(57)【要約】動物が交配後妊娠しなかったかあるいは妊娠しているかどうかを決定するための方法およびキット。妊娠誘導タンパク質の発現のレベルを、妊娠状態の情報が望まれる動物で測定し、そのレベルを妊娠していない動物のレベルと比較する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の交配後の妊娠初期期間中の動物の妊娠誘導タンパク質の発現のレベルを測定し、さらに動物における該タンパク質の発現のレベルを同種の妊娠していない動物のレベルと比較することを有する動物の妊娠状態の決定方法。
【請求項２】
妊娠誘導タンパク質はタイプＩインターフェロン誘導タンパク質(Type I Interferon-induced protein)である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タイプＩインターフェロン誘導タンパク質はインターフェロン−タウ（ＩＦＮτ）誘導タンパク質(Interferon-tau-induced protein)である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
動物は反芻動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
有蹄動物以外の反芻動物は、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、及びビクーナから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
動物は有蹄動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヤク、水牛、バイソン、アンテロープ、及びシカから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
動物は、雌ヒツジまたは雌ウシである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動物は有蹄動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
動物は、ウマまたはブタである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質は、２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ、β２−ミクログロブリン、ＩＦＮ調節因子１、ユビキチン交差反応性タンパク質、及びＭｘタンパク質から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質はＭｘタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質の発現レベルは、タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｍＲＮＡの測定は、ノーザンブロット分析、スロット−ブロット分析、またはポリメラーゼ連鎖反応による、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質の発現レベルは、タンパク質のレベルを測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質の産生のレベルの測定は、タンパク質への抗体の結合を評価することによるまたはタンパク質の機能に基づくアッセイによる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質の産生のレベルは、比色アッセイによって検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質の発現レベルは、動物の細胞におけるタンパク質の発現を測定することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞は有核血液細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞は末梢血単核細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質の発現レベルは、動物の体液を分析することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
体液は、乳汁、唾液、尿、または鼻、眼、若しくは膣の分泌物から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
体液は、血液、血漿、または血清である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
動物は、妊娠初期期間中の動物のタンパク質の発現のレベルが同種の妊娠していない動物のタンパク質の発現のレベルに比して上昇していない場合には妊娠していないと決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
動物は、妊娠初期期間中の動物のタンパク質の発現のレベルが同種の妊娠していない動物のタンパク質の発現のレベルの２倍以上である場合には妊娠していると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
動物は、妊娠初期中の動物のタンパク質の発現のレベルが同種の妊娠していない動物のタンパク質の発現のレベルの４倍以上である場合には妊娠していると決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
比較は、動物におけるタンパク質の発現のレベル及び妊娠しているまたは妊娠していないことが知られている動物の発現のレベルの並列比較(side-by-side comparison)による、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
