技術を用いて欠失され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それによって、対応するＬＧＲ８遺伝子の転写を抑制する。プロモーター中のＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるＬＧＲ８遺伝子と同じ種または関連する種から）ＬＧＲ８ポリペプチドプロモーターの全体または関連する部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性を減少するかまたは完全に不活性化される。この構築物（これはまた、代表的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブ（内因性）の５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む）は、直接的にかまたは本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してかのいずれかで、適切な細胞（エキソビボまたはインビボのいずれか）に導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組込みは、相同組換えを介し、ここで、プロモーター構築物中の５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを介して改変プロモーター領域の組込みを補助するように作用し得る。
【０２５４】
（治療的使用）
ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、多数の疾患、障害、または状態（本明細書中に言及されるものを含む）を処置、診断、改善、または予防するために使用され得る。
【０２５５】
ＬＧＲ８ポリペプチドアゴニストおよびＬＧＲ８ポリペプチドアンタゴニストは、ＬＧＲ８ポリペプチド活性を調節する分子およびＬＧＲ８ポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増大または減少させるかのいずれかである分子を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量の分子）であり得、これらは、ＬＧＲ８ポリペプチドと相互作用し、それによってＬＧＲ８ポリペプチドの活性を調節する。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはポリペプチドアンタゴニストは、ＬＧＲ８タンパク質の細胞外ドメインの一部または全体を含む、可溶性形態のＬＧＲ８ポリペプチドまたは膜結合形態のＬＧＲ８ポリペプチドのいずれかと反応する抗体を含む。ＬＧＲ８ポリペプチド発現を調節する分子は代表的に、発現のアンチセンス調節因子として作用し得るＬＧＲ８ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２５６】
糖タンパク質ホルモンレセプターサブファミリーの７つのメンバーが、以前に同定されている。これらのうちには、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプター、黄体化ホルモン（ＬＨ）／絨毛性性腺刺激（ＣＧ）レセプター、およびロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質結合レセプター（ＬＧＲ）４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６およびＬＧＲ７がある。ＴＳＨ、ＦＳＨ、およびＬＨ／ＣＧレセプターは、機能的に十分に特徴付けられ、これらのレセプターを介したシグナル伝達は、甲状腺および性腺の増殖および分化に重要な役割を果たす。ＴＳＨレセプターを介したシグナル伝達は、甲状腺ホルモンの産生を調節することによって、基礎代謝に影響を与えることが公知である。ＴＳＨレセプターのＮ末端細胞外ドメインのエピトープに対する自己免疫抗体は、種々の甲状腺ホルモン関連代謝障害を引き起こす。このような自己免疫抗体は、アンタゴニストであり得、甲状腺機能低下症（橋本甲状腺炎のサブグループ）の形態を引き起こすか、またはこのような自己免疫抗体は、アゴニストであって甲状腺機能亢進症（グレーヴズ病）の形態を引き起こす。ＦＳＨレセプターおよびＬＨ／ＣＧレセプターを介したシグナル伝達は、雄性および雌性における生殖機能の維持（すなわち、性腺成熟および性腺ステロイド産生）に重要な役割を果たすことが公知である。さらに、ＬＨ／ＣＧレセプターを介したシグナル伝達は、黄体を刺激して、最初のトリメスターの間にステロイドホルモンを産生することによって、妊娠を維持することに重要な役割を果たすことが公知である。ＴＳＨレセプター、ＦＳＨレセプター、およびＬＨ／ＣＧレセプターは、重要な発生機能（すなわち、増殖および分化）および生理学的機能を有することが公知なので、ＬＧＲ８もまた、おそらく発生およびヒトの生理機能に重要な役割を果たす。
【０２５７】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、骨格筋中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、骨格筋に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、悪液質および筋ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。骨格筋の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５８】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、子宮中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、子宮に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、流産、子宮内膜症、子宮癌、および女性の不妊が挙げられるが、これらに限定されない。子宮の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５９】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、副腎中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、副腎に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、クッシング病およびアジソン病が挙げられるが、これらに限定されない。副腎の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６０】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、精巣中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、精巣に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、男性の不妊および精巣の癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。