(57)【要約】微量液滴輸送路、反応領域、電気泳動モジュール、および放射検出器を含むマイクロスケール装置を用いた、微細流路内の微量液滴の移動および混合について説明する。微量液滴を、定められた体積に計量し、その後様々な生体アッセイ法に組み込む。同じ基板材料上に電子構成要素を製造し、それによってセンサおよび制御回路を同じ装置に組み込むことができる。
2004521315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有する微量液滴輸送路、およびｉｉ）輸送路と流体連絡する気体ポートを含む装置を設ける段階と、
（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を該輸送路に導入すると共に、第１の体積の液体が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件下で第１の体積の液体を該輸送路に導入する段階と、
（ｃ）気体が第２の末端を形成するように該液体含有流路内の液体を分割するようにな条件の下で、ある体積の気体を気体ポートを通して該液体含有流路に導入する段階とを含み、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する方法。
【請求項２】
第２の体積の液体を移動させる段階ｄ）をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２の体積が、反応チャンバ内に移動させられる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第２の液体の体積が、約１ピコリットルから１ミリリットルの間の範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有するエッチングされた微量液滴輸送路、およびｉｉ）微量液滴輸送路と流体連絡し、接合部を形成するように該微量液滴輸送路と交差するエッチングされた気体輸送路を含む装置を設ける段階と、
（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を該微量液滴輸送路に導入すると共に、第１の液体の体積が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件で第１の体積の液体を該微量液滴輸送路に導入する段階と、
（ｃ）気体が液体含有流路内の液体を分裂させ第２の末端を形成するように接合部のところで該液体含有流路に入るような条件の下で、ある体積の気体を該気体輸送路に導入する段階とを含み、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する方法。
【請求項６】
第２の体積が第１の体積よりも少ない、請求項５記載の方法。
【請求項７】
第２の液体の体積が、約１ピコリットルから１ミリリットルの間の範囲である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
第２の体積の液体を移動させる段階ｄ）をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
第２の体積が、反応チャンバ内に移動させられる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有する微量液滴輸送路、およびｉｉ）前記輸送路と流体連絡する複数の気体ポートを含む装置を設ける段階と、
（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を該輸送路に導入すると共に、第１の液体の体積が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件下で第１の体積の液体を該輸送路に導入する段階と、
（ｃ）気体が第２の末端を形成するように液体含有流路内の液体を分割するようにな条件の下で、ある体積の気体を１つの気体ポートを通して該液体含有流路に導入する段階とを含み、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する方法。
【請求項１１】
第２の体積の液体を移動させる段階ｄ）をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
微量液滴輸送路内の、所与の疎水性領域と複数の気体ポートとの間の距離によって、一連の指定の液体体積が決定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
気体が第２の末端を形成するように流路内の液体を分裂させる条件が、計量圧力を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
第２の体積が、反応チャンバ内に移動させられる、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）による政府の支援のもとに行われたものである（助成金番号ＮＩＨ−Ｒ０１−ＨＧ０１０４４およびＮＩＨ−Ｒ０１−ＨＧ０１４０６）。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、微細流路を通る微量液滴の移動に関し、特に微量液滴のサイズおよび移動を制御する組成、装置、および方法に関する。
【０００３】
背景
生物学的反応の複雑さおよび効力は過去３０年間にわたって大幅に増大している。「ハイブリダイゼーション」プロセス、すなわち、相補配列を含む核酸の２つのポリマーが互いを見付け、塩基対形成相互作用を通じてアニールする能力は、マーマー（Ｍａｒｍｕｒ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ４６， ４５３ （１９６０）ならびにドティー（Ｄｏｔｙ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ４６， ４６１ （１９６０））によって初めて見出され、その後、このプロセスが現代生物学の必須手段として改良された。
【０００４】
ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ５０， ６６４ （１９６３））によって行われたようなハイブリダイゼーションについての初期の研究は溶液中で行われた。さらなる開発によって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡが固体支持体上に固定化されるようになった。スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウィルコックス（Ｗｉｌｃｏｘ）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５１， ３７９ （１９７０））によって特定の制限エンドヌクレアーゼが発見されたことによって、ＤＮＡの別個の断片を分離できるようになった。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８， ５０３ （１９７５））が説明したような固定化技術を制限酵素と組み合わせることによって、分離されたゲノムＤＮＡ集団に１コピーの遺伝子をハイブリダイズすることによる同定が可能になった。
【０００５】
１９７７年に、２つのＤＮＡ配列決定方法が報告された。これらは、マキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７４：５６０ （１９７７））の化学的分解方法およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７４：５４６３ （１９７７））の酵素方法である。これらの方法は共に、一定の点から始まり一定の残基またはある種の残基で無作為に終わる放射標識付けされたオリゴヌクレオチド集団を生成する。これらの集団は、長さがわずか１ヌクレオチド異なるオリゴヌクレオチド同士を区別できるようにするポリアクリルアミドゲル上で分解される。
【０００６】
マキサム・ギルバート法は、各々が特定の塩基またはある種の塩基に特有の５つの別々の化学反応で部分的に開裂された一方の末端が放射標識付けされたＤＮＡの断片を使用する。これらの化学反応の生成物は、標識付けされた末端から化学的開裂の部位まで延びる標識付けされた分子から成る５つの集団である。この方法は、その初期に開発されたものと比べてほとんど変わっていない。この方法は、標識された末端から２５０ヌクレオチド未満の部位に位置するＤＮＡ配列にもっとも有効である。
【０００７】
これに対して、サンガー法は、１組の反応で５００個を超えるヌクレオチドの配列を決定することができる。サンガー法は、チェーンターミネーター反応ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を使用する酵素反応である。ｄｄＮＴＰは、後続のデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とのホスホジエステル結合の形成を妨げる３’−ヒドロキシル残基がないので鎖を停止する。重合反応には４つの従来のｄＮＴＰと共に少量の１つのｄｄＮＴＰが含まれる。重合またはＤＮＡ合成は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。従来のｄＮＴＰを取り込むことによる鎖の伸長とｄｄＮＴＰを取り込むことによる鎖の停止が競合する。短いオリゴヌクレオチドまたはプライマーはアニールされ、配列決定すべきＤＮＡを含む鋳型にアニールする。最初のプロトコルでは一本鎖ＤＮＡ鋳型が必要であった。後に、二本鎖鋳型を用いることが報告された。プライマーは、ポリメラーゼ酵素およびｄＮＴＰが与えられた場合にＤＮＡ鎖を重合できるようにする３’ヒドロキシル基を与える。
【０００８】
最初のサンガー法は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用した。この酵素は、非修飾ポリメラーゼの重合と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さない。クレノー断片は、酵素配列決定に用いられた場合にいくつかの制限を有する。１つの制限は、酵素の前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が低いことであり、ｄｄＮＴＰを取り込むことによる所望の停止によって停止するのではなく、酵素が鋳型から無作為に分離されることによって停止する、バックグラウンドの多い断片が生成される。前進性が低いということは、プライマーの５’末端から〜２５０ヌクレオチドよりも離れた部位に現れるヌクレオチドの配列を決定するのに酵素を用いることができないことも意味する。第２の制限は、クレノーは、高次二次構造のホモポリマー経路または領域を有する鋳型を使用できないことである。鋳型の二次構造によって生じる問題は、重合化反応を５５℃で起こさせることによって最小限に抑えることができる。
【０００９】
最初のサンガー法の改良には、クレノー断片以外のポリメラーゼを用いることが含まれる。ホモポリマー経路を有する鋳型の配列を決定するのに逆転写が用いられている。逆転写は、ホモポリマー経路を含む鋳型を用いるという点でクレノー酵素よりもいくらか優れている。
【００１０】
修飾されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標））を用いることは、サンガー法の最も重要な改良であった。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．）ら著「分子クローニング、実験室マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ．）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１３．７〜１３．９およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ．Ｗ．（１９９１） Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． Ｇｅｎ． Ｄｅｖｌ． １：８８〜９２を参照されたい。シーケナーゼ（商標）は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させた化学修飾されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。テイバー（Ｔａｂｏｒ）らＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：４７６７ （１９８７）を参照されたい。シーケナーゼ（商標）バージョン２．０は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性がまったくない遺伝子操作されたＴ７ポリメラーゼである。シーケナーゼ（商標）は前進性が非常に高く、重合率が高い。シーケナーゼ（商標）は、配列決定ゲルの圧縮領域を分解するのに用いられるｄＩＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰなどのヌクレオチド類似体を効率的に取り込むことができる。Ｇ＋Ｃ含有量の多いＤＮＡ領域では、フッグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）結合が形成され、ＤＮＡが圧縮されることができる。このような圧縮によってオリゴヌクレオチド鎖の異常な移入パターンが得られる。このような塩基類似体と従来のヌクレオチドとの対は弱いので、鎖内二次構造は緩和される。これに対して、クレノーはこのような類似体をこれほど効率的には取り込まない。シーケナーゼ（商標）を用いた１組のチェーンタミネーション反応から得られるＤＮＡ配列の量に対する主要な制限は、酵素の特性ではなくポリアクリルアミドゲルの分解力である。
【００１１】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いることは、サンガー法に対するより新しい改良である。イニス（Ｉｎｎｉｓ）らＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：９４３６ （１９８８）を参照されたい。Ｔａｑポリメラーゼは、７０℃〜７５℃で効率的に作用する熱安定酵素である。高温でＤＮＡ合成を触媒することができるため、Ｔａｑポリメラーゼは、３７℃（クレノー反応およびシーケナーゼ（商標）反応に用いられる標準温度）で広範囲の二次構造を有する配列決定鋳型に有用である。Ｔａｑポリメラーゼは、シーケナーゼ（商標）と同様に、高度の前進性を有し、シーケナーゼ ２．０と同様に、３’−５’ヌクレアーゼ活性を欠失している。
【００１２】
ダイレクト配列決定を伴わない一塩基変化についての方法も開発されている。このような方法によって、突然変異または他の配列変化の存在についてＤＮＡ断片を「スキャニング」することができる。たとえば、関心対象の突然変異が制限認識配列内にたまたま入る場合、消化パターンの変化を診断手段（たとえば、制限断片長多型［ＲＦＬＰ］解析）として用いることができる。
【００１３】
このような複雑で有効な生物学的技術が開発されたため、意欲的なプロジェクトが実施されている。ヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）と呼ばれるこのプロジェクトには、３ ｘ １０９ ＤＮＡ塩基対を含む典型的なヒトゲノム配列の完全な特徴付けが含まれる。このプロジェクトの暗黙的な目標は、すべてのヒトがＤＮＡ配列レベルでは９９％同一であることを認識することである。しかし、人間同士の差により、病気に罹る可能性または特定の治療に対する反応の可能性のある推定を含む、個人の健康管理に最も適切な情報を得る。ＨＧＰが完了すると、ヒト遺伝子研究の分野では、引き続き、集団内の差および定義された原型と個々の変異体の差が調査される。ＨＧＰの１５年にわたる活動によって、定められた量のＤＮＡデータが得られたが、個々の遺伝子変異に対してＤＮＡ情報の今後の結びつきが必要であり、したがって、この需要は無限である。
【００１４】
現在のＤＮＡ遺伝型同定技術は、１年当たり数百個ないし数千個の範囲の試料を詳しく解析するのに適している。しかし、数百万のアッセイ法の規模の遺伝型同定プロジェクトは、現在、（ｉ）試薬およびＤＮＡ鋳型溶液の液体の取り扱い、（ｉｉ）溶液の体積の測定、（ｉｉｉ）試薬と鋳型の混合、（ｉｖ）混合液の制御された熱反応、（ｖ）電気泳動ゲル上へのサンプル投入、および（ｖｉ）サイズ分離ゲル上でのＤＮＡ産物検出が非効率的であるため、現在の実験所の能力を超えている。このような既存の非効率なしに生物学的反応をハイスループット処理を可能にする流体の定められた体積を測定する方法が必要である。
【００１５】
発明の概要
本発明は、微細流路を通る微量液滴の移動に関し、特に、微量液滴のサイズおよび移動を制御する組成物、装置、および方法に関する。本発明は、マイクロスケール装置の微細製造およびマイクロスケール装置内の反応を含み、特に、たとえば、生物学的反応を開始するために微細流路を通って微量液滴中の生物試料を移動させることを含む。
【００１６】
本発明では、親水性領域および疎水性領域を有する微量液滴輸送路、反応チャンバ、吸気通路および排気口、電気泳動モジュール、放射線検出器を含むがそれに限らない検出器を備えるマイクロスケール装置が考えられる。いくつかの態様では、装置は、微量液滴を分裂させ移動させるように内部で空気圧を生成する（すなわち、「オンチップ」圧力生成）空気チャンバをさらに含む。
【００１７】
好ましい態様では、これらの要素は、シリコン基板およびガラス基板から微細製造される。これらの様々な構成要素、別々の液滴が差動的に加熱され、エッチングされた流路を通って送られる表面張力勾配機構を含む流れ指向的手段を含むがそれに限らない流れ指向的手段を用いて連結される（すなわち、液体連絡する）。同じ基板材料上で電子構成要素が製造され、センサおよび制御回路を同じ装置に組み込むことができる。すべての構成要素が従来のフォトリソグラフィック技術を用いて作られるので、多要素装置を複雑な一体化されたシステムに容易に組み立てることができる。
【００１８】
本発明は、マイクロスケール装置で実施される反応の性質によって制限されるものではない。反応には、化学反応および生物学的反応が含まれるが、それらに限らない。生物学的反応には、配列決定、制限酵素消化、ＲＦＬＰ、核酸増幅、およびゲル電気泳動が含まれるが、それらに限らない。本発明は、生物学的反応を実施するという特定の目的によって制限されるものでもない。ある医療診断用途では、ヘテロ接合標的とホモ接合標的を区別することが望ましく、後者の場合、どのがホモ接合体が存在するかを特定することが望ましい場合がある。所与の遺伝子座が対立遺伝子Ａまたは対立遺伝子ａの遺伝記号をコードする場合、アッセイ法によって、ＡＡ対立遺伝子対とＡａ対立遺伝子対とａａ対立遺伝子対を区別することができる。他の医療診断用途では、臨床試料中の、病原体の特定の対立遺伝子変異体の有無を簡単に検出することが望ましい場合がある。たとえば、細菌の特定の種または亜種は抗生物質に対してそれぞれの異なる感受性を有し、特定の種または亜種の存在を迅速に同定すると診断の助けになり、適切な処置を開始することができる。
