(57)【要約】本発明は、中枢神経系損傷、とくに外傷性頭部損傷の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項２】
ＣＮＳ損傷の合併症および晩発効果の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項３】
前記ＣＮＳ損傷が外傷性脳損傷である請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記ＣＮＳ損傷が閉鎖性頭部外傷である請求項１、２または３記載の使用。
【請求項５】
前記ＣＮＳ損傷が脊髄損傷である請求項１または２記載の使用。
【請求項６】
前記ＣＮＳ損傷が血管由来である請求項１、２、３、４または５記載の使用。
【請求項７】
前記ＩＬ−１８阻害剤がカスパーゼ−１（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しかつＩＬ−１８受容体を遮断するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、そのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環改変誘導体または塩から選択される請求項１、２、３、４、５または６記載の使用。
【請求項８】
前記ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８抗体である請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記ＩＬ−１８抗体がヒト化ＩＬ−１８抗体である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記ＩＬ−１８抗体がヒトＩＬ−１８抗体である請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８結合タンパク質、またはその塩、アイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環改変誘導体である請求項７記載の使用。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１８阻害剤が１つ以上の部位でグルコシル化されている請求項７、８、９、１０または１１記載の使用。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）融合を含む請求項７、８、９、１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
前記機能的誘導体が、アミノ酸残基上の１つ以上の側鎖として存在する、１つ以上の官能基に結合された少なくとも１つの部分を含む請求項７、８、９、１０、１１、１２または１３記載の使用。
【請求項１５】
前記部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、同時使用、連続使用または個別使用として、インターフェロンをさらに含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
前記インターフェロンが、インターフェロン−αまたはインターフェロン−βである請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬が、同時使用、連続使用または個別使用として、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をさらに含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の使用。
【請求項１９】
前記ＴＮＦがＴＮＦαである請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記医薬が、同時使用、連続使用または個別使用として、抗炎症剤をさらに含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９記載の使用。
【請求項２１】
前記抗炎症剤がＣＯＸ−阻害剤、とくにＣＯＸ−２阻害剤である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
前記医薬が、同時使用、連続使用または個別使用として、抗酸化剤をさらに含有する請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１記載の使用。
【請求項２３】
前記ＩＬ−１８阻害剤が、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１８阻害剤が皮下に投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載の使用。
【請求項２５】
前記ＩＬ−１８阻害剤が毎日投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４記載の使用。
【請求項２６】
前記ＩＬ−１８阻害剤が１日おきに投与される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５記載の使用。
【請求項２７】
ＣＮＳ損傷の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤のコード配列を含む核酸分子の使用。
【請求項２８】
前記核酸分子がさらに発現ベクターの配列を含む請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記核酸分子が筋肉内に投与される請求項２７または２８記載の使用。
【請求項３０】
ＣＮＳ損傷の治療および／または予防用医薬の製造において、細胞におけるＩＬ−１８阻害剤の内因性産生を誘導および／または増強させるためのベクターの使用。
【請求項３１】
ＣＮＳ損傷の治療および／または予防用医薬の製造において、ＩＬ−１８阻害剤を産生するために遺伝的に修飾された細胞の使用。
【請求項３２】
ＣＮＳ損傷の治療および／または予防を必要とするヒトに、有効阻害量のＩＬ−１８阻害剤を投与することからなるＣＮＳ損傷の治療および／または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳の病的な症状の分野に属する。より詳細には、本発明は中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、とくに外傷性頭部損傷の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８９年に、マウスの脾臓細胞から得られるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を誘導するエンドトキシン誘導血清の活性が記載された（Nakamura et al., 1989）。この血清の活性は、直接的なＩＦＮ−γの誘導物質としてではなく、むしろＩＬ−２またはマイトジェン、とともに共刺激剤として作用した。エンドトキシン後のマウス血清から活性を精製しようとする試みにより、明らかに均質な５０〜５５ｋＤａのタンパク質であることが示された。ほかのサイトカインはＩＦＮ−γ産生に対して共刺激剤として作用することができるので、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＴＮＦに対する中和抗体がその血清の活性を中和できないということにより、それが別の因子であることが示唆された。１９９５年には、同科学者らによって、Ｐ．アクネス（P. acnes）で前処理されたマウス由来の肝臓の抽出物中に、ＩＦＮ−γ産生に対するエンドトキシン誘導共刺激剤が存在することが証明された（Okamura et al., 1995）。このモデルにおいて肝臓のマクロファージ集団（クッパー細胞）は増加し、これらのマウスにおいては、低投与量の細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）（前処理されていないマウスでは致死ではない）で致死にいたる。ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）と名づけられ、のちにインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）と呼ばれるその因子が、１，２００グラムのＰ．アクネス処理されたマウスの肝臓から均質的に精製された。精製されたＩＬ−１８のアミノ酸配列から誘導された変性オリゴヌクレオチドは、マウスＩＬ−１８ｃＤＮＡをクローン化するために使用された。ＩＬ−１８は、１５７アミノ酸の１８〜１９ｋＤａタンパク質であり、データベースに存在するいかなるペプチドとも明らかな類似性を有しない。ＩＬ−１８およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のメッセンジャーＲＮＡは、クッパー細胞および活性化マクロファージにおいて容易に検出された。組換えＩＬ−１８は、おそらく別の経路を介して、ＩＬ−１２より強力にＩＦＮ−γを誘導する（Micallef et al., 1996）。エンドトキシン誘導血清の活性と同様に、ＩＬ−１８は単独ではＩＦＮ−γを誘導しないが、主にマイトジェンまたはＩＬ−２との共刺激剤として機能する。ＩＬ−１８は、明らかにＩＬ−２依存経路によりＴ細胞の増殖を増強し、インビトロにおいてＴｈ１サイトカイン産生を増強し、そしてＩＬ−１２と結合した場合、ＴＮＦ−γ産生を増強する点で相乗効果を示す（Maliszewski et al., 1990）。
【０００３】
マウスのフォームのクローニング後、ＩＬ−１８に対するヒトｃＤＮＡ配列は１９９６年に報告された（Ushio et al., 1996）。
【０００４】
影響を受けた組織からＩＬ−１８をクローニングし、ＩＬ−１８遺伝子発現を研究することによって、自己免疫疾患とこのサイトカインとの密接な関連性が見出された。肥満でない糖尿病（non-obese diabetic）（ＮＯＤ）のマウスは、シクロホスファミドの単回注射によって促進および同時進行され得る、自己免疫性インスリン炎および糖尿病に自然に進行する。ＩＬ−１８ｍＲＮＡは、初期段階のインスリン炎のＮＯＤマウスのすい臓における逆転写ＰＣＲによって明らかにされた。ＩＬ−１８のｍＲＮＡのレベルは、シクロホスファミドの処理後、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡの増加に先行し急激に増加し、そののち糖尿病を発症した。興味深いことに、それらの動力学はＩＬ−１２−ｐ４０のｍＲＮＡの動力学と似ており、個々のｍＲＮＡレベルは密接に相関する。すい臓ＲＮＡ由来のＩＬ−１８ｃＤＮＡのクローニングとそれ続く配列決定により、クッパー細胞およびインビボにおける前活性化マクロファージからクローニングされたＩＬ−１８配列との同一性が明らかになった。また、ＮＯＤマウスのマクロファージは、シクロホスファミドに応答してＩＬ−１８遺伝子を発現したが、並行して処理されたＢａｌｂ／ｃマウス由来のマクロファージでは応答しなかった。したがって、ＩＬ−１８の発現は、自己免疫性ＮＯＤマウスにおいて異常に調節され、糖尿病の発症に密接に関連している（Rothe et al., 1997）。
