(57)【要約】本発明は、繊毛虫のホスホリパーゼＡ1をコードする核酸に関する。前記ホスホリパーゼＡ1は、特に、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
2004525622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊毛虫からのホスホリパーゼＡ1をコードする核酸。
【請求項２】
コード領域および非コード領域を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
非コード領域の核酸フラグメントは、配列番号２および３を有し、かつ、コード領域の核酸は、配列番号１、８および／または９を有する、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
コード領域および非コード領域からなり、配列番号４を有する核酸。
【請求項５】
配列番号５のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項６】
配列番号６の配列を有する、請求項５に記載の蛋白質のＮ−末端フラグメント。
【請求項７】
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するホスホリパーゼＡ1蛋白質（ＰＬＡ1）。
【請求項８】
組み換え型蛋白質およびペプチドの相同または非相同発現のための、ならびに、相同または非相同組み換え（“ノック−アウト、“遺伝子置換”）のための、請求項１〜３に記載の核酸またはその一部の使用。
【請求項９】
蛋白質およびペプチドの相同または非相同発現のための、ならびに、相同および非相同組み換え（“ノック−アウト、“遺伝子置換”）のための方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸を、繊毛虫にトランスフェクトする方法。
【請求項１０】
前記核酸またはその一部は、蛋白質の相同もしくは非相同発現に通常用いられるエンハンサー、プロモーター、オペレーター、開始点、ターミネーター、抗生物質耐性、または、他の核酸もしくはＤＮＡフラグメント、または、ウイロイド、ウイルス、バクテリア、アルシェゾアン、原生動物、真菌、植物、動物、もしくはヒトと組み合わせられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸が、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体、またはミニクロモソーム、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、または何らかの他の種類の環状もしくは線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ中に含まれる、請求項１０および／または１１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３の少なくとも１項に記載の核酸を少なくとも１つ含む、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体、またはミニクロモソーム、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、または他の種類の環状もしくは線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１〜５のプレアンブルに記載のホスホリパーゼＡ1をコードする核酸およびその使用に関する。
【０００２】
酵母、バクテリアおよび哺乳動物細胞は、外来蛋白質の非相同発現による組み換え型活性物質のバイオテクノロジー的調製および生成に、非常に重要である。大腸菌または枯草菌に基づくバクテリア発現系は、インシュリン、インターロイキン−２、組織プラスミノーゲン活性化剤、プロテアーゼおよびリパーゼのような、組み換え型ペプチドまたは蛋白質の生成のために使用される。グラム陰性菌では、発現系は、主として、ラクトースオペロンまたはトリプトファンオペロンのような、遺伝的要素の使用に基づいている。ホスト外の蛋白質は、細胞内の“封入体(inclusion bodies)”内、または、β−ラクタマーゼ遺伝子に基づく発現系が使用される場合は、ペリプラスミックスペース(periplasmic space)内のいずれかで生成される。周辺発酵培地内での組み換え型蛋白質の生成は、確立されていない。グラム陽性菌では、今まで、ほぼ例外なく(almost exclusively)細胞固有の蛋白質が、発現系へ導入され、発現されている。
【０００３】
