(57)【要約】【課題】Ｔ細胞活性化およびＴ細胞仲介免疫反応の分子的に解明し、種々の免疫関連障害の診断、予防および治療に有用な医薬組成物を提供する。【解決手段】活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性であるが、活性化前のＴリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列を含む単離された核酸。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性でるが、活性化前の該Ｔリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを使用して決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記プロモーター配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項４】
請求項１記載の単離された核酸を含む核酸構成体。
【請求項５】
前記プロモーター配列の転写制御下にあるポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４記載の核酸構成体。
【請求項６】
相同的組換え現象を選択するためのポジティブまたはネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項４記載の核酸構成体。
【請求項７】
請求項４記載の核酸構成体を含む宿主細胞または動物。
【請求項８】
ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項８記載の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項８記載の単離された核酸を含む核酸構成体。
【請求項１１】
前記プロモーター配列の転写制御下にある付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０記載の核酸構成体。
【請求項１２】
ポジティブまたはネガティブ選択マーカーをさらに含む、請求項１１記載の核酸構成体。
【請求項１３】
請求項１０記載の核酸構成体を含む宿主細胞または動物。
【請求項１４】
有効量の請求項１０記載の核酸構成体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離する方法であって、
（ａ）活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にあるレポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構成体により細胞集団を形質転換する工程；および
（ｂ）予め定められたバックグランド値以上に前記レポーター分子を発現する細胞集団から細胞を同定および／または単離し、それによって活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離する工程
含む方法。
【請求項１６】
前記プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記プロモーター配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター分子がＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド分子が酵素、リガンドおよびフルオロフォアからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する方法であって、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にある細胞毒性分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換し、それによって細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーター配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞毒性分子がＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ分子がリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチド分子が酵素またはリガンドである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞活性化を増強することができるサイトカインをコードし、かつ、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にあるポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換し、それによってＴ細胞活性化を増強する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記プロモーター配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、Ｉｌ−１０およびインターフェロン−γからなる群から選択されたリンホカインである、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞活性化を抑制する方法であって、Ｔ細胞活性化によって開始されたシグナル伝達カスケードを中断することができる分子をコードし、かつ、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にあるポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換し、それによってＴ細胞活性化を抑制する工程を含む方法。
【請求項３１】
前記プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記プロモーター配列が、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞活性化によって開始するシグナル伝達カスケードを中断することができる前記分子は、ＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡ分子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分子である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチド分子は酵素またはリガンドである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
プロモーター特異的調節因子を同定する方法であって、
（ａ）活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性であるが、活性化前のＴリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列の発現制御下にあるレポーター分子を含むレポーター構成体を準備する工程；
（ｂ）該レポーター分子の転写および所望により翻訳に好適である条件下で候補調節因子とともに該レポーター構成体をインキュベートする工程；および
（ｃ）該レポーター分子の存在をモニターし、それによって該候補調節因子が該レポーター分子の発現を調節することができるか否かを決定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性化されたＴリンパ球中でのみ機能するプロモーターを含む単離された核酸配列、および核酸構成体、これを利用した医薬組成物および方法に関する。さらに具体的には、本発明は活性化されたＴ細胞中で、例えば、外因性ポリヌクレオチドを発現することができる核酸構成体、該構成体の医薬組成物における用途、および哺乳動物のＴ細胞仲介免疫反応を調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の免疫反応は、多くの細胞性および分子性構成成分が関与する複雑な現象である。
Ｔ細胞は免疫反応においてエフェクターおよび調節因子としての免疫反応、結合抗原識別および活性化シグナル伝達の中心的役割を果たす。Ｔ細胞の多種多様な応答は、細胞仲介免疫反応と呼ばれ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原識別によって開始する。
【０００３】
