(57)【要約】本発明は目的物質の細胞への導入を強化するのに有用な組成物の製造に向けた、非複合体化ペプチドの使用に関する。かかる組成物は遺伝子治療、予防接種、および目的物質、特に核酸が細胞にin vivo投与されるいずれもの治療または予防状況において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）およびｂ）を含んでなる、組成物：
ａ）下記の（ｉ）および（ii）からなる群から選択される少なくとも一つのペプチド：
(ｉ)アミノ酸配列 Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala(配列番号１)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［ここで、Ｘａａは、アラニン(ＡｌａまたはＡ)、イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、プロリン(ＰｒｏまたはＰ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)、アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、システイン(ＣｙｓまたはＣ)、グルタミン(ＧｌｕまたはＱ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、トレオニン(ＴｈｒまたはＴ)およびチロシン(ＴｙｒまたはＹ)からなる群から互いに独立して選択される］、および
(ii)アミノ酸配列 Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala(配列番号７)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［なお、前記ペプチドは前記組成物において６より大きいｐＨである］；
ｂ）少なくとも１種の目的物質。
【請求項２】
目的物質を細胞へ導入することを目的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
目的物質が核酸である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
脊椎動物の組織に投与した場合に、細胞への核酸導入を強化しうるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
核酸が裸の核酸である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
目的物質の濃度が約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭの範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
医薬上許容される注射可能な担体をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１種の目的物質を細胞へ導入するための組成物を製造するための、下記（ｉ）および（ii）からなる群から選択される、ペプチドの使用：
(ｉ)アミノ酸配列 Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala(配列番号１)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［ここで、Xaaはアラニン(ＡｌａまたはＡ)、イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、プロリン(ＰｒｏまたはＰ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)、アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、システイン(ＣｙｓまたはＣ)、グルタミン(ＧｌｕまたはＱ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、トレオニン(ＴｈｒまたはＴ)およびチロシン(ＴｙｒまたはＹ)からなる群から互いに独立して選択される］、および
(ii)アミノ酸配列 Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala(配列番号７)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［なお、前記ペプチドは前記組成物において６より大きいｐＨである］。
【請求項９】
目的物質が核酸である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
目的物質を細胞へ導入する方法であって、細胞を請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１１】
細胞への目的物質の導入を強化するための、下記（ｉ）および（ii）からなる群から選択される、ペプチドの使用：
(ｉ)アミノ酸配列 Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala(配列番号１)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［ここで、Ｘａａはアラニン(ＡｌａまたはＡ)、イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、プロリン(ＰｒｏまたはＰ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)、アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、システイン(ＣｙｓまたはＣ)、グルタミン(ＧｌｕまたはＱ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、トレオニン(ＴｈｒまたはＴ)およびチロシン(ＴｙｒまたはＹ)からなる群から互いに独立して選択される］、および
(ii)アミノ酸配列 Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala(配列番号７)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［なお、前記ペプチドは前記組成物において６より大きいｐＨである］。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、目的物質の細胞への導入を強化するのに有用な組成物を製造するための、非複合体化ペプチドの使用に関する。かかる組成物は遺伝子治療、予防接種、および目的物質、特に核酸が細胞にin vivo投与されるいずれもの治療または予防状況において特に有用である。
【０００２】
背景技術
遺伝子治療は遺伝物質の細胞または生物への導入と定義されうる。数年のうちに遺伝子治療によるヒト疾患治療の可能性は理論的検討段階から臨床応用の段階に移行する。ヒトに適用された最初のプロトコールは１９９０年９月にアメリカ合衆国においてアデニン・デアミナーゼ(ＡＤＡ)欠損症患者で開始された。この最初の有望な試験は数々の新規なる応用および現在進められている遺伝子治療に基づく有望な臨床試験の後に行われた(例えば、http://cnetdb.nci.nih.gov/trialsrch.shtmlまたはhttp://www. wiley.co.uk/genetherapy/clinical/に挙げられる臨床試験を参照)。
【０００３】
遺伝子治療の成功は主として目的の治療遺伝子の効率的な送達によって得られ、生体生物の細胞内でのその発現を可能にする。治療遺伝子は種々のベクターを用いて細胞へ導入され、その結果、宿主ゲノムの一時的発現または恒久的な形質転換のいずれかが生じうる。この１０年間、多数のウイルス、ならびに非ウイルスベクターが遺伝子導入用に開発されてきた(例えば、総説としてはRobbins et al., 1998, Tibtech 16, 35-40 and Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143-198を参照)。
【０００４】
これまでに使用されてきた細胞内遺伝子送達機構のほとんどがウイルスベクター、特に、アデノウイルス、ポックスウイルスおよびレトロウイルスベクターである(総説としてはRobbins et al., 1998, Tibtech, 16, 35-40を参照)。しかしながら、ウイルスの上記使用では、レトロウイルスベクターは大型のヌクレオチド配列(例えば、約１３ｋｂであるジストロフィン遺伝子)を収容できないこと、レトロウイルスゲノムは宿主細胞ＤＮＡに組み込まれ、そのため、レシピエント細胞において遺伝子変化をもたらしうること、感染ウイルス粒子が生物内または環境に拡散しうること、アデノウイルスベクターは治療した患者において強い免疫応答を誘導しうること(Mc Coy et al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433-442)など、多くの不利な点がある。
【０００５】
このため、大量生産、安全性、低免疫原性、および大きなＤＮＡ断片の送達能力に関し特に有利な非ウイルス系が提案されてきた。例えば、核酸の陽イオン脂質または陽イオンポリマーとの複合体化に基づき、非ウイルスベクター代替物が提案されてきた(総説としてはRolland, 1998, Therapeutic Drug Carrier Systems, 15, 143-198を参照)。これらの陽イオン化合物は陰イオン分子と複合体を形成することができ、そのため、それらの負電荷を中和する傾向があり、かつそれらをそれらの細胞への導入に有利に働く複合形態に構成可能である。これらの非ウイルス送達系は、例えば、受容体媒介性機構(Perales et al., 1994, Eur. J. Biochem. 226, 255-266; Wagner et al., 1994, Advanced Drug Delivery Reviews, 14, 113-135)、ポリアミドアミン(Haensler et Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372379)、樹状ポリマー(ＷＯ９５／２４２２１)、ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）、ポリリジン(米国特許ＵＳ−Ａ−５５９５８９７またはフランス特許ＦＲ２７１９３１６)などのポリマー媒介性トランスフェクション、またはＤＯＴＭＡ(Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417)、ＤＯＧＳもしくはトランスフェクタム(商標)(Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986)、ＤＭＲＩＥもしくはＤＯＲＩＥ(Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75)、ＤＣ-ＣＨＯＬ(Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285)、ＤＯＴＡＰ(商標)(McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622)、リポフェクタミン(商標)もしくはグリセロ脂質化合物(例えば、欧州特許第ＥＰ９０１４６３号およびＷＯ９８／３７９１６を参照)などの脂質媒介性トランスフェクション(Felgner et al., 1989, Nature, 337, 387-388)に基づくものである。
【０００６】
もう一つの代替物が１９９０年に、裸のＲＮＡまたはＤＮＡの注入、すなわち特別な送達系を用いずに直接マウス骨格筋に注射することで筋肉細胞内でのリポーター遺伝子の発現がもたらされることを示したWolff et al.(Science 247 (1990), 1465-1468)により提案された。細胞をトランスフェクトするこの技術により有利な簡便性が提供され、さらに肺(Tsan et al., Am. J. Physiol. 268 (1995), L1052-L1056; Meyer et al., Gene Therapy 2 (1995), 450-460)、脳(Schwartz et al., Gene Therapy 3 (1996), 405-411)、関節(Evans and Roddins, Gene therapy for arthritis; In Wolff (ed) Gene therapeutics: Methods and Applications of direct Gene Transfer. Birkhaiser. Boston (1990), 320-343)、甲状腺(Sikes et al., Human Gen. Ther. 5 (1994), 837-844)、皮膚(Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9519-9523)および肝臓(Hickman et al., Hum. Gene Ther. 5 (1994), 1477-1483)への送達に関するこの系の有用性を確認する試験が行われた。
【０００７】
それでもなお、Davis et al.(Human Gene Therapy 4 (1993), 151-159 and Human Mol. Genet. 4 (1993), 733-740) は、例えば、一次的筋疾患の治療では、不足していると思われる、骨格筋にin vivo注入された裸のＤＮＡの発現に大きな変動性があることを観察した。著者らは筋肉に比較的大量の高張スクロースまたは毒素、例えば、ヘビから単離される心臓毒を予備注射して筋肉の再生を促すことにより遺伝子導入効率の向上を達成するという解決法を提示している。しかし、これらの方法は有望なものではあるがヒト治療には適用できない。
【０００８】
さらに、詳細な検討の結果、これらの非ウイルス系の細胞内送達の主要経路はエンドサイトーシスによる小胞へのインターナリゼーションであることが分かっってきた。エンドサイトーシスは真核細胞が小さなエンドサイトーシス小胞の形態、すなわち、細胞外液および分子材料、例えば、核酸分子を取り込むエンドソームとして原形質膜の部分を摂取する自然プロセスである。細胞内では、これらのエンドソームは細胞内分解の特異部位であるリソソームと融合する。リソソームは酸性であり、エンドソーム小胞の分子内容物を消化する種々の分解酵素を含んでいる。従って、エンドサイトーシス後、インターナライズされた材料は膜によってさらに細胞質から分離されるため、その所望の機能を果たすことができない。実際、上記所望の機能、すなわち、所望の治療効果はほとんどの核酸導入アプローチにおいて、少なくとも細胞質(例えば、ＲＮＡに関して)への、もっと正確に言えば、それらの機能効果が生じうる細胞の核(例えば、ポリペプチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡに関して) へのそれらの送達によって変化する。そのため、インターナライズされた核酸のエンドソーム小胞への集積により核酸の細胞への機能導入効率がかなり低下し、その結果として遺伝子治療の効果が低くなる(Zabner et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 18997-19007)。
【０００９】
よって、生存生物の細胞への効率的な送達およびその細胞内での遺伝情報の発現は送達系の核酸分子を細胞へ導入する能力ならびに核酸のエンドソーム保持および分解回避を促すその能力の両方によって変化する。
【００１０】
送達系がエンドサイトーシスを介して細胞によって取り込まれてしまうと、それは細胞質に局在するまたは核に移動するエンドソームコンパートメントから脱出しなければならない。一般的な方法は、例えば、融合誘導性または膜分解性／エンドソーム分解性ペプチドを用いることによりエンドソーム分解を促進することである(Mahato et al., 1999, Current Opinion in Mol. Therapeutics, 1, 226-243を参照)。
【００１１】
