(57)【要約】生菌を検出および計数する方法。液体ゾルゲルプリカーサ内に組み入れられた１つまたは複数の標識を含む液体組成物を準備する。この液体ゾルゲルプリカーサ組成物を、薄い均一層として透明なスライドにコーティングする。分析対象である液体試料をフィルタに通し、そのフィルタをゾルゲルコーティングスライドに密着させることにより、その試料から微生物を分離する。そのフィルタを、微生物による標識の取込みを促進するのに適した時間および温度で、ゾルゲルコーティングスライドと共に同時にインキュベートする。微生物が取込んだ標識から検出可能なシグナルを発生させるために、ゾルゲルコーティングスライドを外部エネルギ源で照射する。微生物が発した検出可能シグナルの画像を取得し、それをコンピュータシステムで分析して、その微生物の同定および計数を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）液体ゾルゲルプリカーサ内に組み入れられた１つまたは複数の標識を含む液体組成物を準備するステップと、
ｂ）前記液体ゾルゲルプリカーサ組成物を、薄い均一層として透明なスライドにコーティングするステップと、
ｃ）分析すべき液体試料をフィルタに通し、前記フィルタをゾルゲルコーティングスライドに密着させることにより、前記試料から微生物を分離するステップと、
ｄ）前記フィルタおよび前記ゾルゲルコーティングスライドを、微生物による１つまたは複数の標識の取込みを促進するのに適した時間および温度にて、同時にインキュベートするステップと、
ｅ）微生物が取込んだ標識から検出可能なシグナルを発生させるために、前記ゾルゲルコーティングスライドを外部エネルギ源で照射するステップと、
ｆ）前記微生物が発する前記検出可能シグナルの画像を取得し、前記画像をコンピュータシステムで分析して、前記微生物の同定および計数を行うステップと、
を含む、生菌を検出および計数する方法。
【請求項２】
微生物が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エネルギ源が、可視光、蛍光灯、ＵＶ光、赤外光、電磁場、ソナー、超音波、電波、または短波放射線である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
微生物が、水、乳、食品、唾液、尿、咽喉培養試験、創傷、痰、胃内容物、または糞便から分離されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標識が、３−カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−クロロメチル−６，８−ジフルオロウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニドリチウム塩、２−ドデシルレゾルフィン、Ｅｌｆ−９７、フルオレセインジ−β−グルクロニド、５−（ペンタフルオロベンゾイルアミノ）フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、およびβ−トリフルオロメチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標識が、それ自体に抗生物質を付着または結合させて含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗生物質が、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ポリミキシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、トリメトプリム、リファンピシン、ペニシリンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標識が、リポソーム；フィルム；多分子層、網状、層状、葉状、螺旋状、管状および線維状の形状物；溶媒和したロッド；溶媒和したコイル；およびこれらの組み合わせとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ピリジンまたはＫ２ＳＯ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
計数される微生物の数が１０３ｍｌ−１未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
スライドおよびフィルタが、３０分〜６時間にわたり３５〜４４℃で、同時にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標準フレームグラバと、
アレイ状ＣＣＤカメラと、
顕微鏡と、
機械的ｘｙテーブルと、
自動焦点システムと、
蛍光灯発生源と、
を含む、微生物を同定および計数するシステム。
【請求項１３】
フレームグラバの速度が３０フレーム／秒であり、フレームサイズが６４０×４８０ｐｉｘｅｌである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
本質的に明細書内に記載されているように、生菌を同定および計数するための、１つまたは複数の標識を含む、多孔質ゾルゲルガラスの使用方法。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、多孔質ゾルゲルガラス内に取込まれた有機または無機物質を用いて、低濃度の生菌を迅速に検出および計数するための方法および組成物に関する。
