(57)【要約】ほとんどの微細藻類は絶対光栄養体でありそれらの増殖は光合成で誘導されるエネルギーの生成に厳しく依存する。本研究においては、微細藻類フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）を、グルコース輸送体をコードする遺伝子の導入を通して暗所でグルコースを移入しかつ増殖するように、遺伝子操作できることを示した。ヒトおよびクロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ）グルコース輸送体は共に、Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍによるグルコースの取り込みを容易にし、細胞が外因性有機炭素を代謝し光に依存せず増殖できるようにする。これは、代謝遺伝子操作を通した最初の絶対光独立栄養体の栄養変換の成功であり、細胞栄養の方法が基本的に単一遺伝子の導入によって改変できることを実証する。グルコース輸送体遺伝子を用いて形質転換した株は非光合成的に増殖できるので、これらを使って、突然変異体作製と特性決定を通して、光合成プロセスを解析することができる。最後に、本研究はまた、微生物発酵技術の利用を通して、光依存増殖から生じる重要な制限を排除しつつ、絶対光栄養藻類の大規模な商業的利用への重要な進歩も表す。
2004500839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光の実質的不在のもとで増殖する藻類細胞であって、異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送しうるタンパク質をコードするキメラＤＮＡを含んでなり、暗所条件下でキメラＤＮＡの不在のもとでは増殖しえない前記藻類細胞。
【請求項２】
藻類細胞が微細藻類細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
異化可能な炭素源が単糖またはオリゴ糖である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
タンパク質が二糖輸送体である、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
タンパク質がヘキソース輸送体である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送しうるタンパク質をコードするキメラＤＮＡを含んでなる藻類細胞であって、細胞の従属栄養増殖をサポートするのに足りる異化可能な炭素源を細胞中に輸送するために十分な量のタンパク質が発現される前記藻類細胞。
【請求項７】
藻類細胞が微細細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
異化可能な炭素源が単糖またはオリゴ糖である、請求項６に記載の細胞。
【請求項９】
タンパク質が二糖輸送体である、請求項６に記載の細胞。
【請求項１０】
タンパク質がヘキソース輸送体である、請求項６に記載の細胞。
【請求項１１】
実質的に光の不在のもとで藻類を培養することを含んでなる藻類バイオマスを生産する方法であって、前記藻類が絶対光栄養性の株であり、前記藻類が藻類によって発現されると異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送するタンパク質をコードするキメラ核酸をさらに含有することを特徴とする、前記方法。
【請求項１２】
藻類が微細藻類である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
藻類が発酵槽で培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
異化可能な炭素源が単糖またはオリゴ糖である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の従属栄養増殖をサポートするのに足りる異化可能な炭素源を細胞中に輸送するために十分な量のタンパク質が発現される請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質が二糖輸送体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質がヘキソース輸送体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
絶対光栄養海洋生物、原核藻類、および真核藻類からなる群から選択される生物の細胞を従属栄養変換する方法であって、（ａ）細胞膜を横切る異化可能な炭素源の輸送体をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡを用いて細胞を形質転換するステップ、および（ｂ）暗所で異化可能な炭素源によって増殖できる形質転換した細胞を選択するステップを含んでなる前記方法。
【請求項１９】
生物が海洋藻類から選択される、請求項１８に記載の方法
【請求項２０】
異化可能な炭素源の輸送体をコードする遺伝子が選択遺伝子と結合していて、形質転換後に、暗所で異化可能な炭素源によって増殖できる細胞を選択する前に、形質転換した細胞が選択遺伝子に対する選択培地で増殖する請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
選択遺伝子が形質転換した細胞に抗生物質耐性を与え、かつ選択培地はその抗生物質を含有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法
【請求項２２】
目的の遺伝子を含有する形質転換ベクターに曝した細胞集団から形質転換した細胞を選択する方法であって、
暗所で異化可能な炭素源によって増殖することができない細胞の細胞集団を、目的の遺伝子および暗所で異化可能な炭素源による細胞の増殖を可能にする遺伝子を含んでなる形質転換ベクターを用いてトランスフェクトすること；
暗所で増殖できる細胞を選択すること；および
選択した細胞を試験して選択した細胞が目的の遺伝子も含有するかどうかを確認することを含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、本明細書にその全文が参照により組み入れられる２０００年４月２１日に出願された米国予備出願第６０／１９８，７４２号に基づく。
【０００２】
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｎｔ＃９７１０９９０による支援を受けた。米国政府は本発明についてある特定の権利を有しうる。
【０００３】
背景
発明の分野
本発明は、藻類の遺伝子形質転換のための方法、特に絶対光栄養生物の従属栄養増殖できる組換え生物への変換に関する。
【０００４】
関係技術のレビュー
光合成藻類は水環境における一次生産者であって、特に世界の水環境におけるＯ２生産およびＣＯ２固定に重要な比率を占める。Ｔｒｅｑｕｅｒ， Ｐ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｄ． Ｍ．， Ｖａｎ Ｂｅｎｎｅｋｏｍ， Ａ． Ｊ．， ＤｅＭａｓｔｅｒ， Ｄ． Ｊ．， Ｌｅｙｎａｅｒｔ， Ａ． ＆ Ｑｕｅｑｕｉｎｅｒ， Ｂ． １９９５．「世界海洋のシリカ収支：再評価（Ｔｈｅ ｓｉｌｉｃａ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｏｃｅａｎ ： ａ ｒｅｅｓｔｉｍａｔｅ）」， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９ ： ３７５−７９。藻類はまた、水培養にも必要であって、多数の価値ある産物を生産するために利用されている。例えば、藻類は、顔料（例えば、β−カロテン、フィコビリタンパク質）、栄養価のある油（例えば、ドコサヘキサエン酸）、および安定同位体標識したバイオケミカル（例えば、１３Ｃ−グルコース）に利用されている。藻類はまた、食品としてヒトおよび動物の消費にも利用される。
【０００５】
一般的に藻類は、細胞代謝に必要な化学エネルギーを生産する光合成を駆動するために光を要求する。多くは、生存のために光を絶対要求することを意味する絶対光栄養体である。Ｄｒｏｏｐ ＭＲ 「炭素の従属栄養体（Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ）」ｉｎ Ａｌｇａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ， １０：５３０−５５９， Ｓｔｅｗａｒｔ ＷＤＰ編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ （１９７４）。そのような藻類は外来性有機化合物（グルコース、酢酸など）をエネルギーまたは炭素源として利用することができない。複数の藻類は内部または外部の固定炭素を利用することができる。少数の藻類は絶対従属栄養体である：すなわち、光合成能力がなくエネルギーおよび炭素源として全て外来性有機化合物に依存する。
【０００６】
光合成藻類の大規模栽培は、大入力の光エネルギーを伴う相対的に調節された環境を必要とする。これらの生物における光の要求とクロロフィルの高い吸光係数は、栽培および大規模増殖のための新規システムの設計と開発を必要としてきた。Ｃｈａｕｍｏｎｔ， Ｄ． １９９３．「藻類バイオマス生産のバイオテクノロジー：屋外におけるマス培養系のレビュー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｌｇａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｏｕｔｄｏｏｒ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）」 Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ５：５９３−６０４。これらの系の全てに対する共通の制限は光の培養への供給の必要性にあって、培養の表面対容積比を最大化すると有利になる。細胞密度が増加すると、自己遮光が生産性の制限因子となり、相対的に低いバイオマスレベルしか得られない。
【０００７】
ほとんどの商業生産技術は大きな開放池を使って無料の自然太陽光を利用する。これらの系は相対的に低い表面積対容積比および対応する低い細胞密度を有する。また、開放池では汚染生物を排除することが非常に困難である。この困難によって、開放池を利用できるのはほとんどの生物の増殖に適さない条件で繁茂する限られた数の藻類に制限される。例えば、ヅナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）は非常に高い塩分で増殖できる。Ａｐｔ ＫＥら，「微細藻類バイオテクノロジーの商業開発（Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」， Ｊ Ｐｈｙｃｏｌ． ３５：２１５−２２６ （１９９９）。
【０００８】
管式光バイオリアクターなどの密閉型光バイオリアクターがこれに代わる屋外密閉型培養技術であって、培養を密閉して汚染を最小化する透明管を使用する。これらは非常に高い表面対容積比を与えるので、細胞密度はしばしば池で達成しうる値より遥かに高い。しかし技術的に最新の光バイオリアクターでも到達しうる最大藻類細胞密度は相対的に低い。池とバイオリアクターの両方共に低密度であるため大きい容積培養が必要であり、藻類収穫に相当な費用がかかりうる。Ａｐｔ ＫＥら，（１９９９）。さらに全ての屋外培養系は日周および季節によって生じる光強度と温度の大きな変動を受けるので、最大の生産性と再現性を維持するのには問題がある。
【０００９】
また、電気光を照明に使用する藻類の屋内、密閉培養に対する多数の設計がなされている。ＲａｔｃｈｆｏｒｄおよびＦａｌｌｏｗｆｉｅｌｄ （１９９２）「高バイオマス藻類培養を増殖するための平滑板、エアリフトリアクターの性能（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ａ ｆｌａｔ ｐｌａｔｅ， ａｉｒ ｌｉｆｔ ｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｉｇｈ ｂｉｏｍａｓｓ ａｌｇａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）」， Ｊ Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ４：１−９；Ｗｏｈｌｇｅｓｃｈａｆｆｅｎ， ＧＤら （１９９２）「浸漬コア照明付きのバット・インキュベーター：大量植物プランクトン培養用の新しい安価な構成（Ｖａｔ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｗｉｔｈ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｃｏｒｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ−ａ ｎｅｗ， ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｓｅｔ ｕｐ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」， Ｊ Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ４：２５−９；Ｉｑｂａｌ， Ｍら，（１９９３）「微細藻類を培養するための平滑側板光バイオリアクター（Ａ ｆｌａｔ ｓｉｄｅｄ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」， Ａｑｕａｃｕｌｔ． Ｅｎｇ． １２：１８３−９０；ＬｅｅおよびＰａｌｓｓｏｎ（１９９４）「高密度藻類光バイオリアクター；発光ダイオードの利用（Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ａｌｇａｌ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ； ｕｓｉｎｇ ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅｓ）」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４４：１１６１−７。これらのシステムは建設および運転するのに多くの費用がかかり、屋外池と同じ表面対容積制約および低密度収率に関連する問題がある。Ａｐｔ ＫＥら， （１９９９）。
【００１０】
光栄養増殖した珪藻および他の微細藻類の生産コストは、低密度と高い収穫コストの結果、非常に高価である。それにも関わらず、少数の特定の藻類産物についてはこの技術が非常にうまくいくことが立証され、１年当たり数千トンを生産している。Ｌｅｅ， Ｙ−Ｋ （１９９７）「アジア太平洋海面における微細藻類の商業生産（Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｓｉａ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｔｉｍ）」， Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｃｏｌ． ９：４０３−１１；Ａｐｔ ＫＥら， （１９９９）。光合成微細藻類からの主要産物は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヅナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）およびスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）からの乾燥バイオマスまたは細胞抽出物が挙げられる。これらは主に大きな開放池で生産される。
【００１１】
通常の発酵槽で従属栄養によって藻類を増殖することは、池または光バイオリアクターに対する可能な代替法でありかつ藻類を増殖するコストを実質的に削減する可能な手段である。Ｄａｙら， （１９９１）「微細藻類の軟体動物食餌を従属栄養生産するための産業規模プロセスの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｓｃａｌｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏ−ａｌｇａｌ ｍｏｌｌｕｓｋ ｆｅｅｄ）」， Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ ３８：２４５−９；Ｏｒｕｓら， （１９９１）「従属栄養バイオマス生産に対するクロレラ・ブルガリアスＵＡＭ１０１の適性（Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ＵＡＭ １０１ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｂｉｏｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」， Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１７９−１８４；Ｂａｒｃｌａｙら， （１９９４）「藻類と藻類様微生物を利用する、長鎖ω−３脂肪酸の従属栄養生産（Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｏｍｅｇａ−３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａｌｇａｅ ａｎｄ ａｌｇａｅ−ｌｉｋｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ６：１２３−９；Ｇｌａｄｕｅ ａｎｄ Ｍａｘｅｙ （１９９４）「水培養用の微細藻類食餌（Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ｆｅｅｄｓ ｆｏｒ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ）」，Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ６：１３１−１４１；Ｃｈｅｎ Ｆ．，「従属栄養増殖における微細藻類の高い細胞密度培養（Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｇｒｏｗｔｈ）」， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：４２１−６ （１９９６）；Ａｐｔ， ＫＥら， （１９９９）。発酵槽増殖の基本原理は、生産性を最大化する高度に制御した最適増殖条件を与えることにある。
【００１２】
典型的な発酵槽培養条件は次の通りまとめることができる。培養容器は、１〜５００，０００リットルの容積であって、無菌条件下で運転される。一系列のインペラーを備えたモーター駆動シャフトによって混合が行われる。無菌空気を、適当なガス交換を保証する高圧と流速で系内に圧送し、溶存Ｏ２およびＣＯ２レベルを連続的に監視して調節する。加熱および／または冷却コイルによって温度を調節し、酸および／または塩基の自動添加によってｐＨを維持する。藻類発酵増殖用の培地は、グルコースまたは類似炭水化物が発酵増殖における固定炭素とエネルギー源の両方を与えることを除いて、光栄養増殖に使われる培地と類似する。他の栄養レベル（例えば、窒素およびリン）も連続監視して調節する。ケモスタット培養、半回分培養（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、または膜バイオリアクター培養などの技術を利用して、培養密度をさらに増加することができる。発酵槽における微細藻類の増殖に関するさらに詳細な情報は、本明細書に参照により組み入れられる本明細書に引用した文献、およびＡｐｔ， ＫＥら，（１９９９）に見出すことができる。また、本明細書に参照により組み入れられる、Ｋｙｌｅらへの米国特許第５，２４４，９２１号；Ｋｙｌｅへの米国特許第５，３７４，６５７号；Ｋｙｌｅへの米国特許第５，５５０，１５６号；Ｋｙｌｅへの米国特許第５，５６７，７３２号；Ｋｙｌｅらへの米国特許第 ５，４９２，９３８号；Ｋｙｌｅらへの米国特許第５，４０７，９５７号；Ｋｙｌｅらへの米国特許第５，３９７，５９１号；Ｂａｒｃｌａｙへの米国特許第５，１３０，２４２号；Ｋｙｌｅへの米国特許第５，６５８，７６７号；Ｋｙｌｅへの米国特許第５，７１１，９８３号も参照すること。
