(57)【要約】本発明は、癌抗原ＭＵＣ−１に特異的に結合する新規な抗体を提供する。これらの抗体は、イメージング剤および種々の部分を癌に対して特異的に方向づけるための有用なターゲティング部分である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体であって、１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含む抗体。
【請求項２】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、
１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；
１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）とを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体がｓｃｆｖ抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が二重特異性抗体を含む、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト抗体である、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項４、５、６、または７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体をエンコードする核酸であって、１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１５】
前記核酸が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；
１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、をエンコードする、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）と、をエンコードする請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とをエンコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
前記核酸がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とをエンコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
前記核酸がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とをエンコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項２０】
前記核酸がｓｃｆｖ抗体をエンコードする、請求項１６、１７、１８、または１９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸がヒト抗体をエンコードする、請求項１６、１７、１８、または１９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
前記核酸が二重特異性抗体の成分をエンコードする、請求項１６、１７、１８、または１９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２３】
エフェクターに付着した抗体を含むキメラ分子であって、
前記抗体がＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体であり、前記抗体が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含むとともに；
前記エフェクターがエピトープタグ、第二抗体、標識、細胞毒、リポソーム、放射性核種、薬剤、プロドラッグ、リポソーム、およびキレートからなる群から選択されるキメラ分子。
【請求項２４】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２５】
前記抗体が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、を含む、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２６】
前記抗体が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）とを含む、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２７】
前記抗体が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とを含む、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２８】
前記抗体がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とを含む、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項２９】
前記抗体がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とを含む、請求項２３に記載のキメラ分子。
【請求項３０】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項２６、２７、２８、または２９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
【請求項３１】
前記抗体がｓｃｆｖ抗体である、請求項３０に記載のキメラ分子。
【請求項３２】
前記エフェクターがアビジン、およびビオチンからなる群から選択されるエピトープタグである、請求項３０に記載のキメラ分子。
【請求項３３】
前記エフェクターがジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、およびチミジンキナーゼからなる群から選択される細胞毒である、請求項３０に記載のキメラ分子。
【請求項３４】
前記エフェクターが99Ｔｃ、 203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、 111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、 641Ｃｕ、52Ｆｅ、 52mＭｎ、51Ｃｒ、 186Ｒｅ、 188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、 169Ｅｒ、 121Ｓｎ、 127Ｔｅ、 142Ｐｒ、 143Ｐｒ、 198Ａｕ、 199Ａｕ、 161Ｔｂ、 109Ｐｄ、 165Ｄｙ、 149Ｐｍ、 151Ｐｍ、 153Ｓｍ、 157Ｇｄ、 159Ｇｄ、 166Ｈｏ、 172Ｔｍ、 169Ｙｂ、 175Ｙｂ、 177Ｌｕ、 l05Ｒｈ、および 111Ａｇからなる群から選択される金属同位元素を含むキレートである、請求項３０に記載のキメラ分子。
【請求項３５】
前記エフェクターがＤＯＴＡを含むキレートである、請求項３０に記載のキメラ分子。
【請求項３６】
ＭＵＣ−１抗原を有する細胞を検出する方法であって、前記方法が、
エピトープタグに付着した抗ＭＵＣ−１抗体を含むキメラ分子とＭＵＣ−１抗原を有する細胞を接触させるステップであって、前記抗体が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含むステップと；
検出可能な部分を含むキレートと前記キメラ分子を接触させそれによって前記キレートが前記エピトープタグに結合することにより前記キレートと前記検出可能な部分を結合させるステップと；
前記検出可能な部分を検出するステップと、を含む方法。
【請求項３７】
前記抗体が、
１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；
１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能な部分が放射性核種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出可能な部分がガンマ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が癌細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出するステップが外部イメージングを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出するステップが内部イメージングを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能な部分が99Ｔｃ、 203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、 111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、 641Ｃｕ、52Ｆｅ、 52mＭｎ、51Ｃｒ、 186Ｒｅ、 188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、 169Ｅｒ、 121Ｓｎ、 127Ｔｅ、 142Ｐｒ、 143Ｐｒ、 198Ａｕ、 199Ａｕ、 161Ｔｂ、 109Ｐｄ、 165Ｄｙ、 149Ｐｍ、 151Ｐｍ、 153Ｓｍ、 157Ｇｄ、 159Ｇｄ、 166Ｈｏ、 172Ｔｍ、 169Ｙｂ、 175Ｙｂ、 177Ｌｕ、 l05Ｒｈ、および 111Ａｇからなる群から選択される金属同位元素を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記キレートがＤＯＴＡを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
前記エピトープがアビジンまたはビオチンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
ＭＵＣ−１抗原を有する細胞を検出する方法であって、前記方法が、
検出可能な標識に付着した抗ＭＵＣ−１抗体を含むキメラ分子とＭＵＣ−１抗原を有する細胞を接触させるステップと；
前記検出可能な標識を検出するステップと、を含む方法。
【請求項５１】
前記抗体が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体が、
１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；
１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記検出可能な標識が放射性核種である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記検出可能な標識がガンマ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
ＭＵＣ−１抗原を有する細胞の成長または増殖を阻害する方法であって、前記方法が、
抗癌剤、プロドラッグ、および抗癌剤を含む細胞毒、放射性核種、リポソームからなる群から選択されるエフェクターに付着した抗ＭＵＣ−１抗原を含むキメラ分子とＭＵＣ−１抗原を有する前記細胞を接触させるステップを含み、
前記抗体が１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）、１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含む方法。
【請求項６１】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体が、
１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）、３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）、Ａ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）、Ｃ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）からなる群から選択される可変軽ドメインと；
１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）、３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）、Ａ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）、およびＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）からなる群から選択される可変重ドメインと、を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が１２Ｅ可変重ドメイン（配列表の配列番号：１）と１２Ｅ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：２）とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体が３Ｄ可変重ドメイン（配列表の配列番号：３）と３Ｄ可変軽ドメイン（配列表の配列番号：４）とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体がＡ５可変重ドメイン（配列表の配列番号：５）とＡ５可変軽ドメイン（配列表の配列番号：６）とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体がＣ４可変重ドメイン（配列表の配列番号：７）とＣ４可変軽ドメイン（配列表の配列番号：８）とを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
１２Ｅ（配列表の配列番号：９）、３Ｄ（配列表の配列番号：１０）、Ａ５（配列表の配列番号：１１）、およびＣ４（配列表の配列番号：１２）からなる群から選択される単鎖抗体によって特異的に結合されるエピトープでＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体。
【請求項６８】
１２Ｅ（配列表の配列番号：９）、３Ｄ（配列表の配列番号：１０）、Ａ５（配列表の配列番号：１１）、およびＣ４（配列表の配列番号：１２）、またはそれらに対する保存的代用物からなる群から選択される抗体の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を含む単鎖抗体（前記抗体）によって特異的に結合されるエピトープでＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体。
【請求項６９】
請求項１に記載の抗体を含有する容器を含むキット。
【請求項７０】
エフェクターをさらに含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記エフェクターがキレートを含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記抗体が薬学的に許容される賦形剤中にある、請求項６９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年３月３０日に出願され、すべての目的のために参考によって本願中で援用される、米国特許第６０／２８０，７２１号の利益および優先権を請求する。
【０００２】
連邦政府の後援を受けた研究開発によりなされた発明に対する権利に関する声明
本研究は、全米癌協会助成金番号第ＣＡ−４７８２９号、カリフォルニア州乳癌研究プログラム博士号取得後研究奨励助成金番号第５ＦＢ−００２３号、および核医学学会教育および研究奨励金によって支援された。アメリカ合衆国政府は、本発明における一部の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本願は、抗体工学の分野に関する。具体的には、ＭＵＣ−１癌抗原に特異的に結合する抗体が提供される。
【背景技術】
【０００４】
組換え抗体およびそのフラグメントは、高親和性特異的ターゲティング薬をデザインするための鍵となっている。操作されたターゲティング分子の最近の構成では、多価高親和性試薬類に再構築される最小限の結合フラグメントの使用の必要性が明らかにされている。抗体フラグメント単位も遺伝子療法、画像診断、免疫療法、照射療法、化学療法、およびプロドラッグ療法のために分子の範囲で見出されている。ＳｃＦｖ（３９ｋＤ）は通常、特異的結合特性を保持する最小の抗体フラグメントである。ＳｃＦｖは、生物学的に不活性な可動性リンカーを用いることによって、可変重（ＶH ）と可変軽（ＶL ）鎖免疫グロブリン遺伝子を無作為に結合することによって生成される。ｓｃＦｖ分子は現存のＭｏＡｂｓから生成されているが、ファージディスプレイライブラリーは現在，単一源からの多数のｓｃＦｖを提供し，最適な結合特性を有するものがディスプレイされるｓｃＦｖをコード化する遺伝子とともに同時に選択されることを可能にする（１．パブリンコワ（Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ）ら（１９９９年）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、４０、ｐ．１５３６〜１５４６；ヴィッチ（Ｖｉｔｉ）ら（１９９９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９、ｐ．３４７〜３５２；ヴィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら（１９９４年）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２、ｐ．４３３〜４５５；クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、ｐ．６２４〜６２８；ホーゲンボーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９８年）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４、ｐ．１〜２０；ペプチドおよびタンパク質のファージディスプレイ：実験マニュアル。サンディエゴ：アカデミックプレス、１９９６年）。
【０００５】
分子の上皮性ムチンファミリーの１つ、ＭＵＣ−１が抗原ターゲットとして相当な関心を得ているが、それは多数の上皮癌上に広範囲に発現し、異常にグリコシル化され、これを構造的かつ抗原的に非悪性細胞によって発現するものと区別されるためである（バラット−ボーイズ（Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、４３、ｐ．１４２〜１５１；プリース（Ｐｒｉｃｅ）ら（１９９８年）、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、ｐ．１〜２０；ペーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら著（１９９１年）、ｐ．５５〜６８、「乳房上皮抗原」所収、Ｒ．Ｌ．チュリアー二（Ｃｅｒｉａｎｉ）（編）、プレナムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨーク）。ＭＵＣ−１の優占的形態は、多数の２０アミノ酸直列型反復、膜貫通領域、および細胞質末端を有する大きな高免疫原性細胞外ムチン様ドメインからなる高分子量分子である（クイン（Ｑｕｉｎ）ら（２０００年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８７、ｐ．４９９〜５０６；マックグッケン（ＭｃＧｕｃｋｅｎ）ら（１９９５年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２６、ｐ．４３２〜４３９；ドング（Ｄｏｎｇ）ら（１９９７年）、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１８３、ｐ．３１１〜３１７）。正常な上皮組織において、ＭＵＣ−１は細胞の頂端部分に局在化し；悪性転換の結果として、遺伝子増幅および／または転写活性の増大によってＭＵＣ−１のアップレギュレーションが生じ、細胞表面上のＭＵＣ−１の分布はもはや頂端部分に限定されない（ビーチェ（Ｂｉｅｃｈｅ）とリデロー（Ｌｉｄｅｒｅａｕ）（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｔｉｃｓ、９８、ｐ．７５〜８０）。ＭＵＣ−１の機能は依然として解明が待たれるが、ＭＵＣ−１発現の高い細胞質発現は乳癌および／または卵巣癌を有する患者における不良予後と関連している。ＭＵＣ−１は細胞接着、細胞シグナリング、および免疫応答における役割を果たすことも明らかにされている（クイン（Ｑｕｉｎ）ら（２０００年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８７、ｐ．４９９〜５０６；マックグッケン（ＭｃＧｕｃｋｅｎ）ら（１９９５年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２６、ｐ．４３２〜４３９；ドング（Ｄｏｎｇ）ら（１９９７年）、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１８３、ｐ．３１１〜３１７；ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら（１９９８年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２１、ｐ．２４７〜２５６）。
【０００６】
抗ＭＵＣ−１モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の実質的な数が、セリンおよびスレオニンによって各側上に界接する２０アミノ酸直列型反復内に含まれるエピトープを認識するこれらＭｏＡｂの大多数によって生成されている（Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、４３、ｐ．１４２〜１５２；プリース（Ｐｒｉｃｅ）ら（１９９８年）、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、ｐ．１〜２０；ペーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら著（１９９１年）、ｐ．５５〜６８、「乳房上皮抗原」所収、Ｒ．Ｌ．チュリアー二（Ｃｅｒｉａｎｉ）（編）、プレナムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨーク）；フォントノー（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ）ら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５３、ｐ．５３８６〜５３９４；ペムバートン（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ）ら（１９９６年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１、ｐ．２３３２〜２３４０；レジンバルド（Ｒｅｇｉｍｂａｌｄ）ら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５６、ｐ．４２４４〜４２４９；コテラ（Ｋｏｔｅｒａ）ら（１９９４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５４、ｐ．２８５６〜２８６０）。これらの抗ＭＵＣ−１ＭｏＡＢｓは、主に診断薬として腫瘍を確認し、循環抗原のレベルをモニタリングするために用いられている。少数のＭＵＣ−１ＭｏＡｂｓは、放射免疫療法としてターゲット放射線を腫瘍に送達するために用いられている。卵巣癌においては、化学療法を受けた後に極小の残留性疾患を有する患者の腹膜に高用量のイットリウムを送達するためにＨＭＦＧ１抗体が用いられた（パパディミトリウ（Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）ら（１９９９年）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４５５、ｐ．３０１〜３１３；マラヴェヤス（Ｍａｒａｂｅｙａｓ）ら（１９９４年）、Ｃａｎｃｅｒ、７３、ｐ．１０６７〜１０７５）。過去の対照（Ｉｄ．）に比べると、明らかな生存率改善効果が示された。結果は、卵巣癌治療のためのフェーズＩＩＩ多重センター治験を促進するのに相当に十分であった。90Ｙで標識された別の抗ＭＵＣ−１ＭｏＡｂ（ＢｒＥ−３）も乳癌の治療において用いられている（パパディミトリウ（Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）ら（１９９９年）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４５５、ｐ．３０１〜３１３；ドナルド（ＤｅＮａｒｄｏ）ら（１９９７年）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、３８、ｐ．１１８０〜１１８５；クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら（１９９８年）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４、ｐ．１６７９〜１６８８；プレス（Ｐｒｅｓｓ）ら（１９９３年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３２９、ｐ．１２１９〜１２２４）。過渡的な臨床効果により別の試験が保証される（パパディミトリウ（Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ）ら（１９９９年）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４５５、ｐ．３０１〜３１３；ドナルド（ＤｅＮａｒｄｏ）ら（１９９７年）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、３８、ｐ．１１８０〜１１８５；クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら（１９９８年）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４、ｐ．１６７９〜１６８８；プレス（Ｐｒｅｓｓ）ら（１９９３年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３２９、ｐ．１２１９〜１２２４；ドナルド（ＤｅＮａｒｄｏ）ら（１９９１年）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄ  Ａｐｐｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍ［Ｂ］、１８、ｐ．６２１〜６３１；スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）とブルンジェス（１９９３年）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、６２８、ｐ．２４３〜２５３）。
