(57)【要約】本発明は、核酸分子、好ましくは開環およびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡ分子をお互いから分離するための方法であって、当該分子を含む溶液を提供し、担体における吸着基に当該分子を吸着させ、そして所望により適当な溶液で当該カラムを洗浄するステップを含む当該方法に関連する。本方法は、遺伝子治療に用いるためのスーパーコイル化ｃｃｃＤＮＡのラージスケール単離に特に適当である。
2004533237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液から核酸分子を単離する方法であって、
(ａ)核酸分子の混合物を、Ｓ−アリールリガンドが提供される担体表面のマトリクスに適用すること、
(ｂ)当該核酸分子を溶出ステップに適用すること、
(ｃ)異なる核酸分子を含む異なる画分を単離すること、
(ｄ)所望により、適当な溶液で当該担体を洗浄すること、
のステップを含む当該方法。
【請求項２】
当該核酸分子を発現する細胞を分解し、核酸分子を含む溶液を提供する最初のステップを含み、その分解は溶解である、請求項１の方法。
【請求項３】
適当な溶出液を接触させることにより、核酸分子を溶出する更なるステップを含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
当該担体が無機性マトリクスである、請求項１−３の何れかの方法。
【請求項５】
当該担体がガラスである、請求項４の方法。
【請求項６】
当該担体がゼオライトである、請求項４の方法。
【請求項７】
当該担体がシリカである、請求項４の方法。
【請求項８】
当該担体が有機性マトリクスである、請求項１−３の何れかの方法。
【請求項９】
当該担体が樹脂またはポリマーである、請求項８の方法。
【請求項１０】
当該担体がアガロースまたは架橋化アガロース、デキストラン、ポリスチレン／ジビニルベンゼン、コート化ポリスチレン、アクリル性ポリマー、デキストランアクリル性ポリマー、ビニル性グラフト化ポリマー、またはビニル性ポリマーである、請求項９の方法。
【請求項１１】
当該担体が、シリカ−デキストラン、シリカ−アクリル性ポリマーまたはシリカ−ポリエチレンイミン型の、異なるシリカに基づく樹脂である、請求項９の方法。
【請求項１２】
当該担体が、当該核酸分子混合物が付される活性表面として存在する、請求項１から１１の何れか１以上の方法。
【請求項１３】
当該担体が、核酸分子混合物と接触する膜として存在する、請求項１から１２の何れか１以上の方法。
【請求項１４】
当該担体が、核酸分子混合物と接触するフィルターとして存在する、請求項１から１３の何れか１以上の方法。
【請求項１５】
当該担体が、核酸分子混合物が通過するカラム中のクロマトグラフィーマトリクスとして存在する、請求項１から１４の何れか１以上の方法。
【請求項１６】
当該担体が、核酸分子混合物を適用するスポンジ物質として存在する、請求項１から１５の何れか１以上の方法。
【請求項１７】
Ｓ−アリールリガンドが、２(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合するＳ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項１−１６の何れか１以上の方法。
【請求項１８】
Ｓ−アリールリガンドが、３(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合するＳ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項１−１６の何れか１以上の方法。
【請求項１９】
Ｓ−アリールリガンドが、２(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項１７の方法。
【請求項２０】
Ｓ−アリールリガンドが、３(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項１８の方法。
【請求項２１】
Ｓ−アリールリガンドがフェニル−Ｓリガンドである、請求項１−１６の何れか１以上の方法。
【請求項２２】
Ｓ−アリールリガンドが、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介しＳ−基に分離されるフェニル部分を有するフェニル−Ｓリガンドである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
核酸分子がｏｃプラスミドＤＮＡ、ｃｃｃプラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項１から２２の方法。
【請求項２４】