【００１３】
発酵槽の従属栄養増殖で高レベルのプロセス制御が可能である結果として培養条件とバイオマス収率は一定しかつ再現性があり、１リットル当たり５０グラム乾燥バイオマスから１リットル当たり１００グラム乾燥バイオマスまで高い従属栄養藻類細胞密度が報じられている。ＧｌａｄｕｅおよびＭａｘｅｙ （１９９４）；Ｒｕｎｎｉｎｇら， （１９９４）「微細藻類によるアスコルビン酸の従属栄養生産（Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ ６：９９−１０４。これらのバイオマスレベルは、光合成に基づく培養系で達成されるレベルより少なくとも１０倍は高い。Ｒａｄｍｅｒ ＲＪおよびＰａｒｋｅｒ ＢＣ （１９９４）「藻類の商業的応用：機会と制約（Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｇａｅ ： ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）」， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ ６：９３−９８。また、高いバイオマスレベルは収穫中に処理しなければならない水のバイオマス収量１グラム当たりの容積も非常に削減する。培養は日常的に１００，０００Ｌより大きい容積をもつ発酵槽で処理するので、１処理当たり数千ｋｇの乾燥バイオマスを生産することができる。大規模の培養と高バイオマスレベルの生産の効果は、発酵増殖のコストを光バイオリアクターより１オーダー安価にする（ＲａｄｍｅｒおよびＰａｒｋｅｒ １９９４；Ａｐｔ ＫＥら，（１９９９））。
【００１４】
培養全体にわたる完全な制御を提供する能力はまた、食品医薬品庁（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が指導する食品産業標準の優良製造規範（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ （ＧＭＰ））を守るためにも重要である。ＧＭＰの維持は高品質の食品または医薬品グレード物質の生産に必要である。Ａｐｔ ＫＥ ｅｔ ａｌ． （１９９９）。
【００１５】
微生物学的発酵技術を利用して微細藻類を従属栄養増殖させることができれば、生産に関連するコストを著しく削減できるとともに、食品グレード製造物に必要な高度の品質管理を提供する。従属栄養藻類バイオマスを生産する予測コストは＄５／ｋｇより低くしうる。ＧｌａｄｕｅおよびＭａｘｅｙ （１９９４）。対照的に、光栄養的にバイオリアクターで藻類を生産する理論的コストは１のオーダー高いと予測され、そして水培養施設における光栄養藻類の実生産コストは、しばしば２のオーダー高い。Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ， Ｌ． （１９９８）「光バイオリアクターの設計と評価のための判定基準；微細藻類の生産について（Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ； ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」， Ｗｏｒｌｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ， Ｌｏｓ Ｖｅｇａｓ， ＮＶ， ｐ．５８４；Ｂｅｎｅｍａｎｎ， Ｊ．Ｒ． （１９９２）「微細藻類水培養食餌（Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ｆｅｅｄｓ）」，Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ４：２３２−４５。現在、ごく少数の藻類しか発酵技術を利用して生産されてない；これらはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ニチキア・アルバ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ａｌｂａ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、およびクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）が挙げられる。これらの藻類は外部有機化合物をエネルギーおよび炭素源として利用することができる。
【００１６】
藻類によって生産される価値ある産物（藻類バイオマス自身を含んで）と光合成に基づく系における藻類培養の困難を考えると、発酵槽において従属栄養条件で藻類を培養することは極めて望ましい。しかし、発酵技術を藻類産物の生産に利用する上の著しい制約は、ほとんどの藻類が絶対光栄養体であり、従って、この技術を利用して増殖できないことである。それ故に、さらに多様な藻類を、発酵槽の従属栄養条件下で培養する方法を開発する必要がある。
【００１７】
発明の概要
本発明は、光栄養藻類を、暗所で外部炭素源だけを用いて増殖できる従属栄養藻類に形質転換できることの発見に関わる。
【００１８】
本発明の１つの目的は、光栄養藻類を従属栄養藻類に形質転換する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、そのような形質転換した藻類を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法により形質転換した細胞の安定した集団を提供すること、ならびに光栄養細胞のバイオマスおよび産物を、形質転換した細胞を暗所で培養することによって生産する方法を提供することである。
【００２１】
これらおよび他の目的は、１以上の本発明の以下の実施形態によって達成される。
【００２２】
本発明は、従属栄養増殖を増強または可能にするタンパク質をコードする遺伝子を用いて形質転換した細胞を提供する。本実施形態の一様式においては、従属栄養変換は細胞をただ１つの遺伝子を用いて形質転換することによって達成される。他の様式においては、従属栄養変換は複数遺伝子を用いて形質転換することによって達成される。細胞を、糖類および／または他の固定炭素の外来源の取り込みと異化に影響を与えるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換することができる。あるいは、細胞を、外来性固定炭素源（すなわち異化可能な化合物（ｃａｔａｂｏｌｙｚａｂｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ））を取り込むことができる輸送体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換してもよい。または、細胞を、単糖または二糖輸送体、特にヘキソース輸送体をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換してもよい。
【００２３】
一実施形態においては、本発明は、たとえ細胞が絶対光栄養体である藻類株由来であっても、細胞が異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送しうるタンパク質をコードするキメラＤＮＡを含んでなるので、実質的に光の不在のもとで増殖する藻類細胞、好ましくは微細藻類細胞を提供する。あるいは、本発明は、異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送しうるタンパク質をコードするキメラＤＮＡを含んでなる藻類細胞であって、細胞の従属栄養増殖を支援するのに足りる異化可能な炭素源を細胞中に輸送するために十分な量のタンパク質が発現される、前記藻類細胞を提供する。好ましくは、本発明のこれらの様式による異化可能な炭素源は単糖または二糖であり；好ましくは、タンパク質はオリゴ糖輸送体またはヘキソース輸送体である。
【００２４】
他の実施形態においては、本発明は、藻類により発現されると、異化可能な炭素源を藻類細胞中に輸送するタンパク質をコードするキメラ核酸を含有する形質転換した藻類株の細胞を用いて、実質的に光の不在のもとで、好ましくは発酵槽内で藻類を培養することによって、絶対光栄養藻類株由来の藻類バイオマス、好ましくは微細藻類バイオマスを生産する方法を提供する。好ましくは、藻類細胞中に輸送される異化可能な炭素源は単糖またはオリゴ糖であり；さらに好ましくは、キメラ核酸によりコードされるタンパク質は二糖輸送体またはヘキソース輸送体である。この実施形態においては、タンパク質は、細胞の従属栄養増殖を支援するのに足りる異化可能な炭素を細胞中に輸送するために十分な量が発現されると予想しうる。
【００２５】
さらに他の実施形態においては、本発明は、海洋生物、原核藻類、および真核藻類からなる群から選択される絶対光栄養生物の細胞の従属栄養変換のための方法を提供する。本方法は、（１）細胞膜を横切る異化可能な炭素源の輸送体をコードする遺伝子を含むＤＮＡを用いて細胞を形質転換するステップ、および（２）暗所で異化可能な炭素源によって増殖できる細胞を選択するステップを含んでなる。本発明の一様式においては、絶対光栄養生物は海洋藻類である。好ましい様式では、異化可能な炭素源の輸送体をコードする遺伝子は選択遺伝子と結合していて、形質転換後に、暗所で異化可能な炭素源で増殖できる細胞を選択する前に、形質転換した細胞を選択遺伝子に対する選択培地で増殖させる。特に好ましい様式においては、選択遺伝子は形質転換した細胞に抗生物質に対する耐性を与え、そして選択培地はその抗生物質を含有する。
【００２６】
さらに他の実施形態においては、本発明は、目的の遺伝子を含有する形質転換ベクターに曝した細胞集団から、形質転換した細胞を選択する方法を提供する。その方法は、目的の遺伝子およびその発現が暗所で異化可能な炭素源による増殖を可能にする遺伝子を一緒に含んでなる形質転換ベクターを用いて、暗所で異化可能な炭素源による増殖ができない細胞集団の細胞をトランスフェクトすることを含んでなる。トランスフェクション後に、暗所で増幅可能な細胞の選択を実施し、次いで選択した細胞をさらに試験してそれらが目的の遺伝子も含有するかどうかを確認する。
【００２７】
本発明の他の実施形態においては、細胞を、細胞膜を横切る還元炭素源（すなわち、異化可能な化合物）の現存輸送体をアップレギュレートするタンパク質をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換する。本発明の他の実施形態においては、細胞を、膜を横切る還元炭素源の現存輸送体を活性化するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換する。本発明のさらに他の実施形態においては、細胞を、細胞による還元炭素源の利用を容易にするタンパク質をコードする１以上の遺伝子を用いて形質転換する。
【００２８】
本発明による他の実施形態においては、独立栄養細胞を、目的の遺伝子と従属栄養増殖を可能にするかまたは増強する１以上の遺伝子を一緒に用いて形質転換し、従属栄養増殖を確立または増強する形質転換を目的の遺伝子による形質転換のマーカーとして利用する。本発明のさらに他の実施形態においては、従属栄養細胞を突然変異誘発して所与の炭素源による増殖ができないようにし、次いで目的の遺伝子とその炭素源によって増殖する能力の再確立を選択の機構として利用する１以上の遺伝子を一緒に用いて形質転換し、そしてその炭素源での増殖の再確立を目的の遺伝子による形質転換のマーカーに利用する。
【００２９】
藻類産物を生産するための発酵技術の利用についての重要な制限は、ほとんどの藻類が絶対光栄養体であって、従ってこの技術を利用して増殖させることができないことである。絶対光栄養生物は固定炭素を移入する機構をもたないおよび／またはそれを代謝的に利用しうる形態に転化できないので、固定炭素源を利用することができないことが発見されている。本発明は、光栄養体を外部有機化合物による増殖が可能な細胞に変換することによってこの制限を回避する。暗所で有機化合物を炭素およびエネルギー源として増殖するためには、細胞は必要な物質を周辺培地から効果的に取り込み、次いで、光非依存性の代謝反応を経由して増殖に欠かせない全ての成分に同化しなければならない。
【００３０】
特定の実施形態の詳細な説明
微細藻類には多数の価値ある商業的用途がある。しかし、光合成藻類の商業的規模の生産は、ほとんどの場合、大きな屋外池の使用を伴い、それには数多くの欠点がある。池培養は環境から遮蔽されていないので汚染物がしばしば池培養に侵入し、また、季節的変化や温度および光条件の変動によって増殖速度と最終培養密度を予測することが困難になる。さらに、藻類間の自己遮光はバイオマス収率を厳しく制限しうる。これらの要因によって、成功する藻類の大規模培養はスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）を含むごく一部の生物に限定されている（Ａｐｔら， （１９９９） Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ．， ３５：２１５）。
【００３１】
微細藻類バイオマスを商業用に生産するコストを著しく削減する可能性のある方法は、生物を通常の微生物発酵槽内で光なしに増殖するように遺伝子操作することである。以上の考察は、微細藻類の代謝を高速の従属栄養増殖に適するように遺伝子操作することが有利であることを示唆する。ほとんどの光合成生物（植物、藻類、シアノバクテリア）は炭素を糖類として貯蔵するための糖新生の能力を有する。炭素供給が制限されると、それらの貯蔵物質はよく知られる解糖機構を用いてエネルギーとして代謝される。本発明者らは、天然の従属栄養体のように、細胞が解糖用の固定炭素を直接取り込むことができれば、光合成を省き得るかどうかを研究した。
【００３２】
ほとんどの珪藻類は、光が不在のもとで外因性グルコースによって増殖する能力を有しない（Ｄｒｏｏｐ， １９７４）。珪藻類の従属栄養増殖を阻止する「代謝遮断」は、細胞が糖類を取りこむ能力がないかまたはそれをさらに代謝する能力がないことから起こると仮定されている。本発明者らは、本発明において、絶対光独立栄養珪藻、Ｐ．トリコルヌツム（Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）の栄養変換を、この藻をグルコース輸送体をコードする単一遺伝子を用いて形質転換することによって達成できることを示した。Ｃ．ケスレリ（Ｃ． ｋｅｓｓｌｅｒｉ）のＨｕｐ１遺伝子またはヒトのＧｌｕｔ１遺伝子のいずれかを用いて形質転換した株は、グルコースを取り込み、暗所でグルコースを単独の還元炭素源として用いて増殖することができる。これらの結果は明らかに、遺伝子操作による絶対光独立栄養生物の従属栄養生物への栄養変換を実証する。Ｈｕｐ１はまた、緑藻類ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）（Ｈａｌｌｍａｎら， １９９６）および珪藻類シリンドロテカ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）（Ｆｉｓｃｈｅｒら， １９９９）でも発現されているが、これらの形質転換株はいずれも従属栄養的に増殖できなかった。
【００３３】
光栄養藻類の、例えばグルコースを単独炭素源として増殖する能力のある藻類への変換には、必要な機能をコードする遺伝子の導入を必要とする。絶対光栄養体を従属栄養体へ変換するために、光栄養体は外因性の固定炭素源を供給されたときに増殖する能力を取得しなければならない。従って光栄養藻類の、単独炭素およびエネルギー源として、グルコースなどの外部有機物質を用いて暗所で増殖する能力のある藻類への変換は、必要な機能（例えば、輸送体、ヘキソキナーゼなど）をコードする１以上の遺伝子の導入を必要とする。
【００３４】
絶対光栄養藻類を従属栄養藻類に変換する今までの試みは失敗してきた。糖輸送体を発現するように形質転換した藻類は、グルコースを取り込む能力をもつことは示されたが、これらの藻類はいずれも暗所で増殖できなかった。
【００３５】
本発明は、絶対光栄養細胞を暗所で増殖できる従属栄養細胞に変換する方法を提供する。このタイプの変換の明らかな先例はないので、どのタイプの複雑な問題に出会うかを予測することは困難であった。本発明によると、変換には、最も簡単なレベルでは、ヘキソース輸送体のみが必要である。本発明者らによる、従属栄養変換は単一遺伝子（ヘキソース輸送体をコードする遺伝子などの、外因性固定炭素源を取り込むことのできる輸送体をコードする遺伝子）の挿入によって達成できるという発見は、従属栄養代謝の複雑さと当業界における今までの失敗を考えると、驚くべきことである。
【００３６】
勿論、従属栄養増殖は複雑なプロセスであるので、従属栄養増殖は、糖類および／または他の外因性固定炭素源の取り込みおよび／または代謝を増強もしくは可能にするタンパク質をコードする多重遺伝子の導入によって増強することができる。本発明においては、光栄養藻類を、糖類および／または他の外因性固定炭素源の取り込みおよび代謝に影響を与える１以上の遺伝子を用いて形質転換する。細胞を、これらの遺伝子を用いて、適当な形質転換ベクターを使って形質転換する。好ましくは、プロモーターの制御下にて挿入された遺伝子は、形質転換細胞中でその遺伝子の発現をもたらすであろう。
【００３７】
定義
本発明を説明する際に、次の用語は以下に説明した定義に従って使用される。
【００３８】
「従属栄養変換」は、所与の有機炭素およびエネルギー源（例えばグルコース）による増殖の能力がないかまたはほとんど増殖しない光栄養生物、独立栄養生物、または栄養要求生物を、同じ炭素源による従属栄養増殖の能力があるかまたは改善された従属栄養増殖の能力がある生物へ変換することである。従属栄養に変換される細胞は、暗所で増殖できることが必要である。その細胞を常時または完全な暗所に置くことは必要でない。
【００３９】
「異化」は、主にエネルギー生産のための、複雑な分子（すなわちグルコースまたは他の炭素源）のより単純な産物への代謝的破壊または分解である。「異化可能な炭素源」は、生物細胞内で異化され得る複雑な分子、典型的には単糖またはオリゴ糖、アミノ酸、または他の生化学分子である。
【００４０】
「改善された増殖」は、いずれの改善も包含することを意図する。例として、限定されるものでないが、改善は、さらに速い増殖、所望産物のさらに速い生産、または長時間持続しうる増殖であってもよい。同様に、「ほとんど増殖しない」は、改善が求められる増殖に関係する任意の特性を包含することを意図する。「ほとんど増殖しない」および「改善された増殖」はいずれも相対的な用語であって、ある特性または生物に対して「ほとんど…ない」または「改善された」として表される定量的レベルは、他の特性または生物に対しては「ほとんど…ない」または「改善された」ものではないことがありうる。
【００４１】
「従属栄養増殖を可能にするまたは増強することができるタンパク質」は、広く解釈されて、（１）所与の炭素源による増殖ができなかった細胞に対して、その炭素源による増殖を可能にするかもしくは可能にするのを助けるタンパク質、（２）所与の炭素源によってほとんど増殖しなかった細胞に対して、その炭素源による改善された増殖を示すことを可能にするかもしくは可能にするのを助けるタンパク質、または（３）最初から所与の炭素源による増殖ができた細胞に対して、その炭素源による改善された増殖を示すことを可能にするかもしくは可能にするのを助けるタンパク質、のいずれのタンパク質も包含することを意味する。そのようなタンパク質は、限定されるものでないが、細胞膜を横切る炭素化合物の輸送体、炭素化合物を異化するタンパク質、およびそのような輸送体または異化するタンパク質をアップレギュレートおよび／または活性化するタンパク質が挙げられる。
【００４２】
「光栄養体」は、光エネルギーを化学エネルギーに変換する能力をもつ生物である。
【００４３】
「独立栄養体」は、無機物を栄養源としてかつＣＯ２を炭素源として利用する生物細胞である。
【００４４】
