(57)【要約】本発明は、個体におけるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生を減少させる方法であって、該個体における過剰活性ＮＰＹ系を調節することを目的とする方法に関する。ストレス誘発過剰産生はアンタゴニストを投与することにより中和されるか、または個体がプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分において７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型を有する場合には、該個体は該多型を引き起こす変異したアレルの発現を減少または予防することを目的とする方法を受ける。本発明はさらに、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生のリスクを有することに対する人の感受性を診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生を減少させる方法であって、該個体における過剰活性ＮＰＹ系を調節することを目的とする方法。
【請求項２】
前記方法が前記個体の内皮細胞におけるＮＰＹの構成的過剰発現を減少させるために用いられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法が前記個体の心拍数を減少させるために用いられる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記方法が前記個体におけるインスリン分泌を高めるために用いられる請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＮＰＹの過剰産生が前記個体にアンタゴニストを投与することによって中和される請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
前記アンタゴニストがＮＰＹ遺伝子の発現を減少させることを目的とするものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記アンタゴニストがＮＰＹ受容体アンタゴニストである請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニストがＮＰＹ抗体である請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が血清中でＮＰＹと反応する抗体である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＮＰＹのストレス誘発過剰産生が、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型によって引き起こされる請求項５、６、７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
ＮＰＹのストレス誘発過剰産生が、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型によって引き起こされる請求項１、２、３または４記載の方法であって、前記個体が、該多型を引き起こす変異アレルの発現を減少または予防することを目的とする方法を受ける方法。
【請求項１２】
前記方法が、変異アレルを修復することを目的とする特定の遺伝子治療である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用からなる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用からなる請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
リボザイムの使用からなる請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生のリスクを有すことに対する人の感受性を診断する方法であって、該被験者がヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における多型を有するか否かを決定することからなる方法であって、該多型が該プレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなり、かつ該多型がＮＰＹのストレス誘発過剰産生のリスクを指示する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は個体におけるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生を減少させる方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
本発明の背景を示すために本明細書で用いる刊行物およびその他の資料、とくに実施に関する追加的詳細を提供する事例は、参考文献によって取り入れられる。
【０００３】
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）は、ヒトの中枢および末梢の神経系における最も豊富にあるニューロペプチドであり、かつ重要な神経伝達物質である。５つのクローン化され広範に発現される受容体（Ｙ１−Ｙ５）を通じて、ＮＰＹは、たとえば、食物摂取、血管収縮、ホルモン放出、肝機能、脂質分解および血管形成をも調節する１〜９。外来的に与えられるＮＰＹは強い血管収縮剤であり、またノルエピネフリン（ＮＥ）により達せられる血管収縮を修飾する１０〜１２。ＮＰＹは種々の器官を刺激するすべての交感神経末端でＮＥと共に蓄積されかつ共に放出される１３〜１６。血漿中では、ＮＰＹ濃度は休息中および運動中の交感神経の活性化レベルを反映していると考えられている１７〜２０。
【０００４】
最近の研究で、ＮＰＹのシグナルペプチドにおける７位ロイシンが７位プロリンとなった（Ｌｅｕ７Ｐｒｏ）多型が見出され、かつ、この多型が高い血清総コレステロールレベルと低密度（ＬＤＬ）コレステロールレベルとの意味のある関連を有していることが、とくに肥満被験者において示された２１。この多型の保有者頻度は、検討したヨーロッパ人の母集団の６〜１３％である２１。同多型はまた、就学前児童における高い血清トリグリセリドレベル２２、中年男性およびＩＩ型糖尿病患者における進行したアテローム性動脈硬化症ならびにこれら患者における糖尿病性網膜症の早期発症２３とも関連している。この多型をもって生まれた男の赤ん坊は出生時体重がより重い２２が、その後の生活では、この多型はボディマス指数（ＢＭＩ）または完全食物摂取（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ）または食物嗜好とは関連しない２。
【０００５】
変異したプレプロＮＰＹが重要な血中脂質や血管変化を伝えるメカニズムは知られていないが、細胞から循環系へのまたは局所的な組織へのＮＰＹの変化した分泌（ａｌｔｅｒｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を包含しているかもしれない。新たに見出されたプレプロＮＰＹは９６アミノ酸（ａａ）ペプチドであり、このペプチドはＮ末端に２８−ａａシグナルペプチドと他端に３２−ａａＣ−ポンデラルペプチド（Ｃ−ｐｏｎｄｅｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｃ−ｐｏｎ）を有する。シグナルペプチドは当該ペプチドを小胞体（ＥＲ）に誘導する。ＥＲでは、シグナルペプチドが切断され、残りのプロＮＰＹはさらに種々の酵素による修飾をうけて成熟した３６残基のアミド化されたＮＰＹとなり、分泌小胞で蓄積される２４。シグナルペプチドの二次元および三次元構造は、プロリンがα−ヘリックス構造においてブレーキとよじれを容易に形成するようなＬｅｕ７Ｐｒｏ変換により、劇的に変化され得ることが提唱されている２５、２６。したがって、見出された多型は成熟ＮＰＹの形成、蓄積または放出動力学を変えるのかもしれない。
【０００６】
この多型の機能的役割を検討するために、健康な被験者のＬｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型グループおよびＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型グループで、ＮＰＹ分泌を含む交感神経応答を激しい肉体的運動により誘発させた。この多型の機能的結果をさらに評価するために、ＮＰＹを含みかつ分泌することが知られている９内皮細胞を免疫細胞化学的な検討に用いた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を分離し、遺伝子型を決定し、共焦点顕微鏡で検討し、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ細胞と比較してＬｅｕ７Ｐｒｏ細胞中のＮＰＹ−およびプロＮＰＹ−ｉｒのパターンを決定した。
【０００７】
［発明の要旨］
本発明は、個体、とくにヒト個体におけるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生を減少させる方法であって、該個体における過剰活性ＮＰＹを調節することを目的とする方法に関する。
【０００８】
