(57)【要約】式Ａ−Ｌ−Ｐの接合体であって、Ａは、細胞表面の受容体に結合するグリコシル化／ガラクトシル化ペプチドを表し、Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、Ｐは少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表す接合体を提供する。これは、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害する。ここで、ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である。さらに、そのような接合体を含む組成物、および哺乳類における異常な細胞増殖を阻害する方法、および哺乳類におけるウイルスの複製を阻害する方法も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に定義された、式Ａ−Ｌ−Ｐの構造的に均一な接合体であって、
Ａは、肝臓を構成する細胞上の細胞表面受容体に結合するグリコシル化ペプチドを表し、
Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、
Ｐは、少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表し、該ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害し、
ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である接合体。
【請求項２】
請求項１に記載の接合体であって、前記ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体を含む接合体。
【請求項３】
請求項２に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、５−フルオロ−２´−デオキシウリジン（５ＦｄＵ）である接合体。
【請求項４】
請求項２に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、フッ化ピリミジンである接合体。
【請求項５】
請求項４に記載の接合体であって、前記フッ化ピリミジンは５−フルオロ−ウラシル（５ＦＵ）である接合体。
【請求項６】
請求項３に記載の接合体であって、Ｐは５ＦｄＵのホモポリマーである接合体。
【請求項７】
請求項６に記載の接合体であって、前記ホモポリマーは２〜１２の５ＦｄＵを含む接合体。
【請求項８】
請求項７に記載の接合体であって、前記２〜１２の５ＦｄＵのそれぞれは、隣接するそれぞれの５ＦｄＵと、リン酸ジエステル結合またはホスホチオエート結合によって共有結合する接合体。
【請求項９】
請求項６に記載の接合体であって、前記ホモポリマーは２〜６の５ＦｄＵを含む接合体。
【請求項１０】
請求項９に記載の接合体であって、前記２〜６の５ＦｄＵのそれぞれは、隣接するそれぞれの５ＦｄＵと、リン酸ジエステル結合またはホスホチオエート結合によって共有結合する接合体。
【請求項１１】
請求項３に記載の接合体であって、Ｐはモノマーである接合体。
【請求項１２】
請求項２に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体はアザピリミジンヌクレオシドである接合体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の接合体であって、前記アザピリミジンヌクレオシドは５−アザシチジン（５−ＡｚａＣｙｄ）、５−アザウリジン（５−ＡｚａＵｒｄ）、６−アザシチジン（６−ＡｚａＣｙｄ）、または６−アザウリジン（６−ＡｚａＵｒｄ）である接合体。
【請求項１４】
請求項１２に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、３−デアザピリミジンヌクレオシドである接合体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の接合体であって、前記３−デアザピリミジンヌクレオシドは３−デアザウリジン（３−ＤｅａｚａＵｒｄ）である接合体。
【請求項１６】
請求項１に記載の接合体であって、前記ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、糖で修飾されたヌクレオシドを含む接合体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の接合体であって、前記糖で修飾されたヌクレオシドは、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−シトシン（ＡｒａＣ）、シクロシチジン、２´−Ｏ−ニトロ−ＡｒａＣ、９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−アデニン（ａｒａＡ）、シクラリジン、２´，２´−ジフルオロデオキシシチジン、２´−デオキシ−２´−メチリデンシチジン（ＤＮＤＣ）またはアシクロヌクレオシドである接合体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の接合体であって、前記アシクロヌクレオシドは、アシクロビルまたはガンシクロビルである接合体。
【請求項１９】
請求項１に記載の接合体であって、前記ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、フルダラビンフォスフェート、２−ハロアデニン−２´−デオキシリボヌクレオシド、２−クロロアデニン−アラビノヌクレオシド、２´デオキシコフォルミシン、または２−ハロ−２´−フルオロアラビノヌクレオシドを含む接合体。
【請求項２０】
請求項１〜１０および１２〜１９の何れかに記載の接合体であって、Ｐが二以上のヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むとき、該ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は互いに共有結合し、該共有結合の少なくとも一つは細胞内で切断可能である接合体。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れかに記載の接合体であって、Ｐは放射性核種を含む接合体。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れかに記載の接合体であって、Ａはアミド結合によってＬと共有結合する接合体。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れかに記載の接合体であって、Ｌはチオエーテル結合によってＰと共有結合する接合体。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れかに記載の接合体であって、Ａは、
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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から成る群から選択され、
該糖は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコースアミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、またはフコースである接合体。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れかに記載の接合体であって、Ａ
はＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３である接合体。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れかに記載の接合体であって、ＬはＳＭＣＣ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル  ４−（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル−１−カルボキシレート）の生成物である接合体。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れかに記載の接合体であって、Ｌはヘテロ二官能性である接合体。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れかに記載の接合体であって、Ｌは、
【化５】
2004536027.tif 000027
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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およびα−シトラコニル−Ｋ−（ε−ＦＭＯＣ）ＰＩＬＦＦＲＬ（Ｎ−ａ−シトラコニルＬｙｓ（ｅＦＭＯＣ）−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ）から成る群から選択されるクロスリンク試薬の生成物である接合体。
【請求項２９】
化学的に定義された、式Ａ−Ｌ−Ｐの構造的に均一な接合体であって、
Ａは、細胞上の細胞表面アシアロ糖タンパク質受容体に結合するガラクトシル化ペプチドを表し、
Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、
Ｐは、少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表し、該ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害し、
ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である接合体。
【請求項３０】
請求項２９に記載の接合体であって、前記ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体を含む接合体。
【請求項３１】
請求項３０に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、５ＦｄＵである接合体。
【請求項３２】
請求項３０に記載の接合体であって、前記アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、フッ化ピリミジンである接合体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の接合体であって、前記フッ化ピリミジンは５ＦＵである接合体。
【請求項３４】
請求項３１に記載の接合体であって、Ｐは５ＦｄＵのホモポリマーである接合体。
【請求項３５】
請求項３４に記載の接合体であって、前記ホモポリマーは２〜１２の５ＦｄＵを含む接合体。
【請求項３６】
請求項３５に記載の接合体であって、前記２〜１２の５ＦｄＵのそれぞれは、隣接するそれぞれの５ＦｄＵと、リン酸ジエステル結合またはホスホチオエート結合によって共有結合する接合体。
【請求項３７】
請求項３４に記載の接合体であって、前記ホモポリマーは２〜６の５ＦｄＵを含む接合体。
【請求項３８】
請求項３７に記載の接合体であって、前記２〜６の５ＦｄＵのそれぞれは、隣接するそれぞれの５ＦｄＵと、リン酸ジエステル結合またはホスホチオエート結合によって共有結合している接合体。
【請求項３９】
請求項３１に記載の接合体であって、Ｐはモノマーである接合体。
【請求項４０】
請求項２９〜３８の何れかに記載の接合体であって、Ｐが二以上のヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むとき、前記ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は互いに共有結合し、該共有結合の少なくとも一つは細胞内で切断可能である接合体。
【請求項４１】
請求項２９〜４０の何れかに記載の接合体であって、Ｐは放射性核種を含む接合体。
【請求項４２】
請求項２９〜４１に記載の接合体であって、Ａはアミド結合によってＬと共有結合する接合体。
【請求項４３】
請求項２９〜４２に記載の接合体であって、Ｌはチオエーテル結合によってＰと共有結合する接合体。
【請求項４４】
請求項２９〜４３の何れかに記載の接合体であって、Ａは、
【化１１】
2004536027.tif 000033
【化１２】
2004536027.tif 000034
【化１３】
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【化１４】
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から成る群から選択され、
該糖は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコースアミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、またはフコースである接合体。
【請求項４５】
請求項２９〜４４の何れかに記載の接合体であって、Ａ
はＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３である接合体。
【請求項４６】
請求項２９〜４５の何れかに記載の接合体であって、ＬはＳＭＣＣの生成物である接合体。
【請求項４７】
請求項２９〜４６の何れかに記載の接合体であって、Ｌはヘテロ二官能性である接合体。
【請求項４８】
請求項２９〜４７の何れかに記載の接合体であって、Ｌは、
【化１５】
2004536027.tif 000037
【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
2004536027.tif 000042
およびα−シトラコニル−Ｋ−（ε−ＦＭＯＣ）ＰＩＬＦＦＲＬから成る群から選択されるクロスリンク試薬の生成物である接合体。
【請求項４９】
請求項１〜２８の何れかに記載の接合体を含む組成物。
【請求項５０】
請求項４９の組成物であって、薬剤的に許容される担体を含む組成物。
【請求項５１】
請求項２９〜４８の何れかに記載の接合体を含む組成物。
【請求項５２】
請求項５１の組成物であって、薬剤的に許容される担体を含む組成物。
【請求項５３】
哺乳類における異常な細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、異常な細胞増殖を阻害する量の請求項１〜２８の何れかに記載の接合体または請求項４９〜５０に記載の組成物を前記哺乳類に投与し、該哺乳類における異常な細胞増殖を阻害することを含む方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記異常な細胞増殖は肝細胞癌である方法。
【請求項５５】
哺乳類における異常な細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、異常な細胞増殖を阻害する量の請求項２９〜４８の何れかに記載の接合体または請求項５１〜５２に記載の組成物を前記哺乳類に投与し、該哺乳類における異常な細胞増殖を阻害することを含む方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記異常な細胞増殖は肝細胞癌である方法。
【請求項５７】
哺乳類におけるウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、ウイルスの複製を阻害する量の請求項１〜２８の何れかに記載の接合体または請求項４９〜５０に記載の組成物を前記哺乳類に投与し、該哺乳類におけるウイルスの複製を阻害することを含む方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記ウイルスは肝炎である方法。
【請求項５９】
哺乳類におけるウイルスの複製を阻害する方法であって、該方法は、ウイルスの複製を阻害する量の請求項２９〜４８の何れかに記載の接合体または請求項５１〜５２に記載の組成物を前記哺乳類に投与し、該哺乳類におけるウイルスの複製を阻害することを含む方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記ウイルスは肝炎である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、化学的に定義された構造的に均一なグリコシル化／ガラクトシル化ペプチドの接合体、二官能性リンカー、およびヌクレオチドのモノマー／ポリマー、それらを含む組成物、並びに異常な細胞増殖の阻害およびウイルス複製の阻害のような使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオチドおよび核酸の生合成は、癌細胞の制御不能な増殖およびウイルス病原体の複製のどちらにも必要とされる。ヌクレオシド類縁体は、ヌクレオチドおよび核酸の生合成を選択的に妨げるその能力により、理想的な抗癌剤および抗ウイルス剤になる。ヌクレオシド類縁体は、核酸生合成に関与する酵素の結合サイトの天然対応物と競合することにより、ヌクレオチドおよび核酸の合成を阻害する（Ｐｅｒｉｇａｕｄ他、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１１：９０３（１９９２））。これによって、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む核酸前駆体の形成は阻止される。さらに、類縁体が核酸分子に取り込まれることにより、これらの分子の複製および／または転写が妨げられる。従って、ヌクレオシド類縁体を癌性細胞へ投与することによりそれらの増殖を妨げることができ、一方、そのような類縁体をウイルス感染細胞へ投与することにより感染しているウイルスの複製を妨げることができる。
【０００３】
ヌクレオシド類縁体は、比較的サイズが小さく静電気的に中性であるため、容易に原形質膜を通過し、それらの細胞内標的サイトに容易に移動する。しかしながらヌクレオシド類縁体の治療効果は、それらの活性阻害剤への転化が細胞内酵素に依存しているために厳しく制限される。ヌクレオチドおよび核酸の生合成を阻害するために、リン酸基がヌクレオシド類縁体の糖残基に結合する工程が必要である。ヌクレオシド類縁体は、活性代謝生成物に転化する工程を二つ以上経なければならない場合もあり、それによって、それらが阻害剤として作用するのに要する時間、および類縁体が不活性代謝生成物に転化される機会が増加し、結局、それらの有効性は減少する。
【０００４】
活性阻害剤へ転化するための細胞内酵素への依存は、リン酸基を含むヌクレオチド類縁体を使用することにより軽減される。それらはヌクレオシド類縁体と比較してより直接的な作用態様を提供するが、ヌクレオチド類縁体を細胞内に送達することはリン酸基の高い負電荷のために厳しく妨げられる。それ故、ヌクレオチド類縁体をそれらの細胞内標的に送達するための機構が望まれる。
【０００５】
Ｇｍｅｉｎｅｒ他（米国特許番号５，４５７，１８７）は、コレステロール、エチル−スペースドアダマンタン（ｅｔｈｙｌ−ｓｐａｃｅｄ ａｄａｍａｎｔａｎｅ）、１，２−ジヘキサデシルグリセロールおよびポリ−Ｌ−リジンを含む親油性または陽イオン性の部分の共有結合を介した、ヌクレオチド類縁体、５−フルオロデオキシウリジン  ５´モノフォスフェートの送達を開示している。細胞への侵入は、ホモ−オリゴマーのような類縁体を送達することによってさらに亢進される。これらの接合体は、細胞内への薬剤の送達機構を提供するが、それらはヌクレオチド類縁体を特定の組織または細胞に向けさせない。