比較は履歴コントロール(historical control)を用いることによる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
妊娠認識シグナル伝達の期間中に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
動物の交配から１２〜３０日の間の期間中に行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
動物の交配から１２〜２１日の間の期間中に行なわれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
動物の交配から１８〜２１日の間の期間中に行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
試験サンプルを保持するための容器、該容器中の試験サンプルと混合されると、オペレーターが試験サンプル中の妊娠誘導タンパク質のレベルを目視で測定できるような、一以上の試薬、およびサンプル中のタンパク質のレベルに基づいて動物の妊娠状態を決定するための指示書を有する、動物の妊娠状態を決定するためのキット。
【請求項３４】
妊娠誘導タンパク質はインターフェロン−タウ（ＩＦＮτ）誘導タンパク質(Interferon-tau-induced protein)である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＩＦＮτ誘導タンパク質はＭｘタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＩＦＮτ誘導タンパク質はＩＳＧ−１７である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
妊娠誘導タンパク質のエピトープに結合する抗体が結合する試験表面、タンパク質の第二のエピトープに結合する第二の標識抗体を有する容器、タンパク質の基準濃度を有する標準サンプルを有する容器、標識された第二の抗体と接触すると、存在するタンパク質の相対的な量が目視できるような試薬、および試験サンプルが妊娠または妊娠していない状態を示す量のタンパク質を含むかどうかを決定するためのキットの使用に関する指示書を有する、動物の妊娠状態を決定するためのキット。
【請求項３８】
妊娠誘導タンパク質はインターフェロン−タウ（ＩＦＮτ）誘導タンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＦＮτ誘導タンパク質はＭｘタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＦＮτ誘導タンパク質はＩＳＧ−１７である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物の妊娠状態の決定方法に関するものである。特に、本発明は、有蹄動物以外の動物(non-ungulate)、有蹄動物、及び反芻動物の妊娠状態の決定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
家畜の育成において、交配した動物の妊娠状態を正確に決定することは非常に重要である。特に、交配した動物が妊娠していないことを正確にかつ早期に同定することは経済上重要である。現在、動物、例えば、ウシを交配すると、妊娠状態が触診等の方法によって決定されるが、この方法は交配してから３０日後までは正確な妊娠状態の決定ができない。ウシは約２１日の発情周期を有するため、これは、現在利用されている方法では、妊娠しそこなった動物を交配する機会、即ち、交配を失敗した直後の発情期間を少なくとも１回失うであろうことを意味する。
【０００３】
これは、ウシの交配工業、特に酪農工業では重要な経済的な結果を有する。効率よく牛乳を生産する農業には、ウシが自然分娩してから８０〜１００日で妊娠するようにうまく交配することが必要である。しかしながら、酪農用のウシは、人工受精では受精率が低く、平均で１回の妊娠に２．５〜３回受精が必要である。したがって、酪農家が、交配に失敗した後の次の発情期間に動物を再交配する機会を失うことなく動物が妊娠していないことを正確に決定する方法に対する必要性がかなりある。
【０００４】
参考によって本明細書中に引用される、Sasser、米国特許第４，７０５，７４８号には、受胎動物によって生産されるタンパク質を検出することによって妊娠を決定する方法が開示される。この方法によって、ウシは、交配してから２７日という初期に妊娠していることが決定された。Sasserは、次の発情期間が妊娠していないウシで始まるであろう時期前の妊娠の診断は開示しておらず、また、妊娠していないことの初期の決定をも開示していない。
【０００５】
有蹄動物の妊娠の母体の認識は、黄体退行シグナル、プロスタグランジンＦ２α（（ＰＧＦ２α）；Yankey et al., Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred, non-pregnant ewes.  Journal of Endocrinology 170, R7-R11 (2001);  Bazer et al., Regulation of endometrial responsiveness to estrogen and progesterone by pregnancy recognition signals during the peri-implantation period. In Molecular and Cellular Aspects of Peri-implantation Processes, pp 27-47. Ed S.K. Dey. Springer-Verlag, New York, Inc. (1995)）の生産が減少または変化する、受胎動物による局所的な及び全身の遺伝子の調節を伴う。これは、受胎動物が生産する絨毛性性腺刺激ホルモンによる黄体（ＣＬ）への直接的な黄体刺激効果を有する、霊長動物における妊娠の認識と反対である(Bazer et al. 1995)。有蹄動物における母体認識に関するシグナルは、妊娠の第２〜第３週のインターフェロン−タウ(Interferon-tau)（ＩＦＮτ）の受胎動物による分泌物である(Bazer et al., 1995; Godkin et al., J. Reprod. Fert. 65:141-150(1982))。ＩＦＮτは、子宮内膜のエストロゲン及びオキシトシンレセプターの増加を防止し、ＰＧＦ２αのオキシトシン誘導性黄体退行パルスを除去して、ＣＬ機能を維持する(Spencer et al., Endocrinology 136:4932-4944 (1995))。
