(57)【要約】［０１９１］細胞に目的の核酸を導入する、アレイ化トランスフェクション法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞にＤＮＡを導入する、逆トランスフェクション法であって：
（ａ）別個の定義される位置の表面上に、真核細胞に導入しようとするＤＮＡおよびキャリアータンパク質を含んでなるＤＮＡ含有混合物を沈着させ、そしてＤＮＡ含有混合物を表面上で乾燥させ、それによって、別個の定義される位置に、付着したＤＮＡ含有混合物を有する表面を産生し；そして
（ｂ）ＤＮＡ含有混合物中のＤＮＡが真核細胞内に進入するのに十分な密度および適切な条件下で、表面上に真核細胞を蒔き、
それによってＤＮＡ含有混合物中のＤＮＡを真核細胞に導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
導入しようとするＤＮＡがベクター内に含まれ；キャリアータンパク質がゼラチンであり；スライドがガラススライドまたはΣポリ−Ｌ−リジンスライドであり、そして真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
ベクターがプラスミドまたはウイルスに基づくベクターである、請求項２の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ含有混合物中のゼラチン濃度が約０．０５％〜約０．５％である、請求項２の方法。
【請求項５】
目的のＤＮＡを真核細胞に導入する方法であって：
（ａ）別個の定義される位置の表面上に、目的のＤＮＡおよびキャリアータンパク質を含んでなるキャリアー−ＤＮＡ混合物を沈着させ、そしてキャリアー−ＤＮＡ混合物を表面上で乾燥させ、それによって、別個の定義される位置に、キャリアー−ＤＮＡ混合物を所持する表面を産生し；
（ｂ）キャリアー−ＤＮＡ混合物を所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そして生じた産物を、キャリアー−ＤＮＡ混合物中のＤＮＡおよびトランスフェクション試薬間の複合体形成に適した条件下で維持し；
（ｃ）トランスフェクション試薬を除去して、それによってＤＮＡを所持する表面を産生し；
（ｄ）ＤＮＡが真核細胞内に進入するのに十分な密度および適切な条件下で、ＤＮＡを所持する表面上に真核細胞を蒔き、
それによって目的のＤＮＡを細胞に導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項６】
キャリアータンパク質がゼラチンであり、そして表面がスライドの表面である、請求項５の方法。
【請求項７】
スライドがガラススライドまたはΣポリ−Ｌ−リジンスライドである、請求項６の方法。
【請求項８】
ベクター−ＤＮＡ混合物中のゼラチン濃度が約０．０５％〜約０．５％である、請求項７の方法。
【請求項９】
ゼラチン濃度が約０．１％〜約０．２％である、請求項８の方法。
【請求項１０】
目的のＤＮＡが発現ベクター中にあり、そして目的のＤＮＡを含有する真核細胞がＤＮＡの発現に適した条件下で維持され、それによって目的のＤＮＡが発現される、請求項５の方法。
【請求項１１】
目的のタンパク質が発現される真核細胞を同定することをさらに含んでなり、表面上の真核細胞を、目的のタンパク質と結合する抗体と接触させ、そして抗体結合を検出することを含んでなる、ここで結合が、目的のタンパク質が発現される真核細胞を同定する、請求項１０の方法。
【請求項１２】
目的のＤＮＡを真核細胞に導入する方法であって：
（ａ）別個の定義される位置の表面上に、目的のＤＮＡおよびゼラチンを含んでなるゼラチン−ＤＮＡ混合物を沈着させ、そしてゼラチン−ＤＮＡ混合物を表面上で乾燥させ、それによって、別個の定義される位置に、ゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する表面を産生し；
（ｂ）ゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そして生じた産物を、ゼラチン−ＤＮＡ混合物中のＤＮＡおよびトランスフェクション試薬間の複合体形成に適した条件下で維持し；
（ｃ）トランスフェクション試薬を除去して、それによってＤＮＡを所持する表面を産生し；
（ｄ）ＤＮＡが真核細胞内に進入するのに十分な密度および適切な条件下で、ＤＮＡを所持する表面上に真核細胞を蒔き、
それによって目的のＤＮＡを細胞に導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
表面がスライドの表面である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
スライドがガラススライドまたはΣポリ−Ｌ−リジンスライドである、請求項１３の方法。
【請求項１５】
ベクター−ＤＮＡ混合物中のゼラチン濃度が約０．０５％〜約０．５％である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ゼラチン濃度が約０．１％〜約０．２％である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
目的のＤＮＡが発現ベクター中にあり、そして目的のＤＮＡを含有する真核細胞がＤＮＡの発現に適した条件下で維持され、それによって目的のＤＮＡが発現される、請求項１２の方法。
【請求項１８】
目的のタンパク質が発現される真核細胞を同定することをさらに含んでなり、表面上の真核細胞を、目的のタンパク質に結合する抗体と接触させ、そして抗体結合を検出することを含んでなる、ここで結合が、目的のタンパク質が発現される真核細胞を同定する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
真核細胞が哺乳動物細胞であり、そして（ｂ）において、ベクター−ＤＮＡ混合物を所持する表面上に、該細胞を高密度で蒔く、請求項４の方法。
【請求項２０】
真核細胞に目的のＤＮＡを導入する方法であって：
（ａ）別個の定義される位置の表面上に、目的のＤＮＡ；キャリアータンパク質；糖；ＤＮＡ凝縮を促進する緩衝剤および適切な脂質に基づくトランスフェクション試薬を含んでなる脂質−ＤＮＡ混合物を沈着させ、そして脂質−ＤＮＡ混合物を表面上で乾燥させ、それによって、定義される位置に、脂質−ＤＮＡ混合物を所持する表面を産生し；
（ｂ）目的のＤＮＡが真核細胞内に進入するのに十分な密度および適切な条件下で、脂質−ＤＮＡ混合物を所持する表面上に真核細胞を蒔き、
それによって目的のＤＮＡを細胞に導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２１】
キャリアータンパク質がゼラチンであり、そして表面がスライドの表面である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
スライドがガラススライドまたはΣポリ−Ｌ−リジンスライドである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
脂質−ＤＮＡ混合物中のゼラチン濃度が約０．０１％〜約０．０５％であり、そしてスクロース濃度が約０．１Ｍ〜約０．４Ｍである、請求項２２の方法。
【請求項２４】
目的のＤＮＡが発現ベクター中にあり、そして目的のＤＮＡを含有する真核細胞がＤＮＡの発現に適した条件下で維持され、それによって目的のＤＮＡが発現される、請求項２０の方法。
【請求項２５】
表面にＤＮＡを付着させて、別個の定義される位置に、既知の配列または供給源のＤＮＡアレイを産生する方法であって、別個の定義される位置の表面上にキャリアー−ＤＮＡ混合物をスポットし、そしてキャリアー−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、ＤＮＡ含有スポットと称されるスポットが表面に付着したままであるようにすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２６】
表面にＤＮＡを付着させて、別個の定義される位置に、既知の配列または供給源のＤＮＡアレイを産生する方法であって、別個の定義される位置の表面上にゼラチン−ＤＮＡ混合物をスポットし、そしてゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、ＤＮＡ含有スポットと称されるスポットが表面に付着したままであるようにすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２７】
表面にＤＮＡを付着させて、別個の定義される位置に、既知の配列または供給源のＤＮＡアレイを産生する方法であって、別個の定義される位置の表面上に脂質−ＤＮＡ混合物をスポットしてスポットを産生し、そして脂質−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、スポットが表面に付着したままであるようにすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２８】
定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを表面上に産生する方法であって：
ａ）別個の定義される位置の表面上に、ゼラチン−ＤＮＡ混合物のキャリアー−ＤＮＡ混合物スポットをスポットし、そしてキャリアー−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、ＤＮＡ含有スポットと称されるスポットが表面に付着したままであるようにし；
ｂ）ＤＮＡ含有スポットを所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そして生じた産物を、スポット中のＤＮＡおよびトランスフェクション試薬間の複合体形成に適した条件下で維持し；
ｃ）トランスフェクション試薬を除去して、ＤＮＡを所持する表面を産生し；
ｄ）ＤＮＡを所持する表面に、適切な培地中の細胞を添加して、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を産生し；そして
ｅ）蒔いた細胞内へのＤＮＡの進入を生じる条件下で、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を維持し、こうして、定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを産生する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２９】
定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを表面上に産生する方法であって：
ａ）別個の定義される位置の表面上に、ゼラチン−ＤＮＡ混合物のゼラチン−ＤＮＡ混合物スポットをスポットし、そしてゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、ＤＮＡ含有スポットと称されるスポットが表面に付着したままであるようにし；
ｂ）ＤＮＡ含有スポットを所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そして生じた産物を、スポット中のＤＮＡおよびトランスフェクション試薬間の複合体形成に適した条件下で維持し；
ｃ）トランスフェクション試薬を除去して、ＤＮＡを所持する表面を産生し；
ｄ）ＤＮＡを所持する表面に、適切な培地中の細胞を添加して、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を産生し；そして
ｅ）蒔いた細胞内へのＤＮＡの進入を生じる条件下で、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を維持し、こうして、定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを産生する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを表面上に産生する方法であって：
ａ）別個の定義される位置の表面上に、脂質−ＤＮＡ混合物をスポットしてスポットを産生し、そして脂質−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、スポットが表面上に付着したままであるようにし；
ｂ）（ａ）で産生した表面上に細胞を蒔き、そして乾燥脂質−ＤＮＡ混合物および逆トランスフェクションしようとする細胞を含有する、生じた産物を、細胞増殖および細胞内へのＤＮＡの進入に適した条件下で維持し、こうして、逆トランスフェクション細胞のアレイを産生する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項３１】
請求項２５の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３２】
請求項２６の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３３】
請求項２７の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３４】
請求項２８の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３５】
請求項２９の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３６】
請求項３０の方法によって産生されるアレイ。
【請求項３７】
あらかじめ選択された複数の領域を持つ表面を含んでなる固体支持体上で、複数の多様なトランスフェクションベクターを形成する方法であって：
ａ）前記のあらかじめ選択された各領域上に、異なるトランスフェクションベクターを有するキャリアー−ＤＮＡ混合物を形成し；
ｂ）ＤＮＡを所持する表面に、適切な培地中の細胞を添加して、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を産生し；そして
ｃ）蒔いた細胞内へのＤＮＡの進入を生じる条件下で、ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面を維持し、こうして、定義されるＤＮＡを含有する逆トランスフェクション細胞のアレイを産生する
ことを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
［０００１］ゲノムおよび発現配列タグ（ＥＳＴ）プロジェクトは、ヒトを含め、より高次の生物の遺伝子の目録を迅速に作成し、そしてクローニングしている。新たに生じつつある課題は、遺伝子の機能的役割を明らかにすること、および望ましい特性を持つ遺伝子産物を迅速に同定することである。遺伝子配列およびクローニングされたｃＤＮＡのコレクションは増加しつつあり、遺伝子産物を性質決定するのに体系的でそしてハイスループットのアプローチの開発が要求される。転写プロファイリングのためのＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質−タンパク質相互作用を決定するための酵母２ハイブリッドアレイの使用は、遺伝子産物を性質決定するゲノムアプローチの最近の例である（Ｓｃｈｅｎａ，  Ｍ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  １０：６２３（２０００））。多数の遺伝子セットの機能を哺乳動物細胞内で解析する、これらに匹敵する戦略は存在しない。現在、遺伝子産物の過剰発現を指示するか、あるいはその発現または機能を阻害するＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクションすることによって、遺伝子ごとのスケールで、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子解析を行うことが可能である。その後、多様な機能アッセイを用いて、遺伝子産物レベルを改変することによる細胞生理への影響を検出する。
【０００２】
［０００２］リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーションおよび陽イオン性リポソーム仲介トランスフェクション（例えばリポフェクション）などの多様なＤＮＡトランスフェクション法を用いて、細胞にＤＮＡを導入することが可能であり、そしてこれらの方法は、遺伝子制御および機能を研究するのに有用である。多数のＤＮＡセットをスクリーニングして、目的の特性を持つ産物をコードするものを同定するのに使用可能なさらなる方法、特にハイスループットアッセイが利用可能であると有用であろう。
【０００３】
（発明の概要）
［０００３］本発明は、細胞における遺伝子機能のハイスループット解析のための戦略を提供する。本発明の１つの側面は、望ましい産物をコードするか、または目的の細胞表現型を引き起こすものに関して、多数の核酸構築物セットを迅速にスクリーニングするのに適した、トランスフェクション細胞マイクロアレイを生成するための方法および試薬を提供する。例えば、発現ベクターなどの、核酸の空間的に定義されるアレイを用いて、トランスフェクション細胞の空間的に定義されるアレイを生成する。トランスフェクションした核酸が、細胞に特定の表現型を与える能力に関して、細胞をスクリーニングすることが可能であり、そしてアレイ上の細胞（類）の位置を参照することによって、核酸の同一性を決定することが可能である。
【０００４】
［０００４］したがって、本発明は、逆トランスフェクション法と称される方法であって、目的の核酸または細胞に導入しようとする核酸とも称される、定義される核酸（既知の配列または供給源の核酸）が、敷き詰めた真核細胞の定義される領域中の細胞に導入され、該細胞内で核酸が発現されるか、あるいは核酸自体が、細胞構成要素もしくは機能に影響を有するか、または細胞構成要素もしくは機能と相互作用するであろう、前記方法に関する。本発明の方法に、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの、いかなる適切な核酸も使用可能である。本発明の特定の態様はＤＮＡに関して記載される。しかし、本発明には、いかなる適切な核酸も含まれると理解すべきである。
【０００５】
［０００５］１つの態様において、本発明は、目的のＤＮＡまたは細胞に導入しようとするＤＮＡとも称される、定義されるＤＮＡ（既知の配列または供給源のＤＮＡ）が、敷き詰めた真核細胞の定義される領域中の細胞に導入され、該細胞内で核酸が発現されるか、あるいは核酸自体が、細胞構成要素もしくは機能に影響を有するか、または細胞構成要素もしくは機能と相互作用するであろう、前記方法に関する。該方法において、以下に定義される、目的のＤＮＡ（発現ベクターに取り込まれたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなど）およびキャリアータンパク質を含んでなる混合物を、定義される別個の位置の表面（例えばスライド、またはマルチウェルプレートのウェル底などの他の平らな表面）上に沈着させ（例えば、定義される小領域にスポットするかまたは配置し）、そして乾燥させ、その結果、定義される別個の位置の表面にＤＮＡ含有混合物を付着させる。
【０００６】
［０００６］こうした位置は、本明細書において、便宜上、定義される位置と称される。ＤＮＡ含有混合物は、所望されるだけ多くの別個の位置に沈着させることが可能である。生じる産物は、定義される別個の位置に、ＤＮＡ含有混合物を所持する表面であり；別個の位置（スポット）各々に存在するＤＮＡの同一性は既知であり／定義されている。真核細胞へのＤＮＡの導入／進入およびＤＮＡの発現または細胞構成要素とのその相互作用に十分な密度および適した条件下で、哺乳動物細胞（例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、またはネズミ細胞）、細菌、昆虫または植物細胞などの真核細胞を、ＤＮＡ含有混合物を所持する表面上に蒔く（配置する）。好ましくは、真核細胞（適切な培地中）は、逆トランスフェクションが起こる可能性を増加させるため、乾燥したＤＮＡ含有スポット上に、高密度（例えば１ｘ１０５／ｃｍ２）で蒔く。表面に付着したＤＮＡ含有混合物中に存在するＤＮＡは、真核細胞に進入し（逆トランスフェクションが起こり）、そして生じた逆トランスフェクション真核細胞中で発現される。
【０００７】
［０００７］「ゼラチン−ＤＮＡ」態様と称される、方法の１つの態様において、本明細書においてゼラチン−ＤＮＡ混合物と称されるＤＮＡ含有混合物は、ＤＮＡ（例えば発現ベクター中のＤＮＡ）、および水または再脱イオン水（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）などの適切な溶媒中に存在するゼラチンを含んでなる。該混合物をスライドなどの表面上にスポットし、こうして、定義される位置にゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する（該混合物が付着した）表面を産生する。生じた産物を十分に乾燥させて、スポットしたゼラチン−ＤＮＡ混合物がスライドに付着し、そして方法の続く工程で用いる条件下で、付着した位置にスポットが留まるようにする。例えば、手でまたはマイクロアレイ作成装置（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）を用いて、Σポリ−Ｌ−リジン（例えばＳｉｇｍａ，  Ｉｎｃ．）でコーティングしたガラススライドなどのスライド上に、発現ベクター中のＤＮＡおよびゼラチンの混合物をスポットする。例えば、生じた産物を、室温、上昇した温度、または真空乾燥装置中での乾燥に供することによって、ＤＮＡスポットをスライドに付着させることが可能である。十分な乾燥が生じるのに必要な時間の長さは、表面に配置した混合物の量、並びに使用した温度および湿度条件などのいくつかの要因に依存する。
【０００８】
［０００８］混合物に存在するＤＮＡの濃度は、各使用に関して実験的に決定されるであろうが、一般的には、約０．０１μｇ／μｌ〜約０．２μｇ／μｌの範囲であり、そして特定の態様では、約０．０２μｇ／μｌ〜約０．１０μｇ／μｌである。あるいは、混合物に存在するＤＮＡ濃度は、約０．０１μｇ／μｌ〜約０．５μｇ／μｌ、約０．０１μｇ／μｌ〜約０．４μｇ／μｌ、および約０．０１μｇ／μｌ〜約０．３μｇ／μｌであることが可能である。同様に、ゼラチンまたは別のキャリアー巨大分子の濃度は、各使用に関して実験的に決定可能であるが、一般的には、０．０１％〜０．５％の範囲であろうし、そして特定の態様において、約０．０５％〜約０．５％、約０．０５％〜約０．２％または約０．１％〜約０．２％である。混合物中のＤＮＡ（例えばゼラチン中のＤＮＡ）の最終濃度は、一般的に、約０．０２μｇ／μｌ〜約０．１μｇ／μｌであろうし、そして本明細書に記載する特定の態様では、ＤＮＡを０．２％ゼラチン（水中のゼラチン）で希釈して、およそ０．０５μｇ／μｌに等しいＤＮＡ最終濃度を生じる。
【０００９】
