(57)【要約】メタロプロテイナーゼ阻害活性を有する、以下の式（I）：【化１】2004533425.tif 000010{式中、R1は置換又は非置換フェニル、フェノキシ、フェニルチオ、フェニルスルフェニル、フェニルスルフォニル、フェニルアミノ又はフェニルメチル残基を表し、R2は水素であり、R3は水素又はアルキルを表し、R4はアルキル、アリール、アラルキル、ヘテリル又はアシルを表し、そしてR2及びR3及びR4が置換可能なピペラジン環を形成する}により表される化合物。
2004533425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（I）：
【化１】
2004533425.tif 000009
{式中、
R1が、フェニル、フェノキシ、フェニルチオ、フェニルスルフィニル、フェニルスルフォニル、フェニルアミノ又はフェニルメチル残基を表し、ここで、上記フェニル成分が1以上のハロゲン原子、アルコキシ、C1-C6アルキル、シアノ又はニトロ基で置換可能であり、好ましくは1〜2の置換基によるパラ及び／又はメタ位の置換であり；
R2が、水素を表し；
R3が、水素、場合により、1以上のO、N又はS原子による割り込みがあり、且つ、場合により、相互に独立に1以上のヒドロキシル基およびオキソ基で置換される低級アルキルを表し；
R4が、場合により、1以上のO、N又はS原子による割り込みがあり、且つ、相互に独立に1以上のヒドロキシル及びオキソ基、アリール、アラルキル、ヘタリル、又はアシル基で置換される低級アルキルを表し；
R2及びR3又はR3及びR4が、それらが結合する窒素原子と一緒になってピペラジン環を形成することもでき、後者の場合には、第2の窒素原子がアリール、アラルキル、又はヘタリル基で置換されることができる。}により表される化合物、又はそれらの薬剤として許容可能な塩又は式（I）により表される化合物のプロドラッグ。
【請求項２】
Rが、非置換のフェノキシ若しくはフェニルチオ、又はクロロ、ブロモ、メチル、又はｔ−ブチルで1又は2回置換されたフェノキシである、請求項1に記載の式（I）により表される化合物。
【請求項３】
R2及びR3が、ピペラジン環を形成し、且つ、R4が、以下の：―CH２−CH2−O−CH2−CH2−OH；―CH2−CH(OH)−CH2−OH；―CH2−CH(OH)−CH２−O―CH2−CH3；−CH2−CH(OH)−CH２−O−CH3；2−オキソ[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル又は4−スルフォンアミド−ベンジルから成る群から選ばれる、請求項1に記載の式（I）により表される化合物。
【請求項４】
R3及びR4が、ピリミジニルによって置換されたピペラジン環を形成する、請求項1に記載の式（I）により表される化合物。
【請求項５】
R3及びR4がそれぞれ、−CH2CH2OHである、請求項1に記載の式（I）により表される化合物。
【請求項６】
式（I）により表される化合物であって、以下の：
5−[4−（4−クロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−[4−（2,3−ジヒドロキシープロピル）−ピペラジン−1−イル]−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（4−クロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−4−[2−（2−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル]−ピペラジン−1−イル−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（4−クロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−[4−（2−オキソ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル）−ピペラジン−1−イル] −ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（4−クロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−[4−（3−エトキシ−2−ヒドロキシ−プロピル）−ピペラジン−1−イル] −ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（3,4−ジクロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−4−[2−（2−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル]−ピペラジン−1−イル−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−4−[2−（2−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル]−ピペラジン−1−イル−5−（4−フェニルスルファニル−フェニル）−ピリミジン−2,4,6−トリオン
