(57)【要約】本発明はエンドセリン変換酵素−３（ＥＣＥ−３）タンパク質をコードするヒトＤＮＡ分子、ＥＣＥ−３をコードするＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクター、ＥＣＥ−３をコードする組換えベクターを含有する組換え宿主細胞、上記ＤＮＡ分子によってコードされるＥＣＥ−３タンパク質、ＥＣＥ−３の選択的アゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。
2004500023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトエンドセリン変換酵素−３タンパク質をコードする精製核酸分子であって、以下のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子：
【化１】
2004500023.tif 000016
2004500023.tif 000017
【請求項２】
ヒトエンドセリン変換酵素−３タンパク質をコードする精製ＤＮＡ分子であって、以下のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡ分子：
【化２】
2004500023.tif 000018
2004500023.tif 000019
【請求項３】
組換え宿主細胞中でエンドセリン変換酵素−３を発現させるための発現ベクターであって、請求項２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項４】
真核細胞発現ベクターである請求項３の発現ベクター。
【請求項５】
原核細胞発現ベクターである請求項３の発現ベクター。
【請求項６】
組換えエンドセリン変換酵素−３タンパク質を発現させる宿主細胞であって、請求項３の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項７】
組換えエンドセリン変換酵素−３タンパク質を発現させる宿主細胞であって、請求項４の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項８】
組換えエンドセリン変換酵素−３タンパク質を発現させる宿主細胞であって、請求項５の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項６の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１０】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項７の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１１】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項８の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１２】
エンドセリン変換酵素−３をコードする精製ＤＮＡ分子であって、以下のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子：
【化３】
2004500023.tif 000020
2004500023.tif 000021
【請求項１３】
配列番号１のヌクレオチド２１２〜ヌクレオチド２５３９のヌクレオチド配列からなる請求項１２の精製ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
組換え宿主細胞中でエンドセリン変換酵素−３を発現させるための発現ベクターであって、請求項１３のＤＮＡ分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項１５】
真核細胞発現ベクターである請求項１４の発現ベクター。
【請求項１６】
原核細胞発現ベクターである請求項１４の発現ベクター。
【請求項１７】
組換えエンドセリン変換酵素−３を発現させる宿主細胞であって、請求項１４の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１８】
組換えエンドセリン変換酵素−３を発現させる宿主細胞であって、請求項１５の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１９】
組換えエンドセリン変換酵素−３を発現させる宿主細胞であって、請求項１６の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２０】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項１７の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項２１】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項１８の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項２２】
組換えエンドセリン変換酵素−３を含有する、請求項１９の宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項２３】
以下のアミノ酸配列を含んでなる精製エンドセリン変換酵素−３タンパク質：
【化４】
2004500023.tif 000022
2004500023.tif 000023
【請求項２４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる請求項２３の精製エンドセリン変換酵素−３。
【請求項２５】
組換え宿主細胞中でエンドセリン変換酵素−３を発現させる方法であって、
（ａ）適切な宿主細胞に請求項３の発現ベクターをトランスフェクトし、
（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を、エンドセリン変換酵素−３タンパク質が発現ベクターから発現できる条件で培養する各ステップを含む方法。
【請求項２６】
ある物質がエンドセリン変換酵素−３に結合する能力を持つかどうかを決定する方法であって、
（ａ）細胞内で配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）その試験細胞を当該物質にばく露し、
（ｃ）エンドセリン変換酵素−３に対する当該物質の結合量を測定し、
（ｄ）試験細胞におけるエンドセリン変換酵素−３への当該物質の結合量を、配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターをトランスフェクトしていない対照細胞への当該物質の結合量と比較する各ステップを含む方法。
【請求項２７】
ある物質がエンドセリン変換酵素−３活性を調節する能力を持つかどうかを決定する方法であって、
（ａ）細胞内で配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）その試験細胞を当該物質にばく露し、
（ｃ）蓄積した細胞内二次メッセージの量を測定し、
（ｄ）当該物質に反応した試験細胞における二次メッセージの量を当該物質にばく露していない試験細胞における二次メッセージの量と比較する各ステップを含む方法。
【請求項２８】
二次メッセージがｃＡＭＰである請求項２７の方法。
【請求項２９】
ある物質がエンドセリン変換酵素−３活性を調節する能力を持つかどうかを決定する方法であって、
（ａ）配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）エンドセリン変換酵素−３を含んでなる膜調製物を精製し、
（ｃ）ステップ（ｂ）の精製膜調製物に試験物質を添加し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の試験物質含有膜調製物を、エンドセリン変換酵素−３の基質と共にインキュベートし、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成した生成物を、ステップ（ｃ）の試験化合物を添加せずにステップ（ｄ）の基質を含有する膜調製物から生成した生成物の量と比較する各ステップを含む方法。
【請求項３０】
基質がｂｉｇＥＴ−１、ｂｉｇＥＴ−２およびｂｉｇＥＴ−３からなる群より選択される請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の説明）
該当なし。
【０００２】
（連邦政府の助成金による研究開発に関する陳述）
該当なし。
【０００３】
（マイクロフィッシュ添付物の説明）
該当なし。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、エンドセリン変換酵素３（ＥＣＥ−３）（エンドセリン前駆体をタンパク質加水分解的に切断してその活性型を生成する膜結合型メタロプロテアーゼ）をコードするヒトＤＮＡ分子、ＥＣＥ−３をコードするＤＮＡ分子を含んでなる組換えベクター、ＥＣＥ−３をコードする組換えベクターを含有する組換え宿主細胞、上記ＤＮＡ分子によってコードされるＥＣＥ−３タンパク質、およびＥＣＥ−３の選択的調節物質を同定する方法に関する。
【０００５】
（発明の背景）
エンドセリンは、様々な生理学的活性を持つ２１アミノ酸ペプチドの小さなファミリーを構成している。これらのペプチドは１、３、１１および１５位のシステイン残基を特徴とする。エンドセリン−１（ＥＴ−１）は最初に開示されたエンドセリンであり、内皮由来の強力な血管収縮物質であることが示されている（Ｙａｎａｇｉｓａｗａら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ　３３２：４１１−４１５）。エンドセリンファミリーの既知の３メンバーＥＴ−１、エンドセリン−２（ＥＴ−２）およびエンドセリン−３（ＥＴ−３）は様々な組織で産生され、様々な細胞タイプで発現される２種類のＧタンパク質共役レセプターＥＴＡおよびＥＴＢと相互作用することが知られている（Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３８７３−３８７９）。
【０００６】
エンドセリンは約２００アミノ酸の大きいプレプロポリペプチドから産生される。まずこれらの前駆体は、それぞれｂｉｇＥＴ−１、ｂｉｇＥＴ−２およびｂｉｇＥＴ−３と呼ばれる不活性な３８〜４１アミノ酸中間体に切断される（Ｓｅｉｄａｈら，１９９３，Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８０：１３５−１４６）。次に各ｂｉｇＥＴのカルボキシ末端は、保存されたＴｒｐ２１−Ｖａｌ／Ｉｌｅ２２間でタンパク質加水分解的に切断されて、活性なエンドセリンペプチド（すなわち、それぞれＥＴ−１、ＥＴ−２またはＥＴ−３）を生成する。ｂｉｇＥＴのタンパク質加水分解的切断による活性エンドセリンの産生を担う酵素はエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）と呼ばれる。現在までに２種類のＥＣＥ、すなわちエンドセリン変換酵素１（ＥＣＥ−１）およびエンドセリン変換酵素２（ＥＣＥ−２）が開示されている。
【０００７】
Ｍａｓａｋｉらに対し１９９３年７月２７日に発行された米国特許第５，２３１，１６６号にはエンドセリン−２が開示され、クレームされている。
【０００８】
Ｍａｓａｋｉらに対し１９９４年３月１５日に発行された米国特許第５，２９４，５６９号には、エンドセリン−２をコードするＤＮＡ分子が開示され、クレームされている。
【０００９】
Ｍａｓａｋｉらに対し１９９６年８月２０日に発行された米国特許第５，５４８，０６１号には、エンドセリン−３が開示され、クレームされている。
【００１０】
Ｍａｓａｋｉらに対し１９９８年９月２２日に発行された米国特許第５，８１１，２６３号には、エンドセリン−３をコードするＤＮＡ分子が開示され、クレームされている。
【００１１】
Ｙａｎａｇｉｓａｗａに対し１９９７年１１月１８日に発行された米国特許第５，６８８，６４０号には、ウシＥＣＥ−１を利用したＥＣＥ−１調節物質のスクリーニング方法が開示され、クレームされている。
【００１２】
Ｘｕら（１９９４，Ｃｅｌｌ　７８：４７３−４８５）には、ウシＥＣＥ−１をコードするｃＤＮＡと、それに付随するウシＥＣＥ−１のアミノ酸配列が開示されている。
【００１３】
Ｙａｎａｇｉｓａｗａに対し１９９８年４月７日に発行された米国特許第５，７３６，３７６号には、ウシＥＣＥ−２を含んでなる組成物が開示され、クレームされている。
【００１４】
ＥｍｏｔｏおよびＹａｎａｇｉｓａｗａ（１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２５）：１５２６２−１５２６８）には、ウシＥＣＥ−２をコードするｃＤＮＡと、それに付随するウシＥＣＥ−２のアミノ酸配列が開示されている。
【００１５】
エンドセリンの特異的アンタゴニストが血管疾患モデルで決定的な役割を果たしうることを示す一群の研究がある（例えばＯｈｌｓｔｅｉｎら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：８０５２−８０５６；Ｃｌｏｚｅｌら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ　３６５：７５９−７６１；Ｇｉａｉｄら，１９９３，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｃｄ．３２８：１７３２−１７４０；Ｄｏｕｇｌａｓら，１９９４，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｓｃｉ　１５：３１３−３１６を参照されたい）。このようなエンドセリンレベルの調節物質は高血圧、アテローム動脈硬化および血管再狭窄、心筋虚血、脳血管攣縮およびクモ膜下出血、うっ血性心不全、糖尿病、エンドトキシンショック、片頭痛、あるいはレイノー現象などの疾患（これらを概観するにはＯｈｉｓｔｅｉｎら著「末梢エンドセリンレセプターによって媒介される機能」Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔ（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカラトン、１９９５年）の第６章、１０９〜１８５頁を参照されたい）ならびに喘息、肺高血圧症および成人呼吸窮迫症候群などの肺疾患の処置に役立ちうる（Ｊｏｒｋａｓｋｙら著「ヒト疾患におけるエンドセリンの役割：その意味と考えうる治療的介入」Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔ（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカラトン、１９９５年）の第８章、２１５〜２７１頁も参照されたい）。
