(57)【要約】本発明は、染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離する方法に関する。また本発明は、本発明の方法により生成されるＤＮＡ及びこのようなＤＮＡから誘導される医薬（例えばＤＮＡワクチン等）にも関する。本発明の方法は、最初にＲＮＡを消化することなく染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離するものであり、ｉ）染色体外ＤＮＡを含む細胞を溶解してライゼートを作成する工程、ｉｉ）ライゼートを清澄化する工程、及びｉｉｉ）ＲＮＡの大部分がメンブレンを通過できるようにする一方で染色体外ＤＮＡが捕捉されるような条件下で、清澄化したライゼートをタンジェンシャルフロー限外濾過にロードする工程を含む。好適な条件は、伝導率の低い濾過透析バッファー及び１０倍量を超える濾過用液を用いるものである。
2004514428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最初にＲＮＡを消化することなく染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離する方法であって、
ｉ）染色体外ＤＮＡを含む細胞を溶解してライゼートを作成する工程、
ｉｉ）ライゼートを清澄化する工程、及び
ｉｉｉ）ライゼート中に存在するＲＮＡの大部分がメンブレンを通過するようにする一方、染色体外ＤＮＡの大部分が捕捉されるような条件下で、清澄化したライゼートをタンジェンシャルフロー限外濾過にロードする工程を含む、
上記方法。
【請求項２】
清澄化したライゼートを、１０ｍＳ未満の伝導率を有する濾過透析バッファーで処理する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
濾過透析バッファーが５ｍＳ未満の伝導率を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
濾過透析バッファーが２ｍＳ未満の伝導率を有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
濾過透析バッファーが１ｍＳ未満の伝導率を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
濾過透析バッファーがｐＨ６〜１０のバッファーである、請求項２、３、４又は５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
濾過透析バッファーがＴｒｉｓバッファーである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
濾過透析バッファーが１０倍を超える交換量で使用される、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
濾過透析バッファーが２０倍を超える交換量で使用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
濾過透析バッファーが３０倍を超える交換量で使用される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
濾過透析バッファーが４０倍を超える交換量で使用される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
濾過透析バッファーが５０〜１００倍体積の交換量で使用される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＣａＣｌ２の不在下において、メンブレンが１００ＫＤａ〜１０００ＫＤａの分子量カットオフを有し、かつ染色体外ＤＮＡが２Ｋｂ〜２００Ｋｂである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
メンブレンが３００ＫＤａ〜５００ＫＤａの分子量カットオフを有し、及び染色体外ＤＮＡが２Ｋｂ〜５０Ｋｂである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＣａＣｌ２の存在下において、メンブレンが５００ＫＤａ未満の分子量カットオフを有し、及び染色体外ＤＮＡが２Ｋｂ〜２００Ｋｂである、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
メンブレンが３００ＫＤａ未満、より好ましくは約１００ｋＤａの分子量カットオフを有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
メンブレンが、ポリエーテルスルホン、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリアミド、変性ＰＥＳ、ポリビニリジンピロリジン、ポリフッ化ビニリジン（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース及び三酢酸セルロースからなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
メンブレンがポリエーテルスルホンメンブレンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
メンブレンがスクリーンチャンネルと一緒に用いられる、請求項１〜１８のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
スクリーンチャンネルがＴスクリーンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
膜間圧力差１０ｐｓｉ未満で行われる、請求項１〜２０のいずれか記載の方法。
【請求項２２】
５００Ｋメンブレンの場合は１００ｍｇ／ｆｔ２未満及び３００Ｋメンブレンの場合は３０ｍｇ／ｆｔ２未満の量で染色体外ＤＮＡがメンブレンにロードされる、請求項１〜２１のいずれか記載の方法。
【請求項２３】
得られるＤＮＡがライゼート中に存在するＲＮＡの５０重量％未満である、請求項１〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
得られるＤＮＡがライゼート中に存在するＲＮＡの１０重量％未満である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
得られるＤＮＡがライゼート中に存在するＲＮＡの５重量％未満である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
得られるＤＮＡがライゼート中に存在するＲＮＡの２重量％未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
得られるＤＮＡがライゼート中に存在するＲＮＡの１重量％未満である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
限外濾過工程と組み合わせて１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程が用いられる、請求項１〜２７のいずれか記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上の精製もしくは仕上工程が限外濾過工程の前に行われる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の精製もしくは仕上工程が限外濾過工程の後に行われる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程が、内毒素、タンパク質、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡのうちの１種以上を除去するためのものである、請求項２８、２９又は３０のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程がクロマトグラフィー工程を含む、請求項２８、２９、３０又は３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィー工程がイオン交換もしくはヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー工程である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
クロマトグラフィー工程がイオン交換クロマトグラフィー工程である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
クロマトグラフィー工程がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程がｐＨ７．３〜８．３で行われる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程がｐＨ７．６〜８．０で行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ヒドロキシアパタイトがＢｉｏＲａｄ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃである、請求項３５又は３６記載の方法。
【請求項３９】
染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離するために２種類のバッファーを用いたシステムが用いられる、請求項３５〜３８のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
２バッファー系がＲＮＡ溶出用のＮａ２ＨＰＯ４及び染色体外ＤＮＡ溶出用のＫ２ＨＰＯ４を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
限外濾過の後に行われる１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程がＣａＣｌ２沈降工程を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
ＣａＣｌ２沈降工程の後に、さらなる限外濾過工程、脱塩工程、又は逆相クロマトグラフィー工程が行われる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
さらなる限外濾過工程、脱塩工程、又は逆相クロマトグラフィー工程の後に、クロマトグラフィー工程が行われる、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
クロマトグラフィー工程がイオン交換である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
限外濾過の前に行われる１つ以上の追加的な精製もしくは仕上工程がＣａＣｌ２沈降工程を含む、請求項２９記載の方法。
【請求項４６】
塩化カルシウム沈降工程で形成される沈殿物をメッシュまたはふるいで除去する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
塩化カルシウム沈降工程で形成される沈殿物をメッシュまたはふるいで細胞破片と一緒に除去する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ＣａＣｌ２沈降工程により高分子量のＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを除去する、請求項４１〜４７のいずれか記載の方法。
【請求項４９】
限外濾過装置の捕捉物チャンネルの中に乱流を作るように設計されたスクリーンを用いるタンジェンシャルフロー限外濾過プロセスで、高純度且つ高収率で染色体外ＤＮＡを作成する方法。
【請求項５０】
ＣａＣｌ２沈降工程を含む精製プロセスで高純度の染色体外ＤＮＡを高収率で生成する方法であって、逆相クロマトグラフィー工程がＣａＣｌ２沈降工程の後に行われることを特徴とする上記方法。
【請求項５１】
染色体外ＤＮＡを他の細胞成分から精製する方法であって、ｐＨ７．３〜８．３でヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いてＤＮＡを分離することを特徴とする上記方法。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか記載の方法により得られる精製された染色体外ＤＮＡ。
【請求項５３】
請求項５２に記載の精製された染色体外ＤＮＡを含む医薬組成物。
【請求項５４】
請求項５２に記載の精製ＤＮＡを含むワクチン。
【請求項５５】
請求項５２に記載の精製ＤＮＡを含む遺伝子療法用の生成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、染色体外ＤＮＡを他の細胞成分（例えばＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質及び内毒素等）から分離する方法に関する。より詳細には、本発明は、染色体外ＤＮＡをＲＮＡ消化にかけることなく医薬品質（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ）の染色体外ＤＮＡを生成する方法に関する。また本発明は、本発明の方法により生成される染色体外ＤＮＡ及びこのような染色体外ＤＮＡから誘導される医薬（例えばＤＮＡワクチンや遺伝子療法用の生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）等）にも関する。また本発明は、高純度且つ高収率で染色体外ＤＮＡを生成する方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
例えばプラスミドＤＮＡ等の染色体外ＤＮＡはそれ自体が、生物薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）として次第に重要になってきている。その結果、このような染色体外ＤＮＡを大量に、高純度且つ高収率で生成する必要がある。
【０００３】
大量の可燃性有機溶媒（例えばエタノールやイソプロパノール等）及び有毒化学物質（例えば臭化エチジウム、フェノール及びクロロホルム等）を使用する精製方法、又は超遠心分離法及び「回転カラム」等の技法は、少量の研究材料を生成するには適しているが、一般には、生物薬品に応用するのに必要な量の材料を生成するのには適していない。
【０００４】
さらに、多くの現行のプラスミド精製手法では、ＲＮアーゼ（典型的にはウシ起源のもの）が加えられる。ウシ由来の材料は、ウシの海綿状脳症（ＢＳＥ）について心配されることから、製薬業界では次第に望ましくないものとなってきている。
【０００５】
一般に、プラスミド精製法は、以下の２つの特徴的な段階を含むと考えてよい：
プラスミドＤＮＡを細胞から放出させてライゼートを作製する第１段階；及び
プラスミドＤＮＡをライゼートの他の細胞成分から分離及び精製する第２段階。
【０００６】
第１段階（図１ａを参照されたい）を実施する最も一般的な方法は、
ｉ）煮沸すること、または
ｉｉ）細菌の細胞メンブレンをアルカリ性ｐＨ及び洗浄剤を用いて可溶化すること
によりプラスミドＤＮＡを放出させるものである。
【０００７】
第２段階（図１ｂを参照されたい）は、典型的には、細胞破片等の不溶性粒子を除去する清澄化工程の後に、例えばゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び内毒素等の可溶性細胞成分を除去する複数の精製もしくは仕上工程を行うものである。従って典型的な精製法は、例えば
塩化セシウム（ｃａｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）勾配による超遠心分離法、
選択的沈降法（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、
イオン交換クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、及び
２相分離法
等の異なる精製工程を組み合わせたものであってもよい。
【０００８】
ＤＮＡを精製するために用いられる１つの技法は、タンジェンシャルフロー限外濾過法である。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３４９４は、ゲル層を含む限外濾過ユニットに溶液を通過させて濾過することにより透過溶液（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び捕捉溶液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る、溶液からの核酸の精製法について教示している。核酸は捕捉溶液中に保持される。ＲＮＡを除去するために、ライゼートをまずＲＮアーゼで処理して、分離可能なサイズになるまで消化する。分離は例えばイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。
【０００９】
詳細な処理条件を以下に挙げる。
【００１０】
