(57)【要約】ヒト血漿由来の骨髄性コロニー刺激因子（ＣＳＦ）としてのＨＹＡＬ１ヒアルロニダーゼ酵素の同定、本明細書で示されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ、その組換え産生、および使用方法を記載する。このタンパク質は、白血球レベルの増加が有益でありうる、放射線照射、化学療法、または他の疾患後に起こりうる骨髄抑制の治療のために、使用されうる。例えば、ＣＳＦ５は免疫抑制に関連するウイルス感染または他の疾患に対する、免疫反応を増強するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼが回収されるように、ヒトまたはヒト組織起源の生物試料を、相抽出（ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、陽イオン交換クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの段階に供する段階を含む、ヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼタンパク質を精製する過程。
【請求項２】
細胞集団を外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼと接触させる段階を含む、細胞集団中の骨髄前駆体数を増大させる方法。
【請求項３】
哺乳類に、有効量の外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを投与する段階を含む、骨髄抑制状態の哺乳類を治療する方法。
【請求項４】
手術、放射線療法、および化学療法からなる群より選択される治療と併用してＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
骨髄抑制が、放射線、化学療法またはウィルス感染に関連する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
骨髄抑制状態の哺乳類を治療する方法であって、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼが該哺乳類において発現されるように、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを効果的にコードする核酸を、該哺乳類に投与する段階を含む方法。
【請求項７】
核酸が発現ベクター中にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸がプロモーターに機能的に結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
骨髄細胞を外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼに接触させる段階を含む、骨髄細胞によりサイトカインの産生を増強する方法。
【請求項１０】
サイトカインが、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子および骨髄コロニー刺激因子からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
骨髄細胞不全症を治療するための薬物の調製における、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼまたはＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをコードするＤＮＡの用途。
【請求項１２】
骨髄細胞不全症が骨髄抑制である、請求項１１に記載の用途。
【請求項１３】
骨髄細胞不全症が、放射線療法、化学療法、またはウィルス感染に起因する、請求項１２に記載の用途。
【請求項１４】
骨髄細胞不全症が、少なくとも１つのサイトカインの不十分な産生によって特徴づけられ、かつ薬物がそのサイトカインの産生を促進する、請求項１１に記載の用途。
【請求項１５】
サイトカインが、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子および骨髄コロニー刺激因子からなる群より選択される、請求項１４に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、以前に報告されているヒトヒアルロニダーゼＨＹＡＬ１が実は、骨髄性コロニー刺激因子と総称して知られている分子のクラスの新規メンバーであるという発見に関する。
【０００２】
発明の背景
コロニー刺激因子は、身体の血液の細胞成分を担う細胞の増殖および分化に影響を及ぼすことができるタンパク質である。コロニー刺激因子は、従来より、半固形培地での骨髄細胞コロニーの成長を刺激する能力によって特定されている。マクロファージコロニー刺激因子は、未熟造血前駆細胞からのマクロファージの増殖および分化を促し、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子の分泌、および非Ｍ−ＣＳＦコロニー刺激活性を含む、成熟マクロファージのエフェクター機能を誘導することによって免疫応答の調節に役割を果たす、コロニー刺激因子のサブクラスである。
【０００３】
様々な組織において非常に低い濃度で産生された特定の因子が骨髄前駆細胞の顆粒球および／またはマクロファージへの増殖および発達を刺激する能力は何年にもわたって知られている。多くの種からの血清、尿試料、および組織抽出物にこのような因子が存在することは、半固体培地にプレートされた骨髄細胞によるコロニー形成の刺激を測定するアッセイを用いて証明することができる。インビボアッセイは知られていない。これらの因子はこのようなコロニーの形成を誘導するので、総称してコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と呼ばれている。
【０００４】
コロニー刺激因子は多くの組織供給源および種から精製されている。日本国特許第８，０２０，５９９号は、ラット胸腺マクロファージおよびミクログリア細胞を刺激することができるラット筋様細胞由来コロニー刺激因子を開示している。ある種に由来するＣＳＦが遠類の種においてコロニー形成活性を欠く場合があるように、コロニー刺激因子の中にはその活性が種によって制限されているものもある（シャナフェルト（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９１ Ｊｕｌ ２５；２６６（２１）：１３８０４−１０）。
【０００５】
結果として生じたコロニーに見出される細胞タイプによって特定される少なくとも３種類のサブクラスのヒトＣＳＦタンパク質があることが示されている。サブクラスＣＳＦ−１は、主にマクロファージを含むコロニーをもたらす。他のサブクラスは、好中性顆粒球およびマクロファージの両方からなるコロニー；好中性顆粒球だけを含むコロニー；ならびに好中性顆粒球および好酸性顆粒球およびマクロファージを含むコロニーを産生する。
【０００６】
ＰＣＴ国際公開公報第８７／０３２０４号および米国特許第４，４８２，４８５号では、コロニー刺激因子を単独で用いた、またはエリスロポエチンおよび／または抗ウイルス薬および／またはＩＬ−２と共に用いたＡＩＤＳ患者の治療が報告されている。これらの参考文献は、ＣＳＦが癌治療における補助的な役割に使用できることを開示している。さらに、欧州特許第１１８，９１５号は、癌治療を受けている患者の顆粒球減少症およびマクロファージ減少症を予防および治療するための、感染症を予防するための、ならびに骨髄が移植された患者を治療するためのＣＳＦの産生を報告している。さらに、ＣＳＦは非特異的な殺腫瘍活性を刺激する（Ｒａｌｐｈら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １７２：１９４−２０４，１９８６）。ＣＳＦには、線維肉腫１０２３、リンパ腫１８−８、および熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ）無鞭毛型に対する殺腫瘍活性および殺微生物活性のためのマクロファージ活性化に直接的な役割がない（Ｒａｌｐｈら、７６：１０〜２１、１９８３）。ＣＳＦ−１およびリンホカインの組み合わせはマウス肉腫ＴＵ５標的に対して付加的な殺腫瘍効果を有する（Ｒａｌｐｈら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：２７０〜２７９、１９８７）。ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）ら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２８１−２２８５，１９８６）は、ＣＳＦがインターフェロン、ＴＮＦの単球産生、およびコロニー刺激活性を刺激することを開示している。リー（Ｌｅｅ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３０１９−３０２２，１９８７）は、マウスマクロファージにおけるウイルス感染に対するＣＳＦ誘導耐性を開示している。
