(57)【要約】本発明は、特異的に開裂されることができるペプチドを、所定のアミノ酸配列を使用して、核酸ペプチド融合分子のライブラリーに基づいて検出し同定する方法に関する。前記方法によれば、様々なペプチド部分は、それぞれそれに繋がる核酸によりコードされ、タンパク質分解活性溶液が使用される。本発明は、化学活性成分の増大した放出のため及び診断のための前記ペプチドの使用に関する。
2004507240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にタンパク質分解性である開裂性ペプチドを同定する方法であって、下記各工程を含んでなる方法：
ａ）ペプチドと前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子のライブラリーをタンパク質分解活性試料と共にインキュベートすること；
ｂ）前記融合分子のタンパク質分解的に外れた部分を単離すること；
ｃ）取り出された該融合分子の該核酸部分の配列を決定すること。
【請求項２】
特異的にタンパク質分解性である開裂性ペプチドを同定する方法であって、下記各工程を含んでなる方法：
ａ）　ペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子のライブラリーをタンパク質分解活性試料と共にインキュベートすること；
ｂ）　融合分子の同じライブラリーを対等混合物にして、少なくとも１つのタンパク質分解活性比較試料と共にインキュベートすること；
ｃ）　前記融合分子のタンパク質分解により外れた部分を単離すること；
ｄ）　差違ある核酸のバンクを構築すること；
ｅ）　測定された該核酸の配列を決定すること。
【請求項３】
特異的にタンパク質分解性である開裂性ペプチドを同定する方法であって、下記各工程を含んでなる方法：
ａ）　ペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子のライブラリーをタンパク質分解活性予備試料と共にインキュベートすること；
ｂ）　開裂によって外れた該融合分子部分を取り出すこと；
ｃ）　このようにして調製されたライブラリーをタンパク質分解活性試料と共にインキュベートすること；
ｄ）　タンパク質分解性開裂により外れた該融合分子部分を単離すること；
ｅ）　該外れた融合分子の該核酸部分の配列を決定すること。
【請求項４】
ペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなり且つ公知ヌクレオチド配列が一方の側又は両側へフランクした融合分子のライブラリーが使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドを含んでなる融合分子のライブラリーであって、該ペプチドがピューロマイシン分子を介してポリＡ核酸配列に連結しこれが前記ペプチドコーディング領域及び１又はそれを超える公知核酸配列に繋がる融合分子のライブラリーが使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも４つの可変アミノ酸配列により構成されるペプチドを含んでなる融合分子が使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
７〜１１の可変アミノ酸配列により構成されるペプチドを含んでなる融合分子が使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
融合分子が使用され、それらは、前記可変配列領域に加えて少なくとも１つの連続する配列領域を有するペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標識された核酸部分及び／又はペプチド部分を有する融合分子が使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸部分及び／又はペプチド部分の磁性標識、放射性標識、蛍光標識を有するか、又は特定の公知核酸配列及び／又は公知の特定アミノ酸配列を含む標識を有する融合分子が使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライブラリーの融合分子を固体表面に付着させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライブラリーの融合分子を固体粒子に付着させる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記公知核酸配列が制限酵素により切断され、切り離された又は切り出された該核酸部分のみが更に使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質分解活性試料により切断された前記融合分子部分を単離した後、その核酸部分を倍増させるためにＰＣＲが行われる、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅された核酸が融合分子の新たなライブラリーを構築するために使用され、請求項１〜３のいずれかに記載の方法サイクルが前記ライブラリーを使用して行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質評価のための、請求項１４に記載の方法であって、そのＰＣＲ、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、及び／又はそのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を増大させたエラー率で行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
使用される前記タンパク質分解活性試料、予備試料及び比較試料が、細胞全体の抽出物、細胞質抽出物、膜抽出物、細胞外抽出物、亜細胞抽出物、前記抽出物の組合わせ、又は公知プロテアーゼの溶液である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
使用される前記試料、予備試料及び比較試料が、疾患特異的及び／又は組織特異的及び／又は器官特異的及び／又は生物特異的抽出物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
使用される前記タンパク質分解活性試料及び／又は予備試料が生理的条件下で該方法に使用される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
更なる補助物質が、前記試料及び／又は予備試料に加えられる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
加えられる前記補助物質が、特異的に作用するプロテアーゼ阻害剤及び／又はヌクレアーゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
可能性のあるプロテアーゼ阻害剤又はプロテアーゼ活性化剤が前記試料に加えられる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法の工程が繰り返されるか、又は異なるインキュベーション期間及び／又は異なる試料濃度で繰り返される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により決定された核酸配列の、特異的にタンパク質分解性である開裂性物質を調製するための使用。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により得ることができるペプチドを含んでなる特異的にタンパク質分解性である開裂性物質。
【請求項２６】
化学的に活性な物質を含んでなる、請求項２５に記載の特異的タンパク質分解性開裂性物質。
【請求項２７】