【０００６】
ＩＦＮτは、ＩＦＮα、β、及びω(Samuel, Virology 183:1-11 (1991))、ならびにさらに最近では、インターフェロンδ(Lefevre, F., et al., Biochimie 80:779-788 (1998))をも含む、タイプＩ  ＩＦＮ群のひとつである。タイプＩ  ＩＦＮレセプターならびにヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）−シグナルトランスデューサー及び転写の活性化因子（ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を介したＩＦＮτのシグナル伝達(Stewart et al., Endocrinology 142:98-107 (2001))は、２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ(2',5' oligoadenylate synthetase)(Johnson et al., Biol. Reprod. 64:1392-1399 (2001))、β２−ミクログロブリン(Vallet et al., J. Endocrinol. 130:R1-4 (1991))、ＩＦＮ調節因子１(Spencer et al., 1998)、ユビキチン交差反応性タンパク質(Johnson et al., Biol. Reprod. 62:622-627(2000))、及びＭｘタンパク質(Charleston and Stewart, Gene 137:327-331(1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998))等のヒツジの子宮で数多くの遺伝子を誘導する。抗ウィルス応答におけるこれらのタンパク質の多くの機能の特徴がかなり明らかであるものの、妊娠初期中のその役割は明らかではない。
【０００７】
Ｍｘタンパク質は、単量体のＧＴＰａｓｅであり、動物の種及びウィルスのタイプによって、ウィルスの複製の強力な阻害剤となる(Samuel, Virology 183:1-11 (1991))。ヒツジ、ウシ、ブタ、及びウマ等の、様々な種由来のＭｘタンパク質の配列がＧｅｎＢａｎｋにより公的に利用でき、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号Ｘ６６０９３、Ｕ８８３２９、Ｍ６５０８７、及びＵ５５２１６で寄託されている。Ｍｘの抗ウィルス効果は、通常、マイナス鎖ＲＮＡウィルス（例えば、オルトミキソウィルス(orthormyxovirus)）に対するものであるが、その発現はタイプＩ  ＩＦＮレセプターを有する全ての細胞中で誘導され、細菌及びウィルス感染を区別するのに使用されてきた(Haller et al., Rev. Sci. Tech. 17:220-230 (1998))。近年、ＭｘのｍＲＮＡ及びタンパク質は、妊娠した雌ヒツジの子宮壁内で上皮（１３日まで）から子宮筋層（１５日まで）まで上昇することが示され、レベルは２５日をとおして上昇したままだった(Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998))。加えて、ＭｘのｍＲＮＡレベルは、子宮腔中にｒｏＩＦＮτを注射したことに応答して黄体中で上昇した(Spencer et al., Biol Reprod 61:464-470 (1999))。
【０００８】
これらの結果から、ＩＦＮτは、１）すべての子宮細胞型（即ち、上皮、間質及び子宮筋層）でならびにＣＬで直接作用する；または２）子宮の細胞及び卵巣等の他の器官でパラクリン／内分泌効果を有する物質（サイトカイン）を誘導する；または３）子宮粘膜の成分に影響を及ぼして、免疫系を循環した後、様々な子宮細胞及びＣＬに影響を与えることが示された。
【０００９】
しかしながら、妊娠状態を評価する試験として子宮組織中のＭｘタンパク質のレベルを測定することは実用的でない。侵襲性でかつ時間と手間がかかるプロセスである上、Ｍｘの子宮レベルを測定するのに必要である子宮組織の破壊が妊娠に有害な影響を与える傾向がある。
【００１０】
家畜の妊娠または妊娠していないことを決定する信頼性の高い、再現性のある及び非侵襲性の方法に対する必要性がかなりある。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ、β２−ミクログロブリン、ＩＦＮ調節因子１、ユビキチン交差反応性タンパク質（「インターフェロン刺激遺伝子因子１７(interferon stimulated gene factor 17)」（「ＩＳＧ−１７」）としても知られている）、及びＭｘタンパク質などの、本明細書中では「妊娠誘導タンパク質(pregnancy-induced protein)」と称される、いくつかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が妊娠の初めの１ヶ月の間、特定の動物で有意に増加することを発見した。さらに、妊娠誘導タンパク質の発現の増加が妊娠していない動物では起こらないことを発見した。
【００１２】