【０００７】
発明の要約
本発明は、以前に報告されたヒアルロニダーゼ活性を有するヒトタンパク質ＨＹＡＬ１が強力なコロニー刺激活性を有するという発見に基づいている。このために、この分子は本明細書でＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼと新たに命名される。
【０００８】
本発明の１つの態様は、精製ヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼが回収されるように、ヒトまたはヒト組織起源の生物学的試料を、相抽出、陽イオン交換クロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの段階に供する段階を含む、ヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼタンパク質を精製する過程である。
【０００９】
本発明はまた、細胞集団と外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを接触させる段階を含む、細胞集団における骨髄球系前駆細胞の数を増やす方法を含む。
【００１０】
本発明は、哺乳類に有効量の外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを投与する段階を含む、骨髄抑制状態を有する哺乳類を治療する方法をさらに提供する。１つの態様において、外科手術、放射線療法、および化学療法からなる群より選択される治療と共にＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼが投与される。ある特定の態様において、骨髄抑制は、放射線、化学療法、またはウイルス感染と関連している。
【００１１】
本発明は、ＳＣＦ５ヒアルロニダーゼが哺乳類において発現されるように、哺乳類にＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを作動可能にコードする核酸を投与する段階を含む、骨髄抑制状態を有する哺乳類を治療する方法をさらに含む。有利なことに、核酸は発現ベクター内にあってもよく、好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。プロモーターは、例えば、外因性プロモーター、誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、または異種ヒトプロモーターでもよい。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、骨髄性細胞と外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを接触させる段階を含む、骨髄性細胞によるサイトカインの産生を増強する方法である。本発明で意図されるサイトカインとして、例えば、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および骨髄性コロニー刺激因子が挙げられる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、文献においてＨＹＡＬ１として知られているタンパク質に関連するコロニー刺激活性の発見に関する。このタンパク質は、単球サブクラスのコロニー刺激因子ファミリーの新規メンバーであり、その生化学的に精製された組換えタンパク質もまた、酸性条件下でコンドロイチン硫酸およびヒアルロナンに対してグリコサミノグリカン分解活性を有するという点で独特の二重機能を有する。ＨＹＡＬ１として以前に知られているこのタンパク質は、最近、そのグリコサミノグリカン分解活性またはヒアルロニダーゼ活性によって精製、クローニング、および配列決定された（Ｆｒｏｓｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｎｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．２３６：５〜１０，１９９７）。ＨＹＡＬ１とパラロガスな６つの配列がヒトゲノムにおいて同定されている（Ｃｓｏｋａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９９ Ｓｅｐ １５；６０（３）：３５６〜６１）。ヒアルロニダーゼ様遺伝子が、マウスおよびラットを含む他の哺乳類種において同定されている（Ｓｔｒｏｂｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９８ Ｏｃｔ １５；５３（２）：２１４〜９）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号４１０４２３５）。このような遺伝子間のオルソロガスな関係はいくつかの種で確立されていない。
【００１４】
本発明より前に、骨髄刺激活性またはコロニー刺激活性はこのグリコサミノグリカン分解酵素によるものだとは考えられていなかった。ＨＹＡＬ１酵素は高い特異性を有し、主にヒト血漿に２０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で存在する（フロストら、１９９７）。そのＣＳＦ活性のために、ＨＹＡＬ１遺伝子産物はＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼと再定義されるべきである。
【００１５】
ヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼはインビトロで単球の増殖および／または分化を支援する。この遺伝子産物の新規特性は、インビトロでヒト末梢血単球を以下の実施例に記載のように産生された組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼで処理することから同定された。この発見に基づいて、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼおよびこのタンパク質をコードするベクターは、インビボでの造血の支援、および化学療法またはウイルス感染に関連する免役不全の治療における使用に適している。
【００１６】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼはまた、本発明において、細胞集団と有効量のタンパク質とを接触させることによって細胞集団における単球の数を増やすのに用いられる。この有効量は、一般的に、約０．０１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである。これらの量は、標準的な用量応答曲線を用いて任意の細胞集団について最適化することができる。これは、治療に用いることができる多数の培養単球を産生するのに、または単球からのサイトカインの放出を刺激することができる化合物を発見するためのスクリーニングアッセイに有用である。これはまた、骨髄性細胞の機能不全を治療するためにインビボで使用することができる。
【００１７】
