(57)【要約】【課題】【解決手段】ある側面において、本発明は、主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットを提供する。本発明は、主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットを備えたベクターも提供する。本発明は、疾病の症状を改善する方法も提供し、該方法は、ポリペプチドをコードする核酸発現カセットを備えたベクターを哺乳類の患者の肝臓に導入する工程と、治療量の前記ポリペプチドを肝臓で発現させる工程とを備える。【選択図】図１
2004500880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットであって、
（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、
（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、
（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、
（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、
（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、
前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている核酸発現カセット。
【請求項２】
前記カセットが、少なくとも１００日間にわたって、肝細胞中で治療量の前記ポリペプチドの発現を誘導する請求項１の発現カセット。
【請求項３】
前記カセットが、少なくとも３００日間にわたって、肝細胞中で治療量の前記ポリペプチドの発現を誘導する請求項１の発現カセット。
【請求項４】
前記カセットが、少なくとも５００日間にわたって、肝細胞中で治療量の前記ポリペプチドの発現を誘導する請求項１の発現カセット。
【請求項５】
前記ポリペプチドが第ＩＸ因子であり、前記カセットが、少なくとも２００日間にわたって、肝細胞中で前記第ＩＸ因子の発現を誘導する請求項１の発現カセット。
【請求項６】
前記ポリペプチドが第ＩＸ因子であり、前記カセットが、少なくとも５００日間にわたって、肝細胞中で前記第ＩＸ因子の発現を誘導する請求項１の発現カセット。
【請求項７】
前記肝臓遺伝子座調節エレメントが、ストリンジェントな条件下で、配列番号４に示された核酸配列からなる前記肝臓遺伝子座調節エレメントの相補鎖にハイブリダイズする請求項１の発現カセット。
【請求項８】
前記肝臓遺伝子座調節エレメントが配列番号４に示された核酸配列か、又は配列番号９に示された核酸配列からなる請求項１の発現カセット。
【請求項９】
前記肝臓プロモーターが構成的プロモーターである請求項１の発現カセット。
【請求項１０】
前記肝臓プロモーターが誘導性プロモーターである請求項１の発現カセット。
【請求項１１】
前記肝臓プロモーターが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示された核酸配列の群から選択される核酸配列からなる少なくとも一つの肝臓核因子結合部位を備えた請求項１の発現カセット。
【請求項１２】
前記肝臓プロモーターが、ストリンジェントな条件下で、配列番号５に示された核酸配列からなる前記肝臓プロモーターの相補鎖にハイブリダイズする請求項１の発現カセット。
【請求項１３】
前記肝臓プロモーターが配列番号５に示された核酸配列からなる請求項１の発現カセット。
【請求項１４】
前記コード配列が血液凝固ポリペプチドをコードする請求項１の発現カセット。
【請求項１５】
前記コード配列が第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする請求項１の発現カセット。
【請求項１６】
前記コード配列が、配列番号３に示されたアミノ酸配列からなる第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする請求項１の発現カセット。
【請求項１７】
前記イントロン配列が前記コード配列の５’側に位置する請求項１の発現カセット。
【請求項１８】
前記イントロン配列が前記コード配列の３’側に位置する請求項１の発現カセット。
【請求項１９】
前記イントロン配列が前記コード配列内に位置する請求項１の発現カセット。
【請求項２０】
前記イントロン配列が、ストリンジェントな条件下で、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドをコードする遺伝子中に位置するイントロン配列の相補鎖にハイブリダイズする請求項１の発現カセット。
【請求項２１】
前記コード配列が第ＩＸ因子ポリペプチドをコードし、前記イントロンが第ＩＸ遺伝子のイントロンの一部である請求項１の発現カセット。
【請求項２２】
前記イントロンが配列番号１に示された核酸配列からなる請求項１の発現カセット。
【請求項２３】
前記ポリアデニル化シグナルが、ストリンジェントな条件下で、配列番号６に示された核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする請求項１の発現カセット。
【請求項２４】
前記ポリアデニル化シグナルが、配列番号６に示された核酸配列からなる請求項１の発現カセット。
【請求項２５】
主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットであって、
（ａ）ストリンジェントな条件下で、配列番号４に示された肝臓遺伝子座調節エレメントの相補鎖にハイブリダイズする肝臓遺伝子座調節エレメントと、
（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターであって、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示された核酸配列の群から選択される核酸配列を含む少なくとも一つの肝臓核因子結合部位を備えた肝臓プロモーターと、
（ｃ）ポリペプチドをコードするコード配列であって、前記肝臓プロモーターの３’側に位置するコード配列と、
（ｄ）前記コード配列の５’側に位置し、且つ前記肝臓プロモーターの３’側に位置するイントロンと、
（ｅ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルとを備え、
前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている核酸発現カセット。
【請求項２６】
前記肝臓遺伝子座調節エレメントが配列番号４に示された核酸配列を備え、前記肝臓プロモーターが配列番号５に示された核酸配列を備え、前記イントロンが配列番号２に示された核酸配列を備え、前記ポリアデニル化シグナルが配列番号６に示された核酸配列を備えた請求項２５の発現カセット。
【請求項２７】
主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットを備えたベクターであって、前記カセットが
（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、
（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、
（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、
（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、
（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、
前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されているベクター。
【請求項２８】
前記ベクターがエピゾーマルベクターである請求項２７のベクター。
【請求項２９】
前記エピゾーマルベクターがプラスミドである請求項２８のベクター。
【請求項３０】
前記ベクターが組込みベクターである請求項２７のベクター。
【請求項３１】
前記ベクターがウイルスベクターである請求項３０のベクター。
【請求項３２】
疾病の症状を改善させる方法であって、
（１）核酸発現カセットを備えたベクターを哺乳類の患者の肝臓に導入する工程であり、前記発現カセットが、
（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、
（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、
（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、
（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、
（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、
前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている工程と、
（２）肝臓中で治療量の前記ポリペプチドを発現させる工程とを備えた方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが血液凝固因子である請求項３２の方法。
【請求項３４】
治療量の前記ポリペプチドが少なくとも２００日間発現される請求項３２の方法。
【請求項３５】
治療量の前記ポリペプチドが少なくとも５００日間発現される請求項３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、哺乳類の肝細胞における核酸分子及び／又はタンパク質の発現に有用な核酸構築物及びベクターに関する。
【０００２】
【発明の背景】
遺伝子治療の分野における最終的な目標の一つは、所望の細胞、組織、又は臓器の中で、アンチセンス分子等の核酸分子、及び／又はポリペプチドを長期にわたって発現させることができる発現カセットやベクターを開発することである。これらのカセット及びベクターは、これを与える者の体内で免疫反応を惹起しないことが好ましい。従って、前記発現カセット及びベクターは、治療量のポリペプチド又は核酸分子を長期にわたって供与することができるであろう。
【０００３】
発現カセットは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターや宿主細胞のゲノム中に組み込まれないエピゾーマルベクター等の遺伝子治療に使用される任意のタイプのベクター中に導入できることが好ましい。
【０００４】
【発明の概要】
ある側面において、本発明は、主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットを提供する。本発明の該側面に係る前記核酸発現カセットは、（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている。幾つかの実施態様においては、本発明の前記発現カセットは、少なくとも１００日間にわたって（少なくとも２００日、少なくとも３００日、少なくとも４００日、又は少なくとも５００日等）、肝細胞中で治療量のポリペプチドの発現を誘導する。
【０００５】
別の側面において、本発明は、主として哺乳類の肝臓中で発現される核酸発現カセットを備えたベクターを提供する。前記ベクターの前記発現カセットは、ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列、（ｄ）前記コード領域の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、（ｅ）前記肝臓プロモーター３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている。本発明の幾つかのベクターはエピゾーマルベクター（ｅｐｉｓｏｍａｌ　ｖｅｃｔｏｒ）であり、本発明の幾つかのベクターは組込みウイルスベクター等の組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）である。
【０００６】
別の側面において、本発明は、疾病の症状を改善する方法を提供する。本発明の該側面に係る方法は、（１）核酸発現カセットを備えたベクターを哺乳類の患者（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｕｂｊｅｃｔ）の肝臓に導入する工程であり、前記発現カセットが、（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている工程と、（２）肝臓中で治療量の前記ポリペプチドを発現させる工程とを備える。本発明の該側面に係る前記方法を用いて発現させることができるポリペプチドの代表的な例は、第ＩＸ因子等の血液凝固因子である。本発明の該側面に係る前記方法の幾つかの実施態様では、少なくとも１００日間（少なくとも２００日、少なくとも３００日、少なくとも４００日、及び少なくとも５００日等）、治療量の前記ポリペプチドが発現される。
【０００７】
本発明のカセット、ベクター、及び方法は、例えば、哺乳類の肝細胞中で所望のポリペプチドを発現させるのに有用である。幾つかの実施態様において、発現される前記一又は複数のポリペプチドは、疾病の一以上の症状を改善させる。例えば、本発明のカセット、ベクター、及び方法は、血液凝固因子である第ＩＸ因子を発現させて、宿主生物における該タンパク質の欠乏を補うために使用することができる。
【０００８】
【好ましい実施形態の詳細な説明】
添付の図面と併せて、以下の詳細な説明を参照することによって、本発明、並びに前述の側面及びこれに伴う本発明の数多くの利点がよりよく理解できるであろう。
【０００９】
本明細書において別段の記述がない限り、本明細書で使用する用語はすべて、それらが本発明の当業者に対して有する意味と同一の意味を有する。発明の実施者は、当分野の定義及び用語に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ．」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ等「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　４７）」，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）を特に参照されたい。
【００１０】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語及びその文法的な同義語は、温度及び塩濃度の規定された条件下で、ある核酸分子が、標的核酸分子（サザンブロット又はノーザンブロットなどのＤＮＡ又はＲＮＡブロット上に固定された標的核酸分子など）とハイブリダイズできることを意味する。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、天然の二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を最大で２５℃〜３０℃下回るにすぎない（例えば１０℃）。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するための代表的な塩及び温度条件は、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、６５℃である。ハイブリダイゼーションを達成するための代表的な時間は１２時間である。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ．」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌ等「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を一般に参照されたい）。
