(57)【要約】本発明は、癌の再発予測に向けた採点システムに関するものである。より詳細には、本発明は、ヒトの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を測定して、その発現パターンを、癌が再発した患者および癌が再発していない患者由来のヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質発現パターンと比較することによって、癌の再発予測のための、遺伝子および／またはタンパク質の選択、ならびに選択した遺伝子および／またはタンパク質による式の作製に関するものである。本発明はまた、癌の再発の指標となる少なくとも2個またはそれ以上、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは6個またはそれ以上、および最も好ましくは12個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質の発現を調べるために、DNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、タンパク質アレイ、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行うために必要な、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、ペプチド、抗体、プローブ、およびプライマーを含む、本発明の方法を実施するためのキットにも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再発したおよび再発していないヒト癌患者からの癌組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンに基づく統計的解析により選択された、2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質を用いる、癌再発の予測に向けた採点システム。
【請求項２】
統計的解析により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が4個またはそれ以上である、請求項1に記載の採点システム。
【請求項３】
統計的解析により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が6個またはそれ以上である、請求項1に記載の採点システム。
【請求項４】
統計的解析により選択された遺伝子および／またはタンパク質の数が12個またはそれ以上である、請求項1に記載の採点システム。
【請求項５】
癌組織が肝癌組織である、請求項1〜4のいずれかに記載の採点システム。
【請求項６】
ヒト癌組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現、ならびに再発したおよび再発していない患者からのヒト原発癌組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、DNAマイクロアレイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、またはタンパク質アレイによって調べる、請求項1〜5のいずれかに記載の採点システム。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれかに記載の採点システムによって選択された遺伝子および／またはタンパク質の発現を調べるための、DNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、タンパク質アレイ、ノーザンブロッティング、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、ウェスタンブロッティング、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要な、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、プローブまたはプライマーを含む、請求項1〜6のいずれかに記載の採点システムを遂行するためのキット。
【請求項８】
（a）患者の癌組織から調製した試料において、請求項1〜6のいずれかに記載の採点システムにより選択された遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンを調べる工程；ならびに
（b）工程（a）において調べた遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたは発現パターンを、請求項1〜6のいずれかに記載の採点システムに適用することにより患者の癌再発を予測する工程
を含む、癌再発の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の再発予測のための採点システムに関する。より詳細には、本発明は、ヒトの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を測定して、その発現パターンを、癌が再発した患者および癌が再発していない患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質発現パターンと比較することによって、癌の再発予測のための、遺伝子および／またはタンパク質の選択、ならびに選択した遺伝子および／またはタンパク質に関する式の作製に関する。
【０００２】
