(57)【要約】本発明はトランスクリプトームの中に場所を占めるＲＮＡ転写物及びＲＮＡスプライス変異体であって対応するゲノム中に場所を占める遺伝子又は転写単位から転写されるＲＮＡ転写物及びＲＮＡ転写物及びＲＮＡスプライス変異体を検出することができるオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する。本発明はオリゴヌクレオチドライブラリーから生成されるオリゴヌクレオチドアレイ及び様々なオリゴヌクレオチド検出システム及び発現プロファイリング研究にオリゴヌクレオチドライブラリーを用いる方法をも提供する。オリゴヌクレオチドの一種であり、ここで開示するオリゴヌクレオチドに基づくアンチセンス分子及び二本鎖干渉ＲＮＡも提供される。
2004508019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項２】
前記トランスクリプトームがヒトのトランスクリプトームである請求項１記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３】
前記トランスクリプトームがラットのトランスクリプトームである請求項１記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項４】
前記トランスクリプトームがマウスのトランスクリプトームである請求項１記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項５】
組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項６】
病理学的組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが病理学的組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項７】
前記病理学的組織起源ががん組織である請求項６記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項８】
発生段階のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが発生段階のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項９】
病気に罹患している患者のトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームが病気に罹患している患者のゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項１０】
前記病気ががんである請求項９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項１１】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項１記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１２】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項５記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１３】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項６記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１４】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項８記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１５】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１６】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項１のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項１７】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項５のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項２０】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項６のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項２３】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項８のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項２６】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項９のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項２９】
トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３０】
前記トランスクリプトームがヒトのトランスクリプトームである請求項２９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３１】
前記トランスクリプトームがラットのトランスクリプトームである請求項２９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３２】
前記トランスクリプトームがマウスのトランスクリプトームである請求項２９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３３】
組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３４】
病理学的組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが病理学的組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３５】
前記病理学的組織起源ががん組織である請求項３４記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３６】
発生段階のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが発生段階のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３７】
病気に罹患している患者のトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームが病気に罹患している患者のゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３８】
前記病気ががんである請求項３７記載のオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項３９】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項２９記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４０】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項３３記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４１】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項３４記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４２】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項３６記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４３】
上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が請求項３７記載のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられているＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４４】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項２９のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項３３のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項４８】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項３４のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項５１】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項３６のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項５４】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法：
