(57)【要約】本発明は、星状細胞及び星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。さらに本発明は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を被検者において治療する方法と、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を被検者において治療する方法を提供する。追加的に、本発明は、ＣＤ８１タンパク質若しくは核酸と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物へ向けられる。最後に、本発明は、被検者が星状細胞腫を有するかどうかを決定する方法と、被検者における星状細胞腫療法の効力を評価する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
星状細胞を星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１と接触させることを含んでなる、星状細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２】
星状細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって星状細胞をＣＤ８１に接触させる、請求項１の方法。
【請求項３】
ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にする態様で星状細胞へ導入することによって星状細胞をＣＤ８１に接触させる、請求項１の方法。
【請求項４】
核酸が、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される、請求項３の方法。
【請求項５】
接触が ｉｎ ｖｉｖｏ でもたらされる、請求項１の方法。
【請求項６】
接触が哺乳動物において ｉｎ ｖｉｖｏ でもたらされる、請求項５の方法。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである、請求項６の方法。
【請求項８】
ヒトが、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を有する、請求項７の方法。
【請求項９】
星状細胞増殖における欠陥が星状細胞症である、請求項８の方法。
【請求項１０】
星状細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって星状細胞をＣＤ８１に接触させる、請求項７の方法。
【請求項１１】
ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にする態様で星状細胞へ導入することによって星状細胞をＣＤ８１に接触させる、請求項７の方法。
【請求項１２】
核酸が、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
星状細胞性腫瘍細胞を星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１と接触させることを含んでなる、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１４】
星状細胞性腫瘍細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって星状細胞性腫瘍細胞をＣＤ８１に接触させる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にする態様で星状細胞性腫瘍細胞へ導入することによって星状細胞性腫瘍細胞をＣＤ８１と接触させる、請求項１３の方法。
【請求項１６】
核酸が、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
接触が ｉｎ ｖｉｖｏ でもたらされる、請求項３の方法。
【請求項１８】
接触が哺乳動物において ｉｎ ｖｉｖｏ でもたらされる、請求項１７の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ヒトが、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を有する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態が星状細胞腫である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
星状細胞性腫瘍細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって星状細胞性腫瘍細胞をＣＤ８１と接触させる、請求項１９の方法。
【請求項２３】
ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にする態様で星状細胞性腫瘍細胞へ導入することによって星状細胞性腫瘍細胞をＣＤ８１と接触させる、請求項１９の方法。
【請求項２４】
核酸が、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療の必要な被検者において治療する方法であって、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を被検者へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２６】
星状細胞増殖における欠陥に関連した状態が星状細胞症である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＣＤ８１が、経口的、非経口的、又は経皮的に投与される、請求項２５の方法。
【請求項２８】
星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療の必要な被検者において治療する方法であって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を被検者へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２９】
星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態が星状細胞腫である、請求項２８の方法。
【請求項３０】
ＣＤ８１が、経口的、非経口的、又は経皮的に投与される、請求項２８の方法。
【請求項３１】
被検者が星状細胞腫を有するかどうかを決定する方法であって、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることを含んでなり、被検者の星状細胞系統の細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は星状細胞腫の症状である、前記方法。
【請求項３２】
被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は ｉｎ ｖｉｖｏ でアッセイされる、請求項３１の方法。
【請求項３３】
星状細胞腫への治療を受けたか又は受けている被検者において星状細胞腫療法の効力を評価する方法であって、被検者の星状細胞性腫瘍細胞の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることを含んでなり、被検者の星状細胞性腫瘍細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は不成功の星状細胞腫療法を示唆するものである、前記方法。
【請求項３４】
被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は ｉｎ ｖｉｖｏ でアッセイされる、請求項３３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６０／２４６，８６８号、２０００年１１月８日提出の優先権を主張する。
背景技術
【０００２】
本年、そして予測可能な将来の毎年、米国では１７，０００の人々が脳腫瘍と診断されるだろう。この腫瘍の大多数は星状細胞系統のものであり、この悪性腫瘍と診断されたほとんどの人々はこの疾患で死亡する。脳腫瘍、又は脳内新生物はすべての通常的な剖検の約２％で見出される。それは早期若しくは中期の成人生活で最も一般的であるが、どの年齢でも起こる可能性がある。その頻度はまた、高齢者で増加しているようである（３１）。
【０００３】
脳腫瘍は、正常組織に浸潤してそれを破壊し、損なわれた感覚運動及び認知の機能、増加した脳内圧、脳浮腫、及び、脳組織、脳神経、及び脳血管の圧迫のような効果をもたらす（３１）。転移には、頭蓋やあらゆる脳内構造が関わる可能性がある。悪性腫瘍の大きさ、位置、増殖の速度、及び組織学上の度数（グレード）が脳腫瘍の重症度を決定する。非悪性腫瘍はゆっくり増殖し、ほとんど有糸分裂がなく、壊死も、血管増殖もない。悪性腫瘍はより速やかに増殖し、他の組織に浸潤する。しかしながら、それがめったに中枢神経系（ＣＮＳ）の先へ広がらないのは、それが局所の増殖により死を引き起こすからである。悪性の脳腫瘍を有する患者の２５％における初期症状は、眠気、嗜眠、鈍感、人格変化、無秩序な行動、及び損なわれた精神能力である（３１）。
【０００４】
脳腫瘍、又は脳内新生物は一般的であるが、それはしばしば誤診される（３１）。脳腫瘍は、部位（例えば、脳幹、小脳、大脳、脳神経、上衣、髄膜、神経膠、松果体領域、脳下垂体、及び頭蓋）又は組織学上のタイプ（例えば、髄膜腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、又は星状細胞腫）により分類される場合がある。一般的な原発性小児期腫瘍は、小脳の星状細胞腫及び髄芽細胞腫、上衣腫、脳幹の神経膠腫、及び先天性腫瘍である。成人では、原発性腫瘍には、髄膜腫、シュワン細胞腫、及び大脳半球の神経膠腫（特に、悪性の多形性膠芽腫及び未分化星状細胞腫、及びより良性の星状細胞腫及び寡突起膠腫）が含まれる。脳内新生物の全体的な発症率は、男性と女性でほとんど等しいが、小脳の髄芽細胞腫と多形性膠芽腫は、男性でより一般的である（３１）。
【０００５】
神経膠腫は、その発達段階のいずれかにある神経膠を代表する組織からなる腫瘍である（３１）。それは、脳内腫瘍の４５％を占める。神経膠腫は、星状細胞腫、上衣腫、及び神経細胞腫を含む、脳及び脊髄のあらゆる原発性内因性新生物を含み得る。星状細胞腫は、形質転換された星状細胞、又は星状細胞性腫瘍細胞からなる腫瘍である。そのような腫瘍は、増加する悪性度の順で分類されている：第Ｉ度は、原線維若しくは原形質の星状細胞からなり；第ＩＩ度は、豊富な細胞質と２又は３つの核を有する細胞からなる、星状膠芽腫であり；そして、第ＩＩＩ及びＩＶ度は、通常は大脳半球に閉じ込められていて、星状細胞、海綿芽細胞、星状芽細胞、及び、他の星状細胞性腫瘍細胞の混合物からなる、速やかに増殖する腫瘍である、多形性膠芽腫の形態である。原発性ＣＮＳ腫瘍である星状細胞腫は、しばしば、脳幹、小脳、及び大脳に見出される。未分化星状細胞腫と多形性膠芽腫は、通常、大脳中に存在する（３１）。
【０００６】
脳腫瘍の治療は、しばしば多モードであり、該腫瘍の病理及び所在に依存する（３１）。悪性の神経膠腫では、化学療法、放射線療法、及び外科療法を含む多モード療法を使用して、腫瘍塊を抑えようとする。しかしながら、アプローチにかかわらず、この腫瘍に罹患している患者の予後は警戒が必要である：化学療法、放射線療法、及び外科療法の後でのメジアン生存期間は約１年にすぎず、２年間生存する患者は２５％だけである。上記のことに照らし、悪性神経膠腫を診断、検出、及び治療するための新たな方法を開発することが希求されている（３１）。
【０００７】
星状細胞はまた、神経変性疾患から生じるＣＮＳ損傷及びニューロン細胞死を含む、ほとんどすべての神経外傷によりもたらされる病理に関連づけられてきた。例えば、ＣＮＳ損傷の場合、生じる星状細胞症は、生産的な神経再生に対する主要なバリアーとなると信じられている、グリア瘢痕の形成への主要な貢献因子であると考えられている（６）。故に、ＣＮＳ外傷と神経変性疾患の両方への治療薬の設計における第一目標は、グリア瘢痕形成を制限する機序の解明である。
【０００８】
頭部損傷は、５０歳以前のどの神経学的状態よりも多くの死亡及び障害を引き起こし、突発事故の７０％以上で起こり、３５歳未満の男性及び少年において第一位の死因である。重篤な損傷による死亡率は５０％に達し、治療してもごくわずかしか軽減されない。傷害は頭蓋骨貫通からか又は急速な脳の加速化若しくは減速化から生じる場合があり、周囲組織への損傷をもたらす。現在のところ、頭部外傷から生じる星状細胞症への治療法はない。
【０００９】
アルツハイマー病は、認知機能の進行性で無情な損失により特徴付けられる神経変性疾患である（３１）。アルツハイマー病の病態形成は、大脳皮質における、過剰数の神経炎性、又は老人性の斑（アミロイド核の周囲の神経突起、星状細胞、及び神経膠細胞から構成される）、及び神経原線維のもつれ（対のらせん状フィラメントから構成される）に関連づけられている。約４００万人のアメリカ人がアルツハイマー病に罹患し、約９００億ドルの年間コストである。この疾患は、男性より女性のほうが２倍ほど多く、高齢者の痴呆症の６５％より多くを占める。老人斑と神経原線維のもつれは正常の加齢に伴っても起こるが、それらは、アルツハイマー病の人々でずっとより頻繁である。今日までのところ、アルツハイマー病の治癒法はなく、認知低下は避けられない。
【００１０】
現在、星状細胞症に特定の治療法はない。さらに、星状細胞腫への標準的な化学療法、放射線療法、及び外科的治療は存在するが、これらの療法は重大な制限に満ちていて、しばしば、治癒的というより一時緩和的である。従って、星状細胞腫、星状細胞症、及び、星状細胞若しくは星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した他の状態を治療する方法を開発することへの大きなニーズがある。ニューロン−神経膠相互作用の基本生物学に関する理解は、そのような治療選択肢の解明への洞察を提供する可能性がある。
発明の要約
【００１１】
本発明は、ＣＤ８１が神経組織において星状細胞の増殖を変調させ、星状細胞性腫瘍細胞では発現されないという発見に基づく。この知見に基づいて、本発明は、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に星状細胞を接触させることによって星状細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に該被検者の星状細胞を接触させることによって、それにより該状態を治療することによって、治療する方法を提供する。また開示されるのは、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めるのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターに星状細胞を接触させることによって、それにより星状細胞の増殖を阻害することによって、星状細胞の増殖を阻害する方法である。
【００１３】
さらに本発明は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に星状細胞性腫瘍細胞を接触させることによって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。追加的には、本発明は、治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に該被検者の星状細胞性腫瘍細胞を接触させることによって、それにより該状態を治療することによって、治療する方法を開示する。さらに本発明は、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めるのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターに星状細胞性腫瘍細胞を接触させることによって、それにより星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に向けられる。
【００１４】
本発明はまた、治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を該被検者へ投与することによって、治療する方法を提供する。また開示されるのは、治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を該被検者へ投与することによって、治療する方法である。
【００１５】