【０００７】
完全なＭｏＡｂｓを用いた放射線免疫療法は乳癌および他の固形腫瘍の治療において利用されているが、治療の奏功は、血液クリアランスを阻害し、腫瘍部位での放射性医薬品の蓄積を遅延させるサイズの大きいＭｏＡｂ（１５０ｋＤ）によって制限されている（マジール（Ｍａｚｉｅｒｅ）ら（１９８６年）、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１６７、ｐ．２５７〜２６１）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＭＵＣ−１抗原に特異的に結合する新規な抗体に関する。３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および１２Ｅで示された本発明の一部の好ましい単鎖抗体は、表２（配列表の配列番号ｓ：９〜１２）に示されている。また、これらの抗体を含むＶH および／またはＶL ドメインは、表１（配列表の配列番号ｓ：１〜８）に示されている。本願中に示されたＶH およびＶL ドメインは、本発明の抗体の特異性および結合を大部分支配し、ＭＵＣ−１抗原およびかかる抗原を有する／提示する細胞を特異的にターゲティングする種々の抗体の作成を可能にする。
【０００９】
したがって、１つの実施形態において、本発明はＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、１２Ｅ可変軽ドメイン、３Ｄ可変軽ドメイン、Ａ５可変軽ドメイン、Ｃ４可変軽ドメイン、１２Ｅ可変重ドメイン、３Ｄ可変重ドメイン、Ａ５可変重ドメイン、およびＣ４可変重ドメインからなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するドメインを含むことが好ましい。一部の実施形態において、抗体は単鎖（例えば、ｓｃＦｖ）抗体である。一部の実施形態において、抗体は多鎖抗体、および／または二重特異性抗体、および／または多価抗体である。本発明の特に好ましい抗体は、１２Ｅ可変軽ドメイン、３Ｄ可変軽ドメイン、Ａ５可変軽ドメイン、Ｃ４可変軽ドメインからなる群から選択される可変軽ドメイン、および１２Ｅ可変重ドメイン、３Ｄ可変重ドメイン、Ａ５可変重ドメイン、およびＣ４可変重ドメインからなる群から選択される可変重ドメインを含む。一部の好ましい抗体は、１２Ｅ可変重ドメインと１２Ｅ可変軽ドメインを含む抗体、３Ｄ可変重ドメインと３Ｄ可変軽ドメインを含む抗体、Ａ５可変重ドメインとＡ５可変軽ドメインを含む抗体、およびＣ４可変重ドメインとＣ４可変軽ドメインを含む抗体を包含する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、ＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体をエンコードする核酸を提供し、該核酸は１２Ｅ可変軽ドメイン、３Ｄ可変軽ドメイン、Ａ５可変軽ドメイン、Ｃ４可変軽ドメイン、１２Ｅ可変重ドメイン、３Ｄ可変重ドメイン、Ａ５可変重ドメイン、およびＣ４可変重ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい核酸は、１２Ｅ可変軽ドメイン、３Ｄ可変軽ドメイン、Ａ５可変軽ドメイン、Ｃ４可変軽ドメインからなる群から選択される可変軽ドメイン、および１２Ｅ可変重ドメイン、３Ｄ可変重ドメイン、Ａ５可変重ドメイン、およびＣ４可変重ドメインからなる群から選択される可変重ドメインをエンコードする。一部の好ましい核酸は、１２Ｅ可変重ドメインと１２Ｅ可変軽ドメイン、３Ｄ可変重ドメインと３Ｄ可変軽ドメイン、Ａ５可変重ドメインとＡ５可変軽ドメイン、および／またはＣ４可変重ドメインとＣ４可変軽ドメインをエンコードする。特に好ましい核酸は、本発明の単鎖（例えば、ｓｃＦＶ）抗体をエンコードし、一部の好ましい核酸はベクターである。
【００１１】
さらに別の実施形態において、本発明は、エフェクターに付着する抗体を含むキメラ分子を提供し、ここでこの抗体は本願中に記載された抗体の１つであり、エフェクターはエピトープタグ、第二抗体、標識、細胞毒、リポソーム、放射性核種、薬剤、プロドラッグ、リポソーム、およびキレートからなる群から選択される。一部の実施形態において、エフェクターはエピトープタグ（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等）である。一部の実施形態において、エフェクターは細胞毒（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、チミジンキナーゼ等）である。一部の実施形態において、エフェクターは同位元素、好ましくは放射性同位元素を含むキレートである。特に好ましい同位元素としては、ガンマ放射体、Ｘ線放射体等が挙げられるが、これらに限定されない。一部の特に好ましい同位元素としては、99Ｔｃ、 203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、 111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、 641Ｃｕ、52Ｆｅ、 52mＭｎ、51Ｃｒ、 186Ｒｅ、 188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、 169Ｅｒ、 121Ｓｎ、 127Ｔｅ、 142Ｐｒ、 143Ｐｒ、 198Ａｕ、 199Ａｕ、 161Ｔｂ、 109Ｐｄ、 165Ｄｙ、 149Ｐｍ、 151Ｐｍ、 153Ｓｍ、 157Ｇｄ、 159Ｇｄ、 166Ｈｏ、 172Ｔｍ、 169Ｙｂ、 175Ｙｂ、 177Ｌｕ、 l05Ｒｈ、および 111Ａｇが挙げられるが、これらに限定されない。一部の特に好ましい実施形態において、エフェクターはＤＯＴＡを含むキレートである。
【００１２】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を有する細胞（例えば、癌細胞）を検出する方法を提供する。この方法は、エピトープタグ（例えば、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン等）に付着した抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、本願中に記載されたもの）を含むキメラ分子とＭＵＣ−１を有する細胞を接触させるステップと、検出可能な部分を含むキレート（例えば、ＤＯＴＡ）とキメラ分子を接触させるステップであって、ここでキレートはエピトープタグに結合することによって、検出可能な分子をキレートと結合させるステップと；検出可能な部分を検出するステップとを含む。好ましい検出可能な部分としては、放射性核種が挙げられる。特に好ましい検出可能な部分としては、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい検出可能な部分としては、99Ｔｃ、 203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、 111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、 641Ｃｕ、52Ｆｅ、 52mＭｎ、51Ｃｒ、 186Ｒｅ、 188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、 169Ｅｒ、 121Ｓｎ、 127Ｔｅ、 142Ｐｒ、 143Ｐｒ、 198Ａｕ、 199Ａｕ、 161Ｔｂ、 109Ｐｄ、 165Ｄｙ、 149Ｐｍ、 151Ｐｍ、 153Ｓｍ、 157Ｇｄ、 159Ｇｄ、 166Ｈｏ、 172Ｔｍ、 169Ｙｂ、 175Ｙｂ、 177Ｌｕ、 l05Ｒｈ、および 111Ａｇが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、検出するステップは外部イメージングを含む。一部の実施形態において、検出するステップは内部イメージングを含む。
【００１３】
本発明は、ＭＵＣ−１抗原を有する細胞を検出する方法も提供し、ここでこの方法は検出可能な標識に付着した抗ＭＵＣ−１抗体を含むキメラ分子とＭＵＣ−１抗原を有する細胞を接触させるステップと；検出可能な標識を検出するステップとを含む。検出可能な標識としては、本願中に記載された検出可能な標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＭＵＣ−１抗原を有する細胞（例えば、癌細胞）の成長または増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、抗癌剤、プロドラッグ、および抗癌剤を含む細胞毒、放射性核種、リポソームからなる群から選択されるエフェクターに付着した抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、１２Ｅ、３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、およびそれらの変種）を含むキメラ分子とＭＵＣ−１抗原を有する細胞を接触させるステップを含むことが好ましい。
【００１５】
本発明は、１２Ｅ、３Ｄ、Ａ５、およびＣ４からなる群から選択される単鎖抗体によって特異的に結合されるエピトープでＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体も提供する。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本発明は、単鎖抗体によって特異的に結合されるエピトープでＭＵＣ−１を特異的に結合する抗体を提供し、ここで抗体は１２Ｅ、３Ｄ、Ａ５、およびＣ４、またはそれらに対する保存的代用物からなる群から選択される抗体の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、本願中に記載された方法を実行するための種々のキットを提供する。好ましいキットは、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体を含有する容器を含む。キットは、任意選択で、さらにエフェクター（例えば、キレートを含むエフェクター）を含む。エフェクターおよび／または抗体は、薬学的に許容される賦形剤で提供することができる。
【００１８】
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は本願中で可換性に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する自然発生のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマー類、および天然発生のアミノ酸ポリマー類に適用される。この用語は、ポリペプチドを作り上げるアミノ酸類を結合する従来のペプチド結合上の変種も含む。
【００１９】
本願中の「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」なる用語または文法的な同義語は、共有結合される少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、一本鎖または二重鎖であることが好ましく、一般にリン酸ジエステル結合を含有するが、以下に概略を示した一部の場合には、例えば、ホスホルアミド（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら（１９９３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５）およびその中の文献；レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）（１９７０年）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３５：３８００；スプリンズル（Ｓｐｒｉｎｚｌ）ら（１９７７年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８１：５７９；レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：３４８７；サワイ（Ｓａｗａｉ）ら（１９８４年）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５、レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８８年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０：４４７０；およびパウウェルズ（Ｐａｕｗｅｌｓ）ら（１９８６年）、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９）、チオリン酸（マグ（Ｍａｇ）ら（１９９１年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：  １４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ジチオリン酸（ブリウ（Ｂｒｉｕ）ら（１９８９年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：２３２１、Ｏ−メチルホスホルアミダイト結合（エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、オリゴヌクレオチドおよび類似体：実際的方法（オックスフォード大学プレス）参照）のほか、ペプチド核酸バックボーン類および結合類（エグホルム（Ｅｇｈｏｌｍ）（１９９２年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；マイヤー（Ｍｅｉｅｒ）ら（１９９２年）、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６；カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７）を含む別のバックボーン類を有しうる核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸としては、陽性のバックボーン類を有するもの（デンプシー（Ｄｅｎｐｃｙ）ら（１９９５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７；非イオンバックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ．（１９９１年）、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８８年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、「アンチセンス研究における糖改変」、Ｙ．Ｓ．サングイ（Ｓａｎｇｈｕｉ）とＰ．ダン・クック（Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ）編；メスマーカー（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ）ら（１９９４年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；ジェフス（Ｊｅｆｆｓ）ら（１９９４年��、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６年））、および米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、および第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、「アンチセンス研究における糖改変」、Ｙ．Ｓ．サングイ（Ｓａｎｇｈｕｉ）とＰ．ダン・クック（Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ）編に記載されたものを含む非リボースバックボーン類が挙げられる。１つまたは複数の炭素環糖類を含有する核酸類も核酸の定義内に含まれる（ジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら（１９９５年）、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐｌ６９〜１７６を参照）。一部の核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ（１９９７年、６月２日、３５頁）に記載されている。リボース−リン酸バックボーンのこれらの改変は、標識など追加の部分の添加を促進し、または生理的環境下でのかかる分子の安定性および半減期を増大するために行うことができる。
【００２０】
「ビオチン」なる用語は、アビチンまたは種々のアビジン類似体を結合する能力があるビオチンおよび改変ビオチン類またはビオチン類似体を指す。「ビオチン」は、とりわけ、通常、その遊離カルボキシル残基によって、１つまたは複数の加数の添加によって改変することができる。有用なビオチン誘導体としては、アミン、アシルまたはアルキル基、カルボニル基、追加化合物またはポリマー上のアルキルハライドまたはマイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）型受容体など補助反応性基と結合される活性エステル類、アミン類、ヒドラジド類、およびチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
アビジンは、一般的に卵白中にあり、複合ビタミンＢであるビオチンに対してきわめて高い結合親和性を有する（ウィルチェク（Ｗｉｌｃｈｅｃｋ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８８年、１７１：ｐ．１）。ストレプトアビジンは、ストレプトマイセス・アビジニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来であり、アビジンに似ているが、非特異的組織結合を有し、したがって、アビジンの代わりに用いられることが多い。本願中で用いられる「アビジン」には、それらの天然の状態またはそれらの改変形態のいずれかのその生物学的形態のすべてが含まれる。例えば、タンパク質の糖残基を除去するように処理されているアビジンの改変形態（「糖鎖除去アビビン」）、および／またはその高い基本電荷を除去するように改変されているアビジンの改変形態（「中性アビジン」）が、本発明において有用である。アビジンとストレプトアビジンの両方はビオチンに対する四価性を有し、前者がビオチンに結合するときに増幅を可能にする。一部の実施形態では、核種などの４種類の検出または治療薬を各ターゲットタンパク質に付着させることができる。
【００２２】
本願中で用いられる「残基」なる用語は、天然、合成、または改変アミノ酸類を指す。
【００２３】
本願中で用いられる「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にエンコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常部遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変部遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは次いで免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ規定する。
【００２４】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識の原因となる約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸類の可変部を規定する。可変軽鎖（ＶL ）および可変重鎖（ＶH ）なる用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００２５】
抗体は完全な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼ類による消化によって生成される多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンはヒンジ領域におけるジスルフィド結合以下の抗体を消化し、それ自体がジスルフィド結合によってＶH −ＣH １に結合された軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ)'2 を生成する。Ｆ（ａｂ)'2 は穏和な条件下に減少し、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を切断することによって、（Ｆａｂ')2 二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は実質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳しい説明について、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗ．Ｅ．ポール（Ｐａｕｌ）、編、レーブンプレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９３年）を参照）。種々の抗体フラグメントが完全な抗体の消化に関して規定されているが、熟練者であれば、このようなＦａｂ'フラグメントが化学的または組換えＤＮＡの方法論を利用することによってデノボ合成することができる。したがって、本願中で用いられる抗体なる用語は、全抗体の改変によって生成され、または組換えＤＮＡの方法論を用いてデノボ合成されるいずれかの抗体フラグメントも含む。好ましい抗体には単鎖抗体（単一ポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、可変重と可変軽鎖が（直接的またはペプチドリンカーによって）結合し、連続的ポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）が含まれる。単鎖Ｆｖ抗体は、直接的に結合され、またはペプチドコードリンカーによって結合されるＶH およびＶL コード配列を含む核酸から発現しうる共有結合されるＶH −ＶL ヘテロ二量体である。ヒューストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、ｐ．５８７９〜５８８３。ＶH とＶL は互いに単一ポリペプチド鎖として結合されるが、ＶH ドメインとＶL ドメインは非共有結合的に結合する。繊維状ファージの表面上に発現される第１の機能的抗体分子は単一鎖Ｆｖ’ｓ（ｓｃＦｖ）であったが、別の発現法も有効であった。例えば、鎖（重または軽）の１つがｇ３キャプシドに融合し、補助鎖が溶解性分子としてペリプラズムに輸出される場合は、Ｆｂ分子をファージ上にディスプレイすることができる。２つの鎖を同じレプリコンまたは異なるレプリコン上でエンコードすることができ；重要な点は、互いのＦｂ分子内の２つの抗体鎖が翻訳後に集合し、例えば、ｇ３ｐへの鎖の１つの結合によってファージ粒子へ二量体が組み入れられることである（例えば、米国特許第５７３３７４３号参照）。自然に凝集するが、抗体Ｖ領域から化学的に分離される軽および重ポリペプチド鎖を抗原結合部位の構造物と実質的に同様の３次元構造物に畳み込まれる分子へ変換するｓｃＦｖ抗体および多数の他の構造物が当業者には周知である（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号参照）。特に好ましい抗体にはファージ上にディスプレイされたすべてを含めるべきである（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、およびジスフィルド結合Ｆｖ（ライター（Ｒｅ��ｔｅｒ）ら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８、ｐ．１３２３〜１３３１参照）。