【００１１】
約１００塩基を超える核酸分子のＴｍは、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ）−ｌｏｇ（Ｎａ＋）という式によって計算することができる。長さが１００塩基未満のオリゴヌクレオチド分子の場合、ハイブリダイゼーションの条件の例は、Ｔｍよりも５〜１０℃低い。平均して、短いオリゴヌクレオチド二重鎖のＴｍは、およそ（５００／オリゴヌクレオチド長）℃だけ低温である。例えば、１４塩基のオリゴヌクレオチドは室温でハイブリダイズし、１７塩基のオリゴヌクレオチドは３７℃、２０塩基のオリゴヌクレオチドは４２℃、２３塩基のオリゴヌクレオチドは４８℃でハイブリダイズする。
【００１２】
「ＳＳＣ」という略語は、核酸のハイブリダイゼーション溶液に使用される緩衝液を意味する。１リットルの２０×（２０倍濃縮物）ＳＳＣ緩衝原液（ｐＨ７．０）は、１７５．３ｇの塩化ナトリウムと８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含有する。
【００１３】
「ベクター」という用語は、核酸分子（通常は二重鎖ＤＮＡ）を意味し、ｃＤＮＡ分子など（これには限定されない）の別の核酸分子（挿入核酸分子）がその中に挿入されていてもよい。ベクターは、挿入核酸分子を適切な宿主細胞に輸送するために使用される。ベクターは、挿入核酸分子の転写を可能にし、さらに必要に応じてその転写物のポリペプチドへの翻訳を可能にするために必要なエレメントを含むことができる。この挿入核酸分子は、宿主細胞に由来してもよいし、異なる細胞又は生物体に由来してもよい。ベクターは、宿主細胞に入った後には、宿主の染色体ＤＮＡとは独立に、又は同時に複製することができ、ベクター及びその挿入された核酸分子のコピーを幾つか与え得る。
【００１４】
本発明で使用する「核酸発現カセット」という用語は、１以上の所望の細胞タイプ、組織、又は器官において遺伝子発現を誘導する１以上の転写調節エレメント（プロモーター及びエンハンサーなど）を含む核酸分子を意味する。
【００１５】
一側面において、本発明は、主として哺乳類の肝臓において発現される核酸発現カセットを提供する。本発明の該側面に係る発現カセットは、以下のエレメント：（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている。
【００１６】
本発明の該側面に係る核酸発現カセットは主として肝臓中で発現され、すなわちコードされた核酸分子又はポリペプチドの発現の少なくとも５０％は肝臓内で起こる。より典型的には、前記発現の少なくとも９０％は肝臓内で起こる。本発明の該側面に係る発現カセットのうち幾つかは、もっぱら肝臓内で発現される。本発明の該側面に係る発現カセットの代表的な実施例を図１に示す。図１Ａに示されている発現カセットは、５’〜３’に配列された以下の隣接するエレメントを含む。すなわち、配列番号４に示す核酸配列（配列番号９に示す核酸配列も有用である）からなる肝臓遺伝子座調節エレメントと、配列番号５に示す核酸配列からなるヒトαアンチトリプシンプロモーターと、配列番号１に示す核酸配列からなるイントロンと、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする配列番号２に示す核酸配列と、及び配列番号６に示す核酸配列からなるポリアデニル化シグナルとを含む。図１Ｂは、イントロン（配列番号１）がコード配列（配列番号２）の３’側に位置する以外は、図１Ｂに示された発現カセットと同じ本発明の代表的な発現カセットを示している。図１Ｃは、イントロン（配列番号１）がコード配列（配列番号２）の中に位置する以外は、図１Ａに示す発現カセットと同じ本発明の代表的な発現カセットを示す。
【００１７】
本発明の発現カセットにおいて有用な肝臓遺伝子座調節エレメントは、肝細胞内の核酸分子の発現を亢進することができ、コピー数に依存し、且つ位置に依存しない発現を発現カセットに与える。本発明の発現カセットに有用な幾つかの肝臓遺伝子座調節領域は、マトリックス付着領域及び／又は肝臓に特異的なエンハンサーエレメントを含む。理論に拘泥するものではないが、本発明の発現カセットに有用な肝臓遺伝子座調節領域は、典型的にはＤＮアーゼＩ高感受性部位の存在によって示される転写的に活性な状態にクロマチンを維持することができる。本発明の発現カセットに有用な幾つかの肝臓遺伝子座調節エレメントは、配列番号４に示す核酸配列からなる肝臓遺伝子座調節エレメントの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明を実施する上で有用な肝臓遺伝子座調節エレメントの例の核酸配列が、配列番号４及び配列番号９に示されている。他の有用な肝臓遺伝子座調節エレメントは、Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．−Ｓ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１１）：８２２１〜８２２９（１９９３）、及びＡｌｌａｎ，Ｃ．Ｍ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４４）：２６２７８〜２６２８１（１９９５）に記載されている。
【００１８】
本発明の発現カセットに有用な肝臓プロモーターは、肝細胞内で核酸分子の発現を誘導することができる。典型的には、肝臓プロモーターは、主として又はもっぱら肝細胞内で活性となる。この文脈における「主として」という用語は、肝臓プロモーター発現の少なくとも５０％、より典型的には肝臓プロモーター発現の少なくとも９０％（肝臓プロモーター発現の１００％など）が肝細胞内で起こることを意味する。本発明の発現カセットに有用な幾つかの肝臓プロモーターは、配列番号５に示す核酸配列からなる肝臓プロモーターの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明の発現カセットに有用な幾つかの肝臓プロモーターは、少なくとも１つ、典型的には数個の肝臓核因子の結合部位（配列番号１０〜１６に示す肝臓核因子の結合部位など）を含む。本発明の発現カセットに有用な肝臓プロモーターは、構成性又は誘導性のプロモーターとすることができる。本発明の発現カセットに有用な肝臓プロモーターの代表的な例には、アルブミンプロモーター、ＨＢＶプロモーター、α１アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）、及びヒト第ＩＸ因子プロモーターが含まれる。
【００１９】
本発明の発現カセット内に含まれるコード配列は、血液凝固タンパク質などの（これには限定されない）生物学的に活性なポリペプチドを含む任意の所望のポリペプチドをコードすることができる。本明細書の例３及び４は、マウスの肝臓内での第ＩＸ因子血液凝固タンパク質の発現について記述している。本発明の発現カセットは、例えば、第ＩＸ因子タンパク質などの肝臓内で本来発現され利用されるタンパク質を発現するために使用することができ、或いは肝臓内で発現された後、身体の他の部分に輸送するために血流に搬出されるタンパク質を発現するために使用することができる。したがって、幾つかの実施態様においては、本発明の発現カセットは、治療量のポリペプチドを発現して疾病の症状を改善させるために使用することができる。また、非限定的な例として、本発明の発現カセットは、肝細胞に感染するウイルスによって合成されるタンパク質を発現させることにより、ウイルスタンパク質の機能を決定できるようにするために使用し得る。
【００２０】
本発明の発現カセットでは、あらゆるイントロンを利用することができる。「イントロン」という用語は、核のスプライシング装置によって認識されてスプライスされるのに十分な大きさを有する完全なイントロンの任意の一部分を含む。典型的には、発現カセットの大きさを可能な限り小さく保ち、発現カセットを作製し易く、また操作し易くするためには、短くて機能的なイントロン配列が好ましい。幾つかの実施態様においては、前記イントロンは発現カセット内のコード配列によってコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得られる。したがって、例えば、例３及び４に記載のベクターにおいては、前記コード配列は第ＩＸ因子ポリペプチドをコードし、前記イントロンは第ＩＸ因子遺伝子（配列番号１）の最初のイントロンの一部である。前記イントロンは、コード配列の５’側、コード配列の３’側、又はコード配列の中に位置することができる。コード配列の５’側にイントロンを配置することの利点は、イントロンがポリアデニル化シグナルの機能に干渉する可能性を最小限にすることである。
【００２１】
本発明の発現カセットにおいては、ポリＡ尾の合成を誘導するあらゆるポリアデニル化シグナルが有用である。本発明の発現カセットに有用な幾つかのポリアデニル化シグナルは、配列番号６に示す核酸配列からなるポリアデニル化シグナルとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２２】
本発明の核酸発現カセットは、発現カセット内のコード配列によってコードされた治療量のポリペプチドの発現を誘導する。治療量とは、疾病の症状を寛解させる量である。本発明の発現カセットは、典型的には２００日を超え、幾つかの例では５００日を超える長期間にわたって、前記コード配列によってコードされる治療量のポリペプチドの発現を誘導する。コード配列によってコードされるポリペプチドの発現は、ウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡアッセイ法などの抗体に基づくアッセイ法などの当分野で認められている任意の手段によって測定することができる。また、非限定的な例として、発現カセット内のコード配列によってコードされたポリペプチドの発現は、ポリペプチドの酵素活性又は生物活性を検出するバイオアッセイにおいて測定することができる。
【００２３】
別の側面において、本発明は本発明の発現カセットを含むベクターを提供する。該ベクターは、エピゾーマルベクター（すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれないベクター）であり得、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであり得る。エピゾーマルベクターの例にはプラスミドが含まれ、宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターの例にはウイルスベクターが含まれる。代表的なプラスミドベクターには、ｐＵＣベクター、ブルースクリプトベクター、及びｐＢＲ３２２が含まれる。代表的なウイルスベクターにはアデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。
【００２４】
例えば、レトロウイルスは、感染後その遺伝子を宿主細胞の染色体中に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染する能力を保持し、その遺伝子を標的細胞の染色体中に挿入するレトロウイルスのベクターが開発されている（Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：５〜１４（１９９０））。
【００２５】
アデノウイルスベクターは、生きた被験者に直接投与するように設計されている。レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターは宿主細胞の染色体中には取り込まれない。その代わり、アデノウイルスベクターを使用して細胞中に導入された遺伝子は、限られた期間存続する染色体外因子（エピソーム）として核の中に維持される。アデノウイルスベクターは、気道の上皮細胞、内皮細胞、肝細胞及び様々な腫瘍を含む多数の異なる組織内の分裂中及び非分裂細胞にインビボで感染するであろう（Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．１２：１８５〜１９９（１９９３））。
【００２６】
他のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス（巨大な二本鎖ＤＮＡウイルス）である。ワクシニアウイルスの組換え体は、大きな挿入断片を収容することができ、相同組換えによって作製される。現在まで、このベクターはヒトＩＬ−１β及び共刺激分子であるＢ７−１やＢ７−２などのインターロイキン類（ＩＬｓ）を輸送するために使用されてきた（Ｇ．Ｒ．Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉ等、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２：１５１〜９（１９９５）；Ｊ．Ｗ．Ｈｏｄｇｅ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：５５５２〜５５（１９９４））。
【００２７】
遺伝子治療の別のアプローチには、生きている被験者へのＤＮＡプラスミドの直接導入が含まれる（Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１１２９〜１１４４（１９９５））。プラスミドＤＮＡは、体内の細胞によって取り込まれ、組換えタンパク質の発現を誘導することができる。幾つかのケースでは、プラスミドＤＮＡは、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイル（ｄｉｏｌｃｙｌ）オキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロマイド）及びＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）などの１以上の脂質に前記ＤＮＡが会合したリポソームの形態で細胞に送達される。ＤＯＴＭＡを用いた処方は、動物モデルの肺上皮細胞において発現することが示されている（Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍ等、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８〜２８１（１９８９）；Ａ．Ｂ．Ｃａｎｏｎｉｃｏ等、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４〜２９（１９９４））。さらに、５％ＰＶＰ（５０，０００ｋＤａ）と共に処方されたプラスミドＤＮＡの筋肉内注入は、筋肉内でのレポーター遺伝子の発現レベルを、生理食塩水中のＤＮＡのみを注入した場合に見られるレベルの２００倍も増大させることが研究により示された（Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒ等、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７０１〜７０９（１９９６）；Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔ．Ｒｏｌ．Ｂｉｏａｃ．Ｍａｔｅｒ．２２：３２５〜３２６（１９９５））。プラスミドＤＮＡの筋肉内投与は、何ヶ月にもわたり持続する遺伝子発現をもたらす（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３〜３６９（１９９２）；Ｍ．Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．４：４１９〜４３１（１９９３）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉ等、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ．３：７１〜８１（１９９ｌ）；Ｄ．Ｇａｌ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：１８−２５（１９９３））。
