(57)【要約】本発明は、以下のステップを含む架橋酵素凝固（ＣＬＥＡ）の調製方法に関する。ａ）液体媒体に存在する溶解酵素を沈殿させる、ｂ）架橋剤を用いて架橋結合させる、ｃ）オプションとして、架橋酵素凝固を洗浄する。本発明によると、I）i）クラウンエーテルと、ii）界面活性剤とで成る群から選択される化合物の存在下でステップａ）を実行する処理、およびII）有機組成が液体とは異なる第二液体でステップｃ）を実行する処理で成る群から選択される少なくとも１つの処理が実行される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋酵素凝固を調製する方法であって、
ａ）液体媒体中に存在する溶解酵素を沈殿させるステップと、
ｂ）架橋剤で架橋結合させるステップと、
ｃ）オプションとして、前記架橋酵素凝固を洗浄するステップと、
を含んでおり、
Ｉ）i）クラウンエーテルと、ii）界面活性剤とで成る群から選択される化合物の存在下で前記ステップａ）を実行する処理と、II）有機組成が前記液体と異なる第二液体で前記ステップｃ）を実行する処理とで成る群の中から少なくとも一つの処理が実行されることを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップａ）およびステップｂ）は同時に実行されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物は架橋結合後に取り除かれることを特徴とする請求項１あるいは２に記載の方法。
【請求項４】
酵素はリパーゼであることを特徴とする請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
リパーゼ触媒反応を実行する方法であって、i）エステル交換と、ii）加水分解と、iii）アンモニア分解とで成る群から選択され、架橋リパーゼ凝固は請求項４によって調製され、前記架橋リパーゼ凝固は基質と接触されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は以下のステップを含む架橋酵素凝固の調製方法に関する。
ａ）液体媒体中に存在する溶解酵素を沈殿させるステップと、
ｂ）架橋剤で架橋結合させるステップと、
ｃ）オプションで、架橋酵素凝固を洗浄するステップ。
【背景技術】
【０００２】
このような方法は、当技術分野において一般的に知られている。これは様々な酵素触媒反応を行うために用いる酵素調製品を調製するのに利用されている。たとえば、Ｃａｏ  Ｌ．他（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  第２巻（１０）、１３６１〜１３６４頁、２０００年）は、ペニシリンアシラーゼベースの凝固の調製を記述している。開示されている架橋凝固は、天然酵素ほど活性でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、酵素活性が増加した凝固を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はこの目的のために以下の群から選択される少なくとも１つの処理が実行されることを特徴とする。I）i）クラウンエーテルと、ii）界面活性剤とで成る群から選択される化合物の存在下で上記ステップａ）を実行する処理と、II）前述の液体とは有機組成が異なる第二液体で上記ステップｃ）を実行する処理。
【０００５】
本発明者は、このような処理によって活性が増加した架橋酵素凝固（ＣＬＥＡ）が得られることを発見した。本発明は特定の反応を触媒するのに使用される特定の酵素の活性増加を保証はせず、活性の増加を予測可能にもしない。しかしながら、より優れた凝固を得るように制御される追加パラメータを提供する。つまり、特定の酵素の場合には、その触媒作用がこの処理によって増加するかどうかを単純で一般的な実験により容易に調べることができる。望む反応を触媒できる各種酵素の中から、最も適切なＣＬＥＡを容易に選択できる。ＣＬＥＡは不溶性であるため、完全な水溶液、有機液体またはそれらの化合物である第二液体で洗浄できる。処理後、ＣＬＥＡは将来使えるように凍結乾燥あるいは懸濁液として保存される。
【０００６】
Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ  Ｐ．Ｌ．Ａ．他は、Ｍｏｌ．Ｃａｔ．Ｂ：Ｅｎｚｕｍａｔｉｃ誌、第１０刊、３８５〜３９３頁、２０００年で、２−メチル−１−２，４−ペンタンジオールの存在下でＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の影響を受けてリパーゼが結晶化して、架橋結晶が形成される方法を記述している。それとは対照的に、本発明は結晶ではなく沈殿剤を利用して凝固を形成する。
【０００７】
好適には、ステップａ）とステップｂ）は同時に実行される。
【０００８】
これによって、時間と手間が減少され、手順は単純化される。
【０００９】
好適実施例によると、化合物は架橋結合後に取り除かれる。
【００１０】
