(57)【要約】本発明は、ＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有するポリペプチド、それらの製造、ならびにＣＡ１９−９抗原陽性細胞の検出および除去のためのそれらの使用、すなわち、腫瘍の診断および治療のためのそれらの使用に関する。さららにそのうえ、本発明は、該ポリペプチドの放射標識誘導体ならびにラジオイムノアッセイ、ラジオシンチグラフィーおよびラジオイムノセラピーにおけるそれらの使用、ならびに該ポリペプチドとインジケーター物質または薬理学的に有効な物質との複合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記オリゴペプチド：
（Ａ）抗ＣＡ１９−９抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）またはＣＡ１９−９抗原に対して結合特異性を有するそのフラグメントからなるオリゴペプチド、および
（Ｂ）抗ＣＡ１９−９抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）またはＣＡ１９−９抗原に対して結合特異性を有するそのフラグメントからなるオリゴペプチド
を含むポリペプチドであって、オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）は直接またはリンカーペプチド（Ｃ）を介して連結されているものであるポリペプチド。
【請求項２】
オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）がリンカーペプチド（Ｃ）により連結されており、好ましくは、該リンカーペプチド（Ｃ）が５ないし５０個、特に、２０ないし５０個のアミノ酸残基からなり、好ましくは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙが豊富な部分配列であり、特別には５ないし１０個のアミノ酸残基からなるものである請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
リンカーペプチド（Ｃ）が下記構造：
―（ＧｌｙｍＳｅｒｎ）ｘ−Ｐｒｏ−（ＧｌｙｏＳｅｒｐ）ｙ−
［式中、ｎ、ｍ、ｏ、およびｐは互いに独立して０ないし１０の整数であり、ｘおよびｙは互いに独立して１ないし５の整数である］を有する部分配列を含むものであるか、あるいは該リンカーペプチドは配列番号：３のアミノ酸配列を有するものである請求項１または２記載のポリペプチド。
【請求項４】
オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）が同じ抗体に由来するものである請求項１ないし３のいずれかまたはいくつかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチド（Ａ）および（Ｂ）の一方または両方が抗体１１１６−ＮＳ−１９−９（ＡＴＣＣ　ＨＢ−８０５９）に由来するものである請求項１ないし３のいずれかまたはいくつかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号：２に示すアミノ酸配列またはＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有するそのフラグメントを有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが他の機能的物質、特に、他のペプチド、サイトカイン、酵素、インジケーター物質、薬理学的に有効な物質、放射活性アイソトープ、トキシンおよび／または色素に連結されているものである請求項１ないし６のいずれかまたはいくつかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし７において定義されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８において定義されたＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９において定義されたベクターで形質転換された宿主生物。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換宿主生物を培養することを特徴とする、請求項１ないし６において定義されたポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
ＣＡ１９−９抗原を有する細胞、特に、腫瘍細胞の検出、局在化および／または除去に適した医薬および診断薬の製造のための、請求項１ないし７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
ポリペプチドが請求項１ないし６において定義されるものである放射標識ポリペプチド。
【請求項１４】
ラジオアイソトープがポリペプチドに直接またはキレート分子を介して結合されている請求項１３記載の放射標識ポリペプチド。
【請求項１５】
放射標識が１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅおよび３２Ｐから選択されるものである請求項１３または１４に記載の放射標識ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１ないし６のいずれかに記載のポリペプチドをラジオアイソトープと反応させることを特徴とする、請求項１３ないし１５に記載の放射標識ポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
腫瘍治療のための医薬または診断薬の製造のための請求項１３ないし１５に記載の放射標識ポリペプチドの使用。
【請求項１８】
請求項１ないし７に記載のポリペプチドおよび／または請求項１３ないし１５に記載の放射標識ポリペプチドを含む医薬または診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＣＡ１９−９抗原に結合特異性を有するポリペプチド、その調製、およびＣＡ１９−９抗原陽性細胞の検出および除去のための、すなわち、腫瘍の診断および治療のためのその使用に関する。さらに、本発明は、該ポリペプチドの放射標識誘導体、その調製ならびにラジオイムノアッセイ、ラジオシンチグラフィーおよびラジオイムノセラピーにおけるその使用、およびインジケーター物質もしくは薬理学上有効な物質との該ポリペプチドの結合体に関する。
【０００２】
アメリカでは、胃癌および膵臓癌はそれぞれ２４，０００および２８，０００の発症を有し、膵臓癌による毎年の死亡は約２８，０００であり、胃癌による毎年の死亡は１４，０００である。ヨーロッパでも同様の数値が認められる。膵臓癌の診断が下された後の平均生存時間は約６ヶ月である。このように予測される期間が望ましくないものであるのは、特に、診断が下される時点でほとんどの膵臓癌がもはや手術が不可能な段階にあり、該疾患の進行にいずれかの効果を持つ治療処置を受けつけないことが原因である。この状況は、多くの症例において効果的な治療を妨げている以下の２つの大きな障害により説明される。：
（１）インビボで腫瘍を初期に同定する効果的な方法がない、および
（２）外科的処置が可能な進行した腫瘍の段階において、十分に腫瘍を退化させる方法がない。
