(57)【要約】本発明は、野生型ＩＬ−１８分子よりもＩＬ−１８ＢＰに対して、より低い親和性を有するＩＬ−１８の変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１８結合タンパク質との相互作用に関与する１以上のアミノ酸残基に変異を含有するＩＬ−１８変異体ポリペプチド。
【請求項２】
前記変異が置換、付加または欠失である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記置換が非保存的なものである請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記変異がＧｌｕ−４２、Ｉｌｅ−８５、Ｍｅｔ−８７、Ｌｙｓ−８９、Ｍｅｔ−９６、Ａｓｐ−１３０、Ｌｙｓ−１３２、Ｐｒｏ−１４３、Ｍｅｔ−１４９およびＬｅｕ−１８９からなる群より選択される残基にある請求項１、２または３記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記変異がＧｌｕ−４２およびＬｙｓ−８９からなる群より選択される残基にある請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記変異がＧｌｕ−４２残基にある請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記変異がＬｙｓ−８９残基にある請求項５記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記変異がＧｌｕ−４２残基およびＬｙｓ−８９残基にある請求項５記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｇｌｕ−４２残基が非極性アミノ酸で置換された請求項６記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｇｌｕ−４２がＡｌａ残基で置換された請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｌｙｓ−８９残基が非極性アミノ酸で置換された請求項７記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｌｙｓ−８９がＡｌａ残基で置換された請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記Ｇｌｕ−４２残基およびＬｙｓ−８９残基の両方が非極性アミノ酸で置換された請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記Ｇｌｕ−４２およびＬｙｓ−８９残基の両方がＡｌａ残基で置換された請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが配列番号４のコーディングポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが配列番号５のコーディングポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが配列番号６のコーディングポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが配列番号７のコーディングポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが配列番号８のコーディングポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１５記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
さらにシグナルペプチドをコードする核酸配列を含有する請求項１５、１９、２０または２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
前記シグナルペプチドが成長ホルモンのシグナルペプチドである請求項２２記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
請求項１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３記載のＤＮＡを含有するベクターであって、該ベクターが適当な宿主細胞において該ＤＮＡにコードされるポリペプチドを発現することができるベクター。
【請求項２５】
前記宿主細胞が原核生物である請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
前記ＤＮＡが配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるポリペプチドをコードする請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
前記宿主細胞が真核生物である請求項２４記載のベクター。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるポリペプチドをコードする請求項２７記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２２または２３記載のＤＮＡを含有する請求項２７記載のベクター。
【請求項３０】
前記ＤＮＡがヒト成長ホルモンシグナルペプチドをコードする配列に結合されている請求項２８記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載のポリペプチドおよび薬学的に許容し得る担体からなる、Ｔｈ１応答によって予防または緩和される疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項３２】
癌の治療のための請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ウイルス疾患の治療のための請求項３１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型タンパク質に関して増強された生物学的活性を有するＩＬ−１８変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８９年に、マウスの脾臓細胞から得られるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を誘導するエンドトキシン誘導血清の活性が記載された（Nakamura et al., 1989）。この血清の活性は、直接的なＩＦＮ−γの誘導物質としてではなく、むしろＩＬ−２、ＩＦＮ−／、ＴＮＦまたはマイトジェンとともに共刺激剤として作用した。エンドトキシン後のマウス血清から活性を精製しようとする試みにより、明らかに均質な５０〜５５ｋＤａのタンパク質であることが示された（Nakamura et al., 1993）。ほかのサイトカインはＩＦＮ−γ産生に対して共刺激剤として作用することができるので、血清活性を中和するための、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＴＮＦに対する抗体の中和の失敗により、それが異なる因子であることが示唆された。１９９５年には、同科学者らによって、Ｐ．アクネス（P. acnes）であらかじめ調整されたマウス由来の肝臓の抽出物中に、ＩＦＮ−γ産生に対するエンドトキシン誘導共刺激剤が存在することが証明された（Okamura at al., 1995）。このモデルにおいて肝臓のマクロファージ数（クッパー細胞）は増加し、バクテリアのリポ多糖（ＬＰＳ）の低い投与量（あらかじめ調整されていないマウスでは致死ではない）が、これらマウスにおいては致死量であった。ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）と名づけられ、のちにインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）と呼ばれるその因子が、１２００グラムのＰ．アクネス処理されたマウスの肝臓から均質的に精製された。精製されたＩＬ−１８のアミノ酸配列から得られた変性オリゴヌクレオチドは、マウスＩＬ−１８ｃＤＮＡをクローン化するために使用された（Okamura et al. 1995）。ＩＬ−１８およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のメッセンジャーＲＮＡは、活性化マクロファージにおいて容易に検出された。ＩＬ−１８は単独ではＩＦＮ−γを誘導しないが、主にマイトジェンまたはＩＬ−１２との共刺激剤として機能する。ＩＬ−１８に対するヒトｃＤＮＡ配列は１９９６年に報告された（図１Ａ  配列番号：１）。
【０００３】
