(57)【要約】移植レシピエント、特に非ヒト哺乳類（例えばブタ）臓器のヒト異種移植片レシピエントにおいて、造血キメラ現象を創生し、長期安定免疫学的寛容性を誘導するための、胸腺−骨髄混成組織構築物および混成臓器。
2004500914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）機能的胸腺組織を含む血管新生可能第１組織成分；
（ｂ）第１組織成分に組織適合性である、骨髄の機能的造血間質微小環境（ＨＳＭ）を含む、血管新生可能第２組織成分；および
（ｃ）該第１および第２組織成分を密接な関係に維持するための支持手段
を含む、哺乳類にインプラントするための混成組織構築物。
【請求項２】
第１成分の機能的胸腺組織の少なくとも一部と第２組織成分の骨髄の機能的ＨＳＭの少なくとも一部が接触関係にある、請求項１に記載の混成組織構築物。
【請求項３】
第１成分の機能的胸腺組織および第２組織成分の骨髄をブタから得る、請求項１に記載の混成組織構築物。
【請求項４】
支持手段が哺乳類腸管嚢の切片を含む、請求項１に記載の混成組織構築物。
【請求項５】
（ａ）哺乳類の血管循環に接合するための手段を有する哺乳類臓器、
（ｂ）機能的胸腺組織を含む血管新生可能第１組織成分；および
（ｃ）骨髄の機能的造血間質微小環境（ＨＳＭ）を含む、該第２組織成分と密接な関係にある、血管新生可能第２組織成分
を含み、該第１および第２成分が哺乳類臓器に組織適合性である、移植のための混成臓器。
【請求項６】
第１成分の機能的胸腺組織の少なくとも一部と第２組織成分の骨髄の機能的ＨＳＭの少なくとも一部が接触関係にある、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項７】
第１組織成分および第２組織成分が、第１および第２組織成分の血管新生を可能にする生体適合性支持手段に包含されている、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項８】
腎臓である、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項９】
心臓である、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項１０】
哺乳類臓器がブタのものである、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項１１】
第１および第２組織成分が自己または非自己ブタ起源である、請求項５に記載の混成臓器。
【請求項１２】
請求項５に記載の混成臓器を含む、非ヒト哺乳類。
【請求項１３】
ブタである、請求項１１に記載の混成臓器を含む非ヒト哺乳類。
【請求項１４】
（ａ）非ヒト哺乳類の移植可能臓器を選択する；
（ｂ）該移植可能臓器に機能的胸腺組織を含む第１組織成分をインプラントする、および
（ｃ）該移植可能臓器に、該第１組織成分と密接な関係に、骨髄の機能的ＨＳＭを含む第２組織成分をインプラントする
ことを含み、該第１および第２組織成分は臓器に組織適合性である、混成臓器の製造法。
【請求項１５】
第１および第２組織成分を同時にインプラントする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１組織成分および第２組織成分が、該組織成分の血管新生を可能にする生体適合性支持手段に包含されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２組織成分が接触関係にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
移植可能臓器が腎臓である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
移植可能臓器が心臓である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
移植可能臓器がブタのものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
第１および第２組織混成物が自己または非自己ブタ起源である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インビボで行なう、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳類ドナー臓器のヒト移植レシピエントにおいて免疫学的寛容性を誘導する方法であり、
（ａ）ドナー哺乳類臓器に組織適合性である、機能的胸腺組織を含む血管新生可能第１組織成分、および、第１組織成分と密接に関係し、骨髄の機能的造血間質微小環境（ＨＳＭ）を含む、血管新生可能第２組織成分を含むために、外科的に適合させた哺乳類ドナーを調製すること、および
（ｂ）該適合臓器を該レシピエントにインプラントする
ことを含み、それにより該臓器の該ヒト移植レシピエントに免疫学的寛容性を誘導する、方法。
【請求項２４】
