(57)【要約】核酸塩基の第１の配列を含む第１鎖；核酸塩基の第２の配列を含み、ワトソン−クリック結合により前記第１鎖と結合している第２鎖；核酸塩基の第３の配列を含む第３鎖；および核酸塩基の第４の配列を含み、ワトソン−クリック結合により前記第２鎖および前記第３鎖と結合している第４鎖：を含む、核酸四重鎖を始めとする多重鎖構造。多重鎖構造の形成は一価陽イオン（例えばナトリウムおよびカリウム）、二価陽イオン、多価陽イオン、挿入剤および／または核酸の小溝内に結合することが知られている分子により促進される。多重鎖構造と多重鎖構造を形成する方法は、診断、治療、予防、およびナノ工学への用途を有している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重鎖構造であって、
核酸塩基の第１の配列を含む第１鎖；
核酸塩基の第２の配列を含み、ワトソン−クリック結合により前記第１鎖と結合している第２鎖；
核酸塩基の第３の配列を含む第３鎖；および
核酸塩基の第４の配列を含み、ワトソン−クリック結合により前記第２鎖および前記第３鎖と結合している第４鎖；
を含む多重鎖構造。
【請求項２】
前記多重鎖構造が、単離された、精製された、人工の、または合成の四重鎖である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項３】
前記鎖の各々が独立して核酸または核酸類似体から成る、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項４】
前記鎖の各々が独立してＤＮＡまたはＲＮＡから成る、請求項３に記載の多重鎖構造。
【請求項５】
前記鎖の各々が独立して非荷電のまたは部分的に荷電したバックボーンを含む核酸類似体から成る、請求項３に記載の多重鎖構造。
【請求項６】
前記第２鎖または前記第４鎖の一方はＤＮＡから成り、前記第２鎖または前記第４鎖の他方はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｃＤＮＡから成る、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項７】
前記第２鎖と前記第４鎖は互いに逆平行である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項８】
前記第１鎖と前記第２鎖の主溝は前記第３鎖と前記第４鎖の主溝に配置される、請求項７に記載の多重鎖構造。
【請求項９】
前記第２鎖と前記第４鎖は互いに平行である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１０】
前記第１鎖と前記第２鎖の主溝は前記第３鎖と前記第４鎖の小溝に配置される、請求項９に記載の多重鎖構造。
【請求項１１】
各核酸塩基は２つの他の核酸塩基にのみ結合する、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１２】
どの鎖も別の鎖と連続していない、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１３】
前記多重鎖構造には本質的にＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合が存在しない、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１４】
前記多重鎖構造にはＧ−Ｇ四つ組が本質的に存在しない、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１５】
前記第１鎖と前記第２鎖は５〜５０の塩基対の長さである、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１６】
前記第３鎖と前記第４鎖はゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１７】
前記第３鎖と前記第４鎖はゲノムＤＮＡ内にハプロタイプを含む、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１８】
前記第３鎖と前記第４鎖はＰＣＲ増幅産物である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項１９】
前記多重鎖構造は固相支持体を必要としない、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２０】
前記多重鎖構造が固相支持体に結び付けられる、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２１】
前記固相支持体は非電気伝導性である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２２】
前記固相支持体は電気伝導性である、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２３】
前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖の少なくとも１つに結び付けられた治療薬、予防薬、または診断薬をさらに含む、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２４】
前記第１鎖と前記第２鎖は各々５〜３０塩基の長さであり、第３鎖と前記第４鎖は各々８〜３．３×１０９塩基対の長さである、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２５】
前記第４の配列は２５％〜７５％のプリン塩基と７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意のオーダーで含む、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項２６】
請求項１に記載の多重鎖構造を提供する方法であって、
前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖、前記第４鎖、水、緩衝液、および少なくとも１つのプロモータを含むハイブリダイゼーション媒体を提供する工程；および
前記多重鎖構造を提供すべく、前記第４鎖に前記第２鎖をハイブリダイズするのに有効なインキュベーション時間の間、前記ハイブリダイゼーション媒体をインキュベートする工程；から成る方法。
【請求項２７】
前記ハイブリダイゼーション媒体は約５〜約９のｐＨに緩衝される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのプロモータは挿入剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのプロモータは挿入用フルオロフォアであり、前記多重鎖構造を含む試験媒体の蛍光強度は前記第４鎖に対する前記第２鎖の結合親和性と正相関する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記挿入用フルオロフォアは、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２およびアクリジンから成る群より選択されたメンバーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのプロモータは、前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖の少なくとも１つに結び付けられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのプロモータは一価陽イオンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのプロモータは１よりも大きい結合価を有する陽イオンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記陽イオンはアルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、遷移金属陽イオン、Ｃｏ（ＮＨ３）６＋３、三価スペルミジンおよび四価スペルミンから成る群より選択された少なくとも１つのメンバーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記陽イオンは、５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で提供されたＫ＋またはＮａ＋である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記第３鎖および前記第４鎖が前記第１鎖と第２鎖の前に前記ハイブリダイゼーション媒体中に供給され、前記第１鎖と前記第２鎖は前記ハイブリダイゼーション媒体との接触による再水和に先立ち、脱水した形で提供される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記インキュベーション時間は約２時間以下である、請求項２６に記載の方法