さらなる側面によれば、本発明は、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生のリスクを有することに対する人の感受性を診断する方法であって、該被験者がヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における多型を有するかどうかを決定することからなる方法であって、該多型が該プレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなり、かつ該多型がＮＰＹのストレス誘発過剰産生のリスクを示す方法に関する。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
下記に提示されている検討は、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分におけるＬｅｕ７Ｐｒｏ多型が運動中個体におけるＮＰＹのストレス誘発過剰産生を引き起こすことを示している。ＮＰＹの過剰産生は、その結果として望ましくない状態や多くの病気を引き起こし得るので、本発明者らはＮＰＹの産生を正常レベルに減少させることが必須であると信ずる。
【００１０】
「過剰産生」なる用語は、本明細書では、過剰発現、過剰放出、または上昇した細胞内形成、分布もしくは蓄積を包含するものと理解されるべきである。
【００１１】
本検討は、ＮＰＹのストレス誘発過剰産生がヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分におけるＬｅｕ７Ｐｒｏ多型に関係していることを示しているが、本発明者らはかかるストレス誘発過剰産生が他の要因によっても引き起こされ得ることを除外しない。本発明者らはその背後にあるメカニズムとは関係なく、ＮＰＹの過剰産生を減少させることが必須であると信ずる。
【００１２】
国際公開第９９／３２５１８号パンフレットは、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ多型と血清中の上昇した総コレステロールおよび上昇したＬＤＬ−コレステロールとの間の関係を示している。図１ａから１ｃはＮＰＹ遺伝子におけるＬｅｕ７Ｐｒｏ多型の部位を示す。
【００１３】
したがって、１つの好ましい実施態様によれば、ＮＰＹの過剰産生は前記個体にアンタゴニストを投与することにより中和される。
【００１４】
アンタゴニストはＮＰＹ遺伝子の発現を減少することを目的とするものでありうる。
【００１５】
例として、Ｙ１−、Ｙ２−およびＹ５−受容体アンタゴニストがあげられる。Ｙ１−受容体アンタゴニストの例として、ＢＩＢＯ３３０４（Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２５， ５４９−５５， １９９８）；ＢＩＢＰ３２２６（Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ ２５， ３７７−８２， １９９８）；ＧＲ２３１１１８（Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３４９， ９７−１０５， １９９８）；および１，３−ジ置換ベンゾアゼピン類（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １７０３−１４， １９９９）があげられる。Ｙ２−受容体アンタゴニストの例として、ＢＩＩＥ０２４６（Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３９６， Ｒ１−３， ２０００； Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２９，１０７５−１０８８， ２０００）があげられる。Ｙ５−受容体アンタゴニストの例として、Ｌ−１５２，８０４（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７２， １６９−１７３，２０００）およびＣＧＰ７１６８３Ａ（Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７８， １１６−２５， ２０００）があげられる。
【００１６】
さらに別の実施態様によれば、アンタゴニストはＮＰＹ抗体であり得る。かかる抗体は組織に結合していてもよく、また血清中で遊離型になっている可溶性抗体であってもよい。後者の場合、かかる抗体は血清中でＮＰＹを捕捉し、ＮＰＹとの複合体を形成することができる。それにより、ＮＰＹのＮＰＹ受容体への結合が阻止される。
【００１７】
前記した別の実施態様において、ＮＰＹの過剰産生はヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型により、あるいはその他の理由により引き起こされ得る。
【００１８】
別の実施態様によれば、ＮＰＹの過剰産生が、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型により引き起こされる場合は、個体は該多型を引き起こす変異アレルの発現を減少または予防することを目的とする方法を受ける。
【００１９】
かかる方法は、たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはリボザイムの使用により、変異アレルを修復することを目的とする、特定の遺伝子治療であり得る。
【００２０】
アンチセンス治療は、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との直接的な相互作用によって翻訳を損なうことを意図する方法のことをいう。これは、機能が破壊されることになるメッセンジャーＲＮＡとワトソン−クリック型塩基対を形成する標的オリゴヌクレオチドを用いることにより遂行される。
【００２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現阻害は、相補的なｍＲＮＡ配列と結合してそのｍＲＮＡの翻訳を妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に依存している。遺伝子内の１つの変異塩基はオリゴヌクレオチドに基づいた戦略を用いることによって修復することが可能である（Ｇｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。短い７または８塩基のオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡのフランキング配列に大きく依存するアンチセンス活性および特異性を充分に保持する。結合は、安定な結合およびＲＮａｓｅＨ媒介切断を促進するのに充分であるべきである。
【００２２】
本発明者らは、変異ＮＰＹ遺伝子の影響を、変異部分：…ｃｇａ ｃｔ／ｃｇ ｇｇｇ…（変異塩基を太字で示す）の配列を含む短いアレル特異的なオリゴヌクレオチドを用いることによって中和している。これは、さまざまな長さであるが、全てがその変異塩基配列を認識するオリゴヌクレオチドを用いることによって遂行され得る。プレプロＮＰＹ ｍＲＮＡの推定２次構造（スキーム１および２）によると、最も良い標的配列は、変異の周辺の−９と＋２塩基間、すなわち３′−ａｃ ａａｇ ｃｇａ ｃｔｇ ｇ−５′を標的とする配列である。この配列は標的ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合を増強することで知られる「バルブ」を含む。
【００２３】
非修飾オリゴヌクレオチドを使用することは可能であるが、それらの安定性、ヌクレアーゼ耐性および核への浸透を増加させるために、オリゴヌクレオチドのいくつかの修飾が使用され得る。主にＣ−２、Ｃ−４、Ｃ−５、およびＣ−６部位の、比較的多くの修飾ピリミジンが合成され、ヌクレオチドへ組み込まれる。またプリンアナログも合成することができ、オリゴヌクレオチドへ組み込まれる。糖部分、ペントフラノ−ス環の２′位はメトキシ、プロポキシ、Ｏ―アルコキシまたはメトキシエトキシ基で置換される。リン酸単位または糖リン酸単位を置換するオリゴヌクレオチドの新しい骨格は、Ｃ−５プロピニルピリミジン修飾ホスホチオエートオリゴヌクレオチドのように製造される。５′末端および３′末端が、メチルホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはメチルホスホネートなどのヌクレオチド間結合によって修飾されたキメラオリゴヌクレオチドも、使用できる。比較的新しい技術は、立体構造的に制限されたＬＮＡ（固定型核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸である。生物工学リボザイムは構造的に様々であるが、それらの特異性はまた標的ｍＲＮＡ配列の認識に基づいている。
【００２４】
遺伝子置換または遺伝子スイッチング技術は、その変異遺伝子配列を不活性化し、正しい配列を導入する。これは、正常なコーディング配列を有する外来遺伝子をトランスフェクトし、アンチセンスオリゴヌクレオチドで変異コーディング配列を遮断することによって遂行され得る。また、変異配列を妨害せず、正しい正常配列を導入するだけの技術も使用できる。これは、ヘテロ接合性細胞、すなわち１つの正常アレルと１つの変異アレルを保持する細胞において使用することができ、それにより正常アレルを過剰発現する結果となる。ホモ接合性変異細胞もまた治療することができ、それによりドミナントポジティブ効果、すなわち正常アレルが変異アレルより高度に発現される結果となる。
【００２５】
