(57)【要約】骨関節炎またはリウマチ様のような関節炎障害を処置し、そして癌、乾癬、発作アルツハイマー病および糖尿病のような改変したミトコンドリア機能に関連する他の疾患を処置する、化合物、組成物および方法。本発明は、本明細書中に記載される構造（Ｉ）のアリールＮ−シアノグアニジン化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、このような薬学的組成物の有効量を、関節炎障害の処置を必要とする動物に投与することによって、関節炎障害を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化１】
2004525906.tif 000012
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであり；あるいは
Ｒ３はＲ４と一緒になるか、またはＲ４はＲ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基に結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成する、
化合物。
【請求項２】
Ｒ１が水素またはアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がメチルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が水素、ハロゲン、アルコキシ、アルキルまたは置換アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３が複素環である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３がモルホリニルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ４が水素またはアルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ５が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ４がＲ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていない縮合フェニル基を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１がメチルであり、そしてＲ３がヒドロキシである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
関節炎障害を処置する方法であって、該方法は、有効量の請求項１４に記載の薬学的組成物を、その必要がある動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
改変したミトコンドリア機能に関連する疾患を処置する方法であって、該方法は、有効量の請求項１４に記載の薬学的組成物を、その必要がある動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、関節炎および関連の障害を処置するため、ならびに改変したミトコンドリア機能と関連する疾患を処置するための化合物および方法に関連し、より詳細には、アリールＮ−シアノグアニジン化合物およびその誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
脊椎動物における骨格系の多数の慢性消耗性疾患（関節炎および関連の関節炎障害を含む）は、専用の軟骨生成細胞（関節軟骨細胞）を含む関節軟骨として公知の特定の無血管軟骨組織の分解を特徴とする。発達している長い骨の末端に存在する骨端増殖プレート軟骨細胞（例えば、軟骨内軟骨細胞または肋軟骨軟骨細胞）のような他の軟骨細胞とは異なり、関節軟骨細胞は、血管系を有さない関節軟骨に存在し続ける。従って、酸素供給源としての血液供給を欠く関節軟骨細胞は、嫌気（例えば、解糖）呼吸によって主に代謝エネルギー（例えば、生体エネルギーＡＴＰ産生）を生成し、そして好気ミトコンドリア酸化的リン酸化によらないと考えられる（Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃｈ−Ｒａｃｉｃら、Ｊ、Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５９：２７４−８０，１９９４）。好気条件下でさえ、関節軟骨細胞は、ほとんど酸素を消費し得ず、従って広範な種々の脊椎動物細胞型とは異なるようであり（Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃｅｈ−Ｒａｃｉｃら、１９９４）、関節障害におけるミトコンドリアの役割は、ほとんど無視される。
【０００３】
筋骨格系は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、鳥類および魚類）において有用な力学的エネルギーおよび負荷の支持を効率的に送達するが、筋骨格系はまた、特定の機構機能を表すように特異化された組織および器官を形作る複雑な高分子を、合成、処理および組織化し得る。関節は、筋骨格系の特定の構造の重要なサブセットであり、そして多くの異なる型の関節が体に存在する。自由に動く関節（例えば、足根関節、肘、股関節部、膝、肩、ならびに、指、足指、および手根の関節）が、可動連結（ｄｉａｒｔｈｒｏｄｉａｌ  ｊｏｉｎｔ）または滑膜性の連結として公知である。反対に、脊柱の椎骨間の関節は、それらが線維性であり、そして自由に動かないので可動連結でないが、これらは、脊柱によって、要求される可撓性を提供する。可動連結内の関節骨端は、関節軟骨として公知の含水軟骨組織の薄層と共に並べられる。第４に、この関節は、関節包の内側または外側にあり得る靱帯および腱によって安定化され、そしてその動きの範囲を制御される。
【０００４】
可動連結の表面内層（すなわち、滑膜層および関節軟骨層）は、滑液を含む関節腔を形成する。従って、脊椎動物骨格関節において、滑髄液、関節軟骨、および支持骨は、滑らかな、殆ど摩擦がない支持系を形成する。可動連結は、多大かつ可変の範囲の荷重条件に供されるが、軟骨表面は、正常な条件下でほとんど消耗（例えば、構造的分解）されない。確かに、大半のヒト関節は、非常に遅い操作速度で、非常に高い荷重およびストレス下で効果的に機能し得る。これらの実行特性は、関節中の軟骨の消耗を最小化する効果的な流涙プロセスを要求する。生化学および／または生体力学的プロセスによる関節軟骨の深刻な損傷は、関節炎を生じ、故にこれは、脊椎動物の体重支持系の欠陥として一般に規定される。
【０００５】
関節軟骨細胞は、大量の２つの主なクラスの高分子、コラーゲン、およびプロテオグリカンを含む３次元軟骨細胞外マトリクスの成分を合成および沈着し、そしてこの中に存在する。従って、関節軟骨細胞は、軟骨細胞外マトリクス（ＥＣＭまたは単に「マトリクス」）を含む高分子の合成、構築、分解および代謝回転を媒介する。このマトリクスのメカノケミカル特性は、インビボでの軟骨の生体力学的機能に有意に貢献する。
【０００６】
関節軟骨の構造完全性は、骨格関節（例えば、脊椎動物の股関節部、肩、肘、踵関節および後膝関節において見出される関節）の任最適な機能の根拠である。損なわれた骨格関節機能は、個々の被験体の運動性（例えば、座位からの立ち上がりまたは階段の上り降りに関する運動性）を劇的に減少する。上記のように、関節軟骨の構造完全性および機能完全性を維持するために、関節軟骨細胞は、関節軟骨の主な成分である、コラーゲンおよびプロテオグリカンを一定に合成し；軟骨細胞はまた、摩擦減少滑液を分泌する。軟骨ＥＣＭ高分子および滑液の関節軟骨細胞によるこの一定の作製は、骨端間の摩擦によって生じ得る大部分の機械的磨耗についての修復機構を有する関節軟骨を提供する。しかし、このような軟骨成分の安定した生合成は、前駆体についての一定の要求、またはこれらの高分子および滑液の構築用ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を生成する。これらの前駆体の欠損は、骨格の関節の構造および機能における欠損を生じる。活性レベルが非常に高い場合、または軟骨組織が傷つけられる場合、この欠損がしばしば生じる。
【０００７】
膝および他の類似の構造（例えば、顎関節の円板および肩の唇）は、正常な関節機能に重要な特異化された線維軟骨構造である。これらは、関節を横切る分散型負荷における関節軟骨を補助し、安定性関節における靭帯および腱を補助し、そして衝撃吸収において主な役割を果たすことが公知であり、そして関節の潤滑をさらに補助し得る。これらの構造に対する損傷は、損なわれた関節機能および関節軟骨分解を生じ得る。これらの線維軟骨構造の外科的除去は、例えば明らかに修復不可能な軟骨損傷に続き、変形性関節症の初期発症を生じ得る。半月、円板および唇は、主にＩＩ型コラーゲンからなる含水線維軟骨構造であり、少量の他のコラーゲンおよびプロテオグリカン（アグリカンおよび少量の凝集していないプロテオグリカンを含む）は、また存在する。これらの線維軟骨構造は、レジデント細胞の疎集団を含み、同様に軟骨の関節軟骨細胞は、この細胞外マトリクスの合成および維持について応答性である。
【０００８】
可動速線は、運動（例えば、歩行）機能および日常生活の他の活動に関する肢節の動きを含む、通常の体の動きを可能にする。関節表面（すなわち、関節軟骨）の欠損は、その中枢機能（例えば、歩行および他の体の動き、力学的エネルギーの送達および負荷支持）を提供するためのこれらの生体力学的支持の故障を意味する、。
【０００９】
生物医学的用語において、可動連結の故障は、関節炎障害を生じ、最も一般に、変形性関節症もしくは変形性関節症、または軟骨石灰化を形成する。関節炎障害の他の形態としては、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎、エリテマトーデス、痛風、感染性関節炎および軟骨石灰化（例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、「Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ」Ｓｅｃｔｉｏｎ  １４，  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄ．，  Ｔｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９７７，  ｐｐ．  ２０４８−８０を参照のこと）ならびに、獣医学の文脈において、イヌの股関節異形成のような形成異常が挙げられるが、これらに限定されない。関節炎障害としてはまた、関節損傷を生じる、身体外損傷（例えば、関節組織に損傷を与える急性の身体的損傷、または反復運動症候群）または食事条件（例えば、くる病（ｒｉｃｋｅｔｔｓ）もしくは他の食事欠損病）が挙げられ得るか、またはこれらから生じ得る。
【００１０】
断然、最も一般的な関節炎障害は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）である。自己免疫障害であると考えられるＲＡは、滑膜の炎症から一部生じる。ヒトにおいて、この障害の発症のピークは、３０歳を超えた成体（代表的に３０代および４０代で）生じ、そして男性の３倍女性が罹患する。さらなる場合において、慢性炎症は関節表面および結合組織を腐食および湾曲し、そして深刻な関節の変形および一定の痛みを生じる。さらに、ＲＡはしばしばＯＡを導き、さらに関節の破壊を強める。最も一般的な関節炎障害であるＯＡは、関節軟骨の表面における変性変化によって、特徴づけられる。軟骨の物理化学的構造における変化は、圧縮力および張力への耐性を減少させる。最終的に、完全な腐食が生じ、肋軟骨下の骨が露出され、磨耗に感受性になる。膝および手の関節は、最も一般的に影響され、また脊柱、股関節、足根関節および肩の１つ以上であり得る。ＲＡおよびＯＡの両方において、体重支持関節（例えば、股関節および膝）の変性は、特に消耗性であり得、そしてしばしば痛みを軽減し、運動性を増加する手術を必要とする。
【００１１】
ＲＡ、ＯＡおよび関連する関節障害によってもたらされる変性変化の停止または逆転のための現在存在しない。同時に、約３７００万人のアメリカ人は、処方薬の形態で症状が軽減することを求める。このような場合において、非ステロイドの抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が、最も頻繁に処方される。これらの化合物は、しばしば関節炎症状を軽減または緩和する一方で、これらは頻繁に望ましくない副作用（例えば、悪心および胃腸の潰瘍）を有する。関節炎障害の処置のために通常処方される他の化合物は、コルチコステロイド（例えば、トリアムシノロン、プレドニゾロンおよびヒドロコルチゾン）である。これらの薬剤はまた、特に長期間の必要が必要とされ得る場合、望ましくない副作用を有し、そして多くの患者において禁忌を示され得る。効果的な投薬の決定における難しさに加えて、これらのステロイドおよび他のステロイドでの関節内処置の間、多数の有害反応が報告されている。結果として、関節炎障害の管理におけるコルチコステロイド処置の使用は、近年再評価されている。
【００１２】
上記のようなＯＡおよびＲＡの処置のための症候的手段および待期的手段の代替として、可能である場合、関節炎の関節の機械的修復は、磨耗した関節を人工のプロテーゼ、または生物学的移植片と置換するための整形外科の手術を含む。これらの無力な疾患に罹患した３千万人を超えるアメリカ人と共に、このような手術は、多数の医学的挑戦および経済的挑戦をもたらし、そしてそれ自体の危険性および禁忌を伴わないわけではない。
【００１３】
上述のように、変性関節疾患として公知の変形性関節症はまた、関節炎の最も一般的な型の１つである。これは、関節内の軟骨の損傷によって特徴づけられ、別の骨に対する関節の１つの骨の痛みのある摩擦を生じ、そして罹患した関節内の動きの損失を導く。変形性関節症は、非常に穏やかなものから非常に深刻なものまであり得、そして最も一般的に中年および高齢の人が罹患する。特に、ＯＡは、しばしば、手および体重支持関節（例えば、膝、股関節、足および背中）に罹患する。年齢が、主な危険因子である、現在、この状態の病因および病原は、ほとんど知られていないままである。多くの環境因子および他の独立した条件（肥満、以前の傷害および／またはメニセクトミー（ｍｅｎｉｓｅｃｔｏｍｙ）（例えば、スポーツ関連の傷害または他の偶発的な傷害）、反復した膝の屈折を含む職業関連活動、喫煙、性ホルモン、婦人科学的傷害および他の代謝因子を含む）は、変形性関節症を有するか、または発展させることについての危険性の増加と関連している。軟骨石灰化は、変形性関節症に関連する変性関節疾患の別の形態であり、ここで異常なカルシウム沈着が、関節の軟骨中で生じる。
【００１４】
以上から、近年の薬理学的治療のいずれも、関節炎障害（例えば、ＲＡおよびＯＡ）における根底の生化学的欠陥を正さないことが明らかである。これらの現在利用可能な処置のいずれも、関節炎障害（例えば、異常な関節の軟骨細胞活性、軟骨分解、関節の腐食および深刻な関節の変形）における全ての生理学的異常を改善しない。さらに、処置の失敗は、これらの因子で共通であり、その結果、多剤治療が、頻繁に必要である。
【００１５】
明らかに、関節炎の原因である生化学的欠陥および／または代謝の欠陥を正すために標的化される、治療を改善するための必要性がある。本発明は、関節炎障害を処置するため、および他の疾患を処置するために有用な組成物および方法を提供し、そして他の関連する利点を提供する。
【００１６】
非制限的な理論に従って、米国出願番号０９／６６１，８４８（これは、参考として援用される）を有する同時係属中の出願において開示されるように、本明細書中で提供されるいくつか、または全ての関節炎障害は、改変したミトコンドリアの機能と関連する疾患の例を表し得る。
【００１７】
背景として、ミトコンドリアは、高等生物の細胞における主なエネルギー供給源であり、そしてこれらのオルガネラは、広範なアレイの細胞の呼吸、酸化および代謝プロセスの直接および間接の生化学的調節を提供する（総説について、Ｅｒｎｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓ−２５５ｓ，１９８１を参照のこと）。これらは、電子伝達系（ＥＴＣ）活性を含み、これらは酸化的リン酸化を駆動してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態で代謝エネルギーを産生し、そしてこれはまた、細胞内カルシウムホメオスタシスにおいて中心的なミトコンドリアの役割の根底にある。代謝プロセスにおけるこれらの役割に加えて、ミトコンドリアはまた、「アポトーシス」として公知の遺伝的にプログラムされた細胞の自殺配列に関連する（ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９−１２，１９９８；Ｓｕｓｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：１５１−６５，１９９８）。
【００１８】
電子伝達系（ＥＴＣ）として公知の活性綿密な多複合ミトコンドリアアセンブリでの任意の工程での失敗を含むがこれらに限定されない不完全なミトコンドリアのは、以下を生じ得る：（ｉ）ＡＴＰ産生における減少、（ｉｉ）高い反応性のフリーラジカル（例えば、スーパーオキシド、過酸化亜硝酸およびヒドロキシルラジカル、および過酸化水素）の生成における増加、（ｉｉｉ）細胞内カルシウムホメオスタシスにおける障害、ならびに（ｉｖ）アポトーシスカスケードを開始または刺激する、因子（例えば、シトクロムｃおよび「アポトーシス関連因子」）の放出。これらの生化学的変化のために、ミトコンドリアの機能不全は、細胞および組織に対する広範な損傷を生じる可能性を有する。
【００１９】
多数の疾患および障害は、ミトコンドリアの代謝における変化および／またはミトコンドリア関連機能（例えば、アポトーシスを導く機能）の不適切な導入または抑制によって生じるか、またはこれらに関連すると考えられる。例として、これらは以下を含むがそれらに限定されない：慢性神経変性障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）；自己免疫疾患、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型を含む）；ミトコンドリア関連疾患（ミトコンドリアの構造異常性を有する先天性筋ジストロフィーを含むがこれに限定されない）、深刻なｍｔＤＮＡ欠乏を有する致命的な乳児の筋障害およびｍｔＤＮＡの穏やかな現象を伴う良性の「遅い発症」筋障害、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアの脳障害、乳酸のアシドーシス、および発作）およびＭＩＤＤ（ミトコンドリアの糖尿病および難聴）；ＭＥＲＦＦ（ミオクローヌス癲癇赤色ぼろ筋線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｒａｇｇｅｄ  ｒｅｄ  ｆｉｂｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；関節炎；ＮＡＲＰ（神経障害；運動失調；色素性網膜症）；ＭＮＧＩＥ（ミオパシーおよび外部の眼筋麻痺；神経障害；胃腸；脳障害）、ＬＨＯＮ（レーバー；遺伝性；視覚；神経障害）キーンズ・セイアー症候群；パーソンズ症候群；ＰＥＯ（進行性外部眼筋麻痺）；ウォルフラム症候群ＤＩＤＭＯＡＤ（尿崩症、糖尿病、眼の萎縮、難聴）；リー症候群；失調；精神分裂病；および過剰増殖障害（例えば、癌、腫瘍および乾癬）。異常なミトコンドリアの活性またはミトヌークリア（ｍｉｔｏｎｕｃｌｅａｒ）活性が特定の疾患プロセスと関連するので、改変したミトコンドリアの機能と関連するさらなる疾患の広範なリストは、増大し続ける。
【００２０】
一般的に受容されるミトコンドリアの機能の理論に従って、適切なＥＴＣ呼吸活性は、共役化学浸透機構（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｈｅｍｉｏｓｍｏｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）によって、内部のミトコンドリア膜における電気化学的電位（Δψｍ）の維持を必要とする。この膜電位を散逸または崩壊する条件（ＥＴＣの任意の工程での失敗が挙げられるが、これに限定されない）は、故にＡＴＰ生合成の阻害および重要な生化学的エネルギー供給源の生成を隠し得るかまたは停止し得る。変化したまたは不完全なミトコンドリアの活性はまた、「ミトコンドリアの透過性遷移（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）」（ＭＰＴ）といわれる破局的なミトコンドリアの崩壊を生じ得る。さらに、ミトコンドリアのタンパク質（例えば、シトクロムｃおよび「アポトーシス誘導因子」）は、ＭＰＴ（または、Ｂａｘのようなミトコンドリアのタンパク質の作用）に起因してミトコンドリアから解離または放出され得、そしてカスパーゼとして公知のトロテアーゼを誘導し得、そしてまたはアポトーシスにおける他の事象を刺激し得る（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４６：１８−２５，１９９９）。
【００２１】
不完全なミトコンドリアの活性は、代替的にまたはさらに細胞および組織を損傷する可能性を有する高い反応性のフリーラジカルの生成を生じ得る。これらのフリーラジカルは、反応性の酸素種（ＲＯＳ）（例えば、スーパーオキシド、過酸化亜硝酸およびヒドロキシルラジカル）および細胞に対して毒性であり得る潜在的な他の反応性種を含み得る。例えば、酸素フリーラジカルが誘導する脂質の過酸化は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷における十分に確立された病原機構（例えば、多数の変性疾患および虚血（すなわち、発作）において見出される機構）である。（アポトーシスカスケードにおけるミトコンドリアの関連はまた、神経の死の病原性において重要な事象であると考えられている）。
【００２２】
