(57)【要約】水性ペプチド混合物からのトリプトファン含有ペプチドの選択的単離方法であって、ａ）水性ペプチド混合物のｐＨを４．０−６．０に制御し、トリプトファン含有ペプチドの沈殿を形成させること；及びｂ）沈殿したペプチドの単離；の工程を含む方法が記載される。水性ペプチド混合物は好ましくは、蛋白質源の酸性ｐＨでの酵素的切断によって得られる。更に、Ｔｒｐ含量８−１５ｗ／ｗ％を有するペプチド、並びに食品添加物としての、及び医薬中の活性成分としてのその使用が記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性ペプチド混合物からのトリプトファン含有ペプチドの選択的単離方法であって、
ａ）水性ペプチド混合物のｐＨを４．０−６．０に制御し、トリプトファン含有ペプチドの沈殿を形成させること；及び
ｂ）沈殿したペプチドの単離；
の工程を含む方法。
【請求項２】
工程ａ）が２０℃未満の温度で行われる、請求項１の方法。
【請求項３】
水性ペプチド混合物が蛋白質源の酵素的切断によって製造される、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
蛋白質源が、１つ以上の酸性プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼ、好ましくは、ペプシン、パパインもしくはブロメライン、又はそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される１つ以上の酸性プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼによって切断される、請求項４の方法。
【請求項５】
蛋白質源は、ｐＨが１．５−３．５、好ましくは２−３でペプシンによって切断される、請求項５の方法。
【請求項６】
ペプチド混合物が脱塩される、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
トリプトファン含有ペプチドが、乳清蛋白質、好ましくはα−ラクトアルブミン濃縮乳清蛋白質由来である、請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項８】
ペプチド基準で８−１５ｗ／ｗ％のトリプトファン含量を有する、請求項１〜７のいずれかの方法によって得られる、トリプトファン濃縮ペプチド混合物。
【請求項９】
重量基準で少なくとも０．９００のＴｒｐ／（Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ）比を有する、請求項８のペプチド混合物。
【請求項１０】
重量基準で少なくとも０．３００のＴｒｐ／（Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ＋Ｖａｌ＋Ｉｓｏ＋Ｍｅｔ）比を有する、請求項８又は９のペプチド混合物。
【請求項１１】
食品成分としての使用のための請求項８〜１０のいずれかのペプチド混合物。
【請求項１２】
医薬中の活性成分としての使用のための請求項８〜１０のいずれかのペプチド混合物。
【請求項１３】
セロトニン、トリプタミン、ニコチン酸又はメラトニンの合成の誘導のための活性成分としてヒト医薬又は獣医学医薬における使用のための請求項８〜１０のいずれかのペプチド混合物。
【請求項１４】
悪性細胞増殖に対する医薬中の活性成分としての使用のための請求項８〜１０のいずれかのペプチド混合物。
【請求項１５】
請求項８〜１０のいずれかのペプチド混合物を含む食品製品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、水性混合物からのトリプトファン（Ｔｒｐ）含有ペプチドの選択的単離方法、該方法によって得られるトリプトファン濃縮ペプチド、ならびに食品添加物および医薬としての該ペプチドの使用に関する。
【０００２】
トリプトファンは、ヒトを含む生物による蛋白質の産生のために使用されるアミノ酸の１つである。トリプトファンは、西欧世界の食品中のより著名でないアミノ酸の１つである；日常的なトリプトファンの消費量は１日につき約１ｇである。
【０００３】
