(57)【要約】本発明はリン脂質スクランブラーゼ（ＰＬＳ）輸送系が活性化されている細胞へ、医薬として有用な薬剤を選択的に標的化するための方法に関する。この方法はＰＬＳ−依存的輸送化合物（ＰＤＴＣ）である薬剤を細胞に投与することを含んでなり、これにより薬剤の細胞への選択的輸送を引き起こす。細胞の例はアポトーシス細胞、活性化細胞および損傷細胞である。またこの方法により使用するための製薬学的組成物も開示する。
2004534001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として有用な薬剤を、リン脂質スクランブラーゼ（ＰＬＳ）輸送系が活性化されている細胞（ＰＤＴ−活性化細胞）に選択的に標的とするための方法であって、該医薬として有用な薬剤がＰＬＳ−依存的に輸送される化合物（ＰＤＴＣ）であり、該方法が：
該薬剤を該細胞に投与することにより該薬剤の該細胞への選択的輸送を引き起こす、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
上記細胞が１以上のアポトーシス細胞、損傷細胞または活性化細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記の活性化細胞が活性化血小板、活性化白血球、活性化マクロファージおよび炎症性細胞から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記薬剤が視覚によりまたは道具による手段で同定することができるマーカー部分を含んでなり、そして上記方法が上記細胞中の該マーカー部分を検出することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記マーカー部分が１以上の蛍光、放射性、Ｘ−線画像、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、一光子発光コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出形断層撮影法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）標識を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記薬剤が固有の蛍光特性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
過度のアポトーシス、変性障害、神経−変性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、感染性障害、免疫性障害、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、虚血性毒性傷害または腫瘍の発生を特徴とする疾患を検出するための請求項４に記載の方法。
【請求項８】
過度の血液凝固、動脈または静脈血栓症、血栓−塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑症（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスまたは不安定なアテローム硬化症斑を特徴とする疾患を検出するための請求項４に記載の方法。
【請求項９】
免疫性障害、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ、強皮症または他の種類の結合組織障害；甲状腺炎；皮膚障害、天疱瘡または結節性紅斑；自己免疫血液障害；自己免疫神経障害、重症筋無力症；脈管炎；炎症性腸障害潰瘍性大腸炎；または臓器移植拒絶を検出するための請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
癌に関する細胞傷害療法の効果のモニタリング；過度のアポトーシスを特徴とする疾患における細胞保護療法に対する応答のモニタリング；または臓器移植後の移植片生存のモニタリングにおいて使用するための請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＤＴ活性化に関係する医学的条件の組織培養実験または動物実験、あるいはアポトーシス研究、細胞活性化および細胞損傷の研究から選択される研究分野において使用するための請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
上記薬剤が細胞に所望の効果を誘導するエフェクター部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記所望の効果が、細胞の生物学的活性をモジュレートすること、細胞を傷害から保護すること、病理学的プロセスを逆転させること、または細胞死のプロセスをモジュレートすることを含んでなる治療効果である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞がアポトーシス細胞であり、そして上記エフェクター部分が細胞死をモジュレートする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記薬剤がカスパーゼインヒビター、Ｂｃｌ−２のモジュレーターまたは酸化防止剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記エフェクター部分が血液凝固をモジュレートし、抗−血小板活性を有し、または繊維素溶解活性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が免疫系の細胞または炎症性細胞であり、そして該エフェクター部分が免疫−調節または抗−炎症効果を有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
上記細胞が白血球またはマクロファージから選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記薬剤が細胞傷害活性を有する請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
治療に有効な量のＰＤＴＣを処置が必要な個体に投与することを含んでなる、ＰＤＴ活性化により現れる疾患を処置するための請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
変性障害、神経変性障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、感染性障害、免疫性障害、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、虚血性または毒性傷害、移植後の臓器移植片拒絶から選択される疾患を処置するための請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
有利な効果が細胞死の増加により顕性となることができ、そして薬剤が細胞傷害剤である疾患の処置のための請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
癌の処置のための請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
医薬として有用な薬剤が血液凝固のモジュレーターである請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
血液凝固のモジュレーターが抗凝固剤、抗血小板剤または繊維素溶解剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
動脈または静脈血栓症、血栓−塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑症（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデスまたはアテローム硬化症から選択される疾患を処置するための請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
医薬として有用な薬剤がマクロファージおよび／または白血球の活性のモジュレーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
医薬として有用な薬剤が免疫−調節剤または抗−炎症剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性関節リウマチ、強皮症または他の種類の結合組織障害；甲状腺炎；天疱瘡または結節性紅斑のような皮膚障害；自己免疫血液障害；重症筋無力症のような自己免疫神経障害；脈管炎；潰瘍性大腸炎のような炎症性腸障害；または臓器移植拒絶から選択される免疫性障害を処置するための請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記薬剤がトラッピング強化部分（ＴＥＭ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
上記医薬として有用な薬剤が親水性および疎水性部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
上記医薬として有用な薬剤が少なくとも１０：１のオクタノール：水分配係数を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
上記疎水性部分が芳香族基（１つまたは複数）、脂肪族基（１つまたは複数）、金属原子（１つまたは複数）を含んでなる疎水性金属キレート（１つまたは複数）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
上記疎水性金属キレート（１つまたは複数）がテクネチウムを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
上記親水性部分が生理学的条件で荷電している請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
上記親水性部分が生理学的条件で両性イオン形であるか、または負に荷電した基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
上記薬剤が式Ｃｅ（ここでｅは１、２および３から選択され、そしてＣは式（Ｉ）：
【化１】
2004534001.tif 000010
ここで該Ｃ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そして
式中、
Ｚはシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基またはそのような基の組み合わせを形成する環系を表し、該環系は５〜１０個の原子からなり；
ＸはＣＨ、ＣＨ２、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳを表し；
ｎ、ｍ、ｒおよびｐは各々が独立して０または１であり；ここでｎ＋ｒ＝１；ｍ＋ｐ＝１；
Ｒ１基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてＡおよびＬ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでＬ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてＤ、Ｕ、Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ、Ｄ−Ｕ−Ｏ、Ｏ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＮＨ、ＮＨ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＤおよびＵ−Ｄ−Ｕからなる群から独立して選択され；
Ｕは水素を表すか、または場合により置換されたＣ１−Ｃ１０Ｃ６アルキレン、Ｃ２−Ｃ１０Ｃ６アルケニレン、Ｃ３−Ｃ１０Ｃ６分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ１０Ｃ６分枝アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニレン、ヘテロアリールおよび該基の任意の組み合わせから選択され；
ＤはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＮＨ、ＰＯ、ＰＯ２、ＰＯＯＨ、ＰＯ（ＮＨ）２、ＮＨＰＯＯＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨＣＨＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＨＣＯまたはＤが二価の基である時に上記リストからの対応する意味からなる群から選択され；
Ａ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてｅが１である時、約７のｐＨで荷電した部分であるか；あるいはｅが２または３である時、Ａ基は極性の非荷電部分および約７のｐＨで荷電した部分から独立して選択され、該荷電した部分は正に荷電しているか、負に荷電しているか、または両イオン状態であり；
Ｒ２はＷＲ３ｂであり、ここでＷは不存在であるか、または２級もしくは３級アミン、酸素、硫黄およびＤからなる群から選択され、ここでＤは上記定義の通りであり；
ｂは１、２または３であり、
Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルキルおよびＣ３−Ｃ８分枝アルケニルからなる群から選択され、そしてｂが２または３である時、Ｒ３置換基は同じかまたは異なってもよく、そして
ｅが２または３である時、Ｃ基は直接的にまたはＬ部分を介して互いに連結する、
を有する基である）、
を有する化合物（式（Ｉ）の構造の製薬学的に許容される得る塩および水和物を含む）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
Ｃｅが、マーカー部分またはエフェクター部分を含んでなるか、またはそれらにＬ基を介して結合している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記薬剤が式（Ｖ）：
【化２】
2004534001.tif 000011