【００１６】
上述のようにＥＣＥが同定されているにも関わらず、ヒトエンドセリンおよびエンドセリンレセプターが関与する事象のカスケードで活性を示す他のＥＣＥ、特に新規ヒトＥＣＥを同定することは有益だろう。Ｘｕら（前掲）が指摘しているように、ウシＥＣＥ−１およびウシＥＣＥ−２はｂｉｇＥＴ−２またはｂｉｇＥＴ−３よりもｂｉｇＥＴ−１基質に強い選択性を持つことから、さらなるＥＣＥが存在して異なる基質特異性を持つ可能性がある。本発明は、ヒトＥＣＥ−３の一形態を発現させる単離された核酸断片、この核酸断片を保有する組換えベクター、ヒトＥＣＥ−３および／または生物学的に活性なその等価物を発現する組換え宿主細胞、ならびにヒトＥＣＥ−３および／または組換えＥＣＥ−３タンパク質をコードするＤＮＡ分子を使って、エンドセリン産生およびエンドセリンレセプター機能に直接作用するＥＣＥ−３および他のＥＣＥ型の調節物質を選択する方法を開示することにより、これらの要求に取り組み、その要求を満たすものである。
【００１７】
（発明の開示）
本発明は、新規ヒトエンドセリン変換酵素ＥＣＥ−３をコードする単離または精製された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は実質的に他の核酸を含まない。
【００１８】
本発明は新規ヒトエンドセリン変換酵素ＥＣＥ−３を発現させるｍＲＮＡをコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、このＤＮＡ分子は本明細書に配列番号１として開示するヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１９】
また本発明は、新規ヒトエンドセリン変換酵素ＥＣＥ−３を発現させるｍＲＮＡをコードする配列番号１の生物学的に活性な断片または突然変異体に関する。そのような生物学的に活性な断片および／または突然変異体は、野生型ＥＣＥ−３タンパク質（例えば配列番号２に記載のＥＣＥ−３タンパク質など）の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣するタンパク質またはタンパク質断片をコードするだろう。そのようなポリヌクレオチドはヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を発現させるｍＲＮＡをコードし、ＥＣＥ−３機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに役立つようになっている。
【００２０】
本発明のこの部分の好ましい態様を新規ＥＣＥ−３タンパク質をコードするヒトｃＤＮＡ分子（配列番号１）、図１Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに開示する。
【００２１】
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖（コーディング鎖またはノンコーディング鎖）であっても二本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成一本鎖ポリヌクレオチドなどの合成ＤＮＡを包含しうる。本発明の単離された核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）も包含しうる。
【００２２】
また本発明は、本明細書に開示する実質的に精製された核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主（原核宿主および真核宿主）に関する。
【００２３】
また本発明は、本発明の核酸によってコードされるタンパク質を含有する組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞ならびに安定に形質転換された細胞および一過性に形質転換された細胞）の細胞膜画分に関する。これらの細胞膜画分は内因性レベルより実質的に高いレベルの野生型または突然変異型ヒトＥＣＥ３タンパク質を含み、それゆえ本明細書に記載する様々なアッセイに有用だろう。本発明のＥＣＥにとって好ましい真核細胞下膜部位には細胞膜および細胞内ゴルジ膜が含まれる。
【００２４】
また本発明は、図２Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに開示し、配列番号２として記載するアミノ酸配列を含んでなる、実質的に精製された形のヒトＥＣＥ−３タンパク質に関する。
【００２５】
本発明のこの部分の好ましい態様は、配列番号２ならびに図２Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに記載するアミノ酸配列からなるヒトＥＣＥ−３である。
【００２６】
また本発明は、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を与え、ＥＣＥ−３機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む（ただしこれらに限らない）選択的調節物質のスクリーニングに役立つようになっている、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる、ヒトＥＣＥ−３の生物学的に活性な断片および／または突然変異体に関する。
【００２７】
本発明の好ましい一態様を新規ヒトＥＣＥ−３のアミノ酸配列、図２Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに開示する。エンドセリン変換酵素−３はｂｉｇＥＴ前駆体の切断による活性型エンドセリンＥＴ−１、ＥＴ−２およびＥＴ−３の生成に関与するＥＣＥ酵素ファミリーの新規メンバーである。ＥＣＥファミリーのヒト型新規メンバーの単離、特徴づけおよび開示により、ヒトにおけるエンドセリン経路の選択的調節物質を同定するためのより洗練された方法が可能になるだろう。標的となりうる疾患は網羅的［関連文献の一覧については例えばＸｕら（１９９４，Ｃｅｌｌ　７８：４７３−４８５）を参照されたい］であり、全身性高血圧症におけるエンドセリンの関与はとりわけ好ましい専門領域である。したがって、過去に他のエンドセリン変換酵素は単離されているが、それらはエンドセリンの産生または作用の説明になっていない。本発明の利点は、本発明によってエンドセリン産生を担う生合成酵素ファミリーの新しいメンバーが同定され、新しい薬物標的候補になることである。したがって本発明の産物および方法は、エンドセリンの産生、代謝および生物学の研究にも役立つばかりでなく、例えば高血圧症、血管痙攣または他の血管障害などといった本明細書に挙げる様々な疾患に対して治療効果を持ちうる本酵素の阻害剤に関する候補化合物選別にも役立つだろう。
【００２８】
また本発明は、ヒト型ＥＣＥ−３または生物学的に活性なその断片に反応して産生されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体に関する。
【００２９】
また本発明は、野生型脊椎動物ＥＣＥ−３を調節する化合物を同定するためのアッセイに有用な融合タンパク質を発現させる融合構築物である単離された核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＥＣＥ−３融合コンストラクト、例えばヒトＥＣＥ−３の細胞内または内腔内（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ）ドメインをＧＳＴ遺伝子のカルボキシ末端へのインフレーム融合物として含んでいるもの、または当業者に知られている方法によってＧＳＴのアミノ末端に融合されたＥＣＥ−３の細胞外および膜貫通リガンド結合ドメインを含むもの、または免疫グロブリン遺伝子に融合したＥＣＥ−３の細胞外および膜貫通ドメインを含むものなどが包含される。可溶性組換えＧＳＴ−ＥＣＥ−３融合タンパク質は、例えばバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、様々な発現系で発現させることができる。そのような融合コンストラクトはＥＣＥ−３に対する抗体の産生にも役立ちうる。
【００３０】
したがって本発明は、本明細書に開示するヒトＥＣＥ−３タンパク質およびその生物学的等価物を発現させる方法、これらの遺伝子産物を使用するアッセイ、これらのタンパク質を発現させるＤＮＡコンストラクトを含んでなる組換え宿主細胞、およびこれらのアッセイによって同定されるＥＣＥ−３活性またはエンドセリン経路の他の成分のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物に関する。
【００３１】
本発明の目的は、新しい型のヒトＥＣＥ−３またはヒトＥＣＥ−３断片、配列番号２の突然変異体または誘導体をコードする単離された核酸分子（例えば配列番号１）を提供することである。そのようなポリヌクレオチドはヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を発現させるｍＲＮＡをコードし、脊椎動物ＥＣＥ−３機能の選択的調節物質に関するスクリーニングに役立つようになっている。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、上記の核酸分子によってコードされるＥＣＥ−３タンパク質またはタンパク質断片を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、ヒトＥＣＥ−３またはその生物学的等価物をコードする核酸配列を含んでなる組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提供することである。
【００３４】
本発明の目的は、配列番号２に記載する実質的に精製された形のヒトＥＣＥ−３タンパク質を提供することである。
【００３５】
本発明の目的は、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療および／または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を与えるようになっている、例えば配列番号２に記載するような、ヒトＥＣＥ−３タンパク質の生物学的に活性な断片および／または突然変異体を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、ヒトＥＣＥ−３を含んでなる実質的に精製された細胞下画分、特に配列番号２ならびに図２Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに記載のアミノ酸を含んでなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞から得られる細胞下画分を提供することである。
【００３７】
また、ＥＣＥ−３に基づくインフレーム融合構築物、それら融合コンストラクトを発現させる方法、本明細書に記載の生物学的等価物、関連するアッセイ、これらのコンストラクトを発現させる組換え細胞、ならびに脊椎動物、哺乳類および／またはヒトＥＣＥ−３タンパク質をコードする核酸ならびに発現されたタンパク質そのものを使用することによって同定されるアゴニストおよび／またはアンタゴニスト化合物を提供することも、本発明の目的である。
【００３８】
また、ＥＣＥ−３もしくはＥＣＥ−３またはその生物学的等価物を含有する膜調製物を使って、ＥＣＥ−３活性の調節物質（好ましくは選択的調節物質）に関するスクリーニングを行なうことも、本発明の目的である。そのような化合物は、高血圧、アテローム性動脈硬化および血管再狭窄、心筋虚血、脳血管攣縮、脳虚血およびクモ膜下出血、うっ血性心不全、糖尿病、良性前立腺肥大、勃起障害、腎疾患および腎不全、エンドトキシンショック、片頭痛、あるいはレイノー現象などの疾患状態、ならびに喘息、肺高血圧症および成人呼吸窮迫症候群などの肺疾患の診断、治療および／または予防的適応に役立ちうる。
【００３９】
本明細書にいう「他の核酸を実質的に含まない」とは、他の核酸を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．９％含まないことを意味する。したがって他の核酸を実質的に含まないＥＣＥ−３　ＤＮＡ調製物は、その総核酸量に対する百分率として、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の非ＥＣＥ−３核酸を含有するだろう。与えられたＥＣＥ−３　ＤＮＡ調製物が実質的に他の核酸を含まないかどうかは、適当な染色法（例えば臭化エチジウム染色）と組み合わせたアガロースゲル電気泳動などの従来の核酸純度評価法によって、または配列決定によって決定できる。
【００４０】
本明細書にいう「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」とは、他のタンパク質を少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．９％含まないことを意味する。したがって他のタンパク質を実質的に含まないＥＣＥ−３タンパク質調製物は、その総タンパク質量に対する百分率として、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の非ＥＣＥ−３タンパク質を含有するだろう。与えられたＥＣＥ−３タンパク質調製物が実質的に他の核酸を含まないかどうかは、適当な検出法（例えば銀染色または免疫ブロット法）と組み合わせたドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの従来のタンパク質純度評価法によって決定できる。「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」という用語と互換的に使用される「単離されたＥＣＥ−３タンパク質」または「精製されたＥＣＥ−３タンパク質」という用語も天然の供給源から単離されたＥＣＥ−３タンパク質を指す。「単離された」または「精製された」という用語の使用は、そのＥＣＥ−３タンパク質がそれ本来の細胞環境から取り出されていることを示す。したがって単離されたＥＣＥ−３タンパク質は無細胞溶液中に存在してもよいし、それが天然に存在する時の細胞環境とは異なる細胞環境に存在してもよい。単離されたという用語は、単離されたＥＣＥ−３タンパク質が唯一存在するタンパク質であることを意味するのではなく、単離されたＥＣＥ−３タンパク質がインビボでそのＥＣＥ−３タンパク質に本来付随している他のタンパク質および非アミノ酸物質（例えば核酸、脂質、糖質）を実質的に含まないことを意味する。したがって、本来であれば（すなわち人間の介入がなければ）そのＥＣＥ−３タンパク質を発現させない原核細胞または真核細胞中で組換え技術によって発現されるＥＣＥ−３タンパク質は「単離されたＥＣＥ−３タンパク質」である。上述のように、単離または精製されたＥＣＥ−３タンパク質であるＥＣＥ−３タンパク質調製物は他のタンパク質を実質的に含まず、その総タンパク質量に対する百分率として１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の非ＥＣＥ−３タンパク質を含有するだろう。