【０００６】
殆どの薬剤と同様に、ヌクレオチド類縁体の臨床的な適用は、それらが標的細胞群に届かないために、また、それらが非標的細胞にもたらす毒性のために制限される。組織特異的薬剤ターゲティングは、全身毒性を減少するだけでなく、標的の細胞または組織に薬剤が集中することによって薬剤の作用を増強するであろう（Ｗａｄｈｗａ他、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ３：１１１（１９９５））。それゆえに、組織特異的方法におけるヌクレオチド類縁体のターゲティングが望まれる。
【０００７】
その結果として、幾つかの組織特異的薬剤のターゲティング戦略が、これらの問題を克服する試みの中で生じた。そのような戦略の一つは、担体が媒介する薬剤ターゲティングであり、薬剤と組織特異的ターゲティング部分との共有または非共有会合のどちらかを含む。活性ターゲティングと称されたこの戦略のサブクラスにおいて、ターゲティング部分は、標的サイトで支配的な特異的受容体によって認識されるリガンドである。受容体に結合しているリガンドは、結果として受容体が媒介するエンドサイトーシスになり、ここで薬剤−リガンド接合体は、標的細胞によって受容体とともに内部に取り入れられる。一旦細胞内部に入ると、接合体はリガンドと薬剤の間の結合を切断する細胞内酵素に感受性が高く、薬剤は接合体から放出される。この方法において、治療薬剤の標的細胞群への送達は達成される。
【０００８】
リガンドが方向づける、受容体が媒介するエンドサイトーシスは、幾つかの薬剤ターゲティングシステムが依存する基礎である。抗体、またはそれらの断片、ホルモン、サイトカイン、およびガストリンおよびトランスフェリンのような他の可溶タンパク質はすべて、薬剤を特異的細胞群に送達するターゲティングリガンドとして使用されている。例えば、Ｍｙｅｒｓ他（米国特許番号５，０８７，６１６）は、薬剤送達接合体（ここで薬剤はダウノマイシン）が、ホルモンリガンド上皮成長因子への接合を介して上皮細胞に特異的に送達されることを開示している。また、Ｇｍｅｉｎｅｒ他（米国特許番号５，６６３，３２１）は、ヌクレオチド類縁体、５−フルオロデオキシリジン  ５´モノフォスフェートのモノマーを含むホモ−オリゴマーを抗体またはそれらの断片を介して送達することを開示している。
【０００９】
しかしながら、リガンドが天然のタンパク質であるとは限らない。糖成分は、レクチンとして知られる、受容体ファミリーのためのリガンドとして役立つ。これらの受容体は、それらの組織発現およびリガンド特異性に基づいて異なる。例えば、クッパー細胞にみられるレクチンはマンノースに特異的であり、一方、肝臓のエンドシリーアル細胞でみられるレクチンはフコース残基に選択的に結合する。
【００１０】
肝細胞の表面で主にみられるレクチン、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）は、肝臓に治療薬剤を送達する目的で深く研究されている。それは、事実上、末端ガラクトースまたはアセチルガラクトースアミン残基を含む何れの存在とも、そのサイズまたは構造に関わりなく親和性の高い相互作用を媒介するので、ＡＳＧＰＲは薬剤送達のための使用のモデルシステムである。Ｗｕ他による先駆的な研究により（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９（１９８７））、ガラクトース／アセチルガラクトースアミンを含有するタンパク質、アシアロオロソムコイドと結合しているポリ−Ｌ−リジンと静電気的に複合したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＧＰＲとの直接的な相互作用を介してヒトの肝細胞癌細胞に効率的且つ特異的に取り込まれることが証明された。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドがターゲティング部分と非共有結合しているために、それが共有結合している場合と比べて、得られた接合体の生体安定性が低いと考えることは妥当である。
【００１１】
ＡＳＧＰＲの使用による組織特異的薬剤ターゲティングは、ヌクレオチド類縁体の送達に適用されている。例えば、Ｇｒｏｍａｎ他（米国特許番号５，５５４，３８６）は、ヌクレオチド類縁体、ａｒａＡＭＰ、および、ＡＳＧＰＲと結合するポリサッカリド、アラビノガラクタンを含む、肝細胞に薬剤を送達するための接合体を開示している。しかしながら、ポリサッカリドが複数の薬剤結合サイトを含んでいるため、この接合体の合成は、接合体の不均一な混合物になり、接合体当たりのヌクレオチド類縁体の数は、バッチごとに異なる。従って、接合体のＩＣ５０もバッチごとに異なり、投与量の決定を非常に困難にするであろう。
【００１２】
Ｒｏｈｌｆｆ他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：１２６８（１９９９））は、薬剤−リガンド接合体、ＯＧＴ７１９を開示しており、単一のガラクトース部分がヌクレオシド類縁体、５−フルオウラシルに共有結合している。動物モデルでは有効性が示されたが、Ｌｅｅ他の指導による研究の観点から、この薬剤接合体はＡＳＧＰＲと弱く結合することが予測され（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４２５５（１９８４））、そのリガンドは３つまたは４つのガラクトース残基を含み、特異的なコンフォメーションに配列され、一つの残基よりずっと大きな親和性でＡＳＧＰＲと結合する。望ましい治療効果を達成するために投与される接合体の投与量をより低くするために、接合体と結合する親和性は高いことが望ましい。
【００１３】
それとともに、ヌクレオチド類縁体をそれらの細胞内標的に組織特異的方法で送達するための、リガンドが配向した、受容体が媒介するエンドサイトーシスを受けることができる接合体が望ましい。その接合体を含む成分は、生体安定性を最大にするために互いに共有結合しているべきである。その接合体は化学的に定義され、単一のＩＣ５０が決定されることができるように構造的に均一であるべきである。その接合体はまた、標的受容体に対して高い親和性で結合する。これらの特質をもった接合体は、治療的指針を改良するであろう。そのような接合体を提供することが本発明の目的である。この目的、および他の目的および利点は、さらなる発明の特徴に加えて、ここに提供される詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００１４】
【発明の概要】
本発明は、化学的に定義された、式Ａ−Ｌ−Ｐの構造的に均一な接合体を提供する。ここで、
Ａは、細胞上の細胞表面受容体に結合するグリコシル化／ガラクトシル化ペプチドを表し、
Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、
Ｐは少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表し、それらは、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害する。
ここで、ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である。Ａがグリコシル化ペプチドである場合、細胞表面の受容体は肝臓を構成する細胞上にある。Ａがガラクトシル化ペプチドである場合、細胞表面の受容体はアシアロ糖タンパク質受容体である。そのような接合体を含む組成物も提供する。
【００１５】
本発明はさらに、哺乳類における異常な細胞増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、異常な細胞増殖を阻害する量の上記接合体またはそれを含む組成物をその哺乳類に投与し、その哺乳類における異常な細胞増殖を阻害する。
【００１６】
本発明によってさらに、哺乳類においてウイルスの複製を阻害する方法が提供される。該方法は、ウイルスの複製を阻害する量の上記接合体またはそれを含む組成物を哺乳類に投与し、その哺乳類におけるウイルスの複製を阻害する。
【００１７】
【発明の詳細な記述】
本発明は、化学的に定義された、式Ａ−Ｌ−Ｐの構造的に均一な接合体であって、
Ａは、肝臓を構成する細胞上の細胞表面受容体に結合するグリコシル化ペプチドを表し、
Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、
Ｐは、少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表し、該ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害し、
ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である接合体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、化学的に定義された、式Ａ−Ｌ−Ｐの構造的に均一な接合体であって、
Ａは、細胞上の細胞表面アシアロ糖タンパク質受容体に結合するガラクトシル化ペプチドを表し、
Ｌは、天然アミノ酸を含まず、ＡおよびＰと位置特異的に共有結合する二官能性リンカーを表し、
Ｐは、少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーを表し、該ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害し、
ＡとＬの間の共有結合、およびＬとＰの間の共有結合のどちらかまたは両方は、細胞内で切断可能である接合体を提供する。
【００１９】
ここで使用される「化学的に定義された」という用語は、例えば、Ｃ６Ｈ１２Ｏ２のような、正確な化学式を有する実体を示す。化学的に定義された実体の分子量は、絶対的であり、平均分子量のようなものではない。さらに、その分子量は、バッチ合成によって異ならない。
【００２０】
ここで使用される「化学的に均一な」という用語は、派生した集合の少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％が、組成物および結合性において単一種であることを意味する。化学的均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴、質量スペクトル、および化学分析によって決定されることができる。「化学的に定義された、構造的に均一な」という句は、「化学的に均一な」と交換可能に使用される。
【００２１】
ここで使用される「構造的に均一な」という用語は、成分の絶対比によって特徴付けられる実体を示す。例えば、本発明は成分Ａ、Ｌ、およびＰを含む接合体（各接合体当たりただ一つのＡ、Ｌ、およびＰが存在する）である。成分Ａ：Ｌ：Ｐの割合１：１：１は、バッチ合成によって異ならない。
【００２２】
「ヌクレオシド」は一つの塩基および一つの糖を含む化合物である。「ヌクレオチド」は上記のように一つの塩基、一つの糖、および一つのリン酸基を含む化合物であり、モノヌクレオチドとも称される。ヌクレオチドおよびヌクレオシドの塩基はプリンおよびピリミジンであることができるが、これに限られない。ヌクレオチドおよびヌクレオシドの糖はリボースおよびデオキシリボースであることができるが、これに限られない。プリンは例えば、アデニンおよびグアニンを含む。ピリミジンは例えば、シトシンおよびチミジンを含む。
【００２３】
「ヌクレオシド類縁体」は、その糖または塩基部分に少なくとも一つの修飾を含む天然ヌクレオシドである。ヌクレオシド類縁体の修飾は、例えば、一つまたは複数の糖原子の置換、複素環式塩基修飾、糖におけるヌクレオシド結合の置換、アノマーの転化（β→α）、糖残基の環状炭素における種々の官能基の付加、糖残基の水酸基の置換または脱離、環サイズの修飾、糖の立体配置の転化（Ｄ→Ｌ）、およびフラノース環のアシクロヌクレオシドへの切断を含む。
【００２４】
何れのヌクレオシド類縁体がリン酸化され、ヌクレオチド類縁体になり得るかは、通常の当業者には理解される。「ヌクレオチド類縁体」という用語は、少なくとも一つの非天然部分を有し、天然ヌクレオチドと同等の、またはより優れた機能を有する成分である。ヌクレオチド類縁体は、例えば、変質した糖成分、塩基、または糖内部の結合を有することができる。ヌクレオチド類縁体の修飾は、リン酸基のリン原子に結合した原子または官能基の変質に加え、上述したヌクレオシド類縁体のようなものを誘導する。これらは、「非−リン酸ジエステルヌクレオチド間結合」即ち、リン酸ジエステル以外の結合（例えばＷａｌｄｎｅｒ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ，６（１９），２３６３−２３６６（１９９６）参照）になりうる変化を含むが、これに限定されない。メチルホスホネートのヌクレオチド間結合、ホスホチオネートのヌクレオチド間結合、およびそれらの組み合わせは、「非−リン酸ジエステルヌクレオチド間結合」の例である。全ての、または幾つかの、または一つの、ヌクレオチドまたはヌクレオシド類縁体を含むポリマーのヌクレオチド間結合は、これらの修飾された結合で置換され得るが、あるいは一つも置換されなくてもよい。
【００２５】
成分「Ｐ」は、ヌクレオチドまたは核酸の細胞内生合成を配列非依存性の方法で阻害する、ヌクレオチドまたはそれらの類縁体のいずれか適したものを含む。阻害とは、いかなる程度の阻害でも有益または治療的な効果が認められるように、完全な阻害を必要としないことは、通常の当業者には理解される。むしろ、阻害の程度は様々である。ここで使用される「配列非依存性の方法」という用語は、Ｐを構成するヌクレオチドまたはそれらの類縁体の塩基配列が重要ではないことを示している。「Ｐ」は、当分野で、即ち、転写または翻訳の阻害において使用される用語のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。与えられたヌクレオチドまたはそれらの類縁体がヌクレオチドおよび核酸の細胞内生合成を阻害するかどうかは、当分野で周知でありここで例示される分析に基づいて決定されることができる。
【００２６】
適切なヌクレオチド類縁体は何れかの数のヌクレオシド類縁体を含むことができる。ヌクレオシド類縁体は、例えばフッ化ピリミジンを含むことができるアグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体を含むが、これに限定されない。フッ化ピリミジンは例えば、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）であることができる。アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体はあるいは５−フルオロ−２´−デオキシウリジン（５ＦｄＵ）であることができ、または５−アザシチジン（５−アザＣｙｄまたは４−アミノ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル−１，３，５−トリアジン−２−オン）としても知られる）、５−アザウリジン（５−ＡｚａＵｒｄ）、６−アザシチジン（６−ＡｚａＣｙｄ）、または６−アザウリジン（６−ＡｚａＵｒｄ）のようなアザピリミジンヌクレオシドであることができる。さらに、アグリコンで修飾されたヌクレオシド類縁体は、３−デアザピリミジンヌクレオシド、例えば、３−デアザウリジン（３−ＤｅａｚａＵｒｄ）であることができる。ヌクレオシド類縁体はまた、糖修飾ヌクレオシド、例えば、ＡｒａＣ（１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、シトシンアラビノシド、シタラビン、およびサイトサル（ｃｙｔｏｓａｒ）としても知られる）、シクロシチジン、２´−Ｏ−ニトロ−ＡｒａＣ、ＡｒａＡ、（９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、およびビラ−Ａ（ｖｉｒａ−Ａ）としても知られる）、シクラリジン（ｃｙｃｌａｒｉｄｉｎｅ）、２´，２´−ジフルオロデオキシシチジン（ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ））、および２´−デオキシ−２´−メチリデン−シチジン（ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ−ｃｙｔｉｄｉｎｅ）（ＤＭＤＣ）をも含む。糖修飾ヌクレオシドは、アシクロヌクレオシド（ａｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）、例えば、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン、アシクログアノシン、およびＡＣＶとも称される）またはガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）（シトヴェン（ｃｙｔｏｖｅｎｅ）、ＤＨＰＧ、９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニン、２´−Ｎｏｒ−２´−デオキシグアノシン、２´ＮＤＧ，ＢＩＯＬＦ−６２、またはＢＷＢ７５９Ｕとしても知られる）であることができる。
【００２７】
ヌクレオシド類縁体はさらに、フルダラビンフォスフェート、２−ハロアデニン−２´−デオキシリボヌクレオシド、２−クロロアデニン−アラビノヌクレオシド、２´−デオキシコフォルマイシン、および２−ハロ−２´−フルオロアラビノヌクレオシドを含む。当業者は、ここで特に挙げられなかった他のヌクレオシド類縁体も本発明の状況において使用されうること、および商業的に利用可能であることを理解するであろう。
【００２８】
「Ｐ」は、少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーである。「Ｐ」は、一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むときモノマーである。「Ｐ」は、少なくとも二つの同じヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含むときホモポリマーである。「Ｐ」が少なくとも二つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含み、その少なくとも一つのヌクレオチドまたはそれらの類縁体が他のヌクレオチドまたはそれらの類縁体と異なるとき、「Ｐ」はヘテロポリマーである。例えば、「Ｐ」は５ＦｄＵを含むモノマー、ホモポリマー、またはヘテロポリマーであることができる。「Ｐ」がホモ−またはヘテロポリマーである場合、ユニットの数は２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、好ましくは２〜１２、さらに好ましくは２〜６、最も好ましくは２〜４であることができる。好ましい実施例では、「Ｐ」は５ＦｄＵのホモポリマーである。好ましくは、「Ｐ」は２〜１２の５ＦｄＵを含むホモポリマーであり、さらに好ましくは、「Ｐ」は２〜６の５ＦｄＵを含むホモポリマーである。特に好ましい「Ｐ」は、５ＦｄＵのモノマーである。
【００２９】