さらに本発明は、治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めるのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターを該被検者へ投与することによって、それにより該被検者の星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療することによって、治療する方法を提供する。やはり提供されるのは、治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めるのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターを該被検者へ投与することによって、それにより該被検者の星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療することによって、治療する方法である。
【００１６】
追加的には、本発明は、ＣＤ８１と製剤的に許容される担体を含んでなるか、又はＣＤ８１をコード化する核酸と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物へ向けられる。
【００１７】
さらに本発明は、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることによって該被検者が星状細胞腫を有するかどうかを決定する方法を提供し、ここで該被検者の星状細胞系統の細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は星状細胞腫の症状を示す。
【００１８】
最後に、本発明は、星状細胞腫への治療を受けたか又は受けている被検者において星状細胞腫療法の効力を、該被検者の星状細胞性腫瘍細胞の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることによって評価する方法へ向けられ、ここで該被検者の星状細胞性腫瘍細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は不成功の星状細胞腫療法を示唆する。
【００１９】
本発明の追加の目的は、以下に続く記載から明らかとなろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
【００２１】
本発明は、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に星状細胞を接触させることによって星状細胞の増殖を阻害する方法を提供する。他に指定しなければ、「ＣＤ８１」には、ＣＤ８１タンパク質（ｐ２７）、ＣＤ８１類似体、及びＣＤ８１誘導体が含まれる。
【００２２】
本明細書に使用されるように、ＣＤ８１タンパク質は、図８に示されるアミノ酸配列を有する。本明細書に定義される「ＣＤ８１類似体」は、ＣＤ８１タンパク質の生物学的活性を有し、ＣＤ８１タンパク質と６０％以上（好ましくは、７０％以上）のアミノ酸配列相同性を有するＣＤ８１タンパク質の機能変異体、並びに、ＣＤ８１タンパク質の生物学的活性を有するＣＤ８１タンパク質のフラグメントである。本明細書にさらに使用されるように、用語「ＣＤ８１タンパク質の生物学的活性」は、本明細書に開示される、星状細胞及び星状細胞腫細胞の増殖を変調させて阻害するタンパク質の活性を意味する。追加的に、本明細書に使用されるように、「ＣＤ８１誘導体」は、直接的に、又は修飾、末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、又は部分置換のいずれかによりＣＤ８１から誘導される化学物質である。例えば、本発明において使用のＣＤ８１誘導体は、ＣＤ８１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であり得る。さらに、本発明のＣＤ８１誘導体は、ＣＤ８１の模擬体、並びに、Ｄ−アミノ酸が逆転又は反対の配向にある、これら模擬体のｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｏ−バージョンであり得る。
【００２３】
ＣＤ８１とその類似体及び誘導体は、合成的にか又は組換え的に産生することが可能であるか、又はネーティブ細胞から単離することが可能である；しかしながら、それらは、好ましくは、慣用技術とＣＤ８１をコード化するｃＤＮＡ（図７）を使用して、合成的に産生される。本発明の１つの態様において、星状細胞は未分化である、即ち、それらは細胞周期停止の状態にはなくて、複合突起を形成していない。
【００２４】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ で星状細胞の増殖を阻害するために使用可能である。本明細書に使用されるように、用語「星状細胞の増殖を阻害する」は、星状細胞の細胞分裂及び増殖を阻害することを意味し、本明細書に開示されるように、星状細胞の増殖速度を制限することが含まれる。星状細胞の成長及び増殖の阻害は、本明細書に開示される方法、分子レベルの方法、及びアッセイのいずれをも含む、既知の方法により検出可能である。
【００２５】
本発明の方法によれば、星状細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することか、又はＣＤ８１タンパク質の発現を可能にするやり方で、ＣＤ８１をコード化する核酸を星状細胞へ導入することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ でＣＤ８１を星状細胞に接触させることが可能である。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。星状細胞は、単独で、又は、例えばニューロン及び寡突起神経膠細胞を含む他のタイプの神経細胞とともに、被検者の神経系の神経組織と他の組織に含まれる場合がある。星状細胞は、被検者の組織において、既知の技術から容易に決定される標準検出法により検出可能であり、その例には、限定なしに、免疫学的技術（例えば、免疫組織化学染色）、蛍光造影技術、及び顕微鏡技術が含まれる。
【００２６】
ＣＤ８１タンパク質は、タンパク質の細胞膜への導入について使用される既知技術により（例えば、リポソームのようなマイクロ被包化調製物の手段により）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかで星状細胞の膜へ導入することが可能である。使用すべきＣＤ８１タンパク質の量は、上記に定義されるように、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量であって、当業者により容易に決定可能である。
【００２７】
リポソームデリバリーの方法によるＣＤ８１タンパク質の導入では、当技術分野で知られた様々な方法によりリポソーム小胞を調製することが可能であり、リポソーム組成物は、当業者に知られたリポソーム調製についての多種多様な慣用技術のいずれかを使用して調製可能である。そのような方法及び技術の例には、限定なしに、キレート透析、（凍結融解を伴うか又は伴わない）押出し成型、フレンチプレス、ホモジェナイゼーション、ミクロ乳化、逆相蒸発、単純凍結融解、溶媒透析、溶媒注入、溶媒気化、音波処理、及び自然形成が含まれる。リポソームの調製は、生理食塩水溶液、リン酸緩衝水溶液、又は滅菌水のような溶液において行うことが可能である。リポソーム調製物はまた、振り混ぜや撹拌を伴う様々な方法により調製してもよい。ＣＤ８１タンパク質は、その細胞内ドメインがリポソームの外側に伸び、その細胞外ドメインがリポソームの内部へ伸びるように、リポソームの諸層へ取り込ませることが可能である。次いで、リポソームの細胞膜への融合について知られた方法により、ＣＤ８１を含有するリポソームを星状細胞と融合させることが可能であり、そうすると、ＣＤ８１タンパク質の細胞内ドメインが星状細胞の内部へ伸び、その細胞外ドメインが星状細胞膜の外側へ伸びて、ＣＤ８１タンパク質が星状細胞の膜へデリバリーされる。
【００２８】
本発明の方法においては、ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にするやり方で、被検者の十分な数の星状細胞へ導入することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかでＣＤ８１を星状細胞に接触させることも可能である。核酸は、当技術分野で知られた慣用法を使用して導入することが可能であり、それには、限定なしに、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、モノ陽イオン性リポソーム融合、ポリ陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入、又はそれらの任意の組合せが含まれる。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林ウイルス、サイトメガロウイルス、及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノムから誘導されたベクターが含まれる。ＣＤ８１をコード化する核酸の使用すべき量は、上記に定義されるように、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１タンパク質を発現する量である。上記の量は、当業者により容易に決定可能である。
【００２９】
ＣＤ８１タンパク質の細胞中での発現を達成するために、慣用法を使用して、ＣＤ８１をコード化する核酸を ｉｎ ｖｉｔｒｏ で好適な細胞へ導入し得ることもまた、本発明の範囲内にある。次いで、ＣＤ８１タンパク質を発現する細胞を被検者へ導入し、星状細胞の増殖を ｉｎ ｖｉｖｏ で阻害することが可能である。このような ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療アプローチでは、この細胞が、好ましくは被検者から取り去られ、ＤＮＡ技術にかけられてＣＤ８１をコード化する核酸を取込んでから、被検者へ再導入される。
【００３０】
星状細胞増殖を変調させるＣＤ８１の能力は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのにＣＤ８１を特に有用にする。本明細書に使用されるように、「星状細胞増殖における欠陥」には、同じタイプの組織における正常な増殖と比較した場合の、特定組織における星状細胞の病理学的な増殖が含まれる。ＣＤ８１は、星状細胞増殖を変調させることによって、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の治療に有用になると考えられる。さらに、ＣＤ８１は、それ単独か、又はこれらの状態の治療に通常使用される、化学療法剤や抗ウイルス剤のような治療剤との組合せのいずれかで有効であろうと考えられる。
【００３１】
従って、本発明は、治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に該被検者の星状細胞を接触させることを含んでなり、それにより該状態を治療することによって治療する方法を提供する。上記に記載されるように、被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。
【００３２】
星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の例には、限定なしに、星状細胞症、グリア瘢痕、過形成、新形成、及び神経炎性斑（特に、アルツハイマー病患者によく見出されるもの）が含まれる。本明細書に使用されるように、「星状細胞症」は、近傍ニューロンの破壊による星状細胞の増殖を意味する。さらに本明細書に使用されるように、「過形成」は、正常な配置にある、正常な星状細胞の数がある組織内で異常に増殖若しくは増加することを意味する。本発明の１つの態様において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態は、星状細胞症である。本発明の他の態様において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態は、神経炎性斑である。
【００３３】
星状細胞症、グリア瘢痕、過形成、新形成、神経炎性斑、及び星状細胞増殖における欠陥に関連した他の状態は、多様な因子により引き起こされるか又はそれと関連づけられる場合があり、それには、限定なしに、神経変性疾患から生じるニューロン細胞死及び神経変性、ＣＮＳ外傷、及び非神経機能不全の後天性二次効果が含まれる。神経変性疾患の例には、限定なしに、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、ビンスワンガー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、及びピック病が含まれる。ＣＮＳ外傷の例には、限定なしに、鈍性（ｂｌｕｎｔ）外傷、低酸素症、及び侵襲性外傷が含まれる。非神経機能不全の後天性二次効果の例には、限定なしに、脳性麻痺、先天性水頭症、筋ジストロフィー、卒中、及び血管性痴呆症が含まれる。
【００３４】
星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の治療においては、上記に記載されるような、既知の方法（例えば、リポソームデリバリー）により、星状細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって、ＣＤ８１を星状細胞に接触させることが可能である。使用すべきＣＤ８１タンパク質の量は、上記に定義されるように、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量であって、当業者により容易に決定可能である。
【００３５】
他のやり方では、上記に記載の方法を含む、既知の方法により、ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１タンパク質の発現を可能にするやり方で星状細胞へ導入することによって、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するために、ＣＤ８１を星状細胞に接触させることが可能である。核酸は、当技術分野で知られた慣用法を使用して導入可能であり、それには、限定なしに、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、モノ陽イオン性リポソーム融合、ポリ陽イオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、ｉｎ ｖｉｖｏ 電場の創出、ＤＮＡコート化微小発射体射撃、組換え複製欠損ウイルス注射、相同的組換え、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸ＤＮＡ移入、又はそれらの任意の組合せが含まれる。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林ウイルス、サイトメガロウイルス、及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノムから誘導されるベクターが含まれる。ＣＤ８１をコード化する核酸の使用すべき量は、上記に定義されるように、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１タンパク質を発現する量である。上記の量は、当業者により容易に決定可能である。
【００３６】
本発明はまた、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に星状細胞性腫瘍細胞を接触させることによって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法へ向けられる。本明細書に使用されるように、用語「星状細胞性腫瘍細胞」は、星状細胞の腫瘍形成型（即ち、形質転換された星状細胞）を意味し、星状細胞腫細胞（即ち、あらゆる星状細胞腫の細胞であって、限定なしに、第Ｉ〜ＩＶ度の星状細胞腫、未分化星状細胞腫、星状芽細胞腫、原線維性星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、大円形星細胞性星状細胞腫、及び多形性膠芽腫を含む）が含まれる。上記に定義されるように、「ＣＤ８１」には、ＣＤ８１タンパク質（ｐ２７）、ＣＤ８１類似体、及びＣＤ８１誘導体が含まれる。
【００３７】
