(57)【要約】電解質を含有する媒質中に分散させる時に動的膨張相を形成することができる肺界面活性組成物。動的膨張過程は偏光顕微鏡法で観察でき、その結果、空気／液体界面で複屈折網又は細管が形成される。動的膨張過程は、非動的膨張相での肺界面活性物質の拡散と比較して、広い表面積にわたって肺界面活性物質を拡散させる。肺界面活性物質を例えば、生理的電解質溶液中に分散した後の特定の時間、分散が生じる。これによって、肺界面活性物質の肺胞へのより活発な拡散は、肺への投与後に生ずることができ、その結果、接触が困難な肺又は他の器官もしくは体の部位内への治療、予防及び／又は診断用作用物質用担体として、そのような組成物を使用する可能性がもたらされる。本発明の肺界面活性組成物は、周囲温度で濃度１０％ｗ／ｗの塩化ナトリウム０．９％ｗ／ｗに粉末又は粒子として分散させる時に、膨張過程において、偏光顕微鏡法で観察されるように、約０．５〜１２０分の期間内で空気−液体−固体界面で複屈折網又は細管を形成できる肺界面活性物質からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
周囲温度で濃度１０％ ｗ／ｗ の塩化ナトリウム０．９％ ｗ／ｗに粉末又は粒子として分散させる時に、膨張過程において、偏光顕微鏡法で観察されるように、約０．５〜１２０分の期間内で空気−液体−固体界面で複屈折網又は細管を形成することができる肺界面活性物質からなる肺界面活性組成物。
【請求項２】
肺界面活性物質がリン脂質からなる請求項１による肺界面活性組成物。
【請求項３】
リン脂質が飽和及び不飽和リン脂質の混合物の形態で存在する請求項２による肺界面活性組成物。
【請求項４】
リン脂質の濃度が、乾燥状組成物の約８０〜９９．５％ ｗ／ｗ、例えば、約８５〜９８％ ｗ／ｗ又は約９０〜９８％ ｗ／ｗである請求項２又は３による肺界面活性組成物。
【請求項５】
ジパルミチルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）からなる前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項６】
例えば、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及び／又はＳＰ−Ｄのような界面活性タンパク質からなる前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項７】
界面活性タンパク質がＳＰ−Ｂ及び／又はＳＰ−Ｃである請求項６による肺界面活性組成物。
【請求項８】
界面活性タンパク質の全濃度が、乾燥状組成物の約０．５〜１０％ ｗ／ｗ、例えば、約０．５〜７．５％ ｗ／ｗ、約０．５〜５％ ｗ／ｗ、約０．５〜２．５％ ｗ／ｗ又は約０．５％〜２％である請求項６又は７による肺界面活性組成物。
【請求項９】
多くても１０％ ｗ／ｗまでのリン脂質以外の脂質からなる前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項１０】
肺界面活性物質が哺乳類の肺から得られる前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項１１】
肺界面活性物質が哺乳類の肺から抽出される請求項１０による肺界面活性組成物。
【請求項１２】
哺乳類の肺が畜牛、ウシ、ブタ、サル、又はヒトの肺である請求項１０又は１１による肺界面活性組成物。
【請求項１３】
肺界面活性物質が合成的又は半合成的に得られる請求項１〜９のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項１４】
肺界面活性物質が哺乳類の肺胞細胞培養物から得られる請求項１〜９のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項１５】
界面活性タンパク質が組換えタンパク質である請求項６による肺界面活性組成物。
【請求項１６】
少なくとも約５ ｍＭのイオン強度、又は生理的条件に対応するイオン強度を有する電解質溶液中に粉末又は粒子として分散させ、このようにして得られた分散液が少なくとも約５５％ ｗ／ｗの水の濃度を有する場合に、偏光顕微鏡法で観察されるように、複屈折網又は細管が形成される間の動的膨張過程及び定常状態に達した時に完了する動的膨張過程に付される肺界面活性組成物。
【請求項１７】
電解質溶液が少なくとも約１０ ｍＭ 、例えば、少なくとも約１５ ｍＭ、少なくとも約２０ ｍＭ、少なくとも約 ２５ ｍＭ、少なくとも約 ５０ｍＭ、少なくとも約 ７５ ｍＭ、少なくとも約 １００ ｍＭ又は少なくとも約１２５ ｍＭのイオン強度を有する請求項１６による肺界面活性組成物。
【請求項１８】
得られた分散液が少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％ ｗ／ｗの水濃度を有する請求項１６又は１７による肺界面活性組成物。
【請求項１９】
肺界面活性物質が電解質溶液に分散される時に液晶層状相の形態である請求項１６〜１８のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２０】
電解質溶液が、Ｎａ＋、 Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋及び／又はＮＨ４＋の少なくとも１つの陽イオン種からなる請求項１６〜１９のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２１】
電解質溶液が、塩化物、酢酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、リン酸一水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸塩（ＰＯ４３−）、酒石酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、フマル酸塩等の少なくとも１つの陰イオン種からなる請求項１６〜２０のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２２】
電解質溶液が、例えば、０．９％ ｗ／ｗの塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液又はリンゲル酢酸溶液のような塩化ナトリウム溶液である請求項１６〜２１のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２３】
例えば、水のような水性媒質中に分散される時に、組成物にイオン強度を与える１以上の無機塩又は有機塩をさらに含む前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２４】
無機塩が、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウムのようなアルカリ金属塩及び例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウムのようなアルカリ土類金属塩等からなる群から選択される請求項２３による肺界面活性組成物。
【請求項２５】
有機塩が、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウムのような酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、ホウ酸、 リン酸塩、塩化アンモニウムのようなアンモニウム塩等からなる群から選択される請求項２３による肺界面活性組成物。
【請求項２６】
治療、予防及び／又は診断用の別の作用物質をさらに含む前記請求項のいずれかによる肺界面活性組成物。
【請求項２７】
乳児の呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、成人の呼吸窮迫症候群 （ＡＲＤＳ）、先天性横隔膜ヘルニア、急性肺損傷、体外膜酸素化で処置した患者及び／又は胎便吸引性肺炎の治療又は予防用の薬剤を製造するための請求項１〜２４のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項２８】
慢性閉塞性肺疾患、喘息、急性気管支炎、慢性気管支炎、気管支肺形成異常、肺感染、持続性肺高血圧、肺形成不全、癌、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症及び／又は先天性ＳＰ−Ｂ欠乏症の治療又は予防用の薬剤を製造するための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項２９】
薬剤が粉末又は粒子状の肺界面活性物質を適当な分散媒質中に分散させることによって製造される請求項２７又は２８による使用。
【請求項３０】
動的膨張及び複屈折網又は細管の形成を確実にするための十分な期間のあいだ分散が行われる請求項２９による使用。
【請求項３１】
十分な期間が、約０．５〜約１２０分、例えば、約１〜１００分、約２〜９０分、約２〜８０分、約２〜７０分、約３〜６０分、約３〜５０分、約３〜４５分、約５〜４０分、約５〜３５分、約１０〜３５分、約１５〜３５分又は約２０〜３５分である請求項３０による使用。
【請求項３２】
請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物からなる医薬組成物。
【請求項３３】
使用前の水性媒質中への分散に適応した粉末又は粒子状の請求項３２による医薬組成物。
【請求項３４】
液状の請求項３２による医薬組成物。
【請求項３５】