式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４基は同じかまたは異なってもよく、そして水素、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２および−Ｎ＋（ＣＨ３）３から独立して選択され；Ｍは不存在、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２、（ＣＨ２）２−、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ、Ｎ（ＣＨ２）ｋＣＨ（ＣＯＯＨ）およびＮ＋（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｋＣＨ（ＣＯＯＨ）から選択され；Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４基は同じかまたは異なってもよく、そして不存在または（ＣＨ２）ｋから選択され、ｋは１〜６の整数であり、そしてＲ３は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルを表す、
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
上記薬剤が式（ＶＩＩＩ）：
【化３】
2004534001.tif 000012
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
上記薬剤が式（ＩＸ）：
【化４】
2004534001.tif 000013
式中、Ｒ３は水素またはメチルを表す、
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
上記薬剤が式（Ｘ）：
【化５】
2004534001.tif 000014
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
上記薬剤が式（ＸＩ）：
【化６】
2004534001.tif 000015
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
製薬学的に許容され得る担体およびＰＤＴ−活性化細胞を選択的に標的とすることができる医薬として有用な薬剤（該医薬として有用な薬剤はＰＤＴＣである）を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４５】
上記ＰＤＴ−活性化細胞が１以上のアポトーシス細胞、活性化細胞または損傷細胞である、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項４６】
上記活性化細胞が活性化血小板、免疫系の活性化細胞、活性化白血球および炎症性細胞から選択される、請求項４５に記載の製薬学的組成物。
【請求項４７】
検査した個体中のアポトーシス細胞、損傷細胞または活性化細胞を検出するための請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項４８】
上記薬剤が視覚的または道具による手段により同定することができるマーカー部分を含んでなる、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項４９】
上記マーカー部分が１以上の蛍光、放射性、Ｘ−線画像、ＣＴスキャン、一光子発光コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出形断層撮影法（ＰＥＴ）またはＭＲＩ標識を含む、請求項４８に記載の製薬学的組成物。
【請求項５０】
上記薬剤が固有の蛍光特性を有する請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項５１】
請求項７ないし９に従い疾患を検出するための請求項４８に記載の製薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項１０ないし１１で使用するための請求項４８に記載の製薬学的組成物。
【請求項５３】
上記薬剤が、所望の効果を標的細胞に誘導するエフェクター部分を含んでなる、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項５４】
上記所望の効果が、細胞の生物学的活性をモジュレートすること、細胞を傷害から保護すること、病理学的プロセスを逆転させること、または細胞死のプロセスの強化をモジュレートすることを含んでなる治療効果である、請求項５３に記載の製薬学的組成物。
【請求項５５】
標的細胞がアポトーシス細胞であり、そして上記エフェクター部分が細胞死をモジュレートする、請求項５４に記載の製薬学的組成物。
【請求項５６】
上記薬剤がカスパーゼインヒビター、Ｂｃｌ−２のモジュレーターまたは酸化防止剤である、請求項５５に記載の製薬学的組成物。
【請求項５７】
標的細胞が活性化血小板またはアポトーシス細胞であり、そして上記エフェクター部分が血液凝固を阻害し、抗−血小板活性を有し、または繊維素溶解活性を有する、請求項５３に記載の製薬学的組成物。
【請求項５８】
標的細胞が免疫系の細胞または炎症性細胞であり、そして上記エフェクター部分が免疫−調節効果または抗−炎症効果を有する、請求項５３に記載の製薬学的組成物。
【請求項５９】
上記炎症性細胞が白血球およびマクロファージから選択される、請求項５８に記載の製薬学的組成物。
【請求項６０】
上記薬剤が細胞傷害活性を有する請求項５３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６１】
請求項２１ないし２９のいずれかによる疾患の処置のための請求項５３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６２】
上記薬剤がＴＥＭを含んでなる請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項６３】
上記医薬として有用な薬剤が親水性および疎水性部分を含んでなる、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項６４】
上記医薬として有用な薬剤が少なくとも１０：１のオクタノール：水分配係数を有する、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項６５】
上記疎水性部分が芳香族基（１つまたは複数）、脂肪族基（１つまたは複数）、金属原子（１つまたは複数）を含んでなる疎水性金属キレート（１つまたは複数）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項６３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６６】
上記疎水性金属キレート（１つまたは複数）がテクネチウムを含んでなる、請求項６３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６７】
上記親水性部分が生理学的条件で荷電している、請求項６３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６８】
上記親水性部分が生理学的条件で両性イオン形であるか、または負に荷電した基である、請求項６３に記載の製薬学的組成物。
【請求項６９】
上記薬剤が請求項３７に定義した式（Ｉ）の化合物、または請求項３７に定義した式（Ｉ）の化合物とマーカー部分もしくはエフェクター部分との結合物を含んでなる、請求項４４に記載の製薬学的組成物。
【請求項７０】
ＰＤＴ−活性化細胞に選択的に送達される化合物（ＰＤＴＣ）をスクリーニングし、そして同定するための方法であって、ＰＬＳ−依存的様式でＰＤＴ−活性化細胞への輸送を現す候補化合物から選択することを含んでなる上記方法。
【請求項７１】
（ａ）候補化合物、およびＰＬＳおよびＰＫＣδが発現し且つ機能する細胞系を提供し、；
（ｂ）ＰＤＴの活性化に適する条件を提供し；
（ｃ）既知濃度の候補化合物を細胞の外側に置き、そして予め定めた時間の後に該化合物の細胞の中の濃度（すなわち、細胞内濃度）を測定し；そして
（ｄ）工程（ａ）および（ｃ）を繰り返すが、工程（ｂ）はＰＤＴ活性が阻害される条件を提供することにより置き換える、
ことを含んでなる請求項７０に記載の方法であって；
ＰＤＴの活性化で達成される細胞内濃度と、ＰＤＴの阻害で達成される細胞内濃度との間で、＞２の比率が測定される化合物が、ＰＤＴＣの候補となる可能性がある上記方法。
【請求項７２】
薬剤が細胞を選択的に標的とするための製薬学的組成物を調製するための、ＰＬＳによるＰＤＴ−活性化細胞に輸送され得るＰＤＴＣである医薬として有用な薬剤の使用。
【請求項７３】
上記細胞が１以上のアポトーシス細胞、活性化細胞または損傷細胞である、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
請求項４４ないし６９のいずれか１項に記載の製薬学的組成物を製造するための請求項７２に記載の使用。
【請求項７５】
上記薬剤が請求項３７に定義した式（Ｉ）の化合物を含んでなる請求項７２に記載の使用。
【請求項７６】
上記薬剤が請求項３６ないし４３のいずれか１項に定義した化合物を含んでなる、請求項７１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、診断または治療の目的で薬剤を特別な細胞群に標的するための新規治療薬および診断法、およびこれらの方法に使用する薬剤に関する。本発明はそのような薬剤のスクリーニング法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
以下の参考文献は本発明の背景を理解するための参考になると考えられる：
非特許文献１
非特許文献２
非特許文献３
非特許文献４
非特許文献５
非特許文献６
非特許文献７
非特許文献８
非特許文献９
非特許文献１０
非特許文献１１
非特許文献１２
非特許文献１３
非特許文献１４
非特許文献１５
非特許文献１６
非特許文献１７
非特許文献１８
非特許文献１９
非特許文献２０
【０００３】
発明の背景
アポトーシスは細胞の自己破壊または「自殺」の本来備わっているプログラムであり、これは全真核細胞に内在する。刺激の誘起に応答して、細胞は細胞の縮み、細胞膜のブレッビング（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、クロマチンの凝縮および断片化、最後に膜に結合した粒子（アポトーシス体）のクラスターへの細胞の転換により現れる高度に特徴的な反応（ｅｖｅｎｔ）カスケードを受け、これはその後、マクロファージにより飲み込まれる（非特許文献２１）。
【０００４】
アポトーシスは今、最も重要な生物学的プロセスの１つとして認識され、正常組織の発生およびホメオスタシスにおける主な役割を果たす。さらにアポトーシス制御の撹乱は、神経変性障害（例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病）のような過度のアポトーシスの障害から、癌のような欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）細胞の死が不適当に阻害される障害にわたる多数の医学的障害の病因となる（非特許文献２２）。
【０００５】
アポトーシスで起こる最も初期の反応の１つは、死のプロセスにかかわる細胞の回りで起こり、リン脂質形質膜の正常な組織化における変質である（非特許文献２３）。通常、健康な静止細胞では、形質膜の脂質二重層の外および内層（ｌｅａｆｌｅｔ）間には非対称的なリン脂質の分布がある。アミノリン脂質、主にホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は主に形質膜の内層に存在し、一方ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）は主に外層に存在する。このリン脂質分布における非対称は、正常細胞とその環境との相互作用を含む種々の細胞機能に重要である。形質膜中のリン脂質のこの非対称は、以下のような少なくとも２つの主要なシステムによりエネルギー依存的様式で正常に維持される：（１）アミノリン脂質トランスロカーゼ（ａｍｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ）と呼ばれる内側に向けられたポンプ、これはＡＴＰ−依存的様式で外から内膜層にＰＳおよびＰＥを特異的かつ連続的に移動させるが、Ｃ２＋により阻害される：および（２）主にＰＣを内から外膜層に移動させる外側に分けられたフロッパーゼ（ｆｌｏｐｐａｓｅ）（非特許文献２４）。
【０００６】
アポトーシスプロセスの初期には、形質膜の正常なリン脂質非対称に急速な破壊があり、細胞表面上にＰＳおよびＰＥを露出させ、そしてＰＣおよびＳＭの内側移動を導く。このプロセスは組織マクロファージの漸増（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を促進してアポトーシス細胞を貪食し、そしてアポトーシス細胞の表面を高度にプロコアグラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）とする（非特許文献２５）。このプロセスは普遍的であり、アポトーシスを受けているほとんどすべての細胞で起こる。したがってＰＳに対して高い親和性を有するタンパク質であるアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖは、細胞表面上のＰＳの露出を検出するために使用され、すなわちインビトロおよびインビボの両方の研究でアポトーシスの診断用プローブとして役立った（非特許文献２６）。
【０００７】
この形質膜のリン脂質非対称の破壊はアポトーシスに大変特徴的であるが、種々の有害な刺激による細胞の活性化または細胞の傷害のような他の生物学的状況でも起こる。例えばこれは血小板活性化中に起こり、すなわちそれらの表面を凝固因子複合体、主にテナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）およびプロトロンビナーゼ複合体の集合のための強力な触媒的プラットホームに変える（非特許文献２７）。同様にこれらは活性を受けている白血球および組織マクロファージでも起こる。
【０００８】
この形質膜リン脂質の劇的な再分布の原因となる因子（「加速されたフリップ−フロップ」、「リン脂質スクランブリング（ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）」）は、未だに完全に解明されていないが、膜および関連するタンパク質系に固有の複雑性による（非特許文献２８）。明らかにリン脂質スクランブリングは多数の因子の調和した活性から生じる。これらにはとりわけ、後にＰＳおよびＰＥの内側運動の阻害を含むアミノリン脂質トランスロカーゼの阻害、（非特許文献２９）、ＭＤＲ１ ｐ−糖タンパク質の活性、トランスグルタミナーゼの活性、細胞性ポリアミン、ホスファチジルイノシトール ４，５−ビスホスフェート（非特許文献３０）、および膜下（ｓｕｂ−ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ）の細胞骨格を膜に正常に繋げるタンパク質の混乱（非特許文献３１）を含む。
