(57)【要約】（ａ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンの取込み輸送体、好ましくはＯＡＴＰ８をコードするＤＮＡ配列、および（ｂ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプ、好ましくは多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）をコードするＤＮＡ配列を含有してなる二重トランスフェクト細胞株が記載されている。さらに、好ましくは、輸送体インヒビター、例えば薬剤候補の同定のための該細胞株の様々な使用が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンの取込み輸送体をコードするＤＮＡ配列、および（ｂ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプをコードするＤＮＡ配列を含有してなる二重トランスフェクト細胞株。
【請求項２】
イヌまたはヒトの細胞株であって、（ａ）および／または（ｂ）のＤＮＡ配列がヒトである、請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
腎臓細胞株である請求項１または２記載の細胞株。
【請求項４】
有機アニオンの取込み輸送体が、溶質担体（ＳＬＣ）スーパーファミリーのサブグループ２１Ａまたは２２Ａのメンバーである、請求項１〜３いずれか記載の細胞株。
【請求項５】
有機アニオンの取込み輸送体が、ＯＡＴ１（ＳＬＣ２２Ａ６）、ＯＡＴＰ２（ＳＬＣ２１Ａ６）、ＯＡＴＰ８（ＳＬＣ２１Ａ８）またはＯＡＴＰ−Ｂ（ＳＬＣ２１Ａ９）である、請求項４記載の細胞株。
【請求項６】
有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプが、ＡＢＣスーパーファミリーのＭＤＲ（ＡＢＣＢ）サブグループまたはＭＲＰ（ＡＢＣＣ）サブグループのメンバーである、請求項１〜５いずれか記載の細胞株。
【請求項７】
有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプが、胆汁酸塩輸出ポンプＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）または多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２；ＡＢＣＣ２）である、請求項６記載の細胞株。
【請求項８】
有機アニオンの取込み輸送体をコードするＤＮＡ配列および／または有機アニオンもしくはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプをコードするＤＮＡ配列が、高発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１〜７いずれか記載の細胞株。
【請求項９】
輸送体基質または輸送体インヒビターの同定のための請求項１〜８いずれか記載の細胞株の使用。
【請求項１０】
輸送体インヒビターが薬剤候補である請求項９記載の使用。
【請求項１１】
輸送体基質または輸送体インヒビターの同定がハイスループットスクリーニングとして行なわれる請求項９または１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、（ａ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンの取込み輸送体、好ましくはＯＡＴＰ８をコードするＤＮＡ配列、および（ｂ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプ、好ましくは多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）をコードするＤＮＡ配列を含有してなる二重トランスフェクト細胞株に関する。本発明はまた、好ましくは、輸送体インヒビター、例えば薬剤候補の同定のための前記細胞株の様々な使用に関する。
【０００２】
一方向性輸送は、解毒、および器官への毒素の進入の防御に寄与するすべての分極細胞の重要な機能である。この例として、腎臓近位管上皮、血管脳関門の細胞、腸上皮が挙げられ、忘れてはならないのものとして肝細胞が挙げられる。主な肝細胞機能の１つは、血液循環からの内因性物質および外因性物質の除去および該物質の胆汁への分泌である。肝細胞によるこの一方向性輸送において、２つの輸送プロセス：血液からの洞様毛細血管（側底側）取込みおよび胆汁への小管（頂端側）分泌が決定的な役割を果たす。ヒト肝細胞において、両親媒性有機アニオンのナトリウム依存性取込みは、少なくとも３つの輸送タンパク質、すなわちヒト有機アニオン輸送体ＯＡＴＰ２（ＯＡＴＰ−ＣまたはＬＳＴ１、記号ＳＬＣ２１Ａ６としても知られる）（Ａｂｅら  １９９９；Ｈｓｉａｎｇら  １９９９；Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ａ；Ｃｕｉら  ２００１）、ヒトＯＡＴＰ８（ＳＬＣ２１Ａ８）（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ；Ｃｕｉら  ２００１）およびヒトＯＡＴＰ−Ｂ（ＳＬＣ２１Ａ９）（Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋら  ２００１）により媒介される。すべての３つの輸送体は、溶質担体（ＳＬＣ）スーパーファミリーのサブグループ２１Ａに属する。ＯＡＴＰ−Ｂは、いくつかの他の組織においても発現されるが、ＯＡＴＰ２およびＯＡＴＰ８はヒト肝細胞において排他的に発現される。ＯＡＴＰの基質スペクトルには、胆汁酸塩、ステロイドホルモンのコンジュゲート、甲状腺ホルモンおよび多くの他の両親媒性有機アニオン類が含まれる（Ａｂｅら  １９９９；Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ａ，ｂ；Ｃｕｉら  ２００１；Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋら  ２０００，２００１）。交換体型と考えられているこれらの側底側取込み輸送体（Ｌｉら  １９９８）とは異なり、これまでにヒト肝細胞において同定された頂端側輸出輸送体は、ＡＴＰ結合性カセット（ＡＢＣ）スーパーファミリーのメンバーである（ＫｅｐｐｌｅｒおよびＡｒｉａｓ  １９９７；Ｊａｎｓｅｎ  ２０００）。有機アニオンの輸出は、ＡＢＣスーパーファミリーのＭＤＲ（ＡＢＣＢ）サブグループに属する胆汁酸塩輸出ポンプＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）（Ｓｔｒａｕｔｎｉｅｋｓら  １９９８；Ｇｅｒｌｏｆｆら  １９９８；Ｗａｎｇら  ２００１）、およびＡＢＣスーパーファミリーのＭＲＰ（ＡＢＣＣ）サブグループに属する多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２、ＡＢＣＣ２）（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら  １９９６；ＳｕｚｕｋｉおよびＳｕｇｉｙａｍａ  １９９８；Ｋｏｅｎｉｇら  １９９９；Ｂｏｒｓｔら  ２０００）により主に媒介される。ＢＳＥＰの主要な基質は、コリルタウリンおよびコール酸塩のような胆汁酸塩であるが（Ｇｅｒｌｏｆｆら  １９９８）、ＭＲＰ２により輸送される有機アニオンは、主に、親油性物質とグルタチオン、グルクロン酸塩または硫酸塩とのコンジュゲートである（Ｅｖｅｒｓら  １９９８；Ｃｕｉら  １９９９；Ｋｏｅｎｉｇら  １９９９）。
【０００３】