【０００３】
この状況を改善する試みは、初期腫瘍および転移を検出し、次いでその位置を同定するための画像処理法においてインビボで用いることができる試薬がないために、より困難なものとなっている。さらに、膵臓癌および胃癌に特異的なインビボ薬物ターゲッティングのための試薬が利用できないという事実のために、治療的試みはより困難なものとなっている。
【０００４】
ＣＡ１９−１９抗原は、多くの胃癌および膵臓癌において、１１１６−ＮＳ−１９−９（ネズミＩｇＧ１）抗体により免疫組織化学分析で検出されるモノシアロガングリオシドである（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ５， ９５７−９７１， １９７９； Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． ４， ４７１，０５７； ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｌｏｎｅ ＡＴＣＣ ＨＢ−８０５９）。
【０００５】
該抗体は２０年以上も前から知られており、そしてインビトロでの診断に利用され、かつ有効に用いられてきたが、１１１６−ＮＳ−１９−９抗体をインビボでの診断に有用なものとする試みは、成功する場合が限られていた。固体腫瘍では、抗体が組織に不十分にしか浸透しないので、インビボでの腫瘍の検出には信頼できないことが判明した（Ｋａｚｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ７， ３９−４４， １９９３）。それゆえ、該抗体の使用は推奨されなかった（Ａｌｕｎ， Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ４， ８５３−８６７， １９９０）。該抗体による組織標識を改良する前処置で、ＣＡ１９−９抗体をコブラ毒の要素（ＣＶＦ）と結合させたものを用いることが提案された（Ｊｕｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３ｓｕｐｐｌ）， ５７４９ｓ−５７５５ｓ， １９９５）。しかし、該抗体によっては、腫瘍の標識のわずか２倍の増加が得られたのみであった。抗−ＣＡ１９−１９Ｆ（ａｂ’）２抗体を用いては、７人の患者のうちの１人でしか初期腫瘍が信頼性を持ってインビボで検出されなかった（Ｎａｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ８， １６３−１６９， １９９４）。
【０００６】
インビボでの目的のための抗−ＣＡ１９−９抗体の複数回の適用は制限されている。抗体１１１６−ＮＳ−１９−９（ＡＴＣＣ　ＨＢ−８０５９）はネズミの抗体なので、反復して適用する間に「ＨＡＭＡ」免疫反応（「ヒト抗−マウス抗体」）を予想しなければならない。該抗体を変更により、診断上もしくは治療上インビボで適用するのに有用なものとするさらなる試みは、現在まで成功していない。
本発明の対象は、胃癌および膵臓癌の検出（インビボターゲッティング）のための試薬を提供することであった。
【０００７】
驚くべきことに、ＣＡ１９−９抗原に対する抗体の特殊なフラグメント、即ち、抗ＣＡ１９−９抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を含む組換え、抗体様分子（即ち、いわゆる「可変領域の一本鎖フラグメント」）が、連携してインビボでの使用を可能ならしめるいくつかの有益な特性を併せ持っていることが見出された。
【０００８】
よって、本発明の主題は
（１）下記オリゴペプチド：
（Ａ）抗ＣＡ１９−９抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）またはＣＡ１９−９抗原に対して結合特異性を有するそのフラグメントからなるオリゴペプチド、および
（Ｂ）抗ＣＡ１９−９抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）またはＣＡ１９−９抗原に対して結合特異性を有するそのフラグメントからなるオリゴペプチド
を含むポリペプチドであり、オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）は直接またはリンカーペプチド（Ｃ）を介して連結されている。
（２）（１）で定義したポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（３）（２）で定義したＤＮＡを含むベクター；
（４）（３）で定義したベクターで形質転換された宿主生物；
（５）（４）で定義した形質転換宿主生物を培養することを特徴とする、（１）で定義したポリペプチドの製造方法；
（６）ＣＡ１９−９抗原を有する細胞、特に、腫瘍細胞の検出、局在化および／または除去に適した医薬および診断薬の製造のための（１）で定義したポリペプチドの使用；
（７）（１）で定義される放射活性（「放射」ともいう）標識ポリペプチド；
（８）（１）で定義されたポリペプチドおよびラジオアイソトープを反応させることを特徴とする、（７）で定義した放射標識ポリペプチドの製造方法；
（９）医薬の製造、特に、腫瘍治療のための医薬およびインビトロおよびインビボ造影法に適した剤の製造のための、（７）で定義した放射標識ポリペプチドの使用；ならびに
（１０）（１）で定義したポリペプチドおよび／または（７）で定義した放射標識ポリペプチドを含む医薬または診断薬。
【０００９】
次いで、（１）のもとに上記で定義されたポリペプチドをさらに記載する。本発明によると、両方のオリゴペプチドを同じ抗体から得る。一方、１または両方のオリゴペプチドを抗体１１１６−ＮＳ−１９−９から得ることが好ましい。該抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から委託番号ＡＴＣＣ ＨＢ−８０５９のもとで入手できる。
【００１０】
オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）を結合する場合、両方のオリゴペプチド（Ａ）およびオリゴペプチド（Ｂ）は、本発明のポリペプチドのＮ末端成分であってもよい。好ましい具体例において、オリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）をリンカーペプチド（Ｃ）（以後、「リンカー」または「結合ペプチド」ともいう）によって互いに連結する。
【００１１】
互いに関連したオリゴペプチド（Ａ）および（Ｂ）のホールディングおよび配置を可能にする（それにより、オリゴペプチドの効果的な抗原結合を提供する）いずれかのペプチドは、リンカーペプチド（Ｃ）として使用してもよい。好ましいリンカーペプチドは、５ないし５０個、特に２０ないし５０個のアミノ酸残基を有する短い柔軟なオリゴペプチドよりなる。例えば、１０個までのアミノ酸残基を有するＳｅｒ−およびＧｌｙ−（ＳＧ−）豊富リンカーペプチドが特に好ましい。これらのＳＧ−豊富リンカーペプチドは、好ましくはモジュール方式において形成され、Ｐｒｏによってある程度分離されたＳＧ−豊富エレメントよりなる。該ＳＧ−豊富エレメントは、２〜２０アミノ酸長を有する。１のＳＧ−エレメントは、上記の機能を実施するのに十分である。リンカーペプチドの真中にあるプロリン残基は、ポリペプチド鎖内に角度をつけるために役立つ。プロリンの代わりに、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＡｓｎのような他のアミノ酸を用いてもよい。
