(57)【要約】抗血管形成活性があり、ヒトエンドスタチン断片の配列に対応する配列を有するペプチド。
2004534736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜５０個のアミノ酸を含み、エンドスタチンの配列６〜１７９に対応する配列を有するペプチド、その塩および非毒性誘導体。
【請求項２】
ヒト配列のアミノ酸６〜９２の範囲の配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸６〜６４の範囲の配列を有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
ヒトエンドスタチンの配列中の配列６〜４９、１１〜６４、５０〜９２、９３〜１３３または１３４〜１７９を有するペプチドから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒトエンドスタチンの配列６〜４９を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
適切な担体と混合した請求項１から５に記載のペプチドを含む、薬剤組成物。
【請求項７】
抗血管形成活性がある薬剤を調製するための、請求項１から５に記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトエンドスタチンの断片に対応する配列を有し、抗血管形成活性があるペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
血管形成は、既存の血管からの新しい毛細血管の生長のプロセスである。この現象は、さまざまな生理学的および病原的状態で起こり、腫瘍の増殖および転移物の形成および維持と非常に関連がある。
【０００３】
血管形成は、内皮細胞の増殖、転移および分化を含む複雑な多工程のプロセスであり、細胞外マトリックスの分解事象、細管の形成および新しい毛細血管の「出芽」がこれと平行する。
【０００４】
エンドスタチンは、in vitroでの内皮細胞の増殖およびin vivoでの血管形成および腫瘍増殖を特異的に阻害する、分子量が２０ｋＤａであるＸＣＩＩＩコラーゲンのＣ末端断片である。特に、組み換えエンドスタチンを全身投与することによって、マウスにおいて腫瘍の退行が引き起こされる。しかしながら、多量のエンドスタチンの投与、およびその後の生成は、これらの影響を観察するために必要である。さらに、タンパク質は不安定であり、組み換えによって大腸菌中で生成されると、溶解度に関する問題が生じる。エンドスタチンに匹敵する生物学的活性が備わっているが、小さな寸法および高い安定性および溶解度を有する分子の効用が、非常に有用である可能性がある。
【０００５】
FolkmanによってＷＯ９７／１５６６６中に記載された、マウスのエンドスタチンに対応する配列を有するペプチドは、ＷＯ９９／２９８５５、ＷＯ９９／４８９２４およびＷＯ００／６３２４９中で開示されている。
【０００６】
特に、ＷＯ９９／２９８５５(Beth Israel Deaconess Medical Center)は、マウスのエンドスタチンの突然変異体およびペプチド(Ｃ末端領域の９個のアミノ酸１７６〜１８４が欠失している)を開示しており、Ｃ末端領域の配列ＳＹＩＶＬＣＩＥ(１６８〜１７５)によって特徴付けられる、
ＷＯ９９／４８９２４(Children's Medical Center、Ben-Sasson)は、ヒトエンドスタチンの３６〜７０領域に対応する、ＡＨＲ配列(血管形成相同領域)に由来する約１０〜約２８個のアミノ酸を有するペプチドを開示している。エンドスタチンのＡＨＲ配列に対応する１０〜１１個のアミノ酸、および他のタンパク質(ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−４；ＴＳＰ＝トロンボスポンジン)のＡＨＲ配列に対応する他の１０〜１１個のアミノ酸を含むハイブリッドペプチドが、ＷＯ９９／４８９２４中に詳細に記載されている。
【０００７】