Ｔ細胞レパトアは広範囲の抗原を識別する。Ｂ細胞と同様に、特定のＴ細胞クローンラインは１つの抗原のみを識別することができる。しかしながら、Ｂ細胞と異なって、Ｔ細胞は、それらが主要組織適合性分子（ＭＨＣ）との複合体において、ペプチドとしてＴＣＲに提示される場合のみ、抗原を認識する。ほとんどのＴ細胞上のＴＣＲは、類似した分子量を有する２つのポリペプチドサブユニット、αおよびβを含む免疫グロブリン様膜内在性グリコプロテインから構成されている。各Ｔ細胞受容体サブユニットは細胞内に広がる定常（Ｃ）領域に結合された可変（Ｖ）領域を含む外部アミノ末端を有する。Ｔ細胞受容体サブユニットの遺伝子は、αにおいては少なくともＶ、接合部（Ｊ）およびＣ領域の３タイプ、およびβにおいては少なくともＶ、多様性（Ｄ）、ＪおよびＣ領域の４種が存在する異なった遺伝子セグメントの体細胞性再配列により構成される。ポリペプチドの不変ＣＤ３複合体およびジスルフィド結合ホモ二量体はＴＣＲに非共有結合的に会合されている。これらの会合されたポリペプチドは、ＴＣＲのシグナル伝達機能の原因となり、また、受容体の効率的表面発現において必要とされる。
【０００４】
適当なＭＨＣコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）における抗原とＴＣＲとの相互作用は、結果としてＴ細胞免疫機能の分化、増殖および取得となる調節された一連の現象につながる。
Ｔ細胞活性化と呼ばれるこの機能的応答は、Ｔ細胞が他の表面受容体を通じて共刺激シグナルを受け取るか否か、およびどのシグナル伝達経路が活性化されるかに依存する（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００５】
ＴＣＲ活性化によって始まるシグナル伝達カスケードは、イノシトールトリリン酸塩／Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール／プロテインキナーゼＣ、Ｒａｓ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびＰＩ３−Ｋ経路を含む。これらの経路の構成成分は、核中に情報を伝達し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびインターフェロン−γなどの種々の分泌因子をコードする遺伝子を活性化する。これらは後に免疫系の細胞成分の増殖、成熟および機能を誘発する。これらの因子はＢ細胞中の抗体分泌およびクラススイッチの誘発、体液性免疫の調節、および腫瘍破壊性および炎症性活性の誘発を刺激することができる（例えば、非特許文献３及び４参照）。
【０００６】
ＴＣＲ抗原レパトアは、発生的に調節されたＴＣＲ遺伝子再配列によって確立され、胸腺内選択プロセスにより形成される。未成熟Ｔ細胞は胸腺から離れる前に結合する抗原に基づいて選択および分化プロセスを受ける。自己抗原に結合するものは、胸腺の皮質中になおも存在する間にアポトーシスによって除去され、免疫寛容性を確立する。細胞の自己反応性集団を除去することができないことは、自己免疫疾患になることが分かっている。
【０００７】
ＴＣＲ遺伝子の欠損、ＴＣＲ発現およびＴ細胞サブタイプ集団の程度は、リンパ腫、白血病、アレルギー反応および自己免疫および免疫不全障害で注目されている。ＴＣＲのαおよびβ−サブユニットを欠損したトランスジェニックマウスでは、Ｂ細胞が増大し、分化し、そして自己抗原に対して反応性である大量の抗体を分泌する。移植片対宿主病は、外来細胞に正常Ｔ細胞が反応する結果であり、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞の細胞溶解性破壊と同じである（例えば、非特許文献５〜１０参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｌａｕｓｎｅｒ， Ｒ． Ｄ． ａｎｄ Ｓａｍｅｌｓｏｎ， Ｌ．，Ｅ．（１９９１） Ｃｅｌｌ， ６４：８７５−８７８
【非特許文献２】
Ｃｌｅｖｅｒｓ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｉｍｎｍｕｎｏｌ． ６： ６２９−６６２
【非特許文献３】
Ａｌｄｅｒｓｏｎ， Ｍ．， Ｒ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： ９２３−９３０
【非特許文献４】
Ｗｅｉｓｓ， Ａ． （１９９１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ， ２５： ４８７−５１０
【非特許文献５】
Ｙｕｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．， ２２： １６９３−１７００
【非特許文献６】
Ｏｌｉｖｅ， Ｃ．， ｓｕｐｒａ （１９９５）
【非特許文献７】
Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５： ２７４−２８２
【非特許文献８】
Ｗｅｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６９： ６５４−６５８
【非特許文献９】
Ｌｅｉｄｅｎ， Ｊ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｔ． ２４： １７−２３
【非特許文献１０】
Ｂａｒｂｅｒ， Ｄ． Ｆ．， ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ， Ｊ． Ａ．， Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｌ３４７３４
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞仲介免疫反応の分子的解明は、種々の免疫関連障害の診断、予防および治療において極めて重要である。
本研究の一部として、本発明者らは日本のフグ（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）から得られたゲノム配列を研究してきた。
思いがけなく、約４００百万年前に魚およびヒト、マウスなどの哺乳動物と共通の祖先から進化したフグは、哺乳動物免疫系においても、Ｔ細胞活性化に重要なリンパ球特異的ｓｒｃファミリーのプロテインチロシンキナーゼＬｃｋの発現を、その哺乳動物固有の同等物と同じように効果的に調節することができる遺伝的調節配列因子を有することが明らかになった。
【００１０】
本発明を完成する間に、マウスの胸腺、睾丸およびわずかな範囲で全血中でのＴリンパ球特異的Ｌｃｋの発現を標的とし、そして調節するプロモーター配列を単離した。１〜数キロベースに及ぶこの配列は連続していて、ＤＮＡ３４キロベースにわたるヒトＬｃｋプロモーターよりも小さい（Ｗｉｌｄｉｎ， Ｒ．Ｓ．ら、Ｔリンパ球のＬｃｋ遺伝子発現の発生的調節（１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：３８３−３９３）。したがって、フグ由来配列は、哺乳動物由来の同等物とは対照的に、哺乳動物のＴ細胞仲介免疫反応を調節する目的でＴ細胞中で外因性ポリヌクレオチドの発現を標的とするために有効に使用され得る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの態様では、活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性であるが、活性化前のＴリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列を含む単離核酸が提供される。
【００１２】
他の好ましい実施態様では、上記プロモーター配列を含む核酸構成体が提供される。
【００１３】
他の好ましい実施態様では、上記核酸構成体はプロモーター配列の転写制御を受ける付加的ポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１４】
他の好ましい実施態様では、上記核酸構成体はポジティブおよび／またはネガティブ選択マーカーをさらに含む。
【００１５】
他の好ましい実施態様では、上記核酸構成体を含む宿主細胞または動物が提供される。
【００１６】
他の好ましい実施態様では、有効量の上記核酸構成体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明の他の態様では、活性化を受けているＴ細胞を細胞集団から同定および／または単離する方法であって、
（ａ）活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にあるレポーター分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、細胞集団を形質転換する工程；および
（ｂ）予め定められたバックグランド値以上にレポーター分子を発現する細胞の集団から細胞を同定および／または単離して、それによって活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離する工程を含む方法が提供される。
【００１８】
他の好ましい実施態様では、レポーター分子はＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である。
【００１９】
他の好ましい実施態様では、ポリペプチド分子は酵素、リガンドおよびフルオロフォアからなる群から選択される。
