(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）：【化１】2004507455.tif 000020の化合物、およびその医薬的に許容される塩について記載する。式（Ｉ）の化合物は、プロテインキナーゼ阻害剤であり、増殖性疾患、例えば、癌、炎症および関節炎の治療に有用である。またそれらは、アルツハイマー病および循環器病の治療にも有用であり得る。
2004507455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2004507455.tif 000019
［式中、
Ｒ１は水素原子、低級アルキル、塩素原子；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルアルキル；
Ｒ３は水素原子または低級アルキル；および
ｎは０、１または２］
の化合物または、その医薬的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ３は水素原子；
Ｒ２はアリールまたはヘテロアリール；
Ｒ４はアルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルアルキル；および
ｎは０、１または２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ３は水素原子；
Ｒ２はフェニル、４−ブロモ−２，６−ジフルオロフェニル、４−クロロ−２，６−ジフルオロフェニルまたは２，４，６−トリフルオロフェニルまたは４−メチル−２，６−ジフルオロフェニル；
Ｒ４は低級アルキル；および
ｎは１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１の化合物および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１の化合物と医薬的に許容される担体および所定の用量で処方した抗癌剤との組合せからなる医薬組成物。
【請求項６】
請求項１の化合物と医薬的に許容される担体および所定の用量で処方したｐ５３トランス活性化修飾因子との組合せからなる医薬組成物。
【請求項７】
請求項１の化合物のアポトーシス調節に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるアポトーシス調節方法。
【請求項８】
請求項１の化合物のプロテインキナーゼ阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるプロテインキナーゼ阻害方法。
【請求項９】
請求項１の化合物のサイクリン依存性キナーゼ阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるサイクリン依存性キナーゼ阻害方法。
【請求項１０】
請求項１の化合物のｃｄｃ２阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｃ２（ｃｄｋ１）阻害方法。
【請求項１１】
請求項１の化合物のｃｄｋ２阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ２阻害方法。
【請求項１２】
請求項１の化合物のｃｄｋ３阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ３阻害方法。
【請求項１３】
請求項１の化合物のｃｄｋ４阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ４阻害方法。
【請求項１４】
請求項１の化合物のｃｄｋ５阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ５阻害方法。
【請求項１５】
請求項１の化合物のｃｄｋ６阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ６阻害方法。
【請求項１６】
請求項１の化合物のｃｄｋ７阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ７阻害方法。
【請求項１７】
請求項１の化合物のｃｄｋ８阻害に効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなるｃｄｋ８阻害方法。
【請求項１８】
請求項４の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる増殖性疾患の治療方法。
【請求項１９】
請求項４の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる癌の治療方法。
【請求項２０】
請求項４の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる炎症、炎症性腸疾患または移植の拒絶反応の治療方法。
【請求項２１】
請求項４の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる関節炎の治療方法。
【請求項２２】
請求項５の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる増殖性疾患の治療方法。
【請求項２３】
請求項５の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる癌の治療方法。
【請求項２４】
請求項６の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる増殖性疾患の治療方法。
【請求項２５】
請求項６の組成物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することからなる癌の治療方法。
【請求項２６】
請求項１の少なくとも一つの化合物において効果のある量を、それを必要とする患者に投薬することからなるサイクリン依存性キナーゼ関連障害の治療方法。
【請求項２７】
請求項１の化合物の治療上効果がある量を、それを必要とする哺乳類種に投薬することを含む化学療法起因の脱毛症、化学療法起因の血小板減少症、化学療法起因の白血球減少症または粘膜炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤と、それらの増殖性疾患治療用途に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