本発明の言及された態様は外因性由来ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを用いることに注目されたい。細胞集団または哺乳類の治療に関連して「外因性由来」は、ある系に導入されているＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ（例えば、別々の時点で、組換え産生されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ、精製もしくは単離されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ、別の生物から産生されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ、または同じ生物の組織または体液から以前に精製されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ）と定義される。このタンパク質をコードするポリヌクレオチドを外部導入して産生されるＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼもまた、本発明のために「外因性由来」と定義される。
【００１８】
細胞集団および哺乳類（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）を治療する様々な方法が本明細書で説明されるが、本発明はまた、本明細書に記載の全ての治療方法を実施するための医薬品の調製におけるＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ（またはＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをコードするポリヌクレオチド）の使用を意図することも理解されると思われる。このような薬物は、一般的に、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを周知の種類の薬学的に許容される担体と共に処方することによって調製される。一般的に、このような担体は注射可能な担体であるが、吸入可能な製剤および他のタンパク質送達法も意図される。
【００１９】
１つの局面において、本発明は、単球を有効量のＣＳＦ５（ネイティブＣＳＦ５または組換えＣＳＦ５）で処理することによって、単球によるサイトカイン（特に、インターフェロン、腫瘍壊死因子、および骨髄性ＣＳＦ）の産生を増強する方法に関する。別の局面において、本発明は、マクロファージによる標的細胞の殺傷を増強する方法、幹細胞からの白血球の産生を増強する方法または被検体の免疫系を増強する方法、マクロファージにおいてウイルス感染に対する耐性を誘導する方法、創傷治癒を促す方法、および腫瘍治療有効量の本発明のＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを用いることによって腫瘍細胞を治療する方法に関する。さらに、本発明は、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを含む薬学的組成物および治療組成物、ならびにそれらと賦形剤またはサイトカインまたはリンホカインとの混合物に関する。
【００２０】
本発明の別の態様において、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをコードする核酸の遺伝子導入によって、単球系列の細胞を刺激する方法が提供される。当業者に理解されるように、遺伝子を発現するのに利用することができる多くの方法があり、これらの全てが本発明による使用に意図される。本発明の特定の局面において、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ遺伝子発現は、遺伝子構築物にＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡを導入することによって達成される（例えば、ヒトＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼｍＲＮＡ配列については配列番号：８を参照のこと）。ウイルスにより媒介される移入（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、裸の核酸、および他の当業者に周知の手段によるＣＳＦ５発現が、患者へのＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ遺伝子の移入に利用可能な方法である。遺伝子送達系はフェルガー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５１１〜５１２，１９９７）により説明され、カチオン性脂質に基づく送達系（リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ））、ポリカチオンに基づく送達系（ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ））、およびその組み合わせ（リポポリプレックス（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘ））を含み、これらの全てが本発明における使用に意図される。
【００２１】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ発現用の宿主ベクター系は原核生物性でも真核生物性でもよいが、真核生物発現ベクターが好ましい。多くのこのような発現ベクターが周知であり、市販されている。これらの発現ベクターを構築するための標準的な技法は周知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らなどの参考文献に、またはいろいろな場所で入手できる組換えＤＮＡ技術に関する任意の実験マニュアルに見出される。発現は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞を、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをコードする適切なベクターで形質転換することによって達成することができる。ＤＮＡ配列は、適切なプロモーター制御下で哺乳類細胞において直接発現することができる。当業者に周知の異種プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターの例として、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子プロモーター、アデノウイルス即時初期遺伝子プロモーター、およびレトロウイルス長末端反復が挙げられる。構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織特異的プロモーターの使用は全て本発明の範囲内である。発現ベクターは、一般的に、タンパク質を発現している細胞を選択するために抗生物質耐性などの選択マーカーを含む。染色体へのＤＮＡの組み込み、ＤＮＡの発現、およびベクターのクローニングを容易にするために、他のヌクレオチド配列エレメントを発現ベクターに組み込んでもよい。例えば、プロモーターの上流にあるエンハンサーまたはコード領域の下流にあるターミネーターが存在すると、発現ベクターに含まれる核酸の発現が容易になりうる。
【００２２】
原核生物細胞または酵母細胞内でＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを発現するために、一般的に、リーダー配列（または分泌配列）が取り除かれる。これは、当業者に周知の標準的な技法を用いて行うことができる。一旦、望ましいＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼｃＤＮＡクローンが得られたら、ＣＳＦタンパク質を発現するために、周知の適切な手段、例えば、適切なベクターへの挿入、適切な宿主細胞へのベクターのトランスフェクション、形質転換細胞の選択、およびＣＳＦ活性を発現するこれらの形質転換体の培養が用いられる。このような方法は、サンブルックら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨークの最新版およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」の最新版に詳細に記載されている。適切な宿主細胞には、細菌、例えば、大腸菌、酵母、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、および昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞が含まれる。このように産生されたＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼタンパク質は、タンパク質のＮ末端にメチオニン基を有している場合がある（本明細書ではＭｅｔ−ＣＳＦと呼ぶ）。原核生物細胞および真核生物細胞によって産生された成熟タンパク質はアミノ酸配列は他の点では同一であるが、真核生物産物は天然産物と同じ程度または異なる程度でグリコシル化されている場合がある。ＣＳＦタンパク質を得るための慣習による様々な方法が以下に記載の実施例で例示される。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、および細胞融合を含む様々な細胞トランスフェクション法を用いることができる。他の方法または材料、例えば、ベクターは実施例および前述の説明に基づいて当業者に容易に明らかであると考えられる。
