(57)【要約】組換え的に産生されたＮＳ２／３プロテアーゼのリフォールディングされた不活性型を作製する方法であって、ａ）カオトロピック試薬の存在下で封入体から前記プロテアーゼを精製する工程；及びｂ）濃度を低下させたカオトロピック試薬又は極性添加物の存在下で、還元試薬及びラウリルジエチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）と接触させることにより、精製タンパク質をリフォールディングする工程を含む前記方法。本発明はさらに、活性化界面活性剤の添加によって前記リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを活性化する方法を含む。本方法は、ＨＣＶに対する治療薬として有用であろうＮＳ２／３プロテアーゼ潜在的阻害剤として小型の分子及びリガンドをスクリーニングすることを可能にする、多量の活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する。
2004514459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リフォールディングされた不活性型ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する方法であって、
ａ）カオトロピック試薬存在下で前記プロテアーゼを単離する工程；
ｂ）濃度を低下させた前記カオトロピック試薬又は極性添加物の存在下で還元試薬及びラウリルジエチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）と接触させることによって、前記単離プロテアーゼをリフォールディングさせる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ＬＤＡＯの最終濃度が臨界ミセル濃度以上である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＬＤＡＯが最終濃度０．００３％〜１％である、請求項４記載の方法。
【請求項４】
ＬＤＡＯが最終濃度０．０３％〜１％である、請求項４記載の方法。
【請求項５】
ＬＤＡＯが最終濃度１％である、請求項５記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）において、カオトロピック試薬がグアニジン−ＨＣｌ、グアニジン及び尿素からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
カオトロピック試薬が５ Ｍ〜８ Ｍの高濃度である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
カオトロピック試薬が、最終濃度６ Ｍのグアニジン又は最終濃度６ Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、又は最終濃度８ Ｍの尿素である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
カオトロピック試薬が６Ｍのグアニジン−ＨＣｌである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、カオトロピック試薬又は極性添加物がグアニジン、グアニジン−ＨＣｌ、尿素及びアルギニン−ＨＣｌからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
グアニジン−ＨＣｌ又はアルギニン−ＨＣｌが用いられる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アルギニン−ＨＣｌが用いられる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アルギニン−ＨＣｌが最終濃度０．２５ Ｍ〜２ Ｍである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アルギニン−ＨＣｌが最終濃度０．５ Ｍ〜１ Ｍである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
アルギニン−ＨＣｌが最終濃度０．５ Ｍである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
還元試薬がＴＣＥＰ及びＤＴＴからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
還元試薬が最終濃度５ ｍＭのＴＣＥＰである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼが細胞内封入体から単離される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
リフォールディングを透析又はゲル濾過によって行い、精製ＮＳ２／３プロテアーゼを得る、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
リフォールデイングをゲル濾過によって行う、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＮＳ２／３プロテアーゼが、完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ、又は、Ｎ末端残基としてアミノ酸８１０〜アミノ酸９０６までのいずれか一つのアミノ酸を有するＮＳ２／３プロテアーゼ短縮片である、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ＮＳ２／３プロテアーゼが、ＨＣＶ１ｂ−４０完全長ＮＳ２／３プロテアーゼの９０４〜１２０６残基の最小アミノ酸配列を有する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＮＳ２／３プロテアーゼが、配列番号１０によって規定する短縮ＮＳ２／３プロテアーゼからなる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ｃ）請求項１において規定するリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを活性化界面活性剤を含む媒体中に希釈し、前記ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断を誘導する工程を含む、活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する方法。
【請求項２５】
ＬＤＡＯが最終濃度０．１％以下に希釈される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
工程ｃ）でグリセロールがさらに加えられる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
グリセロールが最終濃度１０％〜５０％の、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
活性化界面活性剤がＣＨＡＰＳ、トライトンＸ−１００、ＮＰ−４０及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドからなる群より選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
活性化界面活性剤が最終濃度０．１％〜１％の、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
活性化界面活性剤がＣＨＡＰＳである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
活性化界面活性剤がｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドである、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断活性を測定する方法であって、
ｄ）請求項２４の方法によって作製した活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを充分な時間インキュベートし、ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断の誘導、及びその切断生成物又はフラグメントを作製する工程；及び
ｅ）未切断ＮＳ２／３プロテアーゼ、切断生成物又はこれらのフラグメントの有無を測定する工程を含む前記方法。
【請求項３３】
工程ｃ）が１５℃〜３０℃の温度で行われる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
工程ｃ）が１５℃〜２５℃の温度で行われる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
工程ｃ）が室温で行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断活性の潜在的阻害剤をスクリーニングするアッセイであって、
ａ）潜在的阻害剤の存在下又は非存在下で、請求項３２記載の方法を行うこと；
ｂ）潜在的阻害剤の存在下又は非存在下で、未切断ＮＳ２／３プロテアーゼ、切断生成物又はこれらのフラグメントの量を比較することを含む、前記アッセイ。
【請求項３７】
完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ、又は、Ｎ末端残基としてアミノ酸８１０〜アミノ酸９０６のいずれか一つを有するＮＳ２／３プロテアーゼ短縮片からなる、単離ポリペプチド。
【請求項３８】
ＨＣＶ１ｂ−４０完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ９０４〜１２０６残基の最小アミノ酸配列を有するＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼ短縮片からなる、単離ポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号４又は１０によって規定する短縮ＮＳ２／３プロテアーゼからなる、単離ポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３９記載のポリペプチドと比較して、全長にわたって９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号１１、１２、１３、１４及び１５によって規定する配列からなる群より選択される短縮ＮＳ２／３プロテアーゼからなる、単離ポリペプチド。
【請求項４２】
完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ、ＮＳ２／３プロテアーゼ短縮片又は配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５によって規定する配列より選択される単離ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼを含む組成物であって、前記プロテアーゼが充分な濃度のＬＤＡＯを含む溶液中に存在し自己切断が阻害される前記組成物。
【請求項４３】
配列ＳＦＥＧＱＧＷＲＬＬ（配列番号２１）を有するペプチド。
【請求項４４】
ペプチドがＮＳ２／３プロテアーゼインヒビターである、請求項４３記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は概して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ２／３プロテアーゼの精製方法及び活性化方法に関し、特に、自己切断のために後に活性化することが可能であるリフォールデイングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ又はその短縮片を作製する方法に関する。加えて特に本方法は、短縮及び精製された活性型ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼ、及び、その阻害剤を同定するためのアッセイを提供する。
（背景技術）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、人間に肝硬変及び末期の肝臓疾患をもたらす慢性肝臓疾患の有力な原因である。世界中で一億五千万人以上の人々が持続的にＨＣＶに感染し、慢性感染症に起因し得る死亡者数は今後１０〜２０年の間に劇的に増加するだろう。現在有用な治療法は効果が限定されており、十分でない。これらの治療法は、単独又はリバビリンのような他の抗ウイルス薬と併せて、インターフェロンαの使用を必要としている。患者の再発率の高さ及び副作用に加えて、その低い反応速度が観察されることを考慮すると、長期的な治療上の利益を与え得る新しい治療法が必要とされている。
【０００２】
