(57)【要約】タンパク質分解酵素は内在性血管新生阻害物質の生成に関与しており、またウロキナーゼ活性化プラスミンはプラスミノーゲンをプロセッシングして血管新生阻害物質Ｋ１〜５（プロテアーゼ活性化クリングル１〜５）を放出させることが既に立証されている。しかし、このタンパク質分解性タンパク質（タンパク質分解性クリングル１〜５）は細胞から分泌（輸出）される仕組みを欠くため、治療薬としての用途が限られる。本発明者は、適正な折りたたみ能を有し発現後に細胞から分泌されうるようなプラスミノーゲン由来の組換えタンパク質を作り出した。本発明者は意外にも、該組換えタンパク質は適正な折りたたみ能を有し分泌されうるためには、プラスミノーゲンに由来する分泌シグナルペプチドと予備活性化ペプチドとを含まなければならないことを発見した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類プラスミノーゲンのクリングル１〜５、分泌シグナルペプチド及び予備活性化ペプチドに対応するアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。
【請求項２】
本質的に哺乳類プラスミノーゲンのクリングル１〜５、分泌シグナルペプチド及び予備活性化ペプチドに対応するアミノ酸配列からなる組換えタンパク質。
【請求項３】
分子量が５５ｋＤ〜６９ｋＤである請求項１又は２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
分子量が約６５ｋＤである請求項３に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
抗血管新生活性をもつ先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸配列が図６に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有する先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
腫瘍標的化ペプチドをさらに含む先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
腫瘍標的化ペプチドがＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＣＲ及びＣＤＲＧＤＣＦＣからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１０】
哺乳類プラスミノーゲンのクリングル１〜５、分泌シグナルペプチド及び予備活性化ペプチドに対応するアミノ酸配列をもつ組換えタンパク質をコードする核酸配列であって、図１に示すヌクレオチド５０ （コドン開始位置のＡＴＧ）〜１７３４の配列と７０％以上の同一性を有する核酸配列。
【請求項１１】
ｃＤＮＡである請求項９又は１０に記載の核酸配列。
【請求項１２】
発現を導く調節配列と作動可能に連結した請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸を含む複製可能ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを導入した宿主細胞。
【請求項１４】
組換えＫ１〜５ポリペプチドを生産する方法であって、請求項１３の宿主細胞を培養して組換えＫ１〜５が産生されるようにするステップを含む方法。
【請求項１５】
産生された組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を含む製剤組成物。
【請求項１７】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸配列、請求項１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の宿主細胞を含む製剤組成物。
【請求項１８】
製薬上許容しうる担体をさらに含む請求項１６又は１７に記載の製剤組成物。
【請求項１９】
医療用の、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２０】
医療用の、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸配列又は請求項１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の、腫瘍治療薬製造への使用。
【請求項２２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸配列又は請求項１２に記載のベクター又は請求項１３に記載の宿主細胞の、腫瘍治療薬製造への使用。
【請求項２３】
治療が血管新生の予防である請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
抗血管新生療法を必要とする患者の治療方法であって、該患者に請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の製剤組成物を有効量投与することを含む方法。
【請求項２５】
抗血管新生療法を必要とする患者の治療方法であって、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の核酸配列を含むベクターを細胞に導入すること、導入に成功した細胞を選別すること、導入細胞を増殖させること、及び該導入細胞を該患者に移植することを含む方法。
【請求項２６】
細胞が予め患者から獲得されたものである請求項２８に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が抹消血及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、表皮細胞、ミオサイト及び他の体細胞からなる群より選択される請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗血管新生療法を必要とする患者の治療方法であって、該患者に請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含むウイルスベクターを投与することを含む方法。
【請求項２９】
ベクターがレトロウイルスベクターである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質に対し特異的に結合しうる抗体。
【請求項３１】
標識をさらに含む請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の抗体を含む製剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は内皮細胞増殖阻害物質に関する材料と方法に関連する。本発明は特に、ただし非限定的に、哺乳動物のプラスミノーゲンに由来する組換えタンパク質又はその生物活性断片の生産と使用に関連する。
【０００２】
本発明はさらに、該組換えタンパク質の核酸及びアミノ酸配列、並びに該核酸配列を細胞に導入して分泌性の該組換えタンパク質を産生させるようにする方法を提供する。本発明はまた、血管新生の阻害を目的とした該組換えタンパク質の使用を提供する。
【０００３】
発明の背景
「血管新生」はここでは、組織又は器官内での新血管の生成を意味し、上皮細胞の増殖を包含する。正常な生理的条件の下で人間又は動物に血管新生が起こるのはごく特異な限られた事情の場合だけである。たとえば創傷治癒、胚芽・胎児の発生や分化、黄体、子宮内膜及び胎盤の形成などに際しては血管新生が普通に観察される。「内皮」は、漿膜腔、リンパ管及び血管を裏打ちする平坦な内皮細胞の薄い層を意味する。
【０００４】
血管新生は制御型も非制御型も同じように進むと考えられる。内皮細胞と周皮細胞は基底膜に囲まれた状態で毛細血管を形成しているが、血管新生は内皮細胞及び白血球から放出される酵素による基底膜のびらんから始まる。次いで、血管の内腔を裏打ちする内皮細胞が基底膜から突き出す。内皮細胞は血管新生刺激因子に誘発されて遊走し、びらんした基底膜を突き抜ける。この遊走細胞は親血管から出た「新芽」となり、そこで内皮細胞が有糸分裂と増殖を起こす。内皮細胞の芽は互いに融合してループ状の毛細管、すなわち新生血管を形成する。
【０００５】
持続的な、非制御型の血管新生は多様な病態たとえば腫瘍の転移や内皮細胞の異常増殖で起こり、これらの病態で見られる病理的障害を支える。非制御型の血管新生が見られる多様な病態は血管新生依存性疾患又は血管新生関連疾患として分類されてきた。
腫瘍の成長が血管新生に依存するとの仮説は１９７１年に初めて出た（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．， Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ： Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ［腫瘍の血管新生： その療法上の意味］， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊｏｕｒ． Ｍｅｄ． ２８５：１１８２−１１８６， １９７１）。同仮説は端的に「ひとたび腫瘍の“生着”が起き後は、腫瘍細胞集団のいかなる増大も必ず、腫瘍に集中する新毛細血管の増加が前提になる」と主張する。腫瘍の“生着（ｔａｋｅ）”は今日では、腫瘍の血管新生前成長期、すなわち数ｍｍ３の体積を占め数百万個を超えることのない腫瘍細胞集団が既存の宿主微細血管に支えられて生存しうるような段階を指すと理解される。腫瘍体積がこの段階を超えてさらに増大するには、毛細血管新生の誘発が必要となる。たとえば血管新生前の初期段階のマウス肺微小転移巣は検査用組織片を高倍率の顕微鏡で調べない限り、検出不可能であろう。
【０００６】
この仮説を支持する間接的な証拠の例は次のとおりである：
（１）マウスの皮下に埋め込んだ透明チャンバー内の腫瘍の成長速度は、血管新生前は遅く線形であるが、血管新生後は急でほとんど指数関数的である （Ａｌｇｉｒｅ， Ｇ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｉ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｔｏ ｗｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ［正常及び悪性腫瘍組織のｉｎ ｖｉｖｏ血管反応 Ｉ． マウスの創傷に対する、また正常及び腫瘍移植片に対する血管反応］； Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ６：７３−８５， １９４５） 。
【０００７】
（２）血管が増殖していない単離潅流臓器中で成長させた腫瘍は体積が１〜２ｍｍ３に限られるが、この腫瘍をマウスに移植して血管を新生させると、１０００倍超の体積へと急速に拡大する（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｏｒｇａｎｓ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｐｓｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｔｈｙｒｏｉｄ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ［単離した潅流臓器中の腫瘍挙動： ウサギ甲状腺及びイヌ腸管部での生検材料のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長及び転移］． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ １６４：４９１−５０２， １９６６）。
【０００８】
（３）無血管角膜の腫瘍は緩慢に定速度で成長するが、新血管形成後は指数関数的な成長へと転換する（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ， Ｍ．Ａ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ： Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｃｏｒｎｅａ ［腫瘍の成長と新血管形成： ウサギ角膜を使用した実験モデル］． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ５２：４１−４２７， １９７４）。
【０００９】
（４）ウサギ前眼房の房水中に懸濁させた腫瘍は１ｍｍ３未満のサイズで無血管のまま生存し続けるが、それを虹彩血管床に移植すると、新血管を形成して急速に成長し、２週間以内に原体積の１６，０００倍に達する（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ， Ｍ．Ａ．， Ｊｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ［新血管形成の防止による腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ休眠］， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １３６：２６１−２７６）。
