(57)【要約】本発明は、組換えプロテイナーゼＫおよび組換えプロテイナーゼＫを製造する方法に関し、この方法は、以下の工程：ａ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする組換え核酸を含有する宿主細胞の形質転換、ｂ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体が街宿主細胞内に封入体の形態で生じるような様式での宿主細胞の培養、ｃ）封入体の単離および酵素原前駆体のプロテアーゼが天然のコンフォメーションで生じる条件下での再天然化、ｄ）再天然化プロテイナーゼＫの活性化および精製により特徴づけられる。
2004525631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０℃〜37℃の温度で行われ、折りたたみバッファーが以下の特徴：
Ａ）バッファーのpH値が7.5〜10.5の範囲にある、
Ｂ）折りたたみを補助する低分子量物質の存在、
Ｃ）酸化還元シャッフル系の存在、
Ｄ）存在するCa2+イオンと比べて半化学量論的な濃度での複合体化剤の存在
を有することを特徴とする折りたたみバッファーに変性酵素原プロテイナーゼＫが折りたたみバッファーに移される、変性酵素原プロテイナーゼＫの天然化のための方法。
【請求項２】
酸化還元シャッフル系が混合ジスルフィドまたはチオスルホネート
からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
バッファーがpH８〜pH９のpHを有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
０℃〜25℃の温度で行われる請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
変性剤が、天然化の間、50mM未満の濃度で存在する請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
折りたたみを補助する低分子量物質が、以下の群：
0.5〜2.0Mの濃度のＬ-アルギニン、
0.5M〜2.0Mの濃度のTris、
0.5M〜2.0Mの濃度のトリエタノールアミン、
60mM〜120mMの濃度のα-シクロデキストリン
の低分子量化合物から選ばれ、単独または混合物として添加されうる請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
Ca2+イオンが１〜20mMの濃度で存在する請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
存在する変性剤の濃度が減少されながら、変性酵素原プロテイナーゼＫが折りたたみバッファーに移される請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
以下の特性：
Ａ）バッファーのpH値が7.5〜10.5の範囲にある、
Ｂ）折りたたみを補助する低分子量物質の存在、
Ｃ）酸化還元シャッフル系の存在、
Ｄ）存在するCa2+イオンと比べて半化学量論的な濃度での複合体化薬剤の存在
により特徴づけられる折りたたみバッファー。
【請求項１０】
バッファーがpH８〜pH９のpHを有し、酸化還元シャッフル系が混合ジスルフィドまたはチオスルフォネートからなるものである請求項９記載の折りたたみバッファー。
【請求項１１】
活性プロテイナーゼＫが天然のプロテイナーゼＫおよび阻害プロペプチドからなる不活性複合体から放出される、天然のプロテイナーゼＫの酵素原前駆体を活性化する方法であって、界面活性を添加することによりそれが放出されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
プロテイナーゼＫの天然の酵素原前駆体を活性化する方法であって、0.1〜２％（w/v）の濃度でSDSが界面活性剤として添加されることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
組換えプロテイナーゼＫの製造方法であって、プロテイナーゼＫの酵素原プロフォームが、インビトロ天然化により折りたたまれ、自己触媒的切断により活性形態に変換されることを特徴とする、方法。
【請求項１４】
単離され、可溶化された封入体由来のプロテイナーゼＫの酵素原前駆体が、酸化的折りたたみにより天然の構造に変換され、すなわち、天然化され、続いて活性プロテイナーゼＫが、界面活性剤を添加することによる自己触媒的切断により天然に折りたたまれた酵素原から得られ、ここで、酵素原前駆体が請求項１〜８いずれか記載の方法により天然化される、請求項１３記載の組換えプロテイナーゼＫの製造方法。
【請求項１５】
封入体が変性剤および還元剤により可溶化される請求項１４記載の組換えプロテイナーゼＫの製造方法。
【請求項１６】
６〜８Ｍ塩酸グアニジウムまたは８〜10Ｍ尿素が変性剤として添加され、50〜200mM DTTまたはDTEが還元剤として添加される請求項１５記載の組換えプロテイナーゼＫの製造方法。
【請求項１７】
プロテイナーゼＫの酵素原前駆体をコードする組換え核酸で宿主細胞を形質転換することによる組換えプロテイナーゼＫの製造方法であって、
酵素原プロテイナーゼＫが封入体の形態で宿主細胞において形成される様式で宿主細胞が培養され、
封入体が、続いて、単離され、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体が可溶化され、
プロテイナーゼＫの酵素原前駆体が、続いて、請求項１〜８いずれか記載の方法により天然化され、および
天然化された酵素原プロテイナーゼＫが請求項１１または１２記載の方法により活性化される、
ことを特徴とする、方法。
【請求項１８】
宿主細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項１３〜１７いずれか記載の組換えプロテイナーゼＫの製造方法。
【請求項１９】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１１〜１８いずれか記載の組換えプロテイナーゼＫの製造方法。
【請求項２０】
大腸菌における発現のために最適化された組換え酵素原プロテイナーゼＫをコードするコドン最適化組換え核酸。
【請求項２１】
請求項２０記載の組換え核酸を含有してなるベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Tritirachium album Limber由来の組換えプロテイナーゼＫの調製ならびに組換えプロテイナーゼＫの発現、インビトロ天然化（naturation）および活性化の対応する方法に関する。
【０００２】