哺乳類ドナー臓器が腎臓である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類ドナー臓器が心臓である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳類ドナー臓器が同種異系である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳類ドナー臓器が異種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳類ドナー臓器がブタのものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、混成組織インプラント、臓器移植に使用するための該混成組織インプラントから成る哺乳類臓器、該臓器を含む非ヒト哺乳類、および哺乳類移植レシピエントにおける造血キメラ現象および安定なドナー特異的免疫学的寛容性を達成する方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
ドナー特異的免疫学的寛容性の誘導は、同種異系および異種移植研究における捕らえにくい目的のままである。用語“免疫学的寛容性”は、寛容性が誘導された抗原での攻撃に対する、患者被検体の免疫系による不応答の状態を意味する。移植設定において、特に、免疫応答を昂ずる移植片レシピエントの能力の阻害を意味し、その免疫応答はそうでなければ移植片のレシピエントへの非自己ＭＨＣ抗原の導入に対する応答して起こる。
【０００３】
近年の試験は、移植片レシピエント（すなわち、“宿主”）における免疫学的寛容性の発生の手段として胸腺移植片に焦点が当てられている。例えば、Ｎｉｋｏｌｉｃおよび共同研究者らは、免疫敷衍マウスにおけるブタ胸腺移植片が、ポリクローナル、機能的ヒトＴ細胞の正常な発生を支持すること；およびＴ細胞が、ドナー特異的ＭＨＣ  Ａｇｓに特異的に寛容性であったことを示している、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９９， １６２：３４０２−３４０７ （１９９９）。Ｚｈａｏおよび共同研究者らは、一過性に免疫抑制したマウスへのブタ胎児胸腺および肝臓の移植が、続くブタ皮膚移植片に対する寛容性をマウスレシピエントに付与することを報告している、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：１２１１−１２１６ （１９９６）。
【０００４】
Ｌａｍｂｒｉｇｔｓおよび共同研究者らは、自己胸腺移植塩を腎臓皮膜下にまたはブタモデルの腎臓において含む、“胸腺−臓器”の概念を導入している［Ｌａｍｂｒｉｇｈｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３：２９６− （１９９６）］；および後に移植された心臓における胸腺組織の得られた安定な心臓内生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）を得ることを報告している［Ｌａｍｂｒｉｇｈｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６６：８１０− （１９９８）］。Ｙａｍａｄａおよび共同研究者らは、ミニチュア・ブタモデルにおいて、１２日コースのサイクロスポリンを投与された、混成同種異系“胸腺腎臓”（腎臓とその皮膜下に血管新生した自己胸腺組織）の、胸腺摘出クラスＩ異種レシピエントは、安定な腎臓機能を有し、拒絶反応およびドナー特異的不応答の証拠はなかった。手術後（“ＰＯＤ”）１４日目までに、胸腺腎臓における胸腺組織は、レシピエント型樹状細胞を含んだ；そしてＰＯＤ６０日目までに、レシピエント型クラスＩ陽性胸腺が胸腺髄質に出現し、胸腺新生（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）を示す。Ｔ細胞は、レシピエントおよびドナーＭＨＣ限定の両方であることが判明した。Ｙａｍａｄａおよび共同研究者らにより、血管新生ドナー胸腺組織のの粗内が、胸腺摘出したレシピエントにおけるクラスＩ異種腎臓異種移植片に対する寛容性の誘導をできると結論付けられた［Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：３０７９−３０８６ （２０００）； Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６８４−１６９２ （１９９９）； Ｓａｃｈｓ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９５：Ｓ６３−Ｓ６５ （２０００）もまた参照］。
【０００５】
しかし、我々は、先に記載された胸腺−臓器が、同種異系または異種移植における長期の安定な免疫学的寛容性を持続するのに不充分であると考える。特に、移植胸腺組織の必須機能の一つは、樹状細胞による自己寛容のための胸腺細胞の発生の陰性選択のための部位の提供である。今まで記載された胸腺−臓器モデルにおいて、この機能は移植片組織のドナー由来樹状細胞の不可逆的枯渇により、結局妥協する。樹状細胞は、一般に、約１ヶ月以下の半減期を有する。したがって、時間がたつと、ドナーに対する寛容性を維持するための胸腺細胞の発生の陰性選択のための能力が損失する。
【０００６】
現在、胸腺−臓器に、樹状細胞またはその前駆体の製造および能力を維持する手段は報告されていない。したがって、この分野の先の研究者により達成された見かけの寛容性は、一過性でのみ最良である。