【００２６】
生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体等）を指すとき、本願中で用いられる「特異的に結合する」なる用語は、異質な分子集団（例えば、タンパク質および他の生物製剤）における現存生体分子の決定因子である結合反応を指す。したがって、所定の条件（例えば、抗体の場合の免疫アッセイ条件、または核酸の場合の厳密なハイブリッド形成条件）下に、指定されたリガンドまたは抗体はその特定の「ターゲット」分子に結合し、試料中に存在する他の分子に顕著な量で結合することはない。
【００２７】
「エフェクター」は、その活性が細胞に送達し、および／または細胞で局在することが望ましい分子または分子の組合せを指す。エフェクターとしては、標識、細胞毒、酵素、成長因子、転写因子、薬剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
「レポーター」は検出可能なシグナルを提供する（例えば、検出可能な標識である）エフェクターである。一部の実施形態では、レポーターは検出可能なシグナルそれ自体を提供する必要はなく、単にその後に検出可能な標識に結合しうる部分を提供することができる。
【００２９】
「保存的代用物」なる用語は、分子の活性（特異性または結合親和性）を実質的に変化させることがないアミノ酸代用物を示すタンパク質類またはペプチド類に関して用いられる。通常、保存的アミノ酸代用物は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の代用物を含む。以下の６つの群はそれぞれ互いに対する代表的な保存的代用物であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３０】
「エピトープタグ」または「親和性タグ」なる用語は本願中で可換性に用いられ、抗体または他の結合パートナーによって特異的に認識される分子または分子のドメインを指すために用いられる。この用語は、結合パートナー複合物も指す。したがって、例えば、ビオチンまたはビオチン／アビジン複合物は両方とも親和性タグとみなされる。エピトープ／抗体相互作用において認識されるエピトープに加えて、親和性タグは他の結合分子（例えば、レセプターによって認識されるリガンド）によって認識される「エピトープ」、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成する他のリガンドによって結合されるリガンド、Ｎｉ−ＮＴＡによって結合されるＨｉｓ6 、アビジン、ストレプトアビジン、または抗ビオチン抗体によって結合されるビオチン、なども含む。
【００３１】
エピトープタグは当業者には公知である。さらに、幅広い種類のエピトープに特異的な抗体が市販されている。これらに含まれるのは、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列表の配列番号：９）に対する抗体、ｃ−ｍｙｃ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社（セントルイス）より入手可能）、ＨＮＫ−１糖エピトープ、ＨＡエピトープ、ＨＳＶエピトープ、Ｈｉｓエピトープ特異的抗体（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）を参照）によって認識されるＨｉｓ4 、Ｈｉｓ5 、およびＨｉｓ6 エピトープなどであるが、これらに限定されない。また、エピトープタギングタンパク質に対するベクターが市販されている。したがって、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１ベクターは哺乳動物細胞における遺伝子発現のためにデザインされたエピトープタギングベクターである。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１に挿入されるターゲット遺伝子をＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ（Ｎ末端、Ｃ末端、または内部タギング）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（Ｃ末端）、またはＦＬＡＧ（Ｎ末端）エピトープおよびｃ−ｍｙｃ（Ｃ末端）エピトープの両方でタギングすることができる。
【００３２】
図面の簡単な説明
図１は競合ＥＬＩＳＡを示す図である。抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖは１ｎＭで強く阻害され、ＭＵＣ−１競合の１０ｎＭ濃度で発生する阻害のわずかな増大を示した。結合の最大の減少は、それぞれｓｃＦｖ  Ａ５（△）、Ｃ４（Ｘ）、３Ｄ（○）、および１２Ｅ（●）で発生した。
【００３３】
図２Ａはクローン１２Ｅの３次元モデルの立体表示（変形１）を示す。可変重鎖（ＶH ）ドメインおよび軽鎖（ＶL ）ドメインが示されている。超可変抗原結合枝（ｌｏｐ）が標識されている（Ｈ１−Ｈ３）（Ｌ１−Ｌ３）。ドメイン間の高Ｇｌｙ−Ｓｅｒコネクタの近似経路が破線で示されている。図２Ｂはクローン１２Ｄの可変重鎖（ＶH ）ドメインに対する３次元モデルの立体表示（変形１）を示す。注釈は図２Ａと同じである。
【００３４】
図３Ａ〜３Ｄは抗ＭＵＣ−１ＳｃＦｖ免疫細胞化学の結果を示す図である。抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ１２Ｅ  ｓｃＦｖは、ＭＣＦ−７乳腺癌細胞上に発現するＭＵＣ−１膜抗原と特異的に反応する。図３Ａ：ＭＣＦ−７細胞（陽性対照）と反応性のＢｒＥ−３ＭｏＡｂ。図３Ｂ：ＭＣＦ−７細胞と反応性の抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ。図３Ｃ：Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞（陽性対照）と反応性のＬｙｍ−１ＭｏＡｂ。図３Ｄ：Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞と最小限に反応性の抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、分子の上皮性ムチンファミリーの１つ；ＭＵＣ−１に特異的に結合する抗体の同定に関する。ＭＵＣ−１は多数の上皮癌上に広範囲に発現し、異常にグリコシル化し、非悪性細胞によって発現されるものと構造的および抗原的に区別される（バラット−ボーイズ（Ｂａｒｒａｔｔ−Ｂｏｙｅｓ（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、４３、ｐ．１４２〜１５１；プリース（Ｐｒｉｃｅ）ら（１９９８年）、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、ｐ．１〜２０；ペーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら著（１９９１年）、ｐ．５５〜６８、「乳房上皮抗原」所収、Ｒ．Ｌ．チュリアー二（Ｃｅｒｉａｎｉ）（編）、プレナムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）（ニューヨーク）。正常な上皮組織において、ＭＵＣ−１は細胞の頂端部に局在し；悪性転換の結果として、遺伝子増幅および／または転写活性の増大によってＭＵＣ−１のアップレギュレーションが生じ、細胞表面上のＭＵＣ−１の分布は頂端部にはもはや確認されなくなる（ビーチェ（Ｂｉｅｃｈｅ）とリデロー（Ｌｉｄｅｒｅａｕ）（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｔｉｃｓ、９８、ｐ．７５〜８０）。ＭＵＣ−１の機能は依然として解明が待たれるが、ＭＵＣ−１発現の高い細胞質発現は乳癌および／または卵巣癌を有する患者における不良予後と関連している。
【００３６】
ＭＵＣ−１は癌細胞でアップレギュレーションされ、また「異常に」グリコシル化されるため（したがって、抗原的に区別される）、ＭＵＣ−１は癌細胞および／または癌細胞に隣接した細胞に種々のエフェクター（例えば、細胞毒、標識、薬剤、またはプロドラッグ、など）を特異的に送達するための便利なターゲットとして作用しうる、すぐれた癌特異的マーカーを提供する。
【００３７】
したがって、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体は、一時的または持続的にエフェクターに結合し（それによってキメラ分子またはキメラ部分を形成する）、ＭＵＣ−１を発現する特定のターゲット細胞（例えば、癌細胞）にそのエフェクターを方向づけるために用いられる有効なターゲティング部分（すなわち、細胞上にディスプレイされるＭＵＣ−１などのターゲットに特異的に結合する部分）を提供する。本発明の抗体は、この点で特に有利である。それはサイズが小さいため、免疫原性の減少および腫瘍侵入の改善を示す。また、本発明の単鎖抗体は、例えば、振盪フラスコの最適以下の製造方法においても細菌培養液１リットル当たり可溶性タンパク質６００〜８００μｇを供給する対費用効果の高い細菌発現系を用いて容易に生成される。
【００３８】
種々のエフェクター（例えば、細胞毒、標識、治療薬等）を、ターゲティングまたは「プレターゲティング」プロトコルを用いて、腫瘍性細胞、固形腫瘍、転移性細胞などの生体内ターゲット部位にターゲティングすることができる。ターゲティングプロトコルでは、ターゲット部位に送達することが望ましい所望の活性（例えば、細胞毒性、放射能）を有するエフェクターを含むキメラ分子を利用する。キメラ分子をターゲットに有効に結合することにより所望の活性が送達される。
【００３９】
プレターゲティングプロトコルにおいて、所望のターゲット（例えば、癌細胞）を特異的に結合する一次ターゲティング種（例えば、抗ＭＵＣ−１抗体）と、その後に投与される二次ターゲティング種によって結合するために利用可能な結合部位を提供するエフェクターとを含むキメラ分子が利用される。一次ターゲティング種（キメラ分子）の十分な癒着が達成されると、一次ターゲティング種の利用可能な結合部位を認識する（ｉ）診断または治療薬および（ｉｉ）二次ターゲティング部分を含む二次ターゲティング種が投与される。
【００４０】
プレターゲティングプロトコルの例示的な例が、細胞毒性放射性核種を腫瘍に投与するためのビオチン−アビジン系である。一般的な手順において、腫瘍関連抗原に対してターゲティングされるモノクローナル抗体（例えば、抗ＭＵＣ−１）がアビジンに抱合され、抗体によって認識される腫瘍を有する患者に投与される。次いで、治療薬、例えば、ビオチンに共有結合したキレート化放射性核種が投与される。放射性核種は、その付着ビオチンによって、腫瘍にプレターゲティングされた抗体−アビジン抱合体によって取り入れられる。プレターゲティングビオチン／アビジンプロトコルの例は、例えば、グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら、米国特許第４，８６３，７１３号；グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら（１９８８年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２９、ｐ．２２６；フナトウイッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）ら（１９８７年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２８、ｐ．１２９４；エール（Ｏｅｈｒ）ら（１９８８年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２９、ｐ．７２８；クリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）ら（１９８８年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２９、ｐ．１９５１；シニツイン（Ｓｉｎｉｔｓｙｎ）ら（１９８９年）、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３０、ｐ．６６；カロフォノス（Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ）ら（１９９０年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１、ｐ．１７９１；シェヒター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）ら（１９９１年）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４８、ｐ．１６７；パガネリ（Ｐａｇａｎｅｌｌｉ）ら（１９９１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１、ｐ．５９６０；パガネリ（Ｐａｇａｎｅｌｌｉ）ら（１９９１年）、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２、ｐ．２１１；スティックニー（Ｓｔｉｃｋｎｅｙ）ら（１９９１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１、ｐ．６６５０；およびユアン（Ｙｕａｎ）ら（１９９１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１、ｐ．３１１９に記載されている。
【００４１】
第１のターゲティング組成物がターゲット部位に局在した後にキレート化剤が投与される３ステップのプレターゲティングプロトコルも記載されている。キレート化剤は、ターゲット部位に結合されていない循環性の一次抱合体を結合し、除去するとともに、循環性の一次ターゲティング種（例えば、抗体−アビジンまたは抱合体）を活性剤−抱合体上の結合部位に対する競合によってターゲット部位での活性剤種（ビオチン活性剤抱合体）のターゲティングに干渉することから防ぐ。抗体−アビジンを一次ターゲティング部分として用いる場合、ビオチン標識ヒト血清アルブミンなどのビオチン標識ポリマーを注入することによって過剰な循環性抱合体が除去される。このタイプの薬剤は、肝胆道系によって迅速に認識され、主に肝に沈着する高分子量の種を形成する。
【００４２】
これらのプロトコルの例は、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／２５２４０号；パガネリ（Ｐａｇａｎｅｌｌｉ）ら（１９９１年）、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍ．、１２、ｐ．２１１〜２３４；エール（Ｏｅｈｒ）ら著、「潜在的な腫瘍造影剤としてのストレプトアビジンとビオチン」、１９８８年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２９、ｐ．７２８〜７２９；カロフォンス（Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ）ら著、「インジウム−１１１−標識ビオチンおよびストレプトアビジン抱合抗体を有する患者における腫瘍のイメージング」、１９９０年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１、ｐ．１７９１〜１７９６；グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら著、「インジウム−１１１−標識二機能性ハプテンによるマウス腫瘍のプレターゲティングされた免疫シンチグラフィ」、１９８８年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２９、ｐ．２２６〜２３４に開示されている。ビオチン−アビジン系を用いた改良型のプレターゲティングプロトコルが、例えば、われわれの米国特許第５，５２５，３３８号および同第５，４８２，６９８号、ならびに同時係属米国特許出願第０８／４８６，１６６号および同第０８／７３１，１０７号において記載されている。
【００４３】
Ｉ．抗ＭＵＣ−１抗体
一部の実施形態において、本発明は、分子の上皮性ムチンファミリーの１つ；ＭＵＣ−１に特異的に結合する抗ＭＵＣ−１抗体を提供する。ＭＵＣ−１は多数の上皮癌上に広範囲に発現し、異常にグリコシル化し、非悪性細胞によって発現されるものと構造的および抗原的に区別される。本発明の抗体は癌細胞に種々のエフェクター（例えば、イメージング試薬、細胞毒等）をターゲティングするために特に有用である。このようなターゲティングは全体として特異的である必要はなく、ターゲット（例えば、癌）細胞へのエフェクターの優先的な送達を提供すれば有用であることは明らかであろう。
【００４４】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、本願中で１２、３Ｄ、Ａ５、およびＣ４で示される（例えば、表１を参照）単鎖抗体の１つまたは複数の可変重および／または可変軽鎖由来（またはその配列を有する）可変重および／または可変軽鎖を含む。
【表１】
2004536578.tif 000002
【００４５】
一部の実施形態において、可変軽および可変重鎖ドメインはペプチドリンカー（例えば、Ｇｌｙ4(Ｓｅｒ)3（配列表の配列番号： ）によって結合され、単鎖抗体を形成する。このような単鎖抗体の例示的な配列が表２に示されている。
【表２】
2004536578.tif 000003
【００４６】
ＩＩ．抗ＭＵＣ−１抗体を含むキメラ部分
ＭＵＣ−１は癌細胞、抗ＭＵＣ−１においてアップレギュレーションされて見出されるため、種々の癌細胞（例えば、単離細胞、転移性細胞、固形腫瘍細胞等）、特に上皮癌細胞（例えば、乳癌細胞）にエフェクター（例えば、細胞毒、放射標識等）の効率的かつ特異的な送達のためのターゲットとして利用することができる。ＭＵＣ−１は、有効なターゲットを提供するために癌細胞上に単独で存在する必要はない。健常細胞と比較して、癌細胞上のＭＵＣ−１の特異な発現は、重要かつ有用なターゲティングの利点、すなわち、結果としてターゲット（例えば、癌）細胞へのエフェクター部分の優先的な送達を得るのに十分である。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体は「プレターゲティング」法（結果としてエフェクター部分の投与後にターゲット部位でキメラ部分の形成が得られる）において、または抗ＭＵＣ−１抗体が使用前にエフェクター分子に結合され、キメラ分子が得られる「ターゲティング」法において利用される。
【００４８】
キメラ分子またはキメラ組成物すなわちキメラ部分は、それらの自然の状態で別々に存在する２つ以上の分子が結合され、その成分分子の所望の機能性を有する単一分子を形成する分子または組成物を指す。通常、キメラ分子の成分分子の１つは「ターゲティング分子」である。ターゲティング分子は、その対応するターゲット、この場合にはＭＵＣ−１に特異的に結合するリガンドまたは抗体などの分子である。
【００４９】
キメラ分子の別の成分は「エフェクター」である。エフェクター分子は、ターゲット細胞（例えば、ＭＵＣ−１を発現する細胞）に特異的に輸送される分子または分子群を指す。エフェクター分子は通常、ターゲット細胞に送達される特徴的な活性を有する。エフェクター分子としては、細胞毒、標識、放射性核種、リガンド、抗体、薬剤、リポソーム、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
一部の実施形態において、エフェクターは検出可能な標識であり、放射性核種を含む好ましい検出可能な標識を有する。本発明の放射性核種−キレート−（例えば、ビオチン）抱合体において有用な放射性核種および標識のうち、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体が局在、診断および／または病期決定、および／または治療のために適切であるが、ホウ素やウラニウムなどのベータおよびアルファ放射体および電子および中性子捕捉剤も治療のために用いることができる。
【００５１】
検出可能な標識は、外部検出器および／または内部検出器と組み合せて用いることができ、ＭＵＣ−１抗原（例えば、癌細胞、固形腫瘍等）を有する細胞を有効に局在し、かつ／または視覚化する手段を提供する。このような検出／視覚化は、術前および術中のセッティングを含むがこれらに限定されない種々の状況において有用でありうる。したがって、ある実施形態において、本発明は、哺乳動物の体内においてＭＵＣ−１マーカーを有する組織を術中に検出し、局在する方法に関する。これらの方法は通常、検出器（例えば、ガンマ検出プローブ）によって検出するために十分な量で、検出可能な標識（例えば、放射性核種、例えば、 161Ｔｂ、 123Ｉ、 125Ｉ、などで標識された本発明の抗ＭＵＣ−１標識）で標識された抗ＭＵＣ−１を含む組成物を哺乳動物に投与し、活性成分をターゲット組織によって取り入れられるようにした後、好ましくは、標識の血中排除の後、例えば、ガンマ検出プローブを用いることによって、体内の関連領域において哺乳動物を放射免疫検出法にかけるステップを含む。
【００５２】
標識結合抗ＭＵＣ−１抗体は、検出器、例えば、ガンマ検出プローブによって被術者の体内の関連組織を検出し、術中に局在することができるＲＩ（ラジオアイソトープ）ガイド手術の方法において用いることができる。外科医は、術中にこのプロープを用いて、ラジオアイソトープ、すなわち低エネルギーガンマ光子放射体で標識された化合物の取込みが起こった組織を見つけることができる。
【００５３】
検出可能な標識に加えて、好ましいエフェクターとしては細胞毒（例えば、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、など）、または細胞毒性薬剤またはプロドラックが挙げられるが、その場合、キメラ分子はＭＵＣ−１ターゲットを有する細胞に細胞毒を特異的にターゲティングする強力な細胞殺傷剤として作用しうる。
【００５４】
さらに別の実施形態において、エフェクターは薬剤（例えば、ドキシルビシン、ビンブラスチン、タクソール等などの抗癌剤）をカプセル化するリポソーム、免疫系の成分によって結合細胞の認識を刺激する抗原、および免疫系成分を特異的に結合し、それらをＭＵＣ−１を有している細胞などに方向づける抗体を含みうる。
【００５５】
Ａ）抗ＭＵＣ−１ターゲティング分子
本発明の方法および組成物の好ましい実施形態において、ターゲティング分子はＭＵＣ−１抗原に特異的に結合する抗体である。抗体は、完全長抗体のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ等）、または単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）でありうる。特に好ましい抗体としては、１２Ｅ、３Ｄ、Ａ５、および本願中に記載されたそれらの変形が挙げられる。
【００５６】
抗体は、以下に記載したように、当業者には公知の標準方法に従い製造することができる。一旦製造された抗体は化学的にエフェクターに抱合することができる。
【００５７】
エフェクター分子（類）の１つがタンパク質である場合は、抗体は単鎖抗体でありうるとともに、キメラ分子は組換え発現される融合タンパク質でありうる。このような組換え融合タンパク質を製造する手段は当業者には公知である。
【００５８】
Ｂ）一部の好ましいエフェクター
１）イメージング組成物
一部の実施形態において、本発明のキメラ分子を用いて検出可能な標識を腫瘍部位に方向づけることができる。これにより腫瘍の検出および／または局在を促進することができる。一部の特に好ましい実施形態において、キメラ分子のエフェクター成分は「放射線不透過性」標識、例えば、Ｘ線を用いて容易に視覚化することができる標識である。放射線不透過性物質は当業者には公知である。最も一般的な放射線不透過性物質としては、ヨウ化物、臭化物、またはバリウム塩が挙げられる。他の放射線不透過性物質も周知であり、それらには有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号を参照）、放射線不透過性ポリウレタン類（米国特許第５，３４６，９８１号を参照）、有機ビスマス合成物（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号を参照）、放射線不透過性バリウムポリマー複合物（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号を参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