通常の細胞増殖は、細胞周期制御機構を構成する一連のタンパク質で厳格に調節されている。細胞周期の過程を制御するのに重要な役割を担うタンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）である。ＣＤＫは、細胞周期および細胞増殖を支える推進力であるセリン／スレオニン プロテインキナーゼである。活性ＣＤＫ酵素は、少なくとも一つの触媒サブユニット（ＣＤＫ）と一つの調節サブユニット（サイクリン）からなる多サブユニット複合体である。（ブロクスらの文献［Ｂｒｏｏｋｓ および Ｌａ Ｔｈａｎｇｕｅ， ＤＤＴ， ４， ４５５−４６４ （１９９９）］参照。）ＣＤＫ活性阻害剤は、増殖性疾患（例えば癌）の治療に効果があることが見出されている。（ウェブスターらの文献［Ｗｅｂｓｔｅｒ および Ｋｉｍｂａｌｌ， Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ， ５， ４５−５９ （２０００）］参照。）
【０００３】
（発明の開示）
本発明はサイクリン依存性キナーゼの阻害剤として、式：
【化２】
2004507455.tif 000003
の化合物およびその医薬的に許容される塩の用途に関する。本明細書を通して、式Ｉにおいて用いられる記号は、以下の意味である。
Ｒ１は水素原子、アリールまたは低級アルキル；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルアルキル；
Ｒ３は水素原子または低級アルキル；および
ｎは０、１または２の整数である。
【０００４】
式Ｉの化合物は、プロテインキナーゼ阻害剤であり、増殖性疾患、例えば、癌、炎症および関節炎の治療および予防に有用である。これらの化合物はまた、アルツハイマー病のような神経変性疾患、循環器病、ウィルス性疾患および真菌性疾患の治療にも有用であり得る。
【０００５】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤としての式Ｉの化合物の利用方法を提供する。当該化合物は、増殖性疾患、例えば、これらに限られないが、癌、アルツハイマー病、関節炎、炎症および循環器病の治療において活性がある。また本発明は、このような化合物に用いるための医薬組成物についても意図している。
【０００６】
本発明の化合物を記述するのに用いられる様々な用語の定義は以下に挙げる。これらの定義は、個々にまたはより広範囲で、本明細書全体で用いられる用語に適用される（特定の例で他に限定されている場合を除く）。
【０００７】
原子価が空いているヘテロ原子は、水素原子でその原子価をすべて満たすと仮定していることを意味している。
【０００８】
カルボン酸陰イオンは、負電荷した基−ＣＯＯ−をいう。
【０００９】
特に定義しなければ、用語「アルキル」または「アルカ（ａｌｋ）」とは、１〜１２個の炭素原子を含む基から得られる単価のアルカン（炭化水素）をいう。用語「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子からなるアルキル基をいう。アルキル基は、適宜置換された直鎖、分枝または環状の飽和炭化水素基である。置換されている場合、アルキル基は置換可能なあらゆる位置で、Ｒとして定義される置換基が４個まで置換されていてもよい。アルキル基がアルキル基で置換されているという場合は、これは互換的に「分枝アルキル基」として用いる。典型的な無置換のそのような基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルおよびその類似体が含まれる。典型的な置換基には、以下に掲げる基を１またはそれ以上含んでいてもよい。ただし、これらに限られるものではない。置換基の例としては、ハロ（例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）、ハロアルキル（例えばＣＣｌ３またはＣＦ３）、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルＳ（Ｏ）ｍ（ｍ＝０，１，２）、アリールＳ（Ｏ）ｍ（ｍ＝０，１，２）、ヒドロキシ、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、アルキルオキシカルボニル（−ＣＯＯＲ’）、アルキルカルボニルオキシ（−ＯＣＯＲ’）、アミノ（−ＮＨ２）、四級窒素、カルバモイル（−ＮＨＣＯＯＲ’−または−ＯＣＯＮＨＲ’−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨＲ’−）、チオール（−ＳＨ）、シアノまたはニトロである。また定義されるアルキル基には、１またはそれ以上の炭素・炭素の二重結合、または１またはそれ以上の炭素・炭素の三重結合を含んでいてもよい。
【００１０】
用語「アルケニル」とは、２〜１２個の炭素原子を含む直鎖、分枝または環状の炭化水素基で、少なくとも１個の炭素・炭素の二重結合を含むものをいう。
【００１１】
用語「アルキニル」とは、２〜１２個の炭素原子を含む直鎖、分枝または環状の炭化水素基で、少なくとも１個の炭素・炭素の三重結合を含むものをいう。
【００１２】
シクロアルキルとは、３〜１５個の炭素原子を含むアルキルの一種で、炭素原子間で交互するまたは共鳴する二重結合はないものである。それは、１〜４環含んでいてもよい。典型的な無置換のそのような基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。典型的な置換基には以下に掲げる基、すなわちハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、チオールおよび／またはアルキルチオの中から選択される１またはそれ以上の基が含まれる。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「アルコキシ」または「アルキルチオ」とは、酸素結合（−Ｏ−）または硫黄結合（−Ｓ−）を介してそれぞれ結合している上述のアルキル基を示す。
【００１４】
本明細書で用いられる用語「アルキルオキシカルボニル」とは、カルボニル基を介して結合するアルコキシ基を示す。アルコキシカルボニル基は、式−Ｃ（Ｏ）ＯＲで表わされ、この中でＲ基は直鎖または分枝のＣ１−６のアルキル基である。
