(57)【要約】１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液に遠心力場を加えることによって密度勾配を形成する方法が開示される。この密度勾配は自己形成平衡勾配であり、超遠心で生体粒子を分離するのに有用である。また、生体粒子をその密度に応じて分離する方法が開示される。また、その粒子密度に応じて密度勾配に沿って分かれているリポタンパク質粒子および１種または複数の金属イオンキレート錯体の密度勾配が開示される。
2004525368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数の金属イオンキレート錯体の溶液を提供すること、および密度勾配が形成されるまでその溶液に遠心力場を加えることを含む密度勾配を形成する方法。
【請求項２】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約１０，０００ｒｐｍ〜約２００，０００ｒｐｍの速度で回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約８時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約２時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該密度勾配に沿った特定のポイントの溶液密度を決定することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該密度勾配に沿った特定のポイントの溶液密度が、そのポイントの溶液の吸光度を求め、その吸光度を密度に関連付けることによって決定される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
粒子および１種または複数の金属イオンキレート錯体の溶液を含む組成物を提供すること、ならびに、
溶液が密度勾配を形成し、その密度勾配に沿って粒子がその密度に応じて分かれるまで、該組成物に遠心力場を加えることを含む、粒子をその密度に応じて分離する方法。
【請求項１３】
該金属イオンキレート錯体溶液の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該金属イオンキレート錯体溶液の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約１０，０００ｒｐｍ〜約２００，０００ｒｐｍの速度で回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約８時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約２時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
遠心力場を加える前に、溶液上に該粒子の層を形成する請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
遠心力場を加える前に、該粒子を溶液全体に渡って分散させる請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
１種または複数の金属イオンキレート錯体を含む密度勾配。
【請求項２４】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２５】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２６】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２７】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２８】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２９】
ある密度勾配の１種または複数の金属イオンキレート錯体およびリポタンパク質粒子を含み、リポタンパク質粒子がその密度に応じて密度勾配に沿って分かれている組成物。
【請求項３０】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属イオンキレート錯体の密度勾配溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子を分離するために遠心力を用いる遠心法は、数十年来使用されている。媒質中に懸濁した粒子を含む試料をローター内で高速で回転させて、遠心力によって粒子をローターの回転中心から外周に向かって外側に移動させる。この移動は、沈降として知られている。沈降速度は、回転速度、媒質の密度と粘性、粒子の密度、粒子の大きさと形状などいくつかの要因に依存する。粒子は、遠心力のベクトルに沿って移動する距離が異なるため、空間的に分離される。この力のベクトルに沿った分離の程度によって、どの粒子を分離できるかの分解能の程度が決まる。