本発明はまた、少なくとも2個またはそれ以上、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは6個またはそれ以上、および最も好ましくは12個またはそれ以上の、癌再発の指標となる遺伝子および／またはタンパク質の発現を調べるために、DNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、タンパク質アレイ、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以降、RT-PCRと呼ぶ）を行うために必要な、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、ペプチド、抗体、プローブ、およびプライマーを含む、本発明の方法を実施するためのキットにも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、世界における主な死因の一つである。全体的な癌の罹患率は、人口の約1％であり、年間発症率は約0.5％である。退院した患者の10人に約1人がその一次診断として癌を有する。主な既存の治療様式は、外科的切除、放射線療法、化学療法、およびホルモン治療を含む生物療法である。さらに、新たに開発されたバイオテクノロジーにより、遺伝子治療のような新しい治療様式が提供されている。それにもかかわらず、癌はほとんどの場合において真に有効な治療が利用できないために、恐ろしい疾患である。癌治療の主要な問題の一つは、癌細胞が薬物に対して耐性となり、組織の他の部位に広がり、そこで新しい腫瘍を形成し、その結果しばしば再発が起こることである。再発が起こる前に癌の再発を予測することができれば、そのような癌は、手術による局所治療によって治癒可能となる。
【０００４】
様々な腫瘍の中で、肝細胞癌（以降、HCCと呼ぶ）は、世界中で最も一般的な致死性の癌の一つであり、発症数は、アメリカ、日本、中国、およびヨーロッパ諸国を含む多くの国において増加している。B型肝炎ウイルス（以降、HBVと呼ぶ）およびC型肝炎ウイルス（以降、HCVと呼ぶ）感染症はいずれもHCCの原因となりうる。実際に、HCC患者の増加は、慢性HCV感染症の増加と平行している（El-Serag, H.B. and Mason, A.C.、「Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States」、N. Engl. J. Med. 340：745〜750（1999）；およびOkuda, K.、「Hepatocellular carcinoma」、J. Hepatol. 32：225〜237（2000））。HCCの発症率の上昇にもかかわらず、この疾患に対する有望な治療はない。HCCの治療における主な問題は、肝臓内転移である。再発は、肝切除を受けたHCC患者の30％〜50％において認められた（Iizuka, N.ら、「NM23-H1 and NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma」、Cancer Res. 55：652〜657（1995）；Yamamoto, J.ら、「Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery」、Br. J. Surg. 83：1219〜1222（1996）；およびPoon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。病理的TNM分類システムがHCCの治療において適用されているが、このシステムは、肝切除を受ける患者における再発を正確に予想することはできない（Izumi, R.ら、「Prognostic factors of hepatocellular carcinoma in patient undergoing hepatic resection」、Gastroenterology 106：720〜727（1994））。多くの分子が同様にHCCの予測マーカーとして提唱されているが、それらのいずれも臨床的での有用性は証明されていない（Iizuka, N.ら、「NM23-H1 and NM23-H2 messenger RNA abundance in human hepatocellular carcinoma」、Cancer Res. 55：652〜657（1995）；Hsu, H.C.ら、「Expression of p53 gene in 184 unifocal hepatocellular carcinomas：association with tumor growth and invasiveness」、Cancer Res. 53：4691〜4694（1993）；およびMathew, J.ら、「CD44 is expressed in hepatocellular carcinomas showing vascular invasion」、J. Pathol. 179：74〜79（1996））。このように、再発を予測する方法は、癌のメカニズムを理解する上で、そしてまた癌の新しい治療を確立する上で極めて有用である。しかし、従来の方法によって再発を予測するには技術的限界があり、腫瘍は患者間で不均一性が高いためにさらなる限界があることから、腫瘍を特徴づけて、癌の再発を予測する新たな方法を考案する必要がある。
【０００５】
多数の遺伝子の発現を同時に解析することができるマイクロアレイ技術が最近開発されたことにより、医科学に新たな時代が開かれた（Schena, M.ら、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science 270：467〜470（1995）；およびDeRisi, J.ら、「Use of a cDNA microarray to analyze gene expression patterns in human cancer」、Nature Genet. 14：457〜460（1996））。特に、cDNAマイクロアレイによる腫瘍の遺伝子発現に関する研究は、予後および薬物感受性のような悪性腫瘍の特性に有意義な洞察を与えた（Alizadeh, A.A.ら、「Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling」、Nature 403：503〜511（2000）；およびScherf, U.ら、「A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer」、Nature Genet. 24：236〜244（2000））。最近、遺伝子発現解析に管理学習（Supervised learning）が導入された（Brazma, A.