5−[4−（4−クロロ−フェノキシ）−フェニル]−5−[4−（2−ヒドロキシ−3−メトキシ−プロピル）−ピペラジン−1−イル]−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−4−[2−（2−ヒドロキシ−エトキシ）−エチル]−ピペラジン−1−イル−5−（4−フェノキシ−フェニル）−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（3−エトキシ−2−ヒドロキシ−プロピル）−ピペラジン−1−イル]−5−（4−フェノキシ−フェニル）−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−2−[ビス−（2−ヒドロキシ−エチル）−アミノ]−エチルアミノ−5−[4−（4−ブロモ−フェノキシ）−フェニル]−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
5−[4−（4−ブロモ−フェノキシ)−フェニル]−5−[2−（4−ピリミジン−2−イル−ピペラジン−1−イル）−エチルアミノ]−ピリミジン−2,4,6−トリオン；
4−（4−5−[４−(４−ブロモ−フェノキシ）−フェニル]−2,4,6−トリオキソ−ヘキサヒドロ−ピリミジン−5−イル−ピペラジン−1−イルメチル）−ベンゼンスルホンアミド；
４−オキソ−4−4−[2,4,6−トリオキソ−5−（4−フェノキシ−フェニル）−ヘキサヒドロ−ピリミジン−5−イル]−ピペラジン−1−イル−ブチリックアシッド；
から成る群から選ばれる、前記化合物。
【請求項７】
請求項1−6のいずれか１項に記載の式（I）により表される化合物を活性成分として、薬剤として許容可能な賦型剤又は希釈剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項８】
メタロ−プロテイナーゼ阻害活性を有する薬物の調製のための、請求項1−6のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
抗腫瘍及び／又は抗転移活性を有する薬物の調製のための、請求項1−6のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、5,5−２置換ピリミジン−2,4,6−トリオンの新しい誘導体に関する。これらの化合物は顕著な抗腫瘍及び抗転移活性を示す。
【０００２】
正常な組織では、合成と分解の間に平衡が成り立つ。細胞外マトリックスは、少なくとも３の群のマトリックスメタロプロテイナーゼに属するプロテイナーゼによって分解される。これらは、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、及びストロメライシンである。正常には、細胞外マトリックスの過剰な分解がおこらないように、α2マクログロブリン及びTIMP（＝メタロプロテイナーゼ（MMP）の組織インヒビター）のようなこれらの触媒酵素の特異的インヒビターがある。アダマリシンはプロテイナーゼの近縁群である。アダマリシンの著名なメンバーは、TACE（TNF-α-変換酵素）である。
【０００３】
少なくとも１７の、異なるが、それでも高度に相同なMMP種が特徴付けされ、これらは間質性繊維芽細胞コラゲナーゼ（MMP-１、HFC）、好中球コラゲナーゼ（MMP-８、HNC）、２のゲラチナーゼ、ストロメライシン（HSL-1のような）、及びHPUMP（最近の総説については、Birkedal-Hansen, H., et al., Critical Rev. Oral Biol.Med. 4 (1993)197-250を参照のこと。）これらのプロテイナーゼは多くの構造的及び機能的特徴を共通にするがそれらの基質特異性においていくらか異なる。HNC及びHFCのみが、天然の鎖の長さの3/4及び1/4のフラグメントを産生しつつ、I、II及びIII型天然３本鎖コラゲナーゼを単結合において切断することができる。これは、コラーゲンの融点を低下させ、それらを他のマトリックス分解酵素によるさらなる攻撃を受けやすくする。
【０００４】
しかしながら、この制御不能なマトリックスの過剰分解は、例えば、関節リューマチの臨床像における骨関節症及び多発性硬化症、腫瘍転移の形成における角膜潰瘍、炎症性疾患及び侵襲、並びに骨と歯の疾患のような多くの病理学的状態に特徴的である。
【０００５】
これらの臨床像の病原がマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターの投与によって有利な影響を受けることが考えられる。その一方で、多数の化合物が文献（例えば、Levy, D.E., Ezrin, A.M., Emerging Drugs 2 (1997) 205-230; Whittaker, M., Brown, P., Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 1(1998) 157-164の総説を参照のこと）から知られており、又は主にヒドロキサミン酸残基、亜鉛結合基としてのチオール又はホスフィン基、とともに特許文献に記載されている（例えば、GlycomedによるPCT国際出願公開第WO92/09563号、Hoffmann-LaRocheによるヨーロッパ特許出願第EP-A0497192号、Britisch BiotechnologyによるPCT国際出願公開第WO90/05719号、Celltechによるヨーロッパ特許出願第EP-A0489577号、Beechamによるヨーロッパ特許出願第EP-A0320118号、Searleによる米国特許第US-P4,595,700号、Agouron PharmaceuticalsによるPCT国際出願公開第WO97/20824号、Bayer CorporationによるPCT国際出願公開第WO96/15096号を参照のこと）。
