(57)【要約】本発明は、ゲル-クームズ分類Ｉ型のアレルギー反応の治療と予防、ヒト表皮性および毛包性ケラチノサイトおよび皮膚と粘膜との移行部のケラチノサイトの活性化と増殖（ＤＮＡ合成）の加法的を超えて超付加的な阻害、ならびに、毛包性および表皮性の過角化症とケラチノサイトの促進された増殖を伴う皮膚病の治療と予防のため、ヒトＴリンパ球および単核細胞の活性化と増殖（ＤＮＡ合成）およびＴH2サイトカイン産生を加法的を超えて超付加的に阻害するための、アラニルアミノペプチダーゼＮ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子と組合せた、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)および同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子の使用に関する。本発明は、さらに、動脈硬化症の治療と予防のため、ヒトＴリンパ球および単核細胞の活性化、ＤＮＡ合成および増殖を加法的を超えて超付加的に阻害するための、アラニルアミノペプチダーゼＮ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子、Ｘ-Ｐｒｏ-アミノぺプチダーゼ(アミノペプチダーゼＰ、ＡＰＰ)の阻害因子、‘アンギオテンシン変換酵素’(ＡＣＥ)の阻害因子および/またはプロリルオリゴペプチダーゼ(ＰＯＰ，プロリルエンドペプチダーゼ、ＰＥＰ)の阻害因子と組合せた、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)および同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子の使用に関する。本発明は、また、上記グループの酵素の前記阻害因子を少なくとも１つ含む医薬品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)および同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子の使用であって、ヒトＴリンパ球および単核細胞のそれぞれの活性化と増殖(ＤＮＡ合成)ならびにＴH2サイトカイン産生の加法的を越えて超付加的な阻害のための、アラニルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子のそれぞれとの組み合わせの使用。
【請求項２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)および同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子の使用であって、ヒト表皮性および毛包性ケラチノサイトおよび皮膚から粘膜への移行部のケラチノサイトの活性化および増殖(ＤＮＡ合成)の加法的を越えて超付加的な阻害のための、アラニルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子のそれぞれとの組み合わせの使用。
【請求項３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)および同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子の使用であって、ヒトＴリンパ球および単核細胞の活性化、ＤＮＡ合成および増殖の加法的を越えて超付加的な阻害のための、アラニルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子、Ｘ-Ｐｒｏ-アミノぺプチダーゼ(アミノペプチダーゼＰ、ＡＰＰ)の阻害因子、‘アンギオテンシン変換酵素’(ＡＣＥ)の阻害因子および/またはプロリルオリゴペプチダーゼ(ＰＯＰ，プロリルエンドペプチダーゼ、ＰＥＰ)の阻害因子との組み合わせの使用。
【請求項４】
前記ＤＰＩＶの阻害因子が、Ｘａａ-Ｐｒｏ-ジペプチド(Ｘａａ=α-アミノ酸およびそれぞれ側鎖が保護された誘導体)、それに相当する誘導体、好ましくは、ジペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ジペプチドボロン酸（例えば、Pro-boro-Pro）およびこれらの塩、Ｘａａ-Ｘａａ-(Ｔｒｐ)-Ｐｒｏ-(Ｘａａ)nペプチド（Ｘａａ＝α-アミノ酸、ｎ＝０〜１０）、それに相当する誘導体およびそれらの塩、ならびに、アミノ酸-(Ｘａａ)-アミド、それぞれに相当する誘導体およびそれらの塩であって、前記Ｘａａが、それぞれ、α-アミノ酸または側鎖が保護された誘導体であり、好ましくは、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン、Ｌ-プロリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、および、例えば、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン等の環状アミンおよびアミド構造として機能を果たすそれらの誘導体である、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記ＤＰＩＶの阻害因子として、例えば、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン-チアゾリジド、ピロリジン、ピペリジン、ならびに、それらに相当する２-シアノチアゾリジド、２-シアノピロリジド、２-シアノピペリジドの誘導体のアミノ酸アミドを使用する請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ＡＰＮの阻害因子として、アクチノニン(actinoine)、ロイヒスチン(leuhistine)、フェベスチン(phebestine)、アマスタチン(amastatine)、ベスタチン(bestatine)、プロベスチン(probestine)、β-アミノチオール((-aminothiol)、α-アミノホスフィン酸((-aminophosphinic acid)、α-アミノホスフィン酸誘導体、好ましくは、D-Phe-([PO(OH)-CH2]-Phe-Pheおよびそれらの塩を使用する請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ＡＰＰの阻害因子として、アプスタチン(apstatine)、(2S,3R)-ＨＡＭＨ-Ｌ-プロリン、(2S,3R)-ＨＡＰＢ-Ｌ-プロリン、それらに相当するＬ-プロリンメチルエステル、(2S,3R)-ＨＡＭＨ-/(2S,3R)-ＨＡＰＢ-ピロリジド(pyrrolidide)、チアゾリジド(thiazolidide)、およびそれらの塩を使用する請求項３に記載の使用。なお、前記ＨＡＭＨは、3-amino-2-hydroxy-5-methyl-hexanoylであり、前記ＨＡＰＢは、3-amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoylである。
【請求項８】
前記ＡＣＥの阻害因子として、カプトプリル(captopril)、エナラプリル(enalapril)、リシノプリル(lisinopril)、シラゾプリル(cilazopril)およびそれらの塩を使用する請求項３または７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＰＯＰ(ＰＥＰ)の阻害因子として、ポスタチン(postatin)、ユーリスタチン(eurystatin)ＡまたはＢ、Ｎa-保護ペプチドアルデヒド、好ましくは、ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-プロリナルおよびベンジルオキシカルボニル-Ｌ-チオ-プロリル-Ｌ-チオプロリナル、Ｎa-保護アミノ酸-(Ｘａａ)ピロリジドまたはチアゾリジト、および、それぞれ相当する２-シアノピロリジドおよび２-シアノチアゾリジド誘導体、基質類似Ｎa-保護ペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ペプチドジアゾメチルケトン、ペプチドアンモニウムメチルケトンならびにこれらの塩を使用する請求項３、７、８のいずれかに記載の使用。なお、前記Ｘａａは、アミノ酸、好ましくは、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-イソロイシンである。
【請求項１０】
炎症の発生を含む、自己免疫疾患および動脈硬化症のような慢性疾患の予防と治療のための、請求項１および４から９のいずれかに記載の阻害因子の組み合わせの使用。
【請求項１１】
Ｉ型アレルギー反応の予防と治療のための、請求項１および４から６のいずれかに記載の阻害因子の組み合わせの使用。
【請求項１２】
炎症性および非炎症性の表皮性過増殖状況（例えば、先天性魚鱗癬および乾癬）、良性および悪性の表皮性クローン性増殖（例えば、いぼ、コンジローム、光線性角化症/前がん）、良性および悪性の過増殖状況（例えば、毛包性角化症）、ならびに、良性および悪性の上皮性付属器腫瘍および原発および反応性爪細胞過増殖の予防と治療のための、請求項１、２および４から６のいずれかに記載の阻害因子の組み合わせの使用。
【請求項１３】