精巣の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６１】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、骨髄中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、骨髄に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、白血病が挙げられるが、これに限定されない。骨髄の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６２】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、胎児腎臓中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、腎臓に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、貧血、高血圧および低血圧が挙げられるが、これらに限定されない。腎臓の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６３】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、胎児卵巣中で検出されているので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、卵巣に影響を与える疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。このような疾患および状態の例としては、女性の不妊および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。卵巣の発生および機能に関連する他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６４】
ＬＧＲ８ポリペプチドは、細胞増殖および細胞分化において役割を果たしているようなので、ＬＧＲ８核酸分子、ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、細胞増殖および細胞分化を調節する疾患および状態の診断または処置に有用であり得る。例えば、本発明のＬＧＲ８分子は、細胞増殖および細胞分化を増大するために使用され得る。細胞増殖および細胞分化を増大させることによって処理され得る疾患および状態の例としては、組織損傷および組織変性（例えば、癌治療、感染、自己免疫疾患または障害によって引き起こされるようなもの）、加齢、および創傷治癒が挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖および細胞分化を増大させることによって処理され得る他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６５】
あるいは、本発明のＬＧＲ８分子は、細胞増殖および細胞分化を減少するために使用され得る。細胞増殖および細胞分化を減少させることによって処置され得る疾患および状態の例としては、癌、過形成、および肥大が挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖および細胞分化を減少させることによって処理され得る他の疾患および状態が、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６６】
ＬＧＲ８ポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切な場合、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗体、抗炎症因子、および／または化学療法剤と組合わせて（同時または連続的に）使用され得る。
【０２６７】
所望されないＬＧＲ８ポリペプチドレベルによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患または障害が、本発明の範囲内に含まれる。所望されないレベルとしては、ＬＧＲ８ポリペプチドの過剰なレベルおよびＬＧＲ８ポリペプチドの通常より下のレベルが挙げられる。
【０２６８】
（ＬＧＲ８核酸およびＬＧＲ８ポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体が生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、ＬＧＲ８遺伝子および関連する遺伝子の位置を染色体上にマップするために使用され得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によって実行され得る。
【０２６９】
ＬＧＲ８核酸分子（それ自体が生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物の組織サンプルまたは体液サンプル中のＬＧＲ８核酸分子の存在について、定性的にかまたは定量的かのいずれかで試験するために診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【０２７０】
他の方法もまた使用され得、ここで、１つ以上のＬＧＲ８ポリペプチドの活性を阻害することが望ましい。このような阻害は、発現制御配列（三重ヘリックス形成）またはＬＧＲ８　ｍＲＮＡに相補的であり、かつこれらにハイブリダイズする核酸分子によってもたらされ得る。例えば、ＬＧＲ８遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が、細胞に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＬＧＲ８遺伝子の配列を用いて、利用可能な技術によって設計され得る。代表的に、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＬＧＲ８遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＬＧＲ８　ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの転写が、妨害されるかまたは減少する。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物中のＬＧＲ８ポリペプチドの減少またはＬＧＲ８ポリペプチドが存在しないことに関する情報を提供する。
【０２７１】
あるいは、遺伝子治療は、１つ以上のＬＧＲ８ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製するために使用され得る。この状況において、選択された各ＬＧＲ８ポリペプチドの変異ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され、そして、本明細書中に記載されるようなウイルス方法または非ウイルス方法のいずれかを用いて、患者の細胞に導入され得る。このような変異の各々は、代表的に、内因性ポリペプチドとその生物学的役割について競合するように設計される。
【０２７２】