インターロイキンＩＬ−１８は、構造上の性質がＩＬ−１ファミリーのタンパク質と共通している（Nakamura et al., 1993 ; Okamura et al., 1995; Ushio et al., 1996 ; Bazan et al., 1996）。４へリックスバンドル構造を示す多くのほかのサイトカインとは異なり、ＩＬ−１８およびＩＬ−１βはすべてβひだ状シート構造（β-pleated sheet structure）を有する（Tsutsui et al., 1996）。ＩＬ−１βと同様に、ＩＬ−１８は生物学的に不活性な前駆体（プロＩＬ−１８）として合成され、シグナルペプチドを欠いている（Ushio et al., 1996）。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８前駆体は、Ｐ１位のアスパラギン酸残基の後ろで前駆体を切断するカスパーゼ１（１Ｌ−１β−変換酵素、またはＩＣＥ）によって切断される。得られた成熟サイトカインはすぐに細胞から放出される（Ghayur et al., 1997およびGu et al., 1997）。
【０００４】
ＩＬ−１８はＴヘルパーＩ型（Ｔｈ１）細胞によるサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子）の共刺激剤であり（kohno et al., 1997）、マウスナチュラルキラー細胞クローンのＦＡＳリガンド仲介細胞傷害性の共刺激剤でもある（Tsutsui et al., 1996）。
【０００５】
Ｔｈ１リンパ球は腫瘍に対する免疫応答に関与する（Seki et al., 2000）。Ｔｈ１応答は、特定の腫瘍抗原を認識する特定の細胞傷害性Ｔリンパ球の産生だけでなく、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γの分泌を含む。Ｔｈ１応答は、多くの微生物に対する生存目的の宿主の防御手段でもある。しかしながら、Ｔｈ１応答は、いくつかの自己免疫疾患の発症、炎症および臓器移植拒絶などの望ましくない作用にも関連する。
【０００６】
成熟タンパク質をコードするベクターを用いて大腸菌での成熟型のＩＬ−１８の発現を試みたところ、完全に活性なサイトカインはもたらされなかった。完全に生物学的に活性なヒトＩＬ−１８の産生に有効な発現系は、たとえば、悪性腫瘍、またはＩＦＮ−γ誘導が望まれるあらゆる症状における治療での使用のために開発されている（国際公開第００／６１７６８号パンフレット）。この系において、ＩＬ−１８前駆体のカスパーゼ−１切断部位は、Ｘａ因子部位（ＩＣＥ／Ｘａ）に変化し、ＩＬ−１８  ＩＣＥ／Ｘａ前駆体をコードするベクターが、大腸菌の形質転換のために用いられた。大腸菌におけるこのＩＬ−１８前駆体の発現ののち、成熟ＩＬ−１８は、イン  ビトロでＸａ因子切断により産生された。Ｘａ因子切断により産生されたこの成熟ＩＬ−１８は、完全に活性であった。
【０００７】
サイトカイン結合タンパク質（可溶性サイトカイン受容体）は、たいていそれらのそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。それらは、細胞表面受容体の選択的なスプライシング、または細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のどちらかによって産生される。それら可溶性受容体は、今までに、たとえば、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体（Novick et al., 1989）、ＴＮＦの可溶性受容体（Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990）、ＩＬ−１およびＩＬ−４の可溶性受容体（Maliszewski et al., 1990）、ＩＦＮ−α／βの可溶性受容体（Novick et al., 1994; Novick et al. 1992）などが記載されている。オステオプロテグリン（osteoprotegerin）（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子−ＯＣＩＦとしても知られる）と命名され、ＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーである１つのサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例であると思われる（Anderson et al., 1997; Simonet et al., 1997; Yasuda et al., 1998）。
【０００８】
ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８カラム中で尿からアフィニティー精製された（Novick et al., 1999）。ＩＬ−１８ＢＰはＩＮＦ−γおよびＩＬ−８のＩＬ−１８誘導、イン  ビトロにおけるＮＦ−κＢの活性化ならびにイン  ビボにおけるＩＦＮ−の誘導を廃する。ＩＬ−１８ＢＰは、脾臓において構成的に発現される可溶性の循環タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。最も豊富なＩＬ−１８ＢＰアイソフォームである、スプライスされた変異体アイソフォームａは、急速な吸着速度および遅い離脱速度で、ＩＬ−１８に対し高い親和性を示し、およそ４００ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を示した（Kim et al., 1999）。
【０００９】
ＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰとの相互作用に関与する残基は、コンピュータモデリングの使用により（Kim et al., 1999）、およびＩＬ−１のＩＬ１ＲＩ型との相互作用に基づいて（Vigers et al., 1997）、記載されている。ＩＬ−１８ＢＰに結合するＩＬ−１８のモデルにおいて、ＩＬ−１８の４２位のＧｌｕ残基および８９位のＬｙｓ残基が、それぞれＩＬ−１８ＢＰにおけるＬｙｓ−１３０およびＧｌｕ−１１４に結合することが提唱されている（Kim et al., 1999）。
【００１０】
ＩＬ−１８は多くの細胞で構成的に存在し（Puren et al., 1999）、健康なヒトでは循環している（Urushihara et al., 2000）。循環で見出されるＩＬ−１８ＢＰの高い濃度（ＩＬ−１８に比べ２０倍のモル濃度過剰）だけでなく、ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８への高い親和性は、サイトカインの生物学において独特の状態を表わす。したがって、すべてではないが、循環中のほとんどのＩＬ−１８分子はＩＬ−１８ＢＰに結合される。ＩＬ−１８の細胞表面受容体と拮抗するこの循環ＩＬ−１８ＢＰは、天然の抗炎症性分子および免疫抑制性分子として作用し得る。
【００１１】
ＩＬ−１８ＢＰ様タンパク質をコードするウイルス製剤、たとえばＭ．コンタギオーサム（M. contagiosum）のウイルス性タンパク質ＭＣ５３およびＭＣ５４は、哺乳動物のＩＬ−１８ＢＰに対して顕著な相同性を示す（Novick et al. 1999）。Ｍ．コンタギオーサムのタンパク質ＭＣ５３およびＭＣ５４は、ＩＬ−１８Ｂと同様に、ヒトＩＬ−１８と結合し、中和する能力を有する（Xiang and Moss, 1999）。ＩＬ−１８ＢＰと相同である、エクトロメリアポックスウイルスのｐ１３タンパク質は、ヒトＩＬ−１８と結合し、イン  ビトロにおいてその活性を阻害する。ｐ１３欠失変異体ウイルスで感染させたマウスは、感染性のレベルの減少を示した（Born et al., 2000）。したがって、感染性の程度はＩＬ−１８ＢＰの存在と関連があると思われる。
【００１２】
高レベルの循環ＩＬ−１８ＢＰは、感染に対して上昇するＴｈ１応答および自己免疫疾患の発症に対する天然の防御を表わし得る。しかしながら、ＩＬ−１８は腫瘍に対する宿主の防御において重要であるＴｈ１応答に貢献する。したがって、ＩＬ−１８ＢＰは、宿主の腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の発達の失敗を引き起こし得る。実際、マウスにおいてＩＬ−１８が腫瘍に対する宿主の防御を促進するという証拠がある。たとえば、同系のマウスにおいて、マウスＩＬ−１２またはマウスＩＬ−１８を発現するマウス乳腺癌細胞は、ほとんど腫瘍を生じず、対照の非発現細胞よりもゆっくりと腫瘍を形成した（Coughlin et al., 1998）。抗体の中和の研究により、抗腫瘍効果にはＩＦＮ−γが必要であることが明らかにされた。そのほかの研究では、Ｂ７−１（ＣＤ８０）を発現するＢ１６メラノーマとかけ合わせた実験動物へＩＬ−１８を全身に投与した結果、メラノーマ形成、腫瘍成長の劇的な抑制、および生存における有意な改善が生じた（Cho et al., 2000）。
【００１３】
サイトカインは、癌における免疫治療の有効性を増大させるために、アジュバンドとして用いられる。たとえば、ＩＬ−２は腎臓細胞癌またはメラノーマに対して投与される（Gollob et al., 2000）。しばしば、サイトカインを用いる治療の１つの重要な結果は、重篤な全身性毒性プロフィールである。患者自身の腫瘍または樹状細胞によって発現されたサイトカインの使用は、その問題に対する論理的な解決法である。やはり、もしＩＬ−１８が腫瘍の免疫治療においてアジュバンドとして局所的に用いられるべきであれば、局所的な環境でのＩＬ−１８を中和する構成的なレベルのＩＬ−１８ＢＰの能力は依然として強力に発揮され、その結果その有効性は大いに減少する。