多くの動物では、妊娠誘導タンパク質の発現の増加は、妊娠の母体認識に関するシグナルと称される、その存在の胚からの母親へのシグナルである、ホルモン、タイプＩインターフェロンの胚による分泌によるものである。インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンオメガ（ＩＦＮω）、インターフェロンデルタ（ＩＦＮδ）、及びインターフェロンタウ（ＩＦＮτ）等の、様々なタイプＩインターフェロンは、様々な種の胚によって分泌される。例えば、ＩＦＮτは反芻動物で妊娠認識ホルモンとして分泌され、ＩＮＦδはブタで分泌される。ウマ及び他のウマ科等の、他の種では、妊娠誘導タンパク質であるＭｘタンパク質が妊娠初期中に子宮で検出できるものの、現在まで、タイプＩインターフェロンのウマの受胎動物による分泌は示されていなかった。むしろ、ウマや受胎動物がタイプＩ  ＩＦＮを産生しない他の種では、子宮が胚の存在に応答してタイプＩインターフェロンを産生することが可能である。
【００１３】
一実施態様においては、本発明は、動物の妊娠状態を決定する方法である。本発明のこの実施態様によると、妊娠初期中の妊娠誘導タンパク質(pregnancy induced protein)の発現のレベルを測定し、同種の妊娠していない雌動物における同じ期間中の妊娠誘導タンパク質の発現のレベルと比較する。好ましくは、測定、比較される妊娠誘導タンパク質は、タイプＩインターフェロン誘導タンパク質である。最も好ましくは、妊娠誘導タンパク質は、Ｍｘタンパク質またはＩＳＧ−１７である。
【００１４】
本明細書中で使用される、「妊娠誘導タンパク質(pregnancy-induced protein)」ということばは、母体遺伝子によって発現し、その発現が妊娠の存在に応答して誘導されるタンパク質を意味する。妊娠誘導タンパク質は、このようなタンパク質が母体遺伝子によっても発現し、この母体の発現が妊娠の存在に応答して誘導される場合でなければ、受胎動物によって生産されるタンパク質とは区別される。
【００１５】
本明細書中で使用される、「妊娠初期」ということばは、妊娠誘導タンパク質のレベルが同種の妊娠していない動物に比して妊娠動物では上昇する妊娠認識シグナル伝達(pregnancy recognition signaling)期間中または後の時期を意味する。交配がうまくいかない、即ち、妊娠しなかった動物が妊娠認識シグナル伝達の期間を経るか経ないかにかかわらず、「妊娠初期」ということばは、妊娠していない動物に関しては、交配がうまくいった場合には妊娠初期があろう期間を意味するように本明細書中で使用される。具体的には、本発明の方法に関して使用される、妊娠初期の期間は、受胎してから最初の約１ヶ月末で終了する。
【００１６】
本明細書中で使用される、「妊娠認識シグナル伝達の期間」ということばは、胚が、その分泌により胚の存在を母体に認識させる、タンパク質またはホルモンを分泌する間の期間を意味する。交配がうまくいかない、即ち、妊娠しなかった動物が妊娠認識シグナル伝達期間を経るか経ないかにかかわらず、このことばは、妊娠していない動物に関しては、交配がうまくいった場合には、生化学的なシグナル伝達が受胎動物及び子宮間で起こる期間を意味するように本明細書中で使用される。
【００１７】
本発明によると、妊娠した動物は、同種の妊娠していない動物に比べて、妊娠認識シグナル伝達の期間中などの、妊娠初期中の、Ｍｘタンパク質またはＩＳＧ−１７などの、一以上の妊娠誘導タンパク質の発現のレベルが顕著に高くなるであろう。妊娠していない動物は、その動物が交配したか否かにかかわらず、この期間中に、Ｍｘタンパク質等の、妊娠誘導タンパク質の発現の基準レベル付近を示すであろう。
【００１８】
他の実施態様においては、本発明は、受胎動物が妊娠の母体の認識に関するシグナルとしてタンパク質またはホルモンを分泌する種の動物の生殖状態を決定するためのキットである。本発明のこの実施態様によると、キットは、試験サンプルを保持するための容器、試験サンプルと混合されると、オペレーターが、試験サンプル中の、Ｍｘタンパク質またはＩＳＧ−１７等の、一以上の妊娠誘導タンパク質のレベルを目視で測定できるような、一以上の試薬、およびサンプル中のタンパク質のレベルを決定するための指示書を有する。好ましくは、キットは、オペレーターが、サンプル中の測定されたタンパク質のレベルに基づいて動物の妊娠状態を決定できるような指示書をさらに含む。
【００１９】
本発明を、Ｍｘタンパク質を参照しながら以下にさらに詳細に説明する。当業者は、下記開示が、詳細に説明されるＭｘタンパク質に加えて、２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ、β２−ミクログロブリン、ＩＦＮ調節因子１、及びユビキチン交差反応性タンパク質等の、ＩＦＮτ誘導タンパク質などの、他のタイプＩインターフェロン誘導タンパク質等の、他の妊娠誘導タンパク質に適用できることを理解するであろう。したがって、下記開示において、「Ｍｘタンパク質」ということばに言及すると、他の妊娠誘導タンパク質を代わりに使用してもよい。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１は、雌ヒツジを人工授精してから２６日目のＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）のＭｘ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析である。レーン１〜６は、妊娠した雌ヒツジを表わし、およびレーン８〜１３は、妊娠していない雌ヒツジを表わす。Ｍｘ  ｍＲＮＡは、約２．５ｋｂで泳動された。
【００２１】
図２は、雌ヒツジを人工授精してから２６日目のＰＢＭＣから単離された全細胞ＲＮＡのスロット−ブロット分析の結果を示すグラフである。Ｍｘ  ｍＲＮＡレベルは、Ｄ２６で交配したが妊娠しなかった雌ヒツジに対して妊娠した雌ヒツジで約４倍より大きかった（Ｐ＜０．０１）。ＰＳＰＢ（妊娠に特異的なタンパク質Ｂ）レベル（◆）から、妊娠状態が確認され、これは誕生した子羊の数と相関した。（図２のＣＮＴＳは、化学発光ノーザンブロットの光子計測数を示す。）
