(57)【要約】本発明は、神経変性疾患についてのマーカーの発見に関する。特に、重要なシステイン残基で酸化を受け得ないＩＲＰ−２タンパク質の型が神経変性疾患（アルツハイマー病（ＡＤ）を含むが、これに限定されない）のための診断因子であることを見いだした。実施形態は、変異ＩＲＰ−２タンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸、変異ＩＲＰ−２タンパク質およびそのフラグメント、変異ＩＲＰ−２タンパク質およびそのフラグメント上に存在するエピトープに関する抗体、これらの核酸を作製する方法、および動物（ＡＤまたは軽度認識障害症候群（ＭＣＩ）にかかる危険性のあるヒトのような）における神経変性疾患を診断するための方法を含む。ヒト脳における鉄の分布のレベルは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって決定されるように、ＡＤおよび／またはＭＣＩを診断するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトに由来する野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループをコードする配列を含む精製または単離された核酸であって、ここで前記配列が前記ペプチドループ内に変異を含み、ここで前記変異が前記ペプチドループ内に存在するシステイン残基の酸化を受ける能力を妨げる、核酸。
【請求項２】
請求項１の精製または単離された核酸であって、前記核酸配列が配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５の少なくとも１つを含む、核酸。
【請求項３】
請求項１の精製または単離された核酸であって、前記核酸配列が配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される配列を含むペプチドをコードする、核酸。
【請求項４】
ヒトに由来する野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループを含む精製または単離されたポリペプチドであって、ここで前記配列が前記ペプチドループ内に変異を含み、ここで前記変異が前記ペプチドループ内に存在するシステイン残基の酸化を受ける能力を妨げる、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４の精製または単離されたポリペプチドであって、前記ＩＲＰ−２タンパク質が配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項４の精製または単離されたポリペプチドであって、前記ＩＲＰ−２タンパク質が配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される、ポリペプチド。
【請求項７】
神経変性疾患の処置または予防を必要とする被験体を同定する方法であって、以下：
ポリヌクレオチドまたはタンパク質を有する被験体から生物学的サンプルを得ること；
プローブを提供すること、前記プローブは野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質と相互作用するプローブおよび野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと相互作用するプローブから成る群より選択される；
該プローブが該生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用する条件下において、該生物学的サンプルを該プローブと接触させること；
該生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するプローブの量を検出すること；および
該生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と関係するプローブの存在または非存在を決定することによって、該被験体を神経変性疾患の処置または予防を必要とする被験体として同定すること、
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７の方法であって、該プローブが核酸、タンパク質および擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）から成る群より選択される、方法。
【請求項９】
請求項７の方法であって、該ポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するプローブの量の検出が、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣｓ）、免疫沈降、ウェスタンブロット、イムノクロマトグラフィー、抗体染色、およびハイブリダイゼーションアッセイから成る群より選択される技術の使用を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項７の方法であって、前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、方法。
【請求項１１】
神経変性疾患の診断のためのプローブを作製する方法であって、以下：
請求項４に記載のポリペプチドを提供すること；および
前記変異ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体を生成すること（ここで、前記抗体が野生型ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントと交差反応しない）、
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、前記変異がシステイン残基の置換または欠失を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法であって、該生成工程が前記抗体を産生する細胞を培養することを包含する、方法。
【請求項１４】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合し得る、抗体。
【請求項１５】
請求項１３の抗体であって、前記抗体が前記タンパク質の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合し、且つ該タンパク質がシステイン残基の変異を有する、抗体。
【請求項１６】
請求項１３の抗体であって、前記抗体がモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１７】
変異ＩＲＰ−２タンパク質を特異的に結合し得るが野生型ＩＲＰ−２タンパク質を特異的には結合しない精製または単離された抗体であって、前記変異ＩＲＰ−２タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列に相当するペプチドループ内に変異を含む、抗体。
【請求項１８】
請求項７の方法であって、神経変性疾患の処置または予防を必要とする被験体としての該被験体の同定が、該プローブが前記生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するか否かを決定することを包含する、方法。
【請求項１９】
ヒト患者において軽度認知機能障害症候群（ＭＣＩ）を他の型の痴呆と区別する方法であって、以下：
該患者に対して磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行い、脳鉄を定量および／またはモニターすること；
を包含し、ここで脳鉄の異常なレベルまたは分布がＭＣＩの存在を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経変性疾患のためのマーカーの発見に関する。とりわけ、鉄調節タンパク質２（ＩＲＰ−２）の形態は重要なシステイン残基で酸化を受け得ず、またアルツハイマー病を含むがこれに限定されない神経変性疾患のための診断剤であることが見出された。
【０００２】
発明の背景
神経変性疾患は、世界中で数百万人の人々を苦しめている。例えばアルツハイマー病（ＡＤ）は、心臓疾患、癌、および脳卒中に続いてアメリカ合衆国で４番目に一般的な死因である。それは、現在、アメリカ合衆国内だけでも４００万人以上の人々を苦しめ、またその数は、この集団が年を取るにつれて次の４０年間の間に２倍になると予測される。高齢およびダウン症候群は別として、神経変性疾患の進行に関わる唯一の矛盾しない危険因子は、陽性家族病歴の存在であった。現在、研究者らは、神経変性疾患の一因となる病的遺伝子を同定するための遺伝連鎖解析（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｌｉｎｋａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行っているが、しかしながら、これらの疾患の根元となる生化学的メカニズムの理解は依然として初期段階にある。
【０００３】
しかしながら最近、脳鉄調節（ｂｒａｉｎ　ｉｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）における障害がいくつかの形態の神経変性疾患（例えば、ＡＤ）の一因となるという疑いが強まってきた（Ｇｅｒｌａｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６３：７９３−８０７（１９９４））。脳では、鉄代謝が厳しく制御される。過剰な鉄は毒性をもたらし、少なすぎると代謝を損なう。全ての組織は、鉄調節タンパク質１（ＩＲＰ−１）および鉄調節タンパク質２（ＩＲＰ−２）の作用を介して鉄の取り込みを調節する。最近の知見は、これらの鉄調節タンパク質（特に、ＩＲＰ−２）が、アルツハイマー病に罹患する患者において観察される鉄ホメオスタシス障害に関係することが明らかにする。（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７８８：２３２−２３６（１９９８））。
【０００４】
例えば、鉄欠失細胞内でＩＲＰ−２レベルにおける増加が観察される。この増加の結果として、ＩＲＰ−２はトランスフェリンレセプター（これは鉄取り込みを促進するタンパク質である）のためのｍＲＮＡの３’プライム非翻訳領域に結合する。さらに、ＩＲＰ−２は、結合を阻止するフェリチンをコードするＨｎＲＮＡの５’ｃａｐ構造への結合およびそれに続く翻訳を防止する。本質的に、鉄取り込みは高レベルなＩＲＰ−２の存在によって促進される。一方、もし細胞が過剰量の鉄を提供されるならば、ＩＲＰ−２は迅速に分解され、そして鉄の取り込みが直ちに減少される。このように、ＩＲＰ−２の分解を調節することによって、体は鉄ホメオスタシスを達成する。（Ｖａｎ　Ｂｕｓｋｉｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：７２２−７２５　（１９８４））。ＩＲＰ−２分解の誘導に関するより大きな理解が必要である。
【０００５】
ＭＲＩによる脳鉄の定量に関する文献中に多数の報告がなされているが（Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒら、　Ｍａｇｎ　Ｒｅｓｏｎ　Ｍｅｄ．、４２（５）：８２９−３６（１９９９）；　Ｖｙｍａｚａｌら、Ｊ　Ｎｅｕｒｏｌ　Ｓｃｉ．、１３４　Ｓｕｐｐｌ：１９−２６　（１９９５）；　Ｑｕａｓｔら、Ｍａｇｎ　Ｒｅｓｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ、１１（４）：４６５−７１　（１９９３））、普遍的に受け入れられる方法もしくは基準およびヒトに関して較正または実証されたデータは存在しない。例えば側頭葉および海馬の体積の変化率における差異を調べる連続的長期的な研究が、単発的な測定よりもより強力な診断上の助けとなることが立証されてきた。ＭＲ画像化技術を用いて、側頭葉萎縮がＡＤ患者において連続的に追跡されてきた。量的かつ連続的に局部的脳鉄を評価する能力は、神経変性疾患を有する個体の予測処置の診断およびモニタリングの両方において潜在的な利用性を提供する。
【０００６】
鉄は、その常磁性形態において、ＭＲ画像に及ぼす多大な影響を有する。影響としては、Ｔ２＊強調グラディエントエコー画像中のマグニチュードおよび相画像におけるシグナル変化、Ｔ２強調および拡散強調スピンエコー画像におけるシグナル変化、ならびにＴ１強調画像におけるシグナル増加が挙げられる。鉄の含有率が高い灰白質において（例えば、中心溝において）、鉄はＴ１低減造影剤（Ｔ１　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔ）のような挙動を示す。
【０００７】
脳鉄の１つの大きな供給源は、脳内で鉄の貯蔵および利用に主な役割を果たすフェリチンの第２鉄型である。各フェリチン分子は、異なる染色体上にコードされる異なる比率のＨ（重）およびＬ（軽）鎖サブユニットからなり、またそのフェリチン分子の機能において異なる役割を果たす。Ｈ−豊富フェリチン（Ｈ−ｒｉｃｈ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ）は鉄封鎖に効率的であり且つ高い鉄利用性および低い鉄貯蔵性を有する臓器において優勢であるが、一方Ｌ−豊富フェリチン（Ｌ−ｒｉｃｈ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ）は鉄核形成に効率的であり且つ鉄貯蔵に関係する。脳内では、種々の細胞型が、それらの機能的役割と一致するフェリチンアイソフォームを含む。フェリチンは、独特な磁気特性を有し、そしてＭＲ組織緩和時間中の鉄誘導性変化の主な原因であると考えられる。フェリチンの量は脳内のトランスフェリンの量の１０倍であり、各フェリチン分子は４５００までの鉄原子を封鎖する能力を有する。フェリチンは、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、および小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）内のミエリン中に貯蔵される。マクロファージは、フェリチンをヘモシデリン（Ｔ２＊強調ＭＲＩ画像においてシグナル変化を生じる別の強力な常磁性物質）に変換する。この一般的な知識にも関わらず、フェリチンのＭＲＩ特性は十分に理解されていない。Ｒ２の予測される場依存性は静場（ｓｔａｔｉｃ　ｆｉｅｌｄ）の二乗である。対照的に、全ての証拠は、場強度（ｆｉｅｌｄ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に伴うＲ２における直線的変化を示す。さらに、緩和率は非常に高く、単純な常磁性によって説明できないことが一般的に見出されている。最近の文献が、２．１９　＋／−　０．０５　／ｓ／ｍｇ　Ｆｅ／ｇ（他の測定と矛盾しない値）のＲ１についてのフェリチンの緩和度を引用する（Ｇｏｓｓｕｉｎら、Ｍａｇｎ　Ｒｅｓｏｎ　Ｍｅｄ，．４３（２）：２３７−４３（２０００））。
【０００８】
脳鉄の２番目に大きい供給源は、遊離鉄である。捕捉鉄（ｔｒａｐｐｅｄ　ｉｒｏｎ）の他の供給源も存在するが、それらの濃度は低い。相測定、Ｒ２またはＲ２’データおよび脳鉄の他の測定と一致して、脳幹神経節（ｂａｓａｌ　ｇａｎｇｌｉａ）は、大脳半球および白質よりも多くの染色可能な鉄を含む。死後の脳鉄のアッセイから、鉄レベルは、高齢個体についての赤核において２μｇ／ｇｍであるのに対して、一方淡蒼球における正常レベルは約０．２５μｇ／ｇｍ組織であった。他の観察としては、アルツハイマー病およびパーキンソン病における海馬内の鉄貯蔵の増加、老化時の灰白質におけるフェリチンの増加、および星状細胞鉄の変化しないレベルが挙げられる。
【０００９】
動物（Ｆｅｎｚｉら、Ｊ　Ｍａｇｎ　Ｒｅｓｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ、１３（３）：３９２−６（２００１））およびヒト（Ｂｏｎｋｏｖｓｋｙら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、２１２（ｌ）：２２７−３４（１９９９）；Ｂａｒｔｚｏｋｉｓら、Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）、４６（４）：８２１−３３（２０００））に関する強磁場の成果が、脳鉄を定量することを試みてきた。その風潮は、鉄含有率が増加するにつれてＲ２が増加することを明瞭に実証するが、その結果の予測性は困難である。例えば、Ｆｅｎｚｉは、鉄が存在しない場合、４０／ｓのＲ２を有するファントム（ｐｈａｎｔｏｍ）上でＲ２についてのスロープが１０〜３０／ｓ／（ｍｇ／ｇｍ　Ｆｅ）であることを示す。しかしながら、ｉｎ　ｖｉｖｏでは、１５０／ｓの単一Ｔ２が１．５〜３．５ｍｇ　Ｆｅ／ｇｍ湿重量の範囲（臨床値のものとしては広すぎる）に相当し得る。同様に、Ｂｏｎｋｏｖｓｋｙのデータによって、単一シグナル強度測定値が低濃度についての２／ｍｇ／ｇｍ　乾燥肝および１／ｍｇ／ｇ　乾燥肝臓以上の濃度についての５／ｍｇ／ｇｍ　乾燥肝の範囲に相当することが示される。
【００１０】
Ｏｒｄｉｄｇｅおよび彼のグループ（Ｍｉｚｋｅｉｌら、Ｍａｇｎ　Ｒｅｓｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ、１５（１０）：１１１３−９（１９９７）は、鍵となる情報がＲ２ではなくＲ２’の中にあることを実証した。Ｒ２に関する問題は、Ｔ２を変化させ且つ局所的な鉄についての情報を混乱させ得る他の影響因子に起因して生じる。黒質における鉄の局所的増加にも関わらず、長いエコーのためのシグナルは、鉄含有率における増加を伴って増加し続けるＲ２’を用いて変則的に回復される。バックグラウンド場の変化（これは、シグナルの位相をずらし、さもなければＲ２’に対して誤って高い値をもたらす）の存在下にも関わらずＲ２’を測定するために、Ｏｒｄｉｄｇｅらによってある方法が開発された。スライス選択方向にある局所的な場は、異なるスライス選択グラディエントを用いて、スキャンを複数回繰り返すことによって補正された。
【００１１】
Ｇｅｌｍａｎらは、Ｒ２およびＲ２’効果の両方を測定し、そしてＲ２のスロープが切片１２．７または約８０ｍｓのＴ２を伴う６０／ｓ／ｍｇ湿重量であり、Ｒ２’のスロープが切片２．７を伴う５０／ｓ／ｍｇ湿量であり（ある人は、この非−ゼロ切片がヘム鉄の寄与を現すると仮定するかも知れない）、さらに例示として、その淡蒼球のＲ２’が１２／ｓｅｃであることを見出した（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２１３（ｌ）：１３５−４０　（１９９９））。実際に、多くの文献が、脳幹神経節および肝臓における鉄のＴ２およびＴ２＊効果を実証した。さらに、鉄を伴うシグナル損失を記載するために、拡散メカニズムが使用された。さらに最近では、静止または緩慢分散レジーム（ｓｌｏｗ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅ）および迅速分散レジーム（ｆａｓｔ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｒｅｇｉｍｅ）におけるスピンの位相のずれに関する理論。この独特の特徴は、平行な繊維を評価する場合に（Ｈａｊｎａｌら、Ｊ　Ｃｏｍｐｕｔ　Ａｓｓｉｓｔ　Ｔｏｍｏｇｒ．、１６（４）：５０６−１３（１９９２））、そして脳内の酸素含有量を測定するために（Ａｎ　ａｎｄ　Ｌｉｎ，　Ｊ　Ｃｅｒｅｂ　Ｂｌｏｏｄ　Ｆｌｏｗ　Ｍｅｔａｂ．，　２０（８）：１２２５−３６　（２０００））、考慮される。
【００１２】
Ｔ２＊測定およびＲ２’定量化は、脳鉄測定に最適であると現在考えられる。Ｇｉｌｌｅｔら（Ｊ　Ｎｅｕｒｏｌ　Ｓｃｉ．，　１６８（ｌ）：２１−７　（１９９９））は、１１．７Ｔの場強度にてＴＥ＝９ｍｓ（本発明者が最良な相コントラストイメージのために１．５Ｔで使用するものとほとんど正確に等価である）を伴う３Ｄグラディエントエコー構造を使用する。鉄は、ＡＤの神経病理学的徴候（老人性斑および神経原線維のもつれを含む）を有する十分に確立されたマウスモデルにおけるマイネルトの基底部のような基底前脳コリン作動性構造中で見られるが、一方高い鉄含有率がＡＤにおける淡蒼球中で観測される。
【００１３】
ＡＤを最も発病しそうな忘却しやすい個体は、痴呆の発病より前に、軽度認知障害または軽度認知機能障害症候群（ＭＣＩ）として知られる状態を有する。ＭＣＩは、個体の年齢および教育レベルとして異常である記憶障害によって識別される。ＭＣＩを有する全ての個体がＡＤを発症するわけではないが、ＭＣＩはＡＤの初期の始まりについての潜在的なマーカーとして役立ち得る。数人の研究者らは、ＭＣＩが初期ＡＤとして見なされ、そしてＭＣＩで診断される個体が薬物治療からの恩恵を受けるであろうことを示唆した（Ｓｒａｍｅｋら、Ａｎｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，　３４（１０）：１１７９−８８　（２０００））。このように、ＭＣＩスクリーニングは早期のＡＤ介入および／またはＡＤ予防の点から有益であり得る。
【００１４】
発明の要旨
１つの局面において、本発明は、ヒト由来の野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループをコードする配列を含む精製または単離された核酸を提供し、ここで前記配列は、前記ペプチドループ内に変異を含み、ここで前記変異は、前記ペプチドループ内に存在するシステイン残基の酸化を受ける能力を妨げる（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）。１つの実施形態において、この核酸配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、および１５の少なくとも１つを含み得る。好ましくは、この核酸配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される配列を含むペプチドをコードする。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、精製または単離されたポリペプチドは、ヒト由来の野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループを含み、ここで前記配列は、前記ペプチドループ内に変異を含み、ここで前記変異は、前記ペプチドループ内に存在するシステイン残基の酸化を受ける能力を妨げる。ＩＲＰ−２タンパク質は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される配列を含み得る。好ましくは、ＩＲＰ−２タンパク質は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択される。さらに好ましくは、本発明は、神経変性疾患の診断のためのプローブを作製する方法におけるこのような変異ポリペプチドの使用に関し、そして前記変異ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体を生成することに関し、ここで前記抗体は野生型ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントと交差反応しない。その変異体は、システイン残基の置換または欠失を含み得る。さらに、この生成工程は、前記抗体を産生する細胞を培養することを包含し得る。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、神経変性疾患の処置または予防を必要とする被験体を同定する方法に関し、以下：ポリヌクレオチドまたはタンパク質を有する前記被験体に由来する生物学的サンプルを得ること；プローブを提供すること（前記プローブは、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質と相互作用するプローブおよび野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードするポリヌクレオチドと相互作用するプローブからなる群より選択される）；プローブがこの生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用する条件下において、前記サンプルを前記プローブと接触させること；この生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するプローブの量を検出すること；およびこの生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と関係するプローブの存在または非存在を決定することによって、前記被験体を神経変性疾患の処置または予防を必要とする被験体として同定すること、を包含する。好ましくは、この方法は、このプローブがこの生物学的サンプル中のポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するか否かを決定することを包含する。さらに好ましくは、このプローブは、核酸、タンパク質、および擬ペプチドから成る群より選択される。さらに、ポリヌクレオチドまたはタンパク質と相互作用するプローブの量の検出は、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣｓ）、免疫沈降、ウェスタンブロット、イムノクロマトグラフィー、抗体染色、およびハイブリダイゼーションアッセイから成る群より選択される技術の使用を含む。さらに、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的に結合し得る抗体に関する。好ましくは、この抗体が前記タンパク質の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合し、そして前記タンパク質がシステイン残基の変異を有する。さらに好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体である。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、変異ＩＲＰ−２タンパク質を特異的に結合し得るが野生型ＩＲＰ−２タンパク質を特異的に結合しない精製または単離された抗体に関し、ここで、前記変異ＩＲＰ−２タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列に相当するペプチドループ内に変異を有する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ヒト患者において軽度認知機能障害（ＭＣＩ）を他の形態の痴呆と区別する方法に関し、脳鉄を定量および／またはモニターするために、その患者に対して磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を行うことを包含し、ここで脳鉄の異常なレベルまたは分布がＭＣＩの存在を示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の１つの局面は、ＩＲＰ−２遺伝子内における変異が、体内における分解を阻害し且つそれによって鉄のホメオスタシスを混乱させるＩＲＰ−２タンパク質の型をもたらすという発見に関する。ＩＲＰ−２のペプチドループ内にいくつかの変異が起こり、ここで重要なシステイン残基は、分解プロセスを開始する鉄−依存的な酸化事象を受ける。
【００２１】
実施形態としては、変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸、変異ＩＲＰ−２タンパク質、およびこれらの分子のフラグメントが挙げられる。さらに、実施形態としては、変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸に相補的である核酸および変異ＩＲＰタンパク質またはそのフラグメントを結合する抗体が挙げられる。好ましくは、本明細書中に記載される相補性核酸は、変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸を特異的に検出し、そして変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸を野生型ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸と区別する。同様に、本明細書中に記載される好ましい抗体は、変異ＩＲＰ−２タンパク質を特異的に検出し、そして変異ＩＲＰ−２タンパク質を野生型ＩＲＰ−２タンパク質と区別する。
【００２２】
本明細書中に記載されるいくつかのアッセイは、ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸またはＩＲＰ−２タンパク質自体またはこれらの分子のフラグメントにおける変異の存在を検出するよう設計される。従って、野生型および／もしくは変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸に相補的な核酸配列、ならびに野生型および／または変異ＩＲＰ−２タンパク質上のエピトープを結合する抗体が、神経変性疾患（アルツハイマー病を含むが、これに限定されない）のためのｅｘ　ｖｉｖｏマーカーとして使用される。したがって、本明細書中に記載される診断的実施形態は、核酸−ベースおよびタンパク質−ベースのアッセイの両方ならびにこれらのアッセイを統合するキットに関し、これは、生物学的サンプル（例えば、末梢血細胞を有するサンプル）中の野生型および／または変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸またはＩＲＰ−２タンパク質を検出する。診断的決定のための自動技術（標準的なフローサイトメトリー技術およびアレイ工学のような）が、本明細書中に記載される実施形態のいくつかと共に使用され得る。野生型または変異型ＩＲＰ−２タンパク質を検出するモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、例えば患者が神経変性疾患（アルツハイマー病のような）にかかる傾向を有するか否かを迅速に決定するために、フローサイトメトリーと共に使用され得る。
【００２３】