請求項３７のオリゴヌクレオチドライブラリー又はそのサブセットによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、一セットのスプライス変異体の総レベルを決定する。
【請求項５７】
前記ハイブリダイゼーションシグナルはヌクレオチドチップから得られる請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記ハイブリダイゼーションシグナルは電気泳動ゲルから得られる請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーから選択されたオリゴヌクレオチドに基づく二本鎖ＲＮＡ分子であって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードし、二本鎖ＲＮＡ分子が３０以下の塩基対を含み、二本鎖ＲＮＡ分子がｍＲＮＡの翻訳と干渉することができる二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項６０】
トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーから選択されたオリゴヌクレオチドに基づくアンチセンス分子であって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードし、アンチセンス分子が３０以下の塩基対を含み、アンチセンス分子がｍＲＮＡの翻訳と干渉することができるアンチセンス分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に関するクロス参照
参照として以下の文献をここに組み入れる：２００１年５月２日に出願されたＵ．Ｓ．シリアルＮｏ．６０／２８７７２４；２０００年７月２８日に出願されたＵ．Ｓ．仮出願シリアルＮｏ．６０／２２１６０７；及び１９９８年８月１３日に出願されたＵ．Ｓ．出願シリアルＮｏ．０９／１３３９８７。この出願は２００１年５月２日に出願されたＵ．Ｓ．シリアルＮｏ．６０／２８７７２４及び２０００年７月２８日に出願されたＵ．Ｓ．仮出願シリアルＮｏ．６０／２２１６０７を優先権主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は生物学的サンプルからのメッセンジャーＲＮＡを検出するのに有用なオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する。より特別には、本発明はトランスクリプトームの中に場所を占め、対応するゲノムの中に場所を占める遺伝子又は転写単位から転写されるＲＮＡスプライス変異体を含むＲＮＡ転写物を検出することができるオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する。本発明はオリゴヌクレオチドライブラリーから生成されるオリゴヌクレオチドアレイ及び様々なオリゴヌクレオチド検出システム及び発現プロファイリング研究にオリゴヌクレオチドライブラリーを用いる方法をも提供する。
【０００３】
分野の記述
細胞、組織、器官における正常又は異常な生物学的機能及び過程の理解は関心のある生物学的場所において作用する遺伝子、これらの遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ、及び究極的にはＲＮＡ転写物から生産される一セットのタンパク質の知識しだいで決まる。種レベルでは、すべてのＤＮＡ分子のレパートリーがその種のゲノムを作り上げている；これらのＤＮＡ分子の中で、ＲＮＡ分子に転写されるものは遺伝子又は転写単位と称される。対応して、ゲノム中で転写単位から転写されるすべてのメッセンジャーＲＮＡ分子（「ＲＮＡ転写物」又は「転写物」）はトランスクリプトームを作り上げている；そして、メッセンジャーＲＮＡ分子から翻訳されるすべてのタンパク質のレパートリーはプロテオームを作り上げている。
【０００４】
ある種のトランスクリプトームについての研究はその種の対応するゲノム及びプロテオームの研究者の理解に光を投げかける。従って、ＲＮＡ転写物を同定するための及び生物学的サンプル中のそれらの豊富さのレベルを決定するための様々な技術は様々な種のトランスクリプトームを解読する手段であり、それによって対応するゲノム及びプロテオームに関する発見を容易にしてきた。これらの技術はゲルベースの手順（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｄｏｔ　Ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ベースの分析の如き）及びもっとも最近はチップベースの手順（ＤＮＡマイクロアレイ分析の如き）の両方を含む。
【０００５】
多数の種についての全ゲノムの配列決定の完了はこれらのゲノム及びそれらの対応するトランスクリプトーム及びプロテオームの研究におけるよりよい効率、信頼性、及び理解を約束する。ヒトゲノム中の発現される遺伝子又は転写単位の総数は約３００００〜４００００であると見積もられている（Ｖｅｎｔｅｒ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０００，　Ｖｏｌ，２９１：１３０４−１３５１；Ｔｈｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｔｅｒｔｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，　Ｎａｔｕｒｅ　２０００，　Ｖｏｌ．４０９：８６０−９２１）。しかし、ヒトのプロテオームにコードされているタンパク質の数はこの見積もりを有意に超過すると予測されている。なぜなら、多くの場合一つ以上のＲＮＡスプライス変異体が転写単位又は遺伝子から転写されるからである。見積もりは変化する。しかし、研究者の中にはヒトのトランスクリプトームは５０００００までのＲＮＡ転写物を含むかもしれず、ヒトゲノム中の遺伝子又は転写単位の３０％以上がいくつかのＲＮＡスプライス変異体を生成すると信じているものもいる（Ｍｉｒｏｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ．　１９９９，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９：１２８８−１２９３）。これらの数は控えめであると他人によって見なされている。選択的スプライシングもラット及びマウスではたとえば同様の頻度で、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ　の如き下等生物でも起こる。選択的スプライシングの特別な事例は選択的ポリアデニル化であること、及び有意な数の遺伝子又は転写単位は選択的ポリアデニル化部位を有していることに注意すべきである。
【０００６】
異なるＲＮＡスプライス変異体から翻訳されるタンパク質はかなり異なる生物学的機能を有しているかもしれない。異なるＲＮＡスプライス変異体は異なる組織で、異なる発生段階で、異なる病気状況で発現されるかもしれない。転写単位からのＲＮＡ転写物及びＲＮＡスプライス変異体の検出、及び（ｉ）転写単位からのスプライス変異体を含むすべてのＲＮＡ転写物の豊富さのレベル及び（ｉｉ）サブセットのスプライス変異体又は一つのスプライス変異体の豊富さのレベルの決定は従ってトランスクリプトーム、ひいては対応するプロテオームの状況を正確に捉えることにおいて望ましい。そしてなお、ＲＮＡスプライス変異体の定性的及び定量的検出は分子生物学の分野においては不適当な挑戦のままである。特に、トランスクリプトーム規模ではそうである。
【０００７】
オリゴヌクレオチドライブラリーはゲルベースのシステム及びチップベースのシステムの両方においてＲＮＡ分子を検出してそれらの豊富さのレベルを測定するために用いられてきた。しかし、これらのライブラリーのオリゴヌクレオチド（オリゴ）は標的ＲＮＡにハイブリダイズするためのオリゴプローブとして用いられるが、スプライス変異体を正確に検出することは通常不可能である。つまり、それらは一つ以上の特定スプライス変異体にハイブリダイズすることができる（従って認識することができる）オリゴを含まず、それ故、選択的にスプライスされたＲＮＡ転写物を効率的に同定及び／又は区別することができず、又は異なるスプライス変異体の豊富さのレベルを決定することができない。
【０００８】
発明の概要
