(57)【要約】生物学的試料を含んだガラス化溶液の小さな液滴を非常に冷たい固体表面に接触させることにより達成される、非常に速い冷却速度に基づく低温保存のための新たな方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料の低温保存方法であって、下記工程：
（ａ）低温保護平衡化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護するに十分な濃度以下の低温保護剤（複数も可）の濃度を有する低温保護平衡化媒体に生物学的材料を懸濁し；
（ｂ）平衡化された生物学的材料をガラス化溶液で濯ぎ、ガラス化溶媒体は、ガラス化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護を行うに十分な低温保護剤（複数も可）の濃度を有するものであり；次いで
（ｃ）ガラス化溶液で濯がれ、ガラス化溶液の微小液滴中にある生物学的材料を、すでに約−１５０℃ないし約−１８０℃まで冷却された良好な熱伝導率を有する固体表面上に滴下する
を含む方法。
【請求項２】
生物学的材料が細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
生物学的材料が卵母細胞である請求項１の方法。
【請求項４】
生物学的材料が胚である請求項１の方法。
【請求項５】
ガラス化溶液中に懸濁された生物学的材料を低温保存するための改良された方法であって、該改良が、生物学的材料を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面が良好な熱伝導率を有することを特徴とするものである方法。
【請求項６】
生物学的材料が細胞である請求項５の方法。
【請求項７】
生物学的材料が卵母細胞である請求項５の方法。
【請求項８】
生物学的材料が胚である請求項５の方法。
【請求項９】
ガラス化溶液中に懸濁された生物学的材料を低温保存するための改良された方法であって、該改良が、生物学的材料を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面が２０℃において約１０Ｗ／（ｍ−ｋ）よりも大きい熱伝導率を有することを特徴とするものである方法。
【請求項１０】
卵母細胞のガラス化方法であって、下記工程：
（ａ）低温保護平衡化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護するに十分な濃度以下の低温保護剤（複数も可）の濃度を有する低温保護平衡化媒体に卵母細胞を懸濁し；
（ｂ）平衡化された卵母細胞をガラス化溶液で濯ぎ、ガラス化溶媒体は、ガラス化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護を行うに十分な低温保護剤（複数も可）の濃度を有するものであり；次いで
（ｃ）ガラス化溶液で濯がれ、ガラス化溶液の微小液滴中にある卵母細胞を、すでに約−１５０℃ないし約−１８０℃まで冷却された良好な熱伝導率を有する固体表面上に滴下する
を含む方法。
【請求項１１】
ドナー細胞由来の核ＤＮＡを脱核された卵母細胞に移植するための改良された方法であって、該改良が、請求項１０の方法によりガラス化された卵母細胞由来の脱核された卵母細胞中にドナー細胞の核材料を導入する工程を含むものである方法。
【請求項１２】
請求項１０の方法によりガラス化された卵母細胞。
【請求項１３】
請求項１２の卵母細胞から発生した胚。
【請求項１４】
請求項１２の卵母細胞から発生した胎児。
【請求項１５】
請求項１２の卵母細胞から発生した動物。
【請求項１６】
請求項１３の胚から発生した細胞系。
【請求項１７】
請求項１４の胎児から発生した細胞系。
【請求項１８】
請求項１５の動物から発生した細胞系。
【請求項１９】
ガラス化溶液中に懸濁された卵母細胞を低温保存するための改良された方法であって、該改良が、卵母細胞を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面が２０℃において約１０Ｗ／（ｍ−ｋ）よりも大きい熱伝導率を有することを特徴とするものである方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法によりガラス化された卵母細胞。
【請求項２１】
請求項２０の卵母細胞から発生した胚。
【請求項２２】
請求項２０の卵母細胞から発生した胎児。
【請求項２３】
請求項２０の卵母細胞から発生した動物。
【請求項２４】
請求項２１の胚から発生した細胞系。
【請求項２５】
請求項２２の胎児から発生した細胞系。
【請求項２６】
請求項２３の動物から発生した細胞系。
【請求項２７】
ＫＳＯＭプラスＢＳＡ培養系において培養されたガラス化卵母細胞を単為生殖的に発生させるための改良された方法であって、該改良が卵丘細胞と同時培養することを特徴とするものである方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連技術
本願は、いずれも２０００年１月４日出願の米国仮出願第６０／１７４３８３号および第６０／１７４４２４号、ならびに２０００年１月３０日出願の米国仮出願第６０／２１５４３３号について優先権を主張しており、それらの開示を参照により本明細書に一体化させる。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
一般的には、本発明は、生物学的試料の低温保存に関する。より詳細には、本発明は，非常に冷たい固体表面上に溶液の小さな液滴を接触させることにより達成される非常に早い冷却速度に基づく、溶液中の生物学的試料の低温保存方法に関する。該低温保存方法は、卵母細胞および胚、特に哺乳動物の胚の低温保存において有用であることがわかった。
【０００３】
２．関連技術の背景
例えば、後ほど試料を特定の目的に使用したい場合など、生物学的試料を長期にわたり維持したい場合が頻繁にある。不幸なことに、当業者に認識されているように、生物学的試料の生物学的活性が有意に低下することがよくあるので、現在利用可能な方法を用いた生物学的試料の凍結、低温保存および融解は最適でないことが多い。ある種の生物学的方法の実際的な使用には、ある種の細胞を長期にわたり保存することが必要なので、かかる材料の生物学的機能性が温めた後も持続しているような、生物学的試料、特に細胞性材料の新たな保存方法に対する必要性が増大している。生物学的材料の保存に対する特別な必要性が、胚原形質、インビトロでの胚の製造および核移植において生じている。
【０００４】
