(57)【要約】本発明は、ヒトの分泌タンパク質（ＳＥＣＰ）および、ＳＥＣＰを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＳＥＣＰの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｄ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３（配列番号１乃至６３）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを有することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的なＳＥＣＰの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項１７の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法で同定したアゴニスト化合物を有し、薬剤として許容できる賦形剤をも有する組成物。
【請求項２２】
機能的なＳＥＣＰの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２１の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的なＳＥＣＰの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１のポリペプチドの活性の変化が、請求項１のポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示するような方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のＳＥＣＰの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項１１の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者におけるＳＥＣＰの発現に関連する病状または疾患の診断方法であって、有効量の請求項３２の組成物を前記被検者に投与する過程を含む方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２の組成物。
【請求項３５】
被検者におけるＳＥＣＰの発現に関連する病状または疾患の診断方法であって、有効量の請求項３４の組成物を前記被検者に投与する過程を含むような方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つ、またはその免疫原性断片を持つポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を有する群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて前記抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
或るサンプルからのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて前記抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを有するサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程とを含む方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、更に前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基板上の固有の物理的位置の各々は、基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項１１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項１１８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項１１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性障害、心血管障害、神経障害、および発達障害の、診断・治療・予防に関する。本発明は更に、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における、外来性化合物の効果についての算定に関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質の輸送および分泌は、細胞機能のために必須である。タンパク質の輸送は、輸送若しくは分泌されるタンパク質のアミノ末端にあるシグナルペプチドが媒介する。シグナルペプチドは、約１０から２０の疎水性アミノ酸群からなり、新生タンパク質をリボソームから、膜で囲まれた特定の区画、例えば小胞体（ＥＲ）まで導く。ＥＲを標的とするタンパク質には、分泌経路を進むものと、いずれかの分泌細胞器官（例えばＥＲ、ゴルジ装置若しくはリソソーム）に残るものとがある。分泌経路を進むタンパク質類は、細胞外空間へ分泌されるか、または原形質膜内に残る。原形質膜内に保持されるタンパク質類は１つ以上の膜貫通ドメインを持ち、各ドメインは約２０の疎水性アミノ酸残基からなる。分泌タンパク質類は、通常、不活性の前駆体として合成され、分泌経路を進む際に、翻訳後プロセシングイベントによって活性化される。そのようなイベントとして、グリコシル化、タンパク質分解、および、シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの除去が挙げられる。タンパク質の輸送の間に起こり得る他のイベントとしては、新生タンパク質のシャペロン依存アンフォールディングおよびフォールディング、および、このタンパク質と、受容体若しくは細孔複合体との相互作用がある。アミノ末端シグナルペプチドを持つ分泌タンパク質の例は以下に述べるが、中には、細胞間シグナル伝達において重要な役割を持つタンパク質類もある。そのようなタンパク質としては、膜貫通受容体および細胞表面マーカー、細胞外マトリックス分子、サイトカイン、ホルモン、成長因子および分化因子、酵素、神経ペプチド、血管介在物質（ｖａｓｏｍｅｄｉａｔｏｒｓ）、細胞表面マーカー、および抗原認識分子がある（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．他（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ５５７−５６０，５８２， ５８２−５９２ページの概説を参照）。
【０００３】
細胞表面マーカーとしては、免疫系の白血球細胞上で同定される細胞表面抗原類がある。これらの抗原を同定するには、系統的な、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの「ショットガン（ｓｈｏｔ ｇｕｎ）」技術が利用される。これらの技術によって、数百種のｍＡｂが、未知の細胞表面白血球抗原類に対して産生されている。それらの抗原は「分化のクラスター群」へとグループ分けされている。分類は、多様な分化白血球細胞型と未分化白血球細胞型とで共通の、免疫細胞化学的な局在パターンに基づく。或るクラスター内の抗原群は或る単一の細胞表面タンパク質を同定すると仮定され、「分化クラスター」すなわち「ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」名が指定されている。ＣＤ抗原類が同定するタンパク質類をコードするいくつかの遺伝子が、標準的な分子生物学技術によってクローン化され、確証されている。ＣＤ抗原類の特徴は、膜貫通タンパク質であることと、細胞表面タンパク質であって脂肪酸含有糖脂質、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）への共有結合性の接着を介して原形質膜に固着されていることである（Ｂａｒｃｌａｙ， Ａ． Ｎ．他（１９９５） Ｔｈｅ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １７−２０ページの概説を参照）。
【０００４】
マトリックスタンパク質（ＭＰ）類は、膜貫通タンパク質および細胞外タンパク質であり、各組織の形成、成長、再形成、および維持において機能し、炎症反応の重要な介在物質および制御因子として働く。ＭＰ類の発現およびバランスを乱し得る生化学的変化の原因としては、先天的疾患、後成的疾患、若しくは感染性疾患がある。また、ＭＰ類は、免疫応答における白血球の遊走、増殖、分化、および活性化に影響する。
【０００５】
しばしばＭＰ類は、１つ以上のドメインの存在によって特徴付けられ、そのようなドメインとしては、コラーゲン様ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、およびフィブロネクチン様ドメインが含まれ得る。加えて、ＭＰ類は重度にグリコシル化され得る。また、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチドモチーフを持つことがあり、これは接着相互作用において或る役割を果たし得る。ＭＰとしては、細胞外タンパク質として、フィブロネクチン、コラーゲン、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、ビトロネクチンおよびそのタンパク質分解誘導体ソマトメジンＢがあり、また細胞接着受容体として、細胞接着分子（ＣＡＭ）、カドヘリン、およびインテグリンがある（概説はＡｙａｄ， Ｓ． 他（１９９４）Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ２−１６ページ； Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．（１９９７）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５１： １４１３−１４１７； Ｓｊａａｓｔａｄ， Ｍ． Ｄ． および Ｎｅｌｓｏｎ， Ｗ． Ｊ．（１９９７）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １９：４７−５５）。ペルオキシダシン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｉｎ）はショウジョウバエのタンパク質であり、ペルオキシダーゼモチーフと細胞外マトリックスモチーフとを共に有する。１５１２アミノ酸のペルオキシダシンタンパク質には、ペルオキシダーゼドメインであってヒトのミエロペルオキシダーゼと好酸球（ｅｏｓｉｎｉｐｈｉｌ）ペルオキシダーゼとに相同な１ドメインと、６つのロイシンリッチリピート群と、４つの免疫グロブリンドメイン群と、トロンボスポンジン／プロコラーゲン相同性の或る領域とがある。ペルオキシダシンの分泌は血液細胞群が行う。これらの伝播は、発生期のショウジョウバエ胚の全体に渡る。このタンパク質が機能するのは、細胞外マトリックス硬化（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）、食作用、および防御においてであると考えられる（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｒ．Ｅ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３４３８−３４４７）。ショウジョウバエのペルオキシダシン遺伝子の或るヒト相同体は、最近、或る結腸癌細胞株であってｐ５３腫瘍抑制因子依存性アポトーシスを起こす株では上方調節されることが発見され、したがって、或る役割をｐ５３依存アポトーシスの様々な機序の中で果たしている可能性がある（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ， Ｎ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６１：８６４−８６９）。ムチン類は高度にグリコシル化された糖タンパク質であり、粘液ゲルの主要な構造成分である。
ムチン類の生理機能は、細胞保護、機械的保護、分泌物の粘性の保持、および細胞認識である。ＭＵＣ６はヒト胃液ムチンであるが、胆嚢、膵臓、精嚢、および女性生殖器官にも発見されている（Ｔｏｒｉｂａｒａ， Ｎ．Ｗ． 他（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６３９８−１６４０３）。ＭＵＣ６遺伝子はヒト１１番染色体にマップされている（Ｔｏｒｉｂａｒａ， Ｎ．Ｗ． 他（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：５８７９−５８８５）。ヘモムチンは新規なショウジョウバエ表面ムチンであり、抗菌エフェクター分子類の誘導に関与し得る（Ｔｈｅｏｐｏｌｄ， Ｕ． 他（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２１７：１２７０８−１２７１５）。
【０００６】
タフテリン（ｔｕｆｔｅｌｉｎ）類は、これまでに同定された４種のエナメルマトリックスタンパク質の１つである。他３種の既知のエナメルマトリックスタンパク質は、アメロゲニン、エナメリンおよびアメロブラスチンである。これらの成分タンパク質群からのエナメル細胞外マトリックスの構築は、無機質置換を受けるのに適格なマトリックスを産生する中で重要であると考えられている（Ｐａｉｎｅ Ｃ．Ｔ．他（１９９８）Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３８：２５７−２６７）。タフテリンｍＲＮＡは、非ミネラル化歯原性腫瘍であるヒトエナメル上皮腫において発現されることが発見されている（Ｄｅｕｔｓｃｈ Ｄ． 他（１９９８）Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３９：１７７−１８４）。
【０００７】
オルファクトメジン（ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ）関連タンパク質類は細胞外マトリックスの分泌糖タンパク質であり、保存されたＣ末端モチーフ群を持つ。これらのタンパク質は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）からヒトにいたる広範囲の種の多様な組織に発現される。オルファクトメジン関連タンパク質類には、ヒトにおいて少なくともファミリーメンバー５種を持つ遺伝子ファミリーがある。この５種の内の１つ、ＴＩＧＲ／ミオシリン（ｍｙｏｃｉｌｉｎ）タンパク質は眼において発現され、緑内障の病原と関連している（Ｋｕｌｋａｒｎｉ， Ｎ．Ｈ． 他（２０００）Ｇｅｎｅｔ． Ｒｅｓ． ７６：４１−５０）。Ｙｏｋｏｙａｍａ 他（１９９６）の研究では、神経芽細胞腫細胞株ｃＤＮＡライブラリで、ラット神経細胞のオルファクトメジン関連ＥＲ局在タンパク質に対し、１３５アミノ酸タンパク質であるＡＭＹが９６％の配列同一性を持つことが発見され、これは神経組織でのＡＭＹの重要な役割を示唆する（Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ． 他（１９９６）ＤＮＡ Ｒｅｓ． ３：３１１−３２０）。ラット脳ｃＤＮＡライブラリ群から単離された神経細胞特異的オルファクトメジン関連糖タンパク質群は、オルファクトメジンとの強い配列類似性を示す。この類似性は、神経細胞と神経分泌細胞における、これらの糖タンパク質の、マトリックスに関連した機能を示唆する（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ， Ｐ．Ｅ．他（１９９４）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ３８：４６８−４７８）。
【０００８】
Ｍａｃ−２ 結合タンパク質は９０ｋＤａの血清タンパク質（９０Ｋ）であり、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３とヒト母乳との両方から単離された分泌糖タンパク質である。９０Ｋは、ヒトマクロファージ関連レクチンであるＭａｃ−２に特異的に結合する。構造的には、成熟したタンパク質は長さが５６７アミノ酸で、その前に１８アミノ酸リーダーが付いている。１６のシステイン群と、７つの潜在的Ｎ連結グリコシル化部位とがある。最初の１０６アミノ酸は、或るマクロファージスカベンジャー受容体システインリッチドメインによって定義される或る古いタンパク質スーパーファミリーに極めて類似した或るドメインを表す（Ｋｏｔｈｓ，Ｋ． 他（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１４２４５−１４２４９）。９０Ｋはエイズ患者の亜集団群の血清中で上昇し、原発腫瘍サンプルと腫瘍細胞株とにおいて多様なレベルで発現される。Ｕｌｌｒｉｃｈ 他（１９９４）は９０Ｋが複数の宿主防御系を刺激し、インターロイキン２の分泌を誘発し得ることを実証した。この免疫刺激の原因は、発癌性形質転換、ウイルス感染または病原性侵襲であると提起されている（Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．， 他（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１８４０１−１８４０７）。
【０００９】
セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）類は軸索誘導分子の１大グループで少なくとも３０種のメンバーがあり、脊椎動物、非脊椎動物、更には数種のウィルスでも発見されている。すべてのセマフォリンは長さが約５００アミノ酸のセマ（ｓｅｍａ）ドメインを有する。セマフォリン受容体であるニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経突起の生成を促進することが示されている。ニューロピリンの細胞外領域はＣＵＢ、ジスコイジン（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ）、およびＭＡＭドメインの３種のドメインからなる。ニューロピリンのＣＵＢモチーフおよびＭＡＭモチーフはタンパク質間相互作用において幾つかの役割を果たすことが示唆されており、更にセマドメインおよびＣ末端ドメインを介してセマフォリン類の結合に関与していると考えられる（Ｒａｐｅｒ， Ｊ．Ａ．（２０００）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １０：８８９４の概説を参照）。
プレキシン（ｐｌｅｘｉｎ）類は神経細胞表面分子であり、カルシウムイオンの存在下で同種親和性結合メカニズムにより細胞接着を媒介する。プレキシン類は、特定の感覚系の受容体や神経細胞において発現されることがわかっている（Ｏｈｔａ， Ｋ． 他（１９９５）Ｃｅｌｌ １４：１１８９−１１９９）。いくつかのプレキシンが、発生期の神経系において運動神経軸索や中枢神経軸索の誘導を制御するよう機能することを示唆する証拠もある。プレキシン類は、完全なセマフォリンドメインをそれ自体が有しており、古典的セマフォリン類と、セマフォリン類の結合パートナーとの両方の祖先であり得る（Ｗｉｎｂｅｒｇ， Ｍ．Ｌ．他（１９９８）Ｃｅｌｌ ９５：９０３−９１６）。
【００１０】
ヒト妊娠特異的β１糖タンパク質（ＰＳＧ）は、分子量が７２ＫＤａ、６４ＫＤａ、６２ＫＤａおよび５４ＫＤａの、密接に関連する糖タンパク質類の１ファミリーである。ＰＳＧは、癌胎児性抗原と共に、免疫グロブリンスーパーファミリー内の１サブファミリーを構成する（Ｐｌｏｕｚｅｋ Ｃ．Ａ． およびＣｈｏｕ Ｊ．Ｙ．（１９９１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２９：９５０９５８）。ＰＳＧの様々な亜集団が、ヒト胎盤の栄養胚葉、および羊膜や漿膜によって産生されることが発見されている（Ｐｌｏｕｚｅｋ Ｃ．Ａ． 他（１９９３）Ｐｌａｃｅｎｔａ １４：２７７２８５）。
【００１１】
自己分泌型運動促進因子（ＡＭＦ）は腫瘍細胞の遊走を調節する運動性サイトカインの１つであり、したがって、それに伴うシグナル伝達経路の同定は決定的に重要である。自己分泌型運動促進因子受容体（ＡＭＦＲ）の発現は、胸腺腫における腫瘍の進行に関連することが発見された（Ｏｈｔａ Ｙ． 他（２０００） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １７：２５９２６４）。ＡＭＦＲは、分子量７８ＫＤａの細胞表面糖タンパク質である。
【００１２】
ホルモンは、血液循環により運ばれ、標的細胞の表面のまたは内部の特異的受容体に結合する分泌分子である。ホルモンは多様な生化学的組成や作用機構を持っているが、２つのカテゴリーに分類し得る。第１のカテゴリーは小さい親油性ホルモンで、標的細胞の原形質膜を通過して拡散し、サイトゾル内受容体または核内受容体に結合し、複合体を形成して遺伝子発現を改変する。これらの分子としては、レチノイン酸やチロキシンが、更には、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン、コルチゾール、アルドステロンなどの、コレステロール由来ステロイドホルモンがある。第２のカテゴリーに含まれる親水性ホルモンは、原形質膜の内側へ信号を伝達する細胞表面受容体に結合することで機能する。そのようなホルモンの例としては、アミノ酸の誘導体としてカテコールアミン類（エピネフリン、ノルエピネフリン）およびヒスタミンが、ペプチドホルモンとしてグルカゴン、インスリン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、およびバソプレッシンがある（Ｌｏｄｉｓｈ 他（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ８５６−８６４ページなど参照）。
【００１３】
プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は、脳下垂体前葉が合成するホルモンであるコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）の前駆体ポリペプチドであり、副腎皮質の刺激で機能する。ＰＯＭＣはまた、βリポトロピンホルモン（β−ＬＰＨ）の前駆体ポリペプチドでもある。各ホルモンは、固有の生物活性を持つより小さいペプチド群を持つ。α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）と副腎皮質刺激ホルモン様中葉ペプチド（ＣＬＩＰ）はＡＣＴＨから形成され、γ−リポトロピン（γ−ＬＰＨ）とβ−エンドルフィンはβ−ＬＰＨのペプチド成分であるが、β−ＭＳＨはγ−ＬＰＨ中に含有される。ＰＯＭＣのエキソン２および３における遺伝子突然変異に起因する、ＡＣＴＨ欠乏による副腎不全は、早期発症肥満症、副腎不全および赤毛色素沈着を特徴とする、内分泌障害を生じる（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ， Ｍ．他（１９７９）Ｃａｎａｄ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：１１１１−１１２１， Ｋｒｕｄｅ， Ｈ． 他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １９：１５５−１５７， Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）１７６８３０）。