【００１０】
（５）ニワトリ胚漿尿膜に移植した腫瘍は７２時間超の無血管期には緩慢に成長するものの、平均径は０．９３＋０．２９ ｍｍを超えない。新血管形成が始まると２４時間以内に急速な腫瘍の拡大が起こり、７日目には新血管形成腫瘍の平均径が８．０＋２．５ ｍｍに達する（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ， Ｄ．， Ａｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｓｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ［ニワトリ胚における無血管期と血管期の腫瘍成長］． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ３５：３４７−３５６， １９７７）。
【００１１】
（６）ウサギ肝転移巣の血管鋳型を調べると、転移巣サイズは不均一であるが、新血管形成のカットオフポイントとなるサイズは比較的均一である。すなわち腫瘍は直径１ｍｍまでは概して無血管であるが、その直径を超えると新血管形成が見られる（Ｌｉｅｎ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． ＩＩ． Ａ ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｉｌａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｖｅｓｓｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ ［実験的肝転移巣の血液供給： ＩＩ． 潅流シリコーンラバーの使用による正常及び腫瘍肝血管の微小循環研究］． Ｓｕｒｇｅｒｙ ６８：３３４−３４０， １９７０）。
【００１２】
（７）膵島β細胞にがん腫を生じたトランスジェニックマウスでは血管新成前の過形成膵島はサイズが１ｍｍ３未満に限られる。６〜７週令で、膵島の４〜１０％に血管新生が起こり、これらの膵島からは血管新生前膵島の体積の１０００倍超の大きな血管新生腫瘍が生じる（Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｔｏ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ［過形成から腫瘍形成への移行期における血管新生の誘発］． Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８−６１， １９８９）。
【００１３】
（８）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に対して特異的なある抗体は、ＶＥＧＦを唯一の血管新生メディエーターとする（ヌードマウスに移植した） ３種類のヒト腫瘍で微小血管密度を低下させ、それらの成長を「顕著に又は劇的に」阻害する。該抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏでは腫瘍細胞の増殖を阻害しない（Ｋｉｍ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ［ＶＥＧＦ誘発血管新生の阻害は腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ成長を抑制する］． Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４， １９９３）。
【００１４】
（９）抗ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）モノクローナル抗体は、唯一の血管新生メディエーターとしてのｂＦＧＦの分泌に依存するマウス腫瘍の成長を７０％阻害する。該抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏでは腫瘍細胞の増殖を阻害しない（Ｈｏｒｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ［ヒトｂＦＧＦに対する免疫中和モノクローナル抗体による充実性腫瘍の成長抑制］． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５１：６１８０−６１８４， １９９１）。
【００１５】
（１０）ｂＦＧＦの腹腔内注射は原発腫瘍とその転移巣の成長を、腫瘍中の毛細血管内皮細胞の増殖を刺激することにより増進する。該腫瘍細胞自体はｂＦＧＦ受容体を欠き、またｂＦＧＦはｉｎ ｖｉｔｒｏでは該腫瘍細胞のマイトジェンではない（Ｇｒｏｓｓ， Ｊ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｂＦＧＦ ［ｂＦＧＦによる充実性腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ成長の調節］． Ｐｒｏｃ． Ａｍｅｒ． Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ３１：７９， １９９０）。
【００１６】
（１１）ある特異的な血管新生阻害因子（ＡＧＭ−１４７０）は腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ成長及び転移を阻害するが、腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に対する阻害活性はずっと低い。その血管内皮細胞増殖に対する５０％阻害濃度は腫瘍細胞増殖に対するそれを４ ｌｏｇ下回る（Ｉｎｇｂｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｉｏｉｎｈｉｂｉｎｓ： Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ ｗｈｉｃｈ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ［アナイオインヒビン： 血管新生を阻害し腫瘍の成長を抑制するフマギリン合成類縁物］． Ｎａｔｕｒｅ ４８：５５５−５５７， １９９０）。
腫瘍の成長が血管新生に依存することを示す間接的な証拠は臨床面でも示されている。
【００１７】
（１２）ガラス体に対して転移性であるヒト網膜芽腫は無血管スフェロイドへと進化するが、該スフェロイドは（摘出眼球から取り出しｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を行うと）生存能があり３Ｈ−チミジンを取り込むという事実にもかかわらず、サイズが１ｍｍ３未満に限られる。
【００１８】
（１３）卵巣がんは無血管の小さな（１〜３ｍｍ３）白色播種として腹膜に転移する。これらの転移巣はそのうちの１つ又は複数で血管新生が起こるまではめったに成長、拡大しない。
（１４）乳がんの新血管形成度は将来の転移リスクと高い相関関係にあり（Ｗｅｉｄｎｅｒ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ［腫瘍の血管新生は浸潤乳がんの転移と相関関係にある］． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２４：１−８， １９９１及びＷｅｉｄｎｅｒ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ ｎｅｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ［腫瘍の血管新生： 初期乳がんの新しい有意の独立した予後指標］， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８４：１８７５−１８８７， １９９２）、また前立腺がんの新血管形成度も同様である（Ｗｅｉｄｎｅｒ， Ｎ．， Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｐ．Ｒ．， Ｆｌａｘ， Ｊ．， Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ， Ｗ．， Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．， Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ［腫瘍の血管新生は浸潤前立腺がんの転移と相関関係にある］． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １４３ （２）：４０１−４０９， １９９３）。
【００１９】
（１５）ヒト皮膚黒色腫からの転移は新血管形成前には稀である。新血管形成の開始は病変部の肥厚と転移リスクの増大を招く（Ｓｔｒｉｖａｓｔａｖａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ （０．７４〜４．０ ｍｍ ｔｈｉｃｋ） ｓｋｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ［中厚（厚さ０．７４〜４．０ ｍｍ）皮膚黒色腫における腫瘍血管分布像の予後的意味］． Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３３：４１９−４２３， １９８８）。
【００２０】
（１６）膀胱がんでは、細胞診よりも血管新生ペプチドｂＦＧＦの尿中レベルのほうが疾病の状態と程度を示す指標として鋭敏である（Ｎｇｕｙｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ， ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ［膀胱がん患者における血管新生ペプチドｂＦＧＦの尿中レベルの上昇］． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８５：２４１−２４２， １９９３）。
【００２１】
以上のように、血管新生ががんの転移で大きな役割を果たすことは明白である。もしもこの血管新生活性について抑制又は解消、もしくはそれ以外の形での制御や調節が可能であるとしたら、腫瘍は存在しても増殖しないであろう。そうした病態での血管新生の防止は新生微小血管系の侵入に起因する損害の回避を可能にしよう。血管新生過程の制御を目指すこうした療法はこれらの疾病の排除又は緩和につながる可能性がある。
【００２２】
従ってこの技術分野では、特に腫瘍中への内皮細胞の増殖（望ましくない血管新生など）を阻害するような組成物及び方法が強く求められている。また、そうした組成物を検出し、測定し、定位するための方法も求められている。そうした組成物は転移前腫瘍の内在性増殖因子の活性に打ち勝ち、腫瘍内毛細血管形成を阻害し、もって腫瘍の成長を阻害するのに役立ちうるのがよい。また、そうした組成物、その断片、及び該組成物に対して特異的な抗体は他の血管新生過程たとえば創傷治癒及び再生でも毛細血管の形成を調節しうるのがよい。当然、血管新生を阻害する組成物及び方法は無害、低副作用であるのが好ましい。また、そうした組成物の結合部位を検出、測定及び定位するための方法も求められている。そうした組成物及びその断片は、放射性及び非放射性標識を目的に他の分子と結合させうるのがよい。
【００２３】
以上のような要求は部分的には既に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内皮細胞増殖やｉｎ ｖｉｖｏ血管新生を調節又は制御たとえば阻害しうるタンパク質の解明に関する完了済みの重要な試験研究により満たされている。たとえばＰＣＴ／ＳＥ９８／０１２６２、ＰＣＴ／ＳＥ００／００７１９（本出願時未公開）及びＣａｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ， ＵＳＡ Ｖｏｌ． ９６， ｐｐ． ５７２８−５７３３， Ｍａｙ １９９９などを参照。しかし、本発明者はいっそうの解明が求められていることを十分認識している。たとえば開示の阻害因子Ｋ１〜５はプラスミンが介在するタンパク質分解により生成された。タンパク質分解酵素類は多数の内在性血管新生阻害物質の生成に関与しており、また既に証明されているように、ウロキナーゼ活性化プラスミンはプラスミノーゲンをプロセッシングし血管新生阻害物質Ｋ１〜５ （プロテアーゼ活性化クリングル１〜５）を放出させることができる。
【００２４】
しかし、このタンパク質分解性タンパク質（タンパク質分解性Ｋ１〜５）は細胞から分泌（輸出）される仕組みを欠く。従って、このタンパク質分解性タンパク質をコードする核酸を細胞又は体組織に導入しても該タンパク質を発現、分泌させるのは無理である。これは該タンパク質の産生や治療への使用という点での実用性を制限する。
【００２５】
発明の要約
