(57)【要約】癌、特に肺、結腸、直腸および乳癌を治療しかつ診断するための組成物および方法を開示する。例示の組成物は、１以上のＣｒｉｐｔｏ腫瘍ポリペプチド、その免疫原性部分、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、ならびにそのようなポリペプチドを発現する細胞に特異的であるＴ細胞である。開示した組成物は、例えば、疾患、特に肺、結腸、直腸および乳癌の診断、予防および／または治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１全体または配列番号３全体でなく、配列番号１または３に表される配列の少なくとも２０個の隣接残基からなる配列；
（ｂ）配列番号１またはその少なくとも２０個の隣接残基および異種融合パートナーをコードするポリヌクレオチドを含んでなる配列；
（ｃ）上記ａ）およびｂ）の配列の縮重変異体：
からなる群から選択される配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列；および
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列と少なくとも７０％同一性を有する配列；および
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる配列と少なくとも９０％同一性を有する配列：
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項３】
発現制御配列と機能的に連結された請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを用いて形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項５】
配列番号２もしくは４の少なくとも１つポリペプチドまたはその断片もしくは変異体および異種融合パートナーを含んでなる、融合タンパク質
【請求項６】
腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞を刺激および／または拡大する方法であって、Ｔ細胞を
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または４のポリペプチド；
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｄ）請求項１に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞：
からなる群から選択される少なくとも１つの成分と、
（ｅ）Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にする条件下でかつ十分な時間、
接触させることを含んでなる前記方法。
【請求項７】
請求項６の方法によって調製されたＴ細胞を含んでなる、単離されたＴ細胞集団。
【請求項８】
生理学的に許容しうる担体および免疫賦活剤およびアジュバントからなる群から選択される第１成分、ならびに
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２または４のポリペプチド；
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１または３のポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１のタンパク質と反応することができる抗体；
（ｆ）請求項５に記載の融合タンパク質；
（ｇ）請求項７に記載のＴ細胞集団；
（ｈ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞；および
（ｉ）配列番号２または４のポリペプチドを発現する抗原提示細胞：からなる群から選択される第２成分を含んでなる組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の免疫応答を刺激する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物を患者に投与することを含んでなる、患者の癌を治療する方法。
【請求項１１】
患者の癌の発生を抑制する方法であって、
（ａ）患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、（ｉ）請求項２に記載のポリペプチド；（ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つの成分とともにインキュベートしてＴ細胞を増殖するステップ；および
（ｂ）患者に増殖したＴ細胞の有効な量を投与し、それによって患者の癌の発生を抑制するステップを含んでなる前記方法。
【請求項１２】
医薬に使用する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
ｃｒｉｐｔｏ抗原を発現する腫瘍の治療に使用する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のポリペプチド；
（ｃ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１のタンパク質と反応することができる抗体；
（ｆ）請求項５に記載の融合タンパク質；
（ｇ）請求項７に記載のＴ細胞集団；
（ｈ）請求項２に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞；および
（ｉ）配列番号２のポリペプチドを発現する抗原提示細胞：からなる群から選択される成分の、ｃｒｉｐｔｏ抗原を発現する腫瘍を治療するための医薬の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術的分野
本発明は、一般的に、結腸癌、直腸癌、乳癌、膀胱癌および子宮内膜癌などの癌の治療に関する。本発明はさらに特定すると、腫瘍タンパク質であるｃｒｉｐｔｏタンパク質の少なくとも一部分を含んでなるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に、ある特定の非小長細胞癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｌｏｎｇ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、結腸癌、直腸癌などのｃｒｉｐｔｏを発現する癌種である癌を治療するための医薬組成物、例えばワクチンおよび他の組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
ＣＲＩＰＴＯは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーと相同性を共有する１８８個のアミノ酸からなるタンパク質である（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ （１９８９） Ｖｏｌ ８ （７） ｐｐ１９８７−１９９１）。
【０００３】
ｈｕＣＲＩＰＴＯ ｍＲＮＡは未分化細胞にだけ検出されて、分化後に消滅する。ｍＣＲＩＰＴＯは、妊娠および泌乳期に発現し（乳上皮細胞の枝分かれ形態発生を誘導する）、正常乳房細胞の自己分泌増殖因子であると考えられる。ＣＲＩＰＴＯは、マウス胚における前後軸の正しい方向付けに必要である。
【０００４】
ヒトｃｒｉｐｔｏ遺伝子は米国特許第５，６５４，１４０号に記載されている。
【０００５】
癌は、全世界における重要な保健上の課題である。癌の検出と治療に進歩はあったが、予防および／または治療のための、ワクチンまたはその他の広く成功している方法は、現在のところ見当たらない。一般的に化学療法または外科手術と照射との組合せに基づく現行の治療法は、多数の患者で不十分であることが示されている。
【０００６】
大腸癌は、米国において第２の最も高頻度で診断される悪性疾患であるとともに、第２の最も共通した癌死の病因である。１９９８年に９５，６００件の大腸癌の新症例が診断される予測であり、４７，７００人の死亡が予測される。初期局在段階で検出された直腸癌患者の５年間の生存率は９２％であるが、残念ながら、わずか３７％の直腸癌しかこの段階（生存段階）で診断されない。もし癌が隣接器官またはリンパ節まで拡大すると生存率は６４％に、そして遠く転移した患者では７％に低下する。
【０００７】
大腸癌の診断は、腸壁を通しての腫瘍の貫入程度に、転移のレベルに、結節併発の有無に直接関係し、従って早期検出と治療は特に重要である。現在、診断は糞便潜血、Ｓ字結腸鏡検査、結腸鏡検査およびバリウム二重造影注腸検査のスクリーニングアッセイの利用に助けられている。治療計画は、癌の型と段階によって決定され、外科手術、照射療法および／または化学療法が挙げられる。外科手術（治療の最も普通の形態）後の再発は大きな問題であって、しばしば最終的な死因となる。この疾患の治療への研究は相当行われたにも関わらず、大腸癌を診断しかつ治療するのは依然として困難である。従って、当技術分野ではそのような癌の治療法を改善する必要がある。本発明は、これらの必要を達成しかつさらにその他の関係する利点を提供する。
【０００８】
乳癌は、米国および世界中の女性にとって重要な保健上の課題である。この疾患の検出と治療に進歩はあったが、乳癌は、依然として米国において女性の癌に関係する死因の第２位であり、毎年１８０，０００人の女性が冒されている。北米の婦人にとって、乳癌に罹る生存中のオッズは１対８である。
【０００９】
現在、乳癌を予防または治療するためのワクチンまたはその他の広く成功している方法は見当たらない。現在、この疾患の管理は、早期診断（日常的な乳房スクリーニング法）と、外科手術、照射療法、化学療法およびホルモン療法など様々な治療の１以上を含む攻撃的治療との組合せに頼っている。特定の乳癌の治療コースは、しばしば、特異的腫瘍マーカーの分析を含む、様々な予後パラメーターに基づいて選択される。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ−ＪｏｒｄａｎおよびＬｉｐｐｍａｎ， Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ８：７３−１００ （１９９４）を参照。しかし、確立されたマーカーを用いるとしばしば結果の解釈が難しく、乳癌患者に観察される高い死亡率はこの疾患の治療と予防に改良が必要であることを示す。
【００１０】
肺癌は米国の男女における第一位の癌死の死因であり、１９９４年に推定１７２，００人の新症例が報じられている。診断時の症状に関係なしの全肺癌患者の５年間生存率は１３％に過ぎない。これは、該疾患がまだ局在するときに検出された症例における５年間生存率の４６％と対照的である。しかし、拡大する前に発見される肺癌はわずか１６％でしかない。
【００１１】
これらおよび他の癌の治療法に対して相当な研究が行われているにも関わらず、乳房、結腸および直腸癌を効果的に診断しかつ治療することは依然として困難である。従って、当技術分野においてはそのような癌を治療しかつ予防する方法を改善する必要がある。本発明は、これらの必要を満たしかつさらにその他の関係する利点を提供する。
【００１２】
発明の概要
一態様においては、本発明は、
（ａ）　配列番号１もしくは３の全配列でなく、配列番号１もしくは３の配列の少なくとも２０個の隣接残基からなる配列、および
（ｂ）　配列番号１もしくは３または配列番号１もしくは３に与えられた少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドおよび異種融合パートナーをコードするポリヌクレオチドからなる配列：
からなる群から選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、他の態様においては、上記のポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド組成物を提供する。
【００１４】
本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは免疫原性があり、すなわち、免疫応答、特に体液性および／または細胞免疫性応答を誘起することができ、もし必要があれば、それらを適当な担体と結合させおよび／またはそれらにアジュバントを加える。
【００１５】
本発明はさらに、開示したポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列の断片、変異体および／または誘導体であって、配列番号１もしくは３に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２もしくは４に記載のポリペプチド配列の少なくともほぼ５０％、好ましくは少なくともほぼ７０％そしてさらに好ましくは少なくともほぼ９０％のレベルの免疫原性活性レベルを好ましくは有することを特徴とする前記断片、変異体および／または誘導体を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターおよびそのような発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
【００１７】
他の態様においては、本発明は、上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび生理学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明の関係する態様においては、予防もしくは治療に応用するための医薬組成物、例えばワクチン組成物を提供する。そのような組成物は一般的に本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリペプチドおよびアジュバントなどの免疫賦活薬を含んでなる。
【００１９】
さらなる態様においては、本発明は、（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）製薬上許容される担体または賦形剤：を含んでなる医薬組成物を提供する。例示の抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００２０】
関係する態様においては、（ａ）上記のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫賦活薬を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００２１】
他の態様においては、本発明はさらに、少なくとも１つの上記ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質ならびにそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、典型的には、生理学的に許容される担体および／または免疫賦活薬を含んでなる医薬組成物、例えばワクチン組成物の形態で提供する。融合タンパク質は、本明細書に記載の多重免疫原性ポリペプチドまたはそれらの部分／変異体を含んでなってもよく、さらに該ポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性を容易にする１以上のポリペプチドセグメントを含んでなってもよい。
【００２２】
さらなる態様においては、本発明は、患者の免疫応答、好ましくはヒト患者のＴ細胞応答を刺激する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる前記方法を提供する。患者が肺癌または結腸癌または直腸癌または乳癌に冒された症例では本発明の方法は疾患の治療を提供し、あるいは患者にそのような疾患のリスクがあると考えられれば予防的に治療しうる。特に、患者がｃｒｉｐｔｏ抗原を発現する腫瘍に冒されうるときである。
【００２３】
さらなる態様においては、本発明は、患者の癌発生を抑制する方法であって、患者に上述の医薬組成物を投与することを含んでなる前記方法を提供する。患者が肺癌または結腸癌または直腸癌または乳癌に冒されている症例では、本発明の方法は疾患の治療を提供し、あるいは患者にそのような疾患のリスクがあると考えられれば予防的に治療しうる。
【００２４】
本発明はさらに、他の態様においては、生物サンプルから腫瘍細胞を除去する方法であって、サンプルからのタンパク質発現細胞の除去を可能にする条件下でかつ十分な時間をかけて接触のステップが実施されることを特徴とする、生物サンプルを本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞に接触させることを含んでなる前記方法を提供する。
【００２５】
関係する態様においては、患者の癌発生を抑制する方法であって、上記のように処理した生物サンプルを患者に投与することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２６】
他の態様においては、さらに本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激しおよび／または拡大する方法であって、Ｔ細胞と１以上の（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ） そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ） そのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞；とを、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にする条件下でかつ十分な時間をかけて接触させることを含んでなる前記方法を提供する。上記のように調製したＴ細胞を含んでなる、単離されたＴ細胞集団も提供する。
【００２７】
さらなる態様においては、本発明は患者の癌発生を抑制する方法であって、患者に上記のＴ細胞集団の有効な量を投与することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、患者の癌発生を抑制する方法であって、（ａ）患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、１以上の（ｉ）少なくとも本明細書に開示したｃｒｉｐｔｏポリペプチドの免疫原性部分を含有するポリペプチド；（ｉｉ）そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）そのような抗原を発現した抗原細胞とともにインキュベートし；そして（ｂ）増殖したＴ細胞の有効量を患者に投与してそれによって患者の癌発生を抑制するステップを含んでなる前記方法を提供する。増殖した細胞は、必要ではないが、患者への投与に先だってクローニングしてもよい。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば、明白になるであろう。本明細書に開示した全ての参考文献は、本明細書に参照によりその全文が個々に組み入れられたかのごとく組み入れられる。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、一般的に組成物ならびにそれらの癌と転移の治療および診断での使用に関し、前記癌は特にｃｒｉｐｔｏを発現する癌であって、Ｃｒｉｐｔｏを発現する肺、結腸、直腸および乳癌が挙げられる。以下にさらに記載するように、例示の本発明の組成物は、限定されるものでないが、ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合剤、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）および免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
【００３１】
本発明の実施に当たっては、特に反対のことを示さない限り、当技術分野内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の通常の方法を使用し、それらの多くを以下に説明の目的で記載する。そのような技術は文献に全て説明されている。例えば、；Ｓａｍｂｒｏｏｋら 「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」 （第２版， １９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら 「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」 （１９８２）；「ＤＮＡクローニング：実施手法（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」， ｖｏｌ． Ｉ ＆ ＩＩ （Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」 （Ｎ． Ｇａｉｔ編， １９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」 （Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編， １９８５）；「転写と翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」 （Ｂ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編， １９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」 （Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編， １９８６）；Ｐｅｒｂａｌ， 「分子クローニングの実践的手引き（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」 （１９８４）を参照。
【００３２】
本明細書に引用した全ての出版物、特許および特許出願は、前掲または後掲を問わず、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる。
【００３３】
本明細書および添付の請求項に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明白にそうでないことを示さなければ、複数の参照を含む。
【００３４】
ポリペプチド組成物
本明細書に使用される、用語「ポリペプチド」は、その通常の意味で、すなわちアミノ酸配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さの産物に限定されるものでなく；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれ、それらの用語は本明細書において特にそうでないことが示されなければ互換的に使用される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾物、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当技術分野で周知される天然および非天然両方の他の修飾物を意味せずまたは排除する。ポリペプチドは全タンパク質、またはその一部配列であってもよい。本発明の文脈における目的の特定のポリペプチドは、実質的にポリペプチドの免疫原性の原因となりかつ免疫応答を誘起しうるエピトープ、すなわち抗原決定基を含んでなるアミノ酸部分配列である。
【００３５】
例示の本発明のポリペプチドは特に、配列番号２または４のｃｒｉｐｔｏタンパク質の、少なくとも１０個の隣接アミノ酸、好ましくは２０個、さらに好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０個のアミノ酸の配列を含んでなる。
【００３６】
ある特定の好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは免疫原性である、すなわち、これらのポリペプチドは、ｃｒｉｐｔｏを発現する癌の患者由来の抗血清および／またはＴ細胞を用いるイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡもしくはＴ細胞刺激アッセイ）で検出しうる反応を起こす。免疫原性活性のスクリーニングは、当業者が周知する技術を利用して実施することができる。例えば、そのようなスクリーニングは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， 「抗体：研究室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８、などに記載の方法を利用して実施することができる。説明のための一例では、ポリペプチドを固体支持体上に固定して患者血清と接触させ、血清内の抗体と固定されたポリペプチドとを結合させてもよい。次いで結合しない血清を除去して、結合した抗体を例えば１２５Ｉ−標識プロテインＡを用いて検出することができる。
【００３７】
当業者には理解されうるように、本明細書に開示したポリペプチドの免疫原性部分も本発明に包含される。本明細書に使用される「免疫原性部分」は、それ自身、ポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原受容体と免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に反応する）本発明の免疫原性ポリペプチドの断片である。免疫原性部分は一般的に、Ｐａｕｌ， 「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， 第３版， ２４３−２４７ （Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９３）およびその引用文献などに総括された周知の技術を用いて同定することができる。そのような技術としては、抗原特異的抗体、抗血清および／またはＴ細胞系もしくはクローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングが挙げられる。本明細書に使用される抗血清および抗体は、もしそれらが抗原と特異的に結合する（すなわち、それらがＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいて該タンパク質と反応し、かつ無関係のタンパク質と検出しうる反応を起こさない）のであれば、「抗原特異的」である。そのような抗血清および抗体は、本明細書に記載のように、かつ周知の技術を用いて調製することができる。
【００３８】
ある好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、実質的に全長ポリペプチドの反応性以上のレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイにおいて）部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくともほぼ５０％、好ましくは少なくともほぼ７０％、そして最も好ましくはほぼ９０％超である。複数の事例においては、好ましい免疫原性部分は、対応する全長ポリペプチドの免疫原性より高い免疫原性活性のレベルを有すると同定され、例えば、ほぼ１００％以上または１５０％以上の免疫原性活性を有しうる。
【００３９】
ある特定の他の実施形態においては、例示の免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインを欠失しているペプチドを含んでもよい。他の例示の免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、小さいＮおよび／またはＣ末端の欠失（例えば、１−３０個のアミノ酸、好ましくは５−１５個のアミノ酸）を含有しうる。
【００４０】
他の実施形態においては、本発明のポリペプチド組成はまた、本発明のポリペプチド、特に本明細書に開示したアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して産生するＴ細胞および／または抗体と免疫学的に反応性のある１以上のポリペプチド、またはそれらの免疫原性断片もしくは変異体を含んでなる。
【００４１】
他の実施形態においては、本明細書に記載の１以上のポリペプチドと免疫学的反応性のあるＴ細胞および／または抗体を誘起しうる１以上のポリペプチド、または本明細書に開示したポリヌクレオチド配列に含有される隣接核酸配列、またはそれらの免疫原性断片もしくは変異体、またはこれらの配列の１以上と中度または高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする１以上の核酸配列によりコードされる１以上のポリペプチドを含んでなるポリペプチドが提供される。
【００４２】
本発明は、他の態様においては、本明細書の配列番号２もしくは４に記載されるかまたは配列番号１もしくは３の配列に記載したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド組成物の、全ての中間の長さを含む、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、もしくは１５０個の隣接アミノ酸、またはそれ以上を含んでなるポリペプチド断片を提供する。該ポリペプチドは、配列番号１３〜９４に記載したエピトープの少なくとも１つ、好ましくは複数を含んでなることが好ましい。場合によっては、該断片は異種担体と融合またはさもなくば結合していてもよい。
【００４３】
他の態様においては、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド組成物の変異体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド変異体は、典型的には、本明細書に記載のポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくともほぼ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性（以下に記載のように決定した）を示す。
【００４４】
ある好ましい実施形態においては、本発明により提供されるポリペプチド断片および変異体は、本明細書に特定して記述した全長ポリペプチドと反応する抗体およびＴ細胞に対して免疫活性がある。
【００４５】
他の実施形態においては、本発明により提供されるポリペプチド断片および変異体が示す免疫活性のレベルは、本明細書に特定して記述した全長ポリペプチド配列が示すレベルの少なくともほぼ５０％、好ましくは少なくともほぼ７０％、そして最も好ましくは少なくともほぼ９０％またはそれ以上である。
【００４６】
本明細書に使用される用語、ポリペプチド「変異体」は、典型的には本明細書に特定して開示したポリペプチドとは１以上の置換、欠失、付加および／または挿入のある点が異なるポリペプチドである。そのような変異体は天然であってもよいしまたは合成によって、例えば、本明細書に記載のようにおよび／または当技術分野で周知の複数の技術のいずれかを用いて、１以上の本発明の上記ポリペプチド配列を修飾しかつその免疫活性を評価することにより作製してもよい。
【００４７】
例えば、本発明のポリペプチドのある特定の例示の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメインなどの１以上の部分が除去されている変異体が挙げられる。他の例示の変異体は、小部分（例えば、１−３０アミノ酸、好ましくは５−１５アミノ酸）を成熟タンパク質のＮおよび／またはＣ末端から除去した変異体が挙げられる。