【００１５】
用語「アルキルカルボニル」とは、カルボニル基を介して結合しているアルキル基をいう。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「アルキルカルボニルオキシ」とは、酸素結合を介して結合しているアルキルカルボニル基を示す。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「アリールアルキル」とは、上述のアルキル基を介して結合している芳香族環を示す。
【００１８】
用語「アリール」とは、単環または二環式環をいい、例えば、フェニル、置換フェニルおよびその類似体、同様に縮合した環状基、例えばナフチル、フェナントレニルおよびその類似体をいう。かかるアリール基には少なくとも６原子を有する少なくとも１環が含まれ、上限は、かかる環が５個まで存在し、その中に２２個まで原子が含まれ、隣接する炭素または相応するヘテロ原子の間で交互（共鳴）する二重結合を有する場合が含まれる。アリール基としては、それらに限られないが、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、アルキルオキシカルボニル、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、シクロアルキル、シアノ、アルキルＳ（Ｏ）ｍ（ｍ＝０，１，２）またはチオールを含む１またはそれ以上の基で、適宜置換されていてもよい。
【００１９】
用語「ヘテロアリール」とは、少なくとも１つのヘテロ原子（酸素、硫黄または窒素）を含む、５個または６個の環上原子を有する単環式芳香族炭化水素基、または８〜１０個の原子を有する二環式芳香族環基をいう。当該環化合物においては、炭素または窒素が結合する部位であり、そしてさらに別の１または２個の炭素原子が、酸素または硫黄から選ばれるヘテロ原子で適宜置換されていてもよく、さらに１〜３個の炭素原子が、窒素へテロ原子で適宜置換され、該へテロアリール基は、本明細書での記載のように適宜置換されていてもよい。付加の窒素原子は、当初の窒素および酸素または硫黄とともに存在していてもよい。典型的なヘテロアリール基には以下に掲げるものが含まれる。すなわち、チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピペリジニル、チアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジナール、トリアジニルアゼピニル、インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾフラザニルおよびテトラヒドロピラニルである。典型的な置換基には、以下に掲げるものが１またはそれ以上含まれる。すなわち、ハロ、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、シクロアルキル、ニトロ、シアノ、アミノ、アルキルＳ（Ｏ）ｍ（ｍ＝０，１，２）またはチオールである。本明細書で用いられる用語「ヘテロアリールアルキル」とは、これまでに説明したアルキル基を介して結合しているヘテロアリール環を示す。
【００２０】
用語「ヘテロアリリウム」とは、四級窒素原子とこれによる陽電荷を有するヘテロアリール基をいう。
【００２１】
用語「ヘテロシクロアルキル」とは、環上の炭素原子の一つを、酸素、硫黄または窒素から選ばれるヘテロ原子と置換されているシクロアルキル基（非芳香族）をいい、この中で３個までさらに炭素が該へテロ原子で置換されてもよい。さらに、硫黄がスルホン（−ＳＯ２−）またはスルホキシド（−ＳＯ−）に酸化されていても、窒素が四級化されていてもよい。
【００２２】
用語「四級窒素」とは、四価の陽電荷した窒素原子のことをいい、例えばテトラアルキルアンモニウム基の陽電荷した窒素（例えば、テトラメチルアンモニウム、Ｎ−メチルピリジニウム）、プロトン化したアンモニウム種の陽電荷した窒素（例えば、トリメチルヒドロアンモニウム、Ｎ−ヒドロピリジニウム）、アミンのＮ−オキシドの陽電荷した窒素原子（例えば、Ｎ−メチル−モルホリン−Ｎ−オキシド、ピリジン−Ｎ−オキシド）、およびＮ−アミノ−アンモニウム基の陽電荷した窒素原子（例えば、Ｎ−アミノピリジニウム）をいう。
【００２３】
用語「ヘテロ原子」とは、独立して選択された酸素、硫黄、リンまたは窒素を意味する。
【００２４】
用語「ハロゲン」または「ハロ」とは、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素をいう。
【００２５】
用語「ＰＭＢ」とは、パラ−メトキシベンジルをいう。
【００２６】
官能基が「保護された」と記載されているときは、これはその官能基が保護された部位で望まない副反応が起こるのを防ぐような形状に修飾することを意味している。本発明における化合物の好適な保護基としては、当該技術分野の技術のレベルを考慮した本出願から理解されるものであり、そしてグリーンらの著書［Ｇｒｅｅｎｅ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎ． Ｙ． （１９９１）］のような標準的な教科書も参考になる。
【００２７】
無機酸または有機酸による本発明に関する化合物の塩の好適な例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩およびリン酸塩である。医薬的な使用として不適切な塩であるが利用可能な塩、例えば塩フリーである化合物Ｉまたは医薬的に許容されるそれらの塩の単離・精製のために用いられるようなものも、これらの塩に含まれる。
【００２８】
本発明の化合物におけるすべての立体異性体は、混合物または純粋若しくはほぼ純粋の形態のいずれかと考えられる。本発明についての化合物の定義では、すべての可能な立体異性体およびその混合物を含むものである。そして、記載した活性を有するラセミ体および単離された光学活性体を、顕著に含むものである。ラセミ体は物理的方法、例えば分別結晶化、ジアステレオマー誘導体分離または結晶化、または光学活性カラムクロマトグラフィーで分割することができる。個々の光学異性体は、常法、例えば光学活性な酸で塩を形成し、引き続いて結晶化するような方法で、ラセミ化合物から得ることができる。
【００２９】