［０００９］用いるＤＮＡがベクター中に存在する場合、ベクターは、目的のＤＮＡ（逆トランスフェクション細胞中で発現しようとするＤＮＡ）をレシピエント細胞に導入し、そして発現する（逆トランスフェクション後）ことが可能な、プラスミドまたはウイルスに基づくベクターなどの、いかなる種類のものであることも可能である。例えば、ＣＭＶ駆動発現ベクターを使用可能である。ｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの商業的に入手可能なプラスミドに基づくベクター、あるいはウイルスに基づくベクターを使用可能である。本態様において、ゼラチン−ＤＮＡ混合物を含有するスポットを乾燥させた後、スポットを所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そしてスポット中のＤＮＡ（ゼラチン−ＤＮＡ混合物中）および脂質に基づくトランスフェクション試薬間の複合体形成に適した条件下に、生じた産物を維持（インキュベーション）する。１つの態様において、生じた産物を、２５℃でおよそ２０分間インキュベーションする。続いて、トランスフェクション試薬を除去して、ＤＮＡ（トランスフェクション試薬を含む複合体中のＤＮＡ）を所持する表面を産生し、そして適切な培地中の細胞を表面上に蒔く。蒔いた細胞へのＤＮＡの進入を生じる条件下で、生じた産物（ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面）を維持する。
【００１０】
［００１０］本発明の方法の第二の態様は、「脂質−ＤＮＡ」態様と称される。本態様では、ＤＮＡ（例えば発現ベクター中のＤＮＡ）；キャリアータンパク質（例えばゼラチン）；スクロースなどの糖；ＤＮＡ凝縮を促進する緩衝剤および適切な脂質に基づくトランスフェクション試薬を含んでなるＤＮＡ含有混合物（本明細書において、脂質−ＤＮＡ混合物と称する）を、スライドなどの表面上にスポットし、こうして、定義される位置に脂質−ＤＮＡ混合物を所持する表面を産生する。生じた産物を十分に乾燥させて、スポットした脂質−ＤＮＡ混合物がスライドに付着し、そして方法の続く工程で用いる条件下で、付着した位置にスポットが留まるようにする。例えば、手でまたはマイクロアレイ作成装置を用いて、Σポリ−Ｌ−リジン（例えばＳｉｇｍａ，  Ｉｎｃ．）でコーティングしたガラススライドなどのスライド上に、脂質−ＤＮＡ混合物をスポットする。ゼラチン−ＤＮＡ法に関して上述したように、ＤＮＡスポットをスライドに付着させることが可能である。
【００１１】
［００１１］混合物に存在するＤＮＡの濃度は、各使用に関して実験的に決定されるであろうが、一般的には、０．５μｇ／μｌ〜１．０μｇ／μｌの範囲であろう。約０．１Ｍ〜約０．４Ｍなどのスクロース濃度範囲が、混合物に存在可能である。同様に、約０．０１％〜約０．０５％などのゼラチン濃度範囲が、混合物に存在可能である。本態様において、混合物中のＤＮＡの最終濃度は多様であろうし、そして実験的に決定することが可能である。特定の態様では、最終ＤＮＡ濃度は、約０．１μｇ／μｌ〜約２．０μｇ／μｌの範囲である。本態様において、ベクターを使用する場合、ゼラチン−ＤＮＡ態様で使用するために記載されたもののように、目的のＤＮＡ（逆トランスフェクション細胞中で発現しようとするＤＮＡ）を導入し、そして発現する（逆トランスフェクション後）ことが可能な、プラスミドまたはウイルスに基づくベクターなどの、いかなるベクターであることも可能である。
【００１２】
［００１２］乾燥が完了した（方法の続く工程で用いる条件下で、ＤＮＡが表面に付着したままであるのに十分な度合いで起こった）後、ＤＮＡを逆トランスフェクションしようとする真核細胞を、ＤＮＡ含有混合物が付着した表面上に配置する。一般的に、活発に増殖している細胞を用い、そして好ましくは高密度（１ｘ１０５／ｃｍ２など）で、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）と共に１０％熱不活性化胎児血清（ＩＦＳ）を含有するダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの適切な培地中で、付着したＤＮＡ含有混合物を含有する表面上に蒔く。他の培地が使用可能であるし、そしてその構成要素は、トランスフェクションしようとする細胞の種類に基づいて決定可能である。乾燥脂質−ＤＮＡ混合物、およびＤＮＡを逆トランスフェクションしようとする細胞を含有する、生じたスライドを、細胞増殖、および細胞内へのＤＮＡの進入、例えばＤＮＡを含有する発現ベクターの進入に適した条件下で維持する。本発明の方法では、逆トランスフェクションが起こるのに、およそ１〜２の細胞周期で十分であるが、これは、用いる細胞種および条件で多様であろうし、そして特定の組み合わせに適した時間の長さは、実験的に決定可能である。十分な時間が経過した後、既知の方法を用いて、逆トランスフェクション（細胞へのＤＮＡの進入）およびコードされる産物の発現または逆トランスフェクション細胞に対する導入したＤＮＡの影響に関してスライドを評価する。これは、例えば、免疫蛍光の検出または酵素免疫細胞化学、オートラジオグラフィー、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、あるいはＤＮＡの発現またはＤＮＡを導入した細胞に対するコード産物もしくはＤＮＡ自体の影響を検出する他の手段によって、行うことが可能である。免疫蛍光を用いて、コードされるタンパク質の発現を検出する場合、該タンパク質に結合し、そして蛍光標識されている抗体を用いて（例えば、該タンパク質への抗体の結合に適した条件下で、スライドに添加して）、そして蛍光を検出することによって、該タンパク質を含有する位置（表面のスポットまたは領域）を同定する。蛍光の存在は、逆トランスフェクションが起こり、そしてコードされるタンパク質が、蛍光を示す、定義される位置（類）で発現されたことを示す。用いる方法によって検出される、スライド上のシグナルの存在は、細胞へのＤＮＡの逆トランスフェクションおよびコードされる産物の発現またはレシピエント細胞におけるＤＮＡの影響が、シグナルが検出される、定義される位置（類）で起こったことを示す。上述のように、定義される位置各々に存在するＤＮＡの同一性が知られ；したがって、発現が生じた場合、発現されるタンパク質の同一性もまた知られる。
【００１３】
［００１３］したがって、本発明は、１つの態様において、本明細書に記載するように、発現ベクターなどのベクター中のＤＮＡなどの異なるＤＮＡが付着している表面の定義される位置または領域において、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどの定義されるＤＮＡを発現する方法に関する。表面の各領域は、既知の組成のＤＮＡで覆われている／スポットされているため、発現されたタンパク質を同定するのは、単純なことである。さらに、本発明は、その発現が、細胞におけるシグナル伝達経路などの経路、あるいは細胞の形態または遺伝子発現パターンなどの細胞の別の特性を改変する（増進するかまたは阻害する）ＤＮＡを同定するのに有用である。該方法は、例えば、マイクロアレイ形式などのハイスループットスクリーニング法として、特に有用である。その発現が、目的のタンパク質のリン酸化状態または細胞下の位置、あるいは薬剤またはホルモンリガンドなどの試薬に結合する細胞の能力を変化させるＤＮＡを同定するために、この形式を使用可能である。やはりハイスループットスクリーニング法として有用な、第二の態様において、細胞に逆トランスフェクションしたＤＮＡは、細胞に影響を有するか、あるいは細胞性核酸へのハイブリダイゼーションを通じるか、またはアンチセンス活性を通じるなどして、発現されることなく、細胞構成要素（類）と相互作用する。
【００１４】
［００１４］やはり本発明の主題であるのは、表面上にスポットされた（付着した）、定義されるＤＮＡのマイクロアレイを含むアレイ、および本明細書に記載する方法によって表面にスポットした（付着した）逆トランスフェクション細胞のマイクロアレイを含むアレイである。こうしたアレイは、本発明の方法のゼラチン−ＤＮＡ態様または脂質−ＤＮＡ態様によって産生可能である。本発明のアレイは、別個の定義される位置に、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、あるいは本明細書に記載する逆トランスフェクション法によって、細胞に導入された目的のＤＮＡを含有する細胞が付着した（該ＤＮＡまたは細胞を所持する）、スライド（例えばガラスまたはΣポリ−Ｌ−リジンコーティングスライド）またはウェルなどの表面である。
【００１５】
［００１５］本発明のアレイを作成する方法もまた、本発明の主題である。該方法は、ゼラチン−ＤＮＡ態様または脂質−ＤＮＡ態様に関して、本明細書に記載する工程によって、表面上にＤＮＡまたは逆トランスフェクションした細胞を付着させることを含んでなる。
【００１６】
［００１６］本発明のＤＮＡアレイは、本明細書に記載する方法によって、別個の定義される位置で、既知の配列または供給源のＤＮＡを付着させた表面を含んでなる。１つの態様において、別個の定義される位置の表面上に、本明細書に記載するように、ゼラチン−ＤＮＡ混合物をスポットし（例えば手で、またはマイクロアレイ作成装置などのアレイ作成装置を用いることによって）、そしてゼラチン−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、スポットが表面に付着したままにすることによって、スライドなどの表面にＤＮＡを付着させて、アレイ（例えばマクロアレイまたはマイクロアレイ）を産生する。別の態様において、別個の定義される位置の表面上に、本明細書に記載するように、脂質−ＤＮＡ混合物をスポットし（例えば手で、またはマイクロアレイ作成装置などのアレイ作成装置を用いることによって）、そして脂質−ＤＮＡ混合物を所持する、生じた表面を十分に乾燥させて、アレイを使用する条件下で、スポットが表面に付着したままにすることによって、スライドなどの表面にＤＮＡを付着させて、アレイを産生する。この結果、ＤＮＡ含有スポットを所持する（該スポットが付着した）表面が生じる。
【００１７】
［００１７］逆トランスフェクション細胞のアレイもまた、本明細書に記載するいずれかの態様によって産生可能である。ゼラチン−ＤＮＡ態様では、ＤＮＡアレイを産生するための上述の工程を行って、そして続いて、ＤＮＡ含有スポットを所持する表面を、適切な量の、脂質に基づくトランスフェクション試薬で覆い、そしてスポット中のＤＮＡおよび試薬間の複合体形成に適した条件下で、生じた産物を維持（インキュベーション）する。複合体形成が生じるのに十分な時間（例えば２５℃で約２０分間）が経過した後、トランスフェクション試薬を除去して、ＤＮＡを所持する表面を産生し、そして適切な培地中の細胞を添加する。蒔いた細胞へのＤＮＡの進入を生じる条件下で、生じた産物（ＤＮＡおよび蒔いた細胞を所持する表面）を維持し、こうして、定義されるＤＮＡを含有し、そしてアレイ上の別個の定義される位置にある、逆トランスフェクション細胞のアレイ（アレイを所持する表面）を産生する。こうした細胞アレイは、本発明の主題である。
【００１８】
［００１８］脂質−ＤＮＡ態様では、ＤＮＡアレイを産生するための上述の工程を行って、そして続いて（スライドまたはウェル底などの表面に、ＤＮＡ含有スポットを付着させるのに十分な乾燥後）、ＤＮＡ含有スポットを所持する表面上に細胞を蒔き、そして乾燥脂質−ＤＮＡ混合物および逆トランスフェクションしようとする細胞を含有する、生じたスライドを、細胞増殖、および細胞内へのＤＮＡの進入に適した条件下で維持して、こうして定義されるＤＮＡを含有し、そしてアレイ上の別個の定義される位置にある、逆トランスフェクション細胞のアレイ（アレイを所持する表面）を産生する。こうしたアレイは、本発明の主題である。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．概観
［００３３］遺伝子配列およびクローニングされたｃＤＮＡのコレクションは増加しつつあり、遺伝子産物を性質決定するのに体系的でそしてハイスループットのアプローチの開発が要求される。転写プロファイリングのためのＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質−タンパク質相互作用を決定するための酵母２ハイブリッドアレイの使用は、遺伝子産物を性質決定するゲノムアプローチの最近の例である。多数の遺伝子セットの機能を、特に哺乳動物内で解析する、これらに匹敵する戦略は、以前には存在しなかった。現在、遺伝子産物の過剰発現を指示するか、あるいはその合成または機能を阻害する核酸構築物を細胞で発現させることによって、遺伝子ごとのスケールで、ｉｎ  ｖｉｖｏ解析を行うことが可能である。
【００２０】
［００３４］本発明は、平行して多くの遺伝子産物の機能解析を行うための、マイクロアレイ駆動遺伝子発現系に関する。細胞は、細胞に取り込まれることが可能な異なる核酸構築物を定義される位置にプリントした固相表面上の培養物である。トランスフェクションアレイの産物による細胞生理に対する影響を検出可能である。その同一性を確認するため、トランスフェクション構築物を回収しなければならないのではなく、アレイ上の目的のトランスフェクタントの位置によって、同一性を決定する。本アッセイは、細胞が、目的の構築物を同定するのに用いる読み取り対象である場合、特に有用である。
【００２１】
［００３５］平行して細胞における多くの遺伝子の機能を解析するため、マイクロアレイに基づく系が開発された。定義される位置に、異なるＤＮＡを含有する溶液をプリントしたガラススライド上で、細胞を培養する。プリントした領域上で増殖中の細胞は、ＤＮＡを取り込み、敷き詰めた非トランスフェクション細胞内に局在するトランスフェクションのスポットを生成する。発現ベクター中にクローニングされた相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セットをプリントすることによって、各位置で定義されるｃＤＮＡを発現する生存細胞群を含んでなるマイクロアレイを作成可能である。トランスフェクション細胞マイクロアレイは、特にシグナル伝達および薬剤発見などの領域で、遺伝子のハイスループット発現クローニングに関して、広い有用性を持つ可能性がある。例えば、本明細書に示すように、トランスフェクション細胞マイクロアレイは、免疫抑制剤ＦＫ５０６の受容体およびチロシンキナーゼ経路の構成要素の明白な同定のために使用可能である。
【００２２】
［００３６］本発明は、逆トランスフェクション法によって、表面上の、特定で別個の定義される位置で、定義されるＤＮＡを細胞内に導入する方法に関する。すなわち、本発明の方法は、スライドまたはウェル底などの表面に付着した、既知の配列および／または供給源のＤＮＡ（ＤＮＡスポット）、およびＤＮＡスポット上に蒔かれ、そして細胞へのＤＮＡの進入に適した条件下で維持される、増殖中の細胞を使用する。表面に付着したＤＮＡスポットのサイズおよびＤＮＡスポットの量（密度）は、方法で使用する条件に応じて、調整可能である。例えば、ＤＮＡスポットは、直径約１００μｍ〜約２００μｍであることが可能であり、そして表面上で、約２００μｍ〜約５００μｍ離れて付着させることが可能である。本発明の方法はさらに、ＤＮＡが逆トランスフェクションされている細胞の同定または検出も含む。１つの態様において、細胞に導入されたＤＮＡは、該ＤＮＡを含有する発現ベクターによって、または発現される宿主細胞ＤＮＡへの逆トランスフェクションＤＮＡの組込みの結果として、いずれかで、細胞において発現される。本発明の方法の別の態様において、細胞に導入されたＤＮＡは発現されず、細胞構成要素および／または機能自体に影響を及ぼす。例えば、この方法によってアンチセンスＤＮＡを細胞に導入可能であり、そして該ＤＮＡが細胞機能に影響を及ぼすことが可能である。例えば、逆トランスフェクションを介して、薬剤の受容体をコードするｍＲＮＡにアンチセンスであるＤＮＡ断片を細胞に導入することが可能である。アンチセンスＤＮＡは、薬剤受容体タンパク質の発現を減少させて、アンチセンスＤＮＡを含有する細胞に結合する薬剤の減少を引き起こすであろう。該方法において、目的のＤＮＡ（発現ベクターに取り込まれたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなど）およびキャリアータンパク質を含んでなる混合物を、定義される別個の位置で、表面（例えばスライド、またはマルチウェルプレートのウェル底などの他の平らな表面）上に沈着させ（例えば、定義される小領域にスポットするかまたは配置し）、そして乾燥させ、その結果、定義される別個の位置の表面にＤＮＡ含有混合物を付着させる。
【００２３】
［００３７］レシピエント細胞（逆トランスフェクションによって導入されたＤＮＡを含有する細胞）に対する影響の検出は、目的のタンパク質（例えば逆トランスフェクションＤＮＡにコードされると考えられるタンパク質、あるいは逆トランスフェクションＤＮＡの作用を通じて、その発現または機能が改変されるタンパク質）に結合する、蛍光標識抗体を用いて、ＤＮＡスポット上で増殖する細胞に、タンパク質が存在するかどうか決定する、免疫蛍光などの、多様な既知の技術によって、実行可能である。
【００２４】
［００３８］本発明の方法は、目的のＤＮＡ（レシピエント細胞中に発現しているか、あるいはレシピエント細胞構成要素または機能に作用するかまたはこれらと相互作用するＤＮＡ、例えばタンパク質の発現が発現される細胞に与える特性のため、その機能が望ましい該タンパク質をコードするＤＮＡ）を同定するのに有用である。これらは、マクロアレイおよびマイクロアレイを含む、多様な形式で使用可能である。これらは、ＤＮＡアレイが、タンパク質または細胞マイクロアレイなどの、タンパク質または細胞アレイに変換されることを可能にする。
【００２５】
ＩＩ．定義
［００３９］本発明をさらに説明する前に、便宜上、明細書、実施例および付随する請求項で使用する特定の用語をここに集める。
【００２６】
［００４０］本明細書において、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。
［００４１］「相補ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」は、本明細書において、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され、そして介在配列（イントロン）が除去されている組換え遺伝子を含む。
【００２７】
［００４２］本明細書において、用語「異種核酸」および「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）核酸」は、該核酸が存在するゲノムの一部として、天然には存在しないか、あるいはゲノムにおいて、天然に存在するのとは異なる単数または複数の位置に見られる核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。異種ＤＮＡは導入された細胞に対して内因性でなく、別の細胞から得られている。異種核酸の例には、限定されるわけではないが、試験ポリペプチド、受容体、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、薬剤耐性を与えるタンパク質などの選択可能または追跡可能マーカータンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。異種ＲＮＡの例には、限定されるわけではないが、アンチセンスＲＮＡ配列、リボザイム、および二本鎖ＲＮＡ（配列特異的ＲＮＡ干渉を誘導するため）が含まれる。
【００２８】
［００４３］本明細書において、用語「標的核酸」および「標的配列」は、トランスフェクションアレイの構成要素、例えば宿主細胞の表現型に変化を与える能力に関して関心が持たれる、宿主細胞にトランスフェクションされている核酸の単数または複数の部分を指す。常にではないが、一般的に、標的核酸は、アレイの１つの部分と次のもので異なるトランスフェクションアレイの核酸部分（類）であろう。標的核酸は、いくつかのみを挙げると、タンパク質のコード配列、ＲＮＡ分子の「コード」配列（例えばアンチセンスＲＮＡ配列、リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡに転写されるもの）、または制御配列（例えばレポーター構築物の一部として）であることが可能である。
【００２９】
［００４４］用語「フィーチャー」は、トランスフェクションアレイを記載するのに用いる場合、標的配列（または特定の同時トランスフェクション態様の場合、配列類）の均質なコレクションを有する支持体領域を指す。異なるフィーチャーの標的配列が、異なるヌクレオチド配列を有する場合、１つのフィーチャーは、別のフィーチャーと異なる。
【００３０】
［００４５］用語「機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」は、標的配列の影響を指す場合、宿主細胞中で発現された際、遺伝子発現を阻害するか、あるいは別の方式で、対応する野生型遺伝子産物の１以上の機能に比較して、遺伝子産物の活性を実質的に減少させるか、または好ましくはまったく活性をなくさせる、標的配列を指す。
【００３１】
［００４６］本明細書において、「望ましい表現型」は、本発明の方法のユーザーが、標的配列の発現に際して宿主細胞株に選択的に与えようとする特定の表現型を指す。
［００４７］本明細書において、用語「ベクター」は、細胞内に輸送し、そして／または維持することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターは、自律複製可能なものである。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる型であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。
【００３２】
［００４８］本明細書において、用語「機能可能であるように連結される」は、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳開始および停止部位、並びに他のシグナル配列などの、制御およびエフェクターヌクレオチド配列と核酸配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターへのＤＮＡの機能可能である連結は、こうしたＤＮＡの転写が、該ＤＮＡを特異的に認識し、これに結合し、そして転写するＲＮＡポリメラーゼによって、プロモーターから開始されるような、ＤＮＡおよびプロモーター間の物理的および機能的関係を指す。
【００３３】
［００４９］本明細書において、用語「発現」は、ポリ核酸がＲＮＡに転写され、そして（場合によって）ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを含んでなる、いずれかの数の工程を指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来するならば、適切な真核宿主細胞または生物を選択すれば、発現は、ＲＮＡのスプライシングを含む可能性がある。
【００３４】
［００５０］本明細書において、「組換え細胞」は、異種核酸の導入によって修飾されている、いかなる細胞も含む。対照細胞には、組換え細胞と実質的に同一であるが、異種核酸にコードされる１以上のタンパク質を発現しない細胞が含まれる。
【００３５】
［００５１］用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
［００５２］用語「組換えタンパク質」、「異種タンパク質」および「外因性タンパク質」は、本明細書全体で交換可能に用いられ、そして一般的に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、続いてこれを用いて宿主細胞を形質転換して異種タンパク質を産生する組換えＤＮＡ技術によって産生される、ポリペプチドを指す。すなわち、ポリペプチドは、異種核酸から発現される。