さらに、ミトコンドリアそれ自体に不利に影響するミトコンドリアの機能不全から生じる反応性フリーラジカルに対して曝露される少なくとも２つの有害な結果が存在する。第１に、フリーラジカル媒介性の損傷は、ＥＴＣの無数のタンパク質の１つ以上を不活性にし得る。第２に、フリーラジカル媒介損傷は、「遷移透過性」といわれる破局的なミトコンドリアの崩壊が生じ得る。ミトコンドリア機能の一般に受容される理論に従って、適切なＥＴＣ呼吸活性は、共役化学浸透過機構による内部ミトコンドリア膜における電気化学的電位の維持を必要とする。フリーラジカル酸化活性は、この膜電位を散逸し得、これによってＡＴＰ生合成を防止し、そして／またはアポトーシスカスケード−におけるミトコンドリアの事象を誘発する。故に、ミトコンドリアの構造および機能に対するフリーラジカル酸化のこれらの影響および他の影響を調節することによって、本発明は、フリーラジカル誘導脂質過酸化の単原子決定によって提供されないミトコンドリアを保護するための組成物および方法を提供する。
【００２３】
例えば、迅速なミトコンドリアの透過性遷移は、「孔」の形成を生じる内部ミトコンドリアの膜貫通タンパク質のアデニル酸転移酵素における変化を引き起こす傾向がある。この孔が、別個の導管であるか、または単に膜中に広がった漏出であるかは、解明されていない。任意の事象において、透過性の遷移は、フリーラジカルの曝露によって増強されるため、これは、このような反応性フリーラジカルに慢性的に曝露されているミトコンドリア関連疾患を有する患者由来の細胞のミトコンドリア中でより生じる傾向があり得る。
【００２４】
改変した（例えば、疾患を有さない個体のような適切なコントロールと比較して統計学的に有意な様式で増加または減少された）ミトコンドリア関連疾患に特徴的なミトコンドリアの機能はまた、フリーラジカルの酸化以外の機構によるミトコンドリア膜の電気化学的電位の喪失に関連し得、そしてこのような遷移透過性は、ミトコンドリア遺伝子、遺伝子産物または関連の下流の媒介物の直接または間接の効果から、ならびに／あるいは他の公知または未知の原因から生じ得る。故に、ミトコンドリアの電位の喪失は、ミトコンドリア関連疾患または変性疾患の進行における重要な事象であり得る。
【００２５】
糖尿病は、先進国の人口の５〜１０％に罹患する共通の変性疾患である。糖尿病の発症についての傾向は、報告によれば母性遺伝であり、ミトコンドリアの遺伝的関連を示唆する（Ａｌｃｏｌａｄｏ，Ｊ．Ｃ．およびＡｌｃｏｌａｄｏ，Ｒ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ  ３０２：１１７８−８０，１９９１；Ｒｅｎｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍ．２３：８８６−９０，１９９４．）。糖尿病は、強力な遺伝成分を有する異種障害であり；一卵性双生児は、高度に一致しており、そして罹患した個体の第１程度の関係間での疾患の高い発生率が存在する。
【００２６】
細胞レベルで、遅く発症する糖尿病の特性であり得る変性表現型は、改変したミトコンドリアの呼吸機能（例えば、不完全なインスリン分泌、減少されたＡＴＰ合成および増加したレベルの反応性酸素種）の指標が挙げられる。研究は、糖尿病が、特定の関連の障害に先立ち得るか、または関連し得ることを示している。例えば、Ｕ．Ｓ．において４百万の個体が、遅く発症する不完全なグルコース耐性（ＩＧＴ）に罹患していると見積もられる。ＩＧＴ患者は、増加したインスリン分泌を伴うグルコースに対する応答に失敗する。少ないパーセントのＩＧＴ個体（５〜１０％）は、インスリン欠損非インスリン依存糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に各年進行する。これらの個体のいく人かは、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）にさらに進行させる。これらの形態の糖尿病（ＮＩＤＤＭおよびＩＤＤＭ）は、膵臓のβ細胞によるインスリンの放出の減少および／またはインスリンに対する末端器官応答の減少に関連する。糖尿病の他の徴候および糖尿病に先立つかまたはそれと関連する状態としては、肥満、脈管の病理学、末梢ニューロパシーおよび感覚ニューロパシー、失明および難聴が挙げられる。
【００２７】
糖尿病の強力な遺伝成分に起因して、核のゲノムは、原因となる遺伝子の変異についての検索の主な焦点である。しかし、強い努力にも関わらず、糖尿病と分離した核の遺伝子は、インスリン遺伝子、インスリンレセプター遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子における変異の割合がほんの少しであることが公知である。従って、ミトコンドリアの欠損（ミトコンドリアＤＮＡ中に存在する別個の非核ミトコンドリアゲノムに関連する欠陥を含み得るが、これに限定されない）は、糖尿病の病原性に有意に寄与し得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４６：６７７９，１９９９）。
【００２８】
パーキンソン病（ＰＤ）は、脳の黒質の細胞層部分（ｐａｒｓ  ｃｏｍｐａｃｔａ）におけるドーパミン含有ニューロンの喪失および／または萎縮によって特徴付けられる進行性、慢性ミトコンドリア関連神経変性障害である。アルツハイマー病（ＡＤ）と同様に、ＰＤはまた、初老に罹患される。これは、運動緩徐（緩慢な動き）、硬直および安静時振せんによって、特徴づけられる。Ｌ−ドーパ処置は、大半の患者において振せんを減少するが、最終的に振せんはますます制御不可能になり、これは、患者が食事をすることまたは彼ら自身の基本的な衛生の必要性を満たすことさえ、難易または不可能にする。
【００２９】
神経毒１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）が、動物およびヒトにおいて少なくとも１部そのミトコンドリアに対する効果を介して振せん麻痺を誘導することが示された。ＭＰＴＰは、ドーパミンニューロン中のその活性代謝産物、ＭＰＰ＋に転換し；次いで、それはミトコンドリア中で濃縮される。次いで、ＭＰＰ＋は、選択的にミトコンドリアの酵素ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクラーゼ（「複合体Ｉ」）を阻害し、これは、フリーラジカルの産生の増加を生じ、アデノシン三リン酸の産生を減少し、そして最終的に罹患したドーパミンニューロンを死滅させる。
【００３０】
ミトコンドリアの複合体Ｉは、４０〜５０のサブユニットからなり；大半は、核のゲノムによってコードされ、そして７個は、ミトコンドリアのゲノムによってコードされる。振せん麻痺は、複合体Ｉ活性に影響するミトコンドリアの毒素に曝露されることによって、誘導され得るので、複合体Ｉタンパク質における欠損が複合体Ｉ活性における類似の生化学的欠乏を引き起こすことによって、ＰＤの病原に寄与し得る傾向があるようである。確かに、ミトコンドリアの複合体Ｉ活性における欠損は、ＰＤ患者の血液および脳において報告されている（Ｐａｒｋｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６：７１９−２３，１９８９；Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．４６：４４−５０，１９９９）。
【００３１】
類似の理論が、ミトコンドリアの欠陥と他の神経学的疾患との間の相似の関係について進行されており、神経学的疾患としては、アルツハイマー病、レーバー遺伝性視神経ニューロパシー、精神分裂病、「ミトコンドリアの脳障害、乳酸アシドーシス、および発作」（ＭＥＬＡＳ）、および「ミオクローヌス癲癇赤色ぼろ筋線維症候群」（ＭＥＲＲＦ）が挙げられる。
【００３２】
例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の別個の領域におけるニューロンの損失および／または萎縮によって特徴づけられる、慢性、進行性、神経変性障害であり、そしてこれはβ−アミロイドの細胞外沈着および神経線維変化の細胞内累積によって達成される。これは、独特のヒト疾患であり、世界中で１３００万人を超える人々が罹患している。これはまた、独特の悲惨な疾患である。普通に生産的生活をしている多くの個体は、彼らが年をとるにつれてＡＤに除々にみまわれ、そしてこの疾患は、徐々に彼らからその記憶および他の精神的能力を奪う。最終的に、彼らは、家族および愛した人を認識できなくなり、そして彼らは、しばしばその最終的な死までの間、継続的な介護を必要とする。
【００３３】
ミトコンドリア内の酸化的リン酸化における欠陥が、少なくとも散発性のＡＤの部分的な原因であるという証拠がある。酵素シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）（ミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）の一部を構成する）は、ＡＤ患者中に通常量存在する；しかし剖検でのＡＤ患者、およびＡＤ患者の脳におけるこの酵素の触媒活性は、異常に低いことが見出されている。これは、ＡＤ患者におけるＣＯＸが欠損し、ＡＤの特徴である徴候を生じるか、またはこれに寄与するいくつかの様式における触媒活性の減少を導くことを示唆する。
【００３４】
ＡＤの１つの特徴的な病原は、脳の異なる領域における選択されたニューロンの集団の死である。ＡＤにおける細胞死は、アポトーシスであると予測される。なぜならば、プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）の徴候が、見られ、そして活性グリオーシスおよびネクローシスが見出されないからである（Ｓｍａｌｅら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇ．１３３：  ２２５−３０，１９９５；Ｃｏｔｍａｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：１９−４５，１９９５．）。ＡＤにおける細胞死の結果、ニューロンおよびシナプスの損失は、ＡＤの臨床的診断に密接に関連し、そしてＡＤにおける痴呆の程度に高度に関連する（ＤｅＫｏｓｋｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２７（５）：４６７−６４，１９９０）。
【００３５】
ミトコンドリアの機能不全は、種々の細胞型においてアポトーシスを導く事象のカスケードにおいて重要であると考えられ（Ｋｒｏｅｍｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１２７７−８７，１９９５）、そしてＡＤ脳のニューロンにおいてアポトーシスの細胞死の原因となり得る。改変したミトコンドリアの生理学は、ＰＣＤにおける最初の事象であり得（Ｚａｍｚａｍｉら、．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７−７７，１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１６６１−７２，１９９５）、そしてこのような改変したミトコンドリアの機能から生じる上昇した反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルは、アポトーシスカスケードを開始し得る（Ａｕｓｓｅｒｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−４２，１９９４）。ニューロンを含むいくつかの細胞型において、ミトコンドリアの膜電位（Δψｍ）における減少は、アポトーシスを伴う核のＤＮＡ分解に先立つ。無細胞系において、核ではないミトコンドリアの富化された画分は、核のアポトーシスを誘導し得る（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７０：３５３−６４，１９９４）。変化した細胞の代謝状態（例えば、細胞内ＲＯＳの上昇）を導くミトコンドリアの呼吸活性の混乱は、ミトコンドリア関連疾患において生じ得、そしてアポトーシスの機構を介して病原事象をさらに誘導し得る。
【００３６】
酸化ストレスを受けたミトコンドリアは、アポトーシスに先立つ事象である、染色体の縮凝（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を誘導し得る予め形成された可溶性因子を放出し得る（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２０３３−３８，１９９６）。さらに、抗アポトーシス遺伝子産物のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは、外側のミトコンドリア膜内に配置され（Ｍｏｎａｇｈａｎら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１８１９−２５，１９９２）、そしてこれらのタンパク質は、酸化ストレスから膜を保護するようである（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１２７１：６３，１９９５）。この膜に対するＢｃｌ−２の局在化は、アポトーシスの変調に不可欠であるようにみえる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６５２１−２４，１９９４）。従って、ミトコンドリアの生理学における変化は、アポトーシスの重要な媒介物であり得る。アポトーシス細胞死が、ＡＤにおけるニューロンの損失の顕著な特徴であるという点で、ミトコンドリアの機能不全は、この疾患の進行において重要であり得、そしてまた他のミトコンドリア関連疾患における因子に寄与し得る。
【００３７】
酸化ストレスの増加を伴うミトコンドリアにおけるエネルギー代謝での限局的欠損は、ＡＤと関連し得る。エネルギー代謝が、ＡＤ脳において不完全であることは、十分確立されている（Ｐａｌｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６４５：３３８−４２，１９９４；Ｐａｐｐｏｌｌａら、Ａｍ：Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：６２１−２８，１９９２；Ｊｅａｎｄｅｌら、Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５：２７５，１９８９；Ｂａｌａｚｓら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９：１１３１−３７，１９９４；Ｍｅｃｏｃｃｉら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：７４７−５１，１９９４；Ｇｓｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：１２１６−２３，１９９５）。例えば、ＡＤ脳におけるエネルギー代謝での局所特異的欠損は、陽子射出断層撮影法の研究において多数報告されている（Ｋｕｈｌら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．７：Ｓ４０６，１９８７；Ｇｒａｄｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．１０：５７６−９６，１９８８；Ｈａｘｂｙら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４７：７５３−６０，１９９０；Ａｚａｒｉら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１３：４３８−４７，１９９３）。ＡＤ患者の側頭頭頂の新皮質における代謝欠陥は、いく年かにわたる認識低下の明らかな前兆である。ＡＤ患者由来の皮膚線維芽細胞は、グルコース利用の減少、およびグルコース酸化の増加を示し、グリコシル化末端産物の形成を導く（Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：７７８７−９１，１９９４）。死後のＡＤ脳からの皮質組織は、ミトコンドリアの酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、（Ｓｈｅｕら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７：４４４−４９，１９８５）およびα−ケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（Ｍａｓｔｒｏｇｉａｃｏｍｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６：２００７−１４，１９９４）の活性の減少を示し、これらは両方とも、エネルギー代謝における重要な酵素である。機能的磁気共鳴分光法の研究は、ＡＤ脳におけるホスホクレアチンに関連する無機リン酸のレベル増加を示しており、ミトコンドリアによるＡＴＰ産生の減少から生じる前駆体の蓄積を示唆する（Ｐｅｔｔｅｇｒｅｗら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  １５：１１７−３２，１９９４；Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  １６：９７３−７５，１９９５）。さらに、グルコースでも乳酸塩でもなく、ピルビン酸塩のレベルは、大脳のミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）活性における欠損と一致で、ＡＤ患者の脳脊髄液における増加が報告される（Ｐａｒｎｅｔｔｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９９：２３１−３３，１９９５）。
【００３８】
酸化的損傷の徴候はＡＤ病理学の顕著な特徴であり、そして上に記されるように、反応性酸素種（ＲＯＳ）は神経変性の重要なメディエーターである。実際に、検死での研究により、タンパク質、ＤＮＡおよび脂質の過剰酸化のマーカーが、ＡＤ脳において増加することが示される（Ｐａｌｍｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６４５：３３８−４２，１９９４；Ｐａｐｐｏｌｌａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：６２１−２８，１９９２；Ｊｅａｎｄｅｌら，Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５：２７５−８２，１９８９；Ｂａｌａｚｓら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４：８６４，１９９４；Ｍｅｃｏｃｃｉら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：７４７−５１，１９９４；Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０５４０−４３，１９９１）。ＡＤ由来の海馬組織において、タンパク質酸化を示すカルボニル形成が、ニューロンの細胞質ならびにニューロンの核およびグリアの核において増加するが、コントロール由来では増加しなかった（Ｓｍｉｔｈら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：１２０−２１，１９９６）。神経線維変化もまた、タンパク質酸化の顕著な部位であるようである（Ｓｃｈｗｅｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８４６３，１９９５；Ｂｌａｓｓら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４：８６４，１９９０）。検死で採取されたＡＤ脳由来の皮質組織の、ストレス条件下および非ストレス条件下の培養は、非ＡＤコントロールに対して増加したフリーラジカル生成を実証する。さらに、重要な抗酸化酵素活性、具体的にはカタラーゼの活性は、ＡＤにおいて低下しており（Ｇｓｅｌｌら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：１２１６−２３，１９９５）、このことはＡＤ脳が増加したＲＯＳ生成物に弱いことを示唆する。従って、酸化ストレスは、ＡＤのようなミトコンドリア関連疾患の病理に有意に貢献し得、ここで、ミトコンドリア機能不全および／または上昇したＲＯＳが存在し得る。
【００３９】
慢性的神経変性疾患におけるミトコンドリア機能不全の基本的な役割が示す証拠が増え（Ｂｅａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：２１１−２３，１９９８）、そして最近の研究は、ネクローシス細胞死およびアポトーシス細胞死へと導く事象を調節するためのミトコンドリアを包含する（Ｓｕｓｉｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：１５１−６８，１９９８）。ストレス（例えば、とりわけ、フリーラジカル、細胞内高カルシウム、ＡＴＰの消失）をかけられたミトコンドリアは、アポプトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）との相互作用を介してアポトーシスを開始し得る、予め生成された可溶性因子を放出し得る（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２０３３−３８，１９９６；Ｌｉら，Ｃｅｌｌ  ９１：４７９−８９，１９９７）。シトクロムｃのような、ストレスをかけられたミトコンドリアによる、予め生成された可溶性因子の放出は、多くの事象の結果として発生し得る。任意の事象において、ストレスの大きさ（ＲＯＳ、細胞内カルシウムレベル、など）がミトコンドリア生理機構において変化を及ぼし、この変化は、細胞死がネクローシス経路を介して起こるかまたはアポトーシス経路を介するかを最終的に決定する。アポトーシス細胞死が変性疾患の顕著な特徴である程度まで、ミトコンドリア機能不全は疾患の進行において重要な因子であり得る。
【００４０】
慢性的な神経変性疾患と対照的に、発作後のニューロン死は突発性の様式で起こる。膨大な量の文献が、今日、発作、心停止および脳への外傷損傷に伴って起こる虚血／再灌流障害の後のニューロン死におけるミトコンドリア機能の重要性を記載する。実験的な支持により、エネルギー代謝欠陥、酸素ラジカル生成増大および細胞内カルシウム濃度恒常性障害を導くミトコンドリア機能の変化、ならびに突発性神経変性の病因におけるアポトーシスカスケード内での活性なミトコンドリアの関与の中心的役割について、蓄積され続ける。