【００４１】
本明細書で互換的に使用される「機能的等価物」または「生物学的に活性な等価物」という用語は、選択的スプライシング、欠失、突然変異、置換または付加などにより天然に存在するＥＣＥ−３と正確には同じアミノ酸配列を持たないが、ＥＣＥ−３と実質的に同じ生物学的活性を保持しているタンパク質を意味する。そのような機能的等価物は天然に存在するＥＣＥ−３と有意なアミノ酸配列同一性を有し、そのような機能的等価物をコードする遺伝子およびｃＤＮＡは、天然に存在するＥＣＥ−３をコードするＤＮＡ配列とのストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーションによって検出できる。本発明では、天然に存在するＥＣＥ−３は配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１によってコードされる。機能的等価物をコードする核酸は配列番号１に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約５０％の同一性を有する。
【００４２】
本明細書にいう「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基の、化学的に類似する別のアミノ酸残基による置換を指す。そのような保存的置換の例は、ある疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）による別の疎水性残基の置換、ある極性残基による同じ電荷を持つ別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換）である。
【００４３】
本明細書で使用する「ＥＣＥ」はエンドセリン変換酵素を指す。
本明細書で使用する「ＥＣＥ−１」はエンドセリン変換酵素−１を指す。
本明細書で使用する「ＥＣＥ−２」はエンドセリン変換酵素−２を指す。
本明細書で使用する「ＥＣＥ−３」はエンドセリン変換酵素−３を指す。
本明細書で使用する用語「哺乳類宿主」はヒトを含む任意の哺乳動物を指す。
【００４４】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ〜Ｂは配列番号１に記載のヒトＥＣＥ−３をコードするヌクレオチド配列を示す。
図２Ａ〜Ｂは配列番号２に記載のヒトＥＣＥ−３のアミノ酸配列を示す。
図３Ａ〜Ｄは組織特異的ヒトｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフィーを示す。このノーザン解析は、ヒトＥＣＥ−３遺伝子が延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、尾状核、黒質、視床および精巣では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現されることを示している。
図４Ａ〜ＦはヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は新規ヒトエンドセリン変換酵素−３（ＥＣＥ−３）をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は他の核酸を実質的に含まない。大半のクローニング目的にはＤＮＡが好ましい核酸である。
【００４６】
本発明は、新規ヒトＥＣＥ−３を発現させるｍＲＮＡをコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、このＤＮＡ分子は下記配列番号１に開示するヌクレオチド配列を含んでなる：
【００４７】
【化５】
2004500023.tif 000003
2004500023.tif 000004
2004500023.tif 000005
【００４８】
図１Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに示し配列番号１として記載する、上に例示した単離ＤＮＡ分子は、２８９４ヌクレオチドを含有する。このＤＮＡ分子はヌクレオチド２１２（ヌクレオチド２１２〜２１４の開始Ｍｅｔ）からヌクレオチド２５３６までのオープンリーディングフレームを含有し、ヌクレオチド２５３７〜２５３９に「ＴＧＡ」停止コドンを持つ。コザック配列（ＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧ［配列番号１のｎｔ２０６〜２１５に含まれる］）が存在し、ポリＡ＋部位が配列番号１のｎｔ２８６６〜２８８６に認められる。このオープンリーディングフレームは、本発明の好ましい形態であるヒトＥＣＥ−３タンパク質をコードする。ＥＣＥ−３タンパク質は、図２Ａ〜Ｂおよび図４Ａ〜Ｆに示し配列番号２に記載する７７５アミノ酸長のオープンリーディングフレームを含有する。放射線照射ハイブリッドマッピングにより、この遺伝子は、染色体２ｑ３７の、論理的にＥＣＥ突然変異に起因するかもしれないどのヒト疾患とも関連づけられていない領域に割り当てられる。ノーザン解析によると、この遺伝子は延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、精巣、尾状核、黒質および視床では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現される（図３Ａ〜３Ｄ）。
【００４９】
ＥＣＥ−３をコードする完全長ｃＤＮＡは、まず公共ＥＳＴデータベースを検索することによって単離された。ここでは、エンドセリンファミリーの第３のメンバーに相当するＥＳＴが見出され、ＥＳＴシークエンシングとＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）によって完全長配列が単離された。エンドセリン変換酵素を捜すユニジーン検索により、３つのＥＳＴからなりラットＥＣＥ−１と４４％の類似性を持つと注釈されたインデックスクラスＨｓ．２６８８０がヒットする。それら３つのＥＳＴは、２つのＩｍａｇｅクローン（ＡＡ５２３５２７、［Ｒ６１４４０、Ｒ６１３９５］）に相当する。Ｒ６１４４０は６０６ｂｐ長の５’ＥＳＴ（配列番号３）であり、これは全長ＥＳＴの一部のみに６０％の類似性（１６７／２７６ｂｐ）を示すＫＩＡＡ０６０４をヒットする。類似するＥＳＴは公共データベースのこの検索では見つからなかった。２つの３’ＥＳＴ配列（配列番号４および５）は互いに同一であり、他のＥＳＴとは一致しなかった。各ＥＳＴのヌクレオチド配列（配列番号３〜５）は米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得られると共に、本明細書の実施例１に開示する。
【００５０】
また本発明は、ＥＣＥ−３を発現させるｍＲＮＡをコードする配列番号１の生物学的に活性な断片または突然変異体に関する。そのような生物学的に活性な断片および／または突然変異体は、例えば配列番号２に記載のヒトＥＣＥ−３（ただしこれに限らない）を含むヒトＥＣＥ−３タンパク質の酵素的性質を少なくとも実質的に模倣するタンパク質またはタンパク質断片をコードするだろう。そのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を発現させるｍＲＮＡをコードし、ＥＣＥ−３機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストおよび／またはエンドセリンレセプター経路の他の成分の調節物質に関するスクリーニングに役立つようになっている。
【００５１】
本発明のこの部分の好ましい態様を、ヒトＥＣＥ−３をコードするｃＤＮＡ分子（配列番号１）、図１Ａ〜Ｂに開示する。
【００５２】
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖（コーディング鎖またはノンコーディング鎖）であっても二本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成一本鎖ポリヌクレオチドなどの合成ＤＮＡを包含しうる。本発明の単離された核酸分子はリボ核酸分子（ＲＮＡ）も包含しうる。
【００５３】
遺伝コードの縮重は、２つのアミノ酸を除く全てのアミノ酸について、２以上のコドンが特定の一アミノ酸をコードしているというものである。そのため、配列番号１のヌクレオチド配列とはかなり異なるが、それでもなお配列番号１と同じＥＣＥ−３タンパク質をコードしているような、ＥＣＥ−３タンパク質をコードする合成ＤＮＡの構築が可能にある。そのような合成ＤＮＡは本発明の範囲に包含されるものとする。そのような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞または宿主細胞中で発現させることが望ましい場合は、そのような合成ＤＮＡのコドン使用頻度を、その特定宿主のコドン使用頻度を反映するように調整して、その宿主でＥＣＥ−３タンパク質が高レベルに発現されるようにすることができる。言い換えれば、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンのこの冗長性は、本発明の範囲に包含される。したがって本発明は、以下に示すように最終的に同じアミノ酸に翻訳される代替コドンを含んでなるＲＮＡをコードするＤＮＡ配列にも向けられる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００５４】
したがって本発明は、同一のタンパク質を発現させる異なるＤＮＡ分子をもたらしうるコドン冗長性を開示する。本明細書では、１または複数の代替コドンを保持する配列を縮重変異体と定義する。また、発現されるタンパク質の最終的な物理的性質を実質的に変化させないＤＮＡ配列中もしくは翻訳されたタンパク質中の突然変異も、本発明の範囲に包含される。例えばバリンによるロイシンの置換、アルギニンによるリジンの置換、またはアスパラギンによるグルタミンの置換などは、ポリペプチドの機能性を変化させないだろう。
【００５５】
あるペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドとは異なる性質を持つペプチドをコードするように改変しうることは知られている。ＤＮＡ配列を改変する方法には部位特異的突然変異誘発法が含まれるが、これに限らない。改変される性質の例には、基質に対する酵素の親和性またはリガンドに対するレセプターの親和性の変化が含まれるが、これらに限らない。
【００５６】
また本発明は、本明細書に開示する実質的に精製された核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主（真核および原核宿主）に関する。ＥＣＥ−３の全部または一部をコードする本発明の核酸分子は、他のＤＮＡ分子、すなわちヒトＥＣＥ−３が本来連結されていないＤＮＡ分子に連結して、ＥＣＥ−３をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成させることができる。本発明の新規ＤＮＡ配列は、ヒトＥＣＥ−３またはその機能的等価物をコードする核酸を含んでなるベクターに挿入することができる。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡからなることができ、大半のクローニング目的にはＤＮＡベクターが好ましい。典型的ベクターにはプラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびＥＣＥ−３タンパク質をコードできる他の形のエピソームＤＮＡまたは組込み型ＤＮＡが含まれる。特定の遺伝子導入または他の用途に適したベクターの決定は、当業者の能力で十分に可能である。
【００５７】
ストリンジェントな条件で配列番号１にハイブリダイズするＤＮＡ配列は本発明に包含される。一例として高ストリンジェンシー条件を用いる方法を以下に述べるが、これに限るわけではない。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、６５℃で２時間〜終夜行なう。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間行なう。次に、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間の洗浄を行なった後、オートラジオグラフィーを行なう。高ストリンジェンシー条件を使った他の方法としては、ハイブリダイゼーションステップを５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、５０％ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうか、洗浄ステップを０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６０分間行なう方法が挙げられる。
【００５８】
上記の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション実施法で挙げた試薬類は当業者ではよく知られている。これらの試薬類の組成の詳細は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）などに記載されている。上記の条件の他に、使用できる他の高ストリンジェンシー条件も当業者ではよく知られている。
【００５９】
また本発明は、図２Ａ〜Ｂに開示し配列番号２に記載するアミノ酸配列を含んでなる実質的に精製された形のヒトＥＣＥ−３タンパク質に関する。
【００６０】
また本発明は、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断（ただし必ずしもこれらに限らない）を含み、これらの突然変異が診断、治療または予防に役立つタンパク質またはタンパク質断片を与え、ＥＣＥ−３機能またはエンドセリンシグナル経路の他の成分のアゴニストおよび／またはアンタゴニストのスクリーニングに役立つようになっている、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる、ヒトＥＣＥ−３タンパク質の生物学的に活性な断片および／または突然変異体に関する。
