(57)【要約】本発明は経口投与用医薬組成物を製造するための、少なくとも１つの活性薬剤取り込み、水、水溶液、又は、極性溶媒の溶液の層と交互になる両親媒性成分に基づく同一中心の二分子層からなるラメラ液晶内部構造を、その中心から表面まで有する多重膜ベシクルの使用に関する。上記ベシクルは活性薬剤ベクターとして作用し、上記活性薬剤が胃腸バリアをより容易に通過することを可能にする。また、本発明は上記ベシクルは上記活性薬剤を分解、特に胃腸環境に存在する酵素による分解から保護する。さらに、本発明は経口投与用の新規組成物、特に上述のようなベシクルに取り込まれたヘパリンを有する組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、水溶液、又は、極性溶媒の溶液の層と交互になる両親媒性成分に基づく同一中心の二分子層の層板からなるラメラ液晶内部構造を、その中心から表面まで有し、かつ、少なくとも１つの活性成分を内部に取り込んでなる多重膜ベシクルの、経口投与用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項２】
前記ベシクルが前記活性成分のベクターとして使用され、活性成分の胃腸バリアの通過を容易にし、及び／又は、分解、特に胃腸の媒体に存在する酵素による分解から保護することが可能になる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記活性成分がヘパリンである請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記活性成分がペプチドである請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
前記ペプチドがペプチドホルモンである請求項４記載の使用。
【請求項６】
前記活性成分がカルシトニンである請求項４又は５記載の使用。
【請求項７】
前記ベシクルが：
・水素化又は非水素化グリセロ脂質、特にリン脂質、
・酸又はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩若しくはアミン塩の形態にある、エトキシル化又は非エトキシル化された、直鎖状又は分枝状の、飽和型又はモノ不飽和型若しくは多不飽和型のＣ６−Ｃ３０脂肪酸、
・スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、２個〜２０個のグリセロールユニットを含有するポリグリセロール、又は、グリコールの前記脂肪酸とのエトキシル化エステル又は非エトキシル化エステル、
・前記脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリド又はグリセリド混合物、
・エトキシル化又は非エトキシル化された、直鎖状又は分枝状の、飽和型又はモノ不飽和型若しくは多不飽和型のＣ６−Ｃ３０脂肪族アルコール
・コレステロール及びその誘導体、特に、硫酸コレステロールなどの荷電コレステロールエステル又は中性コレステロールエステル、
・ステロール骨格を有する他の誘導体、特に、シトステロール又はシグマステロールなどの植物由来の誘導体、
・スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、２個〜２０個のグリセロールユニットを含有するポリグリセロール、又は、グリコールの前記脂肪族アルコールとのエトキシル化エーテル又は非エトキシル化エーテル、
・水素化又は非水素化されたポリエトキシル化植物油、
・ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック重合体（ポロキサマー）、
・ポリエチレングリコールヒドロキシステアレート、
・スフィンゴ脂質及びスフィンゴシン誘導体、
・ポリアルキルグルコシド、
・セラミド、
・ポリエチレングリコール／アルキルグリコール共重合体、
・ポリエチレングリコール／ポリアルキレングリコールエーテルのジブロック共重合体又はトリブロック共重合体
からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記ベシクルが０．１〜２５μＭ、好ましくは０．２〜１５μＭの直径を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ベシクルの二分子層が少なくとも２つの界面活性剤（その１つが１〜６、好ましくは１〜４の親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有し、もう１方が３〜１５、好ましくは５〜１５の親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有する）を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ベシクルがベシクルに取り込まれる重合体、又は、コーティングの形態でベシクルの周りに配置される重合体を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物が医薬的に許容できる媒体中の前記ベシクルの分散物を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬的に許容できる媒体が水又は緩衝液からなる請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬的に許容できる媒体がオイルなどの親油性媒体からなる請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬組成物が水性媒体中の前記ベシクルの乳化物を含有し、そのベシクル自身が前もってオイルに分散している請求項１１記載の使用。