「絶対光栄養体」は、化学エネルギーの生産に光エネルギーを必要とし、かつ外因的に供給された生成有機分子をその単独の炭素源またはエネルギー源として利用できない生物である。
【００４５】
「従属栄養体」は、生成有機化合物を光の不在のもとで炭素源およびエネルギー源として利用できる生物である。従属栄養体は、従って、照明に依存することなく増殖できる。例えば従属栄養体は、暗所で、明所で、および不完全な明所で増殖できる。同様に、「従属栄養増殖」は、光を必要としないで起こる増殖、従って、照明のレベルに依存することなくまたは照明がなくても起こる増殖を意味する。
【００４６】
「栄養要求体」は、増殖のためにある特定の物質を必要とする生物である。例えば、ある栄養要求体は特定のアミノ酸を産生できず、それゆえ増殖のためにそのアミノ酸を必要とする。多くの栄養要求体は光栄養体である。本発明によれば、従属栄養変換は、グルコースなどの外部炭素源による増殖ができない（またはほとんど増殖しない）生物を、前記外部炭素源による増殖ができる（またはよく増殖する）生物へ変換することを含む。
【００４７】
「光栄養体」、「独立栄養体」、および「栄養要求体」は全て互換的に、それによる増殖が求められる外部炭素源、例えばグルコースによって増殖しないかまたはほとんど増殖しない生物を表すために使用してもよい。これらの生物は、外部炭素源によってほとんど増殖しないかまたは，全く増殖しないので、これらはまた、本発明の内容においては、絶対光栄養体、絶対独立栄養体、または絶対栄養要求体と呼んでもよい。
【００４８】
本明細書に使用される「実質的な暗黒（または光の実質的な不在）下における増殖（または培養）」、「実質的な暗黒（または光の実質的な不在）下において増殖した（または培養した）」などの表現は、光栄養細胞が増殖できないかまたは全くといってよいほど増殖しない光条件下で、増殖または培養が実施されることを示す。同様に、「実質的な暗黒」および「光の実質的な不在」は同義であって、完全な暗黒と光栄養細胞が増殖できないか全くといってよいほど増殖しないレベルとの間で様々でありうる照明のレベルを示す。代わりの方法で表現すると、表現「暗所で」、「光の実質的な不在のもとで」などの表現によって示される照明のレベルは、光栄養細胞に対して、増殖を制限（例えば、限定されるものでないが、倍加時間、最大培養密度または産物生産の点で）しうる照明のレベルである。従って、暗所における増殖または培養は、例として、限定的な例ではないが、発酵槽内に入る光が培養中の絶対光栄養体の長期間増殖をサポートするのに不十分である限り、細胞観察、細胞への養分供給などを行うための窓または開口部を有する発酵槽での増殖を包含する。
【００４９】
「キメラＤＮＡ」は、より大きいＤＮＡ分子中に、そのより大きい分子とは天然では関連のないＤＮＡの、特定可能なセグメントが含まれるものである。従って、キメラＤＮＡがタンパク質セグメントをコードしている場合、そのセグメントコード配列は、いかなる天然のゲノムでもそのコード配列にフランキングしないＤＮＡにフランキングしうる。対立遺伝子変異体または天然の突然変異事象は本明細書に定義したキメラＤＮＡを生じることはない。
【００５０】
「コード配列」は、タンパク質またはペプチド配列と（遺伝子コードで見て）対応するかまたはそれらをコードするインフレームなコドン配列である。２つのコード配列は、それらの配列またはそれらの相補的配列が同一のアミノ酸配列をコードする場合、互いに対応するものである。適当な調節配列と結びつけたコード配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで転写され、ポリペプチドに翻訳されうる。ポリアデニル化シグナルと転写終結配列は通常、コード配列の３’側に置かれる。
【００５１】
「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流のコード配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。コード配列がプロモーター配列の「制御下」にあるというのは、プロモーター配列と結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれがコード配列にコードされるタンパク質に翻訳される場合を言う。本発明を定義する上で、プロモーター配列は、その３’末端にコード配列の翻訳開始コドンが結合しており、かつ上流（５’方向）に、バックグラウンドを超えて検出しうるレベルの転写を開始するために必要な塩基もしくはエレメントの最小数を少なくとも含むだけの長さで伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより都合よく定められる）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。プロモーターは通常、下流遺伝子のさらに効率的な開始および転写のために、追加のコンセンサス配列（プロモーターエレメント）を含有する。
【００５２】
本発明による「遺伝子融合物」は、天然では関連のないプロモーターとコード配列とを含有するキメラＤＮＡである。
【００５３】
「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわちそれ自身の制御により複製可能である、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００５４】
ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの外来物質を生物中に導入するために使用される。「ＤＮＡベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンであって、これに他のＤＮＡセグメントを結合して、結合したセグメントの複製をもたらすことができるものである。
【００５５】
細胞が外因性ＤＮＡによって「形質転換」されたというのは、そのような外因性ＤＮＡが細胞壁の内側に導入されたことを意味する。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに（共有結合によって）組み込まれてもまたは組み込まれなくてもよい。例えば、外因性ＤＮＡは、プラスミドなどの染色体外エレメント（またはレプリコン）上に保持してもよい。安定的に形質転換された細胞は、外因性ＤＮＡが染色体中に組み込まれて染色体複製により娘細胞に継承される細胞である。この安定性は、細胞系またはクローンが、その全体が外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から成るように確立される細胞の能力によって実証される。
【００５６】
本明細書に使用される「塩」は、海水に通常見出される無機イオン化合物またはそのような化合物の混合物を意味する。本明細書において塩濃度は、所与の重量の塩化ナトリウムに対応するイオン量を与える前記化合物の量として表される。海水の塩濃度は約３２〜３３ ｇ／Ｌである。
【００５７】
絶対光栄養体である藻類（大型藻類および微細藻類共に）は、本発明の方法によって従属栄養体に変換することができる。多くの藻類は絶対光栄養体であってグルコースによる増殖はできないので、これらの生物の任意のものが栄養変換の標的となりうる。光栄養体のリストは、Ｄｒｏｏｐ（Ｄｒｏｏｐ ＭＲ， 「炭素の従属栄養（Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ）」， Ｉｎ Ａｌｇａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ， １０：５３０−５５９， Ｓｔｅｗａｒｔ ＷＤＰ編， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ （１９７４））によるレビューに見出しうる。また、潜在的または既知の商業的価値をもつ光栄養藻類属の代表的で非排他的なリストを、門レベルでまとめて、以下に掲げる（表Ａ）。「一般名」を括弧内に記す。
【００５８】
表Ａ光栄養藻類の例のリスト
2004500839.tif 000003
【００５９】
フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、特に生態学、生理学および生化学の分野で珪藻類を研究するための最も広く利用されるモデル系の１つである。Ｉａｎｏｒａ Ａ， Ｐｏｕｌｅｔ ＳＡ， Ｍｉｒａｌｔｏ （１９９５），「橈脚類テンポラ・スチリフェラの生殖生物学に対する珪藻類の阻害効果の比較研究（Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉａｔｏｍｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｐｅｐｏｄ Ｔｅｍｏｒａ ｓｔｙｌｉｆｅｒａ）」， Ｍａｒ． Ｂｉｏｌ． １２１：５３３−５３９；Ｋｕｍａ Ｋ， Ｍａｔｓｕｎｇａ Ｋ （１９９５），「沿岸海洋植物プランクトンに対するコロイド状酸化鉄のアベイラビリティ（Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｆｅｒｒｉｃ ｏｘｉｄｅｓ ｔｏ ｃｏａｓｔａｌ ｍａｒｉｎｅ ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ）」， Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌ． １２２：１−１１；Ａｌｗｙｎ Ｔ， Ｒｅｅｓ Ｖ （１９９５），「海洋単細胞藻類におけるアンモニア空転サイクリングについて（Ｏｎ ａｍｍｏｎｉａ ｆｕｔｉｌｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｇａ）」， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２２８：２５４−２６０；Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉら （１９９５），「海洋珪藻類における鉄制限の指標としてのフラボドキシン発現（Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｉｒｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｒｉｎｅ ｄｉａｔｏｍｓ）」， Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ． ３１：５２０−５３０；Ｒｅｅｓ ＴＡＶら， （１９９５）， 「海洋単細胞藻類中のｉｎ ｓｉｔｕグルタミンシンセターゼ活性：高感度比色アッセイの開発と窒素状態の酵素活性に対する影響（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｇａ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．）」， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０９：１４０５−１４１０；Ｋｈａｌｙｆａ Ａら， （１９９５）「予備的未変性電気泳動による珪藻類フェオダクチルム・トリコルヌツムからのクロロフィラーゼの精製と特性決定（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｌｇａ Ｐｈａｅｏｄａｃｒｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｉｔｕｍ ｂｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｎａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ ５３：１１−２７；Ｚｈｕｋｏｖａ ＮＮ， Ａｌｚｄａｉｓｃｈｅｒ ＮＡ （１９９５），「海洋微細藻類１５種の脂肪酸組成（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ １５ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：３５１−３５６、を参照すること。最近、これはまた、珪藻類に見られるユニークな生物学的プ���セスのうちのいくつか、特に色素体タンパク質ターゲッティングおよび細胞壁形成に関する生物学的プロセスを研究する分子モデルとしても使用されている。Ａｐｔ ＫＥ， Ｃｌｅｎｄｅｎｎｅｎ ＳＫ， Ｐｏｗｅｒｓ ＤＡ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＲ （１９９５）「褐藻類マクロシスチス・ピリフェラ由来のフコキサンチンクロロフィルタンパク質をコードする遺伝子ファミリー（Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ａｌｇａ Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ）」， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｄｉｅｎｔ． ２４６：４５５−６４；Ａｐｔ ＫＥら， （１９９４）， 「珪藻類の光獲得タンパク質をコードする遺伝子の特性決定：フコキサチンクロロフィルａ／ｃタンパク質タンパク質複合体の生物発生（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ−ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｄｉａｔｏｍｓ ： ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ／ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）」， Ｊ Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ． ６：２２５−２３０；Ｂｈａｙａ Ｄ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＧ （１９９３），「珪藻類フェオダクチルム・トリコルヌツムのフコキサチンクロロフィルタンパク質をコードする遺伝子クラスタの特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉａｔｏｍ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）」， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：４４５８−６８。
【００６０】
微細藻類フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、外部グルコース、酢酸、アミノ酸などを単独のエネルギー源または炭素源として利用できないことが繰返し報じられている。Ｃｏｏｋｓｅｙ ＫＥ 「フェオダクチルム・トリコルヌツムの全体細胞による酢酸代謝（Ａｃｅｔａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）」， Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ． １０：２５３−７ （１９７４）；Ｄｒｏｏｐ １９７４ ； Ｈｅｌｌｅｂｕｓｔ ＪＡ， Ｌｅｗｉｎ Ｊ 「従属栄養型栄養摂取（Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」， ｉｎ （Ｗｅｒｎｅｒ Ｄ編） Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉａｔｏｍｓ， Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ １３：１６９−１９７， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ， （１９７７）。本発明者らはこの微細藻類を暗所でグルコースを含有する培地にて繰返し試験して、検出可能な増殖または栄養取り込みを観察しなかった。最近の遺伝学的形質転換系の開発は、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）などの生物における生物学的プロセスについての分子機構を研究する新しい機会を提供した（ＡｌｌｎｕｔｔらのＷＯ ９７／３９１０６および米国特許第６，０２７，９００号、標題は共に「真核生物藻類の形質転換のための方法とツール（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ａｌｇａｅ）」、両方共に本明細書に参照により組み入れられる）。その結果、フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）を、遺伝子工学を利用して絶対光栄養生物を変換する能力を試験するモデルとして選択した。
【００６１】
形質転換した細胞を作るには、外因性ＤＮＡを標的細胞集団中に導入し、そして、通常は、外因性ＤＮＡに存在するが非形質転換細胞に見られないなんらかの決定因子の発現を測定することによって、外因性ＤＮＡを取りこんだ細胞を選択する。藻類での使用に好ましい選択マーカーは、ＷＯ ９７／３９１０６に記載されたゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）耐性選択系である。Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号も参照。簡単に説明すると、ゼオシン（および関連抗生物質）に対する耐性は、高塩培地において、他の抗生物質耐性遺伝子で観察されるより遥かに大きい程度で維持されることが発見された。従って、ゼオシン耐性決定因子をもつ外因性ＤＮＡを含有する形質転換体は、適当な濃度のゼオシンの存在する塩水中で増殖しうるが、海洋生物の非形質転換細胞は増殖しえない。
【００６２】
キメラＤＮＡの構築ならびに細胞の形質転換および該細胞でのタンパク質発現におけるその利用についての標準的方法は、当業者によく知られており、これらの方法は標準的な分子生物学操作についての多数の教科書に記載されている（例えば、Ｐａｃｋｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ， １９８８， 「シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）」， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １６７；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ， １９８８， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ＆ Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．；およびＣｌａｒｋ ＭＳ， １９９７， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
【００６３】
本発明のキメラ核酸、例えば、適当なプロモーターと融合した、従属栄養増殖を可能にするかまたは増強するタンパク質をコードするコード配列、を含んでなる核酸構築物を、例えば海洋生物または真核藻類の細胞中に単独でまたはＤＮＡベクターの部分として導入することができる。海洋生物または真核藻類において使用する適当なベクターは当業界で周知であって、そのようないずれのベクターを使ってもよい。もしベクターとゲノムの間の組換えが起こるのであれば、藻類で複製しないベクターでも利用しうる。
【００６４】
