(57)【要約】本発明は、少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている粘液産生生物から分離された微生物から誘導された生物学的に活性な化合物又は化合物の組合せを含む抽出物を開示する。サラマンダー及びカエルの皮膚から分離された桿菌は、抗ウィルス、抗腫瘍、抗菌及び抗真菌特性を有する化合物を産生することを見出した。これらの化合物は、カンジダ属、小胞子菌属、ブドウ球菌属、緑膿菌属、大腸菌属、及び腸球菌属を含むヒト日和見病原体、並びにＨＩＶ株及び腫瘍細胞系に対する阻害効果を有する。
2004521935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている生物の皮膚から分離した細菌からの抽出物であって、細菌、真菌、ウィルス、又は腫瘍の成長を阻害する抽出物。
【請求項２】
生物が両生類である、請求項１に定義の抽出物。
【請求項３】
生物がサラマンダー類からなる群から選ばれる、請求項１に定義の抽出物。
【請求項４】
生物がカエル類からなる群から選ばれる、請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
抽出物がヒト病原菌又はヒト病原真菌の成長を阻害する、請求項１に記載の抽出物。
【請求項６】
抽出物がヒトＨＩＶの成長を阻害する、請求項１に記載の抽出物。
【請求項７】
ヒト病原菌が、腸球菌属、ブドウ球菌属、大腸菌属、及び緑膿菌属からなる群から選ばれる、請求項６に記載の抽出物。
【請求項８】
抽出物が約５ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍの範囲で効果を示す、請求項１に記載の抽出物。
【請求項９】
請求項１に記載の抽出物の治療量をヒトに投与すること。
【請求項１０】
ＤＱ００１Ｄ、ＰＯ０１４、ＰＯ０１９、ＰＯ０２６、ＰＯ０２７、ＡＣ０２１、ＡＣ０２４、ＰＣ０１７、ＰＤ０２６、ＥＧ００６、ＥＣ００９、ＥＣ０２４、及びＲＣ００３からなる群から選ばれる細菌分離株。
【請求項１１】
生物学的に活性な細菌代謝産物を確認する方法であって、請求項１０に記載の細菌分離株を１種類以上の病原微生物を含むアッセイ系で培養し、細菌分離株によって産生された代謝産物の、病原微生物の成長に及ぼす影響を対照と比較して評価することを含む方法。
【請求項１２】
生物学的に活性な抽出物、画分、又は化合物を確認する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の細菌分離株を培養し；
（ｂ）該培養株から代謝産物を抽出し；
（ｃ）場合により、抽出した代謝産物を分画し；そして
（ｄ）適切なアッセイ系で、抽出した又は分画した代謝産物の、病原微生物、腫瘍細胞、又はウィルスの成長を阻害する能力を評価する
ことを含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法に従って確認された生物学的に活性な抽出物、画分、又は化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の一つ以上の生物学的に活性な抽出物、画分、又は化合物と、製薬上許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
組成物が患者への局所、腸内、非経口、又は静脈内投与に適している、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
患者における病原微生物の成長阻害法であって、請求項１４に記載の医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
患者における腫瘍細胞の成長阻害法であって、請求項１４に記載の医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項１８】
患者におけるウィルスの成長阻害法であって、請求項１４に記載の医薬組成物の有効量を該患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
先願
本願は、仮出願第６０／２６０，０２２号、出願日２００１年１月５日に基づく優先権を主張する。
【０００２】
背景技術
すべての両生類は、程度の差こそあれ、皮膚呼吸をしている。従って、両生類の外皮は、外部環境に対するガス透過性バリヤとしての役割を果たさねばならない［Ｌｉｌｌｃｙｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｂ．，及びＰ．Ｆ．Ａ．Ｍａｄｅｒｓｏｎ。１９８８年。外皮の構造と透過性(The structure and permeability of the integument)。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｚｏｏｌｏｇｉｓｔ  ２８：９４５−９６２］。皮膚が呼吸器として利用されるには水分が不可欠である［Ｆｏｘ，Ｈ．１９９４年。外皮の構造(Structure of the integument)。“Ａｍｐｈｉｂｉａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ”の第１章、Ｈ．Ｈｅａｔｗｏｌｅ及びＧ．Ｔ．Ｂａｒｔｈａｌｍｕｓ編、Ｓｕｒｒｅｙ  Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，チッピング・ノートン］。この必要な水分は、外皮に付随する粘液産生腺による粘液の産生によって達成される（Ｄｕｅｌｌｍａｎ，Ｗ．Ｅ．，及びＬ．Ｔｒｕｅｂ。１９８６年。Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｍｐｈｉｂｉａｎｓ。ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，米国ニューヨーク州ニューヨーク；Ｆｏｘ  １９９４年）。両生類の粘液の主成分はムコ多糖（糖タンパク質）である（Ｄｕｅｌｌｍａｎ及びＴｒｕｅｂ  １９８６年）。糖タンパク質は、ポリペプチド骨格に共有結合している一つ以上の炭水化物鎖を含有する［Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，Ｍ．，及びＩ．Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ。１９８９年。分枝Ｏ−グリカンの生合成(The biosynthesis of branched O-glycans)。粘液及び関連トピックスに収載。Ｅ．Ｃｈａｎｔｌｅｒ及びＮ．Ａ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ（編）、Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｎｏ．XLIII、ケンブリッジ大学、ケンブリッジ］。粘液は、微生物の成長及び全部ではないがほとんどの細胞化合物の合成を支える必須元素の炭素に富んでいる［Ｇｕｉｒａｒｄ，Ｂ．Ｍ．，及びＥ．Ｅ．Ｓｎｅｌｌ。１９６２年。微生物の栄養必要量(Nutritional requirements of microorganisms)。Ｐｐ．３３−９３。Ｉ．Ｃ．Ｇｕｎｓａｌｉｓ及びＲ．Ｙ．Ｓｔａｎｃｉｒ（編）、Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａに収載。