両親媒性有機アニオンの肝臓経由輸送は、スルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）およびインドシアニングリーン（ＩＣＧ）（Ｓｃｈａｒｓｃｈｍｉｄｔら  １９７５）のようなモデル化合物の使用により頻繁に研究されている。肝細胞基底外膜において同定された３つのヒトＯＡＴＰの機能特性付けにより、これら３つは、ＯＡＴＰ２が最も高い親和性で（Ｋm ＝１４０ｎＭ）、ＯＡＴＰ８が最も低い親和性で（Ｋm ＝３．４μＭ）で、ＢＳＰの取込みを媒介し得ることが示された（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ；Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋら  ２００１；Ｃｕｉら  ２００１）。肝細胞において、ＢＳＰは、グルタチオンと主にコンジュゲートを形成し、ＢＳＰグルタチオンＳ−コンジュゲート（ＢＳＰ−ＳＧ）を生じる（Ｗｈｅｌａｎら  １９７０；Ｓｎｅｌら  １９９５）。小管輸出ポンプＭｒｐ２（Ｐａｕｌｕｓｍａら  １９９６；Ｂｕｅｃｈｌｅｒら  １９９６；Ｉｔｏら  １９９７）を欠く輸送欠陥変異体ラットを用いた研究（Ｊａｎｓｅｎら  １９８７）では、この輸出ポンプがＢＳＰ−ＳＧの胆汁への分泌を媒介することが示された。しかしながら、ＢＳＰ自体がヒトＭＲＰ２の基質であることは確立されなかった。これまで、ＯＡＴＰおよびＭＲＰのような輸送タンパク質は、たいてい、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の使用または１つの外因性組換え輸送タンパク質しか発現しないアフリカツメガエル卵母細胞系の使用により研究された（Ｍａｄｏｎら  １９９７；Ｉｔｏら  １９９８；Ｅｖｅｒｓら  １９９８；Ｃｕｉら  １９９９，２００１；Ａｂｅら  １９９９；Ｈｓｉａｎｇら  １９９９；Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ａ，ｂ；Ｋｕｌｌａｋ−Ｕｂｌｉｃｋら  ２００１）。
【０００４】
新しい医薬を開発または設計する場合、重要な問題点の１つは、候補化合物が、体内で生成するか、または通常体内に存在する物質の輸送の妨害、例えば、リファンピシン、リファマイシンＳＶまたはＣＤＮＢによるＢＳＰの経細胞輸送の妨害に例示されるような有機アニオンの肝臓輸送または腎臓輸送の妨害のような所望しない副作用を有するか否かである。経費削減のためには、開発の早い段階で薬剤候補のかかる副作用を検出することが望ましい。これまで、薬剤候補の潜在的な副作用の研究では動物または細胞培養物を使用した。しかしながら、これらのアプローチは、種々の不都合、例えば、時間とコストの浪費を提示し、薬剤候補などのハイスループットスクリーニングが可能でない。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、現在使用されているシステムの不都合を克服する、体内で生成するか、または通常体内に存在する物質の輸送の薬剤候補による妨害、特に有機アニオンの肝臓輸送または腎臓輸送の妨害の効率的な解析のための手段を提供することである。
【０００６】
本発明によれば、このことは、特許請求の範囲に記載された主題により達成される。特定のヒト取込み輸送体および輸出輸送体を有する細胞株、すなわち、基底外膜において有機アニオンの組換え取込み輸送体を永続的に発現し、頂端側膜においてアニオン性コンジュゲートのＡＴＰ依存性輸出ポンプを永続的に発現する二重トランスフェクトＭＤＣＫ細胞株を樹立した。側底側取込みは、ヒト有機アニオン輸送体ＯＡＴＰ８（記号ＳＬＣ２１Ａ８）により媒介され、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２；記号ＡＢＣＣ２）による頂端側輸出が続く。生理学的条件下では、両方の輸送タンパク質が肝細胞において強く発現され、有機アニオンの肝胆管排除に寄与する。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長しているＭＤＣＫ細胞におけるＯＡＴＰ８およびＭＲＰ２の発現および局在は、イムノブロットおよび共焦点レーザー走査顕微鏡検査により示された。 3Ｈ−標識スルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）を両輸送タンパク質の基質とし、二重トランスフェクトＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞により、単独トランスフェクトＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８またはＭＤＣＫ−ＭＲＰ２細胞よりも少なくとも６倍速い速度で側底側画分から頂端側画分に移動した。単独トランスフェクト細胞よりもずっと高速での二重トランスフェクト細胞による一方向性輸送もまた、3 Ｈ−標識された基質ロイコトリエンＣ4 、１７ｂ−グルクロノシルエストラジオールおよび硫酸デヒドロエピアンドロステロンと、蛍光アニオン性基質ｆｌｕｏ−３と、抗生物質リファンピシンとで観察された。阻害研究により、２，４−クロロジニトロベンゼンからのＳ−（２，４−ジニトロフェニル）−グルタチオンの細胞内形成が、ＭＲＰ２−媒介性輸出の部位で［3 Ｈ］ＢＳＰの経細胞輸送を選択的に阻害することが示された。
【０００７】
ＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８の新しい基質の同定により、二重トランスフェクト細胞株がこれらの輸送体の特性付けに有用であることが示された。ＯＡＴＰ８またはＭＲＰ２のいずれかで個別にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞との比較において、二重トランスフェクタントはいくつかの利点を有する。ＭＲＰ２の基質のほとんどは生理学的条件下で負に帯電し、したがって、取込み輸送体なしでは原形質膜を貫通できないため、これまでは細胞全体におけるＭＲＰ２機能を研究するのが困難であった。したがって、ＭＲＰ２は、たいてい、ＭＲＰ２発現細胞から調製した反転膜小胞を用いて研究されている。ＯＡＴＰ８およびＭＲＰ２を発現する二重トランスフェクトＭＤＣＫ細胞ならびに両輸送体の基質である［3 Ｈ］ＢＳＰおよびＦｌｕｏ−３のような化合物を用いると、細胞がインタクトなままでＭＲＰ２インヒビターをより容易にスクリーニングし得る。ＭＲＰ２のみのインヒビターは、経細胞輸送を阻害し、［3 Ｈ］ＢＳＰの細胞内蓄積を増強する。ＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８の両方のインヒビターは、［3 Ｈ］ＢＳＰの細胞内蓄積よりも経細胞輸送をより強く低減させる。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させた二重トランスフェクト細胞の取扱いは、膜小胞の調製および取扱いと比べて容易なため、二重トランスフェクト細胞の使用によるＭＲＰ２インヒビターのハイスループットスクリーニングシステムを開発することが可能である。ＯＡＴＰ８およびＭＲＰ２の両方の基質としての蛍光ペンタ−アニオンＦｌｕｏ−３の使用は、該スクリーニングをさらに容易にし得る。
【０００８】
結論として、本発明の二重トランスフェクト細胞は、薬剤候補を含む、輸送体基質および輸送体インヒビターの同定のための有用なシステムを提供する。本発明の二重トランスフェクト細胞株を使用することにより、例えば、肝臓、腎臓、腸または血液脳関門に存在する特定の輸送タンパク質に対する薬剤候補の阻害効果を調べることができる。
【０００９】
したがって、本発明は、（ａ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンの取込み輸送体をコードするＤＮＡ配列、および（ｂ）プロモーターと作動可能に連結された、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプをコードするＤＮＡ配列を含有してなる、好ましくは安定な、二重トランスフェクト細胞株を提供する。好ましくは、有機アニオンの組換え取込み輸送体は側底側細胞膜において発現され、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプは頂端側細胞膜において発現される。
【００１０】
