(57)【要約】本発明は、抗ＣＤ１５４抗体と複合体化した、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）の組成物および結晶に関する。さらに、本発明は、Ｘ線結晶学によって得られる場合の、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体の、高分解能構造に関する。具体的には、この構造は、本明細書中で決定される構造座標によって規定される結合部位を提供する。本発明はまた、機械読取り可能データ記憶媒体を備える、コンピュータ（機械）に関する。このデータ記憶媒体は、本発明によって提供される構造座標を含む、機械読取り可能データで符号化された、データ記憶材料を含む。このコンピュータは、本発明によって提供される構造座標に基づいて、この機械読取り可能データを、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体の分子複合体の三次元表現へと処理するための命令を有する。
2004517814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ１５４抗体または該抗体の抗原結合フラグメントと複合体形成したＣＤ１５４ポリペプチドを含有する、結晶化可能組成物。
【請求項２】
前記抗ＣＤ１５４抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項３】
前記ＣＤ１５４ポリペプチドが、ＣＤ１５４の細胞外ドメインを含むポリペプチドである、請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項４】
前記ＣＤ１５４ポリペプチドが、ＣＤ１５４のアミノ酸１１６〜アミノ酸２６１からなるポリペプチドを含む、請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項５】
前記抗ＣＤ１５４抗体が、５ｃ８抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体であり、該５ｃ８抗原は、（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）モノクローナル抗体５ｃ８によって特異的に結合される、請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項６】
前記フラグメントがＦａｂフラグメントである、請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項７】
前記Ｆａｂフラグメントが、（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）モノクローナル抗体５ｃ８またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントである、請求項６に記載の結晶化可能組成物。
【請求項８】
ＣＤ１５４ポリペプチドの三量体と、３つの抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体または３つの該抗体の抗原結合フラグメントとを含有する、結晶化可能組成物であって、該ポリペプチドの各々が、ＣＤ１５４の細胞外ドメインを含む、結晶化可能組成物。
【請求項９】
抗ＣＤ１５４抗体または該抗体の抗原結合フラグメントと複合体形成した、ＣＤ１５４ポリペプチドを含有する、結晶。
【請求項１０】
前記ＣＤ１５４ポリペプチドが、ＣＤ１５４ポリペプチドの細胞外ドメインを含む、請求項９に記載の結晶。
【請求項１１】
前記ＣＤ１５４ポリペプチドが、ＣＤ１５４のアミノ酸１１６〜アミノ酸２６１からなるポリペプチドを含む、請求項９に記載の結晶。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ１５４抗体が、モノクローナル抗体である、請求項９に記載の結晶。
【請求項１３】
前記抗ＣＤ１５４抗体が、５ｃ８抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体であり、該５ｃ８抗原は、（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）モノクローナル抗体５ｃ８によって特異的に結合される、請求項９に記載の結晶。
【請求項１４】
前記フラグメントがＦａｂフラグメントである、請求項９に記載の結晶。
【請求項１５】
前記Ｆａｂフラグメントが、（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）モノクローナル抗体５ｃ８のＦａｂフラグメントまたはヒト化５ｃ８モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントである、請求項１４に記載の結晶。
【請求項１６】
ＣＤ１５４ポリペプチドの三量体と、３つの抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体または３つの該抗体の抗原結合フラグメントとを含有する、結晶であって、該ポリペプチドの各々が、ＣＤ１５４の細胞外ドメインを含む、結晶。
【請求項１７】
ａ）図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標により規定される第１の結合部位を含む、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
の三次元表現を作成するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
（ｉ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；および
（ｉｉ）該機械読取り可能データを該三次元表現へと処理するための命令；
を備える、コンピュータ。
【請求項１８】
前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項１７に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項１９】
前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項１７に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項２０】
前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項２１】
前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項２２】
ａ）図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標により規定される第１の結合部位を含む、分子複合体であって、該第１の結合部位は、図４に従う１つ以上の抗ＣＤ１５４抗体の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３、ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６と結合する、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、該ＣＤ１５４のアミノ酸の骨格原子および該１つ以上の抗ＣＤ１５４アミノ酸からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
の三次元表現を作成するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
（ｉ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標、ならびに図４に従う抗ＣＤ１５４抗体の１つ以上の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の１つ以上の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６の構造座標を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；および
（ｉｉ）該機械読取り可能データを該三次元表現へと処理するための命令；
を備える、コンピュータ。
【請求項２３】
前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項２２に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項２４】
前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項２２に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項２５】
前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項２６】
前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項２７】
ａ）図４に従う抗ＣＤ１５４抗体の１つ以上の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の１つ以上の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６の構造座標により規定される、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
の三次元表現を作成するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
（ｉ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４に従う抗ＣＤ１５４抗体の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３、ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６の構造座標を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；および
（ｉｉ）該機械読取り可能データを該三次元表現へと処理するための命令；
を備える、コンピュータ。
【請求項２８】
前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項２７に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項２９】
前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項２７に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項３０】
ａ）図４記載のＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体のアミノ酸の全ての構造座標の少なくとも一部によって規定される、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
の三次元表現を作成するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
（ｉ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４記載のＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体のアミノ酸の全ての構造座標の少なくとも一部を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；および
（ｉｉ）該機械読取り可能データを該三次元表現へと処理するための命令；
を備える、コンピュータ。
【請求項３１】
前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項３０に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項３２】
前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、請求項３０に記載の、三次元表現を作成するためのコンピュータ。
【請求項３３】
分子複合体から得られたＸ線回折データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
ａ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４記載のＣＤ１５４または抗ＣＤ１５４抗体の構造座標の少なくとも一部を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；
ｂ）機械読取り可能データで符号化されたデータ記憶材料を含む、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、該分子複合体から得られたＸ線回折データを含む、機械読取り可能データ記憶媒体；ならびに
ｃ）（ａ）の機械読取り可能データのフーリエ変換を実行するため、および（ｂ）の機械読取り可能データを構造座標へと処理するための、命令、
を備える、コンピュータ。
【請求項３４】
前記構造座標を表示するためのディスプレイをさらに備える、請求項１７〜１９、２２〜２４、または２７〜３３のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項３５】
前記構造座標を表示するためのディスプレイをさらに備える、請求項２０に記載のコンピュータ。
【請求項３６】
請求項２１に記載のコンピュータであって、前記構造座標を表示するためのディスプレイをさらに備える、コンピュータ。
【請求項３７】
請求項２５に記載のコンピュータであって、前記構造座標を表示するためのディスプレイをさらに備える、コンピュータ。
【請求項３８】
請求項２６に記載のコンピュータであって、前記構造座標を表示するためのディスプレイをさらに備える、コンピュータ。
【請求項３９】
化学実体が以下：
ａ）図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標により規定される第１の結合部位を含む、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
に結合する能力を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該化学実体と、該分子複合体の該第１の結合部位または該分子複合体の該ホモログの該第２の結合部位との間の当てはめ操作を実施するために計算機手段を使用する工程；および
（ｉｉ）該化学実体と、該第１の結合部位または該第２の結合部位との間の結合を定量するために、該当てはめ操作の結果を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、前記ホモログが、第２の結合部位を有し、該第２の結合部位は、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項４３】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項４４】
化学実体が以下：
ａ）図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標により規定される第１の結合部位を含む、分子複合体であって、該第１の結合部位は、図４に従う１つ以上の抗ＣＤ１５４抗体の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３、ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６と結合する、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、該ＣＤ１５４のアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
に結合する能力を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該化学実体と、該第１の結合部位または該第２の結合部位との間の当てはめ操作を実施するために計算機手段を使用する工程；および
（ｉｉ）該化学実体と、該第１の結合部位または該第２の結合部位との間の結合を定量するために、該当てはめ操作の結果を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記ＣＤ１５４のアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法であって、前記ホモログが、第２の結合部位を含み、該第２の結合部位は、前記ＣＤ１５４のアミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項４７】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項４８】
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項４９】
化学実体が以下：
ａ）図４に示されるＣＤ１５４のアミノ酸および抗ＣＤ１５４抗体のアミノ酸すべての構造座標の少なくとも一部により規定される、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、該ホモログは、該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、ホモログ；
に結合する能力を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該化学実体と、該分子複合体の該第１の結合部位または該分子複合体の該ホモログの該第２の結合部位との間の当てはめ操作を実施するために計算機手段を使用する工程；および
（ｉｉ）該化学実体と、該第１の結合部位または該第２の結合部位との間の結合を定量するために、該当てはめ操作の結果を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．００Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、前記ホモログが、前記アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと０．５０Åとの間の平方自乗平均偏差を有する、方法。
【請求項５２】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法であって、前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項５３】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法であって、前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項５４】
請求項３９〜５３のいずれか１項に記載の方法によって同定される、化学実体。
【請求項５５】
請求項５４に記載の化学実体１つ以上から構成される、化合物。
【請求項５６】
ＣＤ１５４の潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）（図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標）±（該アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差）を使用して、結合部位を含む分子複合体の三次元構造を作成する工程；
ｂ）該三次元構造を使用して、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；
ｃ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに
ｄ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストをＣＤ１５４と接触させて、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストがＣＤ１５４に結合する能力を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、前記アミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと１．００Åとの間である、方法。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法であって、前記アミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと０．５０Åとの間である、方法。
【請求項５９】
請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法であって、前記結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項６０】
ＣＤ１５４の潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）（図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標）±（該ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差）を使用して、結合部位を含む分子複合体の三次元構造を作成する工程であって、該ＣＤ１５４のアミノ酸は、図４に従う１つ以上の抗ＣＤ１５４抗体の重鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３、ならびに該抗ＣＤ１５４抗体の軽鎖アミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５、およびＴｒｐ９６と結合する、工程；
ｂ）該三次元構造を使用して、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；
ｃ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに
ｄ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストをＣＤ１５４と接触させて、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストがＣＤ１５４に結合する能力を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、前記ＣＤ１５４のアミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと１．００Åとの間である、方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、前記ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと０．５０Åとの間である、方法。
【請求項６３】
請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法であって、前記結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントの改変体のための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項６４】
ＣＤ１５４の潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）（図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸および抗ＣＤ１５４抗体のアミノ酸すべての構造座標）±（該ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの、０．００Åと１．５０Åとの間の平方自乗平均偏差）の少なくとも一部を使用して、結合部位を含む分子複合体の三次元構造を作成する工程；