リボザイム技術は、たとえば、つぎの刊行物に記載されている。リボザイムプロトコール：Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐ Ｃ（編者）． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ ０−８９６０３−３８９−９， ５１２ｐｐ． １９９７； Ｒｏｓｓｉ ＪＪ． Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ， ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６， Ｒ３３−７， １９９９； およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＭＰ， Ｂｕｌｌ Ｊ． Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｉｎ ｗｏｎｄｅｒｌａｎｄ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６， ５４６−７， １９９７．
ＰＮＡ技術は、Ｒａｙ Ａ， Ｎｏｒｄｅｎ， Ｂ． ペプチド核酸（ＰＮＡ）：その医療および生物工学的適用ならびに将来の展望、ＦＡＳＥＢ Ｊ １４， １０４１−１０６６， ２０００ に記載されている。
【００２６】
本発明は、つぎの非制限的な実験の部により説明される。
【００２７】
実験の部
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のシグナルペプチドにおけるかなり共通のＬｅｕ７Ｐｒｏ多型が、高い血中脂質濃度に関係しており、また血中脂質値とは無関係に、進行したアテローム性動脈硬化症にも関係していることが以前示された。本発明者らは、ヒトおよびＮＰＹを内在的に発現する分離されたヒト内皮細胞において、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型のＮＰＹ分泌およびプロセシングに対する効果を検討した。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する９人の被験者と対応させたＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型対照群９人において、ＮＰＹ分泌および他の交感神経応答を激しい自転車エルゴメーター運動によって刺激した。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者は、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する被験者よりも、血漿ＮＰＹ濃度において４２％高い最大増加を有していた。これら被験者は、また顕著に高い心拍数と低い運動誘発遊離脂質濃度を有しており、これらは増加したＮＰＹレベルに対する二次的変化であるかもしれない。さらに、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有するヒト内皮細胞において、共焦点顕微鏡で立証されるように、明らかにより強い免疫活性を観察した。結論として、本研究は、ＮＰＹのより効率的な産生と放出に導くＬｅｕ７Ｐｒｏ多型の機能的な結果の最初の直接的な証拠を提供するものである。したがって、ＮＰＹの過剰産生はアテローム性動脈硬化症や血漿脂質の望ましくない変化に導き得る。本観察は、これらの疾患およびＮＰＹの過剰産生により引き起こされるその他の疾患の予防および治療に対する新たな戦略を提供し得る。
【００２８】
方法
研究被験者
ツルク大学およびツルク大学中央病院の共同倫理委員会は本研究のすべての部分を承認した。遺伝子型分析ならびに最大酸素消費量（Ｖｏ２ｍａｘ）測定および８０％Ｖｏ２ｍａｘ自転車運動試験（１００％負荷に対応する測定Ｖｏ２ｍａｘの８０％負荷）への参加に対して、各被験者から書面によるインフォームドコンセントを得た。遺伝子型スクリーニングへの参加は問診により確かめた病気にかかっていない１８歳以上の非選択被験者に要請した。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者９人（表１）とＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する対応させたコントロール群９人（年齢、性別およびＢＭＩが対応している）（表１）を、Ｖｏ２ｍａｘ測定および前者の遺伝子型分析に基づいて８０％Ｖｏ２ｍａｘ自転車エルゴメーター運動試験のために選択した。健康でない被験者を除くために、詳細な医学的履歴（病気、薬物治療、喫煙、外傷、アルコール消費を含む）を取得し、また身体検査（ＥＣＧ、聴診、血圧測定、甲状腺触診、感染の臨床的徴候のスクリーニングを含む）を被験者が検討に入る前に実施した。また、病気の被験者を除外するため、実験室測定（血中ヘモグロビン、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、グルコース、遊離脂肪酸およびアラニンアミノトランスフェラーゼの濃度、白血球数、および赤血球沈降速度）を実施した。体脂肪をスキンフォールド測定（ｓｋｉｎ−ｆｏｌｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）で決定した２７。
【００２９】
遺伝子型分析
遺伝子型分析のため、血液サンプル（１０ｍｌ）を肘前静脈から採取し、分離した培養液中のＨＵＶＥを採集した。血中白血球ＤＮＡおよびＨＵＶＥＣ　ＤＮＡを、ＤＮＡ分離キット　プルジーン（Ｐｕｒｕｇｅｎｅ）およびキャプチャーカラムキット（ジェントラ　システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）をそれぞれ用い、製造者の指示にしたがって抽出した。遺伝子型をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてプレプロＮＰＹ遺伝子（２３７ｂｐ）の一部を増幅して決定した。チミジン−１１２８からシトシンへの置換は、結果としてプレプロＮＰＹの７位におけるロイシンからプロリンへのスイッチとなり、それはＢｓｉＥ１（ニューイングランド　バイオラブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）製、べバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ＭＡ、米国）によるＰＣＲ産物の消化および制限断片長多型分析（１８９ｂｐおよび４８ｂｐ断片は変異Ｐｒｏ７アレルにより製造される）により検出した。
【００３０】
検討手順
健康な被験者１８人に、Ｖｏ２ｍａｘ測定および８０％Ｖｏ２ｍａｘ自転車運動試験の４８時間前は、薬物治療、アルコール含有飲料またはアルコール含有食物を、また１２時間前はカフェイン含有飲料またはカフェイン含有食物を拒否するよう要請した。また、これら被験者に試験に先立つ２日間は炭水化物の豊富な食物を取り、激しい運動は避けるように要請した。標準的な軽い食事を試験実施２時間前に提供した。個々の最大酸素取込量（Ｖｏ２ｍａｘ）をパーボ　ヌルミ　センター（Ｐａａｖｏ Ｎｕｒｍｉ Ｃｅｎｔｒｅ）、ツルクで決定した。初期力量出力を女性では４０Ｗ、男性では６０Ｗとし、疲労困ぱいするまで２分毎にそれぞれ２０Ｗおよび３０Ｗ増加させた。呼吸ガスを分析し（ＡＭＥＴＥＫ Ｓ−３Ａ１ Ｏ２ および Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＢ−２ ＣＯ２　分析器）、オンラインリアルタイムＰＣシステムで１５秒毎に記録した。呼吸交換比（＞１．１５）および酸素取込量（Ｖｏ２）均一性を評価して真の最大努力を確保した。最大Ｖｏ２を決定し、対応力量レベルを１００％Ｖｏ２ｍａｘとした。８０％Ｖｏ２ｍａｘ運動試験では、静脈内カニューレを肘前静脈に挿入し、そののち被験者は３５分間（分）横になっていた。自転車運転を始める前（０分）に、自転車エルゴメーターに５分間座り、０分に被験者は最少（２０Ｗ）負荷から運動を開始した。負荷を２分間隔で２０％Ｖｏ２ｍａｘ段階きざみに増加し、８分間で４段階のちに８０％Ｖｏ２ｍａｘ負荷に達した。被験者はついで１２分間この８０％Ｖｏ２ｍａｘレベルで運動を継続し、そののち２０％Ｖｏ２ｍａｘ負荷で１０分間クーリングをおいた。被験者は、運動前３０分のベースライン期間、３０分の運動中、および運動後の着座５０分の間、Ｄａｔｅｘ Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ＡＳ／３−ｓｙｓｔｅｍ（ダテックス　オーメダ社（Ｄａｔｅｘ Ｏｈｍｅｄａ）製、オウル（ｏｕｌｕ）、フィンランド）により調べられた（ＥＫＧおよび血圧）。１５ｍｌの血液サンプル９個（血漿ＮＰＹ、エピネフリン（Ｅ）、ノルエピネフリン、酪酸、インスリンおよび血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の測定用）を採取し、心拍数を−５、０、８、１６、２０、３０、４０、６０および８０分に記録した。心拍数はさらに−３０分でも記録した。血圧を−３０、−１０、０、１６、２５、３０、４０、６０および８０分に測定した。
【００３１】
分析方法
