(57)【要約】本出願は、Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントを含む単離された核酸、低減されたレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡを中に有するトランスジェニックタバコ植物を産生する方法におけるおよびその使用、ならびにシス作用性デコイエレメントを中に含むために、変化したレベルの関心あるタンパク質を中に含む他の植物または宿主細胞について記述する。
2004507250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に記載の配列またはそのフラグメントから実質的に構成され、該フラグメントが約２０〜４５５個の連続したヌクレオチドである、単離された核酸と、
（ｂ）配列番号１の相補鎖にハイブリダイズし、且つ、Ｎｉｃ遺伝子産物に応答する、単離された核酸と
からなる群から選択される単離された核酸。
【請求項２】
配列番号１として記載された配列またはそのフラグメントから実質的に構成され、該フラグメントが約２０〜４５５個の連続したヌクレオチドである、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１として記載された配列から実質的に構成される、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
組換え核酸構築物をさらに含み、前記単離された核酸が該組換え核酸構築物に連結されており、該組換え核酸構築物がＮｔＱＰＴ１コード配列を含まない、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記組換え核酸構築物が線状である、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記組換え核酸構築物が環状である、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項８】
微粒子をさらに含み、前記単離された核酸が該微粒子に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記組換え核酸構築物がアグロバクテリウムベクターである、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１に記載の単離された核酸を含む植物細胞。
【請求項１１】
少なくとも１つの形質転換されたタバコ植物細胞を生じさせるために、Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントから実質的に構成される核酸を、少なくとも１つのタバコ植物細胞に導入するステップであって、
該少なくとも１つの形質転換されたタバコ植物細胞は、該核酸が存在しない場合に存在するであろうニコチンの量に比べて、該細胞から再生されるタバコ植物中のニコチンの量を低減させるのに十分なコピー数で該核酸を含有することを特徴とするステップと、
該タバコ植物を得るために、該少なくとも１つの形質転換されたタバコ植物細胞を再生させるステップと
を含む、低減された量のニコチンを有するトランスジェニックタバコ植物を産生する方法。
【請求項１２】
前記タバコ植物から葉を採集するステップをさらに含み、該タバコの葉が、前記核酸が存在しない場合に該タバコ植物存在するであろうニコチンの量に比べて低減された量のニコチンを含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タバコ植物からタバコ種子を採集するステップをさらに含み、該タバコ種子が、前記核酸が存在しない場合に存在するであろうニコチンの量に比べて、該種子から再生されるタバコ植物のニコチンの量を低減させるのに十分なコピー数で該核酸を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントが、
（ａ）配列番号１に記載の配列またはそのフラグメントから実質的に構成され、該フラグメントが約２０〜４５５個の連続したヌクレオチドである、単離された核酸と、
（ｂ）配列番号１の相補鎖にハイブリダイズし、且つＮｉｃ遺伝子産物に応答する、単離された核酸と
からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントが、配列番号１として記載された配列からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が組換え核酸構築物内に含まれ、前記単離された核酸が該組換え核酸構築物に連結されており、該組換え核酸構築物がＮｔＱＰＴ１コード配列を含まず、該組換え構築物が線状である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え核酸構築物が環状である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記導入するステップが弾道的形質転換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記導入するステップがアグロバクテリウム形質転換を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１１に記載の方法で産生されるタバコ植物。
【請求項２２】
請求項２１に記載のタバコ植物から採集されるタバコ葉。
【請求項２３】
請求項２１に記載のタバコ植物から採集されるタバコ種子。
【請求項２４】
減少された量のニコチンを含有するタバコ植物であって、該植物が外因性核酸を含有する細胞類を含み、該外因性核酸がＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントから実質的に構成され、該外因性核酸が、該外因性核酸が存在しない場合に該植物に存在するであろうニコチンの量に比べて、該タバコ植物中のニコチンの量を減少させるのに十分なコピー数で該細胞類に含まれる、タバコ植物。
【請求項２５】
前記Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントが、
（ａ）配列番号１に記載の配列またはそのフラグメントから実質的に構成され、該フラグメントが約２０〜４５５個の連続したヌクレオチドである、単離された核酸と、
（ｂ）配列番号１の相補鎖にハイブリダイズし、且つＮｉｃ遺伝子産物に応答する、単離された核酸と
からなる群から選択される、請求項２４に記載のタバコ植物。
【請求項２６】
前記Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントが、配列番号１として記載された配列から実質的に構成される、請求項２４に記載のタバコ植物。
【請求項２７】
前記外因性核酸が組換え核酸構築物内に含まれ、前記単離された核酸が該組換え核酸構築物に連結されており、該組換え核酸構築物がＮｔＱＰＴ１コード配列を含まず、該組換え構築物が線状である、請求項２４に記載のタバコ植物。
【請求項２８】
前記組換え核酸構築物が環状である、請求項２７に記載のタバコ植物。
【請求項２９】
前記外因性核酸がＤＮＡである、請求項２４に記載のタバコ植物。
【請求項３０】
請求項２４に記載のタバコ植物から採集されるタバコ葉。
【請求項３１】
請求項２４に記載のタバコ植物に成長するタバコ種子。
【請求項３２】
請求項２４に記載のタバコ植物から採集されるタバコ種子。
【請求項３３】
変更された含量の関心あるタンパク質を中に有する植物を産生する方法であって、該関心あるタンパク質はシス作動性エレメントにより制御されており、
該シス作動性エレメントを含む外因性核酸構築物を、少なくとも１つの植物細胞に導入して、少なくとも１つの形質転換された植物細胞を産生するステップを含み、
該シス作動性エレメントが、該関心あるタンパク質に関するコード配列またはその相補鎖に作動可能に連結されていないという条件で、該少なくとも１つの形質転換された植物細胞が、該外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該細胞から再生される植物中の該関心あるタンパク質のレベルを増加または低減させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有することを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記シス作動性エレメントが、アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントであり、該アクティベーター化合物が、前記植物における前記関心あるタンパク質の発現を増加させ、且つ前記少なくとも１つの形質転換された植物細胞が、前記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該細胞から再生される植物における該関心あるタンパク質のレベルを低減させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シス作動性エレメントが、リプレッサー化合物を結合するシス作動性リプレッサーエレメントであり、該リプレッサー化合物が、前記植物における前記関心あるタンパク質の発現を減少させ、且つ前記少なくとも１つの形質転換された植物細胞が、前記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該細胞から再生される植物における該関心あるタンパク質のレベルを増加させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記形質転換された植物細胞から植物を発生させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物から種子を採集するステップをさらに含み、該種子が、前記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう前記関心あるタンパク質のレベルに比べて、該種子から再生される植物における該関心あるタンパク質のレベルを低減させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記シス作動性エレメントが、ＵＡＳ−１、ビシリンボックス、サイトＢ、およびタバコＲＢ７プロモーターの根に特異的なシス作動性エレメントからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記外因性核酸が線状である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記外因性核酸が環状である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記外因性核酸がＤＮＡである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記導入するステップが弾道的形質転換を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記導入するステップがアグロバクテリウム形質転換を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
請求項３３に記載の方法で産生される植物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の植物から採集される、葉、果実、花、根または塊茎。
【請求項４６】
請求項４４に記載の植物から採集される種子。
【請求項４７】
変更されたレベルの関心あるタンパク質を中に有する植物であって、該植物が外因性核酸を含有する細胞を含み、
該外因性核酸が、該植物における該関心あるタンパク質のレベルを制御するシス作動性エレメントを含み、
該シス作動性エレメントが該関心あるタンパク質に関するコード配列またはその相補鎖に作動可能に連結されていないという条件で、該細胞が、該外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該植物における該関心あるタンパク質のレベルを増加または低減させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含む植物。
【請求項４８】
前記シス作動性エレメントが、アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントであり、該アクティベーター化合物が、前記植物における前記関心あるタンパク質の発現を増加させ、且つ前記少なくとも１つの形質転換された植物細胞が、前記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該植物における該関心あるタンパク質のレベルを低減させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有する、請求項４７に記載の植物。
【請求項４９】
