(57)【要約】本発明は、（ｉ）ペプチドにジスルフィド橋かけ結合が含まれなくなるような形でのシステイン残基の修飾；（ｉｉ）１〜１８個好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換及び／又は少なくとも１対のアミノ酸の交換（なおかかる置換及び／又は交換は、前記ペプチドが両親媒性を示すようなものである）、による抗生物質ペプチドの誘導体を含有するか又はこの誘導体により構成されているペプチドを目的とする。本発明は同様に、少なくとも１つの活性物質に直接的又は間接的に結び付けられた前記ペプチドのうちの少なくとも１つで形成された化合物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  ペプチドにジスルフィド橋かけ結合が含まれなくなるような形でのシステイン残基の修飾；
−  １〜１８個好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換及び／又は少なくとも１対のアミノ酸の交換（なおかかる置換及び／又は交換は、前記ペプチドが両親媒性を示すようなものである）；
による抗生物質ペプチドの誘導体を含有するか又はこの誘導体により構成されていること、
及び０．１５〜０．７の間に含まれる残基１個あたりの平均疎水性＜Ｈ＞を示すこと、
を特徴とするペプチド。
【請求項２】
０．１５を上回るらせん疎水性モーメント＜μＨ＞αを示すことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
０を上回るベータ疎水度モーメント＜μＨ＞βを示すことを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４】
プロテグリン又はタキプレシン、その類似体又はフラグメントから誘導されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
１〜１８個好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換及び／又は少なくとも１対のアミノ酸の交換（なおかかる置換及び／又は交換は、前記ペプチドが両親媒性を示すようなものである）による、
2004517039.tif 000020
の中から選択されたアミノ酸配列をもつペプチド、又は
−  少なくとも５個、好ましくは少なくとも７個の連続したアミノ酸から成るそのフラグメント、
の誘導体を含むか又はこれにより構成されたペプチド。
【請求項６】
６、８、１３、１４、１５、１６の位置にある残基のうちの少なくとも１つの、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選ばれた疎水性アミノ酸による変異そして場合によっては、少なくとも１つのその他の残査、好ましくは１２の位置の残基Ｐｈｅの、Ｔｙｒ又はＴｒｐ残基による変異によって、配列番号１のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
2004517039.tif 000021
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
位置３及び５、位置１０及び１２、そして位置１６及び１７の少なくとも１つの残基対の交換により、配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８というアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されていることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
−  位置３及び５、位置１０及び１２、そして位置１６及び１７の少なくとも１つの残基対の交換；
−  分光シグナルを与えかつペプチドの秤量を可能にする、６、１３、１４、１６の位置にある残基のうちの少なくとも１つの、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選ばれた疎水性アミノ酸による変異そして場合によっては、少なくとも１つのその他の残査、好ましくは１２の位置の残基Ｐｈｅの、Ｔｙｒ又はＴｒｐ残基による変異；
−  場合によっては、好ましくは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された、疎水性アミノ酸による、位置３の残基の変異、
によって配列番号１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８というアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されていることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
2004517039.tif 000022