【０００５】
ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞におけるＦａｓリガンドの機能的活性を増大させることによって、免疫調節または炎症において潜在的な役割を担っている（Conti et al., 1997）。ＩＬ−１８はまた、副腎皮質において発現され、したがって、ストレスの多い経験の後で免疫系を調節する際に重要な役割を担う分泌型の神経−免疫モジュレーターであり得る（Chater, 1986）。
【０００６】
インビボにおいて、ＩＬ−１８は、プロＩＬ−１８の切断によって形成され、その内因性の活性は、Ｐ．アクネスおよびＬＰＳに仲介される致死性におけるＩＦＮ−γ産生を説明するように思われる。成熟ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β変換酵素（１Ｌ−１β−変換酵素、ＩＣＥ、カスパーゼ−１）によって、その前駆体から産生される。
【０００７】
ＩＬ−１８受容体は、リガンドの結合において共作用する、少なくとも２つの成分からなる。ＩＬ−１８に対する高親和性および低親和性の結合部位がマウスＩＬ−１２に刺激されるＴ細胞において見出されたことにより（Yoshimoto et al., 1998）、多重鎖受容体複合体（multiple chain receptor complex）であることが示唆される。２つの受容体サブユニットはこれまでに同定され、どちらもＩＬ−１受容体ファミリーに属している（Parnet et al., 1996）。ＩＬ−１８のシグナル伝達はＮＦ−κＢの活性化に関与する（DiDonato et al., 1997）。
【０００８】
最近、ＩＬ−１８に高い親和性を有する可溶性タンパク質がヒトの尿から単離され、ヒトおよびマウスのｃＤＮＡが記載された（Novick et al., 1999; 国際公開第９９／０９０６３号パンフレット）。そのタンパク質はＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と呼ばれている。
【０００９】
ＩＬ−１８ＢＰは、既知のＩＬ−１８受容体の１つの細胞外ドメインではないが、分泌され、通常循環しているタンパク質である。ＩＬ−１８ＢＰは、分泌タンパク質の新しいファミリーに属する。さらに、そのファミリーは、ＩＬ−１８ＢＰに高い相同性を有する、ポックスウイルスにコードされるいくつかのタンパク質を含む（Novick et al., 1999）。ＩＬ−１８ＢＰは脾臓において構成的に発現され、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＩＬ−１のII型受容体にわずかな相同性を有する。ＩＬ−１８ＢＰの遺伝子はヒト染色体の１１ｑ１３に位置し、８．３ｋｂのゲノム配列中には膜貫通ドメインをコードするエクソンは見つかっていない（Novick et al., 1999）。
【００１０】
ＩＬ−１８ＢＰの４つのヒトアイソフォーム２つのマウスアイソフォームとは、ｍＲＮＡスプライシングによって得られ、さまざまなｃＤＮＡライブラリーにおいて見出され、そして発現され、精製され、ついで結合およびＩＬ−１８の生物学的活性の中和に対して評価されてきた（Kim et al., 2000）。ヒトＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームａ（ＩＬ−１８ＢＰａ）は、急速な吸着速度、遅い離脱速度、および３９９ｐＭの解離定数（Ｋ（ｄ））により、ＩＬ−１８に対する最も高い親和性を示した。ＩＬ−１８ＢＰｃは、２９のＣ末端アミノ酸を除いてはＩＬ−１８ＢＰａのＩｇドメインを有し；ＩＬ−１８ＢＰｃのＫ（ｄ）は、１０倍小さい（２．９４ｎＭ）。それにもかかわらず、ＩＬ−１８ＢＰａおよびＩＬ−１８ＢＰｃは、２つのモル過剰で、９５％を超えるＩＬ−１８を中和する。ＩＬ−１８ＢＰｂおよびＩＬ−１８ＢＰｄアイソフォームは、完全なＩｇドメインを欠き、ＩＬ−１８に対する結合能力または中和能力を欠く。マウスのＩＬ−１８ＢＰｃおよびＩＬ−１８ＢＰｄのアイソフォームは同一のＩｇドメインを有し、また、２つのモル過剰で、９５％を超えるマウスＩＬ−１８を中和する。しかしながら、ヒトＩＬ−１８ＢＰａと共通するＣ末端モチーフを有するマウスＩＬ−１８ＢＰｄはまた、ヒトＩＬ−１８を中和する。分子モデリングは、ＩＬ−１８ＢＰのＩｇドメインにおいて、多数の混合された静電気性および疎水性の結合部位を同定し、そのリガンドに対する高い親和的結合を説明することができる（Kim et al., 2000）。
【００１１】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、単に頭部損傷、または閉鎖性頭部外傷（ＣＨＩ）とも呼ばれ、頭部への外部からの打撃によって脳に損傷を受けた中枢神経系の損傷をいう。それは、主に自動車または自転車事故中に起こるが、溺水、心臓発作、脳梗塞および感染の結果としても起こり得る。外傷性脳損傷のこのタイプは、通常、脳に対する酸素または血液供給の欠乏によって生じるため、「無酸素性損傷（anoxic injury）」ということもできる。
【００１２】
閉鎖性頭部外傷は、自動車事故または墜落時における頭部への打撃により生じる。この場合、頭蓋は静止している物体に当たり、頭蓋の中の脳は、その軸（脳幹）において回転しねじれ、局部的なまたは広範囲に渡る傷害を引き起こす。また、脳、すなわち「浮動（float）」を可能とする液体に覆われた軟らかい塊は、頭蓋に跳ね返ることによってさらに傷害を受け得る。
【００１３】
外傷の直後の無意識の期間があることもあり、それは、数分、数週間または数ヵ月続き得る。ねじれおよび跳ね返ることによって、外傷的に脳に損傷を受けた患者は、通常脳の多くの部分に損傷または傷を受ける。これは、脳に対するびまん性障害、または「非弾丸型損傷（non-missile injury）」と呼ばれる。非弾丸型損傷において起こる脳障害のタイプは、一次性障害または二次性障害のいずれかに分類され得る。
【００１４】
一次性脳障害は、損傷時、主に衝撃部位で、とくに頭蓋の破片が存在する場合起こる。大きな挫傷は脳内出血に関連し、あるいは皮膚の裂傷を伴う。びまん性軸索損傷は、頭蓋内の脳の循環的な移動によって起こるニューロンの突起（neuronal processes）の剪断および引っ張り歪みの結果として起こる。顕微鏡でしか検出できない軸索に対する小さな出血性の傷害またはびまん性障害があり得る。
【００１５】
二次的脳損傷は、傷害の瞬間ののち発症する合併症の結果として起こる。それらは、頭蓋内出血（intracranial hemorrhage）、脳外動脈に対する外傷性障害、頭蓋内ヘルニア（intracranial herniation）、低酸素性脳障害または髄膜炎を含む。
【００１６】
「開放性頭部外傷」は、頭部に対する明らかな強襲であり、銃創、事故、または頭蓋から脳へ通り抜ける物体（「脳に対する弾丸型損傷」）により生じ得る。頭部損傷のこのタイプは、脳の特定の領域をより損傷しがちである。
【００１７】
いわゆる「軽度の脳損傷」は、意識消失を伴わずに、あるいは短時間続くぼんやりした感覚または混乱状態のみを伴って起こり得る。処理される医療ケアは最小限であるにもかかわらず、脳損傷であり昏睡状態でない患者は、昏睡傷害（coma injury）の生存者が受けるのと同様の症状および障害を経験する。
【００１８】
外傷に対する応答において、脳内で起こる変化はさらなる障害を防ぐために監視する必要がある。しばしば脳のサイズは、深刻な頭部損傷ののち増大する。これは、脳腫脹と呼ばれ、脳に対する血液の量が増大するときに起こる。病気ののち水が脳内に集中し、これは脳浮腫と呼ばれる。脳腫脹と脳浮腫はどちらも、結果として頭蓋内圧（「ＩＣＰ」）と呼ばれる脳内の過剰な圧力を生じる。
【００１９】
昏睡状態とは、外傷性頭部損傷の直後の長期間の無意識状態である。
【００２０】
昏睡状態にはいくつかレベルがある。昏睡状態レベルは、頭部損傷患者の感応性の進行によって測定できる。頭部損傷の急性期において、「グラスゴー  コーマ  スケール」が使用される。患者が回復または安定したときは、認識（理解および論理）判断のレベルを測定する「ランチョ  ロス  アミーゴ  スケール（Rancho Los Amigos Scale）」が使用される。
【００２１】
脳外傷はしばしば、結果として外傷後癲癇、持続的な植物状態または外傷後痴呆などの持続的な衰弱を生ずる。
【００２２】
脊髄損傷とは、ＣＮＳ損傷のほかのタイプである。脊髄損傷は対麻痺および四肢麻痺に対する入院の主な原因である。８０％以上は道路事故の結果として起こる。２つの主な損傷の群、開放性損傷および閉鎖性損傷が臨床的に認められる。
【００２３】
開放性損傷は、脊髄および神経根の直接的な外傷を引き起こす。貫通損傷は、広範囲な破壊および出血を引き起こし得る。閉鎖性損傷は、ほとんどの背骨の損傷の原因であり、通常、脊柱の挫傷／脱臼に関係付けられ、それは通常放射線学的に証明できる。索状組織に対する損傷は、骨性損傷の程度に依存し、２つの主な段階（一次性損傷：挫傷、神経線維の断裂および出血性壊死、ならびに二次性損傷：硬膜外血腫、脳梗塞、感染および浮腫）において考慮される。
【００２４】
索状組織損傷の晩発効果は、損傷を受けた神経線維の上昇的および降下的な順行性変性（anterograde degeneration）、外傷後脊髄空洞症、ならびに尿路感染、呼吸器感染、褥創および筋肉消耗（muscle wasting）などの対麻痺の全身性作用を含む。
【００２５】
外傷性脳損傷の病変は、とても複雑でまだあまり理解されていない。過去１０年間にわたる研究の労力は、脳外傷後に全身的に、および鞘内区画（intrathecal compartment）において局所的に放出されるサイトカインの重要な役割を明らかにし、ＴＮＦ、ＩＬ−６またはＩＬ−８などの前炎症性サイトカインの二重の効果が、これらのメディエーターの時間依存的薬効および副作用という発見に基づき仮定された（Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et al., 1999, Scherbel et al., 1999; Whalen et al., 2000)。前記したように、最近発見されたＩＬ−１ファミリーのサイトカインがＩＬ−１８である。最近の研究は、ＩＬ−１８が、インビボでマウス、ラットおよびヒトのＣＮＳ（Culhane et al., 1998; Jander and Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et al., 2000）、ならびにインビトロでニューロンではなく星状細胞および小膠細胞の初期培養（Conti et al., 1999）において構成的に発現することを証明している。増大したＩＬ−１８レベルは、細菌性髄膜炎およびウイルス性脳脊髄膜炎などの炎症性ＣＮＳ疾患の患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において検出されたが、多発性硬化症（ＭＳ）患者のＣＳＦにおいては検出されなかった（Fassbender et al., 1999）。ＭＳ患者における一般的に低い髄腔内ＩＬ−１８レベルの発見とは対照的に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のルイスラット（Lewis rats）、すなわちＭＳの動物モデルの脊髄において、増大されたＩＬ−１８ｍＲＮＡ発現が証明された（Jander and Stoll, 1998）。神経外傷におけるＩＬ−１８の発現および機能的重要性は、現在まで研究されていない。