血漿ＮＰＹ濃度は、市販のラジオイムノアッセイキット（ＥＵＲＩＡ−ＮＰＹ、ユーロ−ダイアグノスチカ社（Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．）製、マルモー（Ｍａｌｍｏ）、スウェーデン）を用いて決定した。血漿中のＮＥおよびＥ濃度は、高速液体クロマトグラフィーを用い、電気化学的検出で決定した２８。この方法はＮＥおよびＥの両者に対してイントラアッセイおよびインターアッセイの変動が１２％以下であった。日立９１７自動分析器（日立社製、東京、日本）を用いて、血清中のＦＦＡ濃度は、ＮＥＦＡ−Ｃ試薬セット（和光ケミカルズ社（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）製、ネウス（Ｎｅｕｓｓ）、ドイツ）で決定し、血漿酪酸濃度は酵素的ＵＶ法（ロッシュ　ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）製、マンハイム、ドイツ）で決定した。インターアッセイ変動は０．６２ｍｍｏｌ／ＬのＦＦＡ（ｎ＝３７）で０．６％、２．１０ｍｍｏｌ／Ｌの酪酸（ｎ＝４７）で１．６％であった。血漿インスリン濃度はラジオイムノアッセイキットＩＮＳＩＫ−５（ダイアソリン社（ＤｉａＳｏｒｉｎ ｓ．ｒ．ｌ．）製、サルギア（Ｓａｌｕｇｇｉａ）、イタリア）により決定した。他の実験室測定は標準的な方法で行った。
【００３２】
統計学的解析
対応のない両側ｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔｓ）を用いて、被験者のベースライン特性（表１）を比較した。カテコールアミン（Ｅ、ＮＥ）値はさらなる分析の前に対数変換した。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型とＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型とのあいだで、順次測定した各パラメーターの平均値を、種々のモデル（表２）に対して反復測定ＡＮＯＶＡを用いることにより比較した。ＡＮＯＶＡが統計学的に有意な遺伝子型−時間相互作用（全般的な相違）を表す場合、各時点におけるグループ平均値の同等性を試験するために、フィッシャー最小有意差マルチプル比較法を用いた。これらの試験は、同じ統計学的モデルを用いてリニアーコントラスト（ｌｉｎｅａｒ ｃｏｎｔｒａｓｔｓ）として実施した。相関分析のために、ピアソンの相関係数を計算した。すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表示した。統計学的分析はＳＡＳソフトウェア（バージョン６．１２、ＳＡＳインスティチュート社（ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）製、カリー（Ｃａｒｙ）、ＮＣ，米国）を用いて行った。
【００３３】
細胞培養ならびにプロＮＰＹおよびＮＰＹの免疫細胞化学的検出
ＨＵＶＥＣを、ＰＢＳ中３７℃１５分間、コラーゲナーゼ　タイプＩＩ（０．３ ｍｇ／ｍｌ）およびタイプＩＶ（０．３ｍｇ／ｍｌ）酵素（シグマ　ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）製、セントルイス、ＭＯ、米国）を用いて、新たに届けられた臍帯から分離した。分離した細胞を、０．２％ゼラチン被覆（シグマ　ケミカル社製、セントルイス、ＭＯ、米国）２５ ｃｍ２ 細胞培養フラスコ中に播種した。ＨＵＶＥＣを、２．５Ｕ／ｍｌ　ヘパリンナトリウム、１０％熱不活化ＦＢＳ（オートゲン　バイオクリアー社（Ａｕｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｃｌｅａｒ）製、ウィルトシャイアー（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ）、英国）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（バイオウィタカー社（ＢｉｏＷｉｔｔａｋｅｒ）製、ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）、ＭＤ、米国）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ライフ　テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）製、パイスレイ（Ｐａｉｓｌｅｙ）、スコットランド）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（バイオウィタカー社製、ウォーカーズビル、ＭＤ、米国）および２５μｇ／ｍｌＥＣＧＳ（内皮細胞成長補助因子）（アップステイト　バイオテクノロジーズ社（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）製、レークプラシッド、ＮＹ、米国）で補填したＭｅｄｉｕｍ−１９９（ライフ　テクノロジーズ社製、パイスレイ、スコットランド）中で、成育した。新鮮な培地を１日おきに加え、細胞を２〜３日ごとに置き替えた。実験は継代２と７のあいだの細胞で実施した。免疫細胞化学のために、細胞を０．２％ゼラチン被覆ガラスカバースリップ上に１〜２×１０４細胞／ｃｍ２で置き、２４〜４８時間後に、室温で２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。免疫細胞化学的反応を室温で行った。非特異的結合は、透過性化剤として０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０（カルビオケム、ノバビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）製、ラホーレ、ＣＡ，米国）を含有し、かつ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６中５％脱脂粉乳を含有するブロッキングバッファーを用い、４５分間細胞をインキュベーションしてブロックした。細胞を、同じバッファー中で、２つの一次抗体、すなわちウサギポリクローナル抗ヒトＣ−ｐｏｎ抗体（１：２００）（アフィニティー　リサーチ　プロダクツ社（Ａｆｆｉｎｉｔｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ．）製、マンヘッド（Ｍａｍｈｅａｄ）、英国）およびヤギポリクローナル抗ヒトＮＰＹ抗体（１：１００）（アフィニティー　リサーチ　プロダクツ社製、マンヘッド、英国）と共に４５分間インキュベーションして二重染色した。インキュベーションののち、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ついで５分間のブロッキングおよびそれに続き、ブロッキングバッファー中で、二次抗体であるＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ（１：５００）（シレニウス　ラボラトリーズ社（Ｓｉｌｅｎｉｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製、ホウソーン（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ）、オーストラリア）およびＴＲＩＴＣ結合抗ヤギＩｇＧ（１：２５０）（シグマ　ケミカル社製、セントルイス、ＭＯ、米国）を用いる２回の３０分間イン���ュベーションを暗所にて行った。ＰＢＳで３回洗浄したのち、蛍光顕微鏡検査のために、カバースリップを、顕微鏡スライド上の一滴の抗フェードマウンティング培地（ＰＢＳ中、５０％グルセロール、１００ｍｇ／ｍｌＤＡＢＣＯ（１、４−ジアザビシクロ［２．２．２．］オクタン、シグマ社製）および０．０５％アジ化ナトリウムを含有する）上にマウントした。レーザースキャンニング共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ４Ｄ、１００×／１．４ｏｉｌＩＣＴ：Ｄ対物レンズ、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて、二重標識免疫蛍光顕微鏡検査を実施した。これらの免疫細胞化学的反応により、プロＮＰＹを緑と赤のオーバーラッピング染色として染色した（黄色になる）。その理由は、Ｃ−ｐｏｎとＮＰＹとは共局在しているからである。赤色染色は単独のＮＰＹ−ｉｒのマーカーであり、緑色染色は単独のＣ−ｐｏｎ−ｉｒとしてのマーカーである。
【００３４】
結果
ベースライン特性およびＶｏ２ｍａｘ測定
２つの遺伝子型のグループにおける検討被験者の間で、平均ベースライン特性またはＶｏ２ｍａｘ値には差はなかった（表１）。
【００３５】
ＮＰＹ−遺伝子型は心拍レベルに影響する
検討期間中、心拍数において統計的に有意な遺伝子型効果があり（表２）、Ｌｅｕ７Ｐｒｏのグループは長期間にわたってより高い平均心拍数を有していた（図１Ａ）。しかしながら、グループ間に、いかなる個々の時間においても平均心拍数には、統計的に有意な差は検出されなかった。全検討期間中、遺伝子型間で収縮期血圧または拡張期血圧に差は観察されなかった（表２、図１Ｂ）。
【００３６】
ＮＰＹ−遺伝子型はＮＰＹおよびＦＦＡ濃度の運動誘発増加に影響する
Ｌｅｕ７Ｐｒｏグループは、明らかにより高い全般的な血漿ＮＰＹ濃度を有しており（表２、図２Ａ）、２０分の最大ＮＰＹ濃度では統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を、３０分および４０分の運動後ＮＰＹ濃度では近似の有意差（ｐ＝０．０５）を有していた。０分と２０分の間での運動誘発の平均ＮＰＹ上昇は、Ｐｒｏ７アレルを有する被験者では９０．４±１２．７ｐｍｏｌ／Ｌであり、このアレルを有しない被験者では５１．９±５．４ｐｍｏｌ／Ｌであった（ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。血漿中のＥおよびＮＥの濃度（表２、図２Ｂおよび２Ｃ）には、グループ間で統計的に有意な差はなかった。血漿中での平均ＮＥ／ＮＰＹ比は、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ被験者で８４．９±９．７であり、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ被験者で５６±５．３であった（ｐ＜０．０５；ｔ−検定）。