前記化学活性物質がタンパク質分解放出により活性化可能である、請求項２６に記載の特異的タンパク質分解性開裂性物質。
【請求項２８】
該物質に更なる補助物質及び添加物が加えられている、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の特異的タンパク質分解性開裂性物質。
【請求項２９】
請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の特異的タンパク質分解性開裂性物質の、喘息、骨粗鬆症、癌、卒中、神経障害、関節炎、膵臓炎、高血圧、血栓症、感冒、又は住血吸中症のための医薬を製造するための使用。
【請求項３０】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法により得ることができるタンパク質分解性開裂性ペプチドを含んでなる診断用マーカー。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異的作用性プロテアーゼを検出するための方法であって、請求項３０に記載の診断用マーカーを含んでなる方法。
【請求項３２】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により決定された特異的タンパク質分解性開裂性ペプチドを含んでなる物質の、前記ペプチドを開裂する該プロテアーゼを同定するための使用。
【請求項３３】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により決定された特異的タンパク質分解性開裂性ペプチドの、プロテアーゼ阻害剤を同定するための使用。
【請求項３４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により決定された特異的タンパク質分解性開裂性ペプチド配列の、阻害剤を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、所定のアミノ酸配列を有し特異的に開裂性であるペプチドをタンパク質分解活性溶液を使用することによりに見出し且つ同定する方法、及び化学活性物質の特異的放出のため及び診断のための前記ペプチドの使用に関する。
【０００２】
ＵＳ５９８１２００は、特異的な開裂性ペプチドをそれがタンパク質分解的に開裂したときに蛍光を発する特定のタンパク質構造を使用することにより検出する方法を記載している。その方法は、蛍光共鳴エネルギー技法（ＦＲＥＴ）に基づくものである。この方法は、タンパク質開裂発生のｉｎ ｖｉｖｏ検出のために使用されることもできるという利点を有する。その一方、不利な点は、特定のペプチドしか標識できないという事実、或いは異なる標識タンパク質を調べている場合にその開裂物を関連配列と正確に結びつけるのが非常に複雑であろうという事実にある。前記方法は、検出可能なシグナルを得るために比較的多量の標識基質が使用されなければならないという別の不都合を有する。
酵素基質の選択的同定に使用し得る他の方法は、ファージ提示である（例えば、ＷＯ９７／４７３１４に示されている）。この方法は、ファージ提示ペプチドライブラリーが、他の表面呈示ペプチドライブラリーとは対照的に、異ならしめ得る配列数が少なく、それに続くファージ粒子の取得と同定基質の決定が比較的複雑であるという不都合を有している。
【０００３】
本発明の目的は、特異的にタンパク質分解性である開裂性ペプチドを見出し且つ同定する方法を開発すること、及び化学活性物質の標的化放出を可能にする物質を提供することである。
その目的は、特異的にタンパク質分解性である開裂性ペプチドを同定する方法であって、下記の各工程を含んでなる方法により達成される：
ａ）ペプチドと前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子のライブラリーをタンパク質分解活性試料と共にインキュベートすること；
ｂ）前記融合分子のタンパク質分解的に外れた部分を単離すること；
ｃ）該単離された融合分子の該核酸部分の配列を決定すること。
【０００４】
本発明の方法は、表現型ペプチド部分及び前記ペプチド部分をコードする配列を有する遺伝子型核酸部分を含む融合分子を使用することに基づいている。ペプチド部分は、適したリンカーを介して核酸部分と連結している。使用されるリンカーは、好ましくは、タンパク質アクセプター、例えば、核酸部分に共有結合するピューロマイシンである。リンカーは、例えば、非コード核酸配列、好ましくは、ポリＡ配列のような更なる構成部分を含んでなってもよい。好ましい態様では、その核酸部分は、その配列に連続しており且つそのコーディング領域の一方側又は両側にある更なる領域を含む。これらの連続核酸領域は、例えば、ＲＣＲを行うためのプライマー結合領域として或いは制限酵素開裂部位として役立ち得る。このため、更なる連続コーディングヌクレオチド配列を付加し得る。その連続核酸配列は、融合分子のペプチド部分が固体表面に容易に付着されることを可能にするか又は関心のある構造エレメントを生じさせるペプチドセクションをコードし得る。そのような構造エレメントの例は、抗体のためのエピトープ、それら構造体を精製するため若しくは検出するためのタグ、又は特定の第三の構造を決定するエレメントである。
【０００５】
そのような融合分子は、タンパク質アクセプター、例えばピューロマイシンが適したリンカーを介して核酸、好ましくはＲＮＡに結合した系を記載する、例えばＷＯ９８／３１７００に従って調製し得る。これは、そのＲＮＡの対応タンパク質へのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳が終わる直前に、その合成タンパク質をそのコーディングＲＮＡに結合させて、それをより詳細に特徴付けることを可能にする。本発明に使用できる同等の系の例は、ＤＥ １９６４６３７２Ｃ１、ＷＯ９８／１６６３６、ＵＳ ５８４３７０１、及びＷＯ９４／１３６２３に記載されている。
【０００６】
本発明の方法の好ましい態様において、その融合分子は、それらのペプチド部分を解して表面（支持体）に付着する。“支持体”という用語は、本発明によると固体又はゲル様形態で存在する材料を意味する。適する支持体材料の例は、セラミック、金属、特に半導体、貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性材料、又はその支持体の、特に前記材料の薄層、及びセルロース及び構造タンパク質のような（生体）分子フィラメントである。しかし、適する支持体は、フラットな材料だけでなく、例えば、タンパク質を流すことができるカラムクロマトグラフィーのための材料、又は有機ポリマー製のビーズのような粒子でもよい。支持体は、一般的には、共有結合的に、準共有結合的に、超分子的に（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ）又は物理的に詰め込まれる。
【０００７】
融合分子のペプチド部分は、支持体に付着し得るもので、それは、そのような付着を媒介できる金属結合ドメイン（例えば、Ｈｉｓタグ）、末端システイン残基、又は特異的抗体により認識可能であるエピトープを有するドメインのような、ビオチン−ストレプトアビジン結合性であるが特異的ではないドメインを介する。
本発明の方法においては、融合分子がそのペプチド配列の可変部分に関して可能な組み換え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むライブラリーへ与えられるのが好ましい。そのような融合タンパク質の実際に取り扱い可能なライブラリーは、サイズで約１０１３の異なる配列であるから、他の知られているペプチドライブラリーの１０３〜１０４倍（例えば、ファージディスプレイ）又は１０６〜１０４倍である。すべての組み換えを網羅するために、１１アミノ酸未満の可変ペプチド部分へ与えられるのが好ましく、そして特に、７又は８アミノ酸の構成の可変ペプチド部分へ与えられるのが好ましい。もちろん、その融合分子がより長い可変ペプチド部分を有するライブラリーを構築することも可能であるが、しかしこの場合、もはやその広範で多様な配列を完全に網羅することはできない。今日知られているプロテアーゼで特定のペプチド結合を開裂させるものは、少なくとも４アミノ酸の認識配列を要求するので、少なくとも４アミノ酸の可変ペプチド部分を含むライブラリーへ与えられるのが好ましい。
