(57)【要約】ポリ硫酸化分子に特異的に結合する免疫原性ヘリコバクテル・ピロリ(Helicobacter pylori)−特異的表面タンパク質の同定方法が記載されている。さらに、ポリ硫酸化分子に特異的に結合するヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物およびそれに含まれるタンパク質が記載されている。そのようなタンパク質の例は、1；分子量(ＭＷ)３０(３１.３)kＤa、等電点(pＩ)９.３(９.１)を有し、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；ＭＷ２６(２７.７)、pＩ９.１−９.３(９.０)を有し、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質；ＭＷ２５(２８.７)、pＩ９.０(８.８)を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質である。さらに、Ｈ.ピロリ(H. pylori)感染に対するワクチンにおける診断用抗原としておよび成分としての本発明のタンパク質またはタンパク質生産物の使用、およびイムノアッセイおよびＨ.ピロリ感染に対するワクチン組成物が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ硫酸化分子に特異的に結合する免疫原性ヘリコバクテル・ピロリ(Helicobacter pylori)−特異的表面タンパク質の同定方法であって、
Ｈ．ピロリ(H. pylori)細菌をインビトロで培養し、
培養した細菌を分離し、
酸性グリシン(acid glycine)抽出により塩基性表面タンパク質を遊離させ、
細菌を除去し、
グリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製し、
タンパク質生産物を２次元イムノブロットに付して免疫原性タンパク質を同定する
段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
インビトロ培養を寒天培地またはブロスで実施し、
細菌の分離を、増殖した細胞を燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中に収集し遠心してペレットを調製することにより実施し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質をペレットから遊離させ、
遠心により細菌を除去し、
遠心上清をＰＢＳで希釈し、ｐＨを６.５に調節し、混合物をヘパリン親和性クロマトグラフィーに付すことによりグリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｈ.ピロリ(H. pylori)細菌をインビトロで培養し、
培養した細菌を分離し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質を遊離させ、
細菌を除去し、
グリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製する、
ことにより得られる、ポリ硫酸化分子に特異的に結合するヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物。
【請求項４】
インビトロ培養を寒天培地またはブロスで実施し、
細菌の分離を、増殖した細胞を燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中に収集し遠心してペレットを調製することにより実施し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質をペレットから遊離させ、
遠心により細菌を除去し、
遠心上清をＰＢＳで希釈し、ｐＨを６.５に調節し、混合物をヘパリン親和性クロマトグラフィーに付すことによりグリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製する、請求項３記載のタンパク質生産物。
【請求項５】
生産物が、
a)分子量(ＭＷ)３０(３１.３)kＤa、等電点(pＩ)９.３(９.１)を有し、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
b)ＭＷ２６(２７.７)、pＩ９.１−９.３(９.０)を有し、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、
c)ＭＷ２５(２８.７)、pＩ９.０(８.８)を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質
からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む、請求項３または４記載のタンパク質生産物。
【請求項６】
ポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ３０(３１.３)kＤa、(pＩ)９.３(９.１)を有し、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質。
【請求項７】
ポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ２６(２７.７)、pＩ９.１−９.３(９.０)を有し、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質。
【請求項８】
ポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ２５(２８.７)、pＩ９.０(８.８)を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質。
【請求項９】
イムノアッセイにおける診断用抗原としての、請求項３−５のいずれか１項に記載のタンパク質生産物または請求項６−８のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１０】
Ｈ.ピロリ(H. pylori)感染に対するワクチンにおける免疫化成分としての、請求項３−５のいずれか１項に記載のタンパク質生産物または請求項６−８のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１１】
請求項３−５のいずれか１項に記載のタンパク質生産物または請求項６−８のいずれか１項に記載のタンパク質を診断用抗原として使用する、ヒト患者からの生物学的試料中におけるＨ.ピロリ(H. pylori)細菌の存在を決定するためのイムノアッセイ。
【請求項１２】
免疫化成分として請求項３−５のいずれか１項に記載の少なくとも１種のタンパク質生産物または請求項６−８のいずれか１項に記載の１種のタンパク質を、医薬的に許容される媒質とともに含む、ヒト患者におけるＨ.ピロリ(H. pylori)感染に対するワクチン組成物。
タンパク質生産物を２次元イムノブロットに付して免疫原性タンパク質を同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ヘリコバクテル・ピロリ(Helicobacter pylori)の免疫原性細胞表面タンパク質、そのタンパク質の応用およびそれらの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクテル・ピロリ(Helicobacter pylori)は、ヒトの胃にコロニーを作ってＢ型胃炎および消化性潰瘍を誘導するらせん形の微生物である(Marshall, 1994)。この感染を検出する診断試験は、信頼性があり、費用効率がよく、実施が容易で、好ましくは非侵しゅう的でなければならない。個人に感染したほとんどのＨ.ピロリ(H. pylori)において、数々の抗原に対する強いが多形性が高い体液性免疫反応があり、種々の抗原に対する抗体の検出が血清学的診断のために広く使用されてきた(Bazillou et al., 1994; De Boer, 1997; Aucher et al. 1998)。このような血清診断学的アッセイは、主として種々の抗原製剤を用いる酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)およびイムノブロットアッセイに基づくものであった。ＥＩＡ類の性能がこのようなアッセイに使用されるタンパク質組成物に依存しているにもかかわらず、数種の入手可能な市販キットは使用者に組成が知られていない抗原製剤を使用している(Feldman et al., 1995; Meijer et al., 1997)。ヒートショックタンパク質(Hsps)、鞭毛およびウレアーゼのようなある種のＨ.ピロリ(H. pylori)抗原は、他の細菌種の抗原と交差反応し、このことが抗原抽出物または抽出法の合理的な選択を困難にしている。
【０００３】
以前の研究において、一組の低分子質量(Ｍr)細胞表面遊離タンパク質(２５ないし３５kＤa)に対する抗体の反応性がＨ.ピロリ(H. pylori)の感染に強く相関することが見出された(Nilsson et al., 1997)。しかし、これらのタンパク質の数種は１次元電気泳動(１−ＤＥ)において充分分離せずまたは共泳動した。しかしながら、２次元電気泳動(２−ＤＥ)技術の使用によりタンパク質の高度分離が可能になり、そこでは適切なpＨ勾配がきわめて重要であった(Kimmel et al., 2000)。最近の２−ＤＥ研究(Nilsson et al., 2000)において、Ｍr２５−３０kＤaのＨ.ピロリ(H. pylori)タンパク質に対する強い免疫反応が注目された。しかし、これらのタンパク質は、pＨ範囲３−１０における２−ＤＥによっても非分離のままであった。
【発明の開示】
【０００４】
この発明は、存在量が低いＨ.ピロリ(H. pylori)タンパク質のクロマトグラフィー的濃厚化と狭いpＨ勾配を使用する２−ＤＥを、共泳動するポリペプチドの分離のために結合し、その後質量分析によるタンパク質の同定を行うものである。さらに、免疫原性および交差反応性タンパク質の同定のための２次元(２−Ｄ)イムノブロットの有用性を論証するものである。
【０００５】
一つの特徴として、この発明は、
Ｈ.ピロリ(H. pylori)細菌をインビトロで培養し、
培養した細菌を分離し、
酸性グリシン(acid glycine)抽出により塩基性表面タンパク質を遊離させ、
細菌を除去し、
グリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製し、