【００１９】
本発明では、微量液滴を移動させる方法であって、（ａ）シリコンにエッチングされ、輸送路を介して反応領域と液体連絡し、液体障壁によって微量液滴流指向的手段から分離されている微量液滴輸送路内に置かれた液体微量液滴を設ける段階と、（ｂ）輸送路内の微量液滴を微量液滴流指向的手段を介して反応領域に搬送する段階とを含む方法が考えられる。本発明は、微量液滴流指向的手段の特定の性質によって制限されるものである。一態様では、この手段は、輸送路に沿って配置された一連のアルミニウム発熱体を含み、微量液滴は、発熱体による微量液滴の差動加熱によって搬送される。
【００２０】
上述の搬送の前に、（複数の）輸送路を疎水性増強化合物で処理しておくと、本発明の方法および装置をうまく使用できることが、実験によって判明している。本発明は、この処理を行う厳密に制限されるものではない。実際には、いくつかの増強化合物の長寿命特性のために、ある程度融通性もある。
【００２１】
微細流路の領域を、疎水性領域を形成するように疎水性試薬で処理しておくと、本発明の方法および装置をうまく使用できることも、実験によって判明している。微細流路内の定められた位置に、定められた疎水性領域を使用し、かつ圧力源を使用することによって、厳密なナノリットル体積の液滴（すなわち、微量液滴）を分裂させ、微細流路を通ってこれらの液滴の動きを制御することができる。
【００２２】
このような疎水性領域（「疎水性パッチ」）を用いた一態様では、本発明は、微量液滴を移動させる方法であって、（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有し、ｉｉ）気体源と連絡する微量液滴輸送路（または微量液滴輸送路を含む装置）を設ける段階と、（ｂ）ｉ）輸送路内に置かれた液体微量液滴源およびｉｉ）液体隣接疎水性領域を限定するように１つの疎水性領域で液体が停止するような条件の下で輸送路に液体を導入する段階と、（ｃ）定められたサイズの微量液滴がｉ）液体隣接疎水性領域に接触し、ｉｉ）液体隣接疎水性領域上を移動するような条件の下で気体源からの気体を用いて、別個の量の液体を液体微量液滴源から分離する段階とを含む方法が考えられる。
【００２３】
一態様では、気体源からの気体は、微量液滴輸送路と連絡する吸気経路から輸送路に入り、やはり微量液滴輸送路と連絡する排気口によって輸送路から出る。この態様では、（上述の方法の部分ｂに記載された）輸送路への液体の導入が、ｉ）液体が吸気通路を通過し、ｉｉ）微量液滴の所望のサイズが吸気通路と液体隣接疎水性領域との間の距離によって定められるように行われることが好ましい。この態様では、（上述の方法の部分ｃに記載された）気体の導入によって、微量液滴は、ｉ）液体隣接疎水性領域を通過し、ｉｉ）排気口を通り過ぎる（ただし、排気口には入らない）。
【００２４】
このような疎水性領域（または「疎水性パッチ」）を用いた他の態様において、本発明では、微量液滴を移動させる方法であって、（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有し、ｉｉ）気体源と連絡する、シリコンにエッチングされた微量液滴輸送路を含む装置を設ける段階と、（ｂ）ｉ）輸送路内に置かれた液体微量液滴源およびｉｉ）液体隣接疎水性領域を限定するように１つの疎水性領域で液体が停止するような条件の下で輸送路に液体を導入する段階と、（ｃ）定められたサイズの微量液滴がｉ）液体隣接疎水性領域に接触し、ｉｉ）液体隣接疎水性領域を移動するような条件の下で気体源からの気体を用いて、別個の量の液体を液体微量液滴源から分離する段階とを含む方法が考えられる。
【００２５】
他の態様では、本発明の装置では、基板にエッチングされ、１つまたは複数の疎水性領域を含む微量液滴輸送路と、輸送路と流体連絡する気体ポートとを含み、基板が、シリコン、石英、ガラス、およびプラスチックから成る群から選択される装置が考えられる。
【００２６】
本発明の他の態様では、装置は、気体ポートが５°から１７０°の範囲の角度で微量液滴輸送路に挿入されるように設計される。好ましい態様では、気体ポートの挿入角度は約９０°である。
【００２７】
このような疎水性領域（または「疎水性パッチ」）を用いた他の態様において、本発明では、微量液滴を計量する方法であって、（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有し、ｉｉ）気体ポートと液体連絡する、（たとえば、シリコンにエッチングされた）微量液滴流路を含む装置を設ける段階と、（ｂ）１つの疎水性領域によって液体が停止する（すなわち、液体の第１の末端が疎水性領域に隣接する）ような条件の下で微量液滴流路に液体を導入する段階と、（ｃ）流体のための第２の末端と、第２の末端（すなわち、分裂を生じさせる気体または気泡の界面）および第１の末端（疎水性領域によって制限される第１の縁部）によって決定される液体の一定の体積とを形成するように、気体が微量液滴流路内の液体を分裂させるような条件の下で、ある体積の気体を気体ポートから、流体が充填された微量液滴流路に導入する段階とを含む方法が考えられる。
【００２８】
他の態様では、本発明は、一例では、疎水性パッチを越えて導かれた体積が、生物学的反応手段を含む回路に向けられるように、第１および第２の末端によって決定された液体の体積を疎水性パッチを越えて導くことが考えられる。
【００２９】
他の態様において、本発明では、（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有し、ｉｉ）気体ポートと流体連絡する、微量液滴流路を含む装置を設ける段階と、（ｂ）液体が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件の下で、第１の体積を有する液体を流路に導入する段階と、（ｃ）気体が、流体の第２の末端を形成するように微量液滴流路内の液体を分裂させるような条件の下で、ある体積の気体を気体ポートから、流体が充填された微量液滴流路に導入する段階とを含み、第１および第２の末端が、一例では第１の体積よりも少ない第２の体積を決定する方法が考えられる。
【００３０】
一態様では、本発明は、液体が充填された流路に（気体ポートを介して）気泡が導入された場合に、液体の再現可能な所望の体積が形成されるように、（流路に導入された液体の第１の末端を制限する）疎水性パッチから事前に測定された所望の長さに気体ポートが位置するように設計される。
【００３１】
一態様では、本発明は、液体の末端が疎水性パッチによって制限された場合に、その後（またはそれと同時に）（気体ポートを介して）気体が導入されても、疎水性パッチによって制限された液体の末端が、微量液滴流路に備えられた疎水性パッチのマージンを超えて前進することのないように構成される。
【００３２】
一態様において、本発明では、微量液滴流路内に置かれた液体の計量された体積が、疎水性領域によって制限される流体縁部と、分裂を生じさせる気体体積の界面と、気体を微量液滴流路に導入するための気体ポートの近くの流体縁部とによって形成される、液体の計量された体積が考えられる。
【００３３】
一態様において、本発明では、微量液滴流路へ導入する流体が第１の体積を決定し、第１と第２の末端が第１の体積未満に第２の体積を決定することが考えられる。
【００３４】
一態様において、本発明では、（ａ）ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有する微量液滴輸送路、およびｉｉ）微量液滴輸送路と流体連絡する気体ポートとを含む装置を設ける段階と、（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を微量液滴輸送路に導入すると共に、第１の液体の体積が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件の下で、第１の体積の液体を微量液滴輸送路に導入する段階と、（ｃ）気体が、第２の末端を形成するように微量液滴輸送路内の液体を分裂させるような条件の下で、ある体積の気体を気体ポートから液体含有流路に導入する段階とを含み、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する方法が考えられる。本発明では、第２の体積の液体を移動させる段階（ｄ）を含む態様がさらに考えられる。
【００３５】
一態様では、本発明は、第２の体積を反応チャンバに移動させることが考えられる。
【００３６】
本発明では、液体の第２の体積が約１ピコリットルから１ミリリットルの間の範囲である態様も考えられる。
【００３７】
一態様において、本発明では、（ａ）（ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有するエッチングされた微量液滴輸送路、および（ｉｉ）微量液滴輸送路と流体連絡し、接合部を形成するように微量液滴輸送路と交差するエッチングされた気体輸送路を含む装置を設ける段階と、（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を微量液滴輸送路に導入すると共に、第１の液体の体積が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の体積が第１の末端を形成するように制限されるような条件の下で、第１の体積の液体を微量液滴輸送路に導入する段階と、（ｃ）気体が、流路内の液体を分裂させ第２の末端を形成するように接合部のところで流体含有流路に入るような条件の下で、ある体積の気体を気体輸送路を通して導入し、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する段階とを含む方法が考えられる。
【００３８】
本発明の一態様では、第２の体積は第１の体積よりも少ない。
【００３９】
一態様において、本発明では、（ａ）（ｉ）１つまたは複数の疎水性領域を有する微量液滴輸送路、および（ｉｉ）微量液滴輸送路と流体連絡する複数の気体ポートを含む装置を設ける段階と、（ｂ）液体含有流路を形成するように第１の体積の液体を流路に導入すると共に、第１の液体の体積が、少なくとも１つの疎水性領域によって第１の末端を形成するように制限されるような条件の下で、第１の体積の液体を流路に導入する段階と、（ｃ）気体が、流路内の液体を分裂させ第２の末端を形成するように流路内の液体を分裂させるような条件の下で、ある体積の気体を１つの気体ポートを通して液体含有流路に導入し、第１の末端と第２の末端が第２の液体の体積を決定する段階を含む方法が考えられる。
【００４０】
本発明では、微量液滴輸送路内の、所与の疎水性領域と複数の気体ポートとの間の距離が、ある範囲の液体の所定の体積の範囲を決定する態様も考えられる。
【００４１】
本発明の一態様では、第２の末端を形成するように気体が微量液滴輸送路内の液体を分裂させる条件は、計量圧力を含む。
【００４２】
この場合も、流路内の液体とシリコンチップの電子機器との間に液体障壁が必要であることが、実験によって判明している。好ましい障壁は、第１の酸化ケイ素層、窒化ケイ素層、および第２の酸化ケイ素層を含む。
【００４３】
本発明では、（ａ）第１および第２の液体微量液滴、液体微量液滴送達手段、ならびにｉ）シリコンで構成されたハウジング、ｉｉ）シリコンにエッチングされ、反応領域を含む第３の輸送路を形成するように連結された第１および第２の微量液滴輸送路と、ｉｉｉ）輸送路を介して反応領域と液体連絡する微量液滴受入れ手段、ならびにｉｖ）第１、第２、および第３の輸送路に沿って配置された微量液滴流指向的手段を含む装置を設ける段階と、（ｂ）第１の液体微量液滴を微量液滴供給手段を介して第１の輸送路に送達する段階と、（ｃ）微量液滴輸送手段を介して第２の液体微量液滴を第２の輸送路へ送達する段階と（ｄ）輸送路内の微量液滴を微量液滴流指向的手段を介して第３の輸送路内の反応領域に搬送し、それによって第１の微量液滴と第２の微量液滴を合体し合体された微量液滴を形成する段階とを含む微量液滴を合体する方法がさらに考えられる。
【００４４】
一態様では、第１の微量液滴は核酸を含み、第２の微量液滴は、核酸に作用することのできるヌクレアーゼを含む。この態様では、合体された微量液滴内の混合を推進することが望ましい。これはいくつかの方法で行うことができる。混合の一態様では、段階（ｄ）の搬送の後で、流れの方向を反転させる。本発明は、反転の性質または回数によって制限されるものではない。合体された微量液滴の流れ方向を１回だけ反転した場合でも、このプロセスは反応物の混合を推進する。
【００４５】
本発明では、微量液滴輸送路を含む、シリコンベースの様々な装置が考えられる。一態様では、この装置は、ｉ）シリコンで構成されたハウジングと、ｉｉ）シリコンにエッチングされた微量液滴輸送路と、ｉｉｉ）輸送路を通じて反応領域と液体連絡する微量液滴受入れ手段と、ｉｖ）輸送路と微量液滴流指向的手段との間に配置された液体障壁とを含む。一態様では、この装置は２つの部品から組み立てられる。まず、輸送路を任意の数の構成でエッチングする。第２に、この部材を、電子機器を含むシリコンベースのチップと結合する。これによって（第１の部材における）カスタム化と（第２の部材における）標準化の両方が可能になる。
【００４６】
本発明では、可融材料で流路を密閉する装置および方法も考えられる。一態様では、この装置は、基板内に配置され発熱体に結合された可融材料を含む。
【００４７】
一態様において、本発明では、ａ）基板内に配置され発熱体に結合された可融材料を有する装置を設ける段階と、ｂ）可融材料が少なくとも部分的に液化し、かつ基板が損傷を受けないように、発熱体によって、可融材料を加熱する段階とを含む方法が考えられる。この方法は、ｃ）液化された可融材料を冷却する段階をさらに含んでよい。本発明は、流路のサイズによって制限されることはないが、一態様では、基板は、基板に配置された微量液滴流路をさらに含み、可融材料はこの微量液滴流路内に配置される。
【００４８】
他の態様において、本発明では、流路内の流体の流れを制限する方法であって、ａ）ｉ）基板内に配置され発熱体に結合された可融材料、およびｉｉ）延ばされた場合に可融材料に接触するように位置する隔壁を含む装置を設ける段階と、ｂ）可融材料に接触するように隔壁を拡張する段階とｃ）可融材料が少なくとも部分的に液化し、かつ基板が損傷を受けないように、発熱体によって、可融材料を加熱する段階とを含む方法が考えられる。一態様では、この方法は、ｄ）該可融材料を冷却させる段階をさらに含む。本発明は、流路のサイズによって制限されることはないが、一態様では基板は、基板に配置された微量液滴流路をさらに含み、可融材料はこの微量液滴流路内に配置されている。
【００４９】
本発明では、流路内の流体の流れを制限する方法であって、ａ）ｉ）側部流路に連結され基板内に配置された主流路、ｉｉ）側部流路内に配置され発熱体に結合された可融材料、およびｉｉｉ）適用した場合に、可融材料が側部流路から主流路に流れ込むように側部流路に連結された移動手段とを設ける段階と、ｂ）可融材料を、少なくとも１つの部分的に液化するように可融材料を加熱する段階と、ｃ）液化された可融材料が側部流路から主流路に流れ込むように移動手段を適用する段階とを含む方法も考えられる。本発明は移動手段によって制限されることはないが、一態様では、移動手段は強制空気である。一態様では、この方法は、ｄ）可融材料を冷却する段階をさらに含む。本発明は流路のサイズによって制限されることはないが、一態様では主流路および側部流路は微量液滴流路である。
【００５０】
本発明は、基板の性質によって制限されることはないが、一態様では、基板はシリコンまたはガラスを含む。同様に、本発明は、可融材料の組成によって制限されることはない。一態様では、可融材料ははんだを含む。好ましい態様では、はんだは４０：６０Ｓｎ：Ｐｂを含む。他の態様では、可融材料は、プラスチック、ポリマー、およびろうから成る群から選択される。同様に、本発明は、可融材料の基板内での配置によって制限されることはない。他の態様では、可融材料は流路と隣接して配置され、一方、他の態様では、複数の流路の接合部の近くに配置される。
【００５１】
定義
以下の定義は、本明細書で使用される語に関して与えられる。
【００５２】
「生物学的反応」とは、酵素（たとえば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼなど）や核酸（ＲＮＡとＤＮＡの両方）などの生体分子を伴う反応を意味する。生物試料は、タンパク質、脂質、核酸などの生体分子を含む試料である。この試料は、微生物（たとえば、細菌培養）またはヒトを含む動物から得ることができる（たとえば、血液、尿など）。または、試料に精製（たとえば、抽出）または他の処理を施しておくことができる。生物学的反応には、装置とのある程度の生体適合性が必要である。すなわち、反応は理想的には、装置構成要素の特性または性質によって実質的に阻害されることがないと思われる。
【００５３】
「化学反応」とは、無機化合物などの化学反応物を伴う反応を意味する。
【００５４】
「流路」とは、液体および気体の移動を可能にする、媒体（たとえば、シリコン）を通る通路（直線状であっても、曲線状であっても、単数であっても、複数であっても、網状であってもかまわない）である。したがって、流路は他の構成要素同士を連結することができ、すなわち、構成要素同士を「連絡」、特に「流体連絡」、特に「液体連絡」させることができる。このような構成要素には、吸気流路および排気口が含まれるが、それらに限らない。
【００５５】
「微量液滴輸送路」とは、「微量液滴」を収容するように（マイクロメートル単位で）構成された流路である。本発明は、流路の厳密な寸法または微量液滴の厳密な体積によって制限されることはないが、流路および微量液滴の例示的な範囲は以下のとおりである。流路は深さが０．５μｍから５０μｍ（好ましくは５μｍから２０μｍ）の範囲であり、幅が２０μｍから１０００μｍ（好ましくは５００μｍ）の範囲であってよく、微量液滴の体積は、約０．０１ナノリットルから１００ナノリットルの間（通常は１０ナノリットルから１５ナノリットルの間）の範囲（それらの長さから算出された）であってよい。
【００５６】
「搬送する」とは、微量液滴が輸送路を通して、反応領域のような特定の点に搬送される場合のように「〜内を移動させる」ことを意味する。搬送は、流れ指向的手段を介して行うことができる。
【００５７】
「流れ指向的手段」は、液体（たとえば、微量液滴）の特定の方向への移動を行うための任意の手段である。後述の「バブルポンプ」などのポンプを含むがそれに限らない、様々な流れ指向的手段が考えられる。好ましい指向的手段は、別個の液滴が差動的に加熱され、エッチングされた流路内で推し進められる表面張力勾配機構を使用する。液体の連続する流れの場合は、ポンプ（外部と内部の両方）が考えられる。