【００２３】
単球減少症、特に放射線、化学療法、およびウイルス感染に関連した単球減少症に罹患している哺乳類を治療するために、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの薬学的に許容される組成物を使用することができる。単球減少症は、血中の単球の割合の異常な減少と定義される。様々な哺乳類宿主を本発明に従って治療することができる。このような宿主には、希少または有益な哺乳類、ペットおよび家畜、ヒトなどが含まれる。
【００２４】
前記のように、本発明の方法は、組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのタンパク質またはそれをコードする核酸の投与によって、単球系列の細胞の増加をもたらす。ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼは、外科手術、放射線療法、および化学療法を含む、さらなる治療様式と併用することができる。腫瘍塊の生検および縮小または排除のための外科手術法は当業者に周知である。放射線療法もまた当業者に周知であり、電磁放射線、例えば、高周波数ｘ線ならびに亜原子粒子放射線、例えば、α粒子、β粒子、中性子、陽子、中間子、および重イオンを含む。最後に、様々な化学療法剤および癌治療におけるその使用方法は周知であり、以下を含む：アルキル化剤（例えば、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード，ムスタルゲン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ），ＨＮ２）、シクロフォスファミド（シトバン（Ｃｙｔｏｖａｎ），エンドキサナ（Ｅｎｄｏｘａｎａ））、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、クロラムブシル（リューケラン（Ｌｅｕｋｅｒａｎ））、メルファラン（フェニルアラニンマスタード、Ｌ−サルコリジン（Ｌ−ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎ），アルケラン，ＬＰＡＭ）、ブスルファン（ミレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ））、チオテパ（トリエチレンチオホスホルアミド）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ，ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ，ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）（ザノサール（Ｚａｎｏｓａｒ））など）；植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）、ベルベ（Ｖｅｌｂｅ））、パクリタキセル（タキソール）など）；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、メルカプトプリン（プリネソール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−ＴＧ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（サイトサールＵ（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ）、Ａｒａ−Ｃ）、アザシチジン（ミロサール（Ｍｙｌｏｓａｒ）、５−ＡＺＡ）など；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ コスメゲン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（デュアノマイシン（ｄｕａｎｏｍｙｃｉｎ），セルビジン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ））、イダルビシン（イダマイシン）、ブジェオマイシン（Ｂｊｅｏｍｙｃｉｎ）（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ））、ピカマイシン（Ｐｉｃａｍｙｃｉｎ）（ミトラマイシン，ミトラシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ））、マイトマイシン（ムタマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ））など、および他の抗細胞増殖剤、例えば、ヒドロキシウレア（ハイドレア）、プロカルバジン（ムタラン（Ｍｕｔａｌａｎｅ））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、シスプラチン（プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ））、カルボプラチン（パラプラチン）、アスパラギナーゼ（エスルパール（Ｅｌｓｐａｒ））、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ，ＶＰ−１６２１３）、アムサルクリン（Ａｍｓａｒｃｒｉｎｅ）（ＡＭＳＡ，ｍ−ＡＭＳＡ）、ミトタン（リソドレン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ））、ミトキサントロン（ノバトロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ））など。
【００２５】
本発明の方法と前記で概説された従来の治療様式の１つまたは複数との併用において、単球系列の細胞に対する有益な効果に関して最適の結果が得られるように異なる様式の時機を調節することができる。
【００２６】
本発明の実施における使用に意図される、薬学的に許容される組成物は、固体、溶液、エマルジョン、分散液、ミセル、リポソームなどの形で使用することができ、ここで、結果として得られる組成物は、鼻適用、経腸適用、または非経口適用に適した有機または無機の担体または賦形剤との混合物中に、その活性成分として本明細書での使用に意図される活性化合物の１つまたは複数を含む。活性成分は、錠剤、小丸剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、水性懸濁液または油性懸濁液、分散可能な散剤または顆粒剤、坐剤、溶液、エマルジョン、懸濁液、硬カプセルまたは軟カプセル、カプレットまたはシロップ剤またはエリキシル剤、および使用に適した他の任意の形態のために、例えば、ありふれた無毒の薬学的または生理学的に許容される担体と調合されてもよい。使用することができる担体には、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドケイ酸、バレイショデンプン、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、および固体、半固体、または液体の形をした製剤の製造における使用に適した他の担体が挙げられる。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、および着色剤を使用してもよい。本明細書での使用に意図される活性化合物は、標的の過程、状態、または疾患に対して望ましい効果を生じるのに十分な量で、薬学的組成物に含まれる。
【００２７】
