(57)【要約】一緒に化学的又は生化学的に反応する物質のための少なくとも２個の反応室を備えるマイクロ反応アレイを使用した生化学的分析方法に関する。反応室の容量は１μリットル未満であり、前記反応室は貫流により一緒に充填されるが、その後はその中に保持されている物質の化学的又は生化学的反応が個別に分離された反応室内で発生するので、個別反応室内の反応物間のクロストークが防止され、反応生成物は当該反応室内に封入されたまま残留する。前記装置は、平面アレイは物質を受け入れる少なくとも２つの反応室を有し、物質交換を防止する目的で反応室を閉鎖するための手段を備えている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的又は生化学的に反応する物質のための少なくとも２個の反応室を備えるマイクロ反応アレイを使用する生化学分析方法であって、下記の事項を特徴とする方法。
局所的に区切られた反応室を第１容積として使用し、
反応室を第２容積の上方で所謂供給容積に結合させ、
個々の反応室内で定量的および／又は相違する種類の化学的ないし生化学的反応を進行させ、更に
反応室と供給容積との間の物質交換を各々必要に応じて一方向又は両方向において許容し又は阻止する。
【請求項２】
第１時点（ｔ１）で、反応室と供給容積との間で所定の物質交換を行い、第２時点（ｔ２）で、反応室間の物質交換を極めて広範囲に抑制又は阻止することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
反応室内での相違する液体中の化学物質の相違する溶解挙動により一方向への物質交換を阻止することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
所定の物質交換のために、反応室を機械的に開・閉することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
反応室の閉鎖を、供給容積の排除で実現することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
所定の時点での物質交換のため、反応室と供給容積内に存在する物質間の相境界を一時的に透過性にすることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
相境界の閉鎖を、遮断媒質による供給容積の排除により実現することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
供給容積内の液体を、該液体と不混合の液体又は気体により排除することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
反応相手の相違する溶解挙動に基づき、反応室と供給容積内に存在する物質間の相境界を非透過性にすることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１０】
ヒドロゲル層において進行する化学反応の遊離体は供給容積からヒドロゲル層内へ拡散するが、該反応の少なくとも１種の生成物はヒドロゲル層から外へ拡散しないことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１１】
個別の相互に分離した反応室内で、物質のコンビナトリアル解析および／又は合成を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
酸化還元リサイクル法での使用を特徴とする請求項１ないし１１の１項に記載の方法。
【請求項１３】
酵素結合反応法での使用を特徴とする請求項１ないし１２の１項に記載の方法。
【請求項１４】
平面アレイ（８、８’・・・）が、供給容積（４）から物質を受け入れる少なくとも２つの反応室（１０、１０’・・・）を有し、更に反応室（１０、１０’・・・）を閉鎖する手段が存在することを特徴とする平面アレイを使用して請求項１から１３の１項に記載の方法を実施するための装置。
【請求項１５】
反応室（１０、１０’・・・）が、各々１μリットル未満の容積を有することを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
平面アレイ（８、８’・・・）が、シリコン基板（１）上に取付けられたことを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項１７】