「Ｐ」がヘテロ−またはホモポリマーである場合、ヌクレオチドまたはそれらの類縁体のそれぞれは、隣接するヌクレオチドまたはそれらの類縁体と共有結合する。望ましくは、少なくとも一つの共有結合は細胞内で切断可能である。適切なヌクレオチド間の共有結合は全て使用可能である。好ましい共有結合は、リン酸ジエステル結合（ｐｏ）またはリン酸チオエート結合（ｐｓ）を含む。ホモポリマーまたはヘテロポリマーにおけるヌクレオチド間の共有結合は、等しいか、または異なることができ、例えば代替可能である。ホモポリマーまたはヘテロポリマーにおけるヌクレオチド間の共有結合は等しいことが好ましい。ＡＬＰの送達および／または有効性をモニターするために、「Ｐ」は放射性核種を含むことができる。
【００３０】
「Ａ」は、肝臓を構成する細胞上の細胞表面受容体に結合するグリコシル化ペプチドであり、または細胞上の細胞表面アシアロ糖タンパク質受容体に結合するガラクトシル化ペプチドであり、図３において提供される例に限定されない。ここで使用される「グリコシル化ペプチド」は、少なくとも一つの糖（即ち、モノ−またはポリサッカリド）成分を含む何れかのポリアミドである。好ましくは、「Ａ」はグリコシル化オリゴペプチドである。ここで使用される「ガラクトシル化ペプチド」は、少なくとも一つのガラクトース残基を含む何れかのポリアミドである。好ましくは、「Ａ」はガラクトシル化オリゴペプチドである。「Ａ」は、グルコース、Ｎ−アセチルグルコースアミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、およびフコースを含むが、これらに限定されない多数の糖残基のいずれかでグリコシル化された、合成の、化学的に定義された、構造的に均一のオリゴペプチド骨格である。好ましくは「Ａ」は
【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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であり、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３が特に好ましい。適切な成分「Ａ」は、当業者に周知の方法で調製される（例えば、Ｌｅｅ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３：４２５５−４２６１（１９８４）；Ｌｅｅ他，  Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５（３）：３４３−３５７（１９８６）；Ｌｅｅ他，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．，４：６５−８６（１９９１）；Ｌｅｅ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６７：５０９−５１４（１９７８）を参照）。
【００３１】
「Ｌ」は、天然アミノ酸または天然アミノ酸から形成されるペプチドを含まない二官能性リンカーである。「Ｌ」は、「Ａ」および「Ｐ」と位置特異的に共有結合する。適切なリンカーは何れも使用可能である。「Ｌ」は、ヘテロ二官能性であることが望ましい。
【００３２】
適切なリンカーは、商業的に利用可能なクロスリンク試薬の生成物である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）。一般に、クロスリンク試薬は、「Ａ」および「Ｐ」と位置特異的に結合できる反応基をその末端においてのみ含み、それによって予期しない側面で反応する可能性を減少する。広く多様なクロスリンク試薬が、「Ａ」および「Ｐ」に存在する様々な官能基と反応するために利用可能である。従って、多くの化学的に異なる結合が接合され得る。好ましくは、Ｌは活性エステル、イソチオシアノ、イソシアノ、アシル、ハロ、マレイミド、または活性ジスルフィド基を含むクロスリンク試薬の生成物である。例えば、「Ｌ」は、クロスリンク試薬
【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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または、α−シトラコニル−Ｋ−（ε−ＦＭＯＣ）ＰＩＬＦＦＲＬ（Ｎ−ａ−シトラコニル−Ｌｙｓ（ｅＦＭＯＣ）−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ）の生成物であることができる。好ましくは、Ｌはクロスリンク試薬Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル  ４−（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）の生成物である。
【００３３】
「Ａ」の特異的な例において、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（図３）はそのアミノ末端に遊離アミノ基を含む。それはヘテロ二官能性クロスリンク試薬ＳＭＣＣと位置特異的およびサイト特異的に反応し、アミノ結合を形成する。ヌクレオチドまたはそれらの類縁体は、遊離スルフィドリル基を含むように化学的に修飾されている場合、ＳＭＣＣと結合してチオエーテル結合を形成する。この例では、「Ａ」および「Ｐ」の間に形成された結合は、アミド／チオエーテルとして要約することができる。好ましくは、「Ａ」はアミド結合で「Ｌ」と共有結合し、「Ｌ」はチオエーテル結合で「Ｐ」と共有結合する。「Ｌ」を介した「Ａ」および「Ｐ」の間の他の結合は、アミド／アミド、チオエーテル／アミド、ジスルフィド／アミド、アミド／チオエーテル、およびアミド／ジスルフィドを含むが、これらに限定されない。それらの結合はさらに、生物学的に安定（チオエーテル、アミノ）、生物学的にやや安定（アミド）、および生物学的に不安定（ジスルフィド）のように分類されることができる。従って、送達システムは、細胞内外の媒質で遭遇する様々な化学的環境において機能するように構造的に修飾されることができる。
【００３４】
本発明の好ましい接合体は、「Ａ」はＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３であり、「Ｌ」はクロスリンク試薬ＳＭＣＣの生成物であり、「Ｐ」は少なくとも５ＦｄＵを含むものである。「Ｐ」が５ＦｄＵのホモポリマーであることができる場合、「Ｐ」は好ましくは５ＦｄＵのモノマーである。
【００３５】
本発明はさらに、上記の接合体を含む組成物を提供する。該組成物はさらに、薬剤的に許容される担体を含むことが望ましい。適切な「薬剤的に許容される担体」は、当分野で周知である。一般に、薬剤的な組成物は、生理食塩水；ブドウ糖または他の糖類溶液；または、エチレン、プロピレン、ポリエチレン、または他のグリコールを含むことができる。
【００３６】
当業者は、Ａ−Ｌ−Ｐ接合体またはそれらの組成物を動物、例えば、ヒトのような哺乳類に投与する適切な方法が周知であり、また、ある組成物を投与するのに使用可能な経路は一つ以上あるが、ある経路は他の経路に比べてより素早くより効果的な反応を提供できることを認めるであろう。担体の選択は、一つには、特定の組成物、およびその組成物を投与するのに使用する特定の方法の両方によって決定される。従って、本発明の組成物の適切な製剤形態は広く多様である。
【００３７】
経口投与に適する製剤形態は、（ａ）溶液、例えば有効量の接合体を溶解した水または生理食塩水のような希釈液、（ｂ）それぞれ所定量の有効成分を固体または顆粒として含む、カプセル、包、または錠剤、（ｃ）適切な液体の懸濁液、および（ｄ）適切な乳濁液、からなることができる。
【００３８】
錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、微小結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイドシリコンジオキシド、ナトリウムクロスカルメロース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、加湿剤、防腐剤、香味料剤、および薬理学的に適合する担体を一つ以上含むことができる。ロゼンジ形態は、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシア懸濁液、ゲルおよび、有効成分に加えて当分野で周知の担体を含むもののような不活性基剤中に有効成分を含む錠剤（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）と同じく、通常ショ糖およびアカシアまたはトラガカントが用いられる風味料中に有効成分を含むことができる。
【００３９】
非経口投与に適する製剤形態は、水溶性および非水溶性溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬を含むことができる等張無菌注射薬溶液、および、製剤形態に意図された受取人の血液との等張性を与える溶質、および、懸濁剤、可溶化剤、濃厚剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水溶性および非水溶性の無菌懸濁液を含む。この製剤形態は、アンプルおよびバイアルのような単位投与量または複数投与量の密封容器に存在させることができ、注射に使用する直前に例えば水のような無菌液体担体を加えるだけですむ、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されることができる。即時注射剤溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、および前述したような種類の錠剤から調製できる。
【００４０】
本発明の接合体は、単独で、または他の適切な成分と組み合わせて投与されることができる。そのような成分は、治療薬剤（即ち「Ｐ」）が異常な細胞増殖またはウイルスの複製をより効果的に阻害するのに役立つものを含むことができる。例えば、リガンド由来のロイコボリン（フォリン酸）が５ＦｄＵの有効性を増強するために共に投与されることができる。
【００４１】
上記の観点から、本発明は、それが必要な哺乳類において異常な細胞増殖を阻害する方法をも提供する。この方法は、異常な細胞増殖を阻害する量の上記接合体または組成物を哺乳類に投与し、哺乳類におけるその異常な細胞増殖を阻害する。接合体の「異常な細胞増殖を阻害する量」は、何れの程度の異常細胞増殖でも阻害するのに十分な接合体の量である。好ましくは、その異常な細胞増殖は肝細胞癌である。本発明の接合体および組成物は、腫瘍性のおよび感染性の病気および障害のような、肝臓の他の病気および障害の治癒に治療的に有用でもある。
【００４２】
上記の観点においても、本発明はそれらが必要な哺乳類においてウイルスの複製を阻害する方法を提供する。この方法は、ウイルス複製を阻害する量の上記接合体または組成物を哺乳類に投与し、その哺乳類におけるウイルスの複製を阻害する。接合体の「ウイルス複製を阻害する量」は、何れの程度のウイスル複製でも阻害するのに十分な接合体の量である。好ましくは、ウイルスの複製は肝炎ウイルスの複製である。
【００４３】
本発明の状況において、動物、好ましくはヒトへ投与される量は、合理的な時間枠に渡って動物内で治療的な反応をもたらすのに十分であるべきである。この投与量は、処置される動物（例えばヒト）の体重と共に、ある組成物の濃度およびその動物の状況によって決定される。投与の規模もまた、ある組成物の投与に伴う全ての逆サイドの効果の存在、性質、および程度によって決定されることができる。内部投与の適切な投与量は、一日当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましい投与量は、一日当たり０．０１〜３５ｍｇ／ｋｇである。さらに好ましい投与量は、一日当たり０．０５〜５ｍｇ／ｋｇである。局所的な投与のための製薬組成物における接合体の適切な濃度は、０．０５〜１５％（体重当たり）である。好ましい濃度は、０．０２〜５％である。さらに好ましい濃度は、０．１〜３％である。最終的には、個々の患者に処置する投与量および本発明の接合体の量は、例えば年齢、体重、全身の健康、食事制限、性別、投与される組成物、投与経路、および処置される病気の重症度のようなさまざまな要因を考慮に入れて所属する医師が決定する。
【００４４】
【実施例】
以下に続く例は、本発明の説明に役立つものであり、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
＜略語＞
便宜のため、次の略語を使用する。
【００４６】
ＡＥＴ  ：  ２−アミノマーカプトエタノール（ａｍｉｎｏｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（アミノエタンチオール）
ＡＴＰ  ：  アデノシン三リン酸
ＢＡＰ  ：  細菌性アルカリホスファターゼ
ＣＰＧ  ：  制御された細孔ガラス担体（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｓｕｐｐｏｒｔ）
ＤＩＰＥＡ  ：  ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
Ｄ−ＭＥＭ  ：  ダルベッコの修飾されたイーグル培地
ＤＭＳＯ  ：  ジメチルスルホキシド
ＤＢＰＳ  ：  ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水
ＤＴＴ  ：  ジチオスレイトール
ＥＤＡＣ  ：  １−エチル−３−［３（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド
ＥＤＴＡ  ：  エチレンジアミンテトラアセテート
ＦＣＳ  ：  ウシ胎児血清
ＧａｌＮＡｃ  ：  Ｎ−アセチルガラクトースアミン
ＭＥＭ  ：  アール塩最小基本培地
ＳＭＣＣ  ：  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル ４−（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル−１−カルボキシレート（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）
Ｔｒｉｓ  ：  トリス（ヒドロキシメチル）アミン
ＰＮＫ  ：  フェニルヌクレオチドキナーゼ
Ｈｅｐ Ｇ２  ：  ヒト肝臓癌細胞癌腫
ＴＳＶ  ：  ヒト前立腺癌
Ｃａｋｉ−１  ：  ヒト腎臓細胞
ＨＢＳＳ  ：  ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓａｌｔ）
ＲＰＭＩ  ：  ロズウェルパークメモリアル研究所
ｐｏ １−ｍｅｒ  ：  リン酸ジエステルモノヌクレオチド接合体
ｐｓ １−ｍｅｒ  ：  フォスフォチオエートモノヌクレオチド接合体
５ＦＵ１−ｍｅｒ  ：  ５−フルオロウラシルモノヌクレオチド接合体
ＡＦＰ  ：  アルファ−フェトプロテイン。
【００４７】
＜実施例１＞
本実施例では、５´−Ｃ６ジスルフィド  ５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  モノヌクレオチド（図４の４ａおよび４ｂ）の合成を詳述する。
【００４８】
０．３７０１ｇ（２６μｍｏｌ／ｇローディングキャパシティー）のユニバーサル−Ｑ ＣＰＧ（図４の１）を使用して１５μｍｏｌのカラムを準備し、ミリポア・エクスペディットＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）の二つの反応ポートの一つに設置した。具体的には、５−フルオロ−２´−デオキシウリジンシントン（５ｍｌのＣＨ３ＣＮに０．２５ｇ）を含むＣＨ３ＣＮ溶液を「Ｔ」ボトルに設置し、Ｃ６ジスルフィドフォスフォルアミジトシントン（図４の３）を「５」ボトル（Ｓｍｉｔｈ他、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１５（１０），１５８１−１５９４（１９９６））に設置した。この自動合成は連続的に（３´→５´）実行され、その５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  フォスフォルアミジトシントン（図４の２）と固相担体との反応、続いてチオール修飾シントン（図４の３）での処理を必要とする。リン酸ジエステルが結合した化合物のために、標準酸化溶液（テトラヒドロフラン／ピリミジン／Ｈ２Ｏ溶液に３％Ｉ２；グレン・リサーチ株式会社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用した。必要な場合、ビアウケージ試薬（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（グレン・リサーチ株式会社）が酸化剤溶液の代わりに用いられ、ホスフェートを硫化して、標準の確立された方法に従ってホスホロチオエートが与えられた。この試薬は無水ＣＨ３ＣＮ１０ｍｌ中に試薬１００ｍｇの濃度で使用した。標準の酸化時間は以下のとおりであった（リン酸ジエステルおよびホスホロチオエートが結合した化合物で３０秒）。最終的な５´−ＤＭＴは精製を促進するためにそのままにした。
【００４９】
カラムを反応ポートから取り除き、真空下で乾燥した。そのカラムの内容物を５０ｍｌコニカルチューブにあけ、その固体担体を、１／１のＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（体積／体積）中の０．５Ｍ  ＮａＯＨを１０ｍｌ分取したもので３時間処理した。その後、その溶液を２０ｍｌの０．５Ｍ  リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）で中和した（ｐＨ７にした）。この中和した溶液を、脱イオン化した蒸留Ｈ２Ｏ  ７０ｍｌで希釈し、典型的な逆相Ｃ１８ＳｅｐＰａｋＴＭカートリッジ（ウォーター株式会社）にアプライした。サンプルを添加する前に、カラムはＣＨ３ＯＨ（１０ｍｌ）、Ｈ２Ｏ中の５０％ＣＨ３ＣＮ（体積／体積）、次いで１０ｍｌのＨ２Ｏで予め平衡化した。カラムはＨ２Ｏ（２０ｍｌ）で洗浄し、次にＨ２Ｏ中の５％ＣＨ３ＣＮ  ２５ｍｌで洗浄した。そして、カラムをＨ２Ｏ（２５ｍｌ）に戻し、そしてトリフルオロ酢酸１％水溶液（２０ｍｌ）を使用して脱トリチル化した。カラムは直ちにオレンジ色に変化し、流動はそれから１０分で停止し、この保護基を完全に取り除いた。リン酸ナトリウム（１ｍｌ、ｐＨ５．８、０．５Ｍ溶液）をｐＨ上昇に使用し、続いてＨ２Ｏ（２０ｍｌ）で洗浄した。この生成物は（図５の５ａおよび５ｂ）、その後、Ｈ２Ｏ中５０％ＣＨ３ＣＮで溶出した。この画分を逆相ＨＰＬＣで分析し、ＵＶ分光光度計で定量した。λｍａｘ２６８ｎｍ，λ２６８５２８０Ｍ−１ｃｍ−１；Ａ２６８０．０２／２０μｌ；５ａ（図５）の最終収量  ５．６７μｍｏｌ。５ａ（図５）のＨＰＬＣ分析において、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）中のＣＨ３ＣＮの直線勾配（２％→５０％ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用した溶出時間は、２４分（図５の５ａ）であった。
【００５０】
＜実施例２＞
本実施例では、チオール修飾モノヌクレオチドの調製を説明する（図５）。
【００５１】