本発明の方法は、被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は ｉｎ ｖｉｖｏ で阻害するために使用可能である。本明細書に使用されるように、用語「星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する」は、星状細胞性腫瘍細胞の細胞分裂及び増殖を阻害することを意味し、星状細胞性腫瘍細胞の増殖速度を制限することが含まれる。星状細胞性腫瘍細胞の成長及び増殖の阻害は、本明細書に開示される方法、分子レベルの方法、及びアッセイのいずれをも含む、既知の方法により検出可能である。
【００３８】
本発明の方法によれば、星状細胞性腫瘍細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することか、又はＣＤ８１タンパク質の発現を可能にするやり方で、ＣＤ８１をコード化する核酸を星状細胞性腫瘍細胞へ導入することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ でＣＤ８１を星状細胞性腫瘍細胞に接触させることが可能である。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。星状細胞性腫瘍細胞は、被検者の神経系の神経組織と他の組織において、単独で、又は、例えばニューロン及び寡突起神経膠細胞を含む他のタイプの神経細胞とともに見出される場合がある。星状細胞性腫瘍細胞は、被検者の組織において、既知の技術から容易に決定される標準検出法により検出可能であり、それには、限定なしに、免疫学的技術（例えば、免疫組織化学染色）、蛍光造影技術、及び顕微鏡技術が含まれる。
【００３９】
ＣＤ８１タンパク質は、上記に記載されるように、タンパク質の導入について使用される既知技術（例えば、リポソームデリバリー）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかで、星状細胞性腫瘍細胞の膜へ導入することが可能である。リポソームデリバリーでは、上記に記載のものを含む多種多様な慣用技術を使用して、リポソーム小胞とリポソーム組成物を調製することが可能である。ＣＤ８１タンパク質は、その細胞内ドメインがリポソームの外側へ伸び、その細胞外ドメインがリポソームの内部へ伸びるように、リポソームの諸層へ取り込ませることが可能である。次いで、リポソームの細胞膜への融合について知られた方法により、ＣＤ８１タンパク質を星状細胞性腫瘍細胞の膜へデリバリーするように、ＣＤ８１を含有するリポソームを星状細胞性腫瘍細胞と融合させることが可能である。使用すべきＣＤ８１タンパク質の量は、上記に定義されるように、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量であって、当業者により容易に決定可能である。
本発明の方法においてはまた、ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１の発現を可能にするやり方で、被検者の十分な数の星状細胞性腫瘍細胞へ導入することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者の ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかで、ＣＤ８１を星状細胞性腫瘍細胞に接触させることも可能である。核酸は、当技術分野で知られた慣用法を使用して導入可能であり、それには、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、及び、上記の他の方法がすべて含まれる。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターには、上記のベクターがすべて含まれる。ＣＤ８１をコード化する核酸の使用すべき量は、上記に定義されるように、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１タンパク質を発現する量である。上記の量は、当業者により容易に決定可能である。
【００４０】
ＣＤ８１が星状細胞増殖を変調させ得ること、そして星状細胞性腫瘍細胞系にＣＤ８１が存在しないことは、ともに、星状細胞腫と星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した他の状態を治療するのにＣＤ８１が有用である可能性があることを示唆する。さらに、ＣＤ８１は、それ単独か、これらの状態の治療に通常使用される、化学療法剤や抗ウイルス剤のような治療剤との組合せのいずれかにおいて有効であろうと考えられる。
【００４１】
従って、本発明は、治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１に該被検者の星状細胞性腫瘍細胞を接触させることを含んでなり、それにより該状態を治療することによって治療する方法を提供する。上記に記載されるように、被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。
【００４２】
本明細書に使用されるように、用語「星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態」には、星状細胞腫細胞のような星状細胞性腫瘍細胞と他の新形成の形態の病理学的な増殖が含まれる。本明細書にさらに使用される用語「新形成」は、正常な星状細胞の増殖を誘発することも、その停止を引き起こすこともない条件下での星状細胞性腫瘍細胞の非制御性で進行性の増殖を意味する。新形成は、「新生物」の形成をもたらし、これは、本明細書において、新たな異常増殖、特に、細胞の増殖が非制御性で進行性である新たな組織の増殖を意味するように定義される。新生物には、良性腫瘍と悪性腫瘍（例えば、第Ｉ〜ＩＶ度の星状細胞腫のような星状細胞腫、未分化星状細胞腫、星状芽細胞腫、原線維性星状細胞腫、原形質性星状細胞腫、大円形星細胞性星状細胞腫、及び多形性膠芽腫、及び他の脳腫瘍）が含まれる。悪性新生物が良性から区別されるのは、前者がより大きい程度の未分化性か、又は細胞の分化及び配向性の欠失を示し、浸潤及び転移の特性を有する点である。このように、新形成には「癌」が含まれ、これは、本明細書において、正常な制御の欠失という独自の特質を有し、非調節性の増殖、分化の不足、局所組織浸潤、及び転移を生じる、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を意味する。本発明の１つの態様において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態は、星状細胞腫である。
【００４３】
星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態の治療においては、上記に記載されるような、既知の方法（例えば、リポソームデリバリー）により、星状細胞性腫瘍細胞の膜へＣＤ８１タンパク質を導入することによって、ＣＤ８１を星状細胞性腫瘍細胞に接触させることが可能である。使用すべきＣＤ８１タンパク質の量は、上記に定義されるように、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量であって、当業者により容易に決定可能である。
【００４４】
他のやり方では、上記に記載の方法を含む既知の方法により、星状細胞性腫瘍細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するために、ＣＤ８１をコード化する核酸を、ＣＤ８１タンパク質の発現を可能にするやり方で星状細胞性腫瘍細胞へ導入することによって、ＣＤ８１を星状細胞に接触させることが可能である。核酸は、当技術分野で知られた慣用法を使用して導入可能であり、それには、ｉｎ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療、及び、上記の他の方法がすべて含まれる。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターには、上記のベクターがすべて含まれる。ＣＤ８１をコード化する核酸の使用すべき量は、上記に定義されるように、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１タンパク質を発現する量である。上記の量は、当業者により容易に決定可能である。
【００４５】
さらに本発明は、星状細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターに星状細胞を接触させることを含んでなる、星状細胞の増殖を阻害する方法を提供する。モジュレーターは、ＣＤ８１発現を誘導するか又はアップレギュレートする、本明細書に定義されるような、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、（ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む）核酸、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬物、ニューロン、又は他の薬剤であってよい。モジュレーターの例には、限定なしに、ニューロン、ＦＫ５０６、及び他の神経イムノフィリンが含まれる。
【００４６】
追加のＣＤ８１のモジュレーターは、以下に記載の方法に基づいた単純スクリーニングアッセイを使用して同定可能である。例えば、ＣＤ８１の候補モジュレーターについてスクリーニングするために、星状細胞性腫瘍細胞をマイクロタイタープレート上でプレート培養してから、薬物のライブラリーに接触させることが可能である。生じるＣＤ８１の発現は、核酸ハイブリダイゼーション、及び／又は、ＥＬＩＳＡを含む、当技術分野で知られた免疫学的技術を使用して検出可能である。ＣＤ８１のモジュレーターは、ＣＤ８１の発現を誘導するか又はアップレギュレートする薬物であろう。このやり方では、星状細胞若しくは星状細胞性腫瘍細胞の細胞分裂若しくは増殖が速度において減少しているか、又は停止したことをＣＤ８１発現の指標として使用して、星状細胞若しくは星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する能力について薬剤をスクリーニングすることも可能である。
【００４７】
さらに本発明は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターに星状細胞性腫瘍細胞を接触させることを含んでなる、星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。そのようなＣＤ８１発現のモジュレーターの例には、上記に記載されるものがすべて含まれる。追加のＣＤ８１のモジュレーターは、上記に記載の方法によりスクリーニングすることが可能である。
【００４８】
本発明はまた、治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を該被検者へ投与することによって治療する方法を提供する。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。
【００４９】
上記の記載のように、星状細胞増殖の欠陥に関連した状態の例には、限定なしに、星状細胞症、グリア瘢痕、過形成、新形成、及び神経炎性斑（特に、アルツハイマー病患者によく見出されるもの）が含まれる。追加的に、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態は、多様な因子により引き起こされるか又はそれと関連づけられる場合があり、それには、限定なしに、神経変性疾患から生じるニューロン細胞死及び神経変性、ＣＮＳ外傷、及び非神経機能不全の後天性二次効果が含まれる。神経変性疾患、ＣＮＳ外傷、及び非神経機能不全の後天性二次効果の例には、上記に記載されるものがすべて含まれる。本発明の１つの態様において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態は、星状細胞症である。
【００５０】
本発明のＣＤ８１は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態への治療の必要な被検者へ、該被検者の星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効である量で投与される。本明細書に使用されるように、句「星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効な」は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の臨床上の障害若しくは症状を改善するか又は最小化するのに有効であることを意味する。例えば、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態が星状細胞症である場合、星状細胞症の臨床上の障害若しくは症状は、星状細胞症により産生される星状細胞の塊を抑制することによって、それにより、発生する可能性がある潜在的な軸索の閉塞を最小化することによって、改善されるか又は最小化される可能性がある。治療の必要な被検者において、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに有効なＣＤ８１の量は、各症例の特定要因に依存して変動するものであり、それには、星状細胞増殖における欠陥のタイプ、星状細胞増殖における欠陥のステージ、被検者の体重、被検者の状態の重症度、及び、投与の方法が含まれる。この量は、当業者により容易に決定可能である。
【００５１】
本発明の方法によれば、ＣＤ８１を、ヒト若しくは動物の被検者へ既知の方法により投与することが可能であり、それには、限定なしに、経口投与、非経口投与、経皮投与、及び浸透ミニポンプによる投与が含まれる。好ましくは、ＣＤ８１は非経口的に、頭蓋内、髄腔内、鞘内、又は皮下注射により投与される。本発明のＣＤ８１はまた、星状細胞とＣＤ８１との ｉｎ ｖｉｖｏ 接触をもたらすための上記方法のいずれかによって、被検者へ投与してよい。
【００５２】
経口投与では、ＣＤ８１の製剤を、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤として、又は懸濁液剤として提示してよい。この製剤は、乳糖、マンニトール、コーンスターチ、又はジャガイモデンプンのような、慣用の添加剤を有してよい。この製剤はまた、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチン類のような結合剤とともに提示してもよい。追加的に、この製剤は、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、又はカルボキシメチルセルロースのような崩壊剤とともに提示してよい。この製剤はまた、無水リン酸二塩基性カルシウム又はグリコール酸ナトリウムデンプンとともに提示してもよい。最後に、この製剤は、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤とともに提示してもよい。
【００５３】
非経口投与（即ち、消化管以外の経路を通る、注射による投与）では、被検者の血液と好ましくは等張である無菌の水溶液とＣＤ８１を組み合わせてよい。そのような製剤は、塩化ナトリウム、グリシン、等のような生理学的に適合可能な物質を含有し、生理学的条件に適合する緩衝化ｐＨを有する水に固形の有効成分を溶かし、水溶液を生成してから前記溶液を無菌にすることによって、調製可能である。この製剤は、密封アンプル若しくはバイアルのような、ユニット容器か又は多用量容器において提示してよい。この製剤は、筋膜上、被膜内、頭蓋内、皮内、鞘内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、髄腔内、胸骨内、血管内、静脈内、実質、又は皮下を限定せずに含む、あらゆる注射の形式によりデリバリーしてよい。
【００５４】
経皮投与では、皮膚のＣＤ８１への透過性を高め、ＣＤ８１が皮膚を貫通して血流へ浸透することを可能にする、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン、等のような皮膚浸透エンハンサーとＣＤ８１を組み合わせてよい。さらに、このＣＤ８１／エンハンサー組成物はまた、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、等のようなポリマー物質と組み合わせて、この組成物をゲルの形態で提供してもよく、これは、塩化メチレンのような溶媒に溶かし、所望される粘度まで蒸発させてから、支持材料へ塗布してパッチ剤を提供することが可能である。ＣＤ８１は、神経外傷が発生したか、又は星状細胞増殖における欠陥が局在化している被検者の部位で経皮的に投与することが可能である。他のやり方では、全身投与を達成するために、罹患領域以外の部位でＣＤ８１を経皮的に投与してもよい。