【００１４】
白血病および固体腫瘍（solid tumors）を治療するためのいわゆるミニ移植である、骨髄非破壊的同種移植の使用により、移植片対白血病および移植片対腫瘍の反応の誘導が徐々に成功している（Slavin S., 2000; Slavin et al., 2000）。転移性腎臓細胞癌の患者を治療するために同種の末梢血幹細胞（Childs et al. 2000）または樹状細胞（Kugler et al., 2000）のどちらかを用いる２つの研究は、注目すべき成功を果たした。それらの研究は拡大され確認される必要はあるけれども、現在行われている移植片対腫瘍の反応が癌における免疫治療に利用可能であるという概念は賛同を得ている（Slavin, 2000）。ＩＬ−１８はそれらの成功した治療的アプローチに関与していると思われるので、ＩＬ−１８ＢＰの中和効果を廃することができればさらなる改善が達成され得る。
【００１５】
ＩＬ−１８の変異体（ＩＦＮ−γ、誘導因子）は欧州特許出願第０８４５５３０号明細書に記載されている。その記載されているＩＬ−１８変異体は、ＩＬ−１８の１、２、３または４つすべてのシステイン残基（図１Ｂ）がセリンまたはアラニン残基によって置換されている分子である。これら変異体は完全な保存配列を含む（図１Ｂ）。すべての単離された変異体は野生型のＩＬ−１８よりも高い安定性を示す。その変異体の安定性の程度はその分子内で置換されたＣｙｓ残基の数に比例する。欧州特許出願第０８４５５３０号明細書は、その変異体を中和するためのＩＬ−１８ＢＰの能力については触れていない。
【００１６】
したがって、ＩＬ−１８ＢＰと結合できないかまたは低親和性で結合する完全に活性なＩＬ−１８変異体の生成および治療的使用は、非常に有利である。
【発明の開示】
【００１７】
本発明は、ＩＬ−１８結合タンパク質との相互作用に関与する１つ以上のアミノ酸残基に変異を含有するＩＬ−１８変異体ポリペプチドに関する。より具体的には、該変異は置換、好ましくは非保存的な不可または欠失である。該ポリペプチドにおいて変異される残基はＧｌｕ−４２、Ｉｌｅ−８５、Ｍｅｔ−８７、Ｌｙｓ−８９、Ｍｅｔ−９６、Ａｓｐ−１３０、Ｌｙｓ−１３２、Ｐｒｏ−１４３、Ｍｅｔ−１４９およびＬｅｕ−１８９から選択され得、好ましくはＧｌｕ−４２およびＬｙｓ−８９である。
【００１８】
ある実施態様において、Ｇｌｕ−４２またはＬｙｓ−８９、もしくはＧｌｕ−４２およびＬｙｓ−８９の両方は非極性アミノ酸と置換され、好ましくはアラニンと置換される。
【００１９】
さらに、本発明は前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、好ましくは配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。
【００２０】
ある実施態様において、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８をコードするＤＮＡは、シグナルペプチド、好ましくはｈＧＨのシグナルペプチドと融合される。さらに、本発明は、該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを適当な宿主細胞、たとえば原核生物または真核生物の宿主細胞において発現することができる該ＤＮＡを含有するベクターをも提供する。
【００２１】
さらに、本発明はＴｈ１応答によって予防または緩和される疾患の治療、好ましくはウイルス疾患または癌の治療のための、前記ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、野生型（ＩＬ−１８ＷＴ）に比べてＩＬ１８ＢＰによる中和の影響を受けにくい、ＩＬ−１８変異体もしくはその活性断片、またはムテイン、またはそのほかのタンパク質もしくはそのペプチド誘導体（ＩＬ−１８Ｍ）に関する。より具体的には、ＩＬ−１８ＷＴの１つ以上のアミノ酸、好ましくは３０以下、より好ましくは１０個までのアミノ酸がほかのアミノ酸と置換されるか、もしくは削除されるか、またはＩＬ−１８ＢＰによる中和の影響を受けにくい活性なＩＬ−１８変異体を生成するために、１つ以上のアミノ酸が付加、好ましくは３０以下、より好ましくは１０個までのアミノ酸が付加され得る。アミノ酸はさまざまなアミノ酸で置換されることができ、該置換は好ましくは非保存的な置換である。より具体的には、該変異は、ＩＬ−１８ＢＰとの結合に関与すると予想される残基、たとえばＧｌｕ−４２、Ｉｌｅ−８５、Ｍｅｔ−８７、Ｌｙｓ−８９、Ｍｅｔ−９６、ＡＳＰ−１３０、Ｌｙｓ−１３２、Ｐｒｏ−１４３、Ｍｅｔ−１４９およびＬｅｕ−１８９、より好ましくはＧｌｕ−４２および／またはＬｙｓ−８９を標的とすることができる（Kim et al., 1999）。
【００２３】
ＩＬ−１８Ｍは真核生物または真核生物発現系において、細胞内、ペリプラズムに産生され得、または培地中に分泌され得る。産生されるＩＬ−１８Ｍは可溶型または不溶型（封入体）で回収され得る。
【００２４】
前駆体ＩＬ−１８ＭのｃＤＮＡを含有するベクターは、正しく組み立てられた前駆体ＩＬ−１８Ｍの発現のために原核生物系において用いられ得る。そののち、成熟した完全に活性なタンパク質を、イン  ビトロでＩＣＥによる切断ののち生成することができる。プロテアーゼに特異的な切断部位をコードする配列、好ましくはＸａ因子は、ＩＬ−１８Ｍの前駆体においてＩＣＥ配列と置換することができる。
【００２５】
成熟ＩＬ−１８ＭのｃＤＮＡに融合される、有効なシグナルペプチド、好ましくはヒト成長ホルモンシグナルペプチドをコードする発現ベクターは、真核生物の発現および分泌のために用いられ得る。
【００２６】
変異体構築に用いられる親のＩＬ−１８ｃＤＮＡは、マウスまたはヒトの種から選択されることができる。
【００２７】
ＩＬ−１８Ｍは、便宜的な精製のために、エピトープ、好ましくはヒスチジンを付加することができる。組換えＩＬ−１８Ｍは通常のまたはアフィニティーの方法により精製され得る。産生されたＩＬ−１８Ｍの量は、特異的なＥＬＩＳＡによってモニターされ得る。
【００２８】
ＩＬ−１８Ｍは、Ｔｈ１応答、より具体的にはＩＬ−１８治療によって予防または軽減される疾患、たとえば微生物の感染および癌の治療のための医薬製剤において使用されることができる。そのタンパク質の野生型版の代わりに変異体を用いることの利点は、ＩＬ−１８ＢＰ中和に対する耐性にある。
【００２９】
より具体的には、ＩＬ−１８Ｍは、腫瘍免疫治療における腫瘍抗原に対するアジュバンドとして全身的にまたは局所的に投与され得る。
【００３０】
患者由来の腫瘍細胞は単離され、ＩＬ−１８Ｍを分泌するように遺伝的に修飾され、局所的なワクチン接種のために同じ患者に再移植される（Coughlin et al., 1998）。さらに腫瘍の抗原性を高め、その結果抗腫瘍応答を高めるために、同種の樹状細胞（抗原提示細胞）にＩＬ−１８Ｍを発現する修飾された腫瘍細胞を融合することができる。
【００３１】
ＩＬ−１８ＭはＤＮＡワクチン接種におけるアジュバンドとして投与することができる（Tuting et al., 1998）。サイトカインＩＬ−１２およびＩＦＮ−の使用に関して報告されたものと同じ方法において。この場合、経皮的な腫瘍抗原のワクチン接種は、遺伝子銃を用いて行なうことができる。この結果、腫瘍抗原およびＩＬ−１８Ｍの両方をコードするＤＮＡで皮膚に内在する樹状細胞はトランスフェクションされる。あるいはまた、樹状細胞はエクソ  ビボにおいて処理されたのち、選択的に移入される。
【００３２】
ＩＬ−１８Ｍは、移植片対腫瘍の治療におけるアジュバンドとして使用することができる。同種の幹細胞は癌患者に移植するために用いることができる。同種細胞の移植により、好ましくは遺伝的に修飾された同系の樹状細胞または患者から採取された腫瘍細胞でのＩＬ−１８Ｍの発現により誘導される移植片対腫瘍拒絶を上昇させるために、ＩＬ−１８Ｍは全身的にまたは局所的に投与され得る。
【００３３】
本発明はその好ましい特定の実施態様と関連して記載されているが、前述の記載ならびに以下の実施例は説明を意図するものであり、本発明の範囲を制限するものではないことは理解されるであろう。ほかの局面において、本発明の範囲内の利点および修飾は本発明の属する技術分野の当業者にとって明らかであるだろう。
【実施例１】
【００３４】
Ｘａ因子による切断に対するＷＴ  プロＩＬ−１８ヒスチジンタグ融合タンパク質の発現用ベクターの構築
大腸菌において正しく組み立てられるＩＬ−１８を産生するために、ＩＬ−１８の前駆体のＩＣＥ切断部位をＸａ切断部位によって置換した。そののち、イン  ビトロにおけるＸａによるＩＬ−１８前駆体の切断により、活性なタンパク質が産生される（国際公開第００／６１７６８号パンフレット）。
【００３５】
発現プラスミドを産生するために使用される、ヒトＩＬ−１８前駆体をコードするｃＤＮＡ配列（プロＩＬ１８、ジーンバンク受託番号Ｄ４９９５０、図１）は、記載されているように単離された（Ghayur et al., 1997）。
【００３６】
