(57)【要約】イオンチャンネル活性を欠くウイルスの調製方法を提供する。
2004500830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、且つ精製された組換えインフルエンザウイルスであって、相当する野生型イオンチャンネルタンパク質と比較して、活性を欠いているか、又は低下した活性を有する変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る、ウイルス。
【請求項２】
変異イオンチャンネルタンパク質がキメラタンパク質である、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項３】
変異イオンチャンネルタンパク質が少なくとも１つのアミノ酸の置換を含んで成る、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項４】
置換がイオンチャンネルタンパク質の膜貫通領域内にある、請求項３に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項５】
変異イオンチャンネルタンパク質が欠失を含んで成る、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項６】
イオンチャンネルタンパク質がＡ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項７】
イオンチャンネルタンパク質がＢ型インフルエンザウイルスのＮＢタンパク質である、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項８】
イオンチャンネルタンパク質がＣ型インフルエンザウイルスのＣＭ１タンパク質である、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項９】
組換えウイルスが更に、病原の異種免疫原性タンパク質を含んで成る、請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルス。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離され、且つ精製されたウイルスを含んで成るワクチン。
【請求項１１】
相当する野生型イオンチャンネルタンパク質と比較して、活性を欠いているか、又は低下した活性を有する変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る組換えインフルエンザウイルスの調製方法であって、（ｉ）組換えインフルエンザウイルスを生成するために、宿主細胞を多数のインフルエンザベクターと接触させ、ここで、多数のベクターは、ａ）転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ１ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ２ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＨＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＰ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及び転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＭ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＳ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、から選択される少なくとも２つのベクター（ここで、Ｍ ｃＤＮＡは、変異イオンチャンネルタンパク質のＤＮＡを含んで成る）；及び
ｂ）インフルエンザウイルスのＰＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＰをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＨＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＭ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、イオンチャンネルタンパク質をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及びインフルエンザウイルスのＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、を含んで成る；そして
（ｉｉ）当該ウイルスを単離すること、
を含んで成る方法。
【請求項１２】
変異イオンチャンネルタンパク質が変異インフルエンザウイルスのイオンチャンネルタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異イオンチャンネルタンパク質がＡ型インフルエンザウイルスのイオンチャンネルタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｂ型肝炎の核の細胞質ドメインではない細胞質ドメインと連結した異種タンパク質の膜貫通ドメインと連結したインフルエンザウイルスのイオンチャンネルタンパク質の外部ドメインを含んで成る、キメラタンパク質をコードするベクター。
【請求項１５】
異種の膜貫通ドメインが、イオンチャンネルタンパク質ではないタンパク質由来のものである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
細胞質ドメインが、インフルエンザウイルスのイオンチャンネルタンパク質のものである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
異種膜貫通ドメインがインフルエンザウイルスのタンパク質に由来する、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
脊椎動物を免疫化するための方法であって、脊椎動物を有効量の、請求項１に記載の組換えウイルスと接触させることを含んで成る方法。
【請求項１９】
脊椎動物が鳥類である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
脊椎動物が哺乳類である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
脊椎動物がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ１ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ２ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＨＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＰ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＡ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＭ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及び転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＳ ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、から選択される少なくとも２つのベクター（ここで、Ｍ ｃＤＮＡは、変異イオンチャンネルタンパク質のＤＮＡを含んで成る）；及び
ｂ）インフルエンザウイルスのＰＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＰをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＨＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＭ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、イオンチャンネルタンパク質をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及びインフルエンザウイルスのＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、を含んで成る、多数のベクターを含んで成る組成物。
【請求項２３】
アンチセンスの配向の、注目のＤＮＡフラグメントと作用可能に連結したプロモーターを更に含んで成る、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ベクターが、免疫原性ポリペプチド又は病原のペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含んで成る、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１１に記載の方法によって調製される、単離されたウイルス。
【請求項２６】
請求項１又は２５に記載のウイルスと接触された宿主細胞。
【請求項２７】
薬物療法における使用のための、相当する野生型イオンチャンネルタンパク質と比較して、活性を欠いているか、又は低下した活性を有する変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る組換えインフルエンザウイルス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
この出願は、２０００年４月１４日に出願された米国特許出願番号第６０／１９７，２０９号の一部継続出願である。
【０００２】
政府の権利の主張
本発明は、アメリカ合衆国政府の助成金（国立アレルギー感染病研究所からの助成金ＡＩ−２９５９９， ＡＩ−４２７７４及びＡＩ−４４３８６）によってなされた。当該政府は、本発明における一部の権利を有するものと思われる。
【０００３】
本発明の背景
細胞膜は、様々なタンパク質が埋め込まれている、脂質分子の二重層から成る。その疎水性の内装により、細胞膜の脂質二重層は、多くの極性分子が通過する障壁としての役割を果たし、そしてそれ故に細胞の生存にとって必須である。細胞又は細胞内区画の内側への、又は外側への小さな水溶性分子の輸送を容易にするために、前記膜は担体タンパク質又はチャンネルタンパク質を有する。イオンチャンネルは、多くの細胞機能にとって必須であり、これには筋細胞の電気的な興奮性及び神経系における電気的なシグナル伝達を含む（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４によって概説された）。それらは全ての動物細胞及び植物細胞、並びに微生物において存在するだけでなく、ウイルスにおいても同定されており（Ｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｓｕｒｇｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０；Ｓｕｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６）、この中でそれらはウイルスの生活環における重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）によってキャプシド形成された８つのＲＮＡセグメントでエンベロープ形成された（−）鎖のウイルスである（Ｌａｍｂ及びＫｒｕｇによって１９９６年に概説された）。ウイルスの膜は３つのタンパク質：赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、及びＭ２、が貫通している。ＨＡ及びＮＡの細胞外ドメイン（外部ドメイン）は極めて可変性であり、一方、Ｍ２の外部ドメインはＡ型インフルエンザウイルス間で本質的に不変である。ウイルスの生活環は、一般的に、細胞表面受容体に対する付着、細胞内への侵入及びウイルス核酸のアンコーティング、それに続く細胞の内側でのウイルス遺伝子の複製、を含む。ウイルスタンパク質及び遺伝子の新たなコピーの合成の後に、これらの構成成分は子孫ウイルス粒子へと組み立てられ、これらはその後細胞から出ていく（Ｒｏｉｚｍａｎ及びＰａｌｅｓｅによって１９９６年に概説された）。異なるウイルスタンパク質が、これらの段階の各々で役割を果たしている。Ａ型インフルエンザウイルスにおいて、イオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質（Ｐｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２）は、宿主細胞の透過とウイルスＲＮＡのアンコーティングの間の、ウイルスの生活環における初期状態で機能すると考えられている（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ， １９９１；Ｈｅｌｅｎｉｕｓによって１９９２年に概説されたもの；Ｓｕｒｇｒｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。一旦ビリオンがエンドサイトーシスを経験すると、ビリオンに付随するＭ２イオンチャンネルである、ホモ四量体のへリックスの束が、酸不安定性のＭ１タンパク質−リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の相互作用を分断し、それによって細胞質へのＲＮＰの放出を促進するように、エンドソームからビリオンの内側にプロトンを流入させると考えられている（Ｈｅｌｅｎｉｕｓによって１９９２年に概説された）。更に、ＨＡが細胞内で開裂されるいくつかのインフルエンザ菌株の中でも（例えば、Ａ／ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅｓ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４）、Ｍ２のイオンチャンネルは、トランスゴルジ網のｐＨを上昇させ、この画分における低ｐＨの条件に起因する高次構造の変化を防ぐと考えられている（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．， １９８５；Ｏｈｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｔａｋｅｕｃｈｉ ａｎｄ Ｌａｍｂ， １９９４）。