図３は、人工授精してから０〜３０日での人工授精された妊娠した及び妊娠しなかった雌ヒツジのＰＢＭＣ中のＭｘ  ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。（図３のＣＮＴＳは、化学発光スロット−ブロットの光子計測数を示す。）
図４は、人工授精してから１５及び１８日の妊娠した及び妊娠しなかった雌ヒツジのＰＢＭＣのＭｘタンパク質発現のウェスタンブロット分析である。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、妊娠初期中に増加したレベルの一以上の妊娠誘導タンパク質を分泌する動物種に適用できる。好ましくは、動物種は、妊娠の母体認識に関するシグナルとしてタイプＩインターフェロンを分泌するものである。最も好ましくは、動物種は、妊娠の母体認識に関するシグナルとしてホルモンＩＦＮτを分泌するものである。これらの動物では、増加したレベルの、ＩＦＮτ等の、タイプＩインターフェロンは、妊娠認識シグナル伝達の期間中Ｍｘタンパク質の発現の促進を誘導する。本発明によると、妊娠初期中に、好ましくは交配後の妊娠認識シグナル伝達の期間中を含む期間中に、適当な動物で、Ｍｘタンパク質等の、妊娠誘導タンパク質の発現が増加しないことは、動物が妊娠していないという陽性の表示である。これに対して、この期間中にタンパク質の発現が増加する、陰性の結果は、動物が妊娠していることを示す。
【００２３】
本願では、Ｍｘタンパク質等の、妊娠誘導タンパク質の発現が増加しないことを陽性結果と称し、タンパク質の発現が増加することを陰性結果と称する。農場主または牧場主または動物育種に携わる他の人に最も関心があるのは、妊娠ではなくむしろ、妊娠していないことを発見することであるため、最初は「陽性」及び「陰性」結果ということばの一般的な使用とは逆であるように見える、この用語が本明細書中では使用される。動物が妊娠していると決定されたら、妊娠が終了した兆候を探すために雌を見る以外には、確かに妊娠していることを確かめる作業をさらに行なうことはない。これに対して、動物が妊娠していないと決定されたら、次の発情の開始についてさらに評価されなければならず、さらに再度交配させるであろう。したがって、確実に妊娠させるために動物に労力がさらに払われる起動力を提供するのは妊娠をしていないものを見つけることである。
【００２４】
上述したように、本発明は、ＩＦＮτ等のタイプＩインターフェロンが妊娠の母体認識に関する単一のシグナルまたは一以上のシグナルのうちの一である種の動物等の、妊娠初期中に増加したレベルの妊娠誘導タンパク質を産生する種に属する雌動物に適用できる。本発明の方法に適する動物としては、有蹄動物及び有蹄動物以外の反芻動物がある。有蹄動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヤク、水牛、及びバイソン等の、反芻動物であってもよい。また、アンテロープ、ガゼル、ヘラジカ 、トナカイ、ムース、オオツノヒツジ、キリン、及びウシ、ヒツジ、及びヤギ科の他のものなどの家畜化されていない有蹄動物もまた、本発明に適する有蹄の反芻動物に含まれる。本発明の方法に適する有蹄動物以外の反芻動物としては、フタコブラクダ及びヒトコブラクダならびにラマ、アルパカ、及びビクーナ等の他のラクダ科(camellids)が挙げられる。本発明に適する反芻動物以外の有蹄動物としては、家畜化された及び家畜化されていないブタ及びウマがある。本発明の方法に適する動物には、有蹄動物及び有蹄動物以外の反芻動物以外の動物が包含される。例えば、ヒト等の霊長類、さらにはイヌ及びネコが、本発明の方法に適すると考えられる。
【００２５】
本発明の方法によると、交配後の適当な期間中に、動物を、以降、Ｍｘタンパク質で具体的に説明される、妊娠誘導タンパク質の増加した発現の、存在に関して、またはより正確には存在しないことに関して試験される。試験は、Ｍｘタンパク質が発現する細胞を利用してまたはＭｘタンパク質が検出される体液中で行なわれてもよい。
【００２６】
動物がＭｘタンパク質の発現を増加するまたは増加しないかを決定する際に、妊娠していないことが知られている動物における発現のレベルとの比較がなされる。この比較は、例えば、交配されたが妊娠状態が不明である動物からの試験サンプルの並列比較(side-by-side comparison)を行なうことによってなされてもよい。またはおよび好ましくは、比較は、交配されたが妊娠状態が不明である動物からのサンプルを試験し、このサンプル中のＭｘタンパク質のレベルを妊娠していない動物に存在することが知られているＭｘタンパク質のレベルと比較する、すなわち履歴コントロール(historical control)を用いることによってなされてもよい。
【００２７】
本発明を、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＭｘタンパク質の向上した発現の測定について本明細書で詳述する。しかしながら、血流中に存在する他の有核細胞等の、Ｍｘタンパク質を発現するいずれの細胞がＰＢＭＣの代わりに使用されてもよい。同様にして、本発明による向上したＭｘの発現は、乳汁、唾液、尿または鼻、眼、若しくは膣の分泌物、または全血、血漿若しくは血清等の体液の分析によって測定されてもよい。
【００２８】
ほとんどの種での母体認識の期間はほとんど同時、例えば、雌ヒツジでは交配してから１２〜１４日目及び雌ウシでは１５〜１８日目に起こるが、妊娠の母体認識が起こる胚のシグナル伝達の期間は異なる種によって幾分異なる。したがって、本発明の方法が有効に実施される交配後の実際の日にちは異なるであろう。例えば、家畜化されたヒツジでの妊娠シグナル伝達の母体認識の期間は、具体的には、交配してから約１１日から始まり、約２１日目まで続く。ウシでは、この期間は、具体的には、交配してから約１３日から始まり、約３５日目まで続く。
【００２９】