【０００８】
融合分子のライブラリーは、溶液であるか又は好ましくは支持体に付着しているタンパク質分解活性試料に曝される。適したタンパク質分解活性の試料、予備試料（ｐｒｅｓａｍｐｌｅ）又は比較試料（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓａｍｐｌｅ）は、特に、動物、ヒト、又は植物源の組織特異的抽出物、例えば、細胞質抽出物、亜細胞抽出物、膜構成物の抽出物、細胞外抽出物のような特定細胞区画の抽出物、又はそのような抽出物の混合物である。また、特に関心あるものは、罹患した組織、例えば癌腫の抽出物である。しかし、生物体、特にウイルス、細菌又は原生生物のような微生物の全タンパク質分解活性又はその一部を代表する抽出物を使用することもできる。使用され得るタンパク質分解活性の試料、予備試料又は比較試料は、公知のプロテアーゼを含有する溶液でもよい。
【０００９】
ライブラリーは、タンパク質分解活性試料と共に、好ましくは生理学的条件下で、好ましくは０℃〜４５℃の温度でインキュベートする。この目的のために、それらのタンパク質分解活性について試験される抽出物を直接使用してもよいし、それら抽出物を、例えば生理食塩水のような適した溶剤中に取ってインキュベーションに使用してもよい。
インキュベーションの間、その試料中に含有されているプロテアーゼが、融合分子の可変ペプチド部分を開裂させる。これは、使用された試料抽出物に特徴的である特異的タンパク質分解開裂パターンをもたらす。開裂によって外れたその融合分子部分は、その核酸部分によりコードされている。
ライブラリーを検討すべきタンパク質分解活性試料と共にインキュベートした後、タンパク質分解性開裂によって外れた融合分子部分を単離し、そしてそのコーディング核酸部分の配列を決定する。これで、前記試料により開裂可能なペプチド配列が同定される。
【００１０】
ライブラリー及びタンパク質分解活性抽出物の溶液でのインキュベーションの後、切断された融合タンパク質は、次のようにして単離することができる。それら切断された融合タンパク質の核酸領域は、例えば、特定のペプチド部分内の連続的な構造的特徴の使用、例えば、タンパク質分解性開裂に起因してその核酸部分を含む融合分子の残部へもはや連結しなくなる抗体のための公知のエピトープの使用により、未切断融合タンパク質のそれらから単離することができる。この目的のために、その混合物は、例えば、前記抗体を使用することによってアフィニティクロマトグラフィーにかけられる。結合できない切断融合タンパク質の核酸部分は、その未切断タンパク質の核酸から分離されて、その溶出物中に存在する。また、例えば、その取出しのためのＨｉｓタグ又はＳｔｒｅｐタグのような他の構造的特徴を使用してもよい。そのアフィニティマトリックス上に保持された融合分子は、溶出させ更に溶液で使用されてもよし、好都合なことに、その付着状態で直接使用されてもよい。
その付着ライブラリーの抽出物とのインキュベーションの後、各種方法を使用して、切断された融合タンパク質を単離してもよい。
【００１１】
本発明の好ましい方法では、付着ライブラリーの抽出物とのインキュベーション後、それら切断融合分子の核酸部分が溶出物中に直接得られる。
最も簡易なケースでは、それら開裂ペプチドの配列は、溶出物中に存在する開裂融合タンパク質の核酸部分のＰＣＲ増幅により直接同定し、次いでクローニング及び配列決定することができる。しかし、先ず、最初の別のアフィニティクロマトグラフィー及び開裂した融合タンパク質のペプチド部分又は核酸部分内の特定構造の使用により、その溶出物中に存在する他の成分から、それら開裂融合タンパク質を精製することも可能である。例えば、ＫＯＨ溶液とのインキュベーションによって開裂融合タンパク質をクロマトグラフィー材料から溶出させた後、それら開裂融合タンパク質は、ＰＣＲ、クローニング及び配列決定により、やはりシークエンスされ得る。
【００１２】
これに加えて、タンパク質分解開裂によって外れたそれら融合分子部分を単離するためには、多くの更なるクロマトグラフィー又は電気泳動法が可能である。この目的のために、融合分子はより容易な同定のために標識されるか又は修飾されると好都合である。従って、例えば、融合分子の核酸部分は、例えば、蛍光標識されてもよいし、放射性標識されてもよい。融合分子の核酸部分の磁性標識（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｌａｂｅｌｉｎｇ）は特に好ましく、それは蛍光標識又は放射性標識と関連付けて使用してもよい。開裂によって外れた融合分子部分は、非常に容易且つ選択的に、磁性で単離し得る。そのタンパク質分解パターンは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ又はＮａｎｏｇｅｎから入手可能なようなバイオチップ上でのそれら単離核酸配列のハイブリダイゼーションを介して評価される。こうして、開裂によって外れた各種核酸配列を含む融合分子部分の単離された混合物を直接分析することが可能である。
【００１３】
検討すべき抽出物を調製する時、それらプロテアーゼをそれらの活性形態で単離することに注意を払わなければならない。しかし、それと同時にＤＮＡ分解ヌクレアーゼをできる限り不活性化すべきである。
この目的のために、タンパク質分解活性試料は、次のようにして機械的に用意し得る。完全な組織が単離され、ここで適切には、冷えた緩衝液中でその外側を洗浄することによる（５０ ｍＭトリス−ＨＱ ｐＨ ７．５， ２ ｍＭ ＥＤＴＡ， １５０ ｍＭ ＮａＣＩ， ０．５ ｍＭ ＤＴＴ； Ｄｉｇｎａｍ， Ｊ．Ｄ．， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｆｒｏｍ： Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍ．Ｐ． （ｅｄ．） Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９９０）． Ｐａｇｅ １９４２０２）。その組織を冷えた緩衝液中で切り上げ、ここで適切には、たとえば、結合組織、皮膚及び血管のような構成部分から取り出される。その組織片は、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｈ．， Ｆｕｊｉｓｈｉｒｏ， Ｓ．， Ｔｅｒａｏ， Ｔ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９９４） ５４， ６５３９６５４８）によるホモゲナイゼーション緩衝液（０．０１ Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液， ｐＨ ７．２， ０．２５ Ｍ スクロース， ０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、容量比１：２〜１：５ （ｗ／ｗ））と混合し、氷冷しながら適切な組織ホモゲナイザー（下記参照）中のホモゲネートに処理する。本法は、その望ましい組織タイプに適用されなければならない。適する組織ホモゲナイザーの例は：
−ミキサー：肝臓は、例えば、ミキサー内に容易に仕込むことができ、次いで、密なメッシュのナイロンネットを通してこす。細かい組織ホモゲネートが形成される。
−“Ｐｏｔｔｅｒ”ホモゲナイザー：回転ガラス棒がフィットする容器内にきつく挿入され、その容器壁とそのガラス棒の間で組織が破壊される、絶え間ない冷却を確保しなければならない。