【０００５】
Ｍ２タンパク質がイオンチャンネル活性を有するという証拠は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞において当該タンパク質を発現させ、そして膜電流を測定することによって得られた（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。Ｍ２タンパク質の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける特異的な変化は、当該チャンネルの動力学及びイオン選択性を変え、Ｍ２  ＴＭドメインがイオンチャンネルの細孔を構成しているという強力な証拠を提示した（Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， １９９４）。事実、Ｍ２のＴＭドメイン自身が、イオンチャンネルとして機能しうる（Ｄｕｆｆ ａｎｄ Ａｓｈｌｅｙ， １９９２）。Ｍ２タンパク質のイオンチャンネル活性が、インフルエンザウイルスの生活環において必須であると考えられているのは、Ｍ２イオンチャンネル活性をブロックする塩酸アマンタジンが（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．， １９７８）、ウイルスの複製を阻害するためである（Ｋａｔｏ ａｎｄ Ｅｇｇｅｒｓ， １９６９；Ｓｋｅｈｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９７８）。しかしながら、Ａ型インフルエンザウイルスの複製におけるこの活性についての必要性は、直接的には証明されていなかった。
【０００６】
一般的に、インフルエンザのワクチンは、高い力価で増殖し得る、生弱毒ワクチン又は死滅したウイルスから調製されてきた。生ウイルスワクチンは、免疫系を全ての局面で活性化し、そして防御抗原のそれぞれに対する免疫応答を刺激し、不活性化ワクチンの調製において起こり得る防御抗原の選択的な破壊における困難性を除いている。また、生ウイルスワクチンによって生まれた免疫性は、不活性化ワクチンによって誘導されるものよりも通常より長持ちし、より効果的であり、そしてより交差反応性がある。更に、生ウイルスワクチンは、不活性化ウイルスワクチンよりも製造するのにあまり費用がかからない。しかしながら、弱毒ウイルスにおける変異ははっきりしていない。
【０００７】
この様に、必要なのは、ワクチンのための組換え弱毒インフルエンザウイルス、例えば、確定した変異を有する弱毒ウイルス、を調製するための方法である。
【０００８】
本発明の要約
本発明は、変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る、単離され、且つ精製された組換えウイルスであって、相当する野生型のイオンチャンネルタンパク質の活性と比較して、イオンチャンネル活性を欠いているか、又はそれよりも低下している変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成るウイルス、を提供する。イオンチャンネルタンパク質の活性は、当業界で周知の方法によって測定されることがあり、例えばＨｏｌｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） を参照のこと。本発明の組換えウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで弱毒化される。好ましくは、当該ウイルスは、組換えオルソミクソウイルス、例えば組換えインフルエンザウイルス、又は組換えレンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、である。更に好ましくは、変異イオンチャンネルタンパク質は、変異イオンチャンネルタンパク質である。本発明の１つの態様において、変異イオンチャンネルタンパク質は、相当する野生型のイオンチャンネルタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換を含んで成る。当該イオンチャンネルタンパク質における当該置換は、外部ドメイン、ＴＭドメイン、又は細胞質ドメイン、あるいはそれらの任意な組み合わせにおいて位置づけられることがある。好ましい置換は、イオンチャンネルタンパク質のＴＭドメインの中、又はその付近にある。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスの場合、置換はＭ２の残基２５〜４３、すなわちＴＭドメインにあってもよく、そして好ましくはＭ２のＴＭドメインの、２７、３０、３１、３４、３８、及び／又は４１位にある。本発明の別の態様において、変異イオンチャンネルタンパク質は、外部ドメイン、ＴＭドメイン、細胞質ドメイン、又はそれらの任意な組み合わせの少なくとも一部に欠失を含んで成る。好ましくは、当該欠失はＴＭの中、又はその付近にある。本発明の更に別の態様において、変異イオンチャンネルは、イオンチャンネルタンパク質の一部、例えばウイルスのイオンチャンネルタンパク質の外部ドメイン及び／又は細胞質ドメイン、並びに異種タンパク質、例えば異種タンパク質のＴＭドメインを含んで成るキメラタンパク質である。更に本発明の範囲内のものとして、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、挿入、異種タンパク質の機能的部分、例えば、ＴＭ部分の様な構造を提供し、又は完全長の異種タンパク質の相当する部分と同一の活性、例えばリガンドに結合する、触媒活性、を有する部分、又は検出可能な表現型を有する他のもの、あるいはそれらの組み合わせを含んで成る変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る組換えウイルスである。
【０００９】
後述する様に、欠損したＭ２イオンチャンネル活性を有する組換えＡ型インフルエンザウイルスは、逆遺伝学系を用いて調製した（例１及びＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９を参照のこと）。思いがけないことに、全てのＭ２イオンチャンネル変異体が、野生型がｉｎ  ｖｉｔｒｏでするのと同じ効率で複製したが、それらの増殖はマウスにおいて弱められた。キメラタンパク質、例えば、Ｍ２のＴＭドメインがＨＡ又はＮＡ由来のＴＭドメインによって置換されたキメラタンパク質、である変異Ｍ２イオンチャンネルタンパク質を含んで成る組換えウイルスも調製した。これらの組換えウイルスは、組織培養において良好に複製したが、マウスにおいて高度に弱毒化された。この様に、Ｍ２イオンチャンネル活性は、Ａ型インフルエンザウイルスの生活環に必須ではない。むしろ、例えばｉｎ  ｖｉｖｏにおけるウイルスの複製を促進し得る補助機能を果たすと思われる。Ｍ２の外部ドメイン及びＢ型肝炎のコアタンパク質を含む融合タンパク質から自発的に形成した、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の粒子のマウスに対する投与が、致死ウイルスの曝露に対して９０〜１００％の防御をもたらし（Ｎｅｉｒｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９ ）、そして低温に適合した生ワクチンがヒトに有効であるということを考えると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではなくｉｎ  ｖｉｖｏでの変異Ｍ２イオンチャンネルウイルスの弱められた増殖は、これらの変異ウイルスが生インフルエンザワクチンの開発に有用であろうことを示している。この様に、本発明は更に、本発明の組換えウイルスを含んで成るワクチン又は免疫原性組成物、及び脊椎動物を免疫化し、又は脊椎動物の免疫応答を誘導するために、それぞれ当該ワクチン又は免疫原性組成物を使用する方法、を提供する。
【００１０】
更に提供するものとして、相当する野生型イオンチャンネルタンパク質と比較して、活性を欠き、又はそれより低い活性を有する変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成る組換えインフルエンザウイルスを調製する方法がある。当該方法は、組換えウイルスが生成する様に、変異イオンチャンネルタンパク質を含んで成るベクターを含む、多数のインフルエンザベクターを含んで成る組成物と、宿主細胞を接触させることを含んで成る。例えば、Ａ型インフルエンザの場合、当該組成物は：ａ）転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＡ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ１  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＰＢ２  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＨＡ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＰ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＡ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＭ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及び転写終結配列と連結したインフルエンザウイルスのＮＳ  ｃＤＮＡと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、から選択される少なくとも２つのベクター（ここで、Ｍ  ｃＤＮＡは、変異イオンチャンネルタンパク質のＤＮＡを含んで成る）；及び
ｂ）インフルエンザウイルスのＰＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＰをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＨＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＮＡをコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、インフルエンザウイルスのＭ１をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、イオンチャンネルタンパク質、好ましくは変異イオンチャンネルタンパク質をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクター、及びインフルエンザウイルスのＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントと作用可能に連結したプロモーターを含んで成るベクターを含んで成る。好ましくは、ａ）又はｂ）のベクターにおける変異イオンチャンネルタンパク質は、変異Ｍ２イオンチャンネルタンパク質、例えば少なくとも１）のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は異種配列を有するものであって、相当する野生型のＭ２イオンチャンネルタンパク質の活性と比較して、イオンチャンネル活性を欠くか、又はそれよりも低いイオンチャンネル活性を有するもの、である。本発明は更に、上述の様な組成物、及び、例えば感染性のウイルスを生成せしめる様な、前記組成物と接触した宿主細胞、を提供する。あるいは、当該宿主細胞は、各ベクター、又はベクター群の一部と順次接触され得る。
【００１１】
本発明はまた、例えば膜貫通ドメインを有するインフルエンザタンパク質由来の、異種膜貫通タンパク質と連結し、好ましくは細胞質ドメインと連結したインフルエンザウイルスのイオンチャンネルタンパク質の外部ドメインを含んで成るキメラタンパク質をコードするベクターを提供する。
【００１２】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、用語「単離され、そして／あるいは精製され」は、本発明のベクター、プラスミド又はウイルスのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの調製、単離及び／又は精製であって、その結果、それがｉｎ　ｖｉｖｏの物質を伴わず、又は実質的にｉｎ　ｖｉｔｒｏの物質から精製されること、を言及する。本発明の単離されたウイルス調製物は、通常ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの培養及び増殖によって得られ、そして他の感染性物質を実質的に含まない。本明細書で使用する場合、「実質的に含まない」は、特定の感染性物質のための、その物質についての標準的な検出方法を用いる検出のレベル未満であることを意味する。「組換え」ウイルスは、例えば、ウイルスゲノムに対して変化を導入するための組換えＤＮＡ技術を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで操作されたものである。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「組換え核酸」又は「組換えＤＮＡ配列又はセグメント」は、供給源から誘導され、又は単離され、続いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで化学的に変化させられることがあり、その結果、その配列が天然のものではなく、又は天然のゲノム内に配置した場合に配置されない天然配列に相当する核酸、例えばＤＮＡを言及する。供給源から「誘導される」ＤＮＡの例は、有用なフラグメントとして同定され、そして次に本質的に純粋な形態で化学的に合成されるＤＮＡ配列である。供給源から「単離される」その様なＤＮＡの例は、化学的手段によって、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用によって、前記供給源から切り出され、又は除去され、その結果、本発明における使用のために、遺伝子操作の方法論によって更に操作され、例えば増幅され得る様な、有用なＤＮＡ配列である。