１．ｐＨ８．５の（ただし濃度の規定はない）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濾過透析バッファー（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の使用。ただし、捕捉物は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を詰めたクロマトグラフィーカラムに充填されるので、濾過透析バッファーは典型的な１０〜５０ｍＳの塩濃度を有すると想定される。これは、遺伝子療法で使用するためにＤＮＡを脂質担体と複合体形成させる場合、好ましくは濾過透析によってＤＮＡを低伝導率（ｌｏｗ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）のバッファー中に入れ替えることが望ましいというコメントによって支持される。低伝導率のバッファーは、１０ｍＳ未満、好ましくは１ｍＳ未満のバッファーを含むと言われている。
【００１１】
２．約５０倍体積の交換量（５０ ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｈａｎｇｅｓ）の濾過透析バッファーの使用。
【００１２】
３．孔径３００Ｋのオープンチャンネル（ｏｐｅｎ ｃｈａｎｎｅｌ）カセットの使用。
【００１３】
４．核酸１００ｍｇ ／メンブレンｆｔ２のプラスミドロード量。
【００１４】
この方法には、ＲＮＡをプラスミドＤＮＡから分離することができるようにＲＮＡを消化するためにＲＮアーゼを必要とするという欠点がある。
【００１５】
より最近になって、Ｋａｈｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ ６０， Ｎｏ． １， Ｊｕｌｙ ５ ２０００）は、ＲＮアーゼを使わないプラスミド精製のためのタンジェンシャルフロープロセスについて開示している。しかし、ＲＮＡを除去するために、さらに２４時間延長してアルカリ溶解を行ってＲＮＡをまず消化しなければならなかった。
【００１６】
このプロセスには以下に挙げる２つの主な欠点がある：
１．第１に、このプロセスを行うのにかかる全体的な時間が非常に長くなり、事実上、速度が制限された工程となる可能性があること；及び
２．第２に、溶解時間が長くなることによって、染色体外ＤＮＡ自体にダメージを与える危険性があること。
【００１７】
上記報告書によると、プラスミドＤＮＡは以下の条件下でタンジェンシャルフローによって調製された：
１．バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）であった；
２．このプロセスは８〜１０倍体積の交換量の濾過透析バッファーを使用した；
３．メンブレンは５００Ｋ又は１０００Ｋの孔径を有するものであった；及び
４．プラスミドのロード量は、細胞１０〜１５ｇ／メンブレン０．５ ｆｔ２であった（ｆｔ２あたり約１６ｍｇ）。
【００１８】
注目すべき他の点としては、５００ＫＤａの孔径を有するメンブレンではプラスミドのサイズは５．６Ｋｂ〜７．９Ｋｂであり、１０００ＫＤａの孔径を有するメンブレンではプラスミドのサイズは１０．０Ｋｂであった、という事実が挙げられる。
【００１９】
いずれの方法においても、タンジェンシャルフロー限外濾過法によりＲＮＡを染色体外ＤＮＡから分離することができるように、まずＲＮＡを消化する必要がある。
【００２０】
本発明の目的は、ＲＮアーゼを用いることなくＤＮＡをＲＮＡから分離する、簡単でスケール調節が容易に可能であり、且つＫａｈｎ等のプロセスに伴う欠点を持たない方法を提供することである。
【００２１】
発明の概要
本発明者等は、タンジェンシャルフロー限外濾過を用いて操作条件のうちの１つ以上を慎重に制御することによって、ＲＮＡを実質的に含まないＤＮＡ（例えば染色体外ＤＮＡ等）を簡単且つスケール調節が容易に可能なように得ることができると結論づけた。
【００２２】
多くの操作条件を慎重に制御することによって最も良い結果が得られるが、操作条件のうちの任意の１つ以上を最適化することにより、ＲＮＡをかなり除去することができるので、最適化された各条件は、各々独立して、または他の操作条件の他の１つ以上と組み合わせて、特許請求の範囲に記載されることを認識されたい。
【００２３】
このように、本発明者等は、当技術により示唆されていることに反して、限外濾過プロセスの操作条件のうちの１つ以上を慎重に制御することによって、ＲＮアーゼによる処理により又は時間を延長して溶解を行うことによりまずＲＮＡを消化することを必要とせずに、染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離することが可能であると結論づけた。
【００２４】
これらの条件としては以下に挙げるものが含まれるが、これらに限定されない：
１．バッファーのイオン強度（その伝導率に置き換えて定義することができる）を基準にバッファーを選択する；
２．ＲＮＡをメンブレン透過させて洗浄するのに十分な交換量の濾過透析バッファーを供給する；
３．染色体外ＤＮＡを精製するのに適した孔径を有する適当なメンブレンを選択する；
４．適当な膜間圧力差（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ：メンブレンを介する圧力差）を選択する；及び、
５．ロード量を制御する。
【００２５】
より具体的には、イオン強度を最適化し且つ十分な交換量の濾過透析バッファーを提供することにより、そして好ましくはさらに、染色体外ＤＮＡを精製するのに適した孔径を有する適当なメンブレンを選択することにより、ＲＮアーゼによる消化や溶解時間の延長を必要とすることなく、実質的なＲＮＡの除去を行うことが可能である。
【００２６】
さらに、このプロセスの結果として、所望のレベルの精製を達成するのに必要な工程の数または複雑性を減らすことができる。このように精製工程の数または複雑さを減らせば、処理の時間及びコストならびにプラスミドの損失が減るので、明らかに有益なものである。
【００２７】
本発明の第１の態様に従って、まずＲＮＡを消化することなく染色体外ＤＮＡをＲＮＡから分離する方法であって、
ｉ）染色体外ＤＮＡを含む細胞を溶解してライゼートを作成する工程、
ｉｉ）ライゼートを清澄化する工程、及び
ｉｉｉ）ライゼート中に存在するＲＮＡの大部分がメンブレンを通過できるようにする一方で、染色体外ＤＮＡの大部分が捕捉されるような条件下で、清澄化したライゼートをタンジェンシャルフロー限外濾過にロードする工程を含む、
上記方法が提供される。
【００２８】
「大部分」とは、５０％を超える、より好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える、及び最も好ましくは９８％を超える、という意味である。
【００２９】
「限外濾過工程により行われる実質的なＲＮＡの除去」とは、さらなる精製もしくは仕上工程をたった１回行っただけで医薬品質の染色体外ＤＮＡが得られる、という意味である。
【００３０】
限外濾過工程の前及び／又は後に１以上の追加的な精製もしくは仕上工程を行うことができる。これらの工程とは、さらなるＲＮＡまたは他の細胞成分（例えば内毒素、タンパク質及びゲノムＤＮＡ等）を除去するためのものである。もちろん、限外濾過プロセス中にも、これらの他の細胞成分のうちのかなりの部分が除去されることを理解されたい。１つの実施形態（図１ｂ、ルートＡ）では、タンジェンシャルフロー限外濾過工程の後に、高分子量ＲＮＡを特異的に除去するように設計されたクロマトグラフィー工程（例えばヒドロキシアパタイト式等）を行う。高分子量ＲＮＡとは、ＲＮＡから分離しようとする染色体外ＤＮＡの分子量に近い分子量を有するＲＮＡを意味する。
【００３１】
さらに他の実施形態（図１ｂ、ルートＢ）では、さらなるＲＮＡ除去工程は、限外濾過工程の後に行われる。好ましくは、これは、高分子量ＲＮＡを特異的に除去するよう設計されたＣａＣｌ２沈降工程である。
【００３２】
ＣａＣｌ２沈降工程の後に、さらなる限外濾過工程及び／又は脱塩工程及び／又は逆相クロマトグラフィー工程を行っても良く、その後に、例えばイオン交換式又はヒドロキシアパタイト式等のクロマトグラフィー工程を行っても良い。
【００３３】
さらに他の実施形態（図１ｂ、ルートＣ）では、ＲＮＡ除去工程（例えばＣａＣｌ２沈降工程）は、限外濾過工程の前に行われる。この実施形態において、ＣａＣｌ２沈降工程の後に限外濾過工程が行われた後、例えばイオン交換式又はヒドロキシアパタイト式等のクロマトグラフィー工程を行うことができる。
【００３４】
抗カオトロピック塩（ａｎｔｉｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ ｓａｌｔ）（例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、又は酢酸カリウム等、ただし特に塩化カルシウム）の使用は、限外濾過用のメンブレンの選択に影響を及ぼし得る。
【００３５】
ＲＮＡを実質的に除去する条件としては、以下が挙げられる：
１．イオン強度の低いバッファーの選択。この選択は、ＲＮＡ除去を最大限に行うのに不可欠であることが分かった。イオン強度が低いほど、多くのＲＮＡが除去される。「イオン強度が低い」とは一般に、１０ｍＳ未満、より好ましくは５ｍＳ未満、さらに好ましくは２ｍＳ未満、最も好ましくは１ｍＳ未満の伝導率を有する、ということを意味する。好適なバッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーまたはリン酸ナトリウムバッファーであるが、ｐＨ６〜１０で機能する他のバッファーが適している場合もある。他のこのようなバッファーの例としては、炭酸ナトリウム／ＣＯ２；イミダゾール；２，４，６−トリメチルピリジン；ＭＯＰＳ；ジエチルバルビツール酸ナトリウム；Ｎ−エチルモルホリン；ＨＥＰＥＳ；ＴＲＩＣＩＮＥ；ＥＰＰＳ；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；ＢＩＣＩＮＥ；ホウ酸ナトリウム及びグリシンが挙げられる。好適なｐＨは、約７．５〜８．５である。
【００３６】
２．濾過透析中にＲＮＡがメンブレンを通って洗浄されるように十分な倍数の体積分のバッファー交換量の使用。好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍、さらに好ましくは少なくとも４０倍、及び最も好ましくは５０倍以上（例えば５０〜１００倍）のバッファー交換量である。
【００３７】
３．適当なメンブレンの選択。３００ＫＤａ〜５００ＫＤａの孔径を有するポリエーテルスルホンメンブレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｐｈｏｎｅ）を選択するのが好ましいが、他の好適なメンブレン（酢酸セルロース、ポリスルホン（ｐｏｌｙｓｕｌｐｈｏｎｅ）、ポリビニリデン、ポリプロピレン、ポリアミド、変性ＰＥＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＥＳ）、ポリビニリジンピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）、ポリフッ化ビニリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ， ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、及び３酢酸セルロースを含む）を用いても良い。
【００３８】
大き過ぎる孔径を選択するとプラスミドがメンブレンを通って失われ、また小さ過ぎる孔径を選択するとＲＮＡがメンブレンを通過することができないので、孔径の選択は重要である。したがって、実際の孔径は、染色体外ＤＮＡが特に大きいか小さいかによって、５０ＫＤａ〜１０００ＫＤａ、より典型的には１００ＫＤａ〜１０００ＫＤａの範囲で異なる。従って、実際の選択はプラスミドのサイズ及び操作条件によって異なる。
【００３９】
驚くべきことに、塩化カルシウムを使用する場合、所与の大きささのプラスミドについて通常予測されるサイズよりも小さい孔径を有するメンブレンを使用することが必要であることが分かった。
【００４０】
従って、５．９ｋｂｐ及び７．７ｋｂｐのプラスミドの場合、１００Ｋの孔径を有するメンブレンが特に効果的であることが分かった。
【００４１】
４．また出発膜間圧力差（ＴＭＰ）も、高いプラスミド収率を達成するのに重要であることが分かった。好ましくは、出発ＴＭＰは１０ｐｓｉ未満、より好ましくは８ｐｓｉ未満、さらに好ましくは６ｐｓｉ未満、及び最も好ましくは約５ｐｓｉである。この圧力を１５ｐｓｉ以下、最も好ましくは１０ｐｓｉ以下に維持することが好ましい。
【００４２】
５．またプラスミドのロード量も、収率に大きな影響を及ぼすことが分かった。ロード量が以下の範囲の下限であれば好ましい：
３００Ｋメンブレンの場合、核酸の総ロード量は２００〜１０００ｍｇ／ｆｔ２（１０〜５０ｍｇ／ｆｔ２のプラスミド）であった。従って、３００Ｋメンブレンの場合、好適なロード量は３０ｍｇ／ｆｔ２未満のプラスミド、より好ましくは２０ｍｇ／ｆｔ２未満のプラスミドである；
５００Ｋメンブレンの場合、核酸の総ロード量は１０００〜３０００ｍｇ／ｆｔ２（５０〜１５０ｍｇ／ｆｔ２のプラスミド）であった。従って、５００Ｋメンブレンの場合、好適なロード量は１００ｍｇ／ｆｔ２未満のプラスミド、より好ましくは７５ｍｇ／ｆｔ２未満のプラスミドであった。
【００４３】
塩化カルシウムの存在下では、ロードレベルは１００Ｋメンブレンに対してそれほど影響を及ぼさないようであった。
【００４４】
上記観察結果１〜３を得た実験では、ＴＭＰをだいたい１０〜２０ｐｓｉの範囲に維持し、クロスフロー流量（ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）をだいたい０．５〜１．０Ｌ／ｍｉｎ／ｆｔ２に維持した。この組合せにより、１６〜２６Ｌ／ｈ／ｍ２の透過流量が得られた。上記４に記載したように、これにより、ＴＭＰが低いほどプラスミド収率が高くなることが分かった。
【００４５】
プラスミド収率を最大にするためには（ゲル層を形成するのに十分な時間、透過液ライン（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｌｉｎｅ）を循環させることによって）メンブレンを分極する必要があると考えられていたが、予想に反し、ＲＮアーゼを用いないプロセスでは特に第１段階の限外濾過工程ＵＦ１においてこの動作は必要ではないことが分かった。
【００４６】
本発明の第２の態様に従って、タンジェンシャルフロー限外濾過プロセスにおいて高純度且つ高収率で染色体外ＤＮＡを生成する方法が提供される。この方法は、限外濾過装置の捕捉物チャンネル（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｃｈａｎｎｅｌ）の中に乱流を生じるよう設計されたスクリーンを利用するものである。
【００４７】
ＲＮＡのＣａＣｌ２沈降法は、ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ汚染物質をプラスミド溶液から除去する簡単且つ効果的な方法であるが、ＣａＣｌ２が存在すると、タンジェンシャルフロー限外濾過によってプラスミド溶液を濃縮又は濾過透析するときにプラスミドが失われる結果となる。
【００４８】
ＣａＣｌ２はプラスミドをコンパクトにするので限外濾過メンブレンを通る時にプラスミドが失われることになると考えられる。
【００４９】
好適なマトリックス及びイオン対生成剤（ｉｏｎ ｐａｉｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いてＣａＣｌ２（ＲＮＡも）を除去することにより、後の逆相クロマトグラフィー工程が特に効果的な（高純度且つ高プラスミド収率の）分離を行うことが分かった。
【００５０】
本発明の第３の態様に従って、ＣａＣｌ２沈降工程を含む精製プロセスにおいて高純度の染色体外ＤＮＡを高収率で生成する方法が提供される。この方法は、逆相クロマトグラフィー工程がＣａＣｌ２沈降工程の後に行われることを特徴とする。
【００５１】
ＣａＣｌ２沈降工程の後に逆相カラムクロマトグラフィー工程を行うことによって、このプロセスは、ＣａＣｌ２工程後の工程を１つに減らすことができる。
【００５２】
本発明の第４の態様に従って、ＤＮＡを他の細胞成分から精製する方法であって、ＤＮＡがｐＨ７．３〜８．３でヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分離されることを特徴とする上記方法が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様に従って、特許請求の範囲に記載された発明のいずれかの方法によって得られる、精製された染色体外ＤＮＡ、医薬組成物、ＤＮＡワクチン、または遺伝子療法用の生成物が提供される。
【００５４】
本発明のさらに他の態様に従って、
ＢＣＡキットを用いてテストしたときに０．１３重量％未満のタンパク質；
Ｑ−ＰＣＲ法を用いてテストしたときに０．１１重量％未満のゲノムＤＮＡ；
ＬＡＬテストを用いてテストしたときに５ＥＵ／ｍｇ未満の内毒素；及び
ＨＰＬＣアッセイを用いてテストしたときに１．０重量％未満の残留ＲＮＡ；
を含む、精製された染色体外ＤＮＡが提供される。
【００５５】
本発明について、単なる例として、以下の詳細な説明及び実施例を参照しながらこれから説明する。
【００５６】
好適な実施形態の詳細な説明
