(57)【要約】【課題】本発明は、患者のＴ細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。【解決手段】この方法は、少なくとも１つおよび／または２つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。キメラタンパク質はそれぞれ、Ｔ細胞媒介性病態の患者由来の特定のＴ細胞のＴＣＲのＶαまたはＶβ領域のいずれかの少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域を含有する。Ｖαおよび／またはＶβ領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を単離し発現ベクターに挿入する。キメラタンパク質はその発現ベクターを昆虫細胞系統に導入することにより調製される。キメラタンパク質は抗体アフィニティーカラムを使用して精製され、次いで免疫学的担体キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）と化学的に会合させる。会合体はＴ細胞媒介性病態の患者由来の特定のＴ細胞から特異的に調製されたキメラタンパク質を含有しているので、それを顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦなどのサイトカインまたはケモカインと、またはそれ無しで投与すると、このようなＴ細胞媒介性病態を改変するための免疫応答を誘導させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のＴ細胞媒介性病態を改変する方法であって、
Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲに関連するＴＣＲのＶβまたはＶα領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物を投与し、
それにより患者におけるＴ細胞媒介性病態を改変させる、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
該組成物がさらに、ＴＣＲのＶαまたはＶβ領域の少なくとも一部、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第２のキメラタンパク質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫グロブリン定常領域がヒトＩｇＧγ１定常領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
キメラタンパク質のＶαまたはＶβ領域がＶβである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
キメラタンパク質のＶαまたはＶβ領域がＶαである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
キメラタンパク質がさらに、ＶαまたはＶβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、ＴＣＲのＣβまたはＣα領域の一部であってＣβまたはＣα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第２のキメラタンパク質がさらに、ＶαまたはＶβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、ＴＣＲのＣβまたはＣα領域の一部であってＣβまたはＣα領域の全ての領域でない第２のリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
第１のキメラタンパク質のＴＣＲのＶαまたはＶβ領域がＶβであり、第２のキメラタンパク質のＴＣＲのＶαまたはＶβ領域がＶαである、請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
第２の免疫グロブリン定常領域がヒトκまたはλ定常領域を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
ＴＣＲのＶβ領域が全Ｖβ領域である、請求項１または２記載の方法。
【請求項１１】
Ｖβ領域が全Ｖβ領域を含み、Ｃβの一部がＴＣＲ β鎖定常領域（Ｃβ）由来の最初の９個のアミノ酸を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項１２】
ＴＣＲのＶα領域が全Ｖα領域である、請求項１または２記載の方法。
【請求項１３】
Ｖα領域が全Ｖα領域を含み、リンカー領域が、ＴＣＲ α鎖定常領域（Ｃα）由来の最初の９個のアミノ酸を含む、請求項６または７記載の方法。
【請求項１４】
第１または第２の免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項１または２記載の方法。
【請求項１５】
該キメラタンパク質が、
Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲのＶβまたはＶα領域をコードする遺伝子を単離し、
ＴＣＲのＶβまたはＶα領域をコードする該遺伝子、リンカー領域および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、該第１のキメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、
得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入し、キメラタンパク質を産生させ、そして
得られたキメラタンパク質を単離する、ことにより調製される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ＴＣＲのＶβまたはＶα領域のいずれかをコードする遺伝子、リンカー領域および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をコードする遺伝子を、該発現ベクターに挿入し、第２のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１または第２のキメラタンパク質のリンカー領域が、ＴＣＲのＣβまたはＣα領域の一部であってＣβまたはＣα領域の全ての領域でない、または合成リンカー領域である請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
キメラタンパク質を担体タンパク質に会合させる工程をさらに含む、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１９】
担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
組成物をさらに、サイトカインまたはケモカインと同時投与する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
サイトカインが顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ケモカインが単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
バキュロウイルス発現ベクターがミツバチメリチン分泌シグナル配列およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
バキュロウイルス発現ベクターが、ミツバチメリチンを制御するバキュロウイルスＡｃＮＰＶ ｐ１０プロモーター、およびヒト胎盤アルカリホスファターゼを制御するＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターをさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＴＣＲのＶβ領域をコードする遺伝子および第１の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいて該ｐ１０プロモーターにより制御され、そしてＴＣＲのＶα領域をコードする遺伝子および第２の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいてポリヘドリンプロモーターにより制御されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＴＣＲのＶβまたはＶα領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいて、該ｐ１０プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターのいずれかにより制御されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
第１の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がヒトＩｇＧγ１遺伝子を含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
第２の免疫グロブリン定常領域がヒトκまたはλ定常領域遺伝子を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項３１】
第１のキメラタンパク質がＴＣＲ Ｖβ−Ｃβ−ＩｇＧγ１、ＴＣＲ Ｖα−Ｃα−κまたはＴＣＲ Ｖα−λである、請求項１５記載の方法。
【請求項３２】
第１および第２のキメラタンパク質がＴＣＲ Ｖβ−Ｃβ−ＩｇＧγ１およびＴＣＲ Ｖα−Ｃα−κまたはＴＣＲ Ｖβ−Ｃβ−ＩｇＧγ１およびＴＣＲ Ｖα−Ｃα−λである、請求項１６記載の方法。
【請求項３３】
昆虫細胞系統がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ （Ｈｉ−５）またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９）細胞系統である、請求項１３記載の方法。
【請求項３４】
キメラタンパク質の発現をＥＬＩＳＡにより分析する、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項３５】
キメラタンパク質を、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬおよび、免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質のなかから選ばれるタンパク質を用いて単離する、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項３６】
免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質が抗−免疫グロブリン抗体である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞媒介性病態がＴ細胞リンパ腫である、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞媒介性病態が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、炎症性大腸疾患、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよび甲状腺炎のなかから選ばれる自己免疫疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
患者のＴ細胞媒介性病態を改変するための組成物であって、Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞クローン由来の特定のＴＣＲに関連するＶβまたはＶα領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物。
【請求項４０】
キメラタンパク質がさらに、ＶαまたはＶβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、ＴＣＲのＣβまたはＣα領域の一部であってＣβまたはＣα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞クローン由来の特定のＴＣＲに関連するＴＣＲのＶβまたはＶα領域の少なくとも一部、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第２のキメラタンパク質、をさらに含有する、請求項３９記載の組成物。
【請求項４２】
キメラタンパク質がさらに、ＶαまたはＶβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、ＴＣＲのＣβまたはＣα領域の一部であってＣβまたはＣα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項４０記載の組成物。
【請求項４３】
キメラタンパク質が請求項１３または１４の方法により調製される、請求項３９または４０記載の組成物。
【請求項４４】
免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項３９または４０記載の組成物。
【請求項４５】
免疫グロブリン定常領域が、ＴＣＲのＶβ領域と作動可能に連結されたＩｇＧγ１定常領域を含む、請求項３９記載の組成物。
【請求項４６】
免疫グロブリン定常領域が、ＴＣＲのＶα領域と作動可能に連結されたκまたはλ定常領域を含む、請求項３９記載の組成物。
【請求項４７】
２つのキメラタンパク質がＶβ−ＩｇＧγ１およびＶα−κまたはＶβ−ＩｇＧγ１およびＶα−λである、請求項４０記載の組成物。
【請求項４８】
担体タンパク質をさらに含有する、請求項３９または４０記載の組成物。
【請求項４９】
担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
サイトカインまたはケモカインとともに同時に投与される、請求項３９または４０記載の組成物。
【請求項５１】
サイトカインが顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦである、請求項５０記載の組成物。
【請求項５２】
ケモカインが単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）である、請求項５０記載の組成物。
【請求項５３】
免疫療法剤をさらに含む、請求項３９または４０記載の組成物。
【請求項５４】
Ｔ細胞媒介性病態がＴ細胞リンパ腫である、請求項３９記載の組成物。
【請求項５５】
Ｔ細胞媒介性病態が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、炎症性大腸疾患、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよび甲状腺炎のなかから選ばれる自己免疫疾患である、請求項３９記載の組成物。
【請求項５６】
注射、吸入、経口または経皮的に投与される、請求項３９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、「イディオタイプワクチンの調製方法」と題する米国仮出願番号６０／２２４，７２３、「組換え免疫グロブリンを調製するための発現ベクター」と題する米国仮出願番号６０／２２４，７２２、および「Ｔ細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物」と題する米国仮出願番号６０／２６６，１３３の優先権を主張する。
【０００２】
【技術分野】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はＴ細胞媒介性病態、例えばＴ細胞悪性腫瘍および／または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
【０００３】
【発明の背景】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はＴ細胞媒介性病態、例えばＴ細胞悪性腫瘍および／または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
免疫系は抗体媒介性および細胞媒介性の応答を生じさせる。それぞれのタイプの免疫応答は、Ｂ細胞（抗体性応答）およびＴ細胞（細胞性応答）のリンパ球の型によって調節されている。Ｔ細胞は、特定の外来タンパク質（抗原）と、その一部が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連する場合に主として抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介して結合し、抗原提示細胞では抗原が断片にまで消化されてそのＭＨＣと結合するＡＰＣの表面に提示される。
【０００４】
Ｔ細胞リンパ腫は、免疫系を機能傷害におとしめるＴ細胞複製の不良を原因とするＴ細胞媒介性病態である。Ｔ細胞リンパ腫は、現在の治療法では有効に処置するのが困難であり、さらなる治療上のストラテジーが医師のさらなる手段として望まれる。
【０００５】
他のＴ細胞媒介性病態には、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が含まれる。Ｔ細胞は免疫系の最初の調節物質の１つであり、このような自己免疫病態に対して直接的または間接的に作用する。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病が挙げられる。これら自己免疫疾患の現在の処置は治療するのでなく、症状に対処するのみである。
【０００６】
現在、これらのおよび他の自己免疫疾患には、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）がＭＨＣ／自己抗原（または非自己抗原）複合体と結合することにより刺激されたＴヘルパー細胞の作用が関与していることが知られている。自己免疫疾患の可能性ある処置として、ＭＨＣ／抗原複合体とＴＣＲとの相互作用を妨害することが提案されている。
【０００７】
殆どのＴリンパ球の表面に見出されるＴＣＲは、αおよびβ鎖を最も普通に含むヘテロ二量体の一体化（インテグラル）膜タンパク質である。ＴＣＲの全体三次元構造は、αおよびβ鎖がそれぞれ抗原認識に関与するアミノ末端可変（Ｖ）領域および細胞内部への認識事象をシグナリングするのに重要なカルボキシ末端定常（Ｃ）領域を含む点において、Ｂ細胞上の細胞表面関連免疫グロブリン（Ｉｇ）と類似している。β鎖は、多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメントによってコードされている付加的なアミノ酸をさらに含む。これらのＶ、Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントは離れて位置し、染色体上その配座は分離している。Ｖβ、Ｄβ、ＪβおよびＣβ遺伝子セグメントは再構成され、β鎖をコードする機能的な転写単位が創製される。機能的なα鎖転写単位は、Ｖα、ＪαおよびＣαセグメントの再構成によって形成される。Ｖα、ＪαおよびＣα遺伝子セグメントおよびＶβ、Ｄβ、ＪβおよびＣβ遺伝子セグメントの、リンパ球クローンにおけるこのユニークな再構成により、特定のリンパ球においてのみ見出されるユニークなタンパク質決定基、イディオタイプ（Ｉｄ）が生じる。
【０００８】
ＴＣＲ分子を免疫グロブリン分子と区別する重要な相違が存在する。免疫グロブリンは一般に、Ｂ細胞抗原レセプターまたは分泌型分子としてのリガンドを液相において認識し、他方ＴＣＲは、他の細胞表面に存在するＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子と関連しているタンパク質抗原由来のペプチド断片としてのリガンドのみを認識する。さらに、免疫グロブリンとは異なり、ＴＣＲ ｍＲＮＡの選択的スプライシングは分泌型ＴＣＲ鎖を生じるために起こらず、従ってＴＣＲ分子はＴ細胞の表面上の一体化膜タンパク質としてのみ存在する。最後に、Ｔ細胞が抗原認識の後に活性化されれば、ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントの超変異は起こらず、これは、全体変異を受けてリガンドに対する親和性を増大させる、Ｂ細胞における免疫グロブリンのＶ遺伝子セグメントと対照的である。
【０００９】
自己免疫疾患の膨大な研究により、現在、Ｔ細胞およびその発現ＴＣＲ鎖は他のＴ細胞による免疫調節の標的となり得ることが多く報告されている（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ： Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＨＬＡ−ＤＲ−２ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＡＶ ａｎｄ ＢＶ ＣＤＲ２ ｌｏｏｐｓ，” Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０：５７−８３， ２０００）。ＴＣＲ鎖のペプチド断片は酵素学的にプロセッシングされた後、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子とともに活性化Ｔ細胞の表面に提示されると、現在考えられている。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、活性化された後のＴ細胞上にのみ見出され、最近の証拠は、ＴＣＲペプチドの提示は、活性化の後にその発現が増大されるＭＨＣクラスＩ分子を介して起こることを示している（Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：１７７−１８４， １９９５； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：１８５−９４， １９９５）。このＭＨＣ／ＴＣＲペプチド複合体は、ＭＨＣクラスＩ拘束自己ＣＤ８＋およびＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の形態で自己調節免疫を誘導する。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の準備段階において選択されたＴＣＲペプチドワクチンの免疫調節性が報告されている（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７：５０７−１０， １９９７）。さらに、全ＴＣＲ鎖はＴ細胞上にクローン的に分配されるので（Ｂ細胞のクローンにおける免疫グロブリンのように）、無傷の機能的ＴＣＲはＴ細胞リンパ腫にとっての可能性ある腫瘍特異的抗原としての候補である。無傷のＴＣＲを抗原として使用する不利益のひとつは、αおよびβ鎖の定常領域に対する免疫応答が惹起されることに由来し得る合併症である。