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項８又は９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基の同時変異又は位置４、５及び６の残基の同時変異、そして場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異によって、配列番号２のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
【請求項１２】
2004517039.tif 000023
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
５及び７の位置の残基の交換及びこの交換の結果得られた配列上での、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基又は位置４、６及び７の残基の同時変異、そして場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異によって、配列番号２、配列番号１４、配列番号１５のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５、１１又は１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
2004517039.tif 000024
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
２及び３の位置の残基の交換及び位置５及び８の残基の交換、そしてこの交換の結果得られた配列上での好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基の同時変異又は位置４、６及び８の残基の同時変異、そして場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異によって、配列番号２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５、１１又は１２、１３又は１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
2004517039.tif 000025
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
好ましくはＡｌａ、ＩＬｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＴｒｐを含む基の中から選択された疎水性アミノ酸による、位置３、７、１２、１６の残基の同時変異によって、配列番号３のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５に記載のペプチド。
【請求項１８】
2004517039.tif 000026
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
１２及び１４の位置の残基、１６及び１７の位置の残基の交換及び好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＴｒｐを含むグループの中から選択される疎水性アミノ酸による、３、７、１４及び１７の位置の残基の同時変異によって、配列番号３、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列をもつペプチドから誘導されることを特徴とする請求項５又は１８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２０】
2004517039.tif 000027
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
シトルリン又はオルニチンによる単数又は複数のアルギニンの置換を特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２２】
2004517039.tif 000028
というアミノ酸配列のうちの１つを特徴とする、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
少なくとも１つの活性物質に直接又は間接的に結びつけられた、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドで構成された化合物。
【請求項２４】
受容可能なビヒクル内の請求項２３に記載の少なくとも１つの化合物を活性作用物質として有効量含んで成る薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、線状ペプチド及び、活性物質を媒介するためのその利用に関する。より特定的には、本発明は、抗生物質ペプチド又はその類似体から誘導された両親媒性の強い線状ペプチドに関する。本発明はさらに、少なくとも１つの活性物質に結びつけられた両親媒性の線状ペプチドで形成された新しい化合物、ならびにこれらの化合物及びそれらを含有する組成物の調製をも目的としている。
【０００２】
薬学的特性を備えた異なる物質を生きた細胞内に導入する問題は、研究上及び治療的又は診断的利用上多大な関心の的となっている。
【０００３】