支持体−ベースのアッセイ（ＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフィー、およびイムノストリップアッセイのような）は、また、野生型および／または変異ＩＲＰ−２タンパク質の存在または非存在を検出するように適用され得る。１つの実施形態において、例えば、野生型または変異型ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸に結合するプローブあるいは変異型または野生型ＩＲＰ−２タンパク質に結合する抗体は、支持体に結合され、そして生物学的サンプルをスクリーニングするために使用され、さらにそれによって神経変性疾患の診断を提供する。
【００２４】
さらに、神経変性疾患（アルツハイマー病のような）の診断は、支持体に結合された野生型または変異型ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントを使用することによって達成され得る。従って、固定化ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントは、循環する抗体（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を有する生物学的サンプルと接触され、そして変異型または野生型ＩＲＰ−２タンパク質に対する抗体の存在または非存在が２次検出分子（例えば、標識抗−ＩｇＧ抗体）を使用することによって測定され得る。ＩＲＰ−２の変異型に対する抗体の存在は、神経変性疾患にかかる傾向を示唆する。
【００２５】
ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６によって形成されるペプチドループで起こる鉄−依存型酸化的修飾によって、ＩＲＰ−２分解（およびそれによる鉄ホメオスタシスの調節）が健康な個体において開始されることが考えられる。この鉄−依存型酸化は、ペプチドループ内の３つの重要なシステイン残基を修飾し、結果的にアミノマロン酸産生をもたらす。アミノマロン酸への変換は、ユビキチン化のための段階を準備し、これは、ＩＲＰ−２のプロテオソーム分解を合図する。対照的に、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を患う個体がＩＲＰ−２遺伝子（酸化的修飾を受け得ないか、あるいは酸化的修飾のレベルの減少を示すＩＲＰ−２タンパク質をもたらす）中に変異を有することが考慮される。いくつかの個体は、また、ＩＲＰ−２タンパク質の多面的勾配（ｍｕｌｔｉ−ｆａｃｅｔｅｄ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）を有し、ここで、あるＩＲＰ−２タンパク質は鉄−依存的酸化を受け得ず、あるＩＲＰ−２タンパク質は適度な量の鉄−依存的酸化を受け、また他のＩＲＰ−２タンパク質は正常レベルの鉄−依存的酸化を受ける。変異および野生型ＩＲＰ−２タンパク質ならびに／またはこれらの分子をコードする核酸のレベルをモニターすることによって、神経変性疾患の予後診断が行われ得る。
【００２６】
実施形態としては、体内での分解に対して耐性のある変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸、それらに対する相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ）、および少なくとも１つの変異を有するこれらのタンパク質のフラグメントが挙げられる。望ましくは、これらの核酸は、ヒト野生型ＩＲＰ−２の配列のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループ内に変異を有するタンパク質をコードする。野生型ＩＲＰ−２ペプチドループの領域をコードする１８９ヌクレオチド長のフラグメントは、配列表中に提供される（配列番号１）。ヒト野生型ＩＲＰ−２をコードする全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号１７中に提供され、そして本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得る。さらに、ラット野生型ＩＲＰ−２をコードする全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号１９中に提供され、そして本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得る。野生型ＩＲＰ−２核酸についての参照がなされる場合、その内容によって、配列番号１７および／または１８において提供されるもの、あるいは本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得るものを含む野生型ＩＲＰ−２分子に言及することが意味される。
【００２７】
好ましくは、核酸の実施形態は、野生型ヒトＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループ内のシステイン残基の鉄−依存的酸化を受ける能力の喪失（ｉｎａｂｉｌｉｔｙ）もたらす少なくとも１つの突然変異を有する。この突然変異は、このペプチドループ内のシステイン残基の置換または欠失、あるいは鉄−依存的酸化を防止するようにペプチドループの３次元構造を摂動させる（ｐｅｒｔｕｅｂｓ）突然変異を含み得る。変異ＩＲＰ−２タンパク質のペプチドループの領域をコードするいくつかの核酸の配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５に開示される。
【００２８】
いくつかの核酸実施形態は、変異ＩＲＰ−２をコードするゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡ、それらに対する相補物または少なくとも１つの突然変異を含むこれらの分子のフラグメントである。いくつかの実施形態は、このペプチドループ内に複数の置換および／または欠失をもたらす複数の変異（例えば、１を超えるシステインの置換および／または欠失をもたらす変異）を含む。好ましくは、核酸実施形態としては、配列表（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５中に示されるヌクレオチド配列ならびにそれらに対する相補物ならびにそのフラグメントが挙げられる。ヒト、哺乳動物、および他の生物に由来する変異ＩＲＰ−２をコードする核酸配列もまた、このような配列を得るための方法と同様に、実施形態である。この核酸実施形態は、改変、変異または変化され得、その結果改変、変異または変化は保存的アミノ酸置換をもたらす。
【００２９】
本明細書中に記載されるポリペプチド実施形態は、体内での分解に耐性を有するＩＲＰ−２の変異型および少なくとも１つの突然変異を有するこれらの蛋白質のフラグメントに関する。望ましくは、このようなポリペプチドは、ヒト野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループ内に突然変異を有し、これは体内における分解に関わる分子の安定性（例えば、プロテオソーム分解に対する安定性）に寄与する。野生型ＩＲＰ−２ペプチドループの領域に相当する６３アミノ酸長のペプチドは、配列表中に提供される。（配列番号２）。ヒト野生型ＩＲＰ−２の全長アミノ酸配列は、配列番号１８中に提供され、そして本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得る。さらに、ラット野生型ＩＲＰ−２の全長アミノ酸配列は、配列番号２０中に提供され、そして本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得る。野生型ＩＲＰ−２タンパク質についての参照がなされる場合、その内容によって、配列番号１７および／または１８において提供されるもの、あるいは本明細書中で明白にその全体が参考として援用されるＧｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０　１６５２９（１９９５）において見出され得るものを含む野生型ＩＲＰ−２分子に言及することが意味される。
【００３０】
好ましくは、ペプチド実施形態は、ヒト野生型ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループ内のシステイン残基の鉄−依存的酸化を混乱させる少なくとも１つの変異を有する。この変異は、この領域内のシステイン残基の置換または欠失、あるいはＩＲＰ−２の鉄−依存的酸化に影響するようにペプチドループの３次元構造を摂動させる突然変異を含み得る。いくつかの実施形態は、このペプチドループ内の複数の変異を含む（例えば、１を超えるシステインが突然変異される）。いくつかの変異ＩＲＰ−２ペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６中に提供される。
【００３１】
ポリペプチド実施形態としては、また、配列表に示される部分的または完全なアミノ酸配列（配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６）、および非−保存的アミノ酸置換を有する配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のポリペプチド及びこれら分子に類似する擬ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含む（これに限定されない）このような分子についての機能的等価物が挙げられる。
【００３２】
さらなる実施形態としては、本明細書中に記載されるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに結合する分子を調製する方法が挙げられる。実施形態としては、また、例えば野生型および／または変異ＩＲＰ−２を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が挙げられる。好ましい抗体は、これらの分子間を区別するために、野生型ＩＲＰ−２ではなく変異ＩＲＰ−２上のエピトープに結合するか、またはその反対である。本明細書中に記載されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するための新規の方法が提供される。
【００３３】
診断的実施形態（診断キットを含む）が設計され、生物（例えば、昆虫、動物、哺乳動物、およびヒト）における神経変性疾患への傾向が同定される。好ましくは、診断的実施形態は、アルツハイマー病への危険性を有する被験体を同定するために使用される。核酸およびタンパク質−ベースの診断剤の両方が、本発明の局面によって包含される。すなわち、いくつかの診断的実施形態は、前記診断に用いる核酸またはタンパク質と相互作用するプローブを使用することにより診断に用いる核酸またはタンパク質の存在または非存在を検出することによって、神経変性疾患への傾向を決定する。この診断に用いる核酸は、例えば、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントをコードする核酸であり得る。診断に用いるタンパク質は、例えば、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントであり得る。用語「プローブ」は、その内容に依存して、診断的核酸または診断的タンパク質またはそのフラグメントと相互作用する分子に言及され得る。「プローブ」の例としては、野生型または変異ＩＲＰ−２核酸配列（例えば、ヒトまたはラットＩＲＰ−２）の少なくともフラグメントに相補的な核酸、および野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質配列（例えば、ヒトまたはラットＩＲＰ−２）上に存在するエピトープと相互作用する抗体が挙げられる。好ましいプローブは、前記変異診断用核酸または診断用タンパク質ではなく前記野生型診断用核酸または診断用タンパク質と特異的に相互作用するか、またはその反対である。
【００３４】
いくつかの診断的実施形態としては、例えば、野生型または変異ＩＲＰ−２あるいはそのフラグメントの生物学的サンプル中に存在する抗体と相互作用する能力を決定する支持体−結合アッセイに関する。望ましくは、この野生型または変異ＩＲＰ−２あるいはそのフラグメントは、多重測定様式で支持体上に配置される。好ましい実施形態としては、野生型ヒトＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３６−２１６に相当するペプチドループ（これはＩＲＰ−２の安定性に寄与する）中に突然変異を有するＩＲＰ−２またはそのフラグメントが挙げられる。さらに好ましくは、多重測定剤を作製するよう支持体に結合されるＩＲＰ−２またはそのフラグメントが、ペプチドループ内のシステイン残基の鉄−依存的酸化を受ける能力を混乱させる少なくとも１つの突然変異を有する。
【００３５】
実施形態としては、また、神経変性疾患を患っている被験者または神経変性疾患にかかる危険性がある被験体を同定するために使用され得る診断的キットが挙げられる。これらの診断的キットは、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸と相補的な核酸、または野生型もしくは変異ＩＲＰ−２タンパク質を結合する抗体（まとめて「プローブ」と呼ばれる）を含み得る。さらに、この診断的キットは、サンプルを固定化するための種々の支持体、試薬、酵素、検出試薬、および指示書を含み得る。
【００３６】
本明細書中に記載される診断方法のいくつかは、鉄代謝における欠損（これは、神経変性表現型（例えば、ＡＤ）の一因となる）を同定する。ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸またはＩＲＰ−２タンパク質自体における多型性を検出することによって、例えば、神経変性疾患にかかる危険性がある被験体が同定され得る。他の診断方法としては、変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸または変異ＩＲＰ−２タンパク質の異常な量またはレベルの検出が挙げられる。様々な多型のＩＲＰ−２タンパク質のレベルをモニターすることによって、神経変性疾患に関する予後診断が行われ得る。１つの方法によって、ＩＲＰ−２の各変異型に対する野生型ＩＲＰ−２（または、これらの分子をコードする核酸）の比率が作成され、そして健康または疾患個体より生じるこの比率についての比較分析に基づいて、神経変性疾患についての予後診断が行われる。さらに、ＩＲＰ−２の全変異型に対する野生型の比率が生成され、また被験体が神経変性疾患にかかる危険性を有するか否かを決定するために使用され得る。以下の章では、核酸実施形態のいくつかをより詳細に記載する。
【００３７】
変異ＩＲＰ−２ポリペプチドをコードする核酸
変異ＩＲＰ−２タンパク質のファミリーは、その分子の酸化および付随的な分解を不安にさせる少なくとも１つの突然変異の存在によって同定され得ると発見された。本発明の核酸実施形態としては、変異ＩＲＰ−２タンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの分子をコードするｃＤＮＡが挙げられる。変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸は、多くの異なる生物（昆虫、動物、および哺乳動物を含むがこれらに限定されない）中に存在し得る。
【００３８】
本発明のヌクレオチド配列としては、例えば、以下が挙げられる：（ａ）配列表（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）に示されるＤＮＡ配列；（ｂ）配列表（配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６）に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列表（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）に示されるＤＮＡ配列の相補物にストリンジェントな条件下（例えば、０．５Ｍ　ＮａＨＰ０４、７．０％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中でのフィルター−結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション（５０℃にて）および０．２×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ中での洗浄（５０℃にて））でハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列；および（ｄ）配列表（配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６）に提供されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補物に低ストリンジェントな条件下（例えば、０．５Ｍ　ＮａＨＰ０４、７．０％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中でのハイブリダイゼーション（３７℃にて）および０．２×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ中での洗浄（３７℃にて））でハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列。
【００３９】
本発明の実施形態としては、また、天然に存在するか、または操作される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）他の生物（例えば、植物、菌類、酵母、昆虫、動物、および哺乳動物）から単離される変異ＩＲＰ−２核酸が挙げられる。他の種において変異ＩＲＰ−２核酸を単離するための方法が下記に提供される。実施形態としては、また、上記に記載される配列のフラグメント、修飾体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、誘導体、および改変体が挙げられる。所望される実施形態としては、例えば、変異ＩＲＰ−２核酸に特有な少なくとも９つの連続的塩基を有する核酸またはそれに相補的な配列が挙げられ、そして本発明の好ましいフラグメントとしては、変異ＩＲＰ−２核酸に特有な少なくとも９個の連続的塩基またはそれに相補的な配列が挙げられる。これを考慮すると、核酸実施形態は、９〜約１００個の連続的ヌクレオチドを有し得る。本発明のいくつかのＤＮＡフラグメントとしては、例えば、変異ＩＲＰ−２核酸に特有な９，１０，１１，　１２，１３，　１４，１５，１６，１７，１８，１９，　２０，　２１，　２２，　２３，　２４，　２５，　２６，　２７，　２８，　２９，３０，　３１，　３２，　３３，　３４，　３５，　３６，　３７，　３８，　４０，　４１，　４２，　４３，　４４，　４５，　４６，　４７，　４８，４９，　５０，　５１，　５２，　５３，　５４，　５５，　５６，　５７，　５８，　５９，　６０，　６１，　６２，　６３，　６４，　６５，　６６，　６７，　６８，　６９，　７０，　７１，　７２，　７３，　７４，　７５，　７６，　７７，　７８，　７９，　８０，　８１，　８２，　８３，　８４，　８５，　８６，　８７，　８８，　８９，　９０，　９１，　９２，　９３，　９４，　９５，　９６，　９７，　９８，　９９，　１００，　１２５，　１５０，１７５，　２００，　２２５，　および　２４０個より少ないか、もしくはこれに等しい連続的ヌクレオチドを有する核酸が挙げられ、そして好ましくは配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５の配列またはその相補物によって提供される領域を包含する。好ましくは、核酸実施形態としては、しかしながら、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５の配列に特有な配列またはその相補物の少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９連続的なヌクレオチドが挙げられる。さらに好ましくは、核酸実施形態としては、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５に特有な配列またはその相補物の少なくとも２０〜３０個の連続的ヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
核酸実施形態は、また、機能的に等価な分子をコードする配列を提供する置換、付加、または欠失のような突然変異によって改変され得る。配列をコードするヌクレオチドの縮重のため、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６に示されるのと実質的に同じ変異ＩＲＰ−２アミノ酸をコードする他のＤＮＡ配列がいくつかの実施形態において使用され得る。これらとしては、変異ＩＲＰ−２核酸の全部または特有な部分を含む核酸配列、あるいは配列内の機能的に等価なアミノ酸残基（従って、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅ）を生み出す）、または配列内の機能的に非−等価なアミノ酸残基（従って、検出可能な変化を生み出す）をコードする異なるコドンの置換によって改変された変異ＩＲＰ−２核酸の全部または特有な部分に相補的な核酸が挙げられる。
【００４１】
上記の核酸配列は、生物工学的および診断的用途（例えば、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析など、および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の予後診断）を有する。配列表配列番号１，３、５、７、９、１１、１３および１５に開示される核酸配列を使用することによって、野生型および／または変異ＩＲＰ−２核酸に相補的なプローブが設計され、さらにオリゴヌクレオチド合成によって製造され得る。所望されるプローブは、配列番号１と比較してこれらの分子に特有である配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。これらのプローブが使用され、この核酸実施形態の天然供給源を単離するために種々の生物（例えば、植物、菌類、真菌類、酵母、昆虫、動物、および哺乳動物）に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングは、フィルターハイブリダイゼーション（例えば、デュプリケートフィルターを使用する）によって行われ得る。標識プローブは、好ましくは、配列番号１と比較してこれらの分子に特有であるもの（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）の核酸配列に相補的な核酸配列の少なくとも１５〜３０塩基対を含む。使用されるハイブリダイゼーション洗浄条件は、好ましくは、そのｃＤＮＡライブラリーが標識配列の起源となる生物の型と異なる生物に由来する場合、より低いストリンジェンシーのものである。
【００４２】
変異ＩＲＰ−２核酸のクローニングに関しては、例えば、ハイブリダイゼーションは０．５Ｍ　ＮａＨＰ０４、７．０％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で３７℃にて一晩中行われ得、そして洗浄は０．２×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ中で３７℃にて行われ得る。低ストリンジェンシーな条件は当業者に周知であり、そしてライブラリーおよび標識配列が由来する特定の生物に依存して予測可能に変更し得る。この条件に関する指示は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；　ａｎｄ　Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００４３】
さらに、変異または野生型ＩＲＰ−２核酸またはその部分に相補的な核酸からの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）あるいは他の酵素−媒介型核酸増幅技術を使用する単離および診断手順における使用のために、慣用のオリゴヌクレオチド合成法によってオリゴヌクレオチドプライマーを作製するために使用され得る。変異ＩＲＰ−２核酸は、本明細書中で開示される変異ＩＲＰ−２遺伝子産物内のアミノ酸配列に基づいて設計される２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるＰＣＲを行うことによって、目的の生物から単離され得る。反応のためのテンプレートは、例えば、変異ＩＲＰ−２ＲＮＡを発現すると分かっているまたは考えられる生物の細胞または組織から調製されるｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであり得る。種々のＰＣＲ技術が当業者によく知られている。ＰＣＲ技術の総説に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｗｈｉｔｅ，　Ｂ．Ａ．編（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６７において）：　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｔｏｔｏｗａ　（１９９７）（その全体が本明細書中で参考として援用される開示）、および「ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９１，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）と題される刊行物（その全体が本明細書中で参考として援用される開示）を参照のこと。
【００４４】
ｍＲＮＡの増幅に関しては、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写し、次いでＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）すること；または米国特許第５，３２２，７７０（その開示は全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されるような両工程のために単一酵素を使用することは、本発明の範囲内である。別の技術としては、Ｍａｒｓｈａｌｌ　Ｒ．Ｌ，ら、（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　４：８０−８４，　１９９４）（その開示は全体が本明細書中で参考として援用される）によって記載されるように、逆転写酵素非対称Ｇａｐリガーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　Ｇａｐ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）の使用が挙げられる。簡単には、ＲＮＡが、標準的方法に従って、適切な細胞または組織源より単離される。逆転写反応は、増幅フラグメントの最も５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを第１ストランド合成のプライマーとして用いて、ＲＮＡ上で行われる。生じるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、次いで、標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を用いて、グアニンで「テイル付与（ｔａｉｌｅｄ）」される。次いで、このハイブリッドはＲＮＡｓｅ　Ｈで消化され、そして第２ストランド合成がポリ−Ｃプライマーでプライムされる。このように、増幅フラグメントのｃＤＮＡ配列上流が容易に単離される。使用され得るクローニング方法の総説については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（前出）を参照のこと。
【００４５】
これらの増幅産物の各々において、増幅されるべき配列の各側におけるプライマーが、ｄＮＴＰｓおよび熱安定性ポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、またはＶｅｎｔポリメラーゼのような）と共に、適切に調製される核酸サンプルへ添加される。このサンプル中の核酸は変性され、そしてプライマーはサンプル中の相補的核酸配列に特異的にハイブリダイズされる。次いで、このハイブリダイズされたプライマーは伸長される。その後、変性、ハイブリダイゼーション、および伸長の次のサイクルが開始される。このサイクルが複数回繰り返され、プライマー部位の間の核酸配列を含む増幅フラグメントが生成される。ＰＣＲは、さらに米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号および４，９６５，１８８号（その開示は全体が本明細書中で参考として援用される）を含むいくつかの特許に記載されている。
【００４６】
プライマーは、変異ＩＲＰ−２核酸に特有な（配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５）の核酸配列の部分に対して実質的に相補的であるように選択され、これによって、プライマー間の配列が増幅され得る。好ましくは、プライマーは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０ヌクレオチド長である。安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの溶解温度（Ｔｍ）に依存する。Ｔｍはプライマーの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含有率に依存する。Ｇ：Ｃ対は３つのＨ結合によって保持されるが、Ａ：Ｔ対は２つしか有さないので、プライマーのＧ＋Ｃ含有率が高い程、溶解温度が高くなる。本発明の増幅プライマーのＧ＋Ｃ含有率は、好ましくは、１０〜７５％の範囲であり、さらに好ましくは３５％〜６０％であり、そして最も好ましくは４０〜５５％である。アッセイ条件の特定の設定下でのプライマーについての適切な長さは、当業者によって経験的に決定され得る。