【００４８】
多くの場合、変異体は保存的置換を有しうる。「保存的置換」はアミノ酸を類似の特性をもつ他のアミノ酸により置換する置換であって、従ってペプチド化学の技術者はポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー特性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）が実質的に不変であると予想しうる。以上記載したように、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に修飾を加えてもなお、所望の特性、例えば免疫原性特性をもつ変異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列を改変して本発明のポリペプチドの同等もしくはさらに改善された免疫原性変異体または部分を作製するのが所望であれば、当業者は典型的にはコードするＤＮＡ配列の１個以上のコドンを下の表に従って変更するであろう。
【００４９】
例えば、タンパク質構造においてある特定のアミノ酸を他のアミノ酸と置換しても、例えば、抗体の抗原結合領域もしくは基質分子上の結合部位などの、構造についての相互作用結合能力を消失しないようにすることができる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能力と性質であるので、タンパク質配列中のある特定のアミノ酸配列は勿論、その基礎となるＤＮＡコード配列置換を行っても、それに関わりなく、同様の性質を有するタンパク質を得ることができる。従って、それらの生物学的効用と活性の大きな消失を伴うことなく、開示した組成物のペプチド配列、またはそのペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列に様々な変更を行いうると考えられる。
【００５０】
2004506441.tif 000002
そのような変更を行う場合、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することができる。タンパク質の相互作用的な生物学的機能を与えるに当たって、アミノ酸のヒドロパシー指数の重要性は当技術分野で一般的に理解されている（本明細書に参照により組み入れられる、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、順にタンパク質の他分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが容認されている。各アミノ酸は、その疎水性と電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。それらの値は次の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００５１】
当技術分野では知られているが、ある特定のアミノ酸を類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換して、それでも類似した生物学的活性をもつタンパク質、すなわちそれでも生物学的機能が同等のタンパク質を得ることができる。そのような変更を行うには、置換するアミノ酸のハイドロパシー指数が±２以内が好ましく、±１以内が特に好ましく、そしてさらに±０．５以内が特に好ましい。当技術分野では、同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行いうることも理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（特定して本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関があると明記している。
【００５２】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳しく記載されているが、次の親水性値がアミノ酸残基に割当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０ ± １）；グルタミン酸（＋３．０ ± １）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５ ± １）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を類似の親水性値を有する他のアミノ酸と置換して、それでも生物学的に同等物、特に免疫学的に同等のタンパク質を得ることができることは理解されている。そのような変更において、置換するアミノ酸の親水性値は±２以内が好ましく、特に±１以内が好ましく、そしてさらに特に±０．５以内が好ましい。
【００５３】
従って、以上概観したように、アミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて行われる。以上の様々な特性を考慮にいれた置換の例は、当業者であれば周知しているが、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロシシン：が挙げられる。
【００５４】
さらに、いずれかのポリヌクレオチドをさらに修飾してｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加してもよい。可能な修飾は、限定されるものでないが、５’および／または３’末端におけるフランキング配列の付加；骨格にホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用；および／またはイノシン、キューオシンおよびワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、ならびにアセチル、メチル、チオおよび他の基により修飾された型のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンなどの非伝統的塩基の封入が挙げられる。
【００５５】
アミノ酸置換はさらに残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に帯電したアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する無帯電の極性ヘッドをもつアミノ酸グループとしてはロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表すアミノ酸の他のグループは、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。変異体はまた、あるいは代わりに、非保存的変化を含有してもよい。好ましい実施形態においては、変異体ポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって、自然配列と異なる。変異体はまた（もしくは代わりに）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびハイドロパシー特性に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって修飾することもできる。
【００５６】
上記のように、ポリペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に該タンパク質の輸送を指令するシグナル（またはリーダー）配列をタンパク質のＮ末端に含んでもよい。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするためのまたはポリペプチドの固体支持体との結合を増強するための、リンカーまたは他の配列（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）とコンジュゲートしてもよい。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域とコンジュゲートすることができる。
【００５７】
ポリペプチド配列を比較する場合、もし以下に記載のように最大の対応となるようにアラインメントした時に２つの配列中のアミノ酸の配列が同じであれば、２つの配列は「同一」であると言う。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウ全体について配列を比較し、局所領域の配列類似性を同定しかつ比較することによって実施する。本明細書に使用される用語「比較ウィンドウ」は少なくともほぼ２０個、通常３０〜ほぼ７５個、４０〜ほぼ５０個の隣接する位置からなるセグメントであって、そのセグメント内で２つの配列を最適にアラインメントした後に配列を同数の隣接位置の参照配列と比較する、前記セグメントを意味する。
【００５８】
比較のための最適アラインメントは、生物情報科学ソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のレーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）スーツに含まれるメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを利用し、デフォールトパラメーターを用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載された複数のアラインメントスキームを実現する：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ． （１９７８） 「タンパク質の進化的変化モデル−遠隔の関係を検出するためのマトリックス（Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ） Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ． （編．） 「タンパク質配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ． ５， Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． ３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ． （１９９０） 「アラインメントおよび系統遺伝子への統一手法（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ）」 ｐｐ． ６２６−６４５ 「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 ｖｏｌ． １８３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ． （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ． （１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ． （１９７１） Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ． Ｎｅｓ， Ｍ． （１９８７） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ． （１９７３） 「数値分類学−数値分類学の原理と実施（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ − ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ）」， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．， Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
【００５９】
あるいは、比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズム（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって、これらのアルゴリズムの計算機実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視点検によって実施することができる。
【００６０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい一例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０のアルゴリズムであって、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら （１９７７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、例えば、本明細書に記載のパラメーターを用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのパーセント同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公開されている。アミノ酸配列に対して、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算することができる。それぞれの方向のワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最高達成値から量Ｘだけ外れるか；１以上の負スコア残基アラインメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下となるか；またはいずれかの配列の末端に到達した：ときに止める。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。
【００６１】
好ましい一手法においては、「配列同一性のパーセント」を少なくとも２０個の位置の比較窓にわたって最適アラインメントされた２つの配列を比較することによって決定し、ここで、２配列の最適アラインメントに対して、比較窓内のポリペプチド配列の部分が参照配列（付加または欠失を含有しない）と比較して、２０％以下、通常５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失を含有してもよい。パーセントは、同一のアミノ酸残基が両配列にある位置数を確認して対合位置数を得て、これを参照配列内の全位置数（すなわち、窓サイズ）で除し、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを得ることによって計算する。
【００６２】
他の例示の実施形態においては、ポリペプチドは、本明細書に記載の多重ポリペプチドを含んでなるか、または少なくとも１つの本明細書に記載のポリペプチドと既知の腫瘍タンパク質などの無関係な配列を含んでなる融合タンパク質であってもよい。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープの提供を支援してもよいし（免疫学的融合パートナー）、またはタンパク質を自然の組換えタンパク質より高い収率で発現するのを支援してもよい（発現エンハンサー）。ある特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的および発現エンハンサー融合タンパク質の両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解度を増加するかまたはポリペプチドを所望の細胞内コンパートメントにターゲティングしうるように選択してもよい。なおさらなる融合パートナーは、ポリペプチドの精製を容易にする親和性標識が挙げられる。
【００６３】
融合ポリペプチドは一般的に、化学結合などの標準技術を利用して調製することができる。好ましくは、融合ポリペプチドを組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較した産生のレベルを増加させる。簡単に説明すると、ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を別々に組立て、そして適当な発現ベクター中にライゲートする。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端を、ペプチドリンカーを用いてまたは用いないで、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端とライゲートし、そして配列のリーディングフレームを同相に置く。これによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一融合ポリペプチドへの翻訳が可能になる。
【００６４】
ペプチドリンカー配列を用いて第１と第２のポリペプチド成分を十分な距離だけ分離し、それぞれのポリペプチドがその二次および三次構造にフォールドすることを保証してもよい。そのようなペプチドリンカーは、当技術分野で周知の標準技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込む。適当なペプチドリンカーは、次の因子に基づいて選択することができる：（１）フレキシブルな広がったコンフォメーションを採択できること、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用しうる二次構造を採択しないこと；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応しうる疎水性または帯電性残基を欠くこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列に利用しうる。リンカーとして有用に使用しうるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら， Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６， １９８５；Ｍｕｒｐｈｙら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２， １９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されたものが挙げられる。リンカー配列は一般的に、長さが１〜ほぼ５０個のアミノ酸でありうる。第１と第２のポリペプチドが機能的ドメインを隔離して立体妨害を防止するのに利用しうる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有するときは、リンカー配列を必要としない。
【００６５】
ライゲートしたＤＮＡ配列は、適当な転写または翻訳調節エレメントと機能しうる形で連結される。ＤＮＡの発現に関与している調節エレメントは、第１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’だけに置かれる。同様に、翻訳を終えるために必要な停止コドンおよび転写終結シグナルは、第２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して３’だけに存在する。
【００６６】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドと一緒に、リコール応答を誘起しうる免疫原性タンパク質のような無関係の免疫原性タンパク質を含んでなってもよい。そのようなタンパク質の例は、破傷風、結核および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３６：８６−９１， １９９７を参照）。
【００６７】
ある好ましい実施形態においては、免疫学的融合パートナーは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＲａ１２断片などの放線菌種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）から誘導される。Ｒａ１２組成物、ならびにその異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性の増強における利用の方法は、米国特許出願第６０／１５８，５８５号に記載されており、その開示の全文は本明細書に参照により組み入れられる。簡単に説明すると、Ｒａ１２は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域を意味する。ＭＴＢ３２Ａは、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の病原性および非病原性株の遺伝子によりコードされる３２ＫＤ分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は記載されている（例えば、米国特許出願第６０／１５８，５８５号；本明細書に参照により組み入れられる、Ｓｋｅｉｋｙら， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ． （１９９９） ６７：３９９８−４００７も参照）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端断片は、高いレベルで発現しかつ精製過程全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ｒａ１２は融合した相手の異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強しうる。ある好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端断片を含んでなる。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部分をコードする、少なくともほぼ１５個の連続ヌクレオチド、少なくともほぼ３０個の連続ヌクレオチド、少なくともほぼ６０個の連続ヌクレオチド、少なくともほぼ１００個の連続ヌクレオチド、少なくともほぼ２００個の連続ヌクレオチド、少なくともほぼ３００個の連続ヌクレオチドを含んでなる。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは自然の配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列）を含んでなってもよいしまたはそのような配列の変異体を含んでなってもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド変異体は、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が自然のＲａ１２ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドと比較して実質的に消滅しないような、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含んでなってもよい。変異体は、自然のＲａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくともほぼ７０％同一性、さらに好ましくは少なくともほぼ８０％同一性、そして最も好ましくは少なくともほぼ９０％同一性を示す。
【００６８】
他の好ましい実施形態においては、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌ヘモフィルス・インフルエンザＢ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ）の表面タンパク質であるプロテインＤから誘導される（ＷＯ ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、該タンパク質のほぼ最初の３分の１（例えば、最初のＮ末端の１００−１１０個のアミノ酸）を含んでなり、プロテインＤは脂質化されていてもよい。ある特定の好ましい実施形態においては、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９個の残基がＮ末端に含まれてさらなる外因性Ｔ細胞エピトープをもつポリペプチドを提供し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質の尾部（ｔａｉｌ）は、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（赤血球凝集素）が挙げられる。Ｔヘルパーエピトープを含む様々な断片を利用しうるが、典型的には、Ｎ末端の８１個のアミノ酸を使用する。
【００６９】
他の実施形態においては、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして知られるタンパク質、またはその一部分（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡとして知られるＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ｌｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ ４３：２６５−２９２， １９８６）である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格内のある特定の結合を特異的に分解する自己溶解酵素（ａｕｔｏｌｙｓｉｎ）である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリン、またはＤＥＡＥなどの数種のコリン類似体に対する親和性に関わる。この特性が融合タンパク質の発現に有用な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発に利用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製は記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７９５−７９８， １９９２）。好ましい実施形態においては、ＬＹＴＡの反復部分を融合ポリペプチド中に組み込むことができる。反復部分は、残基１７８から始まるＣ末端領域に見出される。特に好ましい反復部分は残基１８８〜３０５である。
【００７０】
さらに他の例示の実施形態は、エンドソーム／リソソームコンパートメントにポリペプチドを導きうるターゲティングシグナルを含んでなる融合ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドに関わり、米国特許第５，６３３，２３４号に記載されている。本発明の免疫原性ポリペプチドをこのターゲティングシグナルと融合すると、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に結合して、それによりポリペプチドに特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ刺激を増強しうる。
【００７１】
融合分子のｃｒｉｐｔｏ部分は、本明細書に記載のＣｒｉｐｔｏ １またはＣｒｉｐｔｏ ３の全長１８８ａａタンパク質またはそれらの断片であることが好ましい。
【００７２】
本発明のポリペプチドは、様々な周知の合成および／または組換え技術のいずれを用いて調製してもよく、後者をさらに以下に記載する。一般的にほぼ１５０個未満のアミノ酸のポリペプチド、部分および他の変異体は、当業者が周知している技術を用いて、合成的方法により作製することができる。ある説明のための例においては、そのようなポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法などの任意の市販の固相技術を用いて合成してもよく、その場合、アミノ酸を逐次的に付加してアミノ酸鎖を伸ばして行く。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１４６， １９６３を参照。ポリペプチドの自動合成用設備は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）などの供給者から市販されており、製造業者の指示に従って操作することができる。
【００７３】
一般的に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）は単離される。「単離された」ポリペプチドは元来の環境から除去されたものである。例えば、天然のタンパク質またはポリペプチドは、もし自然系において共存する物質の数種または全てが分離されていれば、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた、例えば、少なくともほぼ９０％純度、さらに好ましくは少なくともほぼ９５％純度、そして最も好ましくは少なくともほぼ９９％純度に精製される。
【００７４】
ポリヌクレオチド組成物
本発明は、他の態様においては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は本明細書においては原則的に互換的に使用され、特定種の全ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡ分子を意味する。本明細書に使用される「単離された」は、ポリヌクレオチドが実質的に他のコード領域から分離していて、該ＤＮＡ分子が大きな染色体断片または他の機能的遺伝子もしくはポリペプチドコード領域などの無関係なコードＤＮＡの大部分を含有しないことを意味する。勿論、これは、当初単離されたＤＮＡ分子を意味するものであって、後に人の手によりそのセグメントに加えられた遺伝子またはコード領域を排除しない。
【００７５】
当業者であれば理解しうるように、本発明のポリヌクレオチド組成物としては、ゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされた配列、ならびに、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたは発現するよう適合させたより小さい遺伝子操作された遺伝子セグメントが挙げられる。そのようなセグメントは、天然に単離されるものであってもよいし、人の手により合成法により改変されてもよい。
【００７６】
また当業者であれば認識しうるように、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であってよく、またＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）またはＲＮＡ分子であってよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有しかつＤＮＡ分子と１対１で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が挙げられる。さらなるコードまたは非コード配列が、必要ではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよく、またポリヌクレオチドは、必要ではないが、他の分子および／または支持物質と連結していてもよい。
【００７７】