核酸分子を分離するためマトリクスであって、マトリクスを形成するため担体に結合するアリール−Ｓリガンドを含むが、ただし、当該リガンドは２−(メルカプトメチル)ピリジン、４−(メルカプトメチル)ピリジン、２−(２−メルカプトエチル)ピリジン、４−(２−メルカプトエチル)ピリジン、４−ニトロ−１−メルカプトメチル−ベンゼン、３，４−ジニトロ−１−メルカプトメチルベンゼン、２−メルカプトメチルキノリン、メルカプトエチルイミダゾリン、および６−メルカプトメチルウラシリンではないことを特徴とする、当該マトリクス。
【請求項２５】
Ｓ−アリールリガンドが、２(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項２４のマトリクス。
【請求項２６】
Ｓ−アリールリガンドが、３(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項２４のマトリクス。
【請求項２７】
Ｓ−アリールリガンドが、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するフェニル部分に分離されるＳ−基を所望により有するフェニル−Ｓリガンドである、請求項２４のマトリクス。
【請求項２８】
核酸プラスミド分子の分離および精製のためのカラムであって、アリール−Ｓリガンドが結合するマトリクスを含むが、ただし、当該リガンドは２−(メルカプトメチル)ピリジン、４−(メルカプトメチル)ピリジン、２−(２−メルカプトエチル)ピリジン、４−(２−メルカプトエチル)ピリジン、４−ニトロ−１−メルカプトメチル−ベンゼン、３，４−ジニトロ−１−メルカプトメチルベンゼン、２−メルカプトメチルキノリン、メルカプトエチルイミダゾリン、および６−メルカプトメチルウラシリンではないことを特徴とする、当該カラム。
【請求項２９】
Ｓ−アリールリガンドが、２(オルト)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項２８のカラム。
【請求項３０】
Ｓ−アリールリガンドが、３(メタ)位置でピリジル窒素原子に結合し、所望により、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するピリジル部分に分離される、Ｓ−部分を有するピリジル−Ｓリガンドである、請求項２８のカラム。
【請求項３１】
Ｓ−アリールリガンドが、１から７炭素原子、好ましくは１から４炭素原子を有するアルキレン鎖を介するフェニル部分に分離されるＳ−基を所望により有するフェニル−Ｓリガンドである、請求項２８のカラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、溶液中のプラスミドＤＮＡのような核酸分子を分離するための方法に関する。より特に、本方法は、ｏｃ(開環)ＤＮＡおよびスーパーコイル化ｃｃｃ(共有結合的閉環状)ＤＮＡおよびリボ核酸および他のデオキシリボ核酸の、お互いからの分離および溶液中に存在する他の成分からの分離に基づく。
【０００２】
背景技術
遺伝子治療およびＤＮＡワクチンの開発により、プラスミドＤＮＡのような高純度遺伝子ベクターの必要性が高まってきた。スーパーコイル化プラスミドＤＮＡの精製に伴う問題には、宿主タンパク質、エンドトキシン、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡの開環状およびニック型のような他の細胞成分の完全除去がある。異なるクロマトグラフ法は、粒径排除(size exclusion)クロマトグラフィー、またはゲル濾過、ヒドロキシアパタイト、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーのようなプラスミドＤＮＡ精製に使用されている。殆どの方法は、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを他のプラスミド型から分離する可能性を欠く。多くの利用可能な方法もまた、サンプルをクロマトグラフカラムに適用する前に、透明なライゼート中のＲＮＡを加水分解するＲＮａｓｅを使用する。ＲＮａｓｅの使用は、ヒトでの使用を目的とするプラスミドＤＮＡの分離には推奨されない。
【０００３】
イオン交換クロマトグラフィーは、最も普通に使用されるクロマトグラフィー法である。プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡおよびＲＮＡは、類似の荷電特性を有するため、すべて陰イオン交換体に結合する。疎水性相互作用クロマトグラフィーもまた用いるが、プラスミドＤＮＡは結合せず、フロースルー中に溶出した。
【０００４】
本発明の要約
本発明の目的は、１つまたはそれよりも多い上記の欠点を避ける、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡの単離のための方法を提供することである。そのため、本発明の１つの目的は、効率的な、マトリクスにおける核酸分子の単離のための方法を提供することである。本発明の目的は、本願添付の請求の範囲で定義のような方法により、および添付の請求の範囲のマトリクスにより、より特に得られる。