抗ＭＵＣ−１抗体は放射線不透過性部分に直接結合させることができ、または以下に記載したような放射線不透過性物質を保有し、または含有する「パッケージ」（例えば、キレート、リポソーム、ポリマーミクロビーズ等）に付着させることができる。
【００６０】
放射線不透過性標識に加えて、他の標識も本発明における使用に適している。本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分としての使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な組成物が挙げられる。本発明における有用な標識としては磁気ビーズ（例えば、ダイナビーズ）、蛍光染料（例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、など）、放射標識（例えば、 3Ｈ、 125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられる他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズなど比色標識が挙げられる。
【００６１】
種々の好ましい放射標識としては、99Ｔｃ、 203Ｐｂ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、 111Ｉｎ、113mＩｎ、97Ｒｕ、62Ｃｕ、 641Ｃｕ、52Ｆｅ、 52mＭｎ、51Ｃｒ、 186Ｒｅ、 188Ｒｅ、77Ａｓ、90Ｙ、67Ｃｕ、 169Ｅｒ、 121Ｓｎ、 127Ｔｅ、 142Ｐｒ、 143Ｐｒ、 198Ａｕ、 199Ａｕ、 161Ｔｂ、 109Ｐｄ、 165Ｄｙ、 149Ｐｍ、 151Ｐｍ、 153Ｓｍ、 157Ｇｄ、 159Ｇｄ、 166Ｈｏ、 172Ｔｍ、 169Ｙｂ、 175Ｙｂ、 177Ｌｕ、 l05Ｒｈ、および 111Ａｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
このような標識を検出する手段は当業者には公知である。したがって、例えば、放射標識は写真用フィルム、シンチレーション検出器、などを用いて検出することができる。蛍光マーカーは、放射照明を検出する光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は通常、基質を有する酵素を供給し、基質に対する酵素の作用によって生成される反応生成物を検出することによって検出することができ、比色標識は着色標識を単に視覚化することによって検出される。
【００６３】
２）放射線増加剤
別の実施形態において、エフェクターは細胞に対する電離放射線（例えば、60ＣｏまたはＸ線源によって生成されるものなど）放射線増感剤の細胞毒性効果を増強する放射線増加剤でありうる。多数の放射線増加剤が周知であり、それらにはベンゾポルフィリン誘導化合物（例えば、米国特許第５，９４５，４３９号を参照）、１，２，４−ベンゾトリアジンオキシダーゼ類（例えば、米国特許第５，８４９，７３８号を参照）、ＢＣＮＴ（例えば、米国特許第５，８７２，１０７号を参照）、放射線増加ニトロ安息香酸アミド誘導体（例えば、米国特許第４，４７４，８１４号を参照）、種々の複素環誘導体（例えば、米国特許第５，０６４，８４９号を参照）、白金複合物（例えば、米国特許第４，９２１，９６３号を参照）などが含まれる。
【００６４】
３）リガンド
エフェクター分子はリガンド、およびエピトープタグ、または抗体であってもよい。特に好ましいリガンドおよび抗体は、免疫細胞上の表面マーカーに結合するものである。エフェクター分子などの抗体を利用するキメラ分子は、リガンドまたは抗体に対する結合相手を有する免疫細胞とＭＵＣ−１抗原を発現する腫瘍細胞との結合を確立する二機能性リンカーとして作用する。
【００６５】
３）キレート
本願中に記載された薬剤および／または放射標識の多くは、特にプレターゲティング法が利用される場合、キレートとして提供されることが好ましい。キレート化分子は通常、抗ＭＵＣ−１抗体に付着したエピトープタグを特異的に結合する分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等）に結合される。
【００６６】
キレート基は当業者に公知である。一部の実施形態において、キレート基はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、シクロヘキシル１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ' −二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’−，Ｎ''，Ｎ''' −四酢酸（ＤＯＴＡ）、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ' ，Ｎ''，Ｎ''' −四酢酸（ＴＥＴＡ）、置換型ＤＴＰＡ、置換型ＥＤＴＡ、などに由来する。
【００６７】
一部の好ましいキレート剤の例としては、非置換型、または置換型の２−イミノチオランおよび２−イミノチアシクロへキサン、特に２−イミノ−４−メルカプトメチルチオランが挙げられる。
【００６８】
１つのキレート剤、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ' −，Ｎ''，Ｎ''' −四酢酸（ＤＯＴＡ）は、放射性核種や放射標識など、診断上および治療上重要な多くの金属をキレート化する能力のため特に興味深い。
【００６９】
ＤＯＴＡ、および抗体などのタンパク質の抱合体が記載されている。例えば、米国特許第５，４２８，１５６号は、ＤＯＴＡを抗体および抗体フラグメントに抱合するための方法を開示している。これらの抱合体を製造するには、抗体または抗体フラグメント上のアミンまたはスルフヒドリル基と反応しうる活性エステルにＤＯＴＡの１つのカルボン酸基を変換する。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５、ｐ．５６５〜５７６には同様の方法が記載されており、その方法ではＤＯＴＡの１つのカルボキシル基を活性エステルに変換し、活性化ＤＯＴＡを抗体と混合し、抗体のリシン残基のイプシロン−アミノ基によって抗体をＤＯＴＡに結合し、それによってＤＯＴＡの１つのカルボキシル基をアミド部分に変換する。
【００７０】
あるいは、キレート化剤は、エピトープタグまたはエピトープタグを結合する部分に直接、またはリンカーによって結合することができる。ＤＯＴＡとビオチンの抱合体が記載されている（例えば、ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチンまたはＤＯＴＡ−ベンジル−４−（６−アミノ−カプロアミド）−ビオチンなどの入手可能なアミノ側鎖ビオチン誘導体によるＤＯＴＡのビオチンへの結合を開示する、スー（ＳＵ）（１９９５年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３６（５補遺）、１５４Ｐ、を参照）。ヤウ（Ｙａｕ）ら、ＷＯ９５／１５３３５は、ビオチンに抱合することができるニトロ−ベンジル−ＤＯＴＡ化合物を製造する方法を開示している。この方法は、ヒドロキシ基の一時的投射による環化反応；アミンのトシル化；一時的に保護されたヒドロキシ基の脱保護；脱保護されたヒドロキシ基のトシル化；および分子内トシル化環化を含む。ウー（Ｗｕ）ら（１９９２年）、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９（２）、ｐ．２３９〜２４４は、 111ＩＮおよび90Ｙでタンパク質を放射標識するための大環状キレート化剤の合成を開示している。ウー（Ｗｕ）らは、標識ＤＯＴＡ−ビオチン抱合体を製造し、試験用のモデルタンパク質であるアビジンとの抱合体の安定性および体内分布を試験した。この抱合体は、インサイツ生成される活性化ＤＯＴＡ誘導体と反応する遊離アミノ基を含むビオチンヒドラジドを用いて製造された。
【００７１】
１）細胞毒
特に好ましい細胞毒としてはシュードモナス外毒素、リシン、およびアブリンが挙げられる。シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素が最も好ましい。
【００７２】
シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、そのＡＤＰリボシル化を触媒（酸化型ＮＡＤのＡＤＰリボシル部分のＥＦ−２への転移の触媒）することによって伸長因子２（ＥＦ−２）の不活性化による赤血球中のタンパク質合成を阻害する緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって分泌されるきわめて活性な単量体のタンパク質（分子量６６ｋＤ）である。
【００７３】
この毒素は、協調して作用して細胞毒性をひき起こす３つの構造的ドメインを含有する。ドメインＩａ（アミノ酸１−２５２）は細胞結合を仲介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）はサイトゾルへの転位の原因となり、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は、タンパク質を不活性化し、細胞死をひき起こす伸長因子２のＡＤＰリボシル化を仲介する。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は不明のままであるが、その大部分、アミノ酸３６５〜３８０は細胞毒性の減少なしに除去しうる。シーガル（Ｓｉｅｇａｌｌ）ら（１９８９年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、ｐ．１４２５６〜１４２６１を参照。
【００７４】
ターゲティング分子（例えば、抗ＭＵＣ−１）がＰＥに融合する場合、好ましいＰＥ分子はドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）が除去され、アミノ酸３６５〜３８０がドメインＩｂから除去されているものである。しかし、ドメインＩｂの全部およびドメインＩＩの一部（アミノ酸３５０〜３９４）は、特に除去された配列がＧＧＧＧＳ（配列表の配列番号：１０）などの結合ペプチドで置換される場合は、除去することができる。
【００７５】
また、ＰＥ分子をさらに部位特異的変異誘発または当業界で周知の他の方法を用いて改変し、特定の所望用途に分子を変化させることができる。本願中に記載されたＰＥ分子によって提供される機能的利点に実質的に影響を及ぼすことがないやり方でＰＥ分子を変化させる手段も用いることができ、こうして得られる分子は本願中に包含されることが意図されている。
【００７６】
好ましいＰＥ分子の最大限の細胞毒性特性のために、分子に対するいくつかの変更が推奨される。組換え分子に対する適切なカルボキシル末端配列が、ターゲット細胞のサイトゾルへ分子を転位することが好ましい。有効であることがわかっているアミノ酸配列としては、ＲＥＤＬＫ（配列表の配列番号：１１）（未変性ＰＥの形）、ＲＥＤＬ（配列表の配列番号：１２）、ＲＤＥＬ（配列表の配列番号：１３）、またはＫＤＥＬ（配列表の配列番号：１４）、その反復、または、タンパク質を維持し、本願中では「内質保持配列」と呼ぶ他の配列が挙げられる。例えば、チョードリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、ｐ．３０８〜３１２、およびシータラム（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、ｐ．１７３７６〜１７３８１を参照。ＰＥの好ましい形態は、ＰＥ３８ＱＱＲ（デビンスキー（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、５、ｐ．４０（１９９４年））、およびＰＥ４Ｅ（例えば、チョードリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）ら（１９９５年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、ｐ．１６３０６を参照）で示されるＰＥ分子を含む。
【００７７】
種々のリガンドに融合されるＰＥをエンコードする遺伝子をクローン化する方法は当業者には公知である（例えば、シーガル（Ｓｅｉｇａｌｌ）ら（１９８９年）、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、３、ｐ．２６４７〜２６５２；およびチョードリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）ら（１９８７年）、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、ｐ．４５３８〜４５４２を参照）。
【００７８】
ＰＥと同様、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、伸長因子２のＡＤＰリボシル化によってタンパク質合成を阻害することによって細胞を殺傷する。しかし、ジフテリア毒素は、２つの鎖、ＡおよびＢに分割し、ジスルフィドブリッジによって結合される。ＰＥとは対照的に、カルボキシル端にあるＤＴの鎖Ｂはレセプター結合の原因のとなり、アミノ端に存在する鎖Ａは、酵素活性を含有する（内田（Ｕｃｈｉｄａ）ら（１９７２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７５、ｐ．９０１〜９０３；内田ら（１９７３年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４８、ｐ．３８３８〜３８４４）。
【００７９】
好ましい実施形態において、本発明のターゲティング分子−ジフテリア毒素融合タンパク質は、ジフテリア毒素Ｂ鎖の切断によって除去される未変性のレセプター結合ドメインを有する。特に好ましいのはＤＴ３８８、すなわち、残基３８９で開始するカルボキシル末端配列が除去されているＤＴである。チョードリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）ら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８０、ｐ．５４５〜５５１。ＰＥキメラ細胞毒と同様、ＤＴ分子を化学的にＭＵＣ−１抗体に抱合することができるが、一部の好ましい実施形態において、ターゲティング分子は組換え手段によってぢ不テリア毒素に融合される（例えば、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（１９９０年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、ｐ．１１８８５〜１１８８９）。
【００８０】
４）他の治療的部分
他の適切なエフェクター分子としては、薬物、または種々の薬物を含有するカプセル系が挙げられる。したがって、キメラ分子のターゲティング分子は、腫瘍に直接送達される薬剤に直接付着させることができる。このような薬剤は当業者には公知であり、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
あるいは、エフェクター分子は、ウイルスキャプシド、リポソーム、または薬剤などの治療的組成物を含有するミセル、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または好ましくは循環系への直接的曝露からシールドされている別の治療的部分などのカプセル系であってもよい。抗体に付着されるリポソームを調製する手段は当業者には公知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、コナー（Ｃｏｎｎｏｒ）ら（１９８５年）、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．、２８、ｐ．３４１〜３６５を参照。
【００８２】
Ｃ）エフェクター分子へのターゲティング分子の付着
熟練者には、本発明のＭＵＣ−１抗体とエフェクター分子が任意の順序で結合されうることが明らかであろう。したがって、ターゲティング分子がポリペプチドである場合、エフェクター分子はターゲティング分子のアミノ端またはカルボキシ端のいずれかに結合されうる。このターゲティング分子は、エフェクター分子の内部領域に結合することができ、反対に、エフェクター分子は、付着が分子のそれぞれの活性に干渉することがない限り、ターゲティング分子の内部位置に結合されうる。
【００８３】
ターゲティング分子とエフェクター分子は、当業者には公知の多くの手段のいずれかによって付着させることができる。通常、エフェクター分子は、直接またはリンカー（スペーサー）によって、ターゲティング分子に抱合される。しかし、エフェクター分子とターゲティング分子の両方がポリペプチドである場合、単鎖融合タンパク質としてキメラ分子を組換え発現することが好ましい。
【００８４】
１）エフェクター分子のターゲティング分子への抱合
１つの実施形態において、ターゲティング分子（例えば、抗ＭＵＣ−１Ａｂ）はエフェクター分子（例えば、細胞毒、標識、リガンド、または薬剤もしくはリポソーム）に化学的に抱合される。分子を化学的に抱合する手段は熟練者には公知である。
【００８５】
薬剤を抗体または他のポリペプチドターゲティング分子に付着させるための方法は、薬剤の化学構造によって異なる。ポリペプチドは通常、種々の官能基；例えば、それらにエフェクターを結合させるエフェクター分子上の適切な官能基との反応のために利用可能なカルボン酸（ＣＯＯＨ）基または遊離アミン（−ＮＨ2)基を含有する。
【００８６】
あるいは、ターゲティング分子および／またはエフェクター分子は誘導体化され、追加の反応官能基に曝露または付着させることができる。誘導体化は、ピアース・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍａｐｎｙ）（イリノイ州ロックフォード）より入手可能なものなど多くのリンカー分子のいずれかの付着を必要としうる。
【００８７】
本願中で用いられる「リンカー」は、ターゲティング分子をエフェクター分子に結合させるために用いられる分子である。このリンカーには、ターゲティング分子とエフェクター分子の両方に共有結合を形成する能力がある。適切なリンカーは当業者には公知であり、直鎖または側鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。ターゲティング分子およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーはそれらの側鎖によって（例えば、システインへのジスルフィド連鎖によって）構成アミノ酸に結合しうる。しかし、好ましい実施形態では、リンカーは末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基に結合される。
【００８８】
特定の薬剤の基と反応性の１つの官能基、および抗体と反応性の別の基を有する二機能性リンカーを用いて、所望の免疫複合体を形成することができる。あるいは、誘導体化はターゲティング分子の化学的処理、例えば、遊離アルデヒド基を生成するための過ヨウ素酸による糖タンパク質抗体の糖部分の糖開裂を必要としうる。抗体上の遊離アルデヒド基は薬剤上の遊離アミン基またはヒドラジン基と反応しうる。（米国特許第４，６７１，９５８号を参照）。抗体または抗体フラグメントなど、ポリペプチド上の遊離スルフヒドリル基の生成方法も周知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照）。
【００８９】
放射性核種金属キレート、毒素、および薬剤を含む種々の化合物の抗体などタンパク質への付着のための多くの方法およびリンカー分子が周知である（例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；および同第４，５８９，０７１号；およびボアリングハウス（Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ）ら（１９８７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４７、ｐ．４０７１〜４０７５を参照）。特に、種々の免疫毒素の生成は当業界内で公知であり、例えば、「モノクローナル抗体−毒素抱合体：マジックブリットをめざして」、トルペ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ．１６８〜１９０（１９８２年）、ワルトマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２、ｐ．１６５７、米国特許第４，５４５，９８５号および同第４，８９４，４４３号において見ることができる。
【００９０】
状況によっては、キメラ分子がそのターゲット部位に達した場合にエフェクター分子をターゲティング分子から遊離させることが望ましい。したがって、エフェクターがターゲット部位で放出される場合、ターゲット部位の近くに開裂可能である連鎖を含むキメラ抱合体を用いることができる。薬剤再を抗体から放出させる連鎖の開裂は、酵素活性または免疫複合体がターゲット細胞の内部またはターゲット部位の近くのいずれかにさらされる状態によって促進されうる。ターゲット部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在することを条件として（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝露された場合）開裂可能であるリンカーを用いることができる。
【００９１】
多くの異なる開裂可能な連鎖が当業者には周知である。米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号、および同第４，６２５，０１４号を参照。これらのリンカー基からの薬剤の放出メカニズムとしては、例えば、感光性接着剤の照射および酸触媒加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号は、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって生体内ターゲット部位で開裂されるリンカーを含む免疫複合体の記載を包含する。種々の放射線診断化合物、放射線治療化合物、薬剤、毒素、および他の薬剤を抗体に付着させるために報告されている多数の方法の点から見て、当業者であれば、所定の薬剤を抗体または他のポリペプチドに付着させるために適した方法を決定することができるであろう。
【００９２】
２  キレートの抱合
一部の好ましい実施形態において、エフェクターは抗体またはエピトープタグに付着されたキレートを含む。ＭＵＣ−１抗体は対応するエピトープタグまたは抗体を有し、ＭＵＣ−１抗体のキレートへの単純な接触の結果として抗体のエフェクターとの付着が得られる。結合ステップは部分を用いる前に行うことができ（ターゲティング法）、またはターゲット組織はキレートが送達される前に抗ＭＵＣ−１抗体に結合することができる。種々のターゲティング部分に結合するために適したキレートを製造する方法は当業者には公知である（例えば、米国特許第６，１９０，９２３号、同第６，１８７，２８５号、同第６，１８３，７２１号、同第６，１７７，５６２号、同第６，１５９，４４５号、同第６，１５３，７７５号、同第６，１４９，８９０号、同第６，１４３，２７６号、同第６，１４３，２７４号、同第６，１３９，８１９号、同第６，１３２，７６４号、同第６，１２３，９２３号、同第６，１２３，９２１号、同第６，１２０，７６８号、同第６，１２０，７５１号、同第６，１１７，４１２号、同第６，１０６，８６６号、同第６，０９６，２９０号、同第６，０９３，３８２号、同第６，０９０，８００号、同第６，０９０，４０８号、同第６，０８８，６１３号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０７５，０１０号、同第６，０７１，４９４号、同第６，０７１，４９０号、同第６，０６０，０４０号、同第６，０５６，９３９号、同第６，０５１，２０７号、同第６，０４８，９７９号、同第６，０４５，８２１号、同第６，０４５，７７５号、同第６，０３０，８４０号、同第６，０２８，０６６号、同第６，０２２，９６６号、同第６，０２２，５２３号、同第６，０２２，５２２号、同第６，０１７，５２２号、同第６，０１５，８９７号、同第６，０１０，６８２号、同第６，０１０，６８１号、同第６，００４，５３３号、および同第６，００１，３２９号を参照）。
【００９３】
３）融合タンパク質の製造
ＭＵＣ−１ターゲティング分子および／またはエフェクター分子が比較的短い（すなわち、約５０個未満のアミノ酸）場合、それらは標準の化学ペプチド合成法を用いて合成することができる。両方の分子が比較的短い場合、キメラ分子は単一の連続したポリペプチドとして合成することができる。あるいは、ターゲティング分子およびエフェクター分子を別々に合成し、次いで１つの分子のアミノ末端を他の分子のカルボキシル末端との縮合によって融合し、ペプチド結合を形成することができる。あるいは、ターゲティング分子とエフェクター分子をペプチドスペーサー分子の一端で互いに縮合することによって、連続した融合タンパク質を形成することができる。
【００９４】