【発明の開示】
【００２６】
本発明は、ＣＮＳ疾患におけるＩＬ−１８の病態生理学的役割に関する。それは、実験的な閉鎖性頭部外傷（ＣＨＩ）から１時間または３日後のどちらかでのＩＬ−１８阻害剤によるマウスの治療が、対照動物に比べて改善された回復および脳傷害の範囲の軽減を導くという発見に基づく。本発明は、したがって、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、とくに、外傷性頭部損傷の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００２７】
インターフェロンおよび／またはＴＮＦおよび／または炎症の阻害剤および／または抗酸化剤とのＩＬ−１８阻害剤の組合わせの使用も、本発明により提供される。病気にかかった組織または細胞にＩＬ−１８阻害剤を送達するための遺伝子治療的なアプローチを適用するために、本発明のさらなる局面は、ＣＮＳ損傷の治療および／または予防のための、ＩＬ−１８阻害剤のコード配列を含む核酸分子の使用に関する。本発明は、また、ＣＮＳ損傷の予防および／または治療のための、ＩＬ−１８阻害剤を発現するように遺伝子的に作製された細胞の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、閉鎖性頭部外傷のマウスモデルでの脳損傷からの回復における、統計学的に有意なＩＬ−１８阻害剤の有用な効果の発見に基づいている。本発明に基づき、さらに、ＩＬ−１８は、外傷性頭部損傷ののち脳および脳脊髄液においてアップレギュレーションされることが見出されていることから、この前炎症性サイトカインが脳損傷の病原性に重要な役割を果たすことが示される。
【００２９】
したがって、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００３０】
本発明はさらに、ＣＮＳ損傷の合併症および晩発効果の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様において、ＣＮＳ損傷は、外傷性頭部損傷または閉鎖性頭部外傷である。
【００３２】
さらに好ましい実施態様において、ＣＮＳ損傷は脊髄損傷である。
【００３３】
さらにより好ましい本発明の実施態様において、脳損傷は血管由来の損傷である。
【００３４】
本発明の文脈における表現「中枢神経系損傷」または「ＣＮＳ損傷」は、発症年齢または根本にある原因にかかわらず、脳または脊髄に対するあらゆる損傷に関する。根本にある原因は、たとえば、機械的または感染であり得る。ＣＮＳ損傷ならびにその臨床的徴候および関連性については、「背景技術」に詳細に記載している。ＣＮＳ損傷は、たとえば、外傷、または脳もしくは脊髄のそのほかの任意の傷害を包含し、神経外傷とも呼ばれる。
【００３５】
脳損傷は、たとえば、以下のいずれかの１つまたは複数を含むか、または以下のいずれかの１つまたは複数となり得る。１．注意欠陥障害；２．認知障害；３．言語障害；４．記憶障害；５．行為傷害；６．運動障害；６．ほかの任意の神経機能障害。
【００３６】
脊髄損傷は、たとえば対麻痺または四肢麻痺という結果を導き得る。
【００３７】
ＣＮＳ損傷の合併症または晩発効果もまた、本発明にしたがって治療および／または予防され得る。脳損傷の合併症および晩発効果については、「背景技術」に前記した。それらは、たとえば、昏睡状態、髄膜炎、外傷後癲癇、外傷後痴呆、神経線維の退化、または外傷後脊髄空洞症、もしくは出血を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明はまた、脳に対するあらゆる損傷、すなわち脳梗塞、虚血、脳血管傷害または脳卒中による低酸素性脳障害などの血管由来の治療および／または予防用医薬の製造のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００３９】
用語「治療」および「予防」は、本明細書において使用される場合、ＣＮＳ損傷とともに起こる症状、病気または合併症だけでなく、ＣＮＳ損傷の１つ以上の症状または原因を部分的または全体的に予防、阻害、軽減、改善または逆進することとして理解されるべきである。ＣＮＳ損傷を「治療する」という場合は、本発明による物質は病気の発症後に投与され、「予防」とは、病気の徴候を患者が気付く前の該薬物の投与をいう。
【００４０】
ＣＮＳ損傷の治療は、本発明によると好ましい。ＣＮＳ損傷を治療するために、ＩＬ−１８阻害剤はできるだけＣＮＳ損傷直後、たとえば損傷から１時間以内に投与されることが好ましい。しかしながら、以下の実施例に示すように、あるＩＬ−１８阻害剤は、脳損傷が起こってから３日後に投与した場合でも、脳損傷に有用な効果を発揮することが示された。したがって、ＣＮＳ損傷を治療するために、ＩＬ−１８阻害剤は損傷から３日以内に投与されることが好ましい。
【００４１】
本発明の文脈における用語「ＩＬ−１８阻害剤」は、ＩＬ−１８の産生および／または作用を希釈、減少、または部分的に、実質的にもしくは完全に予防または遮断するというようにＩＬ−１８の産生および／または作用を調節するあらゆる分子をいう。用語「ＩＬ−１８阻害剤」は、ＩＬ−１８作用の阻害剤のみならず、ＩＬ−１８産生の阻害剤を包含することを意図する。
【００４２】
産生阻害剤は、ＩＬ−１８の合成、プロセシングまたは成熟化に否定的に作用するあらゆる分子であり得る。本発明にしたがって考慮される阻害剤は、たとえばインターロイキンＩＬ−１８の遺伝子発現のサプレッサー、ＩＬ−１８ｍＲＮＡの転写を減じさせるもしくは阻害する、またはｍＲＮＡを分解させるアンチセンスｍＲＮＡ、正しい折りたたみを損傷させる、または部分的もしくは実質的にＩＬ−１８の分泌を阻害するタンパク質、いったん合成されたＩＬ−１８を分解するプロテアーゼ、カスパーゼ−１阻害剤などの、成熟したＩＬ−１８を産生するためにプロ−ＩＬ−１８を切断するプロテアーゼの阻害剤などであり得る。
【００４３】
ＩＬ−１８作用の阻害剤は、たとえばＩＬ−１８アンタゴニストであり得る。アンタゴニストは、ＩＬ−１８または、ＩＬ−１８のそのリガンド（たとえばその受容体）への結合を招くＩＬ−１８結合部位を部分的または実質的に中和するために、充分な親和性および特異性でＩＬ−１８分子自身と結合またはＩＬ−１８分子自身を隔離することができる。アンタゴニストはまた、ＩＬ−１８とその受容体の結合に際して細胞内で活性化されるＩＬ−１８シグナル伝達経路をも阻害し得る。
【００４４】
ＩＬ−１８作用の阻害剤はまた、可溶性ＩＬ−１８受容体またはその受容体に似た分子、またはＩＬ−１８受容体を遮断する薬剤、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などのＩＬ−１８抗体、またはＩＬ−１８とその標的との結合を阻害するその他のあらゆる薬剤もしくは分子でもあり得、したがって、ＩＬ−１８によって仲介される細胞内または細胞外の反応の誘因を減少または阻害する。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）の阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体のあらゆるサブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と拮抗または結合し、そしてＩＬ−１８受容体を遮断するＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８結合タンパク質、そのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環改変（circularly permutated）誘導体、またはそれらの塩から選択される。
【００４６】
本明細書において、用語「ＩＬ−１８結合タンパク質」は、「ＩＬ−１８ＢＰ」と同義として使用される。それは、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたはNovick et al., 1999において定義されるようにＩＬ−１８結合タンパク質を含み、Kim et al., 2000において定義されるようにＩＬ−１８結合タンパク質のスプライシング変異体および／またはアイソフォームを含む。とくに、本発明によると、ＩＬ−１８ＢＰのヒトのアイソフォームａおよびｃが有用である。本発明により有用なタンパク質は、グリコシル化または非グリコシル化されていてもよく、尿などの天然源に由来してもよく、また、好ましくは組換え的に産生され得る。組換え体の発現は、大腸菌など原核生物の発現系、または真核生物、好ましくは哺乳動物、の発現系で行なわれ得る。本発明のＩＬ−１８阻害剤にとくによく適する細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００４７】
ＩＬ−１８阻害剤の組換え体の産生は、哺乳動物細胞または細胞系において組換え的に発現される場合、好ましくは無血清細胞培養培地において行なわれ得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ムテイン」は、天然のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換または欠失され、または、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの本来の配列に１つ以上のアミノ酸残基が付加され、野生型のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰと比較して、得られた産物の活性があまり減少していない、ＩＬ−１８ＢＰのアナログまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのアナログを示す。それらのムテインは、既知の合成および／または位置指定突然変異誘発技術、またはこの場合に適した他の既知の技術によって製造される。
【００４９】
そのようなムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同様の活性を有するほど、ＩＬ−１８ＢＰの配列に充分似た、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰに充分似たアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。ムテインがＩＬ−１８に対する実質的な結合能力を有するかぎり、それは、アフィニティークロマトグラフィーの方法などによって、ＩＬ−１８の精製において使用することができ、したがってＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似した活性を有すると考えることができる。したがって、所定のムテインが、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するかどうかは、たとえば、放射線免疫検定法またはＥＬＩＳＡ法などの適宜ラベルされたＩＬ−１８にムテインが結合するかどうか決定するための単純なサンドウィッチ競合アッセイにそのムテインを供することからなるルーチンの実験方法によって、決定されることができる。ＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を評価するための単純で機能的なアッセイは、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットのたとえば実施例２（クロスリンクによって評価された場合のＩＬ−１８との結合）または５（単核血球細胞におけるＩＬ−１８誘導ＩＦＮ−γの阻害）に詳細に記載された。
【００５０】
好ましい態様において、そのようなムテインはいずれも、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスにコードされたＩＬ−１８ＢＰのホモログのいずれかの配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、ムテインはそれらと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【００５１】
本発明にしたがって使用されることができる、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドのムテインまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのムテイン、またはそれをコードする核酸は、本明細書中で紹介された教示および指導に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によって決まりきった手順で得られる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に一致する配列の有限の一群を含む。
【００５２】
本発明によると、ムテインは、本発明にしたがい、ゆるやかにまたは高度にストリンジェントな条件下で、ＩＬ−１８阻害剤をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェントな条件」とは、当業者が通常「ストリンジェント」という、ハイブリダイゼーションおよびそのあとの洗浄の条件をいう。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992)、およびSambrook et al., (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 参照。
【００５３】
制限なく、ストリンジェントな条件の例は、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを３７℃で３０〜６０分間、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを６８℃で３０〜６０分間において、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍの１２〜２０℃低い洗浄条件を含む。当業者であれば、ストリンジェントな条件がＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（たとえば１０〜４０塩基）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することは理解される。もし混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。Ausubel, supra参照。
【００５４】
好ましい実施態様において、そのようなムテインはいずれも、添付の配列表の配列番号１、２または３の配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、ムテインはそれらと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【００５５】
同一性は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列間、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の、該配列の比較によって決定された関係を反映する。一般的に、同一性は、比較されている配列の全長に渡って、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチド−ヌクレオチド、またはアミノ酸−アミノ酸間の正確な一致をいう。
【００５６】
正確な一致がない配列に対して、「％同一性」が決定され得る。一般的に、比較されるべき２つの配列は、該配列間に最大の相関関係が得られるように整列される。これは、整合の程度を高めるために、片方または両方の配列のいずれかにおける「ギャップ（gap）」の挿入を含む。％同一性は、同一または非常に似かよった長さの配列にとくに適する、比較されるそれぞれの配列の全長に渡って決定され得る（いわゆるグローバル・アライメント）か、または長さの異なる配列により適している、比較されるそれぞれの配列のより短い決定された長さに渡って決定され得る（いわゆるローカル・アライメント）。
【００５７】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当業者に周知である。したがって、たとえば、ウィスコンシン  シークエンス  アナリシス  パッケージ  バージョン９．１（Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1）（Devereux J et al., 1984）において利用可能であるプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、ならびに２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、スミスとウォーターマン（Smith and Waterman）の「局所的相同性」アルゴリズム（１９８１）を用い、２つの配列間の相同性の最適な単一領域を見出す。配列間の同一性および／または相同性を決定するためのほかのプログラム、たとえばＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, www.ncbi.nlm.nih.govで、ＮＣＢＩのホームページを通して利用できる）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, 1990; Pearson 1988）もまた、当業者に周知である。
【００５８】
本発明におけるムテインの好ましい変更は、「保存的な」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドまたはタンパク質もしくはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓの保存的なアミノ酸置換とは、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸を含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
【００５９】
好ましくは、同義アミノ酸群は表１に示されているものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表２に示されているものであり；最も好ましくは、同義アミノ酸群は表３に示されているものである。
【００６０】
【表１】
2004534777.tif 000002
【００６１】
【表２】
2004534777.tif 000003
【００６２】
【表３】
2004534777.tif 000004
【００６３】
本発明における使用のための、ＩＬ−１８ＢＰのポリペプチドもしくはタンパク質のムテイン、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのムテインを得るために用いられ得る、タンパク質のアミノ酸置換の産生の例は、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shaw et al）に示されたリジン置換タンパク質を含む。
【００６４】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテインもしくは断片からなるポリペプチドのことをいう。ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰは、このようにたとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００６５】
本明細書中で用いられる「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から調整され得るＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの誘導体、ならびに、そのムテインおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００６６】
それらの誘導体は、たとえば、抗原部位を覆い、体液内でＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの滞留を延ばし得るポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンを用いた反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、アシル部分と形成される遊離水酸基（たとえばセリルまたはトレオニル残基）のＯ−アシル誘導体を含む。
【００６７】
ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、ムテインおよび融合タンパク質の「活性画分」がＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似した活性を有する場合、本発明では、該画分として、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片または前駆体単独もしくはそれと結合する関連分子または残基（たとえば糖またはリン酸塩残基、もしくはタンパク質分子または糖残基自身の集合体）を伴うタンパク質分子のポリペプチド鎖の断片または前駆体を含む。
【００６８】