Ａ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ。Ｖｏｌ．ＩＶ：Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク］。従って、両生類が皮膚呼吸を達成するために必然的に産生している粘液層は、微生物にとって栄養豊富な生息環境となる［Ａｕｓｔｉｎ，Ｊｒ．，Ｒ．Ｍ．２０００年。プレトドン・ベントラリスにおける皮膚の微生物フローラと抗生作用：プレトドン科における子育てに関する推論(Cutaneous microbial flora and antibiosis in Plethodon ventralis: inferences for parental care in the Plethodontidae)。Ｐｐ．４５１−４６１。Ｒ．Ｃ．Ｂｒｕｃｅ，Ｒ．Ｇ．Ｊａｅｇｅｒ及びＬ．Ｄ．Ｈｏｕｃｋ（編）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌｅｔｈｏｄｏｎｔｉｄ  Ｓａｌａｍａｎｄｅｒｓに収載、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．，米国ニューヨーク州ニューヨーク］。
【０００３】
ほとんどの生態系において大多数の微生物は表面に付着するので［Ｗｉｍｐｅｎｎｙ，Ｊ．Ｗ．Ｔ．，Ｓ．Ｌ．Ｋｉｎｎｉｍｅｎｔ，及びＭ．Ａ．Ｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄ。１９９３年。バイオフィルムの生理学と生化学(The physiology and biochemistry of biofilms)。Ｐｐ．２７４−３１８。Ｓ．Ｄｅｎｙｅｒ，Ｐ．Ｇｏｒｍａｎ，及びＭ．Ｓｕｓｓｍａｎ（編）、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ；Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌに収載。Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、英国ロンドン］、動物の外皮は微生物共同体の発達に適した生息環境として働くことが多い（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．１９７１年。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク）。これらのミクロ共同体は、より大きい生物の共同体（マクロ共同体）が示すのと同じ種類の共同体レベルの相互作用を示すことが多い。ミクロ共同体のメンバーは限られた資源を巡って競合し、親密関係、時に偏害作用関係を築く［Ａｔｌａｓ，Ｒ．Ｍ．，及びＲ．Ｂａｒｔｈａ。１９９３年。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第３版。Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク；Ｂｕｌｌ，Ａ．Ｔ．，及びＪ．Ｈ．Ｓｌａｔｅｒ。１９８２年。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ。Ｖｏｌ．１。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，及びＧ．Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ。１９８１年。微生物の競合(Microbial competition)。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３：９７２−９７９］。このような偏害作用戦略の一つは、抗生物質の産生である。
【０００４】
抗生物質は、微生物が産生する、他の微生物を殺滅したり成長を阻害することが可能な物質である［Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．１９８２年。抗生物質は土壌中に産生されるか(Are antibiotics produced in soil  )。Ｐｅｄｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３：８５−８７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．，及びＪ．Ｃ．Ｖｉｃｋｅｒｓ。１９８６年。抗生物質産生の生態学(The ecology of antibiotic production)。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  １２：４３−５２；Ｂｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．１９９４年。Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ。第７版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ、ニュージャージー州］。このような物質の産生は、自然環境中の競合を削減又は阻害するための適応とみなされてきた（Ｗｅｉｎｅｒ  １９９６年）。固体及び液体培地における抗生物質産生菌と抗生物質感受性菌間の競合研究により、この理論を裏付ける証拠が提供されている［例えば、Ｒａｓｏｏｌ，Ｋ．，及びＪ．Ｗ．Ｔ．Ｗｉｍｐｅｎｎｙ。１９８３年。抗生物質産生ストレプトミセス菌と大腸菌を用いた混合連続培養実験(Mixed continuous culture experiments with an antibiotic-producing streptomycete and Escherichia coli)。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ８：２６７−２７７；Ｔｕｒｐｉｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｖ．Ｋ．Ｄｉｈｒ，Ｋ．Ａ．Ｍａｙｃｒｏｆｔ，Ｃ．Ｒｏｗｌａｎｄｓ，及びＥ．Ｍ．Ｈ．Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ。１９９２年。土壌中のサルモネラの生存に及ぼすストレプトミセス属の影響(The effect of Streptomyces species on the survival of Salmonella in soil)。ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．１０１：２７１−２８０］。実験室での実験によれば、抗生物質の産生は競合菌の侵入を防止するものの、確立された抗生物質感受性微生物集団を侵害したりそれと競合する能力までは改善しないことを示している［Ｗｉｅｎｅｒ，Ｐ．１９９６年。細菌の抗生物質産生の生態学的役割に関する実験的研究(Experimental studies on the ecological role of antibiotic production in bacteria)。Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  １０：４０５−４２１］。実験室での実験では抗生物質産生に証拠があるにもかかわらず、抗生物質の自然の役割及びそれらの産生条件は不明のままである（Ｗｉｅｎｅｒ  １９９６年）。
【０００５】