最後に、ＷＯ００／６３２４９は、出願人の名前で、マウスのエンドスタチンの配列１〜３９、４０〜８９、９０〜１３４、１３５〜１８４に対応する断片を開示している。前記断片のいくつかは、エンドスタチン分子全体より活性がある。
【０００８】
マウスの配列は、ヒトの配列と約８６％の相同性を有する。
【０００９】
（発明の開示）
２０〜５０個のアミノ酸、およびヒトエンドスタチンの配列６〜１７９に対応する配列を有するいくつかのペプチドは、エンドスタチン自体および前に引用した、知られているペプチドよりも、著しく高い抗血管形成活性を示すことが現在見出されている。
【００１０】
したがって本発明は、前記ペプチド、前記ペプチドを含む薬剤組成物、および抗血管形成活性を有する薬剤を調製するためのこれらの使用に関する。
【００１１】
（図面の説明）
図１は、マウスと比較した、ヒトエンドスタチンの配列を示す図である。
【００１２】
図２は、ヒトエンドスタチンと比較した、ペプチド６〜４９を用いて得られた細胞転移の、阻害のパーセンテージの曲線を示す図である。
【００１３】
図３ａおよび図３ｂは、それぞれペプチド６〜４９、およびヒトエンドスタチンによる、内皮ヒト細胞Ｅａｈｙ９２６中でのＤＮＡ合成の阻害パーセントのグラフ図である。
【００１４】
図４は、in vivoでのマトリゲル・アッセイにおける、ペプチド６〜４９による細管形成の阻害パーセントを示す図である。
【００１５】
図５は、ペプチド６〜４９で治療したＣ５７／ｂ１６マウスに移植した、ゼラチン化したペレット中のヘモグロビン量を測定することによって、in vitroでのマトリゲル・アッセイで得られた結果を示す図である。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明のペプチドは、ヒトエンドスタチンの２０〜５０、好ましくは３０〜４５の配列、配列６〜１７９の任意の領域の近隣アミノ酸を有する。本発明は前記ペプチドの誘導体も含み、これらの誘導体は、元のアミノ酸をＤ系の対応するアミノ酸で置換することによって、および／またはセリン、スレオニン、システイン、チロシン、リジン、アルギニン残基のヒドロキシ、チオまたはアミノ官能基の誘導体化によって、および／または末端ＮＨ2の官能化(たとえば、アセチル基を用いたアシル化)、および／またはペプチドを加水分解酵素に対して安定化させることが可能な知られている技法に従った、１つまたは複数のペプチド結合の逆位によって得られ、したがって薬物動態的性質が改善される。
【００１７】
本発明のペプチドの例は、図１で報告されるヒトエンドスタチンの配列を参照すると、配列６〜４０、６〜４９、７〜４２、８〜５２、１０〜４４、１０〜４７、１１〜６４、１２〜４３、１３〜５０、１５〜５５、１７〜４７、２５〜６５、３３〜７７、４１〜８０、４９〜８８、５０〜９２、７０〜１１７、８８〜１１０、９０〜１２７、９３〜１３３、１１１〜１５０、１２４〜１６１、１３０〜１７０、１３３〜１７９などによって定義されるペプチドである。
【００１８】
特に好ましいペプチドは、ヒトエンドスタチンの配列のアミノ酸６〜４９、１１〜６４、５０〜９２、９３〜１３３および１３４〜１７９の範囲の配列によって定義されるペプチドである。
【００１９】
ヒト配列のアミノ酸６〜９２の範囲の配列を有するペプチドが特に好ましく、アミノ酸６〜６４の範囲の配列を有するペプチドがより好ましい。
【００２０】
ペプチド６〜４９が最も好ましい。
【００２１】
本発明の目的であるペプチドは、ペプチド合成において従来使用されている方法および反応によって、調製することができる。
【００２２】
アミノ酸中のアミノ基の保護は、９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)、tert−ブトキシカルボニル(Ｂｏｃ)、ベンジルオキシカルボニル(Ｚ)、トリチル(Ｔｒｔ)成分、およびペプチド化学において一般的に使用される他のものを使用することによって行うことができる。
【００２３】
カルボキシル基は、tert−ブチルエステル、ベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、および前記目的で従来使用されている他のものによって保護することができる。
【００２４】