液体が肺界面活性組成物及び電解質溶液からなる分散液状である請求項３４による医薬組成物。
【請求項３６】
組成物が生理的条件に適応する請求項３５による医薬組成物。
【請求項３７】
電解質溶液が生理的に許容される溶液である請求項３５による医薬組成物。
【請求項３８】
治療、予防及び／又は診断用の別の作用物質をさらに含む請求項３２〜３７のいずれかによる医薬組成物。
【請求項３９】
吸入器等からの投与に適応した粉末又は粒子状の請求項３２による医薬組成物。
【請求項４０】
平均的な粒子の大きさ及び／又は粉末又は粒子の静電気特性が、吸入器等で投与後に呼吸器官内の特定部位に到達するのに必要な条件に調整される請求項３９による医薬組成物。
【請求項４１】
使用前に肺界面活性組成物を分散媒質中に分散させるための指示書がつけられた、第１容器が請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物からなり、第２容器が肺界面活性組成物のための分散媒質からなる第１及び第２容器からなる医薬キット。
【請求項４２】
肺界面活性組成物が粉末又は粒子状である請求項４１による医薬キット。
【請求項４３】
指示書に、分散媒質中に分散した後に肺界面活性組成物を投与すべき期間が推奨されている請求項４２による医薬キット。
【請求項４４】
分散媒質が電解質溶液である請求項４１〜４３のいずれかによる医薬キット。
【請求項４５】
電解質溶液が、例えば、０．９％ ｗ／ｗの塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液又はリンゲル酢酸溶液のような生理的に許容される電解質溶液である請求項４４による医薬キット。
【請求項４６】
治療、予防及び／又は診断用の別の作用物質をさらに含む請求項４１〜４５のいずれかによる医薬キット。
【請求項４７】
第１容器が請求項３９又は４０による医薬組成物を含む吸入器等の形態であり、第２容器が、第１容器の医薬組成物の投与後に投与した場合に、動的膨張過程に適したイン シトゥー微環境を確実に形成する適当な媒質を含む噴霧器などの形態である第１及び第２容器からなる医薬キット。
【請求項４８】
請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の効果的な量をそれを必要とする哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物の肺の疾患又は症状の治療及び／又は予防法。
【請求項４９】
肺界面活性組成物が請求項３２〜４０のいずれかによる医薬組成物の形状で投与される請求項４８による方法。
【請求項５０】
肺界面活性組成物の動的膨張相の間に投与が行われる請求項４８又は４９による方法。
【請求項５１】
肺疾患又は肺の症状が、乳児の呼吸窮迫症候群 （ＩＲＤＳ）、成人の呼吸窮迫症候群 （ＡＲＤＳ）、先天性横隔膜ヘルニア、急性肺損傷、体外膜酸素化で処理した患者及び胎便吸引性肺炎からなる群から選択される請求項４８〜５０のいずれかによる方法。
【請求項５２】
肺疾患又は肺の症状が、慢性閉塞性肺疾患、喘息、急性気管支炎、慢性気管支炎、気管支肺形成異常、肺感染、持続性肺高血圧、肺形成不全、癌、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症及び先天性ＳＰ−Ｂ欠乏症からなる群から選択される請求項４８〜５０のいずれかによる方法。
【請求項５３】
約０．５〜１２０分の期間内で、空気−液体−固体界面で形成される複屈折網又は細管として偏光顕微鏡で観察される肺界面活性物質の動的膨張を可能にするために、少なくとも約５ ｍＭのイオン強度を有する電解質溶液中に肺界面活性物質を分散させることにより医薬組成物を製造するための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項５４】
肺界面活性組成物の膨張が動的に働き、約０．５〜１２０分の期間内で空気−液体−固体界面で複屈折網又は細管を形成する間に液状医薬組成物を製造するための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項５５】
肺界面活性物質の動的膨張相の間に投与する医薬組成物を製造するための請求項５３又は５４による使用。
【請求項５６】
肺界面活性物質の動的膨張挙動に関して改善された、肺疾患の治療、予防及び／又は診断用の薬剤を製造するための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項５７】
肺のドラッグデリバリーのための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項５８】
治療、予防及び／又は診断用の肺デリバリー作用物質のための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項５９】
治療、予防及び／又は診断用の作用物質がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である請求項５８による肺界面活性物質の使用。
【請求項６０】
組織間の相互接触における接着を防ぐための請求項１〜２６のいずれかによる肺界面活性組成物の使用。
【請求項６１】
ａ）　ここに記載されるように最大動的膨張についてｔ１／２を測定し、
ｂ）　　　こうして得たｔ１／２を、ここに記載されるように得られたインビボ−インビトロ相関曲線と比較し、かつ
ｃ）　　 条件を満たしているか、満たしていないかバッチを評価する
ことからなる、電解質溶液中に分散させる時に動的膨張挙動を有する肺界面活性組成物の各バッチを試験するためのインビトロ確認方法。
【請求項６２】
治療、予防及び／又は診断的効果を予測するために、定常状態の膨張の半減期を測定し、このようにして得られた半減期をインビボ−インビトロ相関曲線と比較することからなる、電解質溶液中に分散される時に動的膨張挙動を有する肺界面活性組成物の治療、予防及び／又は診断的効果を評価するためのインビトロ方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
この発明は、電解質を含有する媒質中に分散される時に動的膨張相を形成することができる肺表面活性組成物に関する。動的膨張過程は偏光顕微鏡法で観察することができ、その結果、空気／液体界面で複屈折網又は細管が形成される。動的膨張過程は、非動的膨張相での肺界面活性物質の拡散と比較して、広い表面積にわたって肺界面活性物質を拡散させる。例えば、生理的電解質溶液中に肺界面活性物質を分散した後、ある特定の時間、拡散が生じる。これによって、肺胞への肺界面活性物質のより活発な拡散は肺への投与後に観察でき、その結果、接触が困難な肺又は他の器官もしくは体の部位内への治療、予防及び／又は診断用作用物質用担体として、そのような組成物を使用できる可能性がもたらされる。
さらに、この発明は、肺界面活性組成物からなる医薬組成物及び医薬キットだけでなく、呼吸窮迫症候群 （ＩＲＤＳ又はＡＲＤＳ）もしくは肺界面活性物質の欠乏に関連する他の肺疾患の治療、予防及び／又は診断方法に関する。
【０００２】
発明の背景
肺界面活性物質（ＬＳ）は、肺の肺胞表面の内側を流れる液体中にみられる脂質及びタンパク質からなる複雑な高界面活性物質である。それらの主な特性は肺の表面張力を低下させることであり、それは肺胞内の空気−液体界面の組織化構造としての脂質の存在によって達せられる。ＬＳは、低肺容量での肺胞陥没を防ぎ、正常及び強制呼吸中の呼吸活動（生物物理的機能）を低下させる。その上、それは吸入した粒子及び微生物によって引き起こされる創傷及び感染からの肺の保護（免疫学的な非生物物理的機能）に関与している。ＬＳは肺胞ＩＩ型細胞で合成され、分泌される（概説にはＲｏｂｅｒｔｓｏｎ 及びＴａｅｕｓｃｈ、１９９５を参照）。
【０００３】
肺界面活性物質の構成は、対象の様々な要因、例えば、種類、年齢及び全身の健康状態で変化するであろう。様々な天然及び合成成分が、界面活性物質中で互いに置換可能である。したがって、肺界面活性物質とは何か及び治療用の肺界面活性物質に何が含まれるべきかという非厳密な定義すら、状況次第である。健康な哺乳動物の肺洗浄により単離された界面活性物質は、約１０％のタンパク質（その半分は界面活性物質に特異的である）及び約９０％の脂質を含有する。脂質のうち約８０％がリン脂質で、約１０％の非エステル化コレステロールを含有する約２０％が中性脂肪である。リン脂質画分は、大部分（約７６％）はホスファチジルコリン（ＰＣ）を含有し、約２／３はジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であり、残りは不飽和である。約１１％のリン脂質は、ホスファチジルグリセロール （ＰＧ）、約４％のホスファチジルイノシトール、約３％のホスファチジルエタノールアミン、約２％のホスファチジルセリン、 約１．５％のスフィンゴミエリン及び約 ０．２％のリゾホスファチジルコリンからなる。最新の評価によれば、界面活性タンパク質Ａ（ＳＰ−Ａ）は ４％の界面活性物質を表し、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄはそれぞれ１％未満を構成している。
【０００４】
ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄ は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーのコレクチン亜群に属する。ＳＰ−Ａ はジパルミトイルホスファチジルコリンを結合し、ＳＰ−Ｄはホスファチジルイノシトールを結合する。さらに、ＳＰ−Ａは、界面活性リン脂質の恒常性におけるＳＰ−Ａも含めて、肺胞ＩＩ型細胞と相互作用する。ＳＰ−Ａは、分泌された層状体物質からの管状ミエリンの形成に必要である。