さらに、このような組成物は、薬学的に優れかつ味のよい製剤を提供するために、着香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油またはサクランボ油）、着色剤、防腐剤などから選択される１つまたは複数の薬剤を含んでもよい。無毒の薬学的に許容される賦形剤との混合物に活性成分を含む錠剤もまた、周知の方法によって製造することができる。使用される賦形剤は、例えば、（１）不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウムなど）、（２）顆粒化剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、バレイショデンプン、アルギン酸など）、（３）結合剤（例えば、トラガカントゴム、コーンスターチ、ゼラチン、アカシアなど）、ならびに（４）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなど）でもよい。錠剤はコーティングされてなくてもよく、胃腸管内での崩壊および吸収を遅らし、それにより長期間にわたって持続作用をもたらすために周知の技法でコーティングされてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ ｍａｔｅｒｉａｌ）を使用してもよい。錠剤はまた、制御された放出のための浸透性治療錠剤を形成するための、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号に記載の技法によってコーティングされてもよい。
【００２８】
経口使用の製剤が硬ゼラチンカプセルの形をとる場合、活性成分は、不活性固形希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンなど）と混合されてもよい。製剤はまた軟ゼラチンカプセルの形をとってもよく、ここで、活性成分は、水または油媒質（例えば、ラッカセイ油、流動パラフィン、オリーブ油など）と混合される。
【００２９】
製剤はまた、注射可能な滅菌懸濁液の形をとってもよい。このような懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、周知の方法に従って処方することができる。この注射可能な滅菌製剤はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒に溶解した注射可能な滅菌溶液または懸濁液（例えば、１，４−ブタンジオール中の溶液）でもよい。溶媒または懸濁媒質として、滅菌した不揮発性油が従来より用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドもしくはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、天然に存在する植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、綿実油など）、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクルなどを含む、任意の無刺激性の不揮発性油を使用することができる。必要に応じて、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤などを含めてもよい。
【００３０】
本発明の実施における使用に意図される製剤はまた、活性成分の直腸投与用に坐剤の形で投与されてもよい。これらの組成物は、活性成分を適切な非刺激性賦形剤（例えば、カカオ脂、ポリエチレングリコールの合成グリセリドエステル（常温では固体であるが、直腸腔では液化および／または溶解して活性成分を放出する）など）と混合することによって調製することができる。
【００３１】
さらに、成型物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形をした半透性ポリマーマトリックスを含む徐放システムもまた、本明細書で用いられる活性化合物の投与に使用することができる。ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼはまた、凍結乾燥された、または水溶液に溶解した１回服用量（例えば、セプタムで密封されたバイアル）として提供されてもよい。
【００３２】
患者に投与されるＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの量は、治療しようとする状態、状態の重篤度、および治療に対する患者の応答によって異なる。一般的に、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの投与量は、約０．０１μｇ／ｋｇと１，０００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは約０．１μｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの間、およびより好ましくは約１μｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間である。標準的な用量応答曲線を用いて、投与量の最適化を行うことができる。
【００３３】
実施例１
ヒトヒアルロニダーゼ−ＣＳＦ５の精製
２リッターのヒト血漿（Ｉｒｗｉｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ、カリフォルニア州サンフランシスコ）に、０．０２％のアジ化ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のショ糖および７．５％のトリトンＸ−１１４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）を４℃において９０分撹拌しながら溶解し、次いで１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離した。次いで、３７℃において血漿を温度で誘導される相抽出に供した。抽出物を３７℃において１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離して、２相を清澄させた。界面活性剤に富む相を取り除き、氷冷した５０ ｍＭの（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌで２ Ｌに希釈し、次に３７℃において遠心分離して再区分した。この洗浄手法を３回繰り返した。最終的な界面活性剤相を２５ ｍＭ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）、ｐＨ ６．０で６倍に希釈し、かつ２０ ｍｌの平衡化したＳＰ−セファロース陽イオン交換樹脂を添加し（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、かつ４℃において一晩撹拌した。遠心分離でビーズを回収し、４６ ｍＭオクチルグルコシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する２５ ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ ６．０で洗浄した。ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０中の０．３ Ｍ ＮａＣｌを添加することにより、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼをビーズから溶出し、数回洗浄した。ＹＭ３膜（Ａｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ベヴァリー）を使用して、ＳＰ−セファロース溶離液を限外濾過で濃縮し、ＦＰＬＣ、急速脱塩（Ｆａｓｔ−Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、２５ ｍＭ ＮａＣｌ、４６ ｍＭオクチルグルコシドを加えた１０ ｍＭ ＰＯ４ ｐＨ ７．４へと脱塩した。次いで、ヒアルロニダーゼ調製物を、同じ緩衝液で平衡化した１０ｍＬのヒドロキシアパタイト樹脂（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）と混合して、４℃において一晩ロッカーに放置した。ＣＳＦ−５ヒアルロニダーゼは樹脂に吸着せず、上清に回収された。次いで、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）ＹＭ３ 濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ベヴァリー）で０．５ ｍＬに上清を濃縮し、ファストゲルシステム（Ｐｈａｓｔ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１２．５％ポリアクリルアミドゲルに適用し、純度を保障するために、製造業者の指示に従って銀染色した。タンパク質定量は、精製全体を通して、標準としてＢＳＡを用いるラウリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）またはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ法（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して測定した。
