(57)【要約】本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける防御免疫処理において、ワクチンに対するＴｈ−１型体液性免疫応答を増強する非毒性アジュバント組成物を調製するためのＩ型ＩＦＮの使用であって、ＩＦＮをワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量で用いる使用に関する。本発明はさらに、抗原の存在に関する疾患の予防又は治療において、別々に、同時に又は連続して使用するためのＩ型ＩＦＮを含む非毒性アジュバント組成物及び少なくとも前記抗原を含むワクチンを含む部分のキットに関する。
2004533431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける防御免疫治療において、ワクチンに対するＴｈ−１型体液性免疫応答を増強する非毒性アジュバント組成物を調製するためのＩ型ＩＦＮの使用であって、該ＩＦＮを、ワクチン用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量で用いる、上記使用。
【請求項２】
前記増強された体液性免疫応答が、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂ及び／又はＩｇＧ３及び／又はＩｇＡ及び／又はＩｇＭ産生の選択的誘導を伴う、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記防御免疫治療が、皮下、筋肉内若しくは皮内の注射、又は経口若しくは粘膜の投与によって実施される請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
粘膜投与は、鼻腔内又は経口の投与であり、局所及び／又は全身の防御免疫をもたらす、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物及びワクチンは、前記アジュバント及び前記ワクチンを、投与部位に同時送達するように処方されている、請求項１から請求項４までのいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ防御が、たった一度の免疫処置後に実現される、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ防御が、最初にワクチン及びアジュバント組成物を同時投与し、次いで、さらにアジュバント組成物のみをワクチン注射後１日目、或いは１日目及び２日目に投与して実現される、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記Ｉ型ＩＦＮが、天然ＩＦＮα、合成組換えＩ型ＩＦＮ、組換えＩＦＮ−αサブタイプ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、又はＩ型ＩＦＮの１個又は複数の一員をコードする核酸配列である請求項１から請求項７までのいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記Ｉ型ＩＦＮが、ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｉ型ＩＦＮの投与量が、１×１０6〜６×１０6Ｕの範囲である、請求項１から請求項９までのいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｉ型ＩＦＮが、樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体と融合した組換えＩ型ＩＦＮである、請求項１から請求項１０までのいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記ワクチンが、感染因子（ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）又はその他の起源からなる１種又は複数の抗原を含む、請求項１から請求項１１までのいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記ワクチンが、腫瘍由来の１種又は複数の抗原を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗原の量が、１〜１０００μｇである、請求項１１又は請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗原の量が、１０〜２００μｇである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
抗原及びアジュバント双方の放出を、制御及び持続化するために、アジュバントとしてワクチン用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量でＩ型ＩＦＮを含むワクチン。
【請求項１７】
皮下、筋肉内若しくは皮内の注射、又は経口若しくは粘膜の投与に適用する、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
粘膜投与が、鼻腔内又は経口の投与である請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記Ｉ型ＩＦＮが、天然ＩＦＮα、合成組換えＩ型ＩＦＮ、組換えＩＦＮ−αサブタイプ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、又はＩ型ＩＦＮの１種又は複数の一員をコードする核酸配列である、請求項１６から請求項１８までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
前記Ｉ型ＩＦＮが、ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプである、請求項１６から請求項１９までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２１】
前記Ｉ型ＩＦＮ投与量が、１×１０6〜６×１０6ＩＵの範囲である、請求項１６から請求項２０までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２２】
前記Ｉ型ＩＦＮが、樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体と融合した組換えＩ型ＩＦＮである、請求項１６から請求項２１までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ワクチンが、感染因子又はその他の起源からなる１種又は複数の抗原を含む、請求項１６から請求項２２までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２４】
前記ワクチンが、腫瘍由来の１種又は複数の抗原を含む、請求項１６から請求項２３までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２５】
前記抗原の量が、１〜１０００μｇである、請求項１６から請求項２４までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２６】
前記抗原の量が、１０〜２００μｇである、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記Ｉ型ＩＦＮ投与量が、１×１０6〜６×１０6ＩＵの範囲である、請求項１６から請求項２６までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２８】
さらにアルミニウム塩を含む、請求項１６から請求項２７までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２９】
前記抗原の存在に関連した疾患の予防又は治療において、別々に、同時に又は連続して使用するための、
１００．０００ＩＵ以上の用量でＩ型ＩＦＮを含む非毒性アジュバント組成物と、
少なくとも１種の抗原、及び薬剤として許容される担体、媒体又は補助剤を含むワクチンと
からなる、複数の構成成分からなるキット（ａ  ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）。
【請求項３０】
抗原を、ワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量のＩ型ＩＦＮと一緒にして、制御されかつ持続的な放出を行なう組成物を処方するステップを含む、請求項１６から請求項２８までのいずれかに記載のワクチンの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン、特にサブユニットワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
当業界では、ワクチンが知られている。一般的に、ワクチンには、死菌ワクチン、弱毒化病原体及びサブユニットワクチンがあり、感染症を予防、改善又は治療する目的で投与される。
【０００３】
特に、サブユニットワクチンは、宿主免疫系を介した防御の重要な標的になるとされる病原体の成分から得られる抗原に基づくワクチンである。サブユニットワクチンは、高い安全性はわかっているものの、ベースとなる抗原の免疫原性が不十分であるか、又は免疫原性がないために適切な免疫応答が誘導されないことが多い。
【０００４】
そのため、サブユニットワクチンは、しばしば、免疫原性を高めるため、アジュバント、すなわち定義によれば、抗原と一緒に投与すると抗原のみの場合と比較してより効果的な免疫応答を生じさせる物質、と供に、含有する又は投与することが必要である。
【０００５】
多くの種類のアジュバントが動物モデルで使用されており、標準的な例としては、油性エマルジョン、アルミニウム若しくはカルシウムの塩、サポニン及びＬＰＳ由来産物があるが、今日ではアルミニウムをベースとした無機塩がヒトワクチンの処方に一般的に含有される唯一のアジュバントである。安全なものの、このような塩は抗体の誘発が弱いアジュバントであり、古典的な細胞性免疫応答を刺激することができない。
【０００６】
抗体と細胞性応答の両方を誘導することは、侵入した病原体の拡散を制限、又はそれらを排除する目的で、高度に効果的な防御をもたらすために必要とされる。強い防御免疫応答を惹起するためには、ワクチンが、２種類のシグナルを供与又は誘導することが必要である。第１に、ワクチンは、Ｔ及びＢリンパ球上に抗原特異的受容体を誘発する抗原を送達することが必要である。第２に、効果的なワクチンは、抗原提示細胞による同時刺激分子の発現を誘導し、次いで抗原によって誘発されるリンパ球によって強力な応答を促進することが必要である。この第２のシグナルは、生きた病原体を含むワクチンを使用したとき、感染に関連した因子によってもたらされることが多いが、一般的にサブユニットワクチンでは、この第２のシグナルを欠いており、その免疫原性は不十分となる。この第２のシグナルに寄与し得るアジュバントを添加すると、ワクチンの効果が高まり、さらには惹起される免疫応答の種類を指定することが可能である。
【０００７】
これらのシグナルの宿主免疫系に対する指令的役割は、所与の感染因子に対する全体的な免疫応答の種類及び能力を特徴づけるエフェクター機構の２次的な発現を可能とする。
【０００８】
サイトカインは、抗原及び感染因子に対する免疫応答過程において、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞およびその他の免疫細胞の間の情報交換に関与する主要な因子である。マウス及びヒトのＴヘルパー（Ｔｈ）クローンに関するいくつかの研究によって、Ｔｈ細胞（Ｔｈ１及びＴｈ２と呼ばれる）によって示された異なる活性の存在について、サイトカイン分泌プロファイルから推論された詳細な証拠がもたらされた。この結果、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−４の産生は、それぞれＴｈ１又はＴｈ２応答の典型的な特徴と考えられている。Ｔｈ１型の免疫応答は、一般的にマウスのＩｇＧ２ａ産生及び細胞性免疫の発現に関連しており、一方、Ｔｈ２型の免疫応答は、ＩｇＥの産生、好酸球及び肥満細胞の産生に関連している。一般的に、Ｔｈ１型の免疫応答の誘導は、ウイルス及びある種の細菌感染に対する防御免疫応答の発生に寄与する。この点に関して、アルミニウムベースの鉱物塩などの臨床的に有用なアジュバントは、Ｔｈ２型の免疫応答を誘導し、その一方で、Ｔｈ１を促進するアジュバントの中には一般的に毒性又は安全性の問題によって使用が制限されるものがあることは、特筆すべき点である。
【０００９】
上記意味において、効果の高いアジュバントがないことは、ワクチン、特に細胞性免疫が必要な細胞内病原体に向けられたワクチン、の開発を成功させるには重大な障害となる。
【００１０】
したがって、潜在的には有効な組換え抗原の利用が可能であるにもかかわらず、ワクチン接種に対する応答性の弱さ若しくは欠如、並びに患者の承諾が、依然として予防用又は治療用サブユニットワクチンにとっての重要な問題となっている。サブユニットワクチンの免疫原性が弱いと、十分な応答を惹起するためにこれらのワクチンを複数回投与することが必要となり、患者の承諾がないと重大な問題となる。
【００１１】
したがって、抗原の免疫原性を高め、確実に強い免疫応答を促すことで、一回投与でさえも血清変換／血清防御率を誘導するように必要なワクチン投与回数を減らすアジュバントの必要性が、実際上、長年亘り痛切に叫ばれている。
【００１２】
この点について、前記で証明された特性のために、当業界においては、サイトカインに、アジュバントとしての可能性が考えられている。特に、中でもインターフェロン（ＩＦＮ）は注目を浴びてきた。
【００１３】
今日、現在の見解によれば、ＩＦＮは、ウイルス感染又はその他の刺激に対する応答において様々な細胞によって分泌される複雑な抗ウイルス蛋白質ファミリーであり、そのことが多数の生物学的活性を示すと言われている。ＩＦＮは、その生体活性を誘導する受容体系に応じて２つの主要な型に分類される。
ｉ）Ｉ型ＩＦＮ：ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−ωの少なくとも１３個の機能的サブタイプからなるＩＦＮ−αファミリーが含まれる。
ｉｉ）ＩＩ型ＩＦＮ：ＩＦＮ−γとも称される。
【００１４】
Ｉ型ＩＦＮは、当初、単純な抗ウイルス物質と理解されていたが、その後実験モデル並びに患者で抗腫瘍活性を含めた様々な生物学的作用を示すことが示された。初期の研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答に対するＩ型ＩＦＮのいくつかの作用が報告された。しかし、これらの研究の中には、多くのケースでＩＦＮ調製物がまだ不純物を含んでいたために、懐疑的に思われるものもあった。長い間、免疫系に対するＩ型ＩＦＮの作用は、重要性の点で、防御細胞が媒介する免疫応答の主要な媒介物とされるＩＩ型ＩＦＮの作用と比較することなどできず、このことは、元々の「免疫ＩＦＮ」という定義と首尾一貫するものと、一般的に思われてきた。
【００１５】
Ｉ型ＩＦＮはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体産生及びＴ細胞増殖に対し、強力な阻害作用を発揮することが示され、これらのサイトカインがｉｎ  ｖｉｖｏで刺激的に作用するのか、阻害的に作用するのかという問題が生じた。特筆すべきは、最近、数名の著者等が、Ｉ型ＩＦＮが免疫抑制作用を有する可能性を強調していることである。この考えは、疾患の進行に関与する推定の免疫抑制因子とされる内因性ＩＮＦの活性を中和するという原理に基づき、ＨＩＶ−１感染患者における臨床応用にさえ至った。他方、最近、異なるモデル系で得られたデータ全体から、Ｔｈ１型の免疫応答の誘導、並びにある種のＴ細胞サブセットの増殖、機能的活性及び生存において、Ｉ型ＩＦＮの重要性が指摘された（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ  Ｆ．及びＧｒｅｓｓｅｒ  Ｉ．「Ｔ細胞応答における無視されたＩ型インターフェロンの役割。臨床的使用との関係（Ｔｈｅ  ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ．）」Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：３６９〜３７２、１９９６、及びＴｏｕｇｈ  ＤＦ、Ｂｏｒｒｏｗ  Ｐ、及びＳｐｒｅｎｔ  Ｊ．「ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるウイルス及びＩ型インターフェロンによるバイスタンダーＴ細胞増殖の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９４７〜１９５０、１９９６）。
