(57)【要約】本発明は、凝固活性を有するヒト凝固因子ＶＩＩａ変異型ならびにこのような変異型をコードする核酸構築物、ベクターおよび核酸を含んでなりかつそれを発現する宿主細胞、医薬組成物、使用および治療法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項２〜７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１、３〜８のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１の位置３３４におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜２、４〜９のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１の位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜３、５〜１０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１の位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜４、６〜１１のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１の位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜５、７〜１２のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１の位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜６、８〜１３のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１５】
プロテアーゼドメイン中の残りの位置における少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１６】
プロテアーゼドメイン中の残りの位置における最大２０のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１５に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１の１５９〜１７０から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１５〜１６のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１の２９０〜３１２から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１５〜１７のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１の３３０〜３３９から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、請求項１５〜１８のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される３つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される４つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される５つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される６つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成るアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号１の位置１５７における前記ＬｙｓがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項１、８、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１の位置３３７における前記ＬｙｓがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項２、９、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１の位置３３４における前記ＡｓｐがＧｌｙ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項３、１０、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１の位置３３６における前記ＳｅｒがＧｌｙ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項４、１１、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号１の位置１５８における前記ＶａｌがＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項５、１２、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号１の位置２９６における前記ＧｌｕがＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項６、１３、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号１の位置２９８における前記ＭｅｔがＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、請求項７、１４、２０〜２６に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３４】
アミノ酸が核酸構築物によりコードことができる異なるアミノ酸により置換されている、請求項１〜２６のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３５】
前記因子ＶＩＩポリペプチドがヒト因子ＶＩＩである、請求項１〜３４のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３６】
前記因子ＶＩＩポリペプチドがヒト因子ＶＩＩａである、請求項１〜３４のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３７】
［Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、および ［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩから成る群から独立して選択される因子ＶＩＩポリペプチドである、請求項２０に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３８】
［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、および ［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩから成る群から独立して選択される因子ＶＩＩポリペプチドである、請求項２１に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項３９】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩである、請求項２２に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項４０】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩである、請求項２３に記載の因子ＶＩＩポリペプチド。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物。
【請求項４２】
ベクターである、請求項４１に記載の核酸構築物。
【請求項４３】
請求項４１に記載の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項４４】
哺乳動物由来である、請求項４３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４５】
細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫから成る群から選択される、請求項４４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４１に記載の核酸構築物を含有しかつそれを発現するトランスジェニック動物。
【請求項４７】
請求項４１に記載の核酸構築物を含有しかつそれを発現するトランスジェニック植物。
【請求項４８】
核酸構築物の発現を可能とする条件下に適当な増殖培地中で請求項４３〜４５のいずれかに記載の細胞を培養し、生ずるポリペプチドを培地から回収することを含んでなる、請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載のトランスジェニック動物により産生されたミルクから変異型を回収する、請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法。
【請求項５０】
請求項４７に記載のトランスジェニック植物の細胞を培養し、生ずる植物から変異型を回収することを含んでなる、請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法。
【請求項５１】
配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５２】
配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５３】
配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５４】
配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５５】
配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５６】
配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５７】
配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５８】
請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドと、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項５９】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６０】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６１】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６２】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６３】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６４】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６５】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用。
【請求項６６】
出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドの使用。
【請求項６７】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項６８】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項６９】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項７０】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項７１】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項７２】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項７３】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【請求項７４】
治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の請求項１〜４０のいずれかに記載の因子ＶＩＩポリペプチドを投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、凝固活性を有するヒト凝固因子ＶＩＩａ変異型ならびにこのような変異型をコードする核酸構築物、ベクターおよび核酸を含んでなりかつそれを発現する宿主細胞、医薬組成物、使用および治療法に関する。
【０００２】
発明の背景
血液凝固は、究極的にフィブリン凝固を発生させる種々の血液成分 （または因子） の複雑な相互作用から成るプロセスである。一般に、血液成分は凝固「カスケード」と呼ぶプロセスに参加し、アクチベーター （それ自体活性化された凝固因子である） の作用によりタンパク質分解酵素に変換される。このような変換を行った凝固因子一般に「活性因子」と呼び、そして凝固因子の名称への文字「ａ」に付加により表示される （例えば、ヒト因子ＶＩＩａ）。
【０００３】
止血プロセスの開始は、血管壁に対する外傷の結果暴露される組織因子とヒト因子ＶＩＩａとの間の複合体の形成により仲介される。次いで、この複合体は因子ＩＸおよびＸをそれらの活性形態に変換する。因子Ｘａは組織因子支持細胞上で制限された量のプロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは血小板および因子Ｖおよび因子ＩＩＩを因子Ｖａおよび因子ＶＩＩＩａに活性化し、それ以上のプロセスにおける両方のコファクターはトロンビンの完全な破裂に導く。このプロセスは因子Ｘａおよび因子ＩＸａ （因子ＶＩＩＩａとの複合体中の） の発生を含み、活性化された血小板上で起こる。トロンビンは最終的にフィブリノゲンをフィブリンに変換し、フィブリン凝固を形成する。近年において、因子ＶＩＩおよび組織因子は血液凝固の主要なイニシエーターであることが見出された。
【０００４】
