(57)【要約】本発明は、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片若しくは円順列変異誘導体又はそれらの塩の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片若しくは円順列変異誘導体又はそれらの塩の使用。
【請求項２】
該ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが１箇所以上の部位でグリコシル化されている請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラがグリコシル化されていない請求項１に記載の使用。
【請求項４】
該融合タンパク質がイムノグロブリン（Ｉｇ）融合物を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
該機能的誘導体が、アミノ酸残基上の１つ以上の側鎖として生ずる１つ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
該部分がポリエチレン部分である請求項６に記載の使用。
【請求項７】
ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を発現する細胞の使用。
【請求項８】
ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体のコード配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項９】
該ベクターがレンチウイルスベクターである請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を発現する細胞を、任意に１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１１】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性断片又はそれられの円順列変異誘導体のコード配列を含む発現ベクターを、任意に１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項１２】
有効量のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片、円順列変異誘導体又はそれらの塩を、任意に医薬的に許容される担体とともに、それを必要とする患者へ投与することを含む、ハンチントン病の治療方法及び／又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明はハンチントン病（ＨＤ）の分野に属するものである。特に、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するためのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの使用に関する。
発明の背景
ハンチントン病は遺伝性で、常染色体性優性の神経疾患である。これは稀な病気ではあるが、約１００００人に１人が罹患する（Ｂｒｅｉｇｈｔｏｎ及びＨａｙｄｅｎ， １９８１）。この病気は生涯のうちの５０年以前には通常臨床的に明瞭にならないが、典型的には発症から１７年で冷酷な死への進展を伴う精神障害、不随意運動障害及び認知力の低下が生ずる。
【０００２】
ハンチントン病の原因遺伝子はハンチンチンと呼ばれる。それは染色体４ｐ上に位置し、前臨床及び出生前診断のための有効な手段となっている。その遺伝子異常は過剰な数のタンデムに繰り返されたＣＡＧヌクレオチド配列からなる。
【０００３】
ハンチンチン遺伝子はいたる所で発現しており（Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、広範な生物種において保存されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。そのプロモーター領域の構造解析はそれがハウスキーピング遺伝子であることと矛盾しない（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ハンチンチン遺伝子は６７個のエクソンを包み、２００ｋｂ以上におよび（Ａｍｂｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、３’非翻訳領域が異なる１０．３ｋｂと１３．６ｋｂの２種類の転写産物と関連している（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。両メッセージは３１４４個のアミノ酸を含有する３４８キロダルトンのタンパク質をコードしていると予想されている。さらに、ハンチンチン遺伝子は健常人において８から３５までの異なる数の高度多型性ＣＡＧリピートを包含している（Ｋｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。３６個のＣＡＧリピートを超えるＣＡＧ伸張がハンチントン病患者で認められる。
【０００４】
ハンチントン病患者におけるＣＡＧリピートサイズの増加は臨床的特徴の発症年齢と非常に有意な相関を示す。この関連は、通常５０リピートを超える非常に顕著な伸張を持つ若年性発症ハンチントン病患者において特に際立っている。ハンチントン病の家系におけるＣＡＧリピート長は、罹患した父親から子供がハンチンチン遺伝子を受け継いだ際に特に顕著なある種の不安定性を示す。
【０００５】
ＨＤにおいて、この広範に発現している遺伝子が如何にして選択的ニューロン死をもたらすのかは不明である。さらに、塩基配列の解析からは、他の公知遺伝子との明瞭なホモロジーは何も明らかにされておらず、その機能に明らかに洞察を加える構造モチーフ又は機能ドメインは同定されていない。特に、これらの広範に発現している遺伝子が如何にして選択的ニューロン死を引き起こすのかという疑問は回答のないままである。
【０００６】
ＨＤにおける病理の主部位はニューロンの９０％までもが欠失してしまう線条体である。線条体内ではある神経細胞集団の選択的欠失が起こる。神経化学マーカーであるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、サブスタンスＰ、ダイノルフィン及びエンケファリンを含む線条体中型有棘ニューロンが優先的に影響を受ける。対照的に、ニューロペプチドであるソマトスタチン及びニューロペプチドＹを含む中型無棘ニューロン及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性を含む大型無棘ニューロンは（ＣｈＡＴ活性がほとんど消失するにもかかわらず）免れる。ドーパミン作動性及びセロトニン作動性の求心性突起もまた免れる（Ｂｅａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０００７】
認知機能障害及び最終的な痴呆は、皮質ニューロンの欠失又は大脳基底核の認知部位、すなわち背外側前頭前野及び外側眼窩前回路における正常活動の破綻のいずれかによるものかもしれない。特有の舞踏病は、視床下核活動の減少も寄与しているかもしれないが、線条体における神経細胞の欠失が原因であると考えられている。通常は３つの生化学的に異なるが機能的に相互に関連したシステム：（１）黒質線条体のドーパミン作動性システム；（２）線条体内コリン作動性ニューロン；及び（３）線条体から淡蒼球及び黒質に投射しているＧＡＢＡ作動性システム、の間で平衡が維持されている。ドーパミン、アセチルコリン又はＧＡＢＡシステム中のいずれかにおける不均衡も不随意運動の原因となり得る。アセチルコリンの形成に必要な酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ及びＧＡＢＡを合成するために必要な酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼの両方がＨＤ患者の線条体中で顕著に減少している。これらの酵素欠損は、ＨＤ患者においてＬ−ＤＯＰＡの投与後に舞踏病性運動がより悪化するという臨床的観察と一致している。
【０００８】
グルタミン酸誘導神経細胞死がハンチントン病に寄与していると考えられている。グルタミン酸は脳における主要な興奮性トランスミッターである。それは実質的に全ての中枢ニューロンを興奮させ、また神経末端に非常に高い濃度（１０−３Ｍ）で存在する。グルタミン酸受容体は（それらのモデルアゴニストにちなんで命名された）４つの型：カイニン酸受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体及び代謝共役型（ｍｅｔａｂｏｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）受容体、に分類される。多くの正常シナプス伝達事象はグルタミン酸の放出を伴う。
【０００９】
グルタミン酸はまた神経毒性及び神経細胞死を高レベルに誘導する（Ｃｈｏｉ、１９８８）。細胞死の機序は主にＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体へのグルタミン酸の持続的作用とその結果生ずる過剰なＣａ２＋の流入により起こる。過剰なＣａ２＋は活性型Ｃａ２＋依存性プロテアーゼを動員し、フォスフォリパーゼＡ２を活性化し、それは次にはアラキドン酸を遊離させ、炎症の原因物質及びさらに破壊的な結果を引き起こすフリーラジカルの産生を導く。グルタミン酸興奮毒性と呼ばれる、グルタミン酸により生ずるこれらの毒性変化は、脳卒中あるいは過度の痙攣のような急性脳傷害後の細胞傷害及び細胞死の原因になると考えられている。興奮毒性が脳虚血、アルツハイマー病及びＨＤに関わっていることが示唆されている（Ｇｒｅｅｎａｍｙｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【００１０】
ＨＤの病理を模したいくつかの動物モデルが作製されている。ラット線条体中へのグルタミン酸受容体アゴニストの注入によりＨＤと同様な神経細胞欠失のパターンを創出することが可能である。実際の注入部位中にあるニューロンの大部分は死滅するが、周辺に選択的細胞死を示す段階的移行帯が存在する。カイニン酸（ＫＡ）誘導病変を用いた初期の研究はＨＤとの際立った類似性を示した。ＫＡは海藻海人草（Ｄｉｇｉｎｅａ ｓｉｍｐｌｅｘ）から単離されたものであり、哺乳動物の脳内には見出されない。ＫＡの線条体内注入は、固有線条体ニューロンのマーカーの減少及びドーパミン作動性求心性神経の保存を伴う神経細胞欠失とグリオーシスを生じる。しかし、これらのＫＡ誘導病変は、それらが顕著なソマトスタチンレベルの減少とソマトスタチンニューロンの欠失を生じるために不完全なＨＤのモデルである。キノリン酸（ＱＡ）のようなＮＭＤＡ受容体アゴニストにより生ずる病変は、ＧＡＢＡとサブスタンスＰの両方のレベルが顕著に減少するにもかかわらずソマトスタチンとニューロペプチドＹのレベルが比較的影響されないため、より良いＨＤのモデルを提供する。ＱＡ病変の長期間（６ヶ月から１年）のフォローアップにより、ソマトスタチンやニューロペプチドＹ及びセロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸（ＨＩＡＡ）の増加が明らかになり、それは実際のＨＤ患者における所見と同様なものである。従って、慢性的ＱＡ病変はＨＤの神経化学的特徴と酷似している（Ｂｅａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。他の研究者たちは線条体のＱＡ誘導損傷がＨＤの組織病理と類似していることを確認している（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３を参照）。