これらの保護基は、文献中で知られている方法に従い、トリフルオロ酢酸、無水フッ化水素酸、ピペリジンなどを用いる処理によって除去することができる。
【００２５】
アミノ酸は、ペンタフルオロフェニルエステル(ＯＰｆｐ)、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンエステル(ＯＤｈｂＴ)などの活性エステル、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰｙＢｏｐ)、２−(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチル)−ウロニウムテトラフルオロほう酸塩(ＴＢＴＵ)などのカルボキシ活性物質、およびこのタイプの反応に関して従来使用されている他の活性物質を使用することによって、縮合させることができる。
【００２６】
本発明において記載したポリペプチドの精製は、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィおよび調製用電気泳動などの、タンパク質化学の知られている技法に従って行うこともできる。
【００２７】
より詳細には、Novabiochem(Nottingham, Great Britain)による、固相ペプチド合成および自動合成機Biolynx plus,mod.4170を使用して、ペプチドを調製することができる(A. Dryland and R.C. Sheppard, J.Chem.Soc., Perkin 1,125,1986)。
【００２８】
アミノ酸中のα−アミノ基の保護は、９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)を使用することによって行うことができる。アミノ酸側鎖の官能基は、以下の保護基：アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンに関してはtert−ブチル；リジンおよびトリプトファンに関してはtert−ブトキシカルボニル；ヒスチジンに関してはトリチル；アルギニンに関しては２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルフォニル；システインに関してはtert−ブチルおよびトリチルを使用して保護する。
【００２９】
合成は、Ｃ末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸をエステル結合によって、ポリスチレンマトリックスにグラフトしたポリエチレンオキシドからなる樹脂に結合させ、４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸残基によって官能性を与えることから始めて、段階的に行う(E. Bayer，Angew.Chem.,103,117,1991)。Ｆｍｏｃは、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)にピペリジンを溶かした溶液を使用して除去する。Ｆｍｏｃ−アミノ酸のペンタフルオロフェニルエステルは一般に、縮合反応用に使用される。セリンおよびスレオニンの場合、ＯＤｈｂｔエステルを使用することが好ましかったが、一方アルギニンおよびヒスチジンの場合、３時間の反応時間でジイソプロピルエチルアミンの存在下において、ＰｙＢｏｐによってカルボキシル基を活性化させた。反応収率を最大にするために、５当量過剰なＦｍｏｃ−アミノ酸を使用する。脱保護および縮合反応の時間は合成機によって自動的に決定され、ＰｙＢｏｐを用いる活性化の場合のみ、技術者はアシル化時間を選択するであろう。
【００３０】
すべての保護基を除去するのと同時に、以下の組成：８０％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール、２．５％フェノール、および５％チオアニソールを有する混合物を用いた酸分解によって、ペプチドを固形担体から開裂させる。
【００３１】
