(57)【要約】本発明は概して、組換えポリヌクレオチド、プラス鎖ＲＮＡウイルス（ｐｓＲＮＡＶ）組換え発現ベクター、およびパッケージングシステムに関する。パッケージングシステムは、組換えポリヌクレオチドを含む組換えＰＯＸウイルスを同時乾癬させることによるヘルパー機能の発現に基く。ｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子をこれらのパッケージングシステムを用いて得る方法を開示する。本発明のレプリン粒子を含む免疫原性組成物および医薬組成物が提供される。免疫反応を生むための、または医薬効果を生じるための方法も提供する。
2004507249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列を含んでいる第一部分、および少なくとも一つのプラス鎖ＲＮＡウイルス（ｐｓＲＮＡＣＶ）構造タンパク質をコードしているが、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質のすべてをコードしているわけではない、第二異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合している配列を含んでいる第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択され、第一異種構造プロモーターがｐｏｘウイルスプロモーターであり、第二部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質がアルファウイルスキャプシッドおよびアルファウイルス糖タンパク質から選択されるアルファウイルス構造タンパク質であり、および第二異種構造プロモーターが該ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する、請求項１記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼであり、ｐｏｘウイルスプロモーターがワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターであり、第二異種構造プロモーターがＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、およびアルファウイルスキャプシッドがベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）キャプシッドであり、およびアルファウイルス糖タンパク質がＶＥＥ糖タンパク質である、請求項２記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
第二部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質がアルファウイルス構造タンパク質、ルベラウイルス構造タンパク質、コロナウイルス構造タンパク質、デングウイルス構造タンパク質、およびＣ型肝炎ウイルス構造タンパク質から選択される、請求項１記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしているが、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質の全てをコードしているわけではない、第一異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合している配列を含んでいる第一部分、および少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているｐｓＲＮＡＶサブゲノムプロモーターを含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンに操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターを含んでいる第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が、アルファウイルスキャプシッドおよびアルファウイルス糖タンパク質から選択されるアルファウイルス構造タンパク質であり、および第一および第二異種構造プロモーターが共に、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択されるポリメラーゼに結合する、請求項５記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
アルファウイルスキャプシッドがＶＥＥキャプシッドであり、およびアルファウイルス糖タンパク質がＶＥＥ糖タンパク質であり、および第一異種構造プロモーターおよび第二異種構造プロモーターが共にＴ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する、請求項６記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項８】
第一部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が、アルファウイルス構造タンパク質、ルベラウイルス構造タンパク質、コロナウイルス構造タンパク質、デングウイルス構造タンパク質、およびＣ型肝炎ウイルス構造タンパク質から選択され、および第二部分のｐｓＲＮＡＶレプリコンが、アルファウイルスレプリコン、ルベラウイルスレプリコン、コロナウイルスレプリコン、デングウイルスレプリコン、およびＣ型肝炎ウイルスレプリコンから選択される、請求項５記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項９】
第一異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列を含んでいる第一部分、および第二異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列をコードしている配列を含んでいる第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項１０】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択され、第一異種構造プロモーターがｐｏｘウイルスプロモーターであり、第二部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、アルファウイルスキャプシッドおよびアルファウイルス糖タンパク質から選択されるアルファウイルス構造タンパク質をコードしている配列を含んでいるアルファウイルスヘルパーＲＮＡ配列であり、および第二異種構造プロモーターが、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択されるポリメラーゼに結合する、請求項９記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１１】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、ｐｏｘウイルスプロモーターがワクシニア合成初期／後期プロモーターであり、アルファウイルスキャプシッドがＶＥＥキャプシッドであり、およびアルファウイルス糖タンパク質がＶＥＥ糖タンパク質であり、および第二異種構造プロモーターがＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する、請求項１０記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、アルファウイルスヘルパーＲＮＡ配列、ルベラウイルスヘルパーＲＮＡ配列、コロナウイルスヘルパーＲＮＡ配列、デングウイルスヘルパーＲＮＡ配列、およびＣ型肝炎ウイルスヘルパーＲＮＡ配列から選択される、請求項９記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１３】
第一異種構造プロモータに操作可能な状態で結合しているレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡをコードしている配列を含んでいる第一部分、および少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているｐｓＲＮＡＶサブゲノムプロモーターを含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンに操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターを含んでいる第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項１４】
第一部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、アルファウイルス糖タンパク質およびアルファウイルスキャプシッドから選択されるアルファウイルス構造タンパク質をコードしている配列を含んでいるアルファウイルスヘルパーＲＮＡ配列であり、および第一異種構造プロモーターおよび第二異種構造プロモーターが共に、Ｔ３、Ｔ７、およびＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択されるポリメラーゼに結合する、請求項１３記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１５】
アルファウイルスキャプシッドがＶＥＥキャプシッドであり、アルファウイルス糖タンパク質がＶＥＥ糖タンパク質であり、および第一プロモーターおよび第二プロモーターが共にＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する、請求項１４記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１６】
第一部分のｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、アルファウイルスヘルパーＲＮＡ配列、ルベラウイルスヘルパーＲＮＡ配列、コロナウイルスヘルパーＲＮＡ配列、デングウイルスヘルパーＲＮＡ配列、およびＣ型肝炎ウイルスヘルパーＲＮＡ配列から選択され、および第二部分のｐｓＲＮＡＶレプリコンが、アルファウイルスレプリコン、ルベラウイルスレプリコン、コロナウイルスレプリコン、デングウイルスレプリコン、およびＣ型肝炎ウイルスレプリコンから選択される、請求項１３記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか一項記載のウイルスベクターおよび組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１−１６のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換え変更ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項１９】
（ａ）請求項１記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡであって、第二部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるもの、
（ｂ）請求項５記載の組換えポリヌクレオチドであって、第一部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるもの
を含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質と（ｂ）のｐｓＲＡＮＶ構造タンパク質が同じではないもの。
【請求項２０】
（ａ）請求項９記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡであって、第二部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしている配列であるもの、
（ｂ）請求項１３記載の組換えポリヌクレオチドであって、第一部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしている配列であるもの
を含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質と（ｂ）のｐｓＲＡＮＶ構造タンパク質が同じではないもの。
【請求項２１】
（ａ）請求項３記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡ、
（ｂ）請求項７記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡ
を含んでいるアルファウイルスレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のアルファウイルス構造タンパク質と（ｂ）のアルファウイルス構造タンパク質が同じではないもの。
【請求項２２】
（ａ）請求項１１記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡ、
（ｂ）請求項１５記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えＭＶＡ
を含んでいるアルファウイルスレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のアルファウイルス構造タンパク質と（ｂ）のアルファウイルス構造タンパク質が同じではないもの。
【請求項２３】
（ａ）請求項１記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第一の組換えベクターであって、第二部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質がｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質か選択されるもの、および
（ｂ）請求項５記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第二の組換えベクターであって、第一部分の少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるもの
を含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質と（ｂ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が同じではなく、第一の組換えベクターと第二の組換えベクターが同じプラスミドまたはウイルスベクター由来のものでないもの。
【請求項２４】
（ａ）請求項９記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第一の組換えベクターであって、第二部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質か選択されるｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしている配列であるもの、および
（ｂ）請求項１３記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第二の組換えベクターであって、第一部分のレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質から選択されるｐｓＲＡＮＶ構造タンパク質をコードしている配列であるもの
を含んでいるｐｓＲＮＡＶレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質と（ｂ）のｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質が同じではなく、第一の組換えベクターと第二の組換えベクターが同じプラスミドまたはウイルスベクター由来のものでないもの。
【請求項２５】
（ａ）請求項３記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第一の組換えベクター、および
（ｂ）請求項７記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第二の組換えベクター
を含んでいるアルファウイルスレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のアルファウイルス構造タンパク質と（ｂ）のアルファウイルス構造タンパク質が同じではなく、第一の組換えベクターと第二の組換えベクターが同じプラスミドまたはウイルスベクター由来のものでないもの。
【請求項２６】
（ａ）請求項１１記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第一の組換えベクター、および、
（ｂ）請求項１５記載の組換えポリヌクレオチドを含んでいる第二の組換えベクター
を含んでいるアルファウイルスレプリコンパッケージングシステムであって、（ａ）のアルファウイルス構造タンパク質と（ｂ）のアルファウイルス構造タンパク質が同じではなく、第一の組換えベクターと第二の組換えベクターが同じプラスミドまたはウイルスベクター由来のものでないもの。
【請求項２７】
（ａ）請求項１９−２６のいずれか一項記載のアルファウイルスパッケージングシステムで細胞を同時感染すること；
（ｂ）レプリコン粒子を作製するのに適当な条件下で同時感染細胞をインキュベートすること、および、
（ｃ）作製されたレプリコン粒子を細胞から得ること
を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を得るための方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法から得られるアルファウイルスレプリコン粒子。
【請求項２９】
請求項１９−２６のいずれか一項記載のアルファウイルスレプリコンパッケージングシステムで同時感染した宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２９記載の同時感染宿主細胞により産生される単離外来ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２７記載の方法から得られる少なくとも一つのアルファウイルスレプリコン粒子および薬理学上許容されるキャリアまたは希釈剤を含む免疫原性組成物。
【請求項３２】
哺乳動物またはヒトの宿主において免疫反応を誘導するための方法であって、宿主に免疫学的に有効な量の請求項３１記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
請求項２７記載の方法から得られる少なくとも一つのアルファウイルスレプリコン粒子および薬理学上許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬製剤。
【請求項３４】
哺乳動物またはヒトの宿主において予防、治療、または緩和効果を引き起こすための方法であって、宿主に有効量の請求項３３記載の医薬製剤を投与することを含む方法。
【請求項３５】
請求項１９−２６のいずれか一項記載のパッケージングシステムを含む、アルファウイルスレプリコン粒子を得るためのキット。
【請求項３６】
請求項１８記載の組換えＭＶＡを含む、アルファウイルスレプリコン粒子を得るためのキット。
【請求項３７】
組換えベクターが、ｐｏｘウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスから選択されるウイルスベクターである、請求項１７記載の組換えベクター。
【請求項３８】
ｐｓＲＮＡＶキャプシッドをコードしている第一の配列に操作可能な状態で結合している第一異種構造プロモーターを含む第一部分、およびｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質をコードしている第二の配列に操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターを含む第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項３９】
第一および第二異種構造プロモーターが、ｐｏｘウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターからそれぞれ選択され、第一部分のｐｓＲＡＮＶキャプシッドがアルファウイルスキャプシッドであり、第二部分のｐｓＲＡＮＶ糖タンパク質がアルファウイルス糖タンパク質である、請求項３８記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４０】
第一異種構造プロモーターおよび第二異種構造プロモーターが共にワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターであり、第一の配列のアルファウイルスキャプシッドがＶＥＥキャプシッドであり、および第二の配列のアルファウイルス糖タンパク質がＶＥＥ糖タンパク質である、請求項３９記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３８−４０のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む組換えＭＶＡ。
【請求項４２】
（ａ）請求項４１記載の組換えＭＶＡおよびアルファウイルスレプリコン粒子で細胞を同時感染すること；
（ｂ）レプリコン粒子が複製するのに適当な条件下で同時感染細胞をインキュベートすること、および、
（ｃ）増幅されたレプリコン粒子を細胞から得ること
を含む、アルファウイルスレプリコン粒子を増幅するための方法。
【請求項４３】
第一異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列を含んでいる第一部分、および第二異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているレポーター遺伝子を含むレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列を含む第二部分を含んでいる組換えポリヌクレオチド。
【請求項４４】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択され、第一異種構造プロモーターがｐｏｘウイルスプロモーターであり、第二部分のレポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ベータ−グルコロニダーゼ遺伝子、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子から選択され、および第二異種構造プロモーターが、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼから選択されるポリメラーゼに結合する、請求項４３記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４５】
第一部分のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、第一異種構造プロモーターがワクシニアーウイルス合成初期／後期プロモーターであり、第二部分のレポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子であり、および第二異種構造プロモーターがＴ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する、請求項４４記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４６】
ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡ配列が、アルファウイルスヘルパーＲＮＡ配列、ルベラウイルスヘルパーＲＮＡ配列、コロナウイルスヘルパーＲＮＡ配列、デングウイルスヘルパーＲＮＡ配列、およびＣ型肝炎ヘルパーＲＮＡ配列から選択される、請求項４３記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４３−４６のいずれか一項記載の組換えポリヌクレオチドを含む組換えＭＶＡ。
【請求項４８】
ｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子の溶液の力価を測定する方法であって、
（ａ）請求項４７記載の組換えＭＶＡおよびｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子の溶液で細胞を同時感染すること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現のために適当な条件下で同時感染細胞をインキュベートすること、および、
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を検出すること、および、
（ｄ）ｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子の溶液の力価を測定すること
を含む方法。
【請求項４９】
請求項１−１６、３８−４０、または４３−４６のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む組換えＭＶＡであって、ポリヌクレオチドを、欠失Ｉ、欠失ＩＩ、欠失ＩＩＩ、欠失ＩＶ、欠失Ｖ、欠失ＶＩ、ヘマグルチニンをコードしている配列、またはチミジンキナーゼをコードしている配列に挿入されたもの。
【請求項５０】
請求項２３−２６のいずれか一項記載のレプリコンパッケージングシステムであって、第一の組換えベクターおよび第二の組換えベクターが、ｐｏｘウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスから選択されるウイルスベクターである、請求項２３−２６のいずれか一項記載のレプリコンパッケージングシステム。
【請求項５１】
細胞が、ＢＨＫ−２１細胞およびＦＲｈＬ細胞から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項５２】
細胞が、ＢＨＫ−２１細胞およびＦＲｈＬ細胞から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項５３】
細胞が、ＢＨＫ−２１細胞およびＦＲｈＬ細胞から選択される、請求項４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は概して、組換えポリヌクレオチド、プラス鎖ＲＮＡウイルス組換え発現ベクター、およびパッケージングシステムに関する。該パッケージングシステムは、組換えｐｏｘウイルスベクターなどの組換えベクターで細胞を同時感染することによるスプリット−ヘルパー機能の発現に基く。
【０００２】
（発明の背景）
組換えＤＮＡ技術により、今や、ウイルスを用いて、目的の実質上あらゆる遺伝子をほとんどあらゆる目的の細胞に導入することが可能となっている。そのようなウイルスは目的の遺伝子を「発現させる」、すなわち遺伝子によりコードされるタンパク質を製造するために操作されているので、それらは「ウイルス発現ベクター」と呼ばれる。
【０００３】
近年、節足動物経由で哺乳動物に伝染されるプラス鎖ＲＮＡウイルス（その核酸がＤＮＡではなく、ＲＮＡの形態にあるウイルス）であるアルファウイルスが注目されている（（１６）および（１７）に概説されている）。プラス鎖ＲＮＡウイルス、および特にアルファウイルスは、いくつかの理由のために特に魅力的なウイルス発現ベクターである：１）そのゲノムがｃＤＮＡの形態で容易に操作され、および裸のＲＮＡとして感染する、２）その複製サイクルがもっぱら細胞質で行なわれる、３）外来遺伝子の発現が、強いウイルスプロモータにより駆動される、および、４）それらはインビトロで広範な宿主範囲を持つ。
【０００４】
構造的には、図１に示すように、アルファウイルスゲノムはおよそ１１．７キロベース（ｋｂ）長の、５’末端にて「キャップ」され、および３’末端にて「ポリアデニル化」されている一本鎖のＲＮＡである。ゲノムの５’末端側の３分の２が非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）をコードし、および３’末端側の３分の１が構造タンパク質（ｓＰｓ）をコードする。図１は、非構造タンパク質がＲＮＡ配列全体の複製（コピー）、ならびに構造タンパク質の翻訳に至る「サブゲノム」ＲＮＡの転写を招くことも示している（概説に関しては、（３２）および（３４）を参照されたい。）。
【０００５】
複製に関しては、ｎｓＰｓは、図１のステップ１に示すように、感染しているウイルスゲノムである指定の（＋）ＲＮＡから直接翻訳される（ステップは、番号を含む黒丸により示す）。ｎｓＰｓの翻訳により、「レプリカーゼ」および「トランスクリプターゼ」を含んでいる「複製／転写複合体」を形成する４つのタンパク質が生じる。ステップ２に示すように、レプリカーゼ／トランスクリプターゼは、「アンチゲノム」とも呼ばれる、ゲノム長の相補鎖である指定の（−）ＲＮＡの合成を媒介する。ステップ３では、レプリカーゼ／トランスクリプターゼは次いで、アンチゲノムを鋳型として用いて（＋）全長ＲＮＡの更なるコピーを作製する。
【０００６】
アンチゲノムはステップ４の前のステップに示されるように、ゲノムの末端の３分の１の転写のための鋳型としても役立つ。前記のように、ゲノムの３’末の３分の１はｓＰｓをコードし、従って、サブゲノムｍＲＮＡはｓＰｓをコードする。ｓＰｓは巨大「ポリプロテイン」の形態でコードされ、これは次いでプロセシングされて、キャプシッドタンパク質およびＥ１およびＥ２と指定される２つのエンベロープタンパク質を出じる。サブゲノムセグメントの転写は、ｎｓＰコーディング領域およびｓＰコーディング領域の間の連結部分にかかるものであって、かつ「プロモーター」として役立つヌクレオチドにより媒介される。サブゲノムプロモーターからの転写により、感染細胞当たり１０８のウイルス構造タンパク質を生じる１０６コピー／細胞に達し得るレベルのサブゲノムｍＲＮＡを生じ得る（３０）。
【０００７】
ステップ４により一度エンベロープタンパク質およびキャプシッドタンパク質が合成されたら、キャプシッドタンパク質は複製されたゲノムＲＮＡと相互作用して「ヌクレオキャプシッド」を形成し、これは次いでエンベロープタンパク質によりパッケージングされる。ゲノムＲＮＡのｎｓＰコーディング配列内に位置する「パッケージングシグナル」がこのプロセスを促進するのに役立つ。サブゲノムＲＮＡはこれらのパッケージングシグナルを欠くので、ゲノムＲＮＡのみがキャプシッドに包まれる。
【０００８】
トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）およびフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスは同様の包含された、二十面体のヌクレオキャプシッド構造を持ち、共通の先祖ウイルスから進化したと考えられている（５４）。共にトガウイルスファミリーのメンバーであるアルファウイルスおよびルビウイルスは、同様のゲノム構造および複製サイクルを持つ（図２２を参照されたい）。レプリカーゼ／トランスクリプターゼ複合体はゲノムの５’末端から直接翻訳され、およびｓＰｓは、アンチセンスＲＮＡ上に存在するサブゲノムプロモーターから下流に転写される。フラビウイルスのウイルス（例えば、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス）は全て、共通のゲノム構成および複製戦略を持つ。トガウイルスと異なり、フラビウイルスゲノムは、ｓＰｓおよびｎｓＰｓの両方をコードするポリタンパク質のｍＲＮＡとして役立つ。これらの遺伝子産物の発現は、翻訳後のステップで調節され、フラビウイルスにおいてサブゲノムの転写はない。さらに、遺伝子の配置が逆転している、すなわち、ｓＰ遺伝子がｎｓＰｓの上流に位置する。これらのウイルスはそのゲノムの配置および複製戦略が異なるが、それらは本明細書に開示するウイルスに代用することができる。例えば、それらは、本明細書中に開示するものと実質上同じ方法を用いて、ｓＰｓコーディング領域を取り出すことによりレプリコン発現ベクター中に操作し（（（５５）、（５６））、トランスにてｓＰｓを提供することによりウイルス様粒子にパッケージングすることができる（５７）。
【０００９】
生きたおよび／または複製欠損いずれかの発現ベクターとして操作されている他のプラス鎖ＲＮＡウイルスには、ポリオウイルス（５８）およびコロナウイルス（５９）が含まれる。それらはアルファウイルスとも異なるが、これらのウイルス由来のレプリコンベクターを、本明細書に開示されるものと同様の方法を用いてパッケージングしてよい。
【００１０】
アルファウイルスの複製／転写プロレスならびにその核酸配列を理解することにより、発現ベクターとしてそれらを使用することが可能となっている。いくつかのアルファウイルスが配列決定されており、および、感染性ｃＤＡＮクローンがさらに、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス（ＳＶ；（３１））、セムリキ森（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス（ＳＦＶ；（２０））、ベネズエラウマ脳脊髄炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＶＥＥ；（１１））およびロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス（ＲＲＶ；（１８））に関して操作されている。ＳＶ、ＳＦＶおよびＶＥＥに基くベクターが、有効な遺伝子発現システムとしての見込みがあることが示されている（概説として、（１４）、（２１）、（１５）を参照されたい。）
【００１１】
一般に、２タイプのアルファウイルス発現ベクターが存在する。１タイプのベクター、「複製−コンピテント」ベクターにおいては、第２のサブゲノムプロモーターを付加して外来の（異種構造）遺伝子の発現を指向させる。このタイプのダブル−サブゲノムプロモーターベクターは、目的の外来遺伝子、ならびにウイルスのパッケージングに必要な全構造成分を発現する；すなわち、これらのベクターは自己複製性および自己パッケージング性である。このような系に関して明らかな不都合は、生存力のあるウイルスが生じることである。
【００１２】
生存力のあるウイルスが生じる可能性を最小限に抑えるために、アルファウイルス発現ベクターをさらに「複製欠損」となるべくさらに操作した。これらのベクターは、ｓＰｓをコードする遺伝子を除去し、そして、１またはそれ以上の外来遺伝子をサブゲノムプロモーターのコントロール下に置くことにより作製される。ｎｓＰコーディング配列は完全なままであるので、これらのベクターは複製複合体を作製し、かつ自己複製することができ、そして外来遺伝子を発現することができる。しかし、それらはキャプシッドおよびエンベロープタンパク質をコードするｓＰｓを欠くので、自己−パッケージング性ではない。これらのベクターを感染粒子にパッケージするために、ベクターを「ヘルパー」ベクター、すなわち別のＲＮＡ分子上にｓＰｓを有するベクターで「トランスにて」補うことができる。例えば、これらのベクターは、ウイルスキャプシッドおよび糖タンパク質をコードする、インビトロで転写される欠損ヘルパー（ＤＨ）ＲＮＡと共にベクターを同時感染することにより（１９）、（５）、または別法としてレプリコンＲＮＡを、ＤＨ　ＲＮＡを核プロモーターの調節下に発現する継代パッケージング細胞系統にトランスフェクションすることにより（２６）、パッケージングしてよい。いずれのシステムを用いても、ヘルパーＲＮＡはｎｓＰコーディング領域内に存在するパッケージングシグナルを欠くがゆえに、ヘルパーＲＮＡはパッケージされないか、または非常に低い効率でしかパッケージされない。
【００１３】
しかし、組換えは（レプリコンおよびＤＨ　ＲＮＡを含んでいる）アルファウイルス複製中間生成物の間で頻繁に生じ、そして、自己複製および自己パッケージングウイルスの作製を生じる可能性がある（３５）、（２９）、（３７）。これは、これらのパッケージングシステムの使用について、潜在的な生物学的安全性および取り締まりについての問題を呈する。これらの問題に対処するために、科学者は、複製および自己パッケージングし得るベクターを生じる可能性を有意に減らす「スプリット−ヘルパー」パッケージングシステムを開発した（１４）、（２７）、（３３）。「スプリット−ヘルパー」システムは、キャプシッドタンパク質をコードしている一つと、ウイルス糖タンパク質（Ｅ２／Ｅ１）をコードしているもう一つの、２つの別個のＤＨ　ＲＮＡを用いるものである。しかし、２つの別個のＤＨ　ＲＮＡはまずインビトロで転写し、精製し、次いでその後にトランスフェクションのために調製されたパッケージング細胞中に挿入しなければならないので、コストがかかり、かつ効率の悪いシステムである。ＲＮＡおよび細胞の多くの操作のために、レプリコン粒子の産生が一貫しないものとなる。
【００１４】
アルファウイルスで感染した細胞は、典型的には１０３−１０４感染ウイルス粒子／細胞を生じる。いわんやレプリコン粒子の産生は、対照的に、効率的でない。これらのベクターで感染した細胞は、典型的には、細胞当たり平均１−５０個のレプリコン粒子を産生する。レプリコン粒子の収量が低いことは、インビトロでの転写および細胞のトランスフェクションが乏しいことの累積効果の結果である。例えば、インビトロで転写されたＲＮＡがうまく発現されるには、ＲＮＡが５’末端でキャップされることが必要である。２つの別個のＤＨ　ＲＮＡを含むスプリット−ヘルパーシステムに関して、キャップされなければならない３つのＲＮＡセグメント：両ヘルパーＲＮＡおよびレプリコン自体、が存在する。インビトロでのレプリコンのキャッピングの効率が例えば６５％であり、および各ＤＨ　ＲＮＡのそれが８５％である場合、トランスフェクションの効率は最良４２％（０．６５×０．８×０．８）である。つまり、発現の効率は３つのキャッピング反応およびトランスフェクションプロセスにより限定される。
【００１５】
キャッピングの問題を複雑にしているのは、化学試薬を用いるトランスフェクション法が相対的に効果的でないという事実である。化学試薬ではなく電気分野を用いて細胞にＲＮＡを導入する場合、エレクトロポーレーション法がより有効であるが、それらは多くの操作と厳密な最適化を必要とする。さらに、エレクトロポーレーション法は、巨大規模の調製には未だ有効に用いられていない。
【００１６】
理想的なパッケージングシステムには、遺伝子発現のために最適化された有効な遺伝子送達システムを用いることが必要である。そのようなシステムは、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、ｐｏｘウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、レトロウイルスなど）に基くことができる。ウイルスベクターを用いて、広範囲の細胞のタイプを大規模で、高い効率で感染することができる。多くのウイルスベクターが、特定の細胞系統における最適の遺伝子発現および有限成長のために操作されている。
【００１７】
これらのレプリコンベクターを用いることに対するさらに別の考え得る制限は、ベクター粒子のための大規模なパッケージングシステムを欠くことである。例えば、アルファウイルス粒子のパッケージングに必要とされる試薬の調製はコストがかかり、非実用的であり、有意義なスケールアップに従わない。つまり、安全で、かつコスト的に有効なレプリコン発現ベクターおよびパッケージングシステムが、当該分野において必要とされている。そのようなベクターを、サブユニットワクチン遺伝子の送達、遺伝子治療、癌免疫治療、および組換えタンパク質合成の目的のための感染性レプリコン粒子の大規模産生のためのｐｓＲＮＡＶ−由来のＲＮＡを効率よく送達および発現するのに用いる。
【００１８】
（発明の概要）
本発明は、感染性プラス鎖ＲＮＡウイルス（ｐｓＲＮＡＶ）レプリコン粒子、組換えプラス鎖ＲＮＡウイルス発現ベクター、およびｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子を組換えｐｏｘウイルスベクターを用いて製造するためのパッケージングシステムを対象とする。これらのパッケージングシステムは、ウイルスＲＮＡのインビトロでの合成またはトランスフェクションを必要としない。そのかわり、本発明の方法および組成物は、感染性ｐｓＲＮＡレプリコン粒子を組み立てるのに必要とされる成分を細胞へ送達するための組換えＤＮＡウイルスおよび／またはプラスミドを用いる。宿主へ投与するための免疫原性組成物および医薬製剤を含む方法および組成物が提供される。ｐｏｘウイルスに基くレプリコン粒子パッケージングシステムを作製するための組換えポリヌクレオチドおよびベクターも提供される。開示される組成物および方法を用いる使用のためのキットが提供される。
【００１９】
本発明の所定のパッケージングシステムは、その発現生成物が組換えｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子をパッケージすることができる一対の組換えｐｏｘウイルスベクターでの同時感染に基く。このシステムにより、少なくとも一つの（その天然の状態から取り出された遺伝子である）外来遺伝子を含む、ウイルス遺伝子であってもよい感染性レプリコン粒子が作製される。典型的な具体例において、ｐｏｘウイルスベクターの対は、ワクシニアウイルス、特に、厳しく宿主が制限され、減毒化されたワクシニアウイルス株（変更されたワクシニアウイルスアンカラ、またはＭＶＡ）に基く。この具体例において、ｐｓＲＮＡＶはアルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）である。ＭＶＡベクターの対により、後にＶＥＥレプリコンＲＮＡをパッケージして、感染性ＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）を作製するＶＥＥキャプシッドおよびエンベロープタンパク質が作製される。
【００２０】
ＭＶＡ−に基くＶＲＰパッケージングシステムは、レプリコンＲＮＡおよびヘルパータンパク質の産生に依存する。ヘルパータンパク質の発現は、ＭＶＡベクターにより転写されるＲＮＡの形態に基いて、誘導型であるか、または構造型であるかのいずれかである。誘導型ヘルパーＲＮＡは、翻訳される前にＶＥＥレプリカーゼ／トランスクリプターゼにより、複製および転写される。構造型ヘルパーＲＮＡはｍＲＮＡとして転写され、およびそれゆえ、直接翻訳される。
【００２１】
本発明のレプリコン粒子パッケージングシステムにより、前に論じた常套のスプリット−ヘルパーＲＮＡトランスフェクション法よりも大きな力価のレプリコン粒子が得られる。本明細書中に開示するパッケージングシステムを用いて、ヘルパー機能ＲＮＡは、用いられるパッケージングシステムにより、ＤＨ　ＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかとして発現されることができる。レプリコンパッケージングプロセス中に、自己複製感染ウイルスを生じる可能性は、構造型システムにおいてはｐｓＲＮＡＶ調節配列の全てがヘルパーＲＮＡを欠くので、さらに減る。このシステムにより、全公知のパッケージングシステムの中で最高レベルの安全性が提供される。
【００２２】
さらに、本発明により、組換え遺伝子産物の大規模産生において他のｐｏｘウイルスベクターを用いるための方法が提供される（２）。これらの方法は、レプリコン粒子の大量生産に適用しやすい。
新規組換えポリヌクレオチド、および組換えウイルスを含む組換えベクターは、当該分野において周知の常套のクローニングおよび分子生物学的技術を用いて調製することができる。そのような技術に関する記載は、他の箇所、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（３８）およびＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３， 付録を含む（３９））に見出すことができる。
【００２３】
発明は、組換えウイルスを含む組換えベクターの構成要素として役立ち、ひいてはレプリコン粒子パッケージングシステムの構成要素である組換えポリヌクレオチドに基く。所定の具体例において、これらの組換えウイルスおよびパッケージングシステムを本発明の方法に用いて、レプリコン粒子が得られる。
【００２４】
所定の具体例において、本発明の範囲内の組換えポリヌクレオチドは少なくとも第一部分と第二部分を含む。第一部分は、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列に操作可能な状態で結合している少なくとも一つの第一異種構造プロモーターを有する配列を含む。「操作可能な状態で結合している」により、発現をコントロールするプロモーターなど、調節性のコントロールを可能とする結合を意味する。第二部分には、少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードするが、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質の全てをコードするわけではない配列に操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターが含まれる。つまり、第二部分はｐｓＲＮＡＶキャプシッドをコードしてよく、またはそれはｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質をコードしてよいが、両方ともはコードしない。第一部分および第二部分なる用語は、組換えポリヌクレオチド内のいずれかの配列の位置を示すわけではない。つまり、第一部分は第二部分の上流または下流のいずれにあってもよい。
【００２５】
さらに、第一部分および第二部分なる用語は、制限するものであることは意図されない。例えば、所定の具体例において、組換えポリヌクレオチオドは３またはそれ以上の部分を含む。例えば、第二部分がＥ１糖タンパク質をコードする配列を含んでよく、および第三部分がＥ２糖タンパク質をコードする配列を含んでよい。
【００２６】
第一および第二部分のプロモーターは同一または異なっていてよい。第一部分において、第一異種構造プロモーターが結合しているＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはウイルスのまたはバクテリオファージのポリメラーゼであってよく、例えば、制限するものではないが、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼであってよい。
【００２７】
所定の具体例において、第一および第二異種構造プロモーターは異なる。例えば、制限するものではなく、第一プロモーターはｐｏｘウイルスプロモーターを含んでよく、および第二プロモーターはバクテリオファージプロモーターを含んでよい。一の典型的な具体例において、組換えポリヌクレオチオドは、バクテリオファージＴ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターおよび、例えばベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス糖タンパク質などの少なくとも一つのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしている配列に操作可能な状態で結合している、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する第二異種構造プロモーターを有する。
【００２８】
