(57)【要約】本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子の発現を修飾又は阻害する能力をもつ少なくとも１つの２次構造を含有するオリゴヌクレオチドにおいて、単数又は複数の２次構造が、標的核酸上のオリゴヌクレオチドの固定の際に崩れるような形で選択された１つのアンチセンス配列及び場合によってはアンチセンス配列の一方及び／又は他方の末端にある補足的なヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチドに関する。本発明は同様に、前記オリゴヌクレオチドを含有する薬学組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子の発現を修飾又は阻害する能力をもつ少なくとも１つの２次構造を含有するオリゴヌクレオチドにおいて、単数又は複数の２次構造が、標的核酸上のオリゴヌクレオチドの固定の際に崩れるような形で選択された１つのアンチセンス配列及び場合によってはアンチセンス配列の一方及び／又は他方の末端にある補足的なヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
２次構造が、
−  基本的にアンチセンス配列の全部又は一部分、又は
−  アンチセンス配列の両側にある補足的ヌクレオチド配列の全部又は一部分又は、
−  アンチセンス配列の全部又は一部分及び前記アンチセンス配列の両側にある補足的な１つの又は２つの配列の全部又は一部分、
で形成されていることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
２次構造が主として又は排他的に、アンチセンス配列に属するヌクレオチド対で形成されていること、を特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
２次構造が基本的に又は排他的に、アンチセンス配列の末端にある補足的ヌクレオチド配列に属するヌクレオチド対で形成されていることを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
アンチセンス配列の両側に配置されたヌクレオチド配列が実質的に互いに相補的であることを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
２次構造が同様に、アンチセンス配列のみに属する単数又は複数のヌクレオチド対を含んで成ることを特徴とする請求項４又は５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
２次構造が、アンチセンス配列及び該アンチセンス配列の一方の末端に配置された補足的ヌクレオチド配列に属するヌクレオチド対で形成されていることを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
アンチセンス配列の一方の末端に配置されたヌクレオチド配列が実質的に前記アンチセンス配列と相補的であることを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが、アンチセンス配列の各末端に１つずつの２つの２次構造を含んで成ることを特徴とする請求項７又は８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
２次構造が、アンチセンス配列のみに属する単数又は複数のヌクレオチド対を含んで成ることを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
２次構造がヘヤピン構造であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
２次構造が３〜２０個のヌクレオチド対好ましくは５〜１０個のヌクレオチド対を含んで成ることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
３’末端及び５’末端にあるホスホロチオエートヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
遊離した、包埋された、カップリングされた、さまざまな物質に接合された、薬学的に受容可能なビヒクルに対し前記組成物中で結びつけられた、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の同一の又は異なる単数又は複数のオリゴヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする薬学組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを用いて１つの病理に関与する単数又は複数の遺伝子の発現を遮断することから成る、ヒト、動物又は植物生体の治療を目的とする請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１６】
ユーイング肉腫の１つを治療することを目的とし、有効成分として配列番号１又は配列番号２という番号で配列リスト中に表わされているオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含んで成ることを特徴とする請求項１４、１５に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列とハイブリッド形成する能力をもちかつ、生物学的環境内で分解、主としてヌクレアーゼによる分解に対する耐性をもつような形で２次構造により安定化されているオリゴヌクレオチドに関する。本発明は同様に、かかるオリゴヌクレオチドを含む薬学組成物及びｉｎ ｖｉｖｏ 及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子の発現を遮断するためのそれらの利用にも関する。
【０００２】
アンチセンス核酸は、標的細胞伝令ＲＮＡと選択的にハイブリッド形成してタンパク質へのその翻訳を阻害する能力をもつ核酸配列である。これらのオリゴヌクレオチドは、従来のワトソン−クリックタイプの相互作用により、標的ｍＲＮＡと局所的に、２本鎖領域を形成する。
【０００３】
多くの病的状態は、１つの細胞内部における異常な遺伝子の発現の結果である。かかる外来性遺伝子は、例えばウイルス感染の後に、細胞ＤＮＡ内に組込まれる可能性があり、従ってその細胞によって発現され得る。これは、真核性細胞及び生体全体の中の腫瘍に対しガン性表現型を付与する能力をもつ数多くのオンコ遺伝子についても言えることである。
【０００４】
かかる遺伝子の作用を阻害するための先行技術において提案されたアプローチの１つは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用にある（１〜３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現の調節は、実際、増々開発されつつある１つの治療的アプローチを構成している。このアプローチは、１つの核酸の相補的領域に特異的にハイブリッド形成しかくして一定の遺伝子の発現を特異的に阻害するオリゴヌクレオチドの能力に基づくものである。この阻害は、翻訳レベル（アンチセンスオリゴヌクレオチド）でか、又は転写レベル（抗原オリゴヌクレオチド）で介入することができる。
【０００５】
アンチセンス技術の治療的応用については、後天性免疫不全症ウイルス（４），インフルエンザウイルス（５），エプスタインバーウイルス（６），ヒト乳頭腫ウイルス（７，８）及び単純ヘルペスウイルス（９，１０）を含めた数多くのウイルス感染症において広く研究されている。
【０００６】
ここで問題となりうるのは、例えば、小型で細胞ｍＲＮＡと相補的でかつ標的細胞内に導入される合成オリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドは例えば、欧州特許出願第９２，５７４号の中で記述されている。同様に問題となりうるのは、標的細胞内でのその発現が細胞ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡを生成することになるアンチセンス遺伝子である。かかる遺伝子は例えば、欧州特許出願第１４０３０８号の中で記述されている。