【００６１】
本発明の好ましい態様を図２Ａ〜Ｂに示し、配列番号２に三文字コードで記載すると共に、以下に示す：
【００６２】
【化６】
2004500023.tif 000006
2004500023.tif 000007
。この配列は野生型ヒトＥＣＥ−３タンパク質のアミノ酸配列を含んでなる。
【００６３】
多くの酵素と同様に、ＥＣＥ−３のアミノ酸の多く（特に活性部位内にないアミノ酸または活性部位と接触していないアミノ酸）を改変し、依然として野生型タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を保つことができる。したがって本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を持つが依然としてＥＣＥ−３と実質的に同じ生物学的活性を保っている改変ＥＣＥ−３ポリペプチドを包含する。一アミノ酸置換がタンパク質の生物学的活性を通常、変化させないことは一般に認められている（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ（Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）の２２６頁ならびにＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって本発明は、１つのアミノ酸置換が配列番号２に施されているポリペプチドであって、そのポリペプチドが依然としてＥＣＥ−３と実質的に同じ生物学的活性を保っているポリペプチドを包含する。また本発明は、２またはそれ以上のアミノ酸置換が配列番号２に施されているポリペプチドであって、そのポリペプチドが依然としてＥＣＥ−３と実質的に同じ生物学的活性を保っているポリペプチドも包含する。特に本発明は上述の置換が保存的置換である態様を包含する。特に本発明は、上述の置換がＥＣＥ−３の活性部位内では行なわれない態様を包含する。
【００６４】
また、ＥＣＥ−３の機能的等価物であって、アミノ酸の小さい欠失または挿入であるＥＣＥ−３アミノ酸配列の変化を持つポリペプチドも、同じ指針に従って（すなわちＥＣＥ−３と関連タンパク質の間のアミノ酸配列の相違を最小にすることによって）作製できることは、当業者に理解されるだろう。小さい欠失または挿入は一般に約１〜５アミノ酸の範囲である。改変ＥＣＥ−３ポリペプチドの生物学的活性に対するこのような小さい欠失または挿入の影響は、そのポリペプチドを合成的に製造するか、またはＥＣＥ−３をコードするＤＮＡに必要な改変を施した後、そのＤＮＡを組換え発現させ、そのような組換え発現によって産生されたタンパク質をアッセイすることによって、容易に測定できる。
【００６５】
本発明は酵素の活性部位を含む領域を含有する切断型のＥＣＥ−３も包含する。そのような切断型タンパク質は、本明細書に記載する様々なアッセイ、結晶化および構造活性相関研究に有用である。
【００６６】
また本発明は、本発明の核酸分子を含有する組換え宿主細胞（原核宿主細胞および真核宿主細胞であって安定に形質転換された細胞および一過性に形質転換された細胞）から得られる粗製のまたは実質的に精製された細胞膜画分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に関する。これらの組換え宿主細胞は、翻訳後に生物学的に活性な形で適当な膜（細胞膜またはゴルジ膜など）に結合した状態になるＥＣＥ−３またはその機能的等価物を発現させる。これらの細胞膜画分は野生型または突然変異型のヒトＥＣＥ−３を、内因性レベルを実質的に上回るレベルで含み、それゆえ本明細書に記載する様々なアッセイに役立つだろう。言い換えれば、このような細胞下膜の具体的使用法では、組換え細胞内でＥＣＥ−３を発現させた後、膜を他の細胞成分から単離し、実質的に精製する。原核または真核宿主細胞（ヒト組換え宿主細胞株を含む）から回収できるこれらの実質的に精製された膜調製物は、ｂｉｇＥＴ前駆体から各エンドセリンへのＥＣＥ−３触媒作用に対する試験物質の影響を決定するためのアッセイにとりわけ役立つだろう。
【００６７】
また本発明は、野生型脊椎動物ＥＣＥ−３活性を調節する化合物を同定するためのアッセイおよびヒトＥＣＥ−３に対する抗体の産生に役立つ融合タンパク質を発現させる融合構築物である単離された核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＥＣＥ−３融合コンストラクト、例えばヒトＥＣＥ−３の細胞内ドメインをＧＳＴ遺伝子のカルボキシ末端へのインフレーム融合物として含んでいるもの、または当業者に知られている方法によってＧＳＴまたは免疫グロブリンに融合されたＥＣＥ−３の細胞外および膜貫通リガンド結合ドメインを含むものなどが包含される。組換えＧＳＴ−ＥＣＥ−３融合タンパク質は、例えばバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、様々な発現系で発現させることができる。
【００６８】
ヒトＥＣＥ−３のクローニングには様々な方法を使用できる。これらの方法には以下の方法があるが、これらに限るわけではない。（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２）。５’および／または３’ＲＡＣＥを行なって完全長ｃＤＮＡ配列を得ることができる。この戦略では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使ってヒトＥＣＥ−３  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行なう。これらの遺伝子特異的プライマーは、いくつかの公共核酸およびタンパク質データベースを検索することによって同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定によって設計される。（２）ヒトＥＣＥ−３含有ｃＤＮＡライブラリーを適当な発現ベクター系に構築してから行なわれるヒトＥＣＥ−３  ｃＤＮＡの直接的な機能発現。（３）ヒトＥＣＥ−３タンパク質のアミノ酸配列から設計された標識縮重オリゴヌクレオチドプローブを使った、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトＥＣＥ−３含有ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。（４）ヒトＥＣＥ−３タンパク質をコードする部分ｃＤＮＡを使った、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトＥＣＥ−３含有ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。この部分ｃＤＮＡは、ヒトＥＣＥ−３タンパク質と近縁関係にある他のキナーゼについて知られているアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトＥＣＥ−３  ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる。（５）哺乳類ＥＣＥ−３タンパク質に相同な部分ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを使った、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトＥＣＥ−３含有ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング。この戦略でも、上述のようにＥＳＴとして同定されたヒトＥＣＥ−３  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。または（６）既知のＲＡＣＥ法によって完全長ｃＤＮＡが得られるように、またはヒトＥＣＥ−３をコードする完全長型のヌクレオチド配列を単離する目的で様々なタイプのｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリーの一つをスクリーニングするためのプローブとして使用されるコード領域の一部を生成し単離するために、同じ既知のＲＡＣＥ法によってコード領域の一部を得ることができるように、配列番号１をテンプレートとして使用して５’および３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計する。
【００６９】
他のタイプのライブラリーおよび他の細胞タイプまたは種タイプから構築されたライブラリーがヒトＥＣＥ−３コードＤＮＡまたはヒトＥＣＥ−３ホモログの単離に役立ちうることは、当業者にはすぐにわかるだろう。他のタイプのライブラリーには、他のヒト細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーが含まれるが、これに限るわけではない。
【００７０】
適切なｃＤＮＡライブラリーをＥＣＥ−３活性を持つ細胞または細胞株から調製できることは当業者にはすぐにわかるだろう。ヒトＥＣＥ−３をコードするｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの作製に使用される細胞または細胞株の選択は、細胞に付随するＥＣＥ−３活性をそのような目的に利用できる既知のアッセイを使ってまず測定することによって行なうことができる。
【００７１】
ｃＤＮＡライブラリーの作製は、当業者に既知の標準的方法によって行なうことができる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）などに記載されている。相補ＤＮＡライブラリーは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．やＳｔｒａｔａｇｅｎｅなど、数多くの商業的供給源から入手することもできる。
【００７２】
また、ヒトＥＣＥ−３をコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離できることも、当業者にはすぐにわかるだろう。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業者に既知の標準的技術によって行なうことができる。周知のゲノムライブラリー構築法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）などに記載されている。ＥＣＥ−３遺伝子を含有するゲノムクローンは、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（アラバマ州ハンツビル）などの市販のヒトＰＡＣまたはＢＡＣライブラリーから得ることもできる。もう一つの選択肢として、特にＰ１人工染色体ベクター中にゲノムライブラリーを作製し、そこから、本明細書に開示するＥＣＥ−３ヌクレオチド配列に基づくプローブを使って、ＥＣＥ−３を含有するゲノムクローンを単離することもできる。そのようなライブラリーを製造する方法は当業者で知られている（Ｉｏａｎｎｏｕら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
【００７３】
好ましい方法の一つによってヒトＥＣＥ−３遺伝子をクローン化するには、ヒトＥＣＥ−３または相同タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列が必要だろう。これを得るために、ＥＣＥ−３タンパク質または相同タンパク質を精製し、自動化配列決定装置によって部分アミノ酸配列を決定することができる。部分ヒトＥＣＥ−３  ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅には、全アミノ酸配列を決定する必要はなく、６〜８アミノ酸の２領域の一次配列を決定すればよい。適切なアミノ酸配列が同定されたら、それらをコードすることのできるＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードは縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために２以上のコドンを使用することができ、したがってアミノ酸配列は、類似する一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードすることができる。この一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうち、ヒトＥＣＥ−３配列と一致するのは１つだけだが、その他はミスマッチを持つＤＮＡヌクレオチドの存在下でもヒトＥＣＥ−３  ＤＮＡにハイブリダイズできるだろう。ミスマッチを持つＤＮＡオリゴヌクレオチドは、依然としてヒトＥＣＥ−３  ＤＮＡには十分にハイブリダイズし、ヒトＥＣＥ−３コードＤＮＡの同定と単離を可能にすることができる。もう一つの選択肢として、発現された配列の一領域のヌクレオチド配列を、１または複数の利用可能なゲノムデータベースを検索することによって同定することもできる。遺伝子特異的プライマーは、ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡの集団から関心あるｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するために使用できる。上述のように、ヒトＥＣＥ−３をコードする完全長配列を作製するためのオーバーラップした５’および３’ＲＡＣＥ産物を単離する目的で、または１もしくは複数のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングしてヒトＥＣＥ−３もしくはヒトＥＣＥ−３様タンパク質をコードする完全長配列を単離するためのプローブとして使用されるヒトＥＣＥ−３をコードするヌクレオチド配列の一部を単離するために、ＰＣＲに基づく方法での使用に適したヌクレオチド配列を、配列番号１から得ることができる。
【００７４】
また本発明は、ＥＣＥ−３遺伝子を含有するベクター、そのベクターを含有する宿主細胞、および実質的に純粋なＥＣＥ−３タンパク質を製造する方法であって、ＥＣＥ−３遺伝子を宿主細胞に導入し、その宿主細胞を適当な条件でＥＣＥ−３が産生されるように培養する各ステップを含む方法も包含する。このように製造されたＥＣＥ−３は、従来の方法で宿主細胞から収集できる。したがって本発明は、本明細書に開示するヒトＥＣＥ−３タンパク質およびその生物学的等価物を発現させる方法、それらの遺伝子産物を使用するアッセイ、これらのタンパク質を発現させるＤＮＡコンストラクトを含んでなる組換え宿主細胞、およびＥＣＥ−３活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するこれらのアッセイによって同定される化合物にも関する。