界面活性物質の欠乏は、未熟児に最も一般的かつ重症な肺疾患の苦痛を残す。界面活性物質の欠乏は、新生児の呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）及び成人の呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を招く主な要因である。１９６０年代以来、これらの症候群を治療するための肺界面活性物質の外因性投与が研究されてきた。
【０００５】
界面活性物質の異常生理学的役割は、呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）及びヒアリン膜症の未熟児で最初に認識された。肺界面活性物質の外的な使用及びコルチコステロイドの投与は、この疾患における生存率の改善及び死亡率の低下に多大な影響を与え、結果として臨床及び放射線分野を変化させた。
肺界面活性物質の組成及び分布についての知識が大いに不足していたため、１９６０年代の肺界面活性物質の代用でＲＤＳの治療を改善するという当初の試み（Ｃｈｕら、１９６７）は失敗した。 Ｌｉｇｇｉｎｓと同僚（Ｌｉｇｇｉｎｓら、１９７２）は、最初に胎児の肺成熟を高めるためにコルチコステロイドを利用することによって、出生後のＲＤＳの危険性及び合併症を減少させた。コルチコステロイドと甲状腺放出ホルモンと組み合わせてＲＤＳに対する出生前の予防を高め、さらにＲＤＳの初期段階で、肺界面活性物質の製造用物質としてイノシトールを未熟児に与えることが可能である。
【０００６】
また、ＲＤＳ用の肺界面活性物質の代用物を設計し、使用するための多くの方法が試みられている。最も確実な方法は、ヒトの肺界面活性物質での代用である。ヒトの肺界面活性物質は、洗浄手順でのみ採取することができるが、その既存の生物物理的及び生化学的な微小組織を破壊する可能性がある。Ｈａｌｌｍａｎと協力者の研究で見られるように（Ｈａｌｌｍａｎら、１９８３）、そのような調製物は臨床試験には成功したものの、多量のヒトの肺界面活性物質を得るのが困難なため、商業生産には至っていない。
これらの限界から、合成物の肺界面活性物質の生産が望まれる。
したがって、第二の研究方法は、種々の肺界面活性成分の機能を知り、次いで、容易に、又は天然生成物を単離するより安価に得られる肺界面活性物質を構成することである。
【０００７】
ＥｘｏｓｕｒｆはＤＰＰＣ、ヘキサデカノール及びチロキサポールを含有する市販の調製物である。 ヘキサデカノール及びチロキサポールは、ある程度まで、天然肺界面活性物質中の界面活性タンパク質、ＰＧ及び他の脂質の機能を模倣している。幾つかの群では、タンパク質が天然の界面活性タンパク質の構造と機能を模倣することを意図して、脂質に界面活性タンパク質を付加している。
さらに、デノボペプチド合成又は組換えＤＮＡ技術を用いて、界面活性タンパク質を、処方タンパク質を含む脂質混合物に添加する新たな方法がある（Ｙａｏら、１９９０）。
【０００８】
理想的な治療用の肺界面活性物質は、理想的な療法について多くの特性を共有すべきである。それは、安定的で、容易に入手でき、製造しやすく、安価であるべきであり、容易な投与ルート、疾患過程に一致する半減期ならびに十分に理解される作用、代謝及び異化のメカニズムを有するべきである。それは、毒性、不耐性、免疫原性又は副作用のない疾患に最大効力を有するべきである。それは、天然肺界面活性物質の作用を模倣し、肺内の気体交換を向上し、肺の機構を向上し、機能的な残留能を向上し、不活化を阻止し、最適な分布特性を示し、公知のクリアランスメカニズムを有するべきである。その使用は、初期の疾患過程を完全に後退させて治療するか、又は体が初期疾患からの二次損傷を治療するのを可能にするはずである。
入手可能な治療上の肺界面活性物質は、哺乳類の肺から調製されるものと合成化合物からつくられるものの２種がある。ウシ及びブタの界面活性物質はリン脂質と結合するＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃを含有するが、ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄは全天然界面活性物質中にのみ存在する。現在市販されている合成肺界面活性物質の例は、Ｅｘｏｓｕｒｆ及びＡＬＥＣである。
【０００９】
市販の肺界面活性物質の大部分はすでに混合された液体として提供されているが、Ｅｘｏｓｕｒｆ及びＡｌｖｅｏｆａｃｔは、使用前に食塩水で再構成する必要がある凍結乾燥粉末として供給されている。
界面活性治療は、現在、ＩＲＤＳの新生児に関する常套的な臨床管理について確立された一部である。これらの乳児の肺胞界面活性物質（肺界面活性物質）の欠乏を補うには約１００ ｍｇ／ｋｇの初期服用が通常必要であり、多くの場合、繰り返して治療することが必要である。最近の実験及び臨床データは、外因性肺界面活性物質の多数回の服用が、例えば、胎便の吸引で生じる肺界面活性物質の不活化、感染、又は血漿タンパク質の空気層への漏れによる肺胞浸透性の妨害により特徴付けられる症状においても有益であり得ることを示している。
【００１０】
肺界面活性治療法に対する急性反応は、外因性物質の量（改質した天然肺界面活性物質は一般的に無タンパク質合成界面活性物質より効果的である）、臨床分野に関する治療のタイミング（疾患の初期段階治療は、後の治療より優れ、機械的呼吸のための後の必要性を軽減させ得る）及びデリバリー様式（気管内チューブを介した迅速な点滴により分配がより均一になり、遅い気道注入より効果的となる）に依る。エーロゾル化界面活性物質での治療は、界面活性物質が欠乏した動物モデルで肺機能を向上させるが、通常は、デリバリーシステムにおける霧状物質の多量損失を伴う。さらに、未熟な新生子羊での実験データは、治療反応が出生時の蘇生の仕方に依ること、また、ほんの数回の大きな呼吸での手呼吸が後の界面活性治療法の効果を損なう可能性のあることを示している。肺界面活性物質の一般に普及した臨床的な使用により、先進国で新生児死亡率が低下し、集中治療の費用が低下している。
現在の最も効率的な肺界面活性物質は、哺乳類の肺から調製される。収量が非常に少ないため、治療は極めて高価である。したがって、それらの効率を向上し、用途を標準化することが早急に求められている。
【００１１】
発明の要約
本発明は、周囲温度で濃度１０％ ｗ／ｗ の塩化ナトリウム０．９％ ｗ／ｗに粉末又は粒子として分散させる時に、膨張過程において、偏光顕微鏡法で観察されるように、約０．５〜１２０分、例えば、約３〜６０分の期間内で空気−液体−固体界面で複屈折網又は細管を形成することができる肺界面活性物質からなる肺界面活性組成物を提供する。
複屈折網又は細管は、肺界面活性物質が電解質を含有する媒質中に分散される時から膨張が定常状態（即ち、平衡）に達する時まで生じる動的膨張過程中に形成される。
【００１２】
したがって、別の見解では、本発明は、少なくとも約５ ｍＭ、例えば、少なくとも約１０ ｍＭ、少なくとも約１５ ｍＭ、少なくとも約２０ ｍＭ、少なくとも約２５ ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約７５ ｍＭ、少なくとも約１００ ｍＭ又は少なくとも約１２５ ｍＭのイオン強度もしくは生理的条件に対応するイオン強度を有する電解質溶液に粉末又は粒子として分散され、このようにして得られた分散液が少なくとも約５５％ ｗ／ｗ、例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９８％ ｗ／ｗの水の濃度を有する場合に、偏光顕微鏡法で観察されるように、複屈折網又は細管が形成される間、動的膨張過程に付され、定常状態に達する時に動的膨張過程が完了する肺界面活性組成物に関する。
【００１３】
電解質溶液に分散されると、リン脂質の液晶層状相が形成される。脂質−タンパク質二分子層構造は、平衡組成物の積極的な確立に組織化することが分かっており、複屈折複合網の形成として顕微鏡的に認めることができる。例えば、所定の時点又は明確な期間内で投与するためのＬＳ組成物、ならびに肺界面活性組成物について最適な前記時点又は期間を決定する手段が提供される。
肺界面活性物質の肺胞へのより活発な拡散は、電解質を含有する媒質中で動的膨張挙動を有する肺界面活性物質を肺又は他の呼吸器系器官に適用する場合に生ずることができる。このように、治療、予防又は診断を改善することができる。
さらに、本発明の肺界面活性組成物は、例えば肺のドラッグデリバリーのための治療、予防及び／又は診断用の作用物質用担体として使用することができる。
【００１４】
本発明は、また、医薬組成物、医薬キット及び界面活性物質の欠乏と関わり得る呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）又は他の呼吸器もしくは肺の疾患の改善治療法を提供する。
さらなる観点において、本発明は、
ａ）　　　ここに記載されるように最大動的膨張についてｔ１／２を測定し、
ｂ）　　　こうして得たｔ１／２を、ここに記載されるようにして得たインビボ−インビトロ相関曲線と比較し、かつ
ｃ）　　　条件を満たしているか、満たしていないかバッチを評価する
ことからなる、電解質溶液中での分散時に、動的膨張挙動を有する肺界面活性組成物の個々のバッチを試験するためのインビトロ確認方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、治療、予防及び／又は診断的効果を予測するために、定常状態の膨張の半減期を測定し、このようにして得られた半減期をインビボ−インビトロ相関曲線と比較することからなる、電解質溶液中に分散される時に動的膨張挙動を有する肺界面活性組成物の治療、予防及び／又は診断的効果を評価するためのインビトロ方法に関する。