反応室（１０、１０’・・・）が、シリコン上に被着されたポリマ層（１１）で相互に分離されたことを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
反応室（１０、１０’・・・）が、シリコン基板内へマイクロ構造技術で形成されたことを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項１９】
反応室（１０、１０’・・・）が、物質交換のために開放され、かつ液体を充填された空洞であり、供給容積（４）と接触し、その結果複数の反応室が同時に充填可能であることを特徴とする請求項４記載の装置。
【請求項２０】
液体を充填された反応空洞（１０、１０’・・・）と供給容積（４）との物質交換が閉鎖により阻止され、この際空気等の他の媒質が空洞（１０、１０’・・・）へ到達しないことを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項２１】
反応室（１０、１０’・・・）を閉鎖する閉鎖層が存在することを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項２２】
閉鎖が、シリコーンゴム等の部分的に弾性の平面状ポリマ層（５）により行われることを特徴とする請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
反応室（１０、１０’・・・）の開口部の閉鎖が、供給容積（４）の排除により行われることを特徴とする請求項２２記載の装置。
【請求項２４】
供給容積（４）の排除のため、気体又は不混合の液体（９）を用いることを特徴とする請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
反応室（１０、１０’・・・）が、ゲルが充填された空洞（３）により形成され、該空洞が物質交換のためにゲルと供給容積の相境界を有することを特徴とする請求項１４〜２４の１項に記載の装置。
【請求項２６】
相境界の閉鎖により、充填された反応室（１０、１０’・・・）の物質交換が阻止されることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、他の物質と化学的又は生化学的に反応する物質を受け入れる少なくとも２個の反応室を備えたマイクロ反応アレイを使用する生化学的分析方法に関する。更に本発明は、本方法を実施するための装置にも関する。
【０００２】
生命科学産業（医薬品）、食品技術、農業技術（植物保護）における新規活性物質の開発のため、医学診断において、更に一般バイオテクノロジにおける様々な課題を解決するためにも、現代では益々多くコンビナトリアル解析ないし合成が利用されている。このために、例えば約１２×８ｃｍ２のアレイ面積上で同時反応させるために９６ウエル又は更に３８４ウエルを組み込んだアレイ構造の反応ウエルを用いる所謂マイクロタイタープレート技術が使用されている。このアレイ密度は将来更に上昇しようが、これは種類の異なる化学反応を、益々密に配置された反応室内で発生させねばならないことを意味する。
【０００３】
極めて多いのは、例えば平面基板、所謂ＤＮＡチップ上に僅か数１０μｍの間隔で、ｍｍ２当たり例えば数百の位置密度で配置した、例えば様々なＤＮＡ捕捉分子のアレイにおける状況である。例えば未知のＤＮＡの分析学的検出において自由に移動可能な分子が関わっている場合は、そうした高密度アレイでは化学的クロストークが発生する。
【０００４】
例えば特異性が高く検出限界が低いというような一連の理由から、生化学分析では酵素結合検出方法が頻繁に利用されている。一般に広く普及しているのは、例えば医学診断および研究分野における所謂ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍ‐Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（酵素免疫吸着検査法））試験である（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ他（編集）、Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ ｄｅｒ Ｚｅｌｌｅ（細胞の分子生物学）（１９９７）、第３巻、第２１６頁、ＶＣＨワインハイムの文献を参照）。更にＤＮＡチップの分野で使用するためには、よく知られている酸化還元りサイクリング法において酵素マーカを用いる方法が使用されている（Ａ．Ｖ．Ｄ．Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｂｅｒｇｖｅｌｄ（編集）、μＴＡＳ’９４研究会のプロシーディング集（１９９４）、第２４９〜２５４頁、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ドルトレヒト）。