S. セレビシエ(cerevisiae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)またはピチア・パストリス((Pichia pastoris)のような酵母も、ヒト第ＸＩＩＩａ因子、ウシプロキモシン、フィターゼ、または表面抗原のような、組み換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。ここで、発現系は、ガラクト−キナーゼ−エピメラーゼ、メタノールオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝的要素に基づく（酵母の種類に依存する）シャトルベクター（酵母およびバクテリア部分の両方を有する）に基づいている。一般に、組み換え型蛋白質は、細胞の細胞質内で生成される。アルファ因子のような、酵母固有のシグナル配列が使用される場合、発現された蛋白質も、発酵培地内へ分泌され得る。分泌された蛋白質のグリコシル化は、“ハイマンノース”タイプに従って行われ、しばしば、蛋白質において過度のグリコシル化(hyperglycosylations)が起こり、これにより、患者において抗体が形成され得る。
【０００４】
齧歯類動物（ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞）または類人猿（ベロ、ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞）からの様々な細胞タイプのような、哺乳動物細胞も、組み換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。ここで、発現系は、組み換え型ウイルス（ＢＰＶベクター）またはシャトルベクターに基づいている。発現を制御するために、ウイルスＳＶ４０エンハンサー／プロモーター系または細胞エンハンサー要素が使用される。外来遺伝子は、発現系によって理解され、かつ、ターゲッティングのために使用されるそれら自身のシグナル配列を通常持ってくるので、エリスロポエチンのような組み換え型蛋白質が、発酵培地内へ分泌される。
【０００５】
更に、グリコシル化された細胞外酵素のバイオテクノロジー的生成のために、テトラヒメナ属の原生動物が使用される。テトラヒメナは、標準的な発酵法を用いて、安価な発酵培地において成長するであろう。そのようなテトラヒメナ細胞の形質転換のために、テトラヒメナのｒＤＮＡ要素に基づくベクターを利用できる。テトラヒメナ中でのバクテリア蛋白質の非相同発現のために、テトラヒメナからの遺伝子から作られたＤＮＡ構造物(constructs)が使用される。転写、ターゲッティング、および外来蛋白質のグリコシル化の制御に適した遺伝的要素が利用できる場合、テトラヒメナは、治療に役立つ組み換え型蛋白質の安価な発現のために理想的な発現系である。
【０００６】
今まで使用されていたグラム陰性菌発現系は、通常、蛋白質の変性と共に、細胞内で、“封入体”の形成をもたらす。組み換え型蛋白質を回収するためには、細胞を溶解しなければならず、そして、変性された不活性蛋白質を、折りたたんで機能させなければならない(folded back to function)。このことは、更なる費用がかかる工程段階の原因となり、かつ、所望の蛋白質の収率を減少させる。真核生物蛋白質に重要なグリコシル化は、完全に省かれる。グラム陽性菌発現系を使用する場合、発酵ブロス中での高蛋白質分解活性によるターゲット蛋白質の分解は、更なる問題である。
【０００７】
非相同発現のために酵母を使用する場合、所望のターゲット蛋白質も、細胞内でのみ生成され、そこから、細胞溶解によって除去されなければならない。バクテリア発現系と同様に、これは、時間および費用がかかる更なる工程段階の原因となる。酵母固有のシグナルペプチドを使用する場合、外来蛋白質は、分泌のために正確には接合およびグリコシル化されない。
【０００８】
対照的に、組み換え型蛋白質の生成のために、哺乳動物の細胞系を使用する場合、所望の蛋白質は、発酵培地中で、細胞外状態で見出され、正確に接合され、グリコシル化される。しかし、他方で、ここで不利なことは、ウイルスベクターを介して生成細胞系のゲノム内へ導入された遺伝子の不完全な処理および非効率的な翻訳のために、発現率が低いことである。他方で、哺乳動物細胞の血清含有発酵培地は、非常に費用がかかる。また、剪断に敏感な細胞系(shear-sensitive cell lines)のための発酵技術は、複雑であり、そして、泡を用いない(bubble-free)通気のための構成のため高価である。マイコプラズマおよびウイルスからの細胞系に対する高い感染の危険性から、更なる問題が生じる。概して、組み換え型蛋白質のバイオテクノロジー的調製のための哺乳動物細胞の使用により、コストは非常に高くなり、安全性が要求され、そして、収率は低い。