タンパク質生産物を２次元イムノブロットに付して免疫原性タンパク質を同定する段階を含む、ポリ硫酸化分子、例えばグルコサミノグリカン類および／またはムチン類のような他の硫酸化グリココンジュゲート類に特異的に結合する免疫原性ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質の同定方法に関する。
【０００６】
発明のこの特徴による方法の一つの実施態様において、
インビトロ培養を寒天培地またはブロスで実施し、
細菌の分離を、増殖した細胞を燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中に収集し遠心してペレットを調製することにより実施し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質をペレットから遊離させ、
遠心により細菌を除去し、
遠心上清をＰＢＳで希釈し、pＨを６.５に調節し、混合物をヘパリン親和性クロマトグラフィーに付すことによりグリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製する。
【０００７】
この発明の別の特徴は、
Ｈ.ピロリ(H. pylori)細菌をインビトロで培養し、
培養した細菌を分離し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質を遊離させ、
細菌を除去し、
グリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製することにより生産物が入手しうる、ポリ硫酸化分子、例えばグルコサミノグリカン類および／またはムチン類のような他の硫酸化グリココンジュゲート類に特異的に結合するヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物に関する。
【０００８】
発明のこの特徴の一つの実施態様において、タンパク質生産物は、
インビトロ培養を寒天培地またはブロスで実施し、
細菌の分離を、増殖した細胞を燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中に収集し遠心してペレットを調製することにより実施し、
酸性グリシン抽出により塩基性表面タンパク質をペレットから遊離させ、
遠心により細菌を除去し、
遠心上清をＰＢＳで希釈し、pＨを６.５に調節し、混合物をヘパリン親和性クロマトグラフィーに付すことによりグリシン抽出物を精製してヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質生産物を調製することにより得ることができる。
【０００９】
目下のところ好ましい実施態様において、生産物は、
a)分子量(ＭＷ)３０(３１.３)kＤa、等電点(pＩ)９.３(９.１)を有し、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、
b)ＭＷ２６(２７.７)、pＩ９.１−９.３(９.０)を有し、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、
c)ＭＷ２５(２８.７)、pＩ９.０(８.８)を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質
からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む。
【００１０】
この発明のさらに別の特徴は、ポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ３０(３１.３)kＤa、(pＩ)９.３(９.１)を有し、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質；ポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ２６(２７.７)、pＩ９.１−９.３(９.０)を有し、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質；またはポリ硫酸化分子に特異的に結合し、ＭＷ２５(２８.７)、pＩ９.０(８.８)を有し、配列番号５のアミノ酸配列を含む、ヘリコバクテル・ピロリ−特異的表面タンパク質に関する。
【００１１】
この発明のさらに別の特徴は、イムノアッセイにおける診断用抗原としての、この発明によるタンパク質生産物またはこの発明によるタンパク質の使用に関する。
【００１２】
この発明のさらなる特徴は、Ｈ.ピロリ感染に対するワクチンにおける免疫化成分としての、この発明によるタンパク質生産物またはこの発明によるタンパク質の使用に関する。
【００１３】
この発明の追加的な特徴は、この発明によるタンパク質生産物またはこの発明によるタンパク質を診断用抗原として使用する、ヒト患者からの生物学的試料中におけるＨ.ピロリ細菌の存在を決定するためのイムノアッセイに関する。固相酵素免疫検定法(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)などのような、抗原−抗体相互作用に基づく任意のイムノアッセイを使用しうる。
【００１４】