本明細書において、用語「塩」は、ＩＬ−１８阻害剤分子のカルボキシル基の塩、およびＩＬ−１８阻害剤分子のアミノ基の酸付加塩の両方、またはそれらのアナログをいう。カルボキシル基の塩は、当業者に周知である手段によって形成され得、無機塩（たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、または亜鉛の塩など）、およびたとえばトリエタノールアミン、アルギニン、またはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを伴うように形成された有機塩基の塩などを含む。酸付加塩は、たとえば、塩酸または硫酸などの無機酸の塩、たとえば酢酸、シュウ酸などの有機酸の塩を含む。もちろん、それらの塩はいずれも、本発明に関するＯＰＮの生物学的活性を保持していなければならず、すなわち希突起膠細胞に対して増殖性効果を発揮するものでなければならない。
【００６９】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８抗体である。抗ＩＬ−１８抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、キメラ、ヒト化した、または完全にヒトのものであり得る。組換え抗体およびその断片は、インビボにおけるＩＬ−１８と結合する高い親和性、および低毒性によって特徴付けられる。本発明において用いることができる抗体は、病的な症状またはあらゆる徴候または病的な症状に関連する徴候群を極めて軽減または緩和するために充分な期間、患者を治療することができる能力、および低毒性によって特徴付けられる。
【００７０】
中和抗体は、ＩＬ−１８で免疫されたウサギ、ヤギまたはマウスなどの動物によって容易に作製することができる。免疫されたマウスはとくに、ハイブリドーマを製造するためのＢ細胞の供給源を提供するのに有効であり、次には、ハイブリドーマは大量の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体を産生するために培養される。
【００７１】
キメラ抗体は、さまざまな動物種由来の２つまたはそれ以上の切片または一部によって特徴づけられた免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体のようなヒトではない哺乳動物の抗体由来であり、免疫グロブリンの定常領域はヒトの免疫グロブリン分子由来である。好ましくは、両方の領域およびその組み合わせは、決まりきった手順によって決定されたように低い免疫原性を有する（Elliott et al., 1994）。ヒト化抗体は、マウスの定常領域をマウスの抗原結合領域は残したままヒトの対応物で置き換えるという、遺伝子工学技術によって創出された免疫グロブリン分子である。得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、ヒトにおいて、好ましくは免疫原性が減少し、薬物動態が改善される（Knight et al., 1993）。
【００７２】
したがって、さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体はヒト化ＩＬ−１８抗体である。ヒト化抗ＩＬ−１８抗体の好ましい例は、たとえば欧州特許出願第０９７４６００号明細書に記載されている。
【００７３】
さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体は、完全にヒト由来のものである。ヒト抗体を産生する技術は、たとえば国際公開第００／７６３１０号パンフレット、国際公開第９９／５３０４９号パンフレット、米国特許第６，１６２，９６３号明細書またはオーストラリア特許第５３３６１００号明細書に詳細に記載されている。完全なヒト抗体は、好ましくは、全てまたは一部の機能的なヒトＩｇ座を有するトランスジェニック動物（たとえば異種マウス（Xenomice））において産生される組換え抗体である。
【００７４】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環改変誘導体である。それらアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的な誘導体は、とくにＩＬ−１８と結合するというＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を残し、好ましくは、本質的には少なくともＩＬ−１８ＢＰと類似した活性を有する。理想的には、そのようなタンパク質は、非修飾のＩＬ−１８ＢＰと比較して増大した生物学的活性を有する。好ましい活性画分は、ＩＬ−１８ＢＰの活性よりも優れた活性を有するか、もしくはより優れた安定性またはより低い毒性もしくは免疫原性などのさらなる利点を有し、または大量に産生することがより容易であるか、もしくは精製がより容易である。
【００７５】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのスプライシング変異体／アイソフォームの配列は、２０００年のキム（Kim）らによるものだけでなく、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたは１９９９年のノービック（Novick）らによって提供される。
【００７６】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体は、安定性、半減期、生物学的利用能、人体による寛容または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するために、ポリマーと結合されてもよい。これらの目標を達成するために、機能的誘導体は、アミノ酸残基の１つまたはそれ以上の側鎖に存在し、１つまたはそれ以上の官能基に付加される少なくとも１つの部分を有し得る。そのような官能基はたとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ポリエチレングリコール化（PEGylation）は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている周知の方法によって行なわれる。
【００７７】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤、とくにＩＬ−１８ＢＰはポリエチレングリコール化される。
【００７８】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、免疫グロブリンの全てまたは一部に融合したＩＬ−１８結合タンパク質の全てまたは一部からなる融合タンパク質である。当業者であれば、得られる融合タンパク質が、とくにＩＬ−１８への結合といったＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を保持することを理解するだろう。融合は、直接または、１から３アミノ酸残基長、またはより長いたとえば１３から２０アミノ酸残基長の短いリンカーペプチドを介してなるものであってよい。該リンカーは、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＩＬ−１８ＢＰ配列と免疫グロブリン配列とのあいだに導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液内での長い滞留時間（半減期）、増大した特異的な活性、上昇した発現レベルまたは融合タンパク質の精製が容易になるなどの改善された性質を有する。
【００７９】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、それは、たとえばヒトのＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合される。ＩＬ−１８ＢＰおよび免疫グロブリンの部分を含む特異的な融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。ＩｇＧ2もしくはＩｇＧ4、またはたとえばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスのアイソフォームなど、Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明における融合タンパク質の産生に適する。融合タンパク質は、モノマーまたはマルチマー、ヘテロもしくはホモのマルチマーであり得る。
【００８０】
インターフェロンは、ウイルス複製および細胞増殖に対する阻害効果が広く知られている。インターフェロン−γは、たとえば、免疫および炎症応答の促進において重要な役割を果たす。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β、すなわちＩ型インターフェロン）は、抗炎症性の役割を果たすといわれている。
【００８１】
本発明は、したがって、ＣＮＳ損傷の治療用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤とインターフェロンとの組合わせの使用にも関する。
【００８２】
インターフェロンはまた、そのタンパク質の安定生を改善するために、ポリマーに共役し得る。インターフェロンβとポリオール  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との間の共役は、たとえば、国際公開第９９／５５３７７号パンフレットに記載されている。
【００８３】
そのほかの本発明の好ましい実施態様において、インターフェロンは、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、より好ましくはＩＦＮ−β  １ａである。
【００８４】
ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤は、好ましくは、インターフェロンと同時に、連続的または別々に使用される。
【００８５】
腫瘍壊死因子は、脳損傷において保護的および毒性の効果の両方を有することが文献に記載されている（Shohami et al., 1999）。以下の実施例１において、深刻な脳外傷ののちのマウスへのＴＮＦ注入により、脳内のＩＬ−１８レベルが有意に減少したことから、これは、ＴＮＦが外傷性脳損傷の回復において有用な効果を有し得ることを示している。したがって、本発明の好ましい実施態様は、同時使用、連続使用または個別使用として、脳損傷の治療および／または予防用医薬の製造のためにＴＮＦを組合わせたＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００８６】
本発明によると、ＴＮＦαとＩＬ−１８阻害剤との組合わせが好ましい。
【００８７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、医薬は、さらにＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症剤）などの抗炎症剤を含有する。好ましい実施態様においてはＣＯＸ−阻害剤、最も好ましくはＣＯＸ−２阻害剤が、ＩＬ−１８阻害剤と組合わせて使用される。ＣＯＸ−阻害剤は、当技術分野に周知である。特定のＣＯＸ−２阻害剤は、たとえば国際公開第０１／００２２９号パンフレットに記載されている。その活性成分は、同時、連続的または別々に使用され得る。