【００４１】
発作は、脳のある領域が灌流を消失する場合および突然の虚血の事象の結果として急性的または遅発性の様式でニューロンが死滅する場合に、発作が起こる。脳への血液供給の停止に際し、組織ＡＴＰ濃度は数分で極僅かなレベルまで落ち込む。梗塞の中心部では、ミトコンドリアのＡＴＰ生産の欠損はイオンの恒常性の消失を引き起こし、浸透圧性の細胞溶解およびネクローシス死を導く。多くの派生的な変化はまた、ミトコンドリアＡＴＰの低下の後の細胞死に寄与し得る。急性ニューロン障害における細胞死は、ニューロンが主にネクローシスによって死滅する梗塞の中心部からニューロンがアポトーシスを受ける半影部（ｐｅｎｕｍｂｒａ）まで、組織が依然として損傷を受けていない辺縁へと放射状に広がる（Ｍａｒｔｉｎら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．４６：２８１−３０９，１９９８）。
【００４２】
半影部におけるニューロンへの多くの傷害は、特に酸素除去しないミトコンドリアの生物エネルギー消失によって悪化される場合に、梗塞収束点で細胞溶解の間に放出されるグルタミン酸によって誘導される興奮毒性によって、引き起こされる（ＭａｃＭａｎｕｓおよびＬｉｎｎｉｋ，Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１７：８１５−３２，１９９７）。興奮毒性における最初の発端は、主にＮＭＤＡレセプターを通してのＣａ２＋の大量の流入であり、このことはミトコンドリア内へのＣａ２＋の取り込み増加を生じる（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖ．Ｅ．ＫｏｌｉａｔｏｓおよびＲ．Ｒ．Ｒａｔａｎ共編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，４５−６８頁，１９９９における「Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｄｙｋｅｎｓによって概説される）。このＣａ２＋の超過流入（ｏｖｅｒｌｏａｄ）は、ミトコンドリアの膜電位（ΔΨｍ）を崩壊させ、そして反応性の酸素種の生成増加を引き起こす（Ｄｙｋｅｎｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６３：５８４−９１，１９９４；Ｔｈｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｐａｒａｄｏｘ，Ｋ．Ｊ．Ａ．Ｄａｖｉｅｓ，およびＦ．Ｕｒｓｉｎｉ共編，Ｃｌｅｕｐ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．ｏｆ  Ｐａｄｏｖａ，４５３−６７頁，１９９５における、Ｄｙｋｅｎｓ，「Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」）。十分に重篤である場合、ΔΨｍの崩壊およびミトコンドリアのＣａ２＋隔絶は、ミトコンドリア透過性移行（ｍｉｔｏｃｏｎｄｒｉａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（ＭＰＴ）と呼ばれるプロセスを経てミトコンドリア内膜の開孔を引き起こし、シトクロムｃおよびアポトーシスを開始する他のタンパク質を間接的に放出する（Ｂｅｒｎａｒｄｉら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２９３４−３９，１９９４；ＺｏｒａｔｔｉおよびＳｚａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２４１：１３９−７６，１９９５；Ｅｌｌｅｒｂｙら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：６１６５−７８，１９９７）。これらの観察と一致して、グルタミン酸誘導性興奮毒性は、ミトコンドリアのＣａ２＋取り込みを防止することまたはＭＰＴをブロックすることにより阻害され得る（ＢｕｄｄおよびＮｉｃｈｏｌｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６６：４０３−１１，１９９６；ＷｈｉｔｅおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：５６８８−９７，１９９６；Ｌｉら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７５３：１３３−４０，１９９７）。
【００４３】
ミトコンドリア媒介性のアポトーシスが変性疾患において重要であり得るが、癌のような障害は、通常ではこのような所望されない細胞においてアポトーシスを引き起こす機構から、何らかの方法で逸脱した細胞の制御されないかつ所望されない増殖（過増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒｌａｔｉｏｎ））に関する。抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２およびそのホモログの発現増強は、多くのヒトの癌の病因に関連する。Ｂｃｌ−２はプログラム細胞死を阻害することによって機能し、そしてＢｃｌ−２およびその関連タンパク質Ｂｃｌ−ｘＬの過剰発現は、ミトコンドリアからのシトクロムｃのミトコンドリアによる放出およびカスパーゼ−３の活性化をブロックする（Ｙａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１２９−３２，１９９７；Ｋｌｕｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１３２−３６，１９９７；Ｋｈａｒｂａｎｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：６９３９−４２，１９９７）。対照的に、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬの過剰発現は、化学治療剤によって誘導される、核のアポトーシスを進行させるミトコンドリア機能不全に対して保護する。さらに、細胞傷害性薬物に対する獲得された多剤耐性は、Ｂｃｌ−ｘＬの過剰発現に依存するシトクロムｃの放出の阻害と関連する（Ｋｏｊｉｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６６４７−５０，１９９８）。ミトコンドリアはアポトーシスに関係していたので、ミトコンドリアの成分と相互作用する薬剤がアポトーシスを受ける細胞の能力をもたらすことが期待される。従って、過増殖細胞においてアポトーシスを引き起こすかまたは促進する薬剤は、癌のような過増殖性の障害および疾患を処置することに有用であることが期待される。
【００４４】
従って、ミトコンドリア機能の変化は、改変したミトコンドリア機能と関連する疾患を処置するための薬物設計の広域的な治療ストラテジーの可能性を有し、その疾患としては（非限定的な理論として）、特定の関節炎障害、変性障害、および過増殖性疾患が挙げられる。さらに非限定的な理論に従い、処置が求められる疾患または障害に依存して、このような薬物は、例えば、ミトコンドリア保護薬剤、抗アポトーシス剤、またはプロアポトーシス剤（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）であり得る。
【００４５】
ミトコンドリア機能不全から直接的または間接的に生じる、オルガネラ、細胞および組織への損傷（例えば、細胞内で生成されたフリーラジカルによる損傷）を制限または防止する、化合物および方法の必要性が、明らかに存在する。特に、ミトコンドリアは代謝エネルギー産生のために必須なオルガネラであるので、そのような損傷（例えば、フリーラジカルによる酸化的損傷）に対してミトコンドリアを保護する薬剤は、本質的に有用である。このような薬剤は、ミトコンドリアに関連する疾患を含む変性疾患の処置に適切であり得る。酸化的損傷を制限する薬剤を同定することへの現存のアプローチの存在は、このような薬剤がミトコンドリアの構造および／または機能を保護するのに有用であり得るかどうかの決定を包含し得ない。
【００４６】
また、ネクローシスならびに／または不適切なアポトーシスの結果として直結的または間接的に起こる細胞および組織への損傷を制限または防止する、化合物および方法の必要性が存在する。特に、ミトコンドリアはアポトーシスの事象のメディエーターなので、ミトコンドリアで媒介されるプロアポトーシスの事象を調節する薬剤が、本質的に有用である。このような薬剤は、発作のような急性な変性の事象の処置に適切であり得る。梗塞の中心部でのネクローシス死の遮断のための、限定される治療濃度域を考慮すると、梗塞の非ネクローシス性領域において、ミトコンドリア機能不全を防止することによってニューロンの死を制限する治療ストラテジーを開発することが、特に望ましくあり得る。一過性の虚血およびそれに続く興奮毒性の波動の間にミトコンドリアの完全性を維持する薬剤および方法は、発作に関連するニューロン傷害を制限するのに有用な、新規の神経保護的薬剤であることが期待される。
【００４７】
また、適切なアポトーシスシグナルを免れた細胞または組織の増殖を阻害するかまたは死滅を増強する化合物および方法、ならびにアポトーシスカスケードを誘発することによって所望されない（例えば、癌）細胞の死滅を引き起こす細胞傷害性薬剤が、必要とされる。特に、ミトコンドリアはアポトーシスの事象のメディエーターであるので、ミトコンドリア媒介性のアポトーシス進行性の事象を刺激する薬剤が、特に有用である。このような薬剤は、癌および乾癬のような過増殖性疾患の処置に適切であり得る。
【００４８】
本発明は、これらの必要性を満たし、そして他の関連の利点を提供する。当業者は、本開示を読んだ後、本発明の優位点および利点をさらに認識する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４９】
（発明の要旨）
簡潔に述べると、本発明は、以下の一般式（Ｉ）：
【００５０】
【化２】
2004525906.tif 000002
を有する化合物の有効量を、処置の必要性のある温血動物への投与によって、変関節炎障害の処置および／または化したミトコンドリア機能と関連する疾患の処置に関し、この化合物は、その立体異性体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩を含む。ここで、Ｒ１〜Ｒ５は以下に規定される通りである。
【００５１】
特定の実施形態において、本発明は、構造（Ｉ）のアリールＮ−シアノグアニジン化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。他の実施形態に従って、本発明は、このような薬学的組成物の有効量を、関節炎障害の処置を必要とする動物に投与することによって、関節炎障害を処置する方法が提供される。なおさらなる実施形態に従い、改変したミトコンドリア機能と関連する疾患を処置ための方法を提供し、この方法は、このような薬学的組成物の有効量を、処置を必要とする動物に投与する工程を包含する。
【００５２】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照する際に明らかになる。さらに、本発明の特定の局面をより詳細に記載する種々の参考文献は、本明細書中に示され、従って、それらの全体が参考として援用される。
【００５３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、関節炎障害および／または改変したミトコンドリア機能と関連する疾患の処置において有用である、化合物、組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明の化合物は、以下の構造（Ｉ）：
【００５４】
【化３】
2004525906.tif 000003
またはその立体異性体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩を有し、
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、そして個別には水素、ハロゲン、ヒドロキシ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、もしくは置換複素環アルキルであるか；またはＲ３はＲ４と一緒になるかもしくはＲ４はＲ５と一緒になり、そしてさらにそれらの基が結合されるそれぞれの炭素原子と一緒になって、非置換もしくは置換の縮合アリールもしくは縮合複素環を形成する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、上記の用語は以下の意味を有する。
【００５６】
「アルキル」とは、１〜１０個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の、非環状または環状の、不飽和または飽和の脂肪族炭化水素を意味し、一方、用語「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含むこと以外は同じアルキルを意味する。代表的な置換の直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ；一方、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ２シクロプピル、−ＣＨ２シクロブチル、−ＣＨ２シクロペンチル、−ＣＨ２シクロヘキシルなどが挙げられ；一方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。環式アルキルはまた、「単素環式環」ともいわれ、そしてデカリンまたはアダマンチルのような単素二環式環および単素多環式環を含む。不飽和アルキルは、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む（それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」といわれる）。代表的な直鎖および分枝のアルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられ、一方、代表的な直鎖および分枝のアルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１  ブチニルなどが挙げられる。
【００５７】
「アリール」とは、フェニルまたはナフチルのような芳香族炭素環部分を意味する。
【００５８】
「アリールアルキル」とは、アリール部分で置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキル（例えば、ベンジル、−ＣＨ２−（１または２−ナフチル）、−（ＣＨ２）２フェニル、−（ＣＨ２）３フェニル、−ＣＨ（フェニル）２など）を意味する。
【００５９】
「ヘテロアリール」とは、５〜１０員の芳香族複素環式環を意味し、そしてこれは、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を有し、そして少なくとも１つの炭素原子を含み、そして単環式環系および二環式環系の両方を含む。代表的なヘテロアリールとしては、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【００６０】
「ヘテロアリールアルキル」とは、ヘテロアリール部分で置換される、少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキル（例えば、−ＣＨ２ピリジニル、−ＣＨ２ピリミジニルなど）を意味する。
【００６１】
「複素環」（本明細書中で「複素環式環」ともいわれる）とは、５〜７員の単環式、または７〜１４員の多環式の複素環式環を意味し、これは、飽和か、不飽和かまたは芳香族のいずれかであり、そしてこれは窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含み（そしてここで、この窒素および硫黄のヘテロ原子は必要に応じて酸化され得、そしてこの窒素ヘテロ原子は必要に応じて４級化され得る）、任意の上記の複素環がベンゼン環と融合される２環式環、および３環式（およびより高級な）複素環式環を含む。この複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。複素環は、上記で規定されるようなヘテロアリールを含む。従って、複素環としては、上に列挙された芳香族ヘテロアリールに加えて、また、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【００６２】
「複素環アルキル」とは、複素環で置換された、少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキル（例えば、−ＣＨ２モルホリニルなど）を意味する。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「置換（された）」とは、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換される、任意の上記の基（例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環、複素環アルキル、など）を意味する。ケト置換基（「＝Ｏ」）の場合、２つの水素原子が置換される。本発明の本文中での「置換基」としては、置換される場合、以下が挙げられる：ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロアルキル、アリール、置換のアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、−ＮａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＮＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＮＲａＳＯ２Ｒｂ、−ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＳＨ、−ＳＲａ、−ＳＯＲａ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａ、−ＯＳ（＝Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲａ（ここで、ＲａおよびＲｂは同一であるかまたは異なっており、そして独立して水素、ハロアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、または置換複素環アルキルである）。例えば、置換アルキルとしては、トリフルオロメチルが挙げられる。
【００６４】
「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【００６５】
「ハロアルキル」とは、ハロゲンで置換された少なくとも１つの水素を有するアルキル（例えば、トリフルオロメチルなど）を意味する。
【００６６】
「アルコキシ」とは、メトキシ、エトキシなどのような酸素架橋（例えば、−Ｏ−アルキル）を介して結合されたアルキル部分を意味する。
【００６７】
本発明のより特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のうち少なくとも２つは水素であり、別の実施形態においてはＲ１〜Ｒ５のうち少なくとも３つは水素であり、そしてなお別の実施形態においてはＲ１〜Ｒ５のうち少なくとも４つは水素である。
【００６８】
さらなる実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５は同一であるかまたは異なっており、そして独立して水素、アルキル、置換のアルキル、ヒドロキシル、ハロゲンまたはアルコキシであり、ここで、代表的なアルキルとしてはメチルが挙げられ、代表的なアルコキシとしてはメトキシが挙げられ、そして代表的な置換のアルキルとしてはトリフルオロメチルが挙げられる。
【００６９】
別の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のうち少なくとも１つは、モルホリニルのような複素環である。
【００７０】
なお別の実施形態において、Ｒ３はＲ４と一緒になるか、またはＲ４はＲ５と一緒になって、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、非置換または置換の縮合アリールまたは複素環を形成する。例えば、非置換または置換のアリールの場合、本発明の代表的な化合物は、Ｒ４とＲ５とが一緒になって縮合アリールを形成する場合、以下の構造（ＩＩ）を有し、そしてＲ３とＲ４とが一緒になって縮合アリールを形成する場合、構造（ＩＩＩ）を有する：
【００７１】
【化４】
2004525906.tif 000004
ここで、構造（ＩＩ）または構造（ＩＩＩ）の縮合アリール部分は、上記に規定されるような１つ以上の置換基によって必要に応じて置換され得る。
【００７２】
本発明の化合物は、公知の有機合成技術によって調製され得、この技術は実施例においてより詳細に記載される方法を包含する。一般的に、本発明の化合物は、以下の反応スキームによって調製され得る：
【００７３】
【化５】
2004525906.tif 000005
上記の反応スキームにおいて、Ｎ−シアノ−Ｓ−メチルイソチオウレア１を、ｉ−ＰｒＯＨ中に溶解し、その後ＮａＯＨを添加する。生じた溶液を加熱し、次いで冷却して中間体塩のナトリウムジシナミド２を生成する。次いでこの中間体塩を、ＨＣｌ中の適切に置換されたアナリン３に添加する。この反応混合物を加熱し、冷却して、次いでエバポレートして、粗生成物として構造（Ｉ）の化合物を生成し、次いでこの生成物を精製して、所望の純度を有する構造（Ｉ）の化合物を生成する。
【００７４】