【０００９】
リン脂質スクランブラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ：ＰＬＳ）は、形質膜リン脂質の内層運動を制御する因子間で役割を果たすタンパク質の最近発見されたファミリーである（非特許文献３２：非特許文献３３）。ＰＬＳはすべてのクラスのリン脂質の内層移動を促進する。しかし異なるリン脂質種に関してその活性の動力学に差異を現す。この差異に基づく効果は、頭部基（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）およびリン脂質骨格の構造により決められ、ここでより低速のＰＬＳ−媒介運動は、グリセロリン脂質（例えばホスファチジルコリン）のＰＬＳ−媒介移動と比べて、セラミド骨格を有するリン脂質（例えばスフィンゴミエリン）で観察される。ＰＬＳはしたがって異なる基質に対してその活性を決定する特定の構造／機能特異性が特徴である。
【００１０】
このタンパク質ファミリーの原型の構成要素（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ  ｍｅｍｂｅｒ）は３７ｋＤａタンパク質であり、これは多くの細胞型で発現される。このタンパク質の発現および活性は、細胞の活性化またはアポトーシス中で観察される運動のような形質膜の外面へのＰＳの急激な運動と相関することが見いだされた（非特許文献３４：非特許文献３５）。ＰＬＳファミリーの幾つかの他の構成要素も最近、ヒトおよびマウスでクローン化された（非特許文献３６）。重要なことは、ＰＬＳがその活性にＣａ２＋を必要とすることである。さらにＰＬＳ活性はプロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）により調節される（非特許文献３７）。ＰＬＳ活性に関する他の細胞調節メカニズムは現在、解明されているところである。
【００１１】
ＰＬＳファミリーの構成要素の配列分析により、各構成要素は１回膜貫通タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であることが明らかである。原型である３７ｋＤａＰＬＳファミリーの構成要素は３１８アミノ酸残基を有し、そしてプロリンがリッチである。これは短い９アミノ酸Ｃ−末端細胞外配列を有する。細胞内では、膜貫通セグメント付近でタンパク質は１２アミノ酸残基の推定上のカルシウム結合ループモチーフを含んでなる。細胞内セグメントは有力なプロテインキナーゼＣリン酸化部位も含んでなり（Ｔｈｒ１５９で）、これはＰＫＣδによるＰＬＳの調節の原因となり得る。さらにタンパク質はパルミトイル化された１以上の細胞内システイニル残基を含んでなる。恐らくこれらチオエステル結合パルミテート側鎖がカルシウム結合ループのホールディングを決定する役割を有することができ、あるいはそれらは内層リン脂質運動の強化に直接機能できる。おそらくＰＬＳが複合体の部分であり、ＰＬＳの活性を補助する補助的近隣構造タンパク質単位（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｎｅｉｇｂｏｒｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｉｔｓ）を有するということである。恐らくＰＬＳはオリゴマーとして作用するかもしれない（非特許文献３８）。したがってＰＬＳタンパク質の構成要素（１つまたは複数）；あるいは該タンパク質（１つまたは複数）、該タンパク質（１つまたは複数）のマルチマーおよび／または付随する構造単位を含んでなる複合体、のいずれかが本発明の内容におけるＰＬＳの定義の範囲に入る。
【００１２】
今日まで、ＰＬＳ活性は形質膜のリン脂質成分の膜内分布に及ぼすその効果に関連して、すなわち膜の内層および外層間のリン脂質分布について記載されてきた。
【非特許文献１】
Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１１１３−３１１１７，１９９７
【非特許文献２】
Ｂａｓｓｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７２０５−１７２１０，１９９６
【非特許文献３】
Ｂｅｖｅｒｓ，ＥＭ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７３６：５７−６６，１９８３
【非特許文献４】
Ｂｅｖｅｒｓ，ＥＭ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４３９：３１７−３３０，１９９９
【非特許文献５】
Ｂｕｒｓｃｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１３：２４５−２５１，１９９２
【非特許文献６】
Ｄａｌｅｋｅ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８６：１０８−１２７，２０００
【非特許文献７】
Ｅａｓｔｍａｎ，Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ２：２７５−２８０，１９９０
【非特許文献８】
Ｆｒａｓｃｈ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３０６５−２３０７３，２０００
【非特許文献９】
Ｈｏｆｓｔｒａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：２０９−２１２，２０００
【非特許文献１０】
Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ−Ｍａｒｃｈｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５１３４−５１３９，２００１
【非特許文献１１】
Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．，２８：１２２６−１２２７，１９９６
【非特許文献１２】
Ｍｏｍｃｈｉｌｏｖａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８１：２９５−３０１，２０００
【非特許文献１３】
Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７０４９−１７０５７，１９８９
【非特許文献１４】
Ｓｕｌｐｉｃｅ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６３４７−６３５４，１９９４
【非特許文献１５】
Ｖａｎ−Ｅｎｇｅｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｙｔｏｍｅｔｒｙ，３１：１−９，１９０８）
【非特許文献１６】
Ｖｅｒｈｏｖｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１５９７−１６０１，１９９５
【非特許文献１７】
Ｗｉｅｄｍｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１４６７：２４４−２５３，２０００
【非特許文献１８】
Ｗｙｌｉｅ，ＡＨ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ  ６８：２５１−３０６，１９８０
【非特許文献１９】
Ｚｈａｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６０３−６６０６，１９９８
【非特許文献２０】
Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８２４０−１８２４４，１９９７
【非特許文献２１】
Ｗｙｌｉｅ，ＡＨ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８０
【非特許文献２２】
Ｂｕｒｓｃｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２
【非特許文献２３】
Ｖａｎ−Ｅｎｇｅｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８
【非特許文献２４】
Ｂｅｖｅｒｓ，ＥＭ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９
【非特許文献２５】
Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献２６】
Ｈｏｆｓｔｒａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献２７】
Ｂｅｖｅｒｓ，ＥＭ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８３
【非特許文献２８】
Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ−Ｍａｒｃｈｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献２９】
Ｖｅｒｈｏｖｅｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５
【非特許文献３０】
Ｓｕｌｐｉｃｅ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９４
【非特許文献３１】
Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９
【非特許文献３２】
Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献３３】
Ｂａｓｓｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献３４】
Ｚｈａｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８
【非特許文献３５】
Ｆｒａｓｃｈ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献３６】
Ｗｉｅｄｍｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献３７】
Ｆｒａｓｃｈ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【非特許文献３８】
Ｄａｌｅｋｅ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００
【発明の開示】
【００１３】
発明の要約
本発明は発明者による細胞への薬剤輸送体（ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）としてＰＬＳの活性の知見に基づく。さらに発明者は、多くがＰＬＳが活性化されている細胞への選択的膜貫通輸送にＰＬＳを利用できるリン脂質構造をもたない化学化合物を特性決定した。
【００１４】
すなわち本発明に従い、ＰＬＳが媒介する輸送をＰＬＳ輸送系が活性化されている細胞へ分子を選択的に標的とするための基礎として、および治療的および診断的目的にそのような細胞と他の細胞型との間を識別する方法として使用する。
【００１５】
ＰＬＳが活性化されている細胞へ化学化合物を迅速に輸送するためのＰＬＳ−依存的メカニズムは今後、「ＰＬＳ−依存的輸送（ＰＬＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ＰＤＴ）」と称する。
【００１６】
ＰＤＴにより送達される化合物は今後、「ＰＬＳ−依存的に輸送される化合物（ＰＬＳ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ：ＰＤＴＣ）」と称する。
【００１７】
本発明の内容において用語「ＰＤＴ−活性化細胞（ＰＤＴ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」は、異なる型（例えば異なる組織、異なる系統等）のいずれかの細胞と比較して、より高いＰＬＳ活性：または同じ種類の正常な（健康、静止）細胞と比較して、病気の細胞または特定の病理学的または生理学的改変を示す細胞中に見いだされるより高い活性を現す細胞を意味する。好ましくはＰＤＴ−活性化細胞はアポトーシス細胞（特にアポトーシスの初期段階の細胞）、活性化を受けている細胞（例えば活性化血小板または活性化炎症性細胞）および損傷細胞（例えば損傷した赤血球）から選択される。対照的に、健康な、静止細胞は有意なＰＤＴ活性を現さず、それゆえにＰＤＴ活性化細胞とは考えられない。したがって本発明は治療的および診断的目的にＰＤＴをこれらの細胞群間を識別する方法として利用する。
【００１８】
本発明の内容において用語「選択的標的化（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」は、医薬として有用な薬剤（ｍｅｄｉｃｉｎａｌｌｙ−ｕｓｅｆｕｌ  ａｇｅｎｔ）の非ＰＤＴ−活性化細胞への薬剤の結合および／または侵入（ｅｎｔｅｒｉｎｇ）の速度よりも、ＰＤＴ−活性化細胞への結合／侵入が有意に高い速度であることを意味する。本発明の内容において医薬として有用な薬剤という用語は、診断的または治療的活性を有するＰＤＴＣと定義する。医薬として有用な薬剤は１分子、１つの型の分子または２以上の分子の結合物のいずれかを含んでなり、これにより１以上の分子がＰＤＴＣ機能を提供し、そして１以上の分子が診断的または治療的活性を提供する。時には同じ分子がＰＤＴＣおよび診断または治療機能の両方を提供することができる。
【００１９】
本発明は、リン脂質スクランブラーゼ（ＰＬＳ）輸送系が活性化されている細胞（ＰＤＴ−活性化細胞）に医薬として有用な薬剤を選択的に標的とするための方法に関し、ここで医薬として有用な薬剤はＰＬＳ−依存的に輸送される化合物（ＰＤＴＣ）であり、この方法は：薬剤を細胞に投与し、これによりこれらの細胞に選択的な薬剤の輸送を引き起こす、ことを含んでなる。
【００２０】
また本発明は、製薬学的に許容され得る担体およびＰＤＴ−活性化細胞を選択的に標的とする医薬として有用な薬剤（該医薬として有用な薬剤はＰＤＴＣである）を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
【００２１】
また本発明により提供されるのは、ＰＬＳによりＰＤＴ活性化細胞へ輸送され得るＰＤＴＣである医薬として有用な薬剤の、該細胞への薬剤の選択的標的化のための製薬学組成物の調製のための使用である。
【００２２】