【００１４】
成長因子および分化因子は、細胞間伝達の中で機能する分泌タンパク質である。いくつかの因子の活動には、オリゴマー形成が、または膜タンパク質との会合が必要である。それらの因子とそれらの受容体間の複雑な相互作用は、細胞分裂、細胞分化、細胞シグナル伝達および細胞運動性を刺激または抑制する、細胞内信号伝達経路の引き金となる。殆どの成長および分化因子は、その局所環境にある細胞に作用する（パラ分泌シグナル伝達）。成長因子および分化因子には３つの主要なクラスがある。第１のクラスには、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、インシュリン様成長因子、および血小板由来の成長因子など、大きなポリペプチド成長因子を含む。第２のクラスには、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）のような造血性成長因子を含む。造血性成長因子類は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好中球、マクロファージ、およびそれらの幹細胞前駆体など、血液細胞の増殖および分化を刺激する。第３のクラスには、ボンベシン、バソプレッシン、オキシトシン、エンドセリン、トランスフェリン、アンジオテンシンＩＩ、血管作用性小腸ペプチド、およびブラジキニンなど、小さなペプチド因子を含み、これらは増殖以外の細胞機能を調節するホルモンとして機能する。
【００１５】
成長因子および分化因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の腫瘍性転換、およびｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍進行において、幾つかの重大な役割を果たす。腫瘍細胞による、成長因子の不適正な発現は、腫瘍の血管新生および転移に寄与し得る。造血時の成長因子の調節異常によっては、貧血、白血病、およびリンパ腫が生じ得る。インターフェロンなど幾つかの成長因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの双方で、腫瘍細胞群に対し細胞毒性を持つ。更に、幾つかの成長因子および成長因子受容体は、構造的にも機能的にも腫瘍性タンパク質類と関連する。加えて、成長因子は癌原遺伝子群および腫瘍抑制遺伝子群の双方の転写調節に影響を与える（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ， Ｅ． （１９９４） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ， １−９ページの概説を参照）。
【００１６】
最初にショウジョウバエにおいて同定されたＳｌｉｔタンパク質は、中枢神経系正中線形成およびおそらく神経組織の組織発生と軸索の誘導において重要である。Ｉｔｏｈ他（（１９９８） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６２：１７５−１８６）は、ｓｌｉｔ遺伝子の哺乳類相同体（ヒト Ｓｌｉｔ−１、Ｓｌｉｔ−２、Ｓｌｉｔ−３ およびラット Ｓｌｉｔ−１）を同定した。コードされるタンパク質群は推定上の分泌タンパク質であり、ＥＦＧ様モチーフおよびロイシンリッチリピートを持つが、これらは共に、保存されたタンパク質間相互作用ドメインである。Ｓｌｉｔ−１ ｍＲＮＡ、Ｓｌｉｔ−２ ｍＲＮＡおよび Ｓｌｉｔ−３ ｍＲＮＡは、それぞれ脳、脊髄、甲状腺に発現される（Ｉｔｏｈ， Ａ． 他、上記）。タンパク質のＳｌｉｔ ファミリーは神経組織内のｇｌｙｐｉｃａｎ−１の機能性リガンドであることが示されており、それらの相互作用は中枢神経系の組織発生時の幾つかの段階において重要であり得ると示唆される（Ｌｉａｎｇ， Ｙ． 他（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１７８８５−１７８９２）。
【００１７】
神経ペプチドおよび血管介在物質（ＮＰ／ＶＭ）は、内在性シグナル伝達分子の１大ファミリーを構成する。ＮＰ／ＶＭファミリーに含まれる分子は、神経ペプチドおよび神経ペプチドホルモンとして、ボンベシン、神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、ニューロメディンＮ、メラノコルチン類、オピオイド類、ガラニン、ソマトスタチン、タキキニン類、ウロテンシンＩＩおよび平滑筋刺激に関する関連ペプチド類、バソプレッシン、および血管作用性小腸ペプチドがある。また、循環系に運ばれるシグナル伝達分子として、アンジオテンシン、補体、カルシトニン、エンドセリン類、ホルミルメチオニルペプチド類、グルカゴン、コレシストキニン、およびガストリンがある。ＮＰ／ＶＭは直接に信号を伝達し得る他、別の神経伝達物質およびホルモンの活性若しくは放出をモジュレートしたり、またカスケードで触媒酵素として機能することができる。ＮＰ／ＶＭの効果は、ごく短時間のものから長期間持続するものまで幅広い（Ｍａｒｔｉｎ， Ｃ．Ｒ． 他（１９８５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，  ５７−６２ページの概説を参照）。
【００１８】
ＮＰ／ＶＭは、多くの神経障害および心血管障害に関与する。例えば、神経ペプチドＹは、高血圧症、鬱血心不全、情動障害、食欲調節に関与する。ソマトスタチンは、下垂体前葉での成長ホルモンおよびプロラクチンの分泌を阻害し、また、腸、膵臓腺房細胞、および膵臓β細胞内の分泌も阻害する。ソマトスタチンレベルの低下は、アルツハイマー病およびパーキンソン病で報告された。バソプレッシンは、腎臓内で水分吸収およびナトリウム吸収を増加させ、また高濃度では、血管平滑筋の収縮、血小板活性化、および肝臓内でのグリコーゲン分解を刺激する。バソプレッシンおよびその類似体は、尿崩症の治療のため臨床的に用いられる。エンドセリンおよびアンジオテンシンは高血圧症に関与し、アンジオテンシンの血漿レベルを減少させるカプトプリルなどの薬剤は、血圧を下げるのに用いられる（Ｗａｔｓｏｎ， Ｓ．およびＳ． Ａｒｋｉｎｓｔａｌｌ（１９９４）Ｔｈｅ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， １９４、２５２、２８４、５５、および１１１の各ページ）。
【００１９】
神経ペプチドはまた、侵害受容（痛覚）にも役割を幾つか持つことが示された。血管作用性小腸ペプチドは、慢性神経障害痛において重要な役割を果たすようである。オピオイド受容体様１受容体に対する内在性リガンドであるノシセプチンは、主に抗侵害受容作用を有すると考えられ、持続性の痛み若しくは慢性痛の、様々な動物モデルにおいて鎮痛特性を有している事が示された（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｔ． および Ｆｌｅｅｔｗｏｏｄ−Ｗａｌｋｅｒ， Ｓ． Ｍ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １９：３４６−３４８）。
【００２０】
シグナルペプチドを有する他のタンパク質として、酵素活性を持つ分泌タンパク質類がある。酵素活性としては、例えば、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、異性化酵素活性、若しくはリガーゼ活性がある。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ類は細胞外マトリックスを分解する分泌性加水分解酵素であり、したがって、腫瘍転移、組織形態形成、および関節炎において或る重要な役割を果たす（Ｒｅｐｏｎｅｎ， Ｐ． 他（１９９５）Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２０２：３８８−３９６； Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ， Ｇ． Ｓ．（１９９２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ４：３４８−３５４； Ｒａｙ， Ｊ． Ｍ． およびＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｗ． Ｇ．（１９９４）Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ７：２０６２−２０７２； Ｍｉｇｎａｔｔｉ， Ｐ．および Ｒｉｆｋｉｎ， Ｄ． Ｂ．（１９９３）Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７３：１６１−１９５）。別の例は、脂質合成にまたはエネルギー生成に用いる酢酸を活性化するアセチルＣｏＡ合成酵素である（Ｌｕｏｎｇ， Ａ． 他（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２６４５８−２６４６６）。アセチルＣｏＡ合成酵素が活性化されると、酢酸とＣｏＡからアセチルＣｏＡが形成される。アセチルＣｏＡ合成酵素はＡＭＰ結合ドメインシグネチャとして同定される或る配列類似性領域を共有する。アセチルＣｏＡ合成酵素は、高血圧との関連が示されている（Ｈ． Ｔｏｈ（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑ． Ｄａｔａ Ａｎａｌ． ４：１１１−１１７ およびＩｗａｉ， Ｎ． 他（１９９４）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２３：３７５−３８０）。
【００２１】
多くの異性化酵素は、タンパク質の折りたたみ、光伝達、および種々のタンパク質同化経路や異化経路における諸段階を触媒する。或るクラスの異性化酵素は、ペプチジルプロリルシス−トランス異性化酵素（ＰＰＩアーゼ）として知られる。ＰＰＩアーゼ類は、タンパク質内の特定のプロリンイミド結合の、シスからトランスへの異性化を触媒する。ＰＰＩアーゼの２つのファミリーが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とシクロフィリン（ＣｙＰ）である。ＦＫＢＰ類が、共に強力な免疫抑制薬であるＦＫ５０６とラパマイシンとに結合することにより、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達経路が抑制される。特に、ＦＫＢＰのＰＰＩアーゼ活性は、ＦＫ５０６ あるいはラパマイシンの結合によって阻害される。算出した分子量にしたがって名付けたＦＫＢＰファミリーの５つのメンバー（ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ５２および ＦＫＢＰ６５）は、様々なタンパク質複合体と会合する、細胞の様々な領域に局在する（Ｃｏｓｓ， Ｍ．他（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３６−２９３４１； Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｓ．Ｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：２８３−２８７）。
【００２２】
ＣｙＰのペプチジルプロリル異性化酵素活性は、Ｔ細胞活性化につながるシグナル伝達経路の一部である可能性がある。ＣｙＰ異性化酵素活性はタンパク質折りたたみおよびタンパク質輸送に関連しており、またタンパク質複合体の構築または分解、およびタンパク質活性の調節にも関与し得る。例えば、ショウジョウバエにおいてＣｙＰ ＮｉｎａＡ はロドプシンの正確な局在化に必要であり、哺乳類のＣｙＰ（Ｃｙｐ４０）はステロイド受容体に結合するＨｓｐ９０／Ｈｓｃ７０ 複合体の一部である。哺乳類ＣｙｐＡはヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）からのｇａｇタンパク質と結合するが、この相互作用はシクロスポリンによって抑制し得ることが示されている。シクロスポリンは強力な抗ＨＩＶ−１活性を有するので、ＣｙｐＡはＨＩＶ−１の複製において重要な機能を果たし得る。最後に、Ｃｙｐ４０は転写因子ｃ−Ｍｙｂに結合し、これを不活化するが、この作用はシクロスポリンによって逆転されることが示されている。この作用は、転写、形質転換および分化の調節でのＣｙｐ類の関与を意味する（Ｂｅｒｇｓｍａ， Ｄ．Ｊ． 他（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３２０４ − ２３２１４； Ｈｕｎｔｅｒ， Ｔ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９２： １４１−１４３；  Ｌｅｖｅｒｓｏｎ， Ｊ．Ｄ． および Ｎｅｓｓ， Ｓ．Ａ．（１９９８）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． １：２０３−２１１）。
【００２３】
プロリンリッチγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）タンパク質（ＰＲＧＰ）類は、ビタミンＫ依存性１回貫通型膜内在性タンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＲＧＰタンパク質はＧｌａリッチなほぼ４５アミノ酸の細胞外アミノ末端ドメインを特徴とする。細胞内カルボキシル末端領域には配列ＰＰＸＹの１つまたは２つのコピーがあり、ＰＰＸＹは、シグナル伝達、細胞周期進行、およびタンパク質代謝回転のような、細胞の多様な機能に関与する種々のタンパク質に存在するモチーフである（Ｋｕｌｍａｎ， Ｊ．Ｄ． 他， （２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９８：１３７０−１３７５）。Ｇｌａを形成するグルタミン酸残基の翻訳後修飾過程は、ビタミンＫ依存性のカルボキシル化である。Ｇｌａを含むタンパク質としては、血液凝固に関与する血漿タンパク質類がある。これらのタンパク質とは、プロトロンビン、タンパク質Ｃ、ＳおよびＺ、並びに血液凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子である。オステオカルシン（骨−Ｇｌａタンパク質、ＢＧＰ）およびマトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）もまた、Ｇｌａを含む（Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｐ．Ａ．および Ｃ．Ｔ． Ｐｒｚｙｓｉｅｃｋｉ（１９８７）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９：１−７； Ｃ． Ｖｅｒｍｅｅｒ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６６：６２５−６３６）。
【００２４】
ショウジョウバエ遺伝子ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ ２の特徴は、まず、推定上のシグナル配列または膜貫通配列を持つことである。また、部分的なＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ （フォンウィルブランド）因子Ｄドメインをも持つが、このドメインは分子内結合と分子間結合の形成を調節することが知られるドメイン群に類似している。また、５ヶ所のシステインリッチドメインをも持つが、これらはＢＭＰ（骨形成タンパク質）様リガンド群を結合するとされている。これらの特徴は、ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ ２ が細胞外で、または分泌経路において、直接にリガンドのシグナル伝達を可能にするように作用することと、したがって、翅脈特異化（ｖｅｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において或る役割を果たすとされているＢＭＰ様シグナル伝達経路に関与することを示唆する（Ｃｏｎｌｅｙ， Ｃ．Ａ． 他（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：３９４７−３９５９）。脊椎動物およびショウジョウバエの胚における背腹軸形成（ｄｏｒｓａｌ−ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）には、位置情報勾配（ａ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を発生させるための細胞外タンパク質群の保存された１システムを必要とする。
【００２５】
新規の分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド群の発見により、新規の組成物群を提供することで、当分野の要望に応えることができる。これら新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害の、診断・治療・予防において有用であり、また、分泌タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物群の効果についての算定にも有用である。
【００２６】
（発明の概要）
本発明は、総称して「ＳＥＣＰ」、個別にはそれぞれ「ＳＥＣＰ−１」、「ＳＥＣＰ−２」、「ＳＥＣＰ−３」、「ＳＥＣＰ−４」、「ＳＥＣＰ−５」、「ＳＥＣＰ−６」、「ＳＥＣＰ−７」、「ＳＥＣＰ−８」、「ＳＥＣＰ−９」、「ＳＥＣＰ−１０」、「ＳＥＣＰ−１１」、「ＳＥＣＰ−１２」、「ＳＥＣＰ−１３」、「ＳＥＣＰ−１４」、「ＳＥＣＰ−１５」、「ＳＥＣＰ−１６」、「ＳＥＣＰ−１７」、「ＳＥＣＰ−１８」、「ＳＥＣＰ−１９」、「ＳＥＣＰ−２０」、「ＳＥＣＰ−２１」、「ＳＥＣＰ−２２」、「ＳＥＣＰ−２３」、「ＳＥＣＰ−２４」、「ＳＥＣＰ−２５」、「ＳＥＣＰ−２６」、「ＳＥＣＰ−２７」、「ＳＥＣＰ−２８」、「ＳＥＣＰ−２９」、「ＳＥＣＰ−３０」、「ＳＥＣＰ−３１」、「ＳＥＣＰ−３２」、「ＳＥＣＰ−３３」、「ＳＥＣＰ−３４」、「ＳＥＣＰ−３５」、「ＳＥＣＰ−３６」、「ＳＥＣＰ−３７」、「ＳＥＣＰ−３８」、「ＳＥＣＰ−３９」、「ＳＥＣＰ−４０」、「ＳＥＣＰ−４１」、「ＳＥＣＰ−４２」、「ＳＥＣＰ−４３」、「ＳＥＣＰ−４４」、「ＳＥＣＰ−４５」、「ＳＥＣＰ−４６」、「ＳＥＣＰ−４７」、「ＳＥＣＰ−４８」、「ＳＥＣＰ−４９」、「ＳＥＣＰ−５０」、「ＳＥＣＰ−５１」、「ＳＥＣＰ−５２」、「ＳＥＣＰ−５３」、「ＳＥＣＰ−５４」、「ＳＥＣＰ−５５」、「ＳＥＣＰ−５６」、「ＳＥＣＰ−５７」、「ＳＥＣＰ−５８」、「ＳＥＣＰ−５９」、「ＳＥＣＰ−６０」、「ＳＥＣＰ−６１」、「ＳＥＣＰ−６２」、「ＳＥＣＰ−６３」と呼ぶ、分泌タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施例において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施例で本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３のアミノ酸配列を持つ、単離されたポリペプチドを提供する。
【００２７】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択される。
【００２８】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体を提供する。
【００２９】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００３０】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００３１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００３２】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【００３３】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。
【００３４】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬剤として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様で、上記組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ。更に、本発明は、機能的ＳＥＣＰの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者に上記組成物を投与する方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的ＳＥＣＰの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００３６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の一実施態様で本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的ＳＥＣＰの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００３７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００３８】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００３９】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程からなる。
【００４０】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生物学的サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理済み生物学的サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生物学的サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【００４１】
（本発明の記述について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００４２】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００４３】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００４４】
（定義）
用語「ＳＥＣＰ」は、天然、合成、半合成あるいは組換え体などの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマおよびヒトを含む哺乳類）から得られる、実質的に精製されたＳＥＣＰのアミノ酸配列群を指す。
【００４５】
用語「アゴニスト」は、ＳＥＣＰの生物活性を強化あるいは模倣する分子を指す。アゴニストとしては、ＳＥＣＰと直接に相互作用、あるいはＳＥＣＰが関与する生物学的経路の各成分に作用してＳＥＣＰの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００４６】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＳＥＣＰをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異配列群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る他、変容したｍＲＮＡ群を生じ得る。また、ポリペプチド群を生じ得るが、それらのポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００４７】
ＳＥＣＰをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換がありながら、ＳＥＣＰと同じポリペプチド、あるいはＳＥＣＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列にとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群への不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの或る特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なＳＥＣＰと成るような、アミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的あるいは免疫学的にＳＥＣＰの活性が保持される範囲で、残基群の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての、類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００４８】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００４９】
用語「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる。
【００５０】
用語「アンタゴニスト」は、ＳＥＣＰの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、ＳＥＣＰと直接相互作用すること、あるいはＳＥＣＰが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってＳＥＣＰの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００５１】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、およびＦｖ断片を指す。ＳＥＣＰポリペプチド群と結合する抗体類の作製には、免疫化抗原として、無傷ポリペプチド群を用いることができ、または、当該の小ペプチド群を有する断片群を用い得る。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、ＲＮＡの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００５２】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（すなわちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００５３】
用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化プロセスに由来する（例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの略、試験管内選択法）、米国特許第５，２７０，１６３号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ基は２’−Ｆまたは２’−ＮＨ２によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（例えば、Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ．およびＬ． Ｇｏｌｄ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３を参照）。
【００５４】
用語「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマーが高レベルに発現されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ．他（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【００５５】
用語「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」は、アプタマーの内、Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡなどの左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【００５６】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、修飾されたバックボーン連鎖たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味し得る。
【００５７】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然あるいは組換え体のＳＥＣＰ、合成のＳＥＣＰ、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物の或いは細胞の特異的免疫応答を誘発して特異抗体群と結合する能力を指す。
【００５８】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「５’−ＡＧＴ−３’」は、その相補配列「３’−ＴＣＡ−５’」と対を形成する。
【００５９】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は、広い意味で、指定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＳＥＣＰをコード、若しくはＳＥＣＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることも可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）およびその他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のＤＮＡなど）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００６０】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにＤＮＡ配列解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’および／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）などの断片構築用コンピュータプログラムを用いて１つあるいはそれ以上のオーバーラップするｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長および構築の両方を行ってコンセンサス配列を産生する配列もある。
【００６１】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。
元の残基              保存的な置換
Ａｌａ                  Ｇｌｙ， Ｓｅｒ
Ａｒｇ                  Ｈｉｓ， Ｌｙｓ
Ａｓｎ                  Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ａｓｐ                  Ａｓｎ， Ｇｌｕ
Ｃｙｓ                  Ａｌａ， Ｓｅｒ
Ｇｌｎ                  Ａｓｎ， Ｇｌｕ， Ｈｉｓ
Ｇｌｕ                  Ａｓｐ， Ｇｌｎ， Ｈｉｓ
Ｇｌｙ                  Ａｌａ
Ｈｉｓ                  Ａｓｎ， Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｉｌｅ                  Ｌｅｕ， Ｖａｌ
Ｌｅｕ                  Ｉｌｅ， Ｖａｌ
Ｌｙｓ                  Ａｒｇ， Ｇｌｎ， Ｇｌｕ
Ｍｅｔ                  Ｌｅｕ， Ｉｌｅ
Ｐｈｅ                  Ｈｉｓ， Ｍｅｔ， Ｌｅｕ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ
Ｓｅｒ                  Ｃｙｓ， Ｔｈｒ
Ｔｈｒ                  Ｓｅｒ， Ｖａｌ
Ｔｒｐ                  Ｐｈｅ， Ｔｙｒ
Ｔｙｒ                  Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ
Ｖａｌ                  Ｉｌｅ． Ｌｅｕ， Ｔｈｒ
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【００６２】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【００６３】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【００６４】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００６５】
「示差発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００６６】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって新規のタンパク質群を構築することが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【００６７】
用語「断片」は、ＳＥＣＰの又はＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の或る断片は、或る固有のポリヌクレオチド配列領域を持つ。この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６を特異的に同定するものであり、例えばこの断片を得たゲノム中の他のいかなる配列とも異なる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の或る断片の正確な長さは、また、その断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【００６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の或る断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持つ。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の或る断片の正確な長さは、また、この断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の領域は、その断片に意図する目的に基づき、当業者が慣例的に判定し得る。
【００７０】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００７１】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【００７２】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「％一致」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００７３】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムなどに組込まれているＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定される。「ｗｅｉｇｈｔｅｄ」残基重み付け表がデフォルトで選択される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてなされる。
【００７４】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩおよびインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用できる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ および ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用い得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ（ｇａｐ）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００７５】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得た断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００７７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【００７８】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる（参照先と共に上述）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」として報告される。
【００７９】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）のｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメータに設定して用い得る。
デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００８０】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： １１ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： ３
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００８１】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は直鎖状の微小染色体であり、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【００８２】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【００８３】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容されるアニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子ＤＮＡの存在下である。
【００８４】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度およびｐＨの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２×ＳＳＣおよび約０．１％のＳＤＳの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。別法では、温度は約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃を用い得る。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤の例として、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、せん断した変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【００８６】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【００８７】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【００８８】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【００８９】
用語「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、ＳＥＣＰのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、ＳＥＣＰの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【００９０】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【００９１】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【００９２】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、ＳＥＣＰの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、ＳＥＣＰのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【００９３】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【００９４】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したＤＮＡ配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【００９５】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【００９６】
ＳＥＣＰの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解性切断およびその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成により、あるいは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＳＥＣＰの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【００９７】
「プローブ」とは、核酸配列の内、ＳＥＣＰやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードし、同一配列や対立遺伝子核酸配列、または関連する核酸配列の検出に用いる配列を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【００９８】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【００９９】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． 他（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡなどを参照されたい。ＰＣＲプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用い得る。
【０１００】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０１】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１０２】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１０３】
「調節エレメント」は、或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１０４】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１０５】
或るＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」は、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１０６】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１０７】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１０８】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１０９】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１１０】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１１１】
「転写イメージ」または「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１１２】
「形質転換」とは、外来性ＤＮＡが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１１３】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知の形質転換技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術は公知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に記載がある。
【０１１４】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と記述され得る。スプライス変異配列は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異配列は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１１５】
特定のポリペプチド配列の「変異配列」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１１６】
（発明）
本発明は、新規のヒト分泌タンパク質群（ＳＥＣＰ）および、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づく。また、これらの組成物を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性障害、心血管障害、神経障害、および発達障害の、診断、治療、および予防の開発に基づく。