【００１４】
オルソミクソウイルス
Ａ型インフルエンザウイルス
Ａ型インフルエンザウイルスは、合計１０個のタンパク質をコードする８個の一本鎖の（−）鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを有する。インフルエンザウイルスの生活環は、宿主細胞の表面上のサリチル酸含有受容体に対するＨＡの結合から始まり、これに受容体媒介型のエンドサイト−シスが続く。後期エンドソームにおける低いｐＨは、ＨＡの高次構造の変化を引き起こし、それによってＨＡ２サブユニットのＮ末端（いわゆる融合ペプチド）を表面に曝す。融合ペプチドは、ウイルスの膜とエンドソームの膜との融合を開始し、そしてマトリックスタンパク質（Ｍ１）及びＲＮＰ複合体が細胞質に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡに対してキャプシド形成する核タンパク質（ＮＰ）、及び、ＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２タンパク質によって形成されるウイルスポリメラーゼ複合体、から成る。ＲＮＰは核に輸送され、ここで、転写及び複製が行われる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応：５′キャップ及び３′ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、完全長の相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、及び鋳型としてｃＤＮＡを用いるゲノムｖＲＮＮの合成、から成る。新規に合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ及びポリメラーゼタンパク質は、続いてＲＮＰへと構築され、核から輸出され、そして原形質膜に輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の発芽が起こる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアリル酸を除去し、それによって細胞表面から新規に構築されたビリオンを放出し、そしてウイルス粒子の自己集合を防ぐことによって、感染後期における必須の役割を果たしている。ウイルスの構築はタンパク質−タンパク質の相互作用及びタンパク質−ｖＲＮＡの相互作用を伴うが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。
【００１５】
Ｂ型及びＣ型のインフルエンザウイルスは、構造的且つ機能的にＡ型インフルエンザウイルスに類似しているが、多少の差異がある。例えば、Ｂ型インフルエンザウイルスは、イオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質を有していない。その代わりとして、ＮＡ遺伝子の生成物であるＮＢタンパク質がおそらくイオンチャンネル活性を有し、そしてその結果Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質と類似の機能を有する。同様に、Ｃ型インフルエンザウイルスは、イオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質を有していない。しかしながら、ＣＭ１タンパク質がこの活性を有するようである。
【００１６】
トゴトウイルス
トゴトウイルス（ＴＨＯＶ）は、オルソミクソウイルス科の新しい属を表している。それらはマダニによって伝染し、そして家畜、例えばラクダ、ヤギ、及びウシにおいて発見されてきた。従って、ＴＨＯＶはマダニ及び脊椎動物の細胞において複製し得る。ＴＨＯＶゲノムは、一本鎖の、（−）鎖ＲＮＡの６個のセグメントを含んで成る。３つの最大のセグメントによってコードされるタンパク質は、インフルエンザウイルスのポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡに対して有意な相同性を示す。セグメント５は、インフルエンザウイルスのＮＰに関連するタンパク質をコードする。セグメント４によってコードされるＴＨＯＶの糖タンパク質は、インフルエンザウイルスのＨＡ又はＮＡのいずれに対しても相同性がないが、バキュロウイルスの糖タンパク質に対しては配列類似性を示す。最小のセグメントはマトリックスタンパク質をコードすると考えられており、そしてインフルエンザウイルスタンパク質のいずれにも似ていない。インフルエンザウイルスの様に、ｖＲＮＡの３′及び５′の両末端はプロモーター活性のために必要とされ、そしてこの活性は、それぞれｖＲＮＡの３′及び５′末端の末端１４及び１５ヌクレオチドに位置している。
【００１７】
ＴＨＯＶのｍＲＮＡの合成は、宿主細胞由来のキャップ構造によって刺激される。しかしながら、インフルエンザウイルスと対照的に、キャップ構造のみ（挿入したヌクレオチド無し）が、細胞のｍＲＮＡから開裂される（Ａｌｂｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｌｅａｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ ； Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの開裂アッセイは、ｖＲＮＡの３′及び５′の両末端が、エンドヌクレアーゼ活性のために必要とされるが（Ｌｅａｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、モデルｃＲＮＡプロモーターの挿入がエンドヌクレアーゼ活性を刺激しないことを、インフルエンザウイルスについて示されていた様に（Ｃｉａｎｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ； Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）明らかにした。「フック」構造がＴＨＯＶについて提案されており（Ｌｅａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ ； Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、これはインフルエンザウイルスについて提案されたコークスクリュー構造に類似している（Ｆｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ｃＲＮＡのプロモーター配列は、ｃＲＮＡの５′末端にある２位と９位の間、及び３位と８位の間における塩基対の形成をさせない。これらのヌクレオチド間で塩基対合させるための３位又は８位における変化はエンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これは提案された「フック」構造の強力な補強証拠である（Ｌｅａｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。更に、この構造はＴＨＯＶの生活環の制御に必須であると思われ；「フック」構造を形成するｖＲＮＡプロモーターはＰＢ２のエンドヌクレアーゼ活性を刺激することがあり、それによって転写をせしめる。ｃＲＮＡのプロモーターは、対照的に「フック」構造を形成しないと思われ、そしてその結果、複製をもたらすエンドヌクレアーゼ活性を刺激することができない様である
【００１８】
ブニヤウイルス科
ブニヤウイルス科は、ヒトにおいて出血熱又は脳炎性の熱病（例えば、リフトバレー熱、ハンターン、ラ・クロス、及びクリミアーコンゴの出血熱）を引き起こす複数のウイルスを含む。球状で、且つエンベロープ型のビリオンは、一本鎖で（−）鎖のＲＮＡの３つのセグメントを含む（Ｅｌｌｉｏｔｔ によって１９９７年に概説された）。最大のセグメント（Ｌ）はウイルスのＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌタンパク質）をコードし、一方、Ｍセグメントは、２つのウイルス性糖タンパク質Ｇ１及びＧ２、並びに非構造タンパク質（ＮＳｍ）をコードする。最小のセグメント（Ｓ）は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）及び第二非構造タンパク質（ＮＳｓ）をコードする。ウイルスの複製及び転写は細胞質で起こり、そして新規に構築されたビリオンはゴルジ体の膜を通過して発芽する。
【００１９】
Ｂｒｉｄｇｅｎ及びＥｌｌｉｏｔｔ（１９９６）は、クローニングしたｃＤＮＡに全体が由来する感染性のブニヤンベラウイルスを産生するために逆遺伝学の系を確立した。彼らは、Ｓｃｈｎｅｌｌ 等（１９９４）によって最初に説明された狂犬病ウイルスのための、戦略：ウイルスのポリメラーゼ及び核タンパク質を発現する細胞における、（＋）鎖のアンチゲノムＲＮＡ（（−）鎖のゲノムＲＮＡではない）をコードするｃＤＮＡの細胞内転写、に従った。Ｂｒｉｄｇｅｎ及びＥｌｌｉｏｔｔ（１９９６）は、ＨｅＬａ  Ｔ４＋細胞を、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスに感染させ、そしてこれらの細胞を、Ｓ、Ｍ、及びＬセグメントによってコードされるタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクションした。彼らは次に、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターに隣接する完全長のアンチゲノムｃＤＮＡ及びデルタ型肝炎ウイルスのリボザイムをコードする３つのプラスミドでこれらの細胞をトランスフェクションした。ワクシニアウイルス粒子の数と関連するブニヤウイルス粒子の数を増大させるために、筆者等は、ワクシニアウイルスではなくブニヤンベラウイルスが複製するカの細胞を使用した。このプロトコールは、ブニヤウイルス科を遺伝子操作するだけでなく、異なるブニヤウイルス科の菌株で細胞を同時感染することによって容易に得ることのできない遺伝子交雑（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ウイルスを産生するために使用され得る。
【００２０】
転写及び複製に必要とされるブニヤウイルスのプロモーター因子及びウイルスタンパク質を研究するために、Ｄｕｎｎ等（１９９５）は、ブニヤンベラのＳ  ＲＮＡセグメントの、５′と３′の非翻訳領域間の（−）鎖の配向のＣＡＴ遺伝子をクローニングした。細胞は、Ｌ及びＳセグメントによってコードされるタンパク質を発現するコンストラクトでトランスフェクションされ、そして次にｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡでトランスフェクションされ、これによりＣＡＴ活性がもたらされた。ブニヤウイルスのＳセグメントは、重複するリーディングフレームの２つのタンパク質、Ｎ及びＮＳｓをコードしている。これらの両タンパク質が転写及び複製に必要か否かを決定するために、Ｎ又はＮＳｓを単独で発現するコンストラクトがＣＡＴ活性について試験された。Ｌタンパク質を伴う、Ｎタンパク質の発現はＣＡＴ活性をもたらしたが、ＣＡＴ活性はＮＳｓの発現コンストラクトでは検出されなかった。この様に、Ｌタンパク質及びＮタンパク質は、ブニヤウイルス様ＲＮＡの転写及び複製にとって十分なものである。
【００２１】
インフルエンザウイルスと同様に、ブニヤウイルスのＲＮＡの末端配列は相補性があり、そして高度に保存されている。従って、これらの配列因子はブニヤウイルスのプロモーターを限定し、そしてプロモーター活性に必須であるとみなされている。当該ウイルスＲＮＡの３′末端における５つのヌクレオチドの欠失は、ＣＡＴの発現を大幅に減少させる（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ）。対照的に、５′末端における２つのヌクレオチド、又は３′末端における１１〜３５のヌクレオチドの挿入は、ＣＡＴの発現を無効にはしない（Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ）。従って、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ複合体の様に、ブニヤウイルスのポリメラーゼタンパク質は、内部での転写及び／又は複製を見かけ上開始させ得る。
【００２２】
本発明は、以下の限定しない例によって更に説明される。
【００２３】
例１
材料と方法
細胞とウイルス　２９３Ｔヒト胚性腎細胞及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）を、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び５％ウシ新生児血清を含む改変イーグル培地（ＭＥＭ）中でそれぞれ維持した。全ての細胞が５％ＣＯ２で、３７℃で維持された。インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を１０日齢の卵で増殖した。
【００２４】