クローン化され特徴付けられたＨＣＶゲノムの部分的及び全体配列は、将来的な抗ウイルス治療を目的として適切な標的を提供するために解析されている。ＨＣＶはフラビ・ウイルス科系統群に属する、外被膜で覆われたプラス鎖ＲＮＡウイルスである。一重鎖のＨＣＶ ＲＮＡゲノムは長さおよそ９６００のヌクレオチドであり、約３０１０アミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードする、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。感染した細胞内で、このポリタンパク質は細胞及びウイルスのプロテアーゼによって複数の部位で切断され、構造タンパク質及び非構造（ＮＳ）タンパク質が産生される。ＨＣＶの場合には、成熟非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ）の生成が、２つのウイルスプロテアーゼによって行われている。第一のウイルスプロテアーゼは未だ特徴付けが不十分であるが、ＮＳ２／３接合部を切断し、これ以降はＮＳ２／３プロテアーゼと呼ばれる。第二のウイルスプロテアーゼはＮＳ３のＮ末端領域内に含まれるセリンプロテアーゼであり、これ以降はＮＳ３プロテアーゼと呼ばれ、ＮＳ３／４Ａ切断部位に対してはシス、残りのＮＳ４Ａ／４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／５Ａ、ＮＳ５Ａ／５Ｂ部位に対してはトランスに、ＮＳ３の下流に続く全ての切断を媒介する。ＮＳ４Ａタンパク質は、ＮＳ３プロテアーゼに対する補助因子としての作用、及びおそらくは、ＮＳ３及び他のウイルスレプリカーゼ構成成分の膜局在性を補助することなど、複数の機能に貢献するようである。ＮＳ３タンパク質のＮＳ４Ａとの複合体形成は、前記部位の全てにおいてタンパク質分解効率を増強し、プロセシング現象に必要であると考えられる。ＮＳ３タンパク質は、ヌクレオシドトリフォスファターゼ活性及びＲＮＡヘリカーゼ活性も示す。ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼであって、ＨＣＶの複製に必要とされる。
ＨＣＶがコードする酵素の大部分、すなわち、ＮＳ３のプロテアーゼ、ヘリカーゼ及びＡＴＰアーゼ活性、及び、ＮＳ５ＢのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性は、新しい抗ウイルス治療開発の標的として評価されている（Ｄｙｍｏｃｋ，Ｂ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．１１（２）：７９−９６及びＷａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ４（１１）：５１８−５２９）。今のところ詳細に特徴付けられていないウイルス酵素はＮＳ２／３プロテアーゼだけであり、おそらく、これが同時翻訳的に働くからである。
【０００３】
ＮＳ２／３プロテアーゼはＮＳ２とＮＳ３接合部のアミノ酸Ｌｅｕ１０２６とＡｌａ１０２７間の自己切断に関係している（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３３：３４９−３５６及びＲｅｅｄ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（７）４１２７−４１３６）。この切断は、ＮＳ２／３プロテアーゼ活性を欠損するクローンを接種してもチンパンジーにＨＣＶ感染症が起こらないことに示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏの増殖性複製に必要不可欠であるらしい（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（４）２０４６−２０５１）。機能的ＮＳ２及び真正ＮＳ３プロテアーゼＮ末端配列の生成が、ある程度ＮＳ５Ａリン酸化に関連してもいるらしい（Ｌｉｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４，５７２−５７７及びＮｅｄｄｅｒｍａｎｎ Ｐ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（１２）：９９８４−９９９１）。
自己切断活性のために必要とされるＨＣＶオープンリーディングフレームの最小領域は、Ｎ末端境界側アミノ酸８９８及び９０７とＣ末端境界側アミノ酸１２０６の間のどこかに位置することが報告されている（Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４６６５−４６７５、Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０５８３−１０５８７、Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（１２）：７４６１−７４７１、Ｌｉｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４，５７２−５７７、Ｐａｌｌａｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２０）；９９３９−４６）。興味深いことに、ＮＳ２／３プロテアーゼ活性はＮＳ３プロテアーゼ活性と無関係であるが（Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０５８３−１０５８７、Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４６６５−４６７５）、ＮＳ３プロテアーゼドメインを別の非構造タンパク質によって置換することはできない（Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（１２）：７４６１−７４７１）。変異誘発研究は、Ｈｉｓ９５２及びＣｙｓ９９３残基がシス−切断活性に必要不可欠であることを示している（Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０５８３−１０５８７、Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４６６５−４６７５）。Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａ，Ａ．Ｅ等（（１９９６）Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ．６：６４−８６）は、ＮＳ２／３プロテアーゼがシステインプロテアーゼになり得ることを示唆している。しかしながら、その活性が金属イオンによって刺激されＥＤＴＡによって阻害されるという知見は、ＮＳ２／３プロテアーゼがメタロプロテアーゼであるという示唆を導く（Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０５８３−１０５８７、Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４６６５−４６７５）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写及び翻訳アッセイにおける古典的プロテアーゼインヒビターの研究（Ｐｉｅｒｏｎｉ，Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（９）：６３７３−６３８０）では、未だ明確な分類ができていない。
【０００４】
ＮＳ２／３領域の発現に続くＮＳ２／３接合部におけるプロセシングが、無細胞翻訳系、Ｅ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルス組換え体を感染させた昆虫細胞及び／又は哺乳動物細胞（一過性トランスフェクション又はワクシニア・ウイルスＴ７融合系）において報告されている（Ｄａｒｋｅ，Ｐ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４９）３４５１１−３４５１４及びＷＯ ０１／１６３７９、Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０５８３−１０５８７、Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（８）：４６６５−４６７５、Ｐｉｅｒｏｎｉ，Ｌ．， ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（９）：６３７３−６３８０、Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ，Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（１２）：７４６１−７４７１）。しかしながら、単離組換え酵素におけるプロセシングは、ごく最近まで報告されていなかった（Ｐａｌｌａｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２０）：９９３９−４６、Ｔｈｉｂｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４９）：４６６７８−４６６８４）。
Ｇｒａｋｏｕｉ等（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０５８３−１０５８７）及びＫｏｍｏｄａ等（（１９９４）Ｇｅｎｅ，１４５：２２１−２２６）は両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＮＳ２／３プロテアーゼを含むＨＣＶポリペプチドの発現を開示している。発現に続くプロセシングは、細胞可溶化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析から評価された。Ｋｏｍｏｄａも、Ｎ末端にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｃ末端にジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＥＲ）を融合させたＨＣＶポリタンパク質を用いて、Ｎ末端シークエンシングのみを目的として、アフィニティークロマトグラフィーによる細胞可溶化液からのＤＨＦＲ融合生成物の部分精製を報告している。
【０００５】
このようにして、ＮＳ２／３プロテアーゼのメカニズム研究及び構造研究だけでなく生化学的特性の研究も、この酵素の純粋な組換え体が入手困難であるために、妨げられている。ＮＳ２／３プロテアーゼの潜在的阻害剤が高速大量処理スクリーニング形式により同定可能になる以前に、精製活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの信頼性のある供給源が存在しなければならない。
２００１年９月２０日に公開されたＷＯ ０１／６８８１８｛及びＰａｌｌａｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２０）；９９３９−４６｝は、活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ組換え体を精製する方法を記述している。しかしながら、そのリフォールディング方法は自己触媒作用を避けるために４℃で行われる必要がある。
本発明の方法は、Ｔｈｉｂｅａｕｌｔ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４９）：４６６７８−４６６８４においても開示されるが、２段階で進行する精製方法を開示する。この方法は室温で行うことができ、スケールアップすることが可能で自己切断なしに安定に保存できる可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ（室温で安定）の最初の例である。
従って、本発明の優れている点は、リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを精製する方法を提供することである。
本発明のさらに優れている点は、大規模スクリーニング試験のために、可溶性の不活性型プロテアーゼをさらに活性化させて可溶性の活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを作製することができる点である。
また、本発明のさらに優れている点は、精製活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ組換え体、及び、小型分子及びリガンドを潜在的阻害剤としてスクリーニングすることが可能な規模の前記プロテアーゼ短縮型を提供することである。
本明細書の記述で言及する多数の文献及びその内容は、参照により、本明細書に含まれるものとする。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼの精製及び活性化の新規方法を提供することにより、先行技術の難点及び不利益を減少させる。この方法は、プロテアーゼの自己切断を促進させない状態で、前記プロテアーゼを可溶化及びリフォールディングする点で優れている。加えて本方法は、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現へ続く組換え方法を用いて、ＮＳ２／３プロテアーゼのＮ末端短縮型を封入体中に高レベルで産生する点でさらに優れている。この高レベル産生は、多量のプロテアーゼを単離して精製することを可能とする。
これは、自己触媒作用を進行させることなく室温で安定な、単離不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの最初の報告である。これはまた、本発明の方法から得られる精製活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ組換え体の最初の報告である。精製ＮＳ２／３プロテアーゼ組換え体が入手できることは、この酵素の生化学的特性を詳細にすること及び新規阻害剤をスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの発展を可能にするであろう。
