(57)【要約】本発明は、式Ｉ【化１】2004500338.tif 000018（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、請求項１に示した意味を有する）の化合物に関する。本発明の化合物は、ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３（ＮＨＥ−３）の阻害剤にあたる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＥ−３阻害剤としての式Ｉ
【化１】
2004500338.tif 000015
（式中、
Ｒ１、Ｒ４は、それぞれ互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これは−ＣＯＡ、−ＣＯ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−Ａｒ、−ＣＯＯＡ、−ＯＨによって、または従来のアミノ保護基、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２、
【化２】
2004500338.tif 000016
または
【化３】
2004500338.tif 000017
によってモノ置換されてもよく、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５ は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ａ、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＮＨＣＯＡｒ、ＮＨＳＯ２Ａ、ＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＮＨＡｒ、ＣＯＲ６、ＣＯＡｒ、Ｓ（Ｏ）ｎＡ、Ｓ（Ｏ）ｎＡｒ、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＯＲ６、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＯＲ６、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＮ（Ｒ６）２、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＮ（Ｒ６）２、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＮＨＡｒまたは−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＮＨＡｒであり、
Ｘは、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−、−ＣＲ６＝ＣＲ６−、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−Ｏ−、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＲ６−または−ＮＲ６ＣＯ−であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ａまたはベンジルであり、
Ａは、１〜２０の炭素原子を有するアルキルであり、ここでその１または２のＣＨ２基は、酸素原子もしくは硫黄原子で、または−ＣＲ６＝ＣＲ６−基で置換されてもよく、および／または１〜７の水素原子は、Ｆで置換されてもよく
Ａｒは、フェニルまたはナフチルであり、ここでそれは未置換か、またはＡ、Ａｒ’、ＯＲ６、ＯＡｒ’、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＮＨＣＯＡｒ’、ＮＨＳＯ２Ａ、ＮＨＳＯ２Ａｒ’、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＮＨＡｒ’、ＣＯＲ６、ＣＯＡｒ’、Ｓ（Ｏ）ｎＡもしくはＳ（Ｏ）ｎＡｒ’によって、モノ−、ジ−もしくはトリ置換しており、
Ａｒ’は、フェニルまたはナフチルであり、ここでそれは未置換か、またはＡ、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＲ６もしくはＳ（Ｏ）ｎＡによって、モノ−、ジ−もしくはトリ置換しており、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
ｎは、０、１または２であり、
ｍは、１または２であり、
ｐは、１または２である）
の化合物、並びにその塩および溶媒和物。
【請求項２】
ＮＨＥ−３阻害剤としての、
ａ）　３’−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキサミジン；
ｂ）　３’−（３−カルバムイミドイルベンジルオキシ）ビフェニル−３−カルボキサミジン；
ｃ）　３’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシ−メチル）ビフェニル−３−カルボン酸；
ｄ）　Ｎ−［３’−（３−グアニジノカルボニルフェノキシメチル）−ビフェニル−３−カルボニル］グアニジン；
ｅ）　メチル［３’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）−ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート；
ｆ）　［３’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）−ビフェニル−３−イルオキシ］酢酸
である、請求項１に記載の化合物、並びにその塩および溶媒和物。
【請求項３】
血栓症、心臓の虚血性状態、末梢および中枢神経系、および卒中、末梢器官および手足の虚血性状態の治療のため、並びにショック状態の治療用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用。
【請求項４】
外科手術および臓器移植において使用するため、並びに外科的な手法のための移植片の保存および貯蔵のための医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用。
【請求項５】
細胞増殖が一次的または二次的要因である疾患の治療用、脂質代謝障害または呼吸運行の乱れの治療用または予防用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用。
【請求項６】
虚血性腎臓障害、虚血性腸障害の治療用、または急性もしくは慢性腎臓障害の予防用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用。
【請求項７】
請求項１に記載のＮＨＥ−３阻害剤および／またはその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の少なくとも１つを含有することを特徴とする医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式Ｉ
【化４】
2004500338.tif 000002
（式中、
Ｒ１、Ｒ４は、それぞれ互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これは−ＣＯＡ、−ＣＯ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−Ａｒ、−ＣＯＯＡ、−ＯＨによって、または従来のアミノ保護基、ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２、−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２、
【化５】
2004500338.tif 000003
または
【化６】
2004500338.tif 000004
によってモノ置換されてもよく、
【０００２】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５ は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ａ、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＮＨＣＯＡｒ、ＮＨＳＯ２Ａ、ＮＨＳＯ２Ａｒ、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＮＨＡｒ、ＣＯＲ６、ＣＯＡｒ、Ｓ（Ｏ）ｎＡ、Ｓ（Ｏ）ｎＡｒ、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＯＲ６、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＯＲ６、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＮ（Ｒ６）２、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＮ（Ｒ６）２、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｍ−ＣＯＮＨＡｒまたは−［Ｃ（Ｒ６）２］ｐ−ＣＯＮＨＡｒであり、
Ｘは、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−、−ＣＲ６＝ＣＲ６−、−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−Ｏ−、−Ｏ−［Ｃ（Ｒ６）２］ｎ−、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＲ６−または−ＮＲ６ＣＯ−であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ａまたはベンジルであり、
【０００３】