それ故、本発明の目的はゲノム中の転写単位から転写されるＲＮＡ転写物及びＲＮＡスプライス変異体を検出することができ、それによって対応するトランスクリプトームを定性的に及び定量的に特性決定することができるオリゴヌクレオチドライブラリーを提供することである。本発明の他の目的はオリゴヌクレオチドライブラリーから生成されるオリゴヌクレオチドアレイ及びオリゴヌクレオチドライブラリーを用いて関心のあるトランスクリプトームを研究する方法、及びオリゴヌクレオチドライブラリーを発現プロファイリング研究に用いる方法を提供することである。
【０００９】
本発明によれば、一実施態様において、トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができる、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００１０】
本発明の他の実施態様によれば、オリゴヌクレオチドライブラリーはヒトのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。他の実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはラットのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。さらに他の実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはマウスのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。さらなる実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはアラバドプシスのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。なおさらなる実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはドロソフィラ・メラノガスターのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。
【００１１】
本発明によれば、他の実施態様において、組織起源のサブトランスクリプトーム（特定の生物学的起源、構造、又は機能特性（たとえば組織特異性、病気特異性、発生特異性など）を担持するトランスクリプトームの一部）の中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００１２】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドライブラリーの組織起源は腎臓、脳、心臓、肺、骨、肝臓又は様々な実施態様における関心のある他の組織であることができる。
【００１３】
本発明によれば、さらに他の実施態様において、病理学的組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが病理学的組織起源のサブゲノム（特定の生物学的起源、構造、又は機能特性（たとえば組織特異性、病気特異性、発生特異性など）を担持するゲノムの一部）の中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００１４】
本発明によれば、病理学的組織起源は様々な実施態様における結腸がん組織、乳がん組織、肺がん組織、骨がん組織、前立腺がん組織、脳がん組織、又は肝臓がん組織のごときがん組織であることができる。本発明によれば、病理学的組織起源はたとえば様々な実施態様における異常心臓組織、異常ニューロン組織、異常肝臓組織、又は異常腎臓組織であることができる。
【００１５】
本発明によれば、さらに他の実施態様において、発生段階のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが発生段階のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００１６】
本発明によれば、発生段階はヒトの神経誘導、マウスの中胚葉の誘導、ヒトの赤血球誘導、ヒト又はマウスの幹細胞発生、又は様々な種における他の特異的発生生物学的段階であることができる。
【００１７】
本発明によれば、さらなる実施態様において、病気に罹患している患者のトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームが病気に罹患している患者のゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットのメッセンジャーＲＮＡ（一つ以上のＲＮＡ転写物）に対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００１８】
本発明によれば、病気は様々な実施態様における結腸がん、乳がん、肺がん、骨がん、前立腺がん、脳がん、又は肝臓がんのごときがんであることができる。本発明によれば、病気はたとえば様々な実施態様におけるアルツハイマー病、パーキンソン病、骨粗しょう症、糖尿病、慢性関節リウマチ、又は関心のある他の病気であることができる。
【００１９】
本発明によれば、さらなる実施態様において、トランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームがゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００２０】
本発明の一実施態様によれば、オリゴヌクレオチドライブラリーはヒトのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。他の実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはラットのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。さらに他の実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはマウスのトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出することができる。
【００２１】
本発明によれば、他の実施態様において、組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００２２】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドライブラリーの組織起源は腎臓、脳、心臓、肺、骨、肝臓又は様々な実施態様における関心のある他の組織であることができる。
【００２３】
本発明によれば、なお他の実施態様において、病理学的組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが病理学的組織起源のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００２４】
本発明によれば、病理学的組織起源は様々な実施態様における結腸がん組織、乳がん組織、肺がん組織、骨がん組織、前立腺がん組織、脳がん組織、又は肝臓がん組織のごときがん組織であることができる。本発明によれば、病理学的組織起源はたとえば様々な実施態様における異常心臓組織、異常ニューロン組織、異常肝臓組織、又は異常腎臓組織であることができる。
【００２５】
本発明によれば、さらに他の実施態様において、発生段階のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、サブトランスクリプトームが発生段階のサブゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがサブゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、サブゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００２６】
本発明によれば、発生段階はヒトの神経誘導、マウスの中胚葉の誘導、ヒトの赤血球誘導、又は様々な種における他の特異的発生生物学的段階であることができる。
【００２７】
本発明によれば、さらなる実施態様において、病気に罹患している患者のトランスクリプトームの中に場所を占めるメッセンジャーＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリーであって、トランスクリプトームが病気に罹患している患者のゲノムの中に場所を占める極めて多数の転写単位から転写されるメッセンジャーＲＮＡを含み、ライブラリーが複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドがゲノムの所定の転写単位から転写される一セットの又はサブセットのメッセンジャーＲＮＡに対して選択的にハイブリダイズすることができ、ゲノムの少なくとも一つの転写単位が一以上のメッセンジャーＲＮＡスプライス変異体をコードするオリゴヌクレオチドライブラリーが提供される。
【００２８】