（発明の背景）
微生物検出の研究では、安価で、迅速に、かつ高い信頼性および感度で検出できる検出装置を開発することが主な目的である。現在、微生物の検出には標準的な実験室検査を利用することができる。この検査の大半は、特定の微生物を一定時間増殖させる寒天培地を利用するものであり、通常、その培養には２４〜４８時間必要であり、培養して微生物を増殖させると、その存在を同定および定量化することができるようになっている。
【０００１】
こうした既存試験の場合、結果を得るために長い時間を要することが最大の問題である。例えば、水源が細菌で汚染されていることがわかった場合、その水源およびシステムを運転停止して、より価格の高い、別の水供給源を利用しなければならない。運転停止期間をより短くするには、微生物を迅速に検出しなければならない。医療分野では、抗生物質の投与を行うには必ず、細菌の同定および抗生物質感受性試験が必要であり、その試験結果を得るまでに７２〜９６時間かかる。この時間を短縮できれば、悪化を食い止め、患者を早く回復させることができる。食品および飲料業界では、原料および加工品を細菌汚染について日常的に検査している。試験結果を得るまでの培養時間が長いため、工程処理を迅速に行えず、品物の製造にも供給にも遅れが生じてしまう。培養時間を短縮できれば、インフラ基盤および労働力の節約を図ることができる。
【０００２】
この数年、細菌を１時間半〜１１時間で同定および計数するための方法がいくつか開発された。しかし、比較的単純な方法では大量の細菌（１ｍｌ試料当たり１０４以上）が必要であり、少量の細菌でも検出できる方法となると、今のところ高価で、大規模システムとしての利用が難しい。
米国特許第５，８１１，２５１号に、ＣＣＤシステムに基づいて生菌数を計数するシステムが開示されている。しかし、このシステムは、細菌の種類を区別することができないため、細菌の総数しか得られない。米国特許第５，９７２，６４１号および同第５，５１８，８９４号には、細菌数を決定するために統計学的方法を用いる迅速な腸内細菌検出システムが開示されている。この方法の場合、細菌数が少ないと、結果を得るまでに１１時間かかる。他の特許（米国特許第５，８９１，３９４号、同第５，８５８，６９７号、同第５，７６３，２０３号、同第５，７５１，８３９号および同第５，６６３，０５７号）には、蛍光およびレーザ発生源を用いる微生物検出方法が開示されている。これらの方法の欠点は、高価なレーザ発生源を使用すること、および、平滑ではないフィルタから微生物を直接検出するため、分析時に問題が起こることである。また、これらのシステムは携帯式ではなく、比較的価格も高い。
【０００３】
イムノアッセイ方法も、特定種類の微生物検出に用いられている（Ｌｅｅ他著、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｖｏｌ．５６、１５４１〜１５４６頁）。イムノアッセイ方法では、蛍光染料または放射性染料で標識化した特異抗体標識を用いて微生物を検出する。しかし、イムノアッセイ方法は、対象微生物ごとに抗体を生成しなければならないため、時間および費用がかかるという点で制約がある。
「ゾルゲル」は、金属酸化物を基に室温で製造される無機ガラスを指す用語である。その具体的処理には、セラミック材料のゾル（溶液）が加水分解、縮合および重合を経てゲル相に転換するステップが含まれる。このゾルゲル調製に一般に使用される出発原料は、有機無機ハイブリッドシリカまたは金属酸化物である。近年、ゾルゲル法は有機シランに適用されて、「室温ガラス」が形成されるようになった。ゾルゲル型材料は、数十オングストローム〜数十ナノメータの孔を含むため、その質量に対する面積比は、例えば１グラム当たり数百平方メートルという大きさとなっている。このゾルゲル材料は、ＵＶ波長に対しても透過性であり、粉末、モノリシックブロック、薄いシート、ファイバなどのさまざまな形状に容易に調製することができる。
【０００４】
さまざまな有機分子を基質培地内に取込むためにゾルゲル法による材料を使用することが、当技術分野においてこれまでに記載されている（Ａｖｎｉｒ他著、「Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｔｗｏ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」、Ｂｅｉｎ　Ｔ．編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　ＸＸＸ、１９９２年）。この技法を用いると、比較的影響を受け易い有機分子の構造を損なうことなく、有機分子を室温にてゾルゲル基質内に取込むことができる。また、取込まれた分子は、本来の物理学的および化学的性質をほとんどすべて保持しているため、ゾルゲル内の多孔構造を用いて、その分子を外部反応物に利用することができる。
【０００５】
米国特許第６，０２２，７４８号には、表面に分析物を選択的に結合させ、それに対応する色の変化を利用して分析物を直接検出する方法が開示されている。この検出は、ゾルゲル法を用いて金属酸化物ガラス内に包囲された固定化生体高分子材料内で行われる。この方法の欠点は、ゾルゲル内で目に見える色の変化を起こすことができるのは細菌が多い場合のみであるため、大量の細菌しか検出または計数できないということである。さらに、この方法では、微生物の生死とは無関係に、ゾルゲル表面に対するその微生物の結合を基にしているため、生菌と死菌との区別ができない。