【００５５】
本発明のＣＤ８１はまた、浸透ミニポンプか又は他の時間放出器具から放出されるか又はデリバリーされる場合がある。基本浸透ミニポンプからの放出速度は、放出口（オリフィス）に配置した微孔性、即応性ゲルで変調させることが可能である。浸透ミニポンプは、ＣＤ８１の制御放出、又は標的指向デリバリーに有用であろう。
【００５６】
本発明はまた、治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに有効な量のＣＤ８１を該被検者へ投与することによって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療する方法を開示する。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。上記のように、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態の例には、限定なしに、星状細胞腫、脳腫瘍、及び他の新形成の形態が含まれる。本発明の１つの態様において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態は、星状細胞腫である。
【００５７】
本発明のＣＤ８１は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態の治療の必要な被検者へ、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を該被検者において治療するのに有効である量で投与される。本明細書に使用されるように、句「星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに有効な」は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態の臨床上の障害若しくは症状を改善するか又は最小化するのに有効であることを意味する。
【００５８】
例えば、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態が星状細胞腫である場合、星状細胞腫の臨床上の障害若しくは症状は、該被検者が蒙る疼痛若しくは不快を消失させることによって；該被検者の生存を、そのような治療の非存在下で予測されるものより延長させることによって；新生物の発達若しくは拡大を阻害するか又は防止することによって；又は、星状細胞性腫瘍細胞の星状細胞腫における成熟化及び増殖を限定する、中断させる、終結させる、又は他のやり方で制御することによって、改善されるか又は最小化される可能性がある。治療の必要な被検者において、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに有効なＣＤ８１の量は、各症例の特定要因に依存して変動するものであり、それには、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態のタイプ、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態のステージ、被検者の体重、被検者の状態の重症度、及び、投与の方法が含まれる。この量は、当業者により容易に決定可能である。
【００５９】
本発明の方法によれば、既知の方法によりヒト若しくは動物の被検者へＣＤ８１を投与することが可能であり、それには、限定なしに、経口投与、非経口投与、経皮投与、及び浸透ミニポンプによる投与が含まれる。好ましくは、ＣＤ８１は非経口的に、頭蓋内、髄腔内、鞘内、又は皮下注射により投与される。本発明のＣＤ８１はまた、星状細胞性腫瘍細胞とＣＤ８１との ｉｎ ｖｉｖｏ 接触をもたらすための上記方法のいずれかによって、被検者へ投与することが可能である。
【００６０】
経口投与では、ＣＤ８１の製剤を、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤として、懸濁液剤として、又は上記製剤のいずれかで提示することが可能である。非経口投与では、被検者の血液と好ましくは等張である無菌の水溶液とＣＤ８１を組み合わせてよい。そのような製剤は、上記の調製の方法に従って、調製可能である。非経口投与の製剤は、密封アンプル若しくはバイアルのような、ユニット容器か又は多用量容器において提示してよく、上記のあらゆる注射の形式によりデリバリーしてよい。
【００６１】
経皮投与では、上記のような皮膚浸透エンハンサーとＣＤ８１を組み合わせてよい。さらに、このＣＤ８１／エンハンサー組成物はまた、上記のいずれかのようなポリマー物質と組み合わせて、この組成物をゲルの形態で提供してもよい。ＣＤ８１は、星状細胞性腫瘍細胞増殖が発生した被検者の部位で経皮的に投与してもよい。他のやり方では、全身投与を達成するために、罹患領域以外の部位でＣＤ８１を投与してよい。最後に、本発明のＣＤ８１はまた、上記のように、浸透ミニポンプか又は他の時間放出器具から放出されるか又はデリバリーしてよい。
【００６２】
さらに本発明は、治療の必要な被検者において、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めて、上記に定義されるような、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を該被検者において治療するのに有効な量でＣＤ８１発現のモジュレーターを該被検者へ投与することによって、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療する方法を提供する。そのようなＣＤ８１発現のモジュレーターの例には、上記に記載されるものがすべて含まれる。追加のＣＤ８１のモジュレーターは、上記の方法に従ってスクリーニングすることが可能である。ＣＤ８１のモジュレーターは、上記製剤のいずれにおいても、そして上記のいかなる投与の形式でも投与することが可能である。
【００６３】
本発明はまた、治療の必要な被検者において、ＣＤ８１の発現を誘導するか又は高めて、上記に定義されるような、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を該被検者において治療するのに有効な量のＣＤ８１発現のモジュレーターを該被検者へ投与することによって、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療する方法を提供する。そのようなＣＤ８１発現のモジュレーターの例には、上記に記載されるものがすべて含まれる。追加のＣＤ８１のモジュレーターは、上記の方法に従ってスクリーニングすることが可能である。ＣＤ８１のモジュレーターは、上記製剤のいずれにおいても、そして上記のいかなる投与の形式でも被検者へ投与することが可能である。さらに、ＣＤ８１のモジュレーターはまた、リシン共役ＣＤ８１結合タンパク質のように、化学療法剤とともに投与することが可能である。
【００６４】
上記のことから、ＣＤ８１の投与は、星状細胞増殖における欠陥、又は星状細胞性腫瘍細胞の増殖のいずれかに関連した状態への有効な治療選択肢を提供すると予測される。本明細書に記載の療法は、現行の治療法式に通常伴う多大な副作用や副次効果を伴うことなく、星状細胞及び星状細胞腫の増殖を阻害するために真の治療選択肢を提供する。上記の状態へのリスクがある人口集団は大きく、そのニーズは現行では満たされていない。
【００６５】
さらに本発明は、ＣＤ８１と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供し、ここでＣＤ８１は、前記医薬組成物が投与される被検者において、上記に定義されるような、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに十分であるか又は有効である量で存在する。そのような医薬組成物は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の治療の必要な被検者へ、前記状態を治療するためにＣＤ８１を投与するのに有用であろう。ＣＤ８１は、上記に定義されるような星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を被検者において治療するのに有効である量で該被検者へ提供される。この量は、当業者により容易に決定可能である。医薬組成物は、上記に記載される投与方法のいずれかにより被検者へ投与してよい。
【００６６】
本発明の医薬組成物の製剤は、簡便には単位投与量で提示してよく、経口剤形（例えば、ＣＤ８１と製剤的に許容される担体を、アンプル剤、カプセル剤、丸剤、散剤、又は錠剤において組み合わせてよい）においてか、又は注射に適した形態において提示してよい。製剤的に許容される担体は、固体、液体、又はゲルであってよい。さらに、本発明の製剤的に許容される担体は、組成物の他の成分と適合可能であり、そのレシピエントへ有害ではないという意味において「許容され」なければならない。許容される製剤担体の例には、カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアゴム、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、ポリペプチド、粉末、生理食塩水、アルギン酸ナトリウム、デンプン、スクロース、タルク、及び水がとりわけ含まれる。選択される担体は、投与の経路と、ＣＤ８１が導入される形態に依存する。
【００６７】
本発明の製剤は、製剤技術分野においてよく知られた方法により調製可能である。例えば、ＣＤ８１は、乳剤、懸濁液剤、又は溶液剤として、担体若しくは希釈剤と一緒にしてよい。さらに、ＣＤ８１は、他の成分と必要に応じて混和してよいが、そのような混和は本発明の目的を損なうほどのものではない。そのような他の成分は、適切にも、使用の目的と製剤のタイプに従って選択することが可能である。所望により、１つ以上の付属成分（例えば、緩衝剤、着色剤、芳香剤、界面活性剤、等）も加えてよい。
【００６８】
本発明はまた、ＣＤ８１をコード化する核酸と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を開示し、ここで該核酸は、前記医薬組成物が投与される被検者において、上記に定義されるような、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を治療するのに十分であるか又は有効である量でＣＤ８１を発現する。そのような医薬組成物は、星状細胞増殖における欠陥に関連した状態の治療の必要な被検者へ、前記状態を治療するためにＣＤ８１を投与するのに有用であろう。核酸は、上記に定義されるような星状細胞増殖における欠陥に関連した状態を被検者において治療するのに有効である量のＣＤ８１タンパク質を発現するような量で該被検者へ提供される。これらの量は、当業者により容易に決定可能である。追加的に、医薬組成物は、核酸の投与及び導入の上記に記載の方法のいずれかにより被検者へ投与してよい。
【００６９】
本発明の医薬組成物の製剤は、簡便にも、単位投与量で提示してよく、核酸の投与に適した形態において（例えば、注射により）提示してよい。ＣＤ８１をコード化する核酸は、裸のＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及びベクターＤＮＡ（上記のようなウイルスベクターを含む）を限定なしに含む、核酸の導入について当技術分野でよく知られたいかなる形態でも提示してよく、遺伝子治療や分子遺伝学の技術分野でよく知られた方法に従って調製可能である。さらに、本発明の製剤的に許容される担体は、組成物の他の成分と適合可能であり、そのレシピエントへ有害ではないという意味において「許容され」なければならない。許容される製剤担体の例には、カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、グリセリン、アラビアゴム、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、ポリペプチド、粉末、生理食塩水、アルギン酸ナトリウム、デンプン、スクロース、タルク、及び水がとりわけ含まれる。選択される担体は、投与の経路と、ＣＤ８１をコード化する核酸が導入される形態に依存する。
【００７０】
本発明の医薬組成物の製剤は、製剤技術分野においてよく知られた方法により調製可能である。例えば、ＣＤ８１をコード化する核酸は、乳剤、懸濁液剤、又は溶液剤として、担体若しくは希釈剤と一緒にしてよい。さらに、ＣＤ８１をコード化する核酸は、他の成分と必要に応じて混和することが可能であるが、そのような混和は本発明の目的を損なうほどのものではない。そのような他の成分は、適切にも、使用の目的と製剤のタイプに従って選択することが可能である。所望により、１つ以上の付属成分（例えば、緩衝剤、着色剤、芳香剤、界面活性剤、等）も加えてよい。
【００７１】
さらに本発明は、ＣＤ８１と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供し、ここでＣＤ８１は、前記医薬組成物が投与される被検者において、上記に定義されるような、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに十分であるか又は有効である量で存在する。そのような医薬組成物は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態の治療の必要な被検者へ、前記状態を該被検者において治療するためにＣＤ８１を投与するのに有用であろう。ＣＤ８１は、上記に定義されるような星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を被検者において治療するのに有効である量で該被検者へ提供される。この量は、当業者により容易に決定可能である。医薬組成物は、上記に記載される投与方法のいずれかに従って、そしていずれかの製剤で被検者へ投与してよい。本発明の製剤は、上記のものを含む、製剤技術分野においてよく知られた方法により調製可能である。
【００７２】
本発明はまた、ＣＤ８１をコード化する核酸と製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を開示し、ここで該核酸は、前記医薬組成物が投与される被検者において、上記に定義されるような、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を治療するのに十分であるか又は有効である量でＣＤ８１を発現する。そのような医薬組成物は、星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態への治療の必要な被検者へ、前記状態を該被検者において治療するためにＣＤ８１を投与するのに有用であろう。核酸は、上記に定義されるような星状細胞性腫瘍細胞の増殖に関連した状態を被検者において治療するのに有効である量でＣＤ８１タンパク質を発現するような量で該被検者へ提供される。これらの量は、当業者により容易に決定可能である。追加的に、医薬組成物は、核酸の投与及び導入の上記に記載の方法のいずれかに従って、そして上記のいずれかの製剤で被検者へ投与してよい。本発明の医薬組成物の製剤は、上記のものを含む、製剤技術分野においてよく知られた方法により調製可能である。
【００７３】
さらに本発明は、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることを含んでなる、該被検者が星状細胞腫を有するかどうかを決定する方法を提供し、ここで該被検者の星状細胞系統の細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は、星状細胞腫の症状を示す。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。本明細書に使用されるように、「ＣＤ８１」には、ＣＤ８１タンパク質、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡが含まれる。
【００７４】
本明細書に使用されるように、「ＣＤ８１の発現の無検出」は、ＣＤ８１が被検者の星状細胞性腫瘍細胞において検出可能レベルで存在しないことを意味する。さらに本明細書に使用されるように、用語「星状細胞系統の細胞」には、上記に定義されるような、星状細胞と星状細胞性腫瘍細胞が含まれる。また、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることを含んでなる、被検者における星状細胞腫の診断を確定する方法を提供することも本発明の範囲内にあり、ここで該被検者の星状細胞系統の細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は、星状細胞腫の症状を示す。