【００１６】
図面
図１は、混合して５分後に偏光顕微鏡で見られる１０％ ｗ／ｗＰＬＳ及び９０％ ｗ／ｗリンゲル溶液のサンプルを示す。膨張中のＰＬＳ粒子は、空気に面する表面に蓄積する。
図２は、図１に示すような混合して１５分後のサンプルを示す。「成長」細管は、樹枝状構造のような分枝を形成する。
図３は、混合して３０分後の図１及び図２に示すものと同じサンプルを示す。上の写真は常光で撮影しているが、下の写真は偏光で撮影している。
図４は、ここで実施例２に記載される動物研究の結果を示す。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、例えば、純水に反して、リンゲル溶液又は塩化ナトリウム溶液のような媒質を含有する電解質は、媒質中で肺界面活性物質を分散する初期段階中に分散液の高度な動的膨張挙動を誘発するという驚くべき発見に基づいている。この膨張期間中、脂質−タンパク質二分子層構造は、平衡なコンフォメーションの積極的な確立に対して組織化される。この過程は界面での拡散を伴い、図１〜３ に示す（さらに以下に詳述する）複屈折網の形成として偏光顕微鏡で追跡できる。複屈折は、サンプルの異なる方向に異なる屈折指数が発生することによるもので、サンプル内の結晶又は液晶の発生順序を示す。肺界面活性物質中のこのような極性脂質は、水溶液中に液晶相を形成することが知られている。したがって、それは複屈折によって伴われるこれらの相の光学特性である。
【００１８】
肺界面活性組成物
このように、本発明は、周囲温度及び／又は体温で濃度１０％ ｗ／ｗの塩化ナトリウム０．９％ ｗ／ｗに粉末又は粒子として分散させる時に、膨張過程において、偏光顕微鏡法で観察されるように、約０．５〜１２０分、例えば、約３〜６０分の時間内で空気−液体−固体界面で複屈折網又は細管を形成することができる肺界面活性物質からなる肺界面活性組成物に関する。本発明の肺界面活性組成物とは逆に、公知の市販肺界面活性組成物は、電解質溶液中での分散時にそのような動的膨張挙動を有しない（実施例４参照）。
動的膨張が生じる電解質含有媒質は、通常、１以上の溶媒又は希釈液を含む水性媒質である。溶媒の優れた例は、肺界面活性組成物を肺に投与する時に好ましい水であるが、例えば、エタノール、イソプロパノール又はポリエチレングリコールのような少量の他の溶媒が存在する状況であってもよい。
【００１９】
観察される動態変化は、陽イオン及び／又は陰イオンのようなイオンの存在に関連する。例えば、電解質溶液のような電解質含有媒質は、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋及び／又は ＮＨ４＋の少なくとも１つの陽イオン種、及び／又は塩化物、酢酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、リン酸一水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸塩（ＰＯ４３−）、酒石酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、フマル酸塩等の少なくとも１つの陰イオン種からなってもよい。電解媒質は、通常、生理的に許容されるような構成を有する。即ち、電解質媒質は有害ではなく、身体、特に投与部位を傷つけもしない。言い換えれば、媒質は、通常、生理的に許容される条件に相当する塩濃度及びｐＨを有する。ｐＨに関しては、ｐＨが約５〜８の範囲であることを意味し、塩濃度が０．９％の塩化ナトリウム溶液又はリンゲル溶液もしくはリンゲル酢酸溶液の塩濃度に相当する。また、電解質溶液は０．９％ ｗ／ｗ の塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液又はリンゲル酢酸溶液であってもよい。
【００２０】
媒質を含有する適当な電解質は、例えば、水のような水性媒質に分散される時に組成物にイオン強度を与える１以上の無機塩又は有機塩からなってもよい。本発明の肺界面活性組成物での使用に適した無機塩は、アルカリ金属塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム及びアルカリ土類金属塩、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等からなる群から選択される。
本発明による使用に適した有機塩の例は、酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、アンモニウム塩、例えば、塩化アンモニウム等からなる群から選択される。
【００２１】
肺界面活性組成物の動的膨張挙動を得るために、肺界面活性組成物用の分散媒質として使用に適した媒質のイオン強度も重要である。イオン強度は、少なくとも約５ ｍＭ 、例えば、少なくとも約１０ ｍＭ、少なくとも約１５ ｍＭ、少なくとも約２０ ｍＭ、少なくとも約２５ ｍＭ、少なくとも約５０ ｍＭ、少なくとも約７５ ｍＭ、少なくとも約１００ ｍＭ又は少なくとも約１２５ ｍＭであるべきであると考えられる。イオン強度は、方程式：
Ｉ＝０．５Σｃｉｚｉ２
［式中、ｃｉは媒質中の個々のイオンのモル濃度で、ｚｉは個々のイオンの負荷である］から算出される。したがって、０．９％ ｗ／ｗの塩化ナトリウム溶液は約０．０１５６ Ｍ （１５．６ ｍＭ）のイオン強度に相当し、リンゲル酢酸溶液は約０．１３８ Ｍ （１３８ ｍＭ）のイオン強度を有する。
【００２２】
本発明の肺界面活性組成物は、また、前記のイオン種又は塩類を含んでいてもよい。特に、肺界面活性組成物が粉末又は粒子状である場合、肺界面活性組成物のみが水中に分散して動的膨張挙動を生ずるようイオン種又は塩類の一定量を添加することが適切であろう。
本発明の肺界面活性組成物の動的膨張挙動作用の生理的関連性を動物研究でさらに試験し、重大な臨床効果が示された（実施例２参照）。
【００２３】
肺界面活性物質が動的膨張能を有するかどうかを決定するため、及び／又は動的膨張相が最大になる時点を決定するため、及び／又は本発明による肺界面活性組成物の投与に最適な時点を決定するために、生理的電解質溶液中に分散されたＬＳを含有するサンプルを調製し、その混合物のサンプルを偏光顕微鏡で定期的に調べる。通常、肺界面活性物質の濃度は約０．５〜４５％ｗ／ｗで、水の濃度は約５５％ ｗ／ｗを上回るべきである。水含有量はしばしば８０％ ｗ／ｗ以上、例えば、約９０％ ｗ／ｗであるべきである。最初に、外観を均一化し、サンプルを水のような粘性で混濁する。偏光顕微鏡によるこの段階のサンプルの図は、図１と似ているであろう。電解質溶液で囲まれた弱複屈折を呈した小粒子が、水に面する液相の外側の境界線に蓄積されるのが見られるであろう。次いで、複屈折が、空気に面する液相の接触表面積の著しい増加によって増大するのが観察されるであろう。管状形成は液面から生じ、徐々に枝分かれして樹枝状構造を形成し、引き続いて、図２及び３に示すものに匹敵する複屈折となる。肺界面活性組成物を生理的電解質溶液に添加してから約６０分後（０．５〜１２０分、例えば３〜６０分の範囲）に、採取したサンプルは上述される動的膨張挙動を示さないであろう。
【００２４】
ここで使用される用語「複屈折」は、結晶通過時の、（直交偏光の）不釣合いに屈折する２つの平面偏光への光の分離を意味する。この作用は、光の速度が全ての方向で同じではない、つまり、屈折率が異方性の結晶又は液晶で生じる。
用語「網又は細管」は、空気に面する液相の接触表面積の著しい増加が、偏光顕微鏡法での観察時に、複屈折となる分枝を持つ細管を生じることを指す。液表面は樹枝状構造を形成でき、表面域は複屈折複合網に発達する（図３参照）。
【００２５】
動的膨張が最大になる時間は、肺界面活性組成物（例えば、哺乳動物の抽出物又は半合成もしくは全合成肺界面活性組成物；同一の肺界面活性組成物のバッチ間でも、変動があり得る）の成分の濃度及び性質、その製造方法ならびに使用した分散媒質の組成（イオン強度、イオン種の性質、イオン種の濃度、ｐＨ等）で変動すると考えられ、動的膨張過程及び動的膨張が最大になる時点又は期間を標準手順で決定する必要がある。さらに、肺界面活性組成物の粒子の大きさも重要である。したがって、粒子の大きさの低減が動的膨張を迅速化し、即ち、定常状態となるまでの時間及び動的膨張が最大になるまでの時間が減少すると考えられる。動的膨張を最大にするために一定期間及び明確な期間を設けることが望ましい場合に、この性質を用いてもよい。
【００２６】
本発明に使用される肺界面活性物質は、好ましくは、ブタの肺、即ちブタの肺界面活性物質（ＰＬＳ）に由来するが、当業者が容易に理解しているように、他の哺乳動物に由来していてもよく、又は合成してまでも製造することができる。本発明の一実施形態では、ＰＬＳは新たに屠殺したブタから製造される。ブタの肺を細かく切り刻んで食塩水中で洗浄し、次いで、タンパク質及び脂質の混合物を濾過して遠心分離する。引き続いて、上清を遠心分離して粗界面活性物質のペレットを前記のように抽出した（Ｂｌｉｇｈら、１９５９）。有機溶媒相を蒸発させ、中性脂肪をアセトンで除去する。最終的に、調製物を凍結乾燥し、凍結乾燥した粉末を得る。
本発明の一実施形態では、肺界面活性組成物はブタの肺から得られる（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂａｌｌｅｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）が、界面活性物質は肺胞細胞培養物からも同様に得ることができ、あるいは例えば、組換え技術を用いて化学的又は合成的に得ることができる。