Ａは、１〜２０の炭素原子を有するアルキルであり、ここでその１または２のＣＨ２基は、酸素原子もしくは硫黄原子で、または−ＣＲ６＝ＣＲ６−基で置換されてもよく、および／または１〜７の水素原子はＦで置換されてもよく、
Ａｒは、フェニルまたはナフチルであり、ここでそれは未置換か、またはＡ、Ａｒ’、ＯＲ６、ＯＡｒ’、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＮＨＣＯＡｒ’、ＮＨＳＯ２Ａ、ＮＨＳＯ２Ａｒ’、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＮＨＡｒ’、ＣＯＲ６、ＣＯＡｒ’、Ｓ（Ｏ）ｎＡもしくはＳ（Ｏ）ｎＡｒ’によって、モノ−、ジ−もしくはトリ置換しており、
Ａｒ’は、フェニルまたはナフチルであり、ここでそれは未置換か、またはＡ、ＯＲ６、Ｎ（Ｒ６）２、ＮＯ２、ＣＮ、Ｈａｌ、ＮＨＣＯＡ、ＣＯＯＲ６、ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＯＲ６もしくはＳ（Ｏ）ｎＡによって、モノ−、ジ−もしくはトリ置換しており、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
ｎは、０、１または２であり、
ｍは、１または２であり、
ｐは、１または２である）
の化合物、並びにその塩および溶媒和物に関する。
【０００４】
ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３の他の阻害剤は、例えばＥＰ ０ ８２５ １７８に記載されている。
本発明は、有用な特性を有する新規化合物、とくに医薬の製造に用いることができる化合物を見出す目的に基づいた。
【０００５】
ＤＥ １９８１９５４８には、式Ｉの化合物およびそれらの塩が、因子Ｘａ−阻害特性を有し、したがって、血栓症などの血栓塞栓性障害、心筋梗塞、動脈硬化、炎症、卒中、狭心症、血管形成後の再狭窄および間欠性は行の制御および予防に用いることができることが記載されている。
【０００６】
驚くべきことに、式Ｉの化合物およびそれらの塩がナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３を阻害し、良好な許容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を有することが見出された。式Ｉの化合物は、人医および獣医において薬学的な活性化合物として用いることができる。
【０００７】
Ｎａ＋／Ｈ＋交換体は、少なくとも６つの異なるアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）（ＮＨＥ−１からＮＨＥ−６）を有するファミリーであり、これは今やすべてクローニングされている。サブタイプＮＨＥ−１が体全体のすべての組織の至るところに分布しているが、他のＮＨＥサブタイプは、腎臓または小腸管腔の壁および反対側の管腔の壁（ｃｏｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｗａｌｌ）などの特異的な器官に選択的に発現する。この分布は、種々のアイソフォームにより果たされる特異的機能、即ち一方でサブタイプＮＨＥ−１による細胞内ｐＨおよび細胞容量の抑制、および一方でアイソフォームＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３による腸および腎臓でのＮａ＋の吸収および再吸収を反映している。アイソフォームＮＨＥ−４は、主に胃で見出された。ＮＨＥ−５の発現は、脳および神経組織に限定されている。ＮＨＥ−６は、ミトコンドリアにおけるナトリウム／プロトン交換体を形成するアイソフォームである。
【０００８】
アイソフォームＮＨＥ−３は、とくに近位の腎臓細管の先端膜（ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）において発現し、したがって、ＮＨＥ−３阻害剤は、とりわけ腎臓保護活性を発揮する。
ＮＨＥ−３アイソフォームに対する選択的阻害剤の治療上の使用は多様である。ＮＨＥ−３阻害剤は、腎臓虚血の間または腎臓移植における腎臓の除去、移植および再潅流の間の場合など、ＮＨＥ活性の活性化を導く病理学的な低酸素性および虚血性の事象後の組織の損傷および細胞壊死を阻害するかまたは低減する。
【０００９】
式Ｉの化合物は、血圧降下作用を有し、高血圧の治療用の医薬活性化合物として適している。さらに利尿剤として適している。
式Ｉの化合物は、単独で、または異なるサブタイプの特異性のＮＨＥ阻害剤と組み合わせて、抗虚血性作用を有し、慢性または急性腎不全、並びに手術の前および間の器官（例えば、腎臓および肝臓）の保護のために血栓症、アテローム性動脈硬化症、血管痙攣において用いることができる。
【００１０】
さらに、卒中、脳水腫、神経系の虚血、種々の形のショックの治療、並びに、例えば、以下の状態：中枢性睡眠時無呼吸症、乳幼児突然死、術後低酸素症および他の呼吸障害における呼吸運行の改善に用いることができる。呼吸活性は、さらに呼吸活性は、カルボアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）阻害剤との組み合わせによって改善することができる。
【００１１】
式Ｉの化合物は、例えば、線維芽細胞増殖および血管の平滑筋の増殖などの細胞の増殖に対する阻害作用を有し、したがって細胞増殖が一次的または二次的要因である疾患の治療に用いることができる。式Ｉの化合物は、糖尿病後期合併症、癌性の障害、線維症の障害、内皮性機能障害、器官肥大および肥厚化に対して、とくに前立腺肥大または前立腺の肥厚化において、用いることができる。
【００１２】
さらに高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および増殖性障害のある形態の測定および差別化のための診断剤として適している。
式Ｉの化合物はまた、血清リポ蛋白質レベルに有利に影響を与えるので、単独でまたは他の増加した血中脂質量レベルの治療用医薬と組み合わせて用いることができる。
【００１３】
本発明は、血栓症、心臓の虚血性状態、末梢および中枢神経系、および卒中、末梢器官および手足の虚血性状態の治療のため、並びにショック状態の治療用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用に関する。
【００１４】
さらに本発明は、外科手術および臓器移植において使用するため、並びに外科的な手法のための移植片の保存および貯蔵のための医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用に関する。
【００１５】
また本発明は、細胞増殖が一次的または二次的要因である疾患の治療用、脂質代謝障害または呼吸運行の乱れの治療用または予防用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用に関する。
【００１６】
さらに本発明は、虚血性腎臓障害、虚血性腸障害の治療用、または急性もしくは慢性腎臓障害の予防用の医薬の製造のための、請求項１に記載の式Ｉの化合物並びにその生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和物の使用に関する。
【００１７】
ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３を阻害する物質の同定方法は、例えばＵＳ ５，８７１，９１９に記載されている。
例えば、Ｒ６などの何度もでてくる式Ｉの化合物のすべての基について、それらの意味は互いに独立した状態である。
【００１８】
水和物は、例えば、半水化物、一水和物または二水和物を意味すると理解し、溶媒和物は、例えば、メタノールまたはエタノールなどを含有するアルコール付加化合物を意味すると理解する。
【００１９】
前記式中、Ａは、アルキルであり、直鎖状または分枝状であり、１から２０、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の炭素原子を有する。Ａは、好ましくは、メチル、さらにエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチルであり、さらにペンチル、１−、２−または３−メチルブチル、１，１−、１，２−または２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−、２−、３−または４−メチルペンチル、１，１−、１，２−、１，３−、２，２−、２，３−または３，３−ジメチルブチル、１−または２−エチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−または１，２，２−トリメチルプロピル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシルである。
【００２０】
Ａはさらに、例えば、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、アリルまたはクロチルなどである。
ＣＯＲ６は、アシルであり、好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオニルであり、さらに、ブチリル、ペンタノイルまたはヘキサノイルである。
ＣＯＯＲ６は、好ましくは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニルまたはブトキシカルボニルである。
Ｈａｌは、好ましくは、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒであり、またＩでもある。