【００３６】
［００５３］本明細書において、「細胞表面受容体」は、細胞表面に存在し、細胞外環境と相互作用し、そして細胞内二次メッセンジャー活性または特定のプロモーターの転写を変調することが可能な様式で、環境に関する情報を細胞内に伝えるかまたは伝達して、特定の遺伝子の転写を生じる分子を指す。
【００３７】
［００５４］本明細書において、「細胞外シグナル」は、シグナルと直接または間接的に相互作用する細胞表面タンパク質を介して、細胞内に伝達される、分子または環境の変化を含む。細胞外シグナルまたはエフェクター分子には、何らかの様式で、細胞表面タンパク質の活性を改変するいかなる化合物または物質も含まれる。こうしたシグナルの例には、限定されるわけではないが、細胞表面および／または細胞内受容体およびイオンチャネルに結合し、そしてこうした受容体およびチャネルの活性を変調する、アセチルコリン、増殖因子およびホルモン、脂質、糖およびヌクレオチドなどの分子が含まれる。該用語はまた、細胞受容体の活性を変調し、そしてそれによって細胞内機能に影響を及ぼす、いまだに同定されていない物質も含む。こうした細胞外シグナルは、潜在的な薬理学的剤であり、これを用いて、特定の細胞表面受容体の活性を変調することによって、特定の疾患を治療することが可能である。
【００３８】
［００５５］「オーファン受容体」は、特定の天然リガンドが記載されておらず、そして／または機能が決定されていない受容体に与えられる名称である。
［００５６］本明細書において、「レポーター遺伝子構築物」は、少なくとも１つの転写制御配列に機能可能であるように連結された「レポーター遺伝子」を含む核酸である。レポーター遺伝子の転写は、これらが連結されている配列に調節される。これらの調節配列の少なくとも１以上の活性は、直接または間接的に標的受容体タンパク質に制御される。典型的な転写調節配列はプロモーター配列である。レポーター遺伝子は、細胞で異種性に発現されるプロモーター−受容体遺伝子構築物を含むことを意味する。
【００３９】
［００５７］「シグナル伝達」は、細胞膜を通じた細胞環境からの物理的または化学的シグナルのプロセシングであり、そして酵素（プロテアーゼ、あるいはリン酸化パターンまたは他の翻訳後修飾を改変可能な他の酵素）の活性化／不活性化、イオンチャネルまたは細胞内イオン貯蔵の活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質中間体を介したエフェクター酵素活性化、イノシトールリン酸形成、アデニリルシクラーゼの活性化または不活性化、転写因子および／または転写活性化の直接活性化（または阻害）などの、いくつかの機構の１以上を通じて、起こることが可能である。
【００４０】
［００５８］用語「受容体タンパク質のシグナル伝達活性の変調」は、文法上の多様な形で、本明細書において、受容体下流の１以上のシグナル伝達経路の誘導および／または増強と共に阻害を指す。
【００４１】
［００５９］用語「自己分泌細胞」は、本明細書において、物質を産生するのと同一の細胞内で、表現型上の応答を誘導可能な物質を産生する細胞を指す。
ＩＩＩ．トランスフェクションアレイ
［００６０］本発明のトランスフェクションアレイで用いる標的核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはその修飾型またはハイブリッド型であることが可能である。標的核酸は、細胞から単離される核酸、あるいは組換え的に産生されるか、または化学的に合成される核酸など、多様な供給源のいずれに由来することも可能である。
【００４２】
［００６１］例えば、トランスフェクションアレイは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のコード配列を含むことが可能である。天然配列に加え、コード配列は、天然配列に比較して突然変異されているもの、例えば少なくとも１残基の欠失、置換または付加によって天然存在配列と異なるコード配列を含むことが可能である。全長または部分的配列に対応することが可能であるし、方向においてアンチセンスであることが可能であるし、または非コード配列に相当することが可能である。
【００４３】
［００６２］他の態様において、標的核酸配列のすべてまたは一部を、化学的に合成することが可能である。こうした様式では、無作為および半無作為配列と共に、ヌクレオチドおよびヌクレオチド連結の修飾型、例えば修飾主鎖、メチル化ヌクレオチド等を標的配列に導入することが可能である。
【００４４】
［００６３］標的核酸配列は、発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスに基づくベクター）などのより大きいベクターの一部として存在することが可能であるが、そうである必要はない。アレイの核酸は、少なくとも標的配列がゲノムＤＮＡに組み込まれ、そして発現されるか、または標的配列が染色体外にありつづける（例えばエピソームに維持される）ような様式で、細胞に導入されることが可能である。
【００４５】
［００６４］本発明のトランスフェクションアレイで使用するための核酸は、直鎖または環状、二本鎖または一本鎖であることが可能であり、そしていかなるサイズであることも可能である。特定の好ましい態様において、特に、伝統的な発現ベクターを用いる場合、標的配列は、大きさが約２００ｎｔ〜約１０ｋｂであり、より好ましくは約２００ｎｔ〜約５ｋｂであり、そしてさらにより好ましくは２００ｎｔ〜２ｋｂである。こうした態様において、アレイ化核酸、例えば標的配列を含むものは、約１ｋｂ〜約１５ｋｂであることが可能であり、そしてより好ましくは約５ｋｂ〜約８ｋｂであることが可能である。
【００４６】
［００６５］特定の好ましい態様において、トランスフェクションアレイは、発現ベクターの変化に富んだライブラリーで作成される。ポリヌクレオチドコード配列または他の転写可能配列の発現ベクターへの連結は標準法を用いて実行可能である。同様の方法、またはその修飾法を容易に使用して、本発明にしたがった発現ベクターのアレイを調製することが可能である。
【００４７】
［００６６］一般的に、ベクターが宿主細胞において複製可能であることが望ましいであろう。ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれて、そしてその後、染色体ＤＮＡの一部として複製されるＤＮＡであることが可能であるし、またはエピソームプラスミドの場合のように、自律複製するＤＮＡであることが可能である。後者の場合、ベクターは、宿主において機能する複製起点を含むであろう。組込みベクターの場合、ベクターは、組込みを容易にする配列、例えば宿主配列に相同な配列、またはインテグラーゼをコードする配列を含むことが可能である。トランスフェクションアレイの構築物におけるレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）またはアデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）の使用は、例えば、構築物の染色体組込みを容易にすることが可能である。
【００４８】
［００６７］細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニングおよび発現ベクターが当該技術分野に知られ、そして例えばＰｏｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ニューヨーク，  １９９５）に記載される。こうしたベクターは、本発明で使用するため、容易に適応させることが可能である。発現ベクターは、発現しようとする遺伝子に連結された複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’隣接非転写配列などの非転写要素、並びに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写終結配列などの、５’または３’非翻訳配列を含んでなることが可能である。
【００４９】
［００６８］特定の好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌においてベクターの増殖を促進する原核配列（アレイからの回収後の増幅工程においてなど）、および真核宿主細胞において標的配列を発現するための１以上の真核転写単位両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターが、本発明の方法で使用するのに容易に適応可能な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかを、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で修飾して、原核および真核細胞両方における複製および薬剤耐性選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）等のウイルスの派生物を用いて、本発明のアレイを得ることが可能である。プラスミドの調製に使用する多様な方法が当該技術分野に公知である。原核および真核細胞両方に適した他の発現系と共に、一般的な組換え法に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ監修（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）第１６章および第１７章を参照されたい。
【００５０】
［００６９］特に好ましいベクターは、哺乳動物細胞のトランスフェクションのための標的配列に連結可能な制御要素を含有し、そしてこうしたベクターには、ｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに基づくベクター、ｐＭＡＭＮｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などのＭＭＴＶプロモーターに基づくベクター、並びにｐＳＶ０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）などのＳＶ４０プロモーターに基づくベクターが含まれる。
【００５１】
［００７０］アレイと組み合わせて使用する宿主細胞が酵母である場合、酵母で組換えタンパク質を発現するためのいくつかのベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に遺伝子構築物を導入するのに有用なクローニングおよび発現ビヒクルである（例えば、本明細書に援用される、Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｍ．  Ｉｎｏｕｙｅ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ中，  ｐ．８３を参照されたい）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉが存在するため、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）で、そして酵母２ミクロンプラスミドの複製決定因子が存在するため、Ｓ．セレビシエで、複製可能である。さらに、宿主細胞として酵母を使用する場合、酵母細胞における遺伝子の発現は、酵母で機能するプロモーターを必要とすると理解されるであろう。適切なプロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５，  ２０７３（１９８０））またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ−フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホ−グルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｑ．  ７，  １４９（１９６８）；およびＨｏｌｌａｎｄら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７，  ４９００（１９７８））のプロモーターが含まれる。
【００５２】
［００７１］いくつかの例において、昆虫細胞を用いて宿主細胞を得ることが望ましい可能性がある。こうした態様において、トランスフェクションアレイは、例えばバキュロウイルス発現系に由来することが可能である。こうしたバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩなど）が含まれる。
【００５３】
［００７２］アレイの標的配列の供給源が、天然存在である場合、これらの配列は、いかなる細胞または細胞コレクションから単離することも可能である。例えば、標的配列は、成人組織または器官、あるいは既定の発生段階いずれかの胚性組織または器官（卵母細胞、未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｅ）などを含む）いずれかの細胞から単離することが可能である。細胞は、健康な組織または疾患組織から得ることが可能である。固形器官の場合、細胞試料は、例えば生検によって得ることが可能である。血液、リンパおよび他の体液に関しては、例えばろ過、アフィニティー精製、遠心分離または当該技術分野に知られる他の技術いずれかによって、液体構成要素から細胞を単離することが可能である。既定の組織から特定の表現型サブセットの細胞を含むように細胞を単離することが可能であるし、あるいは組織を代表する細胞をすべてまたは実質的な部分、含むように得ることが可能である。例えば、細胞が特に上皮、間葉または内皮起源のものである器官から、細胞を得ることが可能である。細胞サブセットは、例えば、細胞表面マーカーを使用するか、または組織を注意深く区分化することによって、単離することが可能である。
【００５４】
［００７３］特定の好ましい態様において、標的配列は、目的の単数または複数の細胞から単離されるｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ配列である。細胞供給源からＲＮＡを単離するため、当該技術分野に知られる多様な方法があり、これらのいずれを用いて、本発明の方法を実施することも可能である。例えば、オリゴ−ｄＴストレプトアビジンビーズと組み合わせて用いるイソチオシアン酸グアニジンによって、総細胞ＲＮＡを単離する、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ法（米国特許第４，８４３，１５５号に記載）は、典型的なｍＲＮＡ単離プロトコルである。所望により、逆転写酵素によって、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することが可能であり、例えば逆転写酵素によって、ポリ（ｄＴ）プライミング第一鎖ｃＤＮＡを合成し、その後、第二鎖を合成する（ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ）。
【００５５】
［００７４］同様に、本発明の方法の多様な態様で使用しやすい、広い範囲のゲノムＤＮＡ単離技術がある。好ましい態様において、細胞コレクションに存在する化学的および／または物理的状態に基づいて、総ゲノムＤＮＡの一部のみを単離することが望ましいであろう。例えば、転写的に活性であり、そして／または潜在的に活性である遺伝子は、不活性配列から、いくつかの規準によって区別可能である。より高次の真核生物では、遺伝子活性化には、ＤＮアーゼＩまたはミクロコッカス・ヌクレアーゼのようなエンドヌクレアーゼに対する一般的な感度の増加が付随する。この感度の増加はどちらも、おそらく、クロマチンの部分的脱凝縮を反映する。さらに、遺伝子活性化は、通常、脱凝縮ドメインをはるかに越えて伸長する共複製ドメインを生じる。例えば、ＤＮアーゼＩによるクロマチン消化は、凝縮クロマチン構造の領域に比較して、脱凝縮を経験したゲノム領域から、より小さい消化断片を生じるであろうし（Ｇａｌａｓら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ５：３１５７）、例えば、活性化状態の遺伝子由来のゲノム配列に関しては、より小さい断片が豊富であろう。
【００５６】
［００７５］同様に、遺伝子のメチル化状態の変化は、発現の見込みを改変可能であり、そして標的核酸として特定のゲノム配列を選択するための規準として作用可能な、別の機構を提供する。したがって、取り巻くゲノム配列のメチル化状態に応じて遺伝子のエンドヌクレアーゼ断片を産生するため、ゲノムＤＮＡをメチル感受性制限酵素（ＤｐｎＩなど）で処理することが可能である。
【００５７】
［００７６］特定の態様において、本発明のアレイは、特定のタンパク質の突然変異体のライブラリー、または潜在的なプロモーター配列のライブラリーなど、関連する突然変異配列のライブラリーで作成することが可能である。コンビナトリアルライブラリーを生成するのに利用可能な、多様な型の突然変異誘発がある。例えば、目的のタンパク質の相同体（アゴニストおよびアンタゴニスト型両方）を生成し、そして例えばアラニン・スキャニング突然変異誘発等を用いたスクリーニングによって（Ｒｕｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５  ６５−１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２８８８−２８９３；Ｌｏｗｉｎａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）；リンカースキャニング突然変異誘発によって（Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）；飽和突然変異誘発によって（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）；ＰＣＲ突然変異誘発によって（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）；または無作為突然変異誘発によって（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）、ライブラリーから単離することが可能である。
【００５８】
［００７７］別の態様において、トランスフェクションアレイは、標的配列、例えば優性作用合成遺伝子要素（ＳＧＥ）、例えば由来する遺伝子の機能に干渉する分子（アンタゴニスト）またはこうした遺伝子の優性で恒常的に活性である断片（アゴニスト）をコードすることが可能な配列を提供する。本発明の方法によって同定可能なＳＧＥには、限定されるわけではないが、ポリペプチド、阻害性アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸デコイおよび小ペプチドが含まれる。
【００５９】
［００７８］本発明の方法によって同定されるＳＧＥは、例えばアンチセンスまたはデコイ機構によって、あるいはタンパク質レベルに干渉する機構を通じて阻害性であるポリペプチド、例えば天然タンパク質の優性ネガティブ断片をコードすることによって、核酸レベルで、内因性遺伝子の機能を阻害するよう、機能することが可能である。一方、特定のＳＧＥは、対応する内因性遺伝子の生理活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドをコードすることによって、内因性遺伝子の機能を増強する（模倣することを含む）ように、機能することが可能であり、そして特定の例では、恒常的に活性であることが可能である。
【００６０】
［００７９］１つの態様において、最初のＳＧＥライブラリーを総ｃＤＮＡから生成し、これをさらに断片化して、そして発現ライブラリーの型で提供することが可能である。好ましくは、ライブラリー中の挿入物は、大きさ約１００ｂｐ〜約７００ｂｐ、そしてより好ましくは、約２００ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲であろう。
【００６１】
［００８０］ｃＤＮＡ由来ライブラリーでは、核酸ライブラリーは、いかなる遺伝子の発現レベルにも関わらず、ライブラリーを作成した細胞種で発現される各遺伝子に対応して、おおよそ等しい数のクローンを含有する規準化ライブラリーであることが可能である。
【００６２】
［００８１］センスおよびアンチセンスコード（および非コード）配列両方を含むよう、最初のＳＧＥライブラリーを生成することが可能である。サブトラクティブおよび標的細胞におけるＳＧＥ配列の転写は、対応する内因性遺伝子の転写を阻害することが可能なアンチセンスＲＮＡを生成するであろう。転写ＲＮＡ中の適切なタンパク質コード配列の翻訳は、内因性タンパク質の全長型および一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型と共に、短いペプチドを産生することが可能であり、これらの差別的生物学的影響を、サブトラクティブおよび標的細胞で評価する。
【００６３】
［００８２］米国特許５，７０２，８９８は、一本鎖環に変換可能であり、そして一本鎖環に相補的な核酸分子を産生可能なベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーを規準化する方法であって：（ａ）一本鎖環中のｃＤＮＡライブラリーを変換し；（ｂ）一本鎖環に相補的な核酸分子を生成し；（ｃ）工程（ａ）で変換した一本鎖環を、工程（ｂ）の相補核酸分子とハイブリダイズさせて、適切なＣｏｔに部分的二重鎖を産生し；（ｅ）ハイブリダイズした一本鎖環からハイブリダイズしていない一本鎖環を分離し、それによって規準化ｃＤＮＡライブラリーを生成することを含んでなる、前記方法を記載する。
【００６４】
［００８３］特定の態様において、ＳＧＥライブラリーはサブトラクティブｃＤＮＡライブラリーであることが可能である。サブトラクティブライブラリーを生成するのに、多くの戦略が用いられてきており、そして本発明の方法で使用するのに容易に適応可能である。１つのアプローチは、出発材料として、一方向にクローニングしたｃＤＮＡライブラリーの使用に基づく（ＰａｌａｚｚｏｌｏおよびＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５２：１９７；Ｐａｌａｚｚｏｌｏら（１９８９）Ｎｅｕｒｏｎ  ３：５２７；Ｐａｌａｚｚｏｌｏら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８８：２５）。このアプローチでは、第一の供給源組織または細胞株から調製したｃＤＮＡを、ベクター中のバクテリオファージＴ７プロモーター直下に、一方向に挿入する。総ライブラリーＤＮＡを調製し、そしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写して、第一の供給源組織由来の元来のｍＲＮＡに対応する、多量のＲＮＡを産生する。供給源組織、および正常組織などの別の組織または細胞両方に存在する配列を以下のようにサブトラクションする。第一の供給源から調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを、第二の供給源組織由来の天然ｍＲＮＡまたはライブラリーＲＮＡいずれかから調製したｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。ＲＮＡに対するｃＤＮＡの相補性によって、これらが互いにアニーリングするため、共通の配列を除去することが可能になり、続いて、ハイブリダイズしない、おそらく組織特異的なｃＤＮＡを単離することが可能になる。無方向性ライブラリー中のいかなるｃＤＮＡ配列も、「センス」方向であるのと同程度に「アンチセンス」方向である可能性があるため、このアプローチは、一方向性ｃＤＮＡライブラリーを用いた場合のみ、可能である（センスおよびアンチセンスは互いに相補的である）。センスおよびアンチセンスコピー両方が存在すれば、ハイブリダイゼーション法中、組織に特有のｃＤＮＡ配列が完全に除去されるであろう。