プラスミドの構築　ＲＮＡポリメラーゼＩのコンストラクトを生成するために、Ａ／ＷＳＮ／３３又はＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＲＮＡに由来するクローニングされたｃＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター配列とターミネーター配列との間に導入した。要約すると、クローニングしたｃＤＮＡを、ＢｓｍＢＩ部位を含むプライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、ＢｓｍＢＩで消化し、そして、ＢｓｍＢＩ部位によって分離されるヒトＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーターとマウスＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーターとを含むｐＨＨ２１ベクターのＢｓｍＢＩ部位へとクローニングした（図２）。Ａ／ＷＳＮ／３３菌株のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、及びＮＳ遺伝子を、以下のプラスミド：ｐＳＣＷＰＢ２、ｐＧＷ−ＰＢ１、及びｐＳＣＷＰＡ（全てカリフォルニア大学ロサンゼルス校のＤｒ． Ｄｅｂｉ Ｎａｙａｋより入手）、並びにｐＷＨ１７、ｐＷＮＰ１５２、ｐＴ３ＷＮＡ１５（Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、ｐＧＴ３ＷＮ、並びにｐＷＮＳ１の使用によってそれぞれ増幅した。インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのＰＢ１遺伝子は、鋳型としてｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９８）を用いることによって増幅した。プライマーの配列については図６を参照のこと。遺伝子が不所望の変異を含んでいないことを確認するために、ＰＣＲ由来のフラグメントは、オートシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｎ Ｉｎｃ．， ＣＡ ＵＳＡ）を用いて製造業者によって推奨されるプロトコールに従い配列決定された。Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、及びＭ１遺伝子をコードするｃＤＮＡを記載通りに（Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２）クローニングし、そして真核発現ベクターｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ（ニワトリβ−アクチンプロモーターによって制御される）（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）にサブクローニングし、ｐＥＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ０−１４、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ−１５、及びｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１がそれぞれ生成した。Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来のＭ２及びＭＳ２遺伝子をＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ内にサブクローニングした結果、ｐＥＰ２４ｃ及びｐＣＡ−ＮＳ２が生成した。最後に、ｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）、ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）、及びｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）が、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９８）の支配下でＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡタンパク質を発現するために使用された。
【００２５】
感染性インフルエンザ粒子の産生　２９３Ｔ細胞（１×１０６）を、Ｔｒａｎｓ  ＩＴ  ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ）の取扱い説明書に従う使用により、異なる量の最大１７個のプラスミドでトランスフェクションした。要約すると、ＤＮＡとトランスフェクション試薬を混合し（ＤＮＡ１μｇ当たり２μｌのＴｒａｎｓ  ＩＴ  ＬＴ−１）、室温で４５分間インキュベートし、そして細胞に加えた。６時間後、ＤＮＡ−トランスフェクション試薬の混合物は、０．３％ウシ血清アルゴミン及び０．０１％ウシ胎児血清を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）と交換された。トランスフェクション後の異なる時点で、ウイルスを上清から収集し、そしてＭＤＣＫ細胞上で滴定した。ヘルパーウイルスはこの手順に必要とされなかったので、回収したトランスフェクタントウイルスは、プラーク精製無しで解析された。
【００２６】
プラスミドをトランスフェクションした、ウイルスを産生する細胞のパーセンテージの決定　トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞は、０．０２％ＥＤＴＡで単細胞に分散された。細胞懸濁液を続いて１０倍に希釈し、そして２４穴プレート中のコンフルコントなＭＤＣＫ細胞の単層に移した。ウイルスは赤血球凝集アッセイによって検出した。
【００２７】
免疫染色アッセイ　インフルエンザウイルスの感染から９時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして３．７％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を用いて、室温で２０分間固定した。次に、それらを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で処理し、そして Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） に記載の様に取り扱った。
【００２８】
結果
ウイルスＲＮＡセグメント、３つのポリメラーゼサブユニット及びＮＰタンパク質の、プラスミドに起因する発現による感染性ウイルスの産生　精製したビリオンから抽出したＲＮＰの混合物による細胞のトランスフェクションは感染性のインフルエンザ粒子をもたらすが、このストラテジーは、８個の異なる、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで産生したＲＮＰと一緒に使用した場合、あまり有効ではないようである。ｃＤＮＡから感染性のインフルエンザウイルスを完全に産生するために、８個のウイルスＲＮＰがｉｎ　ｖｉｖｏで産生された。次の様に、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターと、マウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターとが隣接する、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスの完全長ウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むプラスミドが調製された。原則として、これらの８個のプラスミドの、真核細胞内へのトランスフェクションは、全部で８個のインフルエンザｖＲＮＡの合成をもたらすはずである。タンパク質発現プラスミドのコトランスフェクションによって産生したＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰタンパク質は続いて、複製され、そして転写され、最終的に感染性のインフルエンザウイルスを形成する機能的ｖＲＮＰにｖＲＮＡを構築するはずである（図３）。１×１０６個の２９３Ｔ細胞が、タンパク質発現プラスミド（１μｇのｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）、１μｇのｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）、０．１μｇのｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）、及び１μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ０／１４）及び１μｇの以下のＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＰＢ１、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＮＡ、ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−Ｍ、及びｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＮＳ）のいずれかでトランスフェクションした。低量のｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）を使用する決定は、これまでの観察（Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ）、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生のための至適条件上でのデータ（データは示さない）を基にした。２９３Ｔ細胞のトランスフェクションから２４時間後、１ｍｌ当たり７×１０３ｐｆｕ のウイルスが上清中に見られ（表１の実験１）、プラスミドからＡ型インフルエンザウイルスを完全に産生する逆遺伝学の可能性を初めて証明した。
【表１】
2004500830.tif 000003
【００２９】
全てのウイルス構造タンパク質の同時発現によるインフルエンザウイルスの産生の効率　ウイルスのＮＰ及びポリメラーゼタンパク質の発現は、インフルエンザウイルスのプラスミドに起因する産生にとって十分であるが、その効率を向上させ得ることも可能であった。これまでの研究において、全てのインフルエンザウイルスの構造タンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、及びＮＳ２）の発現は、レポーターであるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする人工ｖＲＮＡを含んだＶＬＰをもたらした（Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ）。この様に、構造タンパク質の完全な補集合体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の利用は、ウイルスＲＮＡの複製及び転写に必要とされるもののみの代わりに、ウイルス産生の効率を向上させ得る。このために、２９３Ｔ細胞は至適な量のウイルスタンパク質発現プラスミド（ＶＬＰの産生によって判断する；非公開データ）：１μｇのｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）及びｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）；０．１μｇのｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）；１μｇのｐＥＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ０／１４、及びｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５；２μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１；０．３μｇのｐＣＡ−ＮＳ２；並びに０．０３μｇのｐＥＰ２４ｃ（Ｍ２用）を、１μｇの各ＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（表１の実験２）と一緒にトランスフェクションした。第２の細胞の集合は、遺伝子交雑ウイルスを産生するために置換されたｐＰｏ１Ｉ−ＰＲ／８／３４−ＰＢ１のＰＢ１遺伝子を除き、同一のＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドの集合を、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰのみを発現するプラスミド（表１の実験３）又は全てのインフルエンザ構造タンパク質を発現するもの（表１の実験４）と一緒にトランスフェクションされた。ＷＳＮウイルスの収率は、トランスフェクションから２４時間後（表１の実験１及び２）又は３６時間後（データは示さない）に目立つほど相違はなかった。しかしながら、全てのインフルエンザウイルスの構造タンパク質を提供した場合に、ＰＲ／８／３４−ＰＢ１を有するウイルスの収率において１０倍以上の増大が見られた（表１の実験３及び４）。ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、又はＮＰタンパク質の発現のためのプラスミドの１つを欠くネガティブコントロールは、ウイルスを全く生成しなかった（表１の実験５〜８）。この様に、産生したウイルスに依存して、全てのＡ型インフルエンザウイルスの構造タンパク質の発現は、逆遺伝学的な方法の効率を向上させた。
【００３０】
次に、細胞のトランスフェクション後のウイルス産生の動力学が、Ａ／ＰＲ／８／３４−ＰＢ１遺伝子を有するウイルスを産生するために使用したプラスミドの集合を用いて決定された。３つの実験のうちの２つにおいて、ウイルスはトランスフェクションから２４時間後に初めて検出された。この時に測定した１０３ｐｆｕ／ｍｌ超の力価は、トランスフェクションから４８時間後までに１０６ｐｆｕ／ｍｌ超に増大した（表２）。ウイルスを産生していた、プラスミドをトランスフェクションした細胞のパーセンテージを推定するために、２９３Ｔ細胞は、細胞を分散させるために、トランスフェクションから２４時間後にＥＤＴＡ（０．０２％）で処理され、そして次に限界希釈研究が実施された。この実験において、遊離しているウイルスは、この時点での培養上清中には見られなかった。結果は、１０３．３個の細胞のうちの１つが感染性のウイルス粒子を産生した。