この発明の最後の特徴は、免疫化成分として少なくとも１種のこの発明によるタンパク質生産物または１種のこの発明によるタンパク質を、医薬的に許容される媒質とともに含む、ヒト患者におけるＨ.ピロリ感染に対するワクチン組成物に関する。医薬的に許容される媒質は、例えば米国またはヨーロッパ薬局方の手引きによって製造者により選択される。
【００１５】
この発明を、実験および図の記載により説明するが、この発明はいずれの具体的開示例によっても限定されないことを理解すべきである。
【００１６】
実験
材料および方法
Ａ.細菌株および培養条件
Ｈ.ピロリＣＣＵＧ１７８７４株を、凍結ストック(−１１５℃)からＧＡＢ−ＣＡＭＰ寒天平板(Soltesz et al., 1992)にとり、３７℃において３日間微好気性大気(５％Ｏ２,１０％ＣＯ２,８５％Ｎ２)中で培養した。細胞を採取し、pＨ７.２の燐酸緩衝食塩水(ＰＢＳ,０.０２Ｍ燐酸ナトリウム,０.１５ＭＮaＣｌ)中で一度洗浄し、次のタンパク質抽出のために保存した。
【００１７】
Ｂ.細胞表面タンパク質の抽出
３日齢細胞からの細胞表面タンパク質酸性グリシン抽出(acid glycine extraction)は、前に報告されたように実施した(Lelwala−Guruge et al., 1990)。略述すると、採取し洗浄した細胞をpＨ２.２の０.２Ｍグリシン塩酸塩中に再けんだく(４ｇ細胞／１００ｍｌ)し、プロテアーゼ阻害剤(CompleteTM Roche Diagnostics AB, Bromma, Sweden)を補充して１５分間２０℃で磁気撹拌した。遠心(１５分間８℃で１２０００×ｇ)により細胞を除き、上清をＮaＯＨで中和し、ＰＢＳに対して１８時間８℃で透析した。バイオラドタンパク質アッセイ(BioRad, Richmond, CA, USA)および標準としてのウシ血清アルブミンを使用して、タンパク質をブラッドフォード法で２１０μｇ／ｍｌに定量化した。このタンパク質画分を以後ＡＧＥタンパク質と称する。
【００１８】
Ｃ.ヘパリン親和性クロマトグラフィー
ハイトラップ(HiTrap)ヘパリンカラム(１ｍｌ、Amersham PＨarmacia Biotech, Uppsala, Sweden)をpＨ６.５の５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液と７５ｍＭＮaＣｌで平衡化した。ＡＧＥタンパク質を同じ緩衝液で１：３に希釈し、pＨを６.５に調整し、親和性カラムにかけた。結合しないタンパク質を平衡化緩衝液で洗去し、一方結合したタンパク質は２ＭＮaＣｌを用いて単一ピークとして溶離し、２.５ｍｌのタンパク質画分中に６５６μｇ／ｍｌを得、以下これをＡＧＥ−ＨｅｐＢＰ(酸性グリシン抽出−ヘパリン結合タンパク質)と称する。ＡＧＥ−ＨｅｐＢＰ画分をファストデソルティング(Fast Desalting TM)カラムＨＲ１０／１０ (Amersham PＨarmacia Biotech)上において流速１ｍｌ／分で脱塩し、水中において８Ｍ尿素(Merck Eurolab AB, Stockholm, Sweden)で平衡化し、一部をとり−２０℃で凍結保存した。
【００１９】
Ｄ.１次元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(１−ＤＥ)およびイムノブロット(１Ｄ−イムノブロット)
１−ＤＥは、還元条件(Laemmli, 1970)下、クリテリオン(CriterionTM)細胞電気泳動装置(BioRad, Richmond, CA, USA)と、８−１６％分離用勾配ゲルおよび４％スタックゲル(Criterion Precast Gel, Bio−Rad)を用いて実施した。タンパク質を標準試料緩衝液で希釈し、ゲルに付加し(７５μｇ／ゲル)、２００Ｖで８０分間分離した。分離したＡＧＥ−ＨeｐＢＰのＭrを精密マーカータンパク質(BioRad)を用いて確定した。電気泳動後、ゲルを固定し、銀染色(Heukeshoven et al., 1988)した。別法として、タンパク質を抗体検出のために半乾燥電気ブロッター装置(Ancos, Vig, Denmark)を使用してポリビニリデン・ジフルオリド膜(PVDF)(Micron Separations Inc. Westborough, MA, USA)に転移させた。転移時間は１ｍＡ／ｃｍ２の一定電流下で８０分であった。イムノブロットアッセイは前に報告されたように実施した(Nilsson el al., 1997)。略述すると、水解ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ツイーン２０、エタノールアミンおよびグリシンを含有する緩衝液中で膜を２×１５分間ブロックし、切断してストリップにし、ＴＲＩＳ、ゼラチン水解化物、塩化ナトリウム、pＨ８.７のツイーン２０を含有するpＨ８.７の緩衝液中に１／１００に希釈した血清のパネルでプローブした(Nilsson et al., 1997)。血清は、ｉ)内視鏡によるバイオプシー試料の陽性培養および血清学で確定したＨ.ピロリ感染(ｎ＝１０)、ii)Ｈ.ピロリ培養陰性患者からの血清プール、iii)Waaler−Rose試験により高いリウマトイド因子価を示すリウマチ様関節炎(ｎ＝８)、iv)高い抗体価を示すカンピロバクテル・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)感染(ｎ＝５)、ｖ)肺におけるシュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)のコロニー形成をもつのう胞性線維症、vi)ＴPＨＡ試験で陽性のトレポネーマ・パリズム(Treponema pallidum)感染(ｎ＝３)およびvii)培養において陽性のヘモフィルス・インフルエンゼ(HaemopＨilus influenzae)感染(ｎ＝３)を含む種々の疾患をもつ患者から得た。すべての血清試料はランドのランド大学病院臨床微生物部門(Department of Clinical Microbiology, Lund University HospＩtal, Lund)から集め、試験するまで−２０℃で凍結保存した。