【０００７】
しかしながら、アンチセンス核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの利用は、いくつかの問題点にぶつかり、そのため今日までその治療的開発利用は制限されている。
【０００８】
実際、核酸は、ヌクレアーゼ（１１，１２）といったような生体の酵素による分解に対し高い感受性を示し、このことはすなわち大きな用量の利用を前提としている。その上、これらは或る種の細胞型の中への低い浸透性及び往々にして不適切な細胞内分布を示し、そのため治療的効果のないものとなっている。最後に、その他の細胞機能を改変することなく特異的効果を得るためには、充分選択的で安定した配列を利用できることが重要となる。
【０００９】
ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを利用することによりラウス肉腫ウイルスを阻害するためのＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ及びＺａｍｅｃｎｉｋの最初の試行（１３）以来、特に細胞浸透（１４−１６），それらの標的上での固定（１７），ヌクレアーゼに対する耐性（１８−２０）について、これらのオリゴヌクレオチドの有効性を最適化するために数多くの研究努力がなされてきた。
【００１０】
ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性の問題は、この治療的戦略を開発する可能性を制限する１つの問題でありつづけている。この問題を解決しようとして、先行技術においては、核酸のホスホジエステル骨格構造を化学的に修飾して、新しいクラスの人工的オリゴヌクレオチドを発生させることが提案されてきた（２１−２３）。その中でも、例えば、国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９４／０８００３号の中で記述されているホスホネート、ホスホラミデート及びホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド又は、コレステロール、ペプチド、カチオン重合体などといったような異なる作用物質にカップリングされたオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００１１】
しかしながら、これらの修飾されたオリゴヌクレオチドのいくつかがヌクレアーゼに対する優れた耐性を示すにせよ、これらの修正は、ＲＮＡ標的に対するその親和性、リボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解を変調させるその能力といったようなアンチセンス活性にとって重要なその他の特性の喪失が伴うという欠点を呈する可能性があり、異なる細胞区画内でのその浸透及び分配能はきわめて低いままである（１，２２，２４）。その上、それらの生物学的活性はつねに増大するわけではなく、その構造内の非天然モチーフの存在に関係するいくつかの副作用を呈する可能性もある。実際、かくして修飾されたオリゴヌクレオチドは、細胞タンパク質との非特異的な相互作用及び高い細胞毒性といったような望ましくない特性を呈する（２５−２９）。
【００１２】
ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増強させることができるが、天然のホスホジエステルを使用するもう１つの方法は、ドデカノール接合体を、保護すべき配列の３’末端上に移植することから成る（欧州特許出願第ＥＰ１１７７７７号及びＥＰ１６９７８７号）。
【００１３】
以上で報告した欠点を補正するため、先行技術においては、例えば国際ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９４／１２６３３号の中で、保護すべきアンチセンス配列の末端の一方及び／又は他方に対して、ヌクレアーゼがアンチセンス配列を分解しにくるのを妨げることのできるループ又はヘヤピンの形をした２次構造をもつヌクレオチド配列を付け加えることも提案されてきた（３０−３５）。ところがこの技術は、ヘヤピン状の配列の補足的ヌクレオチドの存在が、標的核酸とアンチセンス配列のハイブリダイゼーションの妨げとなることから、充分なものではない。
【００１４】
本発明は、精確に言うと、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子の発現を修飾又は阻害する能力をもち、上述の欠点を示すことなくヌクレアーゼ消化に対する耐性を示す新規のオリゴヌクレオチドを提供することを目的としている。この目的は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的遺伝子の発現を修飾又は阻害する能力をもつ少なくとも１つの２次構造を含有するオリゴヌクレオチドにおいて、単数又は複数の２次構造が、標的核酸上のオリゴヌクレオチドの固定の際に崩れるような形で選択された１つのアンチセンス配列、及び場合によってはアンチセンス配列の一方及び／又は他方の末端にある補足的なヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチドによって達成される。
【００１５】
かくして、本発明のオリゴヌクレオチドは、２次構造を形成する互いに実質的に相補的で、各々が全体的又は部分的にアンチセンス配列に属している少なくとも２つの領域を含む。
【００１６】
実質的に相補的というのは、前記領域がいくつかの誤対合を含む可能性があり、かかる誤対合には有利にも、本発明のオリゴヌクレオチドの前記領域のヌクレオチドの半分未満しか関与していないということを意味している。
【００１７】
本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、その標的に対するオリゴヌクレオチドの固定の際に崩れる能力をもつ１つの構造を付与する１つの配列で構成されているという点で注目に値する。従って、本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチド長について、標的上に固定された長さをより長いものにすることができそのためハイブリッドのより優れた安定性が保証されることから、２次構造の備わった先行技術のオリゴヌクレオチドに比べて特に有利である。その上、先行技術とは異なり、本発明に従ったオリゴヌクレオチドの２次構造は、ハイブリダイゼーションの際に崩れ、従って、アンチセンス配列のその標的上での固定の妨げとならない。
【００１８】
本発明では、２次構造というのは、１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドが開いているつまりこれらの３’末端及び５’末端が自由であるヘヤピン、ループさらにはエスカルゴ形の構造のことである。本発明は、より特定的には、ヘヤピン（英語で「ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐ」）形の２次構造に関する。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、２次構造が、
−  基本的にアンチセンス配列の全部又は一部分、
−  アンチセンス配列の両側にある補足的ヌクレオチド配列の全部又は一部分、−  アンチセンス配列の全部又は一部分及び前記アンチセンス配列の両側にある補足的な１つの又は２つの配列の全部又は一部分、
のいずれで形成されるかによって複数の実施形態を許容する。
【００２０】
本発明に従ったオリゴヌクレオチドの第１の実施形態によると、２次構造は、主として又は排他的に、アンチセンス配列に属するヌクレオチド対で形成されている。かかるオリゴヌクレオチドの一例は、添付図面の図１に示されている。従ってこの実施形態は、ヒトゲノムの約２％と推定される偽回帰性配列を有する標的核酸に関する。本発明のこの実施形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的上での固定に際して、
−  エキソヌクレアーゼに対しアクセス可能である、
−  標的の近くでその他のＤＮＡ配列と干渉する、
可能性のある未対合ストランドを自由に放置しないという利点を提供する。
【００２１】