ポリヌクレオチドは天然配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質またはその一部分をコードする内因性配列）を含んでもよいしまたはそのような配列の変異体もしくは誘導体、好ましくは免疫原性変異体もしくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。
【００７８】
通常は、ポリヌクレオチド変異体は１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有しうるが、その変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの免疫原性が、本発明に特定して記述したポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較して実質的に減少しないことが好ましい。用語「変異体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することも理解されなければならない。
【００７９】
さらなる実施形態においては、本発明は、配列番号１または３の１以上と同一のまたはそれと相補的な配列上の様々な長さの連続した一続きの配列を含んでなるポリヌクレオチド断片を提供する。例えば、本発明によって、配列番号１の少なくともおよそ１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００個長、ならびにそれらの中間的な長さの全てを含むポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間的な長さ」は、例えば、１６、１７、１８、１９、など；２１、２２、２３、など；３０、３１、３２、など；５０、５１、５２、５３、など；１００、１０１、１０２、１０３、など；１５０、１５１、１５２、１５３、などの上記例示値の間の任意の長さを意味し、それは２００〜５００、５００〜１，０００の全整数などを含むことは容易に理解されるであろう。特に好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１３〜９４に記述したエピトープをコードするポリヌクレオチドである。
【００８０】
本発明の他の実施形態においては、中程度〜高度のストリンジェンシー条件下で、本明細書に提供されたポリヌクレオチド配列もしくはそれらの断片、またはそれらの相補配列とハイブリダイズしうるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技術は分子生物学の技術分野では周知である。説明の目的で記載すると、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための適当な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）の溶液中で前洗浄し；５０℃〜６０℃にて５×ＳＳＣ中で一夜ハイブリダイゼーションし；次いで０．１％ ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２× ＳＳＣをそれぞれ用いる６５℃にて２０分間の洗浄を２回行うことを含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションの実施される温度を改変することによるなどして容易に操作しうることを当業者は理解するであろう。例えば、他の実施形態においては、適当な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除くと上記の条件である。
【００８１】
ある特定の好ましい実施形態においては、上記のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド変異体、断片およびハイブリダイズする配列は、配列番号１または配列番号３に具体的に記述したポリペプチド配列と免疫学的に交差反応性のあるポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態においては、そのようなポリヌクレオチドは、本明細書に具体的に記述したポリペプチド配列の免疫原性活性レベルに対して少なくともほぼ５０％、好ましくは少なくともほぼ７０％、そしてさらに好ましくは少なくともほぼ９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチド、またはそれらの断片は、コード配列自身の長さに関係なく、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素切断部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と結合させることができ、それらの全長はかなり変動してもよい。従って、ほとんど任意の長さの核酸断片を使用しうると予想されるが、その全長は調製の容易さと意図する組換えＤＮＡプロトコルの使用によって制限されることが好ましい。例えば、長さがほぼ１０，０００、ほぼ５０００、ほぼ３０００、ほぼ２，０００、ほぼ１，０００、ほぼ５００、ほぼ２００、ほぼ１００、ほぼ５０塩基対である全長など（全ての中間長を含む）をもつポリヌクレオチドセグメントの例は、本発明の多くの実施事例において有用であることが意図される。
【００８３】
ポリヌクレオチド配列を比較するときに、もし以下に記載のとおり最大に一致するようアラインメントしたとき、２つの配列のヌクレオチド配列が同じであれば、その２つの配列は「同一」であるという。２つの配列の間の比較は、典型的には、比較ウィンドウ全体の配列を比較し、局所領域の配列類似性を確認しかつ比較することによって実施する。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適にアラインメントした後に、１つの配列を参照配列に対して同数の連続位置において比較する、少なくともほぼ２０個、通常は３０〜ほぼ７５個、４０〜ほぼ５０個の連続位置のセグメントを意味する。
【００８４】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ生物情報科学ソフトウエア一式（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）に含まれるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを利用し、デフォルトパラメーターを用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載された複数のアラインメントスキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ． （１９７８） 「タンパク質の進化的変化のモデル−遠縁関係を検出するためのマトリックス（Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）， Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ． （編．） 「タンパク質配列と構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」中に収録， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ． ５， Ｓｕｐｐｌ． ３， ｐｐ． ３４５−３５８；　Ｈｅｉｎ Ｊ． （１９９０） 「アラインメントおよび系統学への統一手法（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ）」 ｐｐ． ６２６−６４５ 「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 ｖｏｌ． １８３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；　Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ． （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；　Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ． （１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ． （１９７１） Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；　Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ． Ｎｅｓ， Ｍ． （１９８７） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４：４０６−４２５；　Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ． （１９７３） 「数量分類学−数量分類学の原理と実践（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ − ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ）」， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ；　Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．， Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。
【００８５】
あるいは、比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視調査によって、実施することができる。
【００８６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの好ましい一例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであって、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら （１９７７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、例えば、本明細書に記載のパラメーターを用いて、本発明のポリヌクレオチドに対するパーセント配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公に入手可能である。説明のための一例においては、ヌクレオチド配列に対する累積スコアはパラメーターＭ（一対の一致残基に対する報酬スコア；常に＞０）とＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算することができる。それぞれの方向におけるワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその最高達成値から数量Ｘだけ外れるか；１以上の負にスコアリングされる残基アラインメントの蓄積によって累積スコアがゼロ以下となるか；またはいずれかの配列の末端に到達したときに、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、および１０の期待値（Ｅ）、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）アラインメント、５０の（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。
【００８７】
好ましくは、「配列同一性のパーセント」は、少なくとも２０位置の比較ウィンドウにわたり最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定するが、ここで、２配列の最適アラインメントについて、比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の部分が、２０％以下、通常５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を、参照配列（これは付加または欠失を含有しない）と比較して含有してもよい。上記パーセントは、同一の核酸塩基が両配列に存在する位置数を決定して一致位置数を得て、この一致位置数を参照配列中の全位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、そしてその結果値に１００を乗算して配列同一性のパーセントを得ることによって計算する。
【００８８】
当業者であれば、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多数のヌクレオチドが存在することを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかはいずれかの天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性しか持たない。それにも関わらず、コドン使用の相違により様々となるポリヌクレオチドは本発明により具体的に意図される。さらに、本明細書に提示されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内にある。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１以上の突然変異の結果として改変された内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必要ではないが、改変された構造または機能を有しうる。対立遺伝子は、標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較などの）を用いて同定することができる。
【００８９】
従って、本発明の他の実施形態においては、位置指定突然変異誘発などの突然変異誘発手法を本明細書に記載のポリペプチドの免疫原性変異体および／または誘導体を調製するために使用する。この手法によって、ポリペプチド配列における特定の改変を、それらをコードする基礎となるポリヌクレオチドの突然変異誘発によって実施することができる。これらの技術は、例えば、１以上の上述の検討事項を組み込んだ、１以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチド中に導入することにより配列変異体を作製しかつ試験する簡単な手法を、提供する。
【００９０】
位置指定突然変異誘発によって突然変異体を作製するために、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに、橋渡しすべき欠失接続部の両側で安定な二本鎖を形成するのに十分なサイズと配列複雑性をもつプライマー配列を提供する上で十分な数の隣接ヌクレオチドを用いる。選択したポリヌクレオチド配列に突然変異を使用して、該ポリヌクレオチド自身の特性を改良し、改変し、減少させ、修飾し、またはそれらと別の様式で変更させ、および／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、または一次配列を改変することができる。
【００９１】
本発明のある特定の実施形態においては、本発明者らは、ポリペプチドワクチンの免疫原性などのコードされたポリペプチドの１以上の特性を改変するための開示したポリヌクレオチド配列の突然変異誘発を意図する。位置指定突然変異誘発技術は当技術分野では周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の変異体を作製するために広く利用されている。例えば、位置指定突然変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を改変するためにしばしば利用される。そのような実施形態においては、典型的には長さがほぼ１４〜ほぼ２５個程度のヌクレオチドを含有し、さらに改変される配列である接続部の両側のほぼ５〜ほぼ１０個の残基を有するプライマーを、使用する。
【００９２】
当業者であれば理解しうるように、位置指定突然変異誘発技術はしばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用する。位置指定突然変異誘発に有用な典型的なベクターとしては、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。これらのファージは市販されていて容易に入手でき、それらの使用は当業者であれば周知している。二本鎖プラスミドはまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージへ導入するステップをもたない位置指定突然変異誘発にも日常的に使用される。
【００９３】
一般的に、このような位置指定突然変異誘発は、配列内に所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクターを最初に得るかまたはそのようなＤＮＡを含む二本鎖ベクターの２つの鎖を融解分離することによって、実施する。所望の突然変異配列を保持するオリゴヌクレオチドプライマーを一般的には合成によって作製する。次いで、このプライマーを一本鎖ベクターとアニーリングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩクレノー断片などのＤＮＡ重合酵素で処理して、突然変異保持鎖の合成を完遂する。こうして、１つの鎖は元来の非突然変異配列をコードしかつ第２の鎖は所望の突然変異を保持するヘテロ二本鎖が形成される。次いでこのヘテロ二本鎖ベクターを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの適当な細胞を形質転換し、突然変異配列配置を保持する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【００９４】
位置指定突然変異誘発を利用する選択したペプチドコード化ＤＮＡセグメントの配列変異体の作製は潜在的に有用な種を産生する方法を提供するが、これに限定されるものでなく、ペプチドの配列変異体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を得る他の方法が存在する。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンなどの突然変異誘発剤を用いて処理し、配列変異体を得ることができる。これらの方法およびプロトコルに関する具体的詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；　Ｓｅｇａｌ、１９７６；　ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；　Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（それぞれこの目的で本明細書に参照により組み入れられる）の教示に見出される。
【００９５】
本明細書に使用される、用語「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発方法」は、テンプレート依存的プロセスおよびベクター媒介型増殖を意味し、その初期濃度と比較して特定の核酸分子濃度の増加または検出可能なシグナル（例えば増幅）の濃度の増加をもたらす。本明細書に使用される用語「オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発方法」は、プライマー分子のテンプレート依存的伸長を伴うプロセスを言うことを意図している。用語「テンプレート依存的プロセス」は、核酸の新しく合成される鎖の配列が周知の相補的塩基対合則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照）により規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を意味する。典型的には、ベクターが介在する方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中への核酸断片の導入、そのベクターのクローン増幅、および増幅した核酸断片の回収を伴う。そのような方法論の例は、本明細書中に参照によりその全文が明確に組み入れられるものとする米国特許第４，２３７，２２４号に記載されている。
【００９６】
本発明のポリペプチド変異体を作製する他の手法においては、米国特許第５，８３７，４５８号に記載の帰納的配列組換えを用いることができる。この手法においては、組換えとスクリーニングまたは選択との反復サイクルを実施して、例えば増強した免疫原性活性をもつ本発明の個々のポリヌクレオチド変異体を「進化させる」。
【００９７】
本発明の他の実施形態によると、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク質合成の効果的かつ標的化されたインヒビターであり、従って、疾患の原因となるタンパク質の合成を妨げることによりその疾患を治療しうる治療手法をもたらすことが実証されている。タンパク質合成を妨げるアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性はよく立証されている。例えば、ポリガラクツロナーゼの合成およびムスカリン性２型アセチルコリン受容体は、それぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体およびヒトＥＧＦについて実証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ． １９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号および米国特許第５，６１０，２８８号）。アンチセンス構築物はまた、様々な異常細胞増殖、例えば癌を抑制しかつ治療するのに利用しうることが記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号および米国特許第５，７８３，６８３号）。
【００９８】
従って、ある特定の実施形態においては、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、またはその相補体と特異的に結合できる任意の配列の全体、または一部分を含んでなるオリゴヌクレオチド配列を提供する。一実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはそれらの誘導体を含んでなる。他の実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡまたはそれらの誘導体を含んでなる。第３の実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化修飾骨格を含んでなる修飾されたＤＮＡである。第４の実施形態においては、前記オリゴヌクレオチド配列はペプチド核酸またはそれらの誘導体を含む。それぞれの事例において、好ましい組成物は、本明細書に開示したポリヌクレオチドの１以上の部分と相補的である配列領域、そしてさらに好ましくは実質的に相補的である配列領域、そしてなおさらに好ましくは完全に相補的である配列領域を含んでなる。
【００９９】
所与の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選んだ標的配列（すなわち、これらの説明の例としてはラットおよびヒト配列）の解析および二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づいて行われ、さらにアンチセンス組成物は、宿主の標的ｍＲＮＡとの特異的結合を低減するかまたは妨げる二量体、ヘアピン、もしくは他の二次構造を形成することが相対的に困難であることに基づいて選択される。
【０１００】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンまたはその近くの領域であり、さらにその配列が実質的に該ｍＲＮＡの５’領域と相補的である領域である。これらの二次構造解析および標的位置選択の検討は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウエアｖ．４および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウエアを用いて実施することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｓｅｐ １；２５（１７）：３３８９−４０２）。
【０１０１】
ＭＰＧと呼ばれる短いペプチドベクター（２７残基）を使用するアンチセンス送達法の使用も意図する。ＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインおよびＳＶ４０ Ｔ−抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインを含有する（Ｍｏｒｒｉｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｌ １５；２５（１４）：２７３０−６）。数分子のＭＰＧペプチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドを被覆して培養哺乳類細胞中に１時間未満で比較的高効率（９０％）で送達できることが実証されている。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する安定性および原形質膜を横切る能力の両方を著しく増加する。
【０１０２】
本発明の他の実施形態においては、本明細書に記載のポリヌクレオチド組成物を、腫瘍細胞において本発明の腫瘍ポリペプチドおよびタンパク質の発現を抑制するリボザイム分子の設計および作製に使用する。リボザイムは、位置特異的な様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を持つ特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ， Ｃｅｌｌ． １９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、しばしばオリゴヌクレオチド基質中の数個のリン酸エステルの１つだけを切断する高度の特異性をもって、リン酸エステル転移反応を促進する（Ｃｅｃｈら， Ｃｅｌｌ． １９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ， Ｎａｔｕｒｅ． １９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応に先立って、基質が特異的塩基対合相互作用によってリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と結合する必要のあることによる。
【０１０３】
現在、天然酵素性ＲＮＡの６つの基本的種類が知られている。それぞれは、生理的条件下で、ＲＮＡリン酸ジエステル結合の加水分解をｉｎ ｔｒａｎｓで触媒することができる（すなわち他のＲＮＡ分子を切断できる）。一般的に、酵素性核酸は最初に標的ＲＮＡと結合することによって作用する。そのような結合は酵素性核酸の標的結合部分を通じて起こり、その結合部分は標的ＲＮＡを切断する作用をするこの分子の酵素性部分に密接した近位にある。従って、酵素性核酸は最初に標的ＲＮＡを認識してそれと相補的塩基対合によって結合し、そして一旦正しい部位と結合すれば、該核酸は酵素作用によって標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指令するその能力を破壊しうる。酵素性核酸はそのＲＮＡ標的と結合してそれを切断した後、ＲＮＡから解放されて他の標的を探索し、そして繰返し新しい標的と結合してそれを切断することができる。
【０１０４】
治療的処置において効果を現すのに必要なリボザイム濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度より低いので、リボザイムの酵素特性は、アンチセンス技術（この場合、核酸分子は単に核酸標的と結合してその翻訳をブロックする）などの多数の技術より遥かに有利である。この利点は酵素として作用するリボザイムの能力を反映するものである。このようにして、１つのリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらにリボザイムは、標的ＲＮＡとの結合の塩基対合機構だけでなく標的ＲＮＡ切断機構にも依存する阻害特異性を有する高度に特異的なインヒビターである。切断部位近くに単一のミスマッチ、または塩基置換があれば、リボザイムの触媒活性を完全に排除しうる。アンチセンス分子の同様のミスマッチはそれらの作用を阻止しない（Ｗｏｏｌｆら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９２ Ａｕｇ １５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用特異性は、同じＲＮＡ部位と結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドより大きい。
【０１０５】
酵素性核酸分子は、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、グループＩイントロンもしくはＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連して）またはアカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ ＲＮＡモチーフとして形成されうる。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開ＥＰ ０３６０２５７）；ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４；および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。肝炎δウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されており；ＲＮアーゼＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら， Ｃｅｌｌ． １９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載されており；アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ， Ｃｅｌｌ． １９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており；そしてグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明の酵素性核酸分子にとって重要なことの全ては、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１以上と相補的である特異的基質結合部位を有し、かつそれが基質結合部位内または周囲に、該分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することである。このように、リボザイム構築物は本明細書に記載の特定のモチーフに限定されるものではない。
