(57)【要約】（ａ）チオールと、亜硝酸基を有する化学種とを含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備し、（ｂ）溶液に酸を加え、同時に混合（例えば、激しく攪拌）することにより溶液を酸性化し、Ｓ−ニトロシル化化学種を生成し、（ｃ）Ｓ−ニトロシル化化学種を単離する。亜硝酸基を有する化学種は、例えば亜硝酸アルカリ金属等の亜硝酸無機物であってもよく、亜硝酸アルキル（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、亜硝酸イソブチル、亜硝酸ｔ−ブチル）等の亜硝酸有機物であってもよい。チオールは、好ましくは、チオール基を含む多糖類、チオール基を含むリポタンパク質、チオール基を含むアミノ酸又はチオール基を含むタンパク質であり、より好ましくは、例えばチオール化シクロデキストリン等のチオール基を含む多糖類である。Ｓ−ニトロシル化化学種は、好ましくは、酸性化された溶液に不溶であり、溶液内に沈殿物を形成する。Ｓ−ニトロシル化化学種は、例えば、（例えば、遠心分離により）この沈殿物を溶液から取り出し、（例えば、沈殿物を凍結し、凍結した沈殿物を真空に曝すことにより）沈殿物内に残る水溶媒を昇華させることにより、単離することができる。単離されたＳ−ニトロシル化化学種は、熱、光、湿気、酸素から保護することが望ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロシル化化学種の合成方法において、
チオールと、亜硝酸基を有する化学種とを含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備する工程と、
上記溶液に酸を加え、同時に混合することにより該溶液を酸性化し、上記Ｓ−ニトロシル化された化学種を生成する工程と、
上記Ｓ−ニトロシル化化学種を単離する工程とを有するＳ−ニトロシル化された化学種の合成方法。
【請求項２】
上記溶液は、水酸化アルカリ金属を加えることによりアルカリ性化されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項３】
上記溶液は、真空脱気によって脱酸素されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項４】
上記溶液は、不活性ガスによるパージングによって脱酸素されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項５】
上記溶液は、真空脱気された後、不活性ガスによりパージングされて脱酸素されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項６】
上記不活性ガスは、窒素であることを特徴とする請求項５記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項７】
チオール１当量に対して１乃至２当量の亜硝酸基を有する化学種が準備されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項８】
上記亜硝酸基を有する化学種は、亜硝酸無機物であることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項９】
上記亜硝酸無機物は、亜硝酸アルカリ金属であることを特徴とする請求項８記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１０】
上記亜硝酸基を有する化学種は、亜硝酸有機物であることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１１】
上記亜硝酸有機物は、亜硝酸アルキルであることを特徴とする請求項１０記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１２】
上記亜硝酸アルキルは、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、亜硝酸イソブチル及び亜硝酸ｔ−ブチルのうちのいずれかであることを特徴とする請求項１１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１３】
上記酸は、少なくとも１時間以内に少なくとも７０％の理論収率を実現できる量をもって上記溶液に加えられることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１４】
上記酸は、無機酸であることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１５】
上記無機酸は、塩酸、リン酸及び硫酸のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１４記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１６】
上記酸は、有機酸であることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１７】