この分野における研究上の優先性の１つは、それが従来の分子であれ、生きた細胞内のペプチド、タンパク質さらにはオリゴヌクレオチドといったような核酸であれ、活性物質の進入効率を増大させるために有効な手段を発見することにある。
【０００４】
細胞膜を通したこれらの物質の通過を可能にするか又は増大させるために、複数の戦略が提案されている。その中でも、該出願人は、ベクターペプチドを利用する細胞膜を通した活性物質の輸送システムを開発した。ベクターペプチドは化学的経路によって合成され得、上述の活性成分の大部分を単純かつ有効な形でベクターにカップリングすることが可能であることから、この媒介戦略は、数多くの利点を提供している。
【０００５】
プロテグリン及びタキプレシンは、その構造がジスルフィド橋かけ結合により維持されたヘヤピンタイプのものである天然ペプチドである。これらの橋かけ結合は、ヒトの細胞上で観察される細胞溶解活性において重要な役割を果たす。これらのペプチドについて出願人が実施した研究作業により、該出願人は、これらのジスルフィド橋かけ結合の不可逆的還元が細胞膜を迅速に通過する特性をもつ線状ペプチドの生成を可能にする、ということを発見することができた。これらの線状ペプチド及び活性物質のためのベクターとしてのその利用は、ＷＯ９９／０７７２８号として公示されたＰＣＴ国際特許出願の中で記述されている。
【０００６】
出願人は現在、活性物質の内在化及びアドレシングベクターとして役立つ能力をもつ新しいアミノ酸配列を定義しようとしてきており、その目的で、改善された物理化学特性を示す複数のペプチドが合成されてきた。
【０００７】
従って本発明の目的は、
−  ペプチドにジスルフィド橋かけ結合が含まれなくなるような形でのシステイン残基の修飾；
−  １〜１８個好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換及び／又は少なくとも１対のアミノ酸の交換（なおかかる置換及び／又は交換は、前記ペプチドが両親媒性を示すようなものである）；
による抗生物質ペプチドの誘導体を含有するか又はこの誘導体により構成されている線状ペプチドにある。
【０００８】
抗生物質ペプチドというのは、ヒト又は動物の細胞上で細胞分解活性を呈する５を超えて７個までのアミノ酸のペプチドのことを意味する。これは、天然由来のペプチド又は、合成ペプチド及びそれらのフラグメントである。本発明は、特に、プロテグリン及びタキプレシンから誘導されたペプチド、その類似体又はフラグメントを考慮している。
【０００９】
本発明のペプチドには、例えばＷＯ９９／０７７２８号として公示されたＰＣＴ国際特許出願の中で記述されているもののようなジスルフィド橋かけ結合が備わっていない。本発明のペプチド内でジスルフィド橋かけ結合を不在にすることは、当業者にとって既知のあらゆる技術、特にシステイン残基を削除するか又はそれらのその他のアミノ酸によって置換するか又はもはやジスルフィド橋かけ結合を形成しないような形で−ＳＨ基を遮断することによって得られる。
【００１０】
本発明のペプチドの両親媒性という性質は、残基あたりの平均疎水性＜Ｈ＞及びらせん疎水性モーメント＜μＨ＞αの値によって表現された。有利には、本発明のペプチドは、以下のような値を示す：
−  ０．１５〜０．７の間に含まれた残基あたりの平均疎水性＜Ｈ＞；
−  ０．１５を上回るらせん疎水性モーメント＜μＨ＞α；
−  ０を上回るベータ疎水性モーメント＜μＨ＞β。
【００１１】
本発明の枠内で行なわれた研究作業は、実際、基準配列からの一次配列の概念を方向づけできる３つのパラメータに関するものであった。（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；らせん疎水性モーメント：らせんの両親媒性の測定。Ｎａｔｕｒｅ  ２９９、３７１−３７４）。選択された３つのパラメータは以下の通りであった：
−  残基あたりの平均疎水性、
−  らせん疎水性モーメント、
−  ベータ疎水性モーメント。
【００１２】
残基あたりの平均疎水性は、１つのペプチドの無極性の尺度である。１つのペプチドの疎水性の量子化は、以下の式に従ってこの疎水性に対する各残基の貢献度を求和することによって行なわれる。
【００１３】
【数１】
2004517039.tif 000002
なお式中、Ｈは、残基あたりの平均疎水性に対応し、Ｎは残基の数を表わし、Ｈｎは、残基ｎの疎水性指数を表わす。利用される疎水性のスケールは、Ｆａｕｃｈｅｔｅ及びＰｌｉｓｋａ（１９８３年  Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  １８．３６９−３７５）のものである。この求和は、らせんの全ての残基について行なわれる（ｎ＝１〜Ｎ）。
【００１４】
らせん疎水性モーメント＜μＨ＞αは、
【００１５】
【数２】
2004517039.tif 000003
という式に従って、αらせんの多少の差こそあれ両親媒性である性質を量子化できるようにする。なお式中、Ｈは、残基ｎの疎水性指数に対応し、δは、連続する２つの残基間の角度（αらせんについて１００°）に対応する。
【００１６】