およびVilo, J.「Gene expression data analysis」、FEBS Lett. 480、17〜24（2000）、ならびにKell, D.B.およびKing, R.D.「On the optimization of classes for the assignment of unidentified reading frames in functional genomics programs：the need for machine learning」、Trends Biotechnol. 18、93〜98（2000））。分類された試料を用いることで、管理学習はデータの本質に関する多くの先験的知識という点で大きな長所を有する（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001）；およびJain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence. 22、4〜37（2000））。しかし、これまでに公表された管理学習法はどれも遺伝子の組み合わせを直接評価しておらず、したがって統計学的特徴、すなわち遺伝子の分布構造に関する情報を利用することができない（Golub, T.R.ら、「Molecular classification of cancer：class discovery and class prediction by gene expression monitoring」、Science 286、531〜537（1999）；およびBrown, M.P.ら、「Knowledge-based analysis of microarray gene expression data by using support vector machines」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97、262〜267（2000））。
【０００６】
癌の再発を予測する採点システムは、統計学的パターン認識における管理学習によるDNAマイクロアレイデータを解析することによって構築される（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001））。
【０００７】
統計学的パターン認識における管理学習は、文書の分類、言語認識、生物測定学的認識、および遠隔知覚のような、多様な問題を解決するために効果的に用いられている（Jain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence 22、4〜37（2000））。
【発明の開示】
【０００８】
本発明において、本発明者らは、ヒトの原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現を解析することによって、癌の再発予測のための採点システムを提供する。すなわち本発明は、ヒトの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を測定して、それを癌が再発した患者および癌が再発していない患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現と比較することを含む、癌の再発を予測する方法に関するものである。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明では、脳、肺、乳腺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、結腸、直腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、前立腺、および皮膚の腫瘍を含む、腫瘍由来のヒト組織を用いる。手術中、ヒト組織を切除した後、それらを液体窒素またはドライアイスを含むアセトン中で直ちに凍結して、O.C.T.化合物（Sakura-Seiki、東京、日本、カタログ番号4583）に包埋後または包埋せずに、使用時まで-70℃〜-80℃で保存することが好ましい。
【００１０】
癌再発の確率について試験する患者からの腫瘍組織の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、RNAおよび／またはタンパク質のレベルを測定することによって解析する。多くの場合、RNAおよび／またはタンパク質のレベルは、フルオレセインおよびローダミンを含む物質からの蛍光、ルミノールからの化学発光、3H、14C、35S、33P、32P、および125Iを含む放射活性材料からの放射活性、ならびに吸光度を測定することによって決定される。RNAおよび／またはタンパク質の発現レベルは、DNAマイクロアレイ（Schena, M.ら、「Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray」、Science 270、467〜470（1995）；およびLipshutz, R.J.ら、「High density synthetic oligonucleotide arrays」、Nature Genet. 21：20〜24（1999））、RT-PCR（Weis, J.H.ら、「Detection of rare mRNAs via quantitative RT-PCR」、Trends Genetics 8、263〜264（1992）；およびBustin, S.A.、「Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays」、J. Mol. Endocrinol. 25、169〜193（2000））、ノーザンブロッティングおよびインサイチューハイブリダイゼーション（Parker, R.M.およびBarnes, N.M.、「mRNA：detection in situ and nothern hybridization」、Methods Mol. Biol. 106、247〜283（1999））、RNA分解酵素プロテクションアッセイ（Hod, Y.A.