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着した後、配列の残ったアミノ酸を連続的に添加する固相合成が、本発明のポリペプチドの化学合成のための好ましい方法である。固相合成の方法は、バラニー（Ｂａｒａｎｙ）とメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によって記載されている（固相ペプチド合成；ペプチド：分析、合成、生物学、第２巻、ペプチド合成における特殊な方法、パートＡ、ｐｐ．３〜２８４所収、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、ｐ．２１４９〜２１５６（１９６３年）、およびスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら著、固相ペプチド合成、第２版、ピアース・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）（イリノイ州ロックフォード）（１９８４年）。
【００９５】
好ましい実施形態において、本発明のキメラ融合タンパク質は組換えＤＮＡ法を用いて合成される。一般に、これには融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を生成し、特定のプロモーターのコントロール下に発現カセットにＤＮＡを配置し、宿主内にタンパク質を発現し、発現タンパク質を単離し、必要に応じて、タンパク質を再生するステップが含まれる。
【００９６】
本発明の融合タンパク質（例えば、抗ＭＵＣ−１−ＰＥ３８ＱＱＲ）をエンコードするＤＮＡは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら（１９７９年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８、ｐ．９０〜９９のリン酸トリエステル法；ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら（１９８１年）、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２、ｐ．１８５９〜１８６２のジエチルホスホラミダイト法；米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの方法による直接化学合成を含む任意の適切な方法によって調製することができる。
【００９７】
化学合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。これは補助配列によるハイブリッド形成、またはテンプレートを用いたＤＮＡポリメラーゼによる重合によって二重鎖ＤＮＡに変換することができる。熟練者であれば、ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に制限されると同時に、短い配列のライゲーションによって長い配列を得ることができることを認めるであろう。
【００９８】
あるいは、部分配列をクローン化し、適切な部分配列を適切な制限酵素を用いて開裂することができる。次いで、フラグメントをライゲーションし、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などＤＮＡ増幅法を用いてクローン化することができる。したがって、例えば、抗ＭＵＣ−１抗体をエンコードする核酸は、ＮｄｅＩの制限部位を含有するセンスプライマーおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を含有するアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅される。これにより抗ＭＵＣ−１配列をエンコードし、末端制限部位を有する核酸が生成される。ＰＥ３８ＱＱＲフラグメントは、デビンスキー（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ）ら（１９９４年）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８、ｐ．７４４〜７４８によって記載されたプラスミドｐＷＤＭＨ４−３８ＱＱＲまたはプラスミドｐＳＧＣ２４２ＦｄＮ１が切り取られる。抗ＭＵＣ−１およびＰＥ３８ＱＱＲ配列のライゲーションおよびベクターへの挿入により、ＰＥ３８ＱＱＲのアミノ末端（ＰＥの２５３位）に結合された抗ＭＵＣ−１をエンコードするベクターが生成される。２つの分子は、グルタミン酸、アラニン、および制限部位によって導入されるフェニルアラニンからなる３個のアミノ酸結合部によって結合される。
【０１００】
２つの分子は実質的に直接結合されることが好ましいが、熟練者であれば、それらの分子が１個以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって分離されうることを理解するであろう。一般に、スペーサーは、タンパク質を結合し、またはそれらの間の最小限の距離または他の空間的関係を保存する以外の特異的な生物学的活性を有することはない。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、畳み込み、実効電荷、または疎水性などの分子の一部の特性に影響するように選択することができる。
【０１０１】
融合タンパク質をエンコードする核酸配列は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母菌を含む種々の宿主細胞、およびＣＯＳ、ＣＨＯ、およびＨｅＬａ細胞株および骨髄腫細胞などの種々の高等真核生物細胞に発現されうる。組換えタンパク質遺伝子は、各宿主に対する適切な発現コントロール配列に実施可能に結合される。大腸菌については、これにはＴ７、ｔｒｐ、またはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは、転写終結シグナルなどのプロモーターが含まれる。真核生物細胞については、コントロール配列はプロモーター、および好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス等由来の転写促進因子、およびポリアデニル化配列を含むとともに、スプライスドナーおよびアクセプター配列を含みうる。
【０１０２】
本発明のプラスミドは、大腸菌での塩化カルシウム形質転換および哺乳類動物細胞でのリン酸カルシウム処理または電気穿孔など公知の方法によって選択された宿主細胞に導入することができる。プラスミドによって導入される細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、およびｈｙｇ遺伝子など、プラスミドに含まれる遺伝子によって与えられる抗生物質に対する耐性によって選択することができる。
【０１０３】
発現されると、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などを含む技術の標準方法に従い組換え融合タンパク質を精製することができる（一般に、Ｒ．スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９８２年）、タンパク質精製、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク；ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）（１９９０年）、酵素学における方法、第１８２巻、タンパク質精製ガイド、アカデミックプレス株式会社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨークを参照）。少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、医薬品使用には９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。精製されると、次いで、部分的に、または所望の均一性に、ポリペプチドを治療的に用いることができる。
【０１０４】
当業者であれば、化学合成、生物学的発現、または精製の後に、ＭＵＣ−１ターゲティングされた融合タンパク質が構成ポリペプチドの自然の高次構造と実質的に異なる高次構造を有しうることを認めるであろう。この場合、ポリペプチドを変性させ、かつ減少させ、次いでポリペプチドを好ましい高次構造に再び折り畳むことが必要とみなれる。タンパク質を減少させ、かつ変性させて再び折り畳むことを誘導する方法が当業者には公知である（デビンスキー（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ）ら（１９９３年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、ｐ．１４０６５〜１４０７０；クライトマン（Ｋｒｅｉｔｍａｎ）とパスタン（Ｐａｓｔａｎ）（１９９３年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、４、ｐ．５８１〜５８５；およびブヒナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）ら（１９９２年）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０５、ｐ．２６３〜２７０を参照）。
【０１０５】
当業者であれば、ＭＵＣ−１ターゲティングされた融合タンパク質に対する変更をそれらの生物学的活性を減少することなく行うことができることを認めるであろう。一部の変更は、クローニング、発現、またはターゲティング分子の融合タンパク質への取込みを促進するためになしうる。このような変更は当業者には公知であり、例えば、開始部位を提供するアミノ末端で追加されるメチオニン、または便利に配置された制限部位を生成する末端または終止コドンのいずれかに配置される追加のアミノ酸を含む。
【０１０６】
ＩＩＩ．抗ＭＵＣ−１抗体の調製および変更
以下に記載したように、本願中で提供される情報を用いて、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体は化学合成手段または組換え発現系の使用のいずれかを用いて調製することができる。また、同じエピトープに結合する抗体のスクリーニングによって、および／または抗ＭＵＣ−１抗体（３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および１２Ｅ）の変更によって他の「関連」抗ＭＵＣ−１抗体を同定し、変更抗体のライブラリーを生成し、次いでＭＵＣ−１結合活性の改善についてライブラリーの抗体を再スクリーニングすることができる。
【０１０７】
Ａ）抗体合成
１）化学合成
本願中で提供された配列情報を用いることにより、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体（３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および１２Ｅ）、またはそれらの変形を、ペプチド合成の公知の方法を用いて化学的に合成することができる。配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着した後、配列に残ったアミノ酸を逐次添加する固相合成は、単鎖抗体の化学合成の１つの好ましい方法である。固相合成の方法は、バラニー（Ｂａｒａｎｙ）とメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によって記載されている（固相ペプチド合成；ペプチド：分析、合成、生物学、第２巻、ペプチド合成における特殊な方法、パートＡ、ｐｐ．３〜２８４所収、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、ｐ．２１４９〜２１５６（１９６３年）、およびスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら著、固相ペプチド合成、第２版、ピアース・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）（イリノイ州ロックフォード）（１９８４年）。
【０１０８】
２）抗ＭＵＣ−１抗体の組換え発現
一部の好ましい実施形態において、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体（３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および１２Ｅ）、またはそれらの変形は、当業者には公知の標準方法を用いて調製される。本願中で提供された配列情報を用いることにより、所望の抗体をエンコードする核酸を当業者には公知の多くの標準方法に従い化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチド合成は、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機械で行われること（ニードハム−ヴァンデバンター（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ）ら（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２、ｐ．６１５９〜６１６８）、またはビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら（ビューケージら（１９８１年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔｓ．、２２（２０）、ｐ．１８５９〜１８６２）によって記載された固相リン酸ホスホラミダイトトリエステル法を用いて手動で合成されることが好ましい。あるいは、抗体をエンコードする核酸を標準方法に従い増幅および／またはクローン化することができる。
【０１０９】
これらの末端を得る分子クローニング法が当業界で周知である。幅広い種類のクローニング法および生体内増幅法が組換え核酸の構成には適している。これらの方法の例および多くのクローニング経験による熟練者を指導するのに十分な説明が、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、分子クローニング法ガイド、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、アカデミックプレス株式会社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、（カリフォルニア州、サンディエゴ）（ベルガー）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）、分子クローニング−実験室マニュアル（第２版）、第１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（サムブルック）；および分子生物学における最新プロトコル、Ｆ．Ｍ．アズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、最新プロトコル、グリーン出版協会株式会社（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）とジョン・ウィリー・アンド・サンズ株式会社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、（１９９４年補遺）（アズベル）において見られる。組換え免疫グロブリンを生成する方法も当業界において周知である。キャビリー、米国特許第４，８１６，５６７号；およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６、ｐ．１００２９〜１００３３を参照。また、本発明の抗体の発現のための詳細なプロトコルが本願中の実施例に示されている。
【０１１０】
Ｂ）３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および／または１２Ｅと同じエピトープを結合する他の抗体の同定
有用な抗ＭＵＣ−１抗体（３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、および１２Ｅ）を同定したところで、抗体によって結合されたエピトープで、同定された抗体、又は本発明の抗ＭＵＣ−１抗体に対して生じるイディオタイプの抗体と交差反応する抗体のスクリーニングによって他の「関連」抗ＭＵＣ−１抗体を同定することができる。
【０１１１】
１）抗イディオタイプ抗体との交差反応性
イディオタイプは抗体の高い可変抗原結合部位を表し、それ自体、免疫原性である。抗体による免疫応答の発生中に、個体は、抗原に対する抗体、およびその免疫原性結合部位（イディオタイプ）が抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体を発生させる。
【０１１２】
抗イディオタイプ抗体は、当業者には公知の標準方法を用いて本願中で同定された抗体の可変領域に対して生じうる。手短に言うと、抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗体、またはそれらのフラグメント（例えば、ＣＤＲｓ）を動物に注入し、イディオタイプの領域における決定因子を含めて、抗体上の種々の抗原性決定因子に対する抗血清を誘発することによって製造することができる。
【０１１３】
抗検体抗体を製造するための方法が当業界において公知である。大分子量抗原（約５０００ダルトン以上）を動物に直接注入することができるが、小分子量化合物（約５０００ダルトン未満）を高分子量の免疫原性担体、通常はタンパク質に結合し、それらに免疫原性を与えることが好ましい。免疫化に応答して生成される抗体を血清、腹水、免疫グロブリン（Ｉｇ）画分、ＩｇＧ画分として、または親和性精製単一特異的材料として利用することができる。
【０１１４】
上述したように調製された抗体で動物を免疫化することによってポリクローナル抗イディオタイプ抗体を調製することができる。一般に、種属であり、抗体（例えば、ファージ−ディスプレイライブラリー）が由来した動物とアロタイプマッチした動物を免疫化することが望ましい。これにより非イディオタイプの決定因子に対して特異的な抗体の生成が最小限に抑えられる。次いで、こうして得られる抗血清は通常、ファージ−ディスプレイライブリーが由来する同じ種からの正常な血清に対して大量に吸収される。吸収は、正常な（非免疫）血清タンパク質をグルタルアルデヒドと架橋結合することによって形成されるゲル上を抗血清を移動させることによって達成することができる。抗イディオタイプ特異性を有する抗体はゲルを直接通過するが、非イディオタイプの決定因子に対する特異性を有する抗体はゲルに結合することになる。不溶性多糖支持体（例えば、セファロース）上への非免疫血清タンパク質の固定化によっても吸収に適した基質が得られる。
【０１１５】
コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、ｐ．４９５の方法を用いてモノクローナル抗イディオタイプ抗体を製造することができる。具体的には、（１）抗原または所定のヘプタン−担体抱合体（すなわち抗体もしくは本発明またはそれらの部分配列）で免疫化されたマウスからの脾細胞を（２）薬剤（例えば、８−アザグアニン）に対する耐性のために選択されているマウス骨髄腫細胞株に融合するステップを含むハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。一般に、免疫グロブリンを分泌することがない骨髄腫細胞株を用いることが望ましい。このような細胞株の一部は当業界において周知である。好ましい細胞株は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３である。この細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）においてＣＲＬ−１５８０として貯蔵されている。
【０１１６】
融合は確立された方法に従いポリエチレングリコールの存在下に行うことができる（例えば、モノクローナル抗体、Ｒ．ケネット（Ｋｅｎｎｅｔｔ）、Ｊ．マックケアン（ＭｃＫｅａｒｎ）とＫ．ベクトル（Ｂｅｃｈｔｏｌ）編、ニューヨーク、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８０年、および微生物学と免疫学における最新の話題、第８１巻、Ｆ．メルチャーズ（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ）、Ｍ．ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）とＮ．Ｌ．ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ）編、ニューヨーク、シュプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照）。融合細胞と非融合細胞の結果として生じる混合物をヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地中にプレートアウトする。これらの条件下では、ハイブリッド細胞のみが増殖する。
【０１１７】
十分な細胞増殖が生じた場合、（通常、融合後１０〜１４日）、培養培地を収集し、固相ＲＩＡおよび酵素結合免疫吸着アッセイを含む多くの方法のうち任意の１つによってモノクローナルイディオタイプの抗分析物抗体の存在ついてスクリーニングする。次いで、所望の特異性の抗体を含有する細胞壁からの細胞を増殖させ、再クローン化する。次いで、当該抗体に対して依然として陽性である培養株からの細胞を通常、感受性、組織適合性、プリスタン初回抗原刺激を受けたマウスの腹水腫瘍として通過させる。
【０１１８】
腹腔を穿刺することによって腹水を収集し、抗体に対して再試験し、上述したように精製する。非分泌骨髄腫細胞株を融合において用いる場合は、抗体がその抗原結合特性に対してすでに均質であるため、モノクローナル抗体の親和性精製は通常、必要ではない。必要であるのは、腹水中の汚染タンパク質から抗体を単離すること、すなわち免疫グロブリン画分を生成することがすべてである。
【０１１９】
あるいは、当該ハイブリッド細胞株を血清フリーの組織培養で増殖させ、抗体を培養培地から収集することができる。一般に、収率が低いため、これは大量の抗体を得るあまり望ましくない方法である。細胞をマウスの静脈内に通過させ、抗体を血清から収集することも可能である。この方法は、出血によって得られる血清が少量であり、他の血清成分からの大量の精製が必要であるという点で、好ましくない。しかし、一部のハイブリドーマは腹水腫瘍して増殖せず、したがって、抗体を得るこれらの代替法の１つを用いる必要がある。
【０１２０】
２）本発明の抗ＭＵＣ−１抗体との交差反応性
抗イディオタイプ抗体の代わりに、それらが本発明の「プロトタイプ」抗体（３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、１２Ｅ）と同じエピトープを結合するということによって、本発明の他の抗ＭＵＣ−１抗体を同定することができる。抗体の交差反応性を測定する方法は当業者には公知である。一般に、本発明のプロトタイプ抗体によって結合されるエピトープは、例えば、エピトープマッピング法によって測定される。エピトープマッピングの方法は当業者には公知である（例えば、レイズ（Ｒｅｙｓ）ら（１９９２年）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：エピトープマッピングと株間類似度、エルゼビア・サイエンス・パブリッシャー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ）シカタ（Ｓｈｉｋａｔａ）ら編、第４３章、ｐ．２３７〜２４５；リ（Ｌｉ）ら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、ｐ．８５〜８８を参照）。エピトープマッピングは、ノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）株式会社より市販されているキットであるノヴァトープ（Ｎｏｖａｔｏｐｅ）系を用いて行うことができる。
【０１２１】
本発明のプロトタイプ抗体によって結合されるエピトープが解明されると、例えば、サンドイッチアッセイ、ビアコア（ｂｉａＣｏｒｅ）アッセイ等などの標準免疫アッセイを用いて、同じエピトープを結合する新しく生成される抗ＭＵＣ−１抗体の能力が測定される。交差反応性アッセイの例は、米国特許第６，１９７，９３８号において示されている。好ましい交差反応性抗ＭＵＣ−１抗体は、本発明の１つまたは複数のプロトタイプ抗体と少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９９％の交差反応性を示す。
【０１２２】
Ｃ）他の「関連」抗ＭＵＣ−１１抗体を選択するファージディスプレイ法
１）鎖シャフリング法
高親和性抗体を生成するには、同定された抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、１２Ｅ）の結合の配列に基づく、突然変異ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを生成し、ファージの表面上に発現する。高親和性ｓｃＦｖは、例えば、上述したように抗原で選択される。
【０１２３】
