(57)【要約】本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（イネもみ枯細菌病菌）から得られたエステラーゼ活性（特に、ブチノールＩエステラーゼ活性）を示す新規タンパク質、それをコードする核酸配列、発現カセット、ベクターおよび組換え微生物に関する。本発明はまた、前記タンパク質の生産方法、ならびに、有機エステルの酵素的（特に、エナンチオ選択的）エステル加水分解またはエステル交換のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、４、５または６に示されるアミノ酸部分配列を少なくとも１つ含んでなる、ブチノールＩエステラーゼ活性を有するタンパク質、またはブチノールＩエステラーゼ活性を有するその機能的等価体。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質、またはその機能的等価体。
【請求項３】
機能的等価体が配列番号２、３、４、５または６に示されるアミノ酸配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基からなる部分配列を少なくとも１つ含んでなる、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
分子量が約４１，３００ Ｄａのポリペプチド鎖を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が寄託番号ＤＳＭ １３１７６を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（イネもみ枯細菌病菌）から得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が下記の反応の少なくとも１つを触媒する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質：
ａ）式Ｉ
Ｒ１−ＣＯＯ−Ｒ２　　　　（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、直鎖または分岐鎖の、置換されていない、または一置換もしくは多置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、またはＣ２−Ｃ１０−アルキニルであり、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖の、置換されていない、または一置換もしくは多置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０−アルキニル、Ｃ７−Ｃ１５−アラルキル、あるいは、単核または多核の、置換されていない、または一置換もしくは多置換された芳香族基であり、
Ｒ１および／またはＲ２は少なくとも１個の不斉炭素原子を含む］
で表される光学活性エステルのエナンチオ選択的加水分解反応；および
ｂ）上記式Ｉのエステルの、式ＩＩ
Ｒ２−ＯＨ　　　　（ＩＩ）
［式中、Ｒ２は上記意味の一つを有し、適切な場合は、少なくとも１個の不斉炭素原子を含む］
で表される光学活性アルコールによるエナンチオ選択的エステル交換反応。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質もしくはその機能的等価体をコードするポリヌクレオチド、それに相補的なポリヌクレオチド、またはそれとハイブリダイズする核酸配列。
【請求項８】
配列番号１に示される核酸配列中の少なくとも３０個の連続するヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１つの調節核酸配列と機能的に連結された、少なくとも１つの請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項１０】
請求項７もしくは８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載の発現カセットを含む、真核または原核宿主細胞を形質転換するための組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を生産する方法であって、該タンパク質を内因的に産生する微生物、または請求項１０に記載のベクターで形質転換された微生物を培養し、該培養物から該タンパク質を単離することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２】
前記微生物が寄託番号ＤＳＭ １３１７６を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項１４】
寄託番号ＤＳＭ １３１７６を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３、またはその変種もしくは突然変異体。
【請求項１５】
請求項１０に記載のベクターを含む微生物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いるエナンチオ選択的エステル加水分解法であって、
ａ）該タンパク質を、式Ｉで表される光学活性エステルの立体異性体混合物と接触させ、
ｂ）該立体異性体のいずれかの立体選択的加水分解により生成する光学活性化合物および／または加水分解されないエステルエナンチオマーを反応媒体から取得する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
エナンチオ選択的エステル交換法であって、
ａ）式ＩＩで表される光学活性アルコールの立体異性体混合物を、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の存在下に、式Ｉで表されるエステルと接触させ、未反応のアルコール立体異性体を反応媒体から取得する、または
ｂ）式Ｉで表される光学活性エステルの立体異性体混合物を、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の存在下に、式ＩＩで表されるアルコールと接触させ、該エステルに含まれる光学活性アルコールの立体異性体を反応媒体から取得する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項１８】
エステル交換反応のために、光学活性アルコールのアシル化剤としてビニルエステルを用いる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
用いる反応媒体が有機溶媒である、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いて調製された光学活性アルコール、カルボン酸、またはエステル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エステラーゼ活性、特にブチノールＩエステラーゼ活性を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（イネもみ枯細菌病菌）由来の新規タンパク質；それをコードする核酸配列；発現カセット、ベクターおよび組換え微生物；該タンパク質の生産方法；ならびに、有機エステルの酵素（特に、エナンチオ選択的酵素）加水分解またはエステル交換のためのその使用に関する。
【０００２】
エステラーゼやリパーゼは、光学活性のある有機化合物を合成するために工業的方法で使用されている、高い基質特異性を特徴とする加水分解酵素である。セリンプロテアーゼと同様の作用機序により、それらはカルボニル基のような求核性の基にアシル基を転移したり、エステル結合を加水分解切断したりすることができる。エステラーゼ、リパーゼおよびセリンプロテアーゼは触媒三つ組（すなわち、Ｓｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐのアミノ酸からなる配列モチーフ）を共有しており、この場合、カルボニル炭素原子が活性Ｓｅｒによる求核攻撃を受け、他の２つのアミノ酸も参加して、電荷配分をまねく。エステラーゼとリパーゼはまた、チオエーテルチオ基や活性化されたアミンのような他の求核性の基にアシル基を転移することができる。