【０００３】
密度勾配超遠心の場合、知られている方法では懸濁媒質の密度は、遠心分離管の上端から下端へ変化する。遠心力の影響下にある粒子がその等密度点に達した場合、すなわち、周囲の液体密度が粒子の密度と同じ場合は、粒子が力のベクトルに沿って移動しなくなる。
【０００４】
超遠心の密度勾配を確立するために用いる溶質系には、無機塩（塩化セシウム、臭化カリウム、塩化ナトリウム）、ショ糖ならびにショ糖を架橋させて作った合成多糖体であるフィコール（登録商標）、ポリビニルピロリドンでコーティングしたシリカ粒子の懸濁液であるパーコール（商標）、合成分子メトリゾ酸の誘導体（メトリザミド）であるナイコデンツ（登録商標）などいくつかの市販されている溶質がある。ナイコデンツ（登録商標）の二量体であるイオジキシノール（Ｉｏｄｉｘｉｎｏｌ）も広く使用されている。
【０００５】
このような溶質系には様々な欠陥がある。無機塩は高濃度で使用しなければならず、そのため生物学的粒子の分析物が脱水され、それによってその分析物の物理的／化学的特性が変化する可能性がある。溶質はまた、粒子の周りに溶媒和層を形成することによって、粒子の物理的／化学的特性を変化させることがある。
【０００６】
ショ糖およびその多糖類誘導体は、溶質密度が高い時には粘性の高い溶液を形成する傾向がある。このため、沈降平衡に達するのに必要な時間が劇的に増大する。
【０００７】
溶液の密度は溶質濃度に比例するので、通常上記の溶質を用いて、相対的に高い濃度の溶液の上にそれより低い濃度の溶液を層状に重ねることによって、密度勾配が形成される。例えば、ショ糖溶液の一方を他方の上に層状に重ねて、チューブの上端から下端へショ糖１０〜４０％の勾配を形成することによって、密度勾配を形成することができる。この方法は時間がかかり、試料ごとの再現性が乏しい可能性がある。
【０００８】
上記の溶質系の使用の容易さおよび再現性を向上させるために、密度勾配を形成する様々な方法および装置が探究されてきた。例えば、米国特許第５，１７１，５３９号は、チューブ中に異なる濃度の溶液を層状に重ねて、そのチューブを垂直方向に対してある角度で配置する、溶液の連続勾配を生成する装置について記載している。このチューブをある期間回転させ、それによって溶液の連続勾配を形成する。
【０００９】
米国特許第４，２９０，３００号は、高濃度のショ糖用のチャンバーおよび低濃度のショ糖用のチャンバーをもつ装置について記載している。２つのチャンバーからの相対的放出速度はチャンバー内の圧力によって制御され、したがって直線的または指数関数的な密度勾配が形成できる。
【００１０】
代替方法は、系を遠心力場にさらした時に、密度勾配を「自己形成」する溶質系を使用するものであろう。米国特許第４，４８０，０３８号は、ショ糖２５ｍＭを含む６０％パーコール（商標）を用いた自己形成勾配について記載している。
【００１１】
米国特許第５，９８５，０３７号は、パーコール（商標）２７〜３３％および糖３６〜４４％を含む溶液に遠心力場を加えることによって得られる自己形成密度勾配について記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような自己形成勾配は、再現するのがより容易であるが、高濃度の溶質が必要である。したがって、勾配環境は生理的状態と著しく異なる。溶質濃度が高いと、溶液の粘性も増大し、それによって粒子が沈降平衡に達するのに必要な時間が増大する。さらに、シリカ系溶質は生理的状態を模倣しないので、シリカ系溶質を使用しない自己形成密度勾配が利用可能なことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様は、１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液を提供すること、および密度勾配が形成されるまでその溶液に遠心力場を加えることを含む、密度勾配を形成する方法である。
【００１４】
本発明の他の態様は、粒子および１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液を含む組成物を提供すること、ならびに溶液が密度勾配を形成しその密度勾配に沿って粒子が分かれるまで、その組成物に遠心力場を加えることを含む、粒子をその密度に応じて分離する方法である。
【００１５】
本発明のさらに他の態様は、１種または複数の金属イオンキレート錯体を含む密度勾配である。
【００１６】
以下の図面は、本明細書の一部を構成しており、本発明のある種の態様をさらに示すために含めてある。１つまたは複数のこれらの図面を、本明細書に示した特定の実施形態の詳細な説明と併せ参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の一態様は、密度勾配を形成する方法であって、この方法は、１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液を提供すること、および密度勾配を形成するまでその溶液に遠心力場を加えることを含む。密度勾配の特性は、特定の金属イオンキレート錯体、溶液濃度、温度および遠心力場の大きさに関係する。