ｂ）該三次元構造を使用して、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを設計または選択する工程；
ｃ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストを合成する工程；ならびに
ｄ）該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストをＣＤ１５４と接触させて、該潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストがＣＤ１５４に結合する能力を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法であって、前記アミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと１．００Åとの間である、方法。
【請求項６６】
請求項６４に記載の方法であって、前記アミノ酸の骨格原子からの前記平方自乗平均偏差が、０．００Åと０．５０Åとの間である、方法。
【請求項６７】
請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法であって、前記結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生される）のための結合部位であるか、もしくは５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントの改変体のための結合部位であるか、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのための結合部位であるか、もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの抗原結合フラグメントのための結合部位である、方法。
【請求項６８】
請求項５６〜５８、６０〜６２、または６４〜６６のいずれか１項に記載の方法であって、以下の工程：
（ｅ）前記潜在的アンタゴニストがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨げるか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項６９】
請求項５９に記載の方法であって、以下の工程：
（ｅ）前記潜在的アンタゴニストがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨げるか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項７０】
請求項６３に記載の方法であって、以下の工程：
（ｅ）前記潜在的アンタゴニストがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨げるか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項７１】
請求項６７に記載の方法であって、以下の工程：
（ｅ）前記潜在的アンタゴニストがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨げるか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項７２】
請求項５７〜７１のいずれか１項に記載の方法によって同定される、ＣＤ１５４の潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項７３】
モノクローナル抗体５ｃ８の改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体が、以下：
ａ）図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標によって規定される第１の結合部位を含む、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、０．００Åと１．５０Åとの間の該アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する第２の結合部位を含む、ホモログ、
と会合する能力を評価するための方法であって、以下：
（ｉ）計算機手段を使用して、該改変体と該第１の結合部位または第２の結合部位との間の当てはめ操作を行う工程；および
（ｉｉ）該当てはめ操作の結果を分析して、該改変体と該第１の結合部位または第２の結合部位との間の会合を定量化する工程、
を包含する、方法。
【請求項７４】
前記ホモログが、０．００Åと１．００Åとの間の前記アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ホモログが、０．００Åと０．５０Åとの間の前記アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
モノクローナル抗体５ｃ８の改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体が、以下：
ａ）図４に従う抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６の１以上と会合する、図４に従うＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標によって規定される第１の結合部位を含む、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、０．００Åと１．５０Åとの間の該ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する第２の結合部位を含む、ホモログ、
と会合する能力を評価するための方法であって、以下：
（ｉ）計算機手段を使用して、該改変体と該第１の結合部位または第２の結合部位との間の当てはめ操作を行う工程；および
（ｉｉ）該当てはめ操作の結果を分析して、該改変体と該第１の結合部位または第２の結合部位との間の会合を定量化する工程、
を包含する、方法。
【請求項７９】
前記ホモログが、０．００Åと１．００Åとの間の前記ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ホモログが、０．００Åと０．５０Åとの間の前記ＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
モノクローナル抗体５ｃ８の改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、またはその抗原結合フラグメントの改変体が、以下：
ａ）図４に示されるＣＤ１５４アミノ酸および抗ＣＤ１５４抗体アミノ酸の全ての構造座標の少なくとも一部によって規定される、分子複合体；または
ｂ）該分子複合体のホモログであって、０．００Åと１．５０Åとの間の該アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、ホモログ、
と会合する能力を評価するための方法であって、以下：
（ｉ）計算機手段を使用して、該改変体と該分子複合体の該第１の結合部位または該分子複合体のホモログの第２の結合部位との間の当てはめ操作を行う工程；および
（ｉｉ）該当てはめ操作の結果を分析して、該改変体と該第１の結合部位または第２の結合部位との間の会合を定量化する工程、
を包含する、方法。
【請求項８４】
前記ホモログが、０．００Åと１．００Åとの間の前記アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ホモログが、０．００Åと０．５０Åとの間の前記アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差を有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記第２の結合部位が、５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、またはその抗原結合フラグメント、またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメントの結合部位である、請求項８３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項７３〜８７のいずれか１項に記載の方法によって同定される、モノクローナル抗体５ｃ８の改変体またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントの改変体。
【請求項８９】
薬学的組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに請求項８８に記載のモノクローナル抗体５ｃ８の改変体もしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、またはそれらの抗原結合フラグメントの改変体、請求項７２に記載のＣＤ１５４の潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト、請求項５４に記載の化学実体、あるいは請求項５５に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項９０】
被験体における不適切なＣＤ１５４誘導性活性化に関連する状態を処置する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９１】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態の重篤度を軽減する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９２】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態の効果を抑制する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９３】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態の発生を予防する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９４】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態の発症を遅延させる方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９５】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態を阻害する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９６】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態を逆転させる方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９７】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態を処置する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９８】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介活性化に関連する状態を予防する方法であって、有効量の請求項８９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９９】
前記被験体が霊長類である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記霊長類がヒトである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記状態が所望でない免疫応答である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記状態が所望でない炎症応答である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記状態が自己免疫疾患である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記状態がアレルギーである、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記状態が治療剤に対する阻害応答である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記状態がドナー器官の拒絶である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記状態がＢ細胞癌である、請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項８８〜９８のいずれか１項に記載の方法であって、前記状態が、以下：全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脊髄傷害、発作、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈再狭窄、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、Ｃ型肝炎、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射線誘導性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性骨髄腫、および悪液質からなる群より選択される、方法。
【請求項１０９】
分子複合体のＸ線回析パターンに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータであって、該コンピュータは、以下：
ａ）機械読取り可能データに符号化されたデータ記憶材料を備える、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、図４に従う構造座標の少なくとも一部を含む、機械読取り可能データ記憶媒体；
ｂ）機械読取り可能データに符号化されたデータ記憶材料を備える、機械読取り可能データ記憶媒体であって、該データは、該分子複合体のＸ線回析パターンを含む、機械読取り可能データ記憶媒体；
ｃ）ａ）およびｂ）の該機械読取り可能データを処理するための命令を記憶するための、ワーキングメモリ；
ｄ）該ワーキングメモリならびにａ）およびｂ）の該機械読取り可能データに連結された中央処理装置であって、ａ）の機械読取り可能データのフーリエ変換を行うため、およびｂ）の機械読取り可能データを構造座標へ処理するための、中央処理装置；ならびに
ｅ）該分子複合体の該構造座標を表示するための、該中央処理装置に連結された、ディスプレイ、
を備える、コンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、タンパク質およびポリペプチドの結晶学およびコンピュータによる分析の分野に関連する。本発明はさらに、コンピュータを用いた薬物設計の分野に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞レセプター（「ＴＣＲ」）媒介シグナルおよび同時に送達される同時刺激シグナルの両方を必要とすることを確立するデータが、過去２０年にわたって蓄積している。例えば、タンパク質抗原に応答するＢリンパ球による抗体産生は、Ｔリンパ球との特異的な同時刺激的相互作用を必要とする。このＢ細胞／Ｔ細胞相互作用は、ＴＣＲの関与に加えて、いくつかのレセプター−リガンド結合事象を介して媒介される。例えば、Ｎｏｅｌｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：４３１−４３３（１９９２）を参照のこと。Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４３１３−４３２１（１９９２）もまた参照のこと。これらのさらなる結合事象は、Ｂ細胞上のＣＤ４０のＴ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ、そしてｇｐ３９、Ｔ−ＢＡＭ、５ｃ８抗原、ＣＤ４０ＣＲおよびＴＲＡＰとしてもまた公知）への結合を含む。ヒトＣＤ４０は、成熟Ｂ細胞、ならびにマクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞および活性化内皮細胞上で発現される５０キロダルトンの細胞表面タンパク質である。ＣＤ４０は、Ｆａｓ／ＣＤ９５および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αレセプターを含む、細胞シグナル伝達およびプログラムされた細胞死に関与するレセプターのクラスに属する。ヒトＣＤ１５４（ＴＮＦαに対する相同性を有する３２キロダルトンのＩＩ型膜糖タンパク質）は、ＴＮＦファミリーのレセプターのメンバーであり、そして主に活性化Ｔ細胞において過渡的に発現される。ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合は、Ｔ細胞依存抗体応答のために必要であることが示されている。詳細には、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合は、抗アポトーシス性シグナルおよび／またはリンホカイン刺激シグナルを提供する。例えば、Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１０３１−１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１４４６（１９９５）、米国特許出願第０９／１８０，２０９号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／００８９５（これらの開示は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０００３】
Ｔ細胞依存生物学的応答を促進する際のＣＤ４０：ＣＤ１５４結合の重要性は、機能的なＣＤ１５４を欠くヒトにおけるＸ連鎖高ＩｇＭ症（Ｘ−ＨＩＧＭ）の発現によって理解される。これらの個体は、正常または高いＩｇＭレベルを有するが、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＥ抗体を産生することができない。罹患した個体は、再発性の、ときどき重篤な細菌感染（最も一般的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉおよびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および特定の異常な寄生虫感染、ならびにリンパ腫および腹部の癌の増加した発生率に苦しむ。疾患のこれらの臨床的徴候は、静脈内免疫グロブリン置換治療を介して取り扱われ得る。
【０００４】
Ｘ−ＨＩＧＭの影響は、ＣＤ１５４をコードする遺伝子に対してヌル接合性（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）が与えられた動物（ノックアウト動物）において刺激される。ヌル接合型を用いる研究により、Ｂ細胞は、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合の非存在下でＩｇＭを産生し得るが、これらは、アイソトープ転換を起こし得ないか、または正常に生存し得ず、そして親和性変異を起こし得ないことが確認されている。機能的なＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用の非存在下で、脾臓およびリンパ節の胚中心は、適切に発生せず、そしてメモリーＢ細胞の発生が損なわれる。これらの欠損は、二次（成熟）抗体応答における重大な減少またはこの応答の非存在に寄与する。
【０００５】
Ｘ−ＨＩＧＭを有する個体およびＣＤ１５４ヌル接合型はまた、細胞性免疫において欠損を有する。これらの欠損は、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ感染、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ感染、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ感染、ならびに慢性Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ感染の発生率の増加によって明らかになる。マウスヌル接合型は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ感染と戦うための能力において欠損している。これらの細胞媒介欠損の多くは、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γの投与によって逆転可能である。これらのデータは、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合が、Ｉ型Ｔヘルパー細胞応答の発生を促進するという考えを実証する。さらなる支持は、マクロファージの活性化が、ＣＤ１５４欠損環境において欠損し、そして抗ＣＤ１５４抗体のマウスへの投与が、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ感染をクリアするための能力を減少させたという観察に由来する。ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合の遮断は、酸化窒素を生成するマクロファージの能力を減少させるようであり、酸化窒素は、多数のマクロファージの炎症促進性活性を媒介する。しかし、機能的なＣＤ１５４を欠く哺乳動物（ヒトを含む）は、ウイルス感染の有意な発生率を生じないことに注意すべきである。
【０００６】
多数の前臨床研究（ＷＯ９８／３０２４１、ＷＯ９８／３０２４０、ＷＯ９８／５２６０６、ＷＯ９８／５８６６９およびＷＯ９９／４５９５８に公開されるような同時係属中の共有に係るＰＣＴ特許出願に記載されるものを含む）は、免疫調節剤としてＣＤ４０：ＣＤ１５４結合を妨害し得る因子の見込みを記載する。マウス系において、ＣＤ１５４に対する抗体は、インビトロおよびインビボにおいて、外因性抗原に対する一次免疫応答および二次免疫応答をブロックする。ＣＤ１５４に対する抗体は、ＣＤ１５４免疫不全に関するデータと一致した、マウスおよびサルにおける胚中心における減少を引き起こす。３用量の抗ＣＤ１５４抗体の狼瘡易発性マウス（３か月齢）への投与は、二重鎖ＤＮＡおよびヌクレオソームに対する力価を実質的に減少させ、重篤な腎炎の発生を遅らせ、そして死亡率を減少させた。さらに、重篤な腎炎を有する５〜７か月齢のマウスへの抗ＣＤ１５４抗体の投与は、腎疾患を安定化するか、または逆転さえすることが示された。少量の休止した同種異系のリンパ球を同時に与えられた抗ＣＤ１５４抗体は、マウス膵臓小島の同種移植片の無期限の生存を可能にした。他の動物モデルにおいて、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合との干渉は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患）、移植片拒絶（例えば、心臓同種移植片、対宿主性移植片病）、および塩化第二水銀誘導性糸球体腎炎（これは、体液性機構および細胞性機構の両方によって媒介される）の症状を減少させることが実証されている。
【０００７】
抗ＣＤ１５４抗体を用いるこのような研究は、免疫応答を調節するための重要な標的としてのＣＤ１５４の役割を実証する。
【０００８】