ＰＤＴおよびそれにより輸送されるそれらＰＤＴＣの驚くべき知見により、幾つかの用途が導かれる。本発明の用語「診断的観点（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔ）」の１つの観点に従い、ＰＤＴはＰＤＴ−活性化細胞、例えばアポトーシス細胞（好ましくはアポトーシスの初期段階の細胞）、損傷細胞または活性化細胞（血小板、炎症性細胞および白血球のような）に診断用化合物を輸送するために使用することができる。これらの診断的目的に関して、ＰＤＴＣはマーカー部分を含んでなる診断用化合物そのものであるか、または担体部分をもつ診断用化合物の結合体（該結合体はＰＤＴＣ活性を有する）のいずれかである。用語「診断用ＰＤＴＣ（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＤＴＣ）」は、本発明に従い診断的目的に利用されるＰＤＴＣを示すために使用する。
【００２３】
用語「マーカー部分（ｍａｒｋｅｒ  ｍｏｉｅｔｙ）」は、視覚的または道具による手段［蛍光標識、放射性標識、Ｘ−線画像用の標識、ＣＴスキャン、一光子発光コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放出形断層撮影法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の標識等を含む部分のような］でそのシグナルの同定を可能とする特性を有する診断的ＰＤＴＣ内の部分を示す。ＰＤＴＣは放射性同位体であり得る画像用のマーカー、例えば９９ｍテクネチウム、１１１インジウムまたは１２３Ｉ、ＭＲＩ用のマーカー（例えばガドリニウム）、コンピューター断層撮影用（ＣＴ）のマーカーまたはＰＥＴ用のマーカー（例えば１８Ｆ）を含んでなることができる。マーカーが金属イオンである時、ＰＤＴＣはマーカーの錯化のためにキレーターも含んでなることができる［例えばテクネチウムの錯化用にモノアミン−モノアミド−ビスチオールまたはビス−（アミノエタンチオール）を含んでなるキレーターのようなＮ２Ｓ２キレーター］。場合によってはＰＤＴＣは蛍光特性のような固有の画像特性も有する。
【００２４】
本発明の診断的観点による方法には、ＰＤＴ−活性化細胞中のマーカー部分の検出を含む。ＰＤＴ活性化とアポトーシスのプロセス、細胞活性化または細胞損傷との間の直接的相関により、診断的ＰＤＴＣの投与でこのような画像手段により組織から得られるシグナルは、上記の任意のプロセスを受けている組織内の細胞数またはフラクションの分析および定量に使用することができる。
【００２５】
本発明の診断的観点は、例えばアポトーシス細胞、特にアポトーシスの初期段階の細胞、損傷細胞または活性化細胞、特にそれら活性化の初期の細胞を検出するために利用することができる。活性化細胞は例えば活性化血小板であることができ；活性化血小板の検出は凝血または凝血による血管閉塞の危険性の評価を可能とする。活性化細胞は活性化炎症性細胞または白血球であることもでき、この場合、診断的ＰＤＴＣは炎症プロセスの診断を可能とすることができる。
【００２６】
本発明の用語「治療的観点（ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔ）」の別の観点によれば、ＰＤＴはＰＤＴが活性化される細胞［例えば、アポトーシス（特に死のプロセスの初期段階）の細胞、活性化血小板のような活性化を受けている細胞（特に活性化の初期段階の細胞）、または損傷細胞］に治療物質を標的化するか、または輸送するために使用することができる。標的化は細胞の生物学的活性をモジュレートし（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）（下方（ｄｏｗｎ）または上方（ｕｐ）モジュレーション）、細胞を傷害から保護し、病理学的プロセスを逆転させ、または細胞死を強化する等の目的に使用することができる。用語「治療用ＰＤＴＣ」は標的細胞内で上に挙げたような効果を発揮するために、細胞中に選択的に送達されるＰＤＴＣを示すために使用する。用語「エフェクター部分（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｏｉｅｔｙ）」は、いったんに細胞に結合そして内在化されれば（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）細胞に所望の効果を誘導する、ＰＤＴＣ内に含まれる部分を示すために使用する。該所望の効果は特に、細胞の生物学的活性をモジュレートし、細胞を傷害から保護し、病理学的プロセスを逆転させ、または細胞死のプロセスをモジュレートすることを含んでなる治療効果である。
該治療的目的に関して、ＰＤＴＣはエフェクター部分そのものであるか、またはエフェクター部分と担体部分の結合体のいずれかであり、該結合体はＰＤＴＣ活性を有する。アポトーシス細胞について、該治療物質は好ましくは細胞死をモジュレートする（強化またはそれからの保護のいずれか）物質である。活性化血小板またはアポトーシス細胞については、該治療物質は好ましくは血液凝固を調節する物質である［例えば抗凝固剤、繊維素溶解（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ）剤または抗血小板剤（血小板凝集のインヒビターのような）］。活性化炎症性細胞について、該治療物質は好ましくは抗−炎症剤、または免疫系をモジュレーションすることができる薬剤である（すなわち、免疫−調節剤（ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ））。そのような炎症性細胞は、例えば白血球またはマクロファージであり得る。
【００２７】
治療的観点に従い、本発明の方法はＰＤＴ−活性化により傷付けられた細胞または組織（すなわちアポトーシス細胞；血小板または白血球のような活性化細胞；または損傷細胞）に選択的に薬剤を送達することによる疾患の処置を改善するために利用することができる。
【００２８】
時にはＰＤＴＣまたは医薬として有用な薬剤はその全体として細胞に影響を及ぼすか、または細胞を検出する目的のいずれかの目的に役立つ（それぞれ治療的または診断的観点に従う）。しかしまたは、ＰＤＴＣは定めたマーカー部分またはエフェクター部分、場合により、および担体を含んでなることができ、ここで該担体はマーカー部分またはエフェクター部分と一緒に結合してＰＤＴＣを形成する。ＰＤＴＣは診断的および治療的目的の両方で作用することができる部分を含んでなることができる。
【００２９】
治療的観点の１つの態様に従い、ＰＤＴＣは本質的に即座の効果のために細胞に送達される。治療的観点の別の態様に従い、ＰＤＴＣは後に細胞内でのエフェクター部分の漸次的な放出を目的として、ＰＤＴが活性である細胞（例えばアポトーシスの初期段階の細胞、血小板または炎症性細胞のような活性化細胞、または損傷細胞）中に治療的物質の貯蔵を作成するために送達される。場合により放出はＰＤＴ−依存的プロセスであり、すなわちここでＰＤＴは細胞に薬剤を標的とするために作用するだけではなく、後に細胞内の貯蔵から薬剤の遅れた徐放性を可能とするためにも作用する。この態様に従う治療的ＰＤＴＣの例は、血液凝固をモジュレートできる分子である。血液凝固をモジュレートできるＰＤＴＣは、最終的に中に蓄積する凝血内の活性化血小板またはアポトーシス内皮細胞を本発明に従い標的とする抗凝固剤、抗血小板剤および繊維素溶解剤から選択することができる。このようにＰＤＴＣは血栓プロセスのその場、すなわち血栓形成の部位で阻害効果を発揮することができる。この態様に従う治療的ＰＤＴＣの別の例は、抗−炎症剤または免疫−調節剤であり、すなわち炎症の焦点を標的とし、またはアポトーシスの焦点を標的とするアポトーシスのモジュレーター（インヒビターまたはエンハンサー）である。
【００３０】
最後に上記の知見はアポトーシス、損傷または活性化細胞を標的とする新規化合物のスクリーニングおよび探索のための方法を導く。そのような化合物の同定は診断または治療的目的のいずれかに望ましい可能性を有する。そのようなスクリーニング法はそれらのＰＤＴＣとして役立つ能力について化合物をスクリーニングすることに基づくことができる。
【００３１】
本発明によるＰＤＴＣは以下の特性を有する：
（ａ）ＰＤＴＣの細胞への輸送は該細胞のＰＬＳの活性化で増加し、該活性化は例えば細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇から生じる；および
（ｂ）ＰＬＳが活性化されている細胞へのＰＤＴＣの輸送は、適切な条件下での該細胞のＰＬＳの阻害（例えばＣａ２＋の除去による）、またはＰＫＣδの阻害（例えばロッテレリン（ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ）のようなインヒビターによる）で減少する（Ｆｒａｓｃｈ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００３２】
好ましくは本発明によるＰＤＴＣは以下のさらなる特徴のうちの１つ、または両方を有する：
（ｃ）ＰＤＴＣは両親媒性構造、すなわち親水性および疎水性部分の両方を有し；好ましくは疎水性部分が芳香族基（１つまたは複数）、脂肪族基（１つまたは複数）、金属原子（１つまたは複数）を含んでなる疎水性金属キレート（１つまたは複数）およびそれらの組み合わせから選択され；好ましくは親水性部分は生理学的条件で荷電しており；有利には該親水性部分は両イオン状であるか、あるいは生理学的条件下で負に荷電した基である。別の好適な態様では、該疎水性金属キレート（１つまたは複数）はテクネチウムを含んでなる。
（ｄ）ＰＤＴＣはリン脂質膜層に親和性を有し；該親和性は、例えば少なくとも１０：１のオクタノール：水分配係数を特徴とする。
【００３３】
ＰＤＴＣが２つの部分を含む場合（すなわち１方のマーカー部分またはエフェクター部分、そしてもう１方の担体部分）、２つの間の連結は細胞内で開裂されるように設計され、これによりマーカー部分またはエフェクター部分が放出される。好ましくは該開裂は細胞内酵素により行われる。
【００３４】
ＰＤＴＣがアポトーシス細胞または損傷細胞であるＰＤＴ−活性化細胞を標的とする薬剤を含んでなる場合では、薬剤は好ましくは細胞死のモジュレーターである。有利なことには該薬剤はアポトーシスのインヒビターまたはエンハンサーである。
【００３５】
例えばアポトーシスの阻害は、慢性の内科的障害（例えば神経変性障害）または心筋梗塞または脳卒中のような急性の内科的障害のいずれかの処置に望ましくなり得る。そのような場合、ＰＤＴＣは例えばカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）インヒビター、Ｂｃ１−２のモジュレーター、酸化防止剤または他の細胞−保護的（ｃｙｔｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）化合物でよい。
【００３６】
細胞死の強化は、例えば欠陥性の有害な細胞の排除が強化されるべきである癌の処置に必要となり得る。本発明の１態様は腫瘍組織中のアポトーシスを誘導または強化することができる抗癌剤、細胞傷害剤を含んでなるＰＤＴＣである。
【００３７】
ＰＤＴ−活性化細胞が活性化血小板である場合には、本発明の方法により活性化血小板を標的とするＰＤＴＣは血小板活性のインヒビター（例えば血小板凝集のインヒビター）、血液凝固のインヒビターまたは繊維素溶解剤であることができる。
【００３８】
ＰＤＴ−活性化細胞がリンパ球またはマクロファージのような活性化された白血球（ＷＢＣ）である場合には、本発明の方法により標的とされる薬剤は抗炎症剤、免疫−調節剤またはマクロファージ活性のモジュレーターであることができる。
【００３９】
任意に本発明のＰＤＴＣは侵入した後に細胞内にＰＤＴＣのトラッピング（ｔｒａｐｐｉｎｇ）を強化することができる部分（今後、「トラッピング強化部分（ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ：ＴＥＭ）」も含んでなることができる。この部分は薬剤が侵入した後に細胞から薬剤の流出を下げることを援助することを目指す。好ましくは該ＴＥＭは細胞に侵入した後に選択的にＰＤＴＣから解離する基を含んでなるので、該解離の生成物は例えばその脂質溶解性または静電的特性により細胞の内側に維持される。そのような解離は細胞内酵素による開裂によることができる（例えばエステラーゼ）。
【００４０】
治療用ＰＤＴＣのエフェクター部分は、上記のように担体部分に結合した、その治療活性が知られている薬剤でもよい。該薬剤はこのようにＰＤＴ活性化を受けている細胞、組織または器官を選択的に標的とすることができる。いったん薬剤が標的に到達すれば、薬剤はその治療活性をそこで発揮することができる。この薬剤は未だに結合体の一部である時、またはそれらから外れた後（例えば天然の酵素活性により、または任意の既知の他のメカニズムにより成された開裂、破壊等による）のいずれかで治療活性を発揮することができる。該ＰＤＴＣがＴＥＭを含んでなる場合には、該ＴＥＭは細胞内で薬剤の蓄積を増すように作用することができる。
【００４１】
エフェクター部分は組成物が意図する特異的な疾患に従い選択するべきである。神経変性障害、脊髄形成異常症候群、ＡＩＤＳ、種々の虚血性または毒性損傷または臓器移植後の移植片損失のような疾患が不適切および過剰なアポトーシスにより現れる場合には、、薬剤は好ましくはアポトーシスを阻害することができるべきである。中でもそのような薬剤は、カスパーゼインヒビター、酸化防止剤または他のアポトーシス−阻害剤であることができる。
【００４２】
抗癌プロトコールの効力を強化するために、ＰＤＴＣはエフェクター部分として抗癌剤を含んでなることができる。抗癌プロトコールの強化は以下のいずれかにより達成される：（１）該抗癌剤の癌組織への標的化；異常に過剰なアポトーシスは異常な組織増殖に平行してしばしば腫瘍内で発生し、そして該アポトーシスは腫瘍の活発度（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）のレベルに正に相関することが多い；あるいは（２）アポトーシスの２つの波（ｗａｖｅ）の使用：第１の波は、腫瘍内のアポトーシスプロセスを開始／上昇させることを目的とした標準的な化学療法または放射線療法剤を使用することにより達成され；続いてアポトーシスの第２の波は、抗癌剤を含んでなるＰＤＴＣにより誘導され、該ＰＤＴＣを第１の波により生じたアポトーシスの焦点に標的化する。本発明の方法のこのような態様により、抗癌剤を含んでなるＰＤＴＣが腫瘍内のアポトーシスで傷つけられた領域に標的化され、これにより局所的な腫瘍を殺すプロセスが強化される。
【００４３】
疾患が血小板活性化に関係する場合には、エフェクター部分は好ましくは血小板活性および／または血液凝固を阻害することができる。そのようなエフェクター部分は抗血小板剤、抗凝固剤または繊維素溶解剤であり得るはずである。そのようなエフェクター部分は抗血小板剤、抗凝固剤または繊維素溶解剤であることができる。そのような疾患は例えば、アテローム硬化症、動脈または静脈血栓症、血栓−塞栓症、心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑症（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス等であり得る。