前記シス作動性エレメントが、リプレッサー化合物を結合するシス作動性リプレッサーエレメントであり、該リプレッサー化合物が、前記植物における前記関心あるタンパク質の発現を減少させ、且つ前記少なくとも１つの形質転換された植物細胞が、前記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう該関心あるタンパク質の量に比べて、該植物における該関心あるタンパク質のレベルを増加させるのに十分なコピー数で該外因性核酸を含有する、請求項４７に記載の植物。
【請求項５０】
前記外因性核酸が線状である、請求項４７に記載の植物。
【請求項５１】
前記外因性核酸が環状である、請求項４７に記載の植物。
【請求項５２】
前記外因性核酸がＤＮＡである、請求項４７に記載の植物。
【請求項５３】
請求項４７に記載の植物から採集される、葉、果実、花、根または塊茎。
【請求項５４】
請求項４７に記載の植物に成長する種子。
【請求項５５】
請求項４７に記載の植物から採集される種子。
【請求項５６】
宿主細胞における関心あるタンパク質の発現を減少させる方法であって、該関心あるタンパク質の転写が、アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントによって増強され、該アクティベーター化合物が、該宿主細胞における該関心あるタンパク質の発現を増加させ、
（ａ）該シス作動性活性化エレメントを含むデコイ組換え核酸構築物を提供するステップと、
（ｂ）該シス作動性エレメントが、該関心あるタンパク質に関するコード配列またはその相補鎖に作動可能に連結されていないという条件で、該デコイ構築物を、該アクティベーター化合物に結合して該関心あるタンパク質の発現を低減させるのに十分な量で該宿主細胞に導入するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記宿主細胞が維管束植物細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記宿主細胞が単子葉植物細胞または双子葉植物植物細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記デコイ構築物がプラスミドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
宿主細胞における関心あるタンパク質の発現を増加させる方法であって、該関心あるタンパク質の転写が、リプレッサー化合物に結合するシス作動性リプレッサーエレメントによって低減され、該リプレッサー化合物が該宿主細胞における該関心あるタンパク質の発現を低減させ、
（ａ）前記シス作動性活性化エレメントを含むデコイ組換え核酸構築物を提供するステップと、
（ｂ）該シス作動性エレメントが、該関心あるタンパク質に関するコード配列またはその相補鎖に作動可能に連結されていないという条件で、該デコイ構築物を、前記アクティベーター化合物に結合して、該関心あるタンパク質の発現を増加させるのに十分な量で該宿主細胞に導入するステップと
を含む方法。
【請求項６６】
前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記宿主細胞が維管束植物細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記宿主細胞が単子葉植物細胞または双子葉植物植物細胞である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記デコイ構築物がプラスミドである、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０００年８月３０日出願の仮出願番号６０／２２９，１９８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、変化した表現型、たとえば、低減されたニコチンレベルにつながる、その中のタンパク質含量が変化したトランスジェニックタバコ植物等の、トランスジェニック植物を産生する方法と共に、このようにして産生されたトランスジェニック植物、およびこのような植物の種子について説明する。
【０００３】
［発明の背景］
ニコチンの常習性に関する懸念を考えると、低下したニコチンレベルを有するタバコを産生することは興味深い。さらに、極めて低レベルのニコチンを産生するか、またはニコチンを全く産生しないタバコ植物は、商業的に価値のある生成物、たとえば、医薬、化粧品成分、または食品添加物を発現する導入遺伝子のレシピエントとして魅力的である。ニコチンをタバコから除去するために、様々な方法が設計されてきた。しかし、これらの方法のほとんどは、ニコチンに加えて、他の成分もタバコから除去し、それによってタバコに悪影響を与える。古典的な作物育種技術は、野生型のタバコ植物でみられるより低レベルのニコチン（およそ８％）を含むタバコ植物をもたらした。ニコチン含量がさらに減少されたタバコ植物およびタバコが望ましい。
【０００４】
ニコチンは、主としてタバコ植物の根で形成され、その後に葉に輸送され、そこで貯蔵される（Ｔｓｏ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｔａｂａｃｏ　Ｐｌａｎｔ，ｐｐ．２３３−３４，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　＆　Ｒｏｓｓ，Ｓｔｒｏｕｄｓｂｕｒｇ，Ｐａ．（１９７２））。ニコチンは、二つの別々の生合成経路から生じる二つの前駆物質であるニコチン酸およびＮ−メチルピロリニウムの縮合によって生成される（図１参照）（Ｂｕｓｈ　ａｎｄ　Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｎｅｗ　Ｏｒｌｅａｎｓ，ｐｐ．３８９−４２５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｙａｍａｄａ（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４５，２５７−２８５；Ｔｈｅ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｌａｎｓ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｐ．Ｋ．Ｓｔｕｍｐｆ　ａｎｄ　Ｅ．Ｅ．Ｃｏｎｎ編、ＡｃａｄｅｍｉａＰｒｅｓｓ，ｐｐ．３１７−３９５中のＷａｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｄｅｒｍｅｒ（１９８１））。ピリジンヌクレオチドサイクルは、ニコチン酸を合成する（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔａ　１６７，２２６−２３２；Ｗａｇｎｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ（１９８５）Ｐｌａｎｔａ　１６５，５３２−５３７）が、Ｎ−メチルピロリニウムカチオン類は、オルニチンまたはアルギニンから腐敗（ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｃｅ）を経て合成される（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｖｏｌ．８，Ｅ．Ａ．Ｂｅｌｌ　ａｎｄ　Ｂ．Ｖ．Ｃｈａｒｌｗｏｏｄ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．６５−９１中のＬｅｅｔｅ　（１９８０）；　Ｔｉｂｕｒｃｉｏ　　ａｎｄ　Ｇａｌｓｔｏｎ　（１９８６）　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，１０７−１１０）。相互移植実験で、ニコチンは根で合成され、木部を経て葉および他の植物器官に輸送されることが証明された（Ｄａｗｓｏｎ（１９４１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，９４，３９６−３９７）。
【０００５】
二つの制御遺伝子座（Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２）は、ニコチン産生を制御する。Ｌｅｇｇら（（１９６９）Ｊ　Ｈｅｒｅｄ，６０，２１３−２１７）は、低アルカロイド含量のキューバ葉巻（Ｃｕｂａｎ ｃｉｇａｒ）品種からの遺伝子をバレー２１（Ｂｕｒｌｅｙ ２１）品種に組み込んだ。これらの研究者は、低アルカロイド系が、二つの遺伝子座Ｎｉｃ１（以前は、Ａとして識別された）およびＮｉｃ２（以前は、Ｂとして識別された）にて、標準品種と異なることを示した。これらの二つの遺伝子座は、同一連鎖群に属さず、また遺伝子作用は半優性であり、主として付加的である（Ｌｅｇｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９６９）Ｊ　Ｈｅｒｅｄ．，６０，２１３２１７）。Ｃｏｌｌｉｎｓら（（１９７４）Ｃｏｒｐ　Ｓｃｉ．，１４，７７−８０）は、これらの四つのアルカロイド遺伝子型の倍化半数体タバコ育種系を作製した。標準品種の遺伝子型は、Ｎｉｃ１／Ｎｉｃ１　Ｎｉｃ２／Ｎｉｃ２であり、低ニコチン系のそれは、ｎｉｃ１／ｎｉｃ１　ｎｉｃ２／ｎｉｃ２である。Ｎｉｃ１／Ｎｉｃ１　ｎｉｃ２／ｎｉｃ２は、高中間体であり、ｎｉｃ１／ｎｉｃ１　Ｎｉｃ２／Ｎｉｃ２は低中間体である（Ｌｅｇｇ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｉｎｓ（１９７１）Ｃａｎ．Ｊ　Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｌ．１３，２８７−２９１）。これらの系は、開花までの日数、葉の数、葉のサイズ、および植物の高さが似ている。単一および二重のＮｉｃ突然変異体の根の酵素分析から、二つの酵素、キノリネートホスホリボキシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴａｓｅ）および腐敗メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴａｓｅ）の活性は、ニコチン生合成のレベルに正比例していることがわかる（Ｓａｕｎｄｅｒｓ　ａｎｄ　Ｂｕｓｈ（１９７９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　６４：２３６）。Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２は共に、根におけるＰＭＴａｓｅ活性およびＱＰＴａｓｅ活性に影響を及ぼし、従って、ニコチン合成を制御する（Ｌｅｅｔｅ（１９８３）Ｉｎ：Ａｌｋａｌｏｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｓ．Ｗ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ｐｐ．８５１５２）。
【０００６】
Ｈｉｂｉら（（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，６，７２３−７３５）は、ＰＭＴａｓｅをコードするｃＤＮＡであるＰＭＴを単離し、ＰＭＴ転写物レベルは、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２によって制御されることを示した。ＱＰＴａｓｅ　ｃＤＮＡおよびゲノムクローン（ＮｔＱＰＴ１）も単離されており、ＮｔＱＰＴ１の転写物レベルもＮｉｃ１およびＮｉｃ２によって制御される（Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｍｅｎｄｕ，Ｎ．，ａｎｄ　Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，Ｍ．Ａ．．（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ、準備中）。従って、Ｎｉｃ遺伝子は、二つの律速酵素、即ちＰＭＴａｓｅおよびＱＰＴａｓｅを、コードする遺伝子の転写物レベルを制御することにより、ニコチン含量を制御するようである。さらに、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２は、ＮｔＱＰＴ１転写の陽性制御因子であること、また、転写開始部位の上流のプロモーター配列は、ＮｔＱＰＴ１転写のＮｉｃ遺伝子産物活性化に必要なシス作動性配列を含有することが証明されている。ＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅの発現は、Ｎｉｃ遺伝子産物によって同等に制御されるため、Ｎｉｃ遺伝子産物は、ＰＭＴ遺伝子の転写も直接制御するようである。
【０００７】