【００６５】
［００８４］最初のＳＧＥライブラリーを生成するのに使用可能な、一方向クローニング戦略において、特定の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードするＤＮＡ配列（通常６〜１０塩基）をオリゴ（ｄＴ）プライマーの５’端で提供する。この比較的短い認識配列は、ｍＲＮＡへの１２〜２０塩基のオリゴ（ｄＴ）プライマーのアニーリングに影響を与えず、したがって、第一鎖テンプレートから合成したｃＤＮＡ第二鎖には、コード配列の元来の３’端に付加された、新規認識部位が含まれる。第二鎖ｃＤＮＡ合成後、第二の制限部位を含有する平滑末端リンカー分子（または第二の制限部位と適合する突出端を含有する、部分的二本鎖リンカーアダプター）をｃＤＮＡの両端に連結する。リンカーにコードされる部位は、ここで、ｃＤＮＡ分子の両端にあるが、ｃＤＮＡの３’端のみが、修飾プライマーによって導入される部位を有する。リンカー連結工程にしたがって、両制限酵素で（または部分的二本鎖リンカーアダプターをｃＤＮＡに連結した場合、修飾プライマー配列を認識する酵素のみで）産物を消化する。ｃＤＮＡ分子集団はすべて、５’端に１つの定義される配列、および３’端に異なる定義される配列を有するものを生じる。
【００６６】
［００８５］Ｍｅｉｓｓｎｅｒら（（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：４１７１）に開発された、関連する一方向クローニング戦略は、配列特異的修飾プライマーをまったく必要としない。Ｍｅｉｓｓｎｅｒらは、配列ｄ（ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣ）を有し、オリゴ（ｄＴ）でプライミングされるｃＤＮＡ集団に連結され、その後、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで連結産物を消化する、二本鎖パリンドロームＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ一方向性リンカーを記載する。このパリンドロームリンカーは、アニーリングして二本鎖型になった際、内部ＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）に隣接する、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）を明示する６塩基のうち４つを含む。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を完成させるのに必要な、失われた塩基は、５’端上のｄ（ＡＡ）または３’端上のｄ（ＴＴ）である。この一方向性リンカーが連結する配列にかかわらず、内部ＢａｍＨＩ部位は存在するであろう。しかし、ＨｉｎｄＩＩＩは、リンカーがｄ（ＡＡ）：ｄ（ＴＴ）二ヌクレオチド塩基対の隣に連結されている場合のみ、リンカーを切ることが可能である。オリゴ（ｄＴ）プライミング戦略では、この一方向性リンカーへの連結後、ｃＤＮＡの３’端で、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が常に生成される。５’端に配列ｄ（ＴＴ）を有するｃＤＮＡ（統計的に１６分子中１分子）では、リンカーの付加はまた、５’端にもＨｉｎｄＩＩＩ部位を生じるであろう。しかし、逆転写酵素の伸長能（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が欠如していることから、ｃＤＮＡの５’端が不均一であるため、各遺伝子セグメント由来のｃＤＮＡ産物がライブラリー中に提示されるであろう。
【００６７】
［００８６］他の態様において、ゲノムＤＮＡ断片からＳＧＥライブラリーを生成する。好ましくは、ライブラリー中の挿入物は、大きさ約１００ｂｐ〜約７００ｂｐの範囲であろうし、そしてより好ましくは、約２００ｂｐ〜約５００ｂｐの範囲であろう。こうしたＳＧＥライブラリーは、試験法における機能するＳＧＥである可能性がある、コードポリペプチドおよびアンチセンス分子に加え、デコイ分子、例えば遺伝子の制御要素に対応し、そして例えば転写因子を隔離し、そしてそれによって内因性遺伝子を発現するのに必要な構成要素と競合することによって、遺伝子の発現を阻害可能な核酸配列もまた「コードする」ことが可能である。
【００６８】
［００８７］さらに別の態様において、単一遺伝子を無作為に断片化して、もっぱら目的の遺伝子に由来する無作為断片発現ライブラリーを得ることによって、ＳＧＥライブラリーを生成する。実際問題として、こうしたライブラリーは、総ｃＤＮＡから調製した無作為断片ライブラリーよりも、はるかにより多様な、目的の遺伝子由来のＳＧＥを含有するであろう。その結果、単一遺伝子無作為断片ライブラリーから、本発明の方法にしたがった差別的活性を有する、最適化ＳＧＥを得る可能性は、はるかにより高くなる。
【００６９】
［００８８］１つの態様において、抑制しようとする遺伝子またはゲノムに対応する精製ＤＮＡをまず、酵素的、化学的、または物理的方法によって無作為に断片化する。好ましい態様において、ＤＮＡをＤＮアーゼＩなどのヌクレアーゼで処理することによって、ＤＮＡの無作為断片を産生する。無作為ＤＮＡ断片をＳＧＥライブラリー中の挿入物として取り込む。ＤＮアーゼＩ部分的消化およびライブラリー構築の一般的な原理に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）を参照されたい。特定の態様において、挿入された断片を、融合タンパク質の一部として発現することが可能である。他の態様において、挿入された断片を単独で発現することが可能である。別の態様において、リボザイムコード配列を挿入物に直接隣接して挿入して、最も有効なリボザイム−アンチセンスクローンの選択を可能にすることが可能である。さらに他の態様において、当該技術分野に知られる無作為突然変異誘発法によって、遺伝子抑制要素ライブラリーをさらに修飾することが可能である。挿入された断片を、恒常性または誘導性プロモーターいずれかから発現することが可能である。
【００７０】
［００８９］さらに別の態様において、小ペプチド、例えば長さ４〜２５アミノ酸残基の変化に富んだ集団をコードするライブラリーを用いて、本発明の方法を行う。ライブラリーは、総ｃＤＮＡ、または単一遺伝子のコード配列から生成可能であるし、あるいは配列において無作為であってもまたは半無作為であってもよい。タンパク質のわずかな部分にしか対応しない小ペプチド断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのタンパク質の機能を阻害することが可能である。
【００７１】
［００９０］さらに他の態様において、例えばＲＮＡ干渉によって特定の表現型を生じるｄｓＲＮＡ構築物を同定するのに使用するため、標的配列が宿主細胞において転写される際、二本鎖ＲＮＡを生じる、トランスフェクションアレイを用いて、本発明の方法を行う。
【００７２】
［００９１］コード配列のライブラリーは、無作為ペプチドか、または全長タンパク質をコードしているか、いずれであれ、キメラ（融合）タンパク質の一部を含め、多くの方式で発現させることが可能である。いくつかの例では、異なるタンパク質由来のキメラタンパク質部分間に、無構造（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ポリペプチドリンカー領域を導入することが必要である可能性がある。このリンカーは、キメラタンパク質の柔軟性が増進するのを促進可能であり、各部分が正しくフォールディングし、そして宿主細胞において適切な生物学的活性を保持することを可能にする。リンカーは、タンパク質の２つのドメイン間のランダムコイルに存在することが決定された配列など、天然起源のものであることが可能である。あるいは、リンカーは、合成起源のものであることが可能である。例えば、配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を合成無構造リンカーとして使用可能である。この種のリンカーはＨｕｓｔｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：４８７９；並びに米国特許第５，０９１，５１３号および第５，２５８，４９８号に記載される。ヒト起源の天然存在無構造リンカーは免疫原性のリスクを減少させるため、これらのリンカーが好ましい。
【００７３】
［００９２］例えばペプチドライブラリーの分泌が望ましい場合、ペプチドを含む融合タンパク質の一部として分泌シグナル配列を含むことによって、ペプチドライブラリーを分泌のために操作することが可能である。
【００７４】
［００９３］特定の好ましい態様において、トランスフェクションアレイは、単一アレイ中で、例えば好ましくは、少なくとも１０の異なる配列、より好ましくは、少なくとも１００、１０００または１０，０００の異なる別個の配列を提供する。
【００７５】
［００９４］好ましくは、支持体が平面である場合、横列および縦列などのアドレス可能な様式で、標的配列をアレイ化する。
［００９５］各フィーチャーサイズが幅約１００ミクロンである場合、各チップは、１平方センチメートル（ｃｍ２）領域に、約１０，０００の標的配列アドレス（フィーチャー）を有する可能性がある。特定の好ましい態様において、トランスフェクションアレイは、平方センチメートルあたり少なくとも１０３の異なるフィーチャー（１０３配列／ｃｍ２）、そしてより好ましくは、少なくとも１０４フィーチャー／ｃｍ２、１０５フィーチャー／ｃｍ２、または少なくとも１０６フィーチャー／ｃｍ２の密度を提供する。もちろん、少なくとも１００フィーチャー／ｃｍ２などの、より低い密度が意図される。
【００７６】
［００９６］特定の態様において、トランスフェクションアレイは、例えば、少なくとも２つの異なる標的配列での宿主細胞の同時トランスフェクションを促進するため、各フィーチャーにおいて、多数の異なる標的配列を提供する。同時トランスフェクションは、２以上のプラスミドあるいは他のＤＮＡまたは核酸構築物を、同一細胞に同時に導入することを指す。プラスミドまたは核酸構築物が、タンパク質、ＲＮＡまたは他の遺伝子産物などの遺伝子産物の発現を指示する場合、その後、細胞は、同時に、両方の遺伝子産物を発現するであろう。
【００７７】
［００９７］逆トランスフェクションが起こる表面上にスポットされた溶液が、１を超えるプラスミドまたは核酸構築物を含有する場合、トランスフェクション細胞マイクロアレイを用いて、同時トランスフェクションを行うことが可能である。もちろん、１つのフィーチャーにおける異なる標的配列コレクションは、アレイの他のフィーチャーとは別個のものであるべきである。同時トランスフェクションフィーチャーには、例えば、フィーチャーあたり２〜１０の異なる標的配列、フィーチャーあたり１０〜１００の異なる標的配列、またはフィーチャーあたり１００を超えさえする、異なる標的配列が含まれることが可能である。
【００７８】
［００９８］トランスフェクション細胞マイクロアレイにおいて、細胞を同時トランスフェクションする能力は、多くの重要な使用を有する。これらには、限定されるわけではないが：マーカータンパク質（例えばＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、または特異的抗体が入手可能なタンパク質いずれか）をコードする同時トランスフェクションプラスミド発現を検出することによって、遺伝子産物の発現を推測する能力、同一細胞において多サブユニット複合体（例えばＴ細胞受容体）の構成要素をすべて発現する能力、同一細胞においてシグナル伝達経路（例えばＭＡＰキナーゼ経路）の構成要素をすべて発現する能力、および小分子を合成する経路の構成要素（例えばポリケチドシンテターゼ）をすべて発現する能力が含まれる。さらに、同時トランスフェクションする能力は、同時発現されたプラスミドのコンビナトリアルな組み合わせで、マイクロアレイを生成することを可能にする。この能力は、餌（ｂａｉｔ）および餌食（ｐｒｅｙ）タンパク質をコードするプラスミドを、マイクロアレイの１つのフィーチャー中にスポットすることによって、同一細胞内に同時トランスフェクションして、哺乳動物２ハイブリッドアッセイを実行するのに特に有用である。
【００７９】
［００９９］同時トランスフェクションする能力はまた、特定の組織系譜に沿って、トランスフェクション細胞の分化を促進することが目的である場合にも有用である。例えば遺伝子の組み合わせを、幹細胞または初期前駆細胞で発現させることが可能であり、これは、内皮、肝臓、心臓、膵臓、リンパ、島、脳、肺、腎臓または他の細胞種への細胞の分化を強いるであろう。この方式で、細胞種特異的であるタンパク質または小分子の相互作用を調べるのに使用可能な、初代様細胞を用いて、アレイを作成することが可能である。
【００８０】
［０１００］さらに、ｃＤＮＡの組み合わせを、逆トランスフェクションが起こる表面上で、異なるパターンでプリントすることが可能である。パターンには、限定されるわけではないが、黒点（ｂｕｌｌｓ−ｅｙｅｓ）、正方形、多様な高さおよび幅の長方形、並びに単細胞厚の線が含まれる。異なる組織種への細胞の分化を引き起こすｃＤＮＡの組み合わせを、特定のパターンでプリントすることによって、この技術を用いて、別個の位置に別個の細胞種を持つアレイを得ることが可能である。この能力は、アレイ上に、血管および間質構造などの組織様構造を生成しようとする際に、または別の細胞種のタンパク質分泌に対する１つの細胞の応答を研究する際に、有用である可能性がある。例えば、黒点パターンの中央で分泌細胞種を生成し、そして黒点の縁に、異なる組織の応答細胞種を生成することが可能である。その後、中央細胞の分泌に対する応答細胞の応答を調べることが可能である。
【００８１】
［０１０１］単なる例であるが、プリントする前にプラスミドを混合するか、連続してプリントするか、マスクを用いてプリントするか、またはパターン化したプリントヘッドでプリントすることによって、各フィーチャーでプラスミド混合物を含有するアレイを構築可能である。例えば、プリントする前に容器中でプラスミドを混合し、そして均一混合物としてプリントすることが可能である。あるいは、互いの上に、または互いに近接してプラスミドをプリントすることが可能である。この方法では、各プラスミドを含有する混合物の厳密な組成を修飾して、細胞への進入の順序およびタイミングを調節することが可能であり、例えばより遅いまたはより速い遊離混合物がある。異なるパターンの穴を持つマスクまたは異なる構成のプリントヘッドを用いて、プラスミドの組み合わせをプリントすることもまた可能である。例えば、ポリケチド合成に関与する、異なる酵素を組み合わせて、異なるポリケチドを生成することが可能である。
【００８２】
［０１０２］本発明の方法で使用するためのキャリアーは、例えば、ゼラチンまたはその同等物であることが可能である。特定の態様において、キャリアーは、ポリカルボン酸、セルロース性ポリマー、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸ポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、またはポリエチレンオキシドなどのヒドロゲルである。
【００８３】
［０１０３］表面に核酸含有混合物を付着させるのに使用可能な、いかなる適切な表面も使用可能である。例えば、表面は、ガラス、プラスチック（ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンなど）、シリコン、金属（金など）、膜（ニトロセルロース、メチルセルロース、ＰＴＦＥまたはセルロースなど）、紙、バイオマテリアル（タンパク質、ゼラチン、寒天など）、組織（皮膚、内皮組織、骨、軟骨など）、ミネラル（ヒドロキシアパタイト、グラファイトなど）であることが可能である。表面の基本材料に、さらなる化合物を添加して、機能性を提供することが可能である。例えば、ポリスチレン支持体にシンチラントを添加して、シンチレーション近接アッセイを実行可能にすることが可能である。支持体は、多孔固体支持体または無孔固体支持体であることが可能である。表面は、凹面または凸面領域、疎水性または親水性領域パターン、回折格子、チャネルまたは他のフィーチャーを有することが可能である。これらのフィーチャーのスケールは、メートルからナノメートルスケールの範囲であることが可能である。例えば、スケールは、ミクロ流体チャネルまたは他のＭＥＭＳフィーチャーではミクロンスケールであることが可能であり、あるいはナノチューブまたはバッキーボールではナノメートルスケールであることが可能である。表面は、平面、上昇または陥没フィーチャーを持つ平面、球状（例えば光学的にコード化されたビーズ）、ファイバー（例えば光ファイバー束）、管状（内部または外部両方）、３次元ネットワーク（連結したロッド、管、球体）または他の形状であることが可能である。表面は一体化された系の一部であることが可能である。例えば、表面は、マイクロタイタープレート、培養プレート、培養チャンバーの底であることが可能である。レンズ、格子、電極などの他の構成要素を表面と一体化することが可能である。一般的に、支持体の材料およびアレイの幾何学的配列は、アレイ形成、培養および／または細胞表現型の検出の自動化に有用である規準に基づいて、選択されるであろう。
【００８４】
［０１０４］さらに他の態様において、固体支持体は、ミクロ球体（ビーズ）、特にＦＡＣＳ選別可能ビーズである。好ましくは、各ビーズは、個々のフィーチャーであり、例えば均質の標的配列集団を有し、そして混合物中の大部分の他のビーズとは別個であり、そして既定のビーズいずれか、そしてしたがってそれが示す標的配列を同定するのに使用可能な１以上のタグを有する。ビーズに付着する細胞において、ＦＡＣＳで検出可能な変化を誘導可能な既定の標的配列いずれかの同一性は、ビーズと会合するタグ（類）から容易に決定可能である。例えば、タグは、バイナリコードとして使用される、電子捕捉（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｃ）タグ付き分子であることが可能である（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：１０９２２−１０９２６）。典型的なタグは、電子捕捉ガスクロマトグラフィー（ＥＣＧＣ）によってフェントモルレベルより少ないレベルで、トリメチルシリルエーテルとして検出可能な、ハロ芳香族アルキルエーテルである。アルキル鎖の長さと共に、芳香族ハロゲン化物置換基の性質および位置を変動させて、少なくとも４０のこうしたタグを合成することが可能であり、原理的には、２４０（例えば１０１２より多く）の異なる分子をコードすることが可能である。しかし、本質的にいかなるコンビナトリアルライブラリーもコードすることを可能にする、より融通が利く系が開発された。ここで、化合物は光切断可能リンカーを介して固体支持体に付着するだろうし、そしてビーズマトリックスへのカルベン挿入を介し、カテコールエーテルリンカーを通じて、タグが付着する（Ｎｅｓｔｌｅｒら（１９９４）Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ５９：４７２３−４７２４）。この直交付着戦略によって、細胞／ビーズ実体をＦＡＣＳで選別し、そして続いて、単離されたビーズからタグセットを酸化脱離した後、ＥＣＧＣによってデコードすることが可能になる。他の態様において、２以上の蛍光的に活性な分子をビーズにタグ付けし、そして多様なフルオロフォアの比によって、ビーズの同一性を定義する。
【００８５】
［０１０５］さらに別の態様において、光ファイバー束などの光ファイバー系の端に、トランスフェクションアレイを配置することが可能である。各光ファイバー束は、束の直径に応じて、数千〜数百万の個々のファイバーを含有する。空間的に定義される光束に渡る、光の伝導性または透過性によって、トランスフェクションアレイに適用した細胞の表現型の変化を分光測定的に検出することが可能である。光ファイバーは、被覆処理したプラスチックまたはガラス管であり、被覆処理は、管のコアより低い回折指数のものである。複数のこうした管を合わせて、光ファイバー束を産生する。光ファイバー用の材料の選択は、少なくとも部分的に、トランスフェクション細胞の分光測定解析を達成しようとする波長に応じるであろう。
【００８６】
［０１０６］さらに、表面を例えば陽イオン性部分でコーティングすることが可能である。陽イオン性部分は、負に荷電したポリヌクレオチドに静電的に結合可能な、正に荷電した種いずれであることも可能である。キャリアーで使用するのに好ましい陽イオン性部分は、ポリリジン（例えばポリ−Ｌ−リジン）、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミンなどのポリカチオン、ヒストン（Ｃｈｅｎら（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３８：１６７−１６９）、アビジン、プロタミン（例えばＷａｇｎｅｒら（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：３４１０−３４１４を参照されたい）、修飾アルブミン（すなわちＮ−アクリル尿素アルブミン）（例えばＨｕｃｋｅｔｔら（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：２５３−２６３）などの塩基性タンパク質およびポリアミドアミン・カスケード・ポリマー（例えばＨａｅｎｓｌｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ４：３７２−３７９を参照されたい）である。好ましいポリカチオンはポリリジン（例えば３，８００〜６０，０００ダルトンの範囲）である。あるいは、表面自体が正に荷電していることが可能である（ガンマアミノプロピルシランまたは他のアルキルシランなど）。
【００８７】
［０１０７］表面はまた、さらなる機能を持つ分子でコーティングされていることも可能である。例えばこれらの分子は、抗体、ビオチン、アビジン、エピトープに結合するＮｉ−ＮＴＡ、アビジン、ビオチン化分子、または６−Ｈｉｓタグ付き分子などの捕捉試薬であることが可能である。あるいは、分子は、細胞外マトリックス、ウシ胎児血清、コラーゲンなどの培養試薬であることが可能である。
【００８８】
［０１０８］本発明はまた、アレイ化核酸を所持する表面上に細胞を蒔いた際に、核酸が細胞に導入される（導入可能である）（すなわち核酸が表面から細胞内に移動可能である）ように、表面に付着した核酸を含んでなるアレイを作成する方法も含む。本発明はまた、本明細書に記載される方法による、別個の定義される位置に、既知の配列または供給源の核酸が付着している表面を含んでなる核酸アレイも含む。
【００８９】