【００１６】
Ｉ型インターフェロンは、現在臨床で最も使用されているサイトカインである。特に、ＩＦＮ−αは、世界的に４０を上回る国々で、いくつかのウイルス性疾患（特にＣ型肝炎）、並びに血液の悪性腫瘍（ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、いくつかのＢ細胞及びＴ細胞性の白血病）及びある種の固形癌、たとえばメラノーマ、腎癌及びカポシ肉腫を含む様々な種類のヒト癌の治療のために使用されている。対照的に、ＩＮＦ−γは、専ら毒性のために臨床適用例が乏しい。ここ数年にわたり、いくつかの研究によって、Ｉ型及びＩＩ型のＩＦＮによって発揮される生物学的作用が、異なる実験モデルにおいて、活性の種類の点で実質的に異なり得ることが証明された。メラノーマ及び多発性硬化症などのいくつかのケースにおいて、ＩＦＮ−γの臨床的な使用が、Ｉ型ＩＦＮで達成される効果とは反対の効果をもたらした。
【００１７】
臨床用途が広いにもかかわらず、Ｉ型ＩＦＮは、まだワクチンアジュバントとしては使用されていない。これは、兎にも角にも免疫応答の調節におけるＩ型ＩＦＮの役割及び重要性に関して、現在の技術水準が、混乱し、問題の多いままであるためである。
【００１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるワクチンのアジュバントとしての、ＩＦＮの関連する使用は、ＩＩ型ＩＦＮ（すなわち、ＩＦＮ−γ）についてのみ示されている。特に欧州特許第０２４１７２５号では、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉの毒性ＹＭ系で感染させたマウスの血液細胞から得られた粗蛋白質抽出物を含有し、アジュバントとしてＩＦＮ−γを含むワクチンが記載されている。ワクチンに含まれるＩＦＮ−γの量は、用量当たり１．０００から１０．０００Ｕの範囲が示され、その中で、アジュバント効果を生じるＩＦＮ−γの量として、１００から５０．０００Ｕの範囲が示されている。たとえ２００単位より少ない用量でも有効であると示されていても、使用される用量は５．０００Ｕである。
【００１９】
アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮの使用はいくつかの従来技術の文献で予見されているが、ワクチンアジュバントとして使用したときｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｈ−１型防御応答を促進するＩ型ＩＦＮの有効性は、証明も、示唆もされていない。
【００２０】
実際、ＷＯ／８７０４０７６は、ウシの感染性鼻腔気管炎（ＩＢＲ）ウイルスに感染した子牛の研究によって、免疫応答の間接的な増進に向けたＩＦＮ−αの使用の可能性が増大されたことを開示する。
【００２１】
特に、ＷＯ／８７０４０７６によれば、ＩＦＮαは、好ましくは経口経路で、１日当たり約５ＩＵ／ｌｂ（１１２ＩＵ／ｋｇ）体重以下の非常に低い用量で、好ましくは１ＩＵ／ｌｂ（２４．２ＩＵ／ｋｇ）体重の用量で投与する。これらの量はあまりに低すぎるため、本発明で得られる効果を達成できないばかりでなく、この適用の例で報告された結果では、好ましい５ＩＵ／ｌｂ（１１２ＩＵ／ｋｇ）の濃度を超えてＩＦＮの量を増加させると、免疫応答を減少させる反対の効果をもたらすことを示す。
【００２２】
Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ他（Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．７、１９８９、ＰＰ４５７〜４６１）は、ボランティアを抗Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｍワクチンで免疫した後のＩｇＧ及びＩｇＭ抗体産生に関し、ＩＦＮ−αが発揮する一般的なアジュバント効果について報告している。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたＩｇＧ及びＩｇＭ力価の穏やかな増加は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御効果の証明にはならない。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏの防御効果は、この文献から推論できない。
【００２３】
さらに、Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ他は、選択的な非毒性の方法で、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴｈ−１型の防御免疫応答を誘導するＩＦＮ−αの能力については、開示も示唆もしていない。
【００２４】
Ａｎｔｏｎ  Ｐ．他（Ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｌｉｅｂｅｒｔ、ＵＳ、Ｖａｌ．１１、ｎｏ．５、１９９６、ｐｐ３１５〜３１８）は、不活化自己腫瘍細胞及び組換えＩＦＮ−α２ａを含有する抗腫瘍ワクチンの実験について記載している。この文献は、免疫治療における特定の有効性について記載しているが、自己細胞による関与とＩＦＮによる関与との間の区別がなされていない。したがって、単にＩＦＮのアジュバント効果を主張しているにすぎず、まして得られる免疫応答の種類については言うまでもない。したがって、本発明で意図されるＩ型ＩＦＮのアジュバント効果については、この文献からも、推測することができない。
【００２５】
Ｇｒｏｂ  Ｐ．Ｊ．他（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９４、Ｖｏｌ．３、ｎｏ．３、ｐｐ１９５〜１９８）は、組換えＩＦＮ−α及び市販の抗Ｂ型肝炎ワクチンを、従来の免疫に応答しない患者に投与することを記載している。その結果は、ＩＦＮで治療した患者での、低い血清変換率、及び抗体力価の同程度の小さな増加を証明し、ｉｎ  ｖｉｖｏで防御効果を期待できるものではなかった。このケースにおいて、ＩＦＮαがワクチンと間隔をおいて投与されたことを強調しなければならない。概念的に、この方法は、アジュバント（典型的には、当該アジュバントは抗原と会合（association）する）として任意の物質を使用する方法とは異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
前述の従来技術に対する本発明の範囲は、具体的には死菌を含むワクチンで、より具体的にはサブユニットワクチンで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御免疫治療において、ワクチンに対するＴｈ−１型体液性免疫応答を増強するための安全で効果の高い手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の概要）
本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける防御的免疫治療において、ワクチンに対するＴｈ−１型体液性免疫応答を増強する非毒性アジュバント組成物を調製するためのＩ型ＩＦＮの使用であって、ＩＦＮをワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量で使用することである。
【００２８】
このような増強された体液性免疫応答は、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂ及び／又はＩｇＧ３及び／又はＩｇＡ及び／又はＩｇＭ産生の選択的誘導を伴う。
【００２９】
非毒性アジュバント組成物は、特に皮下、筋肉内又は皮内の注射、或いは経口又は粘膜又は経鼻の投与で実施されるｉｎ  ｖｉｖｏでの防御免疫に有用である。
【００３０】
特に、本発明の目的は、前述の目的で、非毒性アジュバント組成物を調製するためにＩ型ＩＦＮを使用することであり、当該組成物は、投与部位に、ワクチンと一緒に同時に送達されるように調合される。好適なアジュバント組成物及びワクチンは、一緒に調合される。
【００３１】
本発明の他の目的は、任意の必要な薬剤として許容される担体媒体又は補助剤と一緒に、抗原とアジュバント双方の放出を制御し且つ持続的とするために、アジュバントとしてワクチン１用量当たり１０００００ＩＵ以上の用量でＩ型ＩＮＦを含むワクチンである。
【００３２】
さらに他の目的は、別々に投与するための、前記ＩＮＦを含むアジュバント組成物と、ワクチン組成物とを含有する、複数の構成成分からなるキット（a kit of parts）である。
【００３３】
本発明の第１の利点は、本発明によって調製されたアジュバント化ワクチンが、総抗体産生量の程度によって測定されるような、長期間の抗体産生及び免疫学的記憶が特徴であるＴｈ−１型の免疫応答の誘導を増強できることである。
【００３４】
本発明の第２の利点は、上記投与量におけるＩ型ＩＮＦ組成物でアジュバント化したワクチンは、ワクチンを１回投与しただけでも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特異的にＴｈ−１型の体液性防御免疫応答および細胞媒介性免疫応答を誘導できることである。
【００３５】
第３の利点はまた、いかなる毒性、特に動物においてＴｈ−１型の応答を促進することが知られているＣＦＡ又はＩＦＡなどの現在利用されているアジュバントに一般的な毒性／安全性の問題を伴うことなく、Ｔｈ−１型の免疫防御を迅速に誘導する点で高い効能を有することである。
【００３６】
Ｉ型ＩＮＦによって誘導される免疫応答は、特異的なＩｇプロフィール、すなわち、マウスにおいては、細菌又はウイルスなどの病原体の攻撃に対する防御を付与する、ＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＡの特異的誘導によって特徴づけられる、Ｔｈ−１型の応答である。
【００３７】
本発明の非毒性アジュバント組成物では、Ｉ型ＩＦＮは、前記の投与量で含まれるのであれば、このファミリーに属するいかなるインターフェロンであってもよい。ちなみに、ヒトにおいて最も有効な用量は１×１０6〜６×１０6ＩＵの範囲である。
【００３８】
好ましい実施形態では、ワクチン１用量当たり指示した前述の用量で使用する限り、健康な提供者の刺激を受けた白血球から得た天然のＩＦＮ−α（異なるＩＦＮ−αサブタイプの混合物若しくは個々のＩＦＮ−αサブタイプ）又はＮａｍａｌｗａ細胞から得られたリンパ芽球細胞ＩＦＮ−α、合成Ｉ型ＩＦＮ、たとえばコンセンサスＩＦＮ（ＣＩＦＮ）及びＩＦＮ−β、又は組換えＩＦＮ−αサブタイプ、たとえばＩＦＮ−αａ及びＩＦＮ−αｂ、若しくはＩＦＮ−ω、或いはＤＮＡシャッフリング法によって創出した新規のＩＦＮ分子を使用する。
【００３９】
注射後ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮの半減期が長く、原則的に、より顕著で迅速な免疫応答の達成に有効なＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプを使用してもよい。
【００４０】
樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体と融合させた組換えＩ型ＩＦＮに代表される、融合ハイブリッド蛋白質は、特にワクチン製剤に含められるアジュバントとして有効であろう。
【００４１】
本発明のアジュバント組成物は、アジュバント化ワクチン形態において、感染因子又はその他の起源からなる１種又は複数の抗原とも一緒にする(combine)ことができる。
【００４２】
抗原としては、精製した、若しくは部分精製した蛋白質調製物、ペプチド、炭水化物又は脂質抗原、並びに／或いは全細胞に関連する抗原、特に抗原と混合されている樹状細胞がある。概して、アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮに関連した病原体が、免疫原候補と考えることができ、当業者は容易に確認することができる。
【００４３】
各アジュバント化ワクチン用量中の抗原の量は、ワクチン接種対象において防御免疫応答を誘導することができる量として選択される。この量は、特異抗原及びその他の一般的なアジュバントの存在（可能な場合）に左右され、当業者は確認することができる。一般的に、それぞれの用量は、抗原を１〜１０００μｇ、好ましくは１０〜２００μｇ含有する。
【００４４】
他の成分もまた、本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンにおいて、有利に存在することができる。特に、好ましい実施形態では、他のアジュバント、特にアルミニウム塩を組成物に含む。
【００４５】
形態に関し、本発明のアジュバント組成物は、前記アジュバントとワクチンとを投与部位に同時に送達するように処方するとよい。好ましくは、アジュバント組成物及びワクチンは、アジュバント化ワクチンの形態で１つの組成物中に一緒に処方される。アジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンの処方は、抗原と関連的にアジュバントを投与するのに適する、当業界で公知のいかなる形態であってもよい。
【００４６】
場合によっては、アジュバント組成物及びワクチン、又はアジュバント化ワクチンを、期待する効果や、使用の容易さを考慮して、皮下又は筋肉内に注射することがある。ワクチンによっては皮内注射で効果的に実施でき、注射部位に相当数の樹状細胞を動員するために適したその他の送達系を考えることもできる。
【００４７】
鼻腔内及び経口の投与はまた、特に、例えばインフルエンザウイルスの感染などのウイルス性呼吸器系感染のように、鼻腔内及び経口の感染経路を通じて輸送されるそれらの感染因子用とされる。
【００４８】
さらに、アジュバント組成物及びワクチン或いは直接アジュバント化されたワクチンの、鼻腔内、経口又は任意のその他の粘膜投与は、非常に実用的なワクチン送達様式を使用することによって、予想外の有利な、局所及び／又は全身の潜在的な防御免疫の誘導をもたらす、有益な選択肢を提示する。
【００４９】
この点に関し、当業者は、ワクチン摂取によって中和される抗原の機能に最も適合した処方を決定することができる。
【００５０】
本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、生理食塩水などの滅菌した生理学的に適合した担体、賦形剤、その他のアジュバント（もし必要であれば）、保存剤、安定化剤を含む薬剤組成物として、従来の方法で処方することができる。
【００５１】
アジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、使用前に滅菌担体で溶解するために、液状形態又は凍結乾燥形態にすることができる。また、ＩＦＮと抗原の両方について徐放性を獲得する上で有用なため、製剤中にアラム又はリポソーム様粒子を存在させることも可能である。ＩＦＮ−アジュバント化ワクチンの徐放性を可能とするその他の戦略は、当業者に容易に確認することができ、それらは、本発明の範囲に包含されるものである。
【００５２】
したがって、薬剤として許容される担体媒体又は補助剤は、それぞれの製剤において当業者が容易に確認することができる。
【００５３】
これに関し、本発明は、
抗原とＩ型ＩＦＮを一緒に調合し、該Ｉ型のＩＦＮを、ワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量とするステップを含む、本発明のアジュバント化ワクチンの調製方法をも目的とする。
【００５４】
前記のアジュバント化ワクチンは、感染症及び癌の予防的及び治療的な処置の両方で使用することができる。具体的には、本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、ウイルス性及び細菌性疾患の予防（すなわち、予防ワクチン）、並びに重度の慢性感染症の治療（すなわち、治療ワクチン）の処置において使用することができる。さらに、該アジュバント組成物又は該アジュバント化ワクチンは、適切な抗原を使用すれば、癌の予防及び治療に使用することもできる。
【００５５】
これは、ヒト悪性腫瘍（ＥＢＶ、ＨＰＶ及びＨ．ｐｉｌｏｒｉ）に関連した感染因子に対する抗原、或いはヒトメラノーマ並びにその他のヒト腫瘍において特徴的な抗原など充分に確定された腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ抗原、チロシナーゼｇｐ１００、ＭＡＲＴ）を使用することによって、実現することができる。
【００５６】
とりわけ、本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、いわゆる低応答又は非応答の患者、たとえば持続的血液透析患者及び移植患者のような免疫障害患者のワクチン接種に特に適している。一般的に、本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、早期に血清変換／血清防御が望ましい状況で感染の危険性が高い個体へのワクチン接種に好適である。
