(57)【要約】本発明は、変形性関節症の治療の必要がある被験者を治療する方法を提供する、該方法は前記被験者にスペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のあるスペルミジン生合成の阻害剤の用量を投与することを含む。本発明は、変形性関節症の治療の必要がある被験者の治療において、スペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤の使用をも提供する。本発明は、更に変形性関節症治療の必要がある被験者を治療する治療組成物を製造する方法を提供する、並びに本発明は、更にスペルミジン生合成の阻害剤を同定する方法であって、該阻害剤がスペルミジン・シンターゼ阻害剤である方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症の治療の必要がある被験者を治療する方法であって、前記被験者に、スペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤を投与することを含み、これにより前記被験者を治療することができる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記阻害剤が、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記スペルミジン・シンターゼ阻害剤が、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’− （ （３− アミノプロピル） アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択される方法。
【請求項４】
変形性関節症を治療する必要がある被験者の治療における、スペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤の使用であって、これにより前記被験者を治療することができる使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、前記スペルミジン生合成の阻害剤が、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である使用。
【請求項６】
請求項５に記載の使用であって、前記阻害剤が、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン （４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’− （ （３−アミノプロピル） アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択される使用。
【請求項７】
変形性関節症を治療する必要がある被験者を治療するための薬学的組成物の製剤におけるスペルミジン生合成の阻害剤の使用。
【請求項８】
請求項７に記載の使用であって、前記スペルミジン生合成の阻害剤が、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記阻害剤が、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’− （（３−アミノプロピル） アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’− （イソブチルチオ） アデノシン および５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択される使用。
【請求項１０】
変形性関節症の治療の必要がある被験者を治療する治療組成物であって、スペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤、および担体を含んでいる治療組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の治療組成物であって、前記スペルミジン生合成の阻害剤が、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である治療組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の治療組成物であって、前記担体が、薬学的または獣医学的に許容される担体である治療組成物。
【請求項１３】
変形性関節症の治療の必要がある被験者を治療する治療組成物を製造する方法であって、
（ａ）スペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤を取得することと、および
（ｂ）前記阻害剤を薬学的に許容される担体と混合することと、
を含む方法。
【請求項１４】
スペルミジン生合成の阻害剤を同定する方法であって、前記阻害剤がスペルミジン・シンターゼ阻害剤であり、且つ前記同定が
（ａ）候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤を取得することと；
（ｂ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生のうちの何れか１つにおける前記候補 阻害剤の効果を、評価方法を用いてコントロールと比較して評価することと；
により実施される方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記評価方法が、
（ｉ） スペルミジン・シンターゼをコードするＤＮＡを含んでいる試験系を提供することと；
（ｉｉ） スペルミジンの発現を通常生じる条件下で前記系を前記試験候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤と接触させることと； および
（ｉｉｉ） コントロールと比較した終点の指標における前記試験候補阻害剤の効果を決定することと；を含み、
前記効果が、前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を示す方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記試験系が、外因性に発現されるスペルミジン・シンターゼを含んでいるインビトロでトランスフェクションした細胞培養である方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記トランスフェクションした細胞培養が、スペルミジン・シンターゼ 蛋白質をコードする核酸配列を含んでいるｐＣＭＶｎｅｏ 発現ベクターで安定的にトランスフェクションされたＲＣＪ３．１ Ｃ５． １８ 細胞の培養物である方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、前記試験系が、内在性に 発現される スペルミジン・シンターゼを含んでいるエックスビボ 骨培養である方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記骨培養が、胚の骨培養。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、前記試験系が、動物モデルを含むインビボ 試験系である方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記終点の指標が、関節炎の発生である方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記関節炎の発生が前記動物の足の厚さにより決定され、コントロールと比較して足のサイズの増加が低いことが、前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生並びに関節炎の発生のうちの何れか１つの阻害の指標である方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記動物モデルが、トランスジェニックマウスである方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法であって、前記インビボ 試験系が、内在性 スペルミジン・シンターゼを発現している関節炎哺乳類モデルである方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記終点の指標が、関節炎の発生である方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記関節炎の発生が、前記関節炎哺乳類の足の厚さにより決定され、コントロールと比較して足のサイズの増加が低いことが、前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生並びに関節炎の発生のうちの何れか１つの阻害の指標である方法。
【請求項２７】
請求項２４〜２６の何れか１項に記載の方法であって、前記関節炎哺乳類が、関節炎ラットである方法。
【請求項２８】
請求項１４に記載の方法であって、候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤を取得することが、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から阻害剤を選択することによる方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載の方法であって、候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤を取得することが、スペルミジン・シンターゼの阻害剤である物質をスクリーニング方法により実施され、このスクリーニング方法が、
（ａ）スペルミジン・シンターゼを含んでいる混合物を提供することと；
（ｂ）スペルミジンの生合成を通常生じる条件下で前記混合物を試験物質と接触させることと； および
（ｃ）終点の指標において前記試験物質の効果を決定することと；を含み、
これによる前記終点の阻害が、前記試験物質によるスペルミジン・シンターゼの阻害の指標である方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記終点の指標が、スペルミジン・シンターゼ 触媒反応の産物の存在である方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、スペルミジン・シンターゼ触媒反応の産物の存在が、蛍光または放射性の検出可能なシグナルのうち何れか１つを生じる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一部継続出願であって、２０００年１２月１２日に出願された米国仮出願番号６０／２５４，８５０の優先権を主張するものである。この出願の内容は、本明細書中に引用することにより本出願に援用される。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、変形性関節症の発生および軟骨リハビリテーションにおけるスペルミジン・シンターゼの関与に関する。より具体的には、本発明は、変形性関節症およびそれに関連する軟骨障害の治療における治療方法、スペルミジン・シンターゼ阻害剤の組成物および使用に関する。
【０００３】
【発明の背景】
変形性関節症 （ＯＡ；  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、よく知られた、消耗性（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）で、治療に金のかかる疾患であり、現在不治の疾患である。新規の治療アプローチが明らかに必要とされている。本疾患は、軟骨細胞の異常機能、関節の軟骨組織内の軟骨細胞の終末分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）および骨形成開始、および正常軟骨マトリックスの崩壊によって特徴づけられる。遺伝子産物が共通前駆細胞から開始される軟骨形成 および 骨形成に関与する遺伝子、軟骨細胞の終末分化を決定する遺伝子、並びに遺伝子産物が軟骨性マトリックス（ｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ）の崩壊を引き起こす遺伝子は、治療介入（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の明白な候補者である。
【０００４】
ＯＡの疫学
ＯＡ〔間違って変性関節疾患（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｊｏｉｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）とも称される〕は、可動関節性（ｄｉａｒｔｈｒｏｄｉａｌ）〔可動性（ｍｏｖａｂｌｅ）、滑膜が裏打ちされた（ｓｙｎｏｖｉａｌ−ｌｉｎｅｄ）〕の関節の不全（ｆａｉｌｕｒｅ）を代表する疾患である。特発性（一次性）ＯＡ（本疾患の最も一般的な形態）において、如何なる素因（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）も明らかとはなっていない。
【０００５】
二次性ＯＡは、特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）ＯＡと病理学的に区別できないが、その根底にある原因を何かの原因に帰属させることはできる。ＯＡは、全てのヒトの関節障害において最も一般的な疾患であり、米国および全世界において最も蔓延している関節炎状態である。様々な試験の臨床評価に基づくＯＡ罹患率の推測は、７０歳を越える集団の９０％を越えるヒトがＯＡを有していることを示している。本発明は、本疾患の療法および予防の新規手段の開発を課題とする。
【０００６】
ＯＡの病因
ＯＡは、関節軟骨の欠陥のある全体性（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）、加えて関節の周縁（ｍａｒｇｉｎｓ）に存在する硬骨（ｂｏｎｅ）の相関する変化、に関連する関節の症状（ｓｙｍｐｔｏｍ）および徴候（ｓｉｇｎｓ）を生じる状態の不均一なグループである。ＯＡは、特発性（即ち、一次性）または他の病状（炎症性、生化学性、内分泌関連、代謝性、および解剖学的もしくは発生学的な異常）に対しての二次性の何れかであろう。年齢は、ＯＡの最も大きなリスク因子であるが、重い外傷および反復性の関節の使用もＯＡの重要なリスク因子である。ＯＡにおける関節の関与のパターンは、以前の職業（ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ）または副業（ａｖｏｃａｔｉｏｎａｌ）での過重負担によっても影響される。
【０００７】
本疾患は、２つの一般的な段階、即ち、（１）代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）および（２）代償不全性（ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）の段階を有している。現在、多くの研究者は、主な変化が軟骨細胞外マトリックスにおいて外因性の原因（即ち、負荷、負傷など）によって発生するとの印象をもっている。軟骨のコラーゲンネットワークにおける欠陥は明白であり、そしてリソゾーム酵素および分泌されたプロテアーゼ（ＭＭＰｓ、プラスミン、カテプシン）が、おそらく軟骨マトリックスにおいて最初に観察される変化の原因となっている。それらの合成および分泌は、ＩＬ−１または他の因子（例えば、機械的な刺激）によって刺激される。疾患の初期段階において、補償的な細胞応答が活性化される。軟骨細胞によって分泌されるＴＩＭＰ および ＰＡＩ−１のようなプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼ活性に対向することにより系を安定化させる。ＩＧＦ−１ および ＴＧＦ−βなどの成長因子は、損傷を治癒させる修復プロセスに関係しており、少なくとも軟骨細胞系統（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ）の細胞の増殖を活性化することによって前記プロセスを安定化する。最終的に、これは肥大性（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ）軟骨細胞の蓄積を生じる。後者の細胞は、プロテオグリカン （ＰＧ）濃度が増大する際に発現する顕著な生合成活性を有しており、軟骨の肥厚に関係している（「代償性」ＯＡ）。代償性の機構は、幾年にもわたり適度な機能的状態に関節を維持し得る。
しかしながら、修復組織は持続することはなく、ＰＧ合成の速度は軟骨の厚さが完全になくなることに伴って減少する。これはＯＡの代償不全段階を示している。関節軟骨の崩壊に続いて、組織障害の部位への前駆細胞の移動を生じる。これらの細胞は、増殖して４つの細胞タイプに分化する、即ち、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）、軟骨芽細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａｓｔｓ）、軟骨吸収細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｌａｓｔｓ） および線維芽細胞であり、これらは協力して関節空間に突出する骨増殖体（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅｓ）と称される骨様の構造体を形成し、このようにしてその動きが阻害されることになる。最終的に、徐々に軟骨の硬骨による置換が生じる。
