(57)【要約】抗癌活性を有する医薬を調製するための式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の使用、および式Iを有する四量体誘導体の合成方法であって、インドール‐３‐カルビノールがインドール‐３‐カルビノールの重合体酸化を生じるように酸化剤と反応させられる方法。【化１】2004534052.tif 000008
2004534052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の使用であって、
【化１】
2004534052.tif 000004
抗癌活性を有する医薬を調製するための使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬が乳癌細胞の成長を阻害することを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項２に記載の使用であって、前記医薬が乳癌細胞（該細胞は成長においてエストロゲン依存的な及びエストロゲン陰性の細胞の双方である）に対して活性があることを特徴とする使用。
【請求項４】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体を純粋形態（pure form）で取得するための方法であって、
【化２】
2004534052.tif 000005
インドール‐３‐カルビノールが酸化剤とインドール‐３‐カルビノールの選択的な重合体酸化（polymeric oxidation）を生じるように反応させられることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記酸化反応が室温で実施されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、過マンガン酸カリウム、重クロム酸カリウム、酢酸、リン酸、オキシ塩化リン、過酸化水素、塩化第2銅およびヨウ素からなる群から選択される酸化剤を用いることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、使用される前記酸化剤が塩化第2銅またはヨウ素であり、前記四量体誘導体の収率を増加するための方法。
【請求項８】
請求項４〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化反応が、エチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール、エタノールおよび水からなる群から選択される溶媒中で生じることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、使用される前記溶媒が有機溶媒である方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、使用される前記溶媒がメタノールまたはエタノールである方法。
【請求項１１】
請求項４〜１０の何れか１項に記載の方法であって、更に少なくとも１段階の酸化産物の精製を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記の少なくとも１段階の精製が、クロマトグラフィーカラムを用いた手段により実施され、反応産物が該カラムを介して溶出されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記の少なくとも１段階の精製が、所望の四量体反応産物をアルコール溶液から選択的に結晶化する手段により実施されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項11および12に記載の方法であって、２つの精製段階を含み、第一段階はクロマトグラフィーカラムを用いた手段による前記精製からなり、第二段階は第一段階後に部分的に精製された反応産物に関して、四量体誘導体をアルコール溶液から結晶化する手段によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体であって、
【化３】
2004534052.tif 000006
請求項３〜１４の何れかに記載の手段により取得される誘導体。
【請求項１６】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体であって、
【化４】
2004534052.tif 000007
純粋形態の（in pure form）誘導体。
【請求項１７】
式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の純粋形態であって、以下のスペクトラムを有することを特徴とする誘導体：
IR: 3400, 2958, 2933, 2905, 2852, 1460, 1379, 745 cm-1
Ms: 516[M+], 504, 387, 375 (100), 258 (100), 245, 130
1H-NMR :DMSO-d6（δ）: 4.18(m), 5.37 (m), 6.70-7.60(m), 10.70 (m)
13CH-NMR :CDCL3 (δ): 21.2, 107.4, 111.0, 119.5, 120.2, 122.3, 128.8, 135.3, 136.8。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌活性を有する医薬を調製するためのインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の使用に関する。