プロテイナーゼＫ（E.C. 3.4.21.64、エンドペプチダーゼＫとしても公知）は、真菌Tritirachium album Limberにより合成される細胞外エンドペプチダーゼである。典型的な触媒三連構造Asp39-His69-Ser224を有するセリンプロテアーゼのクラスのメンバーである（Jany, K.D.ら、(1986) FEBS Letters Vol.199(2), 139-144）。279アミノ酸長のポリペプチド鎖の配列（Gunkel, F.A.およびGassen, H.G. (1989) Eur.J.Biochem. Vol:179 (1), 185-194）および三次元構造（Betzel, C.ら、(1988) Eur. J. Biochem. Vol. 178(1), 155-71）が細菌サブチリシンに高い相同性を有するので、プロテイナーゼＫはサブチリシンファミリーのメンバーとして分類される（Pahler, A.ら、(1984) EMBO J. Vol. 3(6), 1311-1314; Jany, K.D.およびMayer, B. (1985), Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366(5), 485-492）。プロテイナーゼＫは、天然のケラチンを加水分解する能力に基づき名付けられ、従って炭素および窒素の唯一の供給源としてのケラチン上で真菌が増殖することを可能にする（Ebeling, W.ら、(1974) Eur.J.Biochem. Vol. 47(1), 91-97）RoelckeおよびUhlenbruch, 1069, Z.Med.Mikrobiol.Immunol. Vol.155(2), 156-170)。プロテイナーゼＫは、30 U/mgより高い比活性を有し、従って既知のエンドペプチダーゼの内で最も活性なものの１つであり (Betzel, C.ら、(1986) FEBS Lett. Vol. 197(1-2), 105-110)、天然および変性タンパク質を非特異的に加水分解する (Kraus, E.およびFemfert, U, (1976) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. Vol. 357(7):937-947)。
【０００３】
Tritirachium album Limber由来のプロテイナーゼＫは、その天然の宿主中ではプレプロタンパク質として翻訳される。プロテイナーゼＫをコードする遺伝子のcDNAの配列は、 Gunkel, F.A.およびGassen, H.G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1), 185-194により1989年に解読された。これによると、プレプロ-プロテイナーゼＫの遺伝子は、２つのエキソンからなり、15アミノ酸長のシグナル配列、90アミノ酸長のプロ配列および279アミノ酸長の成熟プロテイナーゼＫをコードする。63 bp イントロンは、プロ配列の領域内に位置する。プレペプチドは、小胞体（ER）へのトランスロケーションの間に切り離される。現在、プロペプチドの切断により成熟プロテイナーゼＫを形成するための引き続くプロセシングについてはほとんど知られていない。
【０００４】
従って、成熟プロテイナーゼＫは279アミノ酸からなる。緻密な構造は、２つのジスルフィド架橋および２つの結合カルシウムイオンにより安定化される。これは、他のサブチリシンと比べてプロテイナーゼＫが、極度のpH値、高温、カオトロピック物質および界面活性剤に対して相当に高い安定性を有する理由を説明する（Dolashka, P.ら、(1992) Int.J.Pept.Protein.Res. Vol. 40(5), 465-471）。プロテイナーゼＫは、高い熱安定性（65℃まで、Bajorathら、(1988), Eur. J. Biochem. Vol. 176, 441-447）および広範なpH範囲（pH 7.5〜12.0, Ebeling, W.ら、(1974) Eur. J. Biochem. Vol. 47(1), 91-97)により特徴づけられる。その活性は、尿素またはSDS等の変性物質の存在下で増大する（Hilz, H.ら、(1975) J. Biochem. Vol. 56(1), 103-108; Jany, K.D. およびMayer, B. (1985) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366(5), 485-492）。
【０００５】
上記特性により、プロテイナーゼＫは非特異的タンパク質分解が必要されるバイオテクノロジー応用に特に重要となる。特定の例は、粗抽出物からの核酸単離（DNAまたはRNA）およびDNA解析におけるサンプル調製である（Goldenberger, D.ら、(1995) PCR Methods Appl. Vol. 4(6), 368-370; US 5,187,083; US 5,346,999）。他の応用は、構造解明等のタンパク質解析の分野にある。
【０００６】
プロテイナーゼＫは、真菌Tritirachium album Limber（例えば、CBS 348.55, Merck 2429号株またはATCC 22563株）の発酵により大量に商業的に得られる。プロテイナーゼＫの産生は、グルコースまたは遊離アミノ酸により抑制される。タンパク質-含有培地はまた、プロテアーゼの発現を誘導するので、唯一の窒素源としてBSA、粉ミルクまたはダイズ穀粉等のタンパク質を使用することが必要である。プロテアーゼの分泌は、増殖の定常期が達成されるとすぐに始まる（Ebeling, W.ら、(1974) Eur.J.Biochem. Vol. 47(1), 91-97）。
【０００７】
Tritirachium album Limberは、結果的に大規模の発酵に適さず、さらに遺伝的に操作することも困難であるため、他の宿主細胞において組換えプロテイナーゼＫを過剰発現させるために種々の試みがなされた。しかし、発現の欠如、不活性な封入体の形成または天然化に関する問題のためにこれらの実験において有意な活性は検出されなかった（Gunkel, F.A.およびGassen, H.G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1), 185-194; Samal, B.B.ら、(1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104）。
【０００８】
さらに、Tritirachium album Limberは、培地に小量のプロテアーゼのみを分泌する緩徐に増殖する真菌である。１〜２週間の長い発酵期間は不利である。さらに、T.albumはまた、プロテイナーゼＫとは別に調製物を汚染しうる他のプロテーゼを産生することが知られている（Samal, B.B.ら、(1991) Enzyme Microb.Technol.Vol.13, 66-70）。
【０００９】
本発明の目的は、組換えプロテイナーゼＫおよび自己触媒的に活性化されうるプロテイナーゼＫの不活性な酵素原前駆体の経済的な製造方法を提供することである。
【００１０】
前記目的は、プロテイナーゼＫの不活性な酵素原プロフォームが封入体において不溶性形態で産生され、プロテイナーゼＫの酵素原プロフォームが天然化され、酵素原プロフォームがプロセスされる、すなわち、引き続くステップで活性化される組換えプロテイナーゼＫの製造方法を提供することにより達成された。プロテイナーゼＫの天然化および活性化のための方法もまた、本発明の主題である。本発明は、酵素原プロフォームがインビトロ天然化により折りたたまれ、自己触媒的に切断されることにより活性形態に変換されることにより特徴づけられる組換えプロテイナーゼＫの製造方法に関する。本発明は、特に、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体が、酸化的折りたたみにより単離され、可溶化された封入体から天然の構造に変換され（すなわち、天然化され）、続いて活性プロテイナーゼＫが、界面活性剤を添加することによる自己触媒的切断により天然に折りたたまれた酵素原から得られる組換えプロテイナーゼＫを製造する方法に関する。
【００１１】
従って、本発明は、以下のプロセス工程により特徴づけられるプロテイナーゼＫの酵素原プロフォームをコードするDNAで宿主細胞を形質転換することによる組換えプロテイナーゼＫを得るための方法に関する。