第一態様によれば、本発明は以下の工程を含む、リフォールディングされた不活性型ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する方法を提供する：
ａ）カオトロピック試薬の存在下でプロテアーゼを単離する工程；
ｂ）濃度を低下させたカオトロピック試薬又は極性添加物の存在下、還元試薬及びラウリルジエチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）と接触させることにより、単離したプロテアーゼをリフォールディングする工程。
本発明の第二態様によると、以下を含む活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ作製方法が提供される：
ｃ）工程ｂ）で得られた可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを含む媒体に活性化物質を加え、その結果、ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断を誘起する切断／活性化緩衝液を形成させること。
【０００７】
第三態様では、本発明は、以下を含むＮＳ２／３プロテアーゼの活性を検定する方法を提供する：
ｄ）ＮＳ２／３プロテアーゼを工程ｃ）の切断／活性化緩衝液中に、自己切断に充分な時間インキュベートすること；及び
ｅ）自己切断の指標として、切断生成物又はそのフラグメントの有無を測定すること。
本発明の第四態様によれば、以下を含む、ＮＳ２／３プロテアーゼのプロテアーゼ活性を阻害する候補薬物又はリガンドをスクリーニングするためのアッセイを提供する：
ｄ）候補薬物又はリガンドの存在下、又は非存在下で、工程ｃ）の切断／活性化緩衝液中にＮＳ２／３プロテアーゼサンプルを充分な時間インキュベートすること；
ｅ）切断生成物又はそのフラグメントの量を測定すること；及び
ｆ）前記候補薬物又はリガンドの存在下、又は非存在下で、切断生成物又はそのフラグメントの量を比較すること。
本発明の第五態様によると、リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ、図１Ｂにおいて用いられる番号に従って番号付けられた完全長ＮＳ２／３プロテアーゼの残基９０６〜１２０６の最小アミノ酸配列を有する前記プロテアーゼ短縮片又はその機能的に等価な変異体を提供する。
本発明の第六態様によると、完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ、それらの短縮片又は配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５によって定義される配列より選択される、単離ＮＳ２／３プロテアーゼを含む組成物を提供する（ここで、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼの自己切断を阻害するのに充分な濃度のＬＤＡＯを含む溶液中に存在する）。
【０００８】
本発明を一般的に説明してきたが、例として好ましい態様を示しつつ添付の図面を参照する。
（好ましい態様の詳細な説明）
定義
特に定義されない限り、本明細書中に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、細胞培養の手順、感染、分子生物学的手法などは、前記技術分野において用いられる通常の方法である。これらの技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌ等（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のようなリファレンス・マニュアルにおいて見出すことができる。
本明細書において、ヌクレオチド配列は一重鎖で５’から３’方向で左から右に、この技術分野においてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の勧告（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７２，１１：１７２６−１７３２）に従って通常用いられる１文字のヌクレオチド記号を用いて表される。
本明細書で用いられる「ＮＳ２／３プロテアーゼ」、「プロテアーゼ」及び「酵素」という用語は、本明細書中を通じて互換的に用いられ、ＨＣＶがコードするＮＳ２／３プロテアーゼを指す。
本明細書で用いられる「活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ」という用語は、検出可能なレベルの１０２６−１０２７残基間を切断する活性を保持しているＮＳ２／３プロテアーゼを表すことを意図する。前記プロテアーゼ活性は、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析のような酵素アッセイ法によって、残存する未切断ＮＳ２／３プロテアーゼ、ＮＳ２タンパク質又はＮＳ３プロテアーゼのような切断生成物、又はそれらのフラグメントをモニターすることによって測定される。
本明細書でＮＳ２／３プロテアーゼに言及する時に用いられる「単離された」という用語は、細胞成分に関してＮＳ２／３プロテアーゼが濃縮されているのを意味することを意図する。特に、この用語は、混入する細胞成分と比較してＮＳ２／３プロテアーゼが５０％以上に濃縮されていることを意味する。
【０００９】
本明細書でＮＳ２／３プロテアーゼに言及する時に用いられる「精製」又は「精製された」という用語は、混入する細胞成分が実質的に存在しないＮＳ２／３プロテアーゼを意味することを意図する。好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼは約９０％の純度に精製される。さらに好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼは約９５％に精製される。ＮＳ２／３プロテアーゼは約９８％の純度に精製されるのが、最も好ましい。
本明細書で用いられる「不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼ」という用語は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した場合に残基Ｌｅｕ１０２６−Ａｌａ１０２７間を切断する活性を著しく減少した、又は、本質的に除去されたＮＳ２／３プロテアーゼを表すことを意図している。
本明細書で用いられる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含むことを意図する。この核酸分子は一重鎖又は二重鎖であってもよいが、好ましくは二重鎖のＤＮＡである。
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、連結している別の核酸分子を運搬することが可能な核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、付加的ＤＮＡ断片をその中に結合することができる環状二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡ断片をウイルスゲノム中に結合することができる。ある種のベクターは、それらが導入されている宿主細胞内において自律増殖する能力がある（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、従って宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、操作可能なように連結されている遺伝子発現を行わせる能力がある。このようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形をとることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形であるため、本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に用いることがある。しかしながら、本発明はウイルスベクターのような、同等な機能を果たす前記以外の形態を含むことを意図する。
【００１０】
本明細書で用いられる「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターのような、本発明の核酸がその中に導入される細胞を指すことを意図する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中では互換的に用いられる。前記用語は、特定の対象細胞だけでなく、それらの細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことが理解されるべきである。突然変異または環境的影響のためにある種の修飾が後継世代に起こり得るため、前記子孫は実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、その場合も本明細書で用いられる用語の範囲内には含まれる。
本明細書で用いられる「組換え」又は「組換え的に産生された」という用語は、細胞が、起源が細胞外因性である核酸分子を複製又は発現している、又は前記核酸分子によってコードされるペプチド又はタンパク質を発現しているのを指すことを意図する。特に、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）型においては見出されない遺伝子を発現することができる。
本明細書で用いられる「機能的に等価な変異体」とはＮＳ２／３プロテアーゼを記述する場合に用いられ、一つないしはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸又は天然でないアミノ酸に置換されたタンパク質配列であって、ＮＳ２／３プロテアーゼ活性が実質的に影響されないものを指すことを意図する。前記置換は、保存的なアミノ酸置換又は縮退核酸置換を含む。タンパク質配列に関する場合、必ずしも必要ではないが、置換するアミノ酸は通常、置換されるアミノ酸と同様な物理化学的特性を有する。前記同様な物理化学的特性は、電荷、かさ高性、疎水性、親水性などにおける類似性を含む。最も一般的に知られる保存性のアミノ酸置換の一部は以下のものを含むが、これだけに限られない：Ｌｅｕ又はＶａｌ又はＩｌｅ；Ｇｌｙ又はＡｌａ；Ａｓｐ又はＧｌｕ；Ａｓｐ又はＡｓｎ又はＨｉｓ；Ｇｌｕ又はＧｌｎ；Ｌｙｓ又はＡｒｇ；Ｐｈｅ又はＴｒｐ又はＴｙｒ；Ｖａｌ又はＡｌａ；Ｃｙｓ又はＳｅｒ；Ｔｈｒ又はＳｅｒ；及びＭｅｔ又はＬｅｕ。
本明細書でＮＳ２／３プロテアーゼに言及する際に用いられる「阻害する」という用語は、自己切断のプロテアーゼ活性が減少させられるのを意味することを意図する。ＮＳ２／３プロテアーゼを阻害することのできる薬物又はリガンド（以下では「潜在的阻害剤」と呼ばれる）は、細胞集団へのＨＣＶ感染を調節するために有用であり、従って、細胞内におけるＨＣＶの存在によって特徴付けられる病症を治療するための薬として有用であろう。
【００１１】
本明細書でＮＳ２／３プロテアーゼに言及する際に用いられる「リフォールディングされた」という用語は、室温において検出し得る自己切断活性を伴わない可溶性及び安定な高次構造を獲得するために、広げられた、又は不適切に折り畳まれたＮＳ２／３プロテアーゼによって行われる高次構造変化（部分的又は全体）の工程を指すことを意図する。前記リフォールディングされたタンパク質は、活性化されるために、活性化界面活性剤の添加を必要とする。
本明細書でＮＳ２／３プロテアーゼを記述する際に用いられる「自己切断」又は「自己切断された」という用語は、外因性の基質を伴わずにＮＳ２／３接合部（Ｌｅｕ１０２６−Ａｌａ１０２７）で起こる分子内の切断を意味することを意図する。
本明細書で用いられる「アフィニティーラベル」又は「アフィニティータグ」は、相補的リガンドによって特異的に捕捉される標識を指す。アフィニティーマーカー／アフィニティーリガンドの対の例は、以下のものを含むが、これだけに限られない：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）／マルトース；グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン；ヒスチジン（Ｈｉｓ）／金属；ストレプトアビジン・タグ／ストレプトアビジン又はニュートルアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）。アフィニティーリガンドとして用いられる金属は、以下のものからなる群より選択されてもよい：コバルト、亜鉛、銅、鉄及びニッケル（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（１），４９−１０６）。前記アフィニティーラベルはタンパク質のＮ又はＣ末端に位置付けることができるが、好ましくはタンパク質のＮ末端である。前記選択される金属は、ニッケルが好ましい。前記アフィニティーリガンドは、アフィニティークロマトグラフィーによる分離を容易にするために、カラム内に配置されることが可能である。
【００１２】
（好ましい態様）
Ｉ．リフォールディング及び精製の方法
本発明の第一態様の第一側面によれば、以下の工程を含むリフォールディングされた不活性型ＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する方法が提供される：
ａ）高濃度のカオトロピック試薬の存在下で、封入体からプロテアーゼを単離する工程；
ｂ）低濃度のカオトロピック試薬又は極性添加物の存在下で還元試薬及びＬＤＡＯと接触させることにより、前記単離プロテアーゼをリフォールディングする工程。