ベクターを構築するプロセスを総括すると、適当なプロモーターの制御下で発現される遺伝子の上流ＤＮＡ配列について制限酵素によりマッピングして、タンパク質の発現に重要な領域を同定することができる。遺伝子の開始コドンの正確な位置を決定し、その情報と上記制限酵素地図を利用して、その遺伝子のタンパク質をコードする領域を除去するが、遺伝子発現の制御に関わる遺伝子材料を含有することがわかっている上流領域を残すことによって、従属栄養タンパク質の発現のためのベクターを設計することができる。合成オリゴヌクレオチドのマルチクローニングサイトを、好ましくは、以前にタンパク質コード配列があった位置に挿入して、任意の遺伝子（例えば、タンパク質コード配列）を合成オリゴヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ部位を利用してクローニングできるようにする。これによりこの部位に挿入された無関係な遺伝子（またはコード配列）は、残存する開始コドン、およびこの遺伝子によってコードされる外来の（すなわち、普通はベクターの調節配列と関連していない）タンパク質の発現を駆動する上流調節領域、の制御下にあるであろう。外来タンパク質の遺伝子がクローニングベクター中に置かれると、これは、複数の方法のいずれか（そのいくつかは宿主生物に特有でありうる）を利用して宿主生物中に導入することができる。
【００６５】
当業者が精通するＤＮＡ送達方法としては、炭化シリカ・ウイスカー・ボルテックス、ガラスビーズ・ボルテックス、エレクトロポレーション、および微粒子銃が挙げられる。好ましくは、ガラスビーズ・ボルテックスを使用する。さらに好ましくは、微粒子銃を使用する。これらの方法を使用して、本発明の遺伝子融合物を、例えば海洋生物または真核藻類の細胞中に、単独でまたはＤＮＡベクターの部分として導入することができる。
【００６６】
これらの方法の変法は、本明細書に引用した一般的な参考文献に十分記載されている。特定の宿主のために形質転換を最適化する条件の操作は、当技術分野の範囲内にある。
【００６７】
適当な形質転換ベクターは、従属栄養増殖を増強するかまたは可能にするタンパク質をコードする遺伝子を挿入するための少なくとも１つの部位を有するベクターが挙げられる。好ましくは、本発明による方法に使用される形質転換ベクターは、外因性固定炭素源を取りこむことができる輸送体をコードする遺伝子を挿入するための少なくとも１つの挿入部位を有する。さらに好ましくは、本発明による方法に使用される形質転換ベクターは、ヘキソース輸送体をコードする遺伝子を挿入するための挿入部位を少なくとも１つ有する。典型的には、形質転換ベクターはまた、細菌内で複製することもできるので、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｉ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ＆ Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．などに記載の方法を利用して、大量のベクターを容易に調製しうる。好ましくは、宿主藻類種をトランスフェクトする上で公知であるベクターを選ぶ。
【００６８】
形質転換系は、珪藻類を含む限られた数の真核藻類属について記載されている。例えば、４種類の珪藻類が形質転換されている。各事例で、目的の珪藻類に対する特殊なベクターが開発された。本発明者らは、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）を、以下さらに詳細に説明するｐＰｈａ−ＴＩと呼ぶベクターを用いて形質転換した。シクトテラ・クリプチカ（Ｃｙｃｔｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ）およびナビキュラ・サプロフィラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ）は、抗生物質Ｇ４１８耐性を与えるｎｐｔＩＩ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を有するベクターｐＡＣＣＮＰＴ１０およびｐＡＣＣＣＮＰＴ５．１を用いて形質転換されている。導入した遺伝子の発現を駆動するプロモーターは外因性ａｃｃ遺伝子（アシルＣｏＡカルボキシラーゼ）から得られた。Ｄｕｎａｈａｙ， Ｔ．Ｇ．， Ｊａｒｖｉｓ， Ｅ．Ｅ． ＆ Ｒｏｅｓｓｌｅｒ， Ｐ．Ｇ． （１９９５）「珪藻類シクトテラ・クリプチカおよびナビキュラ・サプロフィラの遺伝学的形質転換（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉａｔｏｍｓ Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ ａｎｄ Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ）」， Ｊ Ｐｈｙｃｏｌ． ３１：１００４−１２。シリンドロテカ・フシフォルミス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）は、Ｆｉｓｈｅｒらによって形質転換された（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｈ．， Ｒｏｂｌ， Ｉ．， Ｓｕｍｐｅｒ， Ｍ．， ＆ Ｋｒｏｇｅｒ， Ｎ．， （１９９９），「珪藻類シリンドロテカ・フシフォルミス（珪藻植物）にて異種的に発現された細胞壁および膜タンパク質のターゲッティングと共有結合改変（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｔｏｍ Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ （Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ））」， Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ． ３５：１１３−２０）。この事例では、抗生物質ゼオシンに対する耐性を与えるｓｈ ｂｌｅ遺伝子が利用された。発現を駆動するプロモーターは、細胞壁タンパク質をコードする内因性ｆｒｕ遺伝子由来であり、そのベクターはｐｂｌｅ／ｆｒｕＥと呼ばれた。クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）由来のグルコース輸送体をコードするｈｕｐ１遺伝子を含有する、このベクターの誘導体ｐｂｌｅ／ＨＵＰｔａｇはまた、シリンドロテカ・フシフォルミス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換するのにも利用された。形質転換した藻類はグルコースを取り込むことができた。しかし、形質転換した藻類は従属栄養的に増殖できなかった（Ｆｉｓｃｈｅｒら， １９９９）。
【００６９】
少数の緑藻類が形質転換されている（ＳｔｅｖｅｎｓおよびＰｕｒｔｏｎ （１９９７）「真核藻類の遺伝子操作：進歩と見通し（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ａｌｇａｅ ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」， Ｊ Ｐｈｙｃｏｌ． ３３：７１３−２２を参照）。最も顕著なものはクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）である。この藻類は、研究に携わる多数の研究室で長い間、重要な分子モデル系となっている。その結果、この藻類の栄養変換に利用しうる多数の記載されたベクターがある。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）と近縁な属であるボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）も、形質転換されている（Ｈａｌｌｍａｎ Ａ， Ｓｕｍｐｅｒ Ｍ （１９９６）， 「ボルボックスにて発現される場合、クロレラ・ヘキソース／Ｈ’共輸送体は有用な選択マーカーおよび生化学試薬である（Ｔｈｅ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｈｅｘｏｓｅ／Ｈ’ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ ｉｓ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｖｏｌｖｏｘ）」， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：６６９−６７３）。ＨａｌｌｍａｎｎとＳｕｍｐｅｒはクロレラｈｕｐ遺伝子をボルボックス中に導入した。その藻類はデオキシグルコースに感受性があり、そのことは輸送体が機能性であることを示している。しかし、著者らは取り込みの測定値を提供しなかったし、その細胞は従属栄養的に増殖しなかった。
【００７０】
本発明に好ましいベクターは、１以上の藻類系のために開発されたベクターである。さらに、本明細書に記載の方法とゼオシン耐性選択系は、当業者に、光栄養藻類の従属栄養藻類への形質転換に適しているベクターの調製と選択の手引きを提供する。
【００７１】
様々なプロモーターが、多かれ少なかれ様々な宿主系で有効でありうる。例えば、ある光合成種において光合成に関連する遺伝子由来のプロモーターを、形質転換した藻類細胞または他の光合成海洋生物の細胞におけるタンパク質の発現を指令するのに利用することができる。本発明の利用に適したプロモーターを、他の光合成生物から単離するかまたはそれから得られる既知の配列に基づいて合成することができる。好ましいプロモーターとしては、他藻類およびシアノバクテリアを含む他の光合成種由来であって、形質転換すべき藻類宿主の光合成遺伝子と相同的である遺伝子に対するプロモーターが挙げられる。好ましくは、本発明による使用のために選ばれるプロモーターは、そのプロモーターを用いる生物内で、それが制御するキメラ遺伝子の構成的で高レベルの産生を提供する。好ましくは、この構成的で高レベルの産生は照明に依存しないものであり、そのため光が存在してもしなくてもそのような産生が起こる。そのようなプロモーターの例は、ハウスキーピング遺伝子などの構成的に発現される遺伝子に対するプロモーターである。ここで、利用しうるレポーター遺伝子系があれば、所望の特性をもつプロモーターの選択は、十分に、分子生物学、藻類学などの当業者の能力の範囲内である。Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａらを参照。
【００７２】
特定の藻類宿主については、その宿主由来の相同的な光捕捉（ｌｉｇｈｔ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）遺伝子を同定し、最適発現を得るためにその宿主生物から相同的プロモーターを単離することが好ましい場合がある。しかし、複数の生物について、外来のプロモーターが、宿主生物の相同的プロモーターと比較して、宿主に優れたまたは制限のより少ない発現を与えることが見出されている（Ｍｅｒｍｅｔ−Ｂｏｖｉｅｒら， （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２６：３２３−３２７）。
【００７３】
一実施形態においては、発現を所望する遺伝子をクロロフィル結合タンパク質のプロモーターによって調節する。このほど、本発明者らは、フコキサンチンクロロフィル結合タンパク質由来の一連の光捕捉プロモーターを同定し、そしてフェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からクローニングした。Ａｐｔら（１９９６）を参照。藻類、特に光合成珪藻類の形質転換に対するｆｃｐプロモーターの使用はＷＯ ９７／３９１０６に記載されている。Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号も参照。好適なプロモーターとしては、ｆｃｐＡ、ｆｃｐＢ、ｆｃｐＣ、およびｆｃｐＥプロモーター、ならびに多くの他のｌｈｃ（光捕捉複合体）プロモーターが挙げられる。当業者に明らかな他の好適なプロモーターを、本発明による従属栄養変換に使用してもよい。
【００７４】
汎用の形質転換ベクターｐＰｈａ−Ｔ１（図１）を、異種遺伝子の珪藻類Ｐ．トリコルヌツム（Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）中への効率的な導入を容易にするために構築した。このベクターは、目的の遺伝子を挿入するための１０のユニークな制限部位をもつマルチクローニングサイトを含有する。ｆｃｐＡ遺伝子のプロモーターとターミネーター領域がマルチクローニングサイトに隣接し、挿入遺伝子の効率的な発現を促進する。ベクターを有するＰ．トリコルヌツム細胞の一次選択はゼオシン耐性であって、これはＰ．トリコルヌツムｆｃｐＢプロモーターとｆｃｐＡターミネーターが隣接するｓｈ ｂｌｅ遺伝子によってコードされる。
【００７５】
プラスミド形質転換ベクターｐＰｈａ−Ｔ１（図１）は数段階を経て構築した。第１ステップはｐｆｃｐＡ／ｂｌｅ（Ａｐｔら， １９９６）由来のｆｃｐＡターミネーター領域をｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎＤＩＩＩ−Ｘｈｏｌ部位中にサブクローニングすることを含む。ｓｈ ｂｌｅ遺伝子を駆動するｆｃｐＢプロモーターを含有するｐｆｃｐＢ／ｂｌｅ（Ａｐｔら， １９９６）由来のゼオシン耐性カセットを、ＸｈｏＩ断片としてｐＳＰ７３ ＸｈｏＩ部位中にサブクローニングした。ｐｆｃｐＡ／ｂｌｅ（Ａｐｔら， １９９６）由来のｆｃｐＡプロモーター領域は、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてサブクローニングし、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−中に挿入した。次いでこの同じ断片をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片として取り出し、ｐＳＰ７３のＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＰＶ部位中に連結して最終基本構築物を形成した。ＥｃｏＲＶとＨｉｎＤＩＩＩ部位の間のｐＳＰ７３由来のマルチクローニングサイトは、潜在ＡＴＧ開始コドンを抹消するために部位特異的突然変異誘発によって除去したＣｌａｉ部位を除いて、無傷で保存した（Ｄｅｎｇ， Ｗ． Ｐ． ＆ Ｎｉｃｋｏｔｏｆｆ， Ｊ． Ａ．， （１９９２）「ユニークな部位を抹消することによる実施的に任意のプラスミドの部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｔｕａｌｌｙ ａｎｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｂｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅ）」， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．‘１１００：８１−８；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， ２０００）。
【００７６】
プラスミド形質転換ベクターｐＰｈａ−Ｔ１を用いて、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、シリンドロテカ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、およびニツキア・アルバ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ａｌｂａ）などの珪藻類を微粒子ボンバードメントによって形質転換することができる。当業者はまた、ｐＰｈａ−Ｔ１ベクターを調製するために用いた方法によって調製しうる相同的プロモーターに基づく代わりの形質転換ベクターも使用することができる。ＷＯ ９７／３９１０６。Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号も参照すること。
【００７７】
任意の藻類の特定種における、遺伝子発現、ならびにその発現のタイミングおよびその発現に影響する因子を調節する所与のプロモーターの能力は、ＷＯ ９７／３９１０６に記載のゼオシン選択系を用いて評価することができる。また、Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号も参照すること。所与の生物における、プロモーターとその活性を評価するために使用しうるさらなる選択系は、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， ２０００に記載されている。
【００７８】
任意の生物への遺伝子材料の導入を容易に検出するためには、すなわち、細胞が形質転換されているか否かを検出するためには、この導入を示す表現型試験を確立する必要がある。最も好都合に従って伝統的に操作される形質は抗生物質感受性である。様々な生物の増殖を完全に抑止するゼオシンとノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）の最低濃度は、ＷＯ ９７／３９１０６のＰ．トリコルヌツムについて詳述された方法を使用して決定できる。Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号、および以下の実施例１も参照すること。生物への遺伝子材料導入を検出するために使用できるさらなる選択系は、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら（２０００）に記載されている。
【００７９】
本発明の遺伝子構築物に使用するのに好適なコード配列としては、従属栄養増殖を増強するまたは可能にするタンパク質に対する遺伝子が挙げられる。好ましくは、コード配列は、糖類および／または他の外因性固定炭素源の取り込みと異化に影響を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。さらに好ましくは、コード配列は、外因性固定炭素源を取り込むことができる輸送体をコードする遺伝子である。そのような炭素源の例としては、限定されるものでないが、糖類、脂肪酸、アミノ酸、ピルベート、グリセロール、およびシトレートが挙げられる。さらにもっと好ましくは、コード配列は、限定されるものでないが、スクロース輸送体などの単糖もしくは二糖輸送体をコードする遺伝子である。最も好ましくは、コード配列は、限定されるものでないが、グルコース輸送体などのヘキソース輸送体をコードする遺伝子である。
【００８０】
本発明の遺伝子構築物に好適である他のコード配列の非排他的な例としては、細胞膜を横切る還元炭素源の存在する輸送体をアップレギュレートするタンパク質をコードするコード配列、細胞膜を横切る還元炭素源の存在する輸送体を活性化するタンパク質をコードするコード配列、および細胞による還元炭素源の異化を容易にするタンパク質をコードするコード配列が挙げられる。
【００８１】
本発明者らは、異化可能な炭素源として作用する化合物の輸送体をコードする単一外因性遺伝子の発現が、絶対光栄養生物（ｏｂｌｉｇａｔｅ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈ）を従属栄養増殖できる組換え細胞に変換するために十分でありうることを発見した。本発明の好ましい実施形態においては、単一遺伝子による形質転換が光栄養生物から従属栄養生物への変換に影響を与える。勿論、複数遺伝子の導入はさらに十分な従属栄養増殖を達成するために必要であるかもしくは所望される場合があり、そして好適なコード配列の組合せを用いる構築物は本発明に従って使用することができる。例えば、様々な化合物の輸送体または化合物の代謝に関わる酵素と結合した輸送体をコードする配列を使用することができる。
【００８２】