【００１８】
本明細書では、「金属イオンキレート錯体」という用語は、金属イオンとキレート剤の間で形成される錯体を意味する。金属イオンは、一般にどんな金属イオンでもよい。本発明の金属イオンとしては、銅、鉄、ビスマス、亜鉛、カドミウム、カルシウム、トリウム、マンガンなどのイオンがあるが、それだけに限定されるものではない。現時点で好ましい金属イオンは、銅、鉄、カルシウム、トリウム、ビスマスのイオンである。
【００１９】
「キレート剤」という用語が、金属イオンと錯体を形成することができる特定の種類の配位子を意味することが、当業者には分かるだろう。この配位子は、同じ金属イオンと結合または会合する非共有電子対を有する２つ以上の原子を含む。キレート剤は、多座配位子とも呼ばれる。本発明によるキレート剤の例には、シュウ酸エステル、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、１，３，５−トリアミノシクロヘキサンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などがあるが、それだけに限定されるものではない。ＥＤＴＡは、金属キレート錯体に非共有電子対を最大で６対まで与えることができ、現時点で好ましいキレート剤である。
【００２０】
本発明の金属イオンキレート錯体は、錯体全体の電荷のバランスをとるために、正に帯電した対イオンを１つまたは複数必要とすることがある。対イオンの例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムならびにアンモニウム錯体、例えばテトラブチルアンモニウムなどの対イオンがあるが、それだけに限定されるものではない。全体の電荷のバランスをとるために２つ以上の対イオンを必要とする場合は、対イオンを混合してもよい。例えば、正電荷を２つ必要とする金属イオンキレート錯体には、ナトリウムから正電荷を１つ供給し、カリウムからもう１つ供給することができる。
【００２１】
密度勾配の特性は、金属イオン、キレート剤および対イオンを様々な組合せで選択することによって改変することができる。適当な金属イオンキレート錯体の例には、ＮａＣｕＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＢｉＥＤＴＡおよびＣｓＢｉＥＤＴＡなどがあるが、それだけに限定されるものではない。ＣｓＢｉＥＤＴＡが、現時点で好ましい金属イオンキレート錯体である。２種以上の金属イオンキレート錯体溶液を、本発明による密度勾配を形成するのに用いることもできる。
【００２２】
金属イオンキレート錯体の濃度は、一般にどんな濃度範囲でもよい。金属イオンキレート錯体溶液の濃度は、通常約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍ、より一般的には約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである。一般に、より低い濃度はより低い密度範囲をもたらし、通常、より高濃度の溶液はより高い密度範囲をもたらす。
【００２３】
本発明の密度勾配は、適当などんな容器内に形成してもよい。本発明の密度勾配は通常、チューブ内に、特に遠心分離管内に形成する。チューブをローター内で回転させることによって、遠心力場を溶液に加えることができる。回転速度は密度勾配を形成する速さに影響し、回転速度が高速になるほど、通常、勾配形成が速くなる。急速な勾配形成は、分離に必要とされる時間が減るので、望ましい。しかし、あまりに急速な勾配形成は、過度に急勾配になる前に粒子がその等密度点に達することができないので、粒子の分離に悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、所与の１組の条件および分析物の回転速度は、実験で最適化しなければならない。通常、回転速度は約１０，０００ｒｐｍ〜約２００，０００ｒｐｍである。
【００２４】
当技術分野で知られている様々なローター／チューブ構造のどれでも、本発明の勾配に用いることができる。例には、固定角ローター、垂直ローターおよび水平ローターなどがある。通常のローター構造は、固定角が約３０°である。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、この方法によって形成した密度勾配は、本質的に指数関数的密度勾配である。すなわち、溶液の密度は、チューブの上端から下端までの位置に応じて、本質的に指数関数的に変化する。密度勾配が指数関数的配置になっているのは、その勾配が平衡に達していることの指標である。この種の勾配は、粒子がそれ自体の密度と等しい位置に達するまで勾配中を移動する、沈降平衡法による分離には理想的である。沈降平衡法による分離は、粒子の正しい平衡密度を反映するので、望ましい。
【００２６】