【０００５】
技術文献の中で報告されている全てのケースで、酵素は所謂アッセイと呼ばれる装置の液相内に自由に存在するのではなく結合されているので、「酵素標識」として主として検出すべき物質をマーキングする。このとき検出すべき物質への酵素分子の「結合」は常に化学量論的に行われる。これを増幅する、つまり増強するために、酵素が添加されている基板分子が高速で分解される。この分解がそのつど使用された基板ないしは発生する生成物に従って例えば光学的又は電気化学的に定量される。このために、使用する方法とは無関係に、特に生成物Ｐの濃度上昇、即ち時間依存性関数ｄｃ（Ｐ）／ｄｔが追求される。
【０００６】
そのアッセイを先行技術の項で詳細に説明したように１つのアレイ内で実施すると、酵素によって形成され、自由に移動する反応生成物が隣接する酵素を含まないアレイ位置へ到達し、そこで酵素標識が存在するかのように見せかける可能性がある。これはクロストークと呼ばれており、測定誤差を導き、それにより間違った結果を生じる可能性がある。
【０００７】
このため本発明の課題は、クロストークを回避することで先行技術に比べ高い信頼性を持ち、更に「擬陽性」の結果の排除を保証できる方法と相応の装置を提供することである。精度の上昇に伴い、特に測定効率を改善できる。
【０００８】
この課題は、本発明に従うと上記の種類の方法において請求項１に記載の方法により解決される。その他の態様は従属する方法請求項に示す。対応装置は、特許請求項１４の対象である。これに関連するその他の態様は従属する物の請求項に記載してある。
【０００９】
本発明に従う方法では、局所的に区切った反応室を第１容積として使用する。この際反応室は第２容積の上方で所謂供給容積に結合し、個々の反応室内では定量的および／又は種類の異なる化学的ないし生化学的反応が進行する。種類の異なる反応とは、質的に又は量的に異なるプロセスである。この際同様に、反応室と供給容積との間の物質交換が各々必要に応じ一又は両方向において許容されるか阻止される。
【００１０】
本発明の本質的な長所は、反応室が密に隣接するにも係らず、測定結果を歪める可能性がある干渉性のクロストークが不可能になり、その結果選択性が改善されることにある。更に、本発明により検出感度も上昇する。即ち検出限界が極めて低い量へ移動する。
【００１１】
検出感度の上昇を実際的に実現するには、基板／生成物濃度の時間的変化をできる限り上昇させることが重要である。これは本発明に従う方法では反応容積を著明に１μリットル未満、特に１ｎリットルの範囲に迄低下させ、かつそれに結び付いている基板／生成物濃度変化を上昇することにより達成される。
【００１２】
本発明に従う装置は、１つの平面基板上に装置されている数ｍｍ２、好ましくは１〜約１０ｍｍ２上の、各々２以上、典型的には数百の位置を備えるアレイである。各アレイは反応室アレイとして形成され、反応室が一緒に接近できる供給容積を備えた容器の構成要素である。このような供給容積は、例えばそれを通して検出又は合成反応のために必要な化学／生化学物質の全体的な液体処理を進行させる貫流セル内に反応室アレイを埋め込むことで実現できる。
【００１３】
貫流セル内で平面基板に対向する、例えばシリコーンゴム製の弾性膜又は層を用いると、本発明の好適な第１実施形態では基板に機械的装置を強く押し付けることで個々のアレイ位置に形成された反応室を相互に分離し、その結果クロストークを効果的に防止できる。この装置は、それらを用いると反応室で形成されたキャビティが閉鎖される、例えば蓋、押し型（スタンプ）又は密封性の膜の形状で形成できる。キャビティを閉じると、個別アレイ位置の上方の液体室の容積も減少するので、化学／生化学反応に伴い惹起される基板／生成物の濃度が上昇する。これにより同時に検出感度が上昇する利点がある。
【００１４】
