(57)【要約】リガンドの特異的な検出の高感度な方法であって、（ａ）前記リガンドと特異的に結合することができるレセプターと、核酸分子と、を含んだ試薬複合体を形成することができる試薬に試料を接触させ、（ｂ）核酸領域を増幅し、リアルタイムに増幅反応の生成物を同時に検出することにより、核酸分子の存在を特異的に検出することによって、前記試薬複合体のレセプター部分が試料中に存在するリガンドと結合して形成される複合体を検出する工程を含む方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリガンドを検出する方法であって、
（ａ）前記リガンドと特異的に結合することができるレセプターと、核酸分子と、を含んだ試薬複合体を形成することができる試薬に試料を接触させる工程と、
（ｂ）核酸領域を増幅し、リアルタイムに増幅反応の生成物を同時に検出することにより、核酸分子の存在を特異的に検出することによって、前記試薬複合体のレセプター部分が試料中に存在するリガンドと結合して形成される複合体を検出する工程と、
を含む前記方法。
【請求項２】
核酸配列に基づく増幅反応（ＮＡＳＢＡ）を用いた核酸領域の増幅を前記工程（ｂ）が含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸分子に結合している、前記リガンドに結合することができるレセプターに、試料を接触させることを前記工程（ａ）が含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）が、連続的な又は同時の以下の工程：
（ｉ）生物学的結合対の第一の構成要素とコンジュゲートしている、前記リガンドに結合することができるレセプターに、試料を接触させる工程；
（ｉｉ）生物学的結合対の第二の構成要素とコンジュゲートしている、前記リガンドに結合することができるレセプターに、試料を接触させる工程；
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）が、連続的な又は同時の以下の工程：
（ｉ）前記リガンドに結合することができるレセプターに試料を接触させる工程；
（ｉｉ）核酸分子に結合している、（ｉ）のレセプターに結合することができる二次レセプターに、試料を接触させる工程；
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）が、連続的な又は同時の以下の工程：
（ｉ）前記リガンドに結合することができるレセプターに試料を接触させる工程；
（ｉｉ）生物学的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートしている、（ｉ）のレセプターに結合することができる二次レセプターに、試料を接触させる工程；
（ｉｉｉ）生物学的結合対の第二のメンバーとコンジュゲートしている一本鎖核酸分子に試料を接触させる工程；
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）が、連続的な又は同時の以下の工程：
（ｉ）前記リガンドに結合することができるレセプターに試料を接触させる工程；
（ｉｉ）生物学的結合対の第一のメンバーにコンジュゲートしている、（ｉ）のレセプターに結合することができる二次レセプターに、試料を接触させる工程；
（ｉｉｉ）生物学的結合対の第一のメンバーと一端でコンジュゲートし、生物学的結合対の第二のメンバーともう一端でコンジュゲートした、核酸分子に試料を接触させる工程；
（ｉｖ）生物学的結合対の第二のメンバーのみとコンジュゲートした核酸分子と試料を接触させる工程；
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
生物学的結合対の第一及び第二の構成要素がストレプトアビジン又はアビジン及びビオチンである、又はその逆である、請求項３、５、６及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記二次レセプターが前記核酸分子と直接的な化学結合により結合している請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
リガンドに結合することができるレセプターと、核酸分子と、キャリア高分子と、を含んだコンジュゲートである試薬複合体の添加を前記工程（ａ）が含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
キャリア高分子がデキストランである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドに結合することができるレセプターが抗体又は抗体断片である請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が部分的に又は全部一本鎖である請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸が一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、リガンドの特異的検出の高感度な方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
