(57)【要約】オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含むエピトープ検出体を用いることによる、試料中の選択されたエピトープを発現する分子を検出するための方法、システムおよびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の選択されたエピトープを発現する分子を検出するための方法であって：
（ａ）試料中の選択されたエピトープを発現する分子を、選択された表面に固定化し；
（ｂ）表面と、エピトープ検出体とを接触させて、エピトープ検出体が、表面上の固定化された分子に結合するようにし；および
（ｃ）表面に結合したすべてのエピトープ検出体を検出し、ここで、結合したエピトープ検出体は、試料中の選択されたエピトープを発現する分子を示す
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
選択されたエピトープを発現する分子が、選択された表面に、選択されたエピトープに特異的な表面上のエピトープアンカーに結合することにより固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エピトープ検出体が、一般的なエピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出された分子が、翻訳後に修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのシステムであって：
（ａ）選択されたエピトープを発現する分子を固定化するか、または固定化することができる、選択された表面；および
（ｂ）選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含み、それが修飾されてオリゴヌクレオチドの付着を可能にする、エピトープ検出体
を含む、前記システム。
【請求項６】
さらに、分子を選択された表面に固定化するためのエピトープアンカーを含み、前記エピトープアンカーが、選択されたエピトープに特異的である、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
エピトープ検出体が、一般的なエピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのキットであって、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含むエピトープ検出体を含む、前記キット。
【請求項９】
さらに、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲが、オリゴヌクレオチドの付着のために修飾されている、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
エピトープ検出体が、一般的エピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
細胞生物学および医学における中心的な問題の１つは、タンパク質、脂質、糖および代謝物レベル、並びに、単一の生存細胞中でのこれらの修飾をモニターすることが不可能であることに関する。種々の技術が用いられて、これらの分子の検出の感受性が改善された。
【０００２】
例えば、極めて少ない量でタンパク質を検出することができるイムノアッセイの感受性を増大させるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が、慣用の免疫検出方法と組み合わされた（米国特許第５，６６５，５３９号）。イムノ−ＰＣＲと名付けられたこの技術は、タンパク質を検出する極めて感受性のある方法を提供する。イムノ−ＰＣＲにおいて、ＤＮＡおよび抗体に対する二重特異結合親和性を有するリンカー分子を用いて、抗原−抗体複合体に特異的にマーカーＤＮＡ分子を付着させ、従って特異的な抗原−抗体−ＤＮＡ接合体の形成がもたらされている。
【０００３】
付着したマーカーＤＮＡを、ＰＣＲにより、適切なプライマーを用いて増幅することができる。米国特許第５，６６５，５３９号に記載されているように、抗原を、マイクロタイタープレートの表面上に固定化し、その後イムノ−ＰＣＲにより検出する。この技術を用いて、アルカリホスファターゼ接合ＥＬＩＳＡに対し、感受性において約１０５の増大が得られた。イムノ−ＰＣＲの感受性の利点は、その後、マウス抗リポタンパク質ＩｇＧ（Ｒｕｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３ ２６０： ６９８−６９９）；ヒトプロトオンコジーンタンパク質（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９３ ２１： ６０３８−６０３９）；および腫瘍壊死因子アルファ（Ｓａｎｎａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９５ ９２： ２７２−２７５）についてのアッセイにおいて確認された。
【０００４】
しかし、本来のイムノ−ＰＣＲプロトコルは、ストレプトアビジン−プロテインＡキメラを用いて、抗原−抗体複合体を検出した。種々の群のＩｇＧに対するプロテインＡの親和性の変化により、広い範囲の抗原の検出における直接的な適用が制限される。ある改善されたプロトコルは、この問題を、ビオチン化された二次抗体または遊離のストレプトアビジンを導入することにより、解決することを試みた。
【０００５】
Ｊｏｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． １９９５ ４１（９）： １３７１−１３７７）は、二重らせんＤＮＡ標識が、抗体に直接付着することができ、従って接合体試薬を、アッセイ前に調製することが可能になることを例証した。
【０００６】
Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ． （Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５ ８６： ８８５−８８９）は、２種のモノクローナル抗体を用い、ここで、抗原をはさみ、特異的なＤＮＡ分子をマーカーとして用いる、二重決定因子（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｅｔｅｍｉｎａｎｔ）イムノポリメラーゼ連鎖反応（二重決定因子イムノ−ＰＣＲ）と呼ばれる方法を記載している。この方法において、循環抗原に結合する第１のモノクローナル抗体を、抗原自体の代わりに、固定化する。ビオチン化された第２のモノクローナル抗体を、抗原に結合させ、遊離のストレプトアビジンを用いて、ビオチン化されたＤＮＡを、第２のモノクローナル抗体に付着させる。抗原−抗体−ストレプトアビジンと複合した、ビオチン化されたＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅する。次に、生成物を、サザンブロット分析により分析する。
【０００７】
これらのイムノ−ＰＣＲ手法が、タンパク質検出の伝統的な方法にまさる利点、例えば感受性の増大を提供した一方、これらの使用に対していくつかの顕著な制限が尚存在する。イムノ−ＰＣＲの主要な制限の１つは、ＰＣＲ反応の非直線的増幅能力にある。シグナルの量と存在するタンパク質の量との間には、直接的な相関はない。従って、この手法は、定量的検出方法としては制限される。
【０００８】
米国特許第５，９２２，５５３号には、イムノ−ａＲＮＡと呼ばれる手法により、選択されたタンパク質のレベルを定量するための方法が開示されている。この方法において、選択されたタンパク質に標的された第１の抗体を、固体支持体に固定化する。次に、支持体を、選択されたタンパク質と接触させ、選択されたタンパク質が、第１の抗体に固定化されるようにする。次に、固体支持体を、選択されたタンパク質に標的された第２の抗体に共有結合した、ＲＮＡプロモーターにより駆動されたｃＤＮＡ配列と接触させて、第２の抗体が、結合した選択されたタンパク質に結合するようにする。選択されたタンパク質の量を、結合した第２の抗体に共有結合した、プロモーターにより駆動されたｃＤＮＡ配列のレベルを、増幅されたＲＮＡ手法により定量することにより、決定する。好ましい態様において、Ｔ７プロモーターにより駆動されたｃＤＮＡ配列を、第２の抗体に共有結合させる。
【０００９】
ここで、単鎖フラグメントおよび、環外ペプチドに基づいた相補性決定領域（ＣＤＲ）サブユニットを、このイムノ−ａＲＮＡ手法において用いることができることが見出された。さらに、ＰＣＲおよび増幅されたＲＮＡ手法を用いて、結合した単鎖フラグメントまたはＣＤＲサブユニットに共有結合した、プロモーターにより駆動されたｃＤＮＡ配列を定量することができる。すでに存在する大きい単鎖または環式ペプチドライブラリーと結合した、一層小さい抗体結合単位およびフラグメントを用いることおよびロボット工学的補助を用いることにより、この方法が、医学的および研究目的の両方のために広範囲に有用になる。さらに、単一の第３の検出体種を、二重らせんＤＮＡと結合させ、単鎖ＦｖまたはＣＤＲのいずれかに結合させ、検出を均一かつ簡単にすることができる。これを、本明細書において、普遍的検出体と呼ぶ。
【００１０】
発明の概説
本発明の目的は、試料中の選択されたエピトープを発現する分子を検出するための方法を提供することである。この方法において、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを、選択された表面に固定化する。エピトープアンカーは、単鎖Ｆｖフラグメント、ＣＤＲ、抗体または、選択されたエピトープと相互作用する他のリガンドペプチドもしくは化学物質もしくは医薬を含むことができる。次に、表面を、選択されたエピトープを発現する分子を含むことが疑われる試料と接触させて、分子が、固定化されたエピトープアンカーに結合するようにする。次に、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含むエピトープ検出体を用いて、すべての結合した分子を検出する。１つの態様において、単鎖ＦｖまたはＣＤＲを修飾して、オリゴヌクレオチドの単一の部位への付着を可能にした。あるいはまた、本発明の方法を、エピトープアンカーと共に実施することができる。この態様において、エピトープ検出体を用いて、表面に直接結合する分子を規定する。
【００１１】
本発明の他の目的は、選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのシステムを提供することである。本発明のこれらのシステムは、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカー、エピトープを固定化するか、または固定化することができる、選択された表面および、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含むエピトープ検出体を含む。１つの態様において、単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを修飾して、オリゴヌクレオチドの付着を可能にする。
【００１２】
本発明の尚他の目的は、選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのキットであって、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーおよび、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含むエピトープ検出体を含む、前記キットを提供することにある。１つの態様において、単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを修飾して、オリゴヌクレオチドの付着を可能にする。
【００１３】
発明の詳説