平衡勾配を自己形成する溶質系は、当技術分野では相当珍しいものである。オプティプレップ（登録商標）およびパーコール（商標）は、勾配を自己形成することが示されている。しかし、小さな生物学的粒子を分離するのに必要とされる速度のような高速の回転速度では、勾配があまりに急なため、効果的に分離できない。このため、これらの適用は、細胞や細胞小器官などの大きい粒子に限定される。
【００２７】
対照的に、本発明の方法では、高速のローター速度で使用可能な自己形成平衡勾配が得られる。したがって、これらの勾配は、リポタンパク質などより小さい生物学的粒子を分離するのに有用である。
【００２８】
本発明の有利な態様は、多くの金属イオンキレート錯体がＵＶスペクトルおよび可視スペクトル中で強い特徴的な吸光度を有することである。この吸光度は溶液濃度に比例するので、溶液密度と関連付けられる。このため、勾配に沿ったどのポイントの溶液密度も、そのポイントで溶液の吸光度を求めることによって決定できる。
【００２９】
例えば、金属イオンキレート錯体溶液の密度と所与の波長でのその吸光度の関連を示す較正曲線を、知られている密度の標準溶液を用いて作成することができる。次に、チューブ内の正確に分かっている位置から勾配の試料溶液を取り出し、較正曲線を参照して、その吸光度から密度を決定することができる。勾配濃度によっては、吸光度を測定する前に、勾配試料を希釈することが有用であろう。較正曲線を作成し使用するこうした方法は、当業者にはよく知られている。
【００３０】
したがって、本発明の一実施形態はさらに、密度勾配に沿った特定のポイントの溶液密度を、そのポイントの溶液の吸光度を求め、その吸光度を密度に関連付けることによって決定することを含む。
【００３１】
密度勾配に沿った所与のポイントの密度を決定するための代替法は、金属イオンキレート錯体溶液中に内部密度マーカーを含めるものである。これらのマーカーは、目に見える化合物または蛍光法や発光法など何らかの方法で検出可能な化合物である。この密度マーカーは、勾配中でその密度に応じて分かれ、それによって勾配中の所与のポイントでの検出可能な密度の指標を与える。
【００３２】
本発明の他の態様は、１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液からなる密度勾配である。上記の方法によって、好ましい濃度勾配を調製する。これらの濃度勾配は、従来技術で知られている勾配に勝るいくつかの利点を与える。本発明の濃度勾配は、通常従来技術のそれよりも粘性が低く、したがって、この勾配を用いると、粒子はより短い時間で分離平衡に達する。また、この勾配内の環境は、他の勾配の環境よりも生体条件によく似ている。本発明の勾配はまた、溶媒和効果および生体試料の脱水を減少させる。したがって、本発明の勾配を用いて決定した粒子密度は、その生体内での密度により近い。
【００３３】
本発明のさらに他の態様は、粒子をその密度に応じて分離する方法であって、この方法は、粒子および１種または複数の金属イオンキレート錯体溶液を含む組成物を提供すること、ならびに溶液が密度勾配を形成しその密度勾配に沿って粒子がその密度に応じて分かれるまで、その組成物に遠心力場を加えることを含む。粒子を分離するこの方法は、上記の方法によって調製した密度勾配を利用する。
【００３４】
一般に、密度勾配超遠心に適用できるどんな種類の粒子も、本発明による密度勾配を用いて分離できる。例には、リポタンパク質、タンパク質、様々な微生物、様々な細胞型、細胞成分およびＤＮＡなどがある。
【００３５】
本発明による密度勾配は、異なる密度のリポタンパク質を互いに分離するのに特に適している。リポタンパク質は通常、その密度と組成に基づいて分類される。こうした種類には、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））などがある。血中のこれらのリポタンパク質の相対量は、冠状動脈性心臓病の重要な臨床診断指標である。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、遠心力場を加える前に、分離すべき粒子を金属イオンキレート錯体溶液中に分散させる。次いで、溶液中に密度勾配が形成され粒子がその密度に応じて勾配中に分散するまで、遠心力場を加える。通常、この方法によって最も速く沈降平衡による分離が得られる。
【００３７】
沈降平衡法はリポタンパク質の平衡密度について重要な情報をもたらすので、沈降平衡法による分離はリポタンパク質の分析に特に適している。この情報は、冠状動脈性心臓病の臨床診断として適切である。
【００３８】
本発明の密度勾配は、他の分離法にも使用できる。例えば、沈降速度法では、金属イオンキレート錯体溶液上に粒子の層を形成してもよい。遠心中に、粒子はその大きさに依存する沈降係数に応じて分離する。この技術は、粒子の分子量を計算するのにしばしば使用される。十分な時間の後、分離が等密度になる。
【００３９】