ＣＬＥＡで実行される接触反応の間に、高い活性を保つために界面活性剤および／あるいはクラウンエーテルが存在する必要はない。ゆえに、接触反応を妨げる場合あるいはその他の理由によって化合物を取り除くことができる。その技術分野で知られた方法の何れかを使用して取り除くことができる。それらの方法とは、特に透析法、あるいは遠心分離を利用した洗浄である。
【００１１】
本発明の方法の重要な１利用方法によると、酵素はリパーゼである。
【００１２】
ゆえに、本発明はまたリパーゼ触媒反応の実行にも関し、この反応は以下の群から選択される。i）エステル交換と、ii）相互エステル化と、iii）加水分解と、iv）エステル化と、v）アンモニア分解と、vi）アミノ分解と、vii）ペルヒドロ分解。この方法は架橋リパーゼ凝固が本発明によって調製され、この架橋リパーゼ凝固を基質と接触させることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下では実施例を用いて本発明を記述する。
【実施例１】
【００１４】
架橋リパーゼの調製
−．Ｒ  ｍｉｅｈｅｉ  リパーゼ  Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）
−．カンジダ  アントラクティカ  リパーゼ  Ｂ  ＳＰ５２５（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）
−．Ｐ．アルカリゲネスリパーゼ（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ）
【００１５】
方法  Iａ）（ＮＨ4）2ＳＯ4（水）の存在下で、０．５ｍｌの市販の酵素溶液（ＬｉｐｏｚｙｍｅあるいはＳＰ５２５、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）あるいは５０ｍｇのＰａＬ酵素パウダー（ＰａＬはＰ．アルカリゲネスリパーゼ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、デルフト、オランダ））を１０ｍｌの遠心分離管中でリン酸カリウムバッファ（１００ｍＭ、ｐＨ７）１ｍｌに溶解させる。５５０ｍｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4を加え、続いてリン酸カリウムバッファ中の５５０ｍｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4（沈殿剤）で成る１ｍｌの沈殿溶液Ａを加えた。次に、グルタルジアルデヒド（水中の２５％の溶液）８０μｌを加えた。化合物を４℃（ＳＰ５２５では室温）で１７時間かき混ぜる。化合物に３ｍｌのＨ2Ｏを加え、遠心分離機にかける。上清を傾寫し、残渣をさらに３回Ｈ2Ｏ（１回に５ｍｌずつ）と共に洗浄し、遠心分離機にかけ、傾寫する。得られた酵素調製品は、５ｍｌのＨ2Ｏ中で保存する。必要に応じて、固体は磁石でかき混ぜて分散させる。
【００１６】
方法  IｂおよびIｃ）（ＮＨ4）2ＳＯ4および界面活性剤の存在下で、沈殿溶液Ａに２５ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（方法Iｂ）あるいは２５ｍｇのトリトンＸ−１００（ＴＲ）（方法Iｃ）が加えられる点で異なるが、Iａ）を繰り返した。
【００１７】
方法  Iｄ）ジメトキシエタン（ＤＭＥ）の存在下で、市販の酵素溶液（ＬｉｐｏｚｙｍｅまたはＳＰ５２５）０．５ｍｌ、あるいはＰａＬ酵素パウダー５０ｍｇを１０ｍｌの遠心分離管内に導入し、続いて１ｍｌのリン酸カリウムバッファ（１００ｍＭ、ｐＨ７）、３ｍｌのＤＭＥおよび８０μｌのグルタルジアルデヒドを加える。化合物は４℃（ＳＰ５２５では室温）で１７時間かき混ぜる。
化合物に１ｍｌのＤＭＥを加えて、次に遠心分離機にかける。上清を傾寫し、残渣をさらに３回ＤＭＥ（１回に５ｍｌずつ）で洗浄し、遠心分離機にかけ、傾寫する。得られた酵素調製品は、５ｍｌのＤＭＥ中で保存する。必要に応じて、固体は磁石でかき混ぜて分散させる。
【００１８】
方法  Iｅ）ＤＭＥあるいはクラウンエーテルの存在下で、６．９ｍｇのクラウンエーテルジベンゾ−１８−クラウン−６が３ｍｌのＤＭＥと共に加えられている点で異なるが、方法Iｄを繰り返した。
架橋リパーゼ調製品を水あるいはＤＭＥ中で懸濁液として保存し、これらを標本Iａ〜ｅと名付けた。
【実施例２】
【００１９】
活性テスト
標本Iａ〜ｅによって調製されたＣＬＥＡの活性を、３つの反応でテストした。これらの反応は、水溶液あるいは有機溶液中で実行された。
IIｂとIIｃをテストするために、アッセイ実行前に以下の通常手順を実行した。
−水性懸濁液では、ＣＬＥＡ懸濁液の０．５ｍｌのサンプルをそれぞれ２ｍｌのエッペンドルフカップ中で凍結乾燥させた。
−有機懸濁液では、ＣＬＥＡ懸濁液の０．５ｍｌのサンプルをそれぞれ２ｍｌのエッペンドルフカップ中で遠心分離機にかけ、上清は傾寫した。
−対照として使用される天然酵素は、市販の溶液（５０μｌ）から直接、あるいはパウダー（５ｍｇ）のままで、処理を加えずに使用した。