ＩＣＥ切断部位のＸａ切断部位での置換は、２つのＰＣＲ反応を用いて達成された（図１で使用するプライマーを参照）。ＰＣＲ反応１：ＩＬ−１８ｃＤＮＡのプロピース（ｐｒｏｐｉｅｃｅ）は、ＯＲＦの上流に位置するＥｃｏＲ１部位を含有するセンスプライマー（Ｐｒ１）、すなわち５′−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧ（配列番号：１１）、およびＩＣＥ部位（３３−ＬＥＳＤ−３６）の６ヌクレオチドがＸａ因子部位（３３−ＬＥＧＲ−３６）をコードするように変換して設計されたリバースプライマー（Ｐｒ２）、すなわち５′−ＡＡＡＧＴＡＡＣＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＧＴＴＴＴＣ（配列番号：１２）を用いて生成された。成熟ＩＬ−１８をコードする増幅されたＤＮＡフラグメントは、Ｐｒ２に相補的なセンスプライマー（Ｐｒ３）、すなわち５′−ＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＡＣＧＴＴＡＣＴＴＴ（配列番号：１３）、およびＩＬ１８のコーディング配列の下流にＢａｍＨＩ部位を含有するリバースプライマー（Ｐｒ４）、すなわち５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号：１４）を用いて生成された。そのプロピース１０８ｂｐおよび成熟４７４ｂｐのＩＬ−１８ＤＮＡは１％のアガロースで電気泳動法によって分離され、ゲル抽出システム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）によって溶出された。
【００３７】
ＰＣＲ反応２：ＰＣＲ反応１において得られた２つのＤＮＡ断片を１：１の比率で混合し、ＩＣＥ部位がＸａ因子部位で置換された完全なヒトＩＬ−１８ｃＤＮＡ（ＩＣＥ／Ｘａ）を生成するために、プライマーＰｒ１とＰｒ４とともに用いた。
【００３８】
プロＩＬ−１８（ＩＣＥ／Ｘａ）ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）制限部位によってＢｌｕｅＳｃｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にライゲーションした。このプラスミドは配列の確認のために利用した。コードされる予想アミノ酸配列は配列番号：２に示す。大腸菌での発現のために、ＩＬ−１８ＤＮＡインサートを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位（ＢｌｕｅＳｃｉｐｔにもともと存在する）を使用してｐＰＲＯＥＸ  ＨＴａベクター（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に再びライゲーションした。このベクターにおいて、得られるタンパク質はＮ末端にヒスチジンタグが融合している。
【実施例２】
【００３９】
Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａ変異体の構築
ＩＬ−１８における変異は、阻害剤ＩＬ−１８ＢＰに結合するのに重要であると予想される残基に生み出された（Kim et al. 2000）。３つの変異体：Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＦ−４２Ａ／Ｋ８９Ａが生成された。該変異は、以下に記載のプライマーおよび鋳型（プライマーは図２に示す）を用い、実施例１に記載されているように２つのＰＣＲ反応によって達成された。
【００４０】
Ｅ４２変異体
ＰＣＲ反応１：変異体Ｅ４２Ａを調製するために用いる対のプライマーは：対Ａ−Ｐｒ１（実施例１）および、グルタミン酸（Ｅ４２）の代わりにアラニンをコードするリバースプライマー（Ｐｒ５）５′−ＴＡＡＴＴＴＡＧＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣ（配列番号：１５）、および対Ｂ  グルタミン酸が変換されアラニンをコードする（ＧＡＡからＧＣＡへ）センスプライマー（Ｐｒ６）５′−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡ（配列番号：１６）およびリバースプライマーＰｒ４（実施例１）であり、ＰＣＲ反応には鋳型としてプロＩＬ−１８（ＩＣＥ／Ｘａ）を用いた。
【００４１】
ＰＣＲ反応２：ＰＣＲ反応１において得られた２つのＤＮＡ断片を、プライマーＰｒ１およびＰｒ４を用いる第２のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【００４２】
Ｋ８９Ａ変異体
ＰＣＲ反応１：変異体Ｋ８９Ａを調製するために用いる対のプライマーは、対Ａ  Ｐｒ１（実施例１）、およびリジン（Ｋ８９）の代わりにアラニンをコードするリバースプライマー（Ｐｒ７）５′−ＣＴＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴ（配列番号：１７）、および対Ｂ  リジンの代わりにアラニンをコードする（ＡＡＡからＧＣＡへ）センスプライマー（Ｐｒ８）５′−ＡＧＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＧＣＣＡＧ（配列番号：１８）およびリバースプライマーＰｒ４（実施例１）であり、第１のＰＣＲ反応には鋳型としてプロＩＬ−１８（ＩＣＥ／Ｘａ）を用いた。
【００４３】
ＰＣＲ反応２：ＰＣＲ反応１において得られた２つのＤＮＡ断片を、プライマーＰｒ１およびＰｒ４を用いる第２のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【００４４】
Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａ変異体
二重変異Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａに関しては、Ｆ−４２Ａ変異の調製用と同じプライマーを使用し、変異体Ｋ８９ＡのｃＤＮＡを反応における鋳型として使用した。
【００４５】
各３つのＩＬ−１８変異遺伝子を、配列の確認のためにＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクターにライゲーションした。前駆体ＩＬ−１８Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａ変異体の予想アミノ酸配列を、それぞれ配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５に示す。大腸菌での発現のために、各３つのＩＬ−１８ＤＮＡインサートを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を使用してｐＰＲＯＥＸ  ＨＴａベクター（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に再びライゲーションした。この得られるタンパク質はＮ末端にヒスチジンが融合している（図１）。
【実施例３】
【００４６】
タンパク質の発現および精製
ＩＬ１８変異体前駆体は大腸菌において発現され、ヒスチジンタグによりアフィニティー精製され、ついでそれぞれの成熟分子はＸａ因子でのタンパク質分解的切断によって生成される。
【００４７】
各４つのｐＰＲＯＥＸ  ＨＴｕ／ＩＬ−１８プラスミド（ＷＴおよび３つの変異体）を、ＤＨＱ株のコンピテント大腸菌細胞（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に導入し、記載されているように発現させた（１１）。一晩の培養物２５ｍｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４５０ｍｌのＬＢ培地に対する播種材料として使用し、細胞密度が０．６〜１ＯＤ600に達するまで増殖させた。タンパク質の発現はイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ  ０．３ｍＭ）による処理および３時間の振とうを伴う連続した３７℃のインキュベーションによって誘導される。培養されたバクテリア細胞を遠心分離（５，０００×ｇ、１５分、４℃）によって回収し、ついでペレットを３０ｍｌのタロン緩衝液（Talon buffer）（５０ｍＭ  ＮａＨ2Ｐ０4／２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁した。細胞を氷上で音波処理（２×３０ｓバースト）によって溶解した。可溶性タンパク質を遠心分離（４，０００×ｇ、３０分、４℃）により得、３ｍｌのミニ−タロンカラム（mini-Talon column）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に注入した。タロンカラムをついで３０体積倍量（30 bed volumes）のタロン緩衝液で洗浄し、６ｍｌの１００ｍＭイミダゾールタロン緩衝液で溶出した。溶離液を４℃で２０時間、Ｘａ因子緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  ＣｓＣｌ2）に対して透析した。０．２ｍｌのタロンアフィニティーで精製されるＮ−末端Ｈｉｓ×６融合プロＩＬ−１８を、２ｍＭのフェニルメチルスルホニル  フルオロイド（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の存在下で、４μｇのＸａ因子酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で４時間、室温でインキュベーションした。産生されたＩＬ−１８の量は特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってモニターした。成熟ＩＬ−１８ＷＴ、Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２／Ｋ８９Ａ変異体の予想されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８に示す。