【００５８】
「バブルポンプ」は、流れ指向的手段の一態様であり、液体は、流路内に置かれた液体試料に接触するように配置された１つまたは複数の電極を含む流路に導入される。２つの電極を用いることができ、２つの電極間に電位をかけることができる。電極の両端で加水分解が起こり、気泡が発生する。気泡は、電極が引き続き流体に電荷を送り込むにつれて成長し続ける。気泡が膨張することにより、最終的に液体を前方に押しポリマー流路内を移動させるのに十分大きい圧力差が液滴の２つの側の間に生じる。
【００５９】
バブルポンプは、毛細管弁に結合された場合に、ある量の流体試料を流路に沿って作動させることができる。毛細管弁は基本的に、流路の幅の狭い区間である。動作時には、まず流体試料を入口の液だめに注入する。流体は、充填された直後に、毛細管力によって流路内を移動する。流体は次いで、流体の幅の狭い区間を通過するが、流路が再び広くなる縁部で停止する。流体試料を充填した後、２つの電極間に電位をかける。電極の両端で加水分解が起こり、気泡が発生する。気泡は、電極が引き続き流体に電荷を送り込むにつれて成長し続ける。次いで、気泡が膨張することにより、最終的に液体を前方に押し出すのに十分大きい圧力差が液滴の２つの側の間に生じる。
【００６０】
バブルポンプと毛細管弁の組合せは、いずれの可動部品を必要とせず、製造が容易である。さらに、この装置は、気泡の圧力に依存する十分に制御された流体の動きを生じさせる。気泡の圧力は、電極によって送り込まれる電荷の量によって調節される。さらに、装置の電力消費量は最小限である。
【００６１】
「親水性増強化合物」とは、輸送路の親水性のような構成要素の親水性を高める化合物または薬剤である。この定義は、機能に関する定義であり、構造に関する定義ではない。たとえば、レイン−Ｘ（Ｒａｉｎ−Ｘ）（商標）かぶり防止剤は、エチルアルコールに溶解したグリコールおよびシロキサンを含む市販の試薬である。しかし、この試薬によってガラスまたはシリコンの表面の親水性がより高くなることは、この試薬の特定の化学式よりも重要である。
【００６２】
「疎水性試薬」は、流路内に「疎水性コーティング」を作るのに用いられる。本発明は、特定の疎水性試薬に制限されることはない。一態様では、本発明は、酸化ケイ素表面に化学的にグラフト重合することのできる疎水性ポリマー分子が考えられる。このようなポリマー分子にはポリマージメチルシロキサンが含まれるがそれに限らない。他の態様では、本発明は、シランを用いて、ハロゲン化シランおよびアルキルシランを含むがそれらに限らない疎水性コーティングを作ることが考えられる。なお、本発明は、特定のシランに制限するものではない。シランの選択は、機能の点、すなわち、それが表面を疎水性にするという点でのみ制限される。
【００６３】
一態様では、ｎ−オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）が疎水性試薬として用いられる。他の態様では、オクタデシルジメチルクロロシランが用いられる。他の態様において、本発明では、１Ｈ， １Ｈ， ２Ｈ， ２Ｈ−ペルフロロデシルトリクロロシラン（ＦＤＴＳ、Ｃ１０Ｈ４Ｆ１７ＳｉＣｌ３）が疎水性試薬として考えられる。さらに、他の態様では、フロロアルキル−、アミノアルキル−、フェニル−、ビニル−、ビスシリルエタン−、および３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＡＯＰ）が疎水性試薬として考えられる。このような試薬（またはその混合物）は、疎水性コーティングを作るのに有用であり、より好ましくは、（流路全体のコーティングとは異なり）流路のある領域を疎水性にするうえで有用である。
【００６４】
本発明は、本発明の疎水性領域の特定の寸法に限るものではない。様々な寸法が可能であるが、各領域の幅は一般には約１０μｍから１０００μｍ（必要に応じてそれ以上）の間であることが好ましく、約１００μｍから５００μｍの間であることがより好ましい。
【００６５】
表面（流路の表面など）は、約７００よりも大きな水に対する前進接触角を示す場合は「疎水性」である。一態様では、本発明の処理された流路表面の水に対する前進接触角は、約９００から約１３００の間である。他の態様では、処理された微細流路は、水に対する前進接触角が約１３００よりも大きい領域を有する。
【００６６】
「液体隣接疎水性領域」とは、液体（たとえば、水溶液）を停止させるか、または流路に沿ったさらなる移動を阻止する、流路内の疎水性領域である。この停止または阻止は、領域の疎水性によるものであり、停止または阻止された液体は、疎水性領域のすぐ隣りに位置する。
【００６７】
「反応を開始する」とは、反応を生じさせることを意味する。反応は任意の手段（たとえば、熱、光の波長、触媒の添加など）によって開始することができる。
【００６８】
「液体障壁」または「水分障壁」とは、短絡および／または電子素子の損傷を防止する（たとえば、アルミニウム発熱体の破壊を防止する）、既存の構造に対する任意の構造または処理プロセスである。本発明の一態様では、液体障壁は、第１の酸化ケイ素層、窒化ケイ素層、および第２の酸化ケイ素層を含む。
【００６９】
「合体」は「混合」とは異なる。第１の微量液滴と第２の微量液滴を合体して、合体された微量液滴を形成する場合は、液体を混合してもしなくてもよい。さらに、合体された微量液滴における混合の程度は、合体された微量液滴の流れ方向を反転させることを含むがこれに限定されない、本発明によって考えられる様々な技術によって高めることができる。
【００７０】
「核酸増幅」は、核酸の濃度、特に核酸の特定の部分の濃度を高めることを含む。好ましい技術は、「ポリメラーゼ連鎖反応」と呼ばれている。参照として本明細書に組み入れられたミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号には、クローニングや精製なしにゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を高める方法が記載されている。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物にモル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入することから成る。２つのプライマーは、二本鎖配列のそれぞれの鎖と相補的である。混合物は変性させられ、次いでハイブリダイズさせられる。ハイブリダイゼーションに続いて、プライマーは、相補的な鎖を形成するようにポリメラーゼを用いて伸長される。変性、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ伸長は、所望の標的配列の比較的高い濃度のセグメントを得るのに必要な回数だけ繰り返すことができる。所望の標的配列のセグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対位置によって決定され、したがって、この長さは調節可能なパラメータである。このプロセスの反復局面のために、発明者はこの方法を「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下ＰＣＲ）と呼ぶ。標的配列の所望のセグメントは、（濃度に関して）混合物中の優位の配列になるので、「ＰＣＲ増幅」されていると言う。
【００７１】
本明細書で用いられる「基板」は、流路および微量液滴輸送路を含むことのできる材料を指す。この例には、シリコンおよびガラスが含まれるが、それらに限らない。
【００７２】
本明細書で用いられる「可融材料」は、周囲温度で少なくとも半固体（好ましくは完全な固体）であり、周囲温度よりも高い温度に加熱された場合に液化し、冷却した場合に少なくとも部分的に再凝固する材料を指す。好ましくは、可融材料は、基板が損傷を受けないような温度で少なくとも部分的に液化する。すなわち、可融材料が液化する温度では、基板および基板内の他の金属は、液化せず（実施例６に記載されているように容易に試験できる）、その特性を変化させない。「特性を変化させる」とは、基板または金属がその構造的完全性を維持し、その導電率を変化させず、かつ液化しないことを意味する。したがって、融解可能であるという特性は、必ずしも特定の融点に関連する特性ではない。この実施例には、はんだ、ろう、ポリマー、およびプラスチックが含まれるが、それらに限らない。
【００７３】
本明細書で用いられる「はんだ」は、可融材料である金属または合金を指す。好ましくは、はんだは、参照として本明細書に組み入れられた米国特許第４，９６７，９５０号に記載されたような低温はんだである。「低温はんだ」とは、共晶合金を意味する。本発明は特定のはんだに限らないが、ペースト用の１つの好ましいはんだ組成は、すず：鉛の６３：３７共晶合金である。他の適合はんだは、すず：鉛：銀の６３：３５：２共晶合金を有する９０％金属組成である。共晶Ｐｂ：Ｓｎ、Ｐｂ：Ｉｎ、Ｐｂ：Ｉｎ：Ｓｎのような他の所望のはんだ組成。
【００７４】
本明細書で用いられる「発熱体」は、可融金属を少なくとも部分的に液化できる要素である。可融材料は、発熱体が可融材料を少なくとも部分的に融解できるように発熱体の近くにある場合に発熱体に「結合されて」いる。必要な近さは、可融材料の融解特性と発熱体の加熱容量に依存する。発熱体は、可融材料と同じ基板内に含まれても含まれなくてもよい。
【００７５】
本明細書で用いられる「隔壁」とは、ある位置（伸長位置）で流路内の流体の通過を少なくとも部分的に阻止し、他の位置で流路内の流体の流れを可能にすることのできるように操作できる要素を指す。「作動力」とは、隔壁を伸ばすことのできる力である。「弁座」とは、隔壁が伸ばされた場合に隔壁の一部を受け入れるように設計された要素である。「移動手段」とは、液化された可融材料を移動させることのできる手段である（たとえば、強制空気、磁界など）。
【００７６】
「液体微量液滴源」とは、微量液滴を作ることのできる液体源である。このような液体源には、液体の連続的な流れと静的供給源（液だめ内の液体など）が含まれるが、それらに限らない。好ましい態様では、液体微量液滴源は、個別のサイズの微量液滴を分裂させるための微細流路内の液体を含む。
【００７７】
本明細書で用いられる「計量」とは、液体の定められた体積を分離するプロセスを指す。計量は、流路寸法（たとえば、直径など）が既知である流路などの通路内で流路を（第１の末端を形成するように）停止させるかまたは閉じ込め、流路内の流体の測定可能な長さまたは事前に測定された長さを決定するように（たとえば、本明細書で説明するように気体を導入することによって）第２の末端を形成することによって行うことができる。
【００７８】
本明細書で用いられる「気体ポート」は、一態様では、微量液滴輸送路内の液体が分裂するような条件の下で、液体が充填された微量液滴輸送路を通して気体を導入することのできる、微量液滴輸送路に沿った開口を指す。
【００７９】
本明細書で用いられる「気体輸送路」は、微量液滴輸送路と流体連絡する、気体を輸送する導管を指す。
【００８０】
本明細書で用いられる「制限」は、液体の、疎水性領域に接触する液体縁部が、疎水性領域を限定する境界内に保持されるように、疎水性領域によって液体を保持することを指す。
【００８１】
本明細書で用いられる「交差する」は、２つまたはそれ以上の流体経路が収束することを指す。
【００８２】
本明細書で用いられる「接合部」は、２つまたはそれ以上の流体経路が交差する点を指す。
【００８３】
本明細書で用いられる「計量圧力」は、微量液滴輸送路内に置かれた液体を第１の体積および第２の体積に分裂させるのに必要な最低限の気体圧力（一例では気体ポートで測定される）を指す。
【００８４】
本明細書で用いられる「所定の液体体積」は、計量圧力の下での、液体が充填された輸送路のある部分を気体の体積で割ることによって、再現可能に計量することのできる液体の所望の体積を指す。
【００８５】
本明細書で用いられる「気体」の語は、空気、窒素、酸素、ヘリウム、ネオン、およびアルゴンを含む（ただし、それらに限らない）。
【００８６】
本明細書で用いられる以下の記号は、本明細書で引用される等式に組み入れられる項を定義する記号である。
ｄ＝流路の深さ
ｇ＝重力による加速度
ｈ＝入口における余分な液体の高さ
Ｌｄ＝別個の液滴の長さ
Ｐａｔｍ＝大気圧
Ｐｌ，ａ＝前進する液体の前面における液体の圧力
Ｐｌ，ｉ＝入口における液体の圧力
Ｐｍ＝しきい値計量圧力
Ｐｓ＝微細流路内の別個の液滴を分裂させるのに必要な空気圧
Ｒｂ＝入口における余分な液体の基底半径
Ｒｃ＝液体表面の平均曲率半径
Ｒｃ，ｒ＝別個の液滴の後退界面の平均曲率半径
2004521315.tif 000003
微細流路の平面内の別個の液滴の後退界面の主曲率半径
2004521315.tif 000004
微細流路の平面に直交する平面内の別個の液滴の後退界面の主曲率半径
Ｒｃ，ａ＝別個の液滴の前進前面の平均曲率半径
Ｒｈ＝入口の穴の半径
Ｒｖ＝入口における球形の液体セグメントの半径
Ｖ＝入口穴における余分な液体の体積
ｗｂ＝スプリッタ接合部における成長する気体の瞬間幅
ｗｃ＝主流路幅
ｗｓ＝スプリッタ流路幅
θｐ＝疎水性パッチにおける液体の接触角
θｔ＝装置の頂部における液体の接触角
2004521315.tif 000005
＝液体の表面張力
ψ＝液体の密度
【００８７】
発明の説明
本発明は、微細製造された装置における微細製造および生物学的反応に関し、特に、微細流路内の微量液滴中の生物試料の移動および混合に関する。本発明の説明は、Ｉ）シリコンおよびガラス基板を用いた（微量液滴輸送路、反応チャンバ、電気泳動口、および放射検出器を含む）マイクロスケール装置の設計、ＩＩ）個別のサイズを有する微量液滴の形成（または限定）、ＩＩＩ）別個の微量液滴が差動的に加熱され、エッチングされた流路を通って推し進められる表面張力勾配機構を用いた、別個の微量液滴の移動、ＩＶ）密閉された弁を有する流れ制御、Ｖ）反応させる生物試料の混合を含む。
【００８８】
１．マイクロスケール装置の設計
一体化された流体システムの構成に関して多数の形式、材料、およびサイズスケールがあるが、本発明は、費用有効な解決策としてのシリコン微細製造装置が考えられる。シリコンは、計算マイクロプロセッサの構成に用いられる材料であり、その製造技術は、過去３０年にわたって前例のないペースで発展している。この技術は最初、微細電子装置を作るのに適用されたが、同じ技術が現在微細機械システムにも用いられている。
【００８９】
シリコンによって作製された微細流体装置を用いた、連続的に流れる液体の流れの輸送について文献に記載されている。ファザー（Ｊ． Ｐｆａｔｈｅｒ）ら著「センサおよびアクチュエータ（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ）」Ａ２１〜Ａ２３（１９９０）、４３１ページ〜４３４ページを参照されたい。シリコンの微細加工に基づき流体を作成する外部の力を用いたポンプも記載されている。リンテル（Ｈ．Ｔ．Ｇ． Ｖａｎ Ｌｉｎｔｅｌ）ら著「センサおよびアクチュエータ（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ）」１５：１５３〜１６７（１９８８年）を参照されたい。これに対して、本発明は、内部の力を用いたシリコン内の個別の液滴の輸送（すなわち、連続的な流れとは異なる）を使用する。
【００９０】
機械的組立て材料として、シリコンを公知の製造特性を有する。シリコン装置の経済的な魅力は、それに関連する微細加工技術が基本的に写真再生技術であることである。このようなプロセスでは、不透明なデザインを含む透明な鋳型またはマスクを用いてシリコン基板の表面上に対象が光形成される。鋳型上のパターンは、コンピュータ支援デザインプログラムを用いて生成され、１μｍ未満の線幅を持つ構造を形成することができる。鋳型が生成された後、この鋳型をほぼ無期限に用いて同一の複製構造を作製することができる。したがって、すべての構成要素がシリコン微細加工プロセスに適合するならば、極めて複雑なマイクロマシンでも大量にかつ低い増分単価で再現することができる。ガラスや石英のような他の基板もフォトリソグラフィック法を用いて微細製造分析装置を構築することができるが、同じ構造内に様々な電子構成要素を製造できるようにする追加の利点を与えるのはシリコンだけである。
【００９１】
一態様では、本発明は、図１に概略的に識別された要素を含む、一体化された分析システム内のシリコン微細加工構成要素が考えられる。提案されたこの形式では、試料および試薬を入口ポート（Ａ）を通して装置内に注入し、別個の液滴として、流路（Ｂ）を通して、熱制御式反応器などの反応チャンバに輸送し、そこで混合および反応（例えば制限酵素消化や核酸増幅）が行われる（Ｃ）。次いで、生化学産物を同じ方法で電気泳動モジュール（Ｄ）に移動させ、そこで検出器（Ｅ）によって泳動データを収集し、データを記録計器（図示せず）に送信する。重要なこととして、流体構成要素および電子構成要素は、機能および構成が生物学的反応および試薬に完全に適合するように構成される。
【００９２】
シリコン微細加工において、密計された流路を形成する簡単な技術では、基板の表面上に開放された流路をエッチングし、次いで開放された流路上に第２のエッチングされていない基板を結合する。適切に決定された側壁および一様なエッチング深さを持つ流路を形成することのできる、液体または気体の、様々な等方性エッチング試薬および異方性エッチング試薬がある。流路の経路はフォトプロセスマスクによって決定されるので、装置上の流路パターンの複雑さは事実上無限である。制御されたエッチングによって、基板を完全に貫通する試料入口穴を作製し、それによって装置の外側の表面上の入口ポートを流路構造に連結することができる。
【００９３】
図２は、２分割構築手法を示している。シリコン基板（２００）に微細流路（１００）を作り、この構造をガラス基板（３００）に結合する。２分割流路構成技術は、アライメントプロセスおよび結合プロセスを必要とするが、様々な基板形状および流路形状に適合させることができる。言いかえれば、製造のために、２分割手法は、一方の部材（すなわち、流路および反応形式を有するシリコン）をカスタム化し、たとえば、標準電気パッド（４００）を含む標準化された（カスタム化されていない）第２の部材と結合するのを可能にする。
【００９４】
ＩＩ．微量液滴の形成
本発明は、個別の（すなわち、制御された所定の）サイズの微量液滴を形成する方法、組成、および装置が考えられる。本発明は、弁を用いる必要のない液体試料注入および運動システムを、選択的な疎水性コーティングを用いて開発することが考えられる。一態様では、本発明は、ｉ）金属層によってパターン化された酸化ケイ素表面上に疎水性試薬（ＯＴＳの自己組立て単層膜など）を付着させ、ｉｉ）その後、疎水性パターンが得られるように金属を除去することを含む、ガラス基板、石英基板、およびシリコン基板上に疎水性領域および親水性領域をパターン化するリフトオフ方法が考えられる。酸化ケイ素またはスピン・オン・グラスの薄膜を付着させた後でプラスチックのような他の基板を使用することもできる。