因子ＶＩＩは血液中を一本鎖チモーゲンとして循環する微量の血漿糖タンパク質である。チモーゲンは触媒的に不活性である。一本鎖因子ＶＩＩをｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて因子Ｘａ、因子ＸＩＩａ、因子ＩＸａ、因子ＶＩＩａまたはトロンビンにより二本鎖因子ＶＩＩａに変換することができる。止血作用に関係するいくつかの他の血漿タンパク質と同様に、タンパク質のアミノ末端に密接してクラスターする、多数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化のために必要とされる活性のためにビタミンＫに因子ＶＩＩは依存する。これらのγ−カルボキシル化グルタミン酸は、因子ＶＩＩとリン脂質との金属イオン誘導相互作用のために要求される。チモーゲン因子ＶＩＩの活性化二本鎖分子への変換は、内部のＡｒｇ１６２−Ｉｌｅ１６３ペプチド結合の切断により起こる。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在において、二本鎖因子ＶＩＩａは制限されたタンパク質分解により因子Ｘまたは因子ＩＸを急速に活性化する。
【０００５】
被検体における凝固カスケードを改良することはしばしば望ましい。いくつかの原因を有する出血性障害、例えば、凝固因子 （例えば、血友病ＡおよびＢまたは凝固因子ＩＸまたはＶＩＩ） または凝固因子インヒビターを制御するために、因子ＶＩＩａは使用されてきている。また、正常に機能する血液凝固カスケードを有する （凝固因子障害または凝固因子のいずれかに対するインヒビターをもたない） 被検体における過度の出血の発生を防除するために、因子ＶＩＩａは使用されてきている。このような出血は、例えば、不十分な血小板機能、血小板減少症またはフォン・ウィルブランド病により引き起こされる。出血は、また、外科手術および他の形態の損傷と関連して主要な問題である。
【０００６】
欧州特許Ｎｏ． ２００，４２１ （ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）は、ヒト因子ＶＩＩをコードするヌクレオチド配列および哺乳動物細胞における因子ＶＩＩの組換え発現に関する。
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９６） ９３、１４３７９−１４３８４） は、Ｌｙｓ １５７、Ｖａｌ １５８、Ｇｌｕ ２９６、Ｍｅｔ ２９８、Ａｓｐ ３３４、Ｓｅｒ ３３６またはＬｙｓ ３３７がＡｌａにより個々に置換されている、因子ＶＩＩ変異型に関する。
【０００７】
Ｉｗａｎａｇａ ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｒｏｍｂｏ． Ｈａｅｍｏｓｔ． （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ａｕｇｕｓｔ １９９９）、４６６、ａｂｓｔｒａｃｔ １４７４） は、残基３１６〜３２０が欠失されているか、あるいは残基３１１〜３２２がトリプシンからの対応する残基で置換されている、ＦＶＩＩａ） に関する。
しかしながら、凝固活性を有する因子ＶＩＩａの変異型、比較的低い投与量で投与することができる高い活性を有する変異型、および望ましくない副作用、例えば、慣用治療に関連する、それぞれ、凝固系の系統的活性化および出血を生成しない変異型がなお必要とされている。
【０００８】
発明の説明
本発明は、凝固活性を有する凝固因子ＶＩＩａポリペプチドを提供する。
第１の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【０００９】
第２の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
第３の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１０】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１１】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはその変異型を含んでなり、配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型はＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１２】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチド。
【００１３】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１４】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される３つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１５】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される４つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１６】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される５つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１７】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成る群から独立して選択される６つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１８】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ、位置３３７におけるＬｙｓ、位置３３４におけるＡｓｐ、位置３３６におけるＳｅｒ、位置１５８におけるＶａｌ、位置２９６におけるＧｌｕおよび位置２９８におけるＭｅｔから成るアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩポリペプチドを提供する。
【００１９】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されておりかつ、必要に応じて、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における１または２以上の追加のアミノ酸残基が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、凝固因子ＶＩＩ変異型を提供する。
【００２０】
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
【００２１】
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置３３４におけるＡｓｐがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置３３６におけるＳｅｒがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
【００２２】
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置１５８におけるＶａｌがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置２９６におけるＧｌｕがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
【００２３】
用語「ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） 」は、本明細書において使用するとき、配列番号１の位置２９８におけるＭｅｔがアラニンにより置換されている、配列番号１の配列を有する凝固因子ＶＩＩ変異型を意味する。この用語は、例えば、配列番号１の位置における２つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を包含しない。
【００２４】
それ以上の面において、本発明は、本発明の因子ＶＩＩポリペプチドをコードする核酸構築物に関する。
それ以上の面において、本発明は、因子ＶＩＩ変異型をコードするヌクレオチド配列をコードする核酸構築物を提供する。
それ以上の面において、本発明は、ＦＶＩＩａ変異型をコードする核酸構築物対応する組換えベクターを提供する。
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物または他のベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物を含有しかつそれを発現するトランスジェニック動物を提供する。
【００２５】
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物を含有しかつそれを発現するトランスジェニック植物を提供する。
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物の発現を可能とする条件下に適当な増殖培地中で核酸構築物を含んでなる細胞を培養し、生ずるポリペプチドを培地から回収することを含んでなる、本発明の因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法に関する。
【００２６】
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物の発現を可能とする条件下に適当な増殖培地中で核酸構築物を含んでなる細胞を培養し、生ずるポリペプチドを培地から回収することを含んでなる、本発明の因子ＶＩＩ変異型を産生する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、トランスジェニック動物により産生されたミルクからポリペプチドを回収する、因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法に関する。
【００２７】
それ以上の面において、本発明は、トランスジェニック動物により産生されたミルクからポリペプチドを回収する、因子ＶＩＩ変異型を産生する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、核酸構築物を含んでなるトランスジェニック植物の細胞を培養し、生ずる植物からポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明の因子ＶＩＩポリペプチドを産生する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、トランスジェニック植物の細胞を培養し、生ずる植物から変異型を回収することを含んでなる、本発明の因子ＶＩＩ変異型を産生する方法。
【００２８】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００２９】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００３０】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００３１】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００３２】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
【００３３】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
【００３４】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
【００３５】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型の使用に関する。
【００３６】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型の使用を提供する。
【００３７】
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
【００３８】
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
【００３９】
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
【００４０】
それ以上の面において、本発明は、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の少なくとも位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を含んでなる因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法に関する。
【００４１】
それ以上の面において、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている、凝固因子ＶＩＩ変異型を投与することを含んでなる、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する方法を提供する。
【００４２】
それ以上の面において、本発明は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されておりかつ、必要に応じて、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における１または２以上の追加のアミノ酸残基が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、凝固因子ＶＩＩ変異型と、必要に応じて、薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００４３】
それ以上の面において、本発明は、出血性エピソードを治療しまたは正常の止血作用系を増強する薬剤を製造するための、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されておりかつ、必要に応じて、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における１または２以上の追加のアミノ酸残基が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、凝固因子ＶＩＩ変異型の使用を提供する。
【００４４】
それ以上の面において、治療を必要とする患者に、治療的または予防的に有効量の配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されておりかつ、必要に応じて、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における１または２以上の追加のアミノ酸残基が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、凝固因子ＶＩＩ変異型を投与することを含んでなる、出血性障害を治療または予防しまたは正常の止血作用系を増強する方法を提供する。