多くの動物種の卵母細胞および胚を保存するための努力が多くなっている。これらの努力は、数が減少している動物種を保存する必要性、インビトロ生殖法により動物を繁殖させて遺伝学的多様性を増大させ、生殖の問題を克服する必要性、ならびに高い経済的ポテンシャルを有する動物をクローン化する必要性（これらに限らない）を包含する、多くの人間側の必要性から生じている。卵母細胞に対する興味が増大しており、現在の生物学的保存方では多くの動物種の卵母細胞を保存するには不十分であるという認識が増大している。例えば、ウシ卵母細胞は低温に対して非常に感受性がある。多くの研究グループの努力にもかかわらず（Ｐａｌａｓｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｄｖ． １４： １２７−１４９ （１９９６）によるレビュー参照）、ウシ卵母細胞の保存は困難な作業であり続けている。わずかに限られた数の刊行物には、低温保存された卵母細胞からの胚盤胞およびその後のウシの発生が報告されているが、結果は有効でないままである（Ｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９： ４８５ − ４９２ （１９９２）； Ｈａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３８： １０８５ − １０９０ （１９９２）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３８： ７１１ − ７１９ （１９９２）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４１： ３６１ − ３６６ （１９９５）； Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３： ５１５ − ５２４ （１９９６）； Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１ − ２８６ （１９９８）； Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３ −５８ （１９９８））。
【０００５】
低温保存剤の影響により生殖プロセスが悪影響を受けることが報告されている。多くの報告は、現在利用可能な低温保存剤は高濃度において卵母細胞に対して毒性を有し、卵母細胞および胚のその後の発生に負の影響を及ぼすと述べている（例えば、Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｒ． ４５： ５０３ − ５１２ （１９９６）； Ｐａｌａｓｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ １４： １２７ − １４９ （１９９６）； Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ５９ − ７３ （１９９２）； Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４２： ９０９ − ９１５ （１９９４）； Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １５：１２ − １８ （１９９７）参照）。低温保存の冷却に関連した卵母細胞の毒性についての報告もある（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ５９−７３ （１９９２））。例えば、低温への曝露は減衰分裂の紡錘体の脱ポリマー化を引き起こすことが知られている（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ５９−７３ （１９９２）； Ｐｅｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： ２１１ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．））。凍結／融解された成熟卵母細胞を用いた以前の実験は、新鮮卵母細胞と比較した場合、除核率の有意な低下を示した（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１−２８６ （１９９８））。
【０００６】
現在の努力は低温保存方を改良することによる保存卵母細胞の生存率の向上に集中している。Ｍａｒｔｉｎｏら（Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５４： １０５９ − １０６９ （１９９６））によれば、かかる努力は、異なる低温保存剤の比較（Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４０： ８０１−８０７ （１９９３）； Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ５６９ − ５７０ （１９９４））および異なる凍結方法の比較（Ｌｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３５： １２２５ − １２３５ （１９９１））あるいは関連したガラス化方法（Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４０： ８０１ − ８０７ （１９９３）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７： ７７ − ８５ （１９９８））に向けられている。
【０００７】
「低温保存」は、水の凝固点以下での生物学的材料の保存を意味し、それにより材料は分解しない。「ガラス化」は、低温保存剤（水を凍結から保護する化学物質）を用いて冷却プロセスにおける氷の形成を抑制しつつ、生物学的材料をセ氏約−１００℃またはそれ以下にまで冷却する方法を意味し、その結果、生物学的材料を含有している溶液がそのガラス転移点に到達し、すなわち、分子が互いに対して運動するのを停止する。氷の形成は、材料を残存未凍結溶液の収縮しつつあるポケット中に押し込むので、生物学的材料にダメージを与えることが当該分野において認識されている。冷却を継続すると、組織体積の８０％以上が氷に変化する可能性があり、細胞が破壊されて回復しなくなる。ガラス化の途中では、凍結が進んでも液体の水分子はその本来のランダムな配列を維持する。他の化学物質または細胞成分の妨害はない。うまいガラス化法は過冷却、すなわち、低温保護溶液の凝固点以下での凍結することのない冷却を利用するものである。典型的には、低温保護剤は高濃度では細胞に対して毒性がある。迅速凍結は、氷晶形成に対する保護に必要な低温保護剤の濃度を低下させることにより奏効すると考えられており、そのことにより低温保護剤の無毒な濃度において組織が保存される。
【０００８】
ガラス化法の１の障害は、現在のガラス化スキームにおける卵母細胞の「不十分な」冷却速度であると考えられている（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １５： １２−１８ （１９９７））。この問題を克服するために、非常に少量の溶液を使用するいくつかの方法が提案されている。
【０００９】
いわゆる「最小液滴ガラス化（ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｒｏｐ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」システムは、ウシおよびブタの卵母細胞の低温保存の結果についてはブレイクスルーを可能にしている（例えば、Ａｒａｖ Ａ．， Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｓ，　Ｉｎ： Ｌａｕｒｉａ Ａ， Ｇａｎｄｏｌｆｉ Ｆ （ｅｄｓ．）， Ｎｅｗ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ： Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ， ２５５ − ２６４ （１９９２）参照）。「最小液滴ガラス化」において、迅速に冷却される特別な低温台上に少量の溶液が置かれる。不幸なことに、この方法は、大量の卵母細胞の保存に都合が良いとは当該分野において認識されていない。
【００１０】