【請求項３８】
前記インキュベートする工程は室温で行なわれる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第４鎖に対する前記第２鎖のハイブリダイゼーションは、蛍光シグナル、化学発光シグナル、または電気化学発光シグナルの変化として検知される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナルの強度は、前記第２鎖と前記第４鎖の間の結合親和性と相関がある、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１鎖と前記第２鎖の少なくとも１つは、非挿入のフルオロフォアで共有結合で標識され、前記強度は前記結合親和性と逆相関がある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
非挿入のフルオロフォアはビオチン、ローダミンおよびフルオレセインから成る群より選択されたメンバーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的配列上または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに行われる相同的測定法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第４鎖に対する前記第２鎖のハイブリダイゼーションは、前記第３鎖と前記第４鎖の少なくとも１つに関連する活性を不活性化する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１鎖と前記第２鎖の少なくとも１つはさらに医薬を含み、前記第４鎖に対する前記第２鎖のハイブリダイゼーションは、前記第３鎖上、第４鎖上、または前記第３鎖および前記第４鎖の少なくとも１つに結合した別の分子上の標的から前記医薬を有効な距離に配置する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記医薬は、臨床に関連する遺伝子のプロモータ配列を結び付けるように設計された核酸、臨床に関連する遺伝子を結び付けるように設計された核酸、または病原体の複製起点部位を結び付けるように設計された核酸から成る群より選択されたメンバーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第３鎖と前記第４鎖に対する前記第１鎖と前記第２鎖の比は、約１０：１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１鎖、前記第２鎖、前記第３鎖および前記第４鎖の各濃度が５×１０−１０Ｍ以下である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのプロモータは、挿入しない様式で結合しかつ少なくとも１０３Ｍ−１の結合定数で結合する核酸小溝結合分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１鎖がワトソン−クリック結合により前記第３鎖と結合している、請求項１に記載の多重鎖構造。
【請求項５１】
請求項１の多重鎖構造を含む電気回路。
【請求項５２】
結合を測定する方法であって、
少なくとも１つのプリン塩基と少なくとも１つのピリミジン塩基を含む標的配列を有する標的核酸または核酸類似体を提供する工程；
核酸配列または核酸類似体配列を含む二本鎖プローブを提供する工程；
ハイブリダイゼーションプロモータを提供する工程；
標的配列に結び付けられたプローブを含むワトソン−クリック三本鎖または四重鎖を含む試験試料を提供するために、媒体に前記プローブ、前記標的および前記ハイブリダイゼーションプロモータを加える工程；
試験試料に蛍光放射線を発させるために励起放射線で前記試験試料を照射する工程；
前記蛍光放射線の強度を検出する工程であって、該強度は前記プローブと前記標的配列間の結合親和性と相関する工程；および
前記強度から前記プローブと前記標的配列間の対合の程度を決定する工程；から成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の属する技術分野
本発明は核酸多重鎖に関し、より詳細には二本鎖核酸プローブと二本鎖核酸標的配列との間の特異的結合により四重鎖を形成する方法に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
核酸二本鎖は最も広く研究されている多重鎖核酸構造の種類であるが、核酸は、ある条件下では、三本鎖や四重鎖構造も形成することが見出されている。
最近まで、三本鎖を形成する３つの核酸鎖の間のハイブリダイゼーションは、非常に限られた核酸の種類（例えばポリプリンまたはポリピリミジン配列）に限定されると広く考えられていた。例えばＦｌｏｒｉｓら、「原子価塩混合溶液におけるプリン−プリン−ピリミジン三重らせん形成に対する陽イオンの影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐｕｒｉｎｅ−ｐｕｒｉｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｘｅｄ−ｖａｌｅｎｃｅ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）」、２６０  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０１−８０９（１９９９）を参照されたい。さらに、そのような三本鎖形成やハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリック塩基対形成ではなく、隣接する核酸塩基の限定的な種類間のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合に基づいていると考えられていた。例えばＦｌｏｒｉｓらおよびＤｅｒｖａｎらに付与された米国特許第５，８７４，５５５号を参照されたい。しかしながら、最近、発明者らはいくつかの特許出願において、ワトソン−クリック塩基対形成に基づく三本鎖核酸を作成することができ、それを特異的結合に関する非常に正確で感度の高い測定法の基礎として使用することができることを明らかにした。２０００年７月１０日と１９９９年１２月２１日にそれぞれ出願された米国特許出願出願番号第０９／６１３，２６３号および第０９／４６８，６７９号を参照されたい。
【０００３】
三本鎖核酸の場合と同様に、四重鎖核酸に関する一般通念は、そのような特有の構造は核酸の比較的狭いクラスで比較的極端な条件下でのみ存在するというものであった。特に、Ｓｅｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３６４−３６６（１９８８））は、グアニンに富んだオリゴヌクレオチドがインビトロで四本鎖ヘリックスに自発的に自己集合できることを明らかにした。Ｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：６５−７０（１９９２））は、そのような四本鎖複合体が８、１２または１６個のオリゴマーから構成された超構造にさらに会合できることを明らかにした。
【０００４】