【００４５】
本発明の１つの態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３４におけるＡｓｐに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００４６】
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３６におけるＳｅｒに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置１５８におけるＶａｌに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置２９６におけるＧｌｕに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００４７】
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置２９８におけるＭｅｔに対応するアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
それ以上の面において、因子ＶＩＩポリペプチドは、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における最大２０のアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００４８】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の１５９〜１７０から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の２９０〜３１２から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の３３０〜３３９から選択される位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００４９】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置１５７における前記ＬｙｓがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３７における前記ＬｙｓがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３４における前記ＡｓｐがＧｌｙ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００５０】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置３３６における前記ＳｅｒがＧｌｙ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置１５８における前記ＶａｌがＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置２９６における前記ＧｌｕがＡｒｇ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
【００５１】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、配列番号１の位置２９８における前記ＭｅｔがＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、アミノ酸が核酸構築物によりコードことができる異なるアミノ酸により置換されている、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、前記因子ＶＩＩポリペプチドがヒト因子ＶＩＩである、ポリペプチドである。
【００５２】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、前記因子ＶＩＩポリペプチドがヒト因子ＶＩＩａである、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、 ［Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、および ［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩから成る群から独立して選択される因子ＶＩＩポリペプチドである、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、 ［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、および ［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩから成る群から独立して選択される因子ＶＩＩポリペプチドである、ポリペプチドである。
【００５３】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩである、ポリペプチドである。
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩポリペプチドは、 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩである、ポリペプチドである。
【００５４】
本発明のそれ以上の態様において、因子ＶＩＩ変異型は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されておりかつ、必要に応じて、プロテアーゼドメイン中の残りの位置における１または２以上の追加のアミノ酸残基が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、変異型である。
【００５５】
１つの態様において、因子ＶＩＩ変異型は、因子ＶＩＩ変異型は、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上が核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されており、ただし変異型がＦＶＩＩ （Ａｌａ １５７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３４）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３６）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ３３７）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ １５８）、ＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９６） またはＦＶＩＩ （Ａｌａ ２９８） ではない、変異型である。
【００５６】
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基と、位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
【００５７】
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基と、位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
【００５８】
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓ残基と、位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
【００５９】
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓ残基と、位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５８におけるＶａｌ残基と、位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上と、位置３３４におけるＡｓｐおよび位置３３６におけるＳｅｒの１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
【００６０】
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５７におけるＬｙｓ残基は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３７におけるＬｙｓ残基は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、配列番号１の位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
【００６１】
それ以上の態様において、配列番号１の位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上は核酸構築物によりコードすることができる他のアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基はＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕにより置換されており、および／または位置３３７におけるＬｙｓ残基はＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕにより置換されており、および／または位置１５８におけるＶａｌ残基はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕにより置換されており、および／または位置２９６におけるＧｌｕ残基はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＶａｌはにより置換されており、および／または位置２９８におけるＭｅｔ残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎにより置換されており、および／または位置３３４におけるＡｓｐ残基はＧｌｕにより置換されており、および／または位置３３６におけるＳｅｒ残基はＧｌｕにより置換されている。
【００６２】
それ以上の態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基または位置３３７におけるＬｙｓ残基または位置３３４におけるＡｓｐ残基または位置３３６におけるＳｅｒ残基は置換されている唯一のアミノ酸残基である。
それ以上の態様において、位置１５８におけるＶａｌ残基または位置２９６におけるＧｌｕ残基または位置２９８におけるＭｅｔ残基は置換されている唯一のアミノ酸残基である。
【００６３】
それ以上の態様において、本発明による変異型の活性と、配列番号１に示す自然因子ＶＩＩポリペプチドの活性との間の比は、本明細書において定義する「ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ」において試験したとき、少なくとも約１．２５である。他の態様において、比は少なくとも約２．０である；他の態様において、少なくとも約４．０である。
それ以上の態様において、プロテアーゼドメイン中の位置３１２におけるＧｌｎ残基は置換されていない。
それ以上の態様において、組換え宿主細胞は哺乳動物由来である。他の態様において、細胞はＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ細胞から成る群から選択される。
【００６４】
それ以上の態様において、プロテアーゼドメイン中の残留位置 （位置１５３〜４０６） における最大２０の追加のアミノ酸残基が置換されている。１つの態様において、最大１０のアミノ酸残基が置換されている；他の態様において、最大５つのアミノ酸残基が置換されている。
それ以上の態様において、位置１５７、３３７、１５８、２９８、３３４、または３３６は置換されている唯一のアミノ酸残基である。
【００６５】
それ以上の態様において、位置１５７および位置３３７におけるＬｙｓ残基の一方または両方は中性アミノ酸残基により置換されているか、あるいは残基の１つは負に帯電したアミノ酸残基により置換されているか、あるいは１つのＬｙｓ残基は中性アミノ酸残基により置換されておりかつ１つのＬｙｓ残基は負に帯電したアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の一方または両方は水素結合を形成するおよび／または塩架橋を形成することができるアミノ酸残基により置換されているか、あるいは残基の一方または両方は小さいアミノ酸残基により置換されている。
【００６６】
それ以上の態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基および／または位置３３７におけるＬｙｓ残基は置換されている唯一のアミノ酸残基である。１つの態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基は置換されている。他の態様において、位置３３７におけるＬｙｓ残基は置換されている。
それ以上の態様において、位置１５８におけるＶａｌ残基および／または位置２９８におけるＭｅｔ残基は置換されている。
それ以上の態様において、位置３３４におけるＡｓｐ残基および／または位置３３６におけるＳｅｒ残基は置換されている。
【００６７】
それ以上の態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのリストから選択されるアミノ酸残基により置換されている。他の態様において、位置１５７におけるＬｙｓ残基はＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、位置３３７におけるＬｙｓ残基はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎのリストから選択されるアミノ酸残基により置換されている。他の態様において、位置３３７におけるＬｙｓ残基はＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸残基により置換されている。
【００６８】
それ以上の態様において、位置１５８におけるＶａｌ残基はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｎのリストから選択されるアミノ酸残基により置換されている。それ以上の態様において、位置１５８におけるＶａｌ残基はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＧｌｕから成る群から選択されるアミノ酸残基により置換されている。