【００７５】
本発明の方法によれば、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者において ｉｎ ｖｉｖｏ でＣＤ８１発現についてアッセイすることが可能である。本発明によれば、アッセイが ｉｎ ｖｉｔｒｏ で実施される場合、星状細胞系統の細胞、又は星状細胞系統の細胞を含有する組織の診断サンプルを、生検及び吸引を含む、標準法を使用して被検者から取り去ることが可能である。好ましくは、細胞若しくは組織の診断サンプルは、多方向細針吸引生検法（ＦＮＡＢ）を使用して取り去る。この除去の方法が好ましいのは、標準生検法よりも侵襲的でないからである。被検者から取る診断サンプルは、例えば、星状細胞腫を有することが知られている任意の組織、星状細胞腫を有することが疑われる任意の組織、又は星状細胞腫を有さないと考えられている任意の組織である場合がある。
【００７６】
必要な場合の組織からの抽出（例えば、タンパク質を可溶化する界面活性剤を用いる）に続く、カラムでのアフィニティー精製、クロマトグラフィー（例えば、ＦＴＬＣ及びＨＰＬＣ）、免疫沈殿法（ＣＤ８１への抗体を用いる）、及び沈殿法（イソプロパノールやトリゾールのような試薬を用いる）を限定なしに含む、当技術分野で知られた標準法を使用して、本発明の診断サンプルからタンパク質を単離して精製することが可能である。タンパク質の単離及び精製には（例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での）電気泳動が後続する場合がある。核酸は、当業者に知られた標準技術を使用して、診断サンプルから単離可能である。
【００７７】
本発明の方法によれば、被検者の星状細胞腫は、被検者の診断サンプルをＣＤ８１の発現についてアッセイすることによって診断することが可能である。一般に、ＣＤ８１は、健常で、無疾患性の被検者（即ち、星状細胞腫を有さない被検者）に由来する星状細胞系統の細胞において発現されるので、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルにおけるＣＤ８１発現の無検出は、星状細胞腫の症状を示す。本明細書に使用されるように、「発現」は、ＣＤ８１遺伝子の少なくとも１つのｍＲＮＡ転写物への転写か、又は少なくとも１つのｍＲＮＡの、上記に定義されるようなＣＤ８１タンパク質への翻訳を意味する。従って、診断サンプルは、（上記に定義されるような）ＣＤ８１タンパク質、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡについてアッセイすることによってＣＤ８１発現についてアッセイすることが可能である。適正なＣＤ８１の形態は、本明細書に論じる特別の技術に基づいて明らかになろう。
【００７８】
本発明の方法においては、免疫学的技術、ハイブリダイゼーション分析、蛍光造影技術、及び／又は放射線検出を限定なしに含む、当技術分野から容易に決定されるアッセイ及び検出方法を使用して、被検者の星状細胞系統の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることが可能であり、ＣＤ８１発現を診断サンプルにおいて検出することが可能である。例えば、ＦＮＡＢを使用して被検者から取り去った星状細胞若しくは細胞は、免疫細胞フルオロメトリー（ＦＡＣＳ分析）を使用して分析することが可能である。本発明のもう１つの態様では、星状細胞系統の細胞から抽出したＣＤ８１  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を使用して、診断サンプルをＣＤ８１の発現についてアッセイする。
【００７９】
本発明の方法によれば、ＣＤ８１と反応性の薬剤を使用して、被検者の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることが可能である。本明細書に使用されるように、「反応性」は、ＣＤ８１に対してアフィニティーを有する、それへ結合する、又はそれへ指向する薬剤を意味する。さらに本明細書に使用されるように、「薬剤」には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む）、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬物、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。さらに、ＣＤ８１と反応性の薬剤は、天然又は人工のいずれでもよい。この薬剤は、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、及びこれらの任意の組み合わせの形態であってよい。Ｆａｂフラグメントは、パパイン消化により産生される、一価の、抗体の抗原結合フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ペプシン消化により産生される、二価の、抗体の抗原結合フラグメントである。好ましくは、薬剤は、検出可能マーカーで標識した高アフィニティー抗体である。薬剤が抗体である場合、ＣＤ８１の発現の非存在は、ウェスタンブロッティングのような標準的な免疫学的検出技術とともに、ＣＤ８１と免疫反応性の１つ以上の抗体を使用する結合試験から検出することが可能である。
【００８０】
本明細書に使用されるように、本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってよく、当業者によく知られた技術により産生可能である。例えば、ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギ、又はラットを、精製ＣＤ８１で免疫化することによって産生可能である。次いで、モノクローナル抗体は、免疫化したマウスから脾臓を除去し、この脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成させ、これを培養にて増殖させ、モノクローナル抗体を産生させることによって、産生可能である。ＣＤ８１と反応するモノクローナル抗体はまた、ファーミンゲン（サンディエゴ、カリフォルニア州）（例、ｍＡｂ  ２Ｆ７）とベーリンガー（マンハイム、ドイツ）（例、ｍＡｂ  Ｅａｔ１及びＥａｔ２）から入手可能である。
【００８１】
本明細書に使用される抗体は、検出可能マーカーで標識することが可能である。抗体の標識化は、当技術分野で知られている多種多様な異なる化学発光及び放射活性標識の１つを使用して達成可能である。例えば、本発明の検出可能マーカーは、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アクリジン、コレステロール、又はカルボキシ−Ｘ−ローダミンのような、蛍光や当技術分野で容易に知られた他の造影技術を使用して検出可能である、非放射活性若しくは蛍光のマーカーであってよい。他のやり方では、検出可能マーカーは、例えば、放射性同位体を含む、放射活性マーカーである場合がある。放射性同位体は、検出可能な放射線を放射する、３５Ｓ、３２Ｐ、又は３Ｈのような任意の同位体であってよい。放射性同位体により発射される放射活性は、当技術分野でよく知られた技術により検出可能である。例えば、放射性同位体からのガンマ放射は、ガンマ造影技術、特にシンチグラフィック造影を使用して検出可能である。好ましくは、本発明の薬剤は、検出可能マーカーで標識した高アフィニティー抗体である。本発明の抗体はまた、適正な標識システム、緩衝剤、及び、多様な検出及び診断応用への使用に必要な他の試薬を包含するキットへ取り込ませてもよい。
【００８２】
本発明の薬剤がＣＤ８１と反応性の抗体である場合、被検者からとった診断サンプルを、ビーズ、ゲル、又はプレートの形態の不溶性有機高分子のような固形支持体へ付けたリガンドとしてＣＤ８１抗体を含有するアフィニティーカラムへの通過により、精製することが可能である。固形支持体へ付ける抗体は、カラムの形態で使用可能である。好適な固形支持体の例には、限定なしに、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セファロース、又は他の不溶性有機高分子が含まれる。さらにＣＤ８１抗体は、所望されるならば、スペーサー分子を介して固形支持体へ付けてもよい。適正な結合条件（例えば、温度、ｐＨ、及び塩濃度）は、当業者により容易に決定可能である。好ましい態様では、ＣＤ８１抗体が、セファロース４Ｂのようなセファロースカラムへ付けられる。
【００８３】
薬剤が抗体である場合、被検者の診断サンプルは、標準的な免疫学的検出技術とともにＣＤ８１と免疫反応性の１つ以上の抗体を利用する結合試験を使用して、ＣＤ８１発現についてアッセイすることが可能である。例えば、アフィニティーカラムから溶出されるＣＤ８１タンパク質を、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、又は、抗原−抗体相互作用を利用する他の免疫染色法へかけることが可能である。好ましくは、診断サンプルは、ウェスタンブロッティングを使用してＣＤ８１発現についてアッセイされる。
【００８４】
他のやり方では、被検者の星状細胞系統の細胞の診断サンプルを、被検者から取った星状細胞系統の細胞、又は星状細胞系統の細胞を含有する組織のサンプルから抽出した核酸のハイブリダイゼーション分析を使用して、ＣＤ８１発現についてアッセイしてもよい。本発明のこの方法によれば、ハイブリダイゼーション分析は、ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を使用して実行可能である。この方法はまた、ＣＤ８１をコード化する核酸へハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブを使用する、ＤＮＡのサザンブロット分析を実施することによっても実行可能である。核酸プローブは、当業者に知られた多様な技術により調製可能であり、それには、限定なしに以下が含まれる：ＣＤ８１核酸の制限酵素消化；及び、アプライド・バイオシステムズ  モデル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のような市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用する、ＣＤ８１核酸のヌクレオチド配列の選択部分に対応する配列を有するオリゴヌクレオチドの自動合成。
【００８５】
本発明に使用される核酸プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、約８つのヌクレオチドからＣＤ８１核酸の全長までの長さにおいて変動してよい。プローブに使用されるＣＤ８１核酸は、哺乳動物のＣＤ８１から誘導可能である。ラット、マウス、及びヒトのＣＤ８１の核酸配列が知られている（１９）。これらの配列をプローブとして使用して、当業者は、他の種から、対応するＣＤ８１ｃＤＮＡを容易にクローン化することが可能である。さらに、本発明の核酸プローブは、１つ以上の検出可能マーカーで標識可能である。核酸プローブの標識化は、多種多様な標識（例えば、３５Ｓ、３２Ｐ、又は３Ｈのような放射活性標識、又は、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アクリジン、コレステロール、又はカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）のような非放射活性標識）の１つとともに、当技術分野で知られたいくつかの方法（例えば、ニックトランスレーション、末端標識化、埋込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）末端標識化、ポリヌクレオチドキナーゼ交換反応、ランダム・プライミング、又はＳＰ６ポリメラーゼのリボプローブ調製）の１つを使用して、達成可能である。ＣＤ８１核酸の異なるか又は重複する領域に対応する、２つ以上の核酸プローブ（又はプライマー）の組み合わせも、例えば、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＣＤ８１の発現を検出するために使用可能であり、多様な検出及び診断応用における使用へのキットに含めてもよい。
【００８６】
本発明の診断サンプルは、ＣＤ８１発現について、被検者や彼／彼女の主治医によるのではなく、試験ラボの技術者や他の臨床研究者により頻繁にアッセイされると考えられる。従って、さらに本発明は、被検者の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることによって得られる諸結果の報告を被検者の主治医へ提供することを含む。
【００８７】
本発明はまた、被検者又は患者において星状細胞腫を治療する方法を提供する。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。本発明の方法は：（ａ）被検者若しくは患者において、該被検者若しくは患者の星状細胞系統の細胞においてＣＤ８１の発現の非存在を検出することによって星状細胞腫を診断する工程；及び（ｂ）該被検者若しくは患者において診断された星状細胞腫を治療する工程を含む。被検者若しくは患者の星状細胞系統の細胞におけるＣＤ８１の発現の非存在は、上記の方法のいずれかにより検出可能である。被検者若しくは患者において診断された星状細胞腫は、外科療法、放射線療法、化学療法、免疫療法、及び全身療法を限定なしに含む、星状細胞腫を治療するために一般に使用される任意の方法又は方法の組み合わせにより治療可能である。しかしながら、好ましくは、本明細書に記載の方法に従って診断される星状細胞腫は、上記のように、被検者若しくは患者へＣＤ８１を投与することによって治療される。
【００８８】
ＣＤ８１発現の検出レベルを臨床若しくは病理学上の段階分けツールとして使用し、どの治療選択肢が適正である可能性があるかを決定することも、本発明の範囲内にある。特に、ＣＤ８１発現の検出は、本発明の治療方法のいずれが適正であるかを決定するために使用可能である。さらに、ＣＤ８１発現の検出レベルは、脳腫瘍、特に星状細胞腫を等級つけるために使用可能である。
【００８９】
さらに本発明は、星状細胞腫への治療を受けたか又は受けている被検者において星状細胞腫療法の効力を評価する方法を提供する。被検者はいずれの動物でもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、家畜動物、及び商業用動物）である。より好ましくは、被検者はヒトである。本発明の方法は、被検者の星状細胞性腫瘍細胞の診断サンプルをＣＤ８１発現についてアッセイすることを含み、ここで被検者の星状細胞性腫瘍細胞におけるＣＤ８１の発現の無検出は、不成功の星状細胞腫療法を示唆する。診断サンプルは、上記に記載されるもののいずれでもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は被検者中の ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかでＣＤ８１の発現についてアッセイすることが可能である。さらに、診断サンプルは、上記の様々なアッセイと検出の方法のすべてを使用して、ＣＤ８１の発現についてアッセイすることが可能である。本発明のこの方法は、被検者の星状細胞性腫瘍細胞におけるＣＤ８１発現のレベルの定期的な評価を可能にすることによって、星状細胞腫療法の有効性をモニターする手段を提供する。
【００９０】
本発明の方法によれば、星状細胞腫を治療する療法の開始後のいかなる時点でも、被検者の星状細胞性腫瘍細胞の診断サンプルをアッセイし、ＣＤ８１発現のレベルを評価することが可能である。例えば、ＣＤ８１発現のレベルは、被検者若しくは患者がまだ星状細胞腫の治療を受けている間に評価することが可能である。ＣＤ８１の発現が被検者の星状細胞性腫瘍細胞に存在しないままである場合、医師は、星状細胞腫治療を継続することを選択してもよい。ＣＤ８１発現のレベルが被検者の星状細胞において検出可能になり、継続的な評価を通して増加する場合、それは、星状細胞腫治療が奏効していて、治療用量を減少させるか又はなくすことさえ可能であることの示唆であるかもしれない。ＣＤ８１のレベルが継続的な評価を通して顕著には増加しない場合、それは、星状細胞腫治療が奏効していなくて、治療用量を増加させることが可能であることの示唆であるかもしれない。ＣＤ８１発現が、最終的に、被検者若しくは患者の星状細胞性腫瘍細胞において、正常の無疾患性星状細胞について「期待されるレベルで検出される場合、医師は、星状細胞腫治療が成功し、その治療を止めることが可能であると結論づけてもよい。被検者若しくは患者の星状細胞腫治療の完了後に、該被検者若しくは患者で星状細胞腫が再発したかどうかを決定するために、ＣＤ８１発現のレベルを評価することも本発明の範囲内にある。さらに、ＣＤ８１発現の評価レベルを臨床若しくは病理学上の段階分けツールとして使用し、被検者若しくは患者における星状細胞腫の程度を決定し、適正な治療選択肢を決定し、予後の情報を提供することも、本発明の範囲内にある。