免疫検出は、現在、診断の分野においてリガンドを検出するより抜きの方法である。しかしながら、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような伝統的な免疫検出方法は、非常に低濃度に存在するリガンドを検出する際に、感度及び／又は特異性に欠けている。標準的なＥＬＩＳＡは、単位あたりおよそ１００００の細胞又は標的の最大感度を有している。通常、感度は１０００００細胞又は標的を超えない。免疫磁気法によるタンパク質の濃縮は、学術研究においては１個のヒトの細胞まで検出できるまで感度が上がるが、これは主にヒトの細胞が大きいことによるものである。細菌細胞の検出の最大感度は、たとえ、免疫磁気抗体法を用いても、およそ１０００細胞にとどまる。このように、免疫検出のより高感度な方法が求められている。
【０００３】
ＵＳ５，６６５，５３９には、免疫検出法のための“免疫−ポリメラーゼ連鎖反応”法について記載されている。この方法は、二本鎖ＤＮＡ分子にコンジュゲートした特異的な抗体の使用に基づいている。抗体コンジュゲートが抗原に結合することによって形成される複合体の検出は、まず二本鎖ＤＮＡの領域をＰＣＲを用いて増幅し、次に増幅産物を検出することにより行われる。
【０００４】
本発明者らは、核酸マーカーのリアルタイム増幅に基づいた高感度の抗原（リガンド）検出のための代替方法を開発した。この方法は、免疫反応の特異性に核酸増幅の感度を組み合わせたものであり、リアルタイム定量測定に用いることが可能である。
【発明の説明】
【０００５】
第一の形態として、本発明は、試料中のリガンドを検出する方法であって、
（ａ）前記リガンドに特異的に結合することができるレセプターと及び核酸分子とを含む試薬複合体を形成可能な試薬に試料を接触させるステップ、及び
（ｂ）核酸領域を増幅し同時にリアルタイムで増幅反応の産物を検出することにより核酸分子の存在を特異的に検出することにより、試薬中に存在するリガンドに前記試薬複合体のレセプター部分が結合することにより形成された複合体を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【０００６】
本発明は、特異的なリガンド／レセプター結合反応と、増幅及び増幅産物のリアルタイム検出による核酸マーカーの検出を含む検出ステップと、の組み合わせに基づくものである。従って、本発明の方法の最初の部分は、例えば、イムノアッセイのような標準的なリガンド／レセプター結合試験に類似している。
【０００７】
レセプターは、本質的に、当のリガンドに対して結合特異性を示す分子であればよい。抗体が特に好ましく、また、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片のような抗原結合特異性を保有する抗体断片も特に好ましい。他の適切なレセプターとしては、酵素、ホルモン受容体、レクチン等が含まれる。このリストは、すべてを網羅する意図はない。
【０００８】
核酸分子は、特異的なリガンド／レセプター結合の検出を許すためのマーカーとして用いられる。最も好ましくは、核酸マーカーは、一部又は全部が一本鎖である。核酸を検出するステップは増幅反応を伴っていてもよいため、核酸マーカーの使用は、酵素や蛍光マーカーのような、よりありふれたマーカーよりも重要な利点を提供する。増幅ステップは検出方法の感度を実質的に上げる。
【０００９】
核酸マーカーは、最も好ましくは一本鎖ＤＮＡであるが、一本鎖ＲＮＡマーカーも用いることができる。本発明はまた、例えば、天然にない塩基や誘導体化した塩基や天然にないバックボーン結合を取り込んだ核酸のような、合成ＲＮＡアナログ及び合成ＤＮＡアナログの使用も意図している。
【００１０】
存在する核酸分子の量が試料中のリガンドに結合したレセプターの量の指標となるように、核酸分子がレセプター分子に結合しているのが重要である。一本鎖の核酸は直接レセプターに結合していてもよいが、１つ又はそれ以上の結合分子を介して間接的にレセプターに結合しているのがより一般的である。例えば、リガンド結合レセプターに特異的に結合する二次レセプターを介して、一本鎖核酸分子はレセプターに結合していてもよい。さらに、一本鎖核酸は、リガンド結合レセプターに、又はビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジンのような生物学的結合対の構成要素へのコンジュゲーションを介して二番目のレセプターに、結合していてもよい。従って、「結合」という用語は、結合相互作用を介した結合を含む。
【００１１】
一実施形態においては、検出手順を開始する前に、別のステップにおいてレセプターと一本鎖核酸分子とが結合して試薬複合体を生じてもよい。好ましい実施形態において、リガンド結合レセプターと核酸とキャリア高分子とを含んだコンジュゲートの形成を介して、核酸はリガンド結合レセプターと結合していてもよい。好適なキャリア高分子には水溶性ポリマーが含まれ、例えば、デキストランのような天然又は合成多糖が最も好ましい。オリゴヌクレオチドをキャリア高分子に結合させる好適な方法は、ＷＯ９８／２２６２０及びＵＳ−Ａ−６，２０７，３８５に記載されている。
【００１２】
別の実施形態において、レセプターと、一本鎖核酸と、レセプターを核酸に結合させるのに必要な何らかの結合分子と、を含んだ“試薬複合体”の形成による検出手順の過程の間に、レセプターと一本鎖核酸分子との結合は形成されてもよい。
【００１３】
試薬複合体を構成する構成要素は、検出手順と同時に又は引き続いて加えられてもよい。各々の試薬の添加の間の洗浄に引き続いて、又は特異的な結合の検出の前の結合していない試薬を取り除く最後の洗浄ステップと同時に、試薬を添加できることが、イムノアッセイの分野ではよく知られている。試薬の「同時」添加は、試薬を同時に添加することだけでなく、中間の洗浄ステップなしに試薬が次々に加えられるという状態をも含む。各試薬の添加の間に洗浄を伴う試薬の連続添加はより優れた感度が得られるが、試薬の同時添加はより少ない操作しか要さず、従って、ハイスループット診断適用のための自動化をより受け入れやすい。
