(57)【要約】本発明は、分離された仕切内で、表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリットまたはモノリスを提供することにより標的分子を識別するための分子的にインプリントされた異なるポリマーを調製するための方法に関する。本発明はまた、標的分子の識別のために分子的にインプリントされた異なるポリマーを含む装置に関するものである。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる分子的にインプリントされたポリマーの同時調製及び標的分子の識別のためのスクリーニング方法であって、
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、を特徴とする方法。
【請求項２】
前記仕切がマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記仕切がＴＬＣプレートのレーンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的分子を識別するための異なる分子的にインプリントされたポリマーを含む装置であって、
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、により得られる装置。
【請求項５】
前記仕切がマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記仕切がＴＬＣプレートのレーンである、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記分子的にインプリントされたポリマーの識別特性を評価するための、請求項４乃至６のいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項８】
固相抽出における、請求項４乃至６のいずれか１項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、標的分子を識別するための異なる分子的にインプリントされたポリマーの調製方法、および標的分子を識別するための異なる分子的にインプリントされたポリマーを含む装置に関するものである。
【０００２】
技術背景
分子的にインプリントされたポリマー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ； ＭＩＰｓ）、またはいわゆる人工抗体は、薬剤、毒素又は環境汚染物のように、複合生物学的試料１−３において、標的分子を識別するために作られたプラスチックである。近年、固相抽出における親和性相（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｈａｓｅ）のような物質４，５、センサーにおける識別要素６のような物質、予備精製のための固定相７、もしくはエナンチオマーの分離８，９のような物質、触媒１０のような物質、もしくは医療用吸着剤１１のような物質の適用が続いている。これらの適用間において、固相抽出（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ＳＰＥ）は、その最も幅広い使用が見出されることが期待されている。ＳＰＥは、血液、尿もしくは環境水等の複合生物学的試料中に存在する分析物（例えば、薬剤、代謝産物、農薬、毒素）を取り除く、もしくは濃縮するために使用される（図１）。
【０００３】
薬剤を分析する現在の方法は、有効なＳＰＥ技術に大きく依存している。その高い効力のために、多くの新規薬剤がかなり低い用量において現在投薬されている。従って、従来の除去方法は充分効果的とは言えない。しかしながら、ＭＩＰｓは、高い親和力を有する試料から薬剤を選択的に抽出するために使用され得る。選択的方法においては、生物学的抗体が同一目的のために使用され得る。ＭＩＰｓが実験動物の免疫により製造される生物学的抗体よりもはるかに速く製造され得、また再生法においても優れることは注目に値する。ＭＩＰｓは生物学的抗体が製造及び試験に６乃至１２カ月を要するのに対し、１乃至２週間以内に製造、試験が可能である。
【０００４】
新規薬剤候補の生物学的検査は、薬剤開発においてしばしば妨げとなるため、効果的な分析方法の迅速な普及が、新規薬学的製造物の開発においていずれ重要な救済をもたらすことが期待される。新規標的分析物を支配する上で、短時間に標的のための選択的抽出物を提供することは重要である。
【０００５】
発明の概要
現在用いられている分子インプリンティングプロトコル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、識別される標的分子と同様の構造を示す、標的鋳型分子の存在において過剰な架橋モノマーと１又は２以上の官能性モノマーとの重合に基づく（図２）。
【０００６】
この開発におけるポイントは、物質構造及び分子識別特性に影響を及ぼす主ファクターの同定とその最大限の利用である。これらファクターは、官能性モノマー、架橋モノマー、重合温度、重合圧力又は溶媒のタイプ及び濃度であり得る。これは、多数の物質の識別特性を迅速にスクリーニングさせ得るＭＩＰ合成を率に応じて減ずることにより達成され得る（ｍｉｎｉ−ＭＩＰｓ）（図３）１２。従って、本オートメーション化された手順は、小さなオートサンプラーバイアルにおいて６０ＭＩＰｓの平行合成を可能にする。これに次いで、バッチ平衡結合実験における識別特性の評価が行われる。この物質評価方法における問題は、平行反応の速度論に関するいかなる情報も得られないことである。本目的のために、クロマトグラフィーのフロースルー型において物質を直接的に評価できる技術が所望される。
【０００７】
本発明の目的は、フロースルー型において、モノリスＭＩＰｓおよびグラフトＭＩＰｓを用いたスクリーニング技術を提供することである。本発明の特徴は、特許請求の範囲に規定されている。
【０００８】
本発明に従い、本目的は以下の方法により達成された。
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、を特徴とする方法。
【０００９】
本発明に従い、本目的はまた以下の装置により達成された。