【００３４】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼは、温度で誘導されるトリトンＸ−１１４界面活性剤相に分配され、６０倍濃縮された。活性は、非イオン界面活性剤の存在下において３７℃で非常に安定であった。トリトンＸ−１１４の除去は、ＳＰ−セファロース陽イオン交換樹脂へのバッチ吸着によって実施した。ＳＰ−セファロース処理後の調製物は、銀染色で均一と測定されるまで精製できた。ヒドロキシアパタイト樹脂を使用したバッチ吸着により、全体で１５０万倍の精製となった。ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの酵素活性の非活性（１００，０００ ｒＴＲＵ／ｍｇ）は、精子ヒアルロニダーゼ、ＰＨ−２０に報告されている値とほぼ同じであり（Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２５２：８６５−８７４， １９８８）、それによって少量のコロニー刺激因子夾雑物を有する酵素因子の混入は排除される。タンパク質は、５７ ｋＤａの相対分子量でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動した。
【００３５】
実施例２
抗ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼモノクローナル抗体の作製
確立されている手法（Ｈａｒｌｏｗ， 「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク １９８８）を使用して、実施例１に記載したヒドロキシアパタイト段階後から精製された抗原を使用して、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。標準的な手法（Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ． Ｌ． 「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク １９８８）を使用して、脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合によってハイブリドーマを得た。抗ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ抗体を分泌するハイブリドーマは、酵素捕獲アッセイ法の改良法によってスクリーニングした。ｂＨＡ（Ｆｒｏｓｔら １９９７ａ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５１：２６３−９）酵素基質は、ｂＨＡおよびヤギ抗マウスＩｇＧがプレートに共有結合されるように、１．２５μｇ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ， ペンシルバニア州ウェストグローブ）をｂＨＡと共にインキュベーションすることを除いて、マイクロタイターに基づいた酵素アッセイ法（Ｆｒｏｓｔら １９９７ａ）について記載されているものと同じ条件下で、コバリンク（Ｃｏｖａｌｉｎｋ）プレート（ニュージャージー州プレーサーヴィル）にコーティングした。ハイブリドーマ上清は希釈したヒト血漿と共に３７℃において６０分間インキュベーションし、次に３７℃において６０分間ｂＨＡ／抗マウス−ＩｇＧプレート中でインキュベーションした。１％ トリトン Ｘ−１００および１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳでプレートを５回洗浄し、ギ酸アッセイ緩衝液を添加し、３７℃において６０分間インキュベーションした。標準的なアッセイ法と同様に、免疫沈降したＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの結果として消化されたｂＨＡが検出された。
【００３６】
中性ｐＨにおけるＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ活性の欠損および、ＨＡ−セファロース親和性クロマトグラフィーによって測定したとき、タンパク質はｐＨ ４．５より上では、ＨＡに対する結合親和性がないことを使用した酵素捕獲アッセイ法は、ハイブリドーマをスクリーニングするために開発された。抗体−抗原複合体を免疫沈降させるために、ハイブリドーマ上清をｂＨＡ／抗マウスＩｇＧマイクロタータープレート中で中性ｐＨで粗血漿とインキュベーションした。このスクリーニング手法を使用して、２０のハイブリドーマ融合プレートから８のクローンを同定した。腹水を形成するために、ＩｇＧ２ａクラスの一クローンである、１７Ｅ９を使用した。１７Ｅ９抗体の連続希釈液をヒト血漿に添加し、次にプロテインＡで免疫沈降することにより、酸性で活性な、全ての検出可能なヒアルロニダーゼ活性は沈殿した。
【００３７】
実施例３
免疫沈降および免疫親和性精製
実施例２で記載したように調製した、１７Ｅ９抗ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼハイブリドーマクローンから精製したＩｇＧ２ａを、通常の免疫沈降および精製に使用した。血漿由来のＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを免疫沈降するために、精製した１７Ｅ９ ＩｇＧまたは対照マウスＩｇＧ２ａの連続希釈液を、ＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ中の、１％ ＮＰ４０、１％デオキシコレート、１％ トリトン Ｘ−１００、５ ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した血漿と混合し、次にプロテイン−Ａビーズで免疫沈降させた。次いで、上清中の残存ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ活性をマイクロタイターアッセイ法で測定した。ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを免疫親和性精製するために、１７Ｅ９ハイブリドーマクローンから精製した３ ｍｇのＩｇＧをハイトラップＮＨＳ（Ｈｉ−ＴＲａｐ−ＮＨＳ）活性化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ ｍＬに結合させた。血漿またはＨＥＫ−２９３ヒト胎児腎臓細胞組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ調整培地をＲＩＰＡ緩衝液で１：２に希釈し、抗ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼＩｇＧカラムに通した。２Ｍ ＮａＣｌ、１００ ｍＭオクチルグルコシドを含有するＰＢＳで最初にカラムを洗浄し、次に１００ ｍＭクエン酸塩 ｐＨ ４．０、０．１５ Ｍ ＮａＣｌおよびオクチルグルコシドで洗浄し、次いでｐＨ ３．０に調整した同じ緩衝液で溶出した。
【００３８】