好ましくは、細胞をトランスフェクトするためには、ＤＮＡ配列がベクターまたは発現ベクターに存在する。当業者は、その例をよく知っている。ＤＮＡ配列はまた、適切な発現カセットを含む組換えウイルス内に含まれ得る。本発明において使用され得る好適なウイルスとしては、バキュロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、ＳＶ４０、センダイウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルスまたはＭＶＭもしくはＨ−１などのパルボウイルスが挙げられる。ベクターはまた、ＭｏＭＵＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶもしくはＧａＬＶなどのレトロウイルスであり得る。哺乳動物における発現には、好ましい好適なプロモーターはヒトサイトメガロウイルス「極初期プロモーター」（ｐＣＭＶ）である。
【００１１】
上述のＤＮＡ配列を作製するため、および該ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを構築するため、当該技術分野で公知の一般的な方法を使用することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換え技術、合成法および例えばＳａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載のようなインビボ組換え法が挙げられる。細胞のトランスフェクト法、トランスフェクタントの表現型による選別法および上述のベクターを用いた本発明によるＤＮＡ発現法は、当該技術分野において公知である。
【００１２】
好ましくは、該細胞株はヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３である。特に好ましくは、分極細胞、例えば肝細胞、腎臓細胞、例えば、ＭＤＣＫＩＩまたはＨｅｐＧ２である。
【００１３】
本発明の二重トランスフェクト細胞株のさらに好ましい態様では、有機アニオンの取込み輸送体が、溶質担体（ＳＬＣ）スーパーファミリーのサブグループ２１Ａのメンバーである。特に好ましくは、ＯＡＴ１（ＳＬＣ２２Ａ６）（Ｈｏｓｏｙａｍａｄａら  １９９９）、ＯＡＴＰ２、ＯＡＴＰ８またはＯＡＴＰ−Ｂである。
【００１４】
本発明の二重トランスフェクト細胞株のより好ましい態様では、有機アニオンまたはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプが、ＡＢＣスーパーファミリーのＭＤＲ（ＡＢＣＢ）サブグループまたはＭＲＰ（ＡＢＣＣ）サブグループのメンバーである。特に好ましくは、胆汁酸塩輸出ポンプＢＳＥＰ（ＡＢＣＢ１１）または多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）である。ともにヒト腎臓近位管細胞で発現される（Ｔｏｊｏら  １９９９；Ｓｃｈａｕｂら  １９９９）ＯＡＴ１とＭＲＰ２の組み合わせは、有機アニオンの腎臓クリアランスの研究に役立ち得る。
【００１５】
さらにより好ましい本発明の二重トランスフェクト細胞株では、有機アニオンの取込み輸送体をコードするＤＮＡ配列および／または有機アニオンもしくはアニオン性コンジュゲートの輸出ポンプをコードするＤＮＡ配列が、高発現を可能にするプロモーターと作動可能に連結されている。
【００１６】
細胞内薬剤代謝の輸送に対する効果の調査の際、場合によっては、研究対象の薬剤に従って性質が変わり得る第３の化合物をコードするＤＮＡ配列で本発明の細胞をトランスフェクトすることが望ましい場合がある。
【００１７】
最後に、本発明は、二重トランスフェクト細胞株の種々の使用に関する。好ましい使用は、輸送体基質または輸送体インヒビター、特に薬剤候補の同定である。好適なアッセイ形式は、当業者に公知であり、例えば、以下の実施例に記載されている。好ましいアッセイ形式はハイスループットスクリーニングである。
【００１８】
略語
ＡＢＣ：ＡＴＰ−結合性カセットスーパーファミリー；ＢＳＥＰ：胆汁酸塩輸出ポンプ；ＢＳＰ：スルホブロモフタレイン；ＣＤＮＢ：１−クロロ−２，４−ニトロベンゼン；ＤＨＥＡＳ：デヒドロエピアンドロステロン３−硫酸塩；ＤｉＯＣ６（３）：ヨウ化３，３'-ジヘキシルオキサカルボシアニン；Ｅ2 １７ｂＧ：１７ｂ−グルクロノシルエストラジオール；Ｆｌｕｏ−３：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）］−２−（２'-アミノ−５’−メチル−フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸五アンモニウム塩；ＨＥＫ２９３：ヒト胚性腎臓細胞；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフフィー；ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン；Ｋm ：ミカエリス−メンテン定数；ＬＴＣ4 ：ロイコトリエンＣ4 ；ＭＤＣＫＩＩ：マジン−ダービーイヌ腎臓細胞、第ＩＩ株；ＭＲＰ２：多剤耐性タンパク質２；ＯＡＴ１：有機アニオン輸送体１；ＯＡＴＰ：ヒト有機アニオン−輸送ポリペプチド；ＯＣＴ１：有機カチオン輸送体１；ＳＬＣ：溶質担体スーパーファミリー；ＴＣ：タウロコレートまたはコリルタウリン；ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００１９】
本発明を実施例により説明する。
【００２０】
実施例１：材料および方法
（Ａ）  化学物質。［3 Ｈ］ＢＳＰ（０．５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）は、Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ（Ｋｏｅｌｎ、ドイツ）から通常の合成により得た（Ｃｕｉら  ２００１）。［１４，１５，１９，２０-3Ｈ］ＬＴＣ4 、［１，２，６，７-3Ｈ］デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（０．６ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、［3 Ｈ］コリルタウリン（７３ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）および１７ｂ−Ｄ−グルクロノシル［６，７-3Ｈ］エストラジオール（１．６ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ボストン、ＭＡ）から購入した。［14Ｃ］イヌリンカルボン酸（８２ＭＢｑ／ｇ）は、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｋｏｅｌｎ、ドイツ）から入手した。Ｆｌｕｏ−３（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）］−２−（２'-アミノ−５’−メチル−フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸五アンモニウム塩）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ、ドイツ）製であった。リファンピシン、リファマイシンＳＶ、アシビシンおよびＣＤＮＢは、Ｓｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から購入した。Ｇ４１８（ゲネティシン）硫酸塩は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）製であった。ハイグロマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）製であった。その他の分析上純粋な非放射性化学物質はＳｉｇｍａから入手した。
【００２１】
