(57)【要約】本発明は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のゲノム配列、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチド（例えば、代謝または複製プロセスにに関与するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、上記配列を含むベクターおよび上記ベクターによって形質変換された細胞に関する。本発明は、更に、上記核酸またはポリペプチドを利用する方法、特に、関心ある分子の生合成法または生分解法および上記ポリペプチドを含むキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）ＯＲＳＡＹ株のゲノムの配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のヌクレオチド配列。
【請求項２】
下記から選択されることを特徴とする、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のヌクレオチド配列：
ａ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１と相同的なヌクレオチド配列；
ｃ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１に相補的な、またはａ）もしくはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列および対応するそのＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の代表的フラグメントのヌクレオチド配列またはａ）、ｂ）もしくはｃ）に定義の如きヌクレオチド配列の代表的フラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）ｄ）に定義の如き配列を含むヌクレオチド配列；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に定義の如きヌクレオチド配列から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に定義の如きヌクレオチド配列から改変されたヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列ＯＲＦ２〜ＯＲＦ８１２から選択されていることを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
下記、即ち、
ａ）請求項３に記載のヌクレオチド配列；
ｂ）請求項３に記載のヌクレオチド配列またはａ）に定義の如きヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する相同的ヌクレオチド配列；
ｃ）相補的ヌクレオチド配列または請求項３に記載の配列またはａ）もしくはｂ）に定義の如き配列に対応するＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）もしくはｃ）に定義の如き配列の代表的フラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）に定義の如き配列から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｆ）請求項３に記載の配列またはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）に定義の如き配列から改変されたヌクレオチド配列、
から選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項２〜４の１つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４の１つに記載のヌクレオチド配列のＯＲＦ配列に対応する代表的フラグメントによりコードされることを特徴とする請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２〜ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１２から選択されることを特徴とするピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチド。
【請求項８】
下記から選択されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド：
ａ）請求項５〜７の１つに記載のポリペプチド；
ｂ）請求項５〜７の１つに記載のポリペプチドまたはａ）に定義の如きポリペプチドと相同的なポリペプチド；
ｃ）請求項５〜７の１つに記載ポリペプチドまたはａ）もしくはｂ）に定義の如きポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸のフラグメント；
ｄ）請求項５〜７に記載のポリペプチドまたはａ），ｂ）もしくはｃ）に定義の如きポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント；および、
ｅ）請求項５〜７に記載のポリペプチドまたはａ），ｂ），ｃ）もしくはｄ）に定義の如きポリペプチドから改変されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
エネルギー生成またはエネルギ変換に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１】
2004500802.tif 000107
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
アミノ酸の代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化２】
2004500802.tif 000108
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ヌクレオチドの代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３】
2004500802.tif 000109
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
炭水化物の代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１００，ＯＲＦ１２７，ＯＲＦ１６２，ＯＲＦ１７４，ＯＲＦ３２８，ＯＲＦ３６７，ＯＲＦ３９，ＯＲＦ６０９，ＯＲＦ７６２およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
補酵素の代謝に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４】
2004500802.tif 000110
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
脂質の代謝に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ３１２，ＯＲＦ３１３，ＯＲＦ５４５，ＯＲＦ５５８，ＯＲＦ５５９およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
翻訳またはリボソームの構造または生合成に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化５】
2004500802.tif 000111
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
転写に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１４８，ＯＲＦ３５７，ＯＲＦ４８３，ＯＲＦ４９７，ＯＲＦ５２３，ＯＲＦ５２４，ＯＲＦ６２０，ＯＲＦ７５２およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
複製、修復および組換えに関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化６】
2004500802.tif 000112
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】
外膜または細胞壁の合成に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化７】
2004500802.tif 000113
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２０】
分泌または運動に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｏｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化８】
2004500802.tif 000114
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２１】
ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化９】
2004500802.tif 000115
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２２】
無機イオンの代謝または輸送に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１０】
2004500802.tif 000116
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】
ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１１】
2004500802.tif 000117
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】
トランスフェラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１２】
2004500802.tif 000118
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
ヒドロラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１３】
2004500802.tif 000119
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２６】
インテインを含むピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１３２，ＯＲＦ１６，ＯＲＦ２５０，ＯＲＦ３４０，ＯＲＦ４８４，ＯＲＦ６０３，ＯＲＦ７６１，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０３，ＯＲＦ８０４，ＯＲＦ８０８，ＯＲＦ８１０およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
イソメラーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１７６，ＯＲＦ２８２，ＯＲＦ２８３，ＯＲＦ３９９，ＯＲＦ４２６，ＯＲＦ５３１，ＯＲＦ５８３，ＯＲＦ６８８およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２８】
リガーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ２８，ＯＲＦ６３９，ＯＲＦ６５およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２９】
リアーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１４】
2004500802.tif 000120
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３０】
ホスファターゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１８，ＯＲＦ３５４，ＯＲＦ３９８，ＯＲＦ７５，ＯＲＦ７６０，ＯＲＦ７９３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３１】
糖の代謝に関与するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、次の配列、即ち、ＯＲＦ１５４，ＯＲＦ２１３，ＯＲＦ２９８，ＯＲＦ３７，ＯＲＦ４０，ＯＲＦ４４９，ＯＲＦ５５３，ＯＲＦ６６６，ＯＲＦ７６３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３２】
プロテアーゼ活性を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化１５】
2004500802.tif 000121
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３３】
下記活性，即ち、
−配列ＯＲＦ４８６，ＯＲＦ８０６の細胞増殖の核抗原タイプの活性；
−配列ＯＲＦ１７，ＯＲＦ６９５，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０２，ＯＲＦ８０５またはＯＲＦ８１１の複製因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４またはＯＲＦ１５９の延長因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４８のＤＮＡに対する結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＯＲＦ７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＯＲＦ５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のポリペプチドまたはそのフラグメントの１つまたはその代表的フラグメントの１つをコードする配列を含むことを特徴とする請求項２〜４，９の１つに記載のヌクレオチド配列。
【請求項３４】
エネルギー生成または変換に関与し、下記配列、即ち、
【化１６】
2004500802.tif 000122
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項３５】
アミノ酸の代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化１７】
2004500802.tif 000123
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ヌクレオチドの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化１８】
2004500802.tif 000124
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項３７】
炭水化物の代謝または輸送に関与し、次の配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１６２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１７４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７６２のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項３８】
補酵素の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化１９】
2004500802.tif 000125
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項３９】
脂質の代謝に関与し、次の配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５５９のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４０】
翻訳またはリボソームの構造もしくは生合成に関与し、下記配列、即ち、
【化２０】
2004500802.tif 000126
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４１】
転写に関与し、下記配列、即ち、
【化２１】
2004500802.tif 000127
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４２】
複製、修復および組換えに関与し、下記配列、即ち、
【化２２】
2004500802.tif 000128
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４３】
外膜または細胞壁の合成に関与し、下記配列、即ち、
【化２３】
2004500802.tif 000129
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４４】
分泌または運動に関与し、下記配列、即ち、
【化２４】
2004500802.tif 000130
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４５】
下記配列、即ち、
【化２５】
2004500802.tif 000131
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したシャペロンタンパク質を含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４６】
無機イオンの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化２６】
2004500802.tif 000132
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４７】
下記配列、即ち、
【化２７】
2004500802.tif 000133
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４８】
次の配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２８７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７７７のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項４９】
下記配列、即ち、
【化２８】
2004500802.tif 000134
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５０】
下記配列、即ち、
【化２９】
2004500802.tif 000135
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、インテインを含むポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５１】
下記配列、即ち、
【化３０】
2004500802.tif 000136
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択され、イソメラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５２】
次の配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６５のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リガーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５３】
下記配列、即ち、
【化３１】
2004500802.tif 000137
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リアーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５４】
次の配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３９８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７９３のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５５】
糖の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化３２】
2004500802.tif 000138
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５６】
下記配列、即ち、
【化３３】
2004500802.tif 000139
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択され、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５７】
下記活性，即ち、
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４８６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０６の細胞増殖の核抗原タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６９５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０５またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１１の複製因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５４またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１５９の延長因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５４８のＤＮＡに対する結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つを含むことを特徴とする請求項５〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項５８】
１つまたは複数の上記配列が、１つまたは複数の上記配列の読取、分析および／または利用を容易にする形状および性質を有する記録媒体に記録されていることを特徴とする請求項１〜４および９〜３３の１つに記載のヌクレオチド配列並びに／または請求項５〜８および３４〜５６の１つに記載のポリペプチド配列。
【請求項５９】
配列が、請求項２〜４および９〜３３の１つに記載のヌクレオチド配列から選択されていることを特徴とする、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列。
【請求項６０】
共有結合状態または非共有結合状態で担体上に固定されていることを特徴とする請求項５９に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６１】
請求項２〜５および９〜３３の１つに記載のヌクレオチ配列を含むことを特徴とするクローニングベクターおよび／または発現ベクターベクター。
【請求項６２】
請求項２３，３２の１つに記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】