本発明の所定の具体例では、組換えポリヌクレオチドは、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質の全てではないが少なくとも一つをコードしている配列に操作可能な状態で結合している第一異種構造プロモーターを含む第一部分を含む。つまり、第一部分は、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドタンパク質またはｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質のいずれかをコードしているが、両方ともはコードしていない配列を含む。第二部分は、複製することができるｐｓＲＮＡＶ「レプリコン」に操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターを含む。第二部分のｐｓＲＮＡＶレプリコンは、少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列に操作可能な状態で結合したｐｓＲＮＡＶサブゲノムプロモーターを含む。所定の具体例において、第一および第二異種構造プロモーターは同じポリメラーゼ、例えば制限されるものではないが、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合してよく、または、それらは異なるポリメラーゼ、例えば制限するものではないが、ｐｏｘウイルスまたはバクテリオファージＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合してよい。所定の具体例において、ｐｓＲＮＡＶはアルファウイルスである。
【００２９】
一の例示的具体例において、組換えポリヌクレオチドはアルファウイルスキャプシッドタンパク質をコードしている配列に操作可能な状態で結合しているバクテリオファージＴ７プロモーター、およびアルファウイルスレプリコンをコードしている配列に操作可能な状態で結合している第二のＴ７プロモーターを有する。所定の具体例において、アルファウイルスキャプシッドおよびアルファウイルスレプリコンはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス由来のものである。
【００３０】
さらに別の具体例において、組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列に操作可能な状態で結合している第一異種構造プロモーターを含む第一部分を有する。第二部分は、第二異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡをコードしている配列を含む。つまり、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼが第二異種構造プロモーターに結合すると、レプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡが転写される。レプリコン様ヘルパーＲＮＡがｐｓＲＮＡＶ複製複合体に曝されると、それはレプリカーゼにより複製され、トランスクリプターゼにより転写されてサブゲノム転写産物を作製する「アンチゲノム」鎖を生じる。サブゲノムの転写産物は次いで翻訳されて、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドタンパク質またはｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質のいずれかを生じるが、両方ともは生じない。
【００３１】
これらの具体例において、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列は、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６などからのバクテリオファージポリメラーゼをコードし、およびレプリコン様ヘルパー配列は、ｐｓＲＮＡキャプシッドをコードしている配列を含む。これらの具体例において、第一異種構造プロモーターは、例えばｐｏｘウイルス合成初期／後期プロモーターを含み、および第二異種構造プロモーターは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼなどのバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する。
【００３２】
他の具体例では、組換えポリヌクレオチドはバクテリオファージＴ７ポリメラーゼをコードしている配列に操作可能な状態で結合したワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターを有し、および、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する第二異種構造プロモーターは、ｐｓＲＮＡＶキャプシドをコードしている配列を含んでいるレプリコン様ヘルパー配列に操作可能な状態で結合する。
【００３３】
他の具体例では、組換えポリヌクレオチドは、バクテリオファージＴ７ポリメラーゼをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターを有し、およびＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する第二異種構造プロモーターは、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドをコードしている配列を含んでいるレプリコン様ヘルパー配列に操作可能な状態で結合している。
【００３４】
さらに他の具体例では、本発明の組換えポリヌクレオチドは、第一異種構造プロモーターに操作可能な状態で結合しているレプリコン様ｐｓＲＮＡＶヘルパーＲＮＡをコードしている配列を含んでいる第一部分、およびｐｓＲＮＡＶレプリコンに操作可能な状態で結合している第二異種構造プロモーターを含む第二部分を有する。ｐｓＲＮＡＶレプリコンには、少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているｐｓＲＮＡＶサブゲノムプロモーターが含まれる。これらの具体例において、第一および第二異種構造プロモーターは同一であってよく、またはそれらは異なっていてよい。所定の具体例において、レプリコン様ヘルパー配列はｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質をコードしている配列を含む。所定の具体例において、第一および第二異種構造プロモーターは、例えば、制限するものではないが、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ポリメラーゼなどのバクテリオファージＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する。所定の具体例において、ｐｓＲＮＡＶはアルファウイルスである。
【００３５】
一の例示的具体例において、組換えポリヌクレオチドの第一および第二プロモーターはＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして、レプリコン様ヘルパー配列はアルファウイルス糖タンパク質、例えば制限されるものではないが、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス糖タンパク質をコードしている配列を含む。
【００３６】
一度、前記の組換えポリヌクレオチドが作製されたら、それらを用いて組換えベクター、制限されるものではないが、クローニングベクターまたは発現ベクターなどを作製することができる。典型的なクローニングベクターまたは発現ベクターには、細菌プラスミド、ファージミド、組換えウイルス、酵母ベクターなどが含まれる。クローニングベクターの好ましい特性には、クローニングおよびインビトロでの操作のし易さが含まれ得る。発現ベクターの好ましい特性には、確実な遺伝子発現、感染に関して広範な宿主範囲、細胞系統の有限成長または成長しないこと、哺乳動物宿主細胞への感染、宿主−細胞抗ウイルス反応のコントロール、研究者に対して非病原性であることが含まれ得る。好ましい組換えプラスミドまたはウイルスベクターには、ｐｏｘウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、およびレトロウイルスが含まれる。特に好ましい組換えｐｏｘウイルスベクターは、変更されたワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。
【００３７】
所定の具体例において、生物学的安全性における理由のために、本発明のパッケージングシステムは、それぞれ異なるｐｓＲＮＡＶ構造ポリペプチドをコードしている３つの組換えベクターを含んでよい。所定の具体例において、３つの組換えベクターは、制限するものではないが、キャプシッドをコードしている配列を含んでいる第一の組換えベクター、Ｅ１糖タンパク質をコードしている配列を含んでいる第二の組換えベクター、およびＥ２糖タンパク質をコードしている配列を含んでいる第三の組換えベクターが含まれる。
【００３８】
当業者は、本発明のパッケージングシステムにおいて用いられる組換えウイルスベクターが同じ組換えウイルスから誘導される必要はないが、そうされてもよいことを理解するであろう。例えば、所定のウイルスシステムを用いて、最初のウイルスによる感染により、感染された細胞を同じウイルスシステムからの他のウイルスによる重複感染に対して無反応性としてよい。例えば、所定の具体例においては、第一の組換えウイルスが第二の組換えウイルスと異なるウイルスシステムから誘導されるパッケージング系を用いることが好まれ得る。例えば、制限されるものではないが、ｐｏｘウイルス誘導型ベクターおよびアデノウイルス誘導型ベクターを含んでいるパッケージングシステムがある。
【００３９】
さらに、ダブルプロモーターの挿入／発現ベクターを用いることができる。例えば、ワクシニアウイルスの合成初期／後期プロモーターが、２つの遺伝子がｐｏｘウイルスの同じ部位に同時に挿入され得るように連続配置にて遺伝子操作されている（５０）。この同じタイプのベクターを用いて、ＭＶＡパッケージングシステムに、多重発現カセットを挿入することも可能である。
【００４０】
所定の具体例において、組換えＭＶＡはＭＶＡ欠失ＩＩまたはＩＩＩに挿入される本発明の１またはそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む（図２を参照されたい）。他の具体例において、組換え体は、ＭＶＡヘマグルチニン遺伝子（４２）、チミジンキナーゼ遺伝子（５２）に、またはＭＶＡゲノムの他の非必須領域に挿入された本発明の１またはそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む。他のＭＶＡ欠失部位への挿入も、本発明の範囲内にある。例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ制限フラグメント内の２．９キロ塩基対（ｋｂｐ）の欠失である欠失Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｎ制限フラグメント内の５．０ｋｂｐの欠失である欠失ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ａ制限フラグメント内の３．５ｋｂｐの欠失である欠失ＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｂ制限フラグメント内の１０．２ｋｂｐの欠失である欠失ＩＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ制限フラグメント内の４．７ｋｂｐの欠失である欠失Ｖ、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ａ制限フラグメント内の３．８ｋｂｐの欠失である欠失ＶＩを含む６のＭＶＡの欠失がマッピングされている（ＨｉｎｄＩＩＩ制限マップに関する図２を参照されたい）。ＭＶＡ欠失のマッピングに関する記載は、他の箇所、参考文献（４１）、（４９）、および（５１）にも見出すことができる。
【００４１】
レプリコンパッケージングシステムも提供される。本明細書中に開示される新規なパッケージングシステムには、本発明の少なくとも２つの組換えベクターが含まれる。本発明のパッケージングシステムは、誘導型または構成型であってよい。典型的なｐｓＲＮＡＶレプリコンパッケージングシステムには、それぞれ第一および第二部分を有する２つの組換えＭＶＡが含まれる。第一の典型的な組換えＭＶＡは、バクテリオファージＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしている配列に操作可能な状態で結合しているワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターを含む第一部分、および欠失ＩＩＩへ挿入された少なくとも一つのアルファウイルス構造タンパク質をコードしている配列、ここで、該配列はＶＥＥ糖タンパク質をコードする、に操作可能な状態で結合した、Ｔ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合する第二異種構造プロモーターを含む第二部分を有する（図２を参照されたい）。第二の典型的な組換えＭＶＡは、欠失ＩＩＩに挿入されたベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスキャプシッドタンパク質をコードしている配列に操作可能な状態で結合しているバクテリオファージＴ７プロモーターを含む第一部分、および欠失ＩＩへ挿入された、ＶＥＥレプリコンをコードしている配列に操作可能な状態で結合されたＴ７プロモーターを含む第二部分を有する（図２を参照されたい）。
【００４２】
感染性のレプリコン粒子を作製するための方法も提供される。所定の具体例により、細胞を本発明の新規レプリコン粒子パッケージングシステムを含む組換えウイルスで感染する。一の典型的な具体例においては、細胞を本発明の新規なレプリコン粒子パッケージングシステムを含む１またはそれ以上のＭＶＡ組換えウイルスで同時感染する。他の典型的な具体例では、感染性レプリコン粒子を増幅する方法が提供される。細胞を、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドおよび糖タンパク質を発現するｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子およびＭＶＡ組換え体で同時感染する。典型的な両具体例において、同時感染した細胞を、レプリコン粒子を作製するのに適当な条件下でインキュベートする。一度作製されたら、レプリコン粒子を得る。
【００４３】
レプリコン粒子をタイターする（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）方法が提供される。所定の具体例に従い、細胞に適当なレポーター遺伝子を送達するＭＶＡ組換え体で細胞を感染する。細胞をレプリコン粒子で同時感染すると、レポーター遺伝子が活性化され、そして細胞を次いで検出することができる。このシステムを用いてよいレポーター遺伝子の例には、緑の蛍光タンパク質、青の蛍光タンパク質、黄色の蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ、およびルシフェラーゼが含まれる。
【００４４】
本発明のレプリコン粒子は、宿主に投与される免疫原性組成物または医薬製剤に用いてよい。そのような組成物および製剤は、適当な薬理学上許容されるキャリア、アジュバント、希釈剤、賦形剤、免疫刺激化合物などをさらに含んでよい。これらの組成物および製剤は、いずれかの効果的な方法を用いて投与されてよい。典型的な投与法には、静脈内、筋肉内、または皮内注射、鼻腔内点滴、経口、皮膚または粘膜表面に対する局所適用などが含まれる。
【００４５】
所定の具体例において、哺乳動物またはヒトの宿主において免疫反応を誘導する方法が提供される。そのような方法には、宿主において免疫反応を誘導するための本発明の免疫原性組成物の免疫学的に有効な量を宿主に投与することが含まれる。所定の具体例において、哺乳動物またはヒトの宿主における予防的、治療的、または緩和効果を生む方法が提供される。これらの方法には、宿主に有効量の本発明の医薬製剤を投与して、予防、治療または緩和効果を得ることが含まれる。
【００４６】
組換えポリペプチド； 組換えウイルスを含む組換えベクター；本発明のレプリコン粒子パッケージングシステム；および本発明の方法を用いて得られるレプリコン粒子により発現される外来タンパク質も本発明の範囲内にある。
【００４７】
（図面の簡単な記載）
図１：　アルファウイルス複製サイクルのステップを示している概略図。感染細胞内で、アルファウイルスゲノムの５’末の３分の２が単一の翻訳開始部位から翻訳されて、４つのアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）が生じる（ステップ１）。ｎｓＰｓは、ゲノムＲＮＡを複製するための鋳型として役立つ相補的（−）ＲＮＡ鎖の合成（ステップ２）およびサブゲノムＲＮＡの転写（ステップ３）に必要である。サブゲノムＲＮＡは翻訳されて構造タンパク質（ｓＰｓ）を生じ（ステップ４）、これはサブゲノムＲＮＡではなく、ゲノムＲＮＡ上のパッケージングシグナルと相互作用して、感染アルファウイルス粒子を集合める（ステップ５）。相補（−）ＲＮＡ鎖上に示した水平の矢印は、アルファウイルスサブゲノムプロモーターを示す（図は、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ， Ｓ． １９９９． ＡＳＭ Ｎｅｗｓ ６５： ６８８−９５より）。
【００４８】
図２：　ＭＶＧＫＴ７発現ベクターを図示したもの。ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ制限マップを示す。バクテリオファージＴ７遺伝子−１は、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊフラグメント内に位置している。組換えポリヌクレオチドおよび外来遺伝子の挿入に有用なＭＶＡ欠失ＩＩおよびＩＩＩも示す。他の欠失（Ｉ、ＩＶ、ＶおよびＶＩなど）がこれらのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に対してマッピングされており、外来遺伝子の挿入に有用な部位でもあり得る。
【００４９】
図３：　典型的なアルファウイルスレプリコン粒子構成型パッケージングシステムを図示したもの。ＨｉｎｄＩＩＩ制限マップを、ＣＭＶＡ１およびＣＭＶＡ２に関して掲載する。図３および４で用いる省略−ＰＴ７：バクテリオファージＴ７プロモーター；Ｐ７．５：ワクシニア７．５Ｋプロモーター；ＰＳ−Ｅ／Ｌ：ワクシニア合成初期／後期プロモーター；Ｐ１１Ｋ：ワクシニア１１Ｋプロモーター；ＰＧ８Ｒ：Ｇ８Ｒプロモーター；ｃａｐＯＲＦ：キャプシッドオープンリーディングフレーム；ｇＰＯＲＦ：糖タンパクオープンリーディングフレーム；ＤＨｇＰ：糖タンパク欠陥ヘルパーＲＮＡをコードしている配列；ＤＨｃａｐ：キャプシッド欠陥ヘルパーＲＮＡをコードしている配列。
【００５０】
図４：　典型的なアルファウイルスレプリコン粒子誘導型パッケージングシステムを図示したもの。省略は、前記の図３の簡単な説明に示すものである。
図５：　プラスミドｐＧＫ１６．２の作製を示す図表。斑点をつけた矢印は、ワクシニア合成初期／後期プロモーター（ＰＥ／Ｌ）およびワクシニア７．５Ｋプロモーター（Ｐ７．５Ｋ）を示す。ＴＫ−ＬおよびＴＫ−Ｒは、ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）座と相同の領域を示す。
【００５１】
図６：　プラスミドｐＤＦ１７、ｐＤＦ３０、およびｐＤＦ３３の作製を示す概略図。斑点をつけた矢印は、ワクシニア合成初期／後期プロモーター（ＰＥ／Ｌ）、ワクシニア７．５Ｋプロモーター（Ｐ７．５Ｋ）およびワクシニア１１Ｋプロモーター（Ｐ１１Ｋ）を示す。この図のＭＦ−１およびＭＦ−２は、ＭＶＡの「欠失ＩＩＩ」として指定される領域と相同の領域を示す。
【００５２】
図７：　プラスミドｐＧＫ５３およびｐＧＫ５１の作製を示す概略図。斑点をつけた矢印はワクシニア合成初期／後期プロモーター（ＰＥ／Ｌ）、ワクシニア７．５Ｋプロモーター（Ｐ７．５Ｋ）、ワクシニア１１Ｋプロモーター（Ｐ１１Ｋ）、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｐ−Ｔ７）、およびアルファウイルスサブゲノムプロモーター（Ｐ−２６Ｓ）を示す。ΔｎｓＰは、ｎｓＰ発現カセット内の広範な欠失を示す。
【００５３】
図８：　典型的なｐｏｘウイルスに基くアルファウイルスレプリコン粒子パッケージングシステムにおいて用いられる組換えＭＶＡのゲノムを図示したもの。（Ａ）誘導型システム。（Ｂ）構成型システム。組換えＭＶＡの名称を右に示す。用いる特異的プロモーターは、斑点をつけた矢先として示す。ＶＥＥ複製配列をブラックボックスとして示す。アルファウイルスサブゲノムプロモーターを、屈曲した黒い矢印として示す。ＶＥＥ非構造タンパク質遺伝子はレプリカーゼとして示す。ＧＦＰ、緑の蛍光性タンパク質；ｇｕｓ、β−グルクロニダーゼ遺伝子；Ｔ７遺伝子−１、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子；ｌａｃＺ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子；ｇＰ、Ｅ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１糖タンパク質；ｃａｐ、キャプシッド；ＤＨ−欠損ヘルパー；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム。スケールについては示さず。
【００５４】
図９：　プラスミドｐＤＦ１３、ｐＤＦ４９、ｐＤＦ５１、およびｐＧＫ６１の作製を示す概略図。斑点をつけた矢先はＨ５Ｒプロモーター（Ｐ−Ｈ５Ｒ）およびＧ８Ｒプロモーター（Ｐ−Ｇ８Ｒ）を示す。この図で、ＭＦ−１およびＭＦ−２はＭＶＡの「欠失ＩＩ」と指定される領域と相同の領域を示す。
図１０：　プラスミドｐＶＲ３およびｐＶＲＧＦＰの作製を示す概略図。斑点をつけた矢先は、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｐ−Ｔ７）およびアルファウイルスサブゲノムプロモーター（Ｐ−２６Ｓ）を示す。
【００５５】
図１１：　プラスミドｐＧＫ６３の作製を示す概略図。斑点をつけた矢先はバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｐ−Ｔ７）、Ｇ８Ｒプロモーター（Ｐ−Ｇ８Ｒ）、およびアルファウイルスサブゲノムプロモーター（Ｐ−２６Ｓ）を示す。
図１２：　プラスミドｐＧＫ６４およびｐＧＫ６５の作製を示す概略図。斑点をつけた矢先は、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｐ−Ｔ７）、ワクシニア合成初期／後期（Ｐ−Ｅ／Ｌ）および１１Ｋ（Ｐ１１Ｋ）プロモーターおよびアルファウイルスサブゲノムプロモーター（Ｐ−２６Ｓ）を示す。
【００５６】
図１３：　ＶＥＥはＭＶＡの後期の遺伝子発現を阻害する。ＢＨＫ−２１細胞を、組換えＭＶＡ単独の１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、またはＶＲＰ／ＧＦＰの１０感染単位（ＩＵ）、またはその両方と等価の感染多重度（ＭＯＩ）で感染し、次いで感染後（ｈｐｉ）２４時間で回収した。サイトシンベータ−ＤアラビノシダーゼまたはＡｒａＣ（４４μｇ／ｍｌ）を指示される場合に細胞に添加した。溶解物を調製し、次いでβ−ガラクトシダーゼ活性（ＯＤ４９０）に関してアッセイした。
【００５７】