ある微生物(例えば、ウイルス)は自然に受容体媒介性エンドサイトーシスを介してインターナライズされるものであり、上記のエンドソーム分解を回避する系を発展させた。この性質に基づき、トランスフェクション培地に添加される(Cotten et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6094-6098)、または送達複合体と直接結合させる(Wu et al., 1994, J. Biol. Chem., 269,11542-11546;米国特許第５，９２８，９４４号)いずれかの複製欠陥アデノウイルス粒子またはライノウイルス粒子のエンドソーム不安定化活性をはじめとする遺伝子導入系が提案された。これらの系についてのin vivo遺伝子導入によって生じる発現レベルは将来的な見込みはあるものの依然比較的低いものであり、さらなる最適化が必要である。また、合成系も生み出された。融合誘導活性を有する最も特徴的な合成ペプチドはインフルエンザ血球凝集素ＨＡ２サブユニットのＮ末端ペプチド(例えば、ＩＮＦペプチド)の第１の２３個のアミノ酸から誘導されるものである。ｐＨ７では、このペプチドは優先的にランダムコイル構造をとる。ｐＨ５では、両親媒性のα‐へリックスコンホメーションが有利であり、ペプチドはエンドソーム分解性となる。同様に、Gottschalk et al.(1996, Gene Therapy, 3, 448-457)により開発された合成ペプチドＪＴＳ−１はＩＮＦ配列ＧＬＦＥＡで始まり、その後に最適化されたペプチド配列が続くものである。このＪＴＳ−１ペプチドはホスファチジルコリンリポソームを含有するカルセインをｐＨ７よりもｐＨ５において有利に溶解しうることが分かった。
【００１２】
しかしながら、核酸の細胞内送達には上記ペプチドがそれらの融合誘導活性と上記核酸を細胞へ導入しうる送達複合体を形成するための核酸複合体化活性とを併せもつ必要がある。
【００１３】
現在までに開発されたいくつかの系は上記の特徴(例えば、ＷＯ９６／４０９５８、ＷＯ９８／５００７８またはGottschalk et al., 1996, Gene Therapy, 3,448-457, Haensler & Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372-379)を示す二つの異なる要素を併せもっている。これらの２成分系は実際には酸性残基(グルタミン酸およびアスパラギン酸アミノ酸)により、エンドソームｐＨに関し特異性を有するペプチドを含有している。中性ｐＨでは、負電荷を有するカルボン酸基によってこれらのペプチド構造が不安定化する；カルボン酸基の酸性化によってペプチドの多量体化および／または膜相互作用が促され、膜不安定化および漏出がもたらされる。Wagner et al.(1999, Advanced Drug Delivery Reviews, 38, 279-289)はこのｐＨ特異性を分析し、ペプチドへのさらなるグルタミン酸の導入によってそれらのｐＨ特異性を高め、その結果として、それらのエンドソーム破壊特性を高めることができることを示した。しかしながら、ウイルス粒子のエンドソーム破壊特性を有し、かつ核酸分子と結合して複合体を形成することができる上記の混合系が細胞内核酸導入を促進し、in vitroならびにin vivo状況下で機能するには性質の異なる各部分(すなわち、核酸結合リガンドと膜不安定化合成ペプチド)の微妙なバランスを示す必要がある。
【００１４】
簡易系を提案するために、Wyman et al.(1997, Biochemistry, 36, 3008-3017)は核酸分子のin vitroトランスフェクションを促進することができ、かつ膜破壊を引き起こすことができる設計された合成ペプチド、ＫＡＬＡを用いる単一成分系を開発した。正電荷を有する親水性リジンアミノ酸残基は核酸分子を結合するために選択されものであるが、グルタミン酸アミノ酸残基はＫＡＬＡペプチドにｐＨ特異性を与え、それによってそのエンドソーム破壊特性を確実なものとするためにさらに保持されている。
【００１５】
入手可能な核酸送達系はin vivo遺伝子治療での利用において安全性または効率に関しまだ満足に値するものではなく、さらなる最適化が必要である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の基礎となる技術的な課題は目的物質、好ましくは治療、好ましくは遺伝子治療に有用である核酸分子を細胞へ送達するための改良された方法および手段を提供することである。この問題は特許請求の範囲で記載される態様を提供することによって解決される。
【００１７】
よって、本発明は少なくとも１種の目的物質を細胞へ導入するための組成物を製造するための、ペプチドの使用、より詳しくは、少なくとも１種の目的物質の細胞への導入を強化するための組成物を製造するための、ペプチドの使用に関する。ここでこのペプチドは、下記（ｉ）および（ii）からなる群から選択される：
(ｉ)アミノ酸配列 Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala(配列番号１)を含んでなるまたはからなるペプチド［ここで、Ｘａａはアラニン(ＡｌａまたはＡ)、イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、プロリン(ＰｒｏまたはＰ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)、バリン(ＶａｌまたはＶ)、アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、システイン(ＣｙｓまたはＣ)、グルタミン(ＧｌｕまたはＱ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、トレオニン(ＴｈｒまたはＴ)およびチロシン(ＴｙｒまたはＹ)からなる群から互いに独立して選択される］、および
(ii)アミノ酸配列(配列番号７) Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Alaを含んでなるまたはからなるペプチド［なお、前記ペプチドは前記組成物において好ましくは６より大きい、さらに好ましくは６．５より大きい、なお好ましくは７より大きい、いっそうさらに好ましくは７．５より大きいｐＨ、最も好ましくは約８である］。
【００１８】
本発明者らはこれまでに(以下の例１〜１２を参照)細胞膜破壊を引き起こし、陰イオン物質、特に核酸分子を結合することができる陽イオンペプチドを同定して複合体を作製し、それによって上記複合体化陰イオン物質の細胞への導入を強化した。すなわち、これらの陽イオンペプチドは酸性アミノ酸を含んでおらず、さらに詳しくはグルタミン酸アミノ酸(ＧｌｕまたはＥ)を含んでいない。かかる陽イオンペプチドの例はアミノ酸配列 Gly Leu Phe Xaa Ala Leu Leu Xaa Leu Leu Xaa Ser Leu Trp Xaa Leu Leu Leu Xaa Ala(配列番号１)を含んでなるか、またはからなる、ペプチド［ここで、Ｘａａはリジン(ＬｙｓまたはＫ)、ヒスチジン(ＨｉｓまたはＨ)およびアルギニン(ＡｒｇまたはＲ)アミノ酸からなる群から互いに独立して選択される］である。
【００１９】
現在、試験された一つのペプチド、ｐｐＴＧ２１；配列番号７がｐＨ８ではプラスミドＤＮＡと結合できないが６より大きいｐＨで核酸組成物に加えて使用した場合、特に上記組成物が腫瘍性組織に投与される場合に脊椎動物細胞への核酸導入効率の飛躍的な向上をもたらすことが驚くべきことに分かっている(例１３を参照)。ｐｐＴＧ２１がｐＨ８でＤＮＡと結合できない事実はプラスミドＤＮＡとｐｐＴＧ２１ペプチド間の結合を妨げるｐｐＴＧ２１のヒスチジン残基のプロトン化状態(ｐＫ６)により説明されうる。ｐＨ８ではＤＮＡ結合ができないため、これまでｐｐＴＧ２１は上記核酸を細胞へ導入するのに有用な核酸を含有する複合体の製造から排除されていた。
【００２０】
しかしながら、本願において提供される結果では核酸の細胞への導入を強化するための医薬組成物の製造に、核酸との複合体形成がなされない非荷電ペプチドも使用できることを示している。
【００２１】
「目的物質」とは、好ましくは、荷電分子(電荷数に制限はない)をいう。好ましくは、上記分子は目的の陰イオン物質であり、さらに好ましくは、それはタンパク質および核酸分子からなる群から選択される。好ましい態様によれば、上記目的の陰イオン物質は核酸である。
【００２２】
本発明の範囲内で使用する「核酸」または「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成、修飾または非修飾のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくは断片、もしくはその組合せ(米国特許第５５２５７１１号、同第４７１１９５５号、同第５７９２６０８号または欧州特許第ＥＰ３０２１７５号(変形例)を参照)（大きさに制限はない）を意味する。中でも、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはかかるＲＮＡをコードするＤＮＡであることができる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本発明において同義語である。核酸は直鎖または環状ポリヌクレオチド形態、好ましくはプラスミド形態であってよい。また、核酸は例えば、アンチセンスまたはリボザイム機能に関しては細胞に送達されるオリゴヌクレオチドであることができる。本発明によれば、核酸は、好ましくは裸のポリヌクレオチドである(Wolff et al., Science 247 (1990), 1465-1468)か、またはポリヌクレオチドの細胞への取り込みに関与しうるポリペプチド、好ましくはウイルスポリペプチド、または陽イオン脂質、もしくは陽イオンポリマー、もしくはその組合せなどの少なくとも１種の化合物(総説としてはLedley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144を参照) 、またはプロトン性極性化合物(例は本願において以下にまたは欧州特許第ＥＰ８９０３６２号に示される)とともに合成される。また、核酸は、さらにウイルスベクター(アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクターなど)も示す。本発明において「ウイルスベクター」とは、ベクターゲノム、ウイルス粒子(すなわち、ウイルスゲノムをはじめとするウイルスキャプシド)、ならびにエンプティーウイルスキャプシドを包含する。
【００２３】
「プラスミド」とは、染色体外環状ＤＮＡをいう。プラスミドの選択は非常に多様である。プラスミドは様々な製造業者から購入することができる。好適なプラスミドとしては、限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、ｐＣＩ(Promega)およびｐポリ(Lathe et al., Gene 57 (1987), 193-201)由来のものが挙げられる。分子生物学技術(Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), NY)によりかかるプラスミドを改変することもできる。プラスミドはトランスフェクト細胞(例えば、細胞栄養要求性、抗生物質耐性の誘導による)、安定化エレメント(例えば、ｃｅｒ配列; Summers and Sherrat, Cell 36 (1984), 1097-1103)または組込みエレメント(例えば、ＬＴＲウイルス配列)を選択または同定するために選択遺伝子を含んでもよい。
【００２４】
好ましくは、核酸分子は、転写、翻訳されて目的のポリペプチドおよびその発現を可能にするエレメント(すなわち、発現カセット)を生じうる少なくとも一つの目的のコード化遺伝子配列(すなわち、転写ユニット)を含んでなる。核酸が遺伝子発現に好適な環境におかれている場合にそれがこの正確な遺伝情報を有しているならば、その転写ユニットがコードされた遺伝子産物を発現すると考えられる。発現のレベルおよび細胞特異性は、関連プロモーターの強度および起源、ならびに関連エンハンサーエレメントの存在および活性化に非常に左右される。よって、好ましい態様では、転写制御エレメントには、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなどのプロモーター／エンハンサー配列が含まれる。なお、当業者ならば、ウイルス、原核生物（例えば、細菌）、または真核生物から得られると考えられ、構成性または調節可能であり、真核細胞、特に標的細胞または組織内での発現に好適である種々の他のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列が公知であることが分かるであろう。さらに厳密には、標的細胞または組織による発現に必要なこの遺伝情報は、上記遺伝子配列(この遺伝子配列がＤＮＡである場合)のＲＮＡへの転写、好ましくはｍＲＮＡへの転写、および、必要に応じて、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、に必要な全てのエレメントを含んでなる。種々の脊椎動物系での使用に好適なプロモーターは文献で広く記載されている。好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスＥｌａ、ＭＬＰ、ＰＧＫ(ホスホグリセロキナーゼ；Adra et al. Gene 60 (1987) 65-74; Hitzman et al. Science 219 (1983) 620-625)、ＲＳＶ、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋ、ワクシニアプロモーター、誘導プロモーター、ＭＴ(メタロチオネイン; Mc Ivor et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987), 838-848)、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、免疫グロブリン、α−アクチン(Tabin et al., Mol. Cell Biol. 2 (1982), 426436)、ＳＲ(Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 466-472)、初期ＳＶ４０(シミアンウイルス)、ＲＳＶ(ラウス肉腫ウイルス) 、ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１、ＳＭ２２(ＷＯ９７／３８９７４)、デスミン(ＷＯ９６／２６２８４)、および初期ＣＭＶ(サイトメガロウイルス；Boshart et al. Cell 41 (1985) 521)などが挙げられる。また、Chalcrabarti et al.(1997, Biotechniques 23,1094-1097)、Hammond et al.(1997, J. Virological Methods 66, 135-138)またはKumar and Boyle(1990, Virology 179,151-158)に記載されるものなどの合成プロモーター、ならびに初期および後期ポックスウイルスプロモーターのキメラプロモーターを使用してもよい。また、腫瘍細胞で活性であるプロモーターも使用できる。好適な例としては、限定されるものではないが、ＭＵＣ−１(乳癌および前立腺癌で過剰発現；Chen et al., J. Clin. Invest. 96 (1995), 2775-2782)、ＣＥＡ(癌胎児抗原；結腸癌で過剰発現；Schrewe et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 2738-2748)、チロシナーゼ(黒色腫で過剰発現；Vile et al., Cancer Res. 53 (1993), 3860-3864)、ＥｒｂＢ-２(乳癌および膵臓癌で過剰発現；Harris et al., Gene Therapy 1 (1994), 170-175)およびα-ホエトプロテイン(肝臓癌で過剰発現；Kanai et al., Cancer Res. 57 (1997), 461-465)、またはその組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子から単離されたプロモーターが挙げられる。本発明に関しては初期ＣＭＶプ���モーターが好ましい。
【００２５】
核酸はまた、イントロン配列、標的化配列、輸送配列、複製または組込みに関連した配列を含むことができる。これらの配列は文献で報告されており、当業者は容易に入手することができる。また、核酸を改変して特定の成分、例えば、スペルミンにより安定化させることも可能である。それをさらに、例えば、化学修飾に変えて、例えば、本発明のペプチドなどの特定のポリペプチドとのその結合を助けることもできる。本発明によれば、核酸はそれが導入される標的細胞と同種であってもまたは異種であってもよい。
【００２６】