ヘキソース輸送体は、全て１２膜貫通ドメインを有する構造から成る、同類の糖輸送体のスーパーファミリーを含んでなる。例えば、Ｗａｌｍｓｌｅｙ ＡＲら， （１９９８）「細菌、寄生虫および哺乳類由来の糖輸送体：構造と活性の関係（Ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ， ｐａｒａｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｓ ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）」， Ｔｒｅｎｄｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３（１２）：４７６−８１ （広範な全体レビュー）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＪ， （１９９０）「原核生物と真核生物の相同的グルコース輸送体タンパク質（Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）」， Ｒｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １４１（３）：３１６−２８；Ｂｉｓｓｏｎ ＬＦら， （１９９３）「酵母の糖輸送体（Ｙｅａｓｔ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８（４）：２５９−３０８；Ｋｒｕｃｋｅｂｅｒｇ （１９９６）；Ｍｕｅｃｋｌｅｒ Ｍ ら， （１９９７）；Ｂａｒｒｅｔｔ ＭＰ ら， （１９９８） 「トリパノソームグルコース輸送体（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ９１ （１）：１９５−２０５；Ｃａｓｐａｒｉ Ｔ ら， （１９９４）「下等および高等植物におけるヘキソース／Ｈ＋共輸送体（Ｈｅｘｏｓｅ／Ｈ＋ ｓｙｍｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｌｏｗｅｒ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ）」， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． １９６；４８３−４９１を参照。特性決定されたヘキソース輸送体の例のリストを、特性決定されたスクロース、シトレート、および脂肪酸輸送体の例と共に表Ｂに掲げる。Ｈｉｒｓｃｈ Ｄ． ら， （１９９８）「マイコバクテリウムからヒトに保存された脂肪酸輸送体のファミリー（Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｍａｎ）」， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９５（１５）：８６２５−８６２９；Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ Ｎ．ら， （１９９５）「ディジョージ症候群の重要な領域における染色体２２Ｑ１１に対するヒトのミトコンドリアシトレート輸送体タンパク質遺伝子の局在化（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｉｔｉｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２Ｑ１１ ｉｎ ｔｈｅ ＤｉＧｅｏｒｇｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｉｏｎ）」， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９（２）：４５１−４５６；Ｒｅｎｔｓｃｈ Ｄ ら， （１９９８）「高等植物由来の原形質膜アミノ酸、オリゴペプチドおよびスクロース輸送体の構造と機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ， ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ）」， Ｊ． Ｍｅ��ｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６２（３）：１７７−９０を参照。表Ｂはまた、アミノ酸輸送体の例示的なリストも含む。Ｓａｉｅｒ ＭＨ， （２０００）「アミノ酸とその誘導体に選択的な膜貫通輸送体のファミリー（Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：１７７５−９５；Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ＤおよびＢｏｙｄ ＣＡ， （２０００） 「真核生物ペプチド輸送体の構造と機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）」， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５７（５）：７５４−７８；Ｏｒｔｉｚ−Ｌｏｐｅｚ Ａ， Ｃｈａｎｇ ＨおよびＢｕｓｈ ＤＲ． （２０００）「植物のアミノ酸輸送体（Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）」， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４６５（１−２）：２７５−８０；ならびにＭｃＧｉｖａｎ ＪＤ． （１９９６）「哺乳類アミノ酸輸送体とその調節：序論（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ： ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ． ２４（３）：８３７−８を参照。
【００８３】
表Ｂ　特性決定された還元炭素源（すなわち異化可能な化合物）輸送体の例
特性決定されたヘキソース輸送体の例
2004500839.tif 000004
【００８４】
様々な糖輸送体が関係しているので、それらのいずれを本発明に従って栄養変換における輸送体として使用してもよい。本発明者らは、ｇｌｕｔ１（哺乳類ヘキソース共輸送体）またはｈｕｐｌ（藻類ヘキソース共輸送体）を挿入することによって光栄養藻類を従属栄養生物に変換するのに成功した。本発明者らは、ｇｌｕｔ１の挿入は光栄養藻類を従属栄養生物へ変換するのに特に成功することを発見した。ｈｘｔ１、ｈｘｔ２、ｈｘｔ４（酵母ヘキソース共輸送体）を用いた実験はあまり成功しなかった。フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）を酵母輸送体遺伝子によって形質転換した時に成功が少なかったのは、恐らくミスマッチコドン利用の結果であろう。例えば、酵母輸送体はフェオダクチルムコドン利用とマッチしないコドンバイアスを使用する。
【００８５】
多くの藻類が普通ではないコドン利用を有することが示されている（Ｂｈａｙａ Ｄ．， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＧ （１９９３）「珪藻類フェオダクチルム・トリコルヌツムのフコキサンチンクロロフィルタンパク質をコードする遺伝子クラスターの特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉａｔｏｍ Ｐｈａｅｏｄｕｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）」， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：４４５８−１５９；Ａｐｔ ＫＥ， Ｈｏｆｆｍａｎ Ｎ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＲ （１９９３）「Ｒ−フィコエリトリンのγサブユニットおよび紅藻類の色素体中へのその可能な輸送様式（Ｔｈｅ γ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｏｄｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｔｉｄ ｏｆ ｒｅｄ ａｌｇａｅ）」， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１６２０８−１５；Ａｐｔ ＫＥ， Ｃｌｅｎｄｅｎｎｅｎ ＳＫ， Ｐｏｗｅｒｓ ＤＡ， Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＡＲ （１９９５）「褐藻類マクロシスチス・ピリフェラ由来のフコキサンチンクロロフィルタンパク質をコードする遺伝子ファミリー（Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ａｌｇａ Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ）」， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｎｔ． ２４６：４５５−６４）。Ｐ．トリコルヌツムのコドン利用は、アルギニンコドンＡＧＡとＡＧＧの使用が稀である点が、ヒトのコドン利用と非常に類似している（Ｂｈａｙａ ら， １９９３；Ａｐｔら， １９９５）。Ｐ．トリコルヌツムにおいて優勢なＡＧＡコドンを含有した異種遺伝子を発現する今までの試みは全て失敗した。本発明者らは、コドンＡＧＡおよび、特にＡＧＧの稀な利用が適当な遺伝子発現に重要であると決定した。今まで、Ｐ．トリコルヌツムからクローニングされたまたはＰ．トリコルヌツムにおいてうまく発現された遺伝子で優勢なコドンＡＧＧを含有するものはなかった。本発明によれば、従って、全てのＰ．トリコルヌツム形質転換は、これらのコドンを含有しない（または少なくとも稀にしか含有しない）遺伝子を用いて行うことが好ましい。
【００８６】
簡単に説明すると、目的のタンパク質のＤＮＡ配列を決定する。所望でないコドンを同定する。点突然変異誘発を用いて、これらの所望でないコドンを、同じアミノ酸をコードする所望のコドンによって置き換える。次に、新しく再構築した遺伝子をベクター中に挿入し、目的の種を形質転換するために使用する。この方法で、異種タンパク質が目的の生物内で効率よく発現されるように仕立てることができる。従って、糖および／または他の外因性固定炭素源の取り込みと使用に関係する任意の遺伝子をこのような技術によって再構築して、本発明の方法を用いて光栄養生物を従属栄養生物に変換するために使用することができる。例えば、ｈｘｔ遺伝子を再構築してコドンＡＧＡとＡＧＧの利用を削減するかまたは抹消することによって、酵母ヘキソース輸送体（ｈｘｔ遺伝子のタンパク質産物）を使用してフェオダクチルムをよりよく変換することができる。
【００８７】
あるいは、コドン利用は、保存的アミノ酸置換を用いて遺伝子を再構築することによって、変えることできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ， Ｐｏｔｔｅｒ Ｍ， Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ＷＭ， Ｇｕｙ Ｊ， Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ （１９９６）「哺乳類細胞中の高レベル発現に適合させた「ヒト化」緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（Ａ‘ｈｕｍａｎｉｚｅｄ’ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃＤＮＡ ａｄａｐｔｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７０：４６４６−４６５４；Ｈａａｓ Ｊ， Ｐａｒｋ ＥＣ， Ｓｅｅｄ Ｂ （Ｍａｒ． １， １９９６）「ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の発現におけるコドン利用制限（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６ （３）：３１５−２４）。「保存的アミノ酸置換」は配列中の１つのアミノ酸残基の類似特性をもつ別の残基による置換であって、得られるペプチドの二次および三次構造が実質的に同じである。保存的アミノ酸置換が起こるのは、アミノ酸が置換されるアミノ酸と実質的に同じ電荷を有しかつ置換がタンパク質の局所コンフォメーションに有意な影響を与えない時である。お互いに保存的に置換しうるアミノ酸ペアは当業者には周知である。
【００８８】
所与の遺伝子が所与の形質転換細胞でうまく発現されたか否か（ゼオマイシン耐性選択系を用いて決定するように）は、本発明の方法を使用して決定することができる。光栄養細胞を従属栄養細胞に変換するのに有用な１以上の遺伝子の発現の成功は、形質転換した細胞の外部固定炭素源（例えば、グルコース、アセテート）を取りこむまたは暗所で増殖する能力によって測定することができる。好ましくは、光栄養細胞を従属栄養細胞に変換するのに有用な１以上の遺伝子の発現の成功は、形質転換した細胞の外部固定炭素源を取りこむおよび暗所で増殖する両方の能力によって測定する。この背景における発現の成功を決定するために使用する対照細胞は、陰性対照（例えば、形質転換してない形質転換種の細胞または他の光栄養生物）および／または陽性対照（例えば、天然の従属栄養生物または先に従属栄養生物に変換された光栄養細胞）であってもよい。
【００８９】
外因性炭素源の取り込みおよび／または使用に有用であるタンパク質をコードする遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、通常の組換えＤＮＡ技術によって、選んだベクターに挿入して目的のタンパク質を発現を生じうるベクターを作製することができる。例えば、ヘキソース輸送体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を用いてヘキソース輸送体（ＨＸ）ベクターを作製することができる。ベクター、例えば、ＨＸベクターの集団は、細菌内で複製できるベクターについては細菌培養におけるベクターの拡大によって、またはＰＣＲもしくは他の増幅技術によって得ることができる。次に、拡大したベクター、例えばＨＸベクターの集団を使用して、選んだ宿主細胞の集団を形質転換する。
【００９０】
形質転換は、いずれの好適な技術によって実施してもよく、エレクトロポレーション、ＤＮＡコーティング微粒子ボンバードメント、シリカカーバイドウイスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）・ボルテキシング、ガラスビーズ・ボルテキシングが挙げられる。好ましくは、ガラスビーズ・ボルテキシングまたは微粒子ボンバードメントを使用する。さらに好ましくは、微粒子ボンバードメントを使用する。そのような技術は、当業界では周知であって、さらに詳細は、本明細書に、およびＷＯ ９７／３９１０６に記載されている。また、Ａｌｌｎｕｔｔらの米国特許第６，０２７，９００号も参照すること。
【００９１】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏｌｉｓｉｔｃ ＰＤＳ−１０００／ＨＥＴＭ粒子送達システムを用いた微粒子ボンバードメントを（製造業者の指示に従って）使用するときは、好ましくは、１１００、１３５０、または１５００ｐｓｉ破裂板を用いるが、いずれのｐｓｉ破裂板を用いてもよい。最も好ましくは、１５００ｐｓｉ破裂板を用いる。同様に、当業界で通常使用されるいずれの微粒子をボンバードメントに使用してもよい。好ましくは、タングステン粒子Ｍ５（０．４μｍメディアン径）もしくはＭ１７（１．１μｍメディアン径）または１ミクロンメディアン径の金粒子を使用する。最も好ましくは、タングステン粒子Ｍ１７を使用する。撃ち込む（ｂｏｍｂａｒｄｅｄ）細胞をチャンバー内の任意のレベルに置くことができる。好ましくは、細胞をレベル２または３に置く。最も好ましくは、細胞をレベル２におく。好ましくは、微粒子上にコーティングされるＤＮＡはスーパーコイルしている。
【００９２】
本発明の好ましい様式においては、成功した形質転換体を、第１選択ステップで抗生物質耐性などのベクターの特性に基づいて選択し、そして成功した形質転換体だけを第２ステップで目的の基質（すなわち、形質転換遺伝子により形質転換した細胞の増殖を可能にするはずである外部固定炭素源）を用いる独立栄養で増殖する能力について試験する。他の好ましい様式においては、形質転換ステップの後に、細胞を、弱い光の中で、形質転換によって利用可能になった還元炭素源、例えば糖の低濃度の存在のもとで増殖し、そして形質転換宿主細胞を連続的に増加する基質濃度を有する培地にサブクローニングしてこの形質転換宿主細胞を従属栄養増殖に適合させる。目的の基質がグルコースの場合、選択ステップは細胞を１４Ｃ−グルコースを取り込む能力についてまたは有害なグルコース類似体、２−デオキシグルコースに対する感受性について試験することであってもよい。好ましくは光を消して、そして形質転換細胞を暗所で目的の基質によって増殖する能力について試験する。
【００９３】
例えば、グルコース輸送体タンパク質をコードするＤＮＡを、フレオマイシンに対する耐性などの抗生物質耐性遺伝子を含有するベクター中に挿入してもよい。得られるＨＸベクターを用いて藻類細胞を形質転換し、形質転換ステップ後に、細胞を抗生物質フレオマイシンを含有する培地にまいて、明所で増殖する。現われるコロニーは、ＨＸベクターを用いた形質転換が成功した結果として抗生物質耐性を獲得した細胞を表す。次いでこれらの形質転換した細胞を低糖濃度（例えば、０．１％グルコース）を含有する培地にまく。弱い光のもとでまたは暗所で低糖培地にて増殖するコロニーを、より高いグルコース濃度（例えば、１％グルコース）を含有する培地に再びまく。暗所でこれらの高い糖プレートにて増殖しうる細胞は従属栄養組換え藻類である。
【００９４】
本発明の栄養変換法は、従属栄養増殖能力のある組換え藻類を産生する。これらの組換え藻類は、光栄養藻類に起こる自己遮光による飢餓の問題がなく、発酵槽内で高い細胞数まで増殖できる。従って、藻類細胞産物は、親の光栄養藻類の培養から得る収率と比較して、本発明の組換え藻類の発酵槽培養からより高い収率で得ることができる。組換え藻類のさらなる遺伝子改変を、伝統的突然変異法または組換え法またはそれらの両方によって追跡することができる。暗所でまたは実質的な暗所で、基質（例えば、糖）を含有する培地において改変した細胞を培養すると、その細胞の従属栄養特性を維持しうる。なぜならば、光の不在または光の実質的な不在は、ヘキソース輸送体または他の変換遺伝子をコードするＤＮＡを失った細胞を抑制する選択圧を与えるからである。
【００９５】
本発明はまた、組換え従属栄養藻類を発酵槽内の培養に使用して所望の藻類産物を産生する方法を意図する。従って、本発明は、発酵槽内で例えば異種ヘキソース輸送体タンパク質を発現する組換え藻類細胞を培養し、バイオマスおよび／または所望の藻類細胞産物を回収することを含んでなる、藻類バイオマスまたは藻類細胞産物を得る方法を提供する。組換え藻類をまくおよび発酵槽培養の両方の培地と条件は、当業者によって日常的な最適化を通して容易に決定できる。また、Ｋｙｌｅらの米国特許第５，２４４，９２１号；Ｋｙｌｅの米国特許第５，３７４，６５７号；Ｋｙｌｅの米国特許第５，５５０，１５６号；Ｋｙｌｅの米国特許第５，５６７，７３２号；Ｋｙｌｅらの米国特許第５，４９２，９３８号；Ｋｙｌｅらの米国特許第５，４０７，９５７号；Ｋｙｌｅらの米国特許第５，３９７，５９１号；Ｂａｒｃｌａｙの米国特許第５，１３０，２４２号；Ｋｙｌｅの米国特許第５，６５８，７６７号；およびＫｙｌｅの米国特許第５，７１１，９３３号も参照。
【００９６】
藻類によって産生されうる産物としては、限定されるものでないが、色素（例えば、β−カロテン、フィコビリタンパク質、カロテノイド、キサントフィル）、栄養価のある油（例えば、ドコサヘキサエン酸）、および同位体標識生化学品（例えば、１３Ｃ−または１４Ｃ−グルコース）が挙げられる。
【００９７】
本発明はまた、所望の産物の抽出もしくは部分抽出の前または後に、動物食餌としての藻類バイオマスの使用も意図する。非限定的な例としては、例えば、幼生、ラティファー（ｒａｔｉｆｅｒｓ）、ホウネンエビ（ａｒｔｅｍｉａ）、エビ（ｓｈｒｉｍｐ）、魚類、軟体類、脊椎動物、または無脊椎動物の水産養殖の食餌としてのバイオマスの使用がある。他の非限定的な例としては、例えば家禽、ウシ、またはブタに給餌するためのバイオマスの使用がある。バイオマスはまた、ヒト用の食品または栄養組成物として使用することもできる。
【００９８】