各々のアミノ酸に対し、輪の中心とこの輪の上のその位置を結ぶ直線にその方向が対応しているベクトルが割当てられる。このベクトルのノルムは、アミノ酸の疎水性指数に等しい。ベクトルの向きは、アミノ酸が疎水性である場合（疎水性スケールにおいて正の値）、中心からアミノ酸に向かい、アミノ酸が極性である場合（疎水性スケールにおいて負の値）、アミノ酸から中心へと向かう。
【００１７】
両親媒性らせんのアミノ酸あたりの疎水性モーメントは、これら全てのベクトルの求和の合力ベクトルのノルムをらせんのアミノ酸数で除したものに等しい。求和は、らせんの全ての残基について行なわれる（ｎ＝１からＮまで）。合力ベクトルは、輪の最も疎水性の高いゾーンの方向を指す。
【００１８】
ベータ疎水性モーメント＜μＨ＞βは、βシート構造をとることになるペプチドの疎水性モーメントに対応する。ベータ疎水性モーメントは、パラメータ＜μＨ＞αとして計算されるが、この場合、連続する２つの残基間の角度に対応するδは、１８０°に等しい。
【００１９】
上述の３つのパラメータの研究は、以下の３つの基準ペプチドに適用された：
−  ＳｙｎＢ１及びＳｙｎＢ３と呼称されるプロテグリンから誘導された２つのペプチド；
−  ＳｙｎＢ４と呼称されるタキプレシンから誘導された１つのペプチド。
【００２０】
以下で報告するペプチド ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、及びＳｙｎＢ４について実施されたアミノ酸の置換は、両親媒性の強いペプチドを導く配列の修飾を同定することを可能にした。
【００２１】
本発明は、特に、１〜１８個好ましくは１〜６個のアミノ酸の置換及び／又は少なくとも１対のアミノ酸の交換（なおかかる置換及び／又は交換は、前記ペプチドが両親媒性を示すようなものである）による、
2004517039.tif 000004
というアミノ酸配列をもつペプチド、又は
−  少なくとも５個、好ましくは少なくとも７個の連続したアミノ酸から成るそのフラグメント、
の誘導体を含むか又はこれにより構成されたペプチドに関する。
【００２２】
以下で報告するペプチド配列においては、アミノ酸はその一文字コードで表わされているが、これらは以下の用語体系に従ったその三文字コードで表わすこともできる。
2004517039.tif 000005
【００２３】
１）  ペプチドＳｙｎＢ１の変異
１．１）  ＳｙｎＢ１の疎水性＜Ｈ＞の増大
以下の変異は、パラメータ＜Ｈ＞すなわち残基あたりの平均疎水性を増大させる：
−  ６、８、１３、１４、１５、１６の位置にある残基のうちの少なくとも１つの、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選ばれた疎水性アミノ酸による変異；
−  場合によっては、少なくとも１つのその他の残査、好ましくは１２の位置の残基Ｐｈｅの分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にするＴｙｒ又はＴｒｐ残基による変異。
【００２４】
下表１は、ＳｙｎＢ１の疎水性を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ１から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００２５】
【表１】
2004517039.tif 000006
【００２６】
１．２）  ＳｙｎＢ１の両親媒性の増大
以下の変異は、パラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞αすなわち、残基あたりの平均疎水性及び残基あたり平均らせん両親媒性を増大させる：
−  位置３及び５、位置１０及び１２、そして位置１６及び１７の少なくとも１つの残基対の交換；
−  分光シグナルを与えかつペプチドの秤量を可能にする、６、１３、１４、１６の位置にある残基のうちの少なくとも１つの、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選ばれた疎水性アミノ酸による変異；
−  場合によっては、少なくとも１つのその他の残査、好ましくは１２の位置の残基Ｐｈｅの、Ｔｙｒ又はＴｒｐ残基による変異；
−  場合によっては、好ましくは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された、疎水性アミノ酸による、位置３の残基の変異。
【００２７】
下表２は、ＳｙｎＢ１の両親媒性を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ１から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００２８】
【表２】
2004517039.tif 000007
【００２９】
上表２においては、ペプチド Ａ−ＳｙｎＢ１は、３及び５の位置、１０及び１２の位置、及び１６及び１７の位置のアミノ酸対が交換されたＳｙｎＢ１の誘導体である。
【００３０】
２）  ペプチド ＳｙｎＢ３の変異
２．１）  ＳｙｎＢ３の疎水性＜Ｈ＞の増大
以下の変異は、パラメータ＜Ｈ＞つまり残基あたりの平均疎水性を増大させる：