【０００７】
本発明の要約
我々は、移植片レシピエントにおける造血キメラ現象を達成するための、および、同種異系または異種移植臓器の哺乳類レシピエントにおける、安定な長期寛容性を誘導するための、新規組成物および手段を本発明により考案した。より具体的に、本発明は、臓器レシピエントに、樹状細胞またはその前駆体を含む、ドナー（またはドナー−組織適合性）造血細胞の自己補充（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｉｎｇ）源を移植することを意図する。この新規源は、骨髄の実質的にそのままの造血間質微小環境（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｍｉｃｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（ＨＳＭ）を含む。このような実質的にそのままのＨＳＭの例は、哺乳類ドナーの骨髄から外科的に除去されている、好ましくは１−５ｍｍ３の程度のそのままの骨髄プラグまたはシリンダーを含む。分裂した組織および細胞のそうでなければ非機能的破片における幹細胞摂取物から成る、典型的な注射用骨髄調製物と異なり、本発明の新規の、実質的にそのままのＨＳＭ成分は、胸腺−臓器移植片内で持続した造血に適した微小環境を提供する。
【０００８】
特に、第１成分として、ドナー（またはドナー組織適合性）胸腺組織、および第２成分として、ドナー（またはドナー−組織適合性）骨髄の造血間質微小環境の実質的にそのままの組織を含む、混成組織構築物は、移植レシピエントにおけるドナー型樹状細胞の新たな、そして持続的な製造を提供する；そして更に、このような血管新生混成組織構築物は、ドナー胸腺に移動し、胸腺細胞分化および発育を助けることができる、ドナー型樹状細胞および他の骨髄由来細胞の持続した、自己補充源を提供する、
【０００９】
本発明の好ましい実施態様において、“胸腺−骨髄”−−−あるいは、“ｔｈｙ−ｍａｒｒｏｗ”とも記載するが−−−“混成臓器”は、直前に記載した混成組織構築物を、ドナー臓器における単一のデバイスとしてインプラントすることにより製造する。
【００１０】
本発明の別の実施態様において、胸腺骨髄混成臓器は、臓器中の上記胸腺組織成分と骨髄ＨＳＭ成分を別々にインプラントすることにより製造し得る。
【００１１】
このような胸腺骨髄混成臓器のＴ細胞枯渇またはそうでなければ条件付けしたレシピエントは、宿主の再生Ｔ細胞集団が、ドナーの骨髄由来樹状細胞の持続した存在下で（陽性および陰性選択を解して）成熟しているため、臓器に寛容性（ｔｏｌｅｒｉｚｅｄ）になる。
【００１２】
得られた混合キメラは、自己ならびにドナーに対して免疫応答性および寛容性の両方である。本発明が樹状細胞の継続した補充を提供し、レシピエント内の胸腺または末梢陰性選択またはアネルギー過程の持続した機能性、したがって移植片に対するドナー特異的寛容性の自己永続状態を確実にするため、長期寛容性が可能である。本発明は、本発明の混成組織構築物における寛容性の本質的に移植可能な、携帯用“エンジン”を提供することによる、拒絶反応または異常自己免疫応答の非存在下で、移植組織または臓器に対する長期の、安定した寛容性を確実にする手段を提供する。
【００１３】
本発明の胸腺−骨髄混成組織構築物および混成臓器は、同種異系（すなわち同じ種の）または異種（すなわち、異なる種の）臓器の哺乳類移植レシピエントにおける寛容性の誘導に利用し得る。本発明の混成組織構築物および臓器は、造血キメラ現象の創生および異種移植レシピエント、特に非ヒト哺乳類（特に、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、すなわちブタ）臓器のヒトレシピエントにおける慣用性の誘導に特に有用である。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１  本発明の寛容性誘導のための“携帯用エンジン”の実施態様の模式図である。記載の混成組織構築物は、混合された胸腺と骨髄組織切片を、腸の嚢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓａｃ）の切片に由来する支持手段内に含む（左パネル参照）。また模式的に示されるのは（右パネル）、血管新生混成物と哺乳類宿主の周りの組織を接続する血管のネットワークである。
【００１５】
図２  本発明の混成“骨髄−腎臓”、“胸腺−腎臓”および“胸腺−骨髄（別名“ｔｈｙ−ｍａｒｒｏｗ”−腎臓）”の模式図である。
【００１６】
図３  異所性にインプラントした同系の骨髄間質を含むマウス腎臓皮膜（左パネル）または腎臓皮膜下にインプラントした骨髄（右パネル）の巨視的様相である（矢印は骨髄間質および腎臓を示す）。移植（“Ｔｘ”）後５週間で、広い血管形成がＢＭインプラント部位の周りに形成されており、骨髄は白色組織として見える。
【００１７】
図４  （左パネル）図３に関連して記載したようなマウス腎臓皮膜の更なる巨視的イメージである。（右パネル）“再生”、すなわち、血管に満たされた骨髄を示す、移植後５週間の骨髄間質インプラントの断面の顕微鏡写真（２０×、Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【００１８】