【００９１】
本発明を以下の「実験の詳細」節に記載するが、これは本発明の理解を助けるために説明されるものであり、後続する特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【実施例】
実験の詳細
【００９２】
１．序論
哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）において構成細胞の適正な数及びタイプを確立して維持することは、気力をくじく問題である。正確な数の細胞が正確な位置におさまるだけでなく、外傷又は疾患の非存在下では、細胞の全数が一生を通じてほとんど一定に保たれる。分裂することができないほとんどのニューロンの場合、このことは、継続的な支援を提供する機序が存在することを示唆する。しかしながら、星状細胞では、状況はより複雑である。なぜなら、これらの細胞は、その生活史のほとんどどの時点でも細胞周期に再び入ることが可能であり、外傷や疾患へ応答してそうするからである（１５）。この増殖能力にもかかわらず、星状細胞の数は一生を通してほとんど無変化のままである（２３，２４，２５）。星状細胞は、ニューロン表面と直接接触している間に細胞周期から離脱して維持され得ることが証明された（１１，１２，２９）。この有糸分裂静止がいかに確立されて維持されるのかを決定することが重要であるのは、成体の哺乳動物では、星状細胞増殖から生じる陽性と陰性の両方の重要な後遺症が存在するからである。
【００９３】
ＣＮＳ損傷の場合、生じる星状細胞症は、軸索の再生を阻止することに重要な役割を担う可能性がある、グリア瘢痕の形成の主要な貢献因子であると考えられている（６）。損傷した組織の単離は、血液脳関門を再確立させるのに重要な側面となる可能性があるが、この挙動は、そのような単離領域を、再生に利用可能な神経組織から永久に取り去ることを示唆する。さらに、星状細胞はごく低いレベルであっても一生を通じて増殖するので（７）、それは、ＤＮＡ複製でのエラーやウイルスの組込みの危険を受けやすい。このことは、これらの細胞を、哺乳動物の一生にわたり形質転換の影響を受けやすくしている。実際、脳腫瘍と診断された人々では、腫瘍の大部分が星状細胞系統である。先のことに照らせば、ニューロン−神経膠相互作用の基本生物学を理解することに、星状細胞増殖制御がはじめに達成されて一生を通じて維持される手段への洞察を提供する可能性があることは明らかである。そのような知識は、形質転換細胞において秩序だった増殖を再確立させる方法へのさらなる洞察をもたらす可能性がある。
【００９４】
ニューロン−星状細胞相互作用の細胞生物学は十分に記載されてきたが、この細胞生物学の分子相関物はほとんど探究が不十分である。この相互作用の本質を明確化することを始めるために、発明者は、一連のディファレンシャル遺伝子スクリーニングを実行し、精製した星状細胞培養物における発現パターンを、ニューロンと共存培養した星状細胞のそれと比較した。星状細胞ＲＮＡが「エフェクター」ニューロン由来のＲＮＡで汚染される問題を避けるために、発明者は、ニューロン細胞膜には星状細胞を静止させる能力があるというその初期の観察結果を利用した（２９）。
【００９５】
その観察結果から、発明者は、その発現がニューロン刺激星状細胞により調節されないいくつかの遺伝子を同定した。このアッセイ系で同定した遺伝子の大部分は既知のものであり、非神経組織において、文献にある発現パターンを有した。このスクリーニングでの遺伝子のいくつかは神経系で発現されることが知られていたが、その生物学的意義についてはほとんど知られていなかった。この後者のクラスの中にテトラスパニン、ＣＤ８１があったが、その発現は星状細胞において示されていて、神経外傷の後でアップレギュレートされることが知られていた（８）。しかしながら、外傷やホメオスタシスにおけるＣＤ８１の機能はこれまで明確になっていなかった。
【００９６】
抗体混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）、生化学競合、及び遺伝子ノックアウト試験の組み合わせを使用して、発明者は、ＣＤ８１が星状細胞増殖制御の必須モジュレーターであることを示した．この観察結果は、星状細胞症が数多くの神経外傷から生じ、それから生じるグリア瘢痕が生産的な神経再生への主要な障壁を提示すると考えられているので、きわめて重要である。さらに、星状細胞腫は、毎年約１７，０００症例の罹患数がある脳腫瘍で最も多い単一形態である。本発明で試験した星状細胞腫細胞はすべてＣＤ８１のメッセージ若しくはタンパク質を発現せず、ＣＤ８１が星状細胞腫瘍の形成及び／又は転移に重要な役割を担うという可能性を提起した。
２．材料と方法
Ａ．動物
妊娠したスプリーグ−ドーリーラット及びＣ５７ＢＬ／６マウスをチャールズ・リバーズ・ラボラトリーズから入手した。ＣＤ８１異種接合マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ１０世代より多く戻し交配した。これらマウスの産生についてはすでに記載されている（１７）。異種接合動物を交配すると、予測されるメンデル頻度で子孫が生まれた。しかしながら、ＣＤ８１−／−動物では弱まった生後生存能力が観察された。上記交配の子孫の遺伝子型を記載のように正確に決定した（１７）。注目すべきことに、より初期の戻し交配では、異種接合ヌル動物において正常なメンデル分布と正常な生存があった。
Ｂ．組織培養−一次神経細胞
【００９７】
一次小脳ニューロン及び星状細胞を記載（１８）のように調製した。簡潔に言えば、生後４又は５日目に、ラット若しくはマウスの子どもから小脳を切除し、髄膜を剥離し、残存組織をＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーＰＢＳ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）において洗浄した。次いで、すべて記載（１８）のように、この組織をトリプシン処理し、ＤＮアーゼの存在下、減少口径の針に通して摩砕し、ペレット状にした。この細胞をＣＭＦ−ＰＢＳに再懸濁させ、この単一細胞懸濁液を、Ｐｅｒｃｏｌｌステップ勾配（３０／６０％；アマーシャム・ファルマシア）に載せて分離させた。しっかり洗浄して、残存するＰｅｒｃｏｌｌを除去した後で、このニューロン濃縮分画と星状細胞濃縮分画をさらに濃縮した：差別吸着により、混在する星状細胞をニューロン調製物から除去し、抗Ｔｈｙ１及び補体仲介性細胞溶解を用いた処理により、ニューロン及び線維芽球を星状細胞濃縮分画から除去した。１０％加熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；ジェミニ−バイオ−プロダクツ社）を補充したＤＭＥＭ（ギブコ）、１０％加熱不活性化ウマ血清（ジェミニ−バイオ−プロダクツ社）１％非必須アミノ酸（ギブコ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ；２０Ｕ／ｍｌ）、フンジゾン（ギブコ；０．２５μｇ／ｍｌ）、及びグルコース（最終濃度０．６％）からなるＤ１０においてすべての細胞を培養した。この星状細胞懸濁液を、ポリ−Ｌ−リジン（シグマ）５０μｇ／ｍｌで処理した、２４穴プレート（コスター）において２ｘ１０５細胞／ウェルか、又は８穴Ｌａｂ−Ｔｅｋ組織培養チャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）において５ｘ１０４細胞／ウェルで播いた。星状細胞１につき２のニューロンの比率でエフェクターニューロンを加えた。
Ｃ．星状細胞腫の細胞系
【００９８】
いくつかの大膠細胞系（ラットＣ６及び９Ｌ、ヒトＡ１７２及びＵ２５１ＭＧ、及び、マウスＬＮ３０８及びＬＮ１８）を、１００ミリ組織培養ディッシュ（ファルコン・ラブウェア）中、Ｄ１０において増殖させた。
Ｄ．抗体
【００９９】
ウサギ抗ウシグリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体、並びにＴＲＩＴＣ共役ブタ抗ウサギ抗体を、ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ（コペンハーゲン、デンマーク）から入手した。ＦＩＴＣへ共役した、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）へのマウスモノクローナル抗体をベーリンガー（マンハイム、ドイツ）から入手した。ＣＤ８１（１）へのハムスターｍＡｂ  ２Ｆ７とＦＩＴＣ共役マウス抗ハムスターｍＡｂをファーミンゲン（サンディエゴ、カリフォルニア州）から入手した。ハムスターｍＡｂのＥａｔ１及びＥａｔ２は、ＣＤ８１中の独自エピトープと反応し、最近記載されている（１８）。ＴｕＪ１は、チューブリンのニューロン特異的βＩＩＩサブユニットを認識し、Ｔｏｎｙ  Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ博士の寛大な提供物であった。Ａｌｅｘｉａレッド共役ヤギ抗マウス二次抗体はモレキュラー・プローブから購入し、マウスｍＡｂ抗ＧＳＴはシグマから購入した。ビオチニル化ヤギ抗マウス抗体とＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキットは、ベクター・ラブズから購入した。
Ｆ．融合タンパク質
【０１００】
完全長ＳＣＩＰと大細胞外ループ（ＬＥＬ）をコード化するマウスＣＤ８１の領域をいずれもｐＧＥＸ発現ベクター（５）へクローン化し、ＧＳＴ融合タンパク質を産生した。クローンを配列決定し、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉをそれぞれのクローンで形質転換させ、ＩＰＴＧで誘導した。生じた溶解物をグルタチオン−アガロースビーズで濃縮し、このタンパク質濃縮物をＢＣＡアッセイ（ピアス）により評価した。この材料の完全性を、いずれも標準技術による、ゲル電気泳動と抗原特異抗体及び／又は抗ＧＳＴ抗体を用いたイムノブロッティングにより決定した。
Ｆ．ノーザンブロット分析
【０１０１】
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ と Ｓａｃｃｈｉ（２）に記載されるように、全ＲＮＡを培養細胞から抽出した。各サンプル由来の２０μｇのＲＮＡを、変性アガロースゲル上で電気泳動的に分離させ、ナイロン膜（ミクロン・セパレーションズ社）へ移した。この膜を、無作為プライム化、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識マウスＣＤ８１  ｃＤＮＡを用いて４２℃で一晩探査（プローブ）し、連続的に洗浄し（２ｘＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で１５分を３回；０．２ｘＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で１０分を２回；及び、２ｘＳＳＣ中、室温で５分を１回）、乾燥させ、Ｘ線フィルムに曝した。
Ｇ．イムノブロッティング
【０１０２】
培養した小脳星状細胞とニューロンＣ６大膠細胞腫と共存培養した星状細胞を氷冷ＰＢＳにおいて２回洗浄し、ディッシュからかき取り、ペレット状にし、低張破壊緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、ロイペプシン  ０．５ｍｇ／ｍｌ，ペプスタチンＡ  ０．７ｍｇ／ｍｌ，及びアプロチニン  １ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させた。このサンプルを氷上で１５分インキュベートし、その後でＮＰ−４０を加えて１％の最終濃度とした。界面活性剤の可溶性部分と不溶性部分を遠心分離により分離した。膜を含有する界面活性剤可溶性分画についてＢＣＡアッセイ（ピアス）を使用してタンパク濃度を定量した。１０％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで５０ｍｇのタンパク質を分離してから、このタンパク質を、半乾燥ブロッターを使用してニトロセルロース上に移した。アミドブラック染色により移動の効率を定量した。この膜を、トリス緩衝化生理食塩水に５％ミルク及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する緩衝液Ａにおいて遮断した。次いで、この膜を、ヤギ抗ＣＤ８１抗血清に次いで、ペルオキシダーゼ共役ロバ抗ヤギ二次抗体でプローブした。反応生成物をＥＣＬにより可視化した。
Ｈ．免疫蛍光
【０１０３】
プレート培養から４８時間後、細胞培養物をＰＢＳ中で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳにおいて４℃で３０分固定した。１０％  ＦＢＳ／ＰＢＳ中の３０分、室温でのインキュベーションにより、非特異結合を遮断した。遮断溶液を除去し、一次抗体（ＰＢＳで希釈した、２Ｆ７、Ｅａｔ１、又はＥａｔ２）を３７℃で１時間加えた。この培養物を濯ぎ、マウスＦＩＴＣ共役抗ハムスター抗体において室温で３０分インキュベートし、洗浄し、マウントした（Ｐｒｏ  Ｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅキット、モレキュラー・プローブ）。同じタイプの培養物もＦＩＴＣ共役抗ＢｒｄＵ抗体（シグマ）を用いてＧＦＡＰ及びＢｒｄＵ取込みについて二重標識した（以下参照）。この培養物をＰＢＳで洗浄し、４％／パラホルムアミド／ＰＢＳにおいて４℃で３０分固定し、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳに透過させた。１０％  ＦＢＳ／ＰＢＳ中、室温で３０分のインキュベーションにより非特異結合を遮断し、ＴＲＩＴＣ共役二次抗体を用いてＧＦＡＰを可視化した。
Ｉ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 増殖アッセイ
【０１０４】
対照条件か、又は融合タンパク質、又は増加濃度の本明細書に記載のｍＡｂの１つの存在下で、培養を確立した。２４時間後、１０μＭ  ＢｒｄＵ（シグマ）を加え、この培養をさらに２４時間続けた。引き続き、細胞を固定し、本明細書に記載のように、ＧＦＡＰ染色により星状細胞を同定した。ＢｒｄＵ取込みを可視化するために、クロマチンを２Ｍ  ＨＣｌ、３０分で変性させ、ＰＢＳにおいてしっかり洗浄し、ＦＩＴＣ−抗ＢｒｄＵ抗体と室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後で、細胞をしっかり洗浄し、ビス−ベンズアミド（シグマ）で染色して全細胞数を定量し、再び洗浄し、Ａｎｔｉ−Ｆａｄｅにマウントした。一定の顕微鏡領域でのＢｒｄＵ陽性星状細胞の数をＧＦＡＰ陽性細胞の全数で割ることによって、星状細胞増殖のレベルを定量した。増殖アッセイはいずれも少なくとも３回繰り返した；それぞれの実験サンプル（６００〜７００細胞／サンプル、各実験点につき全部で少なくとも約２０００の細胞）から、３０の顕微鏡領域を検査した。データの統計分析は、スチュ−デントの両側ｔ−検定を使用して行った。
３．結果
Ａ．ＣＤ８１は星状細胞の細胞表面で発現される
【０１０５】
本発明者は、ディファレンシャルスクリーニングのアプローチを使用することによって、ニューロン膜と共存培養した星状細胞においてＣＤ８１発現を同定した。ＣＤ８１タンパク質が本当に星状細胞により発現されるかを決定するために、発明者は、すでに記載のように（２８）、星状細胞又は星状細胞腫細胞系、Ｃ６の培養を確立した。４８時間培養物からタンパク質を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＣＤ８１に対するポリクローナル抗体でブロットした。ＣＤ８１が培養星状細胞により構成的に発現されるのに対し、Ｃ６神経膠腫細胞はＣＤ８１陰性である（図１Ａ）。これらの培養物へニューロンを加えると、星状細胞においてはＣＤ８１発現が５０〜７０％増加したが、Ｃ６細胞には効果を及ぼさなかった（一部データ示さず）。星状細胞上でのＣＤ８１発現を定位するために、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、２Ｆ７（１）を使用して、ラット星状細胞培養物単独と、星状細胞及びニューロンの共存培養物を染色した。図１Ｂは、星状細胞の表面上でのＣＤ８１の斑点状の染色パターンを示す。ニューロンと共存培養させると、星状細胞は、ニューロン移動の指示経路として役立つ複合突起と、ニューロンの吸着及び分化のマトリックスを伸ばす（１１，２９）。ニューロン−星状細胞共存培養物の染色は、星状細胞本体の表面とこの突起に沿ったＣＤ８１発現の斑点状パターンを示した（図１Ｃ、矢印）。対照的に、上記培養物中のニューロンは、２Ｆ７抗体では染色しなかった。
