(57)【要約】非ペプチドＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカーおよび短い合成エフェクタドメインを有する人工転写因子（ＡＴＦ）が提供される。ＡＴＦｓはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで非常に強力な転写調節因子である。遺伝子発現の標準化した操作および医薬品の新規クラスの開発を標的とした方法も提供される。
2004533804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞遺伝子の転写を調節するための組成物であって、
非ペプチドＤＮＡ結合ドメイン、
転写エフェクタ、および
フレキシブルリンカーを含み、ここでリンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は転写活性化因子に共有結合する、前記組成物。
【請求項２】
エフェクタが転写を活性化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
エフェクタが転写を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
転写エフェクタが共作用蛋白質、たとえば抑制因子または活性化因子共作用蛋白質に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
転写抑制因子がヒストン蛋白質に結合する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ結合ドメインが核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
核酸が修飾された核酸である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
修飾された核酸が修飾された骨格を有する核酸、修飾された塩基を有する核酸、およびそれらの組合せの群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
修飾された骨格がホスホロチオエ−トおよびペプチド核酸からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡ結合ドメインがペプチド核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
リンカーが核酸の３’末端または５’末端に結合する、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合ドメインが複数のピロ−ルまたはイミダゾ−ル基を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
転写エフェクタがポリペプチド配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
転写活性化因子がポリペプチド配列であり、そしてポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群から選択されるヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸の活性化因子配列の少なくとも１コピーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
エフェクタが有機部分である、請求項１の組成物。
【請求項１６】
配列のアミノ末端がリンカーに共有結合する、請求項１３の組成物。
【請求項１７】
転写エフェクタ部分が約３，０００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項１３の組成物。
【請求項１８】
転写エフェクタ部分が約１，５００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項１３の組成物。
【請求項１９】
フレキシブルリンカーがポリグリコールを含む、請求項１の組成物。
【請求項２０】
フレキシブルリンカーが少なくとも６グリコールユニットを含む、請求項１９の組成物。
【請求項２１】
フレキシブルリンカーがヌクレオチド、ペプチド、低級アルキルおよび酸素含有アルキル基からなる群から選択されるモノマーユニットを含む、請求項１９の組成物。
【請求項２２】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ１５オングストロームである、請求項１の組成物。
【請求項２３】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ２８オングストロームである、請求項１の組成物。
【請求項２４】
線状２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下で開始された２番目の量に比べて少なくとも１０倍以上多い、請求項１の組成物。
【請求項２５】
線状２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下における２番目の量に比べて３０から５０倍多い、請求項１の組成物。
【請求項２６】
ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ結合部位に親和性を有し、ＤＮＡ鋳型が約５００塩基対より短い、請求項１の組成物。
【請求項２７】
Ａがトリプレックス形成核酸であり、Ｂがフレキシブルリンカーであり、そしてＣが真核細胞ＲＮＡポリメラーゼを含む転写蛋白質複合体上の部位に結合するエフェクタ部分であり、ＢがＡおよびＣに共有結合する、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有する、転写を活性化するための組成物。
【請求項２８】
Ｂがポリグリコール鎖であり、そしてＢとＣの共有結合が二官能橋かけ剤を含む、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
Ｂが少なくとも長さ約２８オングストロームであり、そしてＣがヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸配列を含む、請求項２７の組成物。
【請求項３０】
以下のことを含む、転写調節因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法：
少なくとも１転写調節エレメントの制御下で標的遺伝子を含み、ＤＮＡ結合部位を有する細胞を提供すること；
転写が起きる条件下で、ＤＮＡ結合ドメイン、興味のある試験部分、およびフレキシブルリンカーを含む試験組成物を前記細胞に接触させること、ここでリンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は試験化合物に共有結合し、ＤＮＡ結合ドメインは結合部位に十分な親和性を有する；
転写調節因子としての試験組成物の活性の尺度である、試験組成物の非存在下でのレベルに比べた、試験組成物存在下での標的遺伝子の転写活性のレベルの任意の変化を検出すること。
【請求項３１】
以下のことを含む、転写調節因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法：
ＤＮＡ結合ドメイン、興味のある試験部分、およびフレキシブルリンカーを含む試験組成物を提供すること、ここでリンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は試験化合物に共有結合し、ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ結合部位に対して、当該部位に結合しプロモータにおける転写を活性化するために十分な親和性を有する；
ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物、ならびにＲＮＡ生成物の定量のための検出系を試験組成物と接触させること；および
転写調節因子としての試験組成物の活性の尺度である、試験組成物の非存在下でのレベルに比べた、試験組成物存在下での標的遺伝子の転写活性のレベルの任意の変化を検出すること。
【請求項３２】
試験部分が化学部分であり、そして試験組成物が約３ｋＤより少ない分子量を有する、請求項３０または３１の方法。
【請求項３３】
試験部分が化学部分であり、そして試験組成物が約１．５ｋＤより少ない分子量を有する、請求項３０または３１の方法。
【請求項３４】
試験部分が膜透過性である、請求項３０または３１の方法。
【請求項３５】
試験部分が転写活性化、または抑制因子活性を有すると考えられる、請求項３０または３１の方法。
【請求項３６】
転写活性の変化がｍＲＮＡ、または標的遺伝子によりコ−ドされた蛋白質産物の観察されたレベルの変化として検出される、請求項３０または３１の方法。
【請求項３７】
標的遺伝子が、薬物への耐性を与える蛋白質をコ−ドする遺伝子、酵素をコ−ドする遺伝子、栄養要求表現型を救う遺伝子、および細胞表面抗原をコ−ドする遺伝子からなる群から選択される、請求項３０の方法。
【請求項３８】
標的遺伝子が熱量、発光または蛍光検出を提供する蛋白質をコ−ドする、請求項３７の方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ鋳型への試験組成物の結合部位が転写開始部位から１００塩基対以内に位置する、請求項３０または３１の方法。
【請求項４０】
ＤＮＡ結合部位が複数の結合部位配列反復を含む、請求項３１の方法。
【請求項４１】
試験組成物に転写混合物を提供する段階がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項３０の方法。
【請求項４２】
試験組成物に転写混合物を提供する段階がマルチウェルディッシュへの自動化された試料分配を含む、ハイスループットスクリーニング技術を使用して行われる、請求項３１の方法。
【請求項４３】
自動プレ−トリ−ダ−がデ−タ解析および表示のためのプログラム可能なコンピュ−タ化されたプログラムを有するハイスループット検出法を使用して転写の量を測定する段階が実行される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ結合部位に親和性を有し、ＤＮＡ鋳型が約５００塩基対より短い、請求項３１の方法。
【請求項４５】
以下のことを含む、転写活性を変化させる方法：
ＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカー、リンカーの一末端がＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端が転写調節因子に共有結合する、および転写調節因子を含む転写組成物を細胞に導入すること。
【請求項４６】
調節因子が活性化因子または抑制因子である、請求項４５の方法。
【請求項４７】
以下のものを含む、転写調節因子としての活性に対して試験組成物をアッセイするためのキット：
ＤＮＡ結合ドメインに共有結合するフレキシブルリンカー、ここでＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおいて転写を活性化するために十分な、ＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ結合部位に対する親和性を有する；および
ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成する真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子を含む、転写混合物。
【請求項４８】
調節因子が活性化因子または抑制因子である、請求項４７のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府資金援助
本発明は、一部分Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより本発明者らに授与された政府補助金ＩＲ４１  ＧＭ５７７１２−０１により行われた。政府は本発明にある程度の権利を有する。
【０００２】
関連する出願に対する相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ  １１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、２０００年、１０月１３日に出願された、“人工転写因子および使用の方法”という名称の仮出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２４０，４７９の部分継続出願である。
【０００３】
発明の背景
本発明は遺伝子発現の調節、とりわけ人工転写因子（ＡＴＦｓ）として有用な組成物の設計および合成に関する。本発明はまた、ＲＮＡ転写レベルにおいて遺伝子発現を調節する新規治療薬としての、遺伝子調節および機能的ゲノミクスにおける標的確認のための手段としての、ならびに医薬品開発におけるそのような分子の使用に関する。
【０００４】
真核細胞ゲノム調節における重要な段階は、転写因子によるＲＮＡ合成の活性化および抑制を含む。転写因子は少なくとも２つの機能的部分：ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制（すなわち、“エフェクタ”）ドメインを含む調節蛋白質である（Ｐｔａｓｈｎｅ，“Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｗｉｔｃｈ：Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（１９９２）；およびＰｔａｓｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５６９−５７７（１９９７））。一般に、ＤＮＡ結合ドメインは特異的ＤＮＡ配列との相互作用によりプロモータに転写因子を固定する。エフェクタドメインはＴＡＴＡ−ＢＯＸ結合蛋白質（ＴＢＰ）およびＴＢＰ−関連蛋白質、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素を含む蛋白質、共活性化因子、共抑制因子、ヒストンおよびヒストン修飾酵素などのようなＲＮＡ転写に関連する他の蛋白質との相互作用に関与する（Ｂｌａｕ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，２０４４−５５（１９９６）；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １７，３１４６−５４（１９９８）；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ，Ｔ．Ｎ．，Ｕｍｏｖ，Ｆ．Ｄ．＆Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ  ２３，２５５−７５（１９９９））。これらの蛋白質−ＤＮＡおよび蛋白質−蛋白質相互作用はプロモータにおける転写装置の構築を促進または阻害し、したがって調節された遺伝子によりコ−ドされたＲＮＡ合成を活性化または抑制する（Ｋｏｌｅｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ＲＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ  Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：１１３−１１６（１９９５）；Ｈａｍｐｓｅｙ，Ｍ．＆Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，１３２−９（１９９９））。