図１４：　典型的な、ＭＶＡに基く誘導型ＶＲＰ−パッケージングシステムを用いるＶＲＰのパッケージング。約１×１０６の子供のハムスターの腎臓（ＢＨＫ）−２１細胞を、指示されるＭＯＩのＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰ（ＩＭＶＡ２）およびＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップ（ＩＭＶＡ１）で同時感染し、または別法として、レプリコン−ＧＦＰ　ＲＮＡ、キャプシドおよび糖タンパク質ＤＨ　ＲＮＡで同時感染した。感染およびトランスフェクト細胞培地中のＶＲＰ／ＧＦＰの力価を、３５ｍｍ　ｄｉｓｈ当たりのＶＲＰ／ＧＦＰのトータルのＩＵとして測定およびプロットした。バーの上の数は、細胞当たりのＶＲＰ／ＧＦＰの収量の平均の数を示す。
【００５８】
図１５：　典型的な、ＭＶＡに基く構造ＶＲＰ−パッケージングシステムを用いるＶＲＰのパッケージング。ＢＨＫ−２１細胞を、指示したＭＯＩのＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップおよびＭＶＧＫＴ７／ｇＰで同時感染し、または図５に示すように同時感染した。感染およびトランスフェクトした細胞からの培地を、ＶＲＰ／ＧＦＰに関してタイターした。タイターを、１×１０６細胞当たりのＶＲＰ／ＧＦＰのトータルのＩＵとしてプロットする。バーの上の数は、細胞当たりのＶＲＰ／ＧＦＰ収量の平均の数を示す。
【００５９】
図１６：　典型的な、ＭＶＡに基くＶＲＰ−パッケージングシステムによる構造タンパク質の発現を示す。約１×１０６のＢＨＫ−２１細胞を、５ＰＦＵの各ウイルス／細胞と等価のＭＯＩにて、ＭＶＧＫＴ７／ｇＰおよび／またはＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップ（構成型システム）またはＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰおよび／またはＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップ（誘導型システム）いずれかで感染した。別法として、ＢＨＫ−２１細胞をレプリコン−ＧＦＰ　ＲＮＡ、およびキャプシドおよび糖タンパク質ＤＨ　ＲＮＡで同時エレクトロポーレーションした（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）。（Ａ）細胞溶解物を２４時間で調製し、次いでＶＥＥ−特異的抗血清を用いるイムノブロッティングにより分析した。分子量マーカーを左に示す。キャプシッド、Ｅ２／Ｅ１に関して期待される免疫反応性タンパク質のバンドを右に示す。分子量マーカーのサイズを一番左に示す。ＭＷＭ、分子量マーカー；キャップ、感染されたＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップ；ｇＰ、感染したＭＶＧＫＴ７／ｇＰ；ＲＮＡ、エレクトロポーレーションされたスプリット−ヘルパーＲＮＡ；ＤＨｃａｐ、感染したＭＶＧＫＴ７／ｇＰ；ＤＨｇＰ、感染したＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰ。（Ｂ）感染およびトランスフェクトした細胞培地を回収し、次いで未処理のＢＨＫ−２１細胞に関してタイターした。３５ｍｍ　ｄｉｓｈ当たりのＶＲＰ／ＧＦＰのトータルのＩＵを測定した。バーの上の数は、細胞当たりに作製されたＶＲＰの平均数を示す。
【００６０】
図１７：　ＭＶＡの成長に関して有限である細胞系統におけるＶＲＰのパッケージング。約２．５×１０６の指定の細胞系統を、細胞当たり１０ＰＦＵのＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップおよびＭＶＧＫＴ７／ｇＰ各ウイルスで同時感染した。感染した細胞培地を感染後２４時間にてＶＲＰ／ＧＦＰに関してタイターし、次いでＴ−２５フラスコあたりに作製されたトータルのＩＵとしてプロットした。バーの上の数は、細胞当たりに作製されたＶＲＰの平均数を示す。
【００６１】
図１８：　（Ｂ．Ｍｏｓｓより得られた）ベクターｐＬＷ１７のヌクレオチド配列を示す。実施例１Ｂを参照されたい。（配列番号３）
図１９：　細胞へのレポーター遺伝子の送達に用いられる、ＭＶＡ組換え体の構築に用いるための、プラスミド輸送ベクター、ｐ２１０４を図示したものを示す。
図２０：　ｐ２１０４輸送ベクターの欠失ＩＩＩへの組換え後の、ＭＶＡ組換え体、ＩＭＶＡ３を図示したものを示す。
【００６２】
図２１：　ユニバーサルレプリコンタイトレーションシステムの概略図を示す。
図２２：　Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ（アルファウイルスおよびルビウイルス）の２つのメンバーおよびフラビウイルスの１つの典型的なウイルスのゲノムを示す。非構造性遺伝子を黒ぬりのボックス中に示し、および構造性遺伝子を斑点をつけたボックスとして示す。
【００６３】
図２３：　ＩＭＶＡ３−に基くＧＦＰインジケーターシステムを用いるＶＲＰｇＤのタイタリング。ベロ細胞のコンフルエント培養物を、ＩＭＶＡ３インジケーターウイルス（パネルＡおよびＣ）および／またはＶＲＰｇＤレプリコン粒子（パネルＢおよびＤ）で感染した。細胞を、感染後２４時間で、ＵＶ蛍光顕微鏡で観察した。
【００６４】
（好ましい具体例に関する詳細な記載）
本明細書に用いられるセクションの標題は、構成上の目的のみのためのものであり、記載される内容を制限するものと解釈されるべきではない。記事、書物、特許、および特許出願を含む本出願に引用される全引用は、いずれかの目的のために引用により特に組み込まれる。
【００６５】
定義
本明細書中に用いられる、「プラス鎖ＲＮＡウイルス」または「ｐｓＲＮＡＶ」なる用語は、プラス鎖ＲＮＡとして存在するＲＮＡウイルスを意味する。プラス鎖ＲＮＡウイルスには、制限されるものではないが、ロスリバーウイルス、セムリキ森ウイルス、シンドビスウイルス、およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスを含むアルファウイルス；制限されるものではないが、デングウイルスを含むフラビウイルス；制限されるものではないが、Ｃ型肝炎ウイルスを含むヘパシウイルス；制限されるものではないが、コロナウイルスを含むコロナウイルス科；および制限するものでないが風疹ウイルスを含むルビウイルスが含まれる。
【００６６】
「糖タンパク質」なる用語には、アルファウイルス糖タンパク質、ならびに他のプラス鎖ＲＮＡウイルスの機能的相同タンパク質が包含される。アルファウイルスタンパク質または遺伝子に関して用いられる場合の「糖タンパク質」なる用語は共に、アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質、アルファウイルスＥ２／Ｅ１糖タンパク質プレカーサー、および／またはＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１を含むアルファウイルスポリプロテインまたはその組み合わせを含んで、広範な意味に用いられる。
【００６７】
「レプリコン」なる用語は、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードする配列の代わりにｐｓＲＮＡＶゲノムに挿入された少なくとも一つの外来遺伝子を有する複製−欠損ｐｓＲＮＡＶを意味する。少なくとも一つの外来遺伝子は、ｐｓＲＮＡＶサブゲノムプロモーターに操作可能な状態で結合し、およびこうしてそれにより転写調節される。所定の具体例において、挿入された外来遺伝子は、ｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質をコードしている配列のいくつかのみに置き換わる。つまり、レプリコンは、外来遺伝子およびすべてではないがそのいくつかのｐｓＲＮＡＶ構造タンパク質の両者をコードする。
【００６８】
「ＤＨ　ＲＮＡ」とも呼ばれる「欠損ヘルパーＲＮＡ」なる用語は、複製に不可欠なシス−作用配列および１またはそれ以上の構造タンパク質遺伝子の転写のためのサブゲノムプロモーターを含むよう設計されているＲＮＡを意味する。構造タンパク質の発現は、ｐｓＲＮＡＶレプリカーゼ／トランスクリプターゼをトランスで提供することにより達成される。
【００６９】
本明細書中に用いられる場合、「外来遺伝子」なる用語は、その天然遺伝子環境から取り出され、異なる遺伝子環境に置かれた核酸配列を意味する。例えば、制限されるものではないが、アルファウイルスサブゲノムプロモーターに操作可能な状態で結合したヒトアミロイドペプチドをコードしている遺伝子、またはベネズエラウマ脳脊髄炎からのサブゲノムプロモーターに操作可能な状態で結合したシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子。本明細書中に用いられる「外来ポリペプチド」なる用語は、外来遺伝子によりコードされるポリペプチドをいう。
【００７０】
本明細書中に用いられるように、「免疫原性組成物」なる用語は、体液性または細胞性の免疫反応を刺激または高める１またはそれ以上の物質を意味する。そのような免疫原性組成物の例には、制限されるものではないが、免疫反応を刺激する、または高める抗原、Ｔ−細胞エピトープ、ペプチドまたはヌクレオチドが含まれる。
【００７１】
「操作可能な状態で結合した」なる用語は、プロモーターおよびコーディング配列の組み合わせを意味し、ここでプロモーターは、コーディング配列の発現を転写の段階で調節する。本明細書中に用いられる「異種構造プロモーター」なる用語は、プロモーターが天然に結合しているコーディング配列とは異なるコーディング配列に操作可能な状態で結合しているプロモーターを意味する。典型的な異種構造プロモーターは、原核生物、真核生物、またはウイルスのものであってよく、および制限されるものではないが、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ネズミ白血病ウイルスプロモーター、哺乳動物ｐｏｌ　Ｉプロモーター、哺乳動物ｐｏｌ　ＩＩプロモーター、および哺乳動物ｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターを含むｐｏｘウイルスプロモーターが含まれる。典型的な異種構造プロモーターには、エストロゲン応答プロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター、メタロチオネインプロモーター、カルシウム応答プロモーター、およびｌａｃプロモーターなどの誘導型プロモーターも含まれる。所定の具体例において、操作可能な状態で結合した異種構造プロモーターは、バクテリオファージコーディング配列に操作可能な状態で結合したワクシニアウイルスプロモーターである。所定の具体例により、アルファウイルスコーディング配列に操作可能な状態で結合したバクテリオファージプロモーターが提供される。
【００７２】
本明細書中に用いられる「医薬製剤」なる用語は、宿主に有効量で提供した場合に、宿主において予防、治療または緩和効果を生じる１またはそれ以上の物質を意味する。医薬製剤は、宿主において免疫応答を刺激してもしなくてもよい。そのような医薬製剤の例には、制限されるものではないが、インシュリン、成長ホルモン、モノカイン、サイトカイン、ビロカインをコードしているアルファウイルスレプリコン粒子、または遺伝子治療に所望される他の遺伝子が含まれる。
【００７３】
「ポリメラーゼ」なる用語は、鋳型依存的方法でヌクレオチドから核酸ポリマーを合成することができる酵素を意味する。作製される核酸ポリマーは鋳型に相補的である。ＤＮＡポリマーを合成するポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼと呼ばれるのに対して、ＲＮＡポリマーを合成するポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼと呼ばれる。さらに、ポリメラーゼは、それらがＤＮＡの鋳型またはＲＮＡの鋳型を用いて機能するかどうかに基いて類別される。つまり、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型を用いて、相補的ＲＮＡコピーを合成する。
本明細書中に用いる「ポリペプチド」なる用語は、少なくとも一つのペプチド結合により結合した２またはそれ以上のアミノ酸を意味する。この語は、一般的意味において、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含めるのに用いられる。
【００７４】
「レプリコン様ヘルパーＲＮＡ」なる用語は、転写されて、ｐｓＲＮＡＶ複製複合体が作用することができるヘルパーＲＮＡ鋳型を生じる配列を意味する。ｐｓＲＮＡＶ複製複合体中の一エレメント、ｐｓＲＮＡＶレプリカーゼは、ヘルパーＲＮＡ鋳型を用いて一本鎖の、ネガティブセンスの「アンチゲノム」を合成する。このアンチゲノムは、複製複合体の他のエレメント、ｐｓＲＮＡＶトランスクリプターゼのための鋳型として役立つ。トランスクリプターゼは、翻訳された場合、ｐｓＲＮＡＶキャプシッドタンパク質またはｐｓＲＮＡＶ糖タンパク質を生じるが、両方は製造しないｍＲＮＡを合成する。
【００７５】
「合成初期／後期プロモーター」なる用語は、転写プロモーターとして有用であり、かつ、プロモーターのファミリーの精密な突然変異生成に基く発現のために遺伝的に最適化されているヌクレオチド配列を意味する（例えば、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーター）。
【００７６】
「転写」なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型の相補的ＲＮＡコピーを合成するプロセスを意味する。
「翻訳」なる用語は、タンパク質が、ＲＮＡ鋳型、一般にはｍＲＮＡに基いて翻訳複合体により合成されるプロセスを意味する。
【００７７】
発明の典型的な具体例
本発明のパッケージングシステムは、ｐｓＲＮＡＶレプリコンおよびヘルパーＲＮＡまたは遺伝子を有している２つの組換えベクターでの同時感染に基く。これらのシステムは、インビトロで合成されるＲＮＡ分子のトランスフェクションを必要としない。本発明をより明確に例証すると、典型的な、組換えベクターに基くアルファウイルスレプリコン粒子パッケージングシステムは、バクテリオファージＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、変更されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）ベクター、およびＶＥＥを用いて作製される。誘導型および構成型両アルファウイルスレプリコン粒子パッケージングシステムが提供される。
【００７８】
２タイプのシステムの間の一つの違いは、ヘルパー機能ＲＮＡの構造である。いくらかの典型的な誘導型タイプのシステムにおいて、欠損ヘルパー（ＤＨ）ＲＮＡは、インデューサー、ＶＥＥレプリカーゼの存在下で複製および転写される場合、Ｔ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼにより翻訳され、次いで発現される。いくつかの典型的な構造性タイプのシステムにおいて、ヘルパー機能は、ワクシニアウイルスＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡとして転写され、次いで感染中に、ＶＥＥレプリカーゼがなくとも発現される。構造型パッケージングシステムは、操作して、バクテリオファージプロモーターの調節下に構造タンパク質遺伝子を発現させることもできる。
【００７９】
レプリコン粒子は、細胞がパッケージングシステムの組換えベクターの両方で同時感染された場合に作製される。作製されるレプリコン粒子は感染の一周期を開始することができる。しかし、外来遺伝子を含んでいるレプリコンゲノムのみがパッケージされるため、レプリコン粒子は生存能力のあるウイルスを形成することができない。これは、パッケージングシグナルを含むレプリコンおよびパッケージングシグナルを欠くヘルパーＲＮＡを発現するパッケージングシステムの作製から生ずるものである。
【００８０】
ｐｓＲＮＡＶレプリコンは、Ｔ７ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子と同じ組換えウイルスベクター上にはないので、レプリコンは、ポリメラーゼ遺伝子を含む第２の組換えウイルスベクターが細胞中に存在しない限り発現されない。さらに、ヘルパーＲＮＡでなくレプリコンのみがパッケージングシグナルを含む。従って、発現されたレプリコンのみがパッケージされて、感染粒子を産生する。
【００８１】
当業者は、バクテリオファージＴ７以外の源から得られるＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼが、ｐｏｘウイルスおよびＭＶＡおよびＶＥＥ以外のプラス鎖ＲＮＡウイルスからのもの同様、本発明の範囲内にあることを理解するであろう。さらに、所定のポリメラーゼ、ｐｏｘウイルス、またはｐｓＲＮＡＶに関する共通ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に加えて、変種からの配列、例えば、さらなる臨床単離物またはインビトロで作製された変種ウイルスが本発明中に企図される。さらにヌクレオチドコードの縮重により、多くの異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードする。つまり、縮重ヌクレオチド配列が、本発明の意図される範囲内にある。
【００８２】
より詳細には、構造型パッケージングシステムには、例として、構造型ＭＶＡベクター１（ＣＭＶＡ１、ＭＶＧＫＴ７／ｇｐとも呼ばれる）および構造型ＭＶＡベクター２（ＣＭＶＡ２、ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップとも呼ばれる）である２つの組換えｐｏｘウイルスベクターが含まれる（図３を参照されたい）。ＣＭＶＡ１は、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターに操作可能な状態で結合した、チミジンキナーゼ座に挿入されたＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているバクテリオファージＴ７遺伝子−１を含む。ＣＭＶＡ１は、ＭＶＡ欠失ＩＩＩに挿入されたワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターに操作可能な状態で結合したＶＥＥ　Ｅ２／Ｅ１オープンリーディングフレームをさらに含む（図３を参照されたい）。ＣＭＶＡ２は、ＭＶＡ欠失ＩＩＩに挿入されたワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターに操作可能な状態で結合したＶＥＥキャプシッドオープンリーディングルフレームを含む。ＣＭＶＡ２は、ＭＶＡ欠失ＩＩに挿入されたＴ７プロモーターに操作可能な状態で結合している、ｎｓＰｓおよび少なくとも一つの外来遺伝子を含んでいるアルファウイルスレプリコンをさらに含む（図３を参照されたい）。細胞をＣＭＶＡ１およびＣＭＶＡ２の両方で感染し、全長のレプリコンを転写するＴ７ポリメラーゼを作製する。キャプシッドおよびＥ２／Ｅ１ｍＲＮＡが直接ｍＲＮＡから翻訳され、レプリコンをキャプシッドに包むアルファウイルス構造タンパク質を産生し、こうしてアルファウイルスレプリコン粒子が産生する。構造性パッケージングシステムにおいてはヘルパー機能が、アルファウイルスレプリカーゼが存在しなくても転写されることに注目されたい。
【００８３】
例示的誘導型パッケージングシステムは、２つの組換えｐｏｘウイルスベクター：誘導型ＭＶＡベクター１（ＩＭＶＡ１、ＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップとも呼ばれる）および誘導型ＭＶＡベクター２（ＩＭＶＡ２、ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰとも呼ばれる）をさらに含む（図４を参照されたい）。ＣＭＶＡ１同様に、ＩＭＶＡ１は、チミジンキナーゼ座に挿入された、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターに操作可能な状態で結合したＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているバクテリオファージＴ７遺伝子−１を含む。ＣＭＶＡ１と対照的に、ＩＭＶＡ１は、ＭＶＡ欠失ＩＩＩに挿入された、Ｔ７プロモーターに操作可能な状態で結合したレプリコン様キャプシッドヘルパーＲＮＡをさらに含む。ＩＭＶＡ２は、ＭＶＡ欠失ＩＩＩに挿入された、Ｔ７プロモーターに操作可能な状態で結合したレプリコン様ヘルパーＥ２／Ｅ１ヘルパーＲＮＡを含む（図４を参照されたい）。ＩＭＶＡ２は、ＭＶＡの欠失ＩＩに挿入された、Ｔ７プロモーターに操作可能な状態で結合しているＶＥＥレプリコンをさらに含む（図４を参照されたい）。誘導型パッケージングシステムのレプリコン様ヘルパーＲＮＡのすべては、それらがヘルパータンパク質へと翻訳される前にアルファウイルスレプリカーゼにより複製されなければならない。つまり、ＩＭＶＡ１およびＩＭＶＡ２で感染した細胞は、アルファウイルスレプリカーゼが存在している場合にのみアルファウイルスレプリコン粒子を作製する。
【００８４】
ｐｓＲＮＡＶレプリコン粒子が一度作製されたら、細胞をレプリコン粒子、およびｐｓＲＮＡＶキャプシッドならびに糖タンパク質を発現しているＭＶＡ組換え体で同時感染させることによりそれらを増幅してよい。このシステムにおいて、ｐｓＲＮＡＶレプリコンを増幅できるが、それは新規なレプリコン粒子を形成するのに必要とされる構造遺伝子を欠く。構造タンパク質を発現しているＭＶＡ組換え体と同時感染すると、ｐｓＲＮＡＶレプリコンを有するレプリコン粒子が集合する。所定の具体例において、ＭＶＡ組換え体は異種構造プロモーターのコントロール下に各構造タンパク質を発現する。所定の具体例において、プロモーターはワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターまたは他の適当なｐｏｘウイルスプロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター、または細胞の細胞質において転写を指向することができる他のプロモーターである。所定の具体例において、バクテリオファージＴ７、Ｔ３またはＳＰ６を発現しているベクターをトランスで提供し、および／または宿主細胞中で安定して発現される。当業者は、すぐに、どのプロモーターが本明細書に開示する増幅システムにおいて適当であるかを理解するであろう。
【００８５】
当業者は、開示する実施例に従い、および通常の技術のみを用いて、別のポリメラーゼ、ｐｏｘウイルスベクター、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ｐｓＲＮＡＶ構造または非構造タンパク質配列、レプリコンおよびレプリコン様ヘルパーＲＮＡを、本発明の組み合えベクターおよびレプリコンパッケージングシステムに代わりに用いることができることを、過度の実験を行うことなく理解するであろう。そのような組換えベクターおよびパッケージングシステムは、本発明の範囲内にある。
【００８６】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、天然に生じる形態から異なる、種々のポリメラーゼおよびウイルス配列のポリペプチド類似体または誘導体、例えば、天然に生じる形態のアミノ酸の全てではないアミノ酸を含む欠失類似体、他の残基で置換された１またはそれ以上のアミノ酸を有する置換類似体、および天然に生じる配列に付加された１またはそれ以上のアミノ酸を有する付加類似体をコードする核酸配列をさらに含む。これらの種々の類似体は、それらが由来するポリメラーゼもしくはウイルス配列またはポリペプチドの生物学的特性のいくつかまたは全てが共通する。例えば、制限するものではないが、適当に、ＤＮＡ鋳型−指向ＲＮＡポリメライゼーション反応を触媒すること、操作可能な状態で結合したコーディング配列を転写の段階で調節すること、ｐｓＲＮＡＶ複製複合体を形成すること、ｐｓＲＮＡＶ「アンチゲノム」を転写すること、ｐｓＲＮＡＶ粒子を形成すること、など。当業者は、適当な類似体を設計し、およびインビトロアッセイシステムを用いて生物活性に関してそのような類似体を試験することができるであろう。