プレトドン科のサラマンダー(salamander)は、現存するサラマンダーの中で最大の科を構成する。その仲間は多くの森林及び流水生態系で最も数の多い脊椎動物の一つである。肺を持たないというのが最も特筆すべき特徴である。この科の示す生活史は極めて多彩である［例えば、Ｔｉｌｌｅｙ，Ｓ．Ｇ．，及びＪ．Ｂｅｒｎａｒｄｏ。１９９３年。プレトドン科サラマンダーにおける生活史の進化(Life history evolution in plethodontid salamanders)。Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ４９：１５４−１６３；Ｗａｋｅ，Ｄ．Ｂ．，及びＳ．Ｍ．Ｍａｒｋｓ。１９９３年。プレトドン科サラマンダーの発生と進化：過去の研究のレビューと将来の研究に対する展望(Development and evolution of plethodontid salamanders: a review of prior studies and a prospectus for future research)。Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ４９：１９４−２０３］。このように多様であるにもかかわらず、それらの繁殖生物学における保守性、特に卵の世話という形態でのほぼ普遍的な子育て［Ｓａｌｔｈｅ，Ｓ．Ｎ．，及びＪ．Ｓ．Ｍｃｃｈａｍ。１９７４年。繁殖及び求愛パターン(Reproductive and courtship patterns)。Ｐｐ．Ｂ．Ｌｏｆｔｓ（編）、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｈｉｂｉａに収載。Ｖｏｌ．２：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク］はよく報告されている［例えば、Ｆｏｒｅｓｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．１９７８年。卵を守るマウンテンダスキーサラマンダー（両生類、有尾目、プレトドン科）の雌と可能性ある捕食者間の実験室での遭遇(Laboratory encounters between attending Desmognathus ochrophaeus(Amphibia, Urodela, Plethodontidae) females and potential predators)。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｙ  １２：５３７−５４１，１９７９年；Ｈｉｇｈｔｏｎ，Ｒ．，及びＴ．Ｓａｖａｇｅ。１９６１年。雌のセアカサラマンダーにおける抱卵行動の機能(Functions of the brooding behavior in the female red-backed salamander, Plethodon cinereus)。Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｓｔａｔｅ  Ｍｕｓｅｕｍ  ６：２３５−２３７；Ｐｉｅｒｓｏｌ，Ｗ．Ｈ．１９０９年。プレトドン・エリスロノトゥスの習性と幼態(The habits and larval state of Plethodon erythronotus)。Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８：４６９−４９３；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｗ．Ｅ．１９０３年。アウトダクス・ルグブリスの習性に関する追加メモ(Further notes on the habits of Autodax lugubris)。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌｉｓｔ  ３７：８８３−８８６；Ｔｉｌｌｅｙ，Ｓ．Ｇ．１９７２年。ノースカロライナ州西部のマウンテンダスキーサラマンダー（両生類：プレトドン科）の子育てと胚発生の様子(Aspects of parental care and embryonic development in Desmognathus ochrophaeus(Amphibia: Plethodontidae) in western North Carolina)。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌｉｓｔ  ８９：３９４−４０７］。
【０００６】
子育ては、接合後の親による子孫への投資と定義できる（Ｔｒｉｖｅｒｓ，Ｒ．Ｌ．１９８５年。Ｓｏｃｉａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ。Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク）。プレトドン科の中では、この投資は、ほとんどの場合雌親による卵の世話という形態で現れる［Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｌ．１９９５年。子育て(Parental care)。Ｐｐ．５１８−５６７。Ｈ．Ｈｅａｔｗｏｌｅ及びＢ．Ｋ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ（編）、Ａｍｐｈｉｂｉａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙに収載。Ｖｏｌ．２：Ｓｏｃｉａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ。Ｓｕｒｒｅｙ  Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、豪ニューサウスウェールズ州チッピング・ノートン］。ほとんどの場合、雌は孵化が起こるまでクラッチ（一腹卵）と共にとどまる。プレトドン科におけるこのような行動の適応利益は明確に確立されており、捕食者、非病原性の常在土壌真菌種による真菌感染、乾燥からの保護、及び発生異常の防止を含む（Ｃｒｕｍｐ、１９９５年、包括的概説参照）。子育ては、行動レパートリー（例えば、クラッチへの身体接触、卵いじり、咽頭による脈動）からなり、これら複数の利益は明らかに発生中の子に対しても同時に授けられる。
【０００７】