【００１１】
これらの動物モデルは、細胞置換や神経防護的アプローチのようなＨＤの治療に関連し得る戦略を開発するためにかなり用いられている。変性しているＧＡＢＡ作動性ニューロンの顕著な救済が、ＱＡ病変を持つラットへの胎児線条体細胞の移植又は神経栄養因子の投与後に認められている（Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００１２】
例えば大脳基底核におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ及びγ−アミノ酪酸レベルの低下のようなさらなる神経化学的異常がＨＤで確かめられている。これらの変化は第一次の神経細胞欠失に続く二次的なものと考えられる。
【００１３】
現在のところハンチントン病の治療法はない。舞踏病性運動や激越性行動は、抗精神病薬（例えばクロルプロマジン１００〜９００ｍｇ／日の経口投与又はハロペリドール１０〜９０ｍｇ／日の経口投与）により、又はレセルピンを０．１ｍｇ／日の経口投与で開始し傾眠、低血圧又はパーキンソニズムの副作用が出るまで増量することにより、通常は不完全にではあるが抑制される。脳ＧＡＢＡストアを置換する治療戦略は無効であった。実験的治療はＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体を介してグルタミン酸作動性神経伝達を減少させミトコンドリアのエネルギー産生を高めることを目的としている。長期間の臨床試験がこれらの治療法を評価するために必要である。
【００１４】
現在有効な治療の全ては、病状への対処に関連する合併症の予防及び患者への支持と援助の提供に主眼を置いている。ＨＤと診断された人々に対して、内科医は情緒及び運動の問題を制御するのに役立つ色々な薬剤を処方することが多い。ベンゾジアゼピンは舞踏病性運動を緩和し、抗精神病薬は幻覚、妄想又は激しい怒発の制御に役立つ。患者が鬱病を患っている場合、内科医は抗鬱剤を処方する。精神安定剤は不安を治療するために使用することができ、またリチウムは病理学的興奮又は激しい気分変動を示す患者に処方される。ＨＤを患っている人の一部に現れる激しい強迫神経症的行動に対しては他の薬物治療が処方される。
【００１５】
従って、ハンチントン病の治療に有用な薬剤、医薬組成物及び方法に対する必要性は未だ満たされていない。理想的には、そのような薬剤、医薬組成物及び方法は、激しい副作用無しに、変性疾患の進展を停止し、傷害されたニューロンの再生さえも促進する。
【００１６】
今までのところいくつかの神経栄養因子がＨＤの動物モデルで試験されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。脳由来増殖因子（ＢＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）又はニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）はＱＡ誘発細胞死から線条体ニューロンを防護するには至らなかった。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）はＨＤのサルモデルで何らかの防護効果を示した（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００１７】
遺伝子治療的なアプローチを用いたいくつかの神経防護戦略が提案されている。これらのアプローチは、導入遺伝子の長期間にわたる強い発現と線条体の広範な領域における治療タンパク質の存在を導く効果的な送達システムの開発に依存している。遺伝子操作を行った細胞の移植、神経栄養因子を放出する被包性細胞の埋め込みや、最近ではアデノウイルスベクターを用いた生体内遺伝子治療アプローチが試験されている（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクターがＣＮＳにおける有望な遺伝子送達システムとして最近登場した（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６ａ； Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。１９９６年以来、このシステムの安全性を向上させるため、及びＨＩＶ−１ベクターの導入に必要な最小限の遺伝情報を明らかにするために多くの努力がつぎ込まれて来た。
【００１８】
複製能力のある組換え体の出現の危険を最小限にするために、いわゆるＳＩＮ（自己不活化）ベクターが開発された。ＳＩＮのデザインは、導入ベクターからロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中のＵ３領域を削除し、ウイルス転写エレメントの主要部分を組込みの前に取り除いておくというものである。この改変は複製能力のあるウイルスが組換えにより出現する危険性を減少させるばかりでなく、ＬＴＲと内部プロモーターとの間の転写干渉を消去し、ベクター組込み部位近傍の遺伝子が活性化されてしまう機会を最小限にする（Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００１９】
この発現ベクターシステムが、ＬａｃＺレポーター遺伝子を発現するＳＩＮを神経細胞に高率かつ持続的に形質導入できるということがマウス、ラット及び霊長類において以前に証明されている（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｋｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。さらに、アデノ随伴ウイルスで観察されたこと（Ｌｏｅｂ ｅｔ ａｌ．， １９９９）と同様に、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後エレメント（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）が存在すると導入遺伝子の発現レベルが３〜４倍増加することが示されている（Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００２０】
サイトカインの１つであるインターロイキン６（ＩＬ−６）の、中枢及び末梢神経システムの細胞に対する効果に関する実験は、ＩＬ−６が炎症性神経変性過程に対する影響だけでなく神経細胞に対して防護作用を有することを示している（Ｇａｄｉｅｎｔ及びＯｔｔｅｎ， １９９７； Ｍｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＩＬ−６が線条体ニューロンばかりでなく（Ｔｏｕｌｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、海馬ニューロンにおいて（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）もグルタミン酸誘導細胞死を予防することが判明した。グルタミン酸受容体のＮＭＤＡサブタイプに対する選択的アゴニストであるＮＭＤＡにより誘起される毒性に対するＩＬ−６の神経防護作用の機序は未だ不明である。事実、ＩＬ−６はＮＭＤＡ介在細胞内カルシウム上昇を促進することが見出されている。ヒトＩＬ−６とヒト可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ６−Ｒ）の両方を高レベルで発現するトランスジェニックマウスでは、脳中舌下核の逆行性標識で示されるように、舌下神経の傷害の後に神経再生が促進されることが観察された（Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。最近、神経疾患である脱髄疾患多発性硬化症（ＭＳ）でのＩＬ−６の役割をほのめかすいくつかの証拠が出されている（Ｍｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＩＬ−６遺伝子を欠損したマウスはこの疾患の実験的誘導に対して抵抗性であった。
【００２１】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、１つがＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ又はｇｐ８０）、他がｇｐ１３０と命名された２つの異なるタンパク質からなる膜受容体システムによりその生物活性が仲介される周知のサイトカインである（Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．の総説、１９９４）。ｇｐ８０の細胞外ドメインに相当する可溶性型ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）は、血中や尿中に糖タンパク質として見出される人体の自然産物である（Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０， １９９２）。ｓＩＬ−６Ｒ分子の異例な特性は、ヒト細胞を含む多くの細胞タイプに対してＩＬ−６の強力なアゴニストとして作用することである（Ｔａｇａ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ｇｐ８０の細胞質内ドメインが無くても、ｓＩＬ−６ＲはＩＬ−６に反応してｇｐ１３０の二量体化を引き起こすことができ、それは次にその後のＩＬ−６特異的シグナル伝達と生物学的効果を仲介する（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。ｓＩＬ−６Ｒにはｇｐ１３０との相互作用が２タイプあり、ともにＩＬ−６特異的生物活性に必須である（Ｈａｌｉｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。また活性型ＩＬ−６受容体複合体は、２つのｇｐ１３０鎖、２つのＩＬ−６Ｒ及び２つのＩＬ−６リガンドで形成される六量体構造であることが提唱されている（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｐａｏｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【００２２】