トリプトファンは、中枢神経系に間接的に作用する；消費された食品のトリプトファンの約１％が、脳においてシナプス伝達物質セロトニンに変換される（Ｈｅｒｄｅｒｉｃｈ ａｎｄ Ｇｕｔｓｃｈｅ， Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ Ｉｎｔ １９９７； １３： １０３−３５）。セロトニンは、精神状態、食欲および疼痛認識などの幾つかの生物的過程に重要な役割を果たす（Ｙｏｕｎｇ， Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ． Ｖｏｌ． ７． Ｗｕｒｔｍａｎ ＲＪ， Ｗｕｒｔｍａｎ ＪＪ編， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ ４９−８８）。更に、セロトニンは、睡眠過程に鍵となる役割を果たす（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｅ， Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ Ｄ， Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｌｅｅｐ： ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ４３ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ａｎｄ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｓｃｈｌｏｓｓｂｅｒｇｅｒ ＨＧ， Ｋｏｃｈｅｎ Ｗ．編， Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃｏ， Ｂｅｒｌｉｊｎ， Ｄｕｉｔｓｌａｎｄ， ｐｐ ２９７−３０４； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｈｅｌｍｅｒｔ Ｄ， Ｓｐｉｎｗｅｂｅｒ ＣＬ． Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １９８６； ８９： １−７； Ｃｕｎｌｉｆｆｅら， Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９８ ； ５２： ４２５−３０）。前駆体トリプトファンとは対照的に、セロトニンは、血液−脳関門を通過できないので、脳におけるセロトニン合成は，血液から中枢神経系へのトリプトファンの輸送に依存する（Ｆｅｒｎｓｔｒｏｍ ＪＤ． Ｊ Ｎｕｔｒ １９８８； １１８： １４１７−１９）。脳におけるトリプトファンの量、及びそれによるセロトニン産生は、血液中で循環しているトリプトファンの量に依存することが、動物及びヒトにおける研究によって示された。
【０００４】
正常状態では、脳へのトリプトファンの流入は、血液中のトリプトファンレベルに依存するばかりではない。血液中のトリプトファンと他の大きな中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）の比も重要である。ＬＮＡＡは、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）として定義される（Ｈｅｉｎｅ， １９９５， 上記）。これらのＬＮＡＡは、血液−脳関門を通過する類似の輸送機構を使用する。血液中のトリプトファン／ＬＮＡＡ比が高ければ高いほど、より多くのトリプトファンは、中枢神経系に輸送されることができ、より多くのセロトニンが脳で産生される（Ｈｅｒｄｅｒｉｃｈ ａｎｄ Ｇｕｔｓｃｈｅ， 上記）。
【０００５】
純粋なトリプトファンの消費により、血液中のトリプトファンとＬＮＡＡのより高い比が達成され、このようにして、上記の神経的効果が誘導される。しかし、機能性食品などの市販製品での純粋なトリプトファンの使用は、国毎に異なりうる厳格な規制を受ける。従って、上記比を正の方向に変えるためには、これは、食品消費のパターンの変化によって達成される必要がある；蛋白質の豊富な食品によって該比の減少が起こる。というのは、トリプトファンは、より入手し難いアミノ酸の１つであるからである（Ｆｅｒｎｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｆｅｒｎｓｔｒｏｍ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９５ ； ６１ ： ３１２−２９）。炭水化物の豊富な食品は該比を増加させる。グルコースなどの糖は、膵臓によるインシュリンの放出を増加させる。インシュリンは、筋肉組織へのＬＮＡＡの取り込みを刺激し、血液中のトリプトファンとＬＮＡＡの比を増加させる（Ｙｏｕｎｇ， 上記）。