【００１４】
本発明の方法の具体的な一実施形態において、標的リガンドに特異的なレセプターが、最初に被験試料に添加される。レセプターは、生物学的結合対の第一の構成要素とコンジュゲートする。レセプター／リガンド結合が生じるように試料はインキュベートされ、次に、結合しなかったレセプターを取り除くために洗浄される。生物学的結合対の第二の構成要素とコンジュゲートした核酸分子が次に添加され、生物学的結合ペアの第一と第二の構成要素のコンジュゲーションを介して核酸がレセプターにリンクするように、試料はインキュベートされ、次に、結合しなかった核酸を取り除くため洗浄される。次に、一本鎖核酸の検出が行われる。生物学的結合対の一例は、ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジンである。最も好ましくは、一本鎖核酸分子がビオチンにコンジュゲートされ、レセプターがアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートされる。レセプターの添加と核酸の添加との間の洗浄ステップは省かれてもよく、二つの試薬は同時に添加されてもよい。
【００１５】
別の具体的な実施形態において、標的リガンドに特異的なレセプターが、最初に被験試料に添加される。次に、レセプター／リガンド結合が生じるように試料はインキュベートされ、次に、結合しなかったレセプターを取り除くために洗浄される。次に、一次レセプターに結合可能な二次レセプターが試料に添加されるが、これらの二次レセプターは一本鎖核酸マーカー分子にリンクしている。次に、二次レセプターが一次レセプターに結合するように、試料はインキュベートされ、結合しなかった核酸を取り除くため洗浄される。次に、核酸の検出が以下に述べるように行われる。この実施形態の具体的な実施例は、抗体を一次レセプター、すなわちリガンドと特異的に結合するレセプターとして、抗アイソタイプ抗体を二次レセプターとして使用することである。レセプターの添加と二次レセプターの添加の間の洗浄ステップは省かれてもよく、二つの試薬は同時に添加されてもよい。
【００１６】
この実施形態の一変更例において、生物学的結合対間の反応を用いて、核酸分子は第二のレセプターにリンクしていてもよい。例えば、二次レセプターはアビジン又はストレプトアビジンとコンジュゲートしていてもよく、核酸分子はビオチンとコンジュゲートしていてもよい。次に、ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプトアビジン結合を介した核酸分子への二次レセプターのリンクは、二次レセプターと核酸分子とを別個の試薬として試験試料に添加することによって達成されてもよく、二つの試薬の添加の間に洗浄ステップを伴っていてもよい。或いは、別個のステップにおいて、第二のレセプターは核酸分子にリンクされてもよく、リンクした試薬は試験試料に添加されてもよい。
【００１７】
さらに具体的な実施形態において、標的リガンドに特異的なレセプターが、最初に被験試料に添加される。次に、レセプター／リガンド結合が生じるように試料はインキュベートされ、次に、結合しなかったレセプターを取り除くために洗浄される。次に、一次レセプターに結合可能な二次レセプターが試料に添加されるが、この二次レセプターは生物学的結合対の第一の構成要素にコンジュゲートしている。次に、二次レセプターが一次レセプターに結合するように、試料はインキュベートされ、結合しなかった二次レセプターを取り除くため洗浄される。次に、生物学的結合対の第一の構成要素と核酸鎖の一端で、生物学的結合対の第二の構成要素と核酸鎖のもう一端で、コンジュゲートしている核酸分子に試料はまず接触され、そして、生物学的結合対の第二の構成要素とのみコンジュゲートした核酸分子に接触される。最終洗浄ステップの後に、核酸は以下に述べるように検出される。
【００１８】
この実施形態の具体的な実施例は、ストレプトアビジンとコンジュゲートした第二のレセプターと、核酸鎖の一端にビオチンがもう一端にはストレプトアビジンがコンジュゲートした第一のタイプの核酸分子と、ビオチンだけがコンジュゲートした第二のタイプ核酸分子と、を利用する。たとえ、残りの試薬の添加が同時に行われたとしても、すなわち中間の洗浄ステップがなかったとしても、二つタイプの核酸分子を中間の洗浄ステップに引き続いて添加するのが好ましい。この実施形態において、添付した図において説明されているように、二つのタイプの核酸分子を使用は、追加の増幅ラウンドを提供する。
【００１９】
上に列挙した具体的な実施形態のいくつかは、試薬複合体の構成要素を一緒にリンクするために“生物学的結合対”を利用する。好適な生物学的結合対には、ビオチン／アビジン及びビオチン／ストレプトアビジンが含まれる。タンパク質及び核酸をビオチン、ストレプトアビジン及びアビジンにコンジュゲートする手法は、その技術の分野においてよく知られている。さらに、有用なコンジュゲートの多くは、商業的に入手可能である。
【００２０】
試薬複合体の構成要素は、特異的な結合によってリンクされていてもよく、一例としては、リガンド結合レセプターに直接結合する二次レセプターの使用がある。構成要素は、二重特異的リンカー分子の使用と結びついていてもよい。二重特異的リンカー分子の例としては、米国特許５，３２８，９８５号に記載されている、組換えプロテインＡ／ストレプトアビジンのキメラタンパク質がある。このキメラ分子は、プロテインＡドメインを介して抗体と、ストレプトアビジンドメインを介してビオチン化された分子と、結合することができる。