【０００８】
この現象の原因は、知られていない。１つの可能性は、ＯＡにおいて関節軟骨細胞または滑膜線維芽細胞の正常な阻害的な成長の制御が変化することである。これは、正常な関節軟骨には認められない２タイプの細胞の蓄積を可能にするものであり、これらの細胞とは、（１）修正された特性を有する未成熟の間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）および骨髄の細胞、並びに（２）肥大性関節軟骨細胞（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）である。以前の結果は、肥大性軟骨細胞が脈管形成性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）および骨形成性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）因子の分泌によって骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を引き起こし得ることを明瞭に示している〔Ｈｏｒｎｅｒ， Ａ．， Ｂｉｓｈｏｐ， Ｎ． Ｊ．， Ｂｏｒｄ Ｓ．， Ｂｅｅｔｏｎ， Ｃ．， Ｋｅｌｓａｌｌ， Ａ． Ｗ．， Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｎ． ａｎｄ Ｃｏｍｐｓｔｏｎ， Ｊ． Ｅ． （１９９９）． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＶＥＧＦ） ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ． Ｊ． Ａｎａｔ． １９４： ５１９−５２４〕。
【０００９】
ＯＡにおける治療上の干渉（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、３つの主なプロセスを標的とするものである。３つのプロセスとは、即ち、
・初期の軟骨障害の阻止
認可された治療戦略の一つ、関節への物理的圧力の減少を推奨することと、メタロプロテアーゼの阻害剤による治療との組み合わせ；
・後期段階での全体の軟骨破壊の阻止または減弱
軟骨リハビリテーション（即ち、完全に機能的な関節軟骨組織を産生することができる成熟軟骨細胞への、間葉の前駆体の適切な分化の促進）につながるプロセスの治療的な活性化を意味している；
・疾患の終結段階における骨増殖体形成の阻止または減弱
関節軟骨の部位での異所性（ｅｃｔｏｐｉｃ）の骨形成の治療的な阻害を意味している。
【００１０】
それ故、発明者は、前駆細胞の軟骨細胞への分化を刺激もしくは阻害する、および／または、前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激もしくは阻害する特定の因子をコードする標的遺伝子の同定を試みた。
【００１１】
既知の骨形成因子（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）であるＩＬ−１、ＦＧＦ−２および機械的ストレスに起因する遺伝子発現の変化は、ＯＡ発症と関連するものであり、それ故、治療介入により妨害されるべき現象である。驚くべきことに、ＦＧＦ−２によりアップレギュレートされた遺伝子の一つがスペルミジン・シンターゼ遺伝子であることが本発明者らによって見つけられた。このことは、スペルミジン・シンターゼ遺伝子がＯＡ経路に関与しているだろうことを示唆していた。
【００１２】
スペルミジン・シンターゼ
スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）は、３つの生物活性ポリアミンの中の１つであり、他の２つはプトレッシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）とスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）である。ポリアミンは、細胞増殖と細胞分化の制御に重要な細胞成分のグループを構成する。
それらの正確な機能はまだ解明されていないが、ポリアミンは複製、転写、および翻訳などの多くの細胞過程において重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【００１３】
ポリアミン生合成経路は、２つの高度に制御される酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）およびＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、並びに、２つの構成的に発現される酵素、スペルミジン・シンターゼおよびスペルミン・シンターゼからなる。
スペルミジン・シンターゼは、プトレッシン （１，４−ジアミノブタン）の３−アミノプロピレーション（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌａｔｉｏｎ）を触媒してスペルミジンを産生する７４ｋＤａの蛋白質である。スペルミジンの生合成は、ＳＡＭ脱炭酸酵素によるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のＳアデノシル−３−メチルチオプロパンアミン（脱炭酸化ＳＡＭ）への脱炭酸反応、及びオルニチン脱炭酸酵素によるオルニチンのプトレッシンへの脱炭酸反応を必要とする。そして脱炭酸化 ＳＡＭは、スペルミジン・シンターゼと反応して、この酵素のアミノプロピル化形態を産生し、そしてそれはアミノプロピル基をプトレッシンに転移してスペルミジンおよび５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を産生する。活性酵素は、２つの同一サブユニットの二量体であり、補酵素を必要とせず、且つアミノプロピル供与体としてｄｃＡｄｏＭｅｔおよび受容体としてプトレッシンを使用する。
【００１４】
プトレッシン、スペルミジン および スペルミンは、軟骨を含む多くの生体組織において見つけられている。それらの形成（ＯＤＣにより触媒される）は、骨において軟骨の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が誘導される期間に観察される。副甲状腺ホルモン（グリコサミノグリカンの合成を刺激する）は、ＯＤＣ活性を誘導し且つ培養下の分化したウサギ肋骨軟骨細胞のポリアミンレベルを増加させる。休息中の軟骨は、プトレッシンを欠いている。骨化している軟骨は、休息中の区域に比べてより多くのポリアミンを含有している（組織重量およびＤＮＡ量に基づく）。骨化している区域のスペルミジン量は５倍高く、スペルミン量は約２倍である。スペルミジン／スペルミン比は、骨化している軟骨において１．７であり、休息中の区域においては０．６９である。スペルミジンのみが、セファロース４Ｂ  ―  タイプＩＩコラーゲンのカラムからプロテオグリカンサブユニットを置換する能力を示した〔Ｆｒａｎｃｏ Ｖｉｔｔｕｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６）． Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ８８１： ３８−４５〕。
【００１５】
プロテオグリカンユニットとコラーゲンとの相互作用におけるポリアミンの効果を、プロテオグリカンサブユニットを充填したセファロース４Ｂ  ―  コラーゲンのカラムからのプロテオグリカンの溶出により試験した。プトレッシン および スペルミンには効果がないにもかかわらず、スペルミジンはプロテオグリカンサブユニットを置換する強い能力を示した、即ちプロテオグリカンサブユニットの約９０％が前記カラムから除去された。スペルミン および スペルミジンは、軟骨で産生されたアルカリ・ホスファターゼの活性を増加させた。スペルミジンは、経骨性軟骨（ｐｒｅｏｓｓｅｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）の休息中の区域の細胞において観察された。細胞染色は消失し、増殖している細胞および円柱細胞（ｃｏｌｕｍｎａｒ ｃｅｌｌｓ）の区域と接近している。スペルミジンの染色は、軟骨細胞の肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）が開始された円柱細胞の境界（ｌｉｍｉｔ）のマトリックス中においてのみ顕著である。３つのポリアミンのなかで、スペルミジンは最も多く：スペルミジン／スペルミンの高モル比は、急速な成長の指標として採用されている。スペルミジンの最大量は、骨化している領域において認められている。
【００１６】
ポリアミン  代謝
前駆体であるプトレッシン および 脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニン （ｄｃＡｄｏＭｅｔ）の合成は、２つの脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素 （ＯＤＣ， ＥＣ ４．１．１．１７） および Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素 （ＡｄｏＭｅｔＤＣ， ＳａｍＤＣ， ＥＣ ４．１．１．５１）の作用により誘発される。これらの酵素は、成長因子およびそれらのレベルを増加させる他の刺激の双方により並びにポリアミン自身（それらの活性を低減させる）により非常に高度に制御される。これらの因子（ａｇｅｎｔｓ）の組み合わせ効果は、ポリアミンレベルを細胞の成長および分化に必要なレベルに調整することである。ＯＤＣ および ＡｄｏＭｅｔＤＣの活性の交代（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）は、ポリアミンレベルを制御する主な原動力である。アミノプロピル転移酵素、プトレッシン アミノプロピル転移酵素 （ＰＡＰＴ， スペルミジン・シンターゼ， ＥＣ ２．５．１．６） および スペルミジン アミノプロピル転移酵素 （ＳＡＰＴ， スペルミン・シンターゼ， ＥＣ２．５．１．２２）の活性は、主にそれらの基質の有効性により制御される。ポリアミンは、細胞内でのそれらのデノボ合成に加えて、特定の輸送系による摂取の結果としても取得できる。この輸送系は、細胞内ポリアミン含有量によりネガティブに、また成長因子および癌遺伝子によりポジティブに制御される。前記輸送系の存在およびポリアミン枯渇による前記輸送系の活性の増強が、ポリアミン合成の阻害効果の改善における重要な因子である。外因性のポリアミンの摂取は、これらの阻害剤（抗腫瘍因子としての）の臨床試験が不成功であったことの重要な要因であろう。最終的に、ポリアミンレベルは、相互交換（ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）、酸化および流出（ｅｆｆｌｕｘ）の結果として変化させることが可能である。ポリアミンの末端の窒素原子の酸化は、主に細胞外に局在すると思われるＣｕ＋２含有  酸化酵素により達成されるが、細胞からそれらを完全に除くことは達成されていない。細胞からのポリアミンの相互交換および流出は、ポリアミンのアミノプロピル端をアセチル化してＮ−アセチルスペルミン およびＮ−アセチルスペルミジンを形成するスペルミジン／スペルミン−Ｎ−アセチル転移酵素 （ＳＳＡＴ， ＥＣ ２．３．１．５７）の作用によって促進される。これらのアセチル誘導体は、細胞の多価陰イオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ）とそれほど強くない程度で結合し、排除されるか又は迅速に代謝される。それらは、ポリアミン酸化酵素 （ＰＡＯ）と称されるＦＡＤ依存性酸化酵素により内部の窒素原子を酸化され、Ｎ−アセチルアミノプロパノールを分離し、そしてスペルミンをスペルミジンに、そしてスペルミジンをプトレッシンへと転換させる。この経路の制限要因はＳＳＡＴの活性である。ＳＳＡＴは通常非常に低いが、ポリアミンの細胞内含有量の増加により又は毒性刺激の適用により多大に誘導され、膜および細胞オルガネラからのポリアミンの放出を生じさせる。生理的な条件下において、ＰＡＯは非アセチル化ポリアミンに対する活性を若干有しているか又は有していない。従って、本発明の課題は、異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤を同定すること、及びＯＡを抑制または遅延さ���る潜在的な薬物としてのそれらの効果を評価することである。
【００１７】
本発明の更なる課題は、ＯＡを治療するための及び軟骨リハビリテーションにおける使用のための治療因子（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）を提供することである。
【００１８】
本発明のこれら及び他の課題は、以下の記載中に詳細に説明される。
【００１９】
【発明の概要】
第一の側面において、本発明は、ＯＡ治療の必要がある被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）を治療する方法であって、この方法はスペルミジン生合成の実質的な阻害に十分効力のある量のスペルミジン生合成の阻害剤を前記被験者に投与することを含み、これによって前記被験者を治療する方法である。
【００２０】
好適な態様において、前記被験者に投与される阻害剤は、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である。
【００２１】
特に好適な態様によると、前記スペルミジン・シンターゼ阻害剤は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｆｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および破骨発生（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の何れか１つの阻害を生じる阻害剤である。
【００２２】
更に別の好適な態様において、前記被験者に投与されるスペルミジン・シンターゼ阻害剤は、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択されてもよい。
【００２３】
本発明は、更に哺乳類被験者のＯＡ治療においてポリアミン生合成経路の１以上の工程の阻害剤の使用に関する。この阻害剤は、好適な態様によるとスペルミジン生合成の阻害剤であり、より好適な態様においてはスペルミジン・シンターゼ阻害剤であり、スペルミジンの蓄積を阻害すべきである。
【００２４】
特に好適な態様によると、使用される前記スペルミジン・シンターゼ阻害剤は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じる阻害剤であってもよい。
【００２５】
使用される前記スペルミジン阻害剤は、既述したような既知のスペルミジン・シンターゼ阻害剤から選択されてもよい。
【００２６】
本発明は、更に哺乳類被験者のＯＡ治療に使用するポリアミン生合成経路の阻害剤を提供する。
この阻害剤は、好適な態様によると、スペルミジン・シンターゼ阻害剤であってもよい。より具体的には、ＯＡの治療に使用される阻害剤は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の阻害を生じるスペルミジン・シンターゼ阻害剤である。
更に別の側面において、本発明は、哺乳類被験者のＯＡを治療する薬学的組成物の製剤におけるポリアミン生合成経路の阻害剤の使用に関する。好ましくは、使用される前記阻害剤は、スペルミジン生合成の阻害剤、より好ましくはスペルミジン・シンターゼ阻害剤であってもよく；最も好ましくは、この阻害剤は、スペルミジンの蓄積を阻害する並びに軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じる阻害剤である。
【００２７】
ＯＡを治療する薬学的組成物の製剤に使用される前記阻害剤は、本発明に従って、上記に開示されたスペルミジン・シンターゼ阻害剤から選択されてもよい。
【００２８】
本発明は、更にＯＡを治療する治療組成物を提供する。この組成物は、活性成分としてポリアミン生合成経路の１以上の工程の阻害剤を含む。より好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジン生合成の阻害剤である。最も好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である。
【００２９】
好適な態様によると、本発明の組成物は、更に随意的に薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含んでもよい。