【００８８】
酸化ストレス、とくに活性酸素種（ＲＯＳ）は、脳損傷の病理生理学において役割を果たすことが記載されている（Shohami et al., 1997）。
【００８９】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、医薬はさらに、同時使用、連続使用または個別使用として抗酸化剤を含有する。ビタミンＡ、ＣもしくはＥ、または５−アミノサリチル酸、またはスーパーオキシド・ジスムターゼなど、多くの抗酸化剤は当技術分野において周知である。
【００９０】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【００９１】
さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重、または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【００９２】
本発明はさらに、ＣＮＳ損傷の予防および／または治療のための医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤、ムテイン、機能的誘導体、またはそれらの活性画分のコード配列を含む核酸分子の使用に関する。
【００９３】
たとえば本発明のＩＬ−１８阻害剤を投与するための遺伝子治療を利用するために、核酸分子は、さらに発現ベクターの配列を含むことが好ましい。
【００９４】
核酸分子は、筋肉内に投与されることが好ましい。
【００９５】
ＣＮＳ損傷を治療および／または予防するために、ＩＬ−１８の産生および／または作用の阻害剤の配列を含む遺伝子治療ベクターは、病的組織に直接注入され得る。たとえば、遺伝子治療ベクターの全身投与には、ベクターの希釈、標的細胞または組織に到達ならびに標的するベクターの希釈、および副作用という避けるべき問題が関与する。
【００９６】
通常ＩＬ−１８阻害剤が発現されていない細胞、または阻害剤の発現量が充分ではない細胞において、ＩＬ−１８阻害剤の内因的な産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用もまた、ＣＮＳ損傷の治療および／または予防に関する本発明において意図される。そのベクターは、ＩＬ−１８阻害剤を発現することが所望される細胞において機能する調節因子からなる。そのような調節配列または因子は、たとえばプロモーターまたはエンハンサーであり得る。その調節配列は、そののち相同組換えによってゲノムの適当な座に導入されてもよく、したがって作動可能に調節配列と遺伝子とを結合させることにより必要とされる発現が誘導または増強される。その技術は、通常「内在性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００９７】
同じ技術で、ＩＬ−１８阻害剤を使用せずに直接ＩＬ−１８の発現を抑えることが可能であることは、当業者によって理解されるであろう。そのようにするためには、たとえばサイレンシング因子のような負の調節因子をＩＬ−１８の遺伝子座に導入することによって、ＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたは予防を導くことができる。そのようなＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または治療するためのＩＬ−１８阻害剤の使用と同じ効果を有することは、当業者に理解されるであろう。
【００９８】
本発明はさらに、ＣＮＳ損傷の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤を産生するために遺伝子的に改変された細胞の使用に関する。
【００９９】
本発明はさらに、治療に有効な量のＩＬ−１８阻害剤および／または治療に有効な量のインターフェロンおよび／または治療に有効な量のＴＮＦおよび／または治療に有効な量の抗炎症剤および／または治療に有効な量の抗酸化剤を含有する医薬組成物、詳細には、炎症性ＣＮＳ損傷の予防および／または治療に有用な医薬組成物に関する。
【０１００】
ＩＬ−１８阻害剤として、前記組成物は、カスパーゼ−１阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体のあらゆるサブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と拮抗し、かつＩＬ−１８受容体を遮断するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、同じ活性を有するそれらのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分または循環改変誘導体を含有する。
【０１０１】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、または循環改変誘導体は、前記したように、医薬組成物の好ましい活性成分である。
【０１０２】
医薬組成物に含有されるインターフェロンは、好ましくはＩＦＮ−βまたはＩＦＮ−αである。
【０１０３】
ほかのより好ましい実施態様において、医薬組成物は、治療に有効な量のＴＮＦαを含有する。本発明による医薬組成物は、さらに１つまたはそれ以上のＣＯＸ阻害剤を含有する。
【０１０４】
「薬学的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の効果を妨げず、投与される宿主に対する毒性がないあらゆる担体を包含することを意図する。たとえば、非経口投与において、活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルで注射用の単位投与形態に処方されてもよい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物の活性成分は、さまざまな方法で個体に投与され得る。投与経路は、皮内、経皮的（たとえば、徐放性製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、直腸、局部および鼻腔内の経路を含む。その他に、たとえば上皮または内皮組織を介した吸収作用、または活性剤をコードするＤＮＡ分子を（ベクターを介して）患者に投与し、インビボでその活性剤を発現および分泌させる遺伝子治療を、治療に有効な投与経路として用いることができる。さらに、本発明によるタンパク質は、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの、生物学的活性剤の他の成分と共に投与することができる。
【０１０６】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与に対して、活性タンパク質は、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等脹を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）とともに、溶液、懸濁液、乳液または親水性の粉末として製剤化され得る。その製剤は、通常用いられる技術によって滅菌される。
【０１０７】
本発明による活性タンパク質の生物学的利用能もまた、ＰＣＴ特許出願の国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように、たとえば分子をポリエチレングリコールに結合するなど、ヒトの体内での分子の半減期を延ばす接合方法を用いることによって改良されることができる。
【０１０８】
活性タンパク質の治療に有効な量は、アンタゴニストのタイプ、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストによって示される残留細胞毒性の活性、投与経路、患者の臨床症状（内因性のＩＬ−１８活性を非毒性レベルに維持するという望ましさを含む）を含む、多くの変数の関数であるだろう。
【０１０９】
「治療に有効な量」とは、投与した場合、ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する結果となる量である。単回投与または複数回投与として個体に投与される用量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬学動態特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、症状の程度、同時進行中の治療、治療頻度および望ましい効果などのさまざまな因子に依存して変化するであろう。確立された投与量範囲の調整および取扱いは、個体においてＩＬ−１８の阻害を測定するインビトロおよびインビボ方法と同様、当業者の能力の充分範囲内である。
【０１１０】
本発明によれば、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重または約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重または約１〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。あるいは、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、または約１〜１００μｇ／ｋｇ体重、または約１０〜５０μｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【０１１１】
本発明により好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、本発明によればさらに好ましい。ＩＬ−１８阻害剤をその作用させる場所に直接投与するために、頭蓋内または鞘内経路を介して投与することも好ましい。頭蓋内経路は、開放性頭部外傷（脳の弾丸型損傷）との組合わせにおいて、とくに好ましい。
【０１１２】
さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、毎日または１日おきに投与される。
【０１１３】
毎日の投与は、通常望ましい結果を得るために有効な、間隔をあけた投与または持続的な放出剤形で与えられる。２回目以降の投与は、個体に最初または事前に投与された用量と同じ、それより少ないまたはそれより多い用量で行なうことができる。２回目以降の投与は、疾患の発症中またはそれ以前に投与されることができる。
【０１１４】
本発明によれば、ＩＬ−１８阻害剤は、治療に有効な量で、ほかの治療養生法または薬剤（たとえば多剤養生法）、とくにインターフェロンおよび／またはＴＮＦおよび／または、ほかのＣＯＸ阻害剤などの抗炎症剤、および／または抗酸化剤より前に、または同時に、または連続的に、個体に予防的または治療的に投与されることができる。脳損傷に依存して、ＴＮＦそのものの代わりにＴＮＦアンタゴニストとの併用投与も考えられる（Shohami et al., 1999）。他の治療薬と同時に投与される活性剤は、同じまたは異なる組成物で投与されることができる。
【０１１５】