【０００５】
したがって報告された実験デ−タは、エフェクタドメインがＤＮＡ結合ドメインから機能的に独立していることを非常に強く示唆する。たとえば、１転写因子の活性化ドメインは異なる因子のＤＮＡ結合ドメインに結合することができる。そのようなハイブリッド分子は酵母からヒト細胞までの範囲の生物にわたり、それらの特徴的な機能を保持し、基礎的な調節機序は多様な真核細胞に共通であることを示唆する（Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４３：７２９−７３６（１９８５））。したがって、ＤＮＡ結合およびエフェクタドメインは二官能分子として一緒になった、完全に別個の機能的構造実体として考えてもよい。
【０００６】
概念的には、転写因子の分子構造は各転写因子分子が単に二座配位リガンドと見なされてもよいことを暗示し、ここでリガンドの一つ（ＤＮＡ結合ドメイン）は配列特異的にＤＮＡに結合し、他のリガンド（“エフェクタ” ドメイン）は転写調節に関与する蛋白質に結合する（活性化または抑制）。この簡単なモデルは、ＤＮＡ結合および／またはエフェクタドメインを合成化学部分に置換し、新規クラスの分子−合成または人工転写因子（ＡＴＦｓ）を生む可能性を高める。ＡＴＦ分子設計の主要なゴ−ルは、きわめて重要な生物学的機能−特異的遺伝子のＲＮＡ転写を調節する能力を維持しながら、より低い分子量、酵素分解への抵抗性および細胞膜透過性のような新規の、薬物様化学的性質を導入することである。
【０００７】
ＶＰ１６またはＧＣＮ４のような強力な転写活性化因子の最小活性化ドメインを、トリプルへリックス形成オリゴヌクレオチドまたはピロ−ルオリゴマーに基づいた人工ＤＮＡ結合ドメインと結合させるためのいくつかの最近の試みがある。これらの努力は、ほとんど検出できない活性を有する（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：３９９５−４０００（１９９９））か、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞）アッセイに限定される、ごくわずかな活性化を示す（Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３９３０−３９３５（２０００））分子を生み出してきた。一般に、そのようなハイブリッド分子の活性は、これらの分子の部分が由来する天然の（または蛋白質）活性化因子のそれに比べ、非常に弱い（そしておそらく非特異的である）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：５６３−５６４（１９８８））。
【０００８】
新規転写活性化因子の同定および改善された活性化系の必要性が依然としてある。とりわけ、強力な天然の転写活性化因子による活性化に匹敵するか、またはそれを越える人工転写活性化因子の必要性が依然としてある。新規転写抑制因子および抑制系の必要性も依然としてある。一般に、転写過程を調節することができる新規転写系の必要性が依然としてある。その分子は生物学および医学における技術の最初の実用的適用のための可能性を開くであろう。
【０００９】
発明の概要
本発明は、無細胞アッセイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（組織培養細胞において）の両方で示された、非常に強力なＡＴＦｓを生じる分子設計に関する。これらのＡＴＦｓは転写レベルでの遺伝子調節の手段として、および癌および多くの他の疾患の治療のための遺伝子タ−ゲッティング医薬品のクラスとして使用することができる。
【００１０】
本発明の一側面において、真核細胞遺伝子の転写を調節する組成物が提供される。組成物は、非ペプチドＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカー、および転写エフェクタを含み、リンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は転写エフェクタに共有結合する。
【００１１】
少なくともいくつかの態様において、エフェクタは転写を活性化する。少なくともいくつかの他の態様において、エフェクタは転写を抑制する。少なくともいくつかの態様において、本発明のＡＴＦのフレキシブルリンカーは長さが少なくとも１０オングストローム、もしくは少なくとも１５オングストロームであるか、または少なくともいくつかの他の態様において、長さが少なくとも２８オングストロームである。少なくともいくつかの態様において、フレキシブルリンカーは１０〜１００オングストロームの範囲の長さを有する。少なくともいくつかの態様において、フレキシブルリンカーは１５〜２５オングストロームの範囲、または２５〜４０オングストロームの範囲、または４０〜６０オングストロームの範囲、または６０〜１００オングストロームの範囲の長さを有する。
【００１２】
少なくともいくつかの態様において、真核細胞遺伝子の転写を調節するための組成物は共調節蛋白質に結合する。少なくともいくつかの態様において、組成物は転写を抑制し、そしてヒストンまたはヒストン調節蛋白質に結合する。
【００１３】
少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは核酸である。少なくともいくつかの態様において、核酸は修飾された核酸である。他の態様において、核酸は修飾された骨格を含むか、または核酸は修飾された塩基を含む。さらに他の態様において、修飾された骨格はホスホロチオエ−トおよびペプチド核酸からなる群から選択されるホスホジエステル結合のための置換基を含む。他の態様において、リンカーは核酸の３’または５’末端に結合する。
【００１４】
少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはペプチド核酸である。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは複数のピロ−ルまたはイミダゾ−ル基を含まない。少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは配列特異的ＤＮＡ結合天然生成物である。
【００１５】
少なくともいくつかの態様において、転写調節因子はポリペプチド配列である。いくつかの態様において、転写調節因子はポリペプチド活性化因子であり、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（表１を参照されたい）
【００１６】
【化１】
2004533804.tif 000003
を含む単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸の活性化因子配列の少なくとも１コピーを含む、ポリペプチド配列を有する。少なくとも一態様において、ポリペプチドはＳＷＱＵＩＤ  ＮＯ：１２の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ペプチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の活性化因子配列の２コピーおよびペプチド配列のアミノ末端にシステイン残基を含み、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（表１を参照されたい）
【００１７】
【化２】
2004533804.tif 000004
の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド配列はシステイン残基およびＳＥＱ  ＩＦ  ＮＯ：１２の活性化因子配列の２コピーを含み、ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を有する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のアミノ末端はリンカーに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のカルボキシル末端はリンカーに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、ポリペプチド転写調節因子のシステイン残基はリンカーに共有結合する。
【００１８】
少なくともいくつかの態様において、真核細胞遺伝子の転写を調節する組成物の転写エフェクタ部分は約３，０００ダルトンより少ない分子量を有する。少なくともいくつかの態様において、転写エフェクタ部分は約１，５００ダルトンより少ない分子量を有する。少なくともいくつかの他の態様において、転写調節因子部分は約１，０００ダルトンより少ない分子量を有する。
【００１９】
真核細胞遺伝子の転写を調節するための組成物の少なくともいくつかの態様において、フレキシブルリンカーはポリグリコールを含む。いくつかの態様において、フレキシブルリンカーポリグリコールは少なくとも２，または少なくとも４，または少なくとも６グリコールユニットを含む。他の態様において、フレキシブルリンカーは核酸、ペプチド、および低級アルキルまたは他の酸素含有アルキル鎖誘導体からなる群から選択される複数のモノマーユニットを含む。
【００２０】
少なくともいくつかの態様において、２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始される転写の量は少なくとも組成物非存在下で開始される２番目の量に比べて１０倍多い。少なくともいくつかの態様において、線状２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始される転写の量は組成物非存在下における２番目の量に比べて少なくとも２０，または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０倍多い。少なくともいくつかの態様において、転写の量は、本発明のＡＴＦの非存在下における転写より３０〜５０倍多い。
【００２１】
少なくとも本発明のいくつかの態様において、真核細胞遺伝子の転写を変化させる（調節する）ための組成物のＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ鋳型上の少なくとも１ＤＮＡ結合部位に対して親和性を有し、ＤＮＡ鋳型は約５００塩基対より短い。
【００２２】
本発明の別の側面において、転写を活性化するための組成物は構造Ａ−Ｂ−Ｃを有し、ここでＡはトリプレックス形成核酸であり、Ｂはフレキシブルリンカーであり、そしてＣは真核細胞ＲＮＡポリメラーゼを含む転写蛋白質複合体上の部位に結合する活性化部分であり、ここでＢはＡおよびＣに共有結合する。少なくともいくつかの態様において、Ｂはポリグリコール鎖であり、そしてＢのＣへの共有結合は二官能橋かけ剤を含む。少なくともいくつかの態様において、Ｂは少なくとも長さ約２８オングストロームのポリグリコールであり、そしてＣは単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明の別の側面は転写調節因子としての活性に関して試験化合物をアッセイするための方法を提供する。方法は以下のことを含む：
試験組成物を提供するために、非ペプチドＤＮＡ結合ドメインに共有結合する、フレキシブルリンカードメインに試験化合物を共有結合させること、ここでＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおける転写を調節するために、ＤＮＡ鋳型上の結合部位に十分な親和性を有する；
ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物を試験組成物と接触させること；および
試験組成物の非存在下での基礎レベルに比べた、試験組成物存在下で産生されたＲＮＡの量を測定すること、ここでＲＮＡの量は転写活性化因子としての試験組成物の活性の尺度である。少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合部位は複数の結合部位配列の反復である。転写活性化因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法の少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ鋳型への試験組成物の結合部位は転写開始部位から１００塩基対以内に位置する。
【００２４】
転写活性化因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法の別の態様において、試験組成物に転写混合物を提供するための段階はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。少なくともいくつかの態様において、試験組成物は鋳型に予め結合し、混合物は形質転換により複数の細胞に提供される。少なくともいくつかの態様において、試験組成物は染色体に取り込まれたレポータープラスミド鋳型を持つ細胞（安定なトランスフェクション系統）に提供される。
【００２５】
少なくともいくつかの態様において、試験組成物に転写混合物を提供する段階がマルチウェルディッシュのウェルへの自動化された分配を含む、ハイスループットスクリーニング技術を使用して行われる。少なくともいくつかの態様において、デ−タ解析および表示のためのプログラム可能なコンピュ−タ化されたプログラムを有する自動プレートリーダーを含むハイスループット検出法を使用して、転写の量を測定する段階が実行される。
【００２６】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義は特記しない限り、本説明および請求項を通して使用される。本明細書で参照する特許および科学文献は当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書で引用した、発行された米国特許、認められた出願、および参考文献は本明細書に参照として引用される。
【００２７】
本明細書で使用する用語“人工転写因子”は、合成転写因子を含む。
用語“約”は、引用した値の±２０％の範囲の数値を意味するように使用される。
【００２８】
用語“形質転換”は、少なくともＤＮＡが細胞の一部に入るように、受容細胞とＤＮＡを混合することにより生じる、細胞系統または株の構築に使用される遺伝的事象を表し、トランスフェクション、リポフェクション、または他のリポソ−ム媒介過程、およびエレクトロポレ−ションを含む。
【００２９】
“転写エフェクタ”は、プロモータの近くに存在し、ＤＮＡ結合ドメインに結合するとき、特定のプロモータまたはプロモータのクラスから合成されるＲＮＡの量の増加または減少を引き起こす化学組成物を表す。エフェクタの非存在下における転写は“基礎（ｂａｓａｌ）”レベルであると言う。転写は正のエフェクタまたは“活性化因子”により活性化（誘導、またはアップレギュレ−トとしても知られる）されてもよい。同様に、基礎または活性化レベルは負のエフェクタまたは“抑制因子”により抑制、またはダウンレギュレ−トされてもよい。
【００３０】