予期せぬことに、まずＲＮＡ消化を行うことなくタンジェンシャルフロー限外濾過プロセスにおいてＲＮＡをＤＮＡから分離することができることが分かったので、基本的なプロトコールを考案し、細胞成分（特にＲＮＡ）の除去に対してどの要因が大きな影響を及ぼすかを決定するために１つ以上の要因を変更した。
【００５７】
幾つかの他の分離ルート（１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）を示す図を図１ａ及び図１ｂに記載し、さらに十分なプロセスの詳細を以下により詳しく説明する。
【００５８】
ＲＮアーゼを用いないプラスミド精製プロトコール：３００ｇスケール
１．細胞の再懸濁
再懸濁バッファー（２．５Ｌ）（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／５５ｍＭデキストロースｐＨ８．０）を細胞ペースト（３００ｇ）に加えて細胞を再懸濁した。
【００５９】
２．アルカリ溶解
リシスバッファー（４．１７Ｌ ０．９６％ ＮａＯＨ， ８３０ｍｌ ６％ ＳＤＳ）を細胞懸濁液に加えて均質化するまで混ぜ、ライゼートを作製した。
【００６０】
３．酢酸カリウム沈降
３Ｍ酢酸カリウム（２．５Ｌ）をライゼートに加え、２５〜３５分間攪拌し、４６００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈの２重層に通して上清を別の容器に移した。細胞ペレットの重さを量り、捨てた。１ｘ１．２μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ及び１ｘ０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルタに上清を通過させた。濾液は清澄化ライゼートである。
【００６１】
４．限外濾過
材料：
３ｘ５ｓｑ ｆｔ ３００Ｋ ＰＥＳを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ装置（Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ、オープンチャンネルメンブレン）。
【００６２】
これは、操作の合間には０．１Ｍ ＮａＯＨ中に保存される。
【００６３】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ蠕動ポンプ。
【００６４】
濾過透析バッファー：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
調製システム：
透過液ラインの中のメンブレンカセット及び容器の中身を空にする。
【００６５】
容器に濾過透析バッファー（２Ｌ）を充填し、透過液ラインを閉じたまま捕捉物ラインに循環させる。
【００６６】
透過液ラインの中のメンブレンカセット及び容器の中身を空にする。
【００６７】
容器に濾過透析バッファー（２Ｌ）を充填し、バッファーのボトルを容器に接続し、濾過透析バッファー（５Ｌ）を透過液ラインに一気に流す。透過液のｐＨをチェックする。
【００６８】
ゲル層の形成：
システムを空にする。
【００６９】
容器に約１．８Ｌの清澄化ライゼートを充填し、ライゼートの入った樽をシステムに接続する。
【００７０】
出発圧力１０ｐｓｉで３０分間、ゲル層が形成されるように、透過液ラインをライゼート容器に戻しながら循環させる。
【００７１】
捕捉物圧（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は急激に上昇するので、これを監視する。捕捉物圧は２０ｐｓｉを越えてはならない。超えたら２０ｐｓｉに下げる。
【００７２】
濃度：
ライゼートを５００ｍｌに濃縮する。濃縮透過液を回収する。
【００７３】
濾過透析：
約５０倍量の濾過透析バッファー（２５Ｌ）を用いて２０ｐｓｉで濾過透析を行う。連続濾過透析モードを用いる。その際、同じ速度で濾液を新しいバッファーに取り替える。濾過透析透過液を容積５Ｌのボトル５本に回収する。体積、ｐＨ及び伝導率を記録する。
【００７４】
回収：
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開いて透過液ラインを閉じ、容器及びカセットの中身を３０分間循環させる。ＵＦ装置の中身を容積５００ｍＬのボトルに排出する（ＵＦ１−Ｄ透過液）。
【００７５】
新しい濾過透析バッファー（５００ｍｌ）を容器に加え、３０分間循環を行う。装置の中身を容積５００ｍＬのボトルに排出する（ＵＦ１−Ｄ透過洗浄液１（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｗａｓｈ １））。
【００７６】
上記動作を繰り返す（ＵＦ１−Ｄ透過洗浄液２）。
【００７７】
ＵＦ１−Ｄ透過液、透過洗浄液１及び透過洗浄液２をプールしておく。
【００７８】
１ｘＧｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ０．４５μｍフィルタ（及び必要であれば１ｘＮ６６ Ｕｌｔｉｐｏｒ ０．２ｕｍ）で捕捉物のプールを濾過する。
【００７９】
このプロトコールの操作条件の１つ以上を変更したときの影響を、以下の実施例１〜１０を参照しながら記載し、実施例１１〜１５はさらにバリエーションを表す。
【００８０】
実施例１（イオン強度の影響−パートＩ）
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．４５Ｍ ＮａＣｌ濾過透析バッファー（ｐＨ８．５、伝導率４１．３ｍＳ）を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ濾過透析バッファー（ｐＨ８．５、伝導率６．８９ｍＳ）に取り替えたところ、非常に重要な成果が得られた。
【００８１】
この低イオン強度バッファーを使用したとき、大量のＲＮＡの除去が観察された。これは、イオン交換ＨＰＬＣによってライゼートにはＲＮＡ及びプラスミドの両方が存在していた（図２ａ）が濾過透析透過液サンプルにはＲＮＡが存在しプラスミドは存在しなかった（図２ｂ）ことにより、明らかであった。捕捉物のプールも、ライゼートに比べてＲＮＡが除去されていた（図２ｃ）。
【００８２】
上記結果は、逆相ＨＰＬＣによりＲＮＡアッセイを実施することによって確認及び定量された。これらの結果は、ライゼート中に見られるＲＮＡの３２％が濾過透析透過液中に存在したこと、ライゼート中に見られるＲＮＡの４３．７％が捕捉物のプール中に存在したこと、及びＲＮＡの０．９％が濃縮透過液中に見られたことを示した。
【００８３】
本発明者は、理論によって限定したいわけではないが、これらの結果は、低分子量ＲＮＡが初めはゲル層の中に含まれているが、濾過透析バッファーによって再び可溶化され、限外濾過メンブレンを通過することができるようになることを示唆している。
【００８４】
実施例２（イオン強度の影響−パートＩＩ）
ＲＮＡ除去に対するイオン強度の重要性を決定するために、さらなる実験を行った。異なるイオン強度の３つのＴｒｉｓバッファーを比較した。全てのＴｒｉｓバッファーはｐＨ７．５であったが、以下に記載するように異なる濃度のものであった：
５００ｍＭ（伝導率２５．３）
１００ｍＭ（伝導率６．８９）
１０ｍＭ（伝導率０．３３）。
【００８５】
ＨＰＬＣトレース（ライゼートと捕捉物のプール）を比較したところ、イオン強度が低いほど、より多くのＲＮＡが除去されることが分かった（図３ａ〜３ｆ）。
【００８６】
実施例３（ｐＨの影響）
ＲＮＡ除去に対してイオン強度が影響を及ぼすと推定されたので、ＲＮＡ除去に対するｐＨの影響を調査した。調査は、ｐＨ６、７．５及び９で１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーに対して行った。ここでも、ＨＰＬＣトレース（ライゼートと捕捉物のプール）を比較することによって、ｐＨ６に比べてｐＨ７．５〜９の方がＲＮＡをより多く除去したが、ｐＨ９の結果はｐＨ７．５に比べて良くはないことが分かった（図４ａ〜４ｄ及び図３ｅ、３ｆ）。
【００８７】
実施例４（透過流束及び膜間圧力差に対するイオン強度の影響）
濾過透析バッファーのイオン濃度は、ＲＮＡの除去に影響を及ぼすだけでなく、透過流束及び膜間圧力差（ＴＭＰ）にも影響を及ぼすことが分かった。従って、透過流束は濾過透析の開始時はだいたい４０Ｌ／ｍ２／ｈであったが、バッファーをどんどん交換していくにつれ、この流束は変化した。５００ｍＭバッファーの場合、透過流束は約３０Ｌ／ｍ２／ｈまで低下したが、１００ｍＭバッファーの場合は約７０Ｌ／ｍ２／ｈまで上昇し、及び１０ｍＭバッファーの場合は約１４０Ｌ／ｍ２／ｈまで上昇した。これらの知見は、イオン強度の低いバッファーでは５倍もの早い速度で処理を行うことができることを示す、という点で重要である。これらの結果を図５にグラフで示す。
【００８８】
また、ＴＭＰは出発圧力（約２０）から、１００ｍＭバッファーの場合は約１７に低下し、１０ｍＭバッファーの場合は約１０に低下した。これは、ＴＭＰが一定に保たれた５００ｍＭバッファーとは対照的である。これらの結果を図６に示す。
【００８９】
実施例５（交換量の影響）
驚いたことに、１０ｍＭバッファーの場合、かなりの量のＲＮＡは、バッファーを３２回交換した後でもなおメンブレンを通過したことが分かった。続いて、ＲＮＡの溶出がいつ止まったかを測定するためにさらに実験を行った。
【００９０】
２０℃保存から清澄化ライゼート（５００ｍｌ）を−取り出し、解凍し、０．２２μｍフィルタで濾過した。濾過したライゼート１５０ｍｌを、ＴＦＦ装置を備えた容器に入れ、クロスフロー流量５５０ｍｌ／ｍｉｎ／ｆｔ２でポンプでシステムの回りに流した。ＴＦＦ装置の捕捉物バルブを部分的に閉じることによって、ＴＭＰを０．６バールに設定した。ライゼートを２０分間循環させてメンブレンを分極した。容器の内容物を約２５ｍｌに濃縮した後、濾過透析バッファー（１６００ｍｌ）に対して濾過透析した。
【００９１】
濾過透析の終了時に、透過液ラインを閉じ、捕捉物バルブを開いて、ＴＭＰをなくした。次に、捕捉物を１０分間循環させてメンブレンを洗浄した後、きれいなボトルに回収した。さらに３０ｍｌの濾過透析バッファーを１０分間ポンプでシステムの回りに流してメンブレンを洗浄した後、回収した。合計で２回洗浄を行った。プロセス中ずっとＴＭＰ及び透過流束を測定し、ＲＮＡ除去の指標としてイオン交換ＨＰＬＣ用にサンプルを取った。
【００９２】
濾過透析時間をさらに延長すると、ライゼート中に存在するＲＮＡの２％を除く全てを除去することができることが分かった（図７ａ及び７ｂ）。さらに図７ｂからは、残留ＲＮＡピークがプラスミドピークのすぐ下にあることは明らかであり、このことは、残留ＲＮＡが全て高分子量ＲＮＡであることを示している。このデータは、サンプルから全てのＲＮＡを除去するために、高分子量ＲＮＡの除去に効果的なプロセス（例えばＣａＣｌ２沈降法等）と平行してこのプロセスを用いることができることを示している。
【００９３】
実施例６（プラスミドロード量の影響）
本発明者は、思いがけず、メンブレンについたプラスミドの量を減らすことによって、プラスミドＤＮＡからＲＮＡをさらに多く分離することができる、という結果に行きついた。実際に、３００ＫＤａメンブレンへのプラスミドロード量を２２．２ｍｇプラスミド／ｆｔ２から１１．１ｍｇ／ｆｔ２に減らしたところ、かなり低いレベルのＲＮＡを含むプラスミドＤＮＡを得ることができた。
【００９４】
結果を図８ａ〜８ｉに示す。
【００９５】
説明のために、一般的なプロトコールに従って、３００Ｋメンブレンで７．６Ｋｂｐプラスミドを５０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５に対して透析した。メンブレンｆｔ２あたり１１．１ｍｇの割合でロードしたサンプルのＩＥ ＨＰＬＣクロマトグラフを、図８ａ〜８ｈに示す。
【００９６】
図８ａは、ライゼートである。
【００９７】
図８ｂは、濃縮透過液である。
【００９８】
図８ｃは、プールした濾過透析透過液（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｒｍｅａｔｅ）（１〜１０倍量）である。
【００９９】
図８ｄは、プールした濾過透析透過液（１１〜２０倍量）である。
【０１００】
図８ｅは、プールした濾過透析透過液（２１〜３０倍量）である。
【０１０１】
図８ｆは、プールした濾過透析透過液（３１〜４０倍量）である。
【０１０２】
図８ｇは、プールした濾過透析透過液（４１〜５０倍量）である。
【０１０３】
図８ｈは、捕捉物のプールである。
【０１０４】
比較として、図８ｉは、メンブレンサンプルｆｔ２あたりプラスミド２２．２ｍｇの捕捉物のプールである。
【０１０５】
これらの結果が示すことは、ロード量が低いほど、プラスミドはＲＮＡを含まないということである（図８ｈを図８ｉと比較されたい）。
【０１０６】
またＩＥ ＨＰＬＣクロマトグラフは、ＲＮＡが濾過透析量の増加とともにどのように除去されるかも示す（図８ｃ〜図８ｇ、そして図８ａ及び図８ｂを比較されたい）。従って、ライゼート中において（図８ａ）、左側の第一のピーク（タンパク質）の後に広いＲＮＡピークが見られ、プラスミドピーク８．０５７及び８．３５６も目立っている。２つのプラスミドピークはそれぞれ開環状ＤＮＡ及びスーパーコイル構造のＤＮＡのピークである。濃縮透過液中において（図８ｂ）、タンパク質ピークは見られるが、ＲＮＡピークは非常にわずかしか見られない。このことは、ＲＮＡが最初はゲル層の中に含まれることを示している。加えられる濾過透析バッファーの量が増えるに従い、溶出されるＲＮＡの量は大きく変化する。１０倍量を加えた後では（図８ｃ）、メンブレンを通して低レベルのＲＮＡしか除去されず、２０倍量を加えた後では、ｐＨ及び伝導率の低下により証明されるように濾過透析バッファーが本当に効力を発揮し、メンブレンを通るＲＮＡのピークはなくなる（ｃｌｅａｒｅｄ）（図８ｄ）。３０〜５０倍量では、ＲＮＡレベルは次第に低くなり、５０倍量がメンブレンを通過したころには、ＲＮＡレベルは殆ど無い状態となり、濾過を止めることができる。捕捉物のプール（図８ｈ）は、純粋なプラスミドを示し、ＲＮＡを含んでいなかった。
【０１０７】
本発明者は、思いがけないことに、より大きな孔径を有するメンブレンを用いれば、プラスミドロード量をより大きくすることができる、という結論に行きついた。例えば、５００ＫＤａメンブレンを用いた場合は、１５０ｍｇプラスミド／ｆｔ２もの非常に高いロード量を用いることができる。実際には、初期の結果は、メンブレンの面積が広いほど使用することができるプラスミドのロード量が大きくなることを示唆しているので、メンブレンの総面積自体が重要である。
【０１０８】
実施例７（追加的な仕上工程）
イオン強度の低いバッファーを十分な交換量で用いると（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５及び６０倍体積の交換量）、溶解直後に存在していたＲＮＡの９８．６％を除去することができたが、本発明者等は、第２の他の技法により、ＲＮＡが検出不能になるレベルにまで残留ＲＮＡ（特に高分子量ＲＮＡ）を除去することができるか否かを調べた。
【０１０９】
本発明者等は、限外濾過工程の後に、クロマトグラフィーをベースとした手法を行った。テストしたクロマトグラフィー工程は、ヒドロキシアパタイト工程であった。従って、ＲＮＡが流動中に除去されると同時にプラスミド結合が最大となるように、ＲＮＡの結合を防ぐ条件（０．３Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．８）下で、捕捉物のプールをヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭａｃｒｏＰｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｔｙｐｅ ＩＩ、ビーズ径＝２０μＭ）に充填した。次に、プラスミドを溶出したところ、９３．４％の回収率であった。イオン交換ＨＰＬＣによって、ＲＮＡは検出されなかった。
【０１１０】
また興味深いことに、本発明者等は、ＲＮＡをプラスミドＤＮＡから分離するためのヒドロキシアパタイトの効果的な使用にとってｐＨが非常に重要である、という結論に達した。プラスミドＤＮＡからのＲＮＡの分離に対してｐＨが及ぼす影響を示すこれらの結果を実施例１０に示す。実施例１０は、分離プロセスにおいて２種類のバッファーを用いたシステムを用いることの利点を示す。
【０１１１】
実施例８（チャンネルの影響）
オープンチャンネルが、ゲル層（プラスミドＤＮＡがメンブレンを通過して透過液中に入るのを防ぐ）をより形成させやすくすることは、一般に受け入れられている。実際に、オープンチャンネルカセットの使用は、このプロセスを首尾良く操作するのに大変重要である、とさえ言われていた。
【０１１２】
本発明者らは、限外濾過工程終了時にメンブレンからプラスミドを回収するが難しかったが、ひどく汚れたメンブレンが核酸消化によって修繕することができる、ということを見出したので、ゲル層に結合した核酸は実際にはメンブレンに不可逆的に結合していると推定した。この結合を破壊することができるか否かを確かめる努力を行っている際に、捕捉物チャンネルの中に乱流を生じさせるよう設計されたスクリーンを用いた。このプロトコールの他の点は以下に記載する通りであり、Ｔ型スクリーンチャンネル（Ｔ−ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ）「Ｏｍｅｇａ」メンブレンを用いた。