【０００６】
これらの化合物のいくつかはマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビターとして高活性を示すが、それらの経口による利用可能性は非常に低い。さらにそのような化合物は望ましくない副作用及び毒性に関連した広範囲のメタロプロテイナーゼの阻害をしばしば示す。
【０００７】
ピリミジン-2,4,6-トリオン誘導体はヨーロッパ特許第0869947号にマトリックスメタロプロテイナーゼのインヒビターとして記載された。しかしながら、なお、低毒性で副作用がなく、メタロプロテイナーゼに対して顕著な阻害活性を有する新しい化合物、特に腫瘍の成長及び転移に対する慢性の治療のための候補として、に対する高度の必要性がある。
【０００８】
本発明の新しいピリミジン-2,4,6-トリオン誘導体が、ヨーロッパ特許第0869947号中に記載された化合物よりも増進したマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を有することが見出された。
【０００９】
したがって、本発明は以下の一般式（I）：
【００１０】
【化１】
2004533425.tif 000003
【００１１】
{式中、
R1が、フェニル、フェノキシ、フェニルチオ、フェニルスルフィニル、フェニルスルフォニル、フェニルアミノ又はフェニルメチル残基を表し、ここで、上記フェニル成分が1以上のハロゲン原子、アルコキシ、C1-C6アルキル、シアノ、又はニトロ基で置換可能であり、好ましくは1〜2の置換基によるパラ及び／又はメタ位の置換であり；
R2が、水素を表し；
R3が、水素、場合により、1以上のO、N又はS原子による割り込みがあり、且つ、場合により、相互に独立に1以上のヒドロキシル基およびオキソ基で置換される低級アルキルを表し；
R4が、場合により、1以上のO、N又はS原子による割り込みがあり、且つ、相互に独立に1以上のヒドロキシル及びオキソ基、アリール、アラルキル、ヘタリル、又はアシル基で置換される低級アルキルを表し；
R2及びR3又はR3及びR4がそれらが結合する窒素原子と一緒になってピペラジン環を形成することもでき、後者の場合には、第2の窒素原子がアリール、アラルキル、又はヘタリル基で置換されることができる。}により表される化合物に関する。
【００１２】
本発明はまた、薬剤として許容可能な塩、又は式（I）の化合物のプロドラッグ並びに医薬作用物質を生産するためのこれらの化合物の使用を含む。
【００１３】
R4の場合に列挙されたアリール基及びR3及びR4の融合から得られたピペラジン環はフェニル環から成る。ヘタリル基は１以上の炭素、窒素、酸素又はイオウ原子から選ばれる５〜７の環の原子から成る不飽和又は飽和の環系として理解されている。ピリジン、ピリミジン、ピラジン又は1,3,5-トリアジンのような窒素を含む６員環のような電子の不足したヘタリル残基が好ましい。最も好ましいのは、ピリミジニル又はピラジニルのヘタリル残基である。
【００１４】
単独又はアラルキル基の一部としての、上記アリール或いはヘタリル環は、以下の：ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、低級アシル、C1-C6アルキルチオ、C1-C6アルキルスルホニル、C1-C6アルキルアミノカルボニル、アミノカルボニル、C1-C6アルキルアミドスルホニル、アミドスルホニル、ニトロ、C1-C6アルコキシカルボニル、カルボキシから成る群から選ばれる１以上の置換基により置換されることができる。上で列挙された置換基の１または２によるパラ及び／又はメタ位の置換が好ましい。
【００１５】
アラルキル基は好ましくは、ベンジルである。
【００１６】
R3及びR4残基中の低級アルキルはそのままで、又は他の残基と結合してC1-C6アルキルを意味し、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はｔ−ブチルである。
【００１７】
O、N又はSにより割り込まれるR3及びR4残基中の低級アルキル基は、好ましくは−CH2−CH2−O−CH2−CH2−OH−CH2−CH(OH)−CH2−O−CH2−CH3；2−オキソ−[1,3]ジオキソラン−4−イルメチル、−CH2−CH(OH)−CH2OH、−CH2−CH(OH)−CH2−O−CH3又は−CH2−CH2OHである。
【００１８】