上記有機酸は、酢酸であることを特徴とする請求項１６記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１８】
上記チオールは、チオール基を含む多糖類、チオール基を含むリポタンパク質、チオール基を含むアミノ酸及びチオール基を含むタンパク質のうちのいずれかであることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項１９】
上記チオール基を含む多糖類は、チオール化されたシクロデキストリンであることを特徴とする請求項１８記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２０】
上記混合は、上記溶液を攪拌することにより実行されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２１】
上記Ｓ−ニトロシル化された化学種は、上記酸性化された溶液に不溶であり、沈殿物を形成することを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２２】
上記Ｓ−ニトロシル化された化学種を単離する工程は、遠心分離により上記溶液から上記沈殿物を取り出す工程を有することを特徴とする請求項２１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２３】
上記Ｓ−ニトロシル化化学種を単離する工程は、上記溶液から上記沈殿物を取り出す工程と、該沈澱物から該沈澱物に残る水溶媒を昇華させる工程とを有することを特徴とする請求項２１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２４】
上記沈澱物から水溶媒を昇華させる工程は、上記沈澱物を凍結させる工程と、該沈澱物を真空に曝す工程とを有することを特徴とする請求項２３記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２５】
上記単離されたＳ−ニトロシル化化学種は、熱、光、湿気及び酸素から保護されることを特徴とする請求項１記載のＳ−ニトロシル化化学種の合成方法。
【請求項２６】
Ｓ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法において、
チオール化されたシクロデキストリンと、亜硝酸アルカリ金属及び亜硝酸アルキルのいずれかから選択される亜硝酸塩を有する化学種とを含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備する工程と、
上記溶液に酸を加え、同時に混合することにより該溶液を酸性化し、上記Ｓ−ニトロシル化されたシクロデキストリン化学種の沈澱物を生成する工程と、
上記溶液から上記沈澱物を取り出す工程とを有するＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法。
【請求項２７】
チオール１当量に対して１乃至２当量の亜硝酸基を有する化学種が準備されることを特徴とする請求項２６記載のＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法。
【請求項２８】
上記沈澱物を上記溶液から取り出した後、該沈澱物に残る水溶媒を昇華させる工程を有することを特徴とする請求項２６記載のＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法。
【請求項２９】
上記沈澱物から水溶媒を昇華させる工程は、上記沈澱物を凍結させる工程と、該沈澱物を真空に曝す工程とを有することを特徴とする請求項２８記載のＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法。
【請求項３０】
上記昇華されたＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種は、熱、光、湿気及び酸素から保護されることを特徴とする請求項２８記載のＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ−ニトロシル化化合物を高収率で合成する合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｓ−ニトロシル化化合物（Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）は、１以上の−Ｓ−ＮＯ基を含む化合物である。−Ｓ−ＮＯ基は、当分野では、亜硝酸スルホニル、チオ亜硝酸エステル、Ｓ−ニトロソチオール、又はチオ亜硝酸とも呼ばれている。
【０００３】
現在、以下のような様々なＳ−ニトロシル化化学種が知られている。
【０００４】
ａ）Ｓ−ニトロシル化デンプン、セルロース、アルギン酸、Ｋ−カラゲナン、フコイジン、シクロデキストリン（例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン）等のある種のＳ−ニトロシル多糖類。
【０００５】
