(57)【要約】Ｌ−グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）またはＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法を提供すること。ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸（ＤＬ−α−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：α−ＡＢＡ）に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）と、この微生物を発酵培地で３０℃にて１６時間活性化させた後、さらに７２時間振盪培養して消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使用するＬ−グルタミンの生産方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミンを生産し、アジ化ナトリウムに耐性を有するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）変異株ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）。
【請求項２】
Ｌ−グルタミンを生産し、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸（ＤＬ−α−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）に耐性を有するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）変異株 ＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）。
【請求項３】
請求項１による微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）変異株ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）または請求項２による微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）変異株 ＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）を活性化させた後、活性化された菌株を培養することを特徴とするＬ−グルタミン生産方法。
【発明の詳細な説明】
（発明の属する技術分野）
本発明は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を生産する微生物及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関し、特にブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸（ＤＬ−α−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：α−ＡＢＡ）に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）と、それを用いたＬ−グルタミン生産方法に関する。
【０００１】
（従来の技術）
Ｌ−グルタミンは、消化器疾患治療や肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使われるアミノ酸である。
【０００２】
従来、微細物によるＬ−グルタミンの生産方法としては、日本特公昭５３−１７６７５に記載のスルファグアニジン（Ｓｕｌｆａｇｕａｎｉｄｉｎｅ）耐性菌株から得る方法、日本特開昭５５−１４８０９４に記載のアザセリン（Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）などの耐性菌株から得る方法、日本特開平０４−０８８９９４に記載のペニシリン感受性菌株を用いた方法、日本特開平０２−１８６９９４に記載のチロシン−グルタミン酸（ｔｙｒ−ｇｌｕ）耐性株を用いる方法などがある。
【０００３】
（発明が解決しようとする課題）
本発明者等は、より生産性に優れたＬ−グルタミン生産菌を得るための研究中、呼吸抑制剤のアジ化ナトリウム、またはアミノ酸の一種であるイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）の類似体としてのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性を有した菌株がグルタミン生産性を高めるものと期待され、従来のグルタミン菌株であるブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＫＦＣＣ−１０６８０（韓国特許公告番号第９１−７８１８号）菌株を母菌株としてアジ化ナトリウムまたはＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性変異株を求めた結果、より高い収率でＬ−グルタミンを生成することを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
（課題を解決するための手段）
本発明は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を生産する微生物及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するもので、ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムに耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）及びＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸（ＤＬ−α−ａｍｉｎｏ−ｎ−ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：α−ＡＢＡ）に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産するブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）と、それを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するものである。
【０００５】
（発明の実施の形態）
以下、本発明の変異株を誘導する方法を説明する。
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＫＦＣＣ−１０６８０に一般的な変異処理方法、即ちＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ：ＮＴＧ）処理を行った後、５００ｍｇ／Ｌのアジ化ナトリウムまたは１５ｇ／ＬのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸が加えられた最小培地（註１）に塗抹して５００ｍｇ／Ｌのアジ化ナトリウム耐性株または１５ｇ／ＬのＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性株を得た。
【０００６】
変異株の誘導方法をより詳細に説明すると、次の通りである。
活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を、１２１℃で１５分間滅菌した種菌培地（註３）で１４時間程度培養した後、このうち５ｍｌを１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄し、次いでＮＴＧを最終濃度が２００ｍｇ／Ｌとなるように添加した後２０分間処理し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。ＮＴＧ処理された菌株を最小培地（註１）に塗抹して死滅率を求めた結果、死滅率は８５％であった。アジ化ナトリウム耐性変異株を求めるために、ＮＴＧ処理された菌株を、アジ化ナトリウムが最終濃度５００ｍｇ／Ｌとなるように加えられた最小培地（註１）に塗抹し、３０℃で６日間培養することにより、アジ化ナトリウム耐性変異株を得た。得られた耐性変異株をグルタミン生産培地（註４）で７２時間振盪用三角フラスコに培養して、母菌株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＫＦＣＣ−１０６８０よりグルタミンの収率が１０以上向上したアジ化ナトリウム耐性変異株を選別し、これをブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１と命名した。
【０００７】
本出願人は、前記微生物ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１を第３者に一般分譲できるように、韓国ソウル市西大門区弘濟洞所在の韓国微細物保存センターに２０００年１０月３日付に受託番号第ＫＣＣＭ−１０２２２号で寄託した。
【０００８】
また、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を求めるために、ＮＴＧ処理された菌株を、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸が最終濃度１５ｇ／Ｌとなるように加えられた最小培地（註１）に塗抹し、３０℃で６日間培養することにより、ＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を得た。得られた耐性変異株をグルタミン生産培地（註４）で７２時間振盪用三角フラスコに培養して、母菌株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＫＦＣＣ−１０６８０よりグルタミンの収率が１０％以上向上したＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株を選別し、これをブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２と命名した。