【００３０】
本発明の別側面は、ＯＡを治療する治療組成物を製造する方法に関する。この製造する方法は、次ぎの工程、（ａ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じるスペルミジン・シンターゼの阻害剤を同定することと；および（ｂ）前記阻害剤を薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤と混合することと；を含む方法である。
【００３１】
本側面の好適な一態様において、ＯＡを治療する治療組成物の製剤に適切なスペルミジン・シンターゼ阻害剤の同定は、次ぎの工程、
（ａ）候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤を取得することと；
（ｂ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つにおいて前記候補阻害剤の効果を評価方法で評価することと；
により実行される。
【００３２】
前記評価方法は、次の工程、即ち：
ｉ．  スペルミジン・シンターゼをコードするＤＮＡを含んでいる試験系を提供することと；
ｉｉ．  スペルミジンの発現を通常生じる条件下で前記系を前記試験候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤と接触させることと；および
ｉｉｉ．  終点の指標（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）における試験候補阻害剤の効果を、コントロールと比較して決定することと；を含み、
前記効果が、前記試験候補阻害剤によって軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生のうちの何れか１つの阻害の指標である方法。
【００３３】
特定の態様において、本発明による評価方法に使用される試験系は、インビトロ 細胞培養， エックスビボ 細胞培養， エックスビボ 器官培養 およびインビボ 動物モデルのうちの何れか１つであってもよい。更に別の特定の態様において、本発明の方法に使用される前記試験系により発現するスペルミジン・シンターゼは、内在性または外因性のうちの何れの様式で発現されてもよい。この試験系は、随意的に内在性および／または外因性の因子を更に含んでいてもよく、該因子はスペルミジンの発現に対して適切な条件を提供し、且つ軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つを決定するための終点の指標の検出に対して適切な条件を提供する。
【００３４】
選択した試験アッセイ系に依存して、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の阻害は、様々な方法で観察することができる。その方法は、細胞内染色アッセイ（免疫組織化学を含む）および観察可能なパラメータに影響するアッセイ（例えば、細胞周期の変化などの生理学的なリードアウト）を含む。
【００３５】
好適な態様によると、前記候補阻害剤の効果を評価するために、本発明の方法に使用される試験系は、インビトロでトランスフェクションした細胞培養（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）である。試験される細胞は、外因性に発現するスペルミジン・シンターゼを保持する。
【００３６】
代替となる態様において、評価の目的で本発明の方法に使用される試験系は、エックスビボ 骨培養であり、これは内在性に発現するスペルミジン・シンターゼを含んでいる。好ましくは、使用される骨培養は、胚の骨培養（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｎｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）である。
【００３７】
別の代替となる試験系は、インビボ系であり、これは動物モデル系である。本発明の方法によると、評価目的の動物モデルの使用は、終点の指標として関節炎の発生を利用可能とする。終点の指標として使用される関節炎の発生は、例えば、前記動物の足（ｐａｗ）の厚さを測定することにより決定されてもよい。足のサイズにおいてコントロールで観察された増加よりも少ない如何なる増加も、前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、或いは関節炎の発生の阻害の指標である。
【００３８】
好適な一試験系において、適切な動物モデルは、トランスジェニックマウスであってもよい。
【００３９】
更に別の好適なインビボ試験系において、内在性のスペルミジン・シンターゼを発現している関節炎哺乳類モデルは、本発明の評価方法によって使用されてもよい。この態様によると、前記関節炎動物により、終点の指標として関節炎の発生を利用することができる。
【００４０】
特に好適な態様によると、前記関節炎哺乳類は、関節炎ラットまたは関節炎マウスであってもよい。
【００４１】
本発明の特に好適な態様は、ＯＡを治療する治療組成物を製造する方法に関する。この方法は、次ぎの工程、（ａ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じるスペルミジン・シンターゼの阻害剤を同定することと；並びに（ｂ）前記阻害剤と薬学的に許容される担体とを混合することと；を含む。適切な阻害剤の同定は、候補阻害剤を取得すること及び特定の候補の効果を評価することを含む。この態様によると、スペルミジン・シンターゼ阻害剤の候補は、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル） アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から阻害剤を選択する更なる評価によって取得し得る。
【００４２】
代替的に、候補阻害剤は、更なる評価のためにスペルミジン・シンターゼの阻害剤である物質を、スクリーニングする方法により取得し得る。
本発明によると、かかるスクリーニング方法は、次の工程、即ち：
（ａ）スペルミジン・シンターゼを含んでいる混合物を提供することと；
（ｂ）スペルミジンの生合成を通常生じる条件下で前記混合物を試験物質と接触させることと；および
（Ｃ）終点の指標において前記試験物質の効果を決定することと；を含み、
これによる前記終点の阻害が、前記試験物質によるスペルミジン・シンターゼの阻害を示す方法である。この代替の特定の態様によると、前記終点の指標は、スペルミジン・シンターゼ触媒反応の産物の存在であってもよい。
【００４３】
本発明の上記および他の特徴および利点の全ては、本願に添付される図面を参照して、以下の例示的で且つ限定されることのないその好適な態様の説明により更に理解されるであろう。
【００４４】
【発明の詳細記述】
本発明は、好適な態様の例示的で且つ限定されることのない記載により以下に更に説明される。
【００４５】
ＯＡは、軟骨の変性のみならず異所性の骨形成によっても特徴づけられる破壊的な関節疾患である。発明者は、インビトロ細胞系（ＨＭＳＣ細胞） および エックスビボ 器官培養〔関節シミュレータにおいて成長した胎児の骨端（ｅｐｉｐｈｙｓｅｓ）〕の双方を実行して、この疾患の発生に重要であろう遺伝子を発見した。ヒトの関節軟骨 前駆細胞（ＨＭＳＣ）を使用して、一連の遺伝子発現プロファイリング実験を実施した。これらの細胞は、軟骨リハビリテーション（ＩＧＦ−１）或いはＯＡの開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および発生 （ＩＬ１−β， ｂＦＧＦ−２， 機械的ストレス）を模倣する様々な治療に供試された。細胞の異なる結合タイプ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｔｙｐｅｓ）を有する複雑な組織状態において生じる遺伝的イベントをよく反映することから、インビトロ試験に加えてエックスビボ実験も実行された。適用される様々な治療に対応する遺伝子発現プロファイルが、マイクロアレイハイブリダイゼーションにより試験され、そして出願者のバイオインフォーマティックツールによって分析された。得られた遺伝子発現パターンは、選択されたインビトロ細胞系がインビボのＯＡ関節で生じるプロセスを正確に反映したことを示しており、これはＯＡのマーカーとして既知の多くの遺伝子が発明者によって同定され、その遺伝子が期待されるタイプの挙動を示したことから理解される。
【００４６】
本発明者は、ｂＦＧＦ−２治療によりアップレギュレートされる遺伝子として、スペルミジンの生合成に関与するスペルミジン・シンターゼ遺伝子を同定した。この発見は、ポリアミン生合成経路、特にスペルミジンの生合成、より具体的にはスペルミジン・シンターゼがＯＡに潜在的に関与していることを示している。従って、それが哺乳動物におけるＯＡを治療する薬物の更なる開発のための薬物標的として選択された。
【００４７】
従って、第一の側面として、本発明は、ＯＡ治療の必要がある被験者を治療する方法に関する。この方法は、この方法によって前記被験者が治療されるように前記被験者にスペルミジン生合成の実質的な阻害を阻害する効果的なスペルミジン生合成の阻害剤の量を投与することを含む。
【００４８】
「治療」とは、疾患状態の緩和およびその進行の緩和を意味し、特定の疾患に関連する症状の部分的な又は完全な除去をも含んでいる。また、「治療」とは、疾患を予防するか又はその発症を遅延させることを意味してもよい。
【００４９】
発明の背景に詳細に記載されているように、ポリアミン生合成経路は、２つの高度の制御された酵素、オルニチン脱炭酸酵素およびＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素、並びに２つの構成的に発現される酵素、スペルミジン・シンターゼおよびスペルミン・シンターゼを必要とする。スペルミジンの生合成は、ＳＡＭ脱炭酸酵素によるＳ−アデノシルメチオニン （ＳＡＭ）のＳ−アデノシル−３−メチルチオプロパンアミン（脱炭酸化ＳＡＭ）への脱炭酸反応、およびオルニチン脱炭酸酵素によるオルニチンのプトレッシンへの脱炭酸反応を必要とする。次に脱炭酸化 ＳＡＭは、酵素のアミノプロピル化形態を形成するためにスペルミジン・シンターゼと反応し、次にアミノプロピル基をプトレッシンに転移して、スペルミジン および５’−メチルチオアデノシン （ＭＴＡ）を産生する。前駆体であるプトレッシンおよび脱炭酸化 Ｓ−アデノシルメチオニン （ｄｃＡｄｏＭｅｔ）の合成は、２つの脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素 （ＯＤＣ， ＥＣ ４．１．１．１７） およびＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素 （ＡｄｏＭｅｔＤＣ，ＳａｍＤＣ， ＥＣ ４． １．１．５１）の作用によって誘発される。
【００５０】
好適な態様において、本発明の方法によって前記被験者に投与される阻害剤は、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である。
本明細書中で使用される「阻害剤」という用語は、元来同定された阻害分子に由来するホモログおよびアナログを含み、その分子はポリアミン生合成の阻害活性を保持しており、より具体的にはスペルミジン 生合成の阻害活性を保持しており、更により具体的には親分子（ｐａｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）において認められる特異的なスペルミジン・シンターゼ阻害活性を保持している。「阻害剤」という用語は、ポリアミン経路の両方の既知の阻害剤を含み、特にスペルミジンの生合成の阻害剤、より具体的にはスペルミジン・シンターゼ活性の阻害剤、同様に以下（例えば、実施例４における）に記載されるスクリーニング系において発見された任意の阻害剤を含む。
【００５１】
「実質的な阻害」という用語は、１０〜９０％の範囲のレベル、より好ましくは２５〜７５％の範囲のレベル、更により好ましくは４０〜６０％の範囲のレベルでスペルミジン生合成を阻害することを意味する。
【００５２】
特に好適な態様によると、スペルミジン・シンターゼ阻害剤は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じる阻害剤である。
【００５３】
更に別の好適な態様において、本発明の方法によって投与されるスペルミジン・シンターゼ阻害剤は、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択されてもよい。
上記にリストされた阻害剤中で特に関連するものは、ＡｄｏＤＡＴＯ、４ＭＣＨＡ およびＤＣＨＡである。文献中には細胞培養 およびインビボ中におけるこれらの阻害剤の効果に注目した研究を記載されている。例えば、ＡｄｏＤＡＴＯ（転移酵素反応の遷移状態アナログ）は、スペルミジンレベルを低減させ、そして細胞増殖を顕著に減少させる。ＡｄｏＤＡＴＯのラセミ体への様々な哺乳類細胞の暴露は、この薬剤によるスペルミジン・シンターゼの阻害と一致する細胞のスペルミジン含有量の劇的な減少およびプトレッシンの付随する上昇を生じた〔Ｐｅｇｇ ＡＥ，Ｔａｎｇ ＫＣ， Ｃｏｗａｒｄ ＪＫ． （１９８２）． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−１， ８−ｄｉａｍｉｎｏ−３−ｔｈｉｏｏｃｔａｎｅ ｏｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１ （２０）： ５０８２−５０８９〕。
【００５４】
１０日間にわたるインビボでの４ＭＣＨＡに対するラットの長期暴露は、様々な組織においてスペルミジンの７０〜８０％の低減を生じるが、成長に如何なる明白な効果も無いままに全体のポリアミン含有量が一定に維持されるようにスペルミンの補償的増加が認められた。１０日間または４ヶ月の期間にわたる４ＭＣＨＡの経口投与は、ラット組織のスペルミジンの特異的で且つ顕著な減少を生じた〔Ｓｈｉｒａｈａｔａ Ａ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ，Ｂｅｐｐｕ Ｔ， Ｈｏｓｏｄａ Ｈ， Ｓａｍｅｊｉｍａ Ｋ． （１９９３）． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｓｐｅｒｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｎ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｒａｔ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５ （９）： １８９７−１９０３〕。
【００５５】
新生児ラットへのＤＣＨＡの日々の投与は、脳のスペルミジンの用量依存的な枯渇を生じ、これはプトレッシンおよびスペルミンの上昇を伴うものであった。継続的なＤＣＨＡ治療にもかかわらず、３つのポリアミン全てのレベルは、２週間以内に正常に戻った〔Ｓｌｏｔｋｉｎ ＴＡ， Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ Ｊ， Ｐｅｒｓｏｎｓ Ｄ，Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ＷＬ． （１９８４）． Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒａｔ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ． ＬｉｆｅＳｃｉ． ３５ （１０）： １１２５−１１３１〕。
好適な態様において、本発明の方法は、哺乳類被験者、好ましくは、ヒトを治療することを意図している。それ故、「患者」、「哺乳類被験者」または「必要がある被験者」という用語によって、その治療が望まれる任意の哺乳類を意味しており、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコの被験者、好ましくはヒト患者を含んでいる。
【００５６】
本発明の治療方法は、必要がある被験者に前記阻害剤の効果量を投与することを含む。本明細書に使用される「効果量」は、選択される結果を達成するのに必要な量を意味する。例えば、本発明の阻害剤または組成物の効果量は、変形性関節症の病状の治療に効果的な量である。
【００５７】
本発明は、更に哺乳類被験者のＯＡの治療において、スペルミジン生合成の１以上の工程の阻害剤の使用に関する。
治療方法において、本態様においてもまた、好適な態様による阻害剤は、スペルミジン・シンターゼ阻害剤であってもよい。好ましくは、本発明において使用されるスペルミジン・シンターゼ阻害剤は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じる阻害剤である。
【００５８】
特に、本発明に使用されるスペルミジン阻害剤は、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン （４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択されてもよい。