可溶性ＩＬ−６受容体とＩＬ−６を一緒に連結したキメラ分子が記載されている（Ｃｈｅｂａｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７； ＷＯ９９／０２５５２号及びＷＯ９７／３２８９１号）。それらはそれぞれＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ及びＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６と命名されている。キメラＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）をコードするｃＤＮＡの全コード領域とＩＬ−６とを融合して作製された。組換え体ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはＣＨＯ細胞で産生された（Ｃｈｅｂａｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７； ＷＯ９９／０２５５２号）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、試験管内で、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの混合物よりも、ｇｐ１３０鎖と高い効率で結合する（Ｋｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００２３】
さらに、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、１４日齢のマウス胎児から採取した背根神経節（ＤＲＧ）の培養においてミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）並びにＰｏ遺伝子産物ＭＢＰ及びＰｏ ＲＮＡとタンパク質の発現を誘導することが示されている（Ｈａｇｇｉａｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。通常、ＭＢＰとＰｏタンパク質はシュワン細胞の最終出生後成熟の間に誘導され、神経再生の間に再誘導される。このようにＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは神経ミエリン形成と再生においてある役割を果たしているようである。
発明の概要
本発明によれば、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの投与がハンチントン病の進展に対して非常に有益な効果を有することが見出された。特に、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの投与が、線条体神経細胞欠失を顕著に予防し、その上確立されたＨＤ動物モデルにおいて行動欠損を改善することが示された。
【００２４】
従って、本発明は、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片、円順列変異誘導体（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）又はそれらの塩の使用に関する。さらに本発明は、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を含む細胞及びベクターの使用に関する。さらに対応する医薬組成物及び治療方法も本発明の目的である。
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの投与が、線条体ＧＡＢＡ作動性ニューロンの細胞死を顕著に予防し、その上確立されたハンチントン病（ＨＤ）動物モデルにおいて行動欠損を改善するという発見に基づいている。
【００２５】
従って、本発明は、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片、円順列変異誘導体又はそれらの塩の使用に関する。
【００２６】
本明細書で使用される「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ」（「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６」又は「ＩＬ−６キメラ」ともいう）は、インターロイキン−６の全分子又は生物活性断片に融合させたインターロイキン−６受容体の可溶性部分を含むキメラ分子である。キメラタンパク質の一部分を直接融合させるか、あるいはジスルフィド架橋又はポリペプチドリンカーのような適当なリンカーで連結することも可能である。リンカーは、長さが１〜３アミノ酸残基位の短いリンカーペプチドでよく、又は例えば長さが１３若しくは１８アミノ酸残基のより長いものでもよい。該リンカーは、例えば、Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）配列のトリペプチド、又はＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸リンカー配列でよく、可溶性ＩＬ−６受容体のアミノ酸配列とＩＬ−６配列の間に導入される。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子の例は当該技術分野に公知のものであり、例えばＷＯ９９／０２５５２号又はＷＯ９７／３２８９１号に詳細に記載されている。
【００２７】
本明細書で使用される用語「治療」及び「予防」とは、ハンチントン病のいずれか又は全ての症状若しくは病因、及びＨＤに付随する症状又は疾患を、特にこの疾患に関連する神経解剖学的変化と行動変化を予防し、抑制し、軽減し、改善し又は後退させることとして理解されるべきである。
【００２８】
本明細書で使用される用語「ハンチントン病」又は「ＨＤ」は、ハンチントン舞踏病、慢性進行性舞踏病又は遺伝性舞踏病とも呼ばれ、舞踏病性運動と進行性知能低下を特徴とする常染色体性優性障害である。この疾患並びにその病因、症状及び現在の治療法は「発明の背景」に詳細に記載されている。
【００２９】
本発明は、これまでのところ事実上治療不可能な脳障害であるＨＤを治療し及び／又は予防する新たな可能性を提供するものである。現在使用されている薬剤は、関連する合併症を予防したり患者へ支持と援助を提供したりすることに主眼を置いており、そのためこの疾患の基になると考えられている病因の１つ、即ち線条体における神経細胞の欠失を直接攻撃していないため、本発明は実質的な進展を与えるものである。ＨＤの治療に有用であることが示唆されている他のタンパク質、即ちＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）と比較して、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは同じＨＤ動物モデルにおいてよりはっきりした有益な効果を示す。以下の実施例に示すように、確立されたＨＤ動物モデルで試験された線条体における神経防護及び行動異常の軽減の両方に関してＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６はＩＬ−６が示す効果よりもさらに優れた効果を示した。
【００３０】
本明細書で使用される用語「ムテイン」とは、天然成分のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のうちの１つ以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換若しくは欠失させるか、又は１つ以上のアミノ酸残基を元のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６配列に付加したもので、得られる産物の活性が元のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と比較して顕著に変化していないＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの類似体を意味する。これらのムテインは公知の合成法及び／又は特定部位突然変異誘発法あるいは適当な公知の技術により調製される。
【００３１】
本発明のムテインは、ストリンジェントな条件下で、本発明のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をコードするＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸にコードされるタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーションとその後の洗浄の条件を意味し、当業者が慣例的に「ストリンジェント」とする条件である。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 上掲， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， §§６．３及び６．４（１９８７， １９９２）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． Ｃ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照されたい。
【００３２】
ストリンジェントな条件の例には、試験下のハイブリッドの計算されたＴｍより１２〜２０℃低い温度での洗浄条件、例えば２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間；０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、３７℃で３０〜６０分間とその後の０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、６８℃で３０〜６０分間、のような条件を含むが、これらに限定されるものではない。当業者は、ストリンジェントな条件が、ＤＮＡ塩基配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）又は混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解している。混合プローブを用いる場合には、ＳＳＣの代わりにテトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用するのが好ましい。上記Ａｕｓｕｂｅｌを参照されたい。
【００３３】
いかなるムテインもＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性と実質的に同等かそれよりもむしろ良好な活性を示すようにＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のアミノ酸配列が十分に複製されたアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３４】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の１つの特徴的な活性はｇｐ１３０への結合能である。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のｇｐ１３０への結合を測定するＥＬＩＳＡタイプのアッセイは、本明細書中にその全体が援用されるＷＯ９９／０２５５２号の第３９頁、実施例７に詳細に記載されている。ムテインが実質的なｇｐ１３０結合能を有している限り、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と実質的に同等の活性を示すものとみなすことができる。従って、ある与えられたムテインが少なくともＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と実質的に同等の活性を有しているかどうかは、例えばＷＯ９９／０２５５２号の実施例７に記載されているような固定化ｇｐ１３０に結合するかどうかを測定する簡便なサンドイッチ結合アッセイに、そのようなムテインを付すことを包む日常的な実験により決定することができる。
【００３５】
好ましい実施態様においては、いずれのムテインもＷＯ９９／０２５５２号に含まれるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の配列と少なくとも４０％が同一又は相同である。より好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは少なくとも９０％が同一又は相同である。
【００３６】
同一性は２つ以上のポリペプチド配列あるいは２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映し、配列を比較することにより決定される。一般的に、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列又は２つのポリペプチド配列におけるそれぞれヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の比較配列の全長にわたる正確な対応を意味する。
【００３７】
完全に一致しない配列については、「％同一性」を決定することができる。一般的には、比較される２つの配列は配列間で最大の相関が得られるように整列させられる。これには配列比較の程度を高めるために一方あるいは両方の配列に「ギャップ」を挿入することが含まれる。％同一性は、比較される各配列の全長にわたって決定することができ（いわゆるグローバルアラインメント）、これは同一若しくは極めて類似した長さの配列に対して特に好適であり、あるいはより短い一定の長さについて決定することもでき（いわゆるローカルアラインメント）、これは異なる長さの配列に対してより好適である。
【００３８】
２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は当該技術分野に周知である。したがって例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ ｅｔ ａｌ．， １９８４）の有用なプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰプログラムが２つのポリヌクレオチド間の％同一性並びに２つのポリペプチド配列間の％同一性及び％相同性を決定するために使用できる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの「ローカルホモロジー」アルゴリズム（１９８１）を使用し、２つの配列間で最良の単一相同領域を見出す。配列間の同一性及び／又は相同性を決定する他のプログラムも当該技術分野に公知であり、例えばＢＬＡＳＴプログラムファミリー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ．， １９９７、 ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ” ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでＮＣＢＩのホームページを通してアクセスできる）やＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ Ｒ， １９９０； Ｐｅａｒｓｏｎ １９８８）などがある。
【００３９】
本発明に使用できるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のムテイン又はそれをコードする核酸には、ここで述べる教示及びガイダンスに基づき、当業者が必要以上の実験をすることなく日常的に得ることのできる置換ペプチド又はポリヌクレオチドのような実質的に相当する一連の限定配列が含まれる。
【００４０】
本発明のムテインの好ましい変更は「保存的」置換として知られるものである。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の保存的アミノ酸置換は、十分に類似した物理化学的特性を有するグループ内の同義（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）アミノ酸を含み、そのグループのメンバー間の置換は分子の生物学的機能を保つであろう（Ｇｒａｎｔｈａｍ， １９７４）。特にアミノ酸の挿入又は欠失がわずか２、３個のアミノ酸、例えば３０個以下、好ましくは１０個以下であり、機能的立体構造に重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は置換しない場合には、機能を変えることなく前に定義した配列内にアミノ酸の挿入及び欠失がなされてもよいことは明らかである。そのような欠失及び／又は挿入により作製されたタンパク質又はムテインは本発明の範囲内に入る。
【００４１】
好ましくは、同義アミノ酸グループは表１に定義されたものである。より好ましくは、同義アミノ酸グループは表２に定義されたものであり；そして最も好ましくは同義アミノ酸グループは表３に定義されたものである。
表１
2004508409.tif 000002
表２
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表３
2004508409.tif 000004
本発明で使用するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６ポリペプチドのムテインを得るために用いることができるタンパク質におけるアミノ酸置換の作製例は、Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号及び第４，７３７，４６２号；Ｋｏｔｈｓ ｅｔ ａｌ．の第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．の第４，９６５，１９５号；Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．の第４，８７９，１１１号；並びにＬｅｅ ｅｔ ａｌ．の第５，０１７，６９１号中に提示されているような公知の方法工程；並びに米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．）中に提示されているリジン置換タンパク質を含む。
【００４２】
「融合タンパク質」という用語は、例えば体液中で長い滞留時間を示す他のタンパク質と融合させた、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６又はそのムテイン若しくはその断片を含むポリペプチドを意味する。従って、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、他のタンパク質やポリペプチドなど、例えばイムノグロブリン又はその断片と融合することができる。
【００４３】
本明細書で用いられる「機能的誘導体」は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の誘導体、並びに残基の側鎖として存在する官能基又はＮ−若しくはＣ−末端基から当該技術分野に公知の方法で作製されるそれらのムテイン及び融合タンパク質を網羅し、そしてそれらが医薬的に許容されるものである限り、すなわちそれらがＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性と実質的に同等であるそのタンパク質の活性を損なわず、かつそれを含む組成物に毒性を付与しない限り本発明に含まれる。
【００４４】
これらの誘導体は、例えば、抗原部位をマスクし体液中でのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の滞留を延ばすことができるポリエチレングリコール側鎖を含む。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一級アミン若しくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えばアルカノイル又はカルボサイクリックアロイル基）、又はアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えばセリル又はスレオニル残基）が含まれる。
【００４５】
本発明の「活性断片」は、例えばＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の断片である。断片という用語はその分子の一部分、すなわち所望の生物活性を保持したより短いペプチドを意味する。断片はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片のｇｐ１３０への結合特性を試験することにより容易に調製される。あるポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端のいずれかから、ある時間に１個のアミノ酸を除去するプロテアーゼは公知であり、また所望の生物活性を保持した断片の決定は日常的な実験のみを必要とする。
【００４６】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６、ムテイン及びそれらの融合タンパク質の活性断片として、本発明はさらに、その断片がｇｐ１３０に対して実質的に同様な活性を有する場合には、そのタンパク質分子単独の、あるいはそれに連結した会合分子若しくは残基、例えば糖若しくはリン酸残基、又はタンパク質分子若しくは糖残基自体の凝集物を伴う分子の、ポリペプチド鎖の断片又は前駆体を網羅している。
【００４７】