【実施例４】
【００４８】
ウエスタンブロットによるＥ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａ  ＩＬ−１８変異タンパク質の特徴付け
精製されたＩＬ−１８変異体を、成熟ＩＬ−１８に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析に供した。
【００４９】
同量のタロンアフィニティー精製された前駆体、および（Ｘａ因子によって切断されたのちの）成熟タンパク質であるＷＴならびに変異体ＩＬ−１８型を、還元条件下でＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）によって分離した。該タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ついで一次抗体（ヒトＩＬ−１８の組換え成熟型に対して起こされ（Puren et al., 1999）、前駆体ＩＬ−１８をも認識する、ウサギ抗ヒトＩＬ−１８ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体クローン８−３１−４（ＩｇＧ２ａ））とともにインキュベーションした。２４時間のインキュベーションののち、対応の二次抗体である、ヤギ抗マウスまたはロバ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、ついでＥＣＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって展開させた。
【００５０】
ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ−１８によるプロＩＬ−１８の染色は、ＷＴおよび各３つの変異体において同程度の彩度であった。同様に、ポリクローナル抗血清を用いて、ＷＴおよびＩＬ−１８ならびに各３つの変異体の成熟型で得られたシグナルは、同程度の彩度であった。見かけの分子量は、種々のＩＬ−１８型が正しいサイズであることを示唆していた。対照的に、モノクローナル抗体を用いた場合、２つの変異体Ｋ８９ＡおよびＥ４２／Ｋ８９Ａは、ＷＴおよびＥ４２変異体よりも濃く染色されるようであり、モノクローナル抗体のアフィニティーがそれらの変異体に対してより強いことが示唆された。それらの結果より、変異体Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａは高親和性を導く異なる形態を有することが示唆される。
【実施例５】
【００５１】
Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａ  ＩＬ−１８変異タンパク質の生物学的活性の特徴付け
精製された成熟型のＩＬ−１８／ＩＣＥ／Ｘａを、ヒトナチュラルキラー細胞（実施例８に記載したＮＫＯ）およびＰＢＭＣｓ（実施例７に記載）におけるＩＦＮ−γの共誘導、ならびにＰＢＭＣｓにおけるＩＬ−８の誘導について解析した。
【００５２】
ＩＬ−１２（またはＩＬ−１５）が共刺激剤として用いられない場合、ＩＬ−１８はそれらの細胞においてＩＦＮ−γを誘導しない。低濃度のＩＬ−１２（１〜２ｎｇ／ｍｌ  １２（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、 ＮＪ）は、少量のＩＦＮ−γを誘導するが、ＩＬ−１８を伴うＩＬ−１２での処理はＩＦＮ−γ産生をより増大する。産生されたＩＦＮ−γは実施例９に記載するように細胞においてモニターされた。ＷＴ  ＩＬ−１８／ＩＣＥ／ＸａおよびＩＬ−１２によるＮＫＯ細胞におけるＩＦＮ−γの誘導は、プロＩＬ−１８のＩＣＥプロセシングにより得られる組換え成熟ヒトＩＬ−１８（Gu et al., 1997）およびＩＬ−１２により誘導されたものに匹敵することが示された。それらの結果は、ＩＬ−１８が大腸菌において正しく組み立てられ、Ｘａ因子により正しくプロセシングされたことを示す。
【００５３】
変異ＩＬ−１８の活性を試験するために、ＩＬ−１２を伴う変異体またはＷＴ  ＩＬ−１８の刺激によるＩＦＮ−γ産生の誘導をＮＫＯ細胞において評価した（統計的解析は実施例１０に記載する）。図３Ａに示すように、ＷＴ  ＩＬ−１８はＩＦＮ−γの誘導物質として活性であり、７．５ｎｇ／ｍｌで開始し、６０ｎｇ／ｍｌ（試験した最高濃度）まで徐々に増加した。各３つの変異ＩＬ−１８型は、それらの細胞においてＷＴよりも優れた生物学的活性を示した。たとえば、単一変異Ｅ４２Ａは、試験された各濃度においてＷＴ型の２倍の活性であった。単一変異Ｋ８９Ａは、７．５ｎｇ／ｍｌの濃度においてＷＴ型の４倍の活性であった。二重変異Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａは最も活性なＩＬ−１８となる結果となった。図３Ａに示すように、Ｅ４２Ａ変異ＩＬ−１８は、３０ｎｇ／ｍｌの濃度で６００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγ、すなわち６０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８ＷＴでの前処理により観察された最大活性を誘導し、Ｋ８９Ａ変異体は１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、二重変異体は７．５ｎｇ／ｍｌの濃度で誘導した。したがって、変異体Ｅ４２Ａ、Ｋ８９Ａおよび二重変異体は、それぞれＷＴの２倍、４倍および８倍強力である。
【００５４】
同様の結果が、ＩＦＮ−γ産生を新しく単離されたヒトＰＢＭＣｓにおいて試験したときに観察された（実施例７）。これらの細胞において、ＩＬ−１２とＩＬ−１８の共刺激はＩＦＮ−γ産生という結果を導くが、２つのサイトカインとも単独ではＩＦＮγを誘導することはできない。二重変異体Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａが最も活性であった（図３Ｂ）。
【００５５】
この結果は、２つの荷電アミノ酸Ｇｌｕ４２および／またはＬｙｓ８９のＡｌａ残基による置換が、ＩＬ−１８の生物学的活性を着実に上昇させることを示す。
【００５６】
ＩＬ−１８はＰＢＭＣ調製物中のＣＤ１４＋細胞においてＩＬ−８を誘導することが知られている（実施例７に記載）。ＩＬ−１８は、それらの細胞において、ＩＬ−１２の共刺激を必要とせずＩＬ−８産生を誘導するけれども、ＩＬ−８の誘導はＩＦＮ−γの誘導よりも高濃度のＩＬ−１８を必要とする。したがって、ＩＬ−１８ＷＴおよび変異体のＰＢＭＣｓ刺激によるＩＬ−８の誘導を試験した。産生されたＩＬ−８を、実施例９に記載する特別な分析によって細胞培地においてモニターした。ＩＬ−８の誘導において、２つの単一変異はＷＴに類似しているけれども、二重変異したＩＬ−１８は野生型版に比べて有意にＩＬ−８を誘導（３．５倍）したことを図４は示す。
【００５７】
それらの結果は、二重変異体Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａがもっとも高い生物学的活性を示すことを示す。
【実施例６】
【００５８】
ＩＬ−１８ＢＰによるＩｌ−１８変異体の中和
阻害剤ＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８結合に重要であると予想される残基に、変異を設計した。したがって、ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８の生物学的活性、たとえばＩＦＮ−γ産生（実施例８）を中和する能力をとくに評価した。
【００５９】
様々な濃度のＩＬ−１８ＢＰ（ＣＨＯ細胞の“ａ”アイソフォームが、組換えＨｉｓ−６が付加されたヒトＩＬ−１８ＢＰを産生した（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供、Ｎｅｓｓ  Ｚｉｏｎａ、Ｉｓｒａｅｌ  Kim et al., 2000））をＷＴ  ＩＬ−１８またはその変異型（３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度）でプレインキュベーションし、ついで細胞培養物に添加した。
【００６０】