【０１１７】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１１８】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）と、それに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＯ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体１つ以上の注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれる。
【０１１９】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１２０】
表２および３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが分泌タンパク質であることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はヒト癲癇発作関連遺伝子６（マウス）様タンパク質、アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６９４１６１２）との３４％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。ＢＬＡＳＴ確率スコアは８．５ｅ−３４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、２つのＣＵＢドメインと１つのスシドメイン（ＳＣＲリピート）とを持ち、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、キイロショウジョウバエのペルオキシダシン前駆体 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５３１３８５） との４０％の同一性を有することが、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは７．８ｅ−２６６であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はまた、１つのペルオキシダーゼドメイン、４つの免疫グロブリンドメイン、６つのロイシンリッチリピート、１つのロイシンリッチリピートＣ末端ドメイン、および１つのフォンウィルブランド因子タイプＣドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析およびＭＯＴＩＦＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２がペルオキシダシン相同体であることを更に確証する証拠を提供する。別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ラットのニューレキソフィリン（ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５０８５７４）と９８％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．７ｅ−１４８であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＰＳＣＡＮ解析およびＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＤＯＭ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４が分泌ニューレキソフィリンであることを示す、更に確証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）による同定では、ブタのプレプロセクレチン（ｐｒｅｐｒｏｓｅｃｒｅｔｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６４６７１）との６８％の同一性を有する（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは２．３ｅ−３６であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はシグナルペプチドを有することが、ＨＭＭＥＲお���びＳＰＳＣＡＮによって予測された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、１つのポリペプチドホルモンドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。このドメインの存在はＢＬＩＭＰＳ解析およびＭＯＴＩＦＳ解析によって確認され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ が分泌ホルモンであることに対する更に実証的な証拠を提供する。別の例においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）による同定で、マウス結節性（ｎｏｄａｌ）ＴＧＦ−β様遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２９６６０５）との７８％の同一性を持つ（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは７．５ｅ−１４８であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８はまた、１つのＴＧＦ−β様ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析、ＭＯＴＩＦＳ解析、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８ がＴＧＦ−β様タンパク質である、更に実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）による同定では、ラット晩期妊娠肺タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４３２４６８２）との８６％の同一性を有する（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは３．４ｅ−９７であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３はまた、１つのＳＣＰ（精子コーティング糖タンパク質）様細胞外タンパク質ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析およびＭＯＴＩＦＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３がプロテアーゼ抑制因子様タンパク質であることを更に確証する証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−２７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９−６２については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６３の解析のためのアルゴリズムとパラメータとを表７に記述する。
【０１２１】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリヌクレオチド配列の長さを塩基対で示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するための、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列群の断片群を示す。列５は、ｃＤＮＡ配列に対応する識別番号、またはゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）に、および／または、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６および列７はそれぞれ、それらの完全長配列に関連する列５のｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列の、開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１２２】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれらに対応するｃＤＮＡライブラリ群を指す場合もある。例えば、２７１９９５９Ｔ６は或るＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＬＵＮＧＴＵＴ１０は、それが由来したｃＤＮＡライブラリである。
【０１２３】
ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ（例えば、５６００２８７９Ｊ１）は、プールされているｃＤＮＡライブラリ群に由来する。または、列５の識別番号は、完全長ポリヌクレオチド配列群の構築に寄与した、ＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡまたはＥＳＴを示す場合もある（例えば、ｇ１５４７７６５）。更に、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースに由来した配列を示す場合もある（すなわち「ＥＮＳＴ」の命名を含む配列）。あるいは、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースに由来する場合もあり（すなわち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓに由来する場合もある（すなわち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ は「スティッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、Ｎ１，２，３．．．がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列５の識別番号は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎは「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎ は特定のエキソンである（実施例５を参照）。或るＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表されるＲｅｆＳｅｑ識別子が、ＧｅｎＢａｎｋ識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用され得る。
【０１２４】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2004534506.tif 000002
【０１２５】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、列５に示すような配列カバレッジと重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが得られたが、該当するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１２６】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリとはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリであり、これは、最も頻繁にはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群によって代表されるが、これらは、上記のポリヌクレオチド配列を構築および確認するために用いられた。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１２７】
本発明はまた、ＳＥＣＰの変異配列をも含む。好適なＳＥＣＰ変異配列は、ＳＥＣＰの機能的あるいは構造的特徴の少なくとも１つを有し、且つＳＥＣＰアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１２８】
本発明はまた、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＳＥＣＰをコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価ＲＮＡ配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１２９】
本発明はまた、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る特定の実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択された或る配列を持つポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。この変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６からなる群から選択された或る核酸配列との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。前記の任意のポリヌクレオチド変異配列は、ＳＥＣＰの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードできる。
【０１３０】
更に、別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、ＳＥＣＰをコードする１ポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング時のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを持つことになる。或るスプライス変異配列は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の全長との間には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性を持ち得るが、このスプライス変異配列のいくつかの部分は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有するであろう。上記したスプライス変異配列は何れも、ＳＥＣＰの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１３１】
遺伝暗号の縮重により、ＳＥＣＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然ＳＥＣＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に成される。このような全ての変異は明確に開示されていると考慮されたい。
【０１３２】
ＳＥＣＰとその変異配列群とをコードするヌクレオチド配列群は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然ＳＥＣＰのヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能であるが、非天然コドンを含むなど実質的に異なるコドン使用を有する、ＳＥＣＰあるいはその誘導体をコードするヌクレオチド配列群を産生することは有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列群を改変せずに、ＳＥＣＰとその誘導体群とをコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由の例として、例えば天然配列から作られる転写物より長い半減期など、より好ましい特性を持つＲＮＡ転写物群の産生がある。
【０１３３】
本発明にはまた、ＳＥＣＰとその誘導体とをコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後、当分野で公知の試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクターおよび細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いて、ＳＥＣＰまたはその任意の断片をコードする１配列に突然変異を誘導し得る。
【０１３４】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６、およびそれらの断片へのハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含む（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１３５】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、ＤＮＡシークエンシング方法を用い得る。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用い得る。あるいは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）およびＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ あるいは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で公知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０１３６】
部分的なヌクレオチド配列を利用し、また、ＰＣＲに基づく当分野で公知の種々の方法で、ＳＥＣＰをコードする核酸配列群を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの、上流にある配列群を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配列群に隣接するＤＮＡ断片群をＰＣＲ増幅する方法を含む（例えばＬａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で公知である（例えばＰａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー類、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ類（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのＰＣＲベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１３７】
完全長ｃＤＮＡ群をスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡ群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５’非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１３８】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１３９】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、ＳＥＣＰ、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えＤＮＡ分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じあるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を産生可能であり、これらの配列をＳＥＣＰの発現に利用可能である。
【０１４０】
種々の目的で、ＳＥＣＰをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異配列の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１４１】
本発明のヌクレオチドは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、ＳＥＣＰの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。ＤＮＡシャッフリングは、ＰＣＲを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異配列のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異配列をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１４２】
別の実施態様によれば、ＳＥＣＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体あるいは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５−２２３； およびＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いて、ＳＥＣＰ自体またはその断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＳＥＣＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変により、および／または他のタンパク質群または任意のその一部からの配列群との組み合わせにより、変異配列ポリペプチドを作製、または、天然ポリペプチドの配列を有するポリペプチドを作製することが可能である。
【０１４３】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（例えばＣｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（例えば前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページを参照）。
【０１４４】
生物学的に活性なＳＥＣＰを発現させるために、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写および翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、ベクター内およびＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５’および３’の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、特長および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＳＥＣＰをコードする配列の、より効果的な翻訳を達成することも可能である。開始シグナルの例には、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。ＳＥＣＰをコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームＡＴＧ開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばＳｃｈａｒｆ， Ｄ． 他（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２を参照）。