本発明に従ったオリゴヌクレオチドの第２の実施形態によると、２次構造は、基本的に又は排他的に、アンチセンス配列の末端にある補足的ヌクレオチド配列に属するヌクレオチド対で形成されている。従ってこの実施形態においては、アンチセンス配列の両側に配置されたヌクレオチド配列は、実質的に相補的である。かかるオリゴヌクレオチドの一例は、添付の図２に示されている。この実施形態においては、同様に、２次構造が、図３に表わされているようにアンチセンス配列のみに属する単数又は複数のヌクレオチド対を含んでいることも可能である。
【００２２】
本発明に従った第３の実施形態によると、２次構造は、アンチセンス配列及び該アンチセンス配列の一方の末端に配置された補足的ヌクレオチド配列に属するヌクレオチド対で形成されている。この実施形態においては、アンチセンス配列の１つの末端に置かれたヌクレオチド配列は、前記アンチセンス配列と実質的に相補的である。当然のことながら、この実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、アンチセンス配列の各末端に１つずつの２つの２次構造を含むことができる。かかるオリゴヌクレオチドの一例は、添付の図４，５及び６に示されている。この実施形態においては、同様に２次構造が、アンチセンス配列のみに属する単数又は複数のヌクレオチド対を含んで成ることもできる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドのこれら３つの実施形態では、単数又は複数の２次構造は、オリゴヌクレオチドがその標的上で固定する際に崩れる。本発明のオリゴヌクレオチドが、補足的な１つ又は２つのヌクレオチド配列を含む場合、それらは、標的上でのアンチセンス配列の固定に際して１本鎖の形にとどまり、ハイブリッドの安定性又はこのハイブリッドに対するリボヌクレアーゼＨの固定を妨げることはないだろう。アンチセンス効果の最終的原因であるのはリボヌクレアーゼＨであることから、このことは非常に重要である。ところが、ここで問題となっているのはまさに、アンチセンス配列のその標的上への固定の際に崩れない２次構造を備えた先行技術のオリゴヌクレオチドがもつ欠点の１つなのである。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドの中に存在する２次構造は、３〜２０個の連続したヌクレオチド対を含むが、２次構造の安定性を実質的に修飾しないかぎりいくつかの誤対合を含むこともできる。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドの中に存在する２次構造は、５〜１０個のヌクレオチド配列対を含む。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくはＤＮＡで構成されている。実際、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＤＮＡ／ＲＮＡハイブッリドより安定性が低いことから、標的核酸の近くでは、本発明のオリゴヌクレオチドの２次構造は、２次構造のその後の再形成無くアンチセンス配列と標的で形成されたハイブリッドの形成に有利なように崩れる。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたヌクレオチド又は先行技術において記述されたさまざまな化合物又は化学的基に対するカップリングの利用を必要とすることなく、生物学的環境の中での分解に対する耐性をもつ。従って、これらのオリゴヌクレオチドは有利にも、化学的に修飾されたヌクレオチドよりも廉価であるという利点を呈する天然ヌクレオチドで構成されている。さらに、これらの化学的に修飾されたヌクレオチドは、細胞にとって有害な分解産物を生成するという欠点を示す。しかしながら、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの利用のため又は１方では２次構造又他方では化学的修飾に起因した分解に対する防御の効果を兼ねもつため、本発明のオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾された塩基で構成されているか又はこれを含有することもできるし、さらには又当業者にとって既知のさまざまな作用物質にカップリングされてもよい。かくして、或る種の実施形態においては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホネート、ホスホラミデード及びホスホロチオネートタイプの単数又は複数の修飾されたヌクレオチドを含有することができる。有利には、これらの修飾されたヌクレオチドは、主として又は排他的にアンチセンス配列に属するヌクレオチド対で形成された２次構造をもち、好ましくはその３’及び５’末端が対合されている、１つのオリゴヌクレオチドの３’及び５’末端を形成する。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアンチセンス配列は、およそ５〜３０個、好ましくは約８〜２０個のヌクレオチドを含んで成る。
【００２８】
本発明は同様に、薬学的に受容可能なビヒクルに対しその中で結びつけられた前述の同一の又は異なる単数又は複数のオリゴヌクレオチドを含む薬学組成物にも関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、遊離していても、包埋されていても、カップリングされていても、又抗体、タンパク質、リポソーム、小球、微生物又は細胞といったような利用される投与様式に適合されたさまざまな物質又はナノ粒子、デンドリマー、カチオン脂質またはペプチドといったようなその他のあらゆるタイプのベクターに対し接合されていてもよい。
【００２９】
ユーイング肉腫の１つを治療するための本発明の薬学組成物は、有効成分として配列番号１又は配列番号２という番号で配列リスト中に表わされているオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含んで成ることを特徴とする。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの相補的配列とハイブリッド形成することを特に目的としたものであり、従って、対象の病理に関与する単数又は複数の遺伝子の発現を遮断することから成るヒト、動物又は植物生体の治療のための薬剤として利用することができる。ただし、本発明のオリゴヌクレオチドは同様に、例えば標識付けされたプローブでの生体材料の遺伝子スクリーニングといったように、生物学的環境におけるオリゴヌクレオチドの耐性の問題が生じた場合、直ちに診断の分野でも利用することができる。
【００３１】
本発明のその他の利点及び特徴は、以下の例及び本発明のオリゴヌクレオチドの実施例を概略的に表わす図１〜６から明らかになることだろう。これらの図においては、太線がアンチセンス配列を象徴し、細線は、存在する場合の単数又は複数の補足的配列を象徴し、水平な棒線は塩基対の結合を象徴している。
【００３２】
例１：フレンドマウス白血病レトロウイルスのｅｎｖ ＲＮＡの翻訳開始領域の相補的領域を含む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究
この例においては、添付図面が参照されている。なお図面中；
−　図７は、以下の実験の部で利用されるオリゴヌクレオチドを表わす。２１ｍｅｒのＤＮＡ及びＲＮＡの標的配列には下線が施されている。標的Ｄ及びＲの相補的アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列は太字で表わされている。
−  図８は、３７℃で１５％の未変性ＰＡＧＥでの２重鎖の形成の電気泳動分析を表わす。Ａでは：オリゴデオキシヌクレオチド２１Ｌ（ライン２），２１ＰＳ（ライン３），Ｈ６（ライン４），Ｈ８（ライン５），Ｈ０（ライン６），Ｄｈ６（ライン７），Ｌ８（ライン８），Ｌ１０（ライン９），ＳＬ（ライン１０），ＳＳＬ（ライン１１）に対する３２Ｐで標識づけされたＲＮＡ標的（ライン１）の固定。 Ｂでは：オリゴデオキシヌクレオチド２１Ｌ（ライン２），２１ＰＳ（ライン３），Ｈ６（ライン４），Ｈ８（ライン５），Ｈ０（ライン６），Ｄｈ６（ライン７），Ｌ８（ライン８），Ｌ１０（ライン９），ＳＬ（ライン１０），５５Ｌ（ライン１１）に対する、３２Ｐで標識付けされたＤＮＡ標的（ライン１）の固定。
