(57)【要約】ｄｓＲＮＡに基づいて哺乳動物細胞中で標的遺伝子の発現を阻害する方法ならびに本発明を行うのに有用な構築物およびそこで得られる細胞とトランスジェニック哺乳動物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、該方法は
再生可能な哺乳動物細胞を核酸に曝露させることを含み、該核酸は、少なくとも部分的に二重鎖のリボ核酸でありそして標的遺伝子に少なくとも６０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２】
配列同一性が少なくとも1８個の塩基にわたって維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的遺伝子の発現が少なくとも５０％だけ阻害される、請求項１もしくは請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的遺伝子が細胞性遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標的遺伝子が内在性遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子ががん遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子が導入遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸がエレクトロポレーションにより細胞の中に導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が胚性である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞ががん細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、該細胞をプロテインキナーゼＲ(ＰＫＲ)阻害剤および／もしくはＲＮａｓｅ  Ｌ阻害剤と接触させることをさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、該プロテインキナーゼＲ阻害剤および／もしくは該ＲＮＡｓｅ  Ｌ阻害剤がＰＫＲおよび／もしくはＲＮＡｓｅ  Ｌに特異的な二重鎖ＲＮＡである、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、該リボ核酸が自己相補的である一つの鎖を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、該リボ核酸が二つの分離した相補的である鎖を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、細胞の外における核酸の合成をさらに含む、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、細胞の内における核酸の合成をさらに含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、該核酸が内在性プロモーターの制御下に転写される、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、該核酸が細胞内における発現ベクターの産物である、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、該発現ベクターが該核酸に機能し得るように結合された構成的プロモーターを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、該発現ベクターが該核酸に機能し得るように結合された誘導性プロモーターを含む、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、該発現ベクターが該核酸に機能し得るように結合された組織特異的プロモーターを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、該発現ベクターがプロモーターに機能し得るように結合されたＰＫＲおよび／もしくはＲＮＡｓｅ  Ｌ  ｄｓＲＮＡをコードする配列をさらに含む、方法。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、該発現ベクターがレポーター遺伝子に機能し得るように結合されたプロモーターをさらに含み、そこでは該プロモーターが第二のプロモーター、双方向性プロモーター、もしくはポリシストロンメッセージを駆動するプロモーターからなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、該レポーター遺伝子が蛍光タンパク質、抗生物質、ベータ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼからなる群から選択される、方法。
【請求項２６】
請求項２４もしくは請求項２５に記載の方法であって、細胞培養での拡張のために該レポーター遺伝子を発現する細胞を選択することをさらに含む、方法。
【請求項２７】
細胞が胚性幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法であって、細胞は生体中に存在しそして標的遺伝子発現の阻害が機能喪失表現型を実証する、方法。
【請求項２９】
興味のある標的遺伝子に少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも部分的に二重鎖のリボ核酸をコードする核酸、ならびにＰＫＲ、ＲＮＡｓｅ  Ｌ、２',５'オリゴアデニル酸サイクラーゼおよびＭｘタンパク質の一つもしくはそれ以上を阻害するのに有効な少なくとも一つのｄｓＲＮＡ分子をコードする第二の核酸を含む、発現構築物。
【請求項３０】
細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する試薬を含有するキットであって、そこでは該キットは標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量でリボ核酸(ＲＮＡ)を哺乳動物細胞内に導入するための手段を含み、そしてそこではＲＮＡが標的遺伝子の一部と比較して同一なヌクレオチド配列を持つ少なくとも部分的に二重鎖の構造を有する、キット。
【請求項３１】
請求項１〜２８に記載の方法のいずれかにより達成される遺伝子サイレンシングを示す、哺乳動物細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の少なくとも一つの細胞を用いて製造される標的遺伝子サイレンシングを示す、ヒト以外の、トランスジェニック哺乳動物。
【請求項３３】
請求項１０に記載の方法により得られる胚性幹細胞を対象に投与することを含む、疾患を処置する方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の構築物の有効量を投与することを含む、疾患を処置する方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ配列に機能をアサインする方法であって、該方法は
ａ)該所望のＤＮＡ配列の細胞性相同体の遺伝子発現を阻害するのに十分な量において、核酸に哺乳動物細胞を曝露することであって、該核酸が少なくとも部分的に二重鎖のリボ核酸でありそして機能未知の所望のＤＮＡ配列と少なくとも６０％の配列同一性を有し、
ｂ)野生型と比較した該哺乳動物細胞の表現型を同定すること、そして
ｃ)該表現型を該所望の核酸にアサインすること
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、該所望の核酸が発現ベクターの中にクローン化されて、自己相補的である転写物の産生を可能にする、方法。
【請求項３７】
細胞の中に特定の表現型を授与する役割を果たすＤＮＡを同定する方法であって、
ａ)プロモーター(複数を含む)に適切な転写因子を結合させて、ｃＤＮＡもしくはＤＮＡの二重鎖(ｄｓ)ＲＮＡへの転写を開始する能力のあるプロモーター(複数を含む)に対する方向において適当なベクターの中に該細胞のＤＮＡのｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを構築すること、
ｂ)該ライブラリーを、該転写因子を含む一つもしくはそれ以上の哺乳動物細胞に導入すること、および
ｃ)該ライブラリーを含む該細胞の特定の表現型を同定および単離すること、ならびに該ライブラリーから該表現型を授与する役割を果たすＤＮＡもしくはｃＤＮＡフラグメントを同定すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子発現の分野、特に二重鎖ＲＮＡによる哺乳動物細胞中で遺伝子発現の阻害に関する。二重鎖ＲＮＡ技術は遺伝子機能の決定および疾患処置のための治療法の開発を含む幅広い応用を有している。
【背景技術】
【０００２】
