(57)【要約】本発明は、実施される次の工程段階：ａ）細胞又は組織を、三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、固着及び染色溶液、及び抗原−非特異的染色剤を含むアルデヒドと共にインキュベートすることによって得られる形態測定用組織又は細胞調製物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施される次の工程段階：
ａ）細胞又は組織を、三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、
ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、固着及び染色溶液、及び抗原−非特異的染色剤を含むアルデヒドと共にインキュベートする；
ことによって得られる形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項２】
前記硬化及び染色溶液が、水、任意には水混和性有機溶媒、及び食塩を含む請求項１記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項３】
前記硬化及び染色溶液が、次の成分：
A）0.5〜35重量％、好ましくは１〜２重量％のアルデヒド、
B）0.01〜10重量％、好ましくは0.3〜0.6重量％の染色剤、
C）0〜90重量％、好ましくは30〜50重量％の１又は複数の水−混和性有機溶媒、
E)0〜5重量％、好ましくは0.1〜１重量％の食塩を含み、それにより、成分A)〜E)の部分の合計が常に100重量％を生成し、そして成分E：Dの重量比が１：1000〜１：100の範囲で存在し、そして好ましくは、生理食塩水の重量比に対応する請求項１又は２記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項４】
前記段階ｂ）におけるインキュベーション期間が、0.5〜24時間、好ましくは１〜10分の範囲である請求項１〜３のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項５】
前記段階ｂ）におけるインキュベーションが、0〜60℃、好ましくは0〜40℃の温度で行われる請求項１〜４のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項６】
前記水−混和性有機溶媒が、１〜３個のOH基を有するC1−10アルカノール、１〜３個のOH基を有するC1−10脂肪族アルコール、C1−C10芳香族アルコール及びそのような物質の混合物から成る群から選択される請求項１〜５のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項７】
前記染色剤が、クリスタルバイオレット、アミドブラック、クレジルバイオレット及びそのような物質の混合物から成る群から選択される請求項１〜６のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項８】
前記マトリックスが、異なった起源、特にラット尾又はブタ皮膚の天然の細胞外マトリックス、そのようなマトリックスの主要成分、特にコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びそれらの物質の混合物から成る群から選択される請求項１〜７のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項９】
前記アルデヒドが、C1−C10アルカンアルデヒド、C1−C10脂肪族アルデヒド、芳香族C1−C10アルデヒド及びそのようなアルデヒドの混合物から成る群から選択される請求項１〜８のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項１０】
前記細胞又は組織が、好ましくはヒト起源の、腫瘍細胞、神経細胞、グリア細胞、筋肉細胞、血液細胞、そのような細胞を含む組織、及びそのような細胞の混合物から成る群から選択される請求項１〜９のいずれか１項記載の形態測定用組織又は細胞調製物。
【請求項１１】
形態測定用組織又は細胞調製物の生成方法であって、次の工程段階：
ａ）細胞又は組織を、明白な三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、
ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、固着及び染色溶液、及び抗原−非特異的染色剤を含むアルデヒドと共にインキュベートすることによって実施する方法。
【請求項１２】
培養−条件−誘発された細胞工程の形態測定用分析のためへの請求項１〜10のいずれか１項記載の形態測定用組織及び/又は細胞調製物の使用。
【請求項１３】