【００２０】
Ｅ.等電点電気泳動(ＩＥＦ)
ＡＧＥ−ＨeｐＢＰを、pＨ６−１１,１１ｃｍの直線pＨ勾配を用いてプレキャストイモビリンドライストリップ(Immobiline TM Dry strips) とＩＰＧストリップ(IPG strips, Amersham PＨarmacia Biotech)上でＩＥＦにより分離した。ＩＰＧストリップを、製造者の指示書にしたがって、８Ｍ尿素、３−(３−クロロアミドプロピル)ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)(２０ｇ／ｌ)、pＨ６−１１のＩＰＧ試料緩衝液(Amersham PＨarmacia Biotech)、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)(１０ｇ／ｌ)およびブロムフェノールブルー(０.５％ｗ／ｖ)２５μｌを含有する溶液２００μｌ中でＡＧＥ−ＨeｐＢＰ(ストリップあたり約２５μｇ)とともに１２時間２０℃で再水和した。ＩＥＦは、ＩＰＧフォール(IPGpＨor)フォーカシング装置(Amersham PＨarmacia Biotech)中で合計８０kＶh実施した。
【００２１】
Ｆ.２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(２−ＤＥ)
２−ＤＥを開始する前に、ＩＰＧストリップをそれぞれpＨ８.８の５０ｍＭＴris−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、３０％(ｖ／ｖ)グリセリンおよび１％(ｗ／Ｖ)ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶液中で２０分間２回平衡化した。ＤＴＴ(１％,ｗ／ｖ)を最初の平衡化溶液に加え、ヨードアセトアミド(４.８％,ｗ／ｖ)を第２の平衡化溶液に加えた。ついでＩＰＧストリップを８−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥクリテリオンプレキャストゲル(Criterion Precast Gels)(BioRad)の上端に適用し、タンパク質の分離を１−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥについて記載したのと同一条件で行った。ついで、ゲルを銀染色、クーマッシーＲ−３５０(PＨastGel Blue R, Amersham PＨarmacia Biotech)およびＰＶＤＦ膜へのタンパク質転移の加工をした。ＩＥＦおよび２−ＤＥ実験は３ないし４回反復した。
【００２２】
Ｇ.２−Ｄイムノブロットアッセイ
２−ＤＥで分離したポリペプチドをＤの部に記載しようにＰＶＤＦ膜に電気泳動で転移し、残留結合能を前に記載されたようにブロックした。膜をポリエチレンバッグに入れ、ｉ)腹痛のため胃鏡検査を受け、胃のバイオプシー培養でＨ.ピロリ陽性の患者から得たプール血清試料(ｎ＝１０)、ii)Ｈ.ピロリ培養し血清陰性者からのプール血清試料(ｎ＝１０)、iii)胃のバイオプシー培養で陽性のＨ.ピロリ感染小児からの血清、およびiv)Ｃ.ジェジュニ(C. jejuni)感染患者からの血清を積層した。血清を１０ｍｌインキュベーション緩衝液(Ｄの部参照)中で１／１００または１／１０００倍に希釈し、インキュベーション時間は一定の振とう下１６時間８℃とした。反復洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼでラベルした１／１５００希釈抗ヒトＩｇＧ抗体(Dako A/S, Glostrup, Denmark)を加え、ついで膜を２時間２０℃でインキュベートした。結合した抗体は、０.０４％３−アミノ−９−エチルカルバゾール(Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO)および０.０１５％Ｈ２Ｏ２含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.０)を加えることにより検出した。
【００２３】
Ｈ.画像分析
ゲルとイムノブロットをＧＳ−７１０イメージングデンシトメーター(BioRad)でスキャンした。１−ＤＥゲルの画像を分析し、タンパク質のＭr類をクオンティティワン(QuantityOne)ソフトウエアパッケージ(BioRad)を用いて推定した。２−ＤＥゲルの画像を、pＩおよびＭr類の推定、スポットの定量を含めて分析し、ゲルと２−Ｄイムノブロットのマッチングはメラニー(Melanie)バージョン３ソフトウエア(BioRad)で達成した。
【００２４】
Ｉ.スポットの同定