【００２１】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ互いに独立して、好ましくは、Ｈ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、アセトアミド、スルホンアミド、メチルスルホンアミド、フェニルスルホンアミド、メチルチオ、エチルチオ、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、メチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルフィニル、フェニルスルホニル、シアノ、、カルボキシル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、カルボキシメトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、カルボキシメチル、メトキシカルボニルメチル、アミノカルボニルメトキシ、アミノカルボニルメチル、Ｎ−フェニルアミノカルボニルメトキシ、Ｎ−フェニルアミノカルボニルメチル、さらにアシルまたはベンゾイルである。
【００２２】
とくに、Ｒ２、Ｒ５は、Ｈである。
Ｒ３は、とくに、例えばＨ、ＣＯＯＡ、または−ＯＣＨ２ＣＯＯＲ６であり、ここでＲ６はＨまたは１〜４の炭素原子を有するアルキルである。
Ｒ６は、Ｈ、Ａまたはベンジルであるが、とくにＨまたは１〜４の炭素原子を有するアルキルである。
Ｘは、好ましくは、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＯＯ−、−ＯＯＣ−、−ＣＯＮＨ−または−ＮＨＣＯ−；極めてとくに、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−が好ましい。
【００２３】
Ａｒは、好ましくは、未置換のフェニルまたはナフチル、さらに好ましくは、例えば、Ａ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ベンジルオキシ、 フェネチルオキシ、メチルチオ、エチルチオ、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、メチルスルホニル、エチルスルホニル、フェニルスルフィニル、フェニルスルホニル、ニトロ、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ホルムアミド、アセトアミド、プロピオニルアミノ、ブチリルアミノ、メチルスルホンアミド、エチルスルホンアミド、プロピルスルホンアミド、ブチルスルホンアミド、フェニルスルホンアミド、（４−メチルフェニル）スルホンアミド、カルボキシメトキシ、カルボキシエトキシ、メトキシカルボニルメトキシ、メトキシカルボニルエトキシ、ヒドロキシメトキシ、ヒドロキシエトキシ、メトキシエトキシ、カルボキシル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、シアノ、フェニルアミノカルボニル、アシルまたはベンゾイル、さらにはビフェニルで、１、２または３置換されているフェニルまたはナフチルである。
【００２４】
したがって、Ａｒは、好ましくは、例えば、ｏ−、ｍ−またはｐ−トリル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アミノフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−メチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アセトアミドフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−カルボキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシカルボニルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−エチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アセチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ホルミルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メチルスルホニルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（フェニルスルホンアミド）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（メチルスルホンアミド）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メチルチオフェニル、さらに好ましくは、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジクロロフェニル、２，３−、２，４−、２，５−、２，６−、３，４−または３，５−ジブロモフェニル、２，４−または２，５−ジニトロフェニル、２，５−または３，４−ジメトキシフェニル、３−ニトロ−４−クロロフェニル、３−アミノ−４−クロロ−、２−アミノ−３−クロロ−、２−アミノ−４−クロロ−、２−アミノ−５−クロロ−または２−アミノ−６−クロロフェニル、２−ニトロ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−または３−ニトロ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル、２，３−ジアミノフェニル、２，３，４−、２，３，５−、２，３，６−、２，４，６−または３，４，５−トリクロロフェニル、２，４，６−トリメトキシフェニル、２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロフェニル、ｐ−ヨードフェニル、３，６−ジクロロ−４−アミノフェニル、４−フルオロ−３−クロロフェニル、２−フルオロ−４−ブロモフェニル、２，５−ジフルオロ−４−ブロモフェニル、３−ブロモ−６−メトキシフェニル、３−クロロ−６−メトキシフェニル、３−クロロ−４−アセトアミドフェニル、３−フルオロ−４−メトキシフェニル、３−アミノ−６−メチルフェニル、３−クロロ−４−アセトアミドフェニルまたは２，５−ジメチル−４−クロロフェニルである。
【００２５】
Ａｒ’は、とくに、例えば、フェニルまたはナフチルであり、さらに好ましくは、例えば、ｏ−、ｍ−またはｐ−トリル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−プロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−イソプロピルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ヒドロキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ニトロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アミノフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−メチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アセトアミドフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−エトキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−カルボキシフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−メトキシカルボニルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ−エチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）フェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−アセチルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ホルミルフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−フルオロフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−ブロモフェニル、ｏ−、ｍ−またはｐ−クロロフェニル、またはｏ−、ｍ−またはｐ−メチルスルホニルフェニルである。
【００２６】
したがって、本発明は、とくに上述の基の少なくとも１つが、上記に示した好ましい意味の１つであるこれら式Ｉの化合物の使用に関する。いくつかの好ましい化合物の群は、以下の従属式Ｉａ〜Ｉｉによって表現することができ、これは式Ｉに対応し、そして式中、基はさらに詳細には示していない基は、式Ｉに示す意味を有するが、ここで、
【００２７】
Ｉａにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく；
Ｉｂにおいて、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり；
Ｉｃにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、そして
Ｒ３は、ＨまたはＣＯＯＲ６であり；
【００２８】
Ｉｄにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、そして
Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＯＲ６または−Ｏ−（ＣＨ２）ＣＯＯＲ６であり；
Ｉｅにおいて、
Ｘは、−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ２−であり；
Ｉｆにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、
Ｒ３は、ＨまたはＣＯＯＲ６であり、そして
Ｘは、−ＣＨ２−Ｏ−または−Ｏ−ＣＨ２−であり；