ｂ）Ｓ機能基（Ｓ−ｍｏｉｅｔｙ）が酸化窒素機能基によって置換されたある種のリポタンパク質。このリポタンパク質の具体例としては、キロミクロン、キロミクロンレムナント粒子、超低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、中密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、リポタンパク質（ａ）等がある。
【０００６】
ｃ）神経ペプチド、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、ヘモグロビン、ミオグロビン、カテプシン等のある種のＳ−ニトロシル化ポリペプチド及びタンパク質。
【０００７】
ｄ）Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソ−グルタチオン、Ｓ−ニトロソ−システイン、 Ｓ−ニトロソ−γ−メチル−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−ニトロソ−γ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−δ−チオ−Ｌ−ロイシン、Ｓ−ニトロソ−カプトリル、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソ−Ｄ−システイニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソ−Ｄ，Ｌ−システイニル−Ｌ−プロリン、１−［５−グアニジノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル］−Ｌ−プロリン、１−［５−アミノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル］−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、１−［５−グアニジノ−２−（Ｓ−ニトロソ）メルカプトメチル−ペンタノイル］−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、１−［２−アミノエチル−３（Ｓ−ニトロソ）−メルカプトメチル−ペンタノイル］−Ｌ−プロリン、Ｓ−ニトロソ−Ｌシステイニル−Ｌ−プロリン等を含むある種のＳ−ニトロソアミノ酸及びこれらの誘導体（これらのうちの多くは、ＡＣＥ阻害剤である）。
【０００８】
ｅ）Ｓ−ニトロソ−ペニシラミン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、及びｘを２〜２０とし、Ｙを−Ｈ、−ＳＨ、フルオロ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、シアン基、カルボキシアミド基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、アラルコキシ基（ａｒａｌｋｏｘｙ）、Ｃ２−Ｃ６アルキルスルフィニル基、アリルチオ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ２−Ｃ１５ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基、カルバモイル基、Ｃ１−Ｃ６Ｎ−アルキルカルバモイル基、Ｃ２−Ｃ１５Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、水素基、ニトロ基、アリル基のいずれかとし、アリル基は、ベンジル基、ナフチル基、アントラセニル基を含むものとして、Ｙ（ＣＨ２）ｘＳＮＯで表されるこの他のある種のＳ−ニトロシル化化合物。
【０００９】
これらのＳ−ニトロソチオール化学種は、血小板凝集阻害作用及び／又は血栓溶解作用があるとともに、骨格筋及び血管平滑筋（血管拡張）、気道平滑筋、胃腸平滑筋、海綿体平滑筋、膀胱平滑筋、子宮平滑筋等を含む平滑筋を弛緩させる作用があることが知られている。更なる情報については、米国特許第５，７７０，６４５号、第５，５８３，１０１号、第５，８６３，８９０号、第５，６１２，３１４号、第５，６４８，３９３号、第６，０５７，３６７号、第５，３８０，７５８号、第５，５９３，８７６号、第５，５７４，０６８号及び第５，３８５，９３７号に開示されており、これらの文献の開示内容は、参照により本願に援用されるものとする。
【００１０】
上述した、参照により本願に援用される米国特許第５，７７０，６４５号では、例えば、懸垂型（ｐｅｎｄａｎｔ）チオール基が付いた多糖類等、１以上のフリーの求核基を有する化合物がフリーのチオール基をニトロシル化するのに適する条件下において、ニトロシル化剤と反応することが開示されている。適切なニトロシル化剤としては、酸性亜硝酸塩、塩化ニトロシル、Ｓ−ニトロソ基を含む化合物（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＳＮＯＧ）、Ｎ−アセチル−Ｓ−ニトロソペニシミニル−Ｓ−ニトロソペニシミン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソチオグリセロール、Ｓ−ニトロソジチオトレイトール、Ｓ−ニトロソメルカプトエタノール）、亜硝酸有機物（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸イソブチル、亜硝酸アミル等）、、ニトロソニウム塩（例えば、硫酸水素ニトロシル）、オサジアゾール（例えば、４−フェニル−３−フロキサンカルボニトリル）等がある。