ヒアルロニダーゼは、１７Ｅ９抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーで、ヒト血漿から一段階で均一に精製することができた。厳密な条件下においてカラムを洗浄後、ｐＨ ４．０で溶出した酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき均一になるまで精製し、アミノ酸の配列を決定した。免疫精製したタンパク質のＣＮＢｒ消化物から３つの配列を得た。
【００３９】
実施例４
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのアミノ酸配列決定
Ｎ末端アミノ酸の配列を決定するために、免疫親和性精製したタンパク質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（ＡＢＩ、カリフォルニア州フォスターシティ）に電気ブロットし、エドマン分解によって配列決定した。免疫親和性精製したＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの内部ペプチドは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）で消化し、次にＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８）カラムでの断片分離によって得た。
【００４０】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：８および配列番号：９に示す。ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのＮ末端および内部アミノ酸配列は、ｃＤＮＡの概念上の翻訳と１００％同一である。コロニー刺激因子およびヒトＰＨ−２０の予測される翻訳のアラインメント（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８５：８９９８−９００２，１９８８）は、アミノ酸レベルで４０％の配列の同一性と６０％の相同性を示した。ＰＨ−２０は、精子特異的で、中性において活性なヒアルロニダーゼである。厳密に酸性において活性なヒアルロニダーゼとＰＨ−２０との相同性は、哺乳類β、１−４ヒアルロニダーゼは全て保存されているファミリーのメンバーであることを示唆している。
【００４１】
実施例５
ｃＤＮＡヒアルロニダーゼｃＤＮＡクロマトグラフィー
発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（Ｌｅｎｎｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３： １５１−１５２， １９９６）のＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０， １９９０）相同性検索（全ての読み枠で翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して、タンパク質配列を比較する）は、実施例４により測定したＮ末端アミノ酸配列に１００％同一であるＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ． コンソーシアム（Ｃｏｎｓｏｒｔｒｉｕｍ）クローン（Ｌｅｎｎｏｎら、上記）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＡＡ２２３２６４号）を明らかにした。このＥＳＴはゲノムシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ）社（ミズーリ州セントルイス）から入手可能であり、２ ｋｂで、３’末端にポリＡ末端を含有する。ｃＤＮＡの５’末端を得るために、５’ＲＡＣＥ（Ｂｏｇｕｓｋｉら、 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４： ３３２．３３３， １９９３）を、わずかな改良を加え、製造業者の指示に従って、まらそんレディ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ）（商標）ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パロアルト）で実施した。簡単に説明すると、最初のＰＣＲ反応には、以下のプライマーを使用した：ＨＰＨＲＡＣＥ１
2004500079.tif 000002
（配列番号：１）およびクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製のアダプタープライマー（Ａｄａｐｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ）２（ＡＰ２）
2004500079.tif 000003
（配列番号：２）。アニーリング／伸長は７３℃で、４０サイクルとした。「ホットスタート」を提供するためにアドバンテージ（Ａｖａｎｔａｇｅ）（商標）クレンタグ（ＫｌｅｎＴａｇ）（商標）ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。８００ ｂｐの拡散したバンドがアガロースゲル電気泳動で観察された。キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， カリフォルニア州チャッツワース）を製造業者の指示に従って使用してバンドを切り取った。切り取ったＤＮＡは、プライマーＨＰＨＲＡＣＥ２
2004500079.tif 000004
（配列番号：３）およびＡＰ２プライマー（配列番号：２）を使用した第２の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの鋳型として使用し、アニーリング／伸長は７２℃で１５サイクルとした。上記のように、「ホットスタート」を使用した。８００ ｂｐの１つの鮮明なバンドがアガロースゲル電気泳動で観察された。ＰＣＲ産物１２０ ｎｇをＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にライゲーションし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カリフォルニア州サンフランシスコ）、製造業者の指示に従ってワンショットトップ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ）１０Ｆコンピテント細胞を形質転換するために使用した。陽性のコロニーを上記のように配列決定した。８００ｂｐの産物はＥＳＴの５’末端と３００ ｂｐだけ１００％の重複を示した。
【００４２】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼｃＤＮＡコード配列を作製するために、以下のプライマー：ＨＰＨＦ１
2004500079.tif 000005
（配列番号：４）およびＨＰＨＲ１
2004500079.tif 000006
（配列番号：５）を用い、５８℃においてアニーリングし、３５サイクルとして、鋳型としてＥＳＴを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物１２０ ｎｇをＴＡ発現ベクターｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングし、製造業者の指示に従ってワンショットトップ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ）１０Ｆコンピテント細胞を形質転換するために使用した。ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ発現ベクター中のコロニー刺激因子を陽性コロニーから精製し、Ｐｓｔ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩを用いた制限マッピングによって証明した。挿入物は標準的な方法によって配列決定され、（Ｆｒｏｓｔら １９９７）およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第Ｕ０３０５６号（Ｗａｉら、１９９６）に記載されているＨＹＡＬ１遺伝子（配列番号：８）と１００％同一である、完全なオープンリーディングフレームを含有することが見出された。
【００４３】
実施例６
ヒト胎児腎臓細胞における組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼの発現