【００８７】
所定の好ましい具体例において、保存的アミノ酸置換がなされるであろう。保存的アミノ酸置換には、制限されるものではないが、所定のアミノ酸が、例えば同様の生理化学的または生物化学的特性を有する残基で置換されてよい変化が含まれる。そのような保存的置換の例には、制限されるものではないが、一の脂肪族残基の他の残基への、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａの相互置換、１の極性残基の他の極性残基との、例えばＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間などの置換、または一の芳香族残基の他の芳香族残基への、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒの相互置換が含まれる。例えば同様の疎水性特性を有する全領域の置換を含む他の保存的置換が周知である。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ， （Ｗｏｏｄ， Ｗ．Ｂ． Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ．Ｈ．， Ｂｅｎｂｏｗ， Ｒ． Ｍ．， ａｎｄ Ｈｏｏｄ， Ｌ． Ｅ．， ｅｄｓ．） Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ （１９８１）， ｐａｇｅ １４−１５を参照されたい。
【００８８】
所定の具体例において、類似体は天然に生じる共通配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一または相同である。当該分野で理解されるように、パーセント同一性は、アミノ酸または核酸配列間の関係に関する。特定の方法によりアドレスされるギャップ配列を用いて、２またはそれ以上の配列の間の同一適合の割合を決定する。パーセント同一性は、視覚的検査および／または数学的な予測により決定されてよい。別法として、２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７， １９８４）により記載され、ウイスコンシン　ジェネティクス　コンピューター　グループの大学（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターには、（１）ヌクレオチドのための（同一に関しては１の値を、および非同一に関しては０の値を含んでいる）ユニタリ比較行列、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３−３５８， １９７９により記載されるＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５， １９８６の重量比較行列；各ギャップに関して３．０のペンタルティおよび各ギャップにおいて各シンボルに関してさらに０．１０のペナルティ；（３）およびエンドギャップに関してペナルティなし、が含まれる。配列比較に関して当業者により用いられる他のプログラムも用いられてよい。
【００８９】
感染レプリコン粒子を得るための方法も提供される。所定の方法に従い、哺乳動物または昆虫細胞を、本発明の新規なパッケージングシステムを形成する組換えウイルスで感染する。ワクチン産生のために食品医薬品局により、使用に関して保証されているあらゆる細胞系統を用いてよい。制限されるものではないが、他の箇所に、引用文献（４３）、（４４）、および（４６）に記載されているＣＨＯ、ＣＨＬ、ＣＶ−１、２９３、ヒーラー、ＳＷ８３９、ＰＫ（１５）、ＭＤＣＫ、ＰＫ１３、ＲＡＢ−９、ＳＩＲＣ、Ｂａｌｂ３ｔ３、ＦＳ−２、ＭＩＢ、ＳＫ２９ＭＥＬ１、ＬＣ５、８５ＨＧ６６、Ｕ１３８、Ｃ８１６６、ＨＵＴ７８、ＳＹ９２８７、およびベロ細胞を含む、ＭＶＡの成長に関して有限であることが示されている他の細胞系統も、レプリコン粒子の産生のための適当な候補であり得る。好ましい哺乳動物細胞には、ＢＨＫ−２１細胞およびＦＲｈＬ細胞が含まれる（それぞれＡＴＣＣ　Ｎｏｓ．ＣＣＬ−１０およびＣＬ−１６０）。
【００９０】
同時感染した細胞をレプリコン粒子が作製されるのに適当な条件下でインキュベートする。当業者は、適当な条件が、例えば細胞系統ごとに、またはパッケージングシステムごとに変化してよいことを認識するであろう。当業者は、レプリコン粒子が生じるのに適当な条件を知るであろうし、または容易にそれを決定することができるであろう。そのような適当な条件には、例えば最適インキュベーション温度および時間、ＣＯ２濃度、成長培地、補充物、血清源および濃度、ＤＮＡ複製のインヒビター、ＡｒａＣなどが含まれてよい。
【００９１】
本発明の所定の具体例において、ｐｓＲＮＡＶの構造遺伝子を含んでいるベクターおよびレプリコン発現ベクターは、ウイルスベクターの代わりにプラスミドを用いて細胞に送達されることができる。ベクターは、当該分野で周知のトランスフェクション技術を用いて細胞に送達される。トランスフェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９）（３８）に開示されている。ｐｓＲＮＡＶ遺伝子の発現は、ｐｏｌＩプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーター、バクテリオファージプロモーター、および／または他の適当なプロモーターにより駆動されてよい。所定の具体例において、ｐｓＲＮＡＶ構造遺伝子およびレプリコンは、誘導型プロモーターであってもなくてもよいｐｏｌＩＩプロモーターのコントロール下にある。所定の具体例において、ｐｓＲＮＡＶ構造遺伝子およびレプリコンは、Ｔ７プロモーターなどのバクテリオファージプロモーターのコントロール下にある。このシステムにおいて、ｐｓＲＮＡＶ遺伝子の発現は、Ｔ７ポリメラーゼの発現に依存する。Ｔ７ポリメラーゼは、同時感染したプラスミドにより発現されてよく、または宿主細胞により安定して発現されてよい。いずれかのシステムを用いて、発現プラスミドをパッケージング細胞系統に同時感染し、次いでレプリコン粒子を細胞培地から回収する。
【００９２】
一度作製されたら、レプリコン粒子は、当該分野で周知の方法を用いて得られる。典型的な方法には、制限されるものではないが、沈降および等密度遠心分離を含む遠心分離、クロマトグラフィー、およびポリエチレングリコール、ＮａＣｌなどを用いる選択的沈殿などの沈殿法が含まれる。
【００９３】
レプリコン粒子をタイターする方法も提供される。所定の具体例において、ＭＶＡ組換え体を用いて、レポーター遺伝子を適当な細胞系統に送達する。細胞をレプリコン粒子で同時感染してレポーター遺伝子を活性化し、次いで同時感染した細胞を検出することができる。典型的な具体例では、ＭＶＡ組換え体を、それが緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする欠損ＶＥＥ　ＲＮＡを含むように作製する。レプリコン粒子と同時感染したとき、ＶＥＥレプリカーゼ−トランスクリプターゼ複合体が「ＶＥＥ様」ＲＮＡを複製および転写し、そして、ＧＦＰタンパク質が発現される。ＧＦＰを次いで検出することができ、そしてレプリコン粒子の力価を決定する。適当なレポーター遺伝子には、制限されるものではないが、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青の蛍光タンパク質、黄色の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコロニダーゼが含まれる。検出法には、制限されるものではないが、蛍光顕微鏡、化学ルミネセンス、抗体染色、酵素分析および比色染色が含まれる。
【００９４】
本発明の方法により作製されるレプリコン粒子は、レプリコン粒子中にコードされる外来ポリペプチドに少なくとも部分的に依存して、治療または予防免疫原性組成物として、または医薬製剤として用いることができる。少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列は所望により変更することができる。特定のレプリコン粒子の適用により、少なくとも一つの外来ポリペプチドをコードしている配列は、コファクター、サイトカイン（インターロイキンなど）、ヘルパー、インデューサー、細胞傷害性の、およびサプレッサーＴ細胞を含むＴ細胞のためのエピトープ、制限マーカー、アジュバント、病原性微生物、癌または腫瘍細胞由来のポリペプチド、アレルゲン、アミロイドペプチド、タンパク質または他の巨大分子成分をコードしてよい。
【００９５】
典型的な病原性微生物には、制限されるものではないが、ヒトおよびヒトでない脊椎動物に感染するウイルス、細菌、真菌、または寄生性の微生物が含まれる。
【００９６】
そのようなウイルスの例には、制限されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス、サルの免疫不全ウイルス、呼吸シンシチ・ウイルス、パラインフルエンザウイルスタイプ１−３、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピロマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、ミースルス（Ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、ムンプスウイルス、ルベラウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、カニンジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻（腔）気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染腹膜炎ウイルス、ニワトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、ブタの呼吸および生殖シンドロームウイルス、ウマの動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスが含まれる。
【００９７】
そのような細菌の例には、制限されるものではないが、ヘモフィルスインフルエンゼ（夾膜を持つものと持たないものの両方）、ヘモフィルスソムナス、モラクセラカタラリス（ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ストレプトコッカスニューモニア、ストレプトコッカスピオゲネス、ストレプトコッカスアガラクティエ、ストレプトコッカスフェカーリス、ヘリコバクターピロリ、ナイセリア髄膜炎、ナイセリア淋病、クラミジアトラコーマ、クラミジア肺炎、オウム病クラミジア、百日咳菌、サルモネラチフス、多剤耐性ネズミチフス菌、サルモネラコレラシス、エスケリキアコリ、シゲラ、ビブリオコレラ、コリネバクテリウムジフテリア、マイコバクテリウム結核、マイコバクテリウムアビウム−マイコバクテリウム細胞内複合体、プロテウスミラビリス、プロテウスブルガリス、スタフィロコッカスアウレウス、クロストリジウムテタニ、レプトスピラインタロガンス、ライム病気ボレリア、パスツレラヘモリチカ、パスツレラムルトシダ、アチノバシラス　シュードモニアおよびマイコプラズマガリセプチカムが含まれる。
【００９８】
そのような真菌の例には、制限されるものではないが、アスペルギルス、ブラストマイセス、カンジダ、コクシジオデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカスおよびヒストプラズマが含まれる。そのような寄生虫の例には、制限されるものではないが、リーシュマニア　メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、アスカリス、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ジアルジア、シストソーマ、クリプトスポリジウム、トリコモナス、トキソプラズマ　ゴンジイおよびカリニ肺炎が含まれる。
【００９９】
癌または腫瘍由来の典型的なポリペプチドには、制限されるものではないが、前立腺特異的抗原、癌胚抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３が含まれる。典型的なアレルゲンには、制限されるものではないが、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、菌の胞子、および薬物（例えばペニシリンなど）を含む、米国特許第５，８３０，８７７に開示され、および国際特許出願公開第９９／５１２５９号に記載されているものが含まれる。そのような成分は、アレルギー反応の公知の原因であるＩｇＥ抗体の産生を妨害する。
【０１００】
一の具体例において、外来ポリペプチドは、アルツハイマー病、アミロイドーシス、またはアミロイド形成疾患とも呼ばれる疾患に関係しているアミロイドペプチドタンパク質（ＡＰＰ）である。β−アミロイドペプチド（Ａ−ベータペプチドとも呼ばれる）は、ＡＰＰの４２のアミノ酸フラグメントであり、これは、βおよびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰのプロセッシングにより作製され、および以下の配列を有する。
【０１０１】
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ（配列番号１）
【０１０２】
いく人かの患者において、アミロイドの沈着は、集合したＡ−ベータペプチドの形態をとる。驚くべきことに、単離したＡ−ベータペプチドの投与により、脊椎動物の宿主におけるアミロイド沈着のＡ−ベータペプチド成分に対する免疫応答が誘導されることが、今や、見出されている（公開国際特許出願第９９／２７９４４号を参照されたい）。そのようなＡ−ベータペプチドは、関連のない部分にも結合した。つまり、本発明の異種構造ヌクレオチド配列には、このＡ−ベータペプチドならびにＡ−ベータペプチドのフラグメント、およびＡ−ベータペプチドまたはそのフラグメントに対する抗体の発現が含まれる。Ａ−ベータペプチドの一のそのようなフラグメントは、（Ｕ．Ｓ．特許第４，６６６，８２９に開示されるような）以下の配列を有する２８アミノ酸のペプチドである。
【０１０３】
Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ（配列番号２）
【０１０４】
いくらかの具体例の外来ポリペプチドは、単一の転写ユニットとして発現される配列を含んでもよい。しかし、さらなるモノシストロン的転写ユニットまたはポリシストロン的転写ユニットも含まれてよい。さらなるモノシストロン的転写ユニットおよびポリシストロン的転写ユニットの使用により、より多くの遺伝子情報の挿入が可能となる。例えば、ポリシストロン的転写ユニットが含まれる場合、配列は１またはそれ以上のリボゾームの挿入部位を含んでよい。別法として、外来遺伝子は、ポリタンパク質、およびポリタンパク質を切断してポリタンパク質の個々のポリペプチドを生じる十分数のプロテアーゼをコードしてよい。
【０１０５】
当業者は、本発明のレプリコン粒子を、医薬、抗原、免疫剤またはアジュバントと組み合わせて、疾患の予防または改善におけるワクチンとして用いてよい。これらの活性剤は、常套法により、すなわち、希釈剤または医薬上許容されるキャリアを用いることにより処方および送達されることができる。
【０１０６】
従って、本発明のさらなる具体例において、レプリコン粒子は、（ｉ）少なくとも一つのレプリコン粒子および（ｉｉ）少なくとも一つの医薬上許容されるバッファーまたは希釈剤、アジュバントまたはキャリアを含む免疫原性組成物中に用いられてよい。好ましくは、これらの組成物は、例えば制限するものでなく、感染性疾患、癌および他の悪性疾患、アレルギー反応、自己免疫疾患などを予防および／または改善することにおいて、免疫原性組成物としての治療的および予防的適用を有する。そのような適用において、本発明の少なくとも一つのレプリコン粒子の免疫学的に有効な量を用いて、疾患、反応、症状または悪性腫瘍の進行が実質上低下する。
【０１０７】
適当な医薬上許容されるキャリアおよび／または希釈剤には、いずれかおよび全ての常套の溶媒、分散培質、充填剤、固体キャリア、水溶液、コーティング、抗細菌剤および／または真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。「医薬上許容されるキャリア」なる用語は、アレルギー反応または他の都合の悪い効果を、投与された患者に引き起こさないキャリアを言う。適当な医薬上許容されるキャリアには、例えば、１またはそれ以上の水、塩水、リン酸緩衝塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組み合わせが含まれる。医薬上許容されるキャリアは、組成物の貯蔵寿命または有効性を高める湿剤または乳化剤、保存剤またはバッファーなどの補助物質の少量をさらに含んでよい。医薬上活性な物質のためのそのような媒質および剤の使用は、当該分野で周知である。いずれかの常套の媒質または剤が活性成分と非親和性であることを除き、本発明の免疫原性組成物におけるその使用が企図される。
【０１０８】
そのような免疫原性医薬製剤の投与は、鼻腔内、非経口（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内注射によるもの）、エアゾールスプレーによるなどの経口、鼻腔内、口、目、肺、膣、または直腸の表面などの粘膜表面への局所適用などのいずれかの常套の有効な形態によるものであってよい。
経口製剤には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、マグネシウムステアレート、ナトリウムサッカリン、セルロース、マグネシウムカーボネートなどのような通常用いられる賦形剤が含まれる。
【０１０９】
本発明の免疫原性組成物または医薬製剤は、制限されるものではないが、アルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）、ＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）；合成アジュバントＲＣ−５２９（アミノアルキルグルコサミンホスフェート誘導体；Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）；ＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）； ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰとも呼ばれるＣＧＰ１１６３７）；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれるＣＧＰ１９８３５Ａ）およびコレラ毒を含むアジュバントを含むことができる。用いられてよい他のものは、コレラ毒、そのＡサブユニット（公開国際特許出願第００／１８４３４に従い、例えば、アミノ酸の第２９位のグルタミン酸が他のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置き換えられている）、および／または少なくとも一つの外来ポリペプチドのコレラ毒またはそのＢサブユニットとの結合物または遺伝子操作された融合物、プロコレラゲノイド、真菌ポリサッカライドを含む、野生型コレラ毒と比べて低下した毒性を有するホロトキシンの非毒性誘導体である。
【０１１０】
本発明の一の重要な態様は、哺乳動物またはヒトの宿主において免疫反応を誘導するための方法であって、本発明の免疫原性組成物を宿主に投与することを含む方法に関する。免疫原性組成物の免疫学的有効量を投与すると、宿主は所望の免疫反応を生ずるであろう。投与量は、宿主個体のサイズ（重量）および発生段階などの特定の事情により変化し得る。この量は、当業者に公知の方法により、常套の試験にて決定することができる。
【０１１１】
確かに、本発明のパッケージングシステムおよび／または方法を用いて作製される単離外来ポリペプチドは、サブユニットワクチンを形成するのに用いられてよい。それらは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製するために、および本発明の外来ポリペプチドと反応する抗体の検出のための免疫アッセイにおいて、抗原として用いられてよい。本発明に包含される免疫アッセイには、制限されるものではないが、米国特許第４，３６７，１１０号（ダブルモノクローナル抗体サンドウィッチアッセイ）および米国特許第４，４５２，９０１号（ウェスタンブロット）に開示されているものが含まれる。他のアッセイには、標識されたリガンドの免疫沈降および、インビトロおよびインビボ両方での免疫細胞化学が含まれる。
【０１１２】
本発明により、対象である方法を手早く行うために設計されたキットも提供される。キットは、該方法を行うのに必要とされる２またはそれ以上の成分を集めることにより、目的の方法を手早く実行するのに都合のよいものとなっている。キットは好ましくは、最終使用者による測定に必要とされるものを最小に見積もった、予め測定された単位量にて成分を含む。キットは好ましくは、本発明の１またはそれ以上の方法を行うための使用説明書を含む。好ましくは、キットの成分は、互いに関連して機能するように最適化される。
【０１１３】
キットは、本明細書に開示されるパッケージングシステムを作製するのに、またはｐｓＲＮＡＶレプリコンに所望の外来遺伝子を挿入するのに用いてもよい。本発明のキットには、レプリコン粒子をタイターすることを促進するキットも含まれる。本発明の免疫原性組成物および医薬製剤は、開示されるキットを用いて調製されてよい。
【０１１４】
前記の発明は、実施例を引用することにより、よりよく理解され得る。以下の実施例は、例示的目的のみのために意図され、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。ＭＶＡおよびＶＥＥが典型的なｐｏｘウイルスおよびプラス鎖ＲＮＡウイルスシステムとしてそれぞれ用いられるが、当業者は他のｐｏｘウイルスおよびプラス鎖ＲＮＡウイルスを代わりに用いてよいことを、過度の実験を行なずに認識するであろう。つまり、他のｐｏｘウイルスおよび／またはアルファウイルスの使用が意図され、および本発明の意図される範囲内にある。ワクシニアウイルスの野生型株をＶＲＰをパッケージするのに用いることもできるが、広範な細胞におけるその細胞変性作用および有限でない成長が、その有用性を制限する。宿主の範囲が制限されているＮＹＶＡＣ株または天然に生じるｐｏｘウイルス（例えば、ニワトリのｐｏｘウイルス、パラｐｏｘウイルス、カプリｐｏｘウイルス（ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、レポリｐｏｘウイルス（ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、スイｐｏｘウイルス（ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、または昆虫ｐｏｘウイルス）を含むワクシニアウイルスの他の宿主範囲欠損変異体も、パッケージングベクターとして用いることができる。用いられてよい他のプラス鎖ＲＮＡウイルスには、制限されるものではないが、ルベラ、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス、コロナウイルスなどが含まれる。
【０１１５】
実施例
実施例１
材料および方法