【００１０】
ＴＣＲ鎖に特異的な免疫調節性細胞性応答は、ＴＣＲ鎖の可変領域の決定基をコードするする生殖系列に対し、明らかに攻撃する。ＴＣＲ鎖はＩｇ分子のように変異を受けないので、包括的ＴＣＲ鎖を治療目的で使うことが動物実験の証拠によって示唆された。細菌にて調製された分泌型ＴＣＲβ鎖（Ｋｕｍａｒ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５１５０−５６， １９９７）、ＴＣＲβ鎖を発現するワクシニアウイルス構築物（Ｃｈｕｎｄｒｕ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６；４９４０−４５， １９９６）、または単一のＴＣＲβ鎖をコードする「裸の」ＤＮＡ構築物（Ｗａｉｓｍａｎ， Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ２：８９９−９０５， １９９６）によるワクチン接種はすべて、ＴＣＲβ鎖を免疫するための調節Ｔ細胞応答を誘導させた。
【００１１】
化学的性質が確定されたユニークなＴＣＲモチーフを基本とするペプチドワクチンがＴ細胞媒介性病態を処置する治療物質として使用され試験された。研究者のなかには、ＴＣＲ鎖のフレームワーク／ＣＤＲ領域誘導化ペプチドは、特定の疾患において過剰発現するＴＣＲ鎖から誘導されるペプチドで処置すると、その動物において自己免疫疾患の発現を予防できることを示したものがいる。これは、Ｔ細胞が自身の内生ＴＣＲ鎖をプロセッシングし、それを再度他のＴ細胞上に提示させてＴ細胞−Ｔ細胞相互作用を機能させ、病原細胞を調節できることを示している。しかし、ＴＣＲペプチド認識には、ＴＣＲ鎖がＭＨＣ分子とともに標的Ｔ細胞表面上に提示されるペプチド断片にプロセッシングされる必要があり、そのため特定のＴＣＲ由来のどのペプチドが臨床において有効であるかを前もって予測することは極めて困難である。これは、ＴＣＲペプチドに対するＭＨＣクラスＩＩ拘束応答を証明する近交系げっ歯類における生存試験によって証明されている （Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７：５０７−１０， １９９７， ｓｕｐｒａ）。従って、殆どのタンパク質同様、Ｖβ配列およびＭＨＣの両者によってどのエピトープがＴ細胞の刺激因子であるかが決定され、相当するＴＣＲペプチドがＶβアミノ酸配列内のどこに存在するのかを予測する明確な規則はない。この試みは、ヒト人口に存在するＭＨＣ多型の膨大さによってより複雑となっている。
【００１２】
ＴＣＲイディオタイプを調製しＴ細胞性免疫応答を調節するのは、ＴＣＲが一体化膜タンパク質であり普通は可溶性タンパク質として合成も分泌もされないため、困難である。従って、病原細胞、例えば腫瘍細胞からＴＣＲの充分量を、治療目的のため慣用的に精製するのは実際的でない。
【００１３】
大量の分泌型へテロ二量体ＴＣＲを調製する試みが昆虫細胞を用いてなされた。分泌型分子は全ＶαＪαＣα／ＶβＤβＪβＣβ細胞外ドメインを含み、コンホメーション的に特異的な抗−ＴＣＲ Ｖβ抗体による検出に基づいて、正しく折り畳まれていた。しかし、分泌型分子の産生レベルは低くなる場合がある。他の研究者は、同起源のパートナーＭＨＣ＋ペプチドを認識する機能的ＴＣＲを産する可溶性へテロ二量体構造を作成する一定の目的で、種々の方法を用いて組換えＴＣＲ鎖を調製した。
【００１４】
治療目的に幾つかの異なる方法によりＴＣＲの可溶性一部を調製する努力は別の顕著な問題をはらんでいた。その問題および関連する努力は次の通りである：（１）封入体として精製した後再折り畳みできる大腸菌における単一鎖Ｆｖ構築物の産生（Ｋｕｒｕｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９０：３８３０−３４， １９９４）、（２）細菌における組換えＴＣＲ分子の産生（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９；５１５０−５６， １９９７； Ｏｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：２１７８−８６， １９９８； Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ８８：８６４６−５０， １９９１）、（３）ＴＣＲ可変領域およびすべてまたは殆どすべてのＴＣＲ定常領域と、哺乳動物細胞から分泌し得るＩｇ定常領域との融合によって作成されるキメラ分子の産生（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８：８０７７−８１， １９９１； Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５６：７９３−９６， １９９２； Ｅｉｌａｔ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８９：６８７１−７５， １９９２）、（４）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣの作用により切断できるホスファチジルイノシトールグリカン結合を介して哺乳動物細胞の表面にＴＣＲの細胞質外ドメインを発現させること（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：６７７−７９， １９９０； Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１：１２６５４−５８， １９９４； Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５９：５５１６−２７， １９９７）、および（５）分泌型タンパク質として単一またはヘテロ二量体完全ＴＣＲ鎖を昆虫細胞において発現させること（Ｋａｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９１：８４６２−６６， １９９４）。これら細菌を利用する方法に付随する欠点は、確実なる可溶性と可能性あるエンドトキシン混入の問題であり、これらは細菌にて作成されるタンパク質の簡便な収獲と高い収量を不可能にする。哺乳動物細胞にて作成されるタンパク質では、ウイルス混入の問題がある。この問題は、リン脂質関連タンパク質を精製する際の困難性と相俟って複雑となり、上記方法の臨床使用の魅力を大幅に低下させる。
【００１５】
所望の結合特異性をコードする遺伝子を同定するには有用であるが治療応用には一般に有益でない大腸菌において抗体を産生させると、さらなる困難性に遭遇する。典型的には、抗体の抗原結合断片であるＦａｂまたはＦｖのみが細菌から分泌される（ｓｅｅ， ｅ．ｇ．， Ｋｕｒｕｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９０：３８３０−３４， １９９４）。全鎖の４量体ＩｇＧを大腸菌から産生させる稀な場合、抗体は不適切にグリコシル化される。適当なグリコシル化がなければ、抗体は、抗体指向性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の細胞融解活性や能動免疫療法を強力にする補体活性化を惹起させない。他方、哺乳動物発現系はグリコシル化された抗体を産生する。しかし、ＦＤＡの「考慮すべき点」のＣＢＥＲ部の最近の改変では、哺乳動物細胞の発現系において産生されるモノクローナル抗体に付随するウイルス混入への問題が明らかに警告されている。さらに、哺乳動物発現系にて産生された遺伝子操作抗体は極めて高価であると予想される （１回投与当たり＄１５００−＄５０００）。
【００１６】
バキュロウイルス発現系は、大腸菌および哺乳動物細胞における抗体産生の優れた代替系である。バキュロウイルス系によれば、生物学的に活性なタンパク質を真核生物細胞において高収量（１−１００ ｍｇ／Ｌ）で得ることが可能である（Ｈａｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８７：３９４２−４６， １９９０）。バキュロウイルス／昆虫細胞系では、組換えタンパク質が原核生物にて過剰発現する際にしばしば遭遇する可溶性の問題を回避できる。さらに、昆虫細胞は、真核生物細胞に存在する、正しい折り畳みに関与する翻訳後修飾機構、ジスルフィド形成、グリコシル化、β−ヒドロキシル化、脂肪酸アシル化、プレニル化、リン酸化およびアミド化を含んでいる。ヒト結腸直腸癌腫細胞を認識する機能的なグリコシル化モノクローナル抗体のバキュロウイルス系における産生が最近証明された（Ｎｅｓｂｉｔ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５１：２０１−２０８， １９９２）。このバキュロウイルス産生抗体はＡＤＣＣを媒介することが示された、これとは対照的に、細菌から産生される抗体はグリコシル化されず、よって検出可能なＡＤＣＣ活性は認められなかった。
【００１７】
幾つかの場合において、生物学的活性タンパク質の発現におけるバキュロウイルス系の利用性が、過剰なタンパク質分解的変性無しに組換えタンパク質を効率的に可溶化できないことから障害されている。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現の際に遭遇する可溶性およびタンパク質分解の問題を回避するため、バキュロウイルス移入ベクターが生物学的活性タンパク質の効率的分泌のために開発された。この宿主昆虫細胞から組みタンパク質を分泌させるベクターは、機能的分泌リーダー配列をポリヘドリンプロモーターの下流に挿入することにより構築される。ｃＤＮＡ配列のインフレーム挿入により、組換えタンパク質を分泌経路に置く異種シグナル配列を含むタンパク質が合成される。ヒトおよび昆虫リーダー配列はともに、昆虫細胞からの異種タンパク質の分泌を最大にするために試験された。ヒト胎盤アルカリホスファターゼシグナル配列（ＭＬＧＰＣＭＬＬＬＬＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳＬＧ （配列番号：１）；ＤＮＡ配列：ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＧＣ （配列番号：２））およびミツバチメリチンシグナル配列（ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号：３）；ＤＮＡ配列：ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＴＴＴ ＡＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＣＴ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＣＧ （配列番号：４））はともに、多くの細菌およびヒトタンパク質の分泌に有用であることが証明されている（Ｍｒｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３５２２−２８， １９９４およびＴｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９８：１７７−８３， １９９１）。
【００１８】
バキュロウイルス発現系を利用し、ＭｃＫｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８４：１７５５−６８， １９９６）は、マウスＩｇＧ１重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが連結したＴＣＲ鎖の細胞外ドメイン（Ｖα−ＣαおよびＶβ−Ｃβ）からなるキメラタンパク質の産生を可能にした。膵β細胞抗原に特異的なＴ細胞クローン由来の、得られた可溶化ＴＣＲ−ＩｇＧ１キメラタンパク質を使用し、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）雌性マウスを免疫した。交配後、これらマウスの子孫を、母方から移入された抗−ＴＣＲ抗体の糖尿病発現活性に対する効果について調べた。これらの試験により、可溶型で投与すると、ＴＣＲのαまたはβ鎖の可変領域は、誘導された系統のマウスにおいて免疫原性を示し得ることが証明された。これらの試験は、可溶性ＴＣＲ−ＩｇＧ１による免疫が天然のクローンタイプエピトープを認識する抗体の産生を刺激し得ることをさらに示している。ＭｃＫｅｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．は、比較的単純な発現および精製ストラテジーを使用し、すべてのαおよびβ鎖を含有する可溶性ＴＣＲ−ＩｇＧ１タンパク質であって、そのＴＣＲ一部がＴＣＲの機能的に活性な細胞表面型に見出されるものと交叉反応し免疫原性であるクローンタイプ決定を保持しているものを産生させることができると、明瞭に証明した。
【００１９】
他の幾人かの研究者も、Ｉｇ鎖との融合分子としてＴＣＲ分子を種々の方法により発現させている。しかし、これらすべての研究はＴＣＲの全構造を、即ち可変および定常領域の両者を、種々のＩｇ骨格の一部と融合するのに使用し、すべてが初期の目的にかなうＴＣＲ可変領域の認識機能を再生していた。さらに、種々の形態のＴＣｒ鎖が、自己免疫疾患を予防／処置するための動物実験においてワクチンとして使用できることが証明されている。例えばＯｋａｄａ ｅｔ ａｌ． （Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５９：５５１６−２７， １９９７）には、哺乳動物細胞から作成した可溶性ＴＣＲ鎖がマウスのＴ細胞腫瘍を処置するのに使用できることが示されている。しかし、上記のように、これらＴＣＲ分子の生産は困難であり、その産生レベルは低い。
さらに、ＴＣＲタンパク質を使用すると、獣医学の分野において治療的価値を有することが予測されている（ｓｅｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０９， ＷＯ ００／０６７３３， ｆｉｌｅｄ ２９ Ｊｕｌｙ １９９９）。
【００２０】
【発明の概要】
本発明は、患者のＴ細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。この方法は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも１つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、約３−約３０の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はＴＣＲ定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基を含み、そこまでのアミノ酸残基を含有する。この組成に使用されるＶβまたはＶα鎖はＴ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲと関連している。このような組成物を患者に投与した後、患者におけるＴ細胞媒介性病態は改変される。
【００２１】
本発明はさらに、２つの異なるキメラタンパク質を含む組成物を投与することによる、患者のＴ細胞媒介性病態を改変する方法をも提供する。それぞれのキメラタンパク質は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と連結されている、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部を有している。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６、または３０の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はＴＣＲ定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるＶβおよび／またはＶα鎖はＴ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲと関連している。
【００２２】
患者由来のユニークなＶαおよび／またはＶβ鎖を含有する特異的ＴＣＲタンパク質は治療用組成物として開発できる。慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定の糖尿病などの、自己免疫Ｔ細胞病態に関連するＴ細胞を、疑われる自己抗原を使用して選択的に刺激し、増殖させることができる。あるいは、自己免疫の攻撃を受けている組織から単離したＴ細胞を、Ｔ細胞成長因子、例えばＬ−２、ＩＬ−４などを使用して選択的に増殖できる。多発性硬化症に関連するＴ細胞は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ７６：１５−２８， １９９７）による方法保父によって特徴付けされている（引用により、その図面、数値および表のすべてが本明細書に包含される）。他のＴ細胞媒介性病態に関連するＴ細胞は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に記載されている方法を提供して特徴付けできる。少数の病原性Ｔ細胞を精製後、その細胞から発現されるＴ細胞レセプターの可変部分を本明細書に記載の方法によりＰＣＲを用いてクローニングすることができる。クローニングすると、Ｔ細胞病態に特異的に関連するレセプターのＶαおよび／またはＶβ部分を使用し、本明細書に記載のバキュロウイルス系にて発現できるキメラタンパク質を作成できる。
【００２３】
上記の組成物およびキメラタンパク質に使用される免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ重鎖、κおよびλ軽鎖のなかから選ばれるタンパク質の一部であることができる。ある態様では、キメラタンパク質は免疫グロブリン定常領域とともにＴＣＲのＶβまたはＶα鎖のいずれかのみを含有する。キメラタンパク質の例としては、Ｖβ−ＩｇＧγ１、Ｖα−κ、またはＶα−γ、またはＶα−ＩｇＧγ１、Ｖβ−κ、またはＶβ−λが挙げられる。別の態様の組成物は、免疫グロブリン定常領域とともにＴＣＲのＶβおよびＶα鎖をそれぞれ含む２つのキメラタンパク質を含有する。この例としては、Ｖβ−ＩｇＧγ１およびＶα−κ、またはＶβ−ＩｇＧγ１およびＶα−λ、またはＶα−ＩｇＧγ１およびＶβ−κ、またはＶα−ＩｇＧγ１およびＶβ−λが挙げられる。さらに特定の好ましい態様では、キメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。特定の好ましい態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６または３０の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。この例としては、Ｖβ−Ｃβ−ＩｇＧγ１およびＶα−Ｃα−κ、またはＶβ−Ｃβ−ＩｇＧγ１およびＶα−Ｃα−λ、またはＶα−Ｃα−ＩｇＧγ１およびＶβ−Ｃβ−κまたはＶα−Ｃα−ＩｇＧγ１およびＶβ−Ｃβ−λが挙げられる。
【００２４】
本発明はまた、組換えＤＮＡ技法および発現系を用いてキメラタンパク質を調製する方法を提供する。この方法は次の工程を含む：（ａ）Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲのＶβまたはＶα鎖をコードする遺伝子を単離し、（ｂ）ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、キメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、（ｃ）得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入して発現させ、キメラタンパク質を産生させ、そして（ｄ）得られたキメラタンパク質を単離する。キメラタンパク質の調製方法はさらに、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖のいずれかをコードする遺伝子および第２の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第２のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む。ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖をコードする単離した遺伝子はさらに、ＴＣＲ定常領域における約３０個以下の一部をさらに含むことができる。
【００２５】
本発明はさらに、患者のＴ細胞媒介性病態を改変するための組成物を提供する。この組成物は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも１つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、そのＴＣＲ鎖の定常領域における約３０アミノ酸残基以下の一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６、または３０個の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるＶβまたはＶα鎖はＴ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲと関連している。このような組成物はさらに、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する第２のキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、リンカー領域は約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６または３０の連続アミノ酸残基であるＴＣＲ定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるＴＣＲ定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。第２のキメラタンパク質の一部であるＶβまたはＶα鎖はＴ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲと関連している。