それ以上の態様において、位置２９６におけるＧｌｕ残基はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｎのリストから選択されるアミノ酸残基により置換されている。それ以上の態様において、残基はＡｒｇ、ＬｙｓまたはＶａｌにより置換されている。
【００６９】
それ以上の態様において、位置２９８におけるＭｅｔ残基はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎのリストから選択されるアミノ酸残基により置換されている。それ以上の態様において、残基はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＡｓｎにより置換されている。
それ以上の態様において、位置３３４におけるＡｓｐ残基はＧｌｙおよびＧｌｕにより置換されている。
それ以上の態様において、位置３３６におけるＳｅｒ残基はＧｌｙおよびＧｌｕにより置換されている。
【００７０】
それ以上の態様において、本発明による変異型の活性と、配列番号１に示す自然因子ＶＩＩポリペプチドの活性との間の比は、本明細書 （実施例１１） において定義する「ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ」において試験したとき、少なくとも約１．２５である。他の態様において、比は少なくとも約２．０である；なお他の態様において、少なくとも約４．０である。
【００７１】
それ以上の態様において、因子ＶＩＩ変異型は、位置１５７、１５８、２９６、２９８、３３４、３３６または３３７における既に述べたアミノ酸置換およびプロテアーゼドメイン中のどこかの任意のアミノ酸置換に加えて、また、Ｎ末端のＧｌａドメイン （残基１〜３７） において置換された、いくつかのアミノ酸残基を有する。１つの態様において、因子ＶＩＩの位置１０および３２ （配列番号１参照） におけるアミノ酸残基の１または２以上は、核酸構築物によりコードことができる他のアミノ酸残基により置換されている。１つの態様において、位置１０におけるアミノ酸残基ＰｒｏはＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＬｙｓにより置換されている；および／または位置３２におけるアミノ酸残基ＬｙｓはＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｎにより置換されている。
【００７２】
本明細書において、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッション・オン・バイオケミカル・ノメンクレイチュアー （Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）　（ＣＢＮ） により承認された、略号 （表１に示されている） を使用して表示される。名称または下記の略号により表される異性体を有するアミノ酸およびその他は、特記しない限り、自然においてＬ−型である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左右の末端は、特記しない限り、それぞれＮ末端およびＣ末端である。
【００７３】
【表１】
2004508822.tif 000002
【００７４】
アミノ酸残基Ｌｙｓ １５７、Ｖａｌ １５８、Ｇｌｕ ２９６、Ｍｅｔ ２９８、Ａｓｐ ３３４、Ｓｅｒ ３３６またはＬｙｓ ３３７の少なくとも１つ （および必要に応じて１または２以上の追加の残基） が他のアミノ酸により置換されている因子ＶＩＩａは凝固活性を有することが今回発見された。
プロテアーゼドメインのアミノ末端の挿入に影響を与え、これによりＩｌｅ １５３の末端アミノ基とＡｓｐ ３４３の側鎖との間の塩架橋に依存する因子ＶＩＩａの凝固活性コンフォメーションの形成に影響を与えると考えられる領域に、残基は位置する。置換は静電的反発を除去し、水素結合を付加するか、あるいはそうでなければアミノ末端の挿入を促進する。
【００７５】
自然ＦＶＩＩａに比較して記載する因子ＶＩＩａ変異型の固有の活性は高いために、作用部位において機能的に適切な濃度を得るためにより少ない投与量が適切であることが予測され、こうして、出血性エピソードを有するか、あるいは正常の止血作用系の増強を必要とする被検体により少ない投与量の投与を可能とするであろう。
【００７６】
簡単に前述したように、位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上を置換することによって、因子ＶＩＩａは通常組織因子により誘導しなくてはならないより高い活性のコンフォメーションを自発的に獲得するであろうことを、本発明者らは仮定する。このような因子ＶＩＩａ変異型は、前凝固活性が組織因子に対して独立である状況 （血小板上の因子Ｘａの発生） において、例えば、高い投与量のＮｏｖｏＳｅｖｅｎＴＭを投与するとき、療法的に有用である、固有の活性を示す。
【００７７】
プロテアーゼドメイン中の追加のアミノ酸残基の置換は、位置１５７におけるＬｙｓ残基および位置３３７におけるＬｙｓ残基および位置１５８におけるＶａｌ残基および位置２９６におけるＧｌｕ残基および位置２９８におけるＭｅｔ残基および位置３３４におけるＡｓｐ残基および位置３３６におけるＳｅｒ残基の１または２以上の置換により得られた効果に加えて、分子の活性コンフォメーションの形成を促進することができる。しかしながら、前述の突然変異をこれらの７つの残基の近傍において（順次にまたは三次元的に） 実施するとき、大部分の顕著な効果は見られる。
【００７８】
因子ＶＩＩのＧｌａドメイン （残基１〜３７） 中のわずかのアミノ酸残基置換は、膜リン脂質、例えば、組織因子支持細胞または血小板の膜リン脂質に対して実質的に高いアフィニティーを有するタンパク質を提供することができる。こうして、因子ＶＩＩ変異型は、位置１５７、１５８、２９６、２９８、３３４、３３６または３３７における既に述べたアミノ酸置換およびプロテアーゼドメイン中のどこかの任意のアミノ酸置換に加えて、また、Ｎ末端のＧｌａドメインにおいて置換された、いくつかのアミノ酸残基を有し、これにより自然因子ＶＩＩに比較して増加した活性ならびに膜リン脂質に対して増加したアフィニティーを有するタンパク質が得られる。
【００７９】
好ましくは、因子ＶＩＩの位置１０および３２ （配列番号１参照） におけるアミノ酸残基は、核酸構築物によりコードことができる他のアミノ酸残基により置換することができる。前述の位置の中に組込むために好ましいアミノ酸残基の例は、次の通りである：位置１０におけるアミノ酸残基ＰｒｏはＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＬｙｓにより置換されている；および／または位置３２におけるアミノ酸残基ＬｙｓはＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｎにより置換されている。
【００８０】
異なるリン脂質アフィニティーおよびビタミンＫ依存性血漿タンパク質の配列に基づいて、Ｇｌａドメイン中の他の残基を置換のために考慮することもできる。
本発明の関係において、アミノ酸の３文字指示を慣用の意味において使用することができる。特記しない限り、本明細書に記載するアミノ酸はＬ−アミノ酸である。
用語「Ｎ末端のＧＬＡ−ドメイン」は、ＦＶＩＩのアミノ酸配列１〜３７を意味する。
用語「プロテアーゼドメイン」は、ＦＶＩＩのアミノ酸配列１５３〜４０６ （ＦＶＩＩａの重鎖）を意味する。
【００８１】
３文字指示「ＧＬＡ」は、４−カルボキシグルタミン酸 （γ−カルボキシグルタメート） を意味する。
用語「中性アミノ酸残基」（ｐＨ ５〜８） は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎのリストから選択されるアミノ酸を含んでなることを意図する。
用語「小さいアミノ酸」は、Ｇｌｙ、ＧｌｕおよびＡｌａから選択されるアミノ酸を含んでなることを意図する。
【００８２】
用語「負に帯電したアミノ酸」（ｐＨ ６〜８） は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸を含んでなることを意図する。
用語「因子ＶＩＩポリペプチド」は、本明細書において使用するとき、自然ヒト因子ＶＩＩのアミノ酸配列１〜４０６ （配列番号１） を含んでなるタンパク質またはそれらの変異型を意味する。これはヒト因子ＶＩＩ、ヒト因子ＶＩＩａおよびそれらの変異型を包含するが、これらに限定されない。
【００８３】
用語「因子ＶＩＩ」は、本明細書において使用するとき、不活性一本鎖チモーゲン因子ＶＩＩ分子ならびに活性化二本鎖因子ＶＩＩ分子 （因子ＶＩＩａ） を含んでなることを意図する。これは自然ヒト因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａのアミノ酸配列１〜４０６を有するタンパク質を包含する。また、それはわずかに修飾されたアミノ酸配列、例えば、Ｎ末端アミノ酸の欠失または付加を包含する修飾されたＮ末端を有するタンパク質を包含する。ただし、それらのタンパク質は因子ＶＩＩａの活性を実質的に保持しなくてはならない。用語「因子ＶＩＩａ」または「ＦＶＩＩａ」は、本明細書において使用するとき、活性化された （因子ＶＩＩａ） から成る産物を意味する。上記定義の範囲内の「因子ＶＩＩａ」または「ＦＶＩＩａ」は、また、個々に存在し、発生することがある天然のアレレ変異型を包含する。また、グリコシル化または他の翻訳後の変更の程度および位置は、選択した宿主細胞および宿主細胞環境の特質に依存する変化することがある。
【００８４】
用語「変異型」は、本明細書において使用するとき、親タンパク質の１または２以上のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されているおよび／または親タンパク質の１または２以上のアミノ酸が欠失されているおよび／または１または２以上のアミノ酸がタンパク質の中に挿入されているおよび／または１または２以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されている、配列番号１の配列を有する因子ＶＩＩを表示することを意図する。このような付加は、親タンパク質のＮ末端またはＣ末端または両方で起こることができる。この定義の範囲内の用語「変異型」は、その活性化された二本鎖分子の形成でＦＶＩＩ活性を有する。１つの態様において、変異型は配列番号１の配列と６５％同一である。１つの態様において、変異型は配列番号１の配列と８０％同一である。他の態様において、変異型は配列番号１の配列と９０％同一である。それ以上の態様において、変異型は配列番号１の配列と９５％同一である。
【００８５】
本明細書において使用するとき、用語「核酸構築物」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、ＲＮＡ由来または混合由来の任意の核酸分子を意味することを意図する。用語「構築物」は、一本鎖または二本鎖であることができ、かつ問題のポリペプチドをコードする完全にまたは部分的に天然に存在するヌクレオチド配列に基づくことができる核酸セグメントを指示することを意図する。構築物は必要に応じて他の核酸セグメントを含有することができる。同様な方法において、用語「核酸構築物によりコードすることができるアミノ酸」は、上に定義した核酸構築物によりコードすることができるアミノ酸残基、例えば、、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｎを包含する。
【００８６】
用語「異なるアミノ酸」は、本明細書において使用するとき、その位置における天然に存在するアミノ酸と異なるアミノ酸を意味する。これは核酸構築物によりコードことができるアミノ酸を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、異なるアミノ酸は天然のＬ−型であり、核酸構築物によりコードことができる。特定の例はＬ−システイン （Ｃｙｓ） である。
本発明の関係において、用語「治療」は、出血を抑制または最小にする目的で、例えば、外科手術示におけるような期待される出血の予防、および例えば、外傷におけるように既に起こった出血調節の両方を包含することを意図する。こうして、因子ＶＩＩａ変異型の予防的投与は用語「治療」の中に包含される。
【００８７】
用語「活性」は、本明細書において使用するとき、因子ＶＩＩポリペプチドまたはその変異型がその基質因子Ｘを活性因子Ｘａに変換するそれらの能力を意味する。因子ＶＩＩポリペプチドの活性は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質分解アッセイ」により測定することができる。また、用語「固有の活性」は、組織因子の非存在下に活性化された血小板表面上でトロンビンを発生させる能力を包含する。
用語「正常の止血作用系の増強」は、トロンビンを発生させる能力の増強を意味する。
【００８８】
本明細書において使用するとき、用語「出血性障害」は、出血における発現される細胞または分子由来の先天性、後天性または誘導された欠陥を反映する。例は凝固因子の欠乏症 （例えば、血友病ＡおよびＢまたは凝固因子ＸＩまたはＶＩＩの欠乏症）、凝固因子のインヒビター、血小板機能の欠乏、血小板減少症またはフォン・ウィルブランド病である。
【００８９】
用語「出血性エピソード」は、外科手術および他の形態の組織損傷の両方に関連する主要な問題である、コントロールされないおよび過剰の出血を包含することを意味する。コントロールされないおよび過剰の出血は、正常の凝固系を有する被検体および凝固または出血性障害を有する被検体において起こることがある。凝固因子の欠乏症 （血友病ＡおよびＢ、凝固因子ＸＩまたはＶＩＩの欠乏症） または凝固因子のインヒビターは、出血性障害の原因であることがある。また、過剰の出血は正常に機能する血液凝固カスケード （凝固因子欠乏症または凝固因子に対するインヒビターをもたない） 被検体において起こり、そして血小板機能の欠乏、血小板減少症またはフォン・ウィルブランド病により引き起こされることがある。
【００９０】
このような場合において、出血は血友病により引き起こされる出血にたとえることができる。なぜなら、止血系は、血友病におけるように、主要な出血を引き起こす異常な必須の凝固性「化合物」 （例えば、血小板またはフォン・ウィルブランド因子のタンパク質） を欠如するか、あるいは有するからである。外科手術または非常に大きい外傷に関連して広範な組織損傷を経験する被検体において、正常の止血メカニズムは即時の止血の要求により圧倒されることがあり、被検体は正常の止血メカニズムにかかわらず出血を発生することがある。また、出血が脳、耳内側領域および眼のような器官において起こるとき、満足すべき止血を達成することは問題であり、外科的止血の可能性を制限する。
【００９１】