【００２０】
本発明の他の態様では、細胞の集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する方法であって、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にある細胞毒性分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換し、それによって細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する工程を含む方法が提供される。
【００２１】
他の好ましい実施態様では、細胞毒性分子はＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である。
【００２２】
他の好ましい実施態様では、ＲＮＡ分子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００２３】
他の好ましい実施態様では、ポリペプチド分子は酵素またはリガンドである。
【００２４】
本発明の他の態様では、Ｔ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞活性化を増強することができる細胞サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にある核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換し、それによってＴ細胞活性化を増強する工程を含む方法が提供される。
【００２５】
他の好ましい実施態様では、細胞サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびインターフェロン−γからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の他の態様では、Ｔ細胞活性化を抑制する方法であって、Ｔ細胞活性化によって開始されたシグナル伝達カスケードを中断することができる分子をコードし、かつ、活性化を受けているＴ細胞中では転写機能性であるが、活性化前においては低転写機能性であるプロモーター配列の転写制御下にあるポリヌクレオチドを含む核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞の集団を形質転換し、それによってＴ細胞活性化を抑制する工程を含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の他の態様では、プロモーター特異的調節因子を同定する方法であって、
（ａ）活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性であるが、活性化前のＴリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列の発現制御下にあるレポーター分子を含むレポーター構成体を準備し；
（ｂ）該レポーター分子の転写および所望により翻訳に好適である条件下で候補調節因子とともに該レポーター構成体をインキュベートし；
（ｃ）レポーター分子の存在をモニターして、それによって候補調節因子がレポーター分子の発現を調節することができるか否かを決定する工程を含む方法が提供される。
【００２８】
他の好ましい実施態様では、Ｔ細胞活性化によって開始されるシグナル伝達カスケードを中断することができる分子は、ＲＮＡ分子またはポリペプチド分子である。
【００２９】
他の好ましい実施態様では、ＲＮＡ分子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００３０】
他の好ましい実施態様では、ポリペプチド分子は酵素またはリガンドである。
【００３１】
以下に説明する本発明の好ましい実施態様では、プロモーター配列は、ギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを用いて決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％同一である。
【００３２】
他の好ましい実施態様では、プロモーター配列は、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を５５℃で用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液で５０℃で最終洗浄するハイブリッド化条件下で、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッドし得る。
【００３３】
本発明は活性化を受けているＴリンパ球中において機能性であるかまたは上向き調節できるプロモーター配列を含む単離された核酸配列を提供することによって、公知である立体配置の欠点を首尾よく解決する。さらに、本発明は該プロモーター配列を使用する核酸構成体、ならびにＴリンパ球活性化を調節するために、および個体の循環血液細胞などの細胞集団から活性化を受けているＴリンパ球を同定、単離または除去するために、これらの核酸構成体を使用する方法を提供する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明は個体のＴリンパ球仲介免疫反応を調節するために利用され得る新規なＴリンパ球活性プロモーターを含む核酸構成体に関する。具体的には、本発明は活性化を受けているＴリンパ球を抑制または除去するために使用され、したがって、例えば自己免疫障害などの免疫障害を患う個体のＴリンパ球仲介免疫反応を抑制することが可能となる。本発明はまた、活性化を受けているＴリンパ球を増強するためにも使用され、したがって、例えばウイルス感染症を患う個体のＴリンパ球仲介免疫反応を増大することが可能となる。
【００３５】
本発明の原理および操作は図面およびその説明を参照することにより、より良く理解される。
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に開示されるかまたは図面に示される構造の詳細および成分の配列への応用に限定されないと理解されるべきである。本発明は他の実施態様を含み、また、種々の方法で実施され得る。また、ここで使用される用語および述語は説明のためのものであると理解されるべきであり、限定と見なされるべきでない。
【００３６】
本発明において、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、ヘルパー、サプレッサーおよび細胞毒性Ｔリンパ球を含む種々のＴリンパ球サブクラスを表すために交互に使用される。
Ｔ細胞活性化およびＴ細胞仲介免疫反応を分子的に解明することは、哺乳動物の種々の免疫関連障害の診断、予防および治療において非常に重要である。
Ｔ細胞活性化中の、Ｔ細胞発現ポリヌクレオチドの転写調節に関与する核酸調節配列は、それ自体、Ｔ細胞仲介免疫反応を研究および調節するための重要な道具である。
【００３７】
本発明を完成する間に、本発明者らは日本のフグ（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）のゲノムから、調節配列因子を単離した。その調節配列は哺乳動物Ｔリンパ球中でＴ細胞活性化に関係があるリンパ球特異的ｓｒｃファミリーのプロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）の発現を司る。
【００３８】
０．９〜４キロベースに及ぶこの配列は連続しており、約３４キロベースのゲノムＤＮＡに及ぶヒトＬＣＫプロモーターより小さい。したがって、その哺乳動物の同等物とは異なり、Ｆｕｇｕ由来配列は哺乳動物のＴ細胞仲介免疫反応を調節するために、Ｔ細胞中での外因性ポリヌクレオチドの発現を標的とするために有効に使用され得る。
【００３９】
したがって、本発明の１つの態様おいて、活性化を受けているＴリンパ球中では転写機能性であるが、活性化前のＴリンパ球中では低転写機能性であるプロモーター配列を含む単離された核酸を提供する。
【００４０】
本発明においては、Ｔ細胞活性化とは、Ｔ細胞免疫性機能の分化、増殖および取得となる調節された一連の現象をいう。
このプロモーター配列は、Ｔリンパ球活性化に対応して活性化されるか、または上向き調節される。Ｔリンパ球の活性化は、細胞毒性のＴリンパ球の場合、外来抗原との相互作用、またはヘルパーまたはサプレッサーＴリンパ球の場合、Ｂ細胞との相互作用によって開始され得る。哺乳動物のＴ細胞仲介免疫反応に関する詳細については、Ａｂｂａｓ， Ｋ．Ｓ．， Ｌｉｃｈｔｍａｎ， Ａ．Ｈ．ａｎｄ Ｐｏｂｅｒ， Ｊ．Ｓ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９７， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ４９４ｐｐ． Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ参照。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様では、プロモーター配列はギャップ重量が５０、長さ重量が３、平均マッチが１０、かつ平均ミスマッチが−９であるスミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用したウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを使用して決定された配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７と少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５〜１００％同一である。