−  好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基の同時変異又は位置４、５及び６の残基の同時変異；及び
−  場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異。
【００３１】
下表３は、ＳｙｎＢ３の疎水性を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ３から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００３２】
【表３】
2004517039.tif 000008
【００３３】
２．２）  ＳｙｎＢ３の残基あたりのらせん両親媒性＜μＨ＞αの増大
以下の変異は、ペプチド ＳｙｎＢ３のパラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞α、すなわち残基あたりの平均疎水性及び残基あたりの平均らせん両親媒性を増大させることができる：
−  ５及び７の位置の残基の交換及びこの交換の結果得られた配列上での、好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基又は位置４、６及び７の残基の同時変異；
−  場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異。
【００３４】
下表４は、ＳｙｎＢ３の残基あたりの平均疎水性及び残基あたりの平均らせん両親媒性を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ３から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００３５】
【表４】
2004517039.tif 000009
【００３６】
２．３）  ＳｙｎＢ３のベータ両親媒性＜μＨ＞βの増大
以下の変異は、ペプチド ＳｙｎＢ３のパラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞β、すなわちこのペプチドの残基あたりの平均疎水性及び残基あたりの平均らせん両親媒性＜μＨ＞βを増大させることができる：
−  ２及び３の位置の残基の交換及び位置５及び８の残基の交換、そしてこの交換の結果得られた配列上での好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含むグループの中から選択された疎水性アミノ酸による、４及び６の位置の残基の同時変異又は位置４、６及び８の残基の同時変異；
−  場合によっては、分光シグナルを与えペプチドの秤量を可能にする、残基Ｔｙｒ又はＴｒｐによる、少なくとも１つのもう１つの残基好ましくは位置１０の残基Ｐｈｅの変異。
【００３７】
下表５は、ＳｙｎＢ３のパラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞βを増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ３から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００３８】
【表５】
2004517039.tif 000010
【００３９】
３）  ペプチド ＳｙｎＢ４の変異
３．１）  ＳｙｎＢ３の疎水性＜Ｈ＞の増大
以下の変異は、パラメータ＜Ｈ＞つまり残基あたりの平均疎水性を増大させる：
−  好ましくはＡｌａ、ＩＬｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐを含む基の中から選択された疎水性アミノ酸による、位置３、７、１２、１６の残基の同時変異。
【００４０】
下表６は、ＳｙｎＢ４の疎水性＜Ｈ＞を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ４から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００４１】
【表６】
2004517039.tif 000011
【００４２】
３．２）  ＳｙｎＢ４の両親媒性の増大
以下の変異は、パラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞αすなわち、残基あたりの平均疎水性及び残基あたりの平均らせん両親媒性を増大させる：
−  １２及び１４の位置の残基、１６及び１７の位置の残基の交換及び好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ及びＴｒｐを含むグループの中から選択される疎水性アミノ酸による、３、７、１４及び１７の位置の残基の同時変異。
【００４３】
下表７は、ＳｙｎＢ４のパラメータ＜Ｈ＞及び＜μＨ＞αつまり残基あたりの平均疎水性及び残基あたりの平均らせん両親媒性を増大させることのできる変異について報告し、ＳｙｎＢ４から誘導された本発明に従ったペプチドの例を示している。
【００４４】
【表７】
2004517039.tif 000012
【００４５】
表７において、ａＳｙｎＢ４は、位置１２及び１４の残基及び位置１６及び１７の残基の交換によって得られたペプチドである。
