(57)【要約】本発明は、細胞もしくは組織が、組織化学もしくは細胞化学的染色操作のための試薬分子による接近を受けやすくする、生物サンプルの細胞コンディショニングのための自動整備環境において使用される試薬を提供する。試薬は、生物サンプル内の細胞および細胞要素に分子を接近可能にするよう最適化された成分を含有する。また、有機溶媒に依存することなく、組織学的もしくは細胞学的操作において染色されるべき生物サンプルを露出することによって、包埋媒質を除去またはエッチングするための自動整備環境において使用される試薬を提供する。試薬は、生物サンプルからの包埋媒質の除去またはエッチングを可能にするよう最適化された成分を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡スライド上の生物サンプルから包埋媒質を除去する自動的方法であって、
ａ）非混和性流体を加熱し；そして
ｂ）該生物サンプルを該加熱された非混和性流体と接触させ、それによって生物サンプルから包埋媒質を遊離させる：
段階を含む方法。
【請求項２】
非混和性流体を加熱する段階が、非混和性流体を包埋媒質の融点以上の温度に加熱する、請求項１の方法。
【請求項３】
該加熱段階が少なくとも約６５℃である該非混和性流体の温度を必要とする、請求項２の方法。
【請求項４】
該包埋媒質がパラフィンであるか、またはパラフィンに基材とする、請求項３の方法。
【請求項５】
生物サンプルを接触させることが、生物標本上に該非混和性溶液を分配し、そして非混和性溶液の温度を包埋媒質の融点以上に維持することによって実施される、請求項２の方法。
【請求項６】
温度を維持することが、該非混和性流体を再循環することによって実施される、請求項５の方法。
【請求項７】
生物サンプルを接触させることが、生物サンプルを該加熱された非混和性流体によりすすぎ洗いをすることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
生物サンプルおよび包埋媒質を加熱する段階をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項９】
生物サンプルおよび包埋媒質を加熱する段階が、包埋媒質の融点以上に生物サンプルおよび包埋媒質を加熱することを含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
生物サンプルおよび包埋媒質を加熱する段階をさらに含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
生物サンプルおよび包埋媒質を加熱する段階が、包埋媒質の融点以上に生物サンプルおよび包埋媒質を加熱することを含む、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．９８，５４１−Ｋにより２００１年３月７日提出の米国特許出願第０９／８００，６８９号の一部継続出願であり、これはＡｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ．９８，５４１−Ｃにより２０００年１１月２２日提出の米国特許出願第０９／７２１，０９６号の一部継続出願である。米国特許第０９／７２１，０９６号は、１９９９年９月３日提出の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０３５３からの優先権の恩典を請求していて、これはＷＯ００／１４５０７として２０００年３月１６日に公開された。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０３５３は、順に、１９９８年９月３日提出の米国暫定特許出願第６０／０９９，０１８号；１９９９年２月２６日提出の米国特許出願第０９／２５９，２４０号；およびＷＯ９９／４４０３０として１９９９年９月２日に公開された１９９９年２月２６日提出の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４１８１からの優先権の恩典を請求した。２００１年３月７日提出の米国特許出願第０９／８００，６８９号；２０００年１１月２２日提出の米国特許出願第０９／７２１，０９６号；１９９９年９月３日提出、そして２０００年３月１６日にＷＯ００／１４５０７として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０３５３；１９９８年９月３日提出の米国暫定特許出願第６０／０９９，０１８号；１９９９年２月２６日提出の米国特許出願第０９／２５９，２４０号；および１９９９年２月２６日提出、そしてＷＯ９９／４４０３０として１９９９年９月２日に公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４１８１は、すべて引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）、イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または他の組織化学的もしくは細胞化学的操作の前に、細胞もしくは組織をコンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）して、それらの各標的への種々の分子の接近を増強し、そして一般に、自動機器における生物サンプルの組織および細胞解読を改良するための溶液方法（ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ）および機器に関する。
【０００３】
関連技術の概要
すべての特許、特許出願および本明細書に記述されている非特許論文もしくは引用は、それらが矛盾していない程度に引用によって本明細書に組み入れられている。
【０００４】
病的組織体から採取された組織もしくは細胞サンプルの解釈に基づく疾病の診断は、過去数年にわたって劇的に進展した。伝統的な組織学的染色技術および免疫組織化学的アッセイに加えて、イン・サイチューハイブリダイゼーションおよびイン・サイチューポリメラーゼ連鎖反応のようなイン・サイチュー技術は、今日ではヒトにおける疾病状態の診断を助けるために使用されている。そのようにして、細胞の形態のみならず、細胞および組織内の特定の高分子の存在を調査することができる種々の技術がある。これらの技術の各々は、サンプル細胞もしくは組織が、アルデヒド（例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドのような）、ホルマリン代替物、アルコール（例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール）のような化学薬剤によるサンプルの固定、またはパラフィン、セロイジン、寒天、ポリマー、樹脂、低温媒質もしくは種々のプラスチック包埋媒質（例えばエポキシ樹脂およびアクリル剤）のような不活性材料中へのサンプルの包埋を含む予備工程を受けることが必要である。他のサンプル組織もしくは細胞標本は、凍結（凍結組織切片）または微細針をとおしての吸引（微細針吸引（ＦＮＡ））のような物理的操作を必要とする。組織もしくは細胞サンプルまたはその調製もしくは保存方法に関して、技術者の目標は、データの正確な解釈を可能にする正確な、解読しうる、そして再現性のある結果を得ることである。正確な、解読しうる、そして再現性のあるデータを提供する１つの方法は、使用される技術に関係なく試験結果を最適化するように組織もしくは細胞を調製することである。免疫組織化学およびイン・サイチュー技術の場合、このことは、特異的プローブ（例えば抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）から得られるシグナル量を増強することを意味する。組織化学的染色の場合には、それは、染色の強度の増強もしくは染色コントラストの増強を意味してもよい。
【０００５】
保存処置なしでは組織サンプルは急速に劣化するので、それらを宿主から除去した後短時間に、それらを診断において使用しなければならない。１８９３年に、Ｆｅｒｄｉｎａｎｄ　Ｂｌｕｍは、組織が組織化学的操作において使用できるように、組織を保存または固定するためにホルムアルデヒドが使用できることを発見した。ホルムアルデヒドが組織を固定する際に働く正確なメカニズムは完全には確立されてないが、それらはメチレン架橋を介して同じタンパク質内および種々のタンパク質間において反応部位の架橋を必要とする（Ｆｏｘ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３：８４５−８５３（１９８５））。近年の証拠では、また、カルシウムイオンがその役割を演じることが示唆されている（Ｍｏｒｇａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈ．１７４：３０１−３０７（１９９４））。これらの結合はタンパク質の４次および３次構造における変化を惹起するが、１次および２次構造は保存されるようである（Ｍａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９：２２５−２２９（１９９１））。架橋反応が起きる度合いは、ホルマリン濃度、ｐＨ、温度および固定の長さのような条件に依存する（Ｆｏｘ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３３：８４５−８５３（１９８５））。若干の抗原、例えばガストリン、ソマトスタチンおよびα−１−抗トリプシンは、ホルマリン固定後に検出されるが、多くの抗原、例えば中間フィラメントおよび白血球マーカーでは、ホルマリン処理後の免疫検出は失われるか、または顕著に低下される（ＭｃＮｉｃｏｌ　＆　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　３２：９７−１０３（１９９８））。抗原免疫反応性の喪失は、断続的な抗原エピトープ、すなわち、エピトープの形成が、連続していなタンパク質配列をもつ部分の集合に依存する場合のアミノ酸配列、においてもっとも著しい。
【０００６】
抗原回復は、架橋剤による組織の処理がその組織内の抗原レジデント（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）において誘導する構造変化を「元に戻す」試みを指す。抗原回復のメカニズムを描くことを試みたいくつかの理論（例えばホルマリン固定によって形成された架橋結合の解放もしくは破壊）があるけれども、ホルマリンによるタンパク質構造の改変が高温加熱のような条件下では可逆的であることは明らかである。また、いくつかの因子が抗原回復に影響を与えることも明らかである：加熱、ｐＨ、モル濃度および溶液中の金属イオン（Ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．４５：３２７−３４３（１９９７））。
【０００７】
マイクロ波加熱は、ホルマリン固定によって遮蔽された抗原の回復のためのもっとも重要な因子であると思われる。マイクロ波加熱（１００°±５℃）は、一般に、抗原回復免疫組織化学（ＡＲ−ＩＨＣ）において最良の結果をもたらす。
【０００８】
種々の加熱法がそのようなＩＨＣにおける抗原回復について記述されている、例えばオートクレーブする（Ｐｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．３：２６５−２６７（１９９５）；Ｂａｎｋｆａｌｖｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈ．１７４：２２３−２２８（１９９４））；圧力処理（Ｍｉｌｌｅｒ　＆　Ｅｓｔｒａｎ，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．３：１９０−１９３（１９９５）；Ｎｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈ．１７３：３７１−３７９（１９９４））；水浴（Ｋａｗａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐａｔｈ．Ｉｎｔ．４４：７５９−７６４（１９９４））；マイクロ波＋プラスチック圧処理（米国特許第５，２４４２７８７号；Ｐｅｒｔｓｃｈｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９（ｓｕｐｐｌ．）：１３４−１３７（１９９４））；および蒸気加熱（Ｐａｓｈａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７２：１６７Ａ（１９９５）；Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｐ　Ｔｏｄａｙ　９：１６−２２（１９９５））。
【０００９】
若干の抗原は、マイクロ波加熱が蒸留水中で実施される場合、満足できる結果をもたらすが、多くの抗原は加熱処理中にバッファーの使用を必要とする。ある抗原は、十分な結果が、狭いｐＨ範囲内でのみ達成されるような特定のｐＨ要件を必要とする。現在、ほとんどの抗原回復溶液はｐＨ約６−８において使用されるが、やや塩基性溶液の方が、わずかにより優れた結果を与えるという若干の指摘がある（Ｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：３２７−３４３（１９９７））。
【００１０】
金属イオンを含む抗原回復溶液の化学成分がマイクロ波加熱操作において可能な補助因子としての役割を演じるけれども、これまでは、抗原回復のために必須であり最良である単独の化学薬品は同定されていない。
【００１１】
多くの溶液および方法が染色増進のために日常的に使用される。これらは、限定されるものではないが、蒸留水、ＥＤＴＡ、尿素、Ｔｒｉｓ、グリシン、塩水およびクエン酸バッファーを含む。種々の洗剤（イオン性もしくは非イオン性界面活性剤）を含有する溶液もまた、広範囲の温度（周囲温度〜１００℃を超える温度）下で染色増進を容易にする。
【００１２】
細胞の外側部分に存在している細胞表面分子に加えて、ＩＨＣ、ＩＳＨならびに他の組織学的および細胞化学的操作において興味ある他の分子は、細胞内、しばしば核エンベロープ上に局在している。これらの分子のあるものは、ホルマリンのような固定液にさらされる場合分子の変形を受ける。かくして、これらの分子に関して、有機および無機化合物と細胞との相互作用を容易にするためには、固定の影響を克服するだけでなく、細胞の透過性を増大することが望ましい。
【００１３】
また、他の組織サンプルが、試験前に架橋剤で処理されなくて、これらの組織に関する結果が改善されたことは重要である。細胞学的および組織学的サンプルを保存および調製するための種々の非ホルマリン法が存在する。これらの方法の例は、限定されるものではないが次のことを含む：ａ）血液学的塗抹標本、ｃｙｔｏｓｐｉｎｓＴＭ、ＴｈｉｎＲｒｅｐＴＭ、ｔｏｕｃｈ　ｐｒｅｐｓ、細胞系、Ｆｉｃｏｌｌ分離物などは、限定されるものではないが風乾、アルコール固定、スプレー固定液および保存媒質、例えばスクロース／グリセリンを含む多くの方法において日常的に保存される；ｂ）組織および細胞（固定されても固定されなくても）は、凍結され、続いて、限定されるものではないが保存、固定および乾燥を含む種々の安定化技術にかけられる；ｃ）組織および細胞は、多数の非架橋のアルデヒド固定液、非アルデヒド含有固定液、アルコール固定液、酸化剤、重金属固定液、有機酸およびトランスポートメディア（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｍｅｄｉａ）において安定化される。
【００１４】