【０００９】
テトラヒメナのような繊毛虫の使用に対して、組み換え型蛋白質の生成における上記の欠点は当てはまらない。よって、例えば、食物の粒子の消化に関連する数種の酸加水分解酵素は、多量に、複雑にグリコシル化されて、細胞から運び出される。
【００１０】
J. Euk. Microbiol. 43 (4)、1996、295〜303頁、において、アラム(Alam)らは、テトラヒメナ・ピリホルミス(Tetrahymena pyriformis)の酸α−グルコシダーゼをコードする遺伝子のクローニングを記載している。しかし、蛋白質の小さな部分だけが、細胞から運び出される。更に、国際特許出願PCT/EP 00/01853には、しかし、約８０％だけが細胞から運び出されることが知られている、テトラヒメナ・サルモフィラ(Tetrahymena thermophila)からのβ−ヘキソサミニダーゼの遺伝子が記載されている。
【００１１】
しかし、今まで、グリコシル化された真核生物蛋白質を、テトラヒメナ中で発現させ、更に、発酵培地内へのみ分泌させることはできなかった。これは、発現ベクターの構成のために必要であり、かつ、外来蛋白質を、まだ知られていない周辺の発酵培地内へのみ運び出す、テトラヒメナに固有の細胞外蛋白質のＤＮＡ配列によるものである。テトラヒメナ・サルモフィラ(Tetrahymena thermophila)のβ−ヘキソサミニダーゼをコードする蛋白質のＤＮＡ配列が知られている。そのような配列は、DE 199 58 979.8、DE 199 09 189.7およびPCT/EP 00/01853として公式に出願された特許出願に記載されている。しかし、これら配列には、それらを含むプレ／プロ−ペプチドが、ホスト外の蛋白質の約８０％のみを、周辺の発酵培地へターゲットするであろうという欠点がある。これは、天然条件下で、膜内には約２０％の酵素β−ヘキソサミニダーゼが存在し、天然に生成された酵素の約８０％のみが、細胞から運び出されるという事実によるものである。このため、β−ヘキソサミニダーゼのプレ／プロ−ペプチドは、遺伝子工学的方法によりホスト外の蛋白質の前に置かれると、ホスト外のこの蛋白質の約２０％のみを、テトラヒメナ・サルモフィラ(Tetrahymena thermophila)の表面上の細胞質膜内へターゲットするであろう。このことは、組み換え型活性物質の生成に対する大きな工程技術的欠点に関連する。他方で、発現された蛋白質の一部が、細胞内で膜と結合したままであるため、収率が低下し、それにより、発酵ブロスから、発現された蛋白質すべてを精製することはできない。他方で、細胞膜中のホスト外の蛋白質は、ホスト細胞に毒性を示し得るため、細胞の成長を遅くする。
【００１２】
更に、非相同蛋白質の、一貫性のある(consistent)、または連続した転写を引き起こす、テトラヒメナの構成性プロモーターは、今まで知られていなかった。今まで、ヒストンおよびチューブリン遺伝子のプロモーターだけが知られていた(バンノン(Bannon)ら、1984、ゲルティグ(Gaertig)ら、1993)。しかし、これらのプロモーターの重大な欠点は、それらの活性化が、細胞サイクルに依存するということである。そのような細胞サイクル依存性プロモーターと結合する非相同蛋白質の遺伝子は、成長細胞または分裂細胞中でのみ発現される。これは、工程技術的に大きな欠点を有する。なぜなら、所望の蛋白質は、対数的成長段階(logarithmic growth phase)でのみ生成されるからである。細胞密度が最も高く、そのため、生成工程における発現生物（テトラヒメナ）の性能が最も高い定常成長段階では、細胞成長はほとんどなく、そのため、非相同蛋白質の発現は、わずかしか起こらない。
【００１３】
本発明の目的は、テトラヒメナ内での形質転換後、細胞から発酵培地内への、発現系における非相同蛋白質の生成を可能にするシステムを提供することである。
【００１４】
この目的は、ホスホリパーゼＡ１（配列番号７）をコードする配列番号１の配列を有する核酸を使用するシステムによって達成される。有利なことに、このＤＮＡの発現産物は、培養条件下で、細胞から多量に運び出される。発現された蛋白質は、周辺の培養培地内へ多量に運び出され、膜中には含まれない。本発明による核酸配列は、非相同蛋白質の下流の遺伝子の、構成性(constitutive)、即ち、細胞サイクルに依存しない転写を引き起こすプロモーターを含む。そのような構成性転写は、細胞サイクルによる影響を受けることなく、ホスト生物における非相同発現によって、蛋白質が連続的に発現されるという利点を有する。よって、外来遺伝子の転写を起こすことができ、そして、非相同蛋白質を、細胞成長が少ない定常成長段階中も、発現させることができる。