上に示すように、関節炎障害の存在および危険度を決定するための臨床的なパラメーターおよび判断基準は十分確立されており（例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら，「Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ」，１４節，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第８版，Ｔｈｏｒｎら編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７７，２０４８−２０８０頁）、これは改変したミトコンドリア機能に関連する多くの他の疾患の存在または危険度を決定するための判断基準（これもまた本明細書中に開示される）と同様である（例えば、ＡＤに関しては、ＭｃＫｈａｎｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４：９３９，１９８４；ＤｅＫｏｓｋｙら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２７（５）：４６７−６４，１９９０；糖尿病に関しては、Ｇａｖｉｎら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（補追１）：Ｓ５−Ｓｌ９，１９９９；など。改変したミトコンドリア機能に関連する疾患の、他の診断的な判断基準は、当業者に知られており、そして本明細書中の開示に基づく）。「改変したミトコンドリア機能」とは、非限定的な理論によると、関節炎障害を伴い得るものを包含する、任意の条件または状態のことをいい得、この場合、ミトコンドリア機能と直接的または間接的に関係する任意の構造または活性が、コントロールまたは標準に対して統計学的に有意な様式で変化されている。改変したミトコンドリア機能は、ミトコンドリア外の構造もしくは事象、およびミトコンドリアの構造もしくは事象において、ミトコンドリア遺伝子および／もしくはそれら遺伝子産物と、ミトコンドリア外の遺伝子および／もしくはそれら遺伝子産物との間の直接的な相互作用において、またはそのような相互作用の結果として形成され得る中間体（代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆体、補因子などを含む）の間の相互作用の結果として発生する構造的変化もしくは機能的変化において、その変化の起源を有し得る。
【００７５】
さらに、改変したミトコンドリア機能とは、生化学的供給源のいくつかの細胞または全ての細胞において変化した、呼吸活性、代謝活性、または他の生化学的もしくは生物物理学的な活性を包含する。非限定的な例として、著しく不活性化したＥＴＣ活性は、改変したミトコンドリア機能と関連し得、これは反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成増大、または酸化的リン酸化の欠損であり得ることと同様である。さらなる例として、改変したミトコンドリアの膜電位（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２２２６１；ＰＣＴ／ＵＳ００／１７３８０）、細胞内カルシウム恒常性の改変したミトコンドリアの調節（米国特許第６，１４０，０６７）、アポトーシス経路の誘発、ならびに細胞内での異常な化学的および生化学的に架橋された種の形成は、酵素的または非酵素的な機構によるかどうかに関わらず、すべて、改変したミトコンドリア機能の指標とみなされ得る。改変したミトコンドリア機能のこれらおよび他の非限定例は、以下にさらに詳細に記載される。
【００７６】
理論に束縛されることを望まないが、本明細書中で提供されるような、関節炎障害または改変したミトコンドリア機能と関連した別の疾患に特徴的であり得る改変したミトコンドリア機能は、また、フリーラジカルの酸化とは別の機構によって（例えば、ミトコンドリア膜通過型の（ｔｒａｎｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）シャトルおよびトランスポーター（例えば、ミトコンドリアのアデニンヌクレオチドトランスポーターまたはマレエート−アスパルテートのシャトル）の欠損によって、細胞内カルシウム流動によって、ＡＴＰ生合成の欠損によって、ヘキソキナーゼもしくは他の酵素のミトコンドリアポーリン（例えば、電圧依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）としても知られる）との会合の減少によって、または他の事象によって）、ミトコンドリア膜電気化学的電位の消失に関連し得る。ミトコンドリア内膜電位のこのような崩壊は、ミトコンドリアの遺伝子、遺伝子産物もしくは関連の下流のメディエーター分子、および／またはミトコンドリア外の遺伝子、遺伝子産物もしくは関連の下流のメディエーターの直接的または間接的な影響から、あるいは他の既知または未知の原因から生じ得る。
【００７７】
背景として、機能性ミトコンドリアはミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）中に存在するミトコンドリア遺伝子、および環状ミトコンドリアゲノム中には存在しないミトコンドリア外遺伝子（例えば、核遺伝子）によってコードされる遺伝子産物を含む。この１６．５ｋｂのｍｔＤＮＡは、２２個のｔＲＮＡ、２つのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および電子伝達鎖（ＥＴＣ）の１３個の酵素（例えば、呼吸性酸化的リン酸化が起こる、精巧な多重複合体のミトコンドリアのアセンブリ）をコードする。ミトコンドリアの構造タンパク質および機能タンパク質の圧倒的大部分は、ミトコンドリア外遺伝子によって、そして大部分の場合おそらくは核内の遺伝子において、コードされる。従って、ミトコンドリア遺伝子とミトコンドリア外遺伝子は、直接的に関係し得るか、または遺伝子産物およびそれらの下流の中間体（代謝産物、異化代謝産物、基質、前駆体、補因子などを含む）を介して間接的に相互作用し得る。従って、ミトコンドリア機能における変化（例えば、不活性化した電子伝達活性、欠陥の酸化的リン酸化または増加したフリーラジカルの生成）は、欠陥のｍｔＤＮＡ、欠陥のミトコンドリア外ＤＮＡ、欠陥のミトコンドリア遺伝子産物もしくはミトコンドリア外遺伝子産物、欠陥の下流の中間体またはこれらおよび他の因子の結果として生じ得る。
【００７８】
本発明の特定の実施形態に従って、本発明は、関節炎障害および／または改変したミトコンドリア機能に関連の疾患と関係するため、変化した（例えば、コントロールに対して、統計学的に有意な様式で増加または減少された）ミトコンドリア機能の決定は、生理学的および病態生理学的なカルシウムの調節を含む、細胞内カルシウム恒常性および／またはこの恒常性の撹乱に対する細胞応答をモニターする工程を包含し得る。特に、これらの実施形態に従って、改変したミトコンドリア機能と関連する疾患を有することが知られるかまたは推定される被験体からの生化学的サンプルにおいて上昇した細胞内カルシウムに対する細胞応答を、コントロールの被験体由来の生化学的サンプルにおける応答と比較する。上昇した細胞内カルシウムに対する細胞応答の範囲は広範であり、このような応答の検出に関する方法および試薬の範囲もまた広範である。多くの特定の細胞応答は、当業者に公知であり；これらの応答は、選択される生物学的サンプル中に存在する特定の細胞型に依存する。非現的的な例として、上昇した細胞内カルシウムに対する細胞応答としては、特定の分泌性産物の分泌、特定の予め生成された成分のエキソサイトーシス、増大したグリコーゲン代謝および細胞増殖が挙げられる（例えば、Ｃｌａｐｈａｍ，Ｃｅｌｌ  ８０：２５９，１９９５；Ｃｏｏｐｅｒ，「Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ−Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，１９９７  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，Ｂｒａｙ，Ｄ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１９９５  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ＮＹを参照のこと）
簡潔な背景として、ミトコンドリア内Ｃａ２＋の通常の変化は、正常な代謝調節と関連する（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２９−５５頁において、Ｄｙｋｅｎｓ，１９９８；Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５７−８９頁においてＲａｄｉら，１９９８；ＧｕｎｔｅｒおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：Ｃ７５５，１９９１；Ｇｕｎｔｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：３１３，１９９４）。例えば、ミトコンドリアの遊離Ｃａ２＋の振動性のレベルは、酵素のアロステリック調節（Ｃｒｏｍｐｔｏｎら，Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８８：５１３−２３，１９９３によって概説される）およびグリセロホスフェートシャトル（Ｇｕｎｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１，１９９４）を介した、増加したＡＴＰ利用に応答して酸化的代謝を調節することの原因であり得る。
【００７９】
通常なミトコンドリア機能は、ミトコンドリアマトリクス内の過剰のＣａ２＋の隔離による、細胞質遊離カルシウムレベルの調節を包含する。細胞型に依存して、細胞質Ｃａ２＋濃度は典型的に５０〜１００ｎＭである。正常に機能している細胞において、Ｃａ２＋レベルが２００〜３００ｎＭに達する場合、ミトコンドリアは、ミトコンドリア内膜においてＣａ２＋ユニポーターを介した流入と、Ｎａ＋依存性キャリアおよびＮａ＋非依存性キャリアの両方を介したＣａ２＋の流出との間の平衡機能として、Ｃａ２＋を蓄積し始める。特定の例において、細胞内カルシウム恒常性のこのような隔離は、カルシウム調節機能不全が改変したミトコンドリア機能の原因性であるか、または結果性であるかどうかに関わらず、改変したミトコンドリア機能と関連する疾患の特徴である。
【００８０】
従って、上昇したミトコンドリアのカルシウムレベルは、上記のように、細胞質遊離カルシウムの初めの開始に応答して蓄積し得る。このような上昇したミトコンドリアのカルシウム濃度は、低減されたＡＴＰまたはミトコンドリアの病理と関連した他の状態と組み合わさり、ミトコンドリア内膜電位の崩壊を導き得る（Ｇｕｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：５，１９９８；ＲｏｔｔｅｎｂｅｒｇおよびＭａｒｂａｃｈ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０１６：８７，１９９０を参照のこと）。一般的に、生物学的サンプル中のＣａ２＋のミトコンドリア外（細胞質）のレベルは、ミトコンドリア内に存在するよりも高い。改変したミトコンドリア機能と関連する疾患の場合、ミトコンドリアカルシウムレベルまたは細胞質カルシウムレベルは、上記の範囲とは異なり得、そして例えば、約１ｎＭ〜約５００ｍＭ、より典型的には約１０ｎＭ〜約１００μＭ、そして通常は約２０ｎＭ〜約１μＭ（ここで、「約」とは±１０％を示す）の範囲内であり得る。種々のカルシウム指示薬は当該分野で公知であり、これらには、例えば、ｆｕｒａ−２（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９７３：４２０，１９８９）；ｍａｇ−ｆｕｒａ−２；ＢＴＣ（米国特許第５，５０１，９８０号）；ｆｌｕｏ−３，ｆｌｕｏ−４およびｆｌｕｏ−５Ｎ（米国特許第５，０４９，６７３号）；ｒｈｏｄ−２；ベンゾチアザ−１；ならびにベンゾチアザ−２（これらの全ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内カルシウムをモニターするためのこれらの手段または任意の他の手段は、改変したミトコンドリア機能の存在を決定するために企図される（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１５００を参照のこと）。
【００８１】
従って、上昇した細胞内カルシウムに対する細胞応答として明白である改変したミトコンドリア機能を決定するために、上昇したＣａ２＋の細胞質濃度およびミトコンドリア濃度を誘発する、カルシウムイオノホアを含む化合物は、細胞内カルシウムを測定する方法と同様に、当業者に周知である（例えば、ＧｕｎｔｅｒおよびＧｕｎｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２６：４７１，１９９４；Ｇｕｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６６：５，１９９８；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９７３：４２０，１９８９；ＯｒｒｅｎｉｕｓおよびＮｉｃｏｔｅｒａ，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．４３：１，１９９４；ＬｅｉｓｔおよびＮｉｃｏｔｅｒａ，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２：７９，１９９８；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ，１９９６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲを参照のこと）。従って、当業者は、適切なイオノホア（または増加した細胞質および／またはミトコンドリアのＣａ２＋濃度を生じる別の化合物）、および本開示および周知の方法に従う改変したミトコンドリア機能の同定における使用のために、細胞内カルシウムを検出するための適切な手段を容易に選択し得る。
【００８２】
ミトコンドリアへのＣａ２＋流入は、電子伝達によってミトコンドリア内膜に生じた負の膜貫通電気化学ポテンシャル（ΔΨ）に大部分依存すると考えられ、そして恐らくそれに完全に依存し、そのような流入は、８倍濃度のＣａ２＋濃度勾配が課された場合でさえも、ΔΨの非存在下では生じない（Ｋａｐｕｓら、１９９１  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８２：６１）。従って、ミトコンドリアは、膜電位が消失した場合、２，４−ジニトロフェノールおよびカルボニルシアニド  ｐ−トリフルオロ−メトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）のような脱共役剤を用いて生じるように、Ｃａ２＋を放出し得る。従って、本発明の特定の実施形態に従って、ΔΨの減衰は、関節炎障害を有する被験体の細胞が遭遇する条件を含む特定の生理的条件下で生じ得るように、ミトコンドリアへの細胞質遊離カルシウムの流入によって増強され得る。そのような減衰の検出は、本明細書中に提供される種々の手段によって達成され得る。
【００８３】
本発明の関連する特定の実施形態において、改変された（例えば、コントロールに比べて統計的に有意な形態で増加または減少した）ミトコンドリア膜電位は、改変されたミトコンドリア機能の指標であり得る。代表的には、ミトコンドリア膜電位は、蛍光指示器、光学プローブならびに／または高感度のｐＨおよびイオン選択性電極のような、検出可能な化合物の検出および／または測定を含むがそれらに限定されない、当業者が容易に精通する方法に従って決定され得る（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓ，１９８１；および引用された参考文献を参照のこと；Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２６６−２７４頁および５８９−５９４頁もまた参照のこと）。例えば、例示のためであるが限定のためではなく、蛍光プローブ（２−，４−ジメチルアミノスチリル−Ｎ−メチルピリジニウム）（ＤＡＳＰＭＩ）およびテトラメチルローダミンエステル（例えば、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）；テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）のような）または関連する化合物（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９６（前出）を参照のこと）は、ミトコンドリア中の蓄積、ミトコンドリアの膜電位に依存するプロセスおよびそれに比例するプロセスに従って定量され得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１５９−１８６およびその中に引用される参考文献；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌを参照のこと）。本発明で使用され得る他の蛍光検出可能な化合物としては、ローダミン１２３、ローダミンＢヘキシルエステル、ＤｉＯＣ６（３）、ＪＣ−１［５，５’，６，６’テトラクロロ−ｌ，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾール−カルボシアニンヨーダイド］（Ｃｏｓｓａｒｉｚｚａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７：４０，１９９３；Ｒｅｅｒｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６０：４０６，１９９５を参照のこと）、ｒｈｏｄ−２（米国特許第５，０４９，６７３を参照のこと；前述の化合物の全ては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎから市販されている）、ならびにローダミン８００（Ｌａｍｂｄａ  Ｐｈｙｓｉｋ，ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓａｋａｎｏｕｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：２９，１９９７を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。ミトコンドリア膜電位をモニターするための方法はまた、米国特許出願第０９／１６１，１７２号に開示される。
【００８４】
ミトコンドリア膜電位はまた、例えば、ＴＴＰ（テトラフェニルホスホニウムイオン）およびＴＴＰ感受性電極を使用することによる、非蛍光手段によって測定され得る（Ｋａｍｏら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．４９：１０５，１９７９；ＰｏｒｔｅｒおよびＢｒａｎｄ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｒ１２１３，１９９５）。当業者は、適切な検出可能な化合物またはΔΨｍを測定するための他の適当な手段を選択し得る。例示のためであるが限定のためではなく、ＴＭＲＭは、いくらかＴＭＲＥに好ましい。なぜなら、ミトコンドリアの流入に続いて、ＴＭＲＥが、小胞体および細胞質中に、ＴＭＲＭよりわずかに多い残存シグナルを生じるからである。
【００８５】
別の非限定的な例として、膜電位は、検出可能な荷電溶質に対するミトコンドリアの透過性の間接的測定から、マトリクス容積および／または分光光度的定量または蛍光光度的定量と組合わせてピリミジンヌクレオチドの酸化還元決定を使用して、追加的にまたは代替的に計算され得る。ミトコンドリア内膜を横切る基質の交換−拡散に依存する膜電位の測定法はまた、膜電位の間接的測定法を提供し得る（例えば、Ｑｕｉｎｎ，１９７６，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２００−２１７頁およびその中に引用される参考文献を参照のこと）。
【００８６】
上記のように、細胞内カルシウムの上昇から生じる、Ｃａ２＋のミトコンドリア内の異常な蓄積に対する鋭敏な感受性はまた、改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患を特徴付け得る。さらに、ヒドロペルオキシドおよびフリーラジカルを含む、種々の生理学的に適切な薬剤は、Ｃａ２＋と共同し、ΔΨの消失を誘導し得る（Ｎｏｖｇｏｒｏｄｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０５８：２４２，１９９１；Ｔａｋｅｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４：７１９，１９９３；Ｇｕｉｄｏｘら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０６：１３９，１９９３）。従って、細胞内カルシウムを上昇に応答して細胞内に現れる、改変されたミトコンドリア機能または改変されたミトコンドリア膜電位を決定するための方法の非限定的な例は、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）アッセイ（同時係属中の米国特許出願第６０／１４０，４３３号に記載される）およびミトコンドリア透過性移行（ＭＰＴ）アッセイ（同時係属中の米国特許出願第０９／１６１，１７２号に記載される）を含む。
【００８７】
改変されたミトコンドリアの機能はまた、（ｉ）改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患に対する危険性があると考えられる被験体、および（ｉｉ）コントロールの被験体からの生物学的サンプルにおけるアポトーシス誘導性（「アポトジェニック（ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ）」）刺激に対する細胞性応答を比較することによって決定され得る。種々の公知のアポトジェニック刺激の細胞性応答の範囲は、そのような応答の検出のための方法および試薬の範囲と同程度に広い。従って、アポトジェニック刺激に対する細胞性応答を、そのような応答が本明細書中に提供されるような改変されたミトコンドリア機能の指標である場合、そのように比較することによって、改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患を決定することは、本発明の企図の範囲内である。
【００８８】