−分散器：シャフトに回転ブレードを持つホモゲナイザー
【００１４】
ホモゲナイズした組織を更なるホモゲナイゼーション緩衝液と混合し、そして、４〜８℃で４５分間振動させながらインキュベートする。次いで、その組織ホモゲネートを４℃及び１６，０００ｇで遠心分離させ、そして、その上澄みを、直接的に又は、例えばカラムクロマトグラフィー若しくは透析を経る更なる精製後に、本発明による分析に使用される。
新鮮な組織の代わりに凍結材料を使用するなら、本法を修飾すべきである。凍結組織は、直ちに解凍すべきではない。この場合、リソソームから放出されたプロテアーゼがそれら酵素を不活性化するからである。好ましくは、その組織を、液体窒素を使用する乳鉢内で絶え間なく冷却しながら粉砕し、その粉末が凍結乾燥機内において一晩で凍結乾燥される。次いで、その乾燥粉末を更に使用することができる。
【００１５】
脳組織とそれの核分画、細胞質分画、膜分画及び細胞骨格分画への分離の適するプロセスの例は、下記の通りである。得られたそれら抽出物は、タンパク質分解活性試料、予備試料又は比較試料として、直接的に又は更なる補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の添加を伴って使用し得る。
脳、例えばマウスからのもので、幾つかの調製物（約５０）を、約２５ｍｌの緩衝溶液１（（ＳＢ１） （２０ｍＭトリス−ＨＣ１ ｐＨ７３； １５０ｍＭ ＮａＣＩ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＥＧＴＡ）に導入し、そして、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用して最大速度で１分間ホモゲナイズする。他のやり方では、少ない材料の場合にＰｏｔｔｅｒガラスホモゲナイザーを使用する。
【００１６】
核分画は、そのホモゲネートを１０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離させることにより単離し得る。その上澄みは、更なる調製のために集められる。その遠心分離物（核ペレット）は、１２ｍｌのＳＢ１中に再懸濁し、そして先のようにして遠心分離させる。その核酸ペレットは、ＳＢ２（２０ｍＭトリス−ＨＣ１ ｐＨ７．５； １５０ｍＭ ＮａＣＩ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＥＧＴＡ， １％ ＮＰ−４０）中に再懸濁する。
集められた上澄みは、細胞質分画を単離して精製するために使用し得る。この目的のために、それらは、１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離させる。それら上澄みは、細胞質タンパク質を含有する抽出物を代表するものである。
【００１７】
膜分画は、取り出す細胞質分画からのペレットをＳＢ１中で３回洗浄し、１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離することにより単離される。その３回目の洗浄工程の後、そのペレットを１５ｍｌのＳＢ２中に再懸濁し、そして、一晩溶解させてから、１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離させる。その上澄みがその膜分画を形成する。
細胞骨格分画は、取り出す膜分画からのペレットをＳＢ２中で３回洗浄し、１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離することにより得られる。その３回目の洗浄工程の後、そのペレットをＳＢ３（１２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５； ０．４％ＳＤＳ）中に再懸濁し、９５℃で溶解させる。これに、２０，８００×ｇで室温で１５分間の最後の遠心分離が次ぐ。その上澄みがその細胞骨格分画を含有する。
【００１８】
分離されたプロテアーゼを含有するタンパク質分解活性抽出物は、細胞又は組織から、例えば、細胞培養物中の単層としてヒト細胞又は細胞系を培養することにより得られる。それら細胞を細胞培養培地で３回洗浄する。次いで、その培地を新鮮な培地と置きかえて、分泌型プロテアーゼをその培地中に３７℃で分泌させる。適した分泌時間は、１〜３時間である。組織片又は組織部分は同じやり方で処理され得る。組織液は、組織集合物から、例えば、器官又は組織をハサミ又はメスで注意深く切り刻むことにより得ることができる。それら組織片を組織緩衝液で数回洗浄する。それら組織片又は他の小器官を生理緩衝液又は培地中に３７℃で１〜３時間インキュベートする。インキュベーションの後、それら細胞片を１５ｍｌ円錐形容器内に沈降させ、そして、その培地は、取り出して更に研究することができる。
【００１９】
別のやり方では、組織を遠心分離管内に写し、穏やかに遠心分離させてもよい。その上澄みは、間質空間からの間質液のプロテアーゼを含有する。
別のやり方では、下記の方法：氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣＩ， ｐＨ７．４； １％ ＮＰ４０， ０．２５％コール酸ナトリウム， １５０ｍＭ ＮａＣＩ， １ｍＭ ＥＧＴＡ， １ｍＭ ＰＭＳＦ， １ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４， １ｍＭ ＮａＦ、そして各々の場合に１μｇ／ｍｌアプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ロイペプチン及びペプスタチン）中で組織を切り刻み、その切り刻まれた組織を凍結させ、それに続けて乳鉢内で破砕することにより、タンパク質抽出物を得ることもできる。その組織は、１〜２の体積比でＲＩＰＡ緩衝液を加えることによりホモゲナイズされ、次いで、その混合物を解凍する。１５分後、その溶解物を１３，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離させる。その溶解物は、等分して急速冷凍（ｓｈｏｃｋｆｒｏｚｅｎ）し、液体窒素中に保存し得る。
【００２０】
更なる修飾法において、未検討試料のタンパク質分解活性を比較試料との比較で測定することができる。タンパク質分解の差違測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）の方法は、下記の各工程を含んでなる：
ａ）　ペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子のライブラリーをタンパク質分解活性試料と共にインキュベートすること；
ｂ）　融合分子の同じライブラリーを少なくとも１つの対等混合物（ｐａｒａｌｌｅｌ ｍｉｘｔｕｒｅ）にして、少なくとも１つのタンパク質分解活性比較試料と共にインキュベートすること；
ｃ）　前記融合分子のタンパク質分解で除去された部分を単離すること；
ｄ）　差違ある核酸のバンクを構築すること；
ｅ）　測定されたそれら核酸の配列を決定すること。
【００２１】
それら融合分子のタンパク質分解的に除去された核酸部分の差違測定は、例えば、その比較試料から単離された過剰量の１本鎖核酸部分を適切な支持体に適用してその支持体のフリー結合部位を飽和させた後、その試料から単離された１本鎖核酸部分とのハイブリダイゼーションによって行われる。取り出された非ハイブリダイズ核酸部分は、当該試料において切断された唯一のペプチド配列を示すものである。
【００２２】
本発明の他の方法では、試料のタンパク質分解活性は、少なくとも１つの予備試料との比較において測定される。融合分子の予備試料及び試料との継続的インキュベーションは、前記予備試料と試料との差違あるタンパク質分解活性を測定することを可能にする。その方法は下記の各工程を含んでなる：