本発明は、選択された分子のレベルを定量するための改善された方法並びに、これらの改善された方法を実施するためのシステムおよびキットに関する。１つの態様において、この方法は、分子の選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを選択された表面に結合させることを含む。エピトープアンカーは、単鎖Ｆｖフラグメント、ＣＤＲ、抗体または、選択されたエピトープに特異的な他のリガンドペプチドもしくは化学物質を含むことができる。好ましい態様において、エピトープアンカーを、表面上の指定された箇所に結合させる。例えば、表面は、チップを含むことができ、エピトープアンカーは、チップの規定された箇所に結合する。１つの態様において、エピトープアンカーは、ピペッターまたは、単一の部位における適用を可能にする同様の装置の補助の下に、表面またはプレート上に堆積する。次に、結合したエピトープアンカーを有する表面を、選択されたエピトープを発現する分子を含むことが疑われる試料と接触させて、分子がエピトープアンカーに結合するようにする。他の態様において、分子を、エピトープアンカーを用いずに、表面に直接付着させる。
【００１４】
本発明の方法によりアッセイすることができる試料の例には、個別の細胞および、生物学的流体、例えば血清を含む溶液が含まれるが、これには限定されない。次に、表面上のすべての結合した分子に結合することができるエピトープ検出体を用いて、結合した分子の量を検出し、定量する。エピトープ検出体は、オリゴヌクレオチドを単一の部位において付着させることを可能にするように修飾された、選択されたエピトープに対する単鎖Ｆｖまたは束縛されたエピトープ特異的ＣＤＲを含む。
【００１５】
選択されたエピトープのためのＦｖフラグメントを、細胞中に、または微生物上に、組み換えＤＮＡ技術を用いることにより、得ることができる。例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ （Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８ ２４０： １０３８−１０４１）には、大腸菌中での機能的Ｆｖフラグメントの生成のための発現システムが記載されている。
【００１６】
抗体軽鎖または重鎖のみの可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを有する真核発現ベクターを有する真核ホスト細胞において、Ｆｖフラグメントを得るための方法もまた、記載されている（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８８ ２０３： ８２５−８２８）。Ｆｖフラグメントの鎖は、ホスト細胞により分泌され、正確に組み立てられて、完全に機能的なＦｖフラグメントが、培養上清液中に生成するようにされている。さらに、ＤＮＡコード配列を、この５’末端の方向に変化させて、アミノ末端が、オリゴヌクレオチドの共有結合に適する表面を有する１または２以上の残基を発現するようにすることができる。さらに、３’末端を変化させて、システイン残基が、各々の可変ドメインのＣ末端の方向に生成して、二量体中の可変ドメインがジスルフィド結合により一緒に連結されることを可能にするようにすることができる。また、これにより、Ｆｖフラグメントの組立が促進される。
【００１７】
あるいはまた、Ｆｖフラグメントを、第１の可変ドメインをコードする第１のＤＮＡ配列および第２の可変ドメインをコードする第２のＤＮＡ配列を有し、第１の配列および第２の配列が、接合ペプチド配列をコードする第３のＤＮＡ配列により結合されているベクターを用いることにより、安定化することができる。この場合において、接合ペプチド配列は、２つのポリペプチドを機能的な単鎖Ｆｖに折り畳むのを可能にするのに十分長く、可撓性である。好ましくは、ホスト細胞は、形質転換前に、抗体または軽鎖の全体を分泌しない骨髄腫細胞系である。このような細胞系は、十分知られており、広範囲に入手可能である（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８８ ２０３： ８２５−８２８）。
【００１８】
また、すべてのハプテンまたは化学的化合物に対するランダムなファージ技術を用いて、Ｆｖを選択することができると考えられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａ Ｌｔｄ． （Ｅｕｒｏｐｅ）， Ｗａｔｆｏｒｄ， 英国）。
【００１９】
ＣＤＲ技術は、十分知られており、米国特許第５，３３４，７０２号、米国特許第５，６６３，１４４号および米国特許第５，９１９，７６４号に記載されている。一般的に、ＣＤＲは、環状に束縛され、芳香族残基により修飾された６〜１５量体ペプチドを含む。本発明において用いるための配座的に束縛されたペプチドの設計における重要な段階は、活性のために重要な残基の描写である。これは、一般的に、先ず、最初の抗体またはレセプターまたは種々の長さのリガンドの生物活性なドメインからの１つの群の類似体を合成し、完全なおよび部分的な活性についての最小の鎖の長さを確立することにより、達成される。
【００２０】
最小の鎖の長さが確立された後に、各々の側鎖を、系統的に変化させて、電荷、立体的嵩、疎水性、芳香性およびキラリティーを各々の位置において決定することができる。多くの一連の類似体の特性の評価の後に、官能基を同定し、結合に伴う特徴を確認することが可能である。次に、種々の配座的に束縛された類似体を、発生させることができる。ペプチドを束縛するための種々の手段が、開発された。
【００２１】
１つの手段は、配座的に束縛されたアミノ酸を導入することを含む。Ｈｒｕｂｙ （Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． １９８２ ３１： １８９−１９９）は、本来的な配座的束縛を有する多数のアミノ酸およびジペプチドの合成、並びにこれらの生物学的に活性なペプチド中への導入を記載している。Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９５ ３５： １１−２０）はまた、α−炭素における水素原子をメチル基で置換して、ジアルキルアミノ酸を生成することによる、アミノ酸単位の配座を束縛する方法を記載している。米国特許第６，０２２，５２３号には、アミノ酸の配座的自由度を、Ｃ−αおよびＣ−β原子において二重結合を導入することにより制限する方法が記載されている。
【００２２】