請求項６１〜６２の１つに記載のベクターによって形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６４】
請求項６２に記載のベクターによって形質転換されていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項６５】
請求項６３〜６４の１つにもとづき形質転換された細胞を含む、ヒト以外の動物。
【請求項６６】
請求項６１または６２に記載のベクター、請求項６３または６４に記載の細胞または請求項６５に記載の動物を利用することを特徴とするポリペプチドの調製法。
【請求項６７】
請求項６５に記載の方法によって得ることができる組換えポリペプチド。
【請求項６８】
請求項５〜８，３４〜５６および６７の１つに記載のポリペプチドのアミノ酸配列を使用することを特徴とする合成ポリペプチドの調製法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法によって得られた合成ポリペプチド。
【請求項７０】
少なくとも、請求項５〜８，３４〜５６，６７および６９の１つに記載のポリペプチドを含むことを特徴とする雑種ポリペプチド。
【請求項７１】
請求項７０に記載の雑種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７２】
請求項７１に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７３】
請求項７２に記載のベクターの使用によって得られる組換えポリペプチドであることを特徴とする請求項７０に記載の雑種ポリペプチド。
【請求項７４】
請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３の１つに記載のポリペプチド、請求項６３〜６４の１に記載の形質転換された細胞または請求項６５に記載の動物を使用することを特徴とする関心ある化合物の生合成法または生分解法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法によって得ることができる化合物。
【請求項７６】
関心ある化合物の生合成または生分解のための請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３の１つに記載のポリペプチド、請求項６３〜６４の１に記載の形質転換された細胞または請求項６５に記載の動物の使用。
【請求項７７】
請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３の１つに記載の，ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを使用することを特徴とする核酸の重合および／または増幅のための方法。
【請求項７８】
生物学的試料とＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つとを、該ポリペプチドと生物学的試料中に存在する核酸との間の重合反応および／または増幅反応が可能な条件において接触させる工程を含むことを特徴とする請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項５〜８，３４〜５６，６７，６９，７０および７３の１つに記載の，ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを含む試薬または必要品。
【請求項８０】
生物学的試料中の標的核酸の検出および／または同定のための、特に、病原微生物に特異的な核酸の検出および／または同定のための請求項７９に記載の試薬または必要品の使用。
【請求項８１】
生物学的試料中の標的核酸、特に、関心ある遺伝子または該遺伝子の突然変異の検出および／または同定のための請求項７９に記載の試薬または必要品の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ）のゲノム配列、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチド（例えば、代謝または複製プロセスにに関与するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列、上記配列を含むベクターおよび上記ベクターによって形質変換された細胞に関する。本発明は、更に、上記核酸またはポリペプチドを利用する方法、特に、関心ある分子の生合成法または生分解法および上記ポリペプチドを含むキットに関する。
【０００２】
（背景技術）
９０℃〜１１３℃の最高温度に耐え得る、現在知られている極めて超好熱性の微生物を発見することは、１９７７年に発見された古細菌（Ｗｏｅｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１９９０）の中核にある。これらのうち、ｅｕｒｙａｒｃｈａｃｏｔｅｓ門に属するｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ属および、特に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種は、古細菌中の系統分類反応を詳述し、真核生物、バクテリアおよび古細菌に普遍的に共通な最新の先祖（ＬＵＣＡ：Ｌａｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ａｎｃｅｓｔｏｒ）の性質に関する問題および生命の起源に関する問題に取組むのに特に重要である。
【０００３】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種の古細菌は、実際に、超好熱性微生物の研究のための優先的モデルである（８０〜１１０℃の増殖最適温度）（Ａｄａｍｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：６２７，１９９７）。上記微生物は、好気性であるが、培養し易く、ボックス上でコロニーの形で得られる（Ｇｅｌｒｉｔｅ媒体中で）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種の古細菌のタンパク質は、本質的に、熱的に安定であり、そのうちの若干は、１１０℃よりも高い温度における数十分間の培養できる。上記タンパク質は、多数の工業的プロセス（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡの修飾酵素、インテイン、プロテアーゼまたは糖の代謝酵素）において使用できる。更に、超好熱性タンパク質の安定性にもとづき、概ね、その結晶化が容易化し、得られた結晶の品質は、その構造的研究に好適である。
【０００４】
ゲノム配列が既に特殊な研究の対象となっているＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種のうち、陸地の熱水源から分離され、部分的に得られたゲノムをユタ大学のＷｅｉｓｓのグループによって配列決定されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓを挙げることができる。深い海中熱水源（東太平洋）から分離したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムは、日本のグループによって配列決定され、１９９８年に発表された（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｉら、ＤＮＡ　Ｒｅｓ．１９９８，５，５５−７６）。他の発表者によれば、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのゲノムは、同定可能な遺伝子の２０％を含むに過ぎず、他の古細菌（例えば、ＭｅｃｈａＮＯ．ｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｈｉｉ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓおよびＭｅｔｈａＮＯ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）のゲノムに比して少ない。上記古細菌の場合、配列の類似性によって同定できるゲノムの割合は、約４０％である。従って、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種のバクテリアは、なお大部分が未知であるが工業的に興味のある潜在的遺伝子のレセプターである。
【０００５】
Ｐｒｉｅｕｒらが北フィジー湾の２つの深い海洋サイトから得たチムニー試料および熱水流から分離したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓの独立の株の２０の分離株は、小サイズで多重複製のプラスミドｐＧＴ５を含むＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ株（ＯＲＳＡＹ株と呼ばれる）を同定できる（Ｅｒａｕｓｏら、１９９２，Ｃｏｍｐｔ　ｒｅｎｄｕ　ｄｅ　Ａｃａｄｅｍｉｅ　ｄｅｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｄｅ　Ｐａｒｉｓ，３１４，３８１−３９３）。この株に対応する種であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉは、生理学的面および分類学的面において詳述されている（Ｅｒａｕｓｏら、Ａｒｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６０：３３８−３４９，１９９３）。この株について、所定の環境、突然変異条件および突然変異体の分離が、確立されている（Ｗａｔｒｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１１３８；１９９５；Ｗａｔｒｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３，３７７，１９９６）。このプラスミドは、ｐＧＴ５と呼ばれ、ローリングサークルタイプのプラスミドであり（Ｅｒａｕｓｏら、１９９６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１７８：３２３２）、実際、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓのシャトルベクターの開発のための出発点である（Ａａｇａｒｄら、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１８，９３，１９９６；Ａｒａｖａｌｌｉら、Ｅｘｔｅｍｏｐｈｉｌｅｓ　１９９７，１：１８３−９１）。プラスミドｐＧＴ５の存在にもとづき、Ｐ．ａｂｙｓｓｉは、超好熱性古細菌におけるＤＮＡの複製の研究のための優先株として選択されている（Ｍａｒｓｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７，１１８３−１１９２，１９９８）。
【０００６】
なお末知の工業的に興味のある多数の潜在的遺伝子の一部およびＰ．ａｂｙｓｓｉに関する研究の進展を考慮して、現在、特に、上記株のゲノムの知見の向上から、上記株の分子生物学に関するより広汎な情報を提示する必要性がある。
【０００７】
他方、異種の３つのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓの完全なゲノム配列を提示することによって、特に、遺伝子マーカとして利用できる遺伝子を同定でき、遺伝子の同定およびその機能解釈の改善のため、比較ゲノムの能力を利用でき（これは、多数の孤独遺伝子を考慮するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓの場合、特に重要である）、そのゲノムの適応性に関する重要な情報を得ることができる。実際、進化の観点から、３つのゲノム配列の提示は、特に有利である。なぜならば、かくして、（外部グループとして）第３ゲノム配列（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）を使用することによって、２つのゲノム配列（最も近いＰ．ａｂｙｓｓｉおよびＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｔ）の間に起きるゲノム的事象を集約できるからである。更に、以降でますます多数利用できるようになる原核生物のゲノムに対してＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのゲノムを極めて精密なレベルにおいて比較検討する場合、外部環境である温度および圧力の定着に関連する分子機構を考慮できなければならない。
【０００８】
上記データ群によって、特に、微小進化、特に、ゲノム組換え、保持された規則的配列、超可変部、インテインの運動性，ｅｔｃ．に関連するゲノム事象を証明できる。
【０００９】
（発明の開示）
これは、まさに、本発明の目的である。
【００１０】
本発明は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ株ＯＲＳＡＹのゲノムの配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のヌクレオチド配列を対象とする。
【００１１】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹ株は、ＣＮＣＭ（パリ、フランス）にナンバーＩ−２１８０として０９．０４．１９９９に提出された寄託の対象である。
【００１２】
本発明は、更に、下記、即ち、
ａ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１と相同のヌクレオチド配列；
ｃ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の相補的またはａ）またはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列および対応するそのＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１を代表するフラグメントのヌクレオチド配列またはａ），ｂ）またはｃ）に定義の如きヌクレオチド配列を代表するフラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）ｄ）に定義の如き配列を含むヌクレオチド配列；
ｆ）ａ），ｂ），ｃ），ｄ）またはｅ）に定義の如きヌクレオチド配列から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｇ）ａ），ｂ），ｃ），ｄ），ｅ）またはｆ）に定義の如きヌクレオチド配列から改変されたヌクレオチド配列、
から選択されていることを特徴とするヌクレオチド配列を対象とする。
【００１３】
ゲノム配列またはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのゲノム配列によって、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの染色体の配列を示すことを意図する。
【００１４】
ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明にもとづき、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび上記ＤＮＡの転写生成物を意味する。
【００１５】
ここで付言するが、本発明は、自然環境において得られた、即ち、自然状態のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのゲノムのヌクレオチド配列には関しない。分離法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分子サイズまたは親和性に依拠する排除、更に、各溶媒中の溶解度に依拠する分画技術）または遺伝子工学法（例えば、増幅、クローン化およびサブクローン化）にもとづき分離、精製または部分的に精製された配列が対象であり、本発明の配列は、ベクターによって担持することができる。
【００１６】
ヌクレオチド配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１は、最初の工程として対をなす端部の配列決定（ランダム段階）と、次いで、配列の完全性を保証する管理された配列決定と、ソフトウエアによるヌクレオチドフラグメントの上記配列の統合とからなる方法によるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹ株のゲノムの配列決定によって得られる（実施例参照）。配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の高精度にも拘わらず、この配列は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹ株のゲノムのヌクレオチド配列を１００％の完全な態様で体現できず、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１には、配列決定のある程度のエラーまたは不確定さが残存する。上記のある程度のエラーまたは不確定さは、容易に証明でき、当業者は、完全な染色体および／または本発明に係るその代表的フラグメントおよび増幅、クローン化および配列決定の標準法にもとづき、上記エラーを修正でき、得られた配列は、特に、情報ソフトウエアによって且つ以下の実施例に記載の如くコンピュータで読取り得る本発明に係る配列記録担体を使用することによって、容易に比較できる。上記の場合によるエラーまたは不確定さの修正後、得られた修正ずみヌクレオチド配列は、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１と少なくとも９９．９％の同一性を有する。
【００１７】
本発明の意味における所与の配列と相同のヌクレオチド配列とは、所与の配列のベースと最適に配列した後、少なくとも８０％，好ましくは、８５％，９０％，９５％および９８％の同一性％を有する。この％は、純粋に統計的であり、２つのヌクレオチド配列の間の差は、その全長にわたってランダムに分布される。
【００１８】
本発明の意味における２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の“同一性％”によって、配列改善後にえられた２つの比較配列の間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の％を表すことを意図する。この％は、純粋に統計的であり、２つのヌクレオチド配列の間の差は、その全長にわたってランダムに分布される。２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の配列の比較は、通常、最適な態様で配列した後の上記配列を比較することによって実施され、上記比較は、配列の類似性の局部範囲の同定および比較のために、セグメントによってまたは“比較窓”によって実施される。比較のための最適な配列は、手操作に加えて、Ｓｍｉｔｈら（１９８１）の局部的相同性のアルゴリズム［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２；４８２］によって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎら（１９７０）の局部的相同性のアルゴリズム［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３］によって、Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）の類似性調査法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４］によって、上記アルゴリズムを使用する情報ソフトウエア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．Ｗａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によってまたは比較ソフトウエア（ＢＬＡＳＴ　ＮまたはＢＬＡＳＴ　Ｐ）によって実施できる。
【００１９】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性％は、比較窓によって最適に配列されたこれら２つの配列の比較によって求める。この場合、核酸配列またはアミノ酸配列の比較範囲は、これら２つの配列の最適配列のために、標準配列に対して付加または欠失を含むことができる。同一性％は、２つの配列の間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である同一位置の数を求め、比較窓内の位置全数で上記同一位置数を除し、これら２つの配列の間の同一性％を得るために得られた結果に１００を乗ずることによって計算する。
【００２０】
例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ，ｎｃｂｉ，ｎｌｍ，ｎｉｈ，ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２，ｈｔｍｌサイトで得られるプログラムＢＬＡＳＴ，“ＢＬＡＳＴ　２配列”
（Ｔａｔｕｓｏｖａら、“Ｂｌａｓｔ　２　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ　ｎｅｗ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を利用でき、使用パラメータは、欠陥によって与えられるパラメータであり（特に、パラメータ“ｏｐｅｎ　ｇａｐ　ｐｅｂａｌｔｉｅ”について：５，および“ｅｘｔｔｉｏｎｇａｐ　ｐｅｂａｌｔｉｅ”について：２；選択マトリックスは、例えば、プログラムによって提案されたマトリックス“ＢＬＯＳＵＭ６２”である），比較される２つの配列の間の同一性％は、プログラムによって直接に計算される。
【００２１】
ヌクレオチド配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のベースに対して少なくとも８０％，好ましくは、８５％，９０％，９５％および９８％の同一性％を有する上記の相同配列は、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ種ＯＲＳＡＹ株の変異体に属するバクテリアのゲノム配列またはその代表的フラグメントの配列に対応する配列を含むことができる。本発明において、用語“科および属”は、相互に交換でき、用語“変異体、株および亜種”は、同じく、相互に交換できる。従って、上記の相同配列は、同一種内のまたは種の間の突然変異に関連する変化に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切除、置換、欠失および／または付加に対応できる。上記の相同配列は、更に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉに存在し得る、遺伝暗号の縮重に関連する変化または属、種または変異体の特定の遺伝暗号の偏りに対応できる。
【００２１】
本発明の配列の相補的ヌクレオチド配列とは、本発明の配列のヌクレオチドの相補的ヌクレオチドを有し且つ配位が逆である（逆平行配列）すべてのＤＮＡを意味する。
【００２２】
本発明に係る配列の代表的フラグメントによって、帰属の配列を構成する少なくとも１５のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０，７５，１５０，３００および４５０のヌクレオチドを有するすべてのヌクレオチドフラグメントを表すことを意図する。
【００２３】
上記の代表的フラグメントのうち、緊縮条件において本発明に係るヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションできるフラグメントが好ましい。緊縮条件におけるハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン力の条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーションを維持できるよう選択されていることを意味する。