上記に示されるように、ミトコンドリアの機能障害および／または関連する上昇したＲＯＳレベルは、種々の細胞型におけるアポトーシスを導く初期の事象を開始し得る（Ｋｒｏｅｍｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１２７７−８７，１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７−７７，１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１６６１−７２，１９９５；Ａｕｓｓｅｒｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２−４２，１９９４）。種々の細胞型において、ミトコンドリア膜電位の減少（ΔΨｍ）は、アポトーシスを伴う核ＤＮＡの分解に先行する。無細胞系において、ミトコンドリア（核ではない）濃縮分画は、核アポトーシスを含み得る（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７０：３５３−６４，１９９４）。上昇した細胞内ＲＯＳのような、改変された細胞代謝状態を導くミトコンドリア呼吸活性の摂動は、改変されたミトコンドリア機能に関連する疾患において生じ得、そしてアポトーシス機構を介して病原性の事象をさらに誘導し得る。
【００８９】
酸化的ストレスを受けたミトコンドリアは、アポトーシスに先行する出来事である、染色体の凝集を含み得る、前もって形成された可溶性因子を放出し得る（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２０３３−３８，１９９６）。さらに、抗アポトーシス遺伝子産物のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは、ミトコンドリア外膜に位置し（Ｍｏｎａｇｈａｎら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１８１９−２５，１９９２）、そしてこれらのタンパク質は、酸化的ストレスから膜を保護すると考えられる（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１２７１：６３，１９９５）。この膜へのＢｃｌ−２の局在化は、アポトーシスの調節にとって不可欠であると考えられる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６５２１−２４，１９９４）。従って、ミトコンドリアの生理学における変化は、アポトーシスの重要な伝達物質であり得る。
【００９０】
従って、改変されたミトコンドリアの機能は、本発明の開示に従う、被験体における改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患に対する危険性を同定するために使用され得るように、アポトジェン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）によるアポトーシスの誘導に関する閾値を低下させ得る。種々のアポトジェンが、当業者に公知であり（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９，１９９８；およびその中に引用される参考文献を参照のこと）、そしてそのアポトジェンとしては、限定ではなく例として、当業者が精通する適切な条件下で細胞に添加される場合に、腫瘍壊死因子レセプター、ＦａｓＬレセプター、グルタミン酸レセプター、ＮＭＤＡレセプター、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−３レセプター、コルチコステロンレセプター、鉱質コルチコイドレセプターまたは糖質コルチコイドレセプターのような特定のレセプターを必要とするアポトジェンが挙げられる。アポトジェンとしては、さらに、ヘルビマイシンＡ（Ｍａｎｃｉｎｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：４４９−６９，１９９７）；パラクアット（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ９９：１−２，１９９５）；エチレングリコール；タンパク質キナーゼインヒビター（例えば、スタウロスポリン、カルホスチン（ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ）Ｃ、カフェイン酸フェネチルエステル、ケレリトリンクロリド、ゲニステインのような）；１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン；Ｎ−［２−（（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル］−５−５−イソキノリンスルホンアミド；ＫＮ−９３；ケルセチン；ｄ−エリスロ−スフィンゴシン誘導体；ＵＶ照射；イオノフォア（例えば、イオノマイシン、バリノマイシンおよび当該分野で公知の他のイオノフォアのような）；ＭＡＰキナーゼ誘導物質（例えば、アニソマイシンおよびアナンダミン（ａｎａｎｄａｍｉｎｅ）のような）；細胞周期ブロッカー（例えば、アフィディコリン、コルセミド、５−フルオロウラシルおよびホモハリントニンのような）；アセチルコリンエステラーゼインヒビター（例えば、ベルベリンのような）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェンのような）；酸化促進剤（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、パーオキシナイトライト、過酸化水素ならびにＬ−アルギニン、５，５’−ジニトロソジチオール、Ｎ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソグルタチオン、ＮＯＲ−１、ＮＯＲ−３、ＮＯＲ４、４−フェニル−３−フロキサンカルボニトリル、３−モルホリノシドノニミン、ニトロプルシドナトリウムおよびストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）が挙げられるがこれらに限定されない一酸化窒素ドナーのような）；グルタチオン枯渇化因子（例えば、エタクリン酸（Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２７１：３５，１９９５）のような）；フリーラジカル（例えば、一酸化窒素のような）；無機金属イオン（例えば、カドミウムのような）；ＤＮＡ合成インヒビター（例えば、アクチノマイシンＤのような）；ＤＮＡインターカレーター（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン硫酸、ヒドロキシウレア、��トトレキサート、マイトマイシンＣ、カンプトセシン、およびダウノルビジンのような）；タンパク質合成インヒビター（例えば、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、およびラパマイシンのような）；微小管の形成または安定性に影響する薬剤（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、コルヒチン、４−ヒドロキシフェニルレチナミド、およびパクリタキセルのような）；および他のＭＰＴ誘導物質（例えば、Ｂａｘタンパク質（Ｊｕｒｇｅｎｍｅｉｅｒら、ＰＮＡＳ  ９５：４９９７−５００２，１９９８）、カルシウムおよび無機リン酸（Ｋｒｏｅｍｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：６１９，１９９８）のような）が挙げられる。
【００９１】
アポトーシスが起こっている可能性がある生物学的サンプル中の細胞は、アポトーシス状態を示す形態学的変化、透過性の変化または他の変化について試験され得る。例えば、限定ではなく例として、多くの細胞型におけるアポトーシスは、（例えば、光学顕微鏡を使用することによって）当業者が容易に検出し得る、細胞膜泡状物、細胞形状の変化、基材接着特性の損失または他の形態学的変化のような形態学的な外見の改変を引き起こし得る。別の例として、アポトーシスが起こっている細胞は、染色体の断片化および崩壊を示し得、これらの断片化および崩壊は、顕微鏡によっておよび／または蛍光色素を含む当該分野で公知のＤＮＡ特異的色素もしくはクロマチン特異的色素の使用を介して明らかになり得る。そのような細胞はまた、生体色素（例えば、プロピジウムヨーダイド、トリパンブルー）の使用を介してかまたは細胞外環境への乳酸デヒドロゲナーゼの漏出の検出によって容易に検出され得るような、改変された細胞膜透過性を示し得る。形態学的基準、改変された細胞膜透過性および関連する変化によってアポトーシス細胞を検出するためのこれらの方法および他の方法は、当業者に明らかである。
【００９２】
あるいは、改変されたミトコンドリアの指標が、アポトジェンに対する細胞性応答である場合、生物学的サンプル中の細胞は、細胞膜の内部リーフレットから外部リーフレットへの細胞膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションについてアッセイされ得、このトランスロケーションは、例えば、ＰＳ特異性タンパク質アネクシンによる外部リーフレット結合を測定することによって検出され得る（Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１５４５，１９９５；Ｆａｄｏｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２２０７，１９９２）。アポトジェンに対する細胞応答をモニターすることによって改変されたミトコンドリアの機能を決定するための、さらに別の方法において、アポトジェンに対する細胞応答は、カスパーゼとして公知であるアポトーシス活性化プロテアーゼファミリーの任意のメンバーにおける、特定のプロテアーゼの誘導についてのアッセイによって決定される（例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９，１９９８を参照のこと）。当業者は、カスパーゼ活性を決定するための（例えば、特異的に認識されるタンパク質基質の、カスパーゼ媒介性切断の決定による）方法に容易に精通する。これらの基質としては、例えば、ポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）もしくは他の天然に存在するペプチドまたは合成ペプチド、および技術分野で公知のカスパーゼによって切断されるタンパク質が挙げられ得る（例えば、Ｅｌｌｅｒｂｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：６１６５，１９９７を参照のこと）。合成ペプチドＺ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＦＣ（配列番号：      ；）（ここで、「Ｚ」は、ベンゾイルカルボニル部分であり、ＡＦＣは、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリンである（Ｋｌｕｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１３２，１９９７；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３７，１９９５））は、そのような基質の１つである。基質の他の非限定的な例としては、Ｕ１−７０ｋＤａおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓのような核タンパク質が挙げられる（ＲｏｓｅｎおよびＣａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５０，１９９７；Ｃｏｈｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１，１９９７）。
【００９３】
上記のように、ミトコンドリア内膜は、多くの小さな溶質に対して高い選択性および制御された透過性を示し得るが、巨大分子（＞約１０ｋＤａ）に対しては不透過性である（例えば、Ｑｕｉｎｎ，１９７６  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄを参照のこと）。しかし、アポトーシスが起こっている細胞では、ミトコンドリア膜電位の消失は、ミトコンドリア膜を横切る高分子の拡散を可能にする透過性の増加によって達成され得る。従って、アポトジェンへの細胞性応答をアッセイするための別の方法において、アポトーシス細胞においてミトコンドリアから漏出するミトコンドリアタンパク質（例えば、シトクロムＣまたは膜間腔タンパク質）の検出は、容易に決定され得るアポトジェンに対する応答の証拠を提供し得る（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ８６：１４７，１９９６）。そのようなシトクロムＣの検出は、分光光度的に、免疫化学的にまたは特定のタンパク質の存在を決定するために十分に確立された他の方法によって実施され得る。
【００９４】
例えば、アポトーシス刺激物質（例えば、周知のカルシウムイオノフォアであるイオノマイシン）でチャレンジされた細胞由来のシトクロムｃの放出は、種々の免疫学的方法に従い得る。親和性捕捉と連結されたマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法は、特にそのような分析に適している。なぜなら、アポ−チトクロームｃおよびホロ−チトクロームｃは、それらの特有の分子量を基本にして区別され得る。例えば、表面活性化レーザー脱着イオン化（ＳＥＬＤＩＴＭ）システム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、アポトジェン標的化細胞におけるミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を検出し得る。このアプローチにおいて、固体支持体上に固定されたシトクロムｃ特異的抗体は、可溶性細胞抽出物に存在する放出されたシトクロムｃを捕捉するために使用される。次いで、捕捉されたタンパク質は、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）のマトリクス中に入れられ、そしてパルスレーザーの励起を使用して、固体支持体表面から脱離される。タンパク質の分子量は、ＳＥＬＤＩＴＭ質量分光光度計の検出器までの飛行時間によって決定される。
【００９５】
当業者は、アポトーシスを定量するための他の適切な技術が存在し得、そしてアポトジェニック刺激に対する細胞性応答で示される、改変されたミトコンドリアの機能を決定する目的のためのそのような技術は、本発明によって提供される方法の範囲内であることを容易に理解する。
【００９６】
生物学的サンプルにおけるフリーラジカル生成の検出はまた、被験体由来の生物学的サンプルにおける、改変されたミトコンドリアの機能の存在を決定するために使用され得る。ミトコンドリアは、生物学的系におけるフリーラジカルの第１の供給源であるが（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１５９−１８６頁ならびにその中に引用される参考文献を参照のこと）、本発明は、そのように限定されるべきではなく、フリーラジカル生成は、特定の亜細胞供給源部位に関わらず、改変されたミトコンドリアの機能の指標であり得る。例えば、フラビン結合オキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼまたは一酸化窒素シンテターゼのような酵素によって触媒される反応による、過酸化水素、一酸化窒素またはスーパーオキシドラジカルのような代謝物質の生成を介するラジカルの形成を導く、多数の細胞内生化学経路は、そのようなラジカルを検出するための方法のように、当該分野で公知である（例えば、Ｋｅｌｖｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３：２１，１９９３；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  Ｂ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８９，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｊ．Ａ．ら、Ｔｈｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｐａｒａｄｏｘ，Ｃｌｅｕｐ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐａｄｏｖａ，ＩＴを参照のこと）。ＥＴＣのいずれかの工程の失敗のような改変されたミトコンドリアの機能はまた、高度に反応性のフリーラジカルの生成を導く。上に記載されるように、改変されたミトコンドリアの機能から生じるラジカルは、活性酸素種（ＲＯＳ）（例えば、スーパーオキシド、パーオキシナイトライト、およびヒドロキシルラジカル）および潜在的には、細胞に対して毒性であり得る他の反応性種を含む。従って、本発明の特定の好ましい実施形態において、改変されたミトコンドリアの機能の指標は、生物学的サンプル中に存在する検出可能なフリーラジカル種であり得る。特定の好ましい実施形態において、検出可能なフリーラジカルは、ＲＯＳである。
【００９７】
改変されたミトコンドリアの機能の指標として有用であり得るフリーラジカルを検出するための方法は、当該分野で公知であり、特定のラジカルに依存する。代表的には、生物学的サンプルのフリーラジカル生成のレベルは、以下の方法および／または測定法を含むがこれらに限定されない、当業者が容易に精通する方法に従って決定され得る：ペントシジン、カルボキシメチリジンおよびピロリンを含む糖化酸化生成物；グリオキサール、マロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシノネナールを含む脂質過酸化生成物；チオバルビツール酸反応性基質（ＴＢＡＲＳ；例えば、Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３８８３，１９８４；Ｗｏｌｆｆ，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４９：６４２，１９９３を参照のこと）および／あるいはヒドロキシルラジカルのサリチル酸塩捕捉（例えば、Ｇｈｉｓｅｌｌｉら、Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：８９，１９９８；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．２７：２３９，１９９７）またはマロンジアルデヒド形成、タンパク質ニトロシル化、ミトコンドリアのＤＮＡ酸化を含むＤＮＡ酸化（８’−ＯＨ−グアノシン付加物）（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４２４：５１，１９９９）、タンパク質酸化、タンパク質カルボニル修飾（例えば、Ｂａｙｎｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：４０５，１９９１；Ｂａｙｎｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１，１９９９）を含む特定の付加物の形成（例えば、Ｍｅｃｏｃｃｉら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３４：６０９，１９９３；Ｇｉｕｌｉｖｉら、Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３３：３６３，１９９４を参照のこと）のような他の化学的検出手段；電子スピン共鳴（ＥＳＲ）プローブ；サイクリックボルタメトリー（ｃｙｃｌｉｃ  ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）；蛍光指示物質および／または化学蛍光物質（例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ａ．（編），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；ＡｃｗｏｒｔｈおよびＢａｉｌｅｙ，（編），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９９５，ＥＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ；Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１０８６，１９８９；Ｖｅｌａｚｑｕｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：７５２，１９９１；Ｂｅｌｃｈら、Ｉｎｔ．Ａｎｇｉｏｌ．１４：３８５，１９９５；Ｓａｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．２１：１０４，１９７９；Ｔｒａｖｅｒｓｏら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１：２６５，１９９８；Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−Ｓｉｘｔｈ編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，４８３−５０２頁、ならびにその中に引用される参考文献もまた参照のこと）。例えば、限定ではなく例示として、蛍光プローブであるジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸およびそのカルボキシル化誘導体であるカルボキシジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９６，前出を参照のこと）の酸化は、反応性酸素種の存在に依存し、かつそれに比例するプロセスである、細胞中での蓄積の後に定量され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓもまた参照のこと）。本発明でフリーラジカル生成物の検出のために使用され得る他の蛍光検出可能な化合物としては、ジヒドロローダミン、ジヒドロロサミン（ｄｉｈｙｄｒｏｒｏｓａｍｉｎｅ）誘導体、ｃｉｓ−パリナリン酸、リゾルフィン誘導体、ルシゲニンおよび当業者に公知であり得る任意の他の適切な化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