【０００３】
リパーゼは長鎖グリセロールエステルを加水分解し、表面活性化（すなわち、活性部位が脂質基質の存在下でのみ利用可能になる）により特徴づけられる。リパーゼは非水性有機溶媒中で安定しており、反応速度論的ラセミ体分割（すなわち、一方のエナンチオマーを他方より実質的に速く変換する）のために多様な工業的方法で利用されている。このエナンチオマーはその後、異なる物理化学的性質により、反応溶液から取得することができる。
【０００４】
Ｎａｋａｍｕｒａら（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｋ．ら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ； Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ９， （１９９９）， ４４２９−４４３９）は、市販のリパーゼ（Ａｍａｎｏ ＡＫ， ＡＨおよびＰＳ；Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を使って疎水性溶媒中でエステル交換することによる１−アルキン−３−オールのラセミ体分割を記載している。この反応においては、エナンチオ選択性がアシル供与体の鎖長とともに増加し、また、立体的に大きな残基（クロロアセテート、ビニルベンゾエート）は反応に悪影響を及ぼす。Ｙａｎｇ（Ｙａｎｇ， Ｈ．ら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６４， （１９９９）， １７０９−１７１２）は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来のリパーゼＢを触媒として用いてビニルエステルでエステル交換することによる光学活性酸のエナンチオ選択的製法を記載している。この場合、エチルエステルは明らかに低い反応速度と選択率をもたらす。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌａｎｔａｒｉｉまたはｇｌｕｍａｅ） ＤＳＭ ６５３５から単離されたリパーゼは、メトキシ酢酸エチルを使ってラセミ体アミンをエナンチオ選択的にアシル化するために利用することができる（Ｂａｌｋｅｎｈｏｈｌ， Ｆ．ら， Ｊ． Ｐｒａｋｔ． Ｃｈｅｍ． ３３９， （１９９７）， ３８１−３８４）。
【０００５】
エステラーゼはエステル結合の形成および分解（前進および逆反応）をエナンチオ選択的に触媒する。光学活性アルコールを得るためにはエステル交換反応でビニルエステルを使用することが好適である。なぜならば、このエステルのアルコール官能基がアルデヒドやケトンへの互変異性化のため変換後にもはや利用されず、それゆえ逆反応を回避できるからである。リパーゼとは対照的に、エステラーゼは表面活性化されることはなく、比較的短い鎖長の有機化合物も変換する。さまざまな基質特異性を示すエステラーゼが種々の生物から単離されている。
【０００６】
こうして、Ｐｓｅｕｄｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＦＥＲＭ−ＢＰ−６２７５由来のエステラーゼは、光学的に活性なクロマン酢酸エステルの加水分解に利用される（ＥＰ−Ａ−０ ８９２ ０４４）。
【０００７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のエステラーゼは、低いエナンチオ選択性でもって、狭い基質範囲からのエステルを加水分解するにすぎない（Ｍａｎｃｏ， Ｇ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３２， （１９９８）， ２０３−２１２）。
【０００８】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のアシラーゼ１は、無極性有機溶媒中でビニルエステルを用いてエステル交換することにより第二級アルコールを得るために用いられ、これは短い側鎖をもつ第二級アルコールを変換するのに好適である（Ｆａｒａｌｄｏｓ， Ｊ．ら， Ｓｙｎｌｅｔｔ ４， （１９９７）， ３６７−３７０）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＳＭ ５０ １０６から、膜結合型のラクトン特異的エステラーゼがクローン化されており（Ｋｈａｌａｍｅｙｚｅｒ， Ｖ．ら， Ａｐｐｌ． ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５（２）， （１９９９）， ４７７−４８２）、また、大腸菌 ｍａｌＱ突然変異体からはアセチルエステラーゼがクローン化されている（Ｐｅｉｓｔ， Ｒ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９， （１９９７）， ７６７９−７６８６）。しかしながら、これら２つのエステラーゼのエナンチオ選択性および基質特異性は詳細には研究されていない。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＮＣＢＭ １１２１６は４種類のエステラーゼ ＲＲ１からＲＲ４を発現するが、これらは異なる特異性をもっている。ナフトールと酸からのエステル合成の場合、ＲＲ１とＲＲ２は炭素鎖の短い酸のほうを優先し、一方ＲＲ３とＲＲ４は比較的長い炭素鎖と立体的により大きい残基をもつ酸を特異的に変換する（Ｇｕｄｅｌｊ， Ｍ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃａｔ． Ｂ， Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ５， （１９９８）， ２６１−２６６）。
【０００９】
しかし、短い炭素鎖をもつ光学活性アルコール、酸またはエステルといった小さい有機分子を製造するための、工業的方法で利用することができ、基質範囲が広くかつエナンチオ選択性が高いエステラーゼは入手可能でない。本発明の目的は、上記特性を少なくとも１つ備えたエステラーゼを提供することである。
【００１０】
本発明の上記目的は、驚いたことに、下記の配列番号３、４、５または６：
ａ）　ＦＩＥＴＬＧＬＥＲＰＶＬＶＧＨＳＬＧＧＡＩＡＬＡＶＧＬＤＹＰＥＲ　（配列番号３）
ｂ）　ＩＡＬＩＡＰＬＴＨＴＥＴＥＰ　（配列番号４）
ｃ）　ＧＧＧＭＭＧＬＲＰＥＡＦＹＡＡＳＳＤＬＶ　（配列番号５）
ｄ）　ＡＩＤＡＩＦＡＰＥＰＶ　（配列番号６）
（それぞれはアミノ酸の一文字表記で表され、各配列の最初のアミノ酸がアミノ末端に相当する）
に示されるアミノ酸部分配列を少なくとも１つ含んでなる、ブチノールＩエステラーゼ活性を有するタンパク質、ならびに、ブチノールＩエステラーゼ活性を有するその機能的等価体を提供することによって達成されることが見出された。
【００１１】
上記目的は、特に、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に示される核酸配列によりコードされるブチノールＩエステラーゼ、ならびに、該タンパク質の機能的等価体を提供することによって達成された。
【００１２】
単純化するために、以後、上記タンパク質をブチノールＩエステラーゼと呼ぶことにする。
【００１３】
特定して開示したポリペプチドまたはタンパク質の「機能的等価体」または「類似体」とは、本発明の目的において、その特定されたポリペプチドまたはタンパク質とは相違するが、所望の生物学的活性（特に、酵素活性）をまだ保持するポリペプチドまたはタンパク質のことである。
【００１４】
「機能的等価体」とは、本発明によれば、とりわけ、上記配列位置の少なくとも１つに、特定して記載したポリペプチドまたはタンパク質と異なるアミノ酸を有するが、それにもかかわらず、本発明の生物学的活性の少なくとも１つを保持する突然変異体を意味する。したがって、「機能的等価体」は、１個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位により得られる突然変異体を含み、かかる改変は、それらが本発明の特性プロファイルを有する突然変異体をもたらすかぎり、配列のどの位置で起こってもよい。機能的等価性は、特に、突然変異体と未改変ポリペプチドとの間に反応性パターンの点で質的一致が認められる場合、すなわち、例えば、同一基質を変換する速度に差がある場合、にも存在する。