【００２６】
本発明の１つの態様では、組成物は、全Ｖβ領域および免疫グロブリンＩｇＧγ１のヒト定常領域を含む第１のキメラタンパク質（ＴＣＲ Ｖβ−ＩｇＧγ１）、および全Ｖαおよびヒトκまたはλ定常領域を含む第２のキメラタンパク質（ＴＣＲ Ｖα−κまたはＴＣＲ Ｖα−λ）の２つのキメラタンパク質を含む。他の好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者におけるリンカー領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６または３０の連続アミノ酸残基であるＴＣＲ定常領域の一部を含むことができる。
【００２７】
本発明の１つの態様では、組成物は、第１のキメラタンパク質が全Ｖβ領域、ＴＣＲβ鎖定常領域（Ｃβ）の３０アミノ酸残基以下の一部および免疫グロブリンＩｇＧγ１のヒト定常領域（ＴＣＲ Ｖβ−ＩｇＧγ１）を含む （ＴＣＲ ＶβＣβ（１−３０）−ＩｇＧγ１）、２つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、Ｃβの使用する一部は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６または３０の連続アミノ酸残基である。第２のキメラタンパク質は、全Ｖα、ＴＣＲα鎖定常領域（Ｃα）の３０アミノ酸残基以下の一部よびヒトκ定常領域を含有する（ＴＣＲ ＶαＣα（１−３０）−κ）。好ましい態様では、Ｃαの使用する一部は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６または３０の連続アミノ酸残基である。
【００２８】
本発明の別の態様では、組成物は、患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲのＶβまたはＶα鎖のいずれか、および免疫グロブリン定常領域を含有する単一のキメラタンパク質を含有する。この例としては、キメラタンパク質Ｖβ−ＩｇＧγ１、Ｖα−κ、またはＶα−λ、またはＶα−ＩｇＧγ１、Ｖβ−κ、またはＶβ−λが挙げられる。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるいずれかまたは両者のリンカー領域は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６、または３０の連続アミノ酸残基であるＴＣＲ定常領域の一部を含有できる。
【００２９】
本発明は１つの態様として、キメラタンパク質を発現するために使用される発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。このベクターは、プロモーター、分泌シグナル配列およびキメラタンパク質をそれぞれ有する２つの発現カセットを含む。１つの発現カセットは、ミツバチメリチン分泌シグナル配列と連結しているバキュロウイルスＡｃＮＰＶｐ１０プロモーターを含む。他の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列と連結しているポリヘドリンプロモーターを含む。このプロモーターおよびシグナル配列に加え、当業者に知られている他のプロモーターおよびシグナル配列をそれらに代替することができる。好ましい態様では、特定の患者由来の免疫グロブリン遺伝子に関連する内生分泌配列を使用する。ＴＣＲのＶβまたはＶα鎖、リンカー領域および免疫グロブリン定常領域の遺伝子を別個におよび／または一緒にバキュロウイルスベクターの上記発現カセットに挿入し、１つまたは２つのキメラタンパク質を発現させる。好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖の定常領域、例えばＩｇＧ１をＶβまたはＶα鎖のいずれかとともにポリヘドリンプロモーターによって制御する。
【００３０】
産生されたキメラタンパク質は抗−免疫グロブリンまたはＩｇ結合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖の定常領域に対するプロテインＡ、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変領域に対するプロテインＬ、および／または免疫グロブリン結合ドメインと結合する他のタンパク質などのアフィニティーカラムを用いて精製する。
【００３１】
本発明はさらに、キメラタンパク質とキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質との共有結合も包含する。本発明の組成物はまた、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦなどのサイトカイン、または単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）などのケモカインとともに投与することができる。キメラタンパク質を含有する本発明の組成物は、Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲに特異的に関連しているため、この組成物を投与すれば、特定のＶαまたはＶβセグメントが関与しているイディオタイプ特異的疾患に対する免疫応答を誘導する。ＶαまたはＶβセグメントなどのＴＣＲ Ｖ領域セグメントの拘束レパートリーを使用するＴ細胞が関与している自己免疫疾患に関連するＴ細胞に対する同様の応答がある。従って、本発明の組成物を投与すれば、患者のＴ細胞媒介性病態および／または自己免疫疾患が改変される。本発明組成物の投与経路には経口、吸入、注射、経皮的供給があるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書に引用するすべての米国特許および特許出願、外国特許および特許出願、科学雑誌、製本および刊行物は図面、数値および表を含みすべて、引用により本明細書に包含される。
【００３３】
【好ましい態様の詳しい説明】
本発明では、免疫系のユニークな特異性をＴ細胞悪性腫瘍および病態の処置に適用する。本発明では、Ｔ細胞レセプターの可変領域をコードするはＤＮＡ配列を、ユニークなＴＣＲ Ｖ遺伝子ファミリーそれぞれの５’末端由来のプライマー、およびＴＣＲ定常領域プライマーを用いてクローニングした。典型的には、この方法では、ＰＣＲなどの幾つかの適当なクローニング手法の１つを利用する。α鎖およびβ鎖に対するＴＣＲ定常領域プライマーを使用して可変領域にクローニングし、ＶαまたはＶβおよびＩｇＧγ１定常領域からなるキメラタンパク質を調製した。さらに、当業者ならば、この系において同等に使用し同等の結果を得るための種々のプライマーを選択し、簡便なサブクローニングのための抗体可変領域の対を増幅できる。あるいは、キメラタンパク質を調製する工程として、５’ＲＡＣＥなどの手法を用い、ＴＣＲ鎖の可変領域をクローニングできる。
【００３４】
このキメラタンパク質はバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞にて調製した。ＣαまたはＣβの全ドメインをすべて含まないで調製されるキメラタンパク質は、α鎖およびβ鎖がすべて存在するキメラＴＣＲ／Ｉｇ分子から区別できる。例えば、これらのキメラタンパク質は、ＴＣＲ可変領域に指向したコンホメーション特異的抗体、例えば抗−マウスＶβ６（ｃｌｏｎｅ ＲＲ４−７）および抗−マウスＶβ１２（ｃｌｏｎｅ ＭＲ １１−１）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａ．）によって認識されない。これらのユニークなキメラタンパク質は、治療を複雑にしかねない正常な決定基が存在せず、自己免疫反応を刺激しないので、ワクチン療法の優れた抗原として期待される。さらに、可溶性ＴＣＲキメラタンパク質を調製するこれまでの試みは、適当なペプチド／ＭＨＣ複合体に結合させるため、ＴＣＲの天然のコンホメーションに適合させたタンパク質を目的としていた。
【００３５】
本発明は、Ｔ細胞媒介性病態および自己免疫疾患の有効な処置に対する大きな要求を満たすものである。本発明は、Ｔ細胞媒介性病態に関与するＴ細胞表面に存在するユニークな細胞表面抗原（イディオタイプ）をうまく利用するものである。そのためには、患者特異的にワクチンを調製する必要がある。このようなワクチンは特定患者に見出される病原性Ｔ細胞にユニークなマーカーに対して加工されることにより、優れて選択的である。
【００３６】
本発明を特定の患者に対して加工するには、まず、ユニーク抗原を同定、単離し、次いでそのような抗原を調製する手段を探索する必要がある。抗原の調製は、当業者に利用可能な種々の多くの手法により行うことができる。例えば、最近開発された本発明の要求にかなう方法は、新規なバキュロウイルス／昆虫細胞発現系を利用し、これは最近、免疫療法のための機能的抗体を効率的に調製するために開発されたものである（ｓｅｅ Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ． ６０／２４４，７２２， ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”）。ヒトカッパ軽鎖またはＩｇＧ１重鎖を有するキメラタンパク質として簡便にサブクローニングし発現させるため、抗体可変領域の対を増幅するのに、２つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。重鎖および軽鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量の活性免疫グロブリンを昆虫細胞から発現させた。このようなベクターは、ヒトカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるカッパ軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびミツバチメリチン分泌シグナル配列に先行されるヒトＩｇＧ１定常ドメインとインフレームにある重鎖可変領域（ＶＨ）を発現させるのに有用である。モノクローナル細胞系統由来のまたはファージディスプレイクローニングにより同定されるマウスまたはヒトモノクローナル抗体がこのベクターにおいて、２つの単純なサブクローニング工程を経て、全ヒトＩｇＧｌ／κまたはＩｇＧｌ／κとして簡便に発現できる。
【００３７】
本発明では、融合Ｖα鎖、リンカーおよびＩｇＧ１重鎖として簡便にサブクローニングし発現させるため、ＴＣＲ可変領域の対を増幅するのに、２つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。ＶαおよびＶβ鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量のキメラタンパク質を昆虫細胞から発現させる。このようなベクターは、Ｉｇカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるＴＣＲα鎖可変領域（Ｖα）、およびヒトＩｇＧ１定常領域とインフレームにありミツバチメリチン分泌シグナル配列を介して分泌されるＴＣＲβ鎖可変領域（Ｖβ）（またはその逆）を発現させるのに有用である。
【００３８】
バキュロウイルス系を使用する組換えタンパク質の発現により、細菌でのタンパク質作成に付随する多くの欠点を伴うことなく、さらに哺乳動物使用に伴う煩雑さを回避して、大規模な生物学的活性タンパク質が生産できる。例えば、市販されているバキュロウイルスシグナルプロモーターベクター（ｐＶＬ１３９２）、または二次元プロモーターベクター（ｐＡｃＵＷ５１）（両者ともＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能）を使用し、単量体β鎖またはヘテロ二量体αβ対として血清不含培地により分泌ＴＣＲラット鎖を調製した。これらの鎖の存在は、抗−Ｃβ定常領域捕獲抗体（Ｒ７３， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗−Ｖβ検出抗体（Ｒ７８； ａｎｔｉ−ｒａｔ Ｖβ８．２またはＨＩＳ ４２； ａｎｔｉ−ｒａｔ Ｖβ１６， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いるＥＬＩＳＡにより、検出される。産生レベルは、およそ３００ｎｇ／ｍｌと測定された。ＴＣＲ鎖を作成し、天然のコンホメーションにて分泌させ、αおよびβ鎖を安定なジスルフィド結合へテロ二量体として形成させた（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ｓｕｐｒａ）。
【００３９】
特定のＶセグメントの特異的エピトープを含む可溶性ヒトＴＣＲ断片は、昆虫宿主細胞において遺伝子操作により調製できる。患者由来の特定のＶαおよび／またはＶβ鎖を含むこのような可溶性組換えＴＣＲタンパク質は治療用組成物に使用できる。患者に投与すれば、Ｔ細胞媒介性病態を改変するための細胞性免疫応答がインビボにおいて特異的に誘発されよう。
【００４０】
この手法はさらに、Ｂ細胞リンパ腫から発現される患者特異的なＶＨおよびＶＬ遺伝子の迅速な同定とクローニングに適用されており、次いでこれらを組換えＩＧｌ／κまたはλ分子として昆虫細胞において発現された（ｓｅｅ Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ． ６０／２２４，７２３ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ−Ｖａｃｃｉｎｅ”）。この方法により調製された分子は製剤化され、患者特異的にリンパ腫に対する抗−イディオタイプ細胞性免疫の誘発に使用された。
【００４１】
「改変」または「改変する」なる用語は、本発明化合物におけるＴ細胞媒介性病態の調整能力を意味する。Ｔ細胞媒介性病態を改変する化合物は、化合物に対する抗体応答を惹起させてＴ細胞病態の細胞を破壊する；
Ｔ細胞病態の細胞のアポトーシスを誘発する；
Ｔ細胞病態の細胞に対する細胞性免疫を誘発してＴ細胞病態の細胞の発育や分裂をさらに阻害する；あるいは病原性Ｔ細胞の活性を阻害する、などの多くの可能性ある機序によりそのように機能する。改変を起こす正確な機序は決定する必要はないが、Ｔ細胞媒介性病態の改変は本発明の分子または組成物を投与することによる何らかの機序により起こるのは確かである。
【００４２】
「Ｔ細胞媒介性病態」または「Ｔ細胞病態」なる用語は、Ｔ細胞の不適切な複製または活性により引き起こされる疾患および状態を意味する。好ましい態様では、本発明は、Ｔ細胞の不適切な複製によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫であるＴ細胞媒介性病態の処置に使用される。Ｔ細胞リンパ腫は現在利用可能な治療法では有効に処置するのが困難である。Ｔ細胞の不適切な複製が関与する他のタイプのＴ細胞病態には慢性および急性のＴ細胞白血病および菌状息肉腫が挙げられる。他の好ましい態様では、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病などの、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が挙げられる。これら自己免疫疾患を処置する現在の処置方法は疾患を治癒するのでなく、症状を処置するのみである。
【００４３】
「Ｔ細胞」なる用語は、生物の正常機能における細胞性免疫に関与する、生物の免疫系細胞（即ち、Ｔ細胞媒介性病態を経験していないもの）を意味する。
【００４４】
「病態」なる用語は、多くの医学領域により異常と認識されている生物（例えばヒト）の状態を意味する。本発明により処置される病態はＴ細胞の機能または複製の異常を特徴とする。
【００４５】
「患者」なる用語は、病態、より具体的にはＴ細胞病態の処置を必要とする生物を意味する。この用語は、臨床の場において治療物質による処置が必要であると示唆される特定の症状（群）を示す生体を意味する。処置は医学領域において一般に許容されている、または経験されるもののいずれであってもよい。好ましい態様では、患者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物である。さらに好ましい態様では、患者はヒトである。患者の診断は疾患の進行により自発的に、または治療方法や処置の経過とともに変化することがある。
【００４６】
「生物」なる用語は単細胞または多細胞であり得る。この用語は、哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。好ましい生物はマウスであり、それは、マウスでの処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。他の好ましい生物は霊長類であり、それは、霊長類での処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。
【００４７】
「キメラタンパク質」なる用語は、異なる少なくとも２つのタンパク質由来のセグメントを含む単一のポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味する。キメラタンパク質のセグメントは異種タンパク質から誘導されなければならず、即ち、キメラポリペプチドのすべてのセグメントが同じタンパク質由来ではない。本発明のキメラタンパク質は、ＴＣＲのαまたはβ鎖の一部を含有するが、αまたはβ鎖いずれかの全定常領域を含まない。
【００４８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」なる用語は本明細書では交換可能に使用している。
【００４９】
「セグメント」または「一部」なる用語は、誘導元の全長ポリペプチドよりも長さが短いキメラタンパク質の供給源として使用されるタンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドを示す用語として使用している。好ましい態様では、セグメントは少なくとも約１０、１５、２０、２１、２２、３０、４０、７０、１００、１５０、３００、または４５０アミノ酸長である。このようなセグメントは天然ポリペプチドの１つまたはそれ以上の特性を保持できると考えられる。このような保持される特性の例としては、天然ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的な抗体との結合性である。
【００５０】
「天然に」または「天然」なる用語は、天然から単離されているタンパク質を意味する。従って、天然に存在するタンパク質とは、それが天然にて見出される形態のタンパク質を意味すると定義できる。天然タンパク質は天然に見出されまたは合成されていてもよいタンパク質と定義できる。また、この用語は、本発明のバキュロウイルス系または親試料の細胞培養によるなどの生物系により産生されるタンパク質にも適用できる。天然タンパク質は変性されていない単離されたタンパク質とも定義できる。「天然」なる用語はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が単独でまたは他のポリペプチドとともに折り畳まれ、天然に見出される同様のタンパク質に類似する態様、あるいは翻訳後に修飾（翻訳後修飾）され、天然に見出される同様のタンパク質と類似する態様をも意味する。天然に存在するタンパク質が存在するのは、単一の患者由来の病原性Ｔ細胞においてのみであるが、いずれにせよ、これは天然に存在するタンパク質と考えられる。
【００５１】
「Ｖα」および「Ｖβ」なる用語は、ＴＣＲのポリペプチド鎖の可変領域またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。可変領域の正確な配列は予測できず、問題の配列を単離することにより決定しなければならない。しかし、ＴＣＲ遺伝子由来の可変領域の多重サブファミリーが同定され特徴付けされている（Ｓｅｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ｂｙ Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９５， ４２：４５５−５００， Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９５， ４２：５０１−５３０， およびＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９５， ４２：５３１−５４０）。これらＶαおよびＶβ領域のいずれかを本発明にて使用できる。α鎖の正確な配列はＴＣＲα鎖座のＶ領域、Ｊ領域およびＴＣＲα鎖座の定常領域のクローン的再構成により決定される。β鎖の正確な配列はＴＣＲβ鎖座のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常領域のクローン的再構成により決定される。「Ｖα」および「Ｖβ」なる用語はＶαまたはＶβ鎖の一部またはセグメントをも意味する。ＶαまたはＶβ鎖のセグメントはＶ領域の少なくとも３０アミノ酸を含む。ＶαまたはＶβ鎖のセグメントはＶ領域のすべてまたは実質的にすべてを含むこともできる。「実質的にすべて」なる用語は可変領域全体の約９０％または可変領域全体の約８０％を意味することができる。「Ｖα」および「Ｖβ」なる用語はまた、上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。「全Ｖα鎖（またはＶα鎖全体）」とはα鎖の可変領域のすべてを意味する。「全Ｖβ鎖（またはＶβ鎖全体）」とはβ鎖の可変領域のすべてを意味する。
【００５２】