【０１０６】
リボザイムはまた、それぞれ本明細書に参照により明確に組み入れられる、国際特許出願公開ＷＯ ９３／２３５６９および国際特許出願公開ＷＯ ９４／０２５９５に記載のとおり設計し、記載のとおり合成してｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。そのようなリボザイムはまた送達用に最適化することもできる。特定の例を提示しているが、当業者であれば、必要なときには他の種において同等のＲＮＡ標的を利用しうることを認識するであろう。
【０１０７】
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを改変するか、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾を施したり（例えば、酵素性ＲＮＡ分子の糖部分に施しうる様々な化学修飾を記載する、国際特許出願公開ＷＯ ９２／０７０６５；国際特許出願公開ＷＯ ９３／１５１８７；国際特許出願公開ＷＯ ９１／０３１６２；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際特許出願公開ＷＯ ９４／１３６８８を参照）、細胞内のそれらの有効性を増強する修飾を施したり、ＲＮＡ合成時間を短縮しかつ化学的必要性を低下させるステムＩＩ塩基（ｓｔｅｍ ＩＩ ｂａｓｅｓ）を除去したりしたリボザイムを化学合成することによって、最適化することができる。
【０１０８】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開ＷＯ ９４／０２５９５）は酵素性ＲＮＡ分子を送達するための一般的方法を記載する。リボザイムは、当業者が精通する様々な方法によって細胞に投与することができ、それらは、以下に制限されるものではないが、リポソーム中の封入、イオン泳動による方法、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生物接着性マイクロスフェアなどの他の媒介体中への組込みによる方法が挙げられる。複数の示唆として、リボザイムは、上記媒介体を用いてまたは用いないで、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞または組織へ直接送達してもよい。あるいは、直接吸入により、直接注射によりまたはカテーテル、注入ポンプもしくはステントの使用により、ＲＮＡ／媒介体の組合せ物を局所送達してもよい。送達の他の経路は、限定されるものでないが、血管内、筋内、皮下または関節注射、エーロゾル吸入、経口（錠剤または丸薬）、局所的、全身的、眼、腹腔内および／またはくも膜下送達が挙げられる。リボザイム送達および投与のさらに詳細な説明は、それぞれ本明細書に参照により明確に組み入れられる国際特許出願公開ＷＯ ９４／０２５９５および国際特許出願公開ＷＯ ９３／２３５６９に記載されている。
【０１０９】
細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積する他の方法は、リボザイムをコードする配列をＤＮＡ発現ベクター中に組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）に対するプロモーターから駆動される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写物は全細胞において高レベルで発現されるが、所与の細胞型中の所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存しうる。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞内で発現される場合には、その原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用することもできる。そのようなプロモーターから発現されるリボザイムは哺乳類細胞内で機能することが示されている。そのような転写ユニットは哺乳類細胞中への導入用の様々なベクター中に組み込むことができ、以下に制限されるものではないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられる。
【０１１０】
本発明の他の実施形態においては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、核酸塩基が偽ペプチド骨格に結合しているＤＮＡ模倣物である（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． １９９７ ７（４） ４３１−３７）。ＰＮＡは、伝統的にＲＮＡまたはＤＮＡを使用している複数の方法において利用することができる。しばしば、ＰＮＡ配列は対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列より技術的に優れた機能性を示し、ＲＮＡまたはＤＮＡが本来持っていない有用性を有する。作製方法、特性、および利用法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７ Ｊｕｎ；１５（６）：２２４−９）に記載されている。そのように、ある特定実施形態においては、ＡＣＥ ｍＲＮＡ配列の１以上の部分と相補的であるＰＮＡ配列を作製して、そのようなＰＮＡ組成物を用いてＡＣＥ特異的ＲＮＡの翻訳を調節し、改変し、減少させ、または低下させ、それによって、そのＰＮＡ組成物を投与しておいた宿主細胞内のＡＣＥ活性レベルを改変することができる。
【０１１１】
ＰＮＡは、ＤＮＡの通常のリン酸ジエステル骨格を置き換える２−アミノエチル−グリシン結合を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ Ｄｅｃ ６；２５４（５０３７）：１４９７−５００；Ｈａｎｖｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９２ Ｎｏｖ ２７；２５８（５０８７）：１４８１−５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９６ Ｊａｎ；４（１）：５−２３）。この化学物質は次の３つの重要な結果をもたらす：第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡは中性分子である；第２に、ＰＮＡはアキラルであって立体選択的な合成を開発する必要がない；そして第３に、ＰＮＡ合成は固相ペプチド合成用の標準的なＢｏｃまたはＦｍｏｃプロトコルを使用するが、改変Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法も使用されている。
【０１１２】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーが、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡ合成は手作業または自動化プロトコルを簡単に利用する（Ｎｏｒｔｏｎら， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９５ Ａｐｒ；３（４）：４３７−４５）。手作業のプロトコルは化学修飾されたＰＮＡの生成または近縁のＰＮＡファミリーの同時合成に適している。
【０１１３】
ペプチド合成と同様に、特定のＰＮＡ合成の成功は選ばれる配列の特性に依存する。例えば、ＰＮＡは理論的にはヌクレオチド塩基のいずれの組合せでも組み込みうるが、隣接したプリンが存在すると生成物において１以上の残基の欠失をもたらしうる。この困難が予想されるので、隣接したプリンをもつＰＮＡを作るときには効率悪く付加されるであろう残基のカップリングを反復しなくてはならないことが示唆される。これに続いて、逆相高圧液体クロマトグラフィによりＰＮＡを精製して、ペプチド合成の際に観察されるのと同程度の生成物の収率および純度をもたらすべきである。
【０１１４】
所与の用途に対するＰＮＡの修飾は、固相合成の際にアミノ酸をカップリングすることによりまたはカルボン酸基を含有する化合物を露出したＮ末端アミンに結合させることにより、達成できる。あるいはＰＮＡを、合成後に、導入したリシンまたはシステインにカップリングさせることにより修飾してもよい。ＰＮＡは容易に修飾できるので、より優れた溶解性または特定機能の必要性に対して最適化するのが容易である。一旦合成すれば、ＰＮＡとそれらの誘導体の正体は、質量分析によって確認することができる。複数の研究においてＰＮＡの修飾が行われ、また利用されている（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９５ Ａｐｒ；３（４）：４３７−４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら， Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ． １９９５ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１（３）：１７５−８３；Ｏｒｕｍら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９９５ Ｓｅｐ；１９（３）：４７２−８０；Ｆｏｏｔｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９６ Ａｕｇ ２０；３５（３３）：１０６７３−９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９５ Ａｕｇ １１；２３（１５）：３００３−８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９５ Ｊｕｎ ６；９２（１２）：５５９２−６；Ｂｏｆｆａら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９５ Ｍａｒ １４；９２（６）：１９０１−５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら， Ｂｌｏｏｄ． １９９６ Ａｕｇ １５；８８（４）：１４１１−７；Ａｒｍｉｔａｇｅら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９７ Ｎｏｖ １１；９４（２３）：１２３２０−５；Ｓｅｅｇｅｒら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９９７ Ｓｅｐ；２３（３）：５１２−７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子、ならびに診断、生物のタンパク質のモジュレーション、および治療に対して感受性のある病的状態の治療におけるそれらの使用を考察している。
【０１１５】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特性決定する方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． １９９３ Ｄｅｃ １５；６５（２４）：３５４５−９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９７ Ａｐｒ ２２；３６（１６）：５０７２−７）にて考察されている。Ｒｏｓｅはキャピラリー電気泳動を用いてＰＮＡとそれらの相補的オリゴヌクレオチドとの結合を確認し、相対結合動態と化学量論を測定している。類似の種類の測定はＪｅｎｓｅｎらがＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を用いて実施している。
【０１１６】
記載されているおよび当業者には明白でありうるＰＮＡの他の用途としては、ＤＮＡ鎖侵入、アンチセンス阻害、突然変異分析、転写のエンハンサー、核酸精製、転写活性のある遺伝子の単離、転写因子結合のブロッキング、ゲノム切断、バイオセンサー、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、などにおける利用が挙げられる。
【０１１７】
ポリヌクレオチド特性決定および発現
本発明のポリヌクレオチド組成物は、様々な十分確立された技術のいずれかを利用して、作製および／または操作することができる（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９、および他の同様な参考文献を参照）。
【０１１８】
本発明の他の実施形態においては、本発明のポリペプチド、もしくは融合タンパク質またはそれらの機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列あるいはそれらの断片を、適当な宿主細胞内のポリペプチドの発現を指令する組換えＤＮＡ分子に使用することができる。遺伝コードが本来示す縮重によって、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を作製してもよく、これらの配列を用いてクローニングして所与のポリペプチドを発現させてもよい。
【０１１９】
当業者であれば理解しうるように、複数の例で、非天然コドンを有するポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を作製することが有利でありうる。例えば、特定の原核生物または真核生物宿主に好まれるコドンを選択して、タンパク質発現速度を増加するかまたは所望の特性（天然の配列から生成される転写物より長い半減期などの）もつ組換えＲＮＡ転写物を生成させることができる。
【０１２０】
さらに、限定されるものでないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変を含む様々な理由でポリペプチドをコードする配列を改変するために、本発明のポリヌクレオチド配列を当業界で一般的に知られる方法を用いて遺伝子操作することができる。例えば、無作為断片化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組立てを用いて、ヌクレオチド配列を遺伝子操作してもよい。さらに、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限酵素切断部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コドン選択の変更、スプライス変異体の作製、または突然変異の導入などを行ってもよい。
【０１２１】
本発明の他の実施形態においては、天然、改変、または組換え核酸配列を、融合タンパク質をコードする異種配列とライゲートしてもよい。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販の抗体によって認識されうるキメラタンパク質をコードすることが有用である。融合タンパク質はまた、ポリペプチドをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように遺伝子操作し、その結果ポリペプチドが切断されて異種部分から分離して精製されるようにしてもよい。
【０１２２】
所望のポリペプチドをコードする配列は、当業界で周知の化学的方法を利用して、全体としてまたは部分として合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍ． Ｈ．ら （１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２１５−２２３、Ｈｏｒｎ， Ｔ．ら （１９８０） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２２５−２３２を参照）。あるいは、ポリペプチド、またはその部分のアミノ酸配列を合成する化学的方法を利用して、タンパク質自体を生産してもよい。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ． Ｙ．ら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４）を用いて実施することができ、自動合成を、例えばＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザー（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて達成することができる。
【０１２３】
新しく合成されるペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィ（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８３） 「タンパク質、構造と分子的原理（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）」， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）または当業界で利用できる他の同等技術によって実質的に精製することができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解法）によって確認することができる。さらに、ポリペプチド、またはその任意の部分のアミノ酸配列を、直接合成の際に改変するかおよび／または化学的方法により他のタンパク質またはその任意の部分由来の配列と結合させることによって、変異体ポリペプチドを作製することができる。
【０１２４】
所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドまたは機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクター、すなわち挿入したコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター中に、挿入してもよい。当業者が周知する方法を利用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としてはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら （１９８９）「分子クローニング：研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら （１９８９） 「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１２５】
様々な発現ベクター／宿主系を利用してポリヌクレオチド配列を含有しかつ発現させることができる。これらは、限定されるものでないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；ウイルス発現ベクターを用いて感染させた昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；ウイルス発現系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０１２６】
発現ベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行するこれらのベクターの非翻訳領域であり、例えばエンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのようなエレメントはそれらの強力度や特異性は様々でありうる。利用するベクター系と宿主に依存して、構成的および誘導性のプロモーターを含む任意の数の適当な転写および翻訳エレメントを使用することができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターを用いてもよい。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが一般的に好ましい。もしポリペプチドをコードする配列の複数コピーを含有する細胞系を作製する必要があれば、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーとともに有利に利用しうる。
【０１２７】
細菌系においては、発現されるポリペプチドについて意図する用途に応じて、任意の数の発現ベクターを選択することができる。例えば抗体の誘導などのために、例えば大量に必要であるとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターを使用することができる。そのようなベクターは、限定されるものでないが、目的のポリペプチドをコードする配列を、βガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基の配列とイン・フレームでベクターにライゲートすることによりハイブリッドタンパク質を産生させうるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ． Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９）などの、多機能性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）を用いて外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であって、グルタチオン−アガロース・ビーズへの吸着とそれに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から該タンパク質を容易に精製することができる。そのような系で作られるタンパク質は、へパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計して、クローニングした目的のポリペプチドをＧＳＴ部分から任意に遊離させることができる。
【０１２８】
酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有する複数のベクターを利用することができる。総説としては、Ａｕｓｕｂｅｌら（前掲）およびＧｒａｎｔら （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４を参照。
【０１２９】
植物発現ベクターを利用するときは、ポリペプチドをコードする配列の発現は多数のプロモーターの任意のものによって駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独でまたはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１）と組合せて使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを使用することができる（Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ．ら （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ．ら （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ．ら （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞中に導入することができる。そのような技術は、一般に入手可能な多くの総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ， Ｓ．またはＭｕｒｒｙ， Ｌ． Ｅ． ｉｎ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ 「科学と技術の年鑑（Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」 （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； ｐｐ． １９１−１９６を参照）。
【０１３０】
昆虫細胞系を利用して目的のポリペプチドを発現させることもできる。例えば、そのような系の１つでは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして利用し、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内でまたは幼生トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）中で外来遺伝子を発現させる。ポリペプチドをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングして、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ポリペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活化されてコートタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。次いでその組換えウイルスを用いて、例えばエス・フルギペルダ（Ｓ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞または幼生トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）を感染させ、目的のポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｅ． Ｋ．ら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１ ：３２２４−３２２７）。
【０１３１】
哺乳類宿主細胞においては、一般的に、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして利用する場合、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターと３部リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲートすることができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入を利用して、感染宿主細胞内で前記ポリペプチドを発現しうる生ウイルスを取得することができる（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．およびＳｈｅｎｋ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて哺乳類宿主細胞内の発現を増加させることができる。
【０１３２】
特定の開始シグナルを利用して、目的のポリペプチドをコードする配列のさらに効率的な翻訳を達成することができる。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入する場合には、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要でない。しかし、コード配列、またはその部分のみを挿入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するために、正しい読み枠で存在しなければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは天然および合成の様々な起源のものであってよい。発現の効率は、文献（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ．ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２）に記載されているように、利用する特定の細胞系にとって適切なエンハンサーを含有させることによって増大させることができる。
【０１３３】
さらに、宿主細胞株を、挿入配列の発現をモジュレートするかまたは発現タンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について選ぶことができる。ポリペプチドのそのような修飾は、限定されるものでないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進することもできる。そのような翻訳後活性に対する特定の細胞機構および特徴的な機構を有するＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８などの様々な宿主細胞を、外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを保証するように選択することができる。
【０１３４】
組換えタンパク質を長期間、高収量で生産するために、安定した発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定して発現する細胞系を、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントならびに選択マーカー遺伝子を同じもしくは別のベクター上に含有する発現ベクターを用いて、形質転換することができる。ベクターを導入した後、細胞を１−２日間、富化培地中で増殖させ、その後、選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択耐性を与えるためであって、その存在によって、導入した配列の発現に成功した細胞の増殖と回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１３５】
形質転換した細胞系を回収するために、任意の数の選択系を利用することができる。これらは、限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ， Ｉ．ら （１９９０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられ、それぞれｔｋ．ｓｕｐ．−またはａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗剤、抗生物質または除草剤耐性を選択の基準に利用してもよい。例えば、メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ．ら （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−７０）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ．ら （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４）；およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対してそれぞれ耐性を与えるａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、前掲）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ． Ｃ．およびＲ． Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１）。可視マーカーの利用も人気があり、そのようなマーカーとして、アントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンなどのマーカーが、形質転換体を同定するだけでなく特定のベクター系に起因する一過性または安定したタンパク質発現の量を定量するためにも広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ． Ａ．ら （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１）。