【００１２】
これらのリンカーペプチドは、好ましくは、下記の構造式
−Ａ−（ＧｌｙｍＳｅｒｎ）ｘ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−（ＧｌｙｏＳｅｒｐ）ｙ−Ｅ−および特に構造式
−（ＧｌｙｍＳｅｒｎ）ｘ−Ｐｒｏ−（ＧｌｙｏＳｅｒｐ）ｙ−
［式中、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅは互いに独立して、結合、アミノ酸残基または５アミノ酸残基までを有するポリペプチドである］
で示される構造を有する。
【００１３】
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＡｓｎから選択され、特に、Ｐｒｏ、ｎ、ｍ、ｏおよびｐは互いに独立して０〜１０であり、ｘおよびｙは互いに独立して０〜１０であり、ｘおよびｙは互いに独立して１〜５である。
特に好ましいリンカーペプチド（Ｃ）は配列番号３に示される。
本発明の特に好ましい具体例において、本発明のポリペプチド（１）は、配列ＶＨ−リンカーペプチド−ＶＬにおいて１１６−ＮＳ−１９−９抗体のＶＨおよびＶＬよりなる配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
ｓｃＦｖ分子を生成するために、当業者は、いくつかの方法から選択してもよい。これらの方法は、一般に、抗体または適当な組換えライブラリーを産生するハイブリドーマから始まり、免疫グロブリンＨ鎖の可変領域（ＶＨ）をコードしているｃＤＮＡおよび免疫グロブリンＬ鎖の可変領域（ＶＬ）をコードしているｃＤＮＡを、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカーＶＨ配列において組換えＤＮＡがｓｃＦｖポリペプチド鎖をコードするように組換える。次いで、該ＤＮＡを適当な宿主生物／細胞系において発現することができる。本発明の目的内の適当な系は、細菌発現系、例えば、ｐＣＡＮＢＡＢ ５Ｅベクターの使用を伴うイー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＨＢ２１５１または真核生物発現系、例えば、ｐＲＳＶベクター（Ｉｇカッパリーダーペプチドを有する）の使用を伴う２９３Ｔ細胞である。
【００１５】
驚くべきことに、本明細書において例示的にｓｃＦｖ分子配列番号２について示される本発明のポリペプチドは、抗原ＣＡ１９−９に対する親抗体１１１６−ＮＳ−１９−９の特異性を保持している。配列番号２の分子は、特に、ＣＡ１９−９抗原（実施例１）、ＣＡ１９−９抗原を有する細胞（実施例２、図５）に結合するが、他の試験された炭水化物抗原およびＣＡ１９−９抗原陰性細胞には結合しない（実施例１）。
【００１６】
さらに、驚くべきことに、別のポリペプチド鎖が配列番号２のポリペプチドに結合していても、抗−ＣＡ１９−９ｓｃＦｖの特異性は保持されるということがわかった。例えば、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＣＨ２ＣＨ３ドメインのｓｃＦｖドメインへの結合が実施例２に示される。
ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ構造を有する分子が水溶液中にあまり溶解せず、沈殿する傾向にあるという頻繁な観察とは逆に、配列番号２の分子は非常に良好な溶解性を有する。さらに、変性後、配列番号２の分子は、結合−活性配置への非常に有効な復元を示す（実施例４）。
【００１７】
さらに、配列番号２の分子は、イン・ビボでＣＡ１９−９陽性細胞、好ましくは腫瘍細胞への予想外に高い組織浸透および蓄積を示す。これは、例えば、標識した配列番号１の分子のマウスにおける静脈内適用が実験に基づいてＣＡ１９−９陽性腫瘍を生成した後に示される（実施例６）。しかしながら、健康な組織への蓄積は起こらない。本発明の分子の好ましい用途は、画像診断におけるイン・ビボでのＣＡ１９−９陽性細胞、特に腫瘍、例えば、胃および膵臓の癌腫の検出および位置推定である。
【００１８】
さらに、配列番号２の分子が抗原を有する細胞に結合後にインターナライズされないことがわかった。レセプター−リガンド系の大多数において結合したリガンドはインターナライズされるので、この特徴は益々驚くべきことである。これは、益々、細胞外膜の分子に結合する抗体に適用する。さらに、配列番号２の分子のインターナライゼーションの欠如は、細胞質プロテアーゼによるいずれの分解も伴わない細胞表面上での長い残存時間を保証する。この特徴は、特に、薬物標的化、プロドラッグ活性化、放射性インビボ標識および分子を標的化のために用いる他の処理のための配列番号２の分子の使用において有利である。
【００１９】
配列番号２の分子には、ネズミ免疫グロブリンの定常部がない。したがって、独特なＨＡＭＡ免疫反応は、該分子の繰り返し利用で予測されるものではない。該特徴は、以前の予め処理した抗ＣＡ１９−９抗体とは逆に、診断および治療におけるイン・ビボでの方法において配列番号２の分子の使用を可能にする。
【００２０】
さらに、配列番号２の分子とヒトＣＨ２ＣＨ３免疫グロブリンドメインとの結合後、ＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞への結合後に特異的な腫瘍溶解がナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）および補体よって媒介されることがわかった。健康な組織または該抗原を有さない腫瘍は溶解しない。Ｉｇ ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインへの結合後の配列番号２の分子の好ましい用途は、イン・ビボおよびイン・ビトロでのＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞の除去である。
【００２１】
本発明の好ましい目的は、所望の使用による、多数の別分子への抗ＣＡ１９−９ｓｃＦｖ分子の共有または非共有カップリングである。本発明ポリペプチドの以下の修飾およびその使用は、単なる具体例として、ここで挙げる。
【００２２】