「リンカー領域」または「リンカー」なる用語は可変領域をコードする配列を免疫グロブリン定常領域分子の一部をコードする配列と連結するＤＮＡセグメントを意味する。リンカー配列は通常のクローニングを可能にする合成配列であってよく、またはＴＣＲのＣαまたはＣβの一部であってよい。いずれの場合でも、キメラタンパク質においてリンカー領域は可変領域の一部と免疫グロブリン定常領域の一部との間のインフレームを妨害しない。「リンカー領域」なる用語はリンカー領域ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸をも含む。「合成リンカー領域」または「合成リンカー」なる用語はＴ細胞レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子以外の供給源から得られるリンカー領域を意味する。好ましい態様では、合成リンカーは研究者によって開発され、インビトロにおいて合成される。合成リンカーはキメラタンパク質におけるＴ細胞レセプターと免疫グロブリン遺伝子部分との解読枠を破壊しない配列を含む。リンカー領域がＴＣＲのＣαまたはＣβの一部を含む場合、定常領域の始めと免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基との間のアミノ酸の幾つかまたはそのすべてを含むことができる。
【００５３】
「Ｃα」および「Ｃβ」なる用語は、ＴＣＲのポリペプチド鎖の定常領域、またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。本発明において定常領域に言及する場合における「セグメント」または「一部」なる用語は、ＴＣＲの定常領域のすべてを含むとは限らず、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、１８、２２、２６、または３０の連続アミノ酸残基を含むことができる。１から約３０（両端を含む）の整数を含むあらゆる整数個のコドンがリンカー領域に存在できる。別の態様では、ＴＣＲの定常領域アミノ酸の約８０％までが存在できる。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の２２個のＣα鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトＴＣＲα鎖の代表的配列を図８に示す。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の３０個のＣβ鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトＴＣＲβ鎖の代表的配列を図８に示す。「Ｃα」および「Ｃβ」なる用語は上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。
【００５４】
「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞レセプター」なる用語は、２つのポリペプチド鎖、およびα鎖およびβ鎖を含むＴ細胞表面に見出されるポリペプチドを意味する。「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞レセプター」なる用語はまた、このポリペプチド鎖をコードする核酸をも意味する。Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ）に記載されているように、免疫系の正常な発達により、ＴＣＲはＤＮＡ再構成の作用に由来して膨大な配列の多様性を示す。特定のＴＣＲの正確な配列は予測できず、問題のＴＣＲをコードするする核酸またはその一部を配列決定することにより決定しなければならない。ＴＣＲの可能性ある配列は本発明に使用できる。
【００５５】
「免疫グロブリン定常領域」なる用語は、免疫グロブリンの可変領域によりコードされていない免疫グロブリン分子部分のすべてまたはその一部を意味する。「免疫グロブリン定常領域」なる用語はまた、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡ配列をも意味することができる。免疫グロブリン定常領域にはＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３セグメント、およびヒンジ領域が含まれる。免疫グロブリンタイプには、
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ重鎖、およびκまたはλ軽鎖またはそのセグメントが含まれる。好ましい態様では、重鎖および軽鎖定常領域は９Ｆ１２細胞から誘導される。免疫グロブリン定常領域セグメントは、それが例えばプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬまたは適当な抗体を介してキメラ分子を精製できる限り、あらゆるものを本発明に使用できる。上記の免疫グロブリン定常領域セグメントの機能的誘導体も使用できる。
【００５６】
「免疫グロブリン折り畳み」または「免疫グロブリンドメイン」なる用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーの構造要素を意味する。免疫グロブリンドメインは各々が、約１１０個のアミノ酸の保存された反復構造ドメインである。各ドメインでは、一般に４または３個のストランドの２つから整列されている７個の逆平行βストランド、および約６０個のアミノ酸のループを形成する鎖内ジスルフィド結合がある。２つのシートは一般に互いに向かい合い、疎水性アミノ酸が内部に、親水性アミノ酸が外部に向かう。
【００５７】
免疫グロブリンドメインは抗体、Ｔ細胞抗原レセプター、サイトカインレセプター（例えば５Ｉｇドメインを有する血小板誘導化成長因子レセプター）、細胞接着分子（例えばＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４）などの多くのタンパク質分子に見出される。２つの免疫グロブリンドメインがＴＣＲの各鎖に見出され、１つは可変領域に、１つは定常領域内にである。２つの免疫グロブリンドメインが抗体軽鎖に見出され、４つがＩｇＧ重鎖に見出される。
【００５８】
「カッパ定常領域」、「ラムダ定常領域」、「κ定常領域」および「λ定常領域」なる用語は、免疫系の発達過程で保存されてきたカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖の定常領域を意味する。これらの用語は、タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列のいずれかを意味できる。ある場合には、免疫グロブリン軽鎖は１つまたはそれ以上の他のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質に含まれていても良い。
【００５９】
「ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ」なる用語は、免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスを意味する。これらの用語は、タンパク質のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を意味できる。免疫グロブリン分子のクラスおよびサブクラスは重鎖によって決定される。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＤは免疫グロブリンの異なるクラスであり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は免疫グロブリン分子の異なるサブクラスである。「ＩｇＡ」なる用語はＩｇＡ分子のあらゆるサブクラスを意味できる。好ましい態様では、これはＩｇＡ１分子を意味する。別の好ましい態様では、これはＩｇＡ２分子を意味する。ある態様では、使用される免疫グロブリン重鎖第２のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質であってもよい。
【００６０】
「ＩｇＧγ１」なる用語は免疫グロブリンのＩｇＧ１クラスと関連する重鎖を意味する。ＩｇＧ１は、ヒトＩＧ免疫グロブリンの約６６％を代表する（Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｂｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， １９９３， ｐｇ．４．２）。
【００６１】
「投与」なる用語は、化合物を生物の細胞または組織とまたはその内部に接触させる方法に関連する。Ｔ細胞媒介性病態は、生物の細胞または組織が生物の内部または生物の外部に存在すると予防または処置できる。生物の外部に存在する細胞は細胞培養皿にて維持または生育できる。生物の内部に保持される細胞では、経口、腸管外、経皮、注射および吸入など（これらに限定されない）の化合物を投与するための多くの手法が当業者に知られている。化合物投与の生物機能に対する効果を次いでモニターすればよい。生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはヤギであり、より好ましくはサルまたは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００６２】
「組成物」なる用語は、目的のタンパク質を含む混合物を意味する。好ましい態様では、組成物は添加剤、安定化剤、賦形剤などの付加的な成分を含むことができる。
【００６３】
Ｔ細胞クローンとの関連において可変領域に対して使用される「関連する」なる用語は、特定のＴ細胞クローンによって産生される免疫グロブリンに見出される可変領域を意味する。
【００６４】
「Ｔ細胞クローン」なる用語は単一のＴ細胞のクローン的子孫を意味する。Ｔ細胞のクローン的子孫は産生されるＴＣＲにおいて親細胞と同じイディオタイプを発現する。当業者であれば、Ｔ細胞のクローン的子孫はＴＣＲ遺伝子内に体細胞性変異を受けることがあるが、Ｔ細胞クローンの部分は依然保持していることを理解できる。
【００６５】
「単離」なる用語は、天然に存在する核酸配列をその通常の細胞環境から取り出すことを意味する。従って、核酸配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がヌクレオチド鎖のみで存在することを意味せず、それに通常付随する非ヌクレオチド物質が実質的に含まれていない（少なくとも約９０−９５％純度）ことを意味しており、従ってこれは単離された染色体と区別される。さらに、核酸に関連して使用する「単離」なる用語は、目的の溶液に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡの画分における特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、その配列が取り出された細胞内よりも有意に高く増大（２−５倍）していることを意味する。これは、他の存在するＤＮＡまたはＲＮＡの量を優先的に減少させること、または特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他の核酸と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味しない。他の供給源由来のＤＮＡとは例えば、酵母または細菌ゲノム由来のＤＮＡ、またはｐＵＣ１９などのクローニングベクターなどである。この用語は、１つのｍＲＮＡレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増大し得るウイルス感染または腫瘍型増殖を区別する。即ち、この用語は、所望の核酸の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【００６６】
単離されたＤＮＡ配列は天然環境におけるよりも比較的純度が高い（天然レベルと比較し、そのレベルは例えばｍｇ／ｍｌ単位にて少なくとも２−５倍高い）。ＰＣＲによって得られる個々の配列は電気泳動的な均一にまで精製できる。ＰＣＲ反応によって得られるＤＮＡ分子は全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから得ることができる。これらのＤＮＡ配列は天然に存在していないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質（例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を操作することにより得られる。例えば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを構築するには、合成物質（ｃＤＮＡ）を作成し、ｃＤＮＡライブラリーを含む細胞からのクローン選択により合成ライブラリーから個々の精製ｃＤＮＡを単離すればよい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ構築および別個のｃＤＮＡクローンの単離を含むこの方法は、天然メッセージの約１０６倍の純度を与える。従って、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の純度が明示的に理解される。
【００６７】
「をコードする遺伝子」なる用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を意味する。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの分子であってもよい。好ましい態様では、この分子はＤＮＡ分子である。他の好ましい態様では、分子はＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子と存在する場合、翻訳を開始させるよう宿主細胞のリボゾームを駆動する配列（例えば開始コドンＡＴＧ）および翻訳を終止させるようリボゾームを駆動する配列（例えば終止コドン）を含む。開始コドンと終止コドンとの間には解読枠（ＯＲＥ）がある。当業者は、これらの意味に精通している。
【００６８】
「昆虫細胞系統」なる用語は、バキュロウイルスによって感染される昆虫由来の細胞系統を意味する。当業者はこのような細胞系統およびその利用に必要な技術に精通している。代表的な昆虫細胞系統の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９） および Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ−５）細胞系統である。
【００６９】
「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ−５）およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９）細胞」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターとともに使用される昆虫細胞系統である。当業者はこのような細胞系統およびその入手方法に精通している。
【００７０】
「アジュバント」なる用語は、選択した抗原または免疫原に対する動物における免疫応答を惹起させる場合に、選択した抗原または免疫原、例えば免疫応答を望むタンパク質またはポリペプチドとともに供給される、免疫応答を増大させるための物質である。当業者は選択および使用に適したアジュバントに精通している。ヒト使用が許可されているアジュバントにはアルミニウム塩およびＭＦ５９ （Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｇａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１０７５−８１， １９９９）がある。他のアジュバントも開発されており（前掲）、それらも本発明に使用できる。
【００７１】
「キーホールリンペットヘモシニアン」なる用語は、免疫反応において担体タンパク質として普通に使用されているカサガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔｓ）から単離されたタンパク質を意味する。当業者はキーホールリンペットヘモシニアンなる用語の意味に精通している。
【００７２】
「サイトカイン」なる用語は、主としてリンパ球から分泌される、普通は可溶性の（糖）タンパク質、成長因子ファミリーを意味する。サイトカインは体液性および細胞性免疫応答、および貪食細胞の活性化の両者を刺激する。サイトカインは、免疫系の種々の細胞型（リンホカイン、インターロイキン、モノカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン）のみならず、血液学の分野で研究されている他の細胞（コロニー刺激因子を産生）、腫瘍学（トランスホーミング成長因子を産生）および細胞生物学の分野の細胞（ペプチド成長因子、熱ショックおよび他のストレスタンパク質を産生）から合成され、保存され輸送される。
【００７３】
リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、単球またはマクロファージから分泌されるものはモノカインと呼ばれる。多くのリンホカインは白血球から分泌されるのみならず、白血球の細胞応答に影響を与え得るため、インターロイキン（ＩＬｓ）とも呼ばれる。具体的には、インターロイキンは造血器官の細胞を標的とする成長因子として機能する。
【００７４】
「成長因子」なる用語は、細胞表面のレセプターと結合した後、細胞増殖および／または分化を活性化するタンパク質を意味する。多くの成長因子は用途が極めて広く、種々の細胞型の細胞分化を刺激するように機能できるが、他のものは特定の細胞型に特異的である。
【００７５】
「ケモカイン」なる用語は、白血球の化学遊走物質および活性化物質として機能する炎症前の小さなサイトカインの一群であり、３０個以上の化学遊走性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインは、血液または骨髄由来の免疫系細胞を活性化し、それらを感染および障害組織へと移動させることを調和させる。ケモカインはまた、骨髄に見出される原始的幹細胞を成長および増殖する本質的な役割を果たし、それは成熟免疫細胞へと成長させる。ケモカインは広範な急性および炎症性疾患に関与し、７回膜貫通へリックスクラスのレセプターと結合することによりその作用を主として発揮する。
【００７６】
ケモカインは分子量８ から １１ ｋＤａであることが多く、１ から １００ ｎｇ／ｍｌの濃度で活性であり、広範な細胞型から産生される。ケモカインの産生は、外因性の刺激物質および内生伝達物質、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＰＤＧＦによって誘導される。ケモカインは特異的細胞表面レセプターに結合し、他のサイトカインの強力な誘導物質でなく、炎症および修復において比較的特殊な機能を果たすのみであるので、一次炎症前サイトカインよりも多面性が明らかに低い二次サイトカインと考えられる。
【００７７】
「顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子」または「ＧＭ−ＣＳＦ」なる用語は、小さな（２０ ｋＤａより小さい）分泌型タンパク質を意味する。これは特異的細胞表面レセプターに結合し、骨髄細胞の種特異的刺激物質として機能する。これは、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球などの幾つかの造血細胞系譜の成長および分化を刺激する。具体的には、このサイトカインはＴ細胞増殖を増大させ （Ｓａｎｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８， １４１（２）：５１９−２６）、顆粒球および単球における接着分子の発現を増大させ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４５（２）：６０７−１５； Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８６， ２３２（４７４９）：５０６−０８）、および抗原提示能を増大させ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７，１３９（４）：１１１３−９； Ｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９８８， １６７（２）：７００−０５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４４（５）：１７７７−８２）、細胞性免疫を形成する役割も果たす。
【００７８】
「単球走化性タンパク質３」または「ＭＣＲ３」なる用語は、単球から主として産生されるケモカインを意味する。ＭＣＲ−３は広範なスペクトラムの化学遊走活性を有し、単球、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、および好中球を引き付ける。このｃＤＮＡは１９９３年にＭｉｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ ４（２）：９９−１１０， １９９３， ａｎｄ Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．， １９１（２）：５３５−４２， １９９３によってクローニングされた。その性質は最近、Ｐｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． ５９（１）：６７−７４， １９９６によって綜説されている。
【００７９】
「発現ベクター」なる用語は、選択した目的遺伝子、通常はタンパク質が適切に挿入された場合、発現するよう作製されている組換えＤＮＡ構築物を意味する。当業者はこの用語を理解する。発現ベクターは普通、目的遺伝子を挿入する部位の５’末端にプロモーター、およびその部位の３’末端にターミネーター領域を含む。目的遺伝子は制限酵素切断部位を選択して適当な部位に挿入することが多い。「発現ベクター」なる用語は、目的産物をコードする目的遺伝子がすでに挿入されている上記のＤＮＡ構築物をも意味する。
【００８０】
「バキュロウイルス発現ベクター」なる用語は、選択した遺伝子がバキュロウイルス系に挿入された場合、発現するよう作製されているＤＮＡ構築物を意味する。本発明では、バキュロウイルス系で機能するよう作製された可能性あるバキュロウイルスまたは発現ベクターはあらゆるものを使用できる。同様に、「発現ベクター」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターの特定の態様を包含する用語であるが、「発現ベクター」は昆虫細胞系統だけではなく、それに加えて細胞および細胞系統において機能できる。