第一態様の好ましい側面では、組換えＤＮＡ技術を用いて活性型ＮＳ２／３プロテアーゼが作製される。本発明の発現ベクター（実施例を参照）は、本発明の核酸を宿主細胞内でのタンパク質発現に適した形態で含む。これは、組換え発現ベクターが一つないしはそれ以上の調節配列を含み、その配列は発現に用いられるために宿主細胞に基づいて選択されて、発現されるタンパク質をコードする核酸配列に操作的に連結されることを意味する。組換え発現ベクターにおいて「操作可能なように連結された」とは、対象とするヌクレオチド配列が、対応するアミノ酸配列を発現することを可能にする様式で調節配列に連結される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系において、又は、ベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞内において）ことを意味することを意図する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。これらの調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において、記述されている。調節配列は、多様な宿主細胞において構成的ヌクレオチド配列発現を支配する配列、及び、ある種の宿主細胞内のみにおいてヌクレオチド配列発現を支配する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、トランスフォームする宿主細胞の選択、要求するタンパク質発現のレベル等の要因に依存し得るということは、当業者には理解できるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入される結果として、本明細書に記述される核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド（例えば、ＮＳ２／３プロテアーゼ、ＮＳ２／３プロテアーゼの短縮型又は変異体）を産生することができる。
【００１３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞内でのＮＳ２／３プロテアーゼ発現のために設計することが可能である。例えば、ＮＳ２／３プロテアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞又は哺乳動物細胞内において、発現させることが可能である。適切な宿主細胞は、ＧｏｅｄｄｅｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）でさらに議論されている。
原核生物内でのタンパク質発現は、融合又は非融合いずれかのタンパク質の発現を支配する構成的又は誘導可能なプロモーターを含むベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行われている。融合ベクターは、コードするタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端、にいくつかのアミノ酸を付加する。これらの融合ベクターは典型的に３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質発現を増加する目的；２）組換えタンパク質の可溶性を高める目的；及び３）親和精製におけるリガンド（例えば、ヘキサヒスチジン・タグのようなアフィニティータグ）として作用することにより、組換えタンパク質の精製を促進させる目的。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大限にするための一つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク分解性切断する能力に障害のある宿主細菌内で、前記タンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８）。もう一つのストラテジーは、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に用いられるものとなるように、改変することである（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列の前記改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【００１４】
ベクターＤＮＡは、従来のトランスフォーメーション又はトランスフェクション技術によって、原核細胞又は真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」という用語は、本技術分野において認知されている、外来性の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の技術を指すことを意図し、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞にトランスフォーム又はトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９））及び他の実験用マニュアルにおいて見出すことができる。
タンパク質発現においては頻繁に、いわゆる封入体が形成される。ＮＳ２／３プロテアーゼは、例えば、宿主細胞を溶菌して封入体から組換えＮＳ２／３プロテアーゼを回収することによって、宿主細胞より単離され得る。封入体は、無処理のタンパク質又はポリペプチドの、非天然様の高次構造凝集物である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃを参照）。封入体からタンパク質を抽出する方法の多くの例が存在し、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｃｉｅｎｃｅのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓにおいて議論されている。培養中の原核細胞又は真核細胞のような本発明の宿主細胞は、本発明のＮＳ２／３プロテアーゼを産生するのに用いることができる。
従って、本発明はさらに、宿主細胞を培地中で培養することを含む。前記宿主細胞は、ＮＳ２／３プロテアーゼをコードする核酸配列のコード領域を有する発現ベクターを含有し、結果として、折り畳まれていない又は不適切に折り畳まれている不活性型組換えＮＳ２／３プロテーアーゼを封入体中に産生する。宿主細胞の溶菌液を作製するために、前記宿主細胞は溶菌緩衝液を用いて溶菌される。宿主細胞溶菌液中の封入体は、低速の遠心分離によって前記溶菌液より回収される。好ましくは、溶菌緩衝液が約０．１％のトライトンＸ−１００を含む。その後、前記封入体は、抽出緩衝液を用いて選択的に抽出される。前記抽出緩衝液は、約２％のトライトンＸ−１００及び２ Ｍの尿素を含むのが好ましい。好ましくは、溶菌緩衝液及び抽出緩衝液の両方に、ＤＴＴ及びＴＣＥＰからなる群より選択される還元試薬を含む。
【００１５】
第一態様のもう一つの側面では、不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを含む封入体は、上述宿主細胞溶菌液より低速の遠心分離によって得られたペレットから選択的抽出をした後、それに続く低速の遠心分離によって単離される。前記単離された封入体は充分な濃度のカオトロピック試薬を用いて処理され、可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼが作製される。前記カオトロピック試薬は、グアニジン、グアニジン−ＨＣｌ及び尿素からなる群より選択されるのが好ましい。さらに好ましくは、前記カオトロピック試薬はグアニジン−ＨＣｌである。前記充分な濃度は４ Ｍ〜９ Ｍであるのが好ましい。さらに好ましくは、グアニジン又はグアニジン−ＨＣｌが４〜８ Ｍの濃度であり、最も好ましくは６ Ｍである。好ましくは、尿素が６〜９ Ｍの濃度であり、さらに好ましくは８ Ｍである。
あるいは、真核細胞から分泌させるために、そのアミノ末端を非相同シグナル配列に操作可能に連結させることにより、組換えＮＳ２／３プロテアーゼを細胞外タンパク質として産生させることもできる。この場合、組換えＮＳ２／３プロテアーゼは、前記細胞が培養されている培地から回収することができる。
第一態様のもう一つの側面では、アフィニティークロマトグラフィーを用いて可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを封入体から単離することを可能にするために、アフィニティータグを含むように構築したＮＳ２／３プロテアーゼを用いることができる。このようなアフィニティータグ、及び、それに対応するリガンドは、この技術分野においてよく知られている。
【００１６】
第一態様の好ましい側面の一つでは、ＬＤＡＯは臨界ミセル濃度以上で用いられる。さらに好ましくは、ＬＤＡＯが０．００３％〜１％の濃度である。最も好ましい側面においては、ＬＤＡＯは０．０３％〜１％の濃度で用いられる。理論に縛られることなく、本発明者はリフォールディング（ゲル濾過）緩衝液中に存在するＬＤＡＯがリフォールディングのために必要とされるが、酵素のシス切断のためには不十分であると信じている。
第一態様の工程ｂ）の好ましい側面の一つでは、カオトロピック試薬又は極性添加物は、グアニジン、グアニジン−ＨＣｌ、尿素及びアルギニン−ＨＣｌからなる群より選択される。さらに好ましくは、グアニジン−ＨＣｌ又はアルギニン−ＨＣｌが用いられる。最も好ましくは、アルギニン−ＨＣｌが用いられる。
第一態様の工程ｂ）の好ましい側面の一つでは、カオトロピック試薬又は極性添加物が０．２５Ｍ〜２Ｍの濃度で用いられるのが好ましい。さらに好ましい側面では０．５Ｍ〜１Ｍの濃度で用いられ、最も好ましくは最終濃度０．５Ｍである。
もう一つの好ましい側面において、還元試薬はＴＣＥＰ及びＤＴＴからなる群より選択される。前記還元試薬は最終濃度０〜１００ ｍＭで存在するのが好ましく、さらに好ましくは１ ｍＭ〜１０ ｍＭである。最も好ましくは、前記還元試薬が最終濃度５ ｍＭで存在することである。
第一態様の好ましい側面の一つでは、上述リフォールディング方法が透析又はゲル濾過によって行われ、精製ＮＳ２／３プロテアーゼを得る。重要な側面の一つでは、可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼは、ゲル濾過を用いてリフォールディングされる。用いられる溶離緩衝液はＬＤＡＯ、アルギニン−ＨＣｌ及び還元試薬を含み、前記可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼは、ＮＳ２／３プロテアーゼをリフォールディングするのに充分な時間、溶離液中に保持される。主要な画分の収集は、高度に精製された酵素の回収を可能にする。
【００１７】
ＩＩ．活性化の方法
本発明の第二態様によれば、以下を含む活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの作製方法を提供する：
ｃ）工程ｂ）で得られた可溶性の不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを活性化物質を含む媒体に添加して、ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断を誘起すること。
第二態様の好ましい側面では、活性化物質はグリセロール、及び、ＣＨＡＰＳ、トライトンＸ−１００、ＮＰ−４０及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドのような界面活性剤からなる群より選択される。
本発明のこの第二態様の別法として、以下を含む活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを作製する方法が提供される。
ｃ）工程ｂ）で得られたリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを、活性化界面活性剤を含む媒体中に希釈して、前記ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断を誘起すること。
好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼ希釈後に残存するＬＤＡＯが、０．２５％より少ない最終濃度である。さらに好ましくは、前記ＬＤＡＯが最終濃度０．１％以下に希釈される。前記ＬＤＡＯが最終濃度０．０５％より少なく希釈されるのが、最も好ましい。
好ましくは、活性化界面活性剤がＣＨＡＰＳ、トライトンＸ−１００、ＮＰ−４０及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドより選択され得る。さらに好ましくは、活性化界面活性剤がＣＨＡＰＳ又はｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドである。
好ましくは、活性化界面活性剤が約０．１％〜約３％の最終濃度である。さらに好ましくは、活性化界面活性剤が約０．１％〜約１％の最終濃度である。最も好ましくは、活性化界面活性剤が最終濃度０．５％である。
活性化界面活性剤に加えてグリセロールを添加することもでき、リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを活性化するのに役立つ。好ましくは、グリセロールが０％〜６０％の最終濃度で存在し得る。さらに好ましくは、グリセロールが１０％〜５０％の最終濃度で存在し得る。最も好ましくは、グリセロールが最終濃度３０％で存在する。