本発明者らはまた、本発明の方法を、形質転換した藻類を検出するおよび／または選択する選択系として使用するかまたはそれを作製することができることも発見した。これらの方法は、（野生型状態でまたは本発明の従属栄養変換を経て）所与の炭素源により暗所で増殖できる生物の形質転換に特に有用である。突然変異誘発を用いて、その炭素源の取り込みおよび／または異化に必要なおよび／または助けとなる１以上の遺伝子を破壊する。細胞を突然変異誘発する手段は、当業界で周知である。細胞を突然変異誘発する非限定的で非排他的な例としては、化学突然変異誘発、放射線誘導突然変異誘発、遺伝子置換および部位特異的突然変異誘発が挙げられる。
【００９９】
遺伝子置換を、不活化が求められる遺伝子を不活化するために使用する場合、不活化が求められる遺伝子を含有し、そのコード領域の中央に抗生物質選択マーカーを挿入して、不活化が求められる遺伝子の非機能的コード領域を生じた遺伝子構築物を産生する。次いで、遺伝子構築物を本明細書に記載の方法によって細胞中に挿入する。不活化が求められる遺伝子の非機能的コピーが組み込まれて内因性機能的遺伝子と置きかわる場合、細胞は、例えば破壊された遺伝子が異化を容易にしていた炭素源によって、増殖できなくなるかまたは増殖が低下する。
【０１００】
炭素源によって増殖できないかまたは増殖が低下する細胞は、その炭素源を取り込むまたは暗所でその炭素源によって増殖する細胞の能力をアッセイするなどの様々な方法によって、検出することができる。不活化された遺伝子がグルコース取り込みに関わる遺伝子である場合、細胞は、有毒なグルコース類似体デオキシグルコースにより増殖することによって、目的の遺伝子の不活化について容易に試験することができる。機能的グルコース輸送体を持つ細胞はこの化合物を移入するであろう。デオキシグルコースが細胞に入ると、代謝されないであろう。結果として、それは細胞内に蓄積して毒性レベルに達して細胞を死滅させるだろう。デオキシグルコースの存在のもとで増殖しうる細胞は恐らくこの化合物を取り込むことができず、従って、所望の通り形質転換されている。細胞がデオキシグルコースまたはグルコースを取り込むことができないことは、グルコース取り込みアッセイおよび細胞が暗所でグルコースを単独の炭素源として増殖する能力のないことによって確認することができる。
【０１０１】
遺伝子が遺伝子置換により不活化されかつ抗生物質選択マーカーが挿入されている場合、破壊された遺伝子をもつ細胞は、細胞を抗生物質上で増殖し、そして耐性のある細胞を選択することによって容易に選択できる。細胞が所与の炭素源を取り込むおよび／または異化することができないことの確証は、取り込みアッセイおよび／または細胞の暗所で炭素源により増殖する能力を決定するアッセイによって試験することができる。
【０１０２】
所与の炭素源による増殖ができなくなったかまたはあまり増殖できなくなった株を、次に、細胞の暗所で特定の炭素源で増殖する能力を回復しうる遺伝子を用いる形質転換と一緒に、他の目的の遺伝子を用いて形質転換することができる。この方法で、抗生物質耐性をマーカーなどとして使用するのと類似したやり方で、特定の炭素源で増殖する能力を形質転換のための選択マーカーとして使用することができる。形質転換に成功した細胞は、細胞を暗所で特定の炭素源によって増殖することによって選択することができる。
【０１０３】
類似した方法で、細胞が先に増殖ができなかったかまたはあまり増殖できなかった特定の炭素源による細胞の増殖を可能にするかまたは増強するタンパク質をコードする１以上の遺伝子の導入（本明細書に記載のように）も、また選択マーカーとして使用することができる。そのような系では、細胞は、先に増殖ができなかったかまたはあまり増殖できなかった特定の炭素源による細胞の増殖を可能にするかまたは増強するタンパク質をコードする１以上の遺伝子によるそれらの形質転換と一緒に、目的の遺伝子を用いて形質転換されるであろう。
【０１０４】
この方法で、抗生物質耐性がそのようなマーカーとして使用されるのと類似した方法で、特定の炭素源によって増殖する能力を形質転換の選択マーカーとして使用することができる。形質転換が成功した細胞は、その細胞を暗所で特定の炭素源で増殖することによって選択することができる。
【０１０５】
特定の炭素源について取り込みまたは増殖を可能にまたは増強するタンパク質をコードする遺伝子の導入または再導入は、本明細書に記載の方法によって達成しうる。ベクター設計は、特定の炭素源について取り込みまたは増殖を可能にまたは増強するタンパク質をコードする遺伝子を抗生物質選択マーカーと置き換えることを除けば、本明細書に記載のものと類似するであろう。形質転換と選択を実施する手引きを本明細書に提供する。
【０１０６】
本発明の細胞は従属栄養で増殖することができ、かつ形質転換選択系として使用できるので、本発明は、これらの細胞を組換えタンパク質の産生に使用することを意図する。そのような適用においては、暗所にて外部炭素源で増殖する能力が突然変異誘発によって破壊されている１以上の独立栄養細胞を、作製することが求められる組換えタンパク質をコードする遺伝子および従属栄養増殖を可能にするかまたは増強するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を用いて、形質転換する。もし所望であれば、本明細書に記載の抗生物質選択系を、形質転換のための細胞の最初のスクリーニングを助けるために使用してもよい。従属栄養形質転換を経た細胞を、次に、本明細書に記載の方法を使用して選択する。選択された細胞を、目的の組換えタンパク質を産生する能力について試験する。タンパク質を産生するこれらの細胞を、次に、発酵槽で従属栄養条件下で増殖し、当業者には周知である技術を用いて、それからそのタンパク質を単離することができる。
【０１０７】
珪藻類などの微細藻類の栄養変換は、微生物発酵技術を用いた大規模栽培成功のための藻類の操作における重要な第１ステップである。生産性を最大化する目的で特定の培養条件を厳密に維持する手段を提供することに加えて、発酵技術の使用は、米国食品医薬庁（Ｕ． Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が要求する食品産業基準を維持するための重要な規準である微生物による培養の汚染を排除するだろう。さらに、グルコースなどの糖類ならびに他の増殖制限栄養を培養物に連続的に提供して、増殖速度を飽和に維持することができる。効率的な発酵は、ヒトの栄養に使用するポリ不飽和脂肪酸ＤＨＡを産生するための微細藻類クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）の栽培を可能にした（Ｋｙｌｅ， Ｄ． Ｊ．， （１９９６） Ｌｉｐｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２：１０６）。天然の従属栄養藻類を発酵増殖するための最適化条件は、１００ｇｍ／ｌに達する乾燥バイオマス蓄積をもたらし（Ｇｌａｄｕｅら、１９９９；Ｒｕｎｎｉｎｇら、１９９４）、これは光依存培養系を使用して得られる収率より１０〜５０倍も高い。発酵槽系におけるバイオマス蓄積の増加によって、池培養産生法を用いてかかるコストより少なくとも１オーダー低い生産コストとなる（Ｒａｄｍｅｒら、１９９４）。このコスト低下は、広範囲の藻類産物開発の実施可能性を高め、そのような藻類産物としては、ポリ不飽和脂肪酸（例えばＥＰＡ）、カロテノイドおよびキサントフィル（ｘａｎｔｈｏｐｈｙＨｓ）（例えば、カロテン、ルテイン、フィルコキサンチン（ｆｉｌｃｏｘａｎｔｈｉｎ）、アスタキサンチン）、水産養殖用の食餌および様々な市場生産用の医薬品と栄養剤が挙げられる。しかし、本研究の結果はまた、海洋生態系の基本的な生物学的態様に関する重要な示唆も与える。約５０％の炭素固定が海で起こり、海は主要な固定炭素シンクとしての役割を果たす（Ｒａｖｅｎら， （１９９９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．， ２２：７４１）。珪藻類は実質的に海洋生息地の無機炭素の削減に寄与し、それらの寄与は海洋環境の生態学が変わるにつれて実質的に増加しうる（Ｍ． Ｒ． Ｌａｎｄｒｙら， （２０００） Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ， ２０１：５７）；Ｂ． Ｂｏｙｌｅ， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７３３；Ｔａｋｅｄａ， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７７７）。遺伝子操作ができてかつ従属栄養で増殖することができる珪藻類の開発により、海洋生態系を維持するために必須である藻類の光合成および他の代謝経路の両方の我々の利用を増大するために、突然変異体を使用することが容易になろう。
【０１０８】
【実施例】
本発明のさらに完全な理解を容易にするために、複数の実施例を以下に提供する。しかし、本発明の範囲は、説明だけを目的とするこれらの実施例に開示された特定の実施形態に限定されるものでない。
【０１０９】
実施例１　珪藻類の抗生物質感受性
珪藻類フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、シリンドロテカ・フジフォルミス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、シクロテラ・クリプチカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｃｒｙｐｔｉｃａ）、およびニツキア・アルバ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ａｌｂａ）を、耐性遺伝子が利用しうる一連の抗生物質感受性について徹底的に試験し、それぞれの抗生物質に対して完全に増殖を抑止する最低濃度を決定した（表Ｃ）。ほとんどの抗生物質は、他の真核生物の増殖を抑止する有効性と比較して、増殖に対して有意な効果を与えないかまたは非常に高濃度でだけ効果があった。これらは、他の真核生物の選択に日常的に利用されるＧ４１８、ハイグロマイシン、カナマイシン、およびスペクチノマイシンなどの抗生物質を含む。
【０１１０】
試験した珪藻類については、抗生物質ゼオシンとフレオマイシンだけが１００％ Ｉ．Ｏ．培地で細胞死をもたらした（培地および増殖条件の説明は実施例４を参照）。
【０１１１】
培地濃度を５０ ％ Ｉ．Ｏ．以下に低下することによって、珪藻類の抗生物質に対する感受性が非常に増加することを見出した。ほとんどの事例において、抗生物質の有効濃度範囲は、１０のファクターで低下した。代表的な珪藻類を、より有効な３種の抗生物質に対して、より低い培地濃度でさらに試験した。
【０１１２】
２５−１００％ Ｉ．Ｏ．培地の塩分当量で、抗生物質濃度の勾配をもたせた固体培地上に、それぞれの珪藻類種をまいた。２週間の照明後に、細胞の増殖を評価して、細胞死に必要な抗生物質の濃度を決定した（表Ｄ）。
【０１１３】
表Ｃ選択した珪藻類の増殖に対する抗生物質の効果。数値は、細胞死に対して必要な１ｍｌ当たり抗生物質の最低濃度または試験した最高濃度を表す。
【０１１４】
2004500839.tif 000005
【０１１５】
表Ｄ　低塩分の培地における、選択した藻類の増殖に対する抗生物質の効果。培地の塩分の相対パーセント−対−正常海水を括弧内に与えた。抗生物質レベルは、細胞死に必要な１ｍｌ当たり抗生物質の最低濃度または試験した最低濃度として与えた。
【０１１６】
2004500839.tif 000006
【０１１７】
実施例２　Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは従属栄養増殖ができない
Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍがグルコースによる従属栄養増殖ができないことを確証するために、細胞を繰返しグルコースを含有する固体培地上にまいて、暗所に置いた。細胞は、典型的には２４時間に１〜２回分裂して、次いで増殖を停止した。１〜２ヶ月後に、さらなる分裂は見られなかった。培養をグルコース輸送体活性についてもチェックした。インキュベーションの４時間後でも、検出しうる取り込みは見られなかった。細胞を、異なるヘキソースまたは関係糖類１６種（アラビノース、セルビオース、フラクトース、フコース、ガラクトース、グルコン酸、ラクトース、マルトース、マルトビオース、マンノース、メリビオース、リボース、ソルビトール、スクロース、トレハロース、キシロース）上にもまいたが、検出しうる増殖はなかった。
【０１１８】
実施例３　属突然変異（ｇｅｎｅｒｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）はＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの従属栄養増殖を可能にしない
Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍは、暗所でグルコースによって増殖する能力をもたらす自然突然変異ができないことを確証するために、１０１０の対照細胞をグルコースを含有する固体培地上にまいた。自然突然変異コロニーはグルコース上に形成しなかった。形質転換操作および／または外来ＤＮＡの挿入は、栄養変換をもたらし得ないことを確証するために、ほぼ１００細胞系を、様々な従属栄養遺伝子（ｕｉｄＡ ｇｆｐ、ｎａｔ、およびｎｐｔｌＩ）を含有するがｇｌｕｔｌまたはｈｕｐｌを含有しないｐＰｈａ−Ｔ１を用いて形質転換し、そしてこれらの形質転換した細胞系を暗所でグルコースによる増殖について試験した。いずれもグルコースで増殖しなかった。
【０１１９】
実施例４　Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの従属栄養への形質転換
フェオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）は、形質転換によって遺伝子を改変できる（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， （２０００）、Ａｐｔら， （１９９６））が、従属栄養で増殖することはできない（Ｃｏｏｋｓｅｙ， １９７４；Ｄｒｏｏｐ， １９７４；Ｈｅｌｌｅｂｕｓｔら， １９７７）微細藻類である。この藻類の栄養変換を、グルコース輸送体をコードする遺伝子を用いる形質転換によって試みた。形質転換に利用したグルコース輸送体遺伝子は、ヒト赤血球由来のＧｌｕｔ１（Ｍｕｅｃｋｌｅｒら， １９９７）、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ）由来のＨｕｐ １（Ｓａｕｅｒら， １９８９）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）由来のＨｘｔ１、Ｈｘｔ２、Ｈｘｔ４（Ｋｒｕｃｋｅｂｅｒｇ， １９９６）を含んだ。これらの遺伝子のコード領域を、珪藻類の外来遺伝子の発現を駆動するフコキサンチンクロロフィル結合タンパク質（Ｆｃｐ）をコードする遺伝子のプロモーターを利用するＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換ベクター中に挿入した（Ｂａｒｃｌａｙら， １９９４；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， ２０００）。ＧＦＰ遺伝子をＧｌｕｔ遺伝子の３’末端に融合した構築物も作製した。プラスミドを微粒子銃手法を用いてＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ中に導入し、明所でゼオシン耐性について選択した（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， ２０００）。次いで形質転換体を、０．１または１．０％グルコースを含有する固体または液体培地に移し、完全な暗所に置いて増殖を監視した。
【０１２０】
培養条件：フェオダクチルム・トリコルヌツム・ボーリン（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ Ｂｏｈｌｉｎ）（テキサス大学培養コレクション、６４６株）を、２０℃、７５μｍｏｌ光子Ｍ−２ｓ−１の連続照明を用いて、天然海水の代わりに０．５ Ｘ 濃度のＩｎｓｔａｎｔ ＯｃｅａｎＴＭ（Ｉ．Ｏ．）人工海水によって作ったＰｒｏｖａｓｏｌｉ’ｓ濃縮海水培地にて増殖した。Ｓｔａｉｒ，Ｒ．Ｃ． ＆ Ｚｅｉｋｕｓ，Ｊ．Ａ． （１９９３）「ＵＴＥＸ：Ａｕｓｔｉｎのテキサス大学における藻類培養コレクション（ＵＴＥＸ−Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｇａｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ａｕｓｔｉｎ）」， Ｊ． Ｐｈｙｃｏｌ． ２９ （Ｓｕｐｐｌ）：９３を参照。固体培地は１．２％寒天を含有し、液培養はＲｏｕｘびん内で１％ ＣＯ２を含有する空気によってバブリングした。
【０１２１】
構築物：フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｎｙｌｕｍ）形質転換ベクターｐＰｈａ−ＴＩの配列（図１を参照）はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２１９９４２を有する。ｆｃｐＡプロモーターをマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の前に配置した。ｆｃｐＢプロモーターをｓｈ ｂｌｅ遺伝子の前に配置した。構築物はまた、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点も含有する。
【０１２２】
ｐＰｈａ−Ｔ１（図１）を複数の段階を経て構築した。第１ステップはｐｆｃｐＡ／ｂｌｅ（Ａｐｔら， １９９６）由来のｆｃｐＡターミネーター領域を、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位にサブクローニングすることであった。ｓｈ ｂｌｅ遺伝子を駆動するｆｃｐＢプロモーターを含有するｐｆｃｐＢ／ｂｌｅ （Ａｐｔら， １９９６）由来のゼオシン耐性カセットを、ＸｈｏＩ断片としてｐＳＰ７３ ＸｈｏＩ部位中にサブクローニングした。ｐｆｃｐＡ／ｂｌｅ （Ａｐｔら， １９９６）由来のｆｃｐＡプロモーター領域をＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−中に挿入した。この同じ断片を、次に、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片として除去し、ｐＳＰ７３のＢｇＨＩ−ＥｃｏＲＶ部位中にライゲートして最終基本構築物を形成した。ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間のｐＳＰ７３由来のマルチクローニングサイトは、潜在ＡＴＧ開始コドンを抹消するために位置指定突然変異誘発（ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ １９９２）によって除去したＣｌａＩ部位を除いて、無傷のまま保存した。ｐＰｈａ−ＴＩベクターは、目的の遺伝子を挿入しうる１０の共通使用される、ユニークな制限酵素切断部位を含有する。
【０１２３】