【００８１】
「発現できる（発現させる）」なる用語は、発現ベクターを、目的遺伝子が発現される環境に置くことを意味する。これは通常、プロモーターおよび他の遺伝子発現に必須の領域が宿主細胞成分によって認識され目的遺伝子を発現させる適当な細胞型に発現ベクターを挿入する意味である。発現は普通、転写および翻訳の２つの工程からなる。発現はまた、細胞由来の成分を用いてインビトロにて行うこともできる。当業者はそのような手法、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９）に記載されている技法に精通している。好ましい態様では、発現産物はタンパク質またはポリペプチドである。他の好ましい態様では、発現産物はＶβ／ＩｇＧγ１、Ｖβ／Ｃκ、Ｖβ／Ｃλ、Ｖα／Ｃκ、Ｖα／Ｃλ、またはＶα／ＩｇＧγ１である。
【００８２】
「分泌シグナル配列」なる用語は、ペプチド配列を意味する。この配列が選択したポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとしてインフレームにて翻訳されると、分泌シグナル配列は宿主細胞の機構と相互作用し選択ポリペプチドを分泌させる。分泌過程の部分では、この分泌シグナル配列は切断除去され、輸送後には目的のポリペプチドのみを残す。好ましい態様では、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を使用する。別の好ましい態様では、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を使用する。さらに好ましい態様では、特定の患者から誘導される免疫グロブリン遺伝子に付随する内生分泌配列を使用する。しかし、本発明はこれら分泌シグナル配列によって限定されず、当業者に周知の他の配列をこれらの代わりに、または付加的に使用できる。「分泌シグナル配列」なる用語はさらに、分泌ペプチドをコードする核酸配列をも意味する。
【００８３】
「ＥＬＩＳＡ」なる用語は、タンパク質の存在または濃度をＥＬＩＳＡ平板のプラスチックウエルとの結合性によって測定し、次いで定量または検出するタンパク質に特異的な抗体により検出を行う、「酵素結合免疫吸着アッセイ」を意味する。
【００８４】
「プロモーター制御」なる用語は、プロモーターが目的遺伝子の５’側に配置され、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ分子に転写させる、発現ベクターにおけるＤＮＡの配列を意味する。ｍＲＮＡ分子は次いで、宿主細胞の機構により翻訳される。当業者のこの用語に非常に精通している。
【００８５】
「プロテインＡ」、「プロテインＧ」、および「プロテインＬ」なる用語は、抗原結合部位と相互作用することなく、免疫グロブリン分子と特異的に結合できる特異的細菌タンパク質である。プロテインＡは免疫グロブリン分子のＦｃ領域と結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから単離されるポリペプチドである。プロテインＧは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する親和性を有する細菌細胞壁タンパク質であり、ヒト連鎖球菌株Ｇ（Ｇ１４８）から単離された。プロテインＬは嫌気性細菌Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓのある種の株から発現される免疫グロブリン軽鎖結合タンパク質である。
【００８６】
タンパク質またはポリペプチドに関して「単離」なる用語は、天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質をその正常な細胞環境から取り出すこと、または発現系（本明細書に記載のバキュロウイルス系）において合成されたポリペプチドまたはタンパク質を他の発現系成分から取り出すこと、を意味する。従って、この配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がアミノ酸鎖のみで存在することを意味せず、それに天然にて付随する非アミノ酸基本物質が実質的に含まれていない（少なくとも約９０−９５％純度）ことを意味している。
【００８７】
ポリペプチドに関連して「増大」なる用語は、特定のアミノ酸配列が正常または疾患細胞またはその配列が取り出された細胞内よりも、目的の溶液または細胞に存在する全アミノ酸配列が有意に高い（２−５倍）画分を意味する。これは、他の存在するアミノ酸配列の量を優先的に減少させること、または特異的アミノ酸配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。ここでの「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他のアミノ酸と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のアミノ酸配列が存在しないことを意味しない。他の供給源のアミノ酸とは例えば、酵母または細菌ゲノムまたはｐＵＣ１９などのクローニングベクターによってコードされるアミノ酸などである。好ましい態様では、アミノ酸配列は上記のキメラタンパク質である。この用語は、所望のアミノ酸配列の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【００８８】
アミノ酸配列は精製形態であることがある種の目的にとって有益である。ポリペプチドに関連して「精製」なる用語は、絶対的純度（均一調製物のような）を要せず、配列が天然環境よりも純粋であることを示すものである。天然のレベルに比較し、このレベルは（例えばｍｇ／ｍｌ単位にて）少なくとも２−５倍高い。精製は、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁であることが明示的に理解される。好ましくは、物質は、機能的に有意なレベル、例えば９０％、９０−９５ ％純度で混入が無いものである。
【００８９】
「作動可能に連結」なる用語は、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御領域が目的の連結ＤＮＡに結合されてその転写、そしてその翻訳を起こす、ＤＮＡの配列操作を意味する。「作動可能に連結」なる用語はさらに、分泌シグナル配列などのプロセッシングシグナルをコードするＤＮＡ配列をポリペプチドをコードする遺伝子と連結させ、単一の解読枠を形成させることをも意味する。転写および翻訳の後、分泌シグナル配列は翻訳ポリペプチドを外部輸送させることができる。当業者はこの用語の意味に精通している。
【００９０】
有用なキメラタンパク質の機能的誘導体
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体をも提供する。「機能的誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変異体」を意味し、これらの用語は以下に詳述する。機能的誘導体はタンパク質の機能の少なくとも一部、例えばタンパク質に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインを介する酵素活性または結合活性を保持しており、これらは本発明の機能的誘導体の有用性を保証する。当業者には、遺伝子コードの縮重により、多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできることが周知である。同様に、アミノ酸の保存的変化により、元の機能が保持されているタンパク質またはポリペプチドが得られることも周知である。両者ともに、すべての順列が本明細書に包含されるものである。
【００９１】
本発明には、本明細書に記載の単離された核酸分子の機能的等価物が包含される。遺伝子コードの縮重により、特定のコドンは同一アミノ酸を特定し同じタンパク質を与える他のコドンに置換できる。メチオニンおよびトリプトファンを除き、既知のアミノ酸は１つ以上のコドンによってコードされ得るので、核酸配列は実質的に変動し得る。従って、本発明の遺伝子の一部またはすべては、天然に見出される配列と有意に異なる核酸配列として合成することができる。しかし、コードされるそのアミノ酸配列は保存されている。
【００９２】
複合体の「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の部分ではない付加的な化学部分を含む。タンパク質またはペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。以下に説明するように、このような修飾は、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導化試薬とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、分子に導入できる。
【００９３】
最も普通には、システイン残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル ２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより誘導化される。
【００９４】
ヒスチジル残基は、ｐＨ ５．５−７．０においてジエチルプロカルボネートと反応させることにより、その試薬は比較的ヒスチジン側鎖に特異的であるので、誘導化される。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくは、ｐＨ ６．０において０．１Ｍ ナトリウム・カコヂレート中にて行う。
【００９５】
リジンアミノ酸末端残基はクエン酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬との誘導化により、リジン残基の効果またはその電荷が保存される。１級アミンを含有する残基を誘導化するための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート、プリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド（水素化クロロホウ素）、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応などである。
【００９６】
アルギニル残基は１つまたは幾つかの通常の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンの中から選ばれるものとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導化には、グアニジン官能基の高いｐＫａ故に、アルカリ条件において反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニンα−アミノ基と反応できる。
【００９７】
チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による分光学的標識を導入する修飾のための周知の標的である。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用し、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ調製する。
【００９８】
カルボキシ側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００９９】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になることが多い。あるいは、これらの基は温和な酸性条件下、脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【０１００】
二機能性試薬での誘導化は、例えば水不溶性支持マトリックスまたは他の高分子担体との複合体において、タンパク質のペプチド成分を互いに、または他のタンパク質と架橋させ際に有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二機能性イミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドなどである。メチル−３−［ｐ−アジドフェニル］ジチオールプロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下に架橋を形成できる光活性化中間体を与える。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物および反応性基質などの反応性水不溶性材料はＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ３，９６９，２８７； ３，６９１，０１６； ４，１９５，１２８； ４，２４７，６４２； ４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され、これらはタンパク質固定化に使用される。
【０１０１】
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化 （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ． ７９−８６ （１９８３））、Ｎ−末端アミノのアシル化などがあり、ある場合には、Ｃ−末端カルボキシ基のアミド化もある。
【０１０２】
このような誘導化部分は安定性、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善できる。これらの部分はまた、タンパク質複合体の望ましくない副作用を排除しまたは減じることができる。このような効果を媒介できる部分は例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９９０）に記載されている。
【０１０３】
アミノ酸残基が欠失、挿入および／または置換されたタンパク質の機能的誘導体は、当業者に周知の標準的手法により調製できる。例えば、機能的誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異手法（Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３， ＤＮＡ ２：１８３に例示）によって調製でき、ここでは配列をコードするＤＮＡのヌクレオチドを修飾し、修飾コード配列を修飾し、次いで既述の手法により原核生物または真核生物宿主細胞において得られた組換えＤＮＡを発現させる。あるいは、アミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するタンパク質は、当業者に周知の方法により直接化学合成によって常法により調製できる。タンパク質の機能的誘導体は通常、天然タンパク質と同じ質的生物活性を示す。
【０１０４】
「断片」なる用語は、タンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドであって、誘導される完全長のポリペプチドよりも長さが短いものを示す。例えば、このような断片は、完全長タンパク質をタンパク質分解的に切断することにより調製される。好ましくは、断片は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を適当に修飾し、天然配列のＣ末端、Ｎ末端および／または内部の１つまたはそれ以上の部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、組換え的に調製できる。このような断片は１つまたはそれ以上の特徴的部分、機能または天然タンパク質またはポリペプチドの特性を１つまたはそれ以上保持できる。このような保持される特性の例としては、触媒活性、基質特異性、無傷の細胞における他の分子との相互作用、調節機能、または天然複合体に特異的な抗体との結合性、またはそのエピトープなどがある。
【０１０５】
本発明に含まれる別の機能的誘導体は、天然ポリペプチドと比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失している、あるいは付加的なアミノ酸または置換アミノ酸を有する「変異体」ポリペプチドである。変異体は天然に存在する複合体成分から、配列をコードするタンパク質ＤＮＡを修飾し、天然配列のＣ末端、Ｎ末端および／または内部の１つまたはそれ以上の部位の１つまたはそれ以上のアミノ酸のコドンを付加、除去および／または修飾することにより適切に誘導できる。付加的アミノ酸の付加、置換、および／またはを有するこのような変異体は上記した天然タンパク質の１つまたはそれ以上の特徴部分を保持していると考えられる。
【０１０６】
本発明の他の態様は、本発明のキメラタンパク質の用途に関する。好ましい用途は、医薬および獣医薬適用であり、ここでは有効量の本発明キメラタンパク質（好ましくは本発明の組成物の形態で）を患者に投与する。このように、キメラタンパク質は患者の細胞と接触し、その接触は所望の生物学的応答を引き起こす。本発明のキメラタンパク質を使用する方法は、生物において免疫応答を引き起こす方法、生物において抗体を産生させる方法（Ｂ細胞免疫応答）、生物によりＴ細胞免疫応答を誘導する方法、およびＴ細胞病態を処置する方法を含む。本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質を投与することにより、Ｔ細胞媒介性病態を改変できる免疫応答を増大させるため、被験者を処置する方法をも含む。
【０１０７】
通常、このような方法は、生物に有効量の本発明キメラタンパク質を供給することにより行われる。「有効量」とは、所望の生物応答を惹起させる量を意味する。このような量を構成するものは、具体的キメラタンパク質、惹起させる所望の生物応答、キメラタンパク質の製剤、処置する生物の年齢、体重、性別および健康度、投与方法、処置または予防する疾患の状態など種々の因子によって変動する。本発明のキメラタンパク質および組成物を投与できる生物は哺乳動物であり、好ましくは哺乳動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類動物から選ばれる哺乳動物である。特に好ましい生物はヒトである。
【０１０８】
本明細書に記載の化合物はそのまま、または他の活性成分と混合して混合療法として、または適当な賦形剤または担体とともに、ヒト患者自身に投与できる。本発明適用のための化合物の製剤および投与方法は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ，に見出すことができる。
【０１０９】
投与経路
適当な投与経路は例えば、経口、直腸、経粘膜、腸管適用；腸管外供給、例えば筋肉内、皮下、静脈内、皮内注射；およびクモ膜下内、直接心室内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射などである。当業者は特定に投与経路に対して組成物を適合させる種々の方法を理解している。
【０１１０】
あるいは、化合物は全身投与でなく、固形癌に直接注入することにより局所的に投与することができ、その場合、デポット（貯蔵）としてまたは徐放製剤として局所投与することが多い。
【０１１１】
組成物／製剤
本発明の医薬組成物は、たとえば、慣例の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程などのそれ自体公知の方法で製造することができる。
したがって、本発明に用いるための医薬組成物は、医薬的に用いることができる調製品への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１種またはそれ以上の生理的に許容しる担体を用いる慣例の方法で製剤することができる。適当な製剤は、選ばれた投与経路に従属する。
【０１１２】
注射液のためには、本発明作用剤は、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液または生理的食塩緩衝液などの生体適合性緩衝液として製剤することができる。経粘膜投与のためには、製剤において、浸透されるべきバリヤーに適した浸透剤を用いる。このような浸透剤は一般に、当業界で公知である。
経口投与のためには、活性化合物と当業界で公知の医薬的に許容しうる担体を合わせることによって、本発明化合物を容易に製剤することができる。このような担体によって、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤されるべき本発明化合物は、処置されるべき患者による経口摂取が可能になる。適当な担体として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物といったような充填剤などの賦形剤が挙げられる。要すれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【０１１３】
糖衣錠のコアは、適当なコーティングをして提供される。この目的のために、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む濃縮糖類溶液を用いる。識別のため、または活性成分用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または含量を加えてもよい。
【０１１４】
経口で用い得る医薬調製物として、ゼラチン製プッシュフィットカプセルならびにゼラチン、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製軟密閉カプセルおよびが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤ならびに必要に応じて安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に活性化合物を溶解または懸濁する。さらに、安定剤を加えてもよい。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した用量であるべきである。
【０１１５】
バッカル投与のためには、組成物を慣例の方法で製剤された錠剤またはロゼンジの剤形にする。