【００４４】
疾患が白血球（ＷＢＣ）またはマクロファージの過剰の活性化に関連する場合には、エフェクター部分は好ましくは抗炎症剤または免疫−調節剤であるべきである。中でもそのような障害には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫性障害、慢性関節リウマチ、強皮症または他の種類の結合組織障害；甲状腺炎；天疱瘡または結節性紅斑のような皮膚障害；自己免疫血液障害；重症筋無力症のような自己免疫神経障害；脈管炎；潰瘍性大腸炎のような炎症性腸障害等を含む。
【００４５】
また本発明は、ＰＤＴＣをスクリーニングし、そして同定するための方法に関し、すなわちアポトーシス、損傷または活性化細胞を選択的に標的とする新規化合物の探索に関する。本発明によるＰＤＴＣは、その細胞への輸送が細胞のＰＬＳ活性のレベルに対する依存に基づき選択することができる。したがって該細胞のＰＬＳ活性をモジュレートする条件を提供することにより細胞へのＰＤＴＣ輸送をモジュレートする能力は、そのようなＰＤＴＣを選択するための手段を提供する。該輸送は例えば細胞性ＰＫＣδ活性の操作および／または周辺Ｃａ２＋レベルの操作（温度およびｐＨのような生理学的条件下で）により制御することができ、例えばＣａ２＋およびＰＫＣδ活性の存在下で細胞への比較的急速な輸送を現すが、これら条件の少なくとも１つが存在しなければ輸送の低下を現す化合物はＰＤＴＣ候補であろう。
【００４６】
例えば化合物は活性化ＰＤＴを有する細胞とのインキューベーションによりスクリーニングされ、そして該化合物の該細胞への輸送をモニタリングすることができる。そのようなスクリーニングにより選択される化合物は、Ｃａ２＋の減少（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のようなＰＤＴを阻害する条件下でのそのような輸送についてさらにスクリーニングされ得る。
【００４７】
実際に、ＰＤＴＣとして役立つ可能性がある候補を同定するアッセイは、既知の濃度の種々の候補化合物を細胞の外側に置き、ＰＫＣδ活性を操作し、かつ／または周辺（細胞内および細胞外）Ｃａ２＋レベルを操作し、そして続いて細胞内の化合物レベルを測定することにより行うことができる。ＰＫＣδ活性の阻害はロッテレリンのようなこの酵素のインヒビターの投与により行うことができる。Ｃａ２＋レベルの上昇によるＰＤＴの活性化は、例えば細胞がインキューベーションされる培地中のＣａ２＋濃度を上げ、そしてＡ−２３１８７のようなカルシウムイオノフォアの同時投与により達成することができる。Ｃａ２＋濃度の減少によるＰＤＴの阻害は、それぞれＥＧＴＡ［エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸］およびＢＡＰＴＡ［１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸］のようなそれぞれ高親和性細胞外および細胞内Ｃａ２＋キレーターにより達成することができる（Ｍｏｍｃｈｉｌｏｖａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。細胞内薬剤レベルの測定は、当該技術分野で既知の標準的手順により行うことができる。
【００４８】
本発明の目的に関して、ＰＤＴの活性化で達成される細胞内濃度と、ＰＤＴの阻害で達成される細胞内濃度との間の比率は、好ましくは＞２であるべきである。
【００４９】
具体的な態様では、ＰＤＴＣとして役立つ可能性がある候補を同定するためのアッセイは：
（ａ）ＰＬＳおよびＰＫＣδが発現し、そして機能する細胞系を提供し、；
（ｂ）ＰＤＴの活性化に適する条件を提供し；
（ｃ）既知濃度の候補化合物を細胞系の外側に置き、そしてある時間の後に細胞内で達成された化合物の濃度を測定し；
（ｄ）工程（ａ）および（ｃ）を繰り返すが、工程（ｂ）をＰＤＴ活性が阻害される条件を提供することにより置き換える、
ことを含んでなる。
【００５０】
（ｄ）で測定された濃度に比べて、（ｃ）で少なくとも２倍高い細胞内濃度を有する化合物は、ＰＤＴＣとして役立つ可能性がある候補化合物である。好ましくはこの時間は３〜５分であるべきである。
具体的な態様の説明
本発明の方法においてＰＤＴＣとして使用することができる化合物の具体的な群は、出願人の同時係属ＰＣＴ出願第ＰＣＴ  ＩＢ／０１／０２２８２号パンフレットに記載され、そして式Ｃｅ（式中、ｅは１、２および３から選択され、そしてＣは式（Ｉ）：
【００５１】
【化１】
2004534001.tif 000003
【００５２】
ここで該Ｃ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてそして
式中、
Ｚはシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリール基またはそのような基の組み合わせを形成する環系を表し、該環系は５〜１０個の原子からなり；
ＸはＣＨ、ＣＨ２、Ｎ、ＮＨ、ＯまたはＳを表し；
ｎ、ｍ、ｒおよびｐは各々が独立して０または１であり；ここでｎ＋ｒ＝１；ｍ＋ｐ＝１；
Ｒ１基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてＡおよびＬ−Ａからなる群から独立して選択され、ここでＬ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてＤ、Ｕ、Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ、Ｄ−Ｕ−Ｏ、Ｏ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＮＨ、ＮＨ−Ｕ−Ｄ、Ｄ−Ｕ−ＤおよびＵ−Ｄ−Ｕからなる群から独立して選択され；
Ｕは水素を表すか、または場合により置換されたＣ１−Ｃ１０アルキレン、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン、Ｃ３−Ｃ１０分枝アルキレン、Ｃ３−Ｃ１０分枝アルケニレン、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリール、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニレン、ヘテロアリールおよび該基の任意の組み合わせから選択され；
ＤはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＮＨ、ＰＯ、ＰＯ２、ＰＯＯＨ、ＰＯ（ＮＨ）２、ＮＨＰＯＯＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＳＯ２ＮＨＣＨＣＯＯＨ、ＳＯ２ＮＨＣＯまたはＤが二価の基である時に上記リストからの対応する意味からなる群から選択され；
Ａ基は各々が同じかまたは異なってもよく、そしてｅが１である時、約７のｐＨで荷電した部分であるか；あるいはｅが２または３である時、Ａ基は極性の非荷電部分および約７のｐＨで荷電した部分から独立して選択され、該荷電した部分は正に荷電しているか、または負に荷電しているか、または両イオン状態であり；
Ｒ２はＷＲ３ｂであり、ここでＷは不存在であるか、または２級または３級アミン、酸素、硫黄およびＤからなる群から選択され、ここでＤは上記定義の通りであり；
ｂは１、２または３であり、
Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルキルおよびＣ３−Ｃ８分枝アルケニルから選択され、そしてｂが２または３である時、Ｒ３置換基は同じかまたは異なってもよく、そして
ｅが２または３である時、Ｃ基は直接的にまたはＬ部分を介して互いに連結する、  を有する基である）
を有する化合物（式（Ｉ）の構造の製薬学的に許容される得る塩および水和物を含む）である。
【００５３】
式ＣｅのＰＤＴＣは上記に定義したようなマーカー部分またはエフェクター部分を含んでなるか、またはＬ基を介してマーカー部分またはエフェクター部分に結合することができ、ここでＬ基は上記定義の通りである。
【００５４】
ＰＤＴＣの具体例は以下の通りである：
−式（Ｖ）：
【００５５】
【化２】
2004534001.tif 000004
【００５６】
式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４基は同じかまたは異なってもよく、そして水素、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨ２および−Ｎ＋（ＣＨ３）３から独立して選択され；Ｍは不存在、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２、（ＣＨ２）２−、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ、Ｎ（ＣＨ２）ｋＣＨ（ＣＯＯＨ）およびＮ＋（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｋＣＨ（ＣＯＯＨ）から独立して選択され；Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４基は同じかまたは異なってもよく、そして不存在または（ＣＨ２）ｋから選択され、ｋは１〜６の整数であり、そしてＲ３は水素またはＣ１−Ｃ６アルキルを表す、
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）；
−式（ＶＩＩ）：
【００５７】
【化３】
2004534001.tif 000005
【００５８】
式中、
Ｒ３置換基は同じかまたは異なってもよく、そして水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ３−Ｃ８分枝アルキルおよびＣ３−Ｃ８分枝アルケニルからなる群から独立して選択され、ｙは２〜６の整数を表し、ｚは１〜６の整数を表し、そしてＴは不存在、水素およびメチルから選択される、
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）；
−式（ＶＩＩＩ）：
【００５９】
【化４】
2004534001.tif 000006
【００６０】
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）；
−式（ＩＸ）：
【００６１】
【化５】
2004534001.tif 000007
【００６２】
式中、Ｒ３は水素またはメチルを表す
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）；Ｒ３がメチルである場合、化合物はＮＳＴ８３０と命名されている。
−今後ＤＤＬとも称する式（Ｘ）：
【００６３】
【化６】
2004534001.tif 000008
【００６４】
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）；および
−今後ＤＤＣとも称する式（ＸＩ）：
【００６５】
【化７】
2004534001.tif 000009
【００６６】
の化合物（それらの製薬学的に許容され得る塩および水和物を含む）。
アポトーシス性のＰＤＴ−活性化細胞を特徴とする疾患
神経変性障害（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病）、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、虚血性（例えば心筋梗塞、脳卒中）または毒性損傷、臓器移植後の移植細胞損失のような過度のアポトーシスの発生を特徴とする疾患。アテローム硬化症斑、特に脆弱（ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ）／不安定な斑も、内皮細胞、平滑筋細胞およびマクロファージのアポトーシスを特徴とする。腫瘍および特に高度に悪性／活発な腫瘍も過剰な組織増殖に加えて、アポトーシス細胞数の上昇を特徴とする。
細胞活性化（例えば活性化血小板または活性化白血球）によるＰＤＴ−活性化細胞を特徴とする疾患
１．過剰な血液凝固により現れる疾患、ここでＰＤＴ活性化は血小板活性化中、かつ／または他の細胞要素（例えば内皮細胞）の活性化または傷害中に起こる。中でもこれらの疾患には動脈および静脈血栓症、血栓−塞栓症（心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症（ＤＩＣ）、血栓性血小板減少性紫斑症（ＴＴＰ）、鎌状赤血球症、サラセミア、抗リン脂質抗体症候群、全身性エリテマトーデス；不安定なアテローム硬化症斑を含む。
２．ＷＢＣまたは組織マクロファージの活性化に関係する炎症性または免疫性疾患；中でもこれらの疾患には全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫性障害、慢性関節リウマチ、強皮症または他の種類の結合組織障害；甲状腺炎；天疱瘡または結節性紅斑のような皮膚障害；自己免疫血液障害；重症筋無力症のような自己免疫神経障害；脈管炎；潰瘍性大腸炎のような炎症性腸障害、臓器移植拒絶等を含む。
【００６７】
これらの病的状態、障害または疾患の検出は、単に具体的な個体の疾患状態の存在を診断するためにそれ自体が目的となり得る。
【００６８】
上記検出は疾患の重篤度、疾患の経過の特徴またを評価する目的で、あるいは種々の治療の使用様式に対する応答を監視するために、疾患があることが知られている人にも行うことができる。そのような監視の例は、抗癌療法に対する応答の評価である。ほとんどの抗腫瘍剤はそれらの効果をアポトーシスの誘導により発揮する（Ｅａｓｔｍａｎ，Ａ．，１９９０）。したがってＰＤＴＣは抗癌療法により腫瘍に誘導されたアポトーシスを検出するために有用となり得る。腫瘍細胞中のＰＤＴＣ活性化の検出を介したそのようなアポトーシスの画像は、腫瘍細胞の死を誘導する処置の使用様式の効力をより良く、しかも直接評価することにより、抗癌処置の至適化を可能とするはずである。
【００６９】
さらに該検出は抗癌処置の悪影響を監視するために使用することができる。そのような悪影響の大部分は、胃腸管表皮または骨髄造血系のような正常で未だ感受性細胞における抗癌処置による望ましくないアポトーシスの誘導による。そのようなＰＤＴＣを使用したアポトーシスの検出は、そのような望ましくない組織傷害の初期診断および該処置プロトコールのより良い至適化を可能とすることができる。
【００７０】
さらに、該検出は腫瘍内で本来のアポトーシス負荷量（ｌｏａｄ）（すなわちアポトーシスを受けている細胞の画分）の特性決定も目指してもよく；該負荷量は腫瘍の活発度と相関することが多いことも知られている。該アポトーシス負荷量の検出は転移の検出も補助することができる。