【００２９】
Ｉｇにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、
Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＯＲ６または−Ｏ−（ＣＨ２）ＣＯＯＲ６であり、そして
Ｘは、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり；
Ｉｈにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、
Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＯＲ６、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＲ６、ＣＨ２−ＣＯＯＲ６、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮ（Ｒ６）２、ＣＨ２−ＣＯＮ（Ｒ６）２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮＨＡｒまたはＣＨ２−ＣＯＮＨＡｒであり、
Ｘは、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒ６は、ＨまたはＡであり、
Ａは、１〜４の炭素原子を有するアルキルであり；
【００３０】
Ｉｉにおいて、
Ｒ１、Ｒ４は、各々の場合において、互いに独立して、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２であり、これはＯＨまたは−ＣＯ−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）２で１置換されていてもよく、
Ｒ２、Ｒ５は、Ｈであり、
Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＯＲ６、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＲ６、ＣＨ２−ＣＯＯＲ６、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＮ（Ｒ６）２またはＣＨ２−ＣＯＮ（Ｒ６）２であり、
Ｘは、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｒ６は、ＨまたはＡであり、
Ａは、１〜４の炭素原子を有するアルキルである。
【００３１】
式Ｉの化合物およびこれらの製造のための出発物質は、他に、それ自体知られている方法、例えば文献（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ ［有機化学の方法］、Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）などの標準的な研究）に記載されているような、即ち前記の反応に適している知られた反応条件下で製造される。また、この場合において、それ自体知られている変法を用いることができるが、ここでは、さらに詳細には述べない。
【００３２】
所望により、出発物質をその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）、これら反応混合物から単離せずに、直ちにさらに反応して式Ｉで表される化合物を生じるように、形成することができる。
【００３３】
式Ｉの化合物は、好ましくは、加溶媒分解剤または水素化分解剤で処理することにより、それらの機能的な誘導体の１つから遊離することによって得ることができる。
加溶媒分解または水素化分解のために、好ましい出発物質は、他に、式Ｉに対応するものであるが、１または２以上の遊離のアミノおよび／または水酸基の代わりに、対応する保護されたアミノおよび／または水酸基を含むものであり、好ましくは、窒素原子に結合する水素原子の代わりにアミノ保護基をもつもの、とくにＨＮ基の代わりに、Ｒ’−Ｎ−基（式中、Ｒ’はアミノ保護基）をもつもの、および／または水酸基の水素原子の代わりに水酸保護基をもつものであり、例えば、式Ｉに対応するが、基−ＣＯＯＨの代わりに基−ＣＯＯＲ”（式中、Ｒ”は水酸保護基）をもつものである。
好ましい出発物質はまた、対応するアミジノ化合物に変換することができるオキサジアゾール誘導体である。
【００３４】
オキサジアゾール基の導入は、例えば、シアノ化合物とヒドロキシルアミンとの反応およびホスゲン、ジアルキルカルボネート、クロロホルム酸エステル、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールまたは無水酢酸との反応によって行なわれる。
出発物質の分子内に多数の（同一または異なる）保護されたアミノ基および／または水酸基が存在することも可能である。存在する保護基が互いに異なる場合、多くの場合において選択的に除去することができる。
【００３５】
「アミノ保護基」という表現は、一般的に知られ、化学反応からアミノ基を保護すること（またはブロックすること）に適している基であるが、分子内の他の場所で所望の化学反応が行なわれた後に容易に除去し得るものに関する。このタイプの典型的な基は、とくに未置換または置換されたアシル、アリール、アラルコキシメチルまたはアラルキル基である。アミノ保護基は所望の反応（または一連の反応）の後に除去されるので、そのサイズおよび性質は、別に重要ではないが、しかしながら、１〜２０、とくに１〜８の炭素原子を有するものが好ましい。「アシル基」という表現は、本方法に関して最も広い意味で、解釈されるべきである。脂肪族、アラリファティック（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族または複素環式である、カルボン酸またはスルホン酸、とくに、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびとりわけアラルコキシカルボニル基から誘導されるアシル基を含む。
【００３６】
このタイプのアシル基の例としては、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのアルカノイル；フェニルアセチルなどのアラルカノイル；ベンゾイルまたはトルイルなどのアロイル；ＰＯＡなどのアリールオキシアルカノイル；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、ＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）、２−ヨードエトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル；ＣＢＺ（「カルボベンゾキシ」）、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＦＭＯＣなどのアラルキルオキシカルボニル；Ｍｔｒなどのアリールスルホニルが挙げられる。好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣおよびＭｔｒであり、さらにＣＢＺ、Ｆｍｏｃ、ベンジルおよびアセチルである。
【００３７】
「水酸保護基」という表現は、同様に一般的に知られ、化学反応から水酸基を保護するのに適している基であるが、分子内の他の場所で所望の化学反応が行なわれた後に容易に除去し得るものに関する。このタイプの典型的な基は、前記の未置換または置換されたアリール、アラルキルまたはアシル基であり、さらにアルキル基もである。所望の化学反応または一連の反応後に再び除去されるので、水酸保護基の性質およびサイズは重要ではないが、１〜２０、とくに１〜１０の炭素原子を有する基が好ましい。水酸保護基の例としては、とりわけベンジル、ｐ−ニトロベンゾイル、ｐ−トルエンスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルおよびアセチルであり、ベンジルおよびｔｅｒｔ−ブチルがとくに好ましい。
【００３８】
式Ｉの化合物のその機能的誘導体からの単離は、用いた保護基に依存し、例えば、強酸を用い、便法としてＴＦＡまたは過塩素酸を用いるが、塩酸、硫酸などの他の強い無機酸、トリクロロ酢酸などの強い有機カルボン酸、またはベンゼンスルホン酸もしくはｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸も用いて行なう。さらに不活性溶媒の存在が可能であるが、常に必要であるものではない。好適な不活性溶媒は、好ましくは、有機溶媒であり、例えば、酢酸などのカルボン酸、テトラヒドロフランまたはジオキサンなどのエーテル、ＤＭＦなどのアミド、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素、さらにはメタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、および水が挙げられる。さらに、前記溶媒の混合物でもよい。ＴＦＡは、好ましくは、さらなる溶媒を加えずに過剰量で用いられ、過塩素酸は、酢酸と７０％過塩素酸とを９：１の比の混合物として用いる。開裂のための反応温度は、便法として、およそ０からおよそ５０°の間であり、反応は、好ましくは、１５から３０°の間（室温）で行なわれる。
【００３９】
基ＢＯＣ、ＯＢｕｔおよびＭｔｒは、好ましくは、例えば、ジクロロメタン中においてＴＦＡを用いて、または１５〜３０°でジオキサン中においておよそ３〜５Ｎ ＨＣｌを用いて除去することができ、Ｆｍｏｃ基は、１５〜３０°でＤＭＦ中においてジメチルアミン、ジエチルアミンまたはピペリジンのおよそ５〜５０％溶液を用いる。
【００４０】