【０００６】
食品中の蛋白質は、中枢神経系に上記効果をもたらすためには、実際にあまりに少ないトリプトファンしか含まない。蛋白質であるα−ラクトアルブミンは乳清の成分であり、食品の中で最も良く知られたトリプトファン源である；それは、１２３個のアミノ酸からなり、その内４個はトリプトファン残基である。これは、蛋白質１００ｇ当りトリプトファン約６ｇである（Ｈｅｉｎｅら，Ｊ Ｎｕｔｒ １９９１； １２１： ２７７−８３）。しかし、腸でのα−ラクトアルブミンの異化は遅く、トリプトファンの非常にゆっくりとした取り込みしか行われない（Ｓｃａｎｆｆら， Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ １９９０； ３８： １６２３−２９）。血液中のトリプトファンとＬＮＡＡの比の所望の（実質的な）変化、及びそれによる中枢神経系に対するトリプトファンの好ましい効果は起こらない。蛋白質は、少数のアミノ酸からなるペプチドに断片化できる。乳清蛋白質の断片化後、形成されるペプチドは、通常、親の蛋白質より速く、そして容易に消化できる（Ｎａｋａｎｏら， Ｊ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃ Ｎｕｔｒ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ １９９４； ４７： １９５−２０１）。
【０００７】
上記理由で、容易に利用できるトリプトファンが豊富なペプチドの必要性が当業界に存在する。
【０００８】
過去において、蛋白質製品のＴｒｐレベルを増加させる幾つかの方法が開発された。例えば、ＩＮＲＡによるＥＰ２２６９６、これはアルファ−ラクトアルブミンの精製方法を記載する；ＷＯ９１／１０４４１（Ｍｅｄｇｅｎｎｉｘ）は、高含量のＴｒｐ、並びにアルギニン及び／又はオルニチンを有するポリペプチドを含むことを特徴とする組成物を記載する。ＷＯ ９８／１４２０４ （Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｏｅｎｏｂｉｏｌ）は、栄養補足物として、そして睡眠及び生物時計を制御する医薬としての、アルファ−ラクトアルブミンの新規使用及びそれを含む組成物を記載する。
【０００９】
しかし、上述の開示は、既に比較的高Ｔｒｐ含量を有する無傷蛋白質の更なる精製以外の、蛋白質製品中でのトリプトファンレベルを増加させる方法に言及しない。従って、個々人にトリプトファンの増加投与量を供給する上記技術の唯一の方法は、大量のアルファ−ラクトアルブミンの投与によってである。この方法の不利な点は、序論で記載したように、ＬＮＡＡに対するＴｒｐの比がまだあまりに低いということである。ＤＥ４１３０２８４（Ｈｅｉｎｅ）は、トリプトファン含有ペプチドの製造を記載するが、レベルはまだ低く、特別の精製は記載されていない。ＪＰ２２７９７００（Ａｓａｈｉ）はより高レベルのトリプトファンに到達するが、使用する方法は、非常に多量のプロナーゼによる酵素的加水分解後、多量のアセトンの添加を必要とする。食品工業では、アセトンの使用は疑問視される；そして、使用する酵素は高価であり、従って、大規模の使用ではより不適切である。
【００１０】
本発明は、水性ペプチド混合物からの選択的に単離されたトリプトファン含有ペプチドの改良方法であって、
ａ）水性ペプチド混合物のｐＨを４．０−６．０に制御し、トリプトファン含有ペプチドの沈殿を形成させること；及び
ｂ）沈殿したペプチドの単離；
の工程を含む方法を提供する。
【００１１】