１Ａ　感染初期に豊富なＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現することができる組換えＭＶＡベクターの開発
ドクター・バーナード・モス（Ｄｒ． Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓ）（ＮＩＡＩＤ）から得たＭＶＡ（２４）、（２３）、（２５）のストックをプラーク精製し、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加した最小必須培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、保証されたニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ；ＳＰＡＦＡＳ）において増幅した。このウイルスを、全外来遺伝子および発現カセットの挿入のための親として利用した。
【０１１６】
組換えＭＶＡ発現ベクター（ＭＶＧＫＴ７）を、感染初期に豊富な量のバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現させるために操作した（図２）。以下に示すように、ＶＥＥの同時感染はバクシニア後期プロモーターからの発現を制限するため、感染初期に豊富なレベルのＴ７ポリメラーゼを発現させることが必要であった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をｐＴ７−Ｎｅｏ（Ｄｒ． Ｓ． Ｌｅｅ， Ｗｙｅｔｈ Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓの提供）からＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、次いでｐＳＣ６５（（９）；Ｄｒ． Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍｏｓｓより入手）のＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＧＫ１６．２を作製した（図５を参照されたい）。当業者は、Ｔ７を他の源から得ることができることを理解するであろう。このプラスミドは、ＭＶＡのチミジンキナーゼ座への相同組換えのための隣接配列、ｌａｃ−Ｚマーカー遺伝子、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の転写を調節している合成初期／後期ワクシニアウイルスプロモーター（９）を含む。組換えウイルス、ＭＶＧＫＴ７は、既に開示されている方法（３６）を用いて作製した。簡単には、ＣＥＦを、細胞当たり０．５のプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）と等価の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＶＡを感染し、次いでＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてｐＧＫ１６．２でトランスフェクトした。組換えウイルスを３回連続してＣＥＦにおいて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）比色プラークアッセイ（８）、（２２）を用いてプラーク精製した。組換えウイルスの純度および安定度を、ウサギのポリクローナル抗−Ｔ７ポリメラーゼ抗体（Ｄｒ． Ｓ． Ｌｅｅの提供、Ｗｙｅｔｈ Ｌｅｄｅｒｌｅ ワクチン）およびワクシニアウイルス（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ）に対して作製したポリクローナル抗血清で免疫染色することによりアッセイした。当業者には、ポリクローナル抗−Ｔ７ポリメラーゼ抗血清が、市場入手可能なＴ７ポリメラーゼを用いて、常套の血清調製法にて容易に作製されることが分かるであろう。そのような方法の詳細な説明は、他の箇所、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８８に見出すことができる。
【０１１７】
１Ｂ．　誘導型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムの開発
外来ＤＮＡのＭＶＡの欠失ＩＩＩ（Ｂ． Ｍｏｓｓより入手された、（７））への挿入のために用いられる発現ベクタープラスミド、ｐＭＣＯ３を、ＢａｍＨＩで消化し、次いで再度ライゲートすることにより変更した（図６を参照されたい）。これにより、マーカー遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を転写するために用いられる７．５Ｋのプロモータを除去し、次いで、外来遺伝子を転写するために用いられる合成初期／後期プロモーターを、ＧＵＳの上流に移した。変更プラスミドｐＤＦ１７は、合成初期／後期プロモーター−ＧＵＳ遺伝子の上流に、ユニークなＰｓｔＩ部位を含む。欠陥−ヘルパー遺伝子カセットを、ｐＶキャップおよびｐＶｇＰとそれぞれ呼ばれるプラスミドｐＶ３０１４Δ５２０−７５０５Δ８４９５−１１２２９およびｐＶ３０１４Δ５２０−７５０５Δ７５６５−８３８６（ＡｌｐｈａＶａｘより入手、（２７））から誘導した。両ヘルパーを、実験室で誘導した、高度に減毒された、Ｅ１に一つの変異を（Ａ２７２Ｔ）、およびＥ２に２つの変異を（Ｅ２０９Ｋ、１２３９Ｎ）含み、未だ免疫原性であり、発現ベクターとして用いられている（１０）、（１２）ＶＥＥ変異体からオリジナルに単離した。プラスミドｐＶキャップおよびｐＶｇＰをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩでそれぞれ消化し、Ｔ７プロモーター−ヘルパー遺伝子カセットを切り出した（図７を参照されたい）。両カセットの末端を、ＰｓｔＩ−共通付着末端を含むように変更し、次いで個々に、ｐＤＦ１７のＰｓｔＩ部位にクローニングした。生じたプラスミドは、Ｔ７プロモーターの調節下にキャプシッド欠損ヘルパー（ｐＧＫ５１）または糖タンパク質欠損ヘルパー（ｐＧＫ５３）発現カセットのいずれかを含む（図７を参照されたい）。ＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップを得るための、ｐＧＫ５１のＭＶＧＫＴ７−感染細胞へのトランスフェクションにより（図８Ａ）、および、ＭＶＡ／ＤＨｇＰを得るための、ＭＶＡ−感染細胞へのｐＧＫ５３のトランスフェクションにより、組換えＭＶＡベクターを作製した。両組換えウイルスを、ＧＵＳ遺伝子発現に基く比色プラークアッセイ（７）を用いて選択した。これらのウイルスは、ＶＥＥレプリカーゼにより複製されない限りは、キャプシッドまたは糖タンパク質に翻訳されない欠損ヘルパーＶＥＥ　ＲＮＡを発現する。つまり、ヘルパーの発現が「誘導型」であると言える。
【０１１８】
誘導型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムの開発における第二段階は、全長のＶＥＥレプリコンをＴ７プロモーターのコントロール下に発現することができる組換えＭＶＡベクターを操作することであった。図９に示すように、いくつかの変更を、レプリコンｃＤＮＡのクローニングを可能とするために、ｐＬＷ１７（ＭＶＡの欠失ＩＩへの外来遺伝子の挿入を可能とする発現ベクター；Ｄｒ． Ｂ． Ｍｏｓｓより入手可能；図１８；配列番号３を参照されたい）に対して行なった。まず、ｐＬＷ１７をＳｍａＩおよびＰｓｔＩで消化して、外来遺伝子の発現のために用いられるワクシニアウイルスＨ５Ｒプロモーターを取り出し、次いでユニークなＮｏｔＩ制限部位をその場所に挿入して、ｐＤＦ１３を作製した（図９を参照されたい）。最終的な輸送ベクターへのクローニングを促進するために、ｐＤＦ１３の相同隣接領域の一つに存在するユニークなＸｂａｌ部位を消化により除去し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを補充し、次いで再度ライゲートした。生じたプラスミド、ｐＤＦ４９をＮｏｔＩで消化し、次いで、ユニークなＮｏｔＩ、Ｘｂａｌ、Ｓｓｅ８３８７１、ＳｍａＩおよびＳａｌＩ制限部位を含むポリリンカーを挿入してｐＤＦ５１を得た（図９を参照されたい）。ワクシニアウイルス中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）プロモーター（Ｇ８Ｒ）−ｌａｃＺ発現カセットをｐ３０／３００（Ｄｒ． Ｂ． Ｍｏｓｓから入手；（１））から得、そして、ｐＤＦ５１のポリリンカーに存在するＳｍａＩ部位に挿入して組換えウイルスの比色選択を可能とした。生じたプラスミド（ｐＧＫ６１）は、欠失ＩＩへの挿入のためのＭＶＡと相同の２つの領域、ｌａｃＺ比色マーカー遺伝子、およびＶＥＥレプリコンｃＤＮＡの指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングのための３つのユニークな制限部位（Ｓｓｅ８３８７１、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ）を含む（図９を参照されたい）。
【０１１９】
緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を発現することができるＶＥＥレプリコンベクターを、ＧＦＰ遺伝子をｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）からＳｍａＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして取り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでゆらぎ末端を補い、次いでｐＶＲ３（ＡｌｐｈａｖＶａｘから得られたｐＶＲ２００の誘導体）のＥｃｏＲＶ部位に挿入することにより構築した（図１０を参照されたい）。生じた発現プラスミド、ｐＶＲＧＦＰ（Ｄｒ． Ｌａｒｒｙ Ｓｍｉｔｈより提供：ＷｙｅｔｈＬｅｄｅｒｌｅ ワクチン）をＸｂａｌおよびＮｏｔＩで消化し、Ｔ７プロモーターが先行する全レプリコンゲノム−ＧＦＰを切り出した（図１０を参照されたい）。Ｔ７プロモータ−連結レプリコン−ＧＦＰフラグメントを次いでｐＧＫ６１に挿入してｐＧＫ６３を得た（図１１を参照されたい）。このプラスミドを次いでＭＶＡ／ＤＨｇＰ−感染細胞にトランスフェクトし、ＶＥＥレプリコン−ＧＦＰｃＤＮＡおよび糖タンパク質ヘルパー遺伝子をＴ７プロモーターの転写調節下に含む組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰ（図８Ａを参照されたい）を得た。
【０１２０】
１Ｃ．　構造型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムの開発
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、それぞれｐＶＲＣａｐおよびｐＶＲｇＰからのキャプシッドおよびＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質カセットのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）を増幅した。これらのフラグメントを次いでｐＤＦ３３（ｐＭＣＯ３から誘導された、欠失ＩＩＩＭＶＡ発現ベクター、（７））にクローニングした（図６および１２を参照されたい）。生じたプラスミドｐＧＫ６４およびｐＧＫ６５はキャプシッドまたはＥ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１ポリタンパク質ＯＲＦｓをそれぞれ、ワクシニアウイルス合成初期／後期プロモーターの調節下に含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＶＥＥ糖タンパク質を発現することができる組換えＭＶＡウイルスを、前記の方法を用いてｐＧＫ６５のＭＶＧＫＴ７感染ＣＥＦへのトランスフェクションにより作製した。生じたウイルス（ＭＶＧＫＴ７／ｇＰ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＶＥＥスパイク（ｓｐｉｋｅ）糖タンパク質を構成的に発現する（図８Ｂ）。
【０１２１】
キャプシッド遺伝子およびＶＥＥレプリコンＲＮＡを転写することができる別個の組換えＭＶＡウイルスを、２段階で操作した。まず、組換えＭＶＡウイルスを、ｐＧＫ６４に感染したＭＶＡ感染細胞から単離した。このウイルス（ＭＶＡ／キャップ）は、ＶＥＥキャプシッド遺伝子を、ＭＶＡの欠失ＩＩＩへ挿入した合成初期／後期プロモーターのコントロール下にＶＥＥキャプシッド遺伝子を含んでいる発現カセットを含む。次に、ｐＧＫ６３（前記実施例１Ｂより）をＭＶＡ／キャップを感染した細胞にトランスフェクトし、ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップを得た（図８Ｂ）。このウイルスはＶＥＥキャプシッド遺伝子を発現し、そしてＴ７プロモーター調節調節レプリコンＧＦＰ発現カセットも含む。
【０１２２】
１Ｄ．　ＶＲＰ−パッケージングＭＶＡの特定
組換えプラスミドを、ダイターミネーターサイクルシークエンシングおよび３７７ＡＢＩ　ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。組換えＭＶＡウイルスを、ＰＣＲ分析により、純度に関して検査した。Ｅ１およびＥ２糖タンパク質およびキャプシッドの発現を、ウェスタンブロット分析によりアッセイした。約２×１０６の子供のハムスターの腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞を、細胞当たり１０ＰＦＵと等価の感染多重度の組換えＭＶＡウイルスで感染し、次いで３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、細胞をＳＤＳ分解バッファー（０．０５Ｍトリス、４％ＳＤＳ、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー）中で煮沸し、次いで一部を、マウスの高免疫抗−ＶＥＥ血清（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を１：１，０００希釈で用いる免疫ブロッティングにより分析した。免疫ブロットは、アルカリホスファターゼ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ）に結合したウサギの抗−マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびウエスタンブルー基質（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて展開した。ＶＥＥ構造タンパク質の発現を、インビトロで転写されたＶＥＥレプリコン−ＧＦＰ　ＲＮＡ、ｇＰヘルパーおよびキャプシッドヘルパーＲＮＡを既に記載されているように用いて（１９）、（２７）、コ−エレクトロポーレートしたＢＨＫ−２１細胞にてさらに分析した（図１６を参照されたい）。
【０１２３】
１Ｅ．　ＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）の産生
サブゲノムプロモーターの調節下にＧＦＰ遺伝子を発現する、ＶＲＰ／ＧＦＰとも呼ばれるＶＥＥレプリコン粒子を、ＢＨＫ−２１細胞をＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップおよびＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰ（典型的な誘導型システム；図４を参照されたい）またはＭＶＧＫＴ７／ｇＰおよびＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップ（典型的な構造性システム；図３を参照されたい）で同時感染させることにより得た。典型的には、組換えウイルスを１時間、振動しつつ、室温にて最小体積の移植片に吸着させた。感染細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、次いで１０％の子ウシ血清（ＦＢＳ）を含む変更イーグル培地（ＭＥＭ）中でインキュベートした。レプリコン粒子を２４時間、３，０００×ｇの遠心分離を１０分間用いて感染した細胞培地から回収した。ＶＲＰ／ＧＦＰ調製物の連続希釈を、新鮮なＢＨＫ−２１細胞にてアッセイし、次いで、ＩＵ／ｍとして表現される力価を、ウェル当たりの蛍光細胞のトータルの数を適当な希釈にて計測することにより決定した。
【０１２４】
ＶＲＰ調製物中の組換えＭＶＡヘルパーウイルスの力価を、ＣＥＦを連続希釈した細胞培地で感染し、細胞を２％のホルムアルデヒドで感染後４８時間にて固定し、次いでその後、抗ワクシニアウイルス抗血清（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ）で、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単層を免疫染色し、次いでＡＥＣペルオキシダーゼ基質キット（Ｅｎｚｏ）で染色することにより決定した。組換えＭＶＡヘルパーウイルスの力価は、ＰＦＵ／ｍｌとして表した。汚染している可能性のある、ヘルパーＲＮＡおよびレプリコンの間の組換えから生じる複製−コンピテントＶＥＥを、ナイーブなベロ細胞における３連続希釈の継代後に、ベロ細胞において通常のプラークアッセイによりアッセイした。このアッセイにより、第２継代後のウイルスの成長に基いて、レプリコン粒子と複製コンピテントウイルスが区別される。
【０１２５】
実施例２
ＭＶＡおよびＶＥＥの同時感染の特徴づけ
ＭＶＡ感染細胞のＶＥＥ同時感染が、ｐｏｘウイルスの初期および／または後期の遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを評価するために、ウイルス初期プロモーター（ＭＶＡ／７．５ＫｌａｃＺ）または後期プロモーター（ＭＶＡ／１１ＫｌａｃＺ）のコントロール下にｌａｃＺを発現する２つの組換えＭＶＡウイルスを用いて、ＶＥＥの同時感染を用いて、または用いずに細胞を感染した。ＢＨＫ−２１細胞を１０ＰＦＵのＭＶＡ／７．５ＫｌａｃＺまたはＭＶＡ／１１ＫｌａｃＺを細胞単独当たりに用いて、または１０ＩＵをＶＲＰ／ＧＦＰの細胞当たりに用いて感染した。細胞を感染後２４時間で回収し、ｐｏｘウイルス遺伝子発現の尺度であるβ−ガラクトシダーゼの活性に関してアッセイした（図１３を参照されたい）。図１３のサンプル１および３において検出されたβ−ガラクトシダーゼのレベルは、ＭＶＡの感染中の正常な初期および後期遺伝子の発現をそれぞれ示すものである。サイトシン−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシド（ＡｒａＣ）、ＭＶＡ　ＤＮＡの複製を遮断する薬物の添加により、初期ではなく後期に遺伝子が阻害されることを示す（図１３、サンプル２〜４を比較）。細胞のＭＶＡ／１１ＫｌａｃＺおよびＶＲＰ／ＧＦＰでの同時感染は、ＶＥＥの複製がＡｒａＣと同様の、後期の遺伝子発現における効果を有することを示す。β−ガラクトシダーゼの発現は、ほぼ９５％まで同時感染した細胞中で低下した（図１３、サンプル３、４、および７を比較）。これは、ＭＶＡ　ＤＮＡの複製および／または後期遺伝子の転写がＶＥＥの複製により阻害されることを示す。ＭＶＡ初期遺伝子発現は、後期遺伝子発現よりも少ない程度ではあるが、ＶＲＰ／ＧＦＰでの同時感染によっても低下した（図１３、サンプル１〜６を比較）。
【０１２６】
ＶＥＥの複製におけるＭＶＡの感染の効果を決定するために、同様の実験を行なった。（表１を参照されたい）。ＢＨＫ−２１細胞を、ＶＲＰ／ＧＦＰを単独で、またはＭＶＡと組み合わせて感染した。感染後２４時間で、細胞をＧＦＰの発現に関して、ＦＡＣスキャン（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ３．１スフトウェアを用いるフローサイトメトリーにより分析した。ＧＦＰ蛍光の強度は、ＶＥＥサブゲノムプロモーターの転写のレベルに直接比例する。驚くべきことに、ＶＲＰ／ＧＦＰおよびＭＶＡで同時感染させた細胞は、ＶＲＰ／ＧＦＰ単独で感染させた細胞よりも少なくとも５０−６０％多くのＧＦＰを発現した。これにより、１またはそれ以上のＭＶＡ遺伝子産物がＶＥＥの複製および／または転写を促進または刺激するようであることが示唆される（表１を参照されたい）。
【０１２７】
図１３および表１に示す結果は、１）ワクシニアウイルス強い初期プロモーター（例えば、合成初期／後期（９）、Ｈ５Ｒ（４８）、Ｐｓｅ１（４７））を用いてＶＥＥレプリコンおよび構造遺伝子を発現させることができること、２）ＶＲＰ−パッケージングＭＶＡの成長は、ＶＥＥレプリコンのパッケージング中にかなり損なわれ、それにより、ＶＲＰのＭＶＡでのアデノウイルス汚染のリスクが減ること、および３）ＭＶＡの感染が進行している間に、ＶＥＥの複製および結果としておこる粒子の形成が高まる可能性があることを示唆する。
【０１２８】
実施例３
誘導型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムの特徴づけ
ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ＤＨｇＰ（ＩＭＶＡ１）およびＭＶＧＫＴ７／ＤＨキャップ（ＩＭＶＡ２）での同時感染（図４を参照されたい）により得られる力価を、常套のスプリット−ヘルパーＲＮＡトランスフェクション法で作製されたものと比較した。ＢＨＫ−２１細胞を、それらはＶＲＰの最高の力価を生じることが示されているので、パッケージングのための細胞基質として選択した。しかし、ＢＨＫ−２１細胞は、それらはＭＶＡの成長を十分に許容するので、ＭＶＡ−に基くＶＲＰ−パッケージングシステムを用いるＶＲＰの大量生産に適当ではない。ＢＨＫ−２１細胞を、１、１０、または２０のトータルＰＦＵ／細胞のＭＯＩにて、誘導型パッケージングシステムを構成している２つの組換えＭＶＡベクターで感染した。別法として、細胞を、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで合成されたＶＥＥ−レプリコン−ＧＦＰ　ＲＮＡ、キャプシッドＤＨ　ＲＮＡ、およびｇＰ　ＤＨ　ＲＮＡでコ−エレクトロポーレートした。
【０１２９】
感染およびエレクトロポーレートした細胞からの培地を２４時間にて回収し、新鮮なＢＨＫ−２１細胞にてタイターした。追加的に、いくつかの原感染およびエレクトロポーレート細胞をトリプシン処理し、回収時に、細胞当たりの基準におけるＶＲＰの産生を算定するべく計測した。結果は、誘導型のＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムが平均２０−６０のＶＲＰ／細胞を産生するのに対して、ＲＮＡトランスフェクション法によっては、約１５ＶＲＰ／細胞が得られることを示した（図１４を参照されたい）。
【０１３０】
ＭＶＡ−に基くＶＲＰパッケージングシステムは、スプリット−ヘルパーＲＮＡトランスフェクション法よりも多くのＶＲＰを製造するが、複製コンピテントウイルスがレプリコンパッケージングプロセス中に生じる可能性があるので、生物学的安全性の問題は残る。これは、誘導型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムおよびインビトロＲＮＡトランスフェクション法が、レプリコンで組換えることができるＤＨ　ＲＮＡを用いるという事実によるものである。
【０１３１】
実施例４
構造型の、ＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムの特徴づけ