【請求項１５】
前記ベシクルが、剪断又は機械的負荷が作用することで起こる前記活性成分を取り込むラメラ液晶相の形質転換によって得られる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
ヘパリンを活性成分として有する経口投与用医薬組成物であって、前記ヘパリンは、請求項１若しくは請求項７〜１０のいずれか１項で定義される多重膜ベシクル、又は、請求項１５で定義される工程によって得られる多重膜ベシクルに取り込まれ、前記ベシクルは請求項１１〜１４のいずれか１項で定義される医薬的に許容される媒体中に分散している経口投与用医薬組成物。
【請求項１７】
カルシトニンを活性成分として有する経口投与用医薬組成物であって、前記カルシトニンは、請求項１若しくは請求項７〜１０のいずれか１項で定義される多重膜ベシクル、又は、請求項１５で定義される工程によって得られる多重膜ベシクルに取り込まれ、前記ベシクルは請求項１１〜１４のいずれか１項で定義される医薬的に許容される媒体中に分散している経口投与用医薬組成物
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は新規の経口投与用医薬組成物に関する。
今日、多くの薬剤が非経口的に、筋肉注射、皮下注射、若しくは、静脈注射のいずれかによって、又は、灌流に取り込むことによって、投与されなくてはならない。一般的に、このような投与経路は以下の理由から必要とされる：
・胃腸系の物理化学的及び生物学的条件（ｐＨ、酵素等）下における活性分子の壊れやすさ、
・活性分子に対する胃腸バリアの不透過性、
・胃腸粘膜に対する活性分子の毒性又は過度の刺激性。
【０００２】
以下の成分は、非経口的に投与されなければならない種類に属する分子の例として挙げられる：
・胃腸の媒体によって分解されるペプチド及びポリペプチド、特にホルモン、
・バリアを通過しないヘパリン、
・多くの細胞増殖抑制剤（それらの毒性とそれらに対する胃腸バリアの不透過性によって知られている）。
【０００３】
さらに、好ましい薬剤投与位置になり得る他の粘液質組織は、問題としている活性分子に対する低い透過性のために薬剤投与位置として利用できない。このために、全身性の投与、又は、活性成分の過度な用量の使用のいずれかが必要となる。どちらの場合も、投与される用量は、必要量よりもかなり多く、このため薬剤の安全性だけでなくコストの面からも多くの不都合が生じる。
【０００４】
さらに、処置に対する患者の容認と患者の快適さは新規の薬剤開発において、非常に考慮に入れるべきパラメーターである。従って、非侵襲性の、経口投与はこの点で明瞭な発展を示している。
【０００５】
いくつかの取り組みが薬剤の経口投与を容易にするためになされてきた。
最も伝統的な取り組みは胃ででくわす酸の作用及び酵素の作用から活性成分を保護することを狙いとしており、そのような媒体に耐性のある外膜で活性分子の入った錠剤をコーティングすることにある。一般的に上記コーティングは、いったん腸で出くわすような中性ＰＨ条件下に置かれると溶解する、従って活性成分を放出できる。この取り組みは直接腸に作用する、又は、腸の粘液を通って一般的な循環に流れ込むのが困難ではない分子に対しては有効である。従って、ヘパリンなどの特定の分子に必要な透過膜移動を促進するには効果的でなく、さらに腸に存在する酵素（特にタンパク質を破壊するプロテアーゼ）に敏感な分子には適用できない。
【０００６】
この技術に由来して、重合体に被覆されたマイクロカプセルによって活性成分の保護だけでなく、腸内部で制御された又は遅延された方法で活性成分を放出することが出来る、そして、薬物動力学の進歩が可能となり、これによって例えば生成物の副作用を減少させることが出来るようになる。このような発明はＥＰ−０７０９０８７にＦＬＡＭＥＬの名前で記載されている。粒子の直径（数百から数千マイクロメーター）及びコーティングの厚みは変更可能であり、動的放出プロフィールの変動も可能である。
【０００７】
多くの試験において、活性成分の保護だけでなく、活性成分が胃腸の膜を通って血流に流れ込むのを容易にするために、マイクロベシクル又はマイクロスフェア重合体若しくはナノスフェア重合体に基づくそれぞれ異なった技術が用いられた。ヘパリンの通過を容易にするために用いられるリポソーム（Ｍ．Ｕｅｎｏら、Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　３０　ｐｐ　２２４５−２２４７，　１９８２）、又は、インシュリンの経口投与に用いられるポリアルキルシアノアクリレートナノスフェア（Ｃ．Ｄａｍｇｅら、Ｊ．　Ｐｈａｒｍａ．　ＳＣ．，　８６　ｐｐ．１４０３−１４０９，　１９９７）が挙げられる。別の技術に基づいて、アミノ酸のアセチル化誘導体（Ａ．Ｌｅｏｎｅ−Ｂａｙら、Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，　５０　ｐｐ．４１−４９，　１９９８）又はヒドロゲル（Ｊ．　Ｍ．ＤｕｎｎとＡ．Ｓ．Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｈｅｒａｐ．　Ｒｅｓ．，５６　ｐｐ．７３８−７４５，１９９５）などの補助剤をヘパリンの経口投与を容易にするために用いてきた。