現在、利用可能なＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｏｒ）の最も効果的な妨害剤は、抗ＣＤ１５４抗体である。しかし、抗体は、全ての場合において、ヒト治療剤としての使用のための最も効果的なＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤であり得ない。ＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を阻害する際により効果的であり、かつ改善されたヒト治療剤として機能する新規の薬剤のさらなる開発が、ＣＤ１５４の構造的情報およびＣＤ１５４に特異的に結合することが公知の因子の欠如によって妨害されている。その情報は、本発明によって初めて提供される。
【０００９】
（発明の要旨）
出願人らは、組成物（この組成物は、結晶化可能であり得る）、ＣＤ１５４を特異的に結合する抗体（抗ＣＤ１５４抗体）との複合体中のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）の結晶、およびこのような組成物および結晶を使用するための方法を提供することによって上述の問題を解決した。
【００１０】
本発明はまた、ＣＤ１５４と特異的に結合する抗体との複合体中のＣＤ１５４の構造座標を提供する。
【００１１】
本発明はまた、分子複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定するための方法を提供し、この分子複合体は、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体に対して少なくともいくつかの構造的に類似した特徴を含む。
【００１２】
本発明はまた、化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストおよびアンタゴニスト）、および５ｃ８モノクローナル抗体の改変体またはその抗原結合フラグメントを設計するための方法を提供し、これらは、ＣＤ１５４を特異的に結合し、従ってＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤として作用する。本発明はさらに、化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストおよびアンタゴニスト）、および５ｃ８モノクローナル抗体の改変体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物に関連し、これらは、ＣＤ１５４を特異的に結合し、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体の構造座標によって合理的に設計される。本発明はさらに、被験体における不適切または異常なＣＤ１５４活性化に関連する状態を処置するための、上に同定された化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストおよびアンタゴニスト）、および５ｃ８モノクローナル抗体の改変体またはその抗原結合フラグメントの使用に関連する。
【００１３】
本発明はまた、ＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体の構造座標によって規定される結合部位を含む分子複合体の三次元表示を生成するための、データ記憶物質を含む記憶媒体を含むコンピュータ、ならびに化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストおよびアンタゴニスト）、および５ｃ８モノクローナル抗体の改変体またはその抗原結合フラグメント、および結合部位の間の当てはめ操作を実施するためのコンピュータ手段を使用することによって、以下を設計するためのこれらの三次元表示を使用するための方法を提供する：１）ＣＤ１５４または抗ＣＤ１５４抗体に関連する化学実体および化合物；２）詳細には、ＣＤ１５４の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのような化合物；または３）改善された特性（例えば、非改変体の親の抗ＣＤ１５４抗体（例えば、５ｃ８  ｍＡｂ）と比較した場合により高いまたはより低い親和性でＣＤ１５４に結合する特性）を有する抗ＣＤ１５４抗体の改変体（例えば、５ｃ８  ｍＡｂの改変体）。本発明はまた、化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストおよびアンタゴニスト）、および５ｃ８モノクローナル抗体の改変体またはその抗原結合フラグメント、ならびにこれらを含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明の前述の目的および他の目的、特徴、および利点、ならびに本発明自体は、好ましい実施形態の以下の説明からより十分に理解される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
以下の考察は、種々の文脈および状況を説明および例示し、ここで、本発明は、実行され得、そして本発明の特定の実施形態を提供する。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、所定の整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを含意することが理解される。
【００１７】
（アミノ酸の略記）
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン。
【００１８】
本出願人らは、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体の三次元構造を、高解像度のＸ線結晶学を使用して、解明した。重要なことに、このことは、抗ＣＤ１５４抗体（具体的には、モノクローナル抗体５ｃ８）に対するＣＤ１５４（具体的には、ヒトＣＤ１５４）の結合部位およびＣＤ１５４に対する抗ＣＤ１５４抗体（具体的には、モノクローナル抗体５ｃ８）の結合部位の両方の形状および構造についての情報を初めて提供した。
【００１９】
（組成物および結晶）
好ましい実施形態に従って、本発明の組成物は、結晶化可能である。これらの組成物は、ＣＤ１５４を特異的に結合する抗体（抗ＣＤ１５４抗体）またはこれらの抗原結合フラグメントとの複合体中に、ＣＤ１５４ポリペプチドを含む。
【００２０】
この複合体のＣＤ１５４ポリペプチド部分は、抗ＣＤ１５４抗体、好ましくはＣＤ４０とＣＤ１５４との間の相互作用をブロックし得る抗体に特異的に結合し得る任意のＣＤ１５４ポリペプチドである。好ましい実施形態において、このＣＤ１５４ポリペプチドは、ＣＤ１５４の細胞外ドメインまたはその一部を含む。別の好ましい実施形態において、このＣＤ１５４ポリペプチドは、ＣＤ１５４のアミノ酸残基１１６〜２６１からなるポリペプチドを含む。図８を参照のこと。好ましい実施形態において、このＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４である。別の好ましい実施形態において、この結晶化可能な組成物は、ＣＤ１５４ポリペプチドの三量体および３個の抗ＣＤ１５４抗体分子またはその抗原結合フラグメントを含む。ＣＤ１５４ポリペプチドは、ＣＤ１５４またはその一部、および１以上の他のタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質であり得る。この融合タンパク質はまた、ＣＤ１５４またはその一部、および１以上のエピトープタグ（例えば、ＭＹＣタグ）を含み得る。
【００２１】
この複合体の抗ＣＤ１５４抗体部分は、抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、抗体（好ましくは、ＣＤ４０とＣＤ１５４との間の相互作用をブロックし得る抗体）によって特異的に結合されるＣＤ１５４上のエピトープを特異的に結合し得る。好ましくは、この抗ＣＤ１５４抗体は、モノクローナル抗体である。例としては、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）５ｃ８（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、５ｃ８  ｍＡｂまたはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ）２フラグメント、およびＦａｂフラグメントが挙げられる。より好ましい実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ１５４に特異的に結合する。例としては、５ｃ８  ｍＡｂ、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、ならびに５ｃ８  ｍＡｂまたはヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ）２フラグメント、およびＦａｂフラグメントが挙げられる。抗ＣＤ１５４抗体は、抗ＣＤ１５４抗体またはその抗原結合部分および１以上の他のタンパク質またはポリペプチドを含む融合タンパク質であり得る。この融合タンパク質はまた、抗ＣＤ１５４抗体またはその抗原結合部分および１以上のエピトープタグ（例えば、ＭＹＣタグ）を含み得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、この抗ＣＤ１５４抗体は、５ｃ８抗原（これは、モノクローナル抗体５ｃ８（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）によって特異的に結合される）に特異的に結合するモノクローナル抗体である。５ｃ８抗原は、ヒトＣＤ１５４である。ヒトＣＤ１５４のＤＮＡ配列およびヒトＣＤ１５４のアミノ酸配列は、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１：４３１３−４３２１（１９９２）に開示されていた。
【００２３】
ＣＤ４０とＣＤ１５４との間の相互作用をブロックし得る抗体は、ＣＤ４０（例えば、（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞および他の抗原提示細胞上の）細胞表面ＣＤ４０）とＣＤ１５４（例えば、活性化Ｔ細胞の表面上で発現されるＣＤ１５４）との相互作用をブロックする抗体である。具体的に意図されるＣＤ４０：ＣＤ１５４結合阻害化合物（例えば、抗ＣＤ１５４化合物）としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体誘導体（例えば、キメラ分子、ヒト化分子、変更された（例えば、減少された）エフェクター機能を有する分子、二重特異性分子、および抗体の結合体）が挙げられる。好ましい実施形態において、この抗体は、米国特許第５，４７４，７７１号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、５ｃ８  ｍＡｂ（１９９１年１１月１４日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生される）である。非常に好ましい実施形態において、この抗体はヒト化５ｃ８  ｍＡｂである。ＣＤ１５４に対する他の公知の抗体としては、例えば、抗体ＩｍｘＭ９０、ＩｍｘＭ９１およびＩｍｘＭ９２（米国特許第５，９６１，９７４号に記載される）が挙げられる。多数のさらなる抗ＣＤ１５４抗体が産生され、そして特徴付けられている（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／２３０７１（この出願の明細書は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。適切なモノクローナル抗体の選択は、ＣＤ１５４が由来する動物種および抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体の種特異性に依存する（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ  １０９１６を有するハイブリドーマによって産生され、かつヒトＣＤ１５４に対して惹起される５ｃ８  ｍＡｂは、ヒトおよび数種の非ヒト霊長類のＣＤ１５４分子に特異的に結合するが、マウスのＣＤ１５４には結合しない）。このＣＤ１５４がマウスＣＤ１５４（ｇｐ３９として公知）である場合、マウスＣＤ１５４を結合する抗体が使用されるべきである。このような抗体の例は、ＭＲ１である（Ｎｏｅｌｌｅら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６５５０を参照のこと）。
【００２４】
本発明はまた、他の型の抗ＣＤ１５４分子（例えば、完全Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２化合物、ＶＨ領域、ＦＶ領域および単鎖抗体ポリペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／２３０７１を参照のこと））を含む。
【００２５】
種々の形態の抗体もまた、標準的な組換えＤＮＡ技術（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−９９、１９９１）を使用して産生され得る。例えば、「キメラ」抗体が構築され得、ここで、非ヒト動物抗体由来の抗原結合ドメインは、ヒト定常ドメインに連結される（抗体は、最初に非ヒト哺乳動物に由来し、ここで、組換えＤＮＡ技術を使用して、重鎖のヒンジ領域および定常領域ならびに／または軽鎖の定常領域の全てあるいは一部を、ヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来の対応する領域で置換した）（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５、１９８４を参照のこと）。
【００２６】
さらに、組換え「ヒト化」抗体が合成され得る。ヒト化抗体は、最初に非ヒト哺乳動物に由来し、ここで、組換えＤＮＡを使用して、抗原結合に必要ではないアミノ酸のいくつかまたは全てを、ヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の対応する領域に由来するアミノ酸で置換した。このような抗体は、特異的抗原結合を担う領域が挿入された、主にヒトの免疫グロブリン配列を含むキメラである（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９０／０４６７９（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。動物を所望の抗原で免疫し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の一部を取り出す。次いで、この動物由来の抗原結合領域を、抗原結合領域が欠失されたヒト抗体遺伝子の適切な部分にクローニングする。ヒト化抗体は、ヒトの治療のために標的化される抗体中の異種（種間）配列の使用を最小化し、そして望まれない免疫応答を誘発する可能性が低い。霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体を、霊長類（例えば、アカゲザル、ヒヒおよびチンパンジー）の抗体遺伝子を使用して、同様に産生し得る。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、ヒト抗体（これは、非ヒト動物（例えば、１以上のヒト免疫グロブリン導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物）において産生され得る）の使用を含む。このような動物を、米国特許第５，５６９，８２５号に記載のように、ハイブリドーマを産生するための脾細胞の供給源として使用し得る。
【００２８】
抗体フラグメントおよび一価の抗体もまた、本発明によって意図される。一価の抗体は、第二の重鎖のＦｃ（またはステム）領域に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む。「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＹ分枝部分を含む配列および軽鎖全部に対して、ほぼ等価または類似である鎖の部分、ならびに抗体活性を示すことが集合的に（集合で）示された鎖の部分をいう。この集合が特定の抗原または抗原ファミリーと選択的に反応し得る限り、上記のいずれかが共有結合的に集合したか非共有結合的に集合したかに関わらず、Ｆａｂタンパク質は、１つの重鎖および１つの軽鎖の集合（一般に、Ｆａｂ’として公知）、ならびに抗体Ｙの２つの分枝セグメントに対応する四量体（Ｆ（ａｂ）２として公知）を含む。
【００２９】
さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、この抗原結合部位の近傍でアミノ酸残基を変更することによって、その抗原との組換え抗体の結合親和性を変更し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく変異誘発によって増大され得る（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：１００２９−３３、１９８９；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９４／０４６７９（これらは、本明細書中で参考として援用される））。これはまた、ファージディスプレイ技術を使用しても行われ得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、１９９４；およびＳｃｈｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３、１９９６（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００３０】
（結晶構造、およびＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体の三次元構造を規定する構造座標を使用する方法）
本発明によって提供される結晶化可能な組成物は、Ｘ線結晶学を受け入れる。従って、本発明はまた、この結晶化可能な組成物の結晶を包含する。本発明はまた、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体のＸ線結晶学によって得られるような三次元構造を、高解像度（例えば、３．１Åの解像度）で提供する。実施例１を参照のこと。好ましい実施形態において、このＣＤ１５４ポリペプチドは、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメイン（例えば、アミノ酸１１６〜２６１）であり、そして抗ＣＤ１５４抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントである。
【００３１】
本発明の他の結晶化可能な組成物の三次元構造もまた、当該分野で慣用的なＸ線結晶学的技術を使用するＸ線結晶学によって決定され得る。
【００３２】
Ｘ線結晶学は、分子実体の構造の決定を可能にする技術の集合である。これらの技術としては、この実体の結晶化、Ｘ線回折強度の収集および処理、位相の決定（例えば、複数の同形置換、分子の置換または異なるフーリエ技術による）、ならびにモデル構築および精密化が挙げられる。
【００３３】
ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメント複合体の三次元構造は、図４に示されるような構造座標のセットによって規定される。用語「構造座標」とは、結晶形態のＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメント複合体の原子（散乱中心）によるＸ線の単色ビームの回折で得られたパターンに関連する、数学的方程式に由来する原子のデカルト座標をいう。回折データを使用して、結晶の反復単位の電子密度マップを算定する。次いで、この電子密度マップを使用して、ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメント複合体の個々の原子を確立する。
【００３４】
実施例１に示すように、ＣＤ１５４上の５ｃ８  ｍＡｂに対するエピトープ（本明細書において抗原性エピトープとしても示される）は、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０を含む。
【００３５】
図４に対応する、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標によって規定される結合部分は、特に５ｃ８  ｍＡｂおよびこれの抗原結合フラグメントならびにｈｕ５ｃ  ８ｍＡｂおよびこの抗原結合フラグメントに結合し得る。
【００３６】
本発明の１つの実施形態は、図４に対応する、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標によって規定される第１の結合部位を含む分子複合体を提供するか、またはこの分子複合体のホモログを提供し、ここでこのホモログは、このアミノ酸の骨格原子に由来する平方自乗平均偏差が、０．００Åと１．５０Åとの間、好ましくは０．００Åと１．００Åとの間、より好ましくは０．００Åと０．５０Åとの間である第２の結合部位を含む。この第１の結合部位を、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｏ．４）からのＣＯＮＴＡＣＴプログラム（Ｎａｖａｊａ、Ｊ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ  ５０、１５７〜１６３）を用いて計算した。Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：タンパク質結晶学に対するプログラム、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ  ５０，７６０−７６３。このプログラムは、複合体中の他の分子に接触する残基からの距離が１Åと３．６Åとの間である全ての残基を見出した。第１および／または第２の結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメント、またはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、第１の結合部位を含む分子複合体またはこの分子複合体のホモログを提供し、この結合部位は、図４に対応する、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標によって規定され、この分子複合体またはこの分子複合体のホモログは、図４に対応する、抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３および軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６の１つ以上に結合し、ここでこのホモログは、第２の結合部位を含み、この第２の結合部位は、このＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差が０．００Åと１．５０Åとの間、好ましくは０．００Åと１．００Åとの間、より好ましくは０．００Åと０．５０Åとの間である。この第１の結合部位を、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｏ．４）からのＣＯＮＴＡＣＴプログラム（Ｎａｖａｊａ、Ｊ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ  ５０、１５７〜１６３）を用いて計算した。Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：タンパク質結晶学に対するプログラム、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ  ５０，７６０−７６３。このプログラムは、複合体中の他の分子に接触する残基からの距離が１Åと３．６Åとの間である全ての残基を見出した。第１および／または第２の結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメント、またはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、分子複合体またはこの分子複合体ホモログを提供し、この分子複合体は、図４に対応する、抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６の１つ以上の構造座標によって、規定され、ここでこの分子複合体ホモログは、これらのアミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差が０．００Åと１．５０Åとの間、好ましくは０．００Åと１．００Åとの間、より好ましくは０．００Åと０．５０Åとの間である。