Ｈ.ピロリ陽性血清プールに明確な抗体反応性を示す６個のスポットを、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために選択し、クリーン条件下にゲルから切り出し、トリプシンで断片化した。ペプチド混合物を抽出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳで分析した。得られた内部ペプチド配列はＴＩＧＲデータベース(http://www.tigr.org/)でＨ.ピロリゲノムタンパク質の同定に使用した。
【００２５】
結果
１−ＤＥおよび１−ＤイムノブロットにおけるＡＧＥ−ＨeｐＢＰタンパク質のプロフィル
１−ＤＥ(８−１６％勾配ゲル)で分離しクーマッシーＲ−３５０で染色したＡＧＥ−ＨeｐＢＰのタンパク質プロフィルを図１に示す。３個のバンドがＭr２５、２６および２９kＤaで同定された。４個のバンド(Ｍr２５、２６、２９、３０)に対する抗体反応性をＨ.ピロリ感染患者および小児患者の血清で検出した。これらのバンドの強度差はおそらく患者間の個人の免疫反応に依存する(図２、レーン１,３−９)。Ｈ.ピロリ血清陰性の血清プールは２５kＤaおよび２６kＤaタンパク質に弱い反応性を示した(図２、レーン２)。他の潜在的交差反応性血清は２５kＤaタンパク質に反応性を確証した(図２、レーン１０−１７、枠内)。Ｍr＞３７kＤaのタンパク質に対する反応性は本研究では推定されなかった。
【００２６】
２−ＤＥおよび２−ＤイムノブロットにおけるＡＧＥ−ＨeｐＢＰ画分のプロフィル
クーマッシーＲ−３５０染色ゲル上で検出された７１個のスポットに対して、合計１４１個のスポットが銀染色ゲル上で検出された(図３Ａ)。２−Ｄイムノブロットを使用すると、１８６個のスポットが希釈率１／１０００のＨ.ピロリ陽性血清プールに抗体反応性を示した(図３Ｃ)。イムノブロットにおいてより多数のスポットが検出されたことは、スポットの銀およびクーマッシー染色に比較して抗体検出の感度が増加したことを確証する。２−ＤＥ実験の反復では、推定pＩ値の差の変化が０.０ないし０.０５の間で、高い再現性を確証した。Ｍrの推定値で変化は見られなかった。銀およびクーマッシー染色を用いて強く染色される若干のスポット(図３ＡおよびＢ、丸印)は免疫原性がなかった(図３Ｃ)。メラニー(Meranie)３ソフトウエアを用いて得られるpＩおよびＭr値を表１に挙げる。
【００２７】
スポット(タンパク質)の同定
６個のスポット(図３Ａ−Ｃ、スポット番号１−６、表１)の内部ペプチド配列を、細胞結合因子２(スポット番号１および２)、ウレアーゼＡサブユニット(スポット番号３および４)、ハイポセチカルタンパク質(スポット番号５)および外膜タンパク質(スポット番号６)のペプチドと同定した。
【００２８】
細胞結合因子２(ＨＰ０１７５)はＣ.ジェジュニ(C.jejuni)の細胞結合因子２(抗原ＰＥＢ４Ａ)に類似しており、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)サバイバルタンパク質surＡの同族体である。ここでは２個が同定されたが、さらに２−３個の低いpＩをもつアイソフォームが同じＭr値で提案されうる。Ｃ.ジェジュニ(C.jejuni)感染患者の血清との交差反応性は観察されなかった。
【００２９】
スポット番号５(ＨＰ０２３１)は、機能が未知のハイポセチカルタンパク質として同定された。このタンパク質は、１−ＤＥにおいてウレアーゼサブユニットおよび外膜タンパク質ＨＰ１５６４と共泳動するが、２−ＤＥで分離された。これは１−Ｄイムノブロットにより希釈率１／１０００のＨ.ピロリ陽性血清プールで認識されたが、Ｈ.ピロリ陰性血清プール(図４)またはＣ.ジェジュニ(C.jejuni)血清では反応性が見られなかった(図５)。
【００３０】
同定された外膜タンパク質(ＨＰ１５６４)は、リポタンパク質スーパーファミリーに属し、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasturella haemolytica)リポタンパク質１に類似性を示し(おそらくリピッドアンカーにより外膜に付着する)、またＥ.コリ(E.coli)のハイポセチカル２９.４kＤaリポたんぱく質および２８kＤaヘモフィルス・インフルエンゼ(HaemopＨilus influenzae)リポタンパク質(hlpＡ、外膜タンパク質ＨＩ０６２０、ＢＬＡＳＴソフトウエアにより相同性３８.５％)の両者とも類似する。このタンパク質(図３Ａ−Ｃ、スポット番号６、図１の２５kＤaバンド)はこの研究で使用した潜在的交差反応血清およびＨ.ピロリ陰性血清プールと反応性を示した(図２)。
【００３１】
結果の利用性
これらのタンパク質の数種が免疫診断試験を最適化するためおよびワクチンをデザインするための候補であるので、ヒト胃病原体Ｈ.ピロリの表面タンパク質明確化は極めて興味が深い。明確さが少ないＨ.ピロリ抗原に基づいて多数の抗体スクリーニング試験が開発されてきた(Glupezynski, 1998)。２−ＤＥ技術は、複合抗原中のタンパク質の同定を１−ＤＥより高度に助長し、１−ＤＥ使用時のタンパク質共泳動問題の克服を容易にする。この研究で示すように、１−ＤＥバンドとして分離されたタンパク質は、狭いpＨ勾配を使用することにより２−ＤＥ技術で数種の異なるタンパク質スポットに分離された。
【００３２】