−  図９は、アンチセンスオリゴヌクレオチド２１Ｌ（ライン２），２１ＰＳ（ライン３），Ｈ６（ライン４），Ｈ８（ライン５），Ｈ０（ライン６），Ｄｈ６（ライン７），Ｌ８（ライン８），Ｌ１０（ライン９），ＳＬ（ライン１０），５５Ｌ（ライン１１）の存在下でのリボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ標的の分割を表わす。単独で（ライン１）又はＯＤＮｓ無しでリボヌクレアーゼＨの存在下で（ライン１２）の、３２Ｐで標識付けされたＲＮＡ Ｒ。矢印は、主要分割部位を表わす。
−  図１０は、Ｓｕｐｅｒ ＦｅｃｔＴＭの不在下（ａ，ｂ）及び存在下（ｃ，ｄ）での、熱により不活性化された１０％のＦＢＳで補足されたＤＭＥＭ中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす。
−　図１１は、細胞溶解産物すなわち（ａ，ｂ）溶解産物ＨｅＬａ，（ｃ，ｄ）溶解産物ＮＩＨ３Ｔ３内のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす。
−　図１２は、細胞内部でのＳｕｐｐｅｒＦｅｃｔＴＭと複合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす：（ａ，ｂ）ＨｅＬａ、 （ｃ，ｄ）ＮＴＨ３Ｔ３。
【００３３】
Ｉ−材料と方法
１）　オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドを、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（Ｓａｒａｉｎｇ， ベルギー）から入手し、その後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上で脱塩し、２６０ｎｍでの吸光度によって数量化した。
【００３４】
２）アンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸塩５’末端の保護
オリゴヌクレオチドの５’末端での標識づけは、ＡＴＰ（３２ｐ−γ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用することによって実施した。標識づけされたオリゴヌクレオチドを、２０％で変性するポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により精製し、５０％のエタノールを含有する１ＭのＮメチルホルフィン（ｐＨ７．５），２０ｍＭのＭｇＣｌ２の緩衝液１００μｌの中で溶解させ、溶液に１０ｍｇの１−エチル−３（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを補足した。反応は４℃で１６時間実施され、オリゴヌクレオチドをアセトン中の２％のＬｉＣｌＯ４溶液１ｍｌで２回沈殿させ、アセトンで洗浄した。ホスファターゼによる加水分解に対しエチル残基により保護された末端リン酸塩をもつこれらのオリゴヌクレオチドを次に、標識づけされていないオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）と混合し、酵素消化に対するその耐性について研究するのに利用した。
【００３５】
３）熱変性実験
サーモプログラマーの備わった分光光度計Ｕｖｉｋｏｎ９３３を利用することによって、２６０ｎｍでの吸光度／温度曲線を記録した。ＯＤＮ溶液は、ＮａＣｌ ５０ｍＭを用いてリン酸ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．５）緩衝液６００μｌ中で調製した。各々のオリゴヌクレオチドストランドの濃度は１０−６Ｍである。温度を毎分０．５℃の割合で２０℃から８０℃まで上昇させる間に吸光度を測定した。１／Ｔに従った吸光度の一次導関数からコンピュータ調整を行なうことによって、融点（Ｔｍ）を決定した。Ｔｍの精度は、実験の反復から±０．５℃と推定された。２重鎖の解離のための自由エネルギー値は、２状態モデル（３６）を利用することによって融合曲線のコンピュータ調整によって誘導された。
【００３６】
４）未変性電気泳動ゲル
ＲＮＡ及びＤＮＡ鋳型（Ｒ及びＤ）を、ＡＴＰ（３２Ｐ−γ）及びＴ４のポリヌクレオチドキナーゼを利用して標識づけした。オリゴヌクレオチド（各ストランドについて１０ｐモル）を１０μｌのトリス−アセテート緩衝液（ｐＨ７．５），ＣＨ３ＣＯＯＮａ１５０ｍＭ，ＭｇＣＬ２２ｍＭの中で溶解させ、１時間３７℃でインキュベートし、次にキシレンシアノール及びプロモフェノールブルーを含むグリセロール７０％溶液１μｌを補足した。３７℃で２４時間、同じトリス−アセテート緩衝液（９Ｖ／ｃｍ）中で、変性しない１５％のアクリルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド／ビス−アクリルアミド）の中で電気泳動を実施した。
【００３７】
５）リボヌクレアーゼＨによる分割
リボヌクレアーゼＨ活性のＯＤＮによる開始を研究するため、１０ｐモルのＯＤＮを、ＲＮａｓｉｎ０．５μｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の存在下で１０μｌのトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ（ｐＨ７．５），ＭｇＣｌ２１０ｍＭ；ＫＣｌ １００ｍＭ，ＤＴＴ０．１ｍＭ中で、（３２Ｐ）で５’において標識づけされたＲＮＡ鋳型（Ｒ）１ｐモルと混合させ、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、０．５ＵのＥ．ｃｏｌｉ リボヌクレアーゼＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を添加し、混合物を１５分間３７℃でインキュベートした。標本を、２％のＬｉＣｌＯ４を含むアセトン沈殿させ、乾燥させ、４μｌのホルムアミド：水（４：１），０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンアノール中で溶解させ、変性する２０％のポリアクリルアミドゲル中での電気泳動とそれに続くオートラジオグラフィによって分析した。
【００３８】
６）細胞と培地
熱により不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ． ＢＲＬ），ストレプトマイシン（１００ｍｇ／μＬ）及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ５％及び１０％追加したＤＭＥＭ培地中で、細胞系統ＮＩＨ ３Ｔ３及びＨｅＬａを培養した。全ての細胞は、５％のＣＯ２中で３７℃でインキュベートさせた。
【００３９】
７）　細胞溶解産物の調製
細胞ＮＩＨ３Ｔ３とＨｅＬａを３回ＰＢＳで洗浄し、その後１ｍｌのリン酸ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．５），ＭｇＣｌ２１０ｍＭ，ＮａＣｌ１５０ｍＭ，ＤＴＴ１ｍＭ，１％のＮＰ−４０，０２ｍｇ／ｍｌのフェニル−メチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）緩衝液中で沈着させ、３０分間、−２０℃で保存した。解凍後、細胞を４℃で１５分間１４０００ｇで遠心分離した。上清は、オリゴヌクレオチドの酵素分解を研究するために利用した。各々の溶解産物の中のタンパク質濃度を、規準としてＢＳＡを用いて数量化した（３７）。
【００４０】
８）生物学的環境内でのオリゴヌクレオチドの分解の研究