【００４７】
プライマーの間隔は、増幅されるべきセグメントの長さに関係する。本発明の内容においては、変異ＩＲＰ−２核酸のフラグメントをコードする核酸配列を有する増幅セグメントは、少なくとも約２５ｂｐ〜３５ｋｂのサイズの範囲をとり得る。２５〜１００ｂｐの増幅フラグメントが代表的であり、５０〜２００ｂｐのフラグメントが好ましく、２００〜３００ｂｐのフラグメントが非常に好ましい。変異ＩＲＰ−２核酸の領域の特異的増幅を可能にする任意の配列を有し且つ、例えば、クローニングを容易にする制限部位のような改変を含み得る増幅プライマーが、認識されるであろう。
【００４８】
ＰＣＲ産物は、サブクローニングされ、そして増幅配列が変異ＩＲＰ−２遺伝子の配列を表すことを確かめるために配列決定され得る。次いで、ＰＣＲフラグメントが使用され、種々の方法によって全長ｃＤＮＡクローンが単離され得る。例えば、増幅フラグメントが標識され、さらにｃＤＮＡライブラリー（バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのような）をスクリーニングするために使用され得る。あるいは、ゲノムライブラリーのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために、標識フラグメントが使用され得る。多くの異なる生物（特にヒト）に由来するゲノムクローンの同定および特徴付けは、診断試験ならびに神経変性疾患を処置および予防するための臨床プロトコールを考案するのに有益である。
【００４９】
あるいは、ゲノムライブラリーは、変異ＩＲＰ−２対立遺伝子を保有するの疑いがあるか、または知られている生物より得られるＤＮＡを使用して構築され得、あるいはｃＤＮＡライブラリーは、変異ＩＲＰ−２対立遺伝子を発現することが知られるか、または疑われる組織に由来するＲＮＡを使用して構築され得る。次いで、正常なＩＲＰ−２遺伝子または任意の適切なそのフラグメントが標識され、そしてこのようなライブラリー中の対応する変異ＩＲＰ−２対立遺伝子を同定するためにプローブとして使用され得る。しかしながら、好ましくは、このプローブは、これらの変異分子に特有である配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５の配列と相補的である。次いで、変異ＩＲＰ−２遺伝子配列を含むクローンが精製され、そして当業者に周知の方法に従って配列解析にかけられる。
【００５０】
さらに、発現ライブラリーは、例えばこのような変異対立遺伝子を保有する疑いがあるまたは知られている生物において変異ＩＲＰ−２対立遺伝子を発現することが知られているかまたは疑われる組織から単離されるＲＮＡより合成されるｃＤＮＡを利用して、構築され得る。この方法において、推定上変異細胞によって作製される遺伝子産物が、発現され、さらに野生型または変異ＩＲＰ−２遺伝子産物に対して惹起される抗体との結合における標準的抗体スクリーニング技術を用いて、スクリーニングされ得る（スクリーニング技術については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，　Ｅ．　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，　ｅｄｓ．，　１９８８，　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒを参照のこと。）。慣用の抗体スクリーニング技術を使用することによって、種々の生物の発現ライブラリーより野生型および／または変異型ＩＲＰ−２タンパク質が単離され得る。ＩＲＰ−２変異が機能変化（例えば、システインの酸化の減少）を伴う発現遺伝子産物を生じる場合、変異ＩＲＰ−２タンパク質に対する抗体のポリクローナルセットは、高効率で変異遺伝子産物と反応し得る。このような標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンは、精製され、さらに当業者に周知の方法に従って配列解析にかけられる。
【００５１】
実施形態は、また、以下を包含する：（ａ）配列および／またはその相補物（例えば、アンチセンス）をコードする前述の変異ＩＲＰ−２のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コーディング配列の発現に向いた調節エレメントと作動可能に結合する前述の変異ＩＲＰ−２コーディング配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞におけるコーディング配列の発現に向いた調節エレメントと作動可能に結合する前述の変異ＩＲＰ−２コーディング配列のいずれかを含む遺伝子的に操作された宿主細胞。これらの組換え構築物は、宿主細胞において自発的に複製され得る。あるいは、この組換え構築物は、宿主細胞の染色体ＤＮＡへ組み込まれるようになり得る。このような組換えポリヌクレオチドは、代表的に、ヒトの取り扱いのための半合成または合成起源の変異ＩＲＰ−２ゲノムまたはｃＤＮＡポリヌクレオチドを含む。それゆえ、天然に存在しない変異ＩＲＰ−２配列およびその相補物を含む組換え核酸が本明細書中で提供される。
【００５２】
変異ＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸または天然に見られるような変異ＩＲＰ−２遺伝子に相補的な配列を有する核酸が使用され得るけれども、それらはしばしば例えば、欠失、置換または挿入によって改変され得、そしてヒトにおいて存在しない配列を伴い得る。本明細書中で使用される場合、調節エレメントとしては、誘導型および非−誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆り立て且つ調節することで当業者に知られる他のエレメントを含むがこれらに限定されない。このような調節エレメントとしては、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子（ｙｅａｓｔ　α−ｍａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ）のプロモーターが挙げられる。
【００５３】
さらに、組換え変異ＩＲＰ−２核酸配列およびそれらの相補配列は、タンパク質のプロセッシングまたは発現を修飾するために、操作され得る。例えば（限定のためではなく）、タンパク質の分泌を可能にし、さらにそれによって収集またはバイオアベイラビリティーを促進させるために、変異ＩＲＰ−２遺伝子がプロモーター配列および／またはリボソーム結合部位と結合されるか、またはシグナル配列がコーディング配列の上流に挿入され得る。さらに、翻訳、開始、および／または終結配列を生成および／または破壊するためか、またはコーディング領域における多様性を生成するおよび／または新しい制限部位を形成するまたは既に存在するものを破壊するためか、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるさらなる修飾を促進するために、所定の核酸がｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで変異され得る。当該分野において公知の突然変異誘発のためのあらゆる技術（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発を含むがこれに限定されない）が使用され得る（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ．　ＢｉｏＬ　Ｃｈｅｍ．、２５３：６５５１　（１９７８）、本明細書中で参考として援用される）。
【００５４】
さらに、融合タンパク質を生成するために、他のタンパク質または他のタンパク質のドメインをコードする核酸が、変異ＩＲＰ−２核酸をコードする核酸に結合され得る。
【００５５】
融合タンパク質実施形態をコードするヌクレオチドは、例えば、無関係なタンパク質もしくはペプチド（例えば、グルタチオン；Ｉｇ　Ｆｃドメイン（これは、生じる融合タンパク質の安定性および半減期を増大する）；マーカーとして使用され得る酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」））に融合される全長変異ＩＲＰ−２タンパク質、切端変異ＩＲＰ−２タンパク質または変異ＩＲＰ−２タンパク質のペプチドフラグメントをコードし得る。この融合タンパク質は、また、下記で議論されるようにバイオテクノロジーの道具としても有用である。以下の章は、ポリペプチド実施形態およびそれらの分子を作製する方法のいくつかを記載する。
【００５６】
変異ＩＲＰ−２ポリペプチド
変異ＩＲＰ−２ポリペプチド、これらの分子のフラグメント、およびこれらの分子に似た化学物質（擬ペプチド、改変ＩＲＰ−２タンパク質、およびそれらの改変体及びバリアントを含むが、これに限定されない）もまた、実施形態である。変異ＩＲＰ−２ポリペプチドは、天然に、または遺伝子操作を介して、多くの生物（例えば、植物、昆虫、両生類、爬虫類、鳥類、他の動物、ネコ、イヌ、げっ歯類、霊長類、ヒト、および他の哺乳動物）において存在し得る。
【００５７】
変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸（前章中に記載される）は、変異ＩＲＰ−２タンパク質または変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントを発現する組換え構築物を作製するために、分子生物学における慣用技術を使用して操作され得る。これらのポリペプチドまたはその誘導体としては、主要なアミノ酸配列として、配列表（配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６）に実質的に示される全てのアミノ酸配列、および機能的に等価なアミノ酸残基がサイレント変化をもたらす配列内の残基と置換される改変配列を含む少なくとも３アミノ酸長の配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のフラグメントを一次アミノ酸配列として含むものが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６の配列の好ましいフラグメントは、少なくとも３つのアミノ酸であり、そして機能的に等価なアミノ酸配列がサイレント変化をもたらす配列内の残基と置換される改変配列を含む変異ＩＲＰ−２タンパク質に特有のアミノ酸配列を含む。変異ＩＲＰ−２ペプチドフラグメントは、前記ペプチドが変異ＩＲＰ−２タンパク質に特有である（配列番号２と比較して）アミノ酸を有する限りは、例えば、９、　１０、　１１、　１２、　１３、　１４、　１５、　１６、１７、　１８、　１９、　２０、　２１、　２２、　２３、　２４、　２５、　２６、　２７、　２８、　２９、　３０、　３１、　３２、　３３、　３４、３５、　３６、　３７、　３８、　４０、　４１、　４２、　４３、　４４、　４５、　４６、　４７、　４８、　４９、　５０、　５１、　５２、　５３、　５４、　５５、　５６、　５７、　５８、　５９、　６０、　６１、　６２、　６３、　６４、　６５、　６６、　６７、　６８、　６９、　７０、　７１、　７２、　７３、　７４、　７５、　７６、　７７、　７８、　７９、　８０、　８１、　８２、　８３、　８４、　８５、　８６、　８７、　８８、　８９、　９０、　９１、　９２、　９３、　９４、　９５、　９６、　９７、　９８、　９９、　および　１００より少ないか、または等しいアミノ酸長であり得る。
【００５８】
本発明の実施形態は、多くの判定基準（酸化される能力の喪失（ｉｎａｂｉｌｉｔｙ））、ユビキネート化（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）される能力の喪失、およびプロテオソーム分解に対して安定に存在し続ける能力を含むが、これらに限定されない）のいずれかによって判断される場合、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる変異ＩＲＰ−２タンパク質に機能的に等価であるタンパク質を包含する。このように機能的に等価な変異ＩＲＰ−２タンパク質は、上に記載される変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列よってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換を含む（しかし、これに限定されない）が、これはサイレントな変化をもたらし、それゆえ機能的に等価な遺伝子産物を産生する。例えば、実施形態としては、機能的等価物として作用する類似した極性を有する別のアミノ酸によって置換される（サイレントな変化を生じる）、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６の変異ＩＲＰ−２ポリペプチドならびに配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のフラグメント内の、１つ以上のアミノ酸残基を有する変異ＩＲＰ−２タンパク質が挙げられる。この配列内のアミノ酸に対する置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非−極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。
【００５９】
変異ＩＲＰ−２ポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　８５：２１４９　（１９６４），　Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ，　８２：５１：３２　（１９８５），　Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ．，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，　ＩＬ　（１９８４），　ａｎｄ　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，　１９８３，　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　および　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，　Ｗ．　Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．，　Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される）によって記載されるような当該分野で公知の技術を使用する化学合成法（固相ペプチド合成のような）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、そのアミノ末端にメチオニンを含んで、または含まないで合成され得る。変異ＩＲＰ−２タンパク質およびそのフラグメントは、天然の精製変異ＩＲＰ−２タンパク質および変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントに対する生物学的に活性な、または免疫学的な代用物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）として使用され得る。
【００６０】
変異ＩＲＰ−２タンパク質は化学的に合成され得るが、当該分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によってこれらのポリペプチドを生産することの方がより効率的であり得る。このような方法が使用され、例えば変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築され得る。これらの方法としては、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。あるいは、変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列をコードし得るＲＮＡは、例えば合成装置を使用して、化学的に合成され得る。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　１９８４，　Ｇａｉｔ，　Ｍ．　Ｊ．編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００６１】
いくつかの実施形態において、変異ＩＲＰ−２タンパク質および変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントは、細胞株において発現される。例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のＩＲＰ−２ポリペプチドまたは配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６のフラグメントを発現させるために、いくつかの細胞が作製される。これらの実施形態を含む配列、構築物、ベクター、クローン、および他の物質は、有利には濃縮または単離形態であり得る。本明細書中で使用される場合、「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」は、その物質の濃度がその天然濃度の少なくとも２、５、１０、１００、または１０００倍（例えば）、有利には０．０１重量％、好ましくは少なくとも約０．１重量％である。約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％（重量）からの濃縮調製物もまた企図される。用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その物質がその本来の環境（例えば、もしそれが天然に存在するならば、天然の環境）から取り除かれることを必要とする。例えば、生きている動物において存在する天然に存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然系において共存する物質のいくつかまたは全てから分離された同一のポリヌクレオチドは単離されている。配列が精製形態で存在することもまた好都合である。用語「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、絶対的な純度を必要とせず；むしろ相対的な定義として意図される。単離されたタンパク質は、慣用的に、例えばＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色によって電気泳動的同質性（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）に至るまで精製されてきた。出発物質または天然物質の少なくとも１桁（ｏｒｄｅｒ　ｏｆ　ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）、好ましくは２または３桁、そしてさらに好ましくは４または５桁までの精製が、明白に企図される。
【００６２】
様々な宿主−発現ベクターが使用され、変異ＩＲＰ−２タンパク質および変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントが発現され得る。変異ＩＲＰ−２タンパク質または変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントが可溶性誘導体である場合、これは培養物から（すなわちそのペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合において宿主細胞から、またそのペプチドまたはポリペプチドが細胞によって分泌される場合において培養培地から））回収され得る。しかしながら、発現系としては、また、ｉｎ　ｓｉｔｕにおける（すなわち細胞膜中に固定される（ａｎｃｈｏｒｅｄ））変異ＩＲＰ−２タンパク質および変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントまたは機能的等価物を発現する遺伝子操作宿主細胞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。このような発現系からの変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントの精製または濃縮は、適切な界面活性剤および脂質ミセルならびに当業者に周知の方法を使用して、達成され得る。しかしながら、このような遺伝子操作宿主細胞自体は、変異ＩＲＰ−２タンパク質の構造的および機能的特徴の維持するためだけではなく、生物学的活性を評価するために重要である状況で使用され得る。
【００６３】
使用され得る発現系としては、ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される微生物（バクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような）；変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；変異ＩＲＰ−２配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）で感染される昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されるか、もしくは変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される、植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
バクテリア系においては、発現される変異ＩＲＰ−２遺伝子産物に意図される使用に依存して、多くの発現ベクターが好都合に選択され得る。例えば、大量なこのようなタンパク質が産生される場合（野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいは野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントに対する抗体の惹起のために）、例えば容易に精製される高レベルな融合タンパク質産物の発現を導く（ｄｉｒｅｃｔ）ベクターが所望され得る。このようなベクターとしては、Ｅ　ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，２：１７９１（１９８３）、（ここで、変異ＩＲＰ−２タンパク質または変異ＩＲＰ−２タンパク質フラグメントコーディング配列は、ｌａｃＺコーディング領域とインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）でベクター内に個別に連結され得、それによって融合タンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ　＆　Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ　＆　Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−５５０９（１９８９））；などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた使用され、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現し得る。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸収、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞より精製され得る。ＰＧＥＸベクターはトロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ開裂部位を含むよう設計され、それによってクローン化された標的遺伝子産物はＧＳＴ部分から放出され得る。
【００６５】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファカリフォルニカ核多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）が使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。変異ＩＲＰ−２タンパク質または変異ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメント核酸配列は、個別にそのウイルスの非−必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）へクローニングされ、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。コーディング配列の挿入の成功は、結果的にポリヘドリン遺伝子の不活性化および非−閉鎖（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリンによってコードされるタンパク質様コートを欠くウイルス）の産生をもたらす。次いで、挿入遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために、これらの組換えウイルスが使用される。（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ　４６：５８４（１９８３）；およびＳｍｉｔｈ、米国特許第　４，２１５，０５１号を参照のこと。）
哺乳動物細胞において、多くのウイルス−ベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のヌクレオチド配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３部分リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ　ｌｅａｄｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ））に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非−必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、結果的に、感染宿主内において生存可能でありかつＩＲＰ−２遺伝子産物を発現し得る組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ　＆　Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３６５５−３６５９（１９８４）を参照のこと。）。特定の開始シグナルもまた、挿入された変異ＩＲＰ−２ヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。全ＩＲＰ−２遺伝子またはｃＤＮＡ（それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む）が適切な発現ベクターへ挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない。
【００６６】
しかしながら、変異ＩＲＰ−２タンパク質コーディング配列の一部のみが挿入される場合、外来性の翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）が供給されるべきである。さらに、その開始コドンは、その全インサートの翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレームと位相を合わせられるべきである。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源（天然および合成の両方）を有し得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって促進され得る。（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，　１５３：５１６−５４４　（１９８７）を参照のこと。）
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または所望される特定の仕方で遺伝子産物を改変およびプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の後−翻訳プロセッシングおよび改変に対して特徴的且つ特有のメカニズムを有する。発現される外来性タンパク質の正確な改変およびプロセッシングを確実に行うために、適切な細胞株または宿主システムが選択され得る。この目的のため、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセッシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３，３Ｔ３、およびＷ１３８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
組換えタンパク質の長期的で高収率な産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントを安定に発現する細胞株が操作される。ウイルス性の複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、むしろ、宿主細胞は適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるＤＮＡを用いて形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作される細胞は濃縮された培地中で１−２日間増殖され、次いで選択培地にスイッチされる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、そして次にはクローニングされ且つ細胞系へ拡大されるフォーカスを形成するまで増殖することを可能にする。この方法は、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントを発現する細胞系を遺伝子操作するために好都合に使用される。