【００２０】
IIｂおよびIIｃをテストするために、ＧＣ  Ｖａｒｉａｎ  Ｓｔａｒ  ３６００ガスクロマトグラフ（Ｖａｒｉａｎ）を用いて分析を実行した。カラム：ＣＰ  ＷＡＸ  ５２  ＣＢ  ５０ｍ×０．５３ｍｍ。キャリヤガス：窒素。
【００２１】
テスト  IIａ）プロピオン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解（水中で実行）
酵素調製品（５０μｌ）を水（ＳＰ５２５の場合は１．５ｍｌ）０．５ｍｌ中で懸濁させ、懸濁液２００μｌ（ＳＰ５２５の場合は５０μｌ）をエスター溶液２．５ｍｌ（２５℃の水中のプロピオン酸ｐ−ニトロフェニル０．４ｍＭ）に加えた。
プロピオン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解において３４８ｎｍ（ｐ−ニトロフェノールの外観）での吸光度増加測定は、Ｖａｒｉａｎの３−Ｂｉｏ  ＵＶ分光光度計を使用してモニターした。値は天然酵素の活性率として与えられる。
結果は表１に要約されている。
【表１】
2004520050.tif 000002
【００２２】
テスト  IIｂ）オクタン酸エチルのオクタノールとのエステル交換（ジイソプロピルエーテル中で実行）
酵素を入れたエッペンドルフカップに０．５ｍｌのジイソプロピルエーテルを加える。５０ｍｇの活性化ゼオライトＮａＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加える。８６ｍＭのオクタン酸エチルの溶液０．５ｍｌ、４００ｍＭのオクタノール、およびジイソプロピエーテル中の５０ｍＭデカンを加え、室温でかき混ぜる。指定時間で反応化合物を遠心分離機にかけ、アリコート（１００μｌ）を抽出し、０．５ｍｌのＤＭＥに溶解させ、ＧＣで分析する。
結果は表２に要約されている。
【表２】
2004520050.tif 000003
【００２３】
テスト  IIｃ）オクタン酸エチルの加水分解（ＤＭＥ／水の化合物中で実行）
酵素を入れたエッペンドルフカップに５０μｌのＨ2Ｏと０．９５ｍｌのオクタン酸エチル４３ｍＭの溶液、および２５ｍＭのデカンを加えて室温でかき混ぜる。指定時間で無水Ｎａ2ＳＯ4を反応化合物に加え、振動させ、遠心分離機にかける。続いて、アリコート（１００μｌ）を抽出し、０．５ｍｌのＤＭＥに溶解させ、ＧＣで分析する。
結果は表３に要約されている。
【表３】
2004520050.tif 000004
上記の結果が示すように、本発明によって界面活性剤あるいはクラウンエーテルを加えることは、酵素活性に有益な効果をもたらすであろう。
【００２４】
例３
洗浄テスト
ＳＰ５２５を用いて方法Iａを繰り返した。上清を傾寫し、ペレットを５ｍｌの水中で再び懸濁させ、遠心分離機にかけ、上清を傾寫する。
得られたペレットは、５ｍｌの水あるいはＤＭＥで同手順を用いて３回洗浄する。最後の洗浄ステップ後、ＣＬＥＡを５ｍｌの同じ溶媒に保存する。
オクタノールを用いたオクタン酸エチルのエステル交換（テストIIｃの記述を参照）を使用して２つのＣＬＥＡをテストした。
２ｍｌのエッペンドルフ中の酵素調製品５０μｌに０．５ｍｌのＤＭＥを加える。水のみで洗浄された酵素は、エッペンドルフカップ中で前もって凍結乾燥させた。５０ｍｇの活性化ゼオライトＮａＡを加える。８６ｍＭのオクタン酸エチルの溶液０．５ｍｌ、４００ｍＭオクタノール、およびＤＭＥ中の５０ｍＭのデカンを加え、室温でかき混ぜる。１時間後に反応化合物を遠心分離機にかけ、アリコート（１００μｌ）を抽出し、０．５ｍｌのＤＭＥ中に溶解させ、ＧＣで分析する。
【表４】
2004520050.tif 000005
【００２５】
例４
リパーゼＣＬＥＡは例１で記述された手順によって調製され、マンデル酸メチルの加水分解でテストされた。酵素をジメトキシエタンリン酸カリウムバッファｐＨ７（９５：５、ｖ／ｖ）中のマンデル酸メチルの溶液５０ｍＭに加えた。４８時間後、ＨＰＬＣを用いて変換と基質の鏡像異性超過（ｅｅｓ）を分析した（表５参照）。
【表５】
2004520050.tif 000006
表５から、本発明の方法を使用することで鏡像異性率が増加することが分かる。
【国際公開パンフレット】
2004520050.tif 000007
2004520050.tif 000008
2004520050.tif 000009
2004520050.tif 000010
2004520050.tif 000011
2004520050.tif 000012
2004520050.tif 000013
2004520050.tif 000014
2004520050.tif 000015
【国際調査報告】
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2004520050.tif 000017
2004520050.tif 000018
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