【０００５】
定義
用語「核酸分子」は、本願明細書では、開環プラスミドＤＮＡ、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよび他のＤＮＡ(例えば、ゲノムＤＮＡ)およびｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｓＲＮＡのようなＲＮＡのような巨大分子および分子集合体(aggregate)を含む。
【０００６】
用語「溶出液」は、本願明細書では、クロマトグラフィーでの通常の意味、すなわち、固相(吸着剤マトリクス)と産物(核酸分子)との間の相互作用に摂動を起こさせる(perturb)ことができ、当該固相からの当該産物の選択的分離を促進できる溶液に使用する。
【０００７】
本明細書に使用する任意の用語は、本願明細書中で特に定義しないが、当業者が理解する一般的な意味により構成されると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、Sepharose 6 Fast Flowと反応するアリール−Ｓ化合物であって、分離特性を有する当該化合物の例を示す。
【図２】図２は、１３０および１５０ｍｌの透明なライゼートをSephacryl S-500HRにそれぞれロードし、２Ｍ硫酸アンモニウム中で作動(run)させた後に得られた２つのクロマトグラムを示す。挿入図(insert)は、選択画分および開始物質のアリコートのアガロースゲル電気泳動を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Ｓリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Ｓリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Ｓリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。挿入図(insert)は、選択画分のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図４】図４は、クロマトグラム上で示すように、多数の異なるアリール−Ｓリガンドを有するSepharose 6 Fast Flowでのクロマトグラフィー後に得られた結果を示す。
【図５】図５は、高伝導率条件(＞240mS/cm)下、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowにサンプル(ゲル濾過により精製)をロードした後に得られたクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、XK16/15カラム中のPyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowに透明なライゼートのクロマトグラフィーを行なった後に得られた結果を示す。
【図７】図７は、本発明によるＳ−アリールリガンドにプラスミドＤＮＡを吸着させる間のＮａ２ＳＯ４の使用の解説に用いるクロマトグラムである。
【０００９】
本発明の詳細な説明
第一の態様では、本発明は、溶液から核酸分子を単離する方法であって、
(ａ)核酸分子の混合物を、Ｓ−アリールリガンドが提供される担体表面のマトリクスに適用する(subject)こと、
(ｂ)当該核酸分子を溶出ステップに適用すること、
(ｃ)異なる核酸分子を含む異なる画分を単離すること、および
所望により、適当な溶液で当該担体を洗浄すること、
のステップを含む当該方法に関する。
【００１０】
そのため、ステップ(ａ)の間に、核酸分子は、Ｓ−アリールリガンドに吸着し得る。当該洗浄は、残存する望ましくない物質を除去するため、当業者に既知のように、吸着の後であるが溶出前に行なう。天然には、本方法もまた、核酸が溶液の望ましくない成分である場合、すなわち、核酸から精製した溶液を提供するために使用し得る。その場合、核酸分子の溶出は、カラムの再生のために行なう。従って、本発明の溶液の精製のための方法は、溶出のステップを含む必要はない。
【００１１】
ある実施態様では、本発明の方法は、細胞中で発現する核酸分子の単離であり、それ故、細胞を破壊し核酸分子を含む溶液を提供する第一のステップをまた含む。その破壊は、例えば、標準的なプロトコール(例えば、Maniatis, T, Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY)による、アルカリ溶解のような溶解により行なう。
【００１２】