図５  マウス腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、移植後４週間の異種（ヌードラットとＲＡＧ１マウス）骨髄の切片の１０×（左パネル）および４０×（右パネル）顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【００１９】
図６  マウス腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、Ｔｘ後８週（左パネル）および１６週（右パネル）の異種（ヌードラットとＲＡＧ１マウス）骨髄の切片の２０×顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【００２０】
図７  マウスモデル（Ｈ ＆ Ｅ染色）において、腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、移植後４週間の同系骨髄の１０×（左パネル）および２０×（右パネル）顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【００２１】
図８  腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、異種（ラットとマウス）骨髄のＨ ＆ Ｅ染色切片（左パネル）および免疫組織化学的染色切片（ＣＤ４５陽性白血球に関して）（右パネル）の顕微鏡写真。矢印は骨髄インプラント（左パネル）および骨髄インプラントにおけるＣＤ４５＋白血球（右パネル）を指す。
【００２２】
図９  交差反応性の不存在を確認するための、マウス脾臓のマウス抗ラットＣＤ４５染色（左パネル）およびラット抗マウスＣＤ４５染色（右パネル）断面の顕微鏡写真。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の寛容性誘導混成組織構築物は、機能的胸腺組織および骨髄の実質的にそのままの造血間質微小環境（ＨＳＭ）を含む。
【００２４】
本発明の混成組織構築物の胸腺組織成分が、天然胸腺細胞からの成熟Ｔ細胞の発育を導く、隔離されたそして構造的に組織化された（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕａｌｌｙ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）微小環境を提供することが必須である。
【００２５】
胸腺におけるＴ細胞成熟。成熟Ｔ細胞を形成するための、胸腺細胞段階を介したＴリンパ球成熟の過程は十分特徴付けされている［例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ ａ． Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ − ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｈ． ６， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９９６）参照］。簡単に、骨髄の造血間質におけるリンパ前駆体の分化により形成されたＴリンパ球が骨髄から末梢に移動し、最終的に胸腺に届き、そこで、主に皮質（一般に成熟Ｔ細胞のみを含む髄質）中で、細胞が分化および選択の種々の段階に付される。リンパ球は最初に、Ｔ細胞レセプターも二つのコレセプター分子ＣＤ４もＣＤ８も発現しない二重陰性細胞として胸腺に入り、胸腺間質として知られる上皮ネットワークに包埋され、それは分化および発育の誘導的微小環境を提供する。皮質の被膜下のゾーンにおける増殖の最初の相に続いて、リンパ球（また“皮質下リンパ芽球”とも呼ぶ）はＴ細胞レセプターおよびＣＤ４およびＣＤ８コレセプターの両方を発現する二重要請細胞に分化する。得られる、印成熟胸腺細胞（“皮質胸腺細胞”）はその後二つのタイプの選択：自己ＭＨＣ：自己ペプチド複合体の認識のための陽性選択、および自己ペプチド：自己ＭＨＣ複合体の認識のための陰性選択に付され、そうでなければ末梢におけるＴ細胞の引き金を引く。
【００２６】
胸腺細胞の陽性選択。胸腺細胞の陽性選択は、通常、ＭＨＣ担持皮質上皮細胞により皮質内に仲介される。陽性選択は、全成熟Ｔ細胞が、自己ＭＨＣにより示される外来ペプチドに応答できること、すなわち、成熟Ｔ細胞が“自己ＭＨＣ制限”であることを確実にする。胸腺上皮上で、それらの制限されているＭＨＣ分子に遭遇していない細胞は、二重陽性のままであり、胸腺中で最後の分割の後３または４日以内に死滅し、マクロファージにより清掃される。
【００２７】
陽性選択過程で生存している細胞は、二つのコレセプターＣＤ４またはＣＤ８の一つのみを発現する。加えて、成熟ＣＤ４担持Ｔ足棒は、自己ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドを認識するレセプターを有し、一方ＣＤ８担持Ｔ細胞は、自己ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを認識するレセプターを有する。したがって、陽性選択は、有効な抗原認識のために必要とされるコレセプターを備えた成熟Ｔ細胞の細胞表面表現型を定義する。