他のガラス化法が報告されている。ガラス製毛細管中（Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ５６９−５７０ （１９９４））あるいはオープン・プルド・プラスチック製ストロー（ｏｐｅｎ ｐｕｌｌｅｄ ｐｌａｓｔｉｃ ｓｔｒａｗｓ）中（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３−５８ （１９９８））に導入される数マイクロリットルのガラス化溶液を用い、次いで、液体Ｎ２中に迅速に投入する方法は、ウシ卵母細胞のガラス化に関しては試験が成功した。同様に、ガラス化法の成功は、卵母細胞含有ガラス化溶液を小さなループに投入することにより達成された（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １６７ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．））。しかしながら、かかる方法は効率が高いとは認識されていない。なぜなら、おそらく、温かい対象物を液体Ｎ２に投入することは、液体の沸騰を生じさせ、短時間のうちに対象物周囲にＮ２気体の隔離層が形成されるからであろう。
【００１１】
有効なガラス化を妨げる気体隔離層発生の可能性を低下させるために、卵母細胞含有ガラス化溶液を液体Ｎ２中に直接滴下することが提案された。かかる方法は、おそらく、気体の隔離効果が除去されたことにより、従来のガラス化法よりも有効であると報告されている（Ｒｉｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｚｉｖｏｃ． Ｖｉｒ． ３６： １１３−１２０ （１９９１）； Ｐａｐｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １７３ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．）； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １７８ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．））。しかしながら、かかる方法はガラス化された卵母細胞の回復という問題がある。
【００１２】
いくつかのグループが、液体Ｎ２により冷却された金属表面を用いることによる生物学的材料の低温保存の改善された成功を報告している。かかる金属表面はより有効な熱伝導を提供し、最小液滴ガラス化に用いられた低温台よりも冷却速度がさらに増大するといわれている。低温金属表面上の金属格子中に置くことにより、ショウジョウバエの胚がうまく保存された（Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４５： １７０−１７２ （１９９０））。やはり、冷却された金属表面を用いる、現在利用可能な方法は大量の卵母細胞の保存に便利であるとは認識されていない。
【００１３】
現在、保存された卵母細胞の生存率に限界があり、使用される方法が煩雑である結果として、ウシにおけるインビトロでの胚の製造および核移植実験は新たに収集された卵母細胞に依存している。このことは多くの研究チームに対する大きな限定要因であり、実験の効率的計画および組織化に対する障害をもたらしている。
【００１４】
それゆえ、生物学的材料の改良された保存方法、特に、卵母細胞および他の壊れやすい細胞の保存に有用な方法に対する必要性がある。方法は、生物学的材料の無菌的取り扱いを可能にし、長期にわたり生物学的活性および生存可能性を保存するものでなくてはならない。
【００１５】
発明の概要
本発明は、生物学的材料、特に、卵母細胞、胚、および他の細胞性材料を低温保存するための新規方法を提供する。ガラス化溶液を含む液体の非常に小さな液滴中に材料を含ませ、次いで、生物学的材料を含有するガラス化液体を、良好な熱伝導度を有する非常に冷たい表面に接触させることにより生物学的材料の低温保存を行いうることが、本発明者らにより見出された。これらの要素すべてが一緒になって非常に高い冷却速度を生じさせる。
【００１６】
ここに記載された発明は、上記先行技術における問題である卵母細胞の保存に関して非常に良好な結果を提供する。卵母細胞の改善された保存は、卵母細胞の生存率を向上させ、かつ核移植胚の発生を支持するための改善された能力を提供する。この改良のレベルは明らかに予期できないものであり、初期の報告（例えば、Ｐｅｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： ２１１ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．））と比較して約１０倍の効率増加を示す。
【００１７】
「固体表面ガラス化」または「ＳＳＶ」法と称される本発明の方法は、微小液滴法における容器を用いないガラス化の利点と、上記の冷金属表面法の増大した熱交換とを一緒にしたものである。さらにそのうえ、きれいな金属表面は液滴の無菌的取り扱いを容易にする。
【００１８】
本発明の固体表面ガラス化法を用いて、脊椎動物および無脊椎動物種ならびに植物に由来する細胞および組織等（これらに限らない）の種々の生きた細胞および組織を低温保存することができる。好ましくは、生物学的材料の生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、溶液中の低温保護剤の濃度がガラス化プロセスを可能にするものである場合には、本発明方法を当業者に知られた種々の低温保護剤溶液の組み合わせとともに用いることができる。
【００１９】
本発明の１の具体例において、下記工程：（１）低温保護平衡化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護するに十分な濃度以下の低温保護剤（複数も可）の濃度を有する低温保護平衡化媒体に生物学的材料を懸濁し；（２）平衡化された生物学的材料をガラス化溶液で濯ぎ、ガラス化溶媒体は、ガラス化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護を行うに十分な低温保護剤（複数も可）の濃度を有するものであり；次いで（３）ガラス化溶液で濯がれ、ガラス化溶液の微小液滴中にある生物学的材料を、すでに約−１５０℃ないし約−１８０℃まで冷却された良好な熱伝導率を有する固体表面上に滴下することを含む、生物学的材料のガラス化方法を提供する。２０℃における好ましい熱伝導率は＞約１０Ｗ／（ｍ−ｋ）、より好ましくは＞約２５Ｗ／（ｍ−ｋ）、さらに好ましくは＞約４０Ｗ／（ｍ−ｋ）、さらにより好ましくは＞約５５Ｗ／（ｍ−ｋ）である。「微小液滴」は１０μｌまたはそれ以下の溶液を含む液滴を意味する。好ましい微小液滴体積は４μｌまたはそれ以下の溶液、より好ましくは３μｌまたはそれ以下の溶液、さらにより好ましくは１μｌまたはそれ以下の溶液である。
【００２０】
本発明のもう１つの具体例において、ガラス化溶液中に懸濁された生物学的材料を低温保存するための改良された方法が提供され、改良は、生物学的材料を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面は良好な熱伝導率を有することを特徴とする。本発明のもう１つの具体例において、ガラス化溶液中に懸濁された生物学的材料を低温保存するための改良された方法が提供され、改良は、生物学的材料を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面は２０℃における熱伝導率＞約１０Ｗ／（ｍ−ｋ）を有することを特徴とする。
【００２１】