【００１５】
「機能的等価体」はまた、他の生物から自然界で得られるポリペプチドおよび天然に存在する変異体も包含する。例えば、配列比較によって相同配列の領域が検索されることがあり、また、同等の酵素が本発明の特定の必要条件に基づいて確立される可能性がある。
【００１６】
同様に、「機能的等価体」には、本発明のポリペプチドの、例えば所望の生物学的機能を有する、断片（好ましくは、単一のドメインまたは配列モチーフ）も包含される。
【００１７】
「機能的等価体」にはさらに、融合タンパク質も含まれ、この融合タンパク質は、上記のポリペプチド配列またはそれから誘導される機能的等価体のうちの１つと、それとは機能的に異なる他の異種配列少なくとも１つを、機能しうるＮ−またはＣ−末端結合で（すなわち、融合タンパク質の各部分の機能を無視できる程度にしか相互に損なわずに）含んでなる。そのような異種配列の例として、限定するものではないが、シグナルペプチド、酵素、免疫グロブリン、表面抗原、受容体または受容体リガンドが挙げられる。
【００１８】
「機能的等価体」は、本発明によれば、特定して開示したポリペプチドまたはタンパク質の相同体を包含する。これらは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５（８）， １９８８， ２４４４−２４４８に記載のアルゴリズムを用いて計算したとき、特定して開示した配列の１つに対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば、９０％、９５％または９９％の相同性を有する。
【００１９】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの相同体は、突然変異誘発（例えば、点突然変異誘発）または該タンパク質のトランケーションにより作製することができる。本明細書で用いる「相同体」という用語は、そのタンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する該タンパク質の改変形態に関係する。
【００２０】
本発明のタンパク質の相同体は、トランケーション突然変異体のような突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、タンパク質変異体の多様性に富んだライブラリーは、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結などによる、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により作製することが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のある相同体のライブラリーを作製するために使用できる方法は数多く知られている。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で実施し、次いで合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを使用すると、１つの混合物中に、可能性のあるタンパク質配列の所望セットをコードするあらゆる配列を提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ， Ｓ．Ａ． （１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３； Ｉｔａｋｕｒａら， （１９８４） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３； Ｉｔａｋｕｒａら， （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６； Ｉｋｅら， （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：４７７）。
【００２１】
さらに、タンパク質コドンの断片のライブラリーを用いることにより、本発明のタンパク質の相同体をスクリーニングし、次いで選別するための、多様性に富んだタンパク質断片の集団を作製することが可能である。一つの実施形態において、コード配列断片のライブラリーを作製するには、例えば、コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ヌクレアーゼを用いて、ニッキングが１分子につき１回程度だけ起こる条件下で処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性し、そのＤＮＡを再生して異なるニック導入産物のセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖ＤＮＡを形成させ、新たに形成された二本鎖から一本鎖部分をＳ１ヌクレアーゼで処理して除去し、こうして得られる断片ライブラリーを発現ベクターに連結させることができる。この方法により、本発明のタンパク質の異なる大きさのＮ−末端断片、Ｃ−末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することが可能である。
【００２２】
点突然変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーから遺伝子産物をスクリーニングするための手法、あるいは所定の性質をもつ遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための手法は、これまでに当技術分野でいくつか知られている。こうした手法は、本発明の相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに応用することができる。大型の遺伝子ライブラリーをハイスループット分析によりスクリーニングするために最も広く用いられている手法は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし；得られたベクターライブラリーで適当な細胞を形質転換し；必要とされる活性の検出により、すでに検出されている産物の遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる；ことを含んでなる。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める技術である、帰納的集合突然変異誘発法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ＲＥＭ）を、相同体を同定するためのスクリーニング試験と組み合わせて使用してもよい（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ （１９９２） ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５； Ｄｅｌｇｒａｖｅら （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【００２３】
本発明の好ましい機能的等価体は、少なくとも１つの位置で配列番号２から変化している配列を有し、かかる配列の変化はエステラーゼ活性を有意には変えないことが望ましく、すなわち、せいぜい±９０％、特にせいぜい±５０％または±３０％しか変えないことが好ましい。この変化は標準条件（例えば、２０ｍＭ基質、１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４、Ｔ＝２０℃）下でブチノール酪酸エステルなどの参照基質を用いて測定することができる。
【００２４】
本発明は特に、配列番号２に示される配列由来の少なくとも１０個の連続するアミノ酸からなる部分配列を少なくとも１つ含み、かつ参照基質に対する上記活性を有する機能的等価体に関する。
【００２５】