１．インビトロおよびインビボ使用、例えば、放射免疫測定法における、または、ラジオシンチグラフィーおよび放射免疫療法における、放射性同位元素、例えば、１２５Ｊ、１３１Ｊ、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、３２Ｐによるポリペプチドおよび特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子の標識化。分子の放射活性（「放射」）標識化のための確立された方法は、金属−キレート基、放射標識化を容易にするペプチド配列、Ｃ−またはＮ−末端システインまたはメタロチオニンの導入を包含する（ディーン（Ｄｅａｎ）ら、テクネチウム・アンド・レニウム・イン・ケミストリー・アンド・ヌクレア・メディスン（Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ ａｎｄ Ｒｈｅｎｉｕｍ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、レイヴァン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、第６０５−６０８頁、１９９０年；リベラトア（Ｌｉｂｅｒａｔｏｒｅ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヌクレア・メディスン（Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．）、２２：１３２６−１３２９、１９９５年；ラム（Ｒａｍ）およびブフスバウム（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ）、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）７３（補遺３）、７６９−７７３、１９９４年；チャオ（Ｚｈａｏ）ら、バイオコンジュゲイト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．）１０、４２４−４３０、１９９９年）。具体的には、分子とカルモジュリンとの結合および多工程免疫シンチグラフィー（ヴァン・エルディック（ＶａｎＥｌｄｉｃ）およびルーカス（Ｌｕｃａｓ）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１３９、３９３−４０５５、１９８７；テーレック（Ｔｏｒｏｋ）およびトレンタム（Ｔｒｅｎｔｈａｍ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３３、１２８０７−１２８２０、１９９４年）における使用のためのカルモジュリン結合放射標識分子による負荷が挙げられる。しかし、多数の標識化反応は、例えば、１８６Ｒｅを用いた標識化において、激しい還元反応条件を必要とする。かかる標識化は、しばしば抗体の変性をもたらし、免疫シンチグラフィーおよび放射免疫療法における抗体の使用を不可能にする。
【００２３】
変性反応条件および極めて良好な復元（変性後）における本発明分子、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の予想外に高い安定性は、いかなる結合特異性を失うことのない標識化反応の使用を可能にする。結合活性な復元分子を精製するには、アフィニティクロマトグラフィーが有利であることが、すなわち、ＣＡ１９−９抗原への結合、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と検出ドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３ドメインとからなる融合分子との結合、ドメイン特異的な抗体への結合により、証明された。
【００２４】
インビボ適用後、本発明ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子は、ＣＡ１９−９陽性腫瘍およびその転移の部位に蓄積する。放射標識分子を用いる場合、腫瘍は、シンチグラフィー法を用いて、インビボで局在化させればよい。本発明の意味内でのインビボ検出では、例えば、放射性同位元素で標識したポリペプチドが患者に投与され、ＣＡ１９−９を有する組織への結合が体外で検出される。また、ＣＡ１９−９陽性腫瘍のインビボ検出には、免疫シンチグラフィーのための他の間接的または直接的な方法を用いてもよい。ここで、本発明分子、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、腫瘍細胞への特異的な結合を付与する。
【００２５】
本発明ポリペプチドの別の使用は、インビボ適用後のＣＡ１９−９陽性細胞の放射治療的な除去である。この場合、直接的または間接的な放射活性標識化が可能である。具体例としては、１８８ＲｅによるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子の直接的な標識化、または、タグを有する融合分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と放射活性標識された抗タグ分子との逐次または同時適用による間接的な標識化が挙げられる。
【００２６】
これに関して、「タグ」は、例えば、Ｎｉ結合の使用により、例えば、抗体の使用および／またはタンパクの精製により、タンパクの検出を容易にするタンパクドメイン（短いペプチド配列）として解釈すべきである。１８８Ｒｅ標識されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子の好ましい治療上の使用は、転移の除去のための、または、成功した効力のある治療の必要条件の創出のためのインビボ腫瘍減少の達成である。腫瘍における１８８Ｒｅ標識されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子の好ましい蓄積は、造血毒性の同時減少を伴う、腫瘍における放射線の蓄積を達成するのに対し、しばしば血液形成系の細胞に対する特有の毒性は、異なる担体分子または外部放射線源を用いる場合に見られる（イズナガ−エスコバール（Ｉｚｎａｇａ−Ｅｓｃｏｂａｒ）、ヌクレア・メディスン・アンド・バイオロジー（Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．）２５、４４１−４４７、１９９８年）。
【００２７】
２．本発明ポリペプチド、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分子の別の使用は、「デザイナー」エフェクター機能を有する修飾分子の調製である。例えば、公知の方法（要約：ネリ（Ｎｅｒｉ）ら、エンジニアリング・リコンビナント・アンチボディーズ・フォア・イムノテラピー（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）、セル・バイオフィジックス（Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．）２７：４７−６１、１９９５年）に従って、様々な化学量論的に定義されたキメラ融合分子を、例えば、他のポリペプチド、糖分子、脂質、または他の合成もしくは天然物質、キレート化剤への結合により、または、薬理学的に活性な物質、例えば、細胞融解活性を有する分子（例えば、パーホリン）もしくはプロドラッグ物質、シグナル機能を有するタンパク（例えば、サイトカイン）（実施例３）、酵素活性を有するタンパク（例えば、メタロプロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ）へのカップリングにより、調製することができる。核酸へのカップリングも可能である。これらの具体例は、ＣＡ１９−９発現の部位、好ましくは腫瘍部位における所望の物質のインビボ蓄積の達成における本発明ポリペプチド、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の使用を共通して有する。
【００２８】