本発明は最も一般的には、細胞から分泌されるようにした組換えタンパク質（本書ではアンジオキエシン（ａｎｇｉｏｑｕｉｅｓｃｉｎ）と命名する）の生産又は使用に関わる材料と方法に関連する。
本発明者は、（タンパク質分解性の阻害物質とは異なる）遺伝子組換え型の内皮細胞増殖阻害因子が求められているとの認識に立ち、ヒト・プラスミノーゲン配列を使用してその種のタンパク質を生産しようと試みた。その第一歩として、分泌シグナル（ＳＳ）ペプチドをコードする配列をＫ１〜５コード配列と共に発現させた。しかし、産生されたタンパク質は適正な折りたたみ能を欠くため、細胞から分泌されることはなかった。
【００２６】
そこで本発明者は予備活性化（ＰＡ）ペプチドをコードする配列を追加し、ＳＳ／ＰＡ／Ｋ１〜５をコードする構築物を使用することにした（図３参照）。この構築物がコードするタンパク質は細胞から分泌（輸出）されたので、適正な折りたたみ能を有するに違いないと推測された。これらの意外な結果は、アンジオキエシンの産生にはＰＡペプチドの存在が不可欠であることを示唆する。
【００２７】
従って本発明の第１の態様では、組換え内皮細胞増殖阻害因子（アンジオキエシン）をコードする核酸分子が提供される。該核酸分子は図１に示すようなヒト・プラスミノーゲンをコードする核酸分子に由来し、また分泌シグナルペプチドと予備活性化ペプチドをコードする配列を、Ｋ１〜５をコードする配列と共に含むのが好ましい。該核酸はＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよく、また好ましくは図１に示す配列との同一性が７０％以上であり、より好ましくは図１に示す配列との同一性が８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上である。
【００２８】
該核酸配列は図１に示すようにヌクレオチドＮｏ．５０ （又はコドンＡＴＧ）で始まり、ヌクレオチドＮｏ．１７３３ （又はコドンＧＣＣ）で終わるのが好ましい。
本発明はさらに、図１のアミノ酸１〜アミノ酸５６２のアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。該核酸がコードするアミノ酸配列は好ましくは図１に示すアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。
【００２９】
本発明の核酸配列はその５’末端又は３’末端に結合した追加配列（非Ｋ１〜５配列又は非プラスミノーゲン配列）を含んでもよい。たとえば、細胞特異的プロモーター又は発現タグに関連する配列、あるいはもっと単純に、特異的制限エンドヌクレアーゼ切断部位に関連する配列を含むのが好ましいかもしれない。本発明の好ましい一実施態様では、組換えＫ１〜５タンパク質に関連するだけでなく、該タンパク質の精製が楽に行えるようにするためのペプチドタグに関連する配列をも含むアミノ酸配列が提供される。
【００３０】
該核酸はまた、腫瘍標的化ペプチドをコードする配列をさらに含んでもよい。この標的化ペプチドは組換えＫ１〜５タンパク質と共に発現されることになろうが、本発明者は意外にも、そうしたタグが該タンパク質の折りたたみに悪影響を及ぼさず、従って分泌性にも変化が生じないことを発見した。腫瘍標的化ペプチドの追加は、該タンパク質を人体又は動物体に投与し治療対象の腫瘍組織に集中させうることを意味する。腫瘍標的化ペプチドの例は図７及び８に示すとおりであるが、他のペプチドも技術上周知である。
【００３１】
本発明の核酸は好ましくは、単離体及び／又は精製単離体として、又は本来の付随物を含まない又は実質的に含まない、たとえばアンジオキエシンのコード領域、分泌シグナル領域及び予備活性化領域を挟む核酸を（１以上の発現用調節配列を除いて）含まない又は実質的に含まない形で、提供される。該核酸は完全合成体でも部分合成体でもよいし、またゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。本発明の核酸がＲＮＡを含む場合には、核酸配列はＴをＵで置き換えたＲＮＡ等価物の配列を意味するものとする。
【００３２】
アンジオキエシンをコードする核酸配列の調製は、本書に収めた情報と参考資料、及び公知の技法（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照）を使用すれば当業者には容易に可能である。そうした技法の例は（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用による、その種の（たとえばゲノム由来の）核酸試料の増幅、（ｉｉ）化学合成、又は（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製などである。アンジオキエシンをコードする配列はたとえば部位指定突然変異誘発などにより変更を加えて、修飾Ｋ１〜５ポリペプチドの発現を導くようにしても、又は核酸の発現に使用する宿主細胞のコドン選好に配慮するようにしてもよい。ヒト・プラスミノーゲンに対応するアミノ酸配列は図２に、またＫ１〜５に対応するアミノ酸配列は図５に、それぞれ示す。
【００３３】
アンジオキエシン核酸配列の発現では、該配列を、それと作動可能に連結される調節配列を有するベクターに組み込んで発現を調節可能にすることができる。該ベクターは挿入核酸の発現を促進するプロモーター又はエンハンサーなどのような他の配列を、及び／又は組換えポリペプチドが融合体として（たとえば細胞標的化ペプチドを組み込む形で）産生されるようにするための核酸配列を、含んでもよい。次いで、このベクターを、その中でベクターが機能しうるような宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養してアンジオキエシン・ポリペプチドを産生させ、該ポリペプチドを宿主細胞又は培地から回収するという手順で、アンジオキエシンを得ることができる。この目的に使用される宿主細胞は原核及び真核細胞たとえばＥ． ｃｏｌｉや酵母の菌株、及びＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などのような真核細胞である。宿主細胞の選択を利用すれば、宿主細胞中で発現されるアンジオキエシン・ポリペプチドの性質を制御する（たとえば該ポリペプチドを宿主細胞のどこに蓄積させるかを制御し、又はそのグリコシル化といった性質に作用を及ぼす）ことができる。
【００３４】
前述の配列は１以上のヌクレオチドの追加、置換、挿入又は削除により変更してもよいが、図１に示す配列を有する核酸との選択的ハイブリダイズ能は保持するようにする、すなわち該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、図示配列との相同性の度合いは十分に高いのが好ましい。
そうした相同性は、市販又は公開ソフトウェアパッケージの使用により容易に決定できる。配列相同性又は同一性の比較や計算を目的とした配列アラインメントへの使用に好適なアルゴリズム及びソフトウェアは当業者が十分に知るところであろう。そうしたツールの重要な例はＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの検索ベースＦＡＳＴ及びＢＬＡＳＴプログラムである。その詳細はＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０及びＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ． ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｗ．Ｒ． （１９８５）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７， ｐｐ． １４３５−４１に求められる。ＢＬＡＳＴの詳細はインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｍｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ−ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）で公開されている。従って配列相同性又は同一性のパーセンテージは、たとえばＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴｎのソフトウェアを組み込んだ市販又は公開ソフトウェアパッケージを使用して、又はインターネットサービスで、確認することができる。前者の例はＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージであり、インターネットサービスを提供しているのはＧｅｎｂａｎｋ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照）及びＥＭＢＬ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｂｌａｓｔ２を参照）である。デフォルト設定を使用するのが便利である。
【００３５】
「同一性」は、適正な配列アラインメントを行って比較すると表記パーセンテージの特許請求アミノ酸配列又は塩基配列が基準配列中の同じ相対位置に見られることを意味する。ただし場合により、配列中の特定の位置に欠失又は付加が存在するために、アミノ酸又は塩基のアラインメント率を最大限に高めるにはギャップを導入する必要があろう。配列アラインメントは好ましくは１０以下のギャップを使用して行う。すなわち、２つの配列中に導入するギャップの合計数は１０以下とする。そうしたギャップの長さは、抗血管新生活性が保持される限り、特に重要というわけではないが、一般的には１０アミノ酸以下、好ましくは５アミノ酸以下、又は３０塩基以下、好ましくは１５塩基以下とする。
【００３６】
ＢＬＡＳＴ検索の好ましいパラメータはデフォルト値である。すなわちＥＭＢＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ２では： Ｂｌａｓｔｐ Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ， Ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｆａｕｌｔ， Ｅｃｈｏｆｉｌｔｅｒ Ｘ， Ｅｘｐｅｃｔ １０， Ｃｕｔｏｆｆ ｄｅｆａｕｌｔ， Ｓｔｒａｎｄ ｂｏｔｈ， Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ ５０， Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ５０である。ＢＬＡＳＴｎでもやはりデフォルト値の使用が好ましい。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅのデフォルト値はＧａｐ Ｗｅｉｇｈｔ １２， Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ ４である。さらに好ましい相同性計算方法に使用されるＦＡＳＴＤＢパラメータはｍｉｓｍａｔｃｈ ｐｅｎａｌｔｙ ＝１．００， ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝１．００， ｇａｐ ｓｉｚｅ ｐｅｎａｌｔｙ ＝０．３３及びｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ３０．０である。
【００３７】
あるいは、アンジオキエシンをコードする核酸配列との然るべき相同性レベルを有する核酸は然るべきストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて同定してもよい。ハイブリダイゼーションはたとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の方法により、５ｘ ＳＳＣ、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５〜１．０％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性・断片化処理したサケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び最高５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション液を使用して行うことができる。ハイブリダイゼーションは３７〜４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次の要領で洗浄する： （１）２ｘ ＳＳＣ＋１％ ＳＤＳにより室温で５分間、（２） ２ｘ ＳＳＣ　＋０．１％ ＳＤＳにより室温で１５分間、（３） １ｘ ＳＳＣ＋１％ ＳＤＳにより３７℃で０．５〜１時間、（４） １ｘ ＳＳＣ＋１％ ＳＤＳにより４２〜６５℃で、３０分ごとに洗浄液を取り換えながら２時間。
【００３８】