【００５７】
これらの特徴は、特にＨＢＶに対するワクチン接種に関連する。
【００５８】
他の例として、説明したアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、特に標準的なワクチンに対して応答の乏しい高齢者において、インフルエンザウイルスに対する防御を誘導するために有効である。
【００５９】
ＨＢＶワクチン並びにその他のウイルスワクチンでは、皮下（ｓ．ｃ．）又は筋肉内の経路で注射することが好ましく、一方その他の場合、特に呼吸系から宿主に感染することができる因子については、期間又は有効性及び／又は患者の承諾の点で鼻腔内投与が有利である。
【００６０】
第２の態様において、本発明によるＩ型ＩＦＮのアジュバント効果は、Ｉ型ＩＦＮ及びサブユニットワクチンを別々に投与することによっても得ることはできる。
【００６１】
効果的なものとするには、投与を、同じ部位に活性物質を同時に存在させる方法によって実施すべきである。実際に、最適な効果は、Ｉ型ＩＦＮを、ワクチンと一緒に、１００．０００〜２００．０００ＩＵの範囲又はそれ以上の用量（１×１０6〜２×１０6ＩＵ）で動物に注射すると達成される。さらに強力な免疫応答の増強は、ワクチン及びアジュバントをまず同時投与して、次いで最初のワクチン投与から１日後又は１日後及び２日後にアジュバント組成物のみを追加投与することで得られる。ＩＦＮを、単独でワクチン投与の−１日目又は＋１日目に与えると、非常に低い効果であることが認められる（図１１Ｃ）。
【００６２】
したがって、本発明はまた、
Ｉ型ＩＦＮ及び薬剤として許容される担体を含む組成物と、
一の抗原、又は２種以上の抗原（明確にされている蛋白質又はペプチドの）の組合せ、又は死滅した若しくは不活化した病原体を含むワクチン組成物とを、
当該抗原の存在に関連した疾患の治療において、別々に、同時に又は順次使用するために含有する、複数の構成成分からなるキット（ａ  ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）をも包含する。
【００６３】
本発明のキットの組成物の処方、形態及び投与経路は、前述と同様である。
【００６４】
本発明は、添付した図面によってより十分に説明されるだろう。
【００６５】
（発明の詳細な説明）
本発明に適するＩ型ＩＦＮは、単一の組換え分子として、或いは天然若しくは組換え分子のプール、又はコンセンサスＩＦＮ（ＣＩＦＮ）として、このファミリーに属する任意のＩＦＮである。
【００６６】
ヒトで使用するには、ヒトＩ型ＩＦＮが好ましいアジュバントである。当該アジュバントは、組換えＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β若しくはＩＦＮ−ω、健康な提供者の刺激リンパ球から得られた天然ＩＦＮ−α（異なるＩＮＦ−αサブタイプの混合物若しくは個々のＩＦＮ−αサブタイプ）若しくはＮａｍａｌｗａ細胞から得られたリンパ芽球細胞ＩＦＮ−α、ＣＩＦＮ、又はＤＮＡシャッフリング法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され生物学的活性を与えられた新規ＩＦＮとすることができる。
【００６７】
家畜に使用する場合は、Ｉ型ＩＦＮは天然に発見されたもの、又はワクチンを調製する種に密接に関連するものから成る。繰り返す述べると、これらのＩ型ＩＦＮは、適切な動物細胞から天然に産生されるか、組み換えることができる。これらの種類のインターフェロンは、ほぼ同じアジュバント活性を有する。
【００６８】
最適なアジュバント活性を実現するために必要なインターフェロンの量は、抗原の種類（すなわち、免疫原性）に左右されるが、一般的にワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵを上回るべきである。マウスでは、高用量のＩ型ＩＦＮ（２×１０5〜２×１０6ＩＵ）を注射することによって最適な効果が得られる。ヒトにおける最適な投与量は、ワクチン１用量当たり１０6〜６×１０6の範囲であると予想される。ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて注射後のＩＦＮの半減期を高めることが可能でるという利点を有し、より顕著で迅速な抗体応答を実現するために有益である。
【００６９】
樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体（たとえば、抗ＤＥＣ−２０５又は抗ＣＤ１１ｃ抗体）と融合した組換えＩ型ＩＦＮによって代表される融合ハイブリッド蛋白質は、アジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンに含められるアジュバントとして特に有効であろう。
【００７０】
また、ＩＦＮ蛋白質の投与に加えて、又はその代わりに、正確に発現するための適切な制御領域を備え、１種又は複数種のＩ型ＩＦＮをコードする核酸配列（すなわち、真核細胞系で発現するために、適切なプロモータ及び転写終結シグナル配列の制御下でＩ型ＩＦＮをコードする遺伝子を含有するプラスミド）をアジュバントとすることもできる。
【００７１】
アジュバント活性は、抗原特異的免疫応答を増強することができるインターフェロンの任意の部分に関連する。
【００７２】
本発明の組成物は、同じ容器に入れた生理学的に適合した担体（たとえば、生理学的ｐＨの緩衝滅菌生理食塩水溶液）中で混合されて、抗原とアジュバントの両方を含有するものが好ましい。
【００７３】
この点に関し、本発明のアジュバント化ワクチンは、有効量の生物学的活性のあるＩ型ＩＦＮと会合させた、感染因子又はその他の起源からの１個若しくはさらに複数の抗原、並びに殺菌若しくは弱毒化した病原体を含むことができる。また、アジュバント化ワクチンは、全細胞、特に自己樹状細胞を含むことができる。
【００７４】
このように調合するための抗原は、任意の種類の天然又は組換え精製抗原とすることができ、当該抗原は、ウイルス、細菌、原生動物及び菌類、並びに腫瘍関連細胞性抗原を含む、細胞内又は細胞外の病原体から得られた蛋白質、ペプチド、脂質又は炭化水素の抗原とすることができる。
【００７５】
各アジュバント化ワクチン用量中の抗原量は、ワクチン接種対象において免疫防御応答を誘導できる量を選択する。この量は、特定の抗原及び存在し得る他の一般的なアジュバントに左右される。一般的に、各用量中、１〜１０００μｇ、好ましくは１０〜２００μｇの抗原が含まれる。
【００７６】
抗原は、ウイルス（ピコナウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス、パルボウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、オルトミキソウイルス、パラミキソウイルス、ブニアウイルス、レトロウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス）、細菌（ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ナイセリア、スピロヘータ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、リステリア、エリジペロスリックス、炭疽菌、ミコバクテリア、エンテロバクター、ビブリオ、カンピロバクター、ヘリコバクター、ヘモフィルス、ボルデテラ、ブルセラ、フランシセラ、パスツレラ、エルシニア、クラミジア、リケッチア及びその他の非発酵性グラム陰性桿菌）、マイコプラズマ及びレジオネラ、原生動物（肉質虫類、有毛類、鞭毛虫類、胞子虫類、クリプトスポリジウム、ニューモシスティス）、菌類（コクシジオイデス、ヒストプラズマ、ブラストミセス、クリプトコッカス、カンジダ、アスペルギルス、ムコラーレス、接合菌）を含む、細胞内又は細胞外病原体から得られた任意の種類の天然若しくは組換え抗原、又はその一部、並びに病原体自体であることができる。
【００７７】
腫瘍関連抗原には、メラノーマ抗原（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原）並びにその他の当業界で公知の腫瘍抗原が含まれる。
【００７８】
本発明のアジュバント組成物又はアジュバント化ワクチンは、滅菌した生理学的に適合した担体、たとえば生理食塩水溶液、賦形剤、その他のアジュバント（適用可能であれば）、保存剤、安定化剤を使用して、従来の方法で調合することができる。使用前に滅菌担体で溶解するために、液状形態又は凍結乾燥形態とすることが可能である。
【００７９】
他の態様において、本発明は、抗原とアジュバントの両方を同時に投与部位に送達させるために、アジュバントとして作用する有効量の生体活性のあるＩ型ＩＦＮと会合して、病原体からの抗原若しくはその一部を含むアジュバント化ワクチンを調合する方法を提供する。ＩＦＮの量は、そのアジュバント効果が発揮するために、局所的に十分長い時間作用するのに十分な量としなければならない。
【００８０】
一緒に混合した抗原及びアジュバントを、注射後同じ相対濃度で維持すること、並びに機能活性を発揮する注射部位に集中する抗原提示細胞４に、抗原及びアジュバントを、同時に曝露することは、アジュバント化ワクチンの重要な点である。
【００８１】
Ｉ型ＩＦＮは、体液性免疫のみならず、細胞媒介免疫応答に関しても強力なアジュバントとして作用する能力を有するため、本発明は、予防ワクチンの分野に関する適用に加えて、慢性疾患、たとえば慢性ウイルス感染及び癌などを治療するための治療用ワクチンの開発へも適用することができる。
【００８２】
この場合、このような新規のアジュバント化ワクチン製剤は、患者に投与して癌又は慢性ウイルス性疾患を治療するために、有効量のＩ型ＩＦＮと一緒に、腫瘍関連抗原又はウイルス関連抗原（又はこれらの抗原をコードするＤＮＡ配列）を含有しなければならない。
【００８３】
アジュバント組成物及びワクチン、或いはアジュバント化ワクチンの皮下注射は、使用が簡単なので好ましい。しかし、筋肉内、皮内、及び粘膜（たとえば、鼻腔内及び経口）経路を含めたその他の投与経路を使用することも可能である。いくつかのウイルス感染は、鼻腔内投与が有益な選択を提示することができ、非常に実用的なワクチン送達様式を使用することによって、局所的及び／又は全身的な防御免疫能の誘導がもたらされる。
【００８４】
本発明はまた、強力な粘膜アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮに関する。
【００８５】
粘膜防御免疫は、病原体侵入部位で局所的免疫防御を実現するために非常に重要で、粘膜アジュバントの同定はワクチン研究の重要な課題である。
【００８６】
Ｉ型ＩＦＮを、粘膜ワクチン接種用アジュバントとして使用する場合には、その組成物を、適切な抗原と混合することができ、たとえば口又は鼻の粘膜に滴下することによって投与することができる。粘膜投与は一般的に、第１免疫後に抗体、特にＩｇＧ２ａ又は／及びＩｇＡの産生を増加させる（図１４ａ及びｂ）。ワクチンと共に本発明のアジュバント組成物を粘膜投与すると、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて病原体攻撃に対する完全な局所的（粘膜免疫）及び／又は全身的な防御が誘導される。特に、１９９５年に流行したＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ｚ／北京／２６２／９５（Ａ／Ｈ１Ｎ１））を精製することによって得られた市販のワクチンは、マウスに注射しても免疫原性が乏しいことがわかった。実際に、一定数のマウスでは、ワクチンを３回注射した後でも有意な抗体応答が発揮されなかった。ワクチンをＩ型ＩＦＮと一緒に鼻腔内（ｉ．ｍ．）投与すると、１００％のマウスが１回免疫後に血清変換しており、２回注射した後では抗体力価が著しく増加した。
【００８７】
用量応答曲線によって、ＩＦＮ用量と抗体力価との間には直線関係があることが示された（図１１）。インフルエンザに特異的な抗体イソタイプを分析すると、マウスにおけるＴｈ−１防御免疫応答の一般的マーカーであるＩｇＧ２ａ抗体サブクラスが増加していることが示された（図示せず）。興味深いことに、ワクチン及びＩ型ＩＦＮを含有する製剤５０μｌを鼻腔内投与したマウスでは、全身性及び粘膜性の抗体応答を生じたが、ワクチンのみではまったく効果がなかった（図１２ａ）。特に、アジュバント化ワクチンで免疫されたマウスの抗体応答は、致死的なウイルス攻撃に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの防御が示された（図１２ｂ）。さらに重要なことに、免疫方法にかかわらず、たった１回の免疫処置後に、致死量のウイルスに対するｉｎ  ｖｉｖｏでの防御が認められた。さらに、攻撃を受けた動物の生存率は、ＩｇＧ力価の増加とまったく無関係であることがわかった。実際に、図１５で示したように、ワクチン単独で免疫すると、ＩｇＧ力価の有意な増加が引き起こされるが、生存率の有意な増加はもたらされなかった。
【００８８】
これらの鼻腔内投与に必要なインターフェロンの量は、皮下経路に必要な量と同じである。たとえば、マウスにおけるインフルエンザワクチンの結果から推論されるように、適切な１回のＩ型ＩＦＮ用量は、かなりの程度の特異的免疫応答を惹起するために十分である。しかし、第１のＩＦＮ−アジュバント化ワクチン投与の１日後又は２日後にさらにアジュバントを投与すると、免疫応答の全体的な規模が増大される。
【００８９】
特に、注射する前にＩ型ＩＦＮを関連抗原及びアラムと混合することが有利と思われる（図６）。
【００９０】
実際に、アラムに予備吸着させると、マウスにＩＦＮを１回注射しただけで、可溶性ＩＦＮを３回注射したときと同程度又はそれ以上に、抗原特異的免疫応答が増強された（図６）。アラム予備吸着の増強効果は、ＩｇＧ２ａ産生に関して最も顕著で、Ｔｈ−１型に優位な応答であることを示す。
【００９１】
したがって、Ｉ型ＩＦＮを長期間存在させると確かにそのアジュバント活性が増大する。この点に関して、ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮは、注射後の半減期が長いので利点を有する。さらに、抗原及びアジュバント双方の放出を、制御し且つ持続的に行なうことを特徴とするヒトに適したワクチン組成物も考えられる。このような組成物は、持続的な放出を行なう製剤によって、治療蛋白質の機能活性を改善するために一般的に使用される方法に適用される。これらの方法は、蛋白質を、生体分解可能なポリマー又はリポソームで形成した小球体にカプセル化し、それらをゆっくり放出させる製剤を使用する。
【００９２】
必要であれば、第１のワクチン用量の投与後、使用した抗原の免疫原性及び特定のワクチン接種プログラムによって確立される免疫変数適用範囲に応じて、対象者に追加用量を投与してもよい。
【００９３】
また、ＩＦＮのアジュバント効果は、当該効果があまり顕著でない場合であっても、キットの一部として、抗原とは別に、Ｉ型ＩＦＮを投与することによっても得ることができる。但し、Ｉ型ＩＦＮの投与は、抗原注射部位の非常に近くに、同時に行なう必要がある。ワクチンの皮下注射は、その使用が簡易なので、キットの一部の組成物において行なうことも好ましい。但し、筋肉内、皮内、鼻腔内及び経口の経路を含めたその他の投与経路を使用することもできる。これらの投与方法に必要なインターフェロンの量は、皮下経路に必要な量と同じである。
【００９４】
本発明は、以下の予期しなかった主要な発見に基づいている：
ｉ）充分に確立された抗原を、適切な量のＩ型ＩＦＮと一緒に混合して同時にマウスに注射すると、毒性を誘導することなく、一般的に有用なアジュバント（図７）を使用して認められるものより優れた、一般的Ｔｈ−１型免疫応答に関連した強力な一次抗体応答の誘導が引き起こされること（図５、６、９）；
ｉｉ）内因性Ｉ型ＩＦＮは、関連抗原と同時に注射された場合、たとえばＩＦＡ、ＣＦＡ、ＣｐＧなどのアジュバント（これらのアジュバントはいずれもヒトで使用すると安全面での問題を提起する）によって誘導されるＴｈ−１促進免疫応答の主要な媒介物となること（図１〜４、８）；
ｉｉｉ）市販のインフルエンザワクチンは、マウスにおいて適切な量のＩ型ＩＦＮと一緒に筋肉内又は鼻腔内投与するとき、ウイルス攻撃に対して高い免疫原性及び防御をもたらすこと（図１１、１２）。
【００９５】
これらの発見の重要性及び詳細は、以下に報告した実施例によって明らかになる。
【実施例】
【００９６】
（材料及び方法）
マウス
マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−ＵＫ（Ｍａｒｇａｔｅ、Ｋｅｎｔ、ＵＫ）、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−Ｉｔａｌｙ（Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｒｙ）又はＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  ＨｅａｌｔｈのＳＰＦ部（Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ）から購入した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ（Ｂｌａｃｋｔｈｏｒｎ、ＵＫ）から購入した。１２９ＳｖＥｖ（１２９）マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  ＨｅａｌｔｈのＳＰＦ部（Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ）から購入した。Ｉ型ＩＦＮ受容体機能（Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯ）が欠如した１２９系統マウスは、最初にＢ  ＆  Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｎｏｒｔｈ  Ｈｕｍｂｅｒｓｉｄｅ、ＵＫ）から購入し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  ＨｅａｌｔｈのＳＰＦ部で飼育繁殖された。
【００９７】
インターフェロン
高力価ＩＦＮ−α／β×１０7Ｕ／ｍｇ蛋白質を、Ｔｏｖｅｙ他の変法によってＣ２４３−３細胞系で調製した（Ｔｏｖｅｙ  ＭＧ、Ｂｅｇｏｎ−Ｌｏｕｒｓ  Ｊ及びＧｒｅｓｓｅｒ  Ｉ．「インターフェロンとしての潜在能力がある調製物の大量産生方法（Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｔｅｆｅｒｏｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．）」Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １４６：８０９〜８１５、１９７４）。簡単に説明すると、融合性細胞を、１０％ＦＣＳ及び酪酸ナトリウム１ｍＭで強化したＭＥＭに溶かしたＩＦＮ  １０Ｕ／ｍｌを添加することによって満たした。３７℃で１６時間培養後、Ｃ２４３−３細胞に、ＭＥＭ＋０．５％ＦＣＳ＋セオフィリン５ｍＭに溶かしたニューキャッスル病ウイルスを感染させた（感染多重度１）。感染して１８時間後に、培養上清を収集し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清のｐＨを２．０に調節し、ＩＦＮ力価測定前に０℃で６日間維持した。Ｆａｌｃｏｎマイクロプレート中で単層培養したＬ細胞に対する水疱性口内炎ウイルスの細胞変性効果の阻害によってＩＦＮをアッセイした。これらのＩＦＮ調製物は、ｐＨ２．０で処理している最中に沈殿した汚染蛋白質を遠心によって除去し、ＰＢＳで透析した後、比活性は２×１０6Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。この文書では、単位はマウス国際基準単位で表す。ＩＦＮを濃縮して、硫酸アンモニア沈殿によって部分精製し、ＰＢＳに対して透析した。ＩＦＮ調製物すべてを、ＩＦＮに耐性のＬ１２１０細胞系における残留毒性の可能性を試験する前に、さらにペルクロル酸０．０１Ｍに対して４℃で２４時間、次にＰＢＳに対して透析した。これらの部分精製ＩＦＮ調製物の力価は、リムルスアメーバ細胞アッセイによって評価したところ、少なくとも２×１０ｍ7Ｕ／ｍｇ蛋白質で、内毒素が含まれていなかった。Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ他、「マウスインターフェロンに対するモノクローナル抗体によるマウス腹腔マクロファージの自然発生インターフェロン及び誘導されたインターフェロンの発現に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）」、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６８：２２０３〜２２１２、１９８７で詳細に説明されているように、ＩＦＮに対するｍＡｂを使用した中和アッセイによって評価すると、これらはＩＦＮ−β７５％、ＩＦＮ−α２５％から構成されていることがわかった。力価の高い精製ＩＦＮ−β（２×１０9Ｕ／ｍｇ蛋白質）は、ＩＦＮ−βに対するラットモノクローナル抗体を結合したセファロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィによって調製された（Ｋａｗａｄｅ  Ｙ  及びＷａｔａｎａｂｅ  Ｙ．「マウスインターフェロンα及びβに対するラットモノクローナル抗体の特徴。インターフェロン系の生物学に関する第３国際ＴＮＯ会議議事。（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎ��ｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  α  ａｎｄ  β．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＴＮＯ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．）」Ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９７〜２０２、１９８７）。
【００９８】
抗原及びアジュバント
ニワトリガンマグロブリン（ＣＧＧ）は、Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ、Ｌｕｔｏｎ、ＵＫから、卵アルブミン（ＯＶＡ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。インフルエンザワクチンは、Ａ／北京／２６２／９５（Ｈ１／Ｎ１）インフルエンザワクチンから調製したサブユニットＸ−１２７単価ワクチンで、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から恵与された。
【００９９】
抗原は、ＰＢＳに溶解し、フィルターで濾過した。不完全（ＩＦＡ）及び完全（ＣＦＡ）フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を抗原溶液と１：１  ｖ／ｖの比で混合し、安定したエマルジョンが形成されるまで、２本のガラスシリンジ及びルアーロック連結装置を使用して乳化した。アラム（水酸化アルミニウムゲル、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を１：２０  ｗ／ｖの比で抗原溶液に溶解し、ｐＨを６．５に調節した。室温で１時間インキュベートした後、溶液を遠心して、ペレットを前記量の生理食塩水に再懸濁した。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＣｐＧ）は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｎｏｓｔｉｃ、Ｍｉｌａｎ、イタリアによって合成された。ＯＶＡ２００μｇを含有する溶液の最終量１ｍｌにＣｐＧ２００μｇを溶解した。この研究で使用したＣｐＧはホスホロチオ酸主鎖で形成され、ＴｓＧｓＡｓＣｓＴｓＧｓＴｓＧｓＡｓＡｓＣｓＧｓＴｓＴｓＣｓＧｓＡｓＧｓＡｓＴｓＧｓＡの配列を有していた。ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解した。一部の凍結物を実験それぞれの直前に解凍し、ポリ（Ｉ：Ｃ）０．１５ｍｇを０．１５ｍｌ量の生理食塩水に溶かしてｉ．ｐ．注射した。ＭＦ５９を抗原溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比で混合し、ピペッティングによって乳化した。
【０１００】
ＣＧＧによる免疫方法
免疫はすべて、ＣＧＧ１００μｇを皮下（ｓｃ）注射することによって実施した。ＣＧＧは、単独で投与するか、又はポリＩＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）１００μｇ、ＩＦＮ−αβ１０5Ｕ、又は示したように精製したＩＦＮ−β１０5Ｕと混合して（ＰＢＳに溶かした）溶解型で投与した。Ｔｉｔｅｒｍａｘ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒｔａｉｏｎ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、ＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ）又はＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）と共に注射したとき、ＰＢＳに溶かした当量のＣＧＧを注射前にアジュバントと共に乳化した。実験によっては、Ｉ型ＩＦＮ、Ｔｉｔｅｒｍａｘ又はＩＦＡを数回投与した。すべての場合において、マウスの１次注射部位に皮下（ｓｃ）注射した。記憶応答を調べるときは、予備誘発抗体濃度を確立するためにＣＧＧで誘発する直前にマウスから採血した。同マウスから、ＣＧＧ誘発６日後に採血した。
【０１０１】
ＯＶＡによる免疫方法
ポリ（Ｉ：Ｃ）以外のアジュバントはすべて、常に、ＯＶＡと一緒に、又は一緒にしないで５０μｌ／マウスの量で皮内（ｉ．ｄ．）注射した。ＯＶＡ濃度は常に１０μｇ／マウスであった。２種類の異なる免疫方法を使用した。良好な抗体及び増殖応答を実現するために、０日目にマウスにＯＶＡ＋アジュバントを注射し、１０日後及び１７日後にＯＶＡのみを追加免疫した。対照的に、遅延型アレルギー（ＤＴＨ）アッセイのために選択したマウスには、０日目と１０及び１７日目とでＯＶＡ＋アジュバントを注射した。免疫実験すべてにおいて、対照としてＯＶＡ単独及び生理食塩水で処理された腕を含めた。その後の抗原注射直前に眼窩後静脈叢から血液試料を採取した。血清を収集し、さらにアッセイするまで−２０℃で保存した。
【０１０２】
インフルエンザ（ＦＬＵ）ワクチンによる免疫方法
筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫のためには、マウスにワクチン（１５μｇ）及び生理食塩水、又はワクチン（１５μｇ）及びＩＦＮ（２×１０5Ｕ）、又は生理食塩水のみを含有する溶液を最終量２００μｌで注射した。鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫のためには、軽く麻酔したマウスに同量のワクチン及び生理食塩水、又はワクチン及びＩＦＮ、又は生理食塩水のみを含有する溶液の液滴（５０μｌ）を注入した。同量のワクチン及びＩＦＮを含有する追加免疫用量を第１免疫後１４日目に添加した。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡによる血清抗体のアッセイ
ＣＧＧ（炭酸緩衝液−ｐＨ９．６に溶かして５μｇ／ｍｌとする）を、ＲＴで９６ウェル  フレキシブルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）にコーティングした。このプレートを４％粉末ミルクを含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした後、３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄した。血清をＰＢＳ−１％ミルクで１２倍に連続希釈し、ＲＴで１時間ウェルに添加した。３回洗浄後、ビオチン化ラット抗マウス抗体（抗マウスＩｇＭ（Ｒ６−６０．２）、ＩｇＧ１（Ａ８５−１）、ＩｇＧ２ａ（Ｒ１９−１５）、ＩｇＧ２ｂ（１２−３）、ＩｇＧ３（Ｒ４０−８２）又はＩｇＥ（Ｒ３５−７２）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をウェルにＲＴで１時間添加した。３回洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をＲＴで１時間添加した。ＯＰＤ錠剤（Ｓｉｇｍａ）をペルオキシダーゼの基質として使用した。最高に希釈した最高力価の血清がバックグラウンドを上回る前に３Ｍ  ＨＣｌ  ５０μｌを添加することによって反応を停止した。光学密度を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で４９２ｎｍで読み取った。結果は、エンドポイント力価の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒｓ）として表し、Ｅｘｃｅｌで設計した自動操作を使用して測定した。簡単に説明すると、ＯＤ値陽性の閾値は、３種類の対照マウス血清の全希釈の平均＋３ＳＤとして各抗体イソタイプについて算出した（未操作マウス又はＩＦＮ−α／β又はポリＩＣのみで処理したマウスの血清）。バックグラウンド濃度はすべての希釈において非常に低く（一般的に約０．０８）、実験間の変化は有意ではなかった。所与の血清試料では、エンドポイント力価を陽性閾値を下回る第１希釈と決定した。エンドポイント力価は任意の単位なので、結果は同一アッセイ内で考察しなければならず、直接実験間で比較することはできない。このため、各実験内の試料すべて、同時にアッセイした。
【０１０４】
マウス血清に存在するＣＧＧ特異的抗体のおよその濃度を測定するため、ＥＬＩＳＡをマウスＩｇ標準と比較することによって半定量的方法で実施した。ＣＧＧ特異的抗体は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合したイソタイプ特異的ヤギ抗マウスポリクローナル抗体を使用して抗体を示す以外は、前述の様に検出した（すべて、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡから入手した）。標準を作製するために、プレートを非標識イソタイプ特異的ヤギ抗マウスポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識した。このプレートを前述のようにブロックして、次に公知濃度の精製マウス抗体を添加した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のマウスＩｇ標準パネル）。洗浄後、ＡＰと結合したイソタイプ特異的ヤギ抗マウス抗体を使用して標準を表した。ＡＰ基質としてｐ−ＮＰＰ錠剤（Ｓｉｇｍａ）を使用した。酵素反応はＮａＯＨ  ３Ｍを添加することによって停止した。ＯＤは４０５ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、各イソタイプについて標準曲線を作製し、ＣＧＧ特異的抗体の量を算出した。
【０１０５】
ＯＶＡ特異的抗体濃度を測定するため、標準的直接ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。簡単に説明すると、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＭＢＸ）をＮａＨＣＯ3緩衝液、ｐＨ９．６（コーティング緩衝液）で希釈した卵アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液１μｇ／ｍｌ（総ＩｇＧ検出用）又は４μｇ／ｍｌ（ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１検出用）１００μｌでコーティングした。一晩４℃でインキュベートした後、プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（洗浄溶液）で３回洗浄し、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳで室温で２時間ブロックした。次に、既に（比１：２に）希釈した血清試料１００μｌを各ウェルに添加して、１時間及び３０分間３７℃でインキュベートした。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼ結合第２抗体１００μｌで３７℃で１時間インキュベートした。以下の第２抗体、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：１０００に希釈した抗総マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１：２００に希釈した抗マウスＩＧＧ２ａ（Ｃａｐｐｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）、１：４００に希釈した抗マウスＩｇＧ１（Ｃａｐｐｅｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用した。インキュベーション終了時に、プレートを３回洗浄し、酵素基質溶液（０．００１％Ｈ2Ｏ2を含有するリン酸−クエン酸０．１Ｍ２０ｍｌに溶かしたオルト−フェニレンジアミン４ｍｇ）１００μｌを各ウェルに添加して、暗所で約２０分間放置した。酵素反応は４Ｎ  Ｈ2ＳＯ4  ５０μｌで停止し、プレートをマイクロプレート自動読み取り機で４５０ｎｍで読み取った。結果は、実験条件当たり３種類の血清の最終希釈点の平均として表し、最終点は各アッセイに含めた３種類の陰性対照試料の平均＋２ｓ．ｄ．より高い吸収値を生じる最終血清希釈と決定する。