本明細書における「塩」という用語は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子又はその類似体のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野に公知の方法で作製され、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩など、及び例えば、トリエタノールアミンのようなアミン、アルギニン若しくはリジン、ピぺリジン、プロカインなどと形成する塩のような有機塩基との塩を含む。酸付加塩は、例えば塩酸又は硫酸のような鉱酸との塩、及び例えば酢酸又はシュウ酸のような有機酸との塩を含む。もちろん、そのようないかなる塩もＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の生物活性、すなわちｇｐ１３０への結合能を保持していなくてはならない。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様では、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは１箇所以上でグリコシル化されている。
【００４９】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのグリコシル化型はＷＯ９９／０２５５２号（ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３２１）に記載されており、それは本発明の非常に好ましいキメラ分子である。そこに記載されているＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、天然の可溶性ＩＬ−６受容体δ−Ｖａｌ（Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０）の全コード配列を、成熟天然ＩＬ−６の全コード配列に融合して得られた組換え糖タンパク質であり、共にヒト由来である。
【００５０】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、酵母細胞、昆虫細胞、バクテリアなどの必要に応じた真核又は原核細胞タイプで産生することができる。好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはＷＯ９９／０２５５２号に記載されているような遺伝子操作したＣＨＯ細胞で産生される。ヒト由来のタンパク質が好ましいが、本明細書に記載の生物活性を保持している限り、他の由来の同様な融合タンパク質も本発明で使用できることが当業者により認識されるであろう。
【００５１】
本発明のさらなる実施態様において、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはグリコシル化されていない。有利なことに、その際にはグリコシル残基を合成できないが、通常組換えタンパク質を高収率で産生するバクテリア細胞中でキメラ分子を産生させることができる。
【００５２】
さらなる実施態様において、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはさらにイムノグロブリン融合物、すなわち本発明のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をイムノグロブリンの全体又は一部に融合させたものを含む。イムノグロブリン融合タンパク質の作製方法は、例えばＷＯ０１／０３７３７号に記載の方法のように、当該技術分野に周知である。当業者は、得られる本発明の融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの生物活性を保持していることを理解するであろう。得られる融合タンパク質は、体液中での滞留時間（半減期）の延長、比活性の増加、発現レベルの増加又は融合タンパク質の精製の容易さなどの改良された特性を有するのが理想的である。
【００５３】
好ましい実施態様では、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはＩｇ分子の不変領域と融合される。好ましくは、例えばヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのようなＨ鎖領域に融合される。Ｉｇ分子の他のアイソフォーム、例えばアイソフォームＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４又はＩｇＭ若しくはＩｇＡのような他のＩｇクラスもまた本発明の融合タンパク質の産生に好適である。融合タンパク質は、単量体又は多量体、ヘテロ若しくはホモ多量体でもよい。
【００５４】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの機能的誘導体は、そのタンパク質の安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、人体の許容度又は免疫原性のような特性を改良するためにポリマーに結合させてもよい。
【００５５】
従って、本発明の好ましい実施態様は、アミノ酸残基の１つ以上の側鎖として生ずる１つ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含むＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの機能的誘導体に関する。
【００５６】
非常に好ましい実施態様はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合したＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６に関するものである。ＰＥＧ化は、例えばＷＯ９２／１３０９５号に記載されているような公知の方法により実施することができる。
【００５７】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは必要に応じた剤形で脳へ送達される。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を発現及び／又は分泌する細胞の形で送達されるのが好ましい。以下の実施例に説明するように、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを十分量発現及び分泌する細胞は好適な発現ベクターを用いるトランスフェクションにより作製される。
【００５８】
従って本発明はさらに、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を発現する細胞の使用に関する。細胞は好適な形で投与することができる。しかしながら、ポリマー被包性ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ発現細胞、好ましくは分泌細胞が、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの送達に非常に好ましい様態である。被包工程は、例えばＥｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）により、又は米国特許第５，８５３，３８５号に詳細に記載されている。好適な細胞株と安定な発現系は当該技術分野に周知である。
【００５９】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの送達は、コード配列又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を含む発現ベクターのようなベクターを用いて実施してもよい。ベクターは、人体内で、好ましくは脳内で、より好ましくは線条体内で、所望のタンパク質を発現させるために必要な全ての制御配列を含む。発現ベクターの制御配列は当業者に公知である。従って本発明はまた、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用薬剤を製造するための、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのコード配列を含むベクターの使用に関する。
【００６０】
当該技術分野に公知のいかなる発現ベクターを本発明に使用してもよい。しかしながら、以下の実施例に示すように、レンチウイルス由来のベクターがＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを線条体中へ直接送達させるために特に有用であった。従って、本発明の非常に好ましい実施態様は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片又はそれらの円順列変異誘導体を発現させるための発現ベクターとしてのレンチウイルスベクターの使用に関するものである。そのようなレンチウイルスベクターは当該技術分野に公知である。それらは例えばＫｏｒｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）又はＤｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）に明確に記載されている。
【００６１】
本発明のさらなる目的は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片、円順列変異誘導体又はそれらの塩を、任意に１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに含む、ハンチントン病の治療用及び／又は予防用医薬組成物を提供することである。
【００６２】
本発明はさらに、ハンチントン病を治療し及び／又は予防するための、任意に１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とともに、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを発現する細胞を含む医薬組成物、及び発現ベクター、特にＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを発現するレンチウイルス遺伝子治療用ベクターを含む医薬組成物に関する。
【００６３】
「医薬的に許容される」の定義は、活性成分の生物活性の効果を妨害せず、また投与される宿主に毒性を示さないいかなる担体をも包含することを意味する。例えば、非経口的投与用には、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは生理的食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液のような媒体中に注射用ユニット剤形で製剤されることができる。