指定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションの実現に必要とされるストリンジェンシー条件の一般的な計算式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）は次のとおりである：
Ｔｍ ＝ ８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二本鎖中の＃ｂｐ
上式の実例として、［Ｎａ＋］ ＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを使用し、ＧＣ含有率４２％、平均プローブサイズを２００塩基とすると、Ｔｍは５７℃となる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは１％の相同性低下につき１〜１．５℃低下する。従って、配列同一性が約７５％超の目標配列は４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すれば観察されよう。そうした配列は本発明の核酸配列と実質的に相同であるとみなされよう。ストリンジェンシー条件については後でさらに説明する。
【００３９】
本発明の組換えタンパク質を生産するための好都合な方法は発現系を使用して該タンパク質をコードする核酸を発現させる方法である。発現系の使用は今日では高度に洗練されている。
従って、本発明はまた（開示の）タンパク質をつくる方法を包摂するが、該方法は組換えタンパク質をコードする核酸（一般に本発明の核酸）からの発現を含む。これを実現するには、そのためのベクターを収めた宿主細胞を培地中で、該タンパク質の発現を引き起こす、又は許容するような然るべき条件の下で、培養するのが好都合であろう。タンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏ系たとえば網状赤血球溶解物中で発現させてもよい。
【００４０】
多種多様な宿主細胞を利用するタンパク質のクローニング及び発現方式が周知である。好適な宿主細胞の例は細菌、哺乳類や酵母などの真核細胞、及びバキュロウイルス系などである。異種タンパク質の発現に利用することができる技術上周知の哺乳類細胞株の例はチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞及びその他多数である。一般的な好ましい細菌宿主はＥ． ｃｏｌｉである。
【００４１】
好適なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子等を適宜含む然るべき調節配列を収めるよう選択又は構築することができる。ベクターは適宜プラスミド、ウイルスたとえばファージ、又はファスミドなどでよい。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどを参照。核酸の操作たとえば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡ導入及び遺伝子発現、タンパク質の解析などに関する数多くの公知手法及びプロトコールはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９２に詳しく記載されている。
【００４２】
従って本発明は更なる態様で、開示の核酸を収めた宿主細胞を提供する。本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）に組み込んでもよい。この組み込みは、ゲノムとの遺伝子組換えを促進するような配列を標準手法に従って含めることにより、促進してもよい。核酸は細胞内の染色体外ベクターに収めてもよい。
別の更なる態様では、宿主細胞への核酸の導入を含む方法が提供される。一般に（特にｉｎ ｖｉｔｒｏ導入では）非限定的に「トランスフォーメーション」とも呼ばれるこうした核酸の導入では、任意公知の手法を使用してよい。宿主細胞が真核細胞であれば、好適な核酸導入手法の例はリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、及びレトロウイルス又は他ウイルス（たとえばワクシニアウイルス）もしくは昆虫細胞の場合にはバキュロウイルスを使用する形質導入法などである。細菌細胞の場合には、好適な手法の例として塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ使用の感染法などがある。代替法として、直接核酸注入法も使用可能であろう。
【００４３】
周知のように、目的の核酸を入れたクローンの識別にはマーカー遺伝子たとえば抗生物質耐性又は感性遺伝子を使用してもよい。
次いで、導入した核酸からの発現を、たとえば宿主細胞（実際に核酸を導入した細胞を含んでもよいが、その系統を引く細胞である可能性のほうが高い）を遺伝子発現条件下で培養するという方法で促し、もってコードされたポリヌクレオチドが産生されるようにする。該ポリペプチドはＳＳリーダーペプチド及びＰＡペプチドと結合した状態で発現されるため、細胞から培地中に分泌されよう。発現により産生されたポリペプチドは宿主細胞及び／又は培地から適宜単離及び／又は精製し、次いで必要に応じてたとえば１以上の追加成分を含む場合もある組成物たとえば１以上の製薬上許容しうる添加剤、佐剤又は担体を含む製剤組成物の調製（以下を参照）に使用する。
【００４４】
核酸の導入は後述のように、遺伝子治療を目的にｉｎ ｖｉｖｏ導入という形をとってもよい。
宿主細胞は、導入遺伝子によってコードされる組換えタンパク質の産生を目的とした使用の代りに又はそれに加えて、目的の核酸を複製し大量に生成するための核酸「工場」として使用してもよい。ＤＨＦＲなどのような増幅性遺伝子と結合すれば、一細胞内で目的の核酸のコピーが複数作製されよう。目的の核酸を導入した宿主細胞又はその系統を引く宿主細胞は好適な条件の下で、たとえば発酵槽内で、培養した後、培地から取り出し、核酸を精製するために処理することになろう。精製後の核酸もしくはその１以上の断片は必要に応じて使用されよう。
【００４５】
当業者は本書で述べた手法又は他の公知手法を用いてアンジオキエシンを、製薬、創薬、及びその性質や生体内機能のいっそうの研究への使用を目的に、量産することができる。アンジオキエシンの生産を確認するための実験的研究については「材料と方法」の項で述べる。
従って、本発明の更なる態様では組換えタンパク質、アンジオキエシンが提供される。該タンパク質は図１又は２に由来するアミノ酸配列を有し、また単離体及び／又は精製体として、本来付随する他のポリペプチド又はヒト・ポリペプチドたとえばヒト・プラスミノーゲンなどのような物質を含まない又は実質的に含まない場合もあろうし、また（たとえば原核細胞中での発現により産生されるならば）本来のグリコシル化を欠くすなわち非グリコシル化体である場合もあろう。好ましくは、アンジオキエシンはヒト・プラスミノーゲンに由来する分泌シグナルペプチド及び予備活性化ペプチドのアミノ酸配列を含む。従って該組換えタンパク質は図６に示すようなアミノ酸配列を有する、又は本質的にそうしたアミノ酸配列からなるのが好ましい。アンジオキエシンは、好ましくは分子量が５５ｋＤ〜６９ｋＤであり、より好ましくは該分子のグリコシル化次第で分子量が約６５ｋＤである。
【００４６】
アンジオキエシンのアミノ酸配列変異形、対立形質、誘導体又は変種であるポリペプチドもまた本発明により提供される。変異形、対立形質、誘導体又は変種であるポリペプチドは、１以上のアミノ酸の付加、置換、欠失又は挿入が見られるという点で図６に示すものとは異なるアミノ酸配列を有するであろう。その種のポリペプチドは抗血管新生活性を有し、また細胞から分泌されうるよう適正な折りたたみ能を維持するのが好ましい。こうした機能及び折りたたみ能の有無は、図６に示す配列を有するポリペプチドに対して反応性である抗体との免疫学的交差反応性により； 図６に示す配列を有するポリペプチドとのエピトープの共有（たとえば両ポリペプチド間の免疫学的交差反応性から判定される）により； また細胞からの被分泌（輸出）能により判定されよう。抗血管新生活性はｉｎ ｖｉｖｏモデルたとえばマウス角膜血管新生モデル、ニワトリ漿尿膜モデル、腫瘍血管新生モデル、又はマトリゲル・モデルを用いて評価してもよい。たとえば次の資料を参照： （１） Ｊａｉｎ Ｒ．Ｋ．， Ｋ． Ｓｃｈｌｅｎｇｅｒ， Ｍ． Ｈｏｃｋｅｌ ａｎｄ Ｆ． Ｙｕａｎ， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｓｓａｙｓ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ［血管新生の定量的評価法： 前進と問題点］， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：１２０３−１２０８， １９９７； （２） Ｃａｏ Ｒ．， Ｈ．Ｌ． Ｗｕ， Ｎ． Ｖｅｉｔｏｎｍａｋｉ， Ｐ． Ｌｉｎｄｅｎ， Ｊ． Ｆａｒｎｅｂｏ， Ｇ．Ｙ． Ｓｈｉ ａｎｄ Ｙ． Ｃａｏ， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋ１−５ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ［血管新生と腫瘍成長の、プラスミン介在タンパク質分解により生成される阻害因子Ｋ１−５による抑制］， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６：５７２８−５７３３， １９９９ａ； （３）Ｃａｏ Ｒ．， Ｊ． Ｆａｒｎｅｂｏ， Ｍ． Ｋｕｒｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｙ． Ｃａｏ， Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ［血管新生及び腫瘍の抑制因子として作用するインターロイキン１８ ］， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １３：２１９５−２２０２， １９９９ｂ； 及び（４） Ｃａｏ Ｙ． ａｎｄ Ｒ． Ｃａｏ， Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｔｅａ ［喫茶による血管新生の抑制］， Ｎａｔｕｒｅ ３９８：３８１， １９９９．血管新生過程は内皮細胞の増殖を前提とするものの、抗内皮活性は必ずしも抗血管新生を意味しないという点に留意することが重要である。
【００４７】
図６に示すアミノ酸配列の変異形、対立形質、誘導体又は変種であるポリペプチドは、約７０％超、約８０％超、約９０％超又は約９５％超を共有するアミノ酸を含んでもよい。該配列は図６に示すアミノ酸配列と約７０％超の類似性、約８０％超の類似性を共有又は約９０％超の類似性を有してもよい。特定のアミノ酸配列変異形は図６に示すものとは、アミノ酸１個、２個、３個、４個、５〜１０個、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜５０個、又は５０個超の付加、置換、欠失又は挿入が見られるという点で、異なるアミノ酸配列を有するであろう。
【００４８】
本発明の更なる態様では、アンジオキエシンの単離アミノ酸配列が提供される。好ましくは、この配列は図１に示すアミノ酸配列に由来する。特に該配列は図１のアミノ酸番号１〜５６２のアミノ酸配列に対応するのが好ましい。図１に示す４本の矢印に関しては、第１の矢印は新規組換えタンパク質の始点となる（第１行の）ＡＴＧで始まるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に関連し、第２の矢印（第３１行）はプラスミノーゲンの当初の酵素的分解による切断の始点とした位置であり、第３の矢印（第１６９１行）はプラスミノーゲンの当初の切断でＫ１〜５の終点とした位置であり、また第４の矢印（第１６９１行）は組換えアンジオキエシンの終点となる位置である。
【００４９】
従って、アンジオキエシンはタンパク質分解酵素で切り取られたＫ１〜５よりも大きな分子であることがわかる。これを図示したのが図４である。
この場合もまた、本発明のアミノ酸配列はそのＮ末端、Ｃ末端又は両末端に追加のアミノ酸配列を含んでもよい。追加配列はたとえばタンパク質精製の一助となるペプチドタグに関連してもよいし、またアンジオキエシンを腫瘍へと特異的に導くための腫瘍標的化ペプチドに関連してもよい。
【００５０】
ここで触れているのは、ヒト・プラスミノーゲンに対応する配列を示す図１と２、及びＫ１〜５に対応する配列を示す図５である。しかし先行技術の説明によればプラスミノーゲンのクリングル領域はヒト、マウス、サル、ウシ及びブタなどの種間で本質的な相同性を有するので、本発明はその最も広範囲の態様では明示のアミノ酸と他種におけるその対応物に関連する。もちろん、マウスとヒトの個別実施態様もまた表に含まれる配列番号に適宜言及することにより定義することができよう。（多様な種に由来するＫ１〜５の説明についてはたとえばＰｅｔｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７０：５４９−６３， １９８８； Ｓｃｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ ４０： ６３−６９， １９８８； Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５９：５８１−９５， １９８６； 及びＳｃｈａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４９：２６７−２７８， １９８５を参照。）