アルファウイルスの感染中のＲＮＡ種間の組換えの割合は、複製１サイクル当たり１０−６であると見積もられている（３）。さらに、ヘルパーＲＮＡの末端における複製配列の長さとレプリコンＲＮＡとの組換えの見込みには直接の関連があると考えられている（２７）。スプリット−ヘルパー発現システムを用いて複製−コンピテントウイルスを作製するために、２つの組換え現象が必要であり、見込みが１０−６から１０−１２へとかなり減る。しかし、単一の組換え現象によっては、構造遺伝子の両方ではないが一つを、外来遺伝子に加えて発現することができるゲノムを有するかなりの割合のＶＲＰを生じる。これらの粒子は、ベクター特異的免疫反応を誘導することにより、組換えＶＲＰでの繰り返される免疫化を理論的に排除することができる。理論上は、ヘルパー遺伝子がＤＨ　ＲＮＡの代わりに、ＶＥＥ−特異的調節エレメントを欠く個々のｍＲＮＡとして発現されることができれば、組換えによりレプリコン−コンピテントＶＥＥが生じる見込みはさらに低下するであろう。さらに、単一の組換え現象がヘルパーｍＲＮＡとＶＥＥレプリコンの間に起これば、ヘルパー遺伝子を発現する見込みは、それはサブゲノムプロモーターを欠くために、わずかなものであろう。
【０１３２】
同一ベクターによるＶＥＥキャプシッドおよび糖タンパク質の構造型同時発現が組換えＭＶＡの成長を阻害することが、予備実験で認められた。キャプシッドおよび糖タンパク質遺伝子を別個の組換えベクターに挿入することにより、正常な力価へと成長する安定な組換えＭＶＡウイルスが単離された（＞１０８ＰＦＵ／ｍｌ）。ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップ（ＣＭＶＡ２）およびＭＶＧＫＴ７／ｇＰ（ＣＭＶＡ１；典型的な構造型システム；図８Ｂを参照されたい）で同時感染させたＢＨＫ−２１細胞中に産生されるＶＲＰ／ＧＦＰの力価を決定するために、およびそれらをスプリット−ヘルパーＲＮＡトランスフェクション法により得られる力価と比較するために、最初の実験を行った。感染は、細胞当たり１、１０、または２０ＰＦＵのトータルのウイルスと等価のＭＯＩにて行った。感染し、および形質転換した細胞からの培地を２４時間にて回収し、次いでＶＲＰ／ＧＦＰの力価を決定した。構造型組換えＭＶＡウイルスでの同時感染により、１×１０６細胞当たり２×１０８ＩＵ、または細胞当たり約１９０ＶＲＰ／ＧＦＰの高さの力価を得た（図１５を参照されたい）。このシステムにより、ＤＨ　ＲＮＡトランスフェクション法よりも高いＶＲＰタイターを得た。
【０１３３】
組換えレプリコンおよびヘルパー機能をトランスフェクトプラスミドとして提供することにより、ＶＲＰをさらに作製した。ＢＨＫ−２１細胞を、プラスミドの以下の組み合わせで感染した。ｐＧＫ６３＋ｐＧＫ５１＋ｐＧＫ５３またはｐＧＫ６３＋ｐＧＫ６４＋ｐＧＫ６５。続いて、トランスフェクト細胞をＭＶＧＫＴ７で感染した。トランスフェクト／感染細胞からの培地をＶＲＰ／ＧＦＰに関して、２４時間にてタイターした。ＶＲＰ／ＧＦＰのタイターは、ＶＥＥレプリコン−ＧＦＰ　ＲＮＡおよび２つのスプリット−ヘルパーＲＮＡの同時感染により得られるものに匹敵した（データは示していない）。
【０１３４】
実施例５
ＭＶＡ−に基くＶＲＰパッケージングシステムおよびＲＮＡのエレクトロポーレーションを用いる構造タンパク質の発現の比較
ＭＶＡ−に基くＶＲＰパッケージングシステムおよびＲＮＡエレクトロポーレーション法により作製されるアルファウイルスキャプシッドタンパク質および糖タンパク質の量を決定するために、感染およびエレクトロポーレート細胞からの溶解物を、イムノブロッティングにより分析した。感染後２４時間で、細胞溶解物を調製し、抗−ＢＥＥ抗血清でプローブした。図１６に示すように、キャプシッド（Ｃａｐ）、Ｅ１、およびＥ２（ｇＰ）の発現は、誘導型のＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムまたはＲＮＡエレクトロポーレーションで感染した細胞よりも構造型のＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムで感染した細胞においてわずかに高い。図１６Ａは、ＶＥＥ構造遺伝子の発現が、細胞を典型的な誘導型組換えＭＶＡウイルスの両方で同時感染させる場合にのみ可能であることをも示す。これに対して、個々の構造型組換えＭＶＡウイルスにおけるそれぞれの構造型遺伝子は、同時感染とは独立して発現される（図１６Ａを参照されたい、レーン３、４および５をレーン７、８および９と比較されたい）。最終的に、感染およびトランスフェクト細胞培地をＶＲＰ／ＧＦＰの存在に関してタイターした（図１６Ｂ）。結果は、ＶＲＴタイターと、各パッケージングシステムにより作製される構造タンパク質の量の間に直接関連があることを示唆する。
【０１３５】
実施例６
ＭＶＡの成長に関して有限である細胞における、ＶＲＰのパッケージング
ＢＨＫ−２１細胞は、ＭＶＡの成長を十分に許容するので、それらはＭＶＡに基くＶＲＰパッケージングシステムにとって理想的な細胞系統ではない。ＭＶＡの成長に関して有限である細胞のパネルを、ＶＲＰパッケージング実験にて試験した。同数の細胞を、１０ＰＦＵ／細胞のＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／ｃａｐおよびＭＶＧＫＴ７／ｇＰ（構造性システム）で感染し、次いで２４時間インキュベートした。感染細胞からの培地を回収し、次いでＶＲＰ／ＧＦＰの力価を新鮮なＢＨＫ−２１細胞に関して測定した。図１７に示すように、２つのヒトの細胞系統（ＭＲＣ−５およびＷＩ３８）、１つのハムスター細胞系統（ＣＨＯ）、およびヒトでない霊長類の細胞系統（ベロ）により、ＢＨＫ−２１細胞を用いて得られたものよりも有意に低いＶＲＰの力価を得た。驚くべきことに、アカゲザル胎児の肺（ＦＲｈＬ）細胞は、ＢＨＫ−２１と同じ高さのＶＲＰ／ＧＦＰ力価を生じた。
【０１３６】
実施例７
ＭＶＡの成長が、ＶＲＰ−パッケージング中に厳格に阻害される。
ＭＶＡ−に基くＶＲＰパッケージングシステムを用いる一つ可能性のある制限は、ほとんどのＭＶＡウイルスは細胞に結合したままであるが、ＶＲＰが細胞膜から生じるとしても、ＶＲＰの調製物がＭＶＡの組換え体で汚染し得ることである。実施例２に示すように、ＭＶＡ後期遺伝子の発現はＶＥＥの複製により阻害される。ＭＶＡの成長阻害のレベルを測定するために、ＢＨＫ−２１細胞（ＭＶＡの成長を許容する）またはＦＲｈＬ細胞（ＭＶＡの成長に関して有限である）をＭＶＧＫＴ７／ｇＰ単独またはＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャップと共に感染した。ＭＶＧＫＴ７／ｇＰ単独での感染ではＶＥＥの複製もＶＲＰの産生も生じない。ＭＶＡ／ＶＥＥＧＦＰ／キャプとの同時感染はしかし、ＶＥＥレプリコンの複製およびＶＲＰの作製を生じる（図１５を参照されたい）。単一感染および同時感染細胞からの培地を感染後２４時間にて回収し、次いで組換えＭＶＡウイルスをＣＥＦ上に関してタイターした。宿主範囲の成長制限が、ＭＶＧＫＴ７／ｇＰ単独で感染したＦＲｈＬ細胞において明らかに示される（表２）。例えば、ＶＥＥ複製の不在下では、ＢＨＫ−２１およびＦＲｈＬ細胞において作製される平均ＰＦＵ／細胞はそれぞれ４３５および０．６ＰＦＵ／細胞であった。ＭＶＡＧＫＴ７／ｇＰおよびＭＶＡＶＥＥＧＦＰ／キャップで同時感染した場合、平均のＰＦＵ／細胞はＢＨＫ−２１細胞において１．１へと減じ（通常許容される）、およびＦＲｈＬ細胞において０．００７まで減じた。つまり、実施例２で得られた結果と一貫して、ＶＥＥの複製中においてＭＶＡの成長が大いに低下する。
【０１３７】
実施例８
ＭＶＡインディケーターウイルスを用いてＶＲＰをタイターする方法
このセクションには、ＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）をタイターするための方法であって、これらの粒子をパッケージングすることにおいて用いられるものと同様の組換えＭＶＡウイルスを使用するものを記載する。簡単には、ＭＶＡ組換え体を用いて、培地中で成長している適当な細胞系統にレポーター遺伝子を送達する。これらの細胞をレプリコン粒子と同時感染させることにより、ＭＶＡインディケーターウイルスのレポーター遺伝子が活性化し、感染細胞を検出、計測することができ、次いで調製のための力価を測定することができる。
【０１３８】
このタイターリングシステムは、研究、遺伝子発現、およびワクチンの産生のためのＶＲＰの使用における重要な必要性を満たす。現在のところ、ＶＲＰの調製をタイターする唯一の実際的な方法は、外来タンパク質、またはＶＲＰによりコードされる外来タンパク質上に操作されたタグに対して指向された抗体を用いる免疫細胞化学によるものである。しかし、特異的遺伝子産物に対する抗体は常に入手可能とは限らず、そして、抗体を作製することは免疫原の単離および精製を必要とする長いプロセスである。
【０１３９】
このアッセイは、ＶＥＥ　ＲＮＡを複製および転写するＶＥＥ非構造タンパク質（ｎｓＰｓ）を全機能性レプリコン粒子がコードするという事実を利用するものである。機能性ｎｓＰをアッセイすることにより、このアッセイは、それらが発現する外来遺伝子生成物とは無関係に、ＶＲＰの力価を測定することができる。これにより、特に、免疫検出による検出の感受性が調製物間でかなり異なる場合に、ＶＲＰの調製物間の比較がより迅速になる。
【０１４０】
そのようなＭＶＡウイルスインディケーターなどの構築のためのプラスミド輸送ベクター（ｐ２１０４）を、図１９に図示する。それは２つの遺伝子カセット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をファージＴ７転写プロモーターのコントロール下にコードしている欠損ＶＥＥ　ＲＮＡをコードしている遺伝子、および選択可能なマーカーとして、ワクシニア合成初期／後期プロモーターのコントロール下のグルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子から成る。欠損ＶＥＥ　ＲＮＡの構造は、前記の「レプリコン−様ヘルパーＲＮＡ」と同様である。つまり、作製されるＲＮＡは、ＶＥＥウイルスＲＮＡのものと同一の５’および３’末端を有し、ｎｓＰｓをコードしているＶＥＥの領域の９０％は削除され、およびＶＥＥサブゲノムプロモーターは、タンパク質生成物の合成を指向する。しかし、ＶＥＥ糖タンパク質またはＶＥＥキャプシッドタンパク質のどちらかをコードする代わりに、このＲＮＡはＧＦＰレポータータンパク質をコードする。ｇｕｓ遺伝子は、組換えウイルスの単離を可能とするのに役立つ。ｐ２１０４中のこれらの２つの遺伝子カセットには、このプラスミドのＭＶＡの欠失ＩＩＩへの組換えを指向するＭＶＡ配列が隣接している。ｐ２１０４プラスミドは、すでにＲ７ＲＮＡポリメラーゼをチミジンキナーゼ座において合成初期／後期プロモータ下にコードする（ＭＶＧＫＴ７；図２を参照されたい）ＭＶＡの欠失ＩＩＩへ再結合する。生じるウイルス（ＩＭＶＡ３、図２０）を滴定アッセイにおけるインジケーターとして用いる。
【０１４１】
ユニバーサルレプリコンタイタリングシステムを図２１に示す。ＭＶＡに関しては非許容性であるが、ＶＥＥの複製に関しては許容性である細胞系統を用いる（例えば、ベロ）。細胞を、培養中の全細胞を確実に感染するため、５の多重度でＩＭＶＡ３インジケーターウイルスで感染する。Ｔ７プロモーター（Ｔ７Ｐｒ）を認識し、そしてＧＦＰ（ｎｓＰ−ＧＦＰ）をコードしている欠損「ＶＥＥ−様」ＲＮＡを転写するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、このウイルスは合成する。翻訳の開始はこのＲＮＡの５’末端から約５００塩基であり、およびいくつかのストップコドンはＧＦＰオープンリーディングフレームの前に位置しているので、ＧＦＰはこのＲＮＡからは翻訳されない。ＭＶＡインジケーター感染培養物を、非公知の力価の連続希釈のＶＲＰ調製物で同時感染する。ＶＲＰは、ＭＶＡインジケーター感染細胞の細胞質に、すぐに翻訳されてｎｓＰ遺伝子によりコードされるＶＥＥレプリカーゼ−トランスクリプターゼ複合体を作製するそのレプリコンＲＮＡを送達する。ＶＥＥレプリカーゼは欠損ＧＦＰ　ＲＮＡの複製を開始し、そしてマイナス鎖（アンチセンス）複製中間体上に存在するサブゲノムプロモーターをさらに転写する。これにより、大量の、ＧＦＰをコードしているｍＲＮＡ（サブゲノムＧＦＰ　ＲＮＡ）の合成を生じる。ＧＦＰｍＲＮＡの翻訳が、細胞はＵＶ光下に蛍光を発するのを引き起こす。蛍光細胞を計測し、次いでＶＲＰｓの原ストックの力価を、外挿法により決定する。
【０１４２】
ＩＭＶＡ３インジケーターウイルスを、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＶＲＰｇＤ）を発現しているＶＥＥレプリコン粒子をタイターするその能力に関して試験した。ベロ細胞のコンフルエント培養物に、１０ＰＦＵ／細胞と等価のＭＯＩのＩＭＶＡ３で、または１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＫのＩＭＶＡ３＋非公知の力価の連続希釈のＶＲＰｇＤ調製物で感染した。細胞を感染後２４時間にて、２％のホルムアルデヒドで固定し、次いで蛍光顕微鏡で視覚化した（図２３）。結果は、レプリコン粒子およびＩＭＶＡ３インジケーターウイルスの両方で細胞を同時感染しない限り、ＧＦＰが発現されないことを示す。図２３のパネルＣは、ＶＲＰｇＤ希釈シリーズにおける典型的なフィールドを示す。
【０１４３】
ＶＥＥの複製とＭＶＡ遺伝子発現の間の干渉は、我々がすでに実施例２に示されるデータ（表１）を用いて、ＭＶＡの感染により実際にＶＥＥの複製が増すことを確立しているため、問題ではない。我々は、ＶＥＥにより阻害されるのは後期ＭＶＡ遺伝子の発現のみであることも示した（図１３）。従って、このアッセイは、初期ならびに後期に機能するワクシニアプロモーターを使用する。
【０１４４】
シンドビスウイルスレプリコンに関するユニバーサルアッセイが既に開示されている（５３）。このシステムは、その転写が細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのコントロール下にあるレポーター遺伝子をコードしている欠損ＲＮＡを用いる。このシステムを用いるために、転写産物を発現している安定な細胞系統を単離することがまず必要である。安定な哺乳動物細胞系統の単離は、時間を消費し、かつ困難な仕事である。ＭＶＡに基くレポーターシステムは、そのようなアッセイを設定する労力を減らす。
【０１４５】
実施例９
レプリコン粒子を増幅するための方法
アルファウイルスレプリコン粒子を新たに作製する方法としてのその有用性に加えて、ＭＶＡ発現ベクターを用いてアルファウイルスレプリコン粒子を増幅することも可能である。アルファウイルスレプリコン粒子の調製物を増幅するために、細胞系統（例えば、アカゲザルの胎児の肺、またはＦＲｈＬ）を、パッケージングに必要とされる構造遺伝子を発現する低ＭＯＩ（１−５ＩＵ／細胞）およびより高ＭＯＩのＭＶＡ組換えウイルス（５−２０ＰＦＵ／細胞）のレプリコン粒子調製物で同時感染する。感染後２４−４８時間にて、培地を回収し、次いで新たにパッケージされたレプリコン粒子を実施例１に記載のように精製する。
【０１４６】
以下は、あらゆる目的のために本明細書中に特に組み込まれる引用文献のリストである。
１． Ｂａｌｄｉｃｋ， Ｃ， Ｊ．， Ｊ． Ｇ． Ｋｅｃｋ， ａｎｄ Ｂ， Ｍｏｓｓ． １９９２． Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｅ， ｓｐａｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｌａｓｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ． Ｊ， Ｖｉｒｏｌ． ６６：４７１０−４７１９．
２． Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｎ．， Ａ． Ｍｉｔｔｅｒｅｒ， Ｗ． Ｍｕｎｄｔ， Ｊ． Ｅｉｂｌ， Ｍ； Ｅｉｂｌ， Ｒ． Ｃ． Ｇａｌｌｏ， Ｂ． Ｍｏｓｓ， ａｎｄ Ｆ． Ｄｏｍｅｒ． １９８９． Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＨＩＶ−１ ｇｐ １６０ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． ５：１５９−１７１．
３． Ｂｅｒｇｌｕｎｄ， Ｐ；， Ｍ． Ｓｊｏｂｅｒｇ， Ｈ． Ｇａｒｏｆｆ， Ｇ． Ｊ． Ａｔｋｉｎｓ， Ｂ． Ｊ． Ｓｈｅａｈａｎ， ａｎｄ Ｐ． Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ． １９９３． Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｎｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ： ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． １１ ：９１６−９２０．
４． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｔ． Ｊ．， Ａ． Ａｌｃａｍｉ， Ｐ． Ａｎｄｒｅａ， ａｎｄ Ｇ． Ｌ． Ｓｍｉｔｈ． １９９８． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌａｃｋｓ ｓｅｖｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ａ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７９：１１５９−１１６７．
５． Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ， Ｐ． Ｊ．， Ｉ． Ｆｒｏｌｏｖ， Ｃ； Ｍ． Ｒｉｃｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ． １９９３．　Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｈｅｌｐｅｒ ＲＮＡｓ． Ｊ， Ｖｉｒｏｌ． ６７：６４３９−６４４６．
６． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９７， Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＭＶＡ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ： ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． ｖｉｒｏｌｏｇｙ： １９８−２１１．
７． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ， Ｗ．， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９５． Ｅ， ｃｏｌｉ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ （ＧＵＳ） ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｎｕｓｅｓ． Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９：３５２−３５４．
８． Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ， Ｓ．， Ｋ， Ｂｒｅｃｈｌｉｎｇ， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９８５． Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ： Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｐｍｖｉｄｅｓ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｐｌａｑｕｅｓ； Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， Ｂｉｏｌ． ５：３４０３−３４０９．
９． Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ， Ｓ．， Ｊ． Ｒ． Ｓｉｓｔｅｒ， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９７． Ｃｏｍｐａｃｔ， ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ， ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２３： １０９４−１０９７．
１０． Ｄａｖｉｓ， Ｎ． Ｌ．， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｎ；， Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ， Ｇ．Ｆ．， Ｗｉｌｌｉｓ， Ｌ．Ｖ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ．Ｊ．Ｂ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｆ．， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｒ，Ｅ． １９９１． Ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ： Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １８３： ２０−３１．
１ １． Ｄａｖｉｓ， Ｎ， Ｌ，， Ｗｉｌｌｉｓ， Ｌ．Ｖ，， Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｆ，， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｒ．Ｅ． １９８９． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｖｉａｂｌｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．　１７１ ： １８９−２０４．
１２． Ｄａｖｉｓ， Ｎ． Ｌ．， Ｋ． Ｗ． Ｂｒｏｗｎ， ａｎｄ Ｒ． Ｅ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， １９９６． Ａ ｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｃｏｓａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７０：３７８１−３７８７．
１３， Ｄｒｅｘｌｅｒ， Ｉ．， Ｋ． Ｈｅｌｌｅｒ， Ｂ． Ｗａｈｒｅｎ， Ｖ， Ｅｒｆｌｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｓｕｔｔｅｒ． １９９８．　Ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｉｎ ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ， ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７９：３４７−３５２．
１４． Ｆｒｏｌｏｖ， Ｉ．， Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｔ．Ａ．， Ｐｒａｇａｉ， Ｂ．Ｍ．， Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ．， Ｈｕａｎｇ， Ｈ．Ｖ．， Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ， Ｓ．， Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． １９９６． Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＳＡ． ９３：１１３７１ −１１３７７．