（Ｂ）  細胞培養およびトランスフェクション。ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）およびＭＤＣＫＩＩ（マジン−ダービー(Madin-Darby) イヌ腎臓の第ＩＩ株）細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した最少必須培地内で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ2 にて培養した。Ｃｕｉら  １９９９に記載のように、ＨＥＫ−ＭＲＰ２およびＨＥＫ−Ｃｏは、それぞれヒトＭＲＰ２  ｃＤＮＡおよび対照ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞であり、ＭＤＣＫ−ＭＲＰ２およびＭＤＣＫ−Ｃｏは、それぞれヒトＭＲＰ２  ｃＤＮＡおよび対照ベクターでトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞である。
【００２２】
ヒトＯＡＴＰ８  ｃＤＮＡ（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングし、ポリブレン法（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）を用いてＭＤＣＫＩＩ細胞内にトランスフェクトした。組換えＯＡＴＰ８を発現するトランスフェクタントをハイグロマイシン（９５０μＭ）で選択した。最も高度なＯＡＴＰ８発現を伴うクローン（ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８）を、完全長ヒトＭＲＰ２  ｃＤＮＡを有するベクター構築物ｐｃＤＮＡ３．１−ＭＲＰ２（Ｃｕｉら  １９９９）でさらにトランスフェクトした。９５０μＭハイグロマイシンおよび８００μＭ  Ｇ４１８二硫酸塩で３週間選択した後、トランスフェクタントをＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８の両方の発現についてイムノブロット解析によりスクリーニングした。最も高度なＭＲＰ２発現およびＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８細胞と類似するＯＡＴＰ８発現レベルを伴うクローンをＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８と命名し、さらなる研究のために選択した。
【００２３】
（Ｃ）  イムノブロット解析。以前に記載（Ｃｕｉら  １９９９）のようにして、粗製膜画分を培養ＭＤＣＫＩＩ細胞から調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）により分離した。ＯＡＴＰ８を、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．６）中１：５０００の希釈度でポリクローナル抗体ＳＫＴ（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）により検出した。ＭＲＰ２は、ＴＢＳ−Ｔ中１：１００００の希釈度でポリクローナル抗体ＥＡＧ５（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら、１９９６；ＫｅｐｐｌｅｒおよびＫａｒｔｅｎｂｅｃｋ、１９９６）により検出した。
【００２４】
（Ｄ）  共焦点レーザー走査免疫蛍光顕微鏡検査。ＭＤＣＫＩＩ細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート（直径６．５ｍｍ、孔径０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｂｏｄｅｎｈｅｉｍ、ドイツ）上にて、コンフルエントで３日間成長させ、１０ｍＭ酪酸ナトリウムで２４時間誘導させた（Ｃｕｉら  １９９９）。細胞をＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、１．５ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．４）中２．５％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間透過させ、室温で一次抗体とともに１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ中１：２５の希釈度のポリクローナル抗体ＳＫＴ（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）およびＰＢＳ中１：２０の希釈度のモノクローナルマウス抗体Ｍ2 ＩＩＩ６（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を、それぞれＯＡＴＰ８およびＭＲＰ２を染色するために使用した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体とともにインキュベートした。Ｃｙ２とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＣｙ３とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から入手し、ＰＢＳ中１：２００の希釈度で使用した。次いで、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を膜インサートから切出し、ＰＢＳ中５０％グリセロールを用いてスライド上に載せた。Ｚｅｉｓｓ（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）製のＬＳＭ５１０装置を用いて共焦点レーザー走査顕微鏡検査を行なった。
【００２５】
（Ｅ）  輸送解析。輸送解析のため、ＭＤＣＫＩＩ細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート（直径２４ｍｍ、孔径０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）上にて、コンフルエントで３日間成長させ、１０ｍＭ酪酸ナトリウムで２４時間誘導させた。細胞をまず輸送バッファー（１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ2 ＰＯ4 、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ2 、５ｍＭグルコースおよび１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）で洗浄し、続いて、 3Ｈ−標識基質を加えた輸送バッファーを、頂端側画分（１ｍｌ）または側底側画分（１．５ｍｌ）のいずれかに添加した。示された時間後、反対の画分内の放射能を測定した。放射能の細胞内蓄積を、０．２％ＳＤＳ含有水２ｍｌで細胞を溶解し、細胞溶解物内の放射能を測定することにより測定した。
【００２６】
Ｆｌｕｏ−３の経細胞輸送を調べるため、細胞を、２μＭ  Ｆｌｕｏ−３とともに側底側画分内で３７℃にて３０分間インキュベートした。頂端側画分内のＦｌｕｏ−３の蛍光を、１．５ｍＭ  Ｃａ2+（Ｎｉｅｓら  １９９８）の存在下、５０６ｎｍの励起波長（５ｎｍバンド幅）および５２６ｎｍの発光波長（１０ｎｍバンド幅）で、ＲＦ−５１０蛍光分光計（シマズ、Ｄｕｉｓｂｕｒｇ、ドイツ）により測定した。
【００２７】
リファンピシンの経細胞輸送を調べるため、細胞を、５０μＭリファンピシンとともに側底側画分内で３７℃にて３０分間インキュベートした。頂端側画分内のリファンピシンの濃度を調べるため、その４７５ｎｍでの吸光度を分光測光計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ＩＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）により測定した。リファンピシンの濃度の計算のための検量線を１〜５０μＭの濃度範囲で測定した。
【００２８】
阻害実験のため、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）以外は、インヒビターを［3 Ｈ］ＢＳＰと同時に側底側画分内に添加した。この場合、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫＩＩ細胞を、ＣＤＮＢとともに頂端側画分内および側底側画分内の両方において、輸送バッファー中で２０分間、室温でプレインキュベートした。次いで、側底側画分内のバッファーを、ＣＤＮＢおよび［3 Ｈ］ＢＳＰを含有する新しいバッファーと交換することにより経細胞輸送を開始した。