【０１３６】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は目的の遺伝子も存在することを示唆するが、その存在と発現は確認する必要があるであろう。例えば、もしポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子内に挿入されれば、配列を含有する組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不在によって同定されうる。あるいはマーカー遺伝子が、単一のプロモーターの制御下に、ポリペプチドをコードする配列とタンデムに配置される可能性もある。誘導または選択に対して応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデムに並んだ遺伝子の発現も同様に示す
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含有し発現させる宿主細胞は、当業者が精通する様々な手法によって同定することができる。これらの手法には、限定されるものでないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が挙げられ、これらには例えば核酸もしくはタンパク質を検出および／または定量するための膜、溶液、またはチップに基づく技術が含まれる。
【０１３７】
目的のポリヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現と回収に適した条件下で培養すればよい。組換え細胞により産生されるタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに依存して、分泌されることもありまたは細胞内に含有されることもある。当業者であれば理解しうるように、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、コードされたポリペプチドを原核生物もしくは真核生物細胞膜を通して分泌することを指令するシグナル配列を含有するように設計することができる。他の組換え構築物を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列と可溶性タンパク質の精製を容易にしうるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列とを結合することができる。そのような精製を容易にするドメインは、限定されるものでないが、固定化金属上の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）に利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとコードされたポリペプチドとの間に、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）を一例とする切断可能なリンカー配列を含有させて、これを利用して精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現をもたらすものであり、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６個のヒスチジン残基をコードする核酸を有する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．ら（１９９２， Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ． ３：２６３−２８１）に記載のようにＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ）上での精製を容易にするのに対して、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製する手段を与える。融合タンパク質を含有するベクターの詳細は、Ｋｒｏｌｌ， Ｄ． Ｊ．ら（１９９３； ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：４４１−４５３）に与えられる。
【０１３８】
組換え生産の方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそれらの断片は、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ． （１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４）を利用して、直接ペプチド合成により生産することができる。タンパク質合成は、手作業の技術を用いてまたは自動化技術を用いて実施することができる。自動合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施することができる。あるいは、様々な断片を別々に化学合成し、化学的方法を用いてそれらを組み合わせて全長分子を作製することができる。
【０１３９】
Ｔ細胞組成物
本発明は、他の態様においては、本明細書に開示した腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞またはその変異体もしくは誘導体を提供する。そのような細胞は一般的に、標準の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで調製することができる。例えば、Ｔ細胞は、骨髄、末梢血、または患者の骨髄もしくは末梢血の一画分から、Ｎｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）から入手可能なＩｓｏｌｅｘＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどの市販の細胞分離システムを使用して単離することができる（米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ ８９／０６２８０；ＷＯ ９１／１６１１６およびＷＯ ９２／０７２４３も参照）。あるいは、Ｔ細胞は、近縁なもしくは近縁でないヒト、非ヒト動物、細胞系または培養物から取得してもよい。
【０１４０】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激することができる。そのような刺激は、目的のポリペプチドに特異的なＴ細胞の産生を可能にする条件下でかつそれに十分な時間にわたり、実施される。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはミクロスフェアなどの送達媒介体内に存在して特異的Ｔ細胞の産生を促進する。
【０１４１】
Ｔ細胞が特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または本発明のポリペプチドでコートされたかもしくはそのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を死滅させる場合には、Ｔ細胞は本発明のポリペプチドに対して特異的であると考えられる。Ｔ細胞特異性は、様々な標準技術のいずれかを利用して評価することができる。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブ対照と比較して溶解および／または増殖における２倍を超える刺激指数の増加は、Ｔ細胞特異性を示す。そのようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：１０６５−１０７０， １９９４に記載の通り実施することができる。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、様々な既知の技術により実施することができる。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成速度の増加を測定することによって（例えば、トリチウム化チミジンを用いてＴ細胞をパルス標識培養し、さらにＤＮＡ中に組込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）検出することができる。腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ−１００μｇ／ｍｌ、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ−２５μｇ／ｍｌ）との３〜７日間の接触により、通常はＴ細胞の増殖が少なくとも２倍増加する。標準サイトカインアッセイを用いて測定される通り、２〜３時間にわたる上記の接触によりＴ細胞の活性化が起こる。このアッセイでは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出レベルの２倍の増加がＴ細胞の活性化を示す。（Ｃｏｌｉｇａｎら，「免疫学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， ｖｏｌ． １， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｇｒｅｅｎｅ １９９８）を参照）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋でありうる。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は標準の技術を用いて増大させることができる。好ましい実施形態においては、Ｔ細胞は患者、近縁の供与者または近縁でない供与者から得られて、刺激および増大の後に患者に投与される。
【０１４２】
治療目的のために、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで数を増大させることができる。そのようなＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、様々な方法で達成することができる。例えば、Ｔ細胞を腫瘍ポリペプチドまたはそのポリペプチドの免疫原性部分に対応する短ペプチドに再曝露してもよく、その際、インターロイキン−２などのＴ細胞増殖因子、および／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激体細胞を加えてもまたは加えなくてもよい。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１以上のＴ細胞を、クローン化により、数を増大させてもよい。細胞をクローン化する方法は当技術分野で周知であって、限界希釈法が挙げられる。
【０１４３】
医薬組成物
さらなる実施形態においては、本発明は、細胞または動物に単独でまたは１以上の他の様式の治療法と組み合わせて投与するための、本明細書に記載した１以上のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはＴ細胞を含有する製薬上許容される溶液の製剤化に関する。特に、本発明は、ｃｒｉｐｔｏポリヌクレオチド、ポリペプチド、断片、融合物および変異体の、腫瘍を治療するための医薬組成物における使用に関する。特に、ＣｒｉｐｔｏはＣｒｉｐｔｏ １であることが好ましい。
【０１４４】
もし所望であれば、本発明に開示した組成物は、例えば、他のタンパク質またはポリペプチドまたは様々な医薬活性物質などの他の薬剤とさらに組合せて投与できることは理解されるであろう。実際、さらに含有させてもよい他の成分には、その追加の薬剤が標的細胞または宿主組織と接触したときに重大な有害作用を生じなければ、実質的に制限はない。従って、該組成物は、特定の事例において必要となるような様々な他の薬剤と一緒に送達することができる。そのような組成物は宿主細胞もしくは他の生物学的供給源から精製してもよいし、または代わりに本明細書に記載のように化学的に合成してもよい。同様に、そのような組成物は置換または誘導体化したＲＮＡもしくはＤＮＡ組成物をさらに含んでもよい。
【０１４５】
従って、本発明の他の態様においては、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはＴ細胞組成物の１以上を、生理学的に許容される担体と組合せて含む医薬組成物が提供される。ある特定の好ましい実施形態においては、本発明の医薬組成物は、予防用および治療用ワクチン用途に使用するための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、例えばＭ．Ｆ． ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ． Ｎｅｗｍａｎ編， 「ワクチン設計（サブユニットとアジュバント手法）（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ （ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ））」 Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （ＮＹ， １９９５）に一般的に記載されている。通常、そのような組成物は１以上の本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド組成物を１以上の免疫賦活薬と組合せて含む。
【０１４６】
本明細書に記載のいずれの医薬組成物も、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製薬上許容される塩を含有しうることは明白であろう。そのような塩は、例えば、有機塩基（例えば第一級、第二級、第三級アミンおよび塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩）を含む製薬上許容される無毒性塩基から調製することができる。
【０１４７】
他の実施形態においては、本発明の例示的な免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物は、上記ポリペプチドがｉｎ ｓｉｔｕで産生されるように、１以上の該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者には公知の様々な送達系のいずれかに入れて投与することができる。実際、多数の遺伝子送達技術が当技術分野では周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５：１４３−１９８， １９９８、およびそれにおいて引用された文献に記載のものが挙げられる。適当なポリヌクレオチド発現系は、勿論、患者における発現に必要な調節用のＤＮＡ調節配列（適当なプロモーターおよび終結シグナルなど）を含有する。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面にポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する細菌（カルメット・ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）のような）の投与を用いるものであってもよい。
【０１４８】
従って、ある特定の実施形態においては、本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、多数の公知のウイルスベースの系のいずれかを用いて、発現に好適な哺乳類宿主細胞中に導入する。例示的な一実施形態においては、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合で有効なプラットフォームを提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列をベクター中に挿入し、当技術分野で周知の技術を用いてレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、被験者に送達することができる。多数の例示のレトロウイルス系が記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ （１９８９） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ． Ｄ． （１９９０） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら （１９９１） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ （１９９３） Ｃｕｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ３：１０２−１０９）。
【０１４９】
さらに、多数の例示のアデノウイルスベースの系も記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスと異なり、アデノウイルスは染色体外に留まるので、挿入性突然変異誘発に関連するリスクを最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｋ． Ｌ． （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら （１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６）。
【０１５０】
様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系も、ポリヌクレオチド送達用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当技術分野で周知の技術を用いて、容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際特許出願公開番号ＷＯ ９２／０１０７０およびＷＯ ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら （１９８８） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら （１９９０） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ． Ｊ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ， Ｒ． Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７−１８７５を参照。
【０１５１】
遺伝子導入により本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を送達するために有用なさらなるウイルスベクターは、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスなどのポックス科ウイルスから誘導されるものが挙げられる。例として説明すると、新規分子を発現するワクシニアウイルス組換え体は次のように構築することができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に適当なベクター中に挿入し、該ＤＮＡが、ワクシニアプロモーター、およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列などのフランキングワクシニアＤＮＡ配列に隣接するようにする。次いでこのベクターを用いて細胞をトランスフェクトし、該細胞を同時にワクシニアに感染させる。相同組換えによって、ワクシニアプロモーター＋本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はそのウイルスゲノム中に挿入される。得られるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体は、その細胞を５−ブロモデオキシウリジンの存在下で培養し、それに対し耐性のあるウイルスプラークを拾うことによって選択することができる。
【０１５２】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、ある生物の宿主細胞において、本明細書に記載の１以上のポリペプチドの誘導性かつ一過性の発現または同時発現を提供するのに都合よく使用することができる。この特定の系においては、細胞を、最初に、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させる。このポリメラーゼはＴ７プロモーターを保持するテンプレートだけを転写する精巧な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターにより駆動される目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトする。細胞質中で発現されたワクシニアウイルス組換え体由来のポリメラーゼはトランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、これは次いで宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡとその翻訳産物の、高レベルかつ一過性の細胞質生産を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９０） ８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８６） ８３：８１２２−８１２６を参照。
【０１５３】
あるいは、鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなどのアビポックスウイルスも、目的のコード配列を送達するのに利用することができる。哺乳類病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与すると防御免疫を与えることが知られている。アビポックスベクターの使用はヒトおよび他の哺乳類種において特に望ましい、というのは、アビポックス属のメンバーは、感受性のある鳥類種においてのみ複製して産生することが可能であり、従って哺乳類細胞に感染性がないからである。組換えアビポックスウイルスを産生する方法は当技術分野で周知であり、ワクシニアウイルスの産生について上述したのと同様に、遺伝子組換えを用いる。例えば、ＷＯ ９１／１２８８２；ＷＯ ８９／０３４２９；およびＷＯ ９２／０３５４５を参照。
【０１５４】
多数のアルファウイルスベクターのいずれでも、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達に利用することができ、そのようなベクターは米国特許第５，８４３，７２３号；第６，０１５，６８６号；第６，００８，０３５号および第６，０１５，６９４号に記載されている。ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）に基づくある特定のベクターも利用することができ、説明のための例は米国特許第５，５０５，９４７号および第５，６４３，５７６号に見出すことができる。
【０１５５】
さらに、Ｍｉｃｈａｅｌら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９３） ２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９２） ８９：６０９９−６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクターなどの分子コンジュゲートベクターも本発明における遺伝子送達に利用できる。
【０１５６】
これらおよび他の既知のウイルスベースの送達系に関するさらなる例示的情報は、例えば、次に見出すことができる：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３１７−３２１， １９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５６９：８６−１０３， １９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら， Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７−２１， １９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、および第５，０１７，４８７号；ＷＯ ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ ２，２００，６５１；ＥＰ ０，３４５，２４２；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７， １９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４， １９９１；Ｋｏｌｌｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：２１５−２１９， １９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１４９８−１１５０２， １９９３；Ｇｕｚｍａｎら， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８， １９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら， Ｃｉｒ． Ｒｅｓ． ７３：１２０２−１２０７， １９９３。
【０１５７】
本発明の他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは「裸の」ＤＮＡとして投与／送達されるが、このような手法は、例えば、Ｕｌｍｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９， １９９３に記載されかつＣｏｈｅｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２， １９９３に総説されている。裸のＤＮＡの取込みは、ＤＮＡを細胞中に効率よく輸送される生物分解性ビーズ上にコーティングすることによって増加させることができる。
【０１５８】
さらなる他の実施形態においては、本発明の組成物は、その多くが記載されているが、粒子衝撃法により送達することができる。説明のための一例においては、ガス推進による粒子加速を、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ （Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ． （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）が製造するものを一例とするデバイスを用いて実施することができ、その数例は米国特許第５，８４６，７９６号；第６，０１０，４７８号；第５，８６５，７９６号；第５，５８４，８０７号；ＥＰ特許第０５００ ７９９号に記載されている。この手法は、針を使用しない送達手法であって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド粒子などの微小粒子の乾燥粉末製剤を、手持式（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ）デバイスによって発生させたヘリウムガスジェット内で高速に加速して、粒子を目的の標的組織に吹きつける手法を提供する。核酸を送達する場合、その粒子は直径が好ましくは０．４〜４．０ ｕｍ、さらに好ましくは０．６〜２．０ ｕｍの金ビーズであり、ＤＮＡコンジュゲートがこれらの上にコーティングされ、「遺伝子銃」中に装填するカートリッジ中に入れられる。粒子は、通常はそして好ましくは皮膚に送達される。皮膚に送達する他の手段は、針を通じた液体製剤の針送達の利用を含む。
【０１５９】
ＤＮＡワクチンは通常、強力で通常はウイルス性のプロモーター、抗原性ペプチドをコードする目的の遺伝子、およびポリアデニル化／転写終結配列を挿入した、細菌プラスミドベクターからなる。そして、目的の遺伝子は、記載した完全ｃｒｉｐｔｏタンパク質または単に配列番号１３〜９４に記載したような抗原性ペプチド配列、をコードするものであってよい。プラスミドを、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌中で増殖させ、次いで単離し、そして、意図する投与経路に応じて適当な媒質中に調製した後に、宿主に投与することができる。投与後、プラスミドは宿主細胞により取りこまれ、コードされたペプチドが産生される。プラスミドベクターは、哺乳類宿主内でのプラスミド複製および関連動物の染色体ＤＮＡ中への組み込みを防止するために、真核生物細胞において機能する複製起点なしに作るのが好ましいであろう。
【０１６０】
伝統的ワクチン接種技術と比較して、ＤＮＡワクチン接種には多数の利点がある。第１に、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は宿主で合成されるので、該タンパク質の構造またはコンフォメーションは、その病状に関連する天然のタンパク質に類似しているだろうと予想される。ＤＮＡワクチン接種はまた、保存タンパク質由来のエピトープを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球応答を生じることによって、様々なウイルス株に対する防御も提供するだろうと考えられる。さらに、プラスミドは、抗原性タンパク質を産生しうる宿主細胞により取り込まれるので、長時間持続する免疫応答を誘発しうる。本技術はまた、多様な免疫原／エピトープを単一調製物中に合わせる可能性も与える。
【０１６１】
ＤＮＡワクチン接種に関係して助けとなる背景の情報は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら， 「ＤＮＡワクチン（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」 Ａｎｎ． Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ １５： ６１７−６４８に提供されていて、本開示は本明細書にその全文が参照により含まれるものとする。
【０１６２】
関係する実施形態においては、本発明の組成物のガス推進無針注射（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に有用でありうる他の装置および方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ， Ｉｎｃ． （Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ）により与えられたものが挙げられ、それらの数例は米国特許第４，７９０，８２４号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；第５，３９９，１６３号；第５，５２０，６３９号；および第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０１６３】