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、により得られる装置。
【００１０】
本発明の好ましい態様は、準用する請求項に規定されている。
【００１１】
好ましい態様の詳細な説明
以下、本発明を好ましく、且つ非制限的な例を用いて詳細に説明する。以下の製造物及び方法は、新規なものとして、またＭＩＰ開発の成功において決定的に重要なものとして主張される。
【００１２】
１．規定された孔及び粒子サイズを有する粒子におけるＭＩＰｓの無作為配列（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）グラフト、並びにその後のＳＰＥくぼみのパッキング
ＷＯ ０１／１９８８６には、開始剤修飾された粒子におけるＭＩＰｓの合成が記載され、得られる複合体ＭＩＰｓは本発明の基礎を形成する。従って、インプリントされたポリマーは粒子表面への鎖成長を制限することにより調製され得る（図４）。これは、ＭＩＰを製造するための強壮で連続的な方法が提供され得ることを意味する（図５）。あるいは、溶液中における鎖の成長は無視し得るので、ＳＰＥにおける元の位置で、あるいは平面基材上で行われ得る。本発明においては、粒子は特別に設計されたマイクロチッタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）にパッキングされ得る。これらの第１は、密閉可能な出口を備え、フリットを有する溶媒耐性マイクロチッタープレートである（Ａｌｔ １）。他は、グラフト後の粒子が標準ＳＰＥプレートに移され得る溶媒耐性プレートである（Ａｌｔ ２、図６）。図６に示される溶媒耐性プレートは好ましくはテフロン（登録商標）加工されたアルミニウムのマイクロチッタープレートである。マイクロチッタープレートの各くぼみは、開始剤修飾された粒子を含む。各くぼみにおける開始剤修飾された粒子の量は、好ましくは約１０乃至２０ｍｇである。各くぼみの底には、以下に述べるようにＭＩＰ粒子のその後の移動のための一方向キャピラリーが備えられている。マイクロチッタープレートの上部には、紫外線（ＵＶ）重合のためのガラス蓋が備えられている。約１０乃至２０ｍｇの粒子を各くぼみに充填した後、鋳型分子を含む異なるモノマー混合物が、工程１（図６）において、粒子を湿らせるのにちょうどいい量だけ各くぼみに加えられる。ＵＶ又は熱による工程２における重合の後、ＭＩＰグラフト粒子は、工程３及び４において、積み重ねられ、逆さにされることにより、標準マイクロチッタープレート抽出ユニットの中に移される。工程３において、標準マイクロチッタープレートは、工程２において得られたＭＩＰ含有マイクロチッタープレートの上部にきっちり逆さに積み重ねられる。工程４において、工程３の積み重ねられたマイクロチッタープレートは逆さにされ、ＭＩＰ粒子は溶媒耐性マイクロチッタープレートから標準マイクロチッタープレートに移される。効果的な移動は、ゆすぎ落としと真空適用により保証される。得られるプレートは、次いで使用のための準備がなされる。従って、本発明は、従来の無作為配列ＭＩＰ合成および評価において使用され得る。開始剤修飾された粒子の使用との選択において、開始剤修飾されたフリットもしくはモノリスもまた使用され得る。
【００１３】
２．識別特性のＴＬＣ評価のためのストライプ状のＭＩＰ無作為配列合成
本発明の本態様は図７において説明される。工程１において、開始剤修飾された粒子はＴＬＣプレート作製のための標準的な方法に従いガラスプレートをコートするために用いられる。コーティング後、レーン又はストライプは割れ目（図７における黒い太線）をカットすることにより分離され、隣接するモノマー混合物と混合されることが防止される。工程２において、ＭＩＰｓを与える鋳型を含む異なるモノマー混合物（Ｔ１乃至Ｔ５）、およびブランクを与える鋳型の存在しない異なるモノマー混合物（Ｂ１乃至Ｂ５）が次いで各レーンに加えられ、表面をガラスプレートでコーティングした後、工程３においてＵＶ又は熱により重合が開始される。重合の後、鋳型及び過剰のモノマーを洗浄により除去する。次いで、鋳型および類似体の識別特性が、ＴＬＣによりフロースルーモードにおいて直接的に評価され得る（工程４）。プレートの開発は、ＴＬＣ開発のための標準的な方法を用いてなされる。従って、プレートを蛍光ラベルで飽和させることにより、蛍光検知が可能である。別な方法では、種々の基の特定試薬を使用し得る。これは、ＳＰＥ又はクロマトグラフィーのためのＭＩＰ開発に代わり高い収率で得られるものとして期待される。
【００１４】
３．蛍光、ＵＶ、ＩＲ、ラマン、または放射能測定に基づく束縛−非束縛基質もしくは分析物の検知
ＭＩＰｓを合成した後、鋳型の解離及び再結合を迅速に評価する方法が必要となる。今日まで、これは連続モードにおいて時間を費やすＨＰＬＣ又はＦＩＡによる定量化を用いて測定されてきた。定量化のための平行した方法が非常に所望される。この目的のために、元の位置においてポリマーに結合したことを測定する繊細な技術を適用することが可能である。しかしながら、かかる技術は、モノマーおよび鋳型において吸着特性が大きく変化するため、特にＭＩＰｓの複合組成物による制限をうけると思われる。より広範な有用性を有するものとして、非束縛基質の定量化に依存する方法がある。ピペットで取ることにより、又は濾過することによりポリマーから上澄み液を分離した後、非束縛画分は鋳型の本質に依存する様々な技術を用いて測定し得る。従って、アミンはオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）等の蛍光試薬を用いてラベル付けされ得、酸は蛍光又はＵＶ吸収剤を用いてエステル化され得、放射性ラベル付けが利用可能である場合には、シンチレーションカウンティングも可能である。従って、マイクロチッタープレートリーダー（蛍光、ＵＶ／Ｖｉｓ−、シンチレーション−リーディング）と組み合わせてこれらの技術を利用することにより、ＭＩＰ合成のための高速スループット技術が可能である。
【００１５】
参考文献