【００３７】
全般的なＦＦＡ濃度において、遺伝子型グループ間で劇的な差が観察された（表２、図３Ａ）；Ｌｅｕ７Ｐｒｏ被験者はＬｅｕ７Ｌｅｕ被験者よりも有意に低いＦＦＡ濃度を有しており、運動後４０分の濃度で最も大きな差であった（ｐ＜０．０５）。ＮＰＹレベルは、Ｌｅｕ７Ｐｒｏグループ（ｒ＝０．４５、ｐ＜０．００１）およびＬｅｕ７Ｌｅｕグループ（ｒ＝０．３６、ｐ＜０．０５）において、ＦＦＡ濃度とポジティブな関係を有していた。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者においてはより低い全般的なインスリン濃度であり、このグループにおいては、明らかな運動誘発のインスリンレベル低下はなく（表２、図３Ｂ）、運動前０分（ｐ＜０．０５）および運動後６０分（ｐ＜０．０５）において、濃度に統計的な有意差が検出された。酪酸レベルは検討期間を通じて２つの遺伝子型グループにおいて同じであった（表２、図３Ｃ）。
【００３８】
ＮＰＹ遺伝子型は、上皮細胞におけるＮＰＹ−およびプロＮＰＹ−ｉｒのパターンを決定する
鮮明な細胞内の点状の染色（図４）を、プロＮＰＹおよびＮＰＹの免疫細胞化学検出によりＨＵＶＥＣで見ることができた。これらのクラスターになった免疫反応性の点は、その細胞のいくつかの細胞内区画中に濃縮されたペプチドを表していると考えられた。図４に示されるように、Ｌｅｕ７ＰｒｏのＨＵＶＥＣとＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型のＨＵＶＥＣとのあいだで、染色パターンに顕著な差があり、前者はいくらかのプロＮＰＹ−ｉｒに加えて顕著なＮＰＹ−ｉｒを有していた（図４Ｂ）。対照的に、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有するＨＵＶＥＣは、いかなるＮＰＹまたはＣ−ｐｏｎ染色も含んでいなかったが、プロＮＰＹ−ｉｒを有する充分な小胞様構造を示した（図４Ａ）。
【００３９】
議論
最近の研究は、プレプロＮＰＹのＬｅｕ７Ｐｒｏ多型を成人および子供における動脈硬化症の危険因子および発症と関連付けてきた２１〜２３。この多型は、変異がシグナルペプチド部分に位置しているので、合成されたプレプロＮＰＹペプチドの細胞内プロセシングに影響するようであり、該シグナルペプチド部分は新たに形成されたペプチドをＥＲへ導き、そこでペプチドは切断され、プロＮＰＹのつぎのさらなるプロセシングが成熟した分泌性ＮＰＹの形成に導く。このプロホルモンの変化したプロセシングの結果として、ＮＰＹ放出の蓄積または動力学がこの多型を有する被験者では変更され得る。この仮説は本検討で試験され、そこでは、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ多型を有する健康な被験者とその対応したＬｅｕ７Ｌｅｕコントロールにおいて、激しい自転車エルゴメーター運動によりＮＰＹ分泌が刺激された。交感神経刺激の変化をもたらす他の応答も測定した。加えて、ＮＰＹを含有しかつプロセシングすることが知られているヒト内皮細胞を分離し、遺伝子型を決定し、そしてＰｒｏ７置換を有しない細胞と比較してＰｒｏ７置換を有する細胞のプロＮＰＹおよびＮＰＹ含量において起こり得る差を調べるために、免疫細胞化学により検討した。
【００４０】
運動中のＮＰＹ排出の顕著な増加が、コントロールに比べてＬｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者で検出された。これらの被験者はまた、検討期間中、より高い心拍数を有していたが、収縮期または弛緩期の血圧には変化がなかった。さらに、類似の運動誘発のカテコールアミン排出およびより低いインスリン濃度にかかわらず、多型を有する被験者はコントロールに比べて明らかにより低いＦＦＡ放出を有していた。グループ間の類似した酪酸レベルは、同一の個人運動強度を示した。
【００４１】
血漿中では、ＮＰＹはおもに完全な３６ａａペプチドとして循環しているが、内皮に見出されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ酵素の生成物であるＹ２−受容体リガンドＮＰＹ３〜３６としても循環している９、２９。休息中および肉体的運動中に循環している血液中に見出されるＮＰＹは、おもに脈管周囲の交感神経束に由来する１６、２０、３０。血漿ＮＰＹレベルのわずかな量は内皮から生じる９。ＮＰＹおよびＮＥは共に放出されるが、ＮＰＹ放出は強度の運動においてのみ刺激され、一方ＮＥは健康な被験者において軽度の運動でも容易に放出される１９、３１。したがって、この検討では、８０％ＶＯ２ｍａｘレベルの運動を交感神経系に対する刺激剤として使用した。
【００４２】
結果は、２つの遺伝子型グループにおいて、運動誘発ＮＰＹ放出の類似した時期を示しているが、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者では有意に高いＮＰＹ濃度を示し、その最大値がコントロールに比べて最も大きな差を示している。ベースのＮＰＹ濃度には差はなかったが、Ｐｒｏ７アレルを有する被験者においてベースから最大のＮＰＹ濃度までには４０％以上高い上昇があった。このことは、より多くのＮＰＹが交感神経によって産生され、ＮＰＹは交感神経刺激によってより容易に放出されることを示唆しているか、またはＮＰＹの排出が本多型を有する被験者では減少していることを示唆している。シグナルペプチドの既知機能および本検討で検出された類似のＮＰＹ排出図に基づき、最初の２つの機構がより合理的に思われる。Ｌｅｕ７Ｐｒｏの被験者において上昇し、刺激されたＮＰＹ濃度は、今まで検討されてこなかった組織レベルにおいても検出されるかもしれない。
【００４３】
カテコールアミン濃度はＰｒｏ７アレルを有する被験者と有しない被験者の間で以前比較されたことはない。本検討では、ベースの、または運動誘発のＮＥおよびＥ濃度には、遺伝子型のあいだで差を示さなかった。血漿中の平均ＮＥ／ＮＰＹ比は、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型グループではＬｅｕ７Ｌｅｕグループに比べて１．５倍小さく、このことは交感神経や他の細胞での蓄積小胞でもＮＥのＮＰＹに対する異なった比をもたらすかもしれない。
【００４４】
ＮＰＹ多型を有する被験者は、本検討では、より高い心拍数を有し、平均心拍数における差は、検討期間中および運動前３０分間の休息期間中においても、継続的に５〜１０心拍／分であった。このことは、ＮＰＹ遺伝子型が健康な非喫煙者において心拍数を調節していることを示唆している。カテコールアミンレベルは検討グループのあいだでは差がなかったので、より高い心拍数はその作用では説明されない。ＮＰＹは、濃いＮＰＹ−ｉｒが結節性組織および心筋繊維に密に接触して検出される３２、心臓での交感神経支配において見出されているが、変力性の、または変時性の効果を有することは知られていない３３。しかしながら、ＮＰＹは、より高いＮＰＹ放出を有する被験者においてより高い心拍数に至らしめ得る、心臓のコリン作動性神経からのアセチルコリン放出を阻止することにより、副交感神経遮断の心臓応答を促進するかもしれない３４、３５。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有するタイプＩＩの糖尿病患者において見出される上昇した交感神経迷走神経比は２３、また、この遺伝子型がＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型に比べてより高い全般的な心拍数を有しているかもしれないとの結論を支持している。
【００４５】
血漿中の上昇したＮＰＹ濃度は高血圧で報告されている３６〜３８。もっとも、このことはこの病気に対する病因としては考えられておらず、むしろこの病気に関連する交感神経の活性化をもたらしている。９６６人の中年男性での以前の検討では、Ｐｒｏ７置換を有する被験者においてはわずかにより高い収縮期血圧（３ｍｍＨｇ）および弛緩期血圧（２．１ｍｍＨｇ）を示したが、高血圧被験者と正常血圧の被験者のグループでは遺伝子型頻度に差はなかった（カルボネン（Ｋａｒｖｏｎｅｎ）ら、未発表の知見）。本検討では、おそらく比較できる差を検出するには検討被験者の人数が少なすぎたために、遺伝子型のあいだで、弛緩期血圧または収縮期血圧に差は検出されなかった。
【００４６】
カテコールアミンレベルが類似しているにもかかわらず、２つの遺伝子型グループは著しく異なった運動誘発ＦＦＡ濃度を有しており、Ｌｅｕ７Ｐｒｏグループでは明らかにより低い運動後の値を有していた。カテコールアミン類は、急速に脂質分解を促進し、そしてホルモン感受性リパーゼによる脂肪組織のトリアシルグリセロール動態化の程度を増すことにより、血漿ＦＦＡ濃度を上昇させる。運動中の脂質分解の増加は、おもにアドレナリン作動性ベータ受容体の活性化とその後の細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇によって実現されている３９（細胞内ｃＡＭＰはホルモン感受性リパーゼの作用のおもなレギュレーターであることが知られている）。その結果、ヒトの脂肪細胞における細胞内ｃＡＭＰの濃度を減少させる、ＮＰＹを含むホルモンおよび薬物は、脂肪分解を阻害することができる４、５。ヒト脂肪細胞におけるＮＰＹによる脂肪分解阻害は用量依存的であることが示されており５、そのため、運動中のＬｅｕ７Ｐｒｏ被験者におけるより高いＮＰＹ放出は、遺伝子型のあいだでのＦＦＡ濃度の差を説明しているかもしれない。運動中のインスリン濃度の減少は、運動中のＦＦＡ動態化を容易にすることが示されている４０〜４２。したがって、グループ間で観察された血漿インスリン濃度の差は、インスリンレベルがＬｅｕ７Ｐｒｏグループではより低かったため、観察されたこのグループにおけるより低いＦＦＡ濃度を説明していない。以前の検討では、Ｌｅｕ７ＰｒｏとＬｅｕ７Ｌｅｕのグループで、類似した食後のインスリン濃度（シュワッブ（Ｓｃｈｗａｂ）ら、未発表の知見）または絶食時インスリン濃度を示していた２１、２３。また、以前の検討では、遺伝子型のあいだで、食後のＦＦＡレベルまたはリポタンパク質リパーゼもしくは肝リパーゼ活性に差は示されていなかった（シュワッブら、未発表の知見）。