【０００８】
つまり、媒性分子の分子配列から形成される球形の物質であるベシクルに関して、多重膜ベシクルは重要な研究の主題となり、いくつかの応用を提示してきた。挙げられる例はＷＯ　９３／１９７３５、ＷＯ　９５／１８６０１、ＷＯ　９７／００６２３、ＷＯ　９８／０２１４４及びＷＯ　９９／１６４６８である。このようなベシクル、つまり、上述の明細書にオニオン構造を持った多重膜ベシクルとして記載されているベシクルはリポソームと以下の点で違う：
・それらの調製方法、ラメラ液晶相、つまり長い範囲にわたって熱力学的平衡にある相から開始する。
・それらのラメラ液晶内部構造。この構造はこれらのベシクルの中心から表面まで水、水溶液又は極性溶媒（例えばグリセロール）の溶液の相と交互になる両親媒性成分の同一中心の二分子層の層板から形成される。使用する媒体に分散する前に、これらのベシクルは熱力学的平衡状態にある。これらのベシクルの特定構造は光学顕微鏡、特に偏光光学顕微鏡によって簡便に実証できる。
・用いることが出来る両親媒性分子そのもの、又は、混合物のベシクル形成に対する性質の違い。
・処方に依存して親水性又は親油性になり得る、ベシクルが分散されうる媒体。
【０００９】
これらの多重膜ベシクルの直径はマイクロメーター単位であり、直径は一般的には０．１μｍ〜２０μｍである。薬剤の経口投与にそれらを使用することは今まで決して明らかにされたり、立証されたりしていない。
【００１０】
本発明の発明者らは壊れやすさ又は胃腸バリアを通って通過できないためのいずれかの理由で経口で投与されないことが知られている分子を取り込む、上記に定義した特定構造を有する多重膜ベシクルの経口投与は、上記分子がこれら多重膜ベシクルに取り込まれる時、可能になることを発見した。このように分子を取り込むことは分子が胃腸壁を通過し、血流に入ることを可能にする。この発見は一方はヘパリン、他方はカルシトニンなどのような全く異なった性質及び特徴の分子に実施される実験に基づいてなされた。
【００１１】
本発明の１つの利点は、これらの多重膜ベシクルは無毒であることから知られる生態適合性成分から調製されることだ。
【００１２】
本発明のもう１つの利点は、ベシクルの調製工程は簡単に実行出来て、標準的な化学装置を必要とするだけであることだ。
【００１３】
さらに、上記工程は熱力学的平衡な初期ラメラ相を含むという事実は高い再現性をもたらし、得られるベシクルに高い安定性を付与する。
従って、その本質的特徴の１つから、本発明は水、水溶液、又は、極性溶媒の溶液の層と交互になる両親媒性成分に基づく同一中心の二分子層の層板からなるラメラ液晶内部構造をその中心から表面まで有し、かつ、少なくとも１つの活性成分を内部に取り込んでなる多重膜ベシクルの、経口投与用医薬組成物の製造のための使用に関する。
【００１４】
「カプセル化」よりむしろ優先して用いる「取り込まれる」という用語は、活性成分がベシクルからなる物質の不可欠な部分を形成することを意味する。実際、活性成分の分子は上記ベシクルの中心から表面までのいかなる相においても発見することが出来る。
【００１５】
「経口投与」という表現は、本来の意味で使われており、例えば非経口的投与形式と反対のものとして、生成物が口を通して生物体に導入されることを意味する。
【００１６】
本発明者らになされる試験の間に、活性成分がベシクルに取り込まれることによってすでに述べた様々な利点がもたらされることが明らかになった。特に、ベシクルは活性成分の正真正銘のベクターとして作用し、活性成分の胃腸バリアの通過を容易にし、及び／又は、分解、特に胃腸媒体中に存在する酵素による分解からの保護を可能にする。
【００１７】
通常用いるベシクルは直径０．１〜２５μＭで、好ましくは０．２〜１５μＭである。
【００１８】
より正確にいうと、本発明で用いるベシクルは好ましくは水性又は極性層と交互になる両親媒性薬剤の複数の層からなる。これらの層それぞれの厚みは分子の厚みであり、一般的には５〜１０ナノメーターの単位である。従って、約１０〜数百層の層板に対して、０．１〜数十マイクロメーターの直径が得られる。これは実験的に分かったことであり、ベシクルは最も小さいベシクルの場合未解決の点として、又は、最も大きいベシクルの場合複屈折球として、光学顕微鏡（それらの複屈折と関連してより良い対称性を得るための偏光において）によって観察される。サイズプロフィールはレーザー粒度分析装置（静的レーザービーム散乱を利用して、複数の角度において分析される）を用いて研究され得る。０．１〜２５μＭの値を中心とし、所定の処方に対する大きさのわずかな不均一性を示すガウスプロフィールは、一般的に所定の準備条件下で得られる。
【００１９】
上記で説明したように、活性成分が取り込まれているベシクルはいわゆるオニオン構造である多重膜を有し、中心から表面まで液状媒体によって分離される一連のラメラ相からなる。これらのベシクルはラメラ液晶相の調製からなる工程、及び、剪断の適用によるその形質転換によって得られる。このような工程は特にＦＲ―２６８９４１８に由来するＷＯ９３／１９７３５、又は、ＷＯ９５／１８６０１に記載されており、これらは参照として引用される。
【００２０】