ａ）プロテイナーゼＫの酵素原前駆体が不溶性封入体の形態で宿主細胞内で形成されるように、プロテイナーゼＫの酵素原プロフォームをコードするDNAの発現を生じる条件下で宿主細胞を培養する工程。
ｂ）封入体を単離し、酵素を可溶化し、プロテイナーゼＫの酵素原前駆体のプロテアーゼ部分が形成される条件下でプロテイナーゼＫの酵素原前駆体を天然化する工程。
ｃ）プロペプチドを除去することによりプロテイナーゼＫを活性化し、さらに精製する工程。
【００１２】
プロテイナーゼＫの酵素原プロフォームをコードするDNAは、配列番号：２に示されるDNAまたは遺伝子コードの縮重の範囲内でそれに対応するDNAに対応する。配列番号：２は、プロテイナーゼＫおよびプロペプチドをコードするDNA配列を含む。さらに、前記DNAは、特定の宿主における発現のためにコドンを至適化しうる。コドン至適化の方法は、当業者に公知であり、実施例１に記載される。従って、本発明は、宿主細胞が上記の群から選ばれるDNAにより組み換えられる方法に関する。
【００１３】
プロテイナーゼＫは、均一である本発明の方法により得られ、従って、解析および診断適用に特に適する。本発明のプロテイナーゼＫの酵素原プロフォームは、さらなるＮ-末端修飾および特に標的タンパク質の精製を促進する配列（アフィニティータグ）、翻訳の効率を増大する配列、折りたたみ効率を増大する配列または培養培地への標的タンパク質の分泌を生じる配列（天然のプレ配列および他のシグナルペプチド）を任意に含む。
【００１４】
本発明の意味においてプロテイナーゼＫは、配列番号：１に示されるGassenら、(1989) による配列ならびにCh. Betzelら、(Biochemistry 40 (2001), 3080-3088)により開示されたアミノ酸配列のようなTritirachium album Limberに由来するプロテイナーゼＫの他のバリアント、特にプロテイナーゼＴ（Samal, B.B.ら、(1989) Gene Vol. 85(2), 329-333; Samal, B.B.ら、(1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104) およびプロテイナーゼＲ(Samal, B.B.ら、(1990) Mol. Microbiol. Vol. 4(10), 1789-1792; US 5,278,062）、さらに組換え手段（例えば、WO 96/28556に記載された）によって作製されたバリアントを意味する。配列番号：１に示される配列は、シグナル配列（１-15, 15アミノ酸）、プロ配列（16〜105;90アミノ酸）および成熟プロテイナーゼＫ（106-384;279アミノ酸）の配列を含む。Betzelらにより記載されたアミノ酸配列（Biochmistry 40 (2001), 3080-3088）は、特に活性プロテアーゼの207位のセリン残基の代わりにアスパラギン酸を有する。
【００１５】
本発明の意味においてプロ-プロテイナーゼＫは、特にＮ末端がそのプロ配列に連結されたプロテイナーゼＫを意味する。緊密に関連するサブチリシンＥおよび他のバリアントの場合、プロ配列が活性プロテアーゼの折りたたみおよび形成において重要な影響を有することが知られている（Ikemura, H.ら、(1987) Biol.Chem.Vol.262(16), 7859-7864）。特に、プロ配列が分子内シャペロンとして作用することが推定される(Inouye, M. (1991) Enzyme Vol. 45, 314-321)。折りたたみの後、プロペプチドを自己触媒的に切断することにより成熟サブチリシンプロテアーゼを形成するようにプロセスされる（Ikemura, H.およびInouye, M. (1988) J.Biol.Chem. Vol. 263(26), 12959-12963）。このプロセスは、サブチリシンＥ (Samal, B.B.ら、(1989) Gene vol. 85(2), 329-333; Volkov, A.およびJordan, F. (1996) J. Mol. Biol. Vol. 262, 595-599)、サブチリシンBPN' (Eder, J.ら、(1993) Biochemistry Vol. 32, 18-26)、パパイン (Vernet, T.ら、(1991) J. Biol. Chem. Vol. 266(32), 21451-21457) およびサーモリジン (Marie-Claire, C. (1998) J. Biol. Chem. Vol. 273(10), 5697-5701) の場合に起こる。
【００１６】
外因的に付加される場合、プロペプチドはまた、変性成熟サブチリシンプロテアーゼの折りたたみにおいてシャペロンとしてトランスで分子間で作用しうる (Ohta, Y.ら、(1991) Mol. Microbiol. Vol. 5(6), 1507-1510; Hu, Z.ら、(1996) J. Biol. Chem. Vol. 271(7), 3375-3384) 。プロペプチドは、サブチリシンの活性中心に結合し(Jain, S.C.ら、(1998) J. Mol. Biol. Vol. 284, 137-144)、特異的インヒビターとして作用する (Kojima, S.ら、(1998) J. Mol. Biol. Vol. 277, 1007-1013; Li, Y.ら、(1995) J. Biol. Chem. Vol. 270, 25127-25132; Ohta, Y. (1991) Mol. Microbiol. Vol. 5(6), 1507-1510)。この効果は、天然化の間に既に折りたたまれた活性プロテイナーゼＫによるタンパク質分解感受性折りたたみ中間体の自己タンパク質分解を妨げるために本発明の意味において使用される。
【００１７】
通常は疎水性であるプロ配列の所定のコア領域のみが、シャペロン機能に必要であるようである。なぜなら、広範な領域の変異が活性に影響を有さないからである(Kobayashi, T. およびInouye, M. (1992) J. Mol. Biol. Vol. 226, 931-933)。さらに、プロペプチドが種々のサブチリシンバリアント間で交換されうることが知られている。従って、例えば、サブチリシンBPN'はまた、サブチリシンＥのプロ配列を認識する（Hu,Z.ら、(1996) J.Biol.Chem. Vol. 271 (7), 3375-3384）。
【００１８】
封入体は、異種タンパク質が過剰発現され、それらが非常に純粋な標的タンパク質を含有する場合、宿主細胞の細胞質中にしばしば形成される不溶性かつ不活性なタンパク質凝集体からなる顕微鏡により見える粒子である。かかる封入体を製造および精製する方法は、例えば、Creighton, T.E. (1978) Prog.Biophys.Mol.Biol. Vol. 33(3), 231-297; Marston, F.A. (1986) Biochem.J. Vol.240 (1), 1-12; Rudolph, R. (1997). Folding proteins ：Creighton, T.E.(編) Protein Function: A practical approach. Oxford University Press, 57-99; Fink, A.L. (1998) Fold.Des. Vol. 3(1), R9-23; およびEP 0 114 506に記載されている。
【００１９】