【０００２】
本発明は、更にインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
cruciferae科に属する植物が腫瘍性細胞の成長に作用する物質を含有すること、およびそれ故にその植物の投与がヒト身体において癌の影響を減少させることが、以前から知られている。
【０００４】
これらの植物の抗癌特性は、疫学的な証拠および動物で実施した検査の双方から見出されている。かかる抗癌特性は、栄養素の及び非栄養素の成分〔例えば、インドールグルコシネート（indole glucosinates）であり、発癌プロセス（carcinogenic process）の阻害剤として知られている〕の存在によるものである。
【０００５】
インドール‐３‐カルビノールは、インドールグルコシネートグルコブラシシン（indole glucosinate glucobrassicin；Cruciferae科に属する植物に含有される）の自然発生的な加水分解に由来する産物である。インドール‐３‐カルビノールは、ジメチルベンザンスラセン（dimethylbenzanthracene）でラットにおいて誘導される乳癌およびベンゾ(a)ピレンで誘導される胃癌の双方の阻害薬であると推測される。一度形成されたら、インドール‐３‐カルビノールは、重合体の分解産物の形成を伴う、更なる光誘導性の変形（transformations）を生じる。
【０００６】
驚くべきことに本発明の発明者（authors）は、インドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体が予想されなかった高い抗癌活性を有することを見出した。特に、四量体誘導体の抗癌活性が腫瘍性細胞におけるエストロジェンレセプタの存在とは独立に発生することを見出した。
【発明の開示】
【０００７】
従って、本発明の課題は四量体誘導体の使用であり、該誘導体は式Iを有し、
【０００８】
【化５】
2004534052.tif 000003
抗癌活性を有する医薬（medicinal）を調製するためのものである。
【０００９】
本発明の更なる課題はインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体（式Iを有する）の合成方法であって、該方法はインドール‐３‐カルビノールが酸化剤とインドール‐３‐カルビノールの選択的な重合体酸化（polymeric oxidation）を生じるように反応させられることを特徴とする方法である。
【００１０】
かかる酸化反応は室温で実施される。
【００１１】
前記酸化反応は、次のものからなる群から選択される酸化剤を用いることにより生じ、即ち：過マンガン酸カリウム、重クロム酸カリウム（potassium dichromate）、酢酸、リン酸、オキシ塩化リン（phosphorus oxychloride）、過酸化水素、塩化第２銅（cupric chloride）およびヨウ素である。
【００１２】
前記酸化反応は、エチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール、エタノールおよび水からなる群から選択される溶媒の存在下で生じる。有機溶媒を使用することが好ましく、使用される溶媒は好ましくはメタノールまたはエタノールの何れかである。実際、水は単量体を可溶化せずに前記反応は水と有機物との周囲の界面で生じるが、有機溶媒中で単量体は可溶化されて酸化反応が四量体誘導体の産物を生じ、これにより生じる産物は水中の反応で得られる量よりもはるかに高い。
【００１３】
前記合成方法は更に精製段階を含み、かかる精製は好ましくはクロマトグラフィーカラムによる手段および／またはアルコールからの結晶化による手段により達成される。
【００１４】
本発明の最後の課題は四量体誘導体であり、該誘導体は式Iを有し上記の合成手段により精製された形態で取得される。
【００１５】
以下に記載される実施例は、更に詳細に且つ限定されることなく、式Iを有する四量体誘導体を調製するための合成方法と共に該四量体誘導体の抗癌活性を決定するために実施されるアッセイを開示する。実施例は以下に記載される図面の簡単な説明において説明される本願の図面を参照して記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜実施例１＞
インドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の合成
化学合成1a
1gのインドール‐３‐カルビノールを20mlのメタノールに溶解し、次にヨウ素を触媒量（catalytic amount）(5: 1)添加し、そして撹拌条件下室温で静置する。5分後に沈殿物が形成され、それは濾過され、適切に精製される。
【００１７】
特に、前記反応から得られる原産物（raw product）は、ロータベーパ（rotavapor）による減圧下で蒸散され、分液漏斗において酢酸エチルおよび水で3回抽出される。有機抽出物（organic extract）を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、そして蒸発させ、次にシクロヘキサン中でシリカゲルのカラムで精製し、シクロヘキサン/酢酸エチル混合液（２つの溶媒の比率は5:5まで）で溶出する。
【００１８】
得られる四量体誘導体は、エチルエーテル／メタノールから再結晶化することができる。
【００１９】