【００２１】
この方法の結合反応部分が一旦完了すれば、核酸マーカー分子の検出により特異的なリガンド／レセプター複合体の存在が検出される。
【００２２】
好ましい実施形態において、核酸配列を増幅し増幅産物を検出することにより、核酸の検出が行われる。最も好ましくは、等温増幅法を用いて増幅は行われる。
【００２３】
最も好ましい増幅法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡと略す）であるが、例えば、転写媒介性増幅やシグナル媒介性増幅といったＲＮＡ技術、スプリットプロモーター増幅反応、等温溶液相増幅のような他の等温増幅法を用いてもよい。ＮＡＳＢＡ法は、Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１−９２（１９９１）やＤａｖｅｙらの米国特許５，４０９，８１８号に記載されているように、この技術の分野においてよく知られている。ＮＡＳＢＡは、通常、一本鎖ＲＮＡマーカーとともに使用され、増幅産物は一本鎖ＲＮＡである。しかしながら、本発明においては、標的は、好ましくは、一本鎖ＲＮＡ増幅産物を提供する一本鎖ＤＮＡである。
【００２４】
ＮＡＳＢＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的核酸配列に対応するＲＮＡを大量を生成させるのに効果的な手順であり、もともとの試験試料中に非常に低濃度に存在する標的配列の検出が可能である。ＮＡＳＢＡ法は、例えば、Ｔ７プロモーターのような、プロモーター配列で修飾したプライマーの使用に基づくものである。ＮＡＳＢＡ増幅の感度及び特異性はＰＣＲと同等であり、たいていのＲＴ−ＰＣＲ法よりも優れていることが示されている。
【００２５】
最も好ましい実施形態において、核酸領域の増殖及び増幅産物のリアルタイム検出によって核酸の検出は行われる。最も好ましくは、リアルタイムＮＡＳＢＡによって核酸の検出は行われる。ＮＡＳＢＡ反応では増幅産物が生成するが、主要な増幅産物は、標的核酸の領域に対応するアンチセンス一本鎖ＲＮＡである。リアルタイムＮＡＳＢＡは、標的の増幅と同時に増幅産物の検出を行う。Ｌｅｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：２１５０−２１５５（１９９８）に記載されているように、標準的なＮＡＳＢＡ増幅を組み合わせた“分子ビーコン”技術の使用により、これは可能である。
【００２６】
等温増幅反応を増幅産物のリアルタイム検出と組み合わせると、感度が著しくよくなる。この改善された感度により、例えば、非常に低いレベルのタンパク質や抗体などの標的分析対象物をｉｎ  ｓｉｔｕ検出することが可能である。さらに、非常に低いレベルの標的分析対象物であっても、正確に直接定量検出することが可能である。
【００２７】
核酸マーカー分子の正確な性質、すなわち、その配列は本発明には重要ではないことは認識される。もし、ＮＡＳＢＡが一本鎖ＲＮＡマーカーの検出に用いられるならば、一般的には、増幅反応の効率を妨げる広範囲な二次構造を形成するようなＲＮＡ配列を避けるのが好ましい。
【００２８】
本発明の方法は、例えば、ＮＡＳＢＡ反応を用いて一本鎖核酸の等温増幅を実質的に行うことができ、増幅反応中に９５℃といった高温に必ずしも加熱しなくてもよいという点で、既知の免疫−ＰＣＲ法よりも優れている。高温により免疫検出において使用される抗原及び／又は抗体が分解され得るため、固定化抗原の免疫−ＰＣＲ検出の際には、ＰＣＲサイクルの変性ステップにおける二本鎖ＤＮＡの変性に必要な高温は不利となる。この問題は、等温ＮＡＳＢＡ反応により一本鎖核酸標的を検出することによって避けることができる。
【００２９】
本発明の方法は、免疫検出の分野、特に診断分野において有用性が見出される。特に、この方法は、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ試験に類似したイムノアッセイを行うのに適用することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡは、通常、特定の抗原に対する二つの抗体を必要とする。一つの抗体は、マイクロタイターアッセイプレートのウェルの表面に受動的に吸着（コート）される。次に、バックグラウンドの非特異的アッセイ試薬の非特異的な結合を減らすために、ウェルは、非特異的ブロッキング試薬でブロックされる。次に、所望の抗原（リガンド）を含んでいると思われる試験試料がウェルに添加され、プレート表面に固定された抗体に抗原が結合するのに充分な時間インキュベートされる。結合しなかった試薬を取り除くため洗浄した後、第二の抗体（レセプター）がウェルに添加される。この第二の抗体は、固定化された抗原に結合し、サンドイッチが完成する。第二の抗体（レセプター）の抗原（リガンド）への結合は、本発明の方法、すなわち、アッセイの検出ステップにおいて検出される核酸に第二の抗体（レセプター）がリンクした試薬錯体の形成により行われる。
【００３０】
ＥＬＩＳＡの別の様式においては、試験試料はマイクロタイタープレートのウェルに直接添加され、試料中の抗原（リガンド）がウェルの表面に結合するようにインキュベートされてもよい。この様式のアッセイは、サンドイッチアッセイに類似するが、第一の抗体を必要とせず、代わりに抗原がマイクロタイタープレートのウェルの表面に直接コートされる。
【００３１】