生成した未精製ポリペプチドを、カラム「Jupiter」(250×10mm)Ｃ18、１０μ(Phenomenex, U.S.A.)およびＡｋｔａｂａｓｉｃ装置１００ｍｏｄ．１８〜１４０５(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)を使用して、逆相半分取ＨＰＬＣによって精製する。溶媒Ａ：９０％の０．１％トリフルオロ酢酸および１０％のアセトニトリル；溶媒Ｂ：９０％のアセトニトリルおよび１０％の０．１％トリフルオロ酢酸。勾配：溶媒Ａ〜溶媒Ｂ６５分。流速：５ｍｌ／１分。検出はλ＝２２６ｎｍ。各回に対して２０〜２５ｍｇの製品を用いた。
【００３２】
主な分画を回収し、凍結乾燥させる。
【００３３】
精製したポリペプチドは、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｍａｔ装置ｍｏｄ．ＬＣＱを用いる、アミノ酸分析およびエレクトロスプレー質量分析法によって特徴付ける。
【００３４】
本発明のペプチドは、ＥＡｈｙ９２６ヒト内皮細胞を使用する細胞の転移、走化性、および増殖試験、ならびにin vitroおよびin vivoでマトリゲルを使用することに基づくアッセイにおいて実証されたように、血管形成阻害剤として非常に活性があることが見出された。
【００３５】
想定される治療用途のために、本発明のペプチド、またはその塩または非毒性誘導体は、適切な希釈剤または担体と混合させて、薬剤組成物に適切に調合されるであろう。ペプチド組成物は、通常は非経口的に投与されるが、ただし経口、直腸、舌下または経皮などの、他の投与経路が除かれるわけではない。用量はいくつかの要因に依存し場合に応じて当業者によって用量を容易に決定することができる。いずれにせよ約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を企図することができる。
【００３６】
以下の実施例は本発明をさらに詳細に例示するものである。
【００３７】
（実施例１）
【００３８】
【表１】
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【００３９】
６６６ｍｇ(０．１ｍｌ)のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−樹脂を２５ｍｌのＤＭＦに懸濁させ、２時間後それらを反応カラムに充填した。
【００４０】
次いでＦｍｏｃ−アミノ酸−樹脂に以下の処理を施した：a)ＤＭＦを用いた洗浄、b)ＤＭＦ中に溶かした２０％ピペリジン溶液を用いた処理によるＦｍｏｃの除去、c)ＤＭＦを用いた洗浄、d)触媒としてのＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(５当量)の存在下での、適切なＦｍｏｃ−アミノ酸活性エステル(５当量)を用いた縮合、および反応時間を自動的に監視するための、アニオン染料(Novachrome, Calbiochem-Novabiochem AG, Laufelfingen, Switzerland)の添加。
【００４１】
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)の場合のみ、染料を加えずにＰｙＢｏｐを使用することによって、カルボキシルが活性化された。
【００４２】
操作のこのサイクルを、適切なＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて繰り返して、最終的に保護樹脂−テトラテトラコンタペプチドを得た。次いでこの生成物を焼結ガラス漏斗中に置き、ＤＭＦ、tert−アミルアルコール、酢酸、tert−アミルアルコール、塩化メチレンおよびエチルエーテルで連続的に洗浄した。
【００４３】
１２１１ｍｇの保護樹脂−テトラテトラコンタペプチドを得た。
【００４４】
（実施例２）
【００４５】
【表２】
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【００４６】