熱（３０分間５６℃）により不活性化されたＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ中及び細胞溶解産物中で、オリゴヌクレオチドの分解率を決定した。１．２２ｍｇ／ｍｌという同じ合計タンパク質濃度を得るため、リン酸ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．５），ＭｇＣｌ２１０ｍＭ，ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＤＴＴ１ｍＭの緩衝液中で溶解産物を希釈した。３２Ｐで標識づけされたリン酸塩の酵素分割を避けるため、上述のとおりに調製された、リン酸塩末端が保護されたオリゴヌクレオチドを利用した。１０μＭの濃度で３２Ｐで標識づけされたＯＤＮｓを、３７℃で対応する培地１２０μｌ内でインキュベートした。異なる時点で、１５μｌのアリコートを採取し、５０ｍＭのＥＤＴＡ１５μｌを追加し、−２０℃で冷凍した。標本をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２５／２４／１）で２回抽出した。オリゴヌクレオチドを、２％のＬｉＣｌＯ４を含むアセトン１０体積により水性分画から沈殿させ、乾燥させ、ホルムアミド／水混合物（４／１），０．０１％のブロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール５μｌ中に溶解させた。標本を、変性する２０％のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析した。得られたゲルを、ホスホイメージャ（Ｓｔｏｒｍ ８４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を利用して走査した。オリゴヌクレオチドの分解を、無傷のオリゴヌクレオチド及び分解したオリゴヌクレオチドに対応するバンドの有効な信号比として数量化した。分解百分率の精度は、実験反復に基づき±０．５％と推定された。
【００４１】
９）細胞内でのオリゴヌクレオチドの分解の研究
前日に、細胞を６ウェル平板上に接種して６０〜８０％の集密度（４×１０５個の細胞）を得た。各ＯＤＮ５μｇを６μｌのＳｕｐｅｒ ＦｅｃｔＴＭ（Ｑｕｉａｇｅｎ， カナダ）と、室温で１５０μｌというＤＭＥＭ最終体積で（ＦＢＳも抗生物質もなし）１０分間混合した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％（ＨｅＬａ細胞について）又は５％（ＮＴＨ３Ｔ３細胞について）のＦＢＳ ＤＭＥＭ（抗生物質を伴う）８５０μｌ で希釈し、細胞に添加した。
【００４２】
１６又は４８時間後に上清を抽出し、トリプシン処理により細胞を収穫した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、リン酸ナトリウム１０ｍＭ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ １５０ｍＭ，ＥＤＴＡ２０ｍＭ，１％ＮＰ−４０緩衝液５００μｌ中で懸濁させ、３０分−２０℃に放置した。解凍後、細胞区画全てを完全に破壊するべく９０℃で３０分細胞を加熱し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）で２回抽出した。５倍余剰のエタノールを添加することにより酢酸ナトリウム０．５Ｍを含む水性分画からＯＤＮｓを沈殿させ、ホルムアミド／水（４／１），０．０１％のプロモフェノールブルー及び０．０１％のキシレンシアノール混合物中に溶解させ、２０％変性ゲル上の電気泳動により分析した。得られたゲルを、ホスホイメージャ（Ｓｔｒｏｍ ８４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を利用して走査した。オリゴヌクレオチドの分解を、無傷のオリゴヌクレオチド及び分解されたオリゴヌクレオチドに対応するバンドの有効信号比として数量化した。
【００４３】
ＩＩ−結果
１）　構造化されたオリゴヌクレオチドの構造
図７に示したように、研究対象の全てのオリゴデオリボヌクレオチドは、フレンドマウス白血病のレトロウイルスのｅｎｖＲＮＡの翻訳開始領域に相補的である図７中に太字で示された、つまり強調された２１個の塩基の配列５’−ＴＧＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＡＴＴＣＴ−３’を含む。オリゴヌクレオチド２１Ｌ及び５５Ｌは、オリゴヌクレオチド２１ＰＳといったような線形構造をもつ。ただし、このオリゴヌクレオチド２１ＰＳは、酵素分解からそれを保護するために、各末端に２つのホスホチオエート基を含有する。オリゴヌクレオチド Ｈ６，Ｈ８及びＨ１０は、末端３’に局在化されたヘヤピン形の２次構造の補足的配列の中で異なる数の塩基対（ｐｂ）を提示する。ＤＨ６は、５’及び３’末端に６ｐｂの尾部と共にヘヤピン形の２次構造を形成することができる。Ｌ８及びＬ１０は、それぞれ８ｐｂ及び１０ｐｂでループ内及び尾部内にある１３のヌクレオチドと共にループ状の２次構造を形成することができる。
【００４４】
２）オリゴヌクレオチドの結合特性の研究
下表１は、１０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ＝７．５中で、単独オリゴヌクレオチド（ＯＮｓ）及びＤＮＡ（Ｄ）及びＲＮＡ（Ｒ）標的との複合体について同時に決定された融点（Ｔｍ）及び△Ｇ°３７に関する。
【００４５】
【表１】
2004500018.tif 000002
【００４６】
△Ｈ，△Ｓ及び△Ｇは、独立した融合曲線から得られた複数の値の平均であり、四捨五入されている。
（ａ）：　ＴＭについての誤差は、±０．５℃である。
（ｂ）：  △Ｈについての誤差は、±５ｋｃａｌ ｍｏｌ−１である。
（ｃ）：　△Ｓについての誤差は、±１０ｅ．ｕ．である。
【００４７】
″ＳＯＤＮｓ）とも呼ばれている、２次構造を有するＯＤＮｓの２重鎖ドメインは、ほぼ生理的な条件下で安定していることがわかった。ＯＤＮｓＨ６，Ｈ８，Ｈ１０及びＬ８及びＬ１０内の内部２重鎖の熱安定性は、その尾部領域における塩基対の数によって左右される。ただし、表１に示されているように、ＳＯＤＮｓは、ＤＮＡ及びＲＮＡ標的の両方と相互作用して、分子内２重鎖とは異なる熱力学パラメータをもつ分子間２重鎖を形成する能力をもつ。これらの２分子２重鎖について見い出されたＴｍは、ＳＯＤＮｓのＴｍとは著しく異なり、２つの標的と共に線形ＯＤＮ２１Ｌにより形成された２重鎖について検出されたＴｍにほぼ対応する。唯一の例外は、非常に安定したヘヤピンを提示するオリゴヌクレオチド Ｈ１０である（Ｔｍ＝７５℃）。標的Ｄ又はＲの存在下では、融合曲線は、次の３つの周期を呈する。すなわち
−　第１の周期は、このＯＤＮ（）の１１ｍｅｒｓの１本鎖フラグメントと標的の間で形成された部分的分子間２重鎖の融合に対応する（ＤＮＡ標的については４３℃，ＲＮＡ標的については４０℃），
−　第２の周期は、全分子間２重鎖の融合に対応する（ＤＮＡ標的で６０℃，ＲＮＡ標的で５７℃）。
−　第３の周期は、２重らせん状の独自のドメインの融合に対応する（７３℃）。
【００４８】
ＤＮＡ及びＲＮＡ標的でのＳＯＤＮｓの固定も同様に、ゲル上の移動度試験によって研究された。ＯＤＮｓを３７℃で（３２Ｐ）で標識づけされた標的Ｄ及びＲを用いてインキュベートし、形成された複合体の移動度を１５％で変性しないポリアクリルアミドゲル内の電気泳動によって決定した。図８は、２つの標的の電気泳動移動度が、対応する複合体の形成への関与に起因して、全てのＳＯＤＮｓの存在下で変化する、ということを示している。
【００４９】
相補的ＲＮＡストランドにハイブリッド形成しリボヌクレアーゼＨによる切断を開始させるＳＯＤＮｓの能力も同様に研究された。図９は、３７℃で１５分間の０．５単位のリボヌクレアーゼＨとのＲＮＡ標的（０．１μＭ）、及び異なるＯＤＮｓ（１μＭ）のインキュベーションの結果を示す。線形オリゴヌクレオチド２１Ｌ及び全てのＳＯＤＮｓの存在下でのリボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ（Ｒ）の切断は、同じ効力でかつ同じ部位で介入する。主要切断部位は、図９に矢印で表わされている。相補的ＯＤＮｓが存在しない場合、ＲＮＡのいかなる切断もみられない。
【００５０】
これらの結果は全て、ＯＤＮｓの内部２本鎖構造が、そのＤＮＡ又はＲＮＡ標的との相互作用を妨げないということを示している。内部２重鎖は、ＳＯＤＮｓとその標的の間の２分子複合体が形成された時点で解離すると思われる。当然のことながら、表１に示されているように、２分子２重鎖は熱力学的にみて好ましい。
【００５１】