水素化分解的に除去し得る保護基（例えば、ＣＢＺ、ベンジルまたはそのオキサジアゾール誘導体からのアミジノ基の単離）は、例えば、触媒の（例えば、便法として炭素などの支持体上、パラジウムなどの貴金属触媒の、または、例えば、酢酸を添加した湿潤性ラネイニッケルなどの）存在下での水素処理によって除去することができる。ここでの好適な溶媒は前記に示したものであり、とくに、例えば、メタノールもしくはエタノールなどのアルコール、ＤＭＦなどのアミドである。一般に、水素化分解は、およそ０〜１００°の間の温度およびおよそ１〜２００ｂａｒの間の圧力で行なわれ、好ましくは、２０〜３０°および１〜１０ｂａｒで行なわれる。ＣＢＺ基の水素化分解は、例えば、（水素に代わって）ギ酸アンモニウムを用いて、２０〜３０°で、メタノール中の５〜１０％ Ｐｄ／Ｃで、またはメタノール／ＤＭＦ中のＰｄ／Ｃで、素早く行なわれる。
【００４１】
Ｒ１およびＲ４が−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２である式Ｉの化合物は、好ましくは、対応するシアノ化合物から得ることができる。例えば、ヒドロキシアミンとの反応、および続く、例えばＰｄ／Ｃまたはラネイニッケルなどの触媒の存在下で水素でのＮ−ヒドロキシアミジンの還元によって、シアノ基はアミジノ基に変換される。式Ｉのアミジン（Ｒ１＝−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）の製造のために、式Ｉのニトリル（Ｒ１＝ＣＮ）にアンモニアを加えることもできる。この添加は、好ましくは、従来知られた方法で、多くの段階、ａ）Ｈ２Ｓを用いてニトリルをチオアミドに、これをＣＨ３Ｉなどのアルキル化剤を用いて対応するＳ−アルキルイミドチオエステルに、そのＮＨ３との部分反応によりアミジンを得る変換をすること、ｂ）ＨＣｌの存在下エタノールなどのアルコールを用いてニトリルを対応するイミドエステルに変換し、これをアンモニアで処理すること、または、ｃ）リチウムビス（トリメチルシリル）アミドとニトリルを反応し、次いで生成物を加水分解すること、により行なわれる。
【００４２】
シアノ化合物の製造は、従来知られた方法で行なわれる。
Ｒ１およびＲ４が−ＣＯＮ（＝ＮＨ）−ＮＨ２である式Ｉの化合物は、好ましくは、クアニジンとの反応によって、対応するアルコキシカルボニル化合物から得ることができる。
さらに、式Ｉの化合物を他の式Ｉの化合物に変換することは、１または２以上の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ５を、例えば、アミノ基をアシル化すること、またはニトロ基をアミノ基に還元すること（例えば、メタノールまたはエタノールなどの不活性溶媒中、ラネイニッケルまたはＰｄ／炭素での水素化による）により、１または２以上の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４および／またはＲ５に変換することによって可能である。
【００４３】
エステルは、例えば、酢酸で、または０〜１００°の間の温度で、水、水／ＴＨＦもしくは水／ジオキサン中において、ＮａＯＨもしくはＫＯＨで加水分解することができる。
さらに、常法により酸塩化物または無水物を用いて遊離アミノ基をアシル化すること、またはこれらを未置換もしくは置換されたアルキルハライドを用いて、便法として、ジクロロメタンもしくはＴＨＦなどの不活性溶媒中、および／または−６０〜＋３０°の間の温度でトリエチルアミンもしくはピリジンなどの存在下で、アルキル化することが可能である。
【００４４】
一般的に、反応は、不活性溶媒中、酸結合剤の存在下、好ましくは、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物塩、炭酸塩もしくは重炭酸塩の存在下、またはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の他の弱酸の塩存在下、好ましくはカリウム、ナトリウム、カルシウムもしくはセシウムの存在下で行なわれる。トリエチルアミン、ジメチルアニリン、ピリジンまたはキノリンなどの有機塩基の添加、または過剰の式ＩＩもしくは式ＩＩＩのアルキル化誘導体のアミン成分もまた好都合であり得る。用いた条件に依存して、反応時間は数分から１４日の間であり、反応温度は、およそ０°〜１５０°で、通常は２０°〜１３０°の間である。
【００４５】
好適な不活性溶媒は、例えば、ヘキサン、石油エーテル、ベンゼン、トルエンまたはキシレンなどの炭化水素；トリクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、四塩化炭素、クロロホルムまたはジクロロメタンなどの塩素化炭化水素；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコール；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサンなどのエーテル；エチレングリコールモノメチルもしくはモノエチルエーテル（メチルグリコールまたはエチルグリコール）、エチレングリコールジメチルエーテル（ジグライム（ｄｉｇｌｙｍｅ））などのグリコールエーテル；アセトンまたはブタノンなどのケトン；アセトアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド；アセトニトリルなどのニトリル；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのスルホキシド；二硫化炭素；ギ酸または酢酸などのカルボン酸；ニトロメタンまたはニトロベンゼンなどのニトロ化合物；酢酸エチルなどのエステル、または述べた溶媒の混合物である。
【００４６】
式Ｉの塩基は、酸で、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中で等量の塩基と酸との反応およびその後蒸発することで、関連する酸付加塩に変換できる。この反応に好適な酸は、とくに生理学的に許容し得る塩を産するものである。したがって、無機酸を用いることができ、例えば、硫酸、硝酸、塩酸もしくは臭化水素酸などのハロゲン化水素酸、オルトリン酸などのリン酸、スルファミン酸、さらには、有機酸、とくに、脂肪族、脂環式、アラリファティック、芳香族または複素環式である一塩基もしくは多塩基のカルボン酸、スルホン酸もしくは硫酸で、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、ピバリン酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタンもしくはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノおよびジスルホン酸、およびラウリル硫酸が挙げられる。ピクリン酸塩などの生理学的に許容し得ない酸との塩は、式Ｉの化合物の単離および／または精製のために用いることができる。
【００４７】
一方、式Ｉの化合物は、対応する金属塩、とくにアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩へ、または、塩基（例えば、水酸化もしくは炭酸ナトリウムもしくはカリウム）を用いて対応するアンモニウム塩へ変換することができる。例えば、エタノールアミンなどの生理学的に許容し得る有機塩基を用いることも可能である。
【００４８】
さらに本発明は、ＮＨＥ−３阻害剤および／またはそれらの生理学的に許容し得る塩としての式Ｉの化合物の医薬製剤の、とくに非化学的ルートによる製造のための使用に関する。
これに関連して、少なくとも１つの固体、液体および／または半流動体のビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）もしくは賦形剤とともに、好適な投与形態にすることができ、適当であれば、１または２以上のさらなる活性化合物を組み合わせることができる。
【００４９】
さらに本発明は、式ＩのＮＨＥ−３阻害剤および／またはその生理学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物の少なくとも１つを含有する医薬製剤に関する。
これら製剤は、人医または獣医において医薬として用いることができる。可能なビヒクルは、有機または無機物質で、経腸（例えば、経口）もしくは非経口投与または局所適用のために好適であり、新規化合物と反応せず、例えば、水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、ラクトースもしくは澱粉などの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルクおよびワセリンなどである。とくに錠剤、丸薬、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、ジュースまたはドロップは経口投与に用いられ、坐剤は直腸投与に用いられ、液剤、好ましくは油性または水性液剤、さらには懸濁液、乳液またはインプラントが、非経口投与に用いられ、そして軟膏、クリームまたは粉末が局所適用または貼付剤において経皮的に用いられる。
【００５０】
新規化合物は凍結乾燥することもでき、得られた凍結乾燥物は、例えば、注射製剤の製造に用いることができる。示した製剤は滅菌でき、および／または潤滑剤などの賦形剤、保存剤、安定化剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝物質、着色料、香料および／または１または２以上のさらなる活性化合物、例えば１または２以上のビタミンを含んでもよい。
エアゾールまたはスプレーの形で投与に好適な医薬製剤は、薬学的に許容し得る溶媒において式Ｉの活性化合物の、例えば、液剤、懸濁液または乳液である。
【００５１】
式Ｉの化合物およびその生理学的に許容し得る塩および溶媒和物は、前記に示した疾患または疾患状態の治療および／または予防のために用いることができる。
【００５２】
これに関連して、本発明の物質は、一般的に、好ましくは、投与単位あたり、およそ０．１〜１００ｍｇの間、とくに１〜１０ｍｇの間で投与される。１日の投与量は、好ましくは、およそ０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。しかしながら、各患者に対し特定の投与量は、すべての種類の因子、例えば、用いる特定の化合物の効能、年齢、体重、健康の一般的状態、性別、食物、投与の時間および経路、並びに排出率、薬学的組み合わせおよび療法を適応する特定の障害の重篤度に依存する。経口投与が好ましい。