本発明には、式Ｉの化合物におけるプロドラッグの形態が含まれていると理解すべきである。プロドラッグの様々な形態は、当該技術においてよく知られている。このようなプロドラッグ誘導体の例は、以下に掲げる参照文献に記載されている。
（ａ）Ｈ．バンドガードの著書［Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５）］およびＫ．ワイダーらの著書［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４２， ｐｐ． ３０９−３９６， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋ． Ｗｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８５）］
（ｂ）クロスガード−ラーセンらの著書［Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５，”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，”ｂｙ Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， ｐｐ． １１３−１９１ （１９９１）］
（ｃ）Ｈ．バンドガードの文献［Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ８， ｐｐ． １−３８ （１９９２）］
（ｄ）Ｈ．バンドガードらの文献［Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ７７， ２８５ （１９８８）］
（ｅ）Ｎ．カイエカらの文献［Ｎ． Ｋａｙｅｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒ． Ｂｕｌｌ．， ３２， ６９２ （１９８４）］
【００３０】
式Ｉの化合物における溶媒和物（例えば、水和物）もまた、本発明の範囲内であると理解すべきである。溶媒和の方法は、一般的に当該技術において知られている。それゆえ、本発明の化合物は、フリーな形態であっても水和された形態でもよく、以下に掲げる反応式で例示される方法で得ることができる。
【００３１】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤として用いられる式Ｉの化合物は、式ＩＩ：
【化３】
2004507455.tif 000004
の化合物を水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムのような塩基と反応させて調製することで、式ＩＩａ：
【化４】
2004507455.tif 000005
の遊離塩基を得ることができる。
【００３２】
化合物ＩＩａは、高温、好ましくは約１３０℃で、減圧下、式ＩＩＩ：
【化５】
2004507455.tif 000006
の化合物と反応することで、式ＩＶ：
【化６】
2004507455.tif 000007
の化合物を得る。
【００３３】
式ＩＩの出発化合物で、Ｒ１が水素である場合、ＴＨＦのような溶媒中、アクリロニトリルとヒドラジン水和物との反応、それに続くｐ−メトキシベンズアルデヒドの付加により調製される。この反応から得られた化合物を、その後ｎ−ブタノール中のｎ−ブトキシナトリウム混液で反応し、それに続く塩酸の処理で、化合物ＩＩの初期の鍵中間体が得られる。
【００３４】
式ＩＶの化合物は、その後高温、好ましくは約２２０℃から２６０℃で、ジフェニルエーテルのような溶媒の存在下反応して、式Ｖ：
【化７】
2004507455.tif 000008
の化合物を得る。
【００３５】
その後、化合物Ｖは、高温、好ましくは約９５℃で、水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液のような水溶性の塩基と反応して、式ＶＩ：
【化８】
2004507455.tif 000009
の化合物を得る。
【００３６】
化合物ＶＩは、高温、好ましくは約２３０℃で攪拌して、式ＶＩＩ：
【化９】
2004507455.tif 000010
の化合物を得る。
【００３７】
式ＶＩＩの化合物は、エタノールのような溶媒の存在下、好ましくは約０℃で、臭素と反応して、式ＶＩＩＩ：
【化１０】
2004507455.tif 000011
の化合物を得る。
【００３８】
その後、化合物ＶＩＩＩは、約２５℃から１３０℃の温度で、オキシ塩化リンと反応して、式ＩＸ：
【化１１】
2004507455.tif 000012
の化合物を得る。
【００３９】
化合物ＩＸは、テトラヒドロフラン、Ｒ４ＯＨおよびその類似体のような溶媒の存在下、約２５℃から９０℃の温度で、式Ｘ：
ＭＯＲ４　（Ｘ）
［式中、
Ｍはナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属であり、
Ｒ４は上記のとおりである］
の化合物と反応して、式ＸＩ：
【化１２】
2004507455.tif 000013
の化合物を形成する。
【００４０】
式ＸＩの化合物は、約−９０℃から−２０℃の温度で、テトラヒドロフラン、エーテルおよびその類似体のような溶媒中、ｎ−ブチルリチウムのような有機リチウム試薬と反応し、それに続く式ＸＩＩ：
Ｒ２ＳＳＲ２　（ＸＩＩ）
（式中、Ｒ２は上記のとおりである）
の化合物との処理により、式ＸＩＩＩ：
【化１３】
2004507455.tif 000014
の化合物を得る。
【００４１】
式ＸＩＩＩの化合物は、その後、
（１）約２５℃から９０℃の温度でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような酸と反応するか、または、
（２）パラジウム炭素のような触媒の存在下、水素と反応して、
式Ｉ：
【化１４】
2004507455.tif 000015
（式中ｎは０）の化合物を得る。
【００４２】
式Ｉ（式中ｎは１または２）の化合物は、塩化メチレンのような溶媒の存在下、ｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）やその類似体のような酸化剤を用いて、式Ｉ（式中ｎは０）の化合物を酸化することで、調製され得る。一般に、１当量の酸化剤を用いれば、式Ｉ（式中ｎは１）の化合物が得られ、２当量またはそれ以上の酸化剤を用いれば、式Ｉ（式中ｎは２）の化合物が得られる。
【化１５】
2004507455.tif 000016