【０１１３】
清澄化ライゼート（ＲＮアーゼで処理したもの）１８０ｍｌを、Ｍｉｎｉｍシステムの容器の中に入れた。ポンプのスイッチをオンにして、１００ｍｌ／分のクロスフロー流量を与えた。捕捉物バルブをやや閉じて、ＴＭＰを０．８バールとした（入口圧１．５バール、出口圧０．１バール）。このシステムを２０分の間、全体循環モードで操作し、ゲル層を形成させた。透過液及び容器から、ＨＰＬＣ分析用にサンプルを取った。透過液ラインをきれいなボトルに入れ、ライゼートを濃縮して最終体積を３０ｍｌとした。次にこの濃縮物を２０倍量（６００ｍｌ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．４５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５に対して濾過透析した。透過液サンプル（各１５０ｍｌ）を、濾過透析中に４つ及び濃縮中に１つ回収し、ＨＰＬＣにより分析した。捕捉物バルブを開き、透過液ラインをしっかり締めてＴＭＰを除去した。このシステムを１０分間放置してゲル層を溶解させ、プラスミドを回収した。１０分後、容器から捕捉物を回収して、３０ｍｌの濾過透析バッファーと取り替えた。これを上記のように１０分間循環させ、別の容器の中に回収して、「洗浄液１」とラベルした。洗浄工程を繰り返した。捕捉物回収物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｈａｒｖｅｓｔ）、洗浄液１、及び洗浄液２の量を測定して、ＨＰＬＣ分析用にサンプルを取った。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸光度も測定し、２６０／２８０比を計算した。
【０１１４】
スクリーンチャンネルを用いた影響を測定するために、２つの基準を用いた。それは、プロセスからのプラスミドの回収、及びＨＰＬＣクロマトグラムの目視検査による汚染物の除去である。
【０１１５】
クロマトグラムから、幾つかの結論が導き出された。２０分間循環を行った後、プラスミドはほとんどメンブレンを通過しなくなった（図９ａ）。容器中のプラスミドの合計量は、出発材料中では１６．３３ｍｇであったのに対し、１２．７８ｍｇであった（図９ｂ及び９ｃ）。従って、３．５５ｍｇのプラスミドがゲル層中に含まれると推測することができる。
【０１１６】
透過液サンプルの目視検査（図９ｄ〜９ｈ）により、汚染物質はメンブレンを通過するがプラスミドは通過しないことがわかった。捕捉物回収物及び洗浄液からのクロマトグラム（図９ｉ〜９ｋ）は、汚染物質が良好に除去されたことを示している。
【０１１７】
プラスミド全体のうち８２％が捕捉物回収物中で回収され、１３．７％は洗浄液中で回収された。これは、捕捉物回収物及び洗浄液を組み合わせると、オープンチャンネルカセットで見られる回収率（典型的には７０〜８０％）に比べてかなり高かった。
【０１１８】
一般的なプロトコールで既に記載されたようなＲＮアーゼを用いないプロセスにこのプロセスを適用した場合も、高いプラスミド収率が得られた。
【０１１９】
プラスミド収率を上げるためのスクリーンチャンネルの使用は、あらゆる限外濾過プロセスにだいたい応用できることは明らかであり、本願発明の独立した態様である。
【０１２０】
実施例９（追加的なクロマトグラフィー工程の影響）
記載されたＲＮアーゼを用いないプロセスは、低分子量ＲＮＡを除去するのに特に効果的であるので、本発明者等は、他のＲＮＡ除去プロセス（特に高分子量ＲＮＡを除去することが分かっているもの）を、ＲＮアーゼを用いないプロセスと組み合わせて、限外濾過工程の前又は後の工程として用いることができるか否かを決定しようと考えた（図１ｂを参照されたい）。そこで、本発明者等は、限外濾過後に塩化カルシウム沈降工程を行った場合の影響を測定するために以下の実験を行った。
【０１２１】
限外濾過中に低分子量ＲＮＡを除去するために、既に記載された一般的なプロトコール（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５バッファーを用いた）に従ってロードする材料を調製した。この後に、塩化カルシウム沈降工程を行った（１．４Ｍ ｐＨ７．５）。
【０１２２】
体積１の捕捉物のプールに、体積１の２．８Ｍ塩化カルシウムの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に加えた。この混合物を室温にて１０分間攪拌およびインキュベートした。沈殿した物質を０．２２μｍフィルタで濾過して除去した。
【０１２３】
塩化カルシウム塩は、タンジェンシャルフロー濾過及びイオン交換クロマトグラフィーの両方の邪魔になることが知られている。従って、組み合わせたプロセスを満足のいくものにしたいなら、塩化カルシウムの除去を行うことが必要となる。本発明者等は、逆相クロマトグラフィーを用いてプラスミドＤＮＡを塩化カルシウム塩から分離することができるだけでなく、適当なイオン対生成剤を選択することによって、ＲＮＡ及び塩化カルシウム塩の両方を除去することを見い出した。
【０１２４】
クロマトグラフィーに影響を及ぼす様々な要因を調査することによって、イオン対形成剤及びマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）がＲＮＡからのプラスミドＤＮＡの分離にとって重要であることが分かった。
【０１２５】
ただし、塩化カルシウム塩のみを除去したい場合は、より簡単なシステムを使用することができる。
【０１２６】
２つの逆相培地（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）が、塩化テトラブチルアンモニウムと組み合わせるのに適していることが分かった。それらは、
Ｐｕｒｅｓｙｎより供給されるＰｏｌｙｆｌｏｗ（粒径５５μｍ、非多孔性の有標ポリマーである）、及び
Ｐｏｒｏｓにより供給されるＰｏｒｏｓ ５０Ｒ１（粒径５０μｍ、多孔性のポリスチレンジビニルベンゼンポリマーである）。
【０１２７】
塩化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＣ）の好適な濃度は２ｍＭであった。
【０１２８】
これら２つのマトリックスのための好適な溶出条件は異なる。
【０１２９】
Ｐｏｌｙｆｌｏｗの場合、ＲＮＡ除去は１０％エタノール及び２ｍＭ ＴＢＡＣを用いて行い、プラスミド溶出は３０％エタノールを用いて行った。
【０１３０】
Ｐｏｒｏｓ ５０Ｒ１の場合、ＲＮＡ除去は２５％エタノール及び２ｍＭ ＴＢＡＣを用いて行い、プラスミド溶出は４０％エタノールを用いて行った。
【０１３１】
いずれのケースでも、プラスミド回収率は高く（約８０％）、非常に低レベルのＲＮＡしか検出されなかった。
【０１３２】
最も良い結果は低いロード量で得られた。
【０１３３】
逆相クロマトグラフィーの適用は、それ自体が、塩化カルシウム沈降法と組み合わせて、ＲＮＡ分離技法として（本発明のタンジェンシャルフロー限外濾過法と組み合わせて用いるか否かに関係なく）、及びプラスミドの収率を上げる手段としての可能性を持つことを明らかに示す。
【０１３４】
実施例１０（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用）
多くのヒドロキシアパタイト媒体を調べて、染色体外ＤＮＡからＲＮＡを分離するこれらの能力を測定した。ｐＨ、バッファーのタイプ、溶出プロトコール、カラムの許容量、及び流量が及ぼす影響を全て調査した。方法論は単純なものであり、所与の流量でバッファーを用いてヒドロキシアパタイトカラムを平衡化し、捕捉物のプール（バッファーで希釈したもの）をカラムに入れ、バッファーで洗浄し、一次勾配上で泳動させ、カラムを再利用するものである。
【０１３５】
これらの実験から得た大きな知見は、以下の通りである。
【０１３６】
ｐＨは、染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡを首尾良く分離するのに非常に重要であることが分かった。ＭａｃｒｏＰｒｅｐセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型４０μｍ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）の場合、最適ｐＨは７．８であり（図１０ｃを参照されたい）、０．２ｐＨ単位というわずかな差が分離に影響を及ぼした。このように、ｐＨ６．８（図１０ａ）及びｐＨ８．８（図１０ｄ）では分離は見られず、ｐＨ７．６（図１０ｂ）では、分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は大きく低下した。
【０１３７】
また、バッファーのタイプも重要であることが判明し、リン酸二ナトリウムの方が、可溶性の高いリン酸二カリウムバッファーに比べてパフォーマンスが良かった。実際には、リン酸二ナトリウムの分離特性をリン酸二カリウムの高い可溶性と組み合わせた２重溶出工程を用いることにより、最良の結果が得られた。ヒドロキシアパタイトカラムをｐＨ７．８の１０ｍＭリン酸二ナトリウムで平衡化及び洗浄した後、ｐＨ７．８の０．３５Ｍリン酸二ナトリウムでＲＮＡを溶出した。プラスミドＤＮＡをｐＨ７．８の０．２Ｍリン酸二カリウムで溶出したところ、回収率は７８．６％であった（以下の表１を参照したい）。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
ＲＮＡ溶出バッファーをｐＨ７．８の０．３Ｍリン酸二ナトリウムと取り替えたところ、同様のプラスミド回収率（７６．２％）が得られたが、ＲＮＡ除去はそれほど効率良く行われなかった。プラスミド溶出バッファーをｐＨ７．８の０．６ｍＭリン酸二ナトリウムバッファーと取り替えたところ、プラスミドの回収率は低かった（６５．７％）。
【０１４０】
表１に記載した溶出工程条件を用いてカラムｍｌあたり合計０．５ｍｇを超える核酸をカラムにロードしたところ、ＲＮＡの溶出ピークにおいて５６〜５８％のプラスミドが損失した。
【０１４１】
また、０．５ｍｇ／ｍｌの合計核酸ロード許容量において、流量を２ｍｌ／分としたところ、ＲＮＡ溶出画分において７．７％の大量のプラスミド損失につながった。
【０１４２】
最適な条件は以下の通りであった：
１．ｐＨ７．８の１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４でカラムを平衡化及び洗浄、
２．ｐＨ７．８の０．３５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４でＲＮＡを溶出、
３．ｐＨ７．８の０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４でプラスミドＤＮＡを溶出、
４．流量０．５ｍｌ／分、
５．カラム１ｍｌあたりの合計核酸量０．５ｍｇまたはカラム１ｍｌあたりのプラスミド２５．４ｍｇのカラム許容量。
【０１４３】
これらの条件によって、プラスミド回収率は７８．６％となり、生成物はＲＮＡを含まないようであった（イオン交換クロマトグラフィーを使用）。
【０１４４】
Ｍｅｒｃｋのヒドロキシアパタイトを用いたところ、最適ｐＨが７．５でありＮａ２ＨＰＯ４バッファーは０．２５Ｍで最良であるという以外は、同様の結果が得られた。目的は、カラム許容量を大きくするためにプラスミドの結合を最大化することである。ＲＮＡはカラムに結合して大量に存在するので、ＲＮＡはヒドロキシアパタイトの結合許容量の大部分を占める。しかし、ＲＮＡはプラスミドに比べてカラムへの親和性が低いので、高リン酸塩条件を用いて、カラムへのＲＮＡの結合を防ぎ、その結果、プラスミド結合を最大化する。これらの条件は、ＢｉｏＲａｄの場合はｐＨ７．８の０．３５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４及びＭｅｒｃｋの場合はｐＨ７．５の０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４である。これらの条件下において、３００〜５００μｇ／ｍｌの許容量を達成することができる。
【０１４５】
図１ｂを参照して例示される他のルートでは、異なる純度及び異なる収率のプラスミドＤＮＡが得られる。
【０１４６】
このように、例えばルートＢとして示すプロセスでは、最大９６％の内毒素を除去し、最大９９．８９％のゲノムＤＮＡを除去したが、ルートＣとして示すプロセスでは最大９９．９７％のゲノムＤＮＡを除去した。
【０１４７】
従って、多くの要因に基づいて、特定のプロセスが選択される。
【０１４８】
これまでの実施例では限外濾過工程は、ＲＮアーゼを用いないプラスミド精製プロトコール（前に概説した３００ｇスケール）に従って行われ、３０分間循環を行うことによるゲル層の形成を含むものであったが、本発明は、循環が不要であることを見出した。これを以下の実施例１１に示す。
【０１４９】
実施例１１（ＵＦ、循環なし）
ａ）対照（ＲＮアーゼを用いる）
アルカリ溶解中にＲＮアーゼを加え、循環を行わずに限外濾過メンブレンに清澄化ライゼートをロードした。
【０１５０】
構築物＝７．８ｋｂプラスミド
メンブレン＝３００Ｋ
プラスミドロード量＝１８３ｍｇ／ｆｔ２
ＴＭＰ＝１０ｐｓｉ
濾過透析バッファー＝５０倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８
結果：　プラスミド回収率＝５２％
濃縮／濾過透析中のプラスミドの損失＝３８％
ｂ）比較（ＲＮアーゼを用いないプロセス）
構築物、メンブレン、及び濾過透析バッファーは対照のところで記載したものを使用した。プラスミドロード量は異なり（記載）、また５ｐｓｉ及び１０ｐｓｉのＴＭＰの両方において結果を得た。以下の表２を参照されたい。
【０１５１】
【表２】
2004514428.tif 000004
【０１５２】
ａ）対照とｂ）ＲＮアーゼを用いない比較プロセスとではプラスミド損失率に大きな差があることは、ＲＮアーゼを用いないプロセスにおいて循環が不要であることを示している。
【０１５３】
理論によって限定したいわけではないが、ＲＮアーゼを用いないプロセスにおいて高レベルのＲＮＡが存在すると、おそらくこの高レベルのＲＮＡによって、「即席の」ゲル層が形成される可能性がある。この点において、ＲＮアーゼを用いないプロセスにおけるライゼートはおよそ９８重量％ＲＮＡに対しおよそ２重量％の染色体外ＤＮＡを含むことに注目されたい。
【０１５４】
実際に、この仮説は、以下の実施例１２（プラスミドロード濃度の影響を調べた）で得られた結果によって支持される。
【０１５５】
実施例１２（ロード濃度の影響）
この実施例において、プラスミドロード量を減らすことによる影響を調べた。これらの結果を以下の表３に示す。
【０１５６】
【表３】
2004514428.tif 000005
【０１５７】
これらの結果から明らかなのは、ライゼートロード物中のプラスミド及びＲＮＡの両方を希釈することによって、プラスミド損失は増加するが、プラスミド回収率は高いままであることである。
【０１５８】
実施例１１及び１２で得た結果を見て、本発明者等は、２回目の限外濾過（ＵＦ２）（すなわちＲＮＡの大分部が既に除去されたもの）において循環が必要であるか否かを調査することにした。プロトコール及び結果を以下の実施例１３に記載する。
【０１５９】
実施例１３（２回目のＵＦ工程での循環）
この実施例では、
ｉ）出発材料中のプラスミドの濃度、
ｉｉ）ＴＭＰ、及び
ｉｉｉ）プラスミドのサイズ
の影響を調べ、これらがプラスミド回収率にどのような影響を及ぼすかを測定した。
【０１６０】
ＵＦ２を用いて、ＴＭＡＥ後のプール（すなわちクロマトグラフィーを用いた精製工程を行ったもの）の体積を減らした。
【０１６１】
材料を以下に列挙する。
【０１６２】
材料
２〜８℃で保存した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．７４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５中にプラスミド（７．７Ｋｂｐ）を含むＴＭＡＥ後のプール。
【０１６３】
２〜８℃で保存した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．７４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５中にプラスミド（５．５Ｋｂｐ）を含むＴＭＡＥ後のプール。
【０１６４】
希釈剤として用いたバッファーは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．７４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）であった。
【０１６５】
０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて限外濾過カセットを洗浄し、製造業社の指示に従って０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存した。
【０１６６】