【００５３】
本明細書中、すべての温度は℃で示される。以下の例において、「通常の仕上げ」は、以下のことを意味する：所要に応じて、水を加え、混合物を所要に応じて、最終生成物の構成に依存して、ｐＨを２〜１０の間にし、酢酸エチルまたはジクロロメタンで抽出し、有機相を分離して除去し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をシリカゲル上のクロマトグラフィーおよび／または結晶化により精製する。
質量分析法（ＭＳ）：　　ＥＩ （電子衝撃イオン化） Ｍ＋
ＦＡＢ （高速原子衝撃） （Ｍ＋Ｈ）＋
【００５４】
例１
ジメトキシエタン５０ｍｌ中、３−ブロモベンゾニトリル２．０６ｇおよび３−トリルボロン酸１．５０ｇの溶液を、パラジウム（ＩＩ）アセテート２４７ｍｇ、トリ−ｏ−トリルホスフィン３３５ｍｇ、水２０ｍｌおよび無水炭酸ナトリウム９５４ｍｇで処理し、撹拌しながら、１００℃で１８時間加熱した。混合物を常法で仕上げ、残留物は、石油エーテル／酢酸エチル９：１を用いてシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行ない、３’−メチルビフェニル−３−カルボニトリルを無色固体（”Ａ”）、ＥＩ １９３として得た。
【００５５】
四塩化炭素１０ｍｌ中、”Ａ”１．１７ｇの溶液を、Ｎ−ブロモサクシンイミド（ＮＢＳ）１．０９ｇおよびアゾビスイソブチロニトリル６０ｍｇで処理し、７０℃で１８時間加熱した。常法で仕上げ、残留物は、石油エーテル／酢酸エチル９：１を用いてシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行ない、３’− ブロモメチルビフェニル−３−カルボニトリルを無色固体（”Ｂ”）として得た。
【００５６】
アセトニトリル１０ｍｌ中、”Ｂ”５００ｍｇおよび３−ヒドロキシベンゾニトリル２３８ｍｇの溶液を炭酸セシウム６５２ｍｇで処理し、室温で４０時間撹拌した。通常の仕上げの後、残留物は、アセトニトリル／水６５：３５を用いた逆相カラムでクロマトグラフィーを行なった。３’−（３−シアノフェノキシ−メチル）ビフェニル−３−カルボニトリル（”Ｃ”）を、無色固体ＦＡＢ ３１１として得た。
【００５７】
エタノール１０ｍｌ中、”Ｃ”９０ｍｇおよびヒドロキシアンモニウムクロリド１２５ｍｇの溶液を、ポリマー結合ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１．２ｇで処理し、室温で１８時間撹拌した。ポリマーをろ別し、溶媒を除去し、Ｎ−ヒドロキシ−３’−［３−（Ｎ−ヒドロキシカルバムイミドイル）フェノキシメチル］ビフェニル−３−カルボキサミジン（”Ｄ”）を、無色固体、ＦＡＢ ３７７として得た。
メタノール１０ｍｌ中、”Ｄ”７６ｍｇの溶液を、水湿潤性（ｗａｔｅｒ−ｍｏｉｓｔ）ラネイ（Ｒａｎｅｙ）ニッケル１００ｍｇおよび酢酸３０ｍｇで処理し、室温、常圧で１８時間水素化した。触媒をろ別し、溶媒を除去し、３’−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシアミジン、アセテート、を得た。ＥＩ ３２７ （Ｍ＋−ＮＨ３）、３１０ （Ｍ＋−２ＮＨ３）
【化７】
2004500338.tif 000005
【００５８】
以下の化合物は、同様に得られた。
３’−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシアミジン、ジアセテート、ＦＡＢ ３４５；
３’−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシアミジン、ジアセテート、ＦＡＢ ３４５；
３’−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシアミジン、ジアセテート、ＦＡＢ ３４５；
４’−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシアミジン、
４’−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシアミジン、
４’−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシアミジン、および
４’−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシアミジン。
【００５９】
例２
例１と同様に、化合物３’−メトキシビフェニル−３−カルボニトリルを、３−ブロモベンゾニトリルと３−メトキシフェニルボロン酸との反応によって得た。続く三ヨウ化アルミニウムを用いたアセトニトリルでのエーテル開裂および３−ブロモメチルベンゾニトリルとの反応によって、３’−（３−シアノベンジルオキシ）ビフェニル−３−カルボニトリルを得た。
【００６０】
ヒドロキシアミンとの反応およびＲａＮｉ触媒下での水素還元によって、３’−（３−カルバムイミドイルベンゾイルオキシ）ビフェニル−３−カルボキサミジンを得た。
【化８】
2004500338.tif 000006
【００６１】
以下の化合物は、同様に得られた。
４’−（４−カルバムイミドイルベンジルオキシ）ビフェニル−４−カルボキサミジン、ジアセテート、ＦＡＢ ３４５；
４’−（３−カルバムイミドイルベンジルオキシ）ビフェニル−４−カルボキサミジン、ジアセテート、ＦＡＢ ３４５。
【００６２】
例３
例１と同様に、化合物メチル３’−シアノ−５−メチルビフェニル−３−カルボキシレートを、３−シアノフェニルボロン酸とメチル３−ブロモ−５−メチルベンゾエートとの反応によって得た。ＮＢＳでの臭素化および３−ヒドロキシベンゾニトリルとの反応によって、メチル３’−シアノ−５−（３−シアノフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシレートを得た。
【００６３】
ヒドロキシアミンとの反応およびＨ２／ＲａＮｉでの還元によって、化合物メチル３’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシレートを得た。それよりＮａＯＨ水溶液を用いたエステルの加水分解によって、３’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボン酸を得た。
【化９】
2004500338.tif 000007
【００６４】
アセトニトリル／水／ＴＦＡ混合物を用いた逆相カラムでのクロマトグラフィーによって、３’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボン酸、ビストリフルオロアセテート、を得た。
以下の化合物は、同様に得られた。
メチル４’−カルバムイミドイル−４−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３；
メチル４’−カルバムイミドイル−４−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−２−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３；
メチル３’−カルバムイミドイル−４−（４−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−２−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３；
メチル３’−カルバムイミドイル−４−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−２−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３；
メチル４’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３；
メチル３’−カルバムイミドイル−５−（３−カルバムイミドイルフェノキシメチル）ビフェニル−４−カルボキシレート、ＦＡＢ ４０３。
【００６５】
例４
例１と同様に、メチル３−ブロモベンゾエートと３−トリルボロン酸との反応によって、メチル３’−メチルビフェニル−３−カルボキシレートを得た。ＮＢＳでの臭素化およびメチル３−ヒドロキシベンゾエートとの反応によって、それよりメチル３’−（３−メトキシカルボニルフェノキシメチル）−ビフェニル−３−カルボキシレートを得た。ナトリウムメトキシドメタノール溶液中のグアニジン塩酸塩との反応によって、それよりＮ−［３’−（３−グアニジノカルボニルフェノキシメチル）ビフェニル−３−カルボニル］グアニジンを得た。
【化１０】
2004500338.tif 000008
【００６６】
同様に、化合物Ｎ−［４’−（４−グアニジノカルボニルフェノキシメチル）−ビフェニル−４−カルボニル］グアニジンが得られた。
【００６７】
例５
アセトニトリル１００ｍｌ中、３−ブロモ−５−メチルフェノール７．０ｇおよびメチルブロモアセテート５．９７ｇおよび炭酸セシウム１３ｇの溶液を、室温で一晩撹拌した。通常に仕上げた後、メチル（３−ブロモ−５−メチルフェノキシ）アセテート（”ＡＢ”）９．７０ｇが得られた。トルエン５０ｍｌ中、”ＡＢ”２．０ｇ、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム１００ｍｇおよび炭酸ナトリウム０．８５ｇの溶液を沸騰まで加熱した。次いでメタノール３０ｍｌ中、３−シアノフェニルボロン酸２．９４ｇの溶液を滴状に加え、そしてこの混合物を還流下１４時間加熱した。常法で仕上げ、メチル（３’−シアノ−５−メチルビフェニル−３−イルオキシ）アセテート（”ＡＣ”）２．１７ｇを得た。
【００６８】
四塩化炭素５０ｍｌ中、”ＡＣ”１．２ｇおよびＮＢＳ０．７６５ｇの溶液を室温でＵＶ光を用いて照射した。通常の仕上げの後、メチル（３’−シアノ−５−ブロモメチルビフェニル−３−イルオキシ）アセテート（”ＡＤ”）１．５４ｇを得た。