【００２９】
経細胞漏出を、５０μＭ［14Ｃ］イヌリンカルボン酸とともに細胞を側底側画分内において３０分間インキュベートし、頂端側画分内の放射能を測定することにより測定した。本研究で使用したすべての４つのＭＤＣＫＩＩ細胞株について、経細胞漏出は１％未満であった。
【００３０】
［3 Ｈ］ＢＳＰのＨＰＬＣ解析。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞を、両方の画分における５ｍＭアシビシン（ｇ−グルタミルトランスフェラーゼのインヒビター）（Ａｌｌｅｎら  １９８０）との３０分間３７℃でのプレインキュベーション後、側底側画分内において３０分間３７℃で１μＭ［3 Ｈ］ＢＳＰとともにインキュベートした。頂端側画分内および細胞溶解物内の放射能をＨＰＬＣにより測定した。Ｃ18Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５ｍｍ粒子；Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）上での逆相ＨＰＬＣを、Ｃｕｉら  ２００１に記載のようにして、１００％バッファーＡ（ｐＨ６．０で２ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウムを含有する４５％メタノール／５５％水）から１００％バッファーＢ（ｐＨ６．０で２ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウムを含有する９０％メタノール／１０％水）の直線勾配溶離液を用い、流速１ｍｌ／分で行なった。１ｍＭ  ＧＳＨ、０．４ｍＭ［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＣｉ）および５ｍＭアシビシンを３５０μｌマウス肝臓サイトゾルとともに最終容量５００μｌで１時間３７℃にてインキュベートすることにより、［3 Ｈ］ＢＳＰ−ＳＧをＨＰＬＣ解析のために合成した。３容量のメタノールでの除タンパク後、上述のようにして２００μｌの上清みをＨＰＬＣにより解析した。
【００３１】
小胞輸送研究。[3H]BSP の膜小胞への輸送を迅速濾過法(Kepplerら、1998) により測定した。簡単には、膜小胞(30 μg タンパク質) を最終容量55μl のインキュベーションバッファー(250mMスクロース、10mM Tris/HCl 、pH7.4)中4mM のATP 、10mMのクレアチンリン酸、100 μg/mlのクレアチンキナーゼ、および[3H]BSP の存在下で37℃にてインキュベートした。アリコート(15 μl)を指示された時点で取り出し、1ml の氷冷インキュベーションバッファー中で希釈し、予浸ニトロセルロース膜(0.2μm 孔径、Schleicher & Schuell, Dassel Germany) を介して直ちに濾過した。フィルターを5ml のインキュベーションバッファーで2 回リンスし、液体シンチレーション流体中に溶解し、放射能をカウントした。対照実験では、ATP を等濃度の5'-AMPと置き換えた。ATP の存在下で得られた値から5'-AMPの存在下で得られた値を引くことにより、ATP-依存性輸送を計算した。
【００３２】
実施例２：MDCKII細胞における組換えヒトOATP8 およびMRP2の発現および局在
トランスフェクトされたMDCKII細胞におけるヒトOATP8 およびMRP2の発現を最初に免疫ブロッティングにより解析した（図１）。図1Aに示されるように、MRP2 cDNA のみでトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-MRP2) 、またはOATP8 cDNAおよびMRP2 cDNA の両方でトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-MRP2/OATP8) において、抗体EAG5によりMRP2発現を検出した。OATP8 cDNAのみでトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-OATP8)およびMDCK-MRP2/OATP8 細胞において抗体SKT によりOATP8 の発現を検出した（図1B）。本発明者らの初期の報告(Koenig ら、2000b)と一致して、ヒトOATP8 の十分なグリコシル化型は、約120kDaの見掛けの分子量を有し、抗体SKT により検出されたより低い見掛けの分子量を有するバンドは、OATP8 の非グリコシル化(under-glycosylated)型から生じた。対照ベクターを用いてトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-Co) において、ヒトOATP8 もMRP2もその発現は検出され得なかった（図１）。
【００３３】
トランスフェクタントにおける組換え輸送体の細胞局在を、免疫蛍光検査および共焦点レーザー走査顕微鏡検査により調査した。MDCK-OATP8細胞において、側底側細胞膜中で抗体SKT を用いてOATP8 を染色し得た（図2AおよびD ）。これらの細胞において、OATP8 のいくつかの細胞内染色もまた観察した。特異的に小胞体を染色する抗体SKT およびDiOC6(3)を用いる二重標識実験(Terasaki ら、1984) は、細胞内OATP8 画分がERに局在されることを指摘した（示さず）。OATP8 の部分的ER局在は、その生物発生に対応し、免疫ブロット解析において観察された非グリコシル化OATP8 の存在に一致する（図1B）。MDCK-MRP2/OATP8 細胞において、OATP8 の側面の出現に加えて、MRP2は頂端側細胞膜に局在した（図2B、C 、E およびF ）。図2Bは、核の面に焦点をあわせた画像を示し、ここではOATP8 のみがこの面において目で見ることができた。図2Cは、細胞の上面に焦点をあわせた画像を示し、ここではMRP2染色を見ることができた。縦断面において、OATP8 およびMRP2の両方を目で見ることができた（図2Eおよび2F）。図３は、それぞれのトランスフェクト細胞株による一方向性輸送における両方の組換え輸送体の役割を概略的に示す。
【００３４】
実施例３：OATP8 およびMRP2により媒介される[3H]BSP の経細胞輸送
二重トランスフェクト細胞におけるヒトOATP8 およびMRP2の機能を、ヒトOATP8 の基質である有機アニオン[3H]BSP の経細胞輸送の測定(Koenig ら、2000b 、Cui ら、2001) により調査した。したがって、Transwell 膜インサート上で増殖した分極したMDCKII細胞を、側底側画分中で1 μM の濃度の[3H]BSP と共にインキュベートした。種々の時点で、頂端側画分中および細胞中に蓄積した放射能を測定した。図4Aに示されるように、[3H]BSP の細胞内蓄積は、OATP8 cDNAのみでトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-OATP8)またはOATP8 cDNAおよびMRP2 cDNA の両方でトランスフェクトされたMDCKII細胞(MDCK-MRP2/OATP8) において、対照トランスフェクト細胞(MDCK-Co) およびMRP2トランスフェクト細胞(MDCK-MRP2) よりも有意に高く、OATP8 が[3H]BSP の細胞内蓄積に必要であることを示した。しかしながら、頂端側画分における放射能を測定した場合、MDCK-Co 、MDCK-MRP2 、およびMDCK-OATP8細胞について側底側画分から頂端側画分への[3H]BSP の有意な移動は観察し得ず（図4B）、一方、[3H]BSP の著しい経細胞輸送がMDCK-MRP2/OATP8 細胞で観察し得た（図4B）。図4Cは、MDCK-OATP8細胞によるよりもMDCK-MRP2/OATP8 細胞による[3H]BSP のより高い全取り込み（細胞内蓄積＋経細胞輸送）を示す。
【００３５】