ニコチン等の生物学的産物のレベルを低減させる１つのアプローチは、この産物につながる生合成経路で必要な酵素（すなわちＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅ）の量を減少させることである。影響を受ける酵素が、律速量（その経路で必要な他の酵素と比較して）で自然に生じる場合、その酵素の発生量が減少することにより、最終生成物の産生量が減少する。この酵素の量が常態で律速でなければ、この経路の生産を減少させるためには、細胞中におけるその存在を、律速レベルまで減少させなければならない。反対に、天然に生じる酵素量が律速であれば、この酵素活性が上昇すると、生合成経路の最終生成物が増加する結果となる。腐敗メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴａｓｅ）発現のアンチセンス制御による、タバコ植物におけるニコチンレベル修飾は、ＮａｋａｔａｎｉとＭａｌｉｋに付与された米国特許第５，３６９，０２３号および第５，２６０，２０５号で提案されている。ＷａｈａｄとＭａｌｉｋに付与されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２８１４２号には、ＰＭＴをコードするＤＮＡおよびセンスおよびアンチセンスＰＭＴ構築物の使用について記載されている。さらに、Ｃｏｎｋｌｉｎｇらに付与されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／５６９２３号には、植物キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＲＴａｓｅ）酵素をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡを含む構築物、および植物におけるニコチン産生量を増加または減少させるために、ＱＰＲＴａｓｅ発現を変化させる三つの方法が記載されている。これまでの努力および成功にもかかわらず、依然として、植物における遺伝子産物（たとえば、ニコチン）の産生を減少させる新しいアプローチが必要なままである。
【０００８】
［発明の概要］
本発明の第一の態様は、シス作動性制御エレメントを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、実質的にシス作動性制御エレメントからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）、またはシス作動性制御エレメントからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）、単離された核酸分子（たとえば、プラスミド）、および変化されたレベル（たとえば、増加されたレベルまたは低減されたレベル）の関心あるタンパク質を中に有するトランスジェニック植物または宿主細胞を産生するための、このような単離された核酸の使用である。具体例は、Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメント（たとえば、Ｎｉｃ遺伝子産物に結合するＤＮＡ配列）であり、たとえば、（ａ）配列番号１による配列またはそのフラグメントを有する単離された核酸であって、該フラグメントは、望ましくは、少なくとも連続した２０〜４５５個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも連続した３０〜４００個のヌクレオチド、より好ましくは、連続した５０〜３５０個のヌクレオチド、最も好ましくは、連続した１００〜３００個または２００〜４００個のヌクレオチドから実質的に構成され（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）、またはこれらから構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）単離された核酸であり、および（ｂ）配列番号１の相補鎖にハイブリダイズして、Ｎｉｃ遺伝子産物を結合するか、またはＮｉｃ遺伝子産物に応答する（すなわち、作動可能に結合した遺伝子の転写を増加または減少させ、その結果、宿主細胞における、コードされた関心あるタンパク質のレベルを増加または低減させる）単離された核酸である。
【０００９】
Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントは、米国特許第５，４５９，２５２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示された配列から得ることもできる。幾つかの実施形態では、Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントは、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００から−６００または−７００ｂｐまでの間にあり、その配列は米国特許第５，４５９，２５２号に開示されている。従って、幾つかの実施形態は、米国特許第５，４５９，２５２号に開示されている、−１０００から−６００または−７００までの間の、ＮｔＱＰＴ１プロモーターに対応する、３００〜４００ヌクレオチド長さの、ＮｔＱＰＴ１プロモーターのフラグメントを含む。
【００１０】
本発明の第二の態様は、シス作動性制御エレメント、たとえば、上述のＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントを含む組換え核酸構築物、ならびに本明細書に記載のトランスジェニック植物または宿主細胞を産生するための、このような組換え核酸の使用である。この構築物は、弾道的核酸転移粒子（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ）またはアグロバクテリウムベクター等のベクターであってもよい。このような構築物および好ましくはその複数のコピーを含有する植物細胞も、本発明の態様である。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、減少されたニコチン含量および／またはタバコ特異的ニトロソアミン類（ＴＳＮＡ）を有するトランスジェニックタバコ植物を産生する方法である。この方法は、少なくとも１つの形質転換されたタバコ植物細胞を作るために、上述のＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントを含む外因性核酸構築物を、上記少なくとも１つのタバコ植物細胞に導入することを含む。この少なくとも１つの形質転換タバコ植物細胞は、外因性核酸が存在しない場合に存在するであろうニコチンおよび／またはＴＳＮＡレベルと比べて、その細胞から再生されるタバコ植物のニコチンおよび／またはＴＳＮＡレベルを低減させるのに十分な量またはコピー数で外因性核酸を含む。この方法は、形質転換された植物細胞からタバコ植物を再生させること、および（任意選択的に）タバコ葉、幹、または種子をタバコ植物から収集するステップをさらに含んでもよい。従って、上記方法により再生させた葉、幹および種子タバコ植物も、本発明の態様である。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、低減されたレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡを中に有するタバコ植物であり、その植物は外因性核酸を含有する細胞を含み、その外因性核酸は上述のＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントを含む。この外因性核酸は、外因性核酸が存在しない場合にその植物に存在するであろうニコチンレベルと比べて、タバコ植物のニコチンレベルを低減させるのに十分なコピー数で細胞に含まれる。また、このような植物の葉、幹および種子も、本発明の態様である。
【００１３】
上記トランスジェニックタバコ植物から作製される、喫煙材料（たとえば、シガレット、シガー、パイプタバコ）、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、ガム、トローチ剤を含むが、その限りではないタバコ製品も、本発明の実施形態である。好ましくは、これらのタバコ製品は、切断し、乾燥させ、保存処理し、および／またはタバコ作製における従来技術に従って醗酵させておいた、収穫されたタバコ葉および幹から製造される。しかし、保存処理およびタバコ加工における改良された技術を実施して、ＴＳＮＡレベルをさらに低下させることができる。幾つかの実施形態では、ニコチンおよび／またはＴＳＮＡを実質的に含まずに作られるタバコは、様々なバレータバコ（Ｂｕｒｌｅｙ ｔｏｂａｃｃｏ）たとえば、バレー２１、東洋タバコ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ｔｏｂａｃｃｏ）、または火力乾燥タバコ（Ｆｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ）から作製される。しかし、ほとんどのタバコ変種は、本明細書に記載の実施形態を使用して、ニコチンおよび／またはＴＳＮＡを含まないように製造できることを理解すべきである。
【００１４】
さらなる実施形態は、所望のレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡが得られるように注意深くブレンドされたタバコ製品を含む。たとえば、実質的に任意の量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを得るために、上述の通りに作製された、低減されたレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコを、従来のタバコとブレンドすることができる。さらに、所望の量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを実現するために、低減されたレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有する、２種類以上のタバコをブレンドしてよい。この方式で、変種、風味、ならびにニコチンおよび／またはＴＳＮＡの違いを、徐々に調整することができる。これらのブレンドされたタバコ製品を、タバコ使用中止キット類およびニコチン依存性および発癌性の可能性を減少または排除するように設計されたプログラム類に組み込むことができる。このようなキット類およびプログラム類も、本発明の実施形態である。
【００１５】
本発明のより多くの実施形態は、シガレット、シガー、噛みタバコ、嗅ぎタバコおよびタバコ含有ガムおよびトローチ剤を含む、タバコ製品の発癌性の可能性を減少させる方法に関する。幾つかの方法は、たとえば、減少された量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコの作製および上記タバコを含有するタバコ製品の製造を含む。従って、上述のトランスジェニックタバコ植物が、収穫され、保存処理され、タバコ製品に加工される。これらのタバコ製品は、減少された量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコから作製されるため、低減された発癌性の可能性を有する。
【００１６】
本発明のまた別の態様は、タバコを喫煙、消費または他の方法で摂取するヒトにおける、ＴＳＮＡおよびその代謝物の量の低減に関する。この方法は、上述の減少された量のＴＳＮＡを有するタバコ製品を、上記ヒトに提供し、それによって、上記ヒトにおける、このような製品の発癌性の可能性を低下させることによって実施される。
【００１７】
より一般的には、本発明は、関心あるタンパク質の増加された含量または低減された含量を有する植物を産生する方法であって、関心あるタンパク質が、（ｉ）アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントであって、そのアクティベーター化合物が上記植物における上記関心あるタンパク質の発現を増加させることを特徴とする、シス作動性活性化エレメント、および（ｉｉ）リプレッサー化合物を結合するシス作動性リプレッサーエレメントであって、そのリプレッサー化合物が上記植物における上記関心あるタンパク質の発現を減少させることを特徴とする、シス作動性リプレッサーエレメント、からなる群から選択されるシス作動性エレメントによって制御される方法を提供する。本方法は、少なくとも１つの形質転換植物細胞を作るために、上記シス作動性エレメントを含む外因性核酸構築物を、少なくとも１つの植物細胞に導入するステップを含み、この少なくとも１つの形質転換された植物細胞は、上記外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう上記関心あるタンパク質の量に比べて、上記細胞から再生される植物における上記関心あるタンパク質のレベルを増加または低減させるのに十分なコピー数で、外因性核酸を含有する。
【００１８】
従って、本発明は、一般に、増加されたレベルまたは低減されたレベルの関心あるタンパク質を中に有する植物（およびその部分）であって、外因性核酸を含有する細胞を含み、その外因性核酸が（ｉ）アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントであって、そのアクティベーター化合物が上記植物における上記関心あるタンパク質の発現を増加させることを特徴とするシス作動性活性化エレメント、および（ｉｉ）リプレッサー化合物を結合するシス作動性リプレッサーエレメントであって、そのリプレッサー化合物が上記植物における上記関心あるタンパク質の発現を低減させることを特徴とするシス作動性リプレッサーエレメントからなる群から選択されるシス作動性エレメントを含み、その細胞が、外因性核酸が存在しない場合に存在するであろう関心あるタンパク質の量に比べて、植物における関心あるタンパク質のレベルを増加または低減させるのに十分なコピー数で外因性核酸を含有する植物を提供する。