【００９５】
従来、疎水性表面パターン化は、このような単層膜を光開裂することによって行われている。光開裂手順では、ディープＵＶ（Ｄｅｅｐ−ＵＶ）露光を用いて単層の分子が疎水性にされる。これに対して、本発明では、高出力ＵＶ源を不要にする方法が考えられ、その代わりに、本発明の好ましい方法では、簡単な微細製造手順が使用される。
【００９６】
本発明は、表面（たとえば、微量液滴輸送路の表面）を適切に疎水性パターン化した後、平坦な表面上のパターンの上に、パターン化されたエッチング済みガラスキャップを載せることが考えられる。次いで、このように形成された疎水性／親水性流路を用いて厳密なナノリットル体積の液体試料を移動させることができる。
【００９７】
図３は、外部の空気を用いてナノリットル体積の液体試料を分裂させ移動させる、複数の疎水性領域を有する装置（１０）の一態様の概略図である。図３Ａを参照すると、入口（２０）に置かれた液体（黒い塊として示されている）が表面力によって引き込まれ、流路内の液体隣接疎水性領域（４０）で停止しており、溢流は、溢流流路および溢流出口（３０）によって対処されている。図３Ａに示されている態様では、液体の前面は、流路と流体連絡している吸気通路（５０）を通り過ぎ（ただし、吸気通路（５０）には入らない）、液体隣接疎水性領域（４０）によって、液体は一定の位置まで移動する。次いで、気体源からの気体（たとえば、外部の空気源および／またはポンプからの空気）を噴射して（図３Ｂ、下の矢印）長さ「Ｌ」の微量液滴を分裂させることができる。分裂した微量液滴の体積（６０）は所定の体積であり、長さ「Ｌ」および流路の断面積に依存する。気体（たとえば、空気）の圧力が入口側に作用するのを妨げるために、入口（２０）および溢流ポート（３０）を封鎖するか、または余分の水を充填して流れに対する抵抗を大きくすることができる。
【００９８】
パターン化された表面を用いて液滴の動きを制御することもできる。疎水性排気口（７０）を流路のさらに下流に配置することによって、液体微量液滴（６０）が排気口（７０）を越えた後で停止することができる。液滴（６０）が排気口（７０）を通過すると、空気が排気口（７０）を抜け、液滴をそれ以上押すことはなくなる。
【００９９】
排気口（７０）を封鎖することによって液滴（６０）の移動を再び開始することができる。疎水性空気圧配管（図示せず）と疎水性排気口と排気口の適切な開閉の組合せを用いることによって、液滴を前後に移動させて混合するか、または流路網内の厳密な位置に移動させて加熱、反応、および／または分離などの動作を行うことができる。
【０１００】
外部の空気を使用するだけでなく、内部で発生した空気圧を用いて液滴を分裂させ移動させることもできる。図４は、内部の気体（空気）圧を発生させることによって微量液滴を分割（たとえば、形成）し、移動させ、停止する、複数の疎水性領域を有する装置（１１０）の一態様の概略図を示す。図４Ａを参照すると、入口（１２０）に置かれた液体（黒い塊として示されている）が表面力によって引き込まれ、液体隣接疎水性領域（１４０）で停止しており、溢流は、溢流流路および溢流出口（１３０）によって対処されている。図４Ａに示されている態様では、液体の前面は、流路と流体連絡している吸気通路（１５０）を通り過ぎる（ただし、吸気通路（５０）には入らない）。吸気通路（１５０）を介して微量液滴輸送路と流路連絡しているチャンバ（１８０）の内側に閉じ込められた空気を加熱することによって、高い圧力を発生させることができる。体積Ｖのチャンバの内側での圧力上昇の大きさは、温度の上昇に比例し、理想気体関係式によって推定することができる。
【０１０１】
気体（たとえば、空気）の温度を上げると、チャンバの内側の圧力は、液滴（１６０）を分裂させ、液滴を液体隣接疎水性領域（１４０）を越えた位置まで移動させるまで上昇する。膨張した空気が液体を加熱する問題を避けるために、チャンバを輸送路から離して配置することができる。さらに、ヒータを空気チャンバの内側に吊り下げるか、薄い絶縁膜上に配置すると、クロストークが回避されるだけでなく、電力消費量が最小限に抑えられる。
【０１０２】
これらの組成および方法は、流路寸法が４０μｍ ｘ ５００μｍの場合に流路体積が０．２４ ｍｍ１から０．３ｍｍ３である装置を含むがそれらに限らない様々な設計および寸法を有する装置に適している。液滴の分裂および移動は、４．５Ｖから７．５Ｖの間の電圧を用いた場合、１〜３秒間観測される（ヒータの抵抗は９．５Ωから１１Ωの間で変化させる）。分裂する液滴のサイズは、流路設計に用いられる値「Ｌ」に応じて約２５ナノリットルから約５０ナノリットルの間である。ヒータを作動させ続けると微量液滴はほぼ流路の端部まで移動し続け（距離約１２．５ｍｍ）、必要な時間は、ヒータにかけられる電圧とチャンバの体積に依存する。液滴の動きの開始は、使用する装置のチャンバが小さいほど早くなることがわかる。厳密な機構を理解しなくても本発明をうまく実施できるが、チャンバが小さいほど、体積が少なくなり、圧力のより高い値がより迅速に実現される。ヒータの近くでの最高温度は、ＲＴＤで測定すると約７０℃である。
【０１０３】
ＩＩＩ．別個の微量液滴の移動
本発明は、シリコン内の別個の液滴中の液体試料の制御された移動について説明する。個別の液滴の輸送には、密閉された流路またはチューブを用いて液体を所望の位置（図１、Ｂ）に輸送するシステムが含まれる。流路内に、別個の液体試薬微量液滴を注入し、測定し、生化学分析構成要素同士の間を移動させることができる。別個の液滴の移動は３つの利点を有する。まず、汚染の危険性が低くなるように各試料液滴が他のすべての試料液滴から分離される。第２に、一様な流路では、液滴の長さを単に測定するだけで、各試料の体積を求めることができる。第３に、このような液滴の移動は、簡単な加熱（すなわち、内部の力を用い、可動部品は用いない）によって行うことができる。移動は、熱勾配を用いて液滴の前後で界面張力を変化させ、したがって、液滴の両端間に圧力差を生じさせることによって行われる（図５）。たとえば、後方の界面を加熱することによって、疎水性流路内の液滴を前方に推し進めることができる。温度を局所的に高くすると、液滴の後方の表面上の表面張力が弱くなり、したがって、界面圧力差が小さくなる。圧力差が小さくなることは、液滴のこの側の局所的な内部圧力が高くなることに相当する（Ｐ１上昇）。２つの液滴界面はもはや平衡せず、Ｐ１がＰ２よりも高くなり、圧力差によって液滴が前方に推し進められる。
【０１０４】
すなわち、流路に沿って連続するヒータを用いて液滴の後方の表面を加熱し続けることによって前進を維持することができ、一方、前方の表面を加熱することによって液滴の動きを反転させることができる。流路の下方のワイヤに電圧をかけると、液滴の縁部の下方で熱が発生する。左の界面を加熱すると、液滴のこの側の内部圧力が高くなり、液滴全体が右側に押される。液滴の内部に対する圧力は、大気圧Ｐａｔｍ、表面張力σ、流路の寸法を知ることによって算出することができる。円形断面の場合、内部圧力ＰｉはＰｉ＝Ｐａｔｍ−（４σｃｏｓθ）／ｄによって与えられ、この場合、ｄは流路の直径であり、θは接触角である。σは温度の関数であるので（σ＝σ０（１−ｂＴ）、この場合、σ０およびｂは正の定数であり、Ｔは温度である）、液滴の左側の温度を高くすると、表面張力が弱くなり、したがって、その側の内部圧力が高くなる。次いで、この２つの側の間の圧力差によって、液滴はより低い圧力の方向（すなわち、右側）に押される。図示の液滴は親水性流路（０＜θ＜９０）内にあり、疎水性流路（９０＜θ＜１８０）の場合、右縁部を加熱すると、液滴は右側に移動する。
【０１０５】
接触角ヒステリシス（液滴の前進縁部上の接触角は後退縁部上の接触角よりも大きい）では、移動が起こる前に最小限の温度差が必要である。動き出した後の液滴の速度は、数式
2004521315.tif 000006
を用いて近似することができ、この数式で、
2004521315.tif 000007
は圧力差であり、μは溶液の粘度であり、Ｌは液滴の長さである。本発明は、移動を生じさせるのに３０℃よりも高い温度差が考えられる。流路全体に沿って配置された温度センサを用いた実験により、移動を生じさせるのに液滴の両端間で約４０℃の差があれば十分であることが示される。この実験では、流路の断面積は２０μｍ ｘ ５００μｍであったが、これらの液滴のそれぞれの体積は、液滴の長さから算出することができ、長さが１ｃｍの液滴の場合、約１００ナノリットルである。
【０１０６】
ＩＶ．密封された弁による流れ制御
本発明では、密封された弁を用いて流体の流れを制御することが考えられる。本発明は特定の密封方法に限らないが、一態様では、作動力によって隔壁が弁座に押し付けられて流体の流れを制限し、次いで隔壁が弁座を密封する。このような態様では、はんだパッドが、はんだを融解することのできる発熱体に結合される。この液化されたはんだが弁座および隔壁の領域上を流れ、隔壁と弁座との間の汚染、亀裂、および湾曲を覆う。作動力によって隔壁および弁座が依然として保持されているので、発熱体がオフにされ、はんだが冷却し再凝固する。凝固時には、作動力を解放することができ、弁が密封される。弁を再び開くには、作動力をかけずにはんだを液化することができる。
【０１０７】
好ましい態様では、弁は、はんだパッドが隔壁または弁座上に配置されるように設計される。本発明は、このようなはんだパッドを配置する厳密な方法に限らないが、特に、はんだパッドを電気メッキすることが考えられる。
【０１０８】
Ｖ．反応時の生物試料の混合
（上記で概略的に説明した）液滴の動きは、通路内の１段階とみなされる。他の段階には通常、試料の混合および制御された反応が含まれる。たとえば、液体を動かすのに用いられる流路の表面全体に沿って配置された一体的なヒータによって、流路のある領域を熱反応チャンバとして用いることができる。反応の前に試料を混合する場合、Ｙ流路装置が考えられる（図６Ａ）。このような装置では、第１の試料（たとえば、核酸）を含む第１の液滴がＹ流路装置の一方の流路に沿って移動させられ、第２の試料（消化用緩衝液中の制限消化酵素））を含む第２の液滴がＹ流路装置の他方の流路に沿って移動させられる（図６Ｂおよび６Ｃ）。
【０１０９】
試料を合体した後（図６Ｄ）、組み合わされた試料が適切に混合されていない恐れがある。すなわち、２つの同様に微量液滴が、同じ流量の層流として単一の流路に流入した場合、これらの微量液滴は、軸方向に一様な液滴を形成するが、幅方向では混合されない。幅方向の混合はいくつかの方法で行うことができる。
【０１１０】
まず、簡単な拡散がある。ただし、大きなＤＮＡ分子の場合、この混合の固有時間は数時間またはそれ以上になることがある。移動および加熱中に液滴の内側で発生する循環パターンによって、この時間は著しく短縮される。なお、本発明では、一体的なヒータおよび温度センサを用いて、混合物を加熱された混合物として維持する（たとえば、温度を１０分間にわたって６５℃に維持する）ことが考えられる。
【０１１１】
第２に、本発明では、混合物の流れ方向を流路内の比較的短い距離にわたって反転させることによる混合が考えられる。様々な反転流手法が可能であるが、約２つの液滴の長さを含む距離にわたる１回または２回の方向転換が適切であることが判明している。
【０１１２】
最後に、混合物を物理的な障害物に接触させるか、または障害物の上を移動させる混合手法がある。たとえば、混合物をＹ流路の合流点に「衝突させる」か、または流路内に故意に設けた欠陥の上を移動させる（すなわち、「ローラーコースター」混合）ことができる。
【０１１３】
もちろん、混合が成功したかどうかは、反応による生成物の特徴によって確認することができる。生成物が検出された場合、混合は少なくとも部分的に成功している。本発明では、一態様において、電気泳動を用いて生成物の形成を確認することが考えられる。
【０１１４】
ＶＩ．ナノリットル液体計量
微細流路網の内側で別個の液滴を操作し制御する前に行われる第１の段階は、ナノリットルサイズの別個の液滴の注入および計量である。したがって、これは様々な小型の化学分析システムをうまく実現するうえで重要である。ナノリットルサイズの液滴を計量する能力によって、試料および試薬の使用度が最小限に抑えられるだけでなく、完全な分析システムの全体的なサイズも小さくなる。その後の試料の準備（たとえば、混合、反応）段階を定量化すると共に、異なる装置で行われた実験を比較するために、オンチップ計量の厳密さも必要である。
【０１１５】
図１１は、ピペット（ｉ）を用いて入口穴に置かれた液滴（〜μｌ）を示している。液体は、毛細管力によって微細流路の内側に引き込まれ、疎水性パッチ（ｉｉ）のところで停止する。微細流路（１００μｍ ｘ ２０μｍ）装置の写真（ｃ）は、疎水性パッチ（幅２００μｍ）のところで停止した液体を示している。微細流路の内側で液体を停止させる（図１１）疎水性パッチの能力は、前進する液体の前面が疎水性パッチに到達した（図１１ａ（ｉｉ））後で微細流路の内側の液体に作用する正味圧力を調べることによって確認することができる。追加の液体を入口穴から疎水性パッチ上に流すには正の圧力差が必要である。疎水性のパッチが液だめからの液体の流れを停止させるには、重力の効果を無視した圧力差がゼロ以下でなければならない。
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【０１１６】
上式で、Ｐｌ，ｉは液だめ内の圧力であり、Ｐｌ，ａは、前進する液体の前面が疎水性パッチに到達した場合の液体側の圧力である。流体位置をうまく制御する装置を設計するためには、これらの圧力を算出しなければならない。入口穴内の液体の高さがミリメートル程度であり、液体の高さによる圧力差を無視できる（ψｇｈ〜１０００ｋｇ／ｍ３ ｘ ９．７ｍ／ｓ２ ｘ １ｍｍ〜１０Ｎ／ｍ２のみ）ことに留意されたい。
【０１１７】
内部の液体圧力は、表面張力のために大気圧に等しくならないが、圧力は、液体と空気の界面の曲率半径（Ｒｃ）および液体の表面張力（ｏ）を知ることによって算出することができる。
【０１１８】
図１３ａに示されているように、入口に置かれた液滴は、基底半径Ｒｂおよび高さｈを持つ球（半径Ｒｖ）の断面を有する。液体と空気の界面は接触角θ１を受ける。図１３ｂに示されているように、Ｒｂ＝Ｒｈになった後、界面は穴の周囲に停止し、基底半径は変化しない。図１３ｂに示されているように、入口における液体と空気の界面の両端間の圧力差は、異なる液滴体積について水に関するラプラスの方程式（σ＝７２ｍＮ／ｍ）を用いて推定される。入口穴における余分な液滴の内側の圧力（Ｐｌ，ｉ）は大気圧よりも高い。この圧力差は、ラプラスの方程式を用いて算出することができ、以下の関係によって与えられる。アダムソン（Ａｄａｍｓｏｎ， Ａ． Ｗ．）著「表面の物理化学（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ）」第５版、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９９０年、３９５ページ〜３９９ページ。
2004521315.tif 000009
【０１１９】
液滴の形状を知ることによって液体の所与の体積（Ｖ）の平均曲率を算出することができる。表面張力は、表面積を最小限に抑え、球状セグメントを形成するように働き、一方、重力は液滴を平坦化する傾向がある。１μｌ程度の液滴体積の場合、表面張力は、重力より１桁大きな値よりもさらに大きい。したがって、液滴は球状セグメント（半径Ｒｖ）の形をとる。液面の２つの主曲率半径は共に、球状セグメントの半径Ｒｖに等しく、したがって、平均曲率半径は次式によって与えられる。
2004521315.tif 000010
【０１２０】
液滴の半径（Ｒｖ）は、液滴の体積（Ｖ）および装置の上部の液体が受ける接触角θ１（図１３ａ）から算出することができる。Ｒｖは次式のように与えられる。
2004521315.tif 000011
【０１２１】
数式（４）は、接触角θ１のあらゆる値に対して成立する。ただし、液体が入口穴を越えて延びている場合に限られる（すなわち、Ｒｂ＞Ｒｈ）。Ｒｖは穴の半径（Ｒｈ）から算出することができ、液体の高さｈは次式のように与えられる。
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【０１２２】
液体の高さは、液体の体積および穴の半径を含む以下の数式から算出することができる。
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【０１２３】
数式（２）から（６）を用いて、入口穴における液体と空気の界面の両端間の圧力差を算出し、様々な頂部接触角および一定の穴半径に対する液滴体積（Ｖ）の関数としてプロットすることができる（図１３ｃ）。液体の体積が減ることによる界面圧力の上昇は、体積の関数としてのＲｃが小さくなることによる。しかし、Ｒｂ＝Ｒｈになった後、Ｖがさらに減ると、Ｒｃが大きくなり、したがって圧力が低下する。Ｒｂ＞Ｒｈの場合の界面圧力の上昇は、液滴体積が０．０５μｌ未満である場合に非常に健著である（図１３ｃの挿入図を参照されたい）。接触角が００から１８００まで大きくなるにつれて、曲率半径が小さくなり、したがって液体の圧力が高くなることに留意されたい。
【０１２４】
毛細管内に前進する液体の前面の界面圧力（Ｐｌ，ａ）も求めることができる。図１４ａは、矩形の毛細管の内側の液体と空気の界面が、すべての壁において一定の接触角θｐを維持する湾曲した円柱であることを示している。図１４ｂは、液体と空気の界面の両端間の圧力差が、深さの異なるそれぞれの異なるスリット型微細流路について水に関するラプラスの方程式（σ＝７２ｍＮ／ｍ）を用いて算出されることを示している。毛細管内に前進する液体の前面の界面圧力（Ｐ１，ａ）を求めることもできる。湾曲した表面は、流路の壁で一定の接触角θｐが維持される（図１４ａ）ような表面である。矩形毛細管の場合、平均曲率半径に関して以下の関係式を有する。キム（Ｋｉｍ， Ｅ．）； ホワイトサイズ（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ． Ｍ．） Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ、１９９７、１０１、８５５：
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【０１２５】
上式で、ｗｃは幅であり、ｄは微細流路の深さである。数式（７）および数式（２）と同様の関係を用いることによって、様々な流路断面および接触角について界面圧力差を算出することができる。液体の圧力は以下の関係によって与えられる。
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【０１２６】
この研究で用いた微細流路は深さが２０μｍ〜６０μｍであり、幅が１００μｍ〜５００μｍである。これらの寸法では、界面圧力は、図１４ｂに示されているように流路の深さに強く依存し、流路の深さが浅くなるにつれて高くなる。さらに、圧力は接触角が大きくなるにつれて高くなる。