【００７５】
組換えヒトＥＣＥ−３を製造するために、上記の方法によって得られるクローン化ヒトＥＣＥ−３  ｃＤＮＡを、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節配列を含有する発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８など）に分子クローニングし、原核または真核宿主細胞に導入することによって組換え発現させることができる。そのような操作を行なうための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載されており、実施例にも詳細に説明すると共に、当業者にはよく知られており、容易に利用できる。したがって本発明のもう一つの態様は、ＥＣＥ−３をコードするＤＮＡ配列を含有および／または発現するように操作された宿主細胞を包含する。ヒトＥＣＥ−３様タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞でのヒトＥＣＥ−３の発現に使用できる。そのような組換え宿主細胞は、ＥＣＥ−３またはその生物学的等価物を産生するのに適した条件で培養できる。組換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、例えば大腸菌などの細菌、酵母などの真菌細胞、哺乳類細胞（例えばヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株など）および昆虫細胞（例えばショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞株など）が挙げられるが、これらに限らない。
【００７６】
例えばある昆虫発現系ではＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をバキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に使用する。また、好適であり市販されている哺乳動物種には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ　ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）およびＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２０９）などがあるが、これらに限るわけではない。
【００７７】
本発明は、ヒトＥＣＥ−３タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物のスクリーニング法にも向けられる。これらの活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質有機分子でありうる。化合物はヒトＥＣＥ−３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現またはヒトＥＣＥ−３の機能を増減することによって調節しうる。ヒトＥＣＥ−３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現またはその生物学的機能を調節する化合物は、様々なアッセイで検出できる。このアッセイは発現または機能の変化があるかどうかを決定する「○×式」アッセイであってもよい。アッセイは、試験試料の発現または機能を標準試料中の発現または機能レベルと比較することによって定量的に行なうことができる。ヒトＥＣＥ−３、ヒトＥＣＥ−３に対する抗体、または改変ヒトＥＣＥ−３を含有するキットは、そのような用途のために既知の方法によって製造できる。
【００７８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はＥＣＥ−３タンパク質の発現に特に適している。なぜならこれらの細胞は多数のＧタンパク質（ＥＴＡおよびＥＴＢを含む）を発現させ、極わずかなＥＣＥ活性しか含有しないからである（Ｘｕら，１９９４，Ｃｅｌｌ　７８：４７３−４８５）。したがって、少なくともエンドセリンレセプターＥＴＡまたはＥＴＢは、ＥＣＥ−３の触媒活性によって生成するエンドセリンペプチドとの相互作用によって生成するシグナルを機能的に共役させて、このシグナルを下流のエフェクターに伝達し、最終的にはアッセイ可能な何らかの成分（例えばｃＡＭＰレベル、レポーター遺伝子の発現、イノシトール脂質の加水分解または細胞内Ｃａ２＋レベルなど）の測定可能な変化をもたらすことができるだろう。当業者は、ヒトＥＣＥ−３を発現させるＤＮＡ分子またはＤＮＡベクターおよびエンドセリンレセプター（ヒトＥＴＡまたはヒトＥＴＢレセプターを含むがこれに限らない）を発現させるＤＮＡ分子またはＤＮＡベクターで安定にまたは一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を作製することもできる。また当業者は、ヒトＥＣＥ−３を発現させるＤＮＡ分子またはＤＮＡベクター、エンドセリンレセプター（ヒトＥＴＡまたはヒトＥＴＢレセプターを含むがこれに限らない）を発現させるＤＮＡ分子またはＤＮＡベクター、およびエンドセリンプレプロポリペプチドまたは各ｂｉｇＥＴポリペプチドを発現させるＤＮＡ分子またはベクターで安定にまたは一過性にトランフェクトされたＣＨＯ細胞株を作製することもできる。このテーマには、例えば異なる細胞株、エンドセリン経路に由来するＤＮＡ分子またはＤＮＡベクターの異なる組み合わせ、および関心あるＤＮＡ分子またはベクターの安定なまたは一過性のトランスフェクションなど、当業者には明白なバリエーションが数多くあるが、細胞株の構築は、ＥＣＥ−３活性の調節物質またはエンドセリン経路中の別のステップの調節物質について試験するために細胞に基づくアッセイを行なうという目的に役立つ。例えば、ヒトＥＣＥ−３とプレプロポリペプチドをそれぞれ発現させるＤＮＡ分子またはＤＮＡベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞などの細胞は、ＥＣＥ−３活性を調節する化合物を選択するためのアッセイに役立つだろう。これらの二重形質転換細胞または二重トランスフェクト細胞をヒトＥＣＥ−３およびエンドセリンプレプロポリペプチドを発現させるのに十分な時間生育させ、ｂｉｇＥＴ基質を生成させる。トランスフェクト細胞を収集し、試料アッセイ緩衝液（＋試験化合物）および対照アッセイ緩衝液（−試験化合物）に十分な時間再懸濁する。それらの細胞から得た調整培地は、成熟エンドセリンペプチドの存在に関する既知の酵素免疫アッセイ法によって直接アッセイできる。ＥＣＥ−３が触媒するｂｉｇＥＴから成熟エンドセリンへの変換のアンタゴニストは、プロセシングされたエンドセリンの濃度を対照に対して低下させ、一方、ＥＣＥ−３が触媒する成熟エンドセリンへの変換のアゴニストは、対照レベルと比較してエンドセリン濃度を増大させるだろう。
【００７９】
したがって本発明は、組換え系でＥＣＥ−３を発現させる方法およびＥＣＥ−３のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。本発明の新規ＥＣＥ−３タンパク質は、ｂｉｇＥＴからＥＴへの変換を調節する化合物を同定するためのアッセイ法での使用に適している。本明細書にいうＥＣＥ−３活性の調節には本酵素の阻害または活性化が包含され、ＥＣＥ−３の酵素活性の正常な制御に直接または間接的影響を及ぼすことも包含される。ＥＣＥ−３を調節する化合物には、アゴニスト、アンタゴニストおよびヒトＥＣＥ−３の制御に直接的または間接的影響を及ぼす化合物が包含される。標的タンパク質と特異的に相互作用する医薬候補を同定するために化合物をスクリーニングする場合は、同定される化合物がその標的タンパク質に対してできる限り特異的であることを保証する必要がある。これを達成するには、標的レセプターに類似するできる限り広範な一連のタンパク質に対して、それら化合物をスクリーニングする必要があるかもしれない。したがって、ＥＣＥ−３と相互作用する医薬候補である化合物を発見するには、その化合物がＥＣＥ−３（「プラス標的」）と相互作用してＥＣＥ−３を介して所望の薬理作用をもたらすことを保証するだけでなく、タンパク質Ｂ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）とは相互作用しない化合物を決定する必要がある。一般に、スクリーニングプログラムの一部としてできるだけ多くのマイナス標的を設けることが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：９７３−９８０の９８０頁を参照されたい）。ヒトＥＣＥ−３タンパク質およびこのタンパク質をコードするＤＮＡ分子には、ＥＴ−１、ＥＴ−２および／またはＥＴ−３のシグナル伝達を達成するエンドセリン経路の他の成分（ＥＣＥ−１およびＥＣＥ−２を含むがこれに限らない）と特異的に相互作用する化合物を同定するために設計されたスクリーニングで「マイナス標的」として使用できるという点でも有用性がある。
【００８０】
本発明の一態様は、ある物質がＥＣＥ−３のアゴニスト候補またはアンタゴニスト候補であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）ＥＣＥ−３をコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、
（ｂ）そのトランスフェクト細胞を、ＥＣＥ−３を発現させるのに十分な時間生育させ、
（ｃ）トランスフェクト細胞を収集し、その細胞をＥＣＥ−３の既知の標識したアンタゴニスト（ホスホラミドンを含むがこれに限らない）またはアゴニスト（すなわちＥＣＥ−３のリガンド）の存在下に、当該物質の存在下または不在下で再懸濁し、
（ｄ）ＥＣＥ−３の標識リガンドの結合を測定する、
という各ステップを含み、既知リガンドの結合量が当該物質の存在下で当該物質の不在下より少なければ、当該物質はＥＣＥ−３活性のアゴニスト候補であるとする方法を包含する。上記の方法の変法では、細胞を収集および再懸濁せず、細胞を基層（例えば組織培養プレート）に付着させた状態で、細胞を放射標識した既知リガンドおよび当該物質と接触させるようにステップ（ｃ）が変更される。本研究および本明細書に開示する他の研究で本法のステップ（ｃ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研究に当業者で通例使用される条件、例えば生理的ｐＨ、ＰＢＳなどの一般に使用される緩衝液に代表されるような塩濃度または組織培養培地の塩濃度、約４℃〜約５５℃の温度などである。そのようなリガンドは必ずしも放射標識される必要はなく、結合した放射標識化合物を置換するために使用できる非同位体化合物または機能アッセイで活性化剤として使用できる非同位体化合物であってもよい。上記の方法によって同定される化合物はおそらくＥＣＥ−３のアゴニストまたはアンタゴニストであり、ペプチド、タンパク質または非タンパク質有機分子でありうる。
【００８１】
また本発明は、ある物質がＥＣＥ−３に結合する能力を持つかどうか、すなわち当該物質がＥＣＥ−３のアゴニスト候補またはアンタゴニスト候補であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）細胞内でＥＣＥ−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）その試験細胞を当該物質にばく露し、
（ｃ）ＥＣＥ−３への当該物質の結合量を測定し、
（ｄ）試験細胞におけるＥＣＥ−３への当該物質の結合量を、ＥＣＥ−３をトランスフェクトしていない対照細胞への当該物質の結合量と比較する、
という各ステップを含み、試験細胞での当該物質の結合量が対照細胞と比較して大きければ、当該物質はＥＣＥ−３に結合する能力を持つとする方法も包含する。次に、当該物質が実際にアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかの決定は、機能アッセイ（例えばＥＣＥ−３および関心ある物質の存在下にｂｉｇＥＴからＥＴへの変換を達成する能力に関わるアッセイ）を使って行なうことができる。
【００８２】
本法のステップ（ｂ）を実施する際の条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研究に当業者で通例使用される条件、例えば生理的ｐＨ、ＰＢＳなどの一般に使用される緩衝液に代表されるような塩濃度または組織培養培地の塩濃度、約４℃〜約５５℃の温度などである。
【００８３】
ある物質がエンドセリン変換酵素−３に結合する能力を持つかどうかを決定する好ましい方法は、以下のステップを含む：
（ａ）細胞内で配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）その試験細胞を当該物質にばく露し、
（ｃ）エンドセリン変換酵素−３への当該物質の結合量を測定し、
（ｄ）試験細胞におけるエンドセリン変換酵素−３への当該物質の結合量を、配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターをトランスフェクトしていない対照細胞への当該物質の結合量と比較する。
【００８４】
ある物質がエンドセリン変換酵素−３活性を調節する能力を持つかどうかを決定する好ましい方法は、以下のステップを含む：
（ａ）配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）その試験細胞を当該物質にばく露し、
（ｃ）蓄積した細胞内二次メッセージの量を測定し、
（ｄ）当該物質に反応した試験細胞における二次メッセージの量を当該物質にばく露していない試験細胞における二次メッセージの量と比較する。
【００８５】
特に好ましい方法では、ＥＴＡまたはＥＴＢを内因的に発現させ内因性エンドセリン変換酵素は極わずかしか含有しないトランスフェクト細胞または形質転換細胞（例えばＣＨＯ細胞）におけるｃＡＭＰの蓄積量を測定する。
【００８６】
本発明のもう一つの好ましいスクリーニング法は、ある物質がエンドセリン変換酵素−３活性を調節する能力を持つかどうかを決定する方法であって、以下のステップの一部または全部を含む方法を包含する：
（ａ）配列番号２に記載のエンドセリン変換酵素−３の発現を指示する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって試験細胞を用意し、