ＦＲ―２６８９４１８によると、この形質転換は、制御された大きさを持つベシクル（マイクロカプセルと呼ばれる）を製造する液晶相の同種の剪断からなるステップにおいて行われる。しかしながら、ラメラ液晶相の処方を変えることによって、特にその組成物に含まれる界面活性剤の性質を変えることによって、この液晶相のベシクルへの形質転換は、特に構成成分を混合する時、機械的圧力によって簡便に行われ得る。
【００２１】
内部において、このようなベシクルは幅広い界面活性剤が用いられる特に簡便な準備工程によって調製できるという利点がある。
【００２２】
また、本発明で用いられるいわゆるオニオン構造のベシクルを調製する為に用いる工程に関連して、本発明のもう１つの利点は、活性薬剤と添加剤はベシクルの形成前に取り込まれること：これによって、良好なカプセル化収率が得られ、高価な分子の場合、より優れた効率性と本質的な倹約をもたらすことにある。
【００２３】
このような構造は少なくとも１つの界面活性剤を含有するラメラ液晶相に少なくとも１つの活性薬剤を取り込み、次にこのラメラ液晶相を小さな多重膜ベシクルの密集した相に形質転換することによって好適に得られる。
【００２４】
この形質転換は上記多重膜ベシクルを特徴づける初期相の液晶対称性を変成しないと明記することは重要である。この液晶対称性は、光学顕微鏡の複屈折、又は、Ｘ線解析における回折ピークの存在などの肉眼での観察から明らかである。しかしながら、このような観察は光学顕微鏡における非常に小さな大きさのベシクルに関しる不十分なコントラスト、又は、希釈によるＸ線回折のシグナルの弱まりによって難しくなり得ることを指摘しておかなければならない。
【００２５】
従って、本発明のベシクルは少なくとも１つの活性薬剤を取り込んでいるラメラ液晶相が形成される工程によって得られ、上記液晶相は例えば上記ラメラ液晶相の構成成分を混合することによって生じる剪断又は機械的圧力の適用によって多重膜ベシクルに再配列される。
【００２６】
この剪断は完全に同一の大きさのベシクルを製造する利点を持った同一の剪断である。しかしながら、簡単な機械的攪拌が本発明の多重膜ベシクルの形成には十分である。
【００２７】
これは必須ではないが、ベシクルの調製の為に用いられる両親媒性分子は薬局方記載の分子、又は、既に経口投与用薬剤に用いられている分子から選択されるだろう。以下の群が例として挙げられるが、このリストに限定されるわけではなく、その生成物は今まで製薬業において決して使われたことのないものである：
・水素化又は非水素化されたグリセロ脂質（特に、リン脂質）、
・酸又はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩若しくはアミン塩の形態にあるエトキシル化又は非エトキシル化された、直鎖状又は分枝状の、飽和型又はモノ不飽和型若しくは多不飽和型のＣ６−Ｃ３０脂肪酸、
・スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、２個〜２０個のグリセロールユニットを含有するポリグリセロール、若しくは、グリコールの上記脂肪酸とのエトキシル化エステル又は非エトキシル化エステル、
・上記脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリド又はグリセリド混合物、
・エトキシル化又は非エトキシル化された直鎖状又は分枝状の飽和型又はモノ不飽和型又は多不飽和型のＣ６−Ｃ３０脂肪族アルコール、
・コレステロール及びその誘導体、特に、硫酸コレステロールなどの荷電コレステロールエステル又は中性コレステロールエステル、
・ステロール骨格を有する他の誘導体、特に、シトステロール又はシグマステロールなどの植物由来の誘導体、
・スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、２個〜２０個のグリセロールユニットを含有するポリグリセロール、又は、グリコールの前記脂肪族アルコールとのエトキシル化エーテル又は非エトキシル化エーテル、
・水素化又は非水素化されたポリエトキシル化植物油、
・ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック重合体（ポロキサマー）、
・ポリエチレングリコールヒドロキシステアレート、
・スフィンゴ脂質及びスフィンゴシン誘導体、
・ポリアルキルグルコシド、
・セラミド、
・ポリエチレングリコール／アルキルグリコール共重合体、例えばＡＫＺＯ　ＮＯＢＥＬからＥＬＦＡＣＯＳファミリーの共重合体、
・ポリエチレングリコール／ポリアルキレングリコールエーテルのジブロック共重合体又はトリブロック共重合体、例えばＩＣＩからＡＲＬＡＣＥＬＬファミリーの共重合体。
【００２８】
これらの両親媒性物質又は界面活性剤はそれぞれ単独で又は混合物として使用できる。これらの両親媒性物質の中には極性溶媒と混合することによってそれ自身でラメラ液晶相を形成できる物もある。他は、低い配合量で、ラメラ液晶相に固さ、又は、不透過性能を付与する為に混合物でのみ使用される。
【００２９】
処方は表面活性分子の混合物を有利に含有する。一般に、異なった親水−親油平衡を有する少なくとも２つの異なった界面活性剤が使用され、それによって二分子層の特性の調節及び多重膜ベシクルの形状を決定する外観の不安定性を制御することが連続的に可能になる。
【００３０】