ある特定のリガンドの存在を検査される“試験試料”は、リガンドの存在を検査することを望まれるものであれば、本質的にいかなる材料であってもよい。臨床試料や環境流体等のような流体試料であってもよい。例えば、診断の分野においては、試験試料は、全血、血清、血漿、リンパ、涙、尿等のような体液を含んでいてもよい。試験試料はまた、以下で述べるように、例えば、組織切片、固定化された細胞、又は細胞塗抹のような固体サンプルであってもよい。試験試料の正確な性質は、発明の本質ではない。
【００３２】
本発明の方法は、例えば、固定された切片組織試料中のリガンドのｉｎ  ｓｉｔｕ検出などの、免疫染色組織化学での使用に適用することもでき、従って、請求の範囲の中で用いられる「試料」という言葉は、組織試料や組織切片、固定化された細胞、細胞塗抹等が含まれると解釈される。本発明の方法が組織試料中のｉｎ  ｓｉｔｕリガンド検出に使用されるときは、ＮＡＳＢＡ増幅を核酸マーカー分子の検出のために用いることが好ましく、一本鎖ＲＮＡマーカーが最も好ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕ分析の主要な目的は、抗原の位置を決定すること、ターゲットを保護して分解しないこと、そして、組織の形態を維持することである。抗原をｉｎ  ｓｉｔｕ検出するために免疫−ＰＣＲを使用すると、ＰＣＲ反応サイクル中に高温のステップを含める必要があるため、抗原や測定に使用される抗体が分解したり、組織の根本的な形態が損傷したりするかもしれない。本発明の方法に従って、ＲＮＡマーカーを検出するためにＮＡＳＢＡを使用すると、ＮＡＳＢＡは本質的に等温増幅技術であり、約４２℃の一定温度で行うことができるため（Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，４０９，８１８）、これらの問題を回避する。このように、高温の変性ステップは必要ない。
【００３３】
本発明の方法のｉｎ  ｓｉｔｕ抗原検出への適用の具体的な実施例は、異なったレベルの卵巣がん中のがん抑制タンパク質ｐ５３を予後マーカーとして検出することにある。がん組織切片中にｉｎ  ｓｉｔｕに位置するｐ５３抗原に対する高度に特異的なモノクローナル抗体を、ＤＮＡマーカーやＲＮＡマーカーなどのビオチンラベルした核酸マーカーに付着した二次抗体でラベルされたストレプトアビジンと組み合わせて使用することにより、１０タンパク質以下のｐ５３の発現レベルの変化を検出することが可能である。（ビオチン／ストレプトアビジン結合を介して）二次抗体に付着した核酸マーカーの検出は、理想的なプライマー対と理想的な分子ビーコンプローブを用いたＮＡＳＢＡによって行うのが好ましい。結合した分子ビーコンプローブからの蛍光シグナルは、ＣＣＤカメラとソフトウェアを備えた通常の蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。
【００３４】
本発明の実施の形態は、添付した図面を参照しながら、実施例のみの観点から説明される。
【００３５】
図に記載され、説明されている、一般的なリガンド検出反応において、固体表面に固定された標的リガンド（抗原）が、抗原に対して特異性のある第一の抗体に結合される。次に、第一の抗体に対して特異性のある第二の抗体が、第一の抗体に結合される。図２及び３に記載されているような多数の様々なリンカーの一つを介して、第二の抗体は、一本鎖ＤＮＡオリゴとコンジュゲートする。次に、図４に示され、以下の実施例でより充分に記載されているように、一本鎖ＤＮＡオリゴは、リアルタイム検出のために、プライマーと分子ビーコンを利用したＮＡＳＢＡによって増幅される。
【実施例】
【００３６】
本発明は、以下の実験例を参照して、さらに理解される。
【００３７】
実施例１  免疫リアルタイムＮＡＳＢＡ増幅
材料及び試薬
マイクロプレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ  製品番号６５０１６１，９６ウェル、Ｕ底
マイクロチューブ：ＭＣＴ−１５０−Ｃ  １．５ｍＬ  透明（Ａｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  製品番号３１１−０８−０５１）
リン酸緩衝生理食塩水錠剤（ＰＢＳ）：０．０１Ｍ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−４４１７）
Ｔｗｅｅｎ２０入りリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）：
０．０１Ｍ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３５６３）
ブロッキングバッファー：０．２５ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−６９１７）
抗体希釈バッファー：０．０１Ｍ  ＰＢＳ
一次抗体（１）：ヤギ抗サルモネラ
（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社，ＣＲ７１００ＧＡＰ）
１０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液
細菌（抗原）の培養：
Salmonella cholerasuis subs.cholerasuis
１：１００に希釈；  １：１００及び１：１０．０００  ＰＢＳ溶液