さらに、ＬＧＲ８ポリペプチド（生物学的に活性であるか活性でないかに関わらず）は、免疫原として使用され得、すなわち、このポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。ＬＧＲ８ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される）に結合する選択的結合因子は、インビボ診断目的およびインビトロ診断目的（体液サンプルまたは細胞サンプル中のＬＧＲ８ポリペプチドの存在を検出するための、標識された形態での使用が挙げられるが、これに限定されない）のために使用され得る。抗体はまた、多数の疾患および障害（本明細書中に言及される疾患および障害を含む）を予防、処置、または診断するために使用され得る。抗体は、ＬＧＲ８ポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を減少もしくはブロックするようにＬＧＲ８ポリペプチドに結合し得るか、またはＬＧＲ８ポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を増加させるように（ＬＧＲ８ポリペプチドの薬物動態を増大させることによるものも含む）ポリペプチドに結合し得る。
【０２７３】
ＬＧＲ８ポリペプチドを使用して、「発現クローニング」ストラテジーを用いてＬＧＲ８リガンドをクローニングし得る。放射性標識された（１２５ヨウ素）ＬＧＲ８ポリペプチドまたは「アフィニティー／活性標的された」ＬＧＲ８ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）を結合アッセイに使用して、ＬＧＲ８リガンドを発現する細胞型、細胞株、または組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞または２９３細胞）にトランスフェクトされて、発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射性標識されたＬＧＲ８ポリペプチドまたはタグ化されたＬＧＲ８ポリペプチドをアフィニティー試薬として使用して、ＬＧＲ８リガンドを発現するこのライブラリー中で細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡをこれらの細胞から単離し、哺乳動物細胞にトランスフェクトし、ＬＧＲ８リガンドを発現する細胞の分画が元々のライブラリーよりも何倍も高い二次発現ライブラリーを作製する。この富化プロセスは、ＬＧＲ８リガンドを含む単一組換えクローンが単離されるまで、反復して繰り返され得る。ＬＧＲ８リガンドの単離は、ＬＧＲ８シグナル伝達経路の新規アゴニストおよび新規アンタゴニストを同定または開発するのに有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＬＧＲ８リガンド、抗ＬＧＲ８リガンド抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２７４】
本発明のマウスＬＧＲ８核酸およびヒトＬＧＲ８核酸はまた、対応する染色体ＬＧＲ８ポリペプチド遺伝子を単離するために有用な手段である。例えば、ＬＧＲ８配列を含むマウス染色体ＤＮＡを使用して、ノックアウトマウスを構築し得、これによって、ＬＧＲ８ポリペプチドのインビボでの役割の試験を可能にする。ヒトＬＧＲ８ゲノムＤＮＡを使用して、遺伝性の組織変性疾患を同定し得る。
【０２７５】
以下の実施例は、例示目的のみのためであることが意図され、いかなる様式でも本発明の範囲を限定するとして構築されるべきではない。
【０２７６】
（実施例１：ヒトＬＧＲ８遺伝子およびマウスＬＧＲ８遺伝子のクローニング）
一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を使用して、マウスＬＧＲ８ポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
【０２７７】
ヒトゲノム配列の情報に基づく検索によって、ヒトＬＧＲ８をコードするヌクレオチド配列の３’末端の同定を導いた。類似の検索によって、ヒトＬＧＲ８の成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを欠く）をコードするヌクレオチド配列の５’末端の同定を導いた。次いで、これらの配列を使用して、種々のＰＣＲストラテジーを用いて、ｃＤＮＡ供給源の同定およびｃＤＮＡクローンの作製のために、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを設計した。非常に相同であるが同一ではないいくつかのＬＧＲ８配列をこのようにして単離した。これらの配列の分析によって、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、ＬＧＲ８−Ｃ、およびＬＧＲ８−Ｄの成熟形態（すなわち、ＬＧＲ８開始コドンおよびシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を欠く形態）をコードする４つのヌクレオチド配列の同定を導いた。
【０２７８】
ヒトＬＧＲ８−Ａの成熟形態をコードするヌクレオチド配列を、最終容量５０μＬでの、５μｌヒト腎Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡテンプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、１．０μｍの各アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒｓ）（５’−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−３’（配列番号２７）および５’−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−ＡＡ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−３’（配列番号２８））、２００μｍのｄＮＴＰ、２．５ＵのＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、および５μＬ　１０×ＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液を用いる、増幅反応において得た。反応は、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で５分間を４５サイクル；ならびに７２℃で７分間を１サイクル、で実行した。
【０２７９】
この増幅混合物を、アガロースゲル上で分離し、ＰＣＲ産物をこのゲルから単離し、次いで、生成物を平滑末端化してｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。多数のクローンを配列決定し、各々が、非常に相同性（同一ではない）ＬＧＲ８ヌクレオチド配列を含んだ。これらの配列を使用して、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、ＬＧＲ８−Ｃ、およびＬＧＲ８−Ｄの成熟形態（すなわち、開始コドンおよびシグナルペプチドを欠く形態）をコードするヌクレオチド配列を収集した。
【０２８０】