［実験］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．７４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）を用いて、ＴＭＡＥ溶出液を必要な濃度にまで希釈した。ＨＰＬＣ分析（Ｄｉｏｎｅｘ）及びＡ２６０測定用にサンプルを取った。容器の中に５００ｍｌを入れ、残りは、その５００ｍｌ容器に接続されたボトルに入れた。ポンプのスイッチをオンにして、９００ｍｌ／分のクロスフロー流量（ＱＲ）を与えた。捕捉物バルブをやや閉じて、必要な膜間圧力差（ＴＭＰ）とした。透過液ラインをきれいなボトルに入れ、ライゼートを濃縮して最終体積を２５０ｍｌとした。全部で４画分の透過液を回収した（体積は出発材料のプラスミド濃度によって異なる）。ＨＰＬＣ分析（Ｄｉｏｎｅｘ）及びＡ２６０測定用にサンプルを取った。
【０１６７】
捕捉物バルブを開き、透過液ラインをしっかり締めてＴＭＰをなくした。システムを１０分間循環させたままにしてメンブレンに結合したプラスミドを溶解し、プラスミドを回収した。１０分後、ＵＦ２捕捉物を容器から回収して、１００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．７４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）に交換した。これを前と同様に１０分間循環させ、別の容器の中に回収して、「洗浄液１」とラベルした。洗浄工程を２回繰返し、回収物を「洗浄物２」及び「洗浄物３」とラベルした。ＵＦ２捕捉物、洗浄液１、洗浄液２、及び洗浄液３の体積を測定し、ＨＰＬＣ分析（Ｄｉｏｎｅｘ）及びＡ２６０測定用にサンプルを取った。
【０１６８】
以下の表４に記載した条件下で、実験を行った。
【０１６９】
【表４】
2004514428.tif 000006
【０１７０】
結果を以下の表５に記載する。
【０１７１】
【表５】
2004514428.tif 000007
【０１７２】
これらの結果は、限外濾過メンブレンの分極は不要であることを示唆している。
【０１７３】
ＲＮアーゼを用いない染色体外ＤＮＡ精製プロセスにおいて、アルカリ溶解後に残るＲＮＡのレベルは特に高い（プラスミドＤＮＡに比べて重量比で約２０倍）ので、本発明者等は、限外濾過前にＲＮＡレベルを低下させる方法を考察した。
【０１７４】
図１ｂのｃを参照すると、本発明者等が限外濾過工程の前にＣａＣｌ２を用いることを既に提案していたことは明らかであろう。この工程は、かなりの量のＲＮＡを除去したので、塩化カルシウムの存在下で限外濾過工程を最適化するためにさらに調査した。これらの調査を実施例１４に記載する。
【０１７５】
実施例１４（ＣａＣｌ２及び孔径）
ＣａＣｌ２を用いたこれまでの実験は３００Ｋメンブレンを介してかなりの量のプラスミドが失われたことを示唆するので、本発明者等は、ＣａＣｌ２がプラスミドを「凝縮している（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）」という仮説を立てた。そのため、より小さな孔径（１００Ｋ）を有するメンブレンを用いて試した。しかし、これだけでは、予想よりも低いプラスミド回収率となった。これを、低いＴＭＰを用いて矯正した（５ｐｓｉ対１０ｐｓｉ）。
【０１７６】
ａ）遠心分離を用い、及び
ｂ）ふるいを用いて、
細胞破片の分離を行った。
【０１７７】
循環を行った又は行わない比較実験を以下に表す：
ａ）塩化カルシウム沈降後のライゼートをＵＦ１にロードする（循環あり）
５０ｇの調製物中でのアルカリ溶解によって、清澄化ライゼートを作製した。
【０１７８】
体積１の２Ｍ ＣａＣｌ２ストック溶液を体積１の清澄化ライゼートに攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて１０分間インキュベートした。沈殿物を５０００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離した。上清を０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ３００フィルタに通した。
【０１７９】
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ装置に１ｆｔ２ １００Ｋ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を除去して空にし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で洗浄した。
【０１８０】
容器に５０ｇ調製物から得た清澄化ライゼート約４００ｍｌを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗポンプを１５８ｒｐｍに設定し（クロスフロー流量１Ｌ／分／ｆｔ２）、ＴＭＰが５ｐｓｉとなるように捕捉物バルブを調節した。循環を２０分間続け、その間、ＴＭＰが１０ｐｓｉを超えないようにした。
【０１８１】
透過液ラインを２Ｌボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを７５ｍｌにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０１８２】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように容器を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液のボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を５ｘ１ Ｌボトル中に回収した。３０倍量（３Ｌ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を加えた後、２０倍量（２Ｌ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を加えた。
【０１８３】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉鎖して、ＵＦシステムの中身を３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０１８４】
容器に１００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を充填し、３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０１８５】
ＵＦ１捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ３００フィルタに通した。
【０１８６】
次に、３００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを３０分間循環させることによって、ＵＦ１系から不要なものを取り除いた。
【０１８７】
ＵＦ１系を０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存した。
【０１８８】
２ｘ５０ｇ調製物から得た清澄化ライゼートをプールし、塩化カルシウムで沈殿させ、ＵＦ１で処理して、ＵＦ１ロード量が２倍になるようにして実験を繰り返した。
【０１８９】
ｂ）塩化カルシウム沈降後のライゼートをＵＦ１にロードする（循環なし）
ｉ）遠心分離を用いて細胞破片を除去する
１００ｇ調製物中でのアルカリ溶解によって清澄化ライゼートを作製した。
【０１９０】
体積１の２Ｍ ＣａＣｌ２ストック溶液を体積１の清澄化ライゼートに攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて１０分間インキュベートした。沈殿物を４６００ｒｐｍにて２０分間、遠心分離した。上清を５μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２に通した後、０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルタに通した。
【０１９１】
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ装置に１ｆｔ２ １００Ｋ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で洗浄した。
【０１９２】
容器に１００ｇ調製物から得た清澄化ライゼート約４００ｍｌを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗポンプを１５８ｒｐｍに設定し（クロスフロー流量１Ｌ／分／ｆｔ２）、ＴＭＰが５ｐｓｉとなるように捕捉物バルブを調節した。清澄化ライゼートを７５ｍｌにまで濃縮し、濃縮透過液を容積２Ｌの容器に回収した。ＴＭＰが１０ｐｓｉを超えないようにした。
【０１９３】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーで交換されるように容器を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を５ｘ１ Ｌボトル中に回収した。３０倍量（３Ｌ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を加えた後、２０倍量（２Ｌ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を加えた。
【０１９４】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、ＵＦシステムの中身を３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０１９５】
容器に７５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を充填し、３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０１９６】
ＵＦ１捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ３００に通した。
【０１９７】
次に、３００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを３０分間循環させることによって、ＵＦ１系から不要なものを取り除いた。
【０１９８】
ＵＦ１系を０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存した。
【０１９９】
ｉｉ）濾過を用いて細胞破片を除去する
プラスミド構築物：５．９ｋｂｐ大腸菌宿主細胞系：
−７０℃で保存した細菌細胞ペースト１００ｇを木槌で砕いて小片にした。室温で、再懸濁バッファー５００ｍｌをＢｅｌｌｃｏ再懸濁容器に加えた。砕いた細胞ペーストを容器に加え、電磁撹拌機（設定８）で室温にて１時間攪拌した。
【０２００】
溶解する直前に、冷室の中で、６％ ＳＤＳ（１６６ｍｌ）に冷たい０．９６％ ＮａＯＨ（８３４ｍｌ）を加えた。Ｈｅｉｄｏｌｐｈオーバーヘッド攪拌機を備えた容積４Ｌのビーカーに細胞懸濁液を移し、冷室に入れた。この細胞再懸濁液に溶解混合物を加え、４０ｒｐｍにて３０分間攪拌した。
【０２０１】
ライゼートに３Ｍ酢酸カリウム（５００ｍｌ）を加え、６０ｒｐｍ、４℃にて３０分間攪拌した。
【０２０２】
ライゼートの２０ｍｌサンプルを取り、ＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ ２０００で、２５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。上清は清澄化ライゼートであった。
【０２０３】
体積１のライゼートに、体積０．６６の３Ｍ ＣａＣｌ２ストック溶液を攪拌しながら加えた。この混合物を室温にて１０分間静置した。
【０２０４】
混合物を再び攪拌し、メッシュフィルタ（直径３５０ｍｍ、孔径２００μｍ）を設置したＰｌａｓｔｏｋホルダに注いだ。重力下で容積５Ｌのビーカー中に濾液を回収した。
【０２０５】
メッシュに通した濾液をポンプでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＥ１５ 奥底フィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）カートリッジに通し、濾液を容積５Ｌのビーカー中に回収した。
【０２０６】
奥底フィルタに通した濾液をポンプで０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルタに通した。この物質を、塩化カルシウム沈降後のライゼートと呼んだ。
【０２０７】
塩化カルシウム沈降後のライゼートを先述のようなＵＦ１で処理した。ただし、濾過透析は３５倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に対して行った後、１５倍体積分の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ０．４５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５に対して行った。
【０２０８】
塩化カルシウム溶液を加える前にＵＦ１濃縮透過液でライゼートを２倍希釈して実験を繰り返した。
【０２０９】
［脱塩］
塩化カルシウム塩を含む全てのサンプル（塩化カルシウム沈降後のライゼート、ＵＦ１濃縮透過液、及びＵＦ１濾過透析透過液を含む）を、ＨＰＬＣにより分析する前に脱塩した。
【０２１０】
サンプル２ｍｌを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で平衡化した２ｘ５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムに連続して流量５ｍｌ／分で注入し、４．５ｍｌの脱塩物（２５４ｎｍでの吸光度ピーク）が得られた。
【０２１１】
［ＨＰＬＣによる分析］
イオン交換ＨＰＬＣによってＤｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃカラム上でプラスミド濃度を測定した。
【０２１２】
サイズ排除ＨＰＬＣによってＧ３０００ＳＷＸＬカラムに連結したＴｏｓｏＨａａｓ ＴＳＫゲルＧ−ＤＮＡ−ＰＷでＲＮＡピーク面積を測定した。流出バッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＋ ０．３Ｍ ＮａＣｌ ＋ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５。流量＝０．３ｍｌ／分。ＲＮＡ含有量は、核酸のパーセンテージで表したＲＮＡの量である。
【０２１３】
［結果］
ａ）塩化カルシウム沈降後のライゼートをＵＦ１にロードする（循環あり）
以下の表６に結果を表す。表６は、塩化カルシウム沈降後のＵＦ１のパフォーマンスに対して核酸ロード量の増量が及ぼす影響を表す。
【０２１４】
【表６】
2004514428.tif 000008
【０２１５】
低容量（ｌｏｗ ｖｏｌｕｍｅ）のＣｅｎｔｒａｍａｔｅ ０．１ｆｔ２ ３００Ｋ Ｏｍｅｇａメンブレンを設置したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦシステムで行ったこれまでの実験は、塩化カルシウム塩の存在下において、メンブレンを通してかなりの量のプラスミドが失われることを示唆している。従って、１００Ｋメンブレンを代わりに用いたところ、大きなプラスミド損失は起こらなかった。ただし、プラスミド回収率は予想していたものよりも低かったが、これは、出発ＴＭＰを１０ｐｓｉではなく、それ低い５ｐｓｉとすることによって改正した。ＲＮＡ除去は、塩化カルシウムを用いないＵＦ１と同様に、低イオン強度の濾過透析バッファーを用いることによって、最大となった。
【０２１６】
１ｆｔ２ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅシステムを用いて、１Ｍ塩化カルシウム塩の存在下で１フィート四方のメンブレンあたりプラスミド６０．０ｍｇをロードして、Ｌａｂｓｃａｌｅの結果を確認した。プラスミド回収率は、１００％超と高くなり、またＲＮＡ除去は非常に効率良く行われ、ＵＦ１捕捉物中のＲＮＡ含有量はたった２．６１％であった（表６）。塩化カルシウムを用いないＵＦ１とは対照的に、濃縮中及び最初の１０倍体積分の濾過透析中に、ＲＮＡが除去された。
【０２１７】
次に、メンブレンロード量を１０８ｍｇプラスミド／ｆｔ２に増やしたところ、プラスミド回収率（＞１００％）及びＲＮＡ除去（ＵＦ１捕捉物中の含有量４．５１％）共に同様の結果が得られた。
【０２１８】
濾過透析は、２つの工程で行った。最初の工程は３０倍体積分の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を用いてＲＮＡ除去を最大とした。この後に、２０倍体積分の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５でプラスミドのバッファー交換を行い、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラムに直接充填するためにこれを調製した。
【０２１９】
ｂ）塩化カルシウム沈降後のライゼートをＵＦ１にロードする（循環なし）