【００１５】
本発明によるホスホリパーゼＡ1のＤＮＡ配列は、転写の開始のためのプロモーター要素、シグナルペプチドおよびプロ−ペプチド、更に、蛋白質のターゲッティングのための遺伝的要素を有するＰＬＡ1の上流領域（配列番号２）、そして、特に、転写の停止のための遺伝的要素を含むＰＬＡ1の下流領域（配列番号３）を含むことが好ましい。ベクター中でのこれら核酸の使用は、細胞サイクルに依存せずに非相同的に発現する蛋白質を発現させ、そして、それらを選択的に細胞外へ出して、細胞質膜中に取り込まれる発現蛋白質を含まない周辺の培養培地内へ運ぶことを可能にする。それにより、そのような蛋白質を、細胞溶解なしに、発酵ブロスから単離することができる。
【００１６】
図１は、繊毛虫からのホスホリパーゼＡ1の上流領域（配列番号２）をコードする核酸、コード領域（配列番号１）、および、下流領域（配列番号３）を示す。
【００１７】
図２は、配列番号１に記載の核酸の対応する発現産物を示す。本発明は、配列番号７に記載の蛋白質にも関する。
【００１８】
特に、本発明は、本発明による蛋白質のシグナル配列（配列番号６）にも関する。好ましくは、これらは、本発明による蛋白質のアミノ酸１から１１０である（配列番号５）。本発明は、Ｎ−末端フラグメントをコードする核酸にも関する（配列番号３）。これは、特に、図１に記載の核酸配列１〜１５５を有する、本発明による核酸のフラグメント（配列番号４）であることが好ましい。
【００１９】
テトラヒメナからのＰＬＡ1のコード配列領域から上流の、非翻訳領域（上流領域）（配列番号２）の核酸配列は、２７５位と１位との間に位置する（小文字で示す）。得られた(established)非翻訳領域は、２７５個の塩基を含む。プロモーターの要素として、４９位から５５位に、ＴＡＴＡボックスが見られ（太字で印刷）、想定されるＣＡＡＴボックスは、１３３塩基と１３６塩基との間に見られる（太字で印刷）。ｃＤＮＡのコード配列範囲は、大文字で示されている。配列の番号は、開始コドンＡＴＧから始まる。蛋白質シーケンシングからわかった領域を四角で囲み、停止コドンに下線を付している。成熟蛋白質は、３３１塩基からコードされている。１塩基から３３０塩基に記載されている配列は、ＰＬＡ1のプレ／プロ配列（配列番号８）を示す。３３１塩基から９６３塩基に記載されている配列は、成熟ＰＬＡ1の配列である（配列番号９）。９６１位には、翻訳停止ＴＧＡがあり、１０３９位には、ポリアデニル化シグナルＡＡＴ  ＡＡＡがある。テトラヒメナのＰＬＡ1のコード領域以下の９６４位から１１３４位の核酸配列は、翻訳されないＰＬＡ1の下流領域（配列番号３）を示す（これも小文字で示す）。９６４位から１１０１位には、ｃＤＮＡのシーケンシングからわかる領域があり、これは、逆ＰＣＲによっても確認された。転写後、ポリ−Ａテールを、ｍＲＮＡの最後のコドンにつける（ｔｔｔ、１０９８−１１０１位）。
【００２０】
本発明の更なる態様は、組み換え型蛋白質およびペプチドの相同または非相同発現のための、ならびに、相同または非相同組み換えのための（“ノック−アウト、“遺伝子置換”）、本発明による酸加水分解酵素の核酸配列またはその一部の使用である。
【００２１】
本発明はまた、本発明による核酸を、繊毛虫にトランスフェクトする、蛋白質およびペプチドの相同または非相同発現のための、ならびに、相同または非相同組み換えのための（“ノック−アウト、“遺伝子置換”）方法に関する。
【００２２】
核酸またはその一部は、特に、蛋白質の相同もしくは非相同発現に通常用いられるエンハンサー、プロモーター、オペレーター、開始点(origins)、ターミネーター、抗生物質耐性(antibiotic resistances)、または、他の核酸もしくはＤＮＡフラグメント、または、ウイロイド、ウイルス、バクテリア、アルシェゾアン(archezoans)、原生動物(protozoans)、真菌、植物、動物、もしくはヒトと組み合わせられ得る。
【００２３】
特に、本発明による核酸は、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体、またはミニクロモソーム、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、またはすべての種類の環状もしくは線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ中に含まれる。
【００２４】