【０１０６】
ＤＣ調製及び注射
ＤＣは、前述の方法を使用して脾臓から単離した（Ｖｒｅｍｅｃ  Ｄ他、「マウス胸腺及び脾臓から精製した樹状細胞の表面表現型：樹状細胞の亜集団によるＣＤ８発現の研究（Ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：４７−５８、１９９２）。簡単に説明すると、１２９又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスの脾臓を小片に切断し、攪拌しながら、５％ＦＣＳ、コラゲナーゼＩＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｌｏｒｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＵＫ）及びＤＮＡ分解酵素Ｉ（０．６ｍｇ／ｍｌＳｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＲＰＭＩ中で３７℃で５分間、ＲＴで１５分間消化した。ＤＣに富んだ細胞集団をＮｙｃｏｄｅｎｚ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）勾配を使用して得た。次に低密度細胞画分をＰＢＳ−ＥＤＴＡ−ＦＣＳに溶かした抗ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で氷上で２０分間標識した。洗浄後、細胞を濾過して（７０μｍ細胞濾過器、Ｆａｌｃｏｎ）、ＣＤ１１ｃ+細胞をＭｏＦｌｏｗフローサイトメトリ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）で選別したところ、得られた集団はＣＤ１１ｃ+が＞９８％であった。ＰＢＳで２回洗浄した後、精製したＤＣをＰＢＳのみ、又はＣＧＧ１００μｇを含有するＰＢＳで３７℃で３０分間インキュベートした。ＣＧＧを含む、、又は含まない５×１０5の精製ＤＣをＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウス±１０5ＵＩＦＮ−α／βにｓｃ注射した。ＣＧＧ＋ＤＣ＋ＩＦＮ−α／βを与えられたマウスにさらに１０5Ｕ  ＩＦＮ−α／βを１日及び２日後にｓｃ注射した。
【０１０７】
Ｔ細胞増殖及びサイトカインアッセイ
ＣＧＧ特異的増殖アッセイ
ＤｒＬＮを小片に切断して、頻繁に混合しながら、５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で、コラゲナーゼＩＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡ分解酵素Ｉ（０．６ｍｇ／ｍｌ）でＲＴで２０分間消化した。次いで細胞懸濁液を濾過して（７０μｍ）、洗浄して、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。増殖アッセイのために、分離されなかった細胞（ウェル当たり５×１０5）を完全培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２−ＭＥ（Ｓｉｇｍａ）５０μＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、５％ＮＣＴＣ培地、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌ及びジェンタマイシン  ２５０μｇ／ｍｌ（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）を補給したＲＰＭＩ  １６４０）で９６ウェルプレート±ＣＧＧ（２０μｇ／ウェル）のウェル３連で培養した。培養４日目に、ウェルを１μＣｉ［3Ｈ］−チミジンで８時間パルス標識した。次に、プレートを収集して、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴＲＩＬＵＳカウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）を使用して取り込まれた［3Ｈ］−チミジンを測定した。サイトカインアッセイ用に、ＤｒＬＮ細胞を抗ＣｌａｓｓＩＩ（ＴＩＢ１２０）、抗ＣＤ８（３１５５）及び抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）と共に氷上で１５分間インキュベートした。洗浄後、ＣＤ４+細胞をヒツジ抗ラットＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧ磁気ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）を使用してネガティブ選択によって精製した。２×１０4精製ＣＤ４+Ｔ細胞を９６ウェルプレートの３連のウェルに入れた完全培地で未処理同系マウスから得られた５×１０5のＴリンパ球除去脾細胞と共に培養した。Ｔリンパ球除去脾細胞は、脾細胞をラット抗マウスＴｈｙ−１抗体（Ｔ２４）及びモルモット補体（ＶＨ  ＢＩＯ  Ｌｔｄ、Ｇｏｓｆｏｒｄ、ＵＫ）と共に３７℃で４５分間インキュベートすることによって調製した。培養前に、Ｔリンパ球除去脾細胞を±ＣＧＧ（２０μｇ／ウェル）で３７℃で１時間予備インキュベートし、３０００ｒａｄで照射した。培養３日後、上清を収集して、製造元の指示のようにＲ  ＆  ＤのマウスＩＦＮ−γ及びＩＬ−４用のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍキット（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｏｘｏｎ、ＵＫ）を使用してサイトカインを測定した。
【０１０８】
ＯＶＡ特異的増殖アッセイ
抗原誘導性増殖応答を調べるために、第１免疫して３２〜３５日後にマウスを殺処分した。各マウスの脾臓の単一脾細胞懸濁液の細胞は、異なる濃度（０、５０、１００及び２００μｇ／ｍｌ）のＯＶＡを含有する１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ培地０．２ｍｌ／ウェルの入った平底９６ウェルトレイで５×１０5の濃度で培養した。５％ＣＯ2加湿インキュベータ内で３７℃で４日間インキュベートした後、3Ｈチミジン（Ｄｕｐｏｎｔ−ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）０．５μＣｉを添加した。さらに１８時間インキュベートした後、細胞をｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ａ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で収集し、放射活性をシンチレータ（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ、Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で読み取った。結果を３連で試験した３匹のマウスの平均ｃｐｍ±ＳＤ．で表す。
【０１０９】
ＣＧＧ特異的エリスポットアッセイ
マルチスクリーン−ＩＰ滅菌エリスポットプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｌｆｏｒｄ、ＵＫ）を、炭酸緩衝液ｐＨ９．６に溶かしたＣＧＧ２０μｇｌ／ｍｌで一晩コーティングした。ＰＢＳで５回洗浄した後、プレートをＰＢＳに溶かした４％ミルクで３７℃で２時間ブロックし、ＰＢＳで５回洗浄した。細胞懸濁液は前述のようにＤｒＬＮから調製し、洗浄し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して、１５％ＦＣＳを補給した完全培地に再懸濁した。試料すべてを３連で異なるいくつかの細胞濃度（２×１０4〜５×１０5細胞／ウェル）でプレートに入れた。５％ＣＯ2中で３７℃で一晩培養した後、次にプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で十分に洗浄した。ウェルをＡＰと結合したイソタイプ特異的ヤギ抗マウスポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＲＴで２時間インキュベートするとＣＧＧ特異的抗体が明らかになった。洗浄後、（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ０．１Ｍ、ｐＨ９．５、１０％ジエタノールアミン、ＮａＣｌ  ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ）で１ｍｇ／ｍｌに希釈したＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）をＡＰの基質として使用した。水道水でプレートを洗浄することによって反応を停止した。スポットを顕微鏡で計数した。
【０１１０】
（実施例１）
ＣＧＧ＋ポリＩＣで免疫したマウスの抗体応答：Ｉ型ＩＦＮの重要性
まず、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩ型ＩＦＮの産生を誘導するため、ポリイノシン酸：ポリシチジン酸（ポリＩＣ）の合成２本鎖ＲＮＡを使用して、アジュバントとしての作用するＩ型ＩＦＮの能力を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスは、ＰＢＳに溶かしたニワトリガンマグロブリン（ＣＧＧ）を皮下（ｓｃ）注射することによって免疫し、同時に注射したポリＩＣの効果を試験した。（Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスはＰＢＳ中のニワトリガンマグロブリン（ＣＧＧ）１００μｇ、又はＰＢＳ中のポリＩＣ１００μｇと混合した同量のＣＧＧを皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって免疫した）。免疫して１０日後、様々なイソタイプのＣＧＧ特異的抗体について、血清をＥＬＩＳＡでアッセイした。
【０１１１】
関連する結果を図１Ａに示す。ＣＧＧ単独では免疫原性は不十分で、応答は主としてＩｇＧ１サブクラスの抗体に限定された。また、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３抗体は非常に低濃度で検出された。ポリＩＣの同時の注射は、ＣＧＧ特異的抗体力価の明瞭な増加を刺激し、このことはＩｇＧのサブクラスすべてに当てはまった（図１Ａ）。力価の増加はそれぞれ、ＩｇＧ１で３倍、ＩｇＧ２ｂで４．２倍、ＩｇＧ２ａで９倍、ＩｇＧ３で８．４倍であった。
【０１１２】
ポリＩＣはＩ型ＩＦＮを誘導することができる物質として知られているが、他のサイトカインも誘導する。したがって、ポリＩＣのアジュバント活性が実際にＩ型ＩＦＮに依存するかどうかを決定することが重要である。そのために、Ｉ型ＩＦＮに対して機能的な受容体を欠くマウス（Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウス、１２９系であった）と対照（１２９）マウスにおける抗体応答を増強するポリＩＣの能力を比較した（免疫処置は前述のように実施した）。
【０１１３】
Ｂ６マウスのように、ポリＩＣは対照１２９マウスでＣＧＧに対する抗体応答を著しく増強した（図１Ｂ）。対照的に、Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスにおけるポリＩＣの抗体応答を増強する能力は非常に低減した。Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスにおいて、ＩｇＭ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂの力価の増加が少し認められ、ポリＩＣがＩ型ＩＦＮに依存せずにこれらイソタイプの産生を増強できることを示唆した。しかし、これらの抗体の力価は対照マウスよりもＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスではずっと低いままで、ポリＩＣの効果のほとんどはＩ型ＩＦＮに依存した。
【０１１４】
さらに、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３抗ＣＧＧ抗体の産生はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスではポリＩＣによってまったく刺激されなかった。総括すると、これらのデータによって、宿主においてＩ型ＩＦＮの発現が誘導されると、ＩｇＧサブクラスすべての抗体を含む可溶性蛋白質抗原に対する著しく増大された抗体応答を刺激することが示される。
【０１１５】
（実施例２）
ＯＶＡ＋アジュバントで免疫したマウスにおける抗体応答：Ｉ型ＩＦＮの重要性
最初に、マウスを、ＯＶＡ、ＯＶＡ＋ＩＦＡ、ＯＶＡ＋ＣＦＡ、ＯＶＡ＋ＣｐＧ又はＯＶＡ＋アラムをｉ．ｄ．注射することによって処理した。抗原は、５０μｌ中に１０μｇの用量として使用し、ＩＦＡ及びＣＦＡを抗原と１：１ｖ／ｖの比で混合して、安定したエマルジョンが得られるまで乳化した。ＣｐＧは、１０μｇの量で使用し、抗原と混合した。アラムは、ＯＶＡを吸着するために十分な量で使用した。最初の免疫の後、ＯＶＡのみで第２（１０日目）及び第３（１７日目）の処理を実施した。対照マウスは、生理食塩水で処理した。得られた結果は、ＯＶＡのみでは免疫原性は不十分で、惹起された抗体応答は非常に低く、その一方アジュバントを同時に注射すると、ＯＶＡ特異的抗体応答の増大が誘導されることを示した（図２）。この増強は、特にＩＦＡ、ＣＦＡ又はＣｐＧの場合に著しく、アラムではあまり目立たなかった。ＩｇＧサブクラスの特徴付けによって、ＩＦＡ及びＣＦＡはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ両方のサブクラスの効果的なアジュバントとして作用し（それぞれ、一般的にＴｈ−２、Ｔｈ−１型抗体応答に関連する）（図２Ａ）、その一方、ＣｐＧは、ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ−１型）により特異的で、アラムはＩｇＧ１（Ｔｈ−２型）により特異的であること（図２Ｂ）が示された。アジュバント活性がＩ型ＩＦＮによって媒介されるかどうかを決定するために、Ｉ型ＩＦＮに対して機能的な受容体を欠如したマウス（Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウス  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）において、抗体応答を増強するこれらすべてのアジュバントの能力を比較した。得られた結果は、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１サブクラスが対照マウスに対してＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスでわずかに増強することを示した（図２Ａ及び２Ｂ）。これによって、一般的なＴｈ−１促進アジュバントによって惹起される抗体応答の増強においてＩ型ＩＦＮの果たす機能的役割が確かめられた。
【０１１６】
（実施例３）
ＣＧＧ＋ポリＩＣで免疫したマウスから得たＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖及びＩＦＮガンマ産生：Ｉ型ＩＦＮの重要性