プレトドン科の中での子育ての利益は明確に報告されているが、ある側面が達成されるメカニズムは最近まで不明のままであった（例えば、Ａｕｓｔｉｎ  ２０００年）。この状況は、雌が寄り添うとクラッチの真菌感染が減少することに関する前世紀来の多くの観察に関して特にそうであった。こうした観察から、雌（例えば、Ｎｏｂｌｅ，Ｇ．Ｋ．１９３１年。Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｈｉｂｉａ。ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、米国ニューヨーク州ニューヨーク；Ｐｉｅｒｓｏｌ，１９０９年）又は発生中の胚子（Ｈｉｇｈｔｏｎ及びＳａｖａｇｅ、１９６１年）のいずれかが、世話されているクラッチ上での真菌の成長を削減又は阻害できる抗真菌代謝産物を産生しているという仮説が導かれた。しかしながら、その後の研究でも、サラマンダーからの抗菌分泌物の存在は示されていない［Ｄａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｒ．，及びＲ．Ｗ．Ｓｉｍｐｓｏｎ。１９５４年。抗生物質に関する否定的報告(A negative note on antibiotics)。Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｉｃａ  １０：１６；Ｆｏｒｅｓｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．１９７９年。マウンテンダスキーサラマンダー（有尾目：プレトドン科）における子育ての適応性(The adaptiveness of parental care in Desmognathus ochrophaeus(Urodela: Plethodontidae))。Ｃｏｐｅｉａ  １９７９年：３３２−３４１；Ｔｉｌｌｅｙ、１９７２年；Ｖｉａｌ，Ｊ．Ｌ．，及びＦ．Ｂ．Ｐｒｉｅｂ。１９６６年。サラマンダーのプレトドン・シネレウス（グリーン）からの皮膚分泌物の抗生物質アッセイ(Antibiotic assay of dermal secretions from the salamander, Plethodon cinereus(Green))。Ｈｅｒｐｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ２２：２８４−２８７；Ｖｉａｌ，Ｊ．Ｌ．，及びＦ．Ｂ．Ｐｒｉｅｂ。１９６７年。サラマンダーのプレトドン・シネレウスにおける抱卵行動の機能としての抗生作用の調査(An investigation of antibiosis as a function of brooding behavior in the salamander, Plethodon cinereus)。Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：３７−４０］。両生類の皮膚環境を可能性ある医学的に有用な細菌源として利用する研究者の発表報告は知られていない。両生類及び他の生物由来の医学的に有用な化合物に関する研究の多くは、両生類及び他のマクロ生物の皮膚分泌物中におけるそのような化合物の産生に焦点を当て、そのような生物の皮膚に生息する細菌フローラには目を向けてこなかった［例えば、Ｇｌａｕｓｉｕｓｚ，Ｊ．１９８８年。カエルの液(The frog solution)。Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  １９：（１１）８８−９２；Ｃａｒｔｅ，Ｂ．Ｋ．１９９６年。天然水産物の生物医学的可能性(Biomedical potential of marine natural products)。Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４６（４）：２７１−２８７；Ｐｏｒｔ，Ｏ．２００１年。カエル由来の薬物研究における躍進(A leap in drug research from frogs)。Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｗｅｅｋ  ３７５２：９９；Ｔｙｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．１９９５年。カエルと薬物(Frogs and Drugs)。Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ２４（１２）：４６−５２；Ｃｏｇｈｌａｎ，Ａ．２０００年。バグ・バスター(Bug busters)。Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．１６６（２２３３）：１５；Ｓｔｉｅｎｂｏｒｎｅｒ，Ｓ．Ｔ．，Ｇ．Ｊ．Ｃｕｒｒｉｅ，Ｊ．Ｈ．Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｃ．Ｗａｌ��ａｃｅ，及びＭ．Ｊ．Ｔｙｌｅｒ。１９９８年。オーストラリアアマガエルのアカメアメガエルの皮膚由来の新規抗生物質カエリン１ペプチド(New antibiotic caerin 1 peptides from the skin of the Australian tree frog Litoria chloris)。ミナミアマガエル属由来のカエリン１ペプチドの活性の比較(Comparison of the activities of the caerin 1 peptides from the genus Litoria)。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：（２），１２１−１２７；Ｒｅｎｎｉｅ，Ｊ．１９９３年。ここにはインチキ薬はない(No snake oil here)。Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６６（３）１３６−１３７；ＭｃＮａｍｅｅ，Ｄ．１９９４年。イモリの眼、カエルの爪先(Eye of newt, toe of frog)。Ｌａｎｃｅｔ．３４４（８９３８）：１６９６−１６９８；Ｅｒｓｐａｍｅｒ  １９９４年］。
【０００８】
皮膚呼吸を容易にするために産生される粘液が栄養豊富な性質を持つため、プレトドン科サラマンダーの成功に関する他の側面は、常在する微生物フローラに帰することができる。プレトドン科サラマンダーは呼吸ガスの交換を皮膚だけに頼らなければならないため、皮膚表面に生息している好気性土壌菌を積み過ぎると、呼吸ガスを通さないバリヤとなり、最終的にはサラマンダーを死に至らしめることになる。
【０００９】
両生類の栄養豊富な皮膚環境は、周囲環境のそれとは明らかに異なる微生物共同体を支持することが示されている［Ａｕｓｔｉｎ，Ｊｒ．，Ｒ．Ｍ．１９９７。トウブジグザグサンショウウウオ（両生類：プレトドン科）の皮膚細菌フローラ(The cutaneous bacterial flora of the eastern zigzag salamander, Plethodon dorsalis Cope(Amphibia;Phethodontidae))。博士論文。ミシシッピ大学、ミシシッピ州ユニバーシティ］。微生物は、栄養豊富な環境で、抗生物質の産生（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ及びＳｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ、１９８１年）を含む偏害作用戦略を利用することが示されていることを考えれば、両生類の皮膚環境は、微生物の成長を削減又は阻害する化合物を産生できる微生物を支持し、そうすることで両生類の生態学及び生活史に競合的利益を付与することが予測できる。驚くべきことに、少なくとも部分的に皮膚呼吸をする生物の皮膚環境から分離されたある種の微生物によって産生される代謝産物は、重要なヒト病原菌及び病原真菌に対して抗菌活性を示し、また抗ウィルス及び抗腫瘍活性も有することが最近確認された。
【００１０】
発明の要旨