、「Simplified ribonuclease protection assay」、Biotechniques 13、852〜854（1992）；Saccomanno, C.F.ら、「A faster ribonuclease protection assay」、Biotechniques 13：846〜850（1992））、ウェスタンブロッティング（Towbin, H.ら、「Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76、4350〜4354（1979）；Burnette, W.N.、「Western blotting：Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radioiodinated protein A」、Anal. Biochem. 112：195〜203（1981））、ELISAアッセイ（Engvall, E.およびPerlman, P.、「Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）：Quantitative assay of immunoglobulin G」、Immunochemistry 8：871〜879（1971））、ならびにタンパク質アレイ（Merchant, M.およびWeinberger, S.R.、「Review：Recent advancements in surface-enhanced laser desorption /ionization-time of flight-mass spectrometry」、Electrophoresis 21：1164〜1177（2000）；Paweletz, C.P.ら、「Rapid protein display profiling of cancer progression directly from human tissue using a protein biochip」、Drug Development Research 49：34〜42（2000））を含む、公知の方法によって決定される。
【００１１】
試験する患者の腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、早期再発した癌患者と再発していない患者の場合と同様に解析することで、再発の可能性を決定する。
【００１２】
癌の早期再発は、異なる癌のタイプでは変わるが、通常、切除後1年または2年以内に起こる。したがって、切除後1年または2年以内に再発した癌患者からの腫瘍を、早期再発患者の腫瘍として用いることができ、切除後1年または2年までに再発していない患者からの腫瘍を、早期再発していない患者の腫瘍として用いることができる。
【００１３】
早期再発した癌患者と再発していない癌患者の腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルまたはパターンの差異を、公知の統計学的解析法によって解析し検出することができる。統計学的パターン認識における管理学習を、腫瘍の遺伝子および／またはタンパク質の発現パターンの統計的解析のために用いることができる。統計学的パターン認識における管理学習によって、調べた遺伝子および／またはタンパク質から、その発現が癌の再発を示す2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質を選択する。
【００１４】
癌の再発を示すいくつかの遺伝子および／またはタンパク質を、一次元基準によって最初に選択する。次に、遺伝子および／またはタンパク質の起こりうる全ての組み合わせを考慮に入れることができるリーブワンアウト（leave-one-out）法による網羅的な検索によって、これらの遺伝子および／またはタンパク質から最適な遺伝子および／またはタンパク質のサブセットを選択する。
【００１５】
その発現が癌の再発の指標となる、少なくとも2個またはそれ以上、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは6個またはそれ以上、および最も好ましくは12個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質の最適なサブセットを用いることによって、癌の再発を予測する式を作製する。遺伝子および／またはタンパク質の数と比較して試料の数が少ない場合でも、十分に機能する線形分類（Duda, R.O.ら、「Pattern classification」、John Wiley & Sons（2001）、およびJain, A.K.ら、「Statistical pattern recognition：A review」、IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence 22、4〜37（2000））のような単純な分類を用いて、式を作製する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットにも関するものである。癌の再発の指標となる、2個またはそれ以上の遺伝子および／またはタンパク質の発現パターンを調べるためのキットは、RNA抽出のための試薬、cDNAおよびcRNAの合成のための酵素、DNAチップ、オリゴヌクレオチドチップ、タンパク質チップ、解析のためのプローブおよびプライマー、制御遺伝子のDNA断片、ならびに様々なタンパク質に対する抗体を含む成分からなる。キットの成分は容易に購入することができる。例えば、オリゴヌクレオチドチップ、グアニジン-フェノール試薬、逆転写酵素、T7 RNAポリメラーゼ、およびtaqポリメラーゼを購入して、本発明のキットのために組み立てることができる。
【００１７】
以下の実施例は、本発明の癌再発を予測するための好ましい方法を単に説明するのであって、それらに限定されると解釈されるべきではない。
【００１８】
実施例
実施例1．早期肝臓内再発を解析するための患者の選択