ヒトＬＧＲ８の未成熟形態のｃＤＮＡ配列の５’末端に対応するｃＤＮＡ配列を単離するために、５’ＲＡＣＥを、最終容量５０μＬでの、５μＬヒト腎Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡテンプレート、１．０μｍの各プライマー（５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号２９）および５’−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−３’（配列番号３０））、２００μｍのｄＮＴＰ、１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ緩衝液を用いて、実行した。反応は、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で２０秒間および６８℃で３分間を３５サイクル；ならびに６８℃で３分間を１サイクル、で実行した。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを、最終容量５０μＬでの、０．１μＬ　５’ＲＡＣＥ増幅産物、１．０μｍの各プライマー（５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号３２）および５’−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−３’（配列番号３３））、２００μｍのｄＮＴＰ、１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ポリメラーゼミックス、および５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ緩衝液を用いて、実行した。ネスティッドＰＣＲ反応は、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で２０秒間および７２℃で３分間を２８サイクル；ならびに７２℃で３分間を１サイクル、で実行した。
【０２８１】
あるいは、５’ＲＡＣＥを、最終容量５０μＬでの、５μｌヒト腎Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡテンプレート、１．０μｍの各プライマー（５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号２９）および５’−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−３’（配列番号３１））、２００μｍのｄＮＴＰ、１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ポリメラーゼミックス、および５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ緩衝液を用いて、実行した。反応は、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で２０秒間、６８℃で３分間を３５サイクル；ならびに６８℃で３分間を１サイクル、で実行した。ネスティッドＰＣＲを、最終容量５０μＬでの、０．１μＬ　５’ＲＡＣＥ増幅産物、１．０μｍの各プライマー（５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−３’（配列番号３２）および５’−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−３’（配列番号３４））、２００μｍのｄＮＴＰ、１μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ポリメラーゼミックス、および５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　ＰＣＲ緩衝液を用いて、実行した。ネスティッドＰＣＲ反応は、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で２０秒間および７２℃で３分間を２８サイクル；ならびに７２℃で３分間を１サイクル、で実行した。
【０２８２】
ネスティッド増幅反応で作製したＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離し、このＰＣＲ産物をゲルから単離し、次いで、生成物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。多数のクローニングを配列決定し、その各々が、ＬＧＲ８の成熟形態をコードする配列に相同である配列を含むが、メチオニンおよび全長シグナルペプチドもコードした。これらの配列を使用して、ＬＧＲ８−Ａ、ＬＧＲ８−Ｂ、ＬＧＲ８−Ｃ、およびＬＧＲ８−Ｄの全長ｃＤＮＡをコードする４つのヌクレオチド配列（すなわち、開始コドンおよびシグナルペプチドをコードするもの）を収集した。
【０２８３】
ＬＧＲ８−Ａコード配列は、大きなＮ末端ロイシンリッチ反復を含む細胞外ドメイン、推定７回膜貫通ドメインおよび細胞質Ｃ末端領域をコードする。全長ＬＧＲ８−Ａコード配列の配列分析によって、このｃＤＮＡが７５４アミノ酸のタンパク質をコードする２２６２ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図１Ａ〜１Ｄ）。ＬＧＲ８−Ａの成熟形態は、７１８アミノ酸長である。ＬＧＲ８−Ａは、糖タンパク質ホルモンレセプターＬＧＲ７に最もよく関連している（図１０Ａ〜１０Ｂ）。
【０２８４】
ＬＧＲ８−Ｂコード配列は、このＬＧＲ８−Ｂコード配列がＮ末端細胞外ドメインをコードする配列の一部を欠くこと以外は、ＬＧＲ８−Ａコード配列に同一である。全長ＬＧＲ８−Ｂコード配列の配列分析によって、このｃＤＮＡが、７３０アミノ酸のタンパク質をコードする２１９０ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図３Ａ〜３Ｄ）。ＬＧＲ８−Ｂの成熟形態は、６９４アミノ酸長である。
【０２８５】
ＬＧＲ８−Ｃコード配列は、このＬＧＲ８−Ｃコード配列がＮ末端細胞外ドメインをコードする配列の一部を欠く以外は、ＬＧＲ８−Ａコード配列に同一である。全長ＬＧＲ８−Ｃコード配列の配列分析によって、このｃＤＮＡが、６８２アミノ酸のタンパク質をコードする２０４６ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図５Ａ〜５Ｄ）。ＬＧＲ８−Ｃの成熟形態は、６４６アミノ酸長である。
【０２８６】
ＬＧＲ８−Ｄコード配列は、ＬＧＲ８−Ｂコード配列のＮ末端細胞外ドメインの約９０％をコードする配列からなるが、膜貫通ドメインおよび細胞質Ｃ末端領域をコードする配列を欠く。全長ＬＧＲ８−Ｄコード配列の配列分析によって、このｃＤＮＡが、３６６アミノ酸のタンパク質をコードする１０９８ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図７Ａ〜７Ｂ）。ＬＧＲ８−Ｄの成熟形態は、３３０アミノ酸長である。
【０２８７】
マウスＬＧＲ８−ＡをコードするｃＤＮＡ配列を同定するために、ヒトゲノムデータベースの相同性に基づくＢＬＡＳＴ検索を、ヒトＬＧＲ８−Ａのアミノ酸配列を用いて実行した。高い程度の相同性を共有する多数の配列を、公開された２１３ｋｂのマウスゲノム配列（登録番号ＡＣ０７７６８９）内に見出した。既知の遺伝子に対するエキソンも、遺伝子も相同性も、記録されていたこのＡＣ０７７６８９配列中には同定されなかった。従って同定されたこの配列を、手で補正し、電子的に編集して、マウスＬＧＲ８−Ａをコードする完全ヌクレオチド配列を得た（図８Ａ〜８Ｄ）。成熟ヒトＬＧＲ８−Ａ配列および成熟マウスＬＧＲ８−Ａ配列の配列比較によって、これらの配列が、８６．６％の類似性および８３．１％の同一性を共有することが示される（図１１Ａ〜１１Ｂ）。ヒトＬＧＲ８−ＡおよびマウスＬＧＲ８−ＡのＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドなし）の配列比較によって、これらの配列が８５．５％の類似性および８２．３％の同一性を共有することが示される（図１２）。
【０２８８】
（実施例２：ＬＧＲ８　ｍＲＮＡの発現）