他の実施形態においては、本明細書に記載の医薬組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１以上の免疫賦活剤を含んでなるであろう。免疫賦活剤は、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞が介在する）を増強するかまたは強力にするいずれの物質も意味する。好ましい型の免疫賦活剤の１つはアジュバントを含んでなる。多くのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱油などの、抗原を迅速な異化作用から保護するように設計された物質、およびリピドＡ、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）または結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質などの免疫応答の刺激因子を含有する。ある特定のアジュバントは市販されていて、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｒａｈｗａｙ， ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）；水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）もしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；カチオンもしくはアニオン誘導体化した多糖類；ポリホスファゼン；生物分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａが挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、−７、−１２などのサイトカインおよび他の同様な増殖因子もアジュバントとして利用しうる。
【０１６４】
本発明のある特定の実施形態においては、アジュバント組成物は優先的にＴｈ１型の免疫応答を誘導するものであることが好ましい。Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）のレベルが高いと、投与された抗原に対する細胞介在性免疫応答の誘導を有利にする傾向がある。対照的に、Ｔｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）のレベルが高いと、体液性免疫応答の誘導を有利にする傾向がある。本明細書で提供されるワクチンの適用後に、患者はＴｈ１型およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を備えうる。応答が優先的にＴｈ１型である好ましい実施形態内では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルはＴｈ２型サイトカインのレベルよりも大きい程度まで増加しうる。これらのサイトカインのレベルは標準アッセイを用いて容易に評価することができる。サイトカインファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５−１７３， １９８９を参照されたい。
【０１６５】
優先的にＴｈ１型応答を誘発する、ある特定の好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組合せが挙げられる。Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号を参照されたい）からＭＰＬ（登録商標）アジュバントが入手可能である。またＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されてない）もＴｈ１応答を優先的に誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であって、例えばＷＯ ９６／０２５５５、ＷＯ ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号に記載されている。また免疫賦活性ＤＮＡ配列も、例えば、Ｓａｔｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６によって記載されている。他の好ましくはアジュバントは、Ｑｕｉｌ Ａなどのサポニン、またはその誘導体を含んでなり、ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）；エスシン（Ｅｓｃｉｎ）；ジギトニン；またはカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）またはキノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ）サポニンが挙げられる。他の好ましい製剤は本発明のアジュバントの組合せに、１以上のサポニン、例えば次のＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む群の少なくとも２つの組合せを含む。
【０１６６】
あるいは、サポニン製剤は、キトサンまたは他のポリカチオンポリマー、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンに基づくポリマーマトリックス、多糖類もしくは化学修飾した多糖類からなる粒子、リポソームおよび脂質に基づく粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチンビヒクルと組み合わせてもよい。サポニンはまた、コレステロールの存在のもとで製剤化して、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの微粒子構造を形成してもよい。さらに、サポニンはポリオキシエチレンエーテルもしくはエステルと一緒に微粒子を含まない溶液（ｎｏｎ−ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）もしくは懸濁液で、またはわずかにラメラの（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの微粒子構造で製剤化してもよい。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）などの賦形剤を用いて粘性を増加するように製剤化するか、またはラクトースなどの粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態で製剤化してもよい。
【０１６７】
好ましい一実施形態においては、アジュバント系は、ＷＯ ９４／００１５３に記載されるＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントの組合せなどのモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、または、ＷＯ ９６／３３７３９に記載されるＱＳ２１をコレステロールによってクエンチした（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の低い組成物を含む。他の好ましい製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。他の特に好ましいＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを含む水中油型エマルジョンを使用するアジュバント製剤がＷＯ ９５／１７２１０に記載されている。
【０１６８】
他の増強されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せ、特にＷＯ ００／０９１５９に記載のＣｐＧとＱＳ２１との組合せを含む。好ましくは、該製剤はさらに水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含んでなる。
【０１６９】
本発明の医薬組成物に使用するさらなる例示のアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９ （Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギー、から入手しうるＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４）、Ｄｅｔｏｘ （Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）およびその開示の全文が本明細書に参照により組み入れられる、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および第０９／０７４，７２０号に記載のもののような他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）、ならびにＷＯ ９９／５２５４９Ａ１に記載のもののようなポリオキシエチレンエーテルアジュバントが挙げられる。
【０１７０】
他の好ましいアジュバントとしては、一般式（Ｉ）：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである］
のアジュバント分子が挙げられる。
【０１７１】
本発明の一実施形態は、一般式（Ｉ）（式中、ｎは１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ成分はＣ１−５０、好ましくはＣ４−Ｃ２０アルキルであり、最も好ましくはＣ１２アルキルであり；そしてＡは結合である）のポリオキシエチレンエーテルを含んでなるワクチン製剤からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲であるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは次の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルク・インデックス（Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ）（第１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子はＷＯ ９９／５２５４９に記載されている。
【０１７２】
上記の一般式（Ｉ）によるポリオキシエチレンエーテルは、もし所望であれば、他のアジュバントと組合せてもよい。例えば、好ましいアジュバントの組合せは好ましくは、係属中の英国特許出願ＧＢ ９８２０９５６．２に記載のＣｐＧとの組合せである。
【０１７３】
本発明の他の実施形態によれば、本明細書に記載の免疫原性組成物は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および効率的なＡＰＣとなるように遺伝子工学的に操作することができる他の細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介して、宿主に送達される。そのような細胞は、必要ではないが、遺伝子学的に改変して、抗原を提示する能力を増加し、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良し、それ自身が抗腫瘍効果を有しおよび／または受給者と免疫学的に適合しうる（すなわち、適合したＨＬＡハプロタイプ）ようにしてもよい。ＡＰＣは一般的に、腫瘍および腫瘍周辺組織を含む様々な体液および器官のいずれから単離してもよく、かつ自己、同種、同系または異種細胞であってもよい。
【０１７４】
本発明のある特定の好ましい実施形態は樹状細胞またはその前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を抗原提示細胞として使用する。樹状細胞は高度に強力なＡＰＣであって（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５１， １９９８）、予防または治療用の抗腫瘍免疫を誘発する生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０：５０７−５２９， １９９９を参照）。一般的に、樹状細胞は、その典型的な形状（ｉｎ ｖｉｔｒｏで目視しうる特徴ある細胞質突起（樹状突起）をもつｉｎ ｓｉｔｕ星状）、抗原を高効率で取込んでプロセシングして提示する能力、およびナイーブＴ細胞応答を活性化する能力に基づいて、同定することができる。樹状細胞は、勿論、通常ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで樹状細胞上に見られない特定の細胞表面受容体またはリガンドを発現するように遺伝子工学的に操作してもよく、本発明はそのような改変した樹状細胞を意図する。樹状細胞の代わりに、分泌小胞抗原を搭載する樹状細胞（エキソソームと呼ぶ）もワクチン内に利用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５９４−６００， １９９８を参照）。
【０１７５】
樹状細胞と前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織−浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または任意の他の好適な組織または体液から得ることができる。例えば、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαなどのサイトカインの組合せを末梢血から回収した単球の培養物に加えることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで分化させてもよい。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から回収したＣＤ３４陽性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物の組合せを培地に加えることによって、樹状細胞に分化させてもよい。
【０１７６】
樹状細胞は「未成熟」および「成熟」細胞として分類すると好都合であり、これにより、２つのよく特徴付けられた表現型を識別する簡単な方法が可能となる。しかし、この命名法は全ての可能な分化の中間段階を排除しないと解釈すべきである。未成熟樹状細胞は、抗原取込みおよびプロセシングの高い能力をもつＡＰＣとして特徴付けられ、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高い発現と相関がある。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの発現はより低いが、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および補助的刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）などのＴ細胞活性化の原因となる細胞表面分子の高い発現によって特徴付けられる。
【０１７７】
ＡＰＣは一般的に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の変異体）を用いてトランスフェクトして、コードされたポリペプチド、またはその免疫原性部分を細胞表面上に発現させることができる。そのようなトランスフェクションをｅｘ ｖｉｖｏで起こして、次いでそのようなトランスフェクトした細胞を含んでなる医薬組成物を本明細書に記載のように治療目的に使用することができる。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与して、ｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションを起こさせてもよい。樹状細胞のｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションは、例えば、一般的に、ＷＯ ９７／２４４４７に記載の方法、またはＭａｈｖｉら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６−４６０， １９９７に記載の遺伝子銃手法などの、当技術分野で公知のいずれの方法を用いて実施してもよい。樹状細胞の抗原搭載は、樹状細胞もしくは前駆細胞を腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸の（ｎａｋｅｄ）またはプラスミドベクター内の）もしくはＲＮＡとともに；または抗原発現組換え細菌もしくはウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）とともにインキュベートすることによって達成することができる。搭載前にポリペプチドを、Ｔ細胞ヘルプを与える免疫学的パートナー（例えば、担体分子）と共有結合でコンジュゲートしてもよい。あるいは、樹状細胞に、非コンジュゲート免疫学的パートナーを用いて、別々にまたはポリペプチドの存在下でパルス（ｐｕｌｓｅｄ）してもよい。
【０１７８】
当業者にとって公知のいずれの好適な担体を本発明の医薬組成物に使用してもよいが、担体の型は典型的には、投与の様式に依って変わりうる。本発明の組成物はいずれの適当な投与方法のために製剤化してもよく、例えば、局所、経口、鼻、粘膜、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下および筋内投与が挙げられる。
【０１７９】
そのような医薬組成物内で使用する担体は生体適合性であり、かつ生物分解性でもありうる。ある特定の実施形態においては、好ましくは、製剤は相対的に一定したレベルの活性成分放出を与える。しかし他の実施形態においては、投与後に直ぐより迅速な放出速度が所望されうる。そのような組成物の製剤は、既知技術を利用する当業者のレベル内にある。この点に関する有用な例示の担体としては、ポリ（ラクチド−コ−グリコチト）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示の遅延放出性担体としては、非液状親水性コア（例えば、架橋多糖またはオリゴ糖）を含んでなる超分子バイオベクター（ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）および、任意に、リン脂質などの両親媒性化合物を含んでなる外層が挙げられる（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ ９６／０６６３８を参照）。徐放性製剤内に含有される活性化合物の量は、移植部位、放出の速度と予想持続時間および治療または予防すべき症状の性質に依存する。
【０１８０】
他の例示の実施形態においては、生物分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート）を本発明の組成物の担体として使用する。好適な生物分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；第５，０７５，１０９号；第５，９２８，６４７号；第５，８１１，１２８号；第５，８２０，８８３号；第５，８５３，７６３号；第５，８１４，３４４号；第５，４０７，６０９号および第５，９４２，２５２号に開示されている。ＷＯ／９９ ４０９３４およびそれに引用された参考文献に記載の改変されたＢ型肝炎コアタンパク質担体系も多くの適用に有用であろう。他の例示の担体／送達系は、米国特許第５，９２８，６４７号に記載のもののような、宿主のクラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導できる微粒子タンパク質複合体を含んでなる担体を使用する。
【０１８１】
本発明の医薬組成物は多くの場合、さらに１以上のバッファー（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤を受給者の血液と等張、低張もしくは弱高張にする溶質、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤を含んでなるだろう。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化してもよい。
【０１８２】
本明細書に記載の医薬組成物は、密閉アンプルまたはバイアルなどの単位用量または多用量容器で提供することができる。そのような容器は典型的には製剤を使用するまで無菌かつ安定に保存する方法で密閉される。一般的に、製剤は油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存することができる。あるいは、医薬組成物は、使用直前に無菌の液状担体の添加だけを必要とする凍結乾燥条件で保存してもよい。
【０１８３】
本明細書に記載の特定の組成物を、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋内投与を含む様々な治療処方計画および製剤において使用するための、好適な投与および治療処方計画の開発は当技術分野では周知であり、それらのいくつかを、一般的な例示の目的で以下に簡単に考察する。
【０１８４】
ある特定の適用においては、本明細書に開示した医薬組成物は、経口投与によって動物に送達することができる。その場合、これらの組成物は不活性の希釈剤を用いてまたは吸収できる食用担体を用いて製剤化してもよいし、または、硬質もしくは軟質シェルのゼラチンカプセルに封入してもよいし、または錠剤に圧縮してもよいし、または直接食品に組み込んでもよい。
【０１８５】
活性化合物は、さらに賦形剤を組み込んでもよく、摂取しうる錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハ（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用してもよい（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら， Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｍａｒ ２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号 および米国特許第５，７９２，４５１号を参照）。錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、任意の様々な追加成分、例えばトラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および蔗糖、乳糖もしくはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミント、ウインターグリーンの油、もしくはチェリー香料などの香料を含有してもよい。単位剤形がカプセルであるとき、上記の型の物質に加えて、液状担体を含有してもよい。様々な他の物質がコーティングとしてまたは投与単位の物理的形態を異なるように改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルを、シェラック、糖、または両方でコーティングしてもよい。勿論、単位剤形を調製するために用いるいずれの物質も、製薬上純粋であり、使用量は実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物を徐放性調製物および製剤中に組み込んでもよい。
【０１８６】
典型的には、これらの製剤は、活性化合物の少なくとも約０．１％以上を含有しうるが、活性成分の割合は、勿論、変えてもよく、全製剤の重量または容積の約１もしくは２％と約６０％もしくは７０％との間またはそれ以上であるのが好都合でありうる。当然、それぞれの治療上有用な組成物中の活性化合物の量は好適な投与が化合物の所与の単位用量のいずれかで得られるように調製しうる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの要因、ならびに他の薬理学的考慮が、そのような医薬組成物を調製する当業者により考慮されるし、そのようなものとして、様々な投与と治療処方計画が所望されうる。
【０１８７】
あるいは、経口投与用に、本発明の組成物は、うがい薬、歯磨剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与製剤の形態で１以上の賦形剤とともに組み込んでよい。あるいは、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有するような経口溶液中に組み込んでも、または歯磨剤に分散しても、または治療上有効な量を、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含みうる組成物に加えてもよい。あるいは、組成物は、舌下に置くかさもなくば口中で溶解しうる錠剤または溶液形態に作ってもよい。
【０１８８】
ある特定の状況においては、本明細書に開示した医薬組成物を、非経口的に、静脈内に、筋内に、またはさらに腹腔内にもしくは皮内に送達することが望ましいだろう。そのような手法は、当業者には周知であり、それらのいくつかはさらに、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号に記載されている。ある特定の実施形態においては、遊離塩基または薬理学上許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合して水中で調製することができる。また分散液を、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でならびに油中で調製することもできる。普通の保存と使用の条件下では、これらの調製物は一般的に微生物の増殖を防止する保存剤を含有するであろう。
【０１８９】
注射可能な使用に好適な例示の剤形としては、無菌水溶液または分散液および無菌注射可能溶液もしくは分散液の用事調製のための無菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照）。全ての場合に、剤形は無菌でなければならないしかつ容易に注射しうる程度の液体でなければならない。剤形は製造および貯蔵条件下で安定でなければならないしかつ細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には所要の粒径の維持により、および／または界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進しうる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって実施できる。
【０１９０】
一実施形態においては、水溶液で非経口投与するために、溶液をもし必要であれば好適に緩衝化し、かつ液希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にしなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内投与用に特に好適である。この関係で使用しうる無菌水性媒質は本開示を考慮に入れて当業者には分かるであろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、そして皮下注入液１０００ｍｌに加えるかまたは注入の所定部位に注射することができる（例えば、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１５版、１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照）。治療する被験者の症状に依っては、若干の用量の変動は必然的に起こりうる。さらに、ヒト投与については、調製物は勿論、ＦＤＡ生物製剤局の基準によって要求される、無菌性、発熱原性、ならびに一般的安全性および純度基準に適合することが好ましいであろう。
【０１９１】
本発明の他の実施形態においては、本明細書に開示した組成物は中性または塩の形態で製剤化してもよい。例示の製薬上許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成した、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成した）が挙げられる。また遊離カルボキシル基と形成した塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。製剤において、溶液は、投与製剤と適合しうる方法でかつ治療上有効な量で投与されるであろう。
【０１９２】
担体はさらに、いずれのおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含んでなってもよい。製薬上活性のある物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は当技術分野では周知である。いずれの従来の媒質または薬剤も、活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。また補充活性成分を組成物中に組み込んでもよい。成句「製薬上許容される」とは、ヒトに投与したとき、アレルギーまたは類似の有害反応を生起しない分子実体および組成物を意味する。
【０１９３】
ある特定の実施形態においては、医薬組成物は鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエーロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を鼻内エーロゾルスプレーを介して肺に直接送達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、また鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８ Ｍａｒ ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を用いる薬物の送達も製薬技術分野では周知である。同様に、例示のポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。
【０１９４】
ある特定の実施形態においては、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、本発明の組成物の好適な宿主細胞／生物中への導入に利用する。特に、本発明の組成物は、送達のために、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアの中に封入してまたはナノ粒子などに製剤化してもよい。あるいは、本発明の組成物は、共有結合によってまたは非共有結合によって、そのような担体ビヒクルの表面に結合させてもよい。
【０１９５】
可能な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成と使用は一般的に当業者には公知である（例えば、それぞれの全文が特定して本明細書に参照により組み入れられる、Ｌａｓｉｃ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ， Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９８ Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号を参照）。