術後の早期肝臓内再発（1年以内）は、主に肝臓内転移から生じるが、後期再発は多中心性再発となる可能性がより高いことが報告されている（Poon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。その上、肝臓内再発を有する患者の転帰は、多中心性再発を有する患者の転帰より悪かったことは周知である（Yamamoto, J.ら、「Recurrence of hepatocellular carcinoma after surgery」、Br. J. Surg. 83、1219〜1222（1996）；およびPoon, R.T.ら、「Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma」、Cancer 89：500〜507（2000））。したがって、早期肝臓内再発に連鎖した遺伝子発現パターンを、術後1年以内に調べた。
【００１９】
1997年5月から2000年1月までの間に山口大学病院において、患者33人がHCCのための外科治療を受けた。手術前に全ての患者から書面でのインフォームドコンセントを得た。研究プロトコールは、1996年5月に山口大学医学部のヒトの利用に関する院内倫理委員会によって承認された。HCCの組織病理学的診断は、術後に全ての患者において行った。組織病理学検査によって、33例のHCC試料全てにおいて残留腫瘍がないこと（R0）も判明した。表1は、国際対癌連合（UICC）のTNM分類（Sobin, L.H.およびWittekind, C.、「TNM classification of malignant Tumors」、第5版、UICC、Wiley-Liss、74〜77（1997））に基づき、患者33人の臨床病理学的特徴を示す。血清学的に、患者7人がB型肝炎表面抗原陽性であり、患者22人が抗HCV抗体陽性であり、残りの患者4人が双方に対して陰性であった。患者33人は、肝切除後3ヶ月毎に超音波検査法、コンピューター断層撮影法、およびα-フェトプロテインレベルによって癌の再発に関して追跡した。必要であれば、磁気共鳴映像および肝血管造影法を加えた。HCC患者33人中、早期肝臓内再発を12人（36％）に認めた。患者12人中11人において、再発したHCCは、残存している肝臓において多数の結節または散在性の内転移として検出された。1人の患者では、術後9ヶ月目に、切除された一次病巣に隣接した部分における単一の結節として新規腫瘍が検出され、その後多数の肺転移を認めた。残りの患者21人はいずれも、術後1年以内に肝臓内再発および他の遠位転移を示さなかった。これらの患者を2群に分けた；A群には1年以内に肝臓内再発した患者（n＝12）、およびB群には再発しなかった患者（n＝21）（表1）。カイ二乗検定およびフィッシャーの直接確率検定を用いて、2群の間の臨床病理学的要因における差を解明した。
【００２０】
実施例2．組織からのRNAの抽出
組織片（約125 mm3）をTRIZOL（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号15596-018）、またはSepasol-RNAI（ナカライテスク、京都、日本、カタログ番号306-55）に懸濁して、ポリトロン（キネマティカ、リッタウ、スイス）（最高速度で5秒間）によって2回ホモジナイズした。クロロホルムを加えた後、組織ホモジネートを15,000×gで10分間遠心して、RNAを含む水相を回収した。総細胞RNAをイソプロピルアルコールで沈殿させて、70％エタノールで1回洗浄し、DEPC処置水（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号10813-012）中に懸濁した。RNAを1.5単位のDNA分解酵素I（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18068-015）によって処理した後、RNAをTRIZOL/クロロホルムで再度抽出して、エタノールで沈殿させ、DEPC処置水に溶解した。その後、RNeasyミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ、カタログ番号74104）を用いて、製造元の取扱説明書に従って低分子量ヌクレオチドを除去した。総RNAの品質は、アガロースゲル電気泳動後の28Sと18SリボソームRNAの比から判断した。精製した総RNAは、使用するまで70％エタノール溶液中で-80℃にて保存した。
【００２１】
実施例3．cDNAおよび標識cRNAプローブの合成
cDNAは、製造元の取扱説明書に従って、reverse SuperScript Choiceシステム（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、アメリカ、カタログ番号18090-019）を用いて合成した。精製した総RNA 5 μgを、T7プロモーターの配列とSuperScript II逆転写酵素200単位とを含むオリゴ-dTプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）とハイブリダイズさせて、42℃で1時間インキュベートした。得られたcDNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、Phase Lock Gel Light（エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ、カタログ番号0032.005.101）で精製した。
【００２２】
cRNAも同様に、MEGAscriptT7キット（アンビオン、オースチン、アメリカ、カタログ番号1334）、および鋳型としてcDNAを用いて製造元の説明書に従って合成した。cDNA約5 μgを、T7ポリメラーゼ、アデノシン三リン酸（ATP）およびグアノシン三リン酸（GTP）各7.5 mM、シチジン三リン酸（CTP）およびウリジン三リン酸（UTP）各5.625 mM、Bio-11-CTPおよびBio-16-UTP（ENZOダイアグノスティックス、ファーミングデール、アメリカ、それぞれカタログ番号42818および42814）各1.875 mMを含む酵素混合物2 μlと共に、37℃で6時間インキュベートした。モノヌクレオチドおよび短いオリゴヌクレオチドをCHROMA SPIN＋STE-100カラムでのカラムクロマトグラフィー（クロンテック、パロアルト、アメリカ、カタログ番号K1302-2）によって除去し、エタノールを加えて溶出液中のcRNAを沈降させた。cRNAの品質は、アガロースゲル電気泳動後のcRNAの長さから判断した。精製したcRNAは使用するまで70％エタノール溶液中で-80℃で保存した。
