(57)【要約】本発明は混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するための方法を記載する。この方法では、そのような混合物をアニオン−交換クロマトグラフィー媒体に添加する。ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖分子は、溶出塩（アニオンおよびカチオンを含む）、バッファーおよび好ましくは有機溶媒を含む移動相で溶出する。溶出は、ヘテロ二本鎖を少なくとも部分変性させるために効果的な条件下（例えば、熱的または化学的変性）で行い、ホモ二本鎖からのヘテロ二本鎖の分離をもたらす。この方法は限定するわけではないが突然変異の検出および比較ＤＮＡスクリーニングを含む多くの応用を有する。
2004514874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するためのクロマトグラフィー法であって、
（ａ）混合物をアニオン−交換固体に添加し、
（ｂ）工程（ａ）の固体を、溶出塩、有機溶媒およびバッファーを含有する移動相で溶出し、該溶出は該ヘテロ二本鎖が少なくとも部分的に変性するために効果的な条件下で行い、そしてこの溶出が該ホモ二本鎖から該ヘテロ二本鎖の分離をもたらす、
工程を含んで成る上記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が工程（ａ）の固体を、
等濃度の：
ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムまたはそれらの混合物から成る群から選択されるカチオン、ここでアルキル基は、メチルおよびエチルの任意の組み合わせから成り；および
ブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネート、またはそれらの混合物から成る群から選択されるアニオン；
を含む溶出塩；
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；および
有機溶媒；
ここで溶出塩の濃度は約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げられる、
を含んで成る４〜９の範囲のｐＨを有する移動相と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶出塩を約１．０Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記カチオンが、アルキル基がメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成るジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記カチオンがコリンを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
上記カチオンがグアニジンを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
上記カチオンがナトリウムを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
上記アニオンがホルメートまたはクロライドである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
上記移動相が金属キレート剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
上記金属キレート剤が、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロム ブラックＴ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサール−ビス（２−ヒドロキシアニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、メタルフタレイン、アルソン酸、α，α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、β−ヒドロキシキナルジン、β−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α，α’，α”−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、ロジゾン酸、サリチルアルドキシム、サリチル酸、タイロン、４−クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバルバミン酸ナトリウム、ジベンジルジチオカルバミン酸亜鉛、デフェロキサミンメシラート、クラウンエーテルおよび上記の任意の１以上の混合物から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記固体がシリカ、多糖または合成ポリオレフィン骨格から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ポリオレフィンがポリスチレンまたはポリアクリル酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記固体がポリアクリル酸骨格を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記固体がジエチルアミノエチル官能基を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記固体がポリエチレンイミン官能基を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
固体が約１０ミクロンから２ミクロンの間の平均直径を持つ粒子を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記固体が実質的に非孔質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記固体がポリスチレン骨格を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記移動相が、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ホルムアミド、２−プロパノールおよびＮ−メチルピロリドンから成る群から選択される有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記移動相が約４０容量％未満の上記有機溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
上記溶出を約５０℃より高いカラム温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
上記溶出を約４０℃から約８０℃の間のカラム温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
上記溶出塩の濃度を連続的に上げる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
上記ＤＮＡ分子の濃度について溶出工程（ｂ）後の移動相を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
上記ＤＮＡ分子の濃度が、約２５０ｎｍ〜約２９０ｎｍのおよその波長範囲で紫外線吸収により測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記方法を完了するために必要な全時間が、約２分から約３０分の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
上記固体が、約２ミクロンから１０ミクロンの間の平均直径の粒子を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
上記固体が円筒形状のカラム内に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するためのクロマトグラフィー法であって、
（ａ）混合物をアニオン−交換固体に添加し、
（ｂ）工程（ａ）の固体を、溶出塩およびバッファーを含有する移動相で溶出し、ここで該溶出は該ヘテロ二本鎖が少なくとも部分的に変性するために効果的な条件下で行い、そしてこの溶出が該ホモ二本鎖から該ヘテロ二本鎖の分離をもたらす、
工程を含んで成る上記方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）が工程（ａ）の固体を、
等濃度の：
ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウム成る群から選択されるカチオン、ここでアルキル基はメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成り；および
ブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネートから成る群から選択されるアニオン；
からなる溶出塩；および
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；
ここで溶出塩の濃度を約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、
を含んで成る４〜９の範囲のｐＨを有する移動相と接触させることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
上記カチオンが、アルキル基がメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成るジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
上記アニオンがブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネートから成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
上記カチオンがコリンを含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
上記カチオンがナトリウムを含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
上記移動相が金属キレート剤を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
上記金属キレート剤が、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロム ブラックＴ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサール−ビス（２−ヒドロキシアニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、メタルフタレイン、アルソン酸、α，α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、β−ヒドロキシキナルジン、β−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α，α’，α”−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、ロジゾン酸、サリチルアルドキシム、サリチル酸、タイロン、４−クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバルバミン酸ナトリウム、ジベンジルジチオカルバミン酸亜鉛、デフェロキサミンメシラート、クラウンエーテルおよび上記の任意の１以上の混合物から成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
上記カチオンがグアニジンを含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
上記アニオンがホルメートまたはクロライドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
溶出塩を約１．０Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＮＡの存在についてカラムから溶出した移動相を分析することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
上記溶出を約５０℃より高いカラム温度で行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
上記溶出を約４０℃から約８０℃の間のカラム温度で行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
二本鎖核酸のアニオン−交換クロマトグラフィーに有用な水性移動相であって、
等濃度の：
ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択されるカチオン、ここでアルキル基はメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成り；および
ブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネートから成る群から選択されるアニオン；
からなる０．５〜１．５Ｍのおよその濃度範囲の溶出塩；および
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸、この酸は約０．０５Ｍを越えない濃度を有し；および
有機溶媒、この有機溶媒は該移動相の約４０容量％を越えない濃度を有する、
を含んで成る上記移動相。
【請求項４４】
二本鎖核酸のアニオン−交換クロマトグラフィーに有用な水性移動相であって、
等濃度の：
ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択されるカチオン、ここでアルキル基はメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成り；および
ブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネートから成る群から選択されるアニオン；
からなる１．０Ｍ〜２．０Ｍのおよその濃度範囲の溶出塩；および
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸、この酸は約０．０５Ｍを越えない濃度を有し；
有機溶媒、この有機溶媒は該移動相の約４０容量％を越えない濃度を有する、
を含んで成る上記移動相。
【請求項４５】
上記カチオンが、アルキル基がメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成るジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択される、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
上記アニオンがホルメートまたはクロライドである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
上記カチオンがコリンを含んで成る、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
上記カチオンがナトリウムを含んで成る、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４９】
上記移動相が金属キレート剤を含んで成る、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５０】
上記金属キレート剤が、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロム ブラックＴ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサール−ビス（２−ヒドロキシアニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、メタルフタレイン、アルソン酸、α，α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、β−ヒドロキシキナルジン、β−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α，α’，α”−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、ロジゾン酸、サリチルアルドキシム、サリチル酸、タイロン、４−クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバルバミン酸ナトリウム、ジベンジルジチオカルバミン酸亜鉛、デフェロキサミンメシラート、クラウンエーテルおよび上記の任意の１以上の混合物から成る群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
上記カチオンがグアニジンを含んで成る、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項４３に記載の移動相とアニオン−交換固体の組み合わせを含んで成る組成物。
【請求項５３】
上記固体が、シリカ、多糖または合成ポリオレフィン骨格から成る、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