本発明の別の好適な実施形態では、遮断液で被覆することにより同様の効果を得る。反応キャビティ内の液体と混合しない適切な遮断液を貫流導管に充填すると、これはシリコーン製押し型を用いたアレイキャビティの閉鎖と同一の作用を果たす。遮断液は例えばシリコーン油である。本実施形態の有益な変形例では、反応室に、遮断液が貫流導管内に流入した際に水分を含有し、反応室へ機械的安定性を与えるヒドロゲルを充填する。ヒドロゲルとして、シリコーン油に比べ要求される特性を示す、例えばポリアクリルアミドを使用する。
【００１５】
本発明の方法の更なる変形例では、関与する材料と物質の相異なる化学的溶解挙動を利用する。本発明に従う装置のこの実施形態でも、反応室にヒドロゲルを充填するとよい。供給容積の貫流導管内のヒドロゲル−反応室と適切な液相管との間で溶解挙動が相違するため、反応遊離体は液相からヒドロゲル相内へ進入するが、反応生成物はもはやヒドロゲル相から離れられない結果となる。この反応遊離体は、例えば酵素基質である。
【００１６】
本発明の詳細および長所を、特許請求項と結び付いた図面を基に、下記の実施例の図の説明から明らかにする。
【００１７】
図面には、同一ないし同様に作用する部分に同一ないし対応する参照符号を付してある。以下、これら図面を部分的に共通して説明する。
【００１８】
図１で１は、例えばシリコンチップの結晶構造表面にて形成された平面状表面を持つ基板を示す。基板１上に、光／電気検出器２、２’・・・のアレイが、それらを用いて一方では捕捉分子、他方では分析物分子を使用する所謂酵素結合反応を含むバイオ分析検査が行われるアレイ位置８、８’・・・に形成されている。アレイ位置８、８’・・・上に相違する捕捉分子１１０、１２０・・・が存在するので、各特定のアレイ位置上では相異なる分析物分子を検出できる。
【００１９】
詳細には、図１ではバイオ分析検査のための方法において、アレイ位置８の上の第１捕捉分子は１１０、アレイ位置８’の上の第２捕捉分子は１２０、分析物分子は２００そして所謂酵素標識は３００で示す。このとき、例えば捕捉分子１１０は相補的分析物分子２００と特異的に反応するので、アレイ内で位置特異的に酵素標識３００を固定化する。引き続いて遊離体として添加される酵素基質４００は酵素標識３００の触媒作用によって生成物５００内へ移動させられる。
【００２０】
従って分析物分子２００は、図１では捕捉分子１１０と反応するが、捕捉分子１２０とは反応しない。ウエハー１の各分析位置８、８’・・・上では、そこに装置した光／電気検出器２、２’・・・を用いて、基板／生成物の増減を測定できる。測定技術上特に有益なのは電気検出器である。
【００２１】
先行技術では、分析位置８、８’・・・それ自身と、それらの間隔とをできる限り小さくすべく努力している。しかし先行技術では、個々の位置８、８’・・・間で、所謂化学的クロストークが発生する可能性がある点が問題になる。これは、先に遊離体であると定義した酵素基質４００も、第１アレイ位置８の反応生成物５００も第２アレイ位置８’へ達する可能性があることを意味する。仮に隣接位置に達すると、陽性結果であるように見せかける疑似信号が発生する。実際には、これは「偽陽性」信号とも呼ばれている。
【００２２】
図２〜４では、別の代替実施形態のためのアレイに各々１μリットル未満の個別容積を持つ個々の反応室１０、１０’・・・を設けている。この際反応室１０、１０’・・・は、通常の作業条件下では相互に分離されている。
【００２３】
図２は、反応室１０、１０’・・・を壁１１、１１’・・・により分離したある装置の活動を３段階で例示する。壁１１、１１’・・・は、特別な幾何学的実施形態では、例えば内径１５０μｍ、外径１８０μｍ並びに高さ５０μｍの、フォトプロセスで成形された円形のポリマリングにより実現できる。反応室１０、１０’・・・には、例えば電解質７中に溶解させた酵素基質等の反応遊離体が充填されるが、この際電解質液２は供給容積４を経て個別反応室へ供給される。
【００２４】
反応室１０、１０’・・・は、図２ではハウジング上部５により機械的押し型６を用いて閉鎖できる。開放状態では、キャビティの上方に液状電解質を含む供給容積４が存在する。図２では、最初にハウジング上部５を取り除いた際に開放しているチャンバとしての反応室１０、１０’・・・に電解質／遊離体７が貫流にて充填されるが、電解質７のためのリザーバは、ここでは示していない。反応キャビティ１０、１０’・・・が電解質／遊離体７で充填されると、押し型６を用いて、例えばシリコーン膜から形成したハウジング上部５が既に述べたようにポリイミドからなる壁１１、１１’・・・上に載せられる。この結果反応室１０、１０’・・・が閉鎖され、それに伴いその後の物質交換が防止される。