ほぼ定量的な産物（almost quantitative yields）として得られた産物の構造は、分光学的な方法により確認されている。IR、NMRおよびMSスペクトラを、各々Nicolet Impact 400、Varian（400MHzで）および島津QP-5000（70eVのイオン化ポテンシャル）で記録する。
【００２０】
次の分光学的データは純粋な産物を意味する：
IR: 3400, 2958, 2933, 2905, 2852, 1460, 1379, 745 cm-1
Ms: 516[M+], 504, 387, 375 (100), 258 (100), 245, 130
1H-NMR :DMSO-d6(δ): 4.18(m), 5.37(m), 6.70-7.60 (m), 10.70 (m)
13CH-NMR :CDCL3 (δ): 21.2, 107.4, 111.0, 119.5, 120.2, 122.3, 128.8, 135.3, 136.8
【００２１】
化学合成1b
1gのインドール‐３‐カルビノールを20mlのエタノールに溶解し、次に無水CuCl2を触媒量(ｒ＝5: 1)添加し、そして磁石撹拌条件下室温で静置する。15分後インドール‐３‐カルビノールは完全に消失し、5:5のシクロヘキサン-酢酸エチルで溶出されるシリカゲル上でのＴＬＣにより観察されるように、四量体誘導体に対応する高いスポットの形成を主に伴い、開始試薬と四量体誘導体との間の中間の高さの他のスポット（三量体誘導体に対応する）の形成を伴うものであった。
【００２２】
生成物の濾過および精製は、化学合成1aに記載された方法にしたがって実施される。
【００２３】
収率は約70%の四量体誘導体に20%の三量体および10%の不純物を伴うものであった。
【００２４】
他の化学合成
インドール‐３‐カルビノールの酸化反応をCuCl2二水和物、POCl3およびI2と共に0℃でエタノール中の還流下（under reflux）で実施し、全ての反応は四量体誘導体の良好な産生量を生じ、そして上記記載と同様に進行する。
【００２５】
当該技術水準において、最高の条件はインドール‐３‐カルビノールをI2またはCuCl2とアルコール溶媒において処理することを含む条件であることが証明されている。
【００２６】
＜実施例２＞
ヒト乳房カルシノーマ株における四量体誘導体の抗増殖性効果の評価アッセイ
四量体誘導体の活性は、研究室で生育させたエストロジェンレセプタを発現している乳癌細胞(株MCF-7)および該レセプタに関して陰性の細胞(株MDA-MB-234)の双方において評価された。
【００２７】
MCF-7およびMDA-MB-234細胞を研究室でDMEM培地中に成長させた、該培地には10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、1%非必須アミノ酸溶液、2mMグルタミンを添加し、MCF-7に関しては10ug/mlインシュリンをも添加した。検査のために対数増殖期の前記細胞を使用し、それらを再び同じ新鮮な培地に懸濁し、それらを四量体誘導体に72時間（37℃、5%C02大気中で）暴露する。処理前に細胞を数時間成育してプラスチックへと良好に接着させ増殖を開始させる。抗増殖活性の評価に関する検査において、DNAの合成を培養に3μCi/mlの[3H]-チミジンを処理終了時の6時間前に添加することにより評価する。
【００２８】
細胞を培養間に四量体誘導体濃度を増加させた条件に暴露し、次にそれらの増殖の阻害程度をDNAトリチウム付加チミジンに導入することにより評価する(Cover C. M. et al., 1998, Journal of Biological Chemistry no. 273, page 3838-3847)。図１および図２に示されるように、四量体誘導体は、用量依存的な様式で株MCF-7および株MDA-MB-234双方の細胞増殖を阻害し、両細胞株における類似する活性を示している。
【００２９】
第二セットの検査において、２つの細胞株における四量体誘導体の活性は、生細胞を死細胞から識別することが可能な方法(Magnani M. et al., 1995, Biochemical Journal no. 312, page 115-123)を用いて細胞障害性として評価された。
【００３０】
MCF-7およびMDA-MB-234細胞を既に記載したように成育させた。次に、四量体誘導体への暴露の24および72時間後に、それらを採取して血球計数器中でトリパンブルー色素による死細胞識別により２回計数する。
【００３１】
図3、4および5に認められるように、このケースでも用量依存的な(図3  e  4)及び時間依存的(図5)な毒性が観察できる。
【００３２】
四量体誘導体がヒト乳癌株の成長の阻害薬として高度な活性を有すること及びかかる活性がエストロジェンレセプタの存在に非依存的であることを、得られた結果は示している。
【００３３】
＜実施例３＞
四量体誘導体の抗増殖性効果を生じる分子機構の決定
研究の目的は特定の分子標的を同定することであり、その標的において四量体誘導体は、乳癌細胞の増殖性活性の減少に関してエストロジェンレセプタの存在とは独立して作用する。
【００３４】