試験結果を改善する１つの方法は、特定のサンプルから得られるシグナルを増強することである。一般的な意味では、増強シグナルはその標的に対する特定の分子の接近性を増強することによって得ることができる。細胞内に見いだされる抗原の場合のように、細胞内の標的は、細胞の透過性を増大し、そして多数の分子の細胞への侵入を可能にすることによって、より接近し易くされるので、それによって分子がその標的を「発見」する可能性を増大する。そのような増強された透過性は、ＩＳＨ、イン・サイチューＰＣＲ、ＩＨＣ、組織化学および細胞化学のような技術のためには特に重要である。
【００１５】
また、組織および細胞は、種々の不活性媒質（パラフィン、セロイジン、ＯＣＴＴＭ、寒天、プラスチックもしくはアクリルなど）に包埋されて将来の分析のためにそれらの保存が助けられる。これらの不活性材料の多くは疎水性であり、そして組織学的および細胞学的応用のために使用される試薬は著しく親水性である；したがって、不活性媒質は試験前に生物サンプルから除去される必要がある。例えば、パラフィン包埋組織切片は、スライドを種々の有機溶媒、例えばトルエン、キシレン、リモネンもしくは他の適当な溶媒を通過させて組織切片からパラフィンを除去することによって、その後の試験のために調製される。これらの有機溶媒は非常に揮発性であり、必要な特殊な処理（例えば脱パラフィン処理は換気フード内で実施される）を含む種々の問題を惹起し、そして特殊な廃液処分を要する。これらの有機溶媒の使用は、分析コストと、試験される各組織サンプルに伴う曝露の危険性を増加し、そして環境に対する重大な悪い影響を有する。
【００１６】
現在、自動方式でスライドを直接加熱することによってサンプル組織から不活性媒質を除去するために利用できる技術はない。１段階の自動染色工程においてサンプル組織もしくは細胞をコンディショニングしながら、サンプル組織から不活性媒質を除去することもまた今日では不可能である。
【００１７】
本発明の方法は、ａ）有機溶媒の使用なしに包埋媒質を自動的に除去して染色のための細胞を露出し、それによって時間、費用および安全の障害を低下させる、ｂ）サンプル細胞もしくは組織から包埋媒質を自動除去することなく自動的に細胞をコンディショニングする、ｃ）細胞を露出する多段階自動工程が細胞のコンディショニングを実施し、そして細胞学的もしくは組織学的標本の透過性を増大し、それによってサンプルの解読性を増大し、そして試験データの解釈を改善する。本発明の方法は、細胞学的および組織学的染色技術と組み合わせて使用されるほとんどの組織学的および細胞学的サンプルの染色性および解読性を改善するために使用することができる。
【００１８】
発明の概要
本発明は、組織化学もしくは細胞化学的アッセイにおいて生物サンプル内の分子の接近性を改善する、細胞もしくは組織のコンディショニングのための溶液、方法および機器に関する。コンディショニングは、組織化学もしくは細胞化学的プロトコールにおけるいかなる時点で実施されてもよい。
【００１９】
さらに、本発明は、包埋媒質を有機溶媒の使用なしに除去することによって組織学的もしくは細胞学的試験操作において使用される生物サンプルを露出するための自動的方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、組織化学および細胞化学的応用のための生物サンプルの同時の露出および細胞コンディショニングのための自動的方法に関する。
【００２１】
好適な実施態様の詳細な記述
本発明の１つの実施態様は、生物サンプルが保存と支持のためにその中に包埋された不活性材料の除去による生物サンプルの露出に関する。本発明の１つの実施態様では、パラフィンもしくは他の不活性材料は、生物サンプルの１面を加熱することによって生物サンプルから除去される。このことは、包埋された生物サンプルが置かれた顕微鏡スライドの接触加熱によって達成できる。包埋された生物サンプルから除去できる他の不活性材料は、限定されるものではないが寒天および低温媒質を含む。不活性な包埋媒質の除去または包埋媒質のエッチングのこの過程は本明細書では露出（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）として言及される。
【００２２】
本発明の好適な方法では、ガラススライド上に置かれているパラフィン包埋された生物サンプルは、最初に加熱エレメントによって加熱される。加熱エレメントは、サンプルスライドが乾燥され、そしてパラフィンが融解されるように、自動染色機器（両方とも引用によって本明細書に組み入れられている、１９９７年１２月１９日提出の米国特許出願第０８／９９５，００２号および１９９８年２月２７日提出の米国暫定特許出願第６０／０７６，１９８号）内の生物サンプルの１面において熱にさらす（例えば、引用によって本明細書に組み入れられている米国特許出願第０９／２５９，２４０号において開示されている熱プラットホーム）。
【００２３】
加熱エレメント
米国特許出願第０９／２５９，２４０号（これは引用によって組み入れられている）において議論され、そして類似の部分が類似の引用数字によって全体に指示されている図面について詳細にここに言及されるように、図１において引用数字１０によって一般に指示される本発明による分子病理学的装置の遠近概要図が図解されている。装置１０は、核酸プローブ、抗体および／または所望の順序、時間および温度においてそれと結合される試薬により顕微鏡スライド上に載せられた組織を、自動的に染色または他の処理をするために設計されている。しかるべく染色または処理された組織切片は、次に、患者の診断、予後または治療の選択のために、スライドを解読する医療実務者によって顕微鏡下で観察されなければならない。
【００２４】
好適な実施態様では、装置１０は、ホストコンピューター１４好ましくはパーソナルコンピューター、モニター１６、キーボード１８、マウス２０、大量の流体（ｆｌｕｉｄ）容器２２、廃液容器２３および関連設備をまた含むシステム１２（図２）の１つの構成部分もしくはモジュールとして機能する。さらなる染色モジュールまたは他の機器が、サーバーとして機能するコンピューター１４とネットワークを形成するようシステム１２に付加されてもよい。あるいはまた、これらの別々の構成部分のある部分または全部が、装置１０に組み入れられてそれを独立機器としてもよい。
【００２５】
装置１０ならびにシステム１２の好適な配置は、一般に、共に本明細書に組み入れられている１９９７年１２月１９日提出の米国特許出願第０８／９９５，００２号ならびにＶｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）から入手できるｔｈｅ　Ｖｅｎｔａｎａ　ＮｅｘＥＳ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅに記述されているが、以下に開示される新規な加熱システム、スライド支持体、大量流体モジュール、容量調整機およびスライドワイパーに関しては除外される。明確にするために、本発明および組み入れられている引用の両方に見いだされるそれらの構成部分の詳細な記述は省略されている。
【００２６】
簡単に言えば、装置１０は、標準のガラス顕微鏡スライド上に載せられた組織に化学および生物試薬を自動的に適用するマイクロプロセッサー制御の染色機器である。放射状に置かれるガラススライドを支持する回転盤は、ステッパーモーターによって回転して、各スライドを一連の試薬ディスペンサーの１つの下に位置させる。装置１０は、分配、洗浄、混合および加熱を制御して反応動態を最適化する。コンピューター制御の自動化は、楽々と、すなわちほとんど手作業なく装置１０の使用を可能にする。
【００２７】
より特別には、装置１０は、上部セクション３２を移動可能に設置されるかまたは蝶番付けされる下部セクション３０から形成される集合体を含む。スライド回転盤３４は、軸Ａ−Ａについて回転するために下部セクション３０内に搭載されている。以下、より詳細に述べるように、複数の熱プラットホーム５０は、回転盤３４の周辺部に放射状に載せられていて、この上に組織サンプルを有する標準ガラススライドが置かれる。回転盤３４は、好ましくはステンレス鋼で構築される。各スライドの温度が本明細書で記述される種々のセンサーおよびマイクロプロセッサーによって個々に制御できることが、本発明の重要な特徴である。また、装置１０内には、洗浄ディスペンサーノズル３６、ＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭディスペンサーノズル３７、流体ナイフ（ｆｌｕｉｄ　ｋｎｉｆｅ）３８。洗浄容量調節ノズル３９、バーコードリーダーミラー４０および空気渦巻きミキサー４２が収容されており、これらの詳細はこの後で議論される。
【００２８】
試薬回転盤２８は、上部セクション３２に回転可能のように搭載されている。試薬は、核酸プローブもしくはプライマー、ポリメラーゼ、１次および２次抗体、消化酵素、前固定液、後固定液、ブロッキング剤、読み取り化学および対比染色剤を含む、スライドに慣用的に適用されるすべての化学または生物材料を含む。試薬ディスペンサー２６は、好ましくは、コンピューターによって同定するためのバーコード標識された２９である。各スライドでは、単一の試薬が適用され、次いで温度制御された環境下で正確な時間インキュベートされる。試薬の混合は、試薬の回転を引き起こすようにスライドの縁に沿って狙い定めた圧搾空気ジェット４２によって行われる。適当なインキュベート後、試薬がノズル３６を用いてスライドから洗い出される。次いで、残留洗浄バッファー容量が容量調節ノズル３９を用いて調節される。次いで、蒸発を抑えるためにＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭ液がノズル３７をとおしてスライドに適用される。エアナイフ３８がＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭの溜まりを分離し、続いて次の試薬が適用される。これらの段階は、プロトコールが完結されるまで回転盤が回転しながら繰り返される。
【００２９】
ホストコンピューター１４に加えて、装置１０は、好ましくは、それ自体のマイクロプロセッサー４４を含み、これに対するホストコンピューター４４からの情報がダウンロードされる。特に、コンピューターは、「ラン・ルール（ｒｕｎ　ｒｕｌｅ）」と呼ばれる両ラン・プログラムにおける段階の順序およびセンサーのモニタリングと制御論理ならびにプロトコールの温度パラメーターをマイクロプロセッサー４４にダウンロードする。Ｄａｌｌａｓ　Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｄａｌｌａｓ　ＴＸ製のモデルＮｏ．ＤＳ２２５１Ｔ　１２８Ｋは、この機能を遂行できるマイクロプロセッサーの例である。
【００３０】
図５については、スライド加熱システム４８の構成図が示される。システムは、一般に、スライドを加熱し、そしてその温度をモニターするための回転盤３４に放射状に載せられた約２０の熱プラットホーム５０、およびセンサーをモニターし、そしてヒーターを制御するためのスライド回転盤にまた載せられた制御エレクトロニクスをプリントされた円板５２を含有する。制御エレクトロニクス５２は、回転するスライド回転盤３４の下に搭載される。情報および出力が、スリップリングアッセンブリー５６を介して固定された機器プラットホームから回転する回転盤に伝達される。この情報は、マイクロプロセッサー４４（コンピューター１４からダウンロードされた後）から下記のような制御エレクトロニクス５２に伝達される、スライド（上部および下部）の加熱に必要な温度パラメーターを含む。作動（ｒｕｎ）中、スライド温度がプログラムされた低い限界以下であると決定されると、熱プラットホームがスライドを加熱する。同様に、スライド温度が高い限界以上であると分かった場合、加熱は停止される。１つのヒーター当たり約８ワットを与える十分な容量の電力供給が必要な温度上昇速度に合致するように提供される（ａ／ｋ／ａ”ｒａｍｐ　ｕｐ”）。
【００３１】
同様に、その他の（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）実施態様では、スライドの冷却が、続いて記述されるように同じように制御される。１つのその他の実施態様では、冷却プラットホームがスライドの下に搭載される。冷却プラットホームはＰｅｌｔｉｅｒ型熱変換器を含んでもよい。その他の実施態様では、スライドの急速な冷却が特定のアプリケーションのために必要である場合は、冷却器具、例えばファン（表示なし）が場合によっては提供されてもよい。冷却器具は、周囲気温の低下を補償するために冷却を必要としないスライドに対応してヒーターを必要とするすべてのプラットホームのために周囲気温を改変できる。ここに記述されるスライド加熱システムは、伝導加熱を使用し、そして個々にスライドを加熱する。システムは、より正確なスライド上温度を提供し、そしてスライドベースによってスライドの温度設定を可能にする。
【００３２】
スライドの加熱
典型的には、生物サンプルはスライド（例えばガラススライド）の上面に置かれる。次いで、スライドは。スライドの下面が熱プラットホームに接するように熱プラットホーム５０の上に置かれる。既に議論したように、熱プラットホーム５０は、伝導によりスライドの裏面を加熱する。生物サンプルの加熱後、不活性材料は流体（気体もしくは液体のような）によってスライドから除去できる。例えば、不活性材料は脱イオン水および界面活性剤によりすすぎ洗いされる。
【００３３】
脱パラフィンのための本方法は、先行技術において実施された方法とは著しく異なっている。先行技術の方法は：（１）パラフィンを溶解するために有機溶媒を使用するか；または（２）手作業で熱と溶解剤を用いてパラフィンを溶解することを含む。反対に、本発明の１つの態様では、脱パラフィンは、パラフィンを溶解する化学反応を必要としない。特に、サンプル上に置かれる流体はパラフィンを溶解しない。その代わり、本方法は、組織からのパラフィンの融解および流体によるそれの洗い落としを伴う。１つの実施態様では、包埋されたサンプル上に置かれる流体は、パラフィンと混和しないか、または混合できない。この１つの例は水であり、これはパラフィンとは混和性ではない。さらに、水は液化パラフィンよりも高い密度を有する。融解した場合、パラフィンは流体の上に浮いており、その結果、スライドの上部が洗浄されて融解したパラフィンをすすぎ洗いして除去することができる。
【００３４】
本発明のその他の方法では、パラフィン包埋の生物サンプルは、ガラスの顕微鏡スライド上に置かれ、そして顕微鏡スライドが加熱エレメント上に置かれる。試薬は生物サンプルスライド上に置かれ、次いで、生物サンプルスライドが、不活性材料の融解を可能にする高い温度にさらされ、そしてこの後、不活性材料が流体（気体もしくは液体のような）によりスライドから除去できる。
【００３５】
本発明の好適な実施態様では、試薬は、包埋生物サンプルの加熱と組み合わされて使用される。適当な試薬は、限定されるものではないが、脱イオン水、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６−１０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、ＳＳＣバッファー、ＡＰＫ　ＷａｓｈＴＭ、酸性バッファーもしくは溶液（ｐＨ１−６．９）、塩基性バッファーもしくは溶液（ｐＨ７．１−１４）、鉱油、Ｎｏｒｐａｒ、ｃａｎｏｌａ油およびＰＡＧ油を含む。これらの試薬の各々は、また、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有してもよい。
【００３６】
本発明の方法において、加熱エレメントの温度は、不活性材料の融点を超える温度に上げられる。例えば、純パラフィンの融点は、Ｍｅｒｃｋインデックスでは５０−５７℃として挙げられている。したがって、本発明の方法では、温度は、中に生物サンプルが包埋されているパラフィンの融点を超える。本発明の好適な方法では、温度は５０℃超約１３０℃に上昇させられる。