医薬品であって、アラニルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子と組み合わせて、かつ、それ自体は既知のキャリヤー、添加剤および/または補助物質と組み合わせて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)の阻害因子または同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子を含む医薬品。
【請求項１４】
医薬品であって、アラニルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼＮ、ＡＰＮ)および同じ基質特異性(ＡＰＮ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子、Ｘ-Ｐｒｏ-アミノぺプチダーゼ(アミノペプチダーゼＰ、ＡＰＰ)の阻害因子、‘アンギオテンシン変換酵素’(ＡＣＥ)の阻害因子およびプロリルオリゴペプチダーゼ(ＰＯＰ，プロリルエンドペプチダーゼ、ＰＥＰ)の阻害因子と組み合わせて、かつ、それ自体は既知のキャリヤー、添加剤および/または補助物質と組み合わせて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ(ＤＰＩＶ)の阻害因子または同じ基質特異性(ＤＰＩＶ類似酵素活性)を有する酵素の阻害因子を含む医薬品。
【請求項１５】
前記ＤＰＩＶの阻害因子として、好ましくは、Ｘａａ-Ｐｒｏ-ジペプチド(Ｘａａ=α-アミノ酸およびそれぞれ側鎖が保護された誘導体)、それに相当する誘導体、好ましくは、ジペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ジペプチドボロン酸（例えば、Pro-boro-Pro）およびこれらの塩、Ｘａａ-Ｘａａ-(Ｔｒｐ)-Ｐｒｏ-(Ｘａａ)nペプチド（Ｘａａ＝α-アミノ酸、ｎ＝０〜１０）、それに相当する誘導体およびそれらの塩、ならびに、アミノ酸-(Ｘａａ)-アミド、それぞれに相当する誘導体およびそれらの塩であって、前記Ｘａａが、それぞれ、α-アミノ酸または側鎖が保護された誘導体であり、好ましくは、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン、Ｌ-プロリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、および、例えば、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン等の環状アミンおよびアミド構造として機能を果たすそれらの誘導体であるを含む請求項１３または１４に記載の医薬品。
【請求項１６】
前記ＤＰＩＶの阻害因子として、例えば、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン-チアゾリジド、ピロリジン、ピペリジン、ならびに、それら相当する２-シアノチアゾリジド、２-シアノピロリジド、２-シアノピペリジドの誘導体のアミノ酸アミドを含む請求項１３から１５のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１７】
前記ＡＰＮの阻害因子として、アクチノニン(actinoine)、ロイヒスチン(leuhistine)、フェベスチン(phebestine)、アマスタチン(amastatine)、ベスタチン(bestatine)、プロベスチン(probestine)、β-アミノチオール((-aminothiol)、α-アミノホスフィン酸((-aminophosphinic acid)、α-アミノホスフィン酸誘導体、好ましくは、D-Phe-([PO(OH)-CH2]-Phe-Pheおよびそれらの塩を含む請求項１３から１６のいずれかに記載の医薬品
【請求項１８】
前記ＡＰＰの阻害因子として、アプスタチン(apstatine)、(2S,3R)-ＨＡＭＨ-Ｌ-プロリン、(2S,3R)-ＨＡＰＢ-Ｌ-プロリン、それらに相当するＬ-プロリンメチルエステル、(2S,3R)-ＨＡＭＨ-/(2S,3R)-ＨＡＰＢ-ピロリジド(pyrrolidide)、チアゾリジド(thiazolidide)、およびそれらの塩を使用する請求項１４から１７に記載の医薬品。なお、前記ＨＡＭＨは、3-amino-2-hydroxy-5-methyl-hexanoylであり、前記ＨＡＰＢは、3-amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoylである。
【請求項１９】
前記ＡＣＥの阻害因子として、カプトプリル(captopril)、エナラプリル(enalapril)、リシノプリル(lisinopril)、シラゾプリル(cilazopril)およびそれらの塩を含む請求項１４から１８のいずれかに記載の医薬品。
【請求項２０】
前記ＰＯＰ(ＰＥＰ)の阻害因子として、好ましくは、ポスタチン(postatin)、ユーリスタチン(eurystatin)ＡまたはＢ、Ｎa-保護ペプチドアルデヒド、好ましくは、ベンジルオキシカルボニル-Ｌ-プロリル-Ｌ-プロリナルおよびベンジルオキシカルボニル-Ｌ-チオプロリル-Ｌ-チオプロリナル、Ｎa-保護アミノ酸-(Ｘａａ)ピロリジドまたはチアゾリジト、および、それぞれに相当する２-シアノピロリジドおよび２-シアノチアゾリジド誘導体、基質類似Ｎa-保護ペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ペプチドジアゾメチルケトン、ペプチドアンモニウムメチルケトンならびにこれらの塩を含む請求項１４から１９に記載の医薬品。なお、前記Ｘａａは、アミノ酸、好ましくは、Ｌ-アラニン、Ｌ-バリン、Ｌ-イソロイシンである。
【請求項２１】
併用効果を目的として同時もしくは逐次に時間的に連続して投与するため、いくつかに分かれた剤形として、それ自体は既知であるキャリヤー、添加剤および/または補助物質と組み合わせて、ＤＰＩＶの阻害因子、ＤＰＩＶ-類似酵素活性を有する酵素の阻害因子、ＡＰＮの阻害因子、ＡＰＮ-類似酵素活性を有する酵素の阻害因子、ＡＣＥ阻害因子、ＰＯＰ(ＰＥＰ)阻害因子、およびＸＺＮＰＥＰ２の阻害因子の２以上を含む、請求項１４から２０のいずれかに記載の医薬品。
【請求項２２】
それ自体は既知であるキャリヤー、添加剤および/または補助物質とともに、経口、経皮、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、直腸、膣、舌下投与による全身適用するための請求項１３から２１のいずれかに記載の医薬品。
【請求項２３】
例えば、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、スプレー、リポソーム、振とう混合物、親水コロイド包帯、および、点滴注入を含むその他の皮膚用基剤/賦形剤の形態で局所適用するための請求項１３から２１のいずれかに記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ合成の阻害、および、免疫細胞の増殖阻害に関する。前記阻害は、免疫細胞の活性、ＤＮＡ合成、そして増殖を抑制するアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ；Ｅ.Ｃ.３.４.１１.２；ＣＤ１３）阻害因子、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ；Ｅ.Ｃ.３.４.１４.５；ＣＤ２６）阻害因子、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ；プロリルエンドペプチダーゼ；ＰＥＰ；Ｅ.Ｃ.３.４.２１.２６）阻害因子、膜局在アミノペプチダーゼＰ（Ｘ-Ｐｒｏ-アミノペプチダーゼ；ＡＰＰ；ＸＰＮＰＥＰ２；Ｅ.Ｃ.３.４.１１.９）阻害因子、および、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ；Ｅ.Ｃ.３.４.１５.１、ＣＤ１４３）阻害因子の複合効果、または、アミノ酸誘導体、ペプチドまたはペプチド誘導体に基づく前述の酵素にそれぞれ特異的な阻害因子を同時に適用することによる前記酵素活性それぞれの複合阻害による。
【０００２】
本発明は、また、増殖に必須であるＤＮＡ合成の阻害およびＴH2細胞によるサイトカイン（インターロイキン-４、ＩＬ-４）産生の阻害に関する。前記阻害は、免疫細胞の活性、増殖（ＤＮＡ合成）およびＴH2細胞によるサイトカイン(ＩＬ-4)産生を抑制する、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ；Ｅ.Ｃ.３.４.１１.２；ＣＤ１３）およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ；Ｅ.Ｃ.３.４.１４.５；ＣＤ２６）のそれぞれに特異的なアミノ酸誘導体、ペプチドまたはペプチド誘導体に基づく阻害因子を同時に適用することによる前記酵素の阻害因子の複合効果による。
【０００３】
本発明は、また、増殖に必須であるケラチノサイトのＤＮＡ合成の阻害に関する。前記阻害は、ケラチノサイトの増殖（ＤＮＡ合成）を抑制する、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ；Ｅ.Ｃ.３.４.１１.２；ＣＤ１３）およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ；Ｅ.Ｃ.３.４.１４.５；ＣＤ２６）または同様の効果を有する酵素のそれぞれに特異的な、アミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体に基づく阻害因子を、同時または逐次に適用することによる前記酵素の阻害因子の複合効果による。