SDS-PAGE(Laemmli U. K. 1970, Nature 227,680-685)およびウエスタンブロット(Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979, Proc. Natl : Acad. Sci. USA 76,4350-4354)技術が、細胞周期制御における基礎的な標的(マーカー)として知られる蛋白質の発現を分析するために使用されており、それらの修飾はしばしば非制御的な細胞増殖を生じる：サイクリン依存性キナーゼcdk6(Cover C. M., et al, 1998, J. Biol. Chem. 273,3838-3847)、インヒビターp27(Wang X., et al., 1997,Oncogene 15,2991-2997; Vidal A., Koff A. 2000, Gene 247,1-15)および網膜芽細胞腫Rb(Dyson N. 1998, Genes & Development 12, 2245-2262; Guardavaccaro D., et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20(5), 1797-1815)。
【００３５】
既に記載したように細胞を成育後、細胞培養に四量体誘導体の用量を増加させて作用させる。次に培養サンプルを採取し、そして細胞をB緩衝剤(Hepes 20 mM pH 7.5, NaCl 420 mM, MgCl2 1.5 mM, EDTA 0.2mM, グリセロール25%)と抗蛋白質分解剤  ノニデットP40  0,5%(v/v)の存在下で溶解し、氷中に20分間維持し、そして遠心（12,000rpm、10分間、4℃）する。
【００３６】
細胞可溶化物(上清液体)を次にサンプルバッファ2Xで1:1に希釈し、SDS-PAGE（12%アクリルアミド）にLaemmliの方法(Laemmli U. K. 1970, Nature 227,680-685)に従って充填した。
【００３７】
以上のように蛋白質を分離し、次にニトロセルロース膜にTowbinの方法(Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979,Proc. Natl : Acad. Sci. USA 76, 4350-4354)にしたがい転写し；その膜をTBS+5%ミルクの溶液剤でブロックし、抗-cdk6(1:200)、抗-p27(1:500)、抗-pRb(1:200)（抗体はSanta Cruz Biotechnologyから購入した）で一晩（the whole night）インキュベーション（4℃で）した。
【００３８】
その膜をTBS+0.08%Tween20で洗浄（8分間室温）を３回行い、そしてペルオキシダーゼを結合させた抗-マウスヤギ抗体または抗-ウサギヤギ抗体(1:4000)で1時間インキュベーションする。化学発光を検出系として使用する。
【００３９】
第一に四量体誘導体の用量を増加させて処理したMCF-7のcdk6発現レベルを定量した：図６に示すように該酵素の大きな減少が15μM用量の四量体誘導体で既に観察でき、急な減少が50μMで観察できる。
【００４０】
ウエスタンブロット技術を再び使用して、Dサイクリン-cdk6およびEサイクリン-cdk2の複合体を阻害する蛋白質p27レベルを検出した。同じ濃度の四量体誘導体が使用された場合、p27が増加する(図7)。
【００４１】
cdk6および抑制性の蛋白質p27は、（図8のチャートに示されるように）Rb因子（E2F因子を介してG1/S移行を許可する）のリン酸化を制御する。
【００４２】
次のステップは、四量体誘導体の抗増殖活性が、cdk6減少およびp27増加に起因する、Rb因子のリン酸化レベルの修飾によるものであるかどうかを検証することである。
【００４３】
これが、既に記載したような検査を使用して、（常にウエスタンブロットの手段で）、pRbレベルを（適切な抗体の使用により）検証する理由である。得られた結果を図9に示す。
【００４４】
図9に示されるように、四量体誘導体の使用は、すでに30μMの濃度でかかるリン酸化を高度に減少させる(60%の阻害)。
【００４５】
次に前記マーカーがエストロゲン陰性の株化細胞MDA-MB-234において既に記載されたように評価される。実施した検査は、これらの細胞においても酵素cdk6の減少およびインヒビターp27の増加が存在することを示す。前記分子の抗増殖性作用が、エストロゲンレセプタの存在とは独立したものであり、乳癌細胞の双方の集団（エストロゲン陽性およびエストロゲン陰性）の治療に適切なものであることを、この結果は示している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図1は、エストロジェンレセプタを発現している乳癌細胞株におけるインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の抗癌活性を示す図である。
【図２】図2は、エストロジェンレセプタが陰性の乳癌細胞株におけるインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の抗癌活性を示す図である。
【図３】図3は、エストロジェンレセプタを発現している生きた乳癌細胞のパーセンテージを、投与したインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の量に対して示す図である。
【図４】図4は、エストロジェンレセプタに関して陰性の生きた乳癌細胞のパーセンテージを、投与したインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の量に対して示す図である。
【図５】図5は、エストロジェンレセプタを発現している生きた乳癌細胞のパーセンテージを、インドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の投与の時間に対して示す図である。