MDCK-MRP2/OATP8 細胞による[3H]BSP の経細胞輸送は、図5Aに示されるように方向性プロセスであった。[3H]BSP の側底側から頂端側への輸送のみが観察され、一方、頂端側から側底側への輸送はごくわずかであった。このことは、二重トランスフェクタントにおけるOATP8 およびMRP2の細胞局在、およびMRP2媒介性輸送の一方向性から予期された（図３）。
【００３６】
MDCK-OATP8およびMDCK-MRP2/OATP8 細胞と1 μM の[3H]BSP との30分間の側底側画分におけるインキュベーションの後、[3H]BSP の流出を測定した。図5Bに示されるように、[3H]BSP は主に側底側細胞膜を横切ってMDCK-OATP8細胞から放出され、一方、それは、主に頂端側細胞膜を横切ってMDCK-MRP2/OATP8 細胞から送出された。30分の流出実験後、細胞に残っている放射能を比較した場合、MDCK-MRP2/OATP8 細胞は、MDCK-OATP8細胞よりも有意に低い細胞内[3H]BSP レベルを示し、頂端側細胞膜におけるMRP2を介する効率的な送出を示した。
【００３７】
実施例４：BSP のグルタチオンS-コンジュゲートではなくBSP それ自身が二重トランスフェクトMDCK細胞においてMRP2により輸送される
ラット肝臓における研究は、BSP が主にグルタチオンコンジュゲートとして胆汁に分泌されることを示した(Combs 1965; Klaassen およびPlaa 1967)。これがまた二重トランスフェクタントについて真実であるかどうかを調査するために、本発明者らは、側底側画分において1 μM の[3H]BSP とMDCK-MRP2/OATP8 細胞の30分間のインキュベーションの後、MDCK-MRP2/OATP8 細胞の頂端側画分における放射能を放射-HPLC によりチェックした。頂端側画分（図6B）および細胞（図6C）において蓄積された大部分の放射能（＞98％）は、コンジュゲートしていない[3H]BSP （図6A）と同じ保持時間（17分）を示した。[3H]BSP-SGの小さなピークのみ（保持時間15分）が、頂端側画分において観察された（図6B）。これらの結果は、BSP は、ヒトOATP8 により取り込まれ、かつ経細胞輸送の間、MRP2に対する基質であるBSP のグルタチオンS-コンジュゲートであるよりむしろBSP 自身であることを示唆する。この仮説を確かめるために、本発明者らは、HEK-MRP2細胞から調製された反転膜小胞への[3H]BSP の輸送を調査した（ヒトMRP2でトランスフェクトされたHEK293細胞、Cui ら、1999）。図7Aに示されるように、[3H]BSP をHEK-MRP2細胞から膜小胞にATP 依存的に輸送した。HEK-MRP2細胞から膜小胞における[3H]BSP の蓄積は、対照トランスフェクトHEK-Co細胞から膜小胞におけるよりも有意に高く（図7B）、このことは、[3H]BSP は、ヒトMRP2に対する基質であることを示していた。BSP に対するK m 値が12μM であることをMRP2について決定した（図7C）。
【００３８】
実施例５：他の有機アニオンの経細胞輸送
OATP8 およびMRP2の両方の基質である他の有機アニオンの経細胞輸送もまた、調査した。[3H]ロイコトリエンC4(LTC4)、17b-グルクロノシル[3H]エストラジオール(E217bG)、および[3H]硫酸デヒドロエピアンドロステロン(DHEAS) は、OATP8 の基質としてすでに同定されている(Koenig ら、2000b ；Kullak-Ublick ら、2001；Cui ら、2001) 。[3H]LTC4および[3H]E217bGは、MRP2に対する高い親和性基質であることが示されている(Cuiら、1999) 。本発明者らの研究はまた、[3H]DHEAS をMRP2の基質として同定した(Gologan、Leier およびKeppler 、未発表データ、2001) 。[3H]BSP と同様に（図8A）、全３つの化合物は、MDCK-OATP8細胞またはMDCK-Co 細胞を横切るよりも非常に高速でMDCK-MRP2/OATP8 細胞を横切って輸送された( 図8B、C 、D)。Fluo-3は、蛍光化合物であり(Mintaら、1989) 、MRP2に対する良好な基質である(Nies ら、1998) 。上記他の化合物と同様に、Fluo-3は、MDCK-OATP8細胞単層と比較してより高い輸送速度でMDCK-MRP2/OATP8 細胞単層を横切って輸送され( 図8E) 、このことは、Fluo-3がまたヒトOATP8 に対する基質であることを示唆した。
【００３９】
図8Fにおいて、ヒトOATP8 に対する基質でなく(Koenig ら、2000b 、Cui ら、2001) 、MRP2に対する基質でもない(Madonら、1997)[3H] コリルタウリン(TC)の経細胞輸送を調査した。試験した他の化合物とは異なって、[3H]コリルタウリンは、非常に高速で３つ全てのMDCKII細胞株を横切って輸送されたが、MDCK-Co 細胞、MDCK-OATP8細胞およびMDCK-MRP2/OATP8 細胞間で輸送速度における差異は観察されなかった。MDCK細胞による[3H]コリルタウリンに対する高い輸送速度は、おそらく胆汁塩に対する内因性の輸送系の発現の結果である。
【００４０】
実施例６：経細胞[3H]BSP 輸送の阻害
拡散を介して細胞に入ると考えられている疎水性化合物CDNBは、細胞内部でグルタチオンとコンジュゲートされ、次にMRP2を介してポンプで送り出される(Eversら、1998) 。CDNBのこれらの特性は、OATP8 により媒介される取り込みとMRP2により媒介される送出を本発明者らが識別することを可能にする。経細胞[3H]BSP 輸送の測定前に、トランスフェクトされたMDCK細胞を種々の濃度のCDNBと室温で20分間予めインキュベートした。図9Aに示されるように、MDCK-OATP8細胞における[3H]BSP の細胞内蓄積および経細胞輸送は、50μM の濃度までCDNBにより阻害されなかった。しかしながら、CDNBはMDCK-MRP2/OATP8 細胞上で全く異なる影響を及ぼした。CDNBとの予めのインキュベーションにより、[3H]BSP の細胞内蓄積は増し、一方、[3H]BSP の経細胞輸送は著しく阻害された( 図9B) 。これらの結果は、細胞内部でのジニトロフェニルグルタチオンの形成後、CDNBは[3H]BSP のOATP8 媒介性取り込みに影響を及ぼさないが、 [3H]BSPのMRP2- 媒介性送出を阻害することを示す。
【００４１】
本発明者らは、ヒト血清アルブミン(HSA) が、おそらく非常に高い親和性で[3H]BSP を結合することにより、[3H]BSP のOATP8 媒介性取り込みを強く阻害することを最近報告している(Cuiら、2001) 。したがって、本発明者らは、ここでMDCKIIトランスフェクタントを横切った[3H]BSP の経細胞輸送におけるHSA の影響を調査した。5 μM のHSA の存在下で、MDCK-OATP8細胞における[3H]BSP のOATP8 媒介性蓄積がほぼ完全に抑制された（図9C）。MDCK-MRP2/OATP8 細胞においてもまた、[3H]BSP 蓄積は、HSA により強く阻害された（図9D）。その結果として、[3H]BSP の経細胞輸送もまた、MDCK-MRP2/OATP8 細胞において減少した（図9D）。
【００４２】
OATP8 トランスフェクトHEK293細胞への[3H]E217bGのOATP8 媒介性取り込みは、抗生物質リファンピシンおよびリファマイシンSVにより阻害されうる(Cuiら、2001) 。図9E〜H は、両方の抗生物質がOATP8 およびMRP2の両方を強く妨げることを説明する。本発明者らの初期の研究 (Cui ら、2001) と一致して、両方の抗生物質は、MDCK-OATP8細胞における[3H]BSP の細胞内蓄積を阻害した（図9EおよびG ）。しかしながら、MDCK-MRP2/OATP8 細胞において、[3H]BSP の細胞内蓄積は、対照の約50％まで抑制されたのみであり、一方、[3H]BSP の経細胞輸送は、リファンピシンおよびリファマイシンSVにより、より強く阻害された（図9GおよびH ）。これらの結果は、両方の化合物がMRP2媒介性送出をさらに阻害することを示唆する。このことは、HEK-MRP2細胞由来の膜小胞を用いる輸送研究により確認される。50μM の濃度のリファンピシンは、HEK-MRP2膜小胞への[3H]LTC4輸送を対照の50％まで阻害し、50μM のリファマイシンSVは、HEK-MRP2膜小胞へのLTC4輸送を対照の38％まで阻害した。