【０００４】
本発明は、疾患ならびにその発生および進行の過程が、免疫細胞とりわけ自己反応性Ｔ細胞の活性化と増殖に基づくまたはそれらから成る、すべての自己免疫が病因の疾患に適用できる。同様のメカニズムは、疾患の発生と慢性化においてＴリンパ球が中心的役割を果たす、例えば、動脈硬化等の炎症性疾患の多くに有効である。
【背景技術】
【０００５】
例えば、ＤＰＩＶやＡＰＮ等の膜局在ペプチダーゼが、免疫細胞とりわけＴリンパ球の活性化とクローン性発現のプロセスにおいて重要な役割を担っていることは、既に示されている（非特許文献１〜３参照）。マイトジェン誘導単核細胞（ＭＮＣ）または集積したTリンパ球のいくつかの機能、例えば、ＤＮＡ合成、免疫誘導サイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ）の産生と分泌、Ｂ細胞のヘルパー機能（ＩｇＧおよびＩｇＭの合成）等は、ＤＰＩＶやＡＰＮに対する特定阻害因子に存在により阻害されることがある（非特許文献４〜９参照）。
【０００６】
一方、近年の科学的発見により、動脈硬化症が、Ｔリンパ球がその発生と進行に重要な役割を果たす炎症性の疾患であると特徴付けられた（非特許文献１０参照）。これらの発見によれば、動脈硬化性の損傷は、一連の細胞および分子反応であって、統合すれば炎症とみなすことができるものと理解される。大および中サイズの弾性動脈および筋性動脈に最初に発生するそのような損傷は、結果として、心臓、大脳および手足の虚血（循環障害）を引き起こし、最終的には、前記器官の梗塞を引き起こす。動脈硬化性損傷は、動脈の限定された部位で形成され、その部位における分岐とカーブは、血流とズレ応力の特徴的な変化と乱流の創生をもたらす（非特許文献１１参照）。これらの部位において、管上皮細胞は、特定の分子を産生し、この分子が、Ｔリンパ球や単核細胞の誘因、結合、集積および活性化を担う。Ｔリンパ球は、動脈形成の全てのフェーズにおいて必須な炎症細胞である。Ｔ細胞は、末梢血からアテローム斑（動脈硬化性プラーク）に侵入し、その損傷部位で増殖する（非特許文献１２、１３参照）。その集積の結果、前記動脈硬化性損傷部位で活性化Ｔリンパ球が、アラニルアミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶを高発現し、ケモカイン、サイトカイン、成長因子およびプロテアーゼが放出される。そして、これらの化合物は、他の免疫細胞をリクルートし、活性化することで、更なる病状の進展をもたらす（非特許文献１４参照）。
【０００７】
さらに、アテローム斑に局在する単核細胞は、例えば、アラニルアミノペプチダーゼ（ＡＰＮ）の恒常的発現を特徴とし、本発明で示されるように、前記酵素の抑制性物質によりその成長と機能を効果的に抑制することができる。同じことは、エクトペプチダーゼ（ectopeptidases）を発現する上皮細胞にも当てはまる。
【０００８】
アンギオテンシン変換酵素は、動脈硬化症の病因において、特別な役割を果たす。前記酵素は、アンギオテンシンＩ（ａｎｇＩ）からアンギオテンシンＩＩ（ａｎｇＩＩ）の生成をもたらす。後者の物質は、血圧を激しく上昇させる。高血圧は、動脈硬化の危険性を推進する重要な要素であり、動脈硬化症の患者は、しばしば、ａｎｇＩＩの血中濃度が上昇している。さらに、ａｎｇＩＩは、平滑筋（管；vessels）の成長を刺激することにより前動脈形成性（pro-arterogeneous）である（非特許文献１５，１６参照）。その上、ａｎｇＩＩもまた、リポキシゲナーゼ活性を増進し、炎症促進伝達物質をより一層放出させることで、炎症反応を増進する。
【非特許文献１】Fleischer B「ＣＤ２６表面プロテアーゼは、Ｔ細胞の活性化に関わる。（CD26 a surface protease involved in T cell activation．）」（1994）Immunology Today ; 15:180-184
【非特許文献２】Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）」（1999）International Journal of Molecular Medicine ; 4:17-27
【非特許文献３】Riemann D et al.「ＣＤ１３-単なる白血病タイピングマーカーにあらず（CD13 - not just a marker in leukemia typing）」（1999）Immunology Today ; 20:83-88
【非特許文献４】Schon E et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、Ｔリンパ球の増殖に関わる膜酵素（The dipeptidyl peptidase IV, a membrane enzyme involved in the proliferation of T lymphocytes）」（1985）Biomed. Biochim. Acta ; 2: K9-K15
【非特許文献５】Schon E et al.「ヒトＴリンパ球活性化におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの役割・ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する阻害因子と抗体は、インビトロでリンパ球の増殖と免疫グロブリンの合成を抑制する。（The role of dipeptidyl peptidase IV in human T lymphocyte activation. Inhibitors and antibodies against dipeptidyl peptidase IV suppress lymphocyte proliferation and immunoglobulin synthesis in vitro.）」（1987）Eur. J. Immunol. ; 17: 1821-1826
【非特許文献６】Reinhold D et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害は、PWC誘導PBMNCおよびＴ細胞におけるトランスフォーミング成長因子β１の分泌を誘導する（Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor (1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells.）」（1997）Immunology ; 91: 354-360
【非特許文献７】Lendeckel U et al.「マイトジェン活性化によるヒトＴ細胞における膜アラニルアミノペプチダーゼ遺伝子および表面発現の誘導（Induction of the membrane alanyl aminopeptidase gene and surface expression in human T cells by mitogenic activation.）」（1996）Biochem. J. ; 319: 817-823
【非特許文献８】Kahne T et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ：細胞表面ペプチダーゼは、Ｔ細胞の成長制御に関わる（Dipeptidyl peptidase IV: A cell surface peptidase involved in regulating T cell growth）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 3-15
【非特許文献９】Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 17-27
【非特許文献１０】Ross R「動脈硬化症-炎症性疾患（Arteriosclerosis-an inflammatory disease.）」（1999） New England J. Med. ; 340 (2): 115-126
【非特許文献１１】Gotlieb AI et al.「アテローム硬化冠動脈疾患におけるレオロジーの役割（The role of rheology in atherosclerotic coronary artery disease.）」（1996） In: Fuster V, Ross R, Topol EJ, eds. 「動脈硬化と冠動脈疾患（Atherosclerosis and coronary athery disease.）」 Vol. 1 Philadelphia: Lippincott-Raven, : 595-606
【非特許文献１２】Jonasson L et al.「ヒトアテローム斑におけるＴ細胞、マクロファージおよび平滑筋細胞の局所的集積（Regional accumulation of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque.）」（1986） Arteriosclerosis. ; 6: 131-138