【００６８】
多くの選択系が使用され得る（単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ　１１：２２３（１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ　＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　４８：２０２６　（１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ　２２：８１７　（１９８０）遺伝子（これらに限定されない）は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る）。また、抗代謝物耐性が、以下の遺伝子のための選択の基礎として使用され得る：ｄｈｆｒ（これはメトトレキサートに対する耐性を与える）（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ，ＵＳＡ　７８：１５２７（１９８１）；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　＆　Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ　７８：２０７２（１９８１）；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシド　Ｇ−４１８に対する耐性を与える）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を与える）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ　３０：１４７（１９８４））。
【００６９】
あるいは、任意の融合タンパク質が、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによって容易に精製され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞系において発現する非−変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする。（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：８９７２−８９７６（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基から成るアミノ−末端タグへ翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミドへサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物はＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにかけられ、そしてヒスチジン−タグ化タンパク質がイミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出される。
【００７０】
変異ＩＲＰ−２遺伝子産物またはそのフラグメントはまた、トランスジェニク生物を作り出すために、植物、昆虫、および動物において発現され得る。ほとんど全ての種の植物または昆虫がこれらの分子を発現するように作製され得る。野生型または変異ＩＲＰ−２またはそのフラグメントを有する所望のトランスジェニック植物系としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ）、メイズ（ｍａｉｚｅ）、およびクラミドモナス（ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。野生型または変異ＩＲＰ−２またはそのフラグメントを有する所望の昆虫系としては、例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓが挙げられる。任意の種の動物としては、両生類、爬虫類、鳥類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇｓ）、ヤギ、イヌ、ネコ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が使用され、変異ＩＲＰ−２トランスジェニック動物が作り出され得る。トランスジェニック生物は、望ましくは、変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントの生殖系列的な伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）を示す。いくつかのトランスジェニック生物は、１つ以上の存在するＩＲＰ−２遺伝子の完全なノックアウトまたは点突然変異を示す。例えば、１つの実施形態において、トランスジェニック動物は、アミノ酸残基１３６−２１６に相当するＩＲＰ−２のペプチドループ内（および、好ましくは配列番号２に提供される領域内）のシステイン残基において、少なくとも１つの点突然変異を含む。最も好ましいトランスジェニック動物実施形態は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６に提供される変異ＩＲＰ−２フラグメントに類似する突然変異を有する。
【００７１】
当該分野で公知の任意の技術が好ましく使用され、変異ＩＲＰ−２トランスジーンが動物へ導入され、トランスジェニック動物の初代の系（ｆｏｕｎｄｅｒ　ｌｉｎｅ）が作製され得るか、または存在するＩＲＰ−２遺伝子がノックアウトまたは置換され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ，Ｐ．Ｃ．　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ，Ｅ．，１９８９，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系へのレトロウイルス媒介型遺伝子導入（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２（１９８５）；胚性幹細胞中の遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ　５６：３１３−３２１（１９８９）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３）；および精子媒介型遺伝子導入（ＬａｖｉｔｒａｎｏらＣｅｌｌ　５７：７１７−７２３（１９８９）；などが挙げられるがこれらに限定されない。このような技術の総説については、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００７２】
本発明は、それら全ての細胞において変異ＩＲＰ−２トランスジーンを有するトランスジェニック動物、および全ての細胞ではないがいくつかにおいてトランスジーンを有する動物（すなわち、モザイク動物）を提供する。このトランスジーンは、単一なトランスジーンとしてか、またはコンカテマー（例えば、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄタンデム、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌタンデム）で組み込まれ得る。トランスジーンは、また、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入され、そしてその中において活性化され得る。このような細胞型特異的な活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかであろう。
【００７３】
変異ＩＲＰ−２遺伝子トランスジーンが内因性変異ＩＲＰ−２遺伝子の染色体部位へ組み込まれることが望ましい場合、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単には、このような技術が利用される場合、染色体配列との相同組換えを介して内因性変異ＩＲＰ−２遺伝子のヌクレオチド配列へ組み込まれ、そしてその機能を破壊する目的のために、内因性変異ＩＲＰ−２遺伝子に相同的ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが設計される。このトランスジーンはまた、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：　１０３−１０６　（１９９４））の教示に従い特定の細胞型へ選択的に導入され得、このようにしてその細胞型だけにおいて内因性変異ＩＲＰ−２遺伝子を不活性化する。このような細胞型特異的な不活性化に必要な調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかであろう。
【００７４】
一旦トランスジェニック動物が作製されると、例えば、標準的な技術を使用して組換え変異ＩＲＰ−２遺伝子の発現がアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、トランスジーンの組み込みが行われたか否かをアッセイするために、動物組織を分析するためのサザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって成し遂げられ得る。トランスジェニック動物の組織中のトランスジーンのｍＲＮＡ発現のレベルは、動物から得られる細胞のノーザンプロット分析、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、およびＲＴ−ＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない技術を使用して評価され得る。変異ＩＲＰ−２遺伝子発現細胞のサンプルは、変異ＩＲＰ−２トランスジーン産物に対して特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的に評価され得る。
【００７５】
天然に存在するポリペプチド実施形態に加え、より望ましい細胞応答を産生する誘導または改変分子も本発明の範囲内である。例えば、誘導型変異ＩＲＰ−２分子としては、より大きな酸化を受ける誘導体の形成を促進させるためにタンパク質へ組み込まれる１つ以上のシステイン残基を有するように操作されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチド内のシステイン残基の導入は、慣用的な分子生物学的技術を使用して成し遂げられ得る。
【００７６】
さらなる実施形態としては、変異ＩＲＰ−２ポリペプチドに似ている擬ペプチドが挙げられる。ペプチドの生物学的産生において使用される天然に存在するアミノ酸は、全てＬ−立体配置（Ｌ−ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）をとる。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または２つの異なる立体配置のアミノ酸の様々な組み合わせを利用する慣用的な合成方法を使用して、調製され得る。特定のペプチド（例えば、オリゴペプチド）（かつてこのようなペプチドが見出された）のコンフォメーションおよび所望の特徴を真似るが所望されない特徴（例えばフレキシビリティ（コンフォメーションの損失）および結合崩壊）を回避する合成化合物は、「擬ペプチド」として知られる。（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ．　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｅｉｓｔｅｉｎ，Ｂ，編．），　Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２６７−３５７，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）（これは、エンケファリンアナログにおけるアミド置換の場合のメチレンチオバイオイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）［ＣＨ２Ｓ］の使用を記載する）；およびＳｚｅｌｋｅら、Ｉｎ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｉｇｈｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，（Ｈｒｕｂｙ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈ，編）；ｐｐ．５７９−５８２，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８３）（これは、アンギオテンシノゲンに由来する６−１３オクタペプチド中のＬｅｕ−Ｖａｌアミド結合におけるメチレンアミノ［ＣＨ２ＮＨ］およびヒドロキシエチレン［ＣＨＯＨＣＨ２］バイオイソスターの両方を有するレニン阻害剤を記載する）を参照のこと）。
【００７７】
一般的に、擬ペプチドの設計および合成は、ペプチドのアミノ酸配列および所望のペプチド（例えば、最もありそうなシミュレートされたペプチド）のコンフォメーションデータ（例えば、結合距離および角度のような幾何学的データ）を用いて出発することを包含する。次いで、このデータは、擬ペプチドへ設計されるべき幾何学を決定するために使用される。この工程を実施することについて多くの方法および技術が当該分野において知られており、そのいずれかが使用され得る。（例えば、Ｆａｒｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，（Ａｒｉｅｎｓ，Ｅ．Ｊ．編），Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１１９−１４３（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｓｙｄｎｅｙ　ａｎｄ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（１９８０）；Ｆａｒｍｅｒら（ＴＩＰＳ，９／８２，ｐｐ．３６２−３６５において）；Ｖｅｒｂｅｒら（ＴＩＮＳ，９／８５，ｐｐ．３９２−３９６において）；Ｋａｌｔｅｎｂｒｏｎｎら（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　３３：　８３８−８４５（１９９０）において）；およびＳｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．２６７−３５７，Ｃｈａｐｔｅｒ５，「Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ａｍｉｄｅ　Ｂｏｎｄ　Ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ．　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ，　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ」　（Ｂ．　Ｗｅｉｓｔｅｎ編；　Ｍａｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐｕｂ．）（１９８３）において）；Ｋｅｍｐ，Ｄ．　Ｓ．，「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ　ｏｆ　∃−ｓｈｅｅｔｓ　ａｎｄ　α−ｈｅｌｉｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，」Ｔｉｂｅｃｈ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４９−２５５（１９９０）を参照のこと）。さらなる技術は、米国特許第５，２８８，７０７；　５，５５２，５３４；　５，８１１，　５１５；　５，８１７，６２６；　５，８１７，８７９；　５，８２１，２３１；および５，８７４，５２９号において見出され得る。以下の章は、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントに向けられた抗体の調製および使用を記載する。
【００７８】
抗−ＩＲＰ−２抗体
ＩＲＰ−２タンパク質またはその一部分の合成または発現および単離または精製に続いて、この単離または精製されたタンパク質が使用され、モノクローナルまたはポリクローナル抗体あるいは両方が作製され得る。その内容に依存して、用語「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを包含し得る。変異または野生型ＩＲＰ−２蛋白質またはそのフラグメントを認識する抗体は、多くの用途（バイオテクノロジー的適用、治療的／予防的適用、および診断的適用が挙げられるがこれらに限定されない）を有する。
【００７９】
抗体の産生のために、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる）が、変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質または免疫原性特性を保持する任意の部分、フラグメントまたはオリゴペプチドを用いる注入によって免役され得る。宿主の種に依存して、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントが使用され得る。このようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムのような）、および表面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）、およびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍもまた、潜在的に有用なアジュバントである。
【００８０】
特異的な抗体を誘導するために使用されるペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、そして好ましくは少なくとも１０から１５個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質のフラグメントをコードするアミノ酸の短い構造がスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）のような別のタンパク質と融合され、その結果キメラ分子に対して抗体が産生される。変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質を特異的に認識し得る抗体は、変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質のタンパク質配列に相当する合成３−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒおよび１５−ｍｅｒペプチドをマウスに注入することによって生成され得るが、一方より多様な抗体のセットは、組換え変異型または野生型ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントを用いることによって生成され得る。
【００８１】
変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントに対する抗体を生成するために、トランスフェクションまたは形質転換細胞から十分に純粋なタンパク質が単離される。最終調製物中のポリペプチドの濃度は、例えばＡｍｉｃｏｎフィルター装置での濃縮によって、数マイクログラム／ｍｌのレベルに調整される。次いで目的のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、以下のように調製され得る：
モノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞系（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）による抗体分子の産生のために提供される任意の技術を使用して調製され得る。これらとしては、Ｋｏｅｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５）によって初めて記載されるハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８０：２０２６−２０３０（１９８３）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｎ．Ｙ．，ｐｐ　７７−９６（１９８５））が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシング）が使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２−４５４（１９８５））。あるいは、単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が適用され、変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質に特異的な単鎖抗体が産生され得る。抗体はまた、リンパ球集団におけるｉｎ　ｖｉｖｏ産生を誘導することによって、またはＯｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８６：３８３３−３８３７（１９８９），ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ；Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３−２９９（１９９１）に開示される様な非常に特異的な結合試薬のパネルまたは組換えイムノグロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって、産生され得る。
【００８２】
変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントに対する特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって生産され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速且つ容易な同定を可能にし得る。（Ｈｕｓｅ　Ｗ，　Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１２７５−１２８１（１９８９））。
【００８３】
１つの方法によって、モノクローナルは以下のように作製される。簡単には、マウスをそれに由来する数マイクログラムの選択タンパク質またはペプチドで数週間の期間に渡って繰り返し接種する。次いでマウスは殺され、そして脾臓の抗体産生細胞が単離される。この脾臓細胞はポリエチレングリコールの存在下でマウス骨髄腫細胞と融合され、過剰な未融合細胞はアミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の生育によって死滅される。首尾よく融合された細胞は希釈され、そしてその希釈物のアリコートを培養物の生育が継続されるマイクロタイタープレートのウェル中に置かれる。抗体産生クローンは、イムノアッセイ方法（ＥＬＩＳＡのような）（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９（１９８０）によって初めて記載される）およびその誘導的方法によるウェルの上澄流体の中の抗体の検出によって、同定される。選択陽性クローンが拡張され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、そして使用のためにモノクローナル抗体産物が回収され得る。モノクローナル抗体産生についての詳細な手順は、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＥｌｓｅｖｉｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．Ｓｅｃｔｉｏｎ　２１−２において記載される。
【００８４】
単一タンパク質の異種起源のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、適切な動物を前記のそれに由来する発現タンパク質またはペプチド（これは未改変であるか、または免疫原性を促進するように改変され得る）で免疫することによって調製され得る。効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関連する多くの因子によって影響される。例えば、小さい分子は、他よりも低い免疫原性の傾向にあり、そしてキャリアおよびアジュバントの使用を必要とし得る。また、宿主動物は接種の部位および用量に応じて変化し、抗原の不十分または過剰な用量の両方ともが、結果的に低い力価の抗血清をもたらす。複数の皮内部位へ投与される少ない用量（ｎｇレベル）の抗原が最も信頼できるようである。ラビットのための効果的な免疫プロトコールは、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９９１（１９７１）において見出され得る。
【００８５】
ブースター注入が規則的な間隔で行われ得、そして抗血清はその抗体力価（例えば、既知濃度の抗原に対するアガー中の二重免疫拡散分散法によって半−定量的に決定されるような）が低下し始めるときに回収される。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．ら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ　Ｄ．　Ｗｉｅｒ（編）　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　（１９７３）中の１９章を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常０．１から０．２ｍｇ／ｍｌ血清（約１２□Ｍ）の範囲内である。抗原に対する抗血清の親和性は、競合結合曲線を作成することによって決定される（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，　Ｄ．，：Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ，２ｄ　Ｅｄ．（Ｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｆｒｉｅｄｍａｎ，　Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）中の４２章によって記載される）。いずれかのプロトコールに従って調製される抗体調製物は、生物学的サンプル中の抗原保持物質（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｅａｒｉｎｇ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である；これらはまた半−定量的または定性的に（例えば、生物学的サンプル中の変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質の存在を同定する診断実施形態において）使用される。ＩＲＰ−２の野生型または変異型の酸化および還元型に対して特異的な抗体の調製の例が以下に提供される。下の章は、野生型または変異ＩＲＰ−２核酸およびタンパク質の特性を評価するいくつかのＩＲＰ−２キャラクタライゼーションアッセイを記載する。実施例１は、野生型または変異ＩＲＰ−２に特異的な抗体を作製およびスクリーニングするために使用される方法を記載し、そして実施例２は、野生型ＩＲＰ−２に特異的な抗体を作製およびスクリーニングするために使用される類似方法を記載する。
【００８６】
ＩＲＰ−２キャラクタライゼーションアッセイ
用語「ＩＲＰ−２キャラクタライゼーションアッセイ」または「ＩＲＰ−２機能アッセイ」または「機能的アッセイ」としては、細胞内の野生型または変異ＩＲＰ−２核酸またはタンパク質の存在、ならびに膜と結合する、別の分子（例えばユビキチン）と相互作用する、および／または鉄−依存的酸化およびプロテオソーム分解を受ける野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質の能力を直接的または間接的に評価するアッセイが挙げられる。
【００８７】
いくつかの機能的アッセイとしては、多重結合因子を利用する結合アッセイが挙げられる。多重結合因子の１つの形態は、支持体上に配置される野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントを含む製品に関する。これらの多重結合因子は、このような形態においてか、あるいは十分な親和性が達成されるこのような方法において、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントを提供する。野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントを有する多重結合因子は、所望のポリペプチドをマクロ分子支持体に結合させることによって得られる。「支持体」は、キャリア、タンパク質、樹脂、細胞膜、またはこのような分子を結合または固定化するために使用される任意のマクロ分子構造を表し得る。固体支持体としては、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルローストリップ、膜、微粒子（ラテックス粒子のような）、動物細胞、Ｄｕｒａｃｙｔｅ（登録商標）、人工細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントは、例えば、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基およびキャリア上の反応性基を介する共有結合によって、無機キャリア（酸化シリコン材料（例えば、シリカゲル、ゼオライト、珪藻土、アミノ化ガラス（ａｍｉｎａｔｅｄ　ｇｌａｓｓ）のような）へ結合され得る。