（ｂ）エンドセリン変換酵素−３を含んでなる膜調製物を精製し、
（ｃ）ステップ（ｂ）の精製膜調製物に試験物質を添加し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の試験物質含有膜調製物を、エンドセリン変換酵素−３の基質と共にインキュベートし、
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成した生成物を、ステップ（ｃ）の試験化合物を添加せずにステップ（ｄ）の基質を含有する膜調製物から生成した生成物の量と比較する。この酵素アッセイでの使用にとりわけ好ましい基質はｂｉｇＥＴ−１、ｂｉｇＥＴ−２およびｂｉｇＥＴ−３からなる群より選択される基質である。
【００８７】
ＥＣＥ−３に親和性を示す化合物の結合の特異性は、当該タンパク質を発現する組換え細胞またはこれらの細胞から得られる膜に対する化合物の親和性を測定することによって明らかになる。タンパク質の発現、およびＥＣＥ−３に結合する化合物またはＥＣＥ−３の既知の放射標識リガンドのこれらの細胞またはこれらの細胞から得られる膜への結合を阻害する化合物に関するスクリーニングは、ＥＣＥ−３に高い親和性を持つ化合物を迅速に選択するための効果的な方法になる。そのようなリガンドは必ずしも放射標識される必要はなく、結合した放射標識化合物を置換するために使用できる非同位体化合物、または機能アッセイで活性化剤として使用できる非同位体化合物であってもよい。上記の方法によって同定される化合物はおそらくＥＣＥ−３のアゴニストまたはアンタゴニストであり、ペプチド、タンパク質または非タンパク質有機分子でありうる。
【００８８】
本発明の一態様は、様々な濃度の未標識リガンドの存在下に標識リガンドを使って様々なリガンド結合親和性を決定することである。二次メッセンジャー経路の活性は、様々な濃度のアゴニストまたはアンタゴニストによって誘発される細胞内ｃＡＭＰを測定することによって決定される。したがって、ｃＡＭＰなどの二次メッセンジャーによって正に制御されるプロモーターおよび応答配列の下流にレポーター遺伝子が融合されているレポーターコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトするトランス活性化アッセイを使用することは、このような化合物に関するスクリーニングの範囲に包含される。例えばＣｈｅｎら（１９９５，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２６：３４９−３５４）は、Ｇタンパク質共役レセプターをコードする発現ベクターを、ＬａｃＺ遺伝子に融合されたｃＡＭＰ応答配列を持つプロモーターを含有する第２の発現ベクターと共にトランスフェクトした組換え細胞を使用する比色アッセイを記述している。過剰発現したＧタンパク質共役レセプターの活性は、β−Ｇａｌの発現量およびＯＤ測定値として測定される。したがって本発明のこの部分のもう一つの態様は、ある物質がＥＣＥ−３のアゴニスト候補またはアンタゴニスト候補であるかどうかを決定するための非放射線法であって、
（ａ）ＥＣＥ−３をコードする発現ベクターで細胞を安定にトランスフェクトまたは形質転換し（ここに、これらの組換え宿主細胞はエンドセリンとの結合に反応して生物学的シグナルを伝達する生物学的に活性な量のＧタンパク質共役レセプターを発現させる）、
（ｂ）ステップ（ａ）の組換え宿主細胞株に、ＬａｃＺなどの比色測定用遺伝子に融合されたｃＡＭＰ誘導性プロモーターを含んでなる発現ベクターを一過性にまたは安定にトランスフェクトし、
（ｂ）トランスフェクト細胞を、ＥＣＥ−３を発現させるのに十分な時間生育させ、
（ｃ）トランスフェクト細胞を収集し、その細胞をＥＣＥ−３の既知アゴニストの存在下および／または試験化合物の存在下および不在下で再懸濁し、
（ｄ）発現したＥＣＥ−３への既知アゴニストおよび試験化合物の結合を、ｃＡＭＰ誘導性プロモーターからの発現を測定する比色アッセイによって測定し、既知アゴニストの存在下での発現レベルおよび未知物質の存在下および不在下での発現レベルを比較して、その未知物質がＥＣＥ−３のアゴニスト候補またはアンタゴニスト候補として作用するかどうかを決定する。
【００８９】
エンドセリンと相互作用するＥＴＡまたはＥＴＢなどのＧタンパク質共役レセプターをコードする第３の遺伝子を含んでなるコンストラクトで、上記の細胞をトランスフェクトまたは形質転換することも可能である。上記のアッセイは、ＥＣＥ−３をコードする発現ベクターで一過性にもしくは安定にトランスフェクトされたまたは安定に形質転換された細胞を使って行なうこともできる。トランスフェクションは、ＥＣＥ−３を試験細胞に導入する当業者に既知の任意の方法を包含するものとする。例えばトランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによるトランスフェクション、リポフェクション、ＥＣＥ−３をコードするレトロウイルスコンストラクトによる感染およびエレクトロポレーションが包含される。形質転換は、ＤＮＡの取り込みによって起こる標的細胞への遺伝的変化を包含するものとする。
【００９０】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体は、ヒトＥＣＥ−３のスクリーニングとそのレベルの測定に使用できる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ヒトＥＣＥ−３の検出および型別に適したキットの構築に向いている。そのようなキットは、少なくとも１つの容器をしっかりと保持するのに適した区画化された保持具を含むだろう。その保持具はさらに、ヒトＥＣＥ−３を検出するのに適した組換えＥＣＥ−３または抗ＥＣＥ−３抗体などの試薬類を含むだろう。保持具は標識抗原または酵素基質などの検出手段を含有してもよい。
【００９１】
組換えヒトＥＣＥ−３を哺乳類細胞中で発現させるには様々な哺乳類発現ベクターを使用できる。発現ベクターとは、本明細書では、適当な宿主におけるクローン化ＤＮＡの転写およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義される。このようなベクターは、細菌、ラン藻類、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの様々な宿主で真核ＤＮＡを発現させるために使用できる。特別に設計されたベクターは、細菌−酵母細胞間または細菌−動物細胞間でのＤＮＡのシャトリングを可能にする。適当な構造を持つ発現ベクターは、宿主細胞内で自律的に複製するための複製起点、選択可能マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数を達成する能力および活性なプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼに指示するＤＮＡ配列であると定義される。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。
【００９２】
発現ベクターには、例えばクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスなどが含まれるが、これらに限らない。組換えヒトＥＣＥ−３発現に適しうる市販の哺乳類発現ベクターには、例えばｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣＩｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３）、ｐＢＰＶ−ｌ（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ　３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ　３７５６５）などがあるが、これらに限らない。
【００９３】
また、細菌細胞で組換えヒトＥＣＥ−３を発現させるには、様々な細菌発現ベクターを使用できる。組換えヒトＥＣＥ−３発現に適しうる市販の細菌発現ベクターには、例えばｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などがあるが、これらに限らない。
【００９４】
また、真菌細胞で組換えヒトＥＣＥ−３を発現させるには、様々な真菌細胞発現ベクターを使用できる。組換えヒトＥＣＥ−３発現に適しうる市販の真菌細胞発現ベクターには、例えばｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などがあるが、これらに限らない。
【００９５】
また、昆虫細胞で組換えタンパク質を発現させるには、種々の昆虫細胞発現ベクターを使用できる。ヒトＥＣＥ−３の組換え発現に適しうる市販の昆虫細胞発現ベクターには、例えばｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）などがあるが、これらに限らない。
【００９６】
上記のアッセイは、ＥＣＥ−３を一過性にまたは安定にトランスフェクトした細胞を使って行なうことができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションを含む（ただしこれらに限らない）多くの技術のいずれかによって導入できる。トランスフェクションは、ＥＣＥ−３を試験細胞に導入するための、当業者で知られる任意の方法を包含するものとする。例えばトランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによるトランスフェクション、リポフェクション、ＥＣＥ−３をコードするレトロウイルスコンストラクトによる感染およびエレクトロポレーションが包含される。発現ベクター含有細胞を個別に解析して、それらがヒトＥＣＥ−３タンパク質を産生するかどうかを決定する。ヒトＥＣＥ−３発現細胞の同定は、例えば抗ヒトＥＣＥ−３抗体との免疫学的反応性、標識リガンド結合、ビックＥＴからＥＴへの変換による宿主細胞付随ヒトＥＣＥ−３活性の存在など（ただしこれらに限らない）といった、いくつかの手段によって行なうことができる。
【００９７】
ヒトＥＣＥ−３　ＤＮＡの発現はインビトロで製造された合成ｍＲＮＡを使って行なうこともできる。合成ｍＲＮＡは、例えばコムギ胚芽抽出物および網赤血球抽出物など（ただしこれらに限らない）の様々な無細胞系で効率よく翻訳できると共に、例えばカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなど（ただしこれに限らない）、細胞に基づく系でも効率よく翻訳することができ、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００９８】
最適なレベルのヒトＥＣＥ−３を与えるヒトＥＣＥ−３　ｃＤＮＡ配列を決定するために、ヒトＥＣＥ−３の完全長オープンリーディングフレームを含有するｃＤＮＡ断片ならびに同タンパク質の特定ドメインのみまたは同タンパク質の再配列されたドメインをコードするｃＤＮＡの一部を含有する様々なコンストラクト（ただしそれらに限るわけではない）を含有するｃＤＮＡ分子を構築することができる。すべてのコンストラクトはヒトＥＣＥ−３　ｃＤＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を含有しないか、その全部または一部を含有するように設計できる。これらのコンストラクトを適当な宿主に単独で、および組み合わせて導入した後、ヒトＥＣＥ−３の発現レベルと活性を決定することができる。一過性アッセイで最適な発現を与えるヒトＥＣＥ−３　ｃＤＮＡカセットを決定した後、そのＥＣＥ−３　ｃＤＮＡコンストラクトを、例えば哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌および酵母細胞用の発現ベクター（ただしこれらに限らない）を含む様々な発現ベクター（組換えウイルスを含む）に導入する。
【００９９】
宿主細胞におけるヒトＥＣＥ−３の発現に続いて、ＥＣＥ−３タンパク質を活性な形で提供するために、ＥＣＥ−３タンパク質を回収することができる。いくつかのＥＣＥ−３タンパク質精製法が利用可能であり、また使用に適している。組換えＥＣＥ−３タンパク質は塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせによって、またはそれらを単独で適用することによって、細胞溶解液および細胞抽出物から精製できる。また、組換えＥＣＥ−３タンパク質は、完全長ＥＣＥ−３タンパク質またはＥＣＥ−３タンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体で作製した免疫アフィニティーカラムを使って、他の細胞たんぱく質から分離することもできる。
【０１００】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒトＥＣＥ−３または配列番号２に開示するヒトＥＣＥ−３の一部に由来する合成ペプチド（通常は約９〜約２５アミノ酸長）に対して産生させることができる。ヒトＥＣＥ−３に対する単一特異性抗体は、ヒトＥＣＥ−３に対して反応する抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製されるか、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）の方法を用いてヒトＥＣＥ−３と反応するモノクローナル抗体として製造される。本明細書にいう単一特異性抗体とは、単一の抗体種またはヒトＥＣＥ−３に対して均一な結合特性を持つ複数の抗体種と定義される。本明細書にいう均一な結合とは、例えば上述のようにヒトＥＣＥ−３に関係する特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトＥＣＥ−３特異抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を、適当な濃度のヒトＥＣＥ−３タンパク質またはヒトＥＣＥ−３の一部に由来する合成ペプチドで、免疫アジュバントを使用してまたは免疫アジュバントを使用しないで、免疫することによって産生させる。
【０１０１】