【００４３】
実施例７：リファンピシンの経細胞輸送
リファンピシンはヒトOATP8 およびMRP2の両方を強く阻害するので、本発明者らは、リファンピシンそれ自身の経細胞輸送が本発明者らの二重トランスフェクタントを用いて測定されうるかどうかに興味があった。本発明者らは、その濃度を決定するために475nm のリファンピシンの強い吸収を利用した。1 μM ほど低いリファンピシン濃度が、この方法により測定され得た。図10に示されるように、MDCK-MRP2/OATP8 細胞で、他の３つのMDCKIIトランスフェクタント細胞株と比較して、リファンピシンの有意に高い経細胞輸送が観察されうる。これらの実験において約50μM のリファンピシン濃度は、測光法により検出される量で頂端側画分へのリファンピシン輸送を得るために本発明者らが使用しうる最も少ないものであった。
【００４４】
実施例８：さらなる二重トランスフェクト細胞株
上記二重トランスフェクト細胞株MDCK-MRP2/OATP8 に加えて、２つのさらなる二重トランスフェクト細胞株を同じ様式で発生させた：MDCK-OAT1/MRP2およびMDCK-OATP2/MRP2 。側底側有機アニオン輸送体OAT1（遺伝子記号：SLC22A6 ；Hosoyomadaら、1999）および頂端側送出ポンプMRP2の組み合わせは、腎臓輸送プロセスにおける研究のためのモデル系を表す。側底側有機アニオン輸送体OATP2 （Abe ら、1999；Hsiangら、1999；Koenigら、2000a ）および頂端側送出ポンプMRP2の組み合わせは、肝臓輸送プロセスにおける研究のためのモデル系を表す。二重トランスフェクト細胞株における組換え輸送タンパク質の正しい局在が、免疫蛍光検査共焦点レーザー走査顕微鏡検査により示された（図11）。
【００４５】
実施例９：p-アミノ馬尿酸塩の経細胞輸送
二重トランスフェクト細胞株MDCK-OAT1/MRP2の輸送活性を、広く使用されるモデル化合物p-アミノ馬尿酸塩(PAH) の使用により調査した。PAH は、有機アニオンの腎臓分泌における研究に使用されている。腎臓隣接面の細管上皮において、PAH は、側底側細胞膜でOAT1により血液から吸収される(Hosoyamada ら、1999) 。続いて、PAH は、MRP2によりATP 依存的に尿に分泌される(Leierら、1999) 。図12に示されるように、PAH の経細胞輸送の速度は、対照トランスフェクト細胞株MDCK-Co および単独トンランスフェクト細胞株MDCK-OAT1 よりも二重トランスフェクト細胞株MDCK-OAT1/MRP2において有意に高い。
【００４６】
実施例10：BSP の経細胞輸送
二重トランスフェクト細胞株MDCK-OAT2/MRP2の輸送活性を、モデル化合物BSP の使用により調査した。図13に示されるように、BSP の経細胞輸送の速度は、対照トランスフェクト細胞株MDCK-Co および単独トンランスフェクト細胞株MDCK-OATP2よりも二重トランスフェクト細胞株MDCK-OAT2/MRP2において有意に高い。
【００４７】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、トランスフェクトＭＤＣＫ細胞内でのＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８のイムノブロット解析の図である。対照ベクターにより永続的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−Ｃｏ）、ヒトＭＲＰ２により永続的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−ＭＲＰ２）、ヒトＯＡＴＰ８により永続的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８）または両ＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８  ｃＤＮＡにより永続的にトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８）からの粗製膜画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ａ：ヒトＭＲＰ２はポリクローナル抗体ＥＡＧ５（ＫｅｐｐｌｅｒおよびＫａｒｔｅｎｂｅｃｋ  １９９６；Ｓｃｈａｕｂら  １９９９）により検出した。Ｂ：ヒトＯＡＴＰ８はポリクローナル抗体ＳＫＴ（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）により検出した。ＯＡＴＰ８の場合、完全にグリコシル化された形態のみ矢印で示すが、約９０ｋＤａにおけるバンドは、該タンパク質の非グリコシル化形態を示す（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）。
【図２】図２は、ＭＤＣＫ細胞における組換えＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８の免疫学的局在の図である。ＯＡＴＰ８のみを発現するＭＤＣＫ細胞（Ａ，Ｄ）またはＭＲＰ２およびＯＡＴＰ８の両方を発現するＭＤＣＫ細胞（Ｂ，Ｃ，ＥおよびＦ）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させ、共焦点レーザー走査顕微鏡検査により調べた。ＯＡＴＰ８（緑蛍光）およびＭＲＰ２（赤蛍光）は、それぞれ、ポリクローナル抗体ＳＫＴ（Ｋｏｅｎｉｇら  ２０００ｂ）およびモノクローナル抗体Ｍ2 ＩＩＩ６（Ｅｖｅｒｓら  １９９８）を用いて染色した。ＡおよびＢは、細胞単層の中間に焦点化した正面図であり、Ｃは、細胞単層の上部に焦点化した正面図である。Ｄ、ＥおよびＦは、Ａ、ＢおよびＣにおける白線により示された位置の縦断面である。ＯＡＴＰ８の横方向局在に加えて、このタンパク質のいくらかの細胞内染色が縦断面に見られる。ＭＲＰ２のみが頂端側膜に局在している（Ｅ，Ｆ）。バー、１０μｍ。
【図３】図３は、分極単層としてのＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長しているＭＤＣＫトランスフェクタントの概略図である。培養培地に面する頂端側膜は、密着結合により膜支持体に面する基底外膜から分離される。輸出ポンプＭＲＰ２は頂端側膜に局在するが、取込み輸送体ＯＡＴＰ８は基底外膜に局在する。
【図４】図４は、［3 Ｈ］ＢＳＰの経細胞輸送の図である。ＭＤＣＫ−Ｃｏ（ｅ）、ＭＤＣＫ−ＭＲＰ２（ｓ）、ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８（ｃ）およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８（ｇ）細胞は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させた。［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＭ）を側底側画分に与えた。示された時間点において、頂端側画分における放射能（経細胞［3 Ｈ］ＢＳＰ輸送）および細胞内における放射能（細胞内［3 Ｈ］ＢＳＰ蓄積）を測定した。［3 Ｈ］ＢＳＰの全取込みを、細胞内放射能および頂端側放射能の合計として算出した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。ほとんどの測定値について、標準偏差は記号(symbol)のサイズ内であった。