過去数年間に、核酸化学および遺伝子導入の進歩が、遺伝子発現の特異的発現阻害を工学設計する新しいアプローチのきっかけをもたらした。アンチセンス技術は、遺伝子特異的阻害を達成するためのプロトコールにおいて最も一般的に記述されているアプローチである。アンチセンス戦略においては、興味のある遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに相補的な単鎖核酸を細胞内に導入する。アンチセンスに基づくアプローチによる幾つかの困難は、送達、安定性、および用量要求性に関する。一般的に、細胞は単鎖核酸の取り込み機構を有していないで、したがって非修飾単鎖物質の取り込みは極めて非効率的である。細胞内に取り込まれるのを待っている間に、単鎖物質は分解を受けやすい。アンチセンス技術は単鎖物質が相対的に高い濃度(内在性ｍＲＮＡの濃度と同じかもしくはそれ以上)で蓄積することを要求するので、送達されるために必要とされる量が効率に対する主要な制約である。その結果、アンチセンス技術開発における努力の多くが、ヌクレアーゼによる消化に対して安定でかつ細胞内に容易に拡散できる両方であるところの修飾核酸の製造に焦点を置いてきた。遺伝子治療もしくは他の全身投与のためのアンチセンス技術の使用は、大量のオリゴヌクレオチドを非天然アナログから合成する必要のあること、そのような合成の経費、ならびにたとえ高用量でもそれぞれの細胞内に単鎖物質の十分に高濃度でかつ均一なプールを維持するのが困難なため、限定されている。
【０００３】
三重鎖技術の使用はまた、遺伝子発現阻害に対して提唱されており、これは特定の核酸集団が三重鎖構造を採用するという稀な活性に依存したアプローチである。生理的条件下では、核酸は、実質的に全て単鎖もしくは二重鎖であり、三重鎖構造をとることはあったとしても稀である。しかしながら、特定の簡単なプリンもしくはピリミジンに富む配列がインビトロで三重鎖構造を形成することができることがしばらく前から知られている。このような構造は一般的には、生理的条件下では非常に一過性であるので、三重鎖構造を生産するようにデザインした非修飾核酸の単純な送達は効果的ではない。アンチセンスと同様に、インビボでの使用のための三重鎖技術の開発は、インビボでより安定でかつ細胞によってより容易に吸収される修飾核酸の開発に焦点を当ててきた。この技術開発のもう一つの目標は、三重鎖物質の形成が生理的ｐＨで効率的に進行する修飾核酸を製造することであった。
【０００４】
標的遺伝子サイレンシングを達成するための有望な技術は、転写後遺伝子サイレンシングもしくはＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)と呼称される応答を惹き起こす二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)に基づく。二重鎖ＲＮＡは、線虫、ショウジョウバエ、トリパノゾーマ、黴、植物を含む多数の異なる生物種に導入されてきた。例えば、ＷＯ９９３２６１号を参照されたい。哺乳動物において、特にマウス卵母細胞および胚においても、若干の限定的な成功が実証されている。適切なｄｓＲＮＡの導入は配列特異的様式で遺伝子発現を阻害するが、これは遺伝子機能研究用の遺伝的ツールとして、C． elegansおよびD． melanogasterで広く用いられてきた効果である。例えば、００/０１８４６は、ｄｓＲＮＡ阻害を用いて遺伝子機能を特徴づける方法を記述している。しかしながら、ｄｓＲＮＡ阻害を哺乳動物のシステムに応用して成功した例は殆ど無い。
【０００５】
哺乳動物のシステムでＲＮＡｉを達成しようと試みた文献での報告がある。成功した報告の一つでは、ｄｓＲＮＡを着床前のマウス卵母細胞に注入しレポーター遺伝子もしくは内在性遺伝子の機能を干渉させた(Wianny and Zernicka-Goetz(2000) Nature Cell Biology 2:70-75)。修飾型の緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を発現するトランスジェニックマウスの系統を用いて、修飾ＧＦＰに対応するｄｓＲＮＡを卵母細胞にマイクロインジェクションすることにより、ＧＦＰ発現を特異的に抑制することを実証した。マウス胚におけるＧＦＰ発現のサイレンシングは着床後６.５日までに観察された。加えて、母親性に発現するｃ−ｍｏｓもしくは接合体性に発現するＥ−カドヘリンに対するｄｓＲＮＡをマウスの卵母細胞もしくは接合体にマイクロインジェクションすると、それぞれ減数第二分裂中期での分裂中止もしくは発生の撹乱を誘発することが示された。もう一つの報告(Svoboda et al. (2000) Development 127, 4147-4156)は、卵母細胞に特異的ｄｓＲＮＡをマイクロインジェクション後に、休止中の母親性ｍＲＮＡ(Ｍｏｓと組織プラスミノーゲンアクチベーター)の選択的減少を記載している。
【０００６】
しかしながら、Caplenらは哺乳動物組織培養において特異的なｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングの証拠を認めなかった(Caplen et al., (2000) Gene 252:95-105)。レポータープラスミドＤＮＡをその対応するｄｓＲＮＡと共にヒト胚性腎細胞(ＨＥＫ  ２９３)もしくはベビーハムスター腎臓細胞ＢＨＫ２１に一過性同時導入を行っても、レポーター遺伝子の発現に対して影響しない(ＨＥＫ  ２９３)かもしくは発現の非特異的減少(即ち遺伝子配列に依存しない)をもたらした。加えて、β−Ｇａｌを発現するレトロウイルスで形質導入したマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｄｓＲＮＡを形質移入しても、レポーター遺伝子発現の検出可能な低下をもたらさなかった。逆に、Caplanらは、培養ショウジョウバエ細胞においてｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを視覚的に示すことができた。
【０００７】
かくして、ＲＮＡｉは非哺乳動物のシステムでは広く用いられてきているけれども、ｄｓＲＮＡ阻害を哺乳動物システムに応用しても、僅かに限定的な成功しか収めていない。非脊椎動物システムは生物機能の解析に貴重なツールを提供するけれども、哺乳動物システムにおける遺伝子機能評価のための一般的なシステムが有利であり、ならびにｄｓＲＮＡ阻害に依存性の治療法の開発を行うことを可能にするであろう。
【０００８】
発明の要約
本発明は、哺乳動物細胞がマウス接合体ではないという条件で、哺乳動物細胞を少なくとも部分的に二重鎖のリボ核酸を有し標的遺伝子に少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸に曝露させることにより、標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。標的遺伝子は、内在性遺伝子、がん遺伝子、導入遺伝子、ウイルス遺伝子もしくは任意の感染性生物由来の遺伝子であってもよい。
【０００９】
本発明の方法は、胚性幹細胞、細胞株およびがん細胞を含む任意の哺乳動物細胞で用いられることができる。プロテインキナーゼＲおよびＲｎａｓｅ  Ｌは、一部の哺乳動物細胞株において標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡと組み合わせたこれらの遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡの使用により好都合に阻害され得る。
【００１０】
阻害のために用いるリボ核酸は少なくとも部分的に二重鎖の性格を有するであろうが、完全に二重鎖であってもよい。ＲＮＡは自己相補的な単鎖であってもよく、または２個もしくはそれ以上の分離した相補鎖を含んでもよい。リボ核酸はまた、修飾されたヌクレオチド残基を含有していてもよい。ＲＮＡは、細胞の中もしくは外で合成されることができる。例えば、それは細胞内で内在性プロモーターの制御下に転写されてもよく、もしくは発現ベクターの産物であってもよい。発現ベクターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターもしくはＲＮＡをコードする核酸に機能し得るように結合された組織特異的プロモーターを含んでもよい。発現ベクターはまた、レポーター遺伝子に機能し得るように結合されたプロモーターを含んでもよく、そこではプロモーターは、第二のプロモーター、双方向性プロモーター、もしくはポリシストロンメッセージを駆動するプロモーターからなる群から選択される。
【００１１】
かくして、ＰＫＲ、およびＲＮＡｓｅ  Ｌ、２',５'オリゴアデニル酸サイクラーゼ、Ｍｘタンパク質の一つもしくはそれ以上に対応するｄｓＲＮＡ分子をコードする配列、ならびに興味のある(即ち、興味のある標的遺伝子に特異的な)ｄｓＲＮＡをコードする核酸を含有する発現構築物が、本発明によりまた提供される。
【００１２】
また、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量で、標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡを哺乳動物細胞内に導入もしくは発現させるための手段を含む、細胞内の標的遺伝子発現を阻害する試薬を含有するキットが提供される。