【００２４】
例えば、上記のヌクレオチドフラグメントを決定するためのハイブリダイゼーション段階の強い緊縮条件は、下記の如くであれば有利である。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、緩衝液ＳＳＣの存在下で好ましくは６５℃の温度において実施する。１×ＳＳＣは、０，１５ＭのＮａＣｌおよび０，０５Ｍのクエン酸ナトリウムに対応する。洗浄工程の例を以下に示す：
一部材温度において２×ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ，次いで、６８℃において１５ｍｉｎ、３回洗浄；１×ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ，０，５×ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ，０，１×ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ。
【００２６】
例えば、緩衝液５×ＳＳＣ存在下で６０℃の温度を利用する中間的な緊縮条件または緩衝液５×ＳＳＣ存在下で５０℃の温度を利用する弱い緊縮条件は、それぞれ、２つの配列のあいだのハイブリダイゼーションのために、大きくない総合相補性を必要とする。
【００２７】
当業者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の教示にもとづき、約３００ベースのサイズを有するヌクレオチドについて上記のハイブリダイゼーション緊縮条件をより大きいまたはより小さいオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
【００２８】
本発明に係る代表的フラグメントのうち、本発明に係る相同配列またはそのフラグメントを得ることができる方法においてまたは配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１に不完全に現れるゲノムフラグメントまたはエラー担体または不確定性担体を再構成できる方法においてプライマーまたはプローブとして使用できるフラグメントが好ましい。上記方法（例えば、ポリメラーゼにおける鎖反応（ＰＣＲ），核酸のクローン化および配列決定）は、当業者によく知られている。種の間または種内の突然変異または変異に対応する上記の相同ヌクレオチド配列および完全なゲノム配列または再構成できるそのフラグメントの１つは、もちろん、本発明の部分をなす。
【００２９】
更に、上記の代表的フラグメントのうち、一般に、開始暗号と停止暗号との間または２つの停止暗号の間に含まれ、ポリペプチド、好ましくは、少なくとも１００のアミノ酸をコードする読み取り枠（配列ＯＲＦ（ＯＲＦ：“ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ”）と呼ばれる）、例えば、以下に例示の配列ＯＲＦに対応するヌクレオチド配列に対応するフラグメントが好ましい。
【００３０】
本明細書において以下で使用するヌクレオチド配列ＯＲＦの連番は、上記ＯＲＦによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列の連番に対応する。
【００３１】
即ち、ヌクレオチド配列ＯＲＦ２，ＯＲＦ３，．，ＯＲＦ８１１およびＯＲＦ８１２は、それぞれ、以降の配列リストに記載のアミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３，，，，，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１２をコードする。
【００３２】
配列ＯＲＦ２，ＯＲＦ３，．，ＯＲＦ７９０およびＯＲＦ７９１は、配列リストに記載のゲノム配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１上のその各位置によって且つ配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の補完鎖上に上記配列が位置することを示す“完全な”特性−これが提示してあれば−によって決定される。本明細書において、上記配列ＯＲＦの上記位置および“完全な”特性−これが提示してある限り−は、“ＳＥＱ　ＩＤ：Ｘ”（ここで、Ｘは、かくして決定したＯＲＦのナンバーに対応する）を示す次の見出し＜２２３＞に関連する識別数字または見出し＜２２２＞を有する配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のための配列リストに記載の特性に示されている。
【００３３】
以下に例を挙げる：
位置ｎｔ１７５６５１７６−ｎｔ１７６４５２３および見出し“＜２２３＞ＳＥＱ　ＩＤ：３７４”に関連する見出し＜２２２＞に示した“完全な”特性によって同定されたＯＲＦ３７４の詳細なヌクレオチド配列は、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の端部間に含まれた位置ｎｔ１７５６５１７６−ｎｔ１７６４５２３の間に含まれた配列の相補的配列である；
見出し“＜２２３＞ＳＥＱ　ＩＤ：２”に関連する見出し＜２２２＞に示されたその位置ｎｔ２５１６２−ｎｔ２６１８１によって同定されたＯＲＦ２の詳細なヌクレオチド配列は、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１の端部間に含まれた位置ｎｔ２５１６２−ｎｔ２６１８１の間に含まれた配列である。
【００３４】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのゲノムの円形にもとづき、配列の若干の要素は、計数原点に跨がることができる。この仮定において、上記端部のうち１つの端部の座標は、ゲノムの長さよりも大きい数値を有することができる。上記位置は、ゲノムサイズを差引いた状態にあると解釈される。しかしながら、この場合、見出し“＜２２３＞ＳＥＱ　ＩＤ：３７４”に関連する見出し＜２２２＞に示されたＯＲＦ３７４の座標１７５６５１７６および１７６４５２３が、それぞれ、５８および１７６４５２３として解釈すべはということを意味するものではない。
【００３５】
本発明に係る代表的フラグメントは、例えば、特殊な増幅（例えば、ＰＣＲ）によってまたは、消化後、本発明に係るヌクレオチド配列の適切な制限酵素によって得ることができる。これらの方法は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文に記載されている。これらの代表的フラグメントは、更に、そのサイズが過大でなければ、化学的合成によって且つ当業者に周知の方法にもとづき得ることができる。
【００３６】
本発明に係る代表的フラグメントは、例えば、上記の代表的フラグメントのうちの若干、特に、配列の一部が欠如したまたは不完全なフラグメントを当業者に周知の方法（例えば、増幅技術、クローン化技術または配列決定技術）によって再構成する際のプライマーとしてい使用できる。
【００３７】
修飾されたヌクレオチド配列とは、当業者に周知の技術にもとづく突然変異誘発によって得られ、正常の配列に対して改善を示す、特に、規則的な配列および／またはポリペプチドの発現プロモータ内に突然変異を示し、上記ポリペプチドの発現または活性を改変するすべてのヌクレオチド配列を意味する。
【００３８】
修飾されたヌクレオチド配列とは、更に、以下に定義の如き改変ポリペプチドをコードするすべてのヌクレオチド配列を意味する。
【００３９】
本発明は、配列ＯＲＦ２〜ＯＲＦ８１２から選択されていることを特徴とするＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのヌクレオチド配列に関する。配列ＯＲＦの連番は、ＯＲＦ７９２−ＯＲＦ８１２を除いて、染色体における上記配列の出現順序に対応する。
【００４０】
配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ７９１の詳細なヌクレオチド配列は、上記の如く定義される。
【００４１】
配列ＯＲＦ７９２−ＯＲＦ８００の詳細なヌクレオチド配列は、対応するペプチド配列ＳＥＱ　ＩＤの識別数字＜２２３＞に示されたゲノム配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１上の最初のヌクレオチドの位置および最後のヌクレオチドの位置によって定められる。
【００４２】
配列ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０５，ＯＲＦ８０６，ＯＲＦ８０７，ＯＲＦ８０８，ＯＲＦ８１１およびＯＲＦ８１２の詳細なヌクレオチド配列は、以下の実施例３−７に示した如く、ゲノム配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１上の最初のヌクレオチドの位置および最後のヌクレオチドの位置によって定められる。
【００４３】
配列ＯＲＦ８０２，ＯＲＦ８０３，ＯＲＦ８０４，ＯＲＦ８０９およびＯＲＦ８１０の詳細なヌクレオチド配列は、以下の実施例３−７に示した如く、帰属のＯＲＦ８０１およびＯＲＦ８０８から演繹によって同定される。
【００４４】
本発明は、更に、
下記、即ち、
ａ）本発明に係るヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２；
ｂ）本発明に係るまたはａ）に定義の如きヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２と少なくとも８０％の同一性を有する相同のヌクレオチド配列；
ｃ）本発明に係るまたはａ）またはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２に対応するヌクレオチド配列またはＲＮＡヌクレオチド配列；
ｄ）本発明に係るまたはａ），ｂ）またはｃ）に定義の如きヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２の代表的フラグメントのヌクレオチド配列；
ｅ）本発明に係るまたはａ），ｂ），ｃ）またはｄ）に定義の如き配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２から得ることができるヌクレオチド配列；および、
ｆ）本発明に係るまたはａ），ｂ），ｃ），ｄ）またはｅ）に定義の如き配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ７９１から改変されたヌクレオチド配列、
から選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【００４５】
ヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２との相同性に関して、ヌクレオチド配列ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２の１つの配列の塩基に対して少なくとも８０％，好ましくは、８５％，９０％，９５％および９８％の同一性％を有する相同配列が好ましい。上記相同配列は、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ種の変異体に属するバクテリアの配列ＯＲＦに対応する配列を含むことができる。
上記相同配列は、同一種内のまたは種の間の突然変異に起因する変化に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切除、置換、欠失および／または付加に対応できる。上記の相同配列は、更に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉに存在し得る、遺伝暗号の縮重に関連する変化または属、種または変異体の特定の遺伝暗号の偏りに対応できる。
【００４６】
本発明は、本発明に係るヌクレオチド配列によって、好ましくは、配列ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．１の代表的フラグメントによってコードされ、配列ＯＲＦに対応する、特に、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１２から選択したことを特徴とするＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドに対応する。
【００４７】
本発明は、更に、下記、即ち、
ａ）本発明に係るポリペプチド；
ｂ）本発明に係るポリペプチドまたはａ）に定義の如きポリペプチドと相同のポリペプド；
ｃ）本発明に係るポリペプチドまたはａ）またはｂ）に定義の如きポリペプチドの少なくとも５つのアミノ酸のフラグメント；
ｄ）本発明に係るポリペプチドまたはａ），ｂ）またはｃ）に定義の如きポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント；および、
ｅ）本発明に係るポリペプチドまたはａ），ｂ），ｃ）またはｄ）に定義の如きポリペプチドから改変されたポリペプチド、
から選択したポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチドを含む。
【００４８】
本明細書において、用語のポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、互換性がある。
【００４９】
ここで注意するが、本発明は、天然の形のポリペプチドには関しない。即ち、ポリペプチドは、自然環境から得られたものではなく、ポリペプチドは、自然源から分離されまたは精製によって得られ、または、遺伝子組換えによってまたは化学的合成によって得られ、従って、以下に説明する如く、天然でないアミノ酸を含むことができる。
【００５０】
相同ポリペプチドによって、天然のポリペプチドとは異なり、若干の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置換、切除、延長、非現実的融合および／または突然変異または翻訳後修飾を受けたポリペプチドを表すことを意図する。相同ポリペプチドのうち、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％，好ましくは、８５％，９０％，９５％および９８％の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。置換の場合、１つまたは複数の連続または非連続アミノ酸が、“同等の”アミノ酸によって置換えられている。この場合、“同等の”アミノ酸という表現は、以下で定義する如く、基本構造のアミノ酸の１つと置換できるが、対応するペプチドの生物学的活性を本質的に変更しないすべてのアミノ酸を意味する。
【００５１】
上記の同等のアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的相同性に依拠してまたは各種ポリペプチドの間の生物学的活性の可能な比較実験の結果に依拠して定めることができる。
【００５２】
例として、対応して改変されたポリペプチドの生物学的活性の大きな変化を結果することなく実施できる置換方式、例えば、バリンまたはイソロイシンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、アスパラギンによるグルタミンの置換、リシンによるアラギニンの置換，ｅｔｃ．を挙げる。同一条件において、もちろん、逆置換も可能である。
【００５３】
相同ポリペプチドは、更に、上記の如きヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドに対応し、従って、本定義にもとづき、突然変異されたまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓにおいて可能な種内のまたは種の間の変化、特に、少なくとも１つのアミノ酸残基の切除、置換、欠失および／または付加に対応する変化に対応するポリペプチドを含む。
【００５４】
本発明に係るポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントによって、特に、本発明に係るポリペプチドの特徴の少なくとも１つを有し、特に、一般的に下記の如き活性を駆使できる、下記の如きポリペプチドフラグメントを表すことを意図する：
−酵素活性（代謝）または有機化合物または無機化合物の生合成または生分解に関する活性；
−構造的活性（細胞エンベロープ、保護分子、リボソーム）；
−分泌時の（エネルギ、イオンの）輸送活性；または、
−特に、ＤＮＡまたはＲＮＡの、複製、増幅、修復、転写、翻訳または成熟プロセスにお　ける活性。
【００５５】
本発明に係るポリペプチドのフラグメントによって、最小５つのアミノ酸、好ましくは、１０，１５，２５，５０，１００および１５０のアミノ酸を含むポリペプチドを表すことを意図する。
【００５６】
本発明に係るポリペプチドのフラグメントは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ内に天然に存在するかＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉから分泌され、分離または精製されたフラグメントまたはタンパク質分解酵素（トリプシンまたはキモトリプシンまたはコラゲナーゼ）または化学試薬（例えば、臭化シアノゲン（ＣＮＢｒ））による上記ポリペプチドの開裂によって得られるまたは強酸性（例えば、ｐＨ２，５）の環境に上記ポリペプチドを設置することによって得られるフラグメントに対応する。この種のポリペプチドフラグメントは、更に、上記フラグメントを発現できる核酸を含む本発明に係る発現ベクターによって形質変換された宿主から、適切な調節および／または発現要素の制御下で、化学的合成によって無差別に調製できる。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドの“改変ポリペプチド”によって、遺伝子組換えによってまたは以下に述べる化学合成によって得られ、正規の配列に対して少なくとも部分的に改変されたポリペプチドを表すことを意図する。上記の改変は、特に、特異性源または活性効果源または構造配座源またはチャージ源または本発明に係るポリペプチドの疎水性源を有するアミノ酸に関連する。かくして、同等の、増大または減少された活性および同等の、縮小または拡大された特異性を有するポリペプチドを創成できる。改変ポリペプチドのうち、最大５つのアミノ酸を改変でき、Ｎ端またはＣ端で切除または欠失または付加を行ったポリペプチドを挙げる。
【００５８】
既述の如く、ポリペプチドの修飾は、特に、下記を目的とする：
−有機化合物または無機化合物の生合成プロセスまたは生分解プロセスにおいて使用可能とするという目的，
−特に、ＤＮＡまたはＲＮＡの、複製、増幅、修復、転写、翻訳または成熟プロセスにおいて使用可能とするという目的，
−その溶解性、その活性の効果または特異性を改善し、更に、その精製を容易化するという目的。
【００５９】
化学合成には、更に、天然でないまたはペプチド結合のないアミノ酸を使用できるという利点がある。更に、本発明に係るポリペプチドの有効期間の改善のため、天然でない、例えば、Ｄ形のアミノ酸またはアミノ酸の類似体、特に、例えば、硫化物を使用すれば有利である。
【００６０】
本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明の部分をなす。
【００６１】
好ましい態様で、本発明は、更に、
エネルギ生成またはエネルギ変換に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３４】
2004500802.tif 000002
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６２】
好ましい態様で、本発明は、アミノ酸の代謝または輸送に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３５】
2004500802.tif 000003
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【００６３】
好ましい態様で、本発明は、ヌクレオチドの代謝または輸送に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３６】
2004500802.tif 000004
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６４】
好ましい態様で、炭水化物の代謝または輸送に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３７】
2004500802.tif 000005
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６５】
補酵素の代謝時に生ずるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３８】
2004500802.tif 000006
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６６】
好ましい態様で、脂質の代謝に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ３１２，Ｏ３１３，ＯＲＦ５４５，ＯＲＦ５５８，ＯＲＦ５５９およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６７】
好ましい態様で、本発明は、翻訳またはリポソームの構造にまたは生合成に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化３９】
2004500802.tif 000007
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００６８】
好ましい態様で、本発明は、転写に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１４８，ＯＲＦ３５７，ＯＲＦ４８３，ＯＲＦ４９７，ＯＲＦ５２３，ＯＲＦ５２４，ＯＲＦ６２０，ＯＲＦ７５２およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明らに係るヌクレオチド配列に関する。
【００６９】
好ましい態様で、本発明は、複製、修正および組換えに関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４０】
2004500802.tif 000008
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７０】
外膜または細胞壁の合成に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４１】
2004500802.tif 000009
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７１】
好ましい態様で、分泌または運動に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４２】
2004500802.tif 000010
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７２】
好ましい態様で、本発明は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの保護タンパク質またはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４３】
2004500802.tif 000011
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７３】
好ましい態様で、本発明は、無機イオンの代謝または輸送に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４４】
2004500802.tif 000012
およびその代表的フラグメントの１つから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７４】
好ましい態様で、本発明は、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４５】