上記ポリオレフィンがポリスチレンまたはポリアクリル酸である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
上記移動相がメタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ホルムアミド、２−プロパノールおよびＮ−メチルピロリドンから成る群から選択される有機溶媒を含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５６】
上記移動相が、約４０容量％未満の上記有機溶媒を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
上記固体がジエチルアミノエチル官能基を含んで成る、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５８】
上記固体がポリエチレンイミン官能基を含んで成る、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５９】
固体が約２ミクロンから１０ミクロンの間の平均直径を持つ粒子を含んで成る、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６０】
上記組成物を約５０℃より高い温度で維持する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６１】
上記組成物を約５０℃より高い温度で維持する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項６２】
上記組成物を約５０℃より高い温度で維持する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項６３】
上記組成物を約５０℃より高い温度で維持する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６４】
混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するためのクロマトグラフィー法であって
（ａ）混合物をアニオン−交換固体に添加し、
（ｂ）工程（ａ）の固体を、溶出塩、有機溶媒およびバッファーを含有する移動相で溶出し、該溶出は該ヘテロ二本鎖が少なくとも部分的に変性するために効果的な条件下で行い、そしてこの溶出が該ホモ二本鎖から該ヘテロ二本鎖の分離をもたらす、
工程を含んで成り、
工程（ｂ）が工程（ａ）の固体を、
等濃度の：
カチオン；
アニオン；
を含んで成る溶出塩；
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；および
有機溶媒；
を含んで成る４〜９の範囲のｐＨを有する移動相と接触させることを含み、
該移動相は約４０容量％未満の該有機溶媒を含み、
溶出塩の濃度を約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、
上記方法。
【請求項６５】
溶出を約５０℃より高いカラム温度で行う、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するためのクロマトグラフィー法であって、
（ａ）混合物をアニオン−交換固体に添加し、
（ｂ）工程（ａ）の固体を、溶出塩、有機溶媒およびバッファーを含有する移動相で溶出し、該溶出は該ヘテロ二本鎖が少なくとも部分的に変性するために効果的な条件下で行い、そしてこの溶出が該ホモ二本鎖から該ヘテロ二本鎖の分離をもたらす、
工程を含んで成り、
工程（ｂ）が工程（ａ）の固体を、
約０．５Ｍから約６Ｍの間の濃度のベタイン；
を含んで成る溶出塩；
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；および
有機溶媒；
を含んで成る４〜９の範囲のｐＨを有する移動相と接触させることを含み、
該移動相は約４０容量％未満の該有機溶媒を含み、
溶出塩の濃度を約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、
上記方法。
【請求項６７】
溶出を約５０℃より高いカラム温度で行う、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子を分離するためのクロマトグラフィー法であって、
（ａ）混合物をアニオン−交換固体に添加し、
（ｂ）工程（ａ）の固体を、溶出塩、有機溶媒およびバッファーを含有する移動相で溶出し、該溶出は該ヘテロ二本鎖が少なくとも部分的に変性するために効果的な条件下で行い、そしてこの溶出が該ホモ二本鎖から該ヘテロ二本鎖の分離をもたらす、
工程を含んで成り、
工程（ｂ）が工程（ａ）の固体を、
等濃度の：
カチオン；
アニオン；
を含んで成る溶出塩；
３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；
を含んで成る４〜９の範囲のｐＨを有する移動相と接触させることを含み、そして
該溶出は約５０℃より高いカラム温度で行い、
溶出塩の濃度を約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げる、
上記方法。
【請求項６９】
ＤＮＡ遺伝子突然変異を検出する方法であって
ａ）サンプルの二本鎖ＤＮＡセグメントおよび対応する野生型二本鎖ＤＮＡセグメントの混合物を、鎖が完全に変性する温度まで加熱し；
ｂ）工程（ａ）の生成物を鎖が完全にアニールするまで冷却し、これによりサンプルセグメントが突然変異を含む場合に２つのホモ二本鎖および２つのヘテロ二本鎖を含んで成る混合物が形成され；
ｃ）ヘテロ突然変異体部位の分離温度を決定し；
ｄ）工程（ｂ）の生成物を変性アニオン−交換−高性能クロマトグラフィーによりヘテロ突然変異体部位の分離温度で分析して、その中のヘテロ突然変異体部位の分離した成分の存在を同定する、
工程を含んで成る上記方法。
【請求項７０】
ヘテロ突然変異体部位の分離温度が、突然変異の分離温度範囲での一連の増分的変性アニオン−交換−高性能液体クロマトグラフィーで変性アニオン−交換−高性能液体クロマトグラフィーにより工程（ｂ）の生成物を分析することにより決定され、各々の連続的な分離は突然変異の分離温度範囲における突然変異の分離プロフィールが観察されるか、または突然変異の分離プロフィールの不存在が観察されるまで直前の分離よりも高い温度を有し、突然変異の分離プロフィールはサンプル中の突然変異の存在を同定し、突然変異の分離プロフィールの不存在は突然変異の不存在を示す、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
ヘテロ突然変異体部位の分離温度が、突然変異の分離温度範囲での一連の増分的変性アニオン−交換−高性能液体クロマトグラフィーで変性アニオン−交換−高性能液体クロマトグラフィーにより工程（ｂ）の生成物を分析することにより決定され、各々の連続的な分離は突然変異の分離温度範囲における突然変異の分離プロフィールが観察されるか、または突然変異の分離プロフィールの不存在が観察されるまで直前の分離よりも低い温度を有し、突然変異の分離プロフィールはサンプル中の突然変異の存在を同定し、突然変異の分離プロフィールの不存在は突然変異の不存在を示す、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
上記アニーリング工程の前に、ＤＮＡ分子をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、そして増幅したＤＮＡ分子を変性させ、そして復元してヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物を形成する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、核酸フラグメント中のヘテロ二本鎖を検出するためのクロマトグラフィー法、そして詳細には突然変異の検出に使用するための変性アニオン−交換高性能液体クロマトグラフィーに関する。
【０００２】
発明の背景
二本鎖ポリヌクレオチド中、特にＤＮＡフラグメント中に突然変異を検出する能力は、医学ならびに自然および社会科学において大変重要である。ヒトゲノムプロジェクトは莫大な量の遺伝情報を提供しており、今これらは突然変異とヒトの疾患との間の関係を評価するための新しい基準を設定しているところである（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０８４１（１９９５））。例えば疾患の究極的な原因は野生型とは異なる遺伝子暗号により説明される（Ｃｏｔｔｏｎ，Ｔ／Ｇ １３：４３（１９９７））。疾患の遺伝的基礎を解明することは、治療のための出発点である。同様に遺伝子暗号中の差異は、進化および個体群の研究に強力かつおそらくは決定的な眼識を提供することができる（Ｃｏｏｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６９：２０１（１９８５））。遺伝子暗号に関連するこのような、そして他の問題を解明することは、異形、すなわち野生型に対してＤＮＡフラグメント中の突然変異を同定する能力に基づく。したがって正確で、再現性があり、しかも信頼のある様式で突然変異を検出するための方法論の必要性が存在する。
【０００３】
ＤＮＡ分子はデオキシヌクレオチドと呼ばれるサブ−ユニットを含んで成るポリマーである。ＤＮＡ中に見いだされる４種のデオキシヌクレオチドは、通常の環式糖であるデオキシリボースを含んで成り、これが以下でＡ、Ｇ、ＣおよびＴとそれぞれ称する４種の任意の塩基であるアデニン（プリン）、グアニン（プリン）、シトシン（ピリミジン）およびチミン（ピリミジン）に共有結合している。リン酸基は１つのデオキシヌクレオチドの３’−ヒドロキシルを別のデオキシヌクレオチドの５−ヒドロキシルと連結してポリマー鎖を形成する。二本鎖ＤＮＡでは、２本鎖は、いわゆる相補的塩基間の水素結合によりらせん構造に一緒に保持されている。塩基の相補性はそれらの化学構造により決定される。二本鎖ＤＮＡでは、各ＡはＴと対をなし、そして各ＧはＣと対をなし、すなわちプリンはピリミジンと対をなす。理想的にはＤＮＡはヒトの身体または他の生物中での細胞分裂中にＤＮＡポリメラーゼにより正しいコピーに複製される。ＤＮＡ鎖はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロでも複製され得る。
【０００４】
時折、正しい複製に失敗し、そして誤った対合が生じ、これは新たな鎖のさらなる複製で親の塩基配列とは異なる遺伝性の差異を含有する二本鎖ＤＮＡの派生物をもたらす。塩基対配列中のそのような遺伝性の変化を突然変異と称する。
【０００５】
本発明では、二本鎖ＤＮＡとは二重鎖を称する。１つの鎖の塩基配列がもう１つの鎖の塩基配列と完全に相補的である時、この二本鎖をホモ二本鎖と称する。二本鎖が相補的ではない少なくとも１塩基対を含む時、この二本鎖をヘテロ二本鎖と称する。ヘテロ二本鎖の二本鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により誤りが作られた時にＤＮＡ複製中に形成され、そして非相補的塩基が複製されたポリヌクレオチド鎖中に加えられる。ヘテロ二本鎖のさらなる複製は、理想的にはヘテロ接合性であるホモ二本鎖を生成し、すなわちこれらのホモ二本鎖は元の親ＤＮＡ鎖と比べて改変した配列を有するだろう。親のＤＮＡが自然な集団の中で優性である配列を有する時、これを一般には「野生型」と称する。
【０００６】
多くの異なる種類のＤＮＡ突然変異が知られている。ＤＮＡ突然変異の例には、限定するわけではないが、１つの誤った塩基対を生じる「点突然変異」または「単塩基対突然変異」を含む。最も多くの点突然変異は、プリンまたはピリミジン塩基が他に置き換わった「対突然変異」およびプリンがピリミジンに（またはその逆に）置換された「転換型突然変異」を含んで成る。点突然変異はまた、ＤＮＡ鎖に塩基が付加した、または欠失した突然変異も含んで成る。そのような「挿入」または「欠失」は、「フレームシフト突然変異」ともしても知られている。それらは起こる頻度は点突然変異よりは低いが、多数の塩基対に影響を及ぼすより大きな突然変異も生じ、そして重要となり得る。より詳細な突然変異に関する考察は、Ｍｏｄｒｉｃｈ（１９９５）への米国特許第５，４５９，０３９号明細書およびＣｏｔｔｏｎ（１９９７）への米国特許第５，６９８，４０９号明細書に見いだすことができる。これらの参考文献およびそこに含まれる参考文献は全部、引用により本明細書に編入する。
【０００７】
ＤＮＡ中の塩基対は、タンパク質の生産をコードする。特にＤＮＡ鎖のエキソン部分のＤＮＡ配列は、タンパク質中で対応するアミノ酸配列をコードする。したがってＤＮＡ配列中の突然変異は、タンパク質中のアミノ酸配列に改変をもたらす。アミノ酸配列中のそのような改変は完全に良性であるかもしれないし、またはタンパク質を不活性化するか、またはその機能を改変させて生命を脅かすか、もしくは致死的となるかもしれない。一方ＤＮＡ鎖のイントロン部分の突然変異は、イントロンの区分がタンパク質生産の暗号を含まないので、生物学的効果は期待されない。しかしイントロン区分の突然変異の検出は、例えば法医学的調査において重要となり得る。
【０００８】
これゆえに突然変異の検出は、疾患の診断、疾患の原因の解明および効力的な処置の開発において大変興味深く、しかも重要である。ＤＮＡサンプル中の突然変異の検出および類似性または差異の確認も、疾患耐性および／またはより高い収穫の作物種を開発することにより増大する世界の食料供給に、法医学に、進化および個体群の研究に、そして一般的な科学調査に大変重要である（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）；Ｃｏｔｔｏｎ （１９９７））。これらの参考文献およびそこに含まれる参考文献は全部、引用により本明細書に編入する。
【０００９】
良性または否定的な結果をもたらさないＤＮＡ配列中の改変は、「多形性」と呼ばれる。本発明では、ＤＮＡ配列中の任意の改変はそれらが否定的な結果をもたらしてももたらさなくても「突然変異」と呼ぶ。本発明の方法は生物学的効果またはそれらの欠如にかかわらず突然変異を検出する能力を有すると考える。簡便性のために、用語「突然変異」は本明細書を通して、参照配列と比べてＤＮＡ鎖の塩基配列中の改変を意味するために使用する。本発明との関連では、用語「突然変異」は用語「多形性」または当該技術分野で任意の他の類似または均等な用語を含むと理解される。
【００１０】
実施が容易な突然変異を検出するための正確でしかも再現性のある分析法の必要性が存在する。自動化され、そして最少の操作配慮で高い処理量のサンプルスクリーニングを提供することができるような方法も大変望ましい。
【００１１】
ＤＮＡサンプルの分析は、歴史的にゲル電気泳動を使用して行われてきた。キャピラリー電気泳動は、ＤＮＡの混合物を分離し、そして分析するために使用されてきた。しかしこれらの方法は同じ塩基対長を有するホモ二本鎖から点突然変異を識別することはできない。
【００１２】
「ヘテロ二本鎖部位の分離温度」とは、本明細書では１以上の塩基対が変性、すなわちヘテロ二本鎖ＤＮＡフラグメント中の塩基対の誤対合部位で分離する温度を含むと定義する。ヘテロ二本鎖中の少なくとも１つの塩基対が相補的でないので、その部位で塩基を分離するためにはホモ二本鎖中の完全に相補的な塩基対同族体に比べて少ないエネルギーを要する。これはホモ二本鎖よりもヘテロ二本鎖の低い融解温度５０をもたらす。局所的な変性は、塩基対誤対合の部位で一般的にいわゆる「バブル（ｂｕｂｂｌｅ）」を生成する。このバブルは同じ塩基対長の完全に相補的なホモ二本鎖に比べてＤＮＡフラグメントの構造を歪める。部分的な変性条件下でのこの構造的歪みは、過去には変性ゲル電気泳動および変性キャピラリー電気泳動によりヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖を分離するために使用されて来た。しかしこれらの技法は実施するための操作が難しく、そして高い熟練者を要する。さらに分析には時間がかかり、そして準備時間も莫大である。９０塩基対フラグメントの変性キャピラリーゲル電気泳動分析には３０分以上を要し、そして変性ゲル電気泳動分析には５時間以上かかる。このゲル法の長い分析時間は、ゲル中のＤＮＡフラグメントの移動がフラグメントの長さに逆比例するという事実によりさらに悪化する。
【００１３】
上記の変性ゲル法の欠点に加えて、これらの技法はゲルの調製および分析の泳動が操作者毎に高度に変動するために、常に再現性があるか、または正確なわけではない。
【００１４】
２つの主要な液体クロマトグラフィー的分離化学がＤＮＡに利用されている：それらはアニオン交換およびイオン−対合逆相である。アニオン交換では、固体のクロマトグラフィーマトリックスはその表面に、ＤＮＡのポリアニオンがＤＮＡ長に直接関連する強さで結合する大量の固定された正電荷を含む。通常は溶出時間および密に充填したマトリックスの円筒カラムを通る移動相の容量で連続的に溶出塩の濃度を上げると、溶解した塩がマトリックスに対するポリアニオンの結合を弱めるので、ＤＮＡフラグメントはおよそサイズが増す順序で溶出する。米国特許第５，８５６，１９２号および同第５，８６６，４２９号明細書では、Ｂｌｏｃｋは非−変性条件下での核酸の塩−勾配のアニオン−交換分離に関する方法を記載している。
【００１５】
最近、イオン対合逆相ＨＰＬＣ（ＩＰＲＨＰＬＣ）が一般に二本鎖ポリヌクレオチドおよび特にＤＮＡの混合物を効果的に分離すると紹介され、ここで分離は塩基対長に基づく（Ｂｏｎｎへの米国特許第５，５８５，２３６号明細書（１９９６）；Ｈｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ３７：６５３（１９９３）；Ｈｕｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：３５１（１９９３））。