【００４６】
本発明は、同様に、
−  ペプチドにジスルフィド橋かけ結合が含まれなくなるような形でのシステイン残基の修飾
−  シトルリン又はオルニチンによる単数又は複数のアルギニンの置換
による、抗生物質ペプチドの誘導体を含む又はこの誘導体で構成される線状ペプチドにも関する。
【００４７】
実際、シトルリン又はオルニチンによるアルギニンの置換は、アルギニンがカチオン性である結果としてのペプチドの偶発的毒性を減少させることができる。かくして、より大量のペプチドベクターを利用することが可能となる。しかしながら、有利には、もとの抗生物質ペプチド内のアルギニンの数及びサイズに応じて、本発明のペプチドは、少なくともさらに１つ、好ましくは少なくともさらに２つ、そして特に好ましくはさらに３つのアルギニンを含む。
【００４８】
１つ又は複数のアルギニンがシトルリン（Ｃｉｔ）で置き換えられている本発明に従ったペプチドの一例として、下表８のＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３及びＳｙｎＢ４の誘導体を挙げることができる。
【００４９】
【表８】
2004517039.tif 000013
【００５０】
本発明のペプチドは、化学合成又は遺伝子工学によって調製され得、これらはレトロ形をしていてもよく又、Ｄ形態のアミノ酸を含むこともできる。同様に、本発明は、上述の配列の少なくとも５つ、好ましくは少なくとも７つの連続するアミノ酸フラグメントにも関する。
【００５１】
本発明は同様に、治療上の利用分野と同様診断上の利用分野向けの単数又は複数の活性物質のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞膜を通した媒介のための、これらの両親媒性線状ペプチド又はその類似体の利用をも目的としている。媒介というのは、本発明に従うと、単数又は複数の細胞膜を横断し、細胞質又は核といった細胞区画内にある標的まで前記活性物質を運ぶことのできるプロセスを意味する。
【００５２】
かくして、本発明の目的は、少なくとも１つの活性物質に直接的に又は間接的に結びつけられた前述の少なくとも１つの両親媒性線状ペプチドで形成された化合物にある。これらの化合物は、以下の構造式（Ｉ）によっても表わすことができる：
【００５３】
【数３】
2004517039.tif 000014
なお式中、
−  Ａは、本発明の両親媒性ペプチドを表わす。
−  Ｂは、活性物質を表わす。
−  水平ラインは、活性物質と両親媒性線状ペプチドの間の結合を表わす。
【００５４】
活性物質として、本発明は特に、ポリペプチド又はペプチドといったようなタンパク質、抗体又はその一部分、核酸及びオリゴヌクレオチド又はリボザイムさらには、当然のことながら、例えば（制限的な意味なく）抗腫瘍薬、抗ウイルス薬などのようなヒト又は動物の病気の治療又は予防のための活性化学分子を考慮している。
【００５５】
診断の分野では、活性物質は放射性マーカー、カラーマーカー又は、代謝又は病理を顕示させる能力をもつ他の全ての手段又は物質であり得る。
【００５６】
構造式（Ｉ）内の水平ラインによって象徴されるベクターペプチドと活性物質の間のカップリングは、式（Ｉ）の化合物内の立体障害及び化学的性質を考慮に入れて受容可能な全ての結合手段によって実施することができる。結合は、生理的環境内又は細胞内部で分割可能又は分割不能の、共有結合、疎水性結合又はイオン結合でありうる。結合は、単数又は複数の中間化合物（リンカー）を含むことができる。
【００５７】
カップリングは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２といったような官能基が天然に存在しているか又は導入されているような、ペプチド（Ａ）の任意の部位で実施可能である。
【００５８】
活性物質のためのカップリング位置は、Ｎ末端又はＣ末端レベルであってもよいし、或いは又ペプチドの側鎖レベルであってもよい。同様に、カップリングは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２といったような官能基が天然に存在するか又は導入されている活性物質（Ｂ）の任意の部位で実施することもできる。
【００５９】
従って、本発明は、活性作用物質として、受容可能なビヒクル内に少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物を有効量含んで成る薬学組成物にも関する。
【００６０】
本発明のその他の利点及び特徴は、両親媒性線状ペプチドの調製、活性物質に対するそのカップリング及び細胞内のこの複合体の進入に関する以下の例から明らかになると思われる。
【００６１】
１）  ＮＢＤ（２）螢光基で標識づけされたペプチドの合成
ＡＭＳ４２２（ＡＢＩＭＥＤ、ドイツ）を利用して、Ｆｍｏｃ−ｔＢｕ戦略によりペプチドを合成した。ペプチド配列は表Ｉに示されている。ＮＢＤ螢光基によるＮ末端の標識づけを〔Ｇａｚｉｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１４７９−１１４８８〕によって記述された手順に従って実施した。