ａ）　ペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなるライブラリーを、少なくとも１つのタンパク質分解活性予備試料と共にインキュベートすること；
ｂ）　開裂によって外れるその融合分子部分を取り出すこと；
ｃ）　このようにして調製されたライブラリーをタンパク質分解試料と共にインキュベートすること；
ｄ）　タンパク質分解開裂によって外れた融合分子部分を単離すること；
ｅ）　その取り出された融合分子の核酸分子部分の配列を決定すること。
【００２３】
本発明の３つの全変法の好ましい態様は、タンパク質分解開裂して単離された融合分子部分の核酸部分がＰＣＲによって倍増される。この目的のために、融合分子は、そのコーディング核酸部分がそのコーディング核酸配列の両側にプライマー結合部位として連続する核酸配列を有するものが使用される。検討された抽出物中に切り出される融合分子の量及びその選択工程（そのタンパク質分解活性抽出物中での開裂）の特異性の双方を大きく上昇させるためには、その開裂した融合タンパク質の単離核酸をＰＣＲにより増幅させること、及びそれをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳することを本発明の方法に与えることが好ましい。このやり方で調製されたＲＮＡから出発して、融合タンパク質の新たなライブラリーを、既に記載した方法により再度調製し且つタンパク質活性物を含有する同じ試料と共にインキュベートする。このサイクルを数回繰り返すことができる。
【００２４】
本発明の方法の更なる変法においては、通常よりも高いエラー率（ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を伴う、記載した１又はそれを超えるサイクルの、ＲＮＡ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことが可能である。これは、試験されるべき取得可能なペプチド配列を増大させる（ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質評価）。
同様に、様々な指向されたｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質評価は、迅速且つ簡易な様式で既知の開裂配列を変化させて、切断するプロテアーゼに関して異なる動態特性を生み出すことを可能にする。
【００２５】
更なる添加物、例えば、特異的に作用するプロテアーゼ阻害剤若しくはヌクレアーゼ阻害剤、又は可能なヌクレアーゼを飽和させる非特異的なＲＮＡ及び／又はＤＮＡをタンパク質活性試料に加えてもよい。例えば、ペプスタチンＡの添加のような前記プロテアーゼに対して特異的に作用する阻害剤の添加は、それら試料抽出物が非特異的に切断を行うリソソーム性又はエンドソーム性プロテアーゼ（アスパラートペプチダーゼのような酸性ペプチダーゼ）を含有する場合、特に推奨される。また、エキソペプチダーゼの特異的阻害は、その試料、比較試料又は全試料に含有されるタンパク質、特にその他のプロテアーゼ及びそれらのペプヂド補助因子の分解を防ぐために好都合である。付加融合分子自体は、Ｎ末又はＣ末のいずれのペプチド終端も存在しないので、エキソプロテアーゼに対する保護がなされる必要はない。タンパク質分解開裂した融合分子のペプチド部分の分解は、本法の更なる進行にとって重要ではない。
【００２６】
融合分子の核酸パッドを保護するための組織抽出物からのヌクレアーゼ活性の除去は、前記組織の取得とそれに続く工程の間に、調製したての組織ホモゲネートをＲＮＡｓｅ阻害剤又はＤＮＡｓｅ阻害剤で既に処置しておくことにより達成され得る。他の態様では、それらヌクレアーゼ阻害剤は、粒子又は適するカラム材料に共有的に会合させ得る。こうして、表面会合したヌクレアーゼ阻害剤に結合するヌクレアーゼは、残存する組織ホモゲネートから除去される。ヌクレアーゼ阻害のための他のやり方は、補助物質による融合分子の核酸部分の保護である。それら補助物質はそのＤＮＡ及びＲＮＡを包んで複合体を形成して、ヌクレアーゼに対する前記ＤＮＡ及びＲＮＡを保護する（Ｋａｔａｙｏｓｅ， Ｓ． （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８７： １６０１６３）。前記補助物質は、特にポリエチレンイミン又はＰＥＧＰＬＬであるが、タンパク質又はシャペロンであってもよい。ヌクレアーゼに対する保護は、同様に、人工合成核酸、例えば、融合分子中のＰＮＡを使用することによっても可能である。安定性を増大させるために、それら核酸は、例えば、メチル化により化学的に修飾されてもよい。
【００２７】
ライブラリーと抽出物のインキュベーション時間は、使用された試料のタンパク質分解活性に依存する。拡張的態様では、本発明の方法は、変動するインキュベーション時間で繰り返し行われる。この利点は、その試料及び融合分子のライブラリーを含めてそれらのペプチド物質に関する動態提示を可能にする。短いインキュベーション時間でタンパク質分解開裂したペプチド物質は、タンパク質分解活性試料成分について高い比定数（ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を有する。
その試料のタンパク質活性についての動態提示を行うためのもう一つの可能性は、それらペプチド物質を構築するライブラリー融合分子の濃度を変動させるか、好ましくは、その試料のインキュベーションのために意図された濃度を変動させることのいずれかである。
【００２８】
本発明の方法の大きな利点は、検討される試料のタンパク質活性を現象学的に、すなわち当該試料のタンパク質分解活性のすべてを知ることなしに、示すことができるという事実である。多様な試料を比較する場合、異なるタンパク質分解活性が多様なプロテアーゼの存在に基づくものか又はむしろ希であるプロテアーゼの直接的変異に基づくものか否か、或いはそれがプロテアーゼ遺伝子の不完全な制御又はプロテアーゼ阻害剤又はプロテアーゼ活性化剤により引き起こされたものか否かは問題ではない。本法は、細胞外シグナルを介して誘導されたタンパク質分解活性における切り替わり（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を記録することもできる。例えば、ホルモンのようなリガンドの膜貫通レセプターへの結合が細胞内の細胞質キナーゼ及び／又はホスファターゼ活性を変化させることができることが知られている。ホスフォリレーションの程度は、細胞内の酵素活性の制御における決定的な部分を担うので、プロテアーゼ活性へ決定的な影響を与える。脱制御化された細胞間のホスファターゼ活性及びそれらと関連したプロテアーゼ活性は、例えば、癌の形成において決定的な部分を担う。
【００２９】
特に有利なことは、健常組織と罹患組織の抽出物、及び健常組織と病原体に感染したものの抽出物に関して差違的で、特異的に開裂性であるペプチドの測定である。個々の生物を比較した場合の特異的開裂性ペプチドを見出すことは、同様に特に興味深い。
さらには、本発明の方法は、検討される試料により切断されたペプチド配列、特に特異的に切断されたものを迅速且つ簡易に決定するために使用することができる。他方で、検討されたその試料によるタンパク質分解開裂を受けなかった配列を同様にして見出すことができる。
【００３０】
特異的なタンパク質開裂ペプチド配列を同定することのほかに、上記方法は、特異的に作用する阻害剤又は活性化剤を見出すために使用することも可能であり、個々のケースについて阻害されるべきプロテアーゼが知られていることは要求されない。この目的のために、可能性のある阻害剤又は活性化剤を試料溶液に単に加えて、試料と可能性のある阻害剤又は活性化剤を含有する試料との間に差違的なタンパク質分解活性が測定される。開裂した配列の数の減少は阻害を示し、そして、開裂した配列の増加は活性化を示す。