【００１６】
ＩＰＲＨＰＬＣの使用および理解が進むにつれ、ＩＰＲＨＰＬＣ分析を部分的な変性温度、すなわち塩基対誤対合の部位でヘテロ二本鎖を変性させるために十分な温度で行う時、同じ塩基対合長を有するヘテロ二本鎖からホモ二本鎖を分離することができた（Ｈａｙｗａｒｄ−Ｌｅｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：４９４（１９９５）；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１９３（１９９６）；Ｄｏｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＤＨＰＬＣ ワークショプ、スタンフォード大学、（１９７７）；米国特許第５，７９５，９７６号明細書）。すなわちＤＨＰＬＣの使用が突然変異の検出に応用された（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：９９６（１９９７）；Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６：１３９６（１９９８））。
【００１７】
発明の要約
したがって本発明の１つの目的は、正確、すなわち実際に誤った結果（例えば「偽陽性」）を導くことがなく、都合よく使用でき、迅速に結果を得ることを可能とし、操作に信頼性があり、簡単、便利でしかも操作が廉価な核酸中の突然変異を検出する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、向上し、そして予想できる分離および効率でポリヌクレオチドを分離するためにアニオン−交換クロマトグラフィー法を利用する突然変異の検出法を提供することである。
【００１９】
さらに本発明の別の目的は、突然変異を検出するための核酸のアニオン−交換クロマトグラフィー分離を行うための温度を選択する改良された方法を提供するとである。
【００２０】
さらに本発明の別の目的は、自動化できる方法を提供することである。
【００２１】
以下の明細書から明らかになるこれらのおよび他の目的が、本発明により達成された。
【００２２】
１つの観点では本発明は、アニオン−交換高性能クロマトグラフィーを使用して混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を分離する方法を提供する。この分離法では、ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖核酸分子の両方を含有する混合物を、固体相であるアニオン−交換支持体に添加する。次いでサンプル混合物は溶出塩、バッファーおよび好ましくは有機溶媒を含有する移動相を用いて溶出される。サンプルの溶出はヘテロ二本鎖の少なくとも一部が変性し、そしてヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖分子の分離をもたらすために効果的な条件下で行う。
【００２３】
分離を行うための固体相には、シリカ、多糖または合成ポリオレフィン骨格から成る支持体を含む。ポリオレフィンは例えばポリスチレンまたはポリアクリル酸であることができる。
【００２４】
本発明の方法では、移動相には溶出塩、有機溶媒およびバッファーを含む。１つの態様では、移動相のｐＨは好ましくは４〜９の範囲であり、そして等濃度の：アルキル基がメチルおよびエチルの任意の組み合わせから成るジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムから成る群から選択されるカチオン；およびブロミド、クロライド、アセテート、ホルメート、ニトレート、ペルクロレート、リン酸二水素、エタンスルホネートおよびメタンスルホネート成る群から選択されるアニオンから成る溶出塩；３．５〜９．５のおよその範囲のｐＫａを有する緩衝酸；および有機溶媒を含んで成り、ここで溶出塩の濃度は約０．５Ｍから約２．０Ｍに規則正しく上げられる。
【００２５】
この方法に使用する有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ホルムアミド、２−プロパノールおよびＮ−メチルピロリドンのような溶媒を含む。
【００２６】
１つの態様では、本発明の分離を行うための移動相は、約４０容量％未満の有機溶媒および約０．５Ｍ〜約２Ｍの溶出塩、および０．０１Ｍから約０．１Ｍの間の濃度を有し、そして約４〜約１０の範囲のｐＨのバッファーを含む。
【００２７】
ヘテロ二本鎖分子の少なくとも部分的な変性は、以下を含む数種の方法により行うことができる。本発明の分離法を行うためのカラム温度は典型的には約５０゜から８０゜の間であり、好ましくは約６５゜から７５℃の間である。好適な態様では、分離は７３℃のカラム温度で行う。あるいはサンプル溶出はヘテロ二本鎖分子が少なくとも部分的に変性するために効果的なｐＨ条件下で行うことができる。そのような場合はサンプル中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖分子の分離のために、約７３℃未満の低いカラム温度で十分である。
【００２８】
本発明の分離法では、移動相のｐＨは種々の成分の性質および濃度に大変依存し、そして典型的には約７から９の間で維持される。好適な態様では、改良されたサンプル解像度を得るために移動相はｐＨ ８．０に維持される。
【００２９】
本発明の別の態様では、混合物中のホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖は混合物をジエチルアミノエチル官能化ポリアクリレート支持体に添加し、そして混合物は塩化コリン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０で）および有機溶媒として１５％アセトニトリルを含有する移動相を用いてカラム温度約７０゜から７７℃の間で溶出される。
【００３０】
別の態様では、混合物中に含まれるホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖分子はポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅され、そして増幅したＤＮＡ分子を本発明の分離法を行う前に変性させ、そて復元させてヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖分子の混合物を形成する。
【００３１】
サンプルスクリーニング中にホモ二本鎖のみが観察される場合、比較するすべての個体中で配列は単形態性であるので（すなわち多形部位を欠く）、さらなる標準的なシークエンシングは必要ではない。本発明の方法の利用では、ヘテロ二本鎖と同定されたＤＮＡフラグメントのみ、したがって少なくとも１つの多形部位を含むと同定されたＤＮＡフラグメントを、通例の方法によりシークエンシングして観察された多形性（１つまたは複数）について特性を決定する。
【００３２】
発明の詳細な記述
１つの観点では、本発明はＤＮＡの突然変異検出を行うために使用するシステムおよび方法に関する。本発明は二本鎖ＤＮＡ中の突然変異を検出するために使用できる。以下の定義を本明細書で使用する：
「融解温度５０」とは本明細書では、ＤＮＡフラグメント中の５０％の塩基対が相補鎖から分離した温度を含むと定義する。
【００３３】
「ホモ二本鎖」とは本明細書では、各鎖中の塩基がもう１つの鎖中の対となる塩基に対して相補的である二本鎖ＤＮＡフラグメントを含むと定義する。
【００３４】
「ヘテロ二本鎖」とは本明細書では、各鎖中の少なくとも１つの塩基がもう１つの鎖中の対となる少なくとも１つの塩基に対して相補的でない二本鎖ＤＮＡフラグメントを含むと定義する。「ヘテロ二本鎖分子」は典型的には２つの相補的な核酸鎖（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）から成り、ここで鎖は１００％未満の相補性を有する。これは誤対合塩基または欠失によるものであり得る。ヘテロ二本鎖中の少なくとも１つの塩基対は相補的でないので、ホモ二本鎖中の完全に相補的な塩基対の同族体と比べて、その部位で塩基を分離するためにはより少ないエネルギーを要する。これはホモ二本鎖に比べてヘテロ二本鎖の誤対合塩基で、より低い融解温度５０をもたらす。
【００３５】
用語「ハイブリダイゼーション」には、ｄｓＤＮＡサンプルの加熱および冷却工程、例えば９５℃までの加熱に続いてゆっくりとした冷却を含む。加熱工程ではＤＮＡ鎖の変性を引き起こす。冷却で、鎖はほぼ統計的様式で再度二本鎖に結合する。サンプルが野生型および突然変異体ＤＮＡの混合物を含む場合、ハイブリダイゼーションはヘテロ−およびホモ二本鎖の混合物を形成するだろう。
【００３６】
「ヘテロ突然変異体部位の分離温度」Ｔ（ｈｓｓｔ）は、突然変異の部位でヘテロ二本鎖ＤＮＡを優先的に変性させ、そしてヘテロ二本鎖とホモ二本鎖との間の変性の程度に最大の差異を与える温度を含む。これはヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖のＤＡＥＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分離を行うために、そしてしたがって突然変異を検出するために至適な温度である。
【００３７】
用語「ヘテロ突然変異体」とは、多形性または非−相補塩基対を含有するＤＮＡフラグメントを含む。
【００３８】
用語「突然変異の分離プロフィール」とは本発明では、ホモ二本鎖からヘテロ二本鎖の分離を示すＤＡＥＨＰＬＣ分離クロマトグラムを意味すると定義する。そのような分離プロフィールは突然変異または多形を含み、そして分離する前にハイブリダイズしたサンプルの特徴である。７３℃で行った図２に示すＤＡＥＨＰＬＣ分離クロマトグラムは、本明細書で定義する突然変異の分離を例示する。
【００３９】
本明細書で使用する「有機溶媒」は、ＤＡＥＨＰＬＣで利用される移動相の成分を含む。しばしば有機モディファイヤーとも呼ばれる有機溶媒は、本発明のクロマトグラフィー分離法での使用に適する任意の有機性（例えば非−水性）液体である。一般に有機溶媒はアセトニトリルまたはメタノールのような極性溶媒（例えば、固相支持体よりも極性）である。
「塩基−対誤対合」は、典型的には合った塩基対に挟まれた単一塩基−対誤対合を称する。塩基対誤対合には、合った塩基対に挟まれた一連の誤対合した塩基対も含む。塩基−対誤対合は、ヘテロ二本鎖に存在し得る。
【００４０】
設定した所定のクロマトグラフィー条件下で「少なくとも部分的に変性した」ヘテロ二本鎖とは、二本鎖の幾つかの相補的塩基対が水素結合で対合していない分子を称し、そのような変性は典型的にはヘテロ二本鎖に含まれる塩基対誤対合の部位を越えて広がり、これにより本質的に同じサイズのホモ二本鎖分子からヘテロ二本鎖を識別することを可能とする。本発明に従いそのような変性条件は、化学的（例えばｐＨ条件から生じる）または温度誘導的のいずれか、あるいは化学および温度因子の両方の結果であり得る。
【００４１】
突然変異を検出するための信頼性できる方法は、サンプル中で推定される突然変異体鎖と野生型鎖とのハイブリダイゼーションによる（Ｌｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：４８２（１９８７））。突然変異体鎖が存在する場合、図１に示すように２つのホモ二本鎖および２つのヘテロ二本鎖がハイブリダイゼーション工程の結果として形成する。したがってホモ二本鎖からのヘテロ二本鎖の分離は、サンプル中に突然変異体ＤＮＡセグメントの存在または不存在を確認する直接的方法を提供する。
【００４２】
本発明の態様は、温度タイトレーションに基づくＴ（ｈｓｓｔ）の選択法である。この態様では、突然変異を含むサンプルを自ら至適化する方法を使用して一連の温度で調査する。この手法により得られる至適温度は、ピークのパターン中の差異により突然変異体ＤＮＡが最も容易に野生型ＤＮＡと区別できる温度である。
【００４３】
本発明と関連して、サンプルのスクリーニング中にホモ二本鎖のみが観察される時、配列は比較するすべての個体で単形態性であるので、さらに標準的なシークエンシングは必要ではない。本発明の方法の使用では、ヘテロ二本鎖であると同定されたＤＮＡフラグメントのみ、それゆえに少なくとも１つの多形部位を有する同定されたＤＮＡフラグメントのみが常法により配列決定されて観察された多形（１つまたは複数）を特性決定する。
【００４４】
核酸は、１つのペントースの５’−ＯＨと次のペントースの３’−ＯＨとの間のホスホジエステル結合でホスホリル基により連結されたペントースのオリゴマーまたはポリマーを含んで成り、そして各ペントースが１つの炭素へのグリコシド結合中に芳香族性複素環式「塩基」を持つ。ペントースがリボースである場合、核酸はＲＮＡである。ペントースが２−デオキシリボースである場合、核酸はＤＮＡである。各ホスホリル基（核酸ポリマーの任意の末端を除く）は、２〜３より高いｐＨで１つの負の電荷を持つので、核酸の総負電荷はおよそその長さ（しばしばヌクレオチドの単位（ｎｔ）または塩基対（ｂｐ）で表される）に比例する。任意の広い種類の塩基がペントースに付くが、自然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡには５個のみが優勢である：アデニン（” Ａ”）、チミン（”Ｔ”、ＤＮＡ中のみ）、ウラシル（”Ｕ”、主にＲＮＡ中）、グアニン（”Ｇ”）およびシトシン（”Ｃ”）。ＲＮＡは通常、１本のリボヌクレオチドポリマー鎖から成る。１本鎖のＤＮＡは、１本のデオキシリボヌクレオチドポリマー鎖である。しかしおよそ相補的な塩基配列の２つのＤＮＡ鎖は、二量体化して二本鎖ＤＮＡを形成する。およそ相補的な塩基配列のＤＮＡおよびＲＮＡ鎖は、二量体化して構造的に二本鎖ＤＮＡに類似するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【００４５】
しばしば個々のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖は、折り畳まれて局所的に二本鎖の領域を形成することを可能とする、ポリマーの異なる部分でおよそ相互に相補的な塩基配列を有する。塩基の相補性は単純な法則に従う：ＡはＴまたはＵと対合でき；ＧはＣと対合でき；最も安定な二本鎖構造は、１つの鎖の５’−ＯＨ末端がもう１つの鎖の３’−ＯＨ末端に塩基−相補的であるような、２つの鎖が「逆平行」の方向を有する時である。
【００４６】
アニオン−交換分離は、１つの相の固定された正電荷（通常は固体、場合により液体）が第１相と接触する第２相（通常、液体）中の負分子と結合するプロセスである。結合した負分子は、単に２相の分離により第２相中の電気的中性または正分子から分離され得る。それらの分子は、第１相に対してより強く結合したアニオンの引力（ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）を弱めるよりも、新規な組成が第１相に対してより弱く結合したアニオンの引力をより弱めるので、第１相を元の第２相とは異なる組成の新たな液体と接触させることにより、互いに分離され得る。第１相に対するアニオン引力の強度は、アニオンの総負電荷で直接変動する。結合したアニオンは新規な液体が第１相からアニオンを置き換え続ける時に「溶出」される。進行的にますますより強力に第１相に対するアニオン結合を妨害する液体と第２相が繰り返し置き換えられる場合、この工程を「勾配溶出」と呼ぶ。溶出する液体の組成が逐次的よりは時間経過にわたり滑らかに変化する場合、この勾配溶出を「連続的」と呼び；そうでなければ「段階的」溶出である。
【００４７】
好ましくは、第１相は固体である。この「アニオン−交換固体」は、サイズ、形状、多孔性および機械的特性、および好ましくは骨格に共有結合した正に荷電した「官能基」を定める電気的に中性の「骨格」材料から成る。３つの最も通例の種類の骨格材料は、シリカ、多糖および合成ポリオレフィンである；２つの主なポリオレフィンのサブクラスは、ポリスチレンおよびポリアクリル酸である。後者は種々の置換されたアクリル酸アミド（「ポリアクリルアミド」）およびアクリル酸エステル（「ポリアクリレート」）を含んで成り、ここでアクリル酸モノマーは、２−または３−炭素上にアルキル置換基を持っても持たなくてもよい。２つの最も通常の正の官能基は骨格に共有結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ：［（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ）、および骨格に共有結合または非共有的に吸着することができるポリエチレンイミン（ＰＥＩ：［−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−］ｎ）である。アニオン−交換固体と接触する液体が約ｐＨ９〜１１未満の水性溶媒である時、ＤＥＡＥおよびＰＥＩの窒素原子はプロトン化され、そしてしたがって正に荷電する。より低いｐＨで、より多くの官能基の画分がカチオン性となる。所定のアニオン−交換固体中のほとんどの官能基が正に荷電するｐＨ領域は、主に骨格構造および骨格の表面上の官能基の密度に依存する。
【００４８】