【００８８】
いくつかの多重結合因子において、マクロ分子支持体は、疎水性非−共有結合的相互作用によって野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントの一部分と相互作用する疎水性表面を有する。いくつかの場合において、支持体上の疎水性表面はポリマー（プラスチック、または疎水性基が結合されている任意の他のポリマー（ポリスチレン、ポリエチレンまたはポリビニルのような）である。さらに、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントは、キャリア（タンパク質およびオリゴ／ポリサッカリド（ｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅｓ）（例えば、セルロース、澱粉、グリコーゲン、キトサンまたはアミノ化セファロース（ａｍｉｎａｔｅｄ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）が挙げられる）に共有結合的に結合され得る。これらの後者の多重結合因子においては、分子上の反応性基（ヒドロキシまたはアミノ基）が用いられ、共有結合を作り出すようにキャリア上の反応性基へ結合される。さらなる多重結合因子は、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質ならびにそのフラグメントを結合させるように、化学的に活性化された他の反応性基を有する支持体を含む。例えば、臭化シアン活性型マトリックス、エポキシ活性型マトリックス、チオおよびチオプロピルゲル、ニトロフェニルクロロホルメートおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドクロロホルメート結合、あるいはオキシランアクリリック支持体が使用される（Ｓｉｇｍａ）。
【００８９】
さらに、いくつかの実施形態において、リポソームまたは脂質二重層（天然または合成）が支持体として企図され、そして野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントが膜表面に結合されるか、またはリポソーム工学における技術によって膜へ組み込まれる。１つの方法によって、リポソーム多重結合支持体は、表面上で暴露される野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントを含む。疎水性ドメインは、膜との相互作用を促進させるように、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントへ結合され得る。
【００９０】
目的のポリペプチドのより大きなフレキシビリティを促進し且つそれにより支持体によってもたらされ得る任意の立体障害を克服するために、（例えば、λファージのフレキシブル領域に似るように遺伝子操作された「λリンカー」のような）野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントと支持体との間の適切な長さのリンカーの挿入もまた、企図される。最適な細胞応答またはその欠如を可能にするリンカーの適切な長さの決定は、本開示中で詳述されるアッセイ法においてリンカーを変化させながら野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントをスクリーニングすることによって、決定され得る。
【００９１】
他の実施形態において、上で議論される多重結合支持体は、「多重結合化された−多重結合支持体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ−ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ　ｓｕｐｐｏｒｔ）」を作製するために、多重結合化された野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントを結合し得る。例えば、多重結合化リガンドは、分子生物学における慣的技術を用いてタンデムの２つ以上のポリペプチドをカップリングすることによって得られ得る。野生型または変異型ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントの多重結合化形態は、例えば高い親和性を有する因子を得る能力ゆえに、多くの適用について好都合である。多重結合化因子を組み立てる個々のドメイン間のリンカーまたはスペーサー（フレキシブルλリンカーのような）の組み込みもまた、いくつかの実施形態について好都合であり得る。適切な長さのλリンカーの挿入は、その分子においてより大きなフレキシビリティを促進し得、そして立体障害を克服し得る。同様に、多重結合化された野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントと支持体との間のリンカーの挿入は、より大きなフレキシビリティを促進し、そして支持体によってもたらされる立体障害を制限する。リンカーの適切な長さの決定は、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメント上のエピトープに対する抗体を用いて、リンカーを変化させながら野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントをスクリーニングすることによって決定され得る。実施例３は、抗−ＩＲＰ抗体またはそのフラグメント（実施例１または２に従って作製される）をビーズへ結合させるために使用された方法を記載する。
【００９２】
従って、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質あるいはそのフラグメントと相互作用する因子を同定するためのいくつかの方法は、前記の支持体−結合因子を用いる。一旦、支持体−結合因子が得られると、例えば分子（例えば、抗体またはユビキチン）がその支持体結合因子へ接触され、そして結合が直接的（例えば、標識抗体またはユビキチンを用いることによって）または間接的（例えば、抗−ＩＲＰ−２抗体またはユビキチンに対する標識抗体を用いることによって）に決定される。いくつかのアッセイにおいて、支持体結合された野生型または変異ＩＲＰ−２を酸化または還元した後に、これをユビキチンのような結合パートナーへ接触させることが望ましい。当業者は、支持体−結合型ＩＲＰ−２タンパク質またはそのフラグメントを酸化する多くの他の方法を認識するであろうが、このような酸化は、十分な濃度の鉄（例えば、ＦｅＣｌ３）の存在下において達成され得る。ＩＲＰ−２を酸化させるための方法は、その全体が本明細書中で参考として明白に援用されるＩｗａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９５：４９２４（１９９８）中に提供される。
【００９３】
１つのキャラクタライゼーションアッセイにおいて、例えば、変異支持体結合型ＩＲＰ−２ペプチドの酸化またはユビキチン化を受ける能力が、野生型支持体−結合型ＩＲＰ−２ペプチドの酸化またはユビキチン化を受ける能力と比較される。１つの方法によって、支持体結合型ＩＲＰ−２の酸化は、２０：１反応混合液（２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ　７．２）および４０ｍＭ　ＫＣＩ）中で０．１：ｇ／：ｌタンパク質の濃度にて、５０：Ｍ　ＦｅＣ１３および１０ｍＭ　ＤＴＴの存在下において、３７℃で１５−３０分間行われる。いくつかの実施形態において、トリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）を１ｍＭで使用し、ＤＴＴの代わりにジスルフィドを還元することが所望される。特に、還元型ＩＲＰ−２が所望される場合、好ましくはＴＣＥＰ（１ｍＭ）が、鉄を含有しない反応混合液中で１５−３０分間３７℃にて使用される。
【００９４】
一旦酸化型および／または還元型ＩＲＰ−２支持体が作製されると、ｉｎ　ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイが以下のように行われ得る。酸化型および／または還元型支持体−結合野生型および変異ＩＲＰ−２は、４００：ｇ　ＲＤ４　Ｓ１００　溶解物、５ｍＭ　ＭｇＣ１２、２ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＤＴＴ、６：ｇ　ユビキチン、２５ｍＭ　トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．６）および６０ｍＭ　ＫＣＩへ５分間添加される。反応は、１％　ＮＰ−４０、０．５％　デオキシコラート、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．１％　ＳＤＳを含む氷冷緩衝液を添加することによって停止される。この支持体結合複合体はこの緩衝液で３回洗浄され；ビーズは洗浄の合間に１５００×ｇでスピンダウンされる。このビーズは、２×Ｌａｅｍｍｅｌｉ緩衝液中で１０分間煮沸され、さらに適切なＳＤＳ　ＰＡＧＥ（例えば、６％−１５％）上で分離される。この分離タンパク質はエレクトロブロッティングによって膜へ移され、そしてユビキチンの存在がアフィニティー精製されたポリクローナルまたはモノクローナル抗−ユビキチン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって実証され得る。このアッセイは、酸化および還元型の変異および野生型ＩＲＰ−２のユビキチンと相互作用する能力を実証する。
【００９５】
別の方法によって、野生型または変異型支持体結合型ＩＲＰ−２ペプチドが酸化され（例えばＨ２Ｏ２または鉄への暴露）、そして放射標識されたユビキチンと相互作用する支持体結型合因子の能力が測定される。コントロールとしては、ＴＣＥＰを用いて還元される支持体結合型因子が挙げられる。例えば、支持体結合された野生型および変異ＩＲＰ−２タンパク質のアリコートが、プロテイナーゼおよびイソペプチダーゼの阻害剤の混合物（５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０μＭ　ヘミン、１ｍＭ　４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド、１ｍＭ　Ｅ−６４、および２μｇ／ｍＩ　アプロチニン、および１０ｍＭ　ヨードアセトアミド）を含む５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０７ｍＭ、および０．１ｍＭ　Ｈ２Ｏ２に、５，１０，１５および３０分間暴露される。次に、このアッセイを５０μｌの最終体積（５０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）、５　ｍＭ　ＭｇＣ１２、１ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＡＭＰ−ＰＮＰ、２μｇの１２５Ｉ−ユビキチン（約
【００９６】
【数１】
2004506420.tif 000002
【００９７】
１０６ｃｐｍにて）、１μＭ　ユビキチンアルデヒド、および３０μｌの支持体結合型ＩＲＰ−２（約１０ｍｇのタンパク質／ｍｌを含む）にした。
【００９８】
３７℃で２０分間のインキュベーションに続いて、この支持体結合型ＩＲＰ−２−ユビキチン複合体は、１５００×ｇで３０秒間スピンダウンされ、そして５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ　ＭｇＣ１２、１　ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＡＭＰ−ＰＮＰ中にて洗浄される。この洗浄手順は３回繰り返される。支持体結合型ＩＲＰ−２と関連する放射活性がシンチレーションによって測定され得る。この方法は、変異または野生型ＩＲＰ−２ポリペプチドと結合し得るユビキチンの量を直接的に検出する。
【００９９】
あるいは、前記の反応は、５０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加、および１００℃での１０分間の煮沸によって停止され得る。続いて、このタンパク質は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離される。このタンパク質は、エレクトロブロットによってナイロンへ転写され、さらにこの膜は乾燥される。この膜は２−４日間フィルムへ暴露され、続いて抗−ＩＲＰ−２抗体を用いるノーザンブロットが行われる。結合型抗体の検出はまた、例えば金またはセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合する二次抗体を用いて達成され得る。この方法では、ユビキチンおよびＩＲＰ−２タンパク質の両方が検出される。ユビキチン複合体のレベルはまた、オートラジオグラムのデンシトメトリーによって定量化され得る。
【０１００】
さらに、細胞に基づくキャラクタライゼーションアッセイが行われ得る。例えば、変異および／または野生型ＩＲＰ−２タンパク質を発現させるために、ＣＯＳ細胞がトランスフェクションされ得る。（例えば、野生型ＩＲＰ−２を発現させるためにＣＯＳ細胞をトランスフェクションするためのプロトコールについては、その全体が本明細書中で参考として明白に援用されるＳａｍａｎｉｅｇｏら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２６９：３０９０４（１９９４）を参照のこと。形質転換体を選択した後、陽性発現細胞のアリコートは、酸化的ストレス下に置かれる。１つの方法によって、酸化的ストレスは、培地中のクエン酸第二鉄アンモニウム（ｆｅｒｒｉｃ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）を４００：ｇ／ｍｌまで上昇させることによってもたらされる。別の方法によって、酸化的ストレスへの暴露は、０．１ｍＭ　Ｈ２Ｏ２を含む血清−およびフェノールレッド−フリーな培地中において、３０分間成し遂げられる。この細胞は、即時に回収されるか、またはこの細胞を酸化的ストレスから回復させるためのＨ２Ｏ２または鉄−フリーな培地中で培養される。コントロール細胞は、Ｈ２Ｏ２または鉄が培地中に含まれていないこと以外、暴露細胞と正確に同じように処理される。Ｈ２Ｏ２または鉄への暴露後の細胞の生存率は、トリパンブルーおよび３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）―２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド染色の排除によってモニターされ得る。還元されたグルタチオンのレベルもまた測定され得る。さらに、細胞内のＡＴＰのレベルは、生物発光体細胞アッセイキット（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ）を製造元の指示書に従って用いることによってモニターされ得る。
【０１０１】
次いで細胞は、０．１ｍＭ　Ｈ２Ｏ２または鉄への３０分間の暴露の後に回収され、そしてプロテイナーゼおよびイソペプチダーゼの阻害剤の混合物（５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０μＭ　ヘミン、１ｍＭ　４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド、１ｍＭ　Ｅ−６４、および２μｇ／ｍｌ　アプロチニン、および１０ｍＭ　ヨードアセトアミド）を含む５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）でホモジナイズされる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）分離およびニトロセルロースへの転写の後、ブロットはユビキチンに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でプローブされ、その後１２５Ｉ−プロテインＡと共にインキュベーションされる。ユビキチンおよびユビキチン複合体は、オートラジオグラフィーによって検出され、また画像分析によって定量化される。
【０１０２】
あるいは、細胞が回収され、そして５０ｍＭ　トリス、１ｍＭ　ＤＴＴ（ｐＨ７．６）中でホモジナイズされる。細胞上清中のユビキチン複合活性は、内因性タンパク質基質と外因性１２５Ｉ−標識ユビキチンとの間の複合体形成を触媒する能力として定量化される。このアッセイは、５０μｌの最終体積（５０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ　ＭｇＣ１２、１ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＡＭＰ−ＰＮＰ、２μｇの１２５Ｉ−ユビキチン（約１０６ｃｐｍ）、１μＭ　ユビキチンアルデヒド、および３０μｌの細胞上清（約１０ｍｇのタンパク質／ｍｌ）を含む）において行われる。この反応は、３０μｌの細胞上清の添加で開始される。３７℃にて２０分間のインキュベーションに続いて、この反応は、５０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液の添加によって停止される。１００℃で１０分間の煮沸の後、２０μｌの混合液中のタンパク質が、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離される。ネガティブコントロールのために、ＡＭＰ−ＰＮＰが４．５ユニットのヘキソキナーゼおよび１２ｍＭ　２−デオキシグルコースで置き換えられて、平行実験が行われる。ゲルを乾燥した後、これを２−４日間フィルムへ暴露する。ユビキチン複合体のレベルは、オートラジオグラムのデンシトメトリーによって定量化され得る。前記のキャラクタライゼーションアッセイを使用することによって、変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質の酸化およびユビキチン化を受ける能力が容易に決定され得る。（ＩＲＰ−２ユビキチン複合体解析に適応され得るさらなるユビキチンアッセイについては、その全体が本明細書中で参考として明白に援用されるＳｈａｎｇら、Ｊ．ＢｉｏＬ　Ｃｈｅｍ．２７２：２３０８６（１９９７）をまた参照のこと。）
本明細書中の開示を考えると、当業者は、このようなアッセイが様々な型のＩＲＰ−２タンパク質のプロテオソーム分解について選択される能力を評価し、そして神経変性疾患に関係するＩＲＰ−２の型を同定するために使用され得ることを認識するであろう。以下の開示において、いくつかの診断実施形態が記載される。
【０１０３】
診断的実施形態
一般的に、診断的実施形態は、それが核酸またはタンパク質−ベースアッセイのいずれであるかに従って分類され得る。いくつかの診断的アッセイは、ＩＲＰ−２核酸またはタンパク質における変異または多型（これは、酸化、ユビキチン化、およびプロテオソーム分解における異常の一因となる）を検出する。他の診断アッセイは、疾患を患う生物中の変異および／または野生型ＩＲＰ−２　ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと似た変異および／または野生型ＩＲＰ−２　ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを試験生物中で検出すること、あるいは疾患を患っていない生物中の変異および／または野生型ＩＲＰ−２のレベルと異なる変異および／または野生型ＩＲＰ−２　ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを試験生物中で検出することによって、酸化、ユビキチン化、およびプロテオソーム分解における欠陥を同定および識別する。
【０１０４】
さらに、神経変性疾患の迅速な検出および同定を可能にするために、試薬を含むキットの製造および以下の実施形態に記載される方法が企図される。診断キットは、核酸プローブまたは抗体あるいはその組み合わせ（これらは特に、ＩＲＰ−２核酸もしくはタンパク質の変異または野生型を検出する）或いは核酸プローブまたは抗体またはそれらの組み合わせ（これらは、野生型または変異ＩＲＰ−２のＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルを測定するために使用され得る）を含み得る。これらのキットの検出成分は、代表的に、以下の試薬の１つ以上を組み合わせて供給される。ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を吸収、もしくは別の方法で結合し得る支持体がしばしば提供されるであろう。利用可能な支持体としては、正に荷電する置換基のアレイを保持することで特徴づけられ得るニトロセルロース、ナイロン、または誘導型ナイロンの膜が挙げられる。１つ以上の制限酵素、コントロール試薬、緩衝液、増幅酵素、非−ヒトポリヌクレオチド様ウシ−胸腺またはサケ−精子　ＤＮＡ、およびキットの中の道具を用いて神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を診断するための方法を記載する一連の指示書もまた、供給され得る。
【０１０５】
有用な核酸−ベースの診断的技術としては、直接的なＤＮＡ配列決定、サザンブロット分析、一本鎖コンファメーション解析（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＳＳＣＡ），
ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ、ドットブロット分析、核酸増幅、およびこれらの方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分析の出発点は、生物学的サンプルから単離または精製された核酸である。被験体からの血液が適切な生物学的サンプルであることが企図される。さらに、変異または多型ＩＲＰ−２の存在を決定するよう診断的アッセイが設計され、ＤＮＡの任意の供給源（毛髪、頬細胞、および皮膚細胞を含むがこれらに限定されない）が生物学的サンプルとして使用され得る。核酸は、サンプルから抽出され、そして酸化、ユビキチン化、およびプロテオソーム分解における欠陥の一因となる多型として認識されるアミノ酸残基をコードするＤＮＡに隣接する領域に相当するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅技術によって増幅され得、それによって神経変性疾患の診断を提供する。
【０１０６】
一旦十分な量のＤＮＡが試験される個体から得られると、ＩＲＰ−２多型を検出するために、いくつかの方法が使用され得る。直接的なＤＮＡ配列決定（手動配列決定または自動蛍光配列決定のいずれか）は、このような配列の変化を検出し得る。別の方法は、一本鎖コンファメーション多型アッセイ（ＳＳＣＡ）である（その全体が本明細書中で参考として明白に援用されるＯｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２７７６−２７７０（１９８９））。しかしながら、この方法は、全ての配列変化を検出するわけではないが（特に、そのＤＮＡフラグメントのサイズが２００塩基対より大きい場合）、ほとんどのＤＮＡ配列変化を検出するように最適化され得る。
【０１０７】
検出感度の低下は不都合であるが、ＳＳＣＡを用いて可能になるスループットの増大がこれを変異検出のための直接的な配列決定法に対する魅力的で現実的な代替法にする。次に、ＤＮＡ配列変化の正確な性質を決定するために、ＳＳＣＡゲル上でシフトされた移動度を有するフラグメントが配列決定される。２つの相補的なＤＮＡ鎖間のミスマッチの検出に基づく他の方法としては、均一変性ゲル電気泳動（ｃｌａｍｐｅｄ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＤＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９：６９９−７０６（１９９１））、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）（Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１２：３０１−３０６（１９９２））、および化学ミスマッチ開裂法（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｃｌｅａｖａｇｅ）（ＣＭＣ）（Ｇｒｏｍｐｅら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：５８５５−５８９２　（１９８９））が挙げられる。ＤＮＡ配列変化を検出する現在利用可能な方法の総説は、Ｇｒｏｍｐｅ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５：１１１−１１７　（１９９３）中に見出され得る。
【０１０８】
多型の存在を確かめるための核酸−ベースの７つの公知の方法が以下に記載される。例示的な目的のためのみに提供され、本発明のいかなる局面を限定することは意図されない、これらの方法としては：
（１）一本鎖コンファメーション分析（ＳＳＣＡ）（Ｏｒｉｔａら）；
（２）変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：２６９９　２７０５（１９９０）およびＳｈｅｆｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２３２−２３６（１９８９））（共に本明細書中で参考として援用される）；
（３）ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７：１６７−１７２（１９９０）およびＫｉｎｓｚｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６６−１３７０（１９９１））（共に本明細書中で参考として援用される）；
（４）ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質（Ｅ．Ｃｏｌｉ　ｍｕｔＳタンパク質のような）の使用（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．　２５：２２９−２５３　（１９９１）（本明細書中で参考として援用される）；
（５）対立遺伝子−特異的ＰＣＲ（Ｒａｎｏ　ａｎｄ　Ｋｉｄｄ，Ｎｕｃｉ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：８３９２（１９８９）（本明細書中で参考として援用される）（これは、それらの３’末端で多型に対してハイブリダイズするプライマーの使用を伴い、もし多型が存在しないならば、増幅産物は観察されない）；および
（６）増幅無反応性変異システム（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）（欧州特許出願公開番号０３３２４３５号およびＮｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２５０３−２５１６（１９８９）（共に本明細書中で参考として援用される）において開示されるような）；および
（７）一時的温度勾配ゲル電気泳動（ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＴＴＧＥ）（本明細書中で参考として援用されるＵ．Ｓ．／Ｅ．Ｇ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　２１０３においてＢｉｏ−Ｒａｄによって記載される）が挙げられる。
【０１０９】
ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥ、ＴＴＧＥおよびＲＮＡｓｅプロテクションアッセイにおいて、多型が存在する場合、新たな電気泳動バンドが現れる。ＳＳＣＡおよびＴＴＧＥは、この配列変化が一本鎖分子内塩基対合における差異（これは、電気泳動的に検出される）をもたらすゆえに異なって移動するバンドを検出する。ＲＮＡｓｅプロテクションは、変異ポリヌクレオチドの２つ以上のより小さなフラグメントへの開裂を伴う。ＤＧＧＥは、変性勾配ゲルを使用して配列の移動速度における差異を検出する。対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドアッセイ（ＡＳＯｓ）（Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２７８−２８２（１９８３））においては、オリゴヌクレオチドが特異的配列を検出するように設計され、そしてハイブリダイゼーションシグナルの存在または非存在を検出することによってアッセイが行われる。ｍｕｔＳアッセイにおいて、タンパク質は、多型性と非多型性配列との間のヘテロ２本鎖におけるヌクレオチドミスマッチを含む配列に対してのみ結合する。ミスマッチ（この言葉のここの意味において）は、２つの鎖が１００％相補的なわけではないハイブリダイズされた核酸２本鎖をいう。全相同性の欠如は、例えば非−多型性鎖にハイブリダイズした生物学的サンプルから得られるアンプリコン中の１つ以上の多型の存在に起因する。ミスマッチ検出は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ中の点突然変異を検出するために使用され得る。これらの技術は配列決定法に比べて低感度であるが、一方これらは多くの生物学的サンプルに対して容易に行われ、またアレイ技術に適用できる（ａｍａｎａｂｌｅ）。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、野生型ＩＲＰ−２をコードするポリヌクレオチドを変異ＩＲＰ−２と区別する核酸プローブが規則正しいアレイで支持体に結合される（ここで、この核酸プローブは互いに重ならない支持体の異なる領域へ結合される）。好ましくは、このような規則正しいアレイは、プローブの異なる位置が記録され且つアッセイ手順の一部としてアクセスされ得る「アドレスで呼び出し可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）」よう設計される。これらのプローブは、異なる既知の位置において支持体に結合される。各核酸プローブの正確な位置の情報は、これらの「アドレスで呼び出せる」アレイを結合アッセイにおいて特に有用なものにする。いくつかの生物学的サンプルの調製物からの核酸は、慣用的な方法（例えば、放射活性または蛍光）によって標識され、そして標識サンプルは、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下においてアレイへ適用される。