浮上分離法では、試料を相対的に高い密度に調整し、次いでそれより低い密度の溶液をその試料の上に層状に重ねて不連続勾配を形成する。遠心中に、粒子はその密度に応じて分離するが、異なる密度層によって形成される帯域に閉じ込められる。長時間回転を続け、不連続勾配が連続になる機会ができるのでない限り、この方法を用いて粒子の平衡密度を決定することはできない。しかし、粒子グループの密度範囲を決定することは可能である。
【００４０】
この方法は、さらに分析物粒子を勾配上でより容易に検出できるように、分析物粒子を処理することを含むことができる。このような処理の例は、分析物粒子とある種の親和性があり、粒子を目に見えるようにあるいは分光法やＸ線撮影技術など何らかの方法によって検出できるようにする染料または色素に、分析物粒子をさらすことである。生物学的粒子の染色および着色技術は、当技術分野でよく知られている。生物学的試料用の一般的な色素の例は、ズダン黒である。
【００４１】
現時点で好ましい本発明の実施形態によれば、分析物粒子を分光法またはＸ線撮影技術によって検出可能なマーカーを有する染料または色素にさらす。この粒子がその密度に応じて勾配中で分離した時、勾配中の所与の位置で検出されるマーカー量は、その位置に存在する分析物粒子の数に比例するようになる。このため、試料の粒子密度分布の定量的な特徴付けが可能になる。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、粒子の混合物を蛍光マーカーを含む染料にさらす。リポタンパク質用の特に適当な種類の蛍光色素は、蛍光リン脂質である。一例は、ＮＢＤ  Ｃ６−セラミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ、カタログ番号Ｎ−１１５４）である。次いで、染色した粒子を金属イオンキレート錯体溶液中に懸濁させる。溶液中に密度勾配が形成され粒子がその密度に応じて勾配中で分かれるまで、この溶液を遠心力場にさらす。次いで、蛍光マーカーを励起させ勾配に沿って得られた蛍光バンドを検出することによって、この粒子の分布を分析する。蛍光励起法および蛍光検出法は、当業者によく知られている。特に好ましい方法は、固有の励起波長で蛍光マーカーを励起させて、カメラで蛍光発光を撮影することである。カメラは、好ましくは励起ベクトルに対してある角度で設置し、好ましくはレンズにフィルターをかけて、蛍光波長で狭帯域の放射線だけをカメラに入射される。この実施形態によれば、励起波長と放射波長の間に実質的な差が出るのに十分なほど蛍光マーカーのストークスシフトが大きい場合には、信号対雑音比が最大になる。信号対雑音比はまた、カメラのシャッター速度を調整することによっても最大にすることができる。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含めたものである。以下の実施例に開示した技術は、発明者が発見した技術が本発明を実施する際に十分に機能することを示すものであり、したがって実施するための好ましい形態を構成すると考えられることが、当業者には理解されよう。しかし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示した具体的な実施形態に多くの変更を加えることができそれでも同様かつ類似の結果が得られることが、本開示に照らせば、当業者には理解されよう。
【実施例１】
【００４４】
知られているＣｓＢｉＥＤＴＡ標準溶液の密度と２６４ｎｍでのその溶液の吸光度の関連を示す本質的に直線的な較正曲線を作成した。１０、１５および２０重量％のＣｓＢｉＥＤＴＡ溶液を調製し、この溶液を含む１．５ｍＬ超遠心管を、固定角が３０°のベックマン超遠心ローター内で１２０，０００ｒｐｍ、２０℃で４時間回転させた。得られた密度勾配は、溶液のアリコート１０μＬを、チューブ内の正確に分かっているポイントから回収することによって分析した。このアリコートを１×１０４倍に希釈し、得られた溶液の吸光度を２６４ｎｍで測定した。較正曲線を用いて、勾配に沿ったポイントの密度を逆算した。図１は、密度勾配をチューブ内の位置の関数としたグラフを示す。チューブの座標はｍｍ単位で測定し、チューブの上面を０ｍｍとした。
【実施例２】
【００４５】
採取したばかりの血液を１５分間凝固させ、次いで３０００ｒｐｍで遠心分離機にかけて血清を得ることによって、血清試料を調製した。血清１００μＬをズダン黒８μＬで染色し、水２９２μＬで希釈した。得られた溶液２００μＬを０．２５Ｍ  ＣｓＢｉＥＤＴＡ（密度＝１．１０３ｇ／ｍｌ）９００μＬ上に層状に重ね、同様に調製した試料を０．７４Ｍ  ＣｓＣｌ（密度＝１．００ｇ／ｍｌ）９００μＬ上に層状に重ねた。どちらのチューブも１２０，０００ｒｐｍで２時間、続いて１００，０００ｒｐｍで２時間回転させた。
【００４６】
図２は、２つの試料で得られた勾配を示す。ＣｓＢｉＥＤＴＡは有効な勾配を形成し、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬに相当するバンドを分離した。ＣｓＣｌは、有効な勾配を形成したようには見えなかった。ＶＬＤＬおよびＬＤＬはチューブの上端に残り、ＨＤＬはチューブの下端に移動した。
【実施例３】
【００４７】
