(57)【要約】生体適合性複合材料の製造方法を提供する。該方法は、ポリマーと有効成分との混ぜ合わせ中の超音波処理工程に超音波を使用する、ポリマーと有効成分とを混ぜ合わせる工程を含む。ポリマーおよび有効成分を含んでなる複合材料も提供する。有効成分はポリマー中に均一に分散される。【選択図】図１９
2004533904.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性の複合材料の製造方法であって、ポリマーと有効成分を混ぜ合わせている間の超音波処理工程にて超音波を使用することによって前記ポリマーと前記有効成分とを混ぜ合わせる工程を含んでなることを特徴とする生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項２】
複合材料全体にわたる有効成分の均一な分布を達成するのに十分な時間、ポリマー／有効成分の組合せを超音波に暴露することを特徴とする請求項１に記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項３】
有効成分への暴露および超音波処理工程に先立ってポリマーを硬化することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項４】
超音波処理工程がポリマーの硬化に先行する請求項１または請求項２に記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項５】
有効成分およびポリマーが、混ぜ合わせに先立って、および混ぜ合わせの後に超音波に暴露されることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項６】
有効成分が水への可溶性に乏しいことを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項７】
有効成分が、アスピリン、抗生物質、ポリペプチド、ステロイドホルモン、抗血小板作用剤、増殖抑制剤、抗菌剤、一酸化窒素供与体、またはこれらの組合せであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項８】
有効成分が、アスピリン、デキサメタゾン、またはニトログリセリンであることを特徴とする請求項７に記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項９】
ポリマーが、シリコーン、シリコーン基剤のポリマー、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリ−α−ヒドロキシ酸、これらのコポリマーまたはこれらの任意の組合せであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項１０】
ポリマーが、フルオロシリコーン、ポリグリコール酸（ＰｇＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、またはこれらのコポリマーであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項１１】
使用される超音波の周波数が２０〜９０ｋＨｚであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項１２】
使用される超音波の周波数が４０〜９０ｋＨｚであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の生体適合性の複合材料の製造方法。
【請求項１３】
ポリマーおよび有効成分を含んでなる複合材料であって、前記有効成分が前記ポリマー中に均一に分散されていることを特徴とする複合材料。
【請求項１４】
有効成分が水への可溶性に乏しいことを特徴とする請求項１３に記載の複合材料。
【請求項１５】
有効成分がアスピリンであることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の複合材料。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の複合材料を含んでなることを特等とする代用血管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の且つ改善された生体適合性複合材料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代用血管は、合併症のために失敗することが多い。特に、内膜肥厚（ＩＨ）につながる再狭窄は移植の早期の失敗に寄与することが知られている。再狭窄は、血管平滑筋細胞の中膜層から内膜層への移動により生じ、そこでは、細胞が増殖し、細胞外マトリクスを過剰生産する。再狭窄に冒された血管は、細胞外マトリクスの沈着と共に制御不能の平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖によって圧迫され、狭められている。