【０１１１】
サンプル中の核酸がアレイ上のプローブにハイブリダイズする場合、シグナルは、ハイブリッドの位置に相当する支持体上の位置で検出されるであろう。各標識サンプルのアイデンティティが既知であり且つ標識サンプルが適用される支持体上の領域が既知であるので、多型改変体の存在の同定は、容易に決定され得る。これらの方法は、高スループットな診断的または検出分析の当業者に公知の技術を使用して、容易に自動化される。
【０１１２】
さらに、上記に示される方法と逆の方法が使用され得る。アドレスで呼び出せるアレイを作製するために、生物学的サンプル中に存在する核酸が支持体上に配置され得る。好ましくは、重ならない既知の位置で支持体上にサンプルが配置される。各サンプル中の所望の多型を有する核酸の存在は、その多型をコードする相補的な核酸の標識核酸プローブを適用し、さらに生物学的サンプルが配置される位置に相当するアレイ上の位置におけるシグナルの存在を検出することによって、決定される。生物学的サンプルのアイデンティティおよびアレイ上の位置が分かるので、多型改変体の同定は迅速に決定され得る。これらの方法は、高スループットな診断的分析の当業者に公知の技術を使用して、容易に自動化される。
【０１１３】
当該分野で公知の任意のアドレスで呼び出し可能なアレイ技術が、本発明のこの局面と共に使用され得る。ポリヌクレオチドアレイの１つの特定の実施形態は、ＧｅｎｅｃｈｉｐｓＴＭとして知られており、そして米国特許第５，１４３，８５４号；ＰＣＴ公開番号　ＷＯ　９０／１５０７０および９２／１００９２において一般的に記載される。これらのアレイは、一般的に、フォトリソグラフ法と固層オリゴヌクレオチド合成法との組み合わせを併せる機械的合成法または光学的合成法（ｌｉｇｈｔ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ）を使用して作製される。（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５１：７６７−７７７，　（１９９１））。固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイの固定化は、「超大規模固定化ポリマー合成法（Ｖｅｒｙ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ＶＬＳＰＩＳＴＭ）（代表的に、プローブがチップの固体表面上に高密度なアレイで固定化される）として一般的に認識される技術の開発によって可能になった。ＶＬＳＰＩＳＴＭ技術の例は、米国特許第５，１４３，８５４号および第５，４１２，０８７号において、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ　９０／１５０７０、ＷＯ　９２／１００９２およびＷＯ　９５／１１９９５（これらは、光学的合成技術のような技術を通じてオリゴヌクレオチドアレイを形成するための方法を記載する）において提供される。固体支持体上に固定化されるヌクレオチドのアレイを提供することを目的とする設計方法において、ハイブリダイゼーションパターンおよび診断的情報を最大限にするための試みとして、チップ上のオリゴヌクレオチドアレイを整列および表示するためのさらなるプレゼンテーション方法が開発された。このようなプレゼンテーション方法の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９４／１２３０５、ＷＯ　９４／１１５３０、ＷＯ　９７／２９２１２およびＷＯ　９７／３１２５６に記載される。
【０１１４】
広く多様な標識および複合技術が当業者によって知られており、そして種々の核酸アッセイにおいて使用され得る。オリゴラベリング、ニックトランスレーション、エンド−ラベリング、または標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含むハイブリダイゼーションまたはＰＣＲのための標識核酸を生産するためのいくつかの方法が存在するがこれらに限定されない。あるいは、ＩＲＰ−２をコードする核酸が、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中へクローニングされ得る。このようなベクターは当該分野で公知であり、また市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のような）および標識ヌクレオチドを添加することによって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡプローブを合成するために、使用され得る。多くの会社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　Ｎ．Ｊ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ　（Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗｉｓ．）、およびＵ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｏｈｉｏ））が市販用のキットおよびこれらの手順に関するプロトコールを提供する。適切なレポーター分子または標識としては、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光、化学発光、または色素産生試薬、および基質、コファクター、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。
【０１１５】
ＲＮＡｓｅプロテクション法は、上記に簡単に記載したように、アレイ技術に適用できるミスマッチ開裂技術の例である。好ましくは、この方法は、多型を有するＩＲＰ−２配列に相補的な標識リボプローブの使用を包含する。しかしながら、この方法は、野生型遺伝子を有するＩＲＰ−２配列に相補的な標識リボプローブの使用を伴う。リボプローブおよび生物学的サンプルから単離または増幅されるｍＲＮＡまたはＤＮＡのどちらか一方がアニールされ（ハイブリダイズされ）、そして引き続き酵素ＲＮＡｓｅ　Ａ（これは、二重鎖ＲＮＡｓｅ構造におけるミスマッチを検出し得る）を用いて消化される。ミスマッチがＲＮＡｓｅ　Ａによって検出される場合、多型改変体はサンプル中に存在せず、またこの酵素はミスマッチの部位で切断し、リボプローブを破壊する。従って、アニールするＲＮＡが電気泳動ゲルマトリックス上で分離されるとき、もしミスマッチが検出され且つＲＮＡｓｅＡによって開裂されるならば、ＲＮＡ産物は、そのリボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての全長二重鎖ＲＮＡよりも非常に小さく見えるであろう。
【０１１６】
リボプローブに対する相補物は、また、アレイ上に分散され、そして任意の残存ハイブリッドを変性させた後にＲＮＡｓｅ　Ａ消化からの産物を用いてストリンジェントにプローブされ得る。この場合において、もしミスマッチが検出され且つプローブがＲｎａｓｅ　Ａによって破壊されるならば、アレイ上の相補物は、分解されたＲＮＡとストリンジェントな条件下においてアニールしないであろう。類似する方法において、酵素的または化学的開裂を通じてミスマッチを検出するために、ＤＮＡプローブが使用され得る。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：４３９７（１９８８）；Ｓｈｅｎｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７２：９８９（１９７５）；およびＮｏｖａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：５８６（１９８６）を参照のこと。ミスマッチはまた、マッチ二重鎖に対してミスマッチ二重鎖の電気泳動能力におけるシフトによって検出され得る。（例えば、本明細書中で参考として援用されるＣａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４２：７２６　（１９８８）を参照のこと）。前記の技術のいずれかを使用して、多型を有するＩＲＰ−２の領域に相当する試験生物由来のｍＲＮＡまたはＤＮＡが、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲによって増幅され得る。
【０１１７】
タンパク質サンプル中のＩＲＰ−２多型または野生型配列の存在は、また、慣用的なアッセイを使用することによって検出され得る。例えば、ＩＲＰ−２多型と免疫反応性である抗体が使用され、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の傾向について生物学的サンプルをスクリーニングし得る。さらに、野生型ＩＲＰ−２を変異ＩＲＰ−２と区別する抗体が使用され、ある生物が神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の傾向を有さないことを決定し得る。好ましい実施形態において、抗体は、溶液から野生型または変異型ＩＲＰ−２を免疫沈降させるために使用されるか、あるいはウエスタンまたはイムノブロット上で野生型また変異ＩＲＰ−２と反応させるために使用される。好ましい診断的実施形態としてはまた、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用するサンドウィッチアッセイを含む）が挙げられる。例示的に、サンドウィッチアッセイは、本明細書中で参考として援用される米国特許第４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号中にＤａｖｉｄらによって記載される。他の実施形態は、その全体が本明細書中で参考として明白に援用される米国特許第５，２９０，６７８号；　５，６０４，１０５号；　５，７１０，００８号；　５，７４４，３５８号；および５，７４７，２７４号に開示される免疫−ストリップ（ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｒｉｐ）技術の局面を使用する。
【０１１８】
別の好ましいタンパク質−ベースの診断において、本発明の抗体は規則正しいアレイで支持体へ結合される（ここで、複数の抗体は、互いに重ならない支持体の異なる領域に結合される）。核酸−ベースのアレイと同様に、タンパク質−ベースのアレイは、明確な位置が記録され且つアッセイ手順の一部としてアクセスされ得るように「アドレスで呼び出し可能な」よう設計される規則正しいアレイである。これらのプローブは、異なる既知の位置で支持体に結合される。各プローブの正確な位置の情報は、これらの「アドレスで呼び出し可能な」アレイを結合アッセイにおいて特に有用なものにする。例えば、アドレスで呼び出し可能なアレイは、特定のＩＲＰ−２タンパク質を特異的に認識し且つ変異および野生型ＩＲＰ−２タンパク質を区別する複数の抗体プローブを結合されるいくつかの領域を有する支持体を含む。
【０１１９】
従って、タンパク質は生物学的サンプルより得られ、そして慣用的な方法（例えば、放射活性、比色的に、または蛍光的に）によって標識される。標識サンプルは、次いで、結合を可能にする条件下においてアレイに適用される。サンプル中のタンパク質がアレイ上の抗体プローブに結合する場合、抗体−タンパク質複合体の位置に相当する支持体上の場所でシグナルが検出されるであろう。各標識サンプルのアイデンティティが既知であり、且つ標識サンプルが適用される支持体の領域が既知であるので、存在の同定、濃度、および／または発現レベルが迅速に決定され得る。すなわち、既知濃度の変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質の標識標準を使用することによって、研究者は、試験サンプル中の特定のＩＲＰ−２タンパク質のタンパク質濃度を正確に測定し得、そしてまた特定の型のＩＲＰ−２タンパク質の発現レベルを評価し得る。特定のＩＲＰ−２タンパク質の濃度または発現レベルをより正確に決定するために、デンシトメトリーにおける慣用的な方法が使用され得る。これらの方法は、高スループット診断的分析の当業者に公知の技術を使用して、容易に自動化される。
【０１２０】
別の実施形態において、上記に示したものと逆の方法が使用され得る。アドレスで呼び出し可能なアレイを作製するために、生物学的サンプル中に存在するタンパク質が支持体上に配置され得る。好ましくは、このタンパク質サンプルは、重ならない既知の位置で支持体上に配置される。各サンプル中の変異または野生型ＩＲＰ−２タンパク質をコードするタンパク質の存在は、次いで、ＩＲＰ−２タンパク質の変異または野生型形態に特異的なエピトープを認識する標識抗体プローブを適用することによって決定される。生物学的サンプルのアイデンティティおよびアレイ上の位置が分かっているので、特定の多型の存在の同定、濃度、および／または発現レベルは迅速に決定され得る。
【０１２１】
すなわち、既知濃度の変異および／または野生型ＩＲＰ−２タンパク質の標識標準を使用することによって、研究者は、サンプル中のＩＲＰ−２タンパク質の濃度を正確に決定し得、そしてこの情報から特定の型のＩＲＰ−２タンパク質の発現レベルを評価し得る。ＩＲＰ−２タンパク質の濃度または発現レベルをより正確に決定するために、デンシトメトリーにおける慣用的な方法が使用され得る。これらの方法はまた、高スループット診断分析の分野における当業者に公知の技術を使用して、容易に自動化される。上記に詳述するように、当該分野において公知の任意のアドレスで呼び出し可能なアレイ技術は、本発明のこの局面と共に使用され得、そして抗体結合パターンおよび診断的情報を最大限にする試みにおいて、チップ上のタンパク質アレイを提示する。
【０１２２】
別の診断的実施形態において、本明細書中でその全体が参考として明白に援用される米国特許第５，２９０，６７８号；５，６０４，１０５号；５，７１０，００８号；５，７４４，３５８号；および５，７４７，２７４号において開示される免疫−ストリップ技術が適応され、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質に対する抗体によって認識される抗原を提示する。次いで、これらの抗原提示免疫ストリップが使用され、種々の型のＩＲＰ−２タンパク質に対する抗体の存在について生物学的サンプルが分析され得る。野生型または変異ＩＲＰ−２ペプチドまたはタンパク質はこれらの実施形態にとって好ましい抗原であるけれども、これらの分子に似た擬ペプチドが使用され得る。これらの擬ペプチド−ベースの実施形態は、よりプロテアーゼ耐性であり得、また多くの適用についてストリップ（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）および使用され得る。好ましくは、擬ペプチド−ベースのＩＲＰ−２アレイが作り出され（例えば、野生型または変異ＩＲＰ−２タンパク質に似た擬ペプチドを有する遺伝子チップ）、そして生物学的サンプルの大きなパネルをスクリーニングするために使用される。
【０１２３】
別の好ましい方法において、神経変性疾患についての危険性があると疑われる被験体に由来する血液サンプルが得られ、そして野生型ＩＲＰ−２タンパク質および／または変異型のＩＲＰ−２タンパク質上のエピトープに向けられた抗体を使用するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析される。蛍光標識二次抗体（例えば、フルオレシン複合化ヤギ抗−ヒトＩｇＧ）を使用する標準的フローサイトメトリー技術および市販の細胞固定化および透過化キット（ＰｅｒｍａＣｙｔｅ−ＦＰ）が使用されるであろう。従って、再懸濁細胞は抗−ＩＲＰ−２抗体および二次抗体と反応させられ、そしてその免疫複合体はＦＡＣＳの前に通される。細胞は、蛍光の分布および定量についてモニターされるであろう。野生型および／または変異型ＩＲＰ−２タンパク質に特異的な抗体を使用することによって、種々の型のＩＲＰ−２タンパク質の存在および量の決定が迅速に決定され得る。
【０１２４】
上記で議論するように、ＩＲＰ−２分子における多型の存在または検出は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の診断を提供し得る。さらなる実施形態としては、検出成分（ＩＲＰ−２の特定の多型改変体に特異的な抗体のような）を含む診断キットの調製が挙げられる。この検出成分は、代表的に、１つ以上の以下の試薬の組み合わせで供給されるであろう。ＲＮＡまたはタンパク質を吸収または他の方法で結合し得る支持体がしばしば供給されるであろう。この目的のために利用可能な支持体としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたは誘導型ナイロン（正に荷電した置換基のアレイを保持することによって特徴づけられる）の膜およびＧｅｎｅｃｈｉｐｓＴＭまたはそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の酵素（逆転写酵素および／またはＴａｑポリメラーゼのような）が、ｄＮＴＰｓ、緩衝液、またはウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡのような非−ヒトポリヌクレオチドと同様に、キットの中に備えられ得る。このキットアッセイからの結果は、医療サービス提供者または診断研究室によって解釈され得る。あるいは、診断キットは、製造され、自己診断のために私的な個人に対して販売される。
【０１２５】
ＩＲＰ−２　ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質における多型の存在または非存在に従って疾患を診断することに加え、ＩＲＰ−２の酸化、ユビキチン化、およびプロテオソーム分解における欠陥を伴ういくつかの神経変性疾患は、歪んだレベルの変異および野生型ＩＲＰ−２に起因する。例えば、特定の型のＩＲＰ−２の発現レベルをモニターすることによって、診断が行われ得、そして疾患状態が同定され得る。すなわち、多くの神経変性疾患は薬用量効果に起因し、ここで、酸化を受け得ない変異ＩＲＰ−２の過剰が持続する。従って、種々のＩＲＰ−２の発現レベルの比（例えば、ＩＲＰ−２発現のパターン）を決定することによって、健康または疾患の予後診断が行われ得る。
【０１２６】
従って、健康個体、および神経変性疾患を患う個体に由来する種々のサンプルにおけるＩＲＰ−２発現のレベルが決定される。このような値はデータベースに記録され、そして試験個体から得られる値と比較され得る。さらに、健康および疾患個体の両方に由来する様々なサンプルにおけるＩＲＰ−２発現の比またはパターンはデータベース中に記録される。これらの分析は、「疾患状態プロフィール」といい、そしてある疾患状態プロフィール（例えば、健康または疾患個体からの）を試験個体からの疾患状態プロフィールと比較することによって、臨床医は、疾患の存在または非存在を迅速に診断し得る。神経変性疾患に罹患するいくつかの個体のＩＲＰ−２発現の測定値を有するデータベースは、疾患の進行がモニターされ得る価値ある標準である。この方法において、標準と生物値との間の偏差が、疾患状態の重篤度を確立する。
【０１２７】
前記の核酸およびタンパク質−ベースの診断技術が使用され、組織中のＩＲＰ−２　ＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルまたは量または比が検出され得る。定量的ノーザンハイブリダイゼーション、ｉｎ　ｓｉｔｕ分析、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、遺伝子チップアレイ技術、ＰＣＲ，およびウェスタンブロットを通じて、例えば、特定のＩＲＰ−２（野生型または変異型）についてのＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルまたは量が容易に決定され得、そしてこの情報から発現の比が確認され得る。１つの診断方法としては、例えば、疾患状態を有する複数のＩＲＰ−２アイソフォームの発現レベルの間の比を相互に関連させる方法が挙げられる。この方法を実施するために、神経変性疾患を患う個体に由来する生物学的サンプルおよび正常な個体に由来する生物学的サンプルが得られる。次いで、サンプル中の２つ以上のＩＲＰ−２タンパク質またはＩＲＰ−２タンパク質をコードする核酸（例えば、ＩＲＰ−２の野生型および変異型）の発現レベルが決定され、そして野生型および変異型ＩＲＰ−２発現の比と神経変性疾患との間に統計的に有意な関連があるか否かについて分析される。統計的に有意な関連は、当業者に良く知られている統計的方法（ｔ検定およびχ２−解析（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ　ａｎａｌｙｓｅｓ）が挙げられる）を用いて決定され得る。
【０１２８】
一旦様々なＩＲＰ−２分子のレベルが決定されると、その情報はコンピューターで読み取り可能な媒体（ハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＤＶＤドライブ、ｚｉｐドライブなどのような）上に記録され得る。記録および研究される様々なＩＲＰ−２分子の発現のレベルをふくむデータベースの生成の後、発現の比を作り出すために、様々なＩＲＰ−２分子の発現のレベルを比較する比較プログラムが使用される。例えば、最初の比較において、変異ＩＲＰ−２に対する野生型ＩＲＰ−２の比が生成される。さらに、種々の変異型ＩＲＰ−２と相互のおよび／または野生型ＩＲＰ−２との所望の比較が挙げられるがこれらに限定されない。例は、ＩＲＰ−２の酸化されたおよび還元された野生型および変異型に特異的な抗体の調製を記載する。本発明の別の局面は、その種々のｉｎ　ｖｉｖｏ状態にある脳鉄（非−トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）、トランスフェリン結合鉄（ＴＢＩ）、およびフェリチンおよびヘモシデリンを含む高分子量複合体）を測定および／またはモニターするための磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用するための方法に関する。高解像度の３Ｄグラディエントエコー画像法、バックグランド場効果の除去を伴う相画像法（ＳＷＩ）、Ｔ２＊シグナル損失の理解、および特別なスピンエコー／グラディエントエコー画像方法を使用する磁化率（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の抽出の統合は、脳鉄の絶対的な定量を導く。
【０１２９】
Ａ．高解像度３Ｄ，グラディエントエコー画像法
小さい局所的な場磁化率効果に対する感度を得ることは、長いエコー時間を伴う画像化を必要とする。空気／組織境界面によって引き起こされるバックグランド場効果は、長いエコー時間の間、これらの部位に隣接する組織において劇的なシグナル損失を導く。以前にも示したように、ボクセルに及ぶ位相のずれは、非常に小さいボクセルを用いることによって減少され得、その結果バックグランド（または他の）場からの相変化は２π未満まで減少する。この操作は、シグナルの劇的な回復をもたらし、そして画像がフィルターされる（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）場合、より高い解像度へ向かう損なわれたシグナル対ノイズの回復をもたらす。これらの結果は、より低い解像度で得られたものとは異なる。この方法は、コミュテーター効果（すなわち、ＭＲ獲得方法において固有な特別な非−直線性）と呼ばれる。１．５Ｔで１２０ｍｓと同程度長いエコー時間からの相画像は、組織間の磁化率の相違を視覚化するための手段となることが示された。静脈構造、灰白質／白質磁化率の差異および脳幹神経節における鉄は、この改変を用いて視覚化される。
【０１３０】
Ｂ．相画像法およびバックグランド場効果の除去
相画像の使用は、脳内の組織間の常磁性の（または反磁性の）差異の存在を評価し始めるための自然な方法である。ＭＲ画像中の相は、φ＝γΔＢｔによって与えられ、ここで、γは磁気回転比（ｇｙｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒａｔｉｏ）、ΔＢはある組織から隣までの磁場における変化、またｔはデータが測定される時間（通常エコー時間ＴＥ）である。
【０１３１】
これらの相違を視覚化することに伴う問題は、空気／組織境界面からのバックグランド場効果からの特別な相効果から生じる。主に低空間周波数（ｌｏｗ　ｓｐａｔｉａｌ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）であるバックグランド場効果を取り除くために、ハイパスフェーズフィルター（ｈｉｇｈ　ｐａｓｓ　ｐｈａｓｅ　ｆｉｌｔｅｒ）が開発された。この処理技術を用いて、相画像は劇的に改善された。脳内の酸素飽和および機能的な脳活性化の間の酸素飽和における小さな変化さえもマッピングする（ｍａｐ）ために、この方法が首尾よく使用されてきた（すなわち、本発明者らは、それらの実験のために使用される特定の３Ｄ配列について０．０３ｐｐｍ（０．００２のエラーを伴う）と同程度小さい変化を容易に測定することができた）。このことは、０．０２５のｐ値について、０．００４と同程度の小さい磁化率相違がこの配列を用いて測定され得ることが断言されることを暗示する（使用される配列は、ＴＥ＝４０ｍｓおよび０．５×１．０×２．０ｍｍ３の解像度を有する５分間、３Ｄグラディエントエコー法であった）。感度は、データを二回収集し、そしてそれを平均することによって、あるいは複数回の収集物を平均し、そしてそのデータを低い解像度にフィルタリングすることによって、改良され得る。
【０１３２】
全ての直線相効果を取り除くための別の方法は、二重エコー法を使用することである。第一エコーからの相は、バックグランド相効果から期待される相の単一直線依存性に基づいて、第二エコーからの相を予測するために使用される。第一エコーの相（γΔＢＴＥ１）にＴＥ２／ＴＥ１を掛けてγΔＢＴＥ２を予測する場合、この予測される相は第二エコーのものから引き算され（複雑な割り算によって達成される）、修正画像の予測される相はゼロであり、また相効果が単に加法的ではない２−コンパートメントモデルに関係する任意の非−直線的効果を後に残す。この方法は、小さい局所的なピクセル効果を切り離すことを可能にする。
【０１３３】
Ｃ．Ｔ２＊シグナル損失の理解
最近、その供給源がボクセル内に封じ込められる小さな体積である双極子場によって引き起こされる球状ボクセルにおけるシグナル損失の分析的評価が、実施された。長いエコー時間は、シグナルの挙動（すなわち、本来非−指数関数的であるシグナル変化）における顕著な振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を導き得る。Ｔ２＊強調画像におけるシグナル損失を定量化する試みにおいて、小さいランダムに分配された磁化率変化の局所的な供給源の存在下で、シグナル挙動の予測を可能にする理論が展開された。特に、シグナル変化は、時間起点の近くで本来指数関数的ではなく、また中間の（そして長い）時間ドメイン内にある。この理論が使用され、ランダムな供給源およびボクセル内の体積フラクションの体積磁化率が抽出され得る。この方法の正確な定量的性質は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるランダム構造のセットに対して有効ではなかった。
【０１３４】
脳内のＴ１緩和時間の依存性が研究され、脳内の前頭野が灰白質について最長のＴ１を有したが、一方運動皮質に近い領域は最小のＴ１値を有することが明らかにされた。この領域における灰白質および白質でコントラストの損失が生じる。同一領域の相測定は、相と鉄含有率との強い相関関係を明らかにし、運動皮質において最大を示した。本発明は、年齢の関数として、相と脳内鉄含有率との間の相関関係に関する。
【０１３５】
Ｄ．特別なスピンエコー／グラディエントエコー画像法を用いる磁化率の抽出　顕微鏡の影響によって引き起こされないスライス（ｓｌｉｃｅ）またはボクセルに及ぶバックグランド場不均質性（ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓ）を説明するために、そしてまたｒｆ相デザインへのあらゆる依存性を排除するために、特別な複合グラディエントエコーおよびスピンエコー獲得方法が定義された。一連のグラディエントエコーは、スピンエコーの周りで集められ、そして以下のようにバックグランド場効果を取り除くために使用される。ボクセルを横切り位相をずらすこと無くＴ２強調画像の等価物を作製するために、最後のグラディエントエコーは最初のグラディエントエコーイメージで割り算される。一旦Ｔ２が分かると、多重グラディエントエコーについてのＴ２の影響が取り除かれ、結果的にＴ２’に起因する初期の変化（磁化率の局所的な供給源によって引き起こされるこれらのシグナル変化）のみが残る。このシグナル依存性は、時間において二次式的な挙動有するように表され、さらにフィットさせると、供給源の体積含有率および磁気モーメントの両方が定量的に抽出され得る。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態において、ＭＲ画像はヒトおよび動物を研究するために約１．５Ｔおよび４．７Ｔで行われるであろう。０．００４ｐｐｍと同程度小さい磁化率差異は、ＴＥ＝４０ｍｓおよび０．５×１．０×２．０ｍｍ３の解像度（５分間のスキャン時間を必要とする）を伴う３Ｄグラディエントエコー法を用いて測定され得る。４．７Ｔまで行い且つ小さいマウスの脳表面コイルを用いることによって、ＳＮＲにおけるおよそ８のファクターが得られ、またボクセルサイズを０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×０．５ｍｍまで減少させる。もしデータが４０分間収集されるならば、このボクセルサイズは、０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍ（これは、このプロジェクトの成功に重要ではないが、マウス脳における構造を区別する際に利益をもたらす）まで減少され得る。