【０１２７】
前述のように、疎水性パッチで液体試料を停止させるためにＰｌ，ｉ−Ｐｌ，ａ≦０である。
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【０１２８】
上式が、数式（１）〜（４）および（８）を用いて得られ、この液体体積の基底半径が入口穴の半径よりも大きい（Ｒｂ＞Ｒｈ）および（ｄ＜＜ｗｃ）場合に成立することに留意されたい。数式（９）から、流路の深さは、入口に置かれる液体体積、およびパッチと装置の上面との疎水性接触角に対して調節しなければならないことが分かる。
【０１２９】
図１５は、入口圧力が疎水性パッチにおける圧力によって釣り合わせられるプロットを示している。 液体をパッチで停止させるには（接触角θｐ）、液体体積を所与の流路深さに対するプロット上の液体体積よりも多くすべきである。図１５も、様々な流路深さおよび９００の頂部接触角（θｔ）に対するＰｌ，ｉ−Ｐｌ，ａ＝０の線をプロットしている。所与のパッチ接触角（θｐ）の場合、様々な流路幅に対する（Ｐｌ，ｉ−Ｐｌ，ｎ＝０）線上に位置するしきい値液滴体積が存在する。液体を停止させるには、液体体積を疎水性パッチのしきい値量よりも多くすべきである。通常実験室で用いられる機械的ピペッタは、マイクロリットルほど小さい液滴を１／２マイクロリットルの精度で取り込むことができる。このような液滴体積（数μｌ）の場合、実験で観測され（図１１）、かつ理論によって予測される（図１５）ように、深さが６０μｍよりも小さな微細流路内で液体を停止させるには１０００の接触角で十分である。
【０１３０】
上記の議論では、微細流路装置上に余分な液体を置くことによって微細流路に液体を導入することについて説明した。液体を導入する他の方法が図１６に示されており、この場合、液体は、微細流路を疎水性パッチまで満たし、次いで入口穴内で上昇し（１６ａ〜１６ｃ）、最終的に入口穴から溢流る（１６ｄ）。他の方法では、圧電ディスペンサまたは他のエロソール型ディスペンサを用いて微細な液滴が微細流路に連続的に注入される（図１６ａ）。液滴の分配は、（ａ）入口穴がもう少しで一杯になる場合（図１６ｂ）に停止しても、（ｂ）入口穴が一杯になった場合（図１６ｃ）に停止しても、入口穴から余分な液体がこぼれ出た後で（図１６ｄ）停止してもよい。
【０１３１】
微細流路を充填する最初の２つの方法（図１６ｂおよび１６ｃ）では常に、液体が、毛細管作用のためにより小さな流路に優先的に流入し、疎水性パッチで停止する（θｐ＞９００）ことが確実になされる。しかし、液体が入口穴から溢流ると（図１６ｄ）、入口の液体圧力は、大気圧よりも高くなることができ、疎水性パッチの液体圧力に対抗する。入口の液体圧力は、入口穴の半径に依存し（数式（２）、（３）、および（５）参照）、したがって、入口穴は、液体がすべての３つの微細流路充填方法（図１６ｂ〜１６ｄ）の場合に疎水性パッチのところで停止するように設計することができる。
【０１３２】
前述のように、液体を疎水性パッチのところで停止させる疎水性パッチの能力は、液体に作用する正味圧力を調べることによって求めることができる（数式（１））。入口の液体圧力は、数式（２）、（３）、（５）、および（６）を用いて評価することができ、この最大値は（ｈ＝Ｒｈ）の場合に得られる。
2004521315.tif 000017
【０１３３】
疎水性パッチの液体圧力は、数式（８）を用いて、前述のように評価することができる。
【０１３４】
液体をパッチのところで停止させる条件Ｐｌ，ｉ−Ｐｌ，ａ≦０を満たすために、以下の関係を使用する。
2004521315.tif 000018
【０１３５】
（１１）で与えた不等式を導きつつ、流路深さが流路幅と比べて小さい（すなわち、＿ｄ＜＜ｗｃ）と仮定していることに留意されたい。したがって、入口穴は、パッチの疎水性接触角に対して流路内で液体を停止させるようなサイズにすることができる。液体をパッチのところで停止させるには、入口穴をしきい値穴半径よりも大きくする必要がある（＝ｄ／ｃｏｓθｐ）。疎水性接触角が大きくなるにつれて、しきい値穴半径が小さくなることに留意されたい。流路深さを大きくした場合も、しきい値半径が大きくなる。
【０１３６】
Ａ．空気圧を用いた液体の分裂
微細流路内の液の分裂は、空気圧により分裂接合部で気泡の成長を誘導することによって起こる。図１７ａに示されているように、分裂する液滴の液体界面圧力は、液体を分裂させる気泡および前進する液体の前面の瞬間形状を知ることによって推定することができる。図１７ｂは、分裂圧力を界面圧力から求め、噴射される空気の体積の関数としてプロットすることができることを示している。ｘ軸は、噴射される空気の体積を液体分裂点の気体の体積で割ることによって無次元になっている。表面張力（σ＝７２ｍＮ／ｍ）および接触角値（θｒ＝３００およびθｐ＝１０００）は水の表面張力および接触角値に対応する。計量に関する圧力要件Ｐｓは、成長する気泡の空気と液体の界面および液体の前進前面の形状を調べることによって推定することができる。
2004521315.tif 000019
上式で、Ｒｃ，ｒおよびＲｃ，ａはそれぞれ、後退液体界面および前進液体界面の曲率半径である。
【０１３７】
後退液体界面の平均曲率半径Ｒｃ，ｒは、気泡が成長するにつれて変動し、次式のように主曲率半径から推定することができる。
2004521315.tif 000020
【０１３８】
上式で、Ｒｃ，ｒ‖およびＲｃ，ｒ∠は、微細流路装置の平面およびその直交平面のそれぞれの主曲率半径である。スプリッタ流路内に空気が噴射されるにつれて、疎水性分裂流路の液体界面は平坦な表面（Ｒｃ，ｒ‖＝Ｒｃ，ｒ∠＝∞）から円柱状に変化する。
2004521315.tif 000021
【０１３９】
空気をさらに導入すると、界面が流路の平面内でも湾曲する。
2004521315.tif 000022
【０１４０】
半径Ｒｃ，ｒ‖は、気泡（幅ｗｂ）が成長するにつれて変動する。別個の液滴が分裂した後（ｗｂ＝ｗｃ）、後退界面形状は、すべての壁において接触角θｒが維持された湾曲した円柱の形状になる。
2004521315.tif 000023
【０１４１】
流路の平面で気泡の湾曲を生じさせる前にしきい値圧力が必要であるという実験観察結果に基づいて上記の気泡成長メカニズムが仮定されていることに留意されたい。
【０１４２】
図１２は、微細流路内の液体を停止させる疎水性パッチだけでなく、液滴を分裂させるように加圧される疎水性スプリッタ流路を示している。一連のクローズアップ写真（１２（ｂ）〜１２（ｅ））は、スプリッタ接合部に空気圧をかけているために、液体が疎水性パッチで停止しており、個別の液滴が計量されていることを示している。計量される液滴の体積は、Ｌ、すなわち疎水性パッチとスプリッタ接合部との間の距離と、Ａ、すなわち流路の断面積との積によって求められる。したがって、気泡の表面が微細流路の平面内で湾曲する前に、流路に垂直な平面内で湾曲しなければならない（図１２ｃ）。
【０１４３】
前進する液体の前面の平均半径曲率Ｒｃ，ａは、分裂プロセスの間一定であり、数式（２）および（７）によって与えられる。前進する液体が流路の疎水性部分にあり（θｐ＞９００）、したがってＲｃ，ａが負であることに留意されたい。
【０１４４】
したがって、液滴を分裂させるのに必要な圧力は、流路の寸法（ｗｃ、ｗｓ、およびｄ）、親水性接触角および疎水性接触角、ならびに液体の表面張力から推定することができる。この圧力を、２つの異なる流路深さについて、図１７ｂに示されているように、噴射される空気の体積の関数として算出した。図を見ると分かるように、各圧力プロファイルは、計量圧力（Ｐｍ）と呼ばれる最大圧力を有する。Ｐｍは以下の関係によって与えられる。
2004521315.tif 000024
【０１４５】
気泡の幅がスプリッタ幅の２分の１に等しい（Ｗｂ＝Ｗｓ／２）場合にＰｓ＝Ｐｍであることに留意されたい。液滴をうまく計量するには、計量圧力よりも高い圧力をかけなければならない。計量圧力は、深さが１００μｍの流路の場合の２．５ｋＮ／ｍ２から深さが１μｍの流路の場合の１５０ｋＮ／ｍ２（＞１気圧）までの範囲の流路深さの逆数に強く依存する。
【０１４６】
図１８ａに示されているように、各微細流路装置の計量圧力のエラーバーは、同じ微細流路装置で行われた様々な実験を表わしている。（組立て後の）流路深さの厳密な値および初期接触角が未知であるので、理論推定値は２本の実線としてプロットされている。流路深さには±１μｍの誤差が用いられ、接触角には±５０の誤差が用いられている。図１８ｂに示されているように、計量圧力は、液滴の長さが１ｍｍから４ｍｍまで変動する微細流路装置に見られるように液滴の長さに依存しない。
【０１４７】
計量圧力（Ｐｍ）を測定するために行われた実験は、理論によって予想される流路深さに対して強い依存性を示している（図１８ａ）。実験による計量圧力は、深さが４０μｍの流路の場合の３．５ｋＮ／ｍ２から深さが２０μｍの流路の場合の９ｋＮ／ｍ２まで変動した。流路幅を大きくすると、液体界面の曲率半径が大きくなり、したがって、計量圧力が低下する。液滴の長さ（１ｍｍ〜５ｍｍ）は圧力低下に影響を与えない（図１８ｂ）。
【０１４８】
測定された計量圧力は、前述の理論的な予測値と比較することができる。微細流路（既知のｗｃおよびｗｓ）内の計量圧力を予測するには、液体接触角（θｒおよびθｐ）の厳密な値が必要である。液体接触角値は、計量の場合と同様に、初期運動時に静止接触角から５°〜１０°変動することがある。本来実際の接触角値を測定するのは困難であるため、誤差５°ですでに測定されている静止接触角値（θｒ＝３００およびθｐ＝１０００）を用いて、様々な微細流路内の計量圧力の理論的範囲を算出した（図１８）。測定された計量圧力は、理論的限界の範囲内に存在する。
【０１４９】
流路の高さを変えるだけでなく、分裂流路の寸法（ｗｓ）を変えることによって計量圧力を調整することもできる。上記の議論では、主流路寸法に対応するスプリッタ幅を維持した。スプリッタ流路の幅を小さくすると、気泡の初期サイズが小さくなり、それによって、気泡を形成するのに必要な圧力が低下する。一方、スプリッタ幅を主流路の幅よりも広くすると、分裂圧力プロファイルが平坦になる。
【０１５０】
計量される液滴の体積は、Ｌｄ、すなわち、スプリッタ接合部の中心から疎水性パッチの縁部までの距離と、流路の断面積との積によって求められる。液滴体積が計量装置の形状に依存するため、所定のサイズの液滴を正確に計量することができる。このことは、実験により、０．１ナノリットルから１２０ナノリットルの範囲の体積を正確に分裂させるように様々な流路内の液滴を計量することによって検証されている（図１９）。流路の断面積は０．００１ｍｍ２から０．０２５ｍｍ２まで変化させ、液滴の長さは０．５ｍｍから５ｍｍまで変化させた。
【０１５１】
計量される液滴の体積の絶対誤差を推定することができ、この値は、スプリッタ流路に停止させられ向かい合う壁に接触する気泡のサイズ程度である。したがって、計量の相対誤差は、分裂接合部のサイズおよび液滴の長さに依存する。計量の誤差は、スプリッタ接合部が小さくなり、かつ液滴の長さが長くなるにつれて小さくなる。したがって、所与の液滴長さについてスプリッタ接合部の幅を狭くすることによって、極めて正確な液滴体積を計量することができる。
【０１５２】
好ましい態様の説明
好ましい態様の説明は、Ｉ）シリコンベースの装置を製造する微細製造技術、ＩＩ）最適な流量および再現性を得るための流路の処理、ＩＩＩ）疎水性領域を製造するための流路の処理、ならびにＩＶ）構成要素の設計（特に電気泳動モジュールおよび放射検出器）を含む。
【０１５３】
Ｉ．シリコンベースの装置の微細製造
前述のように、シリコンは、公知の製造特性および関連する写真再現技術を有する。半導体集積回路を製造するための主要な現代の方法はいわゆるプラナープロセスである。プラナープロセスは、シリコンの固有の特性に依存するプロセスであり、シリコン基板に「層化」集積回路装置を製造する、蒸着、酸化、フォトリソグラフィ、拡散、および／またはイオン注入、およびメタライゼーションを伴う複雑な製造段階シーケンスを含む。たとえば、参照として本明細書に組み入れられたミラー（Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ）の米国特許第５，０９１，３２８号を参照されたい。
【０１５４】
たとえば、結晶シリコン基板を酸化させると、基板表面上に二酸化ケイ素層が形成される。次いで、フォトリソグラフィを用いて二酸化ケイ素層を選択的にパターン化しエッチングして、下にある基板の一部を露出させることができる。二酸化ケイ素層のこれらの開口部によって、下にあるシリコンの定められた領域にイオン（「ドーパント」）を導入（「ドーピング」）することができる。二酸化ケイ素はマスクとして働き、すなわち、ドーピングは開口部がある場所でのみ行われる。ドーピングプロセスおよびドーパントの種類を慎重に制御すると、異なる電気抵抗を持つ局所領域をシリコン中に形成することができる。アクセプタイオンが添加された（正の自由孔「ｐ」）領域とドナーイオンが添加された（負の自由電子「ｎ」）領域の特定の配置によって、主として、トランジスタ、抵抗器、キャパシタ、および他の回路素子の相互関連構成がシリコンウェーハ上に決定される。集積回路を構成する様々なｐ領域またはｎ領域との電気的相互接続および接触は、導電材料、通常はアルミニウムまたはポリシリコンの薄膜を付着させ、それによって集積回路の設計を完成することによって得られる。
【０１５５】
もちろん、使用される特定の製造プロセスおよび順序は、装置の所望の特性に依存する。現在、所望のデジタル論理機能またはアナログ論理機能を実現する場合、様々な装置および回路から選択することができる。
【０１５６】
好ましい態様では、標準水性エッチング手順を用いて厚さが５００μｍのガラスウェーハ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ７７４０）上に流路を作製した。初期ガラス表面を洗浄し、電子線で金属を蒸着させることによって２層を形成した（２０ｎｍのクロム層を形成し、次いで５０ｎｍの金層を形成した）。フォトレジストマイクロポジット１８１３（Ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ １８１３） （Ｓｈｉｐｌｅｙ Ｃｏ．）を４０００ｒｐｍで３０秒間適用し、ガラスマスク１を用いてパターン化し、現像した。ガラス表面上にパターンが明確に見えるまで、クロムエッチング液（Ｃｒ−１４、Ｃｙａｎｔｅｋ Ｉｎｃ．）および金エッチング液（Ｇｏｌｄ Ｅｔｃｈａｎｔ ＴＦＡ、Ｔｒａｎｓｅｎｅ Ｃｏ．）で金属層をエッチングした。次いで、露出しているガラスをフッ化水素酸と水の溶液（１：１、ｖ／ｖ）でエッチングした。通常、最終的なエッチングによって流路深さが２０μｍから３０μｍになるように、試験ウェーハを用いてエッチング速度を推定した。各ウェーハごとに、表面側面計を用いて、完成後の流路の深さを求めた。最終的な剥離（ＰＲＳ−２０００、Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ）によって、残ったフォトレジスト材料と上方の金属との両方を除去した。
【０１５７】
一態様では、上述のようにガラス上にエッチングされた流路を、光学接着剤（ＳＫ−９ Ｌｅｎｓ Ｂｏｎｄ、Ｓｕｍｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州フォートワシントン）を用いて２分割構成手法でヒータ部分ウェーハに結合した。結合部を紫外線光源（３６５ｎｍ）の下で１２時間から２４時間硬化させた。
【０１５８】
本発明者らによる初期装置設計では、単一のシリコン層が含まれていた。しかし、実験により、これは、流路内の（必要な）液体微量液滴による短絡を防止するには不十分であることがわかった（以下に説明する実験を参照されたい）。好ましい構成では、３つの酸化物層が使用される。ナノリットルの液滴を移動させ混合することのできるこのような好ましい装置を、ガラスカバーにエッチングされた流路にプレーナシリコン基板を結合することによって作製した。一連の金属ヒータを、単一のレーンに合体した２つの平行なレーン（「Ｙ」字形）としてシリコン基板上に嵌め込んだ（図７Ａ）。まず１．０μｍの熱二酸化ケイ素層でウェーハを被覆することによって発熱体を形成した。次に、上にあるフォトレジストに形成されたパターンに従って、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）により深さ０．３５μｍ、幅５μｍの溝を二酸化ケイ素に形成した。電子線蒸着を用いてウェハ全体にアルミニウムを蒸着し（０．３５μｍ）、剥離液を用いて、そのままのフォトレジストを有するすべての表面から金属層を「リフトオフ」した。金属インレープロセスによって、比較的平面状の表面が得られると共に、溶液不浸透性の障壁層を蒸着させるための一様なベースが得られる。障壁層は、一連の３回のプラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）により、すなわち、１．０μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）、０．２５μｍの窒化ケイ素（ＳｉｘＮｙ）、および１．０μｍの酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）を蒸着させることによって作られる（図７Ｂ）。いくつかの発熱体は抵抗温度センサとしても使用した。
【０１５９】
ヒータ部分を以下のように製造した。ＳｉＯ２熱酸化物（１μｍ）を成長させる基板としてシリコンウェーハ（ｐ型、１８ｃｍ〜２２．５ｃｍ、＜１００＞、ホウ素濃度Å１０１５ｃｍ−３）を使用した。フォトレジスト（ＡＺ−５２１４−Ｅ、Ｈｏｅｓｃｈｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ）を塗布し３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離させた。レジストをパターン化し（金属１）、現像した。反応性イオンエッチング（ＲＩＥ、ＰｌａｓｍａＴｈｅｒｍ， Ｉｎｃ．）によって、以下の条件、すなわち、ＣＨＦ３、１５ｓｃｃｍ（標準１分当たり立方センチメートル）；ＣＦ４、１５ｓｃｃｍ；４ｍＴｏｒｒ；ＤＣバイアス電圧２００Ｖ、１００Ｗ、２０分でＳｉＯ２層に０．３５μｍの深さまでエッチングした。エッチング深さを側面計によって測定し、０．３５μｍの金属アルミニウムを電子線によって蒸着した。溶解状態のマイクロポジット １１１２Ａ剥離液（Ｓｈｉｐｌｅｙ Ｃｏ．）を用いて現像によって、レジストおよび上にある金属をリフトオフした。障壁層は、プラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）を用いて順次蒸着された１．０μｍのＳｉＯｘ、０．２５μｍのＳｉｘＮｙ、および１．０μｍのＳｉＯｘから成る。ＲＩＥを使用し、第２のマスクを用いて金属層に接触ホールをエッチングした（ＣＨＦ３、１５ｓｃｃｍ；ＣＦ４、１５ｓｃｃｍ；４ｍＴｏｒｒ；ＤＣバイアス電圧２００Ｖ、１００Ｗ、１２０分）。