【００１９】
従って、本発明は、（原核または真核）宿主細胞における関心あるタンパク質の発現を減少させる一般的な方法であって、関心あるタンパク質の転写が、アクティベーター化合物を結合するシス作動性活性化エレメントによって増強され、そのアクティベーター化合物が宿主細胞における関心あるタンパク質の発現を増加させることを特徴とする方法を提供する。本方法は、（ａ）上記シス作動性活性化エレメントを含むデコイ組換え核酸構築物を提供するステップと、（ｂ）上記アクティベーター化合物を結合し、関心あるタンパク質の発現を低減させるのに十分な量で、上記デコイ構築物を上記宿主細胞に導入するステップとを含む。
【００２０】
さらに、本発明は、宿主細胞における関心あるタンパク質の発現を増加させる一般的な方法であって、関心あるタンパク質の転写が、リプレッサー化合物を結合するシス作動性リプレッサーエレメントによって低減され、そのリプレッサー化合物が上記宿主細胞における上記関心あるタンパク質の発現を低減させることを特徴とする方法を提供する。本方法は、（ａ）上記シス作動性活性化エレメントを含むデコイ組換え核酸構築物を提供するステップと、（ｂ）上記リプレッサー化合物を結合し、上記関心あるタンパク質の発現を増加させるのに十分な量で、上記デコイ構築物を上記宿主細胞に導入するステップとを含む。
【００２１】
本発明の前述の態様および他の態様を、本明細書の図面および以下に記載の明細書において、さらに詳細に説明する。
【００２２】
［好適な実施形態の詳細な説明］
本明細書で使用する用語「植物」は、維管束植物を指す。代表的な植物としては、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、カノラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｌｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ　ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ　ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ　ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類の植物（Ｃｉｔｒｕｓ　ｓｐｐ．）、（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ　ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ　ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ　ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ　ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ　ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）、クロイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ　ｒｅｇｉａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）、アンズ（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｒｍｅｎｉａｃａ）、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ）、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ウキクサ（Ｌｅｍｎａ）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、針葉樹、および芝生（たとえば、観賞用、気晴らし用、または飼料用）などがあるが、その限りではない。野菜としては、ナス科に属する種（たとえば、トマト；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（たとえば、Ｌａｃｔｕｅａ　ｓａｔｉｖａ）、ニンジン（Ｃａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ）、カリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）、セロリ（ａｐｉｕｍ　ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ　ｓｐｐ．）、ウリ属のメンバー、たとえば、ハバードカボチャ（Ｃ．Ｈｕｂｂａｒｄ）、バターナットカボチャ（Ｃ．ｍｏｓｃｈａｔａ）、ズッキーニ（Ｃ．ｐｅｐｏ）、ヘチマカボチャ（Ｃ．ｃｒｏｏｋｎｅｃｋ）、Ｃ．ａｒｇｙｒｏｓｐｅｒｍａ、Ｃ．ａｒｇｙｒｏｓｐｅｒｍａ　ｓｓｐ　ｓｏｒｏｒｉａ、Ｃ．ｄｉｇｉｔａｔａ、Ｃ．ｅｃｕａｄｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｆｏｅｔｉｄｉｓｓｉｍａ、Ｃ．ｌｕｎｄｅｌｌｉａｎａ、およびＣ．ｍａｒｔｉｎｅｚｉｉ、およびキューカミス属のメンバー、たとえば、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタループ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）などがある。観賞用植物としては、アザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ　ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ　ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ　ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ　ｓｐｐ．）、ラッパスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ　ｓｐｐ．）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　ｐｕｌｃｈｅｒｉｍａ）、およびキクなどがある。本発明の実施に際して使用することが可能な針葉樹としては、たとえば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｔａｅｄａ）、エリオットマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびモンテレーマツ（Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ）等のマツ；ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ　ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）；ベイツガ（Ｔｓｕｇａ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；ベイトウヒ（Ｐｉｃｅａ　ｇｌａｕｃａ）；アカスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ　ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）；ヨーロッパモミ（Ａｂｉｅｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ）およびバルサムモミ（Ａｂｉｅｓ　ｂａｌｓａｍｅａ）等のモミ類；およびベイスギ（Ｔｈｕｊａ　ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）等のシダー類などがある。芝生としては、ノシバ、コヌカグサ、ウシノケグサ、イチゴツナギ、イヌシバ、バッファローグラス、ライグラスおよびオーチャードグラスなどがあるがその限りではない。主として実験モデルの役割を果たす植物、たとえば、シロイヌナズナも含まれる。本方法で使用するための好ましい植物としては、マメ類、ナス科に属する種（たとえば、トマト）、レタスおよびキャベツ等の葉菜類、芝生、および農産物植物（たとえば、タバコ、コムギ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、コメ、トウモロコシ、ワタ、キャッサバ、等）、および実験用植物（たとえば、シロイヌナズナ）などがある（がその限りではない）。任意の植物を使用して、本発明を実施することが可能であるが、タバコ植物が特に好ましい。
【００２３】
本発明の植物から収集（たとえば、切断または収穫）することができる植物の部分としては、たとえば、果実、花、種子、根、塊茎、葉、茎、樹皮、木部等がある。植物中の、増加されるまたは低減されるある特定のタンパク質に言及するとき、そのタンパク質の量は、植物の全体にわたって変化してもよく、または植物のある特定の部分に限って変化してもよいことに留意されたい。
【００２４】
概して、本発明の説明に役立つ実施形態では、タバコ植物中で、ニコチン酸およびＮ−メチルピロリニウムカチオンの縮合によって、ニコチンが産生される。ニコチンが産生される結果となる生合成経路を、図１に示す。二つの制御遺伝子座（Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２）は、ニコチン産生の相互優先（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ）制御因子の役割を果たす。単一のＮｉｃ突然変異体および二重のＮｉｃ突然変異体の根の酵素分析から、二つの酵素、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴａｓｅ）および腐敗メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴａｓｅ）の活性は、ニコチン生合成レベルに正比例することがわかる。ニコチン合成に関して異なる能力を有するタバコ組織（根およびカルス）における酵素活性の比較から、ＱＰＴａｓｅ活性およびＰＭＴａｓｅ活性は、ニコチン含量と厳密に相関関係があることがわかる（Ｗａｇｎｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，Ｐｌａｎｔａ　１６５：５３２（１９８５））。ＳａｕｎｄｅｒｓとＢｕｓｈ（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ６４：２３６（１９７９））は、低ニコチン突然変異体の根におけるＱＰＴａｓｅレベルは、葉におけるニコチンレベルと比例することを示した。
【００２５】
本発明は、１つの好適な実施形態において、単離された核酸（たとえば、配列番号１またはそのフラグメンであって、該フラグメントは、望ましくは少なくとも連続した２０〜４５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも連続した３０〜４００個のヌクレオチド、より好ましくは連続した５０〜３５０個のヌクレオチド、最も好ましくは連続した１００〜３００個または２００〜４００個のヌクレオチドからなる）に基づく。その単離された核酸は、植物キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴａｓｅ）および腐敗メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴａｓｅ）コード配列の上流に存在する少なくとも１つのシス作動性制御エレメントであるか、またはかかる少なくとも１つのシス作動性制御エレメントを含む。もう１つの例は、米国特許第５，４５９，２５２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている配列から得られるＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントである。幾つかの実施形態では、上記Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントは、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００から−６００または−７００ｂｐまでの間にある。従って、幾つかの実施形態は、米国特許第５，４５９，２５２号に開示されている、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００から−６００または−７００までの間の配列に対応する３００〜４００ヌクレオチド長のフラグメントを含む。