最初の免疫化に先立って免疫前血清を集める。各動物に約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇのヒトＥＣＥ−３タンパク質を許容できる免疫アジュバントと共に与える。そのような許容できるアジュバントには、例えばフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アラム沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍを含有する油中水型エマルションおよびｔＲＮＡなどがあるが、これらに限らない。最初の免疫化は、好ましくはフロイント完全アジュバント中のヒトＥＣＥ−３タンパク質またはそのペプチド断片を、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）またはその両方の複数部位に投与することからなる。各動物から一定間隔で（好ましくは毎週）採血して抗体価を測定する。動物には最初の免疫化の後、追加免疫を施しても施さなくてもよい。追加免疫注射を行なう動物には、一般にフロイント不完全アジュバント中の等量のヒトＥＣＥ−３を同じ経路で与える。追加免疫注射はほぼ３週間間隔で抗体価が最大になるまで行なう。各追加免疫の約７日後または単回の免疫後ほぼ毎週、動物から採血し、血清を集め、小分けにして約−２０℃で保存する。
【０１０２】
ヒトＥＣＥ−３と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）をヒトＥＣＥ−３タンパク質で免疫することによって製造される。マウスはＩＰまたはＳＣ経路により、上述のように等量の許容できるアジュバントに組み込んだ緩衝液または食塩水約０．５ｍｌ中のヒトＥＣＥ−３タンパク質約１ｍｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約１０ｍｇ）で免疫される。フロイント完全アジュバントが好ましい。マウスには０日目に最初の免疫処置を施し、約３〜約３０週間そのままにしておく。免疫したマウスには、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液中のヒトＥＣＥ−３約１〜約１００ｍｇの追加免疫を、静脈内（ＩＶ）経路でさらに１回または複数回行なう。抗体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、免疫したマウスから当業者で既知の標準的技術によって脾臓を摘出することによって得る。その脾臓リンパ球を適当な融合パートナー（好ましくは骨髄腫細胞）と、安定なハイブリドーマの形成が可能な条件で混合することによって、ハイブリドーマ細胞を作製する。融合パートナーとしてはマウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳｌ／Ａｇ　４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４およびＳｐ　２／０などを挙げることができるがこれらに限るわけではなく、Ｓｐ　２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は濃度約３０％〜約５０％のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当業者で既知の方法により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）での生育によって選択する。１４日目、１８日目および２１日目あたりに生育陽性ウェルから上清液を集め、ヒトＥＣＥ−３を抗原として使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などの免疫アッセイによって、抗体産生に関するスクリーニングを行なう。ｍＡｂのイソタイプを決定するために培養液をオクタロニー沈降アッセイでも試験する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ「軟寒天法（Ｓｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９７３）の軟寒天法などの技術によってクローン化される。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、感作の４日後に、約２×１０６〜約６×１０６個のハイブリドーマ細胞をプリスタン感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射（マウス１匹あたり約０．５ｍｌ）することによってインビボで製造される。細胞導入の約８〜１２日後に腹水を収集し、当業者で既知の技術によってモノクローナル抗体を精製する。
【０１０４】
抗ヒトＥＣＥ−３　ｍＡｂのインビトロ製造は、約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを生育させて、十分量の特異的ｍＡｂを得ることによって行なわれる。そのｍＡｂは当業者に既知の技術によって精製される。
【０１０５】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、様々な血清学的または免疫学的アッセイ、例えば沈降、受身凝集法、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法など（ただしこれらに限らない）によって決定される。体液または組織および細胞抽出物中のヒトＥＣＥ−３の存在を検出するには、同様のアッセイが使用される。
【０１０６】
ヒトＥＣＥ−３ペプチド断片または完全長ヒトＥＣＥ−３に特異的な抗体を製造するために、上記の単一特異性抗体製造法を使用できることは、当業者にはすぐにわかるだろう。
【０１０７】
ヒトＥＣＥ−３抗体アフィニティーカラムは、例えば抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されているゲル支持体Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることによって作製される。次に抗体をスペーサーアームとのアミド結合によってゲルに結合させる。次に、残った活性エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。そのカラムを水で洗浄した後、０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非結合抗体または無関係なタンパク質を除去する。次にカラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡させ、完全長ヒトＥＣＥ−３またはヒトＥＣＥ−３タンパク質断片を含有する細胞培養上清または細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次にそのカラムを光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに低下するまでリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、タンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次に、精製されたヒトＥＣＥ−３をリン酸緩衝食塩水に対して透析する。
【０１０８】
ヒトＥＣＥ−３の調節物質を含んでなる医薬的に有用な組成物は、例えば医薬的に許容できる担体の混合によるなど、既知の方法に従って製剤化できる。そのような担体および製剤化法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容できる組成物を形成させるために、そのような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変ヒトＥＣＥ−３、またはチロシンキナーゼ活性化剤もしくは阻害剤を含むＥＣＥ−３アゴニストもしくはアンタゴニストを含有するだろう。
【０１０９】
本発明の治療用または診断用組成物は、障害を処置または診断するのに十分な量で個体に投与される。有効量はその個体の状態、体重、性別および年齢などといった様々な要因に応じて変化しうる。他の要因には投与形式が含まれる。
【０１１０】
医薬組成物は、例えば皮下、局所、経口および筋肉内など、様々な経路によって個体に投与できる。
【０１１１】
「化学誘導体」という用語は、本来のその基本分子の一部でない追加の化学部分を含有する分子を表す。そのような部分は基本分子の溶解性、半減期、吸収などを改善しうる。あるいは、それらの部分が基本分子の望ましくない副作用を弱めるか、基本分子の毒性を低下させることもある。そのような部分の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの様々な教科書に記載されている。
【０１１２】
本明細書に開示する方法に従って同定される化合物は、適当な投与量で単独で使用できる。あるいは他の薬剤の同時投与または逐次的投与が望ましい場合もある。
【０１１３】
本発明には、本発明の新規処置方法での使用に適した局所、経口、全身および非経口医薬製剤を提供するという目的もある。本発明に従って同定される化合物を活性成分として含有する組成物は、従来の投与用賦形剤を使った広範囲にわたる様々な治療剤形として投与できる。例えば本化合物は錠剤、カプセル剤（それぞれ持続性または徐放性製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤などの経口剤形で、または注射によって投与できる。また、静脈内（ボーラス注入および持続注入）、腹腔内、皮下、閉塞を伴なってもしくは閉塞を伴なわずに局所に、または筋肉内に、いずれも医薬分野の当業者によく知られている剤形を使って投与することもできる。
【０１１４】
本発明の化合物は、一日量を単回で投与してもよいし、総一日量を毎日２、３または４回の分割量で投与してもよい。さらに本発明の化合物は、適当な鼻腔内賦形剤の局所使用による鼻腔内剤形で、または当業者によく知られている経皮皮膚パッチの剤形を使って経皮経路で投与することもできる。経皮送達系の形で投与するには、投薬は当然その投与計画中、断続的ではなく連続的になるだろう。
【０１１５】
２以上の活性剤を使った併用処置で、活性剤が別個の投与剤である場合、活性剤は同時に投与するか、それぞれ別々に時期をずらして投与することができる。
【０１１６】
本発明の化合物を利用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態、処置すべき状態の重症度、投与経路、患者の腎、肝および心血管機能、使用する化合物を含む様々な要因に応じて選択される。通常の医師または獣医師は、その状態を予防するか、その状態に対抗するか、またはその状態の進行を停止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方できる。毒性を伴なわずに効能を与える範囲内の薬物濃度を最適な厳密さで達成するには、標的部位に対するその薬物の利用可能性の動態に基づく計画が必要である。これには薬物の分布、平衡および排除を考慮する必要がある。
【０１１７】
本発明を例証するために以下に実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【０１１８】
実施例１
ヒトＥＣＥ−３をコードするＤＮＡ分子の単離および特徴づけ
既に単離されているＥＣＥはＥＣＥ−１とＥＣＥ−２の２種類である。いくつかの完全長ヒト亜鉛メタロプロテアーゼタンパク質配列を使ったＧＳＣデータベース照会で、ＥＳＴ　ｈｓｕｂｎ＿ｌｆ１２．ｘ００が見つかった。ｈｓｕｂｎ＿ｌｆ１２．ｘ００を使って照会したＭｅｒｃｋ．ＥＳＴデータベースｂｌａｓｔｎ検索では、他のマウスＥＳＴ　ＡＡ３８７７９２が一つだけ拾われた。全ＧｅｎＢａｎｋに対するｂｌａｓｔｎ（Ｍｅｒｃｋ．ＤＮＡ）では、ウシＥＣＥ−２（Ｕ２７３４１）が約９０％の類似性でヒットする。Ｍｅｒｃｋ．ＰＲＯＴＥＩＮに対するＢｌａｓｔｘ照会の結果、ヒトＥＣＥ−１（Ｄ４３６９８）ユニジーンクラスＨｓ．８８６１１に対して８５％の類似性が見つかった。ｈｓｕｂｎ＿ｌｆ１２．ｘ００に対する完全長ｃＤＮＡをクローン化して配列決定し、この１４９７塩基対ｃＤＮＡを再びｂｌａｓｔにかけた。Ｍｅｒｃｋ．ＤＮＡに対するｂｌａｓｔｎではやはりウシＥＣＥ−２（Ｕ２７３４１）完全ｍＲＮＡ配列が９０％の同一性でヒットする。二番目に高いヒットは、ＫＩＡＡ０６０４（ａｂ０１１１７６）のヒトｍＲＮＡに、１９９８年４月１０日に入力されたＥＳＴに対するもので、８９％の類似性だった。Ｂｌａｓｔｘでは、タンパク質型のＫＩＡＡ０６０４配列もヒットする。このヒトＫＩＡＡ０６０４タンパク質配列はウシＥＣＥ−１配列に対して８９％の類似性を持ち、ヒトＥＣＥ−１に対して７４％の類似性を持つ。これはＫＩＡＡ０６０４が、おそらくウシＥＣＥ−２のオルソログであり、ヒトＥＣＥ−１のパラログであることを示している。ヒトＥＣＥ−１タンパク質もウシＥＣＥ−２に対して８９％の類似性を持つ。マウスｈｓｕｂｎ＿ｌｆ１２．ｘ００配列はウシＥＣＥ−２とヒトＫＩＡＡ０６０４の両方に対して８９％の類似性を持つので、これはおそらくＥＣＥ−２遺伝子のマウスオルソログに相当するのだろう。
【０１１９】
公共データベースのさらなる検索で、このファミリーの第３のメンバーに相当するＥＳＴが見つかり、ＥＳＴシークエンシングとＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ＥＮＤｓ）によって完全長配列を単離した。エンドセリン変換酵素を捜すユニジーン検索では、３つのＥＳＴからなり、ラットＥＣＥ−１に対して４４％の類似性を持つと注釈されているインデックスクラスＨｓ．２６８８０がヒットする。これら３つのＥＳＴは２つのＩｍａｇｅクローンに相当し、以下の名称とヌクレオチド配列を持つ。
【０１２０】
１．ＡＡ５２３５２７：
ＥＳＴ　Ｉｄ：１１６８１４６；ＥＳＴ名：ｎｉ４５ｇｌ２．ｓｌ；
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡ５２３５２７；ＧｅｎＢａｎｋ　ｇｉ：２２６４２３９；
クローンＩｄ：ＩＭＡＧＥ：９７９８４６（３’）ＮＣＩ由来；
【０１２１】
【化７】
2004500023.tif 000008
【０１２２】
２．Ｒ６１４４０：
ＥＳＴ　Ｉｄ：２３８１９５；ＥＳＴ名：ｙｈｌ５ｈ０２．ｒｌ；
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｒ６１４４０，ＧｅｎＢａｎｋ　ｇｉ：８３２１３５；
ＧＤＢ　Ｉｄ：４１０５２７；
クローンＩｄ：３７９８６（５’）；
【０１２３】
【化８】
2004500023.tif 000009
および
【０１２４】
３．Ｒ６１３９５：
ＥＳＴ　Ｉｄ：２３８１５０；ＥＳＴ名：ｙｈｌ５ｈ０２．ｓｌ；
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｒ６１３９５；ＧｅｎＢａｎｋ　ｇｉ：８３２０９０；
ＧＤＢ　Ｉｄ：４１０５２７
クローンＩｄ：３７９８６（３’）