【００４７】
ＦＦＡｓは、脂質転移阻害タンパク質（ＬＴＩＰ）を阻害することにより、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＰＴ）の活性を調節する４３。したがって、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型におけるより著しい運動誘発ＦＦＡ放出は、増加したＣＥＰＴ活性をもたらすかもしれず、それは最近の報告によれば、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）である４４。ＬＴＩＰを活性化することが知られている血漿中ＦＦＡレベルは、０．８〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌである４３。これらのレベルは、少なくとも運動時に両遺伝子型により一時的に達せられるが、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型ではより長期化し、したがって、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型の被験者にアテローム性動脈硬化症に対するより高いリスクをもたらすことになる。
【００４８】
単離して遺伝子型が決定されたＨＵＶＥＣの免疫組織化学的検討は、遺伝子型のあいだでＮＰＹ関連ｉｒの像が明らかに異なっていることを明白にした。ＮＰＹとＣ−ｐｏｎの二重標識を用いて、本発明者らは、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有するヒト内皮細胞においては、Ｃ−ｐｏｎのないＮＰＹの量が顕著であることを立証することができた。Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する内皮細胞は、Ｃ−ｐｏｎをもつＮＰＹ、すなわちプロＮＰＹのみを含んでいた。このことは、遺伝子型のあいだにプレプロＮＰＹのプロセシングに差があることを示唆している。したがって、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型細胞は成熟ＮＰＹをより効率的に形成するようであり、このことは、多型のシグナルペプチドが機能的であり、新生ペプチドを細胞内プロセシングと分泌経路に容易に導くことを示唆している。以前の検討では、ＮＰＹは平滑筋と内皮細胞増殖を明らかに促進するマイトジェン物質であることを示していた９、４５、４６。Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有するＨＵＶＥＣで観察されたＮＰＹのより高い比率は、より高い局所内皮のＮＰＹ放出およびその下にある内膜平滑筋細胞層の増大した増殖を示唆しているかもしれず、この増大した増殖は、この遺伝子型を有する被験者で観察された、促進された内膜−中膜肥大に対する機構であり得る２３（カルボーネンら、未発表の知見）。
【００４９】
結論として、本発明者らの検討で、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ多型を有する被験者においては、コントロールに比べて、運動誘発の交感神経活性化のあいだ、有意に高いＮＰＹ濃度であることが立証された。これらの被験者はまた、増大した全般的な心拍数とより低い運動誘発ＦＦＡ値を有しており、このことは増大したＮＰＹ排出に対する二次的な変化であるかもしれない。単離したＨＵＶＥＣを用いる検討は、ＮＰＹのより効率的な産生をもたらすＮＰＹシグナルペプチドにおけるＰｒｏ７置換の機能的結果を強化する。以前の検討では、この多型を、血中の総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリド類のレベル増加とアテローム性動脈硬化症の発症増大に関連づけていた２１〜２３。これらはすべて、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者の血中および／または組織中で増大したＮＰＹ含有量の最終的結果であるかもしれない。
【００５０】
本発明の方法は種々の実施態様で組み込まれ得るものであり、本明細書ではその一部のみが開示されているものと理解されるであろう。他の実施態様が存在し、それが本発明の精神から逸脱しないことは、当業者にとって明らかであろう。したがって、記載されている実施態様は例示的であり、限定されたものとして解釈されるべきではない。
【００５１】
スキーム１
プレプロＮＰＹｍＲＮＡの推定二次構造。このスキームは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｋ０１９１１に公表された全プレプロＮＰＹｍＲＮＡ配列の５′末端（１〜１３８塩基）の推定構造を示す。その二次構造は、ウィスコンシン大学の遺伝学コンピューターグループのＭＦＯＬＤプログラムを用いることによって推定された。
【００５２】
【外１】
2004506700.tif 000002
【００５３】
スキーム２
プレプロＮＰＹｍＲＮＡの推定二次構造。このスキームは、ジェンバンク登録番号Ｋ０１９１１に公表された全プレプロＮＰＹｍＲＮＡ配列の５′末端（１〜１３８塩基）の推定構造を示す。その二次構造は、ウィスコンシン大学の遺伝学コンピューターグループのＭＦＯＬＤプログラムを用いることによって推定された。ＴからＣへの変異塩基は塩基番号１０６である。
【００５４】
【外２】
2004506700.tif 000003
【００５５】
【表１】
2004506700.tif 000004
【００５６】
【表２】
2004506700.tif 000005
【００５７】
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１３． Ｅｋｂｌａｄ Ｅ， Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ Ｌ， Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ Ｃ， Ｕｄｄｍａｎ Ｒ， Ｈａｋａｎｓｏｎ Ｒ， Ｓｕｎｄｌｅｒ Ｆ． Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｃｏ−ｅｘｉｓｔｓ ａｎｄ ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｒｖｅ ｆｉｂｅｒｓ． Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ １９８４； ８：２２５−２３５．
１４． Ｆｒｉｅｄ Ｇ， Ｔｅｒｅｎｉｕｓ Ｌ， Ｂｒｏｄｉｎ Ｅ， Ｅｆｅｎｄｉｃ Ｓ， Ｄｏｃｋｒａｙ Ｇ， Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ， ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ ａｎｄ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｃｏｅｘｉｓｔ ｉｎ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ １９８６； ２４３：４９５−５０８．
１５． Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ＪＭ， Ｈｅｍｓｅｎ Ａ， Ｆｒｉｅｄ Ｇ， Ｔｈｅｏｄｏｒｓｓｏｎ−Ｎｏｒｈｅｉｍ Ｅ， Ｌａｇｅｒｃｒａｎｔｚ Ｈ． Ｃｏ−ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ （ＮＰＹ）−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔｓ． Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ １９８６； １２６：４７１−４７３．
１６． Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ＪＭ， Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ Ａ， Ｈｅｍｓｅｎ Ａ， Ｔｈｅｏｄｏｒｓｓｏｎ−Ｎｏｒｈｅｉｍ Ｅ， Ｓｖｅｄｅｎｈａｇ Ｊ， Ｅｋｂｌｏｍ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏ−ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９８５； １３３：３０−３６．