１２１１ｍｇの保護樹脂−テトラテトラコンタペプチドを、以下の組成：８０％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール、２．５％フェノール、および５％チオアニソールを有する２００ｍｌの混合物に懸濁させた。混合物は時々攪拌しながら２時間反応させた。真空下で濾過した後、樹脂をＴＦＡ(２×５０ｍｌ)で洗浄した。濾過物に無水エチルエーテルをゆっくり加えて、ポリペプチドを沈殿させた。生成物を濾過し、無水エチルエーテルで繰り返し洗浄し、最後に真空下においてＫＯＨで乾燥させた。
【００４７】
未精製の化合物を、前記した半分取ＨＰＬＣによって精製し、９７ｍｇの純粋なテトラテトラコンタペプチドを得た。
【００４８】
［α］20D７４．５°(ｃ＝０．１水)
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝４７７８Ｄａ
アミノ酸分析：Ａｓｐ＝２．１０(2)；Ｔｈｒ＝０．９８(1)；Ｓｅｒ＝１．９９(2)；Ｇｌｕ＝４．１１(4)；Ｐｒｏ＝１．８２(2)；Ｇｌｙ＝６．２１(6)；Ａｌａ＝５．９６(6)；Ｃｙｓ＝０．９６(1)；Ｖａｌ＝２．９８(3)；Ｍｅｔ＝０．９５(1)；Ｉｌｅ＝１．１(1)；Ｌｅｕ＝４．９３(5)；Ｐｈｅ＝４．８９(5)；Ｈｉｓ＝０．８９(1)；Ａｒｇ＝３．９６(4)。
【００４９】
（実施例３）
【００５０】
【表３】
2004534736.tif 000005
【００５１】
４５４ｍｇ(０．１ｍｍｏｌｅ)のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−樹脂を２５ｍｌのＤＭＦに懸濁させ、２時間後それらを反応カラム中に置いた。
【００５２】
次いで実施例１に記載した操作を、それぞれのランにおいて適切なＦｍｏｃ−アミノ酸を使用して繰り返した。
【００５３】
この合成においても、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)のカルボキシル基はＰｙＢｏｐによって活性化され、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)のカルボキシル基はＤｈｂｔエステルによって活性化され、一方、他のすべてのＦｍｏｃ−アミノ酸に関してはＰｆｐエステルを使用した。すべてのアミノ酸を集めた後に、生成物を実施例１に記載したように洗浄し、真空下において乾燥させた。
【００５４】
１１９０ｍｇの保護樹脂−トリテトラコンタペプチドを得た。
【００５５】
（実施例４）
【００５６】
【表４】
2004534736.tif 000006
【００５７】
１１９０ｍｇの保護樹脂−トリテトラコンタペプチドを、以下の組成：８０％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール、２．５％フェノール、および５％チオアニソールの２００ｍｌの混合物で処理し、実施例２に記載した手順に従った。
【００５８】
未精製のポリペプチドを、前記した半分取ＨＰＬＣによって精製し、８１ｍｇの純粋なトリテトラコンタペプチドを得た。
【００５９】
［α］20D７１．２°(ｃ＝０．１水)
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝４８２１Ｄａ
アミノ酸の分析：Ａｓｐ＝３．８９(4)；Ｓｅｒ＝５．８２(6)；Ｇｌｕ＝４．０５(4)；Ｐｒｏ＝１．９６(2)；Ｇｌｙ＝２．０９(2)；Ａｌａ＝３．９５(4)；Ｖａｌ＝３．０３(3)；Ｉｌｅ＝１．９６(2)；Ｌｅｕ＝６．８７(7)；Ｔｙｒ＝０．９８(1)；Ｐｈｅ＝２．０７(2)；Ｌｙｓ＝１．０５(1)；Ａｒｇ＝３．８７(4)；Ｔｒｐ＝１．１１(1)。
【００６０】
（実施例５）
【００６１】
【表５】
2004534736.tif 000007
【００６２】
５２６ｍｇ(０．１ｍｍｏｌｅ)のＦｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−樹脂を２５ｍｌのＤＭＦに懸濁させ、２時間後それらを反応カラムに充填した。次いで実施例１に記載した操作のサイクルを、それぞれのランにおいて適切なＦｍｏｃ−アミノ酸を使用して、前に報告した配列において示す順序で繰り返した。
【００６３】
１０８１ｍｇの保護樹脂−モノテトラコンタペプチドを得た。
【００６４】
（実施例６）
【００６５】
【表６】
2004534736.tif 000008