【００２３】
実施例4．再発した患者と再発していない患者からの腫瘍の遺伝子発現解析
生存している癌患者からのヒト原発腫瘍の遺伝子発現を、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって調べた（HuGeneFLアレイ、アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ、カタログ番号510137）（Lipshutz, R.L.ら、「High density synthetic oligonucleotide arrays」、Nature Genet. 21：20〜24（1999））。チップ上でのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに向けて、cRNAを、40 mMトリス（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号T1503）-酢酸（和光、大阪、日本、カタログ番号017-00256）（pH 8.1）、100 mM酢酸カリウム（和光、大阪、日本、カタログ番号160-03175）、および30 mM酢酸マグネシウム（和光、大阪、日本、カタログ番号130-00095）を含む緩衝液において95℃で35分間断片化した。ハイブリダイゼーションは、0.1 M 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸（MES）（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号M3885）（pH 6.7）、1 M NaCl（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号313-20）、0.01％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル（和光、大阪、日本、カタログ番号168-11805）、ニシン精子DNA（プロメガ、マディソン、アメリカ、カタログ番号D181B）20 μg、アセチル化ウシ血清アルブミン（シグマ、セントルイス、アメリカ、カタログ番号B-8894）100 μg、断片化したcRNA 10 μg、およびビオチン化対照オリゴヌクレオチド、ビオチン-5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3'（サワディー・テクノロジー、東京、日本）を含む緩衝液200 μlにおいて、45℃で12時間行った。0.01 M MES（pH 6.7）、0.1 M NaCl、0.001％ポリオキシレン(10)オクチルフェニルエーテル緩衝液を含む緩衝液でチップを洗浄した後、取扱説明書（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）に記載されたようにハイブリダイゼーションシグナルを増大させるために、チップをビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（フナコシ、東京、日本、カタログ番号BA0500）と共にインキュベートして、ストレプトアビジンR-フィコエリスリン（モレキュラープローブズ、ユージーン、アメリカ、カタログ番号S-866）によって染色した。各ピクセルレベルをレーザースキャナ（アフィメトリクス、サンタクララ、アメリカ）で収集し、各cDNAの発現レベルおよび信頼性（有無の判定）を、アフィメトリクスGeneChipバージョン3.3およびアフィメトリクスMicroarray Suiteバージョン4.0ソフトウェアによって計算した。この実験から、肝癌患者のヒト原発腫瘍において6000個の遺伝子発現が明らかとなる。
【００２４】
実施例5．カイネティックRT-PCR解析
遺伝子の発現も同様に、カイネティックRT-PCRによって決定する。カイネティックRT-PCRは、リアルタイム蛍光PCRシステムによって行った。ライトサイクラー（LightCycler）装置（ライトサイクラーシステム、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2011468）を用いるPCR増幅を、ライトサイクラー・キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号1909339）において、マスター混合物および緩衝液（ライトサイクラーDNAマスターハイブリダイゼーションプローブ、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ、カタログ番号2158825）、4 mM塩化マグネシウム（ナカライテスク、東京、日本、カタログ番号7791-18-6）、PCRプライマー（サワディー・テクノロジー、東京、日本）10 pmol、増幅された産物の鎖上で標的配列と頭部-尾部の配置でハイブリダイズするように設計された、蛍光ハイブリダイゼーションプローブ（日本ゲノムリサーチラボラトリーズ、仙台、日本）4 pmol、および鋳型cDNA 2μlからなる反応混合物20 μl中で行った。供与プローブは、3'末端を蛍光によって標識し、受容プローブは、5'末端をLC-Red640によって標識して、伸長を防止するために3'末端をリン酸化によって修飾した。供与プローブの3'末端と受容プローブの5'末端の間のギャップは1〜3塩基であった。増幅前、TaqStart抗体（クロンテック、パロアルト、アメリカ、カタログ番号5400-1）0.16 μlを反応混合物に加えて、その後、プライマーの伸長を防止するために室温で10分間インキュベートした。次に、抗体を95℃で90秒間インキュベートして不活化し、増幅は、ライトサイクラーにおいて変性を95℃で0秒間、アニーリングを57〜60℃で3〜10秒間、および伸長を72℃で10秒間を温度勾配20℃／秒の40サイクルによって行った。