【００２８】
肝臓（Ｍ．Ａ．Ｈｉｃｋｍａｎ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：１４７７〜１４８３（１９９４））、皮膚（Ｅ．Ｒａｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５１９〜９５２３（１９９４））への間質内注入、気道への滴下注入（Ｋ．Ｂ．Ｍｅｙｅｒ等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２：４５０〜４６０（１９９５））、内皮への適用（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．７１：２７〜３３（１９９２）；Ｒ．Ｒｉｅｓｓｅｎ等、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，４：７４９−７５８（１９９３））の後に、及び静脈内投与（Ｒ．Ｍ．Ｃｏｎｒｙ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１１６４〜１１６８（１９９４））後に遺伝子発現が観測された。
【００２９】
標的細胞へのＤＮＡの供給を増大させるために、様々な装置が開発されている。簡単なアプローチ方法は、標的細胞をカテーテル又は移植可能なＤＮＡ含有材料と物理的に接触させることである（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．７１：２７〜３３（１９９２））。別のアプローチ方法は、標的組織内に高圧下で液柱を直接投射する無針噴射式注射装置を利用することである（Ｐ．Ａ．Ｆｕｒｔｈ等、Ａｎａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ．２０：３６５〜３６８（１９９２）；Ｈ．Ｌ．Ｖａｈｌｓｉｎｇ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７５：１１〜２２（１９９４）；Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙ等、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８Ａ：２２６（１９９４））。
【００３０】
標的への遺伝子送達の別のアプローチ方法は、細胞への核酸の特異的なターゲティングのために核酸又はＤＮＡの結合剤を付着させたタンパク質又は合成リガンドからなる分子複合体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用することである（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１５４８〜５２（１９９３）；Ｂ．Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌ等、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：５５９〜６９（１９９２）；Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６０９４〜９８（１９９２））。ＤＮＡが分子複合体と結合すると、タンパク質ＤＮＡ複合体が得られる。この遺伝子送達系は、様々なリガンドを使用することによって多数のタイプの細胞を標的とした送達が可能であることが示されている（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１５４８〜５２（１９９３））。例えば、ビタミンである葉酸塩は、葉酸塩受容体を過剰発現する細胞（例えば、卵巣癌細胞）内へのプラスミドＤＮＡの送達を促進するリガンドとして使用されてきた（Ｓ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１：１８５〜９１（１９９４））。マラリアのスポロゾイト周囲タンパクは、硬変症、糖尿病、及び肝細胞癌などの、肝細胞上のＡＳＯＲ受容体の発現が低い条件下で、肝臓特異的に遺伝子を送達するために使用されてきた（Ｚ．Ｄｉｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３６６７〜７６（１９９５））。癌細胞上の上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体が過剰発現すると、肺癌細胞によってＥＧＦ／ＤＮＡ複合体の特異的な取込みが可能になった（Ｒ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：４〜１０（１９９６））。現時点で好ましい遺伝子送達法は、リポフェクションである。
【００３１】
別の側面においては、本発明は疾病の症状を改善させる方法を提供する。本発明の該側面に係る方法は、（１）核酸発現カセットを備えたベクターを哺乳類の患者の肝臓に導入する工程であって、前記発現カセットが、（ａ）肝臓遺伝子座調節エレメントと、（ｂ）前記肝臓遺伝子座調節エレメントの３’側に位置する肝臓プロモーターと、（ｃ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、ポリペプチドをコードするコード配列と、（ｄ）前記コード配列の３’側に位置するポリアデニル化シグナルと、（ｅ）前記肝臓プロモーターの３’側に位置し、且つ前記ポリアデニル化シグナルの５’側に位置するイントロンとを備え、前記コード配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現するように、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）が作用可能に連結されている工程と、（２）肝臓中で治療量の前記ポリペプチドを発現させる工程とを備える。
【００３２】
前記ベクターは、肝臓への直接注入、門脈への注入、尾静脈への注入、皮下への注入、管逆行性（ｒｅｔｒｏｄｕｃｔａｌ）の注入などの当分野で認知されている任意の手段によって、肝臓内に導入することができる。本発明のベクターは、本発明の該側面に係る前記方法を実施する上で有用である。１以上の疾病の症状を寛解させるために、任意のポリペプチドを肝臓内で発現することができる。肝臓内で発現させ得るポリペプチドの代表的な例は、血液凝固に関与するポリペプチドである。本発明の方法の幾つかの実施態様においては、少なくとも２００日、少なくとも３００日、少なくとも４００日、又は少なくとも５００日などの１００日を超える期間にわたり、治療量のポリペプチドが肝臓内で発現される。本発明は、哺乳類患者の肝臓内にポリペプチドを発現させる方法も提供する。本発明の該側面に係る方法は、発現されるポリペプチドの量が疾病の症状を改善させるのに十分であり得る（但し、必ずしも十分でなければならないわけではない）こと以外は、疾病の症状を改善させるための本発明の前記方法と同じ工程を含む。
【００３３】
以下の例は、本発明を実施するために現在考えられる最良の形態を説明するものにすぎず、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本明細書における文献の引用はすべて参照により開示に含まれる。
【００３４】
例１
この例では、例２に記載の実験において使用される材料と方法を説明する。
【００３５】
プラスミドの作製：まず、ブルースクリプトベクターのバックボーン（ｐＢＳＫＳ）中に第ＩＸ因子の発現カセットを作製した。プラスミドｐＢＳ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡ（Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｌ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３：４８２８〜３７（１９８４））をＥｃｏＲＩで消化してｈＡＡＴ　ｃＤＮＡを除去し、平滑末端化した。ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ（配列番号２）を、ｐＣＭＶ−ＦＩＸ（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：６１４１〜５（１９９０））からＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩを用いて切断し、平滑末端化し、次いでｐＢＳ−ｂｐＡの平滑末端化したＥｃｏＲＩ部位にクローン化してｐＢＳ−ＦＩＸ−ｂｐＡを得た。次に、ｐＢＳ−ＦＩＸ−ｂｐＡをＳａｌＩで消化して、平滑末端化した。ｐＬＴＲ−ｈＡＡＴｐ−ＦＸ（Ｌｅ，Ｍ．等、Ｂｌｏｏｄ　８９：１２５４〜９（１９９７））をＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化してｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）を得、ｐＬＴＲ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴｐ−ｈＡＡＴ（Ｈａｆｅｎｒｉｃｈｔｅｒ，Ｄ．Ｇ．等、Ｂｌｏｏｄ　８４：３３９４〜４０４（１９９４））をＢｇｌＩＩで消化してＡｐｏＥエンハンサー−ｈＡＡＴプロモーターフラグメントを得た。次いで、両エンハンサー−プロモーターフラグメントを平滑末端化し、ｐＢＳ−ＦＩＸ−ｂｐＡのＳａｌＩ平滑末端部位に挿入して、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ及びｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ構築物を得た。プラスミドｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡをさらにＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＬＩＶ７（Ｄａｎｇ，Ｑ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２５７７〜８５（１９９５））からＰＣＲ法で増幅したＡｐｏＥ−ＨＣＲの７１１ｂｐのＫｐｎＩフラグメントと連結させて、ｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡを作製した。プラスミドＡＶＳ１７Ｈ９Ｆ．ＣＭ（Ｋａｌｅｋｏ，Ｍ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１：Ａ：３６６（１９９５））をＳｐｅＩ及びＣｌａＩで消化して、第ＩＸ因子のミニ遺伝子（第ＩＸ因子のイントロンＡ（配列番号１）及び１．７ｋｂの３’−ＵＴＲ（配列番号７）を含む）を得て、これを平滑末端化した。ｐＢＳ−ＦＩＸ−ｂｐＡをＸｈｏＩで消化して、ｈＦＩＸのｃＤＮＡ（配列番号２）を遊離させ、平滑末端化し、次いで、第ＩＸ因子ミニ遺伝子と連結させてｐＢＳ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡを得た。次いで、ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡフラグメントをｐＢＳ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡからＣｌａＩ及びＳｐｅＩによって切断した。ｐＢＳ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸ−ｂｐＡ、ｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸ−ｂｐＡ、及びｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸ−ｂｐＡをＳｐｅＩ及びＣｌａＩで消化して各プラスミドから得られる３つのフラグメント、ｐＢＳ、ＦＩＸ−ｂｐＡ、及び３つの異なるエンハンサー−プロモーター−ＨＣＲの組合せを得た。次いで、消化されたプラスミドｐＢＳを、ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡフラグメント及び３つの異なるエンハンサー−プロモーター−ＨＣＲの組合せと連結させて、それぞれ３つのプラスミド、ｐＢＳ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ、ｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ、及びｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡを作製した。ＰＣＲ法によって増幅したＡｐｏＥＨＣＲフラグメントの配列を決定し、作製したすべての構築物を調べてそれらが正確であることを確認した後、発現プラスミド中にクローン化した。
【００３６】
レトロウイルスベクターのバックボーンを含むプラスミドｐＬＸは、ｐＬＮＣＸ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１：５〜１４（１９９０））からｎｅｏ遺伝子を欠失させることにより作製した。次いで、プラスミドｐＬＸをＨｐａＩで消化した。様々なｈＦＩＸ発現カセットを、上述のｐＢＳ構築物からＳｐｅＩを用いて切断し、平滑末端化し、ｐＬＸのＨｐａＩ部位にクローン化して、図２Ａに列記されている一連のＬＸ構築物を得た。
【００３７】
第ＩＸ因子の遺伝子を持続的に発現するための必須エレメントの特性を決定するために、動物実験における合計８つのプラスミドとの比較用により多くのブルースクリプトの構築物を作製した（図２Ｂ）。ｂｐＡ（配列番号６）又は第ＩＸ因子の３’−ＵＴＲ（配列番号７）のいずれかをプラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡから欠失させて、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ又はｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−ｂｐＡを作製した。次に、ｂｐＡ（配列番号６）をｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−ｂｐＡから欠失させて、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔを産生した。プラスミドｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡをＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＬＩＶ７（Ｄａｎｇ，Ｑ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２２５７７〜８５（１９９５））からＰＣＲ法によって増幅したＡｐｏＥ−ＨＣＲのより短い３３１ｂｐのＫｐｎＩフラグメントと連結させて、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ（ｓ）−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡを作製した。ＡｐｏＥＨＣＲ（ｓ）−ｈＡＡＴｐ又はｈＡＡＴプロモーターフラグメント（配列番号５）を先に記述したように精製したｐＢＳ−ｂｐＡ及びｈＦＩＸ−ｍｇフラグメントと連結させて、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ（ｓ）−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ又はｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡを産生した。すべてのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法によって調製し、Ｑｉａｇｅｎ製のＭａｘｉ−Ｐｒｅｐキットを用いて精製した。タンパク質及びＲＮＡは、これらの調製の際には検出されなかった。