ペプチドを束縛するための他の手段は、共有架橋の導入を含む。ペプチド主鎖を共有架橋の導入により束縛することにより、異常なアミノ酸を導入するよりも劇的な効果が得られる。大環化（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）は、しばしば、ペプチドＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮまたはＣ末端との間、または２つの側鎖の間にアミド結合を形成することにより、達成される。最初の発生のジアルコキシ−ベンジル結合剤である、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酢酸で誘導体化されたポリステリン樹脂上でのＦｍｏｃ／ｔ−ブチル固相手順により合成された、側面保護されたペプチドの頭尾環化は、Ｓｈｅｐｐａｒｄ， Ｒ． Ｃ． （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． １９８２ ２０： ４５１−４５４）により記載されている。
【００２３】
さらに、類似体結合剤である、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−酪酸（ＨＡＭＡ）は、最近、フラグメント縮合、およびこれらの高度に酸性感受性であるリンカーを用いたペプチドの固相合成において用いられた（ペプチドにおいて、Ｅ． ＧｉｒａｌｔおよびＤ． Ａｎｄｒｅｕ編、ＥＳＣＯＭ， Ｌｅｉｄｅｎ， オランダ国、１９９１， １３１−１３３）。Ｓｃｈｉｌｌｅｒにより記載されているエンケファリン類似体は、側鎖から主鎖への共有環化の例を提供し、ここで、Ｄ−ｌｙｓ残基のｅ−アミノ基の、ＬｅｕのＣ末端主鎖カルボン酸基への共有結合により、高い効力および顕著なμレセプター選択性を有する、環式１６員環類似体が得られる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． １９８５； ２５： １７１−１７７）。ＢＯＰ試薬およびカルボイミド／１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールの組み合わせはまた、環式ペプチドの形成において有用であると報告されている（Ｆｅｌｉｘ， Ａ． Ｍ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． １９８８ ３１：２３１−２３８）。Ｄｅｇｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．はまた、ｍ−アミノメチル安息香酸をリンカーとして用いて、ＧＰ　ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の生物学的に活性な環化されたペプチド類似体を開発した（米国特許第６，０２２，５２３号）。
【００２４】
ジスルフィドはまた、ある位置におけるシステインの導入による酸化により、生成することができる。例えば、Ｒｏｍａｎｉ， Ｓ． （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． １９８７ ２９： １０７−１１７）は、非対称ジスルフィドを、アゾジカルボン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの補助により構築することができることを例証した。Ｐｌｏｕｘ， Ｏ． （Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． １９８７ ２９： １６２−１６９）はまた、３Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基のチオール置換による、非対称ジスルフィドの生成のための方法を記載している。
【００２５】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、Ｔ７プロモーターにより駆動されたｃＤＮＡ配列を含み、従って、これを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅することができる。この態様において、二重らせんｃＤＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写のための鋳型として用いるために合成する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、このプロモーター部位が、二重らせんであることを必要とする。
【００２６】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドが付着するＦｖまたはＣＤＲ上の部位は、化学物質、例えばヘテロ二量体カップリング試薬からなるリンカーまたは他のリンカーの付着を可能にする、一連の残基を含む。これらの残基は、リンカー付着のための均一な結合部位を提供する。このリンカーは、この部位に付着し、またオリゴヌクレオチドをＦｖまたはＣＤＲに結合させる。オリゴヌクレオチドはまた、修飾されていないかまたは修飾されていることができる。例えば、増幅されたオリゴヌクレオチドの存在は、指針または蛍光標識したオリゴヌクレオチドを混合物中に導入し、エピトープ発現分子の迅速な半定量的評価を可能にすることにより、増強することができる（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅｕｒ． Ｊ． ２０００ ６（７）： １１０７−１１１１； Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８ ２６（９）： ２１５０−２１５５）。
【００２７】
結合したエピトープ検出体を、方法、例えば慣用のＰＣＲまたはａＲＮＡ手法による増幅により定量することができる。用いる検出方法がイムノａＲＮＡである場合には、二重らせんオリゴヌクレオチドを、エピトープ検出体において用いる。この例において、ａＲＮＡを、特定のプロモーターを認識するポリメラーゼ、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、未標識リボヌクレオチドおよび蛍光的に標識されたリボヌクレオチドを用いて、固体支持体上に転写する。