［０１０９］特定の態様において、トランスフェクション細胞のマイクロアレイがひとたび形成されたら（すなわちスポット中のｃＤＮＡが細胞に進入し、そしてコードされる遺伝子産物を細胞が発現したら）、マイクロアレイを多様な表面上に移すことが可能である。表面は、柔軟であってもまたは柔軟でなくても、そして多孔でもまたは無孔でもよい。表面は、平面であっても、あるいは凹面または凸面領域、疎水性または親水性領域パターン、回折格子、チャネルまたは他のフィーチャーのパターンで形作られていてもよい。これらのフィーチャーのスケールは、メートルからナノメートルスケールの範囲であることが可能である。表面の例には、限定されるわけではないが、ガラス、プラスチック（ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンなど）、シリコン、金属（金など）、膜（ニトロセルロース、メチルセルロース、ＰＴＦＥまたはセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）など）、紙、バイオマテリアル（タンパク質、ゼラチン、寒天など）、組織（皮膚、内皮組織、骨、軟骨など）、ミネラル（ヒドロキシアパタイト、グラファイトなど）が含まれる。さらに、これらの表面の多くを誘導体化して、さらなる機能性を提供することが可能である。例えば、ポリスチレン支持体にシンチラントを添加して、シンチレーション近接アッセイを実行可能にすることが可能である。別の例では、ニッケルまたはコバルトなどの金属を固定し、そしてヘキサヒスチジンタグ（６ｘ  Ｈｉｓ）などの特定のアミノ酸配列を所持するタンパク質の選択的結合を可能にする金属キレーターを用いてニトロセルロース膜を共有的に修飾することが可能である。
【００９０】
［０１１０］１）マイクロアレイ上の細胞材料全体（すなわち細胞によって作成される内因性および組換え材料両方（ＲＮＡまたはタンパク質））をトランスファーするように、または２）組換え材料のみをトランスファーするように、トランスファーを行うことが可能である。別の表面へのマイクロアレイのトランスファーは、マイクロアレイを他の表面に直接接触させ、そして材料がキャピラリー力（通常、「ブロッティング」と称する）、電場または磁場、真空吸引力、あるいは他の力などの力の影響下で新規表面に移動するのを可能にすることによって達成する。材料は、疎水性、親水性、ファンデルワールス力、イオン性または他の力によって仲介される相互作用を通じて、あるいは特定の受容体−リガンド相互作用（例えば抗体−エピトープ相互作用）を通じて、あるいは他の表面の分子構造に巻き込まれることによって、新規表面に結合する。
【００９１】
［０１１１］細胞材料をマイクロアレイから別の表面にトランスファーする能力は、多くの重要な使用を有する。これらには、限定されるわけではないが、特定の表面上で通常行われる技術を用いて、細胞表現型またはタンパク質特性を検出する能力、およびマイクロアレイで発現される組換え遺伝子産物を平行して精製する能力が含まれる。特定の表面上で通常行われる技術の例には、ウェスタンブロッティング、ファー・ウェスタンブロッティング、サウスウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分析、および他のものが含まれる。これらの技術は通常、ニトロセルロース、ナイロン、紙、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、あるいは金または他の金属表面または膜上の、天然または変性タンパク質の固定を要する。サウスウェスタンブロッティングは、タンパク質と核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の相互作用を検出するのに用いられる。適切な膜にトランスファーした後、転写因子などのＤＮＡ結合タンパク質のコレクションを発現する細胞のマイクロアレイを用いて、ゲノムＤＮＡ配列要素に対する結合タンパク質を同定することが可能である。
【００９２】
［０１１２］他の表面へのマイクロアレイのトランスファーはまた、マイクロアレイ上で発現される組換えタンパク質を平行して精製するのにも有用である。このアプローチの１つの態様において、マイクロアレイ上で発現される組換えタンパク質はすべて、特定のタンパク質または化学的試薬のリガンドであるアミノ酸配列（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体に認識されるエピトープ、あるいはニッケルアフィニティーマトリックスに認識されるヘキサ−ヒスチジンタグ）を含有する。その後、リガンドに結合する試薬で誘導体化した表面（例えば抗エピトープ・モノクローナル抗体が結合しているニトロセルロース膜、または表面へのニッケルの結合を可能にする金属キレーターで誘導体化されているニトロセルロース膜）に直接接触させることによって、これらのタンパク質を発現するマイクロアレイをトランスファーする。材料が新規表面に結合した後、特定の相互作用を破壊しないが、表面との非特異的相互作用を排除する適切な緩衝液で表面を洗浄する。非特異的相互作用には、限定されるわけではないが、マイクロアレイがトランスファーされている表面に認識される特定のリガンドを含有しない、細胞構成要素いずれかの相互作用が含まれる。その後、組換えタンパク質のマイクロアレイを用いて、アレイとの他のタンパク質または小分子の相互作用を検出することが可能である。オートラジオグラフィー、蛍光、質量分析、免疫蛍光、または熱量測定を用いて、マイクロアレイとのタンパク質または小分子の結合を検出することが可能である。
【００９３】
［０１１３］以下に示すのは、エピトープタグ付きタンパク質を発現し、そしてガラススライド上で増殖する細胞のマイクロアレイの、ニトロセルロース膜へのトランスファーの概念例の論証である。
【００９４】
［０１１４］マイクロアレイをニトロセルロース膜上にトランスファーし、そして標準的ウェスタンブロッティングプロトコルでタンパク質を検出する。図は、標準的抗ｍｙｃウェスタンブロッティングプロトコルを用いて、化学発光増進を介して検出した、ｍｙｃタグ付きタンパク質アレイの例である。中央の２つの横列（水平方向）は、最上段および最下段の横列の半量の発現構築物を用いてプリントする。Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムを用いてシグナルを検出し、そして各スポットは、直径〜１５０μｍである。
【００９５】
［０１１５］例えば、マイクロアレイをプロセシングする用意ができたら（通常、トランスフェクション１〜２日後）、ピンセットを用いて、培養プレートからスライドを持ち上げ、そしてコプリン瓶中で、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で迅速にリンスする。リンス後、吸収紙タオルで縁から簡単に吸い取ることによって、スライドから過剰のＰＢＳを除去する。その後、細胞を上にしてスライドを平面に置き、テープで固定して、そして２〜３分間乾燥させる（この時間は、どのくらい多くのＰＢＳがスライド上に残っているかに応じて、多様である可能性がある）。その後、スライド面積の約２〜３倍のニトロセルロース膜（０．４５μｍ純粋ニトロセルロース膜；カタログ番号１６２−０１１６、ＢｉｏＲａｄ）を、伝統的なプラークリフトで行うのと類似の方式で（すなわち中央を先に）、非常に注意深くスライド上に置く。この時点で、この工程では、膜またはスライドのいかなる水平方向の移動も許さないことが非常に重要である。１〜３分間、またはＰＢＳがスライドを覆う膜の全領域を湿らせるまで、膜をスライド上に放置する。膜を押し付けたり、またはピンを膜上に転がしたりすると、必ず膜をスリップさせ、そしてアレイを破壊するであろうため、このようにはしないことが非常に重要である。また、膜をスライドに貼り付け、そして持ち上げた時に破ってしまうであろうため、スライド上のすべての水分を膜に移さないことが非常に重要である。トランスファー後、ニトロセルロース膜をピンセットでスライド表面から注意深く持ち上げ、そして２時間風乾させる。乾燥後、膜をｐＨ１１のＣＡＰＳ−メタノールトランスファー緩衝液（２．２ｇ／ｌ  ＣＡＰＳ、１０％メタノール、ｐＨ１１）に１〜２分間浸し、そして標準的ウェスタンブロット・ブロッキング溶液に入れる。その後、標準的なウェスタンブロッティングプロトコルいずれかにおけるように、一次および二次抗体で膜をプロセシングする。
【００９６】
ＩＶ．細胞
［０１１６］本発明のアッセイを生成するのに適した宿主細胞には、原核生物、酵母、または植物および動物細胞を含む、より高次の真核細胞、特に哺乳動物細胞が含まれる。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。
【００９７】
［０１１７］特定の好ましい態様において、より高次の真核生物、例えば後生動物由来の細胞を用いて、本発明の方法を行い、そして特に好ましい態様において、哺乳動物細胞を用い、さらにより好ましいのは、ヒト細胞などの霊長類細胞である。哺乳動物細胞の他の好ましい種には、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウスおよびラットが含まれる。例えば、こうした細胞は、造血細胞、ニューロン細胞、膵臓細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨細胞、または筋細胞であることが可能である。細胞は完全に分化した細胞であっても、または前駆／幹細胞であってもよい。
【００９８】
［０１１８］さらに、細胞は、正常または疾患組織由来、分化または未分化細胞由来、胚性または成体組織由来であることが可能である。
［０１１９］細胞は培養中に分散していることが可能であるし、または器官の微小構造のある程度を保持する多数の細胞を含有する組織試料であることが可能である。
【００９９】
［０１２０］特定の態様において、本発明のトランスフェクションアレイを用いて、標的細胞と同時培養可能な細胞をトランスフェクションする。トランスフェクションアレイから、遺伝子を発現している細胞によって分泌される生物学的に活性なタンパク質は、隣接する標的細胞に分散し、そして他の表現型規準によって直接検出される、例えば増殖または分化、あるいはシグナル伝達経路の活性化などの、特定の生物学的反応を誘導するであろう。同様に、機能的アンタゴニストを産生する細胞が、培地に添加された外因性因子の影響から、隣接する細胞を守る能力によって、類似の様式で、既定の因子のアンタゴニストを選択可能である。宿主および標的細胞は、直接接触していても、または例えば細胞培養インサート（例えばＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号４０４４６）によって分離されていてもよい。
【０１００】
［０１２１］酵母細胞を用いる場合、酵母は、培養可能であり、そしてトランスフェクションの際、トランスフェクションアレイ中で維持することが可能な、いかなる種のものであることも可能である。適切な種には、クルイベレイ・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｅｉ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびウスティラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）が含まれ；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。本発明を実施するのに使用可能な他の酵母は、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。用語「酵母」は、本明細書において、厳密な分類学上の意味での酵母、すなわち単細胞生物だけでなく、酵母様多細胞真菌または糸状真菌も含む。
【０１０１】
［０１２２］適切な宿主細胞の選択はまた、検出シグナルの選択にも影響を受けるであろう。例えば、レポーター構築物は、標的核酸に誘導される機能獲得または機能喪失に際して、選択可能またはスクリーニング可能な特質を提供することが可能である。レポーター遺伝子は、宿主細胞経路にすでにある、修飾されていない遺伝子であることが可能であるし、または異種遺伝子（例えば「レポーター遺伝子構築物」）であることが可能である。他の態様において、細胞内カルシウムの可動化またはリン脂質代謝などの検出工程で直接二次メッセンジャー生成を測定することが可能であり、この場合、宿主細胞は、こうした経路の活性化に適した出発表現型を有するべきである。
【０１０２】
［０１２３］細胞への核酸の導入／進入に十分な密度および適切な条件下で、トランスフェクションアレイを所持する表面上に、宿主細胞を蒔く（配置する）。好ましくは、トランスフェクションが生じるであろう可能性を増加させるため、宿主細胞（適切な培地中）を高密度で（例えば０．５〜１ｘ１０５／ｃｍ２の桁で）アレイ上に蒔く。例えば、細胞密度は、約０．３ｘ１０５／ｃｍ２〜約３ｘ１０５／ｃｍ２であることが可能であり、そして特定の態様では、約０．５ｘ１０５／ｃｍ２〜約２ｘ１０５／ｃｍ２および約０．５ｘ１０５／ｃｍ２〜約１ｘ１０５／ｃｍ２である。細胞へのＤＮＡの導入／進入に適した条件は、用いた細胞の量に応じて多様であろう。
【０１０３】
［０１２４］特定の態様において、宿主細胞を操作して、他の組換え遺伝子を発現させることが可能である。例えば、宿主細胞をレポーター遺伝子構築物で操作して、そしてトランスフェクションアレイのメンバーがレポーター遺伝子の発現レベルを改変する能力を評価することが可能である。単なる例であるが、レポーター遺伝子の転写活性化因子または転写抑制因子をコードし、そして天然および非天然配列を含む可能性があるメンバーに関して、トランスフェクションアレイを評価することが可能である。例えば、その配列に結合するタンパク質を探索するためのプロモーター配列を含むレポーター遺伝子構築物で、宿主細胞をトランスフェクションすることが可能である。トランスフェクションアレイは、ポリメラーゼ活性化ドメインに融合した潜在的なＤＮＡ結合ドメインのライブラリーをコードすることが可能である。レポーター遺伝子の発現を誘導する能力によって、ライブラリーメンバーを選択する。逆に、転写制御要素の配列に関して、変化に富んだレポーター遺伝子構築物のライブラリーをアレイ化することによって、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合特異性を決定可能である。細胞はまた、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば天然にまたは操作によって転写活性化ドメインを含むＤＮＡ結合タンパク質も発現する。適切な制御配列を含むレポーター遺伝子構築物ライブラリーのメンバーを発現し、そしてアレイ中のこうした構築物の位置を用いて、ＤＮＡ結合タンパク質のコンセンサス配列を決定する。
【０１０４】
［０１２５］他の例では、機能喪失または機能獲得表現型を有するように宿主細胞を操作することが可能であり、そしてトランスフェクションアレイメンバーがこうした表現型に対抗する能力を評価する。
【０１０５】
［０１２６］さらに他の例において、組換え細胞表面受容体を発現するように宿主細胞を操作し、そしてトランスフェクションアレイは、遺伝子産物またはペプチドの変化に富んだライブラリーをコードし、そしてそのライブラリーの１以上のメンバーが受容体によるシグナル伝達を誘導するかまたは阻害する能力を評価する。例えば、トランスフェクションアレイは、分泌ペプチドのライブラリーを提供可能であり、そして自己分泌表現型への細胞の変換によって、既定のペプチドがシグナル伝達を誘導する能力を検出する。
【０１０６】
Ｖ．検出
［０１２７］多様な方法を用いて、取り込み結果を検出可能であり、そして多くの態様では、標的配列の発現（少なくとも転写）を検出可能である。一般的な意味で、アッセイは、標的配列が、同一であるが標的配列を欠く細胞に比較して、細胞の表現型に変化を与えることが可能であるかどうかを決定するための手段を提供する。こうした変化は、細胞形態の変化（膜のしわ、有糸分裂速度、細胞死速度、細胞死機構、色素取り込み等）によるなど、全体の細胞レベルで検出可能である。他の態様では、あるとすれば、細胞表現型に対する変化を、いくつかのみを挙げると、特定のタンパク質（選択可能または検出可能マーカーなど）のレベル、あるいはｍＲＮＡまたは二次メッセンジャーのレベルの検出などの、より集中的な手段によって検出する。レポーター遺伝子（ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ベータ−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をアッセイし、酵素をアッセイし、免疫アッセイを用い、色素（例えばＤＡＰＩ、ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）で染色し、電気的変化をアッセイし、細胞形状変化を性質決定し、タンパク質コンホメーション変化を調べ、そして細胞数を計数することによって、細胞表現型の変化を決定することが可能である。化学的アッセイ、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、共焦点顕微鏡、画像再構築顕微鏡、スキャナ、オートラジオグラフィー、光散乱、光吸収、ＮＭＲ、ＰＥＴ、パッチクランプ、熱量測定、質量分析、表面プラズモン共鳴、時間分解蛍光などの方法によって、他の目的の変化を検出することが可能である。単一のまたは複数の時点でデータを収集し、そして適切なソフトウェアによって解析することが可能である。
【０１０７】
［０１２８］例えば、免疫蛍光を用いて、タンパク質を検出することが可能である。あるいは、別のタンパク質のリン酸化状態または細胞下局在を改変するタンパク質、他のタンパク質または核酸と結合するタンパク質、あるいは酵素活性を持つタンパク質の発現を検出することが可能である。
【０１０８】
［０１２９］１つの態様において、スクリーニングは、寄生虫または感染性病原体が目的の細胞に添加された際、増殖または生存が不能であることに関するものであってもよい。この場合、選択は、細胞が感染した際にのみ本質的な、細胞内のウイルスまたは寄生虫機能のいくつかの側面に関して、特に本質的である遺伝子を標的とするノックアウトに関するものであろう。いくつかのウイルス感染は、生存因子（ＣｒｍＡ、ｐ３５など）の誘導を生じるため、少なくともいくつかの細胞機能が異なり、そして選択的に、ウイルス、寄生虫増殖中に必要とされる可能性がある。
【０１０９】
［０１３０］スクリーニング法手段の別の種類は、測定可能な特定の因子の発現に関するものであり、そしてこの測定をスクリーニングに適応させることが可能である。この因子は、限定されるわけではないが、分泌される分子、細胞表面分子、可溶性および不溶性分子、結合活性、他の細胞に対する活性を誘導するか、あるいは他の有機または無機化学反応を誘導する活性を含む、測定がアクセス可能ないかなるものであることも可能である。これらの相互作用は、時間分解蛍光、表面プラズモン共鳴、シンチレーション近接アッセイ、オートラジオグラフィー、蛍光活性化細胞選別、または他の方法によって、検出可能である。
【０１１０】
［０１３１］さらに別のスクリーニング法は、選択スキームに適応可能な手段いずれかによって検出される、細胞構造の変化に関するものである。これには、限定されるわけではないが、示差沈降、示差光散乱、示差浮遊密度、ふるいによって選択される示差細胞体積、原子間力顕微鏡、電子顕微鏡などの物理的方法によって測定される、形態学的変化が含まれる。
【０１１１】
［０１３２］試験化合物の生物活性をスクリーニングする際、細胞内二次メッセンジャー生成を直接測定することが可能である。こうした態様は、例えば、特定のシグナル伝達経路を活性化するかまたは不活性化する標的配列に関して、アレイ化ライブラリーをスクリーニングする場合に有用である。多様な細胞内エフェクターが、受容体またはイオンチャネルに制御されると同定されてきており、これらには、アデニリルシクラーゼ、環状ＧＭＰ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチダーゼ、ホスホイノシトールキナーゼ、およびホスホリパーゼと共に、多様なイオンが含まれる。
【０１１２】
［０１３３］１つの態様において、当該技術分野に知られる技術を用いてγ３２Ｐ  ＧＴＰ分解を測定することによって、Ｇタンパク質によるＧＴＰアーゼ酵素活性を形質膜調製で測定することが可能である（例えば、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｇ．  Ｍｉｌｌｉｇａｎ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  英国オックスフォード）。ｃＡＭＰを変調する受容体を試験する場合、未標識ｃＡＭＰの存在下で、［３Ｈ］ｃＡＭＰを定量化する競合的アッセイなどの、ｃＡＭＰ検出に関して標準的な技術を使用することが可能であろう。
【０１１３】
［０１３４］特定の受容体およびイオンチャネルは、ホスファチジルイノシトール４，５ビスホスフェートの１，４，５−ＩＰ３（細胞内Ｃａ＋＋を可動化する）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（プロテインキナーゼＣを活性化する）への分解を刺激する、ホスホリパーゼＣの活性を刺激する。標準的脂質抽出技術を用いて、イノシトール脂質を抽出し、そして解析することが可能である。ＤＡＧもまた、薄層クロマトグラフィーを用いて、測定することが可能である。３つのイノシトール脂質（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３）すべての水可溶性誘導体もまた、放射標識技術またはＨＰＬＣを用いて、定量化可能である。
【０１１４】
［０１３５］ＰＩＰ２分解の他の産物、ＤＡＧはまた、ホスファチジルコリンからも産生可能である。受容体仲介シグナル伝達に応答した、このリン脂質の分解はまた、多様な放射標識技術を用いても、測定可能である。
【０１１５】
［０１３６］例えば細胞中のアラキドネート生成を含む、既知の技術を用いて、ホスホリパーゼＡ２の活性化を容易に定量化可能である。
［０１３７］多様な細胞、例えば哺乳動物細胞において、分岐するシグナル伝達経路のいくつかのアームのそれぞれで、特定のプロテアーゼが誘導されるかまたは活性化される。各プロテアーゼに特異的な基質を用いて、特有の活性を追うことによって、これらを独立に監視することが可能である。
【０１１６】
［０１３８］特定の受容体およびイオンチャネルのリガンドに関してスクリーニングする場合、細胞リン酸化の変化に関してスクリーニングすることが望ましい可能性がある。こうしたアッセイ形式は、宿主細胞が、受容体キナーゼまたはホスファターゼなどの目的の受容体を発現する際に、そして自己分泌方式で作用可能なペプチド配列に関してアレイ化ライブラリーをスクリーニングする際に、有用である可能性がある。例えば、抗ホスホチロシン、抗ホスホセリンまたは抗ホスホスレオニン抗体を用いたイムノブロッティング（ＬｙｏｎｓおよびＮｅｌｓｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：７４２６−７４３０）。さらに、受容体自体がキナーゼでない可能性があるが、シグナル伝達経路の下流で作用するプロテインキナーゼまたはホスファターゼを活性化する際に、リン酸化に関する試験もまた有用である可能性がある。
【０１１７】