本発明は、少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている粘液産生生物の体から分離された微生物によって産生される化合物及び化合物の組合せを含む抽出物からなる。該抽出物はヒトにおける抗腫瘍、抗ウィルス、抗真菌、及び／又は抗菌活性を有する。更に詳しくは、本発明は、皮膚呼吸をしている動物の粘液中で成長する細菌によって産生される抗生物質からなる。尚更に詳しくは、本発明は、両生類の皮膚から分離された細菌によって産生される、抗ウィルス活性、抗腫瘍活性、ヒトに対して病原性のある細菌及び／又は真菌に対する活性を含む抗菌及び／又は抗真菌活性を有する化合物及び／又は化合物の組合せからなる。具体例は、サラマンダー及びカエルの皮膚から分離された細菌によって産生される、カンジダ属(Candida sp.)、小胞子菌属(Microsporum sp.)、連鎖球菌属(Streptococcus sp.)（ペニシリン耐性連鎖球菌を含む）、ブドウ球菌属(Staphylococcus sp.)（メチシリン耐性ブドウ球菌を含む）、腸球菌属(Enterococcus sp.)（バンコマイシン耐性腸球菌を含む）、緑膿菌属(Pseudomonas sp.)、大腸菌属(Escherichia sp.)に対する活性、ヒトリンパ球のＣＥＭ及びＭＴ−４中のＨＩＶ株の細胞変性の削減を含むヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）株に対する活性、並びに腫瘍細胞のｆ−マウス白血病、マウス乳がん、及びヒトＴ−リンパ球細胞に対する活性を有する化合物を含む抽出物などである。
【００１１】
本発明の目的は、少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている生物の皮膚由来の細菌分離株からの、抗菌、抗真菌、抗ウィルス、又は抗腫瘍効果を有する化合物又は化合物の組合せの抽出である。
【００１２】
本発明の別の目的は、少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている生物の皮膚由来の細菌分離株の確認である（該細菌分離株によって産生され分離株から抽出される化合物は、抗菌、抗真菌、抗ウィルス、又は抗腫瘍効果を有する）。
【００１３】
好適な態様の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に皮膚呼吸をしている動物の皮膚微生物フローラから採取した細菌分離株の確認と、該分離株からの、抗菌、抗真菌、抗ウィルス、又は抗腫瘍効果を有する化合物又は化合物の組合せ（抽出物）の抽出とを含む。分離株の確認法と抽出物の製造法について説明する。抽出物は、単一の活性化合物、化合物の組合せ、又は抽出物中の他の化合物との組合せで見つかったときに相乗効果を有する一つ以上の化合物を含みうる。
【００１４】
原料となる生物は、それらの野生環境で採集し隔離しておく。隔離期間後、生物の皮膚細菌フローラの試料を成長させ、形態学的特徴に基づいて分離する。細菌分離株と該分離株からの抽出物の、特定の細菌株に対する抗菌効果を培地上で試験する。液体抽出技術を用いて細菌分離株から抽出物を調製し、該抽出物の、特定の細菌及び真菌株の成長阻害能を測光評価法を用いて試験する。抽出物の成分の、細胞培養物の細胞変性を阻害する能力を試験する。抽出物の成分の、がん細胞の増殖を阻害する能力を試験する。
【００１５】
実施例１−クロハラサラマンダーの皮膚微生物フローラ及び病原菌に対する抗生作用
クロハラサラマンダー(Desmognathus quadramaculatus)種の抱卵雌をピードモント自然園（Ｐｉｅｄｍｏｎｔ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇａｒｄｅｎ）で採集し、採集地の落葉や土壌を詰めた３．７９リットルビニル袋に入れ、旅行用クーラーに入れ、研究室に輸送した。このサラマンダーを濡らしたろ紙を敷いたガラスペトリ皿に隔離し、１週間６〜７℃に維持した。
【００１６】
隔離期間後、サラマンダーの肩帯と腰帯間の背を細菌学用ループ（白金耳）で画線して細菌を採取した。細菌試料は、トリプシン大豆酵母エキス（ＴＳＹＥ）寒天（２ｇのＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏトリプシン大豆ブロス、１ｇのＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ酵母エキス、１リットルの水に対し１２ｇのＤｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ精製寒天）上で培養し、室温で７２時間成長させた。形態学的に異なる細菌コロニーをＴＳＹＥ寒天上に再分離し、７２時間成長させて純培養物を得た。純培養物が得られたら、分離株をＴＳＹＥ寒天斜面培地上で培養し、室温で２週間成長させ、必要時まで５℃で保管した。
【００１７】
プレートは暗室で周囲温度でインキュベートした。翌日、プレート上で成長はさほど観察されなかった。１スリーブ当たり２０枚のＴＳＹＥプレートを３スリーブ用意した。翌日、抱卵中のクロハラサラマンダーの雌からの４枚のプレートは驚くほどわずかな成長しか観察されず、４枚のプレートに７個のコロニーが観察されただけあった。分離株を新しいＴＳＹＥプレートに塗り広げて分離し、暗室で周囲温度でインキュベートした。
【００１８】
翌日観察すると、６個のコロニーが認められたので、ＤＱ００１Ａ、ＤＱ００１Ｂ、ＤＱ００１Ｃ、ＤＱ００１Ｄ、ＤＱ００１Ｅ、及びＤＱ００１Ｆとして識別した。ＤＱ００１Ｄは、とりわけエッジが不透明で中心部が白色のコロニーであった。
【００１９】
５種類の公知のヒト日和見病原体、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、コリネバクテリウム・ゼロシース(Corynebacterium xerosis)、及びセラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)の平行線条をつけた６枚のプレートを用意した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。次に、６枚のプレートのそれぞれに、６種類の分離株ＤＱ００１Ａ−Ｆを１種類ずつ塗り広げた。次いで、６枚のプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。
【００２０】
次に、６枚のプレートを観察し、６種類の分離株のいずれかが５種類のヒト日和見病原体のいずれかに阻害効果を示したかどうかを判定した。分離株ＤＱ００１Ｄは、表皮ブドウ球菌（阻止帯＝３７ｍｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（阻止帯＝３２ｍｍ）、及びコリネバクテリウム・ゼロシース（阻止帯＝６０ｍｍ）に対して阻害を示したが、他の２種類の病原体に対しては阻害を示さなかったことが観察された。他の分離株はいずれも何の阻害も示さなかった。
【００２１】
実施例２−サラマンダーの皮膚微生物フローラと病原菌及び病原真菌に対する抗生作用
材料と方法
原料生物の採集
１種類あたり最低５個体で構成される（ｎ＝５）１６種類の両生類を、自然の固有生息地から採集した。種と採集地を表１にまとめた。
【００２２】
【表１】
2004521935.tif 000003
【００２３】
採集したら、両生類の種を３．７９リットルのビニル袋に入れて採集地から捕獲し、旅行用クーラーに入れて研究室に輸送した。両生類の種を湿らせたろ紙を敷いた０．０９４６Ｌのプラスチック容器に個別に隔離し、Ｃｏｒｏｎモデル６０１０  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃｈａｍｂｅｒに入れ、１週間１６℃に維持した。
【００２４】