【００３８】
細胞の培養とトランスフェクション：マウスの肝癌細胞（Ｈｅｐ１Ａ）を、Ｌ−グルタミン、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、及び１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ修正イーグル培地中で培養した。ヒトの肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）を、Ｌ−グルタミン、抗生物質、１％可欠アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、及び１０％ウシ胎児血清を補充した最少イーグル培地中で培養した。形質転換されていないマウスの肝細胞（ＮＭＨ）を、５μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、０．１ｍＭデキサメタゾン、０．１％ゲンタマイシン、１０ｍＭニコチン酸アミド、及び２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子を補充した、ダルベッコ修正イーグル培地とハムＦ−１２培地の１：１混合培地中で培養した。３つの細胞系は、全て、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に維持した。
【００３９】
リポフェクタミン試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プラスミドＤＮＡ（２μｇ）及び内部標準として使用したｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡ（１μｇ）を培養した細胞内に同時トランスフェクションした。各トランスフェクションを、少なくとも３回繰り返した。トランスフェクションから６０時間後に、細胞培地を収集し、全ヒトα１−アンチトリプシン又は第ＩＸ因子抗原（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２３５３〜７（１９９４））を、それぞれα１−アンチトリプシン又はｈＦＩＸ（Ｂｒａｙ，Ｇ．Ｌ．等、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０７：２６９〜７８（１９８６））に対するポリクロナール抗血清を用いてＥＬＩＳＡアッセイ法によって分析した。
【００４０】
マウスの門脈へのプラスミドの直接注入：Ｃ５７Ｂ１／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、ＳＰＦ条件下で飼育した。動物は、ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ及びＳｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物の飼育に関するＮＩＨガイドラインに従って取り扱った。Ｂｕｄｋｅｒ等（Ｂｕｄｋｅｒ，Ｖ．等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：５９３〜９（１９９６））によって記述された方法と同様の方法を用いたが、トランスフェクトされた肝細胞の割合は低い結果となった。高張液（微小血管の血栓症を抑制するために、０．９％生理食塩水、１５％マンニトール（Ｓｉｇｍａ）及び３．５ユニット／ｍｌヘパリンを含む）中の１００μｇのプラスミドＤＮＡを門脈経由で３０秒にわたりマウスに注入した。注入中に肝静脈を一時的に閉塞するために、５ｍｍのＫｌｅｉｎｅｒｔ−Ｋｕｔｚの微小血管クリップ（Ｅｄｗａｒｄ　Ｗｅｃｋ）を肝静脈と大静脈の接合部に適用した。後眼窩（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）法によって、マウスから定期的に採血した。マウスの血漿中のヒト第ＩＸ因子レベルを、ｈＦＩＸに対するポリクロナール抗血清を用いたＥＬＩＳＡアッセイ法によって全ｈＦＩＸ抗原量として決定した。
【００４１】
マウスの尾静脈へのプラスミドの直接注入：Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＳＰＦ条件下で飼育した。Ｌｉｕ等（Ｌｉｕ，Ｆ．等、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１２５８〜１２６６（１９９９））及びＺｈａｎｇ等（Ｚｈａｎｇ，Ｇ．等、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１０：１７３５〜１７３７（１９９９））によって記述された方法と同様の方法を用いた。２ｍｌの０．９％生理食塩水溶液中の２０μｇの各試験用プラスミドを、５μｇの対照プラスミド（ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡ）と共にマウスの尾静脈内に６〜８秒にわたり注入した。この方法では約４０％の肝細胞がトランスフェクトされることが判明した。血漿中のｈＦＩＸ又はα１−アンチトリプシンレベルを上述のＥＬＩＳＡによって評価するため定期的にマウスから採血した。
【００４２】
例２
本例では、例１で説明したプラスミドをマウス肝細胞へ導入することにより得られた第ＩＸ因子の発現について説明する。
【００４３】
ベクター構築のデザイン
肝細胞でのヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）産生を最適化するために、組織特異的プロモーター−エンハンサー、肝臓遺伝子座調節領域（配列番号４）、イントロンＡ（配列番号１）、及び３‘’−非翻訳領域（配列番号７）を含むシス活性調節配列の様々な組み合わせをレトロウイルス−含有プラスミドＤＮＡに組み込んで、遺伝子発現を調べた。
【００４４】
最初に、ヒト第ＩＸ因子　ｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する単純なレトロウイルスバックボーンを利用した。肝遺伝子転写に対して、４コピーのアポＥ−エンハンサー（配列番号８）有り又は無しで、α１−アンチトリプシン遺伝子由来の肝特異的プロモーター（配列番号５）を加えた。（Ｓｈａｃｈｔｅｒ，Ｎ．Ｓ．ら、 Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：１６９９−７０７（１９９３））。α１−アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）は強い肝特異的プロモーターであり（Ｈａｆｅｎｒｉｃｈｔｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ　８４：３３９４−４０４（１９９４））、その機能がレトロウイルスベクターのＬＴＲプロモーターにより阻害されない（Ｗｕ，Ｘ．，ら、 Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．７：１５９−７１（１９９６））ため、α１−アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）を選択した。さらに、ｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）の上流に強い１５４ｂｐの肝特異的アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）エンハンサー（配列番号８）（Ｓｈａｃｈｔｅｒ， Ｎ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３４：１６９９−７０７（１９９３））を４コピー加えることにより、他のプロモーター−エンハンサーを持つ構築物よりもα１−アンチトリプシン遺伝子の発現がさらに１５倍超増加するということが報告された（Ｏｋｕｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：６３７−４５（１９９６））。
組込みの位置による抑制効果が起こる可能性を解決するために、最近報告された、ＡｐｏＥ遺伝子の肝特異的発現に対する遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）（配列番号４）、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：８２２１−９）をあるいくつかの発現カセットに組み込んだ。この肝調節領域（配列番号４）はＡｐｏＥ／ＣＩ／ＣＩＩ遺伝子座に位置し、全長の機能的ＬＣＲ活性に対して３１９ｂｐの領域に局在する。このエレメントによりコピー数依存的、位置非依存的な遺伝子発現が起こり、トランスジェニックマウスモデルにおいて、ＡｐｏＥエンハンサー（配列番号８）よりも１０倍高い活性を示すことが明らかとなった（Ｄａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２５７７−８５（１９９５））。複数個のＬＣＲがインビボでどのように遺伝子転写に影響を及ぼすかということが明らかではないため、本プラスミド発現カセット中には、単一のＡｐｏＥ−ＨＣＲ配列（配列番号４）を使用した。コントロールとしてＲＳＶ及びＬＴＲプロモーターを使用した。
【００４５】
プラスミドを含有するレトロウイルスベクターを構築して（図２Ａ）、これらのシス−エレメントの強さを系統的に比較した。前記対照ウイルスＬＴＲ（ＬＸ／ｈＦＩＸ）及びＲＳＶ（ＬＸ／ＲＳＶ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ（−））プロモーターを使用し、次の肝特異的エレメント：ｈＡＡＴプロモーター （配列番号５）単独、又はＡｐｏＥ−エンハンサー（配列番号８）とｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）、又はＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）とｈＡＡＴプロモーター（ＬＸ／ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ（−）、及びＬＸ／ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ（−）、ＬＸ／ ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ（−）、図２Ａ）であった。インビボでのウイルスＬＴＲプロモーターに対するプロモーター妨害を避けるために、及び、イントロン（配列番号１）と３’−ＵＴＲ（配列番号７）とを組み込んだ構築物と比較するために、ＬＴＲプロモーターに対して逆の転写方向に、さらなる内部プロモーターを有する発現カセットを挿入した（Ｅｍｅｒｍａｎ，Ｍ．，及びＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：７９２−８００（１９８６）；Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１：５８４８−５９（１９９１））。さらに、第ＩＸ因子　ｃＤＮＡの３’末端に外部ポリアデニル化シグナル（配列番号６）を加えて、確実にそのｍＲＮＡの適切なプロセシングが行われるようにした。上述の様々な肝臓プロモーターと、Ｍｏｌｏｎｅｙ　ＬＴＲ及び内部ＲＳＶ−ＬＴＲの相対強度を比較することが最終的な目的であった。
【００４６】
次に、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）と１．４ｋｂの末端切断されたイントロンＡ（配列番号１）と１．７ｋｂの３’−ＵＴＲ（配列番号７）とから構成されるｈＦＩＸミニ遺伝子を、異なるプロモーター−エンハンサー配列の組み合わせで組み込んだ。レトロウイルスＬＴＲとは逆向きの転写方向にこれらの発現カセットを挿入した（ＬＸ／ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）、ＬＸ／ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）、及び ＬＸ／ＲＳＶ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）、図２Ａ）。上記操作を行うことにより、これらのプラスミドを使用してレトロウイルスベクターを作製した場合、第ＩＸ因子イントロン（配列番号１）のスプライシング及び３’−ＵＴＲ（配列番号７）におけるポリアデニル化シグナルによりパッケージング細胞系列における完全長のウイルス転写物の産生が妨害されないようにした。
【００４７】
細胞培養系における遺伝子発現のインビトロ試験
次に述べる二つの理由から、まず、これらのプラスミドを３種類の肝細胞培養系において試験した。第一の理由は、インビボでの研究に先立って構築物の機能性を確認するためである。第二の理由は、インビボでの研究における比較及び予測のための基準を確立するためである。
【００４８】
細胞培養におけるトランスフェクションから二日後に、培養液を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイにより分析した。共トランスフェクションさせた対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドから発現されたヒトα１−アンチトリプシンのレベル（ｈＡＡＴ）により第ＩＸ因子発現レベルを標準化した。Ｈｅｐ１Ａ細胞では、全構築物に対して、低レベルの第ＩＸ因子の発現が、１〜２．５倍の幅で観察された（図３）。興味深いことに、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターは、肝特異的エンハンサー−プロモーターと同程度の活性を示した。遺伝子発現に対する前記イントロン（配列番号１）及び３’−ＵＴＲ領域（配列番号７）の存在による影響は僅かであった。
【００４９】
次に、トランスフォーミング増殖因子αを形質転換したトランスジェニックマウス由来の非形質転換肝細胞（ＮＭＨ）系列（Ｗｕ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６７４−８）中でこれらのプラスミドを試験した。この細胞系列はインビボの状態に近い特性を有し得る。一般に、試験を行った全プラスミドに関して、ＮＭＨ細胞中では、Ｈｅｐ１Ａ細胞を用いた場合よりも高レベルで第ＩＸ因子の発現が得られた（図３）。ｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）単独の場合と比較して、ＡｐｏＥ−エンハンサー（配列番号８）又はＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）のいずれかを加えた場合、第ＩＸ因子レベルは約２倍に上昇した。
【００５０】