３．別の使用は、二特異的な（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多特異的な（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）ハイブリッド分子、例えば、二特異的な抗体の生成のための、他の分子または抗体の結合ドメインへの本発明ポリペプチド、特に分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のカップリングである。一例としては、ＣＡ１９−９陽性腫瘍の免疫療法に用いるための組換え抗ＣＡ１９−９／抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）二特異的なｓｃＦｖ抗体が挙げられる。
【００２９】
４．さらなる具体例では、本発明によるポリペプチド、特に分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、細胞内シグナル鎖と融合することができ、シグナル形質導入する受容体分子の形態で、有用な宿主細胞中で発現されうる。驚くべきことに、ＣＡ１９−９抗原のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２への結合により、融合された異種シグナルペプチド鎖（実施例５）について生化学的シグナルが放出されることが示された。当業者は、この点に関して広範囲に言及することができない、いくつかのシグナル鎖の組合せを有する。
【００３０】
本発明によるポリペプチドは、ＣＡ１９−９抗原を有する細胞の局在化および／または除去に適していることを示すこともできた。本発明は、また、ポリペプチド（１）（必要なら、誘導体化または修飾されている）のヒトまたは動物への投与を包含する、ＣＡ１９−９を有する細胞の活性化のための方法に関する。
【００３１】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明する。
【００３２】
実施例
実施例１：単鎖分子配列番号２はＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有し、ＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞由来のＣＡ１９−９抗原に結合する。
【００３３】
分子配列番号１を、ＣＡ１９−９抗原に対する特異性を有する抗体１１１６−ＮＳ−１９−９を発現するハイブリドーマ１１１６−ＮＳ−１９−９（ＡＴＣＣＨＢ−８０５９）（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ５， ９５７−９７１， １９７９）から出発してファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４ （１９９０）； Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３４９： １９３−２９９ （１９９１））により生成させた。
【００３４】
公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＸ．， ｐｐ ８．１１−８．１３， １９８９）に従ってハイブリドーマ細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡを得、逆転写酵素および「ｐｒｉｍｅｄ　ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘ」オリゴヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ２７−９４００−０１）によってｃＤＮＡに転写した。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の可変部（ＶＨおよびＶＬ）をコードするｃＤＮＡを、免疫グロブリン特異的オリゴヌクレオチド（「ｈｅａｖｙ　ｐｒｉｍｅｒ　１」、「ｈｅａｖｙ　ｐｒｉｍｅｒ　２」、「ｌｉｇｈｔ　ｐｒｉｍｅｒ　ｍｉｘ」、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃａｔ．Ｎｒ． ２７−１５８３−０１， ２７−１５８６−０１）によってＰＣＲ反応において増幅した。第２のＰＣＲ反応において、ＶＨ　ｃＤＮＡ（約３４０ｂｐ）およびＶＬ　ｃＤＮＡ（約３２５ｂｐ）ならびに「ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ−ｍｉｘ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｃａｔ．Ｎｒ． ２７−１５８８−０１）を、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチド（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３， １９８８）をコードする結合配列の存在下、１分子に融合させた。このＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメント（ｓｃＦｖ）（約７５０ｂｐ）をオリゴヌクレオチド「ＲＳ−ｐｒｉｍｅｒ−ｍｉｘ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｃａｔ．Ｎｏ． ２７−１５８９−０１）（これは、ＰＣＲ産物の末端に制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩ（５’ＶＨ末端）およびＮｏｔＩ（３’ＶＬ末端）用の隣接切断部位を提供した）を使用することによって再増幅した。これらの制限部位の切断後、生成したＤＮＡ末端によって、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ直鎖化ｐＣＡＮＴＡＢ　５ＥファージミドＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｃａｔ．Ｎｒ． ２９−９４０１−０１）への方向付けられた組込みが可能になる。このファージミド中のｓｃＦｖフラグメントはファージ蛋白ｇｐ３との融合蛋白としてファージ表面上に発現される。
【００３５】
ＣＡ１９−９に結合する能力を有するｓｃＦｖ分子配列番号２を有するＭ１３ファージの生産のために、細菌ＴＧ１　Ｅ．ｃｏｌｉを組換えファージミドＤＮＡを用いて形質転換し、続いてＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに感染させた。ＣＡ１９−９抗原に結合する能力を有するファージをパンニング技術（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３， １９８８）によって選択的に富化した。ＣＡ１９−９抗原に結合する組換えｓｃＦｖ分子（ＮＳ１９−９−ｓｃＦｖ）は図１および配列番号１に示すＤＮＡ配列ならびに配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。ファージ抗体配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３は融合蛋白ｓｃＦｖ−ｇｐ３としてファージ表面上に発現され、ＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞由来のＣＡ１９−９抗原に特異的に結合する（図２）。Ｍ１３ファージのｇｐ３蛋白は結合特異性を有しない。
【００３６】