【非特許文献１３】van der Wal AC et al.「ヒト動脈硬化損傷：インサイチュ免疫表現型解析は、免疫媒介反応を示唆する。（Atherosclerotic lesions in humans: in situ immunophenotypic analysis suggesting an immune mediated response.）」（1989） Lab. Invest. ; 61: 166-170
【非特許文献１４】Libby P and Ross R.「サイトカインと成長調整分子（Cytokines and growth regulatory molecules.）」（1996） In: Fuster V, Ross R, Topol EJ, eds.「動脈硬化と冠動脈疾患（Atherosclerosis and coronary athery disease.）」Vol. 1, Philadelphia: Lippincott-Raven, : 585-594
【非特許文献１５】Chobanian AV et al.「レニンガンギオテンシン系とアテローム硬化血管疾患（Renin angiotensin system and atherosclerotic vascular disease.）」（1996） In: Fuster V, Ross R, Topol EJ, eds. 「動脈硬化と冠動脈疾患（Atherosclerosis and coronary athery disease.）」Vol. 1, Philadelphia: Lippincott-Raven, : 237-242
【非特許文献１６】Gibbons GH et al.「血管平滑筋細胞の肥大ｖｓ.過形成：自己分泌ＴＧＦ-β１発現がアンギオテンシンＩＩに対する成長反応を決定する（Vascular smooth muscle cell hypertrophy vs. hyperplasia: autocrine TGF-s1 expression determines growth response to angiotensin II.）」（1992）J Clin. Invest. ; 90: 456-461
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、（Ｉ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼＮ；（ＩＩ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶと‘アンギオテンシン変換酵素’；（ＩＩＩ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶとプロリルオリゴペプチダーゼ；および（ＩＶ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶとＸ-Ｐｒｏアミノペプチダーゼの酵素活性阻害因子の同時効果、または、前記酵素の生物学的活性の同時作用が、単核細胞（ＭＮＣ）およびＴ細胞のＤＮＡ合成と増殖を、前記酵素阻害因子のより一層の多用量投与を含む単独適用では達成できない程度に阻害するという驚くべき研究成果に基づく。前記阻害因子は、最終的には、同じプロセス、つまり免疫細胞のＤＮＡ合成と増殖に影響を与えるけれども、この効果は、実質的にあまり顕著ではなく、長くは続かない。前述の酵素の活性における機能的オーバーラップのために、本発明のデータで示すように、２または３の前記酵素の同時阻害により、結果として、ＤＮＡ合成と増殖に対して、加法的を超える、または、超付加的な阻害効果が得られる。
【００１０】
本発明は、前述の酵素の阻害物質の同時適用、またはそれぞれに対応する調合剤および投与形態（forms)の同時適用が、例えば、その発生においてＴリンパ球の増殖と活性化が中心的役割を果たす動脈硬化症等の炎症疾患の治療に、確かに適していることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
詳しくは、本発明は、下記（Ｉ）〜（ＩＶ）の酵素活性を阻害する物質の同時投与により、単核細胞（ＭＮＣ）およびＴ細胞のＤＮＡ合成が、加法的を越えて、超付加的にまで阻害できるという知見に基づく。
（Ｉ）    ジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼＮ
（ＩＩ）  ジペプチジルペプチダーゼＩＶと‘アンギオテンシン変換酵素’
（ＩＩＩ）ジペプチジルペプチダーゼＩＶとプロリルオリゴペプチダーゼ
（ＩＶ）  ジペプチジルペプチダーゼＩＶとＸ-Ｐｒｏアミノペプチダーゼ
酵素阻害因子のこのような適用は、新しい方法であり、前述の疾患治療の補足的な形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に従って適用されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ、アミノペプチダーゼＮ、プロリルオリゴペプチダーゼ、‘アンギオテンシン変換酵素’、および、Ｘ-Ｐｒｏアミノペプチダーゼの阻害因子は、阻害因子、基質、シュード基質、阻害効果を有するペプチド、ペプチド誘導体、および前記酵素の抗体として、薬学上適当な剤形の複合体の形態で適用されてもよい。ＤＰＩＶの好ましいエフェクターとしては、例えば、Ｘａａ-Ｐｒｏジペプチジル、それに相当する誘導体であって、好ましくは、ジペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ジペプチドボロン酸（例えば、Pro-boro-Pro）およびそれらの塩、Ｘａａ-Ｘａａ-(Ｔｒｐ)-Ｐｒｏ-(Ｘａａ)nペプチド（ｎ＝０〜１０）、それに相当する誘導体およびそれらの塩、または、アミノ酸-（Ｘａａ)アミド、それに相当する誘導体およびそれらの塩である。前記Ｘａａは、それぞれ、α-アミノ酸またはα-イミノ酸またはα-アミノ酸誘導体またはα-イミノ酸誘導体であって、好ましくは、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン、Ｌ-プロリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、および、例えば、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン等の環状アミンおよびアミド構造としての機能を果たすそれらの誘導体である。そのような化合物とそれらの調製は、以前の特許に記載されている(K. Neubert at al., DD 296 075 A5)。
【００１３】
前記阻害因子は、既知のキャリアー物質と同時に投与される。その投与は、一方で、局所適用の形態をとり、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、スプレー、リポソーム、振とう混合物、親水コロイド包帯、および、点滴注入を含むその他の皮膚用基剤/賦形剤を用いて行われもよく、他方で、全身適用の形態をとり、適した剤形または適した生薬形態にて、経口、経皮、内皮、皮下もしくは筋肉内で適用されてもよい。
【００１４】
例えば、ぜん息性気管支炎や花粉症等のＩ型アレルギー反応は、免疫細胞、とりわけＴH2細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン（とりわけＩＬ-４）の産生に基づく疾患であることが既にわかっている（D.D. Corry et al.「ＩｇＧ応答の誘導と制御(Induction and regulation of the IgG response.)」（1999）Nature ; 402: B18 to B23）。
【００１５】
例えば、ＤＰＩＶやＡＰＮ等の膜局在ペプチダーゼは、免疫細胞、とりわけＴリンパ球の活性化とクローン性発現のプロセスにおいて、重要な役割を担うことは既に示されている（Fleischer B「ＣＤ２６表面プロテアーゼは、Ｔ細胞の活性化に関わる。（CD26 a surface protease involved in T cell activation．）」（1994）Immunology Today ; 15:180-184、Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）」（1999）International Journal of Molecular Medicine ; 4:17-27、Riemann D et al.「ＣＤ１３-単なる白血病タイピングマーカーにあらず（CD13 - not just a marker in leukemia typing）」（1999）Immunology Today ; 20:83-88）。マイトジェン誘導単核細胞（ＭＮＣ）または集積したTリンパ球のいくつかの機能、例えば、ＤＮＡ合成、免疫誘導サイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ）の産生と分泌、Ｂ細胞のヘルパー機能（ＩｇＧおよびＩｇＭの合成）等は、ＤＰＩＶやＡＰＮに対する特定阻害因子に存在により阻害されることがある（Schon E et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、Ｔリンパ球の増殖に関わる膜酵素（The dipeptidyl peptidase IV, a membrane enzyme involved in the proliferation of T lymphocytes）」（1985）Biomed. Biochim. Acta ; 2: K9-K15、Schon E et al.