【０１９６】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、一次肝細胞培養物およびＰＣ １２細胞を含む他の方法によってトランスフェクトすることが通常困難である多数の細胞型について使用され、成功している（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９０ Ｓｅｐ ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスに基づく送達系では典型的であるＤＮＡの長さ制約がない。リポソームは、遺伝子、様々な薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを、様々な培養細胞系および動物内に導入するのに効果的に利用されている。さらに、リポソームの利用は、全身送達後の自己免疫応答または許容されない毒性に関係がないようである。
【０１９７】
ある特定の実施形態においては、リポソームは、水溶媒質中に分散したリン脂質から形成され、多層同心二重層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ ｂｉｌａｙｅｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）（多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然に形成する。
【０１９８】
あるいは、他の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物の製薬上許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは一般的に、化合物を安定でかつ再現しうる方法で封入することができる（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ． １９９８ Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照）。細胞内ポリマーオーバーローディングによる副作用を避けるために、そのような超微粒子（ほぼ０．１μｍサイズ）はｉｎ ｖｉｖｏで分解しうるポリマーを用いて設計することができる。そのような粒子は、例えばＣｏｕｖｒｅｕｒ ら， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎら， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ． １９９８ Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ． １９９８ Ｊａｎ ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されたように作製することができる。
【０１９９】
癌治療法
本発明のさらなる態様においては、本発明に記載の医薬組成物は、癌の治療、特に結腸または結腸直腸癌の免疫療法に使用することができる。他の実施形態においては、該組成物は、乳癌または非小細胞肺癌を治療するのに使用することができる。典型的には、該組成物はｃｒｉｐｔｏ抗原を発現する癌および／またはｃｒｉｐｔｏ抗原を発現する転移の患者を治療するのに有用であろう。そのような方法内においては、本明細書に記載の医薬組成物を患者、典型的には温血動物、好ましくはヒトに投与する。患者は癌を患っていてもまたはいなくてもよい。従って、上記の医薬組成物は、癌の発生を予防するためにまたは癌を患っている患者を治療するために使用することができる。医薬組成物とワクチンは、原発性腫瘍の外科除去および／または放射線治療もしくは通常の化学治療薬の投与などの治療の前にまたはその後に投与してもよい。以上考察したように、医薬組成物の投与は、いずれの好適な方法によってもよく、それらとしては静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所および経口経路による投与が挙げられる。
【０２００】
ある特定の実施形態内においては、免疫療法は能動免疫療法であってもよく、その場合、治療は、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系の、免疫応答改変剤（本明細書で提供したポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの）投与によるｉｎ ｖｉｖｏ刺激に依存する。
【０２０１】
他の実施形態においては、免疫療法は受動免疫療法であってもよく、この治療は、確立された腫瘍免疫反応性をもって直接または間接的に抗腫瘍効果を介在しうる作用物質（エフェクター細胞など）の送達を含み、完全な宿主免疫系に必ずしも依存しない。エフェクター細胞の例としては、先に考察したＴ細胞、Ｔリンパ球（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球など）、キラー細胞（ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞、および本明細書で提供したポリペプチドを発現する抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージなど）が挙げられる。本明細書に列挙したポリペプチドに特異的なＴ細胞受容体と抗体受容体をクローニングし、発現し、そして養子免疫療法用の他のベクターまたはエフェクター細胞中に導入することができる。
【０２０２】
エフェクター細胞は一般的に、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖により養子免疫療法に十分な量を得ることができる。単一の抗原特異的エフェクター細胞を数十億の数までｉｎ ｖｉｖｏ抗原認識を保持して拡大する培養条件は、当技術分野では周知である。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件は、典型的には抗原による断続的刺激を利用し、多くの場合サイトカイン（ＩＬ−２などの）および非分裂支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）の存在のもとで行う。上記のように、本明細書で提供した免疫反応性ポリペプチドは、十分な数の免疫療法用細胞を生成する目的で、抗原特異的Ｔ細胞培養物を迅速に拡大するために使用することができる。特に、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞および／またはＢ細胞などの抗原提示細胞を、当技術分野で周知の標準技術を利用して、免疫反応性ポリペプチドを用いてパルスするかまたは１以上のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトしてもよい。例えば抗原提示細胞を、組換えウイルスもしくは他の発現系における発現を増加するために適当なプロモーターを有するポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトすることができる。治療に用いる培養エフェクター細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間、増殖しかつ広く分布して生存できなければならない。研究により、培養エフェクター細胞がＩＬ−２を補充した抗原を用いる反復刺激によって、ｉｎ ｖｉｖｏで誘導されて増殖し、長期間、実質的な数で生存しうることが示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７， １９９７を参照）。
【０２０３】
あるいは、本明細書に列挙したポリペプチドを発現するベクターを、患者から採取した抗原提示細胞中に導入し、クローニングによりｅｘ ｖｉｖｏで増殖し、前記患者に戻し移植してもよい。トランスフェクトした細胞は、当技術分野で周知の手段を利用して、好ましくは無菌形態で静脈内、腔内、腹腔内または腫瘍内投与によって患者に再導入することができる。
【０２０４】
本明細書に記載した治療組成物の投与経路と頻度、および投与量は、個々の事例によって変わり、標準技術を用いて容易に確立することができる。一般的に、医薬組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋内、静脈内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）または皮下）によって、鼻腔内（吸引により）または経口で投与することができる。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０回用量を投与しうる。好ましくは、６回用量を１ヶ月間隔で投与し、その後、追加免疫ワクチン接種を定期的に与えうる。別のプロトコルが個々の患者に適当でありうる。好適な用量は、上記のとおり投与したときに抗腫瘍免疫応答を促進することができ、その応答が基底（すなわち無処置）レベルを少なくとも１０〜５０％超える化合物の量である。そのような応答は、患者の抗腫瘍抗体を測定することによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで患者の腫瘍細胞を死滅させうる細胞溶解性エフェクター細胞のワクチンに依存する生成によってモニターできる。そのようなワクチンはまた、ワクチン無接種の患者と比較して、ワクチン接種した患者に臨床的成果の改善（例えば、より高い頻度の寛解、完全または部分的またはより長期の疾病のない状態での生存）に導く免疫応答を生じうるものであるべきである。一般的に、１以上のポリペプチドを含んでなる医薬組成物およびワクチンには、１用量に存在する各ポリペプチドの量は宿主体重１ｋｇ当たり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲にある。患者のサイズによって変わりうるが、好適な用量サイズは典型的には約０．１ｍｌ〜約５ｍｌの範囲であろう。
【０２０５】
一般的に、適当な投与および治療処方計画は、治療および／または予防利益を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。そのような応答は、無処置の患者と比較して、処置した患者に臨床的成果の改善（例えば、より高い頻度の寛解、完全または部分的またはより長期の疾病のない状態での生存）を確立することによってモニターすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般的に臨床的成果の改善と相関がある。そのような免疫応答は一般的に、治療前および後の患者から得たサンプルを用いて実施しうる標準の増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを用いて評価することができる。
【０２０６】
実施例１ａ
ヒト病変における免疫反応性ＣＲＩＰＴＯ−１の発現
2004506441.tif 000003
【０２０７】
実施例
実施例１．６：癌組織におけるＣｒｉｐｔｏの過剰発現
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｕ． Ｇｉｂｓｏｎ． １９９６． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： ６，９９６）を利用して、正常および腫瘍組織および／または細胞系のパネルにおける標的タンパク質のｍＲＮＡ転写物存在度を比較する。この分析は、優れたワクチン候補が満たさねばならぬ重要な判定基準であるＣｒｉｐｔｏ発現の腫瘍特異性を確立する上で重要である。
【０２０８】
ＴｒｉＰｕｒｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、全ＲＮＡをスナップ凍結生検または細胞系から抽出する。正常組織由来の全ＲＮＡはＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからも購入する。ポリＡ＋ｍＲＮＡをＤＮＡアーゼ処理後の全ＲＮＡからオリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて精製する。ｍＲＮＡの定量は、分光蛍光分析（ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ， ＢｉｏＲａｄ）によって、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて実施する。
【０２０９】
ＴａｑＭａｎプライマー（フォワードプライマー配列：ＴＧＧＧＴＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴ、配列番号７：リバースプライマー配列：ＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＡＴＣＡ、配列番号８）およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅用のプローブは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒプライマー発現ソフトウエアを用いて、ＴａｑＭａｎ増幅条件に対するデフォルトオプションを使って設計する。
【０２１０】
リアルタイム反応は、標準ＰＣＲプロトコルに従い、それぞれの反応に対して２ｎｇの逆転写したｍＲＮＡ（Ｅｘｐａｎｄ ＲＴ， Ｒｏｃｈｅ）を用いて組立てる。評価サンプルに依って、ＳｙｂｒＩまたはＴａｑＭａｎ検出のいずれかを行う。ＳｙｂｒＩ検出の場合は、ＳｙｂｒＩ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を最終希釈１／７５０００でリアルタイム検出のために加えて、ＴａｑＭａｎプローブを省く。増幅（４０サイクル）およびリアルタイム検出をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＥ７７００システムで、通常の機器設定を用いて実施する。Ｃｔ値はＰＥ７７００配列検出器ソフトウエアを用いて計算する。Ｃｔ値は、それぞれの組織サンプルから標的ｍＲＮＡ（ＣｔＸ）についておよびアクチンｍＲＮＡ（ＣｔＡ）について得る。
【０２１１】
主な実験条件下のＰＣＲ増幅効率は理論的増幅効率に近かったので、２（ＣｔＡ−ＣｔＸ）値は、アクチン転写物レベルについて標準化したサンプルの相対的標的転写物レベルの評価である。従って、１の値は、候補抗原とアクチンは同じ発現レベルを有することを示唆する。
【０２１２】
ＳｙｂｒＩ検出を用いるＲＴ−ＰＣＲ分析を、１セットの結腸腫瘍について実施し、６人の異なる患者から得た正常な結腸および４８の正常組織サンプルと照合した。ＴａｑＭａｎ検出を、１セットの結腸腫瘍について実施し、６人の他の患者（反応は３重で実施した）から得た正常な結腸および４８の正常組織サンプルと照合した。試験した正常組織（およびグラフに用いた略記号）を以下に示す：
副腎（Ａｄ＿Ｇｌ）
大動脈（Ａｏ）
膀胱（Ｂｌ）
骨髄（Ｂｏ＿Ｍａ）
脳（Ｂｒａ、Ｂｒａ１、Ｂｒａ２、Ｂｒａ３、Ｂｒａ４、Ｂｒａ５）
子宮頸（Ｃｅ）
結腸（Ｃｏ）
ファローピウス管（Ｆａ＿Ｔｕ）
心臓（Ｈｅ）
回腸（Ｉｌ）
腎臓（Ｋｉ）
肝臓（Ｌｉ、Ｌｉ１、Ｌｉ２）
肺（Ｌｕ）
リンパ節（Ｌｙ＿Ｎｏ）
食道（Ｏｅ）
卵巣（Ｏｖ）
膵臓（Ｐａ、Ｐａｎｃ１、Ｐａｎｃ２）
上皮小体（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｓ）（Ｐａ＿Ｔｈｙ）
胎盤（Ｐｌ）
前立腺（Ｐｒ）
直腸（Ｒｅ）
皮膚（Ｓｋ）
骨格筋（Ｓｋ＿Ｍｕ）
小腸（Ｓｍ＿Ｉｎ）
脾臓（Ｓｐ）
胃（Ｓｔ）
精巣（Ｔｅ）
甲状腺（Ｔｈｙｒ、Ｔｈｙ、Ｔｈｙ１、Ｔｈｙ２）
胸腺（Ｔｈｙｍ１、Ｔｈｙｍ２）
気管（Ｔｒ、Ｔｒａ）
ＳｙｂｒＩ検出を用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応はまた、以下の１セットの７種の肺細胞系：
ＣＲＬ−５８０３（癌、非小細胞肺癌、大細胞、神経内分泌、転移部位：リンパ節）
ＣＲＬ−５８０７（細気管支肺胞癌（Ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非小細胞肺癌）
ＣＲＬ−５８１０（腺癌、非小細胞肺癌）
ＣＲＬ−５８１５（カルチノイド、肺気管支）
ＣＲＬ−５８６５（腺癌、転移部位：胸水）
ＣＲＬ−９６０９（正常肺、気管支、上皮、ウイルス形質転換した）
ＨＴＢ−１７７（癌、大細胞肺癌、胸水）、
および以下の２種の結腸細胞系：
ＣＲＬ−２１５９（癌、盲腸、デュークＢ（Ｄｕｋｅｓ’ Ｂ））
ＣＣＬ−２５０
でも実施した。
【０２１３】
新鮮な生検正常肺組織（Ｌｕ（ｕｃｌ）、Ｌｕ（ＩＶＧ））および肺腫瘍組織（ＬｕＴｕｍ）も対照として実施した。
【０２１４】
結腸直腸生検および正常組織のＲＴ−ＰＣＲ結果を図１、２、３および４、ならびに表１に示す。細胞系のＲＴ−ＰＣＲ結果を図５に示す。
【０２１５】
【表１】
2004506441.tif 000004
【０２１６】
表１、図１、２、３および４は、Ｃｒｉｐｔｏは正常な成人組織内に限界的に発現されるが、大多数の結腸直腸腫瘍において高度に過剰発現され、過剰発現率は１０倍を上回ることを明らかに示す。さらに、図５は、Ｃｒｉｐｔｏが肺腫瘍細胞系（ＣＲＬ−５８１５）で著しく過剰発現されることを示す。従って、Ｃｒｉｐｔｏ腫瘍関連抗原は、結腸直腸癌および肺癌の両方の患者を治療するための好適なワクチン候補である。
【０２１７】
実施例２：肺腫瘍細胞系からのＣｒｉｐｔｏ−１ ｃ−ＤＮＡのクローニング
全ＲＮＡを、ＴｒｉＰｕｒｅ試薬を用いて、７種の異なる肺細胞系の１０７培養細胞から抽出した（細胞系の完全なリストについては第１節を参照）。全ＲＮＡをプールして、ｍＲＮＡをプールした全ＲＮＡから、オリゴ−ｄ（Ｔ）磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）上で精製した。ｃＤＮＡ合成用に２５０ ｎｇのｍＲＮＡを使用した。ｍＲＮＡの定量は、分光蛍光分析（ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ， ＢｉｏＲａｄ）により、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて実施した。ｃＤＮＡは、全長転写物のみの増幅を確実にするＧｅｎｅＲａｃｅｒ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って合成した。ｍＲＮＡをＣＩＰを用いて処理した。ｍＲＮＡ５’末端を、ＴＡＰ（タバコ酸ピロホスファターゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））を用いて脱キャップ（ｄｅｃａｐｐｅｄ）し、特異的ＲＮＡオリゴヌクレオチドと連結した。連結したｍＲＮＡを、オリゴｄ（Ｔ）テール（ｔａｉｌｅｄ）プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡの増幅は、両方のＧｅｎｅＲａｃｅｒフランキングプライマー（Ａｄｖａｎｔａｇｅ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。Ｃｒｉｐｔｏ増幅は１０ ｎｇのＧｅｎｅＲａｃｅｒ ｃＤＮＡで、遺伝子特異的ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー配列：ＣＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴ、配列番号９；およびリバースプライマー配列：ＴＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡ、配列番号１０）を用いて実施した。ＰＣＲ反応はＡｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて標準条件下で行った。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。増幅配列（配列番号９５）は、コドン２２（配列番号９６）において天然バージョン（配列番号６）のＶａｌ（ＧＴＣ）の代わりにＡｌａ（ＧＣＣ）である変異を提示することが示された。天然バージョンはＰＣＲ突然変異誘発によって回復した。
【０２１８】
実施例３：動物モデルにおけるＣｒｉｐｔｏ腫瘍関連抗原の免疫原性
本発明の抗原の免疫原性は、ウサギおよびマウスを様々な免疫感作の手段を用いて免疫感作することにより実証できる。実際、ペプチドまたは組換えタンパク質のいずれかのＣｒｉｐｔｏ型を用いる免疫感作は、Ｃｒｉｐｔｏに対する特異的抗体の生成を伴う体液性免疫応答を誘導するおよび／またはＣｒｉｐｔｏ特異的細胞性免疫応答を誘導することができた。例えば、ＣｒｉｐｔｏもしくはＣｒｉｐｔｏ断片をコードする適当なベクター中の裸のＤＮＡ、ＣｒｉｐｔｏもしくはＣｒｉｐｔｏ断片をコードするウイルスベクターにより送達したＣｒｉｐｔｏ遺伝子を用いる、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ送達も、Ｃｒｉｐｔｏ免疫原性を実証するのに有用であることができた。
【０２１９】
３．１：合成ペプチド免疫感作
ウサギを免疫感作するために選択したヒトＣｒｉｐｔｏ−１アミノ酸配列由来の合成ペプチドは、ＧＨＱＥＦＡＲＰＳＲＧＹＬ（１３アミノ酸、配列番号１１）、およびＱＥＥＰＡＩＲＰＲＳＳＱＲＶＰＰＭＧ（１８アミノ酸、配列番号１２）である。次いで合成ペプチドを担体タンパク質（ＫＬＨ）とコンジュゲートする。コンジュゲートをフロイント・アジュバントを用いて製剤化し、そして２匹のウサギをそれぞれのコンジュゲートを用いて免疫感作する。第２回の免疫感作の４週間後および第３回の免疫感作の４週間後に、血液サンプルを採取する。血清中の抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体力価をＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロットによって標準プロトコルに従い評価する（第３．５節を参照）。
【０２２０】
３．２：核酸免疫感作
ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてワクチン接種プラスミドを構築する。ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳されたタンパク質の分泌を促進するために、従って本発明の抗原に対する体液性応答を誘導するために、Ｃｒｉｐｔｏ−１をコードする核酸配列をそれ自身のシグナルペプチドとともに、ベクターのポリクローニング部位に挿入する。該組換え発現プラスミドを用いて、ＢＬ２１などの宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を形質転換する。
【０２２１】
上記組換え株を通常の細胞培養培地で増殖する。細菌を、定常期に到達する前に回収する。マウスに注射するために、Ｑｕｉａｇｅｎシステムを用いてプラスミド調製を行う。
【０２２２】
６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに、組換え発現プラスミドの筋内注射を行う。最終注射の２週間後に、血液サンプルを採取する。本発明の抗原に対して誘発された特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロットにより測定する（第３．５節を参照）。
【０２２３】
３．３：アデノウイルスを用いるウイルスベクター免疫感作
組換えアデノウイルスは、コードされた抗原に対する体液性および細胞性免疫応答を誘発できるので、効果的な遺伝子に基づくワクチン接種用ベクターである。Ｃｒｉｐｔｏ−１タンパク質をそれ自身のシグナル配列とともにコードするヌクレオチド配列を適当なアデノ誘導体ウイルスベクターに挿入することができた。アデノウイルス組換えベクターをマウスに様々な経路（筋内、鼻腔内、皮内、皮下または腹腔内）によって投与することができた。２週間後に、血液サンプルを採取し、誘発された抗体の力価を試験することができた。細胞性免疫応答を測定する追加の実験も実施することができた。
【０２２４】
３．４：組換えタンパク質免疫感作
３．４．１：Ｃｒｉｐｔｏ−１組換えタンパク質の発現および精製
微生物宿主における発現を利用して、免疫感作目的のための本発明の抗原の全タンパク質または断片を産生する。組換えタンパク質は、２つの微生物宿主、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母（サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）に発現することができる。これによって、この特定の抗原産生のための最良の特性をもつ発現系の選択が可能になる。
【０２２５】
発現ストラテジーは、最初に組換え抗原の一次構造の設計を含む。一般的に、発現のレベルを改良する発現融合パートナー（ＥＦＰ）および／または抗原の免疫原性特性をモジュレートする免疫融合パートナー（ＩＦＰ）が、Ｎ末端に配置される。さらに、さらなる精製を容易にするのに有用な親和性融合パートナー（ＡＦＰ）がＣ末端に含まれる。
【０２２６】
組換え株を利用できるときは、発現レベルの評価および遺伝子工学的に操作したタンパク質のさらなる溶解度の予測（粗抽出物の挙動分析による）によって、組換え産物を特性付ける。
【０２２７】
適当な培地中における増殖および組換えタンパク質発現の誘導後に、全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。組換えタンパク質を染色したゲルで可視化し、ウェスタンブロット分析により、ウサギにおけるペプチド免疫感作によって生成した特異的抗ペプチド抗体を用いて同定する（第３．１節を参照）。
【０２２８】
発現した抗原と発現宿主の様々なバージョンを比較評価することにより、さらなる精製およびさらなる免疫学的評価に使用するのに最も期待できる候補と宿主の選択が可能になるだろう。
【０２２９】
精製スキームは、組換えタンパク質のヒスチジン親和性テール（ｔａｉｌ）の存在に基づく古典的手法に従う。典型的な実験においては、破壊した細胞を濾過し、そして無細胞抽出物を、組換えタンパク質を特異的に保持しうるイオン金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ；ＱｉａｇｅｎからのＮｉ＋＋ＮＴＡ）上にローディングする。保持されたタンパク質は、リン酸バッファー中で０〜５００ｍＭイミダゾール勾配（可能であれば界面活性剤の存在で）によって溶出する。
【０２３０】
３．４．２：タンパク質免疫感作
ウサギを、アジュバント３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１で製剤化した組換え精製タンパク質を用いて、数週の間隔で数回、筋内に免疫感作する。各免疫感作の３週間後に、血液サンプルを採取する。血清中の抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより評価する。生成した抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の特異性を、ウェスタンブロット（第３．５節を参照）により、精製タンパク質を用いかつ適当な対照を含めて試験する。
【０２３１】
３．５：Ｃｒｉｐｔｏで免疫感作した動物の免疫学的応答アッセイ
Ｃｒｉｐｔｏ免疫感作に対する体液性応答は、動物血清中のＣｒｉｐｔｏ特異的抗体力価をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを用いて測定することにより評価する。Ｃｒｉｐｔｏ−１に由来するペプチドまたは全長タンパク質を有する次の物質をそのような試験に利用することができた：
Ｃｒｉｐｔｏ合成ペプチド（可能なペプチドについては第３．１節を参照）、または
Ｃｒｉｐｔｏ発現細胞系の培養物から得たペプチド抽出物（可能な細胞系については第１節を参照）、または
一過性でＣｒｉｐｔｏ組換えプラスミドを発現するように遺伝子工学的に操作したＣＯＳ細胞の溶解物（以下を参照）、または
組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母株のタンパク質抽出物（組換え株生成については第３．３．１節を参照）、または
精製組換え抗原（抗原精製については第３．３．１節を参照）。
【０２３２】
ＣＯＳ細胞中のＣｒｉｐｔｏの一過性発現は、核酸ワクチン接種用に調製した組換えｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを用いてＣＯＳ細胞を一過的にトランスフェクトすることにより得られる（第３．２節を参照）。
【０２３３】
ＥＬＩＳＡ反応のために、上記抗原の１つをマイクロタイタープレート上にコーティングする（精製組換えタンパク質が好ましい）。次いでＥＬＩＳＡを標準プロトコルを用いて実施する。
【０２３４】
ウェスタンブロットは標準条件下で上記抗原の１つを用いて実施する（精製組換えタンパク質が好ましく、合成ペプチドは使用しない）
細胞性応答はまた、ワクチン接種したマウス脾臓細胞を、そのマウスを免疫感作するのに用いたペプチドを用いて、または全抗原配列を含む抗原に由来する重複ペプチドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激することにより評価してもよい。
【０２３５】
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ初回抗原刺激による、存在するＣｒｉｐｔｏ特異的ヒトＴ細胞の実証
Ｃｒｉｐｔｏ−１の免疫学的関連性は、さらにヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ初回抗原刺激によって確認することができる。全てのＴ細胞リンパ球、Ｔ細胞系および樹状細胞は、健康な供与者または癌患者（好ましい供与者はＨＬＡ−Ａ２亜型からである）のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から誘導する。
【０２３６】
ＨＬＡ対立遺伝子のエピトープ結合性予測：
ＨＬＡクラスＩ結合性ペプチド配列（９量体、１０量体）は、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）のアルゴリズム［Ｐａｒｋｅｒ Ｋら １９９４］（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）、およびラメンゼー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）法［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら １９９７］［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら １９９５］（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／Ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐＰｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍ）のいずれかによって予測される。