一連のグルコース輸送体をＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの発現について試験した。これらは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｅｓａｅ）由来のｈｘｔ１、ｈｘｔ２、ｈｔｘ４遺伝子、クロレラ・ケスレリ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｋｅｓｓｌｅｒｉ） ｈｕｐ１遺伝子および赤血球に見出されるｇｌｕｔ１を含む。Ｋｒｕｃｋｅｂｅｒｇ ＡＬ （１９９６） 「サッカロマイセス・セレビシエのヘキソース輸送体ファミリー（Ｔｈｅ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈｏｒｏｎａｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｓａｅ）」， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６６：２８３−９２；Ｓａｕｅｒ Ｎ， Ｔａｎｎｅｒ Ｗ （１９８９）「クロレラ由来のヘキソース担体、真核生物Ｈ＋共輸送体のｃＤＮＡクローニング（Ｔｈｅ ｈｅｘｏｓｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆｒｏｍ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｅｕｃｒｙｏｔｉｃ Ｈ＋−ｃｏｔｒａｎｐｏｒｔｅｒ）」， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２５９：４３−４６；Ｍｕｅｃｋｌｅｒ Ｍ， Ｈｒｅｓｋｏ ＲＣ， Ｓａｔｏ Ｍ （１９９７）「ＧＬＵＴＩの構造、機能および生合成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＧＬＵＴＩ）」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２５：９５１−４。これらの遺伝子のコード領域を、形質転換ベクターｐＰｈａ−Ｔ１中へ挿入した。
【０１２４】
グルコース輸送体をフェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）の細胞中へ導入するために利用した形質転換ベクターの構築に利用したプラスミドは、適当な制限酵素切断部位をＰＣＲにより加え、そして目的の輸送体をコードする領域をｐＰｈａ−Ｔ１中へ挿入することによって構築した。プラスミドｐＧｌｕｔ−ＰｈａｔはプライマーＧＬＵＴＰＨＡＴ５’（ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧ）およびＧＬＵＴＰＡＴＴ３’（ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴ−ＴＣＡＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＣＡＧＣ）を使用した。プラスミドｐＨｕｐ−ＰｈａｔはプライマーＨＵＰＰＨＡＴ５’（ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡ−ＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧ）およびＨＵＰＰＨＡＴ３’（ＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＴＧＡＣ）を使用した。プラスミドｐＨｘｔ２−ＰｈａｔはプライマーＨＸＴ２ＰＨＡＴ５’（ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＴＡＧＡＡＧ）およびＨＸＴ２ＰＨＡＴ３’（ＣＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＣＴＣＴＴ）を使用した。Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨｘｔ４−ＰｈａｔはプライマーＨＸＴ４ＰＨＡＴ５’（ＧＧＧＡＡＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴ）およびＨＸＴ４ＰＨＡＴ３’（ＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＣＡＴＣ）を使用した。
【０１２５】
微粒子ボンバードメント：細胞を、目的の遺伝子を含有する形質転換ベクターを用いて、１，５００ ｐｓｉ破裂板を備えたＢｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達システムを使ってボンバードした。タングステン粒子Ｍ１７（１．１μｍメジアン直径）を、０．８ｍｇプラスミドＤＮＡを用いてＣａＣｌ２およびスペルミジンの存在のもとで、製造業者の指示に記載の通りコートした。ボンバードメントの１時間前に、ほぼ５ ｘ １０７の細胞を、中心部で固体０．５ Ｘ Ｉ．Ｏ．培地のプレートの３分の１に広げた。プレートをボンバードメント用Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃチャンバ内の第２レベルに配置した。ボンバードした細胞を２４時間照明した（細胞はこの期間に一度分裂した）後に、無菌０．５ Ｘ Ｉ．Ｏ．培地の０．５ｍｌに懸濁し；この懸濁液の１００μＬ（ほぼ１ｘ１０７細胞）を１００μｇ／ｍｌゼオシンを含有する固体培地上にまいた。プレートを一定の照明（７５ μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１）下に２〜３週間置いて、耐性コロニーを少なくとも１００μｇ／ｍｌゼオシンを含有する新鮮な固体培地上に再ストリークした。
【０１２６】
一次形質転換体のコロニーを２５０μｇ／ｍｌゼオシン上に再ストリークした。２週間後に、細胞を０．１％および１．０％グルコースを含有する培地上に再ストリークし、数層のフォイルを用いてラップして暗所に保持した。４週後に、検出しうる増殖をした形質転換体を１．０％グルコース上に再ストリークして維持した。液体培養物を１．０％グルコースを含むＩ．Ｏ．培地で、２０℃にて軌道式振とう器上で増殖させた。
【０１２７】
それぞれのゼオシン耐性細胞系はまた、グルコース取り込みもチェックした。これらの形質転換体は全て独立した微粒子ボンバードメントから得た。
【０１２８】
グルコース取り込みとグルコースによる増殖：対数増殖期の形質転換フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｒｙｌｕｍ）細胞の２５０−５００ｍｌを２０００ｒｐｍで１０分間回収し、５０％ Ｉ．Ｏ．を用いて２回洗浄し、Ｉ．Ｏ．に再懸濁して計数した。細胞のアリコートを５０ｍｌチューブ（７ｍｌ／チューブ）にとった。無標識グルコースを５０％ Ｉ．Ｏ．の０．１Ｍストック溶液から適当な濃度まで加えた。Ｄ−１４Ｃ−グルコース（ＩＣＮ）を０．０５μＣｉ／ｍＬの濃度まで加えた。サンプル（１ｍｌ）を１分間隔でとり、細胞をニトロセルロース上で濾過し、３回、５％無標識グルコースを含有する５０％ Ｉ．Ｏ．を用いて洗浄した。フィルターを、１０ｍｌのＳｃｉｎｔｉｓａｆｅ （Ｆｉｓｈｅｒ）の入ったシンチレーション・バイアルに移し、１時間インキュベートして計数した。熱殺菌またはアルデヒド固定した細胞を対照として使った。
【０１２９】
３２のゼオシン耐性細胞系のうちの２２のｇｌｕｔ１を含有する形質転換体は、検出しうるグルコース取り込み能力があった。取り込み速度は、８．８〜２．０ ｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１（表Ｅ）であった。１．６ ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１以上の取り込み速度をもつ細胞系（２８のうちの１１）は暗所でグルコースによって増殖することができた。抗生物質耐性細胞系２５のうちのｈｕｐ１を含有する形質転換体１４は、グルコース取り込み能力があった。取り込み速度は、１．７２〜０．０６ ｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１（表Ｆ）であった。０．２９ ｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１以上の取り込み速度をもつ細胞系（２５のうちの１１）は暗所で増殖することができた。酵母輸送体を含有するベクターを用いて形質転換したいずれのＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体も、検出しうるグルコース取り込み能力がなかった。細胞内のｈｘｔ １、２、または４遺伝子または遺伝子産物の存在は確認されなかった。形質転換体が機能的Ｈｘｔタンパク質を発現する能力を持たないのは、酵母とＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの間のコドン利用の著しい相違を反映しているのであろう（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら， ２０００）。
【０１３０】
１１のｇｌｕｔ１を含有する形質転換体および１１のｈｕｐｌを含有する形質転換体は、０．１％グルコースを含有する寒天プレート上または液体培地中で２４週後に完全な暗所で、検出しうる増殖をした。２．０ ｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１より大きい取り込み速度をもつＧｌｕｔ１を含有する形質転換体は全て、暗所でグルコースによって増殖することができた。０．２９ ｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１より大きいグルコース取り込み速度をもつ全てのＨｕｐ１を含有する形質転換体は従属栄養で増殖することができた。
【０１３１】
形質転換操作および／または外来ＤＮＡの挿入が栄養変換をもたらさないことを確証するために、様々な従属栄養遺伝子（ｕｉｄＡ ｇｆｐ、ｎａｔ、およびｎｐｔＩＩ）を含有するがグルコース輸送体を含有しないｐＰｈａ−Ｔ１を用いて形質転換したほぼ１００細胞系をグルコース（０．１％）を含有する固体培地上にまいた。これらの細胞系のいずれも暗所で４週後に検出しうる増殖をしなかった。
【０１３２】
形質転換体Ｇｌｕｔ−１３、Ｇｌｔ−１７、およびＨｕｐ−２の従属栄養増殖速度を測定した。３細胞系は全て、１日当たりほぼ０．７分裂の分裂速度を有した。
【０１３３】
表Ｅｇｌｕｔ１を含有するＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体のグルコース取り込み速度。取り込み速度はｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１として表現した。従属栄養増殖の可能な細胞系は「＋」を用いて記し、増殖しない細胞は「−」で記した。
【０１３４】
2004500839.tif 000007
2004500839.tif 000008
【０１３５】
表Ｆｈｕｐ１を含有するＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ形質転換体のグルコース取り込み速度。取り込み速度はｎｍｏｌ・（１０８細胞・ｍｉｎ）−１として表現した。従属栄養増殖の可能な細胞系は「＋」を用いて記し、増殖しない細胞は「−」で記した。
【０１３６】
2004500839.tif 000009
【０１３７】
実施例５　所望の遺伝子インサートの組み込み
細胞系Ｇｌｕｔ−１７およびＨｕｐ−２を用いて、それぞれのグルコース輸送体の組み込みと発現を試験した。サザンブロット（図２参照）に基づくと、Ｇｌｕｔ−１７はｇｌｕｔ１の１コピーを有するようであり、Ｈｕｐ−２は恐らくｈｕｐ１の複数コピーを有する。ＲＮＡブロット（図３参照）はそれぞれの細胞系が予想サイズの転写物を産生することを示す。
【０１３８】
核酸の調製：全ＤＮＡの調製のために、細胞を遠心分離（５，０００ ｘ ｇ、１０分間）によってペレット化し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ、２０μｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａに溶解し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。ライセートをフェノール：クロロホルム（１：１）の１容を用いて抽出し、そして再びクロロホルムの１容を用いて抽出した。水相を採集し、１．２ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌおよび０．２ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミドとした後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｖ６６５．２ローターで６時間、５５，０００ｒｐｍにて遠心分離した。ＤＮＡバンドを採集し、ブタノールを用いて抽出し、エタノールの２容を用いて沈降し、そしてＴＥ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して最終濃度１ｍｇ／ｍｌとした。ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの方法を使って抽出した（１９９４，「酸グアニジン−フェノール抽出による全ＲＮＡ単離の単一ステップ法（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ｐｈｅｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）」， Ｉｎ ： Ｃｅｌｉｓ Ｊ． Ｅ．（編） Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｖｏｌ Ｉ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐｐ ６８０−６８３）。
【０１３９】
ゲル電気泳動とハイブリダイゼーション条件：ＤＮＡをＴＡＥバッファーのアガロースゲル上で分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８２）。核酸をＮｙｔｒａｎフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使ってＵＶ光により架橋した。ハイブリダイゼーションは、Ｂａｃｈｏｆｅｒ回転オーブンにて６５℃で一夜、５ｘＳＳＦＥ、１％ ＳＤＳ、５ｘデンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）および１００μｇ／ｍｌ ＤＮＡにて、標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９）に従って実施した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを３回、３０分間、ハイブリダイゼーション温度にて、０．１％ ＳＤＳを含有する５０ ｍＭリン酸バッファーで洗浄した。次に、フィルターを乾燥して、Ｘ線フィルムに１〜４日間、曝した（Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ５）。全ＲＮＡをホルムアルデヒドを含有するアガロースゲル上で、Ｒｏｓｅｎら， （１９９０， 「ノーザンブロット操作の最適化（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：３９８−４０３）の方法に従って分離した。
【０１４０】
実施例６　挿入した遺伝子から発現したタンパク質の局在化
Ｇｌｕｔ−１７およびＧｌｕｔ ＧＦＰ−４０を含む複数のＧｌｕｔ形質転換体について、さらに詳細な特性決定を実施した。後者の株は、ＧＦＰと融合したｇｌｕｔ１遺伝子を含むｐＰｈａ−Ｔ １を用いて形質転換した。形質転換した細胞を、ミニビーズ・ビーター（ＭｉｎｉｂｅａｄＢｅａｔｅｒ）を用いて、２つの破砕サイクルによりフルスピード（各サイクルについて３０秒、サイクル間に３−５ｍｍ氷上冷却して）で破砕し、膜を１００，０００ ｘ ｇ ｆｏｒ ３０の遠心分離でペレット化し、次に２％ ＳＤＳに可溶化した。可溶化したタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドゲル上で分離してニトロセルロースメンブランに移し（Ｔｏｗｂｉｎら， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：４３５０）、そしてＧｌｕｔ１またはＧＦＰタンパク質を免疫学的に検出した（Ｌｉｓｃｕｍら， （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ７：４７３）。Ｇｌｕｔ１ポリペプチドおよびＧＦＰに対するモノ特異的抗体を用いて、形質転換細胞系におけるＧｌｕｔｌまたはＧｌｕｔ１ＧＦＰ融合タンパク質の蓄積を実証した。
【０１４１】
Ｇｌｕｔ−１７形質転換のメンバーは、Ｇｌｕｔ１特異的抗体と反応する２つの顕著なポリペプチドを含有した（図４）。これらのポリペプチドは４４ｋＤａおよび３９ｋＤａの分子量を有して、これはヒト赤血球から合成した自然のタンパク質（ほぼ５５ｋＤａ）より小さい（図４、レーンＢとＧｌ−１７とを比較すること）が、無グリコシル化Ｇｌｕｔ１（３８ｋＤａ）のサイズに近い（Ａｓａｎｏら， （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｌｉｅｎｔ．， ２６６：２４６３２）。このことは、Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍに蓄積するＧｌｕｔ１がヒト赤血球とは異なってグリコシル化されることを示唆する。Ｇｌｕｔｌ ＧＦＰ−４０形質転換体中に存在するＧｌｕｔｌＧＦＰ融合タンパク質は、ほぼ７５ｋＤａの分子量を有し、これはまた、ＧｌｕｔｌＧＦＰの予想サイズ（８２ ｋＤａ）より若干小さいことも示唆する。
【０１４２】
形質転換系のＧｌｕｔ１タンパク質の細胞下位置（ｓｕｂｃｅｌｌｕｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ）を決定するために、Ｇｌｕｔ１ＧＦＰ−４０株を、共焦点顕微鏡によりＧＦＰ蛍光を試験した。細胞をカバースリップ（＃１ １／２）上に少しスメアして、人工海水の薄層中にマウントした。共焦点顕微鏡観察は、ＫｏｅｈｌｅｒコンフィギュレーションでマウントしたＢｉｏＲａｄ ＭＲＣ １０２４共焦点ヘッドを備えたＮｉｋｏｎ ＴＭＤ ２００ 逆位顕微鏡上のＮｉｋｏｎ ６０ｘ Ｎ．ａ．＝１．２水浸漬対物レンズ（ｗａｔｅｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使って実施した。ＥＧＦＰは４８８ｎｍで励起し、５２２／２５ｎｍバンドパスフィルターを用いて可視化した。プラスチド自己蛍光は４５６ｎｍで励起し５８５ｎｍロングパスフィルターを用いて可視化した。画像は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで調節して対照と実験画像を同一に処理した。元来の画像にコントラストと輝度の線形調節だけを行った。
【０１４３】
非形質転換細胞は赤色蛍光チャネルに強いクロロフィル蛍光を示したが、緑色チャネルには小量の蛍光が観察されただけであった（図６、トップパネル）。ベクターｐＰｈａ−Ｔ１からＧＦＰを発現した細胞は、細胞質および細胞核の管腔における局在化と一致したパターンで強いＧＦＰ蛍光を示した（図６、下左）。植物細胞において、可溶性ＧＦＰの類似の分布が観察されている（Ｃｈｉｕら， （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：３２５；Ｈａｓｅｌｏｆｆら， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：２１２２）。対照的に、Ｇｌｕｔ１ ＧＦＰキメラ構築物を珪藻類細胞中に導入すると、大部分の蛍光は細胞の極く辺縁に関連する（図６、下右）。これらの結果は、Ｇｌｕｔ１タンパク質がＧＦＰを細胞皮質（ｃｅｌｌ ｃｏｒｔｅｘ）にターゲッティングすることを実証し、パターンはキメラタンパク質の細胞質膜への局在化と一致するとともに細胞質膜に関連する輸送体としてＧｌｕｔｉの機能に一致する。
【０１４４】
実施例７　形質転換した細胞によるグルコース取り込みの動力学