プローブとしてヒトＬＧＲ８コード配列から生成したＰＣＲフラグメントを用いて、種々のヒトの複数の組織のＮｏｒｔｈｅｒｎブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）においてハイブリダイゼーションシグナルを得ることは不可能であったので、ＬＧＲ８　ｍＲＮＡの発現をＰＣＲによって分析した。
【０２８９】
胎児の副腎、脳、腎臓、肝臓、肺、脾臓、胸腺、および成体の骨髄、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、胎盤、網膜、骨格筋、小腸、脾臓、精巣、胸腺、下垂体、副腎、および前立腺について、ヒトＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）においてイントロンスパンニングＰＣＲを最初に実施した。
【０２９０】
ＰＣＲにおいて試験したヒトｃＤＮＡライブラリーは、以下のように調製した。総ＲＮＡを、適切な組織または細胞株から、標準的なＲＮＡ抽出手順を用いて抽出し、そしてポリ−Ａ＋ＲＮＡを、標準的な手順を使用してこの総ＲＮＡから選択した。ランダムにプライムされたか、またはオリゴ−ｄＴでプライムされたｃＤＮＡを、このポリ−Ａ＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングキット用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、製造者の示唆したプロトコル、または当業者に公知の他の適切な手順に従って合成した。得られたｃＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、次いでｐＳＰＯＲＴ−１、または当業者に公知の他の適切なベクターにライゲーションする。ライゲーション産物を、標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして細菌性形質転換体を、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールを含有する培養プレートで選択した。ｃＤＮＡライブラリーは、これらの形質転換体の全てまたはサブセットから構成された。
【０２９１】
これらのサンプルにおけるＬＧＲ８　ｍＲＮＡの発現を、最終容積２５μＬ中で、テンプレートとして３μＬのヒトＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ、各々１．０μｍのアンプライマー５’−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−３’（配列番号３５）、および５’−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−３’（配列番号３６）、２００μｍのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ならびに２．５μＬ　１０Ｘ　ＰＣＲ反応緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて増幅反応において分析した。反応を、９４℃にて３分間を１サイクル；９４℃にて３０秒間および７０℃にて１．５分間を３５サイクル；ならびに７０℃にて１０分間を１サイクルで行った。増幅混合物をアガロースゲル上で分離し、そして予期されるサイズ（３１９ｂｐ）のＰＣＲ産物を、成体の骨格筋、精巣、および副腎で同定した。
【０２９２】
次に、以下の組織についての自社のオリゴ−ｄＴプライムしたそしてランダムプライムしたヒトｃＤＮＡライブラリー上で、イントロンスパンニングＰＣＲを実施した：胎児の胃（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児の胃（ランダムプライムした）、橋／延髄（髄質）（オリゴ−ｄＴプライムした）、乳房腫瘍Ｔ１４８５（オリゴ−ｄＴプライムした）、乳房腫瘍Ｔ１４８５（ランダムプライムした）、卵巣腫瘍Ｔ２２（オリゴ−ｄＴプライムした）、卵巣腫瘍Ｔ２２（ランダムプライムした）、胎児胸腺（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児胸腺（ランダムプライムした）、胎児腸間膜（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児腸間膜（ランダムプライムした）、胎盤（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎盤（ランダムプライムした）、複数の細胞株［Ａ２０４、Ａ６７３、Ｈｓ７２９Ｔ、ＨＩＳＭおよびＲＤ（オリゴ−ｄＴプライムした）］、複数の細胞株［Ａ２０４、Ａ６７３、Ｈｓ７２９Ｔ、ＨＩＳＭおよびＲＤ（ランダムプライムした）］、胎児膵臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児膵臓（ランダムプライムした）、リンパ腫細胞株（オリゴ−ｄＴプライムした）、リンパ腫細胞株（ランダムプライムした）、卵巣腫瘍Ｔ２３（オリゴ−ｄＴプライムした）、卵巣腫瘍Ｔ２３（ランダムプライムした）、結腸腫瘍Ｔ２５（オリゴ−ｄＴプライムした）、結腸腫瘍Ｔ２５（ランダムプライムした）、成体Ｔ細胞（オリゴ−ｄＴプライムした）、正規化した胎児組織（ランダムプライムした）、胎児心臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児心臓（ランダムプライムした）、胎児膀胱（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児膀胱（ランダムプライムした）、胎児腎臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児腎臓（ランダムプライムした）、肺腫瘍Ｔ２７（オリゴ−ｄＴプライムした）、肺腫瘍Ｔ２７（ランダムプライムした）、胎児肝臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、細胞質乳房癌腫細胞株（オリゴ−ｄＴプライムした）、細胞質乳房癌腫細胞株（ランダムプライムした）、胎児脾臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児脾臓（ランダムプライムした）、子宮（オリゴ−ｄＴプライムした）、子宮（ランダムプライムした）、副腎（オリゴ−ｄＴプライムした）、副腎（ランダムプライムした）、前脳（オリゴ−ｄＴプライムした）、前脳（ランダムプライムした）、精巣（オリゴ−ｄＴプライムした）、精巣（ランダムプライムした）、結腸腫瘍Ｔ２４（オリゴ−ｄＴプライムした）、結腸腫瘍Ｔ２４（ランダムプライムした）、胎児心臓（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児頭皮（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児頭皮（ランダムプライムした）、胎児肺（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児肺（ランダムプライムした）、気管（オリゴ−ｄＴプライムした）、気管（ランダムプライムした）、小脳（オリゴ−ｄＴプライムした）、中脳ＬＮＶブロック１０（オリゴ−ｄＴプライムした）、中脳ＬＮＶブロック１０（ランダムプライムした）、前立腺腫瘍Ｔ１９４０（ランダムプライムした）、胎児卵巣（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児頭蓋冠（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児頭蓋冠（ランダムプライムした）、胎児胆嚢（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児胆嚢（ランダムプライムした）、脊柱（オリゴ−ｄＴプライムした）、脊柱（ランダムプライムした）、視床（オリゴ−ｄＴプライムした）、前立腺腫瘍Ｔ１１７５（オリゴ−ｄＴプライムした）、前立腺腫瘍Ｔ１１７５（ランダムプライムした）、乳房腫瘍Ｔ１５４３（オリゴ−ｄＴプライムした）、乳房腫瘍Ｔ１５４３（ランダムプライムした）、胎児皮膚（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児皮膚（ランダムプライムした）、胎児大腿骨（オリゴ−ｄＴプライムした）、胎児大腿骨（ランダムプライムした）、Ｔリンパ球（オリゴ−ｄＴプライムした）、Ｔリンパ球（ランダムプライムした）、脚（四肢）の骨（オリゴ−ｄＴプライムした）、および脚（四肢）の骨（ランダムプライムした）。これらのｃＤＮＡライブラリーは上記のように調製した。