【表２】
2004500830.tif 000004
【００３１】
ＮＡタンパク質にＦＬＡＧエピトープを含むインフルエンザウイルスの回収
Ａ型インフルエンザウイルスのゲノム内に変異の誘導をせしめた新規の逆遺伝学系を証明するために、ＮＡタンパク質中にＦＬＡＧエピトープ（Ｃａｓｔｒａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）を含むウイルスが産生された。２９３Ｔ細胞は、ＮＡタンパク質及び、当該タンパク質の頭の下部にあるＦＬＡＧエピトープの両方をコードするｃＤＮＡを含むＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（ｐＰｏ１Ｉ−ＷＳＮ−ＮＡ／ＦＬ７９）を、必要なＲＮＡポリメラーゼＩ及びタンパク質の発現プラスミドと一緒にトランスフェクションされた。回収されたウイルス（ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９）が実際にＮＡ−ＦＬＡＧタンパク質を発現しなかったことを確認するために、ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９又はＡ／ＷＳＮ／３３の野生型ウイルスに感染した細胞の免疫染色アッセイを行った。ＦＬＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体はＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９に感染した細胞を検出したが、野生型ウイルス感染したものは検出しなかった（図４）。ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９ウイルスの回収の効率はタダ無しの野生型ウイルスと同程度であった（データは示さない）。これらの結果は、新規の逆遺伝学系が、Ａ型インフルエンザウイルスのゲノム内に変異を導入せしめることを示唆している。
【００３２】
ＰＡ遺伝子内に変異を含む感染性インフルエンザウイルスの産生　ＰＡ遺伝子内に変異を有するウイルスを産生するために、２つのサイレントな変異が導入されて制限エンドヌクレアーゼのための新規認識配列を生成せしめた（ｍＲＮＡの８４６位のＢｓｐ１２０Ｉ及び１２８４位のＰｖｕＩＩ）。従来、逆遺伝学によってこの遺伝子を修飾することが不可能であったのは、信頼できる選択の系がなかったためである。トランスフェクタントウイルスであるＰＡ−Ｔ８４６Ｃ及びＰＡ−Ａ１２８４が回収された。回収されたトランスフェクタントウイルスは、２つの継続的な限界希釈によって生物学的にクローニングされた。回収されたウイルスがＰＡ遺伝子内に変異を有する実際のトランスフェクタントであることを証明するために、ＰＡ遺伝子のｃＤＮＡが逆転写酵素ＰＣＲによって得られた。図５に示す様に、ＰＡ−Ｔ８４６Ｃ及びＰＡ−Ａ１２８４Ｃウイルスは、新規に導入された制限部位の存在によって示される様に、ＰＡ遺伝子内に予想された変異を有していた。逆転写段階のない、同一のウイルス試料及びプライマーのＰＣＲは、いずれの生成物も生成せず（データは示さない）、このことはＰＡのｃＤＮＡが、当該ウイルスを産生するために使用されたプラスミドの代わりにｖＲＮＡから実際に生じたことを示唆している。これらの結果は、変異した遺伝子を有するウイルスが、ヘルパーウイルスの使用無しにどの様に産生され、そして回収され得るかを例示している。
【００３３】
考察
本明細書に記載の逆遺伝学の系は、クローニングしたｃＤＮＡに完全に由来するＡ型インフルエンザウイルスを効率的に産生せしめる。Ｂｒｉｄｇｅｎ及びＥｌｌｉｏｔｔ （１９９６） もブニヤンベラウイルス（ブニヤウイルス科）を産生するために逆遺伝学を使用したが、それはわずかに３つのセグメントの（−）鎖ＲＮＡを含み、そしてその産生効率は低く、１０２ｐｆｕ／１０７細胞であった。ウイルスの収率は実験によって異なったが、インフルエンザウイルスの場合は一貫して１０３ｐｆｕ／１０６細胞であり、８個のセグメントを含んでいた。上述の逆遺伝学系の高い効率についての複数の説明が存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＰを産生する代わりに（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）、ＲＮＰは、ＲＮＡポリメラーゼＩを用いるｖＲＮＡの細胞内合成を介して、そしてウイルスポリメラーゼタンパク質及びＮＰの、プラスミドに起因する発現を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生された。更に、プラスミドで容易にトランスフェクションされる２９３Ｔ細胞の使用は（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７ ）、細胞の多数の群が、ウイルスの産生に必要なプラスミドの全てを受け入れることを保証した。尚、増殖細胞中で最も豊富に発現した酵素の１つであるＲＮＡポリメラーゼＩによって産生された転写物の多くが、当該系の全体的な収率に寄与している様であった。これらの特徴は、それに相当して豊富な量のｖＲＮＡ転写物並びにｖＲＮＡのキャプシド形成、核におけるＲＮＰの形成、及び新規ウイルスが構築され、そして放出される細胞膜に対するこれらの複合体の輸出、にとって適当な量のウイルスタンパク質をもたらす。
【００３４】
これまでに確立された逆遺伝学系（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０ ； Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４ ； Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ； Ｐｌｅｓｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）はヘルパーウイルスの感染を必要とし、そしてそれ故に少数のトランスフェクタントが膨大な数のヘルパーウイルスから回収されることを可能にする選択方法を必要とする。その様なストラテジーは、次のｃＤＮＡ由来遺伝子：ＰＢ２（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ）、ＨＡ（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ： Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、ＮＰ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、ＮＡ（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、Ｍ（Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ； Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、及びＮＳ（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ）のうちの１つを有するインフルエンザウイルスを産生するために利用されてきた。選択方法の多くは、ＨＡ及びＮＡ遺伝子に適用可能なものを除き、増殖温度、宿主範囲の制限、又は薬物感受性に依存し、その結果遺伝子産物の機能解析のための逆遺伝学の有用性を制限している。信頼性のある抗体に起因する選択系が利用可能なＨＡ及びＮＡ遺伝子を用いても、顕著な増殖欠陥を有するウイルスを産生することは困難である。対照的に、本明細書に記載の逆遺伝学系はヘルパーウイルスを必要とせず、そして任意な遺伝子セグメントの変異又は重度の増殖欠陥を有するトランスフェクタントの産生を可能にする。この利点は図５中に示されており、これは変異したＰＡ遺伝子を有するトランスフェクタントウイルスの回収を示している。Ａ型インフルエンザウイルスゲノム内に任意の生存可能な変異を導入するための技術の使用は、ウイルスゲノムの非翻訳領域内の制御配列の性質、ウイルスタンパク質の構造と機能の関係、並びに宿主範囲の制限及びウイルスの病原性の分子基盤、の様な長年の多くの問題に対して研究者が対処することを可能にするだろう。
【００３５】
不活性化インフルエンザワクチンが利用可能であるが、局所的ＩｇＡ及び細胞障害性Ｔ細胞の応答を誘発するそれらの限定された能力に部分的に起因して、それらの効率も最適状態には及ばない。現在進行中の低温適合型の生インフルエンザワクチンの臨床試験は、その様なワクチンが最適に弱毒化され、その結果それらがインフルエンザの症候を引き起こさないが、なおも防御免疫を誘導することを示唆している（Ｋｅｉｔｅｌ及びＰｉｅｄｒａによって１９９８年に概説された）。しかしながら、予備的な結果は、これらの生ウイルスワクチンが最良に不活性化されたワクチンよりも有意に有効ではなく（Ｋｅｉｔｅｌ及びＰｉｅｄｒａによって１９９８年に概説された）、更なる改良の余地を残していることを示唆している。１つの可能性として、上述の逆遺伝学系を用いて低温適合型ワクチンを修飾することが挙げられる。あるいは、内部タンパク質をコードする遺伝子内に、多数の弱毒化変異を有する「マスター」Ａ型インフルエンザ菌株を産生するために、逆遺伝学を用いることによって最初からやり直すこともできる。本明細書に記載の逆遺伝学系の最も興味をそそる利用は、インフルエンザウイルスの新規なＨＡ又はＮＡのサブタイプに関係する、疑わしい流行病の場合における弱毒化生ウイルスワクチンの素速い産生にあると思われる。
【００３６】
この新規逆遺伝学系は、ワクチンベクターとしてのインフルエンザウイルスの使用を増強する様である。当該ウイルスは、インフルエンザウイルスのタンパク質に加えて、外来タンパク質又は免疫原性エピトープを発現するために操作され得る。例えば、９番目のセグメントとして外来タンパク質を有するウイルスが産生され得ることがあり（Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、そしてそれらは生ワクチンとして使用され得る。インフルエンザウイルスは、強力な細胞性免疫及び体液性免疫の応答を刺激するだけでなく、それらは豊富なビリオン表面のＨＡ及びＮＡタンパク質（例えば、１５個のＨＡ及び９個のＮＡのサブタイプ並びにそれらの流行性変異体）も産生し、同一の標的群の繰り返しの免疫を可能にする。
【００３７】
レポーター遺伝子をコードする人工ｖＲＮＡを有するインフルエンザＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質及びｖＲＮＡをワクシニア−Ｔ７ポリメラーゼ系で発現させることによって産生されてきた（Ｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ）。逆遺伝学を用いて、現在はｖＲＮＡの転写及び複製に必要なタンパク質（すなわち、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰ）をコードするｖＲＮＡ、並びに注目のタンパク質をコードするｖＲＮＡを含むＶＬＰを産生することもできる。その様なＶＬＰは有用な遺伝子送達担体であることもある。重要なことに、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子のそれらの欠如は、感染性のウイルスがＶＬＰ遺伝子治療後に産生されないことを保証する。インフルエンザウイルスのゲノムが宿主の染色体に組み込まれないので、ＶＬＰ系は細胞の短期間の伝達のみを必要とする状況での（例えば、ガンの治療のための）遺伝子治療に適している。アデノウイルスベクターと対照的に、インフルエンザＶＬＰはＨＡ及びＮＡ変異体を含むことがあり、これが標的群の繰り返しの処置を可能にする。
【００３８】
オルソミクソウイルス科は、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型のインフルエンザウイルス、並びに近年分類されたトゴトウイルスを含んで成る。本明細書に記載のクローニングしたｃＤＮＡに完全に由来する感染性Ａ型インフルエンザウイルスを産生するためのストラテジーは任意のオルソミクソウイルスに適用され、そして恐らくは他のセグメント化された（−）鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科）にも同様に適用される。技術的な制限無しにウイルスゲノムを操作する能力は、ウイルスの生活環及びそれらの制限、ウイルスタンパク質の機能及びウイルスの病原性の分子機構の研究についての深遠な意味を有する。
【００３９】
例２
材料と方法
細胞とウイルス　２９３Ｔヒト胚性腎細胞及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ及び５％ウシ新生児血清を含むＭＥＭ中でそれぞれ維持した。２９３Ｔ細胞系は、シミアンウイルス４０Ｔ抗原の遺伝子が挿入された２９３系の誘導体である（ＤｕＢｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ ）。全ての細胞を５％（Ｏ２中で３７℃で維持した。インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／７２（Ｈ３Ｎ２）（Ｕｄｏｒｎ）を１０日齢の卵で増殖した。
【００４０】
プラスミドの構築　ＵｄｏｒｎのウイルスのｃＤＮＡは、Ｋａｔｚ等によって記述されている様に（１９９０）、ウイルスＲＮＡの保存された３′末端に相補的なオリゴヌクレオチドを用いるウイルスＲＮＡの逆転写によって合成された。ｃＤＮＡは、ＢｓｍＢＩ部位を含むＭ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって増幅され、そしてＰＣＲ産物はｐＴ７Ｂｌｕｅｂｌｕｎｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）内にクローニングされた。生じたコンストラクトは、ｐＴＰｏ１ＴＵｄＭと表した。ＢｓｍＢＩによる消化後、ＢｓｍＢＩ部位によって分離された、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーターを含むｐＨＨ２１ベクター（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）のＢｓｍＢＩ部位にフラグメントがクローニングされ、ｐＰｏ１ＵｄＭが生成した。ｖＲＮＡの発現のための、ｐＨＨ２１由来のプラスミドは、この報告の中で「Ｐｏ１Ｉ」として言及される。