【００１３】
本発明はまた、ｄｓＲＮＡにより仲介される遺伝子サイレンシングを示すところの胚性幹(ＥＳ)細胞、ならびに本発明の胚性幹細胞から生産されるところのヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を含む、哺乳動物の細胞を提供する。
また、ｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子阻害を示すＥＳ細胞もしくはｄｓＲＮＡを対象に投与することによる疾患もしくは異常を処置する方法も本発明により提供される。
【００１４】
また、ｄｓＲＮＡを細胞に投与することにより、機能未知のＤＮＡ配列の機能をアサインする方法および細胞に特定の表現型を授与する役割を果たすＤＮＡを同定する方法が提供され、これらの方法はハイスループット技術に適用できる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞内で遺伝子発現の標的特異的阻害を誘導するために二重鎖ＲＮＡを成功裏に使用している。本発明以前には、特異的なｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングは、マウス卵母細胞および接合体へのマイクロインジェクション以外では、哺乳動物システムでは成功していなかった。かくして、その最も広い態様において、本発明は、少なくとも部分的に二重鎖の性質を有している核酸に、細胞内での遺伝子発現を阻害するのに十分な量で、哺乳動物細胞を曝露させることにより、標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【００１６】
核酸は典型的には、二重鎖の形状で興味のある標的遺伝子の一部に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％〜９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するリボ核酸(ＲＮＡ)であるであろう。好ましい阻害用ＲＮＡ分子は、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは少なくとも２０個の連続した塩基、さらに好ましくは少なくとも２５個の連続した塩基に亘って標的遺伝子の一部と同一な配列を含む。しかしながら、標的配列に比して挿入、欠失、および単一点突然変異を持つＲＮＡ配列もまた阻害に有効なようにデザインされることができて、遺伝子変異、多形性、もしくは進化的発散により予想されるかもしれない配列変化を可能にする。遺伝子発現は、ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列が阻害の標的となる点で、配列特異的様式で阻害される。
【００１７】
化学合成および投与が容易なように、ＲＮＡは好ましくはその標的遺伝子に対する特異性を維持しながらもできるだけ短い方がよい。当業者に明らかなように、１８〜２０個の同一の連続したヌクレオチドは、特にヒト配列に対する特異性を達成するのに典型的に十分である。それ故に、ＲＮＡ分子の二重鎖部分は典型的には、少なくとも１８〜２５ヌクレオチド長であり、ヒト細胞での使用には典型的には１８〜２０ヌクレオチド長であり、任意に一つもしくは好ましくは二つのオーバーハングを含む。好ましくは、オーバーハングは非特異的相互作用を避けるために僅か数ヌクレオチド長、典型的には１〜１０ヌクレオチド長、好ましくはただの２〜３ヌクレオチド長である。
【００１８】
配列同一性は、当業者周知の配列の比較およびアラインメントアルゴリズム(Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, およびその引用された参考文献を参照)によりならびに、ヌクレオチド配列間のパーセント差を例えば、デフォルトパラメータを用いるBESTFITソフトウエアを組み入れたSmith-Watermanアルゴリズムにより計算する(例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group)ことにより最適化され得る。これに代えて、より長い配列については、標的遺伝子の転写物の一部とハイブリダイズする(例えば４００ｍＭ  ＮａＣｌ，４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６.４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０℃もしくは７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーション、次いで洗浄)能力のあるヌクレオチド配列として、ＲＮＡの二重鎖領域を機能的に規定してもよい。配列同一性の程度を決定するために使用する核酸の長さはＲＮＡの二重鎖部分の長さに依存し、それ故に少なくとも１８個、少なくとも２０個、２５個、もしくはそれ以上の塩基長であろう。ＲＮＡ配列は好ましくは、エキソン配列(特に標的遺伝子のｍＲＮＡ配列)と同一性を有するように選ばれる。
【００１９】
二重鎖ＲＮＡは、自己相補的ＲＮＡ鎖(逆方向リピートを有する転写物のように)により、または２つもしくはそれ以上の相補的なＲＮＡ鎖により形成されてもよい。ＲＮＡ二重鎖形成は細胞の中もしくは外で開始されてもよい。ＲＮＡは、細胞あたり少なくとも１コピーの送達を可能とする量で、応用に依存して、好ましくは細胞あたり５、１０、１００、５００もしくは１０００個で導入される。本発明は、標的遺伝子のｄｓＲＮＡ仲介性阻害が用量依存的であり得て、それ故に導入される量は所望の効果に依存しそして経験的に容易に決定され得ることを実証している。
【００２０】
核酸は、ヌクレオチドもしくは、例えば、特にＲＮＡが細胞に送達され細胞によって生産されるのではないときには、ｄｓＲＮＡを分解から安定化させるために、リボ核酸において天然に生じるもの以外の連結物を含んでもよい。かくして、一つもしくはそれ以上の修飾された(即ち、合成もしくは非天然の)ヌクレオチドを含むところのオリゴリボヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを使用することができる。通常、核酸中のヌクレオチドモノマーは、ホスホジエステル結合もしくはそのアナログにより連結される。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ペプチド、および類似の連結が挙げられる。当業者は、使用する試薬は市販されていること、オリゴヌクレオチドについては市販の装置を用いて調製できることを認識するであろう。好ましくは、二重鎖ＲＮＡは、細胞により適切に加工させかつ標的遺伝子を効率よく阻害させるリボヌクレオチド単位もしくは他のヌクレオチド単位を含むであろう。
【００２１】
本発明が哺乳動物細胞培養においてｄｓＲＮＡｉを効果的に実施する方法を開発したので、ｄｓＲＮＡｉは、興味のある遺伝子の標的特異的阻害のために数多くの哺乳動物細胞タイプに応用できると期待される。かくして、細胞は、内部細胞塊、胚体外外胚葉もしくは胚性幹細胞からの細胞、全能性もしくは多能性、分裂性もしくは非分離性、不死化もしくは形質転換された実質組織もしくは上皮組織、等であってもよい。細胞は幹細胞もしくは分化細胞であってもよい。分化した細胞種としては、脂肪細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、心筋細胞、内皮細胞、樹状細胞、ニューロン、グリア、肥満細胞、血液細胞、および白血球(例えば、赤血球、巨核球、Ｂ、Ｔ、およびナチュラルキラー細胞のようなリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、顆粒球)、上皮細胞、角質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、幹細胞、および内分泌および外分泌腺の細胞、ならびに感覚細胞が、挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
上述のように、ＲＮＡ干渉は、マウス卵母細胞(ハプロイドゲノム)および接合体(受精後)において実証されており、そのような実施態様は本発明に包含されることを意味しない。本明細書において使用されるように、用語「再生可能な」は、細胞培養もしくはインビボのどちらかにおいて分裂してそれら自身の複製を生産する能力があるところの哺乳動物細胞およびその子孫を指す。以下の実施例は胚細胞株および胚性幹細胞を用いて発明を実証するが、本発明の方法は多様な哺乳動物細胞株に応用可能であることが今や期待されているので、本発明はそのように限定されるものではない。
【００２３】