グルコース含有培地によってよく増殖する、様々なｇｌｕｔを含有する形質転換体について、詳細なグルコース取り込み動力学を研究した。対数増殖期にある形質転換したＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ細胞の２５０〜５００ ｍｌを、４，５００ｒｐｍ（ＳＡ６００ローター）で１０ｍｍ、回収し、２回洗浄し、全て５０％Ｉ．Ｏ．培地に再懸濁して計数した。アッセイは、５０％ Ｉ．Ｏ．中の０．１Ｍのストック溶液から無標識グルコース（適当な濃度まで）、およびＤ−１４Ｃ−グルコース（ＩＣＮ）を０．０５μＣｉ／ｍｌまで加えることによって開始し；アッセイの間、細胞を明所で維持した。標識したグルコースを加えた後に、サンプル（８００μｌ）をアッセイ混合物から特定の時間間隔で（０、２、５、１０および１５ｍｍ）回収した。細胞をＳｕｐｏｒ（ポリエーテルスルホン）メンブラン（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濾過し、１％無標識グルコースを含有する５０％ Ｉ．Ｏ．培地を用いて洗浄した。メンブランを５ｍｌのＳｃｉｎｔｉｓａｆｅ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてシンチレーションバイアルに移し、１時間、２０℃にてインキュベートし、次いで計数した。
【０１４５】
Ｇｌｕｔ−１３、Ｇｌｕｔ−１７およびＧｌｕｔ ＧＦＰ−４０形質転換体は、高速のグルコース取り込みを示した（図５）。形質転換体Ｇｌｕｔ−１３は、１．２ｍＭのＫｍおよび１．４〜３ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１のＶｍａｘを有した。Ｇｌｕｔ−１７は、０．９ｍＭのＫｍおよび１〜５ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１のＶｍａｘを有した。Ｇｌｕｔ−１７形質転換体は、グルコースに対して１．２ ｍＭのＫｍおよび７．６ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１のＶｍａｘを有したが、Ｇｌｕｔ ＧＦＰ−４０形質転換体は、ほぼ１．０ ｍＭのＫｍおよび１３ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１のＶｍａｘを有した。形質転換体のグルコースに対するＫｍ値はヒト赤血球で測定された値（１〜２ｍＭ）と類似する（Ｃｈｉｓｈｏｌｍ， Ｓ． Ｗ．， （２０００） Ｎａｔｕｒｅ， ４０７：６８５；ｍｕｅｃｋｌｅｒら， １９９７）。Ｖｍａｘの相違は恐らく、藻類ゲノム中への組み込み部位に依存しうるＧｌｕｔ１遺伝子の様々な発現レベルを反映するのであろう。さらにｇｌｕｔ１輸送体が正常に機能することを確証するために、特異的インヒビターＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂを細胞系Ｇｌｕｔ−１３とともにインキュベートした。Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂはグルコース型輸送体の特異的インヒビターとして周知である（Ｌｕら， （１９９７） Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ， ７７６：８１）。５ｘ１０−４のＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂが存在すると、グルコース取り込みは、検出できないレベルまで低下した。インヒビターデータはさらに、異種Ｇｌｕｔ１輸送体が正しい様式で機能することを支持した。
【０１４６】
形質転換体Ｈｕｐ２のグルコース取り込み動力学も詳細に測定し、４０μＭのＫｍおよび３ｎｍｏｌグルコース（１０８細胞・ｍｉｎ）−１のＶｍａｘを得た。このＫｍ値は、無傷のクロレラ細胞および酵母またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）で産生したＨｕｐ１に対して測定された報告値、１０〜２０ｍＭより若干高かった（Ｓａｕｅｒ Ｎ， Ｃａｓｐａｒｉ Ｔ， Ｋｌｅｂｌ Ｆ， Ｔａｎｎｅｒ Ｗ （１９９０）「Ｓｃｈｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおけるクロレラ・ヘキソース輸送体の機能的発現（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ Ｓｃｈｚｏｓａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）」， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：７９４９−５２；Ａｏｓｈｉｍａ Ｈ， Ｙａｍａｄａ Ｍ， Ｓａｕｅｒ Ｎ， Ｋｏｒｎｏｒ Ｅ， Ｓｃｈｏｂｅｒｔ Ｃ （１９９３） 「アフリカツメガエル卵母細胞におけるクロレラ由来のＨ＋／ヘキソース共輸送体の異種発現およびその糖特異性、ｐＨおよび膜電位に関する特性決定（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ＋／ｈｅｘｏｓｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｓｕｇａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ｐＨ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」， Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４１：２９３−２９７）。
【０１４７】
実施例８　形質転換体の明所と暗所における増殖の比較
グルコースを補充した培地中で、Ｇｌｕｔ−１７形質転換体の明所および暗所における増殖を測定した。グルコースレベルは、典型的には、５〜１０ｇ／Ｌの間に維持した。増殖速度は、シリコーンフォームで封じた２５０ｍＬフラスコに入った５０ｍＬの培地に維持した培養で監視した。サンプルを日ベースで採取して細胞数と栄養レベルを測定した。フラスコを回転台上で１００ｒｐｍにて振とうした。高密度培養は２Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎｔ発酵槽内で１００ｒｐｍの攪拌速度を用いて増殖し、溶存酸素を＞２０％飽和に、ｐＨを７．５に維持した。
【０１４８】
図７に示した通り、明所で増殖した無形質転換細胞およびＧｌｕｔ−１７形質転換体は両方とも、ほぼ同じ細胞密度（２ｘ１０７細胞・ｍｌ−１）に到達した。グルコースの培地への添加により、無形質転換株の増殖特性は変化しなかった。対照的に、形質転換体株は無形質転換細胞のそれよりほぼ５倍高い細胞密度（５日増殖期間にわたって）を達成した。さらに、無形質転換細胞は暗所でグルコースの存在のもとで増殖できないが、Ｇｌｕｔ−１７形質転換体は、明所でグルコースの存在のもとで増殖するのと同じ速度でかつ同じ細胞密度まで増殖する。印象的なのは、培養物がさらに濃密になって光吸収が自己遮蔽で弱まると、形質転換体の増殖はグルコースの存在のもとで無形質転換細胞の増殖を超えることである。もし培地にグルコースおよび他の栄養を連続添加して従属栄養増殖を微生物発酵槽で実施すれば、形質転換体の培養により達成される密度は野生型細胞の密度を１０〜２０倍上回り、５ ｘ １０８細胞・ｍＬ−１の密度に到達し得る。
【０１４９】
実施例９
突然変異細胞を、＞９０％細胞死をもたらすのに十分なレベルのＵＶ光（２１０〜２６０ｎｍ）に細胞を曝して産生する。
【０１５０】
実施例１０
突然変異細胞を、混合細胞によってニトロソグアニジン（化学変異誘発物質）と共に液中で５分間、＞９０％細胞死を起こすのに十分な濃度で産生する。化学変異誘発物質を細胞から洗浄し、細胞を固体培地上にまく。
【０１５１】
実施例１１
一群の細胞中のグルコース輸送体をコードする遺伝子を遺伝子置換によって不活化する。細胞に内因性のグルコース輸送体遺伝子を含有する構築物を、（本明細書に記載の）輸送体コード領域の中心部に挿入されたゼオシン耐性カセットを用いて作製し、グルコース輸送体の非機能的コード領域を得る。遺伝子構築物を、微粒子ボンバードメントを用いて細胞中に導入する。この遺伝子を組み込み、機能的内因性グルコース輸送体と置換する。細胞をゼオシンで増殖する。ゼオシンで増殖しうる細胞を、内因性グルコース輸送体が不活化されているかどうかを決定するさらなるアッセイについて選択する。
【０１５２】
実施例１２
例えば、実施例９、１０、または１１のように変異誘発した細胞をデオキシグルコースの存在のもとで増殖する。増殖しうる細胞は有毒デオキシグルコースを取りこむことはできず、機能的グルコース輸送体を所持しないことを示す。さらなる実験のために、機能的グルコース輸送体のない細胞を選択する。
【０１５３】
選択した細胞中に、グルコース輸送体をコードする遺伝子を本明細書に記載の方法をによって挿入する。この形質転換と一緒に、これらの細胞を、第２の遺伝子（「目的の遺伝子」）も用いて形質転換する。
【０１５４】
細胞を、暗所でグルコースにより増殖する能力について、本明細書に記載の通り試験する。機能的グルコース輸送体の発現を示して暗所でグルコースにより増殖しうる細胞を、目的の遺伝子により形質転換されているかどうかを決定するさらなる試験について選択する。
【０１５５】
本発明の実施は、他に示さない限り、当業界の技術の範囲内の通常の分子生物学、微生物学、およびＤＮＡ技術を利用する。そのような技術は当業者には周知であって、全て文献に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， ＆  Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． （１９３９）， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；「ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」， Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびＩＩ （Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編， １９８５）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編， １９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」， （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編， １９８５）；「転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」， （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編， １９８４） ；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」を参照すること。
【０１５６】
本発明の原理、好ましい実施形態および操作の方法を以上の明細書に記載した。しかし、本明細書において保護されることを意図する本発明は、開示された特定の形態に制限するためでなく、むしろ説明するためであるとみなされるべきであるので、それらに限定されると解釈してはならない。本発明の精神から逸脱することなく、当業者は改変と変化を行うことができる。
【０１５７】
理解を明確にする目的で、以上の本発明は説明と例を特定の実施形態と一緒に使っていくらか詳細に記載されているが、本発明が関係するその他の態様、利点および改変が当業者には明白であろう。以上の記載と例は説明を意図しているが、本発明の範囲を限定するものでない。分子生物学、生理学および／または関係分野の技術者に明白である、本発明を実施するための上記の方法の改変は、添付の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲内にあることを意図している。
【０１５８】
本明細書で記述した全ての出版物と特許出願は、それらがそれぞれ個々に参照により組み入れられるごとく、本明細書に参照により前記範囲が組み入れられる。本明細書で記述した全ての出版物および特許出願は、この発明が関係する当業者の技術レベルを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、示された制限酵素切断部位をもつＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ形質転換ベクターｐＰｈａ−Ｔ１のマップである。このベクターの配列はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ２１９９４２を有する。ｆｃｐＡプロモーターはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の前に配置されている。ｆｃｐＢプロモーターをｓｈ ｂｌｅ遺伝子の前に配置した。構築物はまたアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点も含有する。ＭＣＳとｓｈ ｂｌｅ領域の両方に続くｆｃｐＡターミネーター領域は示してない。
【図２】
図２は未形質転換Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのサザンブロット分析である。レーンは野生型、およびグルコース輸送体をコードする遺伝子を用いて形質転換した２細胞系の結果を示す。全ＤＮＡを制限酵素を用いて消化した。Ａ）細胞系Ｈｕｐ２由来のＤＮＡの、ｈｕｐコード領域に対するＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション。Ｂ）細胞系Ｇｌｕｔ １３由来のＤＮＡの、ｇｌｕｔコード領域に対するＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション。
【図３】
図３は、未形質転換Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍのノーザンブロット分析である。レーンは野生型、およびグルコース輸送体をコードする遺伝子を用いて形質転換した２細胞系の結果を示す。Ａ）細胞系Ｇｌｕｔ １３由来の全ＲＮＡの、ｇｌｕｔコード領域に対するＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション。Ｂ）細胞系Ｈｕｐ２由来の全ＲＮＡの、ｈｕｐコード領域に対するＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション。
【図４】
図４は、Ｇｌｕｔ１またはＧＦＰに特異的な抗体の、未形質転換および形質転換の細胞系から抽出した膜タンパク質に対する反応性である。Ｗｔ、未形質転換細胞；Ｇｌ−４０、Ｇｌｕｔ１ ＧＦＰ−４０形質転換体；Ｂ、ヒト赤血球；Ｇｌｕｔ１−１７、Ｇｌｕｔ１−１７形質転換体、から得た全膜の可溶化後に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。使用した抗体は、ＧＦＰ（左パネル）またはＧｌｕｔ１（右パネル）に対して特異的であった。
【図５】
図５は、形質転換および未形質転換細胞系によるグルコースの取り込みである。Ｇｌｕｔ１ＧＦＰ−４０およびＧｌｕｔ１−１７の両方を、グルコース取り込みについて、本明細書に記載の方法を用いてアッセイした。
【図６】
図６は、Ｇｌｕｔ１−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を用いて形質転換したＰ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ中のＧｌｕｔ１の所在決定である。上段のパネルは、未形質転換Ｐ． ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ細胞の透過光イメージ（Ａ）、クロロフィル蛍光を表す、赤色チャネルの細胞からの蛍光（Ｂ）、および緑色チャネルの細胞からの蛍光（Ｃ）を示す。下段パネルは、Ｆｅｐプロモーターにより駆動したＧＦＰ遺伝子を用いて形質転換された細胞（Ｄ）、およびキメラＧｌｕｔ１−ＧＦＰ遺伝子を用いて形質転換された細胞（Ｅ、Ｇｌｕｔ−４０と名付けた株）の緑色チャネルの蛍光を示す。全ての蛍光イメージは単共焦点光学セクションである。スケールバー＝１０ミクロン。
【図７】
図７は、異なる条件下の野生型細胞とＧｌｕｔ−１７の増殖である。様々な条件下で左パネルは野生型細胞（Ｗｔ）の増殖を示し、右パネルはＧｌｕｔ１−１７の増殖を示す。細胞は、明所でグルコースを補充せずに（黒丸）、暗所でグルコースを補充して（黒三角）または明所でグルコースを補充して（白丸）培養した。
【図１】
2004500839.tif 000010
【図２】
2004500839.tif 000011
【図３】
2004500839.tif 000012
【図４】
2004500839.tif 000013
【図５】
2004500839.tif 000014
【図６】
2004500839.tif 000015
【図７】
2004500839.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004500839.tif 000017
2004500839.tif 000018
2004500839.tif 000019
2004500839.tif 000020
2004500839.tif 000021
2004500839.tif 000022
2004500839.tif 000023
2004500839.tif 000024
2004500839.tif 000025
2004500839.tif 000026
2004500839.tif 000027
2004500839.tif 000028
2004500839.tif 000029
2004500839.tif 000030
2004500839.tif 000031
2004500839.tif 000032
2004500839.tif 000033
2004500839.tif 000034
2004500839.tif 000035
2004500839.tif 000036
2004500839.tif 000037
2004500839.tif 000038
2004500839.tif 000039
2004500839.tif 000040
2004500839.tif 000041
2004500839.tif 000042
2004500839.tif 000043
2004500839.tif 000044
2004500839.tif 000045
2004500839.tif 000046
2004500839.tif 000047
2004500839.tif 000048
2004500839.tif 000049
2004500839.tif 000050
2004500839.tif 000051
2004500839.tif 000052
2004500839.tif 000053
2004500839.tif 000054
2004500839.tif 000055
2004500839.tif 000056
2004500839.tif 000057
2004500839.tif 000058
2004500839.tif 000059
2004500839.tif 000060
2004500839.tif 000061
2004500839.tif 000062
2004500839.tif 000063
2004500839.tif 000064
2004500839.tif 000065
2004500839.tif 000066
2004500839.tif 000067
2004500839.tif 000068
2004500839.tif 000069
2004500839.tif 000070
2004500839.tif 000071
2004500839.tif 000072
2004500839.tif 000073
2004500839.tif 000074
2004500839.tif 000075
2004500839.tif 000076
2004500839.tif 000077
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500839.tif 000078
【国際調査報告】
2004500839.tif 000079
2004500839.tif 000080
2004500839.tif 000081
2004500839.tif 000082
2004500839.tif 000083
2004500839.tif 000084