３）Ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ分解に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性
２次構造をもつＯＤＮｓの酵素加水分解に耐える能力は、一般に細胞の増大のために利用される、熱によって不活性化された１０％のＰＢＳが追加されたＤＭＥＭ中で、ならびに２つのタイプの細胞系統（ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ）の細胞溶解産物の中で研究された。（３２Ｐ）で標識づけされたリン酸塩の分割を回避するために、エチル残基により５’で保護されたリン酸塩を伴うオリゴヌクレオチドがこの研究が利用された。
【００５２】
ＦＢＳを含む培地中でのＯＤＮの分解の分析に関する図１０（ａ）及び（ｂ）は、ヘヤピン、ループ又はエスカルゴ状の２次構造がＳＯＤＮｓのヌクレアーゼに対する耐性を著しく増大させるということを立証している。ヘヤピン及びループを伴うＯＤＮｓの分解耐性は、内部２重鎖タイプ及びそれらの熱安定性によって左右される。例えば、最も熱安定性の高いヘヤピンＨ１０の半減期は、ヘヤピンＨ６及びＨ８のものを上回る。同時に、ループを伴うＯＤＮＬ１０はヘヤピンをもつＯＤＮＨ８と同じ分解耐性をもつ一方、その熱安定性はより低いものである（Ｌ１０については５３℃，Ｈ８については６０℃）。全ての線形オリゴヌクレオチド２１Ｌ，５５Ｌ及び２１ＰＳは、急速に分解される。これらの結果は、血清中の線形ホスホロチオエート及びホスホジエステルオリゴヌクレオチドの非常に短かい半減期について以前に報告されたデータを確認している（１０，１１）。
【００５３】
細胞内のオリゴヌクレオチドの浸透を増大させるべく、複数のトランスフェクション試薬を利用することができる（３８〜４２）。そのうちの１つ、つまりＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭという名称のデンドリマー分子の、ＦＢＳ１０％が追加されたＤＭＥＭ中のＯＤＮの安定性に対する影響が研究された。図１０（ｃ）及び（ｄ）に示されているように、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭとＯＤＮｓによって形成された複合体は、単独のＯＤＮｓよりも強いｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ分解に対する耐性を示す。耐性の増大は、線形ＯＤＮｓ５５Ｌ及び２１ＰＳで最も有意である。例えば、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭを伴う及び伴わないＯＤＮホスホロチオエート２１ＰＳの半減期は、それぞれ約１２時間から３０分である。同じ安定性の増大は、図１０（ａ）及び（ｃ）に示されているように５５Ｌで観察された。このことは、ＯＤＮｓとポリアミン化合物の複合体の形成がヌクレアーゼに対するその安定性を増大させることを示す文献（３８）から知られているデータと一致している。なお、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭを伴う及び伴わない修飾されていないＯＤＮ２１Ｌの半減期はほぼ同一である。この短かいＯＤＮとＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭで形成された複合体が、酵素分解を受けるオリゴヌクレオチドの末端を充分に保護しない可能性がある。
【００５４】
細胞ＨｅＬａ及びＮＩＨ３Ｔ３の溶解産物内のＯＤＮｓの安定性は、溶解産物のタイプによって変動する。ここで、これらの溶解産物中のタンパク質の濃度が同一であることを指摘しておきたい。その結果、それらのｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ活性間の区別は、ヌクレアーゼの活性の量的又は質的差異によって左右される。図１１（ａ）及び（ｂ）は、分解が、ＨｅＬＡ溶解産物中でより急速であることを示している。全ての線形ＯＤＮｓ２１Ｌ，２１ＰＳ及び５５Ｌは、それらの半減期が約１０分であることから、急速に分解される。
【００５５】
ＮＩＨ３Ｔ３溶解産物に関しては、図１１（ｃ）及び（ｄ）は、ＳＯＤＮの分解率がＨｅＬａ溶解産物の場合よりも低いことを示している。興味深いことに、全て５’及び３’の保護を伴うＳＯＤＮｓＤｈ６，Ｌ８及びＬ１０は、３’末端にヘヤピンを有するだけであるＳＯＤＮｓＨ６〜Ｈ１０よりも安定している。これらの結果は、ＯＤＮの分解に対する５’エキソヌクレアーゼ活性の貢献がこの溶解産物において非常に重要であることを示唆している。しかしながら、末端ホスホロチオエートによる修飾は、ＯＤＮｓ２１Ｌ及び２１ＰＳに比べて、ＯＤＮの耐性に有意な影響を及ぼさない。
【００５６】
図１２は、２つの細胞系統ＨｅＬＡ及び３Ｔ３におけるＯＤＮｓのｅｖｅｎｉｒを報告している。細胞内へのＯＤＮの浸透を改善するために、そのトランスフェクション作用物質ＴｒａｎｓＦｅｃｔＴＭとの複合体を形成させ、細胞とインキュベートさせた。図１２（ｂ）及び（ｄ）は、１６時間のインキュベーションの後２つの細胞型の中には微量の２１Ｌしか見られなかったことを示している。反対に、図１２（ａ）〜（ｄ）は、線形のもの（５５Ｌ及び２１ＰＳ）を含めたその他のＯＤＮｓが細胞中に有利な量（５０〜８０％）で検出されることを示している。４８時間のインキュベーションの後、細胞内部の無傷のＯＤＮｓの量は減少するものの、２０〜３０％のレベルでとどまる。図１２（ａ），（ｂ）及び（ｃ），（ｄ）は、２つの細胞系統間には有意な差異がないということを示している。２次構造を伴う全てのＯＤＮｃは、線形ＯＤＮｓ５５Ｌ及び２１ＰＳの安定性より高い同じ安定性をもつ。
【００５７】
例２：リポータ遺伝子ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のタンパク質発現の阻害
この例は、ＨｅＬａ細胞に対するβ−ｇａｌ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１試験の結果を報告している。
【００５８】
下表２は、この例で利用されておりその配列が添付の図１３で報告されているオリゴヌクレオチドの特徴を示している。
【００５９】
【表２】
2004500018.tif 000003
【００６０】
当該例は、同様に、図１３中に☆で印づけされたホスホロチオエートヌクレオチドを本発明の３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド内に導入することによって得られた結果を報告している。
【００６１】
下表３は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるリポータ遺伝子ｐＥＧＦＰＮ１のタンパク質発現の阻害（％単位）について報告している。
【００６２】
【表３】
2004500018.tif 000004
【００６３】
例３： ユ−イング肉腫のオンコ遺伝子ＥＷＳ−Ｆｌｉｌの相補的領域を含む本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド研究
１．本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択
ＥＷＳ−Ｆｌｉｌは、ユ−イング肉腫（小児の血液学的中実腫瘍）及び神経板外胚葉初期腫瘍のオンコ遺伝子である。
【００６４】
遺伝子ＥＷＳ−Ｆｌｉｌを阻害するために、ＥＷＳ−Ｆｌｉｌキメラタンパク質を産生することを理由に標的としてＲＮＡが選ばれた。疾病の原因であるこのタンパク質は、ユ−イング肉腫の発生を誘発する。（Ｔａｎａｋａ， Ｋ．， Ｉｗａｋｕｍａ， Ｔ．， Ｈａｒｉｍａｙａ， Ｋ．， Ｓａｔｏ， Ｈ．， Ｉｗａｍｏｔｏ， Ｙ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７，２３９−２４７； Ｔｏｒｅｅｔｓｋｙ， Ｊ．Ａ．， Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｙ．， Ｎｅｃｋｅｒｓ， Ｌ．， Ｂｈａｔ， Ｋ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． １９９７，３１，９−１６）。ＲＮＡは、半分が３’組換え（染色体１１のＦｌｉｌ遺伝子）で、そして半分がＥＷＳ５’組換え（染色体２２の遺伝子）で構成されており、これは、キメラ２２／１１を実現するための染色体２２及び１１の転座である。