【００２８】
種々の手段が、エピトープ検出体の増幅された生成物の検出のために有用である。１つの態様において、ａＲＮＡを、例えば放射活性標識または蛍光標識で検出可能に標識する。あるいはまた、ａＲＮＡを、ｃＤＮＡに転化し、方法、例えばゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ハイブリッド形成アッセイ、免疫組織化学的アッセイおよび／または特異的に結合するタンパク質アッセイにより、検出することができる。
【００２９】
ＦｖおよびＣＤＲペプチドをエピトープ検出体として用いることにより、この方法が、米国特許第５，９２２，５５３号のイムノ−ａＲＮＡ手法により同定することができるよりも大きいポリペプチドの同定において、および上清液、流体、細胞もしくは細菌の抽出物またはすべての他の真核生物におけるモチーフの同定において、有用になる。従って、本発明の方法は、医学的および研究目的の両方において、広範囲の適用可能性を有する。さらに、本発明の方法は、現在入手可能な方法よりも感受性が高く、定量的結果を提供する。
【００３０】
本発明の方法において選択された分子のエピトープ検出体として作用する、ＦｖおよびＣＤＲペプチドの能力を、ｐ１８５レセプターについて例証した。この方法を用いて、放出されたｐ１８５レセプターを、ＥＬＩＳＡに対し感受性において１０８倍の増大、およびウエスタン−ＥＣＬ方法に対し約１０００倍の増大で検出した。これらの実験のために、７．１６．４の単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）構造物（７．１６．４ＳｃＦｖと表示する）を、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＆ Ｇｒｅｅｎｅ （ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ １７（１２）： １０３１−１０４０）により概説された手順に従って生成し、ここで、重鎖および軽鎖領域のＦｖ領域は、（ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）５リンカーにより接合された。ＳｃＦｖ７．１６．４が、ポリヒスチジンタグを含んでいたため、これを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製した。精製の後に、７．１６．４ＳｃＦｖの結合を、Ｂ１０４−１−１細胞に対するＦＡＣＳ分析により、直接結合およびモノクローナル抗体７．１６．４に対する競合的結合の両方において確認した。
【００３１】
抗ヒトｐ１８５抗体４Ｄ５のＣＤＲ３．Ｈ領域から設計された、束縛された環外ペプチドである、ＡＨＮＰもまた、用いた。ＡＨＮＰは、ｐ１８５に結合し、４Ｄ５の成長阻害効果を模擬する（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０００ １８： １９４−１９８）。
【００３２】
ＳｃＦｖ７．１６．４とＡＨＮＰとの両方を、二重らせんオリゴヌクレオチド（ｄｓ−オリゴ）に結合させて、エピトープ検出体を形成した。ｄｓ−オリゴが結合した７．１６．４ＳｃＦｖおよびＡＨＮＰの両方は、これらの抗原、それぞれＢ１０４−１−１細胞からのラットｐ１８５ｎｅｕおよびＴ６−１７細胞からのヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕを検出することが可能であった。さらに、ｄｓ−オリゴと接合して、エピトープ検出体を形成することにより、プラスモン共鳴分析により決定して、ＣＤＲ検出分子のこれらの抗原との結合親和性は、変化しなかった。７．１６．４ＳｃＦｖおよびｍＡｂ７．１６．４が、ｐ１８５レセプターに対して同等の結合親和性を有するため、これらを、このアッセイにおいて同等のモル濃度において用いた。しかし、親和性が、４Ｄ５よりも、ｐ１８５Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対して低いため、ＡＨＮＰを、一層高い濃度で用いた。
【００３３】
ｄｓ−オリゴをＣＤＲまたは単鎖Ｆｖに直接カップリングさせることは、特に目的が、質量スクリーニングプロテオミクスアッセイにおいて、数百または数千の抗原を検出することである場合には、時間を消費する手順であり得る。さらに、カップリング能力の変化は、増幅結果の解釈を複雑にし得る。従って、本発明の好ましい態様において、ＦｖまたはＣＤＲは、一般的な、またはユニバーサルエピトープ、例えばヘマグルチニンＨＡタグまたはポリヒスチジンタグを含む。一般的な、またはユニバーサルエピトープの例は、最初はタンパク質の精製のために設計された７．１６．４ＳｃＦｖにおけるポリ−Ｈｉｓ−タグである。次に、単一のモノクローナル抗体またはｄｓ−ＤＮＡと結合した単鎖Ｆｖを用いて、一般的なエピトープに結合させて、ユニバーサルエピトープ検出体を作成する。
【００３４】
本発明の方法におけるユニバーサルエピトープ検出体の能力は、７．１６．４ＳｃＦｖにおけるポリ−Ｈｉｓ−タグを用いて例証された。これらの実験において、ｐ１８５レセプターを、プレート上に塗布したＡ１１により捕集し、遊離の７．１６．４ＳｃＦｖを加え、続いて、長時間洗浄し、次にｄｓ−オリゴと接合した抗Ｈｉｓ抗体と共にインキュベートした。Ｔ７ポリメラーゼ増幅の後に、細胞の１０−６希釈の可溶化液からの特異的なバンドを検出した。従って、この感受性は、ユニバーサルエピトープ検出体を有しない基本的なプロトコルを用いて見られる感受性よりも、さらに高かった。
【００３５】
本発明の方法はまた、翻訳後修飾の検出において有用である。ＰＣＲおよびａＲＮＡ手法を、最初に開発して、ＤＮＡレベルにおける標的遺伝子の活性を検出した。これらの方法は、専ら、時々ハイブリッド形成と組み合わせて、ゲノム研究の用途において採用された。感受性にかかわらず、これらの方法は、タンパク質レベルにおける翻訳後修飾を検出することはできない。しかし、このような事象のモニタリングは、リン酸化およびグリコシル化を含むが、これらには限定されない多くの修飾が、タンパク質の機能的な状態に関連するため、極めて重要である。