この種の部分配列の例は、限定するものではないが、上記の配列番号３、４、５および６に示される部分配列から誘導される。
【００２６】
こうして、さらに、本発明のエステラーゼの好ましい機能的等価体は、特定して記載した部分配列と比較して、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、逆位または付加されており、かつ天然のタンパク質（配列番号２）のエステラーゼ活性とは、せいぜい±９０％または±５０％、好ましくはせいぜい±３０％しか相違しないエステラーゼ活性を有する、配列番号３、４、５または６から誘導された部分配列を少なくとも１つ含むものである。
【００２７】
本発明のブチノールＩエステラーゼは、ＳＤＳゲル電気泳動で測定して、約４０〜４２ ｋＤａ、特に約４１．３ ｋＤａの分子量を有する。それらは、とりわけ、寄託番号ＤＳＭ １３１７６を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（イネもみ枯細菌病菌）Ｌｕ ２０２３から得ることができる。別の変異株は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ８０９３から出発して、唯一の炭素源としてフェニル酢酸エチルを含む最少培地で培養するなどして、選別することによって取得することができる。
【００２８】
本発明はまた、ブチノールＩエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、配列番号１に示される核酸配列またはそれから誘導される配列を含む。
【００２９】
本発明は特に、上記のポリペプチドまたはタンパク質およびそれらの機能的等価体（例えば、人工的なヌクレオチド類似体の使用により得られるもの）のうちの１つをコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）に関する。
【００３０】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子と、例えば、本発明のコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸断片と、の両方に関する。
【００３１】
本発明の核酸分子は、該遺伝子のコード領域の３´および／または５´末端からの非翻訳配列をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
「単離された」核酸分子は、該核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え法により産生されたものである場合は他の細胞性物質や培地を実質的に含まず、また、それが化学合成されたものである場合は化学的前駆物質や他の化学薬品を実質的に含まないものである。
【００３３】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学の手法および本発明により提供される配列情報を用いることにより単離することができる。例えば、適当なｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離するには、標準的なハイブリダイゼーション手法において、特定して開示した完全な配列またはその部分配列の１つをハイブリダイゼーションプローブとして使用する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されるようにして行う）。さらに、開示した配列またはその部分配列の１つを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより単離することも可能である。このようにして増幅した核酸を適当なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列解析により特徴づけることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使って、製造することもできる。
【００３４】
本発明はさらに、特定して記載したヌクレオチド配列またはその部分配列に相補的な核酸分子を含む。
【００３５】
本発明のヌクレオチド配列によって、他の細胞タイプおよび生物に含まれる相同配列を同定および／またはクローニングするために有用なプローブおよびプライマーを作製することが可能となる。そのようなプローブおよびプライマーは通常、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは、少なくとも約２５個、例えば、４０、５０または７５個の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００３６】
本発明のさらなる核酸配列は、配列番号１から誘導され、１個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により配列番号１と異なるが、所望の特性のプロファイル（特に、酵素活性の変化の上記範囲内に入る本発明のエステラーゼ活性など）を有するポリペプチドをなおもコードするものである。
【００３７】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む核酸配列、または、特定して記載した配列に対して、特定の源または宿主生物のコドン使用頻度に従って改変されている核酸配列、ならびにそのスプライス変異体や対立遺伝子変異体などの天然に存在する変異体を包含する。同様に、本発明は保存的ヌクレオチド置換（すなわち、関係するアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解性をもつアミノ酸により置換される）によって得られる配列に関する。
【００３８】
本発明はまた、特定して開示した核酸から配列多型によって誘導される分子に関する。これらの遺伝的多型は集団内の個体間に見られる天然の変異ゆえに存在しうる。こうした天然の変異は１つの遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異度をもたらす。
【００３９】
本発明はさらに、上記のコード配列にハイブリダイズする、または相補的である核酸配列を包含する。これらのポリヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングで見出され、適宜に、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅させた後、例えば、適切なプローブを用いて単離することができる。別の可能性は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで適当な微生物を形質転換し、該微生物（ひいては、該ポリヌクレオチド）を増やし、その後それらを単離することである。さらなる可能性は、化学的経路によって本発明のポリヌクレオチドを合成することである。
【００４０】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」ことができるという性質は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でほぼ相補的な配列と結合することができるが、これらの条件下において非相補的パートナー間には非特異的結合が存在しないことを意味する。そのためには、配列は７０〜１００％、好ましくは９０〜１００％相補的であるべきである。互いと特異的に結合することができる相補的配列の性質は、例えば、ノーザンまたはサザンブロット法や、プライマー結合の場合のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおいて利用される。通常、この目的のためには、３０塩基対またはそれより長いオリゴヌクレオチドを使用する。ストリンジェントな条件は、例えば、ノーザンブロット法では、５０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）での洗浄溶液の使用、例えば、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出するための０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３Ｍ ＮａＣｌ， ０．３Ｍ クエン酸Ｎａ， ｐＨ７．０）の使用を意味する。この場合には、上記のように、高度の相補性を有する核酸のみが互いに結合したままで存在する。ストリンジェントな条件の設定は当業者に公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。