他の実施態様では、本方法は、適当な溶出液をマトリクスに接触させることによりスーパーコイル化プラスミドＤＮＡ分子を溶出する更なるステップを含む。そのため、当該溶出ステップは、動的(dynamic)またはバッチ(batch)の手順として行ない得る。溶出は、以下の実験部分においても解説するように、通常、伝導率が低下する勾配によるような既知の原理で行なう。
【００１３】
そのため、本発明の方法は、例えば、遺伝子治療、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療に関連する実験室での研究での使用のための核酸の精製のために、利用される。有利な実施態様では、本方法は、許容される遺伝子治療品質のスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを単離する。より特に、近い将来、遺伝的物質のキャリアまたはベクターとして遺伝子治療に使用のために大量のプラスミドＤＮＡの必要性が増大する。上記のように、そのキャリアの単離のための従来記載されている方法は、この目的には不十分であり、そのため、本発明の方法は、最初に、医学的および診断的使用のために核酸分子をラージスケールで処理、特にｏｃプラスミドＤＮＡおよびｃｃｃプラスミドＤＮＡを分離し得る。本方法の更なる利点は、都合がよいことには、自動化に適用されることである。例えば、ＡＫＴＡ(商標)explorer(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)での自動化では、高量の同種性プラスミドＤＮＡ、より特に９８％を超えるスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを生ずることが判る。
【００１４】
本発明により単離したプラスミドは任意の起源からなり得る。殆ど通常、E. coliのような細菌などの微生物は、プラスミドの作成(culturing)に使用するが、宿主細胞の使用は制限されず、原核細胞または真核細胞であり得る。当該プラスミドを保持する宿主細胞は、多くの当分野に既知の方法、例えば、インキュベーター、バイオリアクター、発酵槽(fermentor)など中で培養され得る。本発明により単離した当該プラスミドは、実際には任意の大きさ、約１ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲となり得る。上限として、コスミドおよび人工染色体の単離もまた含まれ、その大きさは、それぞれ約５０ｋｂおよび５００ｋｂまでであり得る。
【００１５】
プラスミドは高コピー数または低コピー数であり得、任意の遺伝子、任意の源由来の目的のタンパク質またはペプチドをコードするゲノムまたは合成の何れかの遺伝子を保有し得る。宿主細胞の作成(culturing)および遺伝子治療のためのプラスミドの開発は当分野に既知である。
【００１６】
当該プラスミドを含む宿主細胞を培養した後、当該細胞を例えば遠心分離または濾過により回収する。当該細胞は、例えば、フリーザー中で保存され得、または直前に処理し得る。
【００１７】
上記のように、本発明のプラスミドＤＮＡを細胞中で作成するとき、その溶解は有利にはアルカリ溶解により行なう。次いで、当該ライゼートは、二価アルカリ土類金属イオンのような金属イオンで処理し、不純物および特にＲＮＡおよび染色体ＤＮＡを沈殿させ得る。その沈殿物質を取り除くとき、当該溶液はカラムに適用し得る(本文書中で金属イオン沈殿法の詳細な開示のためには、例えば、Amersham Pharmacia Biotechの名義のWO9916869参照)。
【００１８】
利点ある実施態様では、使用するマトリクス物質は、カラムクロマトグラフィー物質として存在し、リガンドが結合する担体物質は、任意の適当な無機性または有機性物質である。無機性物質は、ガラス、シリカ、または他の不活性粒子無機物である。その物質は、市場で利用可能な任意のマトリクスであり得る。異なる樹脂またはポリマーに基づく利用可能な多くの商業製品、例えば、アガロースまたは架橋化アガロース(Sepharose(商標)など、Amersham Pharmacia Biotech)、デキストラン(Sephadex(商標)、Amersam Pharmacia Biotech)、ポリスチレン／ジビニルベンゼン(MonoBeads(商標)、SOURCE(商標)、Amersham Pharmacia Biotech)、コート化ポリスチレン、アクリル性ポリマー、デキストランアクリル性ポリマー(Sephacryl(商標)、Amersham Pharmacia Biotech)、ビニル性グラフト化ポリマー、またはビニル性ポリマー、シリカ−デキストラン、シリカ−アクリル性ポリマーまたはシリカ−ポリエチレンイミンのような異なるシリカに基づく樹脂がある。
【００１９】