Ｔ細胞初回抗原刺激に対するＩ型ＩＦＮの効果も又評価した。この評価は、最初に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＧＧによる再刺激に対するＬＮ  Ｔ細胞の増殖能力を測定することによって実施した。排除領域ＬＮ（Ｄｒａｉｎｉｎｇ  ＬＮｓ：ＤｒＬＮ）を（実施例１で示したように）免疫後１０日目に除去して、得られた細胞懸濁液をＣＧＧの存在下又は非存在下で培養した。対照（１２９）マウスを、ポリＩＣをＣＧＧと同時に注射すると、ＣＧＧのみで免疫したよりも高いＣＧＧ特異的増殖応答がｉｎ  ｖｉｔｒｏで引き起こされ（図３Ａ）、ＢｒｄＵでパルス標識するとｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞のほとんどはＣＤ４+であることが示された（データは示さず）。Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスのポリＩＣ処理でも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖応答が、いくらか増加したことから（図３Ａ）、Ｔ細胞初発抗原刺激の増強は、部分的にＩ型ＩＦＮに左右された。しかし、ＣＧＧ＋ポリＩＣを注射したＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスの細胞増殖は、ＣＧＧ＋ポリＩＣを注射した対照マウスよりもかなり低く、実際、Ｉ型ＩＦＮがｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞応答を強く増強することが示唆された。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激ＣＤ４+Ｔ細胞によるサイトカイン産生を検討した際にも（図３Ｂ）証明された。
【０１１７】
したがって、ＣＧＧ単独で免疫したマウスのＣＤ４+細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＧＧによって刺激したとき、ＩＦＮ−γがあったとしてもほとんど分泌されないが、一方ポリＩＣ＋ＣＧＧを注射したマウスのＣＤ+４細胞からは著しく高い量のＩＦＮ−γが産生された。重要なことは、ポリＩＣによって、Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスよりも対照マウスにおいてＩＦＮγを分泌するＣＤ４+Ｔ細胞の初発抗原刺激が相当強く増強された点である。対照的に、すべての群においてＣＤ４+細胞から分泌されるＩＬ−４の量は少なく、互いに有意な差は無かった。結果として、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩ型ＩＦＮの誘導は、Ｔ細胞初回抗原刺激を増強し、ＩＦＮγを分泌するＣＤ４+Ｔ細胞の生成を促進する。
【０１１８】
（実施例４）
ＯＶＡ＋アジュバントで免疫したマウスのＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖及びＤＴＨ応答における内因性Ｉ型ＩＦＮの役割
実施例２で説明した免疫の終了時に、ＯＶＡに対する増殖アッセイのためにマウスを殺処分して脾臓を摘出した。図４では、ＯＶＡ１００μｇを含有する培地で培養した脾細胞の3Ｈチミジン取り込み結果を示す。この実験において、ＯＶＡ、ＯＶＡ＋ＣＦＡ（図４Ａ）又はＯＶＡ、ＯＶＡ＋ＣｐＧ、又はＯＶＡ＋アラム（図４Ｂ）で免疫したＩ型ＩＦＮ  Ｒ+/+マウスから得られた脾細胞はすべて、生理食塩水処理対照に対して有意な増殖を示し（ＯＶＡ＋アラムは除く）、一方Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウス処理群のいずれにおいても増殖は検出されなかった。
並行して行なった実験において、ＤＴＨ応答を測定するためにアジュバントを２回目及び３回目の免疫処置でも投与し、その後足蹠にＯＶＡで誘発する若干異なった方法で数匹の正常マウス及びＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスを免疫した（図４Ｃ及び４Ｄ）。対照と比較してＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスで不完全なＤＴＨ応答が認められたことは、  のアジュバント誘導ＤＴＨ応答は内因性Ｉ型ＩＦＮによって媒介されることを示す。この点に関し、ＤＨＴを誘導することができる総てのアジュバントが、マウスに注射した後Ｉ型ＩＦＮ産生をも刺激することは特筆すべきことである（図示せず）。
【０１１９】
（実施例５）
Ｉ型ＩＦＮ処理による一次抗体応答刺激
外因性Ｉ型ＩＦＮの抗体応答に対する効果を、最初に、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βを含有する部分精製高力価マウスＩ型ＩＦＮ調製物を使用して研究した。Ｂ６マウスにＣＧＧのみを１００μｇ又は同用量のＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／β  １０5Ｕ（ＩＦＮ１Ｘ）を、皮下（ｓｃ）注射した。さらに、ＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βを注射した異なる群のマウスに、１日後に、ＩＦＮ−α／βのみ（１０5Ｕ）の２回目の皮下注射（ＩＦＮ２Ｘ）をするか、又は１日後と日後に、ＩＦＮ−α／β（１０5Ｕ）を皮下（ｓｃ）注射した（ＩＦＮ３Ｘ）。図５Ａに示したように、マウスをＩＦＮ−α／βで処理するとＣＧＧ特異的抗体応答が著しく増強された。この効果は、Ｉ型ＩＦＮを３回注射したマウスで最も顕著であり、明らかにＩｇＧのすべてのサブクラスで認められた。ＣＧＧ特異的ＩｇＥは、どのマウス群でも検出されなかった（データは示さず）。同様に、ＩＦＮ−α／βの処理は、ＬＰＳ−非反応性ＣＨ３／ＨｅＪマウスでの抗体応答を増強し、内毒素の混入の可能性は考えられなかった（データは示さず）。
【０１２０】
アフィニティ精製ＩＦＮ−βを使用して同様の実験を実施した（図５Ｂ）。この実験において、部分精製ＩＦＮ−α／βに限っては、３回ＩＦＮ−βを注射した後に最も高い抗体力価が達成されるものの、ＩＦＮ−βの１回の注射は、１次抗体応答を十分に増強した。ＩＦＮ−βを１、２又は３回注射すると、抗体力価はそれぞれＩｇＭで５倍、６倍及び８倍に、ＩｇＧ１で６．４、８．５及び１２．８倍に、ＩｇＧ２ｂで１３．３、１６及び２６．６倍に、ＩｇＧ２ａで２５．６、３２及び１５３．６倍に、ＩｇＧ３で１６．６、６４及び１１７．３倍に増加した。部分精製したＩＦＮ−α／βを使用した実験と考え合わせると、これらの結果は、免疫応答初期にＩ型ＩＦＮを投与すると可溶性蛋白質抗原に対する１次抗体応答が著しく増加することを明確に示す。
【０１２１】
（実施例６）
アラムに予備吸着したＣＧＧ＋Ｉ型ＩＦＮで免疫したマウスにおける抗体応答
Ｉ型ＩＦＮの半減期の延長がアジュバントとして作用する能力を強化するかどうかを決定するために、Ｉ型ＩＦＮ−α／βＵ）をｓｃ注射前にＣＧＧ（１００μｇ）及び飽和量のアラムと混合した。このような方策が、ＩＬ−１２のアジュバント活性を非常に増強することを示した（２４）。特に目を引くのは、アラムに予備吸着すると、Ｉ型ＩＦＮを１回注射しただけで可溶性Ｉ型ＩＦＮを３回注射したときと同程度、又はそれ以上にＣＧＧ特異的抗体応答が増強したことである（図６）。
【０１２２】
アラム予備吸着の増強効果は、ＩｇＧ２ａ産生に関して最も顕著であった。このような結果は、Ｉ型ＩＦＮが長期間存在すると実際にそのアジュバント活性が増加し、アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮの使用が、実用面で重大な意味を持つことを示唆する。
【０１２３】
（実施例７）
Ｉ型ＩＦＮとその他のアジュバントとの比較
アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮの効果をさらに評価するために、市販のアジュバントと１次抗体応答を増強する能力について比較した。最初に、油をベースとした２種類のアジュバント、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）及びＴｉｔｅｒｍａｘと比較した。
【０１２４】
ＣＧＧ１００μｇを含有する抗原溶液とアジュバントとを１：１ｖ／ｖ比で混合し、安定なエマルジョンが形成されるまで乳化した。次に、マウスを免疫して、抗ＣＧＧ抗体について血清を分析した。ＩＦＡ及びＴｉｔｅｒｍａｘは高レベルでＩｇＧ１抗体を刺激したが、Ｉ型ＩＮＦはＩｇＭ及びＩｇＧ２ｂ抗体を誘導する能力はこれらのアジュバントと同等で、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３抗体産生の増加については遙かに優れていた（図７）。
【０１２５】
アジュバント活性のより厳密な試験として、Ｉ型ＩＦＮを完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）と比較した。ＣＦＡは長い間マウスにおいてアジュバント活性用の「最も基準になる試験」と考えられており、全イソタイプの抗体産生を増強することが知られている。そこで、免疫１０日後に対照（ＷＴ１２９）とＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウスにＣＧＧのみ、ＣＧＧ＋ＣＦＡ又はＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βを注射して、ＣＧＧ特異的抗体力価を比較した（図８）。
【０１２６】
対照マウスでは、抗体力価はＣＧＧのみで免疫したマウスよりもＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／β又はＣＧＧ＋ＣＦＡを注射したマウスの方が高かった。驚くべきことに、ＩＦＮ−α／βのアジュバント活性は、ＣＦＡに比べてまさるとも劣らなかった。実際、ＣＦＡは（１２９系のみで）高力価のＩｇＭ抗体を誘導したが、ＩＦＮ−α／βは同力価のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ抗体の産生を刺激した。さらに、ＩＦＮ−α／βは、ＣＦＡよりも高レベルでＩｇＧ２ａを誘導するとともに、少なくとも１２９ｓｖ系では、ＩｇＧ３抗体を誘導した。したがって、これらの結果によって、ＩＦＮ−α／β投与は実際に強力なアジュバント活性を有することが示された。
【０１２７】
比較する応答が、迅速に取り除かれる傾向がある、可溶性蛋白質＋可溶性ＩＦＮ−α／βに対する応答と、注射部位に長期間保持され得るＣＦＡの油性エマルジョンとの比較であることを考慮すると、この効果は特に著しい。
【０１２８】
（実施例８）
ＣＦＡのアジュバント活性及び蛋白質のみに対する応答の刺激における内因性Ｉ型ＩＦＮの役割
ＣＦＡとＩＦＡ又はＴｉｔｅｒｍａｘの間のアジュバント活性の著しい違いは、前者のみが著しい力価のＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ３抗体を誘導できることである。これはＩ型ＩＦＮが有する特性なので、ＣＦＡのこのような能力がこのアジュバントによる内因性Ｉ型ＩＦＮの誘導に関連するかどうかという疑問が生じた。ＣＦＡの重要な構成要素が熱殺菌マイコバクテリアであるならば、ＣｐＧ  ＤＮＡなどの細菌成分がＩ型ＩＦＮの産生を刺激することは知られているので、Ｉ型ＩＦＮがＣＦＡによって誘導されるように思われる。
【０１２９】
この仮説を調べるために、Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスと対照マウスでＩＦＮ−α／β及びＣＦＡについて、ＣＧＧに対する抗体応答を増強する能力を比較した（図８）。予想通り、ＩＦＮ−α／βはＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスにおいてＣＧＧに対する応答をまったく増強できなかった。また、ＣＦＡが抗体応答を増強する能力が、Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスでは非常に欠如していたことは重要である。ＣＦＡは依然として、Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスにおいて高力価のＩｇＧ１抗体力価を誘導するが、ＣＧＧのみによる免疫と比較すると、もはやＩｇＭ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ３抗体を増強しなかった。これらの結果は、ＣＦＡのアジュバント活性におけるＩ型ＩＦＮの重要な役割を示す。
【０１３０】
（実施例９）
Ｉ型ＩＦＮによる長期抗体産生及び記憶の誘導
Ｉ型ＩＦＮが１次抗体応答を増強することが示されたので、この応答が長く維持されるかどうかを決定することに興味を持った。最初に、ＣＧＧを１回注射するか、又は実施例５で説明したようにＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βを３回注射して、６カ月後、マウスの血清をアッセイすることによって長期抗体産生を調べた（図９Ａ）。ＣＧＧのみで初回抗原刺激を受けたマウスは、６カ月後のＣＧＧ特異的抗体の濃度が極めて低かった。
【０１３１】
対照的に、ＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βで初回抗原刺激を受けたマウスは、血清中のＣＧＧ特異的抗体の力価が依然として顕著であった。力価が非常に低く、ＣＧＧのみで初回抗原刺激を受けたマウスと有意な差がなかったＩｇＧ３以外は、試験したすべてのイソタイプの抗体が存在していた。かくして、初回抗原刺激中にＩ型ＩＦＮを注射すると、長期間の抗体産生が可能となった。
【０１３２】
長期間の抗体産生が、長命血漿細胞によって、又は記憶Ｂ細胞の抗体産生細胞の補給によって維持されるかどうかは相変わらず議論の的となっている。したがって、記憶も、Ｉ型ＩＦＮの存在下における免疫によって誘導されるかどうかを調べることに興味を抱いた。それを実施するために、ＣＧＧに対する第２応答を開始する６カ月前に初回抗原刺激したマウスの能力について調べた。即ち、ＣＧＧのみ、又はＣＧＧ＋Ｉ型ＩＦＮ−α／β３回注射を６カ月以前に注射したマウスに再度ＣＧＧ（１００μｇ）のみを注射した。ＣＧＧに対する１次応答の関与を最小限に抑えるために、第２応答を抗原投与６日後に調べて、天然の初回抗原刺激をしていないマウスを対照として使用した。ＣＧＧ特異的抗体力価をＣＧＧ再注射の前後に同じマウスで比較した（図９Ｂ）。
【０１３３】
ＣＧＧのみで６カ月前に初回抗原刺激したマウスでは、ＣＧＧ抗原投与に対する応答は投薬を受けていないマウスと区別がつかなかったので、ＣＧＧのみで初回抗原刺激して６カ月後ではＣＧＧに対する記憶がないことが示された。しかし、極めて対照的に、ＣＧＧ＋Ｉ型ＩＦＮ−α／βで６カ月前に初回抗原刺激したマウスでは、ＣＧＧに対する迅速な第２応答を示した。しかし、これらのマウスではＩｇＧ１抗体の高い力価が維持されている事実にもかかわらず、第２応答はＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ抗体イソタイプに限定されたようであった。これらの結果は明らかに、Ｉ型ＩＦＮは可溶性蛋白質抗原を１回投与した後長命記憶の発生を促進することを示す。
【０１３４】
（実施例１０）
Ｉ型ＩＦＮによる樹状細胞の刺激によって生じる、抗体応答の増強及びイソタイプスイッチング
Ｉ型ＩＦＮは明らかに抗体応答の規模及び様々なＩｇＧサブタイプへの交換の両方を著しく増強することができるが、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの作用機構はわかっていなかった。ＤＣがＩ型ＩＦＮ−α／βに応じることができる有一の細胞である養子免疫細胞移入モデルを設計した。これらの実験では、野生型１２９マウス又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスの高度に精製した脾臓ＤＣ５〜７×１０5を、ＣＧＧ１００μｇと短時間インキュベートし、Ｉ型ＩＦＮ−α／β（１０5Ｕ）と一緒に、又は一緒にしないでＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯ受容体に皮下（ｓｃ）注射した。ＣＧＧ＋ＤＣ＋Ｉ型ＩＦＮ−α／βを投与されたマウスに、さらに２回前述のようにＩ型ＩＦＮ−α／βを注射した。次に、ＣＧＧ特異的抗体力価を、免疫後１０日目に測定した（図１０）。
【０１３５】
予測通りに、ＣＧＧ＋Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  ＤＣを投与されたマウスをＩ型ＩＦＮ−α／β処理すると、これらのマウスの細胞はＩ型ＩＦＮに対して応答することができないので、抗体応答は増強されなかった。反対に、ＣＧＧ＋野生型ＤＣを投与されたマウスにＩ型ＩＦＮ−α／βを注射すると、ＣＧＧ＋野生型ＤＣのみの注射に比べて４種類のＩｇＧサブクラスすべての抗体力価の増強が誘導された。したがって、Ｉ型ＩＦＮによるＤＣの刺激は一緒に注射した蛋白質に対する抗体応答を増強するだけでなく、イソタイプスイッチングを誘導するために十分である。
【０１３６】
（実施例１１）
ＩＦＮ型アジュバント化インフルエンザワクチンで免疫したマウスの抗体応答