アニオン−交換分離で最も通例には、溶出液体が水性の電解質であり；そして勾配溶出が水に完全に溶解した塩の濃度を上昇させることにより行われる。アニオン−交換溶媒中での溶出塩濃度の上昇は、核酸のようなアニオンのアニオン−交換固体への結合を弱める。本発明の目的に存在することができる溶出塩は、約０．１〜０．５Ｍ、そして好ましくは０．５〜２Ｍの範囲であり、ジ−、トリ−またはテトラ−アルキルアンモニウムカチオン、および任意の種々のモノ−アニオン、好ましくはホルメート、アセテート、クロライド、ブロミド、ニトレート、ペルクロレート、メタンスルホネート、リン酸二水素またはエタンスルホネートから成る。好ましくはアンモニウムカチオン上のアルキル基は、メチルまたはエチル基であり、メチルが最も好ましい。メチルおよびエチル基を含むカチオンも可能であるが、唯一のまたは他のアルキル基を含有するカチオンよりは調製が困難である。溶出塩は水に溶解して溶出溶媒を作成する固体として調製することができ、あるいは溶出塩の溶液は、プロトン化されたモノアニオン（例えば、ギ酸、酢酸または塩酸）から構成される酸を、等モルの化学量論でアルキルアミンまたは水酸化アルキルアンモニウムの水溶液と混合することにより調製することができる。
【００４９】
本発明に使用するために適するカチオンの他の例には、ナトリウム、グアニジンおよびコリンを含む。これらは約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲、そして好ましくは約０．５Ｍ〜約２Ｍの範囲で使用することができる。
【００５０】
本明細書に記載したカチオンの混合物も、本発明で使用することができる。記載したアニオンの混合物も使用することができる。
【００５１】
アミノ酸同族体であるベタインも、Ｏ．５Ｍ〜約６Ｍで使用して本発明の二本鎖ＤＮＡを溶出するために使用することができる。これはＤＮＡ融解の塩基対組成依存性を下げる利点がある（Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１３７−１４４，１９９３）。
【００５２】
アニオン−交換溶媒は、溶解したアルキルアンモニウム塩を含むだけでなく、約３．５〜約９．５の間のｐＫａ（酸分子の半分がプロトンを失ったｐＨ）を有する弱酸をを所望のｐＨを達成するために十分な塩基と一緒に加えることにより、約４〜約９の間のｐＨで緩衝化される。好ましくはこの緩衝酸の濃度は、約０．０５Ｍを越えない。また好ましくは緩衝酸自体がカチオンである（すなわち、緩衝酸カチオンおよび別の酸、通常は強鉱酸のアニオン共役塩基の塩として供給される）ので、その共役塩基はアニオン性ではない。アニオン性バッファーの共役塩基は、アニオン−交換固体に所望の値からｐＨを下げる様式で結合する。特に好適な緩衝酸は、元はＧｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９６６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７−４７７に記載され、そして今では生化学用試薬会社から高純度で市販されている「両性イオンバッファー」により提供される。
【００５３】
好適なアニオン−交換分離法は「クロマトグラフィー」であり、ここでアニオン−交換固体、通常は粒子形を連続的に流れるアニオン−交換溶媒と接触させ、この溶媒は最初の結合反応のために核酸を固体に運び、そして溶出塩濃度を上昇させて核酸を固体から効率的に取り出す。粒子状のアニオン−交換固体は好ましくは円筒状のカラムに充填される；溶媒がカラムの一端から流れ、そしてもう一端から出る。特に好適な液体クロマトグラフィーの様式はＨＰＬＣであり、ここでアニオン−交換固体粒子は大変小さく（通常は直径２〜１０ミクロン）、そして大変密に充填されているので、カラムに溶媒を通すために高圧（１インチ平方あたり数百から数千ポンド）が必要である。そのような小さい粒子は大変迅速にアニオン−交換結合および溶出反応を受け、数分の時間規模で分離を可能とし、これは１から２の次元の規模にわたる範囲の長さの多くの異なる核酸種を互いに分離することを可能とする（例えば５０〜５００または５，０００塩基対）。
【００５４】
１つの観点では本発明は以下に詳細に記載するように、アニオン−交換高性能液体クロマトグラフィー、そしてより詳細には変性アニオン−交換高性能液体クロマトグラフィーを使用して、混合物中のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖ＤＮＡ分子の分離法を提供する。この方法は、最高約２０００塩基対までを含有するＤＮＡ二本鎖中の単塩基誤対合を検出するために使用することができる。
【００５５】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、一般にサンプルまたはより具体的にはサンプルの成分を液体移動がする相または移動相と、固体の固相との間に分配する技法を称する。本発明では出願人は、サンプル溶出中にヘテロ二本鎖を少なくとも部分的に変性させるために効果的な条件を利用するクロマトグラフィー法を見いだし、これにより混合物中に含まれるヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖の分離および同定を可能とする。
【００５６】
突然変異を検出するための信頼性のある方法は、サンプル中に推定される突然変異体の鎖と野生型の鎖とのハイブリダイゼーションによる（Ｌｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：４８２（１９８７））。突然変異体の鎖が存在する場合、図１に示すようにハイブリダイゼーション工程の結果として２つのホモ二本鎖および２つのヘテロ二本鎖が生じるだろう。すなわちホモ二本鎖からのヘテロ二本鎖の分離は、サンプル中の突然変異体ＤＮＡセグメントの存在または不存在を確認する直接的方法を提供する。
【００５７】
ホモ二本鎖からのヘテロ二本鎖の解像には、ＤＮＡがちょうど融解しはじめる温度での勾配溶出が必要である。ヘテロ二本鎖は誤対合した塩基により不安定化され、したがってこの温度ではホモ二本鎖よりもわずかに多く融解する。保持時間はＤＮＡの変性に従い減少し、すなわちより変性したヘテロ二本鎖がホモ二本鎖よりも先に現れる。
【００５８】
本発明の方法では、ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖分子の両方を含有するサンプル混合物を固相に添加する。一般に、固相は以下に記載するようなアニオン−交換支持体である。多数の市販されているアニオン−交換逆相固体支持体を本核酸分離法に使用することができるが、解像度はサンプルの性質および他の関連する実験パラメーターにより大変変動するかもしれない。
【００５９】
本発明の方法に使用するための固相は、典型的には直径が約３０Å未満（例えば非孔質材料）からサイズが最高約１０００Åの範囲のサイズの孔を有する。非孔質のポリマー性支持材料を使用すると、比較的小さい孔サイズにより多くのサンプル化合物が孔構造を浸透することを排除し、そして活性表面との相互作用を促進することができる。固相は１種類以上の孔または孔系、例えばミクロポア（約５０Å未満）およびマクロポア（約１０００Åより大きい）の両方を含むこともできる。
【００６０】
サイズが最高約２０００塩基対のヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖を含有するサンプルの分離を行うために、固相は典型的には窒素吸着により測定した約２〜４００ｍ２／ｇ、そして好ましくは約８〜２０ｍ２／ｇの表面積を有するだろう。
【００６１】
好適な態様では、本発明の分離法はＤＡＥＨＰＬＣを使用する。本発明の方法に従い分離を行うにあたり、水性の移動相は溶出塩、バッファーおよび好ましくは有機溶媒を含む。
【００６２】
水性移動相の成分の選択は、サンプルの性質および所望する分離の程度に依存して変動するだろう。アニオン−交換ＨＰＬＣで典型的に使用される多くの移動相の成分が本発明での使用に適する。幾つかの移動相パラメーター（例えば、ｐＨ、有機溶媒、塩、バッファー、溶出勾配）は至適な分離を達成するために変動し得る。
【００６３】
本発明で使用する塩は、分離支持体の表面上のカチオン基と相互作用するアニオンを含むものである。
【００６４】
移動相のｐＨは種々の成分の濃度に依存して変動するだろう。核酸の少なくとも部分変性を行う温度を使用するＲＮＡまたはＤＮＡフラグメントのような核酸サンプルの分離には、移動相のｐＨは典型的には約７から９の間に維持される。好ましくは移動相は約７．５付近のｐＨに維持される。
【００６５】
別の態様では、移動相のｐＨはヘテロ二本鎖分子の分離および検出を可能とするために、ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖の混合物を含有するサンプル中のヘテロ二本鎖を少なくとも部分的に変性するように調整される。ヘテロ二本鎖の変性を行うための化学的手段の使用では、ヘテロ二本鎖分子を少なくとも部分的に変性し、しかもサンプル中に存在する核酸を分解せず、また固相の完全性に悪影響も及ぼさない条件下で、ｐＨを塩基（例えば水酸化ナトリウムまたは尿素を使用して約８付近のｐＨとする）または酸（例えば約ｐＨ８以上でトリエチルアミンおよび酢酸）のいずれかの添加により調整することができる。そのような場合、サンプル溶出は約６０℃未満の温度で行うことができる。
【００６６】
移動相成分の濃度は、行う分離の性質に大変依存するだろう。移動相の組成はサンプルおよびサンプル溶出の経過中に変動するだろう。２以上の成分を含有する勾配系が使用される。
【００６７】
サンプルは典型的には、溶出塩、バッファーおよび好ましくは有機溶媒を含有する水性またはほぼ水性の移動相から出発して、増加する溶出塩量を含有する移動相に進行することにより溶出される。多数の勾配プロフィールおよび系の成分を、本発明の変性条件を達成するために使用することができる。本発明による１つのそのような勾配系の例は、（ｉ）１５％アセトニトリル中の０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ＝８．０、および（ｉｉ）１５％アセトニトリル中の２Ｍコリン、０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ＝８．０から成る直線性の二成分勾配系である。
【００６８】
本発明の変性条件を達成するための１法は（例えば、ヘテロ二本鎖の少なくとも部分変性に効果的な）、以下の実施例を参照にして検討するようにカラム温度をモジュレートすることである。
【００６９】
典型的には約６５〜８０℃の間のカラム温度は、ＤＡＥＨＰＬＣクロマトグラフィーによりヘテロ二本鎖分子をそれらに対応するホモ二本鎖分子から分離するために好ましい。至適なカラム温度は分離するサンプルの配列（塩基組成）、固相の選択、移動相の選択、ｐＨ、流速等に依存し、そして多くの場合で実験的に決定されるだろう。理想的には既知の配列の場合、適当なカラム温度を計算することができる。
【００７０】
本発明の１つの観点は、約５０℃〜約７５℃の温度範囲で一連のＤＡＥＨＰＬＣ分離におけるＤＡＥＨＰＬＣによりＤＮＡ混合物を分析することを含む温度タイトレーションを行う工程を含む方法であり、各々の連続的な分離は突然変異の分離温度範囲において突然変異の分離プロフィールが観察されるか、または突然変異の分離プロフィールの不存在が観察されるまで直前の分離よりも高い温度を有し、ここで突然変異の分離プロフィールはサンプル中の突然変異の存在を同定し、突然変異の分離プロフィールの不存在は突然変異の不存在を示す。あるいは約５０℃〜約７５℃の温度範囲で一連のＤＡＥＨＰＬＣ分離におけるＤＡＥＨＰＬＣにより混合物を分析し、各々の連続的な分離は突然変異の分離温度範囲において突然変異の分離プロフィールが観察されるか、または突然変異の分離プロフィールの不存在が観察されるまで直前の分離よりも低い温度を有し、ここで突然変異の分離プロフィールはサンプル中の突然変異の存在を同定し、突然変異の分離プロフィールの不存在は突然変異の不存在を示す。
【００７１】
以下の実施例の検討から分かるように、ヘテロ二本鎖の検出は多くの場合で約７３℃のカラム温度で行うことができる。
【００７２】
本発明の方法を支持するために実験を行い、ここで以下に記載するようにサイズが２０９塩基のヘテロ二本鎖中に１つの塩基誤対合が検出された。
【００７３】
核酸フラグメント中の多形を検出するために例示する方法では、１個の塩基対を除き配列が同一である２種の異なるホモ二本鎖を、変性そして再アニールさせて４種の生成した二本鎖生成物である２種のホモ二本鎖および２種のヘテロ二本鎖を含有する混合物を形成する実験を行った。実験の詳細は以下の実施例に記載する。２種のそのようなホモ二本鎖を変性そして再アニールすることにより形成される生成物の混合物を具体的に説明する一般的なスキームを図１に提供する。
【００７４】
以下に記載する実験の組で使用する例示のポリヌクレオチドは、一般に以下のように、そして実施例２に記載するように調製した。所望のポリヌクレオチドフラグメントは、ヒトＹ染色体ＳＴＳ、ｓＹ８１（ＤＹＳ２７１座）の代表的な対立遺伝子状態をクローニングすることにより得た。ＳＴＳ ｓＹ８１は、２０９ｂｐ配列のタグをつけた部位（ＳＴＳ）内のヌクレオチド１６８位で１つの点突然変異、ＡからＧへの転移を表す（Ｓｅｉｅｌｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２１５９（１９９４））。最初に、２０９ｂｐの「野生型」Ａ対立遺伝子およびアフリカ人のＧ対立遺伝子形を市販されているプラスミドから増幅した。
【００７５】
実施例２に記載するように、２０９−ｍｅｒの二本鎖で行った実験について簡単に説明すると、二本鎖のポリヌクレオチドＰＣＲ生成物、ホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９を変性および再アニーリングに供した。
【００７６】
あるいは２０９塩基対フラグメント（Ｓｅｉｅｌｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．）の野生型およびＧ対立遺伝子形を含む市販の混合物（パート番号 ４４０５８２、トランスゲノミック社：Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．）を得、そして変性および再アニーリングに供した。
【００７７】
２０９塩基対フラグメントの二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖Ａである「ホモ−Ａ−２０９」は、２種の相補的な２０９塩基フラグメントであるポリヌクレオチド１０および２０から成った（図１）。２番目の２０９塩基対フラグメントの二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖Ｇである「ホモ−Ｇ−２０９」は、１つの塩基対（ホモ−Ａ−２０９にはＧ−Ｃに代わりＡ−Ｔ置換が存在する）を除きホモ−Ａ−２０９と配列が同一であり、そしてポリヌクレオチド３０および４０から成った。ポリヌクレオチド３０は、ポリヌクレオチド１０中の同様な位置のアデノシンに比べてポリヌクレオチド３０の５’末端から１６８位のグアノシンを除き、ポリヌクレオチド１０と配列が同一であった。同様な様式で、ポリヌクレオチド４０は、ポリヌクレオチド２０中の同じ位置でチミジンを置き換える５’末端から４２位のシトシンを除きポリヌクレオチド２０と配列が同一である。
【００７８】
元のホモ二本鎖ホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９、および新たに形成されたヘテロ−ＡＣ−２０９およびヘテロ−ＧＴ−１０９を含有する生成物の生成混合物を、次でＤＡＥＨＰＬＣを使用する本発明の変性条件下で分析した。名称ヘテロ−ＡＣ−２０９は、ポリヌクレオチド１０および４０をアニーリングすることにより形成された二本鎖生成物を表し、そしてホモ−Ａ−２０９に対して１６８位で１つの塩基対Ａ−Ｃ誤対合を含む。名称ヘテロ−ＧＴ−２０９は、ポリヌクレオチド２０および３０をアニーリングすることにより形成された二本鎖生成物を表し、そしてホモ−Ｇ−２０９に対して１６８位で１つの塩基対Ｇ−Ｔ誤対合を含む。
【００７９】
６回の別個の実験を７２℃から７７℃で行って（図２）、カラム温度が生成物の混合物成分の分離に及ぼす効果を至適化した。予想どうり、所定の固相支持体を使用すること、移動相の成分およびそれらの相対的量、ｐＨ、勾配プロフィール、流速、カラム温度等のような実験パラメーターの調整が、本発明の分離法を行うための至適変性条件の選択に有用であり得る。
【００８０】
７２℃のより緊縮度の低いカラム温度で、ホモ−Ａ−２０９、ホモ−Ｇ−２０９、ヘテロＡＣ−２０９およびヘテロＧＴ−２０９を含有する生成混合物中の個々の成分の分離／検出は行わなかった（図２）。混合物の成分は同時に単一ピークとして溶出し、保持時間は、各ホモ二本鎖ホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９（図３）の保持時間とおよそ等しかった（図３）。図３では、プロフィール２２、２４、２６および２８は、それぞれＡ対立遺伝子、Ｇ対立遺伝子、ハイブリダイズしていないＡおよびＧ対立遺伝子の混合物、およびＡおよびＧ対立遺伝子のハイブリダイズから生じた混合物に対応する。
【００８１】
カラム温度７３℃に上げると、図２に示すように分離の解像度が有意に強化される。ホモ二本鎖生成物はヘテロ二本鎖から明らかに分離され、これはホモ二本鎖の溶出よりもわずかに後にカラムから溶出した。
【００８２】
ＤＮＡフラグメントは本発明の至適化された変性クロマトグラフィー条件を使用して部分的に変性するだけであり、塩基−対誤対合の部位で「バブル」の形成をもたらす。この部分的変性またはバブルにより引き起こされるＤＮＡ二本鎖の歪みは、より長い保持時間へのシフトを生じ、そして図１に示すように同じサイズのホモ二本鎖から単一の塩基対誤対合を含むヘテロ二本鎖の分離を可能とすると思われる。
【００８３】
上記の結果は、本明細書に記載した変性アニオン−交換ＨＰＬＣ条件を使用するヘテロ二本鎖の部分変性により、同じサイズのホモ二本鎖から単一の塩基対誤対合を含有する核酸二本鎖の効果的分離を示し、より長い保持時間を導く。
【００８４】