従って、上記にもまた記載されるように、フリーラジカル媒介性損傷は、ＥＴＣの無数のタンパク質の１つ以上を不活化し得、それが生じている間、酸化的リン酸化およびＡＴＰ生成を担うミトコンドリアの化学浸透機構と分離し得る。ＡＴＰ生成の決定を含む、ＡＴＰ生合成因子である改変されたミトコンドリアの機能の指示物質は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／２５３１７号および米国特許第６，１４０，０６７号に、より詳細に記載される。ミトコンドリアの機能の完全性に対するフリーラジカル媒介性の損傷はまた、ミトコンドリア内膜によって保持される電気化学ポテンシャルの消失を生じ得る改変されたミトコンドリアの機能に関連する多数の機構のほんの一例である。ミトコンドリア内膜電位の変化を検出するための方法は、上記および同時係属中の米国特許出願第０９／１６１，１７２号に記載される。
【００９９】
生物学的サンプルは、改変されたミトコンドリアの機能の少なくとも１つの候補指示物質が検出され得る任意の組織または細胞調製物を含み得、比較されるべき特定の指示物質に依存して、それに従って性質が変化し得る。従って、本明細書中の開示に基づいて、当業者に明らかであるように、特定の高度に好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、ミトコンドリアを含む細胞または細胞調製物を含み、そして、特定の他の好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、亜ミトコンドリア粒子を含み得る。生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源由来の、血液サンプル、生検標本、組織外植片、器官培養物または任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。被験体または生物学的供給源としては、ヒトまたは非ヒト動物であり、染色体に組込まれた組換え核酸配列またはエピソームの組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化細胞株または不死化可能細胞株、体細胞ハイブリッドまたは細胞質ハイブリッド「サイブリッド（ｃｙｂｒｉｄ）」細胞株、分化した細胞株または分化し得る細胞株、形質転換された細胞株などが挙げられるがこれらに限定されない、初代細胞培養物または培養適合細胞株であり得る。特に好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物であり、そして他の特に好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源は、本明細書中に提供されるように、脊椎動物由来の初代細胞培養物または培養適合細胞株であるが、本発明は、そのように限定される必要はない。例示による非限定的な例として、特定の実施形態において、本発明は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／２５３１７号および米国特許第６，１４０，０６７号において提供されるように、例えば、組換え遺伝子操作技術を介して、人工的に操作された非脊椎動物組織または非脊椎動物細胞調製物であり得る生物学的サンプルが、ミトコンドリア分子構成成分および／またはＡＴＰ生合成因子のような、１つ以上の脊椎動物由来遺伝子、脊椎動物由来遺伝子産物などを含むことを意図する。例えば、多くの酵母細胞株および昆虫細胞株は、当業者が精通する確立された方法に従って、異種脊椎動物由来の構成成分を用いて容易に再構成され得、本明細書中に提供されるような改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患に関するモデル系を生成する。従って、生物学的サンプルに対する多くのバリエーションおよび改変は、本発明の企図される範囲および精神の範囲内にある。
【０１００】
本発明の特定の他の特に好ましい実施形態において、被験体または生物学的供給源は、改変されたミトコンドリアの機能に関連する関節障害および／または関節疾患を有するかまたは有する危険性の疑いがあり得、そして本発明の特定の好ましい実施形態において、この被験体または生物学的供給源は、そのような疾患の危険性がないかまたは存在しないことが既知であり得る。被験体または生物学的供給源が関節障害を示す臨床的パラメーターに含まれるかどうかを決定することが望ましい、特定の他の好ましい実施形態において、当業者によって受け入れられる関節疾患の徴候または症状（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（７ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｈ．Ｋｌｉｐｐｅｌ（編），１９９７  Ｔｈｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）およびその中に引用される参考文献にいわれる臨床的徴候または関節障害を診断するために、当該分野で公知の他の手段）は、被験体または生物学的供給源をそうであると示すために使用される。同様に本明細書中に提供されるような改変されたミトコンドリアの機能に関連する特定の他の疾患を示す臨床的パラメーターは、当該分野で公知であり、上で議論される。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つの改変された機能を検出された被験体または生物学的供給源由来の生物学的サンプルは、本明細書中に提供されるようなアリールＮ−シアノグアニジン薬剤のような、構造（Ｉ）の組成物と被験体または生物学的供給源とを接触させる前後で比較され得、例えば、被験体または生物学的供給源を薬剤へ曝す前に、薬剤は、ミトコンドリアの機能のレベルについての変化に影響し得る候補のミトコンドリアの機能を同定する。
【０１０２】
本発明の最も好ましい実施形態において、改変されたミトコンドリア機能が決定された生物学的サンプルとしては、軟骨細胞、そしてさらにより好ましくは関節軟骨細胞が挙げられる。軟骨細胞は、例えば、通常の成熟軟骨組織から得られ得る。例えば、米国特許第４，８４６，８３５号および５，０４１，１３８号は、コラーゲナーゼ溶液中で関節軟骨を消化することによって軟骨細胞を単離、そして続くインビトロでの軟骨細胞の有糸分裂増殖を開示する。本発明の別の好ましい実施形態において、改変されたミトコンドリアの機能の少なくとも１つの候補指示物質を含む生物学的サンプルは、軟骨細胞由来のマトリクス小胞（ＭＶ）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．１４：３０３，１９８８；Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１９９，１９８２；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｈｏｓｐ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｆｆ．Ｅｄ．２９：９３，１９９４）（例えば、多くの確立された手順（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：８８３，１９９９）のいずれかに従ってか、または当業者が精通する他の技術によって調製されたＭＶ）を含み得る。
【０１０３】
軟骨細胞および骨芽細胞によるマトリクスカルシウム沈着の開始は、マトリクス小胞（ＭＶ）として公知の膜限定細胞フラグメントの放出によって媒介されると考えられる。ＭＶ構成成分（種々の酵素を含む）は、細胞外マトリクスを改変し、そしてＭＶ内部は、ヒドロキシアパタイト結晶形成のための保護された環境を提供する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３１４：２６６−８０，１９９５；Ｂｏｓｋｅｙら、Ｃａｌｃｉｆ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６０：３０９−１５，１９９７；Ｂｏｓｋｅｙ，Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３５：３５７−６３，１９９６；およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｐｒｏｇ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３１：１−１８７，１９９６）。ＭＶ調製の方法は、本明細書中に開示され、そして他の方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：８８３−９２，１９９９，および米国特許第５，６５６，４５０号を参照のこと）。
【０１０４】
ミトコンドリアおよびＳＭＰは、種々の方法によって調製され得る（例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１：２９２−９９，１９７４；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４１１−８１，１９７８；ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４８：１１１−２０，１９８６；およびＬａｕｑｕｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４６０：３３１−４５，１９７７を参照のこと）。例えば、ミトコンドリアおよび／またはＳＭＰを調製するために、以下の手順を使用し得る。細胞溶解物を、６００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、そしてこの第１の上清を除去し、取っておく。細胞膜物質を含むペレットを、１００μｌのＭＳＢ（２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて洗浄し、第２の上清を生成するために、６００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。第１および第２の上清を合わせ、そして１４，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し；得られたペレットは、ミトコンドリアを調製するためにＭＳＢ中に再懸濁されたミトコンドリア分画を示す。そのようなミトコンドリアを、０．２５ｍｇ／ｍｌのジギトニン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に２分間インキュベートし得、亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）を生成するために、カップホルン超音波破砕機中で５０％能率サイクルで３分間超音波処理する。
【０１０５】
従って、本明細書中に提供される場合、生物学的サンプルは、特定の好ましい実施形態において、軟骨細胞、軟骨細胞由来ＭＶおよび／または軟骨細胞由来亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）を含み、この生物学的サンプルにおいて、改変されたミトコンドリアの機能の１つ以上の指示物質のレベルが、比較され得る。
【０１０６】
本発明の別の好ましい実施形態において、改変されたミトコンドリアの機能の少なくとも１つの候補物質を含む生物学的サンプルは、全血を含み得、そして、この生物学的サンプルは、別の好ましい実施形態において、全血の粗製軟膜画分を含み得、血小板および有核血液細胞（好中球、好酸球および好塩基球を含むリンパ球、単球および顆粒球のような白血球）で濃縮された全血の微粒子画分、ならびに実質的に枯渇化した赤血球をさらに含むことは当該分野で公知である。当業者は、そのような軟膜画分をどのように調製するかを知り、この軟膜画分は、例えば、規定された条件下で、密度依存性分離溶媒の使用を含む、血液構成成分の差示的な密度勾配沈降によって、または他の方法によって調製され得る。他の好ましい実施形態において、改変されたミトコンドリア画分の少なくとも１つの指示物質を含む生物学的サンプルは、例えば、リンパ球、多形核白血球、顆粒球などのような、濃縮され、単離されまたは精製された血液細胞部分集団分画を含み得る。特定の造血細胞部分集団の選択的な調製のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、（編）１９９８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹを参照のこと）。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態に従って、生物学的サンプルを得た特定の細胞型および組織型は、共通の生物学的供給源の異なる細胞型または組織型から得られる、改変されたミトコンドリアの機能に対応する候補指示物質に比べて、この生物学的サンプルの中に含まれる改変されたミトコンドリアの機能に対する少なくとも１つの候補指示物質の定性的局面および定量的局面に影響し得る。従って、本発明の利点を、特定の指標（例えば、本明細書中に提供される場合、改変されたミトコンドリアの機能に関連する関節障害および関節疾患）に対して、およびさらに脊椎動物被験体における、既知のまたは疑わしい関節障害（または改変されたミトコンドリアの機能に関連する疾患）の特定の進行度に対して最も有用にし得るように、異なる細胞型または組織型からの生物学的サンプルにおける改変されたミトコンドリアの機能の少なくとも１つの候補指示物質を定量することは、本発明の企図の範囲内である。関連する細胞型または組織型は、そのような疾患の当業者に公知である。
【０１０８】
例えば、本明細書中に提供される場合、関節軟骨細胞は、関節障害の状況において、特に好ましい細胞型を示し得る。なぜなら、軟骨恒常性、骨移植回復または靱帯移植回復、瘢痕組織吸収または結合組織再造形（例えば、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄間質細胞、筋細胞、運動神経／末端プレート細胞、炎症細胞および／または骨膜細胞）のような、関節の成長プロセス、安定化プロセス、維持プロセスおよび修復プロセスにおける他の細胞型もまた示し得るからである。
【０１０９】
ミトコンドリア変化が、特定の疾患状態に寄与し得るか否かを決定するために、診断試験のためおよび候補治療薬をスクリーニングするためのモデルシステムを構築することが有用であり得、このモデルシステムにおいて、核遺伝バックグラウンドは、ミトコンドリアゲノムが改変される間一定に保たれ得る。培養細胞からミトコンドリアＤＮＡを枯渇させて、ρ０細胞を産生し、それによってミトコンドリア遺伝子の発現および複製を防ぎ、ミトコンドリア機能を不活化させることは、当該分野で公知である。レシピエント細胞の呼吸表現型（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に対するドナーミトコンドリア遺伝型の寄与を評価するために、外来細胞由来のミトコンドリアを用いてこのようなρ０細胞を増殖させることは、当該分野においてさらに公知である。このような細胞質ハイブリッド細胞は、異なる生物学的起源のゲノムＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを含み、サイブリドとして公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ  ９５／２６９７３および米国特許番号５，８８８，４９８（これらは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）、および本明細書中に列挙される参考文献を参照のこと。
【０１１０】
特定の他の実施形態において、本発明は、化学構造（Ｉ）を有する薬剤を含む組成物を患者に投与することによって関節炎障害を有する患者を処置する方法を提供し、この化学構造（Ｉ）は、関節炎障害を有することまたは関節炎障害を有する危険性があることについての、少なくとも１つの臨床的規準を実質的に改善（例えば、実質的に有意な様式において、コントロールまたは無症候状態に近付けるための変化）する（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，第７版，Ｊ．Ｈ．Ｋｌｉｐｐｅｌ（編），１９９７  Ｔｈｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡを参照のこと）。本発明はまた、化学構造（Ｉ）を有する薬剤を含む組成物を患者に投与することによって異常ミトコンドリア機能と関連する疾患を有する患者を処置する方法を提供し、この化学構造（Ｉ）は、このような疾患を有することまたはこのような疾患を有する危険性があることについての、少なくとも１つの臨床的規準を実質的に改善（例えば、統計学的に有意な様式において、コントロールまたは無症候状態に近付けるための変化）し、当該分野で公知であるようであり、そして本明細書中で提供されるとおりである。当業者は、このような臨床的規準における変化が、通常の値により近いレベルをもたらし、そして／または被験体に臨床的に有益であるか否かを容易に決定し得る。従って、本発明によって提供される好ましい薬剤は、このようなレベルを十分にまたは部分的に回復し得る薬剤を含み得る。
【０１１１】
従って、本明細書中で提供されるような特定の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、関節炎障害の処置および／または異常ミトコンドリア機能に関連する疾患の処置に適切であり、構造（Ｉ）の薬剤（例えば、アリールＮ−シアノグアニジン薬剤）を含む。関節炎障害の場合において、このような薬剤は、関節炎障害（例えば、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、変形性関節症（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）など）を予防または処置するため、および損傷した関節（例えば、外傷によって損傷した軟骨または反復運動障害）の治癒を促進するために使用され得る。任意の特定の理論によって制限されることを望むことなく、いくつかのこのような薬剤は、抗酸化薬としての活性を有し得、そしてミトコンドリアに対する酸化ストレス損傷の影響を防止または改善（ａｍｅｒｉｏｌａｔｅ）することによっておそらく作用し得る（総説については、例えば、Ｋｏｗａｌｔｏｗｓｋｉら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２６：４６３−４７１，１９９９を参照のこと）。これらおよび／または他のこのような薬剤は、変形性関節症の発達（Ｂｌａｎｃｏら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：２８４−２８９，１９９８）および／もしくは本明細書中で提供されるような異常ミトコンドリア機能に関連する他の疾患に寄与し得るプログラムされた細胞壊死（アポトーシス）を防ぐために作用し得るかまたは、他の機構を通して臨床的に有益な影響を及ぼし得る。
【０１１２】
従って、これらおよび他の関連する実施形態において、本明細書中で提供されるような構造（Ｉ）（例えば、アリールＮ−シアノグアニジン薬剤）を含む組成物は、本明細書中で提供されるように、関節炎障害または異常ミトコンドリア機能に関連する疾患を処置または予防するために、患者に投与され得る。従って、特定の好ましい実施形態において、薬剤は、ミトコンドリア機能変更薬剤である。本明細書中で提供される治療薬は、本発明の方法において使用される場合、好ましくは、薬学的組成物の一部である。薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤、さらに１種以上のミトコンドリア機能変更薬剤および、必要に応じて、他の成分を含む。
【０１１３】
本発明に従う化合物（例えば、アリールＮ−シアノグアニジン薬剤のような構造（Ｉ）の組成物）、またはその薬学的に受容可能な塩は、治療的に有効な量で患者に投与される。治療的に有効な量は、所望の効果を達成するために計算された量である。投与経路が、特定の処置とともに変化し得ることは、当業者に明らかである。投与経路は、非侵襲性か侵襲性かのいずれかであり得る。非侵襲性の投与経路としては、経口、口腔／舌下、直腸、経鼻、局所的（経皮および眼を含む）、経膣、膀胱内、および肺が挙げられる。侵襲性の投与経路としては、動脈内、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下腔内および眼内が挙げられる。
【０１１４】
必要とされる用量は、特定の処置および投与経路とともに変化し得る。一般的に、本明細書中に記載されるような、構造（Ｉ）のアリールＮ−シアノグアニジン薬剤のような本発明の化合物の用量は、１日あたり、宿主動物の体重１ｋｇにつき、約１〜約５ｍｇの化合物である；しばしば、１日あたり、体重１ｋｇにつき、約１００μｇと約５ｍｇとの間であるが、約５０ｍｇの化合物まで変化し得る。治療投与は、一般的には、医師の指導の下で実施され、薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に薬剤を含む。これらのキャリアは、当該分野で周知であり、典型的には無毒性の塩および緩衝液を含む。このようなキャリアは、生理学的に緩衝化された生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、マンニトールまたはデキストラン）、アミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバントおよび防腐剤のような緩衝液を含み得る。受容可能な無毒性塩は、酸付加塩または金属錯体（例えば、亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグネシウム、アルミニウムなどとの金属錯体）（これらは、この適用の目的のために付加塩として考えられる）を含む。このような酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が、錠剤形態で投与されるべき場合、その錠剤は、トラガカントゴム、コーンスターチまたはゼラチンのようなバインダー；アルギン酸のような分散剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含み得る。液体形態での投与が所望される場合、甘味料および／または香料が使用され得、そして等張食塩水、リン酸緩衝液などでの静脈内投与が効果的であり得る。