【００６５】
タンパク質オンコ遺伝子は１５００個の塩基を含む。オンコ遺伝子を阻害するためには、融合オンコ遺伝子の「ブレークポイント」上に中心をおくアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することが必要である。先行技術の論文において、（Ｔａｎａｋａ， Ｋ．， Ｉｗａｋｕｍａ， Ｔ．， Ｈａｒｉｍａｙａ， Ｋ．， Ｓａｔｏ， Ｈ．， Ｉｗａｍｏｔｏ， Ｙ．Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７，２３９−２４７；Ｔｏｒｅｅｔｓｋｙ， Ｊ．Ａ．， Ｃｏｎｎｅｌｌ， Ｙ．， Ｎｅｃｋｅｒｓ， Ｌ．， Ｂｈａｔ， Ｋ．Ｊ． Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． １９９７，３１，９−１６）著者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ でキメラオンコ遺伝子を阻害する能力をもつホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定している。これらのオリゴヌクレオチドは線形である。
【００６６】
本発明の枠内では、ここでは２次構造によって構造化されているアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、一方では分解のアンチセンスを保護するためそして他方では標的とのその相互作用及びｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ でのその効力を容易にする目的で調製された。
【００６７】
標的に最も適合された２次構造を選択するために、この標的の２次構造は、「ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３．２１」プログラムを用いて計算された。添付の図１４は、この標的の構造を表わしている。ＲＮＡ ＥＷＳ−Ｆｌｉｌの全ての配列を分析し、６つの２次構造が標的の構造を保存していた。この標的に対抗して選択された本発明に従って構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは２タイプある。
【００６８】
その構造が添付の図面１５Ａに示されているＥＦ２９２９ＡＳと呼称される第１のタイプを調製した。これは、２次構造を実現するために標的に対し付加されるいかなる要素も利用しない。図１５Ｂは、標的との相互作用を示す。これは３’において、標的と相互作用するループを伴う構造を形成し、同じく５’でも標的のループとのもう１つの相互作用を有する。従って構造化されたオリゴヌクレオチド ＥＦ２９２９ＡＳは、標的の相補的連続として現われる。この新しい設計によると、標的との相互作用は多重であり、一方では３’でループと作用し、他方では５’「一本鎖」で標的自体のループ上に作用する。
【００６９】
添付の図１６Ａにその構造が表わされている本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの第２のタイプは、各々３’及び５’末端に補足的な２次構造を付加することにより調製された。相互作用は、内部で２次構造とそして外部で標的と複数レベルで、同時に行なわれる。図１６Ｂは標的との相互作用を示す。
【００７０】
かくして、構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＥＦ３００８ＡＳと呼称された５’で付加された２次構造の唯一の要素を用いて調製された。オリゴヌクレオチド ＥＦ２９２９ＡＳと同様、オリゴヌクレオチド ＥＦ３００８アンチセンスは、その二次構造のため、構造化されたオリゴヌクレオチド内で相互作用するためだけでなく、標的の内部で複数のレベルで多数の相互作用を有するように設計された。
【００７１】
実現された構造化された異なるオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの活性の保護の面でテストされ、ナノ粒子（ＴｒａｎｓｄｒｕｇＴＭ）又はＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭと呼ばれるベクターを伴う投与も、保護及び効力面で研究された。
【００７２】
ＥＦ２９２９ＡＳ及び３００８ＡＳと呼ばれるオリゴヌクレオチド及び対応する対照の配列が図１７に表わされており、ここで ＊ はホスホロチオエート基を表わす。
【００７３】
オリゴヌクレオチド ＥＦ２９２９ＡＳの配列は、配列番号１として添付の配列リスト中に表わされ、オリゴヌクレオチド３００８ＡＳの配列は、配列番号２という番号で添付の配列リスト中に表わされている。
【００７４】
２）結果
ａ）　分解に対する耐性
本発明に従った２次構造で実現されたオリゴヌクレオチドＥＦ２９２９ＡＳ及びＥＦ３００８ＡＳの酵素加水分解に耐える能力は、１０％のウシ新生児血清（熱不活性化されたＮＣＳ（ｎｅｗｂｏｒｎ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ） と呼ばれる）及びヒト血清（ＭＨ）が補足されたＤＭＥＭ中で研究された。（３２Ｐ）で標識づけされたリン酸塩の分割を避けるため、この研究については、エチル残基により５’に保護されたリン酸塩を伴うオリゴヌクレオチドが利用された。
【００７５】
図１８（Ａでは３００８ＡＳ）及び（Ｂでは２９２９ＡＳ）は、ウシ新生児血清（ＮＣＳ）及びヒト血清（ＭＨ）を含む培地中でのオリゴヌクレオチドの分解の分析に関するものであり、これは、２次構造がヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を著しく増加させることを示している。
【００７６】
Ｍｏｎｚａ特許（ＢｉｏＡｌｌｉａｎｃｅ）に従って６５ｎｍ（ＣＤ２）及び１００ｎｍ（ＣＤ３）のサイズの２つのナノ粒子ＰＩＨＣＡ（ＴｒａｎｓｄｒｕｇＴＭ）を実現し、これらのナノ粒子上に吸着されたオリゴヌクレオチドの調製を実施した。１０％ウシ新生児血清ＮＣＳ及びヒト血清ＭＨで補足されたＤＭＥＭ中のオリゴヌクレオチドの安定性に対する、ナノ粒子を用いたこの調製の影響を研究した。図１８を見ればわかるように、ナノ粒子と吸着されたオリゴヌクレオチドによって形成された複合体は、単独オリゴヌクレオチドに比べさらに強いヌクレオチド分解耐性を示す。
【００７７】
ｂ）生物学的効力
細胞増殖の阻害の測定方法は、以下のとおりである：
Ｊ１：ウェルあたり１０万個の細胞ＥＷＳ／Ｆｌｉｌ及び３Ｔ３を、６ウェルの平板（１カ所に２ウェル）内で分布させる。
Ｊ２：細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％のウシ新生児血清（ＮＣＳ）溶液６００μｌを添加する。
【００７８】
ＯＤＮｓ複合体を、Ｓｕｐｅｒ ＦｅｃｔＴＭ又はＴｒａｎｓｄｒｕｇＴＭ（ＢｉｏＡｌｌｉａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａ） を用いて実現し、ＮＣＳも抗生物質もない培地２００μｌ中に希釈させ、細胞上に添加する。完全培地を各ウェル内に添加して最終体積８００μｌを得る。
Ｊ３： ＯＤＮｓとのインキュベーションの後（トランスフェクションから１６時間後）、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの１０％のＮＣＳ溶液を添加する。夜には、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１０％のＮＣＳ溶液６００μｌを添加する。
【００７９】
ＮＣＳも抗生物質も含まない２００μｌの培地中に希釈させたＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴＭを伴うＯＤＮｓを細胞上に添加する。完全培地を各ウェル内に添加して８００μｌの最終体積を得る。
【００８０】