本発明の分離法の実施では、種々の因子が生成物の解像に影響を及ぼし得る。すべての可能性のある核酸フラグメントを本ＤＡＥＨＰＬＣ法で分析するために適する理想的な条件の組を決定することは不可能であるが、今日まで行った実験に基づき、好適であると決定されたか、またはサンプルの解像に影響すると判明した条件を以下で検討する。
【００８５】
本発明のＤＡＥＨＰＬＣ法の実施では、分析する核酸サンプルを典型的には注入し、そして固体支持体を溶出する前に移動相と前混合する。次いでサンプルを固相と直接接触させるか、あるいは「プレ−コンディショニング」チューブまたはプレ−カラムに通して、サンプルおよび移動相を固体支持体と接触する前に平衡化させる。
【００８６】
１つの態様では、移動相成分をカラムオーブン内側のミキサーに導入し、サンプルと接触する前に混合する。あるいは移動相成分を周囲温度で混合し、そしてこれもまたカラムオーブンの外側で周囲温度に維持されたサンプル注入器と接触させる。上記の両変更方法は、記載してきたようなヘテロ二本鎖の検出に適することが示された。
【００８７】
好適な態様では、サンプルは移動相に注入され、カラムの温度に前−平衡化される。この様式では、カラムと注入器との間のほぼ直接的な連結が提供されて、拡散を最小とし、そしてサンプルの解像を強化する。
【００８８】
あるいは低−圧ＨＰＬＣシステムを使用する時、サンプル混合は典型的には周囲温度で行う。オートーサンプラーがカラム温度まで注入口の加熱を提供しない場合、標準的なＨＰＬＣチューブ（例えば直径０．００５〜０．０１）を注入器とカラムとの間に配置して移動相を加熱し、そしてＤＮＡサンプルの部分変性を誘導することができる。このチューブは好ましくは、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）またはチタニウムから作られるような非−ＤＮＡ結合ハードウェアを備えている。チューブの長さは典型的には熱変換の効率に基づき決定される。プレ−カラムの全長はオーブン温度で維持することができるか、あるいはプレ−カラムの一部のみが加熱されてもよい。サンプルはプレ−カラムに通され、そして次に後の溶出のために固相と接触させられる。
【００８９】
上記に検討したように、本発明のＤＡＥＨＰＬＣ法に影響を及ぼす１つのパラメーターはｐＨである。一般に移動相のｐＨは７から９の間に維持される。２０９塩基対長のポリヌクレオチド中に１つの塩基の誤対合を観察する試みでは、分離を行うために好適なｐＨは８．０となることが分かった。
【００９０】
本発明の分離法を行うために選択されるパラメーターに影響を及ぼす別の因子は、分析するサンプル配列の組成である。これに関して、ＧＣ−リッチな領域に挟まれた多形部位を含有するサンプルについては、多形を検出するためにより高い温度が必要となり得る。
【００９１】
本発明は、異なる源から単離された類似の核酸間の多形および配列変動をスクリーニングするための一般法を提供する。
【００９２】
本発明のＤＡＥＨＰＬＣは、結合分析、進化研究、法医学、疾患の原因遺伝子の突然変異の同定、遺伝子マーカーの開発等を含む広範な分野に潜在的な応用を有する。本発明の方法は、少量（典型的には約１００ナノグラム未満）の非精製サンプルが必要なだけであり、数分で結果を与え、オンライン検出を利用し、そして完全な自動化を適用することが可能である。
【００９３】
ヘテロ二本鎖の形成（例えばＰＣＲ生成物の）に基づく本発明のヘテロ二本鎖の分離および検出法は、現在利用できる手法（ＲＮａｓｅ Ａ 開裂誤対合）によりも迅速、簡便、より感受性であり、そしてより多くの情報を提供する。本発明のＤＡＥＨＰＬＣ法は、ヘテロ二本鎖を少なくとも部分変性するために効果的な条件を利用することにより、ヘテロ二本鎖およびホモ二本鎖の両方を含有する混合物中のヘテロ二本鎖分子を検出する。そのような変性条件下で、ヘテロ二本鎖はそれらのホモ二本鎖の対とはわずかに異なる保持時間（典型的には短い）を現し、このようにしてヘテロ二本鎖形成を検出するための感度のある、しかも簡便なアッセイを提供する。
【００９４】
上記の条件を使用して、塩基対誤対合およびインデル（ｉｎｄｅｌ）は、本発明の方法を使用してヘテロ二本鎖中に観察することができる。これらのヘテロ二本鎖に関して好適なサイズ範囲は、約３０〜１０００塩基対長の範囲であるが、より大きなサイズのヘテロ二本鎖も使用することができる。さらにより長い増幅生成物のポスト−ＰＣＲから生じる消化制限フラグメント（例えば１００〜１０００ｂｐのサイズ範囲）の複雑な混合物も、ヘテロ二本鎖の存在について調査することができる。
【００９５】
サンプルスクリーニング中にホモ二本鎖だけが観察される場合、配列は比較するすべての個体で単形態性であるので（例えば多形部位を欠く）、さらに標準的なシークエンシングは必要ではない。本発明の方法を使用するにあたり、ヘテロ二本鎖と同定された、およびしたがって少なくとも１つの多形部位を含有すると同定されたＤＮＡフラグメントのみが常法によりシークエンシングされて、観察された多形（１つまたは複数）の特性決定がなされる。
【００９６】
本ＤＡＥＨＰＬＣ法を使用して、多数の比較するＤＮＡサンプルを迅速かつ効率的に多形の存在（または不存在）についてプレ−スクリーニングすることができ、そしてこのプレ−スクリーニングで多形部位を保有すると同定されたサンプルのみがさらに典型的には通例のシークエンシング技法により特性決定される必要がある。そのようなゲノム分析は、例えば哺乳動物、魚類、爬虫類、植物または他の目的生物に由来する任意のゲノム核酸材料を使用して行うことができる。
【００９７】
本発明は、ＤＮＡフィンガープリントのような法医学的応用にも使用することができる。ＤＮＡフィンガープリントには、同一のハプロタイプを含む２つの個体のＤＮＡサンプルが偶然に異なる個体に由来する確率は大変低くなるように選択した１組の多形座の同定が必要である。この方法は組換えの確率が極めて低いので、連続する配列の長さに沿って低い突然変異する多形部位を同定するための効率的な取り組みを提供し、法医学的利用のために望ましいハプロタイプ情報が保存されている見込みが上がる。
【００９８】
ゲノムの多様性を分析することに加えて、本発明の方法はバクテリア、寄生虫および他の感染源を含む多数の微生物分析に応用することができる。限定するわけではないが微生物の例には以下を含む：
（ｉ）細菌性。ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）−外膜タンパク質、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クラミジア（Ｃｌａｍｙｄｉａ）−外膜タンパク質、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；
（ｉｉ）ウイルス性。ネコ白血病ウイルス（ＦｅｌＶ）、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）；
（ｉｉｉ）菌類性。ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）−コリン依存性肺炎球菌ムレインハイドロラーゼ；ハクセンキン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ブラストマイセス（ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コクシジオイデス（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）（ニューモシスチス カリニー：Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｎｉｉ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（カンジダ アルビカンス：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むヒト病原性真菌に関する１８Ｓ ｒＤＮＡ配列；
（ｉｖ）寄生虫：オンコセルカ（Ｏｎｃｏｃｅｒｃａ）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５８：２５９−２６７（１９９３））、バベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ）（Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５４：８７−９５（１９９２））、ギアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ）（Ｗｅｉｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５４：８７−９５（１９９２））、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐｐ）（Ｂｒｉｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５３：１２１−７（１９９１））、トリパノソーマ種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ）（Ｂｒｅｎｉｅｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ ４６：３３５−４１（１９９２））；および
（ｖ）マイコプラズマ。例えば１６Ｓ ＲＮＡに由来する配列を使用したライム病、マイコプラズマ肺炎（Ｋｌｅｅｍｏｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１２：３４４−５（１９９３））。
【００９９】
典型的には任意の標的核酸用のプローブを、ｒＲＮＡのような微生物のゲノム材料の領域から選択することができる（例えば、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７１（１２）：６４５５−６４６７（１９８９）のような）。このようにヘテロ二本鎖を形成するプローブを同定し、特別な種を同定することができる。ヘテロ二本鎖の形成は、配列がプローブ配列から得られたものであることを示す。
【０１００】
本発明の方法は、クロロプラストおよびミトコンドリアのような細胞下のオルガネラを含む実体を含有する任意の核酸の分析に応用することもできる。
【０１０１】
さらに本発明の方法は、上記の微生物の治療的処置の評価法をスクリーニングするためにも使用することができる。本明細書に記載した方法は、混合物中の核酸（組織サンプルから得た核酸のような）において、疾患の処置の継時的変化が、疾患に関連する核酸標的配列のＤＮＡ配列の変動に及ぼす効果を評価するために有用である。治療的処置は典型的には例えば微生物／感染源により引き起こされる疾患状態の消散、排除または軽減に向けられる。
【０１０２】
例示的応用では、本方法は処置中に生じるかもしれない感染および任意の変化を監視するために使用する。感染に応用した時、本発明のＤＡＥＨＰＬＣ法は処置の開始前に選択した患者における感染のベースラインを確立するために使用することができる。典型的には、血液および血漿サンプルを治療試験中に個体から連続的に採取する。
【０１０３】
１つの例示的応用では、本発明の方法は結核（ＴＢ）の場合のように疾患の処置の効果を監視するために使用することができる。本発明のＤＡＥＨＰＬＣ分離法は、個体中で増殖している結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株の存在および多様性を監視するために使用することができる。例えば６５ｋＤａの結核菌表面抗原をコードする遺伝子の３８３ｂｐセグメントを、処置中の患者から得たサンプルから増幅し（Ｇｈｏｓｓｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１（３）：１８５−１９１（１９９２））、そして本発明の方法により分析することができる。
【０１０４】
本発明は、治療中に豊富なＴＢ変異体の特異的な損失または増加を検出するためにも使用することができる。
【０１０５】
一般に本発明の方法は、感染中にいつ変異体が入り、そして出たのか、およびどの処置が変異体群に影響を有するのかを監視するために使用することができる。本発明の方法を使用して、特定の微生物に関する薬剤耐性に関連する特別な座を、微生物の異なる個体群を追跡するために使用することができ、ここで変異体の座をアニオン−交換ＨＰＬＣを使用した検出に応用する。
【０１０６】
本アッセイは細胞培養系および動物モデルならびに患者の多様性を評価するために使用することができる。
【０１０７】
さらに系統発生的関係を本発明の方法により確立することができる。系統発生的分析は、解糖酵素（ホスホグリセレートキナーゼのような（Ｖｏｈｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖａｌ．３４：３０３−３９５（１９９２）））またはｒＲＮＡ配列のようなほとんどの選択されたゲノム配列を用いて行うことができる。植物間の系統発生的関係は、例えば色素体のリボゾームＲＮＡオペロン（Ｗｏｌｆｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８（６）：１３０７−１０４８（１９９２））に由来する配列を使用して確立することができる。
【０１０８】
本発明の別の態様は、ホモ二本鎖複合体の形成に基づき変異体を同定するための特異的プローブの使用である。例えば、特定のウイルス変異体に対応する配列をクローン化し、そして増幅することができる。これらのクローン化した配列は、次いで多数の試験起源から単離したウイルス分子に対するプローブとして使用する。本発明の方法を使用して、プローブと試験起源との間のハイブリダイゼーション反応でホモ二本鎖が形成された場合、試験起源はクローン化したプローブ変異体と類似することが示される。一方、プローブと試験起源との間でヘテロ二本鎖が形成された時、プローブと試験起源との間で配列多様性が示される。
【０１０９】
ガンに関して、いったん診断が行われ、そしてガン性の増殖に関連するＤＮＡの領域が同定されたら、本発明のヘテロ二本鎖分離法は組織群内の腫瘍細胞の浸潤の程度を評価するために使用することができる。有効な標的配列の例は、限定するわけではないが以下を含むプロトオンコジーンである：ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｋｉｔ、ｒａｓ、ＢＣＲ／ＡＢＬ（例えばＧａｚｄａｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８９２，８２９号明細書；Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｅ．，編集、ガンおよびエイズのアンチセンス核酸療法の展望（ＰＲＯＳＰＥＣＴ ＦＯＲ ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＡＮＤ ＡＩＤＳ）、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９９１））；Ｚａｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．８８：１１９０−１１９５（１９９３）；Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．３（６）；３９１−３９８（１９９２）；Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖ．１９（２）：１６９−１７９（１９９３））、およびオンコジーン／腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、Ｂａｙｅｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：３８３−３９０（１９９３））。腫瘍細胞では、そのような遺伝子中またはそのような遺伝子のコード配列を囲むＤＮＡの領域中の欠失、挿入、転位および開散性配列が、すべて増幅した変異体ＤＮＡと正常細胞からの増幅したＤＮＡとの間にヘテロ二本鎖の形成を可能とする。
【０１１０】
上記で検討した応用の観点では、本発明の方法は個体内および間の両方の核酸配列群中のＤＮＡ配列の多様性のおよそのレベルを決定するための手段を提供することが分かる。
【０１１１】
典型的には本発明の方法により分析するサンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応増幅により得−増幅した配列をＤＡＥＨＰＬＣ分析前に変性そして再アニールする。増幅により核酸サンプルを得ることに加えて、他のサンプル起源も使用することができる。例えば２つの異なる起源から目的の配列をクローン化することができる（例えばラムダベクター中で：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、第２版（１９８９））。目的の配列はベクター配列から独立して単離される（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化およびフラグメント精製により）。これらの２種類のサンプルを合わせ、本発明の方法に従い変性させ、復元し、そして生成したヘテロ二本鎖を分析することができる。
【０１１２】