本発明はさらに、薬学的に許容し得る担体と有効量のＩＬ−１８阻害剤および／またはインターフェロンおよび／またはＴＮＦアンタゴニストおよび／またはＣＯＸ阻害剤を混合することからなる医薬組成物の製造方法に関する。
【０１１６】
本発明はさらに、医薬的に有効量のＩＬ−１８阻害剤を、治療を必要とする患者に投与することからなるＣＮＳ損傷の治療方法に関する。
【０１１７】
雑誌の論文もしくは要約、公開されたもしくは未公開の米国もしくは外国特許出願、公布された米国もしくは外国特許またはそのほかの参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献は、該引用文献で紹介された全てのデータ、表、図および文章を含めて、完全に本明細書中での言及によって包含されている。さらに、本明細書で引用された参考文献内で引用された参考文献の完全な内容もまた、言及によって完全に包含される。
【０１１８】
既知の方法手段、常套的な方法手段、既知の方法または常套的な方法への言及は、本発明のあらゆる局面、記載または実施態様が関連技術において開示、教示または示唆されるものであると認めるものではない。
【０１１９】
特定の実施態様の先行する記載は、第三者が、当業者の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験をすることなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、特定の実施態様などのさまざまな適用のために、容易に修飾および／または適応させることができるほど、本発明の全体的な性質を充分に示すものであろう。したがって、本明細書で紹介された教示および手引きに基づいて、そのような適応および修飾は、開示された実施態様と同等の範囲の意味であると意図される。本明細書の用語または術語は、本明細書で紹介された教示および手引きによる見地と当業者の知識とを組み合わせて、当業者に理解されるものであるため、本明細書での用語または術語は、説明を目的とするものであって限定するためのものではない。
【０１２０】
今や本発明について記載したので、説明のために提供され、本発明を限定するためのものでない、以下の実施例への言及によって容易に理解されるだろう。
【実施例】
【０１２１】
材料と方法
外傷モデル
本研究に使用したマウスは、８〜１６週齢の体重３０〜３５ｇのオスであった。そのマウスらを特定の無菌環境下で飼育し、４〜６匹の檻の中で、標準状態の温度および光を維持し、餌および水を適宜与えた。本研究は、イスラエルのエルサレムのヘブライ大学のインスティテューショナル  アニマル  ケア  コミッティーのガイドラインに基づいて行なわれた。実験的ＣＨＩは、前もって開発された重錘落下器材（weight-drop device）を用いて行なった（Chen et al. 1996）。簡単に言えば、エーテル麻酔の誘導後、縦方向の正中切開を行ない、皮膚を剥がし、頭蓋を露出させた。左前部の前頭骨領域を識別し、付刃テフロン（登録商標）コーン（tipped teflon cone）を、前額面で中線に〜１ｍｍ横に設置した。頭部を固定し、７５ｇの錘を１８ｃｍの高さからコーン上に落下させ、左脳半球に局所の損傷を与えた。外傷ののち、マウスは１００％Ｏ2による支持酸化（supporting oxygeneration）を２分だけ受け、檻に戻された。
【０１２２】
マウスの脳におけるＩＬ−１８レベルの評価
頭蓋内ＩＬ−１８レベルを定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）株のマウス（総数  ｎ＝６２）を、６つの別の群に割り当てた。（１）「正常対照」；未処理のＢ６マウス（ｎ＝１０）。（２）「エーテル麻酔」；１０分間エーテルで麻酔し、２４時間後（ｎ＝１０）または７日後（ｎ＝１０）に骨頭切除したマウス。（３）「偽手術」；麻酔および縦方向の頭皮切開を受け、２４時間後（ｎ＝１５）または７日後に犠牲死させたマウス。（４）「外傷群」；実験的ＣＨＩを前記したように行ない、動物を、外傷後４時間（ｎ＝７）、２４時間（ｎ＝７）、７日（ｎ＝７）にエーテル麻酔において骨頭切除した。（５）「ＴＮＦ注入」；大脳内ＩＬ−１８の調節におけるＴＮＦの潜在的な役割を評価するために、マウスをエーテル麻酔し、１０μｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２００ｎｇのマウス組換えＴＮＦ（R&D Systems, Abingdon, UK）を脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入し、２４時間後に犠牲死させた（ｎ＝１０）。（６）「模擬注入（mock injection）」；これらの動物は、ＴＮＦ注入動物に対する対照群として、ビヒクルのみ（１０μｌ  滅菌ＰＢＳ）をｉ．ｃ．ｖ．注入し、２４時間後に犠牲死させた（ｎ＝６）。全てのマウスにおいて、骨頭切除後すぐに脳を摘出し、液体窒素において素早く凍結させ、解析まで−７０℃で保存した。外傷群由来の脳は、損傷  対  無損傷の脳半球においてＩＬ−１８レベルを比較するために、左（同側）および右（反対側）の脳半球に分離した。ポリトン（Polyton）（Kinematica, Kriens, Switzerland）で、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ（ｐＨ  ７．２）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００  １％（Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerland）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（cocktail）（Boehringer Mannheim）を含有する１：４で希釈された氷冷抽出緩衝液（Ｗ／Ｗ）を用いて、組織のホモジナイゼーションを行なった。ホモジネートは９０分間氷上で振とうし、ついで１５分間３，０００ｇおよび４℃で遠心した。上清を等分し、解析まで−７０℃で保存した。脳抽出物中の全タンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Bio Rad Laboratories, Munich, Germany）で測定し、評価された全てのマウスにおいて、非常に一定していることが見出された（１２．１±２．１ｍｇ／ｍｌ；平均±ＳＤ）。大脳内サイトカインレベルの定量は、取扱説明書（R&D Systems, Abingdon, UK）にしたがって、マウスＩＬ−１８に特異的なＥＬＩＳＡによって行なった。アッセイの感度は５ｐｇ／ｍｌであった。異なる動物群間の大脳内ＩＬ−１８レベルの比較において、検出限界である５ｐｇ／ｍｌ未満の濃度は、全て４．９ｐｇ／ｍｌという値を指定した。試料を２つのウェルに未希釈のものを入れ、最終濃度を２つの試料の平均ＯＤから算出した。ＯＤは分光光度計（Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA）によって消光波長４０５ｎｍで測定した。
【０１２３】
ＩＬ−１８ＢＰ処置のプロトコル
ヘブライ大学株のオスのイスラエル生まれのマウス（ｎ＝４０）を、ＩＬ−１８ＢＰの研究のために使用した。麻酔および実験的ＣＨＩを前記のように行なった。処置プロトコルに対して、動物を２つの群に分けた。Ａ群（「対照群」、ｎ＝１６）において、マウスを実験的ＣＨＩに供し、１時間後にビヒクルのみ（ＰＢＳ）を注入し、ついで神経評価のために７日間観察した（以下参照）。Ｂ群（「研究群」、ｎ＝１８）において、マウスは、ＣＨＩ後ｔ＝１時間での神経スコアの測定直後、５０μｌのＩＬ−１８ＢＰをｉ．ｐ．注入された。同じ実験モデルで前もって測定したように、血液脳関門の透過性はＣＨＩ後１〜４時間の間は５〜６倍上昇するため（Chen et al. 1996）、ＩＬ−１８ＢＰはそれらの状況下の脳に対して利用可能である。マウスのさらなる２つの群をＡおよびＢ群にしたがって処理し（それぞれ、Ｃ群：「対照群」；Ｄ群：「研究群」）、以下に記載するように、４８時間後に骨頭切除し、引き続き外傷後浮腫の評価のために脳切開を行なった。
【０１２４】
神経損傷の評価
外傷後神経損傷の評価のために、神経重症度スコア（Neurological Severity Score）（ＮＳＳ）が前もって開発され、有効なものとされている（Stahel et al., 2000）。
【０１２５】
前記スコアは、運動機能、敏捷および生理的行為における１０個の臨床的な課題からなり、それによって、課題の失敗に対して１点与えられ、成功に対してゼロ点が与えられる（表４）。最大ＮＳＳである１０点は、全ての課題を失敗した深刻な神経機能障害を示し、一方ゼロのスコアは、健康な損傷を受けていないマウスによって達成される。外傷後１時間のＮＳＳは、損傷の初期の重症度を示し、臨床結果に非常に相関する（Beni-Adani et al. 2001）。課題行為の評価は、その研究グループを知らない２人の研究者によって、実験的ＣＨＩ後１時間、２４時間、７２時間および７日の時点で行なった。ｔ＝１時間のＮＳＳとその後の時点でのＮＳＳとの間の相違として算出したΔＮＳＳは、以前記載したように（Chen et al. 1996）、脳損傷ののち自然に回復する程度を示すパラメーターである。
【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
脳浮腫の評価
脳浮腫の程度を、以前に記載したように（Chen et al. 1996）、損傷した脳半球における組織の水分含量を測定することによって評価した。簡単に言えば、外傷後４８時間でマウスを前記したように麻酔し、なおその時点は浮腫がこのモデル系においてなお有意である時点と一致する（Chen et al. 1996）。骨頭切除ののち、小脳および脳幹を摘出し、外傷部位に隣接する領域由来、および皮質の脳半球由来の〜２０ｍｇの皮質の断片を調製した。右（無損傷）脳半球を内在的な対照として使用した。組織切片の重量を測定し、２４時間９５℃で乾燥した。「乾燥」切片の重量を測定後、脳の水分含量のパーセンテージを以下のように算出した。
％Ｈ2Ｏ＝［（湿重量−乾燥重量）×１００］／湿重量
【０１２８】
脳損傷患者
チューリッヒの大学病院の外傷部門に収容される、単独の重症なＣＨＩの１０人の患者（平均年齢±ＳＤ：３７±１０歳；幅２４〜５７歳；９人の男性および１人の女性）は、本研究に含まれる。全患者は、心肺機能蘇生ののち、グラスゴー  コーマ  スケール（ＧＣＳ）スコア≦８を有した（Teasdale and Jennett, 1974）。ＣＴスキャン評価ののち全患者は、頭蓋内圧（ＩＣＰ）が１５ｍｍＨｇを超える場合、治療上ＣＳＦを排水するために脳室内カテーテルを受けた。ステロイドにより治療された患者はいなかった。胸部、腹部、骨盤、脊髄の損傷または長骨骨折を随伴するため、介入を必要とする複数の損傷を有する患者は、本研究では除外した。個々の結果は、グラスゴー  アウトカム  スケール（Glasgow Outcome Scale）（ＧＯＳ）を用いて評価した（Jennett and Bond, 1975）。ＣＳＦおよび血清収集に対するプロトコルは、チューリッヒの大学病院の倫理委員会によって承認された。
【０１２９】