種々の器官 （肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管） からの生検材料を採取するとき、ならびに腹腔鏡検査の外科手術において、同一の問題が起こることがある。これらの状況のすべてに共通して、外科技術 （縫合糸、クリップ、およびその他） により止血することは困難であり、これは出血が拡散する場合でもある （出血性胃炎およびおびただしい子宮出血）。また、急性およびおびただしい出血は、欠陥性止血が与えられた療法により誘導された凝固防止治療を受けている被検体において起こることがある。このような被検体は、抗凝固作用を急速に中和しなくてはならない場合、外科的関与を必要とすることがある。局在化前立腺癌を有する被検体について、根治的恥骨前立腺切除が普通に実施される。
【００９２】
手術は有意な、時には大量の血液喪失によりしばしば複雑となる。前立腺切除間のかなりの血液喪失は主として複雑な解剖学的状況に関係し、このような状況において、外科的止血のために容易にアクセスできない、種々の密に血管化した部位が存在し、大きい領域からの拡散性出血を生ずることがある。不満足な止血の場合において問題を引き起こすことがある他の状況は、血栓塞栓症を防止するために抗凝固療法を止血メカニズムが正常である被検体に施すときである。このような治療は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫ−アンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固インヒビターを含むことができる。
【００９３】
本発明の１つの態様において、出血は血友病に関係付けられる。他の態様において、出血は後天性インヒビターを有する血友病に関係付けられる。他の態様において、出血は血小板減少症に関係付けられる。他の態様において、出血はフォン・ウィルブランド病に関係付けられる。他の態様において、出血は重症の組織損傷に関係付けられる。他の態様において、出血は重症の外傷に関係付けられる。他の態様において、出血は外科手術に関係付けられる。
【００９４】
他の態様において、出血は腹腔鏡検査的外科手術に関係付けられる。他の態様において、出血は出血性胃炎に関係付けられる。他の態様において、出血はおびただしい子宮出血に関係付けられる。他の態様において、出血は機械的止血について制限された可能性を有する器官において起こる。他の態様において、出血は脳、耳の内側領域または眼において起こる。他の態様において、出血は生検材料を採取するプロセスに関係付けられる。他の態様において、出血は抗凝固治療に関係付けられる。
【００９５】
用語「被検体」は、本明細書において使用するとき、任意の動物、特に哺乳動物、例えば、ヒトを意味することを意図し、適当ならば、用語「患者」と互換的に使用することができる。
本明細書において使用するとき、用語「適当な増殖培地」は、栄養素と、細胞の増殖および本発明の因子ＶＩＩをコードする核酸配列の発現のために要求される他の成分を含有する培地を意味する。
【００９６】
因子ＶＩＩ変異型の調製
本明細書に記載する因子ＶＩＩ変異型は、組換え核酸技術により調製することができる。一般に、所望のタンパク質をコードするように、クローニングされた野生型因子ＶＩＩ核酸配列を修飾する。次いで、修飾された配列を発現ベクターの中に挿入し、これを引き続いて宿主細胞の中に形質転換またはトランスフェクトする。高等真核細胞、特に培養した哺乳動物細胞は宿主細胞として好ましい。ヒト因子ＶＩＩのための完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られている （米国特許第４，７８４，９５０号参照、ここで組換えヒト因子ＶＩＩのクローニングおよび発現が記載されている）。ウシ因子ＶＩＩ配列は、Ｔａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４８６８−１４８７２ （１９８８））。
【００９７】
アミノ酸配列の変更は種々の技術により達成することができる。核酸配列の修飾は部位特異的突然変異誘発であることができる。部位特異的突然変異誘発の技術はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ （ＤＮＡ ３：４７９−４８８、１９８４） または “Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｖｅｒｌａｐ，” Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７７、１９８９、ｐｐ． ６１−６８。こうして、因子ＶＩＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用して、１または２以上の選択した変更を導入することができる。同様に、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によりＤＮＡ構築物を製造する手順は、この分野においてよく知られている （下記の文献を参照のこと、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， 米国カリフォルニア州サンディエゴ）。
【００９８】
本発明の因子ＶＩＩ変異型をコードする核酸構築物は、適当にはゲノムまたはｃＤＮＡ由来であり、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準技術に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、ポリペプチドのすべてまたは一部分をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって得ることができる （下記の文献を参照のこと、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９）。
【００９９】
また、因子ＶＩＩ変異型をコードする核酸構築物は、確立された標準的方法、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ （１９８１）， １８５９−１８６９に記載されている方法、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３ （１９８４）， ８０１−８０５に記載されている方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動的ＤＮＡ合成装置により合成し、精製し、アニールし、結合し、適当なベクター中でクローニングする。
さらに、核酸構築物は、標準技術に従い、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ由来 （適当ならば） のフラグメントを結合することによって調製された混合合成およびゲノム由来、混合合成およびｃＤＮＡ由来または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ由来であることができ、フラグメントは全核酸構築物の種々の部分に対応する。
【０１００】
核酸構築物は好ましくはＤＮＡ構築物である。
本発明に従い因子ＶＩＩ変異型を調製するとき使用するＤＮＡ配列は、典型的には、適切な翻訳後のプロセシング （例えば、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化） および宿主細胞からの選択を可能とするために、因子ＶＩＩのアミノ末端におけるプレプロポリペプチドをコードするであろう。プレプロポリペプチドは、因子ＶＩＩまたは他のビタミンＫ依存的血漿タンパク質、例えば、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、プロテインＣまたはプロテインＳのそれであることができる。当業者は理解するように、追加の修飾を因子ＶＩＩ変異型アミノ酸配列において行うことができ、ここでそれらの修飾はタンパク質が凝固因子として作用するタンパク質の能力を有意に障害しない。例えば、一般的に米国特許第５，２８８，６２９号に記載されているように、因子ＶＩＩ変異型を活性化切断部位において修飾して、チモーゲン因子ＶＩＩがその活性化された二本鎖型に変換されるのを阻害することもできる。
【０１０１】
因子ＶＩＩａ変異型を発現させるとき使用する発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡ天然に存在する転写を指令することができるプロモーターを含んでなるであろう。培養した哺乳動物細胞において使用するために好ましいプロモーターは、ウイルスのプロモーターおよび細胞のプロモーターを包含する。ウイルスのプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター （Ｓｕｂｒａｍａｎｉｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：８５４−８６４， １９８１） およびＣＭＶプロモーター （Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０， １９８５） を包含する。
【０１０２】
特に好ましいウイルスのプロモーターは、アデノウイルス２からの主要な後期プロモーターである （ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２：１３０４−１３１９， １９８２）。細胞のプロモーターは、マウスカッパ遺伝子プロモーター （Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：７０４１−７０４５， １９８３） およびマウスＶＨプロモーター （Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３３：８５−９３， １９８３） を包含する。特に好ましい細胞のプロモーターは、マウスメタロチオネイン−１プロモーター （Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４， １９８３） を包含する。また、発現ベクターは、因子ＶＩＩ配列それ自体についてプロモーターから下流および挿入部位から上流に位置する１組のＲＮＡスプライス部位を含有することができる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【０１０３】
また、発現ベクターは挿入部位から下流に位置するポリアデニル化シグナルを含有する。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの初期または後期のポリアデニル化シグナル （ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、前掲）、アデノウイルス５ Ｅｌｂ由来からのポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター （ＤｅＮｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：３７１９−３７３０， １９８１） またはヒト因子ＶＩＩまたはウシ因子ＶＩＩ遺伝子からのポリアデニル化シグナルを包含する。また、発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する、非コーディングウイルスリーダー配列、例えば、アデノウイルス２三部分リーダー；およびエンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサーを包含する。
【０１０４】
クローニングされたＤＮＡ配列は、例えば、下記の方法により、培養した哺乳動物細胞の中に導入される：リン酸カルシウム仲介トランスフェクション （Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １４：７２５−７３２， １９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３−６１６， １９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２ｄ：４５６−４６７， １９７３） またはエレクトロポレーション （Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５， １９８２）。外因的ＤＮＡを発現する細胞を同定し、選択するために、選択可能な表現型 （選択可能なマーカー） を与える遺伝子を一般に問題の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞の中に導入する。
【０１０５】
好ましい選択可能なマーカーは、薬剤、例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートに対する耐性を与える遺伝子を包含する。選択可能なマーカーは、増幅可能である選択可能なマーカーであることができる。好ましい増幅可能である選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ （ＤＨＦＲ） 配列である。選択可能なマーカーは、下記の文献において概観されている：Ｔｈｉｉｌｙ， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， マサチューセッツ州ストーンハム （引用することによって本明細書の一部とされる）。当業者は適当な選択可能なマーカーを容易に選択することができる。
【０１０６】
選択可能なマーカーは問題の遺伝子と同時に細胞の中に別々のプラスミド上に導入することができるか、あるいは同一プラスミド上に導入することができる。同一プラスミド上において、選択可能なマーカーおよび問題の遺伝子が異なるプロモーターまたは同一プロモーターの制御下にあることができる場合、後者の配置はジシストロン （ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ） メッセージを生成する。この型の構築物はこの分野において知られている （例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、米国特許第４，７１３，３３９号）。また、「キャリヤーＤＮＡ」として知られている追加のＤＮＡを細胞の中に導入される混合物に添加することが好都合であることがある。
【０１０７】
細胞がＤＮＡを吸収した後、細胞を適当な培地中で、典型的には１〜２日間、増殖させて、問題の遺伝子の発現を開始する。細胞を培養するために使用する培地は、宿主細胞を増殖させるために適当な、任意の慣用の培地、例えば、適当な補助物質を含有する最小または複合培地であることができる。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された調製法に従い調製することができる （例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） のカタログ） 。