R4残基中のアシルはCO−(C1-C6)アルキル；−C(O)−(C1-C6)−アルキレン−COOH；−CO−アリール；−CO−アラルキル又は−CO−ヘタリルを示す。アリール及びヘタリル残基は上記と同様である。
【００１９】
ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、好ましくは塩素又は臭素と理解される。
【００２０】
一般式（I）の化合物が１又はいくつかの非対称な炭素原子を含む場合、一般式（I）の光学活性化合物もまた、本発明の対象である。
【００２１】
一般式（I）の化合物は、好ましくは以下の一般式（II）：
【００２２】
【化２】
2004533425.tif 000004
【００２３】
{式中、
R1が上記の意味を有し、TがHal又はOSO2R3のような脱離基を表し、Halが塩素、臭素、又はヨウ素を示し、R3がアリール又はメチル残基を示す｝
により表される化合物が以下の一般式III：
【００２４】
【化３】
2004533425.tif 000005
【００２５】
｛式中、
R２、R3及びR4が上述の意味を有し、場合により薬剤として許容可能な塩に変換される｝
により表される化合物と反応する周知のプロセスにより合成されることができる。
【００２６】
一般式（II）の化合物は既知の文献の方法に類似した方法によって合成されることができる。したがって、例えば、5位が臭化されたピリミジン−2,4,6−トリオンは適切な臭化マロン酸ジアルキルエステルを尿素と反応させることによって合成されることができる（例えば、Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 107(2)(1981) 139を参照のこと）。一般式（II）の化合物の対応する臭化又は塩化化合物は、5位がR1−フェニルで置換されたピリミジン−2,4,6−トリオンを臭素（J. Prakt.Chemie 136(1933) 329又はJ.Chem.Soc.1931,1870に類似して）、又は塩化スルフリル（J. Chem. Soc. 1938,1622)、又はN-ブロモ−サクシニミド又は類似の臭化剤と反応させることによって得られる。そのような方法もまた、ヨーロッパ特許出願第EP0869947号に記載される。
【００２７】
一般式（III）のアミンは商業的に入手可能、又は文献中で普通に知られ、又は出版された方法に類似して調製されることができる。１置換されたアルキルピペラジンの好ましい合成方法は、ジメチルホルムアミドのような非プロトン性の溶媒中のナトリウムハライドまたはカリウム炭酸塩のような塩の存在下、例えば臭素又はヨウ素であるアルキルハライド、或いは例えばトルエンスルホン酸塩又はメチルスルホン酸エステルであるアルコールのスルホン酸塩エステルのようなアルキル化剤でモノ−ベンジル−ピペラジンをアルキル化することから成る。
【００２８】
R4がアシルである式（I）の化合物はR4=水素である式（I）の化合物のアシル化により調製されることができる。そのような化合物はR4が例えばベンジルである窒素保護基である式（I）の化合物の開裂により得られることができる。
【００２９】
Tが水素を表す式（II）のピリミジン−2,4,6−トリオンは既知の方法に従ってマロン酸エステルを尿素と反応させることによって調製されることができる（例えば、J. Med. Chem. 10 (1967)1078又はHelvetica Chim。 Acta 34(1959)459, Pharmacie 38 (1)(1983)65又はヨーロッパ特許出願第0869947号を参照のこと）。反応は通常、適切なナトリウムアルコレートの存在下40℃及び100℃の間の温度で、メタノール、エタノール又はブタノールのようなアルコール中で行われる。
【００３０】
ピリミジン−2,4,6−トリオンの調製のために必要なマロン酸エステルは文献から公知、又は文献から公知の方法に従って製造されることができる。R1が上記の意味を有するマロン酸の便利な調製プロセスは以下のスキーム中に記載される：
【００３１】
【化４】
2004533425.tif 000006
【００３２】
これらの反応の実施例は、Houben-Weyl, Vol E5/2, J. Org. Chem. 46(1981)2999及びArch. Pharm. 323(1990)579中に見出されることができる。
【００３３】
一般式（I）の化合物は１又は数個のキラル中心を含むことができ、そしてラセミ形態又は光学活性形態で存在することができる。ラセミ体は既知の方法によってエナンチオマーに分離されることができる。好ましくは、結晶化によって分離され得るジアステレオマー塩が例えばD-又はL-酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸又はカンホスルホン酸のような光学活性のある酸、或いは例えばD-又はL-α-フェニル-エチルアミン、エフェドリン、キニジン又はシンコニジンのような光学活性のあるアミンとの反応によってラセミ混合物から形成される。
【００３４】