転写エフェクタは、遺伝子の転写開始部位の近くまたはかかる部位において作用することができる。遺伝子は鋳型としてＤＮＡ鎖を使用して５’から３’方向に合成されるとき転写される。初めのリボヌクレオシドトリホスフェ−トがＲＮＡポリメラーゼと複合体を形成する転写開始部位は“＋１”として既知のＤＮＡ鋳型上の部位に相補的に見出され、それぞれの連続したヌクレオチド添加は正の数を増しながら“下流”部位に相補的に起こる。＋１部位の“上流”には、一般に、転写因子、転写装置の成分、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連する蛋白質の結合を特定するプロモータのようなＤＮＡ調節シグナルが見出される。プロモータは一般に、転写開始のために適切にＲＮＡポリメラーゼホロ酵素を配置するために、＋１部位の上流の一定の距離内に見出される。転写の量を調節するＤＮＡ配列中の調節シグナル、たとえば最初は酵母で発見されたＧＡＬ−４結合部位配列は一般にプロモータ中、たとえば＋１部位の上流またはかかる部位に隣接して位置する。
【００３１】
本明細書で引用する核酸およびアミノ酸配列を表１に記載する。
【００３２】
【表１】
2004533804.tif 000005
Ａはアラニンを意味し；Ｃはシステインを意味し；Ｄはアスパラギン酸を意味し；Ｅはグルタミン酸を意味し；Ｆはフェニルアラニンを意味し；Ｇはグリシンを意味し；Ｈはヒスチジンを意味し；Ｉはイソロイシンを意味し；Ｋはリジンを意味し；Ｌはロイシンを意味し；Ｍはメチオニンを意味し；Ｎはアスパラギンを意味し；Ｐはプロリンを意味し；Ｑはグルタミン酸を意味し；Ｒはアルギニンを意味し；Ｓはセリンを意味し；Ｔはスレオニンを意味し；Ｖはバリンを意味し；Ｗはトリプトファンを意味し；そしてＹはチロシンを意味する。
【００３３】
態様の詳細な説明
驚くべきことに、いずれの部分も無傷の、折りたたまれた、蛋白質ドメインを含まない、３部分からなるＡＴＦが転写活性化において、これらの部分の設計の基になった蛋白質転写調節因子と同じか、またはそれより好ましく機能できることが見出されている。３部分からなる分子の設計は、ＡＴＦがＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカー、および転写を活性化するか、または抑制するか、さもなければ変化させる、転写エフェクタを含むものであり、それらは発明の説明および請求項中でそれぞれＡ、Ｂ、およびＣとして表される。しかし、これらの“ドメイン”はいずれも蛋白質ドメインである必要はない。本明細書で使用する“ドメイン”の意味は、ＡＴＦ分子の３部分のそれぞれの機能を表す。
【００３４】
本発明の一側面において、あるＡＴＦ成分が関連する天然の転写活性化因子蛋白質の活性に匹敵するか、またはさらに越える活性を持つ、合成または人工転写因子（ＡＴＦｓ）が提供される。本発明のいくつかの実施例において、転写反応、すなわち活性化または抑制は、対照、すなわち本発明のＡＴＦが存在しない系のそれより、１０倍、または２０倍、または３０倍または４０倍、またはさらに５０倍も大きい。
【００３５】
本発明のＡＴＦの態様は、図１に示される。機能的ＡＴＦはＤＮＡ結合ドメインＡを含み、リンカーＢに５’位で結合するトリプレックス形成オリゴヌクレオチドとして本明細書で示される、。しかし、活性を損失せずに、ＤＮＡ結合ドメインの３’末端でリンカーに結合することは可能である。リンカーは、エフェクタドメインＣ、すなわち転写に影響を及ぼすドメインに遠位端で結合する。作用は、転写を活性化すること、または抑制することであってもよい。ここで、エフェクタは活性化ドメイン、ＡＤとして示される。以下でより詳細に説明するように、ＡＴＦ分子の個々のドメインはもっとも一般には共有結合する；しかし、任意の適切な結合、すなわち共有結合、水素結合、親水性または疎水性結合がＡＴＦを形成するために使用されてもよいことが企図される。
【００３６】
ＤＮＡ結合ドメインＡは、プロモータＤＮＡ内の具体的な認識部位に親和性を有する任意の非ペプチド部分である。非ペプチド部分という用語により、ドメインが天然のアミノ酸の実質的な量を含まないことを意味する。ＤＮＡ結合ドメイン中のペプチド成分を実質的に除外することは、孤立したアミノ酸の包含の可能性を除外しない。本発明の目的のためには、実質的に非ペプチドであるとは、天然のアミノ酸含有量が５０％より少ないか、または２０％より少ないことを意味するべきである。ＤＮＡ結合ドメインの選択は、活性化することを意図した遺伝子に依存する。いくつかの活性化因子は長い距離にわたり作用することができるが、ＤＮＡ結合ドメインは、一般に活性化因子が転写に影響を及ぼすことができる遺伝子の転写開始位置の比較的近くに位置する部位を認識する。多くの活性化因子または抑制因子は長い距離にわたり作用することが可能であり、これらのエフェクタの使用が本発明で企図される。
【００３７】
少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはトリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）のようなオリゴヌクレオチドである。これらの部分はＤＮＡへリックスの主要な溝（ｇｒｏｏｖｅ）に結合すると考えられている。トリプレックス形成核酸の設計は、Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第５，８７４，５５５号に記載され、これを本明細書に参照として援用する。ＤＮＡ結合ドメインの付加的な型をトリプレックス形成核酸と置換できることが予想される。
【００３８】
ＴＦＯｓは生理的条件で２本鎖ＤＮＡと強力で安定な配列特異的な複合体を形成できる（Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７０−８１（１９９２））。この性質は以下の実施例で証明されるように、エフェクタとの結合に不都合な影響を与えない。任意の作用様式または理論には束縛されないが、リンカーは他の可能性のある役割に加えて、結合した化学基による妨害からＴＦＯを“絶縁”する役割を果たすと考えられる。
【００３９】
ＴＦＯとＤＮＡ間のトリプルへリックス形成は、両分子の配列が特別な特徴、とりわけ１ＤＮＡ鎖におけるプリン塩基および相補鎖におけるピリミジンの均一な伸長を有するとき促進される。このことは、医薬的（遺伝子タ−ゲッティング）適用またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏＡＴＦアッセイのような多くの適用の障害ではない、なぜならＴＦＯｓの配列およびレポーター遺伝子の任意のプロモータにおけるその対応する結合部位は随意に選択できるからである。さらに、そのような部位が天然の遺伝子、もっともしばしばプロモータの調節領域に存在することが示されている（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：３７４２−３７４７（１９９４）；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：５２１８−５２２２（１９９８）；およびＢｒａｍａｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９０：１７−２６（１９９７））。さらに、化学的に修飾されたＴＦＯｓは多くの付加的な種類のＤＮＡ配列を認識してもよい。たとえば、“架橋”または固定されたＴＦＯｓを持ついくつかのピリミジン残基により中断されたポリプリン伸長を標的にすることが現在可能である（Ｈｅｌｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：９４−１０２（１９９７））。また、トリプレックス認識スキ−ムは非天然塩基およびヌクレオチド類似体を持つＴＦＯｓを合成することにより拡大することができる。ＴＦＯを基礎にしたＡＴＦは、プロモータの都合のよいＴＦＯ結合部位を同定することを可能にする、ゲノムデ−タベ−スの最近の進歩および有用性を利用してもよい。本発明の一適用において、医学的興味のある遺伝子および適切な結合部位が同定され、したがって適切な親和性を有するＴＦＯ配列が合成される。
【００４０】
ＴＦＯｓに加え、人工（非ペプチド）ＤＮＡ結合ドメインとして使用することができる他の分子クラスがある。本発明の少なくともいくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインはペプチド核酸（ＰＮＡ）、すなわちホスフェ−ト骨格がペプチドに見出される骨格に類似したものにより置換されたＤＮＡの分子類似体である。ペプチド核酸はワトソン−クリック塩基対合により１本鎖ＤＮＡに結合することが可能で、ほぼヌクレオシドの様式で、ＤＮＡ／ＰＮＡ２本鎖に対してトリプルへリックスを形成することができる（Ｎｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：１６５−７０（１９９４）；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−８（１９９３）；およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２７：２８４２−７（１９９９））。フレキシブルリンカーと結合する２本のＰＮＡ鎖からなるＰＮＡ“クランプ”は、ＤＮＡ２本鎖と非常に安定な複合体を形成することが可能で、ＴＦＯｓのように類似した種類のポリプリンおよびポリピリミジンＤＮＡ配列を標的にするように設計することができる。最近、“偽相補的ＰＮＡｓ”（ｐｃＰＮＡｓ）と呼ばれる新規世代のＰＮＡｓが合成された（Ｉｚｖｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１０９０８（２０００））。これらのＰＮＡｓは２重２本鎖侵入様式により、プリンおよびピリジミンの混合配列を含む、ＤＮＡ上に明示された位置を標的にする。ＰＮＡの骨格は荷電していないため、静電反発作用の欠如がＤＮＡとの強力で安定な複合体の形成を導く。また、ＰＮＡはＤＮＡより少ないモノマーユニットあたりの質量を有し、一般にオリゴヌクレオチドのホスフェ−ト骨格を攻撃することができる酵素による分解に耐性である。これらおよび他の性質がＰＮＡを、ＡＴＦ  ＤＮＡ結合ドメインの非常に魅力的な選択物にする。
【００４１】
別の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは米国特許第５，８７４，５５５号に記載の、ポリアミド、たとえばポリピロ−ルおよびポリイミダゾ−ルのような、ペプチド類似体であってもよい。これらの部分は、ＤＮＡへリックスの小さい溝に結合すると考えられ、ポリアミドＤＮＡ結合ドメインを使用してＡＴＦで観察される活性化は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインを有するＡＴＦｓで観察される活性化ほど大きくない。ＤＮＡ２本鎖の小さい溝内でのＤＮＡ結合ドメインの結合の特質は、結合した転写エフェクタが転写装置を含む蛋白質と効率的に相互作用する能力を限定することができる。
【００４２】
さらに他の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは有機小分子を使用した、抗生物質または他の部分のような配列特異的な天然のＤＮＡ結合産物を含む、非蛋白質結合ドメインである。
【００４３】
エフェクタドメイン、Ｃは、基礎転写レベル（ｍＲＮＡ）の量の正（活性化因子）または負（抑制因子）の調節因子であってもよい。多くの機能的活性化因子および抑制因子ペプチドが既知であり、本発明のＡＴＦ分子において使用することができる。いくつかの態様において、エフェクタドメインはエフェクタとリンカー間に共有結合を形成する適切な化学結合基（たとえば、アミン、カルボキシルまたはチオール基）を含む（図１）。他の態様において、エフェクタドメイン、リンカーおよびＤＮＡ結合ドメイン（またはその亜成分）は一分子として合成され、そのため付加的な化学結合基は提供されない。
【００４４】
いくつかの態様において、エフェクタドメインはもっとも一般には、転写をアップレギュレ−トまたはダウンレギュレ−トする能力に関して選択されるペプチドである。ペプチドはＬ−またはＤ−アミノ酸のいずれかを含んでいてもよい。エフェクタを活性化する代表的な例としては、ＶＰ−１６、Ｏｃｔ−２、およびＶＰ−１６およびＯｃｔ−２の活性フラグメントが挙げられるが、それらに限定されない。少なくともいくつかの態様において、ＶＰ−１６ペプチドの２９−マ−または１４−マ−がとりわけ強い活性化作用を有することが示されている。
【００４５】
少なくともいくつかの態様において、より長いペプチドの活性化機能の、全部でなくても、大部分を含むより短いペプチドは、ＡＴＦ分子の一部として使用してもよい。より短いペプチドは、たとえば“コア”活性化因子のような、活性化因子ドメインの最も短いペプチド部分を決定することにより同定することが可能で、そのような部分はエフェクタドメインのサイズおよび質量を最小にするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて機能的のままである。
【００４６】
本発明の少なくともいくつかの態様において、Ｏｃｔ−２のグルタミンに富むドメインのような、活性化ドメインの他の一般型に由来するペプチドがエフェクタドメインとして使用される。１８アミノ酸ペプチドのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
【００４７】
【化３】
2004533804.tif 000006
がＯｃｔ−２のコア活性化配列を形成することが示されている（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：６０４６−５５（１９９４）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，６０５６−６７（１９９４））。この配列の２または３の直列反復は機能的な活性化ドメインを形成する。最近の報告は、８アミノ酸ペプチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
【００４８】
【化４】
2004533804.tif 000007
が蛋白質ＤＮＡ結合ドメインに融合するとき、比較的強力な活性化ドメインを形成することを証明する（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．，ＬａＲｉｃｃｉａ，Ｌ．Ｍ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．＆Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８，１０８０−５（２０００））。
【００４９】
本発明の少なくともいくつかの態様において、ＡＴＦｓの有効性は１つのエフェクタ中に異なる活性化因子由来の最小活性化ドメインを結合させることにより促進される。これは転写活性化における協同作用を利用する。たとえば、同じプロモータに結合する２つの異なる活性化因子は、おそらく異なるクラスの活性化ドメインを、転写開始に関与する異なる共活性化因子と接触させることにより、それらのおのおのが単独で作用するより、比例した、より強力な作用を生じる（Ｂｌａｕ  Ｊ．Ｘｉａｏ、Ｈ．，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｓ．，Ｏ’Ｈａｒａ，Ｐ．，Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．＆Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｄ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，２０４４−５５（１９９６）；Ｈａｍｐｓｅｙ，Ｍ．＆Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ９，１３２−９（１９９９））。少なくともいくつかの態様において、Ｏｃｔ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびＶＰ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）活性化ドメイン由来のコア配列は、それらの有効性を最大にするための新しい配列で結合する。