【０１６０】
図７に示されているように、各素子を、１つのレーンとして合体された各々の幅が５００μｍである２つの平行なレーンとして配置する。個々のヒータは、幅が５００μｍの領域を横切って巻かれた一対のアルミニウム線（５μｍ）から成る。各素子の各側の広い金属領域は、外部の回路に接続される結合位置である。アルミニウム素子の幅は５μｍである。図７Ｃの流路は、図７Ａの発熱体レーンと同一の幅および構成を有し、幅５００μｍおよび深さ約２０μｍになるように一様にエッチングされる。
【０１６１】
同じ「Ｙ」形式を有するエッチングされた流路を含むガラスウェーハに発熱体ウェーハを結合した。濃フッ化水素酸の水性化学エッチングを用いて、定められた側壁および一様な深さを有する流路を作製した。エッチングされた流路は、クロム／金のマスクによって定義され、幅が５００μｍで深さが約２０μｍである。相補的なシリコンヒータウェーハとガラス流路ウェーハを並べ、次いで接着剤によって結合し、完全な装置を形成した。
【０１６２】
温度センサとし使用される各発熱体を好ましくはまず、２２℃および６５℃で一定の電圧の下で電気抵抗を測定することによって較正する。中間温度を一次補間によって推定する。
【０１６３】
ＩＩ．親水性増強化合物による流路処理
微量液滴の移動および生物学的反応を実施する前に、好ましくは塩基、酸、緩衝液、および親水性増強化合物を用い、次いで無指定のタンパク質の比較的高濃度の溶液を用いて洗浄することによって処理する。好ましい態様では、それぞれ約１００μｌの以下の溶液、すなわち、０．１Ｎ ＮａＯＨ；０．１Ｎ ＨＣｌ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、脱イオン化Ｈ２Ｏ、レイン−Ｘかぶり防止剤（アリゾナ州スコッツデールのＵｎｅｌｋｏ Ｃｏｒｐから市販されている親水性増強化合物）、および５００μｇ／μｌのウシ血清アルブミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから制限酵素グレードで市販されている無指定のタンパク質）で順次流路を洗浄する。ウェーハをステレオスコープステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＳＺ１１４５）上に配置し、発熱体用の接触パッドを、調整された電源に接続した。約３０Ｖの電圧を短いパルスで素子に通電し、液滴の移動速度を観測することによって加熱を行った。通常は３０％未満の、蒸発による液滴体積の検出可能な減少を各実験ごとに記録した。ハママツビデオカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｖｉｄｅｏ ｃａｍｅｒａ）を用いて液滴の移動をビデオテープ上に記録した。
【０１６４】
ＩＩＩ．疎水性領域用の流路処理
本発明の装置の一態様（図８Ａ）では、装置は、ヒータ（８９１）、接触パッド（８９２）、および抵抗温度検出器（８９３）を含むシリコン基板（８１０Ｂ）に結合されたガラス頂部（８１０Ａ）を含んでいる。ガラス側には、流路およびチャンバがエッチングされている。図８Ａは、入口ポート（８２０）および溢流ポート（８３０）、排気口（８７０）、ならびに空気チャンバ（８８０）を示している。
【０１６５】
Ａ．ヒータおよび抵抗温度検出器
ヒータおよび温度検出器（図８Ｂ）の製造プロセスではまず、シリコンウェーハ（ｐ型、１８〜２２ ａｌｕｎ−ｃｍ、ホウ素濃度〜１０１５ｃｍ３）を、ＳｉＯ２熱酸化物（１μｍ）を成長させるための基板として使用する（段階１）。０．５μｍ金属アルミニウム膜を電子線によって蒸着する。フォトレジストＰＲ１８２７を塗布し、４０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離させ、パターン化し（金属１）、現像する。露出しているアルミニウムをアルミニウムエッチング液でエッチングし、フォトレジストを剥離して金属ヒータを限定する（段階２）。
【０１６６】
フォトレジストを再び遠心分離させ、第２のリソグラフィを行う（金属２）。
０．１５μｍの白金（「Ｐｔ」）層を電子線によって蒸着する。厚さが０．０３μｍのチタン金属層（電子線で蒸着）を接着層として使用する。溶解状態のマイクロポジット １１１２Ａ剥離液（Ｓｈｉｐｌｅｙ Ｃｏ．）を用いて現像によって、レジストおよび上にある金属をリフトオフする。この白金金属を抵抗熱検出器として使用する。次に、障壁層および親水性基板として働く０．７μｍのシリコン低温酸化物（ＬＴＯ）を蒸着する（段階４）。第３のリソグラフィを行い、緩衝フッ化水素酸でＬＴＯをエッチングし、金属接触パッドとの接点を開放する。さらなる処理段階を行い、親水性酸化ケイ素表面上に疎水性領域をパターン化する。
【０１６７】
Ｂ．酸化ケイ素基板の疎水性パターン化
処理されたウェーハ上に電子線によって０．１μｍのクロム金属層を蒸着する。フォトレジストＰＲ１８２７を塗布し、２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離させる。レジストをパターン化し（ＳＡＭマスク）、現像する。露出しているクロム金属をクロムエッチング液でエッチングして酸化ケイ素を露出させ、次いでフォトレジストを剥離する（段階５）。次いで、試料をアセトン、イソプロピルアルコール、およびＤＩ水でそれぞれ１０分間洗浄し、空気乾燥させ、オーブンにおいて１００℃で５分間乾燥させる。次いで、試料を、トルエンに溶かした１ｗｔ％のオクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）溶液に１５分〜３０分間浸漬させる。ＯＴＳが試料上に自己組立て単層（ＳＡＭ）として付着する（段階６）。次いで、試料をトルエン、イソプロピルアルコール、およびＤＩ水でそれぞれ５分間リンスし、オーブンにおいて乾燥させる（１００℃、５分間）。次に、試料をクロムエッチング液に浸漬させ、下方のクロム層を除去する。この結果、クロム金属上のＳＡＭがリフトオフされる。次いで、試料をＤＩ水でリンスし、空気乾燥して、親水性酸化物基板上にそのままの疎水性領域を形成する（段階７）。ヒータ部分およびＲＴＤも石英基板上に製造されている。製造段階は、シリコン処理段階と同様である。
【０１６８】
Ｃ．ガラス流路およびチャンバの製造
流路およびチャンバの製造（図８Ｃ）ではまず、厚さが５００μｍのガラスウェーハ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ７７４０）の表面上に０．４μｍの金金属層を蒸着する（電子線蒸着）（段階１）。０．０６μｍのクロム層を接着層として使用する。フォトレジストを塗布し、ガラスマスク１を用いてパターン化し、現像する（段階２）。金属層を金エッチング液（Ｇｏｌｄ Ｅｔｃｈａｎｔ ＴＦＡ、Ｔｒａｎｓｅｎｅ Ｃｏ．）およびクロムエッチング液（ＣＲ−１４、Ｃｙａｎｔｅｃ Ｉｎｃ．）でエッチングする。次いで、新たに準備したフッ化水素酸および硝酸の溶液で、接触可能ガラスをエッチングする。エッチング速度は約５μｍ／分であり、エッチング深さは、従来のように表面側面計を用いて測定する。金属層を除去し（段階３）、ウェーハをＤＩ水でリンスし、空気乾燥させ、オーブンにおいて１００℃で２０分間乾燥させる。ガラス表面上に疎水性領域をパターン化する以後の処理段階を実施する。
【０１６９】
Ｄ．ガラス基板の疎水性パターン化
エッチングされた流路およびチャンバを覆う厚さが１．５μｍのアルミニウム層を電子線によって蒸着した（段階４）。厚いフォトレジスト（ＡＺ４６２０）を塗布し、７５０ｒｐｍで５０秒間遠心分離させる（段階５）。レジストをパターン化し（ＳＡＭマスク）、現像する。露出しているアルミニウムをアルミニウムエッチング液でエッチングする。高温のＰＲＳ２０００（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ）でフォトレジストを剥離する（段階６）。次いで、試料をアセトン、イソプロピルアルコール、およびＤＩ水でそれぞれ５分間洗浄し、１００℃のオーブン内で１０分〜１５分間水を蒸発させる。次いで、トルエンに溶かした１％ＯＴＳ溶液に試料を１０分〜１５分間浸漬させる（段階７）。ドラフト内でＳＡＭ蒸着を行う。次いで、試料をトルエン、イソプロピルアルコール、およびＤＩ水でそれぞれ５分間リンスした。次いで、すべての金属アルミニウムが除去されるまで試料をアルミニウムエッチング液に浸漬させた（段階８）。次いで、試料をＤＩ水でリンスし、空気乾燥させる。頂部に入口を有する装置の場合、電気化学放電掘削によって穴を掘削した。
【０１７０】
次いで、ガラス側をシリコン側上に並べ、次いで光学接着剤（ＳＫ−９ Ｌｅｎｓ Ｂｏｎｄ、 Ｓｕｍｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州フォートワシントン）を用いて互いに結合した。結合部を紫外線光源の下で２４時間硬化した。
【０１７１】
ＩＶ．構成要素の設計
本発明では、１つまたは複数の電気泳動モジュールがマイクロスケール装置の構成要素とみなされている。理論的および経験的な研究によって、電気泳動流路の厚さを薄くすると分解能が向上することがわかっている。ゲルが薄いほど熱がより容易に散逸し、より高い電圧を使用することができ、同時に分離が向上する。電気泳動検出器の位置および幅も、電気泳動システムの最終的な分解能にとって重要である。下にあるシリコン基板に配置された、フォトダイオードのような、微細加工された電子検出器は、ゲルマトリックスから１μｍ未満の位置に位置してよく、５μｍまたはそれ以下の幅を有してよい。２つの移動するバンドを分離するのに必要なゲルの長さは検出器の分解能に比例するので、μｍ幅の電子検出器を組み込むと、標準遺伝型同定に必要な総ゲル長を少なくとも１桁短くすることができる。
【０１７２】
標準ゲル電気泳動がマイクロメートル直径の流路で動作できることを実証するために、図６Ｂと同一のエッチングされたガラス流路および蛍光標識付けされたＤＮＡ（ＹＯＹＯインターカレーション色素）を用いてモジュールを製造した。複雑なＤＮＡ混合物のポリアクリルアミドゲル電気泳動が、図９Ａにおいて幅が５００μｍで深さが２０μｍの流路で示されている。この電気泳動は、右側に正電極を取り付け、左側にＤＮＡ試料をアプライすることによって行われた。白い縦線はゲルと緩衝液の界面である。ＤＮＡ試料（Ｍｓｐｌで消化されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ）は、インターカレーションＵＶ蛍光色素（ＹＯＹＯ−１）で標識付けされており、白熱灯の下で視覚化される。構成要素バンドの分離は、緩衝液だめとゲルの界面から３００μｍ未満の位置に明確に見える。検出器（この場合、顕微鏡）の分解能が高いため、例外的に短いゲルを用いて、いくつかの密に溶出するバンドを分解することができた。
【０１７３】
本発明では、微細加工された流路と電子ＤＮＡ検出器を一体化した電気泳動ユニットが考えられる。流路は、前述の結合表面エッチング法ではなく単一のシリコンウェーハに対する犠牲エッチングプロセスを用いて作製される。犠牲エッチング技術では、所望の流路高さに相当する厚さを持つエッチング感応材料（ホスホシリケートガラス、ＳｉＯ２・Ｐｘ）をウェーハ表面上に付着させることによって流路構成をパターン化する。プラズマ増強化学蒸着された窒化ケイ素、ドーピングされていない多結晶シリコン、および窒化ケイ素の３層オーバレイ（ＳｉｘＮｙ／ポリＳｉ／ＳｉｘＮｙ）は、頂部または側面の小さなアクセスホールを除いて犠牲材料を完全に覆う。選択的な液体エッチングによって犠牲層材料が除去されるが、オーバレイや下にある基板は除去されない。犠牲エッチング技術により、電子構成要素を含む基板上に直接完全な流路が形成される（図６Ｃおよび６Ｄ）。深さが３μｍの流路は、リンが添加された一体的な多結晶シリコン電極を含む各端部上に２つの緩衝液だめを有する。この技術によって形成される流路高さ（〜３μｍ）は、犠牲層蒸着の制限および上層の強度のために結合構造の高さよりもかなり低い。このような流路寸法の場合、液滴がピコリットル程度の体積を有することに留意されたい。
【０１７４】
図９Ｂは、シリコンウェーハ上に製造された１組の４つのドーピングされた拡散ダイオード放射検出器素子の顕微鏡写真である。各素子について、３本の平行な黒い線は拡散領域を示しており、検出器の両脇に保護リング遮蔽電極が配置されている。拡散領域は、長さが約３００μｍで幅が約４μｍである。
【０１７５】
外側の縁部の周りに幅が５μｍの保護リングを有する幅が１０μｍの「ｐ−ｎ」型ダイオードから成る放射検出器は、直接シリコン基板の流路の下方に組み込まれている。この実現態様では、（ｉ）感度が高く（単一崩壊現象）、（ｉｉ）開口寸法が小さく、（ｉｉｉ）製造特性および応答特性が公知であるために、一体的な検出器を選択した。この電気泳動システムでは、長さが１ｃｍで厚さが３μｍのゲルはＤＮＡの８０塩基対および３００塩基対の断片に対する分離を行うことができる。このダイオードは、現在高エネルギーβ粒子検出用に構成されているが、光子検出器として動作することもできることに留意されたい。適切な波長フィルタおよび光源を用いることによって、蛍光放出の検出を同様な装置で対処することができる。
【０１７６】
放射検出器は以下のように作製した。ホウ素が添加された２００．５ｃｍ、＜１００＞、フロートゾーンｐ型シリコンウェーハを基板として使用した。リソグラフィによって決定された領域において、リン（５ｘ１０１４ｃｍ−２）およびホウ素（１ｘ１０１５ｃｍ−２）の拡散層を試料上にイオン注入した。ウェーハ上で熱酸化ケイ素を成長させ（９００℃で０．２μｍ）、緩衝フッ化水素酸溶液（５：１）を用いて接触ホールを拡散層までエッチングした。３．３μｍのマイクロポジット１４００−３７フォトレジスト層をパターン化して金属パッドを決定し、レジスト上に５０ｎｍのクロム、次いで４００ｎｍの金を蒸着し、メタライゼーションによって、レジストを保持している領域をリフトオフ（ｌｉｆｔ ｏｆｆ）した。マイクロポジット １８１３フォトレジスト層をウェーハ全体に塗布し、１１０℃で３０分間焼成し、水溶液障壁を形成した。フォトレジスト層上に置かれたＰＣＲ反応緩衝液中の標識付けされたＤＮＡの試料を用いて放射性リン（３２Ｐ）崩壊現象を検出することができた。検出器を電荷感応前置増幅器（ＥＶ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ５５０Ａ）に接続し、次いで線形整形増幅器および標準オシロスコープに接続した。
【０１７７】
図９Ｃは、３２Ｐ標識ＤＮＡからの個々の崩壊現象を示す、放射検出器の出力のオシロスコープトレースを示している。水性ＤＮＡ試料を直接検出器上に置き、３０秒間サンプリングした。画面は、０．５Ｖ／目盛の垂直スケールと２０μｓｅｃ／目盛の水平スケールを示している。
【０１７８】
Ｖ．流路の製造および疎水性パターン化
Ａ．基板の疎水性／親水性パターン化
図１０に示されているように、一態様では、装置は、シリコン基板に並べられ結合されたエッチングされた微細流路網を有するガラス基板から成っている。微細流路の特定の領域は疎水性になっている。図１０ｂは、シリコン基板上の疎水性パッチのパターン化を詳しく示す製造段階を示している。シリコン基板上で酸化ケイ素の薄膜を熱によって成長させる（１０ｂ（１））。金属（クロム／アルミニウム）の薄膜を付着させ（１０ｂ（ｉｉ））、選択的にエッチングして（１０ｂ（ｉｉｉ）〜ｂ（ｖｉ））基板の特定の領域を露出させてシラン化する（１０ｂ（ｖｉｉ））。表面が反応した後、金属マスクを除去する。（ｃ）機械的製造段階。金属マスクを用いて酸溶液（ＨＦとＨＮＯ３の混合物）でガラスを選択的にエッチングする（１０ｃ（ｉ）〜ｃ（ｉｉｉ））。次いで、基板を１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルトリクロロシランと選択的に反応させて疎水性パッチを作製する。電子線蒸着によってガラスウェーハ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ７７４０）またはシリコンウェーハの酸化ケイ素表面上に金属（クロムまたはアルミニウム）の薄膜（５０〜３００ｎｍ）を付着させる（図１０ｂ（ｉ））。フォトレジスト（ＰＲ１８２７、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａｎｅｓｅ）を表面に塗布し、４００ｒｐｍで３０秒間遠心分離させ（図１０ｂ（ｉｉｉ））、厚さが２．７μｍのレジスト膜を形成する。次いで、各ウェーハを９０℃で３０分間軽く焼成し、マスクを通して６０秒間露光し（４８０ｎｍ、５ｍＪ／ｃｍ２）、標準現像液（ＭＦ３１９）で１分間現像した（図１０ｂ（ｉｖ））。次に、ウェーハをオーブンにおいて１１０℃で３０分間焼成し、露光した金属を、そのすべてが除去されるまで金属エッチング液に浸漬させることによって除去する（図１０ｂ（ｖ））。ＰＲＳ−２０００の溶液にウェーハを浸漬させることによってフォトレジストを除去し、その後脱イオン化水でリンスし、空気乾燥させる。ウェーハをアセトン、イソプロピルアルコール、および脱イオン化水でそれぞれ５分〜１０分間リンスし、次いでオーブンにおいて１００℃で１５分間乾燥させる。イソオクタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶かした１％ ｖ／ｖの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルトリクロロシラン（ＦＤＴＳ）（Ｇｅｌｅｓｔ）溶液を窒素の下で準備する。ウェーハをＦＤＴＳ溶液に１５分間浸漬させる。この処理は窒素環境で室温（〜２５℃）で行われる。次に、ウェーハを新鮮なイソオクタン溶媒で１０分ずつ２回にわたってリンスし、イソオクタンからエタノールに移し、次いで脱イオン化水に移し、次いで空気乾燥させる。ウェーハをオーブンにおいて１００℃で１５分間熱処理し、マスキング金属が完全に剥離されるまで金属エッチング液に浸漬させる（図１０ｂ（ｖｉｉｉ））。次いで、ウェーハを脱イオン化水でリンスし空気乾燥させる。
【０１７９】
Ｂ．流路の製造
ガラス流路の製造ではまず、厚さが５００μｍのガラスウェーハ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ７７４０）の表面上にクロム（６０ ｎｍ）および金（４００ ｎｍ）の金属膜を付着させる（電子線蒸着）（図１０ｃ（ｉ））。正のフォトレジストを塗布し、パターン化し、現像する。金属層を金エッチング液（Ｇｏｌｄ Ｅｔｃｈａｎｔ ＴＦＡ、Ｔｒａｎｓｅｎｅ Ｃｏ．）およびクロムエッチング液（ＣＲ−１４、Ｃｙａｎｔｅｋ Ｉｎｃ．）でエッチングする。次いで、新たに準備したフッ化水素酸および硝酸の溶液（７：３、ｖ／ｖ）で、接触可能ガラスをエッチングする。エッチング速度は約６５００ｎｍ／分であり、エッチングされる深さは表面側面計を用いて測定する。金属層を除去し、ウェーハを脱イオン化水でリンスし、空気乾燥させ、オーブンにおいて１００℃で２０分間乾燥させる（図１０ｃ（ｉｉｉ））。次いで、Ａで説明したプロセスに従って疎水性領域をパターン化する（図１０ｃ（ｉｖ）〜１０（ｖｉｉｉ））ようにウェーハを処理する。電気化学放電掘削により、ガラス表面の頂部からガラスウェーハの底面上の微細流路に届くようにホール（半径〜０．１５ｎｍ）を掘削する。ショージ（Ｓｈｏｊｉ， Ｓ．）；エサシ（Ｅｓａｓｈｉ Ｍ．）「１９９０年第９回センサーシンポジウムの技術要約（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ｓｅｎｓｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）」２７ページ〜３０ページ。次いで、ガラスウェーハ上の個々の装置を乾燥させ、次いで、シリコンチップ上に容易に結合することができる。