【００３７】
本発明の方法において、不活性材料を融解するのに要する時間は使用される温度および包埋材料により変わる。典型的には、自動システムにおいて、プロセッサー（例えばマイクロプロセッサー）はメモリーと組み合わせて使用される。パラフィンを融解するのに要する時間量および温度は、メモリーに含まれる表内に含有される。
【００３８】
パラフィン包埋生物サンプルは、５分〜６０分の範囲の高温にさらされる。本発明の方法で使用される加熱エレメントは、生物サンプルが置かれている表面と加熱エレメントの間に十分な接触が維持されることを必要とする。
【００３９】
図６を参照すれば、スライドから包埋媒質を除去するための１つの実施態様についてのフローチャートが示される。区画６０において示されるように、スライドの表面は撹拌される。１つの実施態様では、渦巻きエアミキサー４２がスライドの表面上の生物サンプルを撹拌するために使用される。区画６２において示されるように、スライドの温度は予定された温度まで上昇させられる。１つの実施態様では、スライドの温度は熱プラットホームを用いて加熱することによって上昇させられる。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の１つの例として、最初の加熱段階は６５℃に１６分間、次いで７５℃に２分間スライドを加熱する。免疫組織化学的（ＩＨＣ）例では、最初の加熱段階は熱プラットホームの温度を約４分間７５℃に上昇させる。この最初の加熱段階は、包埋媒質を除去する必要がない限り、（１）生物サンプルとスライド表面の間にあるすべての水分を除去し；そして（２）包埋媒質の融解を始める（パラフィンの融点は前述のように５０−５７℃である）ために実施される。
【００４０】
包埋媒質は、サンプルの外側（すなわち、サンプルを封入している）に存在し、そしてまた組織中に注入されている。この最初の加熱を実施する間、包埋媒質は組織から出て貯留する。具体的には、スライドはスライド角に存在する（完全には水平ではない）ので、包埋媒質は、サンプルが置かれている場所よりも低いスライド上のある点に徐々にたまる。その他の実施態様では、スライドは、貯留した包埋媒質を除去するために、最初の加熱段階後に流体（液体でも気体でもよい）によりすすぎ洗いし得る。例えば、脱イオン水のような流体がスライドから包埋媒質をすすぎ洗いるのに使用できる。
【００４１】
区画６４において示されるように、水性流体がスライドに適用される。流体が全生物サンプルを覆うようないかなる水性流体も許容できる。既に議論されたように、水性流体の例は、脱イオン水、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６−１０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、ＳＳＣバッファー、ＡＰＫ　ＷａｓｈＴＭ、酸性バッファーもしくは溶液（ｐＨ１−６．９）、塩基性バッファーもしくは溶液（ｐＨ７．１−１４）、鉱油、Ｎｏｒｐａｒ、ｃａｎｏｌａ油およびＰＡＧ油を含む。さらに、水性流体は、また、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有してもよい。界面活性剤は水性流体の表面張力を低下させて、水性流体をスライドの表面上により良好に広げさせる。１つの実施態様では、水性流体は、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する脱イオン水を含む。スライド上に適用される前に、水性流体が微生物を含有しないように、抗微生物剤として作用するさらなる成分が添加されてもよい。１つの実施態様では、流体は、水含量９９重量％以上を含む（すなわち、流体は９９％−１００％の水からなる）。包埋材料を除去するための流体として水の使用は、包埋媒質を除去するのに慣例的に使用されるもの、例えば有機溶媒とは異なる。水は全くパラフィン、典型的な包埋材料とは非混和性である。これに対して、有機溶媒、例えばトルエン、キシレン、リモネンは、パラフィンと混和性であり、したがって脱パラフィンには適当と考えられる。
【００４２】
さらに、水性流体は、包埋媒質が水性流体の表面に浮かび、そしてスライド上の生物サンプルが乾固しないように、十分な量および十分な時間（加熱による水性流体の蒸発を考えて）において適用されなければならない。１つの実施態様では、水性流体は、生物サンプル上に水性流体約１ｍｌの最初の適用、そして水性流体の２分後の第２の適用によって連続して適用される。第２の適用は水性流体約０．５ｍｌ〜１ｍｌであってもよい。流体は、スライドの上に直接位置しているノズルを用いてスライドに適用される。この方式では、スライド上に落とされる流体量は制御できる。さらにまた、流体包埋材料（例えばパラフィン）は低い表面張力を有するので、スライド上に流体を適用することは、スライドの上部に十分量の流体を残さないかもしれない。したがって、包埋されたサンプル上へのノズルを用いる流体の滴下は、より多くの流体をスライドの上面に残すようにするのが好ましい。さらなる考慮は、包埋媒質の融点以上に生物サンプルの温度を維持することである。パラフィンの例では、融点は約５０−５７℃である。好適な実施態様では、サンプルは７５℃に加熱される。しかしながら、水性流体は加熱されないので、スライドへの水性流体の適用は、なおパラフィンの融点以上である約６０−６５℃に、生物サンプルの温度を一時的に低下させる。したがって、サンプルを加熱する温度の選択は、スライドへの流体の添加がスライドの温度を包埋媒質の融点以下に低下させないように、十分に高くすべきである。あるいはまた、スライドに適用される流体は、スライド上のサンプルの温度を低下させないように、適用前に加熱されてもよい。
【００４３】
区画６６では、蒸発防止剤が適用される。好適な実施態様では、ＬＩＱＵＩＤ　ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭ（ＬＣＳＴＭ）が適用される。したがって、システムは、区画６８で示されるように、スライドが加熱される予定時間の間待機する。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）では、スライドを加熱する時間の１例は７５℃で６分である。免疫組織化学（ＩＨＣ）の例では、インキュベーション時間は７５℃で８分である。１つの実施態様では、スライドの温度は、後に議論されるように、段階７６までの初期加熱の間は一定に保たれる。かくして、スライドのヒーターは、加熱の初期段階中つけられており、そして包埋媒質がスライドから洗浄される後まで同じ温度において停まっている。あるいはまた、ヒーターのセットポイント温度は、包埋媒質がスライドから洗浄される後までの初期加熱の時間から調節できる。
【００４４】
加熱の間に、包埋媒質は水性流体の上部に浮き上がる。好適な実施態様では、スライドに適用される流体は包埋媒質よりも大きい密度を有する。特定の例では、流体は、ほとんど水（例えば９９％超）からなり、そして包埋媒質はパラフィンである。オイルに基づく生産物としてパラフィンは水より低い密度である。そのために、パラフィンは融解された後水の上部まで上がってくる。
【００４５】
区画７０で示されるように、次にスライドが洗浄されて、包埋媒質は水性流体に押し流される。好適な実施態様では、スライドを覆うために使用される水性流体の同種類が、またスライドを洗浄するために使用される。また、洗浄は生物サンプル上にある量の水性流体を残す。好適な実施態様では、約０．２５ｍｌがスライド上に残される。したがって、区画７２において示されるように、水性流体がさらにスライドに適用される。その他の実施態様では、スライドの洗浄は、さらなる水性流体が適用されなくてもよいように、スライド上に十分量の水性流体を残してもよい。
【００４６】
区画７４では、蒸発防止剤が適用されるが、好適な実施態様では、これはＬｉｑｕｉｄ　ＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭ（ＬＣＳＴＭ）である。したがって、スライドの温度は、区画７６において示されるように低下される。好適な実施態様では、これは熱プラットホーム５０によって適用される熱を低下させるか、または除くことによって実施される。さらにまた好適な実施態様では、スライドの温度は予定の温度４２℃まで低下される。この予定温度は、処理される場合すべてのスライドが既知の温度（変動する周囲温度になるのとは違って）になるように選ばれる。したがって、区画７８に示されるように、装置は予定の時間待機する。
【００４７】
本発明のその他の実施態様は、生物サンプルが保存および支持のために包埋されている不活性材料の除去なしに生物サンプルを露出することに関する。本発明の好適な実施態様では、生物サンプルは、包埋された生物サンプルが置かれている顕微鏡スライドの接触加熱によって試験のために準備される。包埋された生物サンプルから除去しない他の不活性材料は、限定されるものではないが、プラスチックもしくはセロイジン包埋媒質および／または他のポリマーおよび樹脂を含む。
【００４８】
本発明の好適な方法では、ガラススライド上に置かれた包埋生物サンプルは、加熱エレメントによって最初に加熱される。加熱エレメントは、例えば、サンプルスライドが乾燥されるように、自動染色機器（米国特許出願第０８／９９５，０５２号および同第６０／０７６，１９８号）内の、米国特許出願第０９／２５９，２４０号において開示された熱プラットホーム５０を用いることによって生物サンプルの１面を熱にさらす。
【００４９】
本発明のその他の方法では、包埋生物サンプルはガラス顕微鏡スライド上に置かれ、そして顕微鏡スライドが１面において加熱される（例えば熱プラットホーム上にスライドを置くことによって）。次いで、試薬が生物サンプルスライド上に置かれ、そして試薬を含む生物サンプルスライドが、次に、特定の温度（周囲温度〜１００℃超の範囲）に、そして特定の時間（２分〜１２時間の範囲）加熱される。これが、不活性包埋材料の表面のエッチングを惹起し、そしてその後に、エッチング試薬は流体（気体もしくは液体として）によってスライドから除去できる。既に議論されたように、時間量および特定の温度はメモリーに保存されていてもよい。
【００５０】
本発明の好適な方法では、試薬は、包埋生物サンプルの加熱と組み合わされても加熱しなくても使用される。適当な試薬は、限定されるものではないが、脱イオン水、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６−１０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、ＳＳＣバッファー、ＡＰＫ　ＷａｓｈＴＭ、酸性バッファーもしくは溶液（ｐＨ１−６．９）、塩基性バッファーもしくは溶液（ｐＨ７．１−１４）、鉱油、Ｎｏｒｐａｒ、ｃａｎｏｌａ油およびＰＡＧ油を含む。これらの試薬の各々は、また、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有してもよい。
【００５１】
本発明の方法では、加熱エレメントの温度は、包埋生物サンプルの乾燥またはエッチングのために適当なレベルに設定される。例えば、エッチングは、メタノール水酸化ナトリウム（ナトリウムメトキシド）の塩基性溶液を用いて、温度範囲周囲温度〜３７℃において実施されてもよい。
【００５２】
本発明の方法において、不活性材料をエッチングするのに要する時間は使用される温度および包埋材料（プラスチックもしくはセロイジン包埋媒質および／または他のポリマーおよび樹脂など）により変わる。本発明の好適な実施態様では、包埋生物サンプルは範囲２分〜１２時間適当な温度にさらされる。本発明の方法において使用される加熱エレメントは、生物サンプルが置かれている表面と加熱エレメントの間に十分な接触が維持されることを必要とする。
【００５３】
なおその他の実施態様では、本発明は、脱パラフィンを実施するために生物サンプルの直接加熱を利用しない。その他の実施態様は、顕微鏡スライド上の生物サンプルから包埋媒質を除去する自動的方法に対向され、この方法は包埋媒質の融点以上の温度に非混和性流体を加熱し；そして生物サンプルと加熱された非混和性流体とを接触させて生物サンプルから包埋媒質を遊離させる段階を含む。包埋媒質が融点５０−５７℃を有するパラフィンである場合、流体は、パラフィンの融点を超える必要がある（例えば６０−７０℃）。流体の加熱は種々の方式において実施できる。１例は、引用によって完全に組み入れられている米国特許第５，５９５，７０７号に開示されている。米国特許第５，５９５，７０７号に示されるように、図１９Ａおよび１９Ｂは、サンプルの洗浄前に液体を加熱するための異なる実施態様を示している。
【００５４】
既に議論されたように、水性流体の例は、脱イオン水、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６−１０）、リン酸バッファー（ｐＨ６．０−８．０）、ＳＳＣバッファー、ＡＰＫ　ＷａｓｈＴＭ、酸性バッファーもしくは溶液（ｐＨ１−６．９）、塩基性バッファーもしくは溶液（ｐＨ７．１−１４）、鉱油、Ｎｏｒｐａｒ、ｃａｎｏｌａ油およびＰＡＧ油を含む。さらに、水性流体は、また、イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ、サポニンおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有してもよい。界面活性剤は水性流体の表面張力を低下させて、水性流体をスライドの表面上により良好に広げさせる。１つの実施態様では、水性流体は、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する脱イオン水を含む。スライド上に適用される前に、水性流体が微生物を含有しないように、抗微生物剤として作用するさらなる成分が添加されてもよい。１つの実施態様では、流体は、水含量９９重量％超を含む（すなわち、流体は９９％−１００％の水からなる）。
【００５５】
接触は、１つの実施態様では、流体による生物サンプルのすすぎ洗いを含む。すすぎ洗いは、流体の連続の流れまたは一連の流体の流れを含んでもよい。すすぎ洗いは、スライド上に流体をあてる１個または直列のノズルを用いることによって行われる。好適な実施態様では、ある角度（すなわち、１５〜２５度）で生物サンプルにあてられる。あるいはまた、ノズルはサンプルの上に直接位置しており、そして流体がサンプル上に滴下できる。用語「遊離する」は、包埋媒質を組織からそれ自体遊離させるための適当な条件を作成することを意味する。このことは、加熱された非混和性液体、通常はバッファーがサンプルの表面上をすすぎ、同時に包埋媒質を融解し、そして組織からここでの液状包埋媒質を浮かび上がらせるための除去手段を提供する場合に、起きる。
【００５６】
機器は、包埋媒質の融点以上にＥＺ　Ｐｒｅｐバッファーの温度を維持するために（パラフィンに対しては少なくとも約６５℃）、バッファーを加熱し、そして再循環させる液体再循環ポンプを付加するよう改変されてもよい。ＥＺ　Ｐｒｅｐは、次に、好ましくは、パラフィンの融点以上にサンプルを加熱し、そして同時にサンプルから融解パラフィンを洗い落とすのに十分な時間、スライド上のサンプルをすすぐことによって、生物サンプルと接触させられる。実施例１０は、この代替実施態様が実際に行われる１つの方法を教えている。
【００５７】
１つの実施態様では、本発明は、両生物サンプルの直接加熱および脱パラフィンを実施するための流体の加熱を利用する。生物サンプルの直接加熱および流体の加熱は、包埋媒質を融解して除くことと一緒に働く。生物サンプルの加熱は包埋媒質の融点以上でも以下であってもよい。同様に、流体の加熱も包埋媒質の融点以上でも以下であってもよい。例えば、脱パラフィンが両生物サンプルの加熱および流体の加熱によって達成される場合、４つの異なる可能性が存在する：（１）包埋媒質の融点未満までの生物サンプルの加熱および包埋媒質の融点未満までの流体の加熱；（２）包埋媒質の融点未満までの生物サンプルの加熱および包埋媒質の融点超までの流体の加熱；（３）包埋媒質の融点超までの生物サンプルの加熱および包埋媒質の融点未満までの流体の加熱；および（４）包埋媒質の融点超までの生物サンプルの加熱および包埋媒質の融点超までの流体の加熱。