クロマトグラフィー分析用の二本鎖ＤＮＡを提供するために好適な方法は広く知られており、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、この方法は最も多くは５０〜１，０００ｂｐの範囲のサイズの１または２〜３の特別な核酸配列の分子数を大きく増幅させる方法であり、このサイズはサイズに基づくアニオン−交換ＨＰＬＣ分離に完全に適している。ＰＣＲ法は米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；４，８８９，８１８号；および同第４，９６５，１８８号明細書に大変詳細に記載されており、これら各々は引用により本明細書に編入する。１回のＰＣＲは１または２〜３のＤＮＡフラグメントを、クロマトグラフィーのピークのＵＶ吸収検出に丁度必要な濃度範囲（約１０−１０から１０−７Ｍの間）で生成する傾向があり、特にワックス蒸気バリアーを使用するＨｏｔ Ｓｔａｒｔ（商標）法により行った場合はそうである（１９９０年２月１６日に出願された米国特許第４８１，５０１号明細書に記載され、そして引用により本明細書に編入され、そしてＤ’Ａｑｕｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３７４９（１９９１）により記載されているように）。
【０１１３】
本発明の目的のために、アニオン−交換固体に添加した試験サンプル核酸は、試験サンプルが核酸と同じく強力にアニオン−交換固体に結合するか、または目的の核酸を溶出するために効果的な同じ塩濃度範囲でアニオン−交換固体から溶出する実質的な量のＵＶ−吸収物質を含まない限り、精製する意味はない。そのような妨害物質が存在する場合、それらは通常、一般に入手可能な分子生物学の手引き書に記載されているようにフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により除去される。好ましくはアニオン−交換固体に添加されるサンプルは処理されて、アニオン−交換固体を覆う、またはそれに凝固するかもしれない粒状物は除去されている。好適な粒状物の除去様式には、シリンジで操作して（ｓｙｒｉｎｇ−ｄｒｉｖｅｎ）および遠心で操作して（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ−ｄｒｉｖｅｎ）約０．４５μｍ以下の孔サイズのフェルターに通し、および例えばミクロ遠心で最小には１０，０００ｒｐｍで少なくとも５分間、単なる遠心を行う。遠心のみよりも濾過が好ましく；両方法とも化学者、生物学者および分子生物学者に周知である市販されている多数の装置および使い捨てデバイスを用いて行うことができる。試験サンプル調製物の最終的な詳細は、好ましくは核酸が勾配溶出の出発溶媒の組成に近い溶媒に溶解しているべきである。
【０１１４】
クロマトグラフィー被検体は二本鎖のＤＮＡであるが、試験サンプルがＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを含むと予想される時、被検体の溶出プロフィールにおいて後者の２種類の核酸の潜在的妨害を最小にするために、２つの好適な様式が存在する。１つの様式は、ＲＮＡに特異的な（例えば、ＲＮａｓｅＡまたはＲＮａｓｅＴＩ）、または一本鎖ＤＮＡに特異的な（例えば、アスペルギルス オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に由来するＳ１ヌクレアーゼまたはマングビーンヌクレアーゼ）ヌクレアーゼで、同酵素による消化から二本鎖ＤＮＡを保護するために分子生物学者には周知な酵素濃度、温度およびバッファー組成条件下で最初に試験サンプルを処理することから成る。
【０１１５】
他の様式は、最初に試験サンプルと一本鎖ＤＮＡを結合する固体材料とを、この結合特異性を強める溶媒および温度条件下で接触させることから成る。ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡが結合した固体材料を、残りの液体試験サンプルから取り出した時（例えば遠心または濾過により）、液体試験サンプルはアニオン−交換固体に添加する準備ができでいる。好ましくはこの接触はクロマトグラフィー溶出で使用する最初の溶媒とおよそ同じ組成の溶媒中で行われる（例えば、約０．５〜１．０Ｍのおよその濃度範囲のジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムまたはテトラアルキルアンモニウム塩を含む溶媒）。
【０１１６】
ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの特異的な結合のための好適な固体は、膜形態で最も多く利用されており、そして固体支持体に一連のアラルキルアミンが共有結合しているニトロセルロースである。そのようなアラルキルアミンの例は、フェニルエチルアミン、フェニルプロピルアミン、フェニルブチルアミンおよびナフチルエチレンジアミンである。特に好都合な固体支持体は、アルテックアソシエーツ社（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）により供給されるＨＥＭＡ−１０００ ＥＨ Ｂｉｏのような粒状のエポキシド−誘導化された孔質または非孔質のアクリル酸マトリックスである。アラルキルアミンは、アルテックにより供給される使用説明に従いエポキシドを持つ支持体と反応させることができる。市販されている固定化アラルキルアミンは、フェニルブチルアミン Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（ローム ファルマ：Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ）である。しかしこれは容量、結合カイネティクスおよび耐久性がアラルキルアミン−修飾エポキシドを持つＨＥＭＡよりも劣る。試験サンプル処理に使用する固体支持体の量は、代表的な試験サンプルの試行錯誤の後に最少化されて、固体から処理したサンプルの回収を簡略にすることができる。
【０１１７】
ＨＰＬＣ被検体が二本鎖ＤＮＡであり、妨害するＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡが存在する可能性があり、そして丁度記載したような処理が有益である試験サンプルの１種類は、ＰＣＲ生成物である。最初のＰＣＲ標的がゲノムＤＮＡに含まれる場合、ゲノムＤＮＡは実質的にＰＣＲ熱循環の終わりまでに一本鎖にされるだろう。ＰＣＲ増幅用の試験サンプルは、ＲＮＡを含むことも多い。ＰＣＲ生成物には未反応プライマーも付随し、これは一本鎖の合成オリゴヌクレオチドである。
【０１１８】
本発明のアニオン−交換溶媒は、好ましく標準的な化学法を使用して脱イオン化されたまたはガラス−蒸留された水中に作成する。テトラメチルアンモニウム クロライドのような溶出塩の中には高度に精製された固体として販売されているものもある。しかし多くは等モル量のトリメチルアミンおよびテトラメチルアンモニウム 水酸化物のような市販されている塩基、およびギ酸、酢酸、硝酸、過塩素酸、メタンスルホン酸およびエタンスルホン酸のような酸を混合することにより調製しなければならない。成分の酸および塩基のモル濃度は、分析化学の常法により標準化された酸または塩基を用いて、表示器または電位差的終点に対する滴定により前以て決定することができる。多くの市販されているアルキルアンモニウム塩は吸湿性であり、そして酸および塩基の多くが濃度が幾分変動する濃縮された水溶液として供給されるので、溶媒調製における厳密性は注意深く滴定した成分から作られた溶液の伝導度、密度または屈折率の注意深い測定により進められる。次に後者の溶液は、このような容易に測定された物理的特性の記録値に合う濃度に調整することができ、酸−塩基滴定のより面倒な方法を回避する。
【０１１９】
本発明の溶媒中の溶出塩の最終濃度は、一般に０．５から２Ｍの間にある。溶出塩アニオンが強酸の共役塩基である時（例えばブロミド、クロライド、ニトレート、ペルクロレート、メタンスルホネートおよびエタンスルホネート）、溶出塩はｐＨ４〜９の範囲でほとんど効果的な緩衝能を提供しない。したがって、所望のｐＨの１ｐＨ単位内（好ましくは１／２ｐＨ単位内）にｐＫａを持つさらなる緩衝酸を溶媒に加えて最終濃度を好ましくは０．０１〜０．０５Ｍの範囲にする。特に好適な緩衝酸は、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５：４６７−４７７（１９６６）に最初に記載された合成の両性イオンバッファー、あるいはピペラジニウム クロライド、メチル ピペラジニウム クロライドおよびエチレン ジアミン ジヒドロクロライドのようなそれらの共役塩基（アミン）の塩のとして提供されるカチオン性の酸種（プロトン化アミン）である。好適なバッファーの１例はＴｒｉｓ−ＨＣｌである。さらに十分な塩基を加えて希釈した緩衝酸を所望のｐＨ、４から９の間に調整しなければならない。溶媒からすべてのクロライドイオンを排除することを望む場合、所望のｐＨ値を得るために、均等な緩衝化は塩基性アミン（例えばピペラジンまたはエチレンジアミン）を、溶出塩を調製するために使用する十分な酸と合わせることにより得ることができる。
【０１２０】
本発明の実施において、部分変性条件は低いｐＨ値の移動相を使用することにより得られる。より低いｐＨはＡ、ＧおよびＣ塩基に正の電荷を付加する。ｐＨ９〜１０より高いような高いｐＨ値は、二本鎖ＤＮＡを部分的に変性させるために使用することができる。アニオン−交換分離は好ましくは、ｐＨ値が約１０より高い時は４級アミン官能基を持つマトリックス上で行われる。９より高いｐＨを有する移動相を使用する時、シリカ骨格を有するアニオン−交換固体は固体がこのｐＨで溶解する傾向にあるので避けるべきである。
【０１２１】
本発明のアニオン−交換溶媒は、低濃度のキレート剤（例えば０．１〜１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ）のような添加剤または１〜４０％の濃度範囲のアセトニトリル、ホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチルおよび２−プロパノールおよびＮ−メチルピロリドンのような有機溶媒も含むことができる。キレーターは、核酸調製物中に通常見いだされ、そして核酸に強力に結合しているＭｇ２＋が、アニオン−交換分離を妨害することを防止できる。これはまた、Ｆｅ（ＩＩＩ）酸化状態の錯体イオンとして通常存在する偏在する混入物である偶発性の鉄が、溶存Ｏ２による核酸の酸化および開裂を触媒することを防止する。鉄が触媒する酸化反応を遮断するために特に好適なキレーターは、チバ−ガイギー（Ｃｈｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）により製造され、そしてシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）から販売されているデフェロキサミンメシレートである：０．１ｍＭ濃度のこの化合物で十分に保護できる。
【０１２２】
適当なキレート剤の非限定的例には、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロム ブラックＴ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサール−ビス（２−ヒドロキシアニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、メタルフタレイン、アルソン酸、α，α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、β−ヒドロキシキナルジン、β−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α，α’，α’−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、ロジゾン酸、サリチルアルドキシム、サリチル酸、タイロン、４−クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバルバミン酸ナトリウム、ジベンジルジチオカルバミン酸亜鉛、デフェロキサミンメシラート、クラウンエーテルおよび上記の任意の１以上の混合物を含む。
【０１２３】
（ａ）０．５〜２Ｍの濃度範囲のアルキルアンモニウム溶出塩の存在、および（ｂ）３．５〜９．５の間のｐＫａを持つ０．０１Ｍの緩衝酸により提供されるものに少なくとも等しいｐＨ４〜９の範囲での緩衝能に加えて、本発明のアニオン−交換溶媒は、第３の要件を満たさなければならない：溶出した核酸の分光光度的アッセイを可能とするために、特に２６０ｎｍ付近での十分なＵＶ透過性。蒸留水に対して０．０１未満の２６０ｎｍでの吸収（１ｃｍの路長）が好ましく、２成分勾配溶出の両バッファーがおよそ同じ吸収を有する限り、０．０１から０．１の間の吸収に耐えられる。厳密な吸収カット−オフは無いが、吸収が約０．１を越える程度で、大変少量の核酸を分析する能力はますます制限される。したがって、アニオン−交換溶媒を調製するための重要な部分は、ＵＶ−透過性成分の調達ならびに成分および仕上げた溶媒を発色反応（主に縮合および酸化）が起こらない条件下で保存することである。好適な条件は暗中、低温および自らＵＶ−吸収物質（主に酸化防止剤）をそれらの水溶性内容物中に浸出しないプラスチック容器の使用である。好ましくは吸着した鉄のような吸着した酸化的に活性な金属を除くために、ＨＮＯ３のような強い鉱酸に浸した後のガラス容器が許容される。色の形成を最少にする目的では、本発明の溶媒が特に有機溶媒を含有する場合は新しく調製されることが好ましい。また緩衝酸の濃度を０．０５Ｍ以下、好ましくは０．０２Ｍ未満に制限することも好適である。溶媒ｐＨが約７から約４の間である場合、あるいは４級アンモニウム官能基がアニオン−交換固体に使用される場合、塩に必要とされるｐＨ緩衝能は最少である。
【０１２４】
本発明のアニオン−交換溶媒の幾つかの処理は、ＵＶ−吸収性の不純物を除去するために、そしてそのような不純物のより多くの生成を遅らせるために有用である。ＵＶ−吸収性の不純物は実質的には芳香族有機化合物から成り、これは溶媒をそのような化合物を優先的に吸着する固体と接触させることにより除去することができる。そのような固体には、活性炭、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−１６およびＸＡＤ−４のようなビーズ状のマクロ網状（ｍａｃｒｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ならびにＸＡＤ−７およびＸＡＤ−８（ローム アンド ハース：Ｒｈｏｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ）のようなアクリル酸樹脂、ならびにＡｍｂｅｒｓｏｒｂ（商標）ＸＥ−３４０、ＸＥ−３４７およびＸＥ−３４８（ローム アンド ハース）のようなピロール化したビーズ状のマクロ網状ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂を含む。
【０１２５】
製造および保存中の酸化的な副反応から生じる溶媒の着色（ＵＶ中で）の範囲で、着色は、不純物として存在し、そして溶媒中に溶解した酸素により溶媒成分の酸化を触媒する原因である酸化的に活性な遷移金属、主にＦｅ、Ｃｒ、ＣｏおよびＣｕの吸着的除去により減少させることができる。遷移金属混入物を除去する好適な様式は、溶媒または溶媒を作る成分と錯化固体とを接触させることである。市販されている錯化固体には、Ｃｈｅｌｅｘ ２０および１００（バイオラッド ラボラトリーズ：ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＣ−７１８（ローム アンド ハース）、Ｃｈｅｌｉｔｅ（商標）Ｃ、ＮおよびＰ（セルバ バイオケミカルズ：Ｓｅｒｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｄｕｏｌｉｔｅ ＥＳ ３４６、ＥＳ ４６６およびＥＳ ４６７（ケミカル プロセス社：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏ．）、ＢｉｏＲｅｘおよびＣｈｅｌｅｘ 錯化膜（バイオラッド ラボラトリーズ）、およびキレートＳｈｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む。
【０１２６】
溶媒またはそれらの成分を、芳香族化合物を優先的に結合する固体と接触させることは、溶媒または成分の水性濃縮物中に懸濁した固体を撹拌し、続いて固体を沈め、そして上清液体のデカントまたは濾過により行うことができる。あるいは固体を円筒カラムに充填し、これに溶媒または溶媒成分の溶液を、溶媒からの不純物の完全な除去を行うために十分に低い速度で通すことができる。ここで今、フィルター状の多孔質のプラスチックマトリックスに埋められた数種の吸着固体を利用することができるので、効果的な接触にはアニオン−交換溶媒を比較的低い圧をかけてフィルターに通すことが必要なだけである。
【０１２７】
最終的に有用なアニオン−交換溶媒の調製様式は、真空または加圧下で公称０．２２μｍ以下の孔サイズのフェルターに通す、好ましくは滅菌フェルターおよびリザーバーを使用するミクロ濾過である。特に好適なフィルター材料は、アノテック セパレーション社（Ａｎｏｔｅｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）により製造され、そして多くの研究試薬および装置の供給元から販売されている０．２２μｍ孔サイズのアルミナハニカム膜である。そのような濾過はクロマトグラフィー装置を傷つけるかもしれない粒状物質を取り除くだけでなく、溶媒成分を代謝する細菌を除去することにより溶媒の使用期限も延ばす。
【０１２８】