試験サンプルにおけるＭｘタンパク質発現のレベルをＭｘタンパク質発現の基準の（妊娠していない）レベルと比較する際には、基準より具体的に２倍以上高いＭｘタンパク質発現が陰性試験結果であり、即ち、その動物は妊娠していないとは決定されない。一般的に、妊娠認識シグナル伝達の期間中のＭｘタンパク質発現のピークレベルでは、妊娠した動物は、基準の４若しくは５倍、またはそれ以上までのＭｘタンパク質発現のレベルを有するであろう。
【００３０】
本発明によると、方法は、妊娠誘導タンパク質のレベルが同種の妊娠していない動物と比較して妊娠している動物でもはや上昇しなくなるまでシグナル伝達の期間の始まりから開始していずれの時期に行なってもよい。妊娠した動物が妊娠していない動物に比べて高いＭｘタンパク質発現を有するのはこの期間中である。ゆえに、ヒツジやウシでは、妊娠状態を決定するためにＭｘタンパク質発現のレベルを比較するのに好ましい期間は、交配後１２〜３０日の間である。より好ましい期間は、交配後１２〜２１日の間である。最も好ましい期間は交配後１５〜２１日の間であり、最も好ましい時期はウシでは１８日であり、ヒツジでは１５日である。
【００３１】
Ｍｘタンパク質発現のレベルは、この測定がなされるいずれの方法によって測定されてもよい。適当な方法としては、ＥＬＩＳＡ試験、Ｍｘタンパク質の機能に基づくアッセイ、またはウェスタンブロットによるなど、Ｍｘタンパク質自身を検出することがある。また、適当な方法としては、ノーザンブロット、スロットブロット、またはＰＣＲによるなど、Ｍｘ  ｍＲＮＡのレベルの増加を検出することがある。好ましい実施態様においては、Ｍｘタンパク質発現のレベルは、ヒト家庭での妊娠診断キットで使用される方法と同様の、例えば、Ｍｘタンパク質への抗体の結合に基づいた、比色アッセイによってサンプル中に存在するＭｘタンパク質のレベルを検出することによって測定される。
【００３２】
本発明の方法は、動物が妊娠していないことを予想どおりに決定する正確で再現性のある試験であり、また、動物が妊娠していることを決定するのに同様にして使用されてもよい。必ずしも他の妊娠誘導タンパク質ではそうではないが、特にＭｘタンパク質に関しては、動物が妊娠していることを誤って示す、Ｍｘタンパク質発現のレベルが増加する偽陰性結果の源が動物が重篤なウィルス感染にかかっている場合にある。
【００３３】
本発明のキットは、「免疫測定(immunometric)」または「サンドイッチ」アッセイとして知られているもの等の、酵素様免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）に基づくことが好ましい。このようなアッセイは、リガンド（抗原等）を、干渉しないようにかつ異なるエピトープ部位でリガンドと複合体を形成する２以上のレセプター分子（抗体等）で「サンドイッチ」することを含む。このようなアッセイの例は、David et al.、米国特許第４，４８６，５３０号に記載される。または、キットは、化学発光アッセイ、強化発光アッセイ(enhanced luminescence assay)、及びラジオイムノアッセイに基づくものであってもよい。好ましい実施態様においては、キットは、Ｍｘタンパク質等の、有益なタンパク質のエピトープに結合する抗体が結合する、スライドまたは複数の試験ウェル等の、試験表面を有するパッケージ、タンパク質の第二のエピトープに結合する第二の標識された抗体を有する容器、タンパク質の基準濃度を有する標準サンプルを有する容器、標識された第二の抗体と接触すると、存在するタンパク質の相対的な量が目視できるような試薬、および試験サンプルが妊娠または妊娠していない状態を示すＭｘタンパク質の量を含むかどうかを決定するためのキットの使用に関する指示書を有する。
【００３４】
コントロールに比べた試験サンプル中の、Ｍｘタンパク質等の、妊娠誘導タンパク質の相対的な量を測定することによる妊娠状態の決定のための本発明のキットは、多くの様々な様式で配合されてもよく、これは本明細書の記載を読めば当業者には明らかであろう。本発明のキットのこれらの様々な配合は本発明に包含されるものである。
【００３５】
本発明を、下記詳細な実施例でさらに記載するが、本発明を限定するものではない。実施例では、Ｍｘタンパク質を参照しながら本発明の方法を説明する。しかしながら、本発明の方法は、他の妊娠誘導タンパク質にも適用できる。
【００３６】
実施例１  動物モデル
６０匹のU.S. Sheep Experiment Station(USSES, Dubois ID)の成熟した、顔の白い雌ヒツジ(white-faced, ewe)を、同調させて、経子宮頚部による(transcervical)または腹腔鏡による人工授精（「ＡＩ」）のいずれかによって交配した。腹腔鏡によるＡＩは、Stellflug et al., J. Anim. Sci. 79:568-573 (2001)に開示される方法に従って行なった。人工授精の日を０日（Ｄ０）と称した。ＡＩから２６日目（Ｄ２６）に、血液（１０ｍｌ）を、ＥＤＴＡ含有真空管(vacutainer tube)(Sherwood Medical, St. Louis MO)中に頚静脈穿刺によって集めた。ＰＢＭＣを以下の実施例２に記載されるのと同様にして単離した。妊娠を、妊娠に特異的なタンパク質Ｂ（ＰＳＰＢ；Biotracking Inc, Moscow ID）について血清をアッセイすることによって決定し、子羊が生まれた日(lambing date)及び生まれた子羊の数を記録した。
【００３７】
実施例２  ＰＢＭＣの単離
血液を処理するまで氷上に保存した。サンプルを、４℃で３００×ｇで２０分間、遠心した。バフィコートを除き、５に対して１の割合で、０．８７％  Ｔｒｉｓ−ＮＨ４ＣＬ溶解バッファーに再懸濁した。サンプルを３７℃で５分間インキュベートし、３００×ｇで１０分間、遠心した。上清を除去し、ペレットを１０ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、３００×ｇで１０分間、遠心した。上清を除去した後、細胞ペレットをタンパク質の抽出のために−８０℃で冷凍した、または２ｍｌ  ＴＲＩＺＯＬ(Life Technologies, Grand Island NY)で溶解して、ＲＮＡの抽出のために−８０℃で貯蔵した。