従って、上記界面活性剤から、相対的に異なった特性、特に親水−親油平衡（ＨＬＢ）を有する２つの界面活性剤を選択することが有利だろう。１つめの界面活性剤の親水−親油平衡（ＨＬＢ）は有利に１〜６で、好ましくは１〜４だろう。一方、２つめの界面活性剤の親水−親油平衡は３〜１５で、好ましくは５〜１５だろう。
【００３１】
本発明で用いるベシクルのもう１つの利点は多糖（アルギナート、キトサン等）などの天然又は合成重合体を、ベシクルの強度を増加するため及びベシクルが投与媒体の物理化学的負荷（ｐＨ、機械的効果、浸透圧等）に耐えられるようにするために処方に添加することが出来ることだ。これらの重合体はベシクルに取り込まれても良いし、コーティングの形態でベシクルの周りに配置されていても良い。後者の場合、重合体マトリクスでコートされているベシクル又はベシクルからなる粒子はベシクル単独よりも大きな直径を有する。これらの重合体強度をさらに増す為に任意で架橋されていても良い。
【００３２】
本発明で用いるベシクルの直径は有利に０．１〜２５μｍであり、好ましくは０．２〜１５μｍである。
【００３３】
本発明で用いる組成物において、上記ベシクルは通常水又は緩衝液からなる医薬的に許容される媒体中に有利に分散されている、この媒体はベシクルのラメラ間で見られる媒体と全く同じでも、違っていても良い。
【００３４】
本発明のベシクルは、医薬的に使用可能な、オイル等の親油性媒体（例としては植物油若しくは鉱物油、合成脂肪酸エステル、スクアラン又はスクアレンなどが挙げられる）に分散することが出来る。これには、例えば加水分解性の活性薬剤の場合、水の存在を避けたり、制限できる利点がある。このオイル中の分散液はそれ自体で水性媒体中で乳化し、より飲み下しやすい処方を得ることが出来る。油性の中間相の存在によって、外部の連続媒体、例えば水性媒体はベシクルの内部媒体から分離され、それによって、さらにベシクルに取り込まれた活性薬剤を保護する。
【００３５】
他の特徴によると、本発明はさらに本発明で用いるベシクル及び組成物の調製方法に関する。
【００３６】
最初のステップにおいて、調製方法は、混合することによって様々な構成成分を取り込んでいるラメラ液晶相を調製することからなる。上記ラメラ液晶相は、構成成分それぞれの混和性に基づいて、オペレーターによって決定された順序で成分を混合することによって簡便に得られる。取り込みを容易にする為に特定ののりのような構成成分又は固形の構成成分を加熱する必要があってもよい。この場合、もし、活性分子が温度に敏感であれば過度な高温にさらさないように、混合が終了してから活性分子を添加するのが好ましい。ラメラ相を調製するのに必要で用いられる貯蔵混合物の形態で、活性分子又はその水溶液を除いて、全ての構成成分の混合物を調製することも出来る。上記水溶液はその生物学的相溶性を保証する様々な構成成分、特に相乗的な活性分子だけでなく緩衝混合液を有することが可能である。このように調製されたラメラ相に、次に適度な剪断（０〜１０００Ｓ−１）を制限時間（０〜６０分）行う。
【００３７】
ほとんどの場合、この剪断は混合に用いられる装置の作用によって直接的に得られる。
【００３８】
３番目のステップにおいて、剪断されたラメラ相はラメラ相を調製する為に用いた媒体と同一であっても良いし、異なっていても良い、通常水又は緩衝液である最終の媒体に分散される。この分散媒体は極性（グリセリン、ポリエチレングリコール、アルキレングリコール等）又は親油性（オイル等）のいずれかである非水性媒体であっても良い。この分散液は、攪拌を続けながらラメラ相に媒体をゆっくり添加することにより室温（２０〜２５℃）で一般的には得られる。
【００３９】
保存料及び生薬の処方を完成させる為の任意の添加剤を生成物に添加しても良い。
【００４０】
以下の実施例：本発明のベシクルに取り込まれる前のヘパリンの血流への通過（実施例１）−単純系溶液において、この生成物は胃腸バリアを通過できない−及び本発明のベシクルに取り込まれたカルシトニンの血流への通過−ベシクルに取り込まれない同じ生成物は胃腸媒体に適さない（実施例２参照）を実証する事によって本発明の価値が非常に明確に説明される。
【００４１】
以下の実施例において、特にことわりの無い限り、各処方の構成成分の割合は重量％で示されている。
実施例１：ヘパリンを取り込んでいるベシクル
１．ａ　ヘパリンを取り込んでいるベシクルの処方及び調製
これらの実施例で用いられるヘパリンは豚の腸粘膜から抽出された非分画ヘパリン（ＳＩＧＭＡ　Ｈ−９３９９，１８８ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）である。
【００４２】
処方Ａ
▲１▼エトキシル化ラウリルアルコール（ＳＥＰＰＩＣ，Ｓｉｍｕｌｓｏｌ　Ｐ４）４．０％
▲２▼ラノリンコレステロール（ＦＬＵＫＡ）　　　　　　　　３．０％
▲３▼滅菌脱イオン水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
▲４▼ヘパリンの２５％滅菌脱イオン水溶液　　　　　　　　４０．０％
▲５▼大豆レシチン（ＮＡＴＴＥＲＭＡＮＮ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎ　９０）４３．０％
【００４３】
手順
構成成分▲１▼、▲２▼、及び、▲３▼は任意の順番で２ｍｌの試験管に導入し、前もって加熱滅菌しておいたスパチュラを用いて室温で混合した。構成成分▲２▼の総溶解度は顕微鏡観察によって実証される。次に構成成分▲４▼を導入し、混合物をスパチュラを用いて均一にし、構成成分▲５▼を添加した。