詳しい情報は、米国特許第５，７７０，６４５号に開示されている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るＳ−ニトロシル化化学種の合成方法は、（ａ）チオールと、亜硝酸基を有する化学種とを含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備する工程と、（ｂ）溶液に酸を加え、同時に混合（例えば、激しく攪拌）することにより溶液を酸性化し、Ｓ−ニトロシル化化学種を生成する工程と、（ｃ）Ｓ−ニトロシル化化学種を単離する工程とを有する。
【００１２】
この溶液は、例えば、水酸化アルカリ金属を加えることによりアルカリ化される。
【００１３】
また、この溶液は、真空脱気又は不活性ガスによるパージングによって、若しくは真空脱気した後、不活性ガスによりパージングして脱酸素してもよい。
【００１４】
亜硝酸基を有する化学種は、例えば亜硝酸アルカリ金属等の亜硝酸無機物であってもよく、亜硝酸アルキル（例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、亜硝酸イソブチル、亜硝酸ｔ−ブチル）等の亜硝酸有機物であってもよい。
【００１５】
チオールは、好ましくは、チオール基を含む多糖類、チオール基を含むリポタンパク質、チオール基を含むアミノ酸又はチオール基を含むタンパク質であり、より好ましくは、例えばチオール化シクロデキストリン等のチオール基を含む多糖類である。
【００１６】
好ましくは、チオール１当量に対して１乃至２当量の亜硝酸基を有する化学種を準備する。
【００１７】
酸は、例えば、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸であってもよく、酢酸等の有機酸であってもよい。酸は、少なくとも１時間以内に少なくとも７０％の理論収率を実現できる量をもって溶液に加えることが望ましい。
【００１８】
Ｓ−ニトロシル化化学種は、好ましくは、酸性化された溶液に不溶であり、溶液内に沈殿物を形成する。Ｓ−ニトロシル化化学種は、例えば、（例えば、遠心分離により）この沈殿物を溶液から取り出し、（例えば、沈殿物を凍結し、凍結した沈殿物を真空に曝すことにより）沈殿物内に残る水溶媒を昇華させることにより、単離することができる。
【００１９】
単離されたＳ−ニトロシル化化学種は、熱、光、湿気、酸素から保護することが望ましい。
【００２０】
本発明の特に好ましい具体例として、本発明は、Ｓ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法を提供する。このＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法は、（ａ）チオール化されたシクロデキストリンと、亜硝酸アルカリ金属及び亜硝酸アルキルのいずれかから選択される亜硝酸基を有する化学種とを含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備する工程と、（ｂ）溶液に酸を加え、同時に混合することにより溶液を酸性化し、Ｓ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の沈澱物を生成する工程と、（ｃ）溶液から上記沈澱物を取り出す工程とを有する。ここで、好ましくは、チオール１当量に対して１乃至２当量の亜硝酸基を有する化学種を準備する。更に、このＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種の合成方法は、好ましくは、沈澱物を溶液から取り出した後、（例えば、沈殿物を凍結し、凍結した沈殿物を真空に曝すことにより）沈澱物に残る水溶媒を昇華させる工程を有する。昇華されたＳ−ニトロシル化シクロデキストリン化学種は、熱、光、湿気、酸素から保護することが望ましい。
【００２１】
本発明により、尚早な分解及びＮＯ放出が生じるような環境条件への曝露を最小化した条件でＳ−ニトロシル化化学種を合成することができる。
【００２２】
更に、本発明により、チオール化学種を高収率でニトロシル化することができる。
【００２３】
更に、本発明により、Ｓ−ニトロシル化化学種を微細な粉末の形状で合成することができ、したがって生成物を粉砕又は他の方法で粉末状にする必要をなくすることができる。
【００２４】
本発明のこれらの及びこの他の具体例及び利点は、以下の発明の実施の形態及び上述の請求の範囲により、当業者にとって明らかとなる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の一具体例においては、チオール及び亜硝酸基を有する化学種を含む脱酸素されたアルカリ性水溶液を準備し、この溶液に酸を加え、同時に十分に混合して、この溶液を酸性化することにより、Ｓ−ニトロシル化化学種を合成する。