【００４３】
本発明の中間体は、米国特許第３，８２８，０５７号、第３，９６６，７４６号、第３，９７９，３９９号および第３，９８５，７５７号（これらは本明細書の引例を構成する）に開示された方法によっても調製され得る。さらには、式ＩＩの中間体は、ホーエンの文献［Ｈｏｅｈｎ， Ｈ．， Ｚ． Ｃｈｅｍ． １０， ｐｐ． ３８６−３８８ （１９７０）］に記載された方法で調製され得る。
【００４４】
式ＩＩおよびＩＩＩの化合物は購入可能であり、また当該技術における通常の技法の一つとして知られる方法により調製され得る。
【００４５】
他のすべての化合物は、本明細書に記載の方法の変法で調製され得る。
【００４６】
式Ｉの好適な化合物は、式中、
Ｒ１およびＲ３が水素；
Ｒ２がアリールまたはヘテロアリール；
Ｒ４がアルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキルアルキル；および
ｎが０、１または２の整数である、
化合物である。
【００４７】
式Ｉのさらにより好適な化合物は、式中、
Ｒ１およびＲ３が水素；
Ｒ２がフェニル、４−ブロモ−２，６−ジフルオロフェニル、４−クロロ−２，６−ジフルオロフェニル、２，４，６−トリフルオロフェニルまたは４−メチル−２，６−ジフルオロフェニル；
Ｒ４が低級アルキル；および
ｎが１である、
化合物である。
【００４８】
本発明に関する化合物は、薬理的特性がある。特に式Ｉの化合物は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）（例えばｃｄｃ２（ｃｄｋ１）、ｃｄｋ２およびｃｄｋ４）のようなプロテインキナーゼの阻害剤である。新規な式Ｉの化合物は、癌、炎症、関節炎、アルツハイマー病および循環器病のような増殖性疾患の治療に有効であると期待されている。これらの化合物はまた、局所または全身性真菌感染の治療にも有用であり得る。
【００４９】
とりわけ、式Ｉの化合物は、下記を含む様々な癌の治療に有用である（ただし、これらに限られない）。
−癌（膀胱癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頚部癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌）
−リンパ系の造血系腫瘍（急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）
−骨髄系の造血系腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病）
−間葉由来の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫）
−その他の腫瘍（メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫）
【００５０】
一般に細胞増殖の制御におけるｃｄｋの重要な役割によって、阻害剤は、異常細胞増殖、例えば、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成術または血管外科手術の後に起こる再狭窄、肥大性瘢痕形成、炎症性腸疾患、移植の拒絶反応、血管形成、およびエンドトキシンショックに特徴的であるあらゆる疾病過程の治療に有用であるような、可逆性細胞分裂停止剤として作用するかも知れない。
【００５１】
式Ｉの化合物は、ｃｄｋ５がタウタンパク質のリン酸化において含まれるという最近の発見に示されているように、アルツハイマー病の治療にも有用であり得る（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １１７，７４１−７４９ （１９９５））。
【００５２】
式Ｉの化合物は、他のプロテインキナーゼ、例えば、プロテインキナーゼＣ、ｈｅｒ２、ｒａｆ１、ＭＥＫ１、ＭＡＰキナーゼ、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＰＩ３キナーゼ、ｗｅｅ１キナーゼ、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、ＶＥＧＦおよびｌｃｋの阻害剤としても作用し得る。従って、他のプロテインキナーゼと関連のある疾患の治療にも効果があり得る。
【００５３】
式Ｉの化合物はまた、通常の発育および恒常性維持に危機をもたらす生理的細胞死過程であるアポトーシスを誘発または阻害もする。アポトーシス経路が変化することは、ヒトの様々な疾病の病原論に役立つものである。アポトーシスの修飾物質である式Ｉの化合物は、癌（これらに限られないが、特に、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異による癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、および家族性大腸ポリープ症のような前癌性病変）、ウイルス感染（これらに限られないが、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、シンドビスウイルスおよびアデノウイルスを含む）、自己免疫疾患（これらに限られないが、全身性エリテマトーデス、免疫性糸球体腎炎、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患および自己免疫性糖尿病を含む）、神経変性障害（これらに限られないが、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症および小脳変性を含む）、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、再生不良性貧血、心筋梗塞、脳卒中および再灌流傷害に関連する虚血性傷害、不整脈、アテローム性動脈硬化症、毒素誘発性またはアルコール誘発性肝疾患、血液病（これらに限られないが、慢性貧血および再生不良性貧血を含む）、筋骨格組織の変性疾患（これらに限られないが、骨粗鬆症および関節炎）、アスピリン感受性副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎臓疾患、および癌疼痛を含むアポトーシスにおける異常を伴った様々なヒトの疾病の治療に有用となる。
【００５４】