【図６】図6は、酵素cdk6の挙動とインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の存在との関係を示す図である。
【図７】図7は、蛋白質p27の挙動とインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の存在との関係を示す図である。
【図８】図8は、酵素cdk6および蛋白質p27により実行されるRb因子のリン酸化における制御を模式的に示す図である。
【図９】図9は、Rb因子リン酸化の挙動とインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の存在との関係を示す図である。
【図１】
2004534052.tif 000009
【図２】
2004534052.tif 000010
【図３】
2004534052.tif 000011
【図４】
2004534052.tif 000012
【図５】
2004534052.tif 000013
【図６】
2004534052.tif 000014
【図７】
2004534052.tif 000015
【図８】
2004534052.tif 000016
【図９】
2004534052.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004534052.tif 000018
2004534052.tif 000019
2004534052.tif 000020
2004534052.tif 000021
2004534052.tif 000022
2004534052.tif 000023
2004534052.tif 000024
2004534052.tif 000025
2004534052.tif 000026
2004534052.tif 000027
2004534052.tif 000028
2004534052.tif 000029
2004534052.tif 000030
2004534052.tif 000031
2004534052.tif 000032
2004534052.tif 000033
2004534052.tif 000034
2004534052.tif 000035
2004534052.tif 000036
2004534052.tif 000037
2004534052.tif 000038
2004534052.tif 000039
2004534052.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月25日(2003.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の純粋な形態の使用であって、
【化１】
2004534052.tif 000041
抗癌活性を有する医薬を調製するための使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬が乳癌細胞の成長を阻害することを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項２に記載の使用であって、前記医薬が乳癌細胞（該細胞は成長においてエストロゲン依存的な及びエストロゲン陰性の細胞の双方である）に対して活性があることを特徴とする使用。
【請求項４】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体の使用であって、
【化２】
2004534052.tif 000042
乳癌細胞（該細胞は成長においてエストロゲン依存的な及びエストロゲン陰性の細胞の双方である）に対して抗癌活性を有する医薬を調製するための使用。
【請求項５】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体を純粋形態（pure form）で取得するための方法であって、
【化３】
2004534052.tif 000043
インドール‐３‐カルビノールが酸化剤とインドール‐３‐カルビノールの選択的な重合体酸化（polymeric oxidation）を生じるように反応させられることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項5に記載の方法であって、前記酸化反応が室温で実施されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、過マンガン酸カリウム、重クロム酸カリウム（potassium dichromate）、酢酸、リン酸、オキシ塩化リン（phosphorus oxychloride）、過酸化水素、塩化第２銅（cupric chloride）およびヨウ素からなる群から選択される酸化剤を用いることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項7に記載の方法であって、使用される前記酸化剤が塩化第2銅またはヨウ素であり、前記四量体誘導体の収率を増加するための方法。
【請求項９】
請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化反応が、エチルエーテル、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール、エタノールおよび水からなる群から選択される溶媒において生じることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、使用される前記溶媒が有機溶媒である方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、使用される前記溶媒がメタノールまたはエタノールである方法。