【００６２】
樹脂上のペプチドをまずはピペリジン〔ＤＭＦ中２０％（体積／体積（ｖ／ｖ））〕で処理して、Ｎ末端の保護基Ｆｍｏｃを除去した。乾燥ＤＭＦ中のＮＢＤ−Ｃｌ（５倍余剰）を次に撹拌しながら６時間、暗所でＤＩＥＡ（２倍余剰）の存在下で再び添加して、Ｎ末端基を選択的に標識づけした。その後樹脂をＤＭＦで除去し、脱保護用混合物で処理して、樹脂のペプチドを切り離し、側鎖を脱保護した。その後、ペプチドをＴＦＡ０．０１％／アセトニトリル勾配でＨＰＬＣ（逆相高性能液体クロマトグラフィ）（Ｗａｔｅｒ−ｐｒｅｐ  ＬＣ  ４０、水）により精製した。ペプチドの純度を、２２０ｎｍ及び４６０ｎｍでのＵＶ吸光度基準により測定したところ、それは９５％であった。
【００６３】
２）  ドキソルビシンにカップリングされたペプチドの調製
コハク酸環を介したペプチド上のドキソルビシンのカップリングは、３段階で行なわれる。
【００６４】
ジソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２当量）の存在下でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で可溶化された塩酸ドキソルビシン（１当量）に対して、無水コハク酸（ＤＭＦ中に溶解した１．１当量）を添加する。大気温で２０分インキュベートした後、かくして形成されたヘミコハク酸ドキソルビシンを次にＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキソピロリジンホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート、ＤＭＦ中１．１当量）及びＤＩＥＡ（２当量）を添加することによって活性化する。この第２の反応混合物を２０分間インキュベートする。その後ペプチド（ＤＭＦ中１．２当量）を反応混合物に添加すると、これは自然発生的に、２０分間の追加のインキュベーション中に活性化されたヘミコハク酸ドキソルビシン上にカップリングする。
【００６５】
カップリング生成物を次に、調製用ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）上で精製し、次に凍結乾燥する。
【００６６】
各段階ならびに最終生成物は、分析用ＨＰＬＣ及び質量分光測定法によって制御される。
【００６７】
テスト対象のペプチドは、下表９に示されている。
【００６８】
【表９】
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【００６９】
３）  細胞進入
ペプチドの細胞進入を、フラックスサイトメトリによって検討した。細胞Ｋ５６２を、１０％のウシ胎児血清を用いてＲＰＭＩ培地内で培養する。細胞を、実験の２４時間前に、１ｍｌあたり０．３×１０６個の細胞の割合まで希釈する。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）を利用して、フラックスサイトメトリにより細胞進入を測定した。ＮＢＤで標識づけしたペプチド（最終濃度１μＭ）を、可変的時間中３７℃でＯｐｔｉｍｅｍ培地内で細胞Ｋ５６２（ｍｌあたり５×１０５個の細胞）を用いてインキュベートする。インキュベーションの後、細胞を２回洗浄し、その後、低温ＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁させる。その後、ＦＡＣＳにより進入を分析した。螢光体を４８８ｎｍで励起させ、螢光を５２５ｎｍで測定する。螢光強度のヒストグラム（細胞１×１０４個について）が得られ、分布平均は、細胞に会合されたペプチドの量を表わすものとみなされた。
【００７０】
４）  結果
内在化の結果は、下表に報告されている。
【００７１】
表１０は、より両親媒性が強いこれらの類似体のうちの２つの類似体のものに比べたペプチドＳＭ２３６３の進入を示している。
【００７２】
【表１０】
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【００７３】
表１０の結果は、両親媒性類似体（ＳＭ３９７９及びＳＭ３９８０）が、考慮された時間の如何に関わらずはるかに高い効率で進入することを示している。かくして６０分という時間で、ＳＭ３９７９及びＳＭ３９８０の進入は、ＳｙｎＢ１のものよりもそれぞれ９倍及び５倍高いものである。
【００７４】
より短かいペプチドにおいて同じ設計を実施した。基準としてペプチドＳｙｎＢ３を取り上げ、その両親媒性は増大していた。ペプチドＳｙｎＢ３の進入とこれらの類似体との比較が、下表１１及び１２に表わされている。
【００７５】
【表１１】
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【００７６】
【表１２】
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【００７７】
表１１及び１２の結果は、同じく、両親媒性類似体が考慮された時間の如何に関わらずはるかに高い効率で進入することを示している。
【００７８】
５）  脳血管障壁（ＢＨＥ）を通した活性分子の移送のためのベクターとしての本発明のペプチドの利用