塩化カルシウムで処理したライゼートを用いて、ゲル層を形成するための循環を行わないＵＦ１を行った。透過液中にはごく少量のプラスミドしか検出されず（０．２％）、プラスミド回収率は非常に高かった（１００％超）。ＵＦ１捕捉物中のＲＮＡ含有量は４．６４％であった（表７）。表７は、ロード物中の核酸濃度が、塩化カルシウムの存在下で循環を行わないＵＦ１のパフォーマンスに及ぼす影響を示す。
【０２２０】
【表７】
2004514428.tif 000009
中和後の細胞破片除去工程及び塩化カルシウム沈殿物除去工程を組み合わせた。３Ｍの塩化カルシウムストック溶液を用いて、処理量を最小にした。体積０．６６のストック溶液を体積１の中和後のライゼートに直接加えた。この混合物をメッシュフィルタに通して細胞破片を除去した後、奥底フィルタに通してより小さな粒子を除去した。このプロセスは遠心分離よりも処理が速く、また含めるのがより簡単である。２回目の濾過透析バッファーも、０．５４Ｍ ＮａＣｌを含むものから０．４５Ｍ ＮａＣｌを含むものに変更した。プラスミド構築物をより小さいサイズに変更した（７．７Ｋｂｐから５．９Ｋｂｐへ）。
【０２２１】
濃縮透過液中のプラスミド損失は１．３％と比較的高く、これはプラスミドサイズが小さいことによるためであろう。プラスミドの回収率は９０．５％であり、ＵＦ１捕捉物中にはＲＮＡは検出されなかった（表７）。
【０２２２】
次に、ＵＦ１ロード物中のプラスミド濃度が６０．７μｇ／ｍｌから３６μｇ／ｍｌに低下するように、塩化カルシウムを加える前の操作から得た濃縮透過液で、ライゼートを２倍に希釈した。濃縮透過液中のプラスミド損失は５．９％へと大きく増え、プラスミド回収率は８２．７％と比較的低かった。これは、低産生宿主株から得たより小さなプラスミドは、ＵＦ１段階での回収率が低いことを示している。
【０２２３】
実施例１４に概説された実験結果から幾つかの結論を導き出すことができる。
【０２２４】
１．ＲＮＡは、循環中にゲル層に含まれしており、濃縮中にメンブレンを介して低レベルしか除去されないようであった。
【０２２５】
２．濾過透析バッファーのイオン強度は、ＲＮＡの除去において最も重要な要因であった。伝導率が低いと濾過透析中にメンブレンを通過するＲＮＡが大きく増加したが、正確なメカニズムは理解されていない。
【０２２６】
３．ＲＮＡの完全な除去を行うには５０倍体積分の濾過透析が推奨される。
【０２２７】
４．５Ｋｂｐ以上のプラスミドサイズにはメンブレン孔径３００Ｋが推奨される。
【０２２８】
５．ＲＮＡの除去における他の重要な要因は核酸のロード量であった。ロード量が低いほど、除去率が高かった。
【０２２９】
６．ＲＮＡを沈殿させるために塩化カルシウムをライゼートに加えるには、ＵＦ１工程で使用される条件の変更が必要であった。
【０２３０】
ｉ）プラスミドの損失を防ぐためにはより孔径の小さな（例えば１００Ｋ）メンブレンが必要であった。
【０２３１】
ｉｉ）またプラスミドの回収率を上げるためには低いＴＭＰ（５ｐｓｉ）が望ましかった。
【０２３２】
塩化カルシウムでの沈降後は、低分子量ＲＮＡのみが残り、これは、限外濾過工程によって効率良く除去された。
【０２３３】
７．メンブレンを分極するための循環は、塩化カルシウムの存在下もしくは不在下でのＲＮアーゼを用いないプロセスでは必要ないことが分かった。これは、濃縮開始時にすぐに分極する大量のＲＮＡの存在によるものであろう。しかし、核酸ロード量を減らすと、溶解中にＲＮアーゼを加えた時に観察されるプラスミドの損失を生じなかったので、循環を行わなかった。塩化カルシウムの存在下で、より小さなプラスミド構築物を通常濃度の半分でＵＦ１で処理したところ、メンブレンを介したプラスミド損失はごく僅かなレベルしかなかった。これは、循環を行わない塩化カルシウムの存在下でのＵＦ１工程の堅実さ（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を示している。
【０２３４】
上記知見にかんがみて、本発明者等は、抗カオトロピック塩の一例としてＣａＣｌ２を用いたプロセスをさらに最適化できるか否かを検証し続けた。３つの代替的な体制（ｒｅｇｉｍｅ）を研究した。これらの調査結果を以下の実施例１５に示す。
【０２３５】
実施例１５
以下の３つの体制を研究した：
＜オプション２＞
清澄化ライゼート→ＵＦ１→ＣａＣｌ２沈降→Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ
＜オプション３＞
清澄化ライゼート→ＵＦ１→ＣａＣｌ２沈降→ＵＦ２→Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ
＜オプション４＞
ライゼート→ＣａＣｌ２沈降→清澄化→ＵＦ１→Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ
［方法］
［溶解］
−７０℃で保存した細菌細胞ペースト１００ｇをマレットで砕いて小片にした。室温で、再懸濁バッファー５００ｍｌをＢｅｌｌｃｏ再懸濁容器に加えた。砕いた細胞ペーストを容器に加え、電磁撹拌機（設定８）で室温にて１時間攪拌した。
【０２３６】
溶解する直前に、冷室の中で、６％ ＳＤＳ（１６６ｍｌ）に冷たい０．９６％ ＮａＯＨ（８３４ｍｌ）を加えた。Ｈｅｉｄｏｌｐｈオーバーヘッド攪拌機を備えた容積３Ｌのビーカーに細胞懸濁液を移し、冷室に入れた。この細胞再懸濁液に溶解混合物を加え、４０ｒｐｍにて３０分間攪拌した。
【０２３７】
ライゼートに３Ｍ酢酸カリウム（５００ｍｌ）を加え、８０ｒｐｍ、４℃にて３０分間攪拌した。
【０２３８】
ライゼートをＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ Ｐｌｕｓ遠心分離装置で８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。上清をＭｉｒａｃｌｏｔｈの二重層で濾過した後、５μｍ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ２フィルタに通し、その後、０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐに通した。この物質を清澄化ライゼートと呼んだ。
【０２３９】
［ＵＦ１］
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ装置に１ｆｔ２ ３００Ｋ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、濾過透析バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で洗浄した。
【０２４０】
容器に約５００ｍｌの清澄化ライゼートを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗポンプを１５５ｒｐｍに設定し（クロスフロー流量１Ｌ／分／ｆｔ２）、ＴＭＰを５ｐｓｉに設定した。循環を２０分間続け、その間、ＴＭＰが１０ｐｓｉを超えないようにした。
【０２４１】
透過液ラインを２Ｌボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを７５ｍｌにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０２４２】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように容器を濾過透析バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析透過液を５ｘ１ Ｌボトル中に回収した。５０倍体積分（５Ｌ）の濾過透析バッファーを用いた。
【０２４３】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、ＵＦシステムの中身を３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２４４】
容器に７５ｍｌの新しい濾過透析バッファーを充填し、３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２４５】
ＵＦ１捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ０．４５μｍフィルタに通した。
【０２４６】
次に、５００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを１時間循環させることによって、ＵＦ１システムから不要なものを取り除いた。
【０２４７】
このＵＦ１系を０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存した。
【０２４８】
塩化カルシウム沈降
体積１のＵＦ１捕捉物に、体積０．１２の２．８Ｍ ＣａＣｌ２の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０溶液を加えて、最終塩化カルシウム濃度を０．３Ｍとした。この混合物を室温にて１０分間インキュベートした。
【０２４９】
次にこの混合物を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で２倍に希釈して塩化カルシウムの最終濃度を０．１５Ｍとした。次に３ｘ２５ＣＥフィルタ、次に４ｘ４０ＣＥフィルタ、そして最後に２ｘ０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルタに通して、沈殿物を濾過した。
【０２５０】
この物質を、塩化カルシウム沈降後のＵＦ１と呼んだ。
【０２５１】
［Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー］
容積２０ｍｌのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラム（１．６ｘ１０ｃｍ）を、カラム容積の１０倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で、流量５．１ｍｌ／分（１５２ｃｍ／ｈ）で平衡化した。
【０２５２】
カラムに、カラム容積ｍｌあたり約２．５ｍｇのプラスミドの割合で、塩化カルシウム沈降後の希釈したＵＦ１をロードした。このカラムを、カラム容積の２倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、次にカラム容積の５倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５で洗浄した。
【０２５３】
カラム容積の１０倍の０．５４〜３Ｍ ＮａＣｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液の勾配で、プラスミドを溶出した。
【０２５４】
カラム容積の４倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５でカラムを再利用した（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ）。
【０２５５】
カラム容積の５倍の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５でカラムを再び平衡化した。
【０２５６】
［ＵＦ２］
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅシステムに０．１ｆｔ２ １００Ｋ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、限外濾過バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で洗浄した。
【０２５７】
容器に、塩化カルシウム後の希釈していないＵＦ１物質を充填した。透過液ラインを容器に接続して、循環を行った。ポンプを４（クロスフロー流量１Ｌ／分／ｆｔ２）に設定し、ＴＭＰを５ｐｓｉに設定した。循環を２０分間続け、その間、ＴＭＰが１０ｐｓｉを超えないようにした。
【０２５８】
透過液ラインを容積５００ｍｌのボトルに接続して、塩化カルシウム後のＵＦ１を３５ｍｌに濃縮した（濃縮透過液）。
【０２５９】
濾液の損失分が同じ流量で新しいバッファーに交換されるように、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０バッファーのボトルに容器を接続することにより、濾過透析を開始した。濾過透析は、４０倍体積分の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、次に１０倍体積分の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５に対して行った。濾過透析透過液を４ｘ５００ｍＬボトル中に回収した。
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、ＵＦシステムの中身を３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ２濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２６０】
容器に５０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を充填し、３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２６１】
ＵＦ１捕捉物回収物及び２つの洗浄液をプールし、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ ＧＶフィルタに通した。
【０２６２】
次に、１００ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨを１時間循環させることによって、ＵＦ１システムから不要なものを取り除いた。
【０２６３】
このＵＦ１系を０．１Ｍ ＮａＯＨ中で保存した。
【０２６４】
［プロセスオプション２］
上述のようにアルカリ溶解を行った後、上述のようにＵＦ１を行い、上述のように塩化カルシウム沈降を行った。塩化カルシウム沈降後のＵＦ１（２３７ｍｌ）をＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラムに入れた。２４０ｍｌの漏出物（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）／洗浄液（ピーク１）、及び７５ｍｌの溶出物（ピーク２）が回収された。
【０２６５】
ＵＦ１捕捉物２８０ｍｌが生成されたが、濾過後には２１０ｍｌしか回収されなかった。物質の一部はフィルタ上で失われ、一部は漏洩して失われた。
【０２６６】
塩化カルシウム沈降後の希釈したＵＦ１捕捉物（４８２ｍｌ）を作製した。濾過後には４００ｍｌしか回収されなかった。
【０２６７】
［プロセスオプション３］
このオプションは、塩化カルシウム沈降後のＵＦ１捕捉物を希釈しない、という点以外は、アルカリ溶解を行った後にＵＦ１及び塩化カルシウム沈降を行うという意味で、オプション２と似ている。
【０２６８】
塩化カルシウム塩（除去しないとクロマトグラフィーカラムの邪魔になる）を除去するために、限外濾過工程（ＵＦ２）を導入した。
【０２６９】
ＵＦ２捕捉物（９０ｍｌ）を上記のように容積２０ｍｌのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラムに入れた。ただし、カラム容積の１０倍量の勾配は、０．５４〜１Ｍ ＮａＣｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液であった。
【０２７０】
ＵＦ１捕捉物（３１５ｍｌ）が生成されたが、濾過後は２９５ｍｌしか回収されなかった。
【０２７１】
塩化カルシウム沈降後のＵＦ１（３３０ｍｌ）が生成されたが、濾過後は３２０ｍｌしか回収されなかった。
【０２７２】
［プロセスオプション４］
溶解
溶解工程は、先述のような遠心分離は行わない点以外は、先述のものと同じであった。そのかわり、以下に記載するように、ライゼートを塩化カルシウム沈降にロードし、細胞破片の除去を行った。
【０２７３】
塩化カルシウム沈降及び細胞破片の除去
ライゼートの２０ｍｌサンプルを、ＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ ２０００で２５００ｒｐｍにて１０分間、遠心分離にロードした。上清を、清澄化ライゼートと呼んだ。
【０２７４】
ライゼート２１００ｍｌに、１９６０ｍｌの２Ｍ ＣａＣｌ２溶液を攪拌しながら加えた後、室温にて１０分間静置した。
【０２７５】
この混合物を、３５０ｍｍ， ２００μｍメッシュフィルタを設置したＰｌａｓｔｏｋホルダに注いで細胞破片を除去し、重量下で濾液を容積５Ｌのビーカーに回収した。次に濾液を、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ １５ＣＥカートリッジ奥底フィルタ、次に０．４５／０．２μｍ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐフィルタに通した。この濾液を、塩化カルシウム後のライゼートと呼んだ（体積＝３３５０ｍｌ）。
【０２７６】
［ＵＦ１］
Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ装置に１ｆｔ２ １００Ｋ Ｏｍｅｇａ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅオープンチャンネルメンブレンを設置して構成した限外濾過システムから保存溶液を出して空にし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０濾過透析バッファーで洗浄した。
【０２７７】
容器に塩化カルシウム後のライゼート約５００ｍｌを充填し、ライゼートの残りを含むボトルに接続した。透過液ラインを容器に接続することによって、循環を行った。Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗポンプを１５５ｒｐｍに設定し（クロスフロー流量１Ｌ／分／ｆｔ２）、ＴＭＰを５ｐｓｉに設定した。循環を２０分間続け、その間、ＴＭＰが１０ｐｓｉを超えないようにした。
【０２７８】
透過液ラインを２Ｌボトルに接続することによって、清澄化ライゼートを７５ｍｌにまで濃縮した（濃縮透過液）。
【０２７９】
同じ速度で濾液の損失分が新しいバッファーに交換されるように、容器を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０バッファーのボトルに接続することによって、濾過透析を開始した。濾過透析は、３５倍体積分の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の後に、１５倍体積分の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を用いて行った。濾過透析透過液の５ｘ１Ｌサンプルを回収した。
【０２８０】
濾過透析終了時に、捕捉物バルブを開き（逆圧なし）、透過液ラインを閉じて、ＵＦシステムの中身を３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物回収物）。
【０２８１】
容器に１００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．５を充填し、３０分間循環させた。捕捉物ラインを開いてＵＦ１濾過透析濃縮物を回収した（捕捉物洗浄液１）。これをもう１度繰り返した（捕捉物洗浄液２）。
【０２８２】
ＵＦ１捕捉物回収物及び２つの洗浄液（体積＝２９０ｍｌ）をプールし、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ０．４５μｍフィルタで濾過した（最終体積＝２７０ｍｌ）。
【０２８３】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
これは、カラム容積の１０倍の勾配が０．５４〜１Ｍ ＮａＣｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液である以外は、先述のとおりであった。
【０２８４】
ＵＦ１捕捉物（１２５ｍｌ）をカラムに入れた。１３５ｍｌの漏出物／洗浄液（ピーク１）及び１３５ｍｌの溶出物（ピーク２）を回収した。
【０２８５】
サンプルを以下に記載するように分析にロードした。
【０２８６】
サンプル分析
イオン交換ＨＰＬＣ
Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００ ４ｘ２５０ｍｍカラムの陰イオン交換ＨＰＬＣによって標準的なプロトコールに従ってプラスミド濃度を測定した。ＲＮアーゼでサンプルを消化してＲＮＡの干渉を除いた。ウシ膵臓ＲＮアーゼ（２μｌ）を１００μｌのサンプルに加えた。
【０２８７】
陰イオン交換ＨＰＬＣによってＴＳＫ ＤＮＡ−ＮＰＲ ４．６ｍｍｘ７．５ｃｍ、２．５μｍカラムで標準的なプロトコールに従ってプラスミドのトポロジーを測定した。
【０２８８】
ＲＮＡアッセイ
逆相ＨＰＬＣベースのアッセイを用いたＢＡＤにより、ＲＮＡ濃度を測定した。
【０２８９】
ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ ７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、５μｍカラムに接続したＴＳＫ Ｇ−ＤＮＡ−ＰＷ ７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、１０μｍカラムでのサイズ排除ＨＰＬＣにより、プラスミド／ＲＮＡ比を測定した。移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）は０．１Ｍ Ｔｒｉｓ＋０．３Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５であった。流量は０．３ｍｌ／分であった。サンプル投入量は１００μｌであった。
【０２９０】
タンパク質アッセイ
Ｐｉｅｒｃｅ社のＭｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットを用いてタンパク質濃度を測定した。０．６２５〜２０μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を用いて標準曲線をプロットした。ＰＢＳでサンプルを適度に希釈して、ＢＳＡ標準の範囲内に入るようにした。
【０２９１】
内毒素アッセイ
標準的なＬＡＬアッセイを用いてＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙにより内毒素濃度を測定した。
【０２９２】
ゲノムＤＮＡアッセイ
定量的ＰＣＲアッセイを用いてＢＡＤによりゲノムＤＮＡ濃度を測定した。
【０２９３】
脱塩
分析する前に、高レベルの塩化カルシウム塩を含むサンプル（塩化カルシウム沈降後のライゼート、ＵＦ１濃縮透過液、ＵＦ１濾過透析透過液）を脱塩した。低濃度であればアッセイを妨げなかったので、塩化カルシウム塩を含むプロセス２及び３のサンプルは脱塩しなかった。
【０２９４】
サンプル（２ｍｌ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で平衡化した連結２ｘ５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムに流量５ｍｌ／分で注入したところ、４．５ｍｌの脱塩物（２５４ｎｍでの吸光度ピーク）が回収された。
【０２９５】
［結果及び考察］
全ての計算に用いた体積は、濾過中に生じた損失について補正した（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）。これによって、各オプション間の比較がよりし易くなる。
【０２９６】
プロセスオプションの選択：オプション２
ＲＮＡの除去を最大にするために、清澄化ライゼートを、改変したＵＦ１工程にロードして処理した。この工程は、５０倍体積分のイオン強度の低いバッファーで濾過透析し、出発ＴＭＰ＝５ｐｓｉを用いるものである。１ｆｔ２の３００Ｋ ＰＥＳメンブレンにロードされるプラスミドは、平方フィートあたりプラスミド１３６．４ｍｇであった。次に、残ったＲＮＡを０．３塩化カルシウムで室温にて１０分間沈殿させた。この混合物を１対１で希釈して、塩化カルシウム塩濃度を０．１５Ｍとし、濾過により沈殿物を除去した。次に、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ陰イオン交換カラム上に濾液を直接充填した。塩化カルシウム塩がカラムへのプラスミドの結合を妨げるのを防ぐためには、希釈が必要であった。カラムに、カラム容積ｍｌあたり２．４７ｍｇのプラスミドをロードし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓで洗浄して初期のプラスミドが溶出されるのを防ぎ、その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌで残りのＲＮＡを溶出した。プラスミドを塩勾配で溶出した。
【０２９７】
全プラスミド回収率は８９．２％と高かった（以下の表８を参照されたい）。
【０２９８】
【表８】
2004514428.tif 000010
【０２９９】
ＵＦ１工程の回収率は７８．３％であったが、塩化カルシウム沈降工程の回収率は１００％を超えた。クロマトグラフィー工程全体の回収率は９１．１％であった。
【０３００】
全ＲＮＡ除去率は９９．８４％であった（以下の表９を参照されたい）。
【０３０１】
【表９】
2004514428.tif 000011
【０３０２】
改良したＵＦ１工程では、７４．９％のＲＮＡ除去率が得られた。ＲＮＡの大部分が濾過透析中に除去されること、および残りのＲＮＡの殆どは高分子量のものであることは、ＲＮＡが最初はゲル相の中に含まれるが、のちにイオン強度の低い濾過透析バッファーにより「再び可溶化され」、小さなサイズとなるためメンブレンを透過することができるようになることを示唆している。次に、ＵＦ１捕捉物中に回収されたＲＮＡの９９．４４％は、塩化カルシウムでの処理によって沈殿した。塩化カルシウムが高分子量ＲＮＡの特に強力な沈殿剤であることは周知である。しかし陰イオン交換カラムはＲＮＡをさらに除去することはなかったが、ＲＮＡはカラムの漏出物中に検出された。ＲＮＡアッセイの結果に矛盾があるようである。
【０３０３】
サイズ排除ＨＰＬＣによる分析は、塩化カルシウムでの処理の影響を表す。プラスミド／ＲＮＡ比は、ＵＦ１捕捉物中において１６．１１％であったものが、塩化カルシウムでの沈降後に８９．７６％に上昇した（以下の表１０を参照されたい）。
【０３０４】
【表１０】
2004514428.tif 000012
【０３０５】
このプロセスの終了時のＲＮＡ含有量はたったの１．０５％であった。
【０３０６】
イオン交換ＨＰＬＣによるプラスミドのトポロジーの分析結果は、このプロセスがプラスミドのアイソフォームのレベルに影響を及ぼさなかったことを示している。プロセス全体で、プラスミドの約９６％がスーパーコイル構造を形成し、約３．４％が多量体を形成した（以下の表１１を参照されたい）。
【０３０７】
【表１１】
2004514428.tif 000013
【０３０８】
ＵＦ１工程により、タンパク質の９９．８７％が除去された（以下の表１２を参照されたい）。
【０３０９】
【表１２】
2004514428.tif 000014
【０３１０】
タンパク質は３００Ｋメンブレンを介して効率良く除去されるほど小さい。プロセスの終了時には、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ溶出物中にタンパク質を検出することができなかった。
【０３１１】
全体的な内毒素除去率は、９９．９４％超と高かった（以下の表１３を参照されたい）。
【０３１２】
【表１３】
2004514428.tif 000015
【０３１３】
塩化カルシウム工程により、８９．４％を超える高い内毒素除去率が得られた。陰イオン交換工程も、内毒素を除去したが、正確な数字を計算することはできなかった。ＵＦ１工程は内毒素レベルに大きな影響を及ぼさなかった。この段階では１７．６％しか除去されなかった。
【０３１４】
ゲノムＤＮＡレベルは、工程を組み合わせることによって低下した：ＵＦ１工程では５５％、塩化カルシウム工程では７７．６％、及び陰イオン交換工程では６６．１％の低下（以下の表１４を参照されたい。表１４は、塩化カルシウムの存在下で循環を行わない場合の、ＵＦ１のパフォーマンスに対してロード物中の核酸濃度が及ぼす影響を表す）。
【０３１５】
【表１４】
2004514428.tif 000016
【０３１６】
全体的な除去率は９６．６％であった。塩化カルシウム工程は、予想したほどのインパクトを持たなかった。これはおそらく０．３Ｍという低い濃度を用いたためであると思われる。
【０３１７】
プロセスオプション選択：オプション３
オプション３は、陰イオン交換カラムに入れる前に塩化カルシウム塩を除去するために第２のＵＦ工程が導入される以外は、オプション２に非常に良く似ている。ＵＦ２工程で用いたメンブレンは、塩化カルシウム塩の存在下でプラスミドの損失を防ぐために、低分子量１００Ｋのカットオフを有するものであった。ＲＮＡの除去を促進するために濾過透析開始時にはイオン強度の低いバッファーを用い、その後、クロマトグラフィーカラムに充填する前に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌでバッファー交換を行った。プラスミドの回収率を上げるために、５ｐｓｉという低い初期ＴＭＰを選択した。メンブレンロード量は、メンブレンの平方フィートあたりプラスミド９０９ｍｇであった。残ったＲＮＡの大部分は濃縮及び初期濾過透析中に除去された。陰イオン交換工程は、オプション２で記載したように行った。
【０３１８】
ＵＦ１工程全体のプラスミド回収率は７４．５％であり、その後、塩化カルシウム沈降工程全体では１００％を超え、ＵＦ２工程では７１．１％であった（以下の表１５を参照されたい）。
【０３１９】
【表１５】
2004514428.tif 000017
【０３２０】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラムの漏出物中に吸光度のピークが検出された。漏出物中でプラスミドの３７％が失われ、溶出物中で４１．３％が回収された。これらの分画を合わせた全体的な回収率は４８．８％であった。カラムロード量は、カラム容積ｍｌあたりプラスミド２．８６ｍｇ（オプション２よりわずかに高い）であったが、これが観察された大量のプラスミド損失を説明するものであるかは疑問である。充填するバッファーも異なるものであった。カラムに、オプション３では５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌを充填したのに比べ、オプション２では０．１５Ｍ塩化カルシウム及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓを充填したので、充填するバッファーのイオン強度が高すぎたかもしれない。
【０３２１】
全体的なＲＮＡ回収率は９９．９８５％と非常に高かった（以下の表１６を参照されたい）。
【０３２２】
【表１６】
2004514428.tif 000018
【０３２３】
ＲＮＡ除去率は、ＵＦ１工程では７７．２％、塩化カルシウム沈降工程では９８．８％、ＵＦ２工程では７４．９％、及びクロマトグラフィーカラムでは７８％であった。これらの結果は、ＵＦ２工程によって行われる追加的な除去を除けば、プロセス２で得られるものに非常に良く似ている。
【０３２４】
サイズ排除ＨＰＬＣによる分析は、プラスミド／ＲＮＡ比が、ＵＦ１捕捉物中で１７．０２％であったのが塩化カルシウムでの沈降後は９２．２５％に、ＵＦ２捕捉物中では９５．２４％であったのが陰イオン交換クロマトグラフィー工程後には９８．９１％に増加することを表している（表１７を参照されたい）。
【０３２５】
【表１７】
2004514428.tif 000019
【０３２６】
イオン交換ＨＰＬＣによるプラスミドトポロジーの分析は、ＵＦ１捕捉物段階及び塩化カルシウムでの沈降後には、プラスミドの約９６％がスーパーコイル構造を形成し、３．５％が多量体を形成することを表している（以下の表１８を参照されたい）。
【０３２７】
【表１８】
2004514428.tif 000020
【０３２８】
ＵＦ２工程後では、プラスミドの２２．７３％は開環状であり、スーパーコイル状のものは７５．５％しかない。ＵＦ２工程で使用したＬａｂｓｃａｌｅ ＵＦシステム上のポンプは適切ではなく、プラスミドをせん断したため、開環状のプラスミドが高レベルとなった可能性がある。この段階でのこれまでの実験から、ＵＦ２工程自体が不適切であるとは考えられない。しかしこの知見は、クロマトグラフィー工程の漏出物中における高いプラスミドレベルを説明するものと思われる。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌの洗浄バッファーが開環状プラスミドを溶出するように設計された可能性が極めて高い。このバッファー中において、カラムに充填された開環状プラスミドは、そのあと結合を妨げることになるであろう。
【０３２９】
ＵＦ１段階でのタンパク質除去率は９９．８６％であり、全体的な除去率は９９．９９７％となった（以下の表１９を参照されたい）。
【０３３０】
【表１９】
2004514428.tif 000021
【０３３１】
＊塩化カルシウム塩の存在によって形成された混濁沈殿物
内毒素の除去率は、ＵＦ１段階ではたったの２７．９％であったが、塩化カルシウム沈降工程全体では９０％であった（以下の表２０を参照されたい）。
【０３３２】
【表２０】
2004514428.tif 000022
【０３３３】
またＵＦ２工程では、３６．８％という低い除去率であった。これは、限外濾過が内毒素除去工程として重要ではないことを確認するものである。しかし、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥでのクロマトグラフィー工程では、９９．３％を超える残りの内毒素が除去され、全体的な除去率は９９．９７％を超えた。
【０３３４】
ゲノムＤＮＡ除去率は主に、塩化カルシウム沈降工程の結果であった。９４％の除去率が観察された（表２１を参照されたい）。
【０３３５】
【表２１】