【０１０８】
培地はこの分野において知られている手順を使用して調製される （例えば、下記の文献を参照のこと：細菌および酵母の参考文献；Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｊ． Ｗ． およびＬａＳｕｒｅ， Ｌ． 編者， Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州， １９９１）。増殖培地は、一般に、炭素源、窒素原、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン、塩類、リン脂質、タンパク質および成長因子を含む。γ−カルボキシル化因子ＶＩＩ変異型を製造するために、培地はビタミンＫを、好ましくは約０．１ ｍｇ／ｍｌ〜約５ ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するであろう。
【０１０９】
次いで薬剤選択を適用して、安定な方法で選択可能なマーカーを発現する細胞天然に存在する増殖について選択する。増幅可能な選択可能なマーカーでトランスフェクトされた細胞について、薬剤濃度を増加させてクローニングされた配列天然に存在する増加したコピー数について選択し、これにより発現レベルを増加させる。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを所望の因子ＶＩＩ変異型の発現についてスクリーニングする。
【０１１０】
好ましい哺乳動物細胞系統は、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−１ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベイビーハムスター腎 （ＢＨＫ） および２９３ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９−７２， １９７７） 細胞系統を包含する。好ましいＢＨＫ細胞系統は、ｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統　（ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：１１０６−１１１０， １９８２） （以後においてＢＨＫ ５７０細胞系統と呼ぶ） である。
【０１１１】
ＢＨＫ ５７０細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （米国マリイランド州２０８５２、ロックビレパークローンドライブ１２３０１）からＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １０３１４で入手可能である。また、ｔｋ− ｔｓ １３ ＢＨＫ細胞系統はＡＴＣＣからＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １６３２で入手可能である。さらに、下記のものを包含する多数の他の細胞系統を使用することができる：Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ （ラットヘパトーム：ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ （ラットヘパトーム：ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺 （ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ １４６９ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９．１） およびＤＵＫＸ細胞 （ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０）。
【０１１２】
トランスジェニック動物技術を使用して、本発明の因子ＶＩＩ変異型を製造ことができる。宿主雌哺乳動物の乳腺内で製造を産生することが好ましい。乳腺中の発現および引き続く問題のタンパク質のミルクの中への分泌は、他の源からのタンパク質の単離において直面する困難を克服する。ミルクは容易に収集され、大量に入手可能であり、生化学的に十分に特性決定される。さらに、主要なミルクタンパク質はミルクの中に高い濃度 （典型的には約１〜１５ ｇ／ｌ） で存在する。
【０１１３】
商業的観点から、大きいミルク収量を有する種を宿主として使用することが明らかに好ましい。小さい動物、例えば、マウスおよびラットを使用することができる （そして原理的段階の証明において好ましい） が、家畜類を使用することがく、これらはブタ、ヤギ、ヒツジおよび畜牛を包含するが、これらに限定されない。ヒツジはこの種におけるトランスジェネシスの以前の歴史、ミルク収量、コストおよびヒツジのミルクを収集する装置の容易な入手可能性のような因子ために特に好ましく （例えば、宿主種の選択に影響を及ぼす因子の比較についてＷＯ ８８／００２３９を参照のこと）、酪農的使用のために交配された宿主動物の品種、例えば、Ｅａｓｔ Ｆｒｉｅｓｌａｎｄヒツジを選択するか、あるいは後の日にトランスジェニック系統の飼育により酪農系統を導入することが望ましい。いずれの場合においても、既知の、すぐれた健康状態の動物を使用すべきである。
【０１１４】
乳腺中で発現させるために、ミルクタンパク質遺伝子からの転写プロモーターを使用する。ミルクタンパク質遺伝子は、カゼインをコードする遺伝子 （米国特許第５，３０４，４８９号参照）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、およびホエー酸性タンパク質を包含する。β−ラクトグロブリン （ＢＬＧ） プロモーターは好ましい。ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の場合において、遺伝子の５′フランキング配列の少なくとも近位４０６ ｂｐの領域を一般に使用するが、約５ ｋｂｐまでの、５′フランキング配列のより大きい部分、例えば、β−ラクトグロブリン遺伝子の５′フランキングプロモーターおよび非コーディング部分を含む約４．２５ ｋｂｐのＤＮＡセグメントは好ましい （Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８６：３１−３９ （１９９２）参照）。他種からのプロモーターＤＮＡの同様なセグメントもまた適当である。
【０１１５】
また、β−ラクトグロブリン遺伝子の他の領域、ならびに発現すべき遺伝子のゲノム領域を構築物の中に組込むことができる。イントロンを欠如する構築物は、例えば、このようなＤＮＡ配列を含有するものと比較して、発現が低いことは一般にこの分野において受け入れられている （下記の文献を参照のこと：Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８３６−８４０ （１９８８）； Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４７８−４８２ （１９９１）； Ｗｈｉｔｅｌａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． １：３−１３ （１９９１）； ＷＯ ８９／０１３４３； およびＷＯ ９１／０２３１８、それらの各々は引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１１６】
これに関して、可能ならば、問題の通過またはポリペプチドをコードする遺伝子の天然イントロンのすべてまたはいくつかを含有するゲノム配列を使用することが一般に好く、こうして、例えば、β−ラクトグロブリン遺伝子からの、少なくともいくつかをさらに含めることは好ましい。１つのこのような領域は、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の３′非コーディング領域からのイントロンスプライシングおよびＲＮＡポリアデニル化を提供するＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然３′非コーディング領域を置換するとき、このヒツジβ−ラクトグロブリンセグメントは問題のタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを増強しかつ安定化することができる。
【０１１７】
他の態様において、変異型因子ＶＩＩ配列の開始ＡＴＧを取り囲む領域は、ミルク特異的タンパク質遺伝子からの対応する配列で置換される。このような置換は、発現を増強する推定上の組織特異的開始環境を提供する。全体の変異型因子ＶＩＩプレプロおよび５′非コーディング配列を、例えば、ＢＬＧ遺伝子のそれらで置換することは好都合であるが、より小さい領域を置換することができる。
【０１１８】
トランスジェニック動物における因子ＶＩＩ変異型の発現のために、変異型因子ＶＩＩをコードするＤＮＡセグメントをその発現に要求される追加のＤＮＡセグメントに作用可能に連鎖させて発現単位を生成する。このような追加のセグメントは、前述のプロモーター、ならびに転写停止およびｍＲＮＡのポリアデニル化を提供する配列を包含する。発現単位は、さらに、修飾された因子ＶＩＩをコードするセグメントに作用可能に連鎖された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントを包含するであろう。分泌シグナル配列は自然因子ＶＩＩ分泌シグナル配列であるか、あるいは他のタンパク質、例えば、ミルクタンパク質のそれであることができる （例えば、下記文献を参照のこと、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：４６８３−４６９０ （１９８６）； およびＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８７３，３１６号。これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１１９】
トランスジェニック動物において使用する発現単位の構築は、追加のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドまたはファージベクターの中に変異型因子ＶＩＩ配列を挿入することによって好都合に実施されるが、発現単位は本質的に任意の結合配列により構築することができる。ミルクタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有するベクターを準備し、ミルクタンパク質のコーディング配列を変異型因子ＶＩＩポリペプチドのそれで置換し、これによりミルクタンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合物をつくることは特に好都合である。いずれの場合においても、プラスミドまたは他のベクター中の発現単位のクローニングは変異型因子ＶＩＩ配列の増幅を促進する。
【０１２０】
増幅は細菌 （例えば、大腸菌 （Ｅ． ｃｏｌｉ）） 宿主細胞中で好都合に実施され、こうしてベクターは典型的には複製起点および細菌宿主細胞中で機能的である選択可能なマーカーを含むであろう。次いで、発現単位を選択した宿主種の受精卵 （初期段階の胚を含む） の中に導入する。異種的ＤＮＡの導入は下記の経路を包含するいくつかの経路の１つにより達成することができる：マイクロインジェクション （例えば、米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウイルス感染 （Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４ （１９８８）） または胚幹 （ＥＳ） 細胞を使用する部位指定組込み （下記の文献において概観されている：Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４−５３９ （１９９２））。
【０１２１】
次いで卵を偽妊娠雌の輸卵管または子宮の中に移植し、出産予定日まで発育させる。生殖細胞系統の中に導入されたＤＮＡを支持する子孫は正常のメンデル方式でＤＮＡを子孫に伝え、トランスジェニック群れの発生を可能とする。トランスジェニック動物を産生する一般的手順はこの分野において知られている （例えば、下記文献を参照のこと、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８６； Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３ （１９８８）； Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ３２：６４５−６５１ （１９８５）； Ｂｕｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１４０−１４３ （１９９０）； Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８３５−８３８ （１９９１）； Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：８４４−８４７ （１９９１）； Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４９：１１３−１２０ （１９９２）； 米国特許第４，８７３，１９１号； 米国特許第４，８７３，３１６号； ＷＯ ８８／００２３９、ＷＯ ９０／０５１８８、ＷＯ ９２／１１７５７； およびＧＢ ８７／００４５８）。
【０１２２】
外来ＤＮＡ配列を哺乳動物およびそれらの生殖細胞の中に導入する技術は本来マウスにおいて開発された （例えば、下記文献を参照のこと、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４ （１９８０）； ＧｏｒｄｏｎおよびＲｕｄｄｌｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４：１２４４−１２４６ （１９８１）； ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ， Ｃｅｌｌ ４１：３４３−３４５ （１９８５）； Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２ （１９８５）； およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ． （ｉｂｉｄ．））。これらの技術は引き続いてより大きい動物、例えば、家畜種とともに使用するように適合された （例えば、下記文献を参照のこと、ＷＯ ８８／００２３９、ＷＯ ９０／０５１８８、およびＷＯ ９２／１１７５７； およびＳｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３ （１９８８））。
【０１２３】