段階ａ）において、活性成分が使用され、次に段階ｂ）において、細胞又は組織の画像化が光顕微鏡により行なわれ、得られる画像が好ましくは、画像認識システムにより評価され、前記評価の結果が前記活性成分に帰因し、そして任意には、前記工程が種々の活性成分のために反復され、そして得られる種々の活性成分の評価の結果がお互い比較されることを含んで成る、活性成分を見出すための方法への請求項１〜10のいずれか１項の形態測定用組織及び/又は細胞調製物の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、特に後根神経節から成るニューロンであり、そして前記評価が新しく形成された軸索の検出を含んで成る請求項13記載の使用。
【請求項１５】
前記細胞が、腫瘍細胞であり、そして前記評価が移動した細胞の検出を含んで成る請求項13記載の使用。
【請求項１６】
次の成分：
A）0.5〜35重量％、好ましくは１〜２重量％のアルデヒド、
B）0.01〜10重量％、好ましくは0.3〜0.6重量％の染色剤、
C）0〜90重量％、好ましくは30〜50重量％の１又は複数の水−混和性有機溶媒、
E)0〜5重量％、好ましくは0.1〜１重量％の食塩（それにより、成分A)〜E)の部分の合計が常に100重量％を生成し、そして成分E：Dの重量比が１：1000〜１：100の範囲で存在し、そして好ましくは、生理食塩水の重量比に対応する）を含む、形態測定用細胞及び/又は組織調製物のための硬化及び染色溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実施される次の工程段階：ａ）細胞又は組織を、三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、染色溶液と共にインキュベートすることによって得られる形態測定用組織又は細胞調製物に関する。さらに、本発明は、そのような調製物の生成方法、及びその使用に関する。最終的に、本発明はそのような工程への使用のための固着及び染色溶液に関する。
【０００２】
形態測定用組織又は細胞調製物は、細胞構造又は組織構造の形状（形態発生）の検出を可能にする手段で処理される。これに関しては、形状、例えば細胞及び/又は細胞成分及び/又は組織の形状が対比方法により認識されることが必須である。この場合、検出は、種々の光学的方法の使用による観察により、最も単純な場合、通常の光顕微鏡により行われ得る。検出の骨格内で、ほとんどの場合において、一定の細胞工程と相互関係する特定の形状特徴の計算がしばしば行われる。検出はヒトの眼により可視的に行われ、次に観察者は、例えば、任意には顕微鏡を通して、又は対応する画像を観察することによって、調製物の観察に基づいて、所望する構造の同定及び任意には、その計算を行う。
【０００３】
しかしながら、（顕微鏡）画像を記録し、そしてまた自動的に計算を行うことができるコンピューター制御されたパターン認識システムにより評価することによって、検出を自動化することは、単純且つより信頼できる。画像処理は、例えばCCD要素により写真的に又は電子的に行われ得る。このために、前記方法論は、定義された培養条件が形態発生に対して何の影響を及ぼすかを同定するために使用される。従って、定義された培養条件の表現は特にまた、例えば１又は複数の予測される活性成分を標準培地に添加することによって特徴づけられる非天然又は非標準の条件を包含する。いずれの場合においても、前記条件は、調製物におけるすべての細胞の実質的に即座のアポプトシスが誘発されないよう選択されるべきであることは言うまでもない。
【０００４】
染色溶液は、対比のために興味ある形状特徴を強調するために使用される。当業者である平均的個人は、興味ある形状に比例して容易に色素を選択することができる（例えば、塩基性色素は、酸性細胞構造体、例えば核におけるDNA又はリボソームにおけるRNAに結合し；酸性色素は好ましくは、塩基性血漿タンパク質に結合する）。色素は、任意の続く洗浄工程段階がもはや色素を溶解しないように、（特定の）細胞構造体にしっかりと結合されることが染色において必須である。次に、色素の結合部位が染色された領域を形成し、そして色素のための結合部位がほとんどか又はまったく存在しない領域はわずかに染色されるか又は少しも染色されない領域を可視化する。これが究極的には、比較機構である。
【０００５】
上記タイプの工程は、例えば引用文献Leclere, P., Neuroscience: 82,545-548,1998から知られている。この点において知られている工程においては、神経節細胞外植片が、神経成長因子により処理されるか、又はその存在下で培養され、そして次に、そのようにして誘発された軸索成長が形態測定用により分析される。この場合、染色は、色素によりラベルされるか、又は色素によりラベルされ得る抗体の使用により行われる。従って、これは抗原依存性染色方法である。しかしながら、このタイプの特徴染色は、非常に薄いマトリクスンためにのみ適切である。しかしながら、十分に均質の抗原依存性染色は困難であるか又はまったく不可能であるので、三次元マトリックス又は培養物を明確に使用することがしばしば所望される。さらに、抗原依存性染色方法は時間の浪費であり、且つ大きな労力を要する。