図４Ａに示すように、ＮＫＯ細胞由来のＷＴ  ＩＬ−１８によるＩＦＮ−γの共誘導に対するＩＬ−１８ＢＰの５０％の阻害濃度は、およそ１５ｎｇ／ｍｌであった（３．７ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８ＢＰでは阻害は起こらず、この値は１００％の活性を表すと思われる）。単一変異のＥ４２Ａでは、同じようなＩＬ−１８ＢＰによる投与量阻害濃度となった。
【００６１】
しかしながら、変異体Ｋ８９ＡをＩＬ−１８ＢＰとともにインキュベーションしたとき、ＮＫＯ細胞におけるＩＦＮ−γの共誘導物質として作用する能力はより少ない量で中和された（図５Ａ）。たった１２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、活性において統計学的に有意な減少が観察できた。対照的に、ＩＬ−１８ＢＰは、二重ＩＬ−１８変異体Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａを中和することができなかった。
【００６２】
図４Ｂに示すように、ＮＫＯ細胞に比べてＰＢＭＣｓにおいて試験した場合、ＩＬ−１８はＩＬ−１８ＢＰによる中和により感受性である。ＷＴ  ＩＬ−１８を中和するのに必要なＩＬ−１８ＢＰの量は３．７ｎｇ／ｍｌ、すなわち試験された最小濃度であった。単一変異Ｅ４２Ａは、低濃度のＩＬ１８ＢＰがＰＢＭＣｓにおいてその生物学的活性を中和した観察によって確立されたように、ＷＴ  ＩＬ−１８と同じような挙動をする。対照的に、単一変異Ｋ８９Ａは１２０ｎｇ／ｍｌで中和される。ＮＫＯ細胞におけるＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８変異体の中和に関する結果と同様に、二重変異体Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａは、ＰＢＭＣｓにおいてＩＬ−１８ＢＰによる影響をほんの少ししか受けなかった。
【００６３】
これらの結果は、変異体Ｅ８９Ａおよび二重変異体Ｅ４２Ａ／Ｋ８９Ａは天然の阻害剤ＩＬ−１８ＢＰによる影響をほとんど受けないことを示す。
【実施例７】
【００６４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の単離および培養ならびにＩＦＮ−γの誘導
健康なヒト提供者の血小板フェレーシス由来の残留の白血球を血管から洗い流し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅで遠心分離にかけた。ＰＢＭＣｓを界面から吸引し、ピロゲン不含生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＬ）で３回洗浄し、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に１ｍｌ当たり５×１０6細胞で懸濁した。細胞は平滑な底面の９６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２の存在下で、ＲＰＭＩ１６４０培地のみ（対照）、さまざまな濃度の組換えヒトＩＬ−１８、およびＷＴ  ＩＬ−１８（ＩＣＦ／Ｘａ）または３つの変異体で培養した。いくつかの実験において、ＩＬ１８調製物はまず、細胞に添加する前に、ポリミキシンＢ（１μｇ／ｍｌ  Ｓｉｇｍａから購入）と混合した。細胞は１６〜２０時間、３７℃、５％ＣＯ2の加湿した空気でインキュベーションし、ついで培養上清をＩＦＮ−γ測定のために収集した。
【実施例８】
【００６５】
ＮＫＯ細胞系におけるＩＦＮ−γの誘導
元の親株であるＮＫ９２細胞系はハンス  キリンガーマン氏（hans klingerman）より入手した（Gong et al., 1994）。本研究で用いたヒトＮＫＯ細胞系は、この細胞系のサブクローンであった。ＮＫＯ細胞は１０％のＦＢＳおよび５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有する補充ＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。分析のために、ＮＫＯ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に１ｍｌ当たり０．５×１０6細胞で懸濁し、０．２ｍｌ容量の９６穴プレートにおいて、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）とさまざまな濃度の組換えヒトＩＬ−１８ＷＴ、ＩＬ−１８（ＩＣＥ／Ｘａ）またはＥ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａ  ＩＬ−１８変異体で刺激した。５％ＣＯ2の加湿した空気での１６〜２０時間、３７℃ののち、培養上清をＩＦＮ−γ測定のために収集した。
【実施例９】
【００６６】
サイトカインの解析
液相電気化学発光（liquid-phase electrochemiluminescence）（ＥＣＬ）法を用いて、細胞培養培地中のＩＦＮ−γ（１３）およびＩＬ−８（１２）を測定した。ＥＣＬの量はＯｒｉｇｅｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して決定した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−８の検出限界は、それぞれ６２ｐｇ／ｍｌおよび４０ｐｇ／ｍｌであった。
【実施例１０】
【００６７】
統計的解析
データを平均±ＳＥＭで表わす。群の平均はＡＮＯＶＡによって比較し、フィッシャーの最小有意差（Fisher's least significant difference）を使用した。統計学的有意性は９５％の信頼限界の範囲内で許容した。ＡＮＯＶＡおよび相関解析を統計学的パッケージＳＴＡＴＶＩＥＷ５１２＋（Ｂｒａｉｎ  Ｐｏｗｅｒ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）で行なった。
【実施例１１】
【００６８】
ＣＨＯ細胞における成熟ＩＬ−１８変異体の産生
ＣＨＯ細胞における成熟ＩＬ−１８変異体の発現および分泌のために、野生型および変異体ＩＬ−１８ＢＰの成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、実施例１に記載の反応と同様の２つのＰＣＲ反応によって、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のシグナルペプチドのＤＮＡ配列にライゲーションした。各ＩＬ−１８変異体の増幅のための第１のＰＣＲ反応における鋳型は、ＩＬ−１８とｈＧＨシグナルペプチドのオーバーラップ配列を含有するセンスプライマー（Ｐｒ９）、およびＩＬ−１８の最後の１２ヌクレオチド、終始コドンならびに制限酵素部位をコードするリバースプライマー（Ｐｒ１０）を用いた実施例２での構築物に相当する。成長ホルモンシグナルペプチドの増幅のために、鋳型としてプラスミドｐＸＧＨを用い、制限酵素部位、ｈＧＨシグナルペプチドの最初の１２ヌクレオチドを含有するセンスプライマー（Ｐｒ１１）、およびｈＧＨシグナルペプチドとＩＬ−１８成熟タンパク質のオーバーラップ配列を含有するリバースプライマー（Ｐｒ１２）を用いた。ＩＬ−１８の成熟配列に融合したｈＧＨのシグナルペプチドをコードするフラグメントの増幅のために行なった第２のＰＣＲの鋳型は、第１のＰＣＲ反応および制限部位を含有するプライマーＰｒ１０およびＰｒ１１由来の、精製され増幅されたフラグメントである。その融合フラグメントは精製され、適当な制限酵素で切断され、ついで哺乳動物の発現ベクターに挿入しクローニングされる。
【００６９】
前記プラスミドは、遺伝子マーカーとしてマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有するプラスミドとともに、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞をトランスフェクションするために用いる。耐性細胞は選択培地から単離され、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩＬ−１８産生を分析される。
【００７０】
安定したトランスフェクトされた細胞を、ＭＴＸの濃度の上昇による数サイクルの遺伝子増幅に供する。遺伝子増幅過程の最後に、クローンを限界希釈によって単離した。サブクローニングののち、高度に特異的な生産性およびより安定な産生を示すクローンを産生のために選択した。
【００７１】
［参考文献］
1. Anderson, D. M., Maraskovsky, E., Billingsley, W. L., Dougall, W. C., Tometsko, M. E., Roux, E. R., Teepe, M. C., DuBose, R.. F, Cosman, D., Galibert, L. (1997) “A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function.” Nature, 390,175-179.