Ｍａｒｓｈら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１０７１８−１０７２４（１９９４）およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：６９６−７００（１９９５））は、いくつかのグアニンに富んだオリゴヌクレオチドが、位置がずれた平行アラインメントにも集合し、長い「Ｇ（グアニン）−ワイヤ」を形成することを明らかにした。このような高次構造は１つの平面内に整列され、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成によりひとつにまとめられた４つのグアノシン残基から成るＧ−四つ組により安定化される。Ｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：６５−７０（１９９２）によれば、オリゴマー内に存在する少なくとも３つの近接するグアニンが、そのような高次構造の構成に重要である。
【０００５】
四本鎖ＤＮＡは、ＨＩＶ−１インテグラーゼの阻害（Ｍａｚｕｍｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１３７６２−１３７７１（１９９６））、減数分裂中のシナプシス形成（Ｓｅｎｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３６４−３６６（１９８８））、テロメアの維持（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５９：８７１−８８０（１９８９）、Ｂａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：２９７−３０３（１９９７））のような様々な生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示唆されている。
【０００６】
グアニンに富んだ四重鎖の生成の制御がそのような生物学的プロセスの制御の鍵となり得ることもさらに示唆されている。例えば、Ｈａｒｄｉｎらに付与された米国特許第６，０１７，７０９号は、グアニン四つ組の形成を阻害する薬によりテロメラーゼ活性が制御され得ることを示唆している。
【０００７】
Ｐｉｔｎｅｒらに付与された米国特許第５，８８８，７３９号は、Ｇ−四つ組に基づく四重鎖を、核酸を検知する測定法に使用できることを明らかにしている。相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションしている時、Ｇ−四つ組構造は広がっているか線状になっているため、Ｇ−四つ組構造の異なる部分上の供与体と受容体の間の距離が増加し、その結果、それらの相互作用が減少し、構造から発せられるシグナル（例えば蛍光）の検出可能な変化が減小する。
【０００８】
Ａｇｒａｗａｌらに付与された米国特許第５，９１２，３３２号は、合成オリゴヌクレオチドを所望の完全長オリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズさせ、同時に四重鎖ＤＮＡのようなマルチマー集合物を形成する、合成オリゴヌクレオチドの精製方法を開示している。その後、精製すべきオリゴヌクレオチドを含むマルチマー集合物はサイズ排除技術を用いて単離される。
【０００９】
上述の発展にもかかわらず、四重鎖核酸の完全な可能性は十分には理解されておらず、また、十分に活用されてもいない。
本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、核酸塩基の第１の配列を含む第１鎖；
核酸塩基の第２の配列を含み、ワトソン−クリック結合により第１鎖と結合している第２鎖；
核酸塩基の第３の配列を含む第３鎖；
および
核酸塩基の第４の配列を含み、ワトソン−クリック結合により第２鎖および第３鎖と結合している第４鎖；
を含む多重鎖構造を提供する。
【００１１】
さらには、本発明の多重鎖構造を提供する方法も提供する。
該方法は、
第１鎖、第２鎖、第３鎖、第４鎖、水、緩衝液、および少なくとも１つのプロモータを含むハイブリダイゼーション媒体を提供する工程；
および
多重鎖構造を提供すべく、第４鎖に第２鎖をハイブリダイズするのに有効なインキュベーション時間の間、ハイブリダイゼーション媒体をインキュベートする工程；から成る。
【００１２】
またさらには、二本鎖プローブを使用する一本鎖および二本鎖標的の測定法も提供する。
本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す図面に関連付けて説明する。
【００１３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
上記の背景のセクションで論じた四重鎖とは異なり、本発明の好ましい多重鎖構造は、伝統的なワトソン−クリック結合規則に従ってひとつに結合した少なくとも４本の核酸鎖を含んでいる。
【００１４】
本明細書に使用する場合、用語「ワトソン−クリック結合」とは、対合した対向塩基を介した、対向する核酸（または核酸類似体）鎖の対（ペア）の間の特異的結合を定義するものとする。ワトソン−クリックの四重鎖形成は、本明細書ではハイブリダイゼーションの事象と称することもあるが、それは単に便宜のためであって、ワトソン−クリックの四重鎖形成がどのように最良に特徴づけられるかに関して本発明の範囲を制限するものではない。
【００１５】
本発明の多重鎖構造は好ましくは四重鎖である。多重鎖の各鎖は独立して核酸または核酸類似体から成る。適切な核酸には、例えばＤＮＡやＲＮＡが含まれる。好ましい核酸類似体は非荷電のまたは部分的に荷電したバックボーン（すなわち天然のＤＮＡバックボーンほどには陰性でない電荷を有するバックボーン）を含む。
【００１６】
ある実施形態では、四本鎖の第２鎖と第４鎖の一方はＤＮＡから成り、第２鎖と第４鎖の他方はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｃＤＮＡから成る。
【００１７】
ある実施形態では、第２鎖と第４鎖は互いに逆平行である。これらの実施形態は鏡像相補性を有するものとして定義される。これらの実施形態では、第１と第２鎖の主溝が第３鎖と第４鎖の主溝に配置される。
【００１８】
別の実施形態では、第２鎖と第４鎖は互いに平行である。入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）の相補性を有するこれらの実施形態では、第１鎖と第２鎖の主溝が第３鎖と第４鎖の小溝に配置される。
【００１９】
ある実施形態では、各核酸塩基が２つの他の核酸塩基にのみ結合する。これらの実施形態のうちのいくつかでは、第２鎖の塩基は第１鎖の対合塩基および第４鎖の対合塩基に（ワトソン−クリック規則により）特異的に結合し、第４鎖の塩基が第３鎖の対合塩基および第２鎖の対合塩基に（ワトソン−クリック規則により）特異的に結合し、第１鎖と第３鎖の塩基は、１つの他の塩基にのみ各々結合する。したがって、伝統的なワトソン−クリック塩基対に加えて、そのような実施形態は次のワトソン−クリック塩基トリプレットを含んでいる：Ａ−Ｔ−Ａ、Ｔ−Ａ−Ｔ、Ｕ−Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ−Ｕ、Ａ−Ｕ−Ａ、Ｕ−Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃ−Ｇ、および／またはＣ−Ｇ−Ｃ（Ｃ＋−Ｇ−Ｃおよび／または任意の他のイオン化塩基種も含む）。
【００２０】
ある実施形態では、第１鎖と第３鎖の対向する塩基が、（ａ）第１鎖と第２鎖の対向する塩基間の結合；（ｂ）第３鎖と第４鎖の対向する塩基間の結合；および（ｃ）第２鎖と第４鎖の対向間の結合に加えて、さらに互いに結合する。
【００２１】
本発明の多重鎖構造のある実施形態では、どの鎖も別の鎖と連続していない。すなわち、少なくとも４つの別個の鎖が存在する。折り曲げられた構成やそれと同様な構成（例えばヘアピンターンなど）も本発明の範囲内にあるが、一本鎖の折り曲げられた部分は、最小数の４つの別個の鎖に対して鎖の数を複数回形成しない。
【００２２】
わずかな量のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合および／またはＧ−Ｇ四つ組が存在することはあり得るが、本発明の多重鎖構造は、多重鎖構造の維持のためにＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合またはＧ−Ｇ四つ組に依存しないことが好ましい。すなわち、本発明の多重鎖構造には本質的にＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合が存在せず、Ｇ−Ｇ四つ組が本質的に存在しないことが好ましい。