【０１４５】
当業者に周知の方法を用いて、ＳＥＣＰをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製し得る。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章および８章， および１６−１７章； および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章および１６章を参照）。
【０１４６】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＳＥＣＰをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１、『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（例えばＤｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１４７】
細菌系では、多数のクローニングベクターおよび発現ベクターが、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ＳＥＣＰをコードする配列をこのベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば抗体の産生のためなどに多量のＳＥＣＰが必要な場合は、ＳＥＣＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０１４８】
酵母の発現系を使用してＳＥＣＰを産出することもできる。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、およびＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０１４９】
植物系を使用してＳＥＣＰを発現することも可能である。ＳＥＣＰをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって促進し得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）。あるいは、ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（例えば『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページを参照）。
【０１５０】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、ＳＥＣＰをコードする配列を、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結し得る。アデノウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域へ挿入することにより、宿主細胞内でＳＥＣＰを発現する感染ウイルスを得ることができる（例えばＬｏｇａｎ， Ｊ．およびＴ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１５１】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなＤＮＡの断片群を送達し得る。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。
【０１５２】
哺乳類系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるＳＥＣＰの安定した発現が望ましい。例えば、ＳＥＣＰをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、及び／または内在性の発現エレメントを持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１５３】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えばＷｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ．他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（例えばＷｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための、細胞の必要条件を改変するｔｒｐＢおよびｈｉｓＤも、文献に記載がある（例えばＨａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（例えばＲｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１を参照）。
【０１５４】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＳＥＣＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＳＥＣＰをコードする配列を持つ形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、或るマーカー遺伝子を、ＳＥＣＰをコードする配列とタンデムに、１つのプロモーターの制御下に配置し得る。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１５５】
一般に、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を持ち、ＳＥＣＰを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定し得る。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸配列あるいはタンパク質配列の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、あるいはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５６】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＳＥＣＰの発現の検出および計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー）などが挙げられる。ＳＥＣＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよびこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（例えばＨａｍｐｔｏｎ， Ｒ． 他（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ． Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪを参照）。
【０１５７】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。  ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブあるいはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化（エンドラベリング）、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＳＥＣＰをコードする配列、またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１５８】
ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するＳＥＣＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１５９】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質ターゲッティング、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８など）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択し得る。
【０１６０】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードする、自然のあるいは修飾された、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることにより、上記した任意の宿主系内で、１融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＳＥＣＰタンパク質は、ＳＥＣＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃおよび赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質が、ＳＥＣＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を持つように遺伝子操作すると、精製後にＳＥＣＰが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１６１】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、放射能標識したＳＥＣＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の、転写と翻訳とを結合する。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１６２】
本発明のＳＥＣＰまたはその断片を用いて、ＳＥＣＰに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＳＥＣＰへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１６３】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、ＳＥＣＰの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（ｍｉｍｅｔｉｃ）あるいは自然結合パートナーである（例えばＣｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章を参照）。同様に、この化合物は、ＳＥＣＰが結合する天然受容体に、あるいは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。或る実施例では、これら化合物のためのスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でＳＥＣＰを発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＳＥＣＰを発現する細胞、またはＳＥＣＰを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、ＳＥＣＰまたは化合物のどちらかの結合、刺激、または活性の阻害を分析する。
【０１６４】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の、あるいは固体支持物に固定されたＳＥＣＰと混合するステップと、ＳＥＣＰとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０１６５】
本発明のＳＥＣＰまたはその断片を用いて、ＳＥＣＰの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニストなどが含まれる。或る実施例では、ＳＥＣＰが少なくとも１つの試験化合物と結合する、ＳＥＣＰの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＳＥＣＰの活性と、試験化合物不在下でのＳＥＣＰの活性とを比較する。試験化合物の存在下でのＳＥＣＰの活性の変化は、ＳＥＣＰの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。  別法では、試験化合物を、ＳＥＣＰの活性に適した条件下で、ＳＥＣＰを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイのいずれにおいても、ＳＥＣＰの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、試験化合物と直接接触する必要がない場合がある。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１６６】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＳＥＣＰまたはその哺乳類相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号および第５，７６７，３３７号などを参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞系などのマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１６７】
また、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド類を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作し得る。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１６８】
ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することもできる。ノックイン技術を用いて、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＳＥＣＰを乳汁内に分泌するなどＳＥＣＰを過剰に発現する哺乳類近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１６９】
（治療）
ＳＥＣＰのいくつかの領域と分泌タンパク質群との間には、例えば配列およびモチーフの文脈における、化学的および構造的類似性が存在する。更に、ＳＥＣＰの発現は、健常な、または腫瘍性の、肺、心臓、脳、皮膚、結腸上皮、および心血管の各組織に密接に関連し、また、神経組織、泌尿組織、生殖組織、消化系組織、免疫組織、罹患組織、および腫瘍組織に密接に関連する。従って、ＳＥＣＰは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害において、或る役割を果たすと考えられる。ＳＥＣＰの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１７０】
したがって、一実施態様において、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＳＥＣＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌および白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管障害の中には、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、冠動脈バイパス移植術が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（ＳＡＤ）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、およびトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。
【０１７１】
別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＳＥＣＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１７２】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＳＥＣＰを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に患者に投与することも可能である。
【０１７３】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＳＥＣＰの活性をモジュレートするアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１７４】
更なる実施例では、ＳＥＣＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＳＥＣＰのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患としては、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害が含まれる。一実施態様では、ＳＥＣＰと特異的に結合する抗体を、直接にアンタゴニストとして、あるいはＳＥＣＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティングあるいは送達機構として間接的に用い得る。
【０１７５】
別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、ＳＥＣＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防も可能である。
【０１７６】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１７７】
ＳＥＣＰのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造し得る。詳しくは、精製されたＳＥＣＰを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＳＥＣＰと特異的に結合するものの同定が可能である。ＳＥＣＰへの抗体群も、当分野で一般的な複数の方法を用いて製造することが可能である。このような抗体の例として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が挙げられる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１７８】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主が、ＳＥＣＰ、若しくは免疫原性の特性を備えるその任意の断片またはオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０１７９】
ＳＥＣＰに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＳＥＣＰアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなど別のタンパク質の配列と融合し得、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１８０】
ＳＥＣＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子を産生する、任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（例えばＫｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他（１９８４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０１８１】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用い、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＳＥＣＰ特異的一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばＢｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７を参照）。
【０１８２】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、あるいは免疫グロブリンライブラリ類のスクリーニングまたは文献に開示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネル類のスクリーニングによっても行い得る（例えばＯｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０１８３】
ＳＥＣＰに対する特異的な結合部位を持つ抗体断片群を生成することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばＨｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【０１８４】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的な結合、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫学的検定には、ＳＥＣＰとその特異性抗体との間の複合体形成の測定が含まれる。２つの非干渉性ＳＥＣＰエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１８５】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＳＥＣＰに対する抗体類の親和性を算定し得る。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態下の、ＳＥＣＰ抗体複合体のモル濃度を、遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。多数のＳＥＣＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体類の、試薬のＫａは、ＳＥＣＰに対する抗体の、平均親和性または結合活性を表す。特定のＳＥＣＰエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体類の、試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＳＥＣＰ抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＳＥＣＰが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． および Ｃｒｙｅｒ， Ａ．（１９９１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１８６】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、ＳＥＣＰ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である。（前出のＣａｔｔｙの文献、同Ｃｏｌｉｇａｎ 他の文献などを参照）。