ＤＳＭ  製品番号４８８３（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｈｃｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）
一次抗体（２）：ウサギ抗サルモネラ
（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社，ＣＲ７１００ＲＰ）
１μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液
二次抗体（ＥＬＩＳＡ）：ヤギ抗ウサギ  アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート
（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，８１−６１２２）
１：２０００  ＰＢＳ溶液
ＰＮＰＰ（１００Ｘ）−アルカリホスファターゼ基質：
（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，００−２２０１）
ＰＮＰＰ用基質バッファー（１０Ｘ）で１：１００に希釈
ＰＮＰＰ用基質バッファー（１０Ｘ）：
（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，００−２２０８）
蒸留水で１：１０に希釈
ＩＭＲＡＭＰコンジュゲート：
ヤギ抗ウサギＩｇＧ及び合成オリゴ核酸（配列明細は、下記参照）付きのデキストランバックボーン。二つ異なったオリゴ核酸が、このプロトコールで使用されている（Ｉｍｍｂ５及びＩｍｋｏｒｔ）。
ＩＭＲＡＭＰコンジュゲート希釈バッファー：トリス／塩酸  ０．１Ｍ  ｐＨ７．２
自動単離試薬：
Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  Ｎａｓｂａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  製品番号８４０４４（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）
シリカ粒子
溶解バッファー（ｐＨ  通常）
合成オリゴ，（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）配列：
（Ｉｍｍｂ５）：５’アミノ修飾基  Ｃ１２
5'C12-gattaatcggccggcttcgcctaggcagacatttcagcatacgcatactatatcctttgcatgctactatatggcagcgtcgtcagatagcacagtagcagcgattaa-3'
（Ｉｍｋｏｒｔ）：５’アミノ修飾基  Ｃ１２
5'C12-gattaatcgggcagacatttcagcatacgcatactatcctttgcatgctactatatgtcagatagcacagtagcagcgattaa-3'
分子ビーコン（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）配列：
（Ｐｍｂ2）：5' FAM-GCGGC ATC CTT TGC ATG CTA CTA TAGCCGC-Dabsyl-3'
ＮＡＳＢＡプライマー１及び２（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）配列：
（Ｐｎａｓｂａ１）：5'- AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AAG G GCT GCT ACT GTG CTA TCT GA-3'
（Ｐｎａｓｂａ２）：5'-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG GAC ATT TCA GCA TAC GCA TA-3'
ベーシックキット（増幅反応）：
Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  Ｎａｓｂａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  製品番号８４１２１（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）
【００３８】
プロトコール
プレートのコーティング
１．  ９６穴マイクロタイタープレートのウェルを、１００μＬの１０μｇ／ｍＬの一次抗体（１）でコートする。４１℃で一晩インキュベートする。
２．  コートしなかった一次抗体（１）を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
３．  プレートを２００μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで２０℃で２時間インキュベーションし、残っている活性部位をブロックする。
４．  ブロックしなかったＢＳＡを捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
【００３９】
これで、マイクロプレートは、下記のＥＬＩＳＡ又はＩＭＲＡＭＰの適用に使用するための準備が整う。
【００４０】
サンドイッチＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）
（ＩＭＲＡＭＰのステップ１−８において対照としての機能）
５．  ７０μＬの適切な濃度の新鮮なサルモネラ培養液をウェルに加える。振盪（４０回転／分）しながら２０℃で１時間インキュベートする。