【００２３】
ある実施形態では、多重鎖の第１鎖と第２鎖は５〜５０の塩基対の長さであり（好ましくは５〜３０の塩基長）、第３鎖と第４鎖は８〜３．３×１０９塩基対長である。例えば、第１鎖と第２鎖が二本鎖プローブを構成し、第３鎖と第４の鎖がハプロタイプを含み得るゲノムＤＮＡのような二本鎖標的を構成し得る。
【００２４】
実施形態では、第３鎖および第４鎖はＰＣＲ増幅産物である。
本発明の多重鎖は、溶液中、固相支持体上、インビトロ、またはインビボで存在し得る。固相支持体は電気伝導性であってもよいし（例えば電極）、または非電気伝導性であってもよい。
【００２５】
本発明による四重鎖形成は様々な用途に適している。例えば、二本鎖核酸開裂剤に共有結合で結合された二本鎖プローブは、二本鎖核酸の標的配列を特異的に開裂させるために使用することができる。化学療法薬に共有結合で結合された二本鎖プローブは、二本鎖核酸の標的配列を特異的に処理するために使用することができる。したがって、本発明は、第１鎖、第２鎖、第３鎖、第４鎖の少なくとも１つに結合された治療薬、予防薬、または診断薬をさらに含む多重鎖構造を包含する。
【００２６】
さらに、本発明の多重鎖は、分子（つまりナノスケール）レベルの電気回路の提供というような、ナノ工学で使用するのに適している。核酸を用いたナノ工学に関するさらなる詳細は、Ｓｅｎらに付与された米国特許第５，９４８，８９７号およびそこに引用された文献に見出すことができる。
【００２７】
本発明の多重鎖構造は、第１鎖、第２鎖、第３鎖、第４鎖、水、緩衝液、および少なくとも１つのプロモータを含むハイブリダイゼーション媒体を提供する工程；および第４鎖に第２鎖をハイブリダイズするのに有効なインキュベーション時間の間、ハイブリダイゼーション媒体をインキュベートする工程；から成る方法により提供することができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーション媒体は、核酸の保存に適していることが知られているいかなる従来の媒体であってもよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，”第２巻（１９８９年）を参照されたい。例えば、媒体には、ヌクレオチド、水、緩衝液および標準塩濃度が含まれ得る。四重鎖構成を促進するために二価陽イオンが専ら使用される場合には、ＥＤＴＡやＥＧＴＡのようなキレート化剤が反応混合物に含まれるべきではない。
【００２９】
相補的塩基間の特異的結合は、温度、塩濃度、静電気強度、および緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を適用する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３０】
約７．６を超えるｐＨレベルでは不安定であるか存在しない多くのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の多重鎖とは異なり、本発明のワトソン−クリック多重鎖は、広範囲のｐＨレベルにわたって、好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９で安定している。
【００３１】
さらに、本発明の多重鎖は、特定の先行技術の四重鎖とは異なり、ホモピリミジン配列またはホモプリン配列の存在を必要としない。例えば標的配列は、２５％〜７５％のプリン塩基と７５％〜２５％のピリミジン塩基を任意の順序で含み得る。
【００３２】
多重鎖は、約５℃〜２５℃の温度で、約２時間かまたはそれより短い時間に形成されることが好ましい。インキュベーション時間は、室温であっても、５分未満であることが好ましい。それより長い反応時間は要求されないが、多くの場合で２４時間以内のインキュベーションは四重鎖に悪影響を及ぼさなかった。本発明のワトソン−クリック四本鎖の迅速な結合時間は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ四重鎖にかかるはるかに長い結合時間とは対照的である。
【００３３】
ハイブリダイゼーション媒体中のプロモータは、好ましくは挿入剤または陽イオンである。挿入剤は、例えば、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２、およびアクリジンから成る群より選択されたメンバーのようなフルオロフォアである。
【００３４】
適当な陽イオンには、Ｎａ＋（好ましくは５０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度）、Ｋ＋および他のアルカリ金属イオンのような一価陽イオン；アルカリ土類金属イオン（例えばＭｇ＋２およびＣａ＋２）および二価遷移金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｎｉ＋２、Ｃｄ＋２、Ｃｏ＋２およびＺｎ＋２）のような二価陽イオン；ならびにＣｏ（ＮＨ３）６＋３、３価のスペルミジンおよび４価のスペルミンのような、少なくとも３つの陽電荷を有する陽イオン；が含まれる。Ｍｎ＋２は、１０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｍｇ＋２は、１５ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。Ｎｉ＋２は、約２０ｍＭの濃度で提供されることが好ましい。ある実施形態では、Ｍｇ＋２とＭｎ＋２が、各々１０ｍＭ、各々１５ｍＭ、各々２０ｍＭ、または各々３０ｍＭ（つまり各１０〜３０ｍＭ）の濃度で共に提供される。
【００３５】
多重鎖を形成する媒体に加えられる陽イオンの量は、陽イオンの性質、プローブの濃度、標的の濃度、追加の陽イオンの存在、ならびにプローブおよび標的の塩基含量を含む多くの要因によって決まる。好ましい陽イオン濃度と混合物は実験的に常法で検出することができる。
【００３６】
必須ではないが、他のプロモータとして、例えば、Ｒｅｃ  Ａタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌一本鎖結合タンパク質、核酸主溝または核酸小溝結合タンパク質などの一本鎖結合タンパク質や、ビオロゲン、ならびにアクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシンなどのさらなる挿入用物質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
【００３７】
本発明は、第４鎖に対する第２鎖のハイブリダイゼーションが第３鎖と第４鎖の少なくとも１つに関連する活性を不活性化する方法も可能にする。したがって、第１鎖と第２鎖の少なくとも１つはさらに医薬を含み、第４鎖に対する第２のハイブリダイゼーションは、第３鎖上、第４鎖上、または第３鎖および第４鎖の少なくとも１つに結合した別の分子上の標的から医薬を有効な距離に配置する。医薬は好ましくは、臨床に関連する遺伝子のプロモータ配列を結び付けるように設計された核酸、臨床に関連する遺伝子を結び付けるように設計された核酸、または病原体の複製起点部位を結び付けるように設計された核酸から成る群より選択されたメンバーである。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明は、核酸配列または核酸類似体配列を含む一本鎖または二本鎖標的と、核酸配列または核酸類似体配列を含む二本鎖プローブとの間の、迅速で、感度が高く、環境にやさしく、安全な結合測定法を提供する。
【００３９】
本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
【００４０】
本発明はプローブと標的間の特異的結合の存在を検出するだけでなく、プローブと標的間の相互作用の性質に関する定性的・定量的情報も提供する。従って、従事者は、本発明により二本鎖プローブ中の配列と二本鎖標的の鎖中の配列との間に生じる完全対合、１つの塩基対誤対合、２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