隔離期間後、各種の両生類から細菌を採取し、両生類の種から分離された、表現型が異なる細菌に、該分離株を採取した個体に対応するコードを振った。各細菌分離株の表現型は、標準のコロニー形態学技術（Ｓａｌｌｅ及びＭｅａｃｈｅｍ、１９７４年）によって特徴付けした。この特徴付けは、異なる各細菌コロニーについて、コロニー全体の形状、辺縁（エッジ）の形状、隆起、色、及びフィニッシュを記録することによって達成した。細菌分離株のグラム染色は、細菌分離株の確認と分類に役立つＳａｌｌｅ，Ａ．Ｊ．１９７３年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，米国ニューヨーク州ニューヨークに概説してあるようなグラム染色技術によって判定した。細菌分離株の細胞形態学も記録した。コロニーと細胞の特徴付けの後、原料生物から分離した形態学的に異なる各細菌をＴＳＹＥ寒天斜面培地上で培養し、室温で２週間成長させ、必要時まで５℃で保管した。
【００２５】
寒天プレート阻害試験法
原料生物から分離された形態学的に異なる細菌分離株の、グラム陽性及びグラム陰性ヒト病原菌に対して有効な抗菌化合物産生能力を試験した。阻害試験に利用したヒト病原菌種は、エンテロコッカス・フェカーリス（ＡＴＣＣ＃２９２１２）、大腸菌(Escherichia coli)（ＡＴＣＣ＃２５９２２）、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)（ＡＴＣＣ＃２７８５３）及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)（ＡＴＣＣ＃２９２１３）であった。
【００２６】
寒天プレート阻害試験は、原料生物から分離した形態学的に異なる各細菌の、ヒト病原菌の成長阻害能を、Ａｌｃａｍｏ，Ｉ．Ｅ．１９９４年、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、米国ニューヨーク州ニューヨーク、に記載の方法とプロトコルに従って試験することから成った。原料生物由来の細菌分離株を個々にＴＳＹＥ寒天プレート上に細菌学用ループ（白金耳）で中央画線で画線した。次に、プレートを室温で最低７２時間インキュベートして細菌を成長させた。次に、ヒト病原菌種を最初の居住細菌培養物に対して直角に単画線で画線した。病原分離株が最初の細菌画線に接触しないように注意した。次いで、プレートを４８時間再インキュベートして、ヒト病原菌種を成長させた。インキュベーション後、原料生物の細菌に隣接するヒト病原分離株の成長についてプレートを調べた。
【００２７】
阻害は、最初の居住細菌画線に隣接する、成長が観察されない地帯とみなした。観察された場合、阻害は、最初の居住細菌から最も近い０．５ｍｍまでのゼロ成長地帯の距離を測定することによって定量化した。
【００２８】
抗菌／抗真菌代謝産物阻害試験法
原料生物から分離され、寒天プレート阻害試験でヒト病原菌の成長阻害能を示した細菌を、０．５Ｌの液体ＴＳＹＥ培地で周囲温度で７日間成長させた。各分離株は、２種類の異なる抽出法に適用するために複製フラスコで成長させた。成長期間後、原料生物から分離された細菌分離株によって産生された複合分子（代謝産物）を、標準液体抽出法を利用して液体培地から抽出した。
【００２９】
抽出法は、以後の試験のために、水溶性及び非水溶性化合物の両方の抽出を目的として考案された二つの独立した抽出工程から成った。
水溶性の抽出工程は、細菌分離株の細胞培養物を含有する液体培地試料を−８０℃で急速凍結することから成った。凍結工程後、凍結試料を凍結乾燥させた。凍結乾燥後、試料を０．５Ｌの１００％メタノールに加え、１時間機械的に撹拌した。試料をろ過殺菌して、全細菌細胞／細胞フラグメントを確実に除去した。次に、得られたメタノール／化合物の混合物から回転蒸発器を利用してメタノールを蒸発させ、可能性ある生物活性を有する一つ以上の化合物を含有する複数の化合物の粗抽出物だけを残した。
【００３０】
非水溶性の抽出工程は、細菌分離株の細胞培養物を含有する培地試料に、１５０ｍｌの酢酸エチルを加えることから成った。次に、この得られた混合物を１５分間機械的に撹拌した。次に、酢酸エチルを混合物から分液漏斗で分離し、取り置いた。この操作を３回繰り返し、４５０ｍｌの酢酸エチル／化合物の混合物を得た。次に、得られた混合物から回転蒸発器を使用して酢酸エチルを蒸発させ、可能性ある生物活性を有する一つ以上の化合物を含有する複数の化合物の粗抽出物だけを残した。
【００３１】
阻害性の各細菌分離株を水溶性及び非水溶性抽出工程にかけて得られた各代謝産物抽出物を、１種類以上のヒト病原菌、抗生物質耐性ヒト病原菌、ヒト病原真菌、及びヒト病原ウィルスの阻害能について試験した。利用したヒト病原菌は、エンテロコッカス・フェカーリス  ＡＴＣＣ  ２９２１２、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカーリス（ＶＲＥ）  ＡＴＣＣ  ７００２２１、黄色ブドウ球菌  ＡＴＣＣ  ２９２１３、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）  ＡＴＣＣ  ３３５９１、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)  ＡＴＣＣ  １２３５８、ペニシリン耐性肺炎球菌(Streptococcus pneumonia)  ＡＴＣＣ  ７００６７４、緑膿菌  ＡＴＣＣ  ２７８５３、及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)  ＡＴＣＣ  ７００４０８であった。利用したヒト病原真菌は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)  ＡＴＣＣ  ２４４３３、石膏状小胞子菌(Microsporum gypseum)  ＡＴＣＣ  １４６８３、トリコフィトン・メンタグロフィテス(Trichophyton mentagrophytes)  ＡＴＣＣ  ９５３３及びアスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)  ＩＨＥＭ  ２８９５であった。
【００３２】
抗菌試験はＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス中で実施する。接種物は、１８〜２４時間の寒天プレートから選んだ分離コロニーの直接食塩水懸濁液を製造することによって調製する。その後、接種物を５００，０００ＣＦＵ／ｍｌに標準化する。インキュベーション温度は３５℃、インキュベーション時間は１６時間である。酵母スクリーニングは、０．３ｇ／ｌのグルタミン及び３４．６ｇ／ｌのモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ−緩衝液）を補給したＲＰＭＩ  １６４０ブロス中で実施する。インキュベーション温度は３５℃、インキュベーション時間は２４時間である。
【００３３】
接種物は、１８〜２４時間のサブロー寒天プレートから選んだ分離コロニーの直接食塩水懸濁液を製造することによって調製する。その後、接種物を標準化する（１０００〜５０００ＣＦＵ／ｍｌ）。測定ツールは成長曲線下面積で、これをＢｉｏｌｉｎｋソフトウェアによって自動測定する。ブロスと試験物質（例えば２５ｐｐｍの抽出物）だけを含有する試料の面積を、接種物も含有する試料の面積から引く。各試料に５個の複製物を用いる結果、対照抗生物質、例えばアンホテリシンＢ、ペニシリン及びバンコマイシンとの比較が可能な数が得られる。結果は、試験物質を含有しない試料に対する成長率（％）として表される。