場合によっては、分化細胞でしばしば活性を有する経路である、プロテインキナーゼＲ(ＰＫＲ−ＮＣＢＩ登録番号第ＸＭ００２６６１号)および／もしくはアポトシスをもたらすことができるインターフェロン経路(Lee, 1994; Lee, 1996)を阻害することが有利かもしれない。これは今や、ＰＫＲおよび／もしくはＲＮＡｓｅ  Ｌの阻害に特異的な阻害性ＲＮＡ二重鎖を導入することにより、また任意にＭｘタンパク質をも阻害することにより(Fuji et al. (1999) Virus Res. 65:175-185)、容易に達成されることができる。当業者は、ＲＮＡｓｅ  Ｌ(ＮＣＢＩ登録番号第ＡＦ２８１０４５号もしくはヒトの同等品)は、ＲＮＡｓｅ  Ｌ活性化を惹き起こす一つもしくはそれ以上の２',５'オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子(２-５ＡＳ；例えば、ＮＣＢＩ登録番号第ＮＭ００６１８７号)を例えば本明細書に説明するｄｓＲＮＡｉを用いて阻害することにより間接的に阻害され得ることを認識するであろう。また当業者に明らかなように、ＰＫＲ(例えば、カスパーゼ８の化学的阻害剤、Gil and Esteban, 2000, Oncogene 19:3665-74)もしくはＲＮａｓｅ  Ｌの特異的な化学的阻害剤の使用のような他の方法論をそれぞれ用いて、ＰＫＲおよび／もしくはインターフェロン経路を阻害することができる。
【００２４】
ＲＮＡはインビボもしくはインビトロのいずれで合成されてもよい。細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼはインビボでの転写を仲介してもよく、またはクローン化したＲＮＡポリメラーゼをインビボもしくはインビトロの転写に使用することもできる。インビボでの導入遺伝子からの転写には、所望のＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡに機能し得るように結合された少なくとも一つの調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーならびにアクセプターおよびポリアデニレーションシグナル)を含む発現構築物を用いて、ＲＮＡ鎖(もしくは複数鎖)を転写することができる。プロモーターは殆ど任意の起源のものでよい。好ましいものは、ＳＶ４０、ベータ−アクチン、メタロチオネイン、Ｔ７、ポリヘドリン、およびサイトメガロウイルスのプロモーターのような、選ばれた宿主細胞中で活性であるところのプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または例えば、ある臓器もしくは細胞種を標的とした阻害が可能な組織特異的プロモーターであってもよく；または転写が環境条件(例えば、感染、ストレス、温度、化学的誘発剤)による刺激で誘導されるようにしたり；および／もしくはある発生の段階もしくは年齢で転写を工学設計してもよい。これに代えて、当業者周知のように、ノックイン構築物を用いて、内在性プロモーターの制御下に興味のある核酸を転写することができる。また、修飾されたまたは非修飾のＲＮＡを手動もしくは自動化反応により化学的または酵素的に合成することができる。ＲＮＡを、細胞のＲＮＡポリメラーゼもしくはバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ(例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６)により合成してもよい。
【００２５】
発現ベクターはまた、宿主内での自律増殖を可能にする配列、ベクターを含有する細胞が選択されることを可能にする遺伝形質をコードする配列、およびＲＮＡの転写効率を増加させる配列を含有してもよい。安定な長期ベクターは、ウイルスの調節エレメントを用いて自由複製実体として維持されることができる。また、ベクターをゲノムＤＮＡの中に組み込み、このようにして転写物が連続的に生産されるようにした細胞株を生産することができる。
【００２６】
かくして、発現ベクターは、レポーター遺伝子(例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ)のようなプロモーター、マーカー遺伝子(例えば、抗生物質抵抗性を発現するもの、もしくは栄養要求性宿主変異株の場合では宿主の障害を補完する遺伝子)の形質発現により形質転換体の選択を容易にする選択的遺伝子マーカー、もしくはＰＫＲ、ＲＮＡｓｅ  Ｌ、２−５ＡＳおよびＭｘファミリーのタンパク質をコードするような他の有用な配列に機能し得るように結合されたさらに別の配列をさらに含有することができる。
【００２７】
核酸は、例えば、核酸を含有する溶液の注入、核酸で覆われた粒子による射撃、核酸を含有する溶液への細胞もしくは臓器の浸漬、もしくは核酸存在下での細胞膜のエレクトロポレーションなどの物理的方法を含む、遺伝子工学における様々な標準的方法により細胞内に導入されることができる。核酸送達のために特に好ましい方法はエレクトロポレーションの使用である。これに代えて、ウイルス構築物は、細胞内への発現構築物の効率的導入と発現構築物によりコード化されたＲＮＡの転写の両方を達成する。脂質仲介型送達システム、燐酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン形質導入のような化学的に仲介される輸送、等のような核酸の導入のための当分野で知られた他の方法を、当業者に明らかなように、用いることもできる。かくして、ＲＮＡは、以下の活性：細胞によるＲＮＡ取り込み促進、二重鎖のアニーリングの促進、アニール化した鎖の安定化、Ｒｎａｓｅ  Ｌ、ＰＫＲもしくはタンパク質ＭｘまたはｄｓＲＮＡの遺伝子特異的作用を阻害する任意の他のタンパク質の阻害、または疾患／病態の阻害もしくは予防の増強、の一つもしくはそれ以上を実行する成分と一緒に導入されてもよい。形質導入された宿主細胞を細胞培養の標準的方法により培養することができる。
【００２８】
遺伝子発現に対するｄｓＲＮＡの作用は、本発明による処置を受けていない細胞と比較するときに、少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、９９％もしくはそれ以上だけ阻害されている標的遺伝子の発現を典型的にはもたらす。より低用量の投与物質、細胞内のｄｓＲＮＡのより低濃度および／もしくはｄｓＲＮＡの投与後の長時間は、より低レベルの阻害および／もしくはより少ない割合の細胞(例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％もしくは９５％)をもたらし得る。しかしながら、所望の結果を与えるように諸条件を適合させることは当分野の技術の範囲内である。遺伝子発現の定量は、細胞内の標的遺伝子産物の量を評価することによって設定される。例えば、標的遺伝子から転写されたいかなるｍＲＮＡもハイブリダイゼーションプローブ、もしくはＲＴ−ＰＣＲに基づく方法論により検出することができて、または翻訳されたポリペプチドはコード化されたポリペプチドに対して育成された抗体により検出され得る。
【００２９】
本明細書に開示するように、本発明はいかなるタイプの標的遺伝子もしくはヌクレオチド配列にも限定されない。例えば、標的遺伝子は、細胞性遺伝子、内在性遺伝子、がん遺伝子、導入遺伝子、もしくは翻訳性および非翻訳性ＲＮＡを含むウイルス遺伝子であってもよい。好ましくは、標的遺伝子は以下のクラスの可能な標的遺伝子に例証されるように細胞性遺伝子であるが、これらは単に例示目的で列挙するものであり限定的なものと解釈されるべきではない：これらは転写因子および発生遺伝子(例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害因子、Wntファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、Winged  helixファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、増殖／分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体)；がん遺伝子(例えばＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭＩ、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＫＰ２、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、およびＹＥＳ)；腫瘍抑制遺伝子(例えば、ＡＰＣ、ＢＲＡＩ、ＢＲＣＡ２、ＣＴＭＰ、ＭＡＤＨ４、ＭＭＣ、ＮＦＩ、ＮＦＺ、ＲＢＩ、ＴＰ５３およびＷＴＩ)；ならびに酵素(例えば、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロフォスファターゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、シクロオキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、インテグラーゼ、インシュリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡおよび／もしくはタンパク質成分を含むテロメラーゼ、およびトポイソメラーゼ)である。
【００３０】
代謝経路の一つもしくはそれ以上の箇所で酵素を、もしくは病因に関与する遺伝子を阻害することにより作用を増強し得る：それぞれの活性は影響を受け、そして作用は複数の異なる成分を標的とすることにより増強され得る。代謝をまた、経路のフィードバック制御の阻害もしくは望ましくない代謝副産物の生産の阻害により操作することができる。