【０００３】
内膜肥厚には、内側の平滑筋細胞の内膜層への異常な移動と増殖が関与し、それは、血管の内腔を狭め、血栓症を招きうる。血管のどの内皮細胞層がさらされようとも、血小板の活性化が起こり、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の放出が誘発される。
【０００４】
外傷に反応して、ＳＭＣが、上方制御された高親和性の受容体に結合することにより、平滑筋細胞の移動と増殖が誘導される。ＶＳＭＣは内膜肥厚に有力な役割を担っている。内皮層の裸出による増殖因子およびマイトジェンは、中膜の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の活性化および中膜層から内膜層へのＶＳＭＣの移動を誘発し、遺伝子表現型を収縮機能から合成機能に変化させる。大量の細胞外マトリクスが生成され、増殖した細胞の支持体を提供する。従って、ＶＳＭＣは内膜層で増殖する。白血球も内膜肥厚に寄与する。血管透過性および接着分子の上方制御が高められ、白血球の血管壁への接着が高まり、白血球の組織への浸潤が増える。白血球は炎症性のメディエータを放出し、外傷部位に白血球をさらに誘引する。従って、細胞外マトリクスの鍵となる成分を分解することによって外傷は固定化される。
【０００５】
上述の合併症を制御する手段に対するニーズが明らかに存在する。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、免疫機能における調節および抑制に重要な合成糖質コルチコイドである。アスピリン（アセチルサリチル酸）は、移植血栓症を防ぎ、内膜肥厚の発生を抑えるために抗血小板療法に共通して用いられている。ニトログリセリン（ＧＴＮ）は、有機硝酸塩であり、血管平滑筋に対する筋肉弛緩剤である。血栓融解が誘発する血小板の活性化に関連する冠動脈血管痙攣を防止するために一般的に用いられる。
【０００６】
ポリマー／有効成分の複合材料を用いて、持続した時間にわたって有効成分を制御して放出することを達成できる。一般に、ポリマーを選択した有効成分に組合せ、有効成分の制御された放出は、生体安定性ポリマーからの有効成分の徐放によるか、または生分解性ポリマーの生分解による。有効成分は普通、医薬物であるが、その他の有効成分は、非医学用の適用を検討されてもよい。そのような複合材料は、有効成分の放出速度を確実に均一なままにするようにポリマー全体に均一に分散される有効成分と共に、成分と相性の良い添加剤に頼る。そこで、有効成分は、ポリマー全体での均一な分散を達成することができる形態でなければならない。
【０００７】
可溶性の乏しい有効成分、例えば、アスピリンをポリマー／有効成分の複合材料に溶け込ませることが所望である場合、特有の問題が生じる。そのような有効成分は、均質なミックス（図１ａ）を達成するのではなく、大きな塊の中で結晶化する（図１ｂ）傾向がある。
【０００８】
放出に利用可能な有効成分の量は、達成される装填に依存するので、硬化前のポリマーに単に有効成分を装填することができるが、達成可能な制御された放出のレベルは限定されることが多い。
【０００９】
超音波は、成分を一緒に混合するのに、特に、均質な懸濁液を製造するのに有用であることが知られている。超音波処理は、薬剤組成物の製造、一般に薬剤／リン脂質複合体の製造に用いられてきた。
【００１０】
従って、欧州特許出願第０，１６１，４４５号公報は、水不溶性の薬剤／リン脂質リポソームの形成における超音波の使用、水溶性の利点を有するリポソーム自体を記載している。
【００１１】
英国特許第９３７，３０３号明細書もまた、超微粒子粉末の形態の薬物の均質な懸濁液の調製における超音波の使用を記載している。薬物の沈殿により粉末が製造され、超音波を用いて、そのように形成された粒子が確実に超微粒子であるように沈殿を行う。
【００１２】
上記の公開物のいずれもポリマー／有効成分複合材料には言及していない。
【００１３】
米国特許第４，８９８，７３４号明細書においては、薬物またはその他の有効成分を含有する微小カプセルまたは微小球体がポリマーに包埋される。球体はポリマーの中に均質に分散され、温度、光または超音波にさらされた際、その中味を強制的に放出する。
【００１４】
国際公開特許（ＷＯ−Ａ）００／６９９４２号公報においては、疎水性／親水性ブロックポリマーから形成されるミセルまたはリポソームが開示されている。ミセルは安定化されたコアを有し、ミセルの安定な内部コアに薬剤を組み入れることができる。超音波に暴露されると、薬剤はコアから放出されるが、これは、超音波を切ると残りの薬剤が再び内包されるように可逆的である。超音波をパルスすることによって、薬剤の制御可能な放出を達成することができる。
【００１５】
上記の公開公報においては双方とも、超音波を用いて有効物質の放出を達成している。