アンジオキエシン・ポリペプチドが使用される更なる重要な分野はアンジオキエシン・ポリペプチドもしくはその断片又は活性部分に対して特異的に結合する抗体の産生である。
【００５１】
モノクローナル抗体の産生は技術的に十分確立されている。モノクローナル抗体にＤＮＡ組換え技術の手法を適用すれば、原抗体の特異性を保持した他の抗体又はキメラ分子を産生させることができる。そうした手法では、ある抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを別種の免疫グロブリンの定常領域又は定常領域＋フレームワーク領域に導入してもよい。たとえばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８又はＥＰ−Ａ−２３９４００を参照。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマに、産生抗体の結合特異性を変化させる（又は変化させない）ような遺伝子突然変異などの変異を起こさせてもよい。
【００５２】
新規タンパク質であるアンジオキエシンの提供により、該タンパク質と特異的に結合する抗体の産生が初めて可能になる。従って本発明の更なる態様では、図６に示す配列を有するアンジオキエシンと特異的に結合する抗体が提供される。そうした抗体は、該抗体との結合親和性を有するポリペプチドを、該抗体との結合親和性を欠く又は実質的に欠く（たとえば結合親和性の値で約１０００ｘ超である）他のヒト・ポリペプチドたとえばプラスミノーゲン又はタンパク質分解性クリングル１〜５から識別しうるという意味で特異的であろう。特異抗体は該ポリペプチド分子上のエピトープに結合するが、それは他の分子上では存在しないか又は得られない。本発明の抗体は、図６に示すアンジオキエシンではなくアンジオキエシンの変異形、対立形質、誘導体又は変種ポリペプチドに対して特異的であってもよい。抗体はまた、その結合相手となるポリペプチド（類）を、たとえばコード配列の核酸からの組換え発現による産生後に精製するうえでも有用である。
【００５３】
本発明の抗体は、他ポリペプチドに対する結合能を有する抗体などの汚染物質を含まない及び／又は血清成分を含まない単離体であるのが好ましい。ポリクローナル抗体もまた本発明の範囲内に入るものの、目的次第ではモノクローナル抗体が好ましい。
抗体は標準手法を用いて獲得してよい。抗体産生方法は、前記タンパク質又はその断片による哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サルなど）への免疫処置を含む。抗体は免疫処置した動物から周知の多様な手法のうち任意の手法を用いて獲得し、また好ましくは目的抗原との結合を利用して選別してもよい。たとえばウェスタン法又は免疫沈降法を使用してもよい（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７： ８０−８２， １９９２）。動物からの抗体及び／又は抗体産生細胞の単離は動物を犠牲にするステップを含んでもよい。
【００５４】
哺乳動物へのペプチドによる免疫処置の代替又は補完として、組換え手法で作製した発現免疫グロブリン可変領域ライブラリーからタンパク質に対する特異抗体を獲得してもよい。それには、表面に機能的免疫グロブリン結合領域を展示するラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用するなどの方法がある。たとえばＷＯ９２／０１０４７を参照。該ライブラリーはナイーブ（すなわちいかなるタンパク質による免疫処置もまだ受けていない生体に由来する配列から構築したもの）でもよいし、目的抗原に感作した生体に由来する配列で構築したものでもよい。
【００５５】
本発明の抗体は種々の方法で修飾してよい。実際、「抗体」は所要の特異性を備えた結合領域を有する任意の結合物質を網羅すると解釈されるべきである。従って本発明は抗体の断片、誘導体、機能的等価物及び類縁物を、形が抗体とよく似ていて抗原又はエピトープとの結合能を有する合成分子等の分子を含めて、網羅する。
【００５６】
抗原又は他の結合相手との結合能を有する抗体断片の例はＶＬ、ＶＨ、Ｃ１及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント； ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント； 抗体単腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント； ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント； 単離ＣＤＲ領域及びＦ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、さらには一本鎖Ｆｖフラグメントなどである。
【００５７】
ヒト化抗体であって、親の非ヒト抗体よりも免疫原性の少ない抗体を提供することを目的に非ヒト由来ＣＤＲをヒト・フレームワーク領域に、一般的にはいくつかのフレームワーク・アミノ酸残基の代りにグラフトした抗体もまた、本発明の範囲内に包含される。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに遺伝子突然変異などの変異を起こしてもよい。当業者にはさらに自明であろうが、モノクローナル抗体にＤＮＡ組換え技術の手法を適用すれば、原抗体の特異性を保持した他の抗体又はキメラ分子を産生させることができる。そうした手法では、ある抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを別種の免疫グロブリンの定常領域又は定常領域＋フレームワーク領域に導入してもよい。たとえばＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８又はＥＰ−Ａ−２３９４００を参照。キメラ抗体のクローニングと発現についてはＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００５８】
所望の結合特性を備えた抗体を産生することができるハイブリドーマはもちろん、抗体（及び抗体断片）をコードしていて、それらを発現させることができる核酸を収めた原核又は真核宿主細胞もまた本発明の範囲内である。本発明はまた該抗体の生産方法を、抗体産生能を有する細胞を、抗体が産生され、また好ましくは分泌されるような条件下で増殖させる方法を含めて、提供する。
【００５９】
試料中の抗体の反応性は任意好適な手段で評価してよい。個別レポーター分子のタグ付けも一法である。レポーター分子は検出可能な、また好ましくは測定可能なシグナルを直接、間接に生成してもよい。レポーター分子の結合は直接、間接結合でも、（たとえばペプチド結合を介した）共有、非共有結合でもよい。ペプチド結合を介した結合は、抗体とレポーター分子とをコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果でもよい。
【００６０】
１つの好ましい方式では各抗体を、孤立した吸光又は発光スペクトル特性をもつ個別の蛍光色素、蛍光体又はレーザー色素と共有結合させる。好適な蛍光色素はフルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッドなどである。好適な発色性色素はジアミノベンジジンなどである。
他のレポーター例は着色、磁性又は常磁性の高分子コロイド粒子又は粒子状物質たとえばラテックスビーズなどであり、それらは生物又は化学活性を有し、検出可能なシグナルを直接、間接に生成して視覚的観察、電子的検出、又は他の形での記録を可能にする。そうした分子はたとえば、発色又は変色させたり電気的性質を変化させたりするような反応を触媒する酵素でもよい。分子励起性であって、エネルギー準位間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収又は放出をもたらすような分子でもよい。バイオセンサー用の化学物質を含んでもよい。ビオチン／アビジン又はビオチン／ストレプタビジン及びアルカリホスファターゼ検出系の使用が可能であろう。
【００６１】
結合の評価方式は本発明の特徴ではないので、当業者はその好みと一般的な知見に応じて好適な方式を選択することができる。
本発明の抗体は、たとえば前述の細胞又は細胞溶解物を含む試験試料中のアンジオキエシンの有無を調べるスクリーニングに使用してもよいし、またたとえばコード配列の核酸からの発現による産生後の本発明ポリペプチドの精製及び／又は単離に使用してもよい。
【００６２】
アンジオキエシンすなわち組換えタンパク質をコードする核酸自体は薬用組成物の調製に使用してもよい。従って本発明は特に、１以上の製薬上許容しうる担体及び／又は添加剤を含む本発明の組成物である医薬又は動物薬組成物に関する。該組成物は予防及び／治療処置を目的に注射、外用、経口又は局所などの投与経路に応じて多様な剤型で投与してよい。たとえば経口投与に好適な剤型は散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などである。水性担体などの多様な担体たとえば緩衝生理食塩水などを使用してよい。これらの溶液は望ましくない物質を含まない。該組成物は、生理的条件に近似させるために必要な製薬上許容しうる補助的物質たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのようなｐＨ調整・緩衝剤、毒性調節剤、他を含んでもよい。注射適性の組成物についてはたとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ （１９８０）を参照。本発明の組成物又は製剤は公知のアンジオスタチン組成物と比べて用量がずっと低く、使用に有利である。すなわち前述のような組換えＫ１〜５タンパク質又はペプチドを含有する製剤はアンジオスタチン製剤と比較して低用量なので、投与しやすいし薬価も低くなる。
【００６３】
本発明の一実施態様では、該組成物はがん転移阻害能を有する本発明のタンパク質を含有する。その作用物質すなわち内皮細胞の増殖を阻害する本発明のタンパク質は５０％有効濃度（ＥＣ５０）が一般に約５０ｐＭであるが、アンジオスタチンはＥＣ５０が１００ｎＭである（図９参照）。
本発明は組換えタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸に関連するが、そのうちのＫ１〜５に対応する配列はヒト・プラスミノーゲン、マウス・プラスミノーゲン、ウシ・プラスミノーゲン、アカゲザル・プラスミノーゲン又はブタ・プラスミノーゲンに由来する。該タンパク質は好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ検定法で内皮細胞の増殖を阻害することができる。そうした検定法については「材料と方法」の項で説明する。
【００６４】
前述のように、本発明は組換えタンパク質、該タンパク質をコードする核酸又は該核酸又はタンパク質を含有する薬用組成物を提供する。本発明はさらに、前述の本発明タンパク質、核酸又は組成物の、血管新生に関連する状態又は疾患たとえば腫瘍（がんなど）の成長、糖尿病、その他の治療を目的とした内皮細胞の増殖を調節（たとえば阻害）する薬剤の製造への使用に関する。
【００６５】
やはり前述のように、本発明は本発明ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質分子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を提供する。本発明にはそうした核酸の配列と相補的なｃＤＮＡ配列もまた包摂される。従って、本発明の更なる態様はストリンジェント条件下で前記核酸と特異的にハイブリダイズする任意の核酸である。
用語「ハイブリダイズする」はここでは、ある分子が、特定ヌクレオチド配列だけを相手に、該ヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡの混合物中に存在するときにストリンジェント条件下で結合する、二本鎖を形成する、又はハイブリダイズすることを意味する。「ストリンジェント（な）条件」はここでは、あるプローブがその標的配列とはハイブリダイズするが、それ以外の配列とはハイブリダイズしないような条件をいう。ストリンジェントな条件は配列に依存するので、事情が異なればその内容も異なろう。当業者はこの点を勘案して好適な条件を容易に選択するであろう。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの個別配列の融解温度を約５℃下回るよう選択されよう。ストリンジェントな条件は普通、ヌクレオチドの長さ次第でｐＨが約７．０〜８．３、温度が約３０〜６０℃のときに、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａイオン未満たとえば約０．０１〜１．０Ｍとなるような条件であろう。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現してもよい。本発明の前記ヌクレオチドは前記定義に従う限り任意の長さでよい。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様では、標準ストリンジェンシー条件は２ ｘ ＳＳＣ、高ストリンジェンシー条件は１ ｘ ＳＳＣである［参照指示により本書に組み込まれるＣｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８４） ８１：１９９１−１９９５を参照）。