本発明の化合物は、放射線療法のような公知の抗癌治療との併用にも有用となり得る。また、細胞分裂停止薬および細胞障害性薬、例えば、これらに限られないが、シスプラチンまたはドキソルビシンのようなＤＮＡ相互作用薬、米国特許第６，０１１，０２９号に記載されているようなファルネシルプロテイントランスフェラーゼ、エトポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＣＰＴ−１１またはトポテカンのようなトポイソメラーゼＩ阻害剤、パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポチロン類のようなチューブリン安定化剤、タモキシフェンのようなホルモン剤、５−フルオロウラシルのようなチミジル酸合成酵素阻害剤、メトトレキサートのような代謝拮抗剤、アンジオスタチンまたはエンドスタチンのような血管新生阻害剤、およびｈｅｒ２特異抗体のようなキナーゼ阻害剤との合剤にも有用となり得る。本発明の式Ｉの化合物はまた、ｐ５３トランス活性化修飾因子との合剤に有用でもあり得る。さらに、式Ｉの化合物は、化学療法起因の脱毛症、化学療法起因の血小板減少症、化学療法起因の白血球減少症または粘膜炎の治療にも用いられ得る。化学療法起因の脱毛症の治療には、式Ｉの化合物が、ゲル、シャンプー、エアゾル、粉塵、クリーム、軟膏、溶液、分散またはペーストのような薬物の処方において、好適に局所で適用される。
【００５５】
所定の用量で処方するなら、かかる合剤は、本発明の化合物を後述の用量の範囲内で用い、他の医薬活性剤を認可された用量の範囲で用いる。例えば、ｃｄｃ２阻害剤オロムシンは、アポトーシスを引き起こす公知の細胞障害性薬と相乗的に作用することが見出されている［Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０８， ２８９７ （１９９５）］。式Ｉの化合物は、合剤処方が不適当な場合は、公知の抗癌剤または細胞障害剤と連続的に用いられ得る。
【００５６】
ｃｄｃ２／サイクリンＢ１キナーゼアッセイ
ｃｄｃ２／サイクリンＢ１キナーゼ活性は、ヒストンＨＩへの３２Ｐの取り込みをモニターして測定した。反応物は、ＧＳＴ−ｃｄｃ２で表されるバキュロウイルス ５０ｎｇ、ＧＳＴ−サイクリンＢ１で表されるバキュロウイルス ７５ｎｇ、ヒストンＨＩ（ベーリンガー マンハイム） １μｇ、３２Ｐ γ―ＡＴＰ ０．２μＣｉおよびキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．５ｍＭ ＤＴＴ）中のＡＴＰ ２５μＭより構成した。反応物を３０℃で３０分間インキュベートし、その後、冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終的に１５％の濃度になるまで加えて反応を終了し、氷上２０分間インキュベートした。反応液をＧＦ／Ｃユニフィルタープレート（パッカード）上で、パッカード フィルターメイト ユニバーサル ハーベスタを用いて収集し、フィルターをパッカードトップカウント９６穴液体シンチレーションカウンターでカウントした（マルシャクらの文献参照［Ｍａｒｓｈａｋ， Ｄ． Ｒ．， Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ， Ｍ． Ｔ．， Ｂａｅ， Ｙ． Ｓ．， Ｙｕ， Ｉ． Ｊ．， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４５，３９１−４００ （１９９１）］、これらは本明細書の引例を構成する）。
【００５７】
ｃｄｋ２／サイクリンＥキナーゼアッセイ
ｃｄｋ２／サイクリンＥキナーゼ活性は、網膜芽細胞腫タンパク質への３２Ｐの取り込みをモニターして測定した。反応物は、ＧＳＴ−ｃｄｋ２／サイクリンＥで表されるバキュロウイルス ２．５ｎｇ、細菌的に生成したＧＳＴ−網膜芽細胞腫タンパク質（ａａ ７７６−９２８）５００ｎｇ、３２Ｐ γ―ＡＴＰ ０．２μＣｉおよびキナーゼ緩衝液（５０ｍＭヘペス，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中のＡＴＰ ２５μＭより構成した。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、その後、冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終的に１５％の濃度になるまで加えて反応を終了し、氷上２０分間インキュベートした。反応物をＧＦ／Ｃユニフィルタープレート（パッカード）上で、パッカード フィルターメイト ユニバーサル ハーベスタを用いて収集し、フィルターをパッカードトップカウント９６穴液体シンチレーションカウンターでカウントした。
【００５８】
ｃｄｋ４／サイクリンＤ１キナーゼ活性
ｃｄｋ４／サイクリンＤ１キナーゼ活性は、網膜芽細胞腫タンパク質への３２Ｐの取り込みをモニターして測定した。反応物は、ＧＳＴ−ｃｄｋ４で表されるバキュロウイルス １６５ｎｇ、Ｓ標識サイクリンＤ１として細菌的に表されるもの５００ｎｇ、細菌的に生成したＧＳＴ−網膜芽細胞腫タンパク質（ａａ ７７６−９２８）５００ｎｇ、３２Ｐ γ―ＡＴＰ ０．２μＣｉおよびキナーゼ緩衝液（５０ｍＭヘペス，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ）中のＡＴＰ ２５μＭより構成した。反応物を３０℃で１時間インキュベートし、その後、冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終的に１５％の濃度になるまで加えて反応を終了し、氷上２０分間インキュベートした。反応液をＧＦ／Ｃユニフィルタープレート（パッカード）上で、パッカード フィルターメイト ユニバーサル ハーベスタを用いて収集し、フィルターをパッカードトップカウント９６穴液体シンチレーションカウンターでカウントした（コレマンらの文献参照［Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｋ． Ｇ．， Ｗａｕｔｌｅｔ， Ｂ． Ｓ．， Ｍｏｒｉｓｓｅｙ， Ｄ， Ｍｕｌｈｅｒｏｎ， Ｊ． Ｇ．， Ｓｅｄｍａｎ， Ｓ．， Ｂｒｉｎｋｌｅｙ， Ｐ．， Ｐｒｉｃｅ， Ｓ．， Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｋ． Ｒ．（１９９７） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ４ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ， ａｎｄ ｐｌ６ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ３０： １８８６９−１８８７４］、これらは本明細書の引例を構成する）。