【００４１】
Ｍ変異体は以下の様に構築した。ｐＴＰｏ１ＩＵｄＭは、連続的な（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）プライマーＭ２１０４Ｒ（５′−ＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧ−３′；配列番号：１）及びＭ２Ｖ２７Ｔ（５′−ＡＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＡＴＣ−３′；配列番号：２）及びＭ２Ａ３０Ｐ（５′−ＧＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣ−３′；配列番号：３）及びＭ２Ｓ３１Ｎ（５′−ＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＡＴＣ−３′；配列番号：４）及びＭ２ｄｅｌ２９−３１（５′−ＧＴＴＧＴＴＡＴＣＡＴＴＧＧＧＡＴＣＴＴＧＣ−３′；配列番号：５）、並びに連続的なプライマーＭ２１２８Ｒ（５′−ＣＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＴＣＧＣＡＧＣ−３′；配列番号：６）及びＭ２Ｗ４１Ａ（５′−ＡＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＴＣ−３′；配列番号：７）、並びに連続的プライマーＭ２ＨＡＴＭＲ（５′−ＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＴＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣ−３′；配列番号：８）及びＭ２ＨＡＴＭ（５′−ＣＴＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＧＧＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣ−３′；配列番号：９ ）、及びＭ２ＮＡＴＭＲ（５′−ＧＣＴＴＡＧＴＡＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣ−３′；配列番号：１０）及びＭ２ＮＡＴＭ（５′−ＡＴＴＡＴＡＧＧＡＧＴＣＧＴＡＡＴＧＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴＡＣＣＡＴＡＡＴＡＧＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣ−３′；配列番号：１１ ）を用いるインバースＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）によって最初に増幅された。
【００４２】
ＰＣＲ産物は、リン酸化され、セルフライゲーションされ、そしてＥ．コリの菌株ＤＨ５α中で増殖され、そして次にＢｓｍＢＩで消化され、そしてｐＨＨ２１ベクターのＢｓｍＢＩ部位にクローニングされた。生じたコンストラクトは、ｐＰｏ１ＩＭ２Ｖ２７Ｔ、ｐＰｏ１ＩＭ２Ａ３０Ｐ、ｐＰｏ１ＩＭ２Ｓ３１Ｎ、ｐＰｏ１Ｍ２ｄｅｌ２９−３１、ｐＰｏ１ＩＭ２Ｗ４１Ａ、ｐＰｏ１Ｍ２ＨＡＴＭ、及びｐＰｏ１ＩＭ２ＮＡＴＭと表された。全てのコンストラクトが、不所望の変異が存在しないことを保証するために配列決定された。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＨＡ（ｐＥＷＳＮ−ＨＡ）、ＮＰ（ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ０／１４）、ＮＡ（ｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５）、Ｍ１（ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１）タンパク質、並びにＡ／Ｐｅｕｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＭ２（ｐＥＰ２４ｃ）、ＮＳ２（ｐＣＡＮＳ２）、ＰＢ１（ｐｃＤＮＡ７７４）、ＰＢ２（ｐｃＤＮＡ７６２）、及びＰＡ（ｐｃＤＮＡ７８７）の発現のためのプラスミドは、Ｎｅｕｍａｎｎ 等によって１９９９年に記述されている。
【００４３】
プラスミドに起因する逆遺伝学　トランスフェクタントウイルスは、Ｎｅｕｍａｎｎ 等によって１９９９年に報告されている様に産生された。要約すると、１７個のプラスミド（８個のＲＮＡセグメントのための８個のＰｏ１Ｉコンストラクト及び９個の構造タンパク質のための９個のタンパク質発現コンストラクト）をトランスフェクション試薬（ＤＮＡ１μｇ当たり２μｌのＴｒａｎｓ  ＩＴ  ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））と混合し、室温で１５分間インキュベートし、そして１×１０６個の２９３Ｔ細胞に加えた。６時間後、ＤＮＡトランスフェクション試薬混合物を、０．３％ＢＳＡ及び０．０１％ＦＣＳを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と交換した。４８時間後、上清中のウイルスをＭＤＣＫ細胞中で１回プラーク精製し、そして次にストックウイルスの産生のためにＭＤＣＫ細胞に接腫した。トランスフェクタントウイルスのＭ遺伝子は、遺伝子の起源及び意図した変異の存在を確認し、そして不所望な変異が存在していないことを保証するために配列決定された。全ての実験において、トランスフェクションウイルスは、ＵｄｏｒｎウイルスからはＭ遺伝子のみを、そしてＡ／ＷＳＮ／３３からは残りの遺伝子を含んでいた。
【００４４】
トランスフェクタントウイルスの複製特性　ＭＤＣＫ細胞は、２４穴プレートの２つ１組の穴において、細胞当たり０．００１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）で野生型及び変異ウイルスに感染され、１ｍｌ当たり０．５μｇのトリプシンを含むＭＥＭ培地を注がれ、そして３７℃でインキュベートされた。異なる時点で、上清はＭＤＣＫ細胞上でのプラークアッセイにおける感染性ウイルスについてアッセイされた。
【００４５】
変異ウイルスのアマンタジン感受性を研究するために、当該ウイルスは、異なる濃度の薬物の存在下で、ＭＤＣＫ細胞中で滴定された。
【００４６】
ウイルスへのＭ２の組み込み　トランスフェクタントウイルスは、１ｍｌ当たり０．５μｇのトリプシンを含むＭＤＣＫ細胞中で生育した。ウイルスは、５０，０００ｇ、４℃での２．５時間の６段階のショ糖勾配（２０、３０、３５、４０、４５、及び５０％）を介して精製された。ウイルスはＰＢＳ中で再懸濁され、そして一定分量において−８０℃で保存された。精製したウイルスは、溶解バッファー（０．６Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔ｐＨ７．５〕、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で再懸濁した。ウイルスの溶解液を１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で流し、次にこれをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気的にトランスファーした。当該膜を、５％スキムミルク／ＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロッキングし、そして次に１４Ｃ２抗Ｍ２モノクローナル抗体（Ｄｒ． Ｒ． Ｌａｍｂ の好意により提供されたもの）及び抗ＷＳＮ−ＮＰモノクローナル抗体と一緒に室温で１時間インキュベートした。当該膜は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。結合した抗体をＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）及びＷｅｓｔｅｒｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ＥＣＬ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出された。シグナルの強度は、Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  ２０００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて定量した。
【００４７】
実験的感染　イソフランで麻酔した５週齢の雌性のＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０μｌ（５．０×１０３ＰＦＵ）のウイルスを用いて経鼻的に感染させた。器官中のウイルスの力価は、既述の様に（Ｂｉｌｓｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ）、ＭＤＣＫ細胞の感染から３日後に決定された。
【００４８】
結果
Ｍ２タンパク質中に変異を含むＡ型インフルエンザウイルスの産生
Ｍ２タンパク質のＴＭドメインは、αヘリックス構造を有する様にモデリングされる（Ｄｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２ ； Ｓｕｇｒｕｅ ａｎｄ Ｈａｙ， １９９１ ； Ｓａｎｓｏｍ ａｎｄ Ｋｅｒｒ， １９９３）。いずれもαヘリックスの同一の面上に位置している残基Ｖ−２７、Ａ−３０、Ｓ−３１、Ｇ−３４、及びＬ−３８における変異は、Ｍ２イオンチャンネルの特性を変える（Ｇｒａｍｂａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２ ； Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２ ； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ）。Ｍ２のイオンチャンネル活性がウイルスの複製に必須であるか否かを決定するために、５つのプラスミドを構築し、そしてＭ２のＴＭドメインにおいて変化を有する変異ウイルスを産生するために使用する（図７）。アフリカツメガエルの卵母細胞で発現した変異タンパク質の全細胞電流が、Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ 等によって（１９９４）、二電極膜電位固定法（Ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ−Ｃｌａｍｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて測定された。３つの変異、すなわちＭ２Ａ３０Ｐ、Ｍ２Ｗ４１Ａ、及びＭ２ｄｅｌ２９−３１のいずれも、中性又は低ｐＨのいずれにおいても機能的なイオンチャンネル活性を有していなかった。低ｐＨでイオンチャンネル活性を示したＭ２Ｖ２７Ｔ及びＭ２Ｓ３１Ｎ（Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）は、ポジティブコントロールとして使用した。
【００４９】
プラスミドに起因する逆遺伝学（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）によって変異ウイルスを産生するために、２９３Ｔ細胞は、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／３０７／７２（Ｈ３Ｎ２）（Ｕｄｏｒｎ）ウイルス（野生型）由来の、Ｍ遺伝子を除き全てのＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルス遺伝子をコードしたウイルスＲＮＡセグメントの産生のために、９個のタンパク質発現プラスミド及び８個の他のものでトランスフェクションされた。相当するトランスフェクタントウイルスは、親のＵｄｏｒｎ  Ｍ遺伝子を含むウイルスのために、Ｍ２Ｖ２７Ｔ、Ｍ２Ａ３０Ｐ、Ｍ２Ｓ３１Ｎ、Ｍ２Ｗ４１Ａ、Ｍ２ｄｅｌ２９−３１、及びＷＳＮ−ＵｄＭと表された。
【００５０】
ウイルス産生の効率を決定するために、トランスフェクションから４８時間後の２９３Ｔ細胞の培養上清中で、ウイルスはＭＤＣＫ細胞を用いて滴定された。表３に示す様に、野生型又は変異体のＭ遺伝子を有する１０５超のトランスフェクタントウイルスが存在していた。この様に、Ｍ２の変異を担持する全てのウイルス及び野生型のＵｄｏｒｎ  Ｍ遺伝子を保持するウイルスは、同じ効率で産生された。トランスフェクタントウイルスは、一度ＭＤＣＫ細胞でプラーク精製され、そして次にウイルスストックを生成するためにＭＤＣＫ細胞に接種された。導入された変異の安定性は、ＭＤＣＫ細胞における１０回の継代の後に、トランスフェクタントウイルスのＭ遺伝子セグメントを配列決定することによって解析した。復帰変異体は見られなかった。
【表３】
2004500830.tif 000005
【００５１】
組織培養におけるＭ２変異ウイルスの増殖特性　次に、ＭＤＣＫ細胞におけるＭ２イオンチャンネル変異体と野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスとの増殖特性が比較された（図８）。細胞は０．００１のＭＯＩで感染し、そして培養上清中でのウイルスの収率は、感染後の異なる時点で決定された。変異ウイルスは、増殖速度又は４８時間目に形成されたプラークのサイズ（３日で直径１．５ｍｍ）のいずれにおいても野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスと目につくほどの差異はなかった。
【００５２】