封入体を単離するために、宿主細胞は、発酵の後に、従来の方法、例えば、超音波、高圧分散またはリゾチームにより溶解される。溶解は、好ましくは、水性の中性からわずかに酸性のバッファー中で起こる。不溶性封入体は、種々の方法、好ましくは、数回の洗浄工程をともなう遠心分離または濾過により、分離され、精製されうる（Rudolph, R. (1997). Folding Proteins: Creighton, T.E. (編) Protein Function: A practical Approach. Oxford University Press, 57-99）。
【００２０】
次いで、この様式で得られる封入体は、公知の様式で可溶化される。変性剤、特に塩酸グアニジウムおよび他のグアニジウム塩および／または尿素は、このために封入体を溶解するのに適切な濃度で好都合に使用される。封入体タンパク質を完全に単量体化（monomerize）するために、可溶化の間、ジチオスレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）または２-メルカプトエタノール等の還元剤を、還元により考えられうるジスルフィド架橋を切断するために添加することもまた有利である。本発明はまた、システインが、特にGSSGで還元されず、誘導体化されて、混合ジスルフィドまたはチオシアネートを形成するプロテイナーゼＫに関する（EP 0 393 725）。
【００２１】
したがって、本発明によれば、封入体は変性剤および還元剤により可溶化される。６〜８Ｍ塩酸グアニジニウムまたは８〜１０Ｍ尿素が変性剤として好ましく、５０〜２００ｍＭ  ＤＤＴ（ジチオトレイトール）またはＤＴＥ（ジチオエリトリトール）が還元剤として好ましい。
【００２２】
したがって、本発明は、９０個のアミノ酸長（アミノ酸１６〜１０５）の配列番号：１のプロ配列、ならびに折りたたみを容易にする他のバリアントに関する。また、本発明は、成熟プロテアーゼＫの折りたたみのために外来的に付加され、かつ上述の機能を有するプロペプチドに関する。
【００２３】
本発明のさらなる主題は、上で定義した組換えＤＮＡのコピーを１つ以上有する組換えベクターである。基本ベクターは、好ましくはマルチコピーの複製起点を有するプラスミドであることが有利であるが、ウイルスベクターを使用することも可能である。発現ベクターの選択は、選択した宿主細胞に依存する。当業者によく知られ、例えば、Sambrook ら (1989), Molecular Cloning（下記参照のこと）に記載された、発現ベクターを構築するための方法、およびこのベクターで宿主細胞を形質転換する方法が使用される。大腸菌での発現に好適なベクターは、例えば、pKKT5 発現ベクターまたは pKK177、pKK223、pUC、pETベクター(Novagen)、ならびにpQEベクター(Qiagen)である。発現プラスミドpKKT5は、tacプロモーターをpDS由来T5プロモーター(Bujardら, 1987, Methods Enzymol. 155:416-433)と置き換えることにより、pKK177-3 (Kopetzkiら,1989, Mol. Gen. Genet. 216:149-155)から形成される。Ｔ５プロモーターの配列内のEcoRI 制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、２つの点変異により除いた。
【００２４】
また、本発明のベクター内のコードＤＮＡ配列は、好ましくは強力で調節可能なプロモーターの制御下にある。lac、lacUV5、tacまたはT5プロモーターなどの、ＩＰＴＧにより誘導されうるプロモーターが好ましい。T5プロモーターは特に好ましい。
【００２５】
本発明の意味における宿主細胞は、内部でタンパク質が封入体として形成されうる、任意の宿主細胞を意味する。宿主細胞は、通常、微生物、例えば原核生物である。原核生物細胞、特に大腸菌が好ましい。以下の菌株：大腸菌 K12 菌株 JM83、JM105、UT5600、RR1Δ15、DH5α、C600、TG1、NM522、M15 が特に好ましく、または大腸菌 B 誘導体 BL21、HB101、大腸菌 M15 が特に好ましい。
【００２６】
対応する宿主細胞を本発明に従って、配列番号：２の組換えチモーゲン(zymogenic)プロテイナーゼＫをコードする組換え核酸で、またはコドン最適化により前記ＤＮＡから誘導される核酸で、または遺伝コードの縮重の範囲内で該ＤＮＡから誘導されるＤＮＡで形質転換する。大腸菌宿主細胞は、好ましくは、大腸菌内での発現のために最適化された、組換えチモーゲンプロテイナーゼＫをコードするコドン最適化組換え核酸で形質転換される。したがって、本発明はまた、例えば上述のベクターから選ばれる好適なベクターであって、大腸菌についてコドン最適化され、かつ組換えプロテイナーゼＫまたは組換えチモーゲンプロテイナーゼＫをコードする組換え核酸を含有する、好適なベクターに関する。本発明の別の主題は、例えば、上述のベクターで形質転換された上述の宿主細胞から選ばれる宿主細胞である。
【００２７】
本発明のさらなる主題は、変性チモーゲンプロテイナーゼＫが折りたたみバッファーに移される、変性チモーゲンプロテイナーゼＫの天然化（naturation）のための方法であり、この方法は、折りたたみバッファーが以下の特徴：
【００２８】
Ａ）  バッファーのｐＨ値が７．５〜１０．５の範囲内である
Ｂ）  折りたたみを補助する低分子量物質の存在
Ｃ）  酸化還元シャッフリングシステムの存在
Ｄ）  Ｃａ２＋イオンと比べてほぼ化学量論的濃度での複合体化剤の存在
を有することを特徴とし、ここで、該方法は、０℃〜３７℃の温度で行われる。
【００２９】
天然化の際には好ましくは低濃度の変性剤が存在する。例えば、変性剤は、封入体の事前の可溶化のため反応溶液中になお存在するため存在しうる。塩酸グアニジンなどの変性剤の濃度は、５０ｍＭ未満であるべきである。
【００３０】
本発明の意味における天然化は、変性された、本質的に不活性なタンパク質が、自己触媒的切断および活性化後もタンパク質が所望の活性を有するコンホメーションに変換される方法であると理解される。これは、変性剤の濃度を低下させながら、可溶化された封入体を折りたたみバッファーに移すことにより達成される。条件は、このプロセスにおいてタンパク質が溶液状を維持するように選択されなければならない。これは、迅速な希釈により、または折りたたみバッファーに対する透析により適切に行われうる。
【００３１】
折りたたみバッファーは、８〜９のｐＨを有することが好ましい。特に好ましいバッファーとしての物質は、Tris/HClバッファーおよびビシンバッファーである。
【００３２】
本発明の天然化方法は、好ましくは、０℃〜２５℃の温度で行われる。
【００３３】
折りたたみバッファー中の低分子量折りたたみ剤は、好ましくは、以下の低分子量化合物の群から選ばれる。それらは、単独で、および混合物で添加されうる。折りたたみを補助する他の物質：
【００３４】
−  ０．５Ｍ〜２．０Ｍの濃度のＬ−アルギニン
−  ０．５Ｍ〜２．０Ｍの濃度のＴｒｉｓ
−  ０．５Ｍ〜２．０Ｍの濃度のトリエタノールアミン
−  ０．５Ｍ〜２．０Ｍの濃度のα−シクロデキストリン
が存在しうる。
【００３５】
折りたたみを補助する低分子量物質は、例えば、米国特許第5,593,865号明細書; Rudolph, R. (1997) タンパク質の折りたたみ(Folding Proteins). In: Creighton, T.E. (編) タンパク質の機能(Protein Function): 実際のアプローチ(A practical Approach). オックスフォード大学出版(Oxford University Press), 57-99 または De Bernardez Clark, E. ら. (1999) Methods. Enzymol. 第309巻, 217-236に記載されている。
【００３６】