【００５９】
さらに、本発明の課題事項は、癌、炎症および関節炎の制御を含む上記のような使用のための医薬品も含み、それらには、上記で定義した式Ｉの化合物の少なくとも１つ、または医薬的に許容できる酸付加塩の少なくとも１つを含み、癌、炎症および／または関節炎に対して含まれる、先に記載しているような増殖性疾患に対する活性を有する医薬品の調製方法として上記に定義されているような式Ｉの化合物の使用も含む。
【００６０】
次に掲げる実施例は、限定例を示すのでなく、むしろ実例を示している。本明細書に書き添えられている請求項で定義された発明の意図および範囲には、他の具体例が含まれる得ることを認識すべきである。
【００６１】
実施例
実施例１
１−（４−ブトキシ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）−１’−フェニルスルホキシド
【化１６】
2004507455.tif 000017
【００６２】
Ａ．４−ヒドロキシ−１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸
４−ヒドロキシ−１［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボン酸エチルエステル（５．２０ｇ，１５．９ｍｍｏｌ，調製方法はＷＯ ９９／３０７１０参照。）のエタノール（２０ｍＬ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０ｍＬ）との溶液を９５℃で１８時間攪拌した。反応混液を室温まで冷却し、１Ｍ塩酸水溶液（〜７０ｍＬ）を加えてｐＨ＝１まで酸性にした。生じた沈殿物をろ過して単離した。その固形物を水で洗浄し、１００℃で終夜減圧乾燥し、パートＡの化合物を白色固形物として得た（４．４８ｇ，９４％）。融点：２２０℃（分解）
【００６３】
Ｂ．１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−オン
パートＡの化合物（３．１８ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下１５分間２３０℃に加熱した。加熱下、当該固形物は融解し、気体の放散が観察された。当該物質を室温まで冷却して、パートＢの化合物をこはく色のガラス状として得た（２．７１ｇ，１００％）。
【００６４】
Ｃ．５−ブロモ−４−ヒドロキシ−１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
氷浴で冷やしたパートＢの化合物（２．７０ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）の無水エタノール（６０ｍＬ）溶液に、臭素（２．０ｇ，１２ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液を５分間かけて滴下して加えた。沈殿物が生じた。反応は完結しておらず、１時間後に臭素（０．３ｍＬ）を追加した。反応混液さらに１時間攪拌し、その後５％重曹水５０ｍＬをゆっくり加えた。反応液を室温まで加温し、１５分後減圧濃縮してスラリー状物を得た。固体物質をろ過して集め、水で洗浄し、その後９０℃で終夜減圧乾燥し、パートＣの化合物を淡ベージュ色の固形物として得た（３．４３ｇ，９７％）。融点：２０９℃（軟化）
【００６５】
Ｄ．５−ブロモ−４−クロロ−１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
オキシ塩化リン（２０ｍＬ）中のパートＣの化合物（２．９２ｇ，８．７４ｍｍｏｌ）の混合物を１１０℃で１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後氷浴につけて、氷（３００ｇ）をゆっくり加えた。１５分後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えた後５０％水酸化ナトリウム溶液（〜５０ｍＬ）をゆっくり加えてｐＨ＝７にした。反応混液をすべて分液ロートに移した。水層を分離し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層合わせて食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（無水硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して、その後９０℃で減圧乾燥して、パートＤの化合物を黄褐色の固形物として得た（２．９４ｇ，９５％）。
【００６６】
Ｅ．５−ブロモ−４−ブトキシ−１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
水素化ナトリウム分散系（６６０ｍｇ，油状中６０％，１６ｍｍｏｌ）からヘキサンで３回洗浄して油を除き、その後乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）で覆った。当該混合物を５０℃に加熱して、２回に分けて合計２．３ｍＬ（２５ｍｍｏｌ）の無水ｎ−ブタノールを加えた。反応混合液を気体が放散し終わるまで攪拌し（〜３０分）、その後室温まで冷却した。生じた溶液にパートＤの化合物（２．９２ｇ，８．２８ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で２時間攪拌し、その後室温まで冷却し減圧乾燥して固形物を得た。当該固形物を水（５０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍＬ）で分割した。有機層を分離し、食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（無水硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して、褐色の固形物を得た。当該粗固形物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル／ヘキサン １：５）で精製し、パートＥの化合物を白色固形物として得た（２．７５ｇ，８６％）。融点：８１−８３℃