１７． Ｄａｈｌｏｆ Ｃ， Ｄａｈｌｏｆ Ｐ， Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ＪＭ， Ｓｔｒｏｍｂｏｍ Ｕ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ａｓｔｈｍａｔｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｓｔ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｓｅｖｅｒｅ ａｓｔｈｍａ． Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８８； １：３−６．
１８． Ｍｉｌｌｅｒ ＭＡ， Ｓａｇｎｅｌｌａ ＧＡ， Ｍａｒｋａｎｄｕ ＮＤ， ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ＧＡ． Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｌａｓｍａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ−Ｙ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １９９０； １９２：４７−５３．
１９． Ｍｏｒｒｉｓ ＭＪ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＡＥ， Ｋａｐｏｏｒ Ｖ， Ｃａｉｎ ＭＤ， Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ， Ｗｅｓｔ ＭＪ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｎ． Ｊ Ａｕｔｏｎ Ｎｅｒｖ Ｓｙｓｔ １９８６； １７：１４３−１４９．
２０． Ｐｅｒｎｏｗ Ｊ， Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ＪＭ， Ｋａｉｊｓｅｒ Ｌ， Ｈｊｅｍｄａｈｌ Ｐ， Ｔｈｅｏｄｏｒｓｓｏｎ−Ｎｏｒｈｅｉｍ Ｅ， Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍａ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ−ｌｉｋｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｎ． Ｃｌｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９８６； ６：５６１−５７８．
２１． Ｋａｒｖｏｎｅｎ ＭＫ， Ｐｅｓｏｎｅｎ Ｕ， Ｋｏｕｌｕ Ｍ， Ｎｉｓｋａｎｅｎ Ｌ， Ｌａａｋｓｏ Ｍ， Ｒｉｓｓａｎｅｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｅｕｃｉｎｅ（７）−ｔｏ−ｐｒｏｌｉｎｅ（７） ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｒｕｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ＬＤＬ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９８； ４：１４３４−１４３７．
２２． Ｋａｒｖｏｎｅｎ ＭＫ， Ｋｏｕｌｕ Ｍ， Ｐｅｓｏｎｅｎ Ｕ， Ｕｕｓｉｔｕｐａ ＭＩ， Ｔａｍｍｉ Ａ， Ｖｉｉｋａｒｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｌｅｕｃｉｎｅ ７ ｔｏ ｐｒｏｌｉｎｅ ７ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐｒｏｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ ａｇｅｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２０００； ８５：１４５５−１４６０．
２３． Ｎｉｓｋａｎｅｎ Ｌ， Ｋａｒｖｏｎｅｎ ＭＫ， Ｖａｌｖｅ Ｒ， Ｋｏｕｌｕ Ｍ， Ｐｅｓｏｎｅｎ Ｕ， Ｍｅｒｃｕｒｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｌｅｕｃｉｎｅ ７ ｔｏ ｐｒｏｌｉｎｅ ７ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｇｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃａｒｏｔｉｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ［Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｉｔａｔｉｏｎ］． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２０００； ８５：２２６６−２２６９．
２４． Ｐａｑｕｅｔ Ｌ， Ｍａｓｓｉｅ Ｂ， Ｍａｉｎｓ ＲＥ． Ｐｒｏｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｄｅｎｓｅ−ｃｏｒｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ： ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９６； １６：９６４−９７３．
２５． Ｒｙａｎ Ｐ， Ｅｄｗａｒｄｓ ＣＯ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５； ２７０：２７８７６−２７８７９．
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３７． Ｓｏｌｔ ＶＢ， Ｂｒｏｗｎ ＭＲ， Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｂ， Ｋｏｌｔｅｒｍａｎ ＯＧ， Ｚｉｅｇｌｅｒ ＭＧ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ， ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ， ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９０； ３：８２３−８２８．
３８． Ｌｅｔｔｇｅｎ Ｂ， Ｗａｇｎｅｒ Ｓ， Ｈａｎｚｅ Ｊ， Ｌａｎｇ ＲＥ， Ｒａｓｃｈｅｒ Ｗ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｉｎ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． Ｊ Ｈｕｍ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９４； ８：３４５−３４９．
３９． Ａｒｎｅｒ Ｐ， Ｋｒｉｅｇｈｏｌｍ Ｅ， Ｅｎｇｆｅｌｄｔ Ｐ， Ｂｏｌｉｎｄｅｒ Ｊ． Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｔ ｒｅｓｔ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｅｒｃｉｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９０； ８５： ８９３−８９８．
４０． Ｈｉｒｓｃｈ ＩＢ， Ｍａｒｋｅｒ ＪＣ， Ｓｍｉｔｈ ＬＪ， Ｓｐｉｎａ ＲＪ， Ｐａｒｖｉｎ ＣＡ， Ｈｏｌｌｏｓｚｙ ＪＯ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｇｌｕｃａｇｏｎ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９１； ２６０：Ｅ６９５−Ｅ７０４
４１． Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＤＨ， Ｌａｃｙ ＤＢ， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＲＥ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＥ， Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ＡＤ． Ｅｘｅｒｃｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆａｌｌ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｆａｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｗｏｒｋ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９８９； ３８：４８４−４９０．