ガラス化した液滴を、糖類または他の浸透圧活性剤の存在下または不存在下において温かい（約３９℃）緩衝溶液（０．３Ｍトレハロース溶液）中に数分間（約３分）直接置くことにより、生物学的活性に対する有意な有害効果なしに本発明のガラス化法により低温保存された試料を温めることができる。
【００２２】
詳細には、本発明は、卵母細胞利用可能性の変動および季節的な品質の変化による障害を補填するために、研究者により使用されうる。さらにそのうえ、かかる卵母細胞のうまい低温保存により、存亡の危機に瀕した動物の保存および家畜の繁殖が容易化されうる。本発明は、少なくとも下記の態様において現存する手法を改良するものである：（１）本発明は、大部分の現存手法に使用されている容器の壁の隔離効果を除去する；（２）固体表面との直接接触により、液体低温気体、例えばＮ２中に投入された試料周囲の低温気体の隔離効果が除去され、より良好な熱伝導が提供され、その結果、より効率的なガラス化が提供される。卵母細胞の保存における本発明の効率は他の公表されたいずれの方法よりも高く、実行する場合に安価であると考えられる。
【００２３】
好ましい具体例において、ガラス化／融解された卵母細胞を体細胞核移植のためのレシピエントとしてうまく用いて高度な胚盤胞の発生を行わせることができる。この知見は核移植の研究および実用に重要な意味を持つ。
【００２４】
以前、Ｌｉｍらは凍結‐融解された成熟ウシ卵母細胞のＩＶＦ後の胚盤胞段階の胚を得た（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３５： １２２５−１２３５ （１９９１））。その後、いくつかのチームがウシ卵母細胞の低温保存の可能性について調べた。しかしながら、卵母細胞の生存およびその後の胚盤胞の発生は０ないし１０％の低い範囲のままであった（Ｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９： ４８５−４９２ （１９９２）； Ｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９： ４８５ − ４９２ （１９９２）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３８： ７１１ −７１９ （１９９２）；　Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４１： ３６１ − ３６６ （１９９５）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４０： ８０１ −８０７ （１９９３）；　Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ５６９ − ５７０ （１９９４）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７： ７７ − ８５ （１９９８）；　Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ３５１ − ３６１ （１９９２）； Ｓｃｈｅｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ４２： ９０９ − ９１５ （１９９４））。いくつかの限定された研究（Ｈａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３８： １０８５ − １０９０ （１９９２）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３８： ７１１ − ７１９ （１９９２）； Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３： ５１５ −５２４ （１９９６）； Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１ − ２８６ （１９９８）； Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３ − ５８ （１９９８））は凍結−融解されたウシ卵母細胞に由来する胚の移植後に妊娠および生誕を起こさせた。勇気付けられることに、最近のガラス化法の発達は成功率を上昇させ、ガラス化された成熟ウシ卵母細胞のＩＶＦ由来の胚盤胞について、２５％にまで（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３−５８ （１９９８））および３０％にまで（Ｐａｐｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １７３ （１９９９）（ａｂｓｔｒ．））であると報告されている。これらの改善された成功率は、卵母細胞ガラス化中の冷却速度の上昇によると考えられている（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １５： １２−１８ （１９９７））。しかしながら、本発明の方法によれば、低温保存後の形態学的に無傷な卵母細胞の割合は８６％と高く、以前の結果をはるかに凌ぐものであった。
【００２５】
本発明の好ましい具体例において、ガラス化溶液中に懸濁された卵母細胞を低温保存するための改良された方法が提供され、改良は、卵母細胞を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面は良好な熱伝導率を有することを特徴とする。本発明のもう１つの具体例において、ガラス化溶液中に懸濁された卵母細胞を低温保存するための改良された方法が提供され、改良は、卵母細胞を含むガラス化溶液の微小液滴を、約−１５０℃ないし約−１８０℃の温度を有する固体表面と接触させ、該表面は２０℃において約１０Ｗ／（ｍ−ｋ）よりも大きい熱伝導率を有することを特徴とする。
【００２６】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、下記工程：（１）低温保護平衡化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護するに十分な濃度以下の低温保護剤（複数も可）の濃度を有する低温保護平衡化媒体に卵母細胞を懸濁し；（２）平衡化された卵母細胞をガラス化溶液で濯ぎ、ガラス化溶媒体は、ガラス化媒体のガラス転移温度まで氷の形成に対して保護を行うに十分な低温保護剤（複数も可）の濃度を有するものであり；次いで（３）ガラス化溶液で濯がれ、ガラス化溶液の微小液滴中にある卵母細胞を、すでに約−１５０℃ないし約−１８０℃まで冷却された良好な熱伝導率を有する固体表面上に滴下することを含む、卵母細胞のガラス化方法を提供する。ガラス化に使用される卵母細胞は、低温保存溶液中に卵母細胞を置く前に、それらの卵丘細胞から部分的に（３〜５層の内層を除く）あるいは完全に剥ぎ取られたものであってもよい。当業者は、必要に応じて融解されたガラス化卵母細胞を核移植クローニング法に使用することができる。
【００２７】
本発明のもう１つの具体例において、胚盤胞の発生速度を増加させる方法が提供される。限定的なＫＳＯＭプラスＢＳＡ培養系において、卵丘細胞との同時培養によりガラス化卵母細胞の単為生殖的発生が有意に改善されうることが、本発明者らにより見出された。かかる方法を用いた単為生殖的発生が胚盤胞の発生を３２％まで増大させることが、本発明者らにより見出された。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的試料、特に、細胞性材料を低温保存するための新たな方法を開示し、該方法によれば、材料の生物学的機能性が温めた後も保存される。特に、本発明は、卵母細胞および胚をガラス化および融解する方法を開示する。すでにガラス化された卵母細胞中への体細胞核移植のための方法がさらに開示される。