【００５８】
また、本発明の好適な実施態様は、生物サンプルから不活性包埋媒質の除去またはエッチングに続けても、また独立でも同時に、細胞のコンディショニングの自動方法を含む。適当な（有機もしくは無機）試薬における生物サンプルの加熱は、細胞中の標的分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、色素または他の小分子など）への試薬の接近を改善することが見い出された。分子標的への試薬（有機もしくは無機）の接近を改善するこの方法は、本明細書では細胞コンディショニングとして言及される。
【００５９】
本発明の１つの方法では、細胞コンディショニングは、生物サンプルが前述のように露出されながら達成される。本発明のこの方法では、生物サンプルはガラス顕微鏡スライド上に置かれ、そして顕微鏡スライドは、自動染色機器（米国特許出願第０８／９９５，０５２号および同第６０／０７６，１９８号）内で１面を加熱される（例えば、熱プラットホーム上にスライドを置くことによって）。試薬が生物サンプル上に置かれ、そして加熱エレメントの温度は増大されてもされなくてもよい。生物サンプルは適当な時間、適当な温度にさらされて、不活性材料の融解またはエッチングを可能にし、そして組織学的または細胞学的技術を用いて続いて染色されるよう生物サンプルの細胞コンディショニングを可能にする。
【００６０】
図７ａ−ｂについて言えば、細胞のコンディショニングを可能にするよう生物サンプルを露出するための１つの実施態様のフローチャートが示されている。区画８０において示されるように、細胞コンディショニングが適用されるか否かが決定される。種々の細胞コンディショニングが、処理の必要性に応じて適用できる。区画８２において示されるように、スライドが水性流体で洗浄される。流体が全生物サンプルを覆うようないかなる水性流体も許容できる。好適な実施態様では、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する脱イオン水が使用される。その後に、蒸発防止剤が、区画８４に示されるようにスライドに適用される。好適な実施態様では、Ｌｉｑｕｉｄ　ＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭが適用される。その後、区画８６に示されるように、スライドの温度が予定値に改変される。好適な実施態様では、ヒーターがスライドを４２℃に加熱する。この最初の加熱は、すべてのスライドが予定温度において細胞コンディショニングを確実に開始するために実施される；または、スライドの温度が周囲温度によって決められる場合は、スライドの温度は定めなくてもよい。
【００６１】
次いで、区画８８に示されるように、蒸発防止剤が適用される。その後、区画９０に示されるように、スライドの温度が予定温度まで上昇される。これは細胞のコンディショニングが実施される温度である。好適な実施態様では、ヒーターの温度は１００℃に設定される。その後、区画９２に示されるように細胞コンディショニングが適用され、そして区画９４に示されるように、蒸発防止剤が適用される。本明細書で議論されるように、多数の細胞コンディショニングが適用されてもよい。
【００６２】
サンプルがいかに軽く／強く固定されているかが、必要な細胞コンディショニングの量を決定する。サンプルが軽く固定されている場合、弱い細胞コンディショニングが推奨される。同様に、サンプルが中等または強く（広く）固定されている場合、中等または強い細胞コンディショニングが、それぞれ推奨される。不適当な細胞コンディショニングは、サンプルの処理において悪い結果を有するであろう。好適な実施態様では、細胞コンディショニングの弱／中／強の時間は、それぞれ３０／６０／９０分である。さらに、細胞コンディショナー（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）は、細胞を適当にコンディショニングし、そしてサンプルの乾固を避けるために、処理中に予定の増加量において適用される。図７ａにおいて示されるように、細胞コンディショナーおよびＬＣＳＴＭの適用をとおして繰り返す回数は、区画９６に示されるように決定される。この変数は「ループ　カウンター（ｌｏｏｐ　ｃｏｕｎｔｅｒ）」と呼ばれる。ループ　カウンターは、図７ｂにおける区画９８に示されるように、０に設定される。ループは開始され（区画１００に示されるように）、そしてシステムは予定時間待機する（区画１０２に示されるように）。好適な実施態様では、予定時間は６分である。細胞コンディショナーが適用され（区画１０４に示されるように）、そして蒸発防止剤が適用される（区画１０６に示されるように）。次いで、区画１０８に示されるように、ループ　カウンターが増加される。好適な実施態様では、ループが実行される回数は、弱／中／強の細胞コンディショニングについて５／１０／１５である。その後、区画１１０に示されるように、スライドの温度が低下される。ヒーター温度は４２℃に下げられる。あるいはまた、ヒーターは切られてもよく、そしてスライド温度は周囲温度まで戻る。その後、区画１１２に示されるように、スライドが洗浄される。
【００６３】
細胞コンディショニングに使用される試薬は、包埋生物サンプルを露出するためにの試薬と同じであってもよい。例えば、ＤＮＡ標的では、細胞コンディショニング溶液はＥＤＴＡの溶液でもよく；普通の温度設定は、９５℃で時間範囲２−９０分である。タンパク質標的では、細胞コンディショニング溶液はホウ酸バッファー溶液でもよく；普通の温度設定は、１００℃超で時間範囲２−９０分である。ＲＮＡ標的では、細胞コンディショニング溶液はＳＳＣ溶液でもよく；普通の温度設定は、７５℃で時間範囲２−９０分である。組織化学反応物、例えばＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎおよびＥｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色物では、細胞コンディショニング溶液は脱イオン水でもよく；普通の温度は、６０−８０℃で時間範囲２−９０分である。可能な試薬の部分リストは、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，Ｇｕ，ｅｄ．，Ｅａｔｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．（１９９７）　ａｔ　ｐｐ．１−４０において見られる。溶液は、一般に、既知のモル濃度、ｐＨおよび組成を有する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および／またはエチレングリコールが、好ましくは、コンディショニング溶液に添加される。その上、金属イオンもしくは他の物質がこれらの試薬に加えれてもよく、細胞コンディショニングの効率を増強できる。
【００６４】
本発明のその他の方法では、細胞コンディショニングは、前述のように露出される生物サンプルに続いて実施される。本発明のこの方法では、生物サンプルはガラス顕微鏡スライド上に置かれ、そして顕微鏡スライドは、自動染色機器（米国特許出願第０８／９９５，０５２号および同第６０／０７６，１９８号）内で１面において加熱される（例えば、熱プラットホーム上にスライドを置くことによって）。この方法（図６において示される１つの実施態様）では、ガラススライド上に置かれている包埋生物サンプルは、サンプルスライドが乾燥され、そして包埋材料が融解またはエッチングされ、流体の適用によって除去されるように、自動染色機器内の加熱エレメントによって最初に加熱される。生物サンプルの露出に続いて、生物サンプルの細胞コンディショニングを可能にし、続いて組織学的または細胞学的技術を用いて染色されるために、適当な試薬が適用される。
【００６５】
細胞コンディショニングに使用される試薬は包埋生物サンプルを露出するための試薬と同じであってもよい。例えば、ＤＮＡ標的では、細胞コンディショニング溶液はＳＳＣの溶液でもよく；普通の温度設定は、９５℃で時間範囲２−９０分である。タンパク質標的では、細胞コンディショニング溶液はリン酸バッファー溶液でもよく；普通の温度設定は、１００℃超で時間範囲２−９０分である。ＲＮＡ標的では、細胞コンディショニング溶液はＳＳＣ溶液でもよく；普通の温度設定は、７５℃で時間範囲２−９０分である。組織化学反応物、例えばＴｒｉｃｈｒｏｍｅ染色物では、細胞コンディショニング溶液はＢｏｕｉｎｓでもよく；普通の温度は、６０−８０℃で時間範囲２−３０分である。
【００６６】
本発明のなおその他の方法では、細胞コンディショニングは、生物サンプルが露出されることなしに実施される。本発明のこの方法では、生物サンプルはガラス顕微鏡スライド上に置かれ、そして顕微鏡スライドは、自動染色機器内の加熱エレメント上に置かれる。試薬が生物サンプル上に置かれ、そして加熱エレメントの温度は増大されてもされなくてもよい。生物サンプルの細胞コンディショニングは、組織学的または細胞学的技術を用いて染色される前に行われてもよい。
【００６７】
細胞コンディショニングに使用される試薬は包埋生物サンプルを露出するためにの試薬と同じであってもよい。例えば、ＤＮＡ標的では、細胞コンディショニング溶液はクエン酸ナトリウム溶液でもよく；普通の温度設定は、９５℃で時間範囲２−９０分である。タンパク質標的では、細胞コンディショニング溶液は尿素溶液でもよく；普通の温度設定は、１００℃超で時間範囲２−９０分である。細胞全体では、細胞コンディショニング溶液はメタノール溶液でもよく；普通の温度設定は、周囲温度で時間範囲４−１０分である。組織化学反応物、例えばＡｃｉｄ　Ｆａｓｔ　Ｂａｃｉｌｌｉ（ＡＦＢ）染色物では、細胞コンディショニング溶液はピーナツ油でもよく；普通の温度は、６０−７０℃で時間範囲３０−６０分である。
【００６８】
また本発明は、アルデヒドにより固定されていなくても、またマトリックス、例えばパラフィンに包埋されていなくても、細胞標本（Ｐｒｅｐｓ）、例えば微細針吸引（ＦＮＡ）塗抹、ｔｏｕｃｈ　ｐｒｅｐｓ、Ｆｉｃｏｌｌ、ｃｙｔｏｓｐｉｎｓＴＭ、ＴｈｉｎＲｒｅｐＴＭ、頸部−膣パップ（ｐａｐ）塗抹、血液もしくは体液フィルムなど、の細胞コンディショニングを含む。多くはアルコール、例えばメタノールもしくはエタノールにおいて固定され、他はヘアスプレーもしくは他のエアゾル固定液をスプレーされ、そしてまたその他は、中でもカーボワックスおよびＳａｃｃｏｍａｎｎｏ’ｓ（有機もしくは無機）試薬を含んでもよい細胞学的固定液中に入れられる。細胞は、遠心分離またはスライドに濾過されるか、またはガラススライドに直接接触され、そしてある場合には（ＰＡＰ）塗抹されるか、または直接スライドに適用される（ｔｏｕｃｈ　ｐｒｅｐｓ）。
【００６９】
用語「生物サンプル」は、限定されるものではないが、限定なしに臓器切片、腫瘍切片、体液、塗抹、凍結切片、血液、細胞学的標本、微生物、組織系列および細胞系を含む、標準のガラス顕微鏡スライドに載せることができる、細胞（分離されても組織においても）のすべての集合物を含む。
【００７０】
用語「染色物（ｓｔａｉｎ）」は、限定されるものではないが、生物サンプル中の標的分子に適用される場合、検鏡下で検出できる分子を指す、すべての生物学的もしくは化学的実体を含む。染色物は、限定なしに検出できる核酸プローブ、抗体、および組み合わされて、またはそれ自体で、発色された最終産物をもたらす（明るい視野または蛍光によって）他の試薬を含む。
【００７１】
露出または脱パラフィンする（すなわち、脱パラフィン化の工程）ための本明細書において使用される用語「試薬」、「バッファー」、「添加物」、「成分」および「溶液」は、次の成分を含み、これらのすべては、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌから得ることができる、別に指示されない限り：脱イオン水、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する脱イオン水、ｐＨ６．０付近の１０ｍＭリン酸塩、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するｐＨ６．０付近の１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．０付近の１０ｍＭクエン酸塩、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１０ｍＭクエン酸塩、２ｘＳＳＣ、ｐＨ８．２付近の１０ｍＭ塩化Ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン（すなわち、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）、約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するｐＨ８．２付近の１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ。本発明が属する当業者は、上記成分の濃度は、露出または脱パラフィンのために試薬、バッファー、添加物もしくは溶液の性質を変化させることなしに変えることができることを認識している。
【００７２】