【００３９】
本発明のなお別の実施形態は、分子複合体またはこの分子複合体ホモログを提供し、この分子複合体は、図４に示されるＣＤ１５４アミノ酸全体または抗ＣＤ１５４抗体アミノ酸の構造座標の少なくとも一部もしくは全てによって規定され、ここでこの分子複合体ホモログは、これらのアミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差が０．００Åと１．５０Åとの間、好ましくは０．００Åと１．００Åとの間、より好ましくは０．００Åと０．５０Åとの間である。この分子複合体は、結合部位を有し、この分子複合体のホモログは、結合部位を有する。この結合部位のいずれかまたは両方は、５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメント、またはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂもしくはこの抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る。
【００４０】
当業者は、ポリペプチド複合体に対する構造座標のセットが、三次元の形を規定する関連した地点のセットであることを理解する。従って、全体的に異なる座標のセットが、同様な形または同一の形を規定し得ることは可能である。さらに、個々の座標においてのわずかな変動は、全体の形にほとんど影響しない。
【００４１】
上記で議論した座標においての変動は、構造座標の数学的処理に起因して生じ得る。例えば、図４に示される構造座標は、この構造座標の結晶学的順列、構造座標の分割、構造座標のセットに対する整数の追加または減算、構造座標の反転またはこれらの任意の組み合わせによって、処理され得る。
【００４２】
あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換および／または結晶を構築する成分のいずれかにおいての他の変更はまた、構造座標における変動に考慮され得る。このような変動が、元の座標に比較して、受容可能な標準誤差内である場合、得られた三次元の形は、未改変の結晶の形と同じとみなされる。
【００４３】
従って、種々のコンピュータ分析は、分子複合体またはこれの一部が、上記のヒト化５ｃ８  ｍＡｂ構造のＣＤ１５４／Ｆａｂフラグメントの細胞外ドメインの全てもしくは一部について、同じであると考えられるまでに十分類似するか否かを決定することが必要である。このような分析は、現在のアプリケーションソフトウェア（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＱＵＡＮＴＡ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１、および添付されるユーザーズガイドの記載）で実施され得る。
【００４４】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ適用は、異なる構造、同じ構造の異なる配座、および同じ構造の異なる部分での比較を可能にする。構造を比較するためのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ適用の使用手順は、４つの工程に分けられる：１）比較のために構造を取りこむ工程；２）これらの構造中の原子等価性を規定する工程；３）当てはめ操作を実施する工程；および４）結果を分析する工程。
【００４５】
各構造を名前により同定する。１つの構造は、標的として同定され（すなわち、固定された構造）、全ての残りの構造は、機能構造である（すなわち、可動構造）。ＱＵＡＮＴＡ内の原子等価性は、本発明の目的に対して、使用者の入力により規定されるので、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）のような等価な原子は、比較する２つの構造の間の全ての保存的残基に対して規定される。強固な当てはめ操作のみも、考慮される。
【００４６】
強固な当てはめ方法が使用される場合、機能構造は、変換され、回転されて、標的構造に最適な一致を得る。当てはめ操作は、最適な変換および回転を算出するアルゴリズムを使用して、可動構造に適用し、特定の等価原子対にわたる一致の平方自乗平均の違いが、絶対的に最小であるようにする。Åで提供されるこの数値を、ＱＵＡＮＴＡで報告する。
【００４７】
本発明の目的に対して、保存的残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）の平方自乗平均偏差が、０．００Åと１．５０Åとの間、好ましくは０．００Åと１．００Åとの間、より好ましくは０．００Åと０．５０Åとの間である任意の分子複合体は、図４に挙げた構造座標によって記載される関連した骨格原子上に重ね合わせられた場合、同一であるとみなされる。
【００４８】
用語「平方自乗平均偏差」とは、平均からの偏差の自乗の相加平均の平方根をいう。これは、傾向または対象からの偏差または変動を表現する方法である。本発明の目的に対して、「平方自乗平均偏差」は、タンパク質複合体の骨格中の、本明細書で記載される構造座標によって規定されるような、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体のＣＤ１５４ポリペプチド部分または抗ＣＤ１５４抗体部分の骨格の関連部分からの変動を、規定する。
【００４９】
一旦、タンパク質結晶の構造座標が決定されると、これらは、他の結晶の構造を解析するのに有用である。
【００５０】
本発明に従って、ＣＤ１５４の細胞外ドメインおよび、例えばヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメント、およびこれらの部分を含む複合体の構造座標は、機械で読み取り可能な記憶媒体中に保存される。機械はコンピュータであり得る。このようなデータは、種々の目的（例えば、薬物発見、改善された特性（例えば、ＣＤ１５４に対する改善された特異的結合）を備えた５ｃ８ｍＡｂ改変体の発見、および他のタンパク質結晶のＸ線結晶学的分析）に使用され得る。
【００５１】
ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体複合体もしくはその結合部位の１つまたはこれらのホモログに対して生じた構造座標を使用するために、これらを三次元の形に変換することが必要である。このことは、分子複合体またはこの一部の三次元画像表示を、構造座標のセットから生じ得る市販のソフトウェアの使用を介して達成される。
【００５２】
従って、本発明の１つの実施形態は、機械で読み取り可能なデータを符号化されるデータ記憶材料を備える、機械で読み取り可能なデータ記憶媒体を提供し、この機械で読み取り可能なデータは、図４に示される構造座標の一部または全体のセットを含む。機械は、コンピュータであり得る。データ記憶媒体を備えたコンピュータもまた、本発明で提供される。本発明はまた、命令を備え得たコンピュータを提供して、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体の分子複合体の三次元表示を、本発明の機械で読み取り可能なデータを処理することにより生じる。本発明のコンピュータはさらに、本発明の構造座標を表示するためのディスプレイを備える。
【００５３】
本発明のコンピュータは、機械で読み取り可能なデータを符号化される機械で読み取り可能なデータ記憶媒体を備え、ここでこのデータが、以下の４つの構造座標のうち１つを含む：
（１）図４に従う、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓｌ７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標；
（２）図４に従う、ＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓｌ７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標であって、これは、図４に対応する、抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６の１つ以上に結合する；
（３）図４に対応する、抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３ならびに軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６の１つ以上の構造座標；または
（４）図４に示す、全てのＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体のアミノ酸の少なくとも一部または全体の構造座標。
そしてこのコンピュータは、この機械で読み取り可能なデータを、本発明の分子複合体またはこのホモログの三次元表示に変換する処理のための命令を備える。好ましくはこのコンピュータはさらに、この分子座標を表示するためのディスプレイを備える。このようなコンピュータは、本発明の分子複合体およびこのホモログの三次元表示を生じる。
【００５４】
本発明はまた、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４抗体の分子複合体から得られるＸ線回折データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータを提供し、ここでこのコンピュータは、以下を備える：
ａ）機械で読み取り可能なデータ記憶媒体であって、機械で読み取り可能なデータで符号化されるデータ記憶材料を備え、ここでこのデータが、図４に対応するＣＤ１５４および／または抗ＣＤ１５４抗体の構造座標の少なくとも一部を備える、記憶媒体；
ｂ）機械で読み取り可能なデータ記憶媒体であって、機械で読み取り可能なデータで符号化されるデータ記憶材料を備え、ここでこのデータが、この分子複合体から得られるＸ線回折データを備える、記憶媒体；ならびに
ｃ）（ａ）の機械で読み取り可能なデータのフーリエ変換を実施し、（ｂ）の機械で読み取り可能なデータを構造座標に処理するための命令。
好ましくはこのコンピュータはさらに、この構造座標を表示するためのディスプレイを備える。
【００５５】
本発明はまた、分子複合体のＸ線回折パターンに対応する、構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータを提供し、ここで、このコンピュータは、以下を備える：
ａ）機械読取り可能なデータ（このデータは、図４に従う構造座標の少なくとも一部を含む）によって符号化されるデータ記憶材料を含む、機械読取り可能なデータ記憶媒体；
ｂ）機械読取り可能なデータ（このデータは、上記分子複合体のＸ線回折パターンを含む）によって符号化されるデータ記憶材料を含む、機械読取り可能なデータ記憶媒体；
ｃ）上記ａ）およびｂ）の機械読取り可能なデータを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ；
ｄ）上記ワーキングメモリと、上記ａ）およびｂ）の機械読取り可能なデータとに連結された、中央処理装置であり、（ａ）の機械読取り可能なデータをフーリエ変換して、（ｂ）の機械読取り可能なデータを構造座標に処理するための、中央処理装置；ならびに、
ｅ）上記中央処理装置に連結されたディスプレイであり、上記分子複合体の構造座標を表示するための、ディスプレイ。
【００５６】
図５は、これらの実施形態の１つのバージョンを示す。システム１０は、コンピュータ１１を備え、このコンピュータは中央処理装置（「ＣＰＵ」）２０、ワーキングメモリ２２（これは、例えば、ＲＭＡ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る）、大容量記憶装置２４（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ）、１つ以上のブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボード２８、１つ以上の入力ライン３０、および１つ以上の出力ライン４０（これらの全ては、従来型の二方向性システムバス５０により相互接続されている）を備える。
【００５７】
入力ハードウェア３６は、入力ライン３０によってコンピュータ１１に連結されており、これは、種々の方法で実行され得る。本発明の機械読取り可能なデータは、電話線または専用のデータライン３４により接続されたモデム３２の使用を介して入力され得る。あるいは、またはさらに、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ、またはディスクドライブ２４を備え得る。ディスプレイ端末２６と組み合わせて、キーボード２８もまた、入力デバイスとして使用され得る。
【００５８】
出力ハードウェア４６は、出力ライン４０によってコンピュータ１１に連結されており、これは、従来型デバイスによって同様に実行され得る。例として、出力ハードウェア４６は、本明細書中で記載されるようなプログラム（例えば、ＱＵＡＮＴＡ）を使用する、本発明の結合部位のグラフ表示を示すためのＣＲＴディスプレイ端末２６を備え得る。出力ハードウェアはまた、プリンタ４２（これにより、ハードコピー出力が作製され得る）、またはディスクドライブ２４を備えて、後の使用のためにシステムの出力を記憶し得る。
【００５９】
操作の際に、ＣＰＵ２０は、種々の入力デバイス３６および出力デバイス４６の使用を統合し、大容量記憶装置２４からのデータアクセスを統合し、そしてワーキングメモリ２２まで、およびワーキングメモリ２２からアクセスし、そしてデータ処理工程の順序を決定する。多数のプログラムを使用して、本発明の機械読取り可能なデータを処理し得る。このようなプログラムは、本明細書中で記載されるような、薬物発見の計算方法を参照して議論される。ハードウェアシステム１０の構成要素に対する特定の参照は、データ記憶媒体の以下の記載全体を通して適切である場合に含まれる。
【００６０】
図６は、磁気データ記憶媒体１００の断面図を示しており、この媒体は、図５のシステム１０のようなシステムによって実行され得る機械読取り可能なデータによって符号化され得る。媒体１００は、従来型のフロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスクであり得、これは、適切な基板１０１（これは従来型であり得る）および適切なコーティング１０２（これは従来型であり得る）を、片面または両面に有し、偏光または方向が磁気によって変更され得る磁気ドメイン（可視化不可能）を備える。媒体１００はまた、ディスクドライブまたは他のデータ記憶デバイス２４のスピンドルを受容するための開口部（図示せず）を有し得る。
【００６１】
媒体１００のコーティング１０２の磁気ドメインは、システム（例えば、図５のシステム１０）を実行するために、本明細書中に記載されるような従来型の機械読取り可能なデータであり得る様式で符号化されるように、偏光または方向付けされ得る。
【００６２】
図７は、光学的機械読取り可能なデータ記憶媒体１１０の断面図を示しており、これはまた、システム（例えば、図５のシステム１０）によって実行され得るこのような機械読取り可能なデータ、または一連の命令の設定によって符号化され得る。媒体１１０は、従来型のコンパクトディスクまたはＤＶＤディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤ−ＲＯＭ）または書換可能媒体（例えば、光学的に読取り可能であり、光磁気により書き込み可能な光磁気ディスク）であり得る。媒体１００は、好ましくは、適切な基板１１１（これは、従来型であり得る）、および通常はこの基板１１１の片面にある適切なコーティング１１２（これは、従来型であり得る）を有し得る。
【００６３】
ＣＤ−ＲＯＭの場合には、周知であるように、コーティング１１２は反射性であり、かつ複数のくぼみ１１３に圧しつけられて（ｉｍｐｒｅｓｓｅｄ）、機械読取り可能なデータを符号化する。くぼみの整列は、レーザ光をコーティング１１２の表面で反射させることによって読み取られる。保護コーティング１１４は、好ましくは実質的に透過性であり、これは、コーティング１１２の上に施される。
【００６４】
光磁気ディスクの場合には、周知のように、コーティング１１２はくぼみ１１３を有さないが、複数の磁気ドメイン（レーザによって、特定の温度を超えて加熱される場合、この偏光性または方向が磁気によって変更され得る）を有する（図示せず）。このドメインの方向は、コーティング１１２から反射されるレーザ光の偏光を測定することによって読み取られ得る。このドメイン整列は、上記のようなデータを符号化する。
【００６５】
本発明は、初めて、構造に基づく技術および合理的な薬物設計技術を使用して、化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニスト）、および改善された特性（例えば、５ｃ８  ｍＡｂと比較して、ＣＤ１５４に対するより高い結合親和性またはより低い結合親和性）を有する５ｃ８  ｍＡｂ改変体を設計、選択および合成することを可能にする。さらに、本発明は、構造に基づく技術または合理的な薬物設計技術を使用して、現在利用可能なＣＤ１５４アンタゴニスト（ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体またはそれらのいずれかの部分に結合し得る）を改善することを可能にする。
【００６６】
本発明によって可能な、特に有用な１つの薬物設計技術は、繰返し（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ）薬物設計である。繰返し薬物設計は、タンパク質／化合物複合体の逐次のセットの三次元構造を決定および評価することによって、タンパク質と化合物（この化合物は抗体を含む）との間の結合を最適化するための方法である。
【００６７】
当業者は、天然のレセプター（例えば、ＣＤ４０）の、またはそれらの対応するリガンド（例えば、ＣＤ１５４（これはまた、ＣＤ４０リガンドとしても公知である））もしくは酵素の結合部位を有する基質との結合が、多くの生物学的作用機構の基礎であることを認識する。同様に、多数の薬物（ｍＡｂを含む）は、例えば、リガンド（例えば、ＣＤ１５４）、レセプターおよび酵素の結合部位との結合を介してそれらの生物学的効果を発揮する。このような結合は、結合部位の全てまたは任意の部分で生じ得る。例えば、５ｃ８  ｍＡｂは、ＣＤ１５４に結合し、ＣＤ１５４とＣＤ４０との間の相互作用をブロックする。このような結合を理解することによって、それらの標的リガンド、レセプターまたは酵素とのより好ましい結合を有し、従って、改善された生物学的効果を有する薬物の設計が可能となる。従って、この情報は、リガンド、レセプターまたは酵素の潜在的な化学実体またはインヒビター（化合物および抗体（例えば、とりわけ、５ｃ８  ｍＡｂ改変体および他の抗ＣＤ１５４抗体の改変体）を含む）を設計する際に有効である。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「結合部位」とは、タンパク質の領域をいい、この領域は、その形状の結果として、好ましくは、別のタンパク質、化学実体、化合物または抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントと結合する。例えば、ＣＤ１５４上の５ｃ８  ｍＡｂに対する結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂのエピトープである。この結合部位はまた、化学実体、５ｃ８  ｍＡｂの化合物または改変体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントの結合部位であり得る。ＣＤ１５４はまた、ＣＤ４０に対する結合部位を有する。
【００６９】
用語「結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ）」とは、２つ以上の化学実体、化合物およびタンパク質、またはそれらの部分の間の近位の状態をいう。この結合は、非共有結合であり得る（ここで、近位は、水素結合あるいはファンデルワールス相互作用または静電的相互作用によってエネルギー的に支持される）か、または共有結合であり得る。
【００７０】
繰返し薬物設計において、タンパク質／化合物または抗体の複合体の一連の結晶が得られ、次いで各新規複合体の三次元構造を解析する。このようなアプローチにより、各新規複合体のタンパク質と化合物または抗体との間の結合に関する識見が提供される。これは、阻害活性を有する化合物または抗体を選択し、新規タンパク質／化合物または抗体の複合体の結晶を獲得し、この複合体の三次元構造を解析し、そしてこの新規タンパク質／化合物または抗体の複合体と、先に解析したタンパク質／化合物または抗体の複合体との間の結合を比較することによって、達成される。化合物または抗体の変化が、どのようにタンパク質／化合物または抗体結合に影響を及ぼすかを観察することによって、これらの結合が最適化され得る。
【００７１】
いくつかの場合において、繰返し薬物設計は、逐次のタンパク質−化合物または抗体の複合体を形成し、次いで、各新規複合体を結晶化することによって、実施される。あるいは、予め形成されたタンパク質結晶をインヒビターの存在下で浸漬し、それによって、タンパク質／化合物複合体を形成し、そして各個々のタンパク質／化合物または抗体の複合体を結晶化する必要性を予め回避する。
【００７２】
図４に示される構造座標もまた使用して、別の結晶化分子複合体についての構造情報を獲得するのを補助し得る。これは、多数の周知技術（分子置換を含む）のいずれかによって実施され得る。この方法は、ＣＤ１５４または抗ＣＤ１５４抗体の変異体およびホモログの構造を決定するために、特に有用である。
【００７３】
図４に示される構造座標はまた、分子複合体（これは、ＣＤ１５４／抗ＣＤ１５４複合体の少なくとも一部と類似の、少なくともいくつかの構造特性を含む）の三次元構造の少なくとも一部を決定するために使用され得る。特に、別の結晶化分子複合体についての構造情報が獲得され得る。これは、多数の周知技術（分子置換を含む）のいずれかによって実施され得る。
【００７４】
従って、本発明の別の実施形態は、構造が未知である結晶化分子複合体についての構造情報を獲得するための分子置換の利用方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）上記結晶化分子複合体からＸ線回折パターンを作製する工程；および、
ｂ）図４に示される構造座標の少なくとも一部を、Ｘ線回折パターンに適用して、構造が未知である分子複合体の三次元電子密度マップを作製する工程。
【００７５】
好ましくは、この結晶化分子複合体は、ＣＤ１５４ポリペプチドおよび抗ＣＤ１５４抗体ポリペプチドを含有する。
【００７６】
分子置換を使用することによって、ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体（本発明によって提供される）の構造座標（図４に示される）の、全てまたは一部を使用して、構造が未知である、結晶化分子複合体の構造を、最初からこのような情報を決定する試みよりも速くかつ効率的に、決定し得る。この方法は、ＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体の変異体およびホモログの構造を決定する際に、特に有用である。
【００７７】
分子置換により、未知の構造に関する位相の正確な推定値が提供される。位相は、直接的に決定され得ない結晶構造を解析するために使用される式中の因子である。分子置換以外の方法によって、この位相の正確な値を獲得することは、近似および洗練の繰返しサイクルを含み、かつ結晶構造の解析を大いに阻害する、時間を消費する処理である。しかしながら、少なくとも１つの相同タンパク質を含むタンパク質の結晶構造が解析されている場合、既知の構造からの位相が、未知の構造に対する位相の満足のいく推定値を提供する。