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５．　Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｌ．Ｉ．， Ｐａｐｒｉｃａ， Ａ． ＆ Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ， Ｔ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４６， ５７−６２ （１９９７）．
６．　Ｔｕｒｋｅｗｉｔｓｃｈ， Ｐ． Ｗａｎｄｅｌｔ， Ｂ．， Ｄａｒｌｉｎｇ， Ｇ．Ｄ． ＆ Ｐｏｗｅｌｌ， Ｗ．Ｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０， ２０２５−２０３０ （１９９８）．
７．　Ｊｏｓｈｉ， Ｖ．Ｐ．， Ｋａｒｏｄｅ， Ｓ．Ｋ．， Ｋｕｌｋａｒｎｉ， Ｍ．Ｇ． ＆ Ｍａｓｈｅｌｋａｒ， Ｒ．Ａ． Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇｎ． Ｓｃｉ． ５３， ２２７１−２２８４ （１９９８）．．
８．　Ｓａｊｏｎｚ， Ｐ．， Ｋｅｌｅ， Ｍ．， Ｚｈｏｎｇ， Ｇ．， Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ， Ｂ． ＆ Ｇｕｉｏｃｈｏｎ， Ｇ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ８１０， １−１７ （１９９８）．
９．　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｄ．Ｗ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｈｅｉｎｚｅ， Ｊ．Ｍ．， Ｈｗａｎｇ， Ｙ． − Ｓ． ＆ Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ， Ｂ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７０， ３３０４−３３１４ （１９９８）．
１０．　Ｄａｖｉｓ， Ｍ．Ｅ．， Ｋａｔｚ， Ａ． ＆ Ａｈｍａｄ， Ｗ．Ｒ． Ｃｈｅｍ． Ｍａｔｅｒ． ８， １８２０ − １８３９ （１９９６）．
１１．　Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ， Ｂ．， Ｗｉｅｓｃｈｅｍｅｙｅｒ， Ｊ．， Ｂｏｏｓ， Ｋ． −Ｓ． ＆ Ｓｅｉｄｅｌ， Ｄ． Ｃｈｅｍ． Ｍａｔ． １０， ４０３７−４０４６ （１９９８）．
１２． Ｌａｎｚａ， Ｆ． ＆ Ｓｅｌｌｅｒｇｒｅｎ， Ｂ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７１， ２０９２−２０９６ （１９９９）．
【図面の簡単な説明】
【図１】固相抽出（ＳＰＥ）の原理の模式的な説明図。
【図２】モルキュラープリンティングの原理の模式的な説明図。
【図３】小規模のオートメーション化されたＭＩＰｓの合成及びスクリーニングのためのシステムの模式的な説明図。
【図４】本発明の方法の模式的な説明図。
【図５】本発明の方法の模式的な説明図。
【図６】本発明の方法の模式的な説明図。
【図７】本発明の方法の模式的な説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月28日(2002.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる分子的にインプリントされたポリマーの同時調製及び少なくとも一種の標的分子の識別のフロースルー型評価ためのスクリーニング方法であって、
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、
ｅ）前記標的分子を前記仕切に加えること、および
ｆ）フロースルー型において前記仕切内で分子的にインプリントされたポリマーにより前記標的分子の識別を評価すること、
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記仕切がマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記仕切がフロースルー固相抽出のためのマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記仕切がＴＬＣプレートのレーンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一種の標的分子の識別のフロースルー型評価のための異なる分子的にインプリントされたポリマーを含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法を適用するためのスクリーニング装置であって、
ａ）分離された仕切中に、その表面に拘束された開始剤を有する粒子、フリット、又はモノリスを提供すること、
ｂ）各仕切に、鋳型分子を含み得る異なるモノマー混合物を加えること、
ｃ）前記混合物を重合すること、
ｄ）前記仕切から鋳型及び過剰モノマーを除去すること、
ｅ）前記標的分子を前記仕切に加えること、および
ｆ）フロースルー型において前記仕切内で分子的にインプリントされたポリマーにより前記標的分子の識別を評価すること、
により得られることを特徴とする装置。
【請求項６】
前記仕切がマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記仕切がフロースルー固相抽出のためのマイクロチッタープレートのくぼみである、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記仕切がＴＬＣプレートのレーンである、請求項５に記載の装置。
【請求項９】
前記分子的にインプリントされたポリマーの識別特性を評価するための、請求項５乃至８のいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項１０】
固相抽出における、請求項５乃至８のいずれか１項に記載の装置の使用。
【国際調査報告】
2004507769.tif 000027
2004507769.tif 000028
2004507769.tif 000029