要約すると、トランスジェニックマウスまたは家畜類の発生において今日まで使用された最も効率よい経路において、確立された技術に従い数　 百の問題のＤＮＡの線状分子が受精卵の前核の１つの中に導入注入される。接合体の細胞質の中へのＤＮＡの注入を使用することもできる。
【０１２４】
また、トランスジェニック植物における産生を使用することができる。発現を一般化するか、あるいは特定の器官、例えば、塊茎に向けることができる （下記の文献を参照のこと、Ｈｉａｔｔ， Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４６９−４７９ （１９９０）； Ｅｄｅｌｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． １２：４４９−４５３ （１９９２）； Ｓｉｊｍｏｎｓ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２１７−２２１ （１９９０）； およびＥＰ ０ ２５５ ３７８）。
【０１２５】
本発明の因子ＶＩＩ変異型を細胞培養培地またはミルクから回収する。本発明の因子ＶＩＩ変異型はこの分野において知られている種々の手順により精製することができ、このような手順はクロマトグラフィー （例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、電気泳動手順 （例えば、調製用等電点電気泳動 （ＩＥＦ）、ディファレンシャル溶解度 （例えば、硫酸アンモニウム沈降）、または抽出 （例えば、下記文献を参照のこと、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ．−Ｃ． ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， 編者， ＶＨＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９） を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の因子ＶＩＩ変異型は抗因子ＶＩＩ抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１２６】
下記の文献に記載されているように、カルシウム依存的モノクローナル抗体を使用することは特に好ましい：Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：１１０９７−１１１０８ （１９８６） およびＴｈｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３ （１９８８）。追加の精製は慣用の化学的精製手段、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより達成することができる。他の精製法、例えば、クエン酸バリウム沈降はこの分野において知られており、そして本明細書に記載する新規な因子ＶＩＩ変異型の精製に適用することができる （例えば、下記文献を参照のこと、Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ． Ｙ．， １９８２）。
【０１２７】
療法的目的のために、本発明の因子ＶＩＩ変異型は実質的に純粋であることが好ましい。こうして、本発明の好ましい態様において、本発明の変異型因子ＶＩＩを少なくとも約９０〜９５％の均質性、好ましくは少なくとも約９８％の均質性に精製する。純度は、例えば、ゲル電気泳動およびアミノ末端アミノ酸の配列決定によりアッセイすることができる。
【０１２８】
因子ＶＩＩ変異型を活性化部位において切断して、それを二本鎖の形態に変換する。活性化はこの分野において知られている手順、例えば、下記の文献に記載されている手順に従い実施することができる：Ｏｓｔｅｒｕｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：２８５３−２８５７ （１９７２）； Ｔｈｏｍａｓ， 米国特許第４，４５８，５９１号； ＨｅｄｎｅｒおよびＫｉｓｉｅｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１：１８３６−１８４１ （１９８３）； またはＫｉｓｅｌおよびＦｕｊｉｋａｗａ， Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ７３：２９−４２ （１９８３）。選択的に、下記の文献に記載されているように、因子ＶＩＩはそれをイオン交換クロマトグラフィーのカラム、例えば、Ｍｏｎｏ−ＱＴＭ （Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ） またはその他に通過させることによって活性化することができる：Ｂｊｏｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ， ｐｐ． ５５４−５６５。次いで、生ずる因子ＶＩＩ変異型を後述するように処方し、投与することができる。
【０１２９】
アッセイ
本発明は、また、本発明に従い変異型因子ＶＩＩを選択する適当なアッセイを提供する。これらのアッセイは簡単な予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験として実施することができる。
こうして、本明細書中の実施例１１において、本発明の変異型因子ＶＩＩの活性に対する簡単な試験 （題名「ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ」） を開示する。それに基づいて、特に重要である因子ＶＩＩ変異型は、本明細書において定義する「ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ」において試験したとき、変異型の活性と第１図に示す特質因子ＶＩＩの活性との間の比が１．０以上、例えば、少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも約２．０、例えば、少なくとも約３．０またはさらにより好ましくは少なくとも約４．０である、このような変異型である。
【０１３０】
変異型の活性は、また、生理学的基質、例えば、因子Ｘ （ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質分解アッセイ、実施例１２参照） を使用して、適当には１００〜１０００ ｎＭの濃度において測定することができ、ここで適当な色素形成基質 （例えば、Ｓ−２７６５） を添加した後、発生した因子Ｘａを測定する。さらに、活性アッセイは生理学的温度において実施することができる。
【０１３１】
トロンビンを発生させる因子ＶＩＩａ変異型の能力は、また、生理学的濃度 （血友病Ａの症状をまねるとき、因子ＶＩＩＩを含まない） のすべての関係する凝固因子およびインヒビターと、活性化された血小板とを含んでなるアッセイにおいて測定することができる （下記の文献に記載されている：Ｍｏｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９９：５４２−５４７のｐ． ５４３、これは引用することによって本明細書の一部とされる）。
【０１３２】
投与および医薬組成物
本発明による因子ＶＩＩ変異型を使用して、いくつかの原因、、例えば、凝固因子欠乏症 （例えば、血友病ＡおよびＢ、凝固因子ＸＩまたはＶＩＩの欠乏症） または凝固因子のインヒビターを有する出血性障害をコントロールするために使用することができるか、あるいは正常に機能する血液凝固カスケード （凝固因子欠乏症または凝固因子に対するインヒビターをもたない） 被検体において起こる過剰の出血をコントロールするために使用することができる。出血は血小板機能の欠乏、血小板減少症またはフォン・ウィルブランド病により引き起こされることがある。
【０１３３】
また、繊維素溶解活性の増加が種々の刺激により誘導された被検体において出血は見られる。外科手術または非常に大きい外傷に関連して広範な組織損傷を経験する被検体において、止血メカニズムは即時の止血の要求により圧倒されることがあり、被検体は正常の止血メカニズムにかかわらず出血を発生することがある。また、出血が脳、耳内側領域および眼のような器官において起こるとき、満足すべき止血を達成することは問題であり、また、源の同定が困難であるとき、拡散性出血 （出血性胃炎およびおびただしい子宮出血） の場合において問題であることがある。種々の器官 （肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管） からの生検材料を採取するとき、ならびに腹腔鏡検査の外科手術において、同一の問題が起こることがある。
【０１３４】
これらの状況に共通して、外科技術 （縫合糸、クリップ、およびその他） により止血することは困難である。また、急性およびおびただしい出血は、欠陥性止血が与えられた療法により誘導された凝固防止治療を受けている被検体において起こることがある。このような被検体は、抗凝固作用を急速に中和しなくてはならない場合、外科的関与を必要とすることがある。不満足な止血の場合において問題を引き起こすことがある他の状況は、血栓塞栓症を防止するために抗凝固療法を止血メカニズムが正常である被検体に施すときである。このような治療は、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫ−アンタゴニストならびにアスピリンおよび他の血小板凝固インヒビターを含むことができる。
【０１３５】
凝固カスケードの系統的活性化は汎発性脈管内凝固 （ＤＩＣ） に導くことがある。しかしながら、高い投与量の組換え因子ＶＩＩａで治療された被検体において、血管壁の部位において暴露されたＦＶＩＩａとＴＦとの間の複合体形成により誘導される種類の局在化止血プロセスのために、このような合併症は見られなかった。こうして、また、正常の止血メカニズムに関連するこのような過剰の出血をコントロールするために、本発明による因子ＶＩＩ変異型を使用することができる。
【０１３６】
計画的関与と組み合わせた治療のために、本発明の因子ＶＩＩ変異型は典型的には関与を実施する約２４時間前に、かつその後７日またはそれ以上の期間にわたって投与されるであろう。
因子ＶＩＩ変異型の投与量は７０ ｋｇの被検体について約０．０５ ｍｇ〜５００ ｍｇ／日、好ましくは約１ ｍｇ〜２００ ｍｇ／日、より好ましくは約１０ ｍｇ〜約１７５ ｍｇ／日の範囲であり、配合および維持の投与量は被検体の重量および症状の重症度に依存する。
【０１３７】
医薬組成物は、主として予防的および／または療法的治療のための非経口的投与に意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内に投与されるか、あるいは連続的または脈動注入により投与することができる。非経口的投与のための組成物は、本発明の因子ＶＩＩ変異型を、薬学上許容される担体、好ましくは水性担体と組み合わせて、好ましくはその中に溶解させて含んでなる。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンおよびその他を使用することができる。また、本発明の因子ＶＩＩ変異型は外傷部位へのデリバリーまたはターゲッティングのためのリポソーム調製物に処方することができる。
【０１３８】
リポソーム調製物は、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，５０１，７２８号、および米国特許第４，９７５，２８２号に一般に記載されている。組成物は慣用のよく知られている滅菌技術により滅菌することができる。生ずる水溶液を使用するために包装するか、あるいは無菌的条件下に濾過し、凍結乾燥し、凍結乾燥した調製物を無菌の水溶液と組み合わせた後、投与することができる。組成物は、必要に応じて生理学的条件に近似させるために薬学上許容される助剤、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、張度調節剤およびその他、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびその他を含有することができる。
【０１３９】
これらの処方物中の因子ＶＩＩ変異型の濃度は、約０．５重量％より小から、通常少なくとも約１重量％〜１５または２０重量％程度に高くまで広く変化することができ、主として流体体積、粘度、およびその他により、選択した特定の投与モードに従い選択されるであろう。
【０１４０】
こうして、静脈内注入のために典型的な医薬組成物は、２５０ ｍｌの無菌のリンガー溶液および１０ ｍｇの因子ＶＩＩ変異型を含有するように調製することができる。非経口的に投与可能な医薬組成物を調製する実際的方法は既知であるか、あるいは当業者にとって明らかであり、そして、例えば、下記の文献にいっそう詳しく記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルベニア州イーストン （１９９０）。
【０１４１】
本発明の因子ＶＩＩ変異型を含有する組成物は、予防的および／または療法的治療のために投与することができる。療法的適用において、組成物は前述したように既に疾患を患う被検体に、疾患およびその合併症を治療し、軽減し、または部分的に抑制ために十分な量で被検体に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的に有効な量」として定義される。当業者は理解するように、この目的に有効な量は、疾患または外傷の重症度ならびに被検体の重量および一般的状態に依存するであろう。しかしながら、一般に、７０ ｋｇの被検体について有効量は約０．０５ ｍｇ〜約５００ ｍｇの変異型因子ＶＩＩ／日の範囲であり、約１．０ ｍｇ〜約２００ ｍｇの変異型因子ＶＩＩ／日がいっそう普通に使用される。
【０１４２】
本発明の物質は一般に重い疾患または外傷状態、すなわち、生命を脅かすまたは潜在的に生命を脅かす状況において使用できることを心に留めなくてはならない。このような場合において、外来性物質の最小化およびヒトにおいてヒト因子ＶＩＩ変異型の免疫原性の一般的欠如にかんがみて、治療医師は実質的に過剰のこれらの変異型因子ＶＩＩ組成物を投与することが可能であり、望ましいと感ずることがあるであろう。
【０１４３】
予防的適用において、疾患状態または外傷が推測されるか、あるいはそうでなければそれらの危険にある被検体に、本発明の因子ＶＩＩ変異型を含有する組成物を投与して、被検体自身の凝固能力を増強することができる。このような量は、「予防的に有効な量」として定義される。予防的適用において、正確な量は再び被検体の健康状態および重量に依存するが、投与量は、一般に、７０ ｋｇの被検体について約０．０５ ｍｇ〜約５００ ｍｇ／日の範囲であり、より普通に７０ ｋｇの被検体について約１．０ ｍｇ〜約２００ ｍｇ／日である。
【０１４４】
組成物の単一または複数の投与を実施することができ、投与のレベルおよびパターンは治療医師により選択される。毎日の維持レベルを必要とする着装携行の被検体について、因子ＶＩＩ変異型は、例えば、携帯用ポンプシステムを使用する連続的注入により投与することができる。