【００２８】
胸腺細胞の陰性選択。二重陽性細胞はまた、自己反応性の可能性のあるＴ細胞を除去するパージ工程に付すべきである。胸腺のパージ機能は陰性選択と呼ばれる。陰性選択は、皮質髄質接合部で最も厳重であると考えられ、そこでほとんど成熟した“髄質胸腺細胞”が、末梢リンパ組織における成熟Ｔ細胞も活性化する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と遭遇する。ＡＰＣは骨髄由来樹状（“互いにかみ合った”）細胞、ならびにマクロファージから成る。これらの細胞により提示される自己抗原は、したがって、自己免疫応答の可能性の最も重要な源であり、このような自己ペプチドに応答するＴ細胞は胸腺とも排出される。自己ペプチド：自己ＭＨＣ複合体によるクローナル欠失は、それ自体のＡＰＣにより発現される自己抗原に応答しない成熟Ｔ細胞のレパートリーを生成し、自己寛容性を確立する。生存成熟Ｔ細胞は髄質から末梢循環に出る［Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｔｒａｖｅｒｓ， ｉｄ． ａｔ ６：１５−６：３１参照］。
【００２９】
したがって、陽性および陰性選択の両方がＴ細胞レセプターの有用なそして非損傷レパートリーの製造に強制的に付随する。
【００３０】
したがって、“機能的胸腺組織”なる用語は、哺乳類において天然胸腺細胞を成熟Ｔ細胞段階に処理することができる微小環境を有する胸腺の組織を意味する。
【００３１】
したがって、本発明の混成組織構造の、ならびに混成臓器の胸腺成分は、“機能的胸腺組織”を構成するために、胸腺細胞の陽性および陰性選択を支持するための、特に、皮質上皮細胞および髄質上皮細胞を含む、胸腺間質の十分な部分を含まなければならず、ドナー自己認識およびドナー自己寛容性を有する成熟Ｔ細胞を生成する。
【００３２】
胸腺が思春期後に縮み、または退縮する傾向にあるため、実際、成人臓器ドナーから十分なまたは機能性自己胸腺組織を引き出すことが不可能でなくても、困難であり得る。したがって、本発明の一つの実施態様において、胸腺組織は臓器ドナーに組織適合性の動物に由来する。組織適合性の動物の例は、臓器ドナーと同じ同系交配種の哺乳類である。したがって、胸腺組織は、若い（またはそうでなければ新生児または胎児）ドナーブタから回収し、同じ同系交配種の成熟ブタ臓器ドナーの臓器にインプラントし得る。
【００３３】
本明細書で使用する“インプラント”または“トランスプラント”または“移植”なる用語は、組織または臓器を、組織または臓器が血管新生し始める条件下で、生存哺乳類レシピエントに挿入する行為を言及すると理解されるべきである；そしてまたいわゆる挿入した（すなわち“インプラントした”または“トランスプラントした”または“移植した”）組織または臓器も意味する。哺乳類中の移植片の血管新生に好都合な条件は、伸長した血管供給ネットワークを有する職変の部位に局在する組織床を含む。例えば、血管新生を促進するための組織または臓器の挿入のための腎臓における適当な部位は、腎臓皮膜下、柔組織の隣である。血管新生を促進するために、組織または臓器を挿入するための心臓における適当な部位は、右および左房室間溝（ｇｏｏｖｅｓ）に存在する（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）噴門上部下（ｓｕｂｅｐｉｃａｒｄｉｃａｌ）脂肪パッド；右および左心耳；大動脈・肺動脈窓；または右心室の自由壁を含む。
【００３４】
胸腺ドナーからの胸腺またはその一部の外科的除去は、胸腺間質微小環境の完全さの保護に注意して行なうべきである。胸腺組織を、注意深い切開により、その本来の環境から除去し得る。
【００３５】
本発明の混成組織構築物の第２成分は、骨髄の機能的造血間質微小環境（ＨＳＭ）を含む。ＨＳＭは胸腺組織成分ならびに臓器ドナーと組織適合性であるべきである。
【００３６】
“機能的造血間質微小環境”なる用語は、哺乳類中で造血性発育および分化を行なうことができる、微小環境を有する骨髄から得た組織を意味する。
【００３７】
造血間質微小環境。Ｔリンパ球が、分化全能の造血幹細胞に由来するリンパ先祖細胞の分化の結果として骨髄に発生する過程は、徹底的に試験されている。間質細胞は、骨髄の洞を形成する内皮細胞および含脂肪細胞、線維芽細胞および筋細胞と一致した特性を有する外膜網膜細胞を含む［Ｃｈａｂｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ６６：１１３８ （１９８５）， Ｃｈａｂｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． １８：２７６ （１９９０）］。骨髄中の間質細胞が造血のための構造的折り畳みを提供することが長い間認められている［Ｍａｙａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈａｔｍａｔ． ４９：２２５−２３３ （１９９２）］。ある試験は、直接の間質細胞と血管細胞接触、細胞外骨髄マトリックスの間質細胞製造、および間質細胞によるサイトカイン合成が、種々の血液細胞の形成に関連することを示している［出典明示により本明細書に包含させる米国特許第５，７３３，５４１号参照］。