【００３４】
抗カビスクリーニングは、０．３ｇ／ｌのグルタミン及び３４．６ｇ／ｌのモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ−緩衝液）を補給したＲＰＭＩ  １６４０ブロス中で実施する。アスペルギルス属に対するインキュベーション温度／時間は３５℃／４８時間である。皮膚糸状菌のインキュベーション温度は２５℃、インキュベーション時間は５日間である。
【００３５】
接種物は、７日間培養した培養物を約１ｍｌの滅菌食塩水で覆うことによって調製する。懸濁液は、コロニーをパスツールピペットの先で優しくプロービングすることによって製造する。その後、接種物を標準化する（４０００〜５００００ＣＦＵ／ｍｌ）。カビの場合、動力学的測定は使用せず、開始点と終点の測定だけである。測定ツールとして、ＯＤ（スタートとエンド）を使用し、これをＢｉｏｌｉｎｋソフトウェアによって自動測定する。ＯＤ−スタートをＯＤ−エンドから引く。各試料に５個の複製物を使用する。これらのデータは、対照抗生物質、例えばアンホテリシンＢとの比較が可能な数になる。結果は、試験物質を含有しない試料に対する成長率（％）としても表される。
【００３６】
ヒト病原菌及び真菌の種は、標準化濃度１００及び２５０マイクログラム／ミリリットル（ｐｐｍ）の、原料生物から分離した各細菌からの代謝産物抽出物に曝露した。代謝産物の阻害試験は、垂直測光法（光学濃度）によって細菌及び真菌種の濁度進行（すなわち成長）をモニタできる自動リーダー−インキュベーターのＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを利用して実施した。結果を用いて、細菌分離株から得られた代謝産物抽出物に応答する成長曲線を作成した。各試験には、陽性対照又は試験生物に対するＭＩＣがわかっている対照抗生物質も含めた。
【００３７】
抗ウィルス阻害試験法
個々の代謝産物を、原料生物の皮膚環境から分離した細菌から得られた粗抽出物から、前述の２種類の抽出工程を通ってＨＰＬＣカラムを用いて抽出した。ＨＰＬＣカラムの詳細は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、パート番号２３５３３０、ＲＰ−１８、粒径５μｍであった。溶離液はアセトニトリル：水＝７５：２５の混合物で、流速１ｍｌ／分であった。ＵＶ検出器を２１０ｎｍにセットした。原料生物の皮膚環境から分離した細菌からの代謝産物抽出物の、ヒトリンパ球ＣＥＭ及びＭＴ−４細胞培養物中のＨＩＶ誘発細胞変性を阻害する能力を試験した。ＣＥＭ細胞を培地１ミリリットル当たり約２５０，０００個の細胞濃度で懸濁させ、１ミリリットル当たり５０％細胞培養物感染量（ＣＣＩＤ50）の約１００倍の野生型ＨＩＶ−１（IIIB）で感染させた。次に、感染細胞懸濁液１００μｌを、適当に希釈した試験化合物１００μｌを含有する２００μｌの微量定量プレートのウェルに加えた。３７℃で４日間のインキュベーション後、細胞培養物のシンシチウム形成を顕微鏡で調べた。シンシチウム形成を５０％阻害するのに要した化合物濃度としてＥＣ50（５０％有効濃度）を測定した。
【００３８】
抗腫瘍試験法
原料生物の皮膚環境から分離した細菌から抽出した代謝産物の、ｆ−マウス白血病細胞（Ｌ１２１０／０）、マウス乳がん細胞（ＦＭ３Ａ）、及びヒトＴ−リンパ球細胞（Ｍｏｌｔ４／Ｃ８及びＣＥＭ／０）の各細胞の増殖阻害能を調べた。すべてのアッセイは９６穴微量定量プレートで実施した。各ウェルに５〜７．５×１０4個の細胞と所定量の試験化合物を加えた。細胞は、加湿ＣＯ2制御雰囲気下３７℃で４８時間（マウス白血病Ｌ１２１０、マウス乳がんＦＭ３Ａ）又は７２時間（ヒトリンパ球ＣＥＭ及びＭｏｌｔ）増殖させた。インキュベーション期間終了時に細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで計数した。ＩＣ50（５０％有効阻害濃度）は、生細胞数を５０％削減する化合物濃度と定義された。
【００３９】
結果
皮膚の微生物フローラの試料を、１３種のサラマンダーと３種のカエルで構成される１６種の両生類（原料生物）から採取した（表１）。これらの試料から合計４１７個の形態学的に異なる細菌分離株を分離した。内訳は、サラマンダーから分離した３０６個のグラム陰性桿菌、２０個のグラム陽性桿菌、２５個のグラム陰性球菌、及び５個のグラム陽性球菌を含む３５６個の固有分離株、並びにカエルから分離した３７個のグラム陰性桿菌、１０個のグラム陽性桿菌、７個のグラム陰性球菌、及び７個のグラム陽性球菌を含む６１個の固有分離株であった（表２）。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
寒天プレート阻害試験
４種類のヒト病原菌、エンテロコッカス・フェカーリス（ＡＴＣＣ  ２９２１２）、大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）、緑膿菌（ＡＴＣＣ  ２７８５３）及び黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ２９２１３）に対する４１７個の各固有細菌分離株の寒天プレート阻害試験から、１種類以上のヒト病原菌種の成長を阻害できる１３個の固有細菌分離株の存在がわかった。これら１３個の分離株のうち、９個はプレトドン科のサラマンダーから分離され、４個はアマガエル科及びアカガエル科のカエルから分離された。クロハラサラマンダーの分離株は、実験１の抱卵中の雌とは対照的に実質的阻害を示さなかった。サラマンダーの皮膚の細菌フローラは、ホルモン、環境変化、及び他の因子によって影響されることがわかっているので、実験１の個体と実験２の個体間で観察された細菌フローラに違いがあっても不思議ではない。従って、実験１の細菌分離株ＤＱ００１Ｄも本実験２で実施する試験に含めた。病原菌の成長を阻害できる１３個の固有細菌分離株のコロニー及び細胞の形態学的特徴を表３にまとめた。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
原料生物から分離した１３個の固有細菌分離株のうち８個が、試験対象のヒト病原菌の２種類以上を阻害する能力を示した。原料生物から分離した５個の固有細菌分離株は、試験対象のヒト病原菌の１種類だけの阻害に有効であった。表４に示したデータからわかるように、細菌分離株ＤＱ００１Ｄ、ＡＣ０２１、ＥＧ００６、ＥＣ００９、ＰＯ０２６、ＰＯ０２７、及びＲＣ００３は、エンテロコッカス・フェカーリス（ＡＴＣＣ  ２９２１２）の成長を阻害する化合物を産生している可能性を示した。細菌分離株ＥＧ００６、ＥＣ００９、ＰＯ０１４、ＥＣ０２４、及びＡＣ０２４は、大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）の成長を阻害する化合物を産生している可能性を示した。細菌分離株ＡＣ０２１、ＰＯ０１９、ＰＯ０１４、ＰＯ０２７、ＲＣ００３、ＰＤ０２６、及びＰＣ０１７は、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ２９２１３）の成長を阻害する化合物を産生している可能性を示した。細菌分離株ＥＣ０２４及びＡＣ０２４は、緑膿菌（ＡＴＣＣ  ２７８５３）の成長を阻害する化合物を産生している可能性を示した。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
抗菌／抗真菌代謝産物阻害試験