好ましい態様では、阻害剤は、そのタンパク質分解活性試料を使用する幾回かの選択サイクルの後に得られる、融合分子の予め選択されたライブラリーを使用することにより同定される。他のやり方では、本発明の方法により同定された特異的開裂ペプチドを、直接的に阻害剤のスクリーニングのため、例えば、ＦＲＥＴアッセイに使用することも可能である。
【００３１】
このようにして、プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法を利用可能であり、それは迅速且つ簡易に行うことができる。
プロテアーゼ阻害剤の迅速且つ単純なスクリーニングは、その耐性の出現を防ぐために、多くの有効な阻害剤を活性化物質との混合物にして組み合わせることも可能である。
本発明は、さらに、本発明の方法の一つを使用して得ることができるペプチド配列を含有するタンパク質分解開裂性物質に関する。
特異的タンパク質分解開裂性ペプチド配列は、特異的に作用する阻害剤に使用し得る。この目的のために、例えば、タンパク質分解を妨げるために、そのペプチド配列が化学的に修飾されてもよいし、そのペプチド酸の１又はそれを超えるα−アミノ酸がβ−アミノ酸と置換されてもよいし、またＬ−アミノ酸がＤ−アミノ酸と置換されてもよい（例えば、Ｗｅｒｄｅｒ Ｍ． ＆ Ｈａｕｓｅｒ Ｈ． （１９９９） Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ８２， １７７４−１７８３を参照されたい）。本法を使用して同定することができる特異的タンパク質分解開裂性ペプチドは、標的部位で活性物質の選択的放出を達成するためにドラッグデリバリーシステムを構築するのに使用し得る。その標的部位は、例えば、特定の器官、組織、特定の細胞タイプ、亜細胞性構成部分であり得るし、また健常組織と比較して罹患した部分でもよいし、また非感染組織又は細胞と比較して微生物感染した部分でもよい。
【００３２】
プロテアーゼ開裂により活性化されることができる活性物質の場合、その特異的タンパク質分解開裂性物質は、共有結合阻害剤として使用し得る。その特異的タンパク質分解開裂性ペプチドは、活性物質を、例えば、特異的抗体又は特異的レセプターリガンドのような標的指向性リガンドに連結させるためのリンカーとして使用してもよい。しかし、特異的タンパク質分解開裂性物質でクローズする活性物質荷重系（ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ−ｌｏａｄｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を構築することも可能である（Ｍｉｎｋｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８６： １０８１１７）。多様な指向されたｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質評価は、異なる開裂動態を生み出すように公知のペプチド開裂配列を変化させることを可能にする。これは、活性物質放出の時間プロファイルをコントロールすることを可能にする。
【００３３】
結果的に、特異的なタンパク質分解開裂性ペプチドの助力で以て且つ活性物質の標的へコントロールされた放出を介して、疾患部をより効果的にコントロールすることが可能であり、そこでは、健常状態と比較して変動させられた或いは不完全な制御又は特定のプロテアーゼの変異又はそれらの阻害剤により引き起こされたタンパク質分解活性が望ましい作用部位で存在する。乱れたプロテアーゼ活性を持つ疾患の例は、喘息、骨粗鬆症、白血病、乳癌、腸癌のような癌、卒中、アルツハイマー病のような神経障害、関節炎、膵臓炎、高血圧、血栓症、感冒、及び住血吸中症である。
活性物質の標的指向化放出は、その生物体内において変化させられた分布プロファイルのおかげで、前記活性物質の副作用を最小化することができ、且つ使用される活性物質の量を低減することができる。特に興味深いのは、医薬活性成分で、例えば、細菌、真菌、ウイルスに対するもの又は罹患した組織細胞に対するものであるが、除草剤、抗真菌剤又は殺虫剤で使用されてもよい。
【００３４】
本発明の方法の他の用途は、診断用アッセイとしての使用である。そのアッセイは、例えば、癌細胞からの罹患組織と検討すべき試料との間での、例えば、抽出物のタンパク質分解活性の所定の組成物を持つ融合分子ライブラリーに向けてのプロファイルの比較に基づくことであり得る。しかし、好ましいのは、比較試料又は予備試料と比較するもので、罹患組織によってのみタンパク質分解開裂可能であるペプチドに基づくアッセイに与えられる。そのような選択的アッセイにおいて、開裂によって外れた融合分子部分の取り出しに続いて意図される配列決定工程は省くことができる。この場合、特定の疾患特異的プロテアーゼ活性の存在がハイブリダイゼーションプローブを使用して同定され得る。そのような方法は、そのようなアッセイにおいて疾患特異的マーカーとして同定された多くの開裂性ペプチドを使用して高度に集積され得る。
【００３５】
他のやり方では、本発明の方法により同定された特異的な開裂性ペプチドを阻害剤のスクリーニングのために直接的に、例えばＦＲＥＴアッセイにおいて使用することも可能である。特異的な開裂性配列は、ＦＲＥＴアッセイのための物質としてｉｎ ｖｉｖｏで使用してもよい。タンパク質分解活性試料によって特異的に開裂されることができるペプチドは、前記ペプチド配列を開裂させるプロテアーゼを単離するために使用してもよい（例えば、Ｌｉ Ｙ．Ｍ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ， ４０５： ６８９６９４を参照されたい）。
例えば、ＵＳ ５８４３７０１は、セリンプロテアーゼを単離するのに適用可能な方法を記載している。セリンプロテアーゼは、タンパク質内のペプチド結合の加水分解を触媒するタンパク質酵素である。頻繁に、その物質内の特異的ペプチドリンケージのためにその標的タンパク質が選択的に切断される。それらセリンプロテアーゼには、とりわけ、組織プラスミノゲンを活性化するもの、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンン、トロンビン、及びプラスミンが含まれる。多くの疾患段階は、例えば、血液凝固障害剤のようなセリンプロテアーゼ阻害剤で処置可能である。エラスターゼ阻害剤は、気腫の臨床上の進行を抑えることができる。
【００３６】
プロテアーゼは、上記した方法により決定された特異的なタンパク質分解開裂性ペプチドをカラム材料にカップリングすることにより、例えば、標準的手法を使用してタンパク質分解活性試料のアフィニティクロマトグラフィーを前記カラム材料上で行うことにより、単離し得る。それら結合サイクルの間に使用される緩衝液は、そのプロテアーゼが不活性化するように変性させてはならない。それらペプチドと相互作用するプロテアーゼは、必要であれば、追加的に、一般的な架橋法を介してそれら付着ペプチドに結合させることができる。この目的のためには、特異的に認識可能であるが、プロテアーゼによって開裂可能ではないβ−アミノ酸含有開裂配列を使用することも可能である。
本発明は、下記の幾つかの例示態様により明らかにされる。
【００３７】
実施例１
公知のプロテアーゼ開裂部位を持つペプチド及び前記ペプチドをコードする核酸を含んでなる融合分子の調製
一般的記載
２タイプの融合分子を調製した。第１の融合分子は、プロテアーゼトロンビンにより特異的に開裂されるペプチド配列を含有するもの（“トロンビン融合分子”）とし、第２の融合分子は、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＭ−３）により特異的に開裂されるペプチド配列を有する融合分子（“ＭＭＭ−３融合分子”）とした。このタイプの融合分子の調製は、例えば、ＷＯ９８／３１７００に記載されている。