【００７１】
同様に、本発明の方法により検出される可能性があるアポトーシスは移植片拒絶中の細胞損失に主要な役割を果たすので、ＰＤＴＣは臓器移植後の移植片の生存を監視するために有用となり得る（Ｍａｔｓｕｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００７２】
加えて、該検出は細胞死の評価の測定を可能とすることにより、細胞−保護的処置に対する応答を監視することを目指し、細胞死の阻害を目指し、すなわち種々の疾患（例えば上記に挙げたような）に関してそのような活性を表すことができる薬剤をスクリーニングし、そして開発することを目指すことができる。
【００７３】
検出はアポトーシス、細胞活性化または細胞損傷の研究で、インビトロまたはインビボの両方でＰＤＴ活性化に伴う生理学的または病理学的条件下での組織培養または動物実験で、基礎的な研究目的のために行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
図面および実験手順の詳細な説明
図１：Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗−Ｆａｓ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）で３時間処理した。結果として著しい割合の細胞がアポトーシス性（すなわちＰＬＳ−活性化細胞）となった。引き続きＰＬＳの阻害に関して、カルチャーを次に３０分間、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）およびＢＡＰＴＡ（２０μＭ）で処理した（すなわちＰＬＳ−阻害カルチャー）。両方のカルチャーをＤＤＬ（１μＭ、２分）で処理し、そして蛍光顕微鏡（オリンパス：Ｏｌｙｍｐｕｓ）で視覚化した：
（ａ）ＰＬＳ−活性化カルチャー：幾つかの細胞はＤＤＬ結合を現し、これらの細胞にアポトーシスプロセスが起こっていることを反映している。ＤＤＬはアポトーシス細胞に内面化され、細胞質を染めるが核は染めないことが示される。
【００７５】
（ｂ）ＰＬＳ−阻害カルチャー：ＤＤＬ−結合の強度に顕著な減少が観察される。
【００７６】
（ｃ）阻害された−ＰＬＳの再活性化：（ｂ）と同じカルチャーへのＣａ２＋（１ｍＭ）およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（２μＭ）の投与によるＰＬＳの再活性化は、強力なＤＤＬ取り込みの再獲得を生じた。倍率は×４００。
【００７７】
図２：ＨｅＬａ細胞はカルチャーを９６時間、成長培地を交換せずにインキューベーションすることにより成長させた（ａｇｅ）。結果として、顕著な割合の細胞がアポトーシス性となった。次いで細胞をＤＤＬ（１μＭ、２分）と異なる３つの条件下でインキューベーションした：上記のようなＰＬＳ−活性化；ＰＬＳ−阻害；および阻害された−ＰＬＳの再活性化。蛍光強度（幾何平均）値の定量的分析を示す。
【００７８】
図３：培養したＪｕｒｋａｔ細胞（Ａ）を抗−Ｆａｓ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）によるアポトーシスを受けるように３時間誘導した。続いて両方の対照細胞（ＡおよびＣ）およびアポトーシス細胞（ＢおよびＤ）を次に５０μＭのＤＤＣと１μＭのロッテレリン（ＰＫＣδのインヒビター）の存在下（ＣおよびＤ）および不存在下（ＡおよびＢ）でインキューベーションした。ＦＡＣＳ分析の前に、細胞はプロピジウムヨージド（ＰＩ）（細胞死の後期中の膜崩壊（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のマーカー）でも同時染色した。ドットプロットで示すように、左下方形（ｑｕａｄｒａｎｔ）は健康な細胞の非染色画分を示す。右下方形はアポトーシスの初期段階で新たに形成された細胞群を示す。これらの細胞はＰＬＳ−活性化細胞であり、未だ膜の統合性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持し、そしてＰＩを排除している。ＤＤＣおよびＰＩの両方に結合する細胞、すなわちアポトーシスの後期の細胞は、右上方形に表す。アポトーシスの誘導は、顕著で明確なアポトーシスプロセスの初期段階の細胞群の発生を伴い、ＤＤＣに選択的に結合し、そして右下方形のプロットを占める。ロッテレリンによるＰＬＳの阻害はこの細胞群を著しく減少させた（４６％から７．９％、それぞれＢ対Ｄ）。ＵＶ軸はＤＤＣの蛍光強度を示し；ＦＬ２軸はＰＩの蛍光強度を示す。
【００７９】
図４：Ｊｕｒｋａｔ細胞は抗−ＦａｓＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）を用いた３時間の処理によりアポトーシスを受けるように誘導した。引き続き、細胞を５０μＭのＤＤＣおよびＰＩを用いて１ｍＭのＣａＣｌ２の存在下またはカルシウム欠乏条件下（すなわちカルシウムキレーターＢＡＰＴＡおよびＥＧＴＡの同時投与）で同時にインキューベーションした。ＤＤＣおよびＰＩの結合をＦＡＣＳにより評価した。
【００８０】
図４：ＡおよびＣ：対照細胞；ＢおよびＤ：アポトーシス細胞；ＡおよびＢ：Ｃａ２＋を含む；ＣおよびＤ：Ｃａ２＋欠乏。各ドットプロットの下左方形は、健康な細胞の非染色画分を表す。下右方形はＰＬＳの活性化を特徴とするが未だ膜の統合性を維持しているアポトーシスの初期段階の新たに形成された細胞群を表す。示したように、これらの細胞は顕著なＤＤＣ結合を現す一方、ＰＩを排除する。しかし初期アポトーシスでの細胞へのＤＤＣ結合は、カルシウム欠乏によるＰＬＳの阻害で著しく失われた（Ｂ対Ｄ）。
【００８１】
図４Ｂはアポトーシスの初期で細胞によるＤＣＣの取り込みの定量を示す（実線、暗いカラム）。取り込みはＣａ２＋欠乏を介するＰＬＳの阻害により遮断された。内部対照として、アポトーシスプロセスの後期段階における細胞へのＤＤＣの結合は、点のカラムにより示す。これらの細胞で細胞膜の統合性が失われると、分子はＰＬＳとは無関係に細胞へ自由に入ることができ、それ故にアポトーシスプロセスの後期段階におけるこれら細胞に及ぼすＣａ２＋欠乏によるＰＬＳ阻害の効果はないことが観察された。
【００８２】
図５：Ｊｕｒｋａｔ細胞は、パン−カスパーゼ（ｐａｎ−ｃａｓｐａｓｅ）インヒビターＺ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋの存在または不存在下で３時間、抗−ＦａｓＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）を用いた処理によりアポトーシスを受けるように誘導し、そして次にＤＤＣで５分間処理した。示すのは反応（ｅｖｅｎｔ）の数（カウント、ｙ−軸）  対  蛍光強度（ＵＶ、ｘ−軸）であり、これらの細胞に対するＤＤＣの結合を反映している。示すように、アポトーシスの誘導は顕著なＤＤＣ結合を現すアポトーシスの初期段階における大規模で明確な細胞群の出現を引き起こした（点−破線、ピークＢ）。パン−カスパーゼインヒビターを用いた処理（破線）は、対照のベースラインレベルの蛍光値への戻り（未処理細胞、実線、ピークＡ）により反映されるようにこのＤＤＣ結合を廃した。内部対照として重要なことは、重大な変化がアポトーシスの後期段階には細胞へのＤＤＣの結合において観察されなかったことであり（ピークＣ）、一方ＤＤＣ結合はＰＬＳ−依存的プロセスではなく、むしろ崩壊した膜を通る侵入であるということである。
【００８３】
図６：対照および活性化血小板を、３つの異なる条件下でＤＤＣ（５μＭの最終濃度）と同時インキューベーションした：さらなる処置なし；ＢＡＰＴＡおよびＥＧＴＡとのインキューベーションによるＣａ２＋−欠乏；およびＣａ２＋およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の再添加後のＣａ２＋の回復。次いで血小板をＦＡＣＳ分析に供した。
【００８４】
Ａ．ＦＡＣＳヒトスグラム；ＵＶ軸はＤＤＣの蛍光強度を表し、一方カウント軸は血小板の数を表す。完全な血小板（細い実線）はＤＤＣとのインキューベーションで低レベルの蛍光強度を示し、活性化血小板（太い実線）により現されるより高い蛍光値への有意なシフトは、顕著なＤＤＣ取り込みを反映している。Ｃａ２＋−欠乏で、低い蛍光値（点線）への血小板群のシフトにより反映されるようにＤＤＣ結合は著しく減少した。しかしＤＤＣ結合はＣａ２＋の回復で完全に回復した（破線）。
【００８５】
Ｂ．血小板群の異なる処理で、ＤＤＣ蛍光強度の幾何平均として算出した蛍光シグナルの定量。活性化血小板は対照に比べて蛍光の著しい強化を現し、ＰＬＳ活性化でのＤＤＣの選択的結合および取り込みを反映している。Ｃａ２＋欠乏によるＰＬＳ系の阻害はＤＤＣ取り込みを著しく減少させ、そして該結合は細胞内Ｃａ２＋の補充によるＰＬＳ−再活性化で完全に回復した。したがって活性化血小板によるＤＤＣの取り込みは、ＰＬＳ−依存的プロセスである。
【００８６】
図７  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、上記図３に記載したような抗−ＦａｓＡｂ処理によりアポトーシスを受けるように誘導した。引き続き細胞を５０μＭのＮＳＴ８３０と５分間インキューベーションし、ＰＩで同時染色し、そしてＦＡＣＳ分析にかけた。アポトーシス細胞でＰＬＳを阻害するために、２つの取り組みを使用した：
（ｉ）．Ｃａ２＋−欠乏：アポトーシス細胞はＢＡＰＴＡ（２０μＭ）およびＥＧＴＡ（１ｍＭ）の存在下で３０分間、室温でインキューベーションし、そして次にＮＳＴ８３０およびＰＩで上記のように染色した。
（ｉｉ）．ロッテレリンによるＰＬＳ阻害：ＮＳＴ８３０およびＰＩで処理する前に、アポトーシス細胞を０．５μＭのロッテレリンの存在下で４０分間インキューベーションし、そして次にＦＡＣＳ分析にかけた。
【００８７】
図７Ａは代表的なＦＡＣＳ分析のドットプロットを表し、ここで左下方形は健康な細胞の非染色画分を示し、右下方形はアポトーシスの初期段階で新たに形成された細胞群を示し、そして右上方形はアポトーシスの後期段階の細胞を表す。一方、対照カルチャー（ａ）は低い割合のアポトーシス細胞（４％）を特徴とし、アポトーシスプロセスの誘起はＮＳＴ８３０結合を特徴とする初期アポトーシスの大きな細胞群（６４％）を導く（ｂ）。Ｃａ２＋欠乏（ｃ）またはロッテレリン（ｄ）によるＰＬＳの阻害は、このＮＳＴ８３０結合群をそれぞれ５％および４％に減少させる。ＰＬＳの活性化および阻害は、後期アポトーシスの細胞群において変化を伴わない。ＵＶ軸はＮＳＴ８３０の蛍光強度を示す；ＦＬ２軸はＰＩの蛍光強度を示す。
【００８８】
図７Ｂは、ＰＬＳ系の活性化および阻害後の後期アポトーシス細胞への化合物の結合（実線カラム）に比べて、ＮＳＴ８３０に結合する初期アポトーシス細胞の群（明るい点のカラム）における相対的変化の定量を記載する。データは図７Ａから取る。後期アポトーシス細胞の細胞群はＰＬＳ系のモジュレーションによる影響を受けず、そして対照および抗−Ｆａｓ処理カルチャーの両方におけるＮＳＴ８３０−結合、ＰＩ−透過性細胞の割合は、Ｃａ２＋−欠乏またはロッテレリン処理にかかわらず影響を受けない。しかしアポトーシスを誘導すると、ＮＳＴ８３０には結合するがＰＩを排除する細胞、すなわち初期アポトーシスの細胞の割合に顕著な上昇がある。この上昇はＣａ２＋−およびロッテレリン−の両方に依存的である。Ｙ−軸は陽性反応の割合を示す。
【００８９】
図８：Ｊｕｒｋａｔ細胞をスタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）の処理によりアポトーシスを受けるように誘導した。続いてこれらの細胞をＤＤＣで処理した。アポトーシスの初期対後期段階における細胞によるＤＤＣ取り込みにおける相対的変化を、ＰＬＳ系の誘導および阻害後に提示する。示すのは３回の独立した実験から算出した陽性の初期または後期アポトーシス反応（平均値）の割合であり、ここでアポトーシス性カルチャーで観察される反応（初期または後期のいずれか）を１００％とする。後期アポトーシス細胞ではなく初期のＤＤＣの選択的蓄積を、スタウロスポリン処理の結果として検出した。Ｃａ２＋−欠乏またはロッテレリン処理は図１に記載のように行った。これら条件のいずれかによるＰＬＳ阻害は、初期アポトーシスの細胞へのＤＤＣの取り込みをそれぞれ１４％および３０％に劇的に減少させた。重要なことは、後期アポトーシスの細胞へのＤＤＣ結合はＰＬＳ系のモジュレーションによる効果が無いことであった。
実施例：
【実施例１】
【００９０】
ＰＬＳの不活性化はＤＤＬのアポトーシス細胞への輸送を阻害する：Ｃａ２＋−欠乏実験
培養したＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ２および抗体（１００単位／ｍｌ  ペニシリン；１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１２．５単位／ｍｌのニスタチン）を補充したＲＰＭＩ培地（ベイト−ヘメック（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ）、イスラエル）の懸濁液で成長させた。アポトーシスを誘導する前に、培地をＨＢＳバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ）と交換した。次いでアポトーシスは抗−ＦａｓＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ；３時間）の処理により誘起した。
【００９１】
そのような手順により、カルチャー内で大きな割合のアポトーシス細胞の蓄積が最高となる。次いでカルチャーは最終濃度１μＭのＤＤＬと５分間インキューベーションし、次いで蛍光顕微鏡用に直ちに採取した［オリンパス蛍光顕微鏡、モデルＩＸ７０、３６０ｎｍの励起波長、５３０ｎｍの発光］。
【００９２】
ＰＬＳが活性化されたアポトーシス細胞による選択的かつ迅速なＤＤＬの取り込みをカルチャー中で検出し、一方、アポトーシスを受けない完全な細胞は明白に有意なＤＤＬに結合しなかった（図１）。ＤＤＬ蛍光はこれらの細胞の細胞質で観察されたが、核内では観察されなかった。
【００９３】
ＰＬＳ活性のモジュレーションはカルシウム減少−補充手順（Ｍｏｍｃｈｉｌｏｖａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，２０００）により達成された。Ｃａ２＋−欠乏によるＰＬＳの阻害は、細胞を細胞外および細胞内錯化剤ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸  １ｍＭ）およびＢＡＰＴＡ−ＡＭ（［１，２−ビス（ｏ−アミノ−フェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸テトラ−（アセトキシメチル）エステル、２０μＭ）とそれぞれインキューベーションすることにより行った。そのような手順は細胞内または細胞外のいずれかに存在する可能性があるＣａ２＋の痕跡を排除する。アポトーシスを３時間誘導した後、細胞を該ＰＬＳ阻害に３０分間供した。次いで細胞をＤＤＬと５分間インキューベーションし、そして蛍光顕微鏡に供した。ＰＬＳの阻害は細胞によるＤＤＬ取り込みに顕著な低下を引き起こし、蛍光強度に顕著な減少を生じた。