【００３１】
それ故に、ｄｓＤＮＡを、インビトロもしくはエクスビボの細胞で使用し、次いで治療効果を得るために動物の中に入れることができて、またはインビボでのｄｓＲＮＡ投与による直接的な処置に使用することができる。それ故に、典型的には標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡを、ＰｋｒおよびＲＮＡｓｅ  Ｌ経路を阻害する手段と一緒に、細胞に導入することによる遺伝子療法の方法が想像される。処置を要する疾患もしくは異常を惹き起こすことが知られている任意の標的遺伝子も使用できる。例えば、ホーミングウイルスベクター、腫瘍特異的プロモーターを用いて、もしくは腫瘍特異的遺伝子(例えばテロメラーゼ)およびがん遺伝子を阻害するのに有効なｄｓＲＮＡ分子を設計することにより、腫瘍細胞を標的とすることができる。処置は、疾患に伴う症状の軽減もしくは回避または病態に関連した臨床的適応を含み、そしてこれは予防的医療を含んでもよい。さらに好ましい実施態様は、所望の標的遺伝子を阻害するために、ｄｓＲＮＡで処置したＥＳ細胞を対象に投与することに関する。
【００３２】
病原体由来の遺伝子(即ち、非細胞性遺伝子)も阻害の標的とし得る。例えば、その遺伝子は宿主の免疫抑制を直接惹き起こすことができたり、または病原体の複製、病原体の感染、もしくは感染の維持に必須であってもよい。ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、インフルエンザ感染、マラリア、肝炎、マラリア原虫、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルス、および口蹄疫ウイルスのような病原体により感染のリスクのある細胞もしくは既に感染した細胞を標的として、本発明にしたがってＲＮＡを導入することにより処置することができる。標的遺伝子は、宿主への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製もしくは組み込み、宿主内での感染の確立および拡散、または次世代病原体のアセンブリーに関与する病原体または宿主の遺伝子であってもよい。予防(即ち、感染の防止もしくは感染リスクの軽減)の方法ならびに感染に伴う諸症状の頻度もしくは重症度の低減も想像され得る。
【００３３】
本発明はまた、二重鎖ＲＮＡを用いて以前知られていなかった(もしくは認識されていなかった)機能を有する標的遺伝子の活性を阻害することを含む生物中で遺伝子機能を同定する方法を提供する。遺伝的スクリーニングによる時間がかかり労の多い変異体分離の代わりに、機能的ゲノミクスは、本発明を用いて標的遺伝子の活性の量の低下および／もしくはタイミングの変更を行うことによる未特定化遺伝子の機能決定を想像させるであろう。本発明は、医薬品の潜在的標的の決定、発生に関与する正常および病理的事象の理解、出生後の発達／加齢に責任のあるシグナル経路の決定、等に使用されることができるであろう。ヒトゲノムを含むゲノムおよび発現された遺伝子源から得られた核酸配列情報は、本発明と組み合わせて、哺乳動物システム、特にヒト細胞培養システムにおける遺伝子機能を決定することができる。推定上のオープンリーディングフレームは、当業者に明らかなように、コンピューター援用検索技術を用いてデータベースとして使用可能なヌクレオチド配列から決定されることができる。このような技術は、哺乳動物システムでの優先的なコドン使用、および関連遺伝子産物(恐らく非哺乳動物の配列も含めて)もしくは機能既知の遺伝子との相同性の検索を考慮に入れ得る。
【００３４】
かくして、本発明の一つの態様では、ＤＮＡ配列に機能をアサインする方法が提供されて、そこでは所望のＤＮＡ配列の細胞性相同体の遺伝子発現を阻止するのに十分な量において、上述のように少なくとも部分的に二重鎖のリボ核酸の性質を有し、所望の機能未知のＤＮＡ配列と少なくとも６０％の配列同一性(好ましくは１００％同一性)を有する核酸に哺乳動物細胞を曝露して、野生型と比較した哺乳動物細胞の表現型を同定し、そしてその表現型を所望の核酸にアサインする。ｄｓＲＮＡ、細胞、他の材料および条件は上述のものであることに留意すべきである。
【００３５】
単純なアッセイは、発現配列タグ(ＥＳＴ)から得られる部分配列にしたがって遺伝子発現を阻害することであろう。成長、発達、代謝、疾患抵抗性、もしくは他の生物学的過程における機能の変化は、ＥＳＴの遺伝子産物の正常な役割を示すであろう。データベーススクリーニングで機能既知のタンパク質との相同領域が見出されれば、その機能に基づいたさらに特異的な生化学的試験を用いて、ＥＳＴ配列の機能(もしくはその阻害)を試験することができる。
【００３６】
標的遺伝子を含有するインタクトな細胞にＲＮＡを導入することは容易なため、本発明をハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に使用することができる。例えば、二重鎖ＲＮＡを、標的細胞由来の任意の遺伝子ライブラリーの挿入体に隣接するプライマーを用いて増幅反応を行うことにより生産することができる。挿入体をゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ(例えば、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ)より誘導し得る。ライブラリーからの個別のクローン(もしくはそのプール)を複製し次いで分離反応により単離することができるが、好ましくはライブラリーを個別の反応容器(例えば９６穴マイクロタイタープレート)内に維持して、本発明の実施に必要なステップの数を最小限に留めかつ方法の自動化を可能にする。異なる発現遺伝子を阻害する能力のある二重鎖ＲＮＡを含有する溶液をマイクロタイタープレート上に規則的に並べられている個別のウエルの中に入れ、それぞれのウエル中のインタクトな細胞を標的活性阻害による挙動もしくは発生の変化もしくは修飾に関して、もしくはプロテオミクス、ゲノミクス、および標準的な分子生物学のテクニックによりアッセイすることができる。これに代えて、二重鎖ＲＮＡをライブラリー生産に用いられた発現構築物からのインビボもしくはインビトロの転写により生産することができる。構築物をライブラリーの個別のクローンとして複製し、転写して、ＲＮＡを生産する；それぞれのクローンを次いで標的遺伝子を含有する細胞に導入する。標的遺伝子の機能を、遺伝子活性が阻害されたときの細胞に及ぼす作用からアッセイすることができる。このスクリーニングは哺乳動物由来の組織培養細胞に特に適している。
【００３７】
好都合には、調節されるプロモーターに応答して比色、蛍光、もしくは発光シグナルを生じる細胞(例えばレポーター遺伝子構築物を形質移入したもの)をハイスループットフォーマットでアッセイして、プロモーターを調節するＤＮＡ結合タンパク質を同定することができる。アッセイの最も単純な形では、負の調節因子の阻害はシグナルの増加をもたらし、そして正の調節因子の阻害はシグナルの減少をもたらす。
【００３８】
かくして、プロモーターに対してｃＤＮＡもしくはＤＮＡの転写を開始する能力のある方向に対して適切なベクターに入れた所望の細胞のＤＮＡのｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを一つもしくはそれ以上の哺乳動物細胞に導入して二重鎖(ｄｓ)ＲＮＡを供給し、細胞をクローニングして、特定の細胞表現型をライブラリー由来の特定のＤＮＡもしくはｃＤＮＡフラグメントに関連づけることにより、細胞の中に特定の表現型を授与する責任があるＤＮＡを同定する方法が提供される。
【００３９】
本発明は必須遺伝子の阻害を可能にするのに有用であり得る。そのような遺伝子は、発生の特定の段階における細胞もしくは生物の生存または細胞コンパートメントに必要であろう。機能的に同等な条件突然変異は、生存に必要でない場合における標的遺伝子の活性を阻害することにより生産され得る。本発明は、標的ゲノム中に永続性の変異を導入することなく、生物の発生の特定の時期におよび部位にＲＮＡの添加もしくは発現を可能にする。
【００４０】