【００６９】
アセトニトリル１０ｍｌ中、”ＡＤ”１８５ｍｇ、４−ヒドロキシベンゾニトリル６３．１ｍｇおよび炭酸セシウム１７２．７ｍｇの溶液を室温で４日間撹拌した。通常の仕上げの後、メチル［３’−シアノ−５−（４−シアノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート（”ＡＥ”）を得た。
【００７０】
エタノール１０ｍｌ中、”ＡＥ”６０ｍｇ、ヒドロキシアンモニウムクロリド６９．５ｍｇおよびトリエチルアミン１０１ｍｇの溶液を、還流下１４時間加熱した。溶媒を除去した後、残留物を水に取り上げた。固体を分離し、メチル［３’−Ｎ−ヒドロキシアミジノ−５−（４−Ｎ−ヒドロキシアミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート（”ＡＦ”）７０ｍｇを得た。Ｈ２／ラネイニッケルを用いた還元によって、メチル［３’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート、ＦＡＢ ４３３、を得た。
【００７１】
【化１１】
2004500338.tif 000009
【００７２】
以下の化合物は、同様に得られた。
メチル［４’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート、ＦＡＢ ４３３、
メチル［３’−アミジノ−５−（３−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート、ＦＡＢ ４３３、
メチル［４’−アミジノ−５−（３−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］アセテート、ＦＡＢ ４３３。
【００７３】
メチルブロモアセテートが、第一段階でｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテートに置き換わった場合、最終段階で得られたｔｅｒｔ−ブチルエステルは、トリフルオロ酢酸および対応するカルボン酸を用いて、開裂することができる。
［３’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］酢酸， ビストリフルオロアセテート、ＦＡＢ ４１９；
［４’−アミジノ−５−（４−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］酢酸；
［３’−アミジノ−５−（３−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］酢酸；
［４’−アミジノ−５−（３−アミジノフェノキシメチル）ビフェニル−３−イルオキシ］酢酸
が得られた。
【００７４】
例６
３’−ブロモメチルビフェニル−３−カルボニトリル５．０ｇおよびトリエチルホスファイト５ｍｌの溶液を、合わせて１５０°までゆっくりと加熱した。混合物を１５０°で６時間撹拌し、通常の仕上げの後、ジエチル（３’−シアノビフェニル−３−イルメチル）ホスホネート（”ＢＡ”）６．０５ｇを得た。
【００７５】
水素化ナトリウム１５０ｍｇを、氷冷しながら、窒素下、エチレングリコールジメチルエーテル２０ｍｌ中、”ＢＡ”１．０ｇおよび３−シアノベンズアルデヒドの溶液に加えた。続いて混合物を４時間撹拌し、常法で仕上げ、そして３’−［２−（３−シアノフェニル）ビニル］ビフェニル−３−カルボニトリル（”ＢＢ”）０．９３　ｇを得た。
【００７６】
メタノール中、５％Ｐｄ−Ｃを用いた”ＢＢ”３６０ｍｇの水素化の後、３’−［２−（３−シアノフェニル）エチル］ビフェニル−３−カルボニトリル（”ＢＣ”）を得た。ヒドロキシルアンモニウムクロリドとの反応およびラネイニッケルを用いた水素化の後、化合物３’−［２−（３−アミジノフェニル）エチル］ビフェニル−３−カルボキサミジン、ＦＡＢ ３４３、が、例１と同様に得られた。
【００７７】
【化１２】
2004500338.tif 000010
【００７８】
同様に化合物３’−［２−（４−アミジノフェニル）エチル］ビフェニル−３−カルボキサミジン、ＦＡＢ ３４３、が得られた。
【００７９】
例７
化合物Ｎ−［３’−（４−グアニジノカルボニルベンジルオキシ）ビフェニル−３−カルボニル］グアニジン， ジヒドロクロリド、ＦＡＢ ４３１
【化１３】
2004500338.tif 000011
が、例えば、次の反応スキームにしたがって得られた。
【化１４】
2004500338.tif 000012
【００８０】
化合物Ｎ−［３’−（３−グアニジノカルボニルベンジルオキシ）ビフェニル−３−カルボニル］グアニジン、ＦＡＢ ４３１；
Ｎ−［３’−（４−グアニジノカルボニルベンジルオキシ）ビフェニル−４−カルボニル］グアニジン、ＦＡＢ ４３１；
Ｎ−［３’−（３−グアニジノカルボニルベンジルオキシ）ビフェニル−４−カルボニル］グアニジン、ＦＡＢ ４３１；
が同様に得られた。
【００８１】
薬理試験
ＮＨＥ−３阻害剤としての式Ｉの化合物の特徴づけに用いた方法を以下に示す。
式Ｉの化合物は、そのアイソフォームＮＨＥ−１からＮＨＥ−３に対する選択性に関して特徴づけた。３つのアイソフォームは、マウス線維芽細胞系で安定して発現した。化合物の阻害活性は、細胞内アシドーシス後の細胞へのＥＩＰＡ−感受性２２Ｎａ＋吸収の測定によって評価した。このアイソフォーム選択性に関するＮａ＋／Ｈ＋交換体阻害剤の特徴づけのために、本発明者らは、マウス線維芽細胞系（方法セクション参照）で安定して発現するＮＨＥアイソフォーム、ＮＨＥ−１、−２および−３の阻害する化合物を、細胞内アシドーシス後の細胞へのＥＩＰＡ−感受性２２Ｎａ＋吸収の測定によって研究した。
【００８２】
材料および方法
異なるＮＨＥアイソフォームを発現するＬＡＰ１細胞系
アイソフォームＮＨＥ−１、−２および−３を発現するＬＡＰ１細胞系（マウス線維芽細胞系）は、Ｊ． Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ博士（フランス、ニース）から得た。トランスフェクションは、Ｆｒａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）の方法で行なった。細胞は、１０％不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＮＨＥ発現細胞の選抜のために、Ｓａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）のいわゆる「酸破壊法（ａｃｉｄ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」を用いた。最初に細胞は、重炭酸塩−、ＮＨ４Ｃｌ−およびナトリウム−無添加緩衝液で洗浄し、ＮＨ４Ｃｌ−含有、重炭酸塩−およびナトリウム−無添加緩衝液に移し、そしてインキュベーションは重炭酸塩−無添加、ＮａＣｌ−含有緩衝液で行なった。機能的にＮＨＥを発現した細胞だけが、それらが曝された細胞内酸性化において生存することができた。
【００８３】
ＮＨＥ阻害剤のアイソフォーム選択性に関する特徴づけ
アイソフォームＮＨＥ−１、ＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３を発現する前記マウス線維芽細胞系を用いて、Ｃｏｕｎｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）およびＳｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９９５）に記載の方法で、アイソフォームに対する選択性について化合物を試験した。細胞は、ＮＨ４Ｃｌプレパルス（ｐｒｅｐｕｌｓｅ）法と、次いで重炭酸塩無添加、２２Ｎａ＋含有緩衝液でのインキュベーションによって、細胞内が酸性化した。細胞内酸性化によって、ＮＨＥは活性化し、そしてナトリウムは細胞内へ吸収された。試験化合物の効果は、ＥＩＰＡ（エチルイソプロピルアミロリド）−感受性２２Ｎａ＋吸収の阻害として現れた。
【００８４】
ＮＨＥ−１、ＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３を発現する細胞を２４ウェルのマイクロタイタープレートに、５〜７．５×１０４細胞／ウェルの密度での接種によって移し、２４〜４８時間、コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで培養した。培地を吸引し、細胞をＮＨ４Ｃｌ緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、７０ｍＭ 塩化コリン、１５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．０）で、３７℃、６０分間インキュベートした。次いで緩衝液を除去し、細胞を素早く、塩化コリン洗浄緩衝液（１２０ｍＭ 塩化コリン、１５ｍＭ ＰＩＰＥＳ／トリス、０．１ｍＭ ウワバイン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．４）の層で素早く２回覆い、この緩衝液中で細胞を６分間インキュベートした。インキュベーション時間が過ぎた後、インキュベーション緩衝液を吸引した。細胞外の放射活性除去を目的として、氷冷したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を素早く４回洗浄した。次いで細胞をウェルあたり０．３ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨの添加によって可溶化した。細胞断片を含む溶液をシンチレーション管に移した。各ウェルをさらに、０．３ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで２回洗浄し、洗浄液を同様に、対応するシンチレーション管に加えた。細胞溶解物を含む管をシンチレーションカクテルと混ぜ、細胞へ吸収された放射活性をβ線の測定によって測定した。