１５， Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ．， ａｎｄ Ｋ． Ｊ． Ｌｉ， １９９８． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９．
１６， Ｈｅｗｓｏｎ， Ｒ． ２０００． ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ： ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ． ６：２８−３５．
１７． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｒ， Ｅ；， ａｎｄ Ｃ； Ｊ． Ｐｅｔｅｒ， １９９６． Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ， ３ ｅｄ， ｖｏｌ． １． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
１８． Ｋｕｈｎ， Ｒ， Ｊ．， Ｈ． Ｇ． Ｍ， Ｎｉｅｓｔｅｒｓ， Ｚ， Ｈｏｎｇ， ａｎｄ Ｊ； Ｈ， Ｓｔｒａｕｓｓ， １９９１．　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｆｒｏｍ Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １８２：４３０，４４１．
１９． Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ， Ｐ．， ａｎｄ Ｈ； Ｇａｒｏｆｆ． １９９１， Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃｏｎ． Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ９： １３５６−１３６１．
２０． Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ， Ｐ．， Ｓ， Ｌｕｓａ， Ｄ． Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ， ａｎｄ Ｈ． Ｇａｒｏｆｆ． １９９１． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｏｆ Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ： ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ６，０００−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｖｉｒｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ６５．
２１． Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， Ｋ． １９９７； Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ８．
２２． Ｍａｃｋｅｔｔ， Ｍ．， Ｇ． Ｌ． Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９８４． Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７−８６４．
２３． Ｍａｙｒ， Ａ．， Ｖ． Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ， ａｎｄ Ｈ， Ｓｔｉｃｋｌ． １９７５． Ａｂｓｔａｍｍｕｎｇ， ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ｕｎｄ ｖｅｒｗｅｎｄｕｎｇ ｄｅｓ ａｔｔｅｎｕｉｅｒｔｅｎ ｖａｃｃｉｎｉａ−ｓｔａｍｍｅｓ ＭＶＡ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ３：６−１４．
２４． Ｍａｙｒ， Ａ．， ａｎｄ Ｅ． Ｍｕｎｚ． １９６４． Ｖｅｒａｎｄｅｒｕｎｇ ｖｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｖｉｒｕｓ ｄｕｒｃｈ ｄａｕｅｒｐａｓｓａｇｅｎ ｉｎ ｈｕｈｎｅｒｅｍｂｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｅｎｋｕｌｔｕｒｅｎ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ （Ａ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓｅｓ）， Ｚｂｌ， Ｂａｋｔ． Ｏｒｉｇ． Ｉ， １９５：２５−３５．
２５， Ｍａｙｒ， Ａ．， Ｈ． Ｓｔｉｃｋｌ， Ｈ． Ｋ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｋ． Ｄａｎｎｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｓｉｎｇｅｒ． １９７８， Ｄｅｒ ｐｏｃｋｅｎｉｍｐｆｓｔａｍｍ ＭＶＡ： Ｍａｒｋｅｒ， ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ ｓｔｒｕｋｔｕｒ， ｅｒｆａｈｎｒｕｎｇｅｎ ｍｉｔ ｄｅｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｅｎ ｓｃｈｕｔｚｉｍｐｆｕｎｇ ｕｎｄ ｖｅｒｈａｌｔｅｎ ｉｍ ａｂｗｅｈｒｇｅｓｃｈｗａｃｈｔｅｎ ｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ． Ｔｈｅ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ＭＶＡ： Ｍａｒｋｅｒ， ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｇａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｂｉｌｉｔａｔｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， Ｚｂｌ； Ｂａｋｔ． Ｈｙｇ， １６７：３７５−３９０．
２６． Ｐｏｌｏ， Ｊ． Ｍ，， Ｂ． Ａ． Ｂｅｌｌｉ， Ｄ． Ａ． Ｄｒｉｖｅｒ， Ｉ， Ｆｒｏｌｏｖ， Ｓ， Ｓｈｅｒｒｉｌｌ， Ｍ． Ｊ． Ｈａｒｉｈａｒａｎ， Ｋ． Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｓ． Ｐｅｒｒｉ， Ｓ， Ｊ， Ｍｅｎｔｏ， Ｄ． Ｊ． Ｊｏｌｌｙ， Ｓ． Ｍ． Ｗ． Ｃｈａｎｇ， Ｓ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ， ａｎｄ Ｔ． Ｗ． Ｄｕｂｅｎｓｋｙ． １９９９． Ｓｔａｂｌｅ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ； Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ， ＵＳＡ． ９６：４５９８．４６０３．
２７． Ｐｕｓｈｋｏ， Ｐ．， Ｍ． Ｐａｒｋｅｒ， Ｇ． Ｖ． Ｌｕｄｗｉｇ， Ｎ． Ｌ． Ｄａｖｉｓ， Ｒ． Ｅ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｓｍｉｔｈ． １９９７， Ｒｅｐｌｉｃｏｎ−ｈｅｌｐｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２３９：３８９−４０１．
２８． Ｍｅｙｅｒ， Ｈ．， Ｇ． Ｓｕｔｔｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｍａｙｒ． １９９１． Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ＭＶＡ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１０３１−１０３８．
２９． Ｒａｊｕ， Ｒ．， Ｓ． Ｖ； Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ， ａｎｄ Ｍ； Ｈａｊｊｏｕ． １９９５． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ６９：７３９１−７４０１，
３０． Ｒｉｃｅ， Ｃ． Ｍ， １９９６． Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
３１， Ｒｉｃｅ， Ｃ， Ｍ，， Ｒ． Ｌｅｖｉｓ， Ｊ， Ｈ． Ｓｔｒａｕｓｓ， ａｎｄ Ｈ． Ｖ． Ｈｕａｎｇ． １９８７．　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ：　ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ， ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ６１ ：３８０９−３８１９．
３２． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ， Ｓ．， ａｎｄ Ｍ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ． １９９６， Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ： Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ３ｒｄ ｅｄ， ｖｏｌ． Ｉ． Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
３３． Ｓｍｅｒｄｏｕ， Ｃ．， ａｎｄ Ｐ， Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ． １９９９， Ｔｗｏ−ｈｅｌｐｅｒ ＲＮＡ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７３：１０９２−１０９８．，
３４． Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｊ． Ｈ．， ａｎｄ Ｅ． Ｇ． Ｓｔｒａｕｓｓ． １９９４． Ｔｈｅ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ： Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ５８：４９１−５２；
３５． Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｊ． Ｈ．， ａｎｄ Ｅ， Ｇ； Ｓｔｒａｕｓｓ． １９９７． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ８：８５−９４；
３６． Ｓｕｆｆｅｒ， Ｇ．， ａｎｄ Ｂ． Ｍｏｓｓ． １９９２． Ｎｏｎｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅｓ． Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ；． ＵＳＡ． ８９： １０８４７−１０８５１．
３７． Ｗｅｉｓｓ； Ｂ． Ｇ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ． １９９１． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：４０１７−４０２５．
３８． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｔ． １９８９． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）．
３９． Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｔ． １９９３ （ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｕｇｕｓｔ ２０００）．　Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．
４０． Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｔ， ２０００． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．
４１． Ａｎｔｏｉｎｅ， ｅｔ ａｔ． １９９８． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｓｔｒａｉｎ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４４： ３６５−９６．
４２． Ａｎｔｏｉｎｅ， Ｇ．， Ｆ． Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ， Ｇ． Ｈｏｌｚｅｒ， Ｔ． Ｈａｎｇｍａｎｎ， Ｆ． Ｇ． Ｆａｌｋｎｅｒ， ａｎｄ Ｆ． Ｄｏｍｅｒ． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ＭＶＡ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ． Ｇｅｎｅ：４３−４６．
４３． Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｔ． Ｊ．， Ａ． Ａｌｃａｍｉ， Ｐ． Ａｎｄｒｅａ， ａｎｄ Ｇ． Ｌ． Ｓｍｉｔｈ． １９９８． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌａｃｋｓ ｓｅｖｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｒｎｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ａ ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７９：１１５９−１１６７．
４４， Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ，， ａｎｄ Ｂ， Ｍｏｓｓ． １９９７． Ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｍＶＡ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ： ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９８−２１１．
４５． Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ， Ｓ，， Ｊ， Ｒ． Ｓｉｓｌｅｒ， ａｎｄ Ｂ， Ｍｏｓｓ． １９９７． Ｃｏｍｐａｃｔ， ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ， ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２３：１０９４−１０９７．
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５３． Ｏｌｉｖｏ， Ｐ．Ｄ．， Ｆｒｏｌｏｖ， Ｉ．， ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ， Ｓ． １９９４． Ａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ： ａ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８： ３８１−３８４．
５４． Ｓｔｒａｕｓｓ， Ｊ．Ｈ．， ａｎｄ Ｓｔｒａｕｓｓ． ２００１， Ｅ，Ｇ， Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ： Ｈｏｗ Ｄｏｅｓ ａｎ Ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｋｅ ａ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｃｅｌｌ １０５： ５−８．
５５． Ｂｅｈｒｅｎｓ， Ｓ．Ｅ，， Ｇｒａｓｓｍａｎｎ， Ｃ．Ｗ，， Ｔｈｉｅｌ， Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｙｅｒｓ， Ｇ．， ａｎｄ Ｔａｕｔｚ， Ｎ． １９９８． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃｏｎ． Ｊ， Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２３６４−２３７４．
５６， Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ， Ｔ．， Ｌｏｈｍａｎｎ， Ｖ．， Ｒｕｔｔｅｒ， Ｇ．， Ｋｕｒｐａｎｅｋ， Ｋ．， ａｎｄ Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ， Ｒ． １９９１． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡｓ． Ｊ， Ｖｉｒｏｌ． ７５： １２５２−１２６４．
５７． Ｋｈｒｏｍｙｋｈ， Ａ．Ａ．， Ｖａｍａｖｓｋｉ， Ａ．Ｎ．， ａｎｄ Ｗｅｓｔａｗａｙ， Ｅ，Ｇ． １９９８． Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ Ｋｕｎｊｉｎ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ Ｋｕｎｊｉｎ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ５９６７−５９７７．
５８． Ｐｏｒｔｅｒ， Ｄ，， Ａｎｓａｒｄｉ， Ｄ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｒｒｏｗ， Ｃ． Ｄ． １９９５． Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ ｇａｇ Ｇｅｎｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗｈｉｃｈ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ Ｐ１ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓ． Ｊ， Ｖｉｒｏｌ， ６９： １５４８−１５５５．
５９． Ａｌｍａｚａｎ， Ｆ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｊ．Ｍ．， Ｐｅｎｚｅｓ， Ｚ．， Ｉｚｅｔａ， Ａ．， Ｃａｌｖｏ， Ｅ．， ａｎｄ Ｐｌａｎａ−Ｄｕｒａｎ， Ｊ． ２０００． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ａｓ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ． ＰＮＡＳ ９７： ５５１６−５５２１
本発明は、種々の適用、方法および組成物に関して記載されているが、種々の変化および変更が本発明から外れることなくなされてよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルファウイルス複製サイクルのステップを示している概略図を示す。
【図２】ＭＶＧＫＴ７発現ベクターを図示したものである。ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ制限マップを示す。組換えポリヌクレオチドおよび外来遺伝子の挿入に有用なＭＶＡ欠失ＩＩおよびＩＩＩも示す。
【図３】典型的なアルファウイルスレプリコン粒子構成型パッケージングシステムを図示したものである。
【図４】典型的なアルファウイルスレプリコン粒子誘導型パッケージングシステムを図示したものである。
【図５】プラスミドｐＧＫ１６．２の作製を示す図表である。
【図６】プラスミドｐＤＦ１７、ｐＤＦ３０、およびｐＤＦ３３の作製を示す概略図である。
【図７】プラスミドｐＧＫ５３およびｐＧＫ５１の作製を示す概略図である。
【図８】典型的なｐｏｘウイルスに基くアルファウイルスレプリコン粒子パッケージングシステムにおいて用いられる組換えＭＶＡのゲノムを図示したものである。（Ａ）誘導型システム。（Ｂ）構成型システム。
【図９】プラスミドｐＤＦ１３、ｐＤＦ４９、ｐＤＦ５１、およびｐＧＫ６１の作製を示す概略図である。
【図１０】プラスミドｐＶＲ３およびｐＶＲＧＦＰの作製を示す概略図である。
【図１１】プラスミドｐＧＫ６３の作製を示す概略図である。
【図１２】プラスミドｐＧＫ６４およびｐＧＫ６５の作製を示す概略図である。
【図１３】ＶＥＥはＭＶＡの後期の遺伝子発現を阻害することを示す図である。
【図１４】典型的な、ＭＶＡに基く誘導型ＶＲＰ−パッケージングシステムを用いるＶＲＰのパッケージングを示す図である。バーの上の数は、細胞当たりのＶＲＰ／ＧＦＰの収量の平均の数を示す。
【図１５】典型的な、ＭＶＡに基く構造ＶＲＰ−パッケージングシステムを用いるＶＲＰのパッケージングを示す図である。バーの上の数は、細胞当たりのＶＲＰ／ＧＦＰ収量の平均の数を示す。
【図１６】典型的な、ＭＶＡに基くＶＲＰ−パッケージングシステムによる構造タンパク質の発現を示す図である。（Ａ）細胞溶解物を２４時間で調製し、次いでＶＥＥ−特異的抗血清を用いるイムノブロッティングにより分析した。（Ｂ）感染およびトランスフェクトした細胞培地を回収し、次いで未処理のＢＨＫ−２１細胞に関してタイターした。バーの上の数は、細胞当たりに作製されたＶＲＰの平均数を示す。
【図１７】ＭＶＡの成長に関して有限である細胞系統におけるＶＲＰのパッケージングを示す図である。バーの上の数は、細胞当たりに作製されたＶＲＰの平均数を示す。
【図１８】（Ｂ．Ｍｏｓｓより得られた）ベクターｐＬＷ１７のヌクレオチド配列を示す。
【図１９】細胞へのレポーター遺伝子の送達に用いられる、ＭＶＡ組換え体の構築に用いるための、プラスミド輸送ベクター、ｐ２１０４を図示したものを示す。
【図２０】ｐ２１０４輸送ベクターの欠失ＩＩＩへの組換え後の、ＭＶＡ組換え体、ＩＭＶＡ３を図示したものを示す。
【図２１】ユニバーサルレプリコンタイトレーションシステムの概略図を示す。
【図２２】Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ（アルファウイルスおよびルビウイルス）の２つのメンバーおよびフラビウイルスの１つの典型的なウイルスのゲノムを示す。非構造性遺伝子を黒ぬりのボックス中に示し、および構造性遺伝子を斑点をつけたボックスとして示す。
【図２３】ＩＭＶＡ３−に基くＧＦＰインジケーターシステムを用いるＶＲＰｇＤのタイタリングを示す図である。細胞を、感染後２４時間で、ＵＶ蛍光顕微鏡で観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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