上述の酸化還元シャッフリングシステムは、好ましくは混合ジスルフィドまたはチオスルホネートである。
【００３７】
システムは、例えば、酸化形態および還元形態のチオール成分からなる酸化還元シャッフリングシステムとして好適である。これは、還元電位を制御することにより天然化の際に折りたたまれているポリペプチド鎖内のジスルフィド結合の形成を許容し、他方において、折りたたまれているポリペプチド鎖内または折りたたまれているポリペプチド鎖間の誤ったジスルフィド結合の再シャッフリングを可能にする（Rudolph, R. (1997)、上記参照のこと）。好ましいチオール成分は、例えば：
【００３８】
−  還元形態（ＧＳＨ）および酸化形態（ＧＳＳＨ）のグルタチオン
−  システインおよびシスチン
−  システアミンおよびシスタミン
−  ２−メルカプトエタノールおよび２−ヒドロキシエチルジスルフィド
である。
【００３９】
本発明の天然化方法において、Ｃａ２＋イオンは、好ましくは、１〜２０ｍＭの濃度で存在する。例えば、ＣａＣｌ２を１〜２０ｍＭの濃度で添加しうる。Ｃａ２＋イオンは、折りたたまれているプロテイナーゼＫのカルシウム結合部位に結合しうる。
【００４０】
Ｃａ２＋と比べてほぼ化学量論的濃度での複合体化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在は、大気中の酸素による還元剤の酸化を防止し、遊離ＳＨ基を保護する。
【００４１】
天然化は、好ましくは、低温、すなわち２０℃未満で、好ましくは１０℃〜２０℃で行われる。本発明の方法では、天然化は、通常、約２４時間〜４８時間の期間後に完了する。
【００４２】
また、本発明は、以下の特徴：
Ａ）  バッファーのｐＨ値が７．５〜１０．５の範囲内である
Ｂ）  折りたたみを補助する低分子量物質の存在
Ｃ）  酸化還元シャッフリングシステムの存在
Ｄ）  Ｃａ２＋イオンに対してほぼ化学量論的濃度での複合体化剤の存在
を有することを特徴とする折りたたみバッファーに関する。
【００４３】
折りたたみバッファーが８〜９のｐＨを有する場合、および／または酸化還元シャッフリングシステムが混合ジスルフィドまたはチオスルホネートである場合が特に好ましい。
【００４４】
本発明の別の主題は、天然化された(natured)プロテイナーゼＫのチモーゲン前駆体を活性化するための方法である。本発明による折りたたみプロセス後、天然プロテアーゼＫおよび阻害性プロペプチドから不活性複合体が形成される。この複合体から活性プロテイナーゼＫが放出され得る。界面活性剤の添加が好ましく、０．１％〜０．２％（ｗ／ｖ）の濃度のＳＤＳが特に好ましい。
【００４５】
組換えプロテイナーゼＫを作製するための本明細書に開示された方法の利点は：
１．  大腸菌または他の好適な微生物の高発現潜在力および迅速かつ簡単な培養を利用しうること、
２．  組換えＤＮＡを遺伝子操作する可能性、
３．  天然化後の複雑でない精製、
４．  原核生物を宿主として選択した場合の真核生物性不純物の非存在、
である。
【００４６】
成熟プロテイナーゼＫをコードする核酸およびプロペプチドまたはプロ−プロテイナーゼＫをコードする核酸が宿主細胞内で別個に発現し、次いで、成熟プロテイナーゼＫの天然化のための折りたたみバッファーに一緒に移される方法も考えられうる。
【実施例１】
【００４７】
成熟型のプロテイナーゼＫをコードする遺伝子の合成
シグナル配列をもたず、かつイントロンをもたないTritirachium album Limber 由来の成熟プロテイナーゼＫの遺伝子を遺伝子合成の手段により作製した。Gunkel, F.A. および Gassen, H.G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1), 185-194 の837 bp 長の配列（Swiss Prot P06873のアミノ酸106〜384）を、鋳型として使用した。発現を最適化するためにアミノ酸配列を再翻訳するための基礎として、大腸菌に対して最適化したコドン使用頻度を使用した(Andersson, S.G.E. および Kurland, C.G. (1990) Microbiol. Rev. Vol. 54(2), 198-210, Kane, J.F. Curr. Opin. Biotechnol., Vol. 6, pp. 494-500)。該アミノ酸配列を配列番号：１に示し、ヌクレオチド配列を配列番号：２に示す。
【００４８】
遺伝子合成のため、遺伝子を、代替配列内においてセンスおよびリバースの相補的対鎖オリゴヌクレオチドの１８個のフラグメントに分割した（配列番号：３〜２０）。少なくとも１５ｂｐの領域を、各場合において隣接するオリゴヌクレオチドと重複する５’末端および３’末端に付着した。引き続く発現ベクター内へのクローニングのために制限エンドヌクレアーゼの認識部位を合成遺伝子の５’末端および３’末端のコード領域の外側に付着した。EcoRI切断部位を含有する配列番号：３に示すオリゴヌクレオチドを、Ｎ−末端アフィニティータグをもたないプロ−タンパク質Ｘ遺伝子をクローニングするための５’プライマーとして使用した。配列番号：２０は、HindIII 切断部位を含有する３’プライマーを示す。３’プライマーは、翻訳の終結を確実にするための天然停止コドンの後ろにさらなる停止コドンを含む。配列番号：２３に示すBamHI切断部位を有するオリゴヌクレオチド、または配列番号：２４に示すBamHI切断部位およびエンテロキナーゼ切断部位を有するオリゴヌクレオチドを、実施例３に記載のような、Ｎ−末端アフィニティータグおよび代替エンテロキナーゼ切断部位を有するプロタンパク質Ｘをクローニングするための５’プライマーとして使用した。
【００４９】
オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応により互いに連結し、得られた遺伝子を増幅した。このために、遺伝子をまず、それぞれ６個のオリゴヌクレオチドの３個のフラグメントに分割し、この３個のフラグメントを第２のＰＣＲサイクルにて互いに連結した。フラグメント１は配列番号：３〜８に示すオリゴヌクレオチドからなり、フラグメント２は配列番号：９〜１４に示すオリゴヌクレオチドからなり、フラグメント３は配列番号：１５〜２０に示すオリゴヌクレオチドからなる。
【００５０】
以下のＰＣＲパラメータを使用した。
【００５１】
ＰＣＲ反応１（３個のフラグメントの作製）
2004525631.tif 000003
【００５２】
ＰＣＲ反応２（遺伝子全体を形成するためのフラグメントの連結）
2004525631.tif 000004
【００５３】
ターミナルプライマーの添加
2004525631.tif 000005
【実施例２】
【００５４】
遺伝子合成による合成プロテイナーゼＫフラグメントのクローニング
ＰＣＲ混合物をアガロースゲルに負荷し、約１１３０ｂｐ  ＰＣＲフラグメントをアガロースゲル（Bio 101, Inc. CA USA 製のGeneclean II キット）から単離した。フラグメントを１時間３７℃で、EcoRI および HindIII 制限エンドヌクレアーゼ (Roche Diagnostics GmbH,独国)を用いて切断した。同時に、pUC18 プラスミド(Roche Diagnostics GmbH, 独国)を１時間３７℃で、EcoRI および HindIII 制限エンドヌクレアーゼで切断し、混合物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２６３５ｂｐベクターフラグメントを単離した。続いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用い、ＰＣＲフラグメントおよびベクターフラグメントを互いにライゲートした。このために、１μｌ（２０ｎｇ）のベクターフラグメントおよび３μｌ（１００ｎｇ）のＰＣＲフラグメント、１μｌ １０×リガーゼバッファー（Maniatis, T., Fritsch, E.F. および Sambrook, T. (1989). Molecular Cloning: A laboratory manual. 第２版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）、１μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ滅菌再蒸留Ｈ２Ｏをピペッティングし、注意深く混合し、１６℃で一晩インキュベートした。