【００６６】
１０８１ｍｇの保護樹脂−モノテトラコンタペプチドを、以下の組成：８０％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール、２．５％フェノール、および５％チオアニソールを有する２００ｍｌの混合物に懸濁させた。混合物は時々攪拌しながら３時間反応させた。
【００６７】
未精製の生成物を、前記した半分取ＨＰＬＣによって精製し、１０１ｍｇの純粋なモノテトラコンタペプチドを得た。
【００６８】
［α］20D７７．０°(ｃ＝０．１水)
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝４６７２Ｄａ
アミノ酸の分析：Ａｓｐ＝３．８８(4)；Ｔｈｒ＝２．０３(2)；Ｓｅｒ＝３．９５(4)；Ｇｌｕ＝２．０１(2)；Ｐｒｏ＝４．８７(5)；Ｇｌｙ＝４．１２(4)；Ａｌａ＝０．９９(1)；Ｖａｌ＝２．１０(2)；Ｉｌｅ＝１．０２(1)；Ｌｅｕ＝３．０７(3)；Ｐｈｅ＝１．９７(2)；Ｌｙｓ＝３．０７(3)；Ａｒｇ＝３．８８(4)；Ｔｒｐ＝２．１２(2)。
【００６９】
（実施例７）
【００７０】
【表７】
2004534736.tif 000009
【００７１】
５００ｍｇ(０．１ｍｌ)のＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−樹脂を２５ｍｌのＤＭＦに懸濁させ、２時間後それらを反応カラムに充填し、次いで実施例１で報告した操作サイクルを、それぞれのサイクルにおいて適切に活性化したＦｍｏｃ−アミノ酸を使用して、前に報告した配列に示す順序で繰り返した。
【００７２】
９６０ｍｇの保護樹脂−ヘキサテトラコンタペプチドを得た。
【００７３】
（実施例８）
【００７４】
【表８】
2004534736.tif 000010
【００７５】
９６０ｍｇの保護樹脂−ヘキサテトラコンタペプチドを、以下の組成：８０％ＴＦＡ、５％Ｈ2Ｏ、２．５％エタンジチオール、２．５％フェノール、および５％チオアニソールを有する２００ｍｌの混合物を用いて処理した。混合物は時々攪拌しながら３時間反応させ、次いで実施例２の手順に従った。
【００７６】
未精製の生成物を、前記した半分取ＨＰＬＣによって精製し、９８ｍｇの純粋な非酸化ヘキサテトラコンタペプチドを得た。
【００７７】
［α］20D４８．９°(ｃ＝０．１水)
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝５４５５Ｄａ
アミノ酸分析：Ａｓｐ＝０．９６(1)；Ｔｈｒ＝２．９７（3）；Ｓｅｒ＝５．８７(6)；Ｇｌｕ＝５．０３(5)；Ｐｒｏ＝０．９３(1)；Ｇｌｙ＝４．１２(4)；Ａｌａ＝５．８８(6)；Ｃｙｓ＝２．８４(3)；Ｖａｌ＝１．０５(1)；Ｍｅｔ＝０．９１(1)；Ｉｌｅ＝２．１１(2)；Ｌｅｕ＝４．８２(5)；Ｔｙｒ＝１．９４(2)；Ｐｈｅ＝１．２０(1)；Ｈｉｓ＝１．９１(2)；Ａｒｇ＝２．０３；Ｔｒｐ＝０．９５(1)。
【００７８】
（実施例９）
【００７９】
【表９】
2004534736.tif 000011
【００８０】
９８ｇ(１７．９６ｍｍｏｌｅ)の非酸化ヘキサテトラコンタペプチドを、２００ｍｌの７５％メタノールに溶かし、次いで一滴ずつ、攪拌下で、１０ｍｇのヨウ素を３０ｍｌの７５％メタノールに溶かした溶液を加えた。この混合物を室温で３時間反応させた後、１０％アスコルビン酸水溶液を、ヨウ素が完全に脱色するまで加えた。メタノールを真空下で完全に蒸発させ、残りの水溶液を凍結乾燥させた。生成した未精製のペプチドを、前記した条件で、半分取ＨＰＬＣによって最終的に精製した。
【００８１】
１１ｍｇの純粋な酸化ヘキサテトラコンタペプチドを得た。
【００８２】
［α］20D２４°(ｃ＝０．０５水)
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝４９６８Ｄａ
アミノ酸分析：Ａｓｐ＝１．０３(1)；Ｔｈｒ＝２．８７(3)；Ｓｅｒ＝５．９１(6)；Ｇｌｕ＝４．９９(5)；Ｐｒｏ＝０．９５(1)；Ｇｌｙ＝３．８７(4)；Ａｌａ＝５．９１(6)；Ｃｙｓ＝２．７９(3)；Ｖａｌ＝０．９７(1)；Ｍｅｔ＝０．９３(1)；Ｉｌｅ＝２．２１(2)；Ｌｅｕ＝４．９２(5)；Ｔｙｒ＝１．８９(2)；Ｐｈｅ＝１．０９(1)；Ｈｉｓ＝１．８９(2)；Ａｒｇ＝１．９９(2)；Ｔｒｐ＝０．８７(1)。