間質細胞との直接接触は、長期骨髄培養における幹細胞維持に必要であることが判明している［Ｄｅｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：４３２−４４１ （１９８７）］。造血を維持するヒト骨髄間質細胞系が確立されている［例えば、出典明示により本明細書に包含させる米国特許第５，８７９，９４０号参照］。間質細胞がドナーの造血微小環境を、同種異系骨髄移植後に移すことができることが報告されている。Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈおよび共同研究者らは、ドナー骨髄の造血間質微小環境内への移植がドナー細胞キメラ現象を増加させ、同種異系および異種移植片の両方の長期生存の条件を提供することを示すデータを報告している、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｏｉｎ ６８：１３６２−１３６８ （１９９９）。
【００３８】
本発明の胸腺骨髄混成組織構築物および臓器の造血間質成分は、組織がレシピエント内で血管再生されたら、造血発育が維持されるように十分そのままの微小乾固油を提供すべきである。
【００３９】
したがって、骨髄の外科的除去は、既知の外科的技術を使用して行い得、骨髄造血間質微小環境の完全さを保護する。骨髄の適当な源は長骨（大腿骨）および脛骨を含む。例えば、骨髄を、ＨＳＭが実質的にそのままで残るプラグを作るためのマンドリン（ｍａｎｄｒｉｎ）またはトロカールにより大腿骨から機械的に押し出し得る。
【００４０】
あるいは、文献（例えば、出典明示により本明細書に包含させる米国特許第５，８７９，９４０号参照）に記載のような、培養造血間質細胞培養物を利用して、本発明の必要な造血間質微小環境を提供し得る。
【００４１】
好ましくは、休戦組織成分および骨髄成分を大野の照射して造血先祖の数を減少させる。照射は、インビボで、すなわち、除去前に（非ヒト哺乳類ドナーの場合）および／またはエキソビボで、すなわち、除去後にレシピエントにインプラント前に、および／または非ヒトレシピエントに再インプラントした後に行ない得る。
【００４２】
骨髄は、移植のための臓器を提供するドナー哺乳類または組織適合製個体（例えば、同じ同系交配種）のいずれかから回収し得る。
【００４３】
本発明の混成組織構築物または臓器を製造するために、胸腺細胞および骨髄組織が、密接な関係で組織構築物または臓器内に配置されることが必須である。
【００４４】
“密接な関係”なる用語は、二つのタイプの組織が、骨髄組織から放出された造血細胞（例えば樹状細胞またはその前駆体）が胸腺組織に移動できるように十分密接に配置されることを意味する。
【００４５】
二つのタイプの組織の密接な関係、すなわち、密接な物理的配置は、このような密接な関係がＨＳＭ骨髄から胸腺組織への樹状細胞前駆体の有効な遷移に必要であり、そこで樹状細胞が移植片自己寛容性を維持するための胸腺細胞の継続的（ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌ）な分泌に重要な役割を担うため、寛容性誘導の達成の必須因子である。外移動は、組織柔組織、続く走化性勾配を介して、または血液循環および／またはリンパ管への挿入によるものであり得る。
【００４６】
胸腺組織成分および骨髄組織成分の少なくとも一部が直接接触しているのが非常に好ましい。直接接触している表面領域は、利用可能な胸腺および骨髄組織を部分に分け、本発明の組織混成構築物または臓器内の合わせた組織部分の多くを一緒に混ぜることにより最適化できる。あるいは、骨髄プラグを、図２に模式的に示すように、胸腺移植片組織上に付着させ得る。
【００４７】
混成物の構造完全性を維持するため、ならびに組織の密接な関係を容易にするため、組織を、封入した組織の血管新生が可能である生体適合性透過性または半透過性膜状物質で囲むのが有利である。このような物質は、簡便には、例えば、組織ドナーの腸管嚢から由来し得る。
【００４８】
したがって、本発明の混成組織構築物の一つの態様は、腸管嚢に由来する支持手段により囲まれた、一緒に混ぜられた胸腺組織の切片またはプラグおよび骨髄の組織のＨＳＭ組織を含む。このような混成組織構築物は図１に記載する。
【００４９】
製造したら、この組織が混合形式で共存するこの混成組織構築物は、腎臓または心臓のような血管新生移植可能臓器、または予め選択した臓器ドナーの他の場所に外科的にインプラントできる。
【００５０】
混成組織構築物は、哺乳類にインプラントした場合、最初に少なくとも一定量の萎縮および細胞損失に付されることは予測される。しかし、血管に富む宿主環境において、インプラントした組織は急速に宿主により血管再生され（図１、右パネルに記載のように）、組織はその正常機能を回復する。
【００５１】