本発明によれば、病気は様々な実施態様における結腸がん、乳がん、肺がん、骨がん、前立腺がん、脳がん、又は肝臓がんのごときがんであることができる。本発明によれば、病気はたとえば様々な実施態様におけるアルツハイマー病、パーキンソン病、骨粗しょう症、糖尿病、慢性関節リウマチ、又は関心のある他の病気であることができる。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーは様々な実施態様において少なくとも９５，２００，４００，６００，８００、又は１０００のオリゴヌクレオチドを有することができる。本発明のライブラリーにおけるオリゴヌクレオチドは、本発明の様々な実施態様において７５，６５，６０，５５，５０，４５，４０，３５，３０、又は２０塩基の長さ、又はそれらの周りの又はそれらの間のいかなる整数であることができる。しかし、本発明によればより小さいか又はより長いオリゴヌクレオチドも用いられることができる。
【００３０】
本発明によれば、なおさらなる実施態様において、様々な実施態様における本発明の上述のオリゴヌクレオチドライブラリーの各オリゴヌクレオチドは、固体表面への取り付けを可能にする改変を含む。取り付けはたとえば共有結合的、又は静電的であることができる。
【００３１】
本発明によれば、他の実施態様において、上に複数のオリゴヌクレオチド配列をスポッティングされたＤＮＡマイクロアレイであって、前記複数のオリゴヌクレオチド配列が様々な実施態様における本発明の上述のオリゴヌクレオチドライブラリーによって与えられているＤＮＡマイクロアレイが提供される。
【００３２】
本発明によれば、なお他の実施態様において、以下のステップを含む様々な豊富さの二つ以上のＲＮＡを含む細胞又は組織サンプルを発現プロファイリングする方法が提供される：
様々な実施態様における本発明の上述のオリゴヌクレオチドライブラリーによって与えられる複数のオリゴヌクレオチド配列に対して前記サンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定し、それによって前記サンプル中の前記二つ以上のＲＮＡのレベルを決定し、そしてＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合、（ｉ）一セットのスプライス変異体の総レベル，（ｉｉ）そのサブセットの総レベル、又は（ｉｉｉ）その一つのスプライス変異体のレベルを決定する。
【００３３】
本発明によれば、発現プロファイリングする方法は様々な実施態様においてヌクレオチドチップ、膜又はフィルター、そこからインプリントされた電気泳動ゲル及びフィルター又は膜、又は上でハイブリダイゼーションが行われる他の同様のプラットフォームを用いることができる。
【００３４】
本発明なお他の側面によれば、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに基づいたＤＮＡ構築物をもちいて翻訳を阻害又は防止する方法が提供され、そこでは構築物は細胞レベルでアンチセンスＲＮＡを生産することができる。
【００３５】
本発明さらに他の側面によれば、ライブラリーのオリゴヌクレオチドは一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖であることができる。
【００３６】
本発明さらに他の側面によれば、特定遺伝子の翻訳後サイレンシングを行うことができる二本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。一実施態様においては、これらのオリゴヌクレオチドは短い二本鎖ＲＮＡである。
【００３７】
図面の簡単な説明
図１．これは３つのエクソン及びそこから転写される２つの選択的にスプライスされた転写物を有する転写単位を示す図である。
【００３８】
図２．これは３つのエクソン及びそこから転写される２つの異なるスプライス変異体を有する転写単位を示す図である。
【００３９】
図３．これは５つのエクソン及びそこから転写される４つの選択的にスプライスされた転写物を有する転写単位を示す図である。
【００４０】
好ましい実施態様の詳細な説明
ライブラリー、オリゴヌクレオチド及びその改変
トランスクリプトーム又はその一部分を特性決定するためには、メッセンジャーＲＮＡサンプルへのハイブリダイゼーションをテストするためのプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の総集団又は関心のあるその一部分を代表しなければならない。この種のオリゴヌクレオチド情報を生成するためには、Ｕ．Ｓ．特許出願シリアルＮｏ．０９／１３３９８７（‘９８７出願）で概説されているアプローチを用いることができる。
【００４１】
公知のヌクレオチド配列、配列断片又は発現された配列タグ（“ＥＳＴ”）の大きなプール、例えばＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＤＢｅｓｔ配列コレクション、は配列クラスター及び長いコンティグ（連続配列、即ち短いＥＳＴから集成された長い配列）を得るために厳格なクラスタリング及び集成手順に供される。これらの手順はＥＳＴ及び他の配列断片の大きなプールと比較して遺伝子又は転写単位のより良い代表である配列を生み出す。
【００４２】
所定の遺伝子又は転写単位についての代表的配列が選択されて、この配列から一以上のオリゴヌクレオチド（又はオリゴ、オリゴプローブ）が誘導される。代表的配列は標的遺伝子又は転写単位に対して高い特異性を有する（即ち、それは他の遺伝子又は転写単位からの配列に対して少ない相同性を共有し、それ故、非特異的結合の頻度が最少化される）；配列の質は良好である（即ち、遺伝子配列情報は正確である）。オリゴヌクレオチドは高い感度を有する。即ち、標的遺伝子又は転写単位に対するプローブのハイブリダイゼーション親和性は高い。プローブは標的遺伝子又は転写単位の３´末端に近い配列を認識することが好ましく、かくして標的遺伝子サンプルが調製される特定の手順においてはその収率は最大化される。オリゴヌクレオチドは二次構造（例、ヘアピン）を欠くか又は二次構造を形成する傾向があるので、ハイブリダイゼーションは損なわれない。
【００４３】
より重要なことには、標的遺伝子及び転写単位の選択的スプライシングを考慮に入れて代表的配列は選択され、一以上のオリゴヌクレオチドは設計される。このように、オリゴヌクレオチドは（ｉ）特定遺伝子又は転写単位のすべてのスプライス変異体、（ｉｉ）すべてのスプライス変異体のサブセット、又は（ｉｉｉ）遺伝子又は転写単位のスプライス変異体の一つのいずれかにハイブリダイズして検出するために用いられることができる。
【００４４】
図１を参照すると、転写単位又は遺伝子は例えば三つのエクソン：Ａ，Ｂ及びＣを有し、転写において選択的にスプライスされて二つの変異体：転写物１（ＡＣ）及び転写物２（ＢＣ）を生ずる。配列Ａに対して相補的なオリゴ又はその断片はそれ故、転写物１のみを検出し、転写物２は検出しないであろう。配列Ｂに対して相補的なオリゴ又はその断片は対照的に転写物２のみを検出し、転写物１は検出しないであろう。
【００４５】
図２に示されているシナリオは若干異なる。転写単位は三つのエクソン：Ａ，Ｂ及びＣを有し、これらは２つのスプライス変異体：転写物１（ＡＣ）及び転写物２（ＡＢＣ）へと転写される。配列Ａに対して相補的なオリゴ又はその断片は転写物１及び転写物２の両者を検出することができ、両者の豊富さのレベルを集合的に測定することができるであろう。対照的に、配列Ｂに対して相補的なオリゴ又はその断片は転写物２を検出するが転写物１を検出することができず、それによって転写物２の豊富さについての直接的な情報を与えるであろう。
【００４６】
図３は５つのエクソン：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びＥを有する転写単位又は遺伝子を示す。４つの選択的にスプライスされた転写物がある：転写物１（ＡＣＤ）、２（ＡＣＥ）、３（ＢＣＤ）及び４（ＢＣＥ）である。これは一層複雑なスキームであるが、原理は同じままである：配列Ａに対して相補的なオリゴ又はその断片は転写物１及び２のみを検出することができ（従って、“１＋２＝Ａ”）；配列Ｂに対して相補的なオリゴは転写物３及び４のみを検出することができ（従って“３＋４＝Ｂ”）；配列Ｄに対して相補的なオリゴは転写物１及び３のみを検出することができ（従って“１＋３＝Ｄ”）；そして配列Ｅに対して相補的なオリゴは転写物２及び４のみを検出することができるであろう（従って“２＋４＝Ｅ”）。それ故、我々はサブセットのスプライス変異体を特異的に検出することができる多数のオリゴを有する。加えて、上述の４つの多変数方程式を解けば各スプライス変異体（Ａ，Ｂ，Ｄ及びＥ）の豊富さのレベルが明らかとなるであろう。更に、配列Ｃに対して相補的なオリゴ又はその断片は４つの転写物すべてを検出することができ、かくしてこれらのスプライス変異体の豊富さの総レベルを測定することができるであろう。
【００４７】