［０１３９］さらに別の態様において、標的とする受容体またはイオンチャネルのシグナル伝達経路は、細胞に添加可能な基質を修飾することが可能な酵素の発現を上方制御するか、または別の方式で活性化する。基質シグナルの喪失を監視する場合は検出可能基質を用いることによって、あるいは検出可能産物を生じる基質を用いることによって、シグナルを検出することが可能である。好ましい態様において、活性化酵素による基質の産物への変換は、試験細胞の光学的特性の検出可能な変化を生じ、例えば基質および／または産物は、色素生産的にまたは蛍光発生的に活性である。実例となる態様において、シグナル伝達経路は、タンパク質分解酵素の活性に変化を引き起こし、基質ペプチドを切断する速度を改変する（または単純に基質に対して酵素を活性化する）。ペプチドには、蛍光発生ドナーラジカル、例えば蛍光発光ラジカル、およびアクセプターラジカル、例えばアクセプターラジカルおよび蛍光発生ドナーラジカルが密接に近接して共有的に保持される場合、蛍光発生ドナーラジカルの蛍光エネルギーを吸収する芳香族ラジカルが含まれる。例えば、ＵＳＳＮ  ５，５２７，６８１、５，５０６，１１５、５，４２９，７６６、５，４２４，１８６、および５，３１６，６９１；並びにＣａｐｏｂｉａｎｃｏら（１９９２）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０４：９６−１０２を参照されたい。例えば、基質ペプチドは、ペプチド上の１つの位に位置する１−アミノ安息香酸（アントラニル酸またはＡＢＺ）またはアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）などの蛍光ドナー基、およびペプチドの遠位端近傍の異なる位置のルシファーイエロー、メチルレッドまたはニトロベンゾ−２−オキソ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）などの蛍光消光基を有する。活性化酵素の切断部位は、ドナーおよびアクセプター基の部位各々の間に配置されるであろう。蛍光ドナー分子から消光剤への分子内共鳴エネルギー移動は、２つが空間的に十分に近接である場合、例えばペプチドが損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）場合、ドナー分子の蛍光を消光するであろう。しかし、ペプチドの切断に際して、消光剤はドナー基から離れ、蛍光断片を残す。したがって、酵素の活性化は、検出ペプチドの切断を、そして蛍光基の脱消光を生じる。
【０１１８】
［０１４０］好ましい態様において、検出ペプチドを切断する酵素は、宿主細胞に内因性であるものである。例えば、酵母のｂａｒ１遺伝子は、プロテアーゼをコードし、この酵素の発現は、酵母フェロモン経路の刺激によって上方制御される。したがって、ｂａｒ１によって切断されて蛍光発生断片を遊離させることが可能である適切な検出ペプチドと、検出にフェロモンシグナル経路を利用するために生成した宿主細胞を接触させ、そしてこうしてｂａｒ１活性レベルを決定する。
【０１１９】
［０１４１］さらに他の態様において、活性が、二次メッセンジャー、例えばカルシウム、イノシトールリン酸の加水分解産物、ｃＡＭＰなどの濃度に依存する、酵素または色素生産／蛍光プローブの使用によって、検出可能シグナルを産生可能である。例えば、標準的技術を用いて、細胞内カルシウムの可動化、または細胞外部からのカルシウム流入を測定することが可能である。適切なカルシウム指標、蛍光剤、生物発光剤、金属発色剤（ｍｅｔａｌｌｏｃｈｒｏｍｉｃ）、またはＣａ＋＋感受性微小電極の選択は、細胞種、並びに研究中の事象の規模および時間定数に応じる（Ｂｏｒｌｅ（１９９０）Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ８４：４５−５６）。Ｃａ＋＋検出の典型的な方法として、標準法を用いて、細胞にＣａ＋＋感受性蛍光剤、ｆｕｒａ−２またはｉｎｄｏ−１を装填し、そして蛍光測定装置を用いて、Ｃａ＋＋のいかなる変化も測定する。
【０１２０】
［０１４２］上述の特定の態様が示唆するように、転写産物の検出によって、例えば指標遺伝子（類）の転写活性化（または抑制）を検出することによって、アレイ化ライブラリーにおいてアゴニストまたはアンタゴニストを探索する、シグナル伝達活性を測定することが可能である。転写産物の検出には、遺伝子転写物の検出、産物の直接検出（例えばイムノアッセイによる）、またはタンパク質活性の検出（例えば酵素活性または色素生産／蛍光発生活性など）が含まれ；これらは各々、本明細書において、一般的に、指標遺伝子の発現を検出する手段と称される。指標遺伝子は、宿主細胞の非修飾内因性遺伝子、修飾内因性遺伝子、または完全に異種性の構築物の一部、例えばレポーター遺伝子構築物の一部であることが可能である。
【０１２１】
［０１４３］１つの態様において、指標遺伝子は、非修飾内因性遺伝子である。例えば、本発明の方法は、Ｇタンパク質カップリング受容体に由来するシグナル伝達経路に応答した、ｃ−ｆｏｓ遺伝子（例えば哺乳動物細胞中）あるいはＢａｒ１またはＦｕｓ１遺伝子（例えば酵母細胞中）などの内因性遺伝子の転写レベルを検出するのに頼ることが可能である。
【０１２２】
［０１４４］特定の例において、例えば試験系のシグナル対ノイズ比を改善するため、または特定の検出技術に適したレベルに応答レベルを調整するため、シグナル経路による内因性指標遺伝子の転写活性化レベルを増加させることが望ましい可能性がある。１つの態様において、シグナル経路の転写活性化能は、細胞内シグナルカスケードに関与する１以上のタンパク質、特に経路に関与する酵素の過剰発現によって、増幅可能である。例えば、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の発現増加は、ＭＥＫＫ／ＪＮＫＫ経路のシグナルによる転写活性化レベルを増強可能である。同様に、酵母フェロモン経路における１以上のシグナル伝達タンパク質の過剰発現は、Ｆｕｓ１および／またはＢａｒ１発現レベルを増加させることが可能である。もちろん、このアプローチはまた、異種レポーター遺伝子の転写レベルを増強するのにも使用可能である。
【０１２３】
［０１４５］他の態様において、内因性指標遺伝子の感度は、指標遺伝子の天然遺伝子座のプロモーター配列を操作することによって、増進可能である。こうした操作は、点突然変異から内因性制御要素、それから制御要素のすべてまたは実質的な部分の全体の置換の範囲にあることが可能である。一般的に、指標遺伝子のゲノム配列操作は、相同組換えを含む当該技術分野に知られる技術を用いて、実行可能である。
【０１２４】
［０１４６］さらに別の態様において、異種レポーター遺伝子構築物を用いて、指標遺伝子機能を提供することが可能である。レポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子を少なくとも１つの転写制御要素と機能可能であるように連結することによって、調製する。１つの転写制御要素のみが含まれる場合、これは制御可能プロモーターでなければならない。少なくとも１つの選択される転写制御要素は、選択される細胞表面受容体の活性によって、間接的にまたは直接制御されなければならず、これによって、レポーター遺伝子の転写を介して、受容体の活性を監視することが可能である。
【０１２５】
［０１４７］多くのレポーター遺伝子および転写制御要素が当業者に知られ、そして当業者に知られる方法によって、他のものを同定するかまたは合成することが可能である。
［０１４８］レポーター遺伝子の例には、限定されるわけではないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ（１９７９），  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：８６４−８６９）、ルシフェラーゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼなどの他の酵素検出系；ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔら（１９８７），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：７２５−７３７）；細菌ルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔおよびＳｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４），  ＰＮＡＳ  １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８２：２３１−２３８、Ｈａｌｌら（１９８３）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  ２：１０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＣｕｌｌｅｎおよびＭａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１６：３６２−３６８）；β−ラクタマーゼまたはＧＳＴが含まれる。
【０１２６】
［０１４９］レポーター遺伝子構築物で使用するための、または指標遺伝子のゲノム遺伝子座を修飾するための転写調節要素には、限定されるわけではないが、プロモーター、エンハンサー、並びに抑制因子および活性化因子結合部位が含まれる。適切な転写制御要素は、その発現が、アレイ化ライブラリーから探索される望ましい表現型に連結されている遺伝子の転写制御領域に由来することが可能である。
【０１２７】
［０１５０］環状ＡＭＰを変調する受容体の場合、特定のセリン（Ｓ１３３）でのリン酸化によって活性が制御される転写因子である環状ＡＭＰ応答要素結合タンパク質、ＣＲＥＢを用いて、転写に基づく読み取り値を構築することが可能である。このセリン残基がリン酸化されると、ＣＲＥＢはｃＡＭＰレベル上昇に応答することが知られるプロモーターの５’に見られるＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答要素）として知られる認識配列に結合する。ＣＲＥにリン酸化ＣＲＥＢが結合すると、このプロモーターからの転写が増加する。
【０１２８】
［０１５１］ｃＡＭＰレベル増加および細胞内Ｃａレベル増加両方に応答して、ＣＲＥＢのリン酸化が見られる。ｃＡＭＰレベル増加は、ＰＫＡの活性化を生じ、これが次にＣＲＥＢをリン酸化し、そしてＣＲＥへの結合および転写活性化を導く。細胞内カルシウムレベル増加は、カルシウム／カルモジュリン応答性キナーゼＩＩ（ＣａＭキナーゼＩＩ）の活性化を生じる。ＣａＭキナーゼＩＩによるＣＲＥＢリン酸化は、ＰＫＡによるＣＲＥＢのリン酸化と同じく有効であり、そしてＣＲＥ含有プロモーターの転写活性化を生じる。
【０１２９】
［０１５２］したがって、その発現が１以上のＣＲＥを含有する基本プロモーターに駆動されるレポーター遺伝子を含有する細胞において、転写に基づく読み取り値を構築することが可能である。Ｃａ＋＋の細胞内濃度の変化（リガンドとの結合に際する受容体活性改変の結果）は：ａ）ＣＲＥＢもまた細胞で同時発現されている場合、そしてｂ）内因性または異種いずれかのＣａＭキナーゼが、カルシウム増加に応答してＣＲＥＢをリン酸化するか、あるいは外因性に発現されるＣａＭキナーゼＩＩが同一細胞に存在する場合、レポーター遺伝子発現レベルの変化を生じるであろう。言い換えると、ＰＬＣ活性の刺激は、ＣＲＥＢのリン酸化およびＣＲＥ構築物からの転写増加を生じることが可能であり、一方、ＰＬＣ活性の阻害は、ＣＲＥ応答性構築物からの転写の減少を生じることが可能である。
【０１３０】
［０１５３］好ましい態様において、レポーター遺伝子は、その発現が、スクリーニング可能かまたは選択可能な表現型変化を引き起こす遺伝子である。変化が選択可能である場合、表現型変化はレポーター遺伝子を発現する細胞および発現しない細胞間の増殖または生存率の相違を生じる。変化がスクリーニング可能である場合、表現型変化は細胞のいくつかの検出可能特性を生じ、それによってマーカーを発現する細胞を、発現しない細胞と区別することが可能である。細胞培養から、受容体エフェクターである試験ポリペプチドを発現する細胞を増幅する手段を提供可能である点で、スクリーニングより選択が好ましい。
【０１３１】
［０１５４］マーカー遺伝子を受容体シグナル伝達経路とカップリングして、マーカー遺伝子の発現が受容体の活性化に依存するようにする。このカップリングは、受容体応答性プロモーターにマーカー遺伝子を機能可能であるように連結することによって、達成可能である。用語「受容体応答性プロモーター」は、標的受容体のシグナル伝達経路のいくつかの産物によって制御されるプロモーターを示す。
【０１３２】
［０１５５］あるいは、プロモーターは、受容体経路によって抑制され、それによって細胞に有害な産物の発現を妨げるものであることが可能である。受容体抑制プロモーターを用いて、有害な遺伝子にプロモーターを連結することによって、アゴニストに関して、そして有益な遺伝子に連結することによって、アンタゴニストに関して、スクリーニングする。マーカー遺伝子にコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部（コードまたは隣接領域いずれでもよい）に対してアンチセンスであるｍＲＮＡをコードする遺伝子に、受容体が誘導するプロモーターを、機能可能であるように連結して、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するようにすることによって、抑制を達成可能である。ＤＮＡ結合抑制因子タンパク質をコードする遺伝子に、受容体が誘導するプロモーターを連結して、そしてマーカー遺伝子のプロモーターまたは他の適切な領域に適切なオペレーター部位を取り込むことによっても、抑制を得ることが可能である。
【０１３３】
［０１５６］酵母の場合、適切に陽性選択可能な（有益な）遺伝子には、以下が含まれる：ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１；ＡＤＥ１、２、３、４、５、７、８；ＡＲＧ１、３、４、５、６、８；ＨＩＳ１、４、５；ＩＬＶ１、２、５；ＴＨＲ１、４；ＴＲＰ２、３、４、５；ＬＥＵ１、４；ＭＥＴ２、３、４、８、９、１４、１６、１９；ＵＲＡ１、２、４、５、１０；ＨＯＭ３、６；ＡＳＰ３；ＣＨＯ１；ＡＲＯ２、７；ＣＹＳ３；ＯＬＥ１；ＩＮＯ１、２、４；ＰＲＯ１、３。無数の他の遺伝子が潜在的な選択マーカーである。上記はよく性質決定された生合成経路に関与する。非常に感受性であり、そして発現レベルの広い範囲に渡って選択可能であるため、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰデヒドラターゼ）遺伝子（ＨＩＳ３）が好ましい。最も単純な場合、細胞は、活性化の非存在下で、ヒスチジンに対して栄養要求性である（増殖のため、ヒスチジンを必要とする）。活性化は酵素の合成を導き、そして細胞はヒスチジンに関して原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）になる（ヒスチジンを必要としない）。したがって、選択はヒスチジンの非存在下での増殖に関するものである。ヒスチジン原栄養性のためには、細胞あたりＩＧＰデヒドラターゼ数分子しか必要でないため、アッセイは非常に高感度である。
【０１３４】
［０１５７］マーカー遺伝子はまた、スクリーニング可能な遺伝子であることも可能である。スクリーニングされる特性は、細胞形態、代謝または他のスクリーニング可能な特徴の変化であることが可能である。適切なマーカーには、ベータ−ガラクトシダーゼ（Ｘｇａｌ）、Ｃ１２ＦＤＧ、ＳＡＬＭＯＮ−ｇａｌ（６−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＭＡＧＥＮＴＡ−Ｇａｌ（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド）（後者の２つは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  Ａｇより）、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、エキソ−グルカナーゼ（酵母ｅｘｂ１遺伝子の産物；非必須、分泌）；ルシフェラーゼ；細菌緑色蛍光タンパク質；（ヒト胎盤）分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）；およびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）。上記のいくつかが分泌されるように操作することが可能である（が、β−ガラクトシダーゼに関しては可能でない）。好ましいスクリーニング可能マーカー遺伝子は、ベータ−ガラクトシダーゼであり；該酵素を発現する酵母細胞は、無色基質Ｘｇａｌを青い色素に変換する。再び、プロモーターは受容体に誘導されても、または受容体に阻害されてもよい。
【０１３５】
ＶＩ．典型的な使用
Ａ．標的同定
［０１５８］各アレイフィーチャー内で潜在的な標的を、またはアレイフィーチャーの各細胞内で潜在的標的の組み合わせを過剰発現するアレイと、目的の化合物をインキュベーションすることによって、薬剤、ホルモン、インターロイキン、または分泌タンパク質などの分子の結合パターンを同定することが可能である。ＳＰＲ、ＳＰＡ、ＴＲＦ、またはオートラジオグラフィーなどの方法によって結合を検出可能である。さらに、アレイまたは色コードビーズと目的の細胞をインキュベーションすることによって、細胞の結合パートナーを同定可能である。例えば、遊走または遊離浮遊試験細胞をアレイとインキュベーションし、遊走させるかまたは結合させ、そしてその後、標準法によって、例えば試験細胞においてＧＦＰまたは他のマーカーを発現させることによって、結合または遊走を検出することが可能である。あるいは、各々、特有の色コード、例えば特有の比の赤対緑の色素と共に、各々、別個のＤＮＡ構築物を発現する色コードビーズのコレクションと、試験細胞を混合することが可能である。その後、蛍光活性化細胞選別または他の方法によって、結合を検出することが可能である。
【０１３６】
［０１５９］アレイはまた、癌、感染性または自己免疫疾患、化学薬品への曝露、あるいは環境的変化への生物の免疫応答の標的を同定するのにも使用可能である。標的タンパク質を発現するアレイを生物由来の血清とインキュベーションすることが可能である。血清を標識するか、または適切な二次抗体を用いることによって、抗体の結合を検出することが可能である。免疫応答の同定された標的を用いて、腫瘍または感染性疾患、免疫抑制薬剤、抗感染薬剤または他のものに対するワクチンを設計することが可能である。
【０１３７】
［０１６０］他の態様において、本発明は、その阻害または活性化が療法的価値を持つ可能性がある内因性遺伝子の同定を可能にすることによって、薬剤標的発見を促進する。戦略は、部分的に、小遺伝子断片が優性作用合成遺伝子要素（ＳＧＥ）、例えば由来する遺伝子の機能に干渉する分子（アンタゴニスト）、またはこうした遺伝子の優性で恒常的に活性である断片（アゴニスト）をコードする能力に頼る。本発明の方法によって同定可能なＳＧＥには、限定されるわけではないが、ポリペプチド、阻害性アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、核酸デコイ、および小ペプチドが含まれる。例えば、同定されるＳＧＥにその活性が不活性化される遺伝子自体を、薬剤開発のための標的として使用して、例えば内因性遺伝子の機能もまた阻害することが可能な、小分子および天然抽出物などの他の剤を同定することが可能である。したがって、本発明の別の側面は、選択されるＳＧＥに対応する遺伝子（またはその遺伝子産物）のアゴニストまたはアンタゴニストを適切なように検出するための薬剤スクリーニングアッセイを提供する。同様に、特定の病的表現型を阻害可能なＳＧＥの同定は、適切なように、対応する内因性遺伝子に対する機能喪失または機能獲得を評価可能な診断アッセイを示すであろう。
【０１３８】
［０１６１］他の態様において、宿主細胞においてｄｓＲＮＡを生じさせる転写アレイの使用を用いて、特定の遺伝子の機能喪失を評価することが可能である。「ＲＮＡ干渉」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「鎮圧（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）」−これらの異なる名称は、導入遺伝子の過剰発現または異所性発現から、あるいは細胞への二本鎖ＲＮＡの計画的な導入から生じる、同様の影響を説明する（Ｆｉｒｅ  Ａ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３５８−３６３；Ｓｈａｒｐ  ＰＡ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：１３９−１４１；Ｈｕｎｔｅｒ  Ｃ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９：Ｒ４４０−Ｒ４４２；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  ＤＣ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９：Ｒ５９９−Ｒ６０１；Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １６：６５１−６５９に概説される）。細胞への二本鎖ＲＮＡの注入が全身性に作用して、相同内因性ＲＮＡの転写後枯渇を引き起こすことが可能である（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１；およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら（１９９８）ＰＮＡＳ  ９５：１５５０２−１５５０７）。一般的にＲＮＡｉと称されるＲＮＡ干渉は、クローニングされた遺伝子を特異的にそして強力に不活性化する方法を提供し、そして遺伝子機能を調べるための強力なツールであることが立証されつつある。
【０１３９】
［０１６２］例えば、本発明の方法は（ａ）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むｃＤＮＡまたはゲノムトランスフェクションアレイを、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから２本鎖ＲＮＡへの転写を開始可能なプロモーター（類）と関連した方向で構築し；（ｂ）本発明の方法によって、細胞にトランスフェクションアレイを導入し、（ｃ）トランスフェクションアレイのメンバーが特定の表現型を与える細胞を同定して、そして単離し、そして（Ｄ）その表現型を与えるのに関与するｄｓＲＮＡ構築物を生じさせるライブラリーから遺伝子配列を同定することを意図する。
【０１４０】
Ｂ．標的検証
［０１６３］各スポットがレポーター遺伝子と目的の遺伝子由来の制御配列を融合させた構築物を含有するアレイを構築することによって、潜在的な目的の遺伝子の発現パターンを試験することが可能である。制御配列は、転写、ＲＮＡプロセシングまたは翻訳に関与することが可能である。レポーター遺伝子は、ＧＦＰ、ベータ・ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ・ラクタマーゼまたは他の遺伝子であることが可能である。異なる組み合わせの条件および細胞株を用いて、アレイをインキュベーションし、そしてその後、レポーター遺伝子の活性に関してアッセイすることによって、目的の遺伝子の発現を試験することが可能である。その後、潜在的な薬剤標的として、適切な発現パターンを持つ遺伝子をさらに研究することが可能である。
【０１４１】