細胞コンディショニングのための本明細書において使用される用語「試薬」、「バッファー」、「添加物」、「成分」、「溶液」および細胞コンディショナー（ｃｅｌｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）は、次の成分を含み、これらのすべては、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌから得ることができる、別に指示されない限り：ｐＨ６付近の５ｍＭクエン酸塩、約０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するｐＨ６付近の５ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．５％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．５％ＳＤＳを含有する５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ８付近の１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳを含有する１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳを含有する２０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳを含有する５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６付近の約０．５％ＳＤＳおよび約５％エチレングリコールを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．５％ＳＤＳおよび約１０％エチレングリコールを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳおよび約１％エチレングリコールを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳおよび約５％エチレングリコールを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８付近の約０．０７５％ＳＤＳおよび約１０％エチレングリコールを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９付近のリン酸塩／クエン酸塩／ＥＤＴＡ、ｐＨ６付近の約１０ｍＭ尿素を含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．２付近の約１ｍＭ尿素を含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７付近の約１．４ｍＭＭｇＣｌ２および約０．１％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．９９付近の約１．４ｍＭＭｇＣｌ２および約０．１％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８付近の１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８付近の約２０％ホルムアミドを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６付近の約５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および約２０％ホルムアミドを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７付近の５ｘＳＳＣおよび約２．５％クロンドロイチンＡを含有する１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ８．２付近の約１０ｍＭＥＤＴＡおよび約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および約２０％ホルムアミドを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６付近の約２０％グリセロールを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６付近の約０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１０ｍＭグリシンを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．８付近の約１ｍＭクエン酸塩および約０．２５％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、Ｎｏｒｐａｒ／鉱油（高温ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）、ＰＡＧ−１００油、ｐＨ約６〜約６．２の約２％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ約６〜約６．２の約１％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ約６〜約６．２の約０．５％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ約６〜約６．２の約０．２５％ＳＤＳを含有する１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ約７．５〜約８の約２％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ約７．５〜約８の約１％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ約７．５〜約８の約０．５％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ約７．５〜約８の約０．２５％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ約７．５〜約８の約０．１％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ約７．５〜約８の約０．０７５％ＳＤＳを含有する１ｍＭＥＤＴＡ、約ｐＨ８の約０．２５％ＳＤＳを含有する０．５ｍＭＥＤＴＡ、約ｐＨ９．６の約０．５％ＳＤＳを含有する１０ｍＭＥＤＴＡ。本発明が属する当業者は、上記成分の濃度は、細胞コンディショニングのために、試薬、バッファー、添加物もしくは溶液の性質を変化させることなしに変えることができることを認識している。
【００７３】
本発明の好適な実施態様は、ｐＨ８．５における１０ｍＭＴｒｉｓ塩基、７．５ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ（二ナトリウム塩）、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎＴＭ３００（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｔｅ，ＰＡ）を含有する塩基性製剤である。意図される他の実施態様は、Ｔｒｉｓ塩基濃度が約５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である、ホウ酸濃度が約５ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である、ＥＤＴＡ濃度が約０．５ｍＭ〜約２ｍＭの範囲である、またはｐＨが約ｐＨ７〜約ｐＨ９の範囲である、塩基性製剤を含む。意図される温度範囲は約９５℃〜約１００℃である。限定と考えられることを意図せず、Ｔｒｉｓ塩基もしくはＥＤＴＡの濃度が先に特定された範囲を越えて変化する場合に有意な違いが見られず、ホウ酸濃度が２０ｍＭもしくは４０ｍＭに対して１０ｍＭであった場合に有意に良好な結果が得られ、ホウ酸濃度が５ｍＭに対して１０ｍＭであった場合にやや良好な結果が得られ、コンディショニングがｐＨ約８〜約８．６において最適であることを注目すべきである。１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．５％Ｂｒｉｊ３５と１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．５％Ｂｒｉｊ３５とを比較すると、両試薬は、１００℃において最強のコンディショニングを示し、９５℃では有意に弱いコンディショニングを示した。
【００７４】
意図される他の実施態様は、限定されるものではないが、クエン酸塩バッファー（クエン酸ナトリウム３ナトリウム塩２水和物およびクエン酸１水和物水和物の組み合わせ物）、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸、１０ｍＭＴｒｉｓ＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．５ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋４０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋１０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋５ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋７．５ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋５％エチレングリコール、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋５％エチレングリコール、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．１％ＳＤＳ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋５％ＤＭＳＯ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋５％ＤＭＳＯ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋１０％ＤＭＳＯ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１０％ＤＭＳＯ、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋５％ホルムアミド、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋５％ホルムアミド、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋１０％ホルムアミド、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１０％ホルムアミド、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．５％Ｂｒｉｊ３５、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．５％Ｂｒｉｊ３５、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．１％Ｂｒｉｊ３５、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．１％Ｂｒｉｊ３５、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋１ｍＭＥＤＴＡ＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＴｒｉｓ＋２０ｍＭホウ酸＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む。
【００７５】
用語「１０ｘＳＳＣ」は、１リットル溶液を作成するために必要な脱イオン水、ＮａＣｌ　８７．６６ｇ、クエン酸３ナトリウム塩２水和物４４．１２ｇを含有し、適当量のＨＣｌまたはＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整された、塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムの１０モル濃度溶液を指す。ＰｒｏＣｌｉｎ３００　０．５ｍｌが保存剤として添加される。いずれかの濃度（Ｘモル）において調製されたすべてのリン酸バッファーでは、（１）Ｋ２ＨＰＯ４もしくはＮａＨＰＯ４を用いるＨＰＯ４−２、および（２）ＫＨ２ＰＯ４もしくはＮａＨ２ＰＯ４を用いるＨ２ＰＯ４−のＸモル溶液を調製する。
【００７６】
細胞コンディショナーのその他の好適な実施態様（細胞コンディショニング溶液２もしくはＣＣ２）は、約ｐＨ６における約１０ｍＭクエン酸バッファー、約５％エチレングリコール、約１ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウム（ＭｏｒｐｈｏｓａｖｅＴＭ，Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；米国特許第５，４３２，０５６号）および約０．３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する。クエン酸塩濃度は約５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲であってもよい。バッファーのｐＨは約４〜約８の範囲であってもよい。エチレングリコール濃度は約１％〜約１０％であってもよい。メタ重亜硫酸ナトリウム濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの範囲であってもよい。ＳＤＳ濃度は約０．１％〜約１％、好ましくは約０．２５％〜約０．５％の範囲であってもよい。
【００７７】
次の実施例は、具体的に説明する目的のためにのみ提示され、そしていかなる点においても本発明を限定することを意図しないし、またそのように考えるべきではない。当業者は、以下における変化が本発明の精神または範囲を越えることなく作成できることを認識できる。すべての特許、特許出願および他の公表物は、引用によって完全に本明細書に組み入れられている。
【００７８】
実施例
実施例１
Ｈ＆Ｅにより染色される生物サンプルを用いる自動「露出（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」および「細胞コンディショニング」
パラフィン中に包埋された、乳腺（ｂｒｅａｓｔ）、胃、脳、扁桃および腎を含む生物サンプルは、次の操作により露出された：上記生物サンプルを含有するスライドが、自動機器（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）上に設置され、そして下記露出プロトコールにかけられた。一般に、パラフィン包埋生物サンプルを含有するスライドが６５℃に６分間加熱乾燥され、次いで、次のいずれかによって洗浄された：各々０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する、１）１ｘクエン酸バッファー、２）脱イオン水、３）１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝６．３）または４）１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４）。
【００７９】
露出プロトコール１
１．　２分間インキュベートする
２．　スライドを洗浄する
３．　スライド容積を調整し、そしてＬＩＱＵＩＤ　ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭを適　　　用する
４．　６分間インキュベートする
５．　スライドを洗浄する
６．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
７．　温度を６５．０℃に上げる
８．　スライドを洗浄する
９．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１０．４分間インキュベートする
１１．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１２．４分間インキュベートする
１３．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１４．４分間インキュベートする
１５．スライドを洗浄する
１６．温度を４２．０℃に下げる
１７．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１８．４分間インキュベートする
１９．スライドを洗浄する
２０．温度を４２．０℃に下げる
２１．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２２．４分間インキュベートする
２３．スライドを洗浄する