本発明の核酸のクローニング又は増幅にはｉｎ ｖｉｔｒｏ法たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法、転写増幅システム（ＴＡＳ）法などを使用する。周知のクローニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法は多様なであり、たとえば次の資料を参照： Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃａｓｈｉｏｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許ｎｏ． ５，０１７，４７８； 及びＣａｒｒの欧州特許ｎｏ． ０ ２４６ ８６４。
【００６７】
本発明の更なる態様は前述の分子たとえばｃＤＮＡの遺伝子治療への使用、並びにそうした遺伝子治療の方法である。該方法は本発明の組換えタンパク質を発現するベクターを哺乳動物の細胞に導入するステップを含んでもよい。そのための導入法はｉｎ ｖｉｖｏでもｅｘ ｖｉｖｏでもよい。ｅｘ ｖｉｖｏ導入の場合には、その後で適宜、該細胞を生体内に再注入する。他に、本発明のポリペプチドと製薬用添加剤及び／又は担体を含む治療有効量の組成物を哺乳動物たとえば人間に投与する方法もある。
【００６８】
遺伝子療法を概観するには、以下の資料を参照： Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９２） ２５６：８０８−８１３； Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｆｅｌｇｎｅｒ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７； Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２６−９３２； Ｄｉｌｌｏｎ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５； Ｍｉｌｌｅｒ （１９９２） Ｍａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ （１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４； Ｖｉｇｎｅ （１９９５） Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６； Ｋｒｅｍｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ （１９９５） Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１） ３１−４４； Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ； 及びＹｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９４） １：１３−２６．
本発明のさらに別の態様では、内皮細胞の増殖特に血管新生を伴う疾患及び過程の治療方法が提供される。そうした方法の適用疾患の１つはがんである。
【００６９】
従って本発明のこの態様には特に、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸配列を導入したベクター又は宿主細胞を、抗血管新生療法を必要とする患者に投与するステップを含む該患者の治療方法が含まれる。
本発明では、血管新生を伴う疾患及び過程への前記治療方法の適用が見込まれるが、適用疾患及び過程の非限定的な例は血管腫、充実性腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、プラーク血管形成、冠動脈側枝、脳動脈側枝、動静脈奇形、虚血肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、血管形成緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、関節炎、糖尿病性血管形成、黄斑変性症、創傷治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクター関連疾患、骨折、ケロイド、血管発生、造血、排卵、月経、胎盤形成、及びネコ引っ掻き病などである。
【００７０】
好ましくは、本発明はがんの増殖を治療又は抑制するための組成物を提供する。前述のように、本発明の組換えタンパク質は阻害物質関連組成物を特定部位に送達するための標的化ペプチド又はポリペプチドなどのような追加分子を含んでもよい。
本発明はさらに別の態様で、内皮細胞増殖たとえば血管新生過程の調節を目的とした遺伝子治療に有効な組成物と方法を提供する。
【００７１】
以下、本発明の態様及び実施態様について添付図面を参照しながら説明する。当業者には更なる態様及び実施態様も自明であろう。本書で言及している資料はすべて参照指示により本書に組み込まれる。
発明の詳細な説明
本発明は、内皮細胞の増殖を阻害し、血管新生を調節し、また望ましくない血管新生特に腫瘍の成長に関連する血管新生を阻害するうえで有効な組成物と方法を提供する。
【００７２】
言うまでもなく、活性組換え分子中のアミノ酸数は変動してもよいし、また内皮阻害活性を有し細胞から分泌（輸出）されうる（すなわち正しい折りたたみ能を有する）相同性の高いアミノ酸配列はすべて本発明に包含される。
本発明は特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定で内皮細胞増殖阻害能を示すヒト・プラスミノーゲン由来アンジオキエシン含有組成物を望ましくない内皮細胞増殖が起きている人間又は動物に投与して、望ましくない非制御型の内皮細胞増殖たとえば血管新生が介在する疾病及び過程を治療するための方法及び組成物を提供する。「内皮阻害活性」はここでは、血管新生一般に対する分子の阻害能、たとえばウシ毛細血管内皮細胞をＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養したときの増殖阻害能を意味する。その方法論については以下説明し、また図９、１０及び１１で明示する。
【００７３】
単離タンパク質の純度は約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上とするのが望ましい。本発明は腫瘍の治療又は腫瘍の成長抑制に特に有効である。血管新生前の転移巣が生じた人間又は動物への該阻害物質の投与はそうした腫瘍の成長又は拡大を防止する効果がある。
前述のように、本発明はアンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列、アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を収めた発現ベクターたとえばウイルスベクター、及びアンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を収めた１以上の発現ベクターを導入した細胞を包摂する。
【００７４】
本発明はさらに、アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を患者に導入してｉｎ ｖｉｖｏ阻害物質濃度を調節することを目的とした遺伝子療法を包摂する。
アンジオキエシンは治療用組成物への賦形を目的に、製薬上許容しうる添加剤、随意に徐放化化合物又は組成物たとえば生体分解性ポリマー及び基剤と混合してもよい。
【００７５】
本発明はまた、アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を収めていて細胞中で該組換えタンパク質を発現しうるような発現ベクターを含有する組成物、アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を収めていて細胞中で該組換えタンパク質を発現しうるような発現ベクターを導入した細胞を含有する組成物、及びアンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を収めていて細胞中で該組換えタンパク質を発現しうるような発現ベクターを導入した細胞を人間又は人間以外の動物に移植するステップを含む方法を包摂する。
【００７６】
本発明はまた、アンジオキエシン又はその機能的断片をコードする遺伝子を患者体内で調節する遺伝子療法を包摂する。ＤＮＡを細胞中に導入して遺伝子産物のタンパク質を発現させるようにする種々の方法は遺伝子療法ともいい、そうした方法は参照指示により本書に組み込まれるＮ． Ｙａｎｇ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ［哺乳類体細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入］，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １２（４）：３３５−３５６ （１９９２）で開示されている。遺伝子療法は、体細胞又は生殖細胞へのＤＮＡ配列の導入を伴うｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ療法を包摂する。遺伝子療法は遺伝子を取り換え、正常又は異常遺伝子機能を増進し、また感染症等の病理を克服する働きをする。
【００７７】
これらの医学上の問題を遺伝子療法で処置するための戦略には、欠陥遺伝子機能の取り換え又は弱い遺伝子機能の増強を目的とした欠陥遺伝子の特定とそれに続く機能遺伝子の付加などのような治療戦略、又は状態を治療するような、あるいは治療計画に対する組織又は器官の感受性を高めるような、産物タンパク質への遺伝子の追加といった予防戦略が含まれる。予防戦略の一例として、阻害物質をコードする核酸配列の患者への患者により血管新生の発生を防止する方法、又は腫瘍細胞の放射線感受性を高めるような遺伝子を挿入し、次いで腫瘍への放射線照射により腫瘍細胞の死滅を増進する方法があろう。
【００７８】
本発明では、アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を導入するための多数のプロトコールを見込む。該タンパク質と特異的に関連して見い出されるのが普通であるプロモーター配列とは別のプロモーター配列の導入、又は該組換えタンパク質の産生を増進するような他の配列の導入もまた遺伝子治療方法として見込まれる。こうした技術の一例は、細胞中のエリスロポエチン遺伝子を作動させる「遺伝子スイッチ」の挿入を目的とした相同的組換えを利用するＴｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の方法である（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ， Ａｐｒｉｌ １５， １９９４を参照）。そうした「遺伝子スイッチ」を使用すれば、通常は分泌性の該組換えタンパク質を発現しないような細胞中で該組換えタンパク質を活性化することができよう。
【００７９】
遺伝子療法のための遺伝子導入方法は物理的方法（すなわちエレクトロポレーション、直接遺伝子導入、及びパーティクルガン）、化学的方法（脂質系キャリアー又は他の非ウイルスベクター）及び生物的方法（ウイルス由来ベクター及び受容体による取り込み）の３種に大別される。たとえばＤＮＡで覆ったリポソームを含む非ウイルスベクターを使用してもよい。そうしたリポソーム／ＤＮＡ複合体は患者に直接静脈注射してもよい。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓に集中し、そこでＤＮＡをマクロファージとクップファー細胞に配ると考えられる。これらの細胞は長寿命であり、配られたＤＮＡを長期的に発現させる。さらに、治療用ＤＮＡを標的に送達するために遺伝子のベクター又は「裸の」ＤＮＡを所望の器官、組織又は腫瘍に直接注入してもよい。
【００８０】