本方法は、膨張ベッド(expanded bed)または充填ベッド(packed bed)としての、またはバッチモードのマトリクスで行ない得る。充填ベッド吸着では、当該吸着剤は、クロマトグラフカラム中に充填され、精製工程の間に使用する全ての溶液は同じ方向でカラムを流れる。しかし、膨張ベッド吸着では、当該吸着剤は膨張し、カラムを通して液体を流すことにより平衡化する。適当な流体化膨張ベッドは、サンプル適用および洗浄ステップにおいて粒子沈降または上昇速度と流速との間にバランスがとれているときに、形成される。溶出ステップでは、吸着剤が沈降し、充填ベッド吸着剤のように挙動する。
【００２０】
担体物質に結合し本発明のマトリクスを形成するリガンドは、メルカプト−ピリジン、メルカプトアルキルピリジンであり、ここで、当該メルカプト−およびメルカプトアルキル基が、ピリジル−窒素原子との関係でそれぞれオルトおよびメタの位置に結合する。ここで、それは、チオエーテル結合を介し担体物質に結合するメルカプト基である。更に、リガンドの一部を形成するアリール基は、フェニル、ベンジル、トルイル、フェネチル、ナフチル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、キノリニル、プリニルである。更なる置換基がまた芳香族環に加えられ得る。望ましい結合および溶出特性を得るため、更なる置換基を有する本Ｓ−アリールリガンドを提供することにより、広範囲の異なる分離媒体を設計し得る。例えば、吸着ステップのための低濃度の溶出液を使用し得るため、溶出プロファイルをシフトすることが望ましいかもしれない。当該置換基は、例えば、１つまたはそれより多いアミン基、ニトロ基、エーテル基、チオール基、および／またはフッ素のようなハロゲンであり得る。これらの更なる置換基はまた、望ましいため、更なる炭素原子を含み得る。また、当業者が理解するように、炭素原子は、上記環構造中のヘテロ原子と置換され得る。本願明細書では、用語「Ｓ−アリールリガンド」は、望ましい程度に置換され得る広範囲の化合物を含み、それらの幾つかは、以下の図１で例示する。リガンド密度は、１０−５００μｍｏｌｅ／ｍＬキャリア、好ましくは１０−１００μｍｏｌｅ／ｍＬキャリアの範囲である。
【００２１】
本発明で使用する溶出液は、ｐＨ中性(好ましくはｐＨ６．５から８．５)の溶出液であり、好ましくは、ｃｃｃ型とは対照的にｏｃＤＮＡが結合しない０．５から４Ｍ、好ましくは１．５から２．０Ｍの濃度を有する硫酸アンモニウムである。サンプルを完全にカラムにロードした後、その後、結合ｃｃｃプラスミドＤＮＡは、減少させた硫酸アンモニウム濃度を用いることによりカラムから溶出させ得る。ＲＮＡ分子は、一様に低濃度の硫酸アンモニウムを用いることによりカラムから溶出し得る。
【００２２】
第二の態様では、本発明は、マトリクスがｏｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、およびＲＮＡ分子のような核酸プラスミド分子を選択的に選択する、メルカプト−アリール部分を含むマトリクスに関する。ここで、メルカプト−基は、アリール基に直接置換され得るか、または１から７炭素原子を有するアルキレン鎖を介して置換され得る。行なわれた実験室での研究では、４−(２−メルカプトエチル)ピリジン、または２−(２−オキソエチル)ピリジンの何れも、ｏｃＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡを分離する能力を有していなかったことが判った。
【００２３】
１つの実施態様では、マトリクス粒子は、約１０−３００μｍの範囲内の平均サイズ、例えば１０−２０、２０−５０、５０−１００、１００−２００または２００−３００μｍの範囲内である。しかし、当該粒子は、都合よくは、２５０、２１２、１８０、１５０、１２５、１０６、９０、７５、６３、４５、３７、３０、２５、２０、１５μｍのような商業的に利用可能なシーブ装置が存在する任意のサイズで作成され得る。
【００２４】
プラスミドまたはウイルスのようなナノ粒子の分離に特に有利な１つの実施態様では、本方法は、スーパーポーラス(superporous)粒子に結合するリガンドとして１つまたはそれより多い上記Ｓ−アリール化合物を含むマトリクスを使用する。本実施態様で使用するスーパーポーラスマトリクス粒子の平均スーパーポア直径は、約５−１０または約１０−２０μｍのような少なくとも約４μｍであり、約２０−３０または一様の約３０−４０μｍのような約２５μｍまでの値であり得る。しかし、本文書では、用語「スーパーポーラス」は、ポアが粒子の構造の本質的部分となり得るように十分大きく、すなわち、実質的に固相である中央部分以外に多孔性表面層を有する通常の粒子よりも相当程度に深くまで粒子に浸透し得る。１つの特に有利な実施態様では、吸着ステップは、動的条件下で行なわれる。従って、本実施態様で使用するスーパーポーラス粒子は、ポアを通過する実質的部分であるが、その一方、それらはまた、動的な流動手順の間、元来の外観を維持、すなわち、破壊されず十分に強固なとなるように設計される。
【００２５】
図面の詳細な説明