【００１６】
米国特許第５，６２０，６９７号明細書は、超音波を用いた医薬組成物の調製方法を記載している。生分解性ポリマーマトリクスおよびマトリクスに混合したまたは溶解した少なくとも１種類の医薬物を、ポリマーと医薬物質の混合物が少なくとも部分的に融解するように、超音波に暴露する。従って、薬剤送達システムを可塑化し、成形するのに超音波を使用する。
【発明の開示】
【００１７】
我々は現在、ポリマーにおける有効成分の分散をさらに円滑にするために、有効成分が可溶性に乏しく、ポリマーに暴露すると結晶化する傾向を有する場合でさえ、さらに効率的な工程において超音波を使用できることを見い出した。さらに、我々は、硬化前ポリマーの有効成分との装填を促進するために、また、硬化ポリマーへの有効成分の取り込みを促進するために超音波を使用できることを見い出した。
【００１８】
従って、本発明は生体適合性の複合材料を製造する方法を提供するものであり、当該方法は、ポリマーと有効成分とを混ぜ合わせる間超音波を用いることによって前記ポリマーと前記有効成分とを混ぜ合わせる工程を含むものである。
【００１９】
望ましくは、ポリマー／有効成分の混ぜ合わせは、ポリマーマトリクス全体にわたる有効成分の均一な分布が確実に達成されるのに十分な時間、超音波に暴露される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施形態の１つにおいては、ポリマーは溶液または懸濁液の中にあり、有効成分との混ぜ合わせおよび超音波処理工程（図２ｂ）にポリマーの硬化が続く。
【００２１】
代わりの実施形態においては、有効成分および超音波処理工程に暴露するのに先立ってポリマーを硬化する（図１ａ）。
【００２２】
上記の方法に従って製造される複合材料は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００２３】
上述のように、本発明は、特に、ポリマーに対して結晶化する傾向を示す、例えばアスピリン（アセチルサリチル酸塩）のような可溶性に乏しい有効成分に有用である。クロロホルムに溶解したアスピリンを単に撹拌によってシリコーンポリマー溶液と混ぜ合わせる試みは、結果として硬化ポリマー上に形成するアスピリンの大きな顆粒状の塊を生じた（図２ａを参照）。ポリマーを先に硬化し、次いで撹拌しているアスピリン溶液に浸すという代わりの試みは、アスピリンによるポリマーへの浸透は達成されず、代わりにポリマー表面上で結晶化されたアスピリンを生じた（図３を参照）。
【００２４】
本発明において使用するポリマーは、薬学上許容可能ないかなるポリマーであってもよい。ポリマーは生体安定性であってもよいし、生分解性であってもよい。例示となるポリマーには、シリコーン類、シリコーン基剤のポリマー（例えば、フルオロシリコーン）、ポリエステル類、ポリウレタン類、ポリオルトエステル類、および例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、およびこれらのコポリマー（例えば、ＰＨＢ／ポリヒドロキシ吉草酸コポリマー）のようなポリ−α−ヒドロキシ酸が挙げられる（これらに限定されない）。シリコーン、フルオロシリコーンおよびポリウレタンが好ましい。
【００２５】
有効成分は、超音波工程に適合するいかなる有効成分であってもよい。例えば、抗生物質、ポリペプチド類、デキサメタゾンのようなステロイドホルモン類が挙げられる。抗血小板作用剤、増殖抑制剤および抗菌剤が好適である。本発明は、さもなければ結晶を形成する傾向を有する可溶性に乏しい有効成分に特に有用である。アスピリンは特に好ましい有効成分であるが、重要なその他の有効成分には、ニトログリセリンのような一酸化窒素供与体が挙げられる。アスピリンについては、例示となる溶液の範囲は、１０ｍｌのクロロホルム中に１００ｍｇ〜５００ｍｇである。我々は、溶媒が複合材料から蒸発し、その中に保持されないことを見い出している。２種類以上の有効成分をポリマーと組み合わせてもよい。
【００２６】
超音波の周波数は、２０〜９０ｋＨｚ、例えば、３０〜５０ｋＨｚの範囲、特に４０ｋＨｚであってもよい。
【００２７】
本発明においては、有効成分およびポリマーはそれぞれ、別々の溶媒に溶解するか、または適当な液状キャリアに分散し、次いで一緒に混ぜ合わせる。次いで、ポリマーを硬化するのに先立って、均一な混合を促進するために超音波を用いてもよい。我々は、複合材料がこのように組み入れられた有効成分に対して何らかの保護効果を有すると思われることを見い出している。具体的には、その融点が１１８℃であるアスピリンに対して、１２０℃の温度にて４５分間のポリマーの硬化が許容可能である。
【００２８】