【００５０】
また、エフェクタの形状は天然のポリペプチド鎖に限定されないことが企図される。少なくともいくつかの態様において、ポリグリコールスペーサが個々のコアペプチド配列間に導入される。このことは、分子量を著しく増加させずに、立体構造の柔軟性および他の蛋白質と相互作用する能力を増加させる。
【００５１】
いくつかの他の態様において、活性化ドメインのより低い質量および／またはより高い潜在能力は、２次構造を安定化させる非天然アミノ酸の取込により得られる。たとえば、短いアルファへリックス構造は側鎖ラクタムブリッジに側鎖を導入することにより安定化させることができる。これらの構造の制約条件が、より長い、非修飾ポリペプチド鎖の構造および活性の大部分を保持する、さらに短いペプチドを導いてもよい。本発明の少なくともいくつかの態様において、エフェクタは転写を抑制するために選択される。抑制因子ドメインの結合、すなわち抑制因子ＡＴＦｓの合成が企図される。天然の転写因子は一般に活性化ドメインまたは抑制ドメインを含み、いくつかの場合それらは活性化および抑制ドメインを共に含んでいてもよい（Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚ．，Ｌｅｅ，Ｉ．Ｋ．Ｌｏｃｋｅ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．＆Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６，２４６４−７２（１９９８）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，Ｗ．Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：６０４６−５５（１９９４）；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．＆Ｈｅｒｒ，Ｗ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，６０５６−６７（１９９４））。抑制因子ドメインを含む転写因子は、活性化因子ドメインを含む転写因子と類似した様式で機能する、すなわち、それらは共に、ＲＮＡ転写にそれらの作用を及ぼすためにプロモータＤＮＡの近くにそれぞれのドメインを運ぶ必要がある（Ｐｔａｓｈｎｅ，“Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｗｉｔｃｈ：Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（１９９２）；およびＰｔａｓｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｏｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ“．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：５６９−５７７（１９９７））。転写活性化因子とは対照的に、転写抑制因子のプロモータへの結合は、ＲＮＡ転写レベルの低下を生じる。この作用は、各種の異なる機序を通じての、ポリメラ−ゼＩＩホロ酵素複合体の構築による転写抑制因子ドメインの妨害により引き起こされる。これらの機序はヒストン脱アセチル化によるクロマチン構造の再配列から、活性化ドメインの作用の妨害までに及ぶ（Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ６，１９２−７（１９９０）。Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｐｕｔｎｅｙ，Ａ．，Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ，Ｆ．Ｅ．＆Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ＮＭｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １４，９００−１４（２０００）；Ｂｕｓｃｈ，Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．，Ｂａｎｉａｈｍａｄ，Ａ．，Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．＆Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１，３７９−８９（１９９７））。抑制因子ドメインは非常に多様で、構造の特徴をほとんど共有しないが、標的遺伝子転写に対するそれらの最終的な作用は大部分類似する。
【００５２】
ＡＴＦの概念に匹敵する多くの抑制ドメイン、たとえばショウジョウバエ転写抑制因子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄおよびＫｒｕｐｐｅｌ由来の抑制ドメイン、およびヒト抑制因子蛋白質ＭａｄＩがある（Ｌｉｃｈｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｈａｎｎａ−Ｒｏｓｅ，Ｗ．，Ｒｅａｄｄｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｍ．Ａ．，Ｒｏ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｓｅｌ，Ｍ．，Ｓｈａｋｎｏｖｉｃｈ，Ｒ．＆Ｈａｎｓｅｎ，Ｕ．（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４，４０５７−６６；Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．Ｋ．，Ｖｉｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．＆Ｒａｕｓｃｈｅｒ，Ｆ．Ｊ．，３ｒｄ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１，４５０９−１３；Ｈａｎ，Ｋ．＆Ｍａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７，４９１−５０３；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｅｇｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｅｒ，Ｂ．＆Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１４６２８−３３；Ｅｉｌｅｒｓ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｊ．＆Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３２７５０−６））。これらの抑制因子は異なる作用機序を有するが、それらはすべて以下の一様な特性を有する：（ｉ）多様な活性化因子を抑制し、結合部位から離れた位置で作用する能力；（ｉｉ）移動可能（異なるＤＮＡ結合部分に移動しても機能を維持すること）；および（ｉｉｉ）比較的小サイズ。たとえば、ヒト蛋白質ＭａｄＩ抑制ドメイン由来の１３アミノ酸ペプチドは、異種ＤＮＡ結合ドメインと融合すると抑制機能を与えることができる（Ｅｉｌｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｂｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｊ．＆Ａｙｅｒ，Ｄ．Ｅ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３２７５０−６）。合成されたペプチド配列はこれらの抑制因子に由来し、活性化因子ＡＴＦｓに関して本明細書に記載され、示された抑制因子ＡＴＦｓを実質的に作製するために使用してもよい。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抑制に関する転写アッセイは、たとえばＡＴＦおよびＧＡＬ４結合部位を共に含む鋳型により行ってもよい。抑制因子ＡＴＦｓは、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合した他の強力な活性化ドメインにより媒介される転写活性化を阻害する能力に関して試験される。あるいは、抑制に関するアッセイは、ＣＭＶ極初期エンハンサ−プロモータのような、基礎転写の構成的高レベルを有するプロモータ中に取り込まれたＡＴＦ結合部位を含む転写鋳型により行われてもよい（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １０，４４０４−１１（１９９０））。この場合、ＡＴＦ抑制因子のプロモータへの結合はＲＮＡ転写を減少させ、そして転写活性化のための付加的な結合部位の存在は必要でない。
【００５４】
“人工抑制因子”という用語は、プロモータへの転写因子の結合の阻害に関与する研究方法を示すために使用されている（Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７０−８１（１９９２）；Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：７２５−７３０（１９８９）；およびＬａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５８−６３（１９９６））。これは、トリプルへリックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯｓ）、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）または同じ部位に結合する特定の転写因子に対抗するように設計された、いくつかの他の配列特異的非ペプチドＤＮＡ結合分子によりもっともしばしば得られる。“受動的”抑制因子という用語は、これらの既知の人工抑制因子分子およびそれらの作用様式を説明するために本明細書で使用される。受動的抑制因子に関するきわめて重要な必要条件は、その結合部位が指定の遺伝子の発現に必要な転写因子（またはいくつかの他の蛋白質）の結合部位に非常に近いか、または重複して位置することである。したがって、受動抑制は、これらのまれな重複結合部位の配列を含む天然のプロモータ上でのみ可能である。対照的に、本明細書に記載のように非ペプチドＤＮＡ結合部分への“活性な”抑制因子部分の結合は、人工抑制因子（抑制因子ＡＴＦｓ）による、より高い柔軟性および転写抑制の効率を与えるであろう。たとえば、プロモータのいずれかの部位への抑制因子ＡＴＦｓの結合は転写を抑制する、なぜならば、ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄまたはＫｒｕｐｐｅｌのような典型的な抑制ドメインは結合部位から長い距離にわたって作用することができるからである。したがって、上記の “受動的”抑制因子についてのように、プロモータ内の抑制因子ＡＴＦｓの結合部位の正確な位置はそれらの作用に関して重要ではない。そのため、抑制因子ＡＴＦｓは受動的人工抑制因子より多様な遺伝子のタ−ゲッティングを可能にする。言い換えれば、ＡＴＦ概念は予言可能な様式で標的遺伝子の転写を調節するための、プロモータへの“活性な”転写エフェクタ（活性化因子または抑制因子）の送達のための新しい方法として説明することができる。ＡＴＦｓは完全に人工（合成）分子であるため、本発明はプロモータへの送達、および完全に人工的な多様な化学部分が、選択された（標的）遺伝子の転写を調節するための能力の試験を可能にする。
【００５５】
ＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインは、フレキシブルリンカー、Ｂを介して、結合（たとえば共有結合）する。本明細書のＡＴＦのリンカーＢ部分は、最小の長さおよび最大の柔軟性を有するため、ＤＮＡ鋳型上のプロモータの近くの認識部位にＤＮＡ結合ドメインが結合するとき、ＡＴＦの調節部分またはドメインはＤＮＡ鋳型から最小の距離内で比較的自由に拡散することが可能であり、細胞の転写装置の各種成分の表面、より具体的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素の蛋白質成分の表面と分子的に相互作用をすることができる。あるいは、エフェクタは酵素または他の転写因子を調節する、ヒストン、ヒストン修飾酵素、または他の転写因子のような、転写調節に関与する他の蛋白質と相互作用してもよい。本発明の少なくともいくつかの態様において、リンカーはエフェクタ部分がＤＮＡの表面より上を自由に動けるような、柔軟性および長さを有する。
【００５６】
少なくともいくつかの態様において、本発明のフレキシブルリンカーは少なくとも長さ５オングストローム、１０オングストロームもしくは１５オングストローム、または少なくとも１５オングストローム、または少なくとも２０オングストローム、または少なくとも２８オングストロームである。リンカーの長さは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素または他の関連する蛋白質と相互作用（結合）するためにエフェクタドメインが近づきやすいように選択されてもよい。リンカーの長さは、とりわけ、ＤＮＡ鋳型におけるＤＮＡ結合ドメインの位置および配向性、またはエフェクタドメインの化学組成に依存して変化してもよい。リンカーは２つのドメイン間の鎖（骨格）に少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも３０原子を含んでいてもよく、そして５０まで、または１００原子までを含んでいてもよい。
【００５７】
結合基は、主に炭素、水素、窒素、酸素、硫黄およびリンからなる。適切なリンカーはポリグリコール、もしくは他のポリアルコキシ部分、またはヌクレオチドモノマー由来のオリゴマーのようなフレキシブル部分、天然または非天然アミノ酸および低級アルキル、ならびに好ましくは酸素含有有機部分を含む。リンカーは好ましくは低分子量、化学的に不活性および水溶性である。少なくともいくつかの態様において、リンカーは酸素含有部分であり、それは親水性を改善し、そして一般に薬物開発に好ましい。
【００５８】
リンカーはＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメイン間のフレキシブルな結合状態であり、他のドメインがそれらの意図した機能を果たしながら、２つのドメイン間の結合状態が存在するように選択される。リンカーは最適な幾何学的配置を可能にし、したがってＡＴＦｓの潜在的な生化学的活性を最大化するため、ＡＴＦ組成物の重要な成分である。リンカーはＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインに共有結合した部分である。共有結合には、アミド、炭酸誘導体、エ−テル、有機および無機エステルを含むエステル、アミノ、ウレタン、尿素などのような各種官能基を使用してもよい。結合を提供するために、具体的なドメイン、たとえばＤＮＡ結合ドメインまたはエフェクタドメインが、たとえば酸化、ヒドロキシル化、置換、還元などにより修飾され、リンカーとの結合部位を提供してもよい。ドメインは、慣用のペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチド反応に感受性のある、反応性アミン、カルボン酸、ヒドロキシ、またはチオール基などで停止してもよい。ドメイン機能を著しく変化させないドメインに対する修飾が好ましいということは理解されるであろう。ドメインに依存して、リンカーを介してのカップリングに利用可能な多数の部位があってもよい。２つのドメインの細胞機能を妨害しない限り、いずれの適切なリンカーおよびリンカーカップリングを使用してもよい。
【００５９】
少なくともいくつかの態様において、自動化学合成でのＤＮＡまたはＰＮＡの合成中に、リンカーがＤＮＡまたはＰＮＡ鎖に容易に含まれてもよい。そのように取り込まれてもよい１部分は、ポリグリコールスペーサである。たとえば、ポリグリコールスペーサはＤＮＡ結合ドメインの末端に結合し、反応基は末端の第１アミンを生じる修飾されたチミジンの添加により、ポリグリコールリンカーの末端に提供される（図２を参照されたい）。
【００６０】
少なくともいくつかの態様において、リンカーをＤＮＡ結合またはエフェクタドメインのいずれかに結合させるために２官能橋かけ剤が使用される。適切な橋かけ剤は、２つの標的基を結合させることができる小さい２官能分子を含む。標的基は一般に上記の官能基である。代表的なチオール−チオール橋かけ基はジブロモビマンを含む。代表的なアミン−アミン橋かけ基はビス（スクシニミジルエステル）、たとえば５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）のビス（スクシニミジルエステル）、またはエチレングリコールビス（コハク酸）を含む。代表的なアミン−チオール橋かけ剤はアミン反応性マレイミドおよびヨ−ドアセチミド誘導体、たとえばスクシニミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレ−ト、スクシニミジル３−マレイミジルベンゾエ−ト、スクシニミジル６−マレイミジルシクロヘキサノエ−ト、または４−ニトロへニルヨ−ドアセテ−トを含む。
【００６１】
アミンおよびカルボン酸基のカップリングも、最終産物に取り込まれない橋かけ剤、“ゼロ長”橋かけ剤により促進されてもよい。代表的な物質は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび２−エトキシ−１−エチキソカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンを含む。
【００６２】
図２Ｂに図式で示した成分を使用して設計し、合成された代表的なＡＴＦを図２Ａに示す。ＤＮＡ結合ドメインは、修飾されたトリプルへリックス形成オリゴヌクレオチドに基づいて設計された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
【００６３】
【化５】
2004533804.tif 000008
の２２塩基配列は、生理的ｐＨでトリプルへリックス複合体を形成することにより、対応する標的２本鎖配列に結合する（Ｓｋｏｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒｓ  Ｂｙ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２１３１−２１３８（１９９３））。長く（たとえば１５オングストロームより長い）フレキシブルなポリグリコールリンカーは自動化学合成により５’または３’末端のいずれかに導入された。これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
【００６４】
【化６】
2004533804.tif 000009
およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７
【００６５】
【化７】
2004533804.tif 000010
の塩基配列を有する２つの分子を合成することにより得られ、そしてここでＸはＳｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８（ヘキサエチレングリコールスペーサ、Ｇｒｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２８２５  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ  ２０１６４）を表し、そしてＹは短いテザ−上に第１アミン基を生じるチミジン残基を表す（Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６−ｄＴ，Ｇｒｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。この第１アミンは分子の残部に影響を与えない各種化合物と反応することができる。このことは、修飾された残基が各種機能的ドメイン（“エフェクタ”）のカップリングのための“アンカ−”として役立つことを可能にし、その活性はその後転写アッセイにおいて試験することができる。エフェクタは合成ペプチド、非天然ペプチド（天然に存在しないアミノ酸を有する）、または非ペプチド有機分子であってもよい。
【００６６】
本発明のＡＴＦｓは標的遺伝子の発現を調節することにおいて有用である。標的遺伝子は細胞により分泌されるいずれの遺伝子であってもよく、その結果コ−ドされた産物が随意に利用可能になってもよい（または抑制されてもよい）。多くの遺伝子の転写はｉｎ  ｖｉｖｏで、正または負に調節されていることが見出されるが、しばしば“ハウスキ−ピング”として呼ばれる他の遺伝子の基礎レベルは細胞の寿命中、比較的一定であってもよい。さらに、任意の遺伝子の調節は、発達のある段階において正常細胞に発現されるときだけ、一時的に特異的であってもよいか、またはある組織または細胞または器官型において発現されるときだけ、組織特異的であってもよい。
【００６７】
ネスチン、またはＩＩ型コラゲナーゼのようなメタロプロテイナーゼの遺伝子のような、一時的に調節される遺伝子は、正常細胞では胎児発達中に発現されてもよいが、ネスチンの場合は脳腫瘍またはメラノーマにおいて、またはＩＩ型コラゲナーゼの場合には腫瘍の転移中にアップレギュレートされてもよい。あるいは、胚ヘモグロビンの遺伝子のような胎児遺伝子が、鎌状赤血球貧血のような各種貧血型疾患において、不十分な成人ヘモグロビンと置換するために現れてもよい。
【００６８】
これらおよび多くの他の適用のために、プロモータ特異的人工転写因子（活性化因子または抑制因子）、とりわけ薬物として、たとえば腫瘍特異的遺伝子を取り除くための負の人工調節因子として作用することができる低分子量のものが提供される。治療薬として有用なＡＴＦは、経口的に投与するため、および対象の標的細胞に透過するために十分低い分子量のものである。
【００６９】
医薬組成物
別の側面において、本発明は１以上の薬剤的に受容できるキャリアと一緒に製剤される、本発明の１以上のＡＴＦ組成物の治療的有効量を含む、薬剤的に受容できる組成物を提供する。本明細書に記載の医薬組成物および方法は本発明の１以上のＡＴＦ組成物を含んでいてもよい。
【００７０】
本明細書で使用する“治療的有効量”という句は、たとえば遺伝子発現の調節のような、意図した機能を生じる、ＡＴＦ組成物に対して有効な、ＡＴＦ組成物、またはそのようなＡＴＦ組成物を含む組成物の量を意味する。有効量は、治療または阻害される細胞増殖の型、ＡＴＦ組成物の具体的な型、対象のサイズ、または望ましくない細胞増殖または活性の程度のような因子に依存して変化してもよい。当業者は、前述の因子を研究し、不適切な実験をしないでＡＴＦ組成物の有効量に関する決定をすることができるであろう。
【００７１】
“薬剤的に受容できる”という句は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギ−反応、または他の問題もしくは合併症を起こさずに、ヒトおよび動物組織と接触しての使用に適した、適切な利益／リスク比に対応する、化合物、および／または剤形を含むＡＴＦ組成物を表すために本明細書で使用される。
【００７２】
本発明のＡＴＦ組成物は、遊離型、または適宜、塩型で存在してもよい。薬剤的に受容できる塩およびそれらの製剤は、当業者には公知である。そのような化合物の薬剤的に受容できる塩は、たとえば無機または有機酸もしくは塩基から形成される化合物の慣用の非毒性塩、または４級アンモニウム塩を含む。本発明の化合物は、水和物または溶媒和物を形成してもよい。荷電した化合物を水と共に凍結乾燥すると水和種を形成すること、または適切な有機溶媒と共に溶液中で濃縮すると溶媒和種を形成することは、当業者には既知である。
【００７３】
特定の疾患または状態の治療または予防に効果的である化合物の量は、疾患または状態の性質に部分的に依存し、標準臨床技術により決定することができる。さらに、至適投与量範囲を同定するのを容易にするためにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用してもよい。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物試験系に由来する用量−反応曲線から推定してもよい。的確な投与量レベルは、主治医または他の健康管理者により決定されるべきであり、投与経路、ならびに年齢、体重、性および一般的な個人の健康状態；疾患の性質、重症度および臨床段階；付随する治療の使用（または不使用）；および患者の細胞の遺伝子工学的操作の性質および程度を含む、既知の因子に依存するであろう。
【００７４】
本発明はまた、医薬品パッケ−ジ、およびＤＮＡ結合ドメインに共有結合したフレキシブルリンカーを有する前駆体組成物を含む、１以上の成分を持つ１以上の容器を含むキットを提供し、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータ前駆体組成物において転写を調節するために十分な、ＤＮＡ鋳型上の部位への親和性を有するＤＮＡ結合ドメインは、転写における組成物の活性を評価するために、前駆体化合物を興味のある試験化合物と結合させるために使用することができる、反応性末端基を含む。キットはまた、ＤＮＡ鋳型を含む転写混合物、およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成する真核細胞ＲＮＡポリメラーゼを含む。場合により、本発明の方法に記載の前駆体組成物を使用するための取り扱い説明書がキットに付いていてもよい。
【００７５】
アッセイ
本明細書に記載の実験系を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学的付加物の活性化または抑制の可能性を試験するために使用してもよい；しかし、本明細書に記載の本発明の付加的な態様はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを含む。本明細書に記載の実験系は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで共に使用することができる線状（一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）または環状プラスミド鋳型からの転写を活性化する。たとえば、プロモータＤＮＡへのＡＴＦの結合は環状（プラスミド）ＤＮＡ転写鋳型を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、得られた予め形成されたＡＴＦ−鋳型複合体は、トランスフェクション、エレクトロポレ−ション、リポソ−ム補助技術などを含む各種形質転換法により組織培養に導入される。開始部位から下流に転写されるレポーター遺伝子からｉｎ  ｖｉｖｏで生じたＲＮＡ転写物（すなわち、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）の定量が、試験されるＡＴＦの活性を明らかにする。あるいは、転写鋳型を有する安定なプラスミドを含む細胞の試料がＡＴＦにより処理される。この場合、鋳型プロモータの対応する部位へのＡＴＦの結合はｉｎ  ｖｉｖｏで起こる。比較的小さく、一般に非ペプチド分子であるため、ＡＴＦはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる透過に類似した様式で細胞膜を透過する。ＡＴＦの存在下および非存在下における細胞のレポーター遺伝子活性は、転写活性化または抑制の程度を表す。
【００７６】
本発明のＡＴＦは、転写調節因子としての活性に関して試験化合物をアッセイするための方法に使用される。方法は以下のことを含む：試験組成物を提供するためにＤＮＡ結合ドメインに共有結合するフレキシブルリンカードメインに試験化合物を共有結合させること（ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおける転写を調節するために、ＤＮＡ鋳型上の部位に十分な親和性を有する）；ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、他の蛋白質を介して直接的、または間接的に試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物を試験組成物と接触させること；および試験組成物の非存在下での基礎レベルに比較して、試験組成物存在下で産生されたＲＮＡの量を測定すること、ここでＲＮＡの量は転写活性化因子としての試験組成物の活性の尺度である。いくつかの態様において、ＤＮＡ結合部位は複数の結合部位配列の反復である
合成されたＲＮＡは任意の慣用の検出系を使用して定量してもよい。ＲＮＡ産物の定量のためのそのような系は、先行技術で公知である。
【００７７】
本発明のＡＴＦ組成物は先に記載の治療的適用だけでなく、新規ＡＴＦｓのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング系を開発するために使用してもよい（ｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスジェニック細胞の的確な調節）。たとえば、安定なトランスフェクトされた細胞系統を、一過性のトランスフェクション（以下のｉｎ  ｖｉｖｏ実験において本明細書に記載される）のかわりに、染色体に導入されたレポーター構築物により作製してもよい。したがって、任意の新規ＡＴＦをこのレポーター遺伝子を活性化するか、または抑制する能力に関して試験してもよい。また、内因性遺伝子を標的として使用してもよいが、この場合シグナルはＤＮＡアレイ（チップ）上で検出される。
【００７８】
高密度ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（“ＤＮＡチップ”）は多くの異なる遺伝子の発現を同時にモニターし、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの拡大を可能にする、なぜならそれは個々のＡＴＦ設計の有効性についての手がかりを提供できるからである。たとえば、組織培養細胞のＡＴＦによる処理後の遺伝子発現パタ−ンの初期の変化のモニターは、ＡＴＦによりどの遺伝子が直接影響されるかを明らかにする。ゲノムにおけるＡＴＦ標的はプロモータの配列についての事前の知識なしに同定することができる。遺伝子発現の相対的レベルはまた、個々のエフェクターの活性に関する有用な情報を提供する。この様式において、将来における可能な医学的適用のための潜在的な遺伝子標的の同定とともに、ＤＮＡ結合ドメインおよびエフェクタドメインの両方が同時に非常に詳細に特徴付けられる。マイクロアレイ解析は１つの細胞型に限定されない；酵母からヒトまでの多くの多様な真核細胞のための検出キットが市販されている（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）．