【０２９３】
テンプレートとして、５０ｎｇのｃＤＮＡを用いて、これらのｃＤＮＡサンプルにおけるＬＧＲ８　ｍＲＮＡの発現を、本質的に上記のように分析した。増幅混合物をアガロースゲル上で分離して、予期されるサイズのＰＣＲ産物を、胎児腎臓、卵巣、および大腿骨、ならびに成体の子宮、副腎、および前脳において同定した。
【０２９４】
ＰＲＩＳＭ　Ｔａｑｍａｎシステムを用いた定量的ＰＣＲを、脳、心臓、小脳、脾臓、肺、骨格筋、腎臓、精巣、小腸、膵臓、骨髄、海馬、視床、脊髄、子宮、前立腺、胃、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、肝臓およびＨｅＬａ細胞のヒトｃＤＮＡ（ｍＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手；ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ；Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬを用いて調製した）で実施した。Ａ４３２細胞、２９３細胞、および白色脂肪組織のヒトｃＤＮＡ（ｍＲＮＡは、標準的なＲＮＡ抽出手順を用いて組織または細胞株から抽出した；ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した）も試験した。
【０２９５】
ＬＧＲ８　ｍＲＮＡ発現を評価するために、最終容積５０μＬ中で、テンプレートとして５０ｎｇのｃＤＮＡ、各々３００ｎｍのプライマー５’−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’（配列番号３７）、および５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’（配列番号３８）、２００ｎｍの蛍光発生プローブ５’−（６−ＦＡＭ）−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ，ＰＥ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；配列番号３９；ここで「６−ＦＡＭ」は、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセインであり、そして「ＴＡＭＲＡ」は、３’クエンチャー６−カルボキシテトラ−メチルローダミンである）、２００μｍのｄＮＴＰ、０．５Ｕのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＡｍｐＥｒａｓｅ　ＵＮＧ；ＰＥ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、１．２５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、および５μＬ　１０×Ｔａｑｍａｎ反応緩衝液（ＰＥ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＰＲＩＳＭ　Ｔａｑｍａｎ反応を実施した。反応を、５０℃において２分間および９５℃において１０分間の１サイクル、そして９５℃において１５秒間および６０℃において１分間の４０サイクルで実施した。ＬＧＲ８　ｍＲＮＡ発現について分析したｃＤＮＡサンプルの各々におけるサイクロフィリンｍＲＮＡ発現を測定することによって、ＬＧＲ８　ｍＲＮＡ発現を、ヒトハウスキーパータンパク質であるサイクロフィリンに対して正規化した。
【０２９６】
サイクロフィリンｍＲＮＡ発現を評価するために、各々３００ｎｍのプライマー５’−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−３’（配列番号４０）および５’−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ａ−３’（配列番号４１）、および２００ｎＭの蛍光発生プローブ５’−（６−ＦＡＭ）−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ，ＰＥ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；配列番号４２；ここで「６−ＦＡＭ」は、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセインであり、そして「ＴＡＭＲＡ」は、３’クエンチャー６−カルボキシテトラ−メチルローダミンである）を用いて、ＰＲＩＳＭ　Ｔａｑｍａｎ反応を上記のように実施した。骨格筋および子宮において、最高レベルのＬＧＲ８　ｍＲＮＡ発現を検出した。副腎および精巣においてさらに低いレベルを見出し、視床および骨髄ではさらに低いレベルであった。　ＬＧＲ８　ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化した。正常胚および成体マウス組織のパネルを４％パラホルムアミド中で固定し、パラフィンに包埋し、そして５μｍに切片化した。切片化した組織を、０．２Ｍ　ＨＣｌ中で透過化処理し、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハート溶液、０．２％　ＳＤＳ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ　ポリＡ，２５μｇ／ｍｌ　ポリＣおよび５０％ホルムアミド）中で１時間６０℃でプレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよび２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ−標識アンチセンスリボプローブ（ヒトＬＧＲ８遺伝子に相補的）を含有する同じ溶液中で６０℃で一晩ハイブリダイズする。標準的技術を用いて、ヒトＬＧＲ８　ｃＤＮＡ配列を含有するクローンのインビトロ転写によって、このリボプローブを得る。
【０２９７】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、４℃で３週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（矢状断面１つおよび冠状断面２つ）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲）、骨（大腿）、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗野かつ標準のイルミネーションによって同時に分析する。
【０２９８】