2. Bazan, J. F., Timans, J. C. and Kaselein, R. A. (1996) “A newly defined interleukin- 1?” Nature 379, 591.
3. Born, T. L,, Morrison, L. A., Esteban, D. J., VandenBos, T., Thebeau, L. G., Chen, N., Spriggs, M.. K., Sims, J. E., Buller, R. M. (2000)“A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response” J Immunol 164, 3246-54.
4. Childs, R., Cheronoff, A., Contentin, N., Bahececi, E., Schrump, D., Leitman, S., Read, E. J., Tisdale, J., Dunbar, C., Linehan, W. M., Young, N. S., Barrett, A. J. (2000) “Regression of metastatic renal-cell carcinoma after nonmyeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation.” N Engl J Med 343,750-8.
5. Cho, D., Kim, T. G., Lee, W., Hwang, Y. I., Cho, H. I., Han, H., Kwon, O., Kim, D., Park, H., Houh, D. (2000) “Interleukin-18 and the costimulatory molecule B7-1 have a synergistic anti-tumor effect on murine melanoma; implication of combined immunotherapy for poorly immunogenic malignancy” J Invest Dermatol, 114,928-34.
6. Coughlin, C. M., Salhany, K. E., Wysocka, M., Aruga, E., Kurzawa, H., Chang, A. E., Hunter, C. A., Fox, J. C., Trinchieri, G. and Lee, W. M. (1998) “Interleukin- 12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis.” J Clin Invest Mar, 101,1441-52.
7. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. and Wallach. D. (1989) “A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity” J Biol. Chem. 264,11974-11980.
8. Engelmann, H., Novick, D. and Wallach, D. (1990) “Two tumor necrosis factor- binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross- reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors.” J Biol. Chem. 265, 1531-1536.
9. Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., and Allen, H. (1997) “Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production.” Nature 386, 619-623.
10. Gollob, J. A., Mier, J. W., Veenstra, K., McDermott, D. F., Clancy, D., Clancy, M., Atkins, M. B. (2000) “Phase I trial of twice-weekly intravenous interleukin 12 in patients with metastatic renal cell cancer or malignant melanoma: ability to maintain IFN-gamma induction is associated with clinical response.” Clin Cancer Res, 5, 1678-92.
11. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. (1994) “Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.” Leukemia 8: 652.
12. Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M. A., Hayashi, N., Higashino, K., Okamura, H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., Tanimoto, T., Flavell, R. A., Sato, V., Harding, M. W., Livingston, D. J., and Su, M. S. (1997) “Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-1beta converting enzyme.” Science 275,206-209
13. Kim, S. H., Eisenstein, M., Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M. and Dinarello, C. A. (2000) “Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18.” Proc Natl Acad Sci USA, 97,1190-5.
14. Kohno, K., J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, and M. Kurimoto. (1997) “IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Thl but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12.” J Immunol. 158: 1541-1550.
15. Kugler, A., Stuhler, G., Walden, P., Zoller, G., Zobywalski, A., Brossart, P., Trefzer, U., Ullrich, S., Muller, C. A., Becker, V., Gross, A. J., Hemmerlein, B., Kanz, L., Muller, G. A., Ringert, R. H. (2000) “Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids.” Nat Med, 3,332-6.
16. Nakamura, K., Okamura, H., Wada, M., Nagata, K. and Tamura, T. (1989). “Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production.” Infect. Immun., 57,590-5 issn: 0019-9567.
17. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, T. and Tamura, T. (1993) “Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma interferon production.” Infect. Immun., 61,64-70
18. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. and Rubinstein. M. (1989) “Soluble cytokine receptors are present in normal human urine.” J Exp. Med., 170,1409-14.
19. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1992) “Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids.” FEBS Lett, 314,445-8.
20. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1994) “The Human Interferon alpha/beta Receptor-Characterization and Molecular cloning.” Cell 77, 391-400.
21. Novick, D., Kim, S., Fantuzzi, G., Rezenkov, L. L., Dinarello, C. A. and Rubinstein, M. (1999) “Interleukin-18 Binding Protein: A Novel Modulator of the Thl Cytokine Response. Immunity 10,127,36.
22. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M., Tanabe, F., konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995) “Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells.” Nature, 378,88-91
23. Puren, A. J., Fantuzzi, G., Dinarello, C. A. (1999) “Gene expression, synthesis, and secretion of interleukin 18 and interleukin 1beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen cells.” Proc Natl Acad Sci U S A, 96,2256- 61.
24. Seki,. S, Habu, Y., Kawamura, T., Takeda, K., Dobashi, H., Ohkawa, T., Hiraide, H. (2000) “The liver as a crucial organ in the first line of host defense: the roles of Kupffer cells, natural killer (NK) cells and NK1.1 Ag+ T cells in T helper 1 immune responses.” Immunol Rev, 174,35-46.
25. Simonet, W. S., Lacey, D. L., Dunstan, C. R., Kelley, M., Chang, M. S., Luthy, R., Nguyen, H. Q., Wooden, S., Bennett, L., Boone, T., Shimamoto, G., DeRose, M., Elliott, R., Colombero, A., Tan, H. L., Trail, G., Sullivan, J., Davy, E., Bucay, N., Renshaw-Gegg, L., Hughes, T. M., Hill, D., Pattison, W., Campbell, P., Boyle, W. J. (1997). “Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density.” Cell, 89,309-19.
26. Slavin, S. (2000) “Immunotherapy of cancer with alloreactive lymphocytes.” N Engl J Med, 343,802-3.
27. Slavin, S., Or, R., Prighozina, T., Gurevitch, O., Aker, M., Panighari, S., Shapira, M., Nagle, A. (2000) “Immunotherapy of hematologic malignancies and metastatic solid tumors in experimental animals and man” Bone Marrow Transplant Suppl, 2: S54-7.