【０１１５】
本発明の１つの実施形態において、本発明の１種類以上の化合物を含む薬学的組成物は、リポソーム内に捕捉される。リポソームは、二層構造で配置される脂質からなる１つ以上の外層によって囲まれる水性核（ａｑｕｅｏｕｓ  ｃｏｒｅ）を有する顕微球である（例えば、Ｃｈｏｎｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：６９８，１９９５を参照のこと）。薬物送達剤としてのリポソームの治療的な可能性は、３０年ほど前に認識された（Ｓｅｓｓａら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．９：３１０，１９６８）。リポソームは、「立体的に安定化されたリポソーム」を含み、この用語は、本明細書中で用いられる場合、リポソームに取りこまれた場合に、１種類以上の特殊化脂質を含み、このような特殊化脂質を欠くリポソームと比較して、高められた循環寿命を生じるリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成液状部分の一部が、（Ａ）１種類以上の糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１）を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））部分で誘導体化されているリポソームである。任意の特定の理論によって制限されることは望まれないが、当該分野において、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む少なくとも立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの高められた循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への減少された取りこみから誘導されると考える（Ａｌｌｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２３：４２，１９８７；Ｗｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３７６５，１９９３）。
【０１１６】
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが、当該分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５０７：６４，１９８７）は、リポソームの血液半減期を改善するための、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：６９４９，１９８８）によって詳述された。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ  ８８／０４９２４（共にＡｌｌｅｎら）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ  ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）に開示される。
【０１１７】
１種以上の親水性ポリマーで誘導体化される脂質を含む種々のリポソーム、およびこれらの調製方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５３：２７７８，１９８０）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤である、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６７：７９，１９８４）は、重合体グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に高められた血液半減期を生じることを記述した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の接着によって修飾された合成ホスホリピドは、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載される。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．２６８：２３５，１９９０）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血液循環半減期において有意な増加を有することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １０２９：９１，１９９０）は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成される、他のＰＥＧ誘導体化ホスホリピド（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）に対するこのような知見を拡大した。外部表面に、共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームは、欧州特許第０  ４４５  １３１号およびＷＯ  ９０／０４３８４（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載される。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モル％含むリポソーム組成物、およびそれらの使用法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許番号ＥＰ  ０  ４９６  ８１３  Ｂｌ）に記載される。多くの他の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームは、ＷＯ  ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎら）およびＷＯ  ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ  ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、その表面上で、機能的部分によってさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載する。
【０１１８】
本発明によって提供されるような、本発明の化合物（例えば、アリールＮ−シアノグアニジン薬剤のような構造（Ｉ）の組成物）はまた、これらのプロドラッグを含む。本明細書中で使用される場合、「プロドラッグ」は、このようなプロドラッグが、脊椎動物被験体に投与される場合に、活性親薬物をインビボに放出する、任意の共有結合されたキャリアである。所定の化合物のプロドラッグは、親化合物に対して、通常の操作またはインビボでのいずれかで修飾が切断されるような方法で、化合物上に存在する官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグは、これらに限定されないが、化合物を含み、ここで、ヒドロキシ基、アミン基またはスルフヒドリル基は、結合を介して親化合物の任意の基に結合され、この結合は、プロドラッグが、被験体に投与される場合、切断されて、それぞれ遊離ヒドロキシ基、遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を形成する。プロドラッグの代表的な例としては、これらに限定されないが、アルコールの酢酸塩誘導体、ギ酸塩誘導体および安息香酸塩誘導体、およびアミン官能基が挙げられる。
【０１１９】
治療的用途のための「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）１９８５）に記載される。例えば、生理学的ｐＨでの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が使用され得る。防腐剤、安定剤、色素および香味剤さえも、薬学的組成物中で提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存剤として添加され得る。さらに、抗酸化剤および懸濁剤が使用され得る。必要に応じて、投与の特定の経路のために、麻酔薬が処方物に含まれ得る。
【０１２０】
本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩は、当該分野において周知の技術（例えば、これらの化合物の遊離酸または塩基形態と、水中の化学量論的な量の適切な塩基または酸を、有機溶媒中で反応させる）によって作製され得る。この脈絡における適切な塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５（これらは、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【０１２１】
例示の目的であって、限定の目的ではないが、本発明の化合物の適切な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩が挙げられ、この酸付加塩は、例えば、本発明に従う化合物の溶液と受容可能な酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、フマル酸、シュウ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸、リン酸、硫酸など）の溶液とを混合することによって形成され得る。この塩は、生成物の遊離塩基形態と１当量以上の適切な酸を、塩が溶解しない溶媒もしくは媒体中、または水のような溶媒中で反応させ、その酸を、減圧下または凍結乾燥または適切なイオン交換樹脂によって存在する塩のアニオンを別のアニオンに交換することによって除去するような従来の手段によって形成され得る。例示の目的であって、限定の目的ではないが、本発明に従う化合物の、適切な薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩を含み、この酸付加塩は、例えば、本発明の化合物の溶液と受容可能な酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、フマル酸、シュウ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、カルボン酸、リン酸、硫酸など）の溶液とを混合することによって形成され得る。この塩は、生成物の遊離塩基形態と１当量以上の適切な酸を、塩が溶解しない溶媒もしくは媒体中、または水のような溶媒中で反応させ、その酸を、減圧下または凍結乾燥または適切なイオン交換樹脂によって存在する塩のアニオンを別のアニオンに交換することによって除去するような従来の手段によって形成され得る。
【０１２２】
本明細書中に開示されるような本発明の１種以上の化合物を含む薬学的組成物は、その組成物が、患者に投与可能である任意の形態であり得る。例えば、その組成物は、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態であり得る。典型的な投与経路としては、限定されないが、経口、局所的、非経口（例えば、舌下または頬側）、舌下、直腸、経膣、および経鼻が挙げられる。非経口という用語は、本明細書中で使用される場合、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、くも膜下腔内注射、海綿体注射、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）注射、尿管間注射、または注入技術を含む。薬学的組成物は、その中に含まれる活性成分が、患者への組成物の投与において生物利用可能となるように処方される。患者に投与される組成物は、１種以上の用量単位の形態をとり、ここで、例えば、錠剤は単回投薬単位であり得、そしてエアロゾル形態での本発明の１種以上の化合物の容器は、複数回投薬単位を維持し得る。
【０１２３】
経口投与について、賦形剤および／またはバインダーが存在し得る。例としては、スクロース、カオリン、グリセリン、スターチ、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースおよびエチルセルロースがある。着色剤および／または香味剤が、存在し得る。コーティングシェルが使用され得る。組成物は、液体形態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液）であり得る。その液体は、２つの例として、経口投与のため、または注射による送達のためであり得る。経口投与について意図される場合、好ましい組成物は、１種以上の構造（Ｉ）の化合物に加えて、１種以上の甘味剤、防腐剤、色素／着色剤および風味増強剤を含む。注射によって投与されることが意図される組成物において、１種以上の表面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤が含まれ得る。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、液体薬学的組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態であって、１種以上の以下のアジュバント：注射のための水としての滅菌希釈剤、生理食塩水溶液、好ましくは生理学的生理食塩水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム、合成モノグリセリドまたはジグリセリドのような固定油（これらは、溶媒または懸濁媒体として働き得る）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または二亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような緊張性の調節のための薬剤を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチックで作製される複数回投与バイアル中に封入され得る。生理学的生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは滅菌水である。
【０１２５】
非経口投与または経口投与のいずれかを意図する液体組成物は、適切な用量が得られるように、一定量の構造（Ｉ）の化合物を含む必要がある。典型的には、この量は、組成物中において、本発明の化合物の少なくとも０．０１ｗｔ％である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の０．１重量％と約７０重量％の間で変化し得る。好ましい経口組成物は、本発明の化合物を約４％と約５０％の間で含む。好ましい組成物および調製物は、非経口投薬単位が、活性化合物を０．０１〜１重量％の間で含むように調製される。
【０１２６】
薬学的組成物は、局所的投与を意図され得、この場合において、キャリアは、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲルベースを適切に含み得る。このベースは、例えば、以下の１つ以上を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水およびアルコールのような希釈剤、乳化剤および安定剤。増粘剤は、局所的投与のための薬学的組成物中に存在し得る。経皮投与を意図するのであれば、組成物は、経皮パッチまたはイオン泳動デバイスを含み得る。局所的処方物は、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（体積あたりの重量）の本発明の化合物の濃度を含み得る。
【０１２７】
この組成物は、例えば、直腸で溶解し、薬物を放出する坐薬の形態で直腸投与を意図され得る。直腸投与のための組成物は、適切な非刺激性賦形剤として脂肪性基剤を含み得る。このような基剤としては、ラノリン、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２８】
本発明の特定の好ましい方法において、本発明の化合物は、挿入物、ビーズ、持続放出処方物、パッチまたは高速放出（ｆａｓｔ−ｒｅｌｅａｓｅ）処方物の使用を介して投与され得る。最適な投薬量の薬剤が、患者の体重および物理的状態；処置される物理的状態の重症度および寿命；活性成分の特定の形態、投与の様式および使用される組成物に依存し得ることは当業者に明らかである。化学療法における本発明の化合物の使用は、別の化合物（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソーム（これらは、前出の化合物の送達を助ける））に結合するような薬剤を含み得ることが理解されるべきである。
【０１２９】
これらおよび関連する利点は当業者に明らかである。以下の実施例は、例示の目的で提供され、制限の目的ではない。
【実施例】
【０１３０】
（実施例１）
（代表的な化合物の一般的な合成）
Ｎ−シアノ−Ｓ−メチルイソチオ尿素（１．３８ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＨ（１８．０ｍＬ）に溶解した。この攪拌溶液にＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、６．０ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を１００℃で３０分間加熱した。この溶液を周囲温度まで放冷し、そして２．０ｍｌずつ（それぞれ約１．０ｍｍｏｌの推定中間体塩、ジシアノアミドナトリウムを含む）を、ＨＣｌ（水溶液）（１．０Ｍ、１．０ｍＬ）中の適切なアニリン（１．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を、攪拌しながら６０分間、１００℃で加熱した。
【０１３１】
室温まで冷却した後、この反応混合物を、構造（Ｉ）の粗生成物を供給しながら減圧下でエバポレートした。精製の前に、各粗製混合物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解し、超音波処理して固体を砕き、そして０．２０ミクロンのＰＴＦＥ膜フィルターを通して濾過した。分離用ＲＰ−ＨＰＬＣを、自動Ｇｉｌｓｏｎ  ２１５  ＨＰＬＣシステムで実施し、各誘導体を、ＢｅｔａｓｉｌＴＭ  Ｃ１８カラム（１５０×２０ｍｍ、５μ粒子、１００Å孔、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）で３回のバッチ（３．３ｍＬ注入体積）で精製した。この生成物を、Ｈ２Ｏ：ＴＦＡ（１００００：５）中、ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（１００００：５）の勾配を使用して、１５．０ｍＬ／分の流速で溶出した。適切な画分を、ＬＣ／ＭＳによって所望の生成物の存在について分析した。プールされた画分を、濃縮し、ＭｅＯＨ（３×５．０ｍＬ）で繰り返し同時エバポレートした。構造物の最終濃度について、ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲ分析を使用した。収率は、１０〜６５％であった。
【０１３２】
対応する分析データとともに、この手順によって作製された代表的な化合物を、以下の表１に要約する。
【０１３３】
【表１】
2004525906.tif 000006
2004525906.tif 000007
（実施例２）
（化合物（１）の代表的な大規模合成）
Ｎ−シアノ−Ｓ−メチルイソチオ尿素（５７６ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）をｉ−ＰｒＯＨ（７．５ｍＬ）に溶解した。この攪拌溶液に、ＮａＯＨ水溶液（２．０Ｍ、２．５ｍＬ）を加え、得られた反応混合物を１００℃で３０分間加熱した。この溶液を周囲温度まで放冷した。このジシアンアミド溶液に、ＨＣｌ（水溶液）（１．０Ｍ、５．０ｍＬ）中の４−ヒドロキシ−２−メチルアニリン（６１６ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この反応混合物を６０分間１００℃で加熱し、そして周囲温度まで冷却した後、エバポレートして乾燥した。粗製物に等重量のシリカゲルおよびＭｅＯＨ（１０ｍＬ／ｇ粗製物）を加えた。数分間攪拌した後、ロータリーエバポレーションによってＭｅＯＨを除去し、そしてシリカ／粗製物は、ジクロロメタン（ＤＣＭ、１０ｍＬ／ｇ粗製物）を加えてエバポレーションすることによって、ＭｅＯＨをさらに除去した。この同時エバポレーション工程を、３度繰り返した。シリカ／粗製物混合物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５：５）で、平衡化されたフラッシュ−ＳＧＣの頂上に配置した。ＤＣＭ（５〜１０％）中のＭｅＯＨの段階的な勾配での溶出によって、高減圧下での乾燥の後、化合物（１）を明褐色固体として得た。収率：４８２ｍｇ（５０．７％）。
【０１３４】
（実施例３）
（軟骨細胞活性アッセイ）