Ｂ．抗ＣＤ８１  ｍＡｂは、独自の非重複、細胞外エピトープを認識する。
【０１０６】
ＣＤ８１は４つの膜貫通ドメインを有し、細胞外ドメインに２つのループを生じる。一方は小細胞外ループ（ＳＥＬ）であり、他方は大細胞外ループ（ＬＥＬ）である。生きた、非透過性星状細胞上で２Ｆ７抗体を使用すると、結果は、それが細胞外エピトープを認識することを示した（図１Ａ及び１Ｂ）。最近の研究は、２Ｆ７  ｍＡｂが、ＣＤ８１のＳＥＬとＬＥＬの両方の存在を必要とするコンホメーション依存性エピトープを認識することを示した。Ｅａｔ２は２Ｆ７よりも高いＣＤ８１へのアフィニティーを示すが、それも、抗原結合のために両方のループを必要とする。対照的に、Ｅａｔ１はＬＥＬ内のエピトープを認識する（１８）。これらｍＡｂのいずれもがニューロン−星状細胞相互作用を遮断することが可能であるかを決定するための努力において、発明者は、これら試薬の存在下で共存培養を確立した。
Ｃ．ニューロン−星状細胞相互作用は ｉｎ ｖｉｔｒｏ においてｍＡｂ  Ｅａｔ１により遮断される
【０１０７】
ニューロン誘導性の星状細胞の分化及び細胞周期退出を遮断することにおけるＥａｔ１及びＥａｔ２の潜在効力を決定するために、発明者は、小脳顆粒細胞と星状細胞の共存培養を確立した。この培養物を４８時間増殖させ、培養の後半２４時間にＢｒｄＵを加えた。図２Ａに見られるように、Ｅａｔ１抗体の濃度に依存する、ニューロン誘導性星状細胞増殖停止の欠失がある。注目すべきことに、この培養物中のニューロンは生存能力があり、星状細胞へ吸着して、神経突起を伸ばした（以下参照）。これまでの研究は、小脳顆粒細胞が生存のために星状細胞と星状細胞誘導因子に鋭敏に依存することを示している。Ｅａｔ１  ｍＡｂがニューロン依存性の星状細胞増殖停止を遮断するが、栄養的な支援は遮断しないという発明者の観察結果は、正常なニューロン−星状細胞相互作用が上記の条件下では必ずしも失われないことを示唆する。
【０１０８】
Ｅａｔ２は、ニューロン−星状細胞相互作用に明瞭な効果を及ぼさなかった：Ｅａｔ２の存在下で確立したニューロン−星状細胞共存培養物は、対照の共存培養物と区別し得なかった。対照とＥａｔ２の両方の条件下で、星状細胞は、ニューロンでチャレンジすると、細胞周期から逸脱し、複合突起を伸ばした（図２Ｄ及び２Ｅ）。対照的に、ｍＡｂ  ２Ｆ７の追加は、ニューロン誘導性星状細胞増殖停止を亢進させ、この抗体の共存培養系への追加によりニューロン依存性星状細胞増殖停止が強まることを示唆した。Ｅａｔ１のデータとともにすると、上記の観察結果は、ＣＤ８１のバイオアベイラビリティ及び／又はコンホメーションにおける改変がニューロンに対する星状細胞の増殖応答を変調させるのに非常に強い効果を及ぼすことを示す。
【０１０９】
星状細胞の増殖とニューロン接触に応答した突起形成は個別の事象であるとこれまで示されてきた。星状細胞増殖の制御にはニューロン膜との接触で十分であるが、細胞周期退出と突起形成の両方には生きたニューロンが必要とされる（２９，３０）。発明者は、ニューロン−星状細胞共存培養物における星状細胞突起生成において、対照条件下か、又はｍＡｂの２Ｆ７又はＥａｔ２のいずれか一方の存在下で違いがないことを認めたが、これらの培養物とＥａｔ１の存在下に確立した共存培養物との間には明瞭な違いがあった。これらの明瞭な違いの例を図２Ｃと２Ｄに見ることができるが、ここでは、それぞれＥａｔ１とＥａｔ２の存在下でのニューロン−星状細胞共存培養物を提示した。Ｅａｔ１の存在下では（図２Ｃ）、星状細胞はニューロンに応答して典型的な突起を伸ばすことができず、細胞周期に留まった。図２Ｃに図示する星状細胞は、抗ＧＦＡＰ抗血清で造影された。これらは、ｉｎ ｓｉｔｕ で出現した娘細胞のクラスターの外観を有す。対照的に、Ｅａｔ２の存在下で（図２Ｄ）、ＧＦＡＰ発現性の星状細胞突起は長く、星状細胞と生きた野生型顆粒細胞ニューロンの共存培養物において見られる星状細胞応答から区別し得ない複雑性がある（図２Ｅ）。さらに、神経炎性突起の完全性は、抗ＣＤ８１  ｍＡＢのＥａｔ１及び２Ｆ７の存在下で失われない（図２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｈ）。これらのデータは、抗ＣＤ８１  ｍＡＢの効果が星状細胞のレベルで起こり、ニューロンの生存能の低下や軸索生成能力の減弱化の結果ではないことを明示する。さらに、このデータは、処理された星状細胞がニューロンの生存と軸索生成を支援することが可能であることを示し、星状細胞のコグネイトニューロンとの相互作用の１つの側面におけるＣＤ８１の役割の特異性をさらに明瞭にする。
Ｄ．可溶性ＧＳＴ−ＣＤ８１融合タンパク質は、ニューロン細胞表面へ結合し、星状細胞発現ＣＤ８１について競合する
【０１１０】
上記の抗体遮断試験は、ニューロン−星状細胞相互作用の仲介におけるＣＤ８１の重要な役割を示唆した。しかしながら、どの抗体遮断実験にも、立体阻害についての懸念が常にある。それ故に、上記の観察結果をさらに発展させるために、発明者は、可溶性マウスＧＳＴ−ＣＤ８１大細胞外ループ（ＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ））融合タンパク質を使用して、星状細胞へのニューロン結合について競合させた。この融合タンパク質がニューロン、星状細胞、又はその両方へ結合することが可能であるかを決定するために、発明者は、記載のように（２８）、それぞれの細胞型を単離して精製した。生きた細胞を、１０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）とともに氷上で１時間インキュベートした。その後、この細胞を固定してから、内因性ＣＤ８１を染色することを避けるために、抗ＧＳＴ抗体で染色した。ＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）融合タンパク質はニューロン分画へ吸着したが、星状細胞分画へは吸着しなかった（図３）。星状細胞濃縮分画に見られるわずかな被染色細胞は、細胞本体の大きさと細胞の形状に基づけば、おそらくニューロンであった。培養中の星状細胞は、上記の細胞と異なって、平板になり、そして二極性又は三極性になる。
【０１１１】
ＣＤ８１（ＬＥＬ）タンパク質がニューロンの表面へ吸着するという観察結果は、上記細胞上でのＣＤ８１受容体の存在を示唆する。この推定受容体は、正常なニューロン−星状細胞相互作用に潜在的に関与している可能性がある。そのような受容体を遮断することが、ＣＤ８１へ結合し、ＣＤ８１を介して星状細胞を分化させるニューロンの能力を遮断するかを決定するために、発明者は、増加する濃度のＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）タンパク質又は無関係なＧＳＴ融合タンパク質、ＧＳＴ−ＳＣＩＰのいずれか一方を加えた。可溶性ＣＤ８１が正常なニューロン誘導性星状細胞増殖停止を用量依存的なやり方で遮断したのに対し、ＧＳＴ−ＳＣＩＰには効果がなかった（図４）。いずれの融合タンパク質もニューロンの生存や分化には明瞭な効果を及ぼさなかった。ニューロン結合パターンと、この遮断に基づけば、上記のデータは、可溶性ＣＤ８１がニューロン上の受容体について競合し、それにより正常なニューロン誘導性、ＣＤ８１仲介性の増殖停止を遮断することを示唆する（図４）。
Ｅ．星状細胞の細胞周期離脱はＣＤ８１依存性である
【０１１２】
星状細胞上での発現に加えて、ＣＤ８１はまた、リンパ球を含む数多くの細胞型により発現される。ＣＤ８１は、ＣＤ８１欠損マウスにおいて観察される免疫障害により裏付けられるように、免疫系において必須の役割を担うことが示されている（１６，１７，２０，２７）。異種接合ＣＤ８１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ、１０世代戻し交配し、純系Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子型においてＣ８１欠失を確立した。誕生直後の動物から混合ニューロン−星状細胞培養を確立した。これらＣＤ８１−／−動物を生後早期に採取したのは、誕生からはじめの数時間を超えると生存能力がひどく低下するためである。採取のときに、同時の遺伝子型決定用に追加の神経組織を取った。培養を確立し、４８時間増殖させた。培養の後半２４時間にＢｒｄＵを加えた。次いで、細胞を固定して染色し、星状細胞増殖をＢｒｄＵ及びＧＦＡＰの二重標識化により決定した。増殖データを作表してから、それぞれの培養物の遺伝子型を明らかにした。野生型共存培養物における星状細胞増殖の程度を１に設定した。このレベルの増殖に関しては、ＣＤ８１＋／−動物が星状細胞のＢｒｄＵ取込みにおいて２０％増加を示したのに対し、ＣＤ８１−／−星状細胞は、星状細胞増殖の倍増を示した（図５）。
Ｆ．ＣＤ８１は多様な星状細胞性腫瘍細胞系に存在しない
【０１１３】
腫瘍形成は、増殖制御の喪失へ貢献する多工程現象である。ＣＤ８１が星状細胞性腫瘍の進行又は転移のいずれかにおいて何らかの役割を担う可能性があるかどうかを決定するために、発明者は、いくつかの星状細胞腫細胞系をＣＤ８１  ｍＲＮＡ発現についてアッセイした。免疫蛍光データに一致して、精製された細胞集団として単離されて培養したときに、星状細胞は、ＣＤ８１  ｍＲＮＡを発現した。ニューロン膜と共存培養すると、星状細胞のＣＤ８１発現がアップレギュレートされ、ＣＤ８１を細胞周期から外して維持する正のフィードバック機構を示唆した。対照的に、アッセイした星状細胞腫細胞系は、いずれも３日間の曝露後も検出可能なＣＤ８１メッセージのレベルを有さなかった（図６）。ＣＤ８１−／−動物では、それがＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにある場合、星状細胞症がほとんど観察されなかったので、ニューロン調節性の増殖制御にはいくつかの階層が存在する可能性がある。しかしながら、ＣＢ８１−／−マウスをＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドへ交配させると、大量の星状細胞症が存在する。従って、ＣＤ８１と相互作用して星状細胞増殖を ｉｎ ｖｉｖｏ で調節する追加の遺伝的成分が存在するのかもしれない。それでも、今回のデータは、ＣＤ８１が星状細胞腫瘍の進行にある役割を担う可能性があることを示唆する。
４．考察
【０１１４】
成熟ＣＮＳの内部で適切な比の細胞型を確立することは完全には理解されていない。ほとんどのニューロン集団は細胞分化の後では細胞周期に再び入ることができないが、このことは星状細胞には当てはまらない。これらの細胞は、哺乳動物の一生のいずれの時点でも増殖することが可能であり、多様な病理学的条件下でそうするのである。しかしながら、ホメオスタシスにおいては、星状細胞の数は顕著にも保存され、定常状態で維持される（２３，２４，２５）。これまでの研究は、ニューロン細胞が星状細胞の増殖停止及び最終分化の強力なエフェクターであることを示した。さらに、これと同じ機序により、星状細胞は一生細胞周期から外して維持される可能性がある。ＮＣＡＭ（９）、心房性ナトリウム利尿タンパク質（２１）、アストロタクチン（４，２２）、及びエンドセリン１（２６）を含め、数多くの候補分子がこの活性のメディエーターであると提唱されてきたが、厳密な分析に耐えたものはない。
【０１１５】
ニューロン−星状細胞相互作用の分析のほとんどは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ でモデル化されている。培養条件下、ニューロンでチャレンジすると、星状細胞は細胞周期から逸脱し、ＧＦＡＰリッチの複合突起を伸ばす（１１，１２，２９，３０）。本明細書において、発明者は、ニューロン仲介性の星状細胞分化及び増殖停止の必須モジュレーターはＣＤ８１であるという最近の知見を報告する。この結論は、３つの独立した系列の実験証拠に基づく。抗体遮断、抗原競合、及び遺伝子アプローチがすべて集束して、ＣＤ８１がこの生物学の必須部分であることを示唆するのである。さらに、試験した星状細胞性腫瘍細胞系はＣＤ８１欠損であり、ＣＤ８１が正常なニューロン−星状細胞生物学において重要な役割を担う可能性があることを示唆する。重要にも、この ｉｎ ｖｉｔｒｏ の知見は、ある遺伝子バックグラウンドで ｉｎ ｖｉｖｏ 事象を表型模写するが、別のバックグラウンドではそうしないので、ＣＤ８１は、追加遺伝子の修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）として作用するか、又はそれにより修飾されるかのいずれかであることを示唆する。
【０１１６】
機能遮断抗体は、きわめて重要な分子相互作用を検査するのに貴重なツールである。発明者は、本明細書において、ＣＤ８１のＬＥＬに位置する個別エピトープへ結合するＥａｔ１が、ニューロンとの共存培養への星状細胞応答性を除去することが可能である（即ち、星状細胞は細胞周期に留まって、完全に分化することはない）ことを示した。これらの試験では、ニューロンは依然として星状細胞性の細胞の表面へ吸着することが可能であり、そこに定着し、元の複合突起を伸ばした。ニューロン細胞の生存及び分化は、ニューロン−星状細胞相互作用にいくつかの階層が存在すること、そして、星状細胞の完全な分化がなくても、星状細胞がこれらの培養物においてニューロンの健全性を維持することが可能であることを示唆する。顆粒細胞の生存及び分化に星状細胞、又は星状細胞誘導性の支援が必要であることはよく知られている（１３）。それ故に、上記のデータは、ニューロン−星状細胞相互作用におけるＣＤ８１活性がニューロン誘導性星状細胞分化に特異的であることを示唆する。
【０１１７】
様々な抗ＣＤ８１  ｍＡｂのそのコグネイト抗原への結合により誘導されるコンホメーション変化は、ニューロンへの特徴的な星状細胞応答をもたらす。ＣＤ８１へきわめて強く結合するＥａｔ２が機能に効果を及ぼさないのに対し、Ｅａｔ１抗体は、ＣＤ８１とこれまで未同定のパートナーとの相互作用を遮断する。ＣＤ８１と未知パートナーの間の分子クロストークという着想は、ニューロンの抗増殖シグナル伝達に対する星状細胞の感受性を２Ｆ７が増加させるという観察結果により裏付けられ、ＣＤ８１におけるコンホメーション変化がその活性に対してごく強い効果を及ぼす可能性があることを示唆する。この着想は、２Ｆ７  ｍＡｂが胸腺細胞成熟化を遮断することが可能であることを示す証拠によりさらに裏付けられる（１）。発生中の神経要素間の認識においてある役割を担うことが知られている、少なくとも１つの他のテトラスパニン、ショウジョウバエのｌａｔｅ  ｂｌｏｏｍｅｒ遺伝子が存在する。ｌａｔｅ  ｂｌｏｏｍｅｒ遺伝子座におけるハエの突然変異体は、時宜に合った形式で適切な神経筋肉シナプスを産生することができず、ハエ神経系での細胞要素の認識における役割を示唆する（１４）。ＣＤ８１がそのメンバーであるテトラスパニンは、膜の平面内にあるパートナー群を一緒にする、分子促進因子であると考えられている（１９）。星状細胞とニューロン間のＣＤ８１仲介性シグナル伝達の分子機序に対して明確に答えるには、星状細胞発現性ＣＤ８１結合パートナーの同定が待たれる。
【０１１８】
一般に、機能遮断抗体を使用する試験は、制御することが困難である非特異的な立体阻害の問題があるので、本来的に限界がある。発明者は、可溶性のＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）融合タンパク質を使用してＣＤ８１結合について競合させることによってこの潜在的な問題に対処した。このアッセイにおいて、ＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）融合タンパク質は、星状細胞ではなく、ニューロンの細胞表面へ結合する。ニューロンが星状細胞上で結合することと、無関係な融合タンパク質は結合することも機能を遮断することもできないことは、結合の特異性を示唆し、ニューロン発現性ＣＤ８１受容体の可能性を提起する。さらに重要にも、上記の可溶性ＧＳＴ−ＣＤ８１（ＬＥＬ）タンパク質は、この推定ニューロンＣＤ８１受容体について星状細胞発現性ＣＤ８１と競合することによって、ニューロン誘導性星状細胞応答を遮断する。これらの観察結果は、ニューロン誘導性星状細胞活性を確立するのにＣＤ８１が重要な役割を担うという直接の証拠を提供する。
【０１１９】