［０１６４］ＤＮＡ構築物が目的の遺伝子の機能を修飾するアレイを作成し、そして表現型をアッセイすることによって、目的の遺伝子の機能を試験することが可能である。これらの修飾は、過剰発現、ノックアウト構築物、優性ネガティブ突然変異体、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のものなどの方法に由来することが可能である。異なる環境条件下、遺伝的背景および細胞種で、生じた表現型変化をアッセイすることが可能である。例えば、各フィーチャーが目的の遺伝子を過剰発現するか、または過少発現するアレイ上の細胞の表現型を調べることによって、経路を活性化するかまたは阻害する遺伝子を同定することが可能である。その後、潜在的な薬剤標的として、適切な表現型を持つ遺伝子をさらに研究することが可能である。
【０１４２】
［０１６５］また、目的のタンパク質の結合パートナーを同定することによって、目的の遺伝子の機能を推論することも可能である。例えば、適切に標識した分子および／または検出系とアレイをインキュベーションすることによって、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、タンパク質結合、ヌクレオチド結合または他の機能に関して、目的のタンパク質を発現するアレイを試験することが可能である。異なる種類のタンパク質、例えばＤＮＡ結合タンパク質を同定し、そして新規結合モチーフの発見に関して、配列を調べることが可能である。あるいは、２ハイブリッドまたは３ハイブリッド系を用いて、潜在的なタンパク質、ＲＮＡまたは他の種類の結合パートナーをｉｎ  ｖｉｖｏで同定することが可能である。例えば、目的の遺伝子を適切な「餌」ベクターにクローニングし、そして適切なレポーター構築物と共に、細胞株に安定にトランスフェクションすることが可能である。試験タンパク質を適切な「試験」ベクターにクローニングした構築物のアレイにおいて、この細胞株を用いることによって、目的の遺伝子と他の潜在的なパートナーとの相互作用を試験することが可能である。あるいは、アフィニティータグ付き構築物（例えば６ｘＨｉｓ、エピトープ、アビジン）のアレイをアフィニティー膜（例えばＮｉ−ＮＴＡ、抗エピトープ抗体、ビオチン化膜）にトランスファーすることが可能である。質量分析または他の方法によって、関連タンパク質を検出し、そして同定することが可能である。その後、潜在的な標的として、適切な結合パートナーを持つタンパク質をさらに調べることが可能である。
【０１４３】
［０１６６］また、翻訳後修飾を同定することによって、目的の遺伝子の機能を推論することも可能である。放射標識前駆体、抗ホスホアミノ酸抗体、抗ユビキチン、レクチンまたは他の特異的検出試薬などの適切な標識または検出試薬とインキュベーションすることによって、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、グリコシル化または他の翻訳後修飾に関して、目的のタンパク質を発現するアレイを試験することが可能である。あるいは、アレイをアフィニティー膜にトランスファーし、そしてその後、質量分析を用いることによって、翻訳後修飾を検出することが可能である。
【０１４４】
［０１６７］各フィーチャーが、エピトープタグ、ＧＦＰまたは他のマーカーに融合させた目的のタンパク質を含むＤＮＡ構築物を含有するアレイを作成することによって、タンパク質の細胞下局在を調べることが可能である。トランスフェクションおよび細胞増殖後、顕微鏡、高分解能スキャナまたは他の検出法を用いて免疫蛍光を行って、目的のタンパク質が核、細胞質、膜、細胞外または他の区画に局在しているかどうかを決定することが可能である。その後、潜在的な標的として、適切な細胞下局在を持つタンパク質をさらに調べることが可能である。
【０１４５】
Ｃ．スクリーニング
［０１６８］適切な構築物のアレイを作成し、そして望ましい表現型に関してスクリーニングすることによって、巨大分子療法剤（タンパク質、核酸、糖など）を同定することが可能である。例えば、分泌タンパク質に関するスクリーニングは、分泌タンパク質を発現する細胞を分泌タンパク質に対するアッセイ可能な応答の可能性があるテスター細胞と混合するアレイを伴うことが可能である。トランスフェクションおよび増殖後、テスター細胞の応答を測定して、望ましい影響を持つ分泌タンパク質を産生するフィーチャーを同定することが可能である。
【０１４６】
［０１６９］マイクロタイタープレートの各ウェル底にアレイを作成することによって、マルチプレックス化スクリーニングを行うことが可能である。各ウェル底の１００以上の潜在的な標的のアレイに分子を結合させる。これらの標的は、薬理ゲノミクス変異体、タンパク質ファミリー、または他のタンパク質コレクションであることが可能である。その後、スキャナ、プレートリーダーまたは他の装置（例えばＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ  ＩＩ）によって結合をアッセイすることが可能である。
【０１４７】
［０１７０］また、化合物ライブラリーを性質決定するのにもアレイを使用可能である。アレイ中の標的への化合物混合物の結合を性質決定して、混合物の多様性の全体の評価を提供することが可能である。高い多様性の混合物は、低い多様性の混合物より、より多くの標的に結合するであろう。混合物は、例えば、コンビナトリアルライブラリーまたは天然産物抽出物であることが可能である。
【０１４８】
Ｄ．リード最適化
［０１７１］候補を潜在的な標的の適切なアレイとインキュベーションすることによって、選択性に関して、潜在的な薬剤候補を評価することが可能である。アレイは、目的のゲノム（類）中の遺伝子の全セットまたは関心が持たれるサブセット、例えばＧＰＣＲ類、イオンチャネル、酵素、核ホルモン受容体であることが可能である。既知の標的および他の潜在的な標的への薬剤候補の相対的結合を測定可能である。ＡＤＭＥまたは毒性検査または他の試験などのさらなる試験の前に、高い度合いの非選択性結合を持つ候補を無視するかまたは修飾して、非選択的結合を減少させることが可能である。候補を、薬理ゲノミクス変異体または他の変異体を含むチトクロムＰ−４５０などの標的の適切なアレイとインキュベーションすることによって、毒性に関して、潜在的な薬剤候補を評価することが可能である。
【０１４９】
［０１７２］薬剤候補の代謝産物に対する選択性試験もまた実行可能である。例えば、放射標識薬剤を、肝臓抽出物などの適切な生体内変換剤、組織培養系、あるいはげっ歯類またはイヌなどの生存生物と反応させることが可能である。その後、放射標識代謝産物を抽出し、そして精製し、そしてアレイとの結合に関して試験することが可能である。その後、標準法によって、結合活性を持つ代謝産物をさらに性質決定することが可能である。本発明の方法の２つの態様を本明細書に詳細に記載する：ＤＮＡ−ゼラチン法、すなわち、ＤＮＡ（例えばプラスミドに基づくベクターまたはウイルスに基づくベクターなどの発現ベクター中のＤＮＡ）およびキャリアータンパク質（例えばゼラチン）を含んでなる混合物を用いる方法、および脂質ベクター−ＤＮＡ法、すなわち、発現ベクター（例えばプラスミド）中のＤＮＡなどのＤＮＡ；キャリアータンパク質（例えばゼラチン）；糖（例えばスクロース）；ＤＮＡ凝縮緩衝液；および適切な脂質含有トランスフェクション試薬を含んでなる混合物を用いる方法。非毒性で、水和され、表面上に核酸混合物を固定することが可能であり、そしてまた表面に固定された核酸がやがて表面に蒔かれた細胞内に導入されることを可能にする、いかなる適切なゼラチンも使用可能である。例えば、ゼラチンは未精製タンパク質ゼラチンまたはフィブロネクチンなどのより純粋なタンパク質に基づくゼラチンであることが可能である。さらに、ヒドロゲル、糖に基づくゼラチン（ポリエチレングリコール）あるいはアクリルアミドなどの合成または化学薬品に基づくゼラチンが使用可能である。
【０１５０】
［０１７３］第一の態様において、２つの構成要素（発現ベクター中のＤＮＡなどのＤＮＡおよびキャリアータンパク質）を含んでなる混合物を、別個の定義される位置または領域の表面（例えばスライド）上にスポットし、そして乾燥させる。この態様の１つの例を実施例１に記載する。キャリアー（例えばゼラチン）−ＤＮＡ混合物が表面に付着するのに十分に乾燥させた後、トランスフェクション試薬（リポフェクション混合物）および逆トランスフェクションしようとする細胞を、好ましくは連続して添加する。トランスフェクション混合物は、入手可能な構成要素から作成されるものであることが可能であり、あるいは、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの、商業的に入手可能なリポフェクション混合物であることが可能である。定義される位置各々のＤＮＡの量を考慮に入れて、これを、実験的に決定可能な適切な量で添加する。カバーウェルを用いて、混合物または溶液が所定の位置に維持可能であるように保持するため、トランスフェクション混合物添加前に、ベクター−ＤＮＡ混合物を含有する表面上の位置の周囲にワックスバリアを集めることが可能である。一般的に、この態様において、ＤＮＡを逆トランスフェクションしようとする細胞の添加前に、真空吸引によるなどで、トランスフェクション試薬を除去する。活発に増殖している細胞を位置の上に蒔き、定義される位置にＤＮＡ含有混合物を所持する表面を産生する。増殖中の細胞へのＤＮＡスポット中のＤＮＡの進入を生じる条件下（例えば温度および時間）で、生じた産物を維持する。これらの条件は、用いる細胞種および試薬にしたがって多様であろうし、そして実験的に決定可能である。温度は、例えば、室温または３７℃、２５℃、または細胞および試薬に適していると決定された、いかなる温度であることも可能である。
【０１５１】
［０１７４］その１つの例を実施例２に記載する、第二の態様においては、発現ベクター中のＤＮＡ；キャリアータンパク質（例えばゼラチン）；糖（例えばスクロース）；ＤＮＡ凝縮緩衝液；および脂質に基づくトランスフェクション試薬を含んでなる混合物を、別個の定義される位置のスライドなどの表面上にスポットし、そして乾燥させる。活発に増殖している細胞を、ＤＮＡを含有する位置の上に蒔き、そして増殖している細胞へのＤＮＡスポット中のＤＮＡの進入（逆トランスフェクション）を生じる条件下（例えば温度および時間）で、生じた表面を維持する。上述のように、既知の方法を用いて、細胞中のＤＮＡの発現を検出する。
【０１５２】
Ｅ．プラスミドの最適化
［０１７５］さらに別の態様において、本発明の方法を用いて、特定の細胞種に対して発現系を最適化することが可能である。簡潔には、トランスフェクションアレイは、ベクター系の多様な順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）のコレクションであることが可能である。例えば、ベクターライブラリーは、プロモーターおよびエンハンサー配列、複製起点、およびタンパク質発現レベルまたはプラスミドに関する細胞株の安定性に影響を及ぼすことが可能な他の構成要素の多様な組み合わせおよび順列を試験することが可能である。
【０１５３】
ＶＩＩ．典型的な態様
［０１７６］本発明は、以下の実施例によって例示されるが、これらの実施例はいかなる点でも限定することを意図しない。
【０１５４】
（実施例１）
逆トランスフェクション：「ゼラチン−ＤＮＡ」法
材料
［ＤＮＡ］：１μｇ／μｌ（例えばＨＡ−ＧＳＴ  ｐＲＫ５、ｐＢＡＢＥ  ＣＭＶ  ＧＦＰ）
ゼラチン（ＩＣＮ、カタログ番号９０１７７１）：ｄｄＨ２Ｏ中の０．２％ストック、すべての希釈はＰＢＳ−中で作成
０．２０％ゼラチン＝０．５ｇゼラチン＋２５０ｍｌ  ｄｄＨ２Ｏ
ＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３０１４２５）
プラスミド−ＤＮＡ：グリセロールストックから１００ｍｌ  Ｌ−ａｍｐ中で一晩増殖、精製は以下による
標準的ＱＩＡＰＲＥＰ  ＭｉｎｉｐｒｅｐまたはＱｉａｇｅｎプラスミド精製Ｍａｘｉプロトコル
細胞種：Ｌ−グルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ／１０％ＩＦＳ中で培養されるＨＥＫ  ２９３Ｔ
ＤＮＡの希釈およびスポット
・ＤＮＡを０．２％ゼラチン＊中で希釈して、最終［ＤＮＡ］＝０．０５μｇ／μｌ＊＊を生じる
・アレイ作成装置を用いて、Σポリ−Ｌ−リジンスライド上に、ＤＮＡ／ゼラチン混合物をスポットする
・真空乾燥装置中で、スライドを一晩＊＊＊乾燥させる
＊用いた条件下で働くゼラチン濃度の範囲＝０．０５％〜０．５％
＊＊用いた条件下で働くＤＮＡ濃度の範囲＝０．０１μｇ／μｌ〜０．１０μｇ／μｌ
＊＊＊乾燥時間の範囲＝２時間〜１週間
ゼラチン−ＤＮＡスポットへのＴｘ．試薬の添加
・エッペンドルフ試験管中で、３００μｌのＤＮＡ凝縮緩衝液（ＥＣ緩衝液）＋１６μｌエンハンサーを混合する
・ボルテックスによって混合する。５分間インキュベーションする
・５０μｌ  ＥＦＦＥＣＴＥＮＥを添加し、そしてピペッティングによって混合する
・スポット周囲のスライド上にワックス環状バリアを集めて、トランスフェクション試薬を適用する
・ワックスで囲まれたスポット領域に３６６μｌの混合物を添加する
・室温で１０〜２０分間インキュベーションする
・その間、細胞を分割して逆トランスフェクションする
・フード中で試薬を真空吸引して除く
スライドをプレートに入れ、そして逆トランスフェクション用の細胞を添加する。
【０１５５】
細胞の分割
・活発に増殖している細胞を［細胞］＝２５ｍｌ中１０７細胞に分割する
・正方形の１００ｘ１００ｘ１５ｍｍペトリ皿中のスライド（類）の上に細胞を蒔く
・逆トランスフェクションを４０時間＝およそ２細胞周期、進行させる
・免疫蛍光用にスライドをプロセシングする
（実施例２）
逆トランスフェクション：「脂質−ＤＮＡ」法
材料
［ＤＮＡ］：１μｇ／μｌ（例えばＨＡ−ＧＳＴ  ｐＲＫ５、ｐＢＡＢＥ  ＢＭＶ  ＧＦＰ）
ゼラチン（ＩＣＮ、カタログ番号９０１７７１）：ｄｄＨ２Ｏ中の０．２％ストック、すべての希釈はＰＢＳ−中で作成
０．０５％ゼラチン＝２５０μｌ  ０．２％＋７５０μｌ  ＰＢＳ−
ＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３０１４２５）：
０．４Ｍスクロース中のＥＣ緩衝液＝２７３．６μｌ  ５０％スクロース＋７２６．４μｌ  ＥＣ緩衝液
プラスミド−ＤＮＡ：グリセロールストックから１００ｍｌ  Ｌ−ａｍｐ中で一晩増殖、精製は以下による
標準的ＱＩＡＰＲＥＰ  ＭｉｎｉｐｒｅｐまたはＱｉａｇｅｎプラスミド精製Ｍａｘｉプロトコル
細胞種：Ｌ−グルタミンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ／１０％ＩＦＳ中で培養されるＨＥＫ  ２９３Ｔ
減少した体積での逆トランスフェクションプロトコル
・別個のエッペンドルフ試験管中に、１．６μｇ  ＤＮＡをアリコットする
・１５μｌのあらかじめ作成したＤＮＡ凝縮緩衝液（ＥＣ緩衝液）と０．４Ｍスクロース＊を試験管に添加する。
【０１５６】
・エンハンサー溶液１．６μｌを添加して、そして数回ピペッティングすることによって混合する。室温で５分間インキュベーションする
・ＤＮＡ−エンハンサー混合物に５μｌのＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクション試薬を添加して、そしてピペッティングによって混合する。室温で１０分間インキュベーションする
・２３．２μｌの０．０５％ゼラチン＊＊を総トランスフェクション試薬混合物に添加する（すなわち１：１希釈）
・アレイ作成装置を用いて、Σポリ−Ｌ−リジンスライド上に、脂質−ＤＮＡをスポットする
・真空乾燥装置中で、スライドを一晩＊＊＊乾燥させる
用いるＥＦＦＥＣＴＥＮＥキット（Ｑｉａｇｅｎ）には、エンハンサー溶液が含まれ、これをＱｉａｇｅｎの指示にしたがって用いた。
【０１５７】
＊用いた条件下で働くスクロースの範囲＝０．１Ｍ〜０．４Ｍ
＊＊用いた条件下で働くゼラチン濃度の範囲＝０．０１％〜０．０５％
＊＊＊乾燥時間の範囲＝２時間〜１週間
細胞の分割
・活発に増殖している細胞を［細胞］＝２５ｍｌ中１０７細胞に分割する
・正方形の１００ｘ１００ｘ１５ｍｍペトリ皿中のスライド（類）の上に細胞を蒔く
・逆トランスフェクションを４０時間＝およそ２細胞周期、進行させる
・免疫蛍光用にスライドをプロセシングする
（実施例３）
トランスフェクション細胞マイクロアレイ：哺乳動物細胞における遺伝子産物の解析のためのゲノミクスアプローチ
脂質−ＤＮＡ法
Ｉ．ゼラチン調製およびＤＮＡ精製
材料：
ガンマ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）スライド（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５５０）
精製ｃＤＮＡ
ゼラチン、Ｂ型：２２５  Ｂｌｏｏｍ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−９３９１）
方法：
６０℃の水槽で１５分間インキュベーションすることによって、０．２％ゼラチンを作成した。ゼラチンをゆっくりと３７℃に冷却し、その時点で０．４５μｍセルロース・アセテート（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｅｔａｔｅ）膜（ＣＡ）でろ過した。
【０１５８】
ＤＮＡプラスミドを含む細菌クローンを、９６ディープウェルプレート中、１．３ｍｌのｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）中で、２５０ｒｐｍ３７℃で震蘯しながら、１８〜２４時間増殖させた。プラスミドをミニプレップし、そして光学密度（ＯＤ）を記録した。最終２８０ｎｍ／２６０ｎｍ吸光度比によって示されるようなＤＮＡ純度は、１．７より大きかった。
【０１５９】
保存：
保存目的のため、ゼラチンは４℃で、そしてミニプレップしたＤＮＡは−２０℃で維持した。
【０１６０】
ＩＩ．試料調製およびアレイプリント
材料：
ＥＦＦＥＮＴＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３０１４２５）
スクロース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＩＮＴＥＧＲＩＤ  １００ｍｍｘ１５ｍｍ組織培養正方形ペトリ皿（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：Ｆａｌｃｏｎカタログ番号３５−１０１２）
Ｃｏｓｔａｒ  ３８４ウェルプレート（ＶＷＲカタログ番号７４０２）
ＳＴＥＡＬＴＨ  ＭＩＣＲＯ  ＳＰＯＴＴＩＮＧ  ＰＩＮＳ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．  カタログ番号ＳＭＰ４）
ＰＩＸＳＹＳ  ５５００ロボットアレイ作成装置（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、モデルＡＤ２０Ａ５）
栓２５０ｍｍ付き真空乾燥装置、ＮＡＬＧＥＮＥ（ＶＷＲカタログ番号２４９８７−００４）
ＤＲＩＥＲＩＴＥ無水硫酸カルシウム（ＶＷＲカタログ番号２２８９０−２２９）
スライドを保持するためのピンセット
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞
組織培養フード
カバースリップ（５０ｍｍｘ２５ｍｍ）
方法：
各ＤＮＡ含有スポットに関して、０．２Ｍ〜０．４Ｍスクロースを含む、１５μｌのあらかじめ作成したＤＮＡ凝縮緩衝液（緩衝液ＥＣ）を、別個のエッペンドルフ試験管中の０．８０μｇ〜１．６０μｇのＤＮＡに添加した。続いて、１．５μｌのエンハンサー溶液を試験管に添加して、そしてピペッティングによって混合した。これを室温で５分間インキュベーションした。５μｌのＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクション試薬を添加し、混合し、そしてＤＮＡ−エンハンサー混合物と、室温で１０分間インキュベーションした。１ｘ体積の０．０５％ゼラチンを添加し、混合し、そしてアレイ化する目的で、適切な量を３８４ウェルプレート中にアリコットした。
【０１６１】
ＴｅｌｅｃｈｅｍのＡＲＲＡＹＩＴ  ＳＴＥＡＬＴＨ  ＰＩＮＳ（ＳＭＰ４）と共に、ＰＩＸＳＹＳ  ５５００ロボットアレイ作成装置を用いて、各スポットは４００μｍ離れており、各スポットに関してスライド上のピンの遅延時間は５０ｍｓ〜５００ｍｓであった。アレイ作成中、５５％の相対湿度環境を維持した。アレイ中のスポットの喪失を生じるであろう、ピンの目詰まりを防ぐため、３８４ウェルプレート中のＤＮＡ試料への各浸漬間で、完全な洗浄工程を実行した。
【０１６２】
組織培養フードにおいて、プロセシングしようとする各３スライドに関して、１０％ＩＦＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよびグルタミンを含む２５ｍｌのＤＭＥ培地中に、１０ｘ１０６ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を調製した。アレイ作成後、単純に、アレイ側を上にして、無菌１００ｘ１００ｘ１０ｍｍ正方形プレート（プレートあたり３スライド）にスライドを入れ、そしてアレイ自体の上に直接注ぐことを避けながら、細胞をスライド上に穏やかに注いだ。スライドの数が３の倍数でないならば、正方形プレートを覆うため、ダミースライドを置いた。
【０１６３】
およそ２細胞周期（２９３Ｔでは〜４０時間）、細胞をアレイ上で増殖させた。続いて、コプリン瓶中で、スライドを穏やかにＰＢＳ−でリンスし、そしてその後、コプリン瓶中、３．７％パラホルムアルデヒド／４．０％スクロースで２０分間固定し、そしてその後、ＰＢＳ−が入った瓶に戻した。
【０１６４】
保存：
アレイ作成後、無水硫酸カルシウムペレットを含む真空乾燥装置中、室温でスライドを保存した。固定後、解析が完了するまで（最大５日間）、スライドをＰＢＳ−中、４℃で維持した。
【０１６５】
ＩＩＩ．検出法
免疫蛍光
蛍光顕微鏡
レーザースキャン
感受性フィルムまたはエマルジョンを用いた放射標識および検出
［０１７７］視覚化しようとする発現タンパク質が蛍光タンパク質である場合、蛍光顕微鏡によって視覚化し、そして写真撮影することが可能である。巨大発現アレイの場合、データ保管のため、スライドをレーザースキャナでスキャンすることが可能である。蛍光抗体が発現タンパク質を検出可能である場合、免疫蛍光用のプロトコルにしたがうことが可能である。検出が放射標識に基づく場合、上述のようにスライドを固定し、そしてフィルムまたはエマルジョンを用いたオートラジオグラフィーによって放射能を検出することが可能である。
【０１６６】
免疫蛍光：
［０１７８］固定後、アレイ領域をＰＢＳ−中の０．１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００で１５分間透過処理した。ＰＢＳ−で２回リンスした後、スライドを６０分間ブロッキングし、１：２００〜１：５００希釈の一次抗体で６０分間探査し（ｐｒｏｂｅｄ）、２０分間ブロッキングし、１:２００希釈の蛍光二次抗体で４０分間探査した。スライドをＰＢＳ−中、コプリン瓶に移し、そして正立蛍光顕微鏡下で視覚化することが可能である。解析後、スライドをマウントし、そして暗所中、４℃で保管することが可能である。
【０１６７】