【００４１】
本発明の実施形態は、第１のプローブ−標的混合物について測定したシグナル（例えば蛍光、化学発光、電気化学発光、または電気的性質）を、同じ標的と結合させた、各々が少なくとも１つの塩基だけ第１のプローブと異なる他のプローブによって示された同じ型のシグナルに対して較正することを含む。
【００４２】
測定したシグナル（例えば蛍光強度）の大きさが標的とプローブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤対合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、四重鎖の内部の誤対合の位置などに応じて変化するため、本発明の測定方法を、標的の配列決定を行うために使用することが可能である。
【００４３】
ある実施形態では、測定するシグナルを、試験試料に含まれるフルオロフォアの蛍光強度とすることができる。そのような実施形態では、フルオロフォアがシグナル消光あるいはシグナル増幅のいずれによりハイブリダイゼーションのシグナルを送るか否かにより、プローブと標的間の結合親和性は強度と正相関または逆相関の関係となる。選択条件下で、挿入剤により発生する蛍光強度はプローブ−標的結合親和性と正相関し、プローブに共有結合により結合される挿入されないフルオロフォアを使用する好ましい実施形態の強度はプローブ−標的結合親和性と逆相関する。プローブと標的との間の対合の程度が、好ましくは０−２の誤対合および／または欠失を含む範囲において、より好ましくは０−３の誤対合および／または欠失を含む範囲において増加するにつれて、非挿入のフルオロフォアに関する蛍光強度は減少する。
【００４４】
本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様々な用途に有用であり得る。
【００４５】
本発明の測定法は好ましくは相同的である。測定は、測定シグナルの大きさの検出に先立って自由プローブと自由標的からプローブ標的複合体を分離せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。従って、この結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化できる。さらに、この結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数を、速やかに決定することを可能にする。
【００４６】
測定法は例えばウェル内またはマイクロチャネル内の溶液中、不浸透性表面上またはバイオチップ上で実行することができる。ある実施形態では、第３鎖と第４鎖が第１鎖と第２鎖の前にハイブリダイゼーション媒体中に供給され、第１鎖と第２鎖はハイブリダイゼーション媒体との接触による再水和に先立ち、脱水した形で提供される。
【００４７】
さらに、本発明の測定法は好ましくは、標的上のまたはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに行われる。
発明者らはハイブリダイゼーションに対する蛍光強度測定法の利点を先に開示したが（例えば１９９８年１２月３１日出願の米国特許出願第０９／２２４，５０５号を参照）、本発明の測定法の特定の実施形態は、プローブと二本鎖標的間の四重鎖を特異的に検出し、標的を変性する必要性をなくす。
【００４８】
例えばＰｉｔｎｅｒら（前掲）の四重鎖ハイブリダイゼーションの非常に限定的なＨｏｏｇｓｔｅｅｎモデルではなくワトソン−クリック塩基対合にプローブと標的の間の相互作用が基づいている（少なくともＡがＴ（またはＲＮＡの場合のＵ）に結合し、ＧがＣに結合するという意味で）二本鎖核酸プローブと二本鎖核酸標的との間に形成された四重鎖を、本願発明者が特異的に測定できることは驚くべきことである。
【００４９】
本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＰＮＡ、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および非荷電のバックボーンまたは部分的に荷電したバックボーンを有する他の二本鎖核酸類似体が含まれる。８個から２０個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれが、原核生物および真核生物のうちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲だからである。１２〜１８個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、５〜３０塩基から成るプローブが最も好ましい。しかしながら、ヌクレオチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい。プローブの長さは標的の長さと対合するように選択することができる。
【００５０】
本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかり、常に再生されなければならない放射性のプローブの使用を必要としない。本発明のプローブは、好ましくは、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成または注文し、保存することが可能である。
【００５１】
ある実施形態では、プローブは、多分子シグナリング複合体または酸化還元対で、もしくは化学発光特性または電気化学発光特性を引き起こす標識で標識される。
【００５２】
蛍光性の挿入剤がハイブリダイゼーション媒体の中にない場合、プローブまたは標的（好ましくはプローブ）は、共有結合で結び付けられた蛍光標識を有することが好ましい。標識は好ましくは非挿入のフルオロフォアまたは挿入用フルオロフォアである。そのような実施形態では、フルオロフォアは、プローブのいずれかの端部に結び付けられることが好ましい。好ましい蛍光マーカーには、ビオチン、ローダミン、アクリジンおよびフルオレセイン、ならびに励起エネルギーで照射された時に蛍光を発する他のマーカーが含まれる。
【００５３】
励起波長は、使用されているフルオロフォアの励起最大値に対応させるために、（日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２００〜１０００ｎｍである。フルオロフォアは２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するように好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長を有する光でフルオロフォアを照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用され、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。
【００５４】
本発明の測定法は、例えば５〜８５℃のような種々の温度にわたって行うことが可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。
【００５５】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニン・シトシン含量には依存しない。Ａ−Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しない一方でＧ−Ｃ塩基対は３つの水素結合を形成するため、より高いＧまたはＣ含量を有する標的配列およびプローブ配列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハイブリッド中に存在するＧＣ含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量が増加した塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合の弱さを相殺し得る。
【００５６】
本発明の測定法は非常に感度が高く、そのため、標的のＰＣＲ増幅を行う必要性がない。例えば、約１０フェムトモルの標的と約１０フェムトモルのプローブを含む、体積が約２０μｌの試験試料を測定することが可能である。本発明の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは５×１０−１０Ｍ以下の濃度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度のプローブを使用するように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