ＣＤ８１がニューロン−星状細胞生物学において必須の役割を担うという最後の確証は、ＣＤ８１異種接合及び同型接合ヌルマウスから培養を確立することによって提供された。ＣＤ８１発現を低下させるか又は除去するための遺伝学を使用して、発明者は、ニューロン誘導性星状細胞応答におけるＣＤ８１の厳密な必要性を証明した。この試験に使用するＣＤ８１マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ十分に戻し交配した。＋／−マウスは、自発的な星状細胞腫瘍を発症しなかったし、星状細胞過形成、星状細胞症の兆候も、検出可能な神経学的異常も示さなかった。しかしながら、このＣＤ８１欠失（マウス）をＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドへ戻し交配すると、甚大な星状細胞過形成が生じた（Ｅ． Ｇｅｉｓｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， 私信）。これは、遺伝子バックグラウンドに依存して観察可能な表現型を有する、ＣＤ８１活性の修飾因子が存在することを明示するので、きわめて重要な観察事実である。ある遺伝子産物の関連性を周囲のゲノムに照らして実体として考慮する必要があることは注目に値する。
【０１２０】
今回の試験の意義は、星状細胞の細胞数をホメオスタシスと損傷において調節することの疑問を超えて拡張される。発明者は、いくつかの星状細胞性腫瘍細胞系を検査したが、これはすべてひどく減弱したレベルのＣＤ８１発現を有する。ＣＤ８１が典型的な腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する証拠はないが、これらの星状細胞腫細胞系におけるＣＤ８１の非存在は、正常なニューロン−星状細胞生物学におけるＣＤ８１機能とひとまとめにして考えると、ＣＤ８１が腫瘍抑制因子カスケードの一部であるかもしれないという可能性を提起する。ここに提示したデータは、星状細胞性腫瘍において ｉｎ ｓｉｔｕ でＣＤ８１を再発現させることを目的とした機序は星状細胞腫に罹患している患者にとってきわめて有益であるかもしれないという可能性を提起する。そのようなアプローチは、腫瘍細胞の増殖速度を ｉｎ ｓｉｔｕ で制限することにより、そうしなければ致命的な疾患を慢性病へ変化させ、より従来の療法の神経学的障害を消失させることを意図するだろう。神経膠腫瘍の浸潤性と、広範な切除の神経学的後遺症により、このタイプのアプローチは魅力的である。星状細胞におけるＣＤ８１の転写調節を解明することを意図したさらなる研究は、潜在的な薬物療法剤への洞察を提供するだろう。
【０１２１】
本明細書に提示したデータは、正常なニューロン誘導性星状細胞増殖調節におけるＣＤ８１の重要性を明らかに示す。この観察結果は、ニューロン及び星状細胞の比率が成体のＣＮＳにおいて確立されて維持される方法の根底にある機序（群）をある程度明らかにする。これらの細胞間の動的相互作用を制御する分子機序のさらなる明確化は、成熟した神経系が数的ホメオスタシスを達成して維持する手段と、神経系が平衡状態から外れるときにこの均衡が回復されることを可能にする方法のより完全な理解の発展にきわめて重要である。
参考文献
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【０１３３】
１２．Ｈａｔｔｅｎ ら，「ニューロン−大膠細胞の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 相互作用とＣＮＳ損傷の修復への意義」， Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｒａｕｍａ， １： １５−２７， １９８４．
【０１３４】
１３．Ｈａｔｔｅｎ と Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ， 「マウス小脳顆粒ニューロンはヒト及びげっ歯類の星状細胞腫細胞の増殖を ｉｎ ｖｉｔｒｏ で停止させる」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ８： １４４７−５３， １９８８．
【０１３５】
１４．Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ ら，「後期ｂｌｏｏｍｅｒによりコード化され、シナプス形成を促進する、神経テトラスパニン」， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７１： １８６７−７０， １９９６．
【０１３６】
１５．Ｌａｔｏｖ ら，「原線維性星状細胞は脳損傷に応答して増殖する：神経膠原線維酸性タンパク質のイムノペルオキシダーゼ技術とトリチウム化チミジンのラジオオートグラフィーを組み合わせる研究」， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７２： ３８１−８４， １９７９．
【０１３７】
１６．Ｍａｅｃｋｅｒ ら，「Ｂ細胞上のＣＤ８１は、ヘルパーＴ細胞２型免疫応答の間にインターロイキン４分泌及び抗体産生を促進する」， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５： ２４５８−６２， １９９８．
【０１３８】
１７．Ｍａｅｃｋｅｒ と Ｌｅｖｙ， 「ＣＤ８１ヌル細胞における正常なリンパ球発生と遅延した体液性免疫応答」， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８５： １５０５−１０， １９９７．
【０１３９】
１８．Ｍａｅｃｋｅｒ ら，「新しい抗マウスＣＤ８１モノクローナル抗体により明確化されるマウスＣＤ８１の差別的な発現」， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １９： １５−２２， ２０００．
【０１４０】
１９．Ｍａｅｃｋｅｒ ら，「テトラスパニンスーパーファミリー：分子促進因子」， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １１： ４２８−４２， １９９７．
【０１４１】
２０．Ｍｉｙａｚａｋｉ ら，「ＣＤ８１を欠失するマウスにおけるリンパ球の正常な発生と差別的に改変された増殖応答」， ＥＭＢＯ Ｊ．， １６： ４２１７−２５， １９９７．
【０１４２】
２１．Ｐｅｄｒａｍ ら，「星状細胞の細胞周期のＧ１からＳ期への進行は、多数のタンパク質相互作用に依存する」， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３： １３９６６−７２， １９９８．
【０１４３】
２２．Ｓｔｉｔｔ と Ｈａｔｔｅｎ， 「アストロタクチンを認識する抗体は、顆粒ニューロンの大膠細胞への結合を遮断する」， Ｎｅｕｒｏｎ， ５： ６３９−４９， １９９０．
【０１４４】
２３．Ｓｔｕｒｒｏｃｋ， Ｒ． Ｒ．， 「マウス脳の前交連の前脚の組織形成：３．神経膠形成の電子顕微鏡的研究」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， １１７： ３７−５３， １９７４．
【０１４５】
２４．Ｓｔｕｒｒｏｃｋ， Ｒ． Ｒ．， 「マウス脳の前交連の前脚の組織形成：ＩＩＩ．神経膠集団の加齢に伴う変化の定量的研究」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， １１７： １７−２５， １９７４．
【０１４６】
２５．Ｓｔｕｒｒｏｃｋ， Ｒ． Ｒ．， 「マウス脳の前交連の前脚の組織形成：ＩＩ．出生前及び後の有糸分裂の定量的研究」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ， １１７： ２７−３５， １９７４．
【０１４７】
２５．Ｔｅｉｘｅｉｒａ ら，「エンドセリン−１により誘導される星状細胞増殖の制御におけるサイクリンＤ１及びＤ３発現の差別調節」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７４： １０３４−４０， ２０００．
【０１４８】
２６．Ｔｓｉｔｓｉｋｏｖ ら， 「ＣＤ８１欠失マウスにおける、ＣＤ１９発現及びシグナル伝達の障害、ＩＩ型Ｔ細胞非依存型抗原への抗体応答の亢進、及びＢ−１細胞の低下」， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： １０８４４−４９， １９９７．
【０１４９】
２７．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｄ． Ｅ．， 「一次星状細胞の培養：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ 中、Ｅ． Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｃ． Ｇｅｒｆｅｎ， Ｒ． ＭｃＫａｙ， Ｍ． Ｒｏｇａｗｓｋｉ， Ｄ． Ｓｉｂｌｅｙ， 及び Ｐ． Ｓｋｏｌｎｉｃｋ 編（ニューヨーク：ウィリー・アンド・サン）」１９９７．
【０１５０】
２８．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ら，「レトロウイルスにより不死化したニューロン細胞系であるＣ１７は、接触仲介機序により星状細胞及び星状細胞腫細胞の増殖を阻害する」， Ｇｌｉａ， ３： １３０−３９， １９９０．
【０１５１】
２９．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ら，「アンチセンスｍＲＮＡによる抑制は、ニューロンへ応答した安定な星状細胞突起の形成における神経膠原線維酸性タンパク質の必要性を明示する」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １１２： ２０５−１３， １９９１．
【０１５２】
３０．Ｂｅｅｒｓ と Ｂｅｒｋｏｗ 編「診断及び治療のメルク・マニュアル、１７版（ホワイトハウスステーション、ニュージャージー州、メルク・リサーチ・ラボラトリーズ、１９９９）」１３９５−１３９８， １４４２−４８．
上記の公表物はすべてそのまま本明細書に援用される。上記の発明を明確化及び理解のためにやや詳しく記載してきたが、当業者には、開示の一読から、付帯の特許請求項における本発明の真の範囲から逸脱することなく形式及び細部において様々な変更をなし得ることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＣＤ８１が星状細胞の表面に発現されることを明示する。ＣＤ８１メッセージの発現をディファレンシャルスクリーンにより同定した後で、タンパク発現をウェスタンブロット分析により決定した。（Ａ）星状細胞が豊富なＣＤ８１を発現する一方、Ｃ６神経膠細胞系はＣＤ８１陰性である。この星状細胞におけるタンパク発現を定位するために、星状細胞を単独（Ｂ）で、又はニューロンの存在下（Ｃ）で４８時間培養してから、固定し、モノクローナル抗体２Ｆ７を使用して、細胞表面のＣＤ８１の発現について染色した。（Ｂ）中の矢印は、星状細胞突起（ニューロン相互作用に必須の細胞のドメイン（１０））に沿ったＣＤ８１の発現を指摘する。
【図２】図２Ａ〜２Ｈは、ＣＤ８１がニューロン−星状細胞相互作用の必須メディエーターであることを図示する。Ｅａｔ１は、正常なニューロン仲介性星状細胞増殖へ効果的に干渉した。（Ａ）増加する濃度のＥａｔ１モノクローナル抗体（ｍＡＢ）の存在下では、ニューロン仲介性星状細胞増殖停止の欠失があった（黒塗り棒）；この抗体は、ニューロンの非存在下では星状細胞増殖に効果を及ぼさなかった（オープン棒）。（Ｂ）対照的に、２Ｆ７は、ニューロン誘導性星状細胞増殖停止を亢進したので、このｍＡｂとニューロンの存在下で、星状細胞増殖は、ニューロン単独で見られるレベルよりさらに抑制された。（Ｃ）ニューロン−星状細胞共存培養物において抗ＧＦＡＰ抗血清で染色した星状細胞の免疫蛍光試験は、Ｅａｔ１の存在下、ニューロン誘導性の星状細胞突起形成への正常な応答性がＥａｔ１エピトープに依存することを示した。対照的に、Ｅａｔ２エピトープを遮断しても、対照の共存培養物（Ｅ）と同じ外観であったこれらの培養物（Ｄ）で見られる複合ＧＦＡＰ突起により裏づけられるように、ニューロンへの星状細胞応答性には効果を及ぼさなかった。ｍＡｂのＥａｔ１及び２Ｆ７は、ニューロンへの星状細胞応答にきわめて強い効果を及ぼしたが、それらは、ニューロンの生存や軸索生成に観察可能な効果を及ぼさなかった。ニューロン−星状細胞共存培養物も、ニューロン特異的βＩＩＩチューブリンアイソフォームを認識する、ｍＡｂのＴｕＪ１で染色した（３）。神経突起の程度及び質は、Ｅａｔ１（Ｆ）及び２Ｆ７（Ｇ）の存在下と対照共存培養物（Ｈ）で比較可能であった。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＧＳＴ−ＣＤ８１が星状細胞ではなくニューロンへ結合することを明示する。記載（２８）のように、Ｐ４ラット小脳から、ニューロン又は星状細胞のいずれか一方の高濃縮培養を確立した。この細胞を、同等の密度でプレート培養し、氷上で冷やし、内部化を予防してから、１０μｇ／ｍｌの細菌発現性ＧＳＴ−ＣＤ８１とともに１時間インキュベートした。この細胞を固定し、ヤギ抗ＧＳＴ抗体に次いで、Ａｌｅｘｉａレッド共役ウサギ抗ヤギ二次抗体で染色した。図３Ａは、バックグラウンド染色（一次抗体対照なし）の非存在を示す。図３Ｂは、ＣＤ８１融合タンパク質のニューロン表面への結合を示す。対照的に、星状細胞濃縮分画中に混在するごくわずかのニューロンがこの融合タンパク質へ結合した（Ｃ）。
【図４】図４は、可溶性ＣＤ８１が星状細胞発現性ＣＤ８１と競合し、ニューロン誘導性星状細胞静止を遮断することを図示する。増加濃度の可溶性ＧＳＴ−ＣＤ８１をニューロン及び星状細胞の共存培養物へ加えた。ＧＳＴ−ＣＤ８１は、ニューロンについて、発現されるＣＤ８１と競合し、それにより星状細胞表面でのニューロンＣＤ８１−受容体結合を遮断した。この競合の結果として、星状細胞はその細胞周期に留まった。１μｇ／ｍｌほどのＧＳＴ−ＣＤ８１で、ニューロン誘導性星状細胞増殖の４０〜５０％阻害が達成された。最大阻害は、３μｇ／ｍｌの可溶性タンパク質で得られた。この可溶性タンパク質は、ニューロンの非存在下では、星状細胞増殖に観察可能な効果を及ぼさなかった。ＧＳＴ−ＣＤ８１の効果の特異性は、他の無関係なＧＳＴ融合タンパク質である、ＧＳＴ−ＳＣＩＰの追加により証明されたが、これは試験したどの濃度でもニューロン誘導性星状細胞静止に効果を及ぼさなかった。統計分析は、スチュ−デントの両側ｔ−検定を使用して行った。
【図５】図５は、ニューロン誘導性星状細胞増殖調節にＣＤ８１が必要であることを示す。野生型、ＣＤ８１＋／−、又はＣＤ８１−／−の小脳星状細胞と顆粒細胞ニューロンとの混合培養を確立し、ニューロン誘導性星状細胞応答における内因性ＣＤ８１の役割について評価した。以下に記載のように、培養を確立後４８時間のＧＦＡＰ及びＢｒｄＵの二重標識化により、星状細胞増殖を決定した。野生型共存培養物における星状細胞増殖を決定し、任意に１と設定した。ＣＤ８１ハプロ−不全星状細胞は、ニューロン応答性のわずかな損失（２０％）を示した。しかしながら、ＣＤ８１の座がヌルである星状細胞はこの条件下でニューロンへの応答性をすべて失い、外植後４８時間以内に数が倍になった。アッセイは、試験した各動物について同一３検体で行い、全体の実験を３回繰り返した。
【図６】図６は、ＣＤ８１  ＲＮＡがある範囲の星状細胞性腫瘍細胞系では存在していないことを示す。細胞形質転換の指標は、天然に存在する刺激（ｃｕｅｓ）へ応答する増殖停止の喪失である。星状細胞性腫瘍細胞系が改変したレベルのＣＤ８１を発現するかどうかを決定するために、発明者は、多様な細胞系からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析を実施した。ＣＤ８１メッセージが野生型星状細胞に見出されたのは、意外ではない。この細胞をニューロン膜とともに４８時間共存培養すると、ＣＤ８１レベルがほぼ２倍増加し、正のフィードバック機構がＣＤ８１発現に影響を及ぼすことを示唆した。きわめて対照的に、試験したどの腫瘍細胞系でも、ブロットを過剰露出しても、検出可能なＣＤ８１メッセージはなかった（データ示さず）。試験した星状細胞腫瘍は、ラット：Ｃ６及び９Ｌ；ヒト：Ａ１７２及びＵ２５１ＭＧ；及びマウス：ＬＮ３０８及びＬＮ１８である。ＲＮＡのローディング対照としては１８Ｓプローブを使用した。
【図７】図７は、ヒトＣＤ８１のヌクレオチド配列を図示する。
【図８】図８は、ヒトＣＤ８１のアミノ酸配列を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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