好ましい態様で重要なのは、活性化のために用いられる緩衝液又は活性化／切断媒体中に、リフォールディング工程のために必要とされるよりも低い濃度であっても、還元試薬が依然存在することである。還元試薬はＴＣＥＰ及びＤＴＴからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、還元試薬がＴＣＥＰである。
好ましくは、還元試薬が１ ｍＭ〜１００ ｍＭの最終濃度である。さらに好ましくは、還元試薬が１ ｍＭ〜１０ ｍＭの最終濃度である。より好ましくは、還元試薬が最終濃度１ ｍＭである。
【００１８】
ＩＩＩ．ＮＳ２／３プロテアーゼ活性の測定方法
本発明の第三態様の好ましい側面によれば、以下を含む精製ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断活性を測定する方法が提供される：
ｃ）工程ｂ）で得られるリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼを活性化界面活性剤を含む緩衝液中に、ＮＳ２／３プロテアーゼが自己切断するのに充分な時間インキュベートすること；及び
ｄ）自己切断の指標として、残存する未切断ＮＳ２／３プロテアーゼ、切断生成物、又はそのフラグメントの有無を測定すること。
好ましくは、リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼが、上述のアッセイが行われる前に、ゲル濾過を用いてリフォールディング及び精製されることである。
好ましくは、活性化界面活性剤がＣＨＡＰＳ、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＮＰ−４０及びトライトンＸ−１００である。さらに好ましくは、活性化界面活性剤が０．１％〜３％の濃度のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＭ）である。さらに好ましくは、活性化界面活性剤が約０．１％〜約１％の濃度のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドである。さらに最も好ましくはＤＭが最終濃度０．５％である。
【００１９】
さらにグリセロールのような活性化物質を加えることもでき、リフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの活性化に役立つ。好ましくは、グリセロールが０％〜６０％の最終濃度で存在し得る。さらに好ましくは、グリセロールが１０％〜５０％の最終濃度で存在し得る。最も好ましくは、グリセロールが最終濃度３０％である。
好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼが切断緩衝液中に少なくとも１時間、１５℃〜３０℃でインキュベートされる。さらに好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼが切断緩衝液中に少なくとも１時間、１５℃〜２５℃でインキュベートされる。最も好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼが切断緩衝液中に少なくとも１時間、室温で（約２３℃）インキュベートされる。
第三態様のもう一つの側面は、ＮＳ２／３プロテアーゼを変性させることによって、切断反応を停止する。さらに好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼが熱によって変性させられる。最も好ましくは、自己切断を停止するために、ＮＳ２／３プロテアーゼがＳＤＳを用いて変性させられる。
切断生成物は、ＮＳ２タンパク質又はＮＳ３プロテアーゼであるのが好ましい。ＮＳ２タンパク質又はＮＳ３プロテアーゼの量、又は、それらのフラグメントの量は、当業者に知られる多くの手法のどれか一つを用いて測定され得る。前記手法の具体例は、酵素活性、免疫ブロット染色、化学発光、蛍光又はクマシー染色である。別法として、切断の指標として残存する未切断ＮＳ２／３プロテアーゼの量を測定することもできる。
【００２０】
ＩＶ．阻害剤をスクリーニングする方法
第四態様では、本発明は、以下を含む活性型ＮＳ２／３プロテアーゼの自己切断活性の潜在的阻害剤をスクリーニングするためのアッセイを提供する：
ｃ）潜在的阻害剤の存在下、又は非存在下において、工程ｂ）で得られるリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼのサンプルを、活性化界面活性剤を含む緩衝液中に充分な時間インキュベートすること；
ｄ）切断生成物の量、又は、それらのフラグメントの量を測定すること；及び
ｅ）潜在的阻害剤の存在下又は非存在下において、切断生成物又はそれらのフラグメントの量を比較すること。
活性型ＮＳ２／３プロテアーゼのサンプルは、候補薬物又はリガンドとともに適切な媒体中に約１時間インキュベートされるのが、好ましい。
好ましい側面では、切断生成物が、ＮＳ２タンパク質又はＮＳ３プロテアーゼのどちらかである。好ましくは、ＮＳ２タンパク質又はＮＳ３プロテアーゼいずれかの有無、又はそれらのフラグメントの有無を、酵素活性、抗ＮＳ３プロテアーゼ抗体又は抗ヒスチジン・タグ抗体の使用を含む免疫ブロット分析を用いて解析する。別法として、切断の指標として残存する未切断ＮＳ２／３プロテアーゼの量を測定することもできる。
【００２１】
Ｖ．ＮＳ２／３プロテアーゼ、ポリペプチド及び短縮片／核酸分子
好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼが、完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ８１０−１２０６又はその短縮片である。さらに好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼがアミノ酸８１５〜アミノ酸９０６に対応している第一アミノ酸を有したままで、Ｎ末端が短縮される。一層好ましくは、アミノ酸８６６〜９０６に対応している第一アミノ酸を有するＮ末端短縮タンパク質である。なお一層好ましくは、アミノ酸８９０〜９０４に対応している第一アミノ酸を有するＮ末端短縮タンパク質である。最も好ましくは、完全長ＮＳ２／３プロテアーゼの残基９０４〜１２０６を最少アミノ酸配列として有するＮＳ２／３短縮タンパク質が提供される。非常に好ましくは、配列番号１０によって番号付けられるアミノ酸残基９０４−１２０６からなる、短縮ＮＳ２／３タンパク質である。
本発明の第五態様では、以下のものからなる群より選択される、短縮ＮＳ２／３プロテアーゼからなる活性型ＮＳ２／３ポリペプチドが提供される：配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５によって定義する配列。好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼは、以下のものからなる群より選択される配列を有する：配列番号４、１０、１１、１２及び１５。さらに好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼは、配列番号４又は１０に示す配列、又は、それらと機能的に等価な変異体を有する。最も好ましくは、ＮＳ２／３プロテアーゼは、配列番号４又は１０に示す配列を有する。
本発明の第五態様のもう一つの側面によれば、以下のものからなる群より選択されるリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼが提供される：完全長ＮＳ２／３プロテアーゼ、配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５によって定義する配列。さらに好ましくは、配列番号４又は１０によって定義するリフォールディングされた不活性型ＮＳ２／３プロテアーゼが提供される。
第五態様のさらに別の側面によれば、配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５によって定義するポリペプチドに比較して、全長に渡って９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。さらに好ましくは、配列番号４又は１０によって定義するポリペプチドに比較して、全長に渡って９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。
第五態様のもう一つの側面では、配列番号２、４、１０、１１、１２、１３、１４及び１５のそれぞれに示すアミノ酸配列をコードする核酸分子が提供される。
配列番号１から一部残基を単離し、コードされるＮＳ２／３プロテアーゼの８９０−１２０６の一部を例えば上述のような宿主細胞中で組換え発現させ、精製及びリフォールディングに続いて前記一部の自己切断活性を評価することによって、ＮＳ２／３プロテアーゼと機能的に等価な変異体をコードする核酸フラグメントを調製することができる。
【００２２】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的手法、及び、本明細書に規定される配列情報を用いることによって、単離することができる。アミノ酸８９０−１２０６をコードしている残基の全部又は一部を含む核酸分子は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは細胞から単離することが可能であり（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等のグアニジニウム−チオシアネート抽出方法（（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９）によって）、ｃＤＮＡは逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．から入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素、又は、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｆｌａ．から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を用いて調製することが可能である。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１に示すヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅方法に従い、鋳型としてｃＤＮＡ又は代替的にゲノムＤＮＡ、及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化されＤＮＡシークエンス解析によって特徴付けることができる。さらに、ＮＳ２／３プロテアーゼのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いるような、標準的な合成方法によって調製することができる。
ウイルス集団に存在し得るＮＳ２／３プロテアーゼ配列の自然発生変異体に加えて、更にアミノ酸８９０〜１２０６をコードするヌクレオチド配列中の変異によって誘起され得る変更は、それによってコードするタンパク質のアミノ酸配列に変更をもたらし、ＮＳ２／３プロテアーゼの機能的活性を変えることも変えないこともあることを、当業者であれば理解するであろう。例えば、“本質的でない”アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１の配列において行われ得る。“本質的な”アミノ酸残基は機能的活性に必要とされるのに対し、“本質的でない”アミノ酸残基は、ＮＳ２／３プロテアーゼの機能的活性を変えることなしに、ＮＳ２／３プロテアーゼの完全長配列（例えば、配列番号２の配列）から変更することが可能な残基である。
従ってもう一つの側面では、本発明は、ＮＳ２／３プロテアーゼ活性に必要不可欠なアミノ酸残基における変更を含むＮＳ２／３プロテアーゼをコードする核酸分子に関する。このようなＮＳ２／３プロテアーゼ変異体は、アミノ酸配列が配列番号１０と異なり、そのプロテアーゼ活性を欠損している。本発明において用いられ得るこのような変異体ＮＳ２／３プロテアーゼの具体例は、Ｈｉｓ−９５２がＡｌａによって置き換わっているＮＳ２／３プロテアーゼ［９０４−１２０６］Ｈ９５２Ａ（配列番号１６）、ＮＳ２タンパク質とＮＳ３タンパク質間の切断部位残基における欠失に対応するＮＳ２／３プロテアーゼ［９０４−１２０６］ΔＬ１０２６Ａ１０２７（配列番号１７）、及び、Ｃｙｓ９９３がＡｌａに置き換わっているＮＳ２／３プロテアーゼ［９０４−１２０６］Ｃ９９３Ａ（配列番号１８）である。
【００２３】
（実施例）
本発明は以下の非限定的な実施例によって、さらに詳しく説明される。
材料及び方法
略語：
Ａｌａ：アラニン
℃：セルシウス度
ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート
ＣＭＣ：臨界ミセル濃度
ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ
ＤＴＰＡ：Ｎ，Ｎ−ビス［２−（ビス［カルボキシメチル］アミノ）エチル］−グリシン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ｇ：グラム
ｇ：相対遠心力
ｈ：時間
ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス
Ｈｅｐｅｓ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸
Ｈｉｓ：ヒスチジン
Ｈｉｓ６：ヘキサヒスチジン・タグ
ＨＭＫ：心筋キナーゼ
ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＤＡＯ：ラウリルジエチルアミンオキシド
Ｌｅｕ：ロイシン
Ｍ：モル濃度
ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質
ｍｉｎ：分
ｍＬ：ミリリットル
ｍＭ：ミリモル濃度
Ｏｃｔｙｌ−ＰＯＥ：ｎ−オクチルペンタオキシエチレン
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓｔ：Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｓｋｅｒｒａ，Ｐｌｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３）６；１０９−１２２で記述される
ストレプトアビジン・タグ
ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンハイドロクロライド
Ｔｒｉｓ：トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン
μｇ：マイクログラム
μｍ：ミクロン
ＷＴ：野生型
ｗ／ｖ：単位体積当りの質量
【００２４】
材料
界面活性剤ＣＨＡＰＳ及びトライトンＸ−１００はＳｉｇｍａから、ＬＤＡＯはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドはＡｎａｔｒａｃｅ Ｉｎｃから、ＮＰ−４０はＲｏｃｈｅから、及びオクチル−ＰＯＥはＢａｃｈｅｍから入手した。還元試薬ＤＴＴ及びＴＣＥＰはそれぞれ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｉｅｒｃｅから入手した。アルギニンハイドロクロライド、グリセロール、Ｈｅｐｅｓ、イミダゾール及び塩化マグネシウムは全て、Ｓｉｇｍａから入手した。グアニジン−ＨＣｌ及びＴｒｉｓはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから、ＩＰＴＧ及び尿素はＲｏｃｈｅから入手した。塩化ナトリウム及び塩化亜鉛はそれぞれ、Ｆｉｓｈｅｒ及びＡｌｄｒｉｃｈから入手し、ＥＤＴＡはＡｍｂｉｏｎから、ＤＮａｓｅはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。制限酵素類はＰｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞はＳｔｒａｔａｇｅｎｅから、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞はＮｏｖａｇｅｎから入手した。ＦＬＡＧ（商標）及び抗ＦＬＡＧ抗体によって認識されるペプチド配列の対応配列は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。ＨＭＫｔａｇは特異的タンパク質キナーゼＨＭＫ（心筋キナーゼ）に対する認識配列の５残基ペプチド（ＲＲＡＳＶ）であり、これによってリン酸化部位が導入される（Ｂｌａｎａｒ，Ｍ．及びＲｕｔｔｅｒ，Ｗ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１０１４−１０１８）。
【００２５】
実施例１
ＮＳ２／３完全長構築物：
完全長（８１０−１２０６）ＮＳ２／３配列は、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｎ末端側に対する５’−ＣＣＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号５）、Ｃ末端側に対する５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＣＣＡＴ−３’（配列番号６）を用いて、ＨＣＶ１ｂ−４０配列（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｃａｎａｄａ），ＬｔｄのＷＯ ９９／０７７３３）からＰＣＲによって増幅した。この方法は、５’末端にＮｃｏＩ認識部位、及び３’末端にＢａｍＨ１認識配列、これに続けてストレプトアビジン・タグ“ｓｔ”（Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｓｋｅｒｒａ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３）６；１０９−１２２）を導入し、配列番号１の核酸分子（図１）を与える。前記ＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡクローニング（登録商標）キットを用いてベクターｐＣＲ３（商標）に挿入した。その後この挿入片を、ＥｃｏＲＩを用いて切断し、平滑末端を作成するためにクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理し、ＮｃｏＩを用いて部分的に切断することによって、細菌発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に移した。この構築物をｐＥＴ−１１ｄ−ＮＳ２／３ｓｔと命名した。このＤＮＡをＸＬ−１Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞にトランスフォームし、単離して、シークエンシングを行った。その後このＤＮＡを、タンパク質産生のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに移した。
【００２６】
実施例２
ＮＳ２／３のＮ末端欠失変異体：
Ｎ末端欠失変異体８１５＊−１２０６、８２７−１２０６、８５５−１２０６、８６６−１２０６、９０４−１２０６及び９１５−１２０６は、５’末端及びＮＳ３ドメイン中のアミノ酸１０８３にＮｃｏＩ認識部位を設計した鋳型ｐＥＴ−１１ｄ／ＮＳ２／３から得られた。この鋳型をＮｃｏＩで切断した後、その３’末端フラグメント及び前記ベクターをゲル精製した。前記変異体は、ＮＳ２／３配列を含む適切な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、アミノ酸１０８３までの所望するＮ末端残基をコードするヌクレオチドから得られた。この得られた挿入片を前記ゲル濾過フラグメントに結合するために、前記プライマーにも５’末端にＮｃｏＩ認識部位を導入した。その後このＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｂｌｕｅ細胞にトランスフォームし、単離して、シークエンシングを行った。最終的に前記ＤＮＡを、タンパク質産生のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに移した。発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）。
＊第一メチオニンが本来の配列の一部であるため、このフラグメンの番号付けは誤っており、従って”８１４”と番号付けられるべきである。よって、”８１５”で始まる短縮片に対する全ての言及を、配列番号１１に正しく表示されるように”８１４”として読むべきである。
【００２７】
実施例３
ＮＳ２／３ Ｎ末端短縮変異体４Ｋ−６Ｈ（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋ（配列番号４）：
この構築物に、４つのリジンをＮ末端及びＣ末端に、かつ、ヘキサヒスチジン・タグをＮ末端に付加した。この構築物は、ＰＣＲ及び鋳型ｐＥＴ−１１ｄ／ＮＳ２／３ｓｔを２つのプライマーとともに用いて得られ、この鋳型はタグのための配列、及び、アミノ酸残基９０４−１２０６をコードするヌクレオチドからのＮＳ２／３配列を含む。前記プライマーは又ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ認識部位を、それぞれ５’及び３’末端に導入した。この挿入物をｐＥＴ−１１ｄにクローン化して、ｐＥＴ−１１ｄ ４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）−ｓｔ−４Ｋ（配列番号３）と命名した。このＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞にトランスフォームして、単離し、シークエンシングを行った。このＤＮＡを、タンパク質産生のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに移した。
短縮構築物９０４−１２０６のために、４つのプライマー及び２つの連続したＰＣＲ反応を用いた。第一のＰＣＲ反応に用いたプライマーは、Ｎ末端側に対しての
ＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＴＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ（配列番号７）、及びＣ末端側に対しての
ＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧ（配列番号８）である。第二のＰＣＲ反応に用いたプライマーは、Ｎ末端側に対しての
ＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ（配列番号９）、及びＣ末端側に対しての
ＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧ（配列番号８）である。
【００２８】
実施例４
酵素の発現及び産生
Ｎ末端にヘキサヒスチジン・タグを有するＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼ遺伝子型１ｂ［９０４−１２０６］（図３）を、ｐＥＴ−１１ｄ発現ベクターにクローン化した。タンパク質の可溶性を高めるために４つのリジン残基をＮ末端とＣ末端の両方に付加し、同時にストレプトアビジン・タグをＣ末端に付加して、配列番号３の核酸分子を得た。１ ｍＭ ＩＰＴＧで３７℃、３時間誘導して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中にプロテアーゼを発現させた。典型的な４Ｌの発酵物から、湿った細胞ペーストおよそ２０ ｇが得られた。この細胞ペーストは−８０℃で保存することができる。
実施例５
封入体の抽出
２３℃での解凍に続き、前記細胞を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１％のトライトンＸ−１００、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ ｍＭ ＤＴＴからなる溶菌緩衝液（５ ｍＬ／ｇ）中でホモジナイズした。続いて４℃で１５分間ＤＮａｓｅ処理（２０ μｇ／ｍＬ）を行い、２２，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離を行った。この細胞ペレットを１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２％ トライトンＸ−１００、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、２ Ｍ 尿素、５ ｍＭ ＤＴＴ中で（５ ｍＬ／ｇ）２回ホモジナイズすることによって洗滌し、２２，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離を行った。最後に細胞を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍＭ ＤＴＴで洗滌した。２２，０００ｘｇ、４℃、３０分間の遠心分離によってペレットとして封入体を回収した。
【００２９】
実施例６
ａ）封入体の抽出
封入体を可溶化するために、細胞ペレットを１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、６ Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．５ Ｍ ＮａＣｌからなる抽出緩衝液（４ ｍＬ／ｇ）中に懸濁して、２３℃で１時間、前記緩衝液中に維持した。その後、この懸濁液を１２５，０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた上清を０．２２ μｍのフィルターを通して濾過した。不純物を除いた封入体抽出物は、必要とするまで−８０℃で保存することができる。
ｂ）封入体からの４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋ単離
４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋ（配列番号４）を単離するために、前記封入体抽出物を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、６ Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ中に２倍希釈（約１ ｍｇ／ｍＬ）し、ファルマシアＨｉ−Ｔｒａｐ Ｎｉ２＋−キレート化カラムに加えた。単離したタンパク質は、５０〜５００ ｍＭイミダゾールの直線グラジエントにおいて典型的に２５０ ｍＭイミダゾールとともに溶離された。主要なピークに対応している画分を保存した。
【００３０】