配列番号２−ｓｃＦｖフラグメントの結合はＣＡ１９−９抗原に対して特異的である。なぜなら、配列番号２−ｓｃＦｖのＣＡ１９−９抗原への結合はモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（図３ａ）および可溶性ＣＡ１９−９抗原（図３ｂ）によって競合されるからである。
【００３７】
実施例２：ポリペプチド配列番号２は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１　ＣＨ２ＣＨ３ドメインへの融合後にも、ＣＡ１９−９抗原に対するその結合特異性を維持している。
【００３８】
ＣＡ１９−９に結合するｓｃＦｖ分子配列番号２を第２の独立蛋白ドメインを有する融合蛋白にアニールさせ、それによってＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を維持させた。この目的で、抗ＣＡ１９−９　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列番号１をヒトＩｇＧ１　ＣＨ２ＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡと連結した。ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３融合蛋白をコードする得られたｃＤＮＡをｐＲＳＶ発現ベクターに挿入し、Ａｇ８．６５３細胞へのトランスフェクション後に発現させる。ｐＲＳＶ発現ベクター（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ７２０−７２４ （１９９３））は、免疫グロブリンκ軽鎖リーダーペプチドを有するＲＳＶ−ＬＴＲ制御発現カセットによって特徴付けられる。これは発現される融合蛋白が培養液上清中に分泌されることを確実にする。融合蛋白配列番号２−ｓｃＦｖＣＨ２ＣＨ３を、トランスフェクトしたＡｇ８．６５３細胞の無血清培養上清から、アフィニティクロマトグラフィーによって（すなわち、抗ヒトＦｃ抗体で修飾したアガロースへの結合によって）単離する。融合分子において配列番号２−ｓｃＦｖドメインはＣＡ１９−９抗原に対するその結合特異性を維持している。保持された結合特異性を、配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３融合蛋白のＣＡ１９−９抗原への結合（図４ａ）ならびにモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（図４ｂ）および可溶性ＣＡ１９−９抗原（図４ｃ）による結合の競合によって決定した。融合分子配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３はＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞に特異的に結合するが、ＣＡ１９−９陰性腫瘍細胞には結合しない（図５）。これらのデータは、配列番号２−ｓｃＦｖドメインが他の機能性ドメインとの融合蛋白の一部である場合、ＣＡ１９−９に結合するドメイン配列番号２が、一方でモノクローナルＮＳ１９−９抗体と同じＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有しているが、他方でその結合特異性をも維持していることを示す。
【００３９】
実施例３：　分子配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３とヒトインターロイキン−２（ＩＬ２）との融合により、ＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有する二機能性蛋白を得る。
分子配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３（実施例２から）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）との融合により、ＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を示し、同時にＩＬ−２蛋白を有する二機能性融合蛋白を得た。そのためには、ＤＮＡ配列番号１−ＣＨ２ＣＨ３（実施例２から）とヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡとを融合させ、発現ベクターｐＲＳＶの発現カセットに挿入した。ｐＲＳＶ発現ベクター（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０： ７２０−７１４ （１９９３））は、免疫グロブリンκ−軽鎖−リーダーペプチドを有するＲＳＶ−ＬＴＲ調節発現カセットにより特徴付けられ、その結果、発現融合蛋白は、培養の上清に分泌される。発現カセットのＡｇ８．６５３細胞へのトランスフェクション後、培養の上清からの融合蛋白配列番号２ＣＨ２ＣＨ３−ＩＬ−２をアフィニティークロマトグラフィーにより、すなわち、該ＣＨ２ＣＨ３−ドメインと結合する抗ヒト−Ｆｃ−抗体と結合させることにより精製した。
【００４０】
融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３−ＩＬ−２は、ＣＡ１９−９を結合する該ドメイン配列番号２と融合する薬理学上有効なサイトカイン（ＩＬ−２）により特徴付けられ、それにより、ｓｃＦｖのＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性もまた、該融合蛋白のこの配置において維持される。融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３−ＩＬ−２とＣＡ１９−９との結合は、図６ａ、ｂに示される。
【００４１】
実施例４：　分子配列番号２は、変性および再生後、ＣＡ１９−９抗原に対するその結合特異性を維持する。
可溶性分子配列番号２（ファージ成分を含まない）は、配列番号１ ＤＮＡを有するｐＣＡＮＴＡＢ ５ＥベクターでのトランスフェクションおよびＩＴＰＧでの誘発後、イー・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＨＢ２１５１細菌中で産生され、該細菌のペリプラズム中に蓄積される。該細菌のペリブラズムからの配列番号２−蛋白の単離は、１／５×（ｖ／ｖ）ＴＥＳバッファー（１×ＴＥＳ：　２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭスクロース、ｐＨ８．０）中、４℃で３０分間、該細菌をインキュベートし、該細菌の上清を硫酸アンモニウムで沈殿させることにより行われる。沈殿物をＰＢＳ中で再生する。再生した配列番号２−分子と未変性配列番号２−ｇｐ３ファージ分子とを、ＣＡ１９−９抗原に対するその結合特異性に関して比較した。この結果、配列番号２−分子は、可溶性形態で変性および再生された後、単離には変性および再生を必要としない配列番号２−ｇｐ３ファージ体と同一の、ＣＡ１９−９抗原に対する結合特異性を有する。
【００４２】
実施例５：　ドメインとしての分子配列番号２は、抗原結合により融合シグナルドメインを活性化することができる。