【００２６】
従って、幾つかの実施形態では、具体的に示された核酸は、ＱＰＴａｓｅおよび／またはＰＭＴａｓｅの転写開始に関与する、１つ以上の転写因子（たとえば、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２）との相互作用を促進する構造を有する。従って、上記核酸は、少なくとも１つの転写因子（たとえば、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２）結合性配列である、または少なくとも１つの転写因子結合性配列を含むといわれ、「シス作動性制御エレメント」とも呼ばれる。こうしたシス作動性制御エレメント（たとえば、Ｎｉｃ１および／またはＮｉｃ２と相互に作用する配列）の多数のコピーを植物細胞内に導入することにより、転写因子が、標的遺伝子（たとえば、ＱＰＴａｓｅ遺伝子および／またはＰＭＴａｓｅ遺伝子）の転写を開始する能力を低減させるか、または抑えることができる。
【００２７】
ＱＰＴａｓｅ活性およびＰＭＴａｓｅ活性は、ニコチン含量と厳密に相関関係があるため、上述のような、植物の根におけるＱＰＴａｓｅレベルまたはＰＭＴａｓｅレベルが（野生型植物におけるレベルと比較して）低下しているトランスジェニックタバコ植物を構築することにより、低減されたレベルのニコチンを有する植物が生じる結果となる。特定の理論に縛られることなく、減少された量のニコチンを有するタバコ植物、タバコ、およびタバコ製品を産生することにより、低減された量のＴＳＮＡも有すると考えられる。すなわち、タバコ植物、タバコ、およびタバコ製品からニコチンを除去することにより、ＴＳＮＡ形成のためのアルカロイド基質が効果的に除去される。タバコ中のニコチンの減少は、ＴＳＮＡの減少と直接関連していることが判明した。意外なことに、本明細書に記載の方法は、常習性の可能性が低減されたタバコを産生するばかりではなく、同時に、発癌性の可能性が低いタバコを産生する。
【００２８】
語句「低減された量」は、低減されたニコチンおよび／またはＴＳＮＡに関して、トランスジェニックにされていない同一種のタバコから、同じ方式で加工されたタバコ植物、タバコ、またはタバコ製品に存在するであろう量より少ない、トランスジェニックタバコ植物、タバコ、またはタバコ製品におけるニコチンおよびまたはＴＳＮＡの量をいうことを強調すべきである。従って、状況によっては、本明細書に記載の創意に富む方法でニコチンおよび／またはＴＳＮＡの低減が得られているかどうかを測定するための対照として、同じ方式で加工された同一種の野生型タバコが使用されることもある。
【００２９】
野生型タバコ種は、種類およびそれが成長した、収穫された、また保存処理された方式によって、ＴＳＮＡおよびニコチンの量が有意に変化する。たとえば、バレータバコの葉は、３０，０００百万分率（ｐｐｍ）のニコチンおよび８，０００十億分率（ｐｐｂ）のＴＳＮＡを有し、火力乾燥バレーの葉は、２０，０００ｐｐｍのニコチンおよび３００ｐｐｂのＴＳＮＡを有し、保存処理した東洋タバコの葉は１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび１００ｐｐｂのＴＳＮＡを有する。本発明による、低減された量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコ植物またはその一部は、検出可能なニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有しないこともあり、あるいは、ニコチンおよび／またはＴＳＮＡの量が同一種の対照植物に存在する量より少ない限り、幾らか検出可能な量の、１つ以上のＴＳＮＡおよび／またはニコチンを含んでもよい。すなわち、低減された量のニコチンを有する、本発明の実施形態によるバレータバコの葉は、０〜３０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜８，０００ｐｐｂのＴＳＮＡ、望ましくは０〜２０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜６，０００ｐｐｂのＴＳＮＡ、より望ましくは０〜１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜５，０００ｐｐｂのＴＳＮＡ、好ましくは０〜５，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜４，０００ｐｐｂのＴＳＮＡ、より好ましくは０〜２，５００ｐｐｍのニコチンおよび０〜２，０００ｐｐｂのＴＳＮＡ、最も好ましくは０〜１，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜１，０００ｐｐｂのＴＳＮＡを有してもよい。本明細書に記載の方法で産生されるバレーの葉の実施形態は、０〜１０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜５００ｐｐｂのＴＳＮＡを有してもよく、本明細書に記載の方法で産生されるバレーの葉の幾つかの実施形態は、検出可能な量のニコチンまたはＴＳＮＡを実質的に有しない。
【００３０】
同様に、低減された量のニコチンを有する、本発明の火力乾燥タバコの葉の実施形態は、０〜２０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜３００ｐｐｂのＴＳＮＡ、望ましくは０〜１５，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜２５０ｐｐｂのＴＳＮＡ、より望ましくは０〜１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜２００ｐｐｂのＴＳＮＡ、好ましくは０〜５，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜１５０ｐｐｂのＴＳＮＡ、より好ましくは０〜２，５００ｐｐｍのニコチンおよび０〜１００ｐｐｂのＴＳＮＡ、最も好ましくは０〜１，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜５０ｐｐｂのＴＳＮＡを有してもよい。本明細書に記載の方法で作製される乾燥処理したタバコの実施形態は、０〜５００ｐｐｍのニコチンおよび０〜２５ｐｐｂのＴＳＮＡを有することもでき、本明細書に記載の方法で作製される乾燥処理したタバコの幾つかの実施形態は、検出可能な量のニコチンまたはＴＳＮＡを実質的に有しない。
【００３１】
さらに、減少された量のニコチンを有する、本発明の保存処理した東洋タバコの実施形態は、０〜１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜１００ｐｐｂのＴＳＮＡ、望ましくは０〜７，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜７５ｐｐｂのＴＳＮＡ、より望ましくは０〜５，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜５０ｐｐｂのＴＳＮＡ、好ましくは０〜３，０００ｐｐｍのニコチンおよび０〜２５ｐｐｂのＴＳＮＡ、より好ましくは０〜１，５００ｐｐｍのニコチンおよび０〜１０ｐｐｂのＴＳＮＡを有してもよく、最も好ましくは０〜５００ｐｐｍのニコチンを有し且つＴＳＮＡを全く有しない。本明細書に記載の方法で作製される保存処理した東洋タバコの実施形態は、０〜２５０ｐｐｍのニコチンを有し且つＴＳＮＡを全く有しなくてもよく、また、本明細書に記載の方法で作製される保存処理した東洋タバコの幾つかの実施形態は、検出可能な量のニコチンまたはＴＳＮＡを実質的に有しない。
【００３２】
本発明は、このようなトランスジェニック植物を生じさせるための方法および核酸構築物、ならびにこのようなトランスジェニック植物を提供する。このような方法は、ニコチン生合成を低減させる（または排除する）トランスジェニックカセットの開発を含む。ニコチン生合成において制御を受けているＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅ（これらに限定されない）をコードする遺伝子のプロモーターに由来する、過剰な数のＤＮＡ配列（シス作動性エレメント）を用いて、タバコ植物を形質転換する。これらのシス作動性エレメントは、代々トランスファーすることが可能なように、植物ゲノムに組み込まれることが好ましい。一般に、これらのシス作動性ＤＮＡ配列と相互に反応するＮｉｃ１およびＮｉｃ２　ＤＮＡ結合性タンパク質は、比較的低レベルにて細胞で発現され、従って、過剰のトランスジェニックシス作動性エレメントは、ＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅ（これらに限定されない）をコードする遺伝子と結合した内因性エレメントと、利用可能なＮｉｃ１およびＮｉｃ２に関して競合する。従って、これらのシス作動性ＤＮＡ配列（および他のシス作動性エレメントのもの）を、本明細書では「デコイ」、または「分子デコイ」と呼ぶ。このような競合は、トランス作動性ＤＮＡ結合性タンパク質が、同起源のシス作動性エレメント上を占有する可能性を低下させ、それによってニコチン生合成酵素の合成をダウンレギュレーションする。
【００３３】
本発明は、ＱＰＴａｓｅまたはＰＭＴａｓｅのシス作動性エレメントのＤＮＡ分子、およびこれらのＤＮＡ分子を含むベクター、ならびにこれらのＤＮＡ分子およびベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞および植物も提供する。本発明のトランスジェニックタバコ細胞および植物は、形質転換されていない対照タバコ細胞および植物より低いニコチン含量を特徴とする。
【００３４】
ニコチン産生が低レベルであるかまたは実質的にニコチンを産生しないタバコ植物は、医薬、化粧品成分、または食品添加物等の商業的に価値がある産物を発現する導入遺伝子のレシピエントとして魅力的である。タバコは、遺伝子操作が容易であり、また１エーカー当たり非常に多くの生物体量を生産することができるため、望ましい産物をコードする導入遺伝子のレシピエント植物として魅力的であり、ニコチン産生に貢献する資源が少ないタバコ植物は、従って、導入遺伝子産物の産生に有効な資源をより多く有する。所望の産物を産生する導入遺伝子を用いて、タバコを形質転換する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の適当な技術を、本発明の低ニコチンタバコ植物と共に使用することが可能である。
【００３５】
低減されたＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅ発現およびおよび低減されたニコチンレベルを有する、本発明のタバコ植物は、低減されたニコチン含量および／またはＴＳＮＡ含量を有するタバコ製品の製造に望ましい。本明細書に記載のタバコ植物は、従来の成長技術および収穫技術（たとえば先端を切り取るまたは先端を切り取らない、花を刈り取るまたは花を刈り取らない、肥料が豊富な土壌または無肥料での栽培）に好適であり、また収穫された葉および茎は、葉タバコ、刻みタバコ、またはカットタバコを含む任意の形態で、パイプ、シガーおよびシガレットタバコ、および噛みタバコを含むがその限りではない伝統的なタバコ製品で使用するのに好適である。
【００３６】
様々な量のニコチンおよび／またはニトロソアミン類を含む広範囲のタバコ製品を作るために、本明細書に記載の低ニコチンおよび／またはＴＳＮＡタバコを加工して、従来のタバコとブレンドできることも予想される。消費者を、高ニコチンおよびＴＳＮＡ製品から低ニコチンおよびＴＳＮＡ製品に徐々に移行させるために、これらのブレンドされたタバコ製品を、タバコ製品中止プログラムに使用することができる。たとえば、喫煙者は、ニコチン１０ｍｇおよびニトロソアミン１．５ｍｇを有するブレンドシガレットを喫煙するプログラムを開始し、ニコチン７ｍｇおよびニトロソアミン１ｍｇを含むシガレットの喫煙に徐々に移行し、続いてニコチン５．０ｍｇおよびニトロソアミン０．５ｍｇを有するシガレット、続いてニコチン２．０ｍｇおよびニトロソアミン０．２５ｍｇを有するシガレット、続いて、ニコチンおよびニトロソアミン類を実質的に含まないシガレットのみを喫煙するか、または喫煙を全くやめると消費者が決意するまで、ニコチン１．０ｍｇを有しＴＳＮＡを含まないシガレットに移行する。従って、本明細書に記載のブレンドシガレットは、ヒトにおける発癌性の可能性を段階的に低減させるためのアプローチの基礎を提供する。
【００３７】
［１．Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメント等の、シス作動性エレメントをコードする核酸］