【００６４】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、いろいろな経路でその投与を必要としている患者に投与することができる。投与経路は、頭蓋内、皮内、経皮（例えば、徐放性製剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所、鼻腔内経路を含む。他の治療的に有効ないかなる投与経路も用いることもでき、例えば上皮又は内皮組織を介した吸収、又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラをコードするＤＮＡ分子を（例えばベクターを介して）患者に投与し、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラを生体内で発現及び分泌させる遺伝子治療を用いることができる。加えて、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、医薬的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤及び媒体のような他の生物学的に活性のある薬品成分と共に投与することができる。
【００６５】
非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内）投与用には、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、医薬的に許容される非経口媒体（例えば水、生理的食塩水、デキストロース溶液）及び等張性を保つ添加剤（例えばマンニトール）又は化学的安定性を保つ添加剤（例えば保存剤及び緩衝液）と共に、溶液、懸濁液、乳濁液又は凍結乾燥粉末として製剤することができる。製剤は一般に使用される技術により滅菌される。
【００６６】
本発明のさらなる目的は、有効量のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片、円順列変異誘導体又はそれらの塩を、任意に医薬的に許容される担体とともに、それを必要とする患者に投与することを包む、ハンチントン病の治療方法及び／又は予防方法を提供することである。
【００６７】
「有効量」とは、上記疾患の経過及び重症度に影響し、そのような病理を軽減又は寛解に導くのに十分な活性成分の量を意味する。有効量は投与経路及び患者の状態に依存するであろう。
【００６８】
単回投与又は頻回投与で個人に投与される用量は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの薬物動態学的特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性、年齢、体重、健康、サイズ）、症状の程度、併用治療、治療頻度、並びに所望する効果を含む色々な要因に依存して変化するであろう。確立される用量範囲の調節と取り扱いは十分に当業者の能力の範囲内である。
【００６９】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片若しくはそれらの円順列変異誘導体を発現する細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与すること、又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、ムテイン、融合タンパク質、活性断片若しくはそれらの円順列変異誘導体のコード配列を含む発現ベクターをそれを必要とする患者に投与すること、を含むハンチントン病の治療方法は、本発明のさらなる目的である。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様では、発現ベクターは遺伝子治療用ベクターである。ウイルスベクターの使用、特にレンチウイルスベクターの使用が非常に好ましい。
【００７１】
次に本発明を、以下の非限定的な実施例および添付図面により詳細に説明する。
【００７２】
本発明が完全に記載されたならば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、また必要以上の実験をすることなく、同等のパラメーター、濃度及び条件の広範な範囲内で、同様に実施できることが当業者により認識されるだろう。
【００７３】
本発明が特定の実施態様に関連して記載されると同時に、それがさらに改変可能であることが理解されるであろう。本願は、概して本発明の原理に沿った、又は本発明の属する技術分野で公知若しくは通例の実施となるような及び添付の特許請求の範囲で述べられた本質的特徴に適用され得るような本開示からの発展を含む、本発明のいかなる変形、使用又は適応をも網羅することを意図している。
【００７４】
雑誌記事若しくは抄録、公開若しくは非公開の米国若しくは外国の特許出願、発行済みの米国若しくは外国の特許、又は他のあらゆる参考文献を含む本明細書で引用した全ての参考文献は、その引用文献中で提示されている全てのデータ、表、図及び本文を含めて、本明細書中にその全体が援用される。さらに、本明細書で引用された参考文献内で引用されている参考文献の全内容もまた本明細書中にその全体が援用される。
【００７５】
いずれにしても、公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法又は従来の方法への参照は、本発明のいずれかの様態、記載又は実施態様が関連技術中に開示され、教示され又は示唆されているということを容認するものではない。
【００７６】
前述の特定の実施態様に関する記載は、第三者が、（本明細書で引用されている参考文献の内容を含めた）当該技術分野の熟練技術内で知識を応用することで、必要以上の実験をすることなく、また本発明の一般理念から逸脱することなく、そのような特定の実施態様を様々な応用のために容易に改変し及び／又は適応することができるという本発明の一般的性質を完全に示すだろう。従って、そのような適応や改変は、本明細書に提示されている教示及びガイダンスに基づいた開示実施態様の等価物の範囲内にあるとみなされる。本明細書中の語法及び用語は、限定ではなく説明を目的とするものであり、よって本明細書の用語又は語法は、当業者の知識と併せて、本明細書中に提示される教示及びガイダンスに照らして当業者により解釈されることが理解されるべきである。
実施例
材料及び方法
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ
可溶性ＩＬ−６受容体（尿中に見出されるｓＩＬ−６の天然型、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７）をコードするｃＤＮＡ配列を、成熟ＩＬ−６をコードするｃＤＮＡ配列と融合した。３個の架橋アミノ酸（ＥＦＭ）の配列もまた存在する。融合遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下にある発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。産生工程を行い、産生された組換えタンパク質を抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体を用いて免疫精製した。精製したＩＬ−６キメラはグリコシル化されており、見かけ上の分子量は８５，０００を示した。
【００７７】
図１は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラタンパク質の構成を模式的に示したものである。成熟タンパク質は５２４アミノ酸からなる。
【００７８】
上に概略したように産生、精製されたタンパク質は本発明に従って投与されることに適している。
レンチウイルスベクターの作製
核局在性β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ヒトＩＬ−６（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１４５８４： ６４−８２４ｂｐ）及びヒトＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ０００５６５： ４１５−１５０８ｂｐ； Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１４５８４： １４８−７０２ｂｐ）（Ｈａｇｇｉａｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９８）をコードするｃＤＮＡをＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫトランスファーベクター中にクローニングした（Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。３個の架橋アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）はＩＬ−６とＩＬ−６Ｒの連結部に存在する。ウイルス粒子は以前に記載されている方法で産生した（Ｈｏｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ＬａｃＺ−、ＩＬ−６−及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６発現ウイルスはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）／１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）中に再懸濁し、ウイルス粒子含有量（ＥＬＩＳＡアッセイでの測定で２５００００ｎｇ ｐ２４抗原／ｍｌ）を合わせた。
生体内実験
体重１８０〜２００ｇの成体雌ウィスターラット（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ、フランス）を用いた。動物は１２時間毎の明暗サイクルに維持され温度制御された部屋に収容した。餌と水は自由摂取とした。実験は実験動物の取扱いと使用に関する欧州共同体評議会指針（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って実施された。
ａ）レンチウイルスの注入
濃縮したウイルスストックを解凍し、ピペッティングを繰り返して再懸濁した。ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６又はＬａｃＺを発現するレンチウイルスベクター２μｌを、ペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した動物（１群当りｎ＝６）の線条体中に、３３ゲージの平滑先端注射針を装着したハミルトン注射筒（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を用いて定位的に注入した。注入のための定位座標は：吻側からブレグマへ１．０ｍｍ；外側から正中線（ＬＭ）へ２．２ｍｍ；硬膜表面から腹側へ５ｍｍである。懸濁液を０．２μｌ／分で注入し、注射針をその場に５分間放置した。皮膚は６−０ Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、ブリュッセル）を用いて縫合した。動物はキノリン酸注入の前に３週間回復させた。
ｂ）キノリン酸損傷