イムノブロットと組み合わせた２−ＤＥはＨ.ピロリ抗原の同定に関して前に報告されている(McAtee et al., 1998b ; Jungblut et al., 2000)。Jungblutと共同研究者は２−Ｄイムノブロットに単一患者血清を使用し、そこで総細胞タンパク質を分離し比較的少数の免疫原性タンパク質に対する抗体反応性を発見した。これらの結果は、数種の抗原が総細胞溶解物中でマイナーな成分であり、したがってイムノブロットで測定するのが困難でありうることを示唆する。個々の宿主の応答も役割をもつかもしれない。
【００３３】
クロマトグラフィーによる画分化および濃厚化はこの問題克服の助けになる。２−ＤＥの前にヘパリン親和性クロマトグラフィーを使用することにより、ある種の低含量タンパク質を高濃度にすることが可能になり、われわれは初めてハイポセチカルタンパク質ＨＰ０２３１がヘパリンに結合することおよびその免疫原的性質を示すことができた。クロマトグラフィーは２−ＤＥと組み合わせてＨ.インフルエンゼ(H. influenzae)マイナータンパク質の濃厚化に使用され、ヘパリン親和性クロマトグラフィーの使用により、１１０個の新規タンパク質が同定された(Fountoulakis et al., 1997)。別の研究において、低含量ヒト脳タンパク質の濃厚化がこの技術を使用して実施された(Karlsson et al., 1999)。別のクロマトグラフィーマトリックスであるヒドロキシアパタイトが、Ｅ.コリ(E.coli)の低含量タンパク質濃厚化に使用された(Fountoulakis et al., 1999)。
【００３４】
幅広いpＨ勾配が早期のＨ.ピロリタンパク質の分離に使用された(McAtee et al., 1998b; Jungblut et al., 2000; Nilsson et al., 2000)。これらの研究において、塩基性タンパク質が低い度合いで分離された。しかし、本研究では、われわれはＩＥＦにおいて狭いpＨ６−１１勾配を使用することにより塩基性タンパク質の高度分解を得た。コード化前駆体の７０％超が７より高い理論的pＩ値を有する(Tomb et al., 1997)ので、このpＨ勾配はＨ.ピロリタンパク質の研究に重要である。
【００３５】
Ｍrが低い抗原に対して生じた抗体は、３３−３５kＤa抗原に対する抗体反応性が胃または十二指腸潰瘍患者の９７.５％にあるが慢性Ｂ型胃炎患者では頻度が少ない(Yamaoka et al., 1998)、Ｈ.ピロリ感染に対して予後上の価値を有することが判明した。２６kＤaタンパク質(ＨＰ１５６３、アルキルヒドロペルオキサイドレダクターゼtsaＡ)に対する抗体応答が胃がん患者血清に見られたが、がんでないＨ.ピロリ感染患者の血清では見られなかった(Wang et al., 1998)。先のイムノブロット研究において、低Ｍr(２６ないし３３kＤa)表面タンパク質セットに対する抗体反応性がＨ.ピロリ感染に高い相関性をもつことが発見された(Nilsson et al., 1997)。この範囲のタンパク質に対する抗体反応性もまたこの研究において見出され、３個の新規抗原が同定された。
【００３６】
Ｈ.ピロリの免疫原性タンパク質としての細胞結合因子２は最近報告された(McAtee et al., 1998a ; Jungblut et al., 2000)が、交差反応性に関するデータは報告されなかった。このタンパク質はＣ.ジェジュニ(C.jejuni)細胞結合因子２と類似しているので、われわれはこのたんぱく質に対する潜在的交差反応性をＣ.ジェジュニ(C.jejuni)感染患者血清および他の潜在的交差反応性血清で試験した。低い血清希釈率(１／１００)においてさえ抗体反応性が見られなかった。Ｈ.ピロリ陽性血清プールは１０倍高い希釈率(１／１０００)において明確な染色を示した(それぞれ図５および４)。すなわち、このタンパク質は強い免疫原性と高い特異性を確証した。前駆体配列におけるシグナルペプチドが予想され、主として表面露出タンパク質が遊離する緩和なタンパク質抽出法を使用したので、このタンパク質は細胞表面に位置すると考えるのが合理的である。強い免疫原性、低い交差反応性および細胞表面露出を示すことは、このタンパク質(細胞結合因子２)を診断目的およびワクチン開発用の候補として適切なものにする。
【００３７】
ハイポセチカルタンパク質ＨＰ０２３１は、ヘパリン結合機能を確証し、他の表面露出ヘパリン結合タンパク質とともに細胞表面およびマトリックス付随グリコサミノグリカン類(ＧＡＧ)に対するＨ.ピロリの結合に関与しているかもしれない。このことは次に宿主タンパク質に対する結合につながるかも知れず(Duensing et al., 1999)、宿主タンパク質で被覆されたＨ.ピロリ細胞は宿主防衛システムの攻撃を逃れるかもしれない。また、ムチンの酸性画分、細胞表面露出グリコサミノグリカン類および硫酸ヘパリンのような細胞外マトリックス成分に対する細菌の付着能力を、この病原体の持続的コロニー形成を維持するためのそれら自身の特異的受容体なしに、増加するかもしれない。
【００３８】
外膜タンパク質ＨＰ１５６４(リポタンパク質２８)およびウレアーゼＡサブユニットは１−ＤＥにおいて共泳動するが、２−ＤＥで分離された。両タンパク質とも免疫原性であるが、しかしＨＰ１５６４は交差反応性血清のセットおよびＨ.ピロリ陰性血清プールでも認識された。Ｈ.ピロリのウレアーゼは他の種のウレアーゼと類似性を有することが知られており、１−Ｄイムノブロットによる２５−２６kＤaタンパク質の染色が薄いことが擬陽性の結果を導くことができる。すなわち、明確な抗体反応性のみがＨ.ピロリ陽性シグナルと解釈されることができる。