本発明のＡＴＦ組成物は上記のような各種適用に使用してもよく、とりわけ遺伝子治療において使用してもよい。多くの例において、随意に治療遺伝子のスイッチをオンまたはオフする能力、または正確に発現を滴定する能力が治療効果にとって重要である。本発明は、ヒト遺伝子治療において治療標的遺伝子が調節された発現を行うためにとりわけよく適する。
【００７９】
本発明はさらに以下の実施例において説明され、それらは説明のためだけに提供され、本発明を限定することを意図せず、明細書に続く請求項において完全な範囲が示される。
【００８０】
実施例
実施例１．ＡＴＦの設計および合成
これらの実験において、エフェクタドメインは、天然に見出される最も強い転写因子の一つである単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６の十分に研究された活性化ドメインに由来する一連の合成ペプチドであった。これらのペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８
【００８１】
【化８】
2004533804.tif 000011
の２９アミノ酸配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のＶＰ１６アミノ酸配列の２つのコピーに結合したシステイン残基を有する。ＶＰ１６アミノ酸の２重コピーを含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８はＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合したとき、全長ＶＰ１６の活性の約７０％を保持する（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｏｔｉｏｎ  Ｆｒｏｍ  Ｒｅｍｏｔｅ（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）  Ａｎｄ  Ｐｒｏｘｉｍａｌ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４９６１−４９６８（１９９２）；およびＮｙａｎｇｕｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３４０２−１３４０６（１９９７））。チオールを持つシステイン残基はアミノ末端に添加され、ＡＴＦ分子の残部に結合するための結合点となる。
【００８２】
すべてのペプチドは標準ＦＭＯＣ化学を使用して、自動ペプチド合成機上により合成された（Ｂａｒｂｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ  Ｓｕｆｆｉｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ８１：３５９−３６８（１９９５））。ペプチドとオリゴヌクレオチドの化学的結合はＦｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから得た２官能橋かけ剤、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル６−マレイミジルヘキサノエ−トの使用により行った（図２Ａを参照されたい）。この市販の橋かけ剤は６炭素鎖で隔てられた２つの官能基を有し：コハク酸のエステルは特異的に第１アミンと反応し、そしてマレイミド官能基はある条件下でチオールと特異的に反応する。カップリング反応は連続した段階で行われた。２つの基のうちエステル基はより不安定なため、橋かけ剤は初めにオリゴヌクレオチドの第１アミンと結合する。過剰な橋かけ剤はクロロホルム抽出およびエタノ−ル沈殿により除去された。第２の段階はペプチドのチオール基と橋かけ剤のマレイミド官能基間の反応に関連した。過剰なペプチドおよび未反応ＤＮＡの結合物の精製は逆相ＨＰＬＣにより行った。精製されたアリコ−トは凍結乾燥機で乾燥し、続いて超純粋（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に溶解し、−７０℃で保存した。
【００８３】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を有する２つの２６塩基オリゴヌクレオチド５’をアニーリングし、結合させて、トリプルへリックス形成のための複数の結合部位を含む一連の２本鎖ＤＮＡフラグメントを得た。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の２本鎖に示された部位の５コピーを含むフラグメントはアガロースゲル電気泳動により精製し、ＧＳＥ４Ｔシリーズの転写鋳型の態様のポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挿入された。
【００８４】
図３は転写鋳型のプロモータ領域を示す。図３Ａでは、対照鋳型は調節された転写のためのプロモーターを含み、＋１転写開始部位に関してそれぞれ−５３および−１５５ｂｐにおいて５ＧＡＬ４および５ＡＴＦ結合部位は当該プロモータに取り込まれており；そして図３Ｂでは、ＡＴＦアッセイ鋳型は−６５ｂｐにおいて取り込まれた５ＡＴＦ結合部位を含む。
【００８５】
得られたプラスミドは、ＥｃｏＲＩによる消化により線状にし、精製し、そして線状鋳型は超純粋中に−２０℃で保存した。転写アッセイは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  ＫＣｌを含む結合バッファー中、ＡＴＦｓと２００ｎｇの線状転写鋳型を室温で２４時間インキュベートすることにより開始した。結合反応の総容積は５マイクロリットルであった。結合反応後、塩およびバッファー状態を水５マイクロリットル、１Ｘ  ＨｅＬａバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、２０％  グリセロール）６マイクロリットル、およびにＨｅＬａ核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）５マイクロリットルの添加により調整した。ＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質のアリコート（全部で１マイクロリットル）を対照鋳型に添加し、すべての反応物を３０℃で１０分間インキュベートした。転写はリボヌクレアーゼトリホスフェ−ト（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）および３２Ｐ−α−ＵＴＰ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）０．５マイクロリットルの混合物１マイクロリットルの添加により開始した。さらに３０℃で３０分間インキュベーション後、すべての転写反応は停止バッファー（０．５Ｍ  酢酸ナトリウム、０．２％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１マイクログラム／ｍｌ  グリコーゲン、１マイクログラム／ｍｌ  プロテイナーゼＫ）１００マイクロリットルの添加により停止した。反応物を撹拌し、３７℃で１０分間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出し、氷冷エタノール２５０マイクロリットルで沈殿させた。ペレットを標準変性用ホルムアルデヒド／色素混合物２０マイクロリットルに溶解し、変性用６％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、流した。
【００８６】
結果は図４に示す。レーン１およびレーン２は対照鋳型由来の対照融合蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６による活性化を示し（図４Ａ）、他のすべてのレーンはＡＴＦアッセイ転写鋳型由来のＡＴＦによる活性化を表す。各試料の正しい開始部位で開始された２５０塩基転写物を以下に示す。レーン１は対照転写鋳型由来の任意の転写因子非存在下での基礎転写のレベルを示す。レーン２は対照融合蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６の添加が、対照鋳型からの著しい転写量の増加を生じることを示す。レーン３はＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の基礎転写を示す。レーン４〜７は予想されるように、ＡＴＦ値の増加量の関数としての転写活性化を示す。レーン５、６、および７はレーン４よりそれぞれ５倍、１００倍および５００倍多いＡＴＦを含む。曲線は“ベル曲線”反応における結果を示す。ＡＴＦの至適濃度（レーン５）において、転写活性化のレベルは対照活性化因子蛋白質ＧＡＬ４−ＶＰ１６存在下において対照鋳型から観察された活性化の最大レベルより高くはないとしても、それに相当する。
【００８７】
図４の結果は、天然の活性化因子ＶＰ１６はＧＡＬ４結合部位に結合して融合ＧＡＬ４−ＶＰ１６を生み出し、５ＧＡＬ４結合部位を含む対照鋳型からの転写を強力に活性化したことを示す。＋１転写開始部位で開始された流出転写物は２５０ｂｐ長である（図４の矢印で示される）。同時に、ＡＴＦ（２９）はプロモータ中に５ＡＴＦ結合部位を含む鋳型からの転写を活性化することができる。ＡＴＦ（２９）は対照鋳型または他のＡＴＦ結合部位を欠如する鋳型からの転写を活性化しないため、その活性は、プロモータの対応する結合部位の存在に完全に依存する（データは示さない）。ＲＮＡ転写物の比較は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＡＴＦが共にＴＡＴＡボックスに隣接するプロモータの同じ、“正しい”（＋１）部位から転写を開始することを確証する。もっとも意外なことには、ＡＴＦ（２９）による転写活性化の最大レベルはＧＡＬ４−ＶＰ１６により得ることのできるレベルに匹敵した。たとえば、ＲＮＡ転写物の定量は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６およびＡＴＦ（２９）が基礎レベルの３０〜４０倍転写を活性化することを示す（図４）。この結果は以前報告された５ＧＡＬ４結合部位を含む線状鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＡＬ４−ＶＰ１６による転写活性化の最大レベルに対応する（Ｈａｉｌｅ，Ｄ．Ｔ．＆Ｐａｒｖｉｎ，Ｊ．Ｄ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，２１１３−７）。これらの活性化のレベルはＡＴＦ濃度２０〜４０ｎＭ間で得られ、濃度のそれ以上の上昇は活性化の減少を導く（図４）。このデ−タはまた、強力な天然の活性化因子とＡＴＦとの別の類似性：転写活性化を“抑制する”能力を示し、これはおそらく過剰な強力な量の活性化因子による転写装置の標的成分の隔離によるものであろう（Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，６８３−９）。活性化および抑制能は共に結合するＡＤペプチドの存在に完全に依存する。なぜならＡＤを欠如する“切断”ＡＴＦｓは完全に不活性であることが証明されたからである。
【００８８】
Ａ．十分に機能的で、非常に強力なＡＴＦｓ．
遺伝子産物を標的にする多くの成功した薬物があるが、遺伝子自体の薬剤的タ−ゲッティングのための効果的で実用的な方法は今まで存在しない。転写レベルでの遺伝子発現の操作は、基礎的な調節機序が大部分の真核細胞遺伝子に共通であるため、薬物開発に高い可能性を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｇ．（２０００）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５７，１１４９−６０）。原則として、特定の遺伝子の転写を調節するために設計された小分子薬物は、そのＤＮＡ結合部分をわずかに修正することにより、異なる遺伝子に類似した作用を引き起こすことができる。したがって、特定の遺伝子を活性化または抑制することができる細胞透過性薬物は、医学的に興味のある多くの異なる遺伝子に適用可能な、一般的な治療方法の基礎を形成することができる。
【００８９】
この分野の進歩は、効果的なＡＴＦを設計することが主な難問であるという事実により妨げられてきた。たとえば、合成ペプチドとポリアミドＤＮＡバインダ−を結合させる以前の試みは、最小の溝によりＤＮＡに結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは非常に低い活性を示す転写活性化因子を生じた（Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。これらの研究はＧ−ｌｅｓｓカセットを含むレポーター遺伝子だけを使用するため、ＲＮＡの全体的な増加が特異的または非特異的（すなわち、任意）転写開始によるためであるか否かは明らかでない。
【００９０】
しかし、ＡＴＦの新規手段としての有用性を示し、初めての実用的適用を開発するためには、一般に使用される天然の転写因子の生物学的活性および特異性に近いものを得ることが必要である。本研究の結果は、（ｉ）正しい部位からのＲＮＡ転写を開始し、そして（ｉｉ）ＧＡＬ４−ＶＰ１６のような強力な転写活性化因子蛋白質に匹敵する生物学的活性を有する、十分に機能的なＡＴＦを設計することが可能であることを初めて示した。
【００９１】
Ｂ．活性化の効果はＡＴＦの化学構造に依存する。
非常に強力なＡＴＦの設計は、いくつかの分子設計および合成の繰り返しにより行われた。いずれか特定の機序に束縛されることなく、リンカーの化学構造（とりわけ、長さおよびフレキシビリティ−）は転写装置へのエフェクタの最適な提示において重要な役割を果たすと考えられる。すなわち、長くフレキシブルなポリグリコール鎖とより剛性で疎水性のヌクレオチド−橋かけ剤構造との組合せは転写因子の分子形状をとりわけよく模倣することができると考えられる。実際、図３および４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイは、ＡＴＦｓがＧＡＬ４−ＶＰ１６よりいっそう強力な転写活性化因子であってもよいことを暗示する。たとえば、ＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質はダイマーとしてプロモータの５部位のそれぞれに結合するが、ＡＴＦ分子はモノマーとして対応するトリプル−へリックス標的部位に結合する（Ｃａｒｅｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０９，４２３−３２）。しかし、プロモータに結合した５ＡＴＦ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０ＧＡＬ４−ＶＰ１６分子に匹敵する類似した転写への作用を引き起こす（図４）。ＡＴＦ分子のこの高い効力は、かさ高い蛋白質ドメインを持たないため、エフェクタがより多く暴露されたまま、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素および／または他の蛋白質と相互作用する、単純に伸長した化学構造のためであってもよい。暴露されたエフェクタは、事実上プロモータへのホロ酵素の補充およびＲＮＡ転写の開始を促進するであろう。この結論は、ＶＰ１６由来の１４−マーペプチド（図２Ａ）が組換えＤＮＡ技術によりＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合したとき不活性であることを示す以前の仕事に一致する（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。対照的に、本研究は同じ１４マーペプチド配列がＡＴＦの環境内で著しい生化学的活性を示すということを示した。