同様に、本発明によれば、代表的配列及び一以上のオリゴヌクレオチドプローブが選択的ポリアデニル化部位を有する特定遺伝子又は転写単位について生成されるように、選択的ポリアデニル化が考慮に入れられる。これらのプローブは（ｉ）すべての選択的ポリアデニル化転写物、（ｉｉ）これらの選択的ポリアデニル化転写物のサブセット、又は（ｉｉｉ）標的遺伝子又は転写物のポリアデニル化部位の一つのいずれかにハイブリダイズして検出するために用いられることができる。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドはゲルベースのシステムにおけるそれらの適用又はＲＮＡ検出のためのチップ又はアレイベースのシステム上への取り付けを容易にするために末端で改変されることができる。例えば一つの実施態様においては、オリゴヌクレオチドは５´末端で改変されている：Ａ５´Ｃ６−アミノ変性はガラスアレイ表面上へのオリゴヌクレオチドの共有結合取り付けを可能にするために行われる。炭素はスペーサーとして機能し、反応性アミン基はガラス表面に共有結合的に取り付けられているアルデヒドと相互作用する。予め処理されたガラスは多数の会社、例えばＡｒｒａｙＩｔ．ｃｏｍ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ），Ｃｏｒｎｉｎｇ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ），Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、から商業的に入手することができる。これらのガラス及び他の類似物はオリゴヌクレオチドの結合のために好適であり、それにより本発明によるオリゴヌクレオチドライブラリーを用いたオリゴアレイを製造するために好適である。取り付けは例えば共有結合的又は静電的であることができる。一例はポリ−Ｌ−リシンガラス上へのオリゴの結合であり、これは静電的である：ポリ−Ｌ−リシンは正に帯電しており、一方、ＤＮＡのリン酸骨格は負に帯電している。他の例はアルデヒドガラス上へのオリゴの結合であり、これは共有結合的である。
【００４９】
ゲルベースの及びアレイベースのプラットフォームと共に用いられるオリゴヌクレオチド
上述の通り、本発明によればトランスクリプトーム中のＲＮＡ種を測定するために様々な検出プラットフォームが用いられることができる。一実施態様においては、ゲルベースのプラットフォームが用いられる；他の実施態様においては、チップ又はアレイベースのプラットフォームが用いられる。ゲルベースのプラットフォームが用いられる場合、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　分析、Ｄｏｔ　Ｂｌｏｔ分析、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　分析、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　分析、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　分析、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ベースの分析又は他の同様の手順の如き技術が用いられることができる。アレイはニトロセルロースの如き基質上に直接スポッテイングすることによって作られることもできる。本質的に、本発明のオリゴヌクレオチドはラベリングされ（放射能活性ラベリング、蛍光ラベリングを介して、又は他の好適なラベリング方法及び技術分野において知られている捕獲成分を用いて）、そしてＲＮＡ又はｃＤＮＡサンプルが泳動されたゲルからインプリントされたフィルター又は膜にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションシグナルはオリゴヌクレオチドプローブが表すＲＮＡ転写物（及びそのスプライス変異体）の同一性及び豊富さを示す。これらのゲルベースのヌクレオチドハイブリダイゼーション及び検出手順は熟練した分子生物学者には周知である。一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　２００１，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　Ｅｄ．　を参照されたい。ヌクレオチドの分離が含まれないいくつかの場合においては、ヌクレオチドプローブ及びサンプルは電気泳動ゲルを使用しないでハイブリダイゼーションのために膜又はフィルターに直接適用されることができる。
【００５０】
特定のチップ又はアレイベースのプラットフォームが用いられる場合、本発明のオリゴヌクレオチドは固体表面、例えばガラススライド上に、上述のような様々な取り付け化学を介して又は他の好適な取り付け手順を介してスポッティング又はプリントされる。スライドは次に典型的なゲルベースの分離及びハイブリダイゼーション実験におけるフィルター又は膜と類似の様式で処理され、続いて、関心のある組織又は細胞系の如き生物学的サンプルから由来するラベリングされた（放射能活性ラベリング、蛍光ラベリングを介して、又は他の好適なラベリング方法を用いて）ｃＤＮＡ又はＲＮＡ分子を用いてプロービングされる。いくつかの場合には、ラベリングされたクローン又は総ゲノムＤＮＡが代わりに用いられることができる。ハイブリダイゼーションに続いて、スライドは洗浄され、スキャニングされてハイブリダイゼーションシグナルが読み取られて記録される。これらのシグナルはオリゴヌクレオチドプローブが対応しておりかつ検出されるＲＮＡ転写物（及びそのスプライス変異体）の同一性及び豊富さを表す。特定の生物学的サンプル中のＲＮＡ転写物及びそれらのスプライス変異体のかかる測定はそれ故、特定の生物学的状況　−　正常、病気、又は治療された　−　におけるトランスクリプト−ムのスナップ写真を与え、従って様々な生物学的状況における特性及び相互作用を解明するのを助ける。
【００５１】
本発明によれば、ライブラリーの全てのオリゴヌクレオチド又はその一部は単一のマイクロアレイ上にスポッティングされることができ、それ故、単一のハイブリダイゼーション手順により多数の転写物又はそれらの対応する多数の遺伝子をテストすることができる。変形として、他の実施態様においてはオリゴヌクレオチドはアレイの表面上で直接合成されることができる。固体表面上でのオリゴの合成方法は技術分野では知られている。例えばＵ．Ｓ．特許第５５９３８３９号を参照されたい。この実施態様においては、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドは約２０〜２５塩基の長さであることが好ましい。何故なら、長い配列のｉｎ　ｓｉｔｕ合成はしばしばエラーを生ずる傾向があるからである。アレイ上に直接合成される本発明のライブラリーはかくして特定の生物学的状況下でサブトランスクリプトームの転写物を検出するために設計された特異的ライブラリー又はミニライブラリーとして有用であるかもしれない。
【００５２】
オリゴヌクレオチドライブラリーのための使用
ゲルベースの、アレイベースの又は他の好適な検出システムが本発明により用いられている場合、オリゴヌクレオチドライブラリーはヒトのトランスクリプトーム、マウスのトランスクリプトーム又はラットのトランスクリプトームの如き所定の種のトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出するために構築されることができる。ライブラリーは特定の生物学的又は病理学的起源の、又は特定の生物学的又は病理学的状況におけるサブトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出するために構築されることもできる。
【００５３】
例えば、本発明の一実施態様においては、サブトランスクリプトームは特定の組織起源のものであることができる。つまり、それは腎臓のサブトランスクリプトーム、脳組織のサブトランスクリプトーム、心臓組織のサブトランスクリプトーム、肺組織のサブトランスクリプトーム、骨組織のサブトランスクリプトーム、肝臓組織のサブトランスクリプトームなどであることができる。従って、本発明のライブラリーは関心のある組織のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を特異的に検出するために用いられることができる。特定遺伝子（即ち、あるサブトランスクリプトーム中にのみ存在し、他のサブトランスクリプトーム中には存在しない特定のＲＮＡ転写物又はスプライス変異体）の組織特異的発現又は組織特異的様式（即ち、特定のＲＮＡ転写物又はスプライス変異体があるサブトランスクリプトーム中では他のサブトランスクリプトーム中よりも多かれ少なかれ豊富である）での特定遺伝子のディファレンシャル発現はそれ故、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーを用いて検出され監視されることができる。転写物又は特定スプライス変異体の存在又は不在、及びそれらの豊富さの相違は統計学的有意さ水準下で評価されることができる。好適な統計学的評価は技術分野では知られている。
【００５４】