ＨＰＬＣ装置の最も重要な部品はカラムおよびその充填材である。分析用の分離のためには、カラム内径は好ましくは１０ｍｍを越えず、そしてより好ましくは５ｍｍを越えない；カラム長は好ましくは１５０ｍｍを越えず、そして最少１０ｍｍである。好適な充填材は、４．６×３５ｍｍのステンレス鋼製カラムに充填され、そしてスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、ネスト グループ（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）およびパーキン−エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から販売されている“ＤＥＡＥ−ＮＰＲ”としてトーソー社（Ｔｏｓｏｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造されたジエチルアミノエチル官能基を持つ２．５μｍの直径の非孔質の有機ポリマー性（アクリル酸）材料である。また４．６×１００ｍｍのステンレス鋼製カラムに充填さた“Ｇｅｌ−Ｐａｋ ＦＡＸ”としてミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のウォーターズクロマトグラフィー部門（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）により製造および販売されているジエチルアミノエチル官能基を持つ２．５μｍの直径の非孔質のアクリル酸ポリマー性ビーズも好適である。また、ポリマーラボラトリーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、パーキン−エルマー社およびパーセプティブ バイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により販売されている、４．６×５０または１５０ｍｍのステンレス鋼製カラムに充填さた“ＰＬ−ＳＡＸ”としてポリマーラボラトリーズ社により製造された親水性ポリマーでコートされ、そして４級アンモニウム基を持つ８μｍの直径の孔質（公称１０００Åまたは４０００Åの孔サイズ）のポリスチレンマトリックスも好適である。適当な充填材には、４×５０ｍｍのプラスチック製カラムに充填さた“ＰｒｏＰａｃ ＰＡ１”または“ＮｕｃｌｅｏＰａｃＰＡ−１００”としてデオネックス社（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造および販売されている４級アンモニウム官能基を持つ０．２μｍの非孔質のポリスチレンビーズで被覆された１０μｍ直径の非孔質ポリスチレン球から成る球状粒子を含む。別の充填材は、ライニン（Ｒａｉｎｉｎ）により４×５０ｍｍのステンレス鋼製カラムに充填され、そして販売されている、“Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ ４０００−７”として、または“Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−４０００−７”としてマッシェリー−ナゲル（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ）により製造された、それぞれジエチルアミノエチルを持つシランで、またはポリエチレンイミンのいずれかで共有的に被覆した直径７μｍの孔質（公称４０００Åの孔サイズ）のシリカ材料である。最後に好適であるのは、プラスチック製のエンドフィッティングを付けた５×５０ｍｍのガラスカラムに充填されたファルマシア−ＬＫＢから“Ｍｏｎｏ−Ｑ”として製造および販売されている直径１０μｍの孔質（公称４００〜６００Åの孔サイズ）の４級アミン官能基を持つアクリル酸ポリマー材料である。
【０１２９】
至適な分離カラムは以下のように計画される：クロマトグラフィー樹脂は好ましくはクロマトグラフィー分野における周知な方法により、直径が約２ｍｍから６ｍｍの間で長さが約１０ｍｍから約３０ｍｍの間の円筒状のカラムに充填される。これらは好ましくはボトムエンドフリット（その孔質部分はベット断面を完全に覆う）、およびカラム軸の中心に寄ったトップエンドフリット（その孔質部分はベット断面の一部のみを覆う）を有する。４．６ｍｍの内径を有するカラムに関してはそのような限定された直径の孔質プラグを有するエンドフリットの選択は、アップチャーチ サイエンティフィック（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手可能である。
【０１３０】
適当なアニオン−交換カラムであれば、突然変異検出のための核酸分離は本発明の溶媒および方法を用いて市販されている広範な種類のＨＰＬＣ装置で行うことが可能である。本発明に好適であるのは、２成分の勾配移動相送達系、少なくとも±０．１℃の精密度のカラム温度制御、および２６０ｎｍでの分光光度的検出である。しかし完全な勾配分離で３分以内に５０〜１，０００ｂｐサイズの範囲の二本鎖ＤＮＡの大変迅速で効率的な解像は、ＨＰＬＣ装置が以下の基準を満たす場合、トーソーＤＥＡＥ−ＮＰＲ材料で得ることができる：溶媒ミキサーとカラムとの間の１００μＬ未満の総容量、最高１．５ｍｌ／分の総流速、１００ｍｓ未満の検出器の応答時間および１０μＬ未満の検出器容量。さらにカラムと検出器との間のチーブの長さを２ｃｍ未満とすること、および注入器および注入器をカラムに連結するチューブをサーモスタットで調温することが好ましい。
【０１３１】
本発明のアニオン−交換溶媒の最も正確な使用には、水の蒸発そして生じる溶出塩の濃縮を最少とするために、通例のＨＰＬＣ溶媒リザーバーの改変が望ましく、これはリザーバーの内容量が減るほど、保持時間が組織的に短くされるだろう。この改変では、液体上の蒸発空間が最小となるように溶媒をより硬質の殻のリザーバー内で畳めるプラスチックバックに包含する；このバックはＨＰＬＣポンプへの出口を除ききっちりと密閉される。リザーバーの内容物が消費された時、バックは畳まれて空気と接触する溶媒は最小に維持される。好ましくはこのバックは水および空気の両方に対して最小の透過性を持つプラスチックで作られている。また好ましくは、溶媒はバックに導入される前にクロマトグラフィー分野で周知な方法により脱気される。次いでこれによりヘリウムパージング（水の蒸発のための機会を増す通例のプラクティス）無しで気泡を含まない溶媒をＨＰＬＣポンプに供給することが可能なはずである。ＮＯＷ テクノロジーズ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ミネアポリス、ミネソタ州）から市販されている、折り畳み可能なテフロンライナーを含む２．５リットルの高−密度ポリエチレンリザーバーは、ＨＰＬＣ溶媒の蒸発を減らすために良く適している。本発明による核酸のＨＰＬＣ分離は、（ａ）カラムを約０．５〜約１Ｍの間の濃度の溶出塩を含有する出発溶媒組成で平衡化し、（ｂ）約１μＬ〜１００μＬの容量（好ましくは約１０μＬ）の核酸を含有するサンプルを注入し、（ｅ）約２分から約３０分の間の間隔で、溶出塩濃度を約１Ｍから約２Ｍの間の値に上げる連続的な勾配プログラムを開始し、そして（ｄ）２６０ｎｍ領域でのＵＶ吸収を記録することにより至適に行われる。任意に、分光光度的検出器からの流出物を等容量の画分または個々のクロマトグラフィーピークを含むように選択した画分のいずれかで集めることができる。溶出プロフィール、吸収のグラフ対時間または容量が、任意の多くの市販されているマイクロコンピューターに基づくデータシステムでデジタル記録される場合、クロマトグラフィーの実験が完了した時に適当なスケールとすることができる。
【０１３２】
移動相中の溶存酸素を除去する好適な方法は、インラインの脱気システムを使用することである。適当なデガッサーの例は、Ｄｅｇａｓｓｉｔ モデル６３２４である。
【０１３３】
至適なＨＰＬＣ勾配溶出プロフィールは通常、試行錯誤により選択される。目的とするすべてのピークを互いに、そしてカラムには残らないＵＶ−吸収材料の通常観察される「注入スパイク」から分離する溶出塩の出発および最終濃度がいったん見い出されれば、勾配の平均傾斜（ｓｔｅｅｐｎｅｓｓ）が所望の間隔での分離を行うために選択される。
【０１３４】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定すること意図せずに具体的に説明する。
【０１３５】
【実施例】
実施例１
一般手順
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得ることができる。この場合、目的を配列を挟むプライマーを選択し、そして目的のオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドの増幅を標準的手法（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７年７月２８日に発効された米国特許第４，６８３，２０２号明細書；Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７年７月２８日に発効された米国特許第４，６８３，１９５号明細書）により行う。目的のオリゴヌクレオチドに関する供給源の核酸はＲＮＡ（Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．、ＰＣＲ法：ＤＮＡ増幅の原理および応用（ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＮＡ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ）で、ストックトン（ｓｔｏｃｋｔｏｎ）出版（１９８９）；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ法：方法および応用の手引き（Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）（Ｍ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，編集）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）出版（１９９０））またはＤＮＡでよい。
【０１３６】
最大の感度および特異性のために理想的には異なる増幅条件を必要とする多様な配列の増幅のために、ＰＣＲ増幅をよりしっかりとしたものにするために、標準的な技法（“ＡＭＰＬＩＷＡＸ”、パーキン−エルマー バイオテクノロジー、ノルウォーク、コネチカット州）を使用して“ホットスタート（ＨＯＴ ＳＴＡＲＴ）ＰＣＲ”（Ｄ’Ａｑｕｉｌａ ｅｔ ａｌ．）を行うことができる。
【０１３７】
ＰＣＲはまた、長い標的配列を増幅することを可能とする反応条件を使用して行うこともできる（“ｒＴｔｈ−ＸＬ”ポリメラーゼおよび“ＸＬ ＰＣＲ バッファー”、アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスター市、カリフォルニア州）。これらの“長い−範囲”のＰＣＲ反応のために使用する系の種類には、ポリメラーゼの混合物を含み、その１つは誤った場合、さらなる重合を遅らせ、最終的には効果的に増幅する配列のサイズを限定し得る出来事である間違って取り込んだヌクレオチドを正すプルーフリーディング活性（すなわち３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性）を有する。Ｐｆｕ１（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）またはＵＬＴｍａ（パーキンエルマー、ノルウォーク、コネチカット州）のようなＰＣＲにおけるプルーフリーディング活性を含む熱に安定なポリメラーゼの排他的使用は、より高い複製度のＰＣＲ生成物をもたらし、そしてクローニングおよびその後の遺伝子発現実験に好適である。
【０１３８】
増幅生成物は過剰なＰＣＲプライマーから、製造元の指示に従い１回“ＷＩＺＡＲＤ ＰＣＲ ＣＯＬＵＭＮ”（プロメガ：Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）を通すことにより分けることができる。この“ＷＩＺＡＲＤ ＰＣＲ ＣＯＬＵＭＮ”は、高イオン強度バッファー中でＤＮＡに結合するシリカ基材であり、そしてＤＮＡを低イオン強度バッファー中で解放する。あるいはキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）の“ＱＩＡＱＵＩＣＫ”カラムを使用してもよい。増幅したＤＮＡは５０〜１００μＬの蒸留水でカラムから溶出される。
【０１３９】
ＨＰＬＣ勾配−等級アセトニトリルおよび標準的な化学試薬は、典型的には（ＪＴ Ｂａｃｋｅｒ）から得た。バッファー溶液の調製に使用した高純水は、Ｍｉｌｌ−Ｑ水システムを使用して得た（ミリポア、ミルフォード、マサチューセッツ州）。
【０１４０】
高性能液体クロマトグラフィーは、２つの高精度高圧勾配ポンプ（モデルＳ１１００、ＳＹＫＡＭ、ギルチング、ドイツ）、コントローラー（モデルＳ２０００，ＳＹＫＡＭ、ギルチング、ドイツ）および±０．１℃の安定性を持つカラムオーブン（モデルＳ４１１０、ＳＹＫＡＭ）、およびＵＶ検出器（モデルＵＶＩＳ２００、ライナー（ＬＩＮＥＲ）、フレモント、カリフォルニア州）から成る高圧勾配ＨＰＬＣシステムで行うことができる。起動的高圧−勾配システムは、２００μＬのミキシングチャンバーおよびカラムオーブンに直接設置されたサンプル注入ループを具備している。
【０１４１】
好適なＨＰＬＣシステムは、ヒタチ インスツルメンツ社（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）（サン ジョーズ、カリフォルニア州）からの以下の部品を含むＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析システム（トランスゲノミック社：Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．、サン ジョラ、カリフォルニア州）である：モデルＬ−７２５０オートサンプラー、モデルＬ−７３００カラムオーブン、モデルＬ−７４００検出器、モデルＬ−７１００二重ピストンポンプ。ＨＰＬＣシステムには本明細書に記載するアニオン−交換カラムが装備されている。
【０１４２】
アニオン交換媒体を含有する新たに充填したカラムは、典型的にはカラムを最初に少なくとも２時間、１５％のアセトニトリル中０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０で、０．５ｍｌ／分の流速および６０℃の温度で洗浄することにより平衡化した。
【０１４３】
次いで移動相が、サンプル注入前にサンプル分離に使用する直線勾配の出発条件に３分間にわたり調整された。
【０１４４】
１〜２時間のコンディショニング時間が、カラム平衡には十分であると決定されたが、一晩の平衡化は最大のカラム性能に好ましいことが見いだされた。
【０１４５】
サンプル分離後、固相を９０％〜１００％のバッファーＢで１〜２分間、勾配サンプリング条件で洗浄した。
【０１４６】
固相の迅速な再生により、早く、しかも反復的な注入が可能となり、このようにして高効率的かつ迅速な分析ツールを提供する。
【０１４７】
実施例２
ＡおよびＧ対立遺伝子を増幅するためのＰＣＲプロトコール
２０９ｂｐのＳＴＳ中のヌクレオチド１６８位は、ヒトにおいて多形的なｓＹ８１であり、そしてアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）塩基のいずれかである（Ｓｅｉｅｌｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．）。ＡおよびＧの両方がヒトゲノムＤＮＡから最初にサブクローン化された。
【０１４８】
プラスミドＡはクラメルバイオテック（Ｋｒａｍｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（カタログ番号 ０３３７４０、バッチ２７９７１３３、英国、ノースアンバーランド、クラムリングトンのトランスゲノミック社の部門）から得た。プラスミドＧもクラメルバイオテック（カタログ番号 ０３３８４０、バッチ２７９７２３６）から得た。プラスミドＡはｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）クローニングベクターであり（ストラタジーン、カタログ番号２１１１８８：ＧｅｎｅＢＡｎｋ（商標）データベースアクセス番号Ｕ４６０１７から入手可能）、ＳｒｆＩ部位に配置された２０９ｂｐ挿入物のＡ対立遺伝子形を有した。プラスミドＧはｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）クローニングベクターであり（ストラタジーン）、ＳｒｆＩ部位に配置された２０９ｂｐ挿入物のＧ対立遺伝子形を有した。
【０１４９】
合成オリゴヌクレオチド一本鎖ＰＣＲプライマー２０９−Ｆ（配列番号１）および２０９−Ｒ（配列番号２）を使用して、多形的ＳＴＳのいずれかの対立遺伝子（ＡまたはＧ）形を含むプラスミドクローンから２０９塩基対のＳＴＳ、ｓＹ８１を増幅した。
【０１５０】
ＰＣＲは１００μＬの最終容量中で行い、そして１×ＰＣＲバッファー（ＰＥアプライドバイオシステムのカタログ番号Ｎ８０８−０００６、１０×バッファーから）、１００μＭの各ｄＮＴＰ（ＰＥアプライドバイオシステムのカタログ番号Ｎ８０８−０００７として入手できるストック溶液から）、５０ｎｇ／反応のプラスミド（ＡまたはＧ）、１μＭの各センスおよびアンチセンスプライマー、２．５単位／反応のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ ポリメラーゼ（カタログ番号．Ｎ８０８−０２４１、ＰＥアプライドバイオシステム）を含んだ。すべての試薬はカリフォルニア州、フォスター市のＰＥアプライドバイオシステムから購入した。最終プラスミドＤＮＡ濃度は、５０ｎｇ／μＬであった。エアロゾル（Ａｅｒｏｓｏｌ）のバリアーフィルターピペットチップを、試薬の分配に使用した。
【０１５１】