本発明は、更に哺乳類被験者のＯＡ治療に使用されるポリアミン生合成経路の阻害剤を提供する。
本態様においても、前記阻害剤は、好ましくはスペルミジン・シンターゼ阻害剤、より具体的には軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の阻害を生じるスペルミジン・シンターゼ阻害剤である。ＯＡ治療に使用される本発明の前記スペルミジン・シンターゼ阻害剤は、具体的には、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’− （ （３− アミノプロピル） アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ） アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から選択され得る。
【００５９】
更に別の側面において、ポリアミン生合成経路の少なくとも１つの工程における上記の阻害剤、具体的にはスペルミジン生合成の阻害剤、より具体的にはスペルミジン・シンターゼの阻害剤は、哺乳類被験者のＯＡを治療する薬学的組成物の製剤に使用し得る。
【００６０】
本発明は、更にＯＡを治療する治療組成物を提供する。本発明のこの組成物は、活性成分としてポリアミン生合成経路の１以上の工程の阻害剤を含む。好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジン生合成の阻害剤である。
最も好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジン・シンターゼ阻害剤である。本発明の組成物に含まれる具体的な阻害剤は、上記のリストに記載されたものである。
本発明の組成物および方法は、ヒトのＯＡ治療を特に意図しているが、他の哺乳類も含まれる。これらの組成物は、治療される被験者に直接投与してもよい、またはそれらの投与前にそれらをオボアルブミンもしくは血清アルブミンなどの担体蛋白質と結合させることが望ましい。治療の処方（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は、任意の通常の投薬処方（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で投与し得る。処方は、典型的には少なくとも１つの活性成分（上記で定義されたような）と共に１以上のその活性成分に許容される担体を含む。
【００６１】
好適な態様によると、本発明の組成物は、更に薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を随意的に含む。
【００６２】
それぞれの担体は、他の成分と適合し且つ被投与者に無害であるという意味で薬学的に且つ生理学的に許容されるものであるべきである。処方には経口、経直腸および経鼻投与に適切な処方が含まれるが、好適な処方は、経筋肉、経静脈、経皮および特に皮下投与を含む非経口投与を意図している。前記処方は、単位用量の形態（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で通常存在し得る、および任意の製薬学（ｐｈａｒｍａｃｙ）の技術において既知の方法により調製し得る。
【００６３】
本発明の組成物は、様々な方法で投与できる。制限されない例として、前記組成物は、経静脈的に配送し得る、又は冒された部位に直接的に若しくは近接する部位に注射し得る。
【００６４】
注射に適切な薬学的形態は、無菌の水性溶液もしくは分散液および無菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調合剤（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のための無菌粉末を含む。全てのケースにおいて、前記形態は、無菌でなければならない且つ容易な注射器性能（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）を示す程度に流動性でなければならない。それは製造および保存する条件下で安定でなければならない、且つそれは細菌および真菌などの微生物の汚染活動に対抗して保存されなければならない。前記担体は、例えば， 水， エタノール， ポリオール （例えば， グリセロール， プロピレン・グリコール， および液体ポリエチレン・グリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持できる。
【００６５】
微生物の活動の防止は、例えばクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤および抗真菌剤により成し得る。多くのケースにおいて、それは、例えば糖類または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を前記組成物中に使用することにより成し得る。
【００６６】
無菌の注射可能な溶液は、要求される量の活性化合物を適切な溶媒中に上記に列挙された様々な他の成分と共に、要求されるように混合し、次に濾過滅菌することにより調製される。
一般的に、分散液は、様々な滅菌した活性成分を、基本的な分散媒および上記に列挙された要求される他の成分を含有する無菌のビヒクルに混合することによって調製される。
【００６７】
無菌の注射可能な溶液を調製する無菌粉末のケースにおいて、好適な調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分に加え任意の付加的な所望の成分を含む粉末を生産する減圧乾燥および凍結乾燥技術である。
【００６８】
本明細書中に使用される「薬学的に許容される担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤等を含む。薬学的な活性物質に対するかかる媒体（ｍｅｄｉａ）および薬剤の使用は、当該技術において周知である。任意の通常の媒体および薬剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物へのその使用が意図される。
【００６９】
補助的な活性成分もまた前記組成物に導入できる。
【００７０】
本発明の組成物の好適な経路としては、例えば不活性の希釈剤と共に若しくは担体と共に、または硬殻もしくは軟殻のゼラチンカプセルに入れて、または錠剤に圧縮して、または食餌と共に直接的に投与するなどの経口投与を介して投与し得る。
【００７１】
組成物の服用量は、患者のＯＡの症状を改善する量であればよい。好適な服用量が優良実験室規範（ｇｏｏｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）および標準的な医学技法にしたがい個別に適合されることは当業者によって理解された。
【００７２】
本発明の別側面は、ＯＡを治療する治療組成物を製造する方法に関する。この方法は、次ぎの工程、（ａ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じるペルミジン・シンターゼの阻害剤を同定することと；および（ｂ）前記阻害剤を薬学的に許容される担体と混合することと；を含む。
【００７３】
本側面の好適な一態様において、ＯＡを治療する治療組成物の製剤に適切なスペルミジン・シンターゼ阻害剤の同定は、次の工程、即ち：
（ａ）候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤を取得することと； および
（ｂ）軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つにおいて前記候補阻害剤の効果を評価方法で評価することと；により実施される。
【００７４】
本発明によると、この評価方法は、次の工程、即ち：
ｉ．  スペルミジン・シンターゼをコードするＤＮＡを含んでいる試験系を提供することと；
ｉｉ．  スペルミジンの発現を通常生じる条件下において、前記系を前記試験候補スペルミジン・シンターゼ阻害剤と接触させることと；および
ｉｉｉ．  コントロールと比較した終点の指標（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）における前記試験候補阻害剤の効果を決定することと；を含み、前記効果が前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害の指標となる方法である。
【００７５】
選択したアッセイ試験系に依存して、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の阻害は、細胞内染色アッセイ（免疫組織化学を含む） および観察可能なパラメータに影響するアッセイ（例えば、細胞周期の変化などの生理学的なリードアウト）を含む様々な様式で観察することが可能である。
【００７６】
特定の態様において、本発明による評価方法により使用される試験系は、インビトロ 細胞培養， エックスビボ 細胞培養， エックスビボ 器官培養 およびインビボ 動物モデルのうちの何れか１つであってもよい。
【００７７】
更に別の特定の態様において、本発明の方法において使用される試験系により発現されるスペルミジン・シンターゼは、内在性または外因性の何れの様式で発現されてもよい。更に、この試験系は、スペルミジンの発現に対し並びに軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生のうちの何れか１つを決定する終点の指標の検出に対し適切な条件を提供する内在性 および／または 外因性の因子を随意的に含んでいてもよい。
【００７８】
更に、異なる試験系の終点の指標において評価された候補阻害剤の効果は、前記終点の上昇または減少の何れかであることが注意される。
【００７９】
特に好適な態様によると、本発明の方法により決定される終点の指標は、分化マーカーであってもよく、これは視覚的に検出可能なシグナルを生じる。前記視覚的に検出可能なシグナルは、アルシアンブルー染色 およびアリザリンレッド染色どちらであってもよいが、それらに限定されることはない。上昇したアルシアンブルー染色は、増加した軟骨プロテオグリカンを反映するものであり且つ軟骨形成の指標である。一方、上昇したアリザリンレッド染色は、石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を反映するものであり且つ軟骨細胞最終分化の指標である。それ故、好適なスペルミジン・シンターゼ阻害剤の一候補は、アルシアンブルー染色の上昇およびアリザリンレッド染色の減少を生じる物質であろう。
【００８０】
別の特に好適な態様において、前記終点の指標は、適切な手段により検出される視覚的に検出可能なシグナルを生じる肥大マーカーの発現であってもよい。制限されない例として、肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を検出するためのかかる手段は、コラーゲンタイプＸの存在を染色する免疫組織化学染色であってもよい。
【００８１】
或いは、前記終点の指標は、適切な手段で検出される細胞増殖であってもよい。１つの可能性として、細胞増殖は、細胞周期 ＦＡＣＳ 分析により検出されてもよい。或いは、前記終点の指標は、細胞増殖であってもよく、適切な手段により検出される。１つの可能性によると、細胞増殖は、細胞周期ＦＡＣＳ分析により検出されてもよい。或いは、増殖 マーカーの存在を染色する免疫組織化学染色によって細胞増殖を決定することが適切であろう。好適な 増殖 マーカーは、ＰＣＮＡであってもよい。
【００８２】
好適な態様によると、前記候補阻害剤の効果を評価する本発明の方法に使用される試験系は、インビトロでトランスフェクションした細胞培養物である。これらの細胞は、外因性に発現される スペルミジン・シンターゼを保持している。
【００８３】
更に別の特に好適な態様において、試験系として本発明の評価方法で使用される、細胞またはトランスフェクションした細胞は、原核または真核細胞であり、特に細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または好ましくは哺乳類細胞である。最も好適なものは、ＲＣＪ３． ＩＣ５．１８ 細胞〔胎児ラット頭蓋冠（ｃａｌｖａｒｉａ）のクローン細胞集団〕であり、これは軟骨 分化 経路に限定された細胞である〔Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ， Ａ． Ｅ， Ｈｅｅｒｓｃｈｅ， ． ＩＮ．， Ａｕｂｉｎ， Ｊ． Ｅ （１９９６）． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｒａｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０： ２９９−３０７〕。これらの細胞は、スペルミジン・シンターゼ 蛋白質をコードする核酸配列を含んでいるｐＣＭＶｎｅｏ 発現ベクターで、安定的にトランスフェクションされる。
【００８４】
本明細書中に使用される「発現ベクター」は、プラスミッド、ウイルス、バクテリオファージ、統合可能なＤＮＡ断片、および他のビヒクルなどのベクターを含み、これらは宿主のゲノム内へのＤＮＡ断片の統合を可能とする。
発現ベクターは、典型的には、所望の遺伝子もしくはその断片、並びに、適切な宿主細胞において認識され且つ所望の遺伝子の発現に影響し且つ作動できるように連結された遺伝子制御因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、を含有する自己複製するＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物である。これらの制御因子は、適切な 宿主内で発現に影響することが可能である。一般的に、前記遺伝子制御因子は、原核生物のプロモータ・システムまたは真核生物のプロモータ発現制御システムを含み得る。かかるシステムは、典型的には、転写プロモータ、転写の開始を制御する随意的なオペレータ、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス部位、転写および翻訳を終結させる配列等々を含む。発現ベクターは、宿主細胞とは独立した複製を許容する複製の起点を通常含む。
【００８５】
「作動できるように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、本明細書中で第１核酸配列が第２核酸配列と機能的に関連して配置された場合に、第１核酸配列が第２核酸配列と作動できるように連結されることを示すために使用される。例えば、プロモータがコード配列に作動できるように連結されている場合とは、該プロモータが該コード配列の転写または発現に影響する場合である。一般的に、作動できるように連結されたＤＮＡ配列群は、隣接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）し、そしてそこでは２つの蛋白質コード領域が同一の読み枠内に連結される必要がある。
【００８６】
一般的に、かかるベクターは、更に形質転換した細胞の表現型選択を提供できる特定の遺伝子を含む。様々な選択可能なマーカーを、何らかの構築物へ導入できる。例えば、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面蛋白質の発現などの選択可能な表現型を呈する選択可能なマーカーを使用できる。本発明の試験系で使用される発現ベクターは、更にタグ配列を含んでいてもよい。かかる配列は、組換え蛋白質の検出および分離を可能とする。制限されない例として、かかるタグ配列は、ＨＡ， ｃ−ｍｙｃ， ＧＳＴ， ＧＦＰ および， 好ましくはＨｉｓ−６のうちの何れであってもよい。
【００８７】
本発明によるヒト スペルミジン・シンターゼをコードする遺伝子を発現する原核生物および真核生物ウイルス発現ベクターの使用も意図される。
【００８８】
前記ベクターは、当業者に既知の方法により宿主細胞に導入される。前記宿主細胞への前記ベクターの導入は、細胞に構築物を導入する任意の方法によって達成され、これには例えば、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、電気穿孔または形質転換が含まれる。例えば、本明細書中に引用により援用される文献〔Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｄ． （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ〕を参照のこと。
【００８９】
「細胞」または「トランスフェクションした 細胞」は、本出願中に使用される用語である。かかる用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的な子孫をも意味することが理解される。ある種の修飾が、変異または環境の影響の何れかによって、続く世代に生じるだろうから、実際にはこのような子孫は親細胞と同一ではないであろう。しかし、かかる子孫は、本明細書中で使用される用語の範囲内になお含まれる。
【００９０】