６．  結合しなかった細菌を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
７．  一次抗体（２）のＰＢＳ溶液の適切な希釈液を調製する。ウェルに７０μＬ加えて、振盪（４０回転／分）しながら、２０℃で１時間インキュベーションする。
８．  結合しなかった一次抗体（２）を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
９．  二次抗体アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートの適切な希釈液を調製する。ウェルに７０μＬ加えて、振盪（４０回転／分）しながら２０℃で１時間インキュベーションする。
１０．  結合しなかった二次抗体を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
１１．  アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）のＰＮＰＰ基質バッファー溶液（１０Ｘ）を調製する。
１２．  陽性試料において、黄色現像が生じる。陰性試料は、透明であるか、発色現像を示さない。
【００４１】
免疫リアルタイム増幅（ＩＭＲＡＭＰ）
５．  ７０μＬの適切な濃度の新鮮なサルモネラ培養液をウェルに加える。振盪しながら２０℃で１時間インキュベートする。
６．  結合しなかった細菌を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
７．  一次抗体（２）のＰＢＳ溶液の適切な希釈液を調製する。ウェルに７０μＬ加えて、振盪（４０回転／分）しながら２０℃で１時間インキュベーションする。
８．  結合しなかった一次抗体（２）を捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
９．  ＩＭＲＡＭＰコンジュゲートのトリス／塩酸緩衝液の適切な希釈液を調製する（コンジュゲートは、上記の通り）。ウェルに７０μＬ加えて、振盪（４０回転／分）しながら２０℃で１時間インキュベーションする。
１０．  結合しなかったＩＭＲＡＭＰコンジュゲートを捨てる；コートされたウェルをＰＢＳＴで少なくとも３回、ＰＢＳで１回洗浄する。
【００４２】
これで、マイクロタイタープレートは、下記の（Ａ）又は（Ｂ）の適用に使用するための準備が整う。
【００４３】
（Ａ）ＮＡＳＢＡ増幅及び分子ビーコン検出によるＩＭＲＡＭＰ
（図４）
１．  マスターミックスを調製する：Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットの説明書に従う。
以下の溶液をマスターミックスに加える：
２０μＭの合成オリゴに対する分子ビーコン（Ｐｍｂ２）を２．５μＬ
１０μＭの合成オリゴに対するＮａｓｂａプライマー１を５μＬ
１０μＭの合成オリゴに対するＮａｓｂａプライマー２を５μＬ
酵素溶液（ＲＮＡポリメラーゼ；Ｒｎａｓｅ  Ｈ；逆転写酵素）を６０μＬ
２．  ウェルに２０μＬのＰＢＳを加える。
３．  ウェルに１５μＬのマスターミックスを加える（上記参照）。
４．  ウェルに最終濃度１Ｕ／μＬとなるようＲｎａｓｉｎを加える。
５．  ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＦＬ６００蛍光プレートリーダー内にて、４１℃で２時間、増幅と検出を進める。
プレートリーダーの設定：
感度：７５
励起：４８５／４０
発光：５３０／２５
【００４４】
（Ｂ）抽出によるＩＭＲＡＭＰ：ＮＡＳＢＡ増幅及び分子ビーコン検出
１．  ウェルに１００μＬの溶解バッファーを加え、３７℃で２０分間インキュベートする。
２．  ０．９ｍＬの溶解バッファーを含んだセパレートチューブに、ウェルからすべての物質を移す。３７℃で１０分間インキュベートする。
３．  各チューブに５０μＬのシリカ粒子を加え、室温で１０分間インキュベートする。チューブを２分おきに混合する。
４．  Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒでの使用のため、セパレートカートリッジ中のチューブからすべての物質を捨てる。
５．  「１ｍＬの血漿の抽出」の方法のマニュアルに従う。
６．  ５μＬの抽出液がＮＡＳＢＡ増幅法（Ａに記載）に使用される。
【００４５】
注：
ＩＭＲＡＭＰコンジュゲートのインキュベーションの後、通常の抽出法（Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ）の前に、溶解バッファーをウェルに加える。
【００４６】
溶解バッファーは、おそらく、デキストランバックボーンを壊し、従って、ＲＮＡポリメラーゼの立体障害の可能性を減少させる。
【００４７】
実施例２  様々なサイズのデキストランを用いた、一本鎖ＤＮＡ及び抗体の結合したデキストランバックボーンを含んだコンジュゲートにおけるオリゴの増幅。
以下のコンジュゲートが調製された：
コンジュゲート    オリゴ            デキストランサイズ（分子量）
６４１１０１      Ｉｍｍｋｏｒｔ      ２００００
６４１１０１      Ｉｍｍｋｏｒｔ    １９６０００
６４１１０１      Ｉｍｍｋｏｒｔ    ５０００００
６４１１０１      Ｐｎａｓｂａ１    ５０００００
【００４８】
増幅
2004520574.tif 000002
１）  ２．５  Ｐｎａｓｂａ２、（ＮＡＳＢＡ  ｐｒｉｍｅｒ２）  １０μＭ
２．５  Ｉｍｍｋｏｒｔ  ０．１μＭ（ＮＡＳＢＡ  ｐｒｉｍｅｒ１として使用）