【０００６】
引用文献Hayakawa, K., など., Neurosci. Lett. :274, 103-106, 1999及びCarreau, A., Neuropharmacology: 36,1755-1762, 1997から、自然位で、すなわち同定されていない状態で相対比顕微鏡により形態測定用分析を行うことは知られている。しかしながら、それを可能にする場合、画像は対比するには非常に低く、自動パターン認識を特に妨げる。さらに、培養物は、この場合、非常にすばやく変性する。上記の最初の引用文献の場合、例えば腫瘍の転移における複雑な組織からの細胞の移動が試験される。上記の２番目の引用文献は、軸索成長に対する神経成長因子の影響を記載する。
しかしながら、本発明は、安定し且つ耐久性のある形態発生スナップショットを表して、そして同時に、非常に良好な対比において単純に生成され得る、形態測定用組織又は細胞調製物を示す技術的問題に基づいている。
【０００７】
この技術的問題を解決するために、本発明は、実施される次の工程段階：ａ）細胞又は組織を、三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、固着及び染色溶液、及び任意にはアルコール、並びに抗原−非特異的染色剤を含むアルデヒドと共にインキュベートすることによって得られる形態測定用組織又は細胞調製物を教示する。例えば、洗浄工程段階が次に続く。抗原−非特異的染色剤は、その酸性又は塩基性基自体により、しかしまたレドックス工程により、分子又は分子種類の細胞又は組織に非特異的に結合する色素である。
【０００８】
細胞又は組織の実質的にすべての構造体への結合がまた生じる。抗体の使用は存在しない。アルデヒド及び任意にはアルコールは、Mannich反応の態様での細胞又は組織の移動分子自体との多数の固定化反応により、細胞又は組織の構造体の信頼できる固着を生成する。細胞増殖は三次元マトリクスにおいて行われるか、又は細胞部分の増殖が空間的にすべての三方向に行われる。特に、後者の中では、空間的にすべての三方向における空間的拡張が、培養された細胞の多数の空間的拡張と同じか、又は２倍以上か、好ましくは10倍以上〜100倍以上である調製物が定義される。
【０００９】
本発明によれば、明らかに三次元の細胞又は組織調製物は、安定し且つ永久的に固定され、そして同時に、非常に対比に富んだ画像が最も単純な方法、例えば単純な光顕微鏡により得られることが達成される。この場合、硬化及び染色溶液による単純な処理のみが必要であり、すなわち、それは“一段階”方法である。さらに、明らかに三次元の調製物は容易に固定され、そして染色され、ところが抗体に基づく方法によるそのような調製物の特異的染色は、ほとんど不可能である。明らかに三次元の調製物は、最小の厚さ（断片）を示すのみならず、むしろ0.2μm〜20mm、特に0.2mm〜20mmの厚さを示すことができる。
【００１０】
明らかに重要のものである本発明の好ましい態様においては、硬化及び染色溶液は、水、任意には水混和性有機溶媒及び食塩を含む。特に生理食塩水の場合、食塩水溶液は、硬化及び染色の間、浸透により引き起こされる、細胞又は組織の信頼できる形状変化を妨げる。
【００１１】
特に、硬化及び染色溶液は、次の成分： A）0.5〜35重量％、好ましくは１〜２重量％のアルデヒド、B）0.01〜10重量％、好ましくは0.3〜0.6重量％の染色剤、C）0〜90重量％、好ましくは30〜50重量％の１又は複数の水−混和性有機溶媒、E)0〜5重量％、好ましくは0.1〜１重量％の食塩を含み、それにより、成分A)〜E)の部分の合計が常に100重量％を生成し、そして成分E：Dの重量比が１：1000〜１：100の範囲で存在し、そして好ましくは、生理食塩水の重量比に対応する。本発明はまた、独立して、そのような硬化及び染色溶液に関する。
【００１２】
前記段階ｂ）におけるインキュベーション期間は、0.5〜24時間、好ましくは１〜10分の範囲である。前記段階ｂ）におけるインキュベーションは、0〜60℃、好ましくは0〜40℃の温度で行われる。
【００１３】
前記水−混和性有機溶媒は、１〜３個のOH基を有するC1−10アルカノール、１〜３個のOH基を有するC1−10脂肪族アルコール、C1−C10芳香族アルコール及びそのような物質の混合物から成る群から選択される。エタノールが好ましい。前記染色剤は、クリスタルバイオレット、アミドブラック、クレジルバイオレット及びそのような物質の混合物から成る群から選択される。
【００１４】
前記マトリックスは、異なった起源、特にラット尾又はブタ皮膚の抽出された天然の細胞外マトリックス、そのようなマトリックスの主要成分、特にコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びそれらの物質の混合物から成る群から選択される。前記アルデヒドは、C1−C10アルカンアルデヒド、C1−C10脂肪族アルデヒド、芳香族C1−C10アルデヒド及びそのようなアルデヒドの混合物から成る群から選択される。ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドが好ましい。