【００２７】
肺界面活性脂質及び／又はタンパク質は、当業者に周知の方法で、肺細胞を培養し、分泌された脂質及び／又はタンパク質を回収して得ることができる。肺界面活性物質は、例えば、ヒトの肺腺癌に由来する市販のＡＴＣＣ細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９， ＵＳＡ）を用いて細胞培養することができる。したがって、この発明の一実施形態は、細胞系に由来する肺界面活性物質の使用に関する。
前記の抽出物は、疎水性のタンパク質及びリン脂質を含有する。それは、さらにコレステロール、遊離脂肪酸及び脂肪酸グリセリドを含有していてもよい。本発明の一実施形態では、肺界面活性組成物は、リン脂質、ＤＰＰＣ、ＰＧ、脂肪酸、ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃからなる群から選択される界面活性タンパク質及び脂質を含んでいてもよい。本発明の別の実施形態では、肺界面活性物質はさらに合成リン脂質及び少なくとも１つの疎水性タンパク質ＳＰ−Ｂ又はＳＰ−Ｃを含んでいてもよい。前記タンパク質は、組換えタンパク質として得ることも可能である。
【００２８】
本発明に使用されるＬＳ抽出物に存在するＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃは、いずれも神経のミエリンのタンパク質のような生理的ｐＨ値以下で塩基性のタンパク質である。脂質は、陽イオンタンパク質を持つ静電複合体を形成し得る陰イオン及び双極性イオン（ＰＣ）である。
前記のように、本発明の肺界面活性組成物は、例えば、飽和及び不飽和リン脂質又はそれらの混合物のようなリン脂質からなる。リン脂質の濃度は、乾燥状組成物の約８０〜９９．５％ ｗ／ｗ、例えば、約８５〜９８％ ｗ／ｗ又は約９０〜９８％ ｗ／ｗである。リン脂質は、ジパルミチルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含んでいてもよい。さらに、本発明の肺界面活性組成物は、例えば、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及び／又はＳＰ−Ｄ、好ましくは、ＳＰ−Ｂ及び／又はＳＰ−Ｃのような界面活性タンパク質からなる。界面活性タンパク質の全濃度は、乾燥状組成物の約０．５〜１０％ ｗ／ｗ、例えば、約０．５％〜７．５％ ｗ／ｗ、約０．５〜５％ ｗ／ｗ、約０．５〜２．５％ ｗ／ｗ又は約０．５％〜２％ ｗ／ｗである。
【００２９】
本発明の肺界面活性組成物を投与する前に、肺界面活性組成物を水性電解媒質中に分散させてもよい。これは、ガラス製試験管内で、電解媒質、例えばリンゲル溶液を所定量の肺界面活性組成物に添加して行われる。分散液を、均衡に混合及び相互作用を促進するため、約０．５分間シリンジで繰り返し吸い上げて排出する。本発明の特定の実施形態では、１３０ｍｍｏｌ Ｎａ＋、４ｍｍｏｌ Ｋ＋、２ｍｍｏｌ Ｃａ２＋、１ｍｍｏｌ Ｍｇ２＋、３０ｍｍｏｌ Ａｃ−及び１００ｍｍｏｌ Ｃｌ−を含むＰｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ （Ｓｗｅｄｅｎ）のリンゲル酢酸が使用される。別の実施形態では、生理的電解質溶液はさらにＳＰ−Ａを含む。
本発明の肺界面活性組成物の動的膨張過程の顕微鏡観察は、図２及び３に見られるように、イオンの存在及び空気／固体／液体界面の存在がいずれも表面網状組織の優れた形成に必要であることを示している。この過程は、肺界面活性物質の動的な活性状態を表す。いかなる理論にも拘束されず、本発明に使用されるＬＳ抽出物又は調製物に見られるように、有機溶媒中の抽出及び蒸発は極性域を内向きにし、炭化水素域で隠すことを意味すると考えられる。したがって、ＰＧ／ＳＰ−Ｂ及びＰＧ／ＳＰ−Ｃイオン複合体は、水にさらした時に二分子層を形成するよう、そのコンフォメーションを激変すると考えられる。この過程は時々生ずる。例えば、食塩水又はリンゲル溶液のイオンが存在する場合、それらは、これらの複合体を分離させる。このメカニズムは、蒸留水中で膨張した肺界面活性物質サンプル中で網が見られない理由を説明している。
【００３０】
二分子層内でのあらゆる再構成が、大きな動態を誘導することが予期される。これが、おそらくＬＳ粉末又は粒子をリンゲル溶液中に分散した後に精巧な複屈折網が形成される理由であろう。表面自由エネルギーを減少するための推進力が暴露界面にあると思われ、再構成過程が固体表面、液体及び空気に面する低エネルギー界面の形成を助けるはずである。生理的電解質溶液の使用が適した本発明の実施形態では、電解質溶液は食塩水（生物食塩液）、リンゲル溶液及び／又はリンゲル酢酸溶液からなる群から選択される。
前記の意外な生理的効果が、動的膨張挙動を有する肺界面活性組成物を臨床的に使用するための新規かつ改善された手段を提供している。したがって、本発明によれば、肺界面活性組成物は、時間を制御して、生理的電解質含有溶液とともに肺に投与すべきである。あるいは、肺界面活性組成物は、例えば、粉末吸入器を用いて粉末又は粒子として投与することができ、次いで、動的膨張過程を適用後その場で生じてもよい。必要であれば、投与は、肺界面活性組成物の動的膨張挙動を局所化するために、霧状液体形態の適当な媒質を続けて投与することによって補足してもよい。粉末吸入器の使用は、喘息、気管支炎又は関連する呼吸症状の治療又は予防時に特に実用的である。
【００３１】
したがって、他の見解では、本発明は、乳児の呼吸窮迫症候群 （ＩＲＤＳ）、成人の呼吸窮迫症候 （ＡＲＤＳ）、先天性横隔膜ヘルニア、急性肺創傷、体外膜酸素化（Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）で処置した患者及び／又は胎便吸引性肺炎の治療又は予防用、もしくは慢性閉塞性肺疾患、喘息、急性気管支炎、慢性気管支炎、気管支肺形成異常、肺感染、持続性肺高血圧、肺形成不全、癌、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症及び／又は先天性ＳＰ−Ｂ欠乏症の治療又は予防用の薬剤を製造するための本発明の肺界面活性組成物の使用に関する。
適当な薬剤は、適当な分散媒質中に粉末又は粒子状の肺界面活性物質を分散して製造することができ、分散は、動的膨張及び網又は細管の形成を確実にする十分な期間で行われるであろう。十分な期間は、例えば、約１〜１００分、約２〜９０分、約２〜８０分、約２〜７０分、約３〜６０分、約３〜５０分、約３〜４５分、約５〜４０分、約５〜３５分、約１０〜３５分、約１５〜３５分又は約２０〜３５分である。
【００３２】
医薬組成物及び医薬キット
また、本発明は、本発明の肺界面活性組成物からなる医薬組成物に関する。医薬組成物は、固体（例えば、粉末、粒子、顆粒、薬袋、タブレット、カプセル等）、半固体（ゲル、ペースト等）又は液体（溶液、分散液、懸濁液、乳濁液、混合物等）の形態であってもよく、例えば、呼吸器官を介する投与に適合するであろう。つまり、医薬組成物は、使用前に水性媒質中への分散に適応した粉末又は粒子状であってもよい。
液状の医薬組成物は、肺界面活性組成物及び電解質溶液、例えば、生理的に許容される溶液のような生理的条件に適応した組成物を含む分散液状であってもよい。本発明の医薬組成物は、治療、予防及び／又は診断用の別の作用物質をさらに含んでもよい。
【００３３】
別の見解において、本発明は、使用前に分散媒質中に肺界面活性組成物を分散させる指示書を添付した第１及び第２の容器からなる医薬キットに関し、第１容器は本発明の肺界面活性組成物からなり、第２容器は肺界面活性組成物用の分散媒質からなる。
キットに含まれる肺界面活性組成物は、粉末又は粒子状であってもよい。
本発明の医薬キットは、分散媒質中に分散した後に肺界面活性組成物を投与すべき期間を推奨する指示書を含んでいてもよい。
本発明の医薬キット内の分散媒質は、電解質溶液、例えば、０．９％ ｗ／ｗの塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液又はリンゲル酢酸溶液のような生理的に許容される電解質溶液であってもよい。
さらに、本発明の医薬キットは、治療、予防及び／又は診断用の別の作用物質を含んでいてもよい。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は第１及び第２の容器からなる医薬キットに関し、第１容器は本発明の医薬組成物を含む吸入器等の形態であり、第２容器は、第１容器の医薬組成物の投与後に投与した場合に、動的膨張過程に適したイン シトゥー微環境を確実に形成する適当な媒質を含む噴霧器の形態である。
臨床的な使用において容易に投与するために、本発明は、
ａ）　　　肺界面活性組成物を含む第１成分、
ｂ）　　　塩、任意に、分散媒質を含む第２成分、及び
ｃ）　　　肺界面活性組成物の水性膨張が生じる期間及び前記キットの使い方についての情報を含む書面の指示書からなる第３成分
を含み、生理的電解質溶液が投与された組成で達せられる、肺界面活性組成物の時間制御投与用の３成分キットをも包含する。
【００３５】
前記のように、肺界面活性組成物は、リン脂質ならびにタンパク質ＳＰ−Ｂ及び／又はＳＰ−Ｃの種々の混合物を含んでいてもよい。本発明の特定の実施形態では、肺界面活性組成物は投与前にリンゲル溶液中に分散される。