【００５５】
クローニングした遺伝子を、両鎖の制限解析およびマルチプル配列決定により検査した。配列を配列番号：２に示す。
【００５６】
ａ）  ｐＰＫ−１発現プラスミドの構築
プロテイナーゼＫを発現させるため、適切なプロモーター、好ましくは lac、lacUV5、tac または T5 プロモーター、特に好ましくは T5 プロモーターなどのＩＰＴＧにより誘導されうるプロモーターの制御下で該構造遺伝子が正しい方法に挿入されるように、構造遺伝子をpKKT5発現ベクター内にクローニングした。この目的のため、プロテイナーゼＫの構造遺伝子をEcoRI および HindIII によりプラスミド pUC18 から切断し、制限混合物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約１１３０ｂｐフラグメントをアガロースゲルから単離した。同時に、発現プラスミド pKKT5 をEcoRI およびHindIII で切断し、制限混合物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約２．５ｋｂｐベクターフラグメントをアガロースゲルから単離した。このようにして得られたフラグメントを上述のようにして互いにライゲートした。遺伝子の正しい挿入を配列決定により確認した。
【００５７】
ｂ）  種々の大腸菌発現菌株における発現プラスミドｐＰＫ−１の形質転換
プラスミド pREP4 および／または pUBS520 であらかじめ形質転換した種々の発現菌株において、発現ベクターを形質転換した。プラスミド pREP4 は、導入前の発現の完全な抑制を確実にするはずである lacI リプレッサーの遺伝子を含む。プラスミドpUBS520 (Brinkmann, U. ら. (1989) Gene Vol. 85(1), 109-114)もまた、lacI リプレッサーを含有するが、さらに、大腸菌における稀有アルギニンコドンＡＧＡおよびＡＧＧを翻訳するのに必要なｔＲＮＡをコードするｄｎａＹ遺伝子を有する。種々の大腸菌株のコンピテント細胞を、Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. Vol. 166, 557-580 の方法に従って調製した。このようにして調製した１００μｌの細胞を、２０ｎｇの単離したｐＰＫ−１プラスミドＤＮＡと混合した。氷上での３０分間のインキュベーション後、それらに熱ショック（４２℃で９０秒）を与えた後、氷上で２分間インキュベートした。続いて、細胞を１ｍｌ ＳＯＣ培地に移し、表現型発現のために振盪しながら１時間３７℃でインキュベートした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとしてアンピシリンを含有するＬＢ培地にプレーティングし、１５時間３７℃でインキュベートした。好ましい菌株は、大腸菌 K12 菌株 JM83、JM105、UT5600、RR1Δ15、DH5α、C600、TG1、NM522、M15、または大腸菌 B 誘導体 BL21、HB101であり、大腸菌M15 が特に好ましい。
【実施例３】
【００５８】
Ｎ−末端アフィニティータグのクローニング
Ｎ−末端アフィニティータグを挿入するため、プロ−プロテイナーゼＫ遺伝子の５’末端の前にBamHI切断部位を挿入した。これは、実施例１で得られた産物を鋳型として、配列番号：２０、２３および２４に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより達成された。配列番号：２３に記載のプライマーは、プロ−プロテイナーゼＫ遺伝子の５’領域の上流にBamHI切断部位を含み、配列番号：２４に記載のプライマーは、さらに、プロ配列の第１コドンの直前にエンテロキナーゼ切断部位を含む。配列番号：２０は、HindIII 切断部位を有する実施例１でも使用した３’プライマーを示す。得られたＰＣＲ産物を上述のようにして単離し、BamHI および HindIII で消化し、アガロース電気泳動により精製した。
【００５９】
２個の相補的オリゴヌクレオチドから構成される合成リンカーにより、さらに制限消化することなく、EcoRI 切断部位が５’末端に、BamHI 切断部位が３’末端に形成されるように、アフィニティタグを挿入した。His タグでは、センス鎖は配列番号：２１に示す配列を有し、アンチセンス鎖は配列番号：２２に示す配列を有した。リンカーは、Ｎ−末端ＲＧＳモチーフを有するヘキサ−His タグをコードした。リンカーとプロ−プロテイナーゼＫとの間のBamHI 切断部位を、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーに翻訳した。リンカーをアニーリングするため、等モル量（それぞれ５０ｐｍｏｌ／μｌ）の２個のオリゴヌクレオチド（配列番号：２１および２２）を５分間、９５℃に加熱し、続いて、１分あたり２℃で室温まで冷却した。結果として、相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングは可能な限り完全となるはずである。
【００６０】
リンカーを、BamHI/HindIII消化したPCR産物（Roche Diagnostics GmbH、Germany製Rapid Ligation Kit）とライゲーションし、アガロースゲル電気泳動（Qiagen、Germany製QIAquick gel extraction Kit）により精製した。得られたライゲーション産物を、実施例2bとほぼ同様にEcoRIおよびHindIIIオーバーハング（overhang）を介して発現ベクターにライゲーションし、発現株において相応じて形質転換した。
【００６１】
このモジュール系は、プロ−プロテイナーゼＫの構造遺伝子に融合されるべき合成リンカーによってコードされる種々の親和性タグを使用可能にする。タグのその後の除去を所望する場合、エンテロキナーゼ切断部位を、対応する5'プライマーの適切な選択によりタグとプロペプチドとの間に代わりに挿入し得る。さらに、成熟プロテイナーゼＫまたはそのプロペプチドなどのプロテイナーゼＫ遺伝子の特定の領域を、PCRプライマーの重複領域の適切な選択により増幅し得る（図１）。
【実施例４】
【００６２】
大腸菌におけるプロテイナーゼＫの発現
プロテイナーゼＫは非常に活性な非特異的プロテアーゼであるので、不活性形態で、好ましくは封入体として発現することが好ましい。
【００６３】
プロテイナーゼＫをコードする遺伝子を発現するため、3mlのLbamp培地にプラスミド含有クローンを接種し、シェーカー内で37℃にてインキュベートした。
【００６４】
2004525631.tif 000006
【００６５】