１．２５  Ｐｍｂ２ｎｙ、（分子ビーコン）  ２０μＭ
２）  １５μＬ  Ｐ  ｎａｓｂａ  １  ＋  Ｐ  ｎａｓｂａ  ２  プライマーミックス、１０μＭ
各ウェルに１５μＬのマスターミックスを入れた。試料及びコンジュゲートが加えられ、生成物はＢＩＯ−ＴＥＫ  ＦＬ６０００蛍光プレートリーダーで検出された。
【００４９】
結果（表わされていない）は、比較的小さな分子量のデキストランが、ＮＡＳＢＡ検出に最も適していることを示している。
【００５０】
実施例３  コンジュゲートの抽出と増幅
試料の抽出
１００μＬのコンジュゲートを９００μＬの溶解バッファー（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ｐＨ通常）に加え、水浴中にて３７℃で１０分間インキュベーションする。溶解バッファー中のコンジュゲートに５０μＬのシリカを加え、２分おきにチューブをひっくり返しながら、１０分間インキュベーションする。
【００５１】
試料は、Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒに入れられ、ＲＮＡ／ＤＮＡが標準法によって抽出された。
【００５２】
ＮＡＳＢＡ増幅の結果
【表１】
2004520574.tif 000003
Ｉｍｍｂ３        オリゴ
ｄｘ              デキストラン
Ａｂ              抗体
Ｂｒｏｎｉｄｏｘ  防腐剤
【００５３】
増幅結果（表わされていない）は、抽出したデキストランコンジュゲートを使用して、増幅が成功することを示している。ＥＤＴＡ、ＲＮａｓｉｎ、ＤＭＳＯを含んだコンジュゲートがＩＭＲＡＭＰにおけるＮＡＳＢＡ増幅に最も適している。
【００５４】
実施例４  Ｒｎａｓｉｎの有無での増幅
オリゴＰｓｅｋ２及びコンジュゲートＦ３２０４０１の増幅。Ｆ３２０４０１はＩｍｍｂ３（オリゴ）、デキストラン、及びＧＡＲ（抗体）から成る。
マスターミックス：
１試薬粒
８０μＬ  試薬粒希釈液
１３．５μＬ  ｎａｓｂａ水
１４μＬ  塩化カリウム
５μＬ  Ｐｎａｓｂａ  ｐｒｉｍｅｒ  １
５μＬ  Ｐｎａｓｂａ  ｐｒｉｍｅｒ  ２
２．５μＬ  Ｐｍｂ２（分子ビーコン）
６０μＬ  酵素
マスターミックスを２つに分ける。片一方には、ＲＮａｓｉｎを最終濃度１Ｕ／ｍＬとなるように加えた。
【００５５】
１５μＬのマスターミックスを各ウェルに加え、５μＬ加えた。
試料：
１）  Ｐｓｅｋ２（１：１００）
２）  Ｐｓｅｋ２（１：１０．０００）  ＲＮａｓｉｎなしのマスターミックス
３）  Ｆ３２０４０１
４）  Ｐｓｅｋ２（１：１００）
５）  Ｐｓｅｋ２（１：１０．０００）  ＲＮａｓｉｎありのマスターミックス
６）  Ｆ３２０４０１
【００５６】
結果（表わされていない）は、Ｒｎａｓｉｎが増幅を促進することを示している。
【００５７】
実施例５  加熱の有無での増幅
人工オリゴＰｓｅｋ２並びにコンジュゲートＦ６２０３０１及びＦ６５０３０１−２の増幅。
【００５８】
Ｆ６２０３０１は、Ｉｍｍｂ５（オリゴ）デキストランから成る。Ｆ６２０３０１−２は、Ｉｍｍｂ５デキストラン及びＧＡＲ（抗体）から成る。コンジュゲートは、トリス／塩酸緩衝液及び塩化ナトリウムに溶解する。
【００５９】
マスターミックス：
２試薬粒
１６０μＬ  試薬粒希釈液
２７μＬ  ｎａｓｂａ水
２８μＬ  塩化カリウム
１０μＬ  ｎａｓｂａプライマー  １：Ｐｎａｓｂａ１
１０μＬ  ｎａｓｂａプライマー  ２：Ｐｎａｓｂａ２
５μＬ  分子ビーコン：Ｐｍｂ２
【００６０】
１０μＬのマスターミックスを２０ウェルに各々入れ、５μＬの試料を加えた：２つのグループのオリゴ又はコンジュゲート。グループ１では、酵素を直接加えた（余熱なし）。グループ２では、マスターミックスを６５℃で４分間余熱し、酵素を加える前に４１℃に冷した。両グループの試料は、４１℃で２時間、増幅され、検出された。
【００６１】
結果（表わされていない）は、人工オリゴのＮＡＳＢＡ増幅はマスターミックスの余熱せずに行うのが最適であることを確かめた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、本発明によるリガンドの検出反応に使用されるコンジュゲートの略図である。
【図２】図２は、第二のレセプターと核酸オリゴとの橋として使用され得る、いろいろなリンカー（アビジン−ビオチン、アビジン−ストレプトアビジン、デキストラン、又は化学結合を介した直接的なコンジュゲーション）の例の略図である。以下の実施例でより充分に記載されているように、一本鎖オリゴは、次に、リアルタイム検出のために、プライマーと分子ビーコンを用いたＮＡＳＢＡによって増幅される。
【図３】図３は、本発明によるリガンド検出反応に利用され得るいろいろなリンカーを含んだ様々なコンジュゲートの略図である。
【図４】図４は、本発明による、ＮＡＳＢＡ増幅と分子ビーコン技術を利用したリガンド検出反応の一般的な図である。
【図１】
2004520574.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520574.tif 000040
【国際調査報告】
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2004520574.tif 000042
2004520574.tif 000043
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