実施例７
ゲル濾過カラム上でのリフォールディング及び精製
単離した封入体を前処理するために５ ｍＭ ＴＣＥＰ、５ ｍＭ ＺｎＣｌ２を加えた。１５分間、２３℃でインキュベートしてから、このサンプルをファルマシアＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル濾過カラムに装荷した。そして４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４ＫをＴｒｉｓ ５０ ｍＭ、ｐＨ ８．０、０．５ Ｍアルギニン−ＨＣｌ、１％ ＬＤＡＯ、５ ｍＭ ＴＣＥＰ中に溶離させて、リフォールディングされたＮＳ２／３プロテアーゼを得た。主要なピークに対応する画分のみ（図４）を集めて保存した。この状態下で、自己切断は検出されなかった。この精製しリフォールディングされた不活性型酵素を溶離緩衝液中−８０℃で保存した。典型的にはＥ．ｃｏｌｉ培養液１リットルあたり、約７ ｍｇのリフォールディングされたＮＳ２／３プロテアーゼが得られた。
ＮＳ２／３プロテアーゼ自己切断の問題を克服するために、最初に４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４ＫのＨｉｓ９５２Ａｌａ変異体（配列番号１６）又はΔＬｅｕ１０２６−Ａｌａ１０２７変異体（配列番号１７）のいずれかを用いて、リフォールディング状態を判定した。これら変異体は両方とも、自己触媒活性を欠いている。リフォールディングされた酵素の段階希釈液を内部消光蛍光発生基質アントラニリル−ＤＤＩＶＰＡｂｕ［Ｃ（Ｏ）−Ｏ］ＡＭＹ（３−ＮＯ２）ＴＷ−ＯＨ（配列番号１９）とともに、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、３０％グリセロール、１ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、及び１ ｍＭ ＴＣＥＰ中に３０又は６０分間、２３℃でインキュベートすること（ＷＯ ９９／０７７３３に詳細に記述されており、参照により本明細書にこれを含むものとする）により、ＮＳ３プロテアーゼの活性に基づいて（図４）リフォールディングを間接的に評価した。タンパク質分解活性は、前記基質の切断に付随する蛍光変化、及び、蛍光生成物アントラニリル−ＤＤＩＶＰＡｂｕ−ＣＯＯＨ（配列番号２０）の出現を、ＢＭＧ Ｇａｌａｘｙ ９６ウェルプレートリーダー（励起フィルター：３５５ ｎｍ；発光フィルター：４８５ ｎｍ）上でモニターした。
４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋを産生し、同じプロトコールに従って、精製及びリフォールディングし、９５％より高い純度の酵素を得た。ＮＳ３プロテアーゼ活性によって、適切なリフォールディングを確認した（図４、点線）。
【００３１】
実施例８
リフォールディング後の活性の確認
シス−切断アッセイ
４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋの自己切断反応は、５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．０、５０％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．１％ ＣＨＡＰＳ（図６）又は１％ ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（図７、８）（ＮＰ−４０及びトライトンＸ−１００を使用することもできる）及び１ ｍＭ ＴＣＥＰからなる切断緩衝液に酵素を加えることによって開始させた。このアッセイ混合物を３時間、２３℃でインキュベートした。この反応は、ＳＤＳ存在下、酵素の熱変性によって停止させた。ＮＳ２／３接合部における切断は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）、及び、自家作製したＮＳ３プロテアーゼポリクローナル抗体又は商業的に入手可能なヘキサヒスチジン・タグポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）のいずれかを用いる免疫ブロット分析によって、モニターした（図５）。
実施例９
不均一時間分解蛍光アッセイ
最初にＮＳ２／３プロテアーゼをニッケル−キレート化プレート上に固定する（図１０）。それから、ユーロピウム標識抗ＮＳ２又は抗ＦＬＡＧｔａｇ抗体を加える。当業者であれば、タンパク質の標識に対して多くのタグが利用可能であることを理解するだろう。この実施例では、ＦＬＡＧ（商標）及びＨＭＫを用いる。前記抗体の結合に続いて、過剰量の抗体を取り除くために洗滌する工程を行った。そして、切断緩衝液の添加によって自己切断反応を開始させる。適切なインキュベート時間の後このアッセイ混合物を第二のプレートに移し、ユーロピウム標識生成物に付随する時間分解蛍光の測定によって、切断をモニターする。ＮＳ２／３プロテアーゼの切断は、ニッケル−キレート化プレートに結合する非プロセシング酵素によって生ずる時間分解ユーロピウム蛍光シグナルの減衰によって、モニターすることもできる。
別法としては、ＮＳ２／３プロテアーゼを含むＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）を活性化緩衝液中にインキュベートして、自己切断反応を進行させる（図１４）。そして、得られたＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＮＳ３フラグメント、及び、未切断Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＮＳ２／３プロテアーゼをストレプトアビジン−コートしたプレート上に固定する。ユーロピウム標識抗ＮＳ２抗体を加えて、結合するユーロピウム標識抗体に付随する時間分解蛍光を測定する。
【００３２】
アッセイプロトコール：
自己切断反応
９６ウェルポリプロピレンプレートに、ｉ）試験化合物（潜在的阻害剤）の存在を伴う又は伴わないアッセイ緩衝液２０μＬ（５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５、３０％グリセロール、１ ｍＭ ＴＣＥＰ）、及びｉｉ）実施例７に従って精製したＮＳ２／３プロテアーゼ１０ μＬ（最終濃度２００ ｎＭ）を順次加える。活性化緩衝液２０ μＬ（５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５、３０％グリセロール、０．５％ ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、１ ｍＭ ＴＣＥＰ）の添加によって自己切断反応を開始させ、１．５時間、３０℃で進行させる。
ストレプトアビジンプレートへの結合
９６ウェルホワイトストレプトアビジン−コートプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）上で、自己切断反応混合物をアッセイ緩衝液（５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５、３０％グリセロール、１ ｍＭ ＴＣＥＰ）中に５倍希釈する。２３℃で１時間インキュベートしてから、このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ Ｍグアニジン−ＨＣｌを含むＰＢＳで洗滌する。
Ｅｕ＋３標識抗ＮＳ２の結合
９６ウェルホワイトストレプトアビジン−コートプレート１に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３％ ＢＳＡ、１ μＭビオチン、１００ μＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳ中にＥｕ＋３標識抗ＮＳ２を最終濃度３５ ｎＭで加える。２３℃で１時間インキュベートしてから、このプレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ）で洗滌する。最後にエンハンスメント溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ）を加え、Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＶＩＣＴＯＲ２マルチ−ラベルカウンターで時間分解蛍光を測定する。
１注釈：ニュートルアビジンプレートを用いることもできる。
【００３３】
実施例１０
均一時間分解蛍光アッセイ
ＮＳ２／３プロテアーゼを、一方の端を蛍光ユーロピウムキレート剤で標識し、もう一方の端をユーロピウム蛍光消光剤で標識する（図１１）。例えば、ユーロピウム標識抗ＮＳ２又は抗ＦＬＡＧｔａｇ抗体を蛍光部分として用い、一方ユーロピウム蛍光消光剤を酵素又は潜在的ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤のいずれかに共有結合させる。この酵素反応は、切断緩衝液の添加によって開始させる。自己切断によって、ユーロピウムキレート剤及び消光剤が分離して、時間が経つにつれて時間分解ユーロピウム蛍光シグナルが増加する。
実施例１１
蛍光偏光アッセイ
蛍光成分で標識した強力なＮＳ３プロテアーゼ阻害剤のような蛍光プローブを、ＮＳ２／３プロテアーゼを含む溶液に加える（図１２）。自己切断反応は、切断緩衝液の添加によって開始させる。自己切断によるプローブの蛍光偏光の変化を経時的にモニターする。別法として、ＮＳ２／３プロテアーゼを固定化したニッケル−キレート化プレートを用いることもできる。酵素を蛍光プローブとともにインキュベートするのに続いて、切断緩衝液の添加によって自己切断反応を開始させる。適切なインキュベーション時間の後、前記プローブの蛍光偏光の変化を測定することによって、切断をモニターする。
【００３４】
実施例１２
放射測定アッセイ
最初に、ＮＳ２／３プロテアーゼをニッケル−キレート化プレートに固定する（図１３）。プロテインキナーゼＡ及び放射能標識した基質を用いて、ＨＭＫｔａｇをリン酸化する。リン酸化反応の完了後、このプレートを洗滌し、切断緩衝液の添加によって自己切断反応を開始させる。適切なインキュベート時間の後、アッセイ溶液中に溶出した放射能標識生成物の量、又は、放射能標識非プロセシングＮＳ２／３プロテアーゼの量のいずれかを測定することによって、前記反応を定量化する。別法として、リン酸化反応を最初に行い、続いてニッケル−キレート化プレート上へ固定化することもできる。
実施例１３
ＮＳ２／３プロテアーゼ阻害
ＮＳ２／３プロテアーゼ切断部位由来のペプチドを、潜在的競合基質として評価した（表１）。ＮＳ２／３プロテアーゼ切断部位由来のペプチド及びＮＳ４Ａ由来のペプチドは、標準的な固相方法論を用いて自家合成したもの、又はマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ペプチドシステム（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって作製した。種々の濃度のペプチドを、０．５４ μＭのＮＳ２／３プロテアーゼとともに５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．０、５０％（ｗ／ｖ）グリセロール中に３０分間、２３℃でプレ・インキュベートした。自己切断反応は、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを最終濃度０．５％まで加えることによって開始させた。最終的なＤＭＳＯ含有量は、決して５％（ｖ／ｖ）を超えなかった。得られた混合物を３時間２３℃でインキュベートした。反応を停止させて、定量した。ＮＳ２／３プロテアーゼ切断部位由来のペプチドは、全くトランスに切断されなかった（データ表示せず）。ＮＳ２／３接合部のＰ１０−Ｐ１０’残基に渡るペプチド（ペプチド１）は２７０ μＭのＩＣ５０で自己切断を阻害したのに対し、Ｐ６−Ｐ６’残基に渡るペプチド基質（ペプチド４）は作用が弱く、６３０ μＭのＩＣ５０であった。対応する切断部位生成物の中で、最も活性があったのはペプチド１のＮ末端生成物であるペプチドＳＦＥＧＱＧＷＲＬＬ（ＩＣ５０＝９０ μＭ、配列番号２１）であった。
【００３５】
【表１】
2004514459.tif 000003
ａペプチドは、ＤＭＳＯ中で２０ ｍＭの保存溶液として調製した。最終ＤＭＳＯ含有量は決して５％（ｖ／ｖ）を超えなかった。
Ｂアッセイは、０．５４ μＭのＮＳ２／３プロテアーゼの存在下で行った。
Ｃハイフンは、Ｐ１とＰ１’の間の切断部位を示す。
【００３６】
（考察）
今日まで、単独又はＮＳ３と連結する天然ＮＳ２の生成は、その疎水性の性質によって妨害されてきて、低レベルの発現しか達成されなかった。Ｎ末端短縮片の研究によって、ＮＳ２／３プロテアーゼ［９０４−１２０６］の同定が可能になった（図３）。この短縮片はＩＰＴＧ誘導によってＥ．ｃｏｌｉ中で高レベルに発現し（図２Ｂ及び２Ｃ、レーン９０４）、ＮＳ３プロテアーゼ切断生成物の存在によって示されるように（図２Ａ及び２Ｃ、レーン９０４）活性型であった。しかしながら、ＮＳ２／３プロテアーゼ［９０４−１２０６］は封入体として、不溶性画分中にのみ回収された。マルトース結合タンパク質及びチオレドキシンのような可溶性の融合相手の使用は、発現するプロテアーゼの可溶性を増加させることに成功しなかった（データ表示せず）。