28. Tsutsui, H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino, H. Okamura, Y. Miyazawa, and K. Kaneda. (1996) “IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand- mediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones.” J. Immunol., 157,3967-73 issn: 0022-1767.
29. Tuting, T., Wilson, C. C., Martin, D. M., Kasamon, Y. L., Rowles, J., Ma, D. I., Slingluff, C. L., Wagner, S. N., van der Bruggen, P., Baar, J., Lotze, M. T., Storkus, W. J. (1998) “Autologous human monocyte-derived dendritic cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes encoding the Th1-biasing cytokines IL-12 and IFN-alpha.” J Immunol, 160, 1139-47.
30. Urushihara, N., Iwagaki, H., Yagi, T., Kohka, H., Kobashi, K., Morimoto, Y., Yoshino, T., Tanimoto, T., Kurimoto, M., Tanaka, N. (2000) “Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia.” J Pediatr Surg, 35, 446-9.
31. Ushio, S., Namba, M., Okura, T., Hattori, K., Nukada, Y., Akita, K., Tanabe, F., Konishi, K., Micallef, M., Fujii, M., Torigoe, K., Tanimoto, T., Fukuda, S., Ikeda, M., Okamura, H., and Kurimoto, M. (1996) J. Immunol., 156, 4274-9.
32. Vigers, G. P., Anderson, L. J., Caffes, P., Brandhuber, B. J. (1997) “Crystal structure of the type-I interleukin-1 receptor complexed with interleukin-1beta.” Nature, 386, 190-4.
33. Xiang, Y. and Moss, B. (1999) “IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human poxvirus-encoded protein.” Proc Natl Acad Sci USA, 96,11537-42.
34. Yasuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Mochizuki, S. I., Yano, K., Fujise, N., Sato, Y., Goto, M., Yamaguchi, K., Kuriyama, M., Kanno, T., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, T., Higashio, K. (1998) “Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro.” Endocrinology, 139, 1329-37.
前記および本明細書を通して引用した参考文献は、言及によって完全に本明細書中に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】ＷＴ  ＩＬ−１８前駆体をコードするヌクレオチド配列、および種々の変異ＩＬ−１８タンパク質を構築するために用いられるプライマーの位置を示す。太い矢印は、成熟ＩＬ−１８タンパク質のコーディング配列がどこから始まるかを示す。
【図１Ｂ】成熟ＩＬ−１８のアミノ酸配列を示す。ＩＬ−１８のさまざまな種間での保存配列は白いボックスで囲んだ。シスチジン（Cystidine）は下線を付した。黒いボックスは本発明にしたがって変異させたＩＬ−１８中の残基を示す。
【図２】本発明によるＩＬ−１８変異体の概要図を示す。Ｈｉｓ−６はＩＬ−１８前駆体プロピースのＮ末端に融合した６つのヒスチジンの配置を示す。矢印はＸａ因子切断部位（ｘ）によって置換されるＩＣＥ切断部位を示す。ＷＴは野生型の成熟ＩＬ−１８を示す。Ｅ４２ＡはＧｌｕ−４２からＡｌａへの変異を示し、Ｋ８９ＡはＬｙｓ−８９からＡｌａへの変異を示し、そしてＥ４２Ａ／Ｋ８９Ａは二重の変異を示す。前駆体／ｘ／ＷＴに基づいて、３つのＩＬ−１８変異体（Ｅ４２Ａ、Ｋ８９ＡおよびＥ４２Ａ＋Ｋ８９Ａ）は２工程のＰＣＲによって生成された。
【図３Ａ】ＩＬ−１２（０．５ｎｇ／ｍｌ）の存在下における、図３ＢのＸ軸下に示す濃度でのＩＬ−１８ＷＴおよび変異体タンパク質によるＮＫＯ細胞におけるＩＦＮ−の誘導を示す。
【図３Ｂ】ＩＬ−１２（１．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下における、Ｘ軸下に示す濃度でのＩＬ−１８ＷＴおよび変異体タンパク質によるＰＢＭＣｓ細胞におけるＩＦＮ−の誘導を示す。
【図４Ａ】ＮＫＯ細胞でのヒトＩＬ−１８ＷＴおよび変異体タンパク質によるＩＦＮ−誘導におけるＩＬ−１８ＢＰの影響を示す。変異体およびＷＴ  ＩＬ−１８（３０ｎｇ／ｍｌ）は、（図３Ｂの）Ｘ軸下に示す濃度でのＩＬ−１８ＢＰで１時間、室温でプレインキュベーションされ、ついでＩＬ−１２（０．５ｍｇ／ｍｌ）で刺激されたＮＫＯ細胞に添加された。
【図４Ｂ】ＰＢＭＣｓ細胞でのヒトＩＬ−１８ＷＴおよび変異体タンパク質によるＩＦＮ−の誘導におけるＩＬ−１８ＢＰの影響を示す。変異体およびＷＴ  ＩＬ−１８（３０ｎｇ／ｍｌ）は、Ｘ軸下に示す濃度でのＩＬ−１８ＢＰで１時間、室温でプレインキュベーションされ、ついでＩＬ−１２（１．０ｍｇ／ｍｌ）で刺激されたＰＢＭＣｓ細胞に添加された。
【図５】ＩＬ−１８ＷＴおよび変異体タンパク質によるＩＬ−８の誘導を示す。ＰＢＭＣｓはＩＬ−１８ＷＴまたは変異体（３０ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションされた。ポリミキシンＢ（１ｇ／ｍｌ）はＰＢＭＣｓに添加する前に３０分間ＩＬ−１８と混合された。２４時間後、上清が除去され，ＥＣＬによるＩＬ−１８濃縮を分析した（実施例９）。３回の実験のうちの１つを示す。
【図１Ａ】
2004530432.tif 000002
【図１Ｂ】
2004530432.tif 000003
【図２】
2004530432.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004530432.tif 000005
2004530432.tif 000006
2004530432.tif 000007
2004530432.tif 000008
2004530432.tif 000009
2004530432.tif 000010
2004530432.tif 000011
2004530432.tif 000012
2004530432.tif 000013
2004530432.tif 000014
2004530432.tif 000015
2004530432.tif 000016
2004530432.tif 000017
2004530432.tif 000018
2004530432.tif 000019
2004530432.tif 000020
2004530432.tif 000021
2004530432.tif 000022
2004530432.tif 000023
2004530432.tif 000024
2004530432.tif 000025
2004530432.tif 000026
2004530432.tif 000027
2004530432.tif 000028
2004530432.tif 000029
2004530432.tif 000030
2004530432.tif 000031
2004530432.tif 000032
2004530432.tif 000033
2004530432.tif 000034
2004530432.tif 000035
2004530432.tif 000036
2004530432.tif 000037
2004530432.tif 000038
2004530432.tif 000039
2004530432.tif 000040
2004530432.tif 000041
2004530432.tif 000042
2004530432.tif 000043
2004530432.tif 000044
2004530432.tif 000045
2004530432.tif 000046
2004530432.tif 000047
2004530432.tif 000048
2004530432.tif 000049
2004530432.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530432.tif 000051
【国際調査報告】
2004530432.tif 000052
2004530432.tif 000053
2004530432.tif 000054