アルカリ属の塩、Ca又はMg塩のようなアルカリ土類塩、アンモニウム塩、酢酸塩又は塩酸塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水性アンモニアのような無機若しくは有機塩基又は無機酸、例えばトリエチルアミンのようなC1-C4-アルキル-アミン或いは塩酸で上記化合物を滴定するような通常の方法によって製造される、薬剤として許容可能な塩として、主に使用される。上記の塩は通常は水／アセトンから再沈殿によって精製される。
【００３５】
本発明による新しい式（I）の化合物及びそれらの塩は、液体又は固体の形態で経腸的に又は非経口的に投与されることができる。この関係で、例えば錠剤、カプセル、被覆錠剤、シロップ、溶液、懸濁液などのすべての通常の投与形態が考慮される。通常、注射溶液中にある安定化剤、溶解剤、及び緩衝液のような付加剤を含む水は、好ましくは注射媒体として使用される。
【００３６】
そのような付加剤は例えば酒石酸及びクエン酸緩衝液、エタノール、キレート剤（エチレンジアミン４酢酸及び無毒性のそれらの塩のような）、粘度を調節するための高分子ポリマー（液体ポリエチレンオキサイドのような）である。注射溶液のための液体担体物質は無菌で好ましくはアンプル中に調剤される。固体担体物質は、例えばデンプン、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、タルカム、高分散の珪酸、高分子脂肪酸（ステアリン酸のような）、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、動物及び植物脂肪、固体高分子ポリマー（ポリエチレングリコールのような）；経口適用のための好適な調製物はまた、場合によりフレーバー剤及び甘味料を含む。
【００３７】
投与量は投与方法、種、年齢及び／又は個々の健康状態のようなさまざまな因子に依存する。日用で投与される用量は約10−1000mg／人、好ましくは100−500mg／人であり、単回で服用又は数回の投与にわたって配給されることができる。
【００３８】
本発明の化合物のプロドラッグは、in vivoで薬理学的活性のある化合物に変換されるようなものである。最も一般的なプロドラッグはカルボン酸エステルである。
【００３９】
以下の実施例及び参考文献は、添付された請求項中にその真の範囲が示される本発明を理解することを助けるために提供される。示される方法中で本発明の精神を離れることなく変更が行われ得ることが理解される。
【実施例１】
【００４０】
5-[4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル]-5-[4-(2,3-ジヒドロキシ-プロピル)-ピペラジン-1-イル]-ピリミジン-2,4,6-トリオン
【００４１】
A)   1-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル-エタノン
【００４２】
4-フルオロ-アセトフェノン（24.4ｇ）をジメチルホルムアミド（180ml）に溶解し、4-クロロフェノール(22.8ｇ)及び炭酸カリウム塩（29.5ｇ）を添加する。混合物を７時間攪拌しつつ還流温度で加熱する。冷却後、混合物を水で希釈し、塩化メチレンで抽出する。有機相を水で洗浄し、乾燥、そして蒸発させて38ｇの融点66-68℃の結晶固体を得る。
【００４３】
B)   2-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-モルフォリン-4-イル-エタンチオン
【００４４】
上記方法により得られた12.4ｇの産物をイオウ（4ｇ）及びモルフォリン（8.8ml）と混合する。混合物を2時間150℃に加熱し、氷浴中で冷却し、エタノール（20ml）で30分処理する。沈殿した結晶を採集し、エタノールからの再結晶により融点104-105℃の表題の化合物を得る。
【００４５】
C)  (4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-アセティックアシッド
【００４６】
ステップBで調製した化合物10.4ｇを50%硫酸（200ml）とともに130℃まで8時間加熱する。室温まで冷却後、反応混合物を水（300ml）で希釈し、酢酸エチルで抽出する。有機相を水で洗浄し、引き続き2N炭酸ナトリウム溶液で抽出する。水相を希塩酸で酸性化し、酢酸エチルを添加し、有機相を分離、乾燥そして蒸発させて融点98-100℃の茶色の残渣5.1ｇを得る。
【００４７】
D)   (4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-アセティックアッシッドメチルエステル
【００４８】
ステップCからの産物5.1ｇをメタノール（50ml）に溶解する。溶液を−10℃まで冷却し、チオニルクロライド（3ml）で処理、引き続き還流温度で1時間加熱する。反応混合物を蒸発させ、残渣をエーテルに溶解する。エーテル相を水で洗浄、乾燥、蒸発させて赤茶色の油5.1gを得る。
【００４９】
E）  2-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-マロニックアシッドジメチルエステル
【００５０】
ナトリウムハイドライド（350mg）のジメチルカーボネート（10ml）懸濁液をステップDで得た産物で室温で処理する。混合物を90℃まで1時間加熱し、冷却し、そして氷水中に注ぎ込み、塩化メチレンで抽出する。抽出物を乾燥し、蒸発させて5.7gの表題の化合物を油として得る。