他の実施態様においては、サブトランスクリプトームは特定の病理学的組織起源のものである。つまり、それはがん組織のサブトランスクリプトーム、例えば結腸がん組織のサブトランスクリプトーム、乳がん組織のサブトランスクリプトーム、肺がん組織のサブトランスクリプトーム、骨がん組織のサブトランスクリプトーム、前立腺がん組織のサブトランスクリプトーム、脳がん組織のサブトランスクリプトーム、又は肝臓がん組織のサブトランスクリプトーム、であることができる。それは異常心臓組織のサブトランスクリプトーム、異常ニューロン組織のサブトランスクリプトーム、異常肝臓組織のサブトランスクリプトーム、又は異常腎臓組織のサブトランスクリプトームなどであることもできる。
【００５５】
それ故、本発明のライブラリーは関心のある病理学的組織起源のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を特異的に検出するために用いることができる。従って、本願は組織及び病気特異的遺伝子、即ち特定組織においてのみ及び特定の病理学的状況下でのみ発現される遺伝子の検出を可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体は特定のサブトランスクリプトームにのみ見出されることができるからである。加えて、本願は組織及び病気特異的様式でディファレンシャルに発現される遺伝子、即ち、他の組織よりも又は正常又は他の状況下よりも特定組織及び特定の病理学的状況下で異なるレベルで発現される遺伝子、の検出を更に可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体は特定のサブトランスクリプトームにおいて多かれ少なかれ豊富であるからである。転写物又はスプライス変異体の存在又は不在、及びそれらの豊富さの相違は統計学的有意さ水準下で評価されることができる。
【００５６】
さらに他の実施態様においては、サブトランスクリプトームは特定の発生段階のものである。つまり、それはヒトの神経誘導、マウスの中胚葉の誘導、ヒトの赤血球誘導、又は様々な種における他の特異的発生生物学的段階からのサブトランスクリプトームであることができる。それ故、本発明のライブラリーは関心のある発生的生物学的段階のサブトランスクリプトームの中に場所を占めるＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を特異的に検出するために用いることができる。従って、本願は発生段階特異的遺伝子、即ち特定の発生段階においてのみ発現される遺伝子の検出を可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体は特定のサブトランスクリプトームにのみ見出されることができるからである。加えて、本願は発生段階に依存する様式でディファレンシャルに発現される遺伝子、即ち、他の状況よりも特定発生段階で異なるレベルで発現される遺伝子、の検出を更に可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体は特定のサブトランスクリプトームにおいて多かれ少なかれ豊富であるからである。転写物又はスプライス変異体の存在又は不在、及びそれらの豊富さの相違は統計学的有意さ水準下で評価されることができる。
【００５７】
更なる実施態様においては、オリゴヌクレオチドライブラリーは特定の病気に罹患している患者のトランスクリプト−ムのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出するために構築される。つまり、それは結腸がん患者、乳がん患者、肺がん患者、骨がん患者、前立腺がん患者、脳がん患者、又は肝臓がん患者のごときがん患者のトランスクリプトームであることができる。それはたとえばアルツハイマー病患者、パーキンソン病患者、骨粗しょう症患者、糖尿病患者、慢性関節リウマチ患者、又は関心のある他の病気の患者のトランスクリプトームであることもできる。
【００５８】
本発明は病気特異的遺伝子、即ち特定の病気に罹患している患者においてのみ発現される遺伝子の検出を可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体はかかる患者のトランスクリプトームにのみ見出されることができるからである。加えて、本発明は特定の病気の患者でディファレンシャルに発現される遺伝子、即ち、正常又は健康な個体におけるよりも特定の病気の患者において異なるレベルで発現される遺伝子、の検出を更に可能にする。何故なら、対応する転写物及びスプライス変異体はかかる患者のトランスクリプトームにおいて多かれ少なかれ豊富であるからである。転写物又はスプライス変異体の存在又は不在、及びそれらの豊富さの相違は例えば特定のｐスコアを要求する統計学的有意さ水準下で評価されることができる。更に、本願は特定の病気に罹患している患者の発現パターン又はプロファイルの個人化された特性決定（所定の患者の転写物及びスプライス変異体の同一性及び豊富さのコンピレーション）を可能にし、従って個人化された治療方法の開発の基礎を提供する。
【００５９】
まとめると、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーはＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出してそれにより関心のあるトランスクリプトーム又はサブトランスクリプトームを特定決定するための様々な機能的関連において用いられることができる。この関連において、サブトランスクリプトームの範囲はタンパク質の機能によって制限されることもできる。例えば、オリゴヌクレオチドライブラリーは細胞表面抗原に対応するサブトランスクリプトームのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体を検出するために用いられることができる。以下に規定するような４０以上のタンパク質機能的グループのリスト（Ｕ．Ｓ．仮出願シリアルＮｏ．６０／２２１６０７も参照されたい）は、例えばサブプロテオーム又は特定の機能のその一つのタンパク質及びその異常型を生ずるサブトランスクリプトームを特定決定することができるオリゴヌクレオチドライブラリーを構築するために本発明において有用である。
【００６０】
グループ１。アダプター結合タンパク質。これらは他の細胞成分と関連し　−　それらと結合又は相互作用し　−　それらの構造的統合性を維持し、その機能的活性を発揮させる。
【００６１】
グループ２。接着分子。これらは隣接細胞間の接着の調節に関与している。
【００６２】
グループ３。アポリポタンパク質。これらはリポタンパク質粒子の一部であるタンパク質であり、これらの粒子の結合及び内面化における細胞シグナリング作用を有する。アポリポタンパク質欠失は異常に高レベル又は低レベルのリポタンパク質及びコレステロールに関与する病気、並びに形成又は動脈硬化に関与する状況において見出される。
【００６３】
グループ４。アポトーシスに関連するタンパク質。これらは阻害又は刺激様式でアポトーシス経路に関与するタンパク質及び酵素である。これらのタンパク質の異常は退行病（例えば神経退行病）の如き細胞の未成熟死に関与する病気、又は老化に関連する状況、又は代わりに要求されるアポトーシスが起こらない病気を引き起こす。かかる病気の例はがん及び心筋梗塞後の心臓機能の欠如である。
【００６４】
グループ５。がんに関連するタンパク質。これらはＤＮＡ修復タンパク質、腫瘍マーカー及び抗原、腫瘍サプレッサー、及び腫瘍形成に参加するメッセンジャー分子などを含み、様々な種類のがん及び対応する転移状況の治療及び検出に関与する。
【００６５】
グループ６。カルボキシラーゼ。これらのタンパク質の異常は他の成分からＣＯ２基を除去する酵素反応の異常制御を引き起こす。
【００６６】
グループ７。細胞表面抗原。これらは細胞の表面で発現されるタンパク質である。これらのタンパク質の異常は例えばＡＩＤＳ及び細胞表面抗原に関与するがんの如き自己免疫疾患において見られることができる。
【００６７】
グループ８。細胞増殖を制御するタンパク質。これらのタンパク質は退行病（低い増殖）又はがん（未制御の増殖）における欠陥構造又は機能を有する。
【００６８】
グループ９。凝集に関連するタンパク質。これらのタンパク質の異常は例えば血友病、又は発作及び血管のブロックを引き起こす。
【００６９】
グループ１０。変換酵素。これらの酵素はプレカーサータンパク質の特異的開裂によって一つのタンパク質を他のタンパク質へと変換する。
【００７０】
グループ１１。サイクラーゼ酵素。これらの酵素はトリホスフェートをサイクリックモノホスフェートへと変換する。これらの酵素の異常はトリホスフェートのサイクリックモノホスフェートへの不十分な又は過剰の変換を引き起こし、それによって細胞シグナリングに影響を与える。
【００７１】
グループ１２。タンパク質の分解に関与するタンパク質。これらのタンパク質の異常は他のタンパク質の異常な分解を引き起こし、それは様々なタンパク質性生産物の細胞中への異常な蓄積をもたらすことがある。
【００７２】
グループ１３。発生に関与するタンパク質。これらのタンパク質の異常は例えば胎児の異常発生に関与する遺伝病において表れる。
【００７３】
グループ１４。ドメインタンパク質。これらのタンパク質はタンパク質とタンパク質の相互作用に関与している。
【００７４】
グループ１５。エステラーゼ。これらのタンパク質はエステル結合を開裂する。