本発明はまた、ホスホリパーゼＡ1をコードする、本発明による核酸またはその一部を、相同または非相同発現において、ＮＦ−１領域（サイトメガロウイルスエンハンサー）のような通常のエンハンサー、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｉｃ、もしくはｔａｃプロモーターのようなプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡＰ  システムのクラスＩＩおよびＩＩＩのプロモーター、バクテリオファージＴ７およびＳＰ６プロモーター、ａｐｒＥ、バチルス発現系のためのアミラーゼもしくはｓｐａｃプロモーター、酵母発現系のためのＡＯＸ１、ＡＵＧ１および２もしくはＧＡＰｐプロモーター(ピチア(Pichia))、RSVプロモーター（ＳＶ４０ウイルス）、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウイルス）、ＡＦＰプロモーター（アデノウイルス）、もしくは哺乳動物発現系のためのメタロチオニンプロモーター、昆虫細胞のためのシンドビスウイルスプロモーターもしくはセムライクフォレスト(Semlike forest)ウイルスプロモーター、ｈｓｐ７０、ＤＳ４７、アクチン５Ｃもしくはコピアのような、昆虫細胞発現系のためのプロモーター、３５Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス）のような植物特異的プロモーター、アミラーゼプロモーターもしくはクラスＩパタチンプロモーター、ｔｅｔオペレーターのようなオペレーター、ａ−ＭＦプレプロシグナル配列（Sac-カロマイセス(charomyces)）のようなシグナル配列、開始点、ターミネーター、アンピシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ペニシリン、アンホテリシン、シクロヘキシミド、６−メチルプリン、パロモマイシン(paromomycin)、ヒグロマイシン(hygromycin)、α−アマナチン(amanatin)のような抗生物質および薬剤耐性、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子のような栄養要求性マーカー、または、他の核酸もしくはＤＮＡフラグメント、または、ウイロイド、ウイルス、バクテリア、アルシェゾアン、原生動物、真菌、植物、動物、もしくはヒトからのすべての種類の配列、と組み合わせられる。
【００２５】
特に、本発明による核酸またはその一部は、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体、またはミニクロモソーム、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、またはすべての種類の環状もしくは線状ＤＮＡもしくはＲＮＡに挿入される。
【００２６】
当業者は、配列番号１に記載の核酸と、少なくとも４０％の相同性を有する核酸も、本発明で使用され得ることを理解するであろう。配列番号２に記載の蛋白質も、その機能を失うことなく、修正され得る。よって、例えば、アミノ酸のいわゆるコンサバティブな(conservative)交換が行われ得る。よって、例えば、疎水性アミノ酸が、交換され得る。
【００２７】
テトラヒメナからのホスホリパーゼＡ1の精製および単離ならびにその配列決定のために、以下の方法を用いることができる。
ＰＬＡ1の回収
テトラヒメナ・サルモフィラ(Tetrahymena thermophila)の細胞を含まない培養上清から、ＰＬＡ１を得た。こうして、それら細胞を、デジタルコントロールユニット（ＤＣＵ）によって制御した、２リットルの発酵槽(バイオスタット(Biostat) MD、ブラウン・ディッセル・バイオテク(Braun Diessel Biotech)、メルスンゲン(Melsungen)、ドイツ)中で発酵させた。発酵槽を、最初にバッチ運転によって２４時間運転させ、次いで、連続的に運転させた。細胞を含まない培養上清の採取を、約０．３μｍの孔径を有する灌流モジュール（Ｓ６／２、エンカ(Enka)、ウッペルタル(Wuppertal)）によって確実に行った。
【００２８】
以下のパラメーターの下で、発酵を行った。
・運転容量は２リットルであった；
・灌流速度は、２リットル／日であった；
・撹拌器の分当たりの回転は、８００ｒｐｍに制限した；
・温度は、常に３０℃であった；
・ｐＨ値は、ｐＨ７で一定に保った；
・接種量(inoculation titer)は、約５０，０００細胞／ｍｌであった。
【００２９】
発酵のために、ＳＢ１８６８ＶＩＩ株を使用した。これは、テトラヒメナ・サルモフィラ(Tetrahymena thermophila)の野生株である。
【００３０】
２６４時間発酵を行い、採取物のＰＬＡ1活性を試験した。
ＰＬＡ1の精製