医薬組成物中、又はキットから調製される医薬組成物を使用する準備が整った肺界面活性組成物の濃度は、一般的に、０．５〜３００ ｍｇ／ｍｌのＬＳ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、２ ｍｇ／ｍｌ、３ ｍｇ／ｍｌ、４ ｍｇ／ｍｌ、５ ｍｇ／ｍｌ、６ ｍｇ／ｍｌ、７ ｍｇ／ｍｌ、８ ｍｇ／ｍｌ、９ ｍｇ／ｍｌ、１０ ｍｇ／ｍｌ、１５ ｍｇ／ｍｌ、２０ ｍｇ／ｍｌ、２５ ｍｇ／ｍｌ、３０ ｍｇ／ｍｌ、４０ ｍｇ／ｍｌ、５０ ｍｇ／ｍｌ、６０ ｍｇ／ｍｌ、７０ ｍｇ／ｍｌ、８０ ｍｇ／ｍｌ、９０ ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２５ ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７５ ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも２００ ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
医薬組成物及びキットは、当業者に周知の方法で製造してもよい。
【００３６】
本発明の肺界面活性組成物の治療、予防及び／又は診断的使用
本発明は、肺抽出物からの脂質及びタンパク質の混合物もしくは半合成又は全合成肺界面活性物質までも含有し得る肺界面活性組成物の使用にも関する。混合物は、脂質及びタンパク質を含む前記混合物を電解質溶液に添加した後、所定の時点又は所定期間投与する組成物を製造するため、例えば、生理溶液のような電解質溶液中に分散される。
このように、本発明は、肺界面活性物質が哺乳類の抽出物又は半合成又もしくは全合成方法に由来する肺界面活性組成物の使用に関する。組成物は、組成物を前記電解質溶液に添加した後に所定の時点又は所定期間適切に投与する組成物を製造するため、電解質溶液に分散される。前記の投与時点又は投与期間は、分散液の膨張挙動が定常状態に達する最早時点の半分として顕微鏡的に測定された。この段階で肺胞に投与することによって、最大の使用は、水中で界面活性物質分子を再構成する間にイオン相互作用により引き起こされる動的拡散とみなされる。
【００３７】
本発明は、さらに肺界面活性物質の動的膨張が電解媒質中で生じる期間を測定及び標準化する方法に関する。この方法は、前記及び実施例１に記載されるように、肺界面活性組成物を電解質媒質に添加し、偏光顕微鏡で動的膨張動態を観察することからなる。
本発明の肺界面活性組成物は、必要としている患者にいずれの時点で投与してもよい。したがって、肺界面活性組成物は、電解質媒質（例えば、生理的電解質溶液）中で分散形態であってもよく、分散後の適当ないかなる時に投与してもよい。ここで実施例２に示すように、作用を向上させる（即ち、作用がより大きくなるか、あるいは同じ治療効果を得るための用量を低減し得る）ために、本発明の肺界面活性組成物の動的膨張挙動を利用することが有益である。
【００３８】
肺界面活性組成物をその最大動的膨張で投与することが適切な場合、生理的電解質溶液中の粉末又は粒子状（例えば、凍結乾燥状又は乾燥状）の肺界面活性物質の混合から最適効果のための前記組成物の肺への投与までの時間は、約０．５〜１２０分、例えば、約１〜１００分、約２〜９０分、約２〜８０分、約２〜７０分、約３〜６０分、約３〜５０分、約３〜４５分、 約５〜４０分、 約５〜３５分、約１０〜３５分、約１５〜３５分、約２０〜３５分の範囲であると考えられる。したがって、本発明は、さらに、肺界面活性組成物及びタンパク質を含む前記混合物を前記生理的電解質溶液に添加後、少なくとも３分及び多くとも６０分、例えば、前記混合物の添加後少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１００又は１２０ 分、もしくは、例えば、前記混合物の添加後多くとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１００又は１２０分の時点での肺界面活性組成物の投与に関する。前記のように、前記組成物を投与する最適な時点は、使用される乾燥粉末の質及び電解質溶液の選択によって変動し、６０分以上、例えば、６０〜７５分より長いか、又は、ある場合ではさらに長くてもよい。
【００３９】
最適な時間は、食塩水とリンゲル溶液とで多少変化する場合もある。生物学的に測定される最適時間と偏光顕微鏡で見られるような製剤の定常状態の複屈折面に達するのに必要な時間の半分との完全な一致は、ラットの研究に見られることが分かっており、本発明の基礎を形成している。ＡＲＤＳの肺界面活性物質療法を用いた他の研究から、ラットの結果がヒトの療法に適用できることが知られている。したがって、ラットの研究から得たデータもヒトに関連すると推断される。投与時のそのような時間の作用は、それまでに観察されていない。
本発明は、ＬＳ組成物の質を測定するための肺界面活性組成物の動的膨張挙動の潜在的な使用も提供する。質を確認するインビトロ方法への手段は貴重で、時間のかかる動物研究にとって代わる可能性がある。その上、肺界面活性組成物の効能は、動的膨張挙動に見られるように性能特質に関連すると思われる。
【００４０】
食塩水又はリンゲル溶液中の肺界面活性組成物を肺投与するための最適濃度は、約４〜１０ ％ ｗ／ｖの範囲であると考えられる。本発明に用いるために、５ ％ ｗ／ｖの濃度は、気管内チューブを介して投与し、多すぎる量の投与を制限するのに適切であるように思われる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％又は少なくとも１０％ ｗ／ｖの肺界面活性物質を含有する組成物に関する。特定の実施形態は、少なくとも５％ ｗ／ｖの肺界面活性物質を含有する組成物に関する。
本発明の一実施形態は、肺界面活性物質を、例えば、生理的電解質溶液のような電解媒質に添加した後の所定の時点又は所定期間で前記肺界面活性組成物を適切に投与することによって特徴付けられる、被験者の肺胞内に前記組成物を改善投与するための肺界面活性物質を含む肺界面活性組成物を拡散する動的過程の使用に関する。被験者は、ヒトを含む動物であってもよい。
【００４１】
本発明の肺界面活性組成物の動的膨張挙動は、臨床的使用では、肺界面活性組成物が、時間を制御して生理的電解質溶液と共に肺内に投与されるべきことを意味している。その結果、それを必要とする人の治療法は、分散が活発な動的拡散を示す所定の時間中に生理的電解質溶液中で分散（可能であれば、再構成）した肺界面活性組成物を人の肺胞に投与することからなるであろう。
上記のような方法は、乳児の呼吸窮迫症候群 （ＩＲＤＳ）、成人の呼吸窮迫症候群 （ＡＲＤＳ）、先天性横隔膜ヘルニア、急性肺損傷、体外膜酸素化で処置した患者及び／又は胎便吸引性肺炎の治療、予防又は診断、もしくは慢性閉塞性肺疾患、喘息、急性気管支炎、慢性気管支炎、気管支肺形成異常、肺感染、持続性肺高血圧、肺形成不全、癌、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症及び／又は先天性ＳＰ−Ｂ欠乏症の治療又は予防に使用することができる。
本発明の特に好ましい実施形態では、気管内チューブを介して肺への投与が行われる。
【００４２】
肺のドラッグデリバリー
本発明の肺界面活性組成物、医薬組成物又は医薬キットは、他の治療、予防及び／又は診断用作用物質用担体として接触が困難な体の部位内にも使用することができ、この結果、例えば、肺胞壁にわたって改善された物質の輸送手段を提供する。
【００４３】
つまり、ここに記載される概念は、治療、予防及び／又は診断用の作用物質を放出（例えば、制御放出）するための肺のドラッグデリバリーとして使用することができる。肺界面活性物質は、付加的作用物質、例えば、気管支拡張薬、抗炎症剤、ヒスタミン−受容体拮抗薬、コルチコステロイドを含有する吸入ステロイド、ＤＮＡ−ａｓｅ、抗体、血管拡張神経、抗生物質、成長因子、上皮完全性増強薬剤、肺成熟促進因子、アセチルシステインを含む粘液性溶解剤、抗新生薬、レチノイド、血管標的化化合物、抗脈管形成物質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む免疫療法及び／又はウィルス性ベクター及び裸のＤＮＡを含む遺伝子療法のための担体又は賦形剤として役立つことができる。肺のドラッグデリバリー用の肺界面活性組成物のこれらの潜在的な使用法は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支肺形成異常、肺感染、持続性肺高血圧、肺感染、肺形成不全、気管支肺形成異常（ビタミンＡを含むレチノイド）、呼吸窮迫症候群、癌、嚢胞性繊維症、肺胞タンパク症及び／又は先天性ＳＰ−Ｂ欠乏症の疾患に特に適用できるであろう。
【００４４】
あるいは、本発明によって提供されるドラッグデリバリーシステムは、被験者が肺に関連する疾患又は肺能力に関連する疾患を罹患していなくても、それを必要とする被験者に薬物を移送するのに当然適用することができる。そのような疾患は例えば癌及び／又は糖尿病のいずれかであるが、例示的な目的にすぎず、それらに限定されない。
本発明の肺界面活性組成物が作用物質を呼吸器官に移送するための担体として使用される場合、肺界面活性組成物の動的膨張の期間は、例えば、被験者への作用物質の移送を変更するために、（例えば、粒子の大きさ、肺界面活性組成物の濃度、電解質の濃度、関連するイオン種の性質等の変化により）ゆっくりと変化するであろう。変化した放出は、所定時期間（約４時間から３〜５日であろう）を超える放出であるかもしれない。
【００４５】
本発明のための別の可能な使用分野は、組成物が組織間の相互接触における接着を予防又は回避するために適用される外科手術後の患者の治療法である。