これらのウイルスのアマンタジン感受性を評価するために、Ｍ２変異体及び野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスは、異なる濃度のアマンタジンの存在下で、ＭＤＣＫ細胞内でプラークを形成した。細胞培養において、アマンタジンは、ウイルスの複製に対して２つの別個の濃度依存性阻害作用を生み出す。エンドソームのｐＨの増大に起因する、５０μＭ超の濃度での非特異的作用は、エンドサイト−シスに関与するＨＡの膜融合活性の活性化を阻害し（Ｄａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５）；一方、０．１〜５μＭの低濃度においては、当該薬物感受性はウイルスの複製を阻害する（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， １９７７ ）。図９に示す様に、アマンタジンは、３つの試験濃度のいずれかにおいて、野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスの収率、及びプラークのサイズを著しく減少させた。対照的に、５μＭのアマンタジンでは、Ｍ２変異ウイルスの複製はほぼ全く影響されず、阻害もされなかった。薬物の非特異的活性による実質的な阻害は、５０μＭで見られた。この様に、Ｍ２変異体の全てが野生型ウイルスよりもアマンタジンに対して耐性があった。
【００５３】
Ｍ２のＴＭドメインがＨＡ又はＮＡのもので置換されたトランスフェクタントウイルスの産生　Ｍ２Ａ３０Ｐ、Ｍ２Ｗ４１Ａ、及びＭ２ｄｅｌ２９−３１変異体は、二電極膜電位固定法（Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）によってアッセイした場合、機能的なイオンチャンネル活性を有さないが、それらは全てＭＤＣＫ細胞において野生型ウイルスと同様に複製した（図８）。この様に、Ｍ２のイオンチャンネル活性は、低レベルのイオンチャンネル活性が当該アッセイの感度末端であったことを除外することはできないが、ウイルスの複製にとって必須ではないと思われる。
【００５４】
Ｍ２チャンネルイオン活性がウイルスの複製にとって必須でないか否かを決定するために、Ｍ２のＴＭドメインがＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＨＡ又はＮＡ由来のもので置換されたキメラ変異ウイルスが産生された（図１０）。プラスミドでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清がウイルスの産生についてアッセイされた場合、キメラ変異体（Ｍ２ＨＡＴＭ及びＭ２ＮＡＴＭ）はそれぞれ生存可能であったが、それらの力価は野生型ＷＳＮ−ＵｄＭの力価より１ｌｏｇ 以上低かった（表３）。当該変異体はまた、４８時間の増殖の後、ピンポイントのプラークを産生した。その様に、Ｍ２のＴＭドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルスの複製にとって不要である。
【００５５】
組織培養におけるＭ２ＨＡＴＭ変異体の増殖特性　Ｍ２ＮＡＴＭウイルスストックの力価が１０４ＰＦＵ／ｍｌを超えなかったので、Ｍ２ＨＡＴＭウイルスは、最初にＭＤＣＫ細胞におけるＭ２ＨＡＴＭウイルス対野生型ＷＳＨ−ＵｄＭウイルスによる子孫ウイルスの産生の時間経過を試験することによる、更なる解析のために適用された（図８）。Ｍ２ＨＡＴＭは、感染から１２及び２４時間後に野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスよりも低い力価をもたらしたが、３６時間目のその最大の力価は、野生型ウイルスのものとほぼ同一であった。その結果は、Ｍ２のＴＭドメインの欠如が、組織培養におけるウイルスの複製能を大幅に害することはないことを示唆している。
【００５６】
ビリオン内への変異Ｍ２分子の組み込み　おそらく、Ｍ２の点変異体及びキメラ変異体は多少の残留性があるイオンチャンネル活性を保持しており、その結果、ビリオン内へのＭ２タンパク質の組み込みの増大が、この機能におけるいずれかの欠陥を補うと思われる。従って、インフルエンザのビリオン内への野生型Ｍ２と変異Ｍ２の組み込み効率が、ＮＰの強度を基に標準化後に、ウェスタンブロット解析を用いて比較された（図１１）。２つの変異Ｍ２タンパク質（Ｍ２ｄｅｌ２９−３１及びＭ２ＨＡＴＭ）のビリオンの組み込みは、Ｗ４１Ａ変異体は更に効率的に組み込まれたが、野生型タンパク質のものよりわずかに低かった。野生型のＭ２タンパク質のわずかに下で検出されたバンドは、他の者によって報告されている様に（Ｚｅｂｅｄｅｅ ａｎｄ Ｌａｍｂ， １９８８）、おそらくＭ２のタンパク質分解的に開裂した形態である。抗ＮＰに反応性があったが、抗Ｍ２抗体にはない、ＮＰタンパク質の下にある更なるバンドは、ＮＰの開裂産物である（Ｚｈｉｒｎｏｖ ａｎｄ Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ， １９８４ ）。同時に、これらの結果は、ビリオン内へのＭ２タンパク質の組み込みの増大が、欠陥のあるＭ２イオンチャンネル活性を補うものではないと思われることを証明している。
【００５７】
マウスにおけるＭ２変異ウイルスの複製　ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＭ２イオンチャンネル活性の役割を決定するために、野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスと同様に、又はそれよりも効率的に肺で複製する６個の変異ウイルスのいずれかでマウスを感染させたが（表４）、Ｍ２ｄｅｌ２９−３１ウイルスの力価は、野生型ウイルスのものより１ｌｏｇ 以上低かった。対照的に、当該変異体は鼻甲介における異なる複製能を示したが、感染したマウスのいずれかのその様な試料から回収されたＭ２Ａ３０Ｐ又はＭ２ｄｅｌ２９−３１はいずれも示さなかった。Ｍ２ＨＡＴＭウイルスは、肺又は鼻甲介のいずれからも回収されなかった。これらの結果は、Ｍ２イオンチャンネル活性がｉｎ  ｖｉｖｏでの効率的なウイルス複製に必要であることを示唆している。更に、感染したマウスの血清は、免疫化ウイルスと結合する抗体を有する（例３を参照のこと）。
【表４】
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【００５８】
考察
逆遺伝学系（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）は、イオンチャンネル活性をブロックすることが知られているＭ２タンパク質のＴＭドメイン内に変化を有する、トランスフェクタントＡ型インフルエンザウイルスを産生するために使用された。この機能的な欠陥にも関わらず、全ての変異ウイルスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで野生型ＷＳＮ−ＵｄＭと同じ効率で複製した。ウイルスの複製におけるＭ２イオンチャンネル活性の不要性は、Ｍ２タンパク質のＴＭドメインがＨＡ又はＮＡ由来のものと置換された実験によって補強された。この様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究において、Ａ型インフルエンザウイルスは、効率的な複製のためにＭ２イオンチャンネル活性を必要としていなかった。
【００５９】
Ｍ２イオンチャンネル活性は、宿主細胞侵入段階とウイルスＲＮＡのアンコーティング段階との間の、ウイルスの生活環の初期に機能することが考えられている。Ｚｈｉｒｎｏｖ 等は（１９９０）、低ｐＨがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルスＲＮＰからのＭ１タンパク質の解離を誘導することを報告した。この観察は、エンドソームにおけるＭ２イオンチャンネル活性を介する、ビリオンの内側へのタンパク質の導入が、ＲＮＰからのＭ１の解離に重要であることを示唆することを導いている（Ｈｅｌｅｎｉｕｓによって１９９２年に概説された）。もしそうであれば、この過程はＭ２イオンチャンネル活性又はＭ２ドメインの欠如で、その様に起こり得るのであろうか。低ｐＨに曝露されたビロソーム中のＨＡタンパク質の免疫電子顕微鏡は、標的膜の不在のもと、ＨＡ２サブユニットのＮ末端融合ペプチドが、ＨＡを固着した同一の膜の部位内に挿入されたことを証明した（Ｗｈａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。従って、１つの可能性として、ＨＡの融合ペプチドがウイルスのエンベロープ内に挿入され、エンドソームからウイルスの内側へのプロトンの流れを可能にする孔をウイルスの膜に形成し、その結果ＲＮＰ−Ｍ１の相互作用の破壊をもたらすということが挙げられる。あるいは、Ｍ１は、他のウイルス膜タンパク質、例えばＨＡ、ＮＡ又はその両方のＴＭ領域によるイオンチャンネル活性を含む、完全に異なる機構によってＲＮＰから解離することが可能なようである。
【００６０】
Ｍ２イオンチャンネルの起源はどこにあるのだろうか。Ｍ２イオンチャンネル活性は、細胞内に開裂可能なＨＡを有するＡ／ｆｏｗｅｌ  ｐｌａｑｕｅ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４（ＦＰＶ  Ｒｏｓｔｏｃｋ）の菌株で最初に発見された（Ｓｕｇｒｅｕ ｅｔ ａｌ．， １９９０ ； Ｏｈｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４ ； Ｔａｋｅｕｃｈｉ ａｎｄ Ｌａｍｂ， １９９４ ）。この菌株において、ＨＡは、トランスゴルジ網における低ｐＨ誘導型の高次構造的変化を、この画分においてｐＨを上昇させるＭ２イオンチャンネル活性無しに受ける。故に、従来、Ａ型インフルエンザウイルスは、高次構造的な変化が細胞内で開裂可能なＨＡで起こる様な上のレベルまで、トランスゴルジ網のｐＨの増大を促進するＭ２タンパク質を備えていたと思われる。細胞内で開裂可能なＨＡ無しに、Ａ型インフルエンザウイルスが出現し始めた場合、Ｍ２タンパク質と関連する高いイオンチャンネル活性を維持するための選択的な圧力はさほどなかった。この活性の結果としての減少は、ＲＮＰからのＭ１の解離をさせるのに十分であったと思われる。事実、イオンチャンネル活性は、現在認識されているウイルスのＭ２タンパク質間で著しく異なり、例えばヒトＵｄｏｒｎウイルス（細胞内で開裂不可能なＨＡを含む）に由来するＭ２タンパク質は、等量のＦＰＶ  Ｒｏｓｔｏｃｋウイルス（細胞内で開裂可能なＨＡを含む）のＭ２によって示される同一のイオンチャンネル活性を生み出すために５倍以上必要とされる（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ａｎｄ Ｌａｍｂ， １９９４ ）。逆に、複数のＡ型インフルエンザウイルスのＨＡが、ニワトリにおける複製の間に、細胞内で開裂不可能なものから開裂可能なものへと変化し（Ｋａｗａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９８４ ； Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｋａｗａｏｋａ， １９９５ ； Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ）、これは限定されたイオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質が、細胞内で開裂可能なＨＡに一度切り替わって、より大きな活性を獲得し得ることを示唆している。
【００６１】
Ｍ２イオンチャンネルノックアウトウイルス及びＭ２ＨＡＴＭウイルスは、組織培養において適度に複製したが、マウスにおいて高度に弱毒化され、生ワクチンとしてのそれらの使用についての可能性を増大させた。現在臨床試験中の低温適合型生ワクチンは（Ｍａａｓａｂ ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔによって１９９９年に概説された）は、一般的な個体群における使用がかなり期待された（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８ ； Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ； Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。主な関心事項は、前記ワクチンにおける限定された数の弱毒化変異が（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９８８ ； Ｈｅｒｌｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ）、復帰変異ウイルスの産生を可能にし得るということにある。例えば、Ｍ２のＴＭドメインＨＡ由来のものと置換することによってＭ２イオンチャンネル活性を除くことは、復帰変異ウイルスの出現の可能性を大きく低下させる。この様に、我々の新規な逆遺伝学の系を用いる、修飾されたウイルス遺伝子を有するインフルエンザウイルスの産生は、安全な生インフルエンザワクチンの製造をもたらし得る。
【００６２】