【図５】図５は、［3 Ｈ］ＢＳＰの一方向性輸送および流出の図である。ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させた。Ａ：［3 Ｈ］ＢＳＰの一方向性輸送。［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＭ）を側底側画分（Ｂ（登録商標）Ａ）または頂端側画分（Ａ（登録商標）Ｂ）のいずれかに与えた。３７℃で１５分後、反対側の画分での放射能を測定した。Ｂ：［3 Ｈ］ＢＳＰの流出。ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞を、側底側画分内で［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＭ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を低温バッファーで洗浄し、［3 Ｈ］ＢＳＰを含まないバッファーで３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、側底側画分内および頂端側画分内および細胞内部に放出された放射能を測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。
【図６】図６は、［3 Ｈ］ＢＳＰのＨＰＬＣ解析の図である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞を、側底側画分内で１μＭ  ［3 Ｈ］ＢＳＰとともに３７℃で３０分間インキュベートした。頂端側画分内の培地および細胞溶解物を、「材料および方法」に記載のようにしてラジオＨＰＬＣにより解析した。Ａ：真正［3 Ｈ］ＢＳＰ（Ｃｕｉら  ２００１）；Ｂ：頂端側画分内で回収された放射能；Ｃ：細胞内に蓄積された放射能。［3 Ｈ］ＢＳＰ（矢印の頂端側）および［3 Ｈ］ＢＳＰのグルタチオンＳ−コンジュゲート（［3 Ｈ］ＢＳＰ−ＳＧ、矢印）を示す。［3 Ｈ］ＢＳＰ−ＳＧのグルタチオン部分の分解インヒビターであるアシビシンをインキュベーション物に５ｍＭの濃度で添加した。
【図７】図７は、ヒトＭＲＰ２による［3 Ｈ］ＢＳＰのＡＴＰ依存性輸送の図である。Ａ：ヒトＭＲＰ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−ＭＲＰ２）由来の反転膜小胞を、ＡＴＰ（ｇ）または５’−ＡＭＰ（ｃ）の存在下で１μＭの［3 Ｈ］ＢＳＰとともにインキュベートした。Ｂ：ＨＥＫ−ＭＲＰ２細胞（ｇ）またはＨＥＫ−Ｃｏ細胞（ｃ）由来小胞内への［3 Ｈ］ＢＳＰの正味ＡＴＰ依存性輸送を、５’−ＡＭＰの存在下で測定した値からＡＴＰの存在下で測定した値を引くことにより算出した。Ｃ：ＢＳＰに対するヒトＭＲＰ２のＫm 値を１〜１０μＭのＢＳＰ濃度で測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。
【図８】図８は、有機アニオンの経細胞輸送の図である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫ−Ｃｏ、ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞を、［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＭ）、［3 Ｈ］ＬＴＣ4 （０．５μＭ）、［3 Ｈ］Ｅ2 １７ｂＧ（５μＭ）、［3 Ｈ］ＤＨＥＡＳ（５μＭ）、Ｆｌｕｏ−３（２μＭ）または［3 Ｈ］コリルタウリン（５μＭ）とともに側底側画分内で３７℃にてインキュベートした。次いで、３０分後に頂端側画分内の放射能（標識物質）または蛍光（Ｆｌｕｏ−３）を測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。
【図９】図９は、［3 Ｈ］ＢＳＰの経細胞輸送の阻害の図を示す。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ）およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ）細胞を、［3 Ｈ］ＢＳＰ（１μＭ）とともに側底側画分内で、異なる濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｃ，Ｄ）、リファンピシン（Ｅ，Ｆ）またはリファマイシンＳＶ（Ｇ，Ｈ）の存在下でインキュベートした。２，４−クロロ−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）（Ａ，Ｂ）では、細胞をＣＤＮＢとともに室温で２０分間プレインキュベートし、側底側画分内のバッファーを、［3 Ｈ］ＢＳＰおよびＣＤＮＢを含有する新しいバッファーと交換することにより［3 Ｈ］ＢＳＰの輸送を開始した。３７℃で３０分間インキュベーション後、頂端側画分内および細胞内部の放射能を測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。
【図１０】図１０は、リファンピシンの経細胞輸送の図である。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させたＭＤＣＫ−Ｃｏ、ＭＤＣＫ−ＭＲＰ２、ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ８およびＭＤＣＫ−ＭＲＰ２／ＯＡＴＰ８細胞を、５０μＭリファンピシンとともに側底側画分内で３７℃で３０分間インキュベートした。頂端側画分内のリファンピシンの濃度を、４７５ｎｍでのリファンピシンの特異的吸収により測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。
【図１１】図１１は、二重トランスフェクト細胞株内での組換え輸送タンパク質の免疫学的局在の図である。ＯＡＴ１およびＭＲＰ２（Ａ，Ｃ）またはＯＡＴＰ２およびＭＲＰ２（Ｂ，Ｄ）でトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させた。組み換えＭＲＰ２を抗血清ＥＡＧ５（Ａ，Ｃ内の緑）または市販の抗体Ｍ2 ＩＩＩ６（Ｂ，Ｄ内の赤）で染色した。組換えＯＡＴ１を、ＯＡＴ１のカルボキシ末端のエピトープに対する市販のモノクローナル抗体で染色した（Ａ，Ｃ内の赤）。組換えＯＡＴＰ２は、ポリクローナル抗血清ＥＳＬで染色した（Ｂ，Ｄ内の緑）。両方の二重トランスフェクト細胞株において、ＭＲＰ２は、分極ＭＤＣＫＩＩ細胞の頂端側膜に局在した。ＯＡＴ１およびＯＡＴＰ２は、それぞれの細胞株の基底外膜内でのみ検出された。
【図１２】図１２は、ＭＤＣＫ−ＯＡＴ１／ＭＲＰ２細胞によるパラ−アミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）の経細胞輸送の図である。対照ベクターでトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−Ｃｏ）、ＯＡＴ１でトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−ＯＡＴ１）またはＯＡＴ１とＭＲＰ２の両方でトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−ＯＡＴ１／ＭＲＰ２）をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させ、３７℃で側底側画分に添加した１０μＭ［3 Ｈ］ＰＡＨとともにインキュベートした。頂端側画分内に蓄積された放射能を３０分後に測定した。
【図１３】図１３は、ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ２／ＭＲＰ２細胞によるＢＳＰの経細胞輸送の図である。対照ベクターでトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−Ｃｏ）、ＯＡＴＰ２でトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ２）またはＯＡＴＰ２とＭＲＰ２の両方でトランスフェクトしたＭＤＣＫＩＩ細胞（ＭＤＣＫ−ＯＡＴＰ２／ＭＲＰ２）をＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜インサート上で成長させ、３７℃で側底側画分に添加した１μＭ［3 Ｈ］ＢＳＰとともにインキュベートした。頂端側画分内に蓄積された放射能を３０分後に測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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