本発明の実施に際して、本発明の個々の用途に応じて、様々なシス作動性エレメントのいずれを使用してもよい。本発明の実施に際して、単独でまたは互いに組み合わせて使用することが可能なシス作動性エレメント（および対応する転写因子）の例としては、ＡＳ−１およびＡＳＦ−１（米国特許第４，９９０，６０７号および第５，２２３，４１９号参照）、ＡＡＴＴ反復エレメントおよびＰＡＢＦ（米国特許第５，８３４，２３６号および第６，１９１，２５８号参照）、ジャガイモ由来の傷害応答性シス作動性エレメント（Ｓｉｅｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：９６１−８（１９８９））、インゲン由来の胚特異的シス作動性エレメント（Ｂｕｓｔｏｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ１：８３９−８５３（１９８９））、タバコＲＢ７プロモーター由来の根に特異的なシス作動性エレメント（米国特許第５，４５９，２５２号およびＹａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ３：３７１３８２（１９９１））、陽性ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）制御エレメントおよび結合性タンパク質および陰性ＣＣＣＡＡ反復エレメントおよび結合性タンパク質（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２：３３９９−３４０６（１９９２））、タバコのタバコフィトクロムＡ１プロモーター由来の根先端制御エレメント（Ａｄａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２９：９８３−９９３（１９９５））、トウモロコシグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素４遺伝子由来の嫌気生活応答性エレメント（Ｇｅｆｆｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４３：１１−２１（２０００））、およびＡｒａｂｉｄｏｐｉｓ　ｏｌｅｏｓｉｎ遺伝子由来の種子特異的調節領域（米国特許第５，７９２，９２２号参照）（これらの全てを、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）などが挙げられるが、その限りではない。
【００３８】
本技術の現状は、同定されたシス作動性調節領域（たとえば、およそ１，３４０の記載があるＰｌａｎｔ　ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ、「ＰＬＡＣＥ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｏｔｄｏｃｓ／ＰＬＡＣＥ／参照）、およびおよそ１５９の植物プロモーターを収載した、Ｐｌａｎｔ　Ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ「ＰｌａｎｔＣＡＲＥ」（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｈｉｎｘ．ｒｕｇ．ａｃ．ｂｅ：８０８０／ＰｌａｎｔＣＡＲＥ／参照））が大きいデータベースに収載されている状態である。これらのデータベースに収載されたシス作動性制御エレメント、およびＲａｕｍｂａｕｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２７：２９５−２９６（１９９９）、およびＨｉｇｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２７：２９７−３００（１９９９）に提供されているシス作動性制御エレメントを、本発明の実施形態と共に使用することができる。従って、上記データベースおよび参考文献を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明の実施形態と共に使用することができるシス作動性調節領域のさらなる例を以下に挙げる：Ｌａｃｏｍｂｅ　Ｅ，Ｖａｎ　Ｄｏｏｒｓｓｅｌａｅｒｅ　Ｊ，Ｂｏｅｒｊａｎ　Ｗ，Ｂｏｕｄｅｔ　ＡＭ，Ｇｒｉｍａ−Ｐｅｔｔｅｎａｔｉ　Ｊ，シンナモイルＣｏＡ還元酵素遺伝子の維管束発現およびタンパク質とＤＮＡとの複合体形成に必要なシスエレメントの特性決定　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　２３：６６３−６７６（２０００）；Ｔｉｌｌｙ　ＪＪ，Ａｌｌｅｎ　ＤＷ，Ｊａｃｋ　Ｔ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｆｌｏｒａｌ　ｏｒｇａｎ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ遺伝子ＡＰＥＴＡＬＡ３のプロモーターにおけるＣＡｒＧボックスは、多様な制御作用を仲介する　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２５：１６４７−１６５７（１９９８）；Ｃｏｒｄｅｓ　Ｓ．，Ｄｅｉｋｍａｎ　Ｊ．，Ｍａｒｇｏｓｓｉａｎ　Ｌ．Ｊ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｒ．Ｌ．発生的に制御されるＤＮＡ結合性因子と、トマト由来の二つの異なる果実熟成遺伝子に隣接する部位との相互作用　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１（１０）：１０２５−１０３４（１９８９）；Ｈａｇｅｎ　Ｇ．，Ｍａｒｔｉｎ　Ｇ．，Ｌｉ　Ｙ．，Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ　Ｔ．トランスジェニックタバコ植物における、ダイズＧＨ３プロモーターのオーキシン誘導性発現　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５６７−５６９（１９９１）；Ｐａｓｔｕｇｌｉａ　Ｍ．，Ｒｏｂｙ　Ｄ．，Ｄｕｍａｓ　Ｃ．，Ｃｏｃｋ　Ｊ．Ｍ．，Ｂｒａｓｓｉｃａ．ｏｌｅｒａｃｅａにおけるＳ遺伝子ファミリー受容体様キナーゼの、傷害および細菌感染による急速な誘導Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　９：１−１３（１９９７）；Ｇｒｉｅｒｓｏｎ　Ｃ，Ｄｕ　ＪＳ，Ｚａｂａｌａ　ＭＴ，Ｂｅｇｇｓ　Ｋ，Ｓｍｉｔｈ　Ｃ，Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ　Ｍ，Ｂｅｖａｎ　Ｍ　別個のシス配列およびトランス因子がジャガイモ塊茎貯蔵タンパク質遺伝子の代謝的制御および発生的制御を指令する　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　５：８１５−８２６（１９９４）；ＭＢＳＩ，フラボノイド生合成遺伝子制御に関与するＰｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　ＭＹＢ結合部位、Ｋｏｅｓ　Ｒ．Ｅ．，Ｓｐｅｌｔ　Ｃ．Ｅ．，ｖａｎ　Ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ　Ｐ．Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｌ　Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａのカルコンシンターゼ多重遺伝子族のクローニングおよび分子の特性決定、遺伝子　８１：２４５−２５７（１９８９）；Ｉｎａｂａ　Ｔ．，Ｎａｇａｎｏ，　Ｙ．，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ　Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ　Ｙ．，エンドウ小ＧＴＰａｓｅ遺伝子ｐｒａ２のフィトクロムダウンレギュレーション発現に関与するシス制御エレメントの同定、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２０：４９１−４９９（１９９９）；ＤＲＥ，脱水素、低温、塩ストレスに関与するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａシス作動性エレメント、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ．，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ　Ｋ．，二つの乾燥応答性ｒｄ２９遺伝子をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＤＮＡ，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０１：１１１９−１１２０（１９９３）；Ｒｕｓｈｔｏｎ　Ｐ．Ｊ．，Ｔｏｒｒｅｓ　Ｊ．Ｔ．，Ｐａｒｎｉｓｋｅ　Ｍ．，Ｗｅｒｎｅｒｔ　Ｐ．，Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ　Ｋ．，Ｓｏｍｓｓｉｃｈ　Ｉ．Ｅ．，エリシター誘導性ＤＮＡ結合性タンパク質と、パセリＰＲＩ遺伝子のプロモーターにおけるエリシター応答エレメントとの相互作用、ＥＭＢＯ　Ｊ．１５（２０）：５６９０−５７００（１９９６）；細胞周期制御に関与するＭＳＡ様シス作動性エレメント、Ｉｔｏ　Ｍ．，Ｃｒｉｑｕｉ　Ｍ．Ｃ．，Ｓａｋａｂｅ　Ｍ．，Ｏｈｎｏ　Ｔ．，Ｈａｔａ　Ｓ．，Ｋｏｕｃｈｉ　Ｈ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｊ，Ｆｕｋｕｄａ　Ｈ．，Ｋｏｍａｍｉｎｅ　Ａ．，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ａ．同調培養におけるＡ型およびＢ型植物サイクリン遺伝子の細胞周期制御転写、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１：９８３−９９２（１９９７）（これら全てを、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。概して、宿主細胞の生命維持に重要ではない（たとえば、基本的な細胞機能に不可欠な「ハウスキーピング遺伝子」と関連していない）が、植物に非致命的な表現型の変化を来たす結果となる遺伝子または遺伝子ファミリーの転写制御と機能的に関連したエレメントが好ましい。
【００３９】
Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントは、本明細書の記載と同じ方式でＮｉｃ遺伝子産物により転写的に活性化される遺伝子のプロモーター領域をスクリーニングすることによって単離することができ、または、本明細書に記載の配列番号１にハイブリダイズし、続いて、以下に記載の方式でＮｉｃ遺伝子産物を結合できる能力をスクリーニングすることにより同定することができる。
【００４０】
本発明の実施に際して使用される核酸配列は、配列番号１またはそのフラグメントと配列類似性を有する天然または合成のフラグメントを含む。そのフラグメントは、望ましくは、少なくとも連続した２０〜４５５個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも連続した３０〜４００個のヌクレオチド、より好ましくは、連続した５０〜３５０個のヌクレオチド、最も好ましくは、連続した１００〜３００個または連続した２００〜４００個のヌクレオチドからなる。この定義は、配列番号１のＤＮＡまたは上記フラグメントの、天然の対立遺伝子の変異を含むことを意図する。従って、本発明の実施に際して、配列番号１のＤＮＡ、またはその相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列も使用することが可能である。好適な実施形態は、配列番号１のフラグメント、またはＮｉｃ遺伝子産物を結合できる能力を保持した他のＮｉｃ遺伝子産物応答エレメント（すなわち、配列番号１の相補鎖に結合するエレメント）を含む。このようなフラグメントは、概して、少なくとも２０，４０または６０ヌクレオチドの長さである天然の構築物の、連続したフラグメントまたは一部である。配列番号１と配列類似性を有する他のＤＮＡ配列を容認する条件は、通常の方法で決定することができる。たとえば、このような配列のハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシーの条件で実施してもよく、またはさらにストリンジェントな条件で実施してもよい（たとえば、標準ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用すると、本明細書に配列番号１として示されている配列を有するＤＮＡに対して、６０℃またはさらに７０℃にて、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーで表される条件。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　クローニング，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２版、１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照））。概して、このような配列は、本明細書に配列番号１として示されている配列と、少なくとも６５％類似、７５％類似、８０％類似、８５％類似、９０％類似、または９５％も、またはそれ以上類似している。配列類似性の決定は、最大マッチングを得るために整列させた二つの配列を用いて行った。マッチングを最大化する際に、マッチさせる２配列のいずれでも、ギャップが許容される。１０以下のギャップ長さが好ましく、５以下のギャップ長さがより好ましく、２以下のギャップ長さが、なおいっそう好ましい。