【００６７】
Ｆ．４−ブトキシ−５−チオフェニル−１−［（４−メトキシフェニル）メチル］−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン
−７８℃に冷却したパートＥの化合物（１９５ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、ｎ−ブチルリチウム溶液（２．５Ｍヘキサン溶液，０．３０ｍＬ，０．７５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。０．５時間後、二硫化フェニル（２１８ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液を加えた。反応混液を−７８℃で６時間攪拌した後、硫酸水素ナトリウム水溶液を加えてクエンチした。反応混液を重曹水と塩化メチレンで分割した。有機層を分離し、乾燥し（無水硫酸ナトリウム）、減圧濃縮した。当該粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル／ヘキサン １：１９で、その後１：４）で精製し、パートＦの化合物を黄色油状物として得た（６０ｍｇ，２９％）。
【００６８】
Ｇ．４−ブトキシ−５−チオフェニル−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン　パートＦの化合物（６０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）溶液を、６５℃で２．５時間加熱した後、室温に冷却して減圧濃縮した。飽和重曹水を当該残渣に加えた。生じた固形物をろ過して集めた後、再結晶（酢酸エチル／ヘキサン）してパートＧの化合物を得た（２８ｍｇ，６２％）。
【００６９】
Ｈ．１−（４−ブトキシ−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）−１’−フェニルスルホキシド
氷浴で冷やしたパートＧの化合物（９ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１５ｍＬ）溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（理論純度８０％，６ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混液を４０分間攪拌した後、重曹水を加え、塩化メチレンで抽出した。有機抽出物を乾燥し（無水硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して、粗生成物を得た。当該粗物質を結晶化（酢酸エチル／ヘキサン）して、標題化合物を黄色の固形物として得た（７ｍｇ，７４％）。
ＬＣ−ＭＳ：３１６（Ｍ＋Ｈ）＋
ＨＰＬＣ：ＴＲ（ＹＭＣ Ｓ３ ＯＤＳ−Ａ，１５０×６．０ｍｍ，１．５ｍＬ／分，緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの濃度勾配法で、緩衝液Ｂを２０分間で０から１００％に勾配をかける。緩衝液Ａ＝メタノール／水／リン酸（１０：９０：０．２），緩衝液Ｂ＝メタノール／水／リン酸（９０：１０：０．２））＝１８．５分，２２０ｎｍで面積百分率：８８％
【００７０】
実施例２
１−（４−ブトキシ−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）−１’−フェニルスルホン
【化１７】
2004507455.tif 000018
【００７１】
Ａ．１−（４−ブトキシ−ｌＨ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）−１’−フェニルスルホン
実施例１のパートＧの化合物（２８ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２５ｍＬ）溶液に、室温でｍ−クロロ過安息香酸（理論純度８０％，５６ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混液を１時間攪拌した後、重曹水を加えて２時間後反応混合物を乾燥し（無水硫酸ナトリウム）、減圧濃縮して、粗生成物を得た。当該粗物質を結晶化（塩化メチレン／ヘキサン）して、標題化合物を白色の固形物として得た（２４ｍｇ，７８％）。
ＬＣ−ＭＳ：３３２（Ｍ＋Ｈ）＋
ＨＰＬＣ：ＴＲ（ＹＭＣ Ｓ３ ＯＤＳ−Ａ，１５０×６．０ｍｍ，１．５ｍＬ／分，緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの濃度勾配法で、緩衝液Ｂを２０分間で０から１００％に勾配をかける。緩衝液Ａ＝メタノール／水／リン酸（１０：９０：０．２），緩衝液Ｂ＝メタノール／水／リン酸（９０：１０：０．２））＝１８．１分，２２０ｎｍで面積百分率：９０％
【国際公開パンフレット】
2004507455.tif 000021
2004507455.tif 000022
2004507455.tif 000023
2004507455.tif 000024
2004507455.tif 000025
2004507455.tif 000026
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2004507455.tif 000028
2004507455.tif 000029
2004507455.tif 000030
2004507455.tif 000031
2004507455.tif 000032
2004507455.tif 000033
2004507455.tif 000034
2004507455.tif 000035
2004507455.tif 000036
2004507455.tif 000037
2004507455.tif 000038
2004507455.tif 000039
2004507455.tif 000040
2004507455.tif 000041
2004507455.tif 000042
2004507455.tif 000043
【国際調査報告】
2004507455.tif 000044
2004507455.tif 000045