【００５７】
プローブ（例えば第１鎖と第２鎖）対標的（例えば第３鎖と第４鎖）の比は、３０：１〜１：１、好ましくは約１０：１である。
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことを理解すべきである。
【００５８】
実施例
実施例１
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０に由来し（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０  ２０７（１９９６年））、ＧＣ含量パーセントが３０％から５２％に変わるように改変したセンスおよびアンチセンス５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ標的配列を、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００５９】
野生型ｄｓＤＮＡ標的Ａのセンス鎖の配列（配列番号１）は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’。
【００６０】
野生型ｄｓＤＮＡ標的Ａのアンチセンス鎖の配列（配列番号２）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００６１】
標的Ｂは野生型塩基ＣＡＴとＡＴＧがそれぞれ塩基ＣＧＴとＡＣＧに置き換わったセンス鎖とアンチセンス鎖上の１塩基対変異（下線）を除くと野生型標的ＤＮＡと同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的であった。
【００６２】
変異型標的Ｂのセンス鎖の配列（配列番号３）は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’。
【００６３】
変異型標的Ｂのアンチセンス鎖の配列（配列番号４）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００６４】
標的Ｃは野生型塩基ＣＡＴとＡＴＧがそれぞれ塩基ＣＴＴとＡＡＧに置き換わったセンス鎖とアンチセンス鎖上の１塩基対変異（下線）を除くと野生型標的ＤＮＡと同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的であった。
【００６５】
変異型標的Ｃのセンス鎖の配列（配列番号５）は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’。
【００６６】
変異型標的Ｃのアンチセンス鎖の配列（配列番号６）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００６７】
標的Ｄは野生型塩基ＣＴＣとＧＡＧがそれぞれ塩基ＣＴＴとＡＡＧに置き換わったセンス鎖とアンチセンス鎖上の１塩基対変異（下線）を除くと野生型標的ＤＮＡと同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的であった。
【００６８】
変異型標的Ｄのセンス鎖の配列（配列番号７）は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’。
【００６９】
変異型標的Ｄのアンチセンス鎖の配列（配列番号８）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００７０】
標的Ｅは野生型塩基ＣＴＣとＧＡＧがそれぞれ塩基ＣＣＣとＧＧＧに置き換わったセンス鎖とアンチセンス鎖上の１塩基対変異（下線）を除くと野生型標的ＤＮＡと同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的であった。
【００７１】
変異型標的Ｅのセンス鎖の配列（配列番号９）は以下の通りであった：５’−ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧ−３’。
【００７２】
変異型標的Ｅのアンチセンス鎖の配列（配列番号１０）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００７３】
プローブＡは、５’位置にフルオレセイン部分が取り付けられた１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡプローブであり、５０ｍｅｒ野生型標的Ａの中心付近でセンス鎖およびアンチセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに鏡像相補性となるよう設計された。そのようなプローブの鎖は、上述のＤＮＡ合成装置で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モル量のプローブ鎖を９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。ｄｓＤＮＡプローブは、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００７４】
プローブＡのセンス鎖の配列（配列番号１１）は以下の通りであった：５’−Ｆｌｕ−ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ−３’。
プローブＡのアンチセンス鎖の配列（配列番号１２）は以下の通りであった：５’−Ｆｌｕ−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ−３’。
【００７５】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅの５’フルオレセイン標識したｄｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００ｍＭ  ＮａＣｌ。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の放出をモニターした。最大蛍光強度は、フルオレセインの放射波長である５２５ｎｍの波長で生じた。図１は、分析した各試料の波長の関数としてプロットした蛍光の強度を示す。
【００７６】
ＫＣｌの不在下では、ｄｓＤＮＡ標的とプローブＡ間のハイブリダイゼーションは検出されず、野生型ｄｓＤＮＡ標的Ａまたは変異型ｄｓＤＮＡ標的ＤがｄｓＤＮＡプローブＡと混合された時かｄｓＤＮＡプローブのみが存在する時に観察されるのと同様の蛍光強度が得られた（データは図示しない）。
【００７７】
１００ｍＭ  ＫＣｌの存在下で２１℃で１時間インキュベーションした後では、ｄｓＤＮＡ標的ＡとｄｓＤＮＡプローブＡの上の完全に相補的な配列から成るｄｓＤＮＡ標的：ｄｓＤＮＡ−Ｆ四重鎖が容易に生じ、ｄｓＤＮＡプローブＡ（標識ｄｓＤＮＡ−Ｆ）のみによって発せられた蛍光強度と比較して、蛍光放出の強度が６２％減少した（図１）。対照的に、１つの塩基対Ｇ−Ｔ誤対合を含む不完全に相補的なｄｓＤＮＡ標的Ｄ：ｄｓＤＮＡ−ＦプローブＡ四重鎖は、上記の反応条件では安定性が低く、ｄｓＤＮＡプローブＡのみによって示された蛍光強度と比較して蛍光強度が１８％しか減少しなかった。
【００７８】
特定の濃度のＫ＋のような一価陽イオンの含有は、予め変性せずにｄｓＤＮＡ標的とフルオレセイン標識ｄｓＤＮＡプローブとの間の四重鎖を形成するのに十分であった。四重鎖の形成は、ワトソン−クリックの塩基対親和性に基づいて起こり、完全に相補的な相同な二本鎖間では測定可能でかなり多量の四本鎖が生じた。さらには反応は、天然ｄｓＤＮＡを使用して、１０対１のプローブ対標的の比で、たった１時間以内の室温でのインキュベーションで起こった。この実施例で使用したｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブは相同で、５３％のＧＣ含量を含んでおり、どのＤＮＡ鎖にもホモプリンやホモピリミジンの延長部を含んでいなかった。四重鎖の形成では二本鎖プローブがその右旋性キラリティを犠牲にする必要があるという推論にもかかわらず、ＤＮＡ四重鎖は容易に生じた。本発明のハイブリダイゼーション測定法は、ｄｓＤＮＡを使用して、完全に相補的ＤＮＡ配列と、１塩基誤対合を含むＤＮＡ配列とを区別することができた。