「ヒトＴリンパ球活性化におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの役割・ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する阻害因子と抗体は、インビトロでリンパ球の増殖と免疫グロブリンの合成を抑制する。（The role of dipeptidyl peptidase IV in human T lymphocyte activation. Inhibitors and antibodies against dipeptidyl peptidase IV suppress lymphocyte proliferation and immunoglobulin synthesis in vitro.）」（1987）Eur. J. Immunol. ; 17: 1821-1826、Reinhold D et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害は、PWC誘導PBMNCおよびＴ細胞におけるトランスフォーミング成長因子β１の分泌を誘導する（Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor (1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells.）」（1997）Immunology ; 91: 354-360、Lendeckel U et al.「マイトジェン活性化によるヒトＴ細胞における膜アラニルアミノペプチダーゼ遺伝子および表面発現の誘導（Induction of the membrane alanyl aminopeptidase gene and surface expression in human T cells by mitogenic activation.）」（1996）Biochem. J. ; 319: 817-823、Kahne T et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ：細胞表面ペプチダーゼは、Ｔ細胞の成長制御に関わる（Dipeptidyl peptidase IV: A cell surface peptidase involved in regulating T cell growth）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 3-15、Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 17-27）。
【００１６】
一方、近年の科学的発見により、Ｉ型アレルギー反応症が、ＴH2リンパ球がその発生と進行に重要な役割を果たす炎症性の疾患であると特徴付られた（D.D. Corry et al.「ＩｇＥ応答の誘導と制御（Induction and  regulation of the IgE）」（1999）Nature ; 402: B18-B23、P.J. Barnes「アレルギー性疾患に対する治療ストラテジー（Therapeutic strategies for allergic diseases.）」（1999）Nature ; 402: B31-B38）。
【００１７】
ＩＬ-４は、Ｂ細胞の増殖のためのヘルパーサイトカインであり、ＩｇＥの発生と低親和性のＦｃ-ＩｇＥ受容体の発現を誘導する。さらに、ＩＬ-４は、ＴH2細胞自身の誘導を増大し、エオシン好性細胞（好酸球）および肥満細胞の増殖と活性を制御する。Ｉ型アレルギー反応において、ＴH2細胞が重要な役割を果たすのは、このような理由によるのである（D.P. Stites, A.I. Terr, T.G. Parslow: Medical Immunology. Appelton & Lange, Stamfort, CT, 1997）。
【００１８】
本発明は、また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼＮの阻害因子の同時効果が、マイトジェン誘導単核細胞（ＭＮＣ）の増殖（ＤＮＡ合成）とＩＬ-４産生を、前記酵素阻害因子のより一層の多用量投与を含む単独適用では達成できない程度まで阻害するという驚くべき研究成果に基づく。前記阻害因子は、最終的には、同じプロセス、つまりＴH2細胞のＤＮＡ合成、増殖およびＩＬ-４産生に影響を与えるけれども、この効果は、前記阻害因子を単独で適用した場合、実質的にあまり顕著ではなく、長くは続かない。前述の酵素の酵素活性における機能的オーバーラップのために、本発明のデータで示すように、２つの前記酵素の同時阻害により、結果として、ＤＮＡ合成と増殖に対して、加法的を超える、または、超付加的な阻害効果が得られる。
【００１９】
本発明は、ＤＰＩＶおよびＡＰＮの酵素阻害物質の同時適用、またはそれぞれに対応する調合剤および投与形態（forms)の同時適用が、その発生においてＴリンパ球の増殖と活性化が中心的役割を果たすＩ型アレルギー性疾患の治療に、確かに適していることを示す。
【００２０】
詳しくは、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼを阻害する物質を同時投与することで、単核細胞（ＭＮＣ）のＤＮＡ合成とＩＬ-４産生を、加法的を越えて、超付加的にまで阻害できるという知見に基づく。
【００２１】
酵素阻害因子のこのような適用は、新しい方法であり、前述の疾患治療の補足的な形態である。
【００２２】
本発明に従って適用されるジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼＮの阻害因子は、阻害因子、基質、シュード基質、阻害効果を有するペプチド、ペプチド誘導体、および前記酵素の抗体として、薬学上適当な剤形の複合体の形態で適用されてもよい。ＤＰＩＶの好ましいエフェクターとしては、例えば、Ｘａａ-Ｐｒｏジペプチジル、それに相当する誘導体であって、好ましくは、ジペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ジペプチドボロン酸（例えば、Pro-boro-Pro）およびそれらの塩、Ｘａａ-Ｘａａ-(Ｔｒｐ)-Ｐｒｏ-(Ｘａａ)nペプチド（ｎ＝０〜１０）、それに相当する誘導体およびそれらの塩、または、アミノ酸-（Ｘａａ)アミド、それに相当する誘導体およびそれらの塩である。前記Ｘａａは、それぞれ、α-アミノ酸またはα-イミノ酸またはα-アミノ酸誘導体またはα-イミノ酸誘導体であって、好ましくは、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン、Ｌ-プロリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、および、例えば、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン等の環状アミンおよびアミド構造としての機能を果たすそれらの誘導体である。そのような化合物とそれらの調製は、以前の特許に記載されている(K. Neubert at al., DD 296 075 A5)。
【００２３】
好ましいアラニルアミノペプチダーゼの阻害因子としては、ベスタチン(bestatin、Ubenimex社製）、アクチノニン(actinonine)、プロベスチン(probestine)、フェベツチン(phebestine)、ＲＢ３０１４、またはロイヒスチン(leuhistine)があげられる。
【００２４】
前記阻害因子は、既知のキャリアー物質と同時に投与される。その投与は、一方で、局所適用の形態をとり、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、スプレー、リポソーム、振とう混合物、親水コロイド包帯、および、点滴注入を含むその他の皮膚用基剤/賦形剤を用いて行われてもよく、他方で、全身適用の形態をとり、適した剤形または適した生薬形態にて、経口、経皮、内皮、皮下もしくは筋肉内で適用されもよい。
【００２５】
多くの皮膚病に、毛包性および表皮性の過角化症とケラチノサイトの増殖増強が伴う。これらの疾患は、炎症性および非炎症性の表皮性過増殖状況（例えば、先天性魚鱗癬や乾癬）、良性および悪性の表皮性クローン性増殖（例えば、いぼ、コンジローム、光線角化症/前がん）、良性および悪性の毛包性過増殖状況（例えば、毛包性角化症）、ならびに、良性および悪性の上皮付属器腫瘍、および原発および反応性爪細胞過増殖を含む。詳細を表１に示す。
【００２６】
例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶやアミノペプチダーゼＮのようなペプチダーゼまたは同様の作用の酵素は、細胞間相互作用の制御と調節それぞれについてとりわけ重要である。なぜなら、それらは、エクト酵素として、特に、細胞の原形質膜に局在し、他の細胞外構造と相互作用し、酵素-触媒加水分解によりペプチド作用性の伝達物質を活性化または不活性化するため、細胞間コミュニケーションに重要だからである（Yaron A, et al.「ペプチドおよびタンパク質のプロリン依存性構造的特性と生物学的特性（Prolinedependent structural and biological properties of peptides and proteins.）」(1993) Crit Rev Biochem Mol Biol ;28:31-81、Vanhoof G, et al.「ペプチドにおけるプロリンモチーフとそれらの生物学的プロセッシング（Proline motifs in peptides and their biological processing.)」(1995) FASEB J ;9:736-744）。