（実施例３：ＬＧＲ８ポリペプチドの生成）
（Ａ．細菌におけるＬＧＲ８ポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、制限酵素部位を含むようにして、発現ベクター内への挿入を可能にし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサート（挿入物）の存在を確認する。
【０２９９】
形質転換した宿主細胞を、導入前に、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。最終濃度３０ｎｇ／ｍＬへのＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＬＧＲ８ポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０３００】
ＬＧＲ８ポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌおよび０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）中にホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０１】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＬＧＲ８ポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５に記載のように決定する。
【０３０２】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＬＧＲ８ポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、制限酵素部位を含むようにして発現ベクター内への挿入を可能にし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法を用いて発現ベクター中に挿入する。エプスタイン・バーウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＬＧＲ８ポリペプチドの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＬＧＲ８ポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０３】
ＬＧＲ８ポリペプチド発現は、銀染色によって検出できる。あるいは、ＬＧＲ８ポリペプチドは、ペプチドタグに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）との融合タンパク質として生成する。
【０３０４】
ＬＧＲ８ポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得る、またはＬＧＲ８融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０３０５】
（Ｃ．哺乳動物細胞からのＬＧＲ８ポリペプチドの精製）
リポフェクチンまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３　ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、ＬＧＲ８ポリペプチド発現構築物を導入する。
【０３０６】
生成されるＬＧＲ８ポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３　ＥＢＮＡクローンのプールから大量の馴化培地を生成する。この細胞を５００ｃｍ　Ｎｕｎｃ　Ｔｒｉｐｌｅ　Ｆｌａｓｋ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換える。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃で凍結しておく。
【０３０７】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通す。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードした。このカラムを、Ａ２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄する。０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌを用いてｐＨ２．７でＬＧＲ８ポリペプチドを、カラムから溶出し、直ちに１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和する。ＬＧＲ８ポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵する。
【０３０８】
ヒトＬＧＲ８ポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化する。
【０３０９】
（実施例４：抗ＬＧＲ８ポリペプチド抗体の生成）
ＬＧＲ８ポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＬＧＲ８ペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載の手順を含む。
【０３１０】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＬＧＲ８抗原（例えば、ＬＧＲ８ポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＬＧＲ８抗体産生について試験する。
【０３１１】
抗ＬＧＲ８抗体を得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３１２】
（実施例５：トランスジェニックマウスにおけるＬＧＲ８ポリペプチドの発現）
ＬＧＲ８ポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＬＧＲ８ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、ＬＧＲ８ポリペプチドの機能に関する情報である、病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長ＬＧＲ８ポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、遍在性発現を生じることが期待される。
【０３１３】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、ＬＧＲ８ポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、所望の配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用い、そしてこの配列は、発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするための制限酵素部位を組み込む。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＬＧＲ８ポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３１４】