【００７５】
グループ１６。成長因子。これらのタンパク質の例はサイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、及びリンポカインなどを含む。これらのタンパク質は少し例を挙げれば自己免疫疾患、炎症関連の病気、移植片対ホスト病、感染性病原体により生ずる病気、及びがんに関与している。
【００７６】
グループ１７。ホルモン及びポイエチンタンパク質。これらのタンパク質の異常は様々な内分泌病において見られる。
【００７７】
グループ１８。ハウスキーピングタンパク質。これらの例はホメオボックスタンパク質、ヒートショックタンパク質、及びシャペロニンなどである。
【００７８】
グループ１９。ヒドロラーゼ。これらの酵素はヒドロキシル基を変性する；例としてヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ヒドロラーゼ、及びヒドロキシラーゼがある。
【００７９】
グループ２０。免疫関連のタンパク質。これらは免疫系に関与するタンパク質であり、抗原、抗体及びそれらの関連タンパク質を含む。これらのタンパク質は炎病、自己免疫病、感染性病及びがんのプロセスの如き病理学的状況において重要である。
【００８０】
グループ２１。阻害剤。これらのタンパク質は細胞過程において他のタンパク質の機能を阻害する。
【００８１】
グループ２２。キナーゼ。これらのタンパク質の異常は不完全な細胞シグナリングに導く。
【００８２】
グループ２３。リパーゼ、ホスホリパーゼ、及びライソホスホリパーゼ。これらのタンパク質は異常脂質代謝に関与している。
【００８３】
グループ２４。細胞マトリックス及び細胞骨格タンパク質。
【００８４】
グループ２５。変性酵素。これらのタンパク質はパラオキソナーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、及びアンヒドラーゼの如き多方面にわたる多数の酵素を含む。これらの酵素の機能不完は様々な細胞過程に関与している。
【００８５】
グループ２６。ムターゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ。これらのタンパク質はがん及び老化に関する様々な他の病理学的過程に関与している。
【００８６】
グループ２７。神経に関連するタンパク質。これらのタンパク質は様々な種類の痴呆、神経退行病、てんかん、精神障害などを含む中央神経系の病気に関与している。
【００８７】
グループ２８。オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ。これらの酵素の異常は例えば過酸化物を含む代謝問題を引き起こすかもしれない。
【００８８】
グループ２９。オキシゲナーゼ（モノ及びジオキシゲナーゼ）。
【００８９】
グループ３０。ホスファターゼ及びホスホリラーゼ。
【００９０】
グループ３１。リンタンパク質、及びリン脂質。
【００９１】
グループ３２。プロテアーゼ、ぺプチダーゼ、及びプロテイナーゼ。
【００９２】
グループ３３。レセプター。
【００９３】
グループ３４。レダクターゼ。
【００９４】
グループ３５。分泌タンパク質。これらのタンパク質はホルモン、神経伝達物質、及び細胞によって細胞外環境へと分泌される様々な他のタンパク質を含む。
【００９５】
グループ３６。シグナル伝達タンパク質。Ａ　Ｇタンパク質はこのグループのタンパク質の一例である。
【００９６】
グループ３７。サブ細胞タンパク質。これらのタンパク質の例はリボゾームタンパク質を含む。
【００９７】
グループ３８。シンターゼ及びシンテターゼ。
【００９８】
グループ３９。ヌクレオチドの相互作用に関与するタンパク質。これらは転写因子、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合タンパク質、ジンクフィンガー、ヘリカーゼ、イソメラーゼ、ヒストン、ヌクレアーゼを含む。
【００９９】
グループ４０。トランスフェラーゼ。これらはタンパク質の官能基の転移に関与する。
【０１００】
グループ４１。翻訳因子。これらは伸長及び開始因子の如き翻訳過程に関与するタンパク質及び酵素である。これらのタンパク質の異常は細胞のタンパク質生産を損なうかもしれない。
【０１０１】
グループ４２。トランスポーター。これらのタンパク質はチャネル、エクスチェンジャー、及びポンプを含む分子及びマクロ分子の輸送を媒介する。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドライブラリーを用いた発現プロファイリング
本発明によるオリゴヌクレオチドライブラリーの一つの適用は発現プロファイリングである。これはこれまで様々な場所で言及されているが、いくつかの追加の議論を必要とする。発現プロファイリングは本発明で用いられるように遺伝子発現プロファイリングとも称され、生物学的サンプル中のＲＮＡ転写物及びスプライス変異体の定性的及び定量的決定を意味する。生物学的サンプルは組織又は細胞系サンプル、正常な又は病気の組織サンプル、病気の組織サンプル又は治療のいくらかの期間の後の組織サンプル、異なる発生の生物学的段階から採取されたサンプル、医薬又は治療方法の適用の過程の様々な時点での患者から採取された生物学的サンプル又は液体サンプルであることができる。発現プロファイリングは、特定の生物学的源又は特定の生理学的又は病理学的状況についてのＲＮＡ転写物及びスプライス変異体の同一性及び豊富さのコンピレーションである発現プロファイル又は発現パターンを確立する。
【０１０３】
発現プロファイリングは上述の通り、本発明によりゲル（及び／又は膜）ベースの又はアレイベースの系を介して行われることができる。本質的に、様々な豊富さの二以上のＲＮＡを含む生物学的サンプルの発現プロファイリングは複数のオリゴヌクレオチド配列に対するサンプルのハイブリダイゼーションシグナルを測定してそれによってサンプル中のＲＮＡ転写物のレベルを決定することによって、及びＲＮＡが一セットのスプライス変異体を有する転写単位から転写される場合には、（ｉ）一セットのスプライス変異体の総レベル；（ｉｉ）そのサブセットの総レベル、又は（ｉｉｉ）その一つのスプライス変異体のレベルを決定することによって行われる。複数のオリゴヌクレオチドが上述の様々な実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーによって与えられる。
【０１０４】
従って、本発明はオリゴヌクレオチドライブラリー及びそのサブライブラリー、カスタマイズされた又は改変されたオリゴヌクレオチド、ライブラリーからのオリゴヌクレオチドを上にスポッティングされたオリゴヌクレオチドアレイ、様々なヌクレオチド検出システムでオリゴヌクレオチドを用いる方法、及びオリゴヌクレオチドライブラリーを用いた発現プロファイリング方法を包含する。
【０１０５】
アンチセンスの用途及びＲＮＡの干渉
本発明のオリゴヌクレオチドはトランスクリプトームの一以上のスプライス変異体に結合することができるので、これらのオリゴヌクレオチドはｉｎ　ｓｉｔｕ及びｉｎ　ｖｉｖｏアンチセンスの関連で用途を有する。例えば、一本鎖アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド自体、又は変性された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）の如き細胞に、及び哺乳類の体（ヒトを含む）の如き体に注入されることができ、それらはそこでｍＲＮＡ転写物に結合すると予測され、それはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害又は防止するであろう。更に、二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又は一本鎖センスオリゴヌクレオチドはアンチセンスＲＮＡの生成のための最初の設計鋳型として用いられることができる。アンチセンスＲＮＡ分子のｉｎ　ｖｉｖｏ発現についての当該技術分野では知られているアプローチを用いると、本発明のオリゴヌクレオチドに基づくアンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡの翻訳を細胞レベルで阻害又は防止するために用いられることができる。
【０１０６】
ライブラリーのオリゴヌクレオチドはＲＮＡの干渉において用いられることもできる。ＲＮＡの干渉現象は　Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ　４１１：４２８−２９（２００１）；Ｅｌｂａｈｉｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４１１：４９４−９８（２００１）；及び　Ｆｉｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３９１：８０６−１１（１９９８）において議論されており、そこでは干渉するＲＮＡの作製方法も議論されている。ここで開示される配列に基づく二本鎖ＲＮＡは長さが１００塩基対（“ｂｐｓ”）未満であり、連続性は約３０ｂｐｓ以下であることが好ましく、相補的ＤＮＡ鎖又は合成アプローチの使用を含む当該技術分野では知られているアプローチを用いて作製されることができる。干渉を引き起こすことができるＲＮＡは小さな干渉ＲＮＡ（“ｓｉＲＮＡ”）と称されることができ、哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）の如き細胞中の、及び哺乳類の体（ヒトを含む）の如き体中の特定遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことができる。本発明による例示的ｓｉＲＮＡは２９ｂｐｓ，２５ｂｐｓ，２２ｂｐｓ，２１ｂｐｓ，２０ｂｐｓ，１５ｂｐｓ，１０ｂｐｓまで、又はそれらの周り又はそれらの間のいかなる数も有することができる。