リアルタイムRT-PCRモニタリングは、各増幅サイクルにおいてアニーリング段階の終了時に蛍光シグナルを測定することによって行った。単離したRNAの完全性を限定し、標的配列のコピー数を標準化するために、グリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に関するカイネティックRT-PCRも同様に、ハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。標的mRNAおよびGAPDH mRNAの外部標準は、プラスミドDNAの10倍連続希釈（103〜108）によって調製した。各試料におけるmRNAの定量は、ライトサイクラー・ソフトウェア（ライトサイクラー・ソフトウェア、バージョン3、ロシュ・ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）に従って、各時点で作製した標準曲線を参照して自動的に行った。
【００２５】
実施例6．その発現によって早期肝臓内再発した肝癌患者と早期肝臓内再発していない患者とを区別する遺伝子セットの同定
早期肝臓内再発は、原発腫瘍の数およびTNM段階とそれぞれ、p値0.041および0.006で関連する傾向があったが、他の臨床病理学的要因とは関連しなかった（表1）。手術時の原発腫瘍の数により、A群とB群は区別されたが、その感度および特異性は限られていた（それぞれ、62％および75％）。TNM段階も同様に、A群とB群の分離に関して感度（67％）および特異性（83％）が限られていた。このように、これらの従来の分類では、早期肝臓内再発を予測することができないと考えられる。
【００２６】
統計学的パターン認識における管理学習を適用して、高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイのデータを解析した。採点システムは、練習試料によって設計し、被験試料によってその成績を確認した（図1）。練習試料と被験試料の独立性を維持するために、練習試料と被験試料とを交換する交差検定アプローチを採用した。交差検定アプローチでは、利用可能な試料33個を練習試料30個と被験試料3個に分けた（図1、段階1）。事前確率に基づいて、A群からの試料11個とB群からの試料19個からなる練習試料のセットを10個作製した。その結果、A群の1個およびB群の2個からなる被験試料3個のセットを10個作製した。
【００２７】
予測採点システムを作製するために、平均差の平均値がA群とB群との間で2倍を超える有用な遺伝子50個を、フィッシャー基準（図1、段階2〜3）を用いて調べた全ての遺伝子から選択し、これを以下の式（I）によって示す：
2004536610.tif 000002
式中、μA(i)は、A群の試料平均ベクトルμAの第i番目の成分であり、σ2A(i)は、A群の試料の共分散行列ΣAのi番目の対角要素であり、P(A)は、A群の先験的確率である。
【００２８】
次に、採点システムに関して遺伝子の最適なサブセットを以下のように同定した。
【００２９】
フィッシャーの線形分類は、以下の式（II）において被験試料xをA群に分類するように割り当てる。
FA(x)＜FB(x)であれば、
2004536610.tif 000003
【００３０】
リーブワンアウト法において、試料の平均ベクトル、試料の共分散行列、および先験的確率を、練習試料として試料29個を用いて概算した。次に、得られたフィッシャー線形分類を、偽被験試料として残りの試料について試験した。この操作を30回繰り返した。遺伝子のそれぞれの可能なサブセットについて誤差率を計算した。例えば、遺伝子50個の中から5個を選択する場合、調べるサブセットの数は、200万個である。
【００３１】
次に、誤差率を最小限にする候補遺伝子サブセットを選択した（図1、段階4）。この試行を独立して10回繰り返した（図1、段階5）。
【００３２】
候補遺伝子サブセットにおいて、10回の試行を通じて最も頻繁に出現する遺伝子サブセットを、二つの群を識別するための遺伝子の最適なサブセットとして選択した（図1、段階6）。選択した遺伝子の最適なサブセットを用いて、評点Tは以下の式（III）によって得られる。
T(x)＝FA(x)-FB(x)
【００３３】
この採点システムにおいて、T値が負であるHCCは全てA群（早期肝臓内再発群）に分類され、T値が正であるHCCは全てB群（再発がない群）に分類される。
【００３４】
遺伝子の最適な数は、以下の式（IV）によって得られる基準Jに従って決定された（図1、段階7）。
2004536610.tif 000004
【００３５】
基準Jは、A群のB群との分離可能性を測定する。異なる練習セット10個におけるJ値の平均値および95％信頼区間を、様々な数の遺伝子に関して計算した（図2）。分離可能性は、遺伝子数の増加と平行して良好になった。信頼区間の95％は、遺伝子数が10および12に達した場合にほとんど類似となり、12が二群の分離可能性に関して最も適当な遺伝子数であることを示している（図2）。
【００３６】
実施例7．その発現が早期肝臓内再発を示す遺伝子12個の最適なサブセット
上記のアルゴリズムに従って、A群とB群とを区別する遺伝子12個の最適なサブセットを同定した。最適な遺伝子サブセットは、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002からなった（表2）。選択した遺伝子12個の中で、11個の発現はA群において下方制御された；A群におけるこれらの遺伝子の平均差の平均値は、B群の平均値の半分以下であった（図3）。対照的に、HUMLUCA19遺伝子発現はA群において上方制御された；A群におけるHUMLUCA19遺伝子の平均差の平均値は、B群と比較して3倍より多く増加した（図3）。早期肝臓内再発を予測するための採点システムの精度を、被験試料3個の異なる10セットについて評価した（図4）。HCCの早期再発は、HCC患者からの遺伝子12個のT値を計算することによって予測する。術後1年以内の再発は、T値がゼロ未満である場合に非常に可能性が高く、術後1年以内の再発はT値がゼロより高ければかなり可能性が低い。採点システムは、10回の試行全てにおいて被験試料3個の早期肝臓内再発を完全に予測することができた（図4）。採点システムは、ウイルス感染パターンとは独立しており、TNM分類システムよりはるかに正確であった（図4）。上記の遺伝子12個によるHCC33例全てに基づく採点システム（図5）には、以下の式（V）が含まれる。