このやり方で調製されたそれら融合分子は、ＭＭＭ−３のための又はトロンビンのためのプロテアーゼ開裂部位を有する。
ＭＭＭ−３プロテアーゼは、ＧｌｕとＬｅｕとの間を切断し、トロンビンプロテアーゼは、ＡｒｇとＳｅｒとの間を切断する。使用されたそれらペプチド配列及び対応するヌクレオチド配列は下に列挙した通りである。
【００３８】
【表１】
2004507240.tif 000003
【００３９】
１．１　ＭＭＰ３鋳型ＤＮＡ及びトロンビン鋳型ＤＮＡのＰＣＲを経た調製
２５０ｎｇのＤＮＡ鋳型、２５ｐｍｏｌの５’と３’プライマー、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液及び５ Ｕ／μｇ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを、５０μｌ反応混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡからの緩衝液と酵素）に組み合わせた。そのＰＣＲを、Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｙｃｌｅｒ内で行った：１ ｍｉｎ ９４℃， ２１×（０．５分 ９４℃、０．５分 ５５℃、０．５分 ７２℃）。
【００４０】
【表２】
2004507240.tif 000004
【００４１】
図１は、２％アガロースエチジウムブロマイドゲル上のＰＣＲ産物を示す。レーン１：５０ｂｐ ＤＮＡマーカー、レーン２：ＭＭＰ３ ＤＮＡ、レーン３：トロンビンＤＮＡ、レーン４：１００ ｂｐ ＤＮＡマーカー
図１が示すように、ＭＭＰ３ ＤＮＡ及びトロンビンＤＮＡは、首尾良く増幅された。そのＰＣＲ産物は、予期されたＭＭＰ３ ＤＮＡに関する１９９ｂｐ及びトロンビンＤＮＡに関する１８９ｂｐの分子量を有する。
【００４２】
１．２　ＭＭＰ３及びトロンビンＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
１００ ｐｍｏｌのＤＮＡをその転写反応に使用した（Ｒｉｂｏｍａｘ Ｔ７／Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）。そのＤＮＡを、５×Ｔ７緩衝液、ｒＮＴＰｓ及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に５００μｌ混合物にして、３７℃で４時間インキュベートとした。
ＲＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出により精製され、そして、６％尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ Ｇｅｌ／ Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ， Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で分析された。
図２は、６％尿素ゲル上の転写後に得られたＲＮＡを示す。レーン１：ＭＭＰ３ ＲＮＡ、レーン２：トロンビンＲＮＡ
図２が示すようにＲＮＡは、予期されたようにその転写反応の後に検出できる。そのＲＮＡは分解していない。
【００４３】
１．３　ＲＮＡのピューロマイシンリンカーでのＵＶ架橋を介したライゲーション
３ｎｍｏｌのＲＮＡ、その配列を有する４．５ｎｍｏｌのピューロマイシン（Ｐｕ）リンカー（ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール、Ｐｓｏ＝ソラレン）
【００４４】
【表３】
2004507240.tif 000005
【００４５】
（Ｉｎｔｒｅｒａｃｔｉｖａ／Ｕｌｍ）、１２μｌの１０×リガーゼ緩衝液（１Ｍ ＮａＣＩ， ２５０ｍＭトリス ｐＨ ７．５）を１２０μｌ混合物に組み合わせて、８５℃で５分間次いで室温で１０分間インキュベートした。ＵＶ架橋は、３６６ｎｍで１５分間行った（ＬＴＦ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ， １２ Ｗによる手持ちＵＶ ランプ）。
ライゲーション効率は、５％尿素アガロースゲル上で確認された。
図３は、５％尿素ＴＢＥゲル上でのライゲーション反応の分析を示す。レーン１：ＭＭＰ３ ＲＮＡ、レーン２：ピューロマイシンリンカーを持つＭＭＰ３ ＲＮＡ、レーン３：トロンビンＲＮＡ、レーン４：ピューロマイシンリンカーを持つトロンビンＲＮＡ（そのシグナルＬは有色マーカーによるものである）
そのＲＮＡへのピューロマイシンリンカーのライゲーションの後、その分子量の明白な増大が観測され、トロンビンＲＮＡ及びＭＭＰ３ ＲＮＡが首尾良くピューロマイシンに連結していることを示す。
【００４６】
１．４　Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
８μｌのリンカーＲＮＡを２００μｌの赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ Ｌ４１６Ｘ）と混合し、５μｌの３５Ｓメチオニン（Ｈａｒｔｍａｎｎ， １０．８μＭ， 特異的活性：その特異的活性は７２１８１ ｄｐｍ／ｐｍｏｌ））、６μｌのアミノ酸ミックス（メチオニンなし， １ｍＭ， Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び８０μｌのＨ２Ｏを混合して、次いで、３０℃で３０分間インキュベートする。１３０μｌの２Ｍ ＫＣＩ及び７５μｌのＭｇＣ１２の添加の後、３０℃で３０分間のインキュベーションを行う。得られた融合分子は、オリゴｄＴセルロースを使用して精製された（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）（そのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳混合物の、ポリＡ配列を含有しないそれら全成分の除去）
【００４７】
１．５　逆転写反応
精製された２００μｌ融合分子を２．５μの１００μＭリバースプライマーと混合し、８０℃で５分間インキュベートした。その反応混合物を氷上で冷やした後、５０μｌの５×ストランド緩衝液、２０μｌのｄＮＴＰｓ（各ケースにおいて１０ｍＭ）、２．５μｌのＲＴＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｌｌ（すべてＰｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡからのもの）を加えて、その混合物を４２℃で４０分間インキュベートした。
【００４８】
実施例２
融合分子のトロンビン及びＭＭＰ３による溶液中でのタンパク質分解開裂
調製された融合分子を対応するプロテアーゼと共にインキュベートし、それら反応生成物を分析した（図４）。１０ｎＭ ＭＭＰ３（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、そのＭＭＰ３開裂部位を有する５ｐｍｏｌの融合分子に加えて、その混合物を全容量で１５μｌのＭＭＰ３緩衝液（５０ｍＭトリス ｐＨ７， １５０ｍＭ ＮａＣＩ， １０ｍＭ ＣａＣ１２）中に３７℃で４５分間インキュベートした。１Ｕのトロンビン（１ＮＩＨユニット＝０．３２４μｇ、Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、そのトロンビン開裂部位を有する５ｐｍｏｌの融合分子に加えて、全容量で１５μｌのトロンビン緩衝液（５０ｍＭトリス ｐＨ８， １５０ｍＭ ＮａＣＩ）中に３７℃で４５分間インキュベートした。それら出発融合分子とタンパク質分解開裂後のそれら融合分子を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ後、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して分析した（図４）。