本明細書では、用語「ペプチド」は、５００−５０００ダルトンの分子量を有するアミノ酸鎖に関する。水性ペプチド混合物のｐＨが、４．０−６．０、好ましくは４．５−６．０、最適には約５．０（即ち、４．７−５．３）に制御されるとき、トリプトファン含有ペプチドは沈殿し、該沈殿は、トリプトファン含有ペプチドを単離するのに都合よく使用できることが驚くべきことに見出された。当業界では、ペプチド混合物を得るための鉱酸による蛋白質の加水分解は推奨されなかった。というのは、それは、トリプトファンの殆ど完全な分解と関連していたからである（Ｗ．Ｈｅｉｎｅら，上記参照）。ｐＨの「制御」は、Ｔｒｐ含有ペプチドの沈殿形成中、ｐＨが上記ｐＨ値に調整されるべきであるか、又は保たれるべきであることを意味する。
【００１２】
沈殿したペプチドの単離は、当業界公知の方法で行える。沈殿したペプチドは、例えば、遠心分離、デカンテーション、又は濾過などによって集めることができる。長保存期間を得るために、単離は好ましくは乾燥工程を含む。当業者は適切な乾燥技術を知っている。
【００１３】
好ましくは、沈殿は、温度２０℃未満で行う。該温度未満で、トリプトファン含有ペプチドは非常に効率良く沈殿することが示された。
【００１４】
好適な実施態様では、水性ペプチド混合物は、蛋白質源の酵素的切断によって製造される。
【００１５】
好ましくは、蛋白質源は、１つ以上の酸性プロテアーゼ又はシステインプロテアーゼによって、特に、ペプシン、レニン、酸性真菌プロテアーゼ、キモシン、パパイン、ブロメライン、キモパパイン、もしくはフィシン、又はそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される１つ以上の酵素によって、酸性ｐＨで切断される。１つ以上の該酸性プロテアーゼによる、特に、ｐＨが１．５および３．５の間の、好ましくは２−３でのペプシンによる蛋白質源の切断によって、疎水性を有するペプチドが生成する。これらのペプチド混合物から、トリプトファン含有ペプチドを、ｐＨを４．０−６．０、好ましくは約５．０に制御することによって非常に効率良く選択的に単離できることが知見された。酵素切断のｐＨが４．０未満である場合、トリプトファン含有ペプチドを沈殿させるために、ｐＨを４．０−６．０に調整すべきである。好ましくは、沈殿工程前に、酵素の不活化によって酵素活性を失わせる。当業者は、蛋白質分解酵素の不活化の方法を知っていよう。例えば、パパイン又はブロメラインなどの、４．５−６．０の上記ｐＨ範囲内にｐＨ至適を有する酵素が選択される場合、蛋白質源の切断とトリプトファン含有ペプチドの沈殿が同時に起こるように、本発明の方法を設計することが可能であろう。加水分解されたペプチドが優先的に沈殿する条件で沈殿を行うように注意する必要がある；さもないと、部分的に加水分解されたペプチドの沈殿が得られるかもしれない。
【００１６】
好ましくは、ｐＨ制御工程（工程ａ）前に、ペプチド混合物を脱塩する。ｐＨ制御工程前の脱塩工程により、沈殿したＴｒｐ含有ペプチドの収量が改良されることが知見された。脱塩は公知の技術であり、例えば、ナノ濾過、限外濾過、又は電気透析によって行うことができる。特に、ペプチドが酵素切断によって得られるとき、得られるペプチド混合物の脱塩により、収量が改良される。好ましくは、切断反応時に存在する塩の５０−９５％がペプチド混合物から除去されるように、脱塩を行う。
【００１７】
好ましくは、トリプトファン含有ペプチドは乳清蛋白質由来である。これは、水性ペプチド混合物のための蛋白質源として、好ましくは乳清蛋白質を選択することを意味する。乳清蛋白質は比較的高いＴｒｐ含量（約１．８ｗ／ｗ％）を有し、これらの蛋白質を本発明の方法に非常に適したものにする。しかし、Ｔｒｐが豊富な蛋白質が好適ではあるが、全てのトリプトファン含有蛋白質を本発明の方法で使用することができる。本発明の非常に魅力的な実施態様では、トリプトファン含有ペプチドは、α−ラクトアルブミンが濃縮された乳清蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）又はα−ラクトアルブミンが濃縮された乳清蛋白質単離物（ＷＰＩ）由来である。このような単離物は乳清蛋白質由来であり、高いα−ラクトアルブミン含量を有する。α−ラクトアルブミンは、約５．８ｗ／ｗ％の高Ｔｒｐ含量を有する。約６０ｗ／ｗ％のα−ラクトアルブミンを含有する乳清蛋白質単離物は、ＤＭＶインターナショナル（オランダ）から得ることができる。
【００１８】