ジスルフィド部分のチオールへの還元は、５´−ジスルフィド−含有化合物をＤＴＴで処理することによりもたらされた。３３０μｌＨ２Ｏ中の１６Ｏ．Ｄ．２６８（１．０μｍｏｌ）ジスルフィドオリゴマーを、脱気体化した０．２５Ｍ  リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８）で処理した。この溶液に、５０μｌの調製直後で脱気体化したＨ２Ｏ中１ＭのＤＴＴ溶液を添加した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートした。定量的還元を逆相ＨＰＬＣ分析で確認し、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）中のＣＨ３ＣＮの直線勾配（２％→５０％ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用して、チオール修飾モノヌクレオチド（溶出時間：元のジスルフィドリン酸ジエステル結合オリゴマーが２０．４分、および元のジスルフィドホスホチオエート結合オリゴマーが２４分であるのと比較して、リン酸ジエステル結合誘導体（図５の６ａ）が１５．４分、ホスホロチオエート結合誘導体（図５の６ｂ）が１７．４分）を示した。この還元生成物をその後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０（１．０ × ９０ｃｍ、カラム空隙体積（Ｖ０）：３５ｍｌ）で精製し、ＤＴＴおよび塩を取り除いた。カラムのパッキングおよび続くサンプルの溶出は、脱気体化した２０％エタノール水で行った。精製チオールオリゴマーを含むこの画分は、直ちに次の反応に使用し、望ましくない酸化を最小限にした。
【００５２】
＜実施例３＞
本実施例ではＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３の合成を説明する。
【００５３】
約１〜２μｍｏｌのＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（例えば、Ｌｅｅ他，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．，４，３１７−３２８（１９８７）を参照）を、１ｍｌガラスＲｅａｃｔｉ−バイアルで乾燥した。この溶液に、無水ＤＭＳＯ（２５０μｌ）および無水ＤＩＰＥＡ（３μｌ）を添加した。そしてこの溶液を、真空乾燥したＳＭＣＣ（６ｍｇ）を含む無水ＤＭＳＯ溶液１５０μｌで処理した。この混合物をボルテックスで短時間攪拌し、室温で２時間静置した。逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ分析により、開始ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（溶出時間：６．６分）が所望の生成物ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（溶出時間：１０．１分）に完全に転化したことが示された。この反応混合物を、２％ＣＨ３ＣＮを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）１０ｍｌに希釈し、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジにロードした。このカートリッジを、２％ＣＨ３ＣＮを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）１０ｍｌで洗浄し、生成物を１０ｍｌの２５％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで溶出した。この生成物をＳｐｅｅｄ−ｖａｃによる減圧下で濃縮し、さらに準調製用（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）逆相Ｃ１８カラムで精製した。ＨＰＬＣおよびＵＶ分光法分析によって同定されたＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３を含む画分を貯蔵し、ＳｅｐＰａｋＴＭで脱塩化した。生成物の最終収量は１．８９Ｏ．Ｄ．２７６または１．３５μｍｏｌであった。
【００５４】
＜実施例４＞
本実施例では、ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３を含むモノヌクレオチド（図６の７ａおよび７ｂ）の合成を説明する。
【００５５】
［リン酸ジエステル結合モノヌクレオチド接合体（ｐｏ １−ｍｅｒ）（図６の７ａ）］  精製チオールオリゴマー（図６の６ａ）を含むＧ−１０画分を、ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（１．８μｍｏｌ）の５０％ＣＨ３ＣＮ水溶液（５ｍｌ）と混合し、その後直ちに５ｍｌのＮ２−脱気体化０．２５Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７）を集めた（ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ）。この混合物を、Ｓｐｅｅｄ−ＶａｃＴＭ（Ｓａｖａｎｔ）で３／４倍体積に濃縮し、２４時間密封し、接合体が完成するようにした。粗製反応混合物を逆相ＨＰＬＣによって、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム中のＣＨ３ＣＮの直線勾配（２％→５％  ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用して分析した結果、３つの化合物が示された。即ち、溶出が１５．７７分の化合物＃１、溶出が１８．０９分の化合物＃２、および溶出が１８．４６分の化合物＃３である（図７）。この粗製反応混合物をさらに１ｍｌまで濃縮し、Ｇ−１５Ｓｅｐｈａｄａｘカラム（１．０×４３ｃｍ；２０％エタノール水充填）にアプライした。２０％エタノール水によるカラムの溶出は、化合物＃１および化合物＃２を含む混合物を提供し、その生成物はＨＰＬＣ分離および質量分光法分析の後に同定された。最後の精製は逆相ＨＰＬＣによって５０ｍＭ  リン酸ナトリウム中のＣＨ３ＣＮの直線勾配（ｐＨ５．８）（２％→５％  ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用して行った。この精製物質をＨ２Ｏで希釈し、逆相ＳｅｐＰａｋＴＭ（ウォーター株式会社）を用いて脱塩化し、３９８ｎ ｍｏｌを得た。接合体の最終確認を、ＭＡＬＤＩ質量分光光度計（スクリップス・リサーチ研究所）を用いて行った。高分解能スペクトル（ＭＡＬＤＩ）、ｍ／ｚ  ２０５１．８５９、Ｍ−Ｈ＋＋２Ｎａ＋（Ｃ８８Ｈ１３９ＦＮ１２Ｎａ２Ｏ３５ＰＳ＋は２０５１．８７０を要求する）。
【００５６】
［ホスホロチオエート結合モノヌクレオチド接合体（ｐｓ １−ｍｅｒ）（図６の７ｂ）］
精製チオールオリゴマー（図６の６ｂ）を含むＧ−１０画分をＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（１．８μｍｏｌ）の５０％  ＣＨ３ＣＮ水溶液（５ｍｌ）と混合し、その後直ちに５ｍｌのＮ２脱気体化した０．２５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）を集めた。この混合物を、Ｓｐｅｅｄ−ＶａｃＴＭ（Ｓａｖａｎｔ）で３／４倍体積に濃縮し、２４時間密封し、接合体が完成するようにした。粗製反応混合物を逆相ＨＰＬＣによって、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム中ＣＨ３ＣＮの直線勾配（２％→５％ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用して分析した結果、３つの化合物が示された。即ち、溶出が１３．９４分の化合物＃１、溶出が１７．７８分の化合物＃２、および溶出が１８．５７分の化合物＃３である（図８）。この粗製反応混合物をさらに１ｍｌまで濃縮し、Ｇ−１５  Ｓｅｐｈａｄａｘカラム（１．０×４３ｃｍ；２０％エタノール水充填）にアプライした。２０％エタノール水によるカラムの溶出は化合物＃１および化合物＃３を含む混合物を提供し、その生成物はＨＰＬＣ分離および質量分光法分析の後に同定された。最後の精製は逆相ＨＰＬＣによって５０ｍＭ  リン酸ナトリウム中のＣＨ３ＣＮ直線勾配（ｐＨ５．８）（２％→５％ＣＨ３ＣＮ  ３０分）を使用して行った。この精製物質をＨ２Ｏで希釈し、逆相ＳｅｐＰａｋＴＭ（ウォーター株式会社）を用いて脱塩化し、６２３ｎ ｍｏｌを得た。接合体の最終確認を、ＭＡＬＤＩ質量分光光度計（スクリップス・リサーチ研究所）を用いて行った。高分解能スペクトル（ＭＡＬＤＩ）、ｍ／ｚ  ２０６７．８５２９、Ｍ−Ｈ＋＋２Ｎａ＋（Ｃ８８Ｈ１３８ＦＮ１２Ｎａ２Ｏ３４ＰＳ２＋は２０６７．８４７５を要求する）。
【００５７】
＜実施例５＞
本実施例は、続いて生物学的実験（例えば細胞取り込みおよびインビボ体内分布）に使用するすべてのＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３誘導接合体のための３´末端放射標識方法を説明する。
【００５８】
反応混合物（３５５μｌ最終容積）は、２０ｎ ｍｏｌのｐｏ  １−ｍｅｒ接合体（７）、３０μｌの１０×ＴｄＴ緩衝液、３０μｌの４ｍＭ  ＣｏＣｌ２、５０μｌの［３５Ｓ］αＳ−ＡＴＰ（１０μＣｉ／μｌ、全量で５００μＣｉ）、および５００ユニット（２５μｌ）のＴｄＴを含む。この混合物を３７℃で１６時間インキュベートし、その後、室温で冷却して４００μｌの０．５Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）で希釈した。この溶液を室温で１時間インキュベートした。生成物の精製は、サイズ分画ゲル濾過（Ｇ−１５Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム、１．０×４３ｃｍ、２０％エタノール水充填）を通して行った。最大分子量に相当する分画を、ＵＶ分光光度計で、続いてシンチレーションカウンターで分析した。Ａ２６８：０．０３６／２０μｌ、画分全容積：１．９ｍｌ、ｃｐｍ／２０μｌ：１３７２２００、全ｃｐｍ：１．３０×１０８、全質量：１２．９５ｎ ｍｏｌ、比放射能：４．５８μＣｉ／ｎ ｍｏｌ。
【００５９】
＜実施例６＞
本実施例では、５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  ５´−モノチオホスフェート（図９の８）の合成を詳述する。
【００６０】
１５μｍｏｌカラムを、０．３４２ｇ（４０μｍｏｌ／ｇ  ローディングキャパシティー）のユニバーサル−Ｑ  ＣＰＧ（図９の１）を使用して準備し、ミリポア・エクスペディットＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）の二つの反応ポートの一つに設置した。具体的には、５−フルオロ−２´−デオキシウリジンシントン（図９の２）（５ｍｌのＣＨ３ＣＮ中０．２５ｇ）を含むＣＨ３ＣＮ溶液を「Ｔ」ボトルに設置し、Ｃ６ジスルフィドフォスフォルアミジトシントンを「５」ボトル設置した。この自動合成は連続的に（３´から５´エンド）実行され、その５−フルオロ−２´−デオキシウリジンフォスフォルアミジトシントン（図９の２）と、固体担体との反応、続いて「化学的リン酸化Ｉ」シントンでの処理を必要とする。リン酸ジエステル結合化合物のために、標準酸化溶液（テトラヒドロフラン／ピリミジン／Ｈ２Ｏ溶液に３％Ｉ２）（グレン・リサーチ株式会社）を使用した。ビアウケージ試薬３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン，１，１−ジオキシド（グレンリサーチ株式会社）が酸化剤溶液の代わりに用いられ、ホスフェートを硫化して、標準の確立された方法に従ってホスホロチオエートが与えられた。この試薬は無水ＣＨ３ＣＮ１０ｍｌ中に試薬１００ｍｇの濃度で使用した。標準の酸化時間は以下のとおりであった（リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合化合物のどちらも３０秒）。最終的な５´−ＤＭＴは精製を促進するために除去した。
【００６１】
次に、そのカラムを反応ポートから取り除き真空下で乾燥した。そのカラムの内容物を１２０ｍｌ  シリンドリカルチューブにあけ、固体担体を１／１のＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（体積／体積）中の０．５Ｍ  ＮａＯＨを１０ｍｌ分取したもので３時間処理した。その後、その溶液を４０ｍｌの０．５Ｍ  リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．８）で中和した（ｐＨ７にした）。この中和した溶液を、１００ｍｌの脱イオン化した蒸留Ｈ２Ｏで希釈し、２０ｃｃ（５ｇ）逆相Ｃ１８ＳｅｐＰａｋＴＭカートリッジ（ウォーター株式会社）にアプライした。サンプルを添加する前に、カラムをＣＨ３ＯＨ（３０ｍｌ）、５０％（体積／体積）Ｈ２Ｏ中ＣＨ３ＣＮ、続いて３０ｍｌのＨ２Ｏで予め平衡化した。カラムはＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄し、次に２０〜４０ｍｌのＨ２Ｏ中５％  ＣＨ３ＣＮで洗浄した。その後カラムをＨ２Ｏに戻し、生成物を５０％ＣＨ３ＣＮ水で溶出した。この画分を逆相ＨＰＬＣで分析し、ＵＶ分光光度計分析で定量した。λｍａｘ２６８ｎｍ，λ２６８５２８０Ｍ−１ｃｍ−１；Ａ２６８０．０６７／１００μｌ。最終収量が６２．３Ｏ．Ｄ．、１１．８μｍｏｌ。ＨＰＬＣ分析：５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）中の２％  ＣＨ３ＣＮのイソクラチック勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用した溶出時間は、２．６分であった。
【００６２】
＜実施例７＞
本実施例では、ｐｏ １−ｍｅｒ接合体（図６の７ａ）の血清安定度の評価に使用される調査を詳述する。
【００６３】
調査は生理学的な条件で実行した。この分析は、逆相ＨＰＬＣおよびＰＡＧＥ法を用いて行った。この生データは表形式で示した（表１，２および３）。［Ａ］＝［Ａ０］ｅ−ｋｔから算出した血清半減期はｔ１／２＝１／ｋ（０．６９３）であり、ここで［Ａ０］は基質の初期量、［Ａ］は計測した基質レベル、ｔは時間（分）、およびｋは一次速度定数である。
【００６４】
［ＨＰＬＣ分析法］
（ａ）反応条件：５０μｌのヒト血清を、ＨＰＬＣで精製した２４ｎ ｍｏｌのｐｏ １−ｍｅｒ接合体に添加し、３７℃で割り当てられた時間インキュベーションした（０分、６０分、１８０分、３６０分）。カラム１：流量１．０ｍｌ／分、レイニン・マイクロソルブ（Ｒａｉｎｉｎ ＭｉｃｒｏＳｏｒｂ）Ｃ１８逆相カラムＨＰＬＣ勾配：１００％ＮＨ４ＯＡｃで１０分、その後０→１００％ＣＨ３ＣＮで２５分（０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ）（表１）。
【００６５】
【表１】
2004536027.tif 000013
（ｂ）反応条件：１００μｌのヒト血清を、ＨＰＬＣで精製した２０ｎ ｍｏｌのｐｏ １−ｍｅｒ接合体に添加し、３７℃で割り当てられた時間インキュベーションした（０分、１５分、６０分、１２０分、２４０分）。ＨＰＬＣ勾配：１００％緩衝液Ａ（２％  ＣＨ３ＣＮ中０．０５Ｍ  ＮａｘＰＯ４（ｐＨ５．８））で５分、その後２％  ＣＨ３ＣＮから５０％  ＣＨ３ＣＮで次の２０分。カラム２：流量４．７ｍｌ／分、レイニン準調整用Ｃ１８逆相カラム（１０ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍＬ）（表２）。
【００６６】
【表２】
2004536027.tif 000014
［ＰＡＧＥ分析］
反応条件：２μｌのヒト血清を２００，０００ｃｐｍの乾燥３５Ｓ標識ｐｏ １−ｍｅｒ接合体に添加した。放射標識接合体は、この血清の存在下、３７℃で割り当てられた時間インキュベートした（１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分）。この反応混合物を２μｌのＨ２Ｏで、その後、４μｌのローディングバッファーで希釈した。この壊変パターンを、８００Ｖで９０分流した２０％  ポリアクリルアミドゲル（０．７５ｍｍ）のオートラジオグラフィーで観察した。バンドはフジックスＢＡＳ２０００ホスホルイメージャー（Ｆｕｊｉｘ  ＢＡＳ  ２０００  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して定量した（表３）。
【００６７】
【表３】
2004536027.tif 000015
＜実施例８＞
本実施例では、５ＦＵ  １−ｍｅｒ接合体（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓＦＵ（ホスホチオエート−結合［ｐｓ］接合体）またはＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｏＦＵ（リン酸ジエステル結合［ｐｏ］接合体）の細胞内取り込みを示す。
【００６８】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を２ｃｍ２のウェルに継代し、Ｌ−グルタミン（１０−０４０，ＣＶ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養し、各ウェル当たり０．３×１０６〜０．４×１０６細胞密度にした（４８ウェルクラスタープレート、コスター、ケンブリッジ、ＭＡ）。この維持培地を吸引し、２％  ＦＣＳを含む培地０．２ｍｌで細胞を３７℃でインキュベートし、［５´−３５Ｓ］で標識したＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓＦＵ（ホスホチオエート結合［ｐｓ］接合体）またはＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｏＦＵ（リン酸ジエステル結合［ｐｏ］接合体）中に１μＭにした。その後、分取した培地をシンチレーションカウンティングのために保存しておき、残りの培地をウェルから吸引した。細胞はＤ−ＰＢＳ（２×０．５ｍｌ）で洗浄し、０．２５％  トリプシン（３７℃、２分；トリプシンは１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製した）で処理し、１０％  ＦＣＳを含む新鮮な成長培地に懸濁した。懸濁した細胞は、１．７ｍｌのコニカルマイクロ遠心管においてシリコンオイル（０．５ｍｌ）上で相を形成し、１４，０００ｒｍｐ（１２，０００ｇ）で３０秒遠心分離してペレットにした。この上清を注意深くデカントし、細胞ペレットを、０．５％  ＮＰ４０、１００ｍＭ  塩酸ナトリウム、１４ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、および３０％  アセトニトリルを含む溶液１００μｌで溶解した。放射活性量、および、推論による細胞溶解液に関するネオグリコ接合体またはオリゴマーの量をシンチレーションカウンティングで決定した。
【００６９】