【００４１】
本発明はまた、少なくとも１つの調節核酸配列と機能的に連結された、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。好ましくは、プロモーター配列を本発明のポリヌクレオチドの５´側上流に配置して、ブチノールＩエステラーゼの制御された発現を促進させる。特に好ましくは、ターミネーター配列と、場合により、別の通常の調節エレメントを、それぞれがブチノールＩエステラーゼをコードする配列と機能的に連結されるようにして、本発明のポリヌクレオチドの３´側下流に配置する。「機能的に連結」とは、調節エレメントのそれぞれがコード配列の発現前、発現中、または発現後に意図したとおりにその機能を果たすことができるように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および場合により、さらなる調節エレメントが連続して配置されていることを意味する。機能的に連結しうる配列のさらなる例としては、ターゲッティング配列があり、また、翻訳増幅因子、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどもそうである。さらに有用な調節エレメントには、選択マーカー、リポーター遺伝子、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。
【００４２】
人工的な調節配列に加えて、実際の構造遺伝子の前には天然の調節配列が依然存在していてもよい。遺伝的改変により、適宜に、その天然の調節のスイッチを切って、遺伝子の発現を増加させたり減少させたりすることが可能である。しかし、発現カセットの構築はもっと単純であってよく、すなわち、構造遺伝子の前に追加の調節シグナルを挿入せず、また、それを調節する天然のプロモーターを取り除くことができる。あるいはまた、天然の調節配列に突然変異を起こさせて、調節がもはや起こらないようにして、遺伝子発現を増強または消失させてもよい。核酸配列は発現カセット中に１以上のコピー数で存在することができる。
【００４３】
有用なプロモーターの例は次のものである：グラム陰性細菌において有利に使用されるｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ、またはλ−ＰＬプロモーター；グラム陽性細菌プロモーター ａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母プロモーター ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、または植物プロモーター ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓまたはユビキチンプロモーターもしくはファセオリンプロモーター。誘導プロモーター、例えば、光誘導プロモーター、特に、ＰｒＰｌプロモーターのような温度誘導プロモーターを使用することが特に好ましい。
【００４４】
原則として、天然のあらゆるプロモーターをそれらの調節配列と共に使用することが可能である。さらに、合成プロモーターを使用することも有利である。
【００４５】
前記調節配列は核酸配列の特別の発現を容易にすべきである。このことは、宿主生物に応じて、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現または過剰発現されること、あるいは、遺伝子が直ちに発現または過剰発現されること、を意味しうる。
【００４６】
これに関して、調節配列または調節因子に積極的な影響を及ぼすことによって発現を増減させることが可能である。こうして、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いて、調節エレメントを転写レベルで有利に増強することができる。しかし、これとは別に、例えば、ｍＲＮＡの安定性を高めることによって、翻訳を増強することも可能である。
【００４７】
本発明の発現カセットを作製するには、適当なプロモーターを、ブチノールＩエステラーゼをコードする適当なポリヌクレオチドに、さらにターミネーターやポリアデニル化シグナルにも、融合させる。そのためには、慣用の組換え・クローニング法を使用するが、これは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）、さらに Ｔ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ．Ｌ． ＢｅｒｍａｎおよびＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８４）、および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７）に記載されている。
【００４８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現カセットを担持する、真核または原核細胞宿主を形質転換するための組換えベクターに関する。かかるベクターは適当な宿主生物におけるブチノールＩエステラーゼの発現を可能にする。ベクターは当業者に公知であり、例えば、”Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ” （Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ら編， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ， １９８５）に載っている。ベクターとは、プラスミドのほかに、当業者に知られた他のあらゆるベクターも意味し、例えば、ファージ、ウイルス（ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、アデノウイルスなど）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、線状または環状ＤＮＡが含まれる。これらのベクターは宿主生物内で自律複製するものでも、染色体に組み込まれて複製するものでもよい。
【００４９】
本発明のベクターを用いて、組換え微生物（例えば、本発明の少なくとも１つのベクターで形質転換されていて、組換えエステラーゼの生産のために使用できる微生物）を作製することが可能である。有利には、本発明の上記組換え発現カセットを発現ベクターの一部として適当な宿主生物に導入して、発現させる。特定の発現系で前記核酸を発現させるために、当業者に知られた通常のクローニングおよびトランスフェクション方法を使用することが好ましい。適当な発現系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７に記載されている。
【００５０】
本発明のベクターで形質転換するのに適する宿主生物には、原則として、本発明のポリヌクレオチド、その対立遺伝子変異体、機能的等価体または誘導体の発現を促す生物がすべて含まれる。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物または動物細胞を指す。好ましい生物は細菌、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例：大腸菌）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌、真核微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、または動物もしくは植物由来の高等真核細胞（例：Ｓｆ９、ＣＨＯ細胞）である。
【００５１】