最後に、ヒト肝癌細胞系列であるＨｅｐＧ２細胞においてこれらのプラスミドを試験した。使用した全ての肝特異的調節シス−配列はヒト配列由来であったため、これらのエレメントは、ただ、ヒト肝細胞において完全に機能的でありうる。図３に示すように、上記他の二つのマウス細胞系列中で発現されたレベルよりも高いレベルで、ベクター中の肝細胞特異的エンハンサー−プロモーターにより支配される第ＩＸ因子　ｃＤＮＡ（配列番号２）が発現された。しかしながら、ＲＳＶプロモーターも、ＨｅｐＧ２細胞中で、より高い活性を有し、肝特異的エンハンサー−プロモーターと同程度の強度を有していた。ベクター中にｈＦＩＸイントロン（配列番号１）及び３’−ＵＴＲ（配列番号７）を含有させることにより、遺伝子発現レベルが〜１．５倍上昇した。
【００５１】
インビボにおける門脈経由からのプラスミドの直接注入
プラスミドを門脈に直接注射する（Ｂｕｄｋｅｒ，Ｖ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：５９３−８（１９９６））ことにより、インビボにおけるプラスミドＤＮＡ発現の試験を行った。一時的に肝門脈を閉塞させたＣ５７Ｂｌ／６マウスの門脈内に、高張液中の１００μｇの各レトロウイルスプラスミドを投与した。半数のマウスが手術中、又は手術から１日後に死亡した。残りのマウスは全て４０日（本実験の期間）まで生存した。
【００５２】
プラスミド注射から二日後に、回収した血漿試料のｈＦＩＸタンパク質をＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ａに示されているように、内部プロモーターなしにＬＸ−ＦＩＸ（＋）を注入した動物では、基礎血清レベルは５〜１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＩＸを示した。内部ｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）、ＡｐｏＥ−ｅｎｈ（配列番号８）−ｈＡＡＴ−プロモーター（配列番号５）、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）−ｈＡＡＴ−プロモーター（配列番号５）、又はＲＳＶプロモーターをさらに加えることにより、第ＩＸ因子　ｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する構築物（ＬＸ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ、及びＬＸ−ＲＳＶ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ）からの第ＩＸ因子発現は上昇しなかった。しかしながら、ＲＳＶプロモーターエレメント及びヒト第ＩＸ因子ミニ遺伝子配列を含有する構築物（ＬＸ−ＲＳＶ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ）を注射したマウスでは、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する構築物から得られたレベルより第ＩＸ因子のレベルが３倍高かった。ｈＦＩＸミニ遺伝子配列と組み合わせて１５４ｂｐのＡｐｏＥ−エンハンサーエレメント（配列番号８）及びｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）を含有する構築物（ＬＸ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ）を注射したマウスでは、第ＩＸ因子のレベルは、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する構築物で得られたレベルよりも、約１０倍高かった（５０〜１８０ｎｇ／ｍｌ）。非常に興味深いことには、ＦＩＸミニ遺伝子配列と組み合わせてＡｐｏＥ−ＨＣＲエレメント（配列番号４）及びｈＡＡＴ−プロモーター（配列番号５）を使用した場合（ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ）、第ＩＸ因子のレベルは、ＬＸ−ＦＩＸ構築物を注射した動物で得られた基礎レベルより約６７倍の高い値を示した（０．７〜１．５μｇ／ｍｌ）。この第ＩＸ因子の発現レベルは正常な血漿第ＩＸ因子濃度（５μｇ／ｍｌ）の約３０％であり、血友病Ｂ患者に対する治療として使用し得る濃度であった。
【００５３】
プラスミドを介した遺伝子発現のマウスでの持続期間を試験するために、血漿試料のｈＦＩＸを定期的に分析した。第ＩＸ因子のｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する構築物を注射したマウスでは、第ＩＶ因子レベルはベクター注入後３〜７日で検出不可能なレベルに低下した。ヒト第ＩＸ因子ミニ遺伝子を含有する構築物を注射したマウスでは、第ＩＸ因子レベルは、最初、さらに高く、より長い期間持続したが、本タンパク質のレベルはやがて時間と共に緩徐に低下していった（図４Ｂ）。構築物、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡを注射して第ＩＸ因子産生量が最大であったマウスの第ＩＸ因子濃度は、一週間にわたって高レベルを保ち、４０日の時点で２００ｎｇ／ｍｌまで緩徐に低下した。プラスミドは細胞内でエピソームとしての性質を有するので、遺伝子発現の低下は予想し得るものであった。
【００５４】
尾静脈を経由した直接的プラスミド注射
上記のような門脈を介してプラスミド直接注射する手術方法は非常に労力を要するので、それ以外のインビボでの遺伝子導入法を使用して、肝臓におけるこれらの構築物の発現を調べた。検査すべき２０μｇのプラスミド及び５μｇの対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドをマウスの尾静脈に注射した。 以前の研究において、この方法によりインビボで約４０％の肝細胞がトランスフェクトされることが示された（Ｌｉｕ，Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２５８−１２６６（１９９９）；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７３５−１７３７（１９９９））。 対照プラスミドを使用して、プラスミド注射操作の変動に対して標準化を行った。第ＩＸ因子レベルは、注射後１日に最高値を示したが、時間が経過するに伴い、より低いレベルに低下するか、又は検出不能レベルにまで低下した（図５）。尾静脈注射の方が門脈注射よりも絶対的な第ＩＸ因子遺伝子の発現レベルが高かったが、ＬＸ−ＦＩＸ構築物からの基底発現レベルに対する各構築物による発現の相対的比率は、門脈での実験におけるそれと同等であった（表１）。
【００５５】
【表１】
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最大産生量を示すマウスの発現レベルは、構築物ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ注射によるものであった。このレベルは、ＬＸ−ＦＩＸ構築物のレベルより６９倍の高く、門脈注射実験で見られたものと同程度であった。全体を総合すると、インビボ実験から得られた結果は、細胞培養実験から得られた結果と著しく異なっていた。興味深いことに、８週齢において、イントロン（配列番号１）及び３’−ＵＴＲ（配列番号７）配列を含有する構築物を注射したマウスは、なお、低レベルのＦＩＸを産生していたのに対して、他のプラスミドを投与したマウスではＦＩＸの産生は認められなかった。
【００５６】
上記の結果により、前記シスＤＮＡエレメントの中に、遺伝子発現の持続性の相違の要因となるものが存在する可能性が示唆された。系統的な研究を行い、この知見の要因となるエレメントの決定を試みた。レトロウイルスＬＴＲ配列からの影響を避けるために、最も発現レベルが高いカセットであるＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡをブルースクリプトベクターにクローニングし、２ｍｌの生理的食塩水中の得られたプラスミド２０μｇを６匹のマウスの尾静脈に注射した （Ｌｉｕ，Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２５８−１２６６（１９９９）；Ｚｈａｎｇ，Ｇ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１７３５−１７３７（１９９９））。注射してから１日後に、平均値１０μｇ／ｍｌ（正常ヒトレベルの２倍）に達し、緩やかにこれより低いレベルへと低下した（図６Ａ）。しかしながら、血漿濃度は、注射後７〜８週の時点で、０．５〜２μｇ／ｍｌの範囲で安定しており、３０週間（実験期間）にわたって維持された。ｈＦＩＸのこの濃度は、血友病Ｂを処置するための治療的範囲の中にあった。持続的な導入遺伝子の発現に必要とされる決定的エレメントの詳細を明らかにするために、ブルースクリプトベクターバックボーンを用いてさらに７個のプラスミドを構築し（図２Ｂ）、７群のマウス（ｎ＝６／群）に注射した。図６Ｂに示されているように、イントロン配列（配列番号１）を含有しない（ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ）、又はポリアデニル化シグナルを含有しない（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ）プラスミドの場合は、遺伝子発現は低いか、又は検出不能なレベルであり、遺伝子の発現は一過性であった。一方、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）及びｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）、イントロン（配列番号１）及び、１．７ｋｂ　３’−ＵＴＲ（配列番号７）（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ）又は０．３ｋｂ　ｂｐＡ（配列番号６）（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−ｂｐＡ）又は両者（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ）からのポリアデニル化シグナルの組み合わせを含有するプラスミドは、治療的レベル（０．５〜２μｇ／ｍｌ）のｈＦＩＸを持続的に産生した。３’−ＵＴＲ（配列番号７）を含有するプラスミドにより、ｂｐＡ（配列番号６）のみを含有するプラスミドより約２倍発現が高くなった。さらに、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ配列（配列番号４）を有しないプラスミドｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡによる初期の遺伝子発現レベルはこれより低く、プラスミド注射後４週間半で検出不能レベルに低下したので、ＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）がこれらの実験での持続的なｈＦＩＸ遺伝子発現に対する重要なエレメントであるということが示された。さらに、プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ（ｓ）−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸｍｇ−ｂｐＡにおいて７７１ｂｐのＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号４）をこれより短い３２８ｂｐのＡｐｏＥ−ＨＣＲ（配列番号９）と置換したところ、ｈＦＩＸ遺伝子発現レベルはプラスミド注射後、同レベルにとどまった。このことは、トランスジェニックマウスを用いた実験結果（Ｄａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２５７７−８５（１９９５））と矛盾せず、完全長の機能的ＬＣＲ活性を含有する３２８ｂｐのＡｐｏＥ−ＨＣＲ断片（配列番号９）が、ｈＦＩＸ遺伝子発現を上昇させるために十分であることを実証している。総合すると、イントロン及び１個のポリアデニル化シグナルを含有させることによって、直接的注射後に、プラスミド中の導入遺伝子の発現が増加し、且つ発現期間が延長され、遺伝子座調節領域（ＡｐｏＥ−ＨＣＲ）（配列番号４または配列番号９）と組み合わせること、治療的レベルであり、且つ持続的なｈＦＩＸ遺伝子の発現が得られるということが示された。
【００５７】
インビボ実験で試験したもので発現量が最大であったプラスミドＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡは、直接的プラスミド注入を行ってから一日後に、１８μｇ／ｍｌという最大第ＩＸ因子レベルを与えた。この第ＩＸ因子の発現レベルは、正常血漿第ＩＸ因子濃度（５μｇ／ｍｌ）の３．６倍であり、従って、血友病を治療するために必要とされる治療的レベルを大幅に超えるものである。長期間経過した後でも、ｈＦＩＸ血清レベルは正常の１０〜４０％というレベルであり、治療に使用可能なレベルを維持していた。
【００５８】
例３
この例では、例４で説明する実験で使用する材料及び方法を説明する。
プラスミド調製
プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ及びｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ の構築は例１に記載されており、該プラスミドの構造は図７Ａに示されている。該プラスミドの大量調製は、Ｑｉａｇｅｎ　ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて行った。精製後、タンパク質質又はＲＮＡは全く検出されなかった。
動物実験
動物の取り扱いに関するＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ガイドライン及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎのガイドラインに従って動物を取り扱った。成獣Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）より購入し、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｍａｓｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＣｅｎｔｅｒにてＳＰＦ環境下で飼育した。プラスミドＤＮＡの注射法及びＤＮＡの単離法は、全て例１に記載されている。簡潔に説明すると、２０〜２４ｇのマウス尾静脈に、６〜８秒にわたって、２ｍｌリン酸緩衝生理的食塩水溶液中の５０μｇの各プラスミドを注射した。後眼窩静脈叢から計画的に血液試料を採取した。マウスに対して部分肝切除を行い、手術中に三分の二を切除した。
ＤＮＡ分析