本発明の他の好ましい実施態様では、プロモーター配列は温和な条件下で配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である。
好ましくは、本発明のこの態様の単離された核酸は、中程度〜厳しいハイブリッド化条件下に配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）２４、２５、２６または２７とハイブリッド可能である。
【００４２】
温和な条件下でのハイブリッド化は、５５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄溶液で５０℃で最終洗浄することによって実施される。中程度の条件下でのハイブリッド化は、６０℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を用い、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄溶液で５５〜６５℃、好ましくは６０℃で最終洗浄することによって実施される。厳しい条件下でのハイブリッド化は、６５℃で１０％のデキストラン硫酸、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳおよび５×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むハイブリッド化溶液を用い、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄溶液で５５〜６５℃、好ましくは６０℃で最終洗浄することによって実施される。
【００４３】
本発明の他の好ましい実施態様では、本発明のプロモーター配列を含む核酸構成体が提供される。
好ましくは、この構成体はまた、本発明のプロモーター配列の転写制御下に位置されるポリヌクレオチド配列を含む。したがって、活性化を受けているＴリンパ球中でのみ、このポリヌクレオチド配列転写の活性化または上向き調節が可能となる。以下にさらに説明するように、このようなポリヌクレオチドは、核酸構成体の使用目的に応じて、例えば、レポーター分子、細胞毒またはサイトカインをコードすることができる。
【００４４】
本発明の他の好ましい実施態様では、上記核酸構成体を含む宿主細胞または動物が提供される。
したがって、本発明の核酸構成体は活性化を受けているＴリンパ球中で外因性ポリヌクレオチドを発現するために哺乳動物の細胞を形質転換するために利用され得る。
【００４５】
以下の記載および実施例においてさらに説明するように、このような細胞は、実施例において説明するトランスジェニックマウスなどの哺乳動物のあらゆる細胞、哺乳動物の血液中に存在するかあるいはそれから誘導された血液細胞、器官組織の細胞または細胞培養物の細胞を包含する。
哺乳動物細胞を形質転換するためには当該技術分野では多くの方法が公知である。このような方法としては、直接ＤＮＡ取り込み技術、およびウイルスまたはリポソーム仲介形質転換（さらに詳細には、例えば「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１巻−３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸被覆粒子でもって細胞培養物または器官由来組織を衝撃することも考えられる。
【００４６】
上記の形質転換方法および他の方法は、使用する組織のあらゆる種類の細胞を形質転換するために利用できる。上記方法のいくつかはＴリンパ球特異的形質転換に利用され得る。例えば、Ｔリンパ球特異的形質転換はＴリンパ球のみに感染する組換えウイルスを利用することによって実施され得る。
上記形質転換方法は本発明の核酸構成体で一過性的にまたは安定して形質転換される細胞を生成するために使用され得ることが理解されるであろう。
【００４７】
一過性形質転換では、核酸構成体は細胞内で発現されるが、このような発現は核酸構成体が細胞中に存在する間に限り維持されるので、ゲノム中へ安定して組み込まれない。安定形質転換では、核酸構成体またはその発現部分は宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、したがって、最初の形質転換細胞から分割された細胞へも導入され、発現する。
【００４８】
いずれの場合も、形質転換方法または形質転換される細胞の種類の多様性にかかわらず、本発明のプロモーター配列の使用は、プロモーターの下流に位置するポリヌクレオチド配列が活性化を受けているＴリンパ球中でのみ転写されることを確実にする。
本発明の核酸構成体は、医薬組成物の成分として循環血液細胞などの細胞中へ輸送され得ることが理解されるであろう。
【００４９】
したがって、本発明の他の好ましい実施態様では、有効量の本発明の核酸構成体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
以後、「薬学的に許容される担体」とは、生物に甚大な刺激作用を生じず、かつ、投与された活性物質の生物学的活性および特性を阻害しない担体を意味する。
【００５０】
医薬組成物の「活性成分」を構成する本発明の核酸構成体は、種々の投与方法により個体に投与される。
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸管または筋肉内、皮下および髄内注射ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹膜内、鼻内、または眼内注射などを含む非経口投与が挙げられる。
また、例えば、リンパ節または器官中に直接に製剤を注射して、全身的投与ではなく局所投与してもよい。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知である方法、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作成、水簸、乳化、カプセル化、エントラッピングまたは凍結乾燥方法によって製造してもよい。
本発明で使用する医薬組成物は、活性成分の製剤への加工を容易にする賦形剤および補助剤などの生理学的に許容される１種以上の担体を使用して、従来の方法で製剤化される。製剤方法は選択された投与経路に依存する。
【００５２】
注射用には、活性成分は水溶液、好ましくはハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）液、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）液、または生理学的塩緩衝液などの生理学的適合性緩衝液に製剤化することができる。経粘膜投与用には、浸透し易くするための湿潤剤が使用される。このような湿潤剤は一般的に当該技術分野で公知である。
経口投与用には、活性成分は患者が経口摂取できる錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤化される。
【００５３】
経口で使用され得る医薬組成物としては、ゼラチンから作られたプッシュフィットカプセルならびにゼラチンとグリセロール、ソルビトールなどの可塑剤から作られた密閉軟カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤および所望により安定剤を混合されていてもよい。軟カプセルでは、活性成分は脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または分散されていてもよい。さらに、安定化剤が添加されていてもよい。経口投与のための製剤は全て、選択された投与経路に好適な薬量であるべきである。
【００５４】
口腔粘膜投与のためには、組成物は従来の方法で調製された錠剤またはトローチの形態をとってもよい。
鼻からの吸入投与では、活性成分は適当な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧の形態で摂取される。加圧エアロゾルの場合には、その単位薬量はある一定量を投与するためのバルブを設けることによって定めることができる。ディスペンサーで使用する例えばゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなど適当な粉末ベースを含んでいてもよい。