【０１３７】
別の好ましい実施形態は、所定の幾何学を用いて鉄含有率を正確に定量化するＭＲＩの能力を検証するために、既知の磁化率を有するファントム（ｐｈａｎｔｏｍｓ）と呼ばれる物質の磁気画像（ＭＲＩ）分析に関する。３つの異なる形状が考えられる：第１に、単一の試験管が主要な磁場に対して平行または垂直の両方で画像化される；第２に、薄い平面が画像化される；そして第３に脳実質のひだをより多く表すようにワープされた薄い平面が画像化される。これらの平面は、ヒト脳を真似るように層を２〜３ｍｍ厚に切り離すためのマイラーフィルムを用いて作製される。これらのファントムの寸法は、さらにヒト脳を真似るため、そしてまたファントムの正確なチューニングおよびシミングを可能にするため、各側において１０ｃｍのオーダーである。アガロースゲルは、脳内の鉄を真似るような一連の異なる濃度（最初の１００ｎｍｏｌ／ｇｍ、次いで５００ｎｍｏｌ／ｍｇで開始して５００ｎｍｏｌ／ｇｍ〜２０００ｎｍｏｌ／ｇｍのさらに４回の単位）でいくつかの異なる鉄保有化合物を用いてドープされる充填物質として使用される。各化合物の磁化率は、それらの条件下の相の幾何学の影響が十分に理解されていることから、試験管形状を使用して測定された。特に、ａ）ＦｅＣｌ−、ｂ）ＦｅＳ０４、ｃ）フェリチンおよびｄ）ヘモシデリンから構成される４つの異なる型のファントムが調製される。ファントム実験は、ランダムな系についての鉄の濃度の影響の研究を可能にする（低濃度は、シグナル損失に指数関数的な影響を有すると予期されるが、高濃度は、より幾何学的に依存性であると予期される）。しかしながら、脳の構造および鉄濃度は、溝相（ｓｕｌｃｉ　ｐｈａｓｅ）のような通常の幾何学的効果を有するようには見えず、むしろ一様であり、生じるフォールディングとは無関係であることが見出される。これは、低濃度および、それゆえ物体の形状と無関係に相を測定するための簡単な手段を示し得る。これらの実験は、直線的挙動が存在し且つある場強度から隣までに必要とされる特別な校正が存在しないことを確実にするために、１．５Ｔおよび４．７Ｔの両方で実行される。従って、ファントムの画像化は、ファントムの各々の内部の既知鉄の濃度に対して、ＭＲ画像からの磁化率測定値の相関を可能にする。異なる形状のファントムおよび異なる濃度の様々な鉄分子を用いて試験され得る。実行の前に、ファントムを使用して、ヒトについては１．５Ｔ、また動物については４．７Ｔにてシーケンス最適化が行われる。本発明は、動物およびヒトにおける使用のための、およびアルツハイマー脳における時間経過に伴う鉄変化をモニタリングするための鉄定量の方法に関する。
【０１３８】
別の好ましい実施形態は、脳鉄を蓄積し且つＭＲＩ技術の検証のための神経変性疾患を患うトランスジェニックマウスの、磁気共鳴画像分析に関する。鉄調節タンパク質−２（ＩＲＰ２）をコードする欠失体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）で遺伝子操作されるトランスジェニックマウスは、有意なレベルの神経鉄を蓄積することが知られる（Ｌａ　Ｖａｕｔｅ　２００１）。このトランスジェニックマウスは、代表的に運動失調、前庭機能不全　振せん（ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ　ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｔｒｅｍｏｒｓ）およびとりわけ体位異常として現れる６ヶ月齢以内に神経変性症状の発病を示す（Ｌａ　Ｖａｕｔｅ　２００１）。好ましくは、マウスは１２時間の明−暗スケジュールで飼育され、市販のペレット状の餌および水へのアクセスは自由である。さらに、マウスは、皮膚、口腔粘膜、行動および神経学的徴候、ならびに体重について毎週観察される。異常な行動を示す動物は、安楽死させた。選択された間隔で、動物は、神経画像化のためにイソフルラン吸入法（４％誘導、１％維持）によって麻酔され、次いでＭＲＩ互換性定位装置（ＭＲＩ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）中に置かれる。直腸の温度は、継続的にモニターされ、またその動物の下に設置される温水コイルを用いて３７±０．５℃に維持される。
【０１３９】
最適化ＭＲＩシーケンスを用いる新規画像法の知見を正確に相関させるために、４グループのマウスが画像化される。本発明は、マウス脳組織における量および局在の両方による鉄調節タンパク質（ＩＲＰ−２を含む）のモニタリングに関する。グループは、ａ）コントロール（Ｃ５７ｂｌ／６）、ｂ）Ｉｒｅｂ２＋／＋、ｃ）　Ｉｒｅｂ２＋／、およびｄ）　Ｉｒｅｂ２−／−マウスである。グループは、脳内の鉄蓄積（およびその様々な形態）の影響の包括的な全体像を提供するであろう。以前の研究によって、これらのマウスが１８月齢になるまで脳鉄含有率を連続的に増大させることが実証されてきた。開発される最適化シーケンスを使用して、マウスが１、３、６、９、１２、および１８ヶ月で継続的に画像化され、脳内の鉄の空間的または時間的な沈着が理解される。最初の画像化グループは定量的組織化学（これは、脳（または、他の組織）内の鉄の様々な形態の絶対的な検証を可能にし、その画像データが鉄の実際のレベルとの相関関係を示し、そして鉄の局所的なレベルおよび変性疾患の基礎へ決定的な見解を提供する画像データと相関関係を示す）のための各時点における６匹の動物の抽出を可能にする程十分に大きかった。
【０１４０】
画像化の前に、マウスは、ＭＲＩ画像についての移動のアーチファクトを避けるのに十分なレベルまでイソフルランで麻酔される。画像化は、Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　４．７Ｔ　イメージャー上で、頭部のみの体積コイル（ｈｅａｄ　ｏｎｌｙ　ｖｏｌｕｍｅ　ｃｏｉｌ）を用いて行われる。磁場を均質化した後、７００ｍｓの緩和時間（ＴＲ）および２０ｍｓのエコー時間（ＴＥ）を伴い、２獲得（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）ならびに冠状、矢状および横方向における３スライス（ｓｌｉｃｅ）を用いて、スピンエコーＴ１−強調スカウト（ｓｃｏｕｔ）が得られる。１０スライス（２ｍｍの分離を伴う各２ｍｍ厚）が、スカウト画像上に海馬（〜４ｍｍ　ブレグマの後方）および梨状皮質（ブレグマのレベルで）のレベルで位置づけられる。スピンエコー拡散強調およびマルチ−エコーＴ２−強調データのセットが収集される。拡散−強調シーケンスに使用されるパラメーターは、４５ｍｍ視野（ＦＯＶ）および１２８×１２８マトリックスを伴う２獲得を用いる冠状スライスについての２２００／１００ｍｓ（ＴＲ／ＴＥ）である。拡散グラディエントはｚ方向において適用される。見かけの拡散係数（ＡＤＣ）マップを計算するために１０００ｓ／ｍｍ２のｂ値が使用される。マルチ−エコーＴ２−強調シーケンスパラメーターは、３０００／４０ｍｓ（ＴＲ／ＴＥ）および各々が４０ｍｓ離れて６エコー（３〜５スライスについて１獲得を伴う）からなる。
【０１４１】
ＡＤＣマップは、次の等式によって決定される：ＡＤＣ＝ｌｎ（Ｓｏ／Ｓｎ）／ｂ　ここで、ＳｎはＤＷ画像についての平均強度であり、そしてＳｏは対応する拡散非強調画像（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ　ｉｍａｇｅ）についての平均強度である｛６０３２｝。ＡＤＣは、マップ中の各ピクセルについて計算される。高いＡＤＣ値はＤＷマップ上で明るく表わされる。目的の領域（ＲＯＩ）についてのＡＤＣは、特定面積における全てのピクセルについてのＡＤＣの平均として計算される。Ｔ２マップは、６エコーＴ２シーケンスから生成される。次いでＴ２緩和定数は、次の等式を用いるデータに対する非線形最小二乗曲線フィットを用いて、各ピクセルについて計算される：Ｍ（ｔ）＝Ｍｏ（１−ｅ−ｔ／Ｔ２）　ここで、Ｍｏは減衰前の初期の磁化値であり、ｔはエコー時間（ｍｓ）そしてＴ２はスピン−スピン緩和時間である。
【０１４２】
別の好ましい実施形態は、海馬が下方にカールしたように見られるスライスの直ぐ前の単一スライスにおいて各マウスについて行われる画像分析に関する。この位置は、およそブレグマ−３．６０ｍｍに相当し、また各々の目的の領域（ＲＯＩ）の断面積を最大化する。Ｃｈｅｓｈｉｒｅ（登録商標）画像処理ソフトウェア（Ｈａｙｄｅｎ　Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ）は、二次研究者によって確認されるＲＯＩの輪郭を描き且つこれを分析するために、使用される。両側性のＲＯＩとしては、扁桃（および関係する核）、梨状皮質（内側および周囲皮質の部分を含む）、海馬、脳梁膨大後方皮質（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ　ｃｏｒｔｅｘ）（運動および体性感覚皮質を含む）および視床が挙げられる。２ピクセル幅が海馬および脳梁膨大後方ＲＯＩを分ける。線は、脳梁膨大後方ＲＯＩの下方の境界を定める皮質の向こう側へ広がる両方の海馬の底を横切って描かれる。梨状および扁桃ＲＯＩは互いに隣接しており、上方および下方に同じ距離広がっている。中間的に２〜４ピクセルが扁桃ＲＯＩから視床を分離し、側脳室からのシグナル寄与を最小化する。５×５ピクセル平方が視床内に中心とされる。３Ｄグラディエントエコー画像について、このスライスの周辺のスライスからの情報が評価される。
【０１４３】
ファントムデータから鉄を抽出する能力は約束されるけれども、動物（およびヒト）脳における鉄定量は、本質的な多義性によって混同される。鉄型の化学的な識別のために、組織とフェリチン中の鉄、マクロファージおよびβ−アミロイドプラークの周りの遊離鉄との間のＭＲＩによって見られるような相対的磁化率が試みられる。脳鉄は、相およびＴ２’画像を使用して定量化され、そしてマウス脳において組織−化学的に見出されるものと比較される。プラークに近い血管の中および周辺に鉄が存在することは良く知られている。ＭＲ画像は、マウスモデルにおける脳鉄変化と相互に関連付けられ、そして初期のプラーク形成を検出する能力を提供する。
【０１４４】
本発明の別の実施形態において、ＭＲＩ分析の完了時に、ＭＲＩ研究を完成させる免疫−組織化学および鉄化学における使用ならびに脳鉄代謝におけるＩＲＰ−２の役割の理解を可能にする組み合わせにおける使用を目的として、脳および血液組織の回収、保管、および処理のために、４匹のマウスが安楽死される。血液および脳組織はＣＯ２窒息後にマウスから取り除かれる。この血液はグループごとにプールされ、そして白血球を単離し且つ−７０℃で凍結保存される血清サンプルを得るために処理される。この脳は右および左半球に分けられ、重量が湿重量で記録され、そしてランダムに各動物由来の一方の半−脳がｐｌｐ（４％緩衝化ホルマリン溶液）中に置かれ、さらに他方の半分が凍結防止剤中に置かれ、そして凍結される。この凍結脳組織が切り分けられ、そして前部（レベル１）、中央（レベル２）、および後部（レベル３）からの各サード切片（ｅｖｅｒｙ　ｔｈｉｒｄ　ｓｅｃｔｉｏｎ）がポリ−ｌ−リジンコートスライド上に置かれる。大脳皮質、側脳室、脳梁および尾状被殻（ｃａｕｄａｔｅ　ｐｕｔａｍｅｎ）がレベル１切片に存在し、大脳皮質、視床、第三脳室および海馬がレベル２切片に存在し、そして小脳、髄質、第四脳室および錐体路がレベル３切片に存在する。３３個の５〜１０□ｍ切片が各半−脳から作製される（以下のものを３通り：Ｈ＆Ｅのために１セット、アポトーシスのために１セット、第二鉄分布のためのプルシアンブルー染色のために１セット、および抗−ＩＲＰ−１、抗−ＩＲＰ−２、抗−フェリチン、抗−トランスフェリンレセプター、β−アミロイドユビキチンおよびヘモシデリンを使用する免疫細胞化学法のために７セット）。３つのさらなる３０□ｍ切片（各脳レベルから１つ）は、重量（湿重量）測定され、元素鉄含有物を処理するために真空凍結バッグ中に置かれる。
【０１４５】
Ｈ＆Ｅおよびマウス組織のアポトーシス測定については、３つの脳レベルの各々に由来する１つの５−１０□ｍ組織切片が、組織の形態学的評価のためにＨ＆Ｅで染色される。各脳組織切片の１セットはＧｒｅｅｎら（２００１）によって記載されるように改変されるアポダイレクトアッセイ（Ａｐｏｄｉｒｅｃｔ　ａｓｓａｙ）を使用して標識される。核酸の遊離３’末端への末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介蛍光（ＦＩＴＣ）−複合化ＢｒｄＵの取り込みを用いて脳組織における後期アポトーシス事象を評価するために、ＤＮＡ損傷が使用される。簡単には、組織を−２０℃　７０％エタノール中で１５分間固定化する。この固定組織をＰＢＳ中で５分間再水和し、そしてキットで提供されるＴｄＴ、反応緩衝液およびＦＩＴＣ−ＢｒｄＵの混合液と共にインキュベーションする。組織をＤＮＡ標識混合液と共に一晩中室温（２２−２４℃）にてインキュベーションし、洗浄し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮＡｓｅで３０分間対比染色し、洗浄し、退色防止剤（ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）で処理し、さらにカバーガラスで覆う。ＦＩＴＣ−ＢｒｄＵ取り込みは、以下に記載されるように、レーザースキャニングサイトメーター（ｌａｓｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＬＳＣ）（ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して定量化される。
【０１４６】
マウスの凍結組織切片の免疫細胞化学的標識化については、組織はアポトーシスアッセイについて上述したように固定化される（Ｇｒｅｅｎら、１９９５；Ｇｒｅｅｎら、２００１）。この固定組織を一次抗体（抗−ＩＲＰ−１、抗−ＩＲＰ−２、抗−フェリチン、抗−トランスフェリン／トランスフェリンレセプター、□−アミロイドユビキチンおよびヘモシデリン）で染色する。一次抗体／抗血清とのインキュベーションは１６時間４℃であり、その後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で洗浄する。蛍光分子と直接的に複合化しない抗体は、４時間の最小インキュベーション時間の間２５℃にて、ａｌｅｘａ−４８８、ａｌｅｘａ−５９４、Ｃｙ−２、Ｃｙ−５抗−マウスまたはウサギＩｇＧ抗体で二次標識される。この２次抗体インキュベーションの完了の直前に、ＤＡＰＩ（１□ｇ／ｍｌ）またはヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５□ｇ／ｍｌ）が、二重標識および／または分析の最終点としての共焦点顕微鏡に依存して、１０分間添加される。ＰＢＳＴ中で洗浄することによって過剰な二次抗体および核対比染色剤を除去し、そしてその組織を退色防止剤（ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ）およびカバーガラスで保護し、そして定量的分析（下記のようなＬＳＣおよび共焦点顕微鏡）および撮影の前に暗所で平らに乾燥される。非−特異的蛍光は、コントロール切片を非−免疫血清および二次抗体、もしくは二次抗体単独と共にインキュベーションすることによって、測定される。
【０１４７】
マウス組織における特定のタンパク質（ＩＲＰ−２を含む）の定量化のために、蛍光−標識マウス組織についてレーザースキャニングサイトメトリック（ＬＳＣ）が行われる。ＬＳＣは、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ５０ベースを有し、そして６色分析のためのＵＶレーザー、ヘリウム−ネオンおよびアルゴンイオンを用いて設定される。４つのセンサーが存在し、スキャンに沿ったわずか０．５−マイクロメーターの空間的間隔に対応して、６２５，０００Ｈｚで同時にデジタル化される。蛍光エネルギーは、対物レンズ（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）によって集められ、ＣＣＤカメラに細胞を画像化させるために、部分的に銀メッキされたミラーによって反射され、そしてスキャンレンズを通ってスキャニングミラーへと導かれる。二色性ミラーおよび光学干渉フィルターが４本の光電子増倍管（各々が特定の範囲の蛍光波長を検出し得る）によって支えられる。蛍光測定値およびｘ、ｙ座標はデジタルに記録され、そしてコンピューターベース中にＦＣＳファイルとして蓄積される。分析される組織は、標識核によって輪郭を描かれる。様々なゲーティングパラメーター（ｇａｔｉｎｇ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）が選択され得るが、シグナル強度対細胞サイズ、細胞数（面積、周長、カウントなど）に関する情報を集めるものを含む。プロトコール設定およびディスプレイパラメーターは、コントロール陽性および陰性サンプルを使用して最適化され、その最適化プロトコールおよびディスプレイファイルは蓄積され、そして複製切片（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ）をスキャンする際に利用される。
【０１４８】
ＬＳＣによって定量化される特定のタンパク質の局在については、共焦点顕微鏡法がマウス組織において行われる。多くのタンパク質は、それらの機能的性質と一致する個別の位置を有し、それゆえ共焦点顕微鏡によって、特定のタンパク質の細胞／亜細胞性局在によってよりよい理解が得られる（Ａｌｔｕｒａら、２００１）。蛍光標識組織切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ−７０　ベース、ＢｉｏＲａｄ−１０２４共焦点顕微鏡を使用して３次元に画像化される。切片は、一般的な分布については低倍率（４−２０ｘ）（０．５□ｍ　ｚ−ステップ）、また上記に列挙されるタンパク質の細胞／亜細胞位置を得るためには高倍率（４０−１００ｘ）で捕らえられる。
【０１４９】
マウス組織の鉄定量化については、鉄分布がプルシアンブルー染色法（第二鉄）によって、また総鉄が原子分光法によって、評価される。プルシアンブルー染色は、フェロシアン化カリウム（２．５％）とＨＣＬ酸（２．５％）との室温にて２０分間の混合を伴う標準的な方法（Ｍｏｏｓ　＆　Ｍｏｌｌｇａｒｄ，　１９９３）の感度改変を用いて、パラフィン包埋切片において行われ、過酸化水素を用いてリンスされ、そして細胞核はＰＩを用いて対比染色される。
【０１５０】
ＭＲ画像データの統計的分析については、両側性の目的の領域（ＲＯＩ）の左右比較が、一元配置（ｏｎｅ　ｗａｙ）ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）を使用して各動物に対して行われるであろう。次いで、両側スチューデンツｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ　ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ）（ｐ＜０．０５で有意であり、ｐ＜０．０１で非常に有意である）が行われ、コントロール値と各時点での実験値とが比較されるであろう。
【０１５１】
ＭＲ画像データから相対的鉄含有率を抽出するために、本発明は高解像度３Ｄグラディエントエコーシーケンスを使用する画像化方法に関する。研究されるほとんどの磁化率特性は、解像度が対象物の１〜２倍サイズのファクターである場合、最も良く画像化される。この理由のために、ヒト脳において以下のパラメーター：ＴＲ＝６７ｍｓ、ＴＥ＝４０ｍｓ、０．５×１．０×２．０ｍｍ３の解像度（５分のスキャン時間を伴う）が使用される。３００〜５００ミクロンのオーダーの細静脈の様な小構造および脳幹神経節中の１ｍｍ３より小さいのサイズの小さい鉄沈着が、それらのシグナル消去特性およびそれらの画像中での相効果ゆえに、画像に視覚化される。微小−ボクセル効果に対するこの鋭い感度は、ＳＷＩを非常に強力にする。前記のように、４０分間のスキャンの間、０．２５×０．２５×０．２５ｍｍ３の解像度がマウス脳において集められ得る。
【０１５２】
本発明の別の実施形態において、ランダムな系について、ボクセルサイズはあまり重要ではなく、それゆえより迅速な画像化およびより良いＳＮＲのためにより大きなボクセルが使用され得る。グラディエントエコーシーケンスが上述されたファントムにおいて試験され、相が鉄濃度の関数および解像度の関数として測定され、測定のスケール不変性が確実にされる。
【０１５３】
灰白質と白質との間の現在の鉄濃度差異は４０ｍｓにおけるおよそ２０度（およそ０．１ｐｐｍに相当する）として明示されるので、ファントム、動物およびヒトにおける相のエラー分析が適用された。マグニチュードイメージにおけるＳＮＲがわずか１５：１であるならば、相の標準偏差は０．０６ラジアン（４°または０．００２ｐｐｍ）またはおよそ１０パーセントエラーである。そのとき、３標準偏差（０．００５のｐ値を伴う０．００６ｐｐｍに相当する）より大きい磁化率差異を評価することが想像される。平均化することによるデータの改良は２つの方法で達成され得る。第１は、必要とされる解像度に依存して、より多くのデータが取得されるか、またはデータがフィルターされる。例えばより低い解像度でも十分である場合、ＳＮＲを高めるためにより低い解像度で実験を行うことによって、ＳＮＲは単位時間当たり劇的に改良され得る。例えば、０．５×１．０×２．０ｍｍ３およびＴＥ＝４０ｍｓの解像度を有するＭＲスキャンは、前記の値を獲得および生成するのに５分間かかる。しかしながら、１×２×２ｍｍ３の解像度でも十分であるならば、スキャンは半分の時間かかり、また２倍高いＳＮＲを生じる。それゆえ同じ５分間が使用される場合、ＳＮＲにおける増加は、８倍高い場強度での画像と同等の２ｓｑｒｔ（２）となる。解像度はファントムおよび動物において０．２５ミクロンから１ｍｍまで変化し得る。
【０１５４】
ヒトの研究については、最初の５人の正常個体およびアルツハイマー患者にマッチする５人の高齢者に関する画像パラメーターのいくつかのセットが使用される。ｉｎ　ｖｉｖｏにおける感度を評価するための４０、８０および１２０ｍｓのエコー時間が含まれる。ボクセルサイズの関数としての感度を研究するために、解像度は０．５×０．５×１．０ｍｍ３から１×１×２ｍｍ３まで変化し得る。高解像度の画像において、このデータは、各方向にある２つのファクターによって低解像度画像にフィルターされ、低解像度のデータと比較されるであろう。この方法の理由としては、ギブスリンギング（Ｇｉｂｂｓ　ｒｉｎｇｉｎｇ）が低解像度スキャンに比例して減少し、場不均質性の影響が減少し、そしてスケール不変性効果がチェックされ得るという事実が挙げられる。
【０１５５】
絶対鉄含有率は、ＭＲ画像データより抽出され得る。Ｔ２’測定値における直線的増加が鉄濃度増加として予測される。次のように定義されるマルチ−エコー、グラディエント／スピンエコーの組み合わせが使用される。８０ｍｓのＴＥを有するスピンエコー構造が作製される。このエコー時間については、同じ極性の一連の３１エコー（２．５ｍｓごとに１エコー）が収集される。以下の理論（より詳細には、参考ｘｘ、ｘｙおよびｘｚを参照のこと）は、理論的に予測され、実験的に実証されている。球体のランダムセットについてのシグナル挙動（これは、球体形状の集塊として知られる鉄についての優れた近似である）とりわけ、私達が大きなボクセルを使用していると仮定すると）は、以下によって与えられる：
Ｓ（ｔ）＝ρ（１−λ）ｅｘｐ（−０．４ｌ（ｔδω）２）　　　　　　　ただし、ｔδω＜１．５
および
Ｓ（ｔ）＝ρ（１−λ）ｅｘｐ（−ｉｔΔω）ｅｘｐ（−Ｒ２’ａｂｓ（ｔ−ｔｓ））　　　ただし、ｔδω＞１．５
ここで、
δω＝γ４π（Ｍ−Ｍｏ）／３、Ｒ２’＝１．２１λδω、ｔｓ＝１／（１．２１δω）およびΔω＝−０．１６λδω　。
短時間および長時間成分を測定することによって、各指数関数における議論について、それゆえ（Ｍ−Ｍｏ）（ｄｗより抽出される）についておよびλ（いまδωが分かっているのでＲ２’から抽出される）についての数的な概算が得られる。例えば、ＭＲＩにおける造影剤（ＡＭＩ　２２５のような）として使用される磁気粒子について、δωは値３．４×１０−７／ｓを有する。λ＝２×１０−６の体積フラクションを使用することによって、他の概算値と非常に良く一致する８２．２３／ｓのＲ２’（数的シミュレーションから８０〜１００／ｓの範囲をとる）が生じる。磁化率が分かっている場合、Ｒ２’は体積フラクションλの測定値として直接的に使用され得る。ｐｐｍのオーダーの非常に小さい磁化率（反磁性または常磁性物質のような）については、δωはｍｓのオーダーである。例えば、０．４のヘマトクリット（ｈａｅｍａｔｏｃｒｉｔ）および５５％の酸素飽和度を有する静脈について、δωの値は約３ｍｓである。皮肉なことに、より小さい磁化率である程より長いδωであり、そしてスピンエコー前または後にｔｓが３〜３０ｍｓにある場合、シグナルは、その体積含有率と同様にシグナル損失を生成する供給源の磁化率を見いだすために使用される。シグナル損失の原因となることが見出される成分（フェリチンなど）の各々の磁化率が測定されるので、この特徴は使用されない。しかしながら、Ｒ２’に直接的に関係する相項（ｐｈａｓｅ　ｔｅｒｍ）−０．１６λδωについて、数的概算がなされ得る。磁場変化の１つの供給源しか存在しない場合、この概算は新たな情報を加えない。しかしながら、非ヘム鉄が唯一の供給源ではなく、またヘム鉄が上記に記載される静脈メカニズムを介して貢献する場合、これら２つはもはや関係ないかもしれないし、またエコーについて測定される時間的な応答は放物線であるだろう。このことから、非ヘム鉄からヘムを抽出するために、２つのパラメーターモデルが使用され得る。最後に、これを明瞭に成し遂げるための手段として、局所的磁化率を既知方法において改変し、そしてこの実験を繰り返すために、造影剤が使用される。
【０１５６】
上記結果を、場における以前の測定値と関連させて、Ｔ１、Ｔ２、および分散強調画像と比較する。動物モデルの切片において記載されるマルチエコー、スピンエコーシーケンスはＴ１を測定する。３Ｄ可変角方法（３Ｄ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ａｎｇｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ）および慣用的な２Ｄ多重ＩＲシーケンスが使用され、Ｔ１値が概算される。
【０１５７】
次の４つの測定値のそれぞれについて完全なエラー分析が行われる：相、Ｒ２’、Ｒ２およびＲ１。この方法の間の矛盾が留意される。Ｒ１およびＲ２方法について鉄との相関関係を壊すが相またはＲ２’に影響しない多くの場合において、シグナル回復が起こり得る。
【０１５８】
全ての直線的相効果を取り除くための別の簡潔な方法は、二重エコー方法を使用することである。第一エコーからの相は、バックグランド相効果から予測される相の単純な直線的依存性に基づいて、第二エコーからの相を予測するために使用される。第一エコーの相（γΔＢＴＥ１）にＴＥ２／ＴＥ１が掛けられて、γΔＢＴＥ２が予測され、そしてその予測される相が第二エコーのものから引き算される（通常、複雑な除法によって達成される）場合、補正画像の予測される相はゼロであるだろう。これは、相効果が単純に加法的でない２つのコンパートメントモデルに関係する任意の非−線形効果を排除し、さらにピクセル効果内の小さい領域の分離を可能にする。
【０１５９】
フェリチンの磁化率およびその赤核から得られる１４５０ｎｍｏｌ／ｇｍの濃度についての既知の概算値を用いてヘムおよび非ヘム供給源から予測される相は、ヘム成分を定量化するためのマルチ−エコー空間技術（ｍｕｌｔｉ−ｅｃｈｏ　ｓｐａｔｉａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して推測される。ヘム鉄は、遊離鉄またはフェリチン中の鉄に対してではなく、血液に対する振動効果として現れる。この技術は、静脈血から生じる部分体積効果に敏感であり、且つ脳実質中の鉄の一様な分布によって生じる影響と区別されるべきである。血液ナリング法（ｂｌｏｏｄ　ｎｕｌｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）を使用して同様のシーケンスが行われる。ヘム鉄（存在するならば）対遊離鉄またはフェリチン中に結合される鉄から生じる相挙動の量が定量化される。血液の影響は、血液の磁化率を真似るように既知量の造影剤（慣用的な試薬は１°／ｍＭ／ｍｓの相効果を有する）を使用することによって決定され得る。血液の影響を二倍することによって、血液そのものの相に及ぼす影響が推測される。解像度およびスケール依存性の問題に取り組むために、ヒトにおいて０．５〜２ｍｍおよび動物において０．２５〜１ｍｍの範囲にある解像度にて実験が実施され、測定に及ぼすボクセルサイズの影響が存在するか否かが決定される。実質におけるまたは臨界時間ｔｓ（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｔｉｍｅ）における画像の相に対する変化は血液の寄与の指標である。
【０１６０】
相挙動および相フィルターのバックグランド材料を取り除く能力の研究が行われ得る。使用されるフィルターはハイパスフィルター（ｈｉｇｈ−ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ）であるので、ＤＣ情報の損失が生じる。これが磁化率の定量化に重要である（組織間の相違はあまり影響されない）ので、ＤＣレベル相を抽出する能力が試験され、そしてもともとの未フィルターデータと比較される。相の絶対測定値（単なる相の差異ではなく）を確実にするために、既知磁化率の基準マーカーが使用される。動物およびヒトの両方の画像化が実施される。
【０１６１】
本発明において、患者をモニターするためにＭＲ画像化が使用される。ＭＲ画像化は、ベーター−アミロイドプラークの初期形成ならびにプラークからおよび血管変化からの後期におけるＡＤおよび変性作用における結合鉄含有率に対して敏感であり、また脳鉄を定量するための方法を提供する。
【０１６２】
本発明の別の局面は、ＡＤの早期介入および／または潜在的予防の方法に関する。ＡＤの危険性を有する被験体は、この障害の攻撃的且つ破壊的な発症の前の数ヶ月〜数年間に、実行機能および記憶を含む軽度認識障害を示すので、ＡＤに対する診断的正確性を高める特定の分析的神経心理学的研究を用いるＡＤ症例の長期的追跡調査、および詳細な認識試験が有用であると判明している。