ｐｓおよびｐｏが結合した５ＦＵ含有ネオグリコ接合体とＨｅｐ  Ｇ２細胞との会合を、肝臓由来の細胞における取り込みを実証し比較するために試験した。最初に、二つのネオグリコ接合体の安定性をＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ中で評価した。ＰＡＧＥ分析が示したように、ｐｓ−結合およびｐｏ−結合接合体は両方とも、１０％  ＦＣＳ含有培養液中で８時間まで安定だった。これらのデータから、接合体は両方とも、細胞の取り込みの調査に使用されるのに十分な安定性をインビトロで示すことが確信される。細胞の取り込み期間において、１μＭの用量のｐｏ−結合接合体は、インビトロでＨｅｐ  Ｇ２細胞によって、４８０分で２４．７５ｐｍｏｌ／１０６細胞程度の急速に進行する方法で取り込まれた。次に、細胞取り込みの速度を、接合体の投与量に関連して分析した。１μＭの投与量のｐｏ−結合接合体の細胞取り込みは、３０分で５ｐｍｏｌ／百万細胞になった。この量は、次の３０分以内に倍になり、４８０分で２５ｐｍｏｌ／百万細胞のピークに達した。投与量を２μＭまで倍化しても、細胞の取り込みに著しい増強をもたらさなかった。というのも、細胞内の接合体の初期濃度、および最大細胞取り込みは、１μＭの投与量の結果に類似していた。投与量を４μＭおよび８μＭに増加した結果の最大細胞取り込みは、それぞれ３６および４３ｐｍｏｌ／百万細胞であった。この４μＭの接合体の投与量は接合体の取り込みの時間関数において直線的な増加を導くが、８μＭの接合体の投与量における細胞の取り込みは１２０分で鋭く上昇した。この接合体の摂取のパターンは、ｐｓ−結合接合体の場合でも同様の細胞取り込みが達成されたので、ヌクレオチドが含む結合の種類によらなかった。
【００７０】
培養液中の接合体の濃度が２μＭ、４μＭ、および８μＭであるとき、取り込みは濃度の上昇と共に増加するが、投与量とは比例しなかった。接合体の濃度の倍化は、細胞取り込みを著しく増加させず、２μＭの投与量は４８０分で約２６ｐｍｏｌ／１０６細胞の取り込みであった。接合体の濃度を４μＭおよび８μＭに増加することにより、細胞の最大取り込みはそれぞれ、４８０分で約３６ｐｍｏｌ／１０６および４２ｐｍｏｌ／１０６になった。しかしながら、取り込みの速度は亢進され、接合体の投与量が８μＭのとき、わずか１２０分で３５ｐｍｏｌ／１０６の取り込みがおこった。
【００７１】
Ｈｅｐ  Ｇ細胞によるＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓＦＵの細胞取り込みは、４８０分で２４．９８ｐｍｏｌ／１０６に達したｐｏ−結合接合体のものと非常に類似していた。また、培養液中の接合体濃度が２μＭ、４μＭ、および８μＭに上昇したとき、取り込みは濃度の増加と共に増加したが、投与量に比例しなかった。
【００７２】
上記のデータから、ｐｏ−およびｐｓ−結合の接合体の取り込み速度は、調査した全ての濃度で基本的に同一であることが示される。これは、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞表面の受容体と特有のリガンドとの相互作用は、「Ｐ」を安定させる化学的結合に関わらず、細胞取り込みの程度に起因することを示唆する。細胞取り込みが接合体の濃度上昇と比例しないという事実は、続くインビトロの生体有効性試験のために必要な細胞増殖期間の間、受容体の発現が、増殖のために必要であるものも含めて最適以下である人工的な細胞培養環境による可能性がある。それにも関わらず、上記の実験は、両方のネオグリコ接合体のインビトロ濃度の上昇は、調査した条件下で、細胞に送達される接合体のレベルの上昇を引き起こすことを示した。
【００７３】
＜実施例９＞
本実施例は、本発明の接合体の細胞増殖における効果を説明する。
【００７４】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞は、１０％  ＦＣＳを補充した４８ウェルプレート中のＲＰＭＩに５×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。このインキュベート期間後、維持培地を吸引し、ネオグリコ接合体を様々な濃度で含む１０％  ＦＣＳを補充した２００μｌのＲＰＭＩ中で細胞を処理した。対照ウェルは２００μｌのＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳのみで処理した。０，２４，４８，７２、および９６時間時点で、各条件の６つのウェルを０．５ｍｌのＤＰＢＳで２度洗浄し、０．５ｍｌのトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製）で処理した。各条件の細胞数は、クールター電子細胞計数器を用いて決定した。全てのケースで、増殖阻害の程度は時間の関数として増加した。Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を非接合のモノマーで処理したものは、約２０％の増殖阻害であった。ヌクレオチド類縁体の接合の効果は、ｐｏ−結合接合体とともに処理したときに著しく、初期には１０％、ピーク時には６４％の阻害であった。ｐｓ−結合接合体での処理による阻害は、初期が約５％、９６時間後でわずか４５％にしか上昇せず、あまり効果がなかった。従って、ヌクレオチド類縁体をＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３と接合させる結合の種類は、増殖阻害能力に影響する。
【００７５】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を１μＭ  濃度のｐｏ−結合ネオグリコ接合体、ｐｓ−結合ネオグリコ接合体、または非接合モノマーで処理した。２４、４８、７２および９６時間時点で、各処理および未処理の対照の６つの複製ウェルの平均細胞数を決定した。非接合モノマーによるＨｅｐ  Ｇ２細胞の処理は、未処理の対照と比較して１５〜２０％の増殖阻害であった。ｐｏ−結合ネオグリコ接合体によるＨｅｐ  Ｇ２の処理は、約６４％の増殖阻害であった。対照的に、同一濃度が投与されたｐｓ−結合ネオグリコ接合体は、約４４％の増殖阻害であった。
【００７６】
何れの接合体も、培養液中の濃度が２μＭ、４μＭ、および８μＭに上昇した場合、増殖阻害は、その同じ接合体の投与量が１μＭの場合と比較して上昇した。このように、ｐｓ−結合接合体によって誘導されたこの阻害は、１μＭの投与量の場合の４４％から、８μＭの投与量の場合の６０％まで上昇した。同様に、ｐｏ−結合接合体によって誘導される阻害は、１μＭの投与量の場合の６４％から、８μＭの投与量の場合の９０％まで上昇した。従って、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞のインビトロでの増殖に関して、ｐｏ−結合接合体は、ｐｓ−結合接合体と比べて約３０％以上活性であった。増殖阻害の上昇は、いずれの接合体でも投与量に比例しなかった。それでもなお、上記の実験で得たデータは、ネオグリコ接合体の送達量が上昇することによって、細胞増殖の阻害が上昇することを示している。
【００７７】
＜実施例１０＞
本実施例は、細胞の毒性調査を詳述する。
【００７８】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を、４８ウェルプレート中で、１０％  ＦＣＳを補充したＲＰＭＩに５×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。このインキュベート期間後、維持培地を吸引し、様々な濃度でネオグリコ接合体を含む１０％  ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  ２００μｌ中で細胞を処理した。対照ウェルは２００μｌのＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳのみで処理した。０，２４，４８，７２、および９６時間時点で、各条件の６つのウェルを０．５ｍｌのＤＰＢＳで２度洗浄し、０．５ｍｌのトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製）で５分、３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２で処理した。トリプシン処理は、０．５ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳを添加して停止した。細胞サンプル（９００μｌ）を、染料の最終濃度が１０％であるような１００μｌのトリパンブルーに接種した。この溶液を室温で５分インキュベートし、サンプル１００μｌを血球計数器に接種した。各ウェルについて、３視野の１００細胞を読み取った。染料を吸収し保持している細胞は死んでいると見なした。データは、＃生細胞数／全細胞＝％生細胞として表した。
【００７９】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を、種々の濃度を有するｐｏ−結合ネオグリコ接合体、またはｐｓ−結合ネオグリコ接合体の何れかで処理した。毒性は、上記のようなトリパンブルー排除法によって決定した。全ての値は、由来が同じ未処理の細胞の結果と比較した。全体的に、毒性の程度は投与量と関係した。７２時間では、２μＭのｐｏ−結合接合体で細胞を処理したところ、約５０％の生細胞が減少し、一方８μＭで処理したものは７５％の生細胞数が減少した。ｐｓ−結合接合体の投与は、ｐｏ−結合接合体と比較して生細胞数を減少させる効果が少なく、２μＭの接合体で７２時間処理したときで約２５％の生細胞数の減少、８μＭの接合体では約４５％の減少が観察されたのみである。８μＭのｐｓ−結合接合体による処理が生細胞数をさらに減少させたことを除くと、全ての場合において、９６時間の処理は７２時間の処理と比較して、生細胞数を著しく変化させなかった。これは、ｐｓ−結合接合体が生細胞数の減少においてあまり効果を有さないことを示唆している。
【００８０】
＜実施例１１＞
本実施例は、ｐｏ１−ｍｅｒおよびｐｓ１−ｍｅｒの存在下における細胞中のチミジル酸合成酵素活性を詳述する。
【００８１】
ＣＤ−１マウス（チャールス・リバー、ウィルミントン、ＭＡ）を屠殺し、肝臓を取り出した。続いてその組織約１グラムをＤＰＢＳ（メディアテック、ハーンドン、ＶＡ）中で洗浄し、３倍容積のバッファーＨ中に置いた。この組織を、ダンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズし、続いて、超音波処理で１５秒のバースト（ｂｕｒｓｔｓ）を３回、その後氷上で１分間処理した。この組織の抽出液を４，０００ｇで１０分遠心分離し、得られた上清を７，０００ｇで２０分スパン（ｓｐｕｎ）した。この上清を３等分にし、２´−デオキシウリジン  ５´−モノフォスフェート、ジアンモニウム塩、［５−３Ｈ］を０．９μＣｉ分取したものを添加した。このとき、５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  ５´−モノチオフォスフェートを一つ目の分取に、５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  ５´−モノフォスフェートを二つ目の分取に添加し、一つの分取は未処理のまま残した。この３つのサンプルを３７℃で３０分インキュベートし、木炭で沈殿させた。得られた上清を１，６００ｇで１０分遠心分離した。各サンプルの分取は、その後ベックマンシンチレーションカウンターを使って計数した。阻害のパーセント（％）は、（対照値−処理値）／対照値のように表した。
【００８２】
これらの測定により、１０ｎＭ  ＦｄＵＭＰ（リン酸ジエステル基質）か、またはＦｄＵＭＰＳ（フォスフォロチオエート基質）かのいずれかのチミジル酸合成酵素（ＴＳ）活性を阻害する能力を決定した。この測定は、［５−３Ｈ］−ｄＵＭＰを３Ｈ−Ｈ２Ｏに変換するＴＳの能力を決定することを目的とした。下記の表４に示すように、ＦｄＵＭＰはＦｄＵＭＰＳと比較して約２倍の生物学的活性を示した。
【００８３】
【表４】
2004536027.tif 000016
＜実施例１２＞
本実施例は、チミジン酸合成酵素（ＴＳ）活性阻害の亢進に起因する、ｐｏ  １−ｍｅｒがＨｅｐ  Ｇ２細胞増殖に及ぼす効果を説明する。
【００８４】
チミジン酸合成酵素の阻害は、ＤＮＡ複製のためのチミジン酸のレベルを不足させ、最終的に細胞の死を導く細胞内の情報伝達プロセスを導き得る。この主要な酵素の活性は、Ｋｅｙｏｍａｒｓｉ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１５１４２−１５１４９（１９９３））の方法に基づいて決定した。手短に言うと、１０５Ｈｅｐ  Ｇ２またはＴＳＵ細胞を４８時間培養し、その培地をｐｏ  １−ｍｅｒまたは非接合体５ＦｄＵのいずれかで１μＭの濃度にした。処理の後、通常の間隔で（２４時間，４８時間，７２時間、および９６時間）、培地を取り除き、デオキシウリジン／［３Ｈ］−デオキシウリジン混合物を含む培地を入れ替えた。細胞は３７℃で３０分インキュベートした。その後、細胞培地を取り除き、木炭で沈殿させた。上清を計数し、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの存在を判定した。デオキシウリジン、５´−モノフォスフェート（ｄＵＭＰ）基質から放出された［３Ｈ］−Ｈ２Ｏとして測定可能な［３Ｈ］は、チミジン酸合成酵素の活性を反映する。
【００８５】
これに関して、１μＭの濃度のｐｏ １−ｍｅｒで処理したＨｅｐ  Ｇ２細胞は、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの放出が漸進的に（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）阻害され、ＴＳ活性の著しい抑制が示された。この場合、ＴＳ活性は、処理の後９６時間で６０％の減少を示した。反対に、非接合体５ＦｄＵはＴＳ活性を同じ時間で約２０％減少させた。これらのデータは、細胞増殖の阻害における処理の効果とよく相関した。ｐｏ １−ｍｅｒによって誘導されるこのＴＳ活性の阻害は細胞特異的であり、ＴＳＵ癌細胞をｐｏ １−ｍｅｒで処理しても、いかなる阻害性効果も観察されなかった。さらにその上、細胞をｐｏ １−ｍｅｒ接合体で処理しても、これらの細胞の生存度は影響を受けなかった。
【００８６】
＜実施例１３＞
本実施例では、ｐｏ １−ｍｅｒのインビボにおける局在化を評価するための体内分布実験を説明する。
【００８７】
これらの調査のため、オスのＣＤ−１マウスに［３´−３５Ｓ］−放射標識化ｐｏ １−ｍｅｒまたは［６−３Ｈ］−非接合５ＦｄＵのいずれかを尾の静脈から静脈注射した。適切な時間間隔の後、そのマウスを屠殺し、臓器を切除し、可溶化した。各臓器に関する放射活性量をシンチレーションカウンティングによって測定し、効率に直した。通常のマウスにおける分布のベースラインを確かめるため、標準的なＣＤ−１マウスをこれらの最初の実験に使用したが、続く生体有効性実験はＣＤ−１ヌードマウスを使用する。これらの実験の結果、ｐｏ １−ｍｅｒは急速且つ特異的に肝臓に局在化した。注入された非接合５ＦｄＵでは１０％より低かったのとは反対に、注入されたｐｏ １−ｍｅｒの５７％が１５分以内に肝臓に局在化した（表５）。注入から６０分後でさえ、２５％のｐｏ １−ｍｅｒが肝臓で観察された（表６）。注入から８時間後では、ｐｏ １−ｍｅｒは実質的に肝臓に局在化していなかった。ｐｏ １−ｍｅｒ接合体は、極めて初期に筋肉での蓄積を示し、続いて腸道における蓄積を示した（表５）。筋肉中に存在する種々のベーターガラクトースレクチンが、ＧａｌＮＡｃ残基とある程度競合するならばこの初期の蓄積が説明されるであろう（Ｂａｒｏｎｄｅｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６９， ２０８０７−２０８１０ （１９９４）；Ｐｏｉｒｉｅｒ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１５，１４３−１５５（１９９２）、参照）。しかしながら、筋肉細胞の増殖指数は低いため、活性代謝物に送達されるヌクレオチド類縁体の提供は最小である。後の時点での腸内の放射標識の蓄積は、５ＦＵ代謝物の腸肝再分布に起因し得る。それにも関わらず、ヌクレオチドは最初に肝臓細胞に送達され、そこでは荷電したリン酸を保有し、それが細胞によって排除されるのを防ぐ。続く同化／異化プロセスは分布分析を複雑にする放射活性代謝物の最分布を導くであろう。腸肝の再循環は考慮されるべき要因であるにも関わらず、その重要性は、胆汁経路により排出された５ＦＵの代謝物のパーセンテージが低いために疑問視されている（Ｙｏｕｎｇ他， Ｎｕｋｌｅａｒｍｅｄｉｚｉｎ， ２１， １−７，（１９８２））。非肝性分布の他の可能な解釈は、標識の非特異的な吸収に続いて、接合体からの放射標識が細胞内で急速に解離したことによって、特徴づけられなかった標識が使用されたことが考えられる。上記の注意にも関わらず、これらの実験により、ｐｏ １−ｍｅｒがその有効量を急速且つ特異的な方法でマウスの肝臓に送達することがはっきりと実証された。
【００８８】
【表５】
2004536027.tif 000017
【表６】
2004536027.tif 000018
＜実施例１４＞
本実施例では、ＣＤ−１マウスにおけるｐｏ １−ｍｅｒの肝臓毒性および全身毒性の両方の分析を説明する。
【００８９】
マウスは次の方法で、前もって５ＦＵ薬物試験のインビボモデルとして使用した（Ａｉｎ他，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，５７，３６６−３７２（１９９４）；Ｗａｎｇ他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，８６９ｓ−８７２ｓ（１９９０））。この血清プロフィール、マウスにおける５ＦＵの誘導毒性および薬物動態学は、ヒトで観察されたものと類似している（Ｗａｇｎｅｒ他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４６， １４９９−１５０６（１９８６））。週に４回（４ｗｅｅｋｌｙ）、臨床的に適切な療法で、ｐｏ １−ｍｅｒおよび５ＦｄＵの両方を、尾の静脈を介して大量瞬時投与した（Ａｎｆｉｅｌｄ他， Ｃａｎｃｅｒ， ３９， ３４−４０（１９７７））。開始量１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇは、インビトロデータを外挿して決定した。各注入から１週間後、コホートの動物（６動物／投与量／処置）を屠殺した。血液および肝臓サンプルを各動物から集め、肝臓毒性および全身毒性を分析した。血液サンプル分析は、スーパーケムパネル（Ｓｕｐｅｒｃｈｅｍ ｐａｎｅｌ）および総血液計数を含んだ。スーパーケムパネルはグルコースの血中レベル、ウレア窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、総タンパク質、アルブミン、接合および非接合の両方のビリルビン、トリグリセリド、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、トリグリセリド、ＣＰＫ、アルカリホスファターゼ、および抹消血液の相違を分析した。総血液計数は、赤血球および白血球の両方の計数とともに、血球容量を分析した。肝臓サンプルは、形態的、構造的および壊死性組織の増加の変化を対照と比較して決定するため、組織学的分析に供した。未処理の対照と比較して、組織の障害を示す血中計数または血清成分における急性または持続的な増加はいずれも、毒性の応答の指標であると見なした。加えて、各コホートの体重は、それらの臨床条件として処理期間を通して記録した。