【００５５】
製剤は、例えば大量瞬時投与または連続注入による非経口投与用に調製されてもよい。注射用製剤は、例えばアンプルなどの一回用の形態であっても、所望により保存剤を添加した多数回用の形態であってもよい。組成物は懸濁液、溶液または油性または水性媒体中の乳化液であってもよく、また懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調製化助剤を含んでいてもよい。
【００５６】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性にした活性成分の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液は適当な油性また水性注射用懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。高濃度溶液とするために、懸濁液は所望により活性成分の溶解性を増加させる安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【００５７】
また、活性成分は、使用前には、媒体、例えば無菌、パイロジェンフリー水性溶液を構成するための粉末形態であってもよい。
本発明の製剤はまた、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤用基材を用いて座剤または保持性浣腸剤などの直腸用組成物として調製されてもよい。
【００５８】
本発明において使用するために好適である医薬組成物は、目的を達成するために有効な量の活性成分を含む。より具体的には、治療上有効な量とはＴリンパ球の活性を調節するために有効な活性成分の量を意味する。
治療上有効な量の決定は、特に下記実施例に示される詳細な開示に照らして、充分に当業者の能力の範囲内である。
【００５９】
本発明の方法に使用されるいずれの製剤においても、治療上有効な量または用量はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養分析によりまず見積もられる。例えば、ある用量は所望調節を達成する動物実験により求められる。このような情報はヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用される。
【００６０】
本発明の活性成分の毒性および治療上の効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養または実験動物における標準薬学的手法によって決定される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養分析および動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための用量範囲を決めるために使用される。用量は使用される投薬形態および使用される投与経路によって異なっていてもよい。製剤、投与経路および用量は個々の患者の必要性に従って正確に選択される（例えば、Ｆｉｎｇｌ， ｅｔ ａｌ．， １９７５， “Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” ， Ｃｈ．１ ｐ．１）。
【００６１】
薬剤輸送方法に関わらず、活性化を受けているＴ細胞中において活性化または上向き調節され得るプロモーター配列を含む本発明の核酸構成体は、活性化を受けているＴ細胞中でのみ制御分子を発現するために利用され、それ故、個体のＴリンパ球仲介免疫反応を調節するために使用される。
【００６２】
したがって、本発明の他の態様では、Ｔ細胞活性化を抑制する方法が提供される。この方法はＴ細胞活性化によって開始されるシグナル伝達カスケードを中断することができる分子を発現するように構成された本発明の核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換することによって実施される。このような分子は例えば、サイトカインｍＲＮＡ翻訳を中断または阻止することができるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム分子、または細胞性サイトカイン分子に結合して阻害することができる抗体の免疫部分である。
【００６３】
本発明の核酸構成体のプロモーター配列は、活性化を受けているＴ細胞中でのみ活性化または上向き調節されるので、シグナル伝達カスケードを中断することができる分子の発現はこれらの細胞に限定され、それによって活性化を受けているＴリンパ球の選択的抑制が可能になる。
【００６４】
細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する方法もまた本発明の教示によって実施され得ることが理解されるであろう。
したがって、本発明の他の態様では、細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を除去する方法が提供される。この方法は細胞毒を発現するように構成された本発明の核酸構成体で、活性化を受けているＴ細胞を含む細胞集団を形質転換して実施される。このような細胞毒とは、例えば生細胞機能を妨害するかまたはアポトーシスを惹起するアンチセンスＲＮＡ分子またはポリペプチドである。
【００６５】
本発明の核酸構成体のプロモーター配列は、活性化を受けているＴ細胞中でのみ活性化または上向き調節されるので、細胞毒の発現はこれらの細胞に限定され、それ故、細胞集団から活性化を受けているＴリンパ球の選択的除去が可能となる。
【００６６】
活性化を受けているＴ細胞の抑制または除去は自己免疫障害などの免疫学的障害を患う個体を治療するために利用され得る。さらに、活性化を受けているＴ細胞の抑制または除去は、移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を軽減するためにも利用され得る。
また、個体がウイルスによって感染されているかまたは腫瘍成長を患っている場合などのように免疫反応の増強が望まれる場合には、本発明の核酸構成体は、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０またはインターフェロン−γなどのリンホカインなどのサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６７】
活性化を受けているＴ細胞中で発現される場合、このようなサイトカインは活性化を受けているＴ細胞の増殖を増加させ、その一方で、Ｔ細胞活性によって調節される他の免疫細胞の増殖を増加させ、これによって免疫反応を増大させる。
【００６８】
本発明の核酸構成体は、細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離するためにも使用される。
したがって、本発明の他の態様では、細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離する方法が提供される。この方法はレポーター分子を発現するように構成された本発明の核酸構成体で細胞集団を形質転換し、そして予め定められたバックグランド値以上にレポーター分子を発現する細胞集団から細胞を同定および／または単離することによって実施される。
【００６９】
このようなレポーター分子はＲＮＡ分子であり、その発現濃度はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリボプローブによって測定される。好ましくは、レポーター分子は酵素、リガンド、選択マーカーまたはフルオロフォア（例えばグリーン蛍光タンパク質、ＧＦＰ）などのポリペプチドであるが、これらに限定されるものではない。その発現濃度は生化学反応、選択培地または蛍光励起によって測定される。
【００７０】
本発明の教示による細胞集団から活性化を受けているＴ細胞を同定および／または単離する方法は、例えば、Ｔ細胞活性化に影響を与える因子を研究するために、あるいは免疫治療において有用であるＴ細胞の特定サブセットを単離するために利用される。
【００７１】
したがって、本発明はＴ細胞によって仲介される免疫反応を調節するように設計された発現構成体に利用することができる新規なプロモーター配列を提供する。その組織的特異性ゆえに、本発明のプロモーター配列は活性化を受けているＴ細胞中で調節分子の転写を推進するために利用され、それ故、Ｔ細胞のこの特定サブセットを増大、抑制または除去し、それによって免疫反応を増大または抑制するために利用される。
【００７２】
本発明の他の目的、利点および新規な特徴は、以下の実施例を検討することにより当業者に明らかになるであろう。なお、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されない。さらに、上述の本発明の種々の実施態様、および請求項に記載した種々の実施態様は、以下の実施例により実験的に支持されている。
【００７３】
【実施例】
上記説明に加えて、本発明を以下の実施例を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