【００８５】
ウサギ赤血球における２２Ｎａ＋吸収阻害
Ｎａ＋／Ｈ＋交換体活性もまた酸性化したウサギ赤血球における２２Ｎａ＋イオンの吸収の観測によって測定した。ウサギ赤血球によって、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体活性における調査での広い応用が見出された（Ｅｓｃｏｂａｌｅｓ ＆ Ｆｕｇｕｅｒｏａ， １９９１： Ｍｏｒｇａｎ ＆ Ｃａｎｅｓｓａ， １９９０）。酸性化赤血球における２２Ｎａ＋吸収のＥＩＰＡ−感受性部分は、Ｎａ＋／Ｈ＋−依存２２Ｎａ＋吸収とみなされた。
【００８６】
細胞調製
赤血球の調製および赤血球の内部酸性化は、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｃａｎｅｓｓａ （１９９０）の方法に準じて行なった。
【００８７】
血液をウサギ（ニュージーランドホワイトなど）から得た。ナトリウム・ヘパリン溶液（２５０ Ｕ／ｍｌ）５ｍｌを含む５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）遠心管に収集した。血液とヘパリン溶液をよく混ぜた。赤血球を２０００×ｇ、４℃での遠心分離によって回収し；血漿および軟膜を除去した。残っている溶液を２００ｍ ｍガーゼでろ過した。ろ液を再び、はじめの体積の洗浄緩衝液（１４０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ トリス／ＭＯＰＳ、ｐＨ ７．４）に懸濁した。赤血球を再び遠心分離（２０００×ｇ、４℃）により回収した。洗浄の手順を２回繰り返した。
【００８８】
細胞内酸性化
細胞内酸性化のために、沈積し収集した赤血球を再び、４５ｍｌの酸性化緩衝液（１７０ｍＭ ＫＣｌ、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ウワバイン、１０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ スクロース、２０ｍＭ トリス／Ｍｅｓ、ｐＨ ６．２）を用いて懸濁した。赤血球の懸濁液を３７℃、１０分間（時折混ぜながら）インキュベートした。内部ｐＨを固定するために、２００μＭ〜１ｍＭの間のＤＩＤＳまたはＤＩＡＭＯＸ（アセタゾールアミド）で処理を行なった。混合物をさらに３７℃、３０分間インキュベートした。
次いで赤血球を遠心分離（４分間、２０００×ｇ、４℃）で回収し；氷冷した非緩衝洗浄液（１７０ｍＭ ＫＣｌ、４０ｍＭ スクロース、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を用いて再び懸濁し、それで４回洗浄した。
【００８９】
インキュベーションおよび２２Ｎａ＋吸収の測定
インキュベーションは、８×１２の形式で、マクロウェル（ｍａｃｒｏｗｅｌｌ）チューブストリップで行なった。インキュベーションを、（予め温めた）赤血球の酸性化溶液２０μｌを添加したインキュベーション緩衝液（１６０ｍＭ ＫＣｌ、２２ＮａＣｌ（３７ＭＢｑ／ウェル）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ウアバイン、１０ｍＭ グルコース、４０ｍＭ スクロース、１０ｍＭ トリス／ＭＯＰＳ、ｐＨ ８．０、０．５ｍＭ Ｄｉａｍｏｘ、１％ ＤＭＳＯ）２００μｌに混ぜることによって始めた。試験物質は最初に１００％ ＤＭＳＯを用いて溶解し、次いで溶液をインキュベーション緩衝液を用いて対応する濃度に希釈した。３７℃、５分間でインキュベーションを行なった。（予備実験において、これらインキュベーション条件下で、５分間のインキュベーション期間では２２Ｎａ吸収率は直線的であることが示された）。氷冷した終止液（１１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ウワバイン）８００μｌを添加することによって、インキュベーションを止めた。管を少しだけ氷上に置いた。次いで管をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で覆い、赤血球を２０００×ｇおよび４℃、７分間の遠心分離で回収した。４つの管を互いのとなりに同時に吸引でき、チップが管の中に深く落ち込みすぎることを防ぐ、チップの他端にあるスペーサーリングを備えた自家製の吸引装置により、赤血球のペレットを吸引した。すべての２２Ｎａを含む上清と洗浄液を放射活性廃棄物として貯蔵し、処分した。
【００９０】
赤血球を氷冷した終止液９００μｌで３回、即ち、上記の懸濁／遠心分離工程を繰り返すことによって、洗浄した。最後の洗浄の後、赤血球のペレットを水２００μｌに混ぜた。次いで管を２×３０分間、超音波処理した。次いでマクロウェルチューブストリップを分解し、各管を個々のシンチレーション管へまっ逆さまに置き、赤血球の溶血液を緩やかな振盪の結果物としてシンチレーションバイアルに空けた。各バイアルはシンチレーション液アクアセーフ（Ａｑｕａｓａｆｅ）３００ ＰＳ ３ｍｌで処理し、バイアルを閉じてよく混ぜた。
【００９１】
赤血球へ吸収された放射活性はβ崩壊をモニターすることによってシンチレーションカウンターにおいて測定される。
物質濃度毎に、３回測定を行なった。赤血球への非Ｎａ＋／Ｈ＋−依存２２Ｎａ＋吸収を含めるために、１０μＭ ＥＩＰＡの存在下での計数測定の平均を各値から差し引いた。物質の存在しない残った計数の平均を１００％対照として用い、試験物質の存在下の平均値をこの対照値の百分率として表した。百分率の吸収データは、片対数的にプロットされ、値を方程式ｆ（ｘ） ＝ １００／（１ ＋ （ＩＣ５０／ｘ）＊＊ｎ）を用いた非線形曲線にあてはめることによってＩＣ５０値を得た。
【００９２】
参照文献：
Ｃｏｕｎｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４４： １０４１−１０４５
Ｅｓｃｏｂａｌｅｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｅｒｏａ （１９９１） Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ． １２０， ４１−４９
Ｆｒａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ９３８８−９３９２
Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｃａｎｅｓｓａ （１９９０） Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ． １１８， １９３−２１４
Ｓａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５６： ２７１−２８０
Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ２９： ２６０−２６８
【００９３】
【化１５】
2004500338.tif 000013
【化１６】
2004500338.tif 000014
【００９４】
以下の例は、医薬製剤に関する。
例Ａ：注射バイアル
式ＩのＮＨＥ−３阻害剤１００ｇおよびリン酸水素二ナトリウム５ｇの溶液を、二回蒸留水３ｌ中の２Ｎ塩酸を用いて、ｐＨ６．５に調整し、滅菌ろ過し、注射バイアルに分注し、滅菌条件下で凍結乾燥し、そして無菌的にシールした。夫々の注射バイアルは、活性化合物５ｍｇを含む。
【００９５】
例Ｂ：坐剤
式ＩのＮＨＥ−３阻害剤２０ｇの混合物を、ダイズレシチン１００ｇおよびココアバター１４００ｇと溶解し、型に流し込み、そして冷ました。夫々の坐剤は、活性化合物２０ｍｇを含む。
【００９６】
例Ｃ：液剤
溶液を、二回蒸留水９４０ｍｌ中、式ＩのＮＨＥ−３阻害剤１ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ９．３８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ２８．４８ｇおよび塩化ベンザルコニウム０．１ｇから調製した。ｐＨ６．８に調整し、１ｌまでにし、照射により滅菌した。この液剤は、目薬の形でも用いることができる。
【００９７】
例Ｄ：軟膏
式ＩのＮＨＥ−３阻害剤５００ｍｇを、無菌条件下でワセリン９９．５ｇと混合した。
例Ｅ：錠剤
式ＩのＮＨＥ−３阻害剤１ｋｇ、ラクトース４ｋｇ、馬鈴薯澱粉１．２ｋｇ、タルク０．２ｋｇ、ステアリン酸マグネシウム０．１ｋｇの混合物を、常法で打錠し、夫々活性化合物１０ｍｇを含む錠剤などの錠剤を得た。
【００９８】
例Ｆ：被覆錠剤
錠剤を例Ｅと同様に圧縮し、次いで常法により、ショ糖、馬鈴薯澱粉、タルク、トラガカントおよび着色料の被覆で覆った。
【００９９】
例Ｇ：カプセル
式ＩのＮＨＥ−３阻害剤２ｋｇを硬質ゼラチンカプセルに、夫々のカプセルが活性化合物を２０ｍｇを含むように、常法により充填した。
【０１００】
例Ｈ：アンプル
二回蒸留水６０ｌ中、式ＩのＮＨＥ−３阻害剤１ｋｇの溶液を滅菌ろ過し、アンプルに分注し、無菌条件下で凍結乾燥し、シールした。夫々のアンプルは、活性化合物１０ｍｇを含む。
【国際公開パンフレット】
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2004500338.tif 000020
2004500338.tif 000021
2004500338.tif 000022
2004500338.tif 000023
2004500338.tif 000024
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2004500338.tif 000027
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【国際調査報告】
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