【００５１】
F)  5-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-ピリミジン,2,4-6-トリオン
【００５２】
ナトリウム（800mg）をエタノール（80ml）に溶解する。この溶液に尿素（1.65g）及び上で得た化合物のエタノール（5.5g）溶液を添加する。混合物を還流温度で3時間加熱し、室温に冷却、氷水（100ml）で処理し希塩酸で酸性化する。沈殿を採集し、水で洗浄、乾燥して融点257-258℃の表題の化合物5gを得る。
【００５３】
G)  5-ブロモ5-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-ピリミジン,2,4,-6-トリオン
【００５４】
ステップFで得た化合物の懸濁液(6.3g)、N-ブロモ-サクシニミド（4.1g）及びカーボンテトラクロライド（120ml）中のジベンゾイルペルオキシド(100mg)を室温で3時間攪拌する。混合物を蒸発させ、残渣を酢酸エチルで抽出する。有機相を乾燥、蒸発させて7.5gの表題の化合物を濃厚な油として得る。
【００５５】
H)  1-(2,2-ジメチル-[1,3]ジオキソラン-4-イルメチル)-ピペラジン
【００５６】
ジメチルホルムアミド（30ml）中の2.6mlのN-ベンジルピペラジンの溶液をゆっくりとナトリウムハイドライド（510mg）で処理する。この懸濁液にトルエン-4-スルホニックアシッド2,2-ジメチル-[1,3]ジオキソラン-4-イルメチルエステル（0.8g）を添加し、混合物を一夜攪拌する。反応混合物を蒸発させ、残渣を水で処理し、産物を酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を乾燥、蒸発させる。粗産物を溶出液としてヘプタン／酢酸エチル1:1を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。精製された中間体（0.9g）をメタノール（30ml）に溶解し、炭上のパラジウム（0.3g）上で水素化する。触媒をろ過により除き、濾液を蒸発させて0.54gの表題の化合物をワックス状の固体として得る。判明したM-H＝486.9、M+H＝488.9。
【００５７】
I)   5-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-フェニル)-5-(4-ピリミジン-2-イル-ピペラジン)-ピリミジン-2,4,6-トリオン
【００５８】
ステップGの産物（410mg）を8mlのメタノールに溶解しステップHの産物（200mg）で処理する。混合物を一夜攪拌する。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーでメチレンクロライド／メタノール20:1を溶出液として用いて精製し、240mgの中間体産物を得る。この産物をエタノール（10ml）に溶解し、ジオキサン中HCl（10滴）で処理する。混合物を一夜攪拌し、溶媒を蒸発させる。残渣を酢酸エチルで倍散し、固体を単離して大気圧イオン化（APCI）を用いたマススペクトロメトリーによって同定した表題の化合物を200mg得る。
【実施例２】
【００５９】
以下の化合物は、4-クロロフェノールを対応するフェノールに、そしてジヒドロキシエチル-ピペラジンを対応するピペラジンに置き換えることによって、実施例１の方法を使用して調製した。最終産物を大気圧イオン化（APCI)を用いたマススペクトロメトリーによって同定した。
【００６０】
【表１】
2004533425.tif 000007
【実施例３】
【００６１】
4-オキソ-4-4-[2,4,6-トリオキソ-5-(4-フェノキシ-フェニル)-ヘキサヒドロ-ピリミジン-5-イル]-ピペラジン-1-イル-ブチリックアシッド
【００６２】
実施例２の方法Hに類似して調製した5-ブロモ-5-(4-(フェノキシ)-フェニル)-ピリミジン,2,4,-6-トリオンとN-ベンジル-ピペラジンを実施例１の方法Iに従って反応させる。産物を炭上のパラジウム上で水素化して非常に不溶性の5-ピペラジノ-5-(4-(フェノキシ)-フェニル)-ピリミジン,2,4,-6-トリオン（融点270-275℃）を得る。この化合物（190mg）をジメチルホルムアミド（10ml）に溶解し、触媒としてのp-ジメチルアミノ-ピリジン（6mg）の存在下、無水コハク酸（60mg）で処理した。混合物をさらにテトラヒドロフランで希釈し、室温で48時間保持した。溶媒の蒸発後に得られた粗物質をジクロロメタン／メタノール9:1を溶出液として使用したシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製した。分画を含む産物をプールして大気圧イオン化を使用したマススペクトロメトリーによって同定された表題の化合物95mgを得た。[M+H]=480.9、[M+Na]=503。
【実施例４】
【００６３】