任意で、ポリマーとの混合に先立って、有効成分の溶液／懸濁液を超音波にさらしてもよい。同様に、有効成分との混合の前に、ポリマーの溶液／懸濁液が超音波処理を受けてもよい。我々は、そのような追加的な予備的超音波処理工程が最終製品を向上させ、特に、有効成分とポリマーの双方を別々に超音波処理し、次いで混ぜ合わせ、混合物を再び超音波処理した場合、良好な結果が達成される可能性があることを見い出している。
【００２９】
溶液、すなわち、ポリマーを硬化する前にポリマーを有効成分と混ぜ合わせると、基材上に複合材料の被覆物を形成することができる。基材が患者への移植（一時的または永続的）を対象としたものである場合、これは特に興味深く、複合材料の中に保持される有効成分は、免疫的拒絶、塞栓形成、瘢痕形成、感染を軽減し、または治癒を促進する。超音波処理に続いて、または超音波処理中のいずれかで、ポリマーと有効成分の混合物に基材を単に浸してもよい。基材は、ポリマーで被覆されるのに好適であるいかなる物質で形成されてもよい。通常、基材は、熱可塑性のエラストマーであるが、その他の具体例には、ニチノール、ポリエステルおよびｅＰＴＦＥが挙げられる。
【００３０】
複合材料に組み入れられた有効成分に依存して、指定されたいかなる目的に対しても被覆された基材を用いてもよいが、カテーテル、ステント、塞栓フィルターおよび心臓弁小葉で言及されてもよい。
【００３１】
もう１つの方法としては、必要とされる形態（例えば、シート、通常厚さ数ミリメートル）にポリマーを硬化し、有効成分の溶液または懸濁液に浸し、次いで超音波処理してもよい。通常、３０分〜２時間、例えば、１時間の時間的尺度が厚さ３ｍｍのポリマーフィルムの全体の装填を可能にするのに十分である。ポリマーシートの代わりの厚さ、または実際の代わりのポリマーの形状（例えば、管または棒）も用いてもよい。
【００３２】
驚くべきことに、我々は、超音波が有効成分の硬化ポリマーの隙間への吸収を促進し、並びにその上へのさらに均一な被覆を達成することを見い出した。ある種のポリマーについて、我々はポリマーの中に薬剤を保持させることに加熱工程が有益であることを見い出した。例えば、我々は、８０〜１１０℃の温度に繰り返し（例えば３または４回）短い時間（例えば１０分）加熱することは、シリコーンおよびフルオロシリコーンのポリマーにアスピリンを保持させるのに役立つが、ポリウレタンポリマーにはその必要がないことを見い出した。
【００３３】
ここで関心のある複合ポリマーでは、有効成分の取り込みは、ポリマーの引張強さの低減を招く。有効成分の高い装填（濃縮した溶液の使用または超音波の存在下長時間の取り込みのいずれかによる）は、受け入れ難く低い引張強さ特性を招く。しかしながら、本発明の有効成分をさらに均質に分布させることによって、引張不足が単一位置における有効成分の大量の沈着の存在によるらしい、複合材料の領域が発生するのを低減する。
【００３４】
要約すれば、上述のような超音波の使用によって、ポリマーの中での有効成分の均質な分布が可能になり、有効成分について最小の粒度が達成される。本発明の方法は必要な調製時間をできるだけ抑え、硬化前および硬化後双方のポリマーの装填に有用である。
【００３５】
本発明のさらなる態様に従って、ポリマーと有効成分とを含んでなる複合材料が提供され、該有効成分は前記ポリマーに均一に分散される。
【００３６】
本発明のさらなる態様に従って、上述の複合材料を含んでなる代用血管が提供される。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例および図を参照して本発明をさらに説明する。
【００３８】
実施例１〜３：アセチルサリチル酸の硬化前装填
【００３９】
実施例１
【００４０】
８０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に２０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍの回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。
【００４１】
２ｍｌのジメチルアセトアミドに１ｇのアセチルサリチル酸を溶解する。直ちに超音波槽に６０分間入れる。
【００４２】
８０ｍｌのフルオロシリコーン分散液にアセチルサリチル酸溶液を加える。６０分間超音波処理をする。
【００４３】
スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００４４】
実施例  ２
【００４５】
６０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に２０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍにて回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。
【００４６】
２ｍｌのジメチルアセトアミドに１ｇのアセチルサリチル酸を溶解する。直ちに超音波槽に６０分間入れる。
【００４７】