【０００６】
Ａｒｍｏｎら（Ｊ．ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５１、２７９〜２８５頁）は、特殊化合物にドープしたゾルゲル上に大腸菌を塗り、大量の大腸菌を検出する方法を開示している。その化合物は、細菌内に取込まれると、特定波長にて細菌を光らせるものである。しかし、これは、所与試料に含まれる細菌を計数するには適した方法ではない。また、この方法では、微生物が少量の場合、これを検出することができない。
このように、当技術分野はこれまでのところ、微生物濃度が低くても信頼できるカウント数を得られる程度に十分に感度が高く、迅速な微生物計数方法を提供できていない。
【０００７】
そこで、本発明の１つの目的は、生菌を検出するための迅速かつ感度の高い方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、少ない試料内に見られる微生物の計数に有用な方法および組成物を提供することである。
本発明の他の目的および利点は、以下の記載により明らかになるであろう。
（発明の概要）
驚くべきことに、多孔質ゾルゲルガラス内に取込んだ有機または無機物質（以下、便宜上「標識」とする）を用いると、濃度が１０３ｍｌ−ｌ未満の生菌を２時間で検出および計数できることがわかった。これが本発明の１つの目的である。
【０００８】
本発明は、多孔質ゾルゲルガラス内に組み入れられた有機または無機物質（標識）を用いて、生菌を検出および計数する方法および組成物に関する。この微生物は、その標識を代謝させて、検出可能な放射線または蛍光を発するものである。したがって、ゾルゲルガラス上で、生菌を迅速に視覚化することができる。ゾルゲル表面は極めて平滑で透明であるため、高解像度の顕微鏡走査用にほぼ均一な焦点が得られる。
本発明の一好適実施形態によれば、ａ）液体ゾルゲルプリカーサ内に組み入れられた１つまたは複数の標識を含む液体組成物を準備するステップと、ｂ）その液体ゾルゲルプリカーサ組成物を、薄い均一層としてガラススライドなどの透明スライドにコーティングするステップと、ｃ）分析対象である試料をフィルタに通し、そのフィルタをゾルゲルコーティングスライドに密着させることにより、その液体試料から微生物を分離するステップと、ｄ）フィルタとゾルゲルコーティングスライドとを、３５〜４４℃で３０分〜６時間など、微生物による標識（１つまたは複数）の取込み促進に適した時間および温度にて、同時にインキュベートするステップと、ｅ）微生物が取込んだ標識から検出可能なシグナルを発生させるために、前記ゾルゲルコーティングスライドを外部エネルギ源で照射するステップと、ｆ）微生物が発した検出可能シグナルの画像を取得し、その画像をコンピュータシステムで分析して、その微生物の同定および計数を行うステップとが実行される。
【０００９】
本発明はさらに、有機または無機物質（標識）を含有する液体ゾルゲル混合物を調製する方法に関する。この標識は、同定対照である微生物により代謝されるものである。
本発明により検出できる腸内細菌類は実際のところ、大腸菌、エンテロバクター属菌、クレブジエラ属菌およびサイトロバクター属菌を含む広範囲にわたる細菌群である。腸内細菌類を、蛍光発色性または色素産生性物質である３−カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＵＧ）または４−クロロメチル−６，８−ジフルオロウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＤｉ　ＦＵＧ）を用いて、酵素β−ガラクトシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２３）の活動を検出することにより、同定する。
【００１０】
本発明によれば、蛍光発色性または色素産生性物質である４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ）、フルオレセインジβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド、リチウム塩（ＤｉＦＭＵＧＧｌｃＵ）、２−ドデシルレゾルフィン、Ｅｌｆ−９７、フルオレセインジ−β−グルコロニド（ＦＤＧＩｃＵ）、５−（ペンタフルオロベンゾイルアミノ）フルオレセインジ−β−Ｄ−グルコロニド（ＰＦＢ−ＦＤＧＩｃＵ）およびβ−トリフルオロメチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコロニドを用いて、大腸菌特異酵素であるβ−グルコロニダーゼ（ＧＵＳまたはＥＣ３．２．１．３１）の活動を検出することにより、大腸菌を同定する。
【００１１】
本発明の別の好適実施形態によれば、細菌の抗生物質耐性を確認するために、抗生物質材料をゾルゲル混合物内に組み入れる。特異抗生物質が含まれていても細菌が蛍光を発すれば、それは、その細菌が抗生物質に対して耐性であることを示していると理解されたい。特異抗生物質が含まれているために蛍光を発する細菌数が一部減少した場合には、一部耐性であることを示すことになる。クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ポリミキシン、ナリジクス酸、ノボビオシン、トリメトプリム、リファンピシン、ペニシリンといった抗生物質がゾルゲル混合物内に添加される。