細胞外ドメインがＣＡ１９−９を結合する分子配列番号２により形成され、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがＦｃεＲＩ受容体のｙ鎖により形成される、組換え膜貫通分子を得た。この融合分子は、ＣＡ１９−９抗原を有する細胞（例えば、腫瘍細胞）との接触後、免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）の特異的細胞活性化を提供する。
【００４３】
配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３（実施例２から）をコードするＤＮＡを、ベクターｐＲＳＶ−ｙ（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ７２０−７２４ （１９９３））のＳｎａｂｌおよびＢａｍＨＩ部位に、該ベクターのＳＰ６ ｓｃＦｖ−ドメインの欠損下にて挿入した。新しい組換えベクター−ＤＮＡをエレクトロポレーションによりマウス−ＭＤ４５−Ｔ細胞にトランスフェクトし、表面上にて所望の配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３γ−受容体を発現した安定な細胞クローンを単離した。受容体を有するＭＤ４５細胞を、ＣＡ１９−９ポジティブ腫瘍細胞との接触後に特異的に活性化されるそれらの特性について試験した。そのためには、受容体を有するＭＤ４５−細胞と対照としての未トランスフェクトＭＤ−４５細胞（各々、１０５細胞）とを、平行して、ＣＡ１９−９＋Ｈ４９８腫瘍細胞およびＣＡ１９９−Ｈ７１６−腫瘍細胞（各々、１０５細胞）と共培養した。４８時間後、細胞活性化の指標として、培養の上清中でＩＬ−２分泌量を測定した。配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３−γ−受容体を有するＭＤ４５−細胞が、ＣＡ１９−９−ポジティブＨ４９８腫瘍細胞との共培養により活性化されたが、ＣＡ１９−９−ネガティブＨ７１６−腫瘍細胞との共培養によっては活性化されなかったことが示された。未トランスフェクトＭＤ４５−細胞は、Ｈ４９８−細胞およびＨ７１６−細胞のいずれによっても活性化されなかった。さらにまた、この結果は、ＣＡ１９−９を結合する細胞外ドメイン配列番号２が、該細胞をベースとしたＣＡ１９−９抗原と結合した後、シグナルを融合細胞内ｙ−シグナル鎖に伝達して細胞活性化を開始することを示している。
【００４４】
実施例６：　分子配列番号２は、ＣＡ１９−９発現を有する細胞上でインビボで蓄積する。
可溶性蛋白配列番号２（実施例１から）を、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を用いることにより１２５Ｉで放射性標識し、精製して未結合１２５Ｉを除去した。インビトロでの１２５Ｉ−配列番号２−分子の結合特異性は、未標識配列番号２−分子のものと同等である。腫瘍の生成のために、ＣＡ１９９ポジティブＨ４９８−細胞およびＣＡ１９−９−Ｈ７１６−細胞（対照として）をヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に皮下注射した（注射１回および動物１匹当たり約１０６細胞）。５〜８日後、各々のケースで直径２〜４ｍｍの皮下腫瘍が形成された。
【００４５】
腫瘍細胞の注射後１７日目に、該腫瘍を有するマウスに１２５Ｉ−配列番号２を静脈内投与した（蛋白５μｇ／マウス）。２４時間後、マウスにおける放射能の分布をワン−タイム−オートラジオグラフィにより測定した。放射能が、Ｈ４９８細胞腫瘍（ＣＡ１９−９＋）では蓄積されるが、Ｈ７１６−細胞腫瘍（ＣＡ１９−９−）では蓄積されないことが判明した。マウスの臓器は、低い放射能を示しており、Ｈ４９８−腫瘍を有するマウスにおける分布とＨ７１６−腫瘍を有するマウスにおける分布は同一である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＡ１９−９結合ペプチドのＤＮＡおよびアミノ酸配列（フレーム：一文字コード）を示す。ＶＨおよびＶＬ領域およびリンカーペプチドにはマークを付している。組込みペプチド（ＤＮＡ３４１−４３３ｂｐ）が好ましいリンカーペプチドであり、他のリンカーペプチドと置換できる。
【図２】間接的に固定化された腫瘍細胞からのＣＡ１９−９抗原におけるファージ抗体配列番号２−ｓｃＦｖの結合
ＣＡ１９−９抗原の間接的固定化のために、マイクロウエルプレートをモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、ＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＳＷ９４８（■）またはＣＡ１９−９陰性腫瘍セルラインＨ７１６（□）の溶解物と共にインキュベートした。配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３ファージ抗体の希釈物を抗原被覆プレートに移し、結合したファージ抗体をパーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体および呈色反応指示薬を使用し、４０５ｎｍのＯＤで測光的に検出した。
【図３ａ】モノクローナル抗体ＮＳ１９−９による、間接的に固定化されたＣＡ１９−９抗原に対するファージ抗体配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３の競合的結合
ＣＡ１９−９抗原の間接的固定化のために、マイクロウエルプレートを抗ＣＡ１９−９抗体ＮＳ１９−９（ＮＳ１９−９ｍＡｂ２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、ＣＡ１９−９を分泌する腫瘍細胞Ｈ４９８の上澄液１００μｌと共にインキュベートした。配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３ファージ抗体のインキュベーションを、モノクローナル抗ＣＡ１９−９抗体ＮＳ１９−９（■）または不適切な特異性を有する同じイソタイプ（ＩｇＧ）の抗体（□）の種々の希釈物（最大濃度１０μｇ／ｍｌ）の存在下で行なった。結合した配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３ファージ抗体の測光検出（ＯＤ４０５ｎｍ）を、パーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体および呈色指示薬反応により行なった。
【図３ｂ】可溶性ＣＡ１９−９抗原による、間接的に固定化されたＣＡ１９−９抗原に対するファージ抗体配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３の競合的結合
ＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＨ４８９の培養上澄液からのＣＡ１９−９抗原を、ＮＳ１９−９抗体（ＮＳ１９−９抗体２μｇ／ｍｌ、Ｈ４９８上澄液１００μｌ）を被覆したマイクロウエルプレートに固定した。配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３抗体のインキュベーションを、ＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＨ４９８のＣＡ１９−９（▲）またはＣＡ１９−９陰性腫瘍セルラインＨＲＳ４（△）を含む培養上澄液の希釈物の存在下で行なった。結合した配列番号２−ｓｃＦｖ−Ｍ１３ファージ抗体の測光検出（ＯＤ４０５ｎｍ）を、パーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体および呈色指示薬反応により行なった。