原料生物の皮膚環境から分離され、寒天プレート阻害試験で病原菌の成長を阻害した１３個の細菌分離株からの代謝産物抽出物の、病原菌又は病原真菌の成長を阻害する効果について試験した。これらの代謝産物のうち、細菌分離株ＤＱ００１Ｄ、ＰＯ０２６、ＰＯ０２７及びＰＣ０１７からの抽出物は、病原菌、病原真菌、又はその両方の成長の阻害に強力な生物活性を示した。
【００４６】
分離株番号ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物は、１００ｐｐｍ（マイクログラム／ミリリットル）及び２５ｐｐｍの両方で、複数種のグラム陽性病原菌の阻害に有効であった。具体的には、ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物は、病原菌種のエンテロコッカス・フェカーリス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカーリス、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、及びペニシリン耐性肺炎球菌の成長を完全に阻害した。さらに、ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物は、１００ｐｐｍでヒト病原真菌のカンジダ・アルビカンスの成長の完全阻害にも有効であり、また１００ｐｐｍでヒト病原真菌の石膏状小胞子菌の成長の部分的阻害も示した。
【００４７】
分離株番号ＰＯ０２６からの代謝産物抽出物は、１００ｐｐｍで病原真菌のカンジダ・アルビカンスの成長の完全阻害を示した。
分離株番号ＰＯ０２７からの代謝産物抽出物は、２５ｐｐｍでヒト病原菌の黄色ブドウ球菌の成長の完全阻害に有効であった。さらに、ＰＯ０２７からの代謝産物抽出物は、２５０ｐｐｍで病原真菌のカンジダ・アルビカンスの成長も阻害した。
【００４８】
分離株番号ＰＣ０１７からの代謝産物抽出物は、１００ｐｐｍでヒト病原真菌のカンジダ・アルビカンスの成長阻害能を示した。各種両生類由来の他の細菌分離株からの抽出物の抗菌／抗真菌活性についても同様の結果が最近得られており、本発明を応用すれば今後他のそのような活性の発見が期待されることを示している。
【００４９】
抗ウィルス阻害試験
原料生物の皮膚環境から分離され、寒天プレート阻害試験で病原菌の成長を阻害した１３個の細菌分離株から抽出された代謝産物の、複数株のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の成長を阻害する効果について試験した。これらの抽出物のうち、ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物（リテンションタイム７．２７分）は、ヒトリンパ球ＣＥＭ及びＭＴ−４細胞培養物のＨＩＶ細胞変性の阻害に顕著な能力を示した。具体的には、ＣＥＭ細胞中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のＨＩＶ細胞変性を阻害するのに要したＤＱ００１Ｄの有効代謝産物濃度は、それぞれ７ｐｐｍ及び１７ｐｐｍであった。ＭＴ−４細胞中のＨＩＶ−１のＨＩＶ誘発細胞変性を阻害するのに要したＤＱ００１Ｄの有効代謝産物濃度は９ｐｐｍであった。ＭＴ−４細胞に対するＤＱ００１Ｄからの代謝産物の確定毒性は４０ｐｐｍであった。分離株を試験したこれまでの経験に基づくと、将来的に他の分離株の抗ウィルス活性が示されるであろうことが期待される。
【００５０】
抗腫瘍試験
細菌分離株番号ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物は、ｆ−マウス白血病細胞（Ｌ１２１０／０）、マウス乳がん細胞（ＦＭ３Ａ）及びヒトＴ−リンパ球細胞（Ｍｏｌｔ４／Ｃ８、ＣＥＭ／０）の増殖を、それぞれ１７ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、１７ｐｐｍ及び１７ｐｐｍで阻害することを示した。分離株を試験したこれまでの経験に基づくと、将来的に他の分離株の抗腫瘍活性が示されるであろうことが期待される。
【００５１】
細菌及び真菌の公知抗生物質及び抗真菌薬に対する耐性のために、そうした疾患と闘うことが可能な薬物の新規材料源が世界中で探し求められている。そのような医学的に有用な化合物の新規細菌源の発見成功率がこれまで極端に低かったため、研究者らは医学的に有用な新薬の可能性ある新規材料としてマクロ生物に焦点を当てるようになった（例えばＢｅａｔｔｉｅ  １９９２年）。本明細書中に提示したデータは、両生類が、抗菌、抗真菌、抗ウィルス、及び抗腫瘍代謝産物を産生可能な医学的に有用な細菌源となることに関する明白かつ実質的な証拠を提供している。
【００５２】
さらに、公知薬物に対する細菌の抗生物質耐性は、世界的に深刻な健康問題をもたらしている。本研究は、両生類の皮膚環境が、高い抗生物質耐性を持つバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカーリス及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む複数のヒト病原菌及び病原真菌の成長を阻害できる細菌種を含有することを明らかに示している。さらに、細菌分離株ＤＱ００１Ｄからの代謝産物抽出物の抗ウィルス及び抗腫瘍活性は、両生類の皮膚環境から分離された医学的に有用な化合物の応用も明確に示している。これ及び他の分離株の生物活性を考えると、今後の分離株も同様の抗ウィルス活性を示すであろうと考えられ、また期待される。
【００５３】
前述の説明は本発明の例示的態様を含む。本明細書中に記載した前述の態様及び方法は、当業者の能力、経験及び好みによって変動可能である。ある順序で本発明の方法のステップを単に列挙することが、必ずしも該方法のステップの順序に関して何らかの制約を構成するわけではない。前述の説明及び図面は単に本発明を説明し図示しているだけであって、本発明は、クレームでそのように制限されない限り、それに制限されることはない。開示内容を前にした当業者であれば、本発明の範囲内で多様な変形を為すことが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】阻害試験の対照として用いたペトリ皿を示す写真である。縦の画線（ＡＣ０２４）はコオロギガエル(Acris crepitans)の皮膚から分離された細菌を含み、横の画線は４種類のヒト病原菌、エンテロコッカス・フェカーリス（ＡＴＣＣ  ２９２１２）、大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）、緑膿菌（ＡＴＣＣ  ２７８５３）、及び黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ２９２１３）である。縦の両生類細菌画線に対する横のヒト病原菌画線の成長の近接度に基づいて阻害効果の有無を示す。
【図２】図１で説明したのと同様の阻害試験の対照として用いたペトリ皿を示す写真で、縦の画線（ＥＣ０２４）はユーリセア・シリゲラ(Eurycea cirrigera)の皮膚から分離された細菌を含む。
【図３】図１で説明したのと同様の阻害試験の対照として用いたペトリ皿を示す写真で、縦の画線（ＲＣ００３）はブロンズガエル(Rana clamitans)の皮膚から分離された細菌を含む。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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