形質転換に成功した生物は、ベクターまたは発現カセットに含まれるマーカー遺伝子により選択することができる。このようなマーカー遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子および形質転換細胞の染色を引き起こす染色反応を触媒する酵素の遺伝子である。次いで、細胞は自動セルソーティングにより選別することができる。ベクターによる形質転換に成功して、適切な抗生物質耐性遺伝子を保有する生物は、その抗生物質を含有する培地または培養基上で選別される。細胞表面に提示されたマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによる選別のために使用することができる。
【００５２】
したがって、本発明はまた、本発明のベクターを保有する微生物、ならびに、ブチノールＩエステラーゼを内因的に発現する、寄託番号 ＤＳＭ １３１７６を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ（イネもみ枯細菌病菌）突然変異体 Ｌｕ ２０２３に関する。
【００５３】
本発明のブチノールＩエステラーゼは特に、下記の反応の少なくとも１つを触媒する：
ａ）式Ｉ
Ｒ１−ＣＯＯ−Ｒ２　　　　（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、直鎖または分岐鎖の、置換されていない、または一置換もしくは多置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、またはＣ２−Ｃ１０−アルキニルであり、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖の、置換されていない、または一置換もしくは多置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０−アルキニル、Ｃ７−Ｃ１５−アラルキル、あるいは、単核または多核の、置換されていない、または一置換もしくは多置換された芳香族基であり、
Ｒ１および／またはＲ２は少なくとも１個の不斉炭素原子を含むが、
ここにおいて、特に好ましくは、エステル結合の炭素原子に結合したＲ１由来の炭素原子、またはエステル結合の酸素原子に結合したＲ２由来の炭素原子が不斉炭素原子である］
で表される光学活性エステルのエナンチオ選択的加水分解反応；および
ｂ）上記式Ｉのエステルの、式ＩＩ
Ｒ２−ＯＨ　　　　（ＩＩ）
［式中、Ｒ２は上記意味の一つを有し、適切な場合は、少なくとも１個の不斉炭素原子を含むが、ここにおいて、特に好ましくは、ＯＨ基をもつ炭素原子が不斉炭素原子である］
で表される光学活性アルコールによるエナンチオ選択的エステル交換反応。
【００５４】
本発明はまた、ブチノールＩエステラーゼを用いるエナンチオ選択的エステル加水分解法にも関し、この方法では、ブチノールＩエステラーゼを、式Ｉで表される光学活性エステルの立体異性体混合物と接触させ、２種の立体異性体の立体選択的加水分解により生成する光学活性化合物および／または加水分解されないエステルエナンチオマーを反応媒体から取得する。しかし、ブチノールＩエステラーゼは、光学的に活性でない式Ｉのエステルを加水分解することも可能である。
【００５５】
本発明はさらに、エナンチオ選択的エステル交換法にも関し、この方法では、式ＩＩで表される光学活性アルコールの立体異性体混合物を、ブチノールＩエステラーゼの存在下に、式Ｉで表されるエステルと接触させ、未反応のアルコール立体異性体を反応媒体から取得するか、または、式Ｉで表される光学活性エステルの立体異性体混合物を、ブチノールＩエステラーゼの存在下に、式ＩＩで表されるアルコールと接触させ、該エステルに含まれる光学活性アルコールの立体異性体を反応媒体から取得する。エステル交換法では、光学活性アルコールのアシル化剤としてビニルエステルを使用することが好ましい。このことは、ビニルエステルのアルコール官能基が変換後に互変異性化のため逆反応にもはや利用されないので、有利である。ブチノールＩエステラーゼはまた、エステルとアルコールのどちらも光学活性でないエステル交換法も触媒する。
【００５６】
エステル加水分解の好ましい基質は、エタノール、プロパノール、ブタノールのエステル、特に好ましくは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、乳酸、２−エチルヘキサン酸、３−メチル酪酸、メトキシ酢酸、２−メチルプロピオン酸、２−ブテン酸、３−クロロプロピオン酸、および２−メチルペンタン酸などのカルボン酸とのブチニルエステル（ブチノールエステル、１−メチルプロパ−２−イノールのエステル）である。特に好ましいものは、酪酸ブチニルとメチル酪酸ブチニルである。
【００５７】
エステル交換に用いるのに好ましいアルコールはエタノール、プロパノールおよびブタノールであり、ブチノールが特に好ましいものである。
【００５８】
エステル交換に用いるのに好ましいエステルは、ビニルエステル、例えば、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルおよび酪酸ビニルである。
【００５９】
上記方法で用いる反応媒体は有機溶媒であり、例えば、アルカン類、エーテル類、トルエン、ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などがある。エステルの加水分解では、用いるバッファーと有機溶媒（例えば、ＭＴＢＥおよびヘプタンまたはトルエン）から調製した混合溶媒も使用できる。
【００６０】
本発明はさらに、ブチノールＩエステラーゼを用いて上記方法により製造された光学活性アルコール、カルボン酸またはエステルに関する。
【００６１】
ラセミ化合物の分割（すなわち、エナンチオ選択性）および反応速度は、酸成分の大きさと疎水性により影響を受けることがある。この反応は、好ましくは、室温においてｐＨ６〜９、特に好ましくは、ｐＨ７．０〜７．４で実施する。エステラーゼは単離または精製された形態の酵素として、エステラーゼを発現している微生物の細胞として、該微生物の培養上清、細胞溶解物または抽出物として、あるいは固定化されたエステラーゼとして用いる。反応生成物は当業者に公知の化学的または物理的分離方法により反応溶液から単離する。ブチノールＩエステラーゼは膜濾過によって反応混合物から単離することができる。
【００６２】
ポリアクリルアミド、アルギン酸またはカラゲーニンを用いてエステラーゼを固定化することが可能である。また、公知の方法を用いてエステラーゼを適当な担体に共有結合させたり、吸着させたりすることもできる。ブチノールＩエステラーゼは、ケイソウ土（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）への凍結乾燥により、または硫酸アンモニウム沈降により固定化することが好ましい。
【００６３】
先に述べたように、ブチノールＩエステラーゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３から得られる。しかし、公知のペプチド合成法によって製造することもできる。
【００６４】
さらに、ブチノールＩエステラーゼは、真核または原核生物が、例えば本発明のベクターを保有する微生物のように、ブチノールＩエステラーゼを発現するのであれば、そのような生物からも得ることができる。
【００６５】
したがって、本発明はブチノールＩエステラーゼの調製方法にも関し、この方法においては、ブチノールＩエステラーゼを産生する微生物または本発明のベクターで形質転換された微生物を培養し、適宜にブチノールＩエステラーゼの発現を誘導し、そして培養物からブチノールＩエステラーゼを単離する。微生物は公知の方法を用いて培養し、発酵させることができる。例えば、細菌をＴＢまたはＬＢ培地にて２０〜４０℃、ｐＨ６〜９で増殖させる。適当な培養条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に詳しく記載されている。
【００６６】