【０１４５】
本発明の因子ＶＩＩ変異型の局所的デリバリー、例えば、局所的適用は、例えば、噴霧、潅流、二重バルーンカテーテル、ステント、脈管移植片またはステントの中に組込んで、バルーンカテーテルの被覆に使用するヒドロゲル、または十分に確立された方法により実施することができる。いずれの場合においても、医薬組成物は被検体を効果的に治療ために十分な量の因子ＶＩＩ変異型を提供する。
下記の実施例により本発明をさらに例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでない。以上の説明および下記の実施例に開示されている特徴は、別々にかつ組み合わせて、本発明をその多様な形態で実現する材料である。
【０１４６】
実施例
下記の実施例において使用するアミノ酸置換についての用語は次の通りである。最初の文字は配列番号１のある位置に自然に存在するアミノ酸を表す。次の数は配列番号１中の位置を表す。第２の文字は天然アミノ酸を置換する異なるアミノ酸を表す。１つの例はＭ２９８Ｑであり、ここで配列番号１の位置２９８におけるメチオニンはグルタミンで置換されている。他の例、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑにおいて、同一因子ＶＩＩポリペプチドの中の配列番号１の位置１５８におけるバリンはトレオニンにより置換されており、そして配列番号１の位置２９８におけるメチオニンはグルタミンで置換されている。
【０１４７】
実施例１．［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩおよび ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩ、［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩをコードするＤＮＡ
問題のインサートを有するスーパーコイルド、二本鎖ＤＮＡベクターと所望の突然変異を含有する２つの合成プライマーを使用する位置指定突然変異誘発により、［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩおよび ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩ、［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩ、［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩ、および［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩをコードするＤＮＡ構築物を調製した。
【０１４８】
下記のプライマーを使用した：
【表２】
2004508822.tif 000003
【０１４９】
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼにより温度サイクリング間に、各々がベクターの反対の鎖に対して相補的である、オリゴヌクレオチドプライマーを拡張した。プライマーを組込むと、食い違いニックを含有する突然変異したプラスミドが発生した。温度サイクリング後に、メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに対して特異的であるＤｐｎＩで生成物を処理して、親ＤＮＡ鋳型を消化し、突然変異を含有する合成されたＤＮＡについて選択した。
特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によりＤＮＡ構築物を調製する手順は当業者によく知られている （下記の文献を参照のこと、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， 米国カリフォルニア州サンディエゴ）。
【０１５０】
実施例２．［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１５１】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。
【０１５２】
１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５３】
実施例３．［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１５４】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。
【０１５５】
１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｋ１５７Ａ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５６】
実施例４．［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１５７】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１５８】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１５９】
実施例５．［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１６０】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１６１】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１６２】
実施例６．［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１６３】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１６４】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１６５】
実施例７． ［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１６６】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１６７】
［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｍ２９８Ｑ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１６８】
実施例８．［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１６９】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１７０】
［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｓ３３６Ｇ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１７１】
実施例９．［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１７２】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１７３】
［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１７４】
実施例１０．［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩの調製
ＢＨＫ細胞を本質的に以前に記載されているようにトラスフェクトして （Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５−７７９３； ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８５：２４１−２４３） 変異型 ［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩを発現させた。因子ＶＩＩ変異型を次のようにして精製した。
【０１７５】
５ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００および１０ ｍＭのＴｒｉｓを添加し、ｐＨ ８．０に調節し、水の添加により導電性を１０〜１１ ｍＳ／ｃｍに調節した、コンディショニングした培地をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） の２５ ｍｌのカラム上に負荷した。１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０から１０ ｍｌのＴｒｉｓ、５０ ｍＭのＮａＣｌ、２５ ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ ８．０にステッピングすることによって、タンパク質の溶離を達成した。
【０１７６】
［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩを含有する画分をプールし、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） にカップリングしたモノクローナル抗体Ｆ１Ａ２ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバード） を含有する２５ ｍｌのカラムに適用した。１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１００ ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のトリトンＸ−１００を含有する、５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．５と、カラムを平衡化した。平衡化緩衝液および２ ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液で洗浄した後、ＣａＣｌ２の代わりに１０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する平衡化緩衝液で結合した物質を溶離した。使用または貯蔵前に、ＥＤＴＡよりも過剰のＣａＣｌ２を添加するか、あるいは［Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ］−ＦＶＩＩをＣａ２＋含有緩衝液に移した。各工程の収量を因子ＶＩＩ ＥＬＩＳＡ測定により追跡し、精製したタンパク質をＳＤ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１７７】
実施例１１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ加水分解アッセイ
天然 （野生型） 因子ＶＩＩａおよび因子ＶＩＩａ変異型 （両方を以後において「因子ＶＩＩａ」と呼ぶ） を平行にアッセイして、それらの比活性を比較した。このアッセイはマイクロタイタープレート （ＭａｘｉＳｏｒｐ、デンマーク国ヌンク） 中で実施する。０．１ ＭのＮａＣｌ、５ ｍＭのＣａＣｌ２および１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４中の因子ＶＩＩａ （最終濃度１００ ｎＭ） に、色素形成基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド （Ｓ−２２８８、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、スウェーデン国） （最終濃度１ ｍＭ） を添加する。
【０１７８】
４０５ ｎｍにおける吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国） で連続的に測定する。２０分のインキュベーション間に発生した吸収から、酵素を含有しないブランクウェルにおける吸収を減じ、変異型および野生型因子ＶＩＩａの活性間の比を計算する：
比 ＝ （Ａ４０５ｎｍ因子ＶＩＩａ変異型）／ （Ａ４０５ｎｍ因子ＶＩＩａ野生型）
【０１７９】
実施例１２．ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質分解アッセイ
天然 （野生型） 因子ＶＩＩａおよび因子ＶＩＩａ変異型 （両方を以後において「因子ＶＩＩａ」と呼ぶ） を平行にアッセイして、それらの比活性を比較した。このアッセイはマイクロタイタープレート （ＭａｘｉＳｏｒｐ、デンマーク国ヌンク） 中で実施する。０．１ ＭのＮａＣｌ、５ ｍＭのＣａＣｌ２および１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１００ μｌの５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４中の因子ＶＩＩａ （１０ ｎＭ） および因子Ｘ （０．８ μＭ） を１５分間インキュベートする。
【０１８０】
次いで、０．１ ＭのＮａＣｌ、２０ ｍＭのＥＤＴＡおよび１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１００ μｌの５０ ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４を添加することによって、因子Ｘの切断を停止させる。色素形成基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド （Ｓ−２７６５、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、スウェーデン国） （最終濃度０．５ ｍＭ） を添加することによって、発生した因子Ｘの量を測定する。４０５ ｎｍにおける吸収をＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国） で連続的に測定する。１０分間に発生した吸収から、ＦＶＩＩａを含有しないブランクウェルにおける吸収を減じ、変異型および野生型因子ＶＩＩａのタンパク質分解活性間の比を計算する：
比 ＝ （Ａ４０５ｎｍ因子ＶＩＩａ変異型）／ （Ａ４０５ｎｍ因子ＶＩＩａ野生型）
【０１８１】
実施例１３．実施例１１および１２に記載するアッセイにおいて測定した因子ＶＩＩａ変異型の相対的活性
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、自然ヒト凝固因子ＶＩＩの完全なアミノ酸配列 （配列番号１） を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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