【００７９】
実施例２
実施例１で行った四重鎖ＤＮＡ測定法は、反応混合物中に一価陽イオンを添加することによって促進された。この測定法の特異性を、５３％のＧＣ含量を有するｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡ−Ｆプローブによる四重鎖ＤＮＡ形成を促進するために二価陽イオンを使用して、さらに詳しく調べた。
【００８０】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅの５’フルオレセイン標識したｄｓＤＮＡプローブ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２と２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で１時間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の放出をモニターした。図２は、分析した各試料の波長の関数としてプロットした蛍光の強度を示す。
【００８１】
２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２と２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下でｄｓＤＮＡ−ＦプローブＡ（５３％のＧＣ含量）を５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的Ａまたは変異型ｄｓＤＮＡ標的Ｄとインキュベートすると、四重鎖が非変性条件下で室温にて形成された。完全対合ＤＮＡ四重鎖は蛍光強度の最大の減少（３４％の減少）を生じたが、、１塩基対Ｔ−Ｇ誤対合を含むより安定性の低いｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ−Ｆ四重鎖（ｄｓＤＮＡ標的Ｄ＋ｄｓＤＮＡプローブＡ）は、プローブＡのみで観察される蛍光強度とほぼ同じ蛍光強度を生じた（図２）。
【００８２】
Ｍｎ＋２やＭｇ＋２のような二価陽イオンの存在は、非変性条件下での四重鎖の形成を促進し、相同つまり鏡像相補性であるｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブの四重鎖と、誤対合の１塩基対を含む四重鎖配列との間の間の正確な区別を可能にした。
【００８３】
二価陽イオンは、四重鎖の形成では二本鎖プローブがその右旋性キラリティを犠牲にする必要があるという推論にもかかわらず、鏡像相補的なワトソン−クリック四重鎖の形成を促進した。
【００８４】
実施例３
実施例１，２で行なった四重鎖ＤＮＡ測定法は、反応混合物中に一価陽イオンまたは二価陽イオンのいずれかを追加することによって促進された。以下の実施例は、ＤＮＡ挿入剤を使用した時の四重鎖ＤＮＡ測定法の特異性を実証する。
【００８５】
プローブＢは、フルオレセインマーカーを取り付けないプローブＡと同一の１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡプローブであり、同様に調製した。
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅのｄｓＤＮＡプローブＢ、０．５×ＴＢＥ、および１００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）。反応混合物を２１℃で５分間インキュベートし、測定した。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射した。ＹＯＹＯ−１の挿入を示す５３５ｎｍの波長で最大の蛍光強度が生じた。
【００８６】
標的かプローブが存在しなかった時（ＹＯＹＯ−１のみ）に観察された蛍光強度を、図３に示す。図３はまた、反応混合物で、ｄｓＤＮＡプローブＢを、相同な配列を有する野生型５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的Ａと、または１誤対合塩基対を除くとｄｓＤＮＡプローブＢの塩基配列と相同な配列を含む４つの他のｄｓＤＮＡ標的と組み合わせた時に観察された蛍光強度も示す。ｄｓＤＮＡプローブＢと共に反応混合物中に存在する時、相同つまり鏡像相補性である野生型標的ｄｓＤＮＡは、最大の蛍光強度を生じた。反応混合物中でｄｓＤＮＡプローブＢと共にインキュベートされた時、誤対合ｄｓＤＮＡ標的は、完全に対合した四重鎖により達成される蛍光強度と比較して、ｄｓＤＮＡ標的Ｃに対する２０％低い値からｄｓＤＮＡ標的Ｅに対する８０％低い値までのより低い蛍光強度の値を生じた（図３）。
【００８７】
ＹＯＹＯ−１挿入により安定化されたワトソン−クリック四重鎖は、そのプローブが完全に相同な配列つまり鏡像相補的な配列を含んでいた時に、相同でないつまりｄｓ標的の配列に鏡像相補的でない１つの塩基対が存在した時よりも、ｄｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブ間でより容易に生成した。ワトソン−クリック四重鎖は、四重鎖の形成では二本鎖プローブがその右旋性キラリティを犠牲にする必要があるという推論にもかかわらず、容易に生成した。
【００８８】
実施例４
この実施例では、５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標的を５３％ＧＣ含量の１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡプローブＣに曝露した。二本鎖プローブの主溝が二本鎖標的の小溝に配置された時に、プローブの鎖の塩基と標的の鎖の塩基との間には、入れ子式相補性と本明細書で称するワトソン−クリック相補性が存在する。二本鎖プローブ中の塩基の配列は相同ではなく、二本鎖標的中の配列に対して逆になっている。
【００８９】
プローブの鎖は、上述のＤＮＡ合成装置で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モル量のプローブ鎖を９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。ｄｓＤＮＡプローブは、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００９０】
ｄｓＤＮＡプローブＣのセンス鎖の配列（配列番号１３）は以下の通りであった：５’−ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ−３’。
ｄｓＤＮＡプローブＣのアンチセンス鎖の配列（配列番号１４）は以下の通りであった：５’−ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＧＴＣ−３’。
【００９１】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅのｄｓＤＮＡプローブＣ、０．５×ＴＢＥ、および１００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。反応混合物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射した。ＹＯＹＯ−１の挿入を示す５３５ｎｍの波長で最大の蛍光強度が生じた。
【００９２】
図４は、予め変性がない状態で、野生型５０ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡ標識Ａを、ｄｓＤＮＡ標的Ａに入れ子式相補性に基づいて完全に対合する１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡプローブＣと反応させた時に、最大の蛍光強度が達成されることを示している。蛍光強度はＤＮＡの結合、この場合にはｄｓＤＮＡ標的と入れ子式相補的ｄｓＤＮＡプローブとの間の四重鎖形成、が起こったことを示す。
【００９３】