図１は、Sepharose 6 Fast Flowと反応する多様なアリール−Ｓ化合物の例を示す。この図面からの様相のように、アリール−Ｓ化合物は、異なる置換基が提供され、それらそれぞれは、異なる目的に利点となることが証明され得る結合および溶出特性を生じ得る。
【００２６】
図２は、２０ｃｍ高さのベッドを有するＸＫ５０／３０カラム中のSephacryl S-500 HRにおける、透明なライゼートのプラスミドＤＮＡ対ＲＮＡの群分離(group separation)後に得られる結果を示す。当該カラムは、２１６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化し、それぞれ１３０および１５０ｍｌの透明なライゼートを流速３０ｃｍ／ｈｒでロードする。サンプルを当該カラムに一旦適用すると、その流速は６０ｃｍ／ｈｒに増加させ、空隙容量(void volume)を回収する。全サンプルの全溶出およびカラムの再平衡の後、次のサンプルをロードする。１％アガロースゲル電気泳動の選択画分の分析により、透明なライゼート調製物中のＲＮＡと共に開環およびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの存在が示される。ゲル濾過の排出体積では、ＲＮＡの存在は検出され得ない。しかし、開環およびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの両方の殆どは、これらの画分中に見られ得る。当該排出体積を回収し、その後のクロマトグラフィーステップに使用する。
【００２７】
図３Ａは、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flow カラムにプラスミドＤＮＡサンプルをロードし、Ｈ２Ｏ勾配で溶出させたのち得られたクロマトグラフを示す。ピリジル−Ｓリガンドは、上側右隅に示している。Pyridyl-S Sepharose 6 FFは、ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られたサンプル２０ｍｌを流速４５ｃｍ／ｈｒでPyridyl-S Sepharose 6FFにロードした後に４．６／１５ＰＥＥＫカラム中の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２１６ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化する。全ての非結合物質を平衡化緩衝液で洗浄後、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡは、２カラム体積のＨ２Ｏの勾配を適用することにより伝導率を低下させることにより溶出させる。伝導率が２１２ｍＳ／ｃｍに到達すると、１つのピークが溶出する。すべての勾配が終了(establish)すると、当該カラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２１６ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で再平衡化する。空隙容量および溶出ピークから選択した画分を、１％アガロースゲル電気泳動で、異なるプラスミドＤＮＡ型の存在を分析する。当該挿入図は、これらの条件下、殆どの開環プラスミドＤＮＡは、Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowとは結合せず、その一方、スーパーコイル化ＤＮＡは当該媒体に結合し、２１２ｍＳ／ｃｍ未満に伝導率を下げることにより溶出し得る。アガロースゲルにおける最後のレーンは、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡを含む溶出ピークの５倍希釈物を示す。
【００２８】
図３Ｂは、Sephacryl S-500 HR カラムでのゲル濾過後に得られるプラスミドＤＮＡサンプルを２−メルカプトエチルピリジンSepharose 6 Fast Flow カラムにロードした後に得られる結果を示す。この実験で使用するリガンドはクロマトグラムの上側右隅に示している。カラムの平衡化後、図１で示した実験で得られたサンプル２０ｍｌを当該カラムに４５ｃｍ／ｈｒでロードする。２カラム体積の洗浄緩衝液後、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡは、Ｈ２Ｏの勾配で伝導率を低下させることによりカラムから溶出させる。伝導率が２０９ｍＳ／ｃｍに到達すると、結合物質はカラムから溶出する。１％アガロースゲル電気泳動に示すように、この溶出ピークは、主にスーパーコイル化プラスミドＤＮＡを含み、その一方、開環プラスミドＤＮＡは、空隙容量中に見ることができ、そのため、これらの設定条件下では当該媒体には結合しない。
【００２９】