【００２９】
本発明による哺乳動物卵母細胞の低温保存は、核移植およびインビトロでの胚の製造のための安定したソースを提供する。単為生殖的活性化の研究および実施、インビトロでの生殖および核移植のための、ウシ卵母細胞を低温保存するための有効なガラス化プロトコルが本発明により提供される。
【００３０】
本発明の好ましい具体例において、インビトロで成熟したウシ卵母細胞を、ＴＣＭ１９９プラス２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中４％エチレングリコール（ＥＧ）中に、３９℃で１２〜１５分間置き、ついで、ガラス化溶液（ＴＣＭ１９９および２０％ ＦＢＳ中３５％ ＥＧ，５％ポリビニル−ピロリドン（ＰＶＰ），０．４Ｍトレハロース）に移した。前もって冷却された（−１５０℃）金属表面上で液滴中の卵母細胞をガラス化させた（固体表面ガラス化またはＳＳＶ）。ガラス化した微小液滴を液体Ｎ２中に保存し、即座に融解、あるいは保存後２〜３週間またはそれ以後必要なときに融解した。
【００３１】
本発明によりガラス化／融解された卵母細胞の直接の生存率は、ＢＳＡまたはＦＢＳを含有するＫＳＯＭ中で９ないし１０日間培養されて処理された卵母細胞に関して７７％ないし８６％の間であることが、本発明者らにより見出された。核移植に関しては、ガラス化卵母細胞は、新鮮卵母細胞と同等に胚の発生を支持したことが注目された。
【００３２】
いかなる理論にも限定するのでなく、本発明者らは、ウシ卵母細胞のガラス化後の比較的高い凍結−生存率、および胚の発生がいくつかの因子によるものである可能性を明らかにした。同様に、使用される固体金属表面ガラス化法は、金属表面との直接接触により、微小液滴と改善された熱交換との組み合わせによる高い冷却速度を達成する。卵母細胞を温めることは、ガラス化した試料を温かい溶液中に直接滴下する場合と同等の迅速さである。
【００３３】
高い成功率はいくつかのプロセス上の修飾によるものであるかもしれず、それらのいくつかは他者により報告された最近の開発に基づいて行われた（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３ − ５８ （１９９８）； Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５４： １０５９ − １０６９ （１９９６）； Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ５６９ − ５７０ （１９９４）； Ｏｔｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７： ７７ − ８５ （１９９８）； Ｐａｐｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １７３ （１９９９） （ａｂｓｔｒ．）； Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔ． ８： ３５６ − ３６１ （１９８８））。特に、本発明は、生理学的温度またはそれに近い温度の溶液中の卵母細胞を取り扱い、その後、ガラス化温度まで急速に冷却し、ガラス化温度から温めて、冷却によりダメージを「回避」するものであった。
【００３４】
ウシ卵母細胞は冷却に対して非常に感受性があることが知られており（Ａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５０： １０３ − １１０ （１９９４）； Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４５： ５０３ − ５１２ （１９９６）； Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ５９ − ７３ （１９９２））；未成熟卵母細胞（ＧＶ段階）は成熟卵母細胞よりも感受性が高いことが報告されている（Ｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９： ４８５ − ４９２ （１９９２）； Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ３５１ − ３６１ （１９９２））。ＰａｒｋｓおよびＲｕｆｆｉｎｇ（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７； ５９ − ７３ （１９９９））ならびにＡｍａｎおよびＰａｒｋｓ（Ａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５０： １０３ − １１０ （１９９４））は、わずか１分で２５℃と４℃との間の冷却後の中期ＩＩ紡錘体のダメージについて報告している。本明細書に記載のごときガラス化法は、凍結法と比べて、卵母細胞がクリティカルな冷却温度にさらされる時間を短くすることができ、かくして、慣用的な卵母細胞およびインビトロで製造された胚の凍結法（Ｐａｌａｓｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｄｖ． １４： １２７ − １４９ （１９９６）； Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５４： １０５９ − １０６９ （１９９６）； Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １５： １２ − １８ （１９９７））よりも優れている可能性がある。
【００３５】
本発明の好ましい具体例において、ウシ卵母細胞または胚の低温保存が下記のごとく行われる：
卵母細胞または胚を、２０％ウシ胎児血清、またはウシ血清アルブミン、または界面活性剤効果を有する他の高分子を補足した基本培地（ＴＣＭ１９９または類似の溶液）中の４％（ｖ／ｖ）エチレングリコールまたは中程度の濃度の他の細胞内低温保護剤からなる平衡化媒体中に、室温またはそれより高い温度、あるいは生理学的温度（例えば３９℃）で数分間懸濁する。この平衡化期間後、卵母細胞または胚の群を、基本培地および２０％ウシ胎児血清または上記の他の界面活性剤化合物中の３５％エチレングリコール（または高濃度の他の細胞内低温保護剤）、５％ポリビニルピロリドン（または他の高分子物質）、０．４Ｍトレハロース（または他の糖類）からなるガラス化溶液の小さな液滴中で少なくとも２回、数秒間濯ぎ、次いで、液体または固体窒素中あるいは他の冷却剤中に部分的に浸漬することにより約−１５０℃ないし−１８０℃または類似の零下温度に冷却されているスチール製キューブ表面上または良好な熱伝導率を有する他の固体表面上に滴下する。液滴サイズは約４μｌまたはそれ以下が好ましく、より好ましくは３μｌまたはそれ以下、さらに好ましくは２μｌまたはそれ以下、さらにより好ましくは１μｌまたはそれ以下であり、そのことにより即座にガラス化が可能となる。窒素で冷却したかん子または他の道具を用いてガラス化した液滴を１ｍｌの凍結バイアルまたは他の適当な容器中に移動させることができる。
【００３６】
図１は、本開示を用いて低温保存するのに有用な固体表面ガラス化デバイス（１０）の断面図を示す。金属キューブ（１５）はアルミニウム箔のごとき箔（２０）で被覆されており、容器（３０）により保持されて部分的に液体Ｎ２（２５）中に浸されている。卵母細胞のごとき生物学的試料を含むガラス化溶液の微小液滴（３５）が金属キューブ（１５）の冷却された上面（４０）に滴下され、即座にガラス化される。