【００４４】
全体をスパチュラで均一化し、室温で一晩放置した。
次にこの調製物を滅菌脱イオン水中に１６．７％の濃度で分散させた。従ってベシクル分散液のヘパリン滴定濃度は１．６７％（１６．７ｍｇ／ｍｌ）である。
【００４５】
処方Ｂ
▲１▼エトキシル化ラウリルアルコール（ＳＥＰＰＩＣ，Ｓｉｍｕｌｓｏｌ　Ｐ４）４．８％
▲２▼ラノリンコレステロール（ＦＬＵＫＡ）　　　　　　　　３．６％
▲３▼大豆レシチン（ＮＡＴＴＥＲＭＡＮＮ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎ　９０）５１．６％
▲４▼ヘパリンの２５％ＰＢＳ　１ｘ溶液　　　　　　　　　４０．０％
【００４６】
手順
構成成分▲１▼、▲２▼、及び、▲３▼は任意の順番で２ｍｌの試験管に導入し、次にジクロロメタンに溶解した。全ての溶媒を蒸留し、構成成分▲４▼を室温で添加した。全体を滅菌したニードルで均一化し、滅菌ＰＢＳ　１ｘ中に１６．７％の濃度で分散させた。従ってベシクル分散液のヘパリン滴定濃度は１．６７％（１６．７ｍｇ／ｍｌ）である。
【００４７】
処方Ｃ
▲１▼エトキシル化ラウリルアルコール（ＳＥＰＰＩＣ，Ｓｉｍｕｌｓｏｌ　Ｐ４）４．８％
▲２▼ラノリンコレステロール（ＦＬＵＫＡ）　　　　　　　　３．６％
▲３▼大豆レシチン（ＮＡＴＴＥＲＭＡＮＮ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎ　９０）５１．６％
▲４▼ヘパリンの５０％ＰＢＳ　１ｘ溶液　　　　　　　　　４０．０％
【００４８】
手順
構成成分▲１▼、▲２▼、及び、▲３▼は任意の順番で２ｍｌの試験管に導入し、次にジクロロメタンに溶解した。全ての溶媒を蒸留し、構成成分▲４▼を室温で添加した。全体を滅菌したニードルで均一化し、４℃で一晩放置してから滅菌ＰＢＳ　１ｘ中に１６．７％の濃度で分散させた。従ってベシクル分散液のヘパリン滴定濃度は３．３４％（３３．４ｍｇ／ｍｌ）である。
【００４９】
１．ｂ　ヘパリンを取り込んでいるベシクルの物理化学的キャラクタリゼーション
ベシクルを１つは粒度分析プロフィールの測定によって、もう１つはカプセル化収率の測定によって特徴づける。
【００５０】
サイズプロフィール
サイズプロフィールをＭａｌｖｅｎのＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ　Ｓ装置を用いてレーザー粒度分析によって研究する。
試料Ａに関して、サイズプロフィールは０．３４μｍ付近を中心とし、５０ｎｍから２０μｍに広がっているメインピークを示し、第２最大値は６μｍ付近である。試料の約６０％（体積）が１０μｍ以下の大きさである。
【００５１】
試料Ｂに関して、サイズプロフィールは０．３２μｍ付近を中心とし、５０ｎｍから２０μｍに広がっているメインピークを示し、第２最大値は３．５μｍ付近である。試料の約６０％（体積）が１０μｍ以下の大きさである。
【００５２】
試料Ｃに関して、サイズプロフィールは０．３３μｍ付近を中心とし、５０ｎｍから３μｍに広がっている単一のピークを示す。試料の約８５％（体積）が１μｍ以下の大きさである。
【００５３】
レーザー散乱分析は、ベシクルを直接観察できるようにする偏光光学顕微鏡での観察によって完成される。試料Ａ及びＢに関する上記観察によって、大部分のマイクロメーター程度の大きさを持つ物質とより大きな大きさを持つわずかな物質が存在する事が示される。また、上記物質はもう一方と凝集する傾向があるが、合体する傾向はない。
【００５４】
ベシクル中の取り込み収率
取り込み収率は、遠心分離によってベシクルと分散媒体を分離し、次にろ液中のヘパリン濃度を分析する事によって測定される。ヘパリン滴定濃度は測色計試験（ＳＩＧＭＡ，Ｈｅｐａｒｉｎ　ＡｃｃｕｃｏｌｏｒＴＭ　ＣＲＳ１０６）を用いて評価される。
【００５５】
処方Ａに対して、試料に取り込まれたヘパリンの約５０％がこの処方Ａのベシクル内部にある事を意味する４７±５％の取り込み収率がえられた。同様にして、処方Ｂ及びＣについて測定した取り込み収率は９０±５％である。
【００５６】
１．ｃ　ヘパリンを取り込んでいるベシクルのラットへの投与に関する研究
投与
上記研究はＷｉｓｔｅｒラットを用いて行われた。
ヘパリンを含有するベシクルとネガティブコントロール溶液を挿管ニードルを用いて胃管栄養法によって麻酔をかけていない動物に経口的に投与する。
ポジティブコントロール溶液（ヘパリンの水溶液）を皮下注射する。
用いる動物を処置前の２４時間絶食させる（水のみ）。Ｔ０で投与を行い、血液試料をＴ０（投与前）で採取し、次に、その後図面に示している別の時にも血液試料を採取した。
投与された用量とプロトコルは以下の表の中で各処方に対して述べる。
【００５７】
【表１】
2004506600.tif 000003
【００５８】
血液採取
血液試料は尾に切り込みを入れて（処方Ａ）又は反軌道的に（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌｌｙ）（処方Ｂ及びＣ）採取する。０．５０ｍｌ（処方Ａ）又は１ｍｌ（処方Ｂ及びＣ）の血液を３．８％クエン酸ナトリウムの入ったチューブに回収する。
【００５９】
試料回収直後に、９２ｇに対し４℃で１０分間遠心分離することによって、血漿を血液全体から分離する。この血漿を、分析に必要な時まで分離直後から−１８℃で冷凍して貯蔵する。