2004500802.tif 000013
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７５】
好ましい態様で、本発明は、トランスフェラーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４６】
2004500802.tif 000014
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７６】
好ましい態様で、本発明は、ヒドロラーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４７】
2004500802.tif 000015
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７７】
好ましい態様で、本発明は、インテインを含むＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４８】
2004500802.tif 000016
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７８】
好ましい態様で、本発明は、イソメラーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１７６，ＯＲＦ２８２，ＯＲＦ２８３，ＯＲＦ３９９，ＯＲＦ４２６，ＯＲＦ５３１，ＯＲＦ５８３，ＯＲＦ６８８およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００７９】
好ましい態様で、本発明は、リガーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ２８，ＯＲＦ６３９，ＯＲＦ６５およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８０】
好ましい態様で、本発明は、リアーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１５６，ＯＲＦ２２３，ＯＲＦ２７１，ＯＲＦ３０６，ＯＲＦ３６，ＯＲＦ３６２，ＯＲＦ４０３，ＯＲＦ４７２，ＯＲＦ５１７，ＯＲＦ６５０，ＯＲＦ７９６およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８１】
好ましい態様で、本発明は、ホスファターゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１８，ＯＲＦ３５４，ＯＲＦ３９８，ＯＲＦ７５，ＯＲＦ７６０，ＯＲＦ７９３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８２】
好ましい態様で、本発明は、糖の代謝時に生ずるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、ＯＲＦ１５４，ＯＲＦ２１３，ＯＲＦ２９８，ＯＲＦ３７，ＯＲＦ４０，ＯＲＦ４４９，ＯＲＦ５５３，ＯＲＦ６６６，ＯＲＦ７６３およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８３】
好ましい態様で、本発明は、プロテアーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、下記配列、即ち、
【化４９】
2004500802.tif 000017
およびその代表的フラグメントから選択したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列に関する。
【００８４】
下記活性，即ち、
−配列ＯＲＦ４８６，ＯＲＦ８０６の細胞増殖の核抗原タイプの活性；
−配列ＯＲＦ１７，ＯＲＦ６９５，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０２，ＯＲＦ８０５またはＯＲＦ８１１の複製因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４またはＯＲＦ１５９の延長因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４８のＤＮＡに対する結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＯＲＦ７１のインテグラーゼ／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＯＲＦ５０３の酸化還元触媒タイプの活性；
を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドそのフラグメントの１つまたはその代表的フラグメントの１つをコードする配列を含むことを特徴とする本発明に係るヌクレオチド配列も好ましい。
【００８５】
他の好ましい観点の下で、本発明は、エネルギ生成または変換に関与し、下記配列、即ち、
【化５０】
2004500802.tif 000018
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドを対象とする。
【００８６】
好ましい態様で、本発明は、更に、アミノ酸の代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化５１】
2004500802.tif 000019
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００８７】
好ましい態様で、本発明は、ヌクレオチドの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化５２】
2004500802.tif 000020
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００８８】
好ましい態様で、本発明は、炭水化物の代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化５３】
2004500802.tif 000021
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００８９】
好ましい態様で、本発明は、補酵素の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化５４】
2004500802.tif 000022
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９０】
好ましい態様で、本発明は、脂質の代謝に関与し、下記配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５５９のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９１】
好ましい態様で、本発明は、リボソームの翻訳時にまたは構造にまたは生合成に関与し、下記配列、即ち、
【化５５】
2004500802.tif 000023
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９２】
好ましい態様で、本発明は、転写に関与し、下記配列、即ち、
【化５６】
2004500802.tif 000024
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９３】
好ましい態様で、本発明は、複製、修復および組換えに関与し、下記配列、即ち、
【化５７】
2004500802.tif 000025
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９４】
好ましい態様で、本発明は、外膜または細胞壁の合成に関与し、下記配列、即ち、
【化５８】
2004500802.tif 000026
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９５】
好ましい態様で、本発明は、分泌または運動に関与し、下記配列、即ち、
【化５９】
2004500802.tif 000027
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９６】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６０】
2004500802.tif 000028
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択した保護タンパク質を含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９７】
好ましい態様で、本発明は、無機イオンの代謝または輸送に関与し、下記配列、即ち、
【化６１】
2004500802.tif 000029
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９８】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６２】
2004500802.tif 000030
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ポリメラーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【００９９】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６３】
2004500802.tif 000031
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１００】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６４】
2004500802.tif 000032
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０１】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６５】
2004500802.tif 000033
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、インテインを含むポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０２】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６６】
2004500802.tif 000034
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択され、イソメラーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０３】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６５のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リガーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０４】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６７】
2004500802.tif 000035
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、リアーゼ活性を有するポリペプチド含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０５】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化６８】
2004500802.tif 000036
のポリペプチドおよびそのフラグメントから選択され、ホスファターゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０６】
好ましい態様で、本発明は、糖の代謝に関与し、下記配列、即ち、
【化６９】
2004500802.tif 000037
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択したポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０７】
好ましい態様で、本発明は、下記配列、即ち、
【化７０】
2004500802.tif 000038
のポリペプチドおよびそのフラグメントの１つから選択され、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドに関する。
【０１０８】
下記活性，即ち、
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４８６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０６の細胞増殖の核抗原タイプの活性；
−配列ＯＲＦ１７，ＯＲＦ６９５，ＯＲＦ８０１，ＯＲＦ８０２，ＯＲＦ８０５またはＯＲＦ８１１の複製因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＯＲＦ５４またはＯＲＦ１５９の延長因子に類似したタンパク質タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５４８のＤＮＡに対する結合タンパク質タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６０７の転写因子タイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７１のインテグラーゼ／／リコンビナーゼタイプの活性；
−配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５０３の酸化換言タイプの活性；
を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つを含むことを特徴とする本発明に係るポリペプチドも好ましい。
【０１０９】
上記ヌクレオチド配列および本発明に係るポリペプチドのうち、ポリペプチドおよびポリメラーゼ活性またはプロターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が好ましい。
【０１１０】
本発明において一般的に、本発明に係るポリペプチドおよび対応するそのヌクレオチド配列が属する機能グループは、既知の配列と比較された類似性によって、あるいは、生化学の標準技術および遺伝子工学に関連する細胞学の標準技術（例えば、免疫親和性、免疫マーキングによる位置決め、分別抽出、酵素活性の測定、発現誘導または抑制活性の検討、Ｅ．ｃｏｌｉの発現の検討）によって決定できる。
【０１１１】
もちろん、一方では、本発明において、機能グループによってリストアップされたヌクレオチド配列（ＯＲＦ２−ＯＲＦ８１２）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１２）は、当該のグループに網羅されている訳ではない。他方では、同じくもちろん、本発明において、所与の機能グループに記載の１つのヌクレオチド配列（ＯＲＦ）または１つのアミノ酸配列は、例えば、記載されたグループ間の影響および選択した配列のベース（例えば、本発明についてスイスプロート・バンクまたはＣＯＧ）を考慮する他のグループの部分もなすことができる。
【０１１２】
本発明は、更に、上記配列が、上記配列の読取、分析および／または利用を容易化する形状および性質を有する担体、即ち、記録担体に記録されていることを特徴とするヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列に関する。上記担体は、もちろん、更に、本発明の他の抽出情報（例えば、特に、本明細書の表１に記載の如く既知の配列との類似性）を含むことができ、および／または、更に、得られた結果の比較解析および利用を容易化するため他の微生物のヌクレオチド配列および／またはポリペプチドに関する情報を含むことができる。
【０１１３】
上記記録担体のうち、特に、コンピュータによって読取り得る担体、例えば、磁気的、光学的、電気的またはハイブリッド担体（例えば、“フロッピー”ディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたは記録カセット）が好ましい。
【０１１４】
本発明は、更に、プライマーまたはプローブとして使用できるヌクレオチド配列であって、本発明に係るヌクレオチド配列から選択されていることを特徴とするヌクレオチド配列に関する。
【０１１５】
本発明は、更に、ヌクレオチド配列の増幅のためプライマーまたはプローブとしての本発明に係るヌクレオチド配列の使用に関する。
【０１１６】
従って、本発明に係るヌクレオチド配列は、特に、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）による、ヌクレオチド配列の増幅に使用できる（Ｅｒｉｃｈ，１９８９；Ｉｎｎｉｓら、１９９０；Ｒｏｌｆｓら，１９９１；Ｗｈｉｔｅら１９９７）。
【０１１７】
上記のオリゴデオキシリボヌクレオチド系またはオリゴリボヌクレオチド系プライマーは、少なくとも１０のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５のヌクレオチド、更に好ましくは、少なくとも２０のヌクレオチドの長さを有していれば有利である。
【０１１８】
有利なことには、ＰＣＲの代わりに、標的核酸の他の増幅技術を使用できる。
【０１１９】
本発明に係るヌクレオチド配列、特に、本発明に係るプライマーは、標的核酸の他の下記の如き増幅プロセスに使用できる：
−ＴＡＳ技術（転写依拠増幅システム），Ｋｗｏｈら，１９８９；
−３ＳＲ技術（自動持続性配列複製），Ｇｕａｔｅｌｌｉら，１９９０；
−ＮＡＳＢＡ技術（核酸配列依拠増幅），Ｋｉｅｖｉｔｉｓら，１９９１；
−ＳＤＡ技術（ストランド置換増幅）または鎖置換増幅技術（Ｗａｌｋｅｒら，１９９２）　；
−ＴＭＡ技術（転写媒介増幅）。
【０１２０】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、プローブとして役立つ核酸の下記の如き増幅技術または修復技術に使用できる：
−ＬＣＲ技術（リガース鎖反応），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，１９８８；熱安定性リガースを使用したＢａｒａｎｙら（１９９１）によって改善された；
−ＲＣＲ技術（修復鎖反応），Ｓｅｇｅｖ，１９９２；
−ＣＰＲ技術（サイクリングプローブ反応），Ｄｕｃｋら，１９９０；
−Ｑ−β−レプリカーゼによる増幅技術，Ｍｉｅｌｅら，１９８３；特に、Ｃｈｕら，１９８６，Ｌｉｚａｒｄｉら，１９８８，ＢｕｒｇらおよびＳｔｏｎｅら，１９９６によって改善された。
【０１２１】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのプライマーによる増幅によって得ることができるフラグメントのヌクレオチド配列を対象とする。
【０１２２】
標的ポリヌクレオチドが、場合によっては、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｍ）である場合、本発明に係る少なくとも１つのプライマーによる増幅反応の実施前にまたは本発明に係る少なくとも１つのプライマーによる検知プロセスの実施前に、試料に含まれるＲＮＡからＤＮＡｃを得るため逆トランスクリプターゼタイプの酵素を使用できる。得られたＤＮＡｃは、本発明に係る増幅プロセスに使用される１つまたは複数のプライマーまたは１つまたは複数のプローブの標的として役立つ。
【０１２３】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのプローブによるハイブリダイゼーションによって得ることができるフラグメントのヌクレオチド配列を対象とする。
【０１２４】
本発明は、更に、共有結合状態または非共有結合状態で担体上に固定されていることを特徴とするヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
本発明の他の対象は、本発明に係るヌクレオチ配列を含むことを特徴とする、配列のクローン化ベクターおよび／または発現ベクターである。
【０１２６】
本発明に係る上記ベクターのうち、エネルギ変換または生成、アミノ酸、炭水化物または糖、脂質、ヌクレオチド、無機イオンまたは補酵素の代謝および／または輸送または、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写、複製、修復または組換え、更に、分泌または運動、リボソームの生合成または構造に、細胞壁または外膜の合成に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードするまたはイソメラーゼ活性、リガーゼ活性、リアーゼ活性、ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、トランスフェゼ活性、ポリメラーゼ活性，ＲＮＡポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードするまたは保護タンパク質またはインテインを含むタンパク質をコードするヌクレオチ配列を含むベクターが好ましい。
【０１２７】
本発明に係るベクターのうち、更に、細胞増殖の核抗原タイプ、複製因子に類似したタンパク質タイプ、ＤＮＡに対する結合タンパク質タイプ、延長因子に類似したタンパク質タイプ、転写因子タイプ、インテグラーゼ／リコンビナーゼタイプまたは酸化還元触媒タイプのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードするヌクレオチド配列を含むベクターが好ましい。
【０１２８】
所定の宿主細胞内で上記ヌクレオチド配列の発現および／または分泌を実現できる要素を含むことを特徴とする本発明に係るベクターは、同じく、本発明の部分をなす。
【０１２９】
ベクターは、プロモータ、翻訳の開始信号および終了信号および転写の適切な調節領域
を含んでいなければならない。ベクターは、宿主細胞内に安定に保持できなければならず、場合によっては、翻訳されたタンパク質の分泌を同定する特殊信号を有することができる。これらの各種要素は、使用する宿主細胞に依存して選択する。このため、本発明に係るヌクレオチド配列は、選択した宿主内の自律反復ベクター内にまたは選択した宿主と一体のベクター内に挿入できる。
【０１３０】
この種のベクターは、当業者が慣用する方法によって調製でき、生じたクローンは、標準的方法（例えば、リポフェクション、エレクトロポーレーション、熱ショック）によって適切な宿主に導入できる。
【０１３１】
本発明に係るベクターは、例えば、プラスミド源またはウイルス源のベクターである。
【０１３２】
上記ベクターは、本発明に係るヌクレオチド配列のクローン化または発現のため、宿主細胞の形質転換に利用される。
【０１３３】
本発明は、更に、本発明に係るベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。
【０１３４】
上記細胞は、上記の如きベクターに挿入されたヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクションされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を実施できる条件において上記細胞を培養することによって得ることができる。
【０１３５】
宿主細胞は、原核生物系または真核細胞系（例えば、バクテリア細胞）から選択でき（Ｏｌｉｎｓら，１９９３）、更に、酵母細胞から選択でき（Ｂｕｃｋｈｏｌｚら，１９９３）、更には、動物の細胞、特に、哺乳類の細胞の培養体から選択でき（Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９３）、特に、中国のハムスタの卵巣（ＣＨＯ）の細胞から選択でき、更には、例えばバキュロウイルスを使用するプロセスを使用できる昆虫の細胞から選択できる（Ｌｕｃｋｏｗ，１９９３）。
【０１３６】