【０２３７】
ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチド配列（９量体）は、Ｔエピトープアルゴリズム［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら １９９９］を用いて予測される。
【０２３８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答：
ＣＤ８＋Ｔ細胞系を産生させる２つのストラテジー：ペプチドに基づく手法および全遺伝子に基づく手法を利用する。両手法は正しいリーディングフレーム内の目的の全長ｃＤＮＡを必要とし、これを適当な送達系にクローニングしかつＨＬＡ結合性ペプチドの配列を予測するために使う。
【０２３９】
ペプチドに基づく手法：
この手法では、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスモデルを用いてＨＬＡ−Ａ２．１ペプチドをスクリーニングする。簡単に説明すると、トランスジェニックマウスをアジュバント化した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ＨＬＡ−Ａ２ペプチドを用いて免疫感作し、ＣＤ８応答を誘導しうるペプチド（効率的溶解またはペプチドパルス標的細胞上のｇ−ＩＦＮ産生によって定義する）をヒト系においてさらに分析する。
【０２４０】
ヒト樹状細胞（［Ｒｏｍａｎｉら］に従って培養した）を選択したペプチドを用いてパルスし、これを用いてＣＤ８＋で選別したＴ細胞（Ｆａｃｓにより）を刺激する。数週間刺激の後、ＣＤ８＋系を最初にペプチドパルスした自己ＢＬＣＬ（ＥＢＶ−Ｂで形質転換した細胞系）について試験する。ペプチドの正しいｉｎ ｖｉｖｏプロセシングを実証するため、次いでＣＤ８＋系をｃＤＮＡトランスフェクトした腫瘍細胞（ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクトしたＬｎＣａＰ、Ｓｋｏｖ３またはＣＡＭＡ腫瘍細胞）について試験する。
【０２４１】
全遺伝子に基づく手法：
ＣＤ８＋Ｔ細胞系を初回抗原刺激し、そして遺伝子銃でトランスフェクトした樹状細胞、レトロウイルスにより形質導入したＢ７．１でトランスフェクトした繊維芽細胞、組換えポックスウイルス［Ｋｉｍら］またはアデノウイルス［Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄら］で感染した樹状細胞のいずれかを用いて刺激する。ウイルス感染細胞は、抗原が高レベルで発現されるので非常に効率的に抗原性ペプチドを提示するが、ウイルスＴ細胞系の過剰増殖を避けるために１回だけしか使用できない。
【０２４２】
交互に刺激した後に、ＣＤ８＋系を、上記に示したようにｃＤＮＡでトランスフェクトした腫瘍細胞について試験する。ペプチド特異性および同一性を決定して本発明の抗原の免疫学的確証を確認する。
【０２４３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞応答：
同様に、またＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答も評価することができる。特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成は、組換え精製タンパク質またはペプチドを搭載する樹状細胞を用いてＴ細胞を刺激することで行われる。
【０２４４】
結果：
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【０２４５】
実施例５：Ｃｒｉｐｔｏワクチンにより誘導される体液性応答の抗腫瘍潜在性
癌におけるＣｒｉｐｔｏの病態生理学的活性に与えるＣｒｉｐｔｏ特異的体液性応答の抑制効果を評価することに向けられた一連の実験は、様々な標準ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを利用して実施できた。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、制限されるものでないが、増殖抑制アッセイ、細胞運動性抑制アッセイ、化学走性抑制アッセイ、細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）を通じた浸潤の抑制、および増殖シグナル伝達経路抑制であることができた。Ｃｒｉｐｔｏペプチドもしくはタンパク質を含むアジュバントを用いて、またはＣｒｉｐｔｏタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡもしくはウイルス送達系、例えばアデノウイルスベクターを用いて免疫感作した動物の血清の効果は、Ｃｒｉｐｔｏ発現細胞系に対するＣｒｉｐｔｏが介在する生物学的効果を測定するこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで評価することができた。平行して、前記動物から得た免疫前の血清の効果を陰性対照として試験しうる。これらのアッセイに用いる細胞系は、限定されるものでないが、ＧＥＯ細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＣＲＬ−５８１５細胞系などのＣｒｉｐｔｏを発現するヒト腫瘍細胞または天然にＣｒｉｐｔｏを過剰発現するマウス腫瘍細胞系であることができた。例えば、ＧＥＯおよびＮＴＥＲＡ２細胞の両方のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の抑制は、以前にＣｒｉｐｔｏ ｍＲＮＡの翻訳を防止するように設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理により実証されている［Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら， １９９６；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら， １９９４；Ａｌｐｅｒら，２０００］。
【０２４６】
５．１：免疫感作プロトコル：
マウスまたはウサギを、０、１４、および２１日目に、ペプチドもしくはタンパク質を含むアジュバントのフットパッド内（ｉｎｔｒａ−ｆｏｏｔｐａｄ）注射、遺伝子銃装置を用いるＣｒｉｐｔｏをコードするプラスミドＤＮＡの皮内注射、またはＣｒｉｐｔｏをコードするウイルスベクター送達系、例えばアデノウイルスベクターの皮内注射によって免疫感作しうる。
【０２４７】
５．２：細胞増殖抑制アッセイ：
免疫感作した動物から得た血清を回収し、様々な希釈度で、９６ウエルプレートにプレーティングした細胞の培地に加えうる。同様に、これらの動物の免疫前血清も細胞に陰性対照として加えうる。細胞を３〜７日間処理するだろう。細胞増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴアッセイ、クリスタルバイオレット染色、または軟寒天培地中の増殖に対するコロニー計数などの標準方法によって測定するだろう。
【０２４８】
５．３：細胞浸潤、運動性および化学走性抑制アッセイ：
血清を免疫感作した動物から免疫感作前および後に回収し、様々な希釈度で、浸潤、運動性および化学走性標準アッセイに使用する細胞懸濁液に加えうる。Ｃｒｉｐｔｏが介在する浸潤、運動性および化学走性の抑制は、例えば、限定されるものでないが、市販のマトリゲル挿入物を備えたＦａｌｃｏｎチャンバー（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、アガロース液滴運動性アッセイ［Ｙａｍａｍｏｔｏら， １９９０］、および市販のＢｏｙｄｅｎ装置（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）を、それぞれ利用して評価することができた。
【０２４９】
５．４：シグナル伝達抑制アッセイ：
血清を免疫感作した動物から免疫感作前および後に回収し、様々な希釈度で、培養中のＣｒｉｐｔｏ発現腫瘍細胞に加えうる。次いで、ＥＬＩＳＡにより検出したＣｒｉｐｔｏの最高濃度［Ｂｉａｎｃｏら， ２００１］を含有する外因性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質またはヒト血清またはミルクを細胞の培地に加えうる。様々なインキュベーション時間後に、細胞を回収して標準法によって処理して免疫ブロット分析を実施しうる。細胞増殖に関わる様々な重要なシグナル伝達経路のリン酸化状態は、免疫前または後の血清の存在のもとでのこれらのＣｒｉｐｔｏで刺激した細胞において評価しうる。例えば、ｅｒｂ Ｂ−４およびＥＲＫ１、ＥＲＫ−２、およびＰ３８などのマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼファミリーのチロシンリン酸化状態は、これらの酵素のリン酸化した活性型を認識する抗体を用いる免疫ブロットによって先に記載のように評価しうる［Ｂｉａｎｃｏら， １９９９；Ｐａｉｎｅら， ２０００］。
【０２５０】
実施例６：動物モデルにおけるＣｒｉｐｔｏワクチンにより誘導される免疫応答のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ヒトＣｒｉｐｔｏタンパク質、Ｃｒｉｐｔｏペプチド、またはＣｒｉｐｔｏ遺伝子を含有するワクチンの予防または治療潜在性は、Ｃｒｉｐｔｏを発現する同系マウス腫瘍細胞系を用いてチャレンジしたマウスにおいて評価することができる。腫瘍細胞系は、ヒトＣｒｉｐｔｏ遺伝子を用いてトランスフェクトしたマウス腫瘍細胞系であることができた。例えば、トランスフェクトした細胞系はヒトＣｒｉｐｔｏ遺伝子を用いてトランスフェクトしたＴＣ１細胞系であることができた。他方、ヒトＣｒｉｐｔｏとそのマウス相同体との間の高い相同性レベルは、ヒトワクチンにより誘導される交差反応性免疫応答がマウスＣｒｉｐｔｏ発現腫瘍に対して防御しうることを示唆する。実際、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子（ＴＤＧＦ−１）は１７１個のアミノ酸タンパク質をコードし、そのヒト対応物と９３％同一性を有する［Ｌｉｇｕｏｒｉら， １９９６］。従って、マウスを、ヒトＣｒｉｐｔｏワクチンを用いる免疫感作により、マウス腫瘍チャレンジまたは内因的にＣｒｉｐｔｏタンパク質を過剰発現することが知られる自発的に生じる腫瘍から防御できた。この点について、またＭＭＴＶ−ポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ｍｉｄｄｌｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＭＴＶ−ｃ−ＥｒｂＢ２、およびＭＴ−ｈＴＧＦαなどの複数の異なる発癌遺伝子を過剰発現するように設計されたトランスジェニックマウスの自発性腫瘍も、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現することが示されている［Ｋｅｎｎｅｙら， １９９６；Ｎｉｅｍｅｙｅｒら， １９９９］。
【０２５１】
あるいは、同系遺伝子を用いてワクチン接種する目的で、腫瘍をもつマウスを、プラスミドＤＮＡまたはウイルス送達系、例えばマウスＣｒｉｐｔｏタンパク質をコードするアデノウイルスベクターを用いてワクチン接種し、マウス腫瘍増殖から防御することができた。
【０２５２】
６．１：予防実験設計：
マウスを、腫瘍チャレンジ前、０および１４日目に、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質５μｇを含むアジュバントのフットパッド内注射、遺伝子銃技術を用いるＣｒｉｐｔｏをコードするＤＮＡプラスミドの皮内注射、またはＣｒｉｐｔｏをコードするウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターの皮内注射によってワクチン接種できた。次いで、１０６個のＴＣ１−ＣＲ−１細胞、ヒトＣｒｉｐｔｏ発現腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスの脇腹の皮下に、ワクチン接種の１または２週間後に注射できた。腫瘍チャレンジ後数週間にわたって、毎週２回、個々の腫瘍を測定して、腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏでモニターしなければならない。
【０２５３】
他方、予防ワクチン接種の有効性は、明白な腫瘍発生前にいずれかの形態のＣｒｉｐｔｏワクチンを用いて複数回免疫感作したトランスジェニックマウス［Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、１９９９］における自発性のＣｒｉｐｔｏを発現する腫瘍の発生を抑制することによって評価することができた。
【０２５４】
６．２：治療実験設計：
１０６個のＴＣ１−ＣＲ−１細胞、ヒトＣｒｉｐｔｏ発現腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスの脇腹の皮下に注射できた。マウスを、腫瘍チャレンジ後、７および１４日目にＣｒｉｐｔｏタンパク質５μｇを含むアジュバントのフットパッド内注射、遺伝子銃技術を用いるＣｒｉｐｔｏをコードするＤＮＡプラスミドの皮内注射、またはＣｒｉｐｔｏをコードするウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターの皮内注射によってワクチン接種することができた。腫瘍増殖を、ｉｎ ｖｉｖｏで毎週２回、個々の腫瘍を測定して、モニターしなければならない。第２回目の免疫感作の１〜４週間後に、１群当たり複数のマウスを犠牲にして脾臓細胞、排出（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節および血清を回収し、免疫応答を分析してＣｒｉｐｔｏ特異的免疫応答の誘導と抗腫瘍効果との間の相関を確立するだろう。免疫感作により誘導されるＣｒｉｐｔｏ特異的免疫応答の分析は、Ｃｒｉｐｔｏ発現標的細胞に対するサイトカイン産生および溶解活性を含む、抗体力価、抗体アイソタイプのプロフィール、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答およびＣＴＬ ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定することによって評価できた。全てのアッセイは標準プロトコルに従って実施できた。
【０２５５】
同種の実験は、親マウスを、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する移植可能なマウス乳腺腫瘍系を用いてチャレンジすることによって実施できた。これらの細胞は、ＭＭＴＶ−ポリオーマウイルスミドルＴ抗原、ＭＭＴＶ−ｃ−ＥｒｂＢ２、およびＭＴ−ｈＴＧＦαトランスジェニックマウスなどの様々な発癌遺伝子トランスジェニックマウス株に生じる自発性腫瘍から確立できた。
【０２５６】
参考文献
Ａｌｐｅｒ Ｏ， Ｄｅ Ｓａｎｔｉｓ ＭＬ， Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ Ｋ， Ｈａｃｋｅｒ ＮＦ， Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ ＹＳ， Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ （２０００） 「上皮増殖因子受容体発現のアンチセンス抑制は、卵巣癌細胞における細胞増殖、細胞接着および腫瘍原性を改変する（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｃｅｌｌ−ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）」 Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８８： ５６６−５７４
Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ Ｇ， Ｂｉａｎｃｏ Ｃ， Ｔｏｒｔｏｒａ Ｇ， Ｒｕｇｇｉｅｒｏ Ａ， Ｍｏａｓｓｅｒ Ｍ， Ｄｍｉｔｒｏｖｓｋｙ Ｅ， Ｂｉａｎｃｏ ＡＲ， Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ Ｆ （１９９６） 「ＣＲＩＰＴＯアンチセンスプラスミドを用いるトランスフェクションは、内因性ＣＲＩＰＴＯ発現を抑制しかつヒト胚性癌細胞系における形質転換を阻害する（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＣＲＩＰＴＯ ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＲＩＰＴＯ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」 Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６６： ５３８−５４３
Ｂｉａｎｃｏ Ｃ， Ｋａｎｎａｎ Ｓ， Ｄｅ Ｓａｎｔｉｓ Ｍ， Ｓｅｎｏ Ｍ， Ｔａｎｇ ＣＫ， Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌａｃａｃｉ Ｉ， Ｋｉｍ Ｎ， Ｗａｌｌａｃｅ−Ｊｏｎｅｓ Ｂ， Ｌｉｐｐｍａｎ ＭＥ， Ｅｂｅｒｔ ＡＤ， Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ Ｃ， Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ （１９９９） 「Ｃｒｉｐｔｏ−１は新規受容体を通してｅｒｂ Ｂ−４のチロシンリン酸化を間接的に刺激する（Ｃｒｉｐｔｏ−１ ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｂ Ｂ−４ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４： ８６２４−８６２９
Ｂｉａｎｃｏ Ｃ， Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ Ｃ， Ｅｂｅｒｔ Ａ， Ｋｈａｎ ＮＩ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ （２００１） 「ヒト乳汁中のＣｒｉｐｔｏ−１の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｉｐｔｏ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ）」Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ ６６： １−７
Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ＬＨ， Ｊｉｌａｎｉ ＳＭ， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ＮＧ， Ｂｕｉ ＬＡ， Ｒｉｂａｓ Ａ， Ｄｉｓｓｅｔｔｅ ＶＢ， Ｌａｕ Ｒ， Ｇａｍｒａｄｔ ＳＣ， Ｇｌａｓｐｙ ＪＡ， ＭｃＢｒｉｄｅ ＷＨ， Ｍｕｋｈｅｒｊｉ Ｂ， Ｅｃｏｎｏｍｏｕ ＪＳ． （１９９８） 「ＭＡＲＴ−１アデノウイルスを用いて形質導入した樹状細胞による黒色腫特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＭＡＲＴ−１ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１： ５６０７−１３
Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ Ｆ， Ｔｏｒｔｏｒａ Ｇ， Ｂｉａｎｃｏ Ｃ， Ｓｅｌｖａｍ ＭＰ， Ｂａｓｏｌｏ Ｆ， Ｆｏｎｔａｎｉｎｉ Ｇ， Ｐａｃｉｆｉｃｏ Ｆ， Ｎｏｒｍａｎｎｏ Ｎ， Ｂｒａｎｄｔ Ｒ， Ｐｅｒｓｉｃｏ ＭＧ （１９９４） 「アンチセンスＲＮＡとオリゴデオキシヌクレオチドによる、ヒト結腸癌細胞中のＣＲＩＰＴＯ発現および腫瘍原性の抑制（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＰＴＯ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９： ２９１−２９８
Ｋｅｎｎｅｙ ＮＪ， Ｓｍｉｔｈ ＧＨ， Ｍａｒｏｕｌａｋｏｕ ＩＧ， Ｇｒｅｅｎ ＪＨ， Ｍｕｌｌｅｒ ＷＪ， Ｃａｌｌａｈａｎ Ｒ， Ｓａｌｏｍｏｎ ＤＳ， Ｄｉｃｋｓｏｎ ＲＢ （１９９６） 「トランスジェニックマウス由来の乳腺腫瘍中のアンフィレギュリンおよびＣｒｉｐｔｏ−１の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ ａｎｄ Ｃｒｉｐｔｏ−１ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」 Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ １５： ４４−５６
Ｋｉｍ ＣＪ， Ｐｒｅｖｅｔｔｅ Ｔ， Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｊ， Ｏｖｅｒｗｉｊｋ Ｗ， Ｒｏｄｅｎ Ｍ， Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ， Ｍａｒｉｎｃｏｌａ ＦＭ． （１９９７） 「ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａをコードするポックスウイルスに感染した樹状細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴリンパ球を感作する（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：２７６−２８６
Ｌｉｇｕｏｒｉ Ｇ， Ｔｕｃｃｉ Ｍ， Ｍｏｎｔｕｏｒｉ Ｎ， Ｄｏｎｏ Ｒ， Ｌａｇｏ ＣＴ， Ｐａｃｉｆｉｃｏ Ｆ， Ａｒｍｅｎａｎｔｅ Ｆ， Ｐｅｒｓｉｃｏ ＭＧ （１９９６） 「マウスＴｄｇｆ１遺伝子およびＴｄｇｆ偽遺伝子の特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｔｄｇｆ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｔｄｇｆ ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅｓ）」 Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ ７： ３４４−３４８
Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ＣＣ， Ｓｐｅｎｃｅｒ−Ｄｅｎｅ Ｂ， Ｗｕ ＪＸ， Ａｄａｍｓｏｎ ＥＤ （１９９９） 「新生物発生前の乳腺腫瘍マーカー：Ｃｒｉｐｔｏおよびアンフィレギュリンはトランスジェニックマウスにおける腫瘍進行の過形成段階に過剰発現する（Ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ： Ｃｒｉｐｔｏ ａｎｄ Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ ａｒｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」 Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８１： ５８８−５９１
Ｐａｉｎｅ Ｅ， Ｐａｌｍａｎｔｉｅｒ Ｒ， Ａｋｉｙａｍａ ＳＫ， Ｏｌｄｅｎ Ｋ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＤ （２０００） 「アラキドン酸はマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ２を活性化し、ヒト乳癌細胞系のコラーゲン型ＩＶとの接着にｐ３８ ＭＡＰキナーゼ依存経路を通して介在する（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＡＰ） ｋｉｎａｓｅ− ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｏ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＶ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ− ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）」 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５： １１２８４−１１２９０
Ｐａｒｋｅｒ Ｋ， Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ， Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ （１９９４）． 「潜在的ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドを個々のペプチド側鎖の独立結合性に基づいて格付けするためのスキーム（Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｒａｎｋｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＨＬＡ−Ａ２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ）」 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ， Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ （１９９７）． 「ＭＨＣリガンドとペプチドモチーフ（ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ）」 Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ， Ｆｒｉｅｄｅ， Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ （１９９５）． 「ＭＨＣリガンドとペプチドモチーフ：第１リスト（ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ： １ｓｔ ｌｉｓｔｉｎｇ）」 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１， １７８−２２８
Ｒｏｍａｎｉ Ｎ， Ｇｒｕｎｅｒ Ｓ， Ｂｒａｎｇ Ｄ， Ｋａｍｐｇｅｎ Ｅ， Ｌｅｎｚ Ａ， Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒ Ｂ， Ｋｏｎｗａｌｉｎｋａ Ｇ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＰＯ， Ｓｔｅｉｎｍａｎ ＲＭ， Ｓｃｈｕｌｅｒ Ｇ． （１９９４） 「ヒト血液中の樹状細胞前駆細胞の増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ）」 Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８０：８３−９３
Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ， Ｂｏｎｏ Ｅ， Ｄｉｎｇ Ｊ， Ｒａｄｄｒｉｚｚａｎｉ Ｌ， Ｔｕｅｒｅｃｉ Ｏ， Ｓａｈｉｎ Ｕ， Ｂｒａｘｅｎｔｈａｌｅｒ Ｍ， Ｇａｌｌａｚｚｉ Ｆ， Ｐｒｏｔｔｉ ＭＰ， Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ， Ｈａｍｍｅｒ Ｊ． （１９９９） 「ＤＮＡマイクロアレイと仮想ＨＬＡクラスＩＩマトリックスを用いる、組織特異的および無差別ＨＬＡリガンドデータベースの作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ＨＬＡ ｌｉｇａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｎｄ ｖｉｒｔｕａｌ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍａｔｒｉｃｅｓ）」 Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７： ５５５−６１
Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｖａｒａｎｉ Ｊ， Ｓｏｏｎｇ ＨＫ， Ｌｉｃｈｔｅｒ ＰＲ （１９９０） 「５−フルオロウラシルおよびマイトマイシンＣの培養ウサギ結膜下繊維芽細胞に与える効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｎｄ ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｂｂｉｔ ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）」 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ９７： １２０４−１２１０
配列指標の簡単な説明
配列番号１：Ｃｒｉｐｔｏ １ ポリヌクレオチド
配列番号２：Ｃｒｉｐｔｏ ３ ポリヌクレオチド
配列番号２：Ｃｒｉｐｔｏ ３ ポリペプチド１
配列番号３：Ｃｒｉｐｔｏ １ ポリペプチド
配列番号４：Ｃｒｉｐｔｏ ３ ポリペプチド
配列番号５：米国特許第５６５４１４０号に記載のＣｒｉｐｔｏポリヌクレオチド
配列番号６：米国特許第５６５４１４０号に記載のＣｒｉｐｔｏポリヌクレオチド
配列番号７〜１０：ＰＣＲプライマー
配列番号１１および１２：合成Ｃｒｉｐｔｏ １ペプチド
配列番号１３〜９４：Ｃｒｉｐｔｏ １および３由来のエピトープ
配列番号９５：Ｃｒｉｐｔｏ １変異体ポリヌクレオチド
配列番号９６：Ｃｒｉｐｔｏ １変異体ポリペプチド
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】大腸癌患者のＣｒｉｐｔｏのＲＴ−ＰＣＲ発現分析、Ｓｙｂｒｌ検出（Ｔは腫瘍結腸、Ｎは照合した正常組織）を示す図である。
【図２】大腸癌患者のＣｒｉｐｔｏのＲＴ−ＰＣＲ発現分析、ＴａｑＭａｎ検出（Ｔは腫瘍結腸、Ｎは照合した正常組織）を示す図である。
【図３】正常組織のパネルにおけるＣｒｉｐｔｏのＲＴ−ＰＣＲ発現分析、Ｓｕｂｒｌ検出を示す図である。
【図４】正常組織のパネルにおけるＣｒｉｐｔｏのＲＴ−ＰＣＲ発現分析、ＴａｑＭａｎ検出を示す図である。
【図５】細胞系のパネルにおけるＣｒｉｐｔｏのＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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