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに、精製したサブユニットインフルエンザワクチンのみ、又はＩ型ＩＦＮ２×１０5Ｕと共に筋肉内（ｉ．ｍ．）又はｉ．ｎ．注射した。免疫して７日後又は１４日後に、血清を、インフルエンザ特異的抗体についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｉ型ＩＦＮを一緒に注射することによって、インフルエンザ特異的抗体応答に対する用量依存性の強いアジュバント効果が引き起こされた（図１１Ａ）。図１１Ｂは抗原注射して２日間持続してＩ型ＩＦＮを投与すると、インフルエンザ特異的抗体応答がさらに増強されることを示す。
【０１３７】
特に、ワクチンのみでは、繰り返し免疫した後でも限られた数のマウス（約３０％）しか抗体応答を誘導しないが、ＩＦＮアジュバント化ワクチンでは、処理マウスすべてにおいて同質の応答を誘導した。図１１Ｃは、アジュバントとしてＩ型ＩＦＮを、ワクチンの前後又は同時といった、異なる時点で投与して使用したときの効果の違いを示す。ＩＦＮをワクチンと一緒に注射したとき、最適なアジュバント効果が認められた。図１２ａは、Ｉ型ＩＦＮアジュバント化ワクチンによる鼻腔内免疫によって、インフルエンザワクチンに高い免疫原性がもたらされることを示している。興味深いのは、インフルエンザに特異的な抗体イソタイプの分析によって、一般的にはＴｈ−１型免疫応答に関連したＩｇＧ２ａ抗体サブクラスを誘導することが示された。特に、ＩＦＮアジュバント化ワクチンによって、ワクチンのみよりもウイルス攻撃に対してより強い防御効果がもたらされた（図１２Ｂ）。
【０１３８】
（実施例１２）
Ｉ型ＩＦＮはインフルエンザワクチンの格別に強力な粘膜アジュバントである
最初の一連の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、インフルエンザワクチンのみ、又はＩ型ＩＦＮと混合したワクチンを１４日の間隔をおいて２回鼻腔内投与することにより免疫した。抗体濃度を各免疫の２週間後に測定した（図１４ａ）。抗体産生（特にＩｇＧ２ａ）の一般的な増加は、最初の免疫の後ＩＦＮ処理した動物で検出可能であった。２度目の免疫の２週間後、ワクチンのみを注射した動物と比較してＩＦＮ処理マウスにおいて抗体力価がさらに増加していた。特に、この時点では、ワクチンのみを注射したマウスと比較して、ＩＦＮと混合したワクチンで免疫した動物でＩｇＧ２ａ及びＩｇＡ力価の驚異的な増加が認められた（それぞれ、１０００倍及び１００倍）。また、アジュバントとしてＩＦＮで免疫したマウスでは、対照動物よりも高レベルの分泌性肺ＩｇＡを示した。興味深いのは、生存値及び感染後のマウスの体重減少がないことの両方から明らかなように、ＩＦＮアジュバント化ワクチンを鼻腔内に投与されたマウスすべてがインフルエンザウイルスの感染から防御されていた。その一方、ワクチンのみで免疫された動物では部分的な防御効果のみが見られた（図１４ｂ）。ＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯ及び対照Ｃ３Ｈ／Ｈ３Ｎマウスにおける同様の免疫実験では、Ｉ型ＩＦＮは、対照動物におけるＩｇＧ２ａ及びＩｇＡの誘導について両時点でＭＦ５９より優れていることがわかり、一方、ＭＦ５９は２回免疫を行った後でより効果的にＩｇＧ１抗体を誘導した（図１４ｃ、下）。予測通りに、アジュバントとしてＩＦＮで鼻腔内免疫したＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯ動物では、Ｉｇサブクラスのすべてについて有意な抗体応答は認められなかった。対照的に、ＭＦ５９はまだＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウスにおいてＩｇＧ１を誘導することができたが、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＡの誘導は、対照動物で検出される応答と比較して大部分が排除された（図１４ｃ）。
【０１３９】
（実施例１３）
ウイルス感染後のマウス生存率及びＩｇＧ力価の増加は厳密には関係がない
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに前述のようにＦＬＵワクチンを１回筋肉内（ｉ．ｍ．）（全身）又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）（粘膜）免疫でワクチン接種し、ＩｇＧ力価を１４日後に測定した。
【０１４０】
図１５で明らかなように、アジュバント化ワクチンを１回投与することで攻撃を受けた動物の完全な防御を引き起こすのに十分であることがわかった。
【０１４１】
さらに、ウイルス攻撃後のマウスの生存率はＩｇＧ２の増加と厳密には関係ない。実際に、アジュバント無しのワクチンで得られる著しいＩｇＧ力価の増加は、生存率の有意な増加をもたらさず、ウイルス攻撃後約１０％のマウスが生存した。
【０１４２】
他方、ワクチンと組み合わせたＩ型ＩＦＮアジュバントは、ワクチン単独と比較すると、引き起こされたＩｇＧ力価の増加は中等度であるにも拘らず、１回免疫処理した後であってもウイルス感染後のマウスの生存率が、著しく増加（約１００％）するという効果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】ｉｎ  ｖｉｖｏでトリのガンマグロブリン（ＣＧＧ）に対する第１抗体応答に対するポリ（ＩＣ）の効果を示した図である。  図Ａは、図面のｘ軸で示したように、ＣＧＧ単独又はＣＧＧ＋ポリＩＣを注射したＢ６マウスの血清において検出されるＣＧＧ特異的抗体の終点力価を示した図である。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。  抗体応答は、終点力価の平均±ＳＤとして表す。  図Ｂは、図面のｘ軸で示したように、ＣＧＧ単独又はＣＧＧ＋ポリＩＣを注射した１２９ｓｖ種（白棒）の野生型マウス又はＩ型ＩＦＮ受容体ＫＯ（Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯ）１２９ｓｖマウス（黒棒）で得られた抗体応答を示した図である。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。  抗体応答は、終点力価の平均±ＳＤとして表す。
【図２】図２Ａ及びＢは、卵アルブミン（ＯＶＡ）＋アジュバントで免疫したマウスの抗体応答を示した図である。  図Ａは、図面のｘ軸で示したように、生理食塩水、ＯＶＡ、ＯＶＡ＋ＩＦＡ及びＯＶＡ＋ＣＦＡで処理した野生型（白棒）又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（灰色棒）マウスで検出される特異的抗体濃度を示した図である。  免疫後２４日目のマウスの血清に存在する終点抗体力価をＯＶＡ特異的総Ｉｇ又はＩｇサブクラスＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ１について標準的ＥＬＩＳＡで測定し、図面Ｉ、図面ＩＩ及び図面ＩＩＩそれぞれに報告する。値は、２連で試験した３種類の個々の血清の終点希釈力価の平均として表す。  図Ｂは、図面のｘ軸で示したように、生理食塩水、卵アルブミン（ＯＶＡ）、ＯＶＡ＋ＣｐＧ及びＯＶＡ＋アラムで処理した野生型（白棒）又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（灰色棒）マウスにおける特異的抗体濃度を示した図である。  免疫して２５日目のマウス血清で示される終点抗体力価を標準的ＥＬＩＳＡアッセイで測定して、ＯＶＡ特異的総Ｉｇは図面Ｉに、ＩｇサブクラスＩｇＧ２ａは図面ＩＩに、及びＩｇＧ１は図面ＩＩＩに示した。値は、２連で試験した３種類の個々の血清の終点希釈力価の平均で表す。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＧＧに対するＴ細胞応答のポリＩＣ増強におけるＩ型ＩＦＮの役割を示した図である。  図Ａは、図面のｘ軸に沿って示したように、ポリＩＣ、ＣＧＧ又はＣＧＧ＋ポリＩＣの注射によって初回抗原刺激を受けた１２９又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスのＴ細胞のＣＧＧに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖性応答を示した図である。  白棒及び幅の狭い縞模様の棒は、ＣＧＧの存在下で（白）又は非存在下で（幅の狭い縞模様）培養した１２９マウスの流入領域リンパ節（ＤｒＬＮ）の細胞懸濁物による増殖を示す。  黒及び幅の広い縞模様の棒は、ＣＧＧの存在下で（黒）又は非存在下で（幅の広い縞模様）培養したＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスのＤｒＬＮの細胞懸濁物による増殖を示す。  図Ｂは、図面のｘ軸に沿って示したように、ポリＩＣ、ＣＧＧ又はＣＧＧ＋ポリＩＣの注射によって初回抗原刺激を受けた１２９又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスのＣＤ４+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示した図である。  白棒及び幅の狭い縞模様の棒は、ＣＧＧの存在下で（白）又は非存在下で（幅の狭い縞模様）培養した非免疫同質遺伝子的マウスのＴリンパ球除去脾臓細胞と一緒に培養した免疫１２９マウスのＤｒＬＮから精製したＣＤ４+Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ−γを示す。  白い棒及び幅の広い縞模様は、ＣＧＧの存在下で（黒）又は非存在下で（幅の広い縞模様）培養した非免疫同質遺伝子的マウスのＴリンパ球除去脾臓細胞と一緒に培養した免疫Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスのＤｒＬＮから精製したＣＤ４+Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ−γを示す。
【図４】ＯＶＡ＋アジュバントで免疫したマウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖及びＤＴＨ応答について、初回抗原刺激を受けたＴ細胞における内在性Ｉ型ＩＦＮの役割を示した図である。  図Ａは、図面のｘ軸に沿って示したように、生理食塩水、卵アルブミン及びＣＦＡで処理した正常マウス（白棒）又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（灰色棒）のＴ細胞による特異的3Ｈチミジン摂取を示した図である。  図Ｂは、図面のｘ軸に沿って示したように、生理食塩水、卵アルブミン及び卵アルブミンとＣｐＧ又はアラムで処理した正常マウス（白棒）又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（灰色棒）のＴ細胞による特異的3Ｈチミジン摂取を示した図である。  図Ｃは、図面のｘ軸に沿って示したように、生理食塩水、卵アルブミン及び卵アルブミンとＩＦＡ又はＣＦＡで処理した野生型マウス（白棒）Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（灰色棒）における特異的ＤＴＨ応答を示した図である。  図Ｄは、図面のｘ軸に沿って示したように、生理食塩水、卵アルブミン及び卵アルブミンとＣｐＧ又はアラムで処理した野生型マウス（白棒）Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（灰色棒）における特異的ＤＴＨ応答を示した図である。
【図５】ＩＦＮ−Ｉ注射によるＣＧＧに対する一次抗体応答の増強を示した図である。  マウスすべてに１回ＣＧＧを注射して投与した。可溶性ＩＦＮ−α／β又はＩＦＮ−βも又投与したマウスに、免疫時のみ（１Ｘ）、又はさらに１日後（２Ｘ）又は１日後及び２日後（３Ｘ）にそれぞれＩＦＮを注射した。  図Ａは、図面のｘ軸に沿って示したように、ＣＧＧ単独で免疫するか、又はＣＧＧで免疫してＩＦＮ−α／βで処理したＢ６マウスにおける抗体応答を示した図である。  それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。抗体応答は、終点力価の平均±ＳＤとして表す。  図Ｂは、ＣＧＧ単独で免疫するか、又はＣＧＧで免疫してＩＦＮ−βで処理したＢ６マウスにおける抗体応答を示した図である。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。抗体応答は、終点力価の平均±ＳＤとして表す。
【図６】ＩＦＮ−α／β＋アラムによる一次抗体応答の増強を示した図である。  データ（黒棒）は、図面のｘ軸に沿って示したように、ＣＧＧ単独又は可溶性ＩＦＮ−α／β、アラム、又はＩＦＮ−α／β＋アラムの組合せを１回皮下注射することによってＢ６マウスを免疫した後１０日目にＥＬＩＳＡによって検出されたＣＧＧ特異的抗体を示す。３ｘの印は、免疫後１日目及び２日目に可溶性ＩＦＮ−α／βをさらに注射したことを示す。  それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。  データは、終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として表す。
【図７】Ｉ型ＩＦＮ及び油をベースとしたアジュバントによって増強された抗体応答を比較した図である。  データ（黒棒）は、図面のｘ軸に沿って示したように、ＣＧＧ、ＣＧＣ＋ＩＦＮ−α／β（０日目にＣＧＧと一緒にＩＦＮ−α／βを投与し、その後１日目及び２日目は単独で投与する）、ＩＦＡ中で乳化したＣＧＧ（０日目にＣＧＧと一緒にＩＦＡを投与し、その後１日目及び２日目は単独で投与する）、又はＴｉｔｅｒＭａｘで乳化したＣＧＧ（０日目にＣＧＧと一緒にＴｉｔｅｒＭａｘを投与し、その後１日目及び２日目は単独で投与する）を皮下注射することによってＢ６マウスを免疫した後１０日目にＥＬＩＳＡによって検出されたＣＧＧ特異的抗体を示す。  結果は、終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として表す。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。
【図８】可溶性ＩＦＮ−α／βはＣＦＡと同程度まで抗体応答を増強し、そのアジュバント活性は内在性Ｉ型ＩＦＮに左右されることを示した図である。  図面のｘ軸に沿って示したように、ＣＧＧ単独、ＣＧＣ＋ＩＦＮ−α／β（免疫後１日目及び２日目に２回ＩＦＮ−α／βを注射する）又はＣＧＧ＋ＣＦＡを皮下注射することによって免疫した後のＷＴ１２９（白棒）又はＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯ（黒棒）の抗体応答を比較した。ＣＧＧ特異的抗体は、免疫後１０日目にＥＬＩＳＡによって検出された。結果は、終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として表す。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。
【図９】Ｉ型ＩＦＮによる長期間の抗体産生及び免疫学的記憶の刺激を示した図である。  図Ａは、ＣＧＧ単独又はＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βを注射することによって６カ月早く免疫したＢ６マウスの終点抗体力価を示した図である。  データ（黒棒）は、ＣＧＧ単独又はＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βを皮下注射することによってＢ６マウスを免疫して６カ月後、ＥＬＩＳＡによって検出されたＣＧＧ特異的抗体を示した図である（免疫後１日目及び２日目に２回ＩＦＮ−α／βを２回注射した）。  結果は、終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として表す。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。  図Ｂは、投薬を受けていないマウス（Ｎｏ）及び図Ａと同様に６カ月前にＣＧＧ単独、又はＣＧＧ＋ＩＦＮ−α／βで免疫したマウスをＣＧＧ単独で誘発して６日後の特異的抗体応答を示した図である。  結果は誘発前（白棒）及び誘発６日後（黒棒）の抗体終点力価を終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として示す。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。