【００６０】
ラット血漿又は犬血漿におけるヘパリンの定量アッセイは測色計法（ＳＩＧＭＡ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標），　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＡｃｃｕｃｏｌｏｒＴＭ，　Ｍｅｔｈｏｄ　ｎｏ．ＣＲＳ１０６）によって行われる。検量線は、４０５ｎｍにおける光学密度として得られる結果をヘパリンの状態として表されるためにプロットされる。
【００６１】
検量線
標準ヘパリンは同様にして絶食させた動物から試験サンプルとして採取した血漿プ−ルを用いて調製した。０、０．２２６、０．４５２及び０．９０５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ濃度の４つのヘパリン標準を調製した。各ヘパリン標準の４０５ｎｍにおける吸光度をヘパリン濃度（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）にたいしてプロットする。試料中のヘパリンの量はこの検量線から決定できる。
【００６２】
結果
結果を図１〜３に示す。この中でヘパリン（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は、０をＴと標準化して、対時間でプロットされている。
【００６３】
処方Ａ（図１）
本発明のベシクルに取り込まれたヘパリンの経口投与によって得られる曲線は、最大値まで上昇した後低下することが示されている。この現象は、比較として示されているヘパリン溶液の皮下注射に対して観察されるものと類似している。対照的に、カプセル化されていないヘパリン溶液の経口投与は動物の血液中のヘパリン量に明白な効果は示さない。
【００６４】
処方Ｂ（図２）
本発明のベシクルに取り込まれたヘパリンの経口投与によって得られる曲線は、投与後１時間程度で最小値まで低下し、次に上昇することが示されている。この現象は比較として示されているポジティブコントロールヘパリン溶液の皮下注射に対して観察されるものと類似しているが，より明白ではない。
【００６５】
処方Ｃ（図３）
この場合、本発明のベシクルに取り込まれたヘパリンの経口投与によって得られる曲線のゆっくりした上昇が観察され、投与後６時間経っても最大値にはまだ到達していない。この長い活性時間は皮下注射の場合に見られるものと比較して著しく非常に長い。
また、用量Ｉ及びＩＩに対して得られる２つの曲線の比較によって、「用量」の効果が証明される。というのも、用量ＩＩ（１８，６００ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）に対して得られた血液中のヘパリン量は、対応する用量ＩＩ（５４６０ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）よりもかなり多い。
【００６６】
１．ｄ　ヘパリンを取り込んでいるベシクルの犬に対する投与の研究
前述の実施例と類似の研究を以下の処方Ｄを用いて、犬に対して行った：
処方Ｄ
▲１▼エトキシル化ラウリルアルコール（ＳＥＰＰＩＣ，Ｓｉｍｕｌｓｏｌ　Ｐ４）４．０％
▲２▼ラノリンコレステロール（ＦＬＵＫＡ）　　　　　　　　３．０％
▲３▼滅菌ＰＢＳ　１ｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
▲４▼ヘパリンの２５％滅菌ＰＢＳ　１ｘ溶液　　　　　　　４０．０％
▲５▼大豆レシチン（ＮＡＴＴＥＲＭＡＮＮ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎ　９０）４３．０％
【００６７】
手順
構成成分▲１▼、▲２▼、及び、▲３▼は任意の順番で２ｍｌの試験管に導入し、次に磁気攪拌によって２時間混合した。構成成分▲２▼の総溶解度は顕微鏡観察によって測定される。次に構成成分▲４▼を導入し、混合物をスパチュラを用いて均一化してから構成成分▲５▼を添加した。全体をスパチュラを用いて均一化してから４℃で一晩放置した。
調製物を滅菌ＰＢＳ　１ｘ中に１０％の濃度で分散させ、ヘパリン滴定濃度が１０ｍｇ／ｍｌ分散液を得る。
【００６８】
プロトコル
用いた犬は１０〜１２ｋｇの雌のビーグル種である。プロトコルは以下の通りである：
・食道管を用いて投与した体積は３ｍｌ／ｋｇである、つまり、使用した犬に対して３０ｍｌ投与しており、対応するベシクル中のヘパリン用量は３００ｍｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）、つまり、１匹当たり５６，４００ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ（５６４０ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）である。
・動物は処置前の２４時間絶食させている（水のみ）。Ｔ０で投与を行い、血液試料をＴ０（投与前）、Ｔ０＋１ｈ、Ｔ０＋２ｈ、又は、Ｔ０＋３ｈ、Ｔ０＋６ｈで頸部静脈から採取する。
・ネガティブコントロール：ヘパリンの１０ｍｇ／ｍｌ水溶液：投与する体積は３０ｍｌで、３００ｍｇのヘパリン（３０ｍｇ／ｋｇ）に対応する。つまり、１匹あたり５６，４００ＵＳＰ（５６４０ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）である。