【００９０】
［週１０ｍｇ／Ｋｇの投与量レベルのｐｏ １−ｍｅｒ］
これらの実験の結果から、各投与に関して穏やかな毒性が示された。物理的には、食物および水の消費は通常であったが、４週間の期間の間、体重の増加は進行し、整理食塩水を処理した対照マウスと類似した。しかしながら、ｐｏ １−ｍｅｒを１０ｍｇ／ｋｇの投与レベルで処理したマウスは、白血球計数の著しい抑制と、軽い低色素性貧血が起きた。血液化学の分析では、ＳＧＰＴのレベルが基準範囲のトップであり、ＳＧＯＴのレベルは著しく上昇していた。これらの結果は表７に纏めてある。加えて、乳酸デヒドロゲナーゼのレベルおよび血清カリウムのレベルが上昇し、細胞原形質の減少および細胞の過剰な破壊を示した。ウレア尿素（ＢＵＮ）およびナトリウムレベルの上昇も、軽度の腎臓障害の特徴であるカルシウム塩化物（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃａｌｃｉｕｍ）レベルの減少と同様に検出された。しかしながら、主な肝障害の指標である総ビリルビンおよびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＴ）レベルの上昇は、観察されなかった。組織学的分析は過去の軽い肝細胞腫脹のいかなる形態的な変化も明らかにしなかった。臨床的な意味で、マウスは処理による有害な影響をまったく示さなかった。２週間で処置を停止したとき、全ての血中値は基準範囲に回復し始め、肝細胞腫脹は減退した（表７の６週目）。
【００９１】
［週１５ｍｇ／Ｋｇの投与量レベルのｐｏ １−ｍｅｒ］
ｐｏ １−ｍｅｒ（１５ｍｇ／ｋｇ）の毒性試験の結果は、１０ｍｇ／ｋｇの投与レベルによるものと同様であった。これらのデータは表８に示した。完全な血中計数の結果は、白血球の計数の著しい低下、軽い低色素性貧血、および軽い血小板減少症を明らかにした。血液化学は、ＳＧＰＴレベルが基準範囲のトップであること、および、いくらかの肝細胞の障害を示すＳＧＯＴレベルが上昇していることを示した。加えて、乳酸デヒドロゲナーゼレベルおよび血清カリウムレベルが上昇し、細胞原形質の減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇを投与する前、肝障害の指標である総ビリルビンおよびガンマ−ＧＴレベルの上昇は観察されなかった。さらにその上、組織学的分析は、一匹のマウスで軽い肝細胞の腫脹および被膜下繊維症を明らかにした。臨床的な意味では、マウスは処理による有害な影響を全く示さなかった。食物および水の消費は通常であったが、体重増加は、増加率が漸進的のままであった未処理の対照マウスよりいくぶん低かった。処置の停止が回復に及ぼす影響は目下分析されている。これらの実験から得られたデータから、ｐｏ １−ｍｅｒの毒性が最善の軽さであり、試験を生体有効性の検討に進めることが許容されることが示された。
【００９２】
【表７】
2004536027.tif 000019
【表８】
2004536027.tif 000020
＜実施例１５＞
本実施例では、チミジン酸合成酵素活性、細胞内ヌクレオチドおよびコファクター（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）濃度、および増殖阻害の測定を詳述する。
【００９３】
［細胞のＴＳレベルおよび活性の測定］
送達された接合体の有効性をさらに評価するため、ＴＳのレベルおよび活性を測定するために正確で感度の高い方法を用いた。使用された方法は、Ｓｐｅａｒｓ他（（１９８８），Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｆｏｌａｔｅｓ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｄｍｉｄｉｎｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｐｌｅｎｕｍ出版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，９７〜１０４頁）およびＫｅｙｏｍａｒｓｉ他（（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４４０２−１４４０９）によって以前に記述されたものを適用した。これらの測定を通して、各５ＦｄＵＭＰまたはロイコボリン残基のＴＳ阻害効果を測定することができる。細胞成分の定量は３通りで行うことができ、統計的有意性は対になって調査されるｔ−試験法を用いて決定されることができる。
【００９４】
［ＴＳレベル］
チミジン酸合成酵素レベルは過剰の葉酸（５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート，５，１０−ＣＨ２−Ｈ４ＰｔｅＧｌｕ）の存在下で［３Ｈ］−ＦｄＵＭＰによって活性サイトを滴定することによって定量する。指数関数的に増殖する細胞は、１０％透析ＦＣＳを補充した培地に含まれる湿気およびＣＯ２をモニターした条件下で薬物に連続的に暴露した。様々な時間で、各培養液を分取して洗浄し、所定の細胞密度でＰＢＳに再懸濁する。この混合物を、超音波処理し、高速で遠心分離する。各上清からの分取をサイズ排除ゲル濾過によって脱塩化し、続いて３０℃で５，１０−ＣＨ２−Ｈ４ＰｔｅＧｌｕおよび［３Ｈ］−ＦｄＵＭＰとともにインキュベートする。デキストランＴ−７０およびＢＳＡで処理した木炭の氷冷懸濁液を添加し、混合し、約５分遠心分離する。その放射活性上清をトリクロロ酢酸の希釈液に添加し、インキュベートし、遠心分離する。得られたペレットは、続いて放射活性を定量するためにシンチレーション流体に溶解する。
【００９５】
［ＴＳ活性］
ＴＳ活性は、Ｓｐｅａｒｓ他（ｓｕｐｒａ）によって記述されたトリチウム放射試験法に従って測定する。その試験法は、サイトゾルの一部を［３Ｈ］−ｄＵＭＰおよびｐＨ７．３、一般に最終濃度〜０．５−１μｍの５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートでインキュベートするからなる。３７℃のインキュベートを経過した後、０℃に冷却して反応を停止する。過剰の［３Ｈ］−ｄＵＭＰは、一般に希釈トリクロロ酢酸を含む活性炭を添加して除去する。遠心分離に続いて、インキュベートの間に形成したトリチウム化水（３Ｈ２Ｏ）を測定する。結果は、インキュベート時間から得られた直線回帰に基づいて、毎分タンパク質１ミリグラム当たり形成した３Ｈ２Ｏのフェムトモルとして表す。この方法の感度は、１０ｆｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質である。
【００９６】
［ヌクレオチド濃度］
接合体の有効性を評価するために同様に重要なことは、遊離および結合ヌクレオチドの細胞内レベルを正確に測定することである。これらのレベルは、毎回接合体の添加の前後に測定する。これらの測定の原理は主として、これらのヌクレオチドの遊離の貯蔵が、細胞増殖および通常のＴＳ活性を支配することを決定した研究におかれている（Ｂｅｒｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｅｖａｎｓ他（１９８０），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：４１１３−４１２２；Ｅｖａｎｓ他（１９８１），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４１：３２８８−３２９５）。過剰レベルの細胞内ＦｄＵＭＰおよびｄＵＭＰの相互関係は競合的性質である。明白には、内在性のｄＵＭＰのレベルが上昇すると、ＦｄＵＭＰの有効性は減少する。さらに、ＬＶの存在下で得られたＦｄＵＭＰ結合を上昇させることで、ＬＶ濃度と有効性の相関を得ることができる。従って、各濃度の正確な測定により、与えられた接合体の有効性の評価が可能になる。この情報を得るため、ｄＵＭＰ、５ＦｄＵＭＰ、およびロイコボリンの細胞内レベルを決定するための分析を行う。
【００９７】
［ｄＵＭＰの測定］
この試験法はＭｏｒａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９７９，７６：１４５６−１４６０）を適応する。この試験法では、１４Ｃ標識  ５，１０−１４ＣＨ２−Ｈ４ＰｔｅＧｌｕの存在下でインキュベートされる、ｄＵＭＰのサンプルの［メチル−１４Ｃ］−ｄＴＭＰへの定量的な転化のために、精製チミジン酸合成酵素（Ｌ．ｃａｓｅｉ）を使用する。このプロセスは、ＴＳ酵素を緩衝されたＢＳＡと、細胞抽出液から得られた未知量のｄＵＭＰで処理することを含む。１４Ｃ標識ロイコボリン（アマシャム・ライフ・サイエンス）を添加し得られた混合物をインキュベートする。メチル転化反応はホルムアルデヒドで急冷し、標識されたＴＭＰはＤＥＡＥセルロースカラムを用いて単離し、緩衝されたアンモニアの炭酸水素塩またはギ酸塩で溶出する。溶出液の放射活性をシンチレーションカウンティングで測定する。１０ｐｍｏｌ程度のｄＵＭＰレベルの感度が信頼性を持って得られる。
【００９８】
［遊離および結合５ＦｄＵＭＰの測定］
遊離５ＦｄＵＭＰ濃度に加えて、既にＴＳと結合した［３Ｈ］−５ＦｄＵＭＰの量を知ることも、この割合が細胞内５ＦＵ送達の有効性と直接関係しているであろうために重要である。この測定は、トリチウム標識基質を利用するこれらの細胞内取り込み実験にのみ適用する。一般に、この方法（Ｍｏｒａｎ， ｓｕｐｒａ）は、ＢＳＡおよびデキストランで処理した木炭を、遊離および結合ＦｄＵＭＰの未知の混合物に添加することを含む。遠心分離で上清を抽出するだけで、未結合の標識ＦｄＵＭＰを９０〜９９％の効率で除去するのに十分である。結合ＦｄＵＭＰに対する遊離ＦｄＵＭＰの割合は、上清と木炭層を別々にシンチレーションカウンティング測定することによって得られる。ｄＵＭＰの細胞内レベルと比較した場合、このデータはいかにして細胞系統が５ＦＵの有害な効果に抵抗するかということへの洞察を提供し得る。
【００９９】
［ロイコボリン（ＬＶ）の測定］
試験法はＬｕ他（ｓｕｐｒａ）によって記述された方法から適用する。これらの細胞取り込み実験のため、肝細胞を、２ｃｍ２のウェルに測定前の密度で、透析した馬の血清を１０％含む葉酸非含有培地に３７℃で２４時間置く。その後、培地を吸引し、細胞を（６ｓ）−［３Ｈ］−ロイコボリンを含む培地に懸濁し、３７℃でインキュベートする。インキュベート期間の後、細胞を０℃に冷却して細胞取り込みを停止し、直ちに冷却ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄する。細胞表面の結合ＬＶを除去するため、細胞を冷却生理食塩水（ｐＨ３．０）でさらにすすぐ。さらにＰＢＳで洗浄した後、細胞を溶解しトリチウム含有物質を測定する。最終吸収量から非特異的結合を減算する。
【０１００】
＜実施例１６＞
本実施例では、本発明の接合体、特に、ヌードマウスにおけるヒト肝細胞腫の異種移植片をターゲットとしたｐｏ １−ｍｅｒの生体効率を説明する。
【０１０１】
異物移植された腫瘍は、腫瘍の直接的な物理的測定（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ他， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３６，１２８５−１２８９（１９８７））、組織学的変化、およびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル（Ｌｅｍｏｉｎｅ他， Ｐａｔｈｏｌ． Ｂｉｏｌ． （Ｐａｒｉｓ）， ４７， ９０３−９１０（１９９９））およびチミジン酸合成酵素レベル（Ｐｅｔｅｒ他， Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，１２，２０３５−２０４１（１９９４））のような生化学的測定により評価されたように、５ＦＵの化学療法にすぐに反応することが予め示されている。ヌードマウスに異種移植された腫瘍は、ヒト腫瘍の増殖を直接的に測定できる腫瘍研究のためのモデルとして使用される。オスのＣＤ−１ヌードマウス（６〜８週齢、体重２０〜２２ｇ）をこれらの生体効率調査に使用した。１０８Ｈｅｐ  Ｇ２細胞は、各マウスの皮下膜領域へ皮下注入された。マウスの腫瘍形成は毎日観察された。腫瘍が出現した後、スライドノギスで二次元の寸法を週二回測定した。腫瘍の重量が、式［（重量、ｍｇ）＝（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ））２／２］で決定される重量で１００ｍｇに達したとき、処理を開始した（Ｇｅｒａｎ他，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．， ３，５１−６１（１９７２））。初期は、マウスを８週間にわたって、毎週一回１０ｍｇ／ｋｇの投与で処理した。続いて、マウスの別々のコホートを８週間の間、週１５ｍｇ／ｋｇで処理し、最後に８週間、週２度１０ｍｇ／ｋｇで処理した。この処理が腫瘍増殖に及ぼす影響は、上述したような直接測定によって判定した。加えて、腫瘍の進行をＡＦＰレベルのような血清学的な測定によって追跡した。ＡＦＰレベルは各注入につづいて毎週測定した。血液は各マウスからレトロ−オービタリー（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）で採取した。ＡＦＰレベルは、アボットラボラトリーズ（Ｗａｕｋｅｇａｎ，ＩＬ）が供給しているキットを使ってＷａｎｇ他の方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，８６９ｓ−８７２ｓ（１９９０））に基づいて免疫化学的に分析した。ＡＦＰレベルの測定は、腫瘍進行の指標として、直接物理的測定を捕捉するように意図した。通常、血清ＡＦＰレベルは腫瘍の質量を反映するかのように振舞う。しかしながら、無併発性の肝臓病患者のなかには、中程度に上昇したＡＦＴレベルが見つかっていることは注意すべきである。これらの擬陽性にも関わらず、血清ＡＦＰレベルは、特に腫瘍を有するヌードマウスにおいて治療への応答をモニターするのにうまく使用することができる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ Ｈｅｐａｔｏｌ．，１４（Ｓｕｐｐｌ．），ｓ３２−ｓ３６（１９９９））。ここでいうヒトの腫瘍とは、ヒトＡＦＰの源となるものだけである。そのような分析の結果は、物理的な腫瘍増殖が顕著になる前に、ＨＣＣの可能性の初期の指標を提供する。上記の実験によって生成されたデータは、大きな哺乳類の試験、および続いて行う治療的研究のための開始投与量を導くのに貢献する。
【０１０２】
［週１０ｍｇ／Ｋｇ投与レベルのｐｏ １−ｍｅｒ］
肝臓癌を有するマウスに１０ｍｇ／ｋｇのｐｏ １−ｍｅｒを処理したところ、腫瘍の増殖の軽い阻害が引き起こされた。ｐｏ １−ｍｅｒ処理の初期の影響は、約５週間後に現れた。しかしながら全体的には、腫瘍はこの時点以降も、対照よりは遅い割合であるが増殖を続けた。例えば、ｐｏ １−ｍｅｒ処理から８週間経過後、ヌードＣＤ−１マウスに異種移植したヒト肝臓癌の平均腫瘍重量は約７ｇであり、生理食塩水で処理した対照の平均腫瘍重量は約１５ｇであった。対照コホートの腫瘍と、ｐｏ １−ｍｅｒ処理ヌードマウスの腫瘍を比較するため、８週間後に組織学的分析を行った。これらの分析から、分裂指数の減少と、処理した腫瘍における壊死組織量の増加が明らかになった。さらに、処理した腫瘍においてＴＳ活性の減少が見られたが、しかし同じ動物から取り出した肝臓では見られなかった（表９）。一般に、ｐｏ １−ｍｅｒ処理したマウスおよび生理食塩水で処理した対照コホートの体重は、腫瘍を有さないマウスに比べて処理後３週間で軽い下降を示した。この体重の損失は、治療処置のためというよりは、腫瘍の負荷のためのものだと考えられ、８週間に渡って継続した。
【０１０３】
【表９】
2004536027.tif 000021
［週１５ｍｇ／Ｋｇ投与レベルのｐｏ １−ｍｅｒ］
ｐｏ １−ｍｅｒ投与レベルを週に１５ｍｇ／ｋｇの注入まで増加したとき、腫瘍重量により著しい影響が誘発された。この投与レベルにおいて、ｐｏ １−ｍｅｒ処理は腫瘍の進行に多大な影響を与え、５回の注入の後に増殖率を著しく減少させた。この時点で、腫瘍の進行は殆ど静止した。さらに２回の注入の後、一匹のマウスで腫瘍の負荷が根絶し、腫瘍サイズが他に比べて減少した。これらの腫瘍のサイズが減少するにつれ、組織は乾燥し壊死してきた。これは、腫瘍重量が４週間の期間で約１２グラムに増加した生理食塩水処理の対照と完全に対照的であった。アルファフェロチン（ＡＦＴ）測定における減少は、腫瘍のサイズの減少とだいたい対応した。ｐｏ １−ｍｅｒの処理は、処理から３週間後でＡＦＴのレベルを２００μｇ／ｍｌより少なくするほど劇的にＡＦＴレベルを減少した。この傾向は、８週間でその値が検出レベル以下になるまで継続した。
【０１０４】
処理が完了した後、腫瘍を組織学的とＴＳ活性の両方から分析した。これらの分析によって、処理した腫瘍のＴＳ活性が大きく減少したこと、しかし同じ動物の肝臓組織では減少しなかったことが明らかとなった（表１０）。組織学的に、ｐｏ １−ｍｅｒ処理した腫瘍はかなり低い分裂指数および広範な壊死を示した。臨床毒性に関しては、ｐｏ １−ｍｅｒ処理したマウスは、腫瘍を有さないマウスと同等の定常的な体重増加を維持した。実験の過程で屠殺した、この生体有効性調査のヌードマウスは、毒性実験において正常のマウスと殆ど同じ血液化学的プロフィールを示した。従って、ｐｏ １−ｍｅｒの投与量の増加は、全身毒性を増加することなしにその有効性を上昇すると推論できる。
【０１０５】
【表１０】
2004536027.tif 000022
［週２回、１０ｍｇ／Ｋｇの投与レベルのｐｏ １−ｍｅｒ］
ｐｏ １−ｍｅｒがＨＣＣ腫瘍に及ぼす有効性がさらに調査され、投与量だけでなくスケジュールの変更を考慮するに及んだ。この変更で、腫瘍を有するマウスはｐｏ １−ｍｅｒかまたは生理食塩水対照を週２回、１０ｍｇ／Ｋｇ処理された。このスケジュールで、ｐｏ １−ｍｅｒの治療は腫瘍増殖に、より急速な変化をもたらした。処理後３週間で、中程度の体重減少とともに腫瘍の進行の著しい減少が観察された。この腫瘍増殖の減少はその後、６週間後に腫瘍が検出以下になるまで規則的な週２回の処理によって継続した。さらに、ｐｏ １−ｍｅｒ処理マウスのＡＦＰ測定値は、３週間目から始まり６週間目で検出限界以下になるまで継続した腫瘍の減少割合とほぼ対応した。反対に、生理食塩水処理のマウスのＡＦＰレベルは７週間の期間に渡って、５０μｇ／ｍｌから９００μｇ／ｍｌまで上昇した。このコホートの一匹は、処置に対していくらかの耐性を示し、５週を通して腫瘍の増殖が継続した。しかしながら、この動物がウイルス感染のために犠牲になったとき、組織学的分析により、生理食塩水対照と比較して広範な腫瘍の壊死が明らかになった。
【０１０６】
＜実施例１７＞
本実施例では、Ｃ６−チオール修飾因子を用いた、および用いない、５ＦｄＵの合成を説明する（図１１）。
【０１０７】
全てのオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステム  ３９２  ＤＮＡ合成器で、標準メチルホスホネート／ホスホラミダイト化学を用いて合成した。固相ＤＮＡ合成は、グレン・リサーチ化学（ユニバーサル−Ｑ  固相担体（５００Å細孔サイズ）、ホスホラミダイト活性化因子溶液（１Ｈ−テトラゾル）、およびβ−シアノエチルホスホラミダイト）、または自己調製化学（ｓｅｌｆ−ｐｒｅｐａｒｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（非ブロック化溶液、キャップＡ溶液、キャップＢ溶液、および酸化剤溶液）を用いた。非ブロック溶液はメチレンクロリド中に２．５％（体積／体積）のジクロロ酢酸を含む（試薬グレード）。キャップＡは、無水酢酸を、乾燥テトラヒドロフラン、および２倍に蒸留した２，６−ルチジンに混合した物（全て体積比で１：８：１）である。キャップＢは無水ＣＨ３ＣＮ中に０．５Ｍの１−メチルイミダゾール溶液である。三価の亜リン酸塩を硫化するため、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（ビアウケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬）を、ＣＨ３ＣＮ（グレン・リサーチ）１０ｍｌに１００ｍｇの試薬濃度で含む溶液を使用した。
【０１０８】
このオリゴヌクレオチドの合成のために、二つのユーザープログラムが開発された。最初のプログラムは、「ＤＢＬ・ＳＵＬＦＵＰ」と題され、ホスホロチオエート結合を合成する。このプログラムは正常量のシントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）を、カップリング時間を上昇させて（即ち、２５秒から６０秒）二度カラムを通過させる。酸化／硫化時間は９００秒にセットした。
【０１０９】
ポリアクリルアミドゲルは、示したような特異的な方法で、１４：１のアクリルアミド：１５％または２０％のクロス結合されたゲルを提供するＮ，Ｎ´−メチレン−ビス（アクリル）アミドの、３０（重量）％水溶液の希釈によって調整した。最終溶液は尿素を含む（最終濃度７Ｍ）。アンモニウム過硫酸塩の２０％水溶液の一定分量１１０μｌを添加し、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）（５５μｌ）を添加して重合を開始した。ゲルは重合させて１時間固化した。水槽をＴＢＥバッファーで満たした。サンプル（８．０〜１２．０μｌ）をゲルのウェルに添加した。ゲルは、個々の実験に特異的な条件で泳動した。その後、放射標識化した産物のバンドをオートラジオグラフィーで可視化した。
【０１１０】
５−フルオロ−２´−デオキシウリジン−含有オリゴヌクレオチドの合成は、現存の自動ＤＮＡ合成技術および方法論を用いて行った（図１１）。この合成は、ユニバーサル−Ｑ  ＣＰＧ固相担体を用いて１μｍｏｌスケールで実行した。上述したように、５ＦＵオリゴヌクレオチドシントン、５´−ジメトキシトリチル−５−フルオロ−２´−デオキシウリジン、３´［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホルアミジト（グレン・リサーチ）を０．１Ｍ（３．４ｍｌのＣＨ３ＣＮに０．２５ｇ）濃度で使用した。ジメトキシトリチル陽イオン吸光度（λｍａｘ  ４９８ｎｍ）をモニターし、カップリング効果（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を測定した。最終合成サイクルが完了したとき、オリゴヌクレオチドに結合した固相担体を合成器から除去し、保護をはずすのに先立って真空中で乾燥した。或いは、オリゴヌクレオチドに結合した固相担体は、チオール修飾因子Ｃ６  Ｓ−Ｓ試薬、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシルジスルフィド、１´−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミジト（０．１Ｍ）を用いた標準ホスホルアミジト条件に暴露した。精製のために、最終ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）はそのまま残した。
【０１１１】
チオール修飾因子を用いた場合および用いない場合のどちらも、オリゴヌクレオチドに結合した固相担体は、５０％  ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏに０．５ＭのＮａＯＨ溶液１ｍｌで１時間、室温（２５℃）で処理した。その溶液を０．５Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４  ２ｍｌで中和し、２０ｍｌのＨ２Ｏで希釈した。その粗製溶液を、精製のためのＣ１８  ＳｅｐＰａｋを予め平衡化するためにアプライした（２０ｍｌ）。カラムは、ＣＨ３ＯＨ（３０ｍｌ）、５０％  ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）、その後Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ）を連続的に溶出して予め平衡化した。粗製オリゴマーの処理の後、カラムはＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄し、それから５％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで洗浄し、合成からすべての不完全な配列を取り除いた。カラムには次いで、Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）を戻し、Ｈ２Ｏに０．５％（体積／体積）のＣＦ３ＣＯ２で処理した。過剰な酸は、Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）を使ってカラムから洗浄した。オリゴマーの産物は、３５％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを用いてカラムから溶出し、画分を集めた。ＨＰＬＣおよびＰＡＧＥ分析で同定されたような産物を含む画分は、貯留され、非−チオール修飾オリゴヌクレオチドが７８Ｏ．Ｄ．、およびチオール修飾オリゴヌクレオチドが３７Ｏ．Ｄ．に成るまで濃縮した。産物は分光光度測定で決定した。
【０１１２】
＜実施例１８＞
本実施例では、チオール修飾オリゴヌクレオチドを説明する（図１０の１２）。
【０１１３】
チオールの還元は（図１０の１２）、５´−ジスルフィド含有オリゴマーをＤＴＴで処理することにより行った。例えば、３．６ＯＤ２６０（〜４０ｎｍｏｌ）ジスルフィドオリゴマー（図１０の１１）を１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８中の、４００μｌの調製仕立てで且つ脱気した５０ｍＭのＤＴＴ溶液に溶解した。その混合物を３７℃で２時間インキュベートした。チオールオリゴマーはその後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ｆｉｎｅ）カラム（１．０×４３ｃｍ）で精製し、ＤＴＴおよび無機塩を除去した。カラム充填およびサンプル溶出は脱気した２０％  エタノールＨ２Ｏを用いて行った。精製チオールオリゴマーを含有するＧ−２５画分は、チオールの二量体化産物の可能性を最小にするために、直ちに次の反応に使用した。
【０１１４】
＜実施例１９＞
本実施例は、チオール含有オリゴマーとＳＭＣＣ−リガンドの接合：ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ＡＨＴ−Ｐｏｌｙ５ＦＵ接合体（図１０および１２）（１３）を説明する。
【０１１５】
３．６ＯＤ２６０（４０ｎｍｏｌ）精製チオールオリゴマー（図１０の１２）を含むＧ−２５画分を、ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（図１０の１０）（「Ａ−Ｌ」接合体）（１００ｎｍｏｌ）と混合し、その後直ちに収集し、その混合物をＳｐｅｅｄ−ｖａｃを用いて真空下で濃縮して乾燥した。その残渣を、ｐＨ７の０．１Ｍ  リン酸ナトリウムを含む脱気された５０％  ＣＨ３ＣＮ１００μｌに溶解した。その溶液をさらに、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で約５分減圧して脱気した。その溶液を次いできつく封じ（ｃａｐｐｅｄ ｔｉｇｈｔｌｔ）、室温で一晩インキュベートし、接合化を完了させた。産物はＡ２６７吸光度の強度によって測定し（１ｎｍｏｌは０．０８９  Ｏ．Ｄ．）、それから紫外線増影法を用いた２０％  変性剤ＰＡＧＥによって分析した。この結果、チオールオリゴマーとネオグリコペプチドの定量的な接合が示された。この接合体（図１３）は、キモトリプシン消化での有意なゲル移動度シフト、およびＤＴＴ処理においてシフトできないことによって確認された。接合体は最終的にＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５によって、２０％  エタノールで溶出して精製し、その後さらに調査に使用した。収量３２．４ｎｍｏｌ（３．８５  ＯＤ２６０）；質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、ｍ／ｚ（Ｃ２４１Ｈ２９１Ｎ４６Ｏ６３Ｐ１８Ｓ５Ｆ１８要求６７１２（Ｍ）＋（スクリップ・リサーチ・株式会社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））。
【０１１６】
＜実施例２０＞
本実施例は、３５Ｓ放射標識トレーサーの導入を説明する（図２）。
【０１１７】
反応混合物（全量  ３００μｌ）は、１８．１ｎｍｏｌの５ＦＵオリゴヌクレオチド基質（１８−ｍｅｒ）、５×末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼバッファー（ｐＨ７．２）（６０μｌ）、［３５Ｓ］ｄＡＴＰ  Ｓ（アマシャム、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を０．５ｍＣｉ、および５００ユニットの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ライフ・テクノロジー、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から成る。得られた溶液を３７℃で１７時間インキュベートした。その後、この混合物を室温で冷却し４００μｌの０．５Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）で希釈し、そして１時間後、内容物を予め平衡化したＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア、Ｐｅａｐａｃｋ、ＮＪ）にアプライした。７００μｌのサンプルを流した後、３００μｌのＨ２Ｏを流し、そして全量１ｍｌを画分１として集めた。引き続いて１ｍｌの画分を集めた。画分４は、ＵＶおよびシンチレーションカウンティングで定量された産物を含む。これらの測定から、特異的活性（μＣｉ／ｎｍｏｌ）を算出した。その収量は、１０．４２ｎｍｏｌで、全量で１８３．３μＣｉであった。
【０１１８】
＜実施例２１＞
本実施例は、Ａ−Ｌ−ＰＰ接合体を使用した細胞取り込み実験のために使用する方法および材料を説明する。ＰＰは抗癌活性を含む製剤である。さらに、インビトロにおける、増強され且つ特異的な、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞によるネオグリコ接合体の細胞取り込みを説明する。
【０１１９】
Ｈｅｐ  Ｇ２、ＴＳＵおよびＣａｋｉ−１細胞（ＡＴＣＣ、Ｐｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、２ｃｍ２のウェルに継代し、Ｌ−グルタミンおよびＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地１６４０で、各ウェルの細胞密度が０．２×１０６〜０．５×１０６になるまで増殖させた。
【０１２０】
維持培地を吸引し、２％  ＦＣＳを含み、［５´−３２Ｐ］−標識化接合体または対応する非接合体オリゴマーを１μＭにした０．２ｍｌの培地で細胞を３７℃でインキュベートした。処方時間が経過した後、培地を５μｌ分取したものをシンチレーションカウンティングのために残し、残りをウェルから吸引した。細胞をＤ−ＰＢＳ（２×０．５ｍｌ）で洗浄し、０．２５％トリプシン（０．２５％；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で３７℃で２分間処理し、１０％  ＦＣＳを含む新鮮な増殖培地に懸濁した。懸濁した細胞は１．７ｍｌコニカル遠心チューブ中でシリコンオイル（０．５ｍｌ）の上に層をなし、１４，０００ｒｐｍ（１２，０００ｇ）で３０秒間遠心分離してペレットにした。上清を注意深くデカントし、０．５％  ＮＰ  ４０、１００ｍＭ  塩酸ナトリウム、１４ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、および３０％アセトニトリルを含む溶液１００μｌに細胞ペレットを溶解した。放射活性量はシンチレーションカウンティングによって、および、ネオグリコ接合体または細胞溶解と関係するオリゴマーの量から推論して決定した。
【０１２１】
肝臓由来の細胞の取り込みが強化されたことを実証するために、ホスホロチオエート結合、５ＦＵ含有ネオグリコ接合体と、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞との細胞会合を試験した。対照として、対応する標識された非接合オリゴマーとＨｅｐ  Ｇ２との細胞会合も試験した。ネオグリコ接合体は速やかにＨｅｐ  Ｇ２細胞と会合し、０．５時間で１９．５４ｐｍｏｌ／１０６細胞  程度になり、４時間でピーク値３９．９１ｐｍｏｌ／１０６に達するまで蓄積し続けた。反対に、対応する非接合オリゴマーはＨｅｐ  Ｇ２細胞による細胞取り込みの割合が低く、０．５時間で６．５１ｐｍｏｌ／１０６程度の会合、およびさらに４時間でピーク値１１．８８ｐｍｏｌ／１０６の蓄積であった。化合物の細胞特異性も試験した。アシアロ糖タンパク質受容体は、肝細胞表面で発見され、種々の治療薬剤がこの組織を選択的にターゲティングするための効率的な手段である。組織特異性は、非肝臓由来の二つのヒト細胞系、ＴＳＵおよびＣａｋｉ−１とネオグリコ接合体の会合を分析することによって試験した。
【０１２２】
ＴＳＵ細胞を非接合オリゴマーとインキュベーションした結果、初期の取り込みは０．５時間で３．８であり、その値は徐々に上昇し、４時間で１１．４３になった。これらの結果は、非接合オリゴマーをＨｅｐ  Ｇ２細胞とインキュベートした場合に観察されたものと類似している。しかしながら、ＴＳＵ細胞がネオグリコ接合体に暴露された場合、取り込みに有意な上昇は現れなかった。ネオグリコ接合体は４時間で５．６程度取り込まれ、徐々に蓄積して４時間で１３．１５の値になり、その値は非接合オリゴマーで見られたものと非常に類似していた。
【０１２３】
同様に、Ｃａｋｉ−１細胞はネオグリコ接合体の取り込みの上昇を示さなかった。非接合オリゴマーと比較して、ネオグリコ接合体は０．５時間で６．４程度、および４時間で１０．５５３程度蓄積した。同様のデータが非接合オリゴマーで観察され、０．５時間で７．６６、および４時間で１１．８６の会合を示した。ネオグリコ接合体および対応する非接合オリゴマーの両方とも、細胞培養培地で９６時間まで構造的に安定であることが証明された。
【０１２４】
上記のデータから、ネオグリコ接合体は、増強され且つ肝臓由来の細胞に特異的な方法で、化学治療薬剤、即ち５ＦＵを肝細胞に送達する能力があることが実証された。
【０１２５】
＜実施例２２＞
本実施例は、インビトロのおよびＨｅｐ  Ｇ２細胞の細胞内における、５−ＦＵオリゴヌクレオチドおよび対応する接合体の酵素的分解を詳述する。
【０１２６】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート部分で結合された５−フルオロ−２´−デオキシウリジン（５ＦｄＵ）ユニットの１８残基）はまず、より小さいオリゴヌクレオチド（下記で述べるようにＨＰＬＣ分析に基づくと約５オリゴマー）に分解され、その後、酵素またはＨｅｐ  Ｇ２細胞に暴露する時間を経過してモノマーユニットに分解された。モノマーユニットへの完全な転化がＨｅｐ  Ｇ２内部に取り入れられたオリゴヌクレオチドで観察されたが（５ＦｄＵＭＰモノマー残基が１００％生成）、オリゴヌクレオチドを酵素的に処理したものでは、１４４時間後で、最大で７２％の５ＦｄＵＭＰの算出量を生成したのみである。しかしこれにも関わらず、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて行われた酵素的な分解はこの例の最良のモデルを表さず、より現実的な細胞モデルを使用するためのガイドラインを表すものでしかないことを指摘することは重要である。さらに、Ｓ１ヌクレアーゼによるモノマーユニットへの完全な分解は観察されなかったが、わずか２４時間で、このオリゴヌクレオチドはより小さい断片へ完全に分解された。
【０１２７】
［５ＦｄＵＭＰのｍｏｌ消光率の算出］
５ＦｄＵＭＰ（５ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ））のサンプルを５ｍｌのＨ２Ｏに溶解した。この溶液を希釈し、１．９μＭ、３．８μＭ、９．５μＭ、１９μＭ、３８μＭ、および９５μＭの溶液を調製した。ベールの法則図を用意し、消光率を５２７８ｃｍ−１Ｌ−１Ｍ−１；ｒ２＝１．０に成るように計算した。この値に基づいて、５ＦＵオリゴヌクレオチド（ｐｓ５ＦＵ−１８−ｍｅｒ）のための消光率を計算した。この値は０．０８９Ｏ．Ｄ．（２６０ｎｍ）で１ｎｍｏｌであった。
【０１２８】
［５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  ５´−モノフォスフェートのＨＰＬＣ標準化曲線の準備］
５−フルオロ−２´−デオキシウリジン  ５´−モノフォスフェート（シグマ−アルドリッチ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む標準溶液を、０．３８μＭ、０．９５μＭ、３．８μＭ、７．６μＭ、３８μＭ、および９５μＭに調製した。これらの濃度はＵＶ分光法により測定した。マイクロソーブ・レイニン・カラム（５μＭ）（４．６ｍｍ×１５０ｎｍ）を使用し、標準化は濃度が既知の溶液のＨＰＬＣピークエリアを測定して行った（１００μｌのサンプル、１００μｌのインジェクターループ）。５ＦｄＵＭＰを含むそれぞれ標準化した溶液サンプルを、２％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中の５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）を使用して、流量１．０ｍｌ／分で流した。オリゴマー生成物は、５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）におけるＣＨ３ＣＮ直線勾配（２％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ、２０分）を使用して溶出した。各濃度およびタイムポイントは３通りで流した。溶離液は２６７ｎｍでモニターした。溶出時間および標準濃度は次のとおり。５ＦｄＵＭＰ：２．７１分、５ＦＵオリゴヌクレオチド：１９．６分。クロマトグラムに示されたピークエリアと５ＦｄＵＭＰの濃度の間に相関が描かれた。等式は、５ＦｄＵＭＰの濃度（μＭ）＝［（観察されたピークエリア−１５７５．０６０）／１０１５８．２２９］である。