【００３８】
実施例３  ＲＮＡの抽出、ノーザン及びスロット−ブロット分析
全細胞ＲＮＡを、製造社の指示に従ってＴＲＩＺＯＬを用いて抽出した。ＲＮＡを、Ａ２６０：２８０比によって定量した。ＰＢＭＣ中のＭｘ転写物の大きさ及び数を確立するために、ＲＮＡ（５μｇ）を１％アガロース／０．６１５Ｍホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、キャピラリーブロッティング(capillary blotting)によってナイロン膜(Nytran, Schleicher & Schuell, Keene NH)に移した。ＰＢＭＣ中のＭｘ  ｍＲＮＡレベルの定量を目的として、ＲＮＡ（５μｇ）を真空瀘過(Minifold II, Schleicher & Schuell, Keene NH)によってナイロン膜に移した。ブロットを、ノース２サウスハイブリダイゼーションキット(North2South Hybridization kit)(Pierce, Rockford IL)を用いてビオチン標識ヒツジＭｘアンチセンスｃＲＮＡプローブ(Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998))で調べ、化学発光シグナルをバイオ−ラッド  フルオル−Ｓ  マルチイメージャーシステム(Bio-Rad Fluor-S MultiImager system)及びクォンティティー  ワンソフトウェア(Quantity One software)(Bio-Rad, Hercules CA)を用いて定量した。スロット−ブロットをはずして、ヒツジの１８ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡプローブで再度調べて、ＲＮＡローディングでの変動を修正した。
【００３９】
ノーザンブロット分析では、図１に示されるように、妊娠したおよび交配したが妊娠しなかった雌ヒツジから単離されたＰＭＢＣ中に、単一の、約２．５ｋＤのバンドが検出され、これはヒツジの子宮のＭｘ  ｃＤＮＡの既知のサイズと一致する(Charleston and Stewart, Gene 137:327-331(1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998))。
【００４０】
ＡＩ後のＤ２６に集められたＰＢＭＣから単離された全細胞ＲＮＡの、図２に示されるような、スロットブロット分析から、交配したが妊娠しなかった（ｎ＝２６）雌ヒツジに対して妊娠した雌ヒツジではＭｘ  ｍＲＮＡレベルが４倍増加したことが示された（Ｐ＜０．０１）。加えて、複数個（３個または４個；ｎ＝１０）を有する雌ヒツジは、１個（ｎ＝１０）または２個（ｎ＝９；Ｐ＜０．０５）を有するものに比べてＭｘ  ｍＲＮＡレベルがより高かった。ＰＳＰＢ（妊娠に特異的なタンパク質Ｂ）アッセイの結果から妊娠の状態が決定され、さらに従来報告されているのと同様に、ＰＳＰＢのレベルが生まれた子羊の数と相関した(Willard et al., J. Anim. Sci. 73:960-966 (1995))。
【００４１】
実施例４  ヒツジの妊娠初期中のＭｘタンパク質ｍＲＮＡの経時的な発現
第二の研究では、図３に示されるように、ヒツジの妊娠初期中のＭｘ  ｍＲＮＡの経時的な発現を調べた。３４匹の成熟したサフォーク雌ヒツジ(Suffolk ewe)を、同調させて、腹腔鏡によるＡＩによって交配した。血液（２０ｍｌ）をＤ０、及びＤ９〜Ｄ３０までは３日毎に頚静脈穿刺によって集め、ＰＢＭＣを単離した。妊娠を、Ｄ３０でリアルタイム超音波検査及びＰＳＰＢアッセイによって確認した。図３に示される結果は、すべての雌ヒツジの代表的なサブセットであり、受精してからはじめの３０日の間の４匹の妊娠したおよび４匹の交配したが妊娠しなかった雌ヒツジの結果を示すものである。これから、１回のブロットですべての複製物が分析でき、ブロット間のシグナル強度に関連する問題を排除できた。結果から、妊娠した雌ヒツジで増加したＭｘ  ｍＲＮＡレベルがＤ１５で始まる（Ｐ＜０．０１）ことが示された。レベルはＤ２１でピークに達し、それ以降は徐々に減少した。Ｄ３０で、妊娠した雌ヒツジでのＭｘレベルは、交配したが妊娠しなかった雌ヒツジに比べて２倍高いままであった（Ｐ＜０．０１）。
【００４２】
実施例５  タンパク質の単離およびウェスタンブロット分析
全細胞タンパク質を、製造社の指示に従って、Ｍ−ＰＥＲ試薬(M-PER reagent)(Pierce, Rockford IL)を用いて抽出した。サンプルのタンパク質濃度を、ウシ血清アルブメン(albumen)を標準物質として使用したＢＣＡアッセイ(Pierce, Rockford IL)によって定量した。Ｄ１５及びＤ１８で妊娠したおよび交配したが妊娠しなかった雌ヒツジから単離されたＰＭＢＣのタンパク質（８μｇ／サンプル）を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜(BA83, Schleicher & Schuell, Keene NH)に移した。２５℃で２時間、トリス緩衝化生理食塩水(Tris-buffered saline)及びＴｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）における５％脱脂粉乳中で非特異的な結合部位をブロッキングした後、膜を、４℃で一晩、ポリクロ−ナルウサギヒツジＭｘペプチド抗血清(#90618-2; 0.7μg/ml)の１：１０００希釈液と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（０．８μｇ／ｍｌ） を、第２の抗体として１：２００，０００の希釈率で使用した。化学発光シグナルを、ウェスト  フェムト  マキシマム  センシティビティー  サブストレート(West Femto Maximum Sensitivity Substrate)(Pierce, Rockford IL)を用いて発色させ、フルオル−Ｓ  マルチイメージャーシステム(Fluor-S MultiImager system)及びクォンティティー  ワンソフトウェア(Quantity One software)を用いて定量した。