一般的に、本発明で使用される命名法および実験操作は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献中に充分に説明されている。例えば、下記のものを挙げることができる。「分子クローニング：研究室マニュアル」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「分子生物学の最近プロトコール」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編集、（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学の最近プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「分子クローニングの実施指針」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら、（編集）「ゲノム分析：研究室マニュアルシリーズ」、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、第５，２７２，０５７号に開示されいる方法；「細胞生物学：研究室ハンドブック」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．，編集（１９９４）；「免疫学の最新プロトコール」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，編集（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら、（編集）「基本および臨床免疫学」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ （１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ （編集）、「細胞免疫学の選択的方法」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）。免疫分析法は下記の特許および科学文献に広く記載されている。米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成」Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．，編集（１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション」Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編集（１９８５）；「転写と翻訳」Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編集（１９８４）；「動物細胞培養」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．，編集（１９８６）：「固定化細胞および酵素」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）；「分子クローニングの実施ガイド」、Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， （１９８４）；および「酵素学の方法」第１〜３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用指針」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク精製および特性化の戦略−研究室コースマニュアル」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）。これらの全ての文献の記載はここに充分に開示されているものとして援用する。他の一般的参考文献はこの資料中に記載されている。前記文献記載の方法は当該技術分野で周知であり、読者の便宜のために提供する。前記文献記載の情報の全てを本願で援用する。
【００７４】
実施例１
原料と方法
ＦｕｇｕＬＣＫのクローニングおよび配列分析：
Ｆｕｇｕリンパ球キナーゼ（ＬＣＫ）のゲノム断片を、ヒトＬＣＫエクソン１０コードポリペプチド領域：ＣＫＩＡＤＦＧ（配列番号３）およびエクソン１１コードポリペプチド領域：ＫＷＴＡＰＥＡ（配列番号４）のそれぞれに相補的である縮重プライマー５’−ＴＧＹ  ＡＡＲ  ＡＴＨ  ＧＣＮ  ＧＡＹ  ＴＴＹ  ＧＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＣＹ  ＴＣＮ  ＧＧＮ  ＧＣＮ  ＧＴＣ  ＣＡＹ  ＴＴ−３’（配列番号２）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。得られたＰＣＲ生成物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化し、配列を決定した。Ｆｕｇｕゲノムコスミドライブラリー（ＵＫ ＨＧＭＰ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ； ＣａｍｂｒｉｄｇｅのＧｒｅｇ Ｅｌｇａｒによって、ＬＡＷＲＩＳＴ４中に組み入れられた）を、ＦｕｇｕＬＣＫ断片でスクリーニングし、２つのポジティブ重複コスミド、８８Ａ８および５２Ｃ１を単離し、配列決定した。この配列は「ショットガン」配列決定法とＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７自動ＤＮＡ配列決定装置を使用するプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）を組み合わせて得られた。データベース配列との相同性比較はバイオテクノロジー情報ナショナルセンター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の非重複タンパクデータベースを使用して行った。コード配列はタンパクデータベースの公知遺伝子との相同性によって同定し、そして、ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子のエクソン−イントロン構造はＦｕｇｕ腎臓から抽出した全ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲにて確認した。
【００７５】
ＬＣＫプロモーター−ＧＦＰ構成体の調製：
８４ｂｐの第１エクソンを含んだ異なった長さのＦｕｇｕＬＣＫプロモーターを、５’末端にＫｐｎＩの制限酵素部位を追加した特定プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。さらに、ヒトＬＣＫの遠位および近位プロモーターを、ＫｐｎＩの制限酵素部位を含むように作られた特定プライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ増幅は、２０ｎｇのＦｕｇｕまたは５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭの各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび５．０単位のＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を含む全容量１００μｌ中で実施した。異なった長さのＦｕｇｕおよびヒトＬＣＫプロモーターを増幅するために使用したプライマー対の配列を下記第１表に示した。熱的サイクル条件は、次の通りである：９４℃で１分間変性、５５℃で３０秒間アニーリングおよび７２℃で２〜４分間伸長。これらを全部で３０回繰り返した。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで電気泳動し、ＰＣＲ生成物を含むバンドをゲルから取り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｍｂｈ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。精製されたＤＮＡをＫｐｎｌで消化し、上流側に増幅されたグリーン蛍光タンパク（ＥＧＦＰ）配列を有する予め消化されたｐＥＧＦＰ−１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）にクローン化した。組換えクローンはＧＦＰＳＥＱ１プライマー（表１）を使用して配列決定して挿入物の存在および配向についてスクリーニングした。
【００７６】
【表１】
2004520013.tif 000002
【００７７】
細胞系への形質移入