・皮下注射によるポジティブコントロール；溶液は１０ｍｇ／ｍｌであり、注射体積は０．２ｍｌ／ｋｇである。つまり、用いる犬に対して２ｍｌであり、対応するヘパリンの用量は２０ｍｇ（２ｍｇ／ｋｇ）である。つまり、１匹あたり３８００ＵＳＰ（３８０ＵＳＰ　ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）である。
・粒度分析によるベシクルのサイズプロフィールに関する研究によると、処方Ａ及びＢの場合よりも強度な４．５μｍ付近での第２最大値を示す。
【００６９】
結果
ラットの場合と同様に結果を図４に示す。
ラットの場合と同様に、経口投与によってベシクルに取り込まれたヘパリンを受け取った犬から得られる曲線は、皮下注射される溶液に対して観察されたものと類似の条件で上昇する。しかしながら、機能時間としての曲線は、ヘパリンがベシクル内に取り込まれ、経口的に投与される時、わずかに長時間にシフトする。対照的に、ヘパリン溶液の経口投与は血液中のヘパリン濃度に何の影響も持たない。
【００７０】
実施例２：カルシトニンを取り込んでいるベシクル
２．ａ　カルシトニンを取り込んでいるベシクルの調製及びキャラクタリゼーション
同様の実験をペプチドであるカルシトニンを取り込んで、ラットに対して行った。この場合、主な問題は、通常の消化工程の間に胃腸の媒体中で急速に劣化する分子の壊れやすさにある。
用いるカルシトニンはＰＢＳ　１ｘ中の水溶液に溶解した鮭のカルシトニン（ＢＡＣＨＥＭ　Ｈ−２２６０）である。ベシクルを調製する為の処方及び手順はヘパリンの場合に用いたもの（処方Ｄ）と類似している。
【００７１】
▲１▼エトキシル化ラウリルアルコール（ＳＥＰＰＩＣ，Ｓｉｍｕｌｓｏｌ　Ｐ４）４．０％
▲２▼ラノリンコレステロール（ＦＬＵＫＡ）　　　　　　　　３．０％
▲３▼滅菌ＰＢＳ　１ｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０％
▲４▼カルシトニンの１２，０００ＩＵ／ｍｌ滅菌ＰＢＳ　１ｘ溶液
４０．０％
▲５▼大豆レシチン（ＮＡＴＴＥＲＭＡＮＮ，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎ　９０）４３．０％
【００７２】
ベシクルを滅菌ＰＢＳ　１ｘ中に１０％の濃度で分散させる、対応するカルシトニン滴定濃度は４８０ＩＵ／ｍｌである。
ベシクルの粒度分析プロフィールは、０．３μｍ付近を中心とする第１最大値及び比較するとそれほど著しくない３μｍ付近を中心とする第２最大値を有する、５０ｎｍ〜１０μｍまで幅のある粒度分布を示す。
【００７３】
３．ｂ　カルシトニンを取り込んでいるベシクルのラットに対する投与の研究
上記の研究は１５０ｇの雌Ｗｉｓｔｅｒラットを４匹の群に分けて実行した。経口投与は、動物１匹あたり１４４ＩＵが投与されることになる３００μｌを、食道管を用いて実施される。
【００７４】
滴定濃度２０ＩＵ／ｍｌであるカルシトニンの水溶液１００μｌ（動物１匹あたり２ＩＵのカルシトニン用量に対応する）を、ポジティブコントロール群に皮下的に投与した。
【００７５】
滴定濃度２４０ＩＵ／ｍｌであるカルシトニンの水溶液３００μｌ（動物１匹あたり７２ＩＵのカルシトニン用量に対応する）を、ネガティブコントロール群に経口的に投与した。
【００７６】
用いた動物は実験前２４時間絶食させた（水のみ）。血液試料は反軌道的に、通常の麻酔を行った上で、Ｔ０（投与前）、Ｔ０＋１ｈ、Ｔ０＋２ｈ、又は、Ｔ０＋３ｈ、Ｔ０＋５ｈで採取した。血液の５０μｌをヘパリンの入ったマイクロキャピラリーチューブに回収する。
【００７７】
血液中のカルシウム及びｐＨは試料回収直後に、ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ　６３４型自動分析機を用いて直接マイクロキャピラリーチューブ内で測定し、血液中のカルシウム濃度を得る。
【００７８】
結果を図５にまとめる。カルシトニンが本発明のベシクルに取り込まれ、経口的に投与される場合、最初の１時間の血液中のカルシウム濃度は初期値の約７５％まで低下する。そして、徐々に次の１時間で増加する。この挙動は水溶液中のカルシトニンを皮下注射した場合に得られるものと類似している。対照的に、この挙動はカプセル化されていないカルシトニン溶液の経口投与に対しては観察されない。
【００７９】
従って、本発明のカルシトニンのカプセル化はこのペプチドを胃腸の媒体における消化から保護し、ペプチドの腸粘膜の通過を可能にすると結論づけることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットに関して、ヘパリンを用いて実施した実験結果。
【図２】ラットに関して、ヘパリンを用いて実施した実験結果。
【図３】ラットに関して、ヘパリンを用いて実施した実験結果。
【図４】犬に関して、ヘパリンを用いて実施した実験結果。
【図５】ラットに関して、カルシトニンを用いて実施した実験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004506600.tif 000038
【国際調査報告】
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