吸入による投与のためには、慣例的に、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体などの適当な噴霧剤を用いて、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの剤形で本発明使用のための化合物をデリバリー（供給）する。加圧エアロゾルの場合、計量された量をデリバリーするバルブを提供することによって用量単位を決定する。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で用いるためのたとえばゼラチン製のカプセル剤およびカートリッジを、本発明化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤することができる。
【０１１６】
ボーラス注射または継続的輸液などの注射による非経口投与用に本発明化合物を製剤することができる。注射用製剤は、たとえば、保存剤を添加したアンプルまたはマルチ投与容器などの単位投与剤形で提供される。該組成物は、懸濁液、溶液または油性または水性ビヒクルにおける乳液などの剤形をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含んでもよい。
【０１１７】
非経口投与用医薬製剤は、水溶性形体の活性化合物の水溶液であってもよい。さらに、適当な油性注入用懸濁液として、活性化合物の懸濁液を製造してもよい。適当な親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増す物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、適当な安定剤または高濃縮溶液が製造されるように化合物の溶解度を増加させる作用剤を含むこともできる。
あるいは、活性成分は適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水により使用前に再構成される粉末形態であってもよい。
【０１１８】
これまでに記載した製剤に加えて、持効性製剤として、本発明化合物を製剤してもよい。このような長期作用製剤は、植込錠（たとえば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与される。したがって、たとえば、適当なポリマーまたは疎水性材料（たとえば、許容しうる油中の乳剤）もしくはイオン交換樹脂とともに、またはたとえば可溶性の小さい塩などの可溶性の小さい誘導体として、本発明化合物を製剤してもよい。
【０１１９】
本発明の疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってよい。ＶＰＤは、３％ ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０および６５％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の無水エタノール溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は、５％デキストラン水溶液で１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体、全身投与において毒性が低い。共溶媒系の特性は、その溶解性および毒性特性を無効にすることなくかなり変えることができる。さらにそのうえ、共溶媒成分の個性は、変更することができる：たとえば、ポリソルベート８０の代りに、他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよい；ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えてもよい；ポリビニルピロリドンなどの他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールと交換してもよい；および他の糖質または多糖類をデキストロースの代りに使ってもよい。
【０１２０】
別法として、疎水性医薬化合物のための他のデリバリーシステムを用いてもよい。リポソームおよびエマルションが、疎水性薬物のためのデリバリービヒクルまたは担体の公知の例である。毒性はより大きいが、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒もまた、用いることができる。さらに、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性系を用いて本発明化合物をデリバリーすることができる。種々の徐放性素材が確立されており、当業者には公知である。徐放性カプセル剤は、その化学的性質に応じて、２、３週間〜１００日間化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のさらなる方策を採ってもよい。
【０１２１】
医薬組成物はまた、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤をふくむことができる。このような担体または賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖質、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
多くの本発明化合物が、医薬的に適合しうる対イオンとして提供される。医薬的に適合しうる塩は、多くの酸とともに形成され、該酸として、硫酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩は、水性または対応する遊離塩基体であるプロトン性溶媒により可溶性であることを企図されるものである。
【０１２２】
有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物は、その企図する目的を達成するのに有効な量で有効成分が含まれる組成物である。さらに詳しくは、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または寛解するか、または治療されている患者の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な記載を考慮して、当業者であれば成しうることである。
【０１２３】
本明細書に記載した本発明化合物の毒性および治療的有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％が死に到る用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療が有効である用量）の決定などの細胞培養または実験動物における標準の薬学的方法によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０およびＥＤ５０の比率として表わされる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を設定するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性が少ししかないか、または無毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。該用量は、採用する投与剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する。正確な製剤、投与経路および用量は、患者のコンディションを考慮して、個々の医師によって選択される（たとえば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｃｈ． １ ｐ．１を参照）。
【０１２４】
投与量および間隔は、必要な効果を維持するのに十分である活性部分の血漿レベル、あるいは最小有効濃度（ＭＥＣ）が提供されるように個々に調節する。ＭＥＣは、各化合物によって変化する。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に応じて変化する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【０１２５】
また、投薬間隔もＭＥＣ値を用いて決定され得る。化合物は、期間のうち１０−９０％、好ましくは３０−９０％、および最も好ましくは５０−９０％の間、ＭＥＣを超える血漿レベルを維持するレジメを用いて投与されるべきである。
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度とは関連しないかもしれない。
当然のことながら、投与される組成物の量は処置される被検体、被検体の体重、苦痛の重篤度、投与様式および指示する医師の判断に依存する。
【０１２６】
パッケージング
所望であれば、組成物は、活性成分を含有する単位投薬形態を１以上を含み得る容器またはディスペンサー装置中に提示され得る。例えば、容器はブリスターパックのような金属またはプラスチックのホイルを備え得る。容器またはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書を有しうる。また、容器またはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規定する政府機関により指示されている形態で、容器に付随した警告を備え得、この警告は、その機関によるヒトまたは動物投与用のポリヌクレオチドの形態の認可を反映している。例えば、このような警告は、処方薬剤または認可された製品添加物（ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｓｅｒｔ）に関して米国食品医薬品局により認可されているラベルであり得る。また、融和性の製薬キャリア中に処方されている本発明の化合物を含有する組成物も、製造し、適切な容器中に配置し、そして指定の状態の治療についてラベルすることができる。ラベル上に記載の適切な状態としては、腫瘍の治療、慢性関節リウマチの治療、糖尿病の治療などを挙げることができる。
【０１２７】
実施例
以下の記載において、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野の当業者にとって公知である種々の方法に対して参照がなされる。そのような公知の方法を記載する、参照の刊行物および他の材料は、そのすべてを本明細書中に参照して組み込む。
【０１２８】
実施例１．Ｔ細胞リンパ腫イディオタイプ（Ｉｄ）同定およびクローニングに関する組織処理：
抹消リンパ節由来の腫瘍サンプルに、臨床的に指示されているように滅菌条件下で生検を実施し、患者イディオタイプ特異的組換えＶαおよびＶβ−Ｉｇキメラタンパク質を作製するために使用する。残りのリンパ節生検材料は今後の使用のために組織細胞バンクで液体窒素中で保存する。
【０１２９】
細胞単離：生検を実施したリンパ腫組織を、滅菌ＰＢＳ中に沈めながら、使い捨ての０．３８ｍｍスチールメッシュスクリーンに押し付けて通すことにより、患者リンパ節生検の単一細胞懸濁物を得る。分散させた細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ついで再懸濁してカウントする。１０％の細胞画分を全ＲＮＡ抽出のために処理し、残りの細胞は、３０％ウシ胎仔血清および１０％ ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ １６４０組織培養培地中での再懸濁の後、液体窒素中に保管（ａｒｃｈｉｖｅ）する。臨床サンプルの処理は全て、生物用安全キャビネットの中で行う。
【０１３０】
全ＲＮＡ調製：ホモジナイズしたリンパ節細胞由来の全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて業者の指示のとおりに単離する。全ＲＮＡは分光光度計により定量する。
【０１３１】
Ｔリンパ腫細胞由来のＴＣＲのＶαおよびＶβ鎖をコードする遺伝子のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅：Ｔリンパ腫細胞レセプターのＶαおよびＶβ鎖の両方を、以下の特性を用いる製品により、記載されるように厳密に、５’ＲＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて同定する。第１鎖ｃＤＮＡ合成に関しては、鋳型としておよそ５．０μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｃα特異的プライマーＣＡＤＳ３またはＣβ特異的プライマーＣＢＤＳ３（表１を参照のこと）を使用して第１鎖ＤＮＡをプライムする。業者の推奨に従ってポリｄＣテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）を行った。ついで、業者から得た５’プライマー、ならびに第二のＣα特異的ＣＡＤＳ２またはＣβ特異的ＣＢＤＳ２アンチセンスプライマー（これらは各々、ｃＤＮＡ合成のために用いた個々のプライマーの内部のものである）を用いてＶαおよびＶβ同定を行った（表１参照）。
【０１３２】
【表１】
2004506021.tif 000003
（ＣＢ／ＩｇＧ１：小文字の文字は、ＩｇＧ１キメラタンパク質を形成するためのＡｐａ Ｉクローニング部位を製造するための変更を示す。Ｃ／ＧおよびＧ／Ｔと示した塩基は、２ヵ所の位置での使用に関しては、Ｃβ １および２の間の差異に応じていずれかの塩基を示す。）
（ＣＡ／ＩｇＫ：小文字の文字は、κ軽鎖とのキメラタンパク質を形成するためのＤｒａ ＩＩＩクローニング部位を製造するためのｂｐの変化を示す）
【０１３３】
ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定：ＶαおよびＶβ鎖に関する腫瘍特異的配列を含有することが決定された反応物由来のＰＣＲ産物を、業者の推奨に従ってプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに直接クローニングし、Ｔｏｐ１０コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入する。２４個のミニプレプＤＮＡプラスミドを、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカーベニシリン耐性細菌コロニーから調製し、分光光度計により定量する。各プラスミド２００ｎｇを、Ｃｙ５／Ｃｙ５．５ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて配列決定した。配列決定反応の完了後、ＯｐｅｎＧｅｎｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでサンプルを電気泳動し、ＧｅｎｅＯｂｊｅｃｔｓソフトウェアパッケージ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いてデータを処理した。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．２ ＤＮＡ分析ソフトウェア （ＧＥＮＥ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて、配列アラインメントを含む更なる分析を行った。ＶαおよびＶβについての腫瘍特異的配列が、サンプルのうちの７５％に存在する場合（例えば、２４個のうち１８個以上が同一のグループを形成する場合）は考慮する。入手可能な場合には２個の独立生検サンプルを比較する。
【０１３４】
実施例２．　イムノグロブリン重鎖および軽鎖の定常域を含有するバキュロウィルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＶαＨＣγ１およびｐＴＲＡＢａｃＶβＨＣγ１の構築
分泌シグナル配列のｐ２Ｂａｃへのクローニング：ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１およびｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１構築物のためのベースベクターはｐ２Ｂａｃ （図２、配列番号：５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）であった。２個の分泌シグナル配列をこのベースベクター中にクローニングし、最初の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターｐ２ＢａｃＭを作製した。たいていの場合、バキュロウィルスＡｃＮＰＶＰ１０プロモーターの転写制御下に配置したミツバチメリチン分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードする相補的オリゴヌクレオチドを利用して、ベクターｐ２Ｂａｃをまず修飾した。メリチン配列クローニングのため、ｐ２Ｂａｃ（２μｇ）を、３７℃で４時間、Ｎｏｔ ＩおよびＳｐｅ Ｉで消化した。１％アガロースゲルでの電気泳動の後、Ｑｉａｅｘ ＩＩ樹脂 （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて線状ベクターを精製した。ついで、精製したＤＮＡを水５０μｌを用いて溶離し、ＤＮＡ濃度を測定した。プライマーＭｅ１Ｓ／Ｎ（配列番号：１６）およびＭｅ１Ｎ／Ｓ（配列番号：１７）、各１μｇを、消化緩衝液Ｍ（１０ μｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）中で混合し、５分間、７０℃まで加熱し、ついで室温まで冷却して相補的プライマーとアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち１０％を、Ｎｏｔ ＩおよびＳｐｅ Ｉを用いて２０μｌの反応系中で、３７℃で４時間、消化し、消化したプライマーを１５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の後、Ｑｉａｅｘ Ｈ樹脂を用いて精製し、アニーリングしたプライマーに対するＤＮＡの濃度を決定した。ｐ２ＢａｃベクターおよびアニーリングしたメリチンフラグメントのＤＮＡを、１：１０のベクター対インサート比でライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントＸＬ １−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて形質転換し、３７℃で一晩増殖させるためにＬＢ−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。標準的なプロトコルによりミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られたベクターｐ２ＢａｃＭはメリチン分泌シグナル配列を含有していた。
【０１３５】
同様に、ｐ２ＢａｃＭベクターを、ＡｃＮＰＶポリへドロンプロモーターの転写制御下にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードするようにさらに修飾して、第二の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターｐ２ＢａｃＭＡを作製した。アルカリホスファターゼ配列を導入するために用いた方法は、概して、以下のとおりであった。ｐ２ＢａｃＭプラスミド（２μｇ）をＢａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩを用いて消化し、線状ベクターをＱｉａｅｘ ＩＩ樹脂を用いてアガロースゲルからゲル精製し、水５０μｌ中に溶出した。ベクターのＤＮＡ濃度を測定した。プライマーＡＰＢ／Ｅ（配列番号：１８）およびＡＰＥ／Ｂ（配列番号：１９）の各１μｇを消化緩衝液Ｍ１０μｌ中に混合し、７０℃で５分間加熱し、ついで室温まで冷却して相補的なプライマーをアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち１０％を、Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩを用いて２０μｌの反応系中で、３７℃で４時間、消化した。ついで、消化したプライマーを１５％ポリアクリルアミドゲルから、Ｑｉａｅｘ ＩＩ樹脂を用いて精製した。また、消化したプライマーのＤＮＡ濃度を決定した。ついで、線状ｐ２ＢａｃＭベクターおよびアルカリホスファターゼフラグメントを、１：１０のベクター対インサート比でライゲーションし、ライゲーション産物をコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉを用いて形質転換し、３７℃で一晩増殖させるためにＬＢ−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。ミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られた中間生成物ベクターｐ２ＢａｃＭＡは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼに対する分泌シグナル配列を含有する。メチル感受性（ｍｅｔｈｙｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｓｔｕ Ｉ部位へのκ定常域の続いてのクローニングのために、ｐ２ＢａｃＭＡプラスミドをさらに、ｄｃｍメチラーゼ活性を欠損したＳＣＳ−１１０ Ｅ． ｃｏｌｉ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。
【０１３６】
ＩｇＧγ１および軽鎖の定常領域の増幅およびクローニング：
ヒトモノクローナル抗体９Ｆ１２のヒトカッパ（κ）定常およびヒトＩｇＧγ１定常ドメインを、ヒト細胞系統９Ｆ１２（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８１７７）から抽出したＲＮＡからＰＣＲ増幅した。κ定常領域は、アルカリホスファターゼシグナル配列の後ろにクローニングした。ＩｇＧγ１定常領域はメリチン分泌シグナル配列の下流に挿入し、それによりベクター（ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１、図５ａ）を作製した。ヒトラムダ（λ）軽鎖定常領域を含むベクター（ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１、図５ｂ）を、κ軽鎖定常領域をλ軽鎖定常領域と置換することにより調製した。軽鎖は、クローン性リンパ球白血病細胞ＲＮＡ調製物からＲＴ−ＰＣＲにより単離した。クローニング操作の詳細は次の通りである。
【０１３７】
９Ｆ１２κおよびＩｇＧγ１定常領域断片の増幅：