プラスミドで処置し異なる時点で屠殺したマウスの脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓及び精巣を含む様々な組織、及び対照マウスの肝臓からゲノムＤＮＡを調製した。前記ベクター中に２ヶ所の認識部位を有するＰｓｔＩを用いて、３７℃で一晩、各調製試料から得た１５μｇの試料消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）へ転写した。該メンブレンをプレハイブリダイズさせ、次に、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ　ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてｈＦＩＸ　ｃＤＮＡプローブと６５℃でハイブリダイズさせた。洗浄の最終的ストリンジェンシーは、０．１ｘＳＳＣ　１％ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃であった。プローブはエクソンＩＩからエクソンＶＩＩＩに渡る８１０ｂｐのｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ断片であり、ランダムプライマー標識キット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、比活性が１０８ｃｐｍ／μｇなるように［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。肝臓ＤＮＡ試料も、未消化のまま、又はＣｌａＩで消化してサザンブロットにより分析を行った。ネガティブコントロールとして、非処置マウス肝臓由来ゲノムＤＮＡを使用した。Ｈｉｒｔ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：３６５（１９６７））を使用して、細胞内ＤＮＡから染色体外断片を単離した。ＤＮＡ添加量の標準としてマウスのメタロチオネイン−１プローブを使用して二倍体ゲノムＤＮＡあたりのプラスミドゲノムを計算した （Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：２７０（１９９７））。
ＲＮＡ分析
ＦａｓｔＴｒａｃｋ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、プラスミドＤＮＡで処置し、屠殺したマウスから、異なる時点で、脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、及び精巣を含む様々な臓器からｍＲＮＡを単離した。まず、オリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵素（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、この転写物に逆転写を行い、ファーストストランドｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡプールを、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡの８１０ｂｐ領域にわたるプライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴ−３’（配列番号１７）及び、５’−ＡＧＣＣＡＣＴＴＡＣＡＴＡＧＣＣ ＡＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１８））を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、９５℃で１分、６０℃で４５秒、７０℃で１分というサイクルを３０サイクル繰り返すという条件で行った。 マウスのβ−アクチンプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて同時にコントロールのＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
肝毒性アッセイ
プラスミド又は生理的食塩水を注射したマウスにおける肝毒性を評価するために、後眼窩静脈叢から異なる時間点で、１０分の１量の０．１５Ｍ　クエン酸ナトリウム中に血液を採取した。酵素アッセイキット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の有無及び総ビリルビンに関して試料を分析した。通常の組織学的染色（ヘマトキシリン／エオシン）法により調製したホルマリン固定マウス肝臓切片に対して、組織学的検査を行った。
ヒトＦＩＸ抗原、及び抗−ｈＦＩＸ抗体に対するアッセイ
ｈＦＩＸに対するポリクローナル抗血清を用いたＥＬＩＳＡによって、マウス血漿中のヒト第ＩＸ因子レベルを総ｈＦＩＸ抗原として測定した（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：２７０（１９９７）； Ｍｉａｏ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：３７９３（２０００））。抗原特異的ＥＬＩＳＡによって、ｈＦＩＸに対する抗体を検出した。まず、血漿由来ｈＦＩＸタンパク質質（１ｍｇ／ｍｌモノナイン、Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ）でマイクロタイタープレートを被覆した。プラスミド注射後、プラスミド処置マウスから異なる時点で採取した血漿を希釈し、前記被覆プレートに添加した。総マウスＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（１：２０００希釈）を用い、続いてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド基質と共にインキュベーションを行って、ｈＦＩＸに対する抗体を検出した。抗−ｈＦＩＸの力価を測定するために使用した標準曲線は、連続希釈した精製総マウスＩｇＧタンパク質を用いて作製した。
【００５９】
例４
本例では、例３に記載したプラスミドをマウス肝細胞に導入することによって取得した第ＩＸ因子の発現について説明する。
【００６０】
マウス肝臓へプラスミドを直接注入した後のヒト第ＩＸ因子遺伝子の発現
プラスミドＤＮＡの非ウイルス性輸送によるｈＦＩＸの長期遺伝子発現を調べるために、高発現プラスミド（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ、図７Ａ）と低発現プラスミド（ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ、図７Ａ）をそれぞれマウスに注入して、様々な時点で一連の分析を行った。ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡの発現カセットには肝臓の遺伝子座調節領域（ＨＣＲ）（配列番号４）、ヒトα１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター（配列番号５）、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）、末端切断されたｈＦＩＸのイントロンＡ（配列番号１）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂｑＡ）（配列番号６）が含まれる。ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡの発現カセットには、一つのｈＡＡＴプロモーター（配列番号５）、ｈＦＩＸ  ｃＤＮＡ（配列番号２）及びｂｐＡ（配列番号６）が含まれている。各プラスミド２０ｇを数群のマウスの尾静脈に速やかに注入した。図７Ｂ〜７Ｄに示すように、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡを注入されたマウスは常に、一過性の低レベルの第ＩＸ因子遺伝子発現を引き起こしたが、ＰＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡを注入されたマウスは、初め平均して１０μｇ／ｍｌのｈＦＩＸタンパク質（正常値＝５μｇ／ｍｌ）という高レベルの第ＩＸ因子遺伝子の発現をもたらし、これは５５０日（本実験の期間中）までに、０．５〜２μｇ／ｍｌに減少して安定した。
【００６１】
様々な臓器におけるプラスミドＤＮＡの経時的分布を調べるためのサザン分析
ＤＮＡベクターと遺伝子発現レベルの相関関係を調べるための第１段階として、我々は細胞中のベクターの状態を研究した。プラスミドを注入して様々な時点で屠殺したマウスの脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓及び精巣を含む様々な臓器から単離したゲノムＤＮＡに対してサザン分析を行った。他の報告（Ｌｉｕ，　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　６：１２５８（１９９９））どおり、前記ＤＮＡの大部分が肝臓に取り込まれたことが見出された。極めて低レベルのＤＮＡベクターが肺、膵臓及び心臓で観察されたが、脳、腎臓及び精巣では検出されなかった。これはおそらく、大量のプラスミド溶液が急速に輸送されたために容量の過剰が起こり、高圧輸送に伴って肝臓に逆流したためである。前記プラスミド溶液の中には他の組織及び臓器に分配されたものもあるであろう。いずれのプラスミドに関しても、前記細胞中に保有されていたベクターＤＮＡの量が一日で最高となったが、その後減少して、３０日〜２４０日までにプラトーレベルで安定した。しかしながら、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡを注入したマウスの肝臓に保持されたベクターは、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡを注入したマウスと比較して３〜４倍多かった。
【００６２】
様々な組織中の転写産物のＲＴ―ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲ法を行って、様々な組織の転写産物の状態を経時的に調べた。前記発現カセットに組み込まれた組織特異的プロモーターから予測されたとおり、転写産物は肝臓のみに観察された。高発現プラスミドであるｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡでは、転写産物の量は注入後１日で最高となったが、時間が経過するに従って、次第に減少して安定状態レベルになった。低発現プラスミドであるｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡでは、低レベルの転写産物がプラスミド注入後１日で観察されたが、それ以後は転写産物を検出できない。ｍＲＮＡの相対的レベルは、長期にわたり、タンパク質の発現レベルと正の相関を示した。このことから、核の中に前記プラスミドが保有されることは前記導入遺伝子が安定に発現されるために必要ではあるが、発現レベルは転写活性化及び安定した転写産物へのプロセシングによってさらに制御されるということが示唆された。
【００６３】
さらに時間をかけてプラスミドを注入した後のベクターＤＮＡ及び転写産物の生体分布
速度を落として（３０秒対８秒）、高発現のｈＦＩＸプラスミドであるｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ―ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡを尾静脈に注入投与すると、ｈＦＩＸ遺伝子発現（８０％減少）の低下が認められた。速度を落として、プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡをマウスの尾静脈に注入すると、さらに多くのゲノムベクターが、主に肝臓に分布せずに、それ以外の臓器に分布した。これはおそらく、前記注入によって与えられる圧力が低くなったためであり、このために、前記プラスミド溶液がその他の組織に流れ込む時間が存在したからである。しかし、様々な組織中の転写産物のＲＴ―ＰＣＲ分析によって導入遺伝子の発現が観察されたのは、肝臓のみであった。その他の組織の遺伝子発現レベルは、我々の実験では検出不可能な微量なレベルであるかもしれない。前記発現カセットには肝臓特異性プロモーター（配列番号５）及び肝臓遺伝子座調節領域（配列番号４）が含まれているので、これは予想どおりである。標的肝細胞に対するＦＩＸ遺伝子発現を制限すると、その他の組織でのＦＩＸの合成が抑えられ、免疫応答の誘発を減少させる（Ｐａｓｔｏｒｅ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　１０：１７７３（１９９９））。レトロウイルスベクター中の外来遺伝子の発現を抗原提示が非効率な骨格筋細胞に限定することによって、マウスでの外来遺伝子産物の発現を長引くことも明らかになっている（Ｐｉｎｔｏ，　Ｖ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　７４：１０２０２（２０００））。
【００６４】
肝臓におけるＤＮＡベクターの状態の時間的制限分析
血清ｈＦＩＸレベルが肝細胞中に保有されたＤＮＡの量と長期にわたり相関があるかどうかを決定するために、様々な時点で屠殺したプラスミド処置マウスの肝臓から単離した全細胞ＤＮＡを制限分析にかけた。遺伝子導入から１日後のマウスの肝臓から抽出した未消化の細胞性ＤＮＡのサザンブロットによって、未消化のプラスミド対照群と同様のエピソームベクターゲノム（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ処置マウスから得られる６．１ｋｂ及び４．２ｋｂのバンド、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ処置マウスから得られる４．５ｋｂ）が明らかとなった。おそらくプラスミドＤＮＡの重合又は凝集が原因と思われるが、これらより大きなサイズのＤＮＡバンドも観察された（ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ治療マウス及びｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ治療マウスからそれぞれ＞１２ｋｂ）。これらのベクターゲノムは全て、注入後３０日の時点で定常状態レベルまで徐々に減少した。ＰｓｔＩによってこれらのサンプルを消化すると、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）及びｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ処置マウス由来のその最初のイントロン（配列番号１）を含む３．１ｋｂ、及びｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ処置マウスから得られるｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）を含有する１．７ｋｂの内部断片が放出された。ベクター中の単一部位を開裂させるＣｌａＩで前記サンプルを消化すると、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ処置マウスからは６．８ｋｂの大きな断片が、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ処置マウスでは４．６ｋｂの断片が観察されたが、これは前記消化されたエピソームのプラスミド対照と同様のサイズであった。プラスミド処置していないマウスサンプルと同じく、プラスミド処置マウスサンプルにも非特異的な高分子重量のバンドが存在した。マウスのグループから算出したベクターの平均コピー数は、消化サンプルと未消化サンプル間で同等であり、投入したベクターの多くはエピソームのままであったことが示唆された。
【００６５】