０．５ Ｍアルギニン−ＨＣｌのような低濃度のカオトロピック試薬又は極性添加物の維持が、リフォールディング処理の間４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋ（図９Ｂ、配列番号４）を溶液中に維持するために重要であった。アルギニン−ＨＣｌは低濃度カオトロピック試薬に匹敵する様式で、タンパク質を僅かに不安定化する極性添加物である。アルギニン−ＨＣｌはフォールディングする中間体の可溶性を増加させ得ると、仮定されている（Ｌｉｎ，Ｔ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：３７２−３８１）。
変性緩衝液に代えてリフォールディング緩衝液に置換することによる凝集を減少、及び／又は抑制するために、界面活性剤もリフォールディングに必要とされた。界面活性剤ＬＤＡＯ、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びオクチル−ＰＯＥを、それぞれのＣＭＣ値０．０３％、０．０１％及び０．２５％（水における）の濃度以上で、４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋのリフォールディング促進能力について評価した。オクチル−ＰＯＥの存在下でリフォールディングは検出されなかった。ＬＤＡＯ及びｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドは、酵素を効果的にリフォールディングすることが見出された。その一方、そのリフォールディング能力に加えて、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドは４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋの活性化を誘導することが見出された。予想に反して、自己切断を促進することなくリフォールディング及びＮＳ３プロテアーゼ活性の再構成を可能にしたので、ＬＤＡＯを選択した。最後に本発明者は、酵素のリフォールディングのために、還元試薬（ＤＴＴにしろＴＣＥＰにしろ）の存在が必要であったことを見出している。
【００３７】
種々の切断／活性化界面活性剤を、４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋの自己切断促進能力について評価した。自己プロセッシングは、実施例７のアッセイ緩衝液にＣＨＡＰＳを添加して観察した（図６、レーン２〜５）。同様な自己プロセッシングをｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ＮＰ−４０及びトライトンＸ−１００でも観察したが、０．５％及び１％のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドが優れているようであった。不十分なプロセッシングが、オクチル−ＰＯＥの存在下で観察されたが、一方ＬＤＡＯではほとんど観察されなかった（データ表示せず）。切断／活性化界面活性剤に加えて、グリセロールが自己切断を促進することも見出された（図６、レーン１）。興味深いことに、０％のグリセロールでは低レベルの切断が観察されたのに対して、グリセロール及び切断／活性化界面活性剤の両方をアッセイ緩衝液に添加した場合には、実質的に向上した切断が観察された（図６、レーン６）。
リフォールディングの間に用いられるＬＤＡＯは、自己プロセッシングを阻害する。そのため自己切断反応は、酵素が適切な切断／活性化緩衝液に希釈され、かつＬＤＡＯが約０．２５％より低い濃度に希釈されることによってのみ開始させることができる。
ＮＳ２／３プロテアーゼの活性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析によって（図７）、及び、対応するＨｉｓ９５２Ａｌａ変異体について切断生成物が存在しないことによって（図８）確認した。さらに、強力なＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下でも、前記活性に変化が認められなかった（データ表示せず）。最後に、両シス切断生成物のＮ末端シークエンシングによって、切断がＬｅｕ１０２６とＡｌａ１０２７残基間で起こったことを確認した。
切断部位由来のペプチド基質Ｐ１０−Ｐ１０’及びＰ６−Ｐ６’を、潜在的競合基質として評価した。精製ＮＳ２／３（９０４−１２０６）及び最適化切断緩衝液（５０％グリセロール及び０．５％ ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含む）を用いる充分に確立されたアッセイ系で、前記Ｐ１０−Ｐ１０’及びＰ６−Ｐ６’ペプチドはそれぞれ２７０及び６３０ μＭのＩＣ５０でＮＳ２／３のプロセッシングを阻害したが、同じアッセイ条件下でペプチドのトランス切断は観察されなかった（データ表示せず）。この結果は、活性化部位へのペプチド基質の非生産的な結合を示唆する。特に、より短いＰ１０−Ｐ１ Ｎ末端切断生成物ペプチドは９０ μＭのＩＣ５０を有する最も優れた阻害剤であったが、一方、対応するＣ末端生成物は阻害活性を欠いていた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＨＣＶ１ｂ遺伝子型の完全長ＮＳ２／３（８１０−１２０６）ｓｔのヌクレオチド配列（配列番号１）を表す。
【図１Ｂ】
図１Ａのヌクレオチド配列によってコードされる、完全長ＮＳ２／３（８１０−１２０６）ｓｔのアミノ酸配列（配列番号２）を表す。
【図２】
ｐＥＴ１１ｄ発現ベクターでクローン化されたＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼの完全長及びアミノ酸８１５−９１５〜１２０６を含むＮ末端欠失変異体における、Ｎ末端短縮片の研究を表す。ＮＳ２／３プロテアーゼ構築物は、ウサギ網状赤血球溶解液中ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳された。翻訳された［３５Ｓ］標識生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）によって分離し、ホスホルイメージャ（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）で視覚化した（Ａ）。ＮＳ２／３プロテアーゼ構築物のＥ．ｃｏｌｉ発現で、誘導しないもの（レーン−）又は１ ｍＭのＩＰＴＧとともに３７℃で２時間誘導したもの（レーン＋）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）（Ｂ）及び抗ＮＳ３ポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット分析（Ｃ）によって評価した。各転写物に発現したＮＳ２／３プロテアーゼの第一アミノ酸に従って、レーンが番号付けされている。分子量の基準物質及びＮＳ３プロテアーゼの位置を示してある。
【図３】
Ｎ末端及びＣ末端にリジン残基、Ｎ末端ヘキサヒスチジン・タグ、及び、Ｃ末端ストレプトアビジン・タグ（”ｓｔ”）とともにアミノ酸残基９０４−１２０６を含むＨＣＶ ＮＳ２／３プロテアーゼ構築物の概略図である。
【図４】
リフォールディングされた４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋ（配列番号４）をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル濾過カラムにかけて得られたクロマトグラムを表す。５ ｍＭ ＴＣＥＰ及び５ ｍＭ ＺｎＣｌ２を精製した封入体に加えると、酵素がリフォールディングされ、Ｔｒｉｓ ５０ ｍＭ、ｐＨ ８．０、０．５ Ｍアルギニン−ＨＣｌ、１％ ＬＤＡＯ、５ ｍＭ ＴＣＥＰ中に溶離される。実線（―）は２８０ ｎｍでの吸光度を表し、点線（・・◆・・）は蛍光発生基質アントラニリル−ＤＤＩＶＰＡｂｕ［Ｃ（Ｏ）−Ｏ］ＡＭＹ（３−ＮＯ２）ＴＷ−ＯＨを用いて選択した画分でモニターしたＮＳ３プロテアーゼドメイン活性を示す。
【図５】
封入体からの４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋの作製及び精製を、クマシーブルー染色した１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）、抗ＮＳ３ウサギ抗血清を用いた免疫ブロット分析（Ｂ）、及び抗Ｈｉｓ６ウサギ抗血清を用いた免疫ブロット分析（Ｃ）によってモニターしたものを表す。レーン１：未精製Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物；レーン２〜５：封入体（ＩＢ）洗液；レーン６〜１０：Ｎｉ２＋−キレート化カラムでの封入体精製；レーン１１：精製した封入体；レーン１２：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル濾過カラムに装荷するもの；レーン１３：リフォールディングされた酵素（詳細については実施例を参照）。未処理酵素、及び切断生成物４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２（９０４−１２０６）及びＮＳ３（１０２７−１２０６）ｓｔ−４Ｋを表示する。
【図６】
抗ＮＳ３ウサギ抗血清を用いた免疫ブロットによってモニターした、４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋの自己プロセッシング活性に対するグリセロール及びＣＨＡＰＳの効果を表す。自己切断反応は、種々の量のグリセロール及びＣＨＡＰＳを含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．０、１ ｍＭ ＴＣＥＰ中にリフォールディングした酵素を希釈することによって開始させ、２３℃で１８時間インキュベートした。レーン１：３０％グリセロール、ＣＨＡＰＳ無し；レーン２〜５：グリセロール無し及び、それぞれ０．１、０．２５、０．５又は１．０％のＣＨＡＰＳ；レーン６〜９：３０％グリセロール及び、それぞれ０．１、０．２５、０．５又は１．０％のＣＨＡＰＳ。未処理酵素及びＮＳ３（１０２７−１２０６）ｓｔ−４Ｋ生成物を表示する。
【図７】
抗ＮＳ３ウサギ抗血清 （Ａ）及び抗Ｈｉｓ６ウサギ抗血清（Ｂ） を用いた免疫ブロットによってモニターした、４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋシス切断の時間経過を表す。自己切断反応は、５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．０、５０％グリセロール（ｗ／ｖ）、１％ ｎ−β−Ｄ−ドデシルマルトシド、１ ｍＭ ＴＣＥＰ中にリフォールディングした酵素を希釈することによって開始させ、２３℃で０、１、２、４、６及び２４時間インキュベートした。未処理酵素、及び生成物４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２（９０４−１０２６）及びＮＳ３（１０２７−１２０６）ｓｔ−４Ｋを表示する。
【図８】
抗ＮＳ３抗血清（Ａ）又は抗Ｈｉｓ６抗血清（Ｂ）を用いた免疫ブロット解析による、４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４ＫのＨｉｓ９５２Ａｌａ（”Ｈ９５２Ａ”）変異体（配列番号１６）精製物、及び野生型精製物のＮＳ２−ＮＳ３プロテアーゼ活性の比較を表す。自己切断反応を、５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．０、５０％グリセロール（ｗ／ｖ）、１％ ｎ−β−Ｄ−ドデシルマルトシド、１ ｍＭ ＴＣＥＰ中、２３℃で０、２及び２４時間行った。２４時間のインキュベーションを、界面活性剤がない状態でも行った（レーン２４＊）。未処理酵素、及び自己切断生成物４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２（９０４−１０２６）及びＮＳ３（１０２７−１２０６）ｓｔ−４Ｋを表示する。
【図９Ａ】
４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋのヌクレオチド配列（配列番号３）を表す。
【図９Ｂ】
図９Ａのヌクレオチド配列によってコードされる４Ｋ−６Ｈ−ＮＳ２／３（９０４−１２０６）ｓｔ−４Ｋのアミノ酸配列（配列番号４）を表す。
【図１０】
不均一時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイの形態を説明する図である。
【図１１】
均一時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイの形態を説明する図である。
【図１２】
蛍光偏光アッセイの形態を説明する図である。
【図１３】
放射測定アッセイの形態を説明する図である。
【図１４】
本発明の精製ＮＳ２／３プロテアーゼを用いる別法のＴＲＦアッセイ形態の模式的表示である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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2004514459.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514459.tif 000087
2004514459.tif 000088
【国際調査報告】
2004514459.tif 000089
2004514459.tif 000090
2004514459.tif 000091
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