８０ｍｌのフルオロシリコーン分散液にアセチルサリチル酸溶液を加える。６０分間超音波処理をする。
【００４８】
スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００４９】
実施例３
【００５０】
６０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に３０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍにて回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。
【００５１】
２ｍｌのジメチルアセトアミドに１ｇのアセチルサリチル酸を溶解する。直ちに超音波槽に６０分間入れる。
【００５２】
８０ｍｌのフルオロシリコーン分散液にアセチルサリチル酸溶液を加える。６０分間超音波処理をする。
【００５３】
スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００５４】
ポリマーとしてシリコーンおよびポリウレタンを用いて上記各実施例を繰り返した。
【００５５】
実施例４〜８：アセチルサリチル酸の硬化後装填
【００５６】
実施例４
【００５７】
１０ｍｌのクロロホルムに５００ｍｇのアセチルサリチル酸を溶解する。６０分間超音波処理をする。クロロホルム溶液に清潔なシリコーンシートを入れる。６０分間超音波処理をする。シリコーンシートを取り出し、高速３Ｄローティッセリ(rotisserie)にて１時間乾燥する。
【００５８】
乾燥シリコーンシートを１１５〜１２０℃のオーブンに１０分間入れ、取り出して室温に１０分間置く。この工程をさらに３回繰り返す。
実施例５
１０ｍｌのクロロホルムに５００ｍｇのアセチルサリチル酸を溶解する。６０分間超音波処理をする。クロロホルム溶液に清潔なシリコーンシートを入れる。６０分間超音波処理をする。シリコーンシートを取り出し、高速３Ｄローティッセリにて１時間乾燥する。
【００５９】
乾燥シリコーンシートを１１５〜１２０℃のオーブンに１０分間入れ、取り出して室温に１０分間置く。この工程をさらに２回繰り返す。
実施例６
【００６０】
８０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に２０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍにて回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００６１】
１０ｍｌのクロロホルムに５００ｍｇのアセチルサリチル酸を溶解する。６０分間超音波処理をする。クロロホルム溶液に硬化したフルオロシリコーンを入れる。６０分間超音波処理をする。フルオロシリコーンを取り出し、高速３Ｄローティッセリにて１時間乾燥する。
【００６２】
フルオロシリコーンを１１５〜１２０℃のオーブンに１０分間入れ、取り出して室温に１０分間置く。この工程をさらに３回繰り返す。
【００６３】
実施例７
【００６４】
６０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に２０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍにて回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００６５】
１０ｍｌのクロロホルムに５００ｍｇのアセチルサリチル酸を溶解する。６０分間超音波処理をする。クロロホルム溶液に硬化したフルオロシリコーンを入れる。６０分間超音波処理をする。フルオロシリコーンを取り出し、高速３Ｄローティッセリにて１時間乾燥する。
【００６６】
フルオロシリコーンを１１５〜１２０℃のオーブンに１０分間入れ、取り出して室温に１０分間置く。この工程をさらに３回繰り返す。
【００６７】
実施例８
【００６８】
６０ｍｌのパークロロエチレン：ブチルアセテート（９５：５、体積／体積％）に３０ｍｌのフルオロシリコーン分散液を溶解する。５０℃、２００ｒｐｍにて回転式振盪器に１時間載せる。下ろして、超音波槽にて３０分間超音波処理をする。スライドグラス上にてフルオロシリコーン分散物のフィルムに成型する。１時間乾燥する。１２０℃にて４５分間硬化する。
【００６９】
１０ｍｌのクロロホルムに５００ｍｇのアセチルサリチル酸を溶解する。６０分間超音波処理をする。クロロホルム溶液に硬化したフルオロシリコーンを入れる。６０分間超音波処理をする。フルオロシリコーンを取り出し、高速３Ｄローティッセリにて１時間乾燥する。
【００７０】
フルオロシリコーンを１１５〜１２０℃のオーブンに１０分間入れ、取り出して室温に１０分間置く。この工程をさらに３回繰り返す。
【００７１】
ポリウレタンフィルムを用いて上記各実施例を繰り返した。
【００７２】
実施例９：  制御された放出
【００７３】