本明細書中で使用される「トランスフェクションした 細胞」は、組換え ＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターで安定的に又は一過性にトランスフェクションされた細胞を意味する。薬物耐性または他の選択可能なマーカーは、一つには形質転換体の選択を促進することを意図している。加えて、薬物耐性マーカーなどの選択可能なマーカーの存在は、汚染した微生物を培養液中で増加させない目的で使用してもよい。トランスフェクションした細胞のかかる純培養は、生存のために誘導される表現型を要求する条件下で前記細胞を培養することにより取得されるであろう。
【００９１】
本明細書中に使用される「トランスフェクション」という用語は、核酸の導入を意味しており、例えば核酸が媒介する遺伝子導入により発現ベクターを受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）に導入することである。
【００９２】
本発明のインビトロ 試験系に使用される細胞またはトランスフェクションした細胞は、スペルミジン生合成に必須である並びに軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生を生じる経路に必須である可能性のある分子をコードする内在性もしくは外因性に発現可能な核酸構築物を更に含んでもよいことが理解される。
【００９３】
トランスフェクションした細胞に準拠した試験系におけるスペルミジン・シンターゼ阻害剤候補の効果は、例えば細胞周期ＦＡＣＳ 分析もしくはＰＣＮＡを用いた軟骨細胞増殖、アルシアンブルー およびアリザリンレッド染色による軟骨細胞最終分化、並びにコラーゲンタイプＸの存在を染色する免疫組織化学染色を使用した軟骨細胞 肥大を検査することによって評価し得る。
【００９４】
他の態様において、評価目的で本発明の方法に使用される試験系は、内在性に 発現される スペルミジン・シンターゼを含んでいるエックスビボ 骨培養である。好ましくは、使用される前記骨培養は、胚の骨培養であってもよい。最も好ましくは、該骨培養は、マウス胚から採取された後肢である。
【００９５】
軟骨細胞最終分化に対する異なる候補の効果は、本試験系の染色で検査される。この染色は処理した骨および非処理コントロール骨から調製した切片をアルシアンブルー（正常な関節 軟骨を染色する）、およびアリザリンレッドで染色する染色である。骨の縦の成長は、肥大性領域および石灰化した骨の長さにおける増加として計算される。
肥大はコラーゲンタイプＸの存在を染色する免疫組織化学染色を使用するこの系において評価され、および軟骨細胞増殖における候補 阻害剤の効果はＰＣＮＡにより決定される。
【００９６】
別の代替となる試験系は、動物モデルのインビボ系であってもよい。本発明の方法によると、評価目的で動物モデルを使用することにより、関節炎の発生を終点の指標として利用できる。終点の指標として使用する場合、関節炎の発生は、試験動物の足の厚さを測定することにより決定し得る。足の厚さの増加がコントロールに比べて低いことが、試験する候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、或いは関節炎の発生の阻害の指標である。
【００９７】
好適な一試験系において、適切な動物モデルは、外因性にスペルミジン・シンターゼを発現しているトランスジェニックマウスであってもよい。より具体的には、前記トランスジェニックマウスは、コラーゲン・タイプＩＩ  プロモータの支配下でスペルミジン・シンターゼ遺伝子を発現する。
【００９８】
この特定の態様によると、このインビボ 試験系を使用した候補 スペルミジン・シンターゼ阻害剤の効果の評価は、通常スペルミジン生合成を生じる条件下で、試験する候補阻害剤を前記トランスジェニックマウスに適用することを伴う。これらの特に適切な条件は、例えば、前記候補 阻害剤の適用前にＳＡＭなどのスペルミジン・シンターゼ基質を、試験されるトランスジェニックマウスに供給することであってもよい。
【００９９】
本明細書中に使用される「トランスジェニック動物」は、任意の動物であり、好ましくはヒト以外の哺乳類であり、トリもしくは両生類であってもよく、前記動物の１以上の細胞は、当該技術において周知のトランスジェニック技術などのヒトが介入する方法で導入した導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、異種核酸（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。前記核酸は、前記細胞に直接的または間接的に導入され、この導入は、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染などの計画的な遺伝子操作によって前記細胞の前駆体へ導入することにより実施される。遺伝子操作という用語は、古典的な交雑育種または試験管内受精を含まず、むしろ組換え ＤＮＡ分子の導入を意味する。この分子は、染色体内に統合されてもよい、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書中に記載される典型的なトランスジェニック 生物において、前記導入遺伝子は、細胞にヒト スペルミジン・シンターゼ遺伝子を発現させる。
【０１００】
トランスジェニック動物は、構成的および条件的な「ノックアウト」動物双方を含む。本発明の「ヒト以外の動物」は、げっ歯類（ｒｏｄｅｎｔｓ）、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの脊椎動物を含む。好適な ヒト以外の動物は、ラットおよびマウス、最も好ましくは マウスを含むげっ歯類のファミリーから選択される。本明細書中で「トランスジェニック動物」という用語は、組換え遺伝子が発見されるか又は前記動物のいくつかの細胞（全ての細胞ではない）において組換え型が発現される動物を意味する。
【０１０１】
本明細書中に使用される、「導入遺伝子」という用語は、部分的もしくは全体的に異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）もしくは外因性  〔即ち、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）である〕であるか、またはそれが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内在性遺伝子に対して相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である核酸配列（例えば、スペルミジン・シンターゼをコードする）を意味している。しかし、この核酸配列は、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような様式で動物のゲノム内に挿入するために設計されるか、または挿入される。例えば、この核酸配列は天然の遺伝子の位置と異なる位置に挿入されるか、またはこの核酸配列の挿入はノックアウト若しくは他の機能損失変異を生じる。導入遺伝子は、１以上の転写制御配列および選択された核酸の至適な発現に必要な任意の他の核酸（イントロンなどの）を含むことができる。
【０１０２】
トランスジェニックマウス 試験系での候補 阻害剤の効果は、関節炎の発生の測定に加え、上記に開示したエックスビボ 試験系に記載したような終点の指標を使用して評価できることが理解される。
【０１０３】
更に別の 好適な インビボ 試験系において、内在性 スペルミジン・シンターゼを発現している関節炎哺乳類モデルは、本発明の評価方法に使用し得る。この態様によると、関節炎動物を使用することで関節炎の発生を終点の指標に利用できる。関節炎の発生は、検査した関節炎哺乳類の足の厚さを測定することにより決定されてもよい。コントロールと比較した際の足のサイズの低い増加は、前記試験する候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生のうちの何れか１つの阻害、並びに関節炎の発生の阻害の指標である。それ故、関節炎動物 試験系での前記候補 阻害剤の効果は、これまで議論したような分化 および増殖の終点を使用して更に検査される。
【０１０４】
試験動物の目的で「動物」は、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、等の実験モデルとしての使用に適切な哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、前記哺乳類は、マウス および ラットの何れかである。しかしながら、本発明の方法および系は、非哺乳類動物にも適合し得ることが理解される。
【０１０５】
特に 好適な態様によると、前記関節炎 哺乳類は、外因性の手段で誘導された関節炎ラットまたは関節炎マウスであってもよい。より具体的には、関節炎ラットが使用された場合、コラーゲンタイプＩＩ誘導性の関節炎 （ＣＩＡ） 雌 ルイス・ラットが好適であろう。
【０１０６】
特に好適な態様は、変形性関節症 （ＯＡ）を治療する本発明の治療組成物を、製造する方法に関する。前記方法は、次ぎの工程、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つの阻害を生じるスペルミジン・シンターゼの阻害剤を同定することと、並びに前記阻害剤を薬学的に許容される担体と混合することと、を含む。適切な阻害剤の同定は、候補 阻害剤を取得すること、および特定の候補の効果を評価することを必要とする。
この特定の態様によると、候補 スペルミジン・シンターゼ阻害剤は、アデノシル・スペルミジン、ＡｄｏＤＡＴＯ、ＤＣＨＡ、トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン （４ＭＣＨＡ）、シクロヘキシルアミン、メチルグリオキサル  ビス−（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）、２−メルカプトプロピルアミン、Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン、５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン、１−アミノオキシル−３−アミノプロパン、５’−（イソブチルチオ）アデノシン、５’−（メチルチオ）アデノシン、並びに任意のその機能的ホモログ及びアナログからなる群から阻害剤を選択する更なる評価により取得されてもよい。
【０１０７】
或いは、候補阻害剤は、更なる評価のために、スペルミジン・シンターゼの阻害剤である物質をスクリーニングする方法により取得し得る。
本発明によると、かかるスクリーニング方法は次の工程、即ち：
（ａ）スペルミジン・シンターゼを含んでいる混合物を提供することと；
（ｂ）スペルミジンの生合成を通常生じる条件下で前記混合物を試験物質と接触させることと；および
（ｃ）終点の指標における前記試験物質の効果を決定することと、を含み、これによる前記終点の阻害が前記試験物質によるスペルミジン・シンターゼの阻害の指標となる方法である。
【０１０８】
この代替の特定の態様によると、前記終点の指標は、スペルミジン・シンターゼ触媒反応の産物の存在であってもよい。
かかる産物は、スペルミジン およびメチルアデノシン （ＭＴＡ）の何れか１つであってもよい。
生じる産物の何れかの検出は、以下の実施例４に記載される蛍光または放射性標識により実施してもよい。
【０１０９】
本発明のスクリーニングおよび評価の方法に対して試験される薬物は、蛋白質に基づく、炭水化物に基づく、脂質に基づく、核酸に基づく、天然の有機物に基づく、合成に由来する有機物に基づく、および抗体に基づく物質からなる群から選択される任意の物質であってもよい。より具体的には、前記核酸に基づく、蛋白質または抗体に基づく物質は、コンビナトリアル・ライブラリーの産物であってもよい。
【０１１０】
本明細書中に使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸 （ＲＮＡ）（適切である場合には）などのポリヌクレオチドを意味する。
前記用語は、均等物としてヌクレオチド アナログから作出されたＲＮＡ 若しくは ＤＮＡの何れかのアナログを含み、並びに、記載された態様に適用可能なものとしてセンス若しくはアンチセンスなどの二本鎖ポリヌクレオチドおよび一本鎖ポリヌクレオチドを含むとも理解されるべきである。
【０１１１】
効果を奏する候補の薬物もしくは物質は、スペルミジン・シンターゼの活性領域上の領域を模倣するペプチド、同様に非ペプチド性の小分子であろう。同定の容易性から、これらのペプチドは、スペルミジン 合成の阻害を検出するスクリーニングアッセイの別形態に特に有効である。開示されたスクリーニングアッセイ方法は、必ずしも大きなケミカルライブラリーの直接のスクリーニングに適切ではないが、それらはリード（ｌｅａｄｓ）を選別する他の技術と組み合わせることが可能な洗練された候補スクリーニングを可能とする。
【０１１２】
開示および記載されたように、本発明は、本明細書中に開示された特定の実施例、方法の工程、および物質に限定されず、方法の工程および物質は若干変化し得ることが理解される。本明細書中に使用される専門用語は、特定の態様を記載する目的でのみ使用され、限定されることを意図していない、従って本発明の範囲は、本願の特許請求の範囲の請求項およびその均等物によってのみ限定されることが理解される。
【０１１３】
本明細書および特許請求の範囲の請求項に使用される、単数形は、内容が明確に他を指示していなければ複数形の対象物（ｒｅｆｅｒｅｎｔｓ）を含む。
【０１１４】
本明細書および特許請求の範囲の請求項の全体において、その内容が他に要求していないのであれば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化した語は、既述された構成要素（ｉｎｔｅｇｅｒ）もしくは工程または構成要素もしくは工程の群の包含を示唆するが、如何なる他の構成要素もしくは工程または構成要素もしくは工程の群の排除を示唆していないと理解される。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明の各側面の実施において、発明者が実施する技術の代表である。これらの技術は、本発明を実施する好適な態様の典型例であるが、本発明の多くの修飾が本発明の精神および意図する範囲から逸脱することなくなされる。本開示を参照することによって、当業者はこの事項を認識するだろうことが理解されるべきである。
【０１１６】
【実施例】
実験方法
細胞培養
１．  細胞株
１． １．  ＨＭＳＣ
正常な成人の関節 軟骨 前駆細胞を、ヒト 軟骨から取得した。前記軟骨を、切開し、そして１０％ ＦＣＳ、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加した新鮮なＤＭＥＭ培地中で培養した。切開した軟骨の培養の２週間後、残った切片を除去し、そして付着した細胞を使用した。
【０１１７】
１． ２．  Ｕ２０Ｓ
ヒト 骨芽細胞様骨肉腫細胞株（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＨＴＢ−９６）から入手した。
【０１１８】
１．３．  ＲＣＪ３．１Ｃ５．１８
ＲＣＪ３．１Ｃ５．１８ 細胞株は、Ｊａｎｅ Ａｕｂｉｎ 教授（トロント大学、カナダ）から入手した。この細胞株は、文献〔Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ Ａ． Ｅ， Ｈｅｅｒｓｃｈｅ Ｊ． Ｎ， Ａｕｂｉｎ ＪＥ （１９９６） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｒａｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ６０： ２９９−３０７〕に記載されている。
【０１１９】
１．４．  ２９３ ヒト腎臓細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＣＲＬ−１５７３）から入手した。
【０１２０】
２．  機械的ストレス
ＨＭＳＣを集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）にまで培養フラスコ中で成育した。二次的な継代培養を１ｘ１０５ 細胞／ｃｍ２の濃度で柔軟なポリウレタン膜上に播種し、これを機械装置に鉗子で付着させた。よりよい細胞の接着および成長のため、前記膜を完全血清（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｒｕｍ）で６０分間室温で前処理した。前記細胞を、前記膜に２４時間接着させた。張力（＝  引き伸ばし）を受ける培養物を、鉗子を３３％にまで移動することにより引き伸ばした。前記張力を、１時間一定に維持した。前記細胞を、機械的に擦ること（ｓｃｒａｐｉｎｇ）で回収し、そしてＲＮＡ分離に使用した。圧縮処理を以下のように実施した：
柔軟な膜を、前記機械装置に鉗子で付着させ、その本来の長さの２５％まで細胞播種前に引き伸ばした。次に細胞を播種し、そして付着のため２４時間インキュベーションした。２４時間後、張りを解放し、そして前記膜をその本来の長さに戻し、圧縮を形成する。この圧縮は、ＲＮＡ抽出の前に１時間維持され、ＲＮＡ抽出を既述のように実施した。