本発明のタンパク質の発現のために好ましい宿主細胞は、原核生物の細胞（例えば、グラム菌）から構成される。
【０１３７】
本発明は、更に、本発明にもとづき形質転換された上記細胞を含む動物（但し、ヒトは除く）に関する。
【０１３８】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの１つまたは複数の遺伝子を発現する本発明に係るトランスジェニックアニマルの獲得は、マウス、ハツカネズミまたはウサギにおいて、当業者に周知の方法（例えば、ウイルストランスフェクションまたは非ウイルストランスフェクション）によって好ましい態様で行われる。１つまたは複数の遺伝子を発現するトランスジェニックアニマルは、遍在性または織物タイプの強いプロモータの制御下で上記遺伝子の多重コピーのトランスフェクションによって得ることができる。トランスジェニックアニマルは、更に、胎児性株の細胞の相同組換え、胚への上記株細胞の移行、生殖系列のレベルにおいて影響を受けたキメラの選択、上記キメラの増殖によって得ることができる。
【０１３９】
本発明に係る形質転換細胞およびトランスジェニックアニマルは、組換えポリペプチドの調製プロセスにおいて使用できる。
【０１４０】
現在、遺伝子工学にもとづき本発明に係る発現ベクターによって形質転換された細胞を使用することによってまたは本発明に係るトランスジェニックアニマルを使用することによって、比較的多量の組換えポリペプチドを調製できる。
【０１４１】
ベクターおよび／または本発明に係るベクターによって形質転換された細胞および／または本発明にもとづき形質転換された上記細胞を含むトランスジェニックアニマルを使用することを特徴とする、組換えの形の本発明に係るポリペプチドの調製プロセスは、それ自体、本発明に含まれる。
【０１４２】
組換えの形の本発明に係るポリペプチドの上記調製プロセスのうち、既述のヌクレオチド配列をそれぞれ含むベクターおよび／または上記ベクターによって形質転換された細胞および／または本発明にもとづき形質転換された上記細胞を含むトランスジェニックアニマルを使用する調製プロセスが好ましい。既述の如く、上記ヌクレオチド配列は、エネルギ変換または生成アミノ酸、炭水化物または糖、脂質、ヌクレオチド、無機イオンまたは補酵素の代謝および／または輸送または、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写、複製、修復または組換え、更に、分泌または運動、リボソームの生合成または構造に、細胞壁または外膜の合成に関与するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、または、イソメラーゼ活性、リガーゼ活性、リアーゼ活性、ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、トランスフェゼ活性、ポリメラーゼ活性，ＲＮＡポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、または、保護タンパク質またはインテインを含むタンパク質をコードし、更に、細胞増殖の核抗原タイプ、複製因子に類似したタンパク質タイプ、ＤＮＡに対する結合タンパク質タイプ、延長因子に類似したタンパク質タイプ、転写因子タイプ、インテグラーゼ／リコンビナーゼタイプまたは酸化還元触媒タイプのＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードする。
【０１４３】
組換えの形の本発明に係るポリペプチドの上記調製プロセスのうち、更に、既述のヌクレオチド配列をそれぞれ含むベクターおよび／または上記ベクターによって形質転換された細胞および／または本発明にもとづき形質転換された上記細胞を含むトランスジェニックアニマルを使用する調製プロセスが好ましい。既述の如く、上記ヌクレオチド配列は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードし、ポリメラーゼ活性，ＲＮＡポリメラーゼ活性またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つをコードする。
【０１４４】
上記の如く得られた組換えポリペプチドは、更に、グリコシル化された形またはグリコシル化されてない形であってよく、天然の３次構造を有することができまたは有してなくてもよい。
【０１４５】
好ましい変更例の場合、タンパク質“担体”（タンパク質キメラ）に融合した組換えポリペプチドを調製する。この系の利点は、融合パートナが特殊リガンドに対する親和性を有していれば、組換え生成物の安定化およびタンパク質分解の減少、インビトロの再生中の安定性の増加および／または精製の簡単化を達成できるという点にある。
【０１４６】
更に詳細に云えば、本発明は、下記工程を含む本発明に係るポリペプチドの調製法に関する：
ａ）本発明に係る核酸配列の組換えポリペプチドを発現できる条件における形質　　転換細胞の培養；
ｂ）場合によっては、上記組換えポリペプチドの回収。
【０１４７】
本発明のポリペプチドの調製プロセスにおいて、本発明に係るトランスジェニックアニマルを使用した場合、次いで、上記アニマルから組換えポリペプチドを抽出する。
【０１４８】
本発明は、更に、上記の如き本発明の方法によって得ることができるポリペプチドに関する。
【０１４９】
本発明は、更に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を使用することを特徴とする合成ポリペプチドの調製法に関する。
【０１５０】
本発明は、更に、本発明に係る方法によって得られた合成ポリペプチドに関する。
【０１５１】
本発明に係るポリペプチドは、更に、ペプチド合成の分野の公知の技術によって調製できる。この合成は、均一な溶液においてまたは固相において実施できる。
【０１５２】
例えば、Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ（１９７４）が発表した、均一溶液中の合成に依拠する。
【０１５３】
本発明の他の好ましい技術にもとづき、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが発表した技術に依拠する。
【０１５４】
本発明は、更に、本発明に係る少なくとも１つのポリペプチドまたはそのフラグメントの１つを有するハイブリッドポリペプチドに関する。
【０１５５】
ハイブリッド分子の合成プロセスは、所望のポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構成するため遺伝子工学で使用される方法を含む。例えば、Ｍｉｎｔｏｎ（１９８４）が発表した融合タンパク質をコードする遺伝子の調製技術を挙げることができる。
【０１５６】
ハイブリッドポリペプチドをコードする上記ハイブリッドヌクレオチド配列および上記ハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られた組換えポリペプチドであることを特徴とする本発明に係るハイブリッドポリペプチドは、同じく、本発明の部分をなす。
【０１５７】
本発明は、更に、上記のハイブリッドヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクターを含む。上記ベクターによって形質転換された宿主細胞および上記ベクター、上記形質転換細胞および／または上記トランスジェニックアニマルを使用する組換えポリペプチドの調製法は、同じく、本発明の部分をなす。
【０１５８】
既述の如く、本発明のヌクレオチド配列は、例えば、有機分子または無機分子の生合成または生分解時に生ずるポリペプチドまたは酵素ポリペプチドフラグメントをコードする如き公知の配列との相同性によって同定される。
【０１５９】
工業的利点または治療的利点を有する有機化合物または無機化合物の生合成または生分解の場合に、本発明に係る上記ポリペプチドを同様に使用することができる。
【０１６０】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの超好熱特性を考慮して、上記プロセスにおいて、このような温度（８０℃〜１１０℃以上）における上記酵素の活性および安定性を有利に利用できる。
【０１６１】
上記ポリペプチドのうち、更に、本発明に係る突然変異または修飾ポリペプチドに対応し、更に、工業的レベルにおける有機化合物または無機化合物の生合成または生分解（例えば、有用化合物の生産）、農作物加工業、製紙業、化学工業、薬品工業または診断製品工業で適用された形質転換の残渣の再処理に使用できる突然変異または修飾酵素を挙げることができる。
【０１６２】
本発明に係るポリペプチドまたはそのフラグメントの１つ、本発明に係る形質転換細胞および／または本発明に係る形質転換動物を使用することを特徴とする、有機化合物または無機化合物の生合成法または生分解法は、同じく、本発明の部分をなす。
【０１６３】
本発明に係るＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、以下の実施例に記載のタイプＩまたはＩＩのＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド）は、核酸増幅を必要とするプロセス、実施例に記載の使用、方法または用途において有利に使用できる。
【０１６４】
本発明に係るＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有する上記ポリペプチドは、下記工程、即ち、
ａ）上記ポリペプチドと生物学的試料中に存在する核酸との間に重合反応および／または増幅反応を実現できる条件において上記生物学的試料を本発明に係るＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つと接触させる工程を含むことを特徴とする、
生物学的試料（組織、細胞または生物学的液体）内の標的核酸の重合および／または増幅のためのプロセスに使用できる。
【０１６５】
本発明は、更に、生物学的試料（組織、細胞または生物学的液体）内の標的核酸の重合および／または増幅のためのＤＮＡポリメラーゼ活性またはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントの１つを含む試薬またはキット（またはユニット）に関する。
【０１６６】
この種の試薬またはキットは、特に、標的核酸の検知および／または同定のために、特に、病原菌（例えば、バクテリア、酵母、寄生生物またはウイルス）の特有の核酸の検出および／または同定のために、更に、当該遺伝子または上記当該遺伝子のうちの変異体の検出および／または同定のために且つタイプＩまたはＩＩのＤＮＡポリメラーゼに関する下記の実施例に記載の使用、方法または用途のために使用できる。
【０１６７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の他の特徴および利点は、実施例の説明および図面の以下の説明から明らかであろう。
【０１６８】
実験方法
１．細胞
使用したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹ株は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，ＩＮＳＴＩＴＵＴ　ＰＡＳＴＥＵＲ（在パリ，フランス）に０９．０４，１９９９にＮＯ．Ｉ−２１８０として寄託された株である。
２．細胞の培養
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹ株は、Ｅｒａｕｓｏらが発表した如き培養条件で且つ培養媒体上で培養した（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６０，３３８−３４９，１９９３；Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７８（１１），３２３２−３２３７，１９９６）。
３．Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの精製
培養後、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文に記載のプロトコルにもとづき、４℃において低速遠心分離によって採取した。
４．ＤＮＡの調製
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文に記載のアルカリ分解法によって、可溶な形のＤＮＡを調製し、次いで、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、リポヌクレアーゼで処理してＲＮＡを除去し、次いで、エタノール沈殿によってＤＮＡを濃縮した。ＤＮＡをＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ（２０ｍＭ−１ｍＭ）で回収し、配量した。
【０１６９】
アガロースブロックに固定したＤＮＡを下記の如く調製した：上記条件において０，３からＤＯ６００ｎｍまで培養した後、細胞を氷中で冷却し、次いで、４℃において低速遠心分離した。細胞の沈渣を培養媒体中で２回、即ち、１回は５０ｍＭのＥＤＴＭ（ｐＨ８，０）で、１回は１２５ｍＭのＥＤＴＭ（ｐＨ８，０）で洗浄し、洗浄毎に遠心分離した。次いで、細胞を３７℃において１２５ｍＭのＥＤＴＭ（ｐＨ８，０）中に再懸濁させ、次いで、等容積の低融点アガロース（σタイプＩＩＩ）を脱イオン水で１．６％に調製し、３７℃に温度調節した。混合物を０，１ｍｌの型に注入し、細胞−アガロース・封入体をゲル化できるよう、室温に放置した。封入体ブロックを離型し、３７℃において、緩衝液（０．５ＭＥＤＴＭ（ｐＨ９．０），１％ラウロイルサクロシンおよびプロテアーゼ１ｍｇ／ｍｌ）で４８ｈ処理し、次いで、４℃に保持した。使用前に、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ−１ｍＭ）＋ＰＭＳＦ０，２５０ｍｇ／ｍｌで強力に（４−６回×２−４ｈ）洗浄した。
【０１７０】
実施例：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのゲノムの配列決定および分析
実施例１：配列決定の戦略
サイズが１．８Ｍｂと評価されたＰ．ａｂｙｓｓｉのゲノム配列決定を、プレ配列のカルトグラフィーの先験的な構成も大きいサイズのサブクローンの事前の全く実験的な確立も必要としないグローバルなアプローチによって実施した。考慮した戦略にもとづき、対をなす端部の配列決定によって特徴づけられ且つランダムに選択されたクローンから誘起されるランダムな相を介入させ（Ｒｏａｃｈら、ＧｅＮＯ．ｍｉｃｓ，２６：３４５，１９９５）、次いで、配列を完成する管理された相を介入させる。操作は、３段階で行う：
１．ｐＢＡＭ３／ＤＨ１０Ｂにおけるプラスミド・バンク（１２０００ヶのクローン）の構成において、平均挿入サイズ５−６ｋｂは、高収量の生産に関連するクローン化の効率の要求と、統合能およびプラスミドｐＧＴ５（３，４ｋｂ）の配列の過剰発現を回避する配慮との間の妥協点として選択した。
ＤＮＡの試料２０μｇを、３００μｌの反応容積中で酵素ＣｖｉＩＩ（ＣＨＩＭＥＲｘ−Ｏｚｙｍｅ）によって部分的に消化した。反応進行のコントロールを向上するため、培養温度を１５℃に低下した。５０μｌの６つの試料を採取し（２ｍｉｎ，５ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，４５ｍｉｎおよび９０ｍｉｎの培養後）、ＥＤＴＭおよびＳＤＳ（最終的にそれぞれ２０ｍＭ，０．２％）を添加して反応を直ちに停止した。分別量（２μｌ）の電気泳動分析後、適切と判断された部分消化状態に対応する試料を捕集し、そのＤＮＡをエタノールで沈殿させ、次いで、低融点の０，４％アガロースゲル（ＬＭＰ，Ｓｅａｐｌａｑｕｅ　ＧＴＧ，ＦＭＣ）上で予分離した。５−６ｋｂの範囲のフラグメントのサイズ範囲に対応するゲルテープを切断し、アガロースＬＭＰの溶融（６５℃×５ｍｉｎ）によってＤＮＡを精製し、次いで、β−アガラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ，アガロース１００μｌについて１単位）の存在下で４０℃において４ｈ培養した。抽出したＤＮＡをエタノールで沈殿させ、無菌水２０μｌ中に再懸濁させ、配量した。自由端を有するプラスミドベクター（例えば、Ｓｍａｌでカットし脱リンしたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の５倍のモル量に、上記ＤＮＡフラグメント５００ｎｇを連結させた。バクテリアＤＨ１０Ｂ中でエレクトロポレーションを行い、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ），Ｘｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴＧ（２０μｇ／ｍｌ）からなる相補的固形媒体上で選択を行った後、１２０００ヶの白色コロニーを９６ピットのマイクロプレート上に移植した。
上記プラスミドクローンの１９３００ヶの端部の配列決定は、統合の大半に貢献する。
２．コスミド・バンクの構成（挿入サイズ３６−４８ｋｂの４０００ヶのクローン）
アガロースブロックに固定したＯＲＳＡＹ株のＤＮＡを、（６５℃における）溶融およびβアガラーゼによるアガロースの消化によって遊離させ、次いで、上記の方法にもとづき酵素ｓａｕ３Ａによって部分的に消化した。３５ｋｂよりも大きいサイズのフラグメント群を、先行例と同様、アガロースゲルＬＭＰ上で電気泳動によって精製し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。端部の脱リン後、上記フラグメントを、ＢａｍＨＩサイトで、コスミドベクター（例えば、ＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の腕の１０倍の過剰量に連結させた。インビトロ・パッケージング、ＤＨ１０Ｂ株の感染およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補完したペトリボックス上の展伸を行った後、約４０００ヶのコスミドクローンを９６ピットのマイクロプレート上に移植した。
１６３５ヶの端部配列を上記コスミドクローンから産出し、統合フレーム上に長い間隔にわたって引延ばした。このうち約５００は、統合中に隣接端から生じたプローブＰＣＲに対するハイブリダイゼーションによって選択されたコスミド上に生成した。
ランダム段階に対応するすべての配列反応は、クローン化サイトの端末にある蛍光プライマー（ＩＲＤ７００およびＩＲＤ８００）によって得られ、ソフトウエアＩｍａｇｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　３．０によってＬＩ−ＣＯＲ４２００上で分析した。
統合は、Ｇｒｅｅｎらによって開発されたソフトウエアＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（Ｅｗｉｎｇら，ＧｅＮＯ．ｍｅ　Ｒｅｓ．，８：１７５，１９９８）を使用して実施し、得られたデータは、ＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎら，ＧｅＮＯ．ｍｅ　Ｒｅｓ．，８：１９５，１９９８）によって交互作用状態で利用した。この段階において、約９８％の配列保護のために、クローン化の１４の不連続性が存続する。配列のデータと酵素ＮＯ．ｔｌに関するＤＮＡゲノムの消化プロフィルとの比較から、分子全体における統合フレームの拡大が認められる。（０，６−５ｋｂの）クローン化の１４の不連続性の保護および弱い鎖の強化は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ　ａｎｄ　Ａｃｕｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：長く正確なポリメラーゼ鎖反応）によって得られた生成物の配列決定によって実施した。
３．仕上げ工程
ランダム段階（“ショットガン”）の終了後、共通配列の連続性および信頼性の保証のため、管理された態様で配列決定を続ける。誤差率は、すべての点において１０−４よりも低くなければならない。これは、２つの段階で展開される：ａ）隣接配列の連結；
ｂ）共通連結は、下記の品質規定を満足しなければならない：
−ＣＯＮＳＥＤに記載のすべての共通点の品質値は４０（１について１０４の確率に対応）以上である，
−各位置において少なくとも３つの読取（このうち少なくとも１つはＤＮＡ鎖による読取）　あるいは、異なる２つのキメラ（規定のプライマーまたは規定のターミネータ）にもとづく３つの読取；
−配列がゲノム上に直接に形成されている場合は除いて、上記の３つの読取は、少なくとも２種のクローンの配列決定に依拠しなければならない。
ヌクレオチドプライマーは、ソフトウエアＰＲＩＭＯ（Ｐｉｎｇら，ＧｅＮＯ．ｍｉｃｓ，４０，４７６−４８５，１９９７）によって半自動的に決定した。　すべての仕上げ配列は、蛍光ターミネータから形成し、シークェンサーＡＢＩ３７７で分析した。
クローン化の若干の不備を解消し、若干の不定のサイトおよび疑わしい多型性を確認するため、Ｐ．ａｂｙｓｓｉのゲノムにおける直接的な配列決定を利用した。
統合配列から演繹した制限地図と酵素Ｎｏ．ｔｌおけるＡｓｃｉに関してＰ．ａｂｙｓｓｉのＤＮＡに観察された消化プロフィルとを比較することによって、統合の補足的確認を行った。特に、観察されたクローン化の１４の不連続性に対応して、酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ，Ｅｃｏｒｉ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩおよびＸｂａＩによって消化されＬＡ６ＰＣＲによって得られた３３のプローブとハイブリダイゼーションされたＯＲＳＡＹ株のＤＮＡの“サザンブロット”によって、より精密な確認を行った。
（読取リストと一体の）注釈データの分析によって、均質化の最終確認を行った。
【０１７１】
実施例２：配列の注釈
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの配列の注釈は、簡単な図式に従う：
コードセグメントの決定、類似性によるコード領域の決定、コード領域の統計的モデルの評価、各領域のコード化可能性の評価、公共分野の配列・データバンクの共通配列の比較による上記セグメントの機能の決定。
簡単なヒューリスティックを利用した：この場合、開始暗号から停止暗号までの１００ヶの暗号よりも長いすべての最大セグメントを決定する。２３４２のこの種の公開読取リストが認められた。次いで、ｂｌａｓｔｐのアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３）によって上記リストをタンパク質配列・バンクＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（Ｂａｉｒｏｃｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｖ．１９９９，２７：４９−５４）と比較して、既知のタンパク質に対して有意の類似性（８０のアミノ酸より大きい長さにわたって同一性３０％以上）を有するペプシド配列のコレクションを構成した。かくして、７１９種類の公開読取リストに対応して、有意の類似性を有する８８３ヶの領域が得られた。当時は未公開のＭａｒｋｏｖの鎖モデルを、上記の類似セグメントをコードするゲノムから誘導した。当時は未公開のこのＭａｒｋｏｖモデルは、プログラムＧｌｉｍｍｅｒ（Ｓａｌｔｚｂｅｒｇら，Ｎｕｃｌ．Ａｃ．Ｒｅｓ．，１９９８，２６（２）：５４４）によって各公開読取リストを再評価するのに使用した。このプロセスの終了時、１６２３ヶの潜在的遺伝子が提案された。このうち、サイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ＣＯＧに得られた配列ベースＣＯＧ（Ｔａｔｕｓｏｖら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９７，２７８：６３１）、バンクＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（Ｂａｉｒｏｃｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｖ．１９９９，２７：４９−５４）、配列バンクＴＩＧＲデータベース（下記サイトで得られる公共分野）およびシアノベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｕｂ／ｃｙａＮＯ．／ｃｙａＮＯ．ｐ．ｓａ．ｇｚ）に含まれた配列によって、上記遺伝子から演繹されたペプチド配列を含む７９０の遺伝子に機能を割付けた：
ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ａ−ｆｕｌｇｉｄｕｓ／ＧＡＦ．ｐｅｐ．ｇｚ
ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｈ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａｃ／ＧＨＩ．ｐｅｐ．ｇｚ
ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｈ−ｐｙｌｏｒｉ／ＧＨＰ．ｐｅｐ．ｇｚ
ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｍ−ｊａｎａｓｈｉｉ／ＧＭＨ．ｐｅｐ．ｇｚ
ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｍ−ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ／ＧＭＧ．ｐｅｐ．ｇｚ
【０１７２】
データバンク
配列とタンパク質またはヌクレオチドのデータバンクとの間の相同性の検討のために、ソフトウエアＢＬＡＳＴ（公共分野，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用した。本発明に係る配列とタンパク質またはヌクレオチドのデータバンクとの間の相同性の検討結果を下表１，２にまとめた。
【０１７３】
表１：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯＲＳＡＹのゲノムの各ヌクレオチド配列ＯＲＦ１−ＯＲＦ７５８によってコードされた配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７９１のタンパク質の想定機能のリスト
表１の説明：
ＯＲＦ１−ＯＲＦ７５８によってコードされたタンパク質の想定機能群は、ソフトウエアＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用する相同性検討から求めた。この場合、ｂｌａｓｔｐによって計算した１０−５よりも小さいＰ値を有する同一性を有する相同性のみを考慮した。確からしい機能は、機能欄に示した。この機能に関連するタンパク質配列をＳＥＱ　ＩＤ欄に示した。
【表１】
2004500802.tif 000039
2004500802.tif 000040
2004500802.tif 000041
2004500802.tif 000042
2004500802.tif 000043
2004500802.tif 000044
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2004500802.tif 000066
2004500802.tif 000067
【０１７４】
表２：同じく既知の機能を各配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８００に割付けることができるデータバンクに得られる配列に対するタンパク質配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２−ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８００の相同性および確からしい機能
ソフトウエアＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を使用して、パラメータの相同性を確認した。相同性最大の配列は、利用可能なバンク（バンクの欄）を参照して、上記配列が属する動物種（種の欄）とともに、その入手ナンバー（入手ナンバーの欄）で示した。相同性％は、所与の長さの配列についてソフトウエアＢＬＡＳＴＰによって評価した。
【表２】
2004500802.tif 000068
2004500802.tif 000069
2004500802.tif 000070
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2004500802.tif 000090
【０１７５】
実施例３：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ（Ｏｒａｓｙ株）の複製（ＲＦＣ）の因子（Ｃ）
Ａ）配列の特徴
２つのサブユニット
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株の基準ゲノム：
１．小さいサブユニット：ＰＡＢ００６８；活性化物質１、複製因子Ｃ，小さいサブユニット（ＲＦｃＳ）。
長さ：４３１１ヶのベース対；３８ｋＤａ（理論値）
ゲノム上の位置：１０３０９４−１０７４０４（配置＋）。このように限定されたこのフラグメントは、ＯＲＦ８０１に対応する。
２．大きいサブユニット：ＰＡＢ００６９；活性化物質１、複製因子Ｃ，大きいサブユニット（ＲＦｃＬ）。
長さ：１４３７ヶのベース対；５３ｋＤａ
配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のゲノム上の位置：１０７４１９−１０８８５５（配置＋）。このように限定されたこのフラグメントは、ＯＲＦ８０５に対応する。
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復。
３．配列
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０１は、小さいサブユニットの（インテイン含有）完全な配列を表す；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０２は、２つのインテイン配列を切除した小さいサブユニットの配列を表す；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０３およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０４は、それぞれ、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０２から切除された２つのインテイン配列を表す；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０１は、大きいサブユニットの配列を表す；
−配列ＯＲＦ８０２は、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０３およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０４のインテインペプチドをコードする配列を抑制した上記の配列ＯＲＦ８０１に対応する；
−ＯＲＦ８０３およびＯＲＦ８０４は、それぞれ、ＯＲＦ８０１の配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０３およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０４のインテインペプチドをコードする配列に対応する。
Ｂ）クローン化および発現
クローン化の戦略
小さいサブユニット
１．インテインの切除：インテインは、“ｓｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”技術（Ｈｏら，１９９８，ＤＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｖｏｌ２，ｐ５０−５５）によって除去した。
使用したプライマー：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＧＧＣＣＴＣＴＡＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣ　ＡＴＧＧＡＧ−３′
再保護サイト，インテイン１：
順サイト：５′−ＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴ−３′
逆サイト：５′−ＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＡＣＴ　ＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣ−３′
再保護サイト，インテイン２：
順サイト：５′−ＡＣＧＴＡＡＧＧＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＴ−３′
逆サイト：５′−ＡＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＡＴＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＴ−３′
末端サイト（ＢａｍＨＩ）：５′−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＧＡＴＴ−３′
２．サブクローン化および配列決定：
使用ベクター：ｐＧＥＭＴ　ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α
３．発現：
使用ベクター：ｐＥＴ１１ａ
株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１（ＤＥ３）
大きいサブユニット
１．ＰＣＲ：ＰＣＲは、下記プライマーによって構成した：
使用プライマー：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＡＴＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣ−３′
末端サイト（ＢａｍＨＩ）：５′−ＧＧＣＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧ−３′
２．サブクローン化および配列決定：
使用ベクター：ｐＢＳ／ＳＫ（−）
株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α
３．発現：
使用ベクター：ｐＥＴ２６ｂ＋
株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１（ＤＥ３）
発現
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１（ＤＥ３）における２つのサブユニットの共発現条件：Ｄ．Ｏ．６００＝１．０における誘導；０．６ｍＭ　ＩＰＴＧ；４ｈ×３７℃；
媒体：ＬＢ
Ｃ）精製
トリスＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８，０に回収した細胞沈渣、
熱ショック：２ｍｉｎ×９０℃，次いで、１５ｍｉｎ×８０℃、
見かけ分子量（図１参照）：
小さいサブユニット：３６ｋＤａ
大きいサブユニット：５６ｋＤａ
Ｄ）大きいサブユニットの免疫生化学的特性
真核生物のＲＦ−Ｃの大きいサブユニットに対する特有の抗体の使用において、ＰＣＮＡに対する連結サイトが保持されるということが判った。他方、ＤＮＡに対する連結サイトは、抗体によって確認されなかった。
使用抗体：
抗体Ａ：ＤＮＡの固定領域に対するハツカネズミのモノクロナール抗体
抗体Ｂ：ＤＮＡの固定領域に対するウサギのポリクロナール抗体；真核生物において確認，ＲＦＣの大きいサブユニットのアミノ酸ゾーン４７８−７１２。
【表３】
2004500802.tif 000091
【０１７６】
実施例４：ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ（Ｏｒａｓｙ株）の細胞増殖核抗原
（ＰＣＮＡ）
Ａ）配列の特徴
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株の基準ゲノム；細胞増殖核抗原
（ｐｏｌ３０）。
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復。
長さ：７４７ヶの塩基対；２８ｋＤａ
ゲノム上の位置：１３３３２９９−１３３２５５３（配向−）。このように限定されたこのフラグメントは、配列ＯＲＦ８０６に対応する。
配列：ポリペプチドのアミノ酸配列ＰＣＮＡは、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０４によって表される。
Ｂ）クローン化および発現
クローン化の戦略
ＰＣＲは、下記のヌクレオチドプライマーによって形成した：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＡＧＧＴＧＣＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＣＧＡＧＡＴＡＧＴＣ−３′
末端サイト（ＢｇｌＩＩ）：５′−ＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧ−３′
サブクローン化および配列決定：
ベクター：ｐＢＳ／ＳＫ−
株：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α
クローン化：ｐＥＴ２６ｂ＋（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１（ＤＥ３）
発現：
条件：Ｄ．Ｏ．６００＝０，６における誘導；１ｍＭ　ＩＰＴＧ；４ｈ×３７℃；
媒体：ＬＢｐＥＴ１１ａ
Ｃ）精製
トリスＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８，０、ＮａＣｌ０，１Ｍに回収した細胞沈渣
熱ショック：１５ｍｉｎ×７５℃
クロマトグラフィー：ＲｅｓｓｏｕｒｃｅＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；緩衝液　トリスＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ７，５．１ｍＭ　ＤＴＴ，０．１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ；ＮａＣｌ勾配：０−０．５Ｍ，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
Ｄ）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　ＯｒａｓｙのＤＮＡポリメラーゼＩに対する効果
緩衝液：トリスＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８．８，１ｍＭジチオトレイトール，
１０ｍＭ　ＫＣｌ，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＢＳＡ０，４ｍｇ／ｍｌ。
培養：それぞれ０．２ｍＭの４つのＮＴＰ，０．３５μＭ［３Ｈ］ｄＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびファージゲノムの４８５０２−４８４４６の領域の相補性オリゴヌクレオチドで開始されるλファージの１５ｆｍｏｌのＤＮＡを含む反応容積２０μｌ。
培養：２０ｍｉｎ×７０℃
上記実験条件においてＮＴＰを１ｎｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、
ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
【表４】
2004500802.tif 000092
【表５】
2004500802.tif 000093
【表６】
2004500802.tif 000094
本発明に係るＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのＰＣＮＡの用途のうち、下記の事例のための使用を挙げることができる：
−特に、下記、即ち、
＊　操作性の向上；
＊　重合速度の増大；
のための、真核生物または古細菌の、熱安定性または非安定性のすべてのＤＮＡポリメラーゼの酵素機能の改善のための使用；
−間隔の大きいＰＣＲの使用時（１００ｋｂよりも大きいフラグメントの合成時）の因子としての使用；
−反応におけるＤＮＡの極めて長いフラグメントの配列決定のための因子としての　使用；
−インビトロの複製系の使用時の因子としての使用；および、
−Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのポリペプチドＰＣＮＡを発現する真核生物の細　胞培養の増殖速度の増大のための使用。
上記ポリペプチドＰＣＮＡの使用または、場合による、上記の如きそのコード配列の使用は、本発明の部分をなす。
【参考文献】
2004500802.tif 000095
【０１７７】
実施例５：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ（Ｏｒａｓｙ株）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ
Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株から得られるＤＮＡポリメラーゼＩＩは、下記の２つのサブユニットからなる：
−小さいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２２６６，名称：ｐｏｌＢ）
−大きいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２４０４，名称：ｐｏｌＣ）。
ＤＮＡポリメラーゼＩＩの大きいサブユニットをコードする遺伝子ｐｏｌＣは、配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０８（インテインを含む完全な配列）をコードする配列のヌクレオチド２８６２と３４１７との間に含まれるインテイン（５５５ヶの分子）をコードする遺伝子を含む。
この実施例では、２つのサブユニットをコードする遺伝子（インテインをコードする配列からあらかじめ除去したｐｏｌＩＩの大きいサブユニットをコードする遺伝子）のＥ．ｃｏｌｉ中の共発現による熱安定性組換えＤＮＡポリメラーゼＩＩの調製条件、クローン化、その精製および分子生物学の各分野におけるその使用を説明する。
Ａ）熱安定性組換えＤＮＡポリメラーゼＩＩの生成法
Ａ−１．ＤＮＡポリメラーゼＩＩの２つのサブユニットの配列
特徴：
＃ＤＮＡポリメラーゼＩＩ：サブユニット１（２．７．７．７）
ＮＡポリメラーゼＩＩの小さいサブユニットの配列（２．７．７．７）
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの基準ゲノム：ＰＡＢ２２６６
名称：ｐｏｌＢ
配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１のゲノム上の位置；先端：１４１４０２，終端：１１９５４６（配置−）
このように限定されたこのフラグメントは、配列ＯＲＦ８０７に対応する。　　遺伝子の長さ：１８５７ｐｂ
＃ＤＮＡポリメラーゼＩＩ：サブユニット２（２．７．７．７）
ＤＮＡポリメラーゼＩＩの大きいサブユニットの配列（２．７．７．７）
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株の基準ゲノム：ＰＡＢ２４０４
名称：ｐｏｌＣ
ゲノム上の位置；先端：１１９５４３，終端：１１５１７９（配置−）
このように限定されたこのフラグメントは、ＯＲＦ８０８に対応する。
遺伝子の長さ：４３６５ｐｂ
配列：
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０７は、ＤＮＡポリメラーゼ　ＩＩのサブユニット１の配列を表す；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０８は、ＤＮＡポリメラーゼ　ＩＩのサブユニット２の配列を表す；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８０９は、インテインを切除したＤＮＡポリメラーゼＩＩのサブユニット２の配列を表す（ＯＲＦ８０９は、コードヌクレオチド配列に対応する）；
−アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８１０は、ＤＮＡポリメラーゼ　ＩＩのサブユニット２のインテイン配列を表す（ＯＲＦ８１０は、コードヌクレオチド配列に対応する）
Ａ−２．ＤＮＡポリメラーゼＩＩの２つのサブユニットの配列
ＤＮＡポリメラーゼＩＩの２つのサブユニットのクローン化は、各種の抗生物質に耐える発現ベクター中で別個に実施した。
＃発現ベクターｐＥＴ１１ａ中のサブユニット１（ｐｏｌＢ）のクローン化　　−Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株のＤＮＡゲノムの生成
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物０．５ｇ／ｌ，硫黄１０ｇ／ｌ，塩３０ｇ／ｌを含む媒体中で、９５℃において１６ｈ，Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株を培養した。培養は、媒体３０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコ内で実施した。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、緩衝液（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ８，３）５００μｌ中に再懸濁させた。１０％サクロシル５００μｌおよびプロテイナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。次いで、混合物を５０℃において１，５ｈ培養した。反応終了時、フェノール／クロロホルム（ｖ／ｖ）で抽出し、次いで、エタノールで抽出し、ＤＮＡゲノム約１ｍｇを得た。
−ＰＣＲによる遺伝子の増幅および発現ベクター中のクローン化
ＰＣＲによる遺伝子の増幅のために、遺伝子配列ｐｏｌＢをベースとするプライマーを合成した（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＣＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧ−３′
末端サイト（ＢａｍＨ１）：５′−ＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧ−３′
ＰＣＲの反応条件を以下に示す：
ＤＮＡゲノム　２０ｎｇ
プライマー　それぞれ１００ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ　それぞれ１００ｎｍｏｌ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）
緩衝液１０×Ｐｆｕポリメラーゼ　５μｌ
Ｐｆｕポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１Ｕ
Ｈ２Ｏ　ｑｓｐ５０μｌ
次いで、反応混合物を培養した：１５ｍｉｎ×９４℃，次いで、２０回（３０ｓ×９４℃，３０ｓ×４５／５０／５５℃）および１５ｍｉｎ×７２℃。反応終了後、生成物ＰＣＲを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、発現ベクターｐＥＴ１１ａ内に連結させた。次いで、得られたベクターを発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４　（ＤＥ３）内で形質転換した（ＣａＣｌ２による形質転換技術）。遺伝子（ｐｏｌＢ）の配列を完全な挿入配列によって管理した。
ベクターｐＥＴ２６ｂ＋内の２−サブユニット２（ｐｏｌＣ）
−Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株のＤＮＡゲノムの生成