図３Ｃは、図の上側右隅に示したリガンドで得られたクロマトグラムを示す。フェニル-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、ゲル濾過の空隙容量２０ｍｌを当該媒体に流速４５ｃｍ／ｈｒでロードする前に、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２１６ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化する。非結合の物質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２１６ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で洗浄し、非結合物質は、Ｈ２Ｏの勾配で伝導率を低下させることにより溶出させる。伝導率２１４ｍＳ／ｃｍで、当該物質は、当該媒体から溶出を開始する。１％アガロースゲル電気泳動での分析により、フロースルー中には開環プラスミドＤＮＡのみの存在が見られる。スーパーコイル化ＤＮＡはカラムに結合し、溶出ピーク中で検出される。
【００３０】
図４は、図１で示される幾つかの異なるリガンドで得られた多くのクロマトグラムを示す。各クロマトグラムで、リガンドは、図の上側右隅に示されている。アリール-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、ゲル濾過の空隙容量２０ｍｌを当該媒体に流速４５ｃｍ／ｈｒでロードする前に、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２２０ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化する。結合物質は、純粋Ｈ２Ｏの勾配で伝導率を低下させることにより溶出させる。異なるクロマトグラムの比較から、リガンド特性を変化させることにより、プラスミドＤＮＡの結合および溶出条件は、修飾され得る。
【００３１】
図５は、高伝導率条件下でPyridyl-S Sepharose 6 Fast FlowにプラスミドＤＮＡサンプルをロードした後に得られる結果を示す。Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flow は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９(２４０ｍＳ／ｃｍ)中の２．４Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化する。Sephacryl S 500 HR でのゲル濾過後に得られるサンプルは、Pyridyl-S Sepharose 6 FFに４５ｃｍ／ｈｒで２０ｍｌロードする前に２４０ｍＳ／ｃｍに調節する。非結合物質を同じ緩衝液を用い洗浄し、溶出は、Ｈ２Ｏ−勾配で伝導率を低下させることにより開始させる。２つの溶出ピークは、これらの条件下で検出し、選択サンプルは、１％アガロースゲル電気泳動で分析する。これらの状況下、開環およびスーパーコイル化プラスミドＤＮＡの両方が、Pyridyl-S Sepharose 6 FFに結合するが、それら両方とも、異なる伝導率値で溶出する傾向があり、そのため、開環またはスーパーコイル化ＤＮＡの何れかが豊富な画分が得られ得ることが判る。
【００３２】
図６は、ＸＫ１６／１５カラム中のPyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowに透明なライゼートにクロマトグラフィーを行なった後に得られる結果を示す。Pyridyl-S Sepharose 6 Fast Flowカラムは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５(２２４ｍＳ／ｃｍ)中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化し、その後、透明なライゼート１５０ｍｌを流速９０ｃｍ／ｈｒでロードする。非結合物質を洗浄し、結合物質を、カラム全体に水の勾配を適用することにより伝導率を低下させることにより溶出させる。開環プラスミドＤＮＡはマトリクスには結合せず、その一方、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡの両方ともPyridyl-S Sepharose 6 FFに結合する。しかし、両方とも、異なる伝導率で溶出し得、ここで、スーパーコイル化プラスミドＤＮＡは、２１１ｍＳ／ｃｍでカラムから溶出を開始し、その一方、ＲＮＡは、伝導率が一旦１７０ｍＳ／ｃｍ未満になると広範のピーク中で僅かに溶出する。
【００３３】
図７は、３．０Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で事前に処理した本発明のカラムに、どのようにプラスミドＤＮＡをロードし、１Ｍ ＮａＣｌまでの勾配でどのように溶出するかを示している。