好ましい態様では、核酸は、治療分子(すなわち、治療遺伝子)である遺伝子産物をコードする少なくとも一つの目的の遺伝子配列を含有している。「治療分子」とは、好適には患者、特に、ある疾患または病状に苦しむ患者、またはこの疾患または病状から守るべき人に投与した際または発現させた際に薬理学的または防御活性を有するものである。かかる薬理学的または防御活性は上記疾患または上記病状の進行または症状への有益な効果との関連が期待されるものである。当業者が本発明を適用する過程で治療分子をコードする遺伝子を選択する際、一般に自分の選択をこれまでに得られた結果と対応させ、請求された本発明の実施以外の不必要な試験を行うことなく、合理的にかかる薬理学的性質が得られると期待できる。本発明によれば、目的の配列はそれが導入される標的細胞と同種であってもまたは異種であってもよい。有利には、上記目的の配列はポリペプチド、特に治療または予防効果を与える治療または予防ポリペプチドの全てまたは一部をコードする。ポリペプチドとは、大きさに関係なく、またグリコシル化されていてもそうでなくても、ポリヌクレオチドの全ての翻訳産物であると考えられるものであり、ペプチドおよびタンパク質を含んでいる。治療ポリペプチドとしては、主な例として、動物またはヒトの欠陥または欠損タンパク質を補うことができるこれらのポリペプチド、または毒作用によって働いて有害な細胞を制限するまたは体から取り除くものが挙げられる。また、これらは内因性抗原として働いて液性または細胞性の応答、もしくはその両方を誘導する免疫付与ポリペプチドでありうる。
【００２７】
次のコード化遺伝子配列は特別注目されているものである。例えば、サイトカイン(α、βまたはγ−インターフェロン、インターロイキン(ＩＬ)、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど)、免疫活性化ポリペプチド(Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭなど)、細胞または核受容体、受容体リガンド(ｆａｓリガンドなど)、凝固因子(ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸなど)、増殖因子(形質転換増殖因子  ＴＧＦ、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦなど)、酵素(ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、一酸化窒素シンターゼ  ＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼなど)、酵素阻害剤(α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤  ＰＡＩ-１など)、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、ＭＨＣ抗原(主要組織適合遺伝子複合体)クラスＩもしくはIIまたは一つ以上の細胞遺伝子の発現を調整／調節できるポリペプチド、細菌、寄生生物もしくはウイルス感染またはその発症を抑制できるポリペプチド(抗原ポリペプチド、抗原エピトープ、競合により天然タンパク質の作用を抑制するトランスドミナント変異体など)、アポトーシス誘導因子または抑制因子(Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸなど)、細胞増殖抑制因子(p２１、pl６、Ｒｂなど)、アポリポタンパク質(ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど)、脈管形成阻害薬(アンギオスタチン、エンドスタチンなど)、脈管形成ポリペプチド(血管内皮増殖因子  ＶＥＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１およびＮｏｖをはじめとするＣＣＮファミリーなど)、酸素ラジカル捕捉剤、抗腫瘍作用を有するポリペプチド、抗体、毒素、抗毒素およびマーカー(β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど)をコードする遺伝子、または病態の治療または予防に有用であると当技術分野で認められているその他の目的の遺伝子。遺伝性機能障害を治療するという点から見て、欠陥遺伝子の機能的対立遺伝子、例えば、ＡまたはＢ型血友病では第VIIIまたはIX因子、ミオパシーではジストロフィン (もしくはミニジストロフィン)、糖尿病ではインスリン、嚢胞性線維症ではＣＦＴＲ(嚢胞性線維性膜貫通調節因子)をコードする遺伝子を使用してもよい。好適な抗腫瘍遺伝子としては、限定されるものではないが、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、単純ヘルペス１型ウイルスのチミジンキナーゼ(TK-HSV-1)などの細胞傷害性産物、リシン、細菌毒、ＵＰＲＴアーゼ(ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ)およびＣＤアーゼ(シトシンデアミナーゼ)活性を各々有する酵母遺伝子ＦＣＹ１および／またはＦＵＲ１の発現産物、抗体、細胞分裂または形質導入シグナルを抑制するポリペプチド、癌抑制遺伝子(ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３)、宿主免疫系を活性化するポリペプチド、腫瘍関連抗原(ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ初期または後期抗原(Ｅ６、Ｅ７、ＬＩ、Ｌ２)をコードするものが挙げられるが、所望により、サイトカイン遺伝子と組み合わせてもよい。ポリヌクレオチドは抗体もまたコードすることができる。これに関し、「抗体」とは、全てのクラスの全免疫グロブリン、二重もしくは多重���原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントをはじめとするＦ(ａｂ)’２、Ｆａｂ’、Ｆａｂおよび抗イディオタイプなどのフラグメントを包含するものである(米国特許第４，６９９，８８０号)。有利には、上記核酸は免疫付与ポリペプチドであり、細胞内ウイルスをはじめとする感染因子または腫瘍細胞に対して内因性免疫原として働いて液性または細胞性の応答、もしくはその両方を誘導するポリペプチドの全てまたは一部をコードする。「免疫付与ポリペプチド」とは、上記ポリペプチドがトランスフェクト細胞で産生される場合にそれが処置した患者の免疫応答に関与していることを意味する。すなわち、ＡＰＣなどの大飲細胞で産生されたまたはその細胞により取り込まれた上記ポリペプチドが加工され、生じたフラグメントがＭＨＣクラスＩおよび／またはII分子によりこれらの細胞の表面に提示され、特定の免疫応答を誘導する。
【００２８】
核酸は１種以上の目的の遺伝子を含んでいてもよい。これに関し、自殺遺伝子産物をコードする遺伝子およびサイトカイン遺伝子(例えば、α、βまたはγ−インターフェロン、インターロイキン(好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２から選択される)、ＴＮＦ因子、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど)、免疫活性化遺伝子(例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ)またはケモカイン(chimiokine)遺伝子(例えば、ＭＩＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ  １)の組合せが有利である。異なる遺伝子発現は特異なプロモーター(ポリシストロン性カセット)または独立したプロモーターによって制御しうる。さらに、それらは核酸に沿って、同じまたは逆方向のいずれかに、特異部位または種々の部位に挿入しうる。
【００２９】
目的のコード化遺伝子配列は分子生物学の通常の技術(ＰＣＲ、好適なプローブを用いたクローニング、化学合成)であらゆる生物または細胞から単離しうる。要すれば、突然変異誘発、ＰＧＲまたは他のプロトコールによりその配列を改変しうる。
【００３０】
また、「目的物質」は変異体または改変ペプチドをはじめとするペプチド(ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは同義語である) 、ペプチド様分子、抗体もしくはそのフラグメント、キメラ抗体もしくはペプチドなどである。
【００３１】
目的物質の細胞への伝達もしくは導入(introduction or transfer)プロセス自体は十分に公知である。「伝達もしくは導入」(introduction or transfer)とは、物質が細胞へ導入され、このプロセスの終わりには上記細胞内部またはその膜内もしくはその上に存在することを意味する。また、物質が核酸である場合、「伝達もしくは導入」(introduction or transfer)のことを「トランスフェクション」ともいう。トランスフェクションは好適な方法、例えば、上記核酸によりコードされた遺伝子の発現を定量する、もしくは発現タンパク質またはそのｍＲＮＡの濃度を測定する、またはその生物学的作用を調べることにより確認できる。
【００３２】
これに関し、本発明の範囲において「導入の強化」(improved transfer)とは、上記ペプチド不在下で行われた導入に対する本発明のペプチドが存在する場合の細胞による目的物質のより効率的な導入を意味する。これは本発明で開示されたペプチドを使用しないで取り込まれた物質の量を対照とし、この量を同一試験条件下で上記ペプチドを使用した場合に細胞によって取り込まれた量と比較することによって確認することができる。好ましくは、導入の強化はペプチドを使用しない状況と比較した本発明のペプチドを含んでなる組成物、および／または６より大きいｐＨを有する、好ましくはｐＨ８を有する組成物を使用した場合に細胞へ導入された核酸に存在する遺伝子の発現量の高まりによって確認することができる。
【００３３】
一つの好ましい態様では、本発明のペプチドは膜破壊を引き起こしうるものである。本明細書において使用する「膜破壊を引き起こしうるペプチド」とは、膜、特に細胞膜、さらに詳しくはエンドソームおよび／またはリソソーム膜との相互作用によって膜不安定化および／または漏出、特にエンドソーム内容物の開放がもたらされるように相互作用しうるペプチドをいう。好ましくは、上記相互作用によってその細胞の細胞質へのエンドソームおよび／またはリソソーム内容物の流出が起こる。ペプチドの膜破壊性は例えば、付属の実施例またはOlson et al.(1979, Biochim. Biophys. Acta, 557,19-23)に記載される方法によって容易に測定できる。本明細書において使用する「膜」は、当業者が一般に理解している意味と同じ意味とする。一般に、主として脂質からなる単または二層をいい、結果的にはタンパク質を含有している。天然(例えば、細胞膜)および合成(例えば、リポソーム)膜が含まれる。好ましい膜は例えば、細胞膜、エンドソームもしくはリソソーム膜、トランスゴルジネットワーク膜、ウイルス膜、核膜などの天然膜である。上記の特性は試験の節で行うように評価できる。
【００３４】
本明細書において使用する「ペプチド」、「アミノ酸残基」および「酸性アミノ酸残基」は、当業者が一般に理解している意味と同じ意味とする。好ましくは、「ペプチド」とは、長さが５０残基未満、さらに好ましくは３０残基未満、最も好ましくは２０残基未満であるアミノ酸残基の重合体をいう。好ましい態様では、本発明において使用するペプチドの分子量は５ｋＤ未満、最も好ましくは３ｋＤ未満である。本発明のペプチドはデノボ合成法によりまたは真核または原核生物細胞における組換えＤＮＡ技術による好適なＤＮＡ断片の発現により作製しうる。特定の態様では、上記ペプチドはカルボキシル部分などの天然ペプチドに存在するものの代わりに１種以上の非加水分解性化学部分を含有する。その特殊な場合では、自然加水分解性部分が例えば、メチレン部分などの非加水分解性部分で置き換えられる。本発明はレトロまたはインベルソペプチドをはじめとする少なくとも一つのアミノ酸が類似特性を有する別のアミノ酸で置き換えられた上記ペプチド類似体(ＷＯ９５／２４９１６)もまた包含する。さらに、本発明において使用するリガンド部分は化学部分の置換または付加(例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、メルカプト基付加など)によるその原型構造の改変がなされていてもよい。また、本発明は本発明のペプチドを検出可能にする改変も意図している。このためには、本発明のペプチドを検出可能な部分(すなわち、シンチグラフィック、放射性、蛍光部分、酵素、色素標識など)で改変できる。好適な放射性標識としては、限定されるものではないが、Ｔｃ９９ｍ、Ｉ１２３およびＩｎ１１１が挙げられる。かかる標識は公知の方法で、例えば、システイン残基を介して本発明のペプチドに付けることができる。その他の技術は他の場所で記載される。標識した本発明のペプチドは診断目的に使用しうる(例えば、腫瘍性細胞、形質転換細胞などの造影)。
【００３５】
特定の態様では、本発明のペプチドをそのＮおよび／またはＣ末端で少なくとも一つのシステイン残基の付加により改変する。この改変により、例えば、本発明のペプチドの二、三または多重結合の形成が可能になる。改変ペプチドの上記結合は直鎖または環状でありうる。
【００３６】
本発明のもう一つの態様では、本発明のペプチドが細胞特異的標的化が可能なリガンドまたは核標的化が可能なリガンドでさらに改変される。「細胞特異的標的化が可能なリガンド」とは、細胞膜の表面受容体(すなわち、抗リガンド)に結合するリガンド部分をいう。上記細胞膜表面受容体は高い親和性、好ましく高い特異性を有する上記リガンドを結合しうる分子または構造である。上記細胞膜表面受容体は好ましくは特定の細胞に特異的であり、すなわち、主としてある種の細胞で別の種の細胞におけるよりも見出される(例えば、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体を標的化するガラクトシル残基)。細胞膜表面受容体は細胞標的化およびリガンドの標的細胞(すなわち、細胞特異的標的化に関与するペプチド) および結合分子(すなわち、本発明のペプチド)へのインターナリゼーションを助ける。
【００３７】
本発明において使用しうる多くのリガンド部分／抗リガンドは文献で広く記載されている。かかるリガンド部分は本発明のペプチドに、所定の抗リガンド分子または少なくとも一つの標的細胞の表面に存在するある種の抗リガンド分子と結合する能力を与えうる。好適な抗リガンド分子としては、限定されるものではないが、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープおよび腫瘍関連マーカーからなる群から選択されるポリペプチドが挙げられる。抗リガンド分子はさらに１種以上の糖、脂質、糖脂質または抗体分子からなってよい、または含んでなってよい。本発明によれば、リガンド部分は例えば、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー(例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩ)、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンの全てまたは一部、例えば、ＪＴＳＩ(ＷＯ９４／４０９５８)などのポリペプチドの全てまたは一部、抗体もしくはそのフラグメント、またはその組合せであってよい。
【００３８】
好ましくは、本発明において使用するリガンド部分は長さが少なくとも７つのアミノ酸であるペプチドまたはポリペプチドである。これは天然ポリペプチドまたは天然ポリペプチド由来のポリペプチドのいずれかである。「由来の」とは、(ａ)天然配列の一つ以上の改変(例えば、一つ以上の残基の付加、欠失および／または置換)、(ｂ)天然アミノ酸でないアミノ酸類似体、または(ｃ)置換結合または(ｄ)当技術分野で公知のその他の改変を含むことを意味する。リガンド部分として働くポリペプチドは変異体および例えば、マウス抗体の可変領域とヒト免疫グロブリンの不変領域を合わせたヒト化抗体などの種々の起源の配列を融合することにより得られたキメラポリペプチドを包含する。さらに、かかるポリペプチドは直鎖または環状構造をとっていてもよい(例えば、システイン残基により両末端でポリペプチドリガンドにフランキングすることによる)。さらに、リガンド部分として使用するポリペプチドは化学部分の置換または付加(例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、メルカプト基付加など)によるその原型構造の改変がなされていてもよい。本発明はさらにリガンド部分を検出可能にする改変も意図している。このためには、検出可能な部分(すなわち、シンチグラフィック、放射性、もしくは蛍光部分、または色素標識など)での改変が考えられる。好適な放射性標識としては、限定されるものではないが、Ｔｃ９９ｍ、Ｉ１２３およびＩｎ１１１が挙げられる。かかる検出標識は標準技術によりリガンド部分に付けて診断目的に使用しうる(例えば、腫瘍性細胞の造影)。
【００３９】