マウス肝臓中に存在する組込み型のベクターＤＮＡとエピソーム型のベクターＤＮＡの相対的な存在量をさらに定量的に測定するために、Ｈｉｒｔ法を用いて、注入から２４０日後のマウスの全肝臓ＤＮＡを単離し、染色体ＤＮＡと染色体外ＤＮＡとを分離した。サザン分析の前に、フェノール／ＣＨＣｌ３で二度前記ＤＮＡを抽出して残存しているタンパク質を全て除去した。ベクターＤＮＡは全てＨｉｒｔ画分に検出され、染色体画分には検出されなかった。対照実験では、加えたｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ（染色体外プラスミドＤＮＡである）はＨｉｒｔ画分にしか検出されず、染色体画分には検出されなかった。これらのデータは、肝細胞内に長期保持された前記ベクターＤＮＡの大部分がエピソーム型のままであったことを明らかに示している。
【００６６】
ｈＦＩＸ遺伝子を持続的に発現するマウスの部分的肝切除後におけるプラスミドの維持
プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡを注入してから３００日後に、２匹のマウスに部分的な肝切除を行った。手術前の前記２匹のマウスのｈＦＩＸレベルは、それぞれ、０．９及び０．５μｇ／ｍｌで安定していた。部分的肝切除後に、おそらく肝再生過程中にタンパク質合成が誘導されたために、ｈＦＩＸレベルは一時的にさらに高いレベルに増加した（データは図示せず）。次いで、前記レベルは手術後７〜３０日ではるかに低いレベルに下がった後、安定した。その後、前記マウスを屠殺し、それらの肝臓が再生していることを確認した。部分肝切除後の前記所見に基づくと、肝臓の再生は、任意的な（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）肝幹細胞からではなく、主に既存の肝細胞から生じている（Ｂｒａｕｎ，　Ｋ．Ｍ．，　ａｎｄ　Ｓａｎｄｇｒｅｎ，　Ｅ．Ｐ．，　Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，　１５７：５６１（２０００）；Ｂｕｓｔｏｓ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，　１５７：５４９（２０００））、肝臓が完全に再生された１ヵ月後にプラスミドの大部分が組み込まれた場合には（Ｆａｕｓｔｏ，　Ｎ．，　Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，　３２：１９（２０００））、ｈＦＩＸは手術前に観察されたレベルと同様のレベルに戻ることが予想された。観察されたレベルはずっと少なかったので、導入遺伝子の発現は主としてエピソーム型から発生したことが示唆された。複数回の細胞分裂中に前記プラスミドが著しく失われたために、前記レベルは正常値の３分の１まで戻らなかったことも驚くべきことではない。
【００６７】
肝機能及び毒性試験
注入処置が原因で起こるマウスの肝臓毒性を調べた。ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ又は等張食塩液を速やかに注入したマウスの血清を用いて、ＡＬＴ、ＡＳＴ及び総ビリルビンレベルを決定した。ＡＬＴ及びＡＳＴレベルは、注入した最初の日に、正常レベルの１０〜２０倍増加した後、注入から３日後及び１０日後に正常レベルまで急速に減少した（表２）。
【００６８】
【表２】
2004500880.tif 000004
マウスの血清を注入後２４０日に検査すると、調べた全てのマウス（ｎ＝６／グループ）で、正常なＡＬＴ及びＡＳＴレベルが検出された。前記サンプルの血清ビリルビンのレベルは全て、プラスミド又は生理食塩水のいずれで治療したマウスにおいても正常のままであった。前記データは、毒性が急性且つ一過性であることを示した。さらに、生理食塩水を注入したマウスとプラスミドを注入したマウスとで、増加したレベルが同等であったので、これは大容量の急速な注入と関連していた。前記肝臓は、ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの降下によって示されたように速やかに回復した。
【００６９】
生理食塩水又はプラスミドの豊富な液体を静脈内ボーラス投与した後に、肝臓の損傷の程度をさらに決定するために、別組の処置マウス（ｎ＝１／グループ）を屠殺して肝臓の組織損傷を調べた。これらの研究では、標準的な尾静脈内ボーラス投与によってマウスに生理食塩水又はプラスミドＤＮＡを与えた後、注入後１、３、１０及び１８０日で屠殺した。組織損傷の量及びパターンは、様々な時点でトランスアミナーゼレベルと相関しており、様々な組のマウス（上記）中に見出された。注入から１日及び３日後に肝臓を全体的に検査すると、主に肝臓周囲被膜に分布する局所的な出血を伴った肝臓及び脾臓の腫脹が見られた。総体的な損傷の程度は肝臓の５％未満にすぎなかった。組織切片は、主として被膜下部に限定された局所凝固性壊死及び出血と同様のパターンを示した。また、損傷の程度は全肝臓の５％未満にすぎず、肝実質細胞の大部分には顕著な組織学的異常は見られなかった。脾臓の損傷は組織学検査では検出されなかった。組織損傷の程度は、生理食塩水対照群のマウスの肝臓でわずかに大きかった。しかしながら、前記損傷は局所的であり、サイズも小さかったので、この差はサンプリングの結果と思われる。生理食塩水対照群マウスに少なくとも同程度の組織損傷が存在したという事実は、前記損傷が主に液体のボーラス投与に起因するものであって、外来プラスミドＤＮＡとは無関係であることを示唆している。注入後１０日のマウスから採取した肝臓の切片には、軽度の単核炎症性浸潤を伴う相当な修復的変化、数個の有糸核分裂像を有する上皮の好塩基性細胞（繊維芽細胞及びオットー（Ｏｔｔｏ）細胞）への紡錘体の局所的な集合、及び胆管増殖を示した。注入から１８０日後のマウスの肝臓切片には顕著な組織学的異常は検出されなかったので、前記局所損傷はその後消失した。これらの長期マウスには顕著な繊維症又は炎症性浸潤がなく、一過性の肝臓の損傷から完全に回復したことを示している。
【００７０】
抗体の形成
前記標的細胞の形質導入が成功したとしても、遺伝子導入後に、ベクター又は導入遺伝子に対する抗体が形成されることによって、タンパク質発現が非常に低く抑えられるか、又はタンパク質が発現されない可能性がある。従って、ベクター又はｈＦＩＸに対する抗体を長期にわたって調べた。抗プラスミド抗体は観察されなかった（データ図示せず）。それでもなお、極めて低いレベル（３〜１１μｇ／ｍｌ）ではあったが、組換えｈＦＩＸ及びｈＦＩＸに対するポリクロナール抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、抗ｈＦＩＸ抗体が検出された。これらの極めて低いレベルの抗体は約１０日で検出され、２０〜４０日間でピークに達し、注入から約６０日に検出不可能なレベルまで減少した。前記一過性の抗体形成は、前記被処置マウスの血漿におけるｈＦＩＸタンパク質の循環を妨害しなかった。
【００７１】
持続的な遺伝子発現の期間中、大部分のプラスミドＤＮＡは肝臓の中でエピソームの状態を保っていた
ウイルスはＤＮＡがエピソームとして保持されることを利用して、宿主細胞内での潜伏状態を確立している。よい一例として、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）があり、これはウイルスタンパク質発現が存在しない潜伏状態のニューロン中で一生生き続けることができる。前記ウイルスには独特のニューロン特異性プロモーターシステムがあり、該システムは、潜伏期間中は転写活性の状態を保つので、潜伏状態を弱めずに治療タンパク質を発現させるために使用することができる（Ｇｏｉｎｓ，　Ｗ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　６８：２２３９（１９９４））。ＨＳＶプロモーター中の何れの部位が該プロモーターを生涯活性な状態に保たせることを可能としているのかは不明である。しかしながら、ＨＳＶの潜伏遺伝子発現から核中に蓄積した転写産物が安定したイントロンであるということは非常に興味深いことである。ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ転写実験から得られるＤＮＡゲノムのサザン分析によって、エピソーム型の前記ベクターが肝臓に持続的に存在する主な型であることが示された。ｈＦＩＸ発現及び細胞中のゲノムベクターの数が最初減少した後、プラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡの量は、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡよりも約３〜４倍多かった。しかし、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡから得た初期及びその後の発現レベルは、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡから得られたレベルより、２桁又はそれ以上高かった（図７）。また、その他の低発現カセットを含むプラスミドに関しては、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡとして同等量のプラスミドＤＮＡが、検出可能な循環導入遺伝子産物を与えずに、長期間、肝臓に残存できることも観察された。
【００７２】
高発現ベクターＤＮＡは二倍体ゲノムに当たり約２．３コピーで保たれた。ブルースクリプトプラスミドをコードする時に前記肝細胞の約２０％が形質導入されたことを考慮して、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を速やかにマウスの尾静脈に注入した。形質導入された各肝細胞には約１１コピーの前記プラスミドが含まれていた。プラスミドが最初に核に入るときに、前記ＤＮＡはヒストン及びその他の分子によってヌクレオソーム様構造へと直ちに凝縮することが明らかになっている（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｙａｎｉｖ，　Ｍ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　３：１２４３（１９８４）；Ｊｅｏｎｇ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｉｎ，　Ａ．，　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　２２：３７０（１９９４））。最初の数日間におけるＤＮＡ及び導入遺伝子発現の量の急速な減少は、注入過程で損傷した形質導入細胞が消失したことと、核内で何らかの不安定なプラスミドＤＮＡが分解されたこととが組み合わさったことが原因かもしれない。残りのプラスミドはおそらくヌクレオソーム様構造の中に残存して、１以上の特異的な核のコンパートメントに随伴する。しかし、一定の調節ＤＮＡ配列を持つプラスミドのみが持続的な高レベルの遺伝子発現を引き起こすことが可能であった。確立した高発現ｈＦＩＸカセットが、プラスミドがエピソームとして存続し、活性なプロモーターが維持されるために必要な条件を満たしているのかもしれない。前記ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子座（Ｓｉｍｏｎｅｔ，　Ｗ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８：８２２１（１９９３））から得られる肝臓の遺伝子座調節領域（ＨＣＲ）（配列番号４）はＤＮａｓｅＩ過敏部位を含有しており、クロマチンの転写活性を保つために一次的に必要とされる。さらに、前記ＡｐｏＥ―ＨＣＲ（配列番号４）は、肝特異的エンハンサーエレメントの他に、該プラスミドの遺伝子発現を増強し得るマトリックス付着部位（ＭＡＲ）を含む（Ｄａｎｇ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ，　Ｃｈｅｍ．，　２７０：２２５７７（１９９５））。前記ＭＡＲ及びイントロン配列はともに前記核マトリックスと相互作用することもあり（Ｇｉｎｄｕｌｌｉｓ，　Ｆ．，　ａｎｄ　Ｍｅｉｅｒ，　Ｉ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　１１：１１１７（１９９９）；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　７６：５５９（２０００）；Ｗｅｉ，　Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１４６：５４３（１９９９））、前記プラスミドＤＮＡからの遺伝子発現の持続に主に必要とされることもある。
【００７３】
別の可能性としては、前記ベクターゲノムが幾つか、細胞の染色体中に組み込まれて、長期遺伝子発現に寄与したということが考えられる。現時点では、この可能性は除外できないが、本明細書で報告した結果は、著しいゲノムへの組込みを支持していない。第一に、部分肝切除後の肝臓の再生によってｈＦＩＸレベルが実質的に減少しており、このことは再生及び細胞複製がプラスミド維持に有害であったことを示唆している。第二に、マウス群から計算した低分子重量ベクターの平均コピー数が消化サンプルと未消化サンプルとの間で同等であったこと、及びベクターＤＮＡの大多数が該プラスミド対照群で認められたものと同一の制限消化断片を有していることが、サザンブロット分析によって示された。これらの結果は、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡの導入後に、筋細胞にプラスミドＤＮＡの組込みを全く認めなかったＷｏｌｆｆ（Ｗｏｌｆｆ，　Ｊ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，　１：３６３（１９２２））及びその他の者（Ｍｏｎｔｈｏｒｐｅ，　Ｍ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　４：４１９（１９９３））によって得られた結果と一致する。
【００７４】
プラスミドＤＮＡの肝臓への非ウイルス遺伝子転移は長期免疫応答も毒性も引き起こさなかった
ウイルスベクターによる遺伝子導入は、通常、導入遺伝子及び／又ベクターに対する免疫応答を引き起こす。アデノウイルスの遺伝子導入は、強力なｈＦＩＸ特異的細胞毒性Ｔリンパ球及びＢ細胞応答を活性化することができ、これにより形質転移細胞の破壊及び導入遺伝子発現を喪失させる。一方、ＡＡＶによるｈＦＩＸの遺伝子導入によって惹起されるＴ細胞及びＢ細胞応答は、筋細胞にウイルス感染／遺伝子導入する条件における応答よりも、タンパク質を注入する条件での応答により近い（Ｆｉｅｌｄｓ，　Ｐ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　１：２２５（２０００））。また、筋細胞では、非ウイルス性プラスミドによって媒介される遺伝子導入により、好中球及びその他の炎症細胞が浸潤し、筋組織の構造的完全性がいくらか失われて、ｈＦＩＸ発現が検出不能なレベルとなったことも報告されている。単核細胞浸潤物を注入した筋肉の炎症は、主としてマクロファージとＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両Ｔリンパ球を含んでいた（ＭｃＭａｈｏｎ，　Ｊ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，５：１２８３（１９９８））。これは、微生物培養から調製したプラスミドの低メチル化によるものであった。
【００７５】
本研究では、マウスに大容量を急速に注入することによって高い静水圧が加えられたことが原因で、初期の肝損傷が生じると予測された。しかしながら、１日目及び３日目の組織学検査によると、９５％を超える肝臓が正常であるように見受けられた。修復的変化を伴う軽度の混合炎症性浸潤が急速に達成されたので、前記組織損傷の大部分は注入後１０日以内に修復された。調べた全切片、生理食塩水対照よりもプラスミド処置した肝臓では、組織の損傷がやや少なかった。これらの結果は、一過性の炎症が、プラスミドＤＮＡ又は導入遺伝子の発現ではなく、注入操作によって非特異的に引き起こされたものであることを示している。