【実施例】
【００３４】
実験部分
以下、本発明を、説明としてのみ提供され、如何なる態様においても添付の請求の範囲により定義されるような本発明の範囲を制限するように解釈されてはならない実施例により記載する。以下または本願明細書中の他の場所で含まれる引用文献はすべて、引用により本願明細書に含める。
【００３５】
アガロースビーズを含むリガンドの調製
Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacial Biotech)は、Hermanson et al[Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992), p. 118]によるエポキシ基で活性化された。当該リガンド密度は、おおよそ５０μｍｏｌエポキシ／ｍＬキャリアであった。アリール−Ｓ試薬(図１参照)、５０μｍｏｌ／ｍＬキャリアは、ｐＨ１０．５のエポキシ活性化セファロースと反応させた。当該反応は、一夜かけて窒素気流下、４５℃で行なった。反応後、当該ゲルを冷却し、アセトンおよび最終的には水で洗浄した。得られた当該リガンド濃度は、３０−５０μｍｏｌ／ｍＬキャリアの範囲であった。
【００３６】
細胞培養
ＪＶ４−挿入物を有するｐＵＣ１９プラスミドを含むE. coli TG1細胞の接種物は、２ＹＴ培地中でＯＤ４まで増殖し、その後、４０ｍｌをBiostat EDリアクター中の１０リッター培地に移す。ＯＤ１３．６で、当該細胞を回収し、Sorvall RC12BPローター中で４２００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、細胞ペレットを−７０℃で保存する。
【００３７】
アルカリ溶解
細菌２５ｇを、氷冷Ｓ緩衝液(６１ｍＭ グルコース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０)５０ｍｌ中に再懸濁する。緩衝液Ｓ１３０ｍｌを更に加える。一定の緩やかな攪拌の後、緩衝液Ｐ２(０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ)３９０ｍｌを加える。室温でゆっくりと攪拌し確実に完全に混合して１０分後、氷冷緩衝液Ｐ３(３Ｍ 酢酸カリウム、ｐＨ５．５)２９３ｍｌを加える。２０分間ゆっくりと攪拌し、当該溶液は、一夜４℃に保存する前に氷上でインキュベーションする。次の日、当該混合物を、ＧＳＡローター中で４℃で１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、当該上清を濾過ペーパーで濾過し、透明なライゼートを得る。
【００３８】
サンプル調製
透明なライゼートを以下の通り処理する：
ａ)等量(体積)の４Ｍ硫酸アンモニウムを加えることにより２Ｍ硫酸アンモニウムに調節するか、または好ましくは、
ｂ)Sephacryl(商標) S-500 HR (Amersham Pharmacial Biotech)の粒径排除(基分離および緩衝液交換)、事前平衡化および２Ｍ硫酸アンモニウム中での作動によるサンプル精製。Sephacryl S-500 HR (XK50/30カラム、ベッドの高さ20cm)は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で平衡化する。０．４ＣＶまでの透明なライゼートを、３０ｃｍ／ｈｒでカラムにロードする。一旦、全てのサンプルをカラムにロードすると、当該溶出速度は、６０ｃｍ／ｈｒに調節し、プラスミドＤＮＡを含むフロースルーは更なる実験のために回収する(図２参照)。
【００３９】
クロマトグラフィー
幾つかのアリール-S Sepharose 6 Fast Flow 媒体は、１４０ｃｍ／ｈｒで４．６／１５ＰＥＥＫ−またはＸＫ１６／１５ガラスカラム(ベッド高さ１５ｃｍ)中に充填し、すべてのカラムを、２１５ｍＳ／ｃｍ(温度２５℃に換算)を超える伝導率を生ずる２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９中の２Ｍ (ＮＨ４)２ＳＯ４で４５ｃｍ／ｈｒで平衡化する。次いで、透明なライゼート調製物(ａ)またはｂ)により、上記参照)２０−１５０ｍｌを、同じ流速でカラムにロードする。２カラム体積の洗浄後、結合物質は、１０カラム体積にわたるＨ２Ｏ勾配で媒体から溶出する。作動の間、２６０ｎｍの吸収を記録する。異なる画分を回収し、それら多くを１％アガロースゲル電気泳動で分析し、エチジウムブロミドで染色し、ＵＶで視覚化する(図３Ａ−Ｃ、図４、図５および図６参照)。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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