【００９４】
ＰＬＳ−再活性化に関しては、ＥＧＴＡ／ＢＡＰＴＡ−処理細胞を今度はＣａＣｌ（１ｍＭ）およびカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（２μＭ、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ダームスタッド、ドイツ）で処理し、すなわち周辺のＣａ２＋レベルを上げた。そのようなＰＤＴ活性化で、アポトーシス細胞は迅速かつ選択的および顕著なＤＤＬ取り込みを現した。
【００９５】
ＰＬＳ活性に依存するアポトーシス細胞によるＤＤＬ取り込みは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によっても証明された。このために、培養し成長させたＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２．２）は、ＣａＣｌ（１．８ｍＭ）を含み、そして２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１２．５単位／ｍｌのニスタチンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。細胞を５×１０６細胞／プレートの密度で１０ｃｍ３の培養皿に１０ｍｌの容量でまき、そして成長培地を交換することなく９６時間、カルチャー中で成長させた。そのような手順により、カルチャー中でアポトーシス細胞の大きな割合が最高となる。カルチャー（１×１０７／ｍｌ）は次いでＨＢＳ中にて５分間、５μＭの最終濃度のＤＤＬとインキューベーションし、そしてベクトン−デッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）セルソーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して結合したＤＤＬを検出するためにＦＡＣＳ分析用に直ちに取り出した。励起は３６０ｎｍであり、そして発光は５３０ｎｍで測定した。
【００９６】
３つの異なる条件を調査した（図２）；アポトーシスプロセスによるＰＬＳ−活性化、ＰＬＳ−阻害；および阻害された−ＰＬＳの再活性化。アポトーシス細胞（すなわちＰＬＳ−活性化細胞）はより高い蛍光レベルへの明らかなシフトを現し、これら細胞への顕著な選択的ＤＤＬ結合を示す。Ｃａ２＋欠乏によるＰＬＳ阻害は、このシフトによりほぼ完全に廃止された。しかしＣａ２＋再投与によるＰＬＳの再活性化は、このシフトを回復し、すなわちＤＤＬ結合およびこれらの細胞への取り込みを回復した。
【００９７】
したがってこの実験は、ＰＬＳがＰＬＳ輸送体の活性化が起こる細胞、例えばアポトーシス細胞への化学化合物の迅速な膜貫通輸送のための有力な系であることを証明する。
【実施例２】
【００９８】
ＰＬＳの不活性化はＤＤＬのアポトーシス細胞への輸送を阻害する
培養したＪｕｒｋａｔ細胞は実施例１に記載したように成長させ、そして次にアポトーシスは抗−ＦａｓＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）で３時間処理することにより誘起し、これによりこれらの細胞にＰＤＴ活性化を誘導した。
【００９９】
アポトーシス細胞中のＰＬＳ活性を阻害するために、ロッテレリン（カルビオケム、ドイツ）を使用した。低用量のロッテレリンはプロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）の選択的阻害を発揮することを示し、これは次にＰＬＳの活性を調節する（Ｆｒａｓｃｈ，ＳＣ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。アポトーシスの誘導に続いて、細胞を１μＭ濃度のロッテレリンと４０分間インキューベーションし、次いで２５０μＭ濃度のＤＤＣを用いた処理に供し、そしてＦＡＣＳ分析のために直ちに採取した（図３）。
【０１００】
ロッテレリンの存在下で、アポトーシスの初期段階の細胞へのＤＤＣの結合に顕著な減少（右下方形）が観察され（４６％から７．９％）、ＰＬＳの不活性化が初期アポトーシスのこれら細胞によるＤＤＣ取り込みに阻害をもたらしたことを示した。重要なことは、アポトーシスの後期段階の細胞群（右上方形）が内部対照として役立ったことである。アポトーシスの後期段階の細胞は、ＰＬＳ活性にかかわらず膜の崩壊が化合物の細胞への侵入を導く。したがってこの細胞群はロッテレリンに応答したＤＤＣ結合に変化を現さず、これはアポトーシスプロセスの初期段階におけるＤＤＣの取り込みにおいて、ＰＬＳの上記役割をさらに強調していた。
【０１０１】
アポトーシス細胞におけるＰＬＳ活性の阻害は、周辺Ｃａ２＋レベルの減少によっても達成された。アポトーシスの誘導後、対照およびアポトーシス細胞の両方（１×１０７細胞）をＢＡＰＴＡ（２０μＭ）およびＥＧＴＡ（１ｍＭ）を用いて３０分間、同時処理することによりＣａ２＋欠乏に供した。次いで細胞をＤＤＣ（２５０μＭ）およびプロピジウムヨージド（ＰＩ）を用いて処理した。ＤＤＣのこれらＣａ２＋欠乏細胞および対照、Ｃａ２＋−処理（１ｍＭ）細胞への結合をＦＡＣＳにより分析し、そしてドットプロットを図４Ａに示す。各ドットプロットの下左方形は、細胞の健康な画分を表す。下右方形はアポトーシスの初期段階の新たに形成された細胞群を表し、未だ膜の統合性を維持しているがＰＬＳの活性化を特徴とする。示したように、これらの細胞はＤＤＣ結合を現すが、ＰＩは排除している。上右方形は、形質膜の崩壊を特徴とするアポトーシスの後期段階の細胞、すなわち通常は健康な細胞から排除されるＰＩを含む化合物が非選択的に透過可能であることを表す。
【０１０２】
アポトーシスおよび付随するＰＬＳ活性化の誘導で、細胞はＤＤＣの取り込みに顕著な増加を表した（４．１１％から３８．４％）。しかしＣａ２＋が欠乏すると、アポトーシスの初期段階の細胞によるＤＤＣの取り込みは３８．４％から８．８９％に低下し、これは対照細胞の取り込みレベルと同様である。対照として重要なことは、カルシウム欠乏がアポトーシスの後期段階の細胞へのＤＤＣ結合に影響を及ぼさなかったことであり、すなわち細胞は透過性膜をもち、すなわちさらに初期アポトーシスの細胞におけるＤＤＣ取り込みのＰＬＳ活性依存性を現している（図４Ｂ）。
【０１０３】
この実施例は薬剤輸送系としてのＰＬＳをさらに証明する：カルシウム欠乏による、またはロッテレリンを用いたＰＫＣδの阻害によるＰＬＳ活性のモジュレーションは、それぞれアポトーシスの初期段階の細胞へのＤＤＣの取り込みを調節した。
【実施例３】
【０１０４】
アポトーシス機構の不活性化によるＰＬＳの阻害はＤＤＣの取り込みを阻害する
アポトーシスの誘導はＰＬＳ活性化のための主要な経路である。したがってＤＤＣのようなＰＤＴＣの細胞性の取り込みのＰＬＳ活性依存性を証明するために、アポトーシス細胞機構のモジュレーションをＰＬＳモジュレーションに関する手段として使用した。このためにアポトーシスは培養したＪｕｒｋａｔ細胞を抗−Ｆａｓ抗体で処理することにより誘起した。アポトーシスプロセスの阻害は、パン−カスパーゼインヒビターＺ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン）により行った。ＤＤＣの対照−未処理細胞、アポトーシス細胞およびパン−カスパーゼ阻害細胞への取り込みは、ＦＡＣＳ分析により比較した（図５）。
【０１０５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０６）は、５０μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋインヒビター（エンザイム  システムズ  プロダクツ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、米国）の存在下または不存在下で、抗−ＦａｓＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で３時間処理した。非処理細胞は対照として利用した。処理後、細胞を遠心し、そして５０μＭのＤＤＣと５分間インキューベーションし、そしてＦＡＣＳ分析用に採取した。図５は細胞へのＤＤＣの結合を反映する反応の数（カウント、ｙ−軸）  対  蛍光強度（ＵＶ、ｘ−軸）を示す。示したように、アポトーシスの誘導は大きな明白な群のアポトーシスの初期段階の細胞の発生を引き起こし、顕著なＤＤＣ結合を現した（点−破線、ピークＢ）。パン−カスパーゼインヒビター（破線）での処理はこのＤＤＣ結合を廃し、これは対照の未処理細胞のベースラインレベルまで蛍光値が戻ることにより反映された（実線、ピークＡ）。内部対照として重要なことは、アポトーシスの後期段階の細胞へのＤＤＣ結合に有意な変化が観察されなかったことであり、ここでＤＤＣ結合はＰＬＳ−依存的プロセスではなく（ピークＣ）、すなわちさらに初期アポトーシスの細胞へのＤＤＣ取り込みのＰＬＣ活性依存性がさらに強調される。
【実施例４】
【０１０６】
活性化血小板へのＤＤＣの取り込みはＰＬＳ−依存的である
ＤＤＣの活性化血小板への選択的結合は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を使用して測定した。血小板リッチ血漿を健康な有志から得た。１０９の新鮮な血小板を遠心し（５分間、３８０×ｇ）、洗浄し、そしてＴｙｒｏｄｅのバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ；２．８ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；０．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；５．５ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４；０．３５％  ＢＳＡ）に再懸濁した。対照血小板は氷上に維持した。
【０１０７】
活性化には、２００μｌの洗浄した血小板をカルシウムイオノフォアＡ２３１８７と、５ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、室温でインキューベーションした。インキューベーション後、血小板を遠心し（２分間、１０４ｒｐｍ）、そして１ｍｌのＴｙｒｏｄｅバッファーに再懸濁した。続いて活性化血小板は、５μＭのＤＤＣと５分間、室温で３つの異なる条件下でインキューベーションした：（ｉ）さらなる処置なし；（ｉｉ）Ｃａ２＋−欠乏の条件下、２０μＭのＢＡＰＴＡおよび１ｍＭ  ＥＧＴＡによる誘導（３０分間、４℃）；（ｉｉｉ）Ｃａ２＋の回復、ここで血小板の細胞内Ｃａ２＋レベルは１ｍＭのＣａＣｌ２および２μＭのカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加により補充した。非活性化血小板を対照とした。血小板はベクトン−デッキンソンのセルソーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析に供した。励起は３６０ｎｍであり、そして発光は５３０ｎｍで測定した。図６Ａに表すＦＡＣＳヒストグラムは、活性化で対照の血小板群（細い実線）がより高い蛍光レベル（太い実線）への顕著なシフトを受け、活性化血小板の群によるＤＤＣの結合および取り込みを反映している。
【０１０８】
しかしＣａ２＋−欠乏によるＰＬＳ阻害で、ＤＤＣの取り込みは阻害され、これは血小板群のシフトが低い蛍光値へ戻ることに反映された（点線）。ＣａＣｌ２を再び培地に加え、そしてＣａ２＋−イオノフォアの投与による血小板の細胞内Ｃａ２＋の回復でＰＬＳを再活性化し、蛍光がＣａ２＋の減少前の活性化血小板で観察された高い値に戻った（破線）。
【０１０９】
図６Ｂは、上記のＰＬＳ活性状態で血小板に結合するＤＤＣを反映している蛍光強度の幾何平均を示す。ＰＬＳが不活性である対照、非活性化血小板は、わずかなＤＤＣの取り込みを示しただけであるが、ＰＬＳが活性化されている活性化血小板はより高い蛍光強度への著しいシフトを現し、顕著なＤＤＣ取り込みを反映している。該取り込みはＰＬＳ活性のレベルに著しく依存し：周辺Ｃａ２＋レベルのモジュレーションによる該活性のモジュレーションは、したがってＤＤＣの取り込みを阻害または促進した。それゆえに血小板によるＤＤＣの取り込みはＰＬＳ活性のレベルに依存する。
【実施例５】
【０１１０】
アポトーシス細胞へのＮＳＴ８３０の取り込みおよび阻害実験
培養したＪｕｒｋａｔ細胞は、実施例１に記載したように抗−Ｆａｓ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）で２．５時間、アポトーシスを受けるように誘導した。続いて対照およびアポトーシス細胞の両方を５０μＭのＮＳＴ８３０と５分間インキューベーションし、そして取り込みをＦＡＣＳにより測定した。ＦＡＣＳ分析前に、細胞をＰＩでも同時染色した。結果のドットプロットは図７Ａに示す。アポトーシスの誘導は、ＮＳＴ８３０に選択的に結合し、そして右下方形のプロットを占めるアポトーシスプロセスの初期段階の大きな明白な６４％の細胞群の発生を伴った。ＰＩおよびＮＳＴ８３０に対して非選択的に透過性の後期アポトーシスの細胞の割合には、これらの条件下で実質的な変化は観察されなかった。
【０１１１】
アポトーシス細胞におけるＰＬＳ活性の阻害は、２つの取り組みにより行った：
（ｉ）．Ｃａ２＋レベルのモジュレーション。
（ｉｉ）．ＰＬＳインヒビターによる処理。
（ｉ）．Ｃａ２＋減少−回復手順によるＰＬＳ活性のモジュレーション．
２．５時間のアポトーシス−誘導期間の終わりに、細胞（１×１０７）を２０μＭのＢＡＰＴＡおよび１ｍＭのＥＧＴＡで処理した（３０分間、室温で）。ＰＬＳ阻害から３０分後、細胞を上記に特定したＮＳＴ８３０で染色し、そして直ちに蛍光顕微鏡に供した（図７Ａ）。ＮＳＴ８３０の取り組みは上記のカルシウム欠乏手順によるＰＬＳの阻害で劇的に減少し、そして初期アポトーシスの細胞の割合に顕著な低下が観察された（６４％から５％）。しかしＣａ２＋−欠乏はＰＩ−透過性の後期アポトーシス細胞の割合に影響を及ぼさなかった。
（ｉｉ）．ロッテレリンによるＰＬＳの阻害：
２．５時間のアポトーシス−誘導期間の後、細胞を４０分間、０．５μＭ濃度のロッテレリンとインキューベーションした。次いで細胞をＮＳＴ８３０（５０μＭ）での処理に供し、ＰＩで同時染色し、そしてＦＡＣＳ分析用に直ちに採取した（図７Ａ）。ロッテレリンの存在下で、初期アポトーシスの細胞の割合に顕著な減少（６４％から４％）が生じ、これはＮＳＴ８３０（右下方形）を現し、ＰＬＳ系の阻害が初期アポトーシス細胞によるＮＳＴ８３０の選択的取り込みの阻害をもたらしたことを示した。ロッテレリンの存在下で後期アポトーシスの細胞群の割合に変化は観察されなかった（上右方形）。