【０１２１】
３．  トランスフェクション
安定トランスフェクション（Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＲＣＪ３．１ Ｃ５．１８を、ｐＣＭＶＮＳＶｎｅｏ 発現ベクターにクローン化したヒト スペルミジン・シンターゼ遺伝子で、リポフェクタミン２０００溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用し、製造者の指示書にしたがってトランスフェクションした。安定クローンを、０．３ｍｇ  Ｇ４１８／ｍｌ培養液の添加後に選択した。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、安定ＲＣＪ３．１Ｃ５．１８クローンから、ＥＺ―ＲＮＡ分離キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用い製造者のプロトコールにしたがって抽出した。
第１鎖のｃＤＮＡ 合成 およびＰＣＲ反応を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｌＩ キット （ＧｉｂｃｏＢＲＬ） を用い製造者の指示書にしたがって実施した。
【０１２３】
ノーザンブロット分析
ヒト スペルミジン・シンターゼのノーザンブロット分析を、Ｕ２０Ｓ 細胞から抽出したＲＮＡを用いて実施した。２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含有するブロットを、スペルミジン・シンターゼの全ＯＲＦでプローブした。プロトコールは、文献〔「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ）， （１９８７），Ｖｏｌ． １， Ｓｅｃｔｉｏｎ ４．９．１〕に記載されている。
【０１２４】
分化マーカー染色
１．  アルシアンブルー
胚の骨（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｂｏｎｅ）を、ブアン固定液で１０分間固定し、アルシアンブルー （３％酢酸中に１％）で３０分間染色し、そして蒸留水で洗浄した。
【０１２５】
２．  アリザリンレッド
胚の骨を、７０％ エタノール 溶液中で固定し、氷上で６０分間インキュベーションし、そして４０ｍＭ アリザリンレッド 溶液 （Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色した。
【０１２６】
増殖検査
１．  ＰＣＮＡ
抗ＰＣＮＡ 抗体（ＤＡＫＯ）による免疫組織化学を、胚の骨の切片で製造者の指示書にしたがって実施する。
【０１２７】
肥大 分析
コラーゲンタイプＸ
抗コラーゲンタイプＸ （ｑｕａｒｔｅｔｔ）による免疫組織化学を、胚の骨の切片で製造者の指示書にしたがって実施する。
【０１２８】
動物モデル：
コラーゲンで誘導した関節炎 （ＣＩＡ）
マウスのＣＩＡは文献〔Ｔｒｅｎｔｈａｍ Ｄ． Ｅ， Ｔｏｗｎｅｓ Ａ． Ｓ， Ｋａｎｇ Ａ． Ｈ （１９７７）．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ： ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌモデル ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １４６： ８５７−８６８〕に記載されている。
【０１２９】
アジュバンドで誘導した関節炎 （ＡＡ）
ＡＡは文献〔Ｋｏｎｇ Ｙ． Ｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）． Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｊｏｉｎｔ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ ｌｉｇａｎｄ．Ｎａｔｕｒｅ， ４０２： ３０４−３０８〕に記載されている。
【０１３０】
髄膜抜去術（Ｍｅｎｉｓｅｃｔｏｍｙ）モデル
髄膜抜去術は文献〔Ｈａｎ Ｆ， Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｎ， Ｉｔｏ Ｔ， Ｓａｋａｉ Ｔ， Ｉｗａｔａ Ｈ．（１９９９）． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｋｎｅｅ ｊｏｉｎｔｓ． Ｎａｇｏｙａ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｎｏｖ， ６２ （３−４）： １１５−２６〕に記載されている。
【０１３１】
［実施例１］
変形性関節症および軟骨リハビリテーションの発生に関与する遺伝子の同定に関する実験モデル
１．  実験計画  ―  モデル系
ＯＡの病因に伴う分子機構を理解するために、発明者は、一連のインビトロ およびエックスビボモデルを用いた。
いくつかの補完的なモデルを寄せ集めることにより、いくつかの関連するが区別される生理学的状態の分類を円滑に進める。その分類は、それら状態の遺伝子発現パターンにより、引き続いて、特定の生理学的若しくは病理学的なプロセスに重要な遺伝子の選別により分類される。
実行する実験戦略は、以下の既存の知識に準拠するものである、即ち：
１．  組織培養中に維持した正常な成人の関節 軟骨 前駆細胞（ＨＭＳＣ）および新規に分離した胎児の ヒト骨端は、関節軟骨の遺伝子発現の正常パターンを正確に模倣する。
【０１３２】
２．  ＩＧＦ−１で処理したＨＭＳＣｓ、同様に関節シミュレータ中で成長させた分離ヒト骨端は、軟骨リハビリテーションに関連するプロセスを模倣する、即ち、正常な軟骨細胞の成熟および良質のマトリックスの過剰合成（ＨＭＳＣに関して）並びに正常な軟骨構造の保護（骨端に関して）。注釈：損傷後の軟骨リハビリテーションを模倣するため、関節シミュレータ中で成長したいくつかの骨端に軟骨欠損（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔ）を作った。
【０１３３】
３．  ＦＧＦ−２ およびＩＬ−１βは、双方がＨＭＳＣの骨形成開始を増大させる骨形成因子である。
【０１３４】
４．  引き伸ばし（ｓｔｒｅｔｃｈ） 若しくは 圧縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）の形態の機械的刺激は、周囲の軟骨の分解並びにスーパーオキサイドアニオンおよび一酸化窒素（ＮＯ）合成の増強に至る軟骨欠損を生じ、これによりＯＡの表現型を模倣する。
【０１３５】
それ故、ＩＧＦ−１ および関節シミュレータによる軟骨 成長の結果生じる遺伝子発現の変化は、正常の軟骨機能に役立つものであり且つ治療介入により模倣されるべき事象である。対照的に、ＩＬ１、ＦＧＦ２ および機械的ストレスにより生じる遺伝子発現の変化は、ＯＡ発生と関連し得る、それ故、この変化は、治療介入により妨害される（ｏｐｐｏｓｅｄ）べき事象である。
【０１３６】
１．１．  インビトロ  モデル系
ヒト間葉幹細胞 （ＨＭＳＣ）。  間葉幹細胞が軟骨細胞 （正常な） 系統のみならず、骨形成性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）および線維形成性（ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ）の系統への分化を開始するという意味において、患部の関節 軟骨で修復プロセスが混乱することを変形性関節症の病因は示唆している。加えて、コラーゲン・タイプ ＩＩの段階で通常アレストする関節 軟骨細胞は、更に肥大性 軟骨細胞の段階へと分化する。このことは次に、骨形成因子（上記を参照のこと）の分泌によって、前駆細胞の骨芽細胞および破骨細胞（これらの前駆体は、常駐しているものではなく、骨髄内で産生される）への分化を増大し得る。既存の知識によると、いくつかの傷害（ｉｎｓｕｌｔｓ）により間葉幹細胞の刺激およびそれらの異常な分化を生じ得る。これらには、ＥＣＭの組成および組織（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の大規模な変化、成長因子、サイトカイン、ケモカインの分泌、および継続的な機械的な束縛（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）が含まれる。このような背景において、間葉幹細胞で異なる刺激により活性化される細胞内シグナル伝達経路の同定および特性解析は、不可欠なステップを代表するものである。この理由から、インビトロ試験が、関節軟骨に直接由来する成人ヒト 間葉幹細胞培養のモデルで実行された。これらの細胞は、テルアビブ大学医学部のＺｖｉ Ｎｅｖｏ教授から提供された。
【０１３７】
以下の処理が選択された：
・ＩＧＦ−１ ：  正常な軟骨の機能およびリハビリテーションに有益な成長因子。最終的に硬骨による置換に至る軟骨細胞の最終分化および軟骨の血管新生を阻害する。
【０１３８】
・インターロイキン−１ ：  炎症性 サイトカイン、ＯＡ関節において過剰産生されることが知られている。軟骨分解酵素並びに骨吸収性サイトカイン（ｂｏｎｅ−ｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）並びにＴＮＦ−α， ＩＬ−６， 可溶性 １Ｌ−６ レセプター（ｓｌＬ−６Ｒ） およびＮＯなどの生物活性分子の発現を誘導する。
【０１３９】
・ＦＧＦ−２：  ＯＡおよびこの疾患の動物モデルの病因に関与するとされている繊維芽細胞 成長因子。重篤なＯＡ患者は、中等度のＯＡ患者に比べ顕著に高いＦＧＦ−２濃度を示した。
重篤なＲＡ患者の滑液で刺激された共培養系における破骨発生（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、ＦＧＦ−２に対する中和抗体により顕著に阻害され、そしてこの阻害は他のサイトカインに対する抗体で認められたものより強かった。発明者は、ＯＡ患者の滑液における内在性 ＦＧＦ−２レベルの増加が、骨芽細胞 （直接的、潜在的に観察できる効果） および破骨細胞（骨破壊性応答の間接的な潜在的媒介者であろう標的細胞内のいくつかの遺伝子の発現が観察できる）の系統を誘導することにより関節の破壊に作用し得ると結論した。
【０１４０】
・機械的刺激：  関節への持続的な機械的負荷は、ＯＡ発生を誘導する原因の１つである。
【０１４１】
１．２．  エックスビボモデル系
関節シミュレータ＊において成長させた完全な分離骨端
インビトロ 実験に加えて、発明者は、分離して関節シミュレータ内で成長させた胎児の ヒト骨端のエックスビボモデルをも使用している。関節シミュレータは、Ｚｖｉ Ｎｅｖｏ 教授および Ｄｒｏｒ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士によって開発された装置である。彼等はこの特別な装置内で成長している分離骨端が、ヒト 間葉幹細胞の著しい増殖、それらの成熟した機能的な軟骨細胞への分化および良質のマトリックスの顕著な合成を生じること示した。対照的に、通常の組織培養条件で維持された骨端（ｅｐｉｐｈｙｓｅｓ）は、関節 組織の膨大なアポトーシスおよびネグローシスを示している。このモデルは、複雑な組織で生じる遺伝的な出来事をより反映することから有用である〔Ｃｏｈｅｎ， Ｉ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｄ．， Ｃｏｈｅｎ， Ｎ．， Ｎｅｖｏ， Ｚ． （２０００） Ｓｔｏｒｉｎｇ ｌｉｖｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｇｒａｆｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｊｏｉｎｔ ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２１： ２１１７−２１２３〕。
【０１４２】
＊関節シミュレータは、無菌 成長チャンバーからなるもので、大きな培養液リザーバーから閉鎖チュウブ系を介して培養液が供給される。従って、関節シミュレータ内に配置された軟骨は、ＣＯ２を富化した新鮮な培養液で常に灌注（ｉｒｒｉｇａｔｅｄ）される。
【０１４３】
インビボの正常な関節 軟骨は、関節の動作および負荷によって発生する流体静力学的な力により汲み出される滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）を供給される。軟骨の深層、特に高到達点（ｔｉｄｅ ｍａｒｋ）の石灰化前に成長している層は、血管による供給を受ける。従って、２つのパターンの脈動（ｐｕｌｓａｔｉｏｎ）が、正常な関節 軟骨に存在している、即ち、関節の動き（ｍｏｔｉｏｎ）の脈動および血液循環の脈動である。関節シミュレータにおいて、組織は、５７０ ｍｌ／ｈの至適速度（予め決定された）で供給される連続的な流れに暴露される。ペリスタティックポンプは、収縮期血圧（１５０ ｍｍＨｇ， １００ 脈拍／ｍｉｎ）と類似する範囲の類洞パターン（ｓｉｎｕｓｏｉｄ ｐａｔｔｅｒｎ）の圧を発生する。要約：関節シミュレータの利点は、即ち：
・継続する潅流が栄養物の十分な供給を満たし、且つ老廃物の蓄積を避ける；
・潅流する流れが、関節 軟骨上に作用する流体静力学的な力および重力による力を模倣することにより軟骨 成長を刺激する；ことである。
【０１４４】
［実施例２］
実験モデル系の樹立
１．  インビトロ 実験
ＨＭＳＣを使用した一連のインビトロ 実験が実施された。細胞を、軟骨形成性（例えば、ＩＧＦ−１） 或いは骨形成性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ）および血管形成性（例えば、ＩＬ１ およびＦＧＦ−２）の応答の何れかを生じる一群の処置に暴露した。２ラウンドのインビトロ 実験を実施した。最初に、校正実験（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を、刺激に対する細胞応答の時間／量のカイネッティックスを決定するために実施した。この研究に基づいて大規模実験を実施し、その実験からＲＮＡを調製して遺伝子発現プロファイリング実験の過程で使用した。
【０１４５】
１． １．  インビトロ細胞系の校正（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）
様々な刺激に対するＨＭＳＣの分化応答を実証するために、異なる処理（表１）に暴露した細胞を、骨芽細胞および軟骨芽細胞の系統に特異的なマーカーの発現に関して免疫組織化学および染色処理で試験した。分化処理に対するＨＭＳＣの応答を至適化するために、様々な密度（低密度およびコンフルエント）で成育した細胞を使用して試験した。
【０１４６】
【表１】
2004517902.tif 000002
【０１４７】
以下の分化 マーカーを試験した：
軟骨細胞終末分化および骨形成のマーカー：
・オステオカルシン〔骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅｓ）〕；
・ＶＥＧＦ （肥大性 軟骨細胞、脈管形成）；
・繊維芽細胞成長因子レセプター ３ （ＦＧＦＲ ３） 〔軟骨細胞の前駆細胞および上部 肥大性 軟骨細胞（ｕｐｐｅｒ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）〕；
軟骨形成のマーカー：
・コラーゲン・タイプ ＩＩ （軟骨細胞成熟）；
・アルシアンブルー （軟骨細胞成熟）。
【０１４８】
校正した至適処理条件を記載した結果を図１〜３に示す。
【０１４９】
得られた結果は以下のことを示している：
１．  ＨＭＳＣは、高密度（コンフルエント）条件下で成長および成熟できる細胞であり、軟骨細胞および骨形成性細胞の系統の双方におけるいくつかの分化の徴候を提示するが、肥大性軟骨細胞および骨細胞に特異的なマーカーを顕著に発現しない（図１〜３、コントロール細胞を参照のこと）。
【０１５０】
２．  ＩＧＦ−１による処理は、コラーゲン・タイプ ＩＩの発現増加およびＦＧＦＲ３の発現減少による、アルシアンブルー染色によって示される軟骨細胞成熟 および軟骨マトリックス産生を加速する（図１）。
【０１５１】
３．   ＩＬ−１β もしくは ＦＧＦ−２の何れかの処理は、ＨＭＳＣに複合的な効果を有しているように思われる、即ちこの処理は：
ｉ）  ＦＧＦＲ−３ 発現〔終末（ｔｅｒｍｉｎａｌ）の軟骨細胞分化の誘導に影響し得る、以下を参照のこと〕の増加で示されるような、前駆細胞の増殖を誘導する；
ｉｉ）  増加したＶＥＧＦ 発現により示されるような、終末の軟骨細胞分化および脈管形成を促進する；
ｉｉｉ）  オステオカルシンの発現増加により示されるような、骨形成を刺激する；
ｉｖ）  アルーシャンブルー染色の低減により示されるような、正常な軟骨マトリックス産生を阻害する。
【０１５２】
結論：
・ＩＧＦ−１でのＨＭＳＣの処理は、軟骨細胞系統のみを刺激するが、骨芽細胞への分化は何らかの形で阻害される。それ故、それは遺伝子を発見するモデル系として機能でき、その遺伝子の産物とは、正常な 軟骨形成を促進するか又はＯＡにおける骨増殖体（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅｓ）の生成を阻害する産物である。