【０１２５】
【化９】
2004500023.tif 000010
【０１２６】
Ｒ６１４４０は６０６ｂｐ長の５’ＥＳＴ（配列番号３）であり、これは全長ＥＳＴの一部のみに６０％の類似性（１６７／２７６ｂｐ）を示すＫＩＡＡ０６０４をヒットする。類似するＥＳＴは公共データベースのこの検索では見つからなかった。２つの３’ＥＳＴ配列は互いに同一であり、他のＥＳＴとは一致しなかった。上記のＥＳＴは米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のホームページでも見ることができる。
【０１２７】
完全長ＥＣＥ−３ｃＤＮＡ配列を５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって得た。まずＥＳＴ　ｙｈｌ５ｈ０２．ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｒ６１４４０）およびｙｈｌ５ｈ０２．ｓ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｒ６１３９５）が由来するＩＭＡＧＥクローン３７９８６と、ＩＭＡＧＥクローン９７９８４６（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ５２３５２７）とをＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手し、ＥＳＴ配列のエラーを修正するために再配列決定した。この配列を公共データベース中の他のＥＣＥファミリーメンバー（ＥＣＥ−１およびＥＣＥ−２）の配列と比較したところ、この遺伝子の３’末端がＩＭＡＧＥクローン３７９８６およびＩＭＡＧＥクローン９７９８４６配列中に存在することがわかった。しかし５’配列は不完全であり、５’ＲＡＣＥによって得た。完全長ＥＣＥ−３配列を得るには２ラウンドの５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲが必要だった。どちらの場合もネステッドＰＣＲ反応を行なった。第１ラウンドのＰＣＲでは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号Ｋ１９０５−１）およびヒト胎児脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４０２−１）を使って、ＩＭＡＧＥクローン９７９８４６および３７９８６の配列に基づく下記のプライマー１〜４（配列番号６〜９）を使用した（９７９８４６は公共データベースには存在しない２４４ｂｐの５’配列を与えた）。アダプタープライマーＡＰ−１およびＡＰ−２は製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から供給された。第１ラウンドＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を配列決定したところ、９３０ｂｐのさらなるＥＣＥ−３配列を得た。この配列に基づいてさらなる遺伝子特異的ＲＡＣＥ−ＰＣＲプライマー（下記５〜７、配列番号１０〜１２）を合成し、それらを使い、ヒト卵巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４１７−１）およびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号Ｋ１９０７−１）を使用して、さらなる５’配列を増幅した。これにより２８９４ヌクレオチドのｃＤＮＡ（配列番号１参照）を得た。このｃＤＮＡはノーザンブロット（配列番号２参照）上のバンドのサイズに一致し、明白なコザックコンセンサス開始部位（ＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧ、配列番号１のヌクレオチド２０６〜２１５）を持つことから、この配列は実際に完全長ＥＣＥ−３遺伝子に相当することが示された。
【０１２８】
【化１０】
2004500023.tif 000011
【０１２９】
ＰＣＲ条件は次の通りとした：９４℃で１分；９４℃１０秒、７２℃４分を５サイクル；９４℃１０秒、７０℃４分を５サイクル；９４℃１０秒、６８℃４分および６８℃１０分を２０サイクル。次にＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ２７００−２０）を使ってＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。
【０１３０】
完全長ヒトＥＣＥ−３　ｃＤＮＡ配列を得たら、次にヒト胎児脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４０２−１）およびヒト卵巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４１７−１）からＰＣＲによって完全長ヒトＥＣＥ−３　ｃＤＮＡクローンを作製した。各産物を配列決定したところ同じ配列が得られたことから、ＥＣＥ−３　ｍＲＮＡは両組織で同じであることがわかった。２対のプライマーを使用した。
【０１３１】
【化１１】
2004500023.tif 000012
【０１３２】
ＰＣＲ条件は次のとおりとした：９４℃で１分、９２℃１２秒および６８℃４分を３２サイクル、次に６８℃で１０分。この一次ＰＣＲ増幅を、プライマー対２（配列番号１５および１６）を使ったネステッドＰＣＲにかけた。ＰＣＲ産物をサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１３３】
９３個の放射線照射ハイブリッドクローンからなるＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４パネル（Ｇｙａｐａｙら，１９９６）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を使って放射線照射ハイブリッドマッピングを行なった。プライマーは次の配列を持ち、予想される１７５ｂｐのバンドを生成した：
【０１３４】
【化１２】
2004500023.tif 000013
。ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を次のサイクリングパラメーターで行った：９４℃で１分；９４℃で２０秒、７０℃で２分、３２サイクル；７０℃で５分。結果をＷｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｃｅｎｔｅｒサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）に投入したところ、同様の結果を得た。ＥＣＥ−３は染色体２ｑのマーカーＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ１２Ｈ１０．１４とＤ２Ｓ３３１の間、ＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ１２Ｈ１０．１４から１０．６５ｃＲの位置にマッピングされた（ロッドスコア＞１５）。
【０１３５】
したがって、例示したｃＤＮＡ分子は２８９４塩基対であり、７７５アミノ酸のタンパク質に相当する２３２５塩基対のオープンリーディングフレームを持つ。放射線照射ハイブリッドマッピングにより、この遺伝子は染色体２ｑ３７の、論理的にＥＣＥ突然突然変異に起因するかもしれないどのヒト疾患とも関連づけられていない領域に割り当てられる。
【０１３６】
実施例２
ヒトＥＣＥ−３発現のノーザン解析
ノーザン解析には次の４つのブロットを使用した：Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ　ＩＩ（カタログ番号７７５５−１）、Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ　ＩＩＩ（カタログ番号７７５０−１）、Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ（カタログ番号７７６０−１）、Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ　ＩＩ（カタログ番号７７５９−１）。ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、実施例１に記載のｃＤＮＡ源から次のプライマーを使って作製した：
フォワード：
【０１３７】
【化１３】
2004500023.tif 000014
【０１３８】
このプローブのＤＮＡ配列は次の通りである：
【０１３９】
【化１４】
2004500023.tif 000015
【０１４０】
ＤＥＣＡｐｒｉｍｅ　ＩＩ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号１４５５）を使って２５〜５０ナノグラムのプローブを５μｌの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）で標識した。Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓのＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰカラム（カタログ番号ＣＳ−９００）を使ってプローブを精製した。ブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号８０１５−１）中、６８℃で１時間プレハイブリダイズし、６８℃で２時間ハイブリダイズした。洗浄条件は室温の２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳで３０分間、５０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回あたり２０分間を２回とした。ブロットをＰｈｏｒｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に室温で終夜ばく露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使って解析した。ノーザン解析は、図３Ａ〜Ｄに図示するように、ＣＮＳ（延髄）および非ＣＮＳ（卵巣）で高レベルに、ＣＮＳ（尾状核、被殻、視床、黒質、脊髄）および非ＣＮＳ（精巣）で中レベルに、またＣＮＳ（扁桃、海馬、視床下核、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、小脳、脳梁）および非ＣＮＳ（胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓、心臓）で低レベルに発現される約３．０ｋｂの単一バンドを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
配列番号１に記載のヒトＥＣＥ−３をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】
配列番号１に記載のヒトＥＣＥ−３をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２Ａ】
配列番号２に記載のヒトＥＣＥ−３のアミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】
配列番号２に記載のヒトＥＣＥ−３のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】
組織特異的ヒトｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフィーを示す。このノーザン解析は、ヒトＥＣＥ−３遺伝子が延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、尾状核、黒質、視床および精巣では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現されることを示している。
【図３Ｂ】
組織特異的ヒトｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフィーを示す。このノーザン解析は、ヒトＥＣＥ−３遺伝子が延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、尾状核、黒質、視床および精巣では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現されることを示している。
【図３Ｃ】
組織特異的ヒトｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフィーを示す。このノーザン解析は、ヒトＥＣＥ−３遺伝子が延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、尾状核、黒質、視床および精巣では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現されることを示している。
【図３Ｄ】
組織特異的ヒトｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフィーを示す。このノーザン解析は、ヒトＥＣＥ−３遺伝子が延髄および卵巣では高レベルに、被殻、脊髄、尾状核、黒質、視床および精巣では中レベルに、また扁桃、脳梁、海馬、全脳、視床下核、小脳、大脳皮質、後頭極、前頭葉、側頭葉、胸腺、前立腺、骨格筋、腎臓、膵臓および心臓では低レベルに発現されることを示している。
【図４Ａ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｂ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｃ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｄ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｅ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４Ｆ】
ヒトＥＣＥ−３のコーディングＤＮＡ配列（配列番号１）およびアンチコーディングＤＮＡ配列（配列番号２２）ならびにオープンリーディングフレームおよびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【国際公開パンフレット】
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