【００７８】
従って、分子置換は、構造が未知である分子または分子複合体の結晶の、観察されたＸ線回折パターンを最良に把握するために、構造座標が未知である分子複合体の予備モデルを、図４に従うＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体（未知の分子複合体の結晶の単位セル内にある）の関連した部分を方向付けて、位置付けることによって、作製する工程を包含する。次いで、位相を、このモデルから算出して、観察されたＸ線回折パターン振幅と組み合わせて、座標が未知である構造の電子密度マップを作製し得る。次いで、これを、任意の周知モデル構成技術および構造洗練技術に供して、未知の結晶化分子複合体の最終的な正確な構造を提供し得る［Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ，「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１５，５５〜７７頁（１９８５）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編，「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ」，Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．，第１３号，Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）］。
【００７９】
ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体の任意の部分に十分に相同な、任意の結晶化された分子複合体の任意の部分の構造は、この方法によって解かれ得る。
【００８０】
好ましい実施形態において、分子置換法は、分子複合体についての構造情報を得るために利用され、ここで、この複合体は、ＣＤ１５４様ポリペプチドを含む。好ましくは、このＣＤ１５４様ポリペプチドは、ＣＤ１５４、その変異体、またはそのホモログである。
【００８１】
本発明によって提供されるような、ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体の構造座標は、ＣＤ１５４様ポリペプチドの他の結晶形態、好ましくはＣＤ１５４の他の結晶形態；ＣＤ１５４様ポリペプチド／抗ＣＤ１５４抗体様ポリペプチド、好ましくは、ＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメント；または上記の任意を含む複合体を解く際に特に有用である。
【００８２】
このような構造座標はまた、ＣＤ１５４様ポリペプチド／抗ＣＤ１５４抗体様ポリペプチド複合体、特に、種々の化学実体と共に複合体化されたＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの結晶構造を解くのに特に有用である。このアプローチは、化学実体間の相互作用、および候補ＣＤ１５４アゴニストまたはアンタゴニストと、ＣＤ１５４またはＣＤ１５４の細胞外ドメイン／ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントの複合体との相互作用についての最適な部位の決定を可能にする。例えば、異なる型の溶媒に曝露される結晶から収集される高分解能Ｘ線回折データによって、それぞれの型の溶媒分子が存在する位置の決定が可能になる。次いで、これらの部位に密接に結合する低分子が、設計され、合成され、そしてそれらのＣＤ１５４アンタゴニスト活性について試験され得る。
【００８３】
上で参照される複合体の全てが、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、そしてＸ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
【００８４】
【数１】
2004517814.tif 000003
【００８５】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．によって配布される）；例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ、前出；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１１４巻および第１１５巻、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと）のようなコンピュータソフトウェアを使用して、１．５〜３．５Åの分解能のＸ線データに対して、約０．２０以下のＲ値まで精密化され得る。従って、この情報は、公知のＣＤ１５４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＤ１５４抗体）を最適化するために、そしてより重要なことには、新規なまたは改善されたＣＤ１５４アンタゴニストを設計するために使用される。
【００８６】
化学実体、化合物（ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニストを含む）、あるいは５ｃ８  ｍＡｂの改変体またはその抗原結合フラグメント、あるいは、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、あるいは別の抗ＣＤ１５４抗体の改変体またはその抗原結合フラグメントは、当てはめ操作を実行することによって計算機手段により設計され得る。化合物は、タンパク質またはポリペプチドのような高分子を含む。
【００８７】
本発明はまた、本発明の分子複合体、またはこの分子複合体のホモログに結合する化学実体の能力を評価する方法を包含する。
【００８８】
本発明は、本発明の分子複合体、またはこの分子複合体のホモログに結合する化学実体の能力を評価するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：
（ｉ）化学実体と分子複合体の結合部位（この結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、あるいはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る）あるいはこの分子複合体のホモログの結合部位との間の当てはめ操作を実行するための計算機手段を使用する工程；ならびに
（ｉｉ）化学実体といずれかの結合部位との間の結合を定量化するための当てはめ操作の結果を分析する工程、
を包含する。
【００８９】
本発明はまた、ＣＤ１５４の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：
ａ）結合部位（この結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、あるいはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る）を含む分子複合体の三次元構造を作製するために、（図４に従うＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標）±（このＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差（０．００Åと１．５０Åの間、好ましくは、０．００Åと１．００Åの間、より好ましくは、０．００Åと０．５０Åの間））を使用するか；または
（図４に従う、１つ以上の抗ＣＤ１５４抗体の重鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｐ５７、Ａｓｎ５９、Ａｒｇ１０２、Ａｓｎ１０３および軽鎖のアミノ酸Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３６、Ｓｅｒ９５およびＴｒｐ９６に結合する、図４に従うＣＤ１５４アミノ酸Ｇｌｕ１２９、Ａｌａ１３０、Ｓｅｒ１３２、Ｇｌｕ１４２、Ｌｙｓ１４３、Ｇｌｙ１４４、Ｔｙｒ１４６、Ｃｙｓ１７８、Ｃｙｓ２１８、Ｓｅｒ２４５、Ｇｌｎ２４６、Ｓｅｒ２４８、Ｈｉｓ２４９およびＧｌｙ２５０の構造座標）±（このＣＤ１５４アミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均偏差（０．００Åと１．５０Åの間、好ましくは、０．００Åと１．００Åの間、より好ましくは、０．００Åと０．５０Åの間））を使用するか；または
（図４に従うＣＤ１５４および抗ＣＤ１５４抗体の全アミノ酸の構造座標）±（このアミノ酸の骨格原子からの平方自乗平均（０．００Åと１．５０Åの間、好ましくは、０．００Åと１．００Åの間、より好ましくは、０．００Åと０．５０Åの間））の少なくとも一部を使用する、工程；
ｂ）この三次元構造を使用して、上記の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを設計または選択する工程；
ｃ）この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程；ならびに
ｄ）この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストをＣＤ１５４と接触させて、この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストが、ＣＤ１５４に結合する（相互作用する）能力を決定するか；またはこの潜在的アゴニストまたはアンタゴニストがＣＤ１５４に結合し得る場合、この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストがＣＤ１５４と相互作用する（結合する）ことを可能にする条件下で、この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストをＣＤ１５４に接触させる工程、
を包含する。
【００９０】
この方法は、さらに、以下の工程：
ｅ）この潜在的アンタゴニストがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を妨害するか否かを決定する工程、
を包含する。
【００９１】
潜在的アゴニストまたは潜在的アンタゴニストは、化合物である。化合物は、タンパク質またはポリペプチドのような高分子であり得る。
【００９２】
本発明はまた、５ｃ８  ｍＡｂの改変体、またはその抗原結合フラグメント、あるいはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメント、あるいは別の抗ＣＤ１５４抗体またはその抗原結合フラグメントが、本発明の分子複合体またはこの分子複合体のホモログに結合する能力を評価するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：
（ｉ）改変体と本発明の分子複合体の結合部位（この結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、あるいはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る）あるいはこの分子複合体のホモログの結合部位（この結合部位は、５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメント、あるいはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂまたはその抗原結合フラグメントに対する結合部位であり得る）との間の当てはめ操作を実行するための計算機手段を使用する工程；ならびに
（ｉｉ）この当てはめ操作の結果を分析して、この分子複合体の結合部位またはこの分子複合体のホモログの結合部位の間の結合を定量化する工程、
を包含する。
【００９３】
従って、本発明は、５ｃ８  ｍＡｂと比較して、改善された特性（例えば、ＣＤ１５４に対する増加したかまたは減少した結合親和性）を有する５ｃ８  ｍＡｂ改変体（または他の抗ＣＤ１５４抗体の改変体）を提供する。
【００９４】
本発明はまた、本発明の方法によって同定された、化学実体、化合物（例えば、ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは５ｃ８  ｍＡｂ（または他の抗ＣＤ１５４抗体）の改変体、またはその抗原結合フラグメント、あるいはｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ、またはその抗原結合フラグメント）を包含する。
【００９５】
初めて、本発明は、化学実体、化合物（ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニスト、および５ｃ８  ｍＡｂ（または別の抗ＣＤ１５４抗体）の改変体、およびＣＤ１５４に結合し得るその抗原結合フラグメント（ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合遮断剤を含む）を含む）を設計、選択および合成するための分子設計技術の使用を可能にする。
【００９６】
化学実体、化合物（ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニスト、および５ｃ８  ｍＡｂ（または別の抗ＣＤ１５４抗体）の改変体、および本発明に従ってＣＤ１５４に結合するその抗原結合フラグメントの設計は、一般的に、２つの因子の考慮を包含する。第１に、化学実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体は、ＣＤ１５４に物理的におよび構造的に結合し得なければならない。タンパク質（例えば、ＣＤ１５４）とその結合パートナーとの結合において重要な非共有結合性分子相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性相互作用が挙げられる。
【００９７】
第２に、化学実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体は、ＣＤ１５４に直接結合し得るコンフォメーションを想定し得なければならない。化学実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体またはヒト５ｃ８  ｍＡｂ改変体の特定の部分は、これらの結合に直接関与しないが、化学実体、５ｃ８  ｍＡｂ改変体または化合物のそれらの部分は、その分子の全体的コンフォメーションになお影響を与え得る。次いで、これは、効力に対して有意な影響を有し得る。このようなコンフォメーションの要件は、結合部位（例えば、ＣＤ１５４の活性部位またはアクセサリー結合部位、あるいはＣＤ１５４に直接相互作用するいくつかの化学実体を含む化合物の官能基間の間隔）の全てまたは一部に関して、化学実体、５ｃ８  ｍＡｂ改変体または化合物の全体的な三次元構造および配向を含む。
【００９８】
化学実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体のＣＤ１５４またはＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害に対する潜在的結合効果は、その実際の合成または生成および試験の前に、コンピュータモデリング技術の使用によって分析され得る。所与の実体または化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体の理論的構造が、ＣＤ１５４との不十分な相互作用および結合を示唆する場合、その実体または化合物の合成および試験および５ｃ８  ｍＡｂ改変体の試験は、不要となる。しかし、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、その実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体を生成し、そして以下に記載されるアッセイを使用して、ＣＤ１５４に結合し、そしてＣＤ４０とのその結合を妨害するその能力について試験し得る。この様式において、実施不可能な実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体の生成は、避けられ得る。
【００９９】
ＣＤ１５４結合実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂもしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの改変体、あるいはいずれかの抗原結合フラグメントは、化学実体またはフラグメントが、本発明によって規定されるようなＣＤ１５４の結合部位と結合するそれらの能力についてスクリーニングされ、そして選択される、一連の工程によって、計算的に評価され、そして設計され得る。
【０１００】
当業者は、ＣＤ１５４、より詳細には、ＣＤ１５４の結合部位に結合する化学実体またはフラグメントの能力について、化学実体またはフラグメントをスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを使用し得る。このプロセスは、例えば、機械読取り可能な記憶媒体から作製された図４のＣＤ１５４座標に基づくコンピュータスクリーン上の抗ＣＤ１５４抗体に対する結合部位の視覚的観察によって開始し得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学実体は、上で規定されるように、ＣＤ１５４の個々の結合部位内で、種々の配向で位置付けられ得るかまたはドッキングされ得る。ドッキングは、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを使用して行われ、標準的な分子力学力場（例えば、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲ）を用いるエネルギー最小化および分子動力学を達成し得る。
【０１０１】
専門のコンピュータプログラムは、フラグメントまたは化学実体を選択するためのプロセスにおいて役に立ち得る。これらには、特に、以下が挙げられる：
１．ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，「Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−６５７頁（１９８５））（ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である）。
２．ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．およびＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ．「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２９−３４頁（１９９１））（ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手可能である）。
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．およびＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２頁（１９９０））（ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である）。
４．ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら、「Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２））（ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である）。
【０１０２】
一旦、適切な化学実体またはフラグメントが選択されると、これらは単一の化合物に集合され得る。集合は、ＣＤ１５４の構造座標に関してコンピュータスクリーン上に表示される三次元画像上におけるこのフラグメントの互いに対する関係を視覚的に調べることによって行われ得る。この後に、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを使用する手動のモデル構築が続く。
【０１０３】
化学実体に対する上に記載される評価プロセスは、化合物および５ｃ８  ｍＡｂ改変体について同様の様式で実施され得る。
【０１０４】
当業者が個々の化学実体またはフラグメントを結合することを補助するのに有用なプログラムとしては、以下が挙げられる：
１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．ら，「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６頁（１９８９））（ＣＡＶＥＡＴは、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手可能である）、
２．ＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）のような３Ｄデータベースシステム（この領域は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．，「３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５４頁（１９９２）において概説される）、
３．ＨＯＯＫ（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手可能である）。
【０１０５】
ＣＤ１５４アンタゴニストまたはＣＤ１５４結合化合物を、１度に１つのフラグメントまたは化学実体の様式で構築することを上記のように行うかわりに、ＣＤ１５４アンタゴニストまたは他のＣＤ１５４結合化合物（５ｃ８  ｍＡｂもしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ、またはこのいずれかの抗原結合フラグメントの改変体を含む）は、空の結合部位を使用するか、またはＣＤ１５４の既知のアンタゴニストまたはＣＤ１５４結合化合物のいくつかの部分を必要に応じて含めるかして全体もしくは「デノボ」で設計され得る。これらの方法としては、以下が挙げられる：
１．ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．−Ｊ．，「Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６，６１−７８頁（１９９２））（ＬＵＤＩは、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である）、
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．およびＡ．Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９８５頁（１９９１））（ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手可能である）、
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（これは、Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）。
【０１０６】
他の分子モデリング技術がまた、本発明に従って使用され得る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４頁（１９９０）を参照のこと。また、Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．およびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）を参照のこと。
【０１０７】