【００９２】
実施例３．ＤＮＡ結合ドメインの３’末端に共有結合したリンカーを有するＡＴＦ
強力な正の転写エフェクタである（図４、レーン３〜７）図２ＡのＡＴＦは、ＤＮＡ結合ドメインの５’末端を介してリンカーＢに共有結合したＤＮＡ結合ドメインＡを有する。ポリリンカーは３’末端に結合し、そしてこのＡＴＦも強力な正の転写エフェクタ活性を示した（図４，レーン８〜９）。レーン８は３’Ａ−Ｂ−Ｃ構造ＡＴＦにより媒介される転写を示し、レーン９は量が５倍増加した転写を示す。鋳型に対する任意のエフェクタの非存在下における基礎レベルを示すレーン３に見られる２５０ｂｐ流出転写物の量と比較したレーン８の量は、活性化ドメインへのフレキシブルポリリンカーの共有結合が強力なＡＴＦである形状を提供することを示す。〔リンカーの存在は、他の形状と対比したとき、正の機能における役割を果たす（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。〕  実施例４．Ｌ−およびＤ−アミノ酸活性化ドメインならびに３’および５’結合ＤＮＡ結合ドメインを有するＡＴＦ。
【００９３】
本実施例は本発明のＡＴＦ組成物の多能性を示し、ドメインに対する活性化因子の両Ｌ−およびＤ−版ならびに３’および５’結合ＤＮＡ結合ドメインの機能を証明する。
【００９４】
Ａ．ＡＴＦｓの合成
ＴＦＯへのリンカーの導入はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（５’ＡＴＦｓに対して）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（３’ＡＴＦｓに対して）の配列を有する２つの分子を合成することにより行われ、ここでＸはＳｐａｃｅｒ  Ｐｈｏｓｐｏｒａｍｉｄｉｔｅ  １８（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を表し、Ｙは短いテザ−上の第１アミン基を持つ修飾されたＴ残基を表す（ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ２−ｄＴ，Ｇｌｅｎｎ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【００９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸の配列を有する２９マーペプチドの２つの異なる形状（Ｌ−およびＤ−）の合成は標準法により行った（Ｎｙａｎｇｕｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３４０２−６（１９９７）；およびＳｔａｎｏｊｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：４５０−４５７（１９９５））。ＡＴＦ分子の残部へのペプチドの化学結合は、実施例１に記載のように、２官能橋かけ剤、スクシニミジル６−マレイミジルヘキサノエートの使用により行った（ＥＭＣＳ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。
【００９６】
Ｂ．転写アッセイ．
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のための鋳型は、ＧｎＥ４Ｔ系列の転写鋳型のポリリンカーにおけるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位へのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
【００９７】
【化９】
2004533804.tif 000012
の配列を有するトリプルへリックス結合ＤＮＡ配列の５直接反復の挿入により作製された（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５Ａ：６５９−６６４（１９８８））。プラスミドは、ＥｃｏＲＩおよび／またはＨｉｎｄＩＩＩによる消化により線状にし、鋳型へのＡＴＦｓの結合は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ  ＫＣｌを含む結合バッファー中で、ＡＴＦｓと２０〜１００ｎｇの線状ＡＴＦ転写鋳型を室温で２４時間インキュベートすることにより開始した。ＡＴＦｓとプロモータ間の至適複合体形成のために十分なインキュベーション時間が与えられた。次に希釈したＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質のアリコ−ト（全部で１マイクロリットル）を対照鋳型に添加し、すべての反応物を３０℃で１０分間インキュベートした。転写反応は標準法（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）を使用してＨｅＬａ粗核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに行った。最終ＲＮＡ転写物を６％変性用ポリアクリルアミドゲル上で分析した。乾燥したゲルをＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳフィルムおよびＦｕｊｉ  Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ｐｌａｔｅｓの両方に暴露した。シグナルの定量はＦｕｊｉ  ＭａｃＢＡＳソフトウェアにより行った。
【００９８】
図５は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６ならびに次のＡＴＦｓ：３’ＡＴＦ、５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）による転写活性化の並列比較を示す。レーン２、４、５、６および７の比較は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏですべてのＡＴＦｓが少なくともＧＡＬ４−ＶＰ１６と同様に強力に転写を活性化できることを示す。３’ＡＴＦおよびＧＡＬ４−ＶＰ１６による活性化の比較は、３’ＡＴＦも転写に非常に強力な効果を有することを示す。わずかに異なる化学的形状を有するにもかかわらず、５’ＡＴＦと３’ＡＴＦはそれらの生物学的作用、すなわち活性化強度および抑制能力において非常に類似する。さらに、図５の結果は、Ｄアミノ酸からなる活性化ドメインにより合成されたＡＴＦｓも強力な転写活性化因子であることを示す。５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）は共に正しい開始部位から転写を活性化し、他のＡＴＦｓまたはＧＡＬ４−ＶＰ１６により生成された２５０ｂｐ  ＲＮＡ転写物と実際に区別ができない転写物を生じることは明白である。活性化強度の点から、両５’ＡＴＦ（Ｄ）は他のＡＴＦｓおよびＧＡＬ４−ＶＰ１６に匹敵する。
【００９９】
実施例５．ｉｎ  ｖｉｖｏ転写
Ａ．ＡＴＦの合成．
ＡＴＦ分子は実質的に実施例１に記載のように作製した。ＡＴＦ構造は、生理的ｐＨで標的ＤＮＡと安定なトリプルへリックス複合体を形成することが示されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の２２−マートリプルへリックス形成オリゴヌクレオチド〔ＴＦＯ〕を包含した。長くフレキシブルなポリグリコールリンカーはおのおののＴＦＯの５’末端近くに挿入される。リンカーの遠位末端は、短い２炭素鎖テザ−上に第１アミン基を含む修飾されたチミジン残基を持つ。この第１アミンは転写活性化ドメイン（ＡＤ）のカップリングのためのアンカー部位として役立つ。ＡＤは単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来の２９−マー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）または１４−マーペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）配列からなる。チオールを持つシステイン残基はアミノ末端に取り込まれ、ＡＴＦ分子の残部と共有結合する。ＡＴＦ分子の残部へのペプチドの化学的結合は２官能橋かけ剤により行われた。カップリング反応は、２９アミノ酸ＶＰ１６ペプチドを持つＡＴＦ（２９）および１４アミノ酸ＶＰ１６ペプチドを持つＡＴＦ（１４）の２つのＡＴＦ分子の形状を生じた。
【０１００】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏＡＴＦ活性化
ｉｎ  ｖｉｖｏで転写を活性化するＡＴＦｓの能力は、ＢＨＫ−２１培養細胞における一過性共トランスフェクションアッセイにより試験した。対照鋳型として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現をおこす、最小ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータを含むレポーター構築物を使用した。転写鋳型は、対照鋳型プロモータ上流のポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位間におけるＡＴＦ結合部位の５コピーを持つオリゴヌクレオチドを組み込むことにより構築した（図６Ａ）。トランスフェクション混合物は、１マイクログラムのプラスミドＤＮＡおよび５０ｎＭ  ＡＴＦｓを包含した。トランスフェクションはポリカチオン性脂質ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．）を使用することにより行った。細胞はトランスフェクション４８時間後に採取し、ＣＡＴアッセイは基質としてＦＡＳＴ  ＣＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行い、Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で視覚化し、定量した。図６Ａに示した各レポーター構築物はＡＴＦ分子と共におよびＡＴＦ分子を伴わないで細胞にトランスフェクトし、活性化シグナルを標準法により測定した。
【０１０１】
図６Ｂおよび６Ｃに示した結果は、ＡＴＦ（２９）が転写を基礎レベルの５倍活性化することを示す。同時に、ＡＴＦ（１４）は同じ鋳型から約３０倍の転写活性化を引き起こした。いずれのＡＴＦもＡＴＦ結合部位を欠如する対照鋳型の転写を活性化することができないため、この作用は配列特異的である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイと同様に、無傷のＡＴＦ構造が同様にｉｎ  ｖｉｖｏで機能するために必要である；すなわち、結合ペプチドを持たないＡＴＦｓはいずれの鋳型からの転写も活性化することができなかった。
【０１０２】
組織培養細胞における共トランスフェクションアッセイの結果は、細胞内環境における実質的なＡＴＦｓの生化学的活性を初めて示し、さらに本発明者らの設計の有効性を確証する。ＡＴＦｓはプロモータに結合し、組織培養細胞に導入したとき、レポーター遺伝子からの転写の強力（３０倍まで）で配列特異的な活性化を引き起こす（図６Ｂおよび６Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＴＦ（２９）よりずっと強力な作用を引き起こすＡＴＦ（１４）の見かけの能力は、細胞透過性の差のためであると考えられる。ＡＴＦ（１４）はより低い静電荷を持つより短いペプチドエフェクタを含むため、より長いＡＴＦ（２９）に比べ高い細胞透過性を有すると予想される。ＡＴＦにより得られる転写活性化の程度は、具体的な実験手順の状況において考慮すべきである。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは合成および天然の転写因子間の直接比較ができるが、組織培養アッセイにおいてそのような実験を解釈することは非常に困難であろう。すなわち、トランスフェクションアッセイは生細胞へのＧＡＬ４−ＶＰ１６発現構築物の導入を必要とし、結果として細胞内におけるＧＡＬ４−ＶＰ１６蛋白質の継続的な合成を起こす。これは、一般に実験の開始における細胞膜からの導入とは明らかに異なる。したがって、実験の経過にわたり天然対合成活性化因子の細胞内濃度を較正することは非常に難しいであろう。
【０１０３】
実施例６．低分子量の潜在的薬物を試験するための方法
ＶＰ１６アミノ酸配列を有する、本明細書に記載のＡＴＦｓの態様の有効性および可能性は、ＡＴＦのＶＰ１６由来エフェクタドメインのかわりにフレキシブルポリリンカーへの付加物として共有結合した、活性化因子化学部分を変化させることにより、各種化合物を転写アッセイにおいて試験することができる。これらの化合物は３，０００より少ないか、または１，５００より少ない分子量を有する、低分子量潜在的薬物を含んでいてもよい。予備的な結果は、多様な分子が活性化または抑制ドメインの機能を模倣することが可能であってもよいことを暗示する。たとえば、１以上の天然に存在しないＤ−アミノ酸を使用して合成された２９アミノ酸ＶＰ１６配列は、天然のＬ−アミノ酸残基から作られた配列と比べ多少の活性化能力を示す（図５）。本明細書に記載の方法を使用すれば、転写を活性化または抑制する能力は、ペプチドおよび非ペプチド分子からなる構造を有する部分に、および効果的な活性化または抑制ドメインであることに限定されないことが示されうる。
【０１０４】
本明細書で考察した他の潜在的なＡＴＦｓのＤＮＡ結合ドメイン、ならびにリンカーおよび小分子エフェクタドメイン候補の非ペプチド性は、治療薬剤的可能性を持つ、より小さい細胞透過性分子の開発を可能にする。本明細書のＡＴＦの態様の化学構造および組成は転写レベルでの遺伝子発現の操作のための新規薬物クラスの開発、またはスクリーニングにおける出発点として役立ってもよい。
【０１０５】
当業者は慣用の実験法を使用して、本明細書に記載の具体的な物質および方法に対する多くの等価物を認識するか、または確かめるであろう。そのような等価物は本発明の範囲内であるとみなし、以下の請求項により包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は本発明の３部分からなるＡＴＦの図による説明である。ＡＴＦはＤＮＡ結合ドメイン（Ａで示す）、フレキシブルリンカー（Ｂ），およびエフェクタドメイン、たとえば活性化因子ドメイン（Ｃ）の３成分を有する。
【図２】
図２は（Ａ）本発明のＡＴＦおよび（Ｂ）本発明の少なくともいくつかの態様におけるＡＴＦ合成のための１つの可能なスキ−ムを示す。
【図３】
図３は転写鋳型のプロモータ領域を示し、ここで：（Ａ）対照鋳型はプロモータ中に、＋１転写開始部位に関して−５３および−１５５ｂｐにおいてプロモータに取り込まれた５ＧＡＬ４および５ＡＴＦ結合部位を含み；そして（Ｂ）ＡＴＦアッセイ鋳型は−６５ｂｐにおいて取り込まれた５ＡＴＦ結合部位を含む。