【０１８７】
本発明の別の実施例では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。或る実施例では、ＳＥＣＰをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現をモディフィケーションし得る。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片を、ＳＥＣＰをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（例えばＡｇｒａｗａｌ， Ｓ．，編集（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照）。
【０１８８】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばＳｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９８）Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ および Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．およびＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他（１９９８）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６などを参照）。
【０１８９】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（ｉ）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ１病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症や、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｈｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）などヒトレトロウイルス、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＳＥＣＰの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＳＥＣＰを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０１９０】
本発明の更なる実施例では、ＳＥＣＰの欠損による疾患や異常症を、ＳＥＣＰをコードする哺乳類発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＳＥＣＰ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、および（ｖ）ＤＮＡトランスポゾンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０１９１】
ＳＥＣＰの発現に有効であり得る発現ベクターの例として、限定するものではないがｐｃＤＮＡ ３．１、ＥｐｉＴａｇ、ｐＲｃＣＭＶ２、ｐＲＥＰ、ｐＶＡＸ、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）およびＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が挙げられる。ＳＥＣＰを発現させるには、（ｉ）構成的に活性なプロモーター（その由来は例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチンの遺伝子）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販のＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれるテトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． および Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドＰＶＧＲＸＲおよびＰＩＮＤに含まれる：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来する、ＳＥＣＰをコードする内在性遺伝子の天然プロモーター、若しくは組織特異的プロモーターを用い得る。
【０１９２】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０１９３】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰの発現に関連する種々の遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（ｉ）レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナル群と、（ｉｉｉ）効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列群と追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列群とを伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療し得る。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢおよびＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７３３−６７３７）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＶＰＣＬは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはＶＳＶｇなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。Ｒｉｇｇに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ．（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０１９４】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はＡｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 並びに、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０１９５】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を持つ標的細胞群に、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群を送達する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）系ベクター類は、ＨＳＶが親和性を持つ中枢神経細胞にＳＥＣＰを導入する際に、特に有益に思える。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えＨＳＶ ｄ９２の利用について記載する。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ２２を欠失した組換えＨＳＶ系統の、作製および使用について開示している。ＨＳＶベクター類については、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ および Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（ｌａｒｇｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０１９６】
別法では、或るαウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いて、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、ＳＦＶゲノムに基づく（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、ウイルスのキャプシッドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムＲＮＡが産生される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長ゲノムＲＮＡよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質群が過剰産生される。同様に、ＳＥＣＰをコードする配列をαウイルスゲノムの、キャプシッドをコードする領域に挿入することにより、ベクター導入細胞において、ＳＥＣＰをコードするＲＮＡが多数、産生され、高レベルにＳＥＣＰが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できるので、様々なタイプの細胞にＳＥＣＰを導入することができる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡおよびＲＮＡの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０１９７】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは、例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（例えばＧｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９４）ｉｎ Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．およびＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ， １６３−１７７ページを参照）。また、相補配列またはアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳をブロックし得る。
【０１９８】
リボザイム類は、酵素性ＲＮＡ分子である。ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＳＥＣＰをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０１９９】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を先ず同定するため、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンする。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２００】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。あるいは、ＳＥＣＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を作成し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的ＲＮＡを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２０１】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’ Ｏ−メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はＰＮＡ群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）を加える。
【０２０２】
本発明の更なる実施例は、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。したがって、ＳＥＣＰの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＳＥＣＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２０３】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、商用または専用の、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合とである。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するには、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いる。本発明の或る特定の実施例は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関する（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２０４】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６などを参照）。
【０２０５】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２０６】
本発明の或る更なる実施例は、薬剤として許容できる賦形剤と共に処方される活性成分を一般に持つ、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な処方が広く知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＳＥＣＰのインヒビターなどからなる。
【０２０７】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２０８】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２０９】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２１０】
ＳＥＣＰまたはその断片を含む高分子を直接に細胞内に送達すべく、特殊な形態の組成物群を調製し得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、ＳＥＣＰまたはその断片を、ＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２１１】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタなどにおいて、治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２１２】
医薬的有効量とは、活性処方成分、たとえばＳＥＣＰまたはその断片、ＳＥＣＰの抗体、ＳＥＣＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの、症状や容態を回復させる量を指す。薬用有効度および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の、治療効果に対する投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲での調剤に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２１３】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、薬剤の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２１４】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビター類についての処方とは異なる、ヌクレオチドについての処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２１５】
（診断）
別の実施例では、ＳＥＣＰに特異的に結合する抗体を、ＳＥＣＰの発現によって特徴付けられる疾患の診断に、またはＳＥＣＰやＳＥＣＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＳＥＣＰの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてＳＥＣＰを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２１６】
ＳＥＣＰを測定するための種々のプロトコル、例えばＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，およびＦＡＣＳなどが当分野では周知であり、変化した、あるいは異常なレベルのＳＥＣＰの発現を診断するための基盤を提供する。正常あるいは標準的なＳＥＣＰの発現の値を確定するため、正常な哺乳類、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物と、ＳＥＣＰに対する抗体類とを、複合体の形成に適した条件下で混合する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者での、または対照での、または生検組織群からの疾患サンプルでのＳＥＣＰ発現の量が、基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２１７】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドを診断に用いることもできる。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、ＳＥＣＰの発現が疾患と相関し得る生検組織での遺伝子発現を、検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、ＳＥＣＰの存在の有無、更には過剰な発現を調べ、治療中のＳＥＣＰ値の調節を監視する。
【０２１８】
一実施形態では、ＳＥＣＰをコードまたは近縁の分子をコードするポリヌクレオチド配列（例えばゲノム配列）を検出可能なＰＣＲプローブ類とのハイブリダイゼーションによって、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を同定できる。例えば５’調節領域など高度に特異的な領域から作られた、または例えば保存されたモチーフなどやや特異性の低い領域から作られたというプローブの特異性は、またハイブリダイゼーションのまたは増幅のストリンジェンシーは、プローブが、ＳＥＣＰをコードする天然配列のみを同定するかどうか、あるいは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかを決めることになる。
【０２１９】
プローブ類はまた、関連配列の検出に利用され得る他、ＳＥＣＰをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を持ち得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブ類はＤＮＡまたはＲＮＡであることがあり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６の配列に由来、或いはゲノム配列群、例えばＳＥＣＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンなどに由来し得る。
【０２２０】
ＳＥＣＰをコードするＤＮＡ群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法として、ＳＥＣＰまたはＳＥＣＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、ｍＲＮＡプローブ作製用ベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０２２１】
ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＳＥＣＰの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、心血管障害、神経障害、および発達障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれ、自己免疫／炎症性の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、心血管障害の中には、鬱血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心移植の合併症、動静脈瘻、アテローム硬化、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、冠動脈バイパス移植術が含まれ、神経障害の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したＳＥＣＰ発現を検出するために患者から採取した体液あるいは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、あるいはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、およびマルチフォーマットのＥＬＩＳＡ式アッセイ、およびマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２２２】
ある実施態様では、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２２３】
ＳＥＣＰの発現に関連する疾患の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件下で、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から採取した体液あるいは細胞抽出物と、ＳＥＣＰをコードする配列あるいはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２２４】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２２５】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２２６】
ＳＥＣＰをコードする配列群から設計したオリゴヌクレオチド群の更なる診断的利用には、ＰＣＲの利用を含み得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの断片、あるいはＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２２７】
或る実施態様においては、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）および蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形のＰＣＲ生成物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするＤＮＡ断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、または統計モデルとＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２２８】