【００２６】
基本的には、塩基性溶液に対する可溶性を有し、酸性条件下においてフリーのチオール基をニトロシル化できるような亜硝酸基を有する分子種を用いることができる。亜硝酸基を有する化学種としては、例えば、亜硝酸有機物及び亜硝酸無機物がある。好ましい亜硝酸有機物としては、亜硝酸アルキルがあり、より好ましい亜硝酸有機物としては、例えば、亜硝酸エチル、亜硝酸アミル、亜硝酸イソブチル、亜硝酸ｔ−ブチル等のＣ１−Ｃ８直鎖亜硝酸アルキル又は分岐亜硝酸アルキルがある。また、好ましい亜硝酸無機物としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸リチウム、亜硝酸カリウムがある。
【００２７】
本発明によれば、好ましくない副反応を最小限に抑制すれば、塩基性溶液に可溶性を有する広範囲に亘るチオール化学種をＳ−ニトロシル化することができる。チオール化学種のＳ−ニトロシル化生成物のいくつかについては、従来の技術の章で説明した通りである。好ましいチオール化学種としては、チオール基を含む多糖類、チオール基を含むリポタンパク質、チオール基を含むアミノ酸、チオール基を含むタンパク質等がある。
【００２８】
本発明のいくつかの具体例においては、チオール基を有する化学種を準備し、後にＳ−ニトロシル化を行うことが望ましい。例えば、チオール化された化学種は、アルコールやアミン等、１以上の懸垂型の求核基を有する化学種から生成できる。これらの懸垂型の求核基は、周知の手法により懸垂型のチオール基に変換できる。この手法については、例えば、ガデル（Ｇａｄｄｅｌｌ）、デファイ（Ｄｅｆａｙｅ）及びアンジュー（Ａｎｇｅｗ）著、「Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３０： ７８ （１９９１）」及びロジャス（Ｒｏｊａｓ）他著「Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１７： ３３６ （１９９５）」に開示されており、この文献の内容は参照により本願に援用されるものとする。
【００２９】
特定の具体例として、多糖類は、通常、チオール基ではなく、懸垂型のアルコール基を有する。例えば、本発明を実現するために特に好ましい多糖類としては、以下に示すようなシクロデキストリンがある。
【００３０】
【化１】
2004506785.tif 000002
【００３１】
本発明においては、Ｓ−ニトロシル化の前に、まず、例えば上述した手法を用いて、多糖類をポリチオール化された多糖類に変換する。これらの処理においては、第１級アルコール基は、第２級アルコール基に優先してチオール化される。いくつかの好ましい具体例においては、過剰量のチオール化試薬を用いて、ペルチオール化多糖類を生成する。多糖類は、全ての第１級アルコール基がチオール基に置換されると「ペルチオール化」される。
【００３２】
上に示す化学式からわかるように、α−シクロデキストリンは、６個の第１級アルコール基を有し、β−シクロデキストリンは、７個の第１級アルコール基を有し、γ−シクロデキストリンは、８個の第１級アルコール基を有する。したがって、ペルチオール化により、α−シクロデキストリンは、６個のチオール基を有することとなり、β−シクロデキストリンは、７個のチオール基を有することとなり、γ−シクロデキストリンは、８個のチオール基を有することとなる。
【００３３】
β−シクロデキストリンをペル−（６−デオキシ−６−チオ）−β−シクロデキストリンに変換するための更に詳しい特定の処理については、米国特許第５，７７０，６４５号（特に、実施例１及び実施例２参照）に開示されている。
【００３４】
米国特許第５，７７０，６４５号では、更に、アルコールにフリーのチオール基又は保護基が付いたチオール基を含む機能基（ｍｏｉｅｔｙ）を付加する試薬によってポリヒドロキシル化された化学種、好ましくはポリヒドロキシル化された化学種の第１級アルコール基を反応させることにより、ポリチオール化された化学種を準備する手法が開示されている。一具体例においては、多糖類をビスイソシアン酸アルキルジスルフィドに反応させ、以下の構造式（Ｉ）に示すように、還元によりアルコールを官能化する。
【００３５】
【化２】
2004506785.tif 000003
【００３６】
この反応の条件は、１９８５年、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）発行、フカモタ（Ｆｕｋａｍｏｔａ）、ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）、トナミ（Ｔｏｎａｍｉ）編「セルロース及びその誘導体（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」第４０章に開示されており、この文献は参照により本願に援用されるものとする。このような反応で得られるポリチオール化された多糖類の一具体例を構造式（ＩＩ）に示す。
【００３７】
【化３】
2004506785.tif 000004
【００３８】
チオール及び亜硝酸基を有する化学種が準備されると、これらはアルカリ性水溶液中で合成される。