【０１８０】
Ｃ．装置の結合
ガラス流路型をシリコン型上に置き、ガラス型上の疎水性パッチをシリコン型上の疎水性パッチに並べる（図１０ａ）。次いで、光学接着剤（ＳＫ−９ Ｌｅｎｓ Ｂｏｎｄ、 Ｓｕｍｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルバニア州フォートワシントン）を用いて２枚の基板を結合する。接着剤を装置の縁部に少なめに塗布し、隙間に入り込ませる。余分な接着剤が流路に入らないように注意する。結合部を紫外線光源（３６５ｎｍ）の下で２４時間にわたって硬化させる。液体の計量に用いられる装置において、高速硬化エポキシを用いてステンレス鋼製皮下チューブをエアラインホールに接着する。小さなテフロンチューブによってステンレスチューブを空気圧源および圧力調整装置に連結する。
【０１８１】
Ｄ．パッチの評価
シーケンシングピペット（Ｓｉｇｍａ、最小カウント０．５μｌ）を用いてガラス−シリコン混成装置の入口穴（直径３００μｍ）に約１μｌの水を置いた（図１１ｂ）。毛細管作用によってこの液体を親水性流路に引き込んだ。疎水性パッチ（幅２００μｍ）の、液体を停止させる能力を顕微鏡の下で観察した。疎水性パッチを微細流路（深さが２０μｍから６０μｍの範囲、幅が５０μｍから５００μｍの範囲）の４枚の壁上の入口穴から特定の距離（１ｍｍから５ｍｍ）だけ離れた位置にパターン化したことに留意されたい。
【０１８２】
Ｅ．圧力の測定
液体計量装置の入口穴に液体を導入し（図１２ａ）、疎水性界面のところで停止させた（図１２ｂ）。入口穴を封鎖し、次いでスプリッタ流路を加圧して個別の液滴を分裂させ、疎水性パッチ上を移動させた（図１２ｃ〜１２ｅ）。様々な微細流路装置（流路幅が１００μｍから５００μｍの範囲、幅が２０μｍから４０μｍの範囲）で行われた液体計量実験についてしきい値圧力値を記録した。
【０１８３】
Ｆ．接触角の測定
実験表面上に液滴（〜μｌ）をそっと置き、ＣＣＤカメラを用いて液滴の側面形状の写真を撮る。レベルインジケータを用いて実験表面とカメラを地面に対して水平にする。さらに、液滴の基部がカメラと同じ水平平面内に位置するように注意する。次いで、画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を用いて接触角を求める。
【０１８４】
Ｇ．体積の測定
ＣＣＤカメラを用いて、顕微鏡を介して、微細流路装置で計量された液滴の写真を撮る。画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を用いて、計量された体積の画像を取り込む。計量された液滴の面積を求め、次いでそれに流路深さをかける。
【０１８５】
Ｈ．選択的な表面処理
シラン化処理を用いてガラスウェーハまたはシリコンウェーハの疎水性を選択的に修正する。この処理では、基板を洗浄し、オルガノシランＦＤＴＳ（ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣｌ３）を含むイソオクタン溶液に基板を浸漬させる。オルガノシラン分子はウェーハの表面に吸着し、各オルガノシランのＳｉ−Ｃｌ基は表面ＯＨ基と反応してＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成する。各分子上の残りのＳｉ−Ｃｌ結合は、すでに吸着している微量の水分子が存在している状態で近くのオルガノシラン分子と反応し、表面上にＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合網を形成する。ウルマン（Ｕｌｍａｎ， Ａ）著「超薄有機膜概論、ラングミュア−ブロジェットから自己組立てまで（Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｉｌｍｓ ｆｒｏｍ Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ ｔｏ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ）」１９９１年、初版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、２４５ページ〜２５０ページを参照されたい。オルガノシラン化合物に長い炭化水素鎖およびフッ素原子が存在すると、処理された表面は水をはじき、疎水性になる。処理の前後のシリコンウェーハの表面上の静止接触角はそれぞれ、３００±０．５０および１０００±０．５０である。
【０１８６】
シランウェーハまたはガラスウェーハとのこのような疎水性領域をパターン化するために、基板の選択された領域を薄いアルミニウム金属膜、クロム金属膜、または金金属膜でマスクする。金属およびその厚さの選択は、非平面表面に関連する段高さを覆う金属の能力、金属膜に対するオルガノシラン溶液および転移溶媒の効果、ならびに処理される表面に対する金属剥離液の効果を含むいくつかの因子に基づいて行われる。イソオクタンに溶かした１％のＦＤＴＳ溶液はクロム膜および金膜に対する視覚効果を有さず、数百オングストロームほどの薄い膜厚を使用することができる。しかし、アルミニウム膜は、イソオクタンで徐々にエッチングされ、疎水性パターンを形成するには１００ｎｍよりも厚い厚さが必要である。
【０１８７】
Ｉ．処理の耐久性
疎水性表面処理の耐久性は、この処理を微細流体装置で使用する場合に重要である。処理される表面は、その製造、組立て、または動作時に様々な薬品と接触することがある。疎水性試料を様々な薬品に１５分間浸漬させ、脱イオン化水でリンスし、乾燥させる実験を行った。試料上に水滴（〜１μｌ）を置き、静止接触角を測定した。浸漬の前後に接触角を比較することによって、シラン化された表面が一般的な酸および塩基の大部分に抵抗することが判明した。このような薬品には濃硫酸（９６．２％）、ＮａＯＨ（５０ｗｔ％）、ピランハ（Ｐｉｒａｎｈａ）洗浄液（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２＝１：１）、ＨＣｌ（３７％）、酢酸（９７％）、１０ｘＴＢＥ緩衝液が含まれる。これらの薬品にさらされ、試験の前後に測定された処理された表面上の水の静止接触角は１０００±０．５０である。しかし、緩衝ＨＦ酸は、酸化ケイ素の表面層をエッチングし、したがって、酸化ケイ素と共にシラン分子を除去することによって静止接触角に影響を与える。シラン化された表面を緩衝ＨＦに１５分間浸漬させた後、静止接触角は２００±５０であった。
【０１８８】
温度に対するシラン化された膜の安定性は通常重要である。装置は、その動作および／または包装時に生じる高温に耐える必要がある場合がある。シリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）らは、ＦＤＴＳ膜が大気中で最高４００℃まで５分間安定であると報告している。シリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ｕ．） ； ハウストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ， Ｍ． Ｒ．）； ハウィ（Ｈｏｗｅ， Ｒ． Ｔ．）； マボウディアン（Ｍａｂｏｕｄｉａｎ， Ｒ．）著「トランスデューサ１９９７年（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ’９７）」１９７７年、１３９９ページ〜１４０２ページ。 マボウディアン（Ｍａｂｏｕｄｉａｎ， Ｒ．）著「表面科学報告書（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ）」１９８８年、３０、２０７ページ〜２６９ページ。長期安定性は、装置が製造されてから実際に使用されるまでの時間が長い場合に重要である。シリニバサン（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ）らは大気中に室温で１８か月ほどの長い間貯蔵した場合に疎水性の損失が最小限に抑えられたと報告している。
【０１８９】
実験例
以下の例は、本発明のある好ましい態様および局面を示すものであり、その範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【０１９０】
以下の実験の開示では、以下の略語を使用する。ｅｑ（当量）、Ｍ（モル濃度）、μＭ（マイクロモル）、Ｎ（通常）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、℃（摂氏〜度）、Ｃｉ（キュリー）、ＭＷ（分子量）、ＯＤ（光密度）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−四酢酸）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＵＶ（紫外線）、Ｖ（ボルト）、Ｗ（ワット）、ｍＡ（ミリアンペア）、ｂｐ（塩基対）、ＣＰＭ（カウント毎分）。
【０１９１】
実施例１
この例では、マイクロスケール装置の電気素子上への水分障壁の形成の問題に対する取組みについて説明する。初期原型では、５０００オングストロームのアルミニウムを使用し、それをＰＥＣＶＤ ＳｉＯｘで覆った。試験時に、液体がこの層を貫通し、アルミニウム発熱体を破壊することが判明した。
【０１９２】
この問題の原因に関する明白な証拠がないので、アルミニウムの段高さがパシベーション層（酸化物）に亀裂を生じさせているという仮説を立てた。亀裂の問題を軽減するために、段高さによって生じる亀裂を追加の厚さで解消するという考えから、２つのＳｉＯｘ層間にＳｉｘＮｙ層を設けてみた。これはうまくいかなかった。
【０１９３】
次の手法として、より薄いアルミニウム層（５００オングストローム）を試してみた。これによって、最初の原型装置の段高さは１０分の１になった。このアルミニウム上にＳｉＯｘ、ＳｉｘＮｙ、およびＳｉＯｘの３層を使用した。さらに、ＳｉｘＮｙ層を作るプロセスを、より密度の高い層を形成するプロセスに変更した。これで問題は解決したようであった。しかし、より薄いアルミニウム層のために、抵抗が受け入れられないほど大きくなった。より厚いアルミニウム層を作製して抵抗を小さくし、しかも表面を比較的平滑（平面状）に維持する方法が必要であると判定した。これをエッチバックプロセスを用いて実施した（現在では「インレープロセス」と呼ばれている）。ＳｉＯｘ層をエッチバックし、結果として得られた空洞にアルミニウムを堆積させ、次いでレジストマスクを剥離することによって、パシベーション層の亀裂を防止するほど低い段高さを有する表面が得られた。
【０１９４】
金属結合パッドが初期ＰＥＣＶＤ ＳｉＯｘ層にうまく付着しないことも分かった。この問題を解消するために、湿性熱ＳｉＯ２層を用いてプロセスを修正した。
【０１９５】
実施例２
この実施例では、表面処理によって液滴の動きを推進する手法について説明する。この場合、表面張力を用いて液滴を移動させる原則を親水性表面と疎水性表面のいずれに適用することもできる。たとえば、ガラスは本来親水性である、水との接触角がゼロに近い。本発明の酸化物コーティングは主としてガラスと同じ材料で作られているので、装置もゼロに近い角度を示すことが予想された。しかし、実際の構成材料の接触角はゼロにはほど遠く、したがって、接触角ヒステリシス（実施例３で詳しく論じる）の効果を高めることが分かった。たとえば、水のポリアミド上での接触角（静止）は〜４２０であり、ＳｉＯ２（たいていのガラスの主成分）上では〜４１０であり、シリコーンスプレー上では〜６２０であった。表面効果を高めるために、以下に説明するように、親水性表面と疎水性表面の両方にいくつかの処理プロセスを試した。
【０１９６】
表面の親水性を高めるために、いくつかの洗浄手順を試した。表面の汚染および／または粗度によって表面の親水性が低下することが報告されている。したがって、高濃度クロム酸洗浄、高濃度硫酸洗浄、ベーキング手順（６００℃まで８時間、汚染物質を焼き払う）、表面コーティングを試した。酸洗浄手順はベーキング手順ほど効果的ではなかったが、濃縮された酸がアルミニウムパッドを腐食させ、高温によってアルミニウム（融点：〜６６０℃）が剥離されるか、またはヒータチップと流路の間の接着結合部が破壊されるので、どちらの手順も装置には適合しないことが証明された。
【０１９７】
処理剤としてのレイン−Ｘかぶり防止剤（市販されている）は有効であることが証明された。これは、表面を疎水性にする表面処理剤である。結果として得られる表面は００ではないが、このコーティングを用いることによって、表面全体が処理され、液滴に対して一様な表面が得られる。実験により、レイン−Ｘかぶり防止剤は、熱を用いた液滴運動実験を大幅に推進することがわかった。試験したが有効ではなかった他のそのような処理剤としてシルウィット（ＳｉｌＷｅｔ）と呼ばれる材料があった。この材料は、農業用スプレーによる植物のぬれを向上させるために農業で使用されている。
【０１９８】
発明者は、疎水性表面を得るために、レイン−Ｘ処理剤およびシラン処理剤で毛細管を覆うことを試した。いずれの場合も９００よりずっと大きな角度は得られず、したがって、この機構に対して有効ではない。これらの処理剤が疎水性運動研究において有用であるには角度が〜１８００になる必要がある。最終的に、今後の試験で良好な結果を示すのに十分な疎水性を有するテフロンコーティングを使用できることが分かった。
【０１９９】
実施例３
この例では、熱処理による液滴移動手法について説明する。前記（上記）に指摘したように、動いている液滴の前進端部上の接触角（前進接触角と呼ばれる）は、後退端部上の接触角（後退接触角）よりも大きい。このため、ガラス上の水のような親水性表面の場合、液滴の後ろ側を加熱することによって前進させる試みを妨げる背圧が生じる傾向がある。これは、流路内の層流を記述する簡単なモデルによって最も良く示される。
【０２００】
円形流路内の平均流量
＜ｖ＞ ＝ −ΔＰ＊［Ｒ２／（８μＬ）］
上式で、Δ ＝ 液滴の後方での値−液滴の前方の端部での値
ΔＰ ＝ （１／Ｒ）＊（ΔＧ） ＝ 液滴両端間の圧力差
ΔＧ ＝ 液滴の端部間の表面張力の変化
Ｒ＝流路の半径
Ｌ＝液滴の長さ
μ＝粘度
【０２０１】
さらに、水の場合、ΔＧ ＝ 定数＊ΔＴであり、温度が高くなるとたいていの液体の表面張力は低下する（水の場合、定数＝０．１６ｄｙｎ／ｃｍ）。
【０２０２】
したがって、
＜ｖ＞ ＝ −（ΔＧ）＊（１／Ｒ）＊［（Ｒ２／（８μＬ）］＝［−０．１６＊ΔＴ＊Ｒ／（８μＬ）］
であり、上式で、
ΔＴ ＝ Ｔ後−Ｔ前
であり、したがって、
＜ｖ＞ ＝ ［０．１６＊Ｒ／（８μＬ）］＊（Ｔ後−Ｔ前）が得られる。
【０２０３】
この数式は、液滴の後方の端部に対する任意の加熱によって（前部が比較的低い温度のままである場合）液滴が移動することを示している。しかし、実験の結果はそうではなかった。ガラス毛細管を用いた研究により、液滴を移動させるのに必要な最小温度差があることが判明した。この効果は、接触角ヒステリシス（ＣＡＨ）の結果であると考えられる。ＣＡＨでは、前進接触角は後退接触角よりも大きく、液滴の移動を実現するのに解消しなければならないある種の背圧が生じる。ＣＡＨは、界面が動かされている場合に生じる（動的角度）。この効果を説明するために、流れの定常（１Ｄ）モデルにＣＡＨを含めた。たとえば、前進角度が３６０であり後退角度が２９０である（液滴の前面は２５℃である）場合、高さが２０μｍの流路内の長さが１ｍｍの液滴では、液滴の後部を〜６０℃に加熱する必要がある。これは一例に過ぎない。
【０２０４】
しかし、実験により、液滴が移動するかどうかは流路寸法パラメータおよび流体パラメータ（表面張力以外）の影響を受けないことが分かった。これらのパラメータは、動き（起こった場合）の大きさを決定する。動きが生じるかどうかを決定するのは以下の不等式である。
Ｇ前／Ｇ後 ＞ （Ｒ前／Ｒ後）＊（ｃｏｓβ後／ｃｏｓβ前）
上式で、β＝接触角である。
【０２０５】
本発明の計算によれば、高さが２０μｍの流路内で前進角度が３６０で後退角度が２９０のシステムにおいて液滴の動きを開始するのに十分な、液滴の前部と後部との温度差は、〜３５℃である。しかし、実際の装置の実験試験では、液滴の前部は比較的早く加熱し、したがって、液滴の前部と後部との間の移動に必要な温度差が小さくなることが分かった。この効果のために、液滴を動かすのにより高い電圧を用いる必要があった。動きを生じさせるには通常は〜３０ボルトの範囲の電圧が必要であることが判明した。さらなる実験の結果、液滴の前部と後部との、結果として得られる温度差は〜４０℃であり、したがって、最初に決定した要件が正しいことが示された。
【０２０６】
熱勾配を用いた、微細加工された流路構造内の個別の液滴の動きは、図６のビデオ記録された画像に示されている。この装置は、平面二酸化ケイ素基板（図２に示されている構造と同様）上に嵌め込まれ、ウェットエッチングされたガラス流路（深さ２０μｍ、幅５００μｍ）に接着剤によって結合された一連のアルミニウムヒータから成っている。マイクロピペットを用いて、左側の２つの流路に液体試料を手動で充填した。各液滴の左側の界面を加熱することによって、流路の交差点の方へ液滴を推し進める。交差点で液滴は接触して接合し、単一のより大きな液滴を形成する。流路の断面が２０μｍ ｘ ５００μｍであるため、これらの液滴のそれぞれの体積をその長さをから算出することができ、かつこの体積が約５０ナノリットルであることに留意されたい。
【０２０７】
図６に示されている流路の表面全体に沿ったヒータによって、流路は、液滴運動装置だけでなく熱反応チャンバとして用いることができる。この図の上部の液滴はＤＮＡ試料を含んでおり、一方、下方の液滴は制限消化酵素（Ｔａｑｌ）および消化用緩衝液を含んでいる。試料が合体した後、一体的なヒータおよび温度センサを用いて、組み合わされた液滴を３０分間６５℃に維持した。流路の右側の端部から液滴をしぼり出し、レーザ誘導蛍光検出器を含む毛細管ゲル電気泳動システムに充填することによって、完全な酵素反応が確認された。シリコン装置によって作成されたクロマトグラムは、標準ポリプロピレン微細反応容器（図示せず）内のＤＮＡ消化行程で生成されたクロマトグラムに類似していた。
【０２０８】
実施例４