本発明の方法によって、ペプチド基準で８−１５ｗ／ｗ％のトリプトファン含量を有するペプチド混合物が得られ、それは、例えば、食品成分又は医薬で有利にも使用できる。食品成分として、本発明によって得られるペプチド混合物は、例えば、代用母乳粉末などの新生児完全栄養調合乳のための成分（Ｔｒｐ源）として使用できる。このような栄養混合物の内容物を、できるだけ天然母乳と一致させるために、Ｔｒｐを多く含むペプチドが調合乳に必要である。本発明のペプチドは優秀な候補である。
【００１９】
Ｔｒｐは、神経伝達物質であるセロトニンおよびトリプタミン、並びにビタミンであるニコチン酸及びメラトニンの合成の前駆体として重要な役割を果たすことが知られている。トリプトファン飢餓により、上記生命の維持に必要な化合物の合成に重大な問題が起こるので、本発明のペプチドは、セロトニン、トリプタミン、ニコチン酸、又はメラトニンの合成を誘導するために、ヒト用医薬又は獣医学用医薬で有利にも使用できる。
【００２０】
更に、Ｔｒｐ含有ペプチドは、癌治療に有用であると考えられている（例えば、Ｐａｎｚｅｒ ａｎｄ Ｖｉｌｊｏｅｎ， １９９７， Ｊ． Ｐｉｎｅａｌ Ｒｅｓ ２２： １８４−２０２； Ｂｕｂｅｎｉｋら， １９９８， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎａｌａ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ７： １９５−２１９； Ｂｌａｓｋら， １９９９， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎａｌａ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ８： ４９−５５参照）。従って、本発明のペプチド混合物は、悪性細胞増殖に対する医薬での活性成分として使用できる。
【００２１】
本発明の方法によって、重量基準で少なくとも０．９００のＴｒｐ／（Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ）比を有するペプチド混合物が得られる。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）とチロシン（Ｔｙｒ）はしばしば、細胞による取り込みでＴｒｐと競合するので（Ｈｅｉｎｅ，上記）、できるだけ高いＴｒｐ／（Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ）比を有することは非常に利点がある。Ｐｈｅ及びＴｙｒは、栄養で制限的ではないからである。トリプトファンの有効な投与のためには、大きな中性アミノ酸に対するトリプトファンの比はできるだけ高くあるべきであり、それは、これらの大きな中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）は、ヒト及び動物身体中の細胞による取り込みでＴｒｐと競合するからである（上記参照）ことが知られている。それ故、ＬＮＡＡは、適切なＴｒｐ取り込みを阻害する。
【００２２】
それ故、別の好適実施態様では、本発明のペプチド混合物は、重量基準で少なくとも０．２５のＴｒｐ／（Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ＋Ｌｅｕ＋Ｖａｌ＋Ｉｓｏ＋Ｍｅｔ）比を有し、ペプチド混合物を、食品成分又は医薬としての使用に非常に適したものとする。ＬＮＡＡの非常な低含量のために、トリプトファンは、投与されるヒト又は動物身体によって容易に取り込まれることができる。
【００２３】
トリプトファン含有ペプチドは、水性ペプチド混合物で同定でき、ペプチド混合物をアセトニトリル及びトリフルオロ酢酸を含む溶液中に希釈し、ペプチドを分画に分離し、各分画でペプチド特異的光吸収とトリプトファン特異的蛍光を測定することによって定量できる。
【００２４】