【００２７】
例えば、ＤＰＩＶやＡＰＮ等の膜局在ペプチダーゼは、免疫細胞、とりわけＴリンパ球の活性化とクローン性発現のプロセスにおいて、重要な役割を担うことは既に示されている（Fleischer B「ＣＤ２６表面プロテアーゼは、Ｔ細胞の活性化に関わる。（CD26 a surface protease involved in T cell activation．）」（1994）Immunology Today ; 15:180-184、Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）」（1999）International Journal of Molecular Medicine ; 4:17-27、Riemann D et al.「ＣＤ１３-単なる白血病タイピングマーカーにあらず（CD13 - not just a marker in leukemia typing）」（1999）Immunology Today ; 20:83-88）。マイトジェン誘導単核細胞（ＭＮＣ）または集積したTリンパ球のいくつかの機能、例えば、ＤＮＡ合成、免疫誘導サイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ）の産生と分泌、Ｂ細胞のヘルパー機能（ＩｇＧおよびＩｇＭの合成）等は、ＤＰＩＶやＡＰＮに対する特定阻害因子に存在により阻害されることがある（Schon E et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、Ｔリンパ球の増殖に関わる膜酵素（The dipeptidyl peptidase IV, a membrane enzyme involved in the proliferation of T lymphocytes）」（1985）Biomed. Biochim. Acta ; 2: K9-K15、Schon E et al.「ヒトＴリンパ球活性化におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの役割・ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する阻害因子と抗体は、インビトロでリンパ球の増殖と免疫グロブリンの合成を抑制する。（The role of dipeptidyl peptidase IV in human T lymphocyte activation. Inhibitors and antibodies against dipeptidyl peptidase IV suppress lymphocyte proliferation and immunoglobulin synthesis in vitro.）」（1987）Eur. J. Immunol. ; 17: 1821-1826、Reinhold D et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害は、PWC誘導PBMNCおよびＴ細胞におけるトランスフォーミング成長因子β１の分泌を誘導する（Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor (1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells.）」（1997）Immunology ; 91: 354-360、Lendeckel U et al.「マイトジェン活性化によるヒトＴ細胞における膜アラニルアミノペプチダーゼ遺伝子および表面発現の誘導（Induction of the membrane alanyl aminopeptidase gene and surface expression in human T cells by mitogenic activation.）」（1996）Biochem. J. ; 319: 817-823、Kahne T et al.「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ：細胞表面ペプチダーゼは、Ｔ細胞の成長制御に関わる（Dipeptidyl peptidase IV: A cell surface peptidase involved in regulating T cell growth）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 3-15、Lendeckel U et al.「ヒトＴ細胞の成長と機能におけるアラニルアミノペプチダーゼの役割（Role of alanyl aminopeptidase in growth and function of human T cells）(総説)」（1999）. Int. J. Mol. Med. ; 4: 17-27）。免疫細胞上のジペプチジルペプチダーゼＩＶを合成阻害因子によって阻害することで、自己免疫疾患や移植拒絶反応の治療が可能となることは知られている（例えば、EP 0 764 151 A1; WO 95/29691; EP 0 731 789 A1; EP 0 528 858 A1）。
【００２８】
本発明は、また、ケラチノサイトの内部または表面で発現するジペプチジルペプチダーゼＩＶ/ＣＤ２６とアミノペプチダーゼＮ/ＣＤ１３または同様の酵素に対する阻害因子の同時効果が、これらの細胞の増殖（ＤＮＡ合成）を、前記酵素阻害因子を規定量投与しても単独適用では達成できない程度まで阻害するという驚くべき研究成果に基づく。前記阻害因子は、最終的には、同じプロセス、つまりケラチノサイトのＤＮＡ合成と増殖に影響を与えるけれども、この効果は、前記阻害因子を単独で適用した場合、実質的にあまり顕著ではなく、長くは続かない。前述の酵素の酵素活性における機能的オーバーラップのために、本発明のデータで示すように、２つの前記酵素の同時阻害により、結果として、ＤＮＡ合成と増殖に対して、より低い濃度で、加法的を超える、または、超付加的な阻害効果が得られる。
【００２９】
本発明は、ＤＰＩＶおよびＡＰＮの酵素阻害物質の同時適用、またはそれぞれに対応する調合剤および投与形態（forms)の同時適用が、その発生において表皮性および毛包性のケラチノサイトならびに粘膜の移行部のケラチノサイトの増殖と活性化が中心的役割を果たす、炎症性および非炎症性の表皮性過増殖状況（例えば、先天性魚鱗癬や乾癬）、良性および悪性の表皮性クローン性増殖（例えば、いぼ、コンジローム、光線角化症/前がん）、良性および悪性の毛包性過増殖状況（例えば、毛包性角化症）、ならびに、良性および悪性の上皮付属器腫瘍、および原発および反応性爪細胞過増殖の治療または予防に、確かに適していることを示す。
【００３０】
ケラチノサイトに加えて、Ｔリンパ球も、皮膚の炎症性疾患、とりわけ、乾癬のような自己免疫疾患において重要な役割を果たす。Ｔ細胞は、ケラチノサイトと同様に、前述したペプチダーゼＤＰＩＶおよびＡＰＮを発現する。その結果、ケラチノサイトに対する請求または保護される治療効果は、Ｔ細胞に影響を及ぼすことで、さらに増大する。これは、独国特許出願No.100 25 464.0「例えば、間接リウマチ、エリテマトーデス(LE)、多発硬化症、自己免疫疾患、インシュリン依存性糖尿病(IDDM)、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、神経皮膚炎、糸球体腎炎、間質性腎炎、血管炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血等の自己免疫疾患、移植、および腫瘍の治療のための、酵素阻害因子およびその医薬品の併用」の主題でもある。
【００３１】
詳しくは、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼを阻害する物質を同時投与することで、ＨａＣａＴケラチノサイトのＤＮＡ合成を加法的に、および、低濃度で超付加的に阻害できるという知見に基づく。
【００３２】
今に至るまで、前述の疾患は、抗増殖性および分化誘発(differentiating)物質（サリチル酸、尿素、内因性および合成レチノイド、ビタミンＤ３誘導体、副腎皮質ステロイド）を投与することで局所的に、および、部分的免疫抑制および抗増殖性製剤（例えば、シクロスポリンＡ、副腎皮質ステロイド、レチノイド等）を投与することで全身的に治療していた。とりわけ、全身的に物質を投与した場合、しばしば、望ましくない副作用が観察された。ＤＰＩＶおよびＡＰＮの阻害因子の併用投与は新規であり、優れた効果が期待でき、安価とすることが可能な治療方法であり、現存する治療コンセプトの価値ある代替構成要素となる。
【００３３】