実施例１〜３に記載された方法を用いて、フルオロシリコーンポリマーに５０μｍのアスピリン層を組み入れた。硬化した複合材料をリン酸緩衝液生理食塩水による連続洗浄にさらした。洗浄５ヵ月後、アスピリンの抗血小板効果は依然として明瞭であった（複合材料から制御された方式にてアスピリンが依然として放出されていた）。
【００７４】
実施例１０および１１：ＤＥＸ、アスピリンおよびＧＴＮへの暴露後のＳＭＣ増殖阻害の比較
【００７５】
実施例１０
【００７６】
ヒト大動脈血管のＳＭＣ細胞株を調べた。９６穴プレートに播き、少なくとも１日インキュベートした。培養液を取り除き、種々の濃度の薬剤を含有する培養液に置き換えた。薬剤はｄｅｘ、アスピリン、ＧＴＮまたはこれら薬剤の組合せである。７２時間後、２種類の生存率試験：ＭＴＴアッセイ(assay)および中性レッドアッセイにより薬剤の効果を分析した。マイクロプレートリーダーから吸収値を読み取った。
【００７７】
ＭＴＴとは細胞に取り込まれる黄色のテトラゾリウム塩である。生存細胞では、細胞質ゾルまたはミトコンドリアにて塩は還元されて青色のホルマザン塩を生じる。ホルマザン生成物は極めて難溶性であり、吸収を計算する前にジメチルスルホキシドに溶解した。死細胞では、反応は起きないので細胞は黄色のままであった。
【００７８】
中性レッドアッセイには、中性の赤い溶液、細胞に対する赤色染料の添加が関与する。生存細胞では、染料はリソソームを染色する。中性レッド溶液と共に細胞を３時間インキュベートし（染料が細胞に浸透できるように）、次いで中性レッド脱色溶液を加えて染料を除いた。赤色の強度は生存細胞の数と同等にみなした。
【００７９】
２４穴プレートのウエルの中に無菌のカバーグラスを入れた。５×１０３  個の濃度にてＦＦＣ（骨細胞）をウエルに播いた。動脈中層の細胞外枠組みの鍵となる成分はコラーゲンであった。蛍光タグで標識した特異抗体によりコラーゲン産生を調べた。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）により試料を調べた。細胞は内因性のビオチンを有する。細胞がコラーゲンを作れば、線維網が細胞を取り囲む。細胞がいったん集密になると、アビジンを加えて内因性のビオチンをブロックした。アビジンとビオチンは互いに非常に高い親和性を有する。細胞をホルマリンで固定してさらなる代謝を止めた。カゼインを添加してタンパクの非特異的な結合を阻止した。（タンパク質は元来、「粘着性」であり、カバーグラスおよびプラスチックに結合する。カゼインに結合することによって、抗体がこれらの領域に結合するのが妨げられた）。ヤギ抗コラーゲン−ビオチン抗体（１次抗体）を陽性対照のウエルに加え、産生されたコラーゲンに特異的に結合させた。最後にアビジン−ＦＩＴＣ（２次抗体）を陽性対照と陰性対照のウエルに加えた。対照の対照ウエルには１次抗体も２次抗体も加えなかった。イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は抗体上にあったビオチンに結合する。ＦＩＴＣの蛍光とそのように結合したＦＩＴＣは同一視することができる。ＣＬＳＭのもとで、コラーゲンが産生されていれば陽性対照のカバーグラス上に蛍光があったし、陰性および対照のカバーグラスには非特異的結合によるある程度の自己蛍光があった。
【００８０】
対照の結果と類似するはずである場合に、陰性対照にてさらに幾分明るい蛍光があった（図１５を参照のこと）。従って、さらにある程度の非特異的結合があることが疑われた。代わりの阻止剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、カゼインの代わり）を用いて実験を繰り返した。
【００８１】
実施例１１
【００８２】
カゼインではなく、阻止剤としてＢＳＡを用いて実施例１０の方法を繰り返した。
【００８３】
バスクテック（Ｖａｓｃｕｔｅｋ）製のシリコーン基剤のフィルム膜上にてＨＡ−ＶＳＣＭを培養した。２種類の膜：被覆していないＦＩＳｉ膜およびＧＴＮで被覆したＦＩＳｉ膜を調べた。５×１０３  個の濃度で細胞を播いた。細胞を１週間培養し、２日毎に培養液を交換した。フィルムが培養液の上に浮くことを意味する疎水性であるために、細胞を確実にフィルムに付着させるのは困難であることが判った。ウエルに播く前に、両面テープでプレートにカバーグラスを貼りつけることによりこの問題を克服した。さらに、染色中に細胞が洗い流された、または細胞が長く確保されすぎた。穏かな洗浄工程を導入することにより一部の細胞を確保した。７日目にカバーグラスを染色し、生存率試験のためにＣＬＳＭのもとで観察した。
【００８４】
生存率の染色として以下を用いた。
【００８５】
ＣＦＤＡ（カルボキシフルオレセインジアセテート）は細胞膜を透過する生体染色である。分子からジアセテートを除くエステラーゼ酵素を含有する生存細胞は従って、蛍光であるＣＦを形成する。いったんＣＦが形成されるとそれは膜に蓄積され、生存細胞は明るい緑の蛍光を持つ。