培養した後、細胞を溶解し、その溶解物からタンパク質分離法によりブチノールＩエステラーゼを取得する。細胞を溶解するには、超音波処理によるか、高圧（例えば、フレンチプレスの使用）によるか、浸透圧によるか、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶剤の作用によるか、ホモジナイザー（好ましくは、ガラスビーズミル）によるか、上記方法の２以上の組合せによるか、のいずれでもよい。遠心分離後、タンパク質と他の可溶性分子は上清中に残っている。塩化マグネシウムを用いてＤＮＡを沈澱させると、明らかに粘性の低い溶液が得られる。タンパク質は、硫酸アンモニウムやリン酸カリウムなどを用いる塩析により、選択的に沈澱させることができる。また、ｐＨもしくは温度を変化させたり、メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶剤を使っても、沈澱を生じさせることができる。塩沈澱の後、その塩を透析して取り除く。
【００６７】
ブチノールＩエステラーゼのさらなる精製は、公知のクロマトグラフィー法、例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを使って、また、限外濾過、結晶化、未変性ゲル電気泳動のような他の慣用方法を使って行うことができる。
【００６８】
以下の実施例は、添付の図面を参照しながら、より詳細に本発明を説明するためのもので、限定するものではない。
【００６９】
実施例１
ブチノールＩエステラーゼを発現するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ突然変異体の選択
このスクリーニングの開始点は、リパーゼ産生株であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ （Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ） ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ８０９３であった。この菌株から得られたリパーゼにより、いくつかの興味のもてる反応を実施することができる（Ｂａｌｋｅｎｈｏｈｌ， Ｆ．ら， Ｊ． ｐｒａｋｔ． Ｃｈｅｍ． ３３９， （１９９７）， ３８１−３８４）。しかし、乳酸エステル、メチル酪酸エステルおよびフェニル酢酸エステルはこのリパーゼの基質ではなく、この菌株は他のどのような方法でもこれらのエステルを加水分解することができない。
【００７０】
しかし、加水分解産物は炭素源として利用可能である。したがって、上記エステルを加水分解して、その加水分解産物を炭素源として利用して生育する能力があるＬｕ ８０９３の突然変異体を探した。したがって、新規なエステラーゼ活性を有する突然変異体は、上記エステルで生育させることによってその正体を現すであろう。
【００７１】
選択条件：　Ｌｕ ８０９３を培地上で１６時間培養し、遠心分離により回収した。細胞を食塩水で２回洗浄した。１０６個の細胞を、唯一の炭素源として０．５または１．０ｇ／ｌのフェニル酢酸エチルを含む最少培地プレートにまいた。ところが、最初は全く生育しなかった。やっと４〜６日後に、単一のコロニーが確認できた。その数はそれ以後さらに増えた。
【００７２】
このようにして得られたエステラーゼ陽性突然変異体から、Ｌｕ ２０２３突然変異株を選択した。驚いたことに、この新規なエステラーゼ活性は比較的小さな有機分子の選択的加水分解にも適していた。例えば、ブチノールエステルを選択的に加水分解することがわかった。
【００７３】
実施例２
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３の発酵
ブチノールＩエステラーゼを得るために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３を１４Ｌのスケールで培養し、活性バイオマスを回収した。
【００７４】
実験室では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３を、Ｍ１２ミネラル塩培地と１ｇ／ＬのＥＰＡを含む寒天プレート上にストリーク接種し、２８℃で３６〜４８時間インキュベートした。その後、このプレートは４℃で４週間保存することができた。
【００７５】
この菌株の発酵は、Ｉｎｆｏｒｓ ｘｘｙ １４−１発酵槽で実施した。前培養のため、２５０ｍｌの培地に２〜３の白金耳を用いて接種し、２００ｒｐｍ、２８℃で２４時間インキュベートした。主培養は下記の条件下で行った：
温度　２８℃
空気の供給　７Ｌ／分
攪拌　６００ｒｐｍ
発酵実施時間　約２４時間
内臓ｐＨおよびｐＯ２の測定
【００７６】
前培養および主培養のための培地
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母自己分解物質６５％　　　　１５ ｇ／ｌ
硫酸マグネシウム×７水　　　　　　　 １．６ ｇ／ｌ
塩化カルシウム×２水　　　　　　　　 ０．０２ ｇ／ｌ
リン酸二水素カリウム　　　　　　　　 ３．５ ｇ／ｌ
リン酸水素二カリウム　　　　　　　　 ３．５ ｇ／ｌ
リン酸水素二アンモニウム　　　　　　 ５ ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｉｏｌ Ｐ２０００消泡剤　　　　　　　　　６ ｍｌ
【００７７】
上記の成分を脱イオン水に溶解し、この溶液を２５％濃度のアンモニア水を用いてｐＨ６．５に調整した。５ ｍｌ／ｌの微量元素溶液および２ ｇ／ｌグルコースを別個に滅菌濾過した。
【００７８】
培地を滅菌して完成させた後、０．５ ｇ／ｌのフェニル酢酸エチルを発酵槽に導入した。Ｐｌｕｒｉｏｌ Ｐ２０００を添加して発酵中の泡の発生を防止した。発酵槽内のｐＯ２が８５％以上に再度増加したとき発酵を停止させた。次いで、発酵槽の内容物を約９０００〜１０，０００ ｇ、１５℃以下で遠心分離し、透明な上清を廃棄した。細胞塊は−１６℃で凍結させた。
【００７９】
実施例３
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３からのブチノールＩエステラーゼの精製
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３細胞（１００ ｍｌ、湿重量：５０ ｇ）を３０００ｒｐｍ、４℃でガラスビーズミル（１００ｍｌのガラスビーズ、直径：０．５ｍｍ）で溶解した。遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、３０分）、ガラスビーズを洗浄した後、上清（３００ｍｌ）を塩化マンガン沈澱（ｐＨ７〜７．５；最終濃度：５０ｍＭ）に付した。もう一回遠心分離した後、上清をｐＨ８．０に調整し、ＥＤＴＡを５０ｍＭの濃度で添加した。この容量をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（３００ｍｌ）クロマトグラフィーで精製した。サンプルをアプライした後、カラムを５０ｍＭ トリス／ＨＣｌで洗浄した。対象となる画分を集めて、限外濾過（１００ ｋＤａ）により濃縮した。分子ふるいクロマトグラフィー（直径：５ｃｍ、高さ：９０ｃｍ；材料：Ｓ−３００）にかけて非特異的エステラーゼからブチノールＩエステラーゼを分離した。得られた活性画分は濁っており、再度濃縮した。このエステラーゼは明らかに膜に結合されていた。次いで、膜画分をまずプロテアーゼ（トリプシン、重量比：１：５０から１：１００）で消化した。これは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において２，３のバンドを別にすれば、膜画分から全タンパク質を消失させた。活性は保存されていた。上記バンドを未変性ゲル電気泳動（０．０４％のＳＤＳ）で互いに分離し、活性アッセイにより未変性ゲル中のエステラーゼを同定した。このエステラーゼをゲルから溶出した後で、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたところ、きれいな１本のバンドとして現れた。
【００８０】