【００３６】
従って、実験を実施して、本発明の方法の、ＥＧＦ処理により誘発されたｐ１８５レセプターのリン酸化を検出する能力を例証した。シグナル形成モデルを確立し、ここで、ＥＧＦ刺激により、ＥＧＦＲは、ｐ１８５とヘテロ二量体化し、これをトランス活性化し（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｅ）、ｐ１８５レセプター上のチロシン残基のリン酸化がもたらされる（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９４ ９１： １５００−１５０４）。ＥＧＦＲおよびｐ１８５ｅｒｂＢ２を過剰発現するＡ４３１細胞系を、これらの実験において用いた。ＥＧＦ刺激の後に、細胞可溶化液中のｐ１８５レセプターを、１Ｅ１により捕集し、モノクローナル抗体を、ｐ１８５ｅｒＢ２／ｎｅｕに対して発生させた。抗リン酸化Ｔｙｒ抗体のＩｇＧ２ｂタイプである、ＰＹ９９を用いて、リン酸化されたレセプターを検出した。
【００３７】
第２の抗体である、ｄｓ−オリゴと結合した抗ＩｇＧ２ｂを用いて、抗原−抗体サンドイッチ複合体を探索した。ＥＧＦで刺激したＡ４３１細胞は、正のバンドを形成し、これは、ＥＧＦ処理を施さない細胞においては、観察されなかった。しかし、Ｔ６−１７細胞はまた、正のバンドを示し、ｐ１８５レセプター上の構成的ホスホチロシンを示した。これらのデータは、この方法が、タンパク質の機能的な状態を、この修飾を分析することにより検出することが可能であることを示す。また、ｄｓ−オリゴに結合したＦｖまたはＣＤＲを含むエピトープ検出体を用いて、タンパク質の機能的な状態を検出することができる。
【００３８】
従って、本発明は、イムノ−ＰＣＲ手法の非定量的な性質についての懸念を解消し、プロテオミクスの分野における極めて大きい可能性を提供する、感受性のある検出方法を提供する。特異的なプロモーターを認識するポリメラーゼ、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼおよび増幅段階における特異的プロモーターを用いることにより、この方法に従って実施されるアッセイは、生物学的および医学的アッセイに関連する直線状の増幅および正確な定量を有する。検出の感受性に影響する因子の数もまた、減少した。抗原と、これらのＦｖまたは１価のＣＤＲとの間の特異的な結合は、この方法の唯一の臨界的に重要なパラメーターである。
【００３９】
ユニバーサルエピトープ検出体を提供する能力により、本発明の方法に、多数の追加の利点が付与される。先ず、すべての細胞抗原を、先ずモノクローナル抗体をｄｓ−オリゴに結合させずに検出することができる。ユニバーサルプローブを用いないと、この方法は、１種または数種の特定の抗原を一度に観察するのに有用であるに過ぎない。他方、ユニバーサルプローブにより、有用なＦｖまたはＣＤＲを有するすべての細胞状または流体存在抗原の検出が可能である。さらに、プロトコルをわずかに変更して、種々の大きさのオリゴヌクレオチドが、エピトープ検出体のＦｖまたはＣＤＲに付着する際には、種々のタンパク質を、単一の電気泳動レーンにおいて同時に検出することができる。従って、本明細書中に例証するように、本発明の方法は、タンパク質抗原の同定並びに、検出の単一の細胞レベルでの、ポリペプチドおよび他の構造物、例えば糖または脂質の翻訳後修飾に適用可能な、多用途の手法を提供する。
【００４０】
この方法はまた、タンパク質相互作用の分析および小さい分子の検出に有用であると考えられる。例えば、リガンドペプチドを、組織試料に対するエピトープ検出体として用いて、特定のレセプターの発現を同定することができ、またその逆もできる。有用なＦｖ、ＣＤＲまたは結合タンパク質を用いて、小さい分子、例えばトキシンまたは薬剤代謝物を、水、食物および体液を含むが、これらには限定されないすべての溶液において検出することができる。
【００４１】
最初のイムノ−ＰＣＲは、アッセイにおいて純粋な抗原を用いた。イムノ−ＰＣＲの後の反復は、混合された抗原を試験したが（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９５ ２３（３）： ５２２−５２９）、ＥＬＩＳＡよりも２〜３桁高い感受性を示したに過ぎない。極めて大きい種々の非特異的抗原を含む背景を有する実在のアッセイにおいて、感受性は、常に、アッセイの特異性により制限される。ＦｖまたはＣＤＲフラグメントにより結合したエピトープは、比較的大きいポリペプチドを同定すると予測され、これを用いて、上清液、流体、細胞もしくは細菌の抽出物またはすべての他の真核生物におけるモチーフを同定することができる。さらに、ポリペプチド、有機分子または糖構造の実際の同一性を、いくつかのエピトープのＦｖによる結合をガイドとして用いて、データベースのコンピューターにより補助された分析により、決定することができる。
【００４２】
例えば、Ｆｖ　ａ、ｄ、ｅおよびｆによる結合により、側鎖ａ、ｄ、ｅおよびｆを有するものとして糖分子が同定され、従って、これらの同一の側鎖を有する等の族に属する。このようにして、本発明により、細胞中の、すべてではないとしても、多くの分子の定義および同定が、すべての１の特定の時点において可能である。さらに、この方法を用いて、活性細胞または細胞上清液において翻訳された代替の転写形態を同定することができる。この手順は、１）非放射活性検出方法での使用、２）微小化された（ｍｉｃｒｏｔｉｚｅｄ）液体取り扱い手順、３）低い試料体積検出、例えば「タンパク質チップ」分析および４）自動化の影響を容易に受ける。
【００４３】
以下の限定的でない例を提供して、本発明をさらに例示する。
例
例１：材料
用いた抗体は、ｍＡｂｓ７．１６．４およびＡ１１を含み、これらの各々は、ｐ１８５ｎｅｕの細胞外ドメイン中の異なるエピトープと反応性である。ｐ１８５ｎｅｕの細胞内ドメインに対して向けられた、ポリクローナル抗血清、α−Ｂａｃｎｅｕを、ウエスタンブロッティングのために用いた。１Ｅ１は、ヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕの外部ドメインに対して発生したＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ｒｈｕＭＡｂ　４Ｄ５（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから得た。