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物０，５ｇ／ｌ，硫黄１０ｇ／ｌ，塩３０ｇ／ｌを含む媒体中で、９５℃において１６ｈ，Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株を培養した。培養は、媒体３０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコ内で実施した。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、緩衝液（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ８．３）５００μｌ中に再懸濁させた。１０％サクロシル５００μｌおよびプロテイナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。次いで、混合物を５０℃において１，５ｈ培養した。反応終了時、フェノール／クロロホルム（ｖ／ｖ）で抽出し、次いで、エタノールで抽出し、ＤＮＡゲノム約１ｍｇを得た。
−ＰＣＲによる遺伝子の増幅および発現ベクター中のクローン化
ＰＣＲによる遺伝子の増幅のために、遺伝子ｐｏｌＢの配列をベースとするプライマーを合成した（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。使用したプライマーの配列を以下に示す：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧ−３′
末端サイト（Ｓａｌｌ）：５′−ＴＣＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＧ−３′
ＰＣＲの反応条件を以下に示す：
ＤＮＡゲノム　３μｇ
プライマー　それぞれ１００ｐｍｏｌ
ＤＮＴＰ　それぞれ１００ｎｍｏｌ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）
緩衝液１０×Ｐｆｕポリメラーゼ　５μｌ
Ｐｆｕポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　１Ｕ
Ｈ２Ｏ　ｑｓｐ５０μｌ
次いで、反応混合物を培養した：１５ｍｉｎ×９４℃，次いで、２０回（３０ｓ×９４℃，３０ｓ×４５／５０／５５℃）および１５ｍｉｎ×７２℃。反応終了後、生成物ＰＣＲを制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌｌによって消化し、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋内に連結させた。次いで、得られたベクターを発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ内で形質転換した（ＣａＣｌ２による形質転換技術）。遺伝子（ｐｏｌＣ）の配列を完全な挿入配列によって管理した。次いで、Ｈｏらの論文に記載の“ｓｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”法を使用して、インテインを　コードする遺伝子から遺伝子ｐｏｌＣを除去した（１９９０，ＤＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｓｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ．ＤＮＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．２：５０−５５）。
このため、２つのヌクレオチドプライマーを合成した：
Ｍ４：５′−ＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＧＣＴＧ−３′　Ｍ６：５′−ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＧＧ−３′
次いで、インテインをコードする遺伝子から除去したＤＮＡポリメラーゼＩＩの大きいサブユニットをコードする得られたベクターｐＥＴ２６ｂ＋を、発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中で形質転換した。インテインをコードする遺伝子から除去した遺伝子ｐｏｌＣの配列を完全な挿入配列によって管理した。
Ａ−３．ＤＮＡポリメラーゼＩＩの生成
２つの戦略を利用した：
＃戦略ＮＯ．１：発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中で別個にクローン化した各サブユニットの発現。２つの組換えクローンを音波処理し、次いで、熱ショック（１５ｍｉｎ×８０℃）によって処理し、次いで、サブユニットを混合して活性ポリメラーゼを形成した。
−小さいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２２６６，名称：ｐｏｌＢ）：
遺伝子ｐｏｌＢを含む発現ベクターｐＥＴ１１ａを含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭ　Ｓ１７４（ＤＥ３）を、濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む媒体２ｘＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ，ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ内で３７℃において培養した。
Ｄ．Ｏ．６００（Ｄ；Ｏ：光学密度）が０，６に達した際、媒体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チォガラクトシド）１ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，２，２ｍＭβ−メルカプトエタノール，１０％グリセロールを含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、８０℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、ポリメラーゼＩＩの小さいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２２６６；名称：ｐｏｌＢ）を含む溶液１０ｍｌが得られた。
インテインをコードする遺伝子から除去した遺伝子ｐｏｌＣを含む発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋を含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、濃度３４μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む媒体２ｘ　ＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ，ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ内で３７℃において培養した。Ｄ．Ｏ．６００が０．６に達した際、媒体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−　チオガラクトシド）１ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，２．２ｍＭβ−メルカプトエタノール，１０％　グリセロールを含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、　細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、８０℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、ポリメラーゼＩＩの大きいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２４０４；名称：ｐｏｌＣ）を含む溶液１０ｍｌが得られた。
＃戦略ＮＯ．２：同一の発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中で２つのサブユニット（ｐｏｌＢ＋ｐｏｌＣ）を共発現させ、音波処理し、次いで、熱ショック（１５ｍｉｎ×８０℃）によって処理する。
インテインをコードする遺伝子から除去した遺伝子ｐｏｌＣを含む発現ベクターｐｏｌＢおよびｐＥＴ２６ｂ＋を含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、濃度３４μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む媒体２ｘＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ，ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ内で３７℃において培養した。Ｄ．Ｏ．６００が０，６に達した際、媒体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チォガラクトシド）１ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．２，２ｍＭβ−メルカプトエタノール，１０％グリセロールを含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、８０℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、ポリメラーゼＩＩの大きいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２２６６；名称：ｐｏｌＢ）を含む溶液１０ｍｌが得られた。
Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩの生成、精製および特徴
Ｂ−１．活性ＤＮＡポリメラーゼの生成
Ａ３章（戦略１，２）に記載の如く調製した分画のポリメラーゼ活性をテストした。　　ポリメラーゼ活性の測定記録を以下に示す：
反応媒体の緩衝液：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，８，１ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭ　ＫＣｌ，ＢＳＡ０，４ＭＧ／ＭＬ，２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２。
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０．３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびファージゲノムの補完オリゴヌクレオチドで開始されるファージＭ１３のＤＮＡ６μｇ／ｍｌを含む。培養は、７０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１８μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄し、フィルタを乾燥した後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。
上記実験条件においてＮＴＰを１ｎｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
テストした各種分画について得られた結果を表に括めた：
【表７】
2004500802.tif 000096
Ｂ−２．ポリメラーゼＩＩの精製および性質
発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中の２つのサブユニット（ｐｏｌＢ＋ｐｏｌＣ）の共発現による培養を実施とた。
インテインをコーディングする遺伝子から除去した遺伝子ｐｏｌＣを含む発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋および遺伝子ｐｏｌＢを含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび濃度３４μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む媒体２ｘＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１　０ｇ／ｌ，ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ中で３７℃において培養した。Ｄ．Ｏ．６００　が０，６に達した際、媒体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チォガラクトシド）１ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，２，β−メルカプトエタノール２ｍＭ，グリセロール１０％を含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、　細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、８０℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、ポリメラーゼＩＩの小さいサブユニット（遺伝子：ＰＡＢ２２６６；名称：ｐｏｌＢ）および大きいサブユニット（遺伝　子：ＰＡＢ２４０４；名称：ｐｏｌＣ）を含む溶液１０ｍｌが得られた。第１精製工程と同様に、２０ｍｉｎ×８０℃の熱ショック処理を実施した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上に得られた抽出物の観察から下記結果が得られた（図５参照）：
サブユニット１：ｐｏｌＢの見かけ分子量：９０ｋＤａ
サブユニット２：ｐｏｌＣの見かけ分子量：１４０ｋＤａ
熱ショック後、抽出物をクロマトグラフィーカラムに装入した：Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；緩衝液：リン酸カリウム５０ｍＭ，ｐＨ６，５，２ｍＭ　β−メルカプトエタノール。ＮａＣｌ勾配は、０−０，５Ｍである。活性ポリメラーゼを含む分画をほぼ３５９ｍＭのＮａＣｌに溶離した。
最適ｐＨの決定
ｐＨに依存するポリメラーゼ活性の測定記録を以下に示す：
リン酸カリウム２０ｍＭ，ＭｇＣｌ２１０ｍＭ，ｐＨ６，６．５，７，７．５，８
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０．３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびマトリックスｐｏｌｙｄＡ／ｏｌｉｇｏｄＴ（４０：１）５μｇ／ｍｌを含む。培養は、７０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１８μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄しフィルタを乾燥した後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。
上記実験条件においてｄＮＴＰを１ｎｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
上記条件における活性ポリメラーゼの最適ｐＨは、６，５である（図６参照）。
Ｃ）反応媒体中に複製因子（ＰＣＮＡ）の添加によるポリメラーゼＩＩの賦活
ポリメラーゼ活量の測定記録を以下に示す：
反応媒体の緩衝液：トリス−ＨＣｌ５０ｍＭ，ｐＨ８，８，１ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭ　ＫＣｌ，ＢＳＡ０，４ＭＧ／ＭＬ，ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ。反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ　ＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０．３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）０，３５μＭおよびファージゲノムの補完オリゴヌクレオチドで開始されるファージＭｌ３のＤＮＡ６μｇ／ｍｌを含む。培養は、７０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１８μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８．９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄した後、シンチレーションカウンタで放射能を測定した。
【表８】
2004500802.tif 000097
かくして、本発明に係るタイプＩＩの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをクローン化し、発現させた。組換え酵素は、２つのサブユニット（９０ｋＤａおよび１４０ｋＤａ）を含む。大きいサブユニットは、重合プロセスにおいてホスホジエステル結合の形成を触媒できる。しかしながら、この活性は、酵素の小さいサブユニットの存在下では増大する。
Ｐ．ａｂｙｓｓｉの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＩＩの触媒活性は、反応媒体中の複製因子：ＰＣＮＡの存在に敏感である。実際、この因子は、当該の反応条件においてＤＮＡポリメラーゼＩＩの触媒活性を刺激する。
しかしながら、タイプＩＩの上記ＤＮＡポリメラーゼは、下記のために利用できる：
−場合によっては、特に下記、
・重合速度の増速；
・操作性の増大；
・信頼性の増大；および／または、
・合成したフラグメントの長さの増大
のためにタイプＰＣＮＡ，ＰＦ−ＣおよびＲＰＡの複製因子と併用して、上記ＤＮＡポリメラーゼの使用による、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の改善のために，
且つまた下記のために：
−場合によっては、特に下記、
・重合速度の増速；
・操作性の増大；
・信頼性の増大；および／または、
・合成したフラグメントの長さの増大
のためにクイプＰＣＮＡ，ＰＦ−ＣおよびＲＰＡの複製因子を含む反応媒体において、ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であるか否かに関係なく、２つのポリメラーゼ（このうち１つは本発明に係るタイプＩＩである）の混合物による、ＰＣＲに使用される真核生物または古細菌の有効性の改善のために。
本発明に係るタイプＩＩのＤＮＡポリメラーゼは、更に、下記のために使用できる：
−間隔の長いＰＣＲ（１００ｋｂよりも大きいフラグメントの合成）；
−バクテリア染色体、古細菌または真核生物のインビトロの複製系の使用；
−反応時にＤＮＡの極めて長いフラグメントのシークェンス化；
−インビトロの複製系の使用。
上記のタイプＩＩのＤＮＡポリメラーゼについて上述した上記の使用は、本発明の部分をなす。
【０１７８】
実施例６：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ（Ｏｒａｓｙ株）の複製タンパク質Ａ（ＰＲＡ）
Ａ）シークェンスの特徴
複製因子に属するタンパク質（ＲＦＡに類似）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの基準ゲノム：ＰＡＢ２１６３
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復
サイズ：１１２５ヶのベース対；４３ｋＤａ
シークェンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１のゲノム上の位置：２９２４７９−２
９１３５２（配置−）
このように限定されたこのフラグメントは、シークェンスＯＲＦ８１１に対応する。
複製タンパク質Ａのアミノ酸のシークェンスは、シークェンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．８１１によって表わされる。
Ｂ）タンパク質Ａ（複製因子）のクローン化、発現および特徴
１．クローン化および発現
−Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株のゲノムＤＮＡの生成
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物０，５ｇ／ｌ，硫黄１０ｇ／ｌ，塩３０ｇ／ｌを含む媒体中で、９５℃において１６ｈ，Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株を嫌気的に培養した。培養は、媒体３０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコ内で実施した。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、緩衝液ＴＥ（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ８，３）５００μｌ中に再懸濁させた。１０％サクロシル５００μｌおよびプロテイナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。次いで、混合物を５０℃において１，５ｈ培養した。反応終了時、フェノール／クロロホルム（ｖ／ｖ）で抽出し、次いで、エタノールで沈殿させ、ゲノムＤＮＡ約１ｍｇを得た。
−ＰＣＲによる遺伝子の増幅および表現ベクター中のクローン化
ＰＣＲによる遺伝子の増幅のために、遺伝子シークェンスｐｏｌＢをベースとするプライ
2004500802.tif 000098
ｅ）。使用したプライマーのシークェンスを以下に示す：
開始サイト（ＮｄｅＩ）：５′−ＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＡＴＧＧＴＡＡＡＴＧＴＴＡＡＡＡＡＣＣＧ−３′
末端サイト（ＢａｍＨ１）：５′−ＴＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣ−３′
ＰＣＲの反応条件を以下に示す：
ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　２０ｎｇ
プライマー　　　　　　　　　　　それぞれ１００ｐｍｏｌ
ＤＮＴＰ　　　　　　　　　　　　それぞれ１００ｎｍｏｌ（ｄＡＴＰ，ｄＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）
緩衝液１０×Ｐｆｕポリメラーゼ　５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ
（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）　　　　１Ｕ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　ｑｓｐ５０μｌ
次いで、反応混合物を培養した：１５ｍｉｎ×９４℃，次いで、２０回（３０ｓ×９４℃，３０ｓ×４５／５０／５５℃）および１５ｍｉｎ×７２℃。反応終了後、生成物ＰＣＲをシークェンスｐＧＥＭＴ　ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のベクター中でクローン化した。組換えプラスミドを細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ内で形質転換した。遺伝子のシークェンスを完全な挿入シークェンスによって管理した。
次いで、プラスミドを制限酵素Ｎｄｅ１およびＢａｍＨＩによって消化し、発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ＋内に連結させた。次いで、組換えベクターｐＲＰＡを発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１　ｐＬｙｓ　Ｓ（ＤＥ３）中で形質転換させた。
発現：