自動露出後、生物サンプルは次の方法によってヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色された。スライドはヘマトキシリン１（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａｌｌｅｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）中に１．５分間入れられ、次いで流れる脱イオン水で１分間すすぎ。次いで、スライドを酸アルコール清澄器（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａｌｌｅｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に１分間置かれ、次いで流れる脱イオン水で１分間すすぎ洗いされた。次いで、スライドは希釈アンモニア−青味付け試薬（ｂｌｕｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａｌｌｅｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）中に１分間置かれ、そして流れる脱イオン水中で１分間洗浄された。次いで、スライドは９５％エタノール中ですすぎ、次いで２．５％エオシンＹ（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａｌｌｅｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）中に２．５分間置かれた。スライド上の生物サンプルは１００％エタノール浴に生物サンプルを１分間さらすことによって脱水された。この操作は３回繰り返され、続いてキシレン浴に生物サンプルを３分間２回さらされた。脱水段階後、生物サンプルはｃｏｖｅｒｓｌｉｐにより覆われた。
【００８０】
対照生物サンプルは伝統的な溶媒に基づく脱パラフィン技術によって脱パラフィンされた。顕微鏡上に置かれ、そしてパラフィン中に保存されたパラフィン包埋生物サンプルは、キシレン浴中に５分間完全に浸漬された。生物サンプルを含有するスライドは第２回のキシレン浴中に５分間置かれた。第２回のキシレン浴から取り除いた後、スライドは１００％エタノール浴中に３分間置かれた。次いで、スライドは第２回の１００％エタノール浴中に３分間置かれ、次いで、９０％エタノール溶液中に２分間置かれた。次いで、スライドは８０％エタノール中に１分間置かれ、続いて蒸留水中に１〜３分間完全に浸漬された。脱パラフィン後、生物サンプルは上記のようにヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された。
【００８１】
溶媒技術および自動加熱技術によって脱パラフィンされた生物サンプルが、ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色後に比較された。全スライドセットにおける形態は許容でき、そして本質的に同等であった。自動加熱法によって露出された扁桃および脳の生物サンプルは、標準の溶媒技術によって脱パラフィンされた生物サンプルよりも強いヘマトキシリン染色を示した。
【００８２】
実施例２
同時「細胞コンディショニング」による生物サンプルの自動「露出」
ホルマリン固定され、そしてパラフィン中に包埋された腎および扁桃の生物サンプルは、実施例１に述べたプロトコールにしたがって露出された。自動露出後、生物サンプルは、免疫組織学的染色のために使用される自動ＤＡＢパラフィンプロトコールにかけられた。ＤＡＢ染色についてのプロトコールは以下に記述される：
ＤＡＢプロトコール１
１．　２分間インキュベートする
２．　スライドをすすぎ洗いする
３．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
４．　スライドをすすぎ洗いする
５．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
６．　スライドをすすぎ洗いする
７．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
８．　インヒビター１滴を適用する
９．　４分間インキュベートする
１０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１１．１次抗体１滴を適用する
１２．３２分間インキュベートする
１３．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１４．ビオチン化Ｉｇ１滴を適用する
１５．８分間インキュベートする
１６．スライドをすすぎ洗いする
１７．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１８．アビジン−ＨＲＰＯ１滴を適用する
１９．８分間インキュベートする
２０．スライドをすすぎ洗いする
２１．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２２．ＤＡＢ１滴およびＤＡＢ　Ｈ２Ｏ２１滴を適用する
２３．８分間インキュベートする
２４．スライドをすすぎ洗いする
２５．スライド容積を調整し、そしてＬＩＱＵＩＤ　ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭを適用する
２６．銅１滴を適用する
２７．４分間インキュベートする
２８．スライドをすすぎ洗いする
腎の生物サンプルのために使用された１次抗体は、抗ＣＤ１５（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｎｏ．２５０−２５０４）であった。扁桃生物サンプルのために使用された１次抗体は、抗ＣＤ４５ＲＯ（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｎｏ．２５０−２５６３）であった。使用されたＤＡＢ染色キットは、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｎｏ．２５０−００１から得られた。
【００８３】
対照生物サンプルは、実施例１に記述されるように、伝統的な溶媒に基づく脱パラフィン技術によって脱パラフィンされた。脱パラフィン後、生物サンプルは、１ｘクエン酸バッファー１．５Ｌを含有する圧力容器（Ｍｏｄｅｌ＃６２１０４　Ｎｏｒｄｉｃ　Ｗａｒｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中にいれられた。次いで、圧力容器は密閉され、そしてマイクロウエーブオーブン（電子レンジ）（Ｍｏｄｅｌ＃ＭＱＳＯ８３６Ｅ，Ｍａｔｓｕｓｉｔａ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）内に置かれた。「高（ｈｉｇｈ）」にセットされた電子レンジにより、サンプルは約３０分間マイクロウエーブ加熱にかけられた。マイクロウエーブ処理後、次にサンプルは、蓋を確実に締められた圧力容器内で３０分間「キュア」された。キュア後、生物サンプルを１ｘクエン酸バッファー中に２分間浸けた。次いで、生物サンプルはクエン酸バッファーから取り除かれ、そしてスライドの端を吸い取り過剰のクエン酸バッファーを除いた。吸い取った後、スライドは自動機器に設置され、前記のように免疫組織学的に染色された。
【００８４】
溶媒技術および自動加熱技術によって脱パラフィンされ、そして同時に細胞コンディショニングされた生物サンプルが、免疫組織学的染色後に比較された。全スライドセットにおける形態および染色は許容でき、そして本質的に同等であった。
【００８５】
実施例３
２段階自動「露出」および「細胞コンディショニング」
パラフィン中に保存され、そしてホルムアルデヒドにより処理された扁桃および乳腺の生物サンプルが、次のプロトコールによって処理された。
【００８６】
露出および細胞コンディショニングプロトコール１
１．　２分間インキュベートする
２．　サーモホイル（ｔｈｅｒｍｏｆｏｉｌ）温度を６５．０℃に上げる
３．　６分間インキュベートする
４．　スライドをすすぎ、そしてＬＣＳＴＭを適用する
５．　６分間インキュベートする
６．　スライドをすすぎ、そしてＬＣＳＴＭを適用する
７．　サーモホイル温度を１００．０℃に上げる
８．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
９．　スライドをすすぎ洗いする
１０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１１．４分間インキュベートする
１２．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１３．４分間インキュベートする
１４．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１５．４分間インキュベートする
１６．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１７．４分間インキュベートする
１８．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１９．４分間インキュベートする
２０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２１．４分間インキュベートする
２２．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２３．４分間インキュベートする
２４．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２５．４分間インキュベートする
２６．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２７．４分間インキュベートする
２８．スライドを洗浄する
２９．温度を４２．０℃に下げる
３０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
３１．４分間インキュベートする
３２．スライドをすすぎ洗いする
３３．温度を２０．０℃に下げる
３４．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
３５．４分間インキュベートする
３６．スライドをすすぎ洗いする
プロトコールで使用されるバッファーは２０％ホルムアミドもしくは０．１％Ｔｒｉｔｏｎのいずれかを含有するＳＳＣバッファーであった。生物サンプルが上記プロトコールにかけられた後、実施例２の免疫組織学的染色に使用されたＤＡＢパラフィンプロトコールが適用された。扁桃生物サンプルは１次抗体として抗Ｋｉ６７により処理された。乳腺サンプルは１次抗体として抗エストロゲン受容体（６Ｆ１１）または抗プロゲステロン受容体（１Ａ６）により処理された。すべての１次抗体はＶｅｎｔａｎａをとおして得られた。
【００８７】
対照生物サンプルは、実施例１に記述されるように、伝統的な溶媒に基づく脱パラフィン技術によって脱パラフィンされた。脱パラフィン後、生物サンプルは、１ｘクエン酸バッファー１．５Ｌを含有する圧力容器（Ｍｏｄｅｌ＃６２１０４　Ｎｏｒｄｉｃ　Ｗａｒｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中にいれられた。次いで、圧力容器は密閉され、そしてマイクロウエーブオーブン（電子レンジ）（Ｍｏｄｅｌ＃ＭＱＳＯ８３６Ｅ，Ｍａｔｓｕｓｉｔａ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｐａｒｋ，ＩＬ）内に置かれた。「高（ｈｉｇｈ）」にセットされた電子レンジにより、サンプルは約３０分間マイクロウエーブ加熱にかけられた。マイクロウエーブ処理後、次にサンプルは、蓋を確実に締められた圧力容器内で３０分間「キュア」された。キュア後、生物サンプルを１ｘクエン酸バッファー中に２分間浸けた。次いで、生物サンプルはクエン酸バッファーから取り除かれ、そしてスライドの端を吸い取り過剰のクエン酸バッファーを除いた。吸い取った後、スライドは自動機器に設置され、前記のように免疫組織学的に染色された。
【００８８】
溶媒技術および自動加熱技術によって脱パラフィンされた生物サンプルが、免疫組織学的染色後に比較された。全セットのスライドにおける形態は許容でき、そして本質的に同等であった。全セットのスライドにおけるＫｉ６７による染色は同等であった。ＥＲ（６Ｆ１１）およびＰＲ（１Ａ６）染色は自動細胞コンディショニングとともにやや弱く、この方法は働くが、より以上の開発および最適化は必要であることを示している。
【００８９】
実施例４
インサイチューハイブリダイゼーションのためのパラフィン包埋されてない細胞系の自動細胞コンディショニング　　（Ｔｈｉｎ　ＰｒｅｐｓＴＭ）
Ｃｙｔｙｋ標本溶液（ｌｏｔ＃０１１３９Ｑ）中に保存されたＨｅｌａ（ＡＴＣＣｌｏｔ＃９８０４２７Ｈ）、Ｃａｓｋｉ（ＡＴＣＣｌｏｔ＃９８０４１６Ｃ）およびＳｉｈａ（ＡＴＣＣｌｏｔ＃９８０４１６Ｓ）細胞系が、Ｃｙｔｙｋ２０００機器を用いて顕微鏡スライド上に沈着された。沈着後、スライドは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒ）インサイチュー染色モジュール（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）において使用するまで水分を維持するためにアルコール中に置かれた。スライドがその機器に装填され、そして２０ＸＳＳＣ（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｐ／Ｎ　６５０−０１２）から作成された２ＸＳＳＣにより湿潤にされた。スライドは、近年Ｄｅｐａｒ３０と言われる細胞コンディショニングプロトコールをとおして処理されたが、ここではスライドは２ＸＳＳＣで洗浄され、そしてスライドの温度は９５℃に約３０分間上昇される。次いで、スライドは３７℃に冷却され、そしてインサイチュー染色が行われる前にＡＰＫ　Ｗａｓｈ（Ｒ）で洗浄される。
【００９０】
プロトコールＢｌｕｅ　Ｓｗａｐ　ＩＳＨを用いて、細胞系はＨＰＶ１６／１８（Ｅｎｚｏ　ＨＰＶ１６／１８　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｂｅ　ｃａｔ＃３２８７４）のために染色された。プローブ適用の前に、細胞系はＰｒｏｔｅａｓｅ２（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｐ／Ｎ２５０−２０１９）により酵素的に消化された。プローブ適用後、プローブおよび生物サンプルは同時に９５℃で８分間変性された。非特異的に結合したプローブは５５℃における２ＸＳＳＣのストリンジェンシー洗浄により洗い落とされた。次いで、プローブはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ａｌｋ　ＰｈｏｓおよびＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて検出された。
【００９１】
細胞系は、９５％エタノールへの１分間暴露および２回反復の１００％エタノールへの１分間暴露により染色後に脱水された。エタノール後、スライドは３分間２回キシレンにさらされた。
【００９２】
コンディショニング後の染色された細胞系は、許容できる形態、弱い染色を示し、そしてこれらのスライドでは強いバックグラウンドが存在し、方法についてのさらなる開発の必要性を示した。
【００９３】
Ｄｅｐａｒ３０プロトコール
１．　適用を省き、２分間インキュベートする
２．　スライドをすすぎ洗いする（２ＸＳＳＣバッファー）（スライドを６５℃に加温）
３．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
４．　適用を省き、６分間インキュベートする
５．　スライドをすすぎ洗いする（２ＸＳＳＣバッファー）（スライドを９５℃に加温）
６．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
７．　スライドをすすぎ洗いする
８．　スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
９．　適用を省き、４分間インキュベートする