もしさらに別のスプライシングが、特徴的なエキソンの使用により識別される転写物のファミリーを生産したならば、本発明は、適切なエキソンを介してファミリーメンバーの機能を特異的に阻害もしくは識別するために阻害の目標を定めることができる。例えば、さらに別のスプライシングを受けた膜貫通ドメインを含有するホルモンは、膜結合型および分泌型の両方で発現され得る。膜貫通ドメインより前で翻訳を停止するナンセンス変異を単離する代わりに、膜貫通ドメインを含有するエキソン(即ち膜貫通ドメインをコードする配列)を標的とし、それにより膜結合ホルモンの発現を阻害することにより、分泌されたホルモンだけを有する機能的配列を本発明にしたがって決定することができる。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、ＰＫＲおよびＲｎａｓｅ  Ｌに特異的なｄｓＲＮＡの発現を任意に可能にする発現カセットを含む胚性細胞株もしくは細胞株のような安定な細胞株を用いて、標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡの存在下もしくは非存在下における特異的転写パターンを評価することができる。ノザンｍＲＮＡ分析もしくはマイクロアレー分析を用いて、標的遺伝子が任意の与えられた細胞株で発現しているか否かを決定することができる。もし標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡが特定の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが示されるならば、次いで生化学的アッセイを用いて、標的遺伝子と発現の変化した遺伝子との間の直接もしくは間接的な関連を確認することができる。当業者によりこのシステムのバリエーションを想像されることができて、例えば、標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡの存在下での発現変化を非特異的なｄｓＲＮＡの存在下の発現変化と対比して追跡することにより、もしくは興味のある遺伝子を発現している細胞株における発現の変化を興味のある遺伝子を発現していない細胞株における発現の変化と対して追跡することによりされることができる。
【００４２】
本発明はまた、遺伝子機能研究のためのトランスジェニック非ヒト動物モデルの生産、候補医薬品化合物のスクリーニング、および潜在的治療法の評価を提供する。本発明の動物モデルとしての使用に適した動物種としては、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ならびにサルおよびチンパンジーのようなヒト以外の霊長類が、挙げられるが、これらに限定されない。。初期の研究としては、トランスジェニックマウスおよびラットは、維持が比較的容易であることと寿命がより短いことのために、極めて望ましい。より長期間の研究には、ヒト以外の霊長類が望ましいであろう。
【００４３】
機能喪失表現型を持つトランスジェニックマウスの創出は好ましく、そのためにはｄｓＲＮＡを培養胚性幹細胞中に導入して、トランスジェニックマウスを創成するのに使用することができる。本明細書の開示において、“機能喪失”は、トランスジェニック動物もしくは細胞であるか否かを問わず、低次形態表現型を含む。一般的には、トランスジェニック動物を創成する技術は広く受け入れられておりかつ実施されている。例えば、マウス胚の操作法の実験マニュアルは入手可能であって、トランスジェニックマウス生産のための標準的な実験技術が詳述されている(Hogan et al., 1986)。好ましい方法では、胚性幹細胞、好ましくはＰＫＲ、ＲＮａｓｅ  Ｌおよび興味のある遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡを発現するカセットで安定的に形質転換し、そしてレポーターおよび／もしくは選択マーカーを発現する胚性幹細胞を選別して細胞培養で拡張させた後、偽妊娠雌性マウス中に移植する。当業者に明らかなように、類似の方法を用いて、他のトランスジェニック動物を使用することができる。
【００４４】
本発明はまた、被検試料もしくは対象にインビトロもしくはインビボでｄｓＲＮＡを導入するのに必要な少なくとも一つの試薬、または哺乳細胞中における標的遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ発現用構築物を含むキット、を提供する。キットは、標的遺伝子の発現を阻止するのに十分な量のリボ核酸(ＲＮＡ)を哺乳動物細胞に導入する手段を含み、そこではＲＮＡは少なくとも部分的に二重鎖の構造、および上述のように標的遺伝子の部分と比較して特異性を付与するのに十分なヌクレオチド配列同一性を有している。好ましいキットは、興味のある標的遺伝子の少なくとも一部に対応するｄｓＲＮＡ、ならびにＰＫＲ、ＲＮＡｓｅ  Ｌ、タンパク質Ｍｘおよび／もしくは２−５ＡＳの少なくとも一部に対応するｄｓＲＮＡを生産する能力がある少なくとも一つの発現ベクターを含む。そのようなキットはまた、キットの使用者が本発明を実施することを可能にするための使用説明書を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明は、例示の目的だけのために、以下の実施例においてさらに説明される。本明細書の開示において言及されているが明示的に記述されていない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド化学、および免疫学の方法は科学文献に報告されており、当業者に周知である。
【実施例１】
【００４６】
マウス培養胚性幹細胞における外来性遺伝子の二本鎖ＲＮＡ仲介性サイレンシング
本実施例は、ｄｓＲＮＡ仲介性サイレンシングが哺乳動物培養細胞において誘発され得ることを実証する。便宜上、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)をｄｓＲＮＡ干渉(ｄｓＲＮＡｉ)を検討する外来性遺伝子として選択したが、これは緑色蛍光タンパク質を発現している細胞とそうでない細胞、例えば、遺伝子サイレンシングを発揮している細胞との分離に蛍光細胞分析分離装置(ＦＡＣＳ)が容易に応用できるからである。
【００４７】
マウス胚性幹細胞に、レポーターｅＧＦＰ発現プラスミドのｐβａｃｔ−ｅＧＦＰ(Ludin et al., Gene, 1996, Gene 173:101-11)を、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰもしくはｄｓＲＮＡ  ＬａｃＺ(ＧＦＰと無関係のコントロール配列)と一緒にに同時形質移入することにより、導入遺伝子ＧＦＰの発現に及ぼすｄｓＲＮＡの影響を検討した。細胞の同時形質移入後２〜３日にｅＧＦＰ陽性細胞の数をＦＡＣＳ分析により測定した。
【００４８】
ｄｓＲＮＡの調製
AmbionT7  MegaScriptキット中でｐβａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミドを鋳型として使用して、Ｔ７プロモーターを付加したＰＣＲ産物を既述の手順(Fire, 1998, Nature; Dixon, 2000, PNAS)を用いて創成した。次いで、製造業者の取り扱い説明書にしたがってＴ７付加ＰＣＲ産物を鋳型として用いて、ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ(配列番号１)およびＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧ(配列番号２)をプライマーとしてインビトロ転写を行って、ｅＧＦＰ  ＲＮＡを創成した。
【００４９】
ＬａｃＺ  ｄｓＲＮＡについてはｐｌｎｄ  ｌａｃＺ(ｌａｃＺをコードする市販の構築物)を、ｐβａｃｔ−ｅＧＦＰについて上述したのと実質的に同じようにして、ただしＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ(配列番号３)およびＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＧＣ(配列番号４)をプライマーとして用いて処理した。ＲＮＡを塩化リチウムで沈殿させ、次いでヌクレアーゼの無い水に再懸濁した。次いで、ＲＮＡを９５℃で３分間加熱することによりアニーリングし、次いで７５℃にし、引き続き徐々に(約４〜６時間)室温に冷却した。ｄｓＲＮＡ(凡そ７００塩基長)の最終濃度を２〜３ｍｇ／ｍｌに調整した。この様式で生産されたｄｓＲＮＡは、Ｔ７プロモーター配列に相当する３'オーバーハングを有している。ｄｓＲＮＡの完全性と品質を１.５％アガロース上の電気泳動により分析した。コントロール試料(ｄｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡ)の電気泳動は、ｄｓＲＮＡの移動度は対応するｄｓＤＮＡに似ているが、対応するセンスもしくはアンチセンス単鎖ＲＮＡの移動度よりも遅いことを示した。加えて、ｓｓＲＮＡと対照的にｄｓＲＮＡはＲＮａｓｅ  ＡおよびＴ１処理に抵抗性であると実証された。
【００５０】
細胞培養と核酸の形質移入
マウスの胚性幹細胞(市販品、ＥＳ  Ｅ-１４細胞)を不活化線維芽細胞のフィーダー細胞でコーティングした組織培養プレート中で、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸、非必須アミノ酸［原液の１００倍希釈、Life Technologies］および白血病抑制因子(ＬＩＦ)(１００００倍希釈、Life Technologies)を補充した１０％牛胎児血清(ＦＢＳ)含有ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ培地)中で培養した。ＥＳ細胞を下記の条件下、ｅＧＦＰもしくはＬａｃＺのｄｓＲＮＡ(３０μｇ)の有無におけるエレクトロポレーションによりｐβａｃｔ−ｅＧＦＰ(３０μｇ)で形質移入した：培地(上述)８００μｌ中に細胞１０００万個、２５０Ｖ，５００μＦ。エレクトロポレーション後、細胞を室温で１０分間インキュベートした後でＤＭＥＭ培地(上記参照)に再懸濁し、約２×１０６個／１０ｃｍプレートの細胞密度で平板培養した。培地を２４時間毎に取り替えた。