遺伝子療法の方法論は導入系から分類することもできる。遺伝子導入の基本的な方法にはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入及びｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入などがある。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入では細胞を患者から取り出し培地で培養し増殖させる。ＤＮＡを細胞に導入しＤＮＡ導入細胞の数を増やしてから患者に再移植する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入ではＤＮＡを導入する細胞は組織培養細胞などのような培地増殖細胞であり、特定の患者に由来する特定の細胞ではない。その手順は「実験用細胞」にＤＮＡを導入し、ＤＮＡ導入細胞を選別し、数を増やして患者への移植や他の用途に回す。
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入では患者体内の細胞にＤＮＡを導入する。その方法は非感染性ウイルスを使用して遺伝子を患者に導入する、又は裸のＤＮＡを患者部位に注入し、遺伝子産物のタンパク質を発現させる細胞群の一部によって該ＤＮＡが取り込まれるようにするなどである。さらに、前述のような他の方法たとえば「遺伝子銃」を使用するパーティクルガン法などにより、アンジオキエシンをコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はその機能的断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ挿入を行ってもよい。
【００８２】
化学的導入法は脂質系化合物（必ずしもリポソームとは限らない）を使用して細胞膜横断的にＤＮＡを運ぶ方法でもよい。このリポフェクション又はサイトフェクション法では、脂質系カチオンがマイナスの電荷をもつＤＮＡと結合して、細胞膜を通過し細胞内部へとＤＮＡをもたらすことができる複合体を形成する。もう１つの化学的方法では、細胞表面受容体に特異的リガンドを結合させ、受容体依存性エンドサイトーシスを利用してリガンドを細胞内に取り込ませる。ＤＮＡは該リガンドと結合した複合体全体として細胞内に運ばれる。リガンド遺伝子複合体を血流中に注入すると、リガンドに対応する受容体をもつ標的細胞がリガンドと特異的に結合して、リガンドＤＮＡ複合体を細胞内に運んでくれる。
【００８３】
遺伝子療法ではウイルスベクターを使用して遺伝子を細胞に挿入する方法も多い。たとえばｅｘ ｖｉｖｏ法では、改造レトロウイルスベクターを使用して遺伝子を抹消血及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、表皮細胞、ミオサイト、又は他の体細胞に導入してきた。次いでこれらの改造細胞を患者体内に導入すれば、挿入ＤＮＡの発現により遺伝子産物が供給される。ウイルスベクターを介して細胞に遺伝子を挿入する方法はｉｎ ｖｉｖｏ法にも使用されてきた。外来遺伝子の組織特異的発現を導くには、組織特異的であると判明しているシス作動性の調節エレメント又はプロモーターを使用することができる。あるいは、特定のｉｎ ｖｉｖｏ解剖学的部位へのＤＮＡ又はウイルスベクターのｉｎ ｓｉｔｕ導入によりこれを行うこともできる。たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換した内皮細胞を動脈壁上の特定部位に移植することで血管へのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入が実現している。ウイルスベクターはたとえばカテーテルによりｉｎ ｖｉｖｏ部位に直接導入すれば、特定領域だけがウイルスに感染するようにして長期の部位特異的遺伝子発現を実現することができる。レトロウイルスベクターを使用するｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入は乳組織及び肝組織でも、これらの器官に通じる血管に改造ウイルスを注入するという方法で実証されている。
【００８４】
遺伝子療法に使用されてきたウイルスベクターの非限定的な例はレトロウイルス、他ＲＮＡウイルスたとえばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス及び他ＤＮＡウイルスなどである。複製欠陥性マウスレトロウイルス・ベクターは最も広く利用されている遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは核内コアタンパク質及びポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合体を形成した一本鎖ＲＮＡからなり、内部構造タンパク質（ｇａｇ）に包まれ宿主域を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に囲まれている。レトロウイルスのゲノム構造は５’末端及び３’末端で長い末端反復配列（ＬＴＲ）に挟まれたｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスベクター系は、ウイルスの構造タンパク質が途中でパッケージング細胞株内で供給される限り、パッケージング、感染及び標的細胞への組み込みを可能にするには５’及び３’ ＬＴＲとパッケージングシグナルを含む最小ベクターベクターで十分であるという事実を利用する。遺伝子導入用レトロウイルスベクターの基本的な利点はほとんどの細胞型での効率的な感染及び発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの単一コピーベクターの精密な導入、及びレトロウイルスゲノムの操作し易さなどにある。
【００８５】
アデノウイルスはコアタンパク質と複合体を形成した線状二本鎖ＤＮＡからなり、キャプシドタンパク質に囲まれている。分子ウイルス学の前進により、これらのウイルスの生物学を利用して新規遺伝子配列を標的細胞にｉｎ ｖｉｖｏで導入しうるようなベクターが作製できるようになった。アデノウイルス系ベクターは遺伝子産物のペプチドを高レベルで発現しよう。アデノウイルスベクターは低ウイルス力価でも感染効率が高い。加えて、ウイルスは無細胞ビリオンとして完全に感染性であるため、プロデューサー細胞株を注入する必要がない。アデノウイルスがもつもう１つの潜在的な利点は、外来遺伝子の長期ｉｎ ｖｉｖｏ発現を実現しうることである。
【００８６】
機械的なＤＮＡ導入法には膜融合脂質小胞たとえばリポソーム又は他の膜融合用小胞すなわちＤＮＡを結合したカチオン脂質粒子を用いるリポフェクションなどの方法、ポリリジンを使用するＤＮＡ導入法、直接ＤＮＡ注入法たとえば生殖細胞又は体細胞へのマイクロインジェクション法、金粒子などのＤＮＡコート粒子の「遺伝子銃」によるガス圧導入法、及び無機化学的方法たとえばリン酸カルシウム法などがある。別の方法すなわちリガンドを使用する遺伝子療法では、ＤＮＡと特異的リガンドの複合体を形成してＤＮＡを特定の細胞又は組織に導く。
【００８７】
プラスミドＤＮＡを筋細胞に注入すると細胞へのＤＮＡ導入効率が高まり、またマーカー遺伝子を持続的に発現させることが判明している。プラスミドＤＮＡは細胞ゲノムに組み込まれる場合も組み込まれない場合もあろう。ＤＮＡの導入が非組込み型であれば、最終分化した非増殖組織にＤＮＡが導入され、そこで遺伝子産物のタンパク質が長期にわたり発現するが、細胞ゲノム又はミトコンドリアゲノムに突然変異性の挿入、欠失又は変質が起こる心配はないであろう。特定細胞への治療用遺伝子の長期的な（ただし必ずしも恒久的ではない）導入は遺伝病の治療又は予防につながろう。ＤＮＡは被導入細胞のゲノムに突然変異を起こすことなく、定期的に再注入して遺伝子産物レベルを維持することもできる。外来ＤＮＡの非組込み型導入は、１細胞内に数種の外来ＤＮＡ構築物が存在し、それらの構築物が多様な遺伝子産物を発現することを可能にしよう。
【００８８】
粒子を使用する遺伝子導入法は当初、植物組織の形質転換に使用された。パーティクルガン又は「遺伝子銃」により、推進力を生成させてＤＮＡコート高密度粒子（金又はタングステン粒子など）を高速に加速し、標的器官、組織又は細胞に入り込ませる。このパーティクルガン法は細胞、組織又は器官へのＤＮＡの導入を目的にｉｎ ｖｉｔｒｏ系に使用するか、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ法と併用することができる。
【００８９】
エレクトロポレーション法による遺伝子導入では電流を使用して細胞又は組織に遺伝子を導入しやすくする。ある電界強さの短い電流パルスを使用して膜の透過性を高め、ＤＮＡ分子が細胞に入り込めるようにする。この手法は細胞、組織又は器官へのＤＮＡの導入を目的にｉｎ ｖｉｔｒｏ系に使用するか、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ法と併用することができる。
【００９０】
キャリアーを使用するｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入法により異種ＤＮＡを細胞に導入することもできる。キャリアー−ＤＮＡ複合体は好都合にも体液又は血流中に導入し、次いで体内の標的器官又は組織へと部位特異的に導くことができる。リポソームとポリカチオン（たとえばポリリジン）のどちらもリポフェクション又はサイトフェクションに使用することができる。リポソームを細胞特異的又は器官特異的に作製すれば、異種ＤＮＡは該リポソームによって運搬され標的細胞に取り込まれよう。細胞表面の特異的受容体を標的とするイムノリポソーム注入法は該受容体をもつ細胞にＤＮＡを導入する好都合な方法として使用できる。既に使用されている別のキャリアー系は肝細胞にＤＮＡを運搬するｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入に好適なアシアロ糖タンパク質／ポリリジン複合体系である。
【００９１】
導入ＤＮＡはまた、他種キャリアーと複合体を形成させて、受容細胞へと運搬され、次いで細胞質内又は核質内に残留するようにしてもよい。ＤＮＡは特製の小胞複合体中でキャリアー核タンパク質と結合させ、核内に直接運搬されるようにすることもできる。
アンジオキエシンをコードするＤＮＡ配列を導入した細胞を患者に投与して、該阻害物質のｉｎ ｖｉｖｏ生成源としてもよい。たとえばこの組換えタンパク質をコードする核酸配列を収めたベクターを細胞に導入してもよい。
【００９２】
「ベクター」はここでは、特定の核酸配列を収める又は結合させることができるキャリアーであって、該核酸配列を細胞中に運ぶ役目を果たすものをいう。ベクターの例はプラスミド及び感染性微生物たとえばウイルス、又は非ウイルスベクターたとえばリガンド−ＤＮＡ複合体、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体などである。アンジオキエシンをコードする配列を含む、又は該配列からなる組換えＤＮＡ分子は、発現調節配列と作動可能に連結してアンジオキエシン発現能を有する発現ベクターとするのが望ましいであろう。受容細胞は患者の正常細胞、患者の病変細胞、又は非患者の細胞いずれでもよい。
【００９３】
たとえば患者から摘出した腫瘍細胞は、本発明の分泌性アンジオキエシンを発現しうるベクターを入れてから患者に再導入することができる。該受容細胞は患者体内で腫瘍の成長を阻害するレベルのアンジオキエシンを産生する。患者は人間でも人間以外の動物でもよい。さらに、アンジオキエシンをコードするＤＮＡは、キャリアーの助けを借りずに患者に直接注入してもよい。特に皮膚、筋肉又は血液へのＤＮＡ注入が可能である。
【００９４】
組換えアンジオキエシンの発現は長期的に持続してもよいし、該タンパク質をコードする核酸を定期的に投与して細胞、組織又は器官内の、もしくは体液中のアンジオキエシンを所望レベルに維持するようにしてもよい。次のような仮説がある（ただしそれに縛られるつもりはない）。腫瘍は血管新生型になると、１以上の血管新生ペプチド（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）を放出するが、そうしたペプチドは局所的に作用し、原発腫瘍周辺の内皮を血管外方向から標的にし、また循環しない（又は循環しても短寿命である）と考えられる。原発腫瘍が拡大し続けるには、内皮細胞阻害物質（血管新生阻害物質）の作用に打ち克つに足る量の血管新生ペプチドが産生されなければならない。原発腫瘍はひとたび十分に増殖するようになると内皮細胞阻害物質を血液循環中に放出し続ける。この仮説によれば、これらの阻害物質は原発腫瘍から離れた遠くで作用し、転移巣の毛細血管内皮を血管内方向から標的にし、また循環し続けることになる。従って、遠くの転移巣が血管新生を起こし始めるかもしれないまさにそのときに、転移巣周辺の毛細血管内皮は到来する阻害物質たとえばアンジオキエシンの作用を受けることになろう。
【００９５】