【００８３】
（実施例１０）
【００８４】
【表１０】
2004534736.tif 000012
【００８５】
実施例１と同様に、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)ではなくＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)を使用し、２５ｍｌのＤＭＦに懸濁させた始めは５００ｍｇのＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−樹脂から１１８７ｍｇの保護樹脂−テトラテトラコンタペプチドを得た。
【００８６】
（実施例１１）
【００８７】
【表１１】
2004534736.tif 000013
【００８８】
実施例２と同様に、実施例１０の１１８７ｍｇの生成物から、以下の特性を有する８３ｍｇの純粋なペプチドを得た：
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝４７７８Ｄａ
［α］20D５５．８°(ｃ＝０．５水)。
【００８９】
（実施例１２）
【００９０】
【表１２】
2004534736.tif 000014
【００９１】
実施例１と同様に、適切なＦｍｏｃ−アミノ酸から始めて、２５ｍｌのＤＭＦに５００ｍｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−樹脂を溶かしたものから、１２８５ｍｇの保護樹脂−テトラペンタコンタペプチドを得た。
【００９２】
（実施例１３）
【００９３】
【表１３】
2004534736.tif 000015
【００９４】
実施例２と同様に、実施例１２の１２８５ｍｇの化合物から、以下の特性を有する１２５ｍｇの純粋なペプチドを得た：
質量スペクトル：分子ピーク(Ｍ＋１)＝５９５３Ｄａ
［α］20D６２．６°(ｃ＝０．４５水)。
【００９５】
（実施例１４）
内皮ヒト細胞ＥＡ.ｈｙ.９２６を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)を補った、グルタミンおよび抗生物質の濃度が適切であるＤＭＥＭ中で増殖させた。この実験の前に、０．１％ＦＢＳ中で２４時間かけて、細胞の血清を取り除いた。
【００９６】
ＥＡ.ｈｙ.９２６細胞の転移は、１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン溶液で予備処理した、孔が１２μｍのポリカーボネートフィルタを使用して、４８ウェルのBoydenチャンバ中での走化性試験によって評価した。エンドスタチン断片６〜４９またはヒトエンドスタチンの存在下あるいは不在下において、細胞１５，０００個／１ウェルの密度で、細胞を上部チャンバのウェルに加えた。神経こう腫細胞の培養によって得られる条件培地によって表される走化性刺激を、下部チャンバに加えた。３７℃で４時間培養した後、転移しなかった細胞をスクレーパーによって除去し、フィルタをDiff Quickで着色した。次いで転移した細胞を、６つの異なる視野で４００倍の倍率で計数した。
【００９７】
図２に報告した結果は、ペプチドまたはエンドスタチンの存在下において、条件培地によって誘導された最大の転移のパーセンテージとして表す。
【００９８】
ペプチド６〜４９は、１０-9Ｍの濃度から始まる約６０％という細胞移動の最大の阻害、および３×１０-13というＩＤ50を引き起こし、一方エンドスタチンは１０-9Ｍで７０％最大の阻害、および５×１０-12ＭというＩＤ50を決定する。
【００９９】
（実施例１５）
ＥＡ.ｈｙ.９２６細胞を９６ウェルのプレートにインキュベートし、２４時間かけて血清を取り除いた後に、異なる濃度のペプチド６〜４９またはエンドスタチンの存在下あるいは不在下でさらに２４時間、１０％ＦＢＳで刺激した。インキュベーションの最後の６時間中にトリチウム化チミジンを加えた(１μＣｉ／１ウェル)。次いで細胞を１０％ＴＣＡ中で抽出し、０．５ＭのＮａＯＨ中で可溶化させた後に、ＴＣＡ不溶分画に取り込まれた放射活性を決定した。