【００４９】
図４は、溶液中のトロンビン及びＭＭＰ−３での融合分子消化を示す：
４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥ後のホスホイメージャー画像
レーン１：消化前の“ＭＭＰ３融合分子”
レーン２：消化前の“トロンビン融合分子”
レーン３：“トロンビン融合分子”＋トロンビン
レーン４：消化前の“トロンビン融合分子”
レーン５：“ＭＭＰ３融合分子”＋ＭＭＰ３
レーン６：消化前の“ＭＭＰ３融合分子”
（バンドｉは融合分子を示し、それらバンドｉｉはペプチド副産物を示し、そして、バンドｉｉｉはＮ末端融合分子フラグメントに由来する。）
その“ＭＭＰ３及びトロンビン融合分子”は、それぞれＭＭＰ−３プロテアーゼ及びトロンビンプロテアーゼによりタンパク質分解開裂された。
【００５０】
実施例３
タンパク質分解開裂した“トロンビン融合分子”の単離と検出、及びその核酸部分の増幅
特異的にタンパク質分解開裂した融合分子は、３つの連続的工程を行うことにより単離され同定された。図５は、特異的開裂ペプチドを同定するための本実施例による方法の工程を概略図で示す。
【００５１】
工程１．融合分子のストレプトアクチン−セファロース（支持材料）へのＮ末端Ｓｔｒｅｐタグ（ｔａｇ）を介したカップリング
工程２．その支持材料上の“トロンビン融合分子”のトロンビンによるタンパク質分解開裂
工程３．開裂したＣ末端融合分子フラグメントの単離、及びその核酸部分のＰＣＲ増幅後の前記フラグメントの検出
場合により、それら単離したフラグメントは、それらのＨｉｓタグを介して、分析前のニッケル粒子へのアフィニティクロマトグラフィーにより精製し得る。
【００５２】
３．１　“トロンビン融合分子”のストレプトアクチンセファロースへのカップリング
５０μｌの“トロンビン融合分子”（約５ｐｍｏｌに相当する）を、５×ストレプトアクチン緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣＩ， １００ｍＭ トリス ｐＨ８）中で洗浄した５０μｌのストレプトアクチンセファロースと混合し、そして４℃で２時間インキュベートした。未結合の融合分子は、ストレプトアクチン緩衝液で５回洗浄することにより除去された。
【００５３】
３．２　“トロンビン融合分子”のトロンビンによるタンパク質分解消化
ストレプトアクチンセファロースに結合した融合分子を、８０μｌの水中に再懸濁し、そして１０μｌの１０×トロンビン緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣＩ， ５００ｍＭ トリス ｐＨ８）及び１０μｌの１００Ｕ／μｌトロンビンと共に３７℃で４５分間インキュベートした。コントロールとして、同じ反応をトロンビン無しで行った。
【００５４】
３．２．１　結合した“トロンビン融合分子”の単離と検出
そのインキュベーション期間後、それら反応混合物を遠心分離させた（３０００ｒｐｍで１分間）。開裂した融合分子のＮ末端フラグメントを含有するペレット化ストレプトアクチンセファロースをストレプトアクチン緩衝液で３回洗浄し、次いで、８０μｌの水中に再懸濁した。ストレプトアクチンセファロースと結合した“トロンビン融合分子”（コントロール混合物）又はトロンビンとのインキュベーション後のストレプトアクチンセファロース結合Ｎ末端フラグメントをＳＤＳ ＰＡＧＥにより画分し、ホスホイメージングにより可視化した（図６）。
【００５５】
図６は、“トロンビン融合分子”及びストレプトアクチンセファロースと結合した融合分子フラグメントを示す。１５μｌの再懸濁化ストレプトセファロースを各ケースで５μｌのＬａｍｍｌｉ ｌｏａｄｉｎｇ緩衝液と混合し、８２℃で５分間加熱し、そして、４〜２０％トリス　グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥにより画分した。次いでそのゲルを８０℃で２時間乾燥させ、ホスホイメージングにより可視化した。
【００５６】
レーン１：トロンビンとインキュベーション後の“トロンビン融合分子”
レーン２：トロンビンとのインキュベーションをしていない“トロンビン融合分子”（コントロール）
（バンドｉは無傷の融合分子を示し、バンドｉｉはペプチド副産物からのものであり、そして、バンドｉｉｉはＮ末端融合分子フラグメントに由来する。）
“トロンビン融合分子”をトロンビンとインキュベートした後は、そのＮ末端フラグメント（３５Ｓ−メチオニンで標識されたもの）だけがストレプトアクチンセファロースと結合したままである。
【００５７】
３．２．２　“トロンビン融合分子”の核酸部分のＰＣＲ分析による検出
ストレプトアクチンセファロースを除去した後、その１５μｌの上澄み又は１５μｌの再懸濁したストレプトアクチンセファロースをＰＣＲに使用した。それら１５μｌ試料のほかに、その５０μｌのＰＣＲ混合物には、５μｌの５’と３’トロンビンプライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、及び５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡからの緩衝液と酵素）も含ませた。その増幅は、下記の条件下：１分 ９４℃、２１×（０．５分 ９４℃、０．５分、５５℃ ０．５分 ７２℃）で行われた。得られたＰＣＲ産物を図７に示す。
【００５８】
図７は、２％アガロースゲル電気泳動後の“トロンビン融合分子”のＰＣＲ産物を示す。レーン１及び２は、それら産物を、明るいバックグラウンド上の黒色シグナルとして示し、レーン３及び４は、それら産物を、異なる画像技術により暗いバックグラウンド上の白色シグナルとして示す。
【００５９】
レーン１：“トロンビン融合分子”＋トロンビン；上澄み
レーン２：“トロンビン融合分子”トロンビンなし（コントロール）；上澄み
レーン３：“トロンビン融合分子”＋トロンビン；ストレプトセファロースと結合したもの
レーン４：“トロンビン融合分子”トロンビンなし；ストレプトセファロースと結合したもの
【００６０】
結果的に、“トロンビン融合分子”はトロンビンとのインキュベーションにより切断されたことが示される。核酸部分を有しないＮ末端フラグメントを除去した後、そのＣ末端部分はその上澄みに残る。従って、強力なＰＣＲ増幅物がその上澄み中に得られるが（例えば、レーン１、図７を見よ）、そのペレット中には非常に弱いＰＣＲ増幅物のみ得られる（例えば、レーン３、図７）。コントロール反応においては、“トロンビン融合分子”はトロンビンとインキュベートされなかった。従って、それら融合分子はストレプトアクチンセファロースに結合したままで、強力なＰＣＲ増幅物がそのペレット中に得られるが（例えば、レーン４、図７）、その一方、その上澄みのＰＣＲ増幅は非常に弱い（例えば、レーン２、図７）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２％アガロースエチジウムブロマイドゲル上のＰＣＲ産物を示す。
【図２】図２は、６％尿素ゲル上の転写後に得られたＲＮＡを示す。
【図３】図３は、５％尿素ＴＢＥゲル上でのライゲーション反応の分析を示す。
【図４】図４は、溶液中のトロンビン及びＭＭＰ−３での融合分子消化を示す。
【図５】図５は、特異的開裂ペプチドを同定するための本実施例による方法の各工程を概略図で示す。
【図６】図６は、“トロンビン融合分子”及びストレプトアクチンセファロースと結合した融合分子フラグメントを示す。
【図７】図７は、２％アガロースゲル電気泳動後の“トロンビン融合分子”のＰＣＲ産物を示す。
【図３】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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