４２． Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ＤＨ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＰＥ， Ｌａｃｙ ＤＢ， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＲＥ， Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ ＡＤ． Ｅｘｅｒｃｉｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆａｌｌ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｄｕｒｉｎｇ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｗｏｒｋ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９８９； ２５６：Ｅ５００−Ｅ５０９
４３． Ｍｏｒｔｏｎ ＲＥ， Ｇｒｅｅｎｅ ＤＪ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｏｌｅａｔｅ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｌａｓｍａ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７； １７：３０４１−３０４８．
４４． Ｓｔｅｉｎ Ｏ， Ｓｔｅｉｎ Ｙ． Ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＨＤＬ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９９； １４４：２８５−３０１．
４５． Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｔ， Ｅｄｖｉｎｓｓｏｎ Ｌ． Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ Ｙ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｃａｎ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００； ７８：２５６−２５９．
４６． Ｚｕｋｏｗｓｋａ−Ｇｒｏｊｅｃ Ｚ， Ｐｒｕｓｚｃｚｙｋ Ｐ， Ｃｏｌｔｏｎ Ｃ， Ｙａｏ Ｊ， Ｓｈｅｎ ＧＨ， Ｍｙｅｒｓ ＡＫ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９３； １４：２６３−２６８．
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡおよびＢは心拍数および血圧を示す。心拍数（Ａ）は、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する被験者（塗りつぶしの三角形）よりもＬｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者（白の三角形）の方が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。グループ間で収縮期血圧（上の曲線）または弛緩期血圧（下の曲線）で差は検出されなかった（Ｂ）。運動時間は３０分間（線影領域）であった。
【図２】Ａ、ＢおよびＣは、ＮＰＹ、ノルエピネフリンおよびエピネフリンの血漿濃度を示す。全般的なおよび２０分（＊）における平均血漿ＮＰＹ濃度（Ａ）は、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する被験者（塗りつぶしの三角形）よりもＬｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者（白の三角形）の方が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。類似の血漿中カテコールアミン濃度（ＢおよびＣ）が、２つの検討グループで検出された。運動時間は３０分間（線影領域）であった。
【図３】Ａ、ＢおよびＣは、血清ＦＦＡ、血漿インスリンおよび血漿酪酸濃度を示す。全体的なおよび４０分（＊）における平均血清ＦＦＡ濃度（Ａ）は、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する被験者（塗りつぶしの三角形）よりもＬｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有する被験者（白の三角形）の方が有意に低かった（ｐ＜０．０５）。異なった全般的なインスリン濃度（Ｂ）が、０分（ｐ＜０．０５）および６０分で有意な差（＊）をもって、遺伝子型間で検出された。血漿中の酪酸濃度（Ｃ）は２つの検討グループで類似していた。運動時間は３０分間（線影領域）であった。
【図４】ＡおよびＢは、ウサギポリクローナル抗ヒトＣ−ｐｏｎ抗体およびヤギポリクローナル抗ヒトＮＰＹ抗体で二重免疫染色した、Ｌｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型（Ａ）およびＬｅｕ７Ｐｒｏ（Ｂ）を有するＨＵＶＥＣの走査共焦点像に基づく印刷図面である。これらの像は透過された細胞の８つの中間切片の合計である。ＮＰＹおよびＣ−ｐｏｎの顕著な重複染色がＬｅｕ７Ｌｅｕ遺伝子型を有する細胞（Ａ）において見られ、プロＮＰＹの圧倒的な存在を示している。Ｃ−ｐｏｎを有していないＮＰＹは、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ遺伝子型を有するＨＵＶＥＣ（Ｂ）における小胞様構造中に豊富であり、これらの細胞はいくらかのプロＮＰＹ染色も有していた。
【図１】
2004506700.tif 000006
【図２】
2004506700.tif 000007
【図３】
2004506700.tif 000008
【図４】
2004506700.tif 000009
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月21日(2002.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体におけるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生を減少させる方法であって、該個体における過剰活性ＮＰＹ系を調節することを目的とする方法に使用するための医薬組成物の製造のための物質の使用。
【請求項２】
前記方法が前記個体の内皮細胞におけるＮＰＹの構成的過剰発現を減少させるために用いられる請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記方法が前記個体の心拍数を減少させるために用いられる請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記方法が前記個体におけるインスリン分泌を高めるために用いられる請求項１記載の使用。
【請求項５】
ＮＰＹの過剰産生が前記個体にアンタゴニストを投与することによって中和される請求項１、２、３または４記載の使用。
【請求項６】
前記アンタゴニストがＮＰＹ遺伝子の発現を減少させることを目的とするものである請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記アンタゴニストがＮＰＹ受容体アンタゴニストである請求項５記載の使用。
【請求項８】
前記アンタゴニストがＮＰＹ抗体である請求項５記載の使用。
【請求項９】
前記抗体が血清中でＮＰＹと反応する抗体である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ＮＰＹのストレス誘発過剰産生が、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型によって引き起こされる請求項５、６、７、８または９記載の使用。
【請求項１１】
ＮＰＹのストレス誘発過剰産生が、ヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなる多型によって引き起こされる請求項１、２、３または４記載の使用であって、前記個体が、該多型を引き起こす変異アレルの発現を減少または予防することを目的とする方法を受ける使用。
【請求項１２】
前記方法が、変異アレルを修復することを目的とする特定の遺伝子治療である請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用からなる請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用からなる請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
リボザイムの使用からなる請求項１２記載の使用。
【請求項１６】
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）のストレス誘発過剰産生のリスクを有すことに対する人の感受性を診断する方法であって、該被験者がヒトプレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における多型を有するか否かを決定することからなる方法であって、該多型が該プレプロＮＰＹのシグナルペプチド部分における７位ロイシンのプロリンへの置換からなり、かつ該多型がＮＰＹのストレス誘発過剰産生のリスクを指示する方法。
【国際調査報告】
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