【０１００】
図３ａおよび図３ｂに報告した結果は、薬剤の不在下において、１０％血清によって誘導された最大の刺激のパーセンテージとして表す。
【０１０１】
ペプチド６〜４９は、１０-12Ｍの濃度から始まる約８０％というＤＮＡ合成の最大の阻害、および５×１０-15ＭというＩＤ50を誘導する。ヒトエンドスタチンは、１０-13Ｍの濃度から始まる約５５％というＤＮＡ合成の最大の阻害、および１０-14というＩＤ50を誘導する。
【０１０２】
（実施例１６）
毛細血管と類似の細管構造の形成を、４℃で液体であり、３７℃で重合を行うと３次元のゲルを形成する特性を有する、再構築した基底膜であるマトリゲル担体上に、内皮細胞を接種することによって評価した。線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)または血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)などの前血管形成因子を、ペプチド９〜４９の存在下で培地に加え、５％ＣＯ2雰囲気下において３７℃でプレートをインキュベートした。倒立顕微鏡で細胞を観察することによって細管形成を監視し、写真撮影によって画像を記録した後、細胞および毛細血管網によって占められた領域を評価することによって、定量化を行った。
【０１０３】
顕微鏡下で観察することによって、本発明のペプチドが、内皮細胞が毛細血管と類似の細管構造を形成する能力を阻害することができることは明白であるが、その細管構造は反対に未処理の対照細胞中で明らかに認められる(図４Ａ)。図４Ｂでは、適切なソフトウェア(NIH Image)によって行われたこの影響の定量分析を報告する。
【０１０４】
断片６〜４９を用いた処理によって、１００％とみなされる対照と比較して、細管形成が２３％に低下する。
【０１０５】
（実施例１７）
ＦＧＦ２ｎｇ／ｍｌおよびヘパリン３６Ｕ／ｍｌを含む５００ｍｌのマトリゲルを、６〜１０週齢の雄マウスＣ５７／ｂ１６の腹部領域の皮下に接種した。指示のある場合は、断片６〜４９を、１および１０μｇ／マウスの濃度でマトリゲルの溶液に加えた。それぞれの実験で６匹の動物を使用した。４日後に、ゼラチン化したマトリゲルペレットを回収し、Drabkinの方法に基づく市販のキット(Sigma Aldrich)によって、その中のヘモグロビン量を測定した。
【０１０６】
３つの独立した実験で得られたデータを示す図５で認めることができるように、断片６〜４９は、１ｍｇ／マウスの用量で既に、マトリゲルペレット中のヘモグロビンレベルを低下させることができ、これによって、対照と比較して、この断片を用いて治療した動物中での血管の形成が減少することが示される。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】マウスと比較した、ヒトエンドスタチンの配列を示す図である。
【図２】ヒトエンドスタチンと比較した、ペプチド６〜４９を用いて得られた細胞移動の、阻害のパーセンテージの曲線を示す図である。
【図３Ａ】それぞれペプチド６〜４９、およびヒトエンドスタチンによる、内皮ヒト細胞Ｅａｈｙ９２６中でのＤＮＡ合成の阻害パーセントのグラフ図である。
【図３Ｂ】それぞれペプチド６〜４９、およびヒトエンドスタチンによる、内皮ヒト細胞Ｅａｈｙ９２６中でのＤＮＡ合成の阻害パーセントのグラフ図である。
【図４Ａ】in vivoでのマトリゲル・アッセイにおける、ペプチド６〜４９による細管形成の阻害パーセントを示す図である。
【図４Ｂ】in vivoでのマトリゲル・アッセイにおける、ペプチド６〜４９による細管形成の阻害パーセントを示す図である。
【図５】ペプチド６〜４９で治療したＣ５７／ｂ１６マウスに移植した、ゼラチン化したペレット中のヘモグロビン量を測定することによって、in vitroでのマトリゲル・アッセイで得られた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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