ＳＥＣＰの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および、標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９−２３６を参照）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０２２９】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２３０】
別の実施例では、ＳＥＣＰ、ＳＥＣＰの断片、ＳＥＣＰに特異的な抗体を、マイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用および遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２３１】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号 「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２３２】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２３３】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系および薬剤の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他（１９９９）Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化することに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。正規化手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２３４】
或る実施例では、核酸を有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０２３５】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２３６】
プロテオームのプロフィールは、ＳＥＣＰに特異的な抗体を用いてＳＥＣＰ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２３７】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はｍＲＮＡの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２３８】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２３９】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０２４０】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（例えばＢｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５）米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他（１９９７）米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集 （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０２４１】
本発明の別の実施例ではまた、ＳＥＣＰをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、あるいは単一染色体ｃＤＮＡライブラリ群に対してマッピングされる（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４； Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．およびＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２４２】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る（例えば前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見られる。物理的地図上の、ＳＥＣＰをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２４３】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされるいかなる配列も、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を表し得る（例えばＧａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２４４】
本発明の別の実施態様では、ＳＥＣＰ、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。ＳＥＣＰと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２４５】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（例えばＧｅｙｓｅｎ他（１９８４）ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＳＥＣＰ、あるいはその断片と反応してから洗浄される。次に、結合したＳＥＣＰを本技術分野で周知の方法で検出する。精製したＳＥＣＰはまた、上記した薬剤スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２４６】
別の実施態様では、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用い、ＳＥＣＰと特異結合可能な中和抗体をＳＥＣＰとの結合について試験化合物と競合させ得る。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をＳＥＣＰと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０２４７】
別の実施態様では、ＳＥＣＰをコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、例えばトリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等）に依存する新技術に用い得る。
【０２４８】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２４９】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願および刊行物、特に米国特許出願第６０／２４７，６４２号、第６０／２４９，８２４号、第６０／２５２，８２４号、第６０／２４７，５０５号、第６０／２５４，３０５号および第６０／２５６，４４８号は、言及することを以て本明細書の一部となす。
【０２５０】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ群の由来は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリ群であり、表４の列５に列記した。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２５１】
ＲＮＡの純度を高めるため、フェノールによるＲＮＡの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて、組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２５２】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、対応するｃＤＮＡライブラリ群をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＰＣＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、あるいはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０２５３】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミド群の精製には、次の内、少なくとも１つを用いた。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ ＰｌａｓｍｉｄおよびＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システムまたはＲ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットである。沈殿させた後、プラスミドを０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、４℃で保管した。
【０２５４】
別法では、高処理フォーマットで直接結合ＰＣＲ法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ．（１９９４）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）およびＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２５５】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのｃＤＮＡ配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０２５６】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群（例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ）と、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓからの配列群を持つＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、および、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群（ＰＦＡＭ等）である（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ群、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。ＰｈｒｅｄとＰｈｒａｐとＣｏｎｓｅｄとに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋとＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとに基づくプログラムを用いて、ｃＤＮＡの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム���指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０２５７】
表７は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡと完全長配列との分析と構築とに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０２５８】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群との構築と分析とに用いた上記プログラム群は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列４に示した。
【０２５９】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定および編集
推定上の分泌タンパク質類の同定には、先ずＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）に対して実行した。Ｇｅｎｓｃａｎは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムＤＮＡ配列を分析する（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が分泌タンパク質をコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドをＰＦＡＭモデル群に対し分泌タンパク質について問合せて分析した。潜在的な分泌タンパク質はまた、既に分泌タンパク質として注釈が付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群に対する相同性により、同定した。これら選択したＧｅｎｓｃａｎ予測配列を、次にＢＬＡＳＴ分析により、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Ｇｅｎｓｃａｎが予測した配列におけるエラーを補正した。ＢＬＡＳＴ分析はまた、Ｇｅｎｓｃａｎ予測配列の、いかなるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたは公共ｃＤＮＡカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列および／または公共ｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築して得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に、完全に由来する。
【０２６０】
５  ｃＤＮＡ配列データを使ったゲノム配列データの構築
スティッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列群を伸長させるため、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したように構築した部分ｃＤＮＡ群を、ゲノムＤＮＡにマッピングし、また、関連するｃＤＮＡ群と、１つ以上のゲノム配列からＧｅｎｓｃａｎ予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。ｃＤＮＡとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライス変異配列群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、ｃＤＮＡ配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と変異配列群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、ＢＬＡＳＴ分析で公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。Ｇｅｎｓｃａｎが予測した不正確なエキソン群は、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加ｃＤＮＡ配列群を用いるかゲノムＤＮＡの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０２６１】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列群を、ＢＬＡＳＴ分析に基づく１アルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体を、ＢＬＡＳＴ分析により、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２６２】
６  ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６を構築するために用いた配列群を、ＢＬＡＳＴ他のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの実装群（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）を用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよび公共ドメインデータベース群の配列群と比較した。これらのデータベースからの配列群の内、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６と一致した配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続しオーバーラップした配列群のクラスター群に組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２６３】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に対して測定する（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒトＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。ｃＭ距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ’９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０２６４】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ４章および１６章を参照）。
【０２６５】
ＢＬＡＳＴを応用した類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのｃＤＮＡデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２６６】
【数１】
2004534506.tif 000003
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の正規化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。ＢＬＡＳＴスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２６７】
あるいは、ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群を用いて構築される（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡの、組織特異的または疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２６８】
８  ＳＥＣＰをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０２６９】
選択したヒトｃＤＮＡライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２７０】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡを有し、また、２００ ｎｍｏｌの各プライマーを有する。また、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを含有する。プライマー対であるＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂとに対し、以下のパラメータで増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
別法では、プライマー対であるＴ７とＳＫ＋に対し、以下のパラメータで増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１× ＴＥおよび０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配し、ＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量すべく、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μｌを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２７１】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液中の３８４ウェルプレート群に３７℃で一晩培養した。
【０２７２】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
ＤＮＡの定量化には、上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、およびＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２７３】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５’調節配列を得た。
【０２７４】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４−１２６由来のハイブリダイゼーションプローブ群を用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、ＸｂａＩまたはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０２７５】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０２７６】
１０  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、非多孔性の表面を持つ固体とすべきである（Ｓｃｈｅｎａ（１９９９）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばＳｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１を参照）。
【０２７７】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生物学的サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザ脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調整および使用について、以下に詳述する。
【０２７８】
組織または細胞サンプルの調製