したがって、移植後の限られた期間に必要な移植患者に対する慣用の免疫抑制処置を管理し得る（例えば、約＋１２０日まで、または好ましくは約＋９０日まで、例えば＋３０日まで）。適当な化合物の例は、シクロスポリン類、ラパマイシン類、またはアスコマイシン類、またはそれらの免疫抑制アナログ、例えばシクロスポリンＡ、シクロスポリンＧ、ＦＫ−５０６、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン；コルチコステロイド類；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキサート；ブレキナール；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）；デオキシスペルグアリン類（例えば、１５−デオキシスペルグアリン）およびアナログ、２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール塩酸塩、コルチコステロイド類（例えば、メトトレキサート、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン）または他の免疫調節性化合物（例えば、ＦＴＬＡ４−Ｉｇ）；抗ＬＦＡ−１または抗−ＩＣＡＭ抗体、または白血球レセプターまたはそれらのリガンドに対する抗体（例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）またはＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）に対する抗体）を含む。
【００５２】
胸腺および骨髄のＨＳＭ組織を含む本発明の混成組織構築物は、レシピエント哺乳類（例えばヒト）への最終的な移植のために、ドナー動物（例えばブタ）の予め選択した臓器に外科的に直接インプラントできる。あるいは、あまり好ましくないが、最初に混成組織構築物を製造するよりも、胸腺組織組成およびＨＳＭ骨髄組成を、別個の成分として臓器にインプラントし、本発明の混成臓器を形成することが可能である。
【００５３】
密接な関係で、および好ましくは接触関係で、移植した組織を含む得られた臓器は、“胸腺骨髄”（または“ｔｈｙ−ｍａｒｒｏｗ”）混成臓器と呼ぶ。予め選択した臓器は、例えば、腎臓、心臓、肺、複合心配、肝臓、または前立腺を含む。胸腺−骨髄（“ｔｈｙ−ｍａｒｒｏｗ”）−腎臓は図２に模式的に記載する。
【００５４】
休戦および骨髄組織のインプラントは、インビボで（すなわち、臓器がまだ生存ドナ−動物の本来の場所に存在しながら）またはエキソビボで（すなわち、臓器がドナーから除去された後であり、レシピエントにトランスプラントする前に）、または移植レシピエントにおいて、臓器血管をレシピエントの対応する血管に吻合するのと同時に、インビボでさえ、行ない得る。
【００５５】
本発明の他の実施態様において、別個の胸腺およびＨＳＭ−骨髄組織または混成組織構築物を、意図した臓器ドナーに、最初に移植する臓器にではなく、他の適当な血管に富む位置に移植し得る。混成組織構築物をついで選択した臓器に、移植までの時間を含む後の時間に移すことができる。
【００５６】
本発明の、更なる、好ましい実施態様において、混成臓器は、インビボでドナー動物中に、移植のために回収する前に、ドナー内で血管新生し始めることを可能にするのに十分な時間および条件下で、維持し得る。胸腺−骨髄−腎臓の血管新生を可能にするのに適当な滞在期間は、例えば、約１から約６ヶ月であり得る。この場合、実際の臓器移植事象（ｅｖｅｎｔ）の前に、インビボまたはエキソビボ（すなわち、ドナーから除去された後であるが、レシピエントに移植される前）で、混成臓器を、Ｔ細胞枯渇または照射により、既知の方法で、予め条件付けするのが好ましい。
【００５７】
所望により、成熟Ｔ細胞を枯渇するためのレシピエントのプレコンディショニングを、本発明の組織混成構築物または胸腺骨髄混成臓器の移植が移植に先立ち得る。プレコンディショニングは、例えば、照射により、または、患者に、ＰＣＴ  ＷＯ９８／３９３６３に記載されているような十分な抗毒素を投与し、患者のＴ細胞集団を、例えば、少なくとも２、および好ましくは少なくとも３の対数まで枯渇させる。
【００５８】
本発明の胸腺−骨髄混成組織構築物および臓器のレシピエントは、レシピエントおよびドナー起源の両方の骨髄前駆細胞を有する混合造血キメラである。成熟Ｔ細胞集団の両方のタイプは、レシピエントに存在し、ドナーＴ細胞は胸腺における陽性選択を介して、ドナーＭＨＣ＋抗原の認識に限定されている。末梢における宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫応答性相互作用が起こり得ることを確認する。加えて、このようなレシピエントは、皮質髄質接合部に局在する樹状細胞を含む、ドナーＡＰＣの自己補充源を、インプラントした胸腺組織のドナー（またはドナー組織適合性）骨髄のインプラントした造血間質微小環境から受ける。ドナー胸腺細胞がインプラントした胸腺組織中で分化し、成熟するため、それらはこの部位を通り、宿主胸腺において宿主細胞が自己に関して陰性選択されたのと同じ方法でドナーに対して陰性選択に付され、移植した個体に、自己ならびにドナーに対して免疫応答性および寛容性の両方を付与する。この方法で、本発明の胸腺−骨髄組織混成物は、移植個体に寛容性を誘導するための、“携帯用エンジン”を提供する。
【００５９】
本発明の“携帯用エンジン”は、異種移植片レシピエント、および特にブタ臓器のヒトレシピエントにおける造血キメラ現象の確立および寛容性の誘導に特に有用である。
【００６０】
以下の実施例は説明の目的のみであり、本発明の範囲をいかなる意味でも限定すると解釈してはならない。