一つの特定の態様では、抗リガンド分子が抗原(例えば、標的細胞特異的抗原、疾患特異的抗原、操作された標的細胞の表面で特異的に発現される抗原)であり、リガンド部分が抗体、フラグメントまたは免疫学マニュアル(例えば、Immunology, third edition 1993, Roitt, Brostoff and Male, ed Gambli, Mosbyを参照)に詳細に記載されるものなどのその最小認識単位(すなわち、抗原特異性をなお示すフラグメント) である。リガンド部分がモノクローナル抗体であってよい。これらの抗原の多くと結合するモノクローナル抗体についてはモノクローナル抗体テクノロジーに関する現在の技術によりいずれの場合もすでに公知であり、ほとんどの抗原に対する抗体を作成することができる。リガンド部分が抗体の一部(例えば、Ｆａｂフラグメント)または合成抗体フラグメント(例えば、ＳｃＦｖ)であってもよい。
【００４０】
選択された抗原に対して好適なモノクローナル抗体は公知の技術、例えば、“Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H. Zola (CRC Press, 1988) および“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications”, J. G. R. Hurrell (CRC Press, 1982)で開示されるものにより作製しうる。適切に作製された非ヒト抗体は公知の方法で、例えば、マウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することにより「ヒト化」（humanized）しうる。さらに、抗体の可変Ｈ(ＶＨ)および可変Ｌ（ＶＬ）ドメインが抗原認識と関係しているため、得られた抗体が齧歯動物親抗体の抗原特異性を有するように齧歯動物起源の可変ドメインとヒト起源の不変ドメインとを融合してもよい(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855)。
【００４１】
抗体の抗原特異性はＦａｂ様分子(Better et al (1988) Science 240, 1041)；Ｆｖ分子(Skerra et al (1988) Science 240,1038)；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドで結合されるＳｃＦｖ分子(Bird et al (1988) Science 242, 423；Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)および単離されたＶドメインを含んでなるｄＡｂ(Ward et al (1989) Nature 341, 544)をはじめとする可変ドメインにより与えられる。それらの特異的結合部位を有する抗体フラグメントの合成に関する技術の一般論はWinter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299に見出せる。
【００４２】
有利な態様によれば、リガンド部分は完全抗体よりも抗体フラグメントから選択される。補体結合などの完全抗体の有効な働きは取り除かれる。ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは一つ以上のその他のポリペプチドとの融合物として示される。最小認識単位はＦｖフラグメントの１以上の相補性決定領域(ＣＤＲ)の配列から誘導されうる。完全抗体、およびＦ(ａｂ’)２フラグメントは「二価」である。「二価」とは、上記抗体およびＦ(ａｂ’)２フラグメントが二つの抗原結合部位を有することを意味する。これに対し、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂフラグメントおよび最小認識単位は一つの抗原結合部位しかない一価である。
【００４３】
さらなる態様では、リガンド部分が天然細胞表面受容体結合に関係のある特定の部分の少なくとも一部である。もちろん、上記の天然受容体(例えば、ホルモン受容体)もまた標的細胞特異的抗原であってよく、モノクローナル抗体、ＳｃＦｖ、ｄＡｂまたは最小認識単位の特性を有するリガンド部分によって認識されうる。
【００４４】
好ましい態様では、リガンド部分がウイルス感染した細胞の標的化を可能にし、ウイルス成分(例えば、エンベロープ糖タンパク質)を認識してそれと結合しうるまたはウイルス生物学(例えば、侵入または複製)を阻害しうる。例えば、ＨＩＶ(ヒト免疫不全ウイルス)感染細胞の標的化は、トランスメンブラン糖タンパク質ｇｐ４１の高度に保存されたエピトープを認識する２Ｆ５抗体由来のリガンド部分などのＨＩＶエンベロープのエピトープに特異的なリガンド部分(Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195)またはその細胞受容体ＣＤ４へのＨＩＶ結合を妨害するリガンド部分(例えば、ＣＤ４分子の細胞外ドメイン)を用いて行うことができる。
【００４５】
もう一つの好ましい態様では、リガンド部分が腫瘍細胞の標的化を可能にし、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞で特異的にまたは過剰発現される細胞タンパク質または癌関連ウイルスの遺伝子産物などの腫瘍状態と関係のある分子を認識してそれと結合しうる。
【００４６】
腫瘍特異的抗原の例としては、限定されるものではないが、乳癌に関連するＭＵＣ−１(Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Biochem 189, 475-486)、乳癌および卵巣癌に関連する変異型ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によりコードされた産物(Miki et al., 1994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Science 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792)、結腸癌に関連するＡＰＣ(Polakis, 1995, Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 66-71)、前立腺癌に関連する前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)(Stamey et al., 1987, New England J. Med. 317, 909)、結腸癌に関連する癌胎児抗原(ＣＥＡ)(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748)、黒色腫に関連するチロシナーゼ(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)、黒色腫細胞で高度に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン(ＭＳＨ)の受容体、乳癌および膵臓癌に関するＥｒｂＢ-２(Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175)、および肝臓癌に関連するα-ホエトプロテイン(Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465)が挙げられる。
【００４７】
本発明において使用する特定のリガンド部分はＭＵＣ−１抗原を認識してそれと結合し、その結果としてＭＵＣ−１陽性腫瘍細胞を標的化しうる抗体のフラグメントである。さらに好ましいリガンド部分はＭＵＣ−１抗原のタンデム反復配列領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のＳｃＦｖフラグメントである(Burshell et al., 1987, Cancer Res. 47, 5476-5482; Girling et al., 1989, Int J. Cancer 43, 1072-1076; Dokumo et al., 1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728)。
【００４８】
腫瘍細胞で特異的にまたは過剰発現される細胞タンパク質の例としては、限定されるものではないが、あるリンパ腫瘍で過剰発現されるインターロイキン２(ＩＬ-２)の受容体、肺癌細胞、膵臓、前立腺および胃癌で過剰発現されるＧＲＰ(ガストリン分泌ペプチド)(Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668)、ＴＮＦ(腫瘍壊死因子)受容体、上皮細胞増殖因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ-４０、αｖインテグリン(Brooks et al., 1994, Science 264, 569)およびある脈管形成増殖因子の受容体(Hanahan, 1997, Science 277, 48)が挙げられる。これらの例示に基づき、当業者によりかかるタンパク質を認識してそれと結合しうる好適なリガンド部分が同定される。例えば、ＩＬ-２はＩＬ-２受容体を結合するのに好適なリガンド部分である。
【００４９】
癌関連ウイルスの好適な遺伝子産物としては、限定されるものではないが、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)Ｅ６およびＥ７初期ポリペプチド、ならびに子宮頸癌で見られるＬＩおよびＬ２後期ポリペプチド(欧州特許第ＥＰ０４６２１８７号、米国特許第５，７４４，１３３号およびＷＯ９８／０４７０５)およびバーキットリンパ腫に関係のあるエプスタイン-バーウイルス(ＥＢＶ)のＥＢＮＡ-１抗原(Evans et al., 1997, Gene Therapy 4, 264-267)が挙げられる。
【００５０】
なおもう一つの態様では、リガンド部分が組織特異的分子の標的化を可能にする。例えば、肝臓細胞の標的化に好適なリガンド部分としては、限定されるものではないが、ＬＤＬ受容体と結合しうるＡｐｏＢ(アポリポタンパク質)由来のもの、ＬＰＲ受容体と結合しうるα−２−マクログロブリン、アシアロ糖タンパク質受容体と結合しうるα−１ 酸糖タンパク質およびトランスフェリン受容体と結合しうるトランスフェリンが挙げられる。活性化内皮細胞を標的化するためのリガンド部分はシアリル−ルイス−Ｘ抗原(ＥＬＡＭ−１と結合しうる)、ＶＬＡ−４(ＶＣＡＭ−１受容体と結合しうる)またはＬＦＡ−１(ＩＣＡＭ−１受容体と結合しうる)由来であってよい。ＣＤ３４受容体との結合により造血前駆細胞を標的化するにはＣＤ３４由来のリガンド部分が有用である。ＩＣＡＭ−１由来のリガンド部分はＬＦＡ−１受容体との結合によりリンパ球を標的化するのに非常に向いている。最後に、Ｔ−ヘルパー細胞の標的化にはＨＩＶ  ｇｐ−１２０またはＣＤ４受容体と結合しうるクラスII ＭＨＣ抗原由来のリガンド部分を使用してよい。
【００５１】
「標的細胞」とは、本発明のペプチドが選択的に標的化しうる細胞または目的物質の導入が望ましい細胞種をいう。「標的細胞」は、リガンド部分および／または抗リガンド分子の性質により、特異な細胞種または共通した特徴として表面に本発明の複合体に存在するリガンド部分により認識される抗リガンド分子を有する異なる細胞種群を指すと考えられる。本発明の目的では、標的細胞は好適なリガンド部分を有する本発明の複合体により標的化されうる哺乳類細胞(好ましくはヒト細胞)である。「標的化する」とは、本発明の組成物と接触させた細胞の残る部分を選択してある細胞種または遺伝子導入用の細胞種群をアドレッシングすることをいう。標的細胞は一次細胞、形質転換細胞または腫瘍細胞でありうる。好適な標的細胞としては、限定されるものではないが、造血細胞(全能、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞など)、筋肉細胞(付随体、ミオサイト、筋芽細胞、骨格もしくは平滑筋細胞、心臓細胞)、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞または線維芽細胞が挙げられる。
【００５２】
「核標的化が可能なリガンド」とは、核受容体(核抗リガンド)と結合しうる特定のリガンドをいう。上記核受容体は核膜内または／および上に存在し、上記リガンドと結合することにより本発明のペプチドの核への細胞内輸送およびその核へのインターナリゼーションを助けうる分子または構造である。核標的化に関与するかかるリガンドの例はＳＶ４０ウイルスのＴ抗原(Lanford and Butel, 1984, Cell 37, 801-813)およびエプスタイン-バーウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質(Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478)由来の核シグナル配列である。
【００５３】
本発明は、好ましくは目的物質を細胞へ導入するための、本明細書上記において定義される少なくとも一つのペプチドおよび少なくとも１種の目的物質を含んでなる組成物もまた包含する。上記ペプチドがｐｐＴＧ２１の場合、組成物のｐＨ値は好ましくは６より大きい、さらに好ましくは６．５より大きい、なお好ましくは７より大きい、いっそうさらに好ましくは７．５より大きい、最も好ましくは約８である。好ましくは、上記目的物質は核酸であり、かつ上記組成物が遺伝子治療法における被検体細胞または組織への核酸送達に特に有用であるが、かかる使用に限定されるものではない。「遺伝子治療法」は、好ましくは細胞への核酸のin vivo導入法、または細胞へin vitro導入した後の被検体への再移植による方法のいずれかと考えられる。「遺伝子治療」は、特に遺伝子産物が組織内で発現される場合、ならびに遺伝子産物が特に血流に分泌される場合に関する。好ましい態様では、本発明の使用により製造される組成物中のペプチド量は約０．０５マイクログラム〜約１００マイクログラム、好ましくは約０．１マイクログラム〜約５０マイクログラム、さらに好ましくは約０．５マイクログラム〜約１５マイクログラムの範囲である。また、当業者ならばこれらの濃度およびｐＨ条件を調整することができる。一般に、組成物中の核酸濃度は約０．０１ｍＭ〜約１Ｍであり、好ましい態様は約０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。
【００５４】
この組成物は種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、水溶液、凍結乾燥形態で製造できる。好ましい態様では、この組成物はヒトまたは動物の治療的処置法においてその使用を可能にする医薬上許容される担体をさらに含んでなる。この特定の場合では、担体は、好ましくは医薬上好適な注射可能担体または希釈剤である(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Coを参照)。かかる担体または希釈剤は医薬上許容される、すなわち使用量および濃度でレシピエントに対し無毒である。これは好ましくは等張、低張またはやや高張であり、スクロース溶液によって提供されるような比較的低いイオン強度を有するものである。さらに、これに関連溶剤、滅菌、パイロジェンフリー水、分散媒、被覆剤、および等価物を含んでなる水性または部分水性液体担体、もしくは希釈剤(例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩)、乳化剤、可溶化剤または補助剤を含めてもよい。医薬製剤のｐＨはin vivo適用においても有用であるよう適宜調整および緩衝させる。組成物が本発明のペプチドｐｐＴＧ２１を含んでなっている特定の態様では、組成物のｐＨはｐＨ６より大きい、好ましくはｐＨ８であるように調整、緩衝させる。これは液体溶液または投与前に溶液に懸濁しうる固体形態(例えば、凍結乾燥)のいずれかとして製造しうる。注射可能な組成物に向く担体または希釈剤の典型例としては、水、所望のｐＨに緩衝化された等張生理食塩水(リン酸緩衝溶液またはＴｒｉｓ緩衝溶液など)、マンニトール、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、ならびにヒト血清アルブミンなどのポリペプチドもしくはタンパク質が挙げられる。例えば、かかる組成物は１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含んでなる。
【００５５】
本発明は、さらに特に上記目的物質のトランスフェクション能を強化しうる少なくとも１種の補助剤をさらに含んでなる上記組成物に関する。補助剤はクロロキン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、ＥｔＯＨ、１−メチル  Ｌ−２−ピロリドンもしくはそれらの誘導体などのプロトン性極性化合物、またはジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルもしくはそれらの誘導体などの非プロトン性極性化合物からなる群から選択してよい。これらの化合物は上記のｐＨ制限に従う条件で加える。