【０１０７】
実施例１．選択的にスプライスされた転写物すべてを検出するためのオリゴヌクレオチドライブラリー：ヒト、ラット及びマウスのライブラリー。
６０塩基または６５塩基の長さのオリゴヌクレオチドが合成された。それらの各々はアルデヒドガラス表面への続く共有結合的取り付けを可能にするために５´末端でＣ６アミノ付加により変性された。各オリゴヌクレオチドは特定の転写単位又は遺伝子から転写された存在するＲＮＡスプライス変異体の間で共通するＲＮＡ転写物の一部分に対して相補的である。各オリゴヌクレオチドはＲＮＡ転写物及び／又はＲＮＡスプライス変異体に対して特異的又はユニークでもあり、それらのＲＮＡ転写物及び／又はＲＮＡスプライス変異体に対してそれは相補的である。即ち、他の転写単位又は遺伝子からのＲＮＡ転写物又はスプライス変異体に対する各オリゴヌクレオチドの結合は無視しうる。換言すれば、各遺伝子又は転写単位に対して一つのオリゴが選択される。各オリゴは各遺伝子又は転写単位について知られている又は予測されている事実上最大数のスプライス変異体に対して共通である配列セグメントから由来される。加えて、オリゴは高精度の配列の質が配列決定エラーを回避するために維持されるような、二次構造が効果的なハイブリダイゼーションを促進するために回避されるような、及び融解温度がライブラリー中のオリゴコレクション全体にわたって一致するために標準化されるような態様で設計されて合成される。
【０１０８】
いくつかの代表的実施態様においては、ヒトのオリゴライブラリーは１８８６１個のヒトオリゴヌクレオチドを含み、それぞれは６０塩基の長さである；ラットのオリゴライブラリーは４８５４個のラットオリゴヌクレオチドを含み、それぞれは６５塩基の長さである；マウスのオリゴライブラリーは７５２４個のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれは６５塩基の長さである。１８８６１個のヒトオリゴ、４８５４個のラットオリゴ、及び７５２４個のマウスオリゴの配列はＳｅｃ．８０１（ａ）下で提出された配列表中に含まれている（出願人名はＣｏｍｐｕｇｅｎ　Ｌｔｄ．（ＣＲＦ及びコピー）であり、ＣＤ−Ｒメディアで本願に沿って提出されたＰａｔｅｎｔｉｎ　３．０中の３２３３７個の配列を含む。ファイルサイズ５．７８ＭＢ、ファイル名Ｓｈｏｓｈａｎ、代理人整理番号３６６８８−０００６。この全体は参照文献としてここに組み入れられる。これはＣＤ−Ｒメディアで本願に沿って提出されたＰａｔｅｎｔｉｎ３．０中の３２３３７個の配列を含む配列表（ＣＲＦ及びコピー）中に規定される配列を含む。ファイルサイズ５．７８ＭＢ、ファイル名Ｓｈｏｓｈａｎ、代理人整理番号３６６８８−０００４。この全体は参照文献としてここに組み入れられる。これは２００１年５月２日に出願されたＵ．Ｓ．シリアルＮｏ．６０／２８７７２４において提出されている。）。配列表中で用いられている３２３３７個の配列もここで与えられる。これらはＲａｗ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓというラベルを貼られたＣＤ−Ｒディスク上のＭＳ　Ｗｏｒｄ　フォーマット中の、Ｓｅｃ．８０１（ａ）下で提出された配列表であり、代理人整理番号３６６８８−０００６を有する５．７８ＭＢの配列表についてのＰＣ／ＭＳ−ＤＯＳ　ＰＡＴＥＮＴＩＮ３．０であり、その全体は参照文献としてここに組み入れられる。これらのライブラリー中の各オリゴは特定の機能的タンパク質をコードする転写単位又は遺伝子から転写されるＲＮＡ転写物及び／又は全ての存在する又は予測されるＲＮＡスプライス変異体を表す。多くの場合、オリゴ配列についての対応する遺伝子又は転写単位の名称、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号、及び他の注釈情報は特定されている。上記配列の数は絶対的ではなく、それ故、異なる数の配列を含む他のライブラリーも出願人の教示に従って作製されることができる。
【０１０９】
ライブラリーのオリゴはプレート上に、例えば３８４又は９６ウェルフォーマットで配置されることができる。それらはスポッティングされるか又はすでにプリントされており、かくしてマイクロアレイ分析において便利に適用されることができる。
【０１１０】
他の種、例えばウシ、ブタ又はアラバドプシスのためのオリゴヌクレオチドライブラリーも本発明に従って同様に構築されることができる；これらのライブラリーはマイクロアレイ分析において、及び当該技術分野で知られている他のＲＮＡ又はｃＤＮＡ検出システムにおいて直ちに用いられることができる。
【０１１１】
実施例２．ＲＮＡ転写物全て又は個別のスプライス変異体を検出するためのミニオリゴヌクレオチドライブラリー
ヒトのオリゴミニライブラリーはヒトのがん／アポトーシス遺伝子、肥満症／糖尿病遺伝子、及び毒素遺伝子について構築された。６０塩基の長さのオリゴヌクレオチドががん／アポトーシス、オベシティ／糖尿病、及び毒素に関与する遺伝子についてＵ．Ｓ．出願シリアルＮｏ．０９／１３３９８７に外略が示されているアプローチを用いて、また選択的スプライシング現象を考慮に入れながらそれぞれ設計又は選択された。これらのオリゴは次に上記実施例１で議論したのと同様のことを考慮に入れて合成された。
【０１１２】
ヒトのがん／アポトーシス遺伝子の個別のスプライス変異体及び／又はそれらの転写物を検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは２０１個の配列を含む。ヒトのがん／アポトーシス遺伝子からの存在する又は予測されるスプライス変異体を全て検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは２８０個の配列を含む。毒性に関与する遺伝子の個別のスプライス変異体を検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは２３４個の配列を含み、そして、ヒトの毒性遺伝子からの存在する又は予測されるスプライス変異体を全て検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは９６個の配列を含む。ヒトの肥満症／糖尿病遺伝子の個別のスプライス変異体を検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは１９５個の配列を含み、そしてヒトの肥満症／糖尿病遺伝子からの存在する又は予測されるスプライス変異体を全て検出することができるヒトのオリゴミニライブラリー中のオリゴヌクレオチドは９２個の配列を含む。再び、上記配列の数は絶対的ではなく、それ故、異なる数の配列を含む他のライブラリーも出願人の教示に従って作製されることができる。
【０１１３】
６つのミニライブラリー中の全てのオリゴの配列は本願に沿って提出された配列表中に含まれている。これらのオリゴはプレート上に、例えば３８４又は９６ウェルフォーマットで配置されることができる。それらはすでにプリントされており、かくしてマイクロアレイ分析において便利に適用されることができる。それ故、病気特異的に又はディファレンシャルに発現される遺伝子はヒトの毒性、糖尿病／肥満症、及びがん／アポトーシス状況についてのこれらのオリゴライブラリー及びマイクロアレイをそれぞれ用いて検出又はモニターされることができる。
【０１１４】
本発明は教示の明確さの目的で例を用いて詳細に説明されてきたが、以上の説明は本発明の範囲を限定することを意図されていないということは理解されるべきである。本発明の教示に鑑みて当業者には明らかな他の側面、利点及び変形は特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
三つのエクソン及びそこから転写される２つの選択的にスプライスされた転写物を有する転写単位を示す図である。
【図２】
三つのエクソン及びそこから転写される２つの異なるスプライス変異体を有する転写単位を示す図である。
【図３】
五つのエクソン及びそこから転写される４つの選択的にスプライスされた転写物を有する転写単位を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004508019.tif 000055
2004508019.tif 000056
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