【００４１】
本発明のＤＮＡ配列は、本明細書に記載の配列（配列番号１）、または対立遺伝子またはこれらの遺伝子の多形変異形を示す等価ヌクレオチド配列、またはそのコード領域から実質的に構成されてもよい。
【００４２】
本明細書および請求の範囲における語句「実質的な配列類似性」の使用は、本明細書に開示され、また請求の範囲に記載されている実際の配列からの、僅かで、重要ではない配列の変化を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ酸配列は、本発明の配列と等価であると考えられることを意味する。この点に関して、「僅かで、重要でない配列変化」は、「類似した」配列（すなわち、本明細書に開示され、また請求の範囲に記載されている、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質と実質的配列類似性を有する配列）が、本明細書に開示され、また請求の範囲に記載されている配列と機能的に等価であることを意味する。機能的に等価の配列は、本明細書に開示され、また請求の範囲に記載されている、核酸およびアミノ酸組成物と実質的に同様に作用し、実質的に同じ組成物を生じさせる。
【００４３】
本発明の態様と共に使用するためのさらなる核酸配列は、米国特許第５，４５９，２５２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている配列から得ることができるＮｉｃ遺伝子産物応答エレメントを含む。幾つかの実施形態では、Ｎｉｃ遺伝子産物応答エレメントは、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００から−６００または−７００ｂｐまでの間にある。従って、幾つかの実施形態は、米国特許第５，４５９，２５２号に開示されている−１０００から−６００または−７００までの間のＮｔＱＰＴ１プロモーターの配列に対応する、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの３００〜４００ヌクレオチド長のフラグメントを含む。
【００４４】
後述の通り、本明細書に記載のＤＮＡ配列を、様々な宿主細胞に形質転換することができる。望ましい成長特性および取扱特性を有する様々な好適な宿主細胞は、当該技術分野において容易に入手できる。
【００４５】
本明細書および請求の範囲における、「単離された」または「実質的に純粋な」という語句のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の変更因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）としての使用は、そのように明示されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が、人間の努力によって、それらのｉｎ　ｖｉｖｏ細胞環境から分離されていることを意味する。本明細書で使用する、「生来のＤＮＡ配列」または「天然のＤＮＡ配列」は、非トランスジェニック細胞または組織から単離することができるＤＮＡ配列を意味する。生来のＤＮＡ配列は、位置指定突然変異誘発等によって、人工的に変化させていないものである。いったん生来のＤＮＡ配列が同定されると、生来のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子を化学的に合成するか、または当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ手順を使用して生じさせることができる。本明細書で使用する、生来の植物ＤＮＡ配列は、非トランスジェニック植物細胞または組織から単離することができるものである。本明細書で使用する生来のタバコＤＮＡ配列は、非トランスジェニックタバコ細胞または組織から単離することができるものである。
【００４６】
［２．核酸構築物およびトランスファーベクター］
本発明の核酸構築物または「カセット」は、一般に、上述のＮｉｃ遺伝子産物応答エレメント等のシス作動性エレメントを、組換え構築物として、Ｎｉｃ遺伝子産物を植物細胞に導入するためのトランスファーベクターの役割を果たす線状または環状の核酸の中に含む。
【００４７】
この構築物またはカセットは、少なくとも１つの複製システムも有するＤＮＡ構築物で提供することも可能である。便宜上、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで機能する複製システム、たとえば、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４等を有することがよくある。この方式では、各操作後の各段階で、結果として生じる構築物をクローニングし、配列決定し、さらに操作の正確さを決定することが可能である。加えて、またはＥ．ｃｏｌｉ複製システムの代わりに、Ｐ−１不和合成（Ｐ−１ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）プラスミドの複製システム、たとえば、ｐＲＫ２９０等の広い宿主範囲の複製システムを使用してもよい。複製システムに加えて、１つ以上の宿主で、または個々の宿主の異なるマーカーで有用な可能性がある、少なくとも１つのマーカーが存在する場合が多い。すなわち、原核宿主の場合、１つのマーカーを選択に使用することができるが、真核宿主、特に植物宿主の場合、もう１つのマーカーを選択に使用することができる。マーカーは、抗生物質、毒素、重金属等の殺生物剤に対する保護であってもよく、栄養要求性宿主に原栄養性を与えることにより補完性を提供してもよく、また、植物における新規な化合物の産生を介して可視表現型を提供することが可能である。
【００４８】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与された米国特許第５，７７３，６８９号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与された第５，７７３，６９５号、Ｍｉｃｈａｌｏｗｓｋｉらに付与された第６，２４５，９７４号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与された第６，２３９，３２８号、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらに付与された第６，１００，４４８号、およびＴｈｏｍｐｓｏｎらに付与された第６，０３７，５２５号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）らに記載の通り、本発明の核酸構築物は、その安定性および／または遺伝性を高めるために、シス作動性エレメントに５’、３’、または５’と３’の両方が配置された１つ以上のマトリックス付着領域を含んでもよい。
【００４９】
適切な複製システムの制限酵素切断、および利用可能な部位への、特定の構築物またはフラグメントの挿入により、様々な構築物、カセット類、マーカー類等を含む様々なフラグメントを、連続的に導入することが可能である。ライゲーションおよびクローニングの後、さらなる操作のために、ＤＮＡ構築物を単離することが可能である。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２版、１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により例示される通り、これらの技術は全て、文献に詳細に例示されている。
【００５０】
本発明の核酸構築物で植物組織を形質転換するのに使用することが可能なベクターとしては、弾道的ベクターおよびアグロバクテリウムベクターの両者、ならびに、ＤＮＡ仲介形質転換に適したベクターなどがある。これらは、以下で詳細に検討する。
【００５１】
本発明の形質転換された細胞および植物を作るために使用される核酸構築物分子およびベクターは、優性の選択可能マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。タバコで使用するのに適した優性の選択可能なマーカーとしては、とりわけ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする抗生物質抵抗性遺伝子などがある。タバコで使用するのに適した既知の優性の選択可能マーカーは、メトトレキサート抵抗性ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする突然変異体ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子である。適当な抗生物質抵抗性遺伝子を含有するＤＮＡベクター、および対応する抗生物質は、市販されている。
【００５２】
［３．植物形質転換、再生および増殖］
適切な濃度の抗生物質（または通常は細胞に有毒な他の化合物）を含有する培地中に混合細胞集団を入れることにより、既知の形質転換されていない細胞集団から形質転換された細胞を選択する（選択された優性の選択可能マーカー遺伝子産物が、それに対する抵抗性を与える）。従って、形質転換されている植物細胞のみが生き残って増殖する。
【００５３】
本発明の組換え植物を産生する方法は、一般に、先ず再生することができる植物細胞（一般に、再生することができる組織中にある植物細胞）を提供することを含む。次いで、この植物細胞を、（本明細書に記載の）本発明のカセットを含むＤＮＡ構築物で形質転換し、この形質転換された植物細胞から組換え植物を再生させる。以下に説明する通り、転写カセットを担持する微粒子で植物細胞に衝撃を与えること、カセットを担持するＴｉプラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに細胞を感染させること、またはトランスジェニック植物の作製に適した任意の他の技術を含むがその限りではない、当該技術分野で既知の技術によって形質転換するステップを実施する。
【００５４】
本発明のＤＮＡ構築物を担持する微粒子であって、植物細胞の弾道的形質転換に適した微粒子も、本発明の形質転換された植物を作るのに有用である。この微粒子を植物細胞内に推進させて形質転換された植物細胞を作り、この形質転換された植物細胞から植物を再生させる。本発明の実施に際して、任意の好適な弾道的細胞形質転換方法および装置を使用することができる。代表的な装置および手順は、Ｓａｎｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｗｏｌｆに付与された米国特許第４，９４５，０５０号、およびＣｈｒｉｓｔｏｕらに付与された米国特許第５，０１５，５８０号（全ての米国特許文献を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。弾道的形質転換手順を使用するとき、形質転換すべき細胞で複製することができるか、または形質転換すべき細胞に組み込むことができるプラスミドに、カセットを組み込んでもよい。このようなシステムで使用するのに適した微粒子の例としては、１〜５μｍの金球などが挙げられる。任意の適当な技術、たとえば、沈澱によって、この微粒子上にＤＮＡ構築物を付着させることができる。
【００５５】
本発明の実施に際して有用な多数のアグロバクテリウムベクターシステムが知られている。たとえば、米国特許第４，４５９，３５５号には、Ｔｉプラスミドを含有するアグロバクテリウム種を用いて、双子葉植物を含む感受性植物を形質転換する方法が開示されている。アグロバクテリウムベクターを用いた木質植物（ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ）の形質転換は、米国特許第４，７９５，８５５号に開示されている。さらに、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔらに付与された米国特許第４，９４０，８３８号には、本発明の実施に際して有用なバイナリーのアグロバクテリウムベクター（すなわち、アグロバクテリウムが、Ｔｉプラスミドのｖｉｒ領域を有するがＴ領域を有しない１つのプラスミドと、Ｔ領域を有するがｖｉｒ領域を有しない第二のプラスミドとを含むもの）が開示されている。
【００５６】