【００５６】
本発明の組成物は脊椎動物組織に投与できる。この投与は注射器またはその他の装置による皮内、皮下、静脈内、筋肉内、経鼻、大脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱腔内、胸腔内、冠動脈内または腫瘍内注射により行われうる。吸入、エアゾール経路、喉頭注入法または局所適用などの経皮投与もまた包含される。腫瘍内投与が好ましい。本発明により製造された組成物が、さらに好ましくは筋肉内注射経路または血管内経路による筋肉細胞への導入に向けたものである場合、輸入および／または輸出リンパ管への注射と上記脈管の浸透性の上昇とを組み合わせることにより投与方法を有利に改善しうる。特定の態様では、上記の上昇は静水圧(すなわち、流出および／または流入を妨げることにより)、浸透圧(高張液を用いて)を高めるおよび／または生物学的に活性な分子(例えば、投与する組成物にヒスタミン)を導入することにより行われる(ＷＯ９８／５８５４２を参照)。
【００５７】
本明細書において使用する「脊椎動物」とは、当業者が一般に理解している意味と同じ意味とする。特に、「脊椎動物」とは、哺乳類、さらに特にはヒトを包含する。
【００５８】
遺伝子治療に適用した場合、本発明によって投与する製剤による重大な免疫反応を誘導する危険性なしに患者への連続投与が可能になる。投与は単回または反復投与、一回または一定時間をおいて複数回であってよい。連続投与では一回に投与する活性物質、特に ＤＮＡの量を減らすことが可能である。投与経路および好適な量は複数のパラメーター、例えば、各患者、治療する疾患または導入する核酸によって様々に異なる。本発明によれば、本発明のペプチドは少なくとも一つの核酸を含有する組成物の同じ標的組織への投与にある第２の投与とは関係なく投与できる。本発明によれば、第１の投与は第２の投与の前に、それと同時に、またはその後に行うことができ、逆もまた同じである。組成物の投与および第２の投与は別々のまたは同じ送達経路(全身送達および標的化送達、または例えば、標的化送達)によって行うことができる。好ましい態様では、各々を最も好ましくは注射によって同じ標的組織に行うべきである。
【００５９】
さらに、本発明は目的物質を細胞へ導入するための、上記細胞を少なくとも一つの本発明の組成物と接触させることを含んでなる方法にも関する。この方法は上記組成物の動物細胞へのin vivo直接投与、または動物から採取した後、動物体内に再導入した細胞(ex vivo法)のin vitro処理により適用しうる。in vitro適用では、好適な培地で培養した細胞を本発明の組成物を含有する懸濁液と接触させて置く。インキュベーション時間後、細胞を洗浄し、回収する。活性物質の導入は(最終的には細胞溶解後)好適な方法により確認できる。
【００６０】
本発明のin vivo治療では、トランスフェクション率を高めるために上記組成物の投与に先立ち、患者にマクロファージデプリーション処置を施してもよい。かかる技術は文献に記載されている(特に、Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184を参照)。
【００６１】
本発明はさらに目的物質を細胞へ導入するための、本明細書上記、下記において定義される少なくとも一つのペプチドを含んでなる組成物と核酸との接触と同時にまたはその後に上記細胞をそれと接触させることを含んでなる方法にも関する(なお、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるペプチドが使用される場合、上記ペプチドが上記組成物において好ましくは６より大きい、さらに好ましくは６．５より大きい、なお好ましくは７より大きい、いっそうさらに好ましくは７．５より大きいｐＨであり、最も好ましくは約８である)。
【００６２】
もう一つの好ましい態様では、本発明は目的物質の細胞への導入を強化するための、本明細書上記において定義されるペプチドの使用を提供する(なお、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含んでなるまたはからなるペプチドが使用される場合、上記ペプチドが上記組成物において好ましくは６より大きい、さらに好ましくは６．５より大きい、なお好ましくは７より大きい、いっそうさらに好ましくは７．５より大きいｐＨであり、最も好ましくは約８である)。有利には、上記目的物質は核酸である。
【００６３】
目的物質の細胞への導入ではin vitro (もしくはex vivo、上記参照)またはin vivoのいずれかで上記強化を果たすことができる。
【００６４】
本明細書において「治療」とは、予防および治療をいう。これはヒトおよび動物の治療の両方に関する。「治療上有効な量のペプチドまたは組成物」とは、治療が望まれる疾患に通常伴う１種以上の症状の緩和に十分な量である。本発明の方法は、特に上記の疾患の治療を意図するものである。
【００６５】
本発明はヒトまたは動物、好ましくは哺乳類の治癒的、予防的またはワクチン治療、すなわち、遺伝子治療で使用するための組成物の製造に向けた、上記ペプチドの使用にさらに関する。
【００６６】
もう一つの態様では、本発明は目的物質を細胞へ導入するための、上記細胞の物質との接触の前に、同時にまたはその後にそれらを本発明の使用により製造される組成物と接触させることを含んでなる方法にもまた関する。この方法は上記組成物の動物細胞へのin vivo直接投与により適用しうる。本発明の実施において標的化「細胞」および「in vivo 投与経路」は上文にて記載するように定義される。「標的化細胞」とは、ポリヌクレオチド取り込みおよび発現が起こるものであり、これらが必ずしも注射した組織(投与部位)に存在する必要はない。特定の態様では、投与が血管に行われ、ポリヌクレオチドトランスフェクションまたは感染が近位または遠位部、例えば、肺、筋肉、肝臓、腎臓、心臓などの器官または組織で起こる。
【００６７】
もう一つの好ましい態様によれば、腫瘍性組織は目的物質、特に核酸の送達および発現部位として使用される。
【００６８】
これらおよびその他の態様は本発明の説明および実施例により開示され、または明らかとなり、さらにこれに包含される。さらなる文献は方法のうちのいずれか一つに関するものであるが、本発明で使用される使用および化合物は、例えば、電子装置を用いて公的ライブラリーから検索することができる。例えば、インターネット上、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlにおいて利用可能な公共データベース“Ｍｅｄｌｉｎｅ”を使用してもよい。 その他のデータベースおよびhttp://www.ncbi.nlm. nih.gov、http://www.infobiogen.fr、http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.orgなどのアドレスも当業者には公知であり、例えば、http://www.lycos.comを利用しても得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報概要ならびに逆上り検索およびカレント・アウェアネスに有用な特許情報関連ソースの調査はBerks, TIBTECH 12 (1994), 352-364で与えられている。
【００６９】
本発明の方法、組成物および使用はその治療および／または診断が細胞における核酸の導入に関連しているまたはそれに依存しているあらゆる種類の疾患の治療に適用可能である。本明細書において記載する使用に動物治療も含まれるが、本発明の組成物、および使用はヒトにおいて使用されることが望ましい。
【００７０】
例を挙げて本発明を記載してきたが、使用した専門用語は限定を意図するものではなく説明を意図するものであることが分かるであろう。上記技術から、本発明の多くの改変および変形が可能であることは明らかである。よって、添付の請求項の範囲であれば、本発明を本明細書において特に記載したものとは異なる方法で行ってもよいことが分かるであろう。
【００７１】
本願で引用した全ての特許、公開特許公報、およびデータベースエントリーの開示は、かかる個々の特許、公報およびデータベースエントリーが各々、具体的かつ個々に本明細書に引用されて組み込まれ、その全てが示されているのと同じ程度でそれらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【実施例】
【００７２】
本発明に従い、新規低分子量陽イオンペプチド、ｐｐＴＧ１(配列番号２)を合成した。このペプチドはグルタミン酸残基を含有せず、ＤＮＡを結合して成形し、さらに膜破壊を引き起こすことができる。
【００７３】
材料および方法
細胞：ＨｅＬａ細胞(ATCC)および２９３−ＥＢＮＡ細胞(Invitrogen)を１０％ウシ胎児血清、１％ゲンタマイシン、１％グルタミンおよび３ｇ／ｌ  グルコースを補給したＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベータ内で培養した。
ＷｉＤｒ(ATCC CCL-218)、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ(ATCC HTB-129)、ＳＷ４８０(ATCC CCL-228)およびＬｏＶｏ細胞(CCL-229)を１０％ウシ胎児血清、１％ゲンタマイシン、１％グルタミンおよび３ｇ／ｌグルコースを含有する好適な培地中、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベータ内で培養した。
【００７４】
プラスミド：ＣＭＶプロモーター、ＨＭＧ遺伝子のイントロン１およびＳＶ４０ポリＡシグナルの制御下、ＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列に加えてルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＴＧ１１０５６(１３７８７ｂｐ；Langle-Rouault et al., 1998, J. Virol., 72, 6181-6185)を使用する。さらに、ＣＭＶプロモーター、ショートＳＶ４０  １６Ｓ/１９ＳイントロンおよびＳＶ４０ポリＡシグナル含んでなるルシフェラーゼ発現カセットを有するプラスミドｐＴＧ１１２３６(５７３８ｂｐ)もこの試験で使用する。
プラスミドｐＴＧ１１０２２(７９９８ｂｐ)は、ＨＭＧ遺伝子のイントロン１およびＳＶ４０ポリＡシグナルを含有する「エンプティー」ＣＭＶ  ＩＥプロモーター駆動発現カセットを有するプラスミドの典型である。
【００７５】
ポリペプチド：以下のペプチドの化学合成はＮｅｏｓｙｓｔｅｍ(France)によって行った。
ｐｐＴＧ１(２０ｍｅｒ、分子量２２９７)(配列番号２)
Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala
ＪＴＳ−１(２０ｍｅｒ、分子量２３０１)(配列番号３)
Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Leu-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Ser-Leu-Trp-Glu-Leu-Leu-Leu-Glu-Ala
ＪＴＳ−１−Ｋ１３(４０ｍｅｒ、分子量４８２６)(配列番号４)
Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Leu-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Set-Leu-Trp-Glu-Leu-Leu-Leu-Glu-Ala-Cys-Cys-Tyr-Lys -Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Gln-Ser
ＫＡＬＡ(３０ｍｅｒ、分子量３１３１)(配列番号５)
Trp-Glu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-His-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Cys-Glu-Ala
ｐｐＴＧ２０(２０ｍｅｒ)(配列番号６)
Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala
ｐｐＴＧ２１(２０ｍｅｒ)(配列番号７)
Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala
ｐｐＴＧ２２(２１ｍｅｒ)(配列番号８)
Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala-Cys
ｐｐＴＧ２３(２１ｍｅｒ)(配列番号９)
Cys-Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala
ｐｐＴＧ２４(２２ｍｅｒ)(配列番号１０)
Cys-Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala-Cys
ｐｐＴＧ２５(２０ｍｅｒ)(配列番号１１)ｐｐＴＧ１−リンカー−ＳＶ４０ＮＬＳ
Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-Asp
ｐｐＴＧ２６(２０ｍｅｒ)(配列番号１２)ｐｐＴＧ１−リンカー−ＳＶ４０ＮＬＳｍ（変異型）
Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Gly-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-Asp
ｐｐＴＧ２７(２０ｍｅｒ)(配列番号１３)ｐｐＴＧ１−リンカー−ＳＶ４０ＮＬＳｒｅｖ（逆転型）
Gly-Leu-Phe-Lys-Ala-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro
ｐｐＴＧ２８(２０ｍｅｒ)(配列番号１４)
Gly-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Trp-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Ala
ｐｐＴＧ２９(２０ｍｅｒ)(配列番号１５)
Gly-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala
ｐｐＴＧ３０(２０ｍｅｒ)(配列番号１６)
Gly-Ile-Phe-Lys-Ala-Ile-Ile-Lys-Ile-Ile-Lys-Ser-Ile-Trp-Lys-Ile-Ile-Ile-Lys-Ala
ｐｐＴＧ３１(２０ｍｅｒ)(配列番号１７)
Gly-Ile-Phe-Arg-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Ile-Arg-Ser-Ile-Trp-Arg-Ile-Ile-Ile-Arg-Ala
ｐｐＴＧ３２(２０ｍｅｒ)(配列番号１８)
Gly-Val-Phe-Lys-Ala-Val-Val-Lys-Val-Val-Lys-Ser-Val-Trp-Lys-Val-Val-Val-Lys-Ala
ｐｐＴＧ３３(２０ｍｅｒ)(配列番号１９)
Gly-Val-Phe-Arg-Ala-Val-Val-Arg-Val-Val-Arg-Ser-Val-Trp-Arg-Val-Val-Val-Arg-Ala
ｐｐＴＧ２０−Ｄ配置(２０ｍｅｒ)(配列番号２０)
Gly-Leu-Phe-Arg-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Ser-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ala
【００７６】
ペプチドは、陽イオンペプチドの場合にはカウンターイオンとして酢酸塩を含有する純度８０〜９７％の凍結乾燥粉末として入手した。ペプチドＪＴＳ−１−Ｋ１３を二段階で合成した。最初にＪＴＳ−１−システインおよびシステイン−Ｋ１３を合成し、次ぎにジスルフィド結合を形成する。全てのペプチドを最終濃度少なくとも１ｇ／ｌまでｍｉｌｌｉＱ水で希釈した。
【００７７】
必要であれば、ペプチドｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０のＮ末端とポリエチレングリコール(ＰＥＧ)  ＭＷ２０００とを共有結合させてＰＥＧ−ｐｐＴＧ１およびＰＥＧ−ｐｐＴＧ２０を得てもよい。これらの生成物にはＨＰＬＣによる精製を行わなかった。３．３μｇ／μｌ〜０．５μｇ／μｌ間の濃度において差がない場合には全てのペプチドをｍｉｌｌｉＱ水に溶解した。
【００７８】
脂質および補助脂質
脂質ｐｃＴＧ９０は、引用することによりその全てが本明細書の一部とされる欧州特許第ＥＰ９０１４６３号に開示される通りである(また、上記に示した式も参照)。
【００７９】
ゲルリターデーション（Gel retardation）アッセイ