発現ベクタｐＲＰＡを含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１　ｐＬｙｓ　Ｓ（ＤＥ３）を、濃度３４μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む媒体２ｘＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ，ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ中で３７℃において培養した。Ｄ．Ｏ．６００が０，６に達した際、媒体に誘導物質ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チォガラクトシド）０，５ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，２，β−メルカプトエタノール２ｍＭ，グリセロール１０％を含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、７５℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、複製ベクターＡを含む溶液１０ｍｌが得られた。
２．特徴
−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）上に得られた抽出物の観察（図７参照）：
図７のゲルの解釈から、４０−６５ｋＤａの範囲にあるタンパク質の見かけ分子量を推定できる。
−ヌクレオチドシークェンスおよびタンパク質シークェンスの分析（図８参照）：
シークェンス上に、ＤＮＡのベースの修飾の識別に関与し且つ単一鎖ＤＮＡに対するＲＰＡの強い親和性に起因する亜鉛の仮説的フィンガの存在が認められる。
更に、タンパク質のＣ末端には、可撓性領域が存在する。この領域は、トリマー化のために必要である。
可変領域のシークェンス：ＥＥＩＡＥＫＩＫＥＬＥＥＳＧＬＴＴＫＥＡＡＲＫＬＡＥＤＥＦ
【表９】
2004500802.tif 000099
【表１０】
2004500802.tif 000100
本発明に係る複製タンパク質Ａは、特に、下記の如く使用できる：
−真核生物または古細菌の熱安定性または非安定性のすべてのＤＮＡポリメラーゼのインビトロ信頼性の改善できる因子として；
−反応中にＤＮＡの極めて長いフラグメントのシークェンス化のための因子として；
−インビトロの複製系の使用のための因子として。
上記の如き本発明に係るＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓの複製タンパク質Ａの使用は、もちろん、本発明の部分をなす。
【０１７８】
【参考文献】
2004500802.tif 000101
実施例７：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ（Ｏｒａｓｙ株）のＤＮＡポリメラーゼＩ
研究の目的：超好熱古細菌起源のタイプＩのＤＮＡポリメラーゼのクローン化、発現および特徴
この研究は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ−Ｏｒａｓｙ株のゲノムの配列決定および活用に関与する。
本実施例において、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現された熱安定性組換えＤＮＡポリメラーゼＩのクローン化、生成条件および特徴を説明する。
Ａ）ＤＮＡポリメラーゼＩの生成法
１．シークェンスの特徴
ＤＮＡポリメラーゼＩ
ＤＮＡポリメラーゼＩのシークェンス：
遺伝子の科：［９．１］ＤＮＡの代謝／ＤＮＡの複製、組換えおよび修復
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉの基準ゲノム：ＰＡＢ１１２８
名称；ｐｏｌＩ
シークェンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１のゲノム上の位置；
先端：１６９５１８３，
終端：１６９７４９５
遺伝子の長さ：２３１３ｂｐ，ゲノム内の配向：＋
ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸のシークェンスは、シークェンスＳＥＱ　　　ＩＤ　Ｎｏ．８１２によって表される。
２．クローン化および発現
Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株のＤＮＡゲノムの生成：
ペプトン２ｇ／ｌ，酵母抽出物０，５ｇ／ｌ，硫黄１０ｇ／ｌ，塩３０ｇ／ｌを含む媒体中で、９５℃において１６ｈ，Ｐ．ａｂｙｓｓｉ　Ｏｒａｓｙ株を嫌気的に培養した。培養は、媒体３０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコ内で実施した。培養終了時、細胞を遠心分離によって回収し、緩衝液ＴＥ（トリス１０ｍＭ，ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ８，３）５００μｌ中に再懸濁させた。１０％サクロシル５００μｌおよびプロテイナーゼ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた。次いで、混合物を５０℃において１，５ｈ培養した。反応終了時、フェノール／クロロホルム（ｖ／ｖ）で抽出し、次いで、９５％エタノールで沈殿させ、ゲノムＤＮＡ約１ｍｇを得た。
−ＰＣＲによる遺伝子の増幅および表現ベクター中のクローン化
ＰＣＲによる遺伝子の増幅のために、遺伝子シークェンスｐｏｌＢをベースとする
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ｅ）。使用したプライマーのシークェンスを以下に示す：
開始サィト（ＮｄｅＩ）：５′−ＣＡＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＣ−３′
末端サイト（ＢａｍＨ１）：５′−ＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣ−３′
ＰＣＲの反応条件を以下に示す：
ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　２０ｎｇ
プライマー　　　　　　　　　　　それぞれ１００ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰ　　　　　　　　　　　　それぞれ１００ｎｍｏｌ（ｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）
緩衝液１０×Ｐｆｕポリメラーゼ　５μｌ
Ｐｆｕポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　　　　１Ｕ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　ｑｓｐ５０μｌ
次いで、反応混合物を培養した：１５ｍｉｎ×９４℃，次いで、２０回（３０ｓ×９４℃，３０ｓ×４５／５０／５５℃）および１５ｍｉｎ×７２℃。反応終了後、生成物ＰＣＲを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ内に連結させた。ベクターを発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（Ｄ　Ｅ３）ｐＬｙｓＳの形質転換（ＣａＣｌ２による形質転換技術）のため結合生成物を使用した。遺伝子ｐｏｌＩのシークェンスを組換えプラスミドｐＥＴ−ｐｏｌＩのシークェンスによって管理した。
遺伝子ｐｏｌＩの発現：
組換えベクタｐＥＴ−ｐｏｌＩを含む発現細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、濃度３４μｇ／ｍｌののカナマイシンを含む媒体２ｘＹＴ（ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ．ペプトン１６ｇ／ｌ）１リッタ中で３７℃において培養した。Ｄ．Ｏ．６００が０，６に達した際、媒体に誘導物質ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チォガラクトシド）０，５ｍＭを加え、３７℃において１５ｈ培養した。
培養体を遠心分離し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，２，β−メルカプトエタノール２ｍＭ，グリセロール１０％を含む緩衝液１０ｍｌ中に細胞を再懸濁させた。次いで、細胞を音波処理し、遠心分離し、次いで、７５℃において１５ｍｉｎ培養した。遠心分離後、ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩ複製ベクターＡを含む溶液１０ｍｌが得られた。
Ｂ）特徴
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＤＮＡポリメラーゼＩの発現の可視化
すべての抽出物を７０℃において１５ｍｉｎ変性処理した（図９参照）。
ＤＮＡポリメラーゼＩの見かけ分子量：８５ｋＤａ
２．ＤＮＡポリメラーゼＩの精製
トリス−ＨＣｌ，１０ｍＭ，ｐＨ８，０，ＮａＣｌ１０ｍＭ，ＭｇＣｌ２２ｍＭ，トリトンＸ１％中で抽出
熱ショック：１５ｍｉｎ，７９℃
クロマトグラフィー：Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅ　Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８，０，０−０，５ＭのＮａＣｌ勾配活性ポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼＩをほぼ３５９ｍＭのＮａＣｌに溶離した。
３．ＤＮＡポリメラーゼＩの性質
ａ）最適ｐＨの決定
ｐＨに依存するポリメラーゼ活性の測定記録を以下に示す：
トリス−ＨＣｌ５０ｍＭ，グリシン−ＮａＯＨ５０ｍＭおよびＣＡＰＳ５０ｍＭ，ｐＨ７，５−１１
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０，３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＭｇＣｌ２２５ｍＭおよびマトリックスｐｏｌｙｄＡ／ｏｌｉｇｏｄＴ（４０：１）５μｇ／ｍｌを含む。培養は、７０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１５μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗ　ｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄しフィルタを乾燥した後、シンチレーショ　ンカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。
上記実験条件においてｄＮＴＰを１ｎｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
上記条件における活性ポリメラーゼの最適ｐＨは、９−９，５である（図１０参照）。
ｂ）最適温度の決定
反応媒体の緩衝液：
トリス−ＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８，８，ＫＣｌ１０ｍＭ，ＢＳＡ０，４ｍｇ／ｍｌ，ＭｇＣｌ２２，５ｍＭ，
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０，３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびマトリックスｐｏｌｙｄＡ／ｏｌｉｇｏｄＴ（４０：１）５μｇ／ｍｌを含む。培養は、３７℃−９０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１５μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄しフィルタを乾燥した後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。
上記実験条件においてｄＮＴＰを１μｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
上記実験条件におけるポリメラーゼ活性の最適温度は、５５−６５℃の範囲にある。
ｃ）ＭｇＣｌ２の最適濃度の決定
反応媒体の緩衝液
トリス−ＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８，８，ジチオトレイトール１ｍＭ，ＢＳＡ０，４ｍｇ／ｍｌ，ＭｇＣｌ２０−５０ｍＭ，
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０，３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびマトリックスｐｏｌｙｄＡ／ｏｌｉｇｏｄＴ（４０：１）５μｇ／ｍｌを含む。培養は、３７℃−９０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１５μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄しフィルタを乾燥した後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。上記実験条件においてｄＮＴＰを１μｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
上記実験条件におけるｐｏｌＩポリメラーゼ活性のＭｇＣｌ２最適濃度は、３ｍＭである。
ｄ）ＫＣｌ最適濃度の決定
反応媒体の緩衝液
トリス−ＨＣｌ，５０ｍＭ，ｐＨ８，８，ジチオトレイトール１ｍＭ，ＢＳＡ０，４ｍｇ／ｍｌ，ＭｇＣｌ２２，５ｍＭ，
反応容積２０μｌは、それぞれ０，２ｍＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），０，３５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（１１９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびマトリックスｐｏｌｙｄＡ／ｏｌｉｇｏｄＴ（４０：１）５μｇ／ｍｌを含む。培養は、３７℃−９０℃において２０ｍｉｎ実施した。上記反応混合物１５μｌをフィルタＧＦ−Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過し、５％ＴＣＡ，即ち、ピロリン酸ナトリウム（８，９ｇ／ｌ）で沈殿させた。９５％エタノールで２回洗浄しフィルタを乾燥した後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射能を測定した。上記実験条件においてｄＮＴＰを１μｍｏｌ／ｍｉｎの速度で導入できる酵素量は、ＤＮＡポリメラーゼ１単位である。
上記実験条件におけるｐｏｌＩポリメラーゼ活性のＫＣｌ最適濃度は、５０−８０ｍＭの反応にある。
ｅ）エキソヌクレアーゼ活性３′．．．．＞５′の明確化
使用したエキソヌクレアーゼ活性３′．．．．＞５′の検知記録を以下に示す：
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫを制限酵素ＥｃｏＲＬで消化した。ラジオヌクレオチド［３Ｈ］ＴＴＰおよびマークされてない４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）をＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗのフラグメントによって導入した。３７℃におけるマーキングの１時間後、プラスミドをＱＵＩＧＥＮカラムで精製し、次いで、組換えＤＮＡポリメラーゼＩとともに培養した。１０％ＴＣＡでＤＮＡを沈殿させた後、シンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ）で残存放射能を測定した。ＤＮＡポリメラーゼＩのポリメラーゼ活量を同一条件で測定
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した。
各ＤＮＡポリメラーゼの１単位を使用した。
【表１１】
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従って、上記のタイプＩのＤＮＡポリメラーゼは、下記のために使用できる：
−特に下記、
・重合速度の増速；
・操作性の増大；
・信頼性の増大；および／または、
・合成したフラグメントの長さの増大；
・（ＰＣＲのサイクル数を増大できる）酵素の堅牢性
のために、エキソヌクレアーゼ活性３′．．．．＞５′の存在にもとづき、場合によってはタイプＰＣＮＡ，ＲＦ−ＣおよびＲＰＡの複製因子と併用して、上記ＤＮＡポリメラーゼＩの使用によってＰＣＲによるＤＮＡ増幅の改善のために，且つまた下記のために：
−特に下記、
・重合速度の増速；
・操作性の増大；
・信頼性の増大；および／または、
・合成したフラグメントの長さの増大
のために、場合によってはタイプＰＣＮＡ，ＲＦ−ＣおよびＲＰＡの複製因子を併用して、反応媒体中で、２つのポリメラーゼ（このうち１つは本発明に係るタイプＩＩである）の混合物による、ＰＣＲに使用される真核生物または古細菌の熱安定性または非熱安定性のすべてのＤＮＡポリメラーゼの有効性の改善のために。
本発明に係るタイプＩのＤＮＡポリメラーゼは、更に、下記のために使用できる：
−間隔の長いＰＣＲ（１００ｋｂよりも大きいフラグメントの合成）；
−バクテリア染色体、古細菌または真核生物のインビトロの複製系の使用；
−反応時にＤＮＡの極めて長いフラグメントのシークェンス化；
−インビトロの複製系の使用。
本発明に係るタイプＩのＤＮＡポリメラーゼについて上述した上記の使用は、本発明の部分をなす。
【参考文献】
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2004500802.tif 000106
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１（ＤＥ３）中の共発現によって得られた組換え複製因子Ｃの２つのサブユニットの特徴を示す図面。１０％ゲルＳＤＳ／ＰＡＧＥ．ライン１＋２＋３＋４：２ｍｉｎ−９５℃；ライン１＋２：１５ｍｉｎ−６０℃；ライン３＋４：１５ｍｉｎ−８０℃；ライン１＋２：誘導クローン；ライン２＋４：対照細胞
【図２Ａ−２Ｂ】
抗体Ａ（図２Ａ）および抗体Ｂ（図２Ｂ）を含むイムノプロット（Ｗｅｔｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）のオートラジオグラフィーによる組換え複製因子Ｃの大きいサブユニットの特徴を示す図面である。
ＲＦ−Ｃ　ＡおよびＲＦ−Ｃ　Ｂ：子牛の胸腺のＲＦ−Ｃの大きいサブユニット（対照）
との反応
ライン１：不溶部分（沈渣）中に発現された分画；
ライン２：可溶分画（上澄液）中に発現された分画
ライン３：非誘導クローンの可溶分画
【図３】
組換えＰＣＮＡポリペチドの特徴を示す図面である。
電気泳動ゲル：ライン１：ＬＭＷ；ライン２：非誘導；ライン３：誘導；ライン４：１５ｍｉｎ−７５℃；ライン５：ｒｅｓｓｏｕｒｃｅＱ；ライン６：ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００
【図４】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉのＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）に対するポリペチドＰＣＮＡの影響
図４に、ｐｏｌＩの量に依存して、場合によってはＰＣＮＡとともに、マトリックスＯｌｉｇｏＦ／ｌａｍｄａを使用する３Ｈ−ＴＴＰへの導入を示した；１：２ＵのｐｏｌＩ
；２：１ＵのｐｏｌＩ；３：０，５ＵのｐｏｌＩ；４：０．２ＵのｐｏｌＩ；５：０．１ＵのｐｏｌＩ；６：０．１ＵのｐｏｌＩ＋５００ｎｇＰＣＮＡ
【図５】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）中の共発現によって得られた２つの組換えサブユニットｐｏｌＢおよびｐｏｌＣの特徴を示す図面。
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に得られた抽出物の可視化
−ライン１：ＬＭＷ；
−ライン２，３，４：８０℃において１５ｍｉｎ熱変性処理した後に３７℃において１５ｈ誘導処理したＤＮＡポリメラーゼＩＩの２つのサブユニット（ｐｏｌＢおよびｐｏｌＣ）を共発現するクローン；
−ライン５：８０℃において１５ｍｉｎ熱変性処理した後に３７℃において１５ｈ誘導処理した対照ＨＭＳ；
−ライン６：ＬＭＷ（“低分子量”）
【図６】
ｐＨ依存のＤＮＡポリメラーゼＩＩのポリメラーゼ活性；最適ｐＨ６，５において得られた活性の％値として示した。
【図７】
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１　ｐＬｙｓ　Ｓ（ＤＥ３）中に発現された組換え複製タンパク質Ａの特徴を示す図面である。
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル
−ライン１：非誘導、３７℃において１５ｈ；
−ライン２：誘導、３７℃において１５ｈ；
−ライン３：７５℃において１５ｍｉｎ熱変性処理した後に３７℃において１５ｈ処理時に非誘導；
−ライン４：７５℃において１５ｍｉｎ熱変性処理した後に３７℃において１５ｈ処理時に誘導；
−ライン５：ＨＭＷ（ｐｈａｒｍｉｃａ）；
【図８】
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｃｈｉｉのＲＰＡおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびヒトのＲＰ７０の配列を示す図面である。
【図９】
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ中に発現された組換えＤＮＡポリメラーゼＩの特徴を示す図面である。
電気泳動ゲル
−ライン１：ＬＭＷ
−ライン２：対照：非誘導Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ；
−ライン３：対照：Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂ１２１（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ；
−ライン４：ＬＭＷ；
−ライン５：非誘導ＤＮＡポリメラーゼＩ；
−ライン６：誘導ＤＮＡポリメラーゼＩ；１５ｈ×３７℃誘導，ＩＰＴＧ０，１ｍＭ；
−ライン７：誘導ＤＮＡポリメラーゼＩ；１５ｈ×３７℃誘導，ＩＰＴＧ０，５ｍＭ；
−ライン８：誘導ＤＮＡポリメラーゼＩ；１５ｈ×３７℃誘導，ＩＰＴＧ１ｍＭ；
【図１０】
組換えＤＮＡポリメラーゼＩのポリメラーゼ活性に対する各種緩衝液のｐＨの影響を示す図面である。
【図１１】
組換えＤＮＡポリメラーゼＩのポリメラーゼの培養温度に依存する活性を示す図面：を最適温度において得られた活性の％値として示した。
【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成13年9月28日(2001.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
下記から選択されることを特徴とする、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ） のヌクレオチド配列：
ａ）配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１と少なくとも９８％の相同性を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に相補的な、またはａ）もしくはｂ）に定義の如きヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列および対応するそのＲＮＡのヌクレオチド配列；
ｄ）配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の少なくとも３００ヌクレオチドの代表的フラグメントのヌクレオチド配列；および
ｅ）ｄ）に定義の如き配列を含むヌクレオチド配列。
【国際調査報告】
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