【請求項１２】
請求項5〜11の何れか１項に記載の方法であって、更に少なくとも１段階の酸化産物の精製を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項12に記載の方法であって、前記の少なくとも１段階の精製がクロマトグラフィーカラムを用いた手段により実施され、反応産物が該カラムを介して溶出されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項12に記載の方法であって、前記の少なくとも１段階の精製が、所望の四量体反応産物をアルコール溶液から選択的に結晶化する手段により実施されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項12または13に記載の方法であって、２つの精製段階を含み、第一段階はクロマトグラフィーカラムを用いた手段による前記精製からなり、および第二段階は第一段階後に部分的に精製された反応産物に関して、四量体誘導体をアルコール溶液から結晶化する手段によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体であって、
【化４】
2004534052.tif 000044
請求項５〜１５の何れかに記載の方法により純粋な形態で取得される誘導体。
【請求項１７】
以下の式Iを有するインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体であって、
【化５】
2004534052.tif 000045
純粋な形態の（in pure form）誘導体。
【請求項１８】
請求項１７に記載のインドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体であって、以下のスペクトラムを有することを特徴とする誘導体：
IR: 3400, 2958, 2933, 2905, 2852, 1460, 1379, 745 cm-1 
Ms: 516[M+], 504, 387, 375 (100), 258 (100), 245, 130
1H-NMR: DMSO-d6（δ）: 4.18(m), 5.37 (m), 6.70-7.60(m), 10.70 (m)
13CH-NMR: CDCL3 (δ): 21.2, 107.4, 111.0, 119.5, 120.2, 122.3, 128.8, 135.3, 136.8。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
インドール‐３‐カルビノールは、インドールグルコシネートグルコブラシシン（indole glucosinate glucobrassicin；Cruciferae科に属する植物に含有される）の自然発生的な加水分解に由来する産物である。インドール‐３‐カルビノールは、ジ−メチルベンザンスラセン（di-methylbenzanthracene）でラットにおいて誘導される乳癌およびベンゾ(a)ピレンで誘導される胃癌の双方の阻害薬であると推測される（supposed）。一度形成されたら、インドール‐３‐カルビノールは、重合体の分解産物の形成を伴う、更なる光誘導性の変形（transformations）を生じる。
かかる重合体産物およびそれらの製剤のいくつかは、文献〔「Oligomerization of Indole-3-carbinol in aqueous acid」 by GROSE, Karl et al. in CHEMICAL RESEARCH IN TOXICOLOGY; ISSN 0893-228X, vol. 5, no. 2, 1992, pages 188-193;〕に報告されている；三量体産物の生物活性は、文献〔「The major cyclic trimeric product of Indole-3-cabinol is a strong agonist of the estrogen receptor signalling pathway」 by RIBY J et al in BIOCHEMISTRY, Americam Chemical society, Easton, PA, US, vol 39, no.5, 2000, pages 910-918〕に報告されている。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
驚くべきことに本発明の発明者（authors）は、インドール‐３‐カルビノールの四量体誘導体が高い抗癌活性を有することを予期せず見出した。特に、四量体誘導体の抗癌活性が、腫瘍性細胞におけるエストロジェンレセプタの存在と独立に発生することを見出した。
【発明の開示】


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
従って、本発明の課題は四量体誘導体の使用であり、該誘導体は式Iを有し、


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【化６】
2004534052.tif 000046
抗癌活性を有する医薬を調製するためのものである（請求項１および４による）。




【国際調査報告】
2004534052.tif 000047