ＪｕｒｋａＴ細胞（ヒト白血球Ｔ細胞系）を１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｈｅｌａ（ヒト頸部腺癌）、Ｈｕｈ７（ヒト肝臓癌）、ＨＴ２９（ヒト大腸癌）、Ｖｅｒｏ（サル腎臓）およびＣ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞）細胞を、ＲＰＭＩ１６４０と同じ補充物を有するＤＭＥ培地中で成長させた。
【００７８】
各形質移入のための混合物は、次のようにして２４ウェル組織培養プレート中で調製した：２μｇのＬＣＫプロモーター−ＧＦＰ構成体またはＦｕｇｕコスミド５２Ｃ１ＤＮＡを１００ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で希釈し、１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で８μｌ（１６μｇ）のＤＭＲＩＥ−Ｃ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と充分に混合した。混合物を室温で３０分間、インキュベートし、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した細胞で覆うか（７０％集密的接着Ｔ細胞、すなわちＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ７、ＨＴ２９、ＶｅｒｏおよびＣ２Ｃ１２の場合）、またはＯｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した細胞中に再懸濁した（指数関数的成長段階の４００，０００個のＪｕｒｋａＴ細胞の場合）。細胞をＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて４時間インキュベートし、次いで２０％ＦＢＳを含む１ｍｌの成長培地を加えた後、インキュベーションを２４〜７２時間続けた。形質移入細胞のＧＦＰの発現は、ＦＩＴＣフィルターを取り付けたＬｅｉｃａＤＭＩＬ倒立顕微鏡で蛍光可視法により測定した。
【００７９】
トランスジェニックマウスの産生：
トランスジェニックマウスを標準的手法を使用して産生した。簡単には、過排卵したＦＶＢ／Ｎマウスから単離された受精１細胞段階（ｏｎｅ−ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ）マウス卵子に、精製線状化５２Ｃ１コスミドＤＮＡまたはプラスミドバックボーンが制限酵素分解および電気泳動で除去された精製ＬＣＫプロモーター駆動ＧＦＰ構成体を微量注入した。Ｆｕｇｕコスミド５２Ｃ１はコスミド中に特殊な部位を有する酵素で分解して線状化させた。トランスジェニック初代動物は尾細胞診（ｔａｉｌ ｂｉｏｐｓｙ）から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認し、野性のＦＶＢ／Ｎマウスと交尾させて、独立ラインを産生した。
【００８０】
ＲＮＡ単離：
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用することによって、トランスジェニックおよび野生のマウスの新鮮であるかまたは凍結された組織から単離した。
ＲＴ−ＰＣＲ：
０．５μｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８、ＰＣＲ緩衝液、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１μｌの１０単位／ｍｌのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む最終容量２０μｌの逆転写酵素反応混合液を、３ｍｇのＲＮＡ試料を含むＤＥＰＣ水へ添加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで７５℃で少なくとも５分間処理してＤＮａｓｅＩを変性した。試料を１分間氷上で冷却し、次いで４２℃で５分間予熱した。１ｍｌ（２００単位）のスーパースクリプトＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を、さらに５０分間インキュベートした試料に添加した。反応を７０℃で１５分間インキュベートした後終了し、１分間氷上で冷却した。冷却後、試料を３７℃で２０分間、１μｌ（２単位／μｌ）の大腸菌ＲＮａｓｅＨ（Ｂｉｂｃｏ ＢＲＬ）とともにインキュベートし、ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ＲＴ−ＰＣＲの熱サイクル条件は次の通りである：ＤｙＮＡｚｙｍｅＴＭＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｚｙｍｅｓ ＯＹ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で４５秒間の伸長を全体として３５回繰り返した。マウスのＦｕｇｕＬＣＫ発現は次のプライマーを使用して検出した：５’−ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ−３’（配列番号１８）および５’−ＡＡＧ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＣＣ−３’（配列番号１９）、これらはＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子の第８および第９エクソンにそれぞれ対応する。トランスジェニックマウスのＧＦＰ発現は次のプライマーを使用することによって検出した：５’−ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ−３’（配列番号２０）および５’−ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＴＧＣ−３’（配列番号２１）、これらはＧＦＰの全長コード配列を増幅する。
【００８１】
ノーザンハイブリダイゼーション
ノーザンブロットおよびハイブリッド形成を標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上掲）に従って行った。約４０μｇの全ＲＮＡを変性ゲル上で分画し、ナイロン膜上に移し、ＰＣＲで増幅したＧＦＰの全長コード配列をプローブとして使用した。プローブを製品の説明書に従い、ハイプライム（Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ）標識化キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して放射性標識した。
【００８２】
ウェスタンブロット分析：
ウェスタンブロット方をＥＣＬウェスタンブロッティング分析キット （Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ）の説明書に従って行った。ＧＦＰに対するモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＧＦＰ発現をチェックするために使用した。
【００８３】
実施例２
実験結果
ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子座の構造：
６１ｋｂの近接ＤＮＡ配列を２つの重複コスミド（５２Ｃ１および８８Ａ８、図１）から得た。ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子の配列を含むほかに、この遺伝子座は次の９つの他の完全遺伝子を含んでいた：ＳＨ３フィロ（ｐｈｉｌｏ）タンパク遺伝子、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＦ０８Ｆ３．４遺伝子と相同な遺伝子、管状筋細胞遺伝子、ヒト仮説タンパク遺伝子に高い相同性を有する遺伝子、ヒストンデアセチラーゼの遺伝子、ポリＡ結合タンパク遺伝子、サイクロフィリン遺伝子、コネキシン遺伝子およびＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの遺伝子。ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子（配列番号２２）はヒトＬＣＫ遺伝子と構造的に類似した１２エクソンによってコードされている。ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子は、ヒトＬＣＫと６７％同一である５０２個のアミノ酸タンパク（配列番号２３）をコードする。ＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子とその５’上流近隣遺伝子配列間の遺伝子間領域は、ＦｕｇｕＬＣＫの完全プロモーターを含む。従って、この配列の種々の長さの断片（配列番号２４〜２６）を、細胞系およびトランスジェニック動物中のＦｕｇｕＬＣＫまたはＧＦＰの発現を調べるために使用した。
【００８４】
細胞系中のＦｕｇｕＬＣＫの発現：