2004514428.tif 000023
【０３３６】
他の工程除去率の数字は、ＵＦ１工程では０％、ＵＦ２工程では７２．５％、及びクロマトグラフィー工程では５９．６％であった。全体的なＤＮＡ除去率は９９．２％であった
プロセスオプション選択：オプション４
アルカリ溶解後の細胞破片除去工程を、塩化カルシウム沈殿物除去工程と組み合わせた。酢酸カリウムで中和した後に、塩化カルシウムの最終濃度が１Ｍとなるようにライゼートに２Ｍの塩化カルシウムストック溶液を加えた。次に、２００μｍの孔を有するふるい型フィルタ（ｓｉｅｖｅ ｆｉｌｔｅｒ）により細胞破片を除去した後、奥底フィルタでの濾過によって、より小さな粒子を取り除いた。１００Ｋ、１ｆｔ２ ＰＥＳメンブレンでＵＦ１工程を行い、塩化カルシウム塩の存在下でのプラスミド損失を防いだ。ＲＮＡ除去率を最大にするために濾過透析開始時にはイオン強度の低いバッファーを使用し、その後、陰イオン交換カラムに入れる前に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋０．５４Ｍ ＮａＣｌをバッファー交換に使用した。出発ＴＭＰを５ｐｓｉに下げ、プラスミド回収率を上げた。メンブレンロード量は、メンブレン平方フィートあたりプラスミド２４０ｍｇであった。カラム容積ｍｌあたりプラスミド２．８３ｍｇの割合でロードして、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ上での陰イオン交換クロマトグラフィーを前記のように行った。
【０３３７】
プラスミド回収率は、塩化カルシウム工程全体では１００％を超え、ＵＦ１工程全体では５０．８％であった（表２２を参照されたい）。
【０３３８】
【表２２】
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【０３３９】
ロードしたプラスミドの１５．９％は漏出物中で失われ、８１．５％が溶出された。２．８３ｍｇ／ｍｌでは、カラムへのロード量が多すぎたのかもしれない。これらの２つの分画を組み合わせた全体的なプラスミド回収率は７２．８％であった。
【０３４０】
全体的なＲＮＡ除去率は９９．９％であった（表２３を参照されたい）。
【０３４１】
【表２３】
2004514428.tif 000025
【０３４２】
除去されたＲＮＡうちの８４．６％（主に高分子量ＲＮＡ）は、塩化カルシウム沈降工程により除去されたものである。次に、ＵＦ１工程によって低分子量ＲＮＡが容易に除去された（除去率９７．７％）。クロマトグラフィーカラム全体のＲＮＡ除去率は７２．２％であった。
【０３４３】
サイズ排除ＨＰＬＣによる分析により、ＵＦ１捕捉物中のプラスミドレベルが９７．７％であり、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ溶出液中では９８．６２％に増加していたことが分かった（表２４を参照されたい）。
【０３４４】
【表２４】
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【０３４５】
イオン交換ＨＰＬＣによるプラスミドトポロジーの分析により、塩化カルシウム沈降後のライゼートはスーパーコイル状のプラスミドを８４．４４％及び開環状のプラスミドを１４％含んでいたことが分かった（表２５を参照されたい）。
【０３４６】
【表２５】
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【０３４７】
スーパーコイル状の割合は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ溶出液中では９４．７６％に増加し、開環状の割合は２．１６％、及び多量体の割合は３．０８％であった。
【０３４８】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ溶出液中にタンパク質は検出されなかった。塩化カルシウム沈降工程では、タンパク質の９５．８％が除去され、ＵＦ１工程では残りのうち９９．７％が除去された（以下の表２６を参照されたい）。
【０３４９】
【表２６】
2004514428.tif 000028
【０３５０】
内毒素の全体的な除去率は９９．５％を超えていた（表２７を参照されたい）。
【０３５１】
【表２７】
2004514428.tif 000029
【０３５２】
これらのアッセイ結果の除去率にどの工程が貢献していたかを決定することは不可能であったが、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥカラムでの除去率は９８．９％を超えていた。
【０３５３】
全体的なゲノムＤＮＡ除去率は９９．８％を超えていた（以下の表２８を参照されたい）。
【０３５４】
【表２８】
2004514428.tif 000030
【０３５５】
塩化カルシウム沈降段階ではゲノムＤＮＡの９８％が除去され、ＵＦ１工程により７４％、及びクロマトグラフィー工程では７５％であった。
【０３５６】
これらの代替的なプロセスの利点は、以下の表２９において最も簡単に比較することができる。
【０３５７】
【表２９】
2004514428.tif 000031
【０３５８】
全体的なプラスミド回収率は、オプション３（ピークの合計が４８．８％）に比べてオプション２（８９．２％）及び４（ピークの合計が７２．８％）の方が高かった。いずれの単独工程も、低いプラスミド回収率となることはなかった。オプション３の全体的なプラスミド回収率が低いのは、主に追加的なＵＦ工程を導入したためである。
【０３５９】
３つのオプション全てにおいてＲＮＡ除去率は高かった（９９．８４〜９９．９８５％）。オプション３は、プラスミドの重量あたりＲＮＡ含有量は１．３７重量％であった。しかし、オプション２及び４は、ＲＮＡ含有量がそれぞれ３．６５％及び３．１３％となった。限外濾過及び塩化カルシウム工程はいずれも効率良く機能し、実際に、限外濾過工程は低分子量ＲＮＡを除去し、塩化カルシウムは高分子量ＲＮＡを沈殿させたので、良い組合せであった。オプション３及び４では、それぞれ９６．６％及び９４．８％で好適なレベルのスーパーコイル状プラスミドが得られた。しかしオプション３は、高い割合の開環状プラスミドを生成することになったので、スーパーコイル状プラスミドは結果的に７８．５％しかなかった。これは、ＵＦ２で用いた限外濾過システムによるものであり、このオプションを除外すべきではない。
【０３６０】
３つのオプション全てについてタンパク質除去率は高く、オプション３及び４では検出不可能なレベルであった。オプション３のタンパク質重量比が０．９６％であったのは、ＢＣＡアッセイが、タンパク質レベルを正確に表すものではなく、むしろ混入により誤った結果が得られる傾向があるためであろう。オプション２に比べて、精製工程が１つ追加されたオプション３でより高いタンパク質レベルを予期する理由はない。ＵＦ１工程及び塩化カルシウム工程はいずれも、タンパク質不純物の除去において非常に効率的であった。
【０３６１】
内毒素の除去率は非常に高く、３つのオプション全ての最終的な物質中において、アッセイの検出限界未満のレベルであった。
【０３６２】
塩化カルシウム沈降工程及び陰イオン交換工程はいずれも高い内毒素除去率であった。
【０３６３】
最後に、ゲノムＤＮＡレベルは特にオプション３及び４について非常に低かった。高いゲノムＤＮＡ除去率は、高い塩化カルシウムレベルと関係があるようであった。
【０３６４】
全てのデータを注意深く評価したところ、３つのオプション全ては不純物の除去を良好に行ったので、不純物の除去を基準に考えると、これら３つのオプションはいずれも、除外する理由は無いように思われた。オプション３はプラスミド回収率が最も低かったが、ＲＮＡ除去率は最も良かった。オプション４は、精製工程数が少なく、スケールを拡大するのが最も簡単なオプションであるため、オプション４が好ましかった。
【０３６５】
結論
これら３つのオプションの異なる点は、塩化カルシウム沈降工程をどこに導入するか（溶解後又はＵＦ１工程後）ということ、及びクロマトグラフィーの前に塩化カルシウム塩を除去するために第２の限外濾過工程が必要か否か、ということだけであった。結果は、３つのオプション全てが実行可能であり、５０％を超えるプラスミド回収率及び良好な不純物除去が得られることを示した。
【０３６６】
低いレベル（１．２ｍｇプラスミド／ｍｌ）でプラスミドをクロマトグラフィーカラムにロードすること、及び勾配溶出を用いることによって、ＲＮＡ除去率は上昇した。実際に、右側の溶出勾配及びピークカット（ｐｅａｋ ｃｕｔｔｉｎｇ）を用いると、最終ＲＮＡレベルは、アッセイの検出限界未満となる程非常に低かった。
【０３６７】
塩化カルシウムは、ＲＮＡ、タンパク質、内毒素及びゲノムＤＮＡのレベルを低下させるのに非常に大きな効果をもたらした。その結果、内毒素及びゲノムＤＮＡの最終レベルは、ＲＮアーゼを用いるプロセスにおけるものよりも低かった。
【０３６８】
本願（本明細書及び特許請求の範囲はその一部をなす）は、あらゆる後続出願に関して優先権の基礎として使用され得る。このような後続出願の特許請求の範囲に記載される発明は、本明細書中に記載される任意の特徴またはその組み合わせに関するものであってもよい。これらの発明は、生成物、組成物、プロセス又は用法に関する発明であってもよく、例として（ただし限定するわけではない）、本願の特許請求の範囲に記載された発明の１つ以上を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、ライゼートを得るために行われる処理工程を表す図であり、図１ｂは、本発明のプロセスを用いて医薬品質の染色体外ＤＮＡを得るための３つの他のルートを表す図である。
【図２】
図２ａは、実施例１のライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図２ｂは、実施例１の濾過透析の透過液のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図２ｃは、実施例１の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図３】
図３ａは、実施例２の５００ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図３ｂは、実施例２の５００ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）を用いて得た捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図３ｃは、実施例２の１００ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図３ｄは、実施例２の１００ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図３ｅは、実施例２の１０ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図３ｆは、実施例２の１０ｍＭバッファー（ｐＨ７．５）の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図４】
図４ａは、実施例３の１０ｍＭバッファー（ｐＨ６．０）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図４ｂは、実施例３の１０ｍＭバッファー（ｐＨ６．０）の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図４ｃは、実施例３の１０ｍＭバッファー（ｐＨ９．０）に対して濾過透析されるライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図４ｄは、実施例３の１０ｍＭバッファー（ｐＨ９．０）の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図５】
図５は、実施例４のバッファーについての透過流束と濾過透析量との関係を表す図である。
【図６】
図６は、実施例４のバッファーについてのＴＭＰと濾過透析量との関係を表す図である。
【図７】
図７ａは、実施例５のライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図７ｂは、実施例５の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図８】
図８ａは、実施例６のライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｂは、実施例６の濃縮透過液のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｃは、実施例６の濾過透析透過液（１０倍量）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｄは、実施例６の濾過透析透過液（２０倍量）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｅは、実施例６の濾過透析透過液（３０倍量）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｆは、実施例６の濾過透析透過液（４０倍量）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｇは、実施例６の濾過透析透過液（５０倍量）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｈは、実施例６の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図８ｉは、図８ｈと比べて２倍のロード量での実施例６の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図９】
図９ａは、２０分循環させた後の実施例８の透過液のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｂは、実施例８のライゼートのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｃは、２０分循環させた後の実施例８の捕捉物のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｄは、実施例８の濃縮中の透過液のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｅは、実施例８の濾過透析中の透過液（１回目の１５０ｍｌ）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｆは、実施例８の濾過透析中の透過液（２回目の１５０ｍｌ）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｇは、実施例８の濾過透析中の透過液（３回目の１５０ｍｌ）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｈは、実施例８の濾過透析中の透過液（４回目の１５０ｍｌ）のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｉは、濃縮及び濾過透析後の実施例８の捕捉物のプールのイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｊは、実施例８の洗浄液１のイオン交換ＨＰＬＣトレースであり、図９ｋは、実施例８の洗浄液２のイオン交換ＨＰＬＣトレースである。
【図１０】
図１０ａは、ｐＨ６．８で１０〜５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いたプラスミドＤＮＡ分離を表す溶出プロフィールであり、図１０ｂは、ｐＨ７．６で１０〜５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いたプラスミドＤＮＡ分離を表す溶出プロフィールであり、図１０ｃは、ｐＨ７．８で１０〜５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いたプラスミドＤＮＡ分離を表す溶出プロフィールであり、図１０ｄは、ｐＨ８．８で１０〜５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を用いたプラスミドＤＮＡ分離を表す溶出プロフィールである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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2004514428.tif 000149
2004514428.tif 000150
2004514428.tif 000151
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514428.tif 000152
2004514428.tif 000153
【国際調査報告】
2004514428.tif 000154
2004514428.tif 000155
2004514428.tif 000156
2004514428.tif 000157
2004514428.tif 000158