MMPｓの阻害を測定するために、例えば触媒ドメインであるHNC(MMP-8)（単離及び精製については例えばSchnierer, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 191(1993) 319-326を参照のこと）を多様な濃度のインヒビターとインキュベートする。引き続き、標準的な基質の変換における反応初速度をGrams, F., et al., FEBS 335(1993)76-80に類似の方法によって測定する。
【００６４】
結果をインヒビター濃度に対して相互反応速度をプロットすることによって評価した。阻害定数（Ki)をDixon, M., Biochem. J. 55(1953)170-202に従ったグラフ法によって横軸のマイナス切片として得る。
【００６５】
合成のコラゲナーゼ基質は、そのC末端でDNP（ジニトロフェノール）と結合するヘプタペプチドである。該DNP残基は、上記ヘプタペプチドに隣接するトリプトファンの蛍光を立体障害によって消光する。DNP基を含むトリペプチドの開裂後、トリプトファンの蛍光が増加する。したがって、上記基質のタンパク分解性の開裂は蛍光値によって測定することができる。
【００６６】
ａ）  第一の方法
【００６７】
アッセイは、微量の重金属を除去するためにジチオゾーンで処理した新たに調製した50mMトリス緩衝液（pH8.0）中で25℃で実施する。4mMCaCl2を添加し緩衝液をアルゴンで飽和させる。アダマリシンIIの原液を硫酸アンモニウム懸濁液からのタンパクの遠心分離、続くアッセイ緩衝液での希釈によって調製した。酵素濃度をuv測定によって（ε280＝2.8×104M-1cm-1、ε288：2.2×104M-1.cm-1）決定し、原液を低温保存する。この溶液を最終的に16nMのアッセイ濃度を得るように1：100に希釈した。52μMのKmを有する蛍光基質DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2を21.4μMの濃度で使用し；Ki決定のためには12.8μMの濃度もまた使用した。基質の蛍光をそれぞれλ＝320及び420nMの励起及び発光波長でサーモスタットセルホルダーを備えた蛍光光度計（Perkin Elmer, Model 650-40）で測定した。基質の加水分解は、酵素添加直後から10分間モニターした。すべての反応を少なくとも３連で実施した。IC50値をシンプルロバストウエイティング（simple robust weighting）を用いた非直線回帰によってvi/vo[インヒビター濃度]のプロットから計算した一方、インヒビターのKi値をvo/vi[インヒビター濃度]のプロットから得られた直線の交点から計算した。
【００６８】
ｂ）  第2の方法
【００６９】
アッセイ緩衝液：
50mMトリス／HCl pH7.6（トリス＝トリス-（ヒドロキシメチル）-アミノメタン）
100mM NaCl/10mM CaCl2/5% MeOH（必要に応じて）
酵素：8nM ヒト好中球コラゲナーゼの触媒ドメイン（Met80-Gly242）（MMP-8)
基質：10μM DNP-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2
総アッセイ容量：１ml
【００７０】
アッセイ緩衝液中の酵素及びインヒビターの溶液（25℃）を調製した。反応を溶液中に基質を与えることにより開始した。蛍光基質の開裂をそれぞれ280及び350nMの励起及び発光波長で蛍光分光法によって追った。インヒビター濃度として計算したIC50値は、インヒビターなしの反応に比較して反応速度を半分に減少させるのに必要な濃度である。
【００７１】
表１はヨーロッパ特許出願第EP0869947号に記載の例26からの化合物および好ましい化合物no．118の比較におけるIC50を示す。
【００７２】
【表２】
2004533425.tif 000008
【００７３】
参考文献のリスト
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Dixon, M., Biochem. J. 55(1953)170-202
ヨーロッパ特許出願第EP0869947号
ヨーロッパ特許出願第EP-A0320118号
ヨーロッパ特許出願第EP-A0489577号
ヨーロッパ特許出願第EP-A0497192号
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【国際公開パンフレット】
2004533425.tif 000011
2004533425.tif 000012
2004533425.tif 000013
2004533425.tif 000014
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2004533425.tif 000026
2004533425.tif 000027
2004533425.tif 000028
2004533425.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533425.tif 000030
【国際調査報告】
2004533425.tif 000031
2004533425.tif 000032