１０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１１．適用を省き、４分間インキュベートする
１２．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１３．適用を省き、４分間インキュベートする
１４．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１５．適用を省き、４分間インキュベートする
１６．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１７．適用を省き、４分間インキュベートする
１８．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
１９．適用を省き、４分間インキュベートする
２０．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２１．適用を省き、４分間インキュベートする
２２．スライドをすすぎ洗いする（２ＸＳＳＣバッファー）（スライドを３７℃に加温）
２３．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
２４．適用を省き、４分間インキュベートする
２５．スライドをすすぎ洗いする（ＡＰＫ　Ｗａｓｈ）
２６．スライド容積を調整し、そしてＬＣＳＴＭを適用する
実施例５
単一コピーＤＮＡ検出のための自動「露出」および「細胞コンディショニング」
ホルマリン固定され、パラフィン包埋された細胞系Ｃａｓｋｉ（Ｒ９６−１０５０Ａ）およびＳｉｈａ（Ｒ９６−９６−Ｃ２）（共に、Ｄｒ．Ｒａｙｍｏｎｄ　Ｔｕｂｂｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｄｅｐｔ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｏｈｉｏから恵与された）が、Ｖｅｎｔａｎａ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｌｉｄｅ上で染色された。スライドは機器において装填乾燥され、そしてスライド温度が６５℃に上げられた。Ｄｅｐａｒ３０プロトコールが試行されたが、この場合、スライドは６５℃において２ＸＳＳＣバッファーで洗浄され、次いで加熱が約４０分間９５℃に上げられた。次いで、スライドを３７℃に冷却し、そしてＡＰＫ　Ｗａｓｈにより洗浄した。この時点で、次のインサイチュープロトコールが試行された：
インサイチュープロトコール：Ｔｕｂｂｓ１
（Ｖｅｎｔａｎａ　ＡＰＫ　Ｗａｓｈがすべてのすすぎ洗い段階のために使用された）プロテアーゼ消化：　Ｐｒｏｔｅａｓｅ２、４分、３７℃
インヒビター段階：　ＤＡＢキット３２からのＶｅｎｔａｎａインヒビター、
３２分、３７℃
プローブ：　　　　　Ｅｎｚｏ　ＨＰＶ　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｂｅ　１６／１８
対照プローブ：　　　Ｅｎｚｏ　ＨＰＶ　Ｂｉｏ　Ｐｒｏｂｅ　６／１１
変性：　　　　　　　９５℃、８分
ハイブリダイゼーション：３７℃、６４分
２回のストリンジェンシー洗浄：２ＸＳＳＣ、６０℃、各８分
第３のストリンジェンシー洗浄：２ＸＳＳＣ、３７℃、４分
プローブ検出：　　　ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＨＲＰＯ
（Ｄａｋｏ　ＧｅｎＰｏｉｎｔ　Ｃａｔ．＃Ｋ０６２０）
増幅：　　　　　　　Ｂｉｏｔｙｎｉｌ　Ｔｙｒａｍｉｄｅ
（Ｄａｋｏ　ＧｅｎＰｏｉｎｔ　Ｃａｔ．＃Ｋ０６２０）
検出：　　　　　　　ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＨＲＰＯ
（Ｄａｋｏ　ＧｅｎＰｏｉｎｔ　Ｃａｔ．＃Ｋ０６２０）
またはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ａｌｋ　Ｐｈｏｓ
（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃａｔ．＃ＳＡ５１００）
色素源：　　　　　　ＤＡＢ
（Ｄａｋｏ　ＧｅｎＰｏｉｎｔ　Ｃａｔ．＃Ｋ０６２０）
またはＶｅｎｔａｎａ　ＮＢＴ／ＢＣＩＰ
（Ｋｉｔ　Ｐ／ｎ２５０−０６０）
またはＶｅｎｔａｎａ　Ｎａｐｈｔｈｏｌ／Ｆａｓｔ　Ｒｅｄ
（Ｋｉｔ　Ｐ／ｎ２５０−０３０）
実施例６
パラフィン包埋されてないサンプルのための自動「細胞コンディショニング」
実施例２で記述されたＤＡＢ染色のためのプロトコールがこの実施例で使用された。
【００９４】
これらの抗体のための細胞コンディショニング段階は、Ｃｙｔｙｋ２０００（Ｒ）機器を使用した後実施されて細胞系のＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（Ｒ）を作成した。ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（Ｒ）は、ＶｅｎｔａｎａＥＳ機器、ＮｅｘＥＳ機器およびマニュアル操作（Ｃｙｔｙｋ、Ｉｎｃ．）においてＥＲ，ＰｇＲ，Ｋｉ６７，Ｐ５３に対する抗体を使用して染色された。２並列群のスライドがＮｅｘＥＳイン・サイチューモジュールにおいて染色されて、細胞コンディショニング段階の自動遂行を可能にした。
【００９５】
前記実施例はＣｙｔｙｋ（Ｒ）機器およびＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（Ｒ）の染色に特異的であるけれども、経験的に細胞標本の作成様式には限定されない。
【００９６】
実施例７
凍結生物サンプルの「細胞コンディショニング」
凍結した扁桃ブロックは、各ブロックから６切片を切り取り、そして顕微鏡スライド上にサンプルを置くことによって調製された。各ブロックからの４スライドが、ＤｓｃｏｖｅｒｙＴＭイン・サイチューモジュール上に置かれ、そしてプロトコールＤｅｐａｒ１０を遂行した。
【００９７】
スライドは６５℃に６分間加熱乾燥され、次いで０．１ＭＥＤＴＡバッファーｐＨ８ですすぎ洗いされた。洗浄後、スライドは６５℃で２０分間インキュベートされた。次いで、スライドを３７℃に冷却し、そしてＡＰＫ　Ｗａｓｈで洗浄した。各ブロックからの２スライドが対照として未処理で残された。Ｄｅｐａｒ１０処理の後、各ブロックからの２枚の処理スライドおよび１枚の未処理スライドが実施例１に記述したようにＨ＆Ｅについて染色された。各ブロックからの２枚の処理スライドおよび各ブロックからの１枚の未処理スライドがＬＣＡについて染色された。試行結果：Ｈ＆Ｅおよび抗体両染色では、処理および未処理スライド間に染色の差異はなかった。
【００９８】
実施例８
免疫組織化学のための自動「露出」および「細胞コンディショニング」
種々の抗体が、次のプロトコールおよびフローチャートにしたがって環境を自動化されたＮｅｘＥＳ　Ｐｌｕｓ（Ｒ）（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）においてアッセイされた：
プロトコール：
（１）＊＊＊＊＊ＥＺ　Ｐｒｅｐを選択する＊＊＊＊＊
（２）＊＊＊＊＊時間合わせ段階を開始する＊＊＊＊＊
（３）脱パラフィンが選択される場合、
（４）　　スライドを７５℃に加温し、そして４分間インキュベートする
（５）　　容積を調整する
（６）　　ＬＣＳＴＭを適用する
（７）　　８分間インキュベートする
（８）　　スライドをすすぎ洗いする
（９）　　容積を調整する
（１０）　ＬＣＳＴＭを適用する
（１１）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（１２）細胞コンディショニングが選択される場合、
（１３）コンディショナー＃１が選択される場合
（１４）　スライドをすすぎ洗いする
（１５）　スライド容積を調整する
（１６）　ＬＣＳＴＭを適用する
（１７）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（１８）　細胞コンディショニングＣｏｖｅｒｓｌｉｐを適用する
（１９）　スライドを１００℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（２０）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（２１）　ＬＣＳＴＭを適用する
（２２）標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）が選択される場合
（２３）　６分間インキュベートする
（２４）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（２５）　ＬＣＳＴＭを適用する
（２６）　（２１）−（２３）を９回反復する
（２７）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（２８）弱（ｍｉｌｄ）が選択される場合
（２９）　６分間インキュベートする
（３０）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（３１）　ＬＣＳＴＭを適用する
（３２）　（２７）−（２９）を４回反復する
（３３）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（３４）強（ｅｘｔｅｄｅｄ）が選択される場合
（３５）　６分間インキュベートする
（３６）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（３７）　ＬＣＳＴＭを適用する
（３８）　（３３）−（３５）を１４回反復する
（３９）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（４０）コンディショナー＃１が選択されない場合、
（４１）コンディショナー＃２が選択される場合
（４２）　スライドをすすぎ洗いする
（４３）　スライド容積を調整する
（４４）　ＬＣＳＴＭを適用する
（４５）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（４６）　細胞コンディショニングＣｏｖｅｒｓｌｉｐを適用する
（４７）　スライドを１００℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（４８）　細胞コンディショナー＃２を適用する
（４９）　ＬＣＳＴＭを適用する
（５０）標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）が選択される場合
（５１）　６分間インキュベートする
（５２）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（５３）　ＬＣＳＴＭを適用する
（５４）　（４９）−（５１）を９回反復する
（５５）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（５６）弱（ｍｉｌｄ）が選択される場合
（５７）　６分間インキュベートする
（５８）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（５９）　ＬＣＳＴＭを適用する
（６０）　（５５）−（５７）を４回反復する
（６１）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（６２）強（ｅｘｔｅｄｅｄ）が選択される場合
（６３）　６分間インキュベートする
（６４）　細胞コンディショナー＃１を適用する
（６５）　ＬＣＳＴＭを適用する
（６６）　（６１）−（６３）を１４回反復する
（６７）　スライドを４２℃に加温し、そして２分間インキュベートする
（６８）　スライドをすすぎ洗いする
（６９）　スライド容積を調整する
（７０）　ＬＣＳＴＭを適用する
（７１）　スライドヒーターを止める
（７２）＊＊＊＊＊反応バッファーを選択する＊＊＊＊＊
表１は、本明細書で記述されている自動脱パラフィンおよび細胞コンディショニングプロトコールを使用してＮｅｘＥＳ　Ｐｌｕｓ（またＢＥＮＣＨＭＡＲＫＴＭＩＨＣとして知られる）において実施された自動免疫組織化学アッセイの結果を総括している。自動免疫組織化学アッセイからのスライドが、ＮｅｘＥＳ機器において手動の脱パラフィン／細胞コンディショニングプロトコールを用いて調製されたスライドと比較された。特異抗体スライドは３並列で調製された。ネガティブ対照スライドは単独で調製された。両アッセイからのスライドは当該技術分野における熟達者によって解析され、そして特異的な染色強度と非特異的バックグラウンドの染色強度について評点を指定された。ＮｅｘＥＳ　Ｐｌｕｓの完全に自動化されたアッセイからのスライドのすべての評点は、特異的な染色強度と非特異的バックグラウンドの染色強度の両方において手動で脱パラフィンされ、そして細胞コンディショニングされたＮｅｘＥＳスライドについての評点を越えていた。スライドは解析され、そして２人の独立した熟達者の最小値で評価され、そして平均染色強度が決定された。表１における「適格組織（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ　ｔｉｓｓｕｅ）」と明示された欄は、そこで使用された抗体を標準化するために使用された標準対照組織を表す。標準化された抗体は評点４．０を与えられる。「平均染色強度」と明示された欄において見られるように、ほとんどの自動脱パラフィン／細胞コンディショニングされたスライドはそれらの結果に一致するかまたはそれを越えていた。
【００９９】
【表１】
2004514886.tif 000002
【０１００】
【表２】
2004514886.tif 000003
【０１０１】
【表３】
2004514886.tif 000004
【０１０２】
表１（前記）において言及される１次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺから取得）が、アルファベット順に以下に記述される：
抗ｂｃｌ−２：
クローンｂｃｌ−２／１００／Ｄ５は、アポトーシスのインヒビターであるｂｃｌ−２を検出するために使用されるモノクローナル抗体である。この抗体は、反応性と新形成の小胞増殖とを区別する助けとなり得る。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２６９３）
抗Ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）：
クローンＣＢ１１は、細胞膜および場合によってはある種の新形成細胞の細胞質に局在しているｃ−ｅｒｂ−Ｂ２に対するモノクローナル抗体である。（ＶＭＳＩ＃７６０−２９９４）
抗ＣＤ１５：
クローンＭＭＡは、顆粒球系統および／またＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｍｂｅｒｇ分化の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。対照：Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０４）
抗ＣＤ２０：
クローンＬ２６は、Ｂリンパ球系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５３１／７６０−２１３７）
抗ＣＤ４３：
クローンＬ６０は、正常な顆粒球およびＴリンパ球の原形質膜に局在する抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１１）
抗ＣＤ４５ＲＡ：
クローンＸ１４８は、正常なＢリンパ球およびＴリンパ球のサブセットの原形質膜に局在する抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１０）