【００６１】
実施例
腎臓皮膜下への骨髄／胸腺インプラント
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＣ５７ＢＬ／６種のドナーおよびレシピエントマウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）のカクテルで麻酔する。
【００６２】
ドナー動物の全ての長骨を除去した後、造血間質組織を骨の頚部（ｎｅｃｋ）を除去し、骨髄洞を冷等張性食塩水で流すことにより回収する。回収した骨髄を貯蔵し、試験管にペレット化する。
【００６３】
ドナー胸腺を回収し、滅菌冷食塩水を満たした滅菌組織培養皿に移す。胸腺を鋏で小片に分ける（２ｍｍ×４ｍｍ）。
【００６４】
Ａ．骨髄インプラント：
レシピエント動物をその右側に置く。左腎臓を１０から１２ｍｍの切り込みを介して曝す。１ｍｍ切片を、組織インプラントのための腎臓皮膜を通した微小チップピンセットで作り、トンネルを作る。同系骨髄組織を腎臓皮膜の下に持ってくる（図２上部パネルおよび図３左パネル）。インプラントが完了すると、腹部切開を縫って綴じる。
【００６５】
インプラントした骨髄を種々の間隔で組織学的評価のために回収する。広い血管形成が骨髄インプラント部位の回りに形成される（図３右パネル）。移植後５週間での、組織学的評価は腎臓皮膜下の“再生”骨髄を示す（図４右パネル）。
【００６６】
この再生骨髄組織はまた異種設定、すなわち、ラットとマウスにおいても、早い（図５）または遅い（図６）時点で観察される。免疫組織化学は、腎臓皮膜下に存在する細胞がドナー（すなわちラット）−起源ＣＤ４５＋白血球であることを各員する（図８、図９）。
【００６７】
Ｂ．骨髄／胸腺インプラント：
レシピエント動物の調製は上記の通りである。骨髄組織を胸腺組織に続いて腎臓皮膜下に持ってくる（図２下部パネル）。この工程を数回繰り返す。インプラントの最終サイズは約６ｍｍ×４ｍｍである。移植後４週間での組織学的評価は、腎臓皮膜下の再生骨髄および胸腺成分を示す（図７）。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の寛容性誘導のための“携帯用エンジン”の実施態様の模式図である。記載の混成組織構築物は、混合された胸腺と骨髄組織切片を、腸の嚢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓａｃ）の切片に由来する支持手段内に含む（左パネル参照）。また模式的に示されるのは（右パネル）、血管新生混成物と哺乳類宿主の周りの組織を接続する血管のネットワークである。
【図２】本発明の混成“骨髄−腎臓”、“胸腺−腎臓”および“胸腺−骨髄（別名“ｔｈｙ−ｍａｒｒｏｗ”−腎臓）”の模式図である。
【図３】異所性にインプラントした同系の骨髄間質を含むマウス腎臓皮膜（左パネル）または腎臓皮膜下にインプラントした骨髄（右パネル）の巨視的様相である（矢印は骨髄間質および腎臓を示す）。移植（“Ｔｘ”）後５週間で、広い血管形成がＢＭインプラント部位の周りに形成されており、骨髄は白色組織として見える。
【図４】（左パネル）図３に関連して記載したようなマウス腎臓皮膜の更なる巨視的イメージである。（右パネル）“再生”、すなわち、血管に満たされた骨髄を示す、移植後５週間の骨髄間質インプラントの断面の顕微鏡写真（２０×、Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【図５】マウス腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、移植後４週間の異種（ヌードラットとＲＡＧ１マウス）骨髄の切片の１０×（左パネル）および４０×（右パネル）顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【図６】マウス腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、Ｔｘ後８週（左パネル）および１６週（右パネル）の異種（ヌードラットとＲＡＧ１マウス）骨髄の切片の２０×顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【図７】マウスモデル（Ｈ ＆ Ｅ染色）において、腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、移植後４週間の同系骨髄の１０×（左パネル）および２０×（右パネル）顕微鏡写真（Ｈ ＆ Ｅ染色）。
【図８】腎臓皮膜下に異所性にインプラントした、異種（ラットとマウス）骨髄のＨ ＆ Ｅ染色切片（左パネル）および免疫組織化学的染色切片（ＣＤ４５陽性白血球に関して）（右パネル）の顕微鏡写真。矢印は骨髄インプラント（左パネル）および骨髄インプラントにおけるＣＤ４５＋白血球（右パネル）を指す。
【図９】交差反応性の不存在を確認するための、マウス脾臓のマウス抗ラットＣＤ４５染色（左パネル）およびラット抗マウスＣＤ４５染色（右パネル）断面の顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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