ＰＬＡ1の精製のために、発酵物からの細胞を含まない培養上清１リットルを使用した。それを、１４０ｇの硫酸アンモニウムと混合し、限外濾過ユニット(ペリコン(Pellikon) XL、排除サイズ3kDa、ミリポア(Millipore))によって、５０ｍｌ容量に濃縮した。次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー(20x1.6 フラクトゲル(Fractogel) EMD フェニル(Phenyl) I 650、メルク(Merck)、ダルムシュタット(Darmstadt))によって、試料を精製した。流速は、５ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出液を、５ｍｌ画分に回収した。放射性ラベルされたリン脂質（Ｌ−３−ホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−[１−14Ｃ]リノレオイル）の脱アクリル化によって、酵素活性を測定した。図３は、得られた溶出プロファイル、酢酸ナトリウム勾配および個々の画分の酵素活性を示す。
【００３１】
最も高い酵素活性を有する３つの画分を混合し、限外濾過ユニットによるアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）のために、開始バッファー（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ｐＨ６．５）内で再度処理した。次いで、試料をカラム（Q-セファロース(Sepharose)-ハイロード(Hiload)-16/10、ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）に満たし、線形ＮａＣｌ勾配（流速＝３ｍｌ／ｍｉｎ）によって、カラムからＰＬＡ1を溶出し、５ｍｌ画分に回収した。図４は、得られた溶出プロファイル、ＮａＣｌ勾配、および個々の画分の酵素活性を示す。
【００３２】
最も高いＰＬＡ1活性を有する画分から、２００μｌを取り出し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分離した。このために、スーパーデックス(Superdex) HR 75 30/10 カラム（ファルマシア(Pharmacia)、スエーデン）を使用した。このクロマトグラフィー中の流速は、０．６ｍｌ／ｍｉｎとし、溶出液を、２００μｌ画分に回収した。図５は、得られた溶出プロファイルおよび個々の画分の酵素活性を示す。
【００３３】
一次元ゲル電気泳動を用いて、得られた画分の純度を調べた。こうして、〜２６および〜２８ｋＤａで、２つの異なるバンドが得られた。二次元ゲル電気泳動によるこれら２つのバンドの分離により、２つのバンドは、それぞれ異なる等電点を有する２スポットおよび３スポットに分離された。
【００３４】
２６ｋＤａの蛋白質では、これらは、ｐＨ６．３および５．７であり、２８ｋＤａの蛋白質では、それらは、ｐＨ６．３、５．７および５．３であった。マスフィンガープリント(mass fingerprint)分析によるこれらスポットの最終的な試験により、これらのスポットが、同じ蛋白質のイソ型であることが示された。
ＰＬＡ1の分子生物学的試験
蛋白質の純度が示された後、蛋白質の試料を、ＰＶＤＦ膜上へブロットし(blotted)、Ｎ末端からの初期シーケンシングに付した。また、更なる試料を、トリプシン消化し(tryptically digested)、更に、初期シーケンシングに付した。これにより得られた蛋白質配列を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、それらを逆転写酵素ＰＣＲ（３’ＲＡＣＥ、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅(rapid amplification of cDNA ends)）に用いた。ＰＣＲ技術を用いて、ホスホリパーゼＡ1のｃＤＮＡを、うまく増幅させ、次いで、配列決定した。得られた配列は、それぞれ、６３３塩基長および７２９塩基長を有していた。それらから得られる成熟蛋白質の分子量は、約２２．４ｋＤａである。得られた配列では、蛋白質シーケンシングから得られた２２アミノ酸（Ｎ−末端）および１８アミノ酸（蛋白質内）のオリゴペプチドが、再び１００％見られた。５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）によって、成熟蛋白質の配列のほかに、プレ／プロペプチドの配列も得られた（図２）。これは、シグナル配列と、酵素を不活性化し、酵素の活性の最後の場所でのみ切断されるプロペプチドの両方を有する１１０アミノ酸長を有するペプチドである。