改変単鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子レパートリーを生成する方法により、最初のＶH またはＶL 遺伝子をＶ遺伝子で置換し、新しいパートナーが生成されている（鎖シャフリング）（クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、ｐ．６２４〜６２８）。鎖シャフリングおよびファージディスプレイを用いることにより、ハプタンフェニルオキサゾロン（ｐｈＯｘ）を結合したヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの親和性が、３００ｎＭから１ｎＭ（３００倍）へ増大した（マークス（Ｍａｒｋｓ）ら（１９９２年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、ｐ．７７９〜７８３）。
【０１２４】
したがって、例えば、抗ＭＵＣ−１抗体の親和性を変化させるには、抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、１２Ｅ）抗体のＶH 遺伝子およびヒトＶL 遺伝子レパートリー（軽鎖シャフリング）を含有する突然変異ｓｃＦｖ遺伝子を生成することができる。ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーはファージディスプレリベクター、例えば、ｐＨＥＮ−１にクローン化し（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９、ｐ．４１３３−４１３７）、形質転換後に形質転換体のライブラリーが得られる。
【０１２５】
同様に、重鎖シャフリングについては、抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、１２Ｅ）抗体ＶH ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３、および軽鎖がヒトＶH 遺伝子レパートリーを含有するベクターにクローン化され、ファージ抗体ライブラリー形質転換体を生成する。抗体親和性を増大させる鎖シャフリングの詳細な説明については、シール（Ｓｃｈｉｅｒ）ら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５、ｐ．２８〜４３、１９９６年を参照。
【０１２６】
２）結合親和性を改善する部位特異的変異原性
アミノ酸側鎖を接触する抗原の大多数は通常、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）に位置し、３つがＶH （ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）であり、３つがＶL （ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）である（チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ら（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、ｐ．９０１〜９１７；チョチアら（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３、ｐ．７５５〜８；ナン（Ｎｈａｎ）ら（１９９１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１７、ｐ．１３３〜１５１）。これらの残基は抗原の抗体親和性の原因である結合エネルギー性の大多数に寄与する。他の分子において、リガンドを接触する変異性アミノ酸が、その結合パートナーに対する１つのタンパク質分子の親和性を増大する有効な手段であることがわかっている（ローマン（Ｌｏｗｍａｎ）ら（１９９３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４、ｐ．５６４〜５７８：ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、ｐ．８５０９〜８５１６）。ＣＤＲｓの部位特異的変異原性および改善された結合親和性を有するＭＵＣ−１抗体に対するスクリーニング。
【０１２７】
３）高親和性ヒトｓｃＦｖを生成するＣＤＲランダム化
単一の部位特異的変異原性の拡大において、部分的又は完全なＣＤＲｓがランダム化される突然変異抗体ライブラリーを生成することができる（ＶL ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、およびＶH ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）。１つの実施形態において、各ＣＤＲは、テンプレートとして周知の抗ＭＵＣ−１抗体（例えば、３Ｄ、Ａ５、Ｃ４、１２Ｅ）を用いることによって別々のライブラリーでランダム化される。各ＣＤＲからの最も高い親和性変異体のＣＤＲ配列を結合し、親和性の追加的増大を得る。同様の方法が、３．４×１０-10 から９．０×１０-13 Ｍへの１５００倍を超える成長ホルモンレセプターに対するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を増大するために用いられている（ローマン（Ｌｏｗｍａｎ）ら（１９９３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４、ｐ．５６４〜５７８）。
【０１２８】
ＶH ＣＤＲ３はしばしば結合ポケットの中心を占め、その結果として、この領域における突然変異は親和性が増大する可能性が高い（クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、ｐ．３８３〜３８６）。１つの実施形態において、４つのＶH ＣＤＲ３残基がヌクレオチドＮＮＳを用いて一度にランダム化される（例えば、シール（Ｓｃｈｉｅｒ）ら（１９９６年）、Ｇｅｎｅ、１６９、ｐ．１４７〜１５５；シール（Ｓｃｈｉｅｒ）とマークス（Ｍａｒｋｓ）（１９９６年）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、７、ｐ．９７〜１０５、１９９６年、およびシール（Ｓｃｈｉｅｒ）ら（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３、ｐ．５５１〜５６７、１９９６年を参照）。
【０１２９】
４）ホモ二量体の生成
（ｓｃＦｖ')2 抗体を生成するには、リンカー（例えば、炭素リンカー、ペプチド等）、または、例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合のいずれかによって、２つの抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖを結合する。したがって、例えば、ジスルフィド結合ｓｃＦｖを生成するには、本願中に記載した抗体のカルボキシ末端で部位特異的変異原性によってシステイン残基を導入する。
【０１３０】
ｓｃＦｖはこの作成物から発現し、ＩＭＡＣによって精製され、ゲルろ過によって分析することができる。（ｓｃＦｖ')2 二量体を生成するには、１ｍＭ  ∃−メルカプトエタノールでインキュベーションすることによってシステインを減少させ、ｓｃＦｖの半分をＤＴＮＢの添加によってブロックする。ブロック化および非ブロック化ｓｃＦｖを共にインキュベートし、（ｓｃＦｖ')2 を形成し、結果として生じる二量体の親和性は標準方法を用いて、例えば、ＢＩＡコアによって測定することができる。
【０１３１】
特に好ましい実施形態において、（ｓｃＦｖ')2 二量体は、リンカーによって、より好ましくはペプチドリンカーによってｓｃＦｖ' フラグメントを結合することによって生成される。これは、当業者には公知の幅広い種類の手段によって行うことができる。例えば、１つの好ましい方法が、ホリガー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ）ら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、ｐ．６４４４〜６４４８（ＷＯ９４／１３８０４も参照）によって記載されている。
【０１３２】
５）抗体／ポリペプチド結合親和性の測定
上記の説明どおり、増大結合活性の選択にはターゲット抗原（例えば、ＭＵＣ−１）に対する抗体の親和性を測定する必要がある。このような測定を行う方法は当業者には公知である。手短に言えば、例えば、３Ｄ−、Ａ５−、Ｃ４−、または１２Ｅ由来抗体のＫd を、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーであるＢＩＡコアにおけるＭＵＣ−１への結合動態から測定する。この方法のために、質量の変化を検出する能力がある誘導体化センサーチップに抗原を結合する。抗原をセンサーチップ上を通過させると、抗体は抗原に結合し、結果として定量化可能である質量の増大が生じる。抗体濃度の関数としての結合速度の測定値を用いて、結合速度定数（ｋon）を計算することができる。結合段階後、バッファーをチップ上に通し、抗体の解離速度（ｋoff ）を測定する。Ｋonは通常、１．０×１０2 〜５．０×１０6 の範囲で測定され、ｋoff は１．０×１０-1〜１．０×１０-6の範囲で測定される。平衡定数ｋｄはしばしばｋoff ／ｋonとして計算され、したがって通常、１０-5〜１０-12 の範囲で測定される。このようにして測定される親和性は、蛍光消光滴定によって溶液中で測定される親和性と十分に相関する。
【０１３３】
Ｄ）ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および二量体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）
本願中に記載した抗体および／または本願中のＶＨおよび／またはＶＬドメインを用いて、種々のヒト、またはヒト化抗体または二量体を製造することができる。
【０１３４】
ｉ）ヒト化（キメラ）抗体
本願中の抗体として具体的には、重および／または軽鎖の一部分が特定の種由来の抗体における対応する配列と同一または相同性であり、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しているが、鎖の残部が別の種由来の抗体における対応する配列と同一または相同性であり、または別の抗体クラスまたはサブクラスのほか、それらが所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントに属する「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が挙げられる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、ｐ．６８５１〜６８５５等を参照）。
【０１３５】
ヒト化（キメラ）抗体は、ヒトおよび非ヒトタンパク質を含む免疫グロブリン分子である。さらに具体的には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域（または可変領域）は非ヒト源（例えば、マウス）由来であり、（生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに与える）キメラ抗体の不変領域はヒト源由来である。ヒト化キメラ抗体は非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、およびヒト抗体分子によって与えられるエフェクター機能を有することになる。キメラ抗体を生成する多数の方法が当業者には公知である（例えば、米国特許第５，５０２，１６７号、同第５，５００，３６２号、同第５，４９１，０８８号、同第５，４８２，８５６号、同第５，４７２，６９３号、同第５，３５４，８４７号、同第５，２９２，８６７号、同第５，２３１，０２６号、同第５，２０４，２４４号、同第５，２０２，２３８号、同第５，１６９，９３９号、同第５，０８１，２３５号、同第５，０７５，４３１号、および同第４，９７５，３６９号、およびＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０９９６号を参照）。
【０１３６】
一般に、キメラ抗体を生成するために用いられる方法は以下のステップからなる（一部のステップの順序は入れ替えることができる）：（ａ）抗体分子の抗原結合部分をエンコードする正確な遺伝子断片を同定し、クローニングするステップ；この遺伝子断片（重鎖についてはＶＤＪ、可変、多様性、および結合領域として、または軽鎖についてはＶＪ、可変、結合領域として、または単にＶもしくは可変領域すなわちＶH およびＶL 領域として知られる）は、ｃＤＮＡまたはゲノムのいずれかの形態でありうる；（ｂ）ヒト不変領域またはそれらの所望部分をエンコードする遺伝子断片をクローニングするステップ；（ｃ）可変領域を不変領域にライゲーションし、完全なキメラ抗体を転写可能な、かつ翻訳可能な形態でエンコードするステップ；（ｄ）この作成物を選択可能なマーカーのほか、プロモーター、エンハンサー、およびポリ（Ａ）添加シグナルなど遺伝子コントロール領域を含有するベクターにライゲーションするステップ；（ｅ）この作成物を宿主細胞（例えば、細菌）中で増幅するステップ；（ｆ）ＤＮＡを真核生物の細胞、最も多くの場合は哺乳動物に導入し（形質移入）；キメラ抗体の発現に適した条件下に宿主細胞を培養するステップ。
【０１３７】
これらのプロトコルによって、いつくかの明確な抗原結合特異性の抗体が操作され、キメラタンパク質が得られている（例えば、抗ＴＮＰ：ブリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ）ら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、ｐ．６４３；および抗腫瘍抗原：サハガン（Ｓａｈａｇａｎ）ら（１９８６年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７、ｐ．１０６６）。同様に、いくつかの異なるエフェクター機能が、抗原結合領域をエンコードするものに新しい配列を結合することによって達成されている。これらの一部には酵素（ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、ｐ．６０４）、別の種からの免疫グロブリン不変領域、および別の免疫グロブリン鎖の不変領域（シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３０９、ｐ．３６４；タン（Ｔａｎ）ら（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５、ｐ．３５６５〜３５６７）が含まれる。
【０１３８】
１つの好ましい実施形態においては、組換えＤＮＡベクターを用いて、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体を生成する細胞株を形質移入する。この新規な組換えＤＮＡベクターは、細胞株内の免疫グロブリン不変領域をエンコードする遺伝子の全部または一部を置換する「置換遺伝子」（例えば、置換遺伝子はヒト免疫グロブリンの不変領域、特異的免疫グロブリンクラス、または酵素、毒素、生物学的活性ペプチド、成長因子、阻害剤、または薬剤、毒素、または他の分子等への抱合を促進するリンカーペプチドの全部または一部をエンコードしうる）、および抗体生成細胞内の免疫グロブリン配列によるターゲティングされた相同性組換えを可能にする「ターゲット配列」を含有する。
【０１３９】
別の実施形態においては、組換えＤＮＡベクターを用いて、所望のエフェクター機能（例えば、ヒト免疫グロブリンの不変領域）を有する抗体を生成する細胞株を形質移入するが、この場合、組換えベクターに含まれる置換遺伝子は、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体の領域、および抗体生成細胞内のターゲティングされた遺伝子改変の全部または一部をエンコードしうる。いずれかの実施形態において、可変または不変領域の一部のみが置換される場合、結果として生じるキメラ抗体は同じ抗原を規定し、かつ／または、さらに変化され、または改善される同じエフェクター機能を有することができ、そのキメラ抗体は、形質移入された抗体生成細胞株によって、大きな抗原特異性、大きな親和性結合定数、エフェクター機能の増大、または分泌および生成の増大等を示しうる。
【０１４０】
実施される実施形態に関係なく、（選択可能なマーカーによる）合成ＤＮＡの選択、キメラ抗体生成のためのスクリーニング、および細胞クローニングの方法を用いてキメラ抗体を生成する細胞のクローンを得ることができる。
【０１４１】
したがって、モノクローナル抗体の改変をエンコードするＤＮＡの小片をＢ細胞またはハイブリドーマ細胞株内の発現免疫グロブリン遺伝子の部位に直接ターゲティングすることができる。特定の改変のＤＮＡ作成物をモノクローナル細胞株またはハイブリドーマのタンパク質生成物に変化させることができるとみられる。キメラ抗体の発現レベルは、その遺伝子がランダム位置ではなく、その自然な染色体の位置にある場合、高くなるはずである。キメラ（ヒト化）抗体を調製するための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号に見ることができる。
【０１４２】
ｉｉ）ヒト抗体
別の実施形態において、本発明は完全ヒト抗ＭＵＣ−１抗体を提供する。ヒト抗体は全体的に特徴的にヒトポリペプチド配列からなる。本発明のヒト抗ＭＵＣ−１中和抗体は、幅広い種類の方法を用いることにおいて得ることができる（例えば、ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら、米国特許第５，００１，０６５を参照、見本用）。
【０１４３】
１つの実施形態において、完全ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を用いて生成される。しかし、マウス遺伝子ライブラリーを利用する代わりに、ヒト遺伝子ライブラリーが用いられる。完全ヒト遺伝子ライブラリーを生成する方法は当業者には公知である（例えば、ボーン（Ｖａｕｇｈｎ）ら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）、ｐ．３０９〜３１４、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら（１９９１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、ｐ．５８１〜５９７、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照）。
【０１４４】
ヒトファージ−ディスプレイライブラリーは、本願中に記載された抗ＭＵＣ−１抗体と同じエピトープを結合する（例えば、交差反応性である）メンバーのついてスクリーニングされる。
【０１４５】
別の方法においては、ヒト抗体はトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法を用いて生成される。トリオーマ法によってヒト抗体を生成するための一般的な方法は、オストベルク（Ｏｓｔｂｅｒｇ）ら（１９８３年）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２、ｐ．３６１〜３５７、オストベルク、米国特許第４，６３４，６６４号、およびエンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎ）ら、米国特許第４，６３４，６６６号によって記載されている。この方法によって得られる抗体生成細胞株は、それらが３つの細胞、すなわち２つはヒト、１つはマウス由来であるためトリオーマと呼ばれる。トリオーマは、ヒト細胞から製造される通常のハイブリドーマよりも安定な抗体を生成することがわかっている。
【０１４６】
トリオーマ細胞の調製には、マウス骨髄腫細胞株の非免疫化ヒト末梢Ｂリンパ球との初期融合が必要である。この融合によりヒト染色体とマウス染色体を含有する異種間ハイブリッド細胞が生成される（例えば、エンゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎ）、上記を参照）。抗体分泌能を失った異種間細胞を選択する。好ましくは、８−アザグアニンに対して耐性である異種間細胞を選択する。このような細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）またはアザセリンヒポキサチン（ＡＨ）培地を増殖することが不可能である。
【０１４７】
抗体分泌能は、さらに異種間細胞とＭＵＣ−１抗原に対して免疫化したＢリンパ球との融合によって与えられる。Ｂリンパ球はヒト供与体の脾、血液、またはリンパ節から得られる。特異的抗原またはエピトープに対する抗体が望ましい（例えば、本願中に記載された抗体によって結合されたエピトープ）場合は、その抗原またはそのエピトープを免疫原として用いることが好ましい。あるいは、Ｂリンパ球は非免疫化個体から得られ、試験管内の所望の抗原で刺激される。
【０１４８】
上記の方法の１つによって調製された免疫化Ｂリンパ球を公知を方法によって異種間ハイブリッド細胞と融合する。例えば、細胞をＭＷ１０００〜４０００の４０〜５０％ポリエチレングリコールで約３７℃下に約５〜１０分間処理する。細胞を融合混合物から分離し、所望のハイブリッドに対して選択的な培地中で増殖する。異種間ハイブリッド細胞が８−アザグアニンに対して耐性である場合、ＨＡＴまたはＡＨ培地での細胞の連続的継代によって不死化したトリオーマ細胞を選択することが都合よい。他の選択的方法は、もちろん、融合において用いられる細胞の性質によって可能である。必要な結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、本願中で例示された抗体によって結合されるエピトープへの結合能についてトリオーマ細胞を分析することによって同定される。所望の特異性を有するヒト抗体を生成するトリオーマは、限界希釈法によってサブクローン化され、培養培地の試験管内で増殖し、または選択された宿主動物に注入され、生体内で増殖する。
【０１４９】
トリオーマは一般に安定ではあるが、きわめて高いレベルで抗体を生成することはない。発現レベルは、抗体遺伝子をトリオーマから１つまたは複数の発現ベクターにクローン化し、そのベクターを組換えまたはヒト化免疫グロブリンの発現に一般的に用いられる細胞株などの細胞株に形質転換することによって増大させることができる。抗体の収量を増大させるのと同様に、この方法は、ヒト成分を有することがなく、したがって、ヒト細胞株に対して必要とされる特に広範囲なウイルス検査にかける必要がない細胞株から免疫グロブリンが得られるという追加の利点を提供する。
【０１５０】
トリオーマ細胞株によって分泌される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をエンコードする遺伝子は、当業界で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれに限定されない方法に従いクローン化される（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８９年；ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、分子クローニング法ガイド、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、アカデミックプレス株式会社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、（カリフォルニア州、サンディエゴ）、１９８７年；コー（Ｃｏ）ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、ｐ．１１４９を参照）。例えば、重鎖および軽鎖をエンコードする遺伝子は、トリオーマのＲＮＡの逆転写によって生成されるトリオーマのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからクローン化される。クローニングは、クローン化される遺伝子、または遺伝子の断片をフランキングまたは重複する配列とハイブリッド形成するＰＣＲプライマーの使用を含む従来の方法によって行われる。
【０１５１】
通常、組換え作成物は、トリオーマ細胞株によって発現される免疫グロブリンの完全免疫グロブリン重鎖および／または完全ヒト免疫グロブリン軽鎖をエンコードするＤＮＡ断片を含む。あるいは、一次抗体遺伝子の一部分のみをエンコードするＤＮＡ断片が生成されるが、その部分は結合活性および／またはエフェクター活性を有する。他の組換え作成物は、他の免疫グロブリン遺伝子の断片、特に他のヒト不変領域配列の断片（重および／または軽鎖）に融合したトリオーマ細胞株の免疫グロブリン遺伝子を含有する。ヒト不変領域配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）ら（１９８７年）、免疫学的関心のタンパク質の配列（米保健社会福祉省）に記載されたものを含むがこれに限定されない種々の情報源から選択することができる。
【０１５２】
ｉｉｉ）二量体（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）