【０１１２】
ＤＤＣおよびＰＩの両方に結合する透過性膜を有する後期アポトーシスの細胞数に比べて、ＤＤＣの上昇した取り込みを示す新たに形成したアポトーシス細胞数の相対的変化を、図７Ｂで定量的に示す。膜透過性の後期アポトーシス細胞へのＤＤＣの結合は細胞内カルシウムレベルの変化に影響されなかったが、初期アポトーシスの細胞によるＤＤＣの取り込みは、著しくカルシウム−依存的プロセスであった。同様な効果がロッテレリン処理後に得られた：初期アポトーシスで新たに形成された細胞群の顕著な減少が観察されたが、後期アポトーシスの細胞の割合には変化は検出されなかった。
【実施例６】
【０１１３】
スタウロスポリン処理細胞へのＤＤＣの取り込みは、ＰＬＳ−依存的プロセスである。
【０１１４】
アポトーシス細胞によるＤＤＣの選択的取り込みは、アポトーシス誘起の種類には依存しない。これを証明するために、細胞をスタウロスポリン（アポトーシスの十分に実証された誘起物）で処理した。スタウロスポリンは抗−ＦａｓＡｂとは大きく異なるアポトーシス性経路で作用する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を実施例１に記載のように成長させ、そして続いて１μＭのスタウロスポリン（Ｓ４４００；シグマ、米国）で４時間処理した。アポトーシスの誘導後、細胞をＤＤＣ（２５０μＭ）で５分間処理し、そしてＰＩで同時染色し、そしてＦＡＣＳ分析に供した。非処理細胞を対照とした。
【０１１５】
ＤＤＣの取り込みを示す、両カルチャー中の初期および後期アポトーシス細胞の割合を図８に与える。スタウロスポリン処理後、ＤＤＣの初期アポトーシスの細胞への顕著な特異的取り込みが検出された（対照細胞中での３６％からアポトーシス細胞中での１００％）。図８に示すように、この取り込みはＰＬＳ活性のレベルに高度に依存的である：Ｃａ２＋−減少またはロッテレリン処理（該処理は実施例１に記載した通りである）のいずれかによるＰＬＳ−阻害は、ＤＤＣ−の取り込みに劇的な減少を生じた。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
以下の例は細胞に化合物ＤＤＬ、ＤＤＣおよびＮＳＴ８３０を取り込むために、ＰＬＳ活性化の必要性を証明し、ここでこれらの化合物はＰＤＴＣとして作用する。これらの例では、ＰＬＳ活性化はアポトーシスの誘起により、または細胞活性化により細胞に誘導される。該ＰＬＳ−活性化細胞におけるＰＬＳ阻害は、Ｃａ２＋の欠乏により、ＰＫＣδの阻害により、またはアポトーシス細胞機構の阻害により例示される。ＤＤＬ、ＤＤＣおよびＮＳＴ８３０に固有の蛍光特性は、これら化合物の該細胞への結合を蛍光顕微鏡により、またはフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）のいずれかにより視覚化するために利用する。これらの評価はアポトーシスまたは活性化のいずれかの初期段階の細胞を中心とし、ここで細胞膜の統合性は未だに維持され、すなわち膜の孔を介した細胞への化合物の非選択的な大量の侵入（ｂｕｌｋ  ｅｎｔｒｙ）は排除される。当業者はこれらの具体的態様が本明細書に記載し、そして定める本発明のより一層広い範囲の具体的説明であると容易に考えられるだろう。
【０１１７】
添付する図面では：
【図１】アポトーシス性の培養したＪｕｒｋａｔ細胞へのＤＤＬの結合の蛍光顕微鏡を示す。化合物のアポトーシス細胞への輸送は、ＰＬＳ−活性レベルに直接相関した：ＰＬＳ−活性化アポトーシス細胞への輸送は、Ｃａ２＋欠乏を通したＰＬＳ−阻害により阻害され（ｂ対ａ）、そしてＣａ２＋の回復によるＰＬＳ−再活性化により促進された（ｃ）。
【図２】ＨｅＬａ細胞の成長したカルチャー中のアポトーシス細胞へのＤＤＬの結合のフローサイトメトリー分析を示す。ＤＤＬ−結合はＰＬＳ−活性レベルと相関した：ＰＬＳ−活性化アポトーシス細胞への輸送は、Ｃａ２＋欠乏によるＰＬＳ−阻害を通して阻害され、そしてＣａ２＋の回復によるＰＬＳ−再活性化により促進された。図面は蛍光強度の幾何平均の算出を介したシグナルの定量を示す。
【図３】抗−Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを受けるように誘導した培養Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＤＤＣの結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を示す。ＵＶ−軸はＤＤＣの蛍光強度を示し；ＦＬ２−軸はプロピジウムヨージド（ＰＩ）（細胞死の後期における膜崩壊のマーカー）の蛍光強度を示す。アポトーシスプロセスによるＰＬＳの活性化は、アポトーシスの初期段階における細胞の大きな群の発生をもたらし、これは顕著なＤＤＣの取り込みを現したが、膜の統合性は未だ維持されていた（すなわちＰＩには結合しなかった；Ｂ対Ａ、右下方形）。低用量のロッテレリン（１μＭ）（ＰＫＣδのインヒビター）の添加による該アポトーシス細胞におけるＰＬＳの阻害は、アポトーシスの初期段階でこれらの細胞によるＤＤＣの取り込みを著しく阻害した（右下方形；ＣおよびＤ）］。
【図４】抗−Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを受けるように誘導した培養Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＤＤＣの取り込みのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を示す。ＵＶ−軸はＤＤＣの蛍光強度を示し；ＦＬ２−軸はプロピジウムヨージド（ＰＩ）（細胞死の後期における膜崩壊のマーカー）の蛍光強度を示す。
【０１１８】
（図４Ａ）は、Ｃａ２＋減少が初期アポトーシスの細胞へのＤＤＣの結合に及ぼす効果を示すドットプロットである。Ｃａ２＋の存在下で、ＤＤＣは細胞に対する顕著な結合を現した（右下方形）（Ｂ対Ａ）。しかしＣａ２＋の欠乏により達成されたＰＬＳの阻害は（Ｄ対Ｂ）は、ＤＤＣ取り込みの顕著な阻害を伴った。
【０１１９】
（図４Ｂ）。アポトーシスの初期段階の細胞によるＤＤＣ取り込みの定量（暗いカラム）。取り込みはＣａ２＋の欠乏を通したＰＬＳの阻害により遮断された。内部標準として、アポトーシスプロセスの後期段階の細胞へのＤＤＣの結合は、点のカラムにより示す。これらの細胞で細胞膜の統合性が失われると、分子はＰＬＳにかかわらず自由に細胞に入る（ｉｎｇｒｅｓｓ）ことができ、したがって後期アポトーシスの細胞によるＤＤＣ取り込みにＰＬＳ−阻害が及ぼす効果は観察されなかった。
【図５】カスパーゼインヒビターによるアポトーシス細胞機構の遮断を介したＰＬＳの不活性化で、ＤＤＣの細胞取り込みを示す。培養Ｊｕｒｋａｔ細胞は、抗−Ｆａｓ抗体によりアポトーシスを受けるように誘導した。カスパーゼインヒビターＺ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋは、これらの細胞におけるアポトーシス細胞機構を阻害するために使用した。ＵＶ−軸はＤＤＣ結合の強度を反映する一方、カウント軸は反応の数を反映する。示すように、アポトーシス機構の阻害を通したＰＬＳの不活性化は、初期アポトーシスの細胞へのＤＤＣの取り込みを防止した。
【図６】対照およびＤＤＣとインキューベーションした活性化血小板のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析、および化合物の結合に及ぼすＣａ２＋レベルの変化の効果を示す。取り込みはＣａ２＋の欠乏により阻害され、そしてＣａ２＋の回復により促進された。（Ａ）ＦＡＣＳヒストグラム（ＵＶ−軸はＤＤＣの蛍光強度を示す一方、カウント軸は反応の割合を示す）。（Ｂ）：蛍光強度の幾何平均として表すＤＤＣ−結合の定量。
【図７】対照細胞による取り込みと比べた、抗−Ｆａｓ抗体での処理によりアポトーシスを受けるように誘導したＪｕｒｋａｔ細胞によるＮＳＴ８３０の取り込みの代表的なフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析、および該取り込みに及ぼすＰＬＳ阻害の阻害効果を示す。
【０１２０】
（図７Ａ）はＦＡＣＳドットプロットであり、対照細胞と比較して、アポトーシスの活性化がアポトーシスの初期段階の細胞によるＮＳＴ８３０の顕著な取り込みを導くことを示す（ａ対ｂ）。Ｃａ２＋の欠乏（ｃ）による、またはロッテレリンでの処理（ｄ）によるいずれかによるＰＬＳ活性の阻害は、初期アポトーシスの細胞によるＮＳＴ８３０取り込みの劇的な阻害を導く（右下方形）。ＵＶ−軸はＮＳＴ８３０の蛍光強度を示す；ＦＬ２−軸はプロピジウムヨージド（ＰＩ）の蛍光強度を示す。
【０１２１】
（図７Ｂ）は、初期（明るい点のカラム）対後期（暗いカラム）アポトーシスの細胞へのＮＳＴ８３０取り込みの定量を表す。Ｙ−軸は陽性反応の割合を示す。ＮＳＴ８３０取り込みはＰＬＳ系の活性レベルに直接相関することが分かる：わずかに残る取り込みはＰＬＳが非活性である対照細胞で観察されるが、顕著な取り込みはアポトーシスプロセスによるＰＬＳ−活性化で観察される。Ｃａ２＋欠乏またはロッテレリン処理のいずれかを介したＰＬＡ阻害は、初期アポトーシスの細胞によるＮＳＴ８３０取り込みを減少させる。すべての場合で、後期アポトーシス細胞へのＮＳＴ８３０の結合は（ここで取り込みはＰＬＳ−依存的プロセスではなく、むしろ崩壊した膜中の孔を通る侵入である）、ＰＬＳ阻害により影響を受けない。
【図８】スタウロスポリンでの処理によりアポトーシスを受けるように誘導したＪｕｒｋａｔ細胞へのＤＤＣの取り込み、およびＣａ２＋欠乏またはロッテレリン処理のいずれかを介したＰＬＳ阻害によるＤＤＣ取り込みの遮断を示す。初期（斜線のカラム）対後期（暗いカラム）アポトーシスの細胞への取り込みを表す。ｙ−軸は異なる処理下でのＤＤＣ染色についての陽性反応の割合を示す。アポトーシスカルチャーの反応の数は、１００％とみなす。アポトーシスの誘導によるＰＬＳ−活性化は初期アポトーシスの細胞への顕著な取り込みを導くが、ＤＤＣ取り込みはＣａ２＋欠乏またはロッテレリン処理のいずれかによるＰＬＳ−阻害後に著しく減少する。重要なことは、後期アポトーシスの細胞（ここで取り込みはＰＬＳに媒介されない）はＰＬＳの阻害に応答してＤＤＣ−結合に変化を表さない点である。
【図２】
2004534001.tif 000016
【図３】
2004534001.tif 000017
【図４Ａ】
2004534001.tif 000018
【図４Ｂ】
2004534001.tif 000019
【図５】
2004534001.tif 000020
【図６】
2004534001.tif 000021
【図７Ａ】
2004534001.tif 000022
【図７Ｂ】
2004534001.tif 000023
【図８】
2004534001.tif 000024
【国際公開パンフレット】
2004534001.tif 000025
2004534001.tif 000026
2004534001.tif 000027
2004534001.tif 000028
2004534001.tif 000029
2004534001.tif 000030
2004534001.tif 000031
2004534001.tif 000032
2004534001.tif 000033
2004534001.tif 000034
2004534001.tif 000035
2004534001.tif 000036
2004534001.tif 000037
2004534001.tif 000038
2004534001.tif 000039
2004534001.tif 000040
2004534001.tif 000041
2004534001.tif 000042
2004534001.tif 000043
2004534001.tif 000044
2004534001.tif 000045
2004534001.tif 000046
2004534001.tif 000047
2004534001.tif 000048
2004534001.tif 000049
2004534001.tif 000050
2004534001.tif 000051
2004534001.tif 000052
2004534001.tif 000053
2004534001.tif 000054
2004534001.tif 000055
2004534001.tif 000056
2004534001.tif 000057
2004534001.tif 000058
2004534001.tif 000059
2004534001.tif 000060
2004534001.tif 000061
2004534001.tif 000062
2004534001.tif 000063
2004534001.tif 000064
2004534001.tif 000065
2004534001.tif 000066
2004534001.tif 000067
2004534001.tif 000068
2004534001.tif 000069
2004534001.tif 000070
2004534001.tif 000071
2004534001.tif 000072
2004534001.tif 000073
2004534001.tif 000074
2004534001.tif 000075
2004534001.tif 000076
2004534001.tif 000077
2004534001.tif 000078
2004534001.tif 000079
2004534001.tif 000080
2004534001.tif 000081
2004534001.tif 000082
2004534001.tif 000083
2004534001.tif 000084
2004534001.tif 000085
2004534001.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534001.tif 000087
2004534001.tif 000088
【国際調査報告】
2004534001.tif 000089
2004534001.tif 000090
2004534001.tif 000091
2004534001.tif 000092
2004534001.tif 000093
2004534001.tif 000094
2004534001.tif 000095
2004534001.tif 000096
2004534001.tif 000097
2004534001.tif 000098
2004534001.tif 000099