キノリン酸（１８０ｎｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、米国）を２Ｍ ＮａＯＨ中に溶解し、ｐＨを７．４に調整し、容積をｐＨ７．４のＰＢＳで合わせた。動物はペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、１μｌのキノリン酸（１８０ｎｍｏｌ）を線条体内へ注入した。座標は以下を用いた：吻側からブレグマへ１．０ｍｍ；外側から正中線（ＬＭ）へ３．２ｍｍ；硬膜表面から腹側へ５ｍｍ。その毒素は１分間に亘って注入され、注射針はさらに３分間その場所にそのままに置かれた。
行動解析
アポモルフィン誘導回転非対称をウイルスの注入前に２回測定した。１．０ｍｇ／ｋｇのアポモルフィン（Ａｍｉｎｏ ＡＧ、Ｎｅｕｎｈｏｆ、スイス）を動物の皮下に注入し、３分間の馴化期間とその後の４５分間の試験期間のために試験チャンバー（Ｒｏｔｏｓｃａｎ、Ｒｏｔｏｍｅｔｅｒ ｖ５．０６、Ｏｍｎｉｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コロンバス、米国）に入れた。回転は完全な３６０度同側性回転と定義し、同側性回転と対側性回転との間の正味の差異として記録した。自然回転行動を示さない動物（４５分当り４０回転以下）を選択した。ウイルス注入１及び２週間後に、またＱＡ投与５、９及び１３日後に動物を試験した。結果はＱＡ投与前後間での全回転数の正味の差異として表した。同側性回転を陽性回転として数え、対側性回転を陰性回転として数えた。
ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのＥＬＩＳＡアッセイ
ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの生体内合成は注入部位の周辺から採取したパンチ片（２．８×２ｍｍ）及び対照ラット（１群当りｎ＝５）の非注入脳半球を用いて測定した。試料をプロテアーゼ阻害剤混合物（プロナーゼ、サーモライシン、キモトリプシン、トリプシン、パパイン；Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）を含む５００μｌのＰＢＳ中で超音波処理した。ＩＬ−６産生は供給業者の推奨事項に従ってＥＬＩＳＡ（ＩＬ−６ ＥＡＳＩＡ−４５ｍｉｎ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＳＡ、Ｎｉｖｅｌｌｅｓ、ベルギー）で定量した。
【００７９】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの産生は次のようにして測定した。９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ；ＮＵＮＣ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＧ、バーゼル、スイス）を、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌ 抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより供与されたクローン３４．１）１００μｌで一晩コーティングした。ブロッキング工程はＰＢＳ中の２％Ｉ−ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を用いて３７℃で１時間行った。試料（１００μｌ／ウェル）をＰＢＳ中の１％Ｉ−ｂｌｏｃｋ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％マウス血清で希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより供与されたｓＩＬ６−Ｒ ３４６６に対するＩｇＧ）をＰＢＳ中の１％Ｉ−ｂｌｏｃｋ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１／１０００に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした（１００μｌ／ウェル）。ＨＲＰ標識ヤギ坑ウサギ抗体（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより供与；ＰＢＳ、１％Ｉ−ｂｌｏｃｋ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１／５０００に希釈）で３７℃、１時間インキュベートした。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの存在はＴＭＢキット（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）を用いて確認した。光学密度は４５０ｎｍで測定した。
組織学的処理
ＱＡ損傷２週間後、動物にペントバルビタールナトリウムを過量に与え、生理的食塩水と４％パラフォルムアルデヒドで心臓を貫いて（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）還流した。脳を取り出し、約２４時間４％パラフォルムアルデヒドで後固定し、最後に２５％スクロース／０．１Ｍリン酸緩衝液中で４８時間凍結予防処置を施した。脳をドライアイス中で凍結し、２５μｍの冠状組織切片を−２０℃でスライディング式ミクロトームクリオスタット（Ｃｒｙｏｃｕｔ １８００、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｕｓｓｌｏｃｈ、ドイツ）を用いて切り出した。全線状体にわたる切片を収集し、０．１２μＭアジ化ナトリウムを補足したＰＢＳ中に浮動性切片として４８ウェルトレイ（Ｃｏｓｔｅｒ、ケンブリッジ、ＭＡ）中に保存した。トレイは免疫組織学的処理まで４℃で保存した。
【００８０】
試料をドーパミン及びｃＡＭＰで制御される分子量３２ｋＤａのリンタンパク質（ＤＡＲＰＰ−３２）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ａｂｉｎｇｔｏｎ、英国）並びに神経膠繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｌｔｄ、ケンブリッジ、英国）に対する免疫組織化学により処理した。ＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼ（ＮＡＤＰＨ−ｄ）に対する酵素的染色は以前に記載されている通りに行った（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。免疫組織化学染色のために、内在性パーオキシダーゼ活性を０．１％ジフェニルヒドラジン／ＰＢＳ（３７℃／３０分）で消去し、ＰＢＳで３回洗浄した。浮動性切片を５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ、Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スイス）／０．１Ｍリン酸緩衝生理的食塩水中で４℃で一晩インキュベートし、次に各々の抗体：ＰＢＳ／１％ＮＧＳ溶液中に希釈したＤＡＲＰＰ−３２（１：２００００）、ＣｈＡＴ（１：５０）、ＩＬ−６（１：２００）、ＧＦＡＰ（１：４００）、で一晩反応させた。３回の洗浄後、切片を対応するビオチン標識二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、１：２００）と室温で２時間インキュベートし、結合した抗体を３，３’ジアミノベンチジンを色素原として用いてＡＢＣシステム（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、米国）で可視化した。切片をエタノールとトルオールに２回通して脱水し、Ｍｅｒｃｋｏｇｌａｓ（登録商標）カバースリップで封入した。
画像解析
ＱＡ病変は、動物１匹当り９〜１２のＤＡＲＰＰ−３２染色切片（個々の切片間は２００μｍ）をスライドスキャナーでデジタル化し、画像解析用公有プログラム（ＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ、バージョン１．６．１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、米国）を用いて光学密度を定量することにより解析した。全線状体にわたる切片を解析した。データは評価したＤＡＲＰＰ−３２光学密度の比（病変部側対非病変部側）として表した。光学密度は、選択物中の全ピクセルのグレー値の合計をピクセル数で割ったものに相当する切片内の平均グレー値を意味する。脳梁及び前交連を用いて線状体領域を詳細に描写した。全線状体にわたるＤＡＲＰＰ−３２染色切片上でＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ解析プログラムを使用して脳室及び線状体容量を決定し、非病変側の割合として表した。ＣｈＡＴ−及びＮＡＤＰＨ−ｄ染色ニューロン数を動物１匹当り９〜１２の切片（個々の切片間は２００μｍ）上で数え、非病変側のニューロンの割合として表した。
データ解析
データは平均±ＳＥＭで表し、ＳｃｈｅｆｆｅのＰＬＳＤ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ（後知恵）テスト（ＪＭＰ３．０、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、米国）に従って分散分析（ＡＮＯＶＡ）で評価した。有意水準はｐ＜０．０５に定めた。
実施例１：試験管内におけるＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの発現
通常の一時的トランスフェクションシステムとレンチウイルス発現システムにおける対照遺伝子（ｌａｃＺ）、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラそれぞれの発現を比較するために、ヒト胎児腎臓細胞株２９３Ｔを、プラスミドＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫ−ｎｌｓ−ｌａｃＺ、ＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫ−ＩＬ−６若しくはＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫ−ＩＬ−６／ＩＬ−６キメラプラスミド、又はｌａｃＺ、ＩＬ−６若しくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのいずれかを含むレンチウイルスベクターで形質転換した。
【００８１】
４日目に、培養上清中のＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラをＥＬＩＳＡで測定した。
【００８２】