一旦、５ｃ８  ｍＡｂもしくはヒト化５ｃ８  ｍＡｂの化合物もしくは改変体またはそのいずれかの抗原結合フラグメントが上記の方法で設計されるかまたは選択されると、この実体、化合物または５ｃ８  ｍＡｂ改変体がＣＤ１５４に結合し得る効率は、計算的な評価によって、試験され、そして最適化され得る。例えば、ＣＤ１５４結合化合物として機能するように設計されるかまたは選択される化合物はまた、この化合物がネイティブのＣＤ１５４に結合する場合に、好ましくは、その結合部位に占有されている空間と重ならない空間に広がらなければならない。効率的なＣＤ１５４結合化合物は、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間のエネルギーにおける相対的に小さい差異（すなわち、結合の小さい変形エネルギー）を実証しなければならない。従って、最も効果的なＣＤ１５４結合化合物は、好ましくは、約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超過しない（好ましくは、７ｋｃａｌ／ｍｏｌを超過しない）結合の変形エネルギーを伴って設計されるべきである。ＣＤ１５４結合化合物は、結合エネルギー全体において類似の１以上のコンフォメーションでＣＤ１５４と相互作用し得る。この場合、この結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーとこの化合物がタンパク質に結合した場合に観察されるコンフォメーションの平均エネルギーとの差異に算入される。
【０１０８】
ＣＤ１５４に結合するように設計されるかまたは選択される化合物は、さらに計算上で最適化され得、その結果、この化合物は、その結合状態において、好ましくは標的タンパク質との反発性の静電的相互作用を欠く。このような非補完的（例えば、静電的な）相互作用は、反発性の電荷−電荷相互作用、反発性の双極子−双極子相互作用、および反発性の電荷−双極子相互作用を含む。具体的には、この化合物がＣＤ１５４に結合する場合に、化合物とタンパク質との間の全ての静電的な相互作用の和は、好ましくは、中性であるか、またはこの和は、結合エンタルピーに有利な寄与を与える。
【０１０９】
特定のコンピュータソフトウェアが、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために当該分野で利用可能である。このような用途について設計されるプログラムの例としては、以下が挙げられる：
【０１１０】
【数２】
2004517814.tif 000004
【０１１１】
これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ製のワークステーション、ＩＲＩＳ  ４Ｄ／３５ワークステーションまたはＩＢＭ  ＲＩＳＣ／６０００ワークステーション  モデル５５０を使用して実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが、当業者に公知である。
【０１１２】
一旦、ＣＤ１５４−結合化合物が上記のように最適に選択されるかまたは設計されると、置換が、原子または側鎖のいくつかにおいてなされ得、その結合特性を改善するかまたは改変し得る。一般に、はじめの置換は保存的であり、すなわち、この置換基は、元々の基とおおよそ同じであるサイズ、形状、疎水性、および電荷を有している。当然、コンフォメーションを変化させる当該分野で公知の成分は回避されるべきであることが理解されるべきである。従って、このような置換された化合物は、上で詳説したものと同じコンピュータによる方法によって、ＣＤ１５４に対する適合の効率について分析され得る。
【０１１３】
本発明によって可能となり、そして実行され得るアプローチは、ＣＤ１５４に全体または部分的に結合し得る化学実体または化合物のついての低分子データベースの計算機スクリーニングである。このスクリーニングにおいて、このような実体の結合部位に対する適合の質は、形状の相補性または推定相互作用エネルギーのいずれかによって判断され得る（Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１３，５０５−５２４頁（１９９２））。
【０１１４】
（化合物）
本発明の化合物は、合成化合物であり得る。１つの実施形態において、本発明の方法によって設計される合成化合物は、好ましくは約１０００ダルトン以下である分子量を有する。本発明の方法によって設計される合成化合物は、好ましくは、生理学的条件のもとで可溶性である。本発明の方法によって設計される合成化合物は、好ましくは、生物学的利用能がある。本発明の方法によって設計される合成化合物は、好ましくは、経口的に投与可能である。本発明の方法によって設計される合成化合物は、その標的（ＣＤ１５４）が生理学的濃度で存在する場合に、好ましくは、その標的に結合可能である。本発明の方法によって設計される合成化合物は、好ましくは、非毒性であるか、または医学的に受容可能な毒性を有する。
【０１１５】
（化合物が結合し、そしてＣＤ４０：ＣＤ１５４の相互作用を遮断したことを確認するためのアッセイ）
当業者は、本発明の方法に従って設計された実体、化合物、５ｃ８  ｍＡｂ改変体またはヒト化５ｃ８  ｍＡｂ改変体がＣＤ１５４に特異的に結合してするか否か、およびこれらがＣＤ４０：ＣＤ１５４相互作用を遮断し得るか否かを評価するための従来のアッセイを知っている。これらのアッセイは、ＣＤ１５４とＣＤ４０との間の相互作用を介して、Ｂ細胞が活性化Ｔ細胞によって活性化されるか否か、またはＢ細胞が活性化Ｔ細胞によってどの程度まで活性化されるかを、検出する。例えば、Ｂ細胞上のＣＤ２３レベル、またはＢ細胞による免疫グロブリンの分泌をモニターすることによって、ＣＤ４０とＣＤ１５４との間の相互作用を介する活性化Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化を示す。例えば、米国特許第５，４７４，７７１号を参照のこと。従って、このようなアッセイの例は、以下である：ＣＤ４０とＣＤ１５４との相互作用をブロックするためのインビトロアッセイ；Ｂ細胞のＴ細胞活性化についてのインビトロアッセイ；Ｂ細胞による免疫グロブリン産生についてのインビトロアッセイおよび体液性免疫応答の阻害についてのインビトロアッセイ。
【０１１６】
（被験体中の不適切なＣＤ１５４誘導性活性化に伴う条件）
本発明に従って設計された化学実体および化合物（これは、ＣＤ１５４のアゴニストまたはアンタゴニスト、５ｃ８  ｍＡｂ改変体およびヒト化５ｃ８  ｍＡｂ改変体を含む）を使用して、不適切なＣＤ１５４誘導性活性化に関する状態を有する被験体の予防および処置を行い得る。被験体内での不適切なＣＤ１５４誘導性活性化に関連する状態の処置としては、特に、状態の重篤度を低くすること、この状態の効果を抑制すること、この状態を阻害することおよびこの状態を一変させることが挙げられる。
【０１１７】
被験体における不適切なＣＤ１５４媒介性活性化に関わる状態の例としては、特に、望まない免疫応答、望まない炎症応答、自己免疫疾患、アレルギー、治療剤に対するインヒビター応答、ドナー器官の拒絶反応およびＢ細胞性の癌が挙げられる。
【０１１８】
被験体内の不適切なＣＤ１５４媒介性活性化に関連する状態の例としては、特に、以下が挙げられる：全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、ループス神経炎（ｌｕｐｕｓ  ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、気腫、多発性硬化症、ブドウ膜炎、アルツハイマー病、外傷性脊髄傷害、発作、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性再狭窄（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、虚血性うっ血性心不全、肝硬変、Ｃ型肝炎、糖尿病性ネフロパシー、糸球体腎炎、変形性関節症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性硬化症、放射線誘導性線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、クローン病、潰瘍性大腸結腸炎、多発性骨髄腫、および悪液質。
【０１１９】
（被験体）
本発明に従って設計される新規のＣＤ４０：ＣＤ１５４結合遮断剤は、不適切なＣＤ１５４活性化に関連する状態に罹患しているかまたは罹患しようとしている任意の哺乳動物被験体に対する処置または予防のために投与され得る。好ましくは、この被験体は霊長類、より好ましくは高等霊長類、最も好ましくはヒトである。本発明の他の実施形態において、この被験体は、商業的に重要な哺乳動物またはコンパニオンアニマルあるいは貴重な他の動物（例えば、絶滅危惧種のメンバー）であり得る。従って、被験体は、特に、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラットおよびマウスであり得る。
【０１２０】
（投与経路）
本発明に従って設計されるＣＤ４０：ＣＤ１５４結合遮断剤は、医学的に受容可能な任意の様式で投与され得る。特定の環境に依存して、局所投与または全身投与が所望され得る。局所投与は、例えば、結膜下投与によるものであり得る。好ましくは、この遮断剤は、経口経路、腸内経路、または非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内，眼窩内、心室内、腹腔内、被膜下、頭蓋内、脊椎内、局所または鼻腔内の注射、注入または吸入）を介して投与される。この遮断剤はまた、注入ポンプまたは生体適合性もしく生体分解持続放出性のインプラントの移植によって被験体に投与され得る。
【０１２１】
（用量および処置の頻度）
一般に、本明細書に記載の方法は、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合遮断剤を所望の間隔（例えば、毎日、１週間に２回、１週間に１回、二週間毎、１月毎、または適切と考えられる他の間隔）で少なくとも２または３週間の期間にわたって投与することを包含する。この投与スケジュールは、被験体において不適切または異常なＣＤ１５４活性化に関連する状態を処置するのに必要である場合に調整される。本発明の処置レジームは、疾病のそれに続くエピソードの成り行きにおいて反復され得る。
【０１２２】
本発明の方法を使用して設計されたＣＤ４０：ＣＤ１５４結合遮断剤は、薬学的に有効な量、予防的に有効な量、または治療的に有効な量で投与され得、この量は、不適切または異常なＣＤ１５４活性化に関連する状態の危険性があるかまたはこれらに罹患している患者において、検出可能であって好ましくは医学的な効果を生じるのに十分な量である。医学的に有益な効果としては、被験体の医学的状態の衰えを予防し、阻害し、一変させるか、または被験体の医学的状態を検出可能な程度に改善することが挙げられる。患者において不適切または異常なＣＤ１５４誘導性活性化に関わる所定の免疫学的な状態のために、患者に投与されるべき任意の特定の化合物についての投薬の量および頻度は、当業者および医療技術および薬学的技術の熟練者の臨床的な判断の範囲にある。一般的な投薬量および投与レジームは、その化合物の最適な投与パラメーターを決定するための広範であるが慣用的な研究を伴う臨床前試験および臨床試験によって確立され得る。このような推奨が行われた後でさえ、医師はしばしば、種々の考慮（例えば、個体の年齢、医療状態、体重、性別および他の医薬との同時処置）に基づいて、異なる被験体についてこれらの投薬量を変更する。使用される各ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤の最適な投薬量および投与レジームの決定は、医療分野および薬学分野の当業者にとって慣用的な事項である。
【０１２３】
一般に、投薬の頻度は、主治医または同様の熟練した医師によって決定され得、そしてより多い投薬頻度の期間（例えば、毎日または毎週の間隔で）を含み得、あるいは、より少ない頻度の投薬期間（例えば、毎月またはそれより長い間隔で）を含み得る。
【０１２４】
ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤についての投薬の考慮を例示するために、以下の抗ＣＤ１５４  ｍＡｂについての投与方法の例が、手引きとして示される。この投与量は、他のタイプの抗ＣＤ１５４化合物について容易に調節または適合され得る。一般に、約０．０５ｍｇ／ｋｇ患者体重と約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重との間の単回投薬量が意図され、投薬量は、最も頻繁には、１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。緊急処置（例えば、移植の前もしくは移植時、または移植片拒絶が始まっている任意の事象に応答して）について、本発明の新規ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害化合物の有効量は、代表的な抗体（例えば、５Ｃ８  ｍＡｂ）の有効量を模倣し得、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、１〜５日間にわたって毎日、好ましくはボーラス静脈内投与によって投与され得る。同じ投薬量および投薬スケジュールが、負荷維持レジメンの負荷期間に使用され得、維持期間は、１週間から３ヶ月の任意の処置期間の間、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体の静脈内投与または筋肉内投与を含む。長期の処置もまた、維持レジメンによって行われ、この維持レジメンは、抗体が、約１週間〜約３ヶ月の範囲の投薬間隔で、静脈内経路または筋肉内経路によって、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与されるレジメンを模倣する。さらに、長期の処置は、断続的なボーラス静脈内レジメンによってもたらされ得、このレジメンは、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間の抗体が投与され、連続する処置の間の間隔が１〜６ヶ月であるレジメンを模倣する。断続的なボーラスレジメンを除く全てについて、投与はまた、経口経路、経肺経路、経鼻経路または皮下経路による投与であり得る。
【０１２５】
処置について、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤は、薬学的組成物または予防的組成物中に処方され得、これらの組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に分散された、それぞれ、薬学的に有効な量または予防的に有効な量のＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤を含む。いくつかの実施形態において、この薬学的組成物または予防的組成物はまた、薬学的に有効な量または予防的に有効な量の別の免疫抑制化合物または免疫調節化合物を含み、これらとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２８（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）、ＣＤ８０またはＣＤ８６によるＴ細胞同時刺激シグナル伝達を妨害する薬剤；カルシニュリンシグナル伝達を妨害する薬剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスのようなマクロライド、以前はＦＫ５０６として公知）；コルチコステロイド；または抗増殖剤（例えば、アザチオプリン）。ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤と共に使用するために適切な他の治療的に有効な化合物としては、ラパマイシン（シロリムスとしても公知）；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、ブレキナルナトリウム、レフルノミド、アザスピラン（ａｚａｓｐｉｒａｎｅ）などが挙げられる。
【０１２６】
被験体における不適切または異常なＣＤ１５４活性化に関連する状態の処置のための、本発明に従う組み合わせ治療は、Ｂ細胞に標的化された薬剤（例えば、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体または抗ＣＤ２０抗体（結合されていないかまたは放射標識されている）、ＩＬ−１４アンタゴニスト、ＬＪＰ３９４（ＬａＪｏｌｌａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  レセプターブロッカー）、ＩＲ−１１１６（Ｔａｋｅｄａ  低分子）および抗Ｉｇイデオタイプモノクローナル抗体）と共に、合成ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤を使用することを包含する。あるいは、この組み合わせは、Ｔ細胞／Ｂ細胞標的化剤（例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＩＬ−２アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−６アンタゴニスト、レセプターアンタゴニスト、抗ＣＤ８０／ＣＤ８６モノクローナル抗体、ＴＮＦ、ＬＦＡ１／ＩＣＡＭアンタゴニスト、ＶＬＡ４／ＶＣＡＭアンタゴニスト、ブレキナルおよびＩＬ−２トキシン結合体（例えば、ＤＡＢ）、プレドニゾン、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、シクロホスファミド、およびカルシニュリンシグナルブロッカーのような他の免疫抑制剤（タクロリムス（ＦＫ５０６）を含むがこれに限定されない））を含み得る。組み合わせはまた、Ｔ細胞標的化剤（例えば、ＣＤ４アンタゴニスト、ＣＤ２アンタゴニストおよび抗ＩＬ−１２抗体）を含み得る。
【０１２７】
不適切または異常なＣＤ１５４の活性化に関連する状態を有する被験体に、ＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤と同時投与され得る免疫調節性化合物は、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＲＡＮＫ  Ｆｃからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する抗体であり得る。
【０１２８】
（処方物）
一般的に、本発明のＣＤ４０：ＣＤ１５４結合妨害剤は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤に、懸濁、溶解または分散される。得られる治療組成物は、レシピエントのホメオスタシス、特に、電解質のバランスに悪影響を与えない。従って、代表的なキャリアは、通常の生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）を含む。他の受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０に記載される。受容可能なキャリアとしては、生体適合性、不活性、または生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖類もしくは多糖類、ポリマー、粘弾性化合物（例えば、ヒアルロン酸）、粘度改良剤、保存剤などが挙げられ得る。
【０１２９】
本明細書中で列挙される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【０１３０】
以下は、本発明の方法および組成物を説明する実施例である。これらの実施例は、説明のみの目的で含まれる。
【０１３１】
（実施例１  ヒト化５ｃ８  ＦＡＢ−ＣＤ１５４複合体の結晶構造の決定）
ヒト化５ｃ８  ｍＡｂを、以下の方法により、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により調製した。抗ヒトＣＤ１５４  ５ｃ８  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０９１６を有するハイブリドーマにより産生された）（米国特許第５，４７４，７７１号およびＬｅｄｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１０９１（１９９２）（両方の開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載されている）の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、マウスハイブリドーマ細胞由来の総細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。ヒト化のために、このマウスＣＤＲを、従来の組換えＤＮＡ技術によって、相同なヒト可変領域のフレームワークに移植し、抗原結合を維持するのに重要であるとみなされるマウス残基を保持させた。図８の配列を参照のこと。従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、可変領域のＤＮＡを、ヒト定常領域（ＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖）に融合し、そしてＮＳ０骨髄腫細胞においてヒト化５ｃ８  ｍＡｂを安定に発現するベクターを構築した。この細胞株を増殖し、そしてヒト化５ｃ８  ｍＡｂを従来技術によって９５％より高い精製度まで精製し、そしてこれは、結合アッセイおよびバイオアッセイにより、インビトロでの阻害について生物学的に活性であることが示された。ヒト化５ｃ８  ｍＡｂは、マウス５ｃ８  ｍＡｂの結合特性を維持していた。
【０１３２】
本質的にパパイン製造者（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により記載されているように（少し改変を加えて）、ＰｉｅｒｃｅのＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐａｐａｉｎ（＃２０３４１）を用いて、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ全体をパパインで切断し、そしてそのＦａｂフラグメントを単離することにより、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントを生成した。インタクトなヒト化５ｃ８  ｍＡｂを、２０ｍＭリン酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２５ｍＭシステインを含む緩衝液（ｐＨ７．０）中で、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。固定化パパインを１：５０の酵素：基質比で添加し、そして３７℃で一晩、振盪しながら消化した。固定化パパインを除去し、そして粗消化物を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析した。Ｆａｂフラグメントを、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ／Ｍ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＰＯ４２Ｍ２６）により、浅い塩勾配を用いて、残存するインタクトな抗体、ダイマーＦａｂフラグメント、およびＦｃフラグメントから分離した。次いで、このヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントを、ＰＢＳ（１４．４ｍＭ第二リン酸ナトリウム、５．６ｍＭ第一リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に緩衝液交換し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりさらに精製した。ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントは、重鎖の少なくともアミノ酸１〜２１９（図４および８のＧｌｎ１〜Ｌｙｓ２１９）および軽鎖のアミノ酸１〜２１５（図４および８のＡｓｐ１〜Ａｒｇ２１５）を含む。ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントはパパイン消化により生成されたので、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖の正確なＣ末端を決定しなかった。重鎖のアミノ酸１〜２１９および軽鎖の１〜２１５は、結晶構造中に見られた。