【図４】
図４は以下のように同定された各レーンの内容を含む、ＡＴＦの存在下および非存在下における流出転写生成物のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す：レーン１は図２Ａの対照転写鋳型由来の低レベルの基礎転写を示す；レーン２は対照鋳型上のＧＡＬ４−ＶＰ１６融合蛋白質により活性化された２５０塩基転写物を示す；レーン３は図２ＢのＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の基礎転写を示す；レーン４〜７はＡＴＦアッセイ転写鋳型由来の転写に対する図１のＡＴＦの作用を示し、レーン４は最小量のＡＴＦを有し、そしてレーン５はレーン４より５倍多いＡＴＦを有し、レーン６はレーン４より１００倍多いＡＴＦを有し、そしてレーン７はレーン４より５００倍多いＡＴＦを有する。レーン８および９は活性化ドメインに共有結合したポリリンカーを有するＡＴＦの作用を示し、ポリリンカーはＡＴＦ試験鋳型の転写に対してＤＮＡ結合ドメインの３’末端に結合する。レーン９はレーン８より２０倍多いＡＴＦを有する。
【図５】
図５は転写活性化因子ＧＡＬ４−ＶＰ１６、３’ＡＴＦ、５’ＡＴＦ（Ｄ）および３’ＡＴＦ（Ｄ）に関する流出転写生成物のアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
【図６】
図６は以下のものを示す：（Ａ）転写鋳型がプロモータ中に５ＡＴＦ結合部位を含む、共転写アッセイで使用されたレポーター構築物、（Ｂ）ＢＨＫ−２１が転写鋳型のみと（レーン１および２）、またはＡＴＦ’ｓと組み合わせて（レーン３〜６）共トランスフェクトされる、代表的なＣＡＴアッセイ、および（Ｃ）それぞれデュプリケ−トで行われた３回の実験のＡＴＦによる転写活性化の平均倍数の棒グラフ；誤差の線はＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533804.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成14年5月10日(2002.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の転写を調節するための組成物であって：
ＤＮＡ結合ドメインが複数のピロールまたはイミダゾール基を含まない、非ペプチドＤＮＡ結合ドメイン；
フレキシブルリンカー；および
転写エフェクタ、を含み、リンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は転写エフェクタに共有結合する、前記組成物。
【請求項２】
転写エフェクタが転写を活性化する、請求項１の組成物。
【請求項３】
転写エフェクタが転写を抑制する、請求項１の組成物。
【請求項４】
転写エフェクタが共作用蛋白質に結合する、請求項１の組成物。
【請求項５】
転写抑制因子がヒストンまたはヒストン修飾蛋白質に結合する、請求項３の組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ結合ドメインが核酸を含む、請求項１の組成物。
【請求項７】
核酸が修飾された核酸である、請求項６の組成物。
【請求項８】
修飾された核酸が修飾された骨格を有する核酸、修飾された塩基を有する核酸、およびそれらの組合せの群から選択される、請求項７の組成物。
【請求項９】
リンカーが核酸の３′末端または５′末端に結合する、請求項７の組成物。
【請求項１０】
修飾された骨格がホスホロチオエートおよびペプチド核酸からなる群から選択される、請求項８の組成物。
【請求項１１】
ＤＮＡ結合ドメインがペプチド核酸を含む、請求項１の組成物。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合ドメインがポリアミドペプチド類似体を含む、請求項１の組成物。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ結合天然産物を含む、請求項１の組成物。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合ドメインが抗生物質または小有機成分を含む部分を含む請求項１の組成物。
【請求項１５】
転写エフェクタがエフェクタ基とリンカー間の共有結合形成のためのカップリング基を含む、請求項１の組成物。
【請求項１６】
転写エフェクタがポリペプチド配列である、請求項１の組成物。
【請求項１７】
ポリペプチド配列のアミノ末端がリンカーに共有結合する、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
転写活性化因子がポリペプチド配列であり、そしてポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群から選択されるヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸の活性化因子配列の少なくとも１コピーを含む、請求項２の組成物。
【請求項１９】
転写エフェクタが非ペプチド有機部分である、請求項１の組成物。
【請求項２０】
転写エフェクタ部分が約３，０００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項１の組成物。
【請求項２１】
転写エフェクタ部分が約１，５００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項１の組成物。
【請求項２２】
フレキシブルリンカーがポリグリコールを含む、請求項１の組成物。
【請求項２３】
フレキシブルリンカーポリグリコールが少なくとも６グリコールユニットを含む、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
フレキシブルリンカーがヌクレオチド、ペプチド、低級アルキルおよび酸素含有アルキル基からなる群から選択される１以上のユニットを含む、請求項１の組成物。
【請求項２５】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ１５オングストロームである、請求項１の組成物。
【請求項２６】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ２８オングストロームである、請求項１の組成物。
【請求項２７】
線形２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下で開始された２番目の転写量に比べて少なくとも１０倍異なる、請求項１の組成物。
【請求項２８】
線形２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下における２番目の転写量に比べて３０から５０倍異なる、請求項１の組成物。
【請求項２９】
遺伝子が真核細胞遺伝子を含む、請求項１の組成物。
【請求項３０】
Ａがトリプレックス形成核酸であり、Ｂがフレキシブルリンカーであり、そしてＣがエフェクタ部分であり、ここでＢがＡおよびＣに共有結合する、構造Ａ−Ｂ−Ｃを有する転写を活性化するための組成物。
【請求項３１】
Ｂがポリグリコール鎖であり、そしてＢとＣの共有結合が二官能橋かけ剤を含む、請求項３０の組成物。
【請求項３２】
Ｂが少なくとも長さ約２８オングストロームであるポリグリコールを含み、そしてＣが単純ヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸配列を含む、請求項３０の組成物。
【請求項３３】
以下のことを含む、転写調節因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法：
少なくとも１つの転写調節エレメントの制御下で標的遺伝子を含む細胞を提供すること；
ＤＮＡ結合ドメイン、興味のある試験部分、およびフレキシブルリンカーを含む試験組成物を提供すること、ここでリンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は試験化合物に共有結合し、ＤＮＡ結合ドメインは標的遺伝子のプロモータ上のＤＮＡ結合部位に対して、当該部位に結合するために十分な親和性を有する；
細胞を試験組成物と接触させること；および
転写調節因子としての試験組成物の活性の尺度である、試験組成物の非存在下でのレベルに比べた、試験組成物存在下での標的遺伝子の転写活性のレベルの任意の変化を検出すること。
【請求項３４】
以下のことを含む、転写調節因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするための方法：
ＤＮＡ結合ドメイン、興味のある試験部分、およびフレキシブルリンカーを含む試験組成物を提供すること、ここでリンカーの一末端はＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端は試験化合物に共有結合し、ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ結合部位に対して、当該部位に結合するために十分な親和性を有する；
ＲＮＡが合成されるように、ＲＮＡ合成に適切な条件下で、ＤＮＡ鋳型、試験組成物およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成することができる真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子、バッファーおよび基質を含む転写混合物、ならびにＲＮＡ生成物の定量のための検出系を試験組成物と接触させること；および
転写調節因子としての試験組成物の活性の尺度である、試験組成物の非存在下でのレベルに比べた、試験組成物存在下での標的遺伝子の転写活性のレベルの任意の変化を検出すること。
【請求項３５】
試験部分が約３ｋＤより少ない分子量を有する化学部分である、請求項３３または３４の方法。
【請求項３６】
試験部分が約１．５ｋＤより少ない分子量を有する化学部分である、請求項３３または３４の方法。
【請求項３７】
試験部分が細胞膜透過性である、請求項３３または３４の方法。
【請求項３８】
試験部分が転写活性化、または抑制因子活性を有すると考えられる、請求項３３または３４の方法。
【請求項３９】
転写活性の変化がｍＲＮＡ、または標的遺伝子によりコードされた蛋白質産物の観察されたレベルの変化として検出される、請求項３３または３４の方法。
【請求項４０】
標的遺伝子が薬物への耐性を与える蛋白質をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、栄養要求表現型を救う遺伝子、および細胞表面抗原をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項３３または３４の方法。
【請求項４１】
標的遺伝子が熱量、発光または蛍光検出を提供する蛋白質をコードする、請求項４０の方法。
【請求項４２】
試験組成物に提供する段階がマルチウェルディッシュへの自動化された試料分配を含む、ハイスループットスクリーニング技術を使用して行われる、請求項３３または３４の方法。
【請求項４３】
自動プレートリーダーがデータ解析および表示のためのプログラム可能なコンピュータ化されたプログラムを有するハイスループット検出法を使用して、転写活性の変化を検出する段階が実行される、請求項３３または３４の方法。
【請求項４４】
複数の試験組成物が提供される、請求項３３または３４の方法。
【請求項４５】
以下のことを含む、標的遺伝子の転写を変化させる方法：
標的遺伝子のプロモータに親和性を有するＤＮＡ結合ドメイン、フレキシブルリンカー、および転写エフェクタであって、リンカーの一末端がＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端が転写エフェクタに共有結合するものを含む組成物を細胞に導入すること。
【請求項４６】
エフェクタが活性化因子または抑制因子である、請求項４５の方法。
【請求項４７】
ＤＮＡ結合ドメインが非ペプチド結合ドメインである、請求項４５の方法。
【請求項４８】
以下のものを含む、転写調節因子としての活性に関して試験組成物をアッセイするためのキット：
ＤＮＡ結合ドメインに共有結合するフレキシブルリンカー、ここでＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合部位に結合し、プロモータにおいて転写を活性化するために十分な、ＤＮＡ鋳型上の結合部位に対する親和性を有する；および
ＤＮＡ鋳型、およびＤＮＡ鋳型と複合体を形成する真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ分子を含む、転写混合物。
【請求項４９】
調節因子が活性化因子または抑制因子である、請求項４８のキット。
【請求項５０】
以下のものを含む遺伝子の転写を調節するための組成物：
ＤＮＡ結合ドメイン、
転写エフェクタ、ここでリンカーの一末端がＤＮＡ結合ドメインに共有結合し、リンカーの他の末端が転写エフェクタに共有結合する、および
非ペプチドフレキシブルリンカー。
【請求項５１】
転写エフェクタがポリペプチド配列である、請求項４５の方法。
【請求項５２】
ポリペプチド配列のアミノ末端がリンカーに共有結合する、請求項５１の方法。
【請求項５３】
転写活性化因子がポリペプチド配列であり、そしてポリペプチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２からなる群から選択されるヘルペスウイルス蛋白質ＶＰ１６由来のアミノ酸の活性化因子配列の少なくとも１コピーを含む、請求項４５の方法。
【請求項５４】
転写エフェクタが非ペプチド有機部分である、請求項４５の方法。
【請求項５５】
転写エフェクタ部分が約３，０００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項４５の方法。
【請求項５６】
転写エフェクタ部分が約１，５００ダルトンより少ない分子量を有する、請求項４５の方法。
【請求項５７】
フレキシブルリンカーがポリグリコールを含む、請求項４５の方法。
【請求項５８】
フレキシブルリンカーポリグリコールが少なくとも６グリコールユニットを含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】
フレキシブルリンカーがヌクレオチド、ペプチド、低級アルキルおよび酸素含有アルキル基からなる群から選択される１以上のユニットを含む、請求項４５の方法。
【請求項６０】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ１５オングストロームである、請求項４５の方法。
【請求項６１】
フレキシブルリンカーが少なくとも長さ２８オングストロームである、請求項４５の方法。
【請求項６２】
線形２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下で開始された２番目の転写量に比べて少なくとも１０倍異なる、請求項４５の方法。
【請求項６３】
線形２本鎖ＤＮＡ鋳型上で開始された転写の量が組成物の非存在下における２番目の転写量に比べて３０から５０倍異なる、請求項４５の方法。
【国際調査報告】
2004533804.tif 000081
2004533804.tif 000082
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