【００３９】
好ましくは、溶液には、チオール１当量に対して１乃至２当量の亜硝酸塩が加えられる。この範囲の亜硝酸塩を用いる場合、チオール基を有する化学種は、必ずしも完全にニトロシル化されない。例えば、１分子につき７個のチオール基を含むペルチオール化β−シクロデキストリンの場合、この範囲の亜硝酸塩により、シクロデキストリン１分子につき約１個のＳ−ニトロソ基しか生成されない。
【００４０】
通常、溶液は、チオール基が尚早且つ過度にニトロシル化されることを防止し、及び非理想的な条件下で材料が沈殿してしまうことを防止するために、十分なアルカリ性度を有する必要がある。実質的には、いかなる材料を用いて溶液をアルカリ化してもよい。溶液をアルカリ化させるために好ましい材料は水酸化アルカリ金属であり、より好ましい材料は、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムである。
【００４１】
溶液は、チオール基が過度にニトロシル化することを防止するためにアルカリ性である必要があるが、チオール化学種の溶解を促進するために必要であれば、この点を超える塩基を溶液に付加してもよい。これらの目的を達成するために適切なｐＨは、例えば選択されたチオール化学種及び亜硝酸塩を有する化学種に応じて異なるが、当業者は、この適切なｐＨを容易に判断することができる。
【００４２】
溶液内でチオールが亜硝酸基を有する化学種に結合するのに十分なアルカリ性度の溶液を実現できる限り、いかなる順序でチオール、亜硝酸基を有する化学種、及び塩基を溶液に加えてもよい。例えば、（１）まず、チオールを塩基性溶液内で溶解させ、次に亜硝酸基を有する化学種を加えてもよく、（２）まず、亜硝酸基を有する化学種を塩基性溶液内で溶解させ、続いてチオール化学種を加えてもよく、（３）亜硝酸基を有する化学種及びチオールを同時に塩基性溶液内で溶解させてもよい。
【００４３】
特定の具体例においては、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ約１３）を初期溶液として用い、この溶液にチオール及び亜硝酸基を有する化学種を順次加える。
【００４４】
ニトロシル化チオールの分解（すなわち、ＮＯを放出してチオールに戻ってしまうこと）は、ニトロシル化チオールを酸素、湿気、熱及び／又は光に曝すことにより加速される。したがって、本発明では、ニトロシル化チオールの生成及び保存の間、ニトロシル化チオールを可能な限りこれらの条件に曝さないことが望ましい。
【００４５】
このため、本発明においては、Ｓ−ニトロシル化化学種を生成する前に（すなわち、チオール化学種及び亜硝酸基を有する化学種を含むアルカリ性溶液を酸性化する前に）、溶液を脱酸素する。特定の具体例においては、酸性化の前に、（１）まず、塩基性溶液を脱酸素し、続いてチオール化学種及び亜硝酸基を有する化学種を同時に溶液に溶解させてもよく、（２）まず、チオール化学種及び亜硝酸基を有する化学種を塩基性溶液に溶解させ、続いて溶液を脱酸素してもよく、（３）まず、チオール化学種を塩基性溶液に溶解させ、続いて溶液を脱酸素し、亜硝酸基を有する化学種を溶液に溶解させてもよく、（４）まず、亜硝酸基を有する化学種を塩基性溶液に融解させ、続いて溶液を脱酸素し、チオール化学種を溶液に溶解させてもよい。
【００４６】
溶液は、周知のいかなる手法により脱酸素してもよい。例えば、溶液を密閉容器に収容した後、（１）真空脱気を行ってもよく、（２）容器内の空間（ｏｖｅｒｈｅａｄ ｓｐａｃｅ）に不活性ガスをパージングしてもよく、（３）溶液を不活性ガスにより攪拌（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）してもよく、（４）沸点近傍まで加熱してもよい。好適な具体例においては、溶液は、まず、真空脱気により脱酸素される。次に、容器内の空間に不活性ガスをパージングすることにより、真空を解除する。この処理に用いて好適な不活性ガスとしては、例えば窒素及びアルゴンガスがある。
【００４７】
脱酸素された、チオール化学種及び亜硝酸基を有する化学種の水溶液が準備されると、次に、この溶液は、好ましくは激しく混合されるとともに酸性化される。酸は、２４時間、好ましくは１時間、より好ましくは１０分以内に少なくとも７０％の理論収率を実現できる量をもって溶液に加えられる。このような結果を得るために適切なｐＨは、例えば選択されたチオール化学種及び亜硝酸基を有する化学種に応じて異なるが、当業者は、この適切なｐＨを容易に判断することができる。
【００４８】
ここで、好ましくない副反応を最小限に抑制できる限りにおいて、上述の目的のために実質的にいかなる酸を用いてもよい。本発明の実施に好適な酸としては、例えば塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸と、例えば酢酸等の有機酸の両方が含まれる。
【００４９】