３μgのプラスミドｐＴＧ１１２３６を０．９％ＮａＣｌを含有する漸増量の各々のペプチド(最終量３０μｌ)とともにインキュベートした。室温で２０分間のインキュベーション後、６μｌ  ５×ローディングバッファー(ＴＡＥバッファー中グリセロールおよびブロモフェノールブルー)を加え、これらの溶液の１０μｌを臭化エチジウムの存在下で１％アガロースゲル上で解析した。
【００８０】
リポソームリーケージ（リポソーム漏出（Liposome leakage）)アッセイ
１−パルミトイル−２−オレイル−ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)リポソームは反復凍結融解法により調製した後、押し出し成形を行った(Olson et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 557, 19-23)。クロロホルム中１０μモルのＰＯＰＣをガラス管に入れ、Labconco Rapidvapボルテックスエバポレータ(Uniequip, Germany)を用いて溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた脂質フィルムをカルセイン水溶液(１００ｍＭカルセイン、３．７５当量ＮａＯＨ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ)０．５ｍｌで水和させた。超音波水浴(Bransonic 221, Branson Ultrasonics Corp., USA)で溶液が透明になるまで脂質懸濁物を超音波処理した。凍結融解を５サイクル行った後、２００ｎｍ孔径ポリカーボーネート膜(Nuclepore, Costar, MA, USA)に４回通してリポソームを押し出し成形した。セファデックスＧ-５０カラム(３ｃｍ×１４ｃｍ)および溶出バッファーとして２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３溶液を用いるゲル排除クロマトグラフィーにより遊離カルセインをリポソーム封入カルセインとを分離した。最終脂質濃度はリンアッセイ(Bartlett, 1959, J. Biol. Chem. 234, 466-469)により確認した。リポソーム粒径はＣｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４プラスサブミクロン粒径分析装置(Coultronics France S. A, France)を用いて動的レーザー光散乱法により測定した。測定では一定の散乱光角度９０°を用い、３ｎｍ〜１００００ｎｍサイズのウインドウ内で行った。
【００８１】
リポソームリーケージアッセイはPlanck et al.(1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924)で記載されるように行った。リポソーム原液を１．８×アッセイバッファー(３６０ｍＭ  ＮａＣｌ、３６ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５およびｐＨ７)で脂質濃度４５μＭまで希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレートである一つのウェルの２０μｌのペプチド溶液を次のウェルに移し、８０μｌ  Ｈ２Ｏで希釈して、試験するペプチドの１：５連続希釈を行った。１００μｌのリポソーム溶液を各ウェルに加え(最終脂質濃度：２５μＭ)、室温で３０分後、マイクロタイタープレート蛍光分光計(WALLAC, 1420 multilabel counter Victor)で５３５ｎｍ(励起：４８５ｎｍ)にて蛍光アッセイを行った。これらの条件はフルオレセインの分析に好適なものであるが、カルセインの好適な励起／発光プロフィール(４９５ｎｍ／５１５ｎｍ)に可能な限り近い。１００％漏出値は１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液１ｌの添加により得られた。漏出活性についてはペプチド濃度に対してプロットした。
【００８２】
融合誘導ペプチドでのトランスフェクションアッセイ
細胞を２４ウェルプレートで１０％ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ中４×１０４(２３９−ＥＢＮＡ)または７×１０４(ＨｅＬａ、Ｒｅｎｃａ)細胞／ウェルの密度で培養した。翌日、培地を２００μｌ血清フリーＤＭＥＭに交換し、プラスミド(ｐＴＧ１１０５６もしくはｐＴＧ１１２３６)／ペプチド複合体またはプラスミド／ペプチド／脂質複合体を０．９％ＮａＣｌまたは５％グルコース３０μｌ中で調製した。室温で２０分後、これらの複合体を細胞に与え、次いで、この細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートし、その後、１ｍｌ血清含有ＤＭＥＭを添加した。約２０時間後、１×Promega溶解バッファー１００μｌを加えて細胞を溶解し、溶解物２０μｌのルシフェラーゼ活性を調べた。タンパク質をビシンコン酸(bicinchonic acid)(ＢＣＡ)比色法(Smith, Anal. Biochem. 150 (1985), 76-85)により定量した。
【００８３】
in vivo試験
指定量のルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６をｐｐＴＧ１および／またはｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥと混合した。得られた製剤はマウスに筋肉内(３０μｌ)、静脈内(２５０μｌ)または腫瘍内(Ｒｅｎｃａ腫瘍、１００μｌ)注射した。指定の時点で筋肉、腫瘍または器官を回収し、細かく砕き、Promegaのルシフェラーゼアッセイキットでルシフェラーゼ活性を調べた。
【００８４】
細胞培養
バフィロマイシンＡの存在下でのトランスフェクション：６×１０４ ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートで培養した。トランスフェクション３０分前とトランスフェクション中、細胞を１７５ｎＭバフィロマイシンＡで処理した(血清不在下での細胞のトランスフェクションミックスとの１時間のトランスフェクション)。
【００８５】
例１：ＤＮＡ結合活性
ｐｐＴＧ１ペプチドのＤＮＡ複合体化能力をゲルリターデーションアッセイによって調べた。３μgのｐＴＧ１１２３６を０．９％ＮａＣｌを最終量３０μｌまで加えた漸増量のｐｐＴＧ１(０．０１μｇ〜２７μｇ)と混合した。室温で２０分間のインキュベーション後、ローディングバッファーを加え、得られた溶液の１０μｌを１％アガロースゲル上で解析した。同じ試験をＪＴＳ−１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３およびＫＡＬＡペプチドでも行った。
【００８６】
プラスミド／ペプチド比３μｇプラスミドＤＮＡ(０．８ｐｍｏｌ)／４μｇペプチド(１．４ｎｍｏｌ)でｐｐＴＧ１と複合体化させるとプラスミドｐＴＧ１１２３６の遅延が得られるという結果が示された。１μｇペプチド(０．３５ｎｍｏｌ)を加えた場合には５０％のＤＮＡが複合体化する。プラスミドＤＮＡの遅延は陰イオンＪＴＳ−１の存在下では見られない(３μｇ  ｐＴＧ１１２３６および０．１μｇ〜１０μｇ  ＪＴＳ−１)が、３μｇ(０．６ｎｍｏｌ)ＪＴＳ−１−Ｋ１３では３μｇ  ｐＴＧ１１２３６の＞９５％の遅延がもたらされる。これらの結果から、本発明のペプチドｐｐＴＧ１がＤＮＡプラスミドと複合体を形成しうることが分かる。
【００８７】
例２：リポソームリーケージアッセイ
ペプチドｐｐＴＧ１を蛍光製品カルセインを含有するＰＯＰＣリポソームを用いるリポソームリーケージアッセイで膜破壊を引き起こすその能力について試験した。リポソームリーケージアッセイはPlanck et al.(1994-上記)に記載されるように行った；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理によるカルセインの放出を正の対照反応とし、水とのインキュベーションを負の対照とした。ペプチドｐｐＴＧ１(開始時の２０μｇ)の膜分解活性と同量(２０μｇ)のＪＴＳ−１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３およびＫＡＬＡのものとを比較した。
【００８８】
この結果を図１Ａ／１Ｂに示す。
【００８９】
図１Ａ／１Ｂから、ｐｐＴＧ１がｐＨ５(図１Ａ)およびｐＨ７(図１Ｂ)の両方で、ＪＴＳ−１およびＪＴＳ−１−Ｋ１３と少なくとも同じくらい効率的に膜破壊を引き起こすことができることが分かる。
【００９０】
例３：in vitroにおけるトランスフェクション効率−ｐｐＴＧ１、リポフェクチンおよびＰＥＩの比較
２９３−ＥＢＮＡ１およびＨｅＬａ細胞をin vitroでトランスフェクトするｐｐＴＧ１およびプラスミドＤＮＡの複合体の能力について調べた。
【００９１】
プラスミドｐＴＧ１１０５６  ０．５μｇ、０．１μｇ、０．０５μｇおよび０．０１μgで、前日に２４ウェルプレートで培養した４×１０４  ２９３−ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトした。このプラスミドをｐｐＴＧ１の完全ＤＮＡ複合体化または不完全ＤＮＡ複合体化量のいずれかと５％グルコース３０μｌ中で混合し、室温で２０分後、この混合物を２００μｌ血清フリー培地でインキュベートした細胞に加えた。さらに、ｐＴＧ１１０５６を確立されたトランスフェクション試薬リポフェクチンおよびＰＥＩを加えて作製した。製造業者の推奨に従い、リポフェクチン(Gibco BRL)およびＰＥＩを使用した。要するに、リポフェクチンを２００μｌ血清フリー培地中４倍重量過剰のプラスミドＤＮＡに加え、その後(室温で２０分後)これを細胞に与えた。ＰＥＩを１０ｍＭ溶液に希釈、例えば、７５μｌを５％グルコース３０μｇ中０．５μｇ  ＤＮＡに加え、室温で３０分後、２００μｌ血清フリー培地で培養した細胞に移した。３時間後、１ｍｌの血清含有ＤＭＥＭを細胞に与えた。２０時間後、細胞を洗浄し、１／５の溶解細胞でルシフェラーゼ活性を確認した。
【００９２】
ルシフェラーゼ活性を図２に示す。
【００９３】
図２より、ｐｐＴＧ１(電荷比約１)０．６５μｇと複合体化したｐＴＧ１１０５６  ０．５μｇで２９３−ＥＢＮＡ１細胞をトランスフェクションした場合にリポフェクチンまたはＰＥＩとで作製した複合体で見られるルシフェラーゼ活性より高い活性が得られることが分かる。ｐｐＴＧ１(同じ電荷比)０．０６５μｇと混合したｐＴＧ１１０５６  ０．０５μｇでのトランスフェクションでもなお高いトランスフェクション効率を示すが、ＰＥＩおよびリポフェクチン製剤では１０倍以上効率が低い。
【００９４】
この試験から、ペプチドｐｐＴＧ１を含んでなる本発明の複合体でのトランスフェクションはリポフェクチンまたはＰＥＩを、特に低濃度で含んでなる先行技術の複合体とのものと少なくとも同程度に効率が良く、ほとんどの測定ではいっそう顕著に効率が良くなることが分かる。プラスミドＤＮＡで細胞を効率的にトランスフェクトするのにはｐｐＴＧ１単独で十分である。
【００９５】
もう一つの試験では、リポフェクチンまたはｐｐＴＧ１と複合体化したｐＴＧ１１２３６  ０．５μgまたは０．０５μgで、トランスフェクション前日に２４ウェルプレートに播種した７×１０４ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。プラスミド／ペプチド複合体を５％グルコースまたは０．９％ＮａＣｌ３０μｌ中で調製し、室温で２０分後、細胞に与えた(２００μｌ血清フリー培地)。３時間後に血清含有培地を添加し、翌日細胞を回収した。
【００９６】
全タンパク質溶解物のルシフェラーゼ活性を図３に示す。
【００９７】
図３より、ｐｐＴＧ１  １．１７μｇまたは０．１１７μｇを含有するｐＴＧ１１２３６  ０．５μgまたは０．０５μgの製剤(ペプチドの全ＤＮＡ複合体化量；電荷比１．８)ではリポフェクチンを用いて作製したＤＮＡで見られるルシフェラーゼ活性と同等の活性が得られたことが分かる。ｐＴＧ１１２３６  ０．０５μｇのトランスフェクション効率に対し、０．９％ＮａＣｌ中でｐｐＴＧ１と混合したプラスミドＤＮＡではリポフェクチン製剤で見られるルシフェラーゼ活性よりも高い活性が得られると考えられる。
【００９８】
図２および図３から、プラスミドＤＮＡを細胞に効率的に導入するにはペプチドｐｐＴＧ１単独で十分であることが示される。この効率は低ＤＮＡ量で、例えば、リポフェクチンまたはＰＥＩ試薬などの確立されたトランスフェクション試薬よりも優れている。
【００９９】
例４：トランスフェクション効率：ＨｅＬａ細胞でのｐｐＴＧ１およびＪＴＳ−１−Ｋ１３の比較
ｐｐＴＧ１およびＪＴＳ−１−Ｋ１３のトランスフェクション効率への影響の比較をＨｅＬａ細胞で行った。ｐＴＧ１１２３６  ０．５μgまたは０．０５μgの複合体を漸増量の各々のペプチドを用いて作製した。
【０１００】
ルシフェラーゼ解析の結果を図４に示す。
図４により、ＪＴＳ−１−Ｋ１３  １．５μｇと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ０．５μｇでは高レベルのルシフェラーゼ発現が得られたが、ＪＴＳ−１−Ｋ１３と複合体化したプラスミドＤＮＡ０．０５μｇでのトランスフェクションではｐｐＴＧ１でのトランスフェクションと比べて相変わらず低いことが分かる。これらの結果より、ｐｐＴＧ１がＪＴＳ−１−Ｋ１３よりも優れたトランスフェクション試薬であることが示唆される。
【０１０１】
例５：in vitroにおけるトランスフェクション効率−ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞でのｐｐＴＧ１およびＫＡＬＡの比較
ｐｐＴＧ１およびＫＡＬＡの比較をＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞で行った。５×１０４細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、０．９％ＮａＣｌ３０μｌ中でｐｐＴＧ１またはＫＡＬＡと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ５００ｎgまたは５０ｎgで細胞をトランスフェクトした。電荷比＋／−は１、２、３、４、７〜１０と変えた。トランスフェクション２０時間後に細胞を回収し、１００μｌ  Promega溶解バッファーに溶解させた。２０μｌ中のルシフェラーゼ活性および全タンパク質濃度を調べた。
【０１０２】
その結果を図５ａ／ｂに示す。
【０１０３】
図５ａ／ｂにより、ｐｐＴＧ１を含んでなる複合体でのトランスフェクションではペプチドＫＡＬＡを用いて作製したものよりも効率が良いことが分かる。ペプチドｐｐＴＧ１の場合、ＨｅＬａ細胞において最適な電荷比条件は１または２のいずれかであった。ＫＡＬＡでは、ｐｐＴＧ１の場合よりも２００倍(ｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇ)〜４倍(５００ｎｇ)低い電荷比７で最適な遺伝子導入が示された。最も優れた事例では、ｐｐＴＧ１を含んでなる複合体はＫＡＬＡを含んでなる複合体よりも３０００倍効率が良かった。
【０１０４】
ＣＨＯ細胞では、トランスフェクションの最適条件はｐｐＴＧ１１を含んでなる複合体では電荷比２および３各々で、ＫＡＬＡを含んでなる複合体では電荷比１０および７各々で見られ、遺伝子導入においてｐｐＴＧ１が比較的効率が良かった(ｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇで６８倍およびｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇで９倍)。最も優れた事例では、ｐｐＴＧ１を含んでなる複合体はＫＡＬＡを含んでなる複合体よりも２５００倍効率が良かった。
【０１０５】
例６：ペプチドｐｐＴＧ１およびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを含んでなる複合体のin vitroにおけるトランスフェクション効率
３５０μｌのクロロホルム中でｐｃＴＧ９０およびＤＯＰＥ(１：１)の混合物を調製した。溶液をボルテックスエバポレーターを用いて蒸発させた。得られた脂質フィルムを１ｍｌの５％グルコースに再懸濁し、濃度約０．５ｍｇ／ｍｌとした。ｐｐＴＧ１を水に溶解して３ｍｇ／ｍｌにし、脂質懸濁物に加えた。次いで、混合物を５％グルコースで希釈したＤＮＡ(ｐＴＧ１１２３６)に加えて攪拌した。
【０１０６】
ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに６×１０４細胞の密度で播種した。翌日、細胞を２００μｌ血清フリー培地とともにインキュベートし、３０μｌのプラスミド(５０ｎｇ)／ペプチド／脂質混合物を加えて５％ＣＯ２中３７℃で３時間インキュベートした。次いで、ＤＭＥＭ  １ｍｌ＋１０％ＦＣＳを添加した。翌日、培地を除去し、細胞を５００μｌのＰＢＳで洗浄し、続けて、１００μｌのPromega溶解バッファーで処理した。
【０１０７】
細胞溶解物２０μｌのルシフェラーゼ活性を測定するまでプレートを−８０℃で保存した。タンパク質アッセイはPierce ＢＣＡキットを用いて行った。
【０１０８】
図６はこの試験の結果である。
【０１０９】
図６より、５０ｎｇのプラスミドおよび最終電荷比３、５および１０では、少量のｐｐＴＧ１の添加(各々複合体の正電荷の１／３、１／５および１／１０を与える)により少なくとも１ｌｏｇ  ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥのトランスフェクション効率が高まることが分かる。最終電荷比５および１０でｐｐＴＧ１量を増やす(各々複合体の正電荷の２／３および７／１０を与える)とこの高まりはいっそう大きなものとなった(２ｌｏｇ)。最終電荷比３では、ｐｐＴＧ１単独でｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ単独よりも優れた結果が得られた。
【０１１０】
例７：in vivo試験
プラスミド ｐＴＧ１１２３６  ６０μｇまたは３０μｇを５％グルコース２５０μｌ中でペプチドｐｐＴＧ１および／またはｐｃＴＧ９０/ＤＯＰＥ  １：２混合物と混合した。室温で２０分間のインキュベーション後、Ｂ６ＳＪＬマウスに複合体を静脈注射した。１日目にマウスを犠牲にした。肺を摘出し、全タンパク質を抽出してルシフェラーゼ活性を調べた。
【０１１１】
その結果を図７に示す。
【０１１２】
図７より、肺での遺伝子発現はｐＴＧ１１２３６およびｐｐＴＧ１(５匹のマウス中５匹とも)を含んでなる複合体で達成できることが分かる。陽イオン脂質をさらに含んでなる複合体にｐｐＴＧ１が存在することによって遺伝子発現が１０倍増強した。
【０１１３】
例８：トランスフェクション効率−ＪＴＳ−１の影響
ＪＴＳ１を１ｍＭ  ＮａＯＨに溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、５％グルコースで希釈したＤＮＡと混合した。次いで、ｐｐＴＧ１をこの溶液に添加した。例６で記載したように、ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ  ｐｐＴＧ１混合物を調製した。例６で記載したように、ＨｅＬａ細胞でプラスミド５０ｎｇを加えてトランスフェクションアッセイを行った。
【０１１４】
その結果を図８に示す。
【０１１５】
図８により、ｐｐＴＧ１  ０．９μｇおよびＪＴＳ１  ０．１μｇ(最終電荷比５)と複合体化したｐＴＧ１１２３６によってｐｐＴＧ１／ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ(最終電荷比５、電荷比２(＋／−)を与えるｐｐＴＧ１)の最適製剤と比べて約１０倍、さらに最終電荷比５のｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ単独と比べて約１０００倍ルシフェラーゼ活性が高まったことが分かる。
【０１１６】
最終電荷比１〜２を有するｐｐＴＧ１/プラスミドＤＮＡ複合体は多様な細胞株の効率的なトランスフェクションを媒介している。この効率はリポフェクチン、ＰＥＩ、またはGottschalk et al., 1996に記載の多成分ペプチド複合体を含んでなる複合体で見られるトランスフェクションレベルと同等またはそれよりも優れている。
【０１１７】
実施例概要：
in vitro
ペプチドｐｐＴＧ１、単独またはプラスミドＤＮＡとの複合体、はＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ(３：２モル比)リポソームを効率的に不安定化するが、ＫＡＬＡはこの種のリポソームに対して活性を示さない。遺伝子導入効率の調査をヒト腫瘍細胞系 ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏまで拡大した。これら全ての細胞系ではｐｐＴＧ１/ＤＮＡ複合体でのトランスフェクトで好結果が得られた。ｐｐＴＧ１／プラスミド複合体でのトランスフェクション効率はバフィロマイシンＡの存在下でも低下しなかった。このことから遺伝子導入がエンドソームの酸性化と関連がないことが示唆される。
【０１１８】
ｐｐＴＧ１の種々の誘導体を設計した。ｐＨ５でプラスミドＤＮＡを結合するｐｐＴＧ２１(Lys＝＞His)を除き、これら全てのペプチド(材料および方法を参照)はｐＨ８でアガロースゲル中のプラスミドＤＮＡの移動を阻止することができた。ｐｐＴＧ２０(Lys＝＞Arg)およびｐｐＴＧ２１のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームでのリポソーム漏出活性はｐｐＴＧ１に匹敵するものであった。ｐｐＴＧ２０でのトランスフェクション効率はｐｐＴＧ１のものに匹敵するものであったが、ｐｐＴＧ２１でのトランスフェクション効率はかなり低下した。二つのさらなる塩基性アミノ酸残基を有するペプチドｐｐＴＧ２８およびｐｐＴＧ２９は、リポソーム漏出および遺伝子導入アッセイにおいてはｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０と同等であった。LeuのIleまたはValでの置換によりリポソーム漏出活性が阻害され(ｐｐＴＧ３２およびｐｐＴＧ３３)、in vitro遺伝子導入効率が低下した(ｐｐＴＧ３０、ｐｐＴＧ３１、ｐｐＴＧ３２およびｐｐＴＧ３３)。Ｃ末端に野生型または変異型核局在化シグナル(ＳＶ４０ラージＴ抗原)を有するｐｐＴＧ１誘導体はリポソーム漏出および遺伝子導入効率を保持した。ｐｐＴＧ１  Ｎおよび／またはＣ末端へのＣｙｓ残基の付加ではリポソーム漏出活性が失われることはなかったが、遺伝子導入効率は低下した。ペプチドのＮ末端と共有結合するポリエチレングリコール(ＰＥＧ)２０００を含有するｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０誘導体はリポソーム漏出活性、遺伝子導入効率を保持したものの、かなり低下した。Ｄ配置の全てのアミノ酸を含有するｐｐＴＧ２０誘導体(ｐｐＴＧ２０−Ｄ)をさらに調べた。このペプチドのリポソーム漏出および遺伝子導入活性は保持された。
【０１１９】
in vivo：
マウスに静脈注射したペプチドｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ２０−Ｄを含有するプラスミドＤＮＡ複合体では、ｐｐＴＧ１を含有するものよりもいっそう高い肺での遺伝子導入効率が得られた。しかし、ＪＴＳ１−Ｋ１３では遺伝子導入が少なく、ＫＡＬＡでは検出すらできなかった。ｐｐＴＧ３２の使用では遺伝子導入効率がかなり低下し、in vivo遺伝子導入を成功させるにはＤＮＡ結合活性のほか、リポソーム漏出活性が重要であることが示唆された。ｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０を用いた遺伝子導入はｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ  １：２[＋／−]１０により作製した最適なリポプレックスを用いた遺伝子導入と少なくとも同等であった。
【０１２０】
リポーター遺伝子活性は注射後１日目で最大となった後、時間の経過とともに低下した。１４日目の再投与によりリポーター遺伝子活性の再生が起こった。
【０１２１】
例９：ＤＮＡ結合活性
材料および方法で示したｐｐＴＧ１誘導体についてのプラスミドＤＮＡ結合能力をゲルリターデーションアッセイによって調べた。
【０１２２】
その結果を以下の表１で示す。
【０１２３】
【表１】
2004534004.tif 000002
【０１２４】
表１に示した結果はｐｐＴＧ２１(Lys＝＞His)を除く、全てのペプチドがｐＨ８でプラスミドＤＮＡと結合することができたことを示している。しかしながら、ｐＨ５でならｐｐＴＧ２１がＤＮＡを結合できることも分かった。この結果はヒスチジン残基(ｐＫ６)のプロトン化状態によって説明することができ、プラスミドＤＮＡとｐｐＴＧ１誘導ペプチドとの結合が主として静電気相互作用によるものであることが示唆される。
【０１２５】
例１０：リポソーム漏出活性
ＰＯＰＣおよびコレステロール、モル比３：２(ｍｏｌ／ｍｏｌ)からなるリポソームでリポソーム漏出活性を調べた。コレステロールは天然膜の流動性を決定するそれらの重要な遍在成分である。よって、かかるリポソームでの試験は純粋なＰＯＰＣリポソームでの試験よりも in vivo条件に近い。ペプチドｐｐＴＧ１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３、ＫＡＬＡおよびＪＴＳ−１をｐＨ５およびｐＨ７で比較した。
【０１２６】
その結果を図９Ａに示す。
【０１２７】
図９Ａにより、ＫＡＬＡではコレステロール(ｃｈｏｌ)含有リポソームからカルセインを遊離させることができなかったことがはっきりと分かる。ＪＴＳ−１−Ｋ１３もまたｐＨ７でカルセイン放出を妨げたが、ｐＨ５では低レベルの放出が起こった。ｐＨ感受性ペプチドＪＴＳ−１はｐＨ５で高い溶解活性を示し、ｐＨ７ではこの活性は低下した。ｐｐＴＧ１はｐＨ５およびｐＨ７でＰＯＰＣ／ｃｈｏｌリポソームからカルセインを効率的に遊離させることができた。
【０１２８】
ＰＯＰＣ／ｃｈｏｌ  ３：２リポソームでのリポソーム漏出活性についてプラスミドＤＮＡ  ｐＴＧ１１２３６とのｐｐＴＧ１複合体を試験した。
【０１２９】
その結果を図９Ｂに示す。
【０１３０】
図９Ｂにより、プラスミドＤＮＡに対してペプチド過剰である場合(Ｐ／Ｎ  ５または１０)、リポソーム漏出は遊離ｐｐＴＧ１と同等であったことがはっきりと分かる。理論的に全てのペプチドがプラスミドＤＮＡとの結合に関与する、電荷比(Ｐ／Ｎ)１または０．８条件では、漏出活性は少し低下した。この観察はＤＮＡ結合および膜破壊活性には異なる構造特性が必要であることから説明できる。
【０１３１】
ｐＨ７におけるＰＯＰＣ／ｃｈｏｌ  ３：２リポソームでのリポソーム漏出活性について材料および方法で記載した一連のｐｐＴＧ１誘導体を試験した。その結果を図９Ｃ(ｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ２１)、図９Ｄ(ｐｐＴＧ２２〜ｐｐＴＧ２４およびｐｐＴＧ２０−Ｄ)、図９Ｅ(ｐｐＴＧ２５〜ｐｐＴＧ２７)、図９Ｆ(ｐｐＴＧ２８〜ｐｐＴＧ３３)、および図９Ｇ(ＰＥＧ−ｐｐＴＧ１およびＰＥＧ−ｐｐＴＧ２０)に示し、また表１に要約する。
【０１３２】
図９Ｃ、９Ｄおよび９Ｇより、ｐｐＴＧ１のＬｙｓのＡｒｇまたはＨｉｓでの置換、Ｄ配置のｐｐＴＧ２０、またはｐｐＴＧ１もしくはｐｐＴＧ２０Ｎ末端へのＰＥＧ２０００付加では得られたペプチドの膜破壊活性が低下しなかったことがはっきり分かる。図９Ｆでは、二つの塩基性アミノ酸(ｐｐＴＧ２８およびｐｐＴＧ２９)の付加、またはＬｅｕのＩｌｅ(ｐｐＴＧ３１)での置換ではリポソーム漏出活性が少し低下したことが示される。ＬｅｕのＶａｌでの置換ではリポソーム漏出活性(ｐｐＴＧ３２およびｐｐＴＧ３３)がかなり低下した。図９Ｄでは、さらなるＣｙｓ残基をＣ末端に付加してもリポソーム漏出活性に影響はなかったが、Ｎ末端に付加すると膜破壊がやや低下した(ｐｐＴＧ２３およびｐｐＴＧ２４)ことが示される。図９Ｅでは、野生型(ｗｔ)、逆転型または変異型ＮＬＳと結合したｐｐＴＧ１の漏出活性は大きいが、ｐｐＴＧ１で得られた最大値よりも低いことがはっきりと示される。
【０１３３】
例１１：in vitroにおけるトランスフェクション効率
プラスミド／ｐｐＴＧ１複合体でのトランスフェクション効率をヒト腫瘍細胞ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏ(ATCC)においてリポフェクチン、ＰＥＩおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ(１：１)[＋／−]５との比較により試験した。トランスフェクション後１日目のルシフェラーゼ活性を図１０Ａに示す。
【０１３４】
図１０Ａより、ｐｐＴＧ１／プラスミド複合体によってヒト腫瘍細胞系、特にＳＷ４８０細胞を効率的にトランスフェクトできることがはっきりと分かる。
ＨｅＬａ細胞における遺伝子導入効率について材料および方法に記載した連続系ｐｐＴＧ１誘導体を試験した。漸増量のペプチドと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇで６×１０４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後１日目にルシフェラーゼ活性を調べた。その結果を図１０Ｂ(ｐｐＴＧ２０、ｐｐＴＧ２１)、図１０Ｃ(ｐｐＴＧ２５、ｐｐＴＧ２６、ｐｐＴＧ２７)、図１０Ｄ(ｐｐＴＧ２８〜ｐｐＴＧ３３)、図１０Ｅ(ＰＥＧ−ｐｐＴＧ１およびＰＥＧ−ｐｐＴＧ２０)、図１０Ｆ(ｐｐＴＧ２２〜ｐｐＴＧ２４)および図１０Ｇ(ｐｐＴＧ２０−Ｄ)に示す。また、全ての結果を表１に示している。
【０１３５】
図１０Ｂより、ＬｙｓのＡｒｇ残基での置換ではトランスフェクション効率に変化はなかったが、ＬｙｓのＨｉｓでの置換ではかなりの低下が起こったことがはっきり分かる。図１０Ｃでは、ＳＶ４０ラージＴ抗原誘導ＮＬＳペプチドのＣ末端付加が遺伝子導入効率に影響しなかったことが示される。
【０１３６】
図１０Ｄでは、二つの塩基性アミノ酸残基の付加(ｐｐＴＧ２８およびｐｐＴＧ２９)によるトランスフェクション効率に変化はなかったことが示される。しかし、ＬｅｕのＩｌｅでの置換(ｐｐＴＧ３０およびｐｐＴＧ３１)では遺伝子導入効率が低下し、ＬｅｕのＶａｌでの置換ではこの活性がさらにいっそう低下したことが示される。ＰＥＧ−２０００のＮ末端への共有結合によりトランスフェクション効率が低下した(図１０Ｅ)。また、Ｃｙｓ残基のｐｐＴＧ１のＮおよび／またはＣ末端への結合も同様であった(図１０Ｆ)。しかし、ｐｐＴＧ２０−Ｄの効率は遺伝子導入試験でのｐｐＴＧ１と同等であった(図１０Ｇ)。
【０１３７】
例１１：ｐｐＴＧ１の遺伝子導入機構に関する研究
バフィロマイシンＡは特異的な液胞型プロトンポンプ阻害剤である。バフィロマイシン処理によって後期エンドソームの酸性化を防ぐ。トランスフェクション３０分前およびその間、ＨｅＬａ細胞をバフィロマイシンＡ(１７５ｎＭ)で処理した(血清不在下でのトランスフェクション複合体との１時間のトランスフェクション)。ＰＥＩまたはｐｐＴＧ１を用いたｐＴＧ１１２３６  １５０ｎｇで６×１０４細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後１日目にルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１３８】
バフィロマイシンＡの存在はｐｐＴＧ１でのトランスフェクション効率には影響を与えなかったが、ＰＥＩでのトランスフェクションを４００倍低下させた(データは示していない)。このことはｐｐＴＧ１／プラスミド複合体がエンドソームに取り込まれた場合にそれらがｐＨに無関係の機構を介して放出されることを示唆している。
【０１３９】
例１２：in vivo試験
単一成分系ペプチドベクターでの遺伝子導入の可能性をin vivoで調べた。ルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５０または６０μｇを５％グルコース２５０μｌ中でｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ(１：２)[＋／−]１０と複合体化した(Meyer et al. 2000)。得られたリポプレックスベクターを５％グルコース２５０μｌ中でｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ３２と複合体化したｐＴＧ１１２３６を用いる遺伝子導入試験の参照とした。各群５匹のマウスに静脈注射を施し、注射後１日目に動物を犠牲にし、肺のルシフェラーゼ活性を調べた。その結果を図１１に示す。
【０１４０】
図１１Ａにより、ｐｐＴＧ１複合体(電荷比２〜３間)を用いた遺伝子導入によりリポプレックスを用いて得られるルシフェラーゼ活性に匹敵する活性が肺で得られたことがはっきり分かる。ｐｐＴＧ２０を用いた遺伝子導入ではｐｐＴＧ１よりも効率が良く、かつ毒性が低いという一般的な傾向が示されたが、ペプチドｐｐＴＧ３２との複合体では検出可能なリポーター遺伝子発現は得られなかった。これはｐｐＴＧ１誘導ペプチドによる遺伝子送達を成功させるには膜破壊活性が必要であることを意味している。
【０１４１】