【０１３３】
ＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインの残基１１６〜２６１からなる組換え可溶性ＣＤ１５４である（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３、１０３１−１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３、１４４６（１９９５））。図８を参照のこと。残基１１６〜２６１からなる組換えヒト可溶性ＣＤ１５４を、Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３、１０３１−１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３、１４４６（１９９５）に記載されるように、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓクローンから発現させ、そして精製した。この可溶性ＣＤ１５４を過剰なｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントと混合し、そして３７℃で１５分間インキュベートした。複合体化しなかったｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントを、Ｓ２００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｂｃｏ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより、飽和状態のＣＤ１５４−ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ複合体から分離した。ＣＤ１５４−ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ複合体を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０（Ａｍｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＰＢＳ緩衝液中で１０〜１５ｍｇ／ｍｌまでさらに濃縮した。飽和複合体中のＣＤ１５４およびｈｕ５ｃ８  Ｆａｂフラグメントの化学量論を、架橋剤を用いる場合と用いない場合の、この複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。
【０１３４】
結晶化条件を決定するために、不完全な要因のスクリーニング（Ｊａｎｃａｒｉｃｋ  ＆  Ｋｉｍ（１９９１）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４，４０９−４１１）を、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｃｈ（Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ，ＣＡ）のＣｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎキットを用いて設計した。代表的な実験において、タンパク質溶液を、等量のリザーバー溶液と混合し、そしてこの混合物の液滴を、ガラスカバースリップの下、リザーバー溶液の上で懸濁した。２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５５０、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．０１硫酸亜鉛を含むリザーバー溶液と等量のＣＤ１５４−５ｃ８  Ｆａｂ複合体溶液を混合することにより、室温での蒸気拡散によって、結晶を成長させた。この結晶は、０．７×０．７×０．０２ｍｍの寸法の薄くて極めて脆いプレートであった。これらは数日の内に成長し、そして再現が容易であった。いくつかの結晶を洗浄および溶解し、そしてこのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、この結晶がＣＤ１５４−ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ複合体からなることを確認した。
【０１３５】
この結晶を、２５％  ＰＥＧ  ４００、２０％  ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５５０、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．０１硫酸亜鉛を含有する溶液中に浸すことにより凍結保護し、そして液体窒素ガス流中（−１７５℃）で凍結させた。結晶のなまし手順を実施した（Ｈａｒｐら、（１９９８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５４、６２２−６２８）。２５％  ＰＥＧ  ４００、２０％  ＰＥＧ  ＭＭＥ  ５５０、０．１Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、０．０１硫酸亜鉛の０．３ｍｌの溶液中での凍結の後、結晶をすばやく室温に３分間移し、次いで、液体窒素ガス流中で再度凍結させた。
【０１３６】
Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＩイメージプレートディテクターシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を用いて、分解能３．１Åまでの未処理のＸ線データセットを１つの結晶から収集した。このデータを、ＨＫＬプログラムパッケージを用いて積算および換算した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．（１９９３）Ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ，５６−６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｔｕｄｙ  ｗｅｅｋｅｎｄ：ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓａｗｅｒ，Ｌ．，Ｉｓｓａｃｓ，Ｎ．＆  Ｂａｉｌｅｙ  Ｓ．編，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）。このデータの収集は、約４日を要した。このデータセットは９６．１％の完全性であり、そして７．６％のＲマージを有した。さらなるデータの統計については表１を参照のこと。
【０１３７】
データ処理により、およそのセル寸法ａ＝２２４．４８Å、ｂ＝１２９．９１Å、ｃ＝９６．４９Å、およびβ＝１０９．６Ｂを有する単斜晶単位のセルが示唆された。空間群をＣ２と同定した。Ｍａｔｔｈｅｗ値（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．（１９６８），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３，４９１−４９７）は、３．１Å３Ｄａ−１であり、非対称単位中のＣＤ１５４トリマーと３つのＦａｂフラグメントの複合体を想定し、溶媒含量は６０．７％であった。ＸＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．（１９９２）Ｘ−ＰＬＯＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１：Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）により算出した自己回転関数（ｓｅｌｆ  ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、Ｋ＝１２０°で６．９７６３の強いピークを示した。このピークは、単位セルのａｂ平面に垂直な３回回転軸が存在したことを示した。
【０１３８】
引き続く分子置換計算を、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｏ．４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ；ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｔｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０〜７６３）からの、プログラムＡＭｏＲｅ（Ｎａｖａｊａ，Ｊ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ５０，１５７〜７６３）で行った。分子グラフィック操作を、プログラムＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。ヒトＣＤ１５４の結晶構造からのＣＤ１５４の細胞外ドメイン（Ａ鎖、Ｂ鎖およびＣ鎖）の三量体の座標（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｕｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１０３１〜１０３９（１９９５）、Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３、１４４６（１９９５）、米国特許出願０９／１８０，２０９およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／００８９５（これらの全ての開示は、本明細書中で参考として援用されている）（ＰＤＢエントリーコードｌａｌｙ））を、回転サーチおよび並進サーチのためのプローブとして使用した。全ての原子の座標（側鎖を含む）は、このサーチモデル中に含まれた。この回転サーチにより、自己回転サーチによって予測される３回回転軸と一致した２４．４の相関係数（ｃｃ）を有する単一の溶液を得た。この溶液を並進サーチのために使用し、これにより、１９．０のｃｃおよび５０．７％のＲ因子を有する単一のピークを得た。剛体改良（ｒｉｇｉｄ  ｂｏｄｙ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を使用して、これらの値を２０．０のｃｃおよび５０．３％のＲ因子に改良した。続いて、ＣＤ１５４溶液を固定したままで、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメントに関するサーチを実施した。複合体化されていないヒトのヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂの部分的に改良した結晶構造を、サーチプローブとして使用した。図９に、その結晶構造体の構造座標を示す。この回転サーチにより、３回回転軸に関連するいくつかを含む、数本の重要ではないピークを生じた。これらのピークの各々のための並進サーチにより、このピークが、補正溶液に対応する３回回転軸に関連し、そして３つのヒト化５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂフラグメント（２０．６のｃｃおよび５０．２％のＲ因子）を配置することを可能にすることを確認した。ＣＤ１５４の三量体および３  Ｆａｂフラグメントの剛体改良により、３５．１のｃｃおよび４８．７％のＲ因子を生じた。
【０１３９】
２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップの計算（図３）は、ＣＤ１５４およびＦａｂフラグメントのＦｖドメインについての連続的な電子密度を示したが、Ｆａｂフラグメントの一定のドメインについて弱い電子密度を示すか、または全く電子密度を示さなかった。このことは、明らかに、サーチプローブのエルボー角度とは異なるＦａｂのエルボー角度のために、Ｆａｂの一定のドメインが正しく配置されないことを示した。一定のドメインを配置するために、Ｆａｂのエルボー角度（Ｆｖに固定されたままである）を、ＸＰＬＯＲパッケージからのスクリプトを使用して１０°の増加で変更し、そして相関係数をモニタリングした。相関係数は、−５０°のエルボー角度でその最も高い値を有し、これは、一定のドメインの近似位置に対応する。２０−４Åの分解範囲のデータを使用して、ＸＰＬＯＲを用いる引き続く剛体改良を、一定のドメインの位置に最適化し、Ｒ因子を４９．４％〜４０．０％の（Ｒフリー（Ｒ  ｆｒｅｅ）＝４０．５％）に減少した。
【０１４０】
全ての引き続く改良計算を、ＸＰＬＯＲプログラムを用いて実施した。このデータの５パーセントを、Ｒフリー因子の計算のために確保した。モデルバイアスを減少させるために、部分的なモデルを、２Ｆｏ−Ｆｃマップ計算およびモデル改良のために使用した。初期の部分モデルを、シミュレートされたアニーリングおよび非結晶学的対称性拘束でグループ分けされたＢ因子改良に供した。このＲワーク因子およびＲフリー因子は、それぞれ２７．０％および３２．０％に降下した。反復性モデル構築からなるいくつかのサイクル、最大の尤度位置の改良（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，５０１８〜５０２３）およびＢ因子の改良に従った。シミュレートされたアニーリング概略マップを、構造の特定の領域のモデル化を確認するために計算した。Ｒフリー因子の降下をもたらすモデル調製のみが、受け入れられた。バルクな溶媒補正は、適用されなかった。非結晶学的対称性拘束を、改良の最終工程において取り除いた。最終のモデルのＲワーク因子およびＲフリー因子は、３５−３．１Å分解範囲におけるデータ（Ｆ＞２σ）に対して、それぞれ２３．３％および２８．５％であった。立体化学統計学により、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｓ．、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２６，２８３〜２９０）で計算した。水素結合（＜３．６Å）を、プログラムＣＯＮＴＡＣＴ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｏ．４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）で見出した。最終のモデルは、１３，１７３個の原子が連続する９種のポリペプチド鎖（鎖の名前は、３種のＣＤ１５４モノマーについてＡ、Ｂ、Ｘ、３種のＦａｂ重鎖についてＨ、Ｋ、Ｘ、および３種のＦａｂ軽鎖についてＬ、Ｍ、Ｙである）からなった。表１は、結晶学的分析の詳細および要約を示す。
【０１４１】
（表１）
（結晶学的分析の要約）
（データコレクション）
【０１４２】
【表１】
2004517814.tif 000005
【０１４３】
ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントで複合体化されたＣＤ１５４細胞外ドメイン（残基１１６〜２６１）の球状部分の構造は、分子置換による３．１Å分解で決定し、そして２３．３％の結晶性Ｒ値（Ｒフリー２８．５％）に改良した。結晶性構造において目に見えるＣＤ１５４の残基は、アミノ酸１１９〜２６１（Ａｓｎ１１９〜Ｌｅｕ２６１（図４〜８））であった。結晶の対称性単位は、ＣＤ１５４ホモ三量体および３つのＦａｂフラグメントからなる単一の複合体を含んだ。ＣＤ１５４のＮ末端残基１１６〜１１８を除くほとんど全ての残基は、最終の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップにおいて十分規定されていた。この最終のモデルは、１７３１個のアミノ酸残基が連続する９個のポリペプチド鎖および３個の亜鉛イオンからなった。水分子は、モデル中に含まれていなかった。ＣＤ１５４の炭化水素についてのいくつかの電子密度は、観測されたが、炭化水素残基のモデル化を可能にするのに十分な質ではなかった。この立体化学は、良好であった（結合長の平方自乗平均（ｒ．ｍ．ｓ．）偏差は、０．０１４Åであり、そして結合角は、１．８９°であった）。ほとんどの改良プロセスの間の非結晶学的対称性拘束を使用することに起因して、異なるＣＤ１５４モノマーまたはＦａｂフラグメントからの等価な残基間のｒ．ｍ．ｓ．位置偏差は、小さかった（主鎖の原子について０．１８Å）。ＣＤ１５４の残基１８３を除いて、全ての非グリシン残基は、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ図の許容された領域中にあった。主鎖原子の平均Ｂ因子は、１８．８Å２であった。Ｆａｂフラグメントの一定のドメインは、可変ドメイン（平均Ｂ因子が約１４．１Å２）と比較してかなり高いＢ因子（平均Ｂ因子が約２９．５Å２）を有する。このことは、可変ドメインと比較して、Ｆａｂフラグメントの一定のドメインに対してより少ない結晶接触の結果であるようである。
【０１４４】
複合体は、３枚刃のプロペラ形状を有し、そして単一のＣＤ１５４ホモ三量体にラジカル結合した、３つのｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ分子からなった（図１および２）。この複合体の寸法は、１４０×１４０×６０Åであった。ＣＤ１５４三量体の３回回転軸は、複合体の非結晶性３回回転軸を有すると考えられた。Ｆａｂフラグメントの近似の偽２回回転軸（これは、重鎖および軽鎖に関連する）は、複合体の３回回転対称角度を増加し、３回回転軸に対して垂直な面に３０℃上向きの近似角度を有した。ＣＤ１５４が細胞表面上に存在するという事実を考慮した場合、この平面は、細胞表面と一致すると予想される。
【０１４５】
この結晶化ＣＤ１５４フラグメントは、ホモ三量体タンパク質であり、そして各モノマーは、Ｇｒｅｅｋキートポロジーでβシートサンドイッチとして折り畳まれた。三量体の全体の形状は、不完全なピラミッドの形状に類似していた。Ｆａｂを有する複合体中のＣＤ１５４の構造は、複合体化されていないヒトＣＤ１５４の構造と非常に類似していた（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１０３１〜１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１４４６（１９９５）、米国特許出願０９／１８０，２０９およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／００８９５）。ＣＤ１５４のＡ−Ａ”ループは、複合体化されていないＣＤ１５４結晶構造中において元々観測された、伸長された構造を維持し、そしてＴＮＦファミリーの他のメンバーの典型ではなかった。このことは、この構造が実在し、そして結晶接触の結果ではないことをさらに示唆する。複合体化されたＣＤ１５４三量体上での複合体化されていないヒトＣＤ１５４三量体の重なり（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１０３１〜１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１４４６（１９９５）、米国特許出願０９／１８０，２０９およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／００８９５）（ＰＤＢエントリーｌａｌｙ））は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ結合上でのＣＤ１５４の有意な構造変化が存在しないことを示した（ｒ．ｍ．ｓ．偏差は、主鎖原子に対して０．７６Åである）。最も大きな差異（４Åシフトまで）は、ＣＤおよびＣＤ１５４のＥＦループにおいて観測され、これは、ｈｕ５ｃ８  Ｆａｂエピトープから離れて、不完全なピラミッドの「頂部」に配置される。これらのループは、ＣＤ１５４部分の最も移動可能な領域であることが知られており（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１０３１〜１０３９（１９９５）およびＫａｒｐｕｓａｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１４４６（１９９５）、米国特許出願０９／１８０，２０９およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／００８９５）、従って、観測された差異は、ｈｕ５ｃ８  Ｆａｂ結合の結果であるようではなかった。いくつかの有意な差異（特に補償的回転異性体シフト）を、結合エピトープの２、３の残基の側鎖（ＣＤ４０結合にとって重要であることが示されているＣＤ１５４のＹ１４５残基およびＲ２０３残基を含む）について観測した。
【０１４６】
Ｆａｂフラグメントを、元々のマウスの５ｃ８  ｍＡｂのヒト化バージョンから得た（図８）。ヒト化Ｌ鎖構築物は、ハイブリドーマＡＥ６−５からのヒトサブグループＩＩＩ  ｋ鎖を基礎とした（Ｓｐａｔｚ，Ｌ．Ａ．ら（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，２８２１−８）。このＨ鎖構築物は、サブグループＩ  ２１／２８ＣＬ遺伝子を基礎とした（Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ，Ｈ．ら（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２４９６−５０１）。モデル化Ｆａｂ構築物は、重鎖の１〜２１９残基および軽鎖の１〜２１５残基からなった。ｈｃ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂの可変ドメインは、１０４０の等価原子について、１．３６Åのｒ．ｍ．ｓ．位置偏差で、抗ｐ１８５ＨＥＲ２抗体（ＰＤＢエントリー１ｆｖｄ）の可変ドメインに重ね合わせられ得る。この複合体化されたｈｕ５ｃ８  Ｆａｂのエルボー角度は、複合体化されていないｈｕ５ｃ８  Ｆａｂのエルボー角度と４９．９°異なった。軽鎖の領域ＣＤＲ  Ｌ１ループ、ＣＤＲ  Ｌ２ループおよびＣＤＲ  Ｌ３ループを決定する相補性は、標準構造３、１および１をそれぞれ有する（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，８７７−８３３）。重鎖のＣＤＲ  Ｈ１ループおよびＣＤＲ  Ｈ２ループは、標準構造１および２を有する。
【０１４７】
単一のＦａｂフラグメントのＣＤ１５４との相互作用は、ＣＤ１５４に対して７７１Å２およびｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂに対して７６５Å２が覆われる全部の溶媒接近可能な領域（１．４Åの溶媒プローブと想定される）において生じる。５ｃ８  ｍＡｂの抗原性エピトープを、ＣＤ１５４のサブユニット間の間隙の右手側に配置し、そして伸長され、かつ連続的になる。エピトープフットプリントの長軸は、ＣＤ４０結合部位の長軸に対して平行である。興味深いことに、ＣＤ１５４のみは細胞表面上の三量体として存在するが、このエピトープはＣＤ１５４の単一モノマーからの残基のみから構成される。
【０１４８】
ＣＤ１５４上のｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂのエピトープは、Ａ−Ａ”ループの残基Ｅ１２９、Ａ１３０、Ｓ１３２、Ｅ１４２、Ｋ１４３、Ｇ１４４、Ｙ１４６；Ｃ鎖のＣ１７８；ＣＤ１５４のＧ−ＨループのＣ２１８、Ｓ２４５、Ｑ２４６、Ｓ２４８、Ｈ２４９、Ｓ２５０からなった。
【０１４９】
ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂは、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２およびＣＤＲ  Ｈ３の超可変領域、ならびにＣＤＲ  Ｌ１およびＣＤＲ  Ｌ３を使用して、ＣＤ１５４との接触を形成することで観測された。覆われた表面積のほとんどは、重鎖（６１％）によって貢献された。ＣＤ１５４との接触に関与するｈｕ５ｃ８  Ｆａｂの残基は、ＣＤＲ  Ｈ１のＳ３１（Ｈ）、Ｙ３２（Ｈ）、Ｙ３３（Ｈ）；ＣＤＲ  Ｈ２のＮ５２（Ｈ）、Ｓ５４（Ｈ）、Ｄ５７（Ｈ）、Ｎ５９（Ｈ）；ＣＤＲ  Ｈ３のＲ１０２（Ｈ）、Ｎ１０３（Ｈ）およびＣＤＲ  Ｌ１のＳ３１（Ｌ）、Ｓ３２（Ｌ）、Ｙ３６（Ｌ）；ＣＤＲ  Ｌ３のＳ９５（Ｌ）、Ｗ９６（Ｌ）であった。この接触は、特性で混合された。いくつかの極性相互作用が存在し、これらのいくつかは、いくつかの主鎖原子を含む一方で、他の原子が側鎖の原子に含まれる（図１０）。例えば、Ｙ３２（Ｈ）の側鎖は、ＣＤ１５４のＳ１３２の側鎖と相互作用すると観測され、そしてＤ５７（Ｈ）の側鎖はＣＤ１５４のＳ２４８と相互作用すると観測された。また、Ｎ５５側鎖のＯ１原子は、ＣＤ１５４のＣｙｓ１７８のカルボニル酸素とＨ結合を形成すると観測された。塩橋の相互作用は、界面において見出されなかった。さらに、いくつかの芳香族残基（ＣＤ１５４のＹ１４６、Ｈ２４９、重鎖のＹ３２、Ｙ３３、および軽鎖のＹ３６、Ｗ９６）は、ＣＤ１５４と抗体とのファンデルワールス接触に寄与する。
【０１５０】
実施例１に記載されるような共晶構造に基づいて、ＣＤ１５４に関するｈｕ５ｃ８  ｍＡｂについてのこのエピトープは重複するが、推定のＣＤ４０結合部位と同一ではない。これは、突然変異誘発のデータに基づく以前の結論と一致している（Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。例えば、残基Ｋ１４３、および残基Ｙ１４６（これらは、ＣＤ１５４とＣＤ４０との相互作用について重要であることが、突然変異誘発により同定されている（Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．ら（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１８３３−４４およびＳｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５））はまた、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂとの相互作用に関する。特に、Ｋ１４３側鎖が、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂのＮ１０３（Ｈ）の側鎖およびｈｕ５ｃ８  ｍＡｂのＳ９５（Ｌ）の主鎖カルボニルと相互作用することが観察された。Ｙ１４６は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂのＳ３２（Ｌ）と相互作用することが観察された。この相互作用は、重鎖と軽鎖との間に形成される裂目の下部で生じ、そして抗原−抗体相互作用の最も顕著な特徴であるようであった。ＣＤ１５４の全体構造は、複合体形成していないでないＣＤ１５４の全体構造と非常に類似していた。したがって、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂの中和効果は、ＣＤ１５４−ＣＤ４０の相互作用の立体的ブロックの結果であるようであり、そして抗体に誘導される構造的変化のいずれの結果をでもないようである。ＣＤ１５４とＣＤ４０との複合体形成の際に埋め込まれた溶媒が接近可能な表面は、８３４〜１１２３Å２の範囲であることが予想される（Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．ら（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，９８８４−９２およびＳｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５）。これは、ＣＤ１５４−ｈｕ５ｃ８  Ｆａｂ複合体に埋め込まれた７６５Å２の表面積よりも広範囲である。このエピトープは、ＣＤ１５４の比較的平らな表面領域にある。
【０１５１】
かなりの電子密度が、ＣＤ１５４の残基Ｎ２４０に接触される２つのアンテナを有する複合体型炭水化物について観察された。炭水化物鎖を、結晶格子（約１００Å幅）の大きな溶媒チャネル内に収容した。炭化水素の電子密度は、おそらく無秩序に起因して、その残基のモデル構築を行うのに十分な質ではなかった。しかし、炭水化物は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂの重鎖との多数の非共有結合の相互作用を形成することが明らかになった。接触距離内で相互作用することが観察された抗体の残基は  Ｑ４３（Ｈ）、Ｅ６２（Ｈ）、Ｋ６３（Ｈ）およびＳ６６（Ｈ）を含む。これらの接触は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂとＣＤ１５４との相互作用のエネルギーに寄与し得る。ＣＤ１５４変異体Ｎ２４０Ｑ（炭水化物を欠く）は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂを用いる免疫沈降で減少レベルを示した（表２）。しかし、この変異体の発現レベルは、野生型（ＷＴ）よりもより低く、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ結合について、この炭水化物の欠損がネガティブな影響を有するのか否かを確認することは難しい。さらに、この電気密度マップは、炭水化物がＣＤ１５４のＲ２０７と相互作用することを示した。この残基は、ＣＤ１５４分子のすぐ隣の領域において、正の静電気的な電位に重大に寄与している（Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５）。
【０１５２】
亜鉛イオンは、この結合部位の近くに位置することが見出された。これは、Ｄ１００（Ｈ）、Ｄ１０６（Ｈ）およびＥ５９（Ｌ）で配位結合され、ＣＤ１５４へのこのイオンの直接的接触はなかった。このイオンは、機能的な役割を果たす見込みななく、その存在はおそらく結晶化の人為的結果である。
【０１５３】
まとめると、本発明に従ってヒト化された５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂとの複合体におけるＣＤ１５４の結晶構造は、中和抗体Ｆａｂフラグメントとの複合体におけるＴＮＦファミリーメンバーの第一の利用可能な構造を構成する。この構造は、この抗体がＣＤ４０レセプターの結合部位を立体的にブロックすることにより、ＣＤ１５４の機能を阻害することを示した。抗体結合がＣＤ１５４（ＣＤ４０結合のために必要とされ得る）の構造的変化を防ぎ得るという可能性は、無視できない。しかし、利用可能なＴＮＦリガンド構造およびそれらの複合体のレセプターとの比較は、結合部位から離れているレセプター結合の際、重大な構造的変化の証拠を示していない（Ｂａｎｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９９６），Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１９，１２５５−６１およびＨｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ら（１９９９），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４，５６３−７１）。
【０１５４】
この抗体のエピトープは、疎水性コア残基（これらの変異はＨＩＧＭＳと関連している）のクラスターのすぐ上に位置した。これらの変異が、レセプター結合に重要な表面領域の構造的な摂動を引き起こし得ることを提唱している（Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら（１９９５），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３，１４２６）。ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂについてのＣＤ１５４抗原エピトープが、変異によって最も摂動されやすい表面領域と一致することは興味深い。
【０１５５】
（実施例２  ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂおよびＣＤ４０に結合するためのＣＤ１５４の部位指向性変異体の能力を試験することによる、５ｃ８モノクローナル抗体およびＣＤ１５４のインターフェイスの性質の評価）
５ｃ８  ｍＡｂのＣＤ１５４抗原性エピトープの位置と性質を、ヒトＣＤ１５４の部位指向性変異によって研究した。選択された変異部位としては、推定のＣＤ４０結合部位に近接する表面残基、２つのＣＤ１５４モノマーのインターフェイスの残基および高−ＩｇＭ症候群（ＨＩＧＭＳ）に関連する変異に関与する残基の表面が挙げられる。残基の置換は、アラニンへの変化、電荷反転の変異または他の残基への変化を含んだ。
【０１５６】
ＣＤ１５４変異体の構築および発現は、以前に記載されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５，この開示は参考として本明細書中に援用される）。要するに、ヒトＣＤ１５４の変異体は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎ．Ｊ．）を用いる特有の部位脱離突然変異誘発により作製された。ＣＯＳ細胞を、変異体遺伝子および増幅のためのＳＶ４０起源の部位を含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、代謝性に標識し、そして収集した。細胞溶解物を、プロテインＡセファロースビーズおよび抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体で予め澄ませた。ビーズ上に収集した免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ電気泳動に供した。各変異体ヒトＣＤ１５４タンパク質の免疫沈降を、野生型ヒトＣＤ１５４タンパク質の免疫沈降と比較した。
【０１５７】
変異型全長ＣＤ１５４は、その全長膜結合形態で一過性に発現した。変異体ＣＤ１５４の発現は、ＣＤ１５４のＮ末端およびＣ末端由来の合成ペプチドに対して指向されたポリクローナル抗体を用いて、代謝性標識された細胞から得た界面活性剤抽出物の免疫沈降で確認した（Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５およびＧａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。ＣＤ１５４変異体への５ｃ８  ｍＡｂの結合を、界面活性剤抽出物由来のＣＤ１５４変異体の５ｃ８  ｍＡｂにより免疫沈降される能力をアッセイすることによって評価した。同様に、ＣＤ１５４変異体のＣＤ４０の結合を、ＣＤ４０−Ｆｃを用いる免疫沈降により評価した。ＣＤ４０−Ｆｃは、ＣＤ４０の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントの融合タンパク質である（Ｈｓｕ  ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９１１−９１５，これの開示は、参考として本明細書中に援用される）。表２は、ヒトＣＤ１５４の２３個の単一残基変異についてまとめたデータである。
【０１５８】
表２：突然変異誘発データの概要★
【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
（★）「＋，＋／−，−」の記号は、ＷＴと比較した免疫沈降のレベルを示す：「＋」匹敵するシグナル；「＋／−」減少するが検出可能なシグナル；「−」検出不可能なシグナル。
【０１６１】
これらの変異のいくつかの影響は、ＣＤ１５４の結晶構造およびＣＤ４０の相同モデルとの関連で以前に記載されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．ら（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，１１２４−３５およびＧａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。ここで、これらの影響および５ｃ８  ｍＡｂ結合のさらなる変異は、ＣＤ１５４−５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂの結晶構造との関連で解釈されている。
【０１６２】
ＣＤ１５４の表面残基の変異は、この免疫沈降に影響し、一般的に、結晶構造から決定されるように５ｃ８  ｍＡｂの抗原エピトープの位置と関連している（表２および図１１）。変異Ｈ２４９Ａに起因する免疫沈降の完全な喪失は、表面残基Ｈ２４９は、ＣＤ１５４−５ｃ８  ｍＡｂ相互作用のエネルギー学に関して重要な役割を果たし得ることを示唆する。この観察は、実施例１に記載される共晶構造においてＣＤ１５４−ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  Ｆａｂ相互作用表面（およびＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用表面）が、非常に広範囲であり、それゆえ、最も多くの場合における単一残基側鎖の欠損が、ＣＤ１５４と５ｃ８  ｍＡｂとの間の相互作用の完全な喪失をおそらくもたらさないという観察に依存する。この結晶構造は、残基Ｈ２４９がエピトープの中央に位置し、そして５ｃ８  ｍＡｂのＹ３３（Ｈ）と相互作用することを示した（実施例１）。残基Ｅ１２９のグリシンへの変異はまた、完全な免疫沈降の喪失をもたらした。この残基は、ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ  ＦａｂのＮ１０３（Ｈ）と相互作用し、そしてこの残基とグリシンとの置換はこの相互作用の喪失をもたらすことが観察された。以下にさらに議論されるように、変異Ｅ１２９Ｇはまた、構造的混乱をもたらし、これは免疫沈降の喪失の原因となり得る。他の表面残基の置換（例えば、Ｋ１４３）は、さらに中間の効果を有する。表面残基Ｙ１４５が興味深い。これは５ｃ８  ｍＡｂとの直接的な相互作用を形成することが観察されなかった。しかし、変異Ｙ１４５Ａは、５ｃ８  ｍＡｂとの免疫沈降について媒介効果を有する。実施例１に記載される共晶構造において、Ｙ１４５の側鎖のＯＨ基が、近接するＣＤ１５４モノマーのＥ２３０のカルボニル酸素と相互作用することが示された。これは、この残基がまた、免疫沈降において観察される影響を説明し得、構造を安定化させる役割を果たし得ることを示唆する。
【０１６３】
ＨＩＧＭＳ変異の多くは、５ｃＢ  ｍＡｂにより免疫沈降されるＣＤ１５４の能力を完全に喪失するという結果をもたらす（Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０およびＢａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．，ら（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１８３３−４４）。共晶構造の検査は、ＨＩＧＭＳ変異の多くが５ｃ８  ｍＡｂ相互作用に直接的に関与しない残基を含み、そしておそらく、構造的役割をより果たしやすいことを示した。例えば、残基Ａ１２３、Ｖ１２６、Ｗ１４０、Ｌ１５５、Ｙ１７０、Ａ２３５、Ｔ２５４、Ｇ２５７は、埋め込まれた残基であり、そしておそらくタンパク質の折りたたみおよび安定性にとって重要である。これに一致して、５ｃ８  ｍＡｂ結合に影響する全ての高−ＩｇＭ変異はまた、ＣＤ４０−Ｆｃ結合に影響した。ＨＩＧＭＳ変異が、構造において、ホモ三量体化を完全に防ぐのに十分な変異を誘発しないことが示されているので、大部分のＨＩＧＭＳ変異が、構造に局所的に影響を与えることは明らかである（Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。興味深いことに、既知のＨＩＧＭＳ変異に関連する多くの残基は、ＣＤ１５４上の５ｃ８  ｍＡｂエピトープの表面領域のすぐ下に埋められたクラスターを形成する（図１１）。この事実は、変異によって誘発される構造的摂動が、このエピトープの表面領域に広がること、および５ｃ８  ｍＡｂ結合の喪失を生じることをより起こりやすくする。
【０１６４】
ＨＩＧＭＳ二重変異Ｓ１２８Ｒ／Ｅ１２９Ｇおよび単一変異Ｔ２１１Ｄのみが、本質的に曝露される表面残基を含むＨＩＧＭＳ変異である。ＨＩＧＭＳ変異Ｓ１２８Ｒ／Ｅ１２９Ｇの各変異された残基の寄与を詳細に分析するために、単一変異Ｓ１２８ＲおよびＥ１２９Ｇを、二重変異体タンパク質に加えて生成した。二重変異Ｓ１２８Ｒ／Ｅ１２９Ｇならびに単一変異Ｓ１２８ＲおよびＥ１２９Ｇは、５ｃ８  ｍＡｂとＣＤ４０−Ｆｃとの結合の完全な喪失を生じた（表２）。結晶構造の検査は、残基Ｓ１２８が、５ｃ８  ｍＡｂと全く相互作用しないが、これは、５ｃ８  ｍＡｂのＹ３３（Ｈ）と相互作用する必須の残基Ｈ２４９を安定化させることを示した。そのアルギニンとの置換はこの相互作用を混乱させ得、そして正電荷の導入は、局所的な静電気的な電位を変更させ得る。変異に関連する他の残基であるＥ１２９は、５ｃ８  ｍＡｂのＮ１０３（Ｈ）と相互作用し、そしてまた、５ｃ８  ｍＡｂのＮ１０３（Ｈ）と相互作用するＣＤ１５４のＫ１４３の立体配座を安定化させることが観察された（図１０および図１１）。これのグリシンとの置換は、これらの相互作用の喪失を生じた。以前の研究はまた、変異体Ｅ１２９ＧがＣＤ４０−Ｆｃに弱く結合するが、変異体Ｅ１２９ＡはＣＤ４０−Ｆｃに野生型のように結合することを示している（Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．，ら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１８３３−４４）。これは、グリシンへの置換がこのループにさらなる柔軟性を導入し、ＣＤ１５４の構造を摂動し得ることを示唆した。従って、５ｃ８  ｍＡｂ結合に関するＥ１２９Ｇ変異の影響が、相互作用の喪失およびさらなる相互作用の喪失をもたらし得る構造の局所的な摂動の組み合わせである。Ｔ２２１Ｄ変異体は５ｃ８  ｍＡｂおよびＣＤ４０−Ｆｃ結合に関して野生型のようにふるまい、そしてこの変異がＣＤ１５４遺伝子の多型の結果であることを結論付けている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。この残基は、表面曝露型であり、そしてエピトープから離れた錐体の頂点近くに位置する（図１１）。以前の結晶学分析は、Ｔ２１１Ｄ変異体タンパク質が野生型のように折りたたまれることを確認した（Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．ら（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，３３５４５−５０）。
【０１６５】
（均等物）
本発明は、それらの精神または本質的な特徴から逸脱することなしに他の特徴的な形態で実施され得る。それゆえ、前述の実施形態は、全ての局面において本明細書中に開示される発明の例示について考慮され、これを制限するものではない。特許請求の均等の意味および範囲内での全ての改変は、本発明に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインの三量体、およびヒト化モノクローナル抗体５ｃ８（「ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂ」）の３つのＦａｂフラグメントを含む複合体のリボン図を示す。ヒト化５ｃ８  ｍＡｂの各Ｆａｂフラグメントは、ＣＤ１５４のモノマーに結合する。この図は、３回回転軸に沿った表示を提供する。３つのＣＤ１５４モノマー（ＣＤ１５４と標識されている）は、図の中央に位置する。ＣＤ１５４のモノマーに結合するヒト化５ｃ８の３つのＦａｂフラグメントは、Ｆａｂと標識され、そして重鎖および軽鎖からなる。３つのＦａｂ重鎖（「Ｈ鎖」）は、３つのＦａｂ軽鎖（「Ｌ鎖」）と比較して前面に位置し、そしてこれらの３つのＦａｂ軽鎖は、Ｆａｂ重鎖と比較して背面に位置する。
【図２】
図２は、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインの三量体、およびヒト化５ｃ８  ｍＡｂの３つのＦａｂフラグメントを含む複合体のリボン図を示す。ヒト化５ｃ８  ｍＡｂの各Ｆａｂフラグメントは、ＣＤ１５４のモノマーに結合する。この図は、３回回転軸に垂直な表示を提供する。この３回回転軸は、図の上部から下部へと延びる。ＣＤ１５４モノマーは、図の中央に位置し、このモノマーの左右に、Ｆａｂフラグメントが存在する。Ｆａｂ重鎖は、「Ｈ鎖」と標識され、そしてＦａｂ軽鎖は、「Ｌ鎖」と標識されている。ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂの３つのＦａｂフラグメントの２つのみが、示される；３つ目のＦａｂフラグメントは、明確にするために省略した。
【図３】
図３は、最終の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップの代表的な部分の立体表示を示す。このマップは、１．２σで区切り（ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ）、そして最終精錬モデル由来の対応する原子上に重ね合わせる。
【図４】
図４−１〜４−２２０は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式で複合体の結晶からのＸ線回析によって誘導されるような、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂのＦａｂフラグメントとの複合体中のヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインについての原子構造座標を列挙する。
【図５】
図５は、図６および７の記憶媒体によって符号化された命令を実行するために使用されるシステムの図を示す。
【図６】
図６は、磁気記憶媒体の断面を示す。
【図７】
図７は、光学的に読取り可能なデータ記憶媒体の断面を示す。
【図８】
図８は、ヒトＣＤ１５４のアミノ酸配列（配列番号１）を示し（大括弧中のフラグメントを、結晶化した）、そしてヒト化５ｃ８  ｍＡｂ重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号３）のアミノ酸配列を示す（大括弧中のフラグメントが、結晶構造中で見られた；ところが、結晶化した実際の分子は、数残基だけより長くあり得るか（重鎖）、またはおそらく完全配列であった（軽鎖））。ｈｕ５ｃ８  ｍＡｂの重鎖および軽鎖のＣＤＲループの残基に下線を引く。
【図９】
図９−１〜９−１３９は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式でＦａｂフラグメントの結晶からのＸ線回析によって誘導されるような、ヒト化５ｃ８  ｍＡｂの複合体化していないＦａｂフラグメントについての原子構造座標を列挙する。
【図１０】
図１０は、ＣＤ１５４−５ｃ８  ｍＡｂ界面の表示を示す。ＣＤ１５４骨格は、淡灰色のリボンで示し、そして５ｃ８  ｍＡｂの重鎖および軽鎖は、それぞれＨ鎖およびＬ鎖で標識された、濃灰色のリボンで示す。ＣＤ１５４−５ｃ８  ｍＡｂ接触に関与する残基の側鎖を示す。濃い線は、Ｈ結合を示す。
【図１１】
図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）は、変異した残基および５ｃ８  ｍＡｂについてのＣＤ１５４上の抗原性エピトープを示す。
図１１（Ａ）溶媒の接近可能な表面を、図の右側に示すモノマーに中位の灰色で示し、抗原性エピトープを示す。示されるＣＤ１５４の２つのモノマーは、空白詰め表示であり、そしてそれぞれ濃灰色（図の左側のモノマー）および淡灰色（図の右側のモノマー）である。
図１１（Ｂ）変異残基の位置を示すＣＤ１５４の空間詰め表示。変異の効果は、実施例２の表２における５ｃ８  ｍＡｂ結合についてのデータに従って、影を付けて、標識で示される：中程度の灰色（＋）、Ｋ１４３およびＹ１４５（＋／−）、濃灰色（−）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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