対合を入れ子式相補性の逆相同に基づいて評価した時、１塩基対だけ二本鎖プローブと誤対合した変異型ｄｓＤＮＡ標的は、完全に相補的な野生型ｄｓＤＮＡ標的よりも、かなり少ないｄｓＤＮＡプローブとの四重鎖複合体を生成した。実施例３で鏡像相補性に基づいて測定した様々な誤対合を、この実施例において入れ子式相補性に基づいて測定した。
【００９４】
図４に示すように、１塩基対誤対合ｄｓＤＮＡ標識とｄｓＤＮＡプローブＣにより形成された四重鎖により生じた蛍光強度は、完全対合の四重鎖（ｄｓＤＮＡ標的Ａ＋ｄｓＤＮＡプローブＣ）により達成される蛍光強度よりも８％〜１６％低かった。
【００９５】
実施例３では完全対合四重鎖と誤対合四重鎖との間により大きな蛍光の区別が観察された。これは、完全に相補的なｄｓＤＮＡプローブまたは１塩基対誤対合のｄｓＤＮＡプローブが、ｄｓＤＮＡ標的に対して鏡像相補的な配向よりも、むしろ入れ子式に相補的な配向で優勢に結合することを示唆している。
この実施例は、入れ子式に相補的な二本鎖ＤＮＡの間のワトソン−クリック四重鎖結合がＹＯＹＯ−１の存在下で容易に生じることを示している。この容易さの一部は入れ子式に相補的な四重鎖結合により、相互作用するそれぞれの二本鎖の右旋性キラリティが維持されるという事実から生じている。
【００９６】
実施例５
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０に由来し（Ｎａｔｕｒｅ  ３８０  ２０７（１９９６年））、ＧＣ含量パーセントが３０％から５２％に変わるように改変した５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡ標的配列を、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。
【００９７】
５０ｍｅｒ野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆである鎖の配列（配列番号２）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００９８】
標的Ｇは、１塩基の変異（下線）を除いて野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆと同一の５０ｍｅｒ変異型ｓｓＤＮＡ標的であった。
変異型ｓｓＤＮＡ標的Ｇの鎖の配列（配列番号４）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【００９９】
標的Ｈは、１塩基の変異（下線）を除いて野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆと同一の５０ｍｅｒ変異型ｓｓＤＮＡ標的であった。
変異型ｓｓＤＮＡ標的Ｈの鎖の配列（配列番号６）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【０１００】
標的Ｉは、１塩基の変異（下線）を除いて野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆと同一の５０ｍｅｒ変異型ｓｓＤＮＡ標的であった。
変異型ｓｓＤＮＡ標的Ｉの鎖の配列（配列番号８）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【０１０１】
標的Ｊは、１塩基の変異（下線）を除いて野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆと同一の５０ｍｅｒ変異型ｓｓＤＮＡ標的であった。
変異型ｓｓＤＮＡ標的Ｊの鎖の配列（配列番号１０）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【０１０２】
標的Ｋは、１塩基の変異（下線）を除いて野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆと同一の５０ｍｅｒ変異型ｓｓＤＮＡ標的であった。
変異型ｓｓＤＮＡ標的Ｋの鎖の配列（配列番号１５）は以下の通りであった：５’−ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣ−３’。
【０１０３】
プローブＢは、フルオレセインマーカーを取り付けないプローブＡと同一の１５ｍｅｒ  ｄｓＤＮＡプローブであり、同様に調製した。プローブＢの鎖の１つ（つまり配列番号１１）は、５０ｍｅｒ野生型ｓｓＤＮＡ標的Ｆの中心付近の１５個のヌクレオチドセグメントに相補的であった。
【０１０４】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は以下を含有していた：０．４ｐｍｏｌｅの標的ｓｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅのｄｓＤＮＡプローブＢ、０．５×ＴＢＥ、および１００ｎＭのＹＯＹＯ−１。反応混合物は予め変性せずに室温（２１℃）で５分間インキュベートした。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、蛍光の放出をモニターした。すべてのレーザー照射の積算時間は８０ミリ秒であった。最大蛍光強度は、ＹＯＹＯ−１の挿入を示す５３５ｎｍの波長で生じた。図５は、分析した各試料の波長の関数としてプロットした蛍光の強度を示す。
【０１０５】
標的ｓｓＤＮＡがない状態では、ｄｓＤＮＡプローブ間のいくつかのハイブリダイゼーションが、鏡像相補的に基づいて起こった（図５）。相同の二本鎖ＤＮＡ間のそのような結合は、先の実施例で開示されている。ＹＯＹＯ−１のみでインキュベートしたｓｓＤＮＡ標的では、放射強度の値が低く、ＹＯＹＯ−１とインキュベートしたｄｓＤＮＡプローブだけの放射強度の値の２分の１未満であった（データは図示しない）。
【０１０６】
１００ｍＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で２１℃で５分間インキュベーションした後に、ｓｓＤＮＡ標的ＦはｄｓＤＮＡプローブＢ上の完全に相補的な配列と容易に結合複合体を形成し、ｄｓＤＮＡプローブＢのみにより発せられた蛍光強度と比較して、放射蛍光強度が７９％増加した。対照的に、種々の１塩基誤対合を含む不完全に相補的なｓｓＤＮＡ標的は、上記の反応条件では安定性が低く、ｄｓＤＮＡプローブＢのみによって示された蛍光強度と比較して蛍光強度が１９％〜３１％しか増加しなかった（図５）。
【０１０７】
ＹＯＹＯ−１（インターカレータ）の存在は、予め変性せずにｄｓＤＮＡプローブとｓｓＤＮＡ標的の間の結合を可能にするのに十分であった。結合はワトソン−クリックの塩基対親和性に基づいて起こり、完全に相補的な相同二本鎖間では測定可能でかなり多量の四本鎖が生じた。反応は、天然ｄｓＤＮＡを使用して、１０対１のプローブ対標的の比で、たった５分以内の室温でのインキュベーションで起こった。この実施例で使用したｓｓＤＮＡ標的とｄｓＤＮＡプローブは５３％のＧＣ含量を含んでおり、どのＤＮＡ鎖にもホモプリンやホモピリミジンの延長部を含んでいなかった。本発明の測定法は、ｄｓＤＮＡを使用して、完全に相補的なｓｓＤＮＡ配列と、誤対合塩基を含むｓｓＤＮＡ配列とを区別することができた。
【０１０８】
本発明の測定法は、完全に自己相補的なすなわち相同な鎖配列を有する二本鎖プローブであって互いに鏡像相補的な様式でつまり主溝と主溝の様式で結合する間で結合する二本鎖プローブ間では、結合がかなりの程度で起こるという事実にも拘わらず機能した。
【０１０９】
本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】分析した各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図２】分析した各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図３】分析した各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図４】分析した各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図５】分析した各試料の波長の関数としてプロットされた蛍光強度の複合グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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