ＣｓＢｉＥＤＴＡとイオジキシノール（オプティプレップ）の密度勾配を比較した。上記のように調製した血清試料を、それぞれ別の遠心管に入った０．２５Ｍ  ＣｓＢｉＥＤＴＡ上および１９．５重量％イオジキシノール上に層状に重ねた。血清試料をそれぞれの密度基質中に分散させる、別の１組の実験を行った。４本のチューブを１２０，０００ｒｐｍで４時間回転させた。１時間ごとにローターを止め、チューブを撮影した。
【００４８】
図３と４は、１時間ごとのＣｓＢｉＥＤＴＡ勾配を示す。層状に重ねたＣｓＢｉＥＤＴＡ試料と分散させたＣｓＢｉＥＤＴＡ試料のどちらも、４時間後に非常に優れた分離を示した。分散させた試料（図４）は、層状に重ねた試料（図３）よりもわずかに優れた分離をもたらした。
【００４９】
イオジキシノール試料は、層状に重ねた実験（図５）でも分散させた実験（図６）でも不十分な結果をもたらした。イオジキシノールでは急勾配が非常に急速に形成し、その結果、勾配が非常に急になる前にリポタンパク質がその等密度点に達する時間がなく、リポタンパク質を分離できなかった。
【実施例４】
【００５０】
凍結乾燥した血清試料に水５００μＬを加えて戻した。各試料のうちのボリューム７８μＬをＮＢＤ  Ｃ６−セラミド５μＬで３０分間染色した。それぞれに水を加えて、ボリュームを６５０μＬまで増やした。これらの試料を逆さにして混合し、次いで７０００ｒｐｍで４分間回転させた。次いで、超遠心管中で、各試料のうちのボリューム５５０μＬを２０重量％ＣｓＢｉＥＤＴＡ５５０μＬと混合した。これらのチューブを１２０，０００ｒｐｍ、２０℃で４時間４０分回転させた。
【００５１】
この勾配を、青紫帯域フィルター（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ社）を通したハロゲン電球の励起光にさらした。サイバーグリーンフィルター（Ｋｏｄａｋ社）を備えたカメラを用いてこのチューブを撮影した。１／３０、１／１５、１／８および１／４秒のシャッター速度で写真を撮影した。
【００５２】
それぞれのシャッター速度での蛍光強度をチューブの座標の関数として図７に示した。最適なシャッター速度は１／１５と１／８である。シャッター速度１／３０の写真はやや不鮮明であり、シャッター速度１／４の写真は最適バックグラウンド照射よりも大きい。
【００５３】
蛍光色素を使用するとＬＤＬバンドがより浮揚するので、蛍光色素を用いて観察したリポタンパク質の輪郭は、ズダン黒を用いて通常観察するものとわずかに異なっている。これは、ズダン黒がＬＤＬの密度を増加させることを示唆している。蛍光色素法では、生体内の値により類似した密度が得られる。また、Ｌｐ（ａ）に伴うバンドもこの方法を用いて検出可能であった。
【００５４】
本明細書で開示し特許請求した組成物および方法はすべて、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実施することができる。好ましい実施形態に関して本発明の組成物および方法を記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法および方法のステップまたは一連のステップに変更を行うことができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的にも物理的にも関連がある特定の薬剤が使用でき、それでも同一または類似の結果が得られることは明らかであろう。添付の特許請求の範囲で定義されているように、当業者に明らかなこうした類似の代替物および変更形態はすべて、本発明の精神、範囲および概念の範囲内に含まれると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】１０、１５および２０重量％のＣｓＢｉＥＤＴＡ溶液の密度勾配をチューブ内の位置の関数としたグラフである。チューブの座標はｍｍ単位で測定し、チューブの上面を０ｍｍとした。
【図２】９００μＬの０．２５Ｍ  ＣｓＢｉＥＤＴＡ上および９００μＬの０．７４Ｍ  ＣｓＣｌ上に層状に重ねた血清試料の勾配を示す図である。どちらのチューブも１２０，０００ｒｐｍで２時間、続いて１００，０００ｒｐｍで２時間回転させた。
【図３】９００μＬの０．２５Ｍ  ＣｓＢｉＥＤＴＡ上に層状に重ねた血清試料の勾配を示す図である。チューブは１２０，０００ｒｐｍで回転させ、４時間の間１時間ごとに写真を撮影した。
【図４】９００μＬの０．２５Ｍ  ＣｓＢｉＥＤＴＡ中に分散させた血清試料の勾配を示す図である。チューブは１２０，０００ｒｐｍで回転させ、４時間の間１時間ごとに写真を撮影した。
【図５】９００μＬの１９．５重量％イオジキシノール上に層状に重ねた血清試料の勾配を示す図である。チューブは１２０，０００ｒｐｍで回転させ、４時間の間１時間ごとに写真を撮影した。
【図６】９００μＬの１９．５重量％イオジキシノール中に分散させた血清試料の勾配を示す図である。チューブは１２０，０００ｒｐｍで回転させ、４時間の間１時間ごとに写真を撮影した。