式（V）
T(x)＝0.053862x1＋0.038848x2＋0.030176x3＋0.001824x4＋0.096997x5＋0.017259x6＋0.015908x7＋0.103081x8-0.093746x9＋0.024031x10-0.005417x11-0.119177x12-11.046007、
式中、x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、x12は、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRA）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）誘導タンパク質A20、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質（LAPTm5）、HLA-DRα重鎖、rel癌原遺伝子、Staf50、推定のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ、MADS/MEF2ファミリー転写因子（MEF2C）、3p21.3由来のHUMLUCA19ヒトコスミドクローンLUCA19、DEADボックスタンパク質p72、ビメンチン、およびKIAK0002遺伝子に関するmRNAの標準化した平均差である（表2）。
【００３７】
本発明によって選択された遺伝子12個は、広範囲の生物学的過程に関与している。これらの中で、HLA-DRα重鎖、TNF-α誘導タンパク質A20、およびStaf50のような免疫応答関連遺伝子は、早期肝臓内再発を有するHCCにおいて下方制御された。HLC-DRα重鎖は、マクロファージによる抗原提示において重要な役割を果たすと考えられることから（Tissot, C.およびMechti, N.、「Molecular cloning of a new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression」、J. Biol. Chem. 270：14891〜14898（1995））、腫瘍状組織において下方制御されると、宿主の免疫監視から腫瘍細胞が容易に逃れることができる可能性がある。NF-κBと同様に細胞内シグナル伝達経路に関与しているRel癌原遺伝子もまた、早期肝臓内再発を有するHCCにおいて下方制御された。さらに、rel/NF-κBの発現は、T細胞活性化に関連すると報告されている（Mora, A.ら、「NF-kappa B/Rel participation in the lymphokine-dependent proliferation of T lymphoid cells」、J. Immunol. 166：2218〜2227（2000））。このように、本発明によって早期肝臓内再発を予測するために用いるように選択されたいくつかの遺伝子は、高い転移能を有するHCC細胞に対する宿主免疫応答を弱めることに関与していると考えられる。
【００３８】
追跡期間が最近1年に達した他のHCC患者の遺伝子発現パターンも同様に、オリゴヌクレオチドマイクロアレイによって解析して、遺伝子12個の発現の評点を上記の式に従って計算した。術後1年を超えても再発せずに生存している患者のT値は陽性（正の評点）であり、術後1年以内に肝臓内再発した他の患者のT値は陰性（負）であった。このように、6000個から得られた遺伝子12個のサブセットからなる採点システムは、早期肝臓内再発を正確に予測することができる。統計学的パターン認識における管理学習の臨床標本への応用は、HCCのみならず他の疾患の予防、診断、および治療の進歩において重要な情報を提供しうる。さらに、DNAマイクロアレイのみならず、RT-PCRのような他の方法も、遺伝子の最適なセットの発現を決定するために用いることができる。
【００３９】
（表１）早期肝臓内再発に対して用いられるHCCの臨床病理学的要因
2004536610.tif 000005
＊  UICCのTNM分類に基づく評価
HBV：B型肝炎ウイルス、HCV：C型肝炎ウイルス、非B非C：HBVでもHCVでもない、A群：早期肝臓内再発（＋）、B群：早期肝臓内再発（-）
N.S.：有意差なし
【００４０】
（表２）早期肝臓内再発を予測するための式および12個の遺伝子
2004536610.tif 000006
GB＊：Gene bankアクセス番号
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】最適な遺伝子サブセットによる採点システムの、遺伝子選択（工程1〜7）および評価（工程8〜10）の手順を説明する。
【図２】最適な遺伝子数を示す。
【図３】早期肝臓内再発を予測するために選択された遺伝子に関する、mRNAの平均差を示す。遺伝子12個のmRNAの平均差を、A群（Aとして示す）およびB群（Bとして示す）の間で比較した。
【図４】早期肝臓内再発の予測に関するウイルスのタイプ、TNM段階、および評点（T値）の間の関係を示す。遺伝子12個の最適なサブセットを用いて、練習試料30個によって作製した採点システムを被験試料3個について評価した。この操作を独立して10回繰り返した。全ての被験試料のT値を計算した。早期肝臓内再発は、T値がゼロ未満である場合に予測された。段階およびウイルスのタイプによらず、負のT値を有するHCCは全て早期肝臓内再発し、正のT値を有するHCCは全て再発しなかった。黒い印、A群（早期肝臓内再発を有する患者）；白い印、B群（早期肝臓内再発を有しない患者）；○、I期；◇、II期；△、IIIA期；□、IVA期。B；HBV陽性、C；HCV陽性、N；HBV-HCV二重陰性。
【図５】採点システムを説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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