ここで、ニトロシル化反応が生じている間の溶液内の濃度勾配を最小化するために、激しく混合する必要がある。混合は、例えば攪拌棒又はへら棒等の可動部材（ｍｏｖｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）により溶液を攪拌することにより行ってもよく、バッフル等の静止部材（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｍｅｍｂｅｒ）に溶液を流すことにより行ってもよい。
【００５０】
溶液を混合することにより、反応速度が非常に速くなり、これに伴う様々な利益を得ることができる。
【００５１】
例えば、複数の反応部位が存在する場合、生成物の均一性が高まる。特定の具体例としては、ペルチオール化βシクロデキストリンは、７個のチオール反応部位を有している。しかしながら、化学量論に従い、これらの反応部位のうち、平均約１個の反応部位しかニトロシル化されない。ここで、理論的な裏付けに頼ることなく、この反応は急速に進むため、酸が加えられた溶液において、僅かな時間でも濃度勾配が存在すれば、酸性度が高い環境下（化学反応速度が速い環境下）のβシクロデキストリン分子は、酸性度が低い環境下のβシクロデキストリン分子より多くのニトロシル化反応部位を有することになると考えられる。
【００５２】
他の具体例として、生成されるＳニトロシル化された化学種が酸性化された溶液に対して不溶であり、生成の際に溶液内で沈殿する場合、酸を加える際に激しい混合を行うことにより、このような混合を行わない場合に比べて、通常、より微細な沈澱物を得ることができる。
【００５３】
本発明に基づく上述の処理は、０℃〜５０℃の範囲の温度下で行うことが好ましく、特に室温で行うことがより好ましい。
【００５４】
Ｓニトロシル化された化学種が生成されると、この化学種は、好ましくは単離され、乾燥されて粉末状にされる。本発明の好適な具体例においては、Ｓニトロシル化された化学種は、生成の際に溶液内で沈殿する。
【００５５】
特に好ましい具体例においては、（例えば、遠心分離により）、まず、湿った状態で水溶液から単離され、脱イオン水により洗浄され、湿った試料内の残りの溶媒を（例えば、凍結乾燥により）昇華させて除去する。この昇華処理により、（例えば、湿気及び酸素が取り除かれるため）試料が分解から保護され、非常に微細な粉末を生成することができる。例えば、沈澱物がＳニトロシル化シクロデキストリンであり、試料を空気乾燥した場合、実質的な集塊（ｃｌｕｍｐ）ができる。一方、沈澱物を昇華により乾燥させた場合、微細な粉末を生成することができ、最終生成物が分解しにくい条件が維持される。
【００５６】
好ましくは、まず、（例えば、試料を−７０℃に冷却し、又は液体窒素に含浸させることにより）湿った沈殿物を凍結して昇華させる。次に、凍結された沈殿物を容器に収容し、真空脱気することにより、冷凍された沈殿物から水溶液が昇華する。
【００５７】
乾燥された生成物を生成した後は、生成物が尚早に分解してしまうことを回避するための処理を行うことが好ましい。例えば、生成物は、冷蔵庫や冷凍庫等の低温で暗い場所に保管することが望ましい。更に生成物を保護するために、試料の周囲の環境は、不活性で無水の環境であることが好ましく、特に真空環境又は乾燥された不活性ガス環境であることがより好ましい。
【００５８】
【実施例】
まず、４ｇのβシクロデキストリンチオールを準備する（βシクロデキストリンは、例えば、参照により本願に援用される米国特許第５，７７０，６４５号の実施例１及び実施例２における処理を用いて準備できる）。次に、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ約１３．０）３００ｍｌをβシクロデキストリンチオールに加える。そして、シクロデキストリンチオールを溶解させるために混合した後、０．４５ミクロンのフィルタを用いて溶液を濾過する。続いて、溶液に１．６ｇの亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）を加える。そして、亜硝酸ナトリウムを溶解させるために混合した後、溶液を２５ｍｌのアリコートに分ける。各アリコートに対して、以下のような処理を行う。
１．溶液を真空脱気した後、脱気された気体を窒素に置換し、又は溶液の環境を真空状態に維持する。
２．窒素又は真空環境下において、０．１Ｎの塩酸３００ｍｌを溶液に速やかに注入し、激しく攪拌する。
３．この混合物を５分間反応させ、これにより桃色の沈殿物が生成される。
４．４０００ｒｐｍ（約８００×ｇ）で１０分間混合物を遠心分離する。
５．上清を取り除く。
６．沈殿物を脱気脱イオン水に懸濁して洗浄した後、遠心分離を行い、沈殿物を取り出す。
７．上述の洗浄処理を３回繰り返した後、取り出された沈殿物を直ちに液体窒素に５分間含浸させ、凍結させる。
８．凍結した試料が乾燥するまで（通常、数日の期間）、凍結乾燥（真空下での昇華）する。
９．乾燥した試料を−２０℃の窒素内で保存する。
【００５９】
本発明の様々な具体例を示し説明してきたが、上述の説明に基づく具体例の修正及び変形は、添付の範囲内にあり、本発明の思想及び意図された範囲から逸脱するものではない。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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