【図４ａ】固定化されたＣＡ１９−９抗原に対する融合蛋白配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３の結合
ＣＡ１９−９抗原の間接的固定化のために、マイクロウエルプレートをモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、ＣＡ１９−９抗原を含むＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＳＷ９４８の培地（■）またはＣＡ１９−９陰性腫瘍セルラインＨ６０の培養上澄液（□）と共にインキュベートした。融合蛋白配列番号２−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３を希釈して抗原被覆プレートに加え、ついで、結合した融合蛋白を、融合蛋白のＣＨ２ＣＨ３ドメインに指向したビオチン結合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体およびストレプトアビジン結合パーオキシダーゼおよび呈色反応指示薬を使用し、測光的に検出した（ＯＤ４０５ｎｍ）。データは２回の独立したテストの平均値である。
【図４ｂ】モノクローナル抗体ＮＳ１９−９による、固定化されたＣＡ１９−９抗原に対する融合蛋白配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３の競合的結合
ＣＡ１９−９抗原の固定化のために、マイクロウエルプレートを抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体ＮＳ１９−９（ＮＳ１９−９抗体２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、Ｈ４９８の細胞培養上澄液からのＣＡ１９−９抗原と共にインキュベートした。配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３融合蛋白のインキュベーションを、モノクローナル抗体ＮＳ１９−９（■）または不適切な特異性を有する同じイソタイプ（ＩｇＧ）の対照抗体（□）の存在下で行なった。結合した配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３融合蛋白の測光検出（ＯＤ４０５ｎｍ）を、ビオチン結合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体およびストレプトアビジン結合パーオキシダーゼを用いて行なった。データは２回の独立したテストの平均値である。
【図４ｃ】可溶性ＣＡ１９−９抗原による、固定化されたＣＡ１９−９抗原に対する配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３の競合的結合
ＣＡ１９−９抗原の固定化のために、マイクロウエルプレートを抗ＣＡ１９−９抗体ＮＳ１９−９（ＮＳ１９−９抗体２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、Ｈ４９８の細胞培養上澄液からのＣＡ１９−９抗原と共にインキュベートした。間接的に固定化したＣＡ１９−９抗原上で、融合蛋白配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３を、大量のＣＡ１９−９抗原を分泌するＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＨ４９８の培地（★）またはＣＡ１９−９陰性腫瘍ラインＨＬ６０の培養上澄液（☆）の希釈物の存在下でインキュベートした。結合した配列番号２−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３融合蛋白の測光検出（ＯＤ４０５ｎｍ）を、ビオチン結合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体およびストレプトアビジン結合パーオキシダーゼを用いて行なった。データは２回の独立したテストの平均値である。
【図５】ＣＡ１９−９陽性腫瘍細胞上での融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３の結合のＦＡＣＳ分析
ＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＬｏＶｏ５１７６およびＣＡ１９−９陰性腫瘍セルラインＨ７１６の細胞を、モノクローナル抗体ＮＳ１９−９（Ａ）および融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３（Ｂ）（実線）と共にインキュベートした。各々、モノクローナル抗体ＨＲＳ３（ＣＤ３０抗原に対して特異性を有する）および融合ＨＲＳ３−ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３（点線）を対照とした。結合した融合蛋白の検出は、各々、ＦＩＴＣ結合抗ネズミＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ａ）および抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｂ）ならびにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により行なった。
【図６ａ，ｂ】固定化ＣＡ１９−９抗原に対する融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３−ＩＬ２の結合
ＣＡ１９−９抗原の固定化のために、マイクロウエルプレートをモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（２μｇ／ｍｌ）で被覆し、ついで、ＣＡ１９−９陽性腫瘍セルラインＨ４９８のＣＡ１９−９抗原含有培養上澄液（■、▲）またはＣＡ１９−９陰性腫瘍ラインＨ７９１６の培養上澄液（□、△）と共にインキュベートした。融合蛋白配列番号２−ＣＨ２ＣＨ３−ＩＬ２を、固定化したＣＡ１９−９抗原上で、所定の希釈でインキュベートした。結合した融合蛋白を、（ａ）融合蛋白ＣＨ２ＣＨ３ドメインと結合するビオチン結合抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体または（ｂ）ビオチン結合抗ヒトＩＬ２抗体、ついで呈色指示薬反応を用いて測光的に検出した（ＯＤ４０５ｎｍ）。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507205.tif 000048
【国際調査報告】
2004507205.tif 000049
2004507205.tif 000050
2004507205.tif 000051
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