このようにして精製されたタンパク質は、ＰＶＤＦ膜へのブロッティングにより移行させてから配列決定するか、または、トリプシンで切断した後にペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離してから配列決定した。このタンパク質のアミノ末端はブロックされたので、トリプシン消化ペプチドのみが得られた。種々のアミノ酸配列がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｗｏｆｆｉｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のムコン酸エステルシクロイソメラーゼ（ｍｕｃｏｎａｔｅ ｃｙｃｌｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）ＥＣ ５．５．１．１に対して、また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のラクトンエステラーゼに対して弱い相同性を示した。配列ＡＩＤＡＩＦＡＰＥＧＶをもつペプチドはペクチンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１１）に対する相同性を示した。
【００８１】
図１は、本発明のアミノ酸部分配列と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のラクトン特異的エステラーゼの部分配列との、配列アラインメントを示す。
【００８２】
実施例４
ブチノールＩエステラーゼの固定化
固定化のために種々の方法を使用した。
１．ブチノールＩエステラーゼは、ケイソウ土（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）の存在下にアセトンで沈澱させることにより実質的に不活性化された。２５ｍｇのタンパク質を３．５ｇのケイソウ土（Ｍｅｒｃｋ）と混合し、１．４Ｌのアセトン（−２０℃）を１０分間添加した。その後、エステラーゼをローディングした担体をＧ３ガラス吸引フィルターにより分離し、フィルター残留物を冷アセトンで洗浄して、乾燥させた。
【００８３】
２．ブチノールＩエステラーゼは、Ａｃｃｕｒｅｌ（Ａｋｚｏ）に結合しない。
【００８４】
３．ブチノールＩエステラーゼ（２．３単位／ｇ、ＥＰＡアッセイ）は、凍結乾燥によりケイソウ土に固定させることができた。そのために、酵素溶液をケイソウ土と混合し、−８０℃で凍結させた。続いて、この固形物質を凍結乾燥により乾燥させた。
【００８５】
４．ブチノールＩエステラーゼ（４５４ミリ単位／ｇ、ＥＰＡアッセイ）は、硫酸アンモニウム沈澱により固定化された。そのために、酵素をケイソウ土の存在下に８０％飽和の硫酸アンモニウムで沈澱させた。
【００８６】
実施例５
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ Ｌｕ ２０２３由来のブチノールＩエステラーゼを用いたラセミ体分割
手順（標準混合物）：
１００単位のブチノールＩエステラーゼを、リン酸バッファー（２００ｍｌ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で２０ｍｍｏｌのブチノール酪酸エステル（酪酸１−メチルプロパ−２−イニル）と攪拌しながら反応させた。ｐＨを絶えず測定して、水酸化ナトリウム溶液の添加により約ｐＨ７．４に維持した。サンプルを採取し、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回抽出し、有機相をＧＣ（Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ ＧＴＡ）により分析した。ブチノールＩエステラーゼを膜濾過により反応混合物から分離した。
【００８７】
その濃度が増加するにつれて、好ましくないほうのエステルエナンチオマーは漸増的に変換された。約４５分後、これは反応混合物中のＳ−ブチノールのｅｅの低下を招いた。この生成物のｅｅは、約３０〜４０分後に８４％（８３〜９７．９％）でその最大値に達した。基質のｅｅは９０分間で９９％以上に増加した。ｅｅ（エナンチオマー過剰率）は、好ましいほうの変換エナンチオマーの量（％）マイナス好ましくないほうの変換エナンチオマーの量（％）として定義される。たいていの場合、これは光学純度に一致する。ｐＨの低下は３０分まで直線状であったが、約１００分以後からは、ｐＨの変化はごくわずかであった。
抽出後、水相中の残留エステラーゼ活性はまだ５０％ほど残っていた。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
表１は、ブチノールＩエステラーゼを用いてブチノール酪酸エステルを変換したときの時間依存的エナンチオマー過剰率を示す。Ｃａｈｎ、ＰｒｅｌｏｇおよびＩｎｇｏｌｄによるＲ／Ｓ変換に従うと、ＲおよびＳ立体配置が１つのキラル分子の２つのエナンチオマーを規定する。変換率は反応混合物中の変換されたエステルの割合である。
【００９０】
実施例６
エステルの酸成分の大きさおよび疎水性／電荷に対するブチノールＩエステラーゼ特異性の依存性
標準方法：
１００単位のブチノールＩエステラーゼを、リン酸バッファー（２００ｍｌ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で２０ｍｍｏｌのブチノールエステルと攪拌しながら反応させた。ｐＨを絶えず測定して、連続滴定により約ｐＨ７．０に維持した。サンプルを採取し、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回抽出し、有機相をＧＣ（Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ ＧＴＡ）により分析した。
【００９１】
結果：
ラセミ体分割の質および反応速度は、酸成分の大きさおよび疎水性に依存していた。ブチノールＩエステラーゼの最良の基質は、ブチノールの酪酸エステルとブチノールのメチル酪酸エステルであった。リパーゼはこれらの基質には不活性である。このことは、ｎ−デカン酸ブチニルのような長鎖エステルにも当てはまる。
【００９２】
【表２】
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【００９３】
表２は、ブチノールＩエステラーゼを用いてエステルを変換したときのエナンチオマー過剰率が、変換されるエステルの酸成分に左右されることを示している。
【００９４】
実施例７
ブチノールＩエステラーゼを用いる有機媒体中でのエステル交換
１０ｍｍｏｌのラセミ体ブチノールと５ｍｍｏｌの酪酸ビニルを５０ｍｌのメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中に溶解し、ケイソウ土に担持された９単位のブチノールＩエステラーゼ（３．３ｇ）と混合した。この混合物を室温で２４時間振とうした。濾過後、溶媒を除去し、生成した混合物をＧＣにより特徴づけた。
【００９５】
４７％の変換率で、（Ｒ）−ブチノール（１８％ ｅｅ）および（Ｓ）−ブチノールの酪酸エステル（４５％ ｅｅ）が残存していた。
メチルイソブチルケトン中では、（Ｒ）−ブチノール（１６％ ｅｅ）および（Ｓ）−ブチノールの酪酸エステル（５２％ ｅｅ）が４３％の変換率で得られた。
表３は、ブチノールＩエステラーゼを用いてエステルを交換したときのエナンチオマー過剰率が、交換されるエステルの酸成分に依存することを示している。
【００９６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のブチノールＩエステラーゼのアミノ酸部分配列と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のラクトン特異的エステラーゼの部分配列との、配列アラインメントを示す。Ｑｕｅｒｙ：本発明のクローンＬＵ２８９８の部分配列。Ｓｂｊｃｔ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ酵素（受入番号０８７６３７）の部分配列。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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