【００７６】
本発明の好ましい態様を例示し、説明してきたが、これには、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、様々な変化を加えることができることが理解できるであろう。
【００７７】
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、第ＩＸタンパク質（配列番号３）をコードするヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ分子（配列番号２）のコード配列の５’に第ＩＸ因子イントロンＡ（配列番号１）が位置する本発明の発現カセットの一実施態様の構造を示している。ＨＣＲ、肝臓遺伝子座調節領域（ｈｅｐａｔｉｃ　ｌｏｃｕｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ）（配列番号４）；ＨＰ、ヒトα１アンチトリプシンプロモーター（配列番号５）；ＣＳ、第ＩＸ因子コード配列（配列番号２）、ｐｏｌｙＡｓ、ポリアデニル化シグナル（配列番号６）。
図１Ｂは、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ分子（配列番号２）のコード配列の３’に前記イントロン（配列番号１）が位置する本発明の発現カセットの構造を示している。略号は、図１Ａの説明に記載されているとおりである。
図１Ｃは、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ分子（配列番号２）のコード配列内に前記イントロン（配列番号１）が位置する本発明の発現カセットの構造を示している。略号は、図１Ａの説明に記載されているとおりである。
【図２Ａ】
図２Ａは、第ＩＸ因子遺伝子の発現レベルを評価するための異なる組み合わせのシス作用性調節エレメントを含むレトロウイルス構築物を示している。（＋）は、５’ＬＴＲによって誘導される転写に対して順方向に前記発現カセットを挿入したことを表す。（−）は、５’ＬＴＲによって誘導される転写に対して逆方向に前記発現カセットを挿入したことを表す。（Ｐ）はプロモーターを示し、（Ｅ）はエンハンサーを示している。ｈＦＩＸミニ遺伝子は、ｈＦＩＸ　ｃＤＮＡ（配列番号２）＋末端切断された１．４ｋｂのイントロンＡ（配列番号１）＋１．７ｋｂの３’ＵＴＲ（配列番号７）から構成される。図２Ａ及び２Ｂで使用されている略号は、ＬＴＲ、末端反復配列（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ）；ｈＦＩＸ、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ（ｈｕｍａｎ　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸ　ｃＤＮＡ）（１．４ｋｂ）（配列番号２）；ｈＡＡＴ（Ｐ）、ヒトα１アンチトリプシンプロモーター（４０８ｂｐ）（配列番号５）；ｂｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（配列番号６）；ＡｐｏＥ、４コピーの１５４ｂｐのＡｐｏＥエンハンサー配列（配列番号８）；ＡｐｏＥＨＣＲ、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子座から得られる肝臓遺伝子座調節領域（７７１ｂｐ）（配列番号４）；ＡｐｏＥＨＣＲ、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子座から得られる肝臓遺伝子座調節領域のより短い断片（配列番号９）；ＲＳＶ、ラウス肉腫ウイルス−ＬＴＲプロモーター（４００ｂｐ）；ｈＦＩＸｍｇ、第ＩＸ因子ｃＤＮＡを含有するヒト因子ミニ遺伝子（１．４ｋｂ）（配列番号２）、１．４ｋｂの末端切断イントロンＡ（配列番号１）、及び１．７ｋｂの３’ＵＴＲ（配列番号７）である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、第ＩＸ遺伝子発現レベルを評価するための異なる組み合わせのシス作用性制御エレメントを含むブルースクリプトプラスミドを示している。
【図３Ａ】
図３Ａは、細胞培養システム中でのプロモーターの強度を評価するための実験結果を示している。肝細胞株Ｈｅｐ１Ａの中に、様々なプラスミド構築物を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に培地を集め、ＥＬＩＳＡによって、ヒト第ＩＸ因子とα１アンチトリプシンのレベルを分析した。各トランスフェクションは少なくとも３回繰り返した。次いで、対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドによって産生されたα１アンチトリプシンの発現レベルに対して、第ＩＸ因子の発現レベルを標準化した。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、細胞培養システム中でのプロモーターの強度を評価するための実験結果を示している。肝細胞株ＮＭＨの中に、様々なプラスミド構築物を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に培地を集め、ＥＬＩＳＡによって、ヒト第ＩＸ因子とα１アンチトリプシンのレベルを分析した。各トランスフェクションは少なくとも３回繰り返した。次いで、対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドによって産生されたα１アンチトリプシンの発現レベルに対して、第ＩＸ因子の発現レベルを標準化した。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、細胞培養システム中でのプロモーターの強度を評価するための実験結果を示している。肝細胞株ＨｅｐＧ２の中に、様々なプラスミド構築物を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に培地を集め、ＥＬＩＳＡによって、ヒト第ＩＸ因子とα１アンチトリプシンのレベルを分析した。各トランスフェクションは少なくとも３回繰り返した。次いで、対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドによって産生されたα１アンチトリプシンの発現レベルに対して、ヒ第ＩＸ因子の発現レベルを標準化した。
【図４Ａ】
図４Ａは、マウスの門脈中にプラスミド（各プラスミドが本発明の発現カセットを含有している）を直接注入した後の第ＩＸ遺伝子の発現を示している。１００μｇの各プラスミドは、門脈内から、一過性に肝静脈が閉塞されたＣ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６／グループ、このうち約半数は本操作中に死亡した）に送達された。注入から２日後に、ＥＬＩＳＡによって、血清のヒト第ＩＸ因子のレベルを分析した。
【図４Ｂ】
図４Ａの説明に記載されている前記注入を受けたマウスにおける、第ＩＸ因子の血清レベルを経時的に示している。異なる記号は、異なるプラスミドを注入したマウスから得られる発現レベルを表している。菱形、ＬＸ−ＦＩＸ（＋）；アスタリスク、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ（−）；丸、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）；四角、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）；三角、ＬＸ−ＲＳＶｐ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）。
【図５】
図５は、マウスの尾静脈中にプラスミドを直接注入した後の様々な時点における血漿ヒト第ＩＸ因子レベルを示している。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６／グループ）の尾静脈の中に、６〜８秒にわたって、２ｍｌの０．９％生理食塩水溶液中の５μｇの対照ｐＢＳ−ＲＳＶ−ｈＡＡＴ−ｂｐＡプラスミドとともに、２０μｇの各レトロウイルスプラスミドを注入した。異なる時点で、ＥＬＩＳＡによって、血漿のヒト第ＩＸ因子及びα１アンチトリプシンのレベルを分析した。続いて、プラスミド送達効率を考慮して、α１アンチトリプシン発現レベルに対してヒト第ＩＸ因子レベルを標準化した。異なる記号は、異なるプラスミドを注入したマウスから得られる発現レベルを表している。黒菱形、ＬＸ−ＦＩＸ（＋）；白丸、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ｅｎｈ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ（−）；白四角、ＬＸ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ（−）；白三角、ＬＸ−ＲＳＶｐ−ＦＩＸ−ｂｐＡ（−）；黒丸、ＬＸ−ＡｐｏＥｅｎｈ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）、黒四角、ＬＸ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）；黒三角、ＬＸ−ＲＳＶｐ−ＦＩＸｍｇ−ｂｐＡ（−）。
【図６Ａ】
図６Ａは、マウスの尾静脈中に様々なブルースクリプトプラスミドを直接注入した後のヒト第ＩＸ遺伝子の発現レベルを示している。Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（ｎ＝６／グループ）の尾静脈の中に、６〜８秒にわたって、２ｍｌの０．９％生理食塩水溶液中の各ブルースクリプト２０μｇを注入した。異なる時点で、血清のＥＬＩＳＡによってヒト第ＩＸ因子及びα１アンチトリプシンレベルを分析した。ブルースクリプトプラスミドｐＢＳ−ＡｐｏＥ−ＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ３’−ＵＴＲ−ｂｐＡ（黒菱形）又はｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ（白菱形）を直接注入した後に、異なる時点で、ＥＬＩＳＡによって、血漿のヒト第ＩＸ因子の長期遺伝子発現レベルをモニターした。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、マウスの尾静脈中に注入された様々なプラスミドを検査することによって、持続的なｈＦＩＸ遺伝子発現に必要とされるエレメントを同定した結果を示している。Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（ｎ＝６／グループ）の尾静脈の中に、６〜８秒にわたって、２ｍｌの０．９％生理食塩水溶液中の各ブルースクリプト２０μｇを注入した。異なる時点で、ＥＬＩＳＡによって、血漿のヒト第ＩＸ因子レベルを分析した。異なる記号は、異なるプラスミドを注入したマウスから得られる発現レベルを表している。黒菱形、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ；黒四角、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−３’ＵＴＲ−ｂｐＡ；黒三角、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−３’ＵＴＲ；黒丸、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−ｂｐＡ；白菱形、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ；白四角、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ；白三角、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ（ｓ）−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−ｂｐＡ；白丸、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−Ｉｎｔ−３’ＵＴＲ−ｂｐＡ。
【図７Ａ】
図７Ａは、様々なｈＦＩＸ発現カセットを含有する構築物の構造を示している。略号は、ＨＣＲ、ＡｐｏＥ遺伝子座から得られた肝臓遺伝子座調節領域（７７１ｂｐ）（配列番号４）；ｈＡＡＴ（Ｐ）、ヒトα１アンチトリプシンプロモーター（４１８ｂｐ）（配列番号５）；ｈＦＩＸ、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ（１．４ｋｂ）（配列番号２）、ＩｎｔＡ、末端切断されたヒト第ＩＸ因子の第一イントロン（配列番号１）；ｂｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（配列番号６）である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ導入によって、図７Ａに示した２つのプラスミドをマウスの肝臓に導入した後３０日にわたるｈＦＩＸの発現レベルを示す。２ｍｌの生理食塩水中のプラスミド２０μｇをマウスの尾静脈中に素早く（５〜８秒）注入した。注入後１日目（データは図示せず）、３日目（データは図示せず）、及び３０日目に、各プラスミドで処理したマウスのグループ（ｎ＝３／グループ）を屠殺した。黒塗りの記号、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ；白抜きの記号、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ。
【図７Ｃ】
図７Ｃは、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ導入によって、図７Ａに示した２つのプラスミドをマウスの肝臓に導入した後２４０日にわたるｈＦＩＸの発現レベルを示す。２ｍｌの生理食塩水中のプラスミド２０μｇをマウスの尾静脈中に素早く（５〜８秒）注入した。注入後２４０日目に、各プラスミドで処理したマウスのグループ（ｎ＝３／グループ）を屠殺した。黒塗りの記号、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ；白抜きの記号、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ。
【図７Ｄ】
図７Ｄは、ｎａｋｅｄ　ＤＮＡ導入によって、図７Ａに示した２つのプラスミドをマウスの肝臓に導入した後５５０日にわたるｈＦＩＸの発現レベルを示す。２ｍｌの生理食塩水中のプラスミド２０μｇをマウスの尾静脈中に素早く（５〜８秒）注入した。実験の期間中、各プラスミドで処理したマウスのグループ（ｎ＝３／グループ）を経過観察した。黒塗りの記号、ｐＢＳ−ＡｐｏＥＨＣＲ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ＋ＩｎｔＡ−ｂｐＡ；白抜きの記号、ｐＢＳ−ｈＡＡＴｐ−ｈＦＩＸ−ｂｐＡ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500880.tif 000097
2004500880.tif 000098
【国際調査報告】
2004500880.tif 000099
2004500880.tif 000100
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