細胞を、550nmでの光学密度0.5にて1mM IPTGを用いて誘導し、シェーカー内で37℃にて４時間インキュベートした。続いて、個々の発現クローンの光学密度を測定し、OD550に対応する3/mlのアリコートを取り出し、細胞を遠心分離した（10分6000rpm、４℃）。細胞を、400μlのTE緩衝液に再懸濁し、超音波により溶解し、可溶性タンパク質画分を、不溶性タンパク質画分から遠心分離（10分、14,000g、４℃）により分離した。
【００６６】
2004525631.tif 000007
【００６７】
SDSおよびβ-メルカプトエタノールを含む応用（application）緩衝液を、全ての画分に添加し、タンパク質を加熱（５分95℃）により変性させた。その後、10μlのアリコートを、12.5％分析SDSゲルにより解析した（Laemmli、U.K.（1970）Nature Vol.227(259)、680〜685）。不溶性タンパク質凝集物（封入体）の形態での非常に強い発現を、成熟プロテイナーゼＫのクローンおよびプロ−プロテイナーゼＫのクローンについて観察した。従って、プロテイナーゼＫ活性は測定されなかった。
【実施例５】
【００６８】
封入体の単離
封入体を公知の方法（Rudolph,R.（1997）上記参照）により調製した。
【００６９】
細胞溶解のため、10gの湿潤バイオマスを、各場合について50ml  100mM Tris/HCl pH7.0、1mM EDTAに再懸濁した。その後、15mgのリゾチームを添加し、４℃にて60分間インキュベートし、続いて細胞を、高圧（Gaulin細胞溶解装置）で溶解した。3mM MgCl2および10μg/ml DNase を粗抽出物に添加して、DNAを、RTにて30分間消化した。封入体を含む不溶性細胞成分を、遠心分離（30分20,000g）により分離し、洗浄緩衝液１で１回、洗浄緩衝液２で３回洗浄した。
【００７０】
2004525631.tif 000008
【００７１】
2004525631.tif 000009
【００７２】
最終洗浄工程のペレットは、すでに高純度の精製タンパク質を含む粗封入体を構成する。
【実施例６】
【００７３】
封入体の可溶化
ａ）システインで還元しながらの可溶化
1gの粗封入体を、10mlの可溶化緩衝液に懸濁し、穏やかに攪拌しながらRTにて２時間インキュベートした。
【００７４】
2004525631.tif 000010
【００７５】
可溶化物（solubilisate）を、25％HClでpH3に滴定し、500ml 6M塩酸グアニジンpH3に対してRTにて４時間２回、次いで1000ml塩酸グアニジンpH7に対して４℃にて一晩透析した。タンパク質濃度を、280nmで計算した吸光係数を用いてBradford法（Bradford、1976）により測定し、その濃度は10〜20mg/mlの間であった。遊離システインの数を、Ellman法に従って測定した。配列に従うと、1molプロテイナーゼＫあたり5molの遊離システインを見出した。可溶化封入体の純度を、12.5％SDS PAGEおよびクマシー染色後のバンドの定量により測定した。
【００７６】
ｂ）グルタチオンを用いて混合ジスルフィドを形成するためのシステインの誘導による可溶化。1g粗封入体を、10ml可溶化緩衝液に懸濁した。
【００７７】
2004525631.tif 000011
【００７８】
穏やかに攪拌しながらのRTでの15分インキュベーション（この間、触媒量の還元システインが少量のDTTにより形成される）後、100mM GSSGを添加し、pHを8.0に調整し、穏やかに攪拌しながらRTにてさらに２時間インキュベートした。
【００７９】
ａ）に記載したようなさらなる処理。
【実施例７】
【００８０】
プロ−プロテイナーゼＫの天然化（naturation）の最適化
種々のパラメータを、実施例6a)で調製した可溶化物からのプロ−プロテイナーゼＫの折り畳みおよびプロセシングにおける収量を最適にするために変更した。全ての調製物について、決められた折り畳み緩衝液を濾過し、脱気し、N2ガスで満たし、所望の温度にてインキュベートした。酸化還元シャッフリング（shuffling）系を、折り畳み反応の開始直前まで加えず、pHを再調整した。折り畳みを、速やかに混合しながら可溶化封入体を添加することにより開始した。折り畳み混合物の体積は、スクリューキャップ付き2mlガラス管に1.8mlであった。収量を、Bachem Company（Heidelberg）製の色素形成基質Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAを用いる活性試験により解析した。100mMのTris/HCl、5mMのCaCl2、25℃にてpH8.5を試験緩衝液として使用した。試験におけるペプチドの濃度は、DMSO中200mMのストック溶液由来の2mMであった。復元を活性化するために、0.1％SDSを試料に添加した（実施例８参照）。410nmでの吸光度を、20分間にわたって測定し、活性を傾きから計算した。
【００８１】
以下のパラメータを変更した：
a)温度および時間
100mMのTris、1.0mMのL-アルギニン、10mMのCaCl2を含む折り畳み緩衝液を、種々の温度にて平衡にした。3mMのGSHおよび1mMのGSSGを添加した後、pHを対応する温度にて再調整した。反応を、50μg/mlのプロ−プロテイナーゼＫを添加することにより開始した。12時間、36時間および60時間後、アリコートを取り出し、活性について試験した。結果を図２に示す。
【００８２】
b)pH値
50mMのクエン酸塩、50mMのMES、50mMのビシン、500mMのアルギニン、2mMのCaCl2および1mM EDTAを含む万能緩衝液を15℃にてインキュベートし、3mMのGSHおよび1mMのGSSGを添加した。pHを、pH4.0〜pH12.0の間の範囲に再調整し、折り畳み反応を、50μg/mlのプロ−プロテイナーゼＫ封入体を添加することにより開始した。18時間、３日および５日後測定した活性を図３に示す。
【００８３】
c)酸化還元電位
種々の酸化還元電位を、種々の比の酸化グルタチオンおよび還元グルタチオンを混合することにより、1.0MのL-アルギニン、100mMのビシン、2mMのCaCl2および10mMのCaCl2を含む復元緩衝液において設定した。折り畳み混合物中のタンパク質濃度は、50μg/mlであった。折り畳みを15℃にて実施した。GSHおよびGSSGの濃度を表１に示し、測定値を図４に示す。
【００８４】
【表１】
2004525631.tif 000012
【００８５】
d)折り畳みを促進する溶媒添加剤
種々の物質を、プロテイナーゼＫの折り畳み収量を増加する能力について試験した。この目的のため、種々の濃度で物質を含む溶液を調製し、2mMのCaCl2、1mMのEDTAおよび100mMのビシンと混合した。pHを15℃の折り畳み温度にてpH8.75に調整した。タンパク質濃度は、50μg/mlであった。図５は、選択した緩衝液添加剤の濃度に関する活性プロテイナーゼＫの相対的収量を示す。
【実施例８】
【００８６】
天然化された（natured）プロ−プロテイナーゼＫの活性化
本発明の方法によるプロ−プロテイナーゼＫの天然化（naturation）後、活性を有さないかまたはほんのわずかな活性のみを有することがわかった。クロマトグラフ法およびSDS-PAGEは、成熟プロテイナーゼＫはすでに存在しているが、プロペプチドとの複合体中にまだ会合されていることを示した。これは、本明細書で活性化としていわれ、また本発明の主題である方法で分離され得る。
【００８７】
この実施例において，SDSを、折り畳み混合物に２％（v/v）の濃度で添加し、続いて折り畳み添加物およびSDSを透析により除去する。あるいは、SDSをまた、透析によって添加剤を除去した後に添加し得る。全ての場合において、プロテイナーゼＫの十分な活性を検出した。
【実施例９】