肺のドラッグデリバリー分野は、現在非常に盛んである。主な移送ルートは経口移送ルートであるが、例えば、低ｐＨ又は胃腸管内の何らかの酵素による薬物分解のような肺移送には存在しない多くの合併症が報告されている。 界面活性物質の生理的性質は、全身に使用されるほぼ全ての薬物の肺への移送において界面活性物質を賦形剤として理想的なものにしている。
その上、本発明に基づく治療薬は、界面活性リポソームに封入された医薬物質を含んでいてもよい。
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに例示する。
【００４６】
実施例
実施例１
ブタの肺界面活性物質（ＰＬＳ）の組成物及びその膨張挙動−動的膨張過程のインビトロ観察
ＰＬＳ組成物の製造
全ての実験は、新たに屠殺したブタから調製したブタの肺界面活性抽出物（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂａｌｌｅｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）（ＰＬＳ）を用いて行った。ＰＬＳは、ＢｌｉｇｈとＤｙｅｒの方法（Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｌ． １９５９， ３７， ９１１〜９１７）に従って細かく切り刻んだブタの肺から抽出した。有機溶媒相を蒸発させ、中性脂肪をアセトンで除いた。得られた調製物を最終的に凍結乾燥させた。飽和及び不飽和リン脂質（粉末組成物の９０〜９８％ ｗ／ｗ）、界面活性タンパク質ＳＰ−Ｂ及びＳＰ−Ｃ（０．５〜２．０％ ｗ／ｗ）、ならびに他の脂質（１０％ ｗ／ｗまで）の混合物からなる粉末組成物として生成物を得た。この組成物を以下の実験で用いた。
【００４７】
ＰＬＳの水性サンプルの製造
ブタの肺界面活性物質（Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｂａｌｌｅｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）（ＰＬＳ）の水性サンプルを、グラス製試験管中でＰＬＳを水もしくは様々な割合の食塩水又はリンゲル溶液を添加して調製した。使用した電解質溶液中のＰＬＳ濃度は全実験で１０％ ｗ／ｗであったが、電解質溶液中の電解質の濃度はさまざまであった（例えば ０．９％ ｗ／ｗ又は１．８％ ｗ／ｗ塩化ナトリウム溶液）。混合するまで約０．５分間、分散液を繰り返しシリンジで吸い上げ、放出した。
最初の実験では、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎのリンゲル酢酸塩を溶媒として使用した（Ｎａ＋ １３０ ｍｍｏｌ、Ｋ＋ ４ ｍｍｏｌ、Ｃａ２＋ ２ｍｍｏｌ、Ｍｇ２＋ １ ｍｍｏｌ、Ａｃ− ３０ ｍｍｏｌ、Ｃｌ− １００ ｍｍｏｌ）。平衡化された、又は新たに調製したサンプルの小滴を、乾燥ＰＬＳ粉末の膨張中又は平衡状態に達した後のいずれかの検査のため顕微鏡スライドに移した。気泡の混入を防ぐため、小滴にカバーグラスを非常に静かにのせた。
【００４８】
顕微鏡での観察を２５℃及び／又は４２℃で行った。Ｓｏｎｙ ＣＤカメラ及びカラープリンタを備えたＬｅｉｔｚ偏光顕微鏡を使用した。
１０％ （ｗ／ｗ）ＰＬＳ及び９０％リンゲル溶液を含むサンプルの膨張挙動を偏光顕微鏡で研究した。異なる時点において、サンプルをバルク溶液から取り、カバーグラス付の顕微鏡スライドに載せた。約５分後、様相は均一化し、サンプルは濁って、リンゲル溶液に囲まれた弱複屈折の粒子は液相の外境界線に蓄積した（図１）。空気に面する液相の接触表面積が著しく増加した。管状形成が液面に観察された。サンプル混合から約１５分後に記録された図２に示すように、「成長」細管は分枝を形成し、引き続き、複屈折性になった。図３（上部及び下部）は、常光（上部）及び偏光（下部）の両方での約３０分後の表面像を示す。表面域は、複屈折複合網に発達した。この分枝挙動は、バッチによって多少の違いはあるものの、約４０〜６０分後に終わった。
【００４９】
ＰＬＳが生理食塩水中で膨張した時、界面で網が同様に成長した。それぞれ０．９％ ｗ／ｗ及び１．８％ ｗ／ｗ の２つの異なる濃度の塩化ナトリウムを使用した。使用したナトリウムの濃度に関係なく、図３に見られるような網構造が観察された。
複屈折網形成のに対し著しい表面拡大を伴うこの動的挙動は、ＰＬＳが食塩水又はリンゲル溶液中で膨張した時にのみ観察され、水では観察されなかった。また、グリセロールの添加により水を等張性になった時も、この溶液中で膨張したＰＬＳは、電解質溶液により示される動的膨張挙動を依然として欠いていた。
さらなる実験は、一定の最低濃度の電解質が分散媒質中に存在すれば、ＰＬＳは複屈折網又は細管構造しか形成しないことを立証した。すなわち、複屈折網又は細管構造の形成は、分散媒質の電解質濃度及び／又はイオン強度に依存している。
前記のとおり、いくつかの実験は２つの異なる温度で行った。複屈折網又は細管構造の形成につながる動的膨張挙動は、両方の温度で観察された。
【００５０】
実施例２
動物実験−膨張度の異なるＰＬＳ組成物のインビボ挙動
動物のプロトコル
プロトコルは、地元のＡｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍにより承認され、動物の世話及び取り扱いは、ＮＩＨガイドラインに従った。体重（ＢＷ） ２４０〜３２０ ｇのスプローグ−ドーレイラット（Ｈａｒｌａｎ、ＣＰＨ、Ｚｅｉｓｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の雄１６匹に、亜酸化窒素、酸素及びイソフルラン（６５／３３／２％）で麻酔をかけ、気管切開し、頚動脈にカテーテルを挿入した。ペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ； Ａｌｇｉｎ ＢＶ、Ｍａａａｓｓｌｕｉｓ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）６０ ｍｇ／ｋｇ／ｈ の腹腔内注射で知覚麻痺を維持し、臭化パンクロニウム（Ｐａｖｕｌｏｎ； Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｋａ、Ｂｏｘｔｅｌ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） ２．０ ｍｇ／ｋｇ／ｈ筋肉内で神経筋遮断を行った。体温は、電気パッドを使って正常範囲内に保った。
【００５１】
ラットを人工呼吸器（Ｓｅｒｖｏ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ ３００， Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ， Ｓｏｌｎａ， Ｓｗｅｄｅｎ）につなぎ、圧力調節モード、振動数３０ ｂｐｍ、１：２のＩ／Ｅ 比、１２ ｃｍ Ｈ２Ｏのピーク気道内圧（ＰＩＰ）、及び２ ｃｍ Ｈ２Ｏの終末呼気陽圧（ＰＥＥＰ）で純粋酸素を補給した。初めに、ＰＩＰを１分間２０ ｃｍ Ｈ２Ｏに上げて、無気肺部を補充した。次に、反復全肺洗浄（ＢＡＬ）により界面活性物質欠乏を誘発し、ＰａＯ２ ＜８５ ｍｍ Ｈｇとした。最初の洗浄の直前に、ＰＩＰ及びＰＥＥＰをそれぞれ２６及び６ ｃｍ Ｈ２Ｏに上げた。
処理は：外因性界面活性物質（２５ ｍｇ／ｍｌの食塩水０．９％ ｗ／ｗに３５ ｍｇ／ｋｇ体重を分散）であった。ＰＬＳ食塩水混合物を、０．５分間繰り返しシリンジに出し入れした。使用したＰＬＳバッチの（ｔ１／２に相当する）最大動的膨張時間は、２０分であることが確認された。界面活性組成物の製造から２０分後、ラット８匹のある群に界面活性物質を与え、界面活性組成物の製造から６０分後、ラット８匹の他の群に界面活性物質を与えた。界面活性組成物（４ ｍｌ／ｋｇ ＢＷ±０．４ｍｌ）、続いて空気の塊（１４ ｍｌ／ｋｇ）を（人工呼吸器の設定は変更せずに）気管内チューブに直接投与した。
【００５２】
ＰａＯ２及びＰａＣＯ２測定のための血液サンプルを、ＢＡＬの前、（直後に処理した）最終洗浄の５分後、ならびに界面活性物質の投与から５、１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に頚動脈から採取した（ＡＢＬ ５０５、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａ／Ｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。
実験後、ペントバルビタールナトリウムを致死量与えて動物を殺した。
【００５３】
統計的分析
ＳＰＳＳ １０．０統計ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ． Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）を用いて統計的分析を行った。群内比較は、ＡＮＯＶＡで分析した。群内比較はＡＮＯＶＡの測定を繰り返して分析した。ＡＮＯＶＡがｐ＜０．０５であれば、この後にＴｕｋｅｙ試験を行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０５で認められた。
【００５４】
結果
前記のとおり、４０分後、ＰＬＳ食塩水サンプルの膨張が定常状態に達し、この過程の約半分の時（すなわち約２０分で）、網形成に伴う動態は最大となる。したがって、２つの時間枠を選択し（食塩水と混合してから２０及び６０分後）、インビトロ界面動態がインビボ界面活性物質の機能と相関しているかどうかを観察した。
インビボ界面活性物質の機能についての膨張挙動のあらゆる作用の検出を最適化するため、低用量のＰＬＳを使用した。以下に述べるＰａＯ２データにより示されるとおり、低用量は単独では誘発した肺損傷を完全に回復させるに不十分であった。