９Ｆ１２細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８１７７）由来の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その製造元の教示に従って抽出した。１本鎖ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）をオリゴ（ｄＴ）プライマーとともに用いて合成した。合成した１本鎖ｃＤＮＡの１／１２を、９Ｆ１２κおよびＩｇＧγ１特異的オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号：２２ ｐｌｕｓ 配列番号：２３および配列番号：２０ ｐｌｕｓ 配列番号：２１）を用い、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ（ロッシュ）を含む１００μｌ ＰＣＲ反応中にて増幅した。増幅９Ｆ１２免疫グロブリン由来の断片をＱｉａｅｘ ＩＩ樹脂を含む１．５％ ＳｅａＫｅｍアガロースから精製し、水５０μｌで溶出させた。断片のＤＮＡ濃度を測定した。精製９Ｆ１２免疫グロブリン断片を別々に、ＴＡ−ＩＩ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ＰＣＲクローニングベクターに連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、プラスミドＤＮＡを配列決定した。
【０１３８】
９Ｆ１２κ定常領域の発現ベクターへの挿入
κ定常ドメインに関し、κ定常ドメインを含有するプラスミドＤＮＡ５μｇおよびＳＣＳ１１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）から精製したベクターｐ２ＢａｃＭＡ のＤＮＡ２μｇ をＳｔｕ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。κ定常領域を含む３２０ｂｐ断片およびｐ２ＢａｃＭＡベクターを含む７．１ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩでゲル精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定した。次いで、精製した断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）で連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップ細菌コロニーを調製し、組換えＤＮＡを配列決定し、それによりκ定常領域の挿入を確認した。得られたプラスミドベクターはｐＴＲＡＢａｃＬＣκであった。
【０１３９】
ＩｇＧγ１定常ドメインのベクターへの付加：
ＩｇＧγ１定常領域を含むプラスミドＤＮＡ５μｇ およびベクターｐＴＲＡＢａｃＬＣκのプラスミドＤＮＡ２μｇ をまずＳｐｅ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、ＩｇＧγ１定常ドメインをベクターに付加した。ＩｇＧγ１定常領域の１ｋｂ断片およびｐＴＲＡＢａｃＬＣκベクターの７．４ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースプラグからゲル精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定した。次いで、精製した断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）で連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、ＩｇＧγ１挿入の連結および方向性を制限部位の制限分析と配列決定により決定した。得られた組換えベクターはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１であった。
【０１４０】
このプラスミドｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１におけるミツバチメリチン分泌配列とＣγ１領域配列、およびアルカリホスファターゼ分泌配列とＣκ領域配列との間にそれぞれ転写終止コドンを付加し、該プラスミドをさらに調整した。この修飾のため、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１ベクターをＳｐｅ Ｉ ＋ Ａｐａ Ｉ消化により線状化した。次いで、線状化したベクターをアニール化相補プライマーγ１−ｓｔｕｆｆ １（配列番号：５３）およびγ１−ｓｔｕｆｆ １’（配列番号：５４）に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。この修飾により得られたベクターを次いで、Ｓｔｕ Ｉ （ＡＧＧＣＣＴ） ＋ Ｄｒａ ＩＩＩ （ＣＡＣｎｎｎＧＴＧ）で線状化した後、アニール化相補プライマーκ−ｓｔｕｆｆ １（配列番号：５５）およびκ−ｓｔｕｆｆ １’（配列番号：５２）に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。これらの修飾の正味の効果をそれぞれ図６Ｃおよび６Ｄ
に示す配列に表す。（付加した配列は二重線と太字により示している）
【０１４１】
γ定常領域のベクターへの付加：
γ軽鎖イディオタイプを示す慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）の患者から精製した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。
【０１４２】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を製造元の教示に従って使用し、約２．０μｇ の全ＲＮＡを第１ストランドｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。オリゴ（ｄＴ）をプライミングに使用した。Ｖγシグナル配列の部分と同一の上流プライマー（ＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧ ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣ ＧＴＧ； 配列番号：４７）およびλ定常領域の最後の幾つかのコドンと相補的な下流プライマー（ＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣ ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴ ＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣ ＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧ ＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡ ＣＡＴＴＣＴＧＴＡＧ ＧＧＧＣＣＡ； 配列番号：４８）および３’非翻訳領域の部分を用い、ＰＣＲ反応により合成した１本鎖ｃＤＮＡの１／１２を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定を行い、同一性を確認した。正しいλ定常領域配列を含むプラスミドを第２のＰＣＲの鋳型として選択した。この反応では、Ｊλの下流直後のλ定常領域の配列に相当する、操作したＤｒａ ＩＩＩ制限部位を含有するセンスオリゴヌクレオチドＣλ−５’（配列番号：４９）、およびλ定常領域の直後の終止コドンをまたぐ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＣλ−３’（配列番号：５０）を使用した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、配列決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限反応に際し、挿入物の方向性に応じて、λ定常領域配列を含む断片を幾つかのプラスミドから遊離させた。この制限断片をゲル単離し、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１（図５Ａ）にクローニングした後、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化により線状化し、それによりλおよびκ定常領域をともに含む中間プラスミドを作製した。このプラスミドをＳｔｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩで制限反応し、κ配列を除去した。得られた線状化プラスミドをアニール化相補プライマーγ−ｓｔｕｆｆ １（配列番号：５１）およびγ−ｓｔｕｆｆ １’に連結し、最終プラスミドであるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１（図５Ｂ）を作製した。
【０１４３】
ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１および／またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１の構築に用いたすべてのオリゴヌクレオチドプライマーのリストは以下の表２および３に認めることができる。
【０１４４】
唯一のクローニング配列Ｓｔｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩを含有するＶαまたはＶβ鎖の遺伝子はκまたはλ定常領域およびアルカリホスファターゼシグナル配列間に、および唯一のクローニング配列Ｓｐｅ ＩおよびＡｐａ Ｉを含有するＶβまたはＶα鎖の遺伝子はＩｇＧγ１定常領域およびミツバチメリチン分泌シグナル配列間にそれぞれ、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のいずれかを使用して挿入することができた。次いで、得られた発現ベクターをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ−９）昆虫細胞に形質導入し、組換え出芽バキュロウイルスを調製した。次いで、組換えバキュロウイルスをＳｆ−９細胞にて連続的に増幅し、高力価の組換えバキュロウイルスストックを調製した。この高い力価の組換えバキュロウイルスストックをＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ （Ｈｉｇｈ−５）細胞に感染させ、以後のキメラＴＣＲ／Ｉｇタンパク質の産生に使用した。
【０１４５】
【表２】
2004506021.tif 000004
【０１４６】
実施例３．患者から誘導したイディオタイプＶαおよび／またはＶβ鎖の遺伝子の発現ベクターへの挿入
上記のようにして、腫瘍由来のＶαおよび／またはＶβ鎖を単離した後、ミリチンリーダーペプチドの末端４０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー（Ｖβ鎖クローニングのため）（配列番号：８−ＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴ ＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴ ＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡ ＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧ）、アルカリホスファターゼリーダーペプチドの末端３１ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー（Ｖα鎖クローニングのため）（配列番号：９−ＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧ ＣＴＡＣＡＧＣＴＣＴ ＣＣＣＴＧＧＧＣ）、ならびに上記の分析から配列決定されたそれぞれＶαまたはＶβ遺伝子の最初の２０ヌクレオチドを調製した。αまたはβ鎖定常領域由来のＣＡ （ＣＡ／ＩｇＫ；配列番号：１５）の４−３６塩基対およびＣＢ （ＣＢ／ＩｇＧ１；配列番号：１４）の６−３５塩基対に相補的な逆オリゴヌクレオチドプライマー。クローナルＶαまたはＶβ配列を有すると同定された組換えプラスミドを２回目のＰＣＲの鋳型として使用する。サイクル条件は既述の通りである。
【０１４７】
発現ベクターへのＶα領域挿入：
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｔｕ Ｉ およびＤｒａ ＩＩＩで消化し、アガロースゲルにて分離する。Ｖα遺伝子を含有すると推測される約３６０ｂｐ断片を溶出させ、適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターに挿入する。基本的には、ＰＣＲ誘導Ｖα産物および対応するｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１カセットベクター２ μｇ をＳｔｕ Ｉ およびＤｒａ ＩＩＩで消化した。患者誘導Ｖα鎖由来の３６０ ｂｐＤＮＡ断片および線状ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１ベクターの８．４ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースプラグから精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定し、次いで両断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）を用いて連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えＤＮＡプラスミドを制限分析と配列決定により確認した。得られたベクターをｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣλＨＣγ１と命名した。
【０１４８】
発現ベクターへのＶβ領域挿入：
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＡｐａ １で消化する。Ｖβ遺伝子を含有する約３６０ｂｐ断片を切りだし、ゲル精製し、関連Ｖα遺伝子を含有する適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣλＨＣγ１に、または関連Ｖα遺伝子を含有しないｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１に挿入する。基本的には、ＰＣＲ誘導Ｖβ産物およびｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣκＨＣγ１、ｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣλＨＣγ１、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１２ μｇ ＤＮＡをＳｐｅ ＩおよびＡｐａ １で消化した。Ｖβ鎖の３６０ ｂｐ断片およびｐＴＲＡＢａｃＶαＨＣγ１、ｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣκＨＣγ１、またはｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣλＨＣγ１の８．８ｋｂ断片またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１の８．４ ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースゲルプラグから精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定し、両断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）を用いて連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えＤＮＡプラスミドを配列決定した。得られたベクターをｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣκＶβＨＣγ１、またはｐＴＲＡＢａｃＶαＨｕＬＣλＶβＨＣγ１、またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＶβＨＣγ１と命名した。
【０１４９】
【表３】
2004506021.tif 000005
【０１５０】
実施例４．Ｖαおよび／またはＶβ鎖イディオタイプを含有するバキュロウイルス発現ベクターによる昆虫細胞系統のトランスフェクションおよび組換えキメラタンパク質の調製：
昆虫細胞発育：
２つの樹立された昆虫細胞系統（Ｓｆ９およびＨｉｇｈ−５）を改変バキュロウイルスベクターにトランスフェクトし、組換えキメラＶＨ／免疫グロブリンおよび／またはＶＬ／免疫グロブリンタンパク質を調製した。すべての昆虫細胞は、使い捨て滅菌通気式振盪フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ）中、１４０−１５０ ｒｐｍにて、５０μｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＥＳＦ−９２１血清不含昆虫培地 （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＰ）にて２８℃において、液体容量が５０％を越えることがないように発育させた。細胞を２−３日ごとに継代した。凍結細胞を産物の各ロットごとに稼動しているセルバンクから、または６週ごとに解凍することにより（凍結保護培地： １０％ ＤＭＳＯ， ４０％ ＥＳＦ−９２１ 培地， ５０％ Ｈｉｇｈ−５ ならし培地）、バキュロウイルスによる感染に対して退縮性でない対数増殖期の細胞を連続して保存できるようにした。
【０１５１】
Ｓｆ９細胞トランスフェクションおよび組換え検定：
Ｖαおよび／またはＶβ領域の遺伝子および免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖定常領域の遺伝子を含む改変バキュロウイルス発現ベクターを、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ−３０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。アガロースオーバーレイから１０個のプラークを個別に取り出した。単離したプラーク由来のウイルスを使用し、ＥＳＦ−９２１培地５ｍｌ中、５０％全面成長のＳｆ−９細胞を播種したＴ−２５フラスコに感染させた。Ｔ−２５フラスコにて増幅したクローナルウイルス単離物を、２つのプライマー（配列番号：３７−ＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴ ＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴ ＴＴＴＧ）および（配列番号：３８−ＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣ ＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧ ＣＴＧ）を使用するＰＣＲにより試験し、単離したプラークのクローン性を確かめ、野生型ウイルスの混入のないことを確かめた。概して言えば、組換え移入ベクタープラスミド２００ｎｇを、供給されているＥｕｆｅｃｔｉｎ ｌｉｐｉｄ試薬を用いたＢａｃ Ｖｅｃｔｏｒマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているようにしてトリプレット−カットＢａｃ−Ｖｅｃｔｏｒ−３０００により同時トランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を連続して５倍に希釈した。この１００μｌを、２．５ ｘ １０６接着Ｓｆ９細胞を含む６０ｍｍ組織培養皿にて培養した。１時間後、細胞に、ＥＳＦ−９２１培養培地の１％アガロース溶液４ｍｌを重層した。トランスフェクションの１４４時間目に、Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて生細胞を染色し、次いでアガロースオーバーレイ中にて発育しているトランスフェクト細胞から１０個のクローンを個別に取り出した。ＥＳＦ−９２１培地１ ｍｌ中、一晩のプラーク・プラグからウイルスを溶出させた。Ｔ−２５フラスコに、ＥＳＦ−９２１培地５ｍｌ中、５０％全面成長のＳｆ−９細胞を播種し、溶出クローナルウイルス０．５ ｍｌを感染させた。感染の９５時間後、Ｔ−２５フラスコから培地０．５ｍｌを取り出し、遠心により細胞を除去し、得られた上清を、ニトロセルロースへのブロッティングにより免疫グロブリン活性について検定した。野生型ウイルスが存在しないことも以下のＰＣＲにより試験した。
【０１５２】