Ｊ４：ＯＤＮｓとのインキュベーション（トランスフェクションから１６時間後）の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４００μｌのトリプシンを添加する。次に細胞の増加を計算する。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの阻害効果を以下のように計算した：
Ｉ（ＡＯ）＝〔Ｎ１（ＡＯ）−Ｎ０（ＡＯ）〕Ｎ，
なお式中、
Ｎ−　オリゴヌクレオチド無しの細胞数
Ｎ０（ＡＯ）−　トランスフェクション以前の細胞数
Ｎ１（ＡＯ）−　最初のトランスフェクションから２日後の細胞数、である。
【００８２】
細胞増殖の阻害を、ＥＷＳ／ｆｌｉｌを発現する３Ｔ３細胞について実施し、正常な３Ｔ３細胞を用いた対照により、細胞増大の阻害の影響を測定することができた。これらの結果は、添付の図１９に報告されている。構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＡＳが、逆配列ＥＦ３００８ＲＬＳをもつ構造化されたオリゴヌクレオチドの負の対照に比べて、この基準に基づき活性であることは明らかである。ＥＦ３００８ＡＳが細胞増大の５０％の阻害を誘発することがわかる。
【００８３】
ｃ）　ユーイング肉腫のｉｎ ｖｉｖｏモデル
ＥＷＳ／Ｆｌｉｌを発現し腫瘍の形で疾病（ユーイング肉腫）を提示するトランスジェニックマウス（Ｃ． Ａｕｃｌａｉｒ Ｆ．Ｓｕｂｒａチームの内部で開発されたモデルであるヌードマウス）について研究を行なった。手で触れることのできるこの腫瘍は、腫瘍細胞注射後１４〜２８日目に現われる。
【００８４】
以下に記すプロトコルが実施された。
【００８５】
生後６週間の雄のヌードマウスを準備し、ＰＢＳ中１ｍｌあたり５×１０６個の細胞の割合で再懸濁させられた細胞培地からＥＷＳ／Ｆｌｉｌ細胞を与え、各々のマウスには２００マイクロリットルのこの溶液を注射する（テスト対象の治療タイプ毎にマウス３匹ずつのグループ）。接種から１４〜２８日目に、少なくとも２〜４ｍｍ３のサイズの腫瘍内に注射することにより治療を行ない、その後、最初の注射から５日、８日、１２日、１５日後にさらに４回の注射を行なう。最後の注射後、２１日目に動物を屠殺する。
【００８６】
腫瘍体積は、実験中、２回の垂直測定により評価される（長さＬ及び幅Ｗ，計算はＬＷ２／２を採用する）。
【００８７】
図２０及び２１に報告された治療グループは以下の通りである：
【００８８】
グループ１： オリゴヌクレオチドの注射無しの対照マウス。
【００８９】
グループ２： マウス１，２，３。構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド，ナノ粒子上に吸着された２０マイクログラムのオリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＡＳを含むＰＢＳ１００マイクロリットル（５０マイクログラム／ｍｌ）及び５０マイクロモルのＣＴＡＢ。ナノ粒子のサイズは６５ナノメートルである。
【００９０】
グループ３： マウス１ｃ，２ｃ，３ｃ，６５ナノメートルのナノ粒子を用いて同じ条件下での負の対照オリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＲＬＳ。
【００９１】
グループ４： マウス１，２，３。構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド，ナノ粒子上に吸着された２０マイクログラムのオリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＡＳを含むＰＢＳ１００マイクロリットル（５０マイクログラム／ｍｌ）及び５０マイクロモルグラムのＣＴＡＢ。ナノ粒子のサイズは１００ナノメートルである。
【００９２】
グループ５： マウス１ｃ，２ｃ，３ｃ，１００ナノメートルのナノ粒子を用いて同じ条件下での負の対照オリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＲＬＳ。
【００９３】
グループ６： マウス１，２，３。構造化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド，ＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭを用いて注射された２０マイクログラムのオリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＡＳを含むＰＢＳ１００マイクロリットル、５４マイクログラム。
【００９４】
グループ７： マウス１ＡＳ，２ＡＳ，３ＡＳ。ＳｕｐｅｒｆｅｃｔＴＭ無しで同じ条件下での負の対照オリゴヌクレオチド ＥＦ３００８ＲＬＳ。
【００９５】
負の対照と比べて、本発明に従った構造化されたオリゴヌクレオチドの腫瘍内注射による腫瘍増大の安定化を伴うｉｎ ｖｉｖｏでの効力が観察され、この効果は、従来利用されているベクターを用いてこれを投与した場合又はオリゴヌクレオチドの細胞内進入を容易にするため異なるサイズのナノ粒子を利用して投与した場合にも観察される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に従ったオリゴヌクレオチドの第１の実施形態を示す説明図である。
【図２】
本発明に従ったオリゴヌクレオチドの第２の実施形態を示す説明図である。
【図３】
アンチセンス配列のみに属する単数又は複数のヌクレオチド対を示す説明図である。
【図４】
アンチセンス配列の各末端に１つずつの２つの２次構造を含むことができるオリゴヌクレオチドを示す説明図である。
【図５】
アンチセンス配列の各末端に１つずつの２つの２次構造を含むことができるオリゴヌクレオチドを示す説明図である。
【図６】
アンチセンス配列の各末端に１つずつの２つの２次構造を含むことができるオリゴヌクレオチドを示す説明図である。
【図７】
本発明における実験の部で利用されるオリゴヌクレオチドを表わす配列表である。
【図８ａ】
未変性ＰＡＧＥでの２重鎖の形成の電気泳動分析結果を示す。
【図８ｂ】
未変性ＰＡＧＥでの２重鎖の形成の電気泳動分析結果を示す。
【図９】
リボヌクレアーゼＨによるＲＮＡ標的の分割を表わす。
【図１０】
熱により不活性化された１０％のＦＢＳで補足されたＤＭＥＭ中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす。
【図１１】
細胞溶解産物ＮＩＨ３Ｔ３内のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす。
【図１２】
細胞内部でのＳｕｐｐｅｒＦｅｃｔＴＭと複合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を表わす。
【図１３】
本発明の実施形態で利用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１４】
「ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３．２１」プログラムを用いて計算された標的の構造を表わす。
【図１５】
図１５ＡはＥＦ２９２９ＡＳと呼称される第１のタイプを示し、図１５Ｂは標的との相互作用を示す。
【図１６】
図１６Ａは本発明に従ったアンチセンスオリゴヌクレオチドの第２のタイプを示し、図１６Ｂは標的との相互作用を示す。
【図１７】
ＥＦ２９２９ＡＳ及び３００８ＡＳと呼ばれるオリゴヌクレオチド及び対応する対照の配列を示す。
【図１８】
ウシ新生児血清（ＮＣＳ）及びヒト血清（ＭＨ）を含む培地中でのオリゴヌクレオチドの分解の分析を示す。
【図１９】
細胞増殖の阻害を、ＥＷＳ／ｆｌｉｌを発現する３Ｔ３細胞について実施し、正常な３Ｔ３細胞を用いた対照により、細胞増大の阻害の影響を測定した結果を示す。
【図２０】
生後６週間の雄のヌードマウスの治療に伴う腫瘍体積を示す。
【図２１】
生後６週間の雄のヌードマウスの治療に伴う腫瘍体積を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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