【０００９】
本出願人は、前記微生物ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２を第３者に一般分譲できるように、韓国ソウル市西大門区弘濟洞所在の韓国微細物保存センターに２０００年１０月３日付に受託番号第ＫＣＣＭ−１０２２３号で寄託した。
【００１０】
（註１）最小培地：
葡萄糖１．０％、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）０．４％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０．０４％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１％、尿素０．１％、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ、ＨＣｌ）０．０００１％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、寒天、ｐＨ７．０。
【００１１】
（註２）活性化培地：
牛肉エキス（Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔ）１％、ポリペプトン（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ）１％、食塩（ＮａＣｌ）０．５％、イースト抽出物（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）０．５％、寒天２％、ｐＨ７．２。
【００１２】
（註３）種菌培地：
葡萄糖５％、バクトペプトン（Ｂａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）１％、食塩（ＮａＣｌ）０．２５％、イースト抽出物１％、ビオチン３μｇ／Ｌ、尿素０．４％、ｐＨ７．０。
【００１３】
（註４）グルタミン生産培地：
葡萄糖４．０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）３．０％、大豆酸加水分解物（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄ Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）０．３％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０．０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．１５％、尿素０．３％、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ、ＨＣｌ）２ｍｇ／Ｌ、ビオチン５μｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８。
【００１４】
ＮＴＧを使用した突然変異誘導方法によってグルタミン生産性が向上したアジ化ナトリウム耐性変異株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１のアジ化ナトリウムに対する耐性は、次の通りである（表１）。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
ＮＴＧを使用した突然変異誘導方法によってグルタミン生産性が向上したＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸耐性変異株としてのブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２のＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に対する耐性は、次の通りである（表２）。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
本発明は下記実施例によってより具体的に例示されるが、これらの実施例は本発明の具現例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１９】
（実施例）
（実施例１）
使用菌株：
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１
醗酵培地：
葡萄糖４．０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）３．０％、大豆酸加水分解物０．３％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０．０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．１５％、尿素０．３％、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ、ＨＣｌ）２ｍｇ／Ｌ、ビオチン５μｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８（註４と同一）。
【００２０】
醗酵方法及び結果：
前記醗酵培地２０ｍｌを２５０ｍｌの振盪用三角フラスコに分株し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を接種（１ｌｏｏｐｆｕｌ）して３０℃で４８時間振盪培養した。
醗酵終了液の結果は表３に示す。
【００２１】
【表３】
2004513654.tif 000004
【００２２】
（実施例２）
使用菌株：
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１
醗酵培地：
葡萄糖１０％、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）４．５％、大豆酸加水分解物（Ｓｏｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）０．５％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）０．０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）０．１５％、尿素０．３％、チアミン（Ｔｈｉａｍｉｎｅ、ＨＣｌ）２ｍｇ／Ｌ、ビオチン５μｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ）１２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８。
【００２３】
醗酵方法及び結果：
前記醗酵培地２０ｍｌを２５０ｍｌの振盪用三角フラスコに分株し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃の活性化培地（註２）で１６時間培養して活性化させた菌株を接種（１ｌｏｏｐｆｕｌ）して３０℃で７２時間振盪培養した。醗酵終了液の結果は表４に示す。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
表４から分かるように、本発明のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２１は、既存のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＫＦＣＣ−１０６８０より１０％以上高い収率でＬ−グルタミンを生産した。
【００２６】
（実施例３）
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２を実施例１と同じ方法で培養した。醗酵培地の組成物も実施例１と同一である。
醗酵終了液の結果を表５に示す。
【００２７】
【表５】
2004513654.tif 000006
【００２８】
（実施例４）
使用菌株のブレビバクテリウムラクトフェルメンタムＣＪＪＡ２２を実施例２と同じ方法で培養した。醗酵培地の組成物も実施例２と同一である。
醗酵終了液の結果は表６に示す。
【００２９】
【表６】
2004513654.tif 000007
【００３０】
（発明の効果）
本発明はＬ−グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）またはＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）及びそれを用いたＬ−グルタミン生産方法に関するもので、ブレビバクテリウム属菌株の変異株であって、アジ化ナトリウムまたはＤＬ−α−アミノ−ｎ−酪酸に耐性を有し且つＬ−グルタミンを生産する微生物のブレビバクテリウムラクトフェルメンタム変異株 ＣＪＪＡ２１（ＫＣＣＭ−１０２２２）またはＣＪＪＡ２２（ＫＣＣＭ−１０２２３）及びこれらの微生物を醗酵培地で３０℃にて１６時間活性化させた後、さらに７２時間振盪培養してＬ−グルタミンを生産する方法に関するものである。このように生産されたＬ−グルタミンは、消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動選手用栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品及び健康食品などに使用することができる。
【国際公開パンフレット】
2004513654.tif 000008
2004513654.tif 000009
2004513654.tif 000010
2004513654.tif 000011
2004513654.tif 000012
2004513654.tif 000013
2004513654.tif 000014
2004513654.tif 000015
2004513654.tif 000016
2004513654.tif 000017
2004513654.tif 000018
【国際調査報告】
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2004513654.tif 000020