一部の実施形態においては、本発明は、本願中に記載されたＶH およびＶL ドメインの１つまたは複数を含む二量体を意図している。「二量体」（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）なる用語は通常、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントを指す。そのフラグメントは通常、同じポリペプチド鎖における軽鎖可変ドメイン（ＶL ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH ）を含む（ＶH −ＶL ）。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは強制的に別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を生成する。二量体については、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１、およびホリガー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ）ら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、ｐ．６４４４〜６４４８により完全に記載されている。
【０１５３】
ＩＩＩ．ライブラーおよびベクター
別の実施形態においては、本発明は本願中に記載された方法を実施するためのライブラリーおよびベクターを提供する。ライブラーには、二量体ライブラリーを含めて、より好ましくは多価単鎖抗体ライブラリー（例えば、ｓｃＦｖ）、（例えば、ファージによって発現される）を含めて、一価または多価のライブラリーを含む。
【０１５４】
ライブラリーは多くの形態をとりうる。したがって、１つの実施形態におて、ライブラリーはファージディスプレイライブラリーのメンバーを含有する細胞のコレクションであるが、別の実施形態において、ライブラリーは単離されたファージのコレクションからなり、さらに別の実施形態では、ライブラリーは多価ファージディスプレイライブラリーをエンコードする核酸のライブラリーからなる。一部の実施形態では、核酸は抗体をエンコードし、ファージベクターへのサブクローン化の用意が整ったファージミドベクターでありうるとともに、核酸はすでにサブクローン化された抗体コード化核酸を保有するファージミドのコレクションでありうる。
【０１５５】
ＩＶ）医薬組成物
本発明の抗ＭＵＣ−１抗体、および／またはキレート、および／またはキメラ分子は、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、経口、または局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば腫瘍部位への注入）、エアロゾル投与、または経皮投与のために、予防のために、しかし原則的には治療的処置のために有用である。医薬組成物は、投与の方法によって種々の単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位剤形としては散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、およびｌｏｚｅｎｇ剤が挙げられる。本発明の融合タンパク質および医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護しなければならない。これは通常、タンパク質を組成物と複合し、酸および酵素加水分解に対する耐性を与えることによって、またはリポソームなど適切に耐性の担体でタンパク質をパッケージングすることによって行われる。消化からタンパク質を保護する手段は当業界で公知である。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は、静脈内投与または体腔や臓器管腔への投与など非経口投与に特に有用である。投与のための組成物は一般的に薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解されたキメラ分子の溶液を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などを用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、公知の滅菌法によって無菌化することができる。この組成物は、ｐＨ調節や緩衝剤、毒性調節剤など生理的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤におけるキメラ分子の濃度は大きく変動しうるとともに、選択された投与の特定様態および患者の要求に従って、主に液量、粘度、体重などに基づき選択されることになる。
【０１５７】
したがって、静脈内投与のための通常の医薬組成物は、毎日患者１人当たり約０．１〜１０ｍｇとなろう。毎日患者１人当たり０．１ないし約１００ｍｇまでの投与量を、特に薬剤を隔離した部位に、血流中ではなく、体腔や臓器管腔などへ投与する場合に用いることができる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者には公知であろうが、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１５版、マック出版会社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ペンシルベニア州、イーストン）（１９８０年）により詳しく記載されている。
【０１５８】
本発明の融合タンパク質またはそれらの反応混液（すなわち、他のタンパク質との）を含有する組成物は、治療的処置のために投与することができる。治療的用途において、組成物は疾患、例えば、癌に罹患した患者に対し、治癒し、または少なくとも部分的に疾患およびその合併症を抑止するのに十分な量で投与される。これを達成するために十分な量を「治療に有効な用量」と規定する。この用途に有効な量は、疾患の重傷度および患者の健康の一般状態によって変動することになる。
【０１５９】
組成物の１回または複数回の投与を、患者によって要求され、許容される投与量および頻度に応じて行うことができる。どの場合でも、組成物は患者を有効に治療するために本発明のタンパク質の十分な量を供給するべきである。
【０１６０】
激しく血管化されず、または血流中に存在する巨大分子の侵入を減少または阻止する緊密な接合および／または活性輸送メカニズムによって結合された細胞によって保護される一部の領域があることを当業者によって理解されるであろう。したがって、例えば、神経膠腫、または他の脳癌を治療する治療薬の全身投与は、巨大分子のくも膜下腔への侵入に抵抗する血液脳関門によって限定される。
【０１６１】
当業者であれば、このような場合、本発明の治療組成物を腫瘍部位に直接投与できることを理解するであろう。したがって、例えば、脳腫瘍（例えば、神経膠腫）は、治療組成物を腫瘍部位に直接投与することによって（例えば、外科的に植込まれるカテーテルによって）治療することができる。カテーテルを通じた流体送達が加圧される場合、小分子（例えば、本発明の治療分子）は通常、腫瘍縁を２ないし３センチメートル超えて浸潤することになる。
【０１６２】
あるいは、治療組成物を徐放製剤でターゲット部位に配置することもできる。このような製剤としては、例えば、治療組成物を含浸させた生体適合性スポンジまたは他の不活性あるいは吸収性の基質材料、ゆっくり溶解する徐放カプセル剤またはマイクロカプセル剤などが挙げられる。
【０１６３】
通常、カテーテルまたは徐放製剤は、外科的処置の一環として腫瘍部位に配置される。したがって、例えば、大きな腫瘍塊が外科的に除去される場合、灌流カテーテルまたは徐放製剤を補助療法として腫瘍部位に据え付けることができる。もちろん、腫瘍塊の外科的除去は、望ましくなく、必要ではなく、または不可能でありうるが、その場合、本発明の治療組成物の送達は一次治療様式を含みうる。
【０１６４】
ＶＩＩＩ．キット
放射性、または他のエフェクターが診断薬および／または治療薬として用いられる場合、使用される放射能標識化合物の不十分な有効期間および／または放射性核種の短い半減期のため、使用者の自由になって使用準備ができている組成物にすることは不可能である場合が多い。このような場合、使用者は、臨床病院、診療室、または実験室において放射性核種との標識反応を行うことができる。次いで、この目的のために、または他の目的のために、種々の反応成分をいわゆる「キット」の形で使用者に提供することができる。このキットは、所望の反応を行うために必要な操作ができる限り簡単であり、使用者の自由になる設備を用いることによって、使用者がキットから所望の組成物を調製できるようにデザインされていることが好ましい。したがって、本発明は、本発明による組成物を調製するためのキットにも関する。
【０１６５】
本発明によるキットは、本発明の抗ＭＵＣ−１抗体を含むことが好ましい。抗体には、望まれる場合は、不活性な薬学的に許容される担体および／または製剤の形で供給することができ、かつ／または補充剤が添加される。また、キットは任意選択で、適切な放射性核種（または他の活性剤）の塩またはキレートの溶液、および（ｉｉｉ）キットに存在する成分を投与し、かつ／または反応させるための処方とともに使用説明書を含む。
【０１６６】
使用者に供給されるキットは、使用説明書とともに、上記規定の成分を含むこともできるが、その溶液の有効期間が限定されている、上記の下（ｉｉ）規定の放射性核種の塩またはキレートの溶液は、別々に使用者の自由になりうる。
【０１６７】
キットは任意選択で、還元剤および／または、望まれる場合は、キレート、および／または組成物の使用説明書および／または所望の製品を形成するキットの成分を反応させるための処方を追加的に含むことができる。望まれる場合は、キットの成分は、それらが適合性であるという条件で、組合せてもよい。
【０１６８】
一部の実施形態において、抗ＭＵＣ−１抗体との複合物形成反応は、中性培地で成分を組合せ、それらを反応させることによって単純に生成することができる。そのために、エフェクターをキレートの形で抗ＭＵＣ−１抗体に提示することができる。
【０１６９】
キット成分が医薬品投与のための成分として（例えば、注射液として）用いられる場合、それらは無菌でなければならない。その成分が乾燥状態で提供される場合、使用者は溶媒として無菌生理食塩水溶液を用いることが好ましい。望まれる場合は、成分は適切な安定剤、例えば、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、またはこれらの酸の塩で従来のやり方で安定化することができ、または他の補助剤、例えば、ブドウ糖、乳糖、マニトールなどの充填剤を含むことができる。
【０１７０】
存在する場合、説明資料は通常、書面または印刷資料を含むが、それらに限定されない。このような説明書を保管し、それらを最終使用者に連絡することが可能なメディアは、本発明によって意図されている。このようなメディアとしては、電子記憶メディア（例えば、磁気ディスク類、テープ類、カートリッジ類、チップ類）、光学メディア（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）、などが挙げられるが、これらに限定されない。このようなメディアは、かかる説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスも含みうる。
【実施例１】
【０１７１】
以下の実施例は、請求された発明を限定するためにではなく、例示のために提供されている。
【０１７２】
実施例１
ターゲット療法のための抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖの前臨床開発
ＭＵＣ−１ムチンは、多くの悪性上皮癌で過剰発現し、過小または異常にグリコシル化し、癌の診断薬や治療薬のための絶好の抗原となる大きな複合糖タンパク質である。転移性乳腺癌へのターゲット放射線を送達するために用いられるＭＵＣ−１ムチンに対する放射標識モノクローナル抗体は、抗体分子のサイズが大きく（１５０ｋＤ）、これにより腫瘍への細胞毒性放射線の送達が遅延し、循環および正常臓器における放射能を延長するため、中程度の成功しか経験されていない。これらの実験では、腫瘍に対してより有効にターゲット放射線を送達するために用いられる分子の構成部分として用いるために適した特性を有する、いくつかの抗ＭＵＣ−１単鎖フラグメメント抗体（免疫グロブリン分子のランダム結合されたＶH およびＶL 抗原結合領域）が同定された。７つの抗ＭＵＣ−１単鎖Ｆｖ抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を、合成ペプチドコア直列型反復を結合し、ＭＵＣ−１陽性ＭＣＦ−７乳腺癌細胞への最も高い特異的結合を示すＥＬＩＳＡ分析によってファージディスプレイライブラリーから選択した。その後の分析では、７つのｓｃＦｖのうち５つが予想されたｓｃＦｖ配列（ＶH ￥Ｇｌｙ4(Ｓｅｒ)3リンカー（配列表の配列番号： ）￥ＶL ）を有することが示されたが、ｓｃＦｖの１つはＶH 抗原結合領域のみを含み、別の１つはＶL 結合領域のみを含んでいた。競合ＥＬＩＳＡ分析では、ｓｃＦｖの４つが１ｎＭの競合で少なくとも５０％阻害されることが示された；Ａ５（８９％）、Ｃ４（９４％）、３Ｄ（５０％）、および１２Ｅ（５０％）。競合ＥＬＩＳＡの回帰分析では、全ｓｃＦｖの親和性（Ｋa ）が１．５×１０8 よりも大きいことが示された；Ｃ４（Ｋa ＝８．２×１０8)、Ａ５（Ｋa ＝７．１×１０8)、３Ｄ（Ｋa ＝２．２×１０8)、および１２Ｅ（Ｋa ＝１．７×１０8)。１２Ｅ  ｓｃＦｖの 125Ｉ標識二価および一価形態のスキャッチャード分析では、１２Ｅ  ｓｃＦｖの二価形態は回帰分析由来と同一のＫa を示したが、１２Ｅ  ｓｃＦｖの単量体形態はＫa ＝８．６±１．１×１０7 Ｍ-1であることが示された。免疫病理学的分析では、１２Ｅ  ｓｃＦｖがＭＣＦ−７細胞と強く反応性であることが示された。分子モデリングは、１２Ｅ  ｓｃＦｖのＭＦＥ−２３  ｓｃＦｖの結晶構造との十分な相同性を示した。これらの抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖは、癌の検出および治療のための新しい薬剤における抗原結合構成部分として用いられている。
【０１７３】
材料と方法
ＭＵＣ−１抗原陽性ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ−７細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州、マナッサス））を５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で７５％の集密に増殖させ、収集した。膜フラグメントを含有するＭＣＦ−７ライセートを以前に記載されたプロトコル（ゴルガ（Ｇｏｒｇａ）ら（１９８７年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、ｐ．１６０８７〜１６０９４）に基づくＥＬＩＳＡ分析のために得た。ＭＣＦ−７細胞膜ライセートの総タンパク量を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質検査試薬キット（ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（イリノイ州、ロックフォード））を用いて測定した。ラジ（Ｒａｊｉ）細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。
【０１７４】
抗ＭＵＣ−１ライブラーの作成
手短に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ハーラン・スプレーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（インディアナ州、インディアナポリス）に対し、ＭＵＣ−１陽性ＭＣＦ−７／ＨＢＴ３４７７（１０：１）細胞膜ライセートを腹腔内注射した後、３週間の間隔をおいてＫＬＨ−ＭＵＣ−１合成ペプチドの免疫化を３回（皮内）行った。免疫化後１０日に収集された血清ＩｇＧレベルをＭＣＦ−７細胞膜ライセートに対するＥＬＳＡによって試験した。免疫化マウスの脾から得られたＲＮＡを除去し、ｍＲＮＡ精製キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｍＲＮＡを精製し；ｃＤＮＡ合成、ＶH およびＶL 遺伝子増幅、ｓｃＦｖアセンブリー、およびｐＣＡＮＴＡＢ  ５ＥへのライゲーションをＲＰＡＳマウスｓｃＦｖモジュール（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて行った。抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖを含有するｐＣＡＮＴＡＢ  ５ＥベクターをＴＧ１大腸菌に電気穿孔した。ＳｃＦｖはＴＧ１大腸菌中に発現し、１２Ｅ  ｓｃＦｖもＨＢ２１５１大腸菌中に発現した。
【０１７５】
抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖの生成
ＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡ分析用に細胞培養プレートでを生成した。２．０％ブドウ糖およびアンピシリン１００Ｆｇ／ｍｌを含有する２ｘＹＴ培地中、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃下に一夜、ｓｃＦｖを増殖させた。培地からブドウ糖を除去し、１ｍＭのイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加することによって可溶性ｓｃＦｖを生成した。２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃下に一夜、ｓｃＦｖ発現を誘導した。（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ペンシルバニア州、ピッツバーク）（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。スキャッチャード分析および免疫化学分析用の可溶性抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖを１リットルの振盪フラスコ中に生成した。凍結グリセロールストックから得られたｓｃＦｖを、２％ブドウ糖およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＴＹ培地に接種した。培養株を３７℃下に８時間増殖させ、２％ブドウ糖およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＴＹ培地を用いて細菌を１０００倍に希釈し、さらに１６時間増殖させた。ＧＳＡローターを備えたＳｏｒｖａｌ遠心分離機を用いて、４℃下に１５分間、６３００ｇで遠心分離することによって細菌をペレット化した。１ｍＭのＩＰＴＧおよびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＴＹ培地中で、３０℃下に４．５時間、可溶性ｓｃＦｖ生成を誘導した。細菌を遠心分離よってペレット化し、２０℃下に保存した。
【０１７６】
抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖ  ＤＮＡ配列の分析
キアフィルター（Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ）プラスミド抽出キットおよびプロトコル（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州、バレンシア））を用いて抗ＭＵＣ−１プラスミドを抽出した。ｐＣＡＮＴＡＢ配列決定プライマーＳ１およびＳ６をそれぞれ用いた（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＡＢＩプリズム７ＢｉｇＤｙｅTMターミネーターサイクル配列決定キット（ＰＥアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（カリフォルニア州、フォスターシティ）を用いることによって、抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の順方向および逆方向のヌクレオチド配列を測定した。
【０１７７】
親和性の精製
ＳｃＦｖをバクテリアのペリプラズムから精製し、スキャッチャード分析および免疫化学分析において用いた。ペレット化細胞を−２０℃のフリーザーから取出し、わずかに温めた。ＴＥＳ［０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、  ０．５Ｍショ糖］２０ｍｌ中に細胞を懸濁し、０．２ｘＴＥＳ  ３３ｍｌを添加し、細胞を適度に攪拌しながら冷蔵庫で３０分間インキュベートした。以前に記載したように、細胞を遠心分離し；０．４５μｍのフィルターを用いて上清をろ過した。ＲＰＡＳ精製モジュール（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた親和性カラムクロマトグラフィによって上清から抗ＭＵＣ−１を精製した。
【０１７８】
ＥＬＩＳＡ分析
ＥＬＩＳＡ分析を３回繰り返して行った。インキュベーションを３７℃下に１．５時間行った。各インキュベーションの後、プレートを０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）［０．０１  リン酸緩衝剤、０．００２７  Ｍ塩化カリウム、および０．１３７  Ｍ塩化ナトリウム］ｐＨ７．４で洗浄した後、ＰＢＳのみで洗浄した。Ｐｒｏ−ＢｉｎｄTMＥＬＩＳＡアッセイプレート（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）（ニュージャージー州、フランクリンレークス）を室温下に一夜、１５ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中のＭＣＦ−７細胞ライセート（２００μｇ／ウェル）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳでリンスし、３．０％乾燥無脂肪牛乳を含有するＰＢＳで室温下に１時間、遮断した。１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として用いた。Ｔｗｅｅｎ２０（１０μＬ）をＰｒｏ−Ｂｉｎｄプレートに添加した後、抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ（９０μＬ）を添加した。プレートを洗浄し、３％無脂肪牛乳溶液中で２５０倍に希釈した抗Ｅ−タグ１００μＬと反応させた。プレートを洗浄し、０．３％Ｈ2 Ｏ2 を含有する２，２’−アミノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州、セントルイス）を用いて展開した。Ａ405 ｎＭの吸光度でマイクロプレートリーダー（ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）（バージニア州、シャンティリー）を用いてプレートを読んだ。
【０１７９】
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＳＡ分析を各濃度で３回繰り返して行った。インキュベーションを３７℃下に１．５時間行った。各インキュベーションの後、プレートを０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した後、ＰＢＳのみで洗浄した。Ｐｒｏ−ＢｉｎｄTMＥＬＩＳＡアッセイプレート（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）（ニュージャージー州、フランクリンレークス）を室温下に一夜、１５ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中のＭＣＦ−７細胞ライセート（２００μｇ／ウェル）でコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳでリンスし、３．０％乾燥無脂肪牛乳を含有するＰＢＳで室温下に１時間、遮断した。１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として用いた。別々のプレートにおいて、１０％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する可溶性ｓｃＦｖを調製し、冷蔵庫で１５分間保存した。競合として用いたＭＣＦ−７細胞ライセートを３％無脂肪牛乳中に希釈し、以下の濃度、１００ｎＭ、１０ｎＭ、および１ｎＭを得た。可溶性ｓｃＦｖをＥＬＩＳＡプレートに移し、競合でインキュベートした。３％無脂肪牛乳溶液中で２５０倍に希釈した抗Ｅ−タグ１００μＬをウェルに添加し、プレートをインキュベートした。０．３％Ｈ2 Ｏ2 を含有する２，２’−アミノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州、セントルイス）を用いてプレートを展開した。Ａ405 ｎＭの吸光度でマイクロプレートリーダー（ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）（バージニア州、シャンティリー）を用いてプレートを読んだ。データは３つの別個の試験から生成し、分析した。