【００４３】
図４に示されるように、Ｍｘタンパク質（約７５ｋＤａ）はＤ１５またはＤ１８のオープンな（妊娠していない）雌ヒツジのいずれでも検出されなかったが、双方の日にちで妊娠した雌ヒツジのＰＢＭＣではかなりアップレギュレートされた。別の２つのバンド（約４８及び３６ｋＤａ）が妊娠した雌ヒツジのＰＢＭＣで検出された。
【００４４】
実施例６  分析
化学発光シグナルをＳＡＳのＧＬＭ方法(Version 8.1, SAS Inc, Gary NC)を用いて分析した。このモデルは、必要であれば、状態（妊娠対交配したが妊娠しなかった）、状態に入る(nested within status)雌ヒツジ、日数（０、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３０）および適当な相互作用を含んだ。Ｆ検定での誤差項は、誤差に関する平均２乗の期待値にしたがった。１８ｓ  ｒＲＮＡに関するシグナルは、モデルの同時変量(covariate)として泳動して、ローディングでの変動を修正した。結果は、調節された最小二乗手段(adjusted Least Squares Means)（ＬＳＭ）及びこみにした標準誤差(pooled standard error)として報告した。
【００４５】
実施例７  ウシ
３３匹の家畜用雌ウシを人工授精によって交配し、Ｍｘ  ｍＲＮＡのレベルを上記実施例２及び３に記載される方法によって測定した。１５日目では、Ｍｘ  ｍＲＮＡのレベルは、後に妊娠したことが決定した雌ウシでおよび後に妊娠していなかったことが決定した雌ウシでほぼ同じであることが分かった。１８日目では、Ｍｘ  ｍＲＮＡのレベルは、後に妊娠していなかったことが決定した雌ウシで検出された値の約３倍と、後に妊娠したことが決定した雌ウシでは顕著に増加していることが分かった。
【００４６】
これらの結果から、妊娠認識シグナル伝達に応答してＭｘ遺伝子発現が迅速にかつ持続して活性化されることが示され、さらに、ＩＦＮτの局所的な効果に加えて、ヒツジ及びウシでは迅速な全身応答があることが示される。加えて、Ｍｘ発現は、妊娠が確立されない際（交配したが妊娠しなかった動物）にはＰＢＭＣで増加しなかった。ＩＦＮτによる妊娠認識シグナル伝達は従来子宮内膜の遺伝子発現の局所的な調節(Stewart et al., Endocrinology 142:98-107 (2001); Johnson et al., Biol. Reprod. 64:1392-1399 (2001); Vallet et al., J. Endocrinol. 130:R1-4 (1991); Spencer et al., Biol. Reprod. 58:1154-1162 (1998); Johnson et al., Biol. Reprod. 62:622-627 (2000); Charleston and Stewart, Gene 137:327-331(1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998); Spencer et al., Biol. Reprod. 61:464-470 (1999))およびＰＧＦ２αの黄体退行パルスを除去するためのエストロゲン及びオキシトシンレセプター発現の抑制からのみ起こると考えられたので、これらの知見は重要である。したがって、本発明の方法およびキットは、家畜の妊娠していない、及び妊娠していることの決定の新規でかつ経済上重要な方法を提供するものである。
【００４７】
本願で列挙されたすべての文献及び特許は、参考によって本明細書中に引用される。
【００４８】
本明細書に記載される本発明のさらなる修飾、使用、および用途は、当業者には明らかであろう。このような修飾は下記特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】雌ヒツジを人工授精してから２６日目のＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）のＭｘ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析である。レーン１〜６は、妊娠した雌ヒツジを表わし、およびレーン８〜１３は、妊娠していない雌ヒツジを表わす。Ｍｘ  ｍＲＮＡは、約２．５ｋｂで泳動された。
【図２】雌ヒツジを人工授精してから２６日目のＰＢＭＣから単離された全細胞ＲＮＡのスロット−ブロット分析の結果を示すグラフである。Ｍｘ  ｍＲＮＡレベルは、Ｄ２６で交配したが妊娠しなかった雌ヒツジに対して妊娠した雌ヒツジで約４倍以上であった（Ｐ＜０．０１）。ＰＳＰＢ（妊娠に特異的なタンパク質Ｂ）レベル（◆）から、妊娠状態が確認され、これは誕生した子羊の数と相間した。（図２のＣＮＴＳは、化学発光ノーザンブロットの光子計測数を示す。）
【図３】人工授精してから０〜３０日での人工授精された妊娠した及び妊娠しなかった雌ヒツジのＰＢＭＣ中のＭｘ  ｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。（図３のＣＮＴＳは、化学発光スロット−ブロットの光子計測数を示す。）
【図４】人工授精してから１５及び１８日の妊娠した及び妊娠しなかった雌ヒツジのＰＢＭＣのＭｘタンパク質発現のノーザンブロット分析である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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