連結（ライゲーション）後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性で選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートの存在，および変異の非存在を確認する。ＬＧＲ８ポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＬＧＲ８ポリペプチド導入遺伝子を含有する直鎖フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。この精製したフラグメントを、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０３１５】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚を、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の着床から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に取り込んだ導入遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％　ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ　プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０３１６】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列に位置し、そしてＬＧＲ８ポリペプチド導入遺伝子の３’側である）を用いて、導入遺伝子転写物からのｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ　ＫＣｌ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ　Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＬＧＲ８ポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３１７】
（実施例６：トランスジェニックマウスにおけるＬＧＲ８ポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルランによって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３１８】
肉眼での解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取り出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０３１９】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体についての免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ　Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ　Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３２０】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ　ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を有する、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３２１】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者には改変および修飾が想到されることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、本願発明の範囲内に入る全てのこのような等価な改変物を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ヒトＬＧＲ８−Ａ（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。推定シグナル配列を示す（下線）。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ａ（配列番号５）のＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドを欠く）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＬＧＲ８−Ｂ（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。推定シグナル配列を示す（下線）。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ｂ（配列番号１０）のＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドを欠く）をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ヒトＬＧＲ８−Ｃ（配列番号１２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。推定シグナル配列を示す（下線）。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ｃ（配列番号１５）のＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドを欠く）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ｄ（配列番号１７）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。推定シグナル配列を示す（下線）。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、マウスＬＧＲ８−Ａ（配列番号２０）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。推定シグナル配列を示す（下線）。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、マウスＬＧＲ８−Ａ（配列番号２３）のＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドを欠く）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ａ（上の配列；配列番号２）と、ヒトＬＧＲ７の長い形態（下の配列；配列番号２４）とのアミノ酸配列アライメントを示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ヒトＬＧＲ８−Ａの成熟形態（上の配列；配列番号３）と、マウスＬＧＲ８−Ａの成熟形態（下の配列；配列番号２１）とのアミノ酸配列アライメントを示す。
【図１２】図１２は、ヒトＬＧＲ８−ＡのＮ末端細胞外ドメイン（シグナルペプチドを欠く）（上の配列；配列番号５）と、マウスＬＧＲ８−ＡのＮ末端細胞外ドメイン（下の配列；配列番号２３）とのアミノ酸配列アライメントを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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