抗ＣＤ４５ＲＯ：
クローンＡ６は、Ｔ系統およびＢ細胞のサブセットの細胞の原形質膜に結合するモノクローナル抗体である。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５６３）
抗ＣＥＡ：
クローンＴＦ−３Ｈ８−１は、粘膜上皮細胞の原形質膜および細胞質領域に局在する抗原に特異的に結合する。対照：結腸がん腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０４／７６０−２１４１）
抗クロモグラニン：
クローンＬＫ２Ｈ１０は、正常および新形成の神経内分泌細胞の分泌顆粒に局在するクロモグラニンタンパク質に結合するモノクローナル抗体である。対照：膵臓。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１９／７６０−２１４０）
抗デスミン：
クローンＤＥ−Ｒ−１１は、ミオサイト系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。デスミンは、成熟平滑、横紋および心筋において見いだされる中間フィラメントである。対照：輸精管。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１３）
抗ＥＧＦＲ：
クローン３１Ｇ７は、種々の細胞に存在する膜貫通糖タンパク質に対向される。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５４８）
抗ＥＭＡ：
クローンＭｃ５は、上皮系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。ＥＭＡは、散在性組織球リンパ腫由来の大細胞植皮がん腫および良好および不十分に分化したリンパ球リンパ腫由来の小細胞植皮がん腫の両方を区別するのに価値がある。対照：がん腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０８）
抗ＥＲ：
クローン６Ｆ１１は、エストロゲン受容体の存在を検出するために使用されるモノクローナル抗体である。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５９６／７６０−２１３２）　また、クローンＣＣ４−５は、エストロゲン受容体の存在を検出するために使用されるモノクローナル抗体である。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５４６／７６０−２１３８）
抗ＧＦＡＰ：
ＧＦＡＰポリクローナル抗体は、ほとんどのヒト星細胞および上衣細胞の細胞質に存在するグリア線維性酸性タンパク質に対向される。この試薬は、グリア系統の細胞の同定を助けるために使用されてもよい。対照：脳（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１６）
抗カッパ：
κ軽鎖はＢ細胞系統の細胞によって発現される。リンパ様細胞による軽鎖生産は、個々の細胞によって生産される免疫グロブリン分子が、単一の軽鎖クラスのみを含有するように遺伝的に制限される。このクローン制限は、Ｂ細胞および血漿細胞集団のポリクローナルまたはモノクローナル性を指示するために使用することができる。対照：形質細胞腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１４）
抗ケラチン：
クローン５Ｄ３は、ヒト表皮ケラチンに対して生成されるモノクローナル抗体である。この抗体は、上皮系統の細胞の同定を助けるために使用される。この抗体はサイトケラチン８および１８と反応する。対照：がん腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０１）
クローンＡＥ１は、ヒト表皮ケラチンに対して生成されるモノクローナル抗体である。この抗体は、管路の上皮系統の細胞の同定を助けるために使用される。ＡＥ１はサイトケラチン１０，１３，１４，１５および１９と反応する。対照：肝臓。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５２１）
抗パンケラチン：
パンケラチンは、上皮系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体クローンのカクテルＡＥ１／ＡＥ３／ＰＣＫ２６である。この抗体カクテルは、９，１１および１２を除く全サイトケラチンと反応する。対照：皮膚。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５９５／７６０−２１３５）
抗Ｋｉ６７：
クローンＭＭ１は、活性な細胞周期をとおして存在する（Ｇ１，Ｓ，Ｇ２およびＭ期）が、休止期（Ｇ０期）細胞には不在である細胞増殖に関連する核抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である。この試薬は増殖細胞の同定を助けるために使用できる。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５２０）
抗ラムダ：
λ軽鎖はＢ細胞系統の細胞によって発現される。リンパ様細胞による軽鎖生産は、個々の細胞によって生産される免疫グロブリン分子が、単一の軽鎖クラスのみを含有するように遺伝的に制限されている。このクローン制限は、Ｂ細胞および血漿細胞集団のポリクローナルまたはモノクローナル性を指示を助けることができる。対照：形質細胞腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１５）
抗ＬＣＡ：
クローンＲＰ２／１８は、リンパ球系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。この抗体は、単球／組織球および多形核白血球への可変反応性を有するリンパ球の原形質膜および細胞質縁に顕著に局在している抗原に特異的に結合する。対照：リンパ腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０５／７６０−２１３６）
抗メラノソーム：
クローンＨＭＢ４５モノクローナル抗体は、メラノサイト系統の細胞の同定を助けるために使用される。それは異常メラノサイトおよび黒色腫細胞において発現される抗原と反応する。対照：黒色腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１８／７６０−２１３９）
抗筋アクチン：
クローンＨＵＣ１−１は、ミオサイト系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。筋アクチンは横紋、平滑および心筋系統の細胞において発現される。対照：回腸。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０２）
抗ＮＳＥ：
クローンＢＢＳ／ＮＣ／ＶＩ−Ｈ１４は、ニューロン、神経内分泌細胞、内分泌腫瘍、がん様腫およびＭｅｒｋｅｌ細胞腫瘍の細胞質において発現される抗原と反応するモノクローナル抗体である。対照：膵臓。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１７）
抗ｐ５３：
クローンＢｐ−５３−１１は、ｐ５３タンパク質に対するモノクローナル抗体である。この試薬は、新形成細胞集団における異常増殖細胞の同定を助けるために使用される。対照：がん腫。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５４０）
抗ＰＣＮＡ：
クローンＰＣ１０は、種々の細胞集団における増殖細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。ＰＣＮＡ抗原は、Ｇ１，Ｓ，Ｇ２およびＭ期におけるすべての増殖細胞において発現される。対照：扁桃。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０３）
抗ＰＳＡ：
ＰＳＡポリクローナル抗体は、前立腺上皮細胞の細胞質において発現される分泌タンパク質と反応する。対照：前立腺。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０６）
抗ＰＳＡＰ：
クローンＰＡＳＥ／４ＬＪは、前立腺系統の細胞の同定を助けるために使用されるモノクローナル抗体である。ＰＳＡＰは、正常な前立腺上皮細胞の細胞質領域に局在する抗原に特異的に結合する。対照：前立腺。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５０９）
抗ＰＲ：
クローン１Ａ６は、ヒト組織におけるプロゲステロン受容体の同定を助けるために使用される。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５４７／７６０−２１３３）
抗Ｓ１００：
Ｓ１００ポリクローナル抗体は、正常および異常神経内分泌系統の細胞の同定を助けるために使用される。対照：皮膚。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５２３／７６０−２１３３）
抗ビメンチン：
クローン３Ｂ４は、間葉織起源の細胞の同定を助けるために使用される。対照：輸精管。（ＶＭＳＩ＃７６０−２５１２／７６０−２１３４）
ネガティブ対照：
ポリクローナル血清が、ポリクローナル抗体に対する特性調節操作の一部としてネガティブ組織対照に適用される。（ＶＭＳＩ＃７６０−１０２３）
ネガティブ対照Ｉｇ：
クローンＭＯＰＣ−２１は、モノクローナル抗体に対する特性調節操作の一部としてネガティブ組織対照に適用される。（ＶＭＳＩ＃７６０−２０１４）
実施例９
免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）もしくはイン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のための「露出」の有無によらない自動「細胞コンディショニング」
ＣＣ２溶液は、免疫組織化学、免疫細胞化学もしくはイン・サイチューハイブリダイゼーション装置（例えば、ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭＩＳＨ、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ：ＢｅｎｃｈＭａｒｋＴＭＩＨＣ、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；など）において、ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子またはそれから発現されるタンパク質を検出するために設計された試薬（例えば、ＩＮＦＯＲＭ（Ｒ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕＤＮＡ試験、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；ＰＡＴＵＷＡＹＴＭＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＣＢ１１）タンパク質試験、Ｖｅｎｔａｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；など）とともに使用することができる。
【０１０３】
ＩＳＨアッセイでは、ＣＣ２溶液は、好ましくは、ＤＮＡプローブの適用前に約９０℃で約１０分間組織に適用されるＣＣ２溶液を用いる脱パラフィン後の自動前処理段階において使用できる。ＣＣ２溶液と組み合わせた加熱処理は、ゲノムＤＮＡを、ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕＤＮＡプローブとの結合のために好適にさせる。
【０１０４】
ＩＨＣアッセイでは、ＣＣ２溶液は、好ましくは、約９５℃で約３０分間組織に適用されるＣＣ２溶液を用いる脱パラフィン後の自動細胞コンディショニング段階において使用できる。ＣＣ２溶液と組み合わせた高温は、ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質（抗原もしくはエピトープ）を、抗ｃ−ｅｒｂ２／ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体との結合のために好適にさせる。
【０１０５】
これらは、ＣＣ２溶液が好適に使用される代表的背景である。また、ＣＣ２溶液は、問題の標的ＤＮＡもしくはタンパク質分子の存在もしくは不在を検出するために設計された多くの他のアッセイ、技術、プロトコールもしくは操作において有用である。
【０１０６】
実施例１０
加熱流体を用いてサンプルを接触させることによる脱パラフィン
ここに開示されるその他の実施態様を用いて、標準Ｈ＆Ｅ染色がウシ肝切片において実施された（図８）。サンプルスライドは、熱ＥＺＰｒｅｐＴＭ（Ｖｅｎｔａｎａ）が予定時間適用（１つの実施態様では少なくとも５分）できるように改変された２０−スライドトレイ上に支持された。
【０１０７】
小再循環ポンプ（Ｆｌｏｊｅｔ　Ｍｏｄｅｌ　Ｎｏ．４３００−０４２，Ｆｏｏｔｈｉｌｌｓ　Ｒａｎｃｈ，ＣＡ）が、高容量（１２００ｍｌ／ｍｉｎ）の加熱流体（１つの実施態様では、６５−７０℃ＥＺＰｒｅｐ）をスライド上に５分間分配するために使用された。標準浸液ポンプがバッファーの温度を上昇させ、そして維持するために使用された。
【０１０８】
脱パラフィンされたスライドは標準Ｈ＆Ｅプロトコールを用いて染色された。また、伝統的な溶媒法またはＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＭ機器（Ｖｅｎｔａｎａ）における自動法のいずれかを用いて脱パラフィンされた対照が試行された。全３方法の比較後、再循環される熱ＥＺＰｒｅｐを受けたスライドが最良の結果を生じたことが結論された。
【０１０９】
図８に見られるように、組織の染色後パラフィンの形跡は見いだせず、そして組織の形態の変化は見られなかった。いくつかのさらなるスライドが同じ方法を用いて処理され類似の結果を得た。流速が結果にいかなる影響をもたらすかを決定する実験が実施された。予備データは、流体の流速が４００ｍｌ／ｍｉｎ以下に低下された場合に、染色が良好ではないことを示唆した。
【０１１０】
これまでの詳細な記述から、多数の変化および改変が、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく本発明の態様に対してなされることを評価できる。本発明のこの真の精神および範囲は、前記明細書に照らして解釈されよう付随する請求項によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
開かれたスライドフードおよび外された回転盤（ｃａｒｏｕｓｅｌ）ドアとともに示された本発明の遠近法概念図である。
【図２】
コンピューターおよびそれが管理する他の機器と組み合わせて示された本発明の遠近法概念図である。
【図３】
本発明の分解組立図である。
【図４】
試薬ディスペンサーとともに示された本発明の遠近法概念図である。
【図５】
本発明の加熱システムの構成図である。
【図６】
スライドから包埋媒質を除去するための１つの態様についてのフローチャートである。
【図７ａ−７ｂ】
細胞のコンディショニングのための１つの態様についてのフローチャートである。
【図８】
本発明の１つの実施態様にしたがって脱パラフィンされたウシ肝臓切片において実施された標準Ｈ＆Ｅ染色物の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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