プライマーはオペロン テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カタログ番号９２１８−０８１）：
配列番号１　　 センス：５’−ＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡＴＧＡＡＧ−３’
１００５４８ピコモルを１．０ｍＬのＴＥバッファーに懸濁した。
配列番号２　　アンチセンス：５’−ＡＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣ−３’
１４１１１６ピコモルを１．０ｍＬのＴＥバッファーに懸濁した。
ＴＥバッファー（テクノバ社：Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．、ハーフムーンベイ、カリフォルニア州）は、２５０ｍＬの滅菌溶液中に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含んだ。
【０１５２】
Ａ対立遺伝子の配列は：
【０１５３】
【表１】
2004514874.tif 000003
【０１５４】
であった。
【０１５５】
Ｇ対立遺伝子の配列は：
【０１５６】
【表２】
2004514874.tif 000004
【０１５７】
であった。
【０１５８】
ＰＣＲ条件：
ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００サーモサイクラーを使用した。ＰＣＲ増幅は最初の“ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）”を９５℃で１２分間行った。変性は９４℃で２０秒、続いて６３℃で１分間アニーリングし（０．５℃／サイクルのタッチダウンを含む）、そして７２℃で１分間延長した（１５サイクル）。これに続いて９４℃で２０秒間の変性、続いて５５℃で１分間のアニーリング、そして７２℃で１分間の延長が続いた（２３サイクル）。最後にＰＣＲサンプルを氷中で保存した。
【０１５９】
ハイブリダイゼーションプロトコール：
プラスミドＡおよびＧの両方の増幅から得た増幅生成物を、等モル比で合わせた。混合物は９５℃で４分間変性させ、続いて０．１℃／４秒の速度で３０分間、２５℃に冷却した。
【０１６０】
実施例３
ＤＡＥＨＰＬＣを使用した突然変異の検出
この実施例は、図２および３を参照にする。Ｇ対立遺伝子およびＡ対立遺伝子に関して、実施例１からの３μＬの増幅生成物のサンプルをアニオン−交換ＨＰＬＣカラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）に注入した。カラムはジエチルアミノエチル官能化ポリアクリレート（Ｇｅｎ−ＰａｋＴＭ Ｆａｘ パーツ番号ＷＡＴ０１５４９０、ロット番号Ｔ８２２７１、ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）を含んだ。実施例２からのハイブリダイゼーション法の生成物の分析のために、６．０μＬのサンプルを注入した。図２および３では、バッファーＡは１５％アセトニトリル中の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝８．０）（Ｔｒｉｓ−Ｃｌおよびアセトニトリルは、ＪＴ ベイカー（Ｂａｋｅｒ）、フィリップスバーグ、ニュージャジー州から）。バッファーＢは、バッファーＡ中の２Ｍ 塩化コリン（ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）、パルハム、ニューハンプシャー州）であった。クロマトグラフィーはＵＶ検出器を使用して２６０ｎｍでモニターした。カラムは７３℃で０．７５ｍＬ／分の流速で、以下の勾配を用いて溶出した。
【０１６１】
【表３】
2004514874.tif 000005
【０１６２】
ＨＰＬＣシステム（トランスゲノミック社からのＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析システム）は、ヒタチ インスツルメンツ社（サン ジョーズ、カリフォルニア州）からの以下の部品を含んだ：モデルＬ−７２５０オートサンプラー、モデルＬ−７３００カラムオーブン、モデルＬ−７４００検出器、モデルＬ−７１００二重ピストンポンプ。
【０１６３】
６種の別個の実験を７２、７３、７４、７５、７６および７７℃で行って、カラム温度が変性および続いて１つの誤対合を含む２０９ｍｅｒの二本鎖の検出に及ぼす効果について調べた。結果を図２に示す。７６℃で、各々が一本鎖オリゴヌクレオチドの保持時間に対応する保持時間の有する２種の単一ピークの検出により証明されるように、二本鎖の完全な変性が観察された。７２℃のより低い温度で、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに対応する単一ピークが観察された。
【０１６４】
図１を参照に、二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖Ａである“ホモ−Ａ−２０９”は、２つの相補的な２０９ヌクレオチドフラグメントであるポリヌクレオチド１０（配列番号３）およびポリヌクレオチド２０（配列番号５）から成った。二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖Ｇである“ホモ−Ｇ−２０９”は、１つの塩基対（ホモ−Ａ−２０９に存在するＡ−Ｔに代わりＧ−Ｃ）を除き、ホモ−Ａ−２０９と配列が同一の２０９塩基対であり、ポリヌクレオチド３０（配列番号４）および相補的ポリヌクレオチド４０（配列番号６）から成った。ポリヌクレオチド３０は、ポリヌクレオチド１０の類似する位置でのアデノシンと比較して、ポリヌクレオチド３０の５’末端から１６８位のグアノシンを除き、ポリヌクレオチド１０と配列が同一であった。同様な様式で、ポリヌクレオチド４０は、５’末端から４２位でポリヌクレオチド２０の同位置でのチミジンをシトシンに置き換えことを除き、ポリヌクレオチド２０と配列が同一であった。
【０１６５】
【表４】
2004514874.tif 000006
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
二本鎖のオリゴヌクレオチドホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９を、実施例２に記載した条件下で変性に供し、そして再アニーリングした。上記２０９−ｍｅｒのホモ二本鎖を変性し、続いて再アニーリングすることにより形成した生成物の概略的表示を図１に提供する。次いで生成物により生じた元のホモ二本鎖であるホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９、および新たに形成されたヘテロ二本鎖ヘテロＡＣ−２０９およびヘテロ−ＧＴ−２０９を含む混合物をＤＡＥＨＰＬＣにより分析した。ヘテロ−ＡＣ−２０９は、ポリヌクレオチド１０および４０をアニーリングすることにより形成した二本鎖生成物を表し、そして１６８位で１つの塩基対Ａ−Ｃの誤対合を含む。ヘテロ−ＧＴ−２０９は、ポリヌクレオチド２０および３０をアニーリングすることにより形成した二本鎖生成物を表し、そして１６８位で１つの塩基対Ｇ−Ｔの誤対合を含む。
【０１６８】
各ホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９、ならびにホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９の変性および復元により形成された生じたヘテロ二本鎖は、それぞれクロマトグラム２２、２４、２８として図３に示すように直接クロマトグラフィーにかけた。クロマトグラム２６は、実施例２に記載したように合わせたホモ−Ａ−２０９およびホモ−Ｇ−２０９の混合物に由来するが、ハイブリダイゼーション法は行なわなかった。
【０１６９】
より緊縮度が低い７２℃のカラム温度で、ホモ−Ａ−２０９、ホモ−Ｇ−２０９、ヘテロＡＣ−２０９およびヘテロ−ＧＴ−２０９を含有する生成物の混合物の分離／検出は、達成されなかった（図２）。しかしカラム温度を７３℃に上げると、２つのホモ二本鎖生成物はホモ二本鎖よりはわずかに後でカラムから溶出されたヘテロ二本鎖から明らかに分離された。
【０１７０】
７３℃でＤＮＡフラグメントは、本発明の至適化されたクロマトグラフィー条件を使用して部分変性しただけであり、塩基対誤対合の部位で「バブル」の形成をもたらす。特定の理論に拘束されることは望まないが、この部分変性またはバブルは、より長い保持時間へのシフトを引き起こし、そして図２に具体的に説明するように、同じサイズのホモ二本鎖から１つの塩基対誤対合を含むヘテロ二本鎖の分離を可能とする。
【０１７１】
まとめると上記の結果は、本明細書に記載したＤＡＥＨＰＬＣ条件を使用したヘテロ二本鎖の部分変性により、およそ同じサイズのホモ二本鎖から１つの塩基対誤対合を含むより長い（例えば２００塩基対以上）核酸二本鎖の効果的分離を表し、より長い保持時間を導く。
【０１７２】
実施例４
溶出塩としてＮａＣｌを用いた二本鎖ＤＮＡのアニオン−交換ＨＰＬＣ分離
ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖分子の混合物を含有する二本鎖ＤＮＡサンプルを実施例２に記載のように調製し、そして米国特許第５，８６６，４２９号明細書に記載した条件に類似する条件下でニオン−交換ＨＰＬＣにより分析する。ＨＰＬＣの移動相バッファーは以下の通りである：バッファーＡは１０ｍＭ シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ、２５℃でｐＫａ ９．５０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．９９を含む；バッファーＢは１０ｍＭ ＣＨＥＳ、７００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．７７を含む。ＨＰＬＣ装置は以下から成る：１０ＷＳＣヘッドを持つギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）モデル３０２Ｂポンプ、６５μＬの混合チャンバーを持つギルソンモデル８１１起動的ミキサー、ギルソンモデル８０２Ｂ圧力計モジュール、５０μＬループを持つギルソンモデル２３１サンプル注入器、ジョーンズカラムクロマトグラフィー社（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｌｔｄ．）からのカラムヒーター、８μＬ（１０ｍｍの路）のフローセルおよび２０ｍｓの応答−時間設定のパーキン−エルマーモデル ＬＣ−９５ ＵＶ／可視分光光度計検出器、ＰＣ−ＡＴクローン（ｃｌｏｎｅ）中でギルソンモデル１７５コントローラーソフトウェア（バージョン１．０）により制御および監視されるギルソンモデル６２１データモジュール。カラム温度はフィシテンプ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ）モデルＢＡＴ−１２電子温度計で±０．１℃で測定し、カラム本体にテープで付けられたテフロン−コートした直径１／２０インチＴ型熱電対を監視する。
【０１７３】
アニオン−交換ＨＰＬＣカラムは、スペルコまたはパーキン−エルマー社により供給されるトーソーＤＥＡＥ−ＮＰＲカラム、４．６×３５ｍｍである。以下の溶媒勾配プログラムを１．０ｍＬ／分の全流速で適用する（注入の時点から、すべての勾配区分は直線状）：０分で８％バッファーＢ（０．５１６Ｍ ＮａＣｌ）、０．３０分で２７％バッファーＢ（０．５５４Ｍ ＮａＣｌ）；１．３０分で５０％バッファーＢ（０．６００Ｍ ＮａＣｌ）；１．６０分で５０％バッファーＢ；１．７０分で１００％バッファーＢ（０．７００Ｍ ＮａＣｌ）；２．１０分で１００％バッファーＢ；２．２０分で８％バッファーＢ。
【０１７４】
６μＬのＤＮＡ混合物の一連の注入は、５０℃〜８０℃の範囲の温度で行う。結果は、温度の溶出プロフィールに対する、および温度が上昇した時のヘテロ二本鎖分子に融解による多くのピークの出現に対する効果を示す。
【０１７５】
実施例５
塩化ナトリウム塩および有機溶媒を用いた二本鎖ＤＮＡのアニオン−交換ＨＰＬＣ分離
実施例４の分析を繰り返すが、移動相バッファーはそれぞれ、１５容量％のアセトニトリルを含む。
【０１７６】
実施例６
溶出塩としてテトラメチルアンモニウムクロライドを用いた二本鎖ＤＮＡの
アニオン−交換ＨＰＬＣ分離
ＤＮＡサンプル、ＨＰＬＣ装置、ＨＰＬＣカラム、ＨＰＬＣの流速、分光光度計検出器の設定、および一般的な実験計画は実施例４に記載した通りである。ＨＰＬＣ溶媒は以下の通りである：バッファーＡは、１０ｍＭ ２（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、２０℃でｐＫａ ６．１５）、８００ｍＭ テトラメチルアンモニウム クロライド（ＴＭＡＣ）、ｐＨ ６．０５を含む；バッファーＢは１０ｍＭ ＭＥＳ、１５００ｍＭ ＴＭＡＣ、ｐＨ ６．０４を含む。以下の勾配プログラムを使用し、すべての勾配区分は直線状である：０分で１２％バッファーＢ（０．８８４Ｍ ＴＭＡＣ）、１．００分で３５％バッファーＢ（１．０４５Ｍ ＴＭＡＣ）；３．００分で４５％バッファーＢ（１．１１５Ｍ ＴＭＡＣ）；３．１０分で１００％バッファーＢ；３．６０分で１００％バッファーＢ；３．７０分で１２％バッファーＢ。
【０１７７】
６μＬの実施例２からのハイブリダイズしたＤＮＡ混合物の一連の注入は、５０℃〜８０℃の範囲の温度で行う。結果は、温度の溶出プロフィールに対する、および温度が上昇した時にヘテロ二本鎖分子の融解による多くのピークの出現に対する効果を示す。
【０１７８】
実施例７
テトラメチルアンモニウムクロライド塩および有機溶媒を用いた
二本鎖ＤＮＡのアニオン−交換ＨＰＬＣ分離
実施例６の分析を繰り返すが、移動相バッファーはそれぞれ、１５容量％のアセトニトリルを含む。
【０１７９】
解像は、（ａ）ＨＰＬＣ流速（例えば１．０〜１．５ｍＬ／分）の調整、（ｂ）カラムと検出器を連結するチューブの長さおよび直径を最小にする、（ｃ）カラムの寸法を改変して、長さ／直径比および全長を下げるような変更により、および（２）カラムの上端でのデットスペースを最小とするために、カラム直径よりも小さい直径のカラム入口フリットを使用することにより向上させることができる。
【０１８０】
実施例８
溶出塩としてテトラメチルアンモニウムホルメートを用いた
二本鎖ＤＮＡのアニオン−交換ＨＰＬＣ分離
ＤＮＡサンプル、ＨＰＬＣ装置、ＨＰＬＣカラム、ＨＰＬＣの流速、分光光度計検出器の設定、および一般的な実験計画は実施例４に記載した通りである。ＨＰＬＣ溶媒は以下の通りである：バッファーＡは、２０ｍＭ シクロヘキシルアミンエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、１．０Ｍ ＴＭＡＦ、ｐＨ ９．０を含む。バッファーＢは２０ｍＭ ＣＨＥＳ、１．５Ｍ ＴＭＡＦ、ｐＨ ９．０を含む。バッファーはテトラメチルアンモニウム水酸化物を、ギ酸にＣＨＥＳを加えた溶液にｐＨ９．０に達するまで加え、そして次に少量の水を加えて２０ｍＭ ＣＨＥＳおよび１．０または１．５Ｍのホルメートを含有する最終容量なるようにすることにより調製する。すべてのバッファーは０．０２μｍの孔サイズを有するアノテック（Ａｎｏｔｅｃ）の膜（ワットマン社：Ｗｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．、クリフトン、ニュージャージー州）を通して真空濾過する。以下の勾配プログラムを使用し、すべての勾配区分は直線状である：０．２分で６．５％バッファーＢ；０分で６．５％；０．２分で１２．８％；０．４分で１８．２％；０．６分で２２．８％；０．８分で２６．５％；１．０分で２９．３％；１．２分で３２．０％；１．４分で３４．５％；１．６分で３７．０％；１．８分で３９．４％；２．０分で４１．７％バッファーＢ；２．２分で６．５％［次の注入は３．０分に計画される］。
【０１８１】
６μＬの実施例２からのハイブリダイズしたＤＮＡ混合物の一連の注入は、５０℃〜８０℃の範囲の温度で行う。結果は、温度の溶出プロフィールに対する、および温度が上昇した時にヘテロ二本鎖分子の融解による多くのピークの出現に対する効果を示す。
【０１８２】
実施例９
テトラメチルアンモニウムホルメート（ＴＭＡＦ）塩および有機溶媒を用いた
二本鎖ＤＮＡのアニオン−交換ＨＰＬＣ分離
実施例８の分析を繰り返すが、移動相バッファーはそれぞれ、１５容量％のアセトニトリルを含む。
【０１８３】
これまで本発明の具体的な態様を提示してきたが、これらの態様は例示の目的で提示されただけであると理解される。当業者は前述の記載とは異なるが本明細書に記載し、そして請求する本発明の精神および範囲から逸脱せずに変更態様を認め、そして実施すると予想される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖分子を形成するためのハイブリダイゼーションの概略的表示である。
【図２】
ジエチルアミノエチル官能化ポリアクリレート支持体での変性アニオン−交換ＨＰＬＣから得られ、そして約７２℃〜７７℃の間の一連の温度で、２０９ｂｐのホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物の別個の注入を溶出する一連のクロマトグラムを示す。
【図３】
ジエチルアミノエチル官能化ポリアクリレート支持体での変性アニオン−交換ＨＰＬＣから得られ、そして約７３℃のカラム温度で、種々の２０９ｂｐのＤＮＡ調製物の別個の注入を溶出する一連のクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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