配列比較では、すべてのリパーゼおよびホスホリパーゼ中で見られ、かつ、脂質またはリン脂質に対する結合部位として論じられる、５つのアミノ酸のコンセンサス配列（ＧｘＳｘＧ）を除き、既知のホスホリパーゼＡ1との相同性は得られなかった。更に、ＰＬＡ1の上流および下流配列が、逆ＰＣＲによって得られた（図１）。こうして、ゲノムＤＮＡが、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、Ｔ４リガーゼによってライゲートされ、最終的に、逆プライマーによって増幅された。逆ＰＣＲによるＰＬＡ1の上流領域の増幅のために、制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩによって切断されたゲノムＤＮＡを使用した。こうして、２７５塩基の上流領域を得ることができ、プロモーター要素を同定することができた。１３６位には、ブルンク(Brunk)およびサドラー(Sadler)(1990)によって見出されたように、テトラヒメナのヒストン遺伝子のＣＣＡＡＴボックス（−１４１および−１５１）と同様の翻訳開始位置からの距離を有するＣＡＡＴボックスがある。真核生物遺伝子中の転写の正確な開始点を固定するＴＡＴＡボックスは、５５位で同定された。その配列は、真核生物において見られるコンセンサス配列に相当する。逆ＰＣＲによる、テトラヒメナからのＰＬＡ1の転写のためのターミネーターを含む下流領域の増幅のために、ＢａｍＨＩによって切断されたゲノムＤＮＡを使用した。こうして、３’−ＲＡＣＥからわかる下流領域のほかに、別の２２２塩基を得ることができた（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、繊毛虫からのホスホリパーゼＡ1の上流領域（配列番号２）をコードする。
【図２】図２は、配列番号１に記載の核酸の対応する発現産物を示す。本発明は、配列番号７に記載の蛋白質にも関する。
【図３】図３は、得られた溶出プロファイル、酢酸ナトリウム勾配および個々の画分の酵素活性を示す。
【図４】図４は、得られた溶出プロファイル、ＮａＣｌ勾配、および個々の画分の酵素活性を示す。
【図５】図５は、得られた溶出プロファイルおよび個々の画分の酵素活性を示す。
【図１】
2004525622.tif 000003
【図２】
2004525622.tif 000004
【図３】
2004525622.tif 000005
【図４】
2004525622.tif 000006
【図５】
2004525622.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004525622.tif 000008
2004525622.tif 000009
2004525622.tif 000010
2004525622.tif 000011
2004525622.tif 000012
2004525622.tif 000013
2004525622.tif 000014
2004525622.tif 000015
2004525622.tif 000016
2004525622.tif 000017
2004525622.tif 000018
2004525622.tif 000019
2004525622.tif 000020
2004525622.tif 000021
2004525622.tif 000022
2004525622.tif 000023
2004525622.tif 000024
2004525622.tif 000025
2004525622.tif 000026
2004525622.tif 000027
2004525622.tif 000028
2004525622.tif 000029
2004525622.tif 000030
2004525622.tif 000031
2004525622.tif 000032
2004525622.tif 000033
2004525622.tif 000034
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525622.tif 000035
2004525622.tif 000036
【国際調査報告】
2004525622.tif 000037
2004525622.tif 000038
2004525622.tif 000039
2004525622.tif 000040
2004525622.tif 000041
2004525622.tif 000042
2004525622.tif 000043
2004525622.tif 000044
2004525622.tif 000045
2004525622.tif 000046