免疫化されたＴＣ２８（ａ．ｋ．ａ．「Ｔ／Ｃ−２８」）若年性肋骨軟骨細胞を、Ｍａｒｙ  Ｇｏｌｄｒｉｎｇ博士（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。ＴＣ２８細胞を、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）中の単層培地で維持し、そして１０％  ＦＣＳ、１％  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリンおよび５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，Ｃａ）を補充し、５％  ＣＯ２と共に３７℃で培養した。さらに、さらなる生理学的な非接着状態にある軟骨細胞をさらに研究するために、いくつかの実験において、ＴＣ２８細胞を、６ウェルプレート（細胞接着インヒビターであるポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリＨＥＭＥ）の９５％エタノール溶液中の１０％（ｖ／ｖ）によって２２℃で１８時間、事前にコーティングしてある）に移動させ、続いて、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、完全なＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地をこのウェルに加え、細胞を培地中で７２時間まで研究した（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．およびＭｏｓｃｏｎａ  Ａ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：３４５−３４９，１９７８；Ｒｅｇｉｎａｔｏ  Ａ，Ｉｏｚｚｏ  Ｒ，Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｓ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｄｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｍａｔｕｒｅ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ａ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３７：１３３８−１３４９，１９９４）。２型コラーゲンおよびアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の発現は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認され、これは、軟骨細胞表現型の維持を検証した。
【０１３５】
代表的な化合物の軟骨細胞保護効果は、インビトロでスクリーニングされる。このアゴニストは、一酸化炭素（ＮＯＣ−１２）のドナー、過酸化亜硝酸（ＳＩＮ−１）のドナー、およびヒト組換えＩＬ−１β含んだ。１００μＭのＳＩＮ−１および２５０μＭのＮＯＣ−１２を、接着細胞についての中毒刺激として使用した。ポリＨＥＭＥプレート中で培養されたＴＣ２８細胞を使用する実験において、１０μＭのＳＩＮ−１、２５μＭのＮＯＣ１２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１を、実施例１からの代表的な化合物（１μＭ）の非存在下または存在下で、前変形性関節症（ｐｒｏ−ｏｓｔｅｏｒｔｈｒｉｔｉｃ）のトリガーとして使用した。細胞障害性を、標準的なＬＤＨ放出アッセイを使用して研究し、そして軟骨細胞細胞内ＡＴＰを、標準的なルシフェラーゼアッセイによって測定した。
【０１３６】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の軟骨細胞からの増強された放出は、変形性関節症軟骨細胞の中心的な特徴であり、ＮＯおよび過酸化亜硝酸が、変形性関節症の主要な病理因子であるように、ＩＬ−１によって強力に刺激されることが知られている。従って、ＧＡＧ放出もまた、スクリーニングアッセイを最適化するために研究し、ポリへム（ｐｏｌｙｈｅｍｅ）系中で形成された軟骨「小結節」の１時間の消化を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム中の３００μｇ／ｍｌのパパイン、１ｍＭのＥＤＴＡ、および２ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ６．８）を使用して実施した。妨害タンパク質の消化を、ＧＡＧ放出をより容易に検出可能にする様式で達成し、そしてそのＧＡＧ放出を、標準的なジメチレンブルー（ＤＭＢ）色素結合比色アッセイによって定量化した。簡単に言えば、上記からの消化された細胞抽出物を、４６μＭのＤＭＢ、４０ｍＭのグリシンおよび４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．０）と合わせ、５２５ｎｍですぐに読み取り、そして１〜５０μｇ／ｍｌの硫酸コンドロイチンのサンプルで作製された標準曲線（Ｆａｒｎｄａｌｅ  Ｒ，Ｂｕｔｔｌｅ  Ｄ，Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｕｓ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８８３：１７３−１７７，１９８６；ＳｚｔｒｏｌｏｖｉｃｓＲ，Ｗｈｉｔｅ  Ｒ，Ｐｏｏｌｅ  Ｒ，Ｍｏｒｔ  Ｊ，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  Ｐ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３９：５７１−５７７，１９９９）で、再度比較した。この実験の結果を、表２に示す。
【０１３７】
（表２：ＧＡＧ放出における減少％）
【０１３８】
【表２】
2004525906.tif 000008
（実施例４）
（化合物（１）を利用するさらなるアッセイ）
（細胞生存率アッセイ）
１×１０５ＴＣ２８細胞（１０％  ＦＣＳ、１％  グルタミン、１％  Ｐ／Ｓを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を、９６ウェルプレート中の各ウェルにプレーティングし、そして一晩接着させた。この細胞を、一度ＰＢＳで洗浄し、そして培地を１％のＦＣＳのみを含有するように交換した。様々な濃度の化合物（１）を、１時間の前処理のために、細胞に添加した。この培地を、除去し、そして新しい化合物＋／−毒性刺激物を、添加した。次いで、この細胞を、２４時間３７℃にてインキュベートした。インキュベーションの後、この培地を回収し、そしてＣｙｔＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）における分析のために使用した。手短に言えば、死亡細胞からのＬＤＨの放出は、テトラゾニウム塩（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｅｔｉｎ）から赤いホルマザン生成物への変換を生じる３０分の酵素反応において定量化した。次いで、この結果を、コントロール細胞を用いて、ＬＤＨの放出に関連する死亡した細胞のパーセントとして表した。
【０１３９】
（ＡＴＰアッセイ）
５×１０５ＴＣ２８細胞を６０ｍｍ皿にプレーティングし、そして一晩接着させた。次いで、この細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして培地を１％ＦＣＳ含有培地に交換した。化合物（１）を、３７℃にて細胞の１時間の前処理のために添加した。この培地を、除去し、そして新しい化合物＋／−毒性刺激物を添加し、そしてこの細胞を２４時間３７℃にてインキュベートした。この細胞を、徐々にＰＢＳ中にすくい取り、そして洗浄し、次いでペレットをドライアイス中でスナップ凍結した。次いで、この細胞を０．４Ｎの過塩素酸で抽出し、そして１５分間、氷上でインキュベートした。この細胞を、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして上清を除去した。２４容量％の２．２Ｍ  ＫＨＣＯ３を、添加し、この溶液を中和し、そして沈殿物を遠心分離によってペレット化した。この上清を、Ｓｉｇｍａ  ＡＴＰ  ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅキットからのＡＴＰアッセイミックスと混合し、そしてこの反応物を、１５秒間（開始から５秒の遅れを有する）３回数えた。カウントを、細胞ペレットにおいて全ＤＮＡについて補正した（表３を参照のこと）。
【０１４０】
上記の細胞生存率およびＡＴＰアッセイの結果を、表３（これは、ＳＩＮ−１ならびに化合物（１）によるＮＯＣ−１２媒介細胞死およびＡＴＰ欠乏の防止についてのおよそのＥＣ５０値（μＭ）を提供する）に示す。これらのアッセイにおいて、ＴＣ２８細胞を、１時間前処理し、次いで２４時間、化合物（１）の存在下でトリガーに曝露した。
【０１４１】
（表３：プロ骨関節炎トリガーの存在下での細胞生存率およびＡＴＰレベルの保存）
【０１４２】
【表３】
2004525906.tif 000009
（コラーゲン合成）
コラーゲン生産を、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４３：１１５６０−７０，２０００に記載されるように以下の３Ｈプロリンの取りこみによって測定した。この結果を、表４（これは、ＳＩＮ−１、ＮＯＣ−１２およびＩＬ−１媒介ＧＡＧ放出（実施例３による）の防止、および化合物（１）による軟骨細胞でのコラーゲン合成（Ｊｏｈｎｓｏｎらによる）の阻害についてのおよそのＥＣ５０値（μＭ）を提供する）に示す。これらの実験において、ポリＨＥＭＥでコートしたプレートにおけるＴＣ２８細胞を、１時間前処理し、次いで化合物（１）の存在下で７２時間、トリガーに曝露した。
【０１４３】
さらに、単層培養において、ＴＣ２８細胞による酸素消費速度をまた、Ｊｏｈｎｓｏｎらの手順によって評価し、これらの結果を図１に示す。この図１は、化合物（１）がＴＣ２８細胞中でミトコンドリアの呼吸に対してＳＩＮ−１媒介阻害をブロックすることを示す。この実験において、ＴＣ２８細胞を、５００μＭ  ＳＩＮ−１、＋／−１０μＭの化合物（１）で、４時間処理した：状態３／４−基質を添加しない基本の呼吸速度；状態４−５μＭ／ｍｌのオリゴマイシンの存在下での呼吸速度；状態３Ｕ−脱共役剤ＣＣＣＰの添加に起因する最大の状態３の脱共役した呼吸速度。
【０１４４】
（表４：プロ骨関節炎トリガーの存在下での軟骨細胞におけるマトリックス保存）
【０１４５】
【表４】
2004525906.tif 000010
（ウシの軟骨器官の培養方法）
成体のウシの膝を、得て、そして大腿の顆および膝蓋骨の溝由来の軟骨を、全体の厚さの切片で取り出した（１〜３ｍｍ）。円形のコア（直径６〜７ｍｍ）を、組織の外側に穴を開ける。このコアを、培地（１％  ＦＣＳ、１％  Ｐ／Ｓ、１％  グルタミン含有ＤＭＥＭ高グルコース）で２回洗浄し、ついで９６ウェルプレートにプレーティングした。この切片を、３７℃にて４８時間、培地（上記のような）中でインキュベートし、単離プロセスから回収させた。回収の後、この培地を除去し、そして化合物（１）を含有する新しい培地を、６時間の前処理のために切片に添加した。次いで、培地を除去し、そして新しい化合物（１）＋／−ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、そして３７℃にて２４時間インキュベートした。この馴化培地を、回収し、そしてＧＡＧ放出およびＮＯ放出を分析した。最後に、この切片を秤量し、大きさまたは厚さにおいてわずかな変化について補正した。この実験の結果を、表５（これは、化合物（１）による、ウシ軟骨におけるＩＬ−１媒介ＧＡＧおよびＮＯ放出の防止についてのおよそのＥＣ５０値（μＭ）を提供する）に示す。
【０１４６】
（表５：ＩＬ−１刺激物に対する応答におけるウシ軟骨切片でのＮＯ放出のマトリックス分解および阻害の防止）
【０１４７】
【表５】
2004525906.tif 000011
上記からの、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されるが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ＴＣ２８細胞におけるミトコンドリアの呼吸のＳＩＮ−１媒介性阻害をブロックする、代表的な化合物の能力を図示する。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525906.tif 000076
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月16日(2003.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化６】
2004525906.tif 000077
ここで、
Ｒ３は、モルホリニルであり；そして
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであるか；あるいは
Ｒ４はＲ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成する、
化合物。
【請求項２】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化７】
2004525906.tif 000078
ここで、
Ｒ１は、メチルであり；
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、水素であり；そして
Ｒ３は、ヒドロキシである、
化合物。
【請求項３】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化８】
2004525906.tif 000079
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであり；そして
Ｒ４はＲ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成する、化合物。
【請求項４】
Ｒ１が水素またはアルキルである、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がメチルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が水素、ハロゲン、アルコキシ、アルキルまたは置換アルキルである、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２が水素である、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはアルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３が複素環である、請求項３に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ４が水素またはアルコキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ５が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４がＲ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素元素と一緒になって、置換されていない縮合フェニル基を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１がメチルであり、そしてＲ３がヒドロキシである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１６】
関節炎障害を処置するための方法であって、該方法は、以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む有効量の薬学的組成物をその必要のある動物に投与する工程を包含し、
【化９】
2004525906.tif 000080
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであるか；あるいは
Ｒ３は、Ｒ４と一緒になるか、またはＲ４は、Ｒ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成する、
方法。
【請求項１７】
改変したミトコンドリア機能に関連する疾患を処置する方法であって、該方法は、以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能なキャリアを含む有効量の薬学的組成物をその必要のある動物に投与する工程を包含し、
【化１０】
2004525906.tif 000081
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであり；あるいは
Ｒ３は、Ｒ４と一緒になるか、またはＲ４は、Ｒ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成する、
方法。
【請求項１８】
Ｒ１が水素またはアルキルである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１がメチルである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ２が水素、ハロゲン、アルコキシ、アルキルまたは置換アルキルである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ２が水素である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ３が水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはアルキルである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ３が複素環である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ３がモルホリニルである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ４が水素またはアルコキシである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ５が水素である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ４が、Ｒ５と一緒になり、そしてこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合フェニル基を形成する、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ１がメチルであり、そしてＲ３がヒドロキシである、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化１１】
2004525906.tif 000082
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであり；あるいは
Ｒ３は、Ｒ４と一緒になるか、またはＲ４は、Ｒ５と一緒になり、そいてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成し、
該化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む有効量の薬学的に受容可能な組成物を、その必要のある動物に投与する工程を包含する、関節炎障害を処置するための方法においての使用ための、
化合物。
【請求項３１】
以下の構造を有する化合物またはその立体異性体、そのプロドラッグもしくはその薬学的に受容可能な塩であって：
【化１２】
2004525906.tif 000083
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同じかまたは異なり、そして独立して水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環式アルキルまたは置換複素環式アルキルであり；あるいは
Ｒ３は、Ｒ４と一緒になるか、またはＲ４は、Ｒ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合アリールまたは縮合複素環を形成し、
該化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む有効量の薬学的に受容可能な組成物を、その必要のある動物に投与する工程を包含する、改変したミトコンドリア機能の関連する疾患を処置するための方法においての使用ための、
化合物。
【請求項３２】
Ｒ１が水素またはアルキルである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ１がメチルである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ２が水素、ハロゲン、アルコキシ、アルキルまたは置換アルキルである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ２が水素である、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ３が水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシまたはアルキルである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ３が複素環である、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ３がモルホリニルである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ４が水素またはアルコキシである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ５が水素である、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ４が、Ｒ５と一緒になり、そしてさらにこれらの基が結合するそれぞれの炭素原子と一緒になって、置換されていないか置換された縮合フェニル基を形成する、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ１がメチルであり、そしてＲ３がヒドロキシである、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の化合物。
【国際調査報告】
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