試料収集およびＩＬ−１８解析
ＣＨＩ患者（ｎ＝１０）のＣＳＦおよびそれと一致する血清試料を、ある一定の時点で毎日収集した。対照ＣＳＦを、診断の脊椎穿刺を受けた患者から収集した（ｎ＝５）。それらの患者は、タンパク質、糖および細胞数の正常ＣＳＦ値に基づき、炎症性ＣＮＳ疾患の徴候を有さなかった（データは示さない）。ＣＨＩ群において、たとえばＩＣＰが２４時間以上、正常範囲（≦１５ｍｍＨｇ）を保持しており、心室カテーテルが早急に除去される場合を除いて、試料収集を外傷後１０日間行なった。合計１０６の一致するＣＳＦおよび血清試料を本研究において解析される外傷患者から収集した。全ての試料を収集後すぐに遠心し、等分し、解析まで−７０℃で保存した。ＣＳＦおよび血清におけるＩＬ−１８レベルの定量は、商業的に利用可能なキット（R&D Systems, Abingdon, UK）を用いるヒトＩＬ−１８に特異的なＥＬＩＳＡにより行なった。マウスアッセイと同様に、ＥＬＩＳＡの感度は５ｐｇ／ｍｌであり、最終ＩＬ−１８濃度は４０５ｎｍの消光波長時で２つの試料において決定された平均ＯＤから算出した。ＣＨＩ患者と対照との間のＩＬ−１８ＣＳＦレベルの比較について、検出限界である５ｐｇ／ｍｌ以下の濃度は全て、４．９ｐｇ／ｍｌの値を指定した。
【０１３０】
データ解析
データの統計解析を、商業的に利用可能なソフトウエア（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＰＳＳ  ９．０）により行なった。神経スコア（ＮＳＳおよびΔＮＳＳ）などの本来は分配されないデータの解析のために、条件のないＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕテストを使用した。不対スチューデントｔ検定（unpaired Student's t-test）を、異なるマウス群において大脳内ＩＬ−１８濃度を比較するため、およびＩＬ−１８ＢＰ処置マウス  対  ビヒクル注入マウスにおける脳の水分含量の相違の解析のために使用した。ＣＨＩ患者における毎日のＣＳＦ  対  一致する血清試料、または外傷  対  対照ＣＳＦのいずれかにおけるヒトＩＬ−１８レベルの比較を、反復測定分散分析（repeated measures ANOVA）に関する一般的な線形モデルを用いて決定した。＜０．０５のｐ値は、統計的に有意であるとみなした。
【０１３１】
結果
実施例１：マウスにおける大脳内ＩＬ−１８レベル
図１に示すように、ＩＬ−１８を、未処理（「正常」）対照マウスであるＢ６株（ｎ＝１０）の脳ホモジネートにおけるＥＬＩＳＡによって決定したところ、平均レベル２７．７±１．７［±ＳＥＭ］ｎｇ／ｍｌであった。実験群において、エーテル麻酔のみまたは「偽」手術との組合わせ（すなわちエーテル麻酔および縦方向の頭皮切開）による誘導により、頭蓋内ＩＬ−１８レベルは、それぞれ４８．９±１．１ｎｇ／ｍｌ（「エーテル」群、ｎ＝８）および５４．３±２．７ｎｇ／ｍｌ（「偽」群、ｎ＝１３）に有意に上昇した（ｐ＜０．０１  対  「正常」マウス、不対スチューデントｔ検定；図１）。「エーテル」処理された動物と「偽」処理された動物間の相違は、統計学的有意性はなかった（ｐ＝０．１６）。
【０１３２】
外傷群（ｎ＝２１）において、ＣＨＩの誘導により、損傷した脳半球および反対側の脳半球の双方において、外傷後４時間以内（それぞれ、６０．６±３．３および５９．８±５．０ｎｇ／ｍｌ）、および２４時間以内（それぞれ、５６．９±２．１および５６．３±３．７ｎｇ／ｍｌ）においてＩＬ−１８レベルが上昇したが、そのレベルは「エーテル」または「偽」群と比較して有意に高いものではなかった（ｐ＞０．０５）。
【０１３３】
これと比較して、ＣＨＩ後第７日までに、エーテル麻酔された動物または偽手術をされた動物と比較して大脳内ＩＬ−１８濃度の有意な上昇が損傷した脳半球においいて検出され（それぞれ、６７．６±５．１ｎｇ／ｍｌ  対  ４２．２±０．８、および４５．２±０．５ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０１）、一方、反対側の脳半球におけるＩＬ−１８レベルは、それら２つの対照群を有意に超えて上昇したものではなかった（６３．２±６．０ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝０．０６）。
【０１３４】
ＴＮＦ（すなわち大脳内ＩＬ−１８レベルの調節に関するこの外傷モデルにおける炎症の重要なメディエーター（Shohami et al. 1999））の役割を評価するために、Ｂ６マウスの追加の群（ｎ＝１０）に、１０μｌ滅菌ＰＢＳ中２００ｎｇマウス組換えＴＮＦをｉ．ｃ．ｖ．注入し、２４時間後に犠牲死させた。図１に示すように、ビヒクルのみによる「模擬」注入（ｎ＝６）により、未処理の正常Ｂ６マウスに比較して、２４時間以内に大脳内ＩＬ−１８は有意にアップレギュレーションされた（５３．６±３．９  対  ２７．７±１．７ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．００１）。
【０１３５】
ＴＮＦの注入は、「模擬」注入した対照群２４時間（５３．６±３．９ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．００１）と比較して、２４時間以内の頭蓋内区画におけるＩＬ−１８レベルの有意な減少を誘導した（２２．１±６．９ｎｇ／ｍｌ；ｎ＝１０）。「ＴＮＦ群」におけるＩＬ−１８レベル（２７．７±１．７ｎｇ／ｍｌ）は未処理の正常マウスよりも充分低いが、このケースにおいて、相違は統計学的に有意でない（ｐ＝０．４５）、。
【０１３６】
実施例２：外傷後の神経回復におけるＩＬ−１８ＢＰ処置の効果
ＩＬ−１８阻害剤が脳損傷における回復を促進させるという仮説について研究するために、ＩＬ−１８ＢＰの単独注入後の異なる時点での回復を比較した。外傷後１時間の神経重症度スコア（ＮＳＳ）が最も正確に外傷の規模を示し、かつＭＲＩおよび組織学において見られるように損傷組織の容積に相関することを前もって明らかにした。
【０１３７】
匹敵する外傷を有する動物群を得るために、初期ＮＳＳがｔ＝１時間で評価されたのち、マウスを異なる処置群に割り当てた。図２（ＩＬ−１８ＢＰにおけるＮＳＳ（四角）  対  対照（丸））に示すように、両群は類似した初期ＮＳＳ（１ｈ）を有し（７．６９±０．３０２３および７．４４±０．３６２７、それぞれ、対照およびＩＬ−１８ＢＰ）、これは類似した損傷の重症度を示す。
【０１３８】
その後（第１〜７日）のＮＳＳの上昇は、腹腔内（ｉ．ｐ．）にＩＬ−１８ＢＰにより処置された動物は、ＮＳＳ値により明らかなようにほとんど神経障害を示さず、外傷後第７日に有意に達する（ｐ＝０．０４５）ことを示した。
【０１３９】
回復の速度を、ΔＮＳＳ（ｔ）＝ＮＳＳ（１ｈ）−ＮＳＳ（ｔ）で表し、算出した。ΔＮＳＳのより高い値は、優れた回復を示し、ゼロまたはマイナスのΔＮＳＳは、無回復または悪化を示す。図３は、２つの群のΔＮＳＳ値を示す。２つの時点、２４時間および第７日の両方で、平均ΔＮＳＳ値間の相違は有意に達した。
【０１４０】
他の実験は、外傷後３日に与えたＩＬ−１８ＢＰによる処置が効果的であるかどうか研究するために行なった。組織の処置のタイミングは重要であり、今まで治療は数時間に渡って与えられた場合に効果的であることが明らかにされている。ＩＬ−１８そのものが外傷後７日に上昇し、かつ外傷後１時間で与えられるＩＬ−１８ＢＰによる処置が、第７日にも最大の効果を導くことが見出されたため、今や外傷後３日にマウスを処理することが決められた。比較のために、他の群を１時間および第３日にＩＬ−１８ＢＰで処置した。対照群は、溶媒（ビヒクル）のみで処置した。
【０１４１】
実験の結果を図４に示す。図４から、第３日に与えた単独処置は、ＣＨＩ後１時間と第３日に再び与えたときと同じように効果的であることが明らかである。
【０１４２】
この実験は、実験マウスモデルにおける外傷性頭部損傷からの回復において、閉鎖性頭部外傷後１時間、または３日のいずれかに与えられるＩＬ−１８ＢＰの単回投与の劇的な有用な効果を証明するものである。
【０１４３】
実施例３：脳損傷後のヒトＣＳＦにおける上昇したＩＬ−１８レベル
ＩＬ−１８レベルを、１０人の重症なＣＨＩ患者由来の毎日のＣＳＦおよび血清試料において、外傷から１０日までの間評価した。患者の人口統計上の臨床データを表５に表す。
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
表５に示すように、鞘内ＩＬ−１８レベルが、外傷または炎症性神経疾患でない５人の患者由来の対照ＣＳＦと比較して、９／１０のＣＨＩ患者において有意に上昇した（ｐ＜０．０５；反復測定分散分析）。たった１人の患者（＃１０）は、対照ＣＳＦと比較しても有意に上昇していないＩＬ−１８ＣＳＦレベルを有した（ｐ＝０．３１）。ＣＳＦおよび血清におけるＩＬ−１８の平均レベルおよび個体の幅を表５に表す。
【０１４６】
とくに、ＣＳＦにおける最大ＩＬ−１８濃度（９６６ｎｇ／ｍｌ）は、対照よりも頭部損傷患者において最大２００倍高い。大脳内ＩＬ−１８は、外傷群における全ＣＳＦ試料の９０％においてＥＬＩＳＡによって検出可能であり、一方対照ＣＳＦ試料は４０％しか検出可能な大脳内ＩＬ−１８レベルを有しなかった（すなわち、＞４．９ｎｇ／ｍｌ）。８／１０のＣＨＩ患者において、平均ＩＬ−１８濃度は、血清よりもＣＳＦにおいて有意に高かった（ｐ＜０．０５；反復測定分散分析）。しかしながら、２人の患者（＃９、１０）において、血清中の平均ＩＬ−１８レベルは、表５に示すようにＣＳＦの対応濃度を上回った。
【０１４７】
これらの結果は、外傷性頭部損傷患者の脳脊髄液においてＩＬ−１８レベルの有意な上昇があることを明らかにした。ＩＬ−１８ＢＰの添加は、前記実施例２に示されるように、それらの上昇したレベルを減少し得るものであり、したがって閉鎖性頭部外傷からの回復に有用な効果を発揮し得る。
【０１４８】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】異なる条件下での全脳（斜線）、左脳半球（黒）または右脳半球（灰）における、大脳内ＩＬ−１８（ｎｇ／ｍｌ）の血清レベルを表すヒストグラムを示す。
【図２】外傷後１時間（ｈ）、２４ｈ、７２ｈまたは１６８ｈに測定された、外傷後１ｈにｉ．ｐ．投与された５０μｇのＩＬ−１８ＢＰ（四角）、またはビヒクルのみの注入（対照、丸）のいずれかのＮＳＳ（神経重症度スコア）の展開を示す。
【図３】外傷後２４ｈ、７２ｈまたは１６８ｈに測定された、外傷後１ｈにｉ．ｐ．投与された５０μｇのＩＬ−１８ＢＰ（四角）、またはビヒクルのみの注入（対照、丸）のいずれかのΔＮＳＳを示す。
【図４】外傷後１ｈ、２４ｈ、３日（ｄ）、７ｄまたは１４ｄに測定された、外傷後３ｄの単回投与（ダイヤ）、または外傷後１ｈおよび３ｄの２回投与（四角）としてｉ．ｐ．投与された５０μｇのＩＬ−１８ＢＰ、またはビヒクルのみの注入（対照、三角）のいずれかのΔＮＳＳを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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