トリプトファン含有ペプチドの同定は、上記製造方法をモニターし、ペプチド混合物のトリプトファン含量の品質制御を行うことができるために重要である。同定方法は、トリプトファンが、他のアミノ酸では観察されない特異的蛍光を発するという事実に基づく（Ｈｅｉｎｅ，上記参照）。トリプトファン含量を確立するための蛍光測定と、ＵＶ光吸収測定によるペプチド特異的測定の組合せは、分画の蛋白質含量（吸収に基づく）とトリプトファン含量（蛍光データに基づく）の両方を確立するのに必要とされる情報の全てを得るための非常に便利な方法である。ペプチドの分画のために、ペプチド混合物は好ましくは、０．５−２ｖ／ｖ％のアセトニトリル及び０．０５−０．２５ｗ／ｗ％のトリフルオロ酢酸の溶液中に希釈する。このような溶液で、カラムクロマトグラフィー、好ましくは逆相カラムでのカラムクロマトグラフィーによって、ペプチドを容易に分離することができる。このために、溶液は好ましくは、１ｖ／ｖ％のアセトニトリル及び０．１ｗ／ｗ％のトリフルオロ酢酸を含む。
【００２５】
ペプチド特異的光吸収は、２１４ｎｍの波長で測定する。
ここで、幾つかの非限定的な実施例によって本発明を更に説明する。
【００２６】
実施例１
４５％α−ラクトアルブミンを含む５％乳清蛋白質溶液（ＤＭＶインターナショナル，オランダ）を脱ミネラル水に溶解する。１Ｍ塩酸を用いてｐＨを２．０に調整する。その後、溶液を５０℃に加熱する。
１％ペプシンを加えて、加水分解反応を開始させる。６時間後、ｐＨを５．０に上げ、温度を１０℃に下げて反応を停止させる。この温度で４時間保存後、トリプトファンペプチドを遠心分離とそれに次ぐ凍結乾燥で集める。
酵素的全加水分解に基づく特異的技術を用い、トリプトファンを測定する（Ｇａｒｃｉａ， Ｓ． Ｅ．； Ｂａｘｔｅｒ， Ｊ． Ｈ． （１９９２） Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｉｎｆａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ． Ｊ． ＡＯＡＣ Ｉｎｔ． ７５： １１１２−１１１９）。ＥＧガイドライン９８／６４（１９９８年９月３日；１９９８年９月１９日の刊行物Ｌ２５７／１４−２３）に基づき、アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンを測定する。標準ケルダール法を用い、蛋白質を測定する（ＩＤＦ−ＦＩＬ ２０Ａ， １９８６）。得られる生成物は、蛋白質に９．７％のトリプトファンを含む。  Ｔｒｐ／ＬＮＡＡの計算された重要な比を表１に記載する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
実施例２
６０％α−ラクトアルブミンを含む乳清蛋白質単離物（ＷＰＩ）（ＤＭＶインターナショナル（オランダ）の実験的生成物）を水溶液に溶解する。希釈リン酸を用い、溶液のｐＨを調整し、４５℃に加熱する。
２％ペプシン（メルク，２５００ＦＩＰ−Ｕ／ｇ）を加えて、加水分解を開始させ、２時間行う。８５℃で１０分間、溶液を低温殺菌することによって反応を停止させる。その後、ｐＨを５．５に上げ、溶液を＜１５℃に冷却する。１０時間後、マイクロ濾過を用いて、トリプトファン含有ペプチドを集める。典型的には、名目分子量カットオフ１μｍを有する膜を用いる。その後、ペプチドをスプレー乾燥する。得られる生成物は、蛋白質に９．３％のトリプトファンを含む。
【００２９】
実施例３
０．２５％及び０．７５％Ｅ／Ｓを用い、ペプシン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって、実施例１と類似する乳清蛋白質溶液を加水分解した。５時間後、１．０Ｍ  ＮａＯＨを用い、ｐＨを５．２に上げ、溶液を＜１５℃に冷却することによって、反応を停止させた。
１６時間後、遠心分離によって、沈殿蛋白質を獲得した。沈殿したトリプトファンが豊富なペプチドと上清の両方で、関連分析を行った。これらを、以下の表で示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
実施例４
４５％α−ラクトアルブミンを含む１０％乳清蛋白質溶液（ＤＭＶインターナショナル，オランダ）を脱ミネラル水に溶解する。１Ｍ水酸化ナトリウムを用い、ｐＨを７．０に調整する。その後、溶液を５０℃に加熱する。
２％ＥＮＺＥＣＯブロメライン２４０（Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えることによって、加水分解反応を開始させる。２１時間後、溶液を８５℃に１０分間加熱して、反応を停止させる。次いで、ペプチド混合物を室温に冷却し、リン酸を用いてｐＨを４．５に調整し、温度を１０℃に低下させる。この温度で１２時間保存後、トリプトファンペプチドを、遠心分離とそれに次ぐ凍結乾燥によって集める。ペプチド中の得られるトリプトファンの濃度は８％であった。