【０１５３】
・ＩＬ−１β もしくは ＦＧＦ−２によるＨＭＳＣの処理は、ＯＡの多くの性状を表出させる。それ故、両者の処理で発現が影響される遺伝子は、抗ＯＡ 薬物の開発の潜在的な標的となりえる。
【０１５４】
１． ２．  遺伝子発現プロファイリングのためのフルスケール・インビトロ実験
パイロット試験の結果に基づき、以下の調整がなされた：
１．  各処理において単一用量のサイトカイン／成長因子のみ（当初予定された２用量の代わりに）が使用された（なぜなら如何なる用量依存性のＨＭＳＣ応答も観察されなかったので）。この観察結果は、この試験に使用されるサイトカイン／成長因子の濃度が生理学的範囲を越えるとの事実により説明できる。従って、最大応答は、計画した如何なる用量の治療においても既に達成され、そしてそれらの更なる増加は細胞応答を増加しなかった。
【０１５５】
２．  ＲＮＡ調製のために細胞を収穫するタイムポイント数を、その処理に対応する遺伝的応答の発生の分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を増大させるため、顕著に増加させた（計画時の２に代わって５タイムポイント）。
【０１５６】
フルスケール 実験に使用する処理形態の要約を表２に示す。
【０１５７】
【表２】
2004517902.tif 000003
【０１５８】
各タイムポイントで、アルカリ・ホスファターゼ染色を実施した。各実験は、２回実施され、４４実験を行った（２２処理形態  ｘ  ２回の繰り返し）。これらの実験に由来するＲＮＡは、専用のＯＡチップ（以下を参照のこと）の調製、並びに、該「ＯＡ」チップおよび「線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）」チップとのハイブリダイゼーションに用いるプローブの作成に使用された。
【０１５９】
２．  ＯＡ試験に関するエックスビボモデル
ＨＭＳＣを用いたインビトロ実験に加えて、ＲＮＡを胎児（２２週齢）ヒト骨端から摘出後、直ちに抽出した、同様に関節シミュレータ中で３日間成長させた後に抽出した。以前計画された１日タイムポイント（１ ｄａｙ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）は、分析されなかった（如何なる生物学的効果もこのタイムポイントの時間内に観察することができなかったので）。マトリックス・リハビリテーションのプロセスを惹起するため、いくつかの骨端を、関節シミュレータに配置する前に傷つけた。この処理は、骨端を通常の組織培養条件下でエックスビボで成長させられる、との以前に提案された認識を差し替えるものであり、パイロット試験はかかる条件下で組織が生存できないことを示した。各エックスビボ実験は、２回実行され、トータル６実験が行われた（即ち、３条件  ｘ  ２回の繰り返し  ＝  ６実験）（表３を参照のこと）。エックスビボ実験に由来するＲＮＡは、専用のＯＡチップの調製にも使用された。作出されたプローブを、「ＯＡ」チップおよび「線維症」チップとハイブリダイズした。
【表３】
2004517902.tif 000004
【０１６０】
［実施例３］
変形性関節症 および軟骨リハビリテーションの発生に関与する遺伝子の同定
１．  「ＯＡ」および「線維症」チップの調製
「ＯＡ」チップを、上記のように処理したＨＭＳＣから抽出されたＲＮＡのプールから調製した、同様に、出願人のＳＤＧＩ法（米国特許出願公開番号ＷＯ ０１／７５１８０、全体が引用により本明細書中に援用される）によるエックスビボ 実験から取得されたＲＮＡから調製した。それはトータルで１０，０００  ｃＤＮＡ クローンを含む。また、「線維症」チップは、出願人の前記ＳＤＧＩ法によって調製された。
【０１６１】
２．  ｃＤＮＡ マイクロアレイとのハイブリダイゼーション
２．１．  プローブ標識およびＤＮＡ マイクロアレイとのハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡプローブを、各サンプルに由来する１μｇのポリＡ  ＲＮＡから、逆転写酵素 （Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） および１８−ｍｅｒ オリゴ−ｄＴ プライマーを使用して合成した。Ｃｙ３−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ） ｏｒ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、ＲＴ反応の間に導入して、ｃＤＮＡを標識した。ハイブリダイゼーション、続くスキャンニング、および視覚化を、以前の記載〔Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｃｌ， Ｓｃｉ ｉｌＳＡ ９３，１０６１４−１０６１９〕のように実施した。ハイブリダイゼーションの品質管理は、出願人の方法にしたがい実施した。
【０１６２】
２．２．  ハイブリダイゼーション・スキーム
ｃＤＮＡ プローブを、表３に示すスキームにしたがいＯＡ および線維症のヒト ｃＤＮＡ マイクロアレイにハイブリダイズした。
【０１６３】
全てのハイブリダイゼーションにおいて、プローブ ２は、０ タイムポイント ＲＮＡ抽出物（表４、  共通コントロール）のプールを含むプローブと同一であった。これは、共通の標準化プローブ（ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）として働き、そして正式の統計学的分析において異なるハイブリダイゼーション結果との比較を可能にする。各ハイブリダイゼーションにおいて、プローブ １は、規定の処理条件下で培養された細胞またはエックスビボ 器官培養から抽出されたＲＮＡから調製された。全体のハイブリダイゼーションセットは、２回反復され、トータルで２６ハイブリダイゼーションタイプ  Ｘ  ２  ｃＤＮＡ マイクロアレイ  Ｘ  ２回繰り返し  ＝  １０４ハイブリダイゼーションが行われた。
【０１６４】
【表４】
2004517902.tif 000005
【０１６５】
2004517902.tif 000006
【０１６６】
２．３．  ハイブリダイゼーション結果の分析
ハイブリダイゼーションデータを、品質管理に関するアルゴリズムおよび遺伝子クラスタリングに関する２つの異なるアルゴリズムを使用して分析した。
【０１６７】
２．３．１  品質管理
品質管理は、Ｃｙ３ およびＣｙ５の正確な帳尻合わせ（ｂａｌａｎｃｉｎｇ）の達成を目的としており、特定のハイブリダイゼーションにおいて低い差異を有すると推定される「偽」シグナルを検出し、そして続く分析に適切な形態で生データを変換する。特定のハイブリダイゼーションにおいて低い差異を有すると推定される「偽」ピクセルを検出するアルゴリズムは、一実験セットのうちの異なるハイブリダイゼーションから取得された共通コントロールシグナルの対数の二次元分布の安定性に基づいている。
通常は、この分布は、対角線に沿って荷重しており（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｌｏｎｇ ａ ｄｉａｇｏｎａｌ）、分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）の適度な安定性を有している。この分散に従い、「偽」となるピクセルのスコアが計算され、そしてかかるピクセルが自動的にマークされる。前記ピクセルの一部のみが「偽」である場合、ハイブリダイゼーションは更なる分析に進むが、どのデータが信頼性があり、どれが無いかについては知られている。
【０１６８】
２．３．２  クラスタリング アルゴリズム
アルゴリズム １．  この処理は、「ブラインド（ｂｌｉｎｄ）」であり、且つ生物学的条件間の相互関係の先験的な知識を必要としない。クラスター化は、多次元空間内のデンセスト領域（ｄｅｎｓｅｓｔ ａｒｅａｓ）の同定に基づいており、分析した遺伝子はこの空間の点である。密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）は、相関関係（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）またはユークリッド間隔（Ｅｕｃｌｉｄｉａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）の何れかにより測定される。この処理を、簡単に説明すると以下のようなものである。分析した遺伝子で最も濃密な空間における前記領域が選択される；このセットは第一クラスターと見なされる。第二クラスターは、第一のものと交差しない次ぎのデンセスト領域であり、以後は同様に定義される。前記領域の区域（ｒａｄｉｕｓ）は、その領域中のランダム化した遺伝子の平均出現度が１であるとの法則にしたがい定義される。これらの狭いクラスターを、空間におけるそれらの近接性（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）にしたがい、より広いものと更に組み合わせることができる。同定されたクラスターは、トータルの遺伝子発現プロファイリングの共変動マトリックス（ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｘ）に対するそれらの寄与の程度にしたがい等級づけされる。
【０１６９】
アルゴリズム ２．  分析されたセット内の異なるハイブリダイゼーションの生物学的な分類が仮定できた場合、その挙動がこの仮定と強く相関する遺伝子を検出できる。全ての遺伝子に関して、その識別できる挙動の有意性のフィッシャー基準（Ｆｉｓｈｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）が計算される。最も有意な遺伝子は、識別できるもの（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｏｎｅｓ）である。
【０１７０】
結果の分析は、次のスキームにしたがい実施された；
１．  品質管理  ―  各マイクロアレイで別々に。
２．  アルゴリズム １によるクラスタリング  ―  各マイクロアレイで別々に。
３．  アルゴリズム ２によるクラスタリング  ―  各マイクロアレイで別々に。
４．  クラスタリングデータの比較  ―  各マイクロアレイで別々に。
５．  アルゴリズム １のみにより、アルゴリズム ２のみにより、および両方により選択された遺伝子を含む統合されクラスター化された遺伝子発現データセットの作成  ―  各マイクロアレイで別々に。
６．  最も顕著な遺伝子発現パターン（クラスター）の同定並びにそれに基づきシークエンシングおよび注釈付けする遺伝子の選択。
７．  マイクロアレイおよび同一の遺伝子が同一となる発現パターンの検証の両方から選択される遺伝子のセットの配列に基づく〔前記アルゴリズムによるコンティグ化（ｃｏｎｔｉｇｉｚａｔｉｏｎ）後〕比較。
８．  双方のマイクロアレイから取得されたクラスター化遺伝子の非重複リスト（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｌｉｓｔ）の作成。
９．  ＥＳＴと同一性を有する非注釈化クローン（ｎｏｎ−ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｃｌｏｎｅｓ）の高度の注釈化（コンティグ化およびホモロジー検索）。
１０．  未知の遺伝子および推測上の蛋白質の高度の注釈化（ホモロジー検索およびドメイン分析）。
１１．  既知の遺伝子の文献分析。
【０１７１】
２．４．  結果
ハイブリダイゼーション結果の完全分析を実行した後、発明者は一群の遺伝子に到達し、その中の５７遺伝子が「線維症」 チップに由来し、そして１９７遺伝子が「ＯＡ」チップに由来するものであった。
既知の遺伝子のいくつかは、生物医学的文献および公共データベースから利用可能な情報を考慮して分析された。
【０１７２】
ＩＬ−１ およびＦＧＦで制御される遺伝子に主に関心があった。なぜならそれらは変形性関節症の表現型（上記記載を参照のこと）（即ち、軟骨マトリックスの分解および異所性の骨形成の刺激）において潜在的な意味合いを有するからである。
【０１７３】
それ故、ＦＧＦ−２による処理で発現が影響される遺伝子は、本発明の目的において特に関心があるものであった。
【０１７４】
このカテゴリーに入る遺伝子は、非処理の生物学的なコントロールと比較してＦＧＦ処理細胞においてその発現が変化していた遺伝子である。
関節炎疾患において未知の関与を有し、ｂＦＧＦ−２によりアップレギュレートされる同定された遺伝子の１つは、スペルミジン・シンターゼ（配列番号１としても記載される）であることが解明された。
【０１７５】
スペルミジンは、３つの生物活性ポリアミンのうちの１つである。ウシ肩甲骨の骨端軟骨において、それらは骨化している領域中により濃縮されており、そこでは休息中の領域よりも石灰化が生じている。スペルミジンは、スペルミン およびプトレッシンよりも大量に存在している。オルニチン脱炭酸酵素は組織の休息中の領域のみで測定可能なので、ポリアミン 生合成が生じているのはこの領域である（それらは骨化している 領域に蓄積するのであるが）。
スペルミジンが、骨化している区域の細胞外のみに存在するとの免疫組織化学的な証拠が取得されている。それ故、ポリアミンは、経骨性（ｐｒｅｏｓｓｅｏｕｓ）の軟骨の石灰化に関連し得る（Ｖｉｔｔｕｒ Ｆ．， ｅｔ ａｌ． １９８６）。スペルミジン依存性蛋白質は、１α， ２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３およびインターロイキン ４により誘導されるマウス肺胞マクロファージの融合に関与していることが示された。
ポリアミン（最もあり得るのはスペルミジン）が、蛋白質 合成の誘導における１α， ２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３作用の重要な細胞内媒介者として関与しており、それは次にマクロファージの融合を誘導する。スペルミジン 合成がメチルグリオキサル  ビス（グアニルヒドラゾン）（ＭＧＢＧ）を添加することにより阻害された場合、１α， ２５（ＯＨ）２  Ｄ３によって誘導される１４蛋白質のうちの９つにおける合成の増強は、融合に伴う阻害により大きく減退した。
スペルミジンの更なる添加は、これら９蛋白質の合成と融合とを同様に復活させた。破骨細胞（それらの活性化のために）も融合プロセスを経由しなければならないので、ポリアミンは破骨細胞活性化においても同様にある種の役割を担っているであろう。
この仮説は、骨格の発生におけるビタミンＤの既知の役割によっても支持されている（Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
【０１７６】
本発明の発明者等は、初めて骨形成効果を有するＦＧＦ−２でＨＭＳＣ 細胞を処理してスペルミジン・シンターゼのアップレギュレーションを実証した。それ故、スペルミジン・シンターゼは、ＯＡを治療するスクリーニング 候補 薬物の好適な標的である。
【０１７７】
［実施例４］
ＯＡの潜在的な薬物としてのスペルミジン・シンターゼ阻害剤の評価
ＯＡを阻害するか又は遅延させる潜在的な薬物としてスクリーニングされる候補 阻害剤の標的となるスペルミジン・シンターゼは、本明細書中に開示されているようにｂＦＧＦ−２処理（３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌ アスコルビン酸 および１０−８ Ｍデキサメタゾン）に対してアップレギュレーションされることに基づいて選択されたものである。更に、ヒト 胚の骨で実施したインサイチューハイブリダイゼーション試験は、滑膜中、小柱（ｔｒａｂｅｃｕｌａ）を囲む骨芽細胞上の骨形成細胞中、および骨内膜（ｅｎｄｏｓｔｉｕｍ）中のスペルミジン・シンターゼの発現を示した。シグナルは、発生している骨の軟骨細胞においても観察された。
【０１７８】
ＯＡにおけるスペルミジン・シンターゼの潜在的な関与は、以下の発見により支持された：
１．  骨化している軟骨は、休息中の区域よりも多くポリアミンを含有している。骨化している区域におけるスペルミジンの量は５倍高く、且つスペルミンの量は約２倍である。スペルミジン／スペルミン比率は、骨化している軟骨において１．７および休息中の区域では０．６９である（Ｖｉｔｔｕｒ Ｆ．， ｅｔ ａｌ． １９８６）。
２．  ポリアミンの高いレベルが、関節炎 患者の滑液で検出された（Ｎｅｓｈｅｒ Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
３．  ＯＤＣ 生合成 阻害剤は、コラーゲン誘導性関節炎 （ＣＩＡ）の発生を阻止し、同様にスペルミジン レベルおよび血清  抗ＣＩＩ 抗体 レベルの減少を生じる（Ｗｏｌｏｓ Ｊ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
４．  スペルミジン 合成の阻害は、マクロファージの融合を阻害する。スペルミジンの添加は、活性を回復させる（Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