【００５１】
形質移入したおよびｄｓＲＮＡを同時形質移入した細胞の百分率、ならびにｅＧＦＰのインビボｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを、蛍光活性化細胞分離分析装置(ＦＡＣＳ、FacsCalibur, Becton Dickinson)により緑色蛍光タンパク質発現のレベルを測定することにより評価した。野生型細胞およびｐβａｃｔ−ｅＧＦＰを形質移入した細胞を用いて、前方散乱光および側方散乱光をゲートした；それぞれの試料について１００００もしくは２５０００回の事象を捕捉した。ｅＧＦＰ陽性細胞の百分率を野生型およびｐβａｃｔ−ｅＧＦＰ形質移入細胞に対してゲートすることにより測定した。平均蛍光値を蛍光の相対強度の指標に使用した。ＦＡＣＳデータの取得と解析をCELLQuest Software (Becton Dickinson)を用いて行った。
【００５２】
形質移入の２日後、ｐβａｃｔ−ｅＧＦＰを形質移入したマウスＥＳ細胞の約３０％がｅＧＦＰ陽性であった。ｄｓＲＮＡ  ＬａｃＺの同時形質移入は、ｅＧＦＰ細胞数もしくは平均蛍光レベルに何ら変化をもたらさなかった。対照的に、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰを同時形質移入したＥＳ細胞は、蛍光細胞数を大幅に減少し(約５０％)、これはコントロールおよびｄｓＲＮＡ  ＬａｃＺ同時移入細胞と比較したｅＧＦＰ陰性細胞の増加と相関した。加えて、残存ｅＧＦＰ陽性細胞の平均蛍光強度はまた、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ同時形質移入で４０％以上減少した。
【００５３】
インビボ蛍光顕微鏡分析
ＧＦＰ陽性細胞数および蛍光レベルに及ぼすｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰの作用を、増殖中のＥＳ細胞のインビボ蛍光顕微鏡検査により確認した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で同時形質移入後、６穴プレート中において酸で洗浄したカバーグラス上で増殖させた。細胞を、Leica  DM  IRBE顕微鏡に取り付けたＧＦＰ−最適化フィルターセット(ChromaTechnologies, Brattolboro, Vermont)を用いて、映像撮影時の「コールドショック」を避けるため特製の観察チャンバー(Life imaging Services, Olten, Switzerland)中３７℃で、自己蛍光のないＤＭＥＭ特別培地(Life Technologies, Basel)中で観察した。照射強度を中性濃度フィルターを用いて調整し、映像をMicroMax冷却CCDカメラ(Princeton Instruments, Trenton, NJ)およびMetamorph 4.1.5イメージングソフトウエア(Universal Imaging corporation, West Chester, Pennsylvania)を用いて１秒の露出時間で撮影した。
【００５４】
それぞれのサンプルについて、シグナル／ノイズ比を自動的に調整する、ソフトウエアに基づくスケール設定を用いて蛍光を記録し、測定して、次いでｐβａｃｔ−ｅＧＦＰを形質移入した細胞に対応するコントロール試料から得た値に対して規格化した。形質移入２〜３日後のインビボイメージングからの結果は、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰで同時形質移入した細胞のＦＡＣＳ分析から得られた結果を確認して、阻害作用はｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ存在下でのみ目視された。
【００５５】
細胞中のｅＧＦＰのレベルを抗ｅＧＦＰ抗体を用いるウエスタンブロットにより分析して、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ含有細胞におけるｅＧＦＰ発現の低下のさらなる証拠を得た。
【００５６】
これらの実験は、陽性ｅＧＦＰ細胞数と相対的ｅＧＦＰ蛍光強度の両方の大幅且つ特異的減少を実証しており、これはｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ仲介性の遺伝子サイレンシングと関連している。ｄｓＲＮＡが哺乳動物培養細胞で機能しかつｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを誘導するのに有効であることが初めて示された。
【実施例２】
【００５７】
培養胚性奇形腫細胞および非胚性細胞株におけるｄｓＲＮＡ仲介性外来遺伝子のサイレンシング
ＥＳ細胞におけるｄｓＲＮＡによる特異的遺伝子サイレンシングは、胚発生の初期段階に関与する遺伝子の研究および機能喪失トランスジェニックマウスを創成するためのツールを提供することができたが、ＥＳ細胞は不活化線維芽細胞でコーティングしたプレートを増殖に必要とし、そして培養中4〜５継代以上の間非分化状態で維持することは困難である。それ故に、技法的により厳密でない細胞タイプを用いることができれば、例えば遺伝子機能の検討にｄｓＲＮｉの使用を考える場合に特異的に便利であろう。本実施例は、取り扱いおよび増殖がより容易な胚性がん細胞株においてｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを誘導することを説明する。
【００５８】
Ｆ９およびＰ１９胚性がん細胞株および非胚性ＨｅＬａ細胞にレポーターｅＧＦＰ発現プラスミドのｐβａｃｔ−ｅＧＦＰをｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ、ｄｓＲＮＡ  ＬａｃＺ、ｄｓＲＮＡインテグリンα３およびβ１(ＧＦＰと無関係なコントロール配列)と一緒に同時形質移入することにより、細胞株における導入遺伝子ＧＦＰの発現に及ぼすｄｓＲＮＡの影響を検討した。細胞の同時形質移入の２〜３日後にｅＧＦＰ陽性細胞の数をＦＡＣＳで分析した。
【００５９】
ｄｓＲＮＡの調製
ｄｓＲＮＡを上記実施例１での説明と実質的に同じように調製した。インテグリンα３もしくはインテグリンβ１に対するｄｓＲＮＡの創成に用いるＴ７付加ＰＣＲ産物は、ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧ(配列番号５)およびＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＣＣ(配列番号６)をプライマーとして用いるインテグリンα３含有プラスミドの増幅により、ならびにＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣ(配列番号７)およびＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣ(配列番号８)をプライマーとして用いるインテグリンβ１コード化プラスミドの増幅により得た。
【００６０】
細胞培養と核酸の形質移入
Ｆ９およびＰ１９胚性がん細胞株を、ＤＭＥＭ培地＋１５％  ＦＢＳおよびＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中でそれぞれ増殖させた。ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で増殖させ、特記されないない限りＰ１９細胞と同様に処理した。Ｆ９細胞を０．１％ゼラチンをコーティングしたプレート上で維持した。Ｆ９およびＰ１９細胞を２日毎に継代して対数増殖および胚の表現形質を維持した。高レベルの生存細胞を確保するため、形質移入の２４時間前にＦ９およびＰ１９細胞を分株した。Ｆ９およびＰ１９細胞にｅＧＦＰ、ＬａｃＺ、インテグリンα３もしくはインテグリンβ１に対するｄｓＲＮＡ(３０μｇ)の有無で下記の条件でのエレクトロポレーションにより、ｐβａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミド(３０μｇ)を形質移入した：培地８００μｌ中細胞１０００万個、３３０Ｖ、５００μＦ。エレクトロポレーション後、細胞を室温で１０分間インキュベートした後でＤＭＥＭ培地(上記参照)に再懸濁し、約２×１０６個／１０ｃｍプレートの細胞密度で平板培養した。培地を２４時間毎に取り替えた。
【００６１】
形質移入したおよびｄｓＲＮＡを同時形質移入した細胞の百分率、ならびにｅＧＦＰのインビボｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを、ＦＡＣＳにより緑色蛍光タンパク質発現レベルを上記実施例１での説明と実質的に同様なように測定することによって評価した。ｐβａｃｔ−ｅＧＦＰを形質移入したＦ９もしくはＰ１９細胞の約２５％がＧＦＰ陽性であると判った。
【００６２】