この実施例では、本発明の装置の加熱および温度検知用の回路を含む基板に流路を結合する様々な手法について説明する（上述の２分割構成の議論を参照されたい）。第１の試みではポリアミドを用いた。通常のポリアミドは、２つの部材が付着しないということが見出された点で不十分であった。
【０２０９】
次の試みでは、光限定可能なポリアミドを用いた。この場合、表面同士はべったりと付着したが、流路に沿って完全なシールが得られたわけではなかった。最終的な焼成プロセス時に放出される溶媒によってポリアミド層にポケットが生じることが分かった。「硬化」によってシールを形成し、溶媒を放出しない接着層が必要であった。
【０２１０】
以下にリストするいくつかの異なるエポキシおよび接着剤を調べた。
2004521315.tif 000025
2004521315.tif 000026
【０２１１】
好ましい接着剤はＵＶ硬化接着剤であった。ただし、ＵＶ接着剤を塗布するプロセスは厄介であり、接着剤を塗布すべきでない場所、たとえば流路に接着剤が入るのを回避する何らかの方法が必要である。
【０２１２】
結合基板の水酸化物結合およびスクリーン印刷も試みた。他の方法はガラステープであったが、テープを溶かすのに必要な高温が、本発明の装置には高すぎるように思われた。
【０２１３】
実施例５
この実施例では、シリコンベースの基板上の核酸増幅反応について説明する。ＰＣＲ用の確立されたＤＮＡ生化学的段階は、イオン強度、温度、およびｐＨの生理学条件の範囲内で行われる。したがって、反応チャンバ構成要素は、ＤＮＡ、酵素、および溶液中の他の試薬に適合しなければならないという設計上の制限を有する。
【０２１４】
生体適合性を評価するために、標準ＰＣＲ反応チャンバに構成要素を付加した。この結果（図２０参照）は、結晶シリコンが生体適合性に関して理想的な材料ではないことを示した。この結果が与えられたものとすると、吸着した表面薬剤、共有結合されたポリマー、または付着した酸化ケイ素層を有する微細加工されたシリコン基板の表面を修飾することが望ましい。
【０２１５】
発明者は、生体適合性を有する発熱体を形成するために、まず標準シリコンウェーハを０．５μｍの二酸化ケイ素層で被覆した。次に、酸化ケイ素に深さが０．３μｍで幅が５００μｍの流路をエッチングし、金またはアルミニウムを付着させた（厚さ０．３μｍ）。このインレープロセスでは、比較的平面状の表面が得られ、不透水性の層を付着させるためのベースが形成される。不透水性層は、一連の３回のプラズマ増強蒸着、すなわち、酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）、窒化ケイ素（ＳｉｘＮｙ）、および酸化ケイ素（ＳｉＯｘ）の蒸着によって作られる。これらの材料は気相から付着させられるので、厳密化学量論は不明である。微細加工されたＰＣＲ反応チャンバに関してすでに実証されているドーピングされたシリコン抵抗ヒータではなく、薄い金属のヒータ構成をこの装置に使用した。というのは、幅の狭い金属インレーによって、ガラスや石英のような下にある透明な基板を通して液体試料を見ることができるからである。さらに、いくつかの独立の発熱体を用いた場合、大部分の発熱体をヒータとして働かせつつ、少数を非常に正確な抵抗温度センサとして動作させることができる。
【０２１６】
既知のＤＮＡ鋳型試料のＰＣＲ増幅を用いて、金属抵抗ヒータおよび酸化物／窒化物／酸化物コーティングで作製された装置を生体適合性および温度調節に関して試験した。反応は、蒸発を防止するために鉱物油で覆われた２０マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物を用いて平面装置上で実施した。プログラム可能な制御装置に連結された一体的な温度センサを用いて、標準３５サイクルＰＣＲ温度循環方式によって反応混合物を循環させた。反応体積が最初のヒータ設計に予定された体積よりも著しく多いので、試料含有チャンバとして働くポリプロピレンリングをヒータ表面の中心に配置した。すべての試験において、増幅された反応産物が存在していたため、二酸化ケイ素表面およびヒータ設計が反応を阻害しないことが分かった。市販のＰＣＲサーモサイクラ上で行った並列増幅実験でも同様の結果が得られた。一連のＰＣＲ適合性試験により、装置上の反応は制御装置の設定および試料に接触する最終的な表面材料（図示せず）の影響を受けやすいことが分かった。
【０２１７】
上記のことから、本発明を遺伝型同定などの大量プロジェクトに適合できることは明白である。この微量液滴輸送では、試薬の液体の取り扱いおよび混合における現在の効率の悪さが解消される。さらに、この装置は、生物学的反応を含む反応の性質によって制限されることはない。
【０２１８】
実施例６
この実施例では、試験構造を製造する（図２１）。この試験構造は非常に単純である（図２１）。主要な部分は、２マスクプロセスで作製され、Ｓｉ基板上に５つの材料層が構築される。ＳｉＯ２は、最下層から最上層まで、Ｓｉ基板と、はんだパッドおよび発熱体として機能する他の金属層との間の絶縁層として働く。Ｔｉ層（２５０Ａ）はＮｉを付着させるための層である。Ｎｉ（１０００Ａ）層およびＡｕ（１０００Ａ）層は、はんだ用の拡散障壁として働く。Ａｕ層は湿潤可能なパッドとしても働く。最後に、はんだ層は２枚の基板を結合するための層である。はんだは、金属層を加熱することによって溶融する。結合される他の基板は、はんだを除いて同じ構成を有する。
【０２１９】
この試験構造では熱空気微細弁を使用する。微細弁の概略的なプロセスフローを図２２に示す。たわみを大きくしかつ感度を高めるために波形隔壁が選択されている。隔壁（横の長さ＝１０００ｕｍ、厚さ＝３ｕｍ、ボスの横の長さ＝５００ｕｍ、ボス厚さ＝１０ｕｍ）は２７ｕｍたわみ、１ａｔｍの圧力がかけられる。この圧力は、より大きな作動力をもたらす熱空気機構によって発生する。１ａｔｍの圧力は、フレオン（Ｆｒｅｏｎ−１１）を室温より１１℃高い温度に加熱すると隔壁とガラスとの間の空洞で発生する。図２２に示されているように、この微細弁を製造する場合、１０個のマスクが使用されることが予想される。
【０２２０】
図９ａは、シリコン基板１０、すなわち、通常の厚さを有し適度なドーピングが施された（＞１ｃｍ）ｐ型（１００）配向Ｓｉウェーハの一部を示している。しかし、好ましいウェーハ厚さは通常、ウェーハ直径の関数である。基板１０を含むシリコンウェーハの上部表面１２を通常の受け入れられる方法でラップ仕上げし、研磨し、洗浄する。反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を用いた等方性エッチングにより、フォトレジストをマスキング材料として用いて隔壁波形１４を形成する。
【０２２１】
図２２Ｂは、完成した装置のリム、中央ボス、入口穴、および出口穴を形成する深ホウ素拡散領域２６の決定段階を示している。図２２Ｃは、隔壁を形成する浅ホウ素拡散領域１８の付着段階を示している。次いで、はんだ２０を含む様々な金属層を付着させる。深ホウ素拡散プロセスおよび浅ホウ素拡散プロセスによって、隔壁および溶解ウェーハプロセス用のエッチストップの形状が決定される。
【０２２２】
この後、図２２Ｄは、完成した装置のはんだの絶縁体として働く酸化物層２２の形成を示している。次いで、図２２Ｅに示されているように、Ｔｉ付着／Ｎｉ／Ａｕ障壁および湿潤可能なパッド２４を付着させる。次いで、図２２Ｆに示されているように、Ｎｉおよびフォトレジストのはんだモールド２６を形成し、フォトレジストを犠牲層として用いた表面微細加工によって第１のＮｉ流路２８を作製する。ＥＤＰを用いて犠牲層を除去し、流路穴３０を形成することによってＮｉ流路穴を決定する（図２２Ｇ）。
【０２２３】
図２２Ｈに示されているように、Ｎｉおよびフォトレジストによって第２のＮｉ流路３２を決定し、ＥＤＰを用いて犠牲層を除去することによって入口穴３４および出口穴３６を形成する（図２２Ｉ）。
【０２２４】
最後に、ガラス３８内のＴｉ／Ｐｔヒータをシリコン基板に陽極結合する（図２２Ｊ）。フレオン−１１をガラス基板の穴（図示せず）を通して空洞に満たす。この穴は、ダイヤモンドドリルで形成され、エポキシで密封される。
【０２２５】
実施例７
この実施例では、低融点はんだを試験構造で使用することにした。はんだで密封された一般的に有用な微細弁を気相微量分析システムで使用するので、気体の特性に影響を与える可能性のある高融点（ｍ．ｐ．）はんだ（＞２００℃）を用いることは望ましくない。さらに、高融点はんだは、集積回路のような装置上の他の構成要素に影響を与え、電力消費量を多くする可能性がある。その結果、低融点はんだが必要である。ビスマスを含むはんだは４７℃〜１３８℃という最低の融点を有する。しかし、この群に属するはんだプールに試験構造を浸漬させると、すべての金属層がはんだ溶液に溶解した。さらに、このはんだは、試験構造の表面を選択的にぬらすことはなかった。
【０２２６】
実施例８
実施例７に示されている実験の結果を考慮して、一般に使用可能な６０：４０Ｓｎ：Ｐｂはんだ（ｍ．ｐ．１８３℃）を試した。試験構造をこのはんだの溶液に浸漬させると、金属はそのままであった。さらに、これらの層は、はんだに対する湿潤性が優れており、すなわち、はんだは金属の領域にのみ制限された。
【０２２７】
実施例９
この例では、流路内の流体の流れを遮断する装置および方法について説明する。図２３は、この態様の試験の概略図である。発熱体４２に結合された６０：４０Ｓｎ：Ｐｂはんだ４０を横流路４４内に置く。発熱体４２は少なくとも部分的にはんだ４０を液化し、空気流４６は、液化したはんだを横流路から主流路４８内に移動させ、主流路を冷却し封鎖する。
【０２２８】
実施例１０
この例では、上述のリフトオフ法を用いてガラス基板およびシリコン基板上に疎水性領域をパターン化することによって製造された装置を、水滴の分離に関して試験した。この装置では、パターン化された金属薄膜を用いて、疎水性にする領域として選択された領域を親水性基板上に露出させた。クロム、金、またはアルミニウムを金属層として使用した。金属の選択は、他の処理段階とのプロセス適合性およびエッチングされる流路の段高さ範囲に基づいて行った。
【０２２９】
本発明の方法を用いて、１０μｍほどの狭い線幅をシリコン基板上にパターン化した。図２４は、この新しい技術によってパターン化された疎水性領域（Ａ）および親水性領域（Ｂ）のラインによって分離された液滴を示している（中央の疎水性ラインの幅は１ｍｍである）。ＯＴＳ（ＳＡＭ）で被覆された酸化ケイ素表面上の水の接触角を測定したところ約１１００であった。
【０２３０】
厚いレジストを用いたリソグラフィを行うことによって、ガラスのエッチングされた流路に疎水性領域を限定することもできる。実験により、基板をＯＴＳ（ＳＡＭ）溶液に浸漬させる前に洗浄することが重要であることが判明した。洗浄が不適切である場合、表面を部分的に覆う膜になる。
【０２３１】
実施例１１
上記の実施例１０の結果によれば、疎水性パターンおよび親水性パターンによって、水性液体、特にそのような液体の微量液滴を基板表面上の位置を決定し、制御することができる。図２５は、単にこのパターン化技術を用いて液滴を複数の液滴に分裂させる様子を示している。上述の本発明の方法を用いて、疎水性セクタ（黒）と親水性セクタ（白）が交互に配置された同心パターンをシリコン基板に加えた（図２５Ａ、円の直径は１ｃｍである）。このパターン上に水滴を置き（図２５Ｂ）、ピペットを用いて余分な水を除去したところ、複数の液滴が互いに分離された（図２５Ｃ）。
【０２３２】
実施例１２
この例では、横入口から数ミリメートルから離れた位置にパターン化された幅が５００μｍの疎水性領域（またはパッチ）を有する直線状の流路（深さ２０〜４０μｍで幅１００〜５００μｍの範囲）を用いて、流路の内側に水の前面を位置させる実験について説明する。連続（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ピペット（Ｓｉｇｍａ、最小カウント０．５μｌ）を用いて入口に水を置き、表面力によって流路内に引き込んだ。調節された量の液体を入口に置いた場合、水の前面は疎水性パッチのところで停止した。しかし、流路が過負荷である場合、液体は疎水性パッチを越えて流れる可能性があった。この挙動は、断面積が比較的小さな流路で健著であった。
【０２３３】
液体がパッチを越えて流れないように、（図３に示されている疎水性パッチなどの）疎水性パッチを越えて流れる水を停止させる溢流流路を構成に導入した。前述のように、この流路の寸法、すなわち深さおよび幅をいろいろと変化させた。入口に置いた水は引き込まれ、交差点で分裂し２つの流れになる。この２つの前面は、主流路内の前面が疎水性パッチに達するまでほとんど等しい速度で移動する。主流路内の前面は疎水性パッチのところで停止するが、他方の前面は引き続き移動し続け、注入された余分な水を吸収する。この溢流流路設計を用いた場合、全範囲の様々な流路寸法について水性液体をうまく停止させることができる。
【０２３４】
実施例１３
図２６Ａ〜２６Ｅは、ヒータを用いた（動作時の）本発明の装置（９１０）の一態様の概略図および写真である。図２６Ａは、入口（９２０）に置かれた液体が疎水性界面のところで停止し、より具体的には液体隣接疎水性領域（９４０）のところで停止することを示している。発生する圧力が入口穴から離れる方向にのみ作用するように、入口ポート（９２０）および溢流ポート（９３０）を封鎖するかまたは余分な液体で大きな負荷をかけた。電圧を印加することによってヒータ抵抗器（９９１）を作動させた。電流によって抵抗加熱が生じ、その後、チャンバ（９８０）内の空気の温度が高くなり、したがって圧力が上昇する。圧力が特定の値に達した後、微量液滴は分裂し疎水性パッチを越えて移動する（図２６Ｂ）。液滴は、ヒータがオンであるかぎり移動し続け、移動するにつれて液滴の速度は低下していく。本発明は、この動作を実施するための機構によって制限されるものではないが、追加の体積（液滴を移動させた体積）によって圧力が低下すると考えられる。
【０２３５】
移動する液滴をある位置で停止するかまたは遮るには、２つのストラテジーを用いることができる。第１の方法では、入口ポートおよび溢流ポートを大気に対して開放し、ヒータをゆっくりとオフにする。チャンバの内側の温度が急速に室温近くまで下がり、それによってチャンバ内の圧力も低下する。入口からの水がチャンバに流れ込み圧力が解放される（図２６ｃ）。第２の方法では、疎水性排気口をチャンバから右側に離れた位置に配置した。移動する液滴が疎水性排気口を越えた（図２６Ｄ）直後に、液滴はそれ以上の移動を停止する（図２６Ｅ）。この瞬間にチャンバを室温に冷却すると、空気が排気口を通って戻り、チャンバ内の低い圧力を解放する。
【０２３６】
上記のことから、本発明の組成、装置、および方法では、エッチングされたチャンバ、流路、およびヒータを用いたオンチップ作動が可能であることが明らかである。機械的な可動部品は必要とされず、パターンの製造は容易である。上述の動作は簡単な設計に関する動作であるが、本発明では、複数の試料を導入し、複数の液滴を移動させる（別々の個別の液滴を同時に移動させることを含む）より複雑な装置が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一体化された分析システムの概略図である。
【図２】本発明のシリコン装置の２分割構成手法を示す。
【図３】気体源からの気体を用いてナノリットル体積の液体試料を分裂させ移動させる装置の一態様の概略図である。
【図４】内部で気体圧力を生成することによって微量液滴を分裂させ、移動させ、停止させる本発明の装置の一態様の概略図である。
【図５】閉鎖された流路内の熱によって誘導される液体微量液滴の動きの原則を示す概略図である。
【図６】図６Ａは、２つの微量液滴がＹ流路の分岐内の微量液滴の開始位置にある、ビデオテープの選択されたフレームを示す。図６Ｂは、２つの微量液滴の左界面を加熱することによる移動を示す。図６Ｃは、交差における微量液滴を示す。図６Ｄは、微量液滴同士を合体して組み合わされた微量液滴を形成することを示す。図中の白い矢印は、各微量液滴の後部メニスカスを示し、黒い矢印は先頭メニスカスを示す。
【図７】図７Ａは、シリコンウェーハの表面上のインレープロセスヒータ要素の顕微鏡写真である。図７Ｂは、インレープロセスヒータワイヤの断面図を示す走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である（矢印は付着したアルミニウム層、二酸化ケイ素層、窒化ケイ素層を示す）。図７Ｃは、ウェーハのエッチングされた表面が２つの流路の交差点のすぐ隣りにある断面図として示された、ウェットエッチングプロセスを用いてガラス上に形成された流路のＳＥＭである。
【図８Ａ】シリコン基板に結合されたガラス頂部を含む本発明の装置の一態様の概略図である。
【図８Ｂ】シリコン中に構成要素を製造する製造段階の一態様を示す概略図である。
【図８Ｃ】ガラス中に構成要素を製造する製造段階の一態様を示す概略図である。
【図９】図９Ａは、幅の広いエッチングされたガラス流路内のポリアクリルアミドゲルの電気泳動の顕微鏡写真である。図９Ｂは、シリコンウェーハ上に製造された１組の４つの添加拡散ダイオード放射検出器素子の顕微鏡写真である。図９Ｃは、３２Ｐ−標識ＤＮＡからの個々の崩壊現象を示す、放射検出器の出力のオシロスコープトレースである。
【図１０】微細流路計量装置の概略図である。
【図１１】微細流路内部の疎水性パッチで液体が停止する様子を示す。
【図１２】ナノリットル計量装置の写真である。
【図１３】液滴の湾曲からの入口への液体圧力の理論的な推定を示す。
【図１４】微細流路内の疎水性パッチにおける液体圧力の理論的な推定を示す。
【図１５】疎水性パッチにおける液体停止基準を示す。
【図１６】圧電液滴供給による液体導入を示す。
【図１７】液体分割圧力の理論的な推定を示す。
【図１８】流路の深さおよび幅が異なる様々な微細流路装置で測定された実験的な計量圧力を示す。
【図１９】様々な流路設計における公称液滴体積の関数としてプロットされた測定された液滴体積を示す。
【図２０】場合によっては阻害的な成分が直接ＰＣＲに添加されたＰＣＲ反応のゲル電気泳動の写真である。
【図２１】本発明の試験装置の一態様である。
【図２２】本発明の密閉可能な弁を製造する一態様の概略図である。
【図２３】本発明の可動密閉手段のレイアウトの一態様の概略図である。
【図２４】本発明の方法によってパターン化された疎水性領域および親水性領域の線によって分離された水滴を示す写真である。
【図２５】複数の液滴を形成するための、本発明の方法による簡単なパターン化を示す写真である。
【図２６】ヒータを用いた本発明の装置の一態様の概略図および写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004521315.tif 000173
【国際調査報告】
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2004521315.tif 000175
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