【００３９】
ウレアーゼＡを除外して、われわれは、http ://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/のシグナルＰソフトウエアを使用して３個の同定タンパク質すべてについてシグナル配列を予言した。これは、これらのタンパク質がＨ.ピロリの表面に露出しておりしたがって診断およびワクチン開発に有用だろうとのわれわれの以前の観察と矛盾しない。
【００４０】
興味あることに、われわれのタンパク質混合物中数種の豊富なタンパク質は免疫原性でなかった(図３Ａ−Ｃ、丸印)。このことは、複合抗原が患者血清によって認識されないタンパク質を含有するかもしれないこと、およびこれらのタンパク質が免疫原性タンパク質濃度に対して減少効果をもちＥＬＩＳＡ平板の効率的な被覆およびイムノブロット様タンパク質付着の減少を招くかもしれないことを示す。
【００４１】
結論として、２−ＤＥの前にクロマトグラフィー工程を使用することによる試料の分画およびタンパク質の濃厚化は、低濃度で存在するタンパク質の同定可能性を改善する。また、抗原製剤中における免疫原性対非免疫原性タンパク質の比率を改善しうる。２−Ｄイムノブロットを使用して、われわれは２種の新規免疫原性Ｈ.ピロリタンパク質、すなわち血清診断試験およびワクチン開発に使用しうる細胞結合因子２(ＨＰ０１７５)およびヘパリン結合タンパク質(ＨＰ０２３１)を同定した。われわれは、また、２−ＤＥが診断試験に使用する複合抗原中における交差反応性タンパク質の同定を促進ことを見出した。ポストゲノム時代において、数百の微生物ゲノムを入手できるようになったとき、古典的Ｎ末端微小配列決定またはさらに進んだＭＳ／ＭＳ配列決定を使用して、免疫原性タンパク質の詳細な同定が必要になるであろう。
【００４２】
本方法は、血清学的試験における特異性をさらに改善するための抗原性タンパク質の同定を可能とするであろう。
【００４３】
引用文献
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【００４４】
Ｔable １.ＭＳ／ＭＳ配列決定により２−ＤＥから同定されたＨ.ピロリ１７８７４株の免疫原性ＡＧＥ−ＨeｐＢＰタンパク質
【表１】
2004536791.tif 000002
ａ） 図３Ａ、Ｂ、Ｃの番号に対応
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】１−ＤＥ(８−１６％勾配ゲル)で分離しクーマッシーＲ−３５０で染色したＨ.ピロリＡＧＥ−ＨeｐＢＰ類のタンパク質バンドパターン。タンパク質の標準は左側に示す。
【図２】ＡＧＥ−ＨeｐＢＰ画分の抗体反応性。ストリップはＨ.ピロリ感染および非感染患者血清をプローブした。  レーン１：Ｈ.ピロリ陽性血清プール、レーン２：Ｈ.ピロリ陰性血清プール、レーン３−９：Ｈ.ピロリ培養陽性患者、レーン１０−１１：Ｐ.エルギノーザ(P.aeruginosa)感染患者、レーン１２−１３：Ｃ.ジェジュニ(C.jejuni)感染患者、レーン１４−１５：リウマチ様関節炎患者、レーン１６−１７：Ｔ.パリズム(P.pallidum)感染患者。血清希釈率１／１００。タンパク質の標準は左側に示す。
【図３Ａ】pＨ範囲６−１１で、クリテリオン８−１６％勾配ゲルを用いてＩＥＦにより分離し銀染色したＨ.ピロリのＡＧＥ−ＨeｐＢＰ。番号１−６は表１に同定したタンパク質に対応する。丸印はＨ.ピロリ陽性血清プールで認識されなかったスポットを示す(図３Ｃ参照)。タンパク質の標準は右側に示す。
【図３Ｂ】pＨ範囲６−１１で、クリテリオン８−１６％勾配ゲルを用いてＩＥＦにより分離したＨ.ピロリＡＧＥ−ＨeｐＢＰのクーマッシーＲ−３５０染色。番号１−６は表１に同定したタンパク質に対応する。タンパク質の標準は右側に示す。
【図３Ｃ】pＨ範囲６−１１で、クリテリオン８−１６％勾配ゲルを用いてＩＥＦにより分離したＨ.ピロリＡＧＥ−ＨeｐＢＰ画分の２−Ｄイムノブロット。膜はＨ.ピロリ感染患者の１０血清プールでプローブした(希釈率１／１０００)。番号１−６は表１に同定したタンパク質に対応する。タンパク質の標準は右側に示す。
【図４】pＨ範囲６−１１で、クリテリオン８−１６％勾配ゲルを用いてＩＥＦにより分離したＨ.ピロリＡＧＥ−ＨeｐＢＰ画分の２−Ｄイムノブロット。膜はＨ.ピロリ陰性患者の１０血清プールでプローブした(希釈率１／１０００)。番号６は表１に同定したタンパク質に対応する。タンパク質の標準は右側に示す。
【図５】pＨ範囲６−１１で、クリテリオン８−１６％勾配ゲルを用いてＩＥＦにより分離したＨ.ピロリＡＧＥ−ＨeｐＢＰ画分の２−Ｄイムノブロット。膜はＣ.ジェジュニ(C.jejuni)感染患者の血清プールでプローブした(希釈率１／１００)。番号６は表１に同定したタンパク質に対応する。タンパク質の標準は右側に示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004536791.tif 000033
2004536791.tif 000034
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