ｐｐＴＧ１との複合体をＪＴＳ−１−Ｋ１３、ＫＡＬＡ、Ｋ８−ＮＬＳｍ／ＪＴＳ−１およびｐｐＴＧ２０で作製したものと比較した。ＫＡＬＡおよびＫ８−ＮＬＳｍ／ＪＴＳ−１では効率が悪かった(データは示していない)。ｐｐＴＧ１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３およびｐｐＴＧ２０と複合体化したｐＴＧ１１２３６  ５０μｇの静脈注射後１日目に肺で見られるルシフェラーゼ活性を図１１Ｂに示す。ｐｐＴＧ１を用いた遺伝子導入はＪＴＳ−１−Ｋ１３を用いた場合よりも良いと考えられる。ｐｐＴＧ２０を用いた遺伝子導入はｐｐＴＧ１よりも高い遺伝子発現をもたらし、かつ毒性が低い再現可能な傾向を示す。
【０１４２】
ｐｐＴＧ１／プラスミド複合体を用いて得られる遺伝子発現は注射後３日目にバックグラウンドレベルまで低下した(データは示していない)。１回目の注射後１４日目のｐｐＴＧ１/プラスミド複合体の再投与によってリポーター遺伝子発現が再現された。３日目にその系はなお不応であった(図１１Ｃ)。
【０１４３】
図１１Ｄでは、ｐｐＴＧ２０がｐｐＴＧ１よりも効率の良い遺伝子導入をもたらし、ｐｐＴＧ２０−ＤがｐｐＴＧ２０よりもいっそう効率が良いと考えられることが確認できる。
【０１４４】
これらのデータは重要なin vivo遺伝子導入を可能にする単一成分系ペプチドベクターを初めて示すものである。
【０１４５】
例１３：in vivo試験：腫瘍内注射後の非濃縮(non-condensing)トランスフェクションエンハンサーとしてのｐｐＴＧ２１
材料および方法
Ｂ６Ｄ２マウスに４×１０５ＲＥＮＣＡ細胞(ネズミ腎臓腫瘍細胞、ATCC)を皮下注射し、腫瘍増殖を誘発した。腫瘍体積が約３０ｍｍ３に達したところで、本発明のペプチドの存在または不在下でルシフェラーゼ発現プラスミドＤＮＡ  ｐＴＧ１３２３６を含有する５％グルコース溶液３０μgを腫瘍に注射した。注射後１日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を回収してホモジナイズした。ルシフェラーゼ活性を調べ、ＲＬＵ／腫瘍ｇとして表した。
【０１４６】
結果
ＲＥＮＣＡ担癌マウスにおいて腫瘍内注射後のプラスミド導入を強化する能力についてペプチドｐｐＴＧ２１を試験した。ルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  １０μｇをｐＨ８(１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８)で漸増量(すなわち、０．１、０．６、３または１５マイクログラム)のｐｐＴＧ２１と混合した。これらの条件下ではｐｐＴＧ２１はプラスミドＤＮＡに結合できない(上記参照)、同時に、同じ条件で漸増量(すなわち、０．１％、０．２％、０．４％および０．６％)のＨＰＣ(ヘキサデシル−ホスホ−コリン)の存在下、同じプラスミドＤＮＡを投与することにより試験を行った。同じ条件でプラスミドＤＮＡ単独、またはＨＰＣまたはｐｐＴＧ２１の存在下でプラスミドＤＮＡを腫瘍内注射した。翌日、腫瘍のルシフェラーゼ活性を調べた(ＲＬＵ／腫瘍ｇ)。その結果を図１２に示す。
【０１４７】
図１２より、ｐＴＧ１１２３６  １０μｇとｐｐＴＧ２１  ０．６μｇとを同時注射することで遺伝子発現が明らかに高まることがはっきり示される。この高まりは非濃縮脂質ＨＰＣで得られた結果に匹敵するものである。
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Wyman, T.B et al., 1997, Biochemistry 36 : 3008-3017
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量のペプチドＪＴＳ１、ｐｐＴＧ１、ＪＴＳ１−Ｋ１３、ＫＡＬＡおよびｐｐＴＧ２０が示される。図１ＡはｐＨ５で行ったリポソーム漏出アッセイの結果である。図１ＢはｐＨ７で得られた結果の概要である。
【図１Ｂ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量のペプチドＪＴＳ１、ｐｐＴＧ１、ＪＴＳ１−Ｋ１３、ＫＡＬＡおよびｐｐＴＧ２０が示される。図１ＡはｐＨ５で行ったリポソーム漏出アッセイの結果である。図１ＢはｐＨ７で得られた結果の概要である。
【図２】in vitroトランスフェクション試験−ｐｐＴＧ１、ＰＥＩおよびリポフェクチンの比較。リポフェクチン、ＰＥＩまたは指定の電荷比(＋／−)のｐｐＴＧ１を加えて製造したプラスミドｐＴＧ１１０５６  ０．５μｇ、０．１μｇ、０．０５μｇまたは０．０１μgで２９３−ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトした。モックはバッファーでのトランスフェクションとする。
【図３】in vitroトランスフェクション試験−ｐｐＴＧ１およびリポフェクチンの比較；電荷比の影響。７×１０４ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートで培養した。翌日、リポフェクチンまたは指定の電荷比(＋／−)のｐｐＴＧ１を加えて製造したｐＴＧ１１２３６  ０．５μgまたは０．０５μgで細胞をトランスフェクトした。
【図４】in vitroトランスフェクション試験−ｐｐＴＧ１およびＪＴＳ１−Ｋ１３の比較。指定の電荷比(＋／−)のｐｐＴＧ１またはＪＴＳ１−Ｋ１３を加えて製造したｐＴＧ１１２３６  ０．５μgまたは０．０５μgで５×１０４  ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。ＪＴＳ１−Ｋ１３の推定は分子あたりの正味の正電荷＋５に基づいて行われる。
【図５ａ】in vitroトランスフェクション試験−ｐｐＴＧ１およびＫＡＬＡの比較。指定の電荷比(＋／−)のｐｐＴＧ１またはＫＡＬＡを加えて作製したｐＴＧ１１２３６(＝ｐ)  ５０または５００ｎｇで５×１０４  ＨｅＬａまたはＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２０時間で確認されるルシフェラーゼ活性を図５Ａ(ＨｅＬａ細胞)および図５Ｂ(ＣＨＯ細胞)に示す。
【図５ｂ】in vitroトランスフェクション試験−ｐｐＴＧ１およびＫＡＬＡの比較。指定の電荷比(＋／−)のｐｐＴＧ１またはＫＡＬＡを加えて作製したｐＴＧ１１２３６(＝ｐ)  ５０または５００ｎｇで５×１０４  ＨｅＬａまたはＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２０時間で確認されるルシフェラーゼ活性を図５Ａ(ＨｅＬａ細胞)および図５Ｂ(ＣＨＯ細胞)に示す。
【図６】in vitroトランスフェクション試験−ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ有りおよび無しでのｐｐＴＧ１の比較。ｐｐＴＧ１またはＫＡＬＡと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでＨｅＬａまたはＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。電荷比＋／−は１、２、３、４、７〜１０と変えた。
【図７】in vivo試験。各群５匹のＢ６ＳＪＬマウスにｐｐＴＧ１単独またはｐｐＴＧ１  ４２ｇの不在または存在下、ｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ  １：２を加えて製造したｐＴＧ１１２３６  ６０μgまたは３０μgを静脈注射した。各製剤の最終電荷比を示す。
【図８】トランスフェクション効率−ＪＴＳ−１の効果。
【図９Ａ−１】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ａ)ｐｐＴＧ１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３、ＫＡＬＡおよびＪＴＳ−１のｐＨ５およびｐＨ７での比較。
【図９Ａ−２】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ａ)ｐｐＴＧ１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３、ＫＡＬＡおよびＪＴＳ−１のｐＨ５およびｐＨ７での比較。
【図９Ｂ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｂ)ｐｐＴＧ１およびプラスミドｐＴＧ１１２３６の複合体のｐＨ７でのリポソーム漏出活性。
【図９Ｃ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｃ)ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ２１のｐＨ７での比較。
【図９Ｄ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｄ)ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０−Ｄ、ｐｐＴＧ２２、ｐｐＴＧ２３およびｐｐＴＧ２４のｐＨ７での比較。
【図９Ｅ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｅ)ｐｐＴＧ１とｐｐＴＧ２５、ｐｐＴＧ２６およびｐｐＴＧ２７とのｐＨ７での比較。
【図９Ｆ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｆ)ｐｐＴＧ１と一連のペプチドｐｐＴＧ２８〜ｐｐＴＧ３３とのｐＨ７での比較。
【図９Ｇ】リポソームリーケージアッセイ。漸増量の指定のペプチドをＰＯＰＣ／コレステロール(３：２  ｍｏｌ／ｍｏｌ)リポソームとともに室温で３０分間インキュベートした。放射蛍光についてはペプチド濃度に対してプロットした。Ｇ)ｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０とＰＥＧ−ｐｐＴＧ１およびＰＥＧ−ｐｐＴＧ２０とのｐＨ７での比較。
【図１０Ａ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図１０Ｂ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｂ)ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ２１。
【図１０Ｃ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｃ)ｐｐＴＧ２５、ｐｐＴＧ２６およびｐｐＴＧ２７。
【図１０Ｄ−１】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｄ)ｐｐＴＧ１および一連のｐｐＴＧ２８〜ｐｐＴＧ３３。
【図１０Ｄ−２】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｄ)ｐｐＴＧ１および一連のｐｐＴＧ２８〜ｐｐＴＧ３３。
【図１０Ｅ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｅ)ｐｐＴＧ１、ＰＥＧ−ｐｐＴＧ１およびＰＥＧ−ｐｐＴＧ２０。
【図１０Ｆ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｆ)ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２２、ｐｐＴＧ２３およびｐｐＴＧ２４。
【図１０Ｇ】in vitroトランスフェクション試験。Ａ)ヒト腫瘍細胞系ＷｉＤｒ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＳＷ４８０およびＬｏＶｏを異なる電荷比のｐｐＴＧ１、ＰＥＩ、リポフェクチンおよびｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥを用いてルシフェラーゼ発現プラスミドｐＴＧ１１２３６  ５００ｎｇまたは５０ｎｇでトランスフェクトした。トランスフェクション後１日におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。Ｂ)〜Ｇ)ＨｅＬａ細胞を漸増電荷比[Ｐ/Ｎ]の指定のペプチドを用いてｐＴＧ１１２３６  ５０ｎｇでトランスフェクトした。Ｇ)ｐｐＴＧ１およびｐｐＴＧ２０−Ｄ。
【図１１Ａ】in vivo試験。アスタリスクの付いた数は各群５匹のうちの死亡マウス数を示す。Ａ)各群５匹のＢ６ＳＪＬマウスにｐｃＴＧ９０／ＤＯＰＥ  １：２  [Ｐ／Ｎ]  １０、または指定量のｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０およびｐｐＴＧ３２と複合体化したｐＴＧ１１２３６  ６０μgまたは５０μgを静脈注射した。注射後１日目にマウスを犠牲にし、肺のルシフェラーゼ活性を調べた。
【図１１Ｂ】in vivo試験。アスタリスクの付いた数は各群５匹のうちの死亡マウス数を示す。Ｂ)各群５匹のＢ６ＳＪＬマウスにｐｐＴＧ１、ＪＴＳ−１−Ｋ１３およびｐｐＴＧ２０と複合体化したｐＴＧ１１２３６  ６０μgまたは５０μgを静脈注射した。注射後１日目にマウスを犠牲にし、肺のルシフェラーゼ活性を調べた。
【図１１Ｃ】in vivo試験。アスタリスクの付いた数は各群５匹のうちの死亡マウス数を示す。Ｃ)５匹のＢ６ＳＪＬマウス群全てに０日目のｐｐＴＧ１と複合体化したｐＴＧ１１２３６またはｐＴＧ１１０２２ (「エンプティベクター」)６０μgの予備注射後、０、３および１４日目にｐｐＴＧ１  １５０μgと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ６０μgを静脈注射した。翌日、マウスを犠牲にした。肺のルシフェラーゼ活性／ｍｇタンパク質を示す。
【図１１Ｄ】in vivo試験。アスタリスクの付いた数は各群５匹のうちの死亡マウス数を示す。Ｄ)各群５匹のＢ６ＳＪＬマウスにｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０またはｐｐＴＧ２０−Ｄ  １８０μgと複合体化したｐＴＧ１１２３６  ６０μgを静脈注射した。注射後１日目にマウスを犠牲にし、肺のルシフェラーゼ活性を示す。
【図１２】ＨＰＣまたはｐｐＴＧ２１の存在または不在下、ｐＨ８でのｐＴＧ１１２３６プラスミド(ｐと記載)１０マイクログラムの腫瘍内投与後１日目のＲＥＮＣＡ腫瘍のルシフェラーゼ活性。
【図１Ａ】
2004534004.tif 000003
【図１Ｂ】
2004534004.tif 000004
【図２】
2004534004.tif 000005
【図３】
2004534004.tif 000006
【図４】
2004534004.tif 000007
【図５ａ】
2004534004.tif 000008
【図５ｂ】
2004534004.tif 000009
【図６】
2004534004.tif 000010
【図７】
2004534004.tif 000011
【図８】
2004534004.tif 000012
【図９Ａ−１】
2004534004.tif 000013
【図９Ａ−２】
2004534004.tif 000014
【図９Ｂ】
2004534004.tif 000015
【図９Ｃ】
2004534004.tif 000016
【図９Ｄ】
2004534004.tif 000017
【図９Ｅ】
2004534004.tif 000018
【図９Ｆ】
2004534004.tif 000019
【図９Ｇ】
2004534004.tif 000020
【図１０Ａ】
2004534004.tif 000021
【図１０Ｂ】
2004534004.tif 000022
【図１０Ｃ】
2004534004.tif 000023
【図１０Ｄ−１】
2004534004.tif 000024
【図１０Ｄ−２】
2004534004.tif 000025
【図１０Ｅ】
2004534004.tif 000026
【図１０Ｆ】
2004534004.tif 000027
【図１０Ｇ】
2004534004.tif 000028
【図１１Ａ】
2004534004.tif 000029
【図１１Ｂ】
2004534004.tif 000030
【図１１Ｃ】
2004534004.tif 000031
【図１１Ｄ】
2004534004.tif 000032
【図１２】
2004534004.tif 000033
【国際公開パンフレット】
2004534004.tif 000034
2004534004.tif 000035
2004534004.tif 000036
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2004534004.tif 000106
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534004.tif 000107
【国際調査報告】
2004534004.tif 000108
2004534004.tif 000109
2004534004.tif 000110
2004534004.tif 000111