本発明に従って適用されるジペプチジルペプチダーゼＩＶとアミノペプチダーゼＮまたは同様の酵素の阻害因子は、阻害因子、基質、シュード基質、阻害効果を有するペプチド、ペプチド誘導体、および前記酵素の抗体として、薬学上適当な剤形の複合体の形態で適用されてもよい。ＤＰＩＶの好ましいエフェクターとしては、例えば、Ｘａａ-Ｐｒｏジペプチジル、それに相当する誘導体であって、好ましくは、ジペプチドホスホン酸ジアリールエステル、ジペプチドホウ酸（例えば、Pro-boro-Pro）およびそれらの塩、Ｘａａ-Ｘａａ-(Ｔｒｐ)-Ｐｒｏ-(Ｘａａ)nペプチド（ｎ＝０〜１０）、それに相当する誘導体およびそれらの塩、または、アミノ酸-（Ｘａａ)アミド、それに相当する誘導体およびそれらの塩である。前記Ｘａａは、それぞれ、α-アミノ酸またはα-イミノ酸またはα-アミノ酸誘導体またはα-イミノ酸誘導体であって、好ましくは、Ｎε-４-ニトロベンジルオキシカルボニル-Ｌ-リジン、Ｌ-プロリン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、および、例えば、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン等の環状アミンおよびアミド構造としての機能を果たすそれらの誘導体である。そのような化合物とそれらの調製は、以前の特許に記載されている(K. Neubert at al., DD 296 075 A5)。
【００３４】
好ましいアラニルアミノペプチダーゼの阻害因子としては、ベスタチン(bestatin、Ubenimex社製）、アクチノニン(actinonine)、プロベスチン(probestine)、フェベツチン(phebestine)、ＲＢ３０１４、またはロイヒスチン(leuhistine)があげられる。
【００３５】
前記阻害因子は、既知のキャリアー物質と同時に投与される。その投与は、一方で、局所適用の形態をとり、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、溶液、スプレー、リポソーム、振とう混合物、親水コロイド包帯、および、点滴注入を含むその他の皮膚用基剤/賦形剤を用いて行われてもよく、他方で、全身適用の形態をとり、適した剤形または適した生薬形態にて、経口、経皮、内皮、皮下もしくは筋肉内で適用されてもよい。
【００３６】
（表１）
2004520330.tif 000002
2004520330.tif 000003
本発明を以下の実施例により、さらに説明するが、本発明は、これらの好ましい態様に限定されない。
【実施例１】
【００３７】
ＤＰＩＶおよびＡＰＮの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成阻害。
【００３８】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン；Actinonine)の同時投与により、ヒト末梢Ｔリンパ球のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記Ｔ細胞を前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図１は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例２】
【００３９】
ＤＰＩＶおよびＡＰＮの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒト末梢単核細胞のＤＮＡ合成阻害。
【００４０】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン；Actinonine)の同時投与により、ヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記ＭＮＣを前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図２は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例３】
【００４１】
ＤＰＩＶおよびＰＯＰの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成阻害。
【００４２】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびプロリルオリゴペプチダーゼ阻害因子(Boc-Ala thiazolidide)の同時投与により、ヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記Ｔリンパ球を前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図３は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例４】
【００４３】
ＤＰＩＶおよびＰＯＰの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒト末梢単核細胞のＤＮＡ合成阻害。
【００４４】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびプロリルオリゴペプチダーゼ阻害因子(Boc-Ala thiazolidide)の同時投与により、ヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成が、さらにより阻害されることを示す。前記ＭＮＣを前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図４は、用量依存的にさらに強まるＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例５】
【００４５】
ＤＰＩＶおよびＡＣＥの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成阻害。
【００４６】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびアンギオテンシン変換酵素阻害因子(カプトプリル：Captopril)の同時投与により、ヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記Ｔリンパ球を前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図５は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例６】
【００４７】
ＤＰＩＶおよびＡＣＥの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒト末梢単核細胞のＤＮＡ合成阻害。
【００４８】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＣＥ阻害因子(カプトプリル：Captopril)の同時投与により、ヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記ＭＮＣを前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図６は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例７】
【００４９】
ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン；Actinonine)の単独および同時投与によるヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)の増殖阻害（図７）。
【実施例８】
【００５０】
ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン；Actinonineとプロベスチン；Probestine)の単独および同時投与によるヒトＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ-２９９株の増殖阻害（図８）。
【実施例９】
【００５１】
ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン；Actinonineとプロベスチン；Probestine)の単独および同時投与によるヒト末梢Ｔ細胞の増殖阻害（図９）。
【実施例１０】
【００５２】
ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＸ-Ｐｒｏ-アミノペプチダーゼ（ＡＰＰ）阻害因子（アプスタチン；Apstatine）の単独および同時投与によるＰＨＡ活性化ヒト単核細胞の増殖阻害（図１０)。
【実施例１１】
【００５３】
ＤＰＩＶおよびＡＰＮの合成阻害因子とのインキュベーションによるヤマゴボウマイトジェン(ＰＷＭ)誘導末梢血ヒト単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成阻害。
【００５４】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(ベスタチン：Bestatine)の同時投与により、ヤマゴボウマイトジェン誘導ヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記ＭＮＣを前記ヤマゴボウマイトジェンおよび前記阻害因子の存在下で７２時間インキュベートし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図１１は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＤＮＡ合成の阻害を示す。
【実施例１２】