【０１８０】
ＳｃＦｖ結合親和性および統計的分析
試験は共分散分析を用いて行った。実験間の勾配の統計的差は有意ではなかったが、しかしながら、切片の実験間には統計的に有意差が認められた。
【０１８１】
125Ｉ−抗ＭＵＣ−１１２Ｅｓｃｆｖ
クロラミンＴ標識法（シール（Ｓｃｈｉｅｒ）ら（１９９５年）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１、ｐ．６３〜７１）を用いて抗ＭＵＣ−１  １２ＥｓｃＦｖをヨウ素化した。 125Ｉ−抗ＭＵＣ−１  １２Ｅ  ｓｃＦｖの特異的活性は０．４６ｍＣｉ／ｍｇであった。
【０１８２】
高性能液体クロマトグラフィを行い、 125Ｉ−１２Ｅ  ｓｃＦｖ２００μｌをＳＥＣ−２０００カラム（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、画分０．５ｍｌを収集することによって、 125Ｉ−抗ＭＵＣ−１  １２Ｅ  ｓｃＦｖを精製した。 125Ｉ−１２Ｅ  ｓｃＦｖは４２ｋＤおよび２５ｋＤに対応し、スキャッチャード分析によって分析した。
【０１８３】
スキャッチャード分析
４２ｋＤおよび２５ｋＤの分子の 125Ｉ−１２Ｅ  ｓｃＦｖに競合する能力を以下のように分析した。ＰＢＳ中５％ＢＳＡを用いて、分析溶液を３部、調製した。 125Ｉ−１２Ｅ（０．１μｇ）を異なる量の非標識免疫抱合体（０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、および５．０μｇ）に添加し；次いでＭＣＦ−７細胞（５．０×１０5 細胞）を０．１５ｍｌの最終容積に添加した。溶液を静かにボルテックスし、室温下に６０分間インキュベートした。溶液を遠心分離した。ペレット化細胞から上清を注意深く分離し、クリーンバイアルに移した。ＬＫＢ  １２８２Ｃｏｍｐｕｇａｍｍａ  ＣＳウェルカウンタ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、上清およびペレットをカウントした。
【０１８４】
周辺質ｓｃＦｖの生成と精製
可溶性抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖを１リットルの振盪フラスコ中で生成した。凍結グリセロールストックから得られたｓｃＦｖを、２％ブドウ糖およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＴＹ培地に接種した。培養株を３７℃下に８時間増殖させ、２％ブドウ糖およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ｘＴＹ培地を用いて細菌を１０００倍に希釈し、さらに１６時間増殖させた。以前に記載したように、遠心分離によって細菌をペレット化した。可溶性ｓｃＦｖ生成を誘導するために、１ｍＭのＩＰＴＧおよびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１リットルの２ｘＴＹ培地中に細菌を懸濁した。ｓｃＦｖを誘導し、３０℃下に４．５時間、可溶性ｓｃＦｖを生成した。細菌を遠心分離によってペレット化した。ＴＥＳ［０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ  ８．０）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、  ０．５Ｍショ糖］２０ｍｌ中にペレット化細胞を懸濁し、０．２ｘＴＥＳ  ３３ｍｌを添加し、細胞を適度に攪拌しながら冷蔵庫で３０分間インキュベートした。以前に記載したように、細胞を遠心分離し；０．４５μｍのフィルターを用いて上清をろ過した。ＲＰＡＳ精製モジュール（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた親和性カラムクロマトグラフィによって上清から抗ＭＵＣ−１を精製した。
【０１８５】
分子モデリング
タンパク質データバック（ＰＤＢ）には、クローン１２Ｅ配列と類似している実験的に決定された３次元構造を有するいくつかの単鎖Ｆｖ作成物が存在する。これらから、最も接近した配列相同性（７３％同一残基）および可変重鎖および軽鎖ドメインを接続する同一のリンカー配列を有したため、マウス単鎖Ｆｖ抗体ＭＦＥ−２３（ＰＤＢコード：１ＱＯＫ）の構造をテンプレートとして選択した。クローン１２Ｅの保存構造領域の高次構造は構造的テンプレートから直接割り当てられた。
【０１８６】
抗原結合の原因となる６つの超可変ループ（Ｈ１〜Ｈ３およびＬ１〜Ｌ３）を、以下のように、ＰＤＢからの追加の構造的情報を用いてモデリングした。まず、１２Ｅにおけるこれら６つのループ領域と類似した高い配列を有するループ構造についてＰＤＢを検索した。超可変ループの４つ（Ｈ２、Ｌ１〜Ｌ３）が、最初のテンプレート（ＭＦＥ−２３）と１２Ｅとの配列類似性によって最も接近した一連の構造の両方における同様の高次構造を有することがわかった。ＭＦＥ−２３におけるループの２つ（Ｈ１およびＨ３）の構造は、１２Ｅと配列が最も類似した対応するループを比較することによって確認されたコンセンサス構造とは異なっていた。その２つの場合、コンセンサス構造を用いて、対応するクローン１２Ｅ  Ｈ１およびＨ３ループをモデリングした。
【０１８７】
クローン３Ｄの可変重鎖ドメインの構造は、クローン１２Ｅに適用された同じ方法を用いて得られた。クローン３Ｄ  Ｃ末端領域の二次構造の評価は、ＰｓｉＰｒｅｄを用いて行った。モデル構築はモデラー（ＭＯＤＥＬＬＥＲ）を用いて行った後、プロチェック（Ｐｒｏｃｈｅｋ）によるモデル品質評価を行った。
【０１８８】
免疫化学
抗ＭＵＣ−１精製ｓｃＦｖをＭＵＣ−１陽性ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＴＣ）およびラジ（Ｒａｊｉ）Ｂ細胞リンパ腫細胞と反応させた。細胞を氷冷アセトン中に５分間、固定した。細胞をＰＢＳ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で洗浄した。特に指定のない限り、すべてのインキュベーションを加湿チャンバーで３７℃下に１．５時間行った。各インキュベーション後、スライドをＰＢＳ中でそれぞれ３分間、３回洗浄した。１０００倍希釈で抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ、Ｌｙｍ−１ＭｏＡｂ（陰性対照）、または、ＴＲＰアミノ酸配列を認識する、１０００倍希釈で抗ＢｒＥ−３ＭｏＡｂ（陽性対照）によりスライドをインキュベートした。２５０倍希釈で抗Ｅ−タグＭｏＡｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または１：１０００倍希釈で抗マウスＦｃ特異的ＨＲＰ抱合ＩｇＧＭｏＡｂ（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））のいずれかによってスライドをインキュベートした。ＤＡＢ［３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド］（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））により室温下に３０分間、スライドをインキュベートした。ハリスへマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて対比染色した。水が澄んだ状態になるまでスライドに水道水をかけた。スライドを区別溶液［７０％エタノール中３０ｍＭ  ＨＣＬ］に浸漬した後、希アルカリ溶液（１．２５ｍＭ  ＮａＯＨ）中で１分間、インキュベートした。スライドを脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウントした。プロビス（Ｐｒｏｖｉｓ）オリンパス顕微鏡を用いて写真を得た。
【０１８９】
結果：
ＤＮＡ配列分析
自動化ＤＮＡ配列決定により、分析された７つのｓｃＦｖのうち５つが抗原結合部位を形成するＶH とＶL の両方の配列を含むが、３Ｄ  ｓｃＦｖはＶH 鎖配列のみを含み、２Ｂ  ｓｃＦｖはＶL のみを含むことが明らかにされた（例えば、配列表の配列番号Ｓ：１〜８、表１、および配列リストを参照）。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡ分析。
７つのｓｃＦｖは、ＭＣＦ−７乳腺癌の表面上に発現したＭＵＣ−１抗原と反応性であることが確認された。ＶL 免疫グロブリン鎖領域のみを含む２Ｂ  ｓｃＦｖはあまり反応性ではなかったが、ＶH 免疫グロブリン鎖領域を含む３Ｄ  ｓｃＦｖはＭＵＣ−１陽性ＭＣＦ−７細胞ときわめて反応性であった（表３、配列リスト）（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら（２０００年）、Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、５８、ｐ．２５５〜２６６）。
【０１９１】
競合ＥＬＩＳＡ分析。
ＭＣＦ−７細胞膜上に発現したＭＵＣ−１抗原の量を増大したインキュベーションにより、７つのｓｃＦｖのうち４つの継代のプレーティングされたＭＵＣ−１抗原図１への結合が阻害された。これらのｓｃＦｖは実質的に（少なくとも５０％）１ｎＭの競合のみで阻害され；阻害の適度の増大は１０ｎｍのＭＵＣ−１競合で生じた。４つのｓｃＦｖは、１ｎｍの競合でＭＵＣ−１とのその後の結合から以下のように阻害された：Ａ５（８９％）、Ｃ４（９４％）、３Ｄ（５０％）、および１２Ｅ（５０％）。ＥＬＩＳＡデータの線形回帰分析を用いて、結合親和性を計算した。分析用に選択した４つのｓｃＦｖはすべて、１．５×１０8 以上のＫa を示した。ＳｃＦｖ  Ｃ４（Ｋa ＝８．２×１０8)およびＡ５は同様の親和性（Ｋa ＝７．１×１０8)および１２Ｅ（Ｋa ＝１．７×１０8)について計算された親和性はわずかに低かった。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡによる親和性の分析。
この分析は、３部で行われた３つの別々の実験から編集したデータから構成された。全体的に、１２Ｅ  ｓｃＦｖのモデルは実質的に有意な切片（ｐ＜０．００１）および勾配（ｐ＝０．０４）を示している。切片（ｐ＝０．１）の実験間の差が認められる。親和性推定値は実験間で１．１×１０8 〜１．５×１０7 の範囲である。実験１のみが自然に統計的に有意であった。
【０１９３】
３Ｄ  ｓｃＦｖの分析は、１２Ｅから得られたものよりも低い切片を示したが、統計的に有意な切片（ｐ＜０．００１）および勾配（ｐ＝０．０４）を示した。実験間の差は示されなかった。親和性は１．２〜１．５×１０8 の範囲であった。自然に個別の実験で統計的に有意なものはなかった。
【０１９４】
Ｃ４  ｓｃＦｖの分析は、切片（ｐ＝０．１）の実験的差を示した。切片の全体的な推定値は統計的に有意（ｐ＝０．０１）であるが、１２Ｅまたは３Ｄについてほど強くはない。勾配はわずかに有意（ｐ＝０．０９）であった。個別の実験について、最初の１は勾配に対する正の推定値を示し、親和性評価を行うことはできなかった。第２の実験は全体的にわずかに統計的に有意であった（ｐ＝０．０５４）。親和性推定値は２．３×１０8 であった。第３の実験も統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．４３）。親和性推定値１．０１×１０9 。親和性は、切片が０に接近し、値を５０％減少させる変化は起こらないため高いと思われる。
【０１９５】
Ａ５  ｓｃＦｖの分析は、モデルが統計的に有意ではなかったことを示したが、自然に個別の実験のうち統計的に有意であるものはない。切片はきわめて小さく、親和性の決定に疑問の余地を残した。しかし、実験３において、ふたたび、勾配の推定値は正である。
【０１９６】
125Ｉ−抗ＭＵＣ−１  １２Ｅ  ｓｃＦｖのスキャッチャード分析
125Ｉ−抗ＭＵＣ−１  １２Ｅ  ｓｃＦｖを用いて、このモデルの以前の分析と比較した結合親和性を確認した。ＨＰＬＣによって精製された２つの画分を分析し、４２ｋＤ画分は（二価）抗ＭＵＣ−１  １２ＥｓｃＦＶの二量体（ｄａｂｏｄｙ）とみなされ、２５ｋＤ画分は一価抗ＭＵＣ−１  １２ＥｓｃＦＶを表した。４２ｋＤ画分のスキャッチャード分析は、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって得られたデータからの線形回帰分析によって計算された親和性（Ｋa ＝１．７±０．２４×１０8 Ｍ-1）と見事に一致した。２５ｋＤ画分は、スキャッチャード分析によって、８．６±１．１×１０7 Ｍ-1を示した。
【０１９７】
分子モデル
クローン１２Ｅの３次元モデル。このモデルは、可変重鎖および可変軽鎖ドメインに対応する２つの構造的ドメインを含む。これらのドメイン間のリンカーは、単鎖Ｆv 抗体ＭＦＥ−２３の結晶学的試験により、このリンカーが屈曲性であり、独自の高次構造を有さない可能性がきわめて高いことが示されるため、明確にモデリングされなかった。ＶH およびＶL ドメインの構造を超えて拡大するクローン１２ＥのＮおよびＣ末端の短い配列フラグメントも屈曲性でありことが予想され、したがってモデリングされなかった。クローン１２Ｅのモデリングされた構造は、６つの超可変抗原−結合ループのうち４つを含めてＭＦＥ−２３のものときわめて類似している。２つのループ（Ｈ１およびＨ３）はＭＦＥ−２３テンプレートとの顕著な差を示し、Ｈ３は最も異なる高次構造を有する。
【０１９８】
クローン３Ｄ配列は、クローン１２Ｅにおけるものと同一の可変重鎖領域およびＧｌｙ／Ｓｅｒが豊富なリンカーを含む。しかし、完全可変軽鎖ドメインの代わりに、リンカー後のクローン３Ｄの配列は、軽鎖ドメインのＮ末端およびＣ末端領域の短い部分配列の組成物である。この短い複合領域は、強固な高次構造を有することが予想されないＧｌｙ／Ｓｅｒが豊富なリンカーおよびＥ−タグによってフランキングされるため、この領域は安定な３次元構造を形成する可能性が低い。クローン３Ｄ配列が予測される二次構造は、せいぜいこの複合Ｃ末端領域がβ−ヘアピンを形成しうることを示している。
【０１９９】
１２Ｅと３Ｄクローンは両方ともほぼ同一の親和性を有する同じ抗原を結合する。同時に、Ｇｌｙ／Ｓｅｒが豊富なリンカー後のクローン３ＤのＣ末端部は、軽鎖抗原結合ループのいずれも含むことがなく、また、上述したように、安定な３次元構造を形成することも予想されない。構造的モデルからわかるように、Ｇｌｙ／Ｓｅｒが豊富なリンカーは、重鎖ドメインの超可変ループの反対側にあり、クローン３ＤのＣ末端部がこれらのループの抗原との相互作用に影響を及ぼす可能性を低くしている。したがって、これらのモデリングされた構造は、結合親和性の測定と併せて、両方のクローンにおいて、抗原結合が重鎖抗原結合ループ（Ｈ１〜Ｈ３）によってのみ（または主に）仲介されることを強く示している。これは、結晶における分子内パッキングに基づき、ＭＦＥ−２３について示された抗原結合モードと十分に一致する。
【０２００】
免疫化学
抗ＭＵＣ−１  １２Ｅ  ｓｃＦｖをＭＣＦ−７乳腺癌細胞上で発現したＭＵＣ−１膜抗原との反応性ついて評価した（図３Ａ）。１２Ｅ  ｓｃＦｖは、ＭＣＦ−７細胞との５０％をはるかに超える高い反応性結合を示したが、低量のＭＵＣ−１を生成することが知られているラジ（Ｒａｊｉ）Ｂ細胞リンパ腫細胞との反応性は最小であった（図３Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞の染色は、抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖで確認された細胞質および膜と異質性であった。確認された染色パターンは、乳腺癌のＭＵＣ−１染色に特有のものである（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら（２０００年）、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、５８：ｐ．２５５〜２６６；シューマッハー（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）とアダム（Ａｄａｍ）（１９９８年）、Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６：ｐ．１２７〜０１３４）。陽性対照として用いたＢｒＥ−３ＭｏＡｂは、ＭＣＦ−７細胞上で発現したＭＵＣ−１を認識し、陽性対照として用いたＬｙｍ−１ＭｏＡｂもラジ（Ｒａｊｉ）細胞リンパ腫細胞株上の異常なＨＬＡ−ＤＲ１０変異株抗原を認識する（図３Ｃおよび図３Ｄ）（ハウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）ら（１９９５年）、Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ、１０、ｐ．１２６〜１３５）。
【０２０１】
考察
ヒト乳腺癌細胞上のＭＵＣ−１を認識する、遺伝子工学およびファージライブラリー法によって生成される抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖが単離されている。ヒト乳腺癌細胞上のＭＵＣ−１を認識する、遺伝子工学およびファージライブラリー法によって生成される抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖが単離されている。競合ＥＬＩＳＡは、３Ｄ  ｓｃＦｖ（ＶL 免疫グロブリン鎖領域は存在せず）を含む７つのｓｃＦｖの４つがＭＵＣ−１競合の増大量（１ｎｍ〜１０ｎｍ）の添加によって阻害されることを示した。線形回帰では、選択されたｓｃＦｖのうち４つすべてが１．０×１０8 Ｍ-1以上の結合親和性（Ｋa ）を有することが推定された。
【０２０２】
配列決定の結果は、配列決定された７つのｓｃＦｖのうち４つが、直接の抗原接触に関係する可能性のあるアミノ酸、および抗原結合ポケットの形成に必要な構造的アミノ酸を含有する完全なＶH およびＶL 免疫グロブリン領域を有することを示した。本発明の目的は、臨床的応用の潜在的可能性を有する抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖ（ＶH −リンカー−ＶL ）を特徴づけ、かつ選択することであったが、ＶL 免疫グロブリン領域のみを有するｓｃＦｖの１つがＥＬＩＳＡによって測定されたＭＵＣ−１陽性ＭＣＦ−７細胞ライセートを認識したのに対して、３Ｄ  ｓｃＦｖは、この特定のｓｃＦｖがＶL 抗原結合ドメインを欠いているとはいえ、競合ＥＬＩＳＡおよび直接細胞染色によってＭＣＦ−７細胞ライセートと反応性であった。これは、同じＶH を有する３Ｄおよび１２Ｅ  ｓｃＦｖの結合が、主にＶH 免疫グロブリン領域内に含まれるアミノ酸の相互作用によってＭＵＣ−１抗原と結合することを示している。抗原に結合するＶH 免疫グロブリン領域の重要性は、免疫化によって生成される抗体および抗体フラグメントについて以前に報告されている（カイ（Ｃａｉ）とガレン（Ｇａｒｅｎ）（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９３、ｐ．６２８０〜６２８５）。抗体−抗原複合体のＸ線結晶学的分析により、抗原の結合における重（Ｈ）鎖の重要性がさらに検証される。（パドラン（Ｐａｄｌａｎ）（１９９４年）、Ｍｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１、ｐ．１６９〜２１７）。疾患および免疫化における抗原への結合は、主にＶH 免疫グロブリン鎖領域に基づくとみられるが、ソング（Ｓｏｎｇ）ら（２０００年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２６８、ｐ．３９０〜３９４、はＢ型肝炎ウイルスへの結合におけるＶL の主な役割を報告した。ＶL 免疫グロブリン領域を欠く評価されたｓｃＦｖの数が限られているため、われわれは、主にＶL 結合によってＭＵＣ−１抗原を認識するｓｃＦｖがライブラリー内に存在しうることをあり得ないとすることはできない。
【０２０３】
上皮癌上の異質性のＭＵＣ−１発現は、ＭｏＡｂを用いて十分に明らかにされている。未処置のヒトファージライブラリー由来の抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖを用いたホーゲンボーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）らも異質性を報告した。ＭＵＣ−１に対する大多数のＭｏＡｂはグリコシル化の存在でアミノ酸を認識するが、ＭｏＡｂの一部は糖を認識する。したがって、診断または悪性細胞への非放射性細胞毒性剤の送達のために、抗ＭＵＣ−１ターゲティング分子の反応混液が有用とみられる。対照的に、ＭＵＣ−１を発現する細胞への放射線の送達における抗ＭＵＣ−１の使用は、適切な放射性核種を隣接細胞に直接結合なしに致死的に照射されることを可能にすると思われる。
【０２０４】
治療的用途のｓｃＦｖは、単一のターゲティング剤としてではなく、分子の成分として利用されることがおそらく最善であろう。これらのｓｃＦｖ分子によって、そのサイズの減少により、腎による体内からの急速な蓄積および除去の不利点を有する完全なＭｏＡｂと比較して、腫瘍取込み、および血中排除の顕著な増大が最初は想定され、その後に証明された（ウー（Ｗｕ）ら（１９９６年）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２、ｐ．２１〜３６；ダルアクア（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ）とカーター（Ｃａｒｔｅｒ）（１９９８年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、８、ｐ．４４３〜４５０；アダムス（Ａｄａｍｓ）（１９９８年）、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ、１２、ｐ．１１〜２２；横田（Ｙｏｋｏｔａ）ら（１９９２年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５２、ｐ．３４０２〜３４０８；ベジェント（Ｂｅｇｅｎｔ）ら（１９９６年）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、  ２、ｐ．９７９〜９８４；ドナルド（ＤｅＮａｒｄｏ）ら（１９９９年）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１０、ｐ．３２１３〜３２１８；アダムス（Ａｄａｍｓ）とシール（Ｓｃｈｉｅｒ）（１９９９年）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．、２３１、ｐ．２４９〜２６０）。ＳｃＦｖはマルチまたは二重特異性薬剤で作成された「プラットホーム」上の結合要素として役立ち、１つは放射性抱合体を結合するために特異的であり、もう１つは、腫瘍結合分子が腫瘍に局在し、循環から除去された後に小さな放射性核種の投与を可能に腫瘍抗原である。成分としてのｓｃＦｖまたはｓｃＦｖの一部分の使用は、最適な排除と腫瘍侵入を示す腫瘍親和性分子を作成する可能性を提示する。
表３．抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖの反応性
2004536578.tif 000004
ＳｃＦｖはＥＬＩＳＡ分析によって同定される抗ＭＵＣ−１ファージライブラリーから無作為に単離された。ＭＣＦ−７細胞株はｓｃＦｖの反応性をスクリーニングするために用いられた。補正されたバックグランドによるＥＬＳＡ吸光度は以下の通りであった：＋＋＋＞０．５；＋＋０．２５〜０．５；−＜０．２５
【０２０５】
本願中に記載された実施例および実施形態は例示目的のみのためであり、それらを考慮に入れて種々の修正や変更が当業者には示され、本願の意図および範囲内、および添付の特許請求の範囲の範囲に包含されると理解される。これによって、本願中に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参考によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】競合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２】図２Ａはクローン１２Ｅの３次元モデルの立体表示（変形１）を示す。図２Ｂはクローン１２Ｄの可変重鎖（ＶH ）ドメインに対する３次元モデルの立体表示（変形１）を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは抗ＭＵＣ−１ＳｃＦｖ免疫細胞化学の結果を示す図である。図３Ａ：ＭＣＦ−７細胞（陽性対照）と反応性のＢｒＥ−３ＭｏＡｂ。図３Ｂ：ＭＣＦ−７細胞と反応性の抗ＭＵＣ−１  ｓｃＦｖ。図３Ｃ：Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞（陽性対照）と反応性のＬｙｍ−１ＭｏＡｂ。図３Ｄ：Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞と最小限に反応性の抗ＭＵＣ−１ｓｃＦｖ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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