【００３７】
本発明者らは、ガラス化前における卵母細胞を囲む少量の卵丘細胞層の存在は、単為生殖的活性化後の分割および発生速度に有害な影響を及ぼさないことを見出している。卵丘細胞の存在は、ＩＶＦ後の高い受精率を達成するための重要因子でありうるが、核移植実験では除核前に卵丘細胞を除去することが必要である。ガラス化／融解された卵母細胞はより壊れやすいように思われ、核移植操作前の卵丘細胞除去に関して注意を払わなくてはならない。
【００３８】
ガラス化卵母細胞の単為生殖的活性化は対照と比べて減じられるかもしれないが、培養条件を変化させることにより単為生殖的活性化を有意に改善することができる。例えば、ＫＳＯＭプラスＦＢＳ培地中での卵丘細胞との同時培養を用いることにより、ガラス化卵母細胞の単為生殖的発生がさらに促進された。
【００３９】
窒素容器の気相中での保存中、あるいは保存前後の取り扱い中に温度の変動が起こった場合には、インビトロで受精した卵母細胞の発生もまたガラス化により減じられるかもしれない。液相保存を用いてかかる影響を減じてもよい。減じられた発生能は障害を受けた受精によるものではないことが研究により示唆されている（ウシを用いた研究であるＭａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３７： ５９−７３ （１９９２）およびＫｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１−２８６ （１９９８）参照、さらに凍結はマウスにおいて多精子受精に対する帯状ブロックの失敗を引き起こすようであったというＩｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５４： ８１−８５ （１９９９）参照）。
【００４０】
通常には、核移植実験にはインビボまたはインビトロで成熟した卵母細胞由来のレシピエント細胞質体が用いられる。以前、本発明者らは、凍結−融解された卵母細胞を、分割球を用いる核移植に使用することができ、この方法によりウシが得られたことを示した（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１−２８６ （１９９８））。ウシ卵母細胞に関する本発明の低温保存法は、核移植の研究および実施に有意な利益をもたらす。なぜなら、本発明の方法は、季節的な変動ならびに屠殺および卵母細胞輸送のタイミングへの依存をなくすからである。
【００４１】
今回開示した方法に従えば、大多数の卵母細胞（９４％）が当該ガラス化法で生き残るであろうし（対照と相違ない生存率）、その生存率は初期の凍結実験で達成された生存率（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５４： ８１−８５ （１９９９）（６２％）およびＫｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１−２８６ （１９９８）（７４％））よりもずっと高い。生き残った卵母細胞は核移植法に有効に使用でき、ガラス化−融解卵母細胞に関して除核率の低下はない。臨界温度ゾーンに曝露する時間を短縮することにより、ガラス化は有益であると仮定されている。なぜなら、卵母細胞を即座に冷却してガラス化状態にすることは紡錘体脱ポリマー化の時間を与えないからである（Ｖａｊｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ５３−５８ （１９９８）； Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ５４： １０５９−１０６９ （１９９６））。
【００４２】
本発明は、新鮮対照で見られる割合に匹敵する高い融合、分割および胚盤胞発生の割合をもたらす。本発明者らの知識に対して、本発明は、体細胞核ドナーのためのレシピエントとしての低温保存された卵母細胞の使用をはじめて示唆するものであり、胚盤胞発生速度が大きいことが約束されている。卵母細胞のオープン−プルドストローガラス化（ｏｐｅｎ−ｐｕｌｌｅｄ ｓｔｒａｗ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行うための初期の試みならびに分割球核移植実験は、新鮮レシピエント細胞質体と比較して、胚盤胞発生速度の有意な低下を生じさせた（それぞれ３４．５％、９．１％）（Ｐｅｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： ２１１（ａｂｓｔｒａｃｔ）（１９９９））。
【００４３】
簡単に説明すると、本発明の低温保存法は、融解後の生存率を高め、活性化後に高い分割率を示すように卵母細胞を保存することができる。そのような卵母細胞は、単為生殖的活性化、インビトロ受精、次いで核移植された後、発生して形態学的に良好な品質の胚盤胞となる。ガラス化−融解されたＭＩＩ卵母細胞を用いて体細胞核移植された胚について、新鮮卵母細胞を核レシピエントとした場合と比較して同様の発生速度が観察される。得られた核移植された胚を用いて子孫を得てもよい。
【００４４】
より明確に本発明を説明するために、使用した一般的材料および方法とともに実施例を以下に示す。下記実施例は限定的なものではなく、本発明の種々の態様および特徴の単なる典型例にすぎない。
【００４５】
典型的な実施例
材料および方法
１．卵母細胞のソース
屠殺場の卵巣からウシ卵巣を集め、成熟媒体中約３７℃ないし３９℃で１９時間以内に成熟が開始した。形態に基づいて成熟した卵丘卵母細胞を選択した。次いで、成熟後２０〜２３時間後にそれらを低温保存して、核移植、単為生殖的活性化、次いでインビトロ受精アッセイ用とした。
【００４６】
２．ガラス化および融解
０．１％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｈ３５０６）に短時間曝露し、次いでピペッティングすることにより成熟卵母細胞を部分的（３〜５層の内層を除く）または完全にその卵丘細胞から剥した。２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ， Ｇｉｂｃｏ， Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｃａｔ Ｎｏ． ０１１９９−４１）を補足したＥａｇｌｅ塩含有ＴＣＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ０４１ ０１１５０Ｈ）で卵母細胞を３回洗浄し、次いで、２０％ ＦＢＳ補足ＴＣＭ１９９中４％（ｖ／ｖ）エチレングリコール（ＥＧ， Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｅ９１２９）からなる平衡化媒体中に、３９℃で１２〜１５分懸濁した。平衡化後、ＴＣＭ１９９および２０％ ＦＢＳ中３５％ ＥＧ、５％ポリビニル−ピロリドン（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｐ０９３０）、０．４Ｍトレハロース（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｔ０１６７）からなるガラス化溶液の小さな液滴中で５ないし１０個の卵母細胞の群を２５〜３０秒間、３回濯ぎ、次いで、トレハロース溶液中に置き（溶液毒性対照）、あるいはアルミニウム箔で覆われ、液体Ｎ２中に部分的に浸すことにより約−１５０℃ないし−１８０℃にまで冷却されたスチール製キューブ上に滴下した。