【図１０】Ｉ型ＩＦＮに対するＣＤの応答性は、抗体産生増強及びＩ型ＩＦＮによるアイソタイプ交換のために十分であることを示した図である。  データは、免疫後１０日目に標準的ＥＬＩＳＡによって検出したＣＧＧ特異的抗体を示す。脾臓ＤＣは、（図面のｘ軸に沿って示したように）１２９マウス（ｗｔ）又はＩ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスから精製し、ＣＧＧと短時間インキュベートし、ＩＦＮ−α／βと一緒に（黒棒）又は一緒にしないで（白棒）Ｉ型ＩＦＮＲ  ＫＯマウスに注射した（後者の場合、ＩＦＮ−α／βをさらに２回免疫後１日目及び２日目に注射投与した）。  結果は、終点力価の平均±ＳＤ（群当たりマウス３匹）として表す。それぞれの単一の図面には、終点力価を測定した抗体のサブクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３）を示してある。
【図１１】インフルエンザワクチンで免疫したマウスの抗体応答に対するＩ型ＩＦＮのアジュバント活性を示した図である。  標準的な免疫計画は以下の通りであった。７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに精製したｆｌｕワクチン１５μｇ及びマウスＩ型ＩＦＮ２×１０5Ｕ、対照としてワクチン単独又は生理食塩水を含有する調製物０．２ｍｌ、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。１４日後、マウスから採血し、血清のｆｌｕ特異的抗体濃度を標準的ＥＬＩＳＡによって試験した。値は、５種類のそれぞれの血清の平均±ＳＤで表す。  図Ａは、マウスをｌｏｇ10希釈したＩ型ＩＦＮ（２×１０5、２×１０4又は２×１０3単位）と混合したワクチン又はワクチン単独又は陰性対照として生理食塩水を含有する異なる調製物で筋肉内（ｉ．ｍ．）処理した用量／応答実験を示した図である。抗体力価は、免疫して７日後に測定した。  図Ｂはワクチン及び１回又は繰り返し投与したＩ型ＩＦＮで処理したマウスにおける抗体応答に対するアジュバントの影響を示した図である。マウスに、ＩＦＮと混合したｆｌｕワクチン、又はＩＦＮと混合したｆｌｕワクチンで筋肉内（ｉ．ｍ．）処理し、その後最初の接種後２日目に同部位にさらにＩＦＮを注射した。Ｆｌｕワクチン単独又は生理食塩水を対照として使用した。  図Ｃは、ｆｌｕワクチン投与と同時に、又は投与前後の異なる時点で投与したＩ型ＩＦＮのアジュバント効果を示した図である。マウスに、ＩＦＮをワクチン投与２日前、１日前、１日後、又は２日後に、又はワクチンと同時に同部位に筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。Ｆｌｕワクチン単独又は生理食塩水を対照として使用した。
【図１２】図ＡはＩ型ＩＦＮ及びインフルエンザワクチンを鼻腔内投与したマウスの抗体応答を示した図である。  ７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを麻酔し、Ｉ型ＩＦＮ５×１０4単位を含有するｆｌｕワクチン（１５μｇ）調製物の液滴（５０μｌ）を鼻腔内注入した。１４日後、処理を繰り返し、さらに７日後、血液試料を採取し、異なるｆｌｕ特異的抗体サブクラスの存在について標準的ＥＬＩＳＡによって試験した。Ｆｌｕワクチン単独又は生理食塩水を対照として使用した。結果は、群当たり５匹のマウスの終点力価の平均±ＳＤで表す。  図Ｂは、生きたインフルエンザウイルスを接種したマウスにおけるＩＦＮアジュバント化ワクチンの防御効果を示した図である。  ７〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをｆｌｕワクチン（１５μｇ）のみ、又はＩ型ＩＦＮ（２×１０5Ｕ）と一緒にした溶液０．２ｍｌで、又は対照として生理食塩水で筋肉内（ｉ．ｍ．）にワクチン接種した。ワクチンは０日目及び１４日目に投与した。ワクチン接種を開始して５０日目に、マウスの鼻腔内に１０  ＬＤ５０の生きたｆｌｕウイルス（Ａ／北京／２６２／９５（Ａ／Ｈ１Ｎ１）の液滴（５０μｌ）を注入した。その後、マウスすべての体重を毎日測定した。結果は、群当たり５匹のマウスの平均体重として表した。各群のマウス全体のうち生存したマウスの数を示す。
【図１３】ＦＬＵ（インフルエンザ）ワクチン単独又はアジュバントとしてのＩ型ＩＦＮと混合したＦＬＵで筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫した対照及びＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウスにおけるＦＬＵ特異的抗体アイソタイプの分析を示した図である。  対照（野生型）及びＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、０日目及び１４日目にＦＬＵワクチン単独、ＦＬＵワクチン＋Ｉ型ＩＦＮ又はＦＬＩワクチン＋ＭＦ５９アジュバントを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。第１免疫後１３日目及び第２免疫後１９日目（それぞれ、１３日目及び３３日目）に、血清を収集して、ＦＬＵ特異的抗体応答を分析した。データは、２連で試験した各実験群の５種類の血清の特異的抗体力価の平均±ｓ．ｅ．で示す。  ＊ｐ＜０．００２、＊＊ｐ＜０．０５対ＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウス、ＮＳ、有意ではない。  白棒：対照の野生型マウス  黒棒：ＩＮＦ−ＩＲ  ＫＯマウス
【図１４】ＦＬＵワクチンを鼻腔内（ｉ．ｎ．）に投与したときのＩ型ＩＦＮの強力なアジュバント効果を示した図である。  図ａ：ＦＬＵワクチン単独又はＩ型ＩＦＮと混合したワクチンでｉ．ｎ．で免疫したＣ５７／ＢＬ６マウスのＦＬＵ特異的ＨＡＩ力価、血清抗体イソタイプ及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）ＩｇＡの分析。マウスに０日目及び１４日目にＦＬＵワクチン５０μｌを単独又はＩ型ＩＦＮ（１０5Ｕ）と混合してｉ．ｎ．で注入した。第１免疫後１４日目に血清を収集した（左図）。第２免疫後１４日目に（右図）、マウスを殺処分し、Ｉｇ分析のために血液試料及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を収集した。データは、２連で試験した各実験群の５種類の試料の特異的抗体力価で示す。＊＊ｐ＜０．００２対ＦＬＵワクチン単独、ＮＳ、有意ではない。  白棒：ワクチン単独  黒棒：ワクチン＋ＩＦＮ  図ｂ：単独又はＩ型ＩＦＮ（１０5Ｕ）と混合したＦＬＵワクチン又は対照として生理食塩水を２回ｉ．ｎ．投与して免疫し、その後３８日して１０  ＬＤ50のＦＬＵウイルスで誘発したＣ５７／ＢＬ６マウスの生存時間。データは、感染マウスの平均体重推移（±ｓ．ｅ．）及び総動物数に対する生存したマウスのパーセントで表す。群当たりマウスは５匹である。  黒丸：生理食塩水処理マウス  白丸：ＦＬＵワクチンをｉ．ｎ．注入したマウス  白四角：ＦＬＵワクチン＋ＩＦＮをｉ．ｎ．注入したマウス  図ｃ：対照及びＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯ  Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに０日目及び１４日目にＦＬＵワクチン単独、ＦＬＵワクチン＋Ｉ型ＩＦＮ又はＦＬＵワクチン＋ＭＦ５９アジュバントをｉ．ｎ．注入した。第１免疫後１３日目（上図）、第２免疫後１９日目に（下図）に血清を収集し、ＦＬＵ特異的抗体応答を分析した。データは、２連で試験したそれぞれの実験群の５種類の試料の特異的抗体力価の平均±ｓ．ｅ．を示す。＊ｐ＜０．００４対ＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウス、ＮＳ、有意ではない。  白棒：対照野生型マウス  黒棒：ＩＦＮ−ＩＲ  ＫＯマウス
【図１５】１回免疫した後、ＦＬＵワクチンを筋肉内（ｉ．ｍ．）（全身）又はｉ．ｎ．（粘膜）でワクチン接種したＣ５７／ＢＬ６マウスにおけるＩ型ＩＦＮのアジュバント効果を示した図である。  図ａは、１回筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫した後１４日目の抗体力価及び生存したマウスを示した図である。筋肉内免疫は、既に説明したように実施した。ウイルス誘発は、免疫後３８日目に実施した。  図Ｂは、１回ｉ．ｎ．で免疫した後１４日目の抗体力価及び生存したマウスを示した図である。粘膜免疫は、既に説明したように実施した。ウイルス誘発は、免疫後３８日目に実施した。  黒丸：生理食塩水処理マウス。  白三角：ＦＬＵワクチンを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射又は鼻腔内（ｉ．ｎ．）注入したマウス。  白丸：ＦＬＵワクチン＋ＩＦＮを筋肉内（ｉ．ｍ．）注射するか、又はＦＬＵワクチン＋ＩＦＮを鼻腔内（ｉ．ｎ．）注入したマウス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月14日(2003.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける防御免疫治療において、ワクチンに対するＴｈ−１型体液性免疫応答を増強する非毒性アジュバント組成物を調製するためのＩ型ＩＦＮの使用であって、
初回免疫処置によって、ワクチンとＩＦＮ組成物が同じ投与部位に同時に与えられ、
該ＩＦＮを、ワクチン用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量で用いる、上記使用。
【請求項２】
前記増強された体液性免疫応答が、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂ及び／又はＩｇＧ３及び／又はＩｇＡ及び／又はＩｇＭ産生の選択的誘導を伴う、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記防御免疫治療が、皮下、筋肉内若しくは皮内の注射、又は経口若しくは粘膜の投与によって実施される請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
粘膜投与は、鼻腔内又は経口の投与であり、局所及び／又は全身の防御免疫をもたらす、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記組成物及びワクチンは、前記アジュバント及び前記ワクチンを、投与部位に同時送達するように処方されている、請求項１から請求項４までのいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ防御が、たった一度の免疫処置後に実現される、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ防御が、最初にワクチン及びアジュバント組成物を同時投与し、次いで、さらにアジュバント組成物のみをワクチン注射後１日目、或いは１日目及び２日目に投与して実現される、請求項１から請求項５までのいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記Ｉ型ＩＦＮが、天然ＩＦＮα、合成組換えＩ型ＩＦＮ、組換えＩＦＮ−αサブタイプ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、又はＩ型ＩＦＮの１個又は複数の一員をコードする核酸配列である請求項１から請求項７までのいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記Ｉ型ＩＦＮが、ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｉ型ＩＦＮの投与量が、１×１０6〜６×１０6Ｕの範囲である、請求項１から請求項９までのいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｉ型ＩＦＮが、樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体と融合した組換えＩ型ＩＦＮである、請求項１から請求項１０までのいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記ワクチンが、感染因子（ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）又はその他の起源からなる１種又は複数の抗原を含む、請求項１から請求項１１までのいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記ワクチンが、腫瘍由来の１種又は複数の抗原を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗原の量が、１〜１０００μｇである、請求項１１又は請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記抗原の量が、１０〜２００μｇである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
抗原及びアジュバント双方の放出を、制御し、持続化し且つ同時に行なうために、アジュバントとしてワクチン用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量でＩ型ＩＦＮを含む、皮下、筋肉内若しくは皮内の注射用、又は経口若しくは粘膜の投与用ワクチン。
【請求項１７】
粘膜投与が、鼻腔内又は経口の投与である請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
前記Ｉ型ＩＦＮが、天然ＩＦＮα、合成組換えＩ型ＩＦＮ、組換えＩＦＮ−αサブタイプ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、又はＩ型ＩＦＮの１種又は複数の一員をコードする核酸配列である、請求項１６から請求項１７までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項１９】
前記Ｉ型ＩＦＮが、ＰＥＧ化Ｉ型ＩＦＮサブタイプである、請求項１６から請求項１８までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２０】
前記Ｉ型ＩＦＮ投与量が、１×１０6〜６×１０6ＩＵの範囲である、請求項１６から請求項１９までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２１】
前記Ｉ型ＩＦＮが、樹状細胞を標的とすることができるモノクローナル抗体と融合した組換えＩ型ＩＦＮである、請求項１６から請求項２０までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ワクチンが、感染因子又はその他の起源からなる１種又は複数の抗原を含む、請求項１６から請求項２１までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ワクチンが、腫瘍由来の１種又は複数の抗原を含む、請求項１６から請求項２２までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２４】
前記抗原の量が、１〜１０００μｇである、請求項１６から請求項２３までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２５】
前記抗原の量が、１０〜２００μｇである、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記Ｉ型ＩＦＮ投与量が、１×１０6〜６×１０6ＩＵの範囲である、請求項１６から請求項２５までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２７】
さらにアルミニウム塩を含む、請求項１６から請求項２６までのいずれかに記載のワクチン。
【請求項２８】
前記抗原の存在に関連した疾患の予防又は治療において、近い注入部位で、別々に、同時に又は連続して投与するための、
１００．０００ＩＵ以上の用量でＩ型ＩＦＮを含む非毒性アジュバント組成物と、
少なくとも１種の抗原、及び薬剤として許容される担体、媒体又は補助剤を含むワクチンと
からなる、複数の構成成分からなるキット（ａ  ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）。
【請求項２９】
抗原を、ワクチン１用量当たり１００．０００ＩＵ以上の用量のＩ型ＩＦＮと一緒にして、制御されかつ持続的な放出を行なう組成物を処方するステップを含む、請求項１６から請求項２８までのいずれかに記載のワクチンの調製方法。
【国際調査報告】
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2004533431.tif 000085
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