【図７】１／３０、１／１５、１／８および１／４秒のシャッター速度での血清の蛍光染色混合物の蛍光強度をチューブの座標の関数として示す図である。１０重量％ＣｓＢｉＥＤＴＡの密度勾配を用いて、チューブを１２０，０００ｒｐｍ、２０℃で４時間４０分回転させた。チューブの座標はｍｍ単位で測定し、チューブの上面を０ｍｍとした。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月27日(2003.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数の金属イオンキレート錯体の溶液に、該１種または複数の金属イオンキレート錯体が密度勾配を形成するまで遠心力場を加えることを含む密度勾配を形成する方法。
【請求項２】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約１０，０００ｒｐｍ〜約２００，０００ｒｐｍの速度で回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約８時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該溶液をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約２時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該密度勾配に沿った特定のポイントの溶液密度を決定することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該密度勾配に沿った特定のポイントの溶液密度が、そのポイントの溶液の吸光度を求め、その吸光度を密度に関連付けることによって決定される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
粒子および１種または複数の金属イオンキレート錯体の溶液を含む組成物を提供すること、ならびに、
該１種または複数の金属イオンキレート錯体が密度勾配を形成し、その密度勾配に沿って粒子がその密度に応じて分かれるまで、該組成物に遠心力場を加えることを含む、粒子をその密度に応じて分離する方法。
【請求項１３】
該金属イオンキレート錯体溶液の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該金属イオンキレート錯体溶液の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約１０，０００ｒｐｍ〜約２００，０００ｒｐｍの速度で回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約８時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
該組成物をチューブ内に入れ、そのチューブをローター内で約０．５時間〜約２時間回転させることによって遠心力場を加える請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
遠心力場を加える前に、溶液上に該粒子の層を形成する請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
遠心力場を加える前に、該粒子を溶液全体に渡って分散させる請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
１種または複数の金属イオンキレート錯体を含む密度勾配。
【請求項２４】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．０１Ｍ〜約０．７Ｍである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２５】
該金属イオンキレート錯体の平均濃度が約０．１Ｍ〜約０．３Ｍである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２６】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２７】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２８】
該密度勾配が本質的に指数関数的である請求項２３に記載の密度勾配。
【請求項２９】
ある密度勾配の１種または複数の金属イオンキレート錯体およびリポタンパク質粒子を含み、リポタンパク質粒子がその密度に応じて密度勾配に沿って分かれている組成物。
【請求項３０】
該金属イオンキレート錯体が、ＮａＢｉＥＤＴＡ、ＣｓＢｉＥＤＴＡ、ＮａＦｅＥＤＴＡ、ＮａＣｕＥＤＴＡ、およびその混合物からなる群から選択される請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
該金属イオンキレート錯体がＣｓＢｉＥＤＴＡである請求項２９に記載の組成物。
【国際調査報告】
2004525368.tif 000033
2004525368.tif 000034