【００４４】
抗ホスホチロシンモノクローナル抗体ＰＹ９９を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）から得た。細胞系Ｂ１０４−１−１を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から、ラットオンコジーンｐ１８５ｎｅｕを発現させることにより、誘導した。Ｂ１０４−１−１細胞中のｐ１８５ｎｅｕの発現レベルを、１２５Ｉで標識した抗ｎｅｕ　ｍＡｂ結合アッセイを用いて決定した。ＥＧＦＲおよびｐ１８５ｎｅｕの両方に陰性のＮＲ６は、ＮＩＨ３Ｔ３からのサブクローンであった。Ｔ６−１７を、ＮＩＨ３Ｔ３から、ヒトｐ１８５ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターを過剰発現させることにより、誘導した。これらの細胞系を、すべて、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃において５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。
【００４５】
例２：免疫ブロット手順
１０ｃｍディッシュ中のサブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＩ／ＲＩＰＡ（１％のトライトンＸ−１００、１％のデオキシコール酸塩、０．１％のＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１％のアプロチニン、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、４００ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムおよび１０ｎＭのヨードアセトアミド緩衝液）で可溶化した。タンパク質を、適切な濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｂｉｎｄ， ＭＳＩ）に移送した。膜を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％脱脂乳および５％ヤギ血清）と共に一晩インキュベートした。免疫ブロット（ウエスタンブロット）分析のために、抗体を、０．１％脱脂乳および１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した。すべてのポリクローナル血清および二次的ＨＲＰ共役抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、１：５０００の希釈において用いた。バンドを、ＥＣＬアッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化した。
【００４６】
例３：Ｈｉｓタグ７．１６．４の発現および精製
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１５０ｍｌ）に、１５ｍｌの大腸菌ＤＨ５αの一晩の培養物を接種し、０．５の光学密度（６００ｎｍ）が得られるまで、３０℃に維持した。イソプロピル−β−（−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの最終濃度において加えて、Ｈｉｓタグ７．１６．４ＳｃＦｖを誘発した。３時間後、細胞を収穫し、凍結および融解することにより溶解し、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μＭのペプスタチンＡおよび２μＭのロイペプチンを捕捉した１０ｍｌの尿素溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ、８Ｍの尿素）中に再懸濁した。
【００４７】
不溶性の細胞残骸を、遠心分離（１２，０００×ｇで１５分間、続いて１２，０００×ｇで３０分間）により除去した。透明にした上清液を、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースと混合し、続いて、氷上で１時間温和に振盪した。混合物を、空のカラム中に装入し、結合していないタンパク質を、４℃で尿素溶解緩衝液（ｐＨ６．３）で洗浄した。Ｈｉｓタグタンパク質を、尿素溶解緩衝液（ｐＨ４．５）で溶離し、溶離フラクションを、例４に記載するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦＡＣＳ分析により試験した。ピークフラクションにおけるタンパク質をプールし、ＴＫＣ緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）に対して透析した。
【００４８】
例４：ＦＡＣＳ分析による７．１６．４ＳｃＦｖ結合の確認
細胞表面抗原を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出した。Ｂ１０４−１−１細胞（約５×１０５）を、精製した７．１６．４ＳｃＦｖを含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中で、インキュベートした（４℃で３０分間）。次に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、抗Ｈｉｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした（３０分、４℃）。この第２のインキュベーションの後に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で再び洗浄し、さらに、マウス免疫グロブリンに対してＦＩＴＣ標識したＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と共にインキュベートした。
【００４９】
ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞ペレットを、ＰＢＳ緩衝液中に懸濁させ、ＦＡＣＳ走査フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による分析のために加工した。各々の試料について、１０，０００個の生存可能な細胞を、大きさ（前方向散乱、ＦＳＣ）および粒度（側面散乱、ＳＳＣ）パラメーターに続いてゲートし、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。競合的結合のために、Ｂ１０４−１−１細胞を、先ず、種々の濃度の７．１６．４ＳｃＦｖの存在下で、モノクローナル抗体７．１６．４と共にインキュベートした。次に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、マウス免疫グロブリンに対してＦＩＴＣ標識したＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）と共にさらにインキュベートし、次にフローサイトメーター上で分析した。
【００５０】
例５：ｄｓ−ｃＤＮＡの抗体またはＦｖまたはＣＤＲへの付着
以下の配列
【外１】
2004506880.tif 000002
を有するｃＤＮＡオリゴヌクレオチドを、５’末端において活性化可能なアミンと共に設計して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素活性によりｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を導くために用いられる、一級アミンおよびＴ７プロモーター部位
【外２】
2004506880.tif 000003
への共有結合を可能にする。１μｇの抗体を３０μｇのｄｓ　ｃＤＮＡに、または１μｇのＣＤＲを０．１μｇのｄｓ　ｃＤＮＡに、または１μｇのＳｃＦｖを３μｇのｄｓ　ｃＤＮＡに付着させるために、等しい容量の０．１％のグルタルアルデヒドを、１０μｌのアリコート中に加えた。溶液を、回転装置上で３時間、室温で混合した。次に、エタノールアミン（１Ｍ；１／２０容積；ｐＨ７．５）を加えた。溶液を、さらに２時間、室温で混合した。タンパク質−ＤＮＡ複合体を、４℃で貯蔵した。
【００５１】
例６：ＲＮＡ増幅
ＲＮＡ増幅を、第１のＡｂ−抗原複合体を含む９６ウェルプレート中で実施した。以下の試薬を加えた：１Ｘ　ＲＮＡ増幅緩衝液（４０ｍＭのトリス−塩基、ｐＨ７．５、７ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのスペルミジン；５ｍＭのＤＴＴ；２５０μＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ；５μＭのＣＴＰ；０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ；１０００ＵのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼおよび３μｌのＰ３２−ＣＴＰ）。次に、この溶液を、４時間３７℃でインキュベートした。ＲＮＡ生成物を、ウェルから除去し、３μｌを、３μｌの反応停止溶液（９５％のホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のブロモフェノールブルー、０．１％のキシレンシアノール）に加え、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）スクリーンに５〜６０分間並べ、１００ｕＭの解像度でホスホイメージャー上で現像した。
【００５２】
例７：対照方法としての標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ， ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ）を、１Ｅ１（ヒトｐ１８５の細胞外ドメインに対して向けられたモノクローナル抗体）で、１００μｌの被覆緩衝液（抗体濃度：５μｇ／ｍｌ）と共に、４℃で一晩インキュベーティングプレートにより被覆した。次に、プレートを、０．２％のトウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ；２００μｌ／ウェル）を含むＰＢＳで３回洗浄し、０．５％のＰＢＳおよび０．２％のトウィーン２０（２００μｌ／ウェル）を含むＰＢＳで１時間室温でブロッキングし、再びＰＢＳ−Ｔ（２００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。平行して、Ｔ６−１７細胞可溶化液の連続希釈１００μｌを、プレートに加え、２時間室温でインキュベートした。
【００５３】
このインキュベーション段階の後に、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ（６回、２００μｌ／ウェル）で洗浄し、ヒト化抗ｐ１８５Ｈｅｒ２抗体４Ｄ５（１５０ｎｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）と共に２時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを、６回洗浄し、５０μｌの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ；最終的な希釈：１：１０，０００）でさらに２時間、室温でインキュベートした。酵素反応を、室温で、ＴＭＢ（各々０．１Ｍのリン酸−クエン酸緩衝液中で２．５ｍＭ、ｐＨ５．０）（１００μｌの各々の試薬／ウェル）を加えることにより、実施した。反応を、１５〜６０分後に、５０μｌの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより、停止した。発色を、ＥＬＩＳＡ読みとり機を用いて、４５０ｎｍにおいて測定した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004506880.tif 000027
2004506880.tif 000028