【００３２】
実施例５
５％乳清蛋白質単離物溶液（Ｄａｖｉｓｃｏ）の１００ｌｔを調製し、次いで、２％ペプシンを用いて加水分解する。ｐＨ３．０で１２時間、溶液を加水分解した。３０分間溶液を８０℃に加熱することによって、反応を停止させた。その後、Ｃｅｌｇａｒｄ ＮＦ−ＰＥＳ−１０膜を用い、パイロットＮＦユニットで溶液を限外濾過した。保持物のｐＨを３．０に制御し、溶液を２００％透析濾過まで濾過した。
脱塩後、保持物のｐＨを５．５に調整し、トリプトファン含有ペプチドの沈殿を容易にするため、溶液を＜１０℃に冷却する。保存１０時間後、遠心分離を用いて沈殿を集めた。その後、ペプチドを乾燥した。
サンプルのトリプトファン濃度と蛋白質濃度はそれぞれ、９．５％と９１％であった。以下の表に、ペプチドの組成を記載する。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
実施例６      トリプトファンペプチドに特異的なＨＰＬＣ
ペプチド混合物中でトリプトファン含有ペプチドを同定し、定量するために逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰＣ）を構築し、このアミノ酸の特異的蛍光性質を利用した。ペプチド混合物の溶液を結合緩衝液中で調製した。０．２μｍフィルターを用い、これらの溶液を濾過し、次いで逆相クロマトグラフィーで分析した。Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ１８ ５μｍ ＲＰＣカラム（Ｂａｋｅｒ）を用いた。結合緩衝液は、脱ミネラル水／０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）から成っており、アセトニトリル／０．０８３％ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ｂ）を用い、ペプチドを溶出した。緩衝液Ｂのレベルを、９０分で６０％に増加し、その後、２０分間１００％緩衝液を流すことによって、きつく結合した物質を除去した。
２１４ｎｍでの吸収と蛍光（励起波長と放射波長はそれぞれ、２９０ｎｍと３４０ｎｍ）を測定することによって、ペプチドを検出する。
実施例１からの加水分解後のペプチド混合物と沈殿ペプチドを、図１及び２に示す。
【００３５】
実施例７
ペプチドは、乳児調合乳で使用できる。モデルレシピは、以下の通りである。
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【００３６】
乳化剤は油分画に溶解する。ペプチド及び炭水化物は、７０℃の水の一部に溶解する。ミネラルは別々に溶解する。次いで、油混合物をペプチド／炭水化物溶液に加えて、高剪断力ミキサーを用い３分間混合する。
次いで、前−エマルションを、２５０バールで２度ホモジナイズする。調合乳は、８０℃で１５分間加熱することにより低温殺菌し、スプレー乾燥してもよいし（粉末調合乳）、あるいは瓶の中で１２０℃で１０分間滅菌してもよい（液体調合乳）。
【００３７】
実施例８
ペプチドは、インスタントドリンク混合物中に含ませることができる。レシピは以下を含む：
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【００３８】
乾燥成分を混合し、次いで、水１１８ｍｌに加える。成分が溶解するように、溶液を混合する。一杯は、粉末混合物３５ｇを含み、それはトリプトファン約５２５ｍｇを供給する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、実施例１からのペプチド混合物のＯＤ２１４ｎｍでの吸収シグナル（上パネル）及び蛍光シグナル（下パネル）を示す。
【図２】
図２は、実施例１からのトリプトファンが豊富なペプチドの分画のＯＤ２１４ｎｍでの吸収シグナル（上パネル）及び蛍光シグナル（下パネル）を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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