【００５５】
ＤＰＩＶおよびＡＰＮの合成阻害因子とのインキュベーションによるヤマゴボウマイトジェン誘導末梢血ヒト単核細胞のＩＬ-４産生阻害。
【００５６】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(ベスタチン：Bestatine)の同時投与により、ヤマゴボウマイトジェン誘導ヒト末梢単核細胞(ＭＮＣ)による（ＴH2細胞特有の）サイトカインＩＬ-４産生が、加法的を越えて超付加的に阻害されることを示す。前記ＭＮＣを前記ヤマゴボウマイトジェンおよび前記阻害因子の存在下で４８時間インキュベートし、その後、それぞれの培地上清中のＩＬ-４濃度を、市販のＩＬ-４解析キット(ＥＩＬＳＡ）を用いて、文献に記載のとおりに測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図１２は、用量依存性であり、加法的を越えて超付加的なＩＬ-４産生の阻害を示す。
【実施例１３】
【００５７】
ＤＰＩＶおよびＡＰＮの合成阻害因子とのインキュベーションによるヒトケラチノサイト(ＨａＣａＴ細胞株)のＤＮＡ合成阻害。
【００５８】
本発明にしたがうサーチは、ＤＰＩＶ阻害因子(Lys[Z(NO2)]-thiazolidide = I49)およびＡＰＮ阻害因子(アクチノニン：actinonine)の同時投与により、ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ株のＤＮＡ合成が、加法的を越えて、低濃度においても超付加的に阻害されることを示す。
【００５９】
前記ヒトケラチノサイトＨａＣａＴ株は、ＤＰＩＶおよびＡＰＮを発現する一般に認められた乾癬の細胞モデルである。生存細胞（vital cell）におけるＤＰＩＶの酵素活性は、30.2±5 pkat/106細胞であり、ＡＰＮの酵素活性は、90±4 pkat/106細胞である。それと一致するように、これらの細胞において、ＡＰＮおよびＤＰＩＶのｍＲＮＡが検出される（図１３）。
【００６０】
ＨａＣａＴ細胞を前述の阻害因子の存在下で４８時間インキューベトし、その後、ＤＮＡ合成を、文献に記載のとおりに、3[H]-チミジンの取り込みを計測することで測定した(Reinhold D. et al.: Inhibitors of dipeptidyl peptidase IV induce secretion of transforming growth factor β1 in PWM-stimulated PBMNC and T cells; Immunology 1997, 91: 354-360）。図１４は、用量依存性ＤＮＡ合成の阻害を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトＴリンパ球のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアミノペプチダーゼＮ阻害因子(アクチノニン：actinonine)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒト末梢血Ｔ細胞を、図１に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図２】ヒト単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアミノペプチダーゼＮ阻害因子(アクチノニン：actinonine)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒトＭＮＣを、図２に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図３】ヒト末梢Ｔリンパ球のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびプロリルオリゴペプチダーゼ阻害因子(Boc-Ala-Thia)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒトＴ細胞を、図３に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図４】ヒト単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびプロリルオリゴペプチダーゼ阻害因子(Boc-Ala-Thia)の促進された用量依存的効果。ヒトＭＮＣを、図４に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図５】ヒト末梢Ｔリンパ球のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアンギオテンシン変換酵素(カプトプリル：captopril)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒトＴ細胞を、図５に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図６】ヒト単核細胞(ＭＮＣ)のＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアンギオテンシン変換酵素(カプトプリル：captopril)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒトＭＮＣを、図６に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図７】ＭＮＣを、単独で（コントロール）、マイトジェンレクチンフィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)とともに、または、ＰＨＡに加えて図７に示す阻害因子とともに７２時間インキュベートした。その後、代謝的に活性のある細胞の数を、市販のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ(Takara Inc.)を用いて、前記製造業者の説明にしたがって測定した。
【図８】ＫＡＲＰＡＳ-２９９細胞を、単独で（コントロール）、または、図８に示す単独もしくは組み合わせた阻害因子とともに７２時間インキュベートした。その後、代謝的に活性のある細胞の数を、市販のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ(Takara Inc.)を用いて、前記製造業者の説明にしたがって測定した。
【図９】Ｔ細胞を、未処理コントロールを除き、フィトヘムアグルチニンおよびホルボール-１２-ミリステイト-１３-アセテート(phorbol-12-myristate-13-acetate)を培養培地に添加することで活性化し、図９に示す単独もしくは組み合わせた阻害因子とともに、７２時間インキュベートした。その後、代謝的に活性のある細胞の数を、市販のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ(Takara Inc.)を用いて、前記製造業者の説明にしたがって測定した。
【図１０】単核細胞(ＭＮＣ)を、図１０に示す単独もしくは組み合わせた阻害因子とともに、７２時間インキュベートした。その後、代謝的に活性のある細胞の数を、市販のＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ(Takara Inc.)を用いて、前記製造業者の説明にしたがって測定した。
【図１１】ヒトＰＷＭ誘導ＭＮＣのＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアミノペプチダーゼＮ阻害因子(ベスタチン：bestatine)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒト末梢ＭＮＣを、ＰＷＭ(2 (g/ml)および図１１に示す濃度の前記阻害因子とともに３日間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図１２】ヒトＰＷＭ誘導ＭＮＣによるＩＬ-４産生に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアミノペプチダーゼＮ阻害因子(ベスタチン：bestatine)の相乗的かつ用量依存的効果。ヒト末梢ＭＮＣを、ＰＷＭ(2 (g/ml)および図１２に示す濃度の前記阻害因子とともに４８時間インキュベートした。その後、それぞれの培養上清におけるＩＬ-４濃度をＩＬ-４-ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【図１３】ＲＴ-ＰＣＲを用いた、ＨａＣａＴケラチノサイトにおけるＤＰＩＶおよびＡＰＮのｍＲＮＡ発現の検出。
【図１４】ヒトＨａＣａＴケラチノサイトのＤＮＡ合成に対するＤＰＩＶ阻害因子(I49)およびアミノペプチダーゼＮ阻害因子(アクチノニン：actinonine)の相乗的かつ用量依存的効果。前記細胞を、図１４に示す濃度の前記阻害因子とともに４８時間インキュベートした。その後、3[H]-メチルチミジンを培養培地に添加し、さらに６時間後、ＤＮＡに取り込まれた3[H]-チミジンの量を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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