【００８６】
臭化エチジウムは、死細胞の障害のある膜だけを通過することができ、それらを赤色に染色する生体染料である。
【００８７】
アクリジンオレンジは、挿入または静電気誘引によってＤＮＡおよびＲＮＡに挿入する染料である。この陽イオン性染料は、ＤＮＡに結合すると緑蛍光を有し、ＲＮＡに結合すると赤蛍光を有する。
【００８８】
細胞は、プラスチック製のカバーグラスよりもガラス製のカバーグラスにて良好に増殖した（図１６ａおよびｂを参照）。細胞は、双方の対照において形態的に正常に見えた。ＦＩＳｉ＋ＧＴＮ膜においては、細胞はかなり良好に増殖した（図１６ｃを参照のこと）。ＦＩＳｉのみの膜においては、死細胞と細胞残渣のみが見られた（図１６ｄを参照）。ＦＩＳｉ＋ＧＴＮ膜においては、細胞質に強い赤色染色があり、他の場所は緑色染色であった。細胞は、膜の被覆されていない縁で増殖することを好み、膜上ではまばらになり、縮んでいた（図１７を参照）。
【００８９】
高用量のｄｅｘおよびアスピリンは、血管の増殖性疾患の治療に有益な役割を有すると思われる。ＧＴＮはＶＳＭの弛緩を促進すると思われ、内皮相互作用性の血管拡張剤とみなしてもよい。しかしながら、ＧＴＮは、ＦＩＳｉのみのフィルム膜に比べて細胞増殖を有意に低下させない。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】超音波を用いて（ａ）、および超音波を用いずに（ｂ）アセチルサリチル酸（アスピリン）を後に装填したシリコーンシートの断面を示す。
【図２】超音波なし（ａ）および超音波あり（ｂ）でアセチルサリチル酸（アスピリン）を前に装填したシリコーンシートを示す。
【図３】アスピリン溶液に１時間浸した硬化シリコーンシートの拡大画像を示す。超音波の非存在下では、アスピリンはシリコーンの上および中で特徴的な結晶構造を形成した。アスピリンの分布は不均一なトポグラフィーを持ち、極めてでたらめである。
【図４】アスピリンを後で装填した硬化シリコーンシートの拡大画像を示す。硬化シートをアスピリンの溶液に１時間浸し、超音波処理をした。結晶構造は見られず、アスピリンの分布は極めて組織化され、最小粒度分布を持ち均一である。
【図５】ａおよびｂは、超音波なしでアスピリンを後で装填したシリコーンシートの光学顕微鏡で撮影した画像を示す。暗い染みは、超音波の非存在下におけるアスピリンによる非浸透領域を示す。
【図６】ａおよびｂは、超音波を伴ってアスピリンを後で装填したシリコーンシートの光学顕微鏡で撮影した画像を示す。アスピリンによる非浸透の暗い染みまたは領域は見られない。均一な分布がある。
【図７】種々の被覆物で被覆したステントの平方ミリメートル当りの血小板の平均数を示す。
【図８】溶出されたフルオロシリコーンフィルムにおけるアスピリンの量を示す。異なった時間量について異なったフィルムが溶出された。
【図９】アスピリンの濃度と、フルオロシリコーンおよびアスピリンフィルム上の血小板の平均数とを比較する。異なった時間量について異なったフィルムが溶出された。
【図１０】層Ａが結合組織でできた外層を示し、層Ｂが平滑筋細胞でできた中層を示し、層Ｃが内皮細胞でできた内膜層を示す、血管の部分断面図を示す。
【図１１】対照がエタノールであり、対照平均のパーセンテージの関数として、播いたウエルプレートにおけるアスピリン、デキサメタゾンおよびアスピリンとデキサメタゾンの組合せの濃度を比較するＭＴＴ試験の結果を示す。
【図１２】対照がエタノールであり、対照平均のパーセンテージの関数として、播いたウエルプレートにおけるアスピリン、デキサメタゾンおよびアスピリンとデキサメタゾンの組合せの濃度を比較する中性レッドアッセイ（ＮＲＡ）の結果を示す。
【図１３】対照がＦ１２−Ｋであり、対照平均のパーセンテージの関数として、播いたウエルプレートにおけるアスピリン、ＧＴＮ、およびアスピリンとＧＴＮの組合せの濃度を比較する中性レッドアッセイ（ＮＲＡ）の結果を示す。
【図１４】対照がＦ１２−Ｋであり、対照平均のパーセンテージの関数として、播いたウエルプレートにおけるアスピリン、ＧＴＮ、およびアスピリンとＧＴＮの組合せの濃度を比較するＭＴＴ試験の結果を示す。
【図１５】細胞試料（ＦＦＣ骨細胞）の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。１５ａは、１次抗体および２次抗体を含有する陽性対照のＣＬＳＭ画像を示し、１５ｂは、２次抗体を含有する陰性対照のＣＬＳＭ画像を示し、１５ｃは、１次抗体および２次抗体を含有しない対照のＣＬＳＭ画像を示す。試料の蛍光は、ＦＦＣ（骨細胞）におけるコラーゲン産生と同等に扱う。