【００１２】
本発明によれば、リポソーム；フィルム；多分子層、網状、層状、葉状、螺旋状、管状および線維状の形状物；溶媒和したロッド；溶媒和したコイル；およびこれらの組み合わせとして、標識を提供することができる。本発明によれば、ゾルゲル内にピルビン酸塩またはＫ２Ｓ０４を組み入れることにより、損傷を受けた、または変形した微生物を検出することも可能である。ピルビン酸塩またはＫ２Ｓ０４を用いて、塩素化され損傷を受けた腸内細菌類を蘇生または回復させられることが、当技術分野において知られている（「ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｉｎｅ−ｓｔｒｅｓｓｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｃｏｌｉｆｏｒｍ　ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｒｏｂｅｒｔ　Ａ　Ｄｕｎｃａｎｓｏｎ著、博士論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｈｏｄｅ　Ｉｓｌａｎｄ、１９９３年）。
【００１３】
本発明によれば、細菌吸収を促進するために、ゾルゲル溶液に１０〜１００ｐｐｍの濃度でポリリシンまたは同様の物質を添加することができる。
以上のみならず、本発明の他の特徴および利点は、好適実施形態に関する以下の例示的かつ非制限的実施例から、より明白になるであろう。
（好適実施形態の詳細な説明）
一好適実施形態によれば、本発明による細菌計数システムは、図１に示す構成要素を含む。すなわち、全体を（１）として示した、コンピュータに連結されている標準フレームグラバ、処理および制御ソフトウェア、およびモータおよび照明制御装置と、フレーム速度が３０ｆｐｓであり、フレームサイズが６４０×４８０である、標準アレイ状ＣＣＤカメラ（２）と、４００および／または１０００倍の倍率であり、自動焦点システムを備えた落射蛍光または蛍光顕微鏡（３）と、光源（４）と、ビームスプリッタ（５）と、機械的ｘｙテーブル（６）と、テーブル（６）上に配置されたフィルタ（７）とを含む。
【００１４】
本発明の別の好適実施形態では、標準ＣＣＤシステムではなく、５１２ｐｉｘｅｌ×５１２ｐｉｘｅｌのフレームサイズで、１３５フレーム／秒の速度に相当する、ラインサイズが５１２ｐｉｘｅｌで、ライン速度が７０ｋＨｚであるライン式ＣＣＤカメラと、特注信号同期化ハードウェアと、特注デジタル／アナログ信号処理ハードウェアとを含むＣＣＤライン手法を用いる。
便宜上、また本明細書内にて開示および請求している本発明の内容を理解し易くするために、以下で用いる略語を次のように定義する。
ＣＦＵ：コロニーの形成単位
ＭＵＧ：４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
ＦＤＧ：フルオレセインジβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
ＣＵＧ：３−カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
（実施例１）
ゾルゲルコーティングを施したガラススライドの準備
標準顕微鏡用スライドを石鹸水の中で３０分間静かにゆすって洗浄した後、水道水ですすぎ、３回蒸留した蒸留水でさらにすすぐ。次にこのスライドを培養器内にて（３６℃で）一晩乾燥させる。こうして洗浄した顕微鏡用スライドを使用するまで柔らかい紙で包んでおく。
【００１５】
ゾルゲル薄膜調製用の基準出発溶液を、純ピリジン０．９ｍｌ＋ＣＵＧ溶液（１００ｍＭ）０．２ｍｌ＋Ｈ２Ｏ０．１ｍｌとし、これを１分間攪拌した（小型磁石による）。基質が完全に溶解しなかった場合、混合物の上方相のみを使用した。この溶液０．８ｍｌを、メチルトリメトキシシラン（Ｆｌｕｋａ製ＭＴＭＳ）０．４ｍｌと混合した。この溶液全体を、さらに２分間磁気撹拌器でよく混合した。反応を開始させるために、ＨＣｌ０．１Ｍの３０μｌをこの溶液に添加して、５分間磁気撹拌器で混合した。
【００１６】
次に、この溶液４０μｌを、極細ピペットを用いてスライドに載せ、スピンコーティングによりガラス全体に均一に延ばした。こうしてコーティングを施したガラスを暗所で２４時間、乾燥条件下にて室温で乾燥させた。この最初の乾燥を終了した後、得られたゾルゲルコーティングスライドをアルミ箔で包囲し、冷所で保存した。
（実施例２）
４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール０．１ｍｌを０．０１６ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて、実施例１を繰返したところ、実施例１と同様の結果が得られた。
【００１７】
（実施例３）
大腸菌の同定および計数
大腸菌の培養菌を、２４時間３６℃にて培養液内で増殖させた。細菌数１０８／ｍｌの見積り濃度で細菌を植付けた溶液を無菌蒸留水で調製した。見積り濃度を細菌数１０９／１００ｍｌ、細菌数１０８／１００ｍｌ、細菌数１０７／１００ｍｌ、細菌数１０６／１００ｍｌ、細菌数１０５／１００ｍｌとする一連の溶液を調製した（各溶液につき３５０ｍｌ）。