【００１５】
調製物の個々の細胞又は複雑な組織は、例えば腫瘍細胞、神経細胞、グリア細胞、筋肉細胞、血液細胞から製造され得るか、又は上記から成ることができる。活性成分の発現の分野においては、細胞は最適には（しかし、必ずしも必要ではないが）、ヒト細胞である。
【００１６】
さらに、本発明は、形態測定用組織又は細胞調製物の生成方法を教授し、ここで前記方法は次の工程段階：ａ）細胞又は組織を、明白な三次元マトリックスにおいて定義された条件下で定義された期間にわたって培養し、ｂ）前記定義された期間の終了の後、前記培養された細胞又は組織を含むマトリックスを、固着及び染色溶液、及び抗原−非特異的染色剤を含むアルデヒドと共にインキュベートすることによって実施される。本発明の方法に関しては、上記言及は、調製物に類似して適用される。
【００１７】
さらに、本発明は、培養−条件−誘発された細胞工程の形態測定用分析のためへの欲発明の形態測定用組織及び/又は細胞調製物の使用を教授する。換言すれば、定義された条件は、一定の形態測定用効果が予測される段階ａ）において設定される。次に、後者が評価され、そして定義された条件と、任意には半定量的に又は定量的に相互関係を示される。
【００１８】
中でも、後者はまた、段階ａ）において、活性成分が使用され、次に段階ｂ）において、細胞又は組織の画像化が光顕微鏡により行なわれ、得られる画像が好ましくは、画像認識システムにより評価され、前記評価の結果が前記活性成分に帰因し、そして任意には、前記工程が種々の活性成分のために反復され、そして得られる種々の活性成分の評価の結果がお互い比較されることを含んで成る、活性成分を見出すための方法への本発明の形態測定用組織及び/又は細胞調製物の使用にも関する。
【００１９】
最終的に、試験される活性成分により生成される、形態発生効果に関する、定量的な、又は少なくとも半定量的情報が得られる。前記細胞は、例えば神経節、特に後根神経節であり、そして前記評価は新しく形成された軸索の検出を含んで成る。細胞はまた、腫瘍細胞であり得、そして次に、その評価は、例えば移動した細胞の検出を含んで成る。
下記のように、本発明は、より詳細に記載されたが、それらは本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００２０】
例１．
生後初期のラットの後根神経節から成る外植片培養物を、明白な三次元コラーゲンゲルにおいて設定した（寸法：直径13mm、高さ8mm）。次に、培養を、神経成長因子を含む培養培地において数時間、行った。培養を、ゲルから培養培地を吸引することによって、及び続く染色及び固着段階により完結した。
【００２１】
例２．
次に、例１において得られたゲルを、濾過された固着及び染色溶液により処理した。後者は、次のものを含んだ：2.42ｇのクリスタルバイオレット、162mlのエタノール（100％）、323mlの蒸留水、16mlのホルムアルデヒド（35％、残りは水）及び0.8gのNaCl。処理は、20℃で５分間、行われた。次に、それを水により洗浄した。
【００２２】
次に、洗浄されたゲルを、光顕微鏡（Zeiss Axiovert, 明るい視野、10倍の倍率のレンズ）上に置き、そして図１に示されるように、詳細が生成された。下記図１においては、外植片コアーの縁が認識できる。さらに、それからの成長される軸索が、神経成長因子との培養のために、検出される。単純且つ信頼できる態様で定量的に分析され得る、非常に対比に富んだ画像が得られることは明白である。
【国際公開パンフレット】
2004520034.tif 000002
2004520034.tif 000003
2004520034.tif 000004
2004520034.tif 000005
2004520034.tif 000006
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2004520034.tif 000009
2004520034.tif 000010
2004520034.tif 000011
2004520034.tif 000012
2004520034.tif 000013
2004520034.tif 000014
2004520034.tif 000015
2004520034.tif 000016
2004520034.tif 000017
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520034.tif 000018
【国際調査報告】
2004520034.tif 000019
2004520034.tif 000020
2004520034.tif 000021
2004520034.tif 000022