５．  インビトロ試験は、３つのポリアミン中でスペルミジンのみが、タイプＩＩコラーゲンのカラムからプロテオグリカンサブユニットを置換する活性を有していることを示した（Ｖｉｔｔｕｒ Ｆ．， ｅｔ ａｌ． １９８６）。
６．  アルカリ・ホスファターゼ活性（肥大および石灰化のマーカー）が、スペルミジンにより増強される（Ｖｉｔｔｕｒ Ｆ．， ｅｔ ａｌ． １９８６）。
【０１７９】
最初の一般的分析として、異なる組織中のスペルミジン・シンターゼの発現パターンが、ノーザンブロット分析で検査された。図４に示すように、予想された１．３Ｋｂ  ｍＲＮＡが、検査した全ての組織において検出された。
【０１８０】
１．  潜在的な スペルミジン・シンターゼ阻害剤
ＯＡを治療する候補 薬物として、異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤の評価を、以下の利用可能な既知のスペルミジン・シンターゼ阻害剤を使用して実施した：
アデノシル・スペルミジン
ＡｄｏＤＡＴＯ
ＤＣＨＡ
トランス−４−メチルシクロヘキシルアミン（４ＭＣＨＡ）
シクロヘキシルアミン
メチルグリオキサル  ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）（ＭＧＢＰ）
２−メルカプトプロピルアミン
Ｎ−クロロスルホニルジシクロヘキシルアミン
５’−（（３−アミノプロピル）アミノ）−５’−デオキシアデノシン
１−アミノオキシル−３−アミノプロパン
５’−（イソブチルチオ）アデノシン
５’−（メチルチオ）アデノシン
更なる評価分析を、以下のスクリーニング方法により取得した、新規のスペルミジン・シンターゼ阻害剤を使用して実施した：
１． １．  放射活性に基づくアッセイ：
スペルミジン・シンターゼに関する放射活性酵素アッセイは、文献〔Ｒａｉｎａ， Ａ．， Ｅｌｏｒａｎｔａ， Ｔ．， Ｐａｊｕｌａ， Ｒ． Ｌ． （１９８３）． Ｒａｐｉｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ） ａｎｄ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ｓｐｅｒｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ９４： ２５７２６０．〕に記載されていた。これらのアッセイは、３Ｈ−、１４Ｃ−、または３５Ｓ−で標識したＳ−アデノシルメチオニン （ＳＡＭ） （Ｅ． ｃｏｌｉのＳＡＭシンテターゼを用い標識メチオニンから調製した）を使用する。メチオニン中の標識される最初の原子の選択が、スペルミジンまたはメチルアデノシン （ＭＴＡ）のうちどちらの産物が標識されるかを決定する。最初に、アッセイプロトコールは、ＤＬ− （２− １４Ｃ） メチオニンを使用し、これによりスペルミジンの標識産物が生じる。このプロトコールは、標識反応物である脱炭酸化 ＳＡＭから標識スペルミジンの単調な分離を必要とするもので、ハイスループットスクリーニング （ＨＴＳ）に適合しない。このアッセイの修正〔Ｌ−（メチル−１４Ｃ） メチオニンの使用を必要とする〕は、他の産物、メチルアデノシン、の標識を生じ、この修正によりＨＳＴに適合するバイオアッセイ開発の候補となる程度まで前記アッセイを大きく単純化する。簡単に説明すると、前記アッセイは、標識した脱炭酸化 ＳＡＭをＭＴＡから分離することを必要とする。これは、酸性条件でＭＴＡに結合するが脱炭酸化 ＳＡＭには結合しないホスホセルロース陽イオン交換体の使用により達成される。
【０１８１】
１．２．  蛍光に基づくアッセイ：
異なる蛍光に基づくアッセイは、第一級および第二級アミンを同定するために開発された。このアッセイにおいて、第一級アミンは、シッフ塩基を提供するサリチルアルデヒドとの反応により最初に保護される。スペルミジン およびプトレッシンは、前者が第二級アミンを有する点で異なっており、このアミンは塩化ダンシルまたは塩化ＮＢＤと反応して、蛍光産物を産生する。
【０１８２】
２．  ＯＡの潜在的な 薬物としてのスペルミジン・シンターゼ阻害剤の評価
異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤のＯＡの潜在的な薬物としての適用性を評価するために、異なる阻害剤が、軟骨細胞増殖および終末分化の阻害または減弱を生じる、同様に関節炎の発生の阻害を生じるそれらの能力に関して検査された。
異なる阻害剤が、以下の評価試験系を使用して検査された：
２．１．  インビトロ 試験系
２．１．１．  ヒト スペルミジン・シンターゼ 全長 ｃＤＮＡのサブクローニング
ヒト スペルミジン・シンターゼの全ＯＲＦ（アクセッション番号ＢＣ０００３０９ およびＮＭ＿００３１３２）が、Ｕ２０Ｓ 細胞から抽出されたＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲによりクローン化された。このＲＴ−ＰＣＲ 産物をＡｖｒＩＩ およびＫｐｎＩで二重消化し、そしてｐＣＭＶＮＳＶ−ｎｅｏ およびＴＮＴ反応のためにｐＢＳｃＫＳにサブクローン化した。加えて、Ｎ末にＨｉｓタグを有する完全なＯＲＦも、ＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。このＲＴ−ＰＣＲ 産物を、ＡｖｒＩＩで消化して、そしてＴＮＴ反応のためにｐＢＳｃにサブクローン化した。この構築物をＮｏｔＩ およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして挿入物をｐＣＭＶＮＳＶ−ｎｅｏ  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにサブクローン化した。
４つ全ての構築物を完全にシークエンスし、そして配列分析によりクローン化した配列と公開された配列とが完全にマッチすることが示された。この遺伝子をｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ 発現ベクター （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローン化することにより、付加的な発現ベクターを調製した。
【０１８３】
２．１．２．  ２９３ 細胞の一過性トランスフェクションによるスペルミジン・シンターゼ構築物の検査
構築物を検査するために、ヒト スペルミジン・シンターゼ  ｃＤＮＡ （Ｈｉｓタグを含み、ｐＩＲＥＳ ｐｕｒｏにクローン化された）による２９３ 細胞の一過性トランスフェクションを実施した。細胞を血清なしの培養液中で２日間成長させ、そして培養液および溶解物を採取した。蛋白質を１０％ＳＤＳゲル上で分離し、次にブロッティングした。膜を抗Ｈｉｓ 抗体と反応させた。推測された３５ｋＤａ のバンド（スペルミジン・シンターゼの１サブユニットを代表する）が、観察された（図５）。
【０１８４】
２．１．３．  トランスフェクションした 細胞における増強した増殖または分化
試験スペルミジン・シンターゼ阻害剤による軟骨細胞増殖および終末分化の阻害を示している異なる終点パラメータは、外因性 ヒト スペルミジン・シンターゼ遺伝子を過剰発現する様々なトランスフェクションした 細胞株（例えば、軟骨細胞、内皮細胞）を使用して検査された。
高い増殖または分化の速度は、前記遺伝子が関節炎を誘導する経路に潜在的に関与していることを示している。
【０１８５】
２．１．４．  安定トランスフェクション細胞株の樹立
ｐＣＭＶｎｅｏ 発現ベクターにクローン化したＨｉｓタグを欠如したヒト スペルミジン・シンターゼ ｃＤＮＡを、ＲＣＪ３．１． Ｃ５．１８ 細胞株の安定的なトランスフェクションに使用した。３０ クローンを越えるクローンが分離され、そしてＲＴ−ＰＣＴを使用してスクリーニングされた（図６に説明した）。最も高度に発現しているクローンを、薬物評価実験のために選抜した。
【０１８６】
スペルミジン・シンターゼ過剰発現の効果は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生を示す異なる終点パラメータを使用して検査された。これらのパラメータは、ＯＡに関連することが以前から示されている。本発明のインビトロ試験系は、これらの効果を阻害および減弱する異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤の能力の評価のためにも使用される。
【０１８７】
軟骨細胞の分化は、アルシアンブルー染色（軟骨 プロテオグリカンを染色する）、アルカリ・ホスファターゼ活性およびコラーゲンタイプＸ 免疫組織化学染色により評価される。アルカリ・ホスファターゼ活性またはコラーゲンタイプＸ 免疫組織化学染色における増加は、軟骨細胞の最終分化を示している。
【０１８８】
軟骨細胞の増殖は、細胞数およびチミジンの取り込みを測定することにより評価される。
【０１８９】
２．２．  エックスビボ 試験系
異なる候補阻害剤による軟骨および硬骨の形成におけるスペルミジン・シンターゼ阻害の効果は、内在性 スペルミジン・シンターゼを発現している胚の骨の 器官培養を使用してエックスビボで検査される。後肢をマウス胚（Ｅ１６）から摘出する。骨培養を１０％ 胎児ウシ血清 （ＦＣＳ）、０．０５ｍｇ／ｍｌ アスコルビン酸、および１ｍＭ−グリセロールリン酸を添加した修正イーグル培養液中で実施する。５％ ＣＯ２、３７ ℃ および９８％湿度の条件下、２４ウェル組織培養プレート中の３００  ｌ完全培養液中でウェル毎に１つの骨を培養する。ＡｄｏＤＡＴＯ 阻害剤− （５−５０  Ｍ）などの異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤の増加濃度を培養液に添加して、そして骨を７日間培養する。
候補 阻害剤で処理した骨、同様にコントロール骨を、タイム０および培養の７日後に評価する。
【０１９０】
コントロールおよび処理した骨から調製した切片を、軟骨細胞最終分化を評価するためにアリザリンレッド（石灰化した組織を染色する） およびアルシアンブルー（軟骨 プロテオグリカンを染色する）を使用して染色する。骨の縦の成長は、肥大性 領域 および石灰化した骨の長さにおける増加として計算される。肥大を、タイプＸ  コラーゲン染色を使用して更に評価する。増殖を、ＰＣＮＡにより検査する。
【０１９１】
２．３．  インビボ 試験系
異なるパラメータ（軟骨細胞増殖、終末分化 および関節炎の発生などのＯＡに関連する）における異なるスペルミジン・シンターゼ阻害剤の効果は、２つのインビボ系（１つの系は外因性 スペルミジン・シンターゼを過剰発現する、および他の系は内在性 スペルミジン・シンターゼを発現する）を使用して評価される。双方の試験系は、ＯＡのモデルとして本発明に使用される。
【０１９２】
２．３．１．  外因性 スペルミジン・シンターゼを発現しているトランスジェニックマウス
スペルミジン・シンターゼ過剰発現の効果は、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、並びに関節炎の発生を示す異なる終点パラメータを使用して検査される。
【０１９３】
コラーゲン・タイプ ＩＩ  プロモータ／エンハンサーの支配下でヒト スペルミジン・シンターゼ ｃＤＮＡを発現しているトランスジェニック ＦＶＢＮマウスが樹立されている。軟骨発生を、トランスジェニックマウス胚（Ｅ１７）または１週齢マウスから採取した切片を用いて検査する。最終分化の評価を、切片をアルシアンブルー およびアリザリンレッドで染色することにより実施する。増殖の評価は、ＰＣＮＡにより実施する。
【０１９４】
スペルミジン・シンターゼ トランスジェニックマウスの成獣において足の厚さを検査することによって関節炎の発生を検査する。これらの トランスジェニック動物においてスペルミジン 合成を促進するために、マウスを脱炭酸化ＳＡＭ（スペルミジン・シンターゼの基質）で処理する。脱炭酸化 ＳＡＭを、飲料水に溶解し、そして経口投与する。
【０１９５】
２．３．２．  内在性 スペルミジン・シンターゼを発現している関節炎ラット
内在性 スペルミジン・シンターゼを発現しているインビボ評価系として、関節炎ラットモデルを使用する。トレンサムの方法〔Ｔｒｅｎｔｈａｍ Ｄ． Ｅ， Ｔｏｗｎｅｓ Ａ． Ｓ， ＫａｎｇＡ． Ｈ （１９７７）． Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ： ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４６： ８５７−８６８〕により、コラーゲン関節炎を雌のルイスラット（Ｌｅｗｉｓ ｒａｔｓ）で誘導する。１． ６ｍｇ／ｍｌのウシ・コラーゲン・タイプ ＩＩ および０．４ ｍｇ／ｍｌのアジュバンド・ペプチド 溶液を等容量のフロインド不完全アジュバンド（ＤＩＦＣＯ， ＭＩ）に添加して、１５分間、４ ℃ 、１０，０００ ｒｐｍでホモジナイザーで撹拌することにより、エマルジョンを調製した。０日に各動物は、０．８ｍｇのコラーゲン（１ｍｌ  エマルジョン中）を皮内に投与された。
【０１９６】
異なる候補 阻害剤によるスペルミジン・シンターゼ阻害の効果は、異なる終点パラメータ（軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、並びに関節炎の発生を示す）を用いたこの系において評価される。
【０１９７】
異なる スペルミジン・シンターゼ阻害剤を、関節炎ラット〔コラーゲン・タイプ ＩＩ 誘導性の関節炎 （ＣＩＡ）〕に投与できる。前記阻害剤は、水に溶解され、そして経口投与されるか、または関節炎ラットの関節に直接的に投与される。関節炎の発生は、足の厚さを測定することによりモニターされる。加えて、処理動物およびコントロール動物から得られた切片により組織学的検査を実施する。
【０１９８】
最終分化の評価を、アルシアンブルーおよびアリザリンレッドによる切片の染色により実施する。増殖の評価を、ＰＣＮＡにより実施する。
【０１９９】
【参考文献】
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【０２００】
【配列表】
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【０２０１】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＩＧＦ−１で６日間処理したコンフルエントなＨＭＳＣ 細胞における、様々な分化 マーカーの発現を示す図である。
コントロール  ―  同様に培養した非処理細胞。マーカー 発現のレベルを、相対的な単位で示した。
略語：Ｃｏｎｔ． ＝ コントロール；  ｔｒｅａ． ＝処理；  コラーゲンｔ． ＩＩ＝コラーゲン・タイプ ＩＩ ；  Ａｌｃｉａｎ ｂｌ． ＝ アルシアンブルー。
【図２】
図２は、ＩＬ−１βで６日間処理したコンフルエントなＨＭＳＣ 細胞における、様々な分化 マーカーの発現を示す図である。
コントロール  ―  同様に培養した非処理細胞。マーカー 発現のレベルを、相対的な単位で示した。
略語：Ｃｏｎｔ． ＝ コントロール；  ｔｒｅａ． ＝処理；  コラーゲンｔ． ＩＩ＝コラーゲン・タイプ ＩＩ ；  Ａｌｃｉａｎ ｂｌ． ＝ アルシアンブルー。
【図３】
図３は、ＦＧＦ−２で６日間処理したコンフルエントなＨＭＳＣ 細胞における、様々な分化 マーカーの発現を示す図である。
コントロール  ―  同様に培養した非処理細胞。マーカー 発現のレベルを、相対的な単位で示した。
略語：Ｃｏｎｔ． ＝ コントロール；  ｔｒｅａ． ＝処理；  コラーゲンｔ． ＩＩ＝コラーゲン・タイプ ＩＩ ；  Ａｌｃｉａｎ ｂｌ． ＝ アルシアンブルー。
【図４】
図４（４Ａ−４Ｂ）は、スペルミジン・シンターゼのノーザンブロット分析の図である。４Ａは、スペルミジン・シンターゼの組織 ノーザンブロット分析を示す：レーン １： 脳；レーン２−結腸 ；レーン３−心臓；レーン４−腎臓；レーン５−肝臓 ；レーン６−筋肉 ；レーン７−肺；レーン８−胎盤；レーン９−小腸；レーン１０−脾臓 ；レーン１１−胃 ；レーン１２−精巣、を示す。
４Ｂは、Ｕ２０Ｓ 骨芽細胞系細胞におけるスペルミジン・シンターゼのノーザンブロット分析を示す。
【図５】
図５は、スペルミジン・シンターゼで一過性にトランスフェクションした２９３ 細胞のウエスタンブロット分析を示す図である。ウエスタンブロットは、抗Ｈｉｓ 抗体でプローブした。レーン ３：トランスフェクションした 細胞の溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）；レーン４：トランスフェクションした 細胞の培養液；レーン５： ２９３ コントロール細胞の溶解物；レーン６： ２９３ コントロール細胞の培養液； Ｌａｎｅ７： ポジティブコントロール。
【図６】
図６は、スペルミジン・シンターゼで安定的にトランスフェクションしたＲＣＪ３．１Ｃ５．１８ 細胞のＰＣＲ 分析を示す図である。番号は異なる クローンを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517902.tif 000095
【国際調査報告】
2004517902.tif 000096
2004517902.tif 000097
2004517902.tif 000098