【００８８】
折り畳み産物の特徴付け
本発明の方法により天然化され（natured）活性化されたプロテイナーゼＫを、さらに種々の方法により特徴付けした。
【００８９】
a)SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度および分子量測定の解析
天然化（naturation）プロセスの種々の段階および最終産物（折り畳みおよび活性化組換えプロテイナーゼＫ）由来のアリコートを、12.5％SDSポリアクリルアミドゲルにあてがった。試料はそれぞれ、10mM DTTまたは１％（v/v）2-メルカプトエタノールを含んでいた。本発明の方法により調製された組換えプロテイナーゼＫは、重大な汚染はなく、約30kDaの見かけ分子量で本物のプロテイナーゼＫと同一に進む（図11参照）。
【００９０】
b)RP-HPLCを用いた純度の解析
折り畳まれ、かつ活性化されたプロテイナーゼＫおよびT.album由来の本物のプロテアーゼＫおよびプロ−プロテイナーゼＫ封入体を、逆相HPLCにより分析した。寸法15cm×4.6cm直径を有するVydac C4カラムを使用した。試料を、0.1％TFA中に０％〜80％のアセトニトリル勾配で溶出した。折り畳み産物は、標準として使用した本物のプロテイナーゼＫと同一の移動特性を示す（図12参照）。
【００９１】
c)解析用超遠心分離
復元されおよびプロセスされたプロテイナーゼＫがプロペプチドなしのモノマー形態で存在しているかどうかを分析するため、タンパク質を解析用超遠心分離により試験した。分子量を29490Daであると決定し、これはこの方法の誤差の限界範囲内でモノマー成熟プロテイナーゼＫの質量に対応する（図13参照）。この故に、このことは、プロペプチドがプロテイナーゼＫの活性化により定量的に切断されること示した。
【００９２】
d)N-末端配列解析
プロペプチドが正確な切断部位で切断されるかどうかを試験するために、天然化され（natured）、かつ活性化された組換えプロテイナーゼＫを配列解析に供した。このために、折り畳み産物を、実施例9b)に記載するようにRP-HPLCで脱塩し、最初の６残基を、N-末端配列決定により試験した。結果（AAQTNA）は、成熟プロテイナーゼＫの本物のN-末端と一致する。
【００９３】
e)活性およびKm値
折り畳みかつ活性化プロテイナーゼＫのKm値を、本物のプロテイナーゼＫの値と比較した。テトラペプチドSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAを、基質として使用した。試験を、1mM CaCl2を含む2.0ml 50mM Tris、pH8.5中で25℃にて実施した。ペプチドの加水分解を410nmで分光的にモニターした。0.16mMのKm値を、組換えプロテイナーゼＫについて見出し、これは本物のプロテイナーゼＫのKm値に非常によく対応する（図14参照）。
【００９４】
f)血清タンパク質の分解パターン
活性を特徴付けるためのさらなる試験において、血清タンパク質の切断パターンを試験した。このために、規定量の血清タンパク質を１μg組換えプロテイナーゼＫまたは同量の本物のプロテイナーゼＫで消化した。切断パターンを、実施例9b)に記載するのと同一条件下でRP-HPLCにより解析した。図15は、組換えおよび本物のプロテイナーゼＫが同一の分解パターンを生じることを示す。
【実施例１０】
【００９５】
折り畳み産物の精製
本発明の方法により天然化した（natured）組換えプロ−プロテイナーゼＫを、ゲル濾過により精製した。図11に記載のように、事前活性化なしの第一ランおよび0.15％（w/v）SDSを使用する事前活性化（30分４℃）ありの第二ランの後に、濃縮天然化（naturation）溶液を、Superdex 75pg上で分離した。100mM Tris/HCl、150mM NaCl pH8.75（４℃）を移動緩衝液として使用した。適用体積は、1200mlのカラム体積かつ5ml/分の流速で10mlであった。適用完了後、14ml画分を収集した。画分のアリコートを、トリクロロ酢酸で沈殿し、洗浄し、10mM DTTを含むLaemmli試料緩衝液中に採取した。試料を12.5％SDSポリアクリルアミドゲルに適用し、ラン後、ゲルをクマシーブルーR250で染色した。
【００９６】
活性化なしの第一ランにおいて、非プロセス組換えプロ−プロテイナーゼＫが、排除体積中で微小凝集体（microaggregate）の形態でおそらくランする第１ピークに見えた。第２ピークにおいて、非共有結合的に結合し、インヒビターとして作用するプロペプチドと同時溶出するプロセス組換えプロ−プロテイナーゼＫを観察する。結果として、活性化は、事前活性化なしでは見出せない。SDSを画分に添加した後のみ、第２ピークは、有意なプロテイナーゼＫ活性を表わす（示さず）。
【００９７】
折り畳み組換えプロテイナーゼＫをSDSで予め活性化した第２ランのみが、同一条件下でプロテイナーゼＫと同一の体積後に溶出する１つのピークを示す（示さず）。SDSゲル上で、このピーク中のプロペプチドのない完全な成熟組換えプロテイナーゼＫを見る。全ての不純物およびプロペプチドは、活性化組換えプロテイナーゼＫにより適用混合物中ですでに消化されたようである。予想したように、プロテイナーゼＫピークの画分は、SDSでのさらなる活性化なしに活性を示した。この様式で精製した組換えプロテイナーゼＫは、SDSゲル上でほとんど100％の純度であるようであり、本物のプロテイナーゼＫと同一の移動挙動を示す（図16）。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、Ｎ−末端BamHI切断部位およびＮ−末端アフィニティータグとの融合のための代替エンテロキナーゼ切断部位を有するプロテイナーゼＫを作製するためのＰＣＲ反応の概略図である。
【図２】図２は、天然化の収率の温度に対する依存性を示す図である。
【図３】図３は、天然化の収率のｐＨに対する依存性を示す図である。
【図４】図４は、天然化の収率の酸化還元電位に対する依存性を示す図である。
【図５】図５は、天然化の収率のアルギニン濃度に対する依存性を示す図である。
【図６】図６は、天然化の収率のＴｒｉｓ濃度に対する依存性を示す図である。
【図７】図７は、天然化の収率のα−シクロデキストリン濃度に対する依存性を示す図である。
【図８】図８は、天然化の収率のトリエタノールアミン濃度に対する依存性を示す図である。
【図９】図９は、天然化の収率の尿素濃度に対する依存性を示す図である。
【図１０】図１０は、プロ−プロテイナーゼＫの天然化のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図１１】図１１は、天然化されたプロ−プロテイナーゼＫの逆相クロマトグラフィーを示す図である。
【図１２】図１２は、再天然化され、プロセッシングされたプロテイナーゼＫを分析的超遠心分離により解析した図である。  遠心分離は、１２０００ｒｐｍ、２０℃で６３時間行った。データ（ｏ）は、見掛け分子量２９〜４９０Ｄａを有する均一な種にフィットしうる。フィットデータと測定データとの間に系統的偏差は観察されなかった（下側データ）。
【図１３】図１３は、天然化されたプロテイナーゼＫのＫｍ値の測定を示す図である。
【図１４】図１４は、天然化されたプロテイナーゼＫによる血清タンパク質の分解パターンを示す図である。
【図１５】図１５は、ゲル濾過による天然化されたプロテイナーゼＫの精製を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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