【００４７】
金属表面上に置かれた液滴のサイズは１ないし２μｌであり、即座にガラス化された。窒素で冷却したかん子を用いてガラス化液滴を１ｍｌの凍結バイアル中に移して長期（２〜３週間）保存用とし、あるいは即座にそれらを３９℃の０．３Ｍトレハロース溶液に滴下し３分間おいた。その後、卵母細胞膜および透明帯の完全性に基づいて卵母細胞生存率を評価した。生き残ったガラス化‐融解された卵母細胞を活性化、インビトロ受精、または核移植実験に供した。
【００４８】
３．卵母細胞の単為生殖的活性化
Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈら（Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６６： ７２９−７３９ （１９９４））により記載された方法を修飾し、単為生殖的活性化に使用した。合計２２時間（融解後のＭＩＩ卵母細胞の場合はさらに３０分）インビトロ成熟培養（ＩＶＭ）した後、ピペッティングにより卵母細胞を完全に卵丘から剥ぎ取った。室温で５分間Ｃａ−イオノフォアＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ７５２２）に曝露し、次いで、２．５ｍＭの６−ジメチルアミノプリン（ＤＭＡＰ， Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｄ２６２９）中で３．５時間培養することにより卵母細胞を活性化させた（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９： ２９８−３０７ （１９９８））。洗浄後、処理された卵母細胞をＫＳＯＭ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９： ２９８−３０７ （１９９８））プラス０．１％ ＢＳＡ（フラクションＶ，Ｓｉｇｍａ， Ａ９４１Ｂ）中でさらに４８時間培養した。培養環境は，３９℃において加湿空気中５％ ＣＯ２、あるいは５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、および９０％ Ｎ２からなっていた。形態学的生存率ならびに分割率を記録した。すべての分割胚を１％ ＢＳＡ補足ＫＳＯＭ培地中でさらに７日間培養した。
【００４９】
４．インビトロ受精および培養
ガラス化‐融解された卵母細胞およびガラス化されていない新鮮対照卵母細胞を、１回射精により得られ、凍結‐融解されたウシ精液で受精させた。凍結‐融解された精子を、１０ｍＭカフェインおよび４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補足したＢｒａｃｋｅｔｔ−Ｏｌｉｐｈａｎｔ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４９： ２９８−３０７ （１９９８））培地中で遠心分離することにより２回洗浄し、次いで、受精媒体（１０μｇ／ｍｌのヘパリンおよび４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補足したｍ−ＢＯ媒体）中に再懸濁した。精子濃度を１ｘ１０７個／ｍｌに調節し、次いで、１００μｌの受精媒体液滴に約２５個の卵母細胞を添加した。精子−卵母細胞インキュベーションを６時間行った後、卵母細胞を洗浄し、加湿空気中５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、および９０％ Ｎ２雰囲気下で、０．１％ ＢＳＡを補足したＫＳＯＭ培地中、３９℃で４８時間培養した。４８時間培養後、ピペッティングによりＩＶＦ卵から卵丘細胞を除去し、分割率を記録した。５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、および９０％ Ｎ２雰囲気下で、１％ ＢＳＡ補足ＫＳＯＭ中で分割胚をさらに７日間培養した。培養期間中２日ごとに培地を交換した。
【００５０】
５．核移植
ＩＶＭで２０時間後、ガラス化‐融解された中期ＩＩの卵母細胞ならびに新鮮対照卵母細胞を卵丘細胞から剥し、第一極体の存在により選択した。透明帯にガラス針を刺し、極体および周囲の細胞質体を押し出すことにより脱核を行った（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ５１： ２８１−２８６ （１９９８））。押し出された核体をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で蛍光染色することにより脱核の成功を確認した。その後、４ないし６日間血清枯渇させた２９〜３１代目の集密線維芽細胞を個々に脱核卵母細胞の囲卵空間（細胞質体）中に移植した。その後、ガラス化−融解された卵母細胞由来の細胞質体−線維芽細胞複合体を、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ細胞融合媒体（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｂｉｏｌ． ６７： １６５−１８２ （１９８２））中に置かれた１ｍｍギャップの電気融合チャンバー中でＢＴＸ２００ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）により２回ＤＣパルス（５０Ｖ／ｍｍ， １０μｓｅｃ， １秒間隔）をかけることにより融合させ、活性化させた（新鮮対照卵母細胞由来の細胞質体−線維芽細胞複合体を用いて同様に行った）。それらの細胞を、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ６２５５）および２．５μｇ／ｍｌサイトカラシン−Ｄ（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｃ８２７３）および０．１％ ＢＳＡを補足したＫＳＯＭ培地中で１時間培養し、さらにシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）およびＢＳＡを含有する（サイトカラシン−Ｄ不含）ＫＳＯＭ培地中で４時間培養した。活性化後、５％ Ｏ２、５％ ＣＯ２、および９０％ Ｎ２雰囲気下にてＫＳＯＭおよび０．１％ ＢＳＡ培地中で胚をさらに４８時間培養した。その後、分割胚を選択し、空気中５％ ＣＯ２雰囲気下、５％ ＦＢＳを補足したＫＳＯＭ中、卵丘細胞単層上でさらに７日間培養した。培養期間中２日ごとに培地を交換した。未分割卵を染色して未融合細胞質体−線維芽細胞複合体の割合をチェックした。形態学的に高品質の核移植胚盤胞をＶＳ３ａ法（Ｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． １０１： ６８１−６８８ （１９９４）； Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｒ． ５３： ３１８−３２４ （１９９９））を用いてガラス化させ、将来の胚移植目的のために保存した。卵母細胞低温保存法の対照として、核移植実験に使用される、ガラス化−融解群からのいくつかの卵母細胞をすでに記載したようにして活性化させ（Ｃａ−イオノフォアおよびＤＭＡＰ）、核移植胚と同様に培養した。
【００５１】
６．統計
すべての実験を少なくとも３回繰り返した。卵母細胞の発生を評価し、カイ−スクエア分析を用いて処理を比較した。
【００５２】
実験例１
ガラス化卵母細胞の単為生殖的発生