ＬＣＫ遺伝子の完全配列を含むＦｕｇｕコスミド５２Ｃ１を、電気穿孔法によってＪｕｒｋａｔおよびＣＨＯ細胞系に形質移入した。ＬＣＫの発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＦｕｇｕＬＣＫの移入転写物の大きさに相当するＰＣＲ断片は、Ｔ細胞から誘導されたＪｕｒｋａＴ細胞にのみ検出された。ＰＣＲ断片はその同一性を確認するために配列決定された（図６）。
【００８５】
セルライン中のＦｕｇｕＬＣＫプロモーター駆動ＧＦＰの発現：
種々の細胞系へのＦｕｇｕＬＣＫ構成体の形質移入研究から得られた結果を下記第２表に要約した。蛍光可視化法により、ＦｕｇｕＬＣＫプロモーターの２ｋｂ（図２）、４ｋｂ（図３）または６ｋｂ（図４）断片に結合したＧＦＰ配列は、ＪｕｒｋａＴ細胞系においてのみ発現することが明らかになった。
【００８６】
【表２】
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【００８７】
さらに、２ｋｂの配列から１３３０ｂｐの配列を除くことによって、ＦｕｇｕＬＣＫの９１４ｂｐ最小プロモーターを得た。この最小プロモーターに結合したＧＦＰ配列は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞系中で特異的かつ高濃度の発現を示し（図８）、これにより、この最小プロモーターがヒトＴ細胞において遺伝子発現を推進する能力を有することが分かった。
【００８８】
ＦｕｇｕＬＣＫコスミドを有するトランスジェニックマウス：
マウス卵子へ５２Ｃ１ＬＣＫコスミドを注入したところ、このコスミドを保有する７匹の独立した初代動物が発生した。そのうち、５匹は導入遺伝子の生殖細胞系の伝達を示した。これらの初代からのＦ１およびＦ２子孫をＲＴ−ＰＣＲによるＦｕｇｕＬＣＫ遺伝子の発現を評価するために使用した。分析結果を下記第３表に示した。ＦｕｇｕＬＣＫの発現はトランスジェニックマウスの血液、胸腺、脾臓、骨格筋、心臓および生殖腺（子宮および睾丸）中に見られた。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
ＦｕｇｕＬＣＫプロモーター駆動ＧＦＰ構成体を有するトランスジェニックマウス：
２ｋｂのＬＣＫプロモーター駆動ＧＦＰ構成体を注入したところ、生殖細胞系の伝達を示す２匹の初代が発生したが、４ｋｂのＬＣＫプロモーター駆動ＧＦＰ構成体の注入は６匹の初代トランスジェニック系列を産生し、そのうち３匹は生殖細胞系の伝達を示した。これらの初代を野生種ＦＶＢ／Ｎマウスと交尾させて産生されたＦ１およびＦ２を、ＧＦＰの発現パターンを分析するために使用した。
【００９１】
ノーザンブロット法にて分析された、トランスジェニックマウス中での４ｋｂＦｕｇｕＬＣＫプロモーターに結合したＧＦＰ発現の結果を図７に示した。４ｋｂのＬＣＫプロモーターは胸腺および睾丸では高濃度ＧＦＰ発現を誘導したが、脾臓では低濃度発現を誘導した。ノーザンブロット分析の結果は４ｋｂＦｕｇｕＬＣＫプロモーター配列が胸腺および睾丸においてのみ発現を誘導したことを示した（図７）。２ｋｂＬＣＫプロモーターは睾丸における発現に加えて胸腺で低濃度発現を誘導したが、脾臓では発現を示さなかった。
【００９２】
実施例３
ＦｕｇｕＬＣＫ最小プロモーター
２ｋｂのＦｕｇｕＬＣＫプロモーターのサブ領域の機能を特性化するために、欠失を研究した。このような研究は、Ｔ細胞中で特異的に遺伝子発現を駆動することができる最小調節配列を同定することを特に目的とする。遺伝子発現系で頻繁に遭遇する臨界的制限は、使用され得る組み合わされた調節遺伝子配列および構造遺伝子配列の最大長さであるので、このような最小調節配列を同定することは極めて望ましい。したがって、短縮された最小調節配列を同定することは、それに応じて増大した長さを有する構造遺伝子配列の発現を可能にする大きな利点をもたらす。
【００９３】
以下に説明するように、２ｋｂのＦｕｇｕＬＣＫプロモーターのうちから１３３０ｂｐを欠失したことによって得られた９１４ｂｐのＦｕｇｕ最小ＬＣＫプロモーター（配列番号２７）は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中で特異的かつ高濃度のレポーター遺伝子発現を指示することができた。
【００９４】
結果：
最小０．９ｋｂのＦｕｇｕＬＣＫプロモーター（配列番号２７）の調節制御下でのＥＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析により、Ｊｕｒｋａｔ細胞中で特異的かつ高濃度でレポーター遺伝子発現が生じていることが分かった。したがって、これらの結果はこの最小プロモーターが効率的かつ組織特異的非相同的遺伝子発現を駆動するために適していることを示している。それ故、これらの最小調節配列は、上で説明した２ｋｂの調節配列よりも優れた改良効果を示す。すなわち、この０．９ｋｂの最小ＦｕｇｕＬＣＫプロモーター（配列番号２７）は、これらが使用できる組み合わされた調節遺伝子配列および構造遺伝子配列の全長によって限定された遺伝子発現系において、２ｋｂのプロモーターによって発現され得るものよりも１．１ｋｂ長い遺伝子配列の発現を可能とする。さらに、そしてこのような限定に関係なく、所定の長さの遺伝子の発現のための短縮された調節配列の使用は、遺伝的に細胞を変性したとき生じる外来導入遺伝子のランダムゲノム挿入に起因する望ましくない遺伝的動揺を低下させることが予期される。
【００９５】
本発明を特定の実施態様に関連して説明したが、本発明を置換し、修正しおよび変更することは当業者には自明であろう。したがって、本発明の主題および請求項の広い範囲内に入るこのような置換、修正および変更の全てが本発明に包含される。全ての刊行物、特許、特許出願およびそれらに記載される配列および／または本明細書で言及されているＧｅｎＢａｎｋ寄託番号によって同定される配列は、個々の刊行物、特許、特許出願または配列それぞれが本願において援用されるのと同様、全体として本願において援用される。また、本願において引用している文献が、本発明に対する先行技術として利用できることを認めるものではない。
【図面の簡単な説明】
本発明の一例を図面を参照して説明する。図面を参照して詳細に説明するが、これは本発明の一例であり、かつ本発明の好ましい実施態様を説明するものであり、本発明の原理、概念を有用かつ容易に理解できるようにするために提供するものである。この点に関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上に詳細に説明することはしないが、上記説明と図面を参照することにより、本発明の他の形態を実施することは当業者に明らかであろう。
【図１】
ＦｕｇｕＬＣＫ４ｋｂプロモーター領域（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）を含む隣接６１ｋｂＤＮＡ断片を生成させる際に使用した２つのコスミッド（５２Ｃ１および８８Ａ８）間の重複を示す制限酵素地図である。
【図２】
プロモーターとしてＦｕｇｕＬＣＫ配列の２ｋｂ断片（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）を含む構成体から得たＪｕｒｋａｔＴ−細胞系中のＧＦＰ発現濃度を示す。
【図３】
プロモーターとしてＦｕｇｕＬＣＫ配列の４ｋｂ断片を含む構成体から得られたＪｕｒｋａＴ−細胞系中のＧＦＰ発現濃度を示す。蛍光は実施例の項で説明した方法により検出した。
【図４】
プロモーターとしてＦｕｇｕＬＣＫ配列の６ｋｂ断片（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）を含む構成体から得られたＪｕｒｋａｔＴ−細胞系中のＧＦＰ発現濃度を示す。蛍光は実施例の項で説明した方法により測定した。
【図５】
ＦｕｇｕＬｃｋプロモーターの異なった断片からＥＧＦＰを発現する構成体を形質移入されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＥＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。
【図６】
トランスジェニックマウスの２ｋｂまたは４ｋｂＦｕｇｕＬＣＫプロモーターから得られたＧＦＰ発現のＲＴ−ＰＣＲ定量化を示す。
【図７】
４ｋｂのＦｕｇｕｌｃｋプロモーターから得られたＥＧＦＰのトンスジェニックマウス発現を示すノーザンブロットである。
【図８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞中の２ｋｂ（ＦＬＣＫ２ｋｂ）および０．９ｋｂ（ＦＬＣＫ最小プロモーター）ＦｕｇｕＬＣＫプロモーターの調節制御下のＥＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。ＣＨＯ、２９３およびＪｕｒｋａｔ細胞中でＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ）の調節制御下に発現されたＥＧＦＰをポジティブコントロールとして使用した。
【国際公開パンフレット】
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