【０１６３】
軽度認識障害（ＭＣＩ）（閾値下の痴呆の障害）がＡＤに関連づけられると示されたので、本発明の好ましい実施形態は、ＭＣＩ患者の標的集団に関する。この診断を受ける被験体は、標準的神経心理学的試験に基づく正常者に対する参照標準より下の１．０〜１．５標準偏差を行い、そして標準的な試験によっては痴呆ではない。高齢者におけるＭＣＩの早期検出についてのガイドラインおよび推奨実施法が最近発行された（Ｊｏｌｌｅｓら、Ｄｒｕｇｓ　Ａｇｉｎｇ，　７（６）：４５９−７９（１９９５））。好ましくは、本発明は、軽度認識障害（ＭＣＩ）の異なる症例の間を区別する方法に関する。さらに好ましくは、本発明は、静止状態に留まるＭＣＩの症例を痴呆に急速に進行するＭＣＩのこれらの症例から同定することを包含する。さらに、本発明は、痴呆症候群と外科的に処置され得るこれらの障害との間の区別する方法を包含する。例えば、ＭＣＩとシャンティング術（ｓｈｕｎｔｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって緩和され得る正常圧水頭症（ｎｏｒｍａｌ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｈｙｄｒｏｃｅｌｐｈａｌｕｓ）との間を区別するための方法が開発される。さらに、前頭側頭骨萎縮症とＡＤからの多発脳梗塞性痴呆障害との間を区別するための方法が開発される。本発明の別の好ましい実施形態としては、焦点の認識方法および情報からのデータをサポートするミニメンタルステート（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｅ）検査、神経心理学的試験を含むスクリーニング手段を用いるＭＣＩ患者における痴呆の経過の臨床的モニタリングが挙げられる。
【０１６４】
別の好ましい実施形態は、脳障害と鉄代謝との間の相互関係に関する。好ましくは、ＭＲＩ技術による脳鉄定量のレベルは、患者における痴呆の臨床的経過と相関する。さらに、ＩＲＰ−２アッセイを介してモニターされる末梢血ＩＲＰ−２のレベルは、患者における痴呆の臨床的経過と相関する。異常なレベルの脳鉄または末梢ＩＲＰ−２を有する患者は、さらなる研究のための、ならびにＡＤ介入および潜在的なＡＤ予防のための主要な候補であると明示される。
【０１６５】
様々な供給源からのＭＣＩを有する１００の個体が研究に参加される。５０の個体は最初の年に参加され、そして５０の個体は二番目の年に参加される。１ヶ月あたり６〜８人の新たなＭＣＩ患者を出会わせる紹介サービスが患者の主な提供元であるだろう。患者の二次的な提供元としては、ラジオおよびテレビジョンで通知および公共サービスメッセージを送るであろう地方の神経学者および心理学者が挙げられる。
【０１６６】
電話での接触および直接的な紹介に続いて、被験体は、障害のレベルを評価するための精神測定学的研究を含むように広範囲な身体的および神経学的検査を受ける。これらのスクリーニング研究は、ｔｈｅ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙによって記載される通りである。
【０１６７】
エントリープロセスは、研究コーディネーターとの電話面接または直接的な紹介からなる。最初の訪問は、痴呆症状に関するメールでのアンケートに基づく選択の後の面接である。
【０１６８】
クオリティースタンダード小委員会（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って、被験体の選択が行われる。この研究への参加のための基準としては、以下のことが挙げられる：
１）年齢＞５０歳
２）７学年以上の教育
３）以下の主な神経学的障害の病歴をもたないこと：脳卒中、腫瘍、外傷、内分泌障害、薬物乱用、または精神医学的障害。
【０１６９】
４）神経破壊薬物維持の経歴をもたないこと
５）ミニメンタルステート検査≧１０のスコア
６）インフォームドコンセントを行うことができる
７）体験を保存する人（家族の一員）がいること
各患者の評価は、２週間で完了され、また３回のセッションからなる。記録は記号化され、そして標準的な情報：精神測定学的スコア、血液分析結果、ＭＲＩデータは特別な記号形態で抽象化されるであろう。データは隔週でまとめられるだろう。ヒューマン　サブジェクト　リサーチ　コミッティーズ　オブ　ローマ　リンダ　ユニヴァーシティー　メディカル　センターおよびＮＩＨによって認可されるガイドラインに従って、全ての被験体にインフォームドコンセントを行う。
【０１７０】
実施例１
ＩＲＰ−２ペプチドに特異的な抗体の調製
野生型および変異ＩＲＰ−２ペプチドの酸化および還元型に特異的な抗体は、以下のように調製される。ＩＲＰ−２のアミノ酸残基１３８−２１６のペプチドループ内にアラニンで置換された１つ以上のシステイン残基を有する７つのクローンが、分子生物学における慣用的な技術によって作製された。「Ｃ１Ａ」クローンは、Ｎ末端に最も近い一番目のシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号４）。「Ｃ２Ａ」クローンは、Ｎ末端から二番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号６）。「Ｃ３Ａ」クローンは、Ｎ末端に三番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号８）。「Ｃ１２Ａ」クローンは、Ｎ末端から一番目および二番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号１０）。「Ｃ２３Ａ」クローンは、Ｎ末端から二番目および三番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号１２）。「Ｃ１３Ａ」クローンは、Ｎ末端から一番目および三番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号１４）。「Ｃ１２３Ａ」クローンは、Ｎ末端から一番目、二番目および三番目に近いシステインのアラニンとの置換を有する。（配列番号１６）。野生型のペプチド配列もまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に作製した。（配列番号２）。
【０１７１】
組換えペプチドを単離すると直ぐに、それらを酸化または還元した。ＩＲＰ−２の酸化は、０．１：ｇ／：ｌタンパク質の濃度で、２０：１反応混合液（２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ　７．２）および４０ｍＭ　ＫＣｌ）中において、５０：Ｍ　ＦｅＣ１３および１０ｍＭ　ＤＴＴの存在下において、３７℃にて１５−３０分間、行った。ペプチドの還元型は、そのペプチドをトリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（１ｍＭ）中において１５〜３０分間３７℃にてインキュベーションすることによって得られた。一旦酸化および還元型ペプチドを得ると、それらをＫＬＨと結合させ、そしてマウスにおいて抗体を作製するために使用した。慣用的な方法を使用してハイブリドーマを作製し、そしてマウスを接種するために使用する特定のペプチドに特異的な抗体の産生のために、クローンをスクリーニングした。野生型ペプチドに対して作製された抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットの両方において配列番号２のペプチドおよび全長ＩＲＰ−２の両方を認識することが見出された。１：５０００希釈で十分であることが見出された。この抗体のいくつかをスクリーニングするために、別の選択方法を使用した。ＩＲＰ−２の酸化はシステイン残基のアミノマロン酸への変換に依存し得るので、アミノマロン酸を有するＩＲＰ−２ペプチドを合成した。このクローンをアミノマロン酸ペプチド、さらにまたネイティブなＩＲＰ−２ペプチドへの反応性についてスクリーニングした。ネイティブなペプチドではなくアミノマロン酸ペプチドに対して反応性であるクローンを選択した。この実施例において記載される教示を使用することによって、変異および野生型ＩＲＰ−２タンパク質の両方に対する抗体を作製し得る。これらの抗体を本明細書中に記載する診断アッセイにおいて使用し、被験体の神経変性疾患に対する傾向を同定し得る。次の実施例は、野生型ＩＲＰ−２に対して特異的な抗体を作製するために使用される類似方法を記載する。
【０１７２】
実施例２
ＩＲＰ−２に対して特異的な抗体
この実施例では、ＩＲＰ−２に対して特異的な抗体を作製およびスクリーニングするために使用する方法を提供する。抗体を作製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、製造元のプロトコールに従いＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ）中で６３−残基（野生型）「ループペプチド」で免役した。次いで、標準的なハイブリドーマ技術を使用して、マウス由来の脾臓細胞をＳｐ２／０骨髄腫細胞に融合した。生じたハイブリドーマを、ループペプチドおよびその全体分子との反応性についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ（ネイティブな分子）およびウェスタンブロット（変性分子）により、６つのクローンが陽性であった。これらのうち１つ（４Ｇ１１）を、その生育特徴および強いアッセイ結果に基づいて、ラージスケール抗体産生のために選択した。
【０１７３】
次いで、４Ｇ１１と他の５つのクローンとの間で競合結合アッセイを行って、それらが同じまたは異なるエピトープを認識するか否かを決定した。唯一（１４Ｆ７）だけ４Ｇ１１の結合を有意に阻害せず、異なる部位で結合すると仮定された。このように、１４Ｆ７および４Ｇ１１−ＨＲＰは捕捉ＥＬＩＳＡ法（以下に記載する）のための基準となり、また、生物学的サンプルにおけるＩＲＰ−２の検出のために使用され得る。このアッセイは、１：ｇ／ｍＬに低下するまで感度が良く、優れた直線性を示す。
【０１７４】
捕捉アッセイを以下のように行った。未標識抗体をカルボネート緩衝液（ｐＨ９．６）（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ−３０４１）中で通常１−１０μｇ／ｍＬに希釈した。個々の抗体濃度は、１０μｇ／ｍＬから始めて下方へ進めながら、経験的に決定される必要があるかも知れない。重要なことは、過密によって抗原結合を妨げないこと、そして依然として強いシグナルを与えるであろう最も低い濃度を選択することである。次いで、この抗体を１ウェル当たり約１００：ＬでＩｍｍｕｌｏｎ−１プレート（Ｄｙｎｅｘ　＃３３５５）中にプレートし、テープ（Ｆａｌｃｏｎ　＃３０７３）で覆い、そして４℃にて一晩中インキュベートした。
【０１７５】
続いて、このプレートを室温まで加温し、そしてこのウェルをＰＢＳ（ｗ／ｏ　ｔｗｅｅｎ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃２０−０３１−ＣＶ、１×に希釈される１０×濃縮液）で３×洗浄した。次いで、このプレートを各ウェルに２００：Ｌを添加し、逆さにすることによって空にし、そしてこのプロセスを合計３回繰り返すことにより、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ　（Ｐｉｅｒｃｅ　＃３７５１５）でブロックした。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ＋０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ　＃Ｐ−６５８５）で３回洗浄した。希釈液（コントロール）、抗原、および標準（約１００：ｌ）をウェルに添加した。使用した希釈液はキャリア（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の１０％　ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）であった。ウェルをテーピングし、そして１時間室温にて反応を起こさせた。（プレートを振とうさせることによって、アッセイにおける感度が大きく増大するであろう）。続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。
【０１７６】
次に、キャリア中で希釈された約１００：ＬのＨＲＰ−タグ化検出抗体を添加した。（市販の製品を使用する場合、製造元の推奨に従い、また自ら作製した抗体の適切な希釈は、経験的に決定した。）ウェルをテーピングし、そして１時間室温にて反応を起こさせた。（プレートを振とうさせることによって、アッセイにおける感度が大きく増大するであろう）。続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３×洗浄した。次いで約１００μＬ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　＃１７２　１０６７）をウェルに添加した。約３０分間覆わずに、反応を起こさせ、そして６３０ｎｍ（参照４９０ｎｍ）での吸光度にて読み取りを行った。アッセイのパラメーターは、約２．０のＯＤがこのアッセイにおける最も濃縮された抗原サンプルについての約３０分間のインキュベーションにおいて得られるというものであった。捕捉抗体、抗原、および検出抗体の適切な希釈度を捜す際、「チェッカーボード」アッセイを行うことが役に立つであろう。以下の実施例は、抗ＩＲＰ−２抗体をビーズに結合するために使用した方法を記載する。
【０１７７】
実施例３
支持体−結合型ＩＲＰ−２抗体
この実施例は、フローサイトメトリーにおける使用のための支持体結合型ＩＲＰ−２抗体を調製するために使用した方法を記載する。およそ、ＩＲＰ−２に向けられた５ミリグラムの精製キャリア−フリー（他のタンパク質を含まない）マウスモノクローナル抗体をスルホ−ＳＭＣＣを用いて修飾し、次いで２−イミノチオランで修飾された１５ｍｇのｒ−フィコエリトリンに複合化させた。生じた複合体を、セファロースＳ−３００−ＨＲカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって、遊離の未複合化ｒ−フィコエリトリンおよび遊離未複合化モノクローナル抗体から分離した。この方法を完了させるのに２日間を要した。使用できる複合体の最終収率は、最初の抗体質量の５０−９５％であった（＞８５％の通常の予測収率）。首尾よい複合化をヤギ抗−マウスでコートされた７ミクロンビーズ上での複合体の捕捉によって確認し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１７８】
実施例４
白血球の調製
単核細胞は、６８％　Ｐｅｒｃｏｌｌを使用する密度勾配分離法によってヘパリンで抗凝血された末梢血サンプルから調製される。簡単には、２０ｍｌの未希釈全血液サンプルを５０ｍｌ遠心管中の６８％　Ｐｅｒｃｏｌｌ（２５ｍｌ）上へ層状に置く。次いでこの血液を８００×ｇで２０分間遠心する。界面の細胞を回収し、そして遠心によってペレット形成させる。この細胞ペレットをボルテックスすることによって粉砕し、そしてＶｉｔａＬｙｓｅ赤血球溶解緩衝液（２５ｍｌ）（ＢｉｏＥｒｇｏｎｏｍｉｃｓ）を使用する溶解によって残りの赤血球を取り除いた。細胞を２５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、次いで１×１０７単核細胞／ｍｌになるように再懸濁する。１００マイクロリットルの細胞（１×１０６）を各標識手順のために使用する。
【０１７９】
炎症性サイトカイン発現の刺激のために、細胞を基本培地またはＡｃｔｉＣｙｔｅ−ＬＰＳ培地（ＢｉｏＥｒｇｏｎｏｍｉｃｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）のいずれかに１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして５％　ＣＯ２の雰囲気において３７℃にて２０時間インキュベーションした。インキュベーションの最後の４時間の間、サイトカインの分泌を阻害し且つ細胞内染色を促進させるために、ゴルジ阻害剤Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａ　（１０　ｎｇ／ｍｌ）を培養物へ添加する。インキュベーション時間の後、細胞を回収し、そしてその培養上清をサイトカイン分泌アッセイのために保持する。細胞を細胞内サイトカインの検出のために保持する。
【０１８０】
細胞内ＩＲＰ−２タンパク質のレベル変化の検出のためのリンパ球の活性化またはアポトーシスの誘導を以下の方法で行う。１００万個の単核細胞を基本培地またはＡｃｔｉＣｙｔｅ−ＴＣ培地（ＢｉｏＥｒｇｏｎｏｍｉｃｓ，　Ｓｔ．　Ｐａｕｌ，　ＭＮ）に再懸濁し、そして５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃にて４８−７２時間インキュベーションした。ＡｃｔｉＣｙｔｅ−ＴＣ培地は抗−ＣＤ３抗体およびヒトサイトカインインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む。この培地は、特に、２つのサイトカインに対するレセプターおよびＴ−細胞抗原レセプターのイプシロン鎖を介してＴ−リンパ球を活性化する。
【０１８１】
実施例５
蛍光色素−標識抗−ＩＲＰ−２抗体
１．抗体の蛍光色素標識化
ＦＩＴＣを用いて抗体を標識するために、抗体を５ｍｇ／ｍｌの濃度で１００ｍＭ　ＫＨ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．０）中へ入れ替える。ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）（ＤＭＦ中で１０ｍｇ／ｍｌ）を２５：１モル比で抗体に添加し、そして１時間室温にて暗所中でインキュベーションする。遊離ＦＩＴＣをＧ−２５　Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上で抗体から分離する。２−イミノチオランを用いてフィコエリスリンおよびＣｙ５ＰＥ複合体を産生し、抗体を修飾するための蛍光色素およびスルホ−ＳＭＣＣを修飾する。次いで、この修飾タンパク質を暗所中で室温にて１時間共にインキュベーションする。遊離蛍光色素および抗体を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００−ＨＲカラム（Ｓｉｇｍａ）上の分離によって、蛍光色素−複合化抗体から分離する。タンパク質に対する蛍光色素の比における改変は、特定の抗体またはペプチド抗原についての蛍光シグナルを最適化するために必要不可欠であるかも知れない。
【０１８２】
２．抗−ＩＲＰ−２抗体および蛍光色素標識抗−ＩＲＰ−２抗体
のクオリティーコントロール
ＩＲＰ−２ネイティブ、変異ペプチドおよびインタクトタンパク質に対して開発された抗体を、抗原−ダウンＥＬＩＳＡ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｏｗｎ　ＥＬＩＳＡ）およびＢｉｏＥｒｇｏｎｏｍｉｃｓ，　Ｉｎｃ．で開発されたマイクロ粒子−ベース免疫蛍光アッセイの両方を用いて、特異性について試験する。ビオチン−標識ネイティブおよび変異ペプチドまたはインタクトＩＲＰ−２タンパク質を、高い特異性およびアビディティーを伴ってビオチン−標識分子へ結合する７μｍ直径アビジン−コートポリスチレン常磁性粒子に結合する。この新たに開発した抗体を、サンドウィッチアッセイによって、個々の様々なＩＲＰ−２ペプチドでコートされる微粒子に対する特異性について試験する。抗原−コート粒子に結合するＩＲＰ−２特異的抗体を、続くフィコエリトリン−標識ヤギ抗−マウスＩｇ抗体との反応によって検出する。サンプルをフローサイトメトリーによって分析する。陽性蛍光シグナルを生成する抗体は、ネイティブまたは変異ペプチドに対して潜在的に特異的であると考えられる。特異性は、細胞または抗原−コート微粒子とのインキュベーションの前のこの細胞または抗原−コート粒子の未標識抗体とのプレ−インキュベーションあるいは標識抗体の抗原とのプレ−インキュベーションにより抗−ＩＲＰ−２抗体の特異的結合および蛍光を遮断することによって、確認される。
【０１８３】
抗原−コート微粒子を、既に選択されたＩＲＰ−２特異的抗体の蛍光複合体のクオリティーコントロールに使用する。最適なシグナル対ノイズ比を生み出すフィコエリトリンまたはＣｙ５−フィコエリトリン蛍光色素のいずれかを用いる抗−ＩＲＰ−２抗体の最適な標識化を、抗原−コート微粒子への結合および抗原−陽性および抗原−陰性細胞集団の両方の細胞内標識化に基づいて選択する。ＩＲＰ−２ペプチドの特定のエピトープまたは完全な分子に対する抗体の特異性のグループ分けを、未標識抗体を用いる蛍光色素−標識抗体の特定の遮断によって決定する。
【０１８４】
実施例６
ＭＣＩ患者に由来する末梢血サンプルの分析
末梢血サンプルはＭＣＩ患者から得られるであろう。血液アッセイは最低限１年に２回行われる。
【０１８５】
１．βＡＰＰの表面膜型の発現についてのアッセイ
βＡＰＰの細胞表面膜型の相対的発現は、フローサイトメトリー分析により研究被験体に対して測定される。簡単には、βＡＰＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｎ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のｎ−末端に特異的なモノクローナル抗体２２Ｃ１１（３０分間）およびフィコエリトリン−複合体化ＣＤ１４を用いて、単離された単核細胞を染色する。抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、未結合抗体を除去し、次いで細胞をフローサイトメトリーによって分析する。
【０１８６】
２．機能的細胞表面トランスフェリンレセプターの発現についてのアッセイ
試験被験体に由来する細胞上の機能的トランスフェリンレセプターの相対的発現をフローサイトメトリー分析によって測定する。簡単には、単離単核細胞を１００ｎｇのフィコエリトリン−複合化ヒトトランスフェリン（ＢｉｏＥ　Ｉｎｃ．）で１５分間染色し、そして未結合複合体を取り除くためにＰＢＳで１回洗浄し、その後フローサイトメトリー分析を行う。機能的レセプター（すなわち、実際にトランスフェリンを結合し得るレセプター）の発現は、細胞の蛍光強度に直接的に比例する。
【０１８７】
３．白血球を循環させることによる前炎症サイトカインの発現についてのアッセイ
単核細胞（１×１０６／ｍｌ）を細菌性リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の存在または非存在下において２０時間インキュベーションし、前炎症サイトカイン類であるインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の基礎および刺激産生を測定する。サイトカイン産生細胞の同定を細胞内サイトカインの分析によるフローサイトメトリーによって行う。簡単には、ＩＲＰ−２タンパク質の同定について記載されるように、細胞を固定化および透過化する。細胞をＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αに対して特異的なＰＥ−またはＣｙ５ＰＥ−標識抗体で標識する。２０時間のインキュベーションの間に培養培地中に分泌されるサイトカインの量を、フローサイトメトリー−ベースの定量的免疫蛍光アッセイ（ＩｍｍｕｎｏＦｌｏｗ　ａｎｄ　ＭｕｌｔｉＦｌｏｗ，ＢｌｏＥｒｇｏｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ　Ｐａｕｌ，ＭＮ）によって測定する。
【０１８８】
４．活性型単核細胞におけるアポトーシスまたは壊死の検出のためのアッセイ　簡単には、ＡｃｔｉＣｙｔｅ−ＴＣによって活性化される１００万の単核細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、ホスファチジルセリン結合タンパク質Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ（２００ｎｇ，Ｃａｌｔａｇ，Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＤＮＡ−インターカレーティング色素ヨウ化プロピジウム（４μｇ）を用いて染色した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ単独またはＡｎｎｅｘｉｎ―Ｖおよびヨウ化プロピジウムに対して陽性である細胞は、それぞれ初期または後期−段階のアポトーシス性であると考えられ、一方ヨウ化プロピジウム単独に対して陽性である細胞は壊死性であると考えられる。
【０１８９】
５．細胞内ＩＲＰ−２ループペプチドの発現およびＩＲＰ−２発現細胞の同定についてのアッセイ
ＦＩＣＴ、ＰＥおよびＣｙ５ＰＥ−複合化抗−ＩＲＰ−２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリー分析によって細胞内ＩＲＰ−２ループペプチドの発現を測定し、ネイティブなＩＲＰ−２タンパク質を発現する細胞を同定する。実験は、ＩＲＰ−２鉄分解ドメイン多型を探索するために計画された。洗浄細胞（ＰＢＳ　１００μｌ中１×１０６）を、細胞内ＩＲＰ−２タンパク質に対して向けられた蛍光標識抗体の特異的結合による３０分間の発現の間、１ｍｌの１％ホルムアルデヒド中でインキュベーションすることによって，固定化する。陽性蛍光および特定の抗−ＩＲＰ−２抗体に対する特異性の同定を、抗原または未標識抗体とのプレインキュベーションによって特異的に競合され得る蛍光強度におけるシフトによって、測定する。特定の抗−ＣＤ抗体に対して陽性の細胞を、同様に標識されたアイソタイプコントロール抗体またはその蛍光染色が未標識抗体によって特異的に阻害される細胞に対する比較によって、決定する。
【０１９０】
６．フローサイトメトリーデータと患者の臨床状態との相関関係
各患者に対するデータシートを有する個別のファイリングシステムにおいて、フローサイトメトリーデータを患者の臨床状態と相関させる。ＩＲＰ−２「ループペプチド」分解スクリーンの結果を、ＭＣＩ被験体群において分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析する。２つの集団コホート（ＡＤおよび高齢者のコントロール）における変異ＩＲＰ−２タンパク質を比較するデータをさらに試験し得る。本発明は実施形態および実施例に対する参照を　用いて記載されたが、種々の改変が本発明の精神から外れることなく行われ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は以上の請求項によってのみ制限される。本明細書中に記載される全ての参照は、本明細書中で参考として明白に援用される。
【国際公開パンフレット】
2004506420.tif 000003
2004506420.tif 000004
2004506420.tif 000005
2004506420.tif 000006
2004506420.tif 000007
2004506420.tif 000008
2004506420.tif 000009
2004506420.tif 000010
2004506420.tif 000011
2004506420.tif 000012
2004506420.tif 000013
2004506420.tif 000014
2004506420.tif 000015
2004506420.tif 000016
2004506420.tif 000017
2004506420.tif 000018
2004506420.tif 000019
2004506420.tif 000020
2004506420.tif 000021
2004506420.tif 000022
2004506420.tif 000023
2004506420.tif 000024
2004506420.tif 000025
2004506420.tif 000026
2004506420.tif 000027
2004506420.tif 000028
2004506420.tif 000029
2004506420.tif 000030
2004506420.tif 000031
2004506420.tif 000032
2004506420.tif 000033
2004506420.tif 000034
2004506420.tif 000035
2004506420.tif 000036
2004506420.tif 000037
2004506420.tif 000038
2004506420.tif 000039
2004506420.tif 000040
2004506420.tif 000041
2004506420.tif 000042
2004506420.tif 000043
2004506420.tif 000044
2004506420.tif 000045
2004506420.tif 000046
2004506420.tif 000047
2004506420.tif 000048
2004506420.tif 000049
2004506420.tif 000050
2004506420.tif 000051
2004506420.tif 000052
2004506420.tif 000053
2004506420.tif 000054
2004506420.tif 000055
2004506420.tif 000056
2004506420.tif 000057
2004506420.tif 000058
2004506420.tif 000059
2004506420.tif 000060
2004506420.tif 000061
2004506420.tif 000062
2004506420.tif 000063
2004506420.tif 000064
2004506420.tif 000065
2004506420.tif 000066
2004506420.tif 000067
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506420.tif 000068
【国際調査報告】
2004506420.tif 000069
2004506420.tif 000070