【図１６】固定し、アクリジンオレンジで染色した後の試料の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示し、１６ａは、赤の蛍光を示す対照カバーグラスのＣＬＳＭ画像を示し、１６ｂは、緑の蛍光を示す対照のプラスチック製ペトリ皿のＣＬＳＭ画像を示し、１６ｃは、緑の蛍光を示すＦｌＳｉ＋ＧＴＮを被覆した膜のＣＬＳＭ画像を示し、１６ｄは、赤の蛍光を示すＦｌＳｉを被覆した膜のＣＬＳＭ画像を示す。カバーグラス上で緑の蛍光は、アクリジンオレンジのＤＮＡへの結合を示し、赤の蛍光は、アクリジンオレンジのＲＮＡへの結合を示す。
【図１７】固定し、アクリジンオレンジで染色した後のカバーグラス上におけるＦｌＳｉ膜の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示し、１７ａは、赤の蛍光を伴った、膜表面上の細胞を示し、１７ｂは、赤の蛍光を伴った、膜の縁でのカバーグラス上の細胞を示し、１７ｃは、緑の蛍光を伴った、膜に付着したカバーグラス上の細胞を示す。
【図１８】生存率試験の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示し、１８ａは、固定し、アクリジンオレンジで染色した後の対照のプラスチック製ペトリ皿における細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。画像は緑の蛍光を示し、１８ｂは、対照のカバーグラス上の細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像を示す。この画像は、緑の蛍光を示す。１８ｃは、ＦｌＳｉのみを被覆した膜における細胞を示す。この画像は緑の蛍光を示す。１８ｄは、ＦｌＳｉ＋ＧＴＮを被覆した膜上の細胞を示す。
【図１９】血栓形成に対するステント被覆物の効果を示す。
【図７】
2004533904.tif 000003
【図８】
2004533904.tif 000004
【図９】
2004533904.tif 000005
【図１１】
2004533904.tif 000006
【図１２】
2004533904.tif 000007
【図１３】
2004533904.tif 000008
【図１４】
2004533904.tif 000009
【図１９】
2004533904.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004533904.tif 000011
2004533904.tif 000012
2004533904.tif 000013
2004533904.tif 000014
2004533904.tif 000015
2004533904.tif 000016
2004533904.tif 000017
2004533904.tif 000018
2004533904.tif 000019
2004533904.tif 000020
2004533904.tif 000021
2004533904.tif 000022
2004533904.tif 000023
2004533904.tif 000024
2004533904.tif 000025
2004533904.tif 000026
2004533904.tif 000027
2004533904.tif 000028
2004533904.tif 000029
2004533904.tif 000030
2004533904.tif 000031
2004533904.tif 000032
2004533904.tif 000033
2004533904.tif 000034
2004533904.tif 000035
2004533904.tif 000036
2004533904.tif 000037
2004533904.tif 000038
2004533904.tif 000039
2004533904.tif 000040
2004533904.tif 000041
2004533904.tif 000042
2004533904.tif 000043
2004533904.tif 000044
2004533904.tif 000045
2004533904.tif 000046
2004533904.tif 000047
2004533904.tif 000048
2004533904.tif 000049
2004533904.tif 000050
2004533904.tif 000051
2004533904.tif 000052
2004533904.tif 000053
2004533904.tif 000054
2004533904.tif 000055
2004533904.tif 000056
2004533904.tif 000057
2004533904.tif 000058
2004533904.tif 000059
2004533904.tif 000060
【国際調査報告】
2004533904.tif 000061
2004533904.tif 000062
2004533904.tif 000063