【００５５】
図１０は、ＰＬＳを与え、投与の２０分又は６０分前に分散させた双方の群における時間中のＰａＯ２レベルを示す。ＰＬＳの投与後、ＰａＯ２は両方のグループで向上したが、１２０分の調査時間の間、洗浄前には達しなかった。投与５分後と実験の終わり（１２０分）のＰａＯ２レベルに差はなかった。しかし、投与の６０分前にＰＬＳを混合した群にＰＬＳを滴下してから５分〜１２０分後に、ＰａＯ２は著しく低下した（ｐ＜０．００１）。さらに、１２０分での２群間のＰａＯ２差もかなり大きかった（ｐ＜０．０１）。
最大膨張状態の動脈酸素投与に代表される界面活性物質の機能は、定常状態のＰＬＳの状態より優れているというのが結論である。動的膨張相中の界面活性物質置換のより優れた効果について説明として可能であるのは、動的膨張が滴下された界面活性物質のより優れた分布をもたらすということである。動的膨張をインビトロ条件で調べる時に見られる樹状突起は、数ミリメートルにわたって、すなわちいくつかの肺胞直径にわたって拡張していた。
【００５６】
この調査の非常に重要な結果は、水性混合時間；インビトロ観察された膨張の動態に直接関係があると思われる時間に関する投与時の生理的作用の変化の立証である。これは、最大動態を測定するため、膨張動態について肺界面活性物質抽出組成物を分析するべきであることを意味する。一般的に、この時間は定常状態達成の時間の約半分であることが分かっている。この所定の時間は、ＰＬＳの生成バッチによって異なり、投与後、治療効果を高めることができた。
食塩水の代わりにリンゲル溶液を用いて補足のラット実験をいくつか行ったところ、膨張動態の最大時の投与での酸素投与について、膨張動態が止まった時の投与と比べて同じ改善が示された。
グリセロールを加えた水だけをＰＬＳ組成物に用いると、投与後の治療効果は、溶液を含む電解質と比べて劇的に低下した。
【００５７】
実施例３
質制御分析用パラメータとしてのＰＬＳの動的膨張挙動
本研究の目的は、ＰＬＳの特定のバッチ（又は、ここに記載されるような動的膨張挙動を有する他の肺界面活性物質）が、治療用、予防用、及び／又は診断用の使用に適するよう、所定の要件を満たすかどうかを決定するのに適切なインビトロ試験方法を開発することである。通常、そのような試験は、実施例２に記載されたものなどの動物研究で行われるが、それらの試験は高価であり、試験動物の使用を必要とする。一般に、可能であれば、試験動物を必要とする試験をインビトロ試験に代えることが望ましい。実施例１及び２に示す結果は、インビボ治療効果と最大動的膨張時間とにインビボ−インビトロ相関関係を確立できることを示している。
【００５８】
そのようなインビボ−インビトロ相関関係の確立は、通常、少なくとも１０の異なるＰＬＳバッチからの結果に基づいて行われる。インビボ−インビトロ相関関係の決定方法を以下に示す。
実施例１に記載されるようにして製造されるＰＬＳの異なるバッチのサンプルを、実施例１に記載された手順に付し、分散液中のＰＬＳの動的膨張挙動を調べた。粉末状又は粒子状の１０％ ｗ／ｗ ＰＬＳを、９０％ ｗ／ｗの０．９％ ｗ／ｗ塩化ナトリウム溶液に分散させる。実施例１に記載されるように、ＰＬＳ分散液のサンプルを偏光顕微鏡で観察し、各サンプル中で複屈折管、分枝又は網形成が起こる時間を、膨張が定常状態に達する時間として記す。また、界面長度が増加し、複屈折の強度を記録してもよい。顕微鏡観察を基に、最大動的膨張を、定常状態膨張に達するのに必要な時間の約半分で各サンプルについて設定する。また、動的膨張挙動の質を分類してもよい。
【００５９】
顕微鏡的に試験した各ＰＬＳ分散液のサンプルを、実施例２に記載された動物モデルでも試験し、インビトロ膨張動態とインビボ界面活性物質機能との相関関係を確立した。各分散液の製造後、ＰＬＳサンプルを異なる時点で動物に滴下し、実施例２の方法に従ってＰａＯ２レベルを測定することによりＰＬＳ滴下の効果を測定する。ＰＬＳ分散液が製造される時間とＰａＯ２レベルの著しい上昇を生じる動物への滴下の時間との間隔を記す。
前記間隔とインビトロ最大動的膨張を生ずることが観察された時間との比較を基に、ＰＬＳ分散液の動的膨張が最適な界面活性物質効果を生じる時間を明確にするため、インビトロ挙動とインビボ効果との相関関係を確立してもよい。また、動的膨張挙動の質を考慮してもよい。
【００６０】
いくつかの代表的なサンプルについて示せば、そのような期間を、あとに製造されるＰＬＳのバッチの確認及び／又は質制御の基準として使用してもよい。時間のかかる動物実験を使用する代わりに、インビボ−インビトロ関係（相関関係）を個々のＰＬＳバッチの確認に使用でき、バッチが許容できる際には、最大動的膨張が起こる時点に一定の限度を設けることもできる。限度は、通常ｔ１／２±１５％、ｔ１／２±１０％、ｔ１／２±７．５％又はｔ１／２±５％に設定される。このことは、ＰＬＳバッチのサンプルを前記に概略するインビトロ試験手順に付し、所定の基準時間内の複屈折管又は網の形成により特徴付けられた所望の動的膨張挙動を示すバッチが許容される一方、この挙動を示さないバッチは廃棄されたことを意味する。
これまでにＰＬＳ分散液で得たデータに基づけば、ＰＬＳ分散液が有利に投与される期間は、ＰＬＳ粉末を食塩水に分散させてから１５〜３０分間の範囲内であると思われる。
【００６１】
実施例４
市販の肺界面活性組成物の膨張挙動
様々な市販の肺界面活性組成物を膨張挙動について試験した。Ａｌｖｏｅｆａｃｔ、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ及びＥｘｏｓｕｒｆの製品を試験した。Ａｌｖｅｏｆａｃｔ及びＥｘｏｓｕｒｆは乾燥粉末状であるのに対して、Ｃｕｒｏｓｕｒｆは分散液状である。以下の表１は、市販の肺界面活性調製物の要約である。
【００６２】
【表１】
2004507485.tif 000002
【００６３】
使用した肺界面活性物質の多くは、子ウシ又はウシの肺の抽出物である。しかし、Ｃｕｒｏｓｕｒｆは、比較的高いリン脂質含量（９９％ ｗ／ｗ）を有する細かく切り刻んだブタの肺の抽出物を含む。
実施例１に記載されるように、５０ ｍｇの肺界面活性物質を１０００ ｍｇの塩化ナトリウム０．９％ ｗ／ｗに分散させることにより膨張挙動を測定し、分散液を偏光顕微鏡で観察した。
Ｃｕｒｏｓｕｒｆ以外の全製品は粉末状であった。Ｃｕｒｏｓｕｒｆは懸濁液状であり、Ｃｕｒｏｓｕｒｆの膨張挙動は、カバーガラス付のスライドに小滴を落として測定した。
食塩水中での分散後、製品は全て膨張した。しかし、この実施例で調査した製品は、どれも複屈折網の形成に伴う動的膨張挙動を示さなかった。すなわち、製品は、ＰＬＳで見られたようには劇的に膨張しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】混合して５分後に偏光顕微鏡で見られる１０％ ｗ／ｗＰＬＳ及び９０％ ｗ／ｗリンゲル溶液のサンプルを示す。膨張中のＰＬＳ粒子は、空気に面する表面に蓄積する。
【図２】図１に示すような混合して１５分後のサンプルを示す。「成長」細管は、樹枝状構造のような分枝を形成する。
【図３】混合して３０分後の図１及び図２に示すものと同じサンプルを示す。上の写真は常光で撮影しているが、下の写真は偏光で撮影している。
【図４】ここで実施例２に記載される動物研究の結果を示す。
【図４】
2004507485.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004507485.tif 000004
2004507485.tif 000005
2004507485.tif 000006
2004507485.tif 000007
2004507485.tif 000008
2004507485.tif 000009
2004507485.tif 000010
2004507485.tif 000011
2004507485.tif 000012
2004507485.tif 000013
2004507485.tif 000014
2004507485.tif 000015
2004507485.tif 000016
2004507485.tif 000017
2004507485.tif 000018
2004507485.tif 000019
2004507485.tif 000020
2004507485.tif 000021
2004507485.tif 000022
2004507485.tif 000023
2004507485.tif 000024
2004507485.tif 000025
2004507485.tif 000026
2004507485.tif 000027
2004507485.tif 000028
2004507485.tif 000029
2004507485.tif 000030
2004507485.tif 000031
2004507485.tif 000032
2004507485.tif 000033
2004507485.tif 000034
2004507485.tif 000035
2004507485.tif 000036
2004507485.tif 000037
2004507485.tif 000038
2004507485.tif 000039
2004507485.tif 000040
2004507485.tif 000041
2004507485.tif 000042
2004507485.tif 000043
2004507485.tif 000044
【国際調査報告】
2004507485.tif 000045
2004507485.tif 000046