中枢神経系の数多くの疾患において、投与された分子は、脳血管障壁を通過せず、従って、脳内のその標的に達することができない。
【００７９】
ａ）  実験条件
ｉ）  ＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔ−ドキソルビシンの調製
コハク酸環を介したペプチドＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔ上のドキソルビシンのカップリングは、３段階で実施される。
【００８０】
ジソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２当量）の存在下でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で可溶化された塩酸ドキソルビシン（１当量）に対して、無水コハク酸（ＤＭＦ中に溶解した１．１当量）を添加する。
【００８１】
大気温で２０分インキュベートした後、かくして形成されたヘミコハク酸ドキソルビシンを次にＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキソピロリジンホスフォニウム ヘキサフルオロホスフェート、ＤＭＦ中１．１当量）及びＤＩＥＡ（２当量）を添加することによって活性化する。この第２の反応混合物を２０分間インキュベートする。
【００８２】
その後ペプチドＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔ（ＤＭＦ中１．２当量）を反応混合物に添加すると、これは自然発生的に、２０分間の追加のインキュベーション中に活性化されたヘミコハク酸ドキソルビシン上にカップリングする。
【００８３】
カップリング生成物を次に、調製用ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）上で精製し、次に凍結乾燥する。
【００８４】
各段階ならびに最終生成物は、分析用ＨＰＬＣ及び質量分光測定法によって制御される。
【００８５】
ｉｉ）  テスト対象の生成物
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【００８６】
ｉｉｉ）  ｉｎ  ｓｉｔｕ  での脳灌流
これは、中枢神経系内でのさまざまな化合物の進入を評価するための迅速で感度の高い方法である。若いマウス（２５〜３０ｇ、Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄ；１′Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）に麻酔をかける。総頸動脈を露呈した後、右外頸動脈を、内頸動脈と分岐レベルで結びつけ、総頸動脈を心臓とカテーテル移植部位の間に結びつける（ポリエチレンカテーテル、内径：０．７６）。ヘパリン溶液（１００単位／ｍｌ）を予め満たしたこのカテーテルを総頸動脈内に挿入する。マウスを、灌流緩衝液（１２８ｍＭのＮａＣｌ、２４ｍＭのＮａＨＣＯ３、４．２ｍＭのＫＣｌ、２．４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．９ｍＭのＭｇＳＯ４、及び９ｍＭのＤ−グルコース）を用いて灌流する。この緩衝液をろ過し、次に、７．４に近いｐＨを維持し灌流中脳に酸素を供給する目的で、９５％のＯ２／５％のＣＯ２を含む混合物によりバブリングした。
【００８７】
遊離ドキソルビシン又はドキソ−ＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔを含む緩衝液でマウスに灌流を行なう。各生成物において、ドキソルビシンを炭素１４で放射性標識付けする（比活性：９．４μＣｉ／ｍｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）。生成物を、マウス一匹につき０．３３μＣｉ／ｍｌ又は０．０３５ｍｇの濃度で灌流する。
【００８８】
灌流の開始直前に、灌流中、灌流液の還流を避けるべく、心室を切断することで心臓を停止させる。このとき、右半球を６０秒間１０ｍｌ／分の速度で灌流させ、その後、マウスを断頭する。
【００８９】
ｂ）  ｉｎ  ｓｉｔｕ  での脳灌流の結果
この研究において、我々は、ＢＨＥ内へのドキソルビシン単独の進入をＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔで媒介されたドキソルビシンと比較した。緩衝液中で６０秒の灌流の後、生成物の進入をμｌ／秒／ｇ単位のＫｉｎ又はインパルス定数によって見積る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｙｎＢ１／３Ｃｉｔベクターによるドキソルビシンの媒介が、緩衝液中の６０秒の灌流後、その脳内通過を２０倍増大させるということを示している。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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