プロトコル：成熟卵母細胞をガラス化‐融解させ、上記のごとく単為生殖的に活性化させた。冷却しない場合のガラス化溶液の毒性を試験し、低温保存前に卵丘細胞が存在する場合、除去した場合の影響を比較した。さらに、酸素高含量（２０％）および低含量（５％）雰囲気における活性化卵母細胞の培養を、２つの別個の試行において試験した。
【００５３】
結果：単為生殖的活性化実験の結果を表１および表２に示す。表１は卵丘細胞の存在下および不存在下でガラス化され、空気中５％ ＣＯ２雰囲気下で培養された成熟卵母細胞の単為生殖的発生の結果を示す。
【００５４】
【表１】
2004508004.tif 000002
【００５５】
表２は、同様の処理を行ったが、Ｏ２含量を減じた（５％）雰囲気下で胚を培養した場合の発生のデータをまとめる。卵母細胞の直接の生存率（すなわち、培養期間開始から融解後に至るまで溶解がないこと）は７７％ないし８６％であったが、ガラス化前の卵丘の有無により相違はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００５６】
【表２】
2004508004.tif 000003
【００５７】
遡及的に比較した場合、Ｏ２含量の低い雰囲気での培養は、高いＯ２レベル（２０％）での処理よりも優れた（Ｐ＜０．０５）胚盤胞発生を引き起こした。高いＯ２レベルでの実験において、活性化された未凍結対照の分割率は、ガラス化／融解された群のそれよりも有意に大きかったが（Ｐ＜０．０５）、胚盤胞の発生には相違がなかった（Ｐ＞０．０５）。減じられたＯ２での実験において、ガラス化卵母細胞の分割および胚盤胞発生は対照のそれよりも劣っていたが（Ｐ＜０．０５）、融解処理だけではこれらのパラメーターは減少しなかった（Ｐ＞０．０５）。卵丘細胞存在下または不存在下でガラス化された卵母細胞の発生は培養環境にかかわらず有意には異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。ガラス化され融解処理された群からの胚盤胞の形成は、新鮮対照のそれよりも約１日遅れるようであった。ガラス化された卵母細胞から発生する胚盤胞の膨張および孵化率は対照からのものよりも有意に遅かった（Ｐ＜０．０５）。
【００５８】
本研究において、ガラス化溶液の毒性試験（実験例１）によれは、対照と比較した場合、分割および胚盤胞発生の低下は示されなかった。我々の初期の結果は、エチレングリコールがウシ卵母細胞に対して比較的低い毒性を有することを示し（Ｄｉｎｎｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ５６９−５７０ （１９９４））、ガラス化前に低濃度の低温保護剤溶液で徐々に平衡化することが有益であることが他人により報告されている（Ｐａｐｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５１： １７３ （１９９９）（ａｂｓｔｒ．））。比較的低分子量および高浸透率の低温保護剤（エチレングリコール）、増粘性化合物（ポリビニルピロリドン）および膜保護性糖類（トレハロース）の混合物の使用は、溶液への短時間の曝露であっても卵母細胞のガラス化を引き起こすことを確実にした。同様の混合物がウシ胚のガラス化にうまく用いられた（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３： ２９１−２９９ （１９９６））。冷却前および融解後における高濃度のエチレングリコールへの非常に短時間の曝露はその毒性効果を減少させた。そのうえ、融解中の毒性効果は直接希釈法により最小化された。
【００５９】
実験例２
受精したガラス化／融解された卵母細胞のインビトロでの発生
プロトコル：上記のようにして、ガラス化−融解された卵母細胞をインビトロで受精させた。実験例１から得られた結果に基づいて、ガラス化前に卵丘を部分的に除去しただけであった。対照卵母細胞をヒアルロニダーゼで処理し、受精前にそれらの周囲の卵丘層を同様に部分的に除去した。ガラス化卵母細胞を即座に融解し、あるいは数日または数週間液体窒素容器中に保存した。受精した接合体を、低Ｏ２含量雰囲気下でさらに培養した。
【００６０】
結果：インビトロで受精した新鮮卵母細胞およびガラス化／融解卵母細胞の発生を表３に示す。卵母細胞の直接の生存率（対照９３％に対し８５％）はガラス化によりわずかに低下した。生き残った卵母細胞の分割率は有意には異ならなかったが（６９％に対し５８％、Ｐ＞０．０５）、ガラス化卵母細胞の胚盤胞発生は対照のそれよりもわずかに低下していた（３５％に対し２０％）。さらにそのうえ、卵母細胞の長期にわたる保存は、さらに有意な胚盤胞発生低下を生じさせた（２０％に対し１１％、Ｐ＜０．０５）。膨張し孵化した段階への発生はガラス化によっては有意には抑制されなかった（１９％に対し１２％、Ｐ＞０．０５）。しかしながら、卵母細胞の低温保存は孵化率に対して負の影響を及ぼした（１９％に対し６％、Ｐ＜０．０５）。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
実験例３
ガラス化／融解卵母細胞を用いてクローン化された胚の発生
プロトコル：ガラス化−融解された卵母細胞を脱核し、体細胞核移植のためのレシピエント細胞質体として使用した。ガラス化および新鮮卵母細胞の脱核、融合、分割および胚盤胞発生率を比較した。ガラス化および培養系の対照群として、いくつかのガラス化−融解された卵母細胞を単為生殖的に活性化させ、さらに培養した。接合体を、低Ｏ２含量雰囲気下で最初の２日間培養し、そして高Ｏ２含量雰囲気下で卵丘細胞と同時培養した。
【００６３】
結果：ガラス化および新鮮卵母細胞を細胞質体ソースとした場合の核移植実験に関するデータを表４に示す。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
大部分の卵母細胞（２５２個／２６９個、９４％）がガラス化プロセス後に生き残った。新鮮卵母細胞およびガラス化卵母細胞の脱核率は異ならなかった（それぞれ１２７個／１３９個、９１％；１４２個／１６３個、８７％；Ｐ＞０．０５）。新鮮あるいはガラス化／融解卵母細胞から得られた細胞質体との融合率（６２％に対し７４％、Ｐ＞０．０５）は異ならなかった。その後の分割段階（８５％に対し９０％）、胚盤胞段階（２７％に対し２９％）あるいは孵化胚盤胞段階（２０％に対し２２％）への胚の発生はいずれも統計学的には異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。単為生殖的に活性化されたガラス化／融解卵母細胞の分割率（５６％）は、核移植胚のそれより有意に低かったが（Ｐ＜０．０１）、胚盤胞段階への発生率（３２％）は異ならなかった。単為生殖的活性化後に卵母細胞が膨張あるいは孵化胚盤胞段階へと到達する割合は核移植後よりも低かった（１０％）。
【００６６】
本発明を好ましい具体例に関して説明したが、当業者は、添付した特許請求の範囲の精神または範囲から離れることなく、本発明に対して種々の変更および／または修飾を行いうることを容易に理解するであろう。本明細書において引用したすべての文献を本明細書に一体化させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の固体表面ガラス化（ＳＳＶ）デバイスの断面図を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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