全ＲＮＡを組織サンプル群から単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製するためオリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いる。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを逆転写するため、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用い、また、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いる。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用い、２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ群は、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプル群の精製には、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いる。混合後、２つの反応サンプルのエタノール沈殿を、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム、および３００ｍｌの１００％エタノールで行う。サンプルは次にＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて完全に乾燥させ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０２７９】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したｃＤＮＡインサート群により、ベクター含有細菌細胞群から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０２８０】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、０．１％のＳＤＳおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理中および処理後に多量の蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、多量の蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０２８１】
コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する手順は、米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを、高速ロボット装置（ｒｏｂｏｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを置く。
【０２８２】
マイクロアレイをＵＶ架橋するため、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０．２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０．２％ＳＤＳおよび蒸留水で洗浄する。
【０２８３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μｌのサンプル混合体には、Ｃｙ３またはＣｙ５で標識したｃＤＮＡ合成産物群の各０．２μｇを、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度１００に保持するため、１４０μｌの５×ＳＳＣをチェンバーの或るコーナーに加える。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０２８４】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ３の励起のために４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のために６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、解像度２０μｍでスキャンする。
【０２８５】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。好適なフィルター群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０２８６】
通常、各スキャンの感度を較正するため、ｃＤＮＡ対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比１：１００，０００で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するｃＤＮＡのサンプルを２種の蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０２８７】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア２０色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０２８８】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０２８９】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＳＥＣＰをコードする配列あるいはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然ＳＥＣＰの発現を検出、低減または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するため、Ｏｌｉｇｏ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳＥＣＰのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な５’配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＳＥＣＰをコードする転写物に結合するのを防ぐ。
【０２９０】
１２  ＳＥＣＰの発現
ＳＥＣＰの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でＳＥＣＰを発現させるためには、抗生物質耐性遺伝子およびｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターおよびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＳＥＣＰを発現する。真核細胞でのＳＥＣＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳類細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換えによって、あるいは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移によって、ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力な多角体プロモーターによって高レベルのｃＤＮＡ転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０２９１】
殆どの発現系では、ＳＥＣＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の、親和性ベースの精製を迅速に１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を、特異的に操作した各部位でＳＥＣＰからタンパク質分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、免疫親和性精製を可能にする（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（ＱＩＡＧＥＮ）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＳＥＣＰを直接用いて以下の実施例１６、１７、および１８の適用可能なアッセイを行うことができる。
【０２９２】
１３  機能的アッセイ
ＳＥＣＰの機能は、哺乳類細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＳＥＣＰをコードする配列の発現によって算定する。ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳類発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＣＲ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのｃＤＮＡ発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、およびフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容がある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに記述がある。
【０２９３】
遺伝子発現におけるＳＥＣＰの影響は、ＳＥＣＰをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて算定することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ＳＥＣＰと、目的とする他の遺伝子とをコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２９４】
１４  ＳＥＣＰに特異的な抗体の作製
実質的に精製されたＳＥＣＰを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で作製し、これを用いて標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０２９５】
あるいは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＳＥＣＰアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。Ｃ末端付近あるいは親水性領域などの、適切なエピトープの選択方法については、当分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， １１章などを参照）。
【０２９６】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ＦＭＯＣケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗ＳＥＣＰ活性を検査するため、例えば、ペプチドまたはＳＥＣＰを或る基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、更に、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２９７】
１５  特異的抗体を用いる天然ＳＥＣＰの精製
天然ＳＥＣＰあるいは組換えＳＥＣＰを実質的に精製するため、ＳＥＣＰに特異的な抗体群を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィを行う。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの、或る活性化したクロマトグラフィー用レジンと抗ＳＥＣＰ抗体とを共有結合させることにより構成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０２９８】
ＳＥＣＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＳＥＣＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファー類で）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＳＥＣＰとの結合を切るような条件で（例えば、或るｐＨ２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させ、ＳＥＣＰを回収する。
【０２９９】
１６  ＳＥＣＰと相互作用する分子の同定
ＳＥＣＰまたは生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する（例えば Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ．およびＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したＳＥＣＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＳＥＣＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＳＥＣＰ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＳＥＣＰの数量および親和性、会合についての値を計算する。
【０３００】
別法では、ＳＥＣＰと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．およびＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）や、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３０１】
ＳＥＣＰはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３０２】
１７  ＳＥＣＰ活性の実証
ＳＥＣＰのペルオキシダーゼ活性の測定には、分光光度アッセイ（例えばＪｅｏｎｇ， Ｍ． 他 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２９２４−２９３０を参照）を用いる。または、アッセイキット、例えばＡＭＰＬＥＸ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用い、蛍光マイクロプレートリーダーまたは蛍光光度計を併用する。
【０３０３】
ＳＥＣＰの成長刺激活性若しくは成長阻害活性の為のアッセイでは、スイスマウス３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の量を測定する（ＭｃＫａｙ， Ｉ． および Ｌｅｉｇｈ， Ｉ．， ｅｄｓ．（１９９３）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）。このアッセイにおいては、可変量のＳＥＣＰを、静止状態３Ｔ３培養細胞に、放射性ＤＮＡ前駆物質である［３Ｈ］チミジンの存在下で加える。このアッセイのためのＳＥＣＰを得る手段は、組み替えでも良く、生化学的な標本より得ても良い。酸−沈殿可能ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの混合は適切な時間間隔で測定し、混合量は、新規に合成されたＤＮＡの量に直接比例する。少なくとも１００倍のＳＥＣＰ濃度レンジにわたる一次の用量‐応答曲線は、成長モジュレート活性を示す。ミリリットルあたりの活性の１ユニットは、５０％の応答レベルを産生するＳＥＣＰの濃度として定義される。ここで、１００％の応答レベルとは、酸−沈殿可能ＤＮＡへの、［３Ｈ］チミジンの最大の混合を表す。
【０３０４】
別法では、ＴＧＦ−β活性を、上皮成長因子２．５ ｎｇ／ｍｌの存在中で、非腫瘍性正常ラット腎臓線維芽細胞群を足場非依存性増殖に誘導することによって測定する。この方法の記載はＡｓｓｏｉａｎ， Ｒ．Ｋ． 他 （１９８３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：７１５５７１６０にある。
【０３０５】
別法では、ＳＥＣＰ活性のためのアッセイで、培養細胞中の神経伝達の、刺激作用若しくは抑制を測定する。培養ＣＨＯ繊維芽細胞をＳＥＣＰに曝す。エンドサイトーシスによるＳＥＣＰ取込後に、これらの細胞を新鮮培養液で洗浄し、細胞全膜電位固定したアフリカツメガエル筋細胞を、ＳＥＣＰを含まない媒質中の線維芽細胞の１つと接触させる。膜電流を、この筋細胞から記録する。対照値に対し増加若しくは減少した電流は、ＳＥＣＰの神経調節効果を示す（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ， Ｔ．他（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５：６８９−６９６）。
【０３０６】
別法では、ＳＥＣＰ活性のアッセイで、分泌性の膜結合細胞小器官におけるＳＥＣＰの量を測定する。上述したように形質移入された細胞を採取し、溶解する。ライセートは、当業者に既知の、ショ糖密度勾配超遠心法などの方法で分画する。そのような方法は、ゴルジ体、ＥＲ、小膜結合小胞、およびその他の分泌細胞小器官のような、細胞内区画の単離を可能とする。分画した細胞ライセートおよび全体の細胞ライセートよりの免疫沈降は、ＳＥＣＰ特異抗体を用いて実行され、また免疫沈降サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット技術を用いて解析される。全細胞ライセート中ＳＥＣＰに対する分泌オルガネラ中ＳＥＣＰ濃度は、分泌経路を通るＳＥＣＰの量に比例する。
【０３０７】
別法では、或るアッセイでＳＥＣＰのプロテインキナーゼ活性を測定するが、これは、γ標識した３２Ｐ−ＡＴＰの存在下での、ＳＥＣＰによるタンパク質基質のリン酸化を定量化することで行う。ＳＥＣＰを、タンパク質基質、３２Ｐ−ＡＴＰ、および或る適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。基質に組み込まれた３２Ｐは、電気泳動法で遊離３２Ｐ−ＡＴＰより分離され、組み込まれた３２Ｐをラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた３２Ｐの量は、ＳＥＣＰの活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０３０８】
別法では、ＡＭＰ結合活性の測定を、ＳＥＣＰと３２Ｐ標識したＡＭＰとを混合して行う。この反応溶液を３７℃でインキュベートし、反応はトリクロロ酢酸の添加で終了する。酸抽出物を中和し、ゲル電気泳動にかけて非結合標識を除去する。ゲル内に留まる放射活性が、ＳＥＣＰの活性に比例する。
【０３０９】
１８  免疫グロブリン活性の実証
ＳＥＣＰ活性の或るアッセイでは、ＳＥＣＰが血清からの抗原類を認識し沈殿させる能力を測定する。この活性の測定は、定量沈降反応で成し得る（Ｇｏｌｕｂ， Ｅ． Ｓ． 他（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， ＭＡ， １１３−１１５ページ）。ＳＥＣＰを、当分野で既知の方法で同位体標識する。一定量の標識ＳＥＣＰに種々の血清濃度を加える。ＳＥＣＰ−抗原複合体を溶液から沈殿させ、遠心分離で収集する。沈殿性ＳＥＣＰ−抗原複合体の量は、沈殿物中に検出される放射性同位元素の量に比例する。沈殿性ＳＥＣＰ−抗原複合体の量を、血清濃度に対してプロットする。多様な血清中濃度に対しての特徴的沈降素曲線が得られ、沈殿性ＳＥＣＰ−抗原複合体の量は、初め血清中濃度の増加に比例して増加し、当量点を頂点とし、その後は血清中濃度の増加に比例して減少する。このように、沈澱性ＳＥＣＰ−抗原複合体の量は、抗原の制限量と過剰量に対する感受性を特徴とするＳＥＣＰ活性の測定方法となる。
【０３１０】
別法として、ＳＥＣＰ活性の或るアッセイは、細胞表面におけるＳＥＣＰの発現を測定する。 ＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡを、非白血球細胞株に形質移入する。細胞表面タンパク質類をビオチンで標識する（ｄｅ ｌａ Ｆｕｅｎｔｅ， Ｍ．Ａ． 他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ９０：２３９８−２４０５）。ＳＥＣＰ特異的抗体群を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロット法で分析する。標識した免疫沈降剤と未標識免疫沈降剤の比は、細胞表面に発現したＳＥＣＰの量に比例する。
【０３１１】
別法で、ＳＥＣＰ活性の或るアッセイは、ＳＥＣＰの過剰発現が誘発する、細胞凝集の量を測定する。このアッセイにおいては、ＮＩＨ３Ｔ３などの培養細胞にＳＥＣＰをコードするｃＤＮＡで形質移入する。このｃＤＮＡは、或る強力なプロモーターの制御下にある或る適切な哺乳類発現ベクター内に含まれるようにする。緑色蛍光タンパク質（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）などの蛍光標識タンパク質をコードするｃＤＮＡとの共形質移入を行うと、安定な形質移入体を同定するのに役立つ。形質移入された細胞と形質移入されない細胞で、細胞の凝集（塊化）量を比較する。細胞の凝集量により、ＳＥＣＰの活性を直接に測定できる。
【０３１２】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３１３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３１４】
表２は、本発明のポリペプチド群のＧｅｎＢａｎｋ識別番号と、最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３１５】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３１６】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡ断片やゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３１７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３１８】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０３１９】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献および閾値パラメータと共に示す。
【表１】
2004534506.tif 000004
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【国際公開パンフレット】
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2004534506.tif 000274
2004534506.tif 000275
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534506.tif 000276
【国際調査報告】
2004534506.tif 000277
2004534506.tif 000278
2004534506.tif 000279
2004534506.tif 000280
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2004534506.tif 000282