Ｆ９およびＰ１９細胞では、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰのレポーターｐβａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミドとの同時形質移入は、ｅＧＦＰ発現細胞数(７０％以上だけ)およびｅＧＦＰ蛍光の相対強度(３５〜４０％だけ)の両方を強力かつｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ特異的な減少を誘導した。対照的に、ｄｓＲＮＡ−ＬａｃＺの同時形質移入は、ＧＦＰ陽性細胞数もしくはそれらの平均蛍光強度のいずれにも何の変化をもたらさなかった。インビボ蛍光顕微鏡分析を、Ｆ９細胞については酸で洗浄したカバーグラスを０．１％  ゼラチンで予めコーティングしたことを除いて、実施例１での記載と実質的に同じように行った。インビボの造影、ノザン分析およびウエスタンブロット分析の両方はｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰの特異的阻害作用を確認した。ｅＧＦＰ発現に及ぼすｄｓＲＮＡｉの遺伝子特異性をまた、インテグリンα３もしくはインテグリンβ１に対応する２つの他のｄｓＲＮＡを用いてＦ９およびＰ１９細胞においてインビボで評価した。ｅＧＦＰ陽性細胞数もしくは蛍光レベルのいずれに対する作用も特定されず、ふたたびＦ９およびＰ１９細胞における遺伝子特異的作用を支持した。
【００６３】
対照的に、ＨｅＬａ細胞にｐβａｃｔ−ｅＧＦＰとｅＧＦＰもしくはＬａｃＺに対応するｄｓＲＮＡとの同時形質移入は、配列非特異的遺伝子サイレンシングおよび細胞死を誘導することが、ｅＧＦＰ蛍光細胞が測定されないことから示された。レポーターｐβａｃｔ−ｅＧＦＰプラスミドおよびｄｓＲＮＡのＨｅＬａ細胞への同時形質移入は非常に効率が良く、これはｄｓＲＮＡ同時形質移入実験でのｅＧＦＰ陽性細胞数が、レポータープラスミドのみを受け取った細胞と比べたときに、バックグラウンドに近い(即ち１％未満)であることをＦＡＣＳ分析の結果が示していたからである。
【００６４】
ｄｓＲＮＡの作用の用量依存性をＰ１９細胞で検討した。概述すると、総ｄｓＲＮＡ３０μｇ(それぞれ、ｅＧＦＰ  ｄｓＲＮＡの３０、２０、１０もしくは０μｇとｌａｃＺ  ｄｓＲＮＡの０、１０、２０、もしくは３０μｇ)を実質的に上で説明したようにＰ１９細胞に導入した。ＧＦＰ陽性細胞数およびまたその平均蛍光強度に及ぼす阻害作用は、同時形質移入に用いたｄｓＲＮＡ−ＧＦＰの量に比例すると実証された。ｅＧＦＰ陽性細胞の相対百分率は、ｅＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ量の減少と共に３０、５０、８０から１００％へと増加した。
【００６５】
細胞への導入前に、３'オーバーハングを有する上述のＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとをアニーリングさせて調製した平滑末端を有するＧＦＰ  ｄｓＲＮＡと置換することにより、オーバーハングを含むｄｓＲＮＡで得られた７０％阻害に比較して５０％阻害の結果となった。
【００６６】
ｄｓＲＮＡ−ＧＦＰを等量のセンスもしくはアンチセンスのどちらかの方向の単鎖ＧＦＰ特異的ＲＮＡで置換すると、ｄｓ  ＲＮＡで得られた８０％阻害と比較して、作用は無い(センスＲＮＡ)か僅か３０％阻害(アンチセンスＲＮＡ)の結果となった。
【００６７】
かくして、阻害の程度は、例えばｄｓＲＮＡの量をコントロールすることにより、および平滑末端もしくはオーバーハングを有するようにｄｓＲＮＡをデザインすることにより潜在的に調整されることができる。上述のそれぞれの実施例では、形質移入／同時形質移入の方法としてエレクトロポレーションを使用したが、発明者は様々な方法を用いてｄｓＲＮＡを細胞に導入して、遺伝子サイレンシングを仲介させている。例えば、リン酸カルシウム、LipFectamine  2000およびfugene６がＦ９およびＰ１９細胞に対して使用されている。種々な結果が得られたが、典型的にはこれらの異なる方法はより少ない形質移入細胞数をもたらして、エレクトロポレーションを形質移入のための好ましい方法とした。
【００６８】
要約すれば、この実施例は、特異的なインビボでのｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングが哺乳動物の胚性細胞株において誘導され得ることを実証する。哺乳動物培養細胞においてｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを惹き起こす活性は、遺伝子の機能および調節の解明を可能にする新たなシステムを提供する。
【実施例３】
【００６９】
胚性奇形腫細胞株における内在性遺伝子のｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシング
この実施例では、ｄｓＲＮＡが内在性遺伝子発現の阻害に有効であると実証される。例示的な目的のために、二つの受容体タンパク質のインテグリンα３およびインテグリンβ１に対応するｄｓＲＮＡを選んで、単純な接着アッセイを用いて細胞表面における対応タンパク質の存在もしくは非存在をモニターした。インテグリンα３はインテグリンβ１と会合しており、細胞外マトリックス分子のラミニンへの結合に責任がある。インテグリンβ１は多数の異なるインテグリンαタイプと相互作用することができて、その結果他のタイプの細胞外マトリックス分子、例えばフィブロネクチン(インテグリンα５β１、α８β１、αｖβ１)に対する結合特異性を示す。
【００７０】
マウスインテグリンα３およびβ１に対するポリクローナル抗体およびＦＡＣＳ分析を用いて、我々はこれらのインテグリンがＦ９細胞の表面ならびにＰ１９細胞に対して存在することを示している。
【００７１】
胚性Ｆ９細胞にｐβａｃｔ−ｅＧＦＰレポータープラスミドをｄｓＲＮＡ  ＬａｃＺ(陽性コントロール)、ｄｓＲＮＡ  ｅＧＦＰ(陰性コントロール)、ｄｓＲＮＡ  α３、もしくはｄｓＲＮＡ  β１のいずれかと、ＧＦＰ陽性細胞を蛍光細胞分離装置(FACSVantage SE, Becton Dickinson)を用いて選別したことを除いて、実質的に実施例２での記載と同じようにして同時形質移入した。ＦＡＣＳデータの収集と解析はCELLQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて行った。次いで、選別したｅＧＦＰ細胞のラミニンもしくはフィブロネクチン結合能を接着アッセイを用いて試験した。
【００７２】
概述すれば、細胞の選別後ＧＦＰ陽性細胞を数え、ＦＢＳ無添加ＤＭＥＭ中で細胞密度を１００個／μｌに調整した。ラミニンもしくはフィブロネクチンの増加する量(０、１、５および１０μｇ／ｍｌ)で予めコーティングしたNunClonプレート上で、ウエル当たり凡そ１０００個の細胞をスポットした。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベーション後、非接着細胞を吸引により除去して、ウエルを接着用緩衝液(ＦＢＳ＋Ｍｇ２＋およびＣａ２＋、２ｍＭグルコースおよび１％ＢＳＡ)で１回洗浄した。次いで、細胞を３.７％ホルムアルデヒド(ＰＢＳ中)で室温１０分間固定した。固定溶液を除去し、細胞をクリスタルバイオレット溶液(２０％ｖ／ｖエタノール溶液中５％ｗ／ｖクリスタルバイオレット)で室温５分間染色した。次いで、細胞をＰＢＳで十分洗浄してから、それぞれのウエルに接着した細胞の数を数えた。
【００７３】
Ｆ９野生型および同時形質導入のコントロールで得られた値と比較するときに、ラミニンへの結合はｄｓＲＮＡインテグリンα３と同時形質移入したＦ９細胞では損なわれていたが、フィブロネクチンへの接着はごく部分的に(約４０％だけ)低下しただけであった。この結果は特異性を実証するものであるが、これはα３β１はこれらの細胞における唯一のラミニン受容体であるが、細胞はα３β１を含む幾つかのフィブロネクチン受容体を発現しているからである。加えて、Ｆ９細胞に導入されたｄｓＲＮＡβ１は、ラミニンおよびフィブロネクチンの両方に対する結合を完全に消滅させたが、これは両方の分子に対する受容体がβ１サブユニットを含有しているからである。細胞のｄｓＲＮＡ  ｌａｃＺによる処置はフィブロネクチンもしくはラミニンのいずれかに対する細胞の接着に影響がなくて、ｄｓＲＮＡの特異性のさらなる証拠を提供している。
【００７４】
要約すると、これらの実験は、ｄｓＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングが胚性細胞株において機能し、かつ内在性遺伝子に対して配列特異的であり、それにより標的遺伝子の特異的発現が他の遺伝子に妨害を及ぼすことなく消滅することを可能にすることを実証する。本明細書ではｄｓＲＮＡを形質移入した細胞の選別を可能にするためにレポーター遺伝子との同時形質移入を説明したが、レポーターの非存在下でのｄｓＲＮＡの形質移入もまた想像される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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