［０１７９］これらのマイクロアレイを生成するため、敷き詰めた細胞の別個のそして定義される領域を、異なるプラスミドＤＮＡで同時にトランスフェクションした（図４Ａ）。これは、個々のウェルを使用してＤＮＡを隔離することなく達成する。ナノリットル体積の水性ゼラチン溶液中のプラスミドＤＮＡをガラススライド上にプリントする。ＳＴＥＡＬＴＨ  ＰＩＮＳ（ＳＭＰ４、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を備えたロボットアレイ作成装置（ＰＩＸＳＹＳ  ５５００、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＭＴ  ＧＡＰＳガラススライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、３８４ウェルプレートに含有されるプラスミドＤＮＡ／ゼラチン溶液をプリントした。ピンは、５５％相対湿度環境中、ピンがスライドに下りる時間を２５ｍｓとして、４００μｍ離れて〜１ｎｌ体積を沈着させた。使用するまで、プリントしたスライドを真空乾燥装置中、室温で保管した。水性ゼラチン溶液の調製が重要であり、そしてこれは以下のとおりである。６０℃の水槽で１５分間加熱し、そして穏やかに回転させることによって、０．０２％ゼラチン（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ  Ｇ−９３９１）をＭＩＬＬＩＱ水に溶解した。溶液をゆっくりと室温に冷却し、そして０．４５μｍセルロース・アセテート膜でろ過し、そして４℃で保管した。プラスミドＤＮＡをプラスミドＭａｘｉまたはＱＩＡＰＲＥＰ  ９６  ＴＵＲＢＯ  ＭＩＮＩＰＲＥＰキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そしてこれは常にＡ２６０／Ａ２８０＞１．７を有した。ゼラチン濃度を＞０．０１７％に維持するように、ゼラチン溶液でＤＮＡ濃縮溶液を希釈し、そして別に明記しない限り、最終プラスミドＤＮＡ濃度は、０．０３３μｇ／μｌであった。ＧＦＰを発現させるため、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏ中のＥＧＦＰ構築物を用いた。
【０１６８】
［０１８０］乾燥後、ＤＮＡスポットを脂質トランスフェクション試薬に簡単に曝露し、スライドを培養プレートに入れ、そして培地中の付着哺乳動物細胞で覆った。ＥＦＦＥＣＴＥＮＥトランスフェクションキット（３０１４２５、Ｑｉａｇｅｎ）を以下のように用いた。１．５ｍｌ微量遠心分離試験管中、１６μｌのエンハンサーを１５０μｌ  ＥＣ緩衝液に添加し、混合し、そして室温で５分間インキュベーションした。２５μｌのＥＦＦＥＣＴＥＮＥ脂質を添加し、混合し、そして全体積を４０ｘ２０ｍｍカバーウェル（ＰＣ２００、Ｇｒａｃｅ  ＢｉｏＬａｂｓ）上にピペッティングした。プリント側を下にしてスライドをカバーウェル上に置き、溶液がアレイ化領域全体を覆い、また完全な密封も生成するようにした。１０分間のインキュベーション後、てこの原理で、スライドからピンセットでカバーウェルをはずし、そして真空吸引によって、トランスフェクション試薬を注意深く除去した。プリント側を上にして、スライドを１００ｘ１００ｘ１０ｍｍ正方形組織培養プレートに入れ、そして２５ｍｌ培地（１０％ＦＢＳ、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）中の１ｘ１０７の活発に増殖しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレートに注いだ。この方式で、３枚のスライドを並べてトランスフェクションすることが可能である。細胞をスライド上で４０時間増殖させた後、ＰＢＳ中の３．７％パラホルムアルデヒド／４．０％スクロース中、室温で２０分間固定した。ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞などの他の一般的に用いられる哺乳動物細胞株もまた試験し、そして同様の結果を得たが、トランスフェクション効率は、ＨＥＫ２９３細胞で得られたものの３０〜５０％であった。ゼラチンゲル中のＤＮＡは、細胞培地中で不溶性であるが、その上で増殖する細胞に容易に進入して、トランスフェクション細胞マイクロアレイを生成する。
【０１６９】
［０１８１］該方法を例示するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現構築物を含有する要素を含むアレイをプリントした。トランスフェクションのため、スライド上にＨＥＫ２９３細胞を蒔き、そしてレーザー蛍光スキャナで細胞の蛍光を検出した。レーザー蛍光スキャナ（ＳＣＡＮＡＲＲＡＹ  ５０００、ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）で５μｍの解像度でマイクロアレイを画像化した。２つのフルオロフォアを連続して励起した後、ＧＦＰおよびｃｙ３発光を別個に測定した。細胞解像度で画像を得るため、慣用的な蛍光顕微鏡で細胞の写真を撮影した。ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ  ５．５（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、すべての画像を擬似的に色付けし、そして重ね合わせた。
【０１７０】
［０１８２］低倍率スキャンは、ＧＦＰ発現構築物をプリントしたパターンに一致する蛍光スポットの規則的パターンを示した（図４Ｂ）。蛍光顕微鏡を介して得た、より高い倍率の画像は、各スポットが直径約１５０μｍであり、そして３０〜８０の蛍光細胞のクラスターからなることを示した（図４Ｃ）。慣用的トランスフェクションにおけるように、クラスターにおける総発現レベルは、定義される範囲に渡って、用いたプラスミドＤＮＡの量に比例する（図４Ｄ）。同一細胞において、２つの異なるプラスミドを発現することが有用である可能性があるため、この技術が同時トランスフェクションと両立するかどうかを調べた。ＧＦＰの発現構築物、エピトープタグ付きタンパク質または両方を含有する要素を含むアレイを調製し、そしてトランスフェクションした。両方のｃＤＮＡでプリントした要素上に増殖する細胞は、両方のコードタンパク質を発現し、同時トランスフェクションが起こったことが示される（図４Ｅ）。
【０１７１】
［０１８３］トランスフェクション細胞マイクロアレイを用いて、その固有の特性に基づいて、遺伝子産物をクローニングすることが可能であるかどうかもまた決定した。試験例として、薬理学的に相当する標的、ＦＫＢＰ１２が細胞内タンパク質である、臨床的に重要な免疫抑制剤、ＦＫ５０６の受容体を同定するためのアレイを用いた（Ｋｉｎｏ，  Ｔ．ら，  Ｊ．  Ａｎｔｉｏｂｉｏｔ．，  ４０：１２５６（１９８７）；Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｍ．Ｗ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２６：７５５（１９８９））。ＦＫＢＰ１２、ＧＦＰ、または両方の発現構築物を含有する要素を、容易に認識可能なパターンで、スライド上にプリントした。トランスフェクション細胞マイクロアレイを形成した後、オートラジオグラフィーおよび免疫蛍光のためにスライドをプロセシングする１時間前に、放射標識ＦＫ５０６を組織培地に添加した。放射標識ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２を発現している細胞クラスターのパターンに正確に一致したスポットパターンで、アレイに結合した（図５Ａ）。オートラジオグラフィーエマルジョンで、結合したＦＫ５０６を検出すると、ＦＫＢＰ１２発現およびＦＫ５０６結合間の共局在が、細胞レベルで確認された（図５Ｂ）。ＧＦＰ発現クラスター、およびクラスターを取り巻く非トランスフェクション細胞がバックグラウンドレベルのシグナルしか示さなかったため、結合は特異的である（図５Ａ）。さらに、ＦＫ５０６の競合的アンタゴニストであるラパマイシンを、前もって過剰に添加すると、シグナルが完全に消去された。放射標識ＦＫ５０６の添加３０分前に、１μＭのラパマイシンを細胞培地に添加した。
【０１７２】
［０１８４］哺乳動物細胞において、目的の表現型を誘導するかまたは別個の細胞下局在を有する遺伝子産物を同定するためのトランスフェクション細胞マイクロアレイの有用性もまた調べた。シグナル伝達分子が濃縮された、発現ベクター中の１９２の別個のエピトープタグ付きｃＤＮＡのコレクションを含むアレイをプリントした。細菌中の１９２のＧＥＮＥＳＴＯＲＭ発現構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２つの９６ウェルプレート中で培養し、そしてＴＵＲＢＯ  ＭＩＮＩＰＲＥＰキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。０．０２％ゼラチンで、プラスミドＤＮＡを最終濃度０．０４０μｇ／μｌに希釈して、そしてプリントした。免疫蛍光染色およびスキャンによって、細胞ホスホチロシンレベルを測定した。抗Ｖ５免疫蛍光で検出した後、クラスター中の細胞の蛍光顕微鏡を介した視覚的検査によって、細胞形態および発現タンパク質の細胞下局在を評価した。
【０１７３】
［０１８５］トランスフェクション後、細胞ホスホチロシンレベルおよび形態に対する影響と共に、その細胞下局在を決定した。グリッド１上の５つの細胞クラスター（Ａ２、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１１、およびＦ６）は、バックグラウンドを超えるホスホチロシンレベルを有した（図５Ｃ）。クラスターの座標は、供給源ｃＤＮＡを含有するマイクロタイタープレートのウェルのものに一致し、そしてこれを用いて、トランスフェクションｃＤＮＡの同一性を調べた。これによって、これらのクラスターの４つが既知のチロシンキナーゼ（ｔｒｋＣ、ｓｙｋ、ｓｙｎ、およびｂｌｋ）でトランスフェクションされ、一方、５番目（Ｃ１１）は未知の機能のタンパク質をコードすることが明らかになった。トランスフェクションクラスター中の細胞の形態を単純に視覚的に検査することによって、この少数のクローンセットにおいてさえ、細胞表現型の多様性が明らかになった。アレイ２では、クラスターＥ８はアポトーシスに特徴的な断片化細胞を有し、一方、２つのクラスター（Ｄ１０およびＦ７）では、細胞は互いに緊密に付着していた（図５Ｄ）。ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが仲介するｄＵＴＰ−ビオチン・ニック末端標識法（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ））染色によって、アポトーシス細胞の存在を確認した。記載されるように（Ｙ．Ｇａｖｒｉｅｌｉ，  Ｙ．  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｓ．Ａ．  Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１９，  ４９３（１９９２））、ＴＵＮＥＬ染色を行った。
【０１７４】
［０１８６］観察される表現型は、これらのクラスターで発現されるｃＤＮＡの推測される機能と一致する（表）。視覚的検査を通じて、発現されるタンパク質の細胞下局在を調べ、そして別個のパターンを持つものに注目した（表）。これによって、既知の転写因子であるいくつかのタンパク質が、主に細胞核に局在することが明らかになった。これはまた、細胞下分布が以前確かめられていなかったホスファターゼ１−ベータなどの他のタンパク質に関してもあてはまった。
【０１７５】
表
トランスフェクション細胞マイクロアレイで発現される、選択されるｃＤＮＡの説明。示すのは、座標、検出された表現型または特性、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号およびｃＤＮＡの名称である。核／細胞質は核および細胞質染色が見られたことを意味する。
【０１７６】
【表１】
2004530426.tif 000002
【０１７７】
［０１８７］伝統的なＤＮＡアレイと同じロボットアレイ作成装置を用いて、マイクロアレイをプリントすることが可能であり、したがって、標準的なスライドあたり、１０，０００〜１５，０００細胞クラスターまでの密度を達成することが可能である。これらの密度で、少数のスライド上に、ヒト遺伝子の全セットを発現させることが可能であり、これによって迅速な総ゲノムスクリーニングが可能になる。したがって、全哺乳動物遺伝子の全長ｃＤＮＡの包括的コレクションを生成可能であり（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｌ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １５：４５５（１９９９））、そしてこれはこうしたアレイを作成するのに有用なツールであろう。
【０１７８】
［０１８８］トランスフェクション細胞マイクロアレイは、ＦＡＣｓまたはｓｉｂ選択を用いた慣用的な発現クローニング戦略とは異なる利点を有する（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，  Ｈ．ら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．，  １５：４３７（１９９４））。まず、目的の表現型を示す細胞からｃＤＮＡを単離する必要がない。これによって、オートラジオグラフィーまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの多様な検出法を用いたスクリーニングが可能になり、そして発現クローニングの進展が有意に加速される。本明細書に記載する実験は、他の発現クローニング戦略で必要な数週間から数ヶ月でなく、数日がかかるのみであった。第二に、トランスフェクション細胞マイクロアレイはまた、生存細胞をスクリーニングし、細胞内カルシウム濃度の変化などの一過性の表現型検出を可能にすることも可能である。第三に、トランスフェクション細胞マイクロアレイは、小型でそして取り扱いやすく、規模の上で節約されている。アレイは数ヶ月安定であり、そして多数プリント可能であって、少数の組織培養プレート中、多様な方法を用いて、平行して多くの表現型をスクリーニングすることが可能である。
【０１７９】
［０１８９］本明細書に記載するのは、トランスフェクションプラスミドが遺伝子過剰発現を指示するアレイである。しかし、哺乳動物細胞において遺伝子機能を減少させるため、アンチセンス技術が改善するか、または他の方法が出現するのにつれて、トランスフェクション細胞マイクロアレイを用いて、遺伝子機能喪失によって引き起こされる表現型に関してスクリーニング可能になる可能性がある。最後に、分解可能ゲル中のプラスミドＤＮＡの固定は、ウェルなしにトランスフェクションを空間的に限定するのに重要である。
【０１８０】
［０１９０］好ましい態様に関して本発明を特に示し、そして説明してきたが、当業者は、付随する請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、型および詳細に多様な変化を行うことが可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】［００１９］図１は、逆トランスフェクションの本発明の方法の１つの態様の略図であり、ここで、発現ベクター（ｐｒｋ５）中のｃＤＮＡ（ＨＡ−ＧＳＴ、ＨＡ−ＦＫＢＰ１２またはｍｙｃ−ＦＲＢ）を以下の方法によって、細胞に導入した：発現ベクター中のｃＤＮＡを、脂質に基づくトランスフェクション試薬およびキャリアータンパク質と合わせて、混合物を産生し；混合物をガラススライド上にスポットし；スポットした混合物をスライド表面上で乾燥させ；ｃＤＮＡを導入しようとするヒト胚性腎臓（ＨＥＫ  ２９３Ｔ）細胞をスライド上に蒔き；逆トランスフェクションが起こるのに適した条件下で、生じたスライドを維持し；そしてＨＡに結合するがｍｙｃに結合しない蛍光標識抗体を用いて、免疫蛍光を検出して、発現されたｃＤＮＡの存在および位置を示す。
【図２】［００２０］図２は、抗ＨＡ免疫蛍光を用いて示されるような、ＨＡ−ＧＳＴでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の逆トランスフェクションの結果を示す。
【図３】［００２１］図３は、ＥＧＦＰの内因性蛍光を検出することによって示されるような、ｐＢＡＢＥ  ＥＧＦＰでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の逆トランスフェクションの結果を示す。
【図４ＡＢＣ】［００２２］図４Ａは、敷き詰めた哺乳動物細胞の定義される領域における、プラスミドＤＮＡのウェル不使用トランスフェクションを用いて、トランスフェクション細胞マイクロアレイを作成するための概略図である。水性ゼラチン溶液に溶解したプラスミドＤＮＡを、ロボットアレイ作成装置を用いて、ガラススライド上にプリントする。スライドを乾燥させ、そしてプリントしたアレイを、脂質トランスフェクション試薬で覆う。脂質除去後、スライドを培養プレート中に入れ、そして培地中の細胞で覆う。トランスフェクション細胞マイクロアレイは、１〜２日で形成され、そしてその後、下流アッセイに使用可能になる。プリント前にＤＮＡ／ゼラチン溶液に脂質を添加する代替法もまた、記載する。
［００２３］図４Ｂは、ＧＦＰ発現構築物を用いて、１２ｘ８パターンでプリントしたスライドから作成したＧＦＰ発現マイクロアレイである。
［００２４］図４Ｃは、図４Ｂで囲んだ細胞クラスターの蛍光顕微鏡で得た、より高次の拡大画像である。スケールバーは１００μｍに等しい。
【図４ＤＥＦ】［００２５］図４Ｄは、ＧＦＰ  ｃＤＮＡ（ピコグラム）対平均シグナル強度＋／−Ｓ．Ｄ．のグラフであり、トランスフェクション細胞マイクロアレイ中のクラスターの発現レベルが、４倍の範囲に渡って、スライド上にプリントされたプラスミドＤＮＡの量に正比例することを示す。ＧＦＰ構築物の示される量を含有する要素を持つアレイをプリントした。ＤＮＡの量は、１ナノリットルがプリント体積と仮定する。トランスフェクション後、細胞クラスターの蛍光強度の平均＋／−Ｓ．Ｄ．を決定した。ＧＦＰ発現プラスミド濃度が０．０１０〜０．０５０μｇ／μｌで多様であり、一方、総ＤＮＡ濃度を空のベクター（ｐｒｋ５）で０．０５０μｇ／μｌで一定に維持したことを除いて、実施例３に記載するとおりにアレイを調製した。細胞クラスターの写真を撮影し、そしてＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ（Ｆｕｊｉ）でシグナル強度を定量化した。蛍光画像は、代表的な実験からのものである。
［００２６］図４Ｅは、２つのプラスミドの混合物をプリントすることによって、トランスフェクション細胞マイクロアレイで同時トランスフェクションが可能であることを示す、スキャン画像である。ＨＡ−ＧＳＴ、ＧＦＰまたは両方の発現構築物を含有する要素を持つアレイをトランスフェクションし、そして抗ｍｙｃ免疫蛍光に関してプロセシングした。免疫蛍光染色のため、実施例３に記載するように細胞を固定し、ＰＢＳ中の０．１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル）で、室温で１５分間透過処理し、そして記載するように、一次および二次抗体で探査した。一次抗体は、以下の濃度で、室温で１時間用いた：１：５００抗ＨＡ腹水（ＢａＢＣｏ）、２μｇ／μｌ抗ｍｙｃ  ９Ｅ−１０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２μｇ／ｍｌ抗Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または１０μｇ／μｌ  ４Ｇ１０抗ホスホチロシン（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。用いた二次抗体は、Ｃｙ３標識抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）であり、３．１μｇ／μｌで、室温で４０分間用いた。Ｃｙ３およびＧＦＰと示すパネルは、それぞれ、ＨＡ−ＧＳＴおよびＧＦＰを発現するクラスターの位置を示す。統合パネルは、Ｃｙ３およびＧＦＰシグナルの重ね合わせを示し、そして黄色は同時発現を示す。スケールバーは１００μｍに等しい。
［００２７］図４Ｆは、図４Ｅのスキャン画像の囲んだ領域の拡大した視野である。
【図５】［００２８］図５Ａは、ＦＫ５０６受容体の検出を示すレーザースキャンである。ＧＦＰ、ｍｙｃ−ＦＫＢＰ１２または両方の発現構築物を含有する要素を持つアレイをプリントし、そしてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。免疫蛍光およびオートラジオグラフィーのための固定およびプロセシングの１時間前に、５ｎＭジヒドロ−ＦＫ５０６［プロピル−３Ｈ］（ＮＥＮ）を培地に添加した。抗ｍｙｃ免疫蛍光のためにスライドをプロセシングし、５μｍ解像度でスキャンし、そして蛍光顕微鏡を用いて写真撮影し、そしてその後、トリチウム感受性フィルム（ＨＹＰＥＲＦＩＬＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に４日間曝露した。製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に記載されるように、オートラジオグラフィーエマルジョンを行った。レーザースキャンは、ＧＦＰおよびＦＫＢＰ１２の発現パターン、並びに両方の重ね合わせ（統合）を示す。フィルムオートラジオグラフィーは、同じアレイへのトリチウム化ＦＫ５０６の結合を検出する（オートラジオグラフィーフィルム）。
［００２９］図５Ｂは、蛍光顕微鏡によって得た、ＦＫＢＰ１２発現クラスターのより高次の拡大画像である（ＦＫＢＰ１２）。エマルジョンオートラジオグラフィーは、細胞解像度で、同じクラスターへのトリチウム化ＦＫ５０６の結合を検出する（オートラジオグラフィーエマルジョン）。
［００３０］図５Ｃは、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードの検出された構成要素を示すスキャンである。発現ベクター中の１９２  Ｖ５−エピトープタグ付きｃＤＮＡを、アレイ１および２と称する、２つの８ｘ１２サブグリッドにプリントした。アレイ内の細胞クラスターの座標決定を容易にするため、ＧＦＰ発現構築物で各アレイ周囲の境界をプリントした。トランスフェクション後、抗Ｖ５または抗ホスホチロシン免疫蛍光用に別個のスライドをプロセシングし、そしてＣｙ３およびＧＦＰ蛍光を検出した。アレイ１の統合画像は、Ｖ５タグ付きタンパク質を発現するクラスター（左のパネル）およびホスホチロシンレベルが増加したクラスター（右のパネル）の位置を示す。座標Ｆ１０〜１２には、ＤＮＡをプリントしなかった。
［００３１］図５Ｄは、図５Ｃに記載するトランスフェクション細胞マイクロアレイで検出可能な形態学的表現型の２つの例を示す。示したクラスターは、アレイ２のＥ８およびＦ７である。
【図６】［００３２］図６は、ニトロセルロースフィルターにトランスファーしたトランスフェクションアレイを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ＡＢＣ】
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【図４ＤＥＦ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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