【００２５】
図３では、下方領域を図２と同様に構成している。壁１１、１１’・・・は、図３では明白にならない特別な実施形態では、例えば１５０μｍの内径ｄ（ｄ＝２ｒ）、１８０μｍの外径Ｄ並びに５μｍの高さｈを有し、特にフォトプロセスで成形された円形のポリマリングで実現できる。この寸法の結果として生じる約０．１ｎリットル（ｒ２πｈ＝７５μｍ２×３．１４×５μｍ）の充填量を持つ反応キャビティには、この特別な実施形態では、例えばポリアクリルアミド等の含水能力の高いヒドロゲル３を充填する。ヒドロゲル３には、その後特異的ＤＮＡ検出のため捕捉ＤＮＡを固定化させて組み込むことができる。
【００２６】
アッセイを実現するため、反応室１０、１０’・・・に、再び共通の供給容積４を経て緩衝液、試薬類そして最後に酵素基質を供給する。全反応室１０、１０’・・・の１つのヒドロゲル３が酵素基質含有緩衝液と平衡して酵素分解が始まった後、供給容積４に例えばシリコーン油等の遮断液を流す。これは反応室の上方の液体をシリコーン油で追い出すように作用する。ヒドロゲル構造は反応室の機械的安全性をもたらす。シリコーン油中では酵素生成物が不溶のため、ヒドロゲルから隣接反応室への酵素生成物の拡散を防止できる。そこで反応生成物は隣接反応室に到達することなく反応室内に高度に蓄積する。その結果、同様に高い感受性と選択性が生ずる。
【００２７】
本質的に、図２、３に従う２つの実施例では、各反応室１０、１０’・・・に最初に供給容積４から貫流する電解質７を充填し、その後例えばシリコーン油９等の、電解質７と界面を形成する物質を供給する。この界面によって、もはや物質交換が不可能となり、干渉性の歪曲を排除できる。
【００２８】
図３に従う実施形態の特別な変形例では、反応室１０、１０’・・・に、シリコーン油等の遮断液９が貫流導管に進入した際に水を含む反応室１０、１０’・・・に機械的安定性を与えるポリアクリルアミド等のヒドロゲル３を充填する。
【００２９】
図４は、本質的には図２における構造と一致している。反応室１０、１０’・・・を、図２、３と同様供給容積４からの貫流で充填する。ここでは、Ｅで示す反応遊離体は、特異的な溶解挙動により、充填後に反応室１０、１０’・・・内に存在する電解質７内へ進入する能力を有している。
【００３０】
図４に示す装置では、反応室内の反応は上述のとおりに進行する。尤もこの反応では、ここではＰで示す、反応生成物の特異的な溶解挙動に伴いＰからの物質放出は不可能である。従って、同様に干渉性のクロストークを防止できる。この実施形態でも、図３と同じく、反応室にヒドロゲル３を充填するとよい。
【００３１】
上述の方法とそれに関連する装置は、特に医学診断およびバイオテクノロジで使用すると良好な結果を得ることができる。本質的な誤差要因であるクロストークを排除できることから、従来方法と比べ一層正確な結果を入手できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
先行技術に従った測定構成を示す図である。
【図２】
ＡからＣは機械的に閉鎖するための装置例を３段階で示す図である。
【図３】
ＡからＣは遮断媒質を用いてキャビティを閉鎖する対応装置例を３段階で示す図である。
【図４】
ＡからＣはキャビティの閉鎖が関与する媒質の相違する溶解挙動により達成される第３の装置例を３段階で示す図である。
【符号の説明】
１　基板、３　ヒドロゲル、７　電解質、８、８’　アレイ位置、９　シリコーン油、１０、１０’　反応室、１１、１１’　壁、１１０、１２０　捕捉分子、２００　分析物分子、３００　酵素標識、４００　酵素基質、５００　反応生成物。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004514152.tif 000028
【国際調査報告】
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2004514152.tif 000030
2004514152.tif 000031
2004514152.tif 000032
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