【００１８】
水試料内で並行してメンブレンフィルタ法による試験を行い、すべての細菌濃度を確認した。この試験は、溶液を無菌プラスチック瓶内にて無菌蒸留水で正確に１：１０８まで希釈して行った。
所与試料内の細菌をカウントするため、その水試料をまずＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製フィルタ（０．４７μｍ、１３ｍｍ）を通して濾過した。次に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製フィルタを逆さまにしてゾルゲル表面上に配置した。フィルタとゾルゲルとを完全に接触させるために、微量の無菌水（１０μｌ）をフィルタ上に載せ、圧力（最大０．５ｋｇ／ｃｍ２）をかけた。
【００１９】
次に、２４時間３６℃にて、湿気のある容器（フィルタが渇いてゾルゲルから離れてしまわないように、湿らせたワットマン（Ｗａｔｔｍａｎ）パッドを入れた大型ぺトリ皿からなる）内でゾルゲルと共に細菌をインキュベートした。ミリポア製フィルタを廃棄し、スライドを、１０〜１５分間４４．５℃にて乾燥させた。
細菌を計数するため、ＬＰ４２０フィルタを使用した４００倍顕微鏡システム（落射蛍光照明システムおよび５０ｗ水銀ランプを備えたＺｅｉｓｓ製Ａｘｉｏｌａｂ）でゾルゲルスライドを観察した。自然蛍光を発する藻類があると、計数結果に誤差が生じる可能性があるため、この藻を排除するため、特定光波長を用いた（例えば、ＬＰ４２０フィルタ）。
【００２０】
ゾルゲルコーティングスライド上の５箇所を無作為に選んで、蛍光スポット写真を撮影した。図２は、ゾルゲル表面上の大腸菌を写した４００倍写真である。次に、画像処理ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ　Ｃｕｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ）を用いて、蛍光スポット数をカウントした。分析から得られたカウント数を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2004513628.tif 000002
顕微鏡で観察する面積がわかっているため、各スライドでカウントされた蛍光スポット数から、もとの溶液内に含まれていた細菌の初期量を正確に見積もることができる。
（実施例４）
Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓにより蛍光スポット数を計数するためのアルゴリズムの説明
ここで説明するアルゴリズムは、ゾルゲル画像に見られる細菌を検出および計数するために用いる１例である。このアルゴリズムの目的は、期待サイズの明るいスポットを検出することである。高周波数ノイズを削減するために、低域フィルタを用いた。画像分割を行い、黒い背景上に細菌の白い斑点が浮かび上がる２値画像を導き出した。この分割は、所定の一定閾値を用いて、その閾値を単純に適用することで行った。
【００２２】
この分析には、
Ａ）２値画像ラベリング処理を行い、細菌として認められる候補である斑点オブジェクトのリストを作成するステップと、
Ｂ）斑点リストの各要素について、幾何学的特徴（面積、対照度など）を算出するステップと、
Ｃ）サイズおよび対照度が期待値範囲外であった候補を除外するステップと、
Ｄ）幾何学的ふるいにかけた後に残った候補を計数するステップと、
が含まれる。
【００２３】
上記アルゴリズムのスクリプト例を図３に示す。これは、以下のステージを含むプロセスを図示したものである。
ステージ１：高周波数ノイズを削減するために低域フィルタを使用する。
ステージ２：画像分割により、黒い背景上に細菌の白い斑点を浮かび上がらせた２値画像を作成する。この分割は、所定の一定閾値を用いて、その閾値を単純に適用することで行う。必要であれば、自動および／または動的閾値設定法による計算を用いることができる。
ステージ３：２値画像ラベリング処理を行い、細菌として認められる候補である斑点オブジェクトのリストを作成する。
ステージ４：斑点リストの各要素について、幾何学的特徴（面積、対照度など）を算出する。
ステージ５：サイズおよび対照度が期待値範囲外であった候補を除外する。
ステージ６：幾何学的ふるいにかけた後に残った候補を計数する。
【００２４】
以上、例示を目的として、本発明の特定実施形態について説明してきたが、当業者であれば、本発明の趣旨および請求の範囲を逸脱することなく、さまざまな修正、変形および変更を加えて本発明を実施できることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の一好適実施形態による、微生物を同定および計数するシステムを示す図である。
【図２】
ゾルゲル表面に見られる大腸菌を示す、４００倍蛍光写真である。
【図３】
本発明の一好適実施形態によるプロセスを示すフローチャートである。
【図１】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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