今日まで、イオンチャンネルとして働く４つのウイルスタンパク質：Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＢ、並びにヒト免疫欠損ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＶｐｕ及びＶｐｒが報告されている（Ｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２ ； Ｓｃｈａｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｓｕｎｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ）。Ａ型及びＢ型のインフルエンザウイルスの複製戦略が非常に類似しているので、ＮＢのイオンチャンネル活性もウイルスの生活環の初期に役割を果たしていると考えられるが、ＮＢはなおもウイルスの複製において証明された機能を欠いている。ＨＩＶ−１のＶｐｕタンパク質は細胞からのウイルス粒子の放出を増強するが（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５ ； Ｓｔｒｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８ ； Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ）、その遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ−１の複製を完全に抑制することなく欠失され得る（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ｌａ．， １９８８ ； Ｋｌｉｍｋａｉｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０ ； Ｓｔｒｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８， １９８９ ）。別のＨＩＶ−１補助タンパク質であるＶｐｒは、組織培養における複製にとって必須でない様である（Ｄｅｄｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ）。最後に、本明細書において、我々はＭ２イオンチャンネル活性がＡ型インフルエンザウイルスの生活環に必須でないことを示した。従って、ウイルスタンパク質のイオンチャンネル活性は、本明細書の上文で示す様なある条件下で、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで、より効率的なウイルスの複製を促進し得るが、通常補助的な機能であると思われる。
【００６３】
例３
材料と方法
細胞とウイルス　２９３Ｔヒト胚性腎細胞及びＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ及び５％ウシ新生児血清を含むＭＥＭ中でそれぞれ維持した。２９３Ｔ細胞系は、シミアンウイルス４０Ｔ抗原の遺伝子が挿入された、２９３系の誘導体である（Ｄｕｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ ）。全ての細胞を５％ＣＯ２中で３７℃に維持した。Ｍ２ｄｅｌ２９−３１ウイルス及びＷＳＮ−ＵｄＭ（野生型）ウイルスは、ＭＤＣＫ細胞中で増殖した。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスは、１０日齢の胚含有型のニワトリの卵で増殖した。
【００６４】
免疫化及び防御試験　ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢の雌）を、１ｍｌのＭ２ｄｅｌ２９−３１ウイルス又は野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルス当たり５０μｌの１．１×１０５ｐｆｕで経鼻的に免疫化した。２週目に、血清、気管−肺の洗浄液、及び鼻の洗浄液を得るために、４匹のマウスを犠牲にした。ワクチン接種から２週間後及び１又は３ヵ月後に、免疫化したマウスを、麻酔にかけて１００ＬＤ５０量の野生型ＷＳＮウイルスで経鼻的に曝露した。ウイルスの力価の決定のために、肺を３日目に回収し、そしてホモジェナイズしてＭＤＣＫ細胞上で滴定した。残りの動物は、曝露から１４日間の感染の臨床的な徴候及び症候のために観察された。
【００６５】
ウイルス特異抗体の検出　血清試料は、ＥＬＩＳＡによって抗体について試験された。このアッセイにおいて、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び０．６ＭのＫＣｌを含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を用いた室温での処理後に、ウェルを精製したＷＳＮウイルスでコーティングし、そしてＰＢＳで希釈した。ウイルスでコーティングしたプレートと試験血清試料とのインキュベーションの後、結合した抗体は、ウサギ抗マウスＩｇＡ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼと複合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出された。
【００６６】
結果
免疫化から２週目に、ウイルス特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが免疫化したマウスの鼻の洗浄液、肺の洗浄液及び血清において見られた。特に、ウイルス特異的ＩｇＧは、３つ全ての試料の型のＭ２ｄｅｌ２９−３１ウイルスで免疫化したマウスにおいて、より高いレベルで見られ、そしてウイルス特異的ＩｇＡは、Ｍ２ｄｅｌ２９−３１で免疫化したマウス由来の肺の洗浄液中で見られたが、ＷＳＮ−ＵｄＭで免疫化したマウス由来の肺の洗浄液中で検出することができなかった（図１２）。
【００６７】
当該マウスは、免疫化から２週間、１ヶ月又は２ヶ月、野生型ウイルスで曝露され、そして最大で２週間体重が測定された（図１３）。Ｍ２ｄｅｌ２９−３１ウイルスで免疫化し、そして野生型ウイルスで曝露したマウスの体重は、免疫化と曝露との間のタイミングに関係なく比較的一定のまま維持されたが、野生型ウイルスで免疫化し、そしてその後野生型ウイルスに曝露されたマウスの体重は、免疫化と曝露との間のタイミングに関係なく、曝露後に急激に低下した。
【００６８】
ウイルスの力価を決定するために、曝露から３日目にいくつかのマウスから肺が回収された（表４）。野生型ウイルスで免疫化され、そして野生型ウイルスで曝露したマウスのみが、肺中に検出可能なウイルスを有していた。曝露された免疫化マウスの肺におけるウイルスの存在の欠如は、暴露後の生存と相関していた。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００６９】
全ての刊行物、特許及び特許出願が、引用によって本明細書に組み入れられる。前述の明細書において、本発明はそれらのいくつかの好ましい態様に関して記載され、そして例示のために多くの詳細なことが記述されたが、当業者にとって、本発明が追加の態様を許すことがあり、そして本明細書で詳述したもののいくつかが、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変更され得ることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、確立された逆遺伝学系の略図である。ＲＮＰトランスフェクション法（Ａ）において、精製されたＮＰ及びポリメラーゼタンパク質は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成したＶＲＮＡを用いて、ＲＮＰへと構築される。細胞をＲＮＡでトランスフェクションし、続いてヘルパーウイルスに感染させる。ＲＮＡポリメラーゼＩ法（Ｂ）において、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、救出されるべきｒＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーターを含むプラスミドが細胞にトランスフェクションされる。ＲＮＡポリメラーゼＩによる細胞内転写は、ヘルパーウイルスの感染によって子孫ウイルス粒子内にパッケージングされる合成ｖＲＮＡを生成する。両方法を用いて、トランスフェクタントウイルス（すなわち、クローニングしたｃＤＮＡ由来のＲＮＡを含むもの）が、ヘルパーウイルス群から選択される。
【図２】
図２は、ＲＮＡポリメラーゼＩコンストラクトの産生の略図である。インフルエンザウイルス由来のｃＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され、ＢｓｍＢＩで消化され、そして、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター（Ｐ）及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーター（Ｔ）を含むｐＨＨ２１ベクターＣＥ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｐｈ． Ｄ． ｔｈｅｓｉｓ， Ｔｕｓｔａｓ， Ｌｉｅｂｉｇ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｉｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢｓｍＢＩ部位にクローニングされた。ターミネーター配列の上流にあるチミジンヌクレオチド（＊Ｔ）は、インフルエンザウイルスＲＮＡの３′末端を表す。Ａ型インフルエンザウイルス配列は、ボールド体の文字で示す。
【図３】
図３は、セグメント化された（−）鎖ＲＮＡウイルスを産生するための逆遺伝学的方法の案である。ＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター、８個のウイルスＲＮＡセグメントのそれぞれのためのｃＤＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩのターミネーターを含むプラスミドが、タンパク質発現プラスミドと一緒に細胞内にトランスフェクションされる。感染性のウイルスが、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰを発現するプラスミドで産生され得るが、残り全ての構造タンパク質（括弧で示す）の発現が、産生されるウイルスに依存して、ウイルスの産生効率を増大させる。
【図４】
図４は、トランスフェクタントウイルスに感染した細胞におけるＦＬＡＧエピトープの検出を示す。抗体の染色は、ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９（Ａ．Ｄ）又はＡ／ＷＳＮ／３３野生型ウイルス（Ｂ．Ｅ）のいずれかに感染したＭＤＣＫ細胞において、あるいはニセ（ｍｏｃｋ）の感染ＭＤＣＫ細胞Ｃ．Ｆ）上で、ＮＡを同定するために使用された。感染から９時間後、細胞をパラホルムアルデヒドに固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理し、そして抗ＦＬＡＧ（Ａ〜Ｃ）又は抗ＷＳＮ  ＮＡ（Ｄ〜Ｆ）モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。強いゴルジ染色（赤色）が、ポジティブな試料（Ａ、Ｄ、並びにＥ）で見られる。
【図５】
図５は、ＰＡ変異体の回収を示す。各ウイルスのＰＡ遺伝子は、１２２６ｂｐのフラグメント（レーン１、３、５の、６７７−１９０３位のｍＲＮＡ）をもたらすプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、続いてこれは制限酵素Ｂｓｐ１２０Ｉ（レーン４、７の、８４６位のｍＲＮＡ）又はＰｖｕＩＩ（レーン２、６の、１２８４位のｍＲＮＡ）で消化された。ＰＣＲ産物におけるＢｓｐＲｏＩ又はＰｖｕＩＩ部位の存在は、１６９ｂｐと１０５７ｂｐ又は６０７ｂｐと６１９ｂｐのフラグメントのいずれかをそれぞれもたらした。ＭＷ＝分子量マーカー。
【図６Ａ】
図６Ａは、インフルエンザ配列を増幅するために利用されるプライマーである。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、インフルエンザ配列を増幅するために利用されるプライマーである。
【図７】
図７は、変異インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質及びそれらの特性の略図を示す。ＴＭドメインのアミノ酸配列（残基２５〜４３）は、図の拡大部分は一文字表記で示される。イオンチャンネル活性は、Ｈｏｌｄｉｎｇｅｒ 等によって（１９９４）、二電極膜電位固定法を用いて決定された。＋は検出可能なイオンチャンネル活性であり；−は検出不可能なイオンチャンネル活性である。
【図８】
図８は、Ｍ２変異ウイルス及び野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスの増殖曲線を示す。ＭＤＣＫ細胞は、０．００１のＭＯＩでウイルスに感染した。感染後の表示時間は、上清中のウイルスの力価が決定された。値は、３つ１組の実験値の平均である。ＳＤは各試料につき０．５９未満である。
【図９】
図９は、Ｍ２イオンチャンネル変異体のアマンタジン感受性を示す。変異ウイルス及び野生型ＷＳＮ−ＵｄＭウイルスは、異なる濃度のアマンタジンの存在下での、ＭＤＣＫ細胞におけるプラーク形成能について試験された。実験は３回実施し、結果は平均±ＳＤで示す。
【図１０】
図１０は、キメラＭ２変異体の略図を示す。各変異体は、Ｍ２のＴＭドメインをＨＡ又はＮＡのもので置換することによって構築した。
【図１１】
図１１は、インフルエンザのビリオン内へのＭ２変異体の組み込みを示す。精製したウイルスは、試料バッファー中で溶解された。ウイルスタンパク質は２−メルカプトエタノールで処理され、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＰＶＤＦ膜にトランスファーされ、そして１４Ｃ２抗Ｍ２モノクローナル抗体（Ｚｅｂｅｄｅｅ ａｎｄ Ｌａｍｂ， １９８８）及び抗ＷＳＮ−ＮＰモノクローナル抗体で検出された。マーカータンパク質の分子量を左側に示す。
【図１２】
図１２は、ワクチン接種したマウス由来の鼻の洗浄液（Ａ）、肺の洗浄液（Ｂ）又は血清（Ｃ）の中のウイルス特異的抗体を示す。マウスは、５０μｌの１．１×１０５ＰＦＵ／ｍｌのＭ２ｄｅｌ２９−３１又は野生型ＷＳＮ−ＵｄＭ（コントロール）ウイルスで経鼻的に免疫化された。免疫化後の第２週目に、４匹のマウスが試料を得るために犠牲となった。
【図１３】
図１３は、免疫化後から２週目（Ａ）、１ヶ月目（Ｂ）又は２ヶ月目（Ｃ）に野生型ウイルスに曝露された免疫化マウスの体重を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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