本発明のアンジオキエシンの生産は、（１）プラスミノーゲンＫ１〜５をコードする核酸を同定する（図５参照）； （２）分泌シグナル（ＳＳ）ペプチド及び予備活性化（ＰＡ）ペプチドをコードする核酸を同定する（図６参照）； （３）発現ベクター中で両核酸配列を連結してＳＳ／ＰＡ／Ｋ１〜５をコードする発現性核酸配列を創出する； （４）発現性核酸配列を収めたベクターを、全配列を発現させうるような微生物又は他の発現系に挿入する； 及び（５）組換え手法で産生させたアンジオキエシンを単離するというステップを含む組換えＤＮＡ手法の使用によって実現してもよい。好適なベクターはウイルス、細菌及び真核生物（酵母）発現ベクターなどである。前記手法についてはラボラトリーマニュアル類たとえば参照指示により本書に組み込まれる“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９などに詳しく記載されている。本書で引用した諸々の参考資料は参照指示により本書に組み込まれる。
【００９６】
さらに別のアンジオキエシン生産方法としてペプチド合成法がある。該分泌性アンジオキエシンのアミノ酸配列はたとえば自動ペプチド配列決定法などで決定することができる。
阻害物質のアンジオキエシンは内皮細胞の増殖が介在する又は伴う疾患又は過程たとえば血管新生などの治療に有効である。本発明は血管新生介在性疾患を有効量の阻害物質又はその生物活性断片、全体として抗血管新生活性を有する生物活性断片の組み合わせ、もしくは阻害物質のアゴニスト又はアンタゴニストによって治療する方法を含む。血管新生介在性疾患の非限定的な例は充実性腫瘍； 血液性腫瘍たとえば白血病； 腫瘍転移； 良性腫瘍たとえば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び可能性肉芽腫； リウマチ様関節炎； 乾癬； 眼血管新生疾患たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管形成緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス； Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群； 心筋血管新生； プラーク血管形成； 毛細血管拡張症； 血管線維腫； 及び創傷肉芽形成などである。
【００９７】
アンジオキエシンは内皮細胞の過剰又は異常刺激による疾患の治療に有効である。そうした疾患の非限定的な例は腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、及び肥厚性瘢痕たとえばケロイドなどである。該タンパク質又はそれをコードする核酸は、胎芽の着床に必要な血管形成を妨げるので避妊薬として使用してもよい。アンジオキエシンは、病理的帰結として血管新生を伴う疾患たとえばネコ引っ掻き病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）などの治療にも有効であろう。
【００９８】
さらに、アンジオキエシン又はそのペプチド断片を短寿命アイソトープで標識するとポジトロンＣＴ等の最新撮影手法を用いたｉｎ ｖｉｖｏ受容体結合部位の視覚化が可能になり、阻害物質結合部位をもつ腫瘍の位置を突き止めることができる。
以下、実施例をもって本発明をさらに説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を何ら限定しないものとする。逆に、本発明には本書の説明を読んだ当業者に思い浮かぶような他の実施態様、変更態様及び等価物が種々あることは自明である。
【００９９】
材料と方法
バキュロウイルスと昆虫細胞
Ｋ１〜５ ｃＤＮＡを収めたバキュロウイルス・トランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ （Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をＳｆ９昆虫細胞中、２７℃で増やした。Ｓｆ９の増殖には１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＳＦ−９００ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。バキュロウイルスの維持と昆虫細胞の増殖のための手順はメーカーの説明書に従った。
【０１００】
Ｋ１〜５バキュロウイルス・トランスファーベクターの構築
ヒト・プラスミノーゲンのアミノ酸１〜５６２とそれに続くＣ末端ｈｉｓ−ｔａｑをコードするＤＮＡを標準ＰＣＲ法で合成した。このＫ１〜５ ＤＮＡをｐＵＣ５７／Ｔベクター（Ｔａｍｒｏ， Ｓｗｅｄｅｎ）中に組み込んだ。Ｋ１〜５断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ で切り出し、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５バキュロウイルス・トランスファーベクターと連結した。その配列はＡＢＩモデル３１０ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による配列決定で確認した。
【０１０１】
コトランスフェクションによる組換えバキュロウイルスの生成
Ｋ１〜５バキュロウイルス・トランファーベクターをウイルスＤＮＡ ［Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（登録商標）線状化ＤＮＡ， Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］と共にＳｆ９細胞中に、メーカーのプロトコールに従ってコインフェクトした。簡単に言えば、２×１０６個のＳｆ９細胞を６０ｍｍディッシュにまいた。細胞が定着した後、４μｇの組換えトランスファープラスミドと０．５μｇのウイルスＤＮＡを含む１ｍｌのトランスフェクション混合液［無ＦＣＳのＳＦ−９００ＩＩ培地＋ＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓ（登録商標）， Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ］を６０ｍｍディッシュに滴下した。細胞を左右揺動型ロッキングプラットホーム上、室温で４時間インキュベートし、次いで１ｍｌのｃｏｍｐｌｅｔｅ ＳＦ−９００ＩＩ培地をディッシュに加えた。２７℃で４日間インキュベーション後、トランスフェクションの上清を回収した。組換えウイルスをｌａｃＺプラーク検定法で、次にメーカーのプロトコールに従ったＰＣＲ解析でスクリーニングした。高ウイルス力価の上清を４℃で滅菌保存した。
【０１０２】
アンジオキエシンの生産
Ｔ７５フラスコ中の約５０％培養飽和密度のＳｆ９細胞に高力価ストックウィルスを感染させた。感染後３日目に培養上清を遠心で回収した。上清を、１００ｍＭトリス緩衝液（Ｐｈ ８．０）で予め平衡化したリジン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）カラムに加えた。カラムを平衡緩衝液で洗い、２００ｍＭの６−アミノ−カプロン酸で溶出した。水を外液として試料を透析し、乾燥し、ｄＨ２Ｏに溶かした。
【０１０３】
組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
約１μｇのアンジオキエシンを、４００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）、４５％ショ糖、０．１％ブロモフェノールブルー、５％ ＳＤＳ及び２０ｍＭ ＤＴＴを含むＳＤＳ試料緩衝液と混ぜた。煮沸試料を４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料（４５％メタノール、９％氷酢酸及び１．２５％ （ｖ／ｖ）クーマシーブルー）で染色した。コントロールにはヒト・タンパク質分解性Ｋ１〜５を用いた。
【０１０４】
内皮細胞増殖試験（図９〜１１）
ウシ毛細血管内皮細胞を、１０％ ＢＣＳと３ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＧＦ−２を含むＤＭＥ培地中に維持した。ゼラチン被覆６穴プレートで培養した細胞をトリプシン処理し、５％ ＢＣＳを含むＤＭＥ培地に再懸濁した。約１０，０００個の細胞を含む培地０．５ｍｌを２４穴プレートの各ゼラチン被覆ウェルに加え、１０％ ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、３ウェルごとに濃度の異なるＫ１〜５を加えた。さらに１時間のインキュベーション後、ＦＧＦ−２を加えてその最終濃度を１ｎｇ／ｍｌとした。７２時間後、細胞をトリプシン処理し、ＩｓｏｔｏｎＩＩ溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ． Ｂｅｄｓ， Ｅｎｇｌａｎｄ）に再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントした。
【０１０５】
ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞を前述の要領で単離した［Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ．， Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ， Ｃ．Ｃ． ＆ Ｚｅｔｔｅｒ， Ｂ．Ｒ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ７６， ５２１７−５２２１］。ＢＣＥ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＢＣＳ）と３ｎｇ／ｍｌ組換えヒトｂＦＧＦを含むＤＭＥ培地中に維持した。ゼラチン被覆６穴プレートで培養した細胞を０．０５％溶液に分散させ、１０％ ＢＣＳを含むＤＭＥ培地に再懸濁した。約１０，０００個の細胞を含む培地０．５ｍｌを２４穴プレートの各ゼラチン被覆ウェルに加え、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を５％ ＢＣＳを含む０．５ｍｌの新鮮ＤＭＥ培地に取り換え、３ウェルごとに濃度の異なるＫ１〜５構造試料を加えた。３０分間のインキュベーション後、ｂＦＧＦを加えてその最終濃度を１ｎｇ／ｍｌとした。７２時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＩｓｏｔｏｎＩＩ溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ． Ｂｅｄｓ， Ｅｎｇｌａｎｄ）に再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントした。
【図面の簡単な説明】
【図１−１】
図１はヒト・プラスミノーゲンの核酸及びアミノ酸配列である。
【図１−２】
図１−１の続き。
【図２】
図２はヒト・プラスミノーゲンのアミノ酸配列である。
【図３】
図３はアンジオキエシンの構造図である。ＳＳ領域は分泌シグナル領域であり、またＰＡ領域は予備活性化領域である。精製の一助とするペプチドタグもまた示してある。
【図４】
図４はタンパク質分解性ヒトＫ１〜５とアンジオキエシン（分泌ｈＫ１〜１）の分子量の違いを示すゲル電気泳動図である。
【図５】
図５はヒト・プラスミノーゲンのＫ１〜５の図であり、対応するアミノ酸配列をその下に示す。
【図６】
図６はアンジオキエシンの構造図とアミノ酸配列である。
【図７】
図７は図６の構造に腫瘍標的化シグナルペプチドを加えた図である。この構築物はＮＧＲシグナルと呼ぶ（図１０参照）。
【図８】
図８は図６の構造に腫瘍標的化シグナルペプチドを加えた図である。この構築物はＲＧＤシグナルと呼ぶ（図１１参照）。
【図９】
図９は内皮細胞増殖に対する阻害効果を示す。種々の濃度の精製アンジオキエシン（組換えヒトＫ１〜５）について「材料と方法」の項に記載の７２時間増殖実験によりＢＣＥ細胞上で１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の存在下に検定を行った。アンジオキエシンは用量依存性のＢＣＥ細胞増殖抑制効果を示した。表示の値は各試料につき３回の検定の平均値（±ＳＥＭ）である。
【図１０】
図１０は内皮細胞増殖に対する阻害効果を示す。種々の濃度の精製アンジオキエシン（組換えヒトＫ１〜５） ＋ ＮＧＲ系腫瘍標的化ペプチドについて「材料と方法」の項に記載の７２時間増殖実験によりＢＣＥ細胞上で１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の存在下に検定を行った。アンジオキエシンは用量依存性のＢＣＥ細胞増殖抑制効果を示した。表示の値は各試料につき３回の検定の平均値（±ＳＥＭ）である。
【図１１】
図１１は内皮細胞増殖に対する阻害効果を示す。種々の濃度の精製アンジオキエシン（組換えヒトＫ１〜５） ＋ ＲＧＤ系腫瘍標的化ペプチドについて「材料と方法」の項に記載の７２時間増殖実験によりＢＣＥ細胞上で１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の存在下に検定を行った。アンジオキエシンは用量依存性のＢＣＥ細胞増殖抑制効果を示した。表示の値は各試料につき３回の検定の平均値（±ＳＥＭ）である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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