コロニー刺激因子とクローニングした遺伝子との同一性を実証するために、ｃＤＮＡをヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞に安定にトランスフェクトした。ｃＤＮＡはＥＳＴから増幅し、次いで一方向性発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを使用して、ヒアルロニダーゼ活性を過剰発現するＨＥＫ−２９３クローンを作製した。
【００４４】
２０ ｍＬのＤＭＥ／Ｆ１２ ５０／５０中の、精製した血漿９μｇおよびリポフェクチン（Ｌｉｐｏｔｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）６０μｌを使用し、血清不含の状態で、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを含有するベクターをヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞の集密度７５％のＴ７５フラスコ中で５時間トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥ／Ｆ１２ ５０／５０中でさらに４８時間増殖させた。４８時間後、ネオマイシン耐性について選択するために、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下において細胞を２４ウェルプレートに限定希釈により培養した。１４日後、耐性コロニーの調整培地を、本明細書に記載されているプロトコールを使用してヒアルロニダーゼ活性についてアッセイした。次いで、高レベルの発現のコロニーを増殖させた。組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを分析し、生化学的に精製したタンパク質と比較するために、ヒアルロニダーゼを過剰発現する組換えＨＥＫ ２９３細胞系統を血清不含培地で４８時間増殖させ、調整培地を１７Ｅ９抗ＣＳＦ免疫親和性カラムに通した。組換え酵素は、ヒト血漿と同じプロトコールを使用して溶出した。次いで、信頼性を保証するために、精製した組換えヒアルロニダーゼをＰＶＤＦにブロットし、Ｎ末端アミノ酸の配列決定に供した。
【００４５】
親ＨＥＫ−２９３細胞系統は、調整培地および細胞層に検出可能なレベルのヒアルロニダーゼを産生しなかったが、安定にトランスフェクトしたクローンは３，０００倍の増加である、約１５ｒＴＲＵ／ｍｌを分泌した。組換えＨＥＫ−２９３細胞クローンに見出されるヒアルロニダーゼ活性が、トランスフェクトしたｃＤＮＡの産物であることを保証するために、ＨＥＫ−２９３過剰発現クローンの血清不含調整培地からヒアルロニダーゼを免疫親和性精製し、１７Ｅ９カラムからの溶離物を配列決定した。これは、ヒト血漿に見出される、同様に処理されたＮ末端（ＦＲＧＰＬＬＶＰ）を生じ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１つのバンドとして移動した。銀染色および基質ゲル酵素電気泳動を使用して、このバンドを精製した血漿と整列させた。比活性を比較するために、市販品の精巣ヒアルロニダーゼ（３，０００ ＴＲＵ／ｍｇ固体）を泳動した。組換えコロニー刺激因子のｐＨ活性曲線は、免疫親和性精製した血漿酵素と同じプロフィールを有し、ｐＨ ７より上で最大の活性を有する、ウシ精巣ヒアルロニダーゼとは異なり、ｐＨ ４．５より上ではインビトロにおいて活性がなかった。
【００４６】
実施例７
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ転写物の臓器調査
コロニー刺激因子ｃＤＮＡの１．３ ｋｂコード領域を増幅する入れ子ＰＣＲプライマーを使用して、λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー中の転写物の組織分布を分析した。最初のＰＣＲに関しては、以下のプライマーをアニーリング温度５８℃において使用した：ＨＰＨＦ２
2004500079.tif 000007
（配列番号：６）およびＨＰＨＲ２
2004500079.tif 000008
（配列番号：７）。第２のＰＣＲ反応は、プライマーＨＰＨＦ１およびＨＰＨＲ１（上記参照）を用い、アニーリング温度５８℃、１５サイクルから成った。ＰＣＲ産物は心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤および骨格筋に見られたが、脳では検出されなかった。
【００４７】
実施例８
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼによる単球コロニー形成の刺激
ＨＥＫ２９３細胞由来の組換えＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ上清を使用して、ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのコロニー刺激活性を血清不含培地で測定した。簡単に説明すると、正常なドナー由来の全血をＥＤＴＡ中に回収した。リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に血液を１：２に希釈し、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）に２：１の比で積層した。試料を１，５００ ｘｇで２０分間遠心分離し、リンパ球バンドを除去した。血清不含ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で細胞を２回洗浄し、２４ウェル培養皿中３７℃で１時間、ＤＭＥＭ中で血清不含状態で培養した。次いで、血清不含ＤＭＥＭでプレートを洗浄し、残存する付着性抹消血単核細胞をコロニー形成アッセイ法に使用した。
【００４８】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼのコロニー形成活性を測定するために、実施例６で記載したＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼを過剰発現するＨＥＫ２９３を、接種量１×１０５細胞／ｍｌで、ＨＥＫ２９３ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で血清不含状態で６日間増殖させた。対照として、ＣＳＦ５を発現しないＨＥＫ２９３細胞を、同じ接種量で同一条件下において６日間増殖させた。６日後に培地中に存在するＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ活性の量を、おおよその比活性１００，０００ＴＲＵ／ｍｇタンパク質に基づいた、酵素に基づくアッセイ法によって測定した（Ｆｒｏｓｔら １９９７ａ）。結果を表３に示す。単球コロニー形成の最大半減刺激は約５ ｎｇ／ｍｌヒアルロニダーゼで生じた。
【００４９】
【表３】
2004500079.tif 000009
【００５０】
ＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ培地、またはＨＥＫ対照細胞由来の対応する対照培地を、ＨＥＫ２９３ＳＦＭ中の連続希釈液で、付着性抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）に適用した。希釈したＣＳＦ５−ヒアルロニダーゼ中で細胞を１０日間培養した。１％クリスタルバイオレットを含有するメタノールで細胞を固定することにより、１０日目に細胞増殖を観察し、ライツ（Ｌｅｉｔｚ）倒立顕微鏡下で観察した。得られたコロニーは、ギムザ用いた核染色によって単核球形態であることが判明した。
【００５１】
上記の発明は、理解を明確にする目的のために、例示および実施例によっていくぶん詳細に記載されているが、記載および主張されている本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、一定の変更および修正をなし得ることは、本発明の開示内容に鑑みて、当業者に容易に明らかである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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