【０１２９】
［Ｓ１ヌクレアーゼによる５ＦＵオリゴヌクレオチドの分解］
反応混合物（全量  ３２０μｌ）は、３０μｌの１０×Ｓ１反応バッファーおよび５０μｌの蒸留Ｈ２Ｏ中に５ＦＵオリゴマー４．３２Ｏ．Ｄ．（４８．５ｎ ｍｏｌ）を含んだ。この溶液に、Ｓ１ヌクレアーゼ（ライフ・テクノロジー、２６３ユニット／μｌ）（１ユニットは、３７℃で毎分１μｇの酸に可溶なヌクレオチドを生成する）を１２０μｌ分取して添加し、反応を開始した。反応混合物を３７℃で割り当てられた時間（２４、４８、７２、および１４４時間）インキュベートした。それぞれのタイムポイントで１０μｌを分取し、２６０ｎｍのＵＶ分光学的検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。マイクロソーブ・レイニン／カラム（５μｍ）（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を使用し、標準化は、既知の濃度の溶液のＨＰＬＣピークエリアを測定して予め行った（１００μｌのサンプル、１００μｌのインジェクターループ）。５ＦｄＵＭＰを含むサンプルをそれぞれ分取し、２％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）を使用して、流量１．０ｍｌ／分で流した。オリゴマー生成物を、５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）におけるＣＨ３ＣＮ直線勾配（２％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ、２０分）を使用して溶出した。５種類のオリゴマー、１５．９、 １７．２、 １７．５、 １８．３５、 １８．６分、が観察された。
【０１３０】
［５ＦＵオリゴヌクレオチド接合体のＨｅｐ  Ｇ２細胞による分解、および接合処理］
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を、培地に含まれる１μＭの５ＦＵオリゴヌクレオチド接合体とともに２４時間インキュベートし、前述の実施例で詳述したように、十分な取り込みをさせる。その可溶化液をＨＰＬＣによるオリゴマー分解分析に直接使用した。マイクロソーブ・レイニン・カラム（５μＭ）（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を使用した。標準化は、既知濃度の溶液のＨＰＬＣピークエリアを測定して予め行った（１００μｌのサンプル、１００μｌのインジェクターループ）。５ＦｄＵＭＰを含むそれぞれの可溶化液サンプルを、２％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中の５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）を使用して、流量１．０ｍｌ／分で流した。オリゴマー生成物を、５０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４（ｐＨ５．８）におけるＣＨ３ＣＮ直線勾配（２％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ、２０分）を使用して溶出した。Ｈｅｐ  Ｇ２可溶化液からは、オリゴヌクレオチド画分は観察されなかった。
【０１３１】
提案された接合体の代謝は、本アプローチの治療の有効性に重大な段階である。ネオグリコペプチドのリガンドが細胞の入り口で急速に分解されることは、以前から証明されていた（Ｈａｎｇｅｌａｎｄ他、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ７：１４１−１４９（１９９７））。さらに、そのリン酸ジエステルが結合したフルオロデオキシウリジンの線（ｓｔｒｉｎｇ）も、急速に加水分解され、５ＦｄＵＭＰ残基を放出する。この接合部で、オリゴヌクレオチドリン酸ジエステルは不安定な生きたシステムであり、急速に分解されることを注目することは重要である（Ｓａｎｄｓ他．， Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７：６３６−６４６（１９９５））。しかしながら、５ＦＵではなく５ＦｄＵＭＰが実際上ＴＳの阻害剤であり、それによってチミジンホスホリラーゼ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９：２６１８−２６２１（１９６４））およびチミジンキナーゼ（Ｕｍｅｄａ他．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２８：２５３９−２５３８（１９６８））の必要性を回避するために、この分解は好都合である。５ＦｄＵＭＰのさらなる分解と関係して、肝臓および腎臓は５−フルオロウラシルの主要なサイトを示す。これらの分解産物は、以前に調査されている（Ｄｉａｓｉｏ他．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．，１６：２１５−２３７（１９８９））。この種の測定は、ペーパークロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ技術のような様々な分析方法を用いて行われる（Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５７：８１７１−８１７６（１９８２） ； Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４５：１１６−１２１（１９８５））。
【０１３２】
さらに、５ＦｄＵＭＰ結合の有効性を増強するために、葉酸のコファクターを投与することができる。細胞内レベルでこれを達成するために、リガンドを送達するロイコボリン接合体が投与される。図１３は、複数のロイコボリン含有接合体Ａ−Ｌ−ＰＰの構造を示している。これらの残基は、ヌクレオシドの主鎖ではなく、リン酸ジエステルとそれらを結合するアミノ結合の切断で遊離し得る。その接合体の分解による５ＦｄＵＭＰおよびＬＶの細胞内での発生は、ＴＳの阻害には有益であり、細胞機能には有害である。
【０１３３】
結論として、分解産物の分析は、幾つかの方法により行うことができる。最も一般的に利用されるものは、（Ｌｅｙｖａ他、（１９８４）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４４： ５９２８−５９３３ ； Ｅｌ−Ｓａｙｅｓ他、（１９８３）， Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ．２０９−２２７）に記載されているように、多孔性ポリマーを充填したイオン対逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析である。商業的に、または容易な合成に利用する場合、信頼できる標準を比較のために使用する。
【０１３４】
＜実施例２３＞
本実施例は、ホスホロチオエートが結合した５ＦＵを含有するオリゴマーおよびチオエートが結合したＦ５０が細胞増殖に及ぼす効果、および、その効果の肝臓由来細胞における特異性を説明する。
【０１３５】
材料：Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ、Ｄ−ＰＢＳ、およびトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製）をＧＩＢＣＯ  ＢＲＬから購入した。Ｈｅｐ  Ｇ２、ＴＳＵ、およびＣａｋｉ−１細胞はＡＴＣＣから購入した。４８ウェルクラスタープレートをＣｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。細胞は、クールター細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を使用して計数した。
【０１３６】
方法：Ｈｅｐ  Ｇ２、ＴＳＵまたはＣａｋｉ−１細胞のいずれかを、１０％  透析ＦＣＳを補充した４８ウェルプレート中のＲＰＭＩに５×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。このインキュベート期間後、維持培地を吸引し、ネオグリコ接合体またはオリゴマーのいずれか１μＭ含む１０％  透析ＦＣＳを補充した２００μｌのＲＰＭＩ中で細胞を処理した。対照ウェルは２００μｌのＲＰＭＩ＋１０％  ＤＦＣＳのみで処理した。０，２４，４８、および７２時間で、各条件の６つのウェルを０．５ｍｌのＤＰＢＳで２度洗浄し、０．５ｍｌのトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡでＨＢＳＳ中に調製）で処理した。各条件の細胞数は、クールター電子細胞計数器を用いて決定した。
【０１３７】
Ｈｅｐ  Ｇ２、ＴＳＵまたはＣａｋｉ−１細胞は、実施例５に記載したように、１μＭのネオグリコ接合体またはオリゴマーのいずれかで処理した。６つの複製ウェルの平均細胞数を、処理、非処理対照のそれぞれで、２４、４８、および７２時間で測定した。非接合オリゴマーで処理したＨｅｐ  Ｇ２細胞の増殖は、未処理の対照と比較して著しく（３０〜４０％）減少した。この細胞を用いた実験期間中に観察された最小の増殖は、７２時間の処理で、わずか０．５倍の個体群であった。反対に、未処理の対照は同じ期間で２．５倍の個体群を示した。Ｈｅｐ  Ｇ２細胞をネオグリコ接合体で処理した結果、未処理の対照と比較して細胞数が５５〜６０％減少した。さらに、細胞数はネオグリコ接合体処理の後、実際に減少し、実験期間中、初期の対照レベルに回復せず、ネオグリコ接合体がこの濃度で使用された場合に予想される細胞毒性効果を示した。
【０１３８】
肝臓由来の細胞に特異的な処理も試験された。ＴＳＵまたはＣａｋｉ−１細胞を、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞のときの方法と同様に、１μＭのネオグリコ接合体またはオリゴマーのいずれかで処理した。この場合、非接合オリゴマーによる処理は未処理の対照と比較して細胞数が３０〜５０％減少した。これらの細胞を肝臓特異的ネオグリコ接合体で処理したところ、非接合オリゴマーで処理した細胞と殆ど同じ結果を生じ、細胞数のさらなる減少は起こさなかった。これらのデータから、肝臓由来の細胞におけるネオグリコ接合体の特異的且つ増大した生体効率が確認された。
【０１３９】
＜実施例２４＞
本実施例は、細胞周期の進行、ウイルスのポリメラーゼ活性、およびウイスルの細胞壊死効果を阻害するｐｏ １−ｍｅｒおよびｐｓ １−ｍｅｒの効果を試験するために使用されうる分析を詳述する。
【０１４０】
［細胞周期の分布の分析］
細胞を１００ｍｍ培養皿に蒔き、４８時間インキュベートし、種々の濃度のｐｏ １−ｍｅｒまたはｐｓ １−ｍｅｒに２４時間、３７℃（５％  ＣＯ２）で暴露し、または種々の時間（０〜４８時間）一定濃度で暴露した。その後、細胞を１０μＭのＢｒｄＵｒｄで３０分、３７℃（５％  ＣＯ２）でインキュベートした。死細胞を有する上清および収集した生細胞を、予め冷却していた（−２０℃）エタノール（８０％）で固定し、−２０℃で３日間まで保存した。ＢｒｄＵｒｄ／プロピジウムヨード染色は、先に記述したように行った（Ｈｏｒｂｅｒ他、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ７２ ： １０６７−１０７３ （１９９５）参照）。簡単に述べると、遠心分離の後、細胞を２Ｍ  ＨＣｌで３０分、２０℃で処理し、５０μｌのＰＢＳ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１％のＢＳＡに再懸濁し、ＦＩＴＣ−標識化抗−ＢｒｄＵＲｄ抗体で３０分、２０℃で処理する。それから１ｍｌ  ＰＢＳ／プロピジウムヨード（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加する。染色された細胞はＥｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＦＬ，ＵＳＡ）によって分析する。単一蛍光サンプル（ＦＩＴＣまたはプロピジウムヨード）を器具の設定を最適化するために使用し、適切な電子補正を確実にした。さらなる詳細は、Ｃａｔｔｅａｎｅｏ他のＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２６：２４７−２５６（２０００）を参照されたい。
【０１４１】
［細胞変性効果の阻害の分析］
簡単に述べると、細胞をｐｏ １−ｍｅｒまたはｐｓ  １−ｍｅｒで処理し、ウイルスに感染させる。６日後、トリパンブルー排出法と組み合わせて血球計数器で生細胞を計数する。
【０１４２】
［精製ＨＩＶ−１  ＲＴの阻害］
２０μｌの分析混合物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ジチオスレイトール；１．０μＭ  プレアニールドプレイマーテンプレート、５´３２Ｐ−標識ｄ（ＧｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡ）プライマー、およびｄ（ＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＧｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＣ）テンプレート；２５０μＭの各ｄＮＴＰ；および種々の濃度のｐｏ １−ｍｅｒまたはｐｓ  １−ｍｅｒを含む。反応は、ＨＩＶ−１  ＲＴを１０ｎＭで添加することによって開始し、３７℃で１５分継続する。これらの条件で、酵素は両方の基質に関して飽和していた。反応混合物は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画する。
【０１４３】
［他のウイルス性ＤＮＡポリメラーゼの阻害］
実験的な分析は、基本的にＨＩＶ−１  ＲＴのところで記載したものと同じである（Ｍａｒｓｈａｌｌ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６２６５−６２６９（１９９２））。精製子ウシ胸腺αポリメラーゼ（Ｐｏｌα）はＲ．Ｋｕｃｈｔａ（コロラド大学）から入手でき、鳥骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴはライフ・サイエンス（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ）から入手でき、そして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＩ）のクレノー断片はＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手できる。酵素濃度は全ての場合で同じである（１０ｎＭ）。プライマーテンプレートは、ＨＩＶ−１  ＲＴで観察されたものと同様に、ポリメライゼーションのために必要な濃度で添加する。ＡＭＶ  ＲＴが０．０５μＭ、ＰｏｌＩクレノー断片が５．０μＭ、およびＰｏｌαが２．０μＭ。
【０１４４】
ここに引用された刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参照文献は、それぞれ個々に、および特異的に、その全体を本明細書の一部として本願に援用する。
【０１４５】
本発明の記述（特に請求の範囲）に関連して使用された成分および構成要素については、他に示さない限り、または内容と明らかに矛盾しない限り、単数および複数は区別せず、その両者を含む。本明細書中に列挙した値の範囲は、他に示さない限り、および、本明細書中に個々に列挙されているかのように、それぞれ別々の値が本明細書中に援用されている場合を除き、単に範囲内のそれぞれ別々の値を個々に言及するのを簡略した方法として役立つことを意図したものである。本明細書中に記載した全ての方法は、他に示さない限り、また内容と明らかに矛盾しない限り、何れの適切な順序でも行うことができる。いずれかの、および全ての実施例の使用、または本明細書中で提供された典型的な語（例えば、「のような」）は、単に、本発明をより明らかにするためのもので、他に請求されていない限り本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる文言も、請求していない要素が本発明を実行するために必須であると示すようには解釈されるべきではない。
【０１４６】
本発明の好ましい実施例は、本発明者が認識する本発明を実行するための最適な態様を含めて本明細書中に記載される。もちろん、これらの好ましい実施例の変形例は、上記の詳述から通常の当業者には明らかであろう。本発明者は、そのような変形例を実行するのに適切な熟練した技術者を想定しており、本発明が本明細書中に特に記載されたものと別の方法で実行されることを意図している。従って、本発明は全ての改変例、および、適用可能な法によって容認されるようにここに付される請求の範囲において列挙された対象物質に相当する全てのものを含む。さらに、上述の要素の全ての可能な変化のいかなる組み合わせも、他に示さない限り、また内容と明らかに矛盾しない限り、包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
「Ａ−Ｌ−Ｐ」接合体の模式図を示す。ここで、Ａはリガンドを含み、Ｌはクロスリンク試薬および修飾因子を含み、そしてＰはｎ個のヌクレオチドまたはそれらの類縁体を含み、ｎはヌクレオチドまたはそれらの類縁体の数である。
【図２】
トレーサーを有する、リガンド特異的Ａ−Ｌ−Ｐ接合体の分子集合を示す。
【図３Ａ】
トリ−アンテナリーリガンドの例を示す。
【図３Ｂ】
トリ−およびテトラ−アンテナリーリガンドの例を示す。
【図３Ｃ】
テトラ−およびマルチ−アンテナリーリガンドの例を示す。
【図４】
５´−Ｃ６−ジスルフィド  ５−フルオロ−２´−デオキシウリジンの自動合成を示す。
【図５】
５´−チオール修飾  ５−フルオロ−２´−デオキシウリジンの固相担体からの脱離および合成を示す。
【図６】
ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５−フルオロ−２´−デオキシウリジン接合体、ｐｏ １−ｍｅｒおよびｐｓ １−ｍｅｒの合成を示す。
【図７】
粗製リン酸ジエステルモノヌクレオチドまたはそれらの類縁体（ｐｏ １−ｍｅｒ）の接合反応混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図８】
粗製フォスフォチオエートモノヌクレオチドまたはそれらの類縁体（ｐｓ １−ｍｅｒ）の接合反応混合物のＨＰＬＣ分析を示す。
【図９】
５´−チオフォスフェート  ５−フルオロ−２´−デオキシウリジンの固体担体からの脱離および合成を示す。
【図１０】
５−フルオロ−２´−デオキシウリジン接合体（１８ｍｅｒ）の詳細な反応図式を示す。
【図１１】
５−フルオロ−２´−デオキシウリジン含有オリゴヌクレオチド（１８ｍｅｒ）の合成を示す。
【図１２】
フルオロデオキシウリジン接合体（１８ｍｅｒ）の構造を示す。
【図１３】
ロイコボリン接合体の構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004536027.tif 000239
2004536027.tif 000240
2004536027.tif 000241
2004536027.tif 000242