結果を図２に示す。ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはトランスフェクション（図２Ａ）及び感染（図２Ｂ）により発現することができる。発現プラスミドのトランスフェクションはレンチウイルスベクターの感染よりも約３倍高い発現率であった。キメラはトランスフェクションで約７μｇ／１０６細胞／２４時間、感染で約１μｇ／１０６細胞／２４時間の高い発現率を示したが、ＩＬ−６はトランスフェクション及び感染の両方でさらに高率で発現した。
【００８３】
これらの結果は、上述の遺伝子導入操作がともにＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの発現に好適であることを示している。従って、組換え体細胞及びレンチウイルスベクターの両方が、このタンパク質がＨＤの治療及び／又は予防においてその効果を発揮するようにヒト体内、特に脳内へ送達するために使用できるであろう。
実施例２：ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ発現用レンチウイルスベクター
ＩＬ−６（ｎ＝５）及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６（ｎ＝５）の生体内での産生を、対応するレンチウイルスベクター２μｌを注入したウィスターラットで測定した。３週間後に、動物を屠殺し、注入部位を包含する２ｍｍ長のパンチ片を切り出した。組織をホモジナイズし、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をＥＬＩＳＡアッセイで解析した。非注入脳半球での値はバックグラウンドレベル以下であったが、注入脳半球では１１．９±７ｎｇのＩＬ−６及び２．４±０．９ｎｇのＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６が検出された。線状体組織切片の免疫組織化学的解析は、両タンパク質、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが線状体の広い範囲で発現していることを示した（データは示していない）。以前の報告と一致して、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトの数が、ＬａｃＺ及びＰＢＳ群と比較して、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を注入した動物において増加した（データは示していない）。
実施例３：ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラはマウスにおけるアポモルフィン誘導回転の程度を減少させる
ＱＡは線条体の実質的萎縮を伴うニューロンの特徴的病変を誘導する興奮毒素である。ＱＡの線条体内注入はＨＤに認められる選択的な神経細胞易損性のパターンを模する。ＱＡ損傷はさらにＨＤで認められる主症状である運動及び認知力欠損をもたらす。従って、線条体内ＱＡ注入はＨＤの有用なモデルとなり、ＨＤに随伴した神経解剖学的及び行動学的変化を予防し、減衰させ又は逆行させることを目指した新規な治療戦略を評価するために供することができる。
【００８４】
ここでは、このモデルを、ハンチントン病に似せた有害な効果を改善するためのＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの能力を評価するために用いている。
【００８５】
両タンパク質の神経防護効果を評価するために、ヒトＩＬ−６（ｎ＝６）、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ（ｎ＝６）及びＬａｃＺレポーター遺伝子（ｎ＝６）を発現するレンチウイルスベクター２μｌを成体ラットの右側線条体中に定位的に注入した。３週間後に、１８０ｎｍｏｌ ＱＡの線条体内注入により動物を損傷した。左側脳半球は未処置にし、内部標準として供した。アポモルフィン誘導回転非対称をＱＡ投与５、９及び１１日後の線条体損傷を評価するために用いた（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｎａｋａｏ ＆ Ｂｒｕｎｄｉｎ， １９９７）。ＩＬ−６及びＬａｃＺを処置した動物は典型的な回転行動を示したが、非対称の減少がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６群で観察された（図３）。
【００８６】
ＩＬ−６が存在すると回転運動数が増加し、疾患の症状が悪化するのに対して、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラが存在すると動物が示す回転運動数が顕著に減少する。このＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの防護効果はＱＡ損傷５日後には既に現れるが、損傷９日後、特に１１日後にはさらにもっと増大する。
実施例４：ＱＡ誘発損傷の防護
上述の行動学的研究で示されたＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの非常に顕著で有益な効果が線条体における神経防護効果と相関するのかどうかを検討するために、組織学的検討を行った。
【００８７】
異なる群の同側及び対側間において線条体及び脳室の容積に顕著な差はなかった。期待したとおりに、ＱＡ損傷は線条体の収縮（ＬａｃＺ：９２．２％±２．１；ＩＬ−６：９１．７％±０．９；ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６：９２．６％±１．７）と内包繊維束を保った脳室の拡張（ＬａｃＺ：１８６．５％±２２．２；ＩＬ−６：１９９．２％±２２．１；ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６：１８０．９％±２９．９）を引き起こした。ＧＡＢＡ作動性線条体ニューロンのマーカーであるＤＡＲＰＰ−３２を染色した切片の光学密度を線条体損傷の程度を測定するために用いた。Ｌａｃ−Ｚを注入した動物では、全ての動物においてＱＡが線条体のＤＡＲＰＰ−３２染色の高度な消失を誘導した。染色を描画した顕微鏡写真は示されていない。ＤＡＲＰＰ−３２を免疫染色した線条体病変における光学密度の測定を基にした損傷程度の定量は図４に示してあり、平均±ＳＥＭで表してある。ＤＡＲＰＰ−３２免疫応答性の喪失がＩＬ−６処置ラットで減衰しているが（ＬａｃＺ：８４．３±２．９％；ＩＬ−６：６３．３±３．６％；ｐ＝０．００１）、神経防護効果は主に外側脳室近傍の内側線状体領域に限られていた。対照的に、線条体の大部分がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６群では防護されていた（３８．６±１０％；ｐ＝０．００１）。
実施例５：コリン作動性及びＮＡＤＰＨ−ｄ陽性介在ニューロンの防護
ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の効果をさらに評価するために、介在ニューロンの２種類の細胞群：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ジアフォラーゼ（ＮＡＤＰＨ−ｄ）を発現する、大型有棘コリン作動性ニューロン（ＣｈＡＴ陽性）及びＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを調べた。ＬａｃＺ対照群においては、ＣｈＡＴ及びＮＡＤＰＨ−ｄ陽性細胞の割合は、ＱＡ非損傷側では１０．２±１．５％であるのと比較して、ＱＡ損傷側では１６．６±３．７％であった（図５Ａ及び５Ｂ）。ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６はＣｈＡＴ及びＮＡＤＰＨ−ｄ免疫応答性ニューロンの変性を対照群と比較して有意に予防した（ＩＬ−６＝３９．３±６．５％；ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６＝６５．４±８．５％；ｐ＝０．０２及びｐ＝０．０００５）（図５Ａ及び５Ｂ）。ＤＡＲＰＰ−３２ニューロンにおける結果と一致して、効果はＩＬ−６キメラの方で大きかった。
結論
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは十分に確立されたＨＤの実験モデル系で顕著で有益な効果を示し、ハンチントン病の行動障害に対するＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの治療有効性を証明した。それに加えて、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は脳のＨＤで影響を受けた領域において神経防護効果を示した。
【００８８】
総合すると、上で示された結果はハンチントン病の治療及び／又は予防におけるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの有効性を明瞭に示している。従って、本発明はこれまでのところ不治の脳障害であるＨＤを治療し及び／又は予防する新たな可能性を提供する。
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラタンパク質の構造を図示した概略図である。
【図２】図２は、それぞれＩＬ−６（ライトグレー）又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６（ダークグレー）のコード配列を含む、発現プラスミドで形質転換した２９３細胞（図２Ａ）の又はレンチウイルス発現ベクターを感染させた２９３細胞（図２Ｂ）の培養上清中におけるｌａｃＺ（対照）、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの発現率を示す。
【図３】図３は、ＱＡ投与５、９及び１１日後にアポモルフィンで誘導される回転非対称性に対するＬａｃＺ（対照）、ＩＬ−６（縦線）及びＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ（横線）の効果を示す。正の数値は病変と同側への回転に相当する。数値は平均±ＳＥＭで表す。
【図４】図４は、ｌａｃＺ（対照）、ＩＬ−６（縦線）又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６（横線）を処置した動物から採取した線条体のＤＡＲＰＰ−３２免疫染色組織切片における光学密度の測定に基づいた損傷度の定量を示す。数値は平均±ＳＥＭで表す。
【図５】図５は、それぞれｌａｃＺ（対照）、ＩＬ−６（縦線）又はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６（横線）で処置した動物の、右側（損傷）と左側（非損傷）（一群当りｎ＝６）の（Ａ）ＮＡＤＰＨ−ｄ陽性ニューロン及び（Ｂ）ＣｈＡＴ陽性ニューロンの割合を示す。数値は平均±ＳＥＭで表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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