組換えバキュロウイルスを含む感染上清（１０ μｌ）を、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ ＫＣｌ、０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン、０．４５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０および０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含み、さらに６ μｇ プロテイナーゼ−Κを含む細胞溶解緩衝液９０ μｌに加えた。この混合物を６０℃にて１時間加熱し、９５℃で１０分間インキュベートすることによりプロテイナーゼ−Κを変性させた。加熱した混合物２５μｌが冷却した後、新しいＰＣＲチューブに移し、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３， ５０ ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ０．４５％ ＮＰ−４０， ０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０， ４００ μＭ 各ｄＮＴＰ， ５ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５０ ｐＭ 各 ＰＣＲ プライマー （最終）および２．５ Ｕ Ｔａｑ ポリメラーゼ （ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を含む別の混合物２５μｌを加えた。ウイルスＤＮＡを、９２℃の１分、次いで５８℃の１分、および７２℃の１分の４０サイクルで増幅した。組換えバキュロウイルスプライマーＰＨフォワード（配列番号：３７）およびＰＨリバース（配列番号：３８）を使用し、Ｔ細胞レセプター遺伝子の部分を発現するポリヘドロン座を増幅した。アガロースゲルでの電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。組換えバキュロウイルスは１３００ ｂｐ断片が増幅され、野生型バキュロウイルスは上記のプライマーセットを用いて約８００ ｂｐ断片が増幅される。野生型ウイルスが混入した組換えウイルスはこれら両断片サイズが増幅される。
【０１５３】
Ｓｆ−９細胞における高力価ウイルス保存液の調製：
Ｔ−２５初代培養物から得た２ｍｌを、ＥＳＦ−９２１培地１０ｍｌ中、５０％全面成長のＳｆ−９細胞を含有するＴ−７５フラスコに移し、２８℃にて１２０時間細胞を発育させた。二次Ｔ−７５培養物５ｍｌを、２ｘ１０６ 細胞／ｍｌのＳｆ−９細胞５０ｍｌを含有する１５０ｍｌ振盪フラスコに移し、細胞を２８℃にて１２０時間発育させた。１５０ｍｌ振盪フラスコから２５ｍｌを取り出し、それを１Ｌ振盪フラスコ中の２ｘ１０６ 細胞／ｍｌのＳｆ−９細胞５００ｍｌに移し、２８℃にて発育させた。培養物が２０％に達したら、トリパンブルー染色により生細胞をスコアー化し（感染の約１２０−１４４時間後）、３０００ｘＧの遠心によりウイルス培養物を収獲し、５０ｍｌ滅菌チューブに分配し、チューブの半分を４℃にて保存し、休止には−８０℃にて保存した。これにより高力価のウイルス保存液５００ｍｌ（＞１ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ）が収獲され、これをキメラタンパク質生産のためのＨｉｇｈ−５昆虫細胞の感染に用いた。ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）はＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて測定した。
【０１５４】
Ｈｉｇｈ−５昆虫細胞におけるＴＣＲ／Ｉｇキメラタンパク質の生産：
Ｈｉｇｈ−５昆虫細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）はＳｆ−９細胞と比較して、より高いレベルの組換え免疫グロブリン（２−２０ Ｘ）を分泌するので、それをＴＣＲ／Ｉｇキメラタンパク質生産のための細胞系統として選択した。初期の対数期にあるＨｉｇｈ−５細胞（１．０−２．０ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、ＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＰ）中５ｘ１０５ 細胞／ｍｌの、通気閉口を有する１Ｌ使い捨て培養フラスコに播種した。フラスコを２８℃にて１４０−１５０ ｒｐｍで振盪させ、フラスコ内の培地容量を経時的に５００ｍｌを越えないようにした。細胞密度が５００ ｍｌ培地中、１．５−２．５ 細胞／ｍｌに達すると、感染多重度（ＭＯＩ）約０．５：１ （ｐｆｕ：細胞）で高力価組換えバキュロウイルス保存液でフラスコを感染させた。次いで、フラスコを２８℃にて１４０−１５０ ｒｐｍで振盪させた。細胞生存率を毎日チェックし、感染の９６時間内に生存率が＜５０％に落ちない段階で培養物を収獲した。
【０１５５】
実施例５．Ｖα免疫グロブリンおよびＶβ免疫グロブリンを含むキメラタンパク質の精製：
約５，０００ ｘ ｇで６０分間遠心し、次いで０．２μ ＰＥＳ滅菌フィルターユニットで濾過し、細胞および細胞残骸を除去した。プロテインＡ Ｈｉｇｈ−Ｔｒａｐ カートリッジ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）によるアフィニティークロマトグラフィー、およびその後の５０％飽和硫安中の沈降により、清澄な組織培養培地からキメラタンパク質を精製した。精製したキメラタンパク質をサイズ分離し、ＦＰＬＣ クロマトグラフィーにより緩衝液をＰＢＳに交換した。タンパク質精製のために使用したすべての試薬はＵＳＰバイオテクノロジー級（ＧｅｎＡｒ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｔ Ｂａｋｅｒ， Ｐａｒｒｉｓ， ＫＹ）であり、製造元によりエンドトキシンは試験されている。滅菌ＵＳＰ級水を使用し、すべての緩衝液および他の溶液を調製した。緩衝液および他の溶液は生物学的安全キャビネット内で調製し、０．２ μｍ ＰＥＳフィルターユニットで滅菌濾過した。
【０１５６】
キメラタンパク質のプロテインＡセファロースアフィニティー精製：
発育している培養フラスコから組織培養培地を取り出し、５，０００ ｘ ｇで６０分回転させて細胞および細胞残骸を沈殿させた。得られた上清を０．２ μ ＰＥＳフィルターユニットで滅菌濾過した。ＶＨおよび／またはＶＬ−免疫グロブリンキメラタンパク質を含む濾過した培地にトリス緩衝液（１Ｍ， ｐＨ ７．４）を終濃度２０ｍＭまで加えた。蠕動ポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、緩衝化組織培養上清をＨｉｇｈＴｒａｐ組換えプロテインＡセファロースアフィニティーカートリッジ５ｍｌ上に流速５ｍｌ／分で加え、清澄なフラスコ内の流路に集めた。カラムを５ ｍｌ／分にてＰＢＳ （ｐＨ７．４） ２５ ｍｌで洗浄した。流れの方向を逆にし、カラムをＰＢＳ ２５ ｍｌでさらに洗浄した。０．０５Ｍクエン酸（ｐＨ ３．５）を１ｍｌ／分で逆にカラムに溶出し、画分１ｍｌを集めた。この溶出した１ｍｌ画分に１Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐＨ ９．０）約０．３ ｍｌ を加え、そのｐＨを素早く約８．０に調節した。この同じ方法により、プロテインＧ、プロテインＬ（これらに限定されない）または免疫グロブリン結合ドメインを結合できる他のタンパク質を含む他のタンパク質カラムを使用できる。
【０１５７】
キメラタンパク質の硫安沈降：
プロテインＡセファロースから溶出されたＶαおよび／またはＶβ−Ｉｇを含有する画分を分光学的手法により同定した。ピーク画分をあつめ、容量を測定した。混合しながら同量の飽和硫安溶液を滴加した。得られた沈殿物を室温にて１５分間放置し、５０００ｘＧの遠心にて沈降させた。沈降したＶαおよび／またはＶβ−Ｉｇキメラタンパク質を滅菌水中に再溶解した。Ｈｉｇｈ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ カートリッジ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、Ｖαおよび／またはＶβ−Ｉｇキメラタンパク質をＰＢＳに緩衝液交換し、次いで０．２ μｌフィルターで最終的な滅菌濾過を行った。
【０１５８】
実施例６．キメラタンパク質のキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）との会合（コンジュゲート）：
精製後、Ｖαおよび／またはＶβ−Ｉｇキメラタンパク質をグルタルアルデヒド架橋を介してＧＭＰ 級 ＫＬＨ （ＶＡＣＭＵＮＥ， Ｂｉｏｓｙｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に次のようにして会合させた。滅菌１５ｍｌ円錐チューブ中、精製した滅菌イディオタイプキメラタンパク質の少なくとも５ｍｇを同重量のＫＬＨと混合した。１％グルタルアルデヒド（２５％ １級 水溶液， Ｓｉｇｍａ）１ｍｌを終濃度０．１％まで滴加した。次いで、チューブを室温にて４時間ゆっくりと振動させた。滅菌ＰＢＳ ２Ｌに対して滅菌ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒｓ （Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）にて会合体を透析し、その際、生物学的安全フードにて少なくとも２４時間緩衝液を３回交換した。最終的Ｖαおよび／またはＶβ−Ｉｇキメラタンパク質−ＫＬＨ会合体を透析チャンバーから無菌的に取り出し、それを滅菌チューブに移し、混合し、次いでバイアルに分配した。最終産物の各バイアルにロット番号、患者情報、バイアル番号およびそれをバイアルに分配した日付を付した。最終ロットの１０％を滅菌性について試験し、またバイアルを選択しエンドトキシンに関して試験した。
【０１５９】
実施例７．産物試験：
生産ロット上清を含むバキュロウイルスのＤＮＡ配列：
昆虫細胞生産培養上清の試料１ｍｌを収獲し、卓上遠心機にて５分間３０００ｒｐｍにて回転させ、細胞残骸を除去した。バキュロウイルス粒子を含む、この清澄な上清の少なくとも０．１ｍｌを、細胞溶解緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．３， ５０ ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ０．４５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０， および ０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）と１：９の容量比で混合し、プロテイナーゼＫ（終濃度６０μｇ／ｍｌ）で１時間６０℃のタンパク質分解反応に付し、次いで９５℃で１５分間変性させた。この細胞溶解液２５μｌを、４００μＭの各ｄＮＴＰ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ ｐｍｏｌ オリゴヌクレオチド（配列番号：３２および配列番号：３５；または配列番号：３６および配列番号：３７）（表４参照）、および２．５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ロッシュ）を含む蒸気の細胞溶解緩衝液２５μｌとさらに混合し、ＰＣＲ反応を行った。サイクリング条件は、（Ｉ） ９２℃での２分間の初期変性、（ｉｉ） その後の、９２℃、５８℃および７２℃でのそれぞれ１分間の４０サイクル、および（ｉｉｉ） ７２℃での７分間の最終伸張。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により、予想サイズおよび量について評価した。次いで、２つまたはそれ以上の裸のプライマーを使用し、ＰＣＲ産物の配列決定を直接行った。完全なＶαおよび／またはＶβヌクレオチド配列を、ＯｐｅｎＧｅｎｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）および上記の配列決定分析ソフトウエアを用いて決定し、その患者イディオタイプに対応するｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＦＶ−８７８６−ＸＸＸ）ベクターのＶ−遺伝子配列と比較した。
【０１６０】
抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡの免疫グロブリン検定を用いたキメラタンパク質の分析：
炭酸緩衝液中、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ重鎖特異的抗体（Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）の３ μｇ／ｍｌ希釈液１００ μｌでマイクロタイタープレートを被覆し、ＴＢＳ （５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．５） １００ μｌで２回洗浄した。次いで、２２℃にて１時間、ウエルをＴＢＳＢ （ＴＢＳ ＋ １％ ＢＳＡ） ２００μｌでブロックした。２倍連続希釈の希釈試料１００μｌ をウエルに加え（２回操作）、２２℃にて１時間インキュベートした。この分析を、精製ヒトＩｇＧ１／κまたはＩｇＧ１／γ標準品（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて繰り返した。ウエルをＴＢＳＴ （ＴＢＳ ＋ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０） ２００μｌで４回洗浄した。検出抗体、ヤギ−抗−ヒト Ｈ および Ｌ−ＨＲＰ （Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｈ ａｎｄ Ｌ−ＨＲＰ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）をＴＢＳＢで１：２０００に希釈し、その１００μｌをウエルに加え、２２℃にて１時間インキュベートした。ウエルをＴＢＳＴ２００μｌで６回洗浄した。基質（ＴＭＢ １ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ＫＰＬ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）１００μｌをウエルに加え、３０分間発色させ、試料をＯＤ６５０クロマトグラムにより測定した。Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ カラムから溶出された主要なタンパク質ピークはヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ活性と対応しなければならない。
【０１６１】
実施例８．キメラタンパク質の濃度および純度：
生産上清におけるバキュロウイルスのＶαおよび／またはＶβ遺伝子のＤＮＡ配列は、生産ベクターのＤＮＡ配列と一致していなければならない。キメラタンパク質の濃度はＯＤ２８０に基づいて０．５ｍｇ／ｍｌを越えなければならず、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ活性と対応しなければならない。
以下の表４は最終産物の同一性を確立するのに使用されるプライマー配列の概要である。
【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
実施例９．　Ｖαおよび／またはＶβ−Ｉｇキメラタンパク質および／またはそのサイトカインとの結合体（会合体）の同時投与
ハツカネズミＴ細胞リンパ腫系統であるＲＭＡにより発現されるＴＣＲ Ｖβ１２遺伝子（Ｖａｎ Ｈａｌｌら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＲＬ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＭＡ， ＥＬ−４， ａｎｄ ＭＢＬ−２ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｍｍｏｎ Ｏｒｉｇｉｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６５：８６９−８７７； ２０００に記載）を、メリチンリーダーペプチドの末端４０ヌクレオチドおよびハツカネズミＶβ１２の最初の２０ヌクレオチドを含有する５’ヌクレオチド（配列番号５６：ＴＴＡＣＴＡＧＴＴＴ ＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴ ＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴ ＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧ ＣＴＧＡＣＧＣＴＧＧ ＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧ Ａ）、ならびにハツカネズミＣｂおよびヒトＩｇＧ１の５’末端に相補的な３’オリゴヌクレオチド（配列番号５７：ＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴ ＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣ ＧＧＧＣＣＣＴＴＣＡ ＧＡＴＣＣＴＣ）を用いて先に記載のようにクローニングした。得られたＰＣＲ産物（図Ｘ、最終ページを参照のこと）をｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のＳｐｅ Ｉ／Ａｐａ Ｉ部位にクローニングしてベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＶβ−ＲＭＡＨＣγ１を得た。ＴＣＲ Ｖβ−ＲＭＡＨＣγ１キメラタンパク質を昆虫細胞中に生じさせ、先に記載のように精製した。このようなタンパク質の例（図９）について、Ｃ５７／Ｂ１６マウスに１０，０００ ＲＭＡ Ｔ細胞リンパ腫細胞を植え付け、続いて３６時間後に、ＲＭＡ−特異的Ｖβ−Ｉｇキメラタンパク質（５００ μｇ／ｍｌの濃度）をサイトカインＧＭ−ＣＳＦ（１００，０００ ＩＵ／ｍｌの濃度）とともに含む組成物を用いて処置した。このワクチンを、毎日、１ｘ＋ＧＭ−ＣＳＦ ｘ３で与えた。正確な処置プロトコルを１４日間の間をおいて後、繰り返した。この方法で注射したマウスのうち６０％が腫瘍移植の４０日後に生存していたが、他方、腫瘍投与したコントロールマウスのうち９０％より多くが死亡した。
【０１６４】
ＲＭＡ Ｖｂ ＰＣＲ産物の配列は以下の通りである（ミツバチメリチンシグナル配列を含む）。
【数１】
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【０１６５】
本発明を完全に記載したので、当業者であれば、広範な範囲の等価なパラメーター、濃度および条件内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を伴うことなく、本発明が行われうることを理解する。
本発明は特定の実施態様に関連付けて説明したが、さらに変更し得ることが理解されるであろう。この適用は、本発明の原則、ならびに本発明が属する分野の既知または慣習的な実施内に入り、かつ添付の請求の範囲の範囲内に入る先に記載の本質的な特徴に当てはめることができるような本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変動、用途または適合を保護することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔ細胞媒介性病態を有する患者のＴ細胞由来の特定のＴＣＲのＶαまたはＶβに対するキメラタンパク質を含有する組成物を調製するための概略である。
【図２】多重クローニング部位を有するバキュロウイルス発現ベクターｐ２Ｂａｃのプラスミド地図である。
【図３】バキュロウイルス発現ベクターｐ２ＢａｃのＤＮＡ配列（配列番号：５）である。５’から３’方向へ描いている。ｐ２ＢａｃベクターはＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｘ０６６３７ （配列番号：４４）のヌクレオチド１ から１２０）、およびＡｃＭＮＰＶ ｐ１０プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ａ２８８８９ （配列番号：４５）のヌクレオチド８から２３７）を含んでいる。
【図４】プラスミドｐＴＲＡＢａｃ／９Ｆ１２のＤＮＡ配列である。このプラスミドは、安定なヒト細胞系統９Ｆ１２（配列番号：４１）から発現される重鎖および軽鎖（κ）の遺伝子を含有する。９Ｆ１２細胞系統は破傷風トキソイド特異的なヒトＩｇＧ１／κ抗体を産生する。下線部分は成熟９Ｆ１２ ＩｇＧγ１（ＴＴＴＡＣＣＣ．．．．）およびカッパ（ＡＴＣＧＡＣＡ．．．）鎖をそれぞれコードする配列である。配列は５’から３’方向へ描いている。
【図５Ａ】ＩｇＧγ１およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図５Ｂ】ＩｇＧγ１およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図６Ａ】ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１（配列番号：６）のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｂ】ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１（配列番号：７）のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｃ】カッパスタッフプライマー（配列番号：４２）を利用する修飾後におけるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｄ】ラムダスタッフプライマー（配列番号：４３）を利用する修飾後におけるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図７】ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖の代表的タンパク質配列である。両配列の定常領域に下線を施し、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基に二重線を付している（配列番号：２４および配列番号：２５）。
【図８Ａ】ＶαおよびＶβの挿入部位を示す、ＩｇＧγ１およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図８Ｂ】ＶαおよびＶβの挿入部位を示す、ＩｇＧγ１およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図９】ＴＣＲ Ｖβ−Ｉｇキメラタンパク質製剤による腫瘍担持マウスの処置である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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