一般に、高コピー数のデコイ配列がゲノムに存在しなければならないため、シス作動性エレメントのタンデムコピーを、アグロバクテリウムベクターに挿入することも可能であるが、好ましい植物の形質転換方法は、トランスジェニックＤＮＡの多数のコピーを植物ゲノムに導入する、粒子衝撃による。本発明の細胞および植物で、増加されたレベルまたは低減されたレベルの関心あるタンパク質を得るために、宿主細胞（およびその子孫または娘細胞）に挿入しなければならないシス作動性エレメント（それぞれが、プラスミド等のベクター上に存在するかどうかにかかわらず、１つのベクターまたはプラスミド、またはそれらの組み合せ上の多数のコピーを計数した）の実際の数は、個々のエレメントによってある程度異なるが、概して、少なくとも２０、３０または５０〜約５００、１，０００または２，０００以上であろう。
【００５７】
本発明のＤＮＡ構築物を用いた植物細胞プロトプラストのＤＮＡ仲介形質転換、およびその後の、形質転換されたプロトプラストからの植物の再生によって、植物種を形質転換することが可能である。当該技術分野で既知の手順による、タバコプロトプラストとＤＮＡ含有リポソームとの融合またはエレクトロポレーションは、当該技術分野で既知である（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，「エレクトロポレーションを含む多数の方法による、双子葉植物および単子葉植物のプロトプラストへの直接遺伝子導入」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５３，３１３−３６（１９８７））
【００５８】
本明細書で使用する「形質転換」は、外因性ＤＮＡで安定に形質転換されたトランスジェニック細胞を作るための、外因性ＤＮＡの細胞への導入を指す。「安定に形質転換された」は、外因性核酸が、最初に形質転換された細胞の娘細胞または子孫細胞に伝達されること、好ましくは、形質転換された植物の子孫植物（有性的および無性的に増殖された子孫植物を含む）に伝達されるか、または形質転換された植物の子孫植物によって受け継がれることを意味する。
【００５９】
当該技術分野で既知の細胞および組織培養技術を利用して、形質転換された細胞を無傷の植物に再生させる。植物再生方法は、形質転換方法と適合するように選択する。形質転換された細胞からトランスジェニック植物を再生させた後、導入されたＤＮＡ配列は、過度の実験をせずに、従来の植物育種業務によって他の植物変種に容易に移入される。
【００６０】
たとえば、トランスジェニックＤＮＡの分離を分析するために、再生させた形質転換植物（Ｒ０）を成熟させ、関心あるタンパク質のレベルをテストし、自己増殖させてＲ１植物を生じさせる。トランスジェニックＤＮＡを担持するＲ１植物の一部は、トランスジェニックＤＮＡについてホモ接合性である。ホモ接合性Ｒ１植物を識別するために、トランスジェニックＲ１植物を成熟させ、自己増殖させる。ホモ接合性Ｒ１植物は、各子孫植物がトランスジェニックＤＮＡを担持するＲ２子孫を産生し、ヘテロ接合性Ｒ１植物の子孫は、３：１に分離する。
【００６１】
ニコチンはタバコ植物を病害虫による被害から保護するのに役立つ天然の殺虫剤の役割を果たす。従って、本方法で産生される低ニコチン植物または無ニコチン植物を、さらなる昆虫保護を与える導入遺伝子（たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）で、さらに形質転換することが望ましいこともある。
【００６２】
本発明で使用するのに好適な植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の任意の種、すなわち、Ｎ　ｔａｂａｃｕｍ，Ｎ　ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ　ｇｌｕｔｉｎｏｓａを含む、タバコである。タバコのあらゆる種または変種を使用することが可能である。
【００６３】
器官形成によろうと、胚形成によろうと、その後のクローン増殖ができる任意の植物組織を、本発明のベクターを用いて形質転換してもよい。本明細書で使用する用語「器官形成」は、分裂組織の中心から苗条および根が順次発生する過程を意味し、本明細書で使用する用語「胚形成」は、体細胞からであれ、配偶子からであれ、苗条および根が協調様式で一緒に（順次ではない）発生する過程を意味する。選択される個々の組織は、形質転換しようとしている種に利用でき、且つ最も適した、クローン増殖システムによって異なる。代表的な組織標的としては、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、カルス組織、既存の分裂組織（たとえば、頂端分裂組織、腋芽、および根の分裂組織）、および誘導された分裂組織（たとえば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）などがある。
【００６４】
本発明の植物は、様々な形態をとることができる。本植物は、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞とのキメラであってもよい。本植物は、クローン形質転換体であってもよい（たとえば、全ての細胞が、本カセットを含有するように形質転換されている）。本植物は、形質転換された組織および形質転換されていない組織の移植片を含んでもよい（たとえば、柑橘種における、未形質転換移植片に移植された形質転換根茎）。本発明の形質転換された植物は、様々な方法で、たとえば、クローン増殖または古典的育種技術で増殖させることが可能である。たとえば、第一世代（すなわちＴ１）形質転換植物を自己増殖させてホモ接合性第二世代（すなわちＴ２）形質転換植物を与え、このＴ２植物を古典的育種技術でさらに増殖させることができる。優性の選択可能マーカー（たとえば、ｎｐｔｌｌ）を本発明の構築物と結び付けて、育種を支援することができる。
【００６５】
本発明の幾つかの好適な実施形態では、変化されたレベルのタンパク質を有するトランスジェニック植物を作るために、十分な数のデコイまたはシス作動性エレメントが細胞に挿入され、且つ多くの細胞分裂がされるあいだにわたって保持されることを確実にすることを助けるために、上述の微粒子銃形質転換を使用し、上述のシス作動性デコイセグメントを輸送するために、環状のＤＮＡまたはプラスミドを使用し、（使用される環状のＤＮＡまたはプラスミドは比較的小さく、たとえば、１０，０００未満または６，０００未満の塩基対からなる）、また高モル比のシス作動性エレメントと選択可能マーカー（たとえば、１０対１）を宿主細胞内に挿入する。
【００６６】
本明細書で使用する農産物は、圃場に一緒に植えられた、本発明の、同一属の、複数の植物を含む。「圃場」は、共通の耕地または温室を意味する。従って、本発明は、同一種および変種の形質転換されていない植物の類似した農産物に比べて、変化したレベルの関心あるタンパク質を有する（たとえば、ＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅ活性、従って低減されたニコチンレベルを有する）植物の農産物を産する方法を提供する。
【００６７】
本発明は、トランスジェニックタバコにおけるニコチンレベルを低減させる方法について説明するが、この方法はまた、各ゲノムの遺伝子座をクローニングせずにトランス作動性転写アクティベーターおよびトランス作動性転写リプレッサーにおける表現型模写の突然変異に使用することができる。転写因子に応答するプロモーターの領域を明確にするための、当業者に既知の技術を使用して、遺伝子のプロモーター領域を分析することができる。一般に、これは、プロモーターの欠失分析によって行われる。プロモーターのネステッド欠失（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）をレポーター遺伝子に融合させ、トランスジェニック生物におけるレポーター遺伝子の発現をモニタリングする。現在の技術を使用した転写因子の単離は非常に難しいが、１つ以上の転写アクティベーターによって同等に制御される遺伝子セットを混乱させることが望ましい用途では、本発明を使用することによって、同族転写因子をクローニングする必要性がなくなる。反対に、本発明の方法は、１つ以上の転写リプレッサーによって協調制御される遺伝子セットの発現をアップレギュレーションする。
【００６８】
上述の通り、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでも、本発明を使用して、植物（特に単子葉植物および双子葉植物等の維管束植物）細胞、動物（トリ、哺乳動物）細胞、真菌細胞、または細菌細胞を含む、様々な宿主細胞で、遺伝子発現を混乱させ、シス作動性活性化エレメントの調節下にある関心あるタンパク質の発現をダウンレギュレーションすることも可能であろう。細菌および真菌において、多コピープラスミドを使用して、細胞内に存在する分子デコイのコピーを増加させることができる。
【００６９】
以下の実施例は、例を挙げて本発明を説明するために記載するものであり、本発明を限定するものと考えてはならない。
【００７０】
［実施例１］
［ＮｔＱＰＴ１プロモーターにおけるシス作動性エレメントの定位］
ＮｔＱＰＴ１シス作動性エレメントに必要な最小配列を特性決定するために、ＮｔＱＰＴ１遺伝子のプロモーター領域を単離し、５’末端で切断し、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子に融合させて、ニコチン産生の特異的エンハンサーとしての機能を評価した。ＮｔＱＰＴ１遺伝子を単離し、配列決定した。ＴｏｂＲＤ２　ｃＤＮＡ配列をゲノム遺伝子座配列と比較することによって、転写物の開始を決定した。転写開始点の５’に位置する配列を、プロモーター配列と定義した。ＰＣＲプライマーおよびプロモーターを鋳型として使用し、プロモーターの５’末端で切断を行って、最小のシス作動性エンハンサー配列を決定した（図２参照）。この切断部分を、ＧＵＳをコードするｕｉｄＡ遺伝子に融合した。この融合遺伝子をベクターに導入し、標準的な弾道的形質転換方法で、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｎｚバレー２１に形質転換した。
【００７１】
植物を、根、茎、および葉に分けることによって、ＧＵＳ活性を評価した。異なるＮｔＱＰＴ１切断構築物で形質転換された各植物組織を、乳鉢および乳棒で粉砕し、ＮａＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０でタンパク質を抽出し、Ｘ−Ｇｌｃ（１００μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間、分析を行った。５９５ｎｍにてＧＵＳ活性を測定した。構築物ごとに、少なくとも２０の独立した形質転換体を分析した。平均値および標準偏差値を決定した。切断におけるＧＵＳ活性を、ＣａＭＶ　３５Ｓ−ＧＵＳ融合体およびプロモーターレスＧＵＳ（ｐＢＩ１０１）対照と比較した。−５８６〜−２０００ｂｐをｕｉｄＡ遺伝子に融合させたとき、ＮｔＱＰＴ１発現を示す最大ＧＵＳ活性を得た（図３）。−１から−５８６までのより短いプロモーターは、高レベルのｕｉｄＡ発現を支持しなかった。従って、ＮｔＱＰＴ１シス作動性エレメントは、転写開始点の−５８６〜−２０００ｂｐ　５’に位置する。
【００７２】
［実施例２］
［ＮｔＱＰＴ１プロモーターにおけるＮｉｃ遺伝子産物結合部位の定位］
ｕｉｄＡレポーター遺伝子（ＧＵＳをコードする）に融合したＮｔＱＰＴ１プロモーター欠失シリーズを、ｎｉｃ−／ｎｉｃ−ホモ接合性Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物に形質転換した。１つの遺伝子座にトランスジェニックＤＮＡを有するＲ０形質転換体を、ｎｉｃ−／ｎｉｃ−またはＮｉｃ＋／Ｎｉｃ＋ホモ接合性植物と交雑させて、導入遺伝子（ＮｔＱＰＴ１プロモーターＧＵＳ）を同一染色体位置に担持するホモ接合性（ｎｉｃ−／ｎｉｃ−）子孫およびヘテロ接合性（Ｎｉｃ＋／ｎｉｃ−）子孫を与えた。多数の、独立した形質転換体からの多数の子孫で、ＧＵＳ活性を定量化し、Ｎｉｃ＋表現型およびｎｉｃ−表現型の間で比較した（表１）。１．５より大きい比率を、Ｎｉｃ遺伝子産物活性化に応答するシス作動性エレメントを含むと決定した。
【００７３】
【表１】
2004507250.tif 000003
【００７４】
Ｎｉｃ＋／ｎｉｃ−およびｎｉｃ−／ｎｉｃ−植物におけるＧＵＳ活性で決定された通り、Ｎｉｃ遺伝子産物の結合は、ＮｔＱＰＴ１プロモーターのおよそ−１０００ｂｐと−６００ｂｐまたは−７００ｂｐとの間に位置することが、これらの実験からわかった。
【００７５】
［実施例３］
［分子デコイを使用したＮｔＱＰＴ１遺伝子発現の制御］
ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００ｂｐと−６００ｂｐまたは−７００ｂｐとの間に位置するヌクレオチド配列を、タンデムアレイ状で、植物−アグロバクテリウムシャトルベクターに挿入し、続いて、当業者に既知の方法でタバコに形質転換する。上記ベクターで安定に形質転換された植物を、ＮｔＱＰＴ１の発現レベルおよびニコチンおよび／またはＴＳＮＡ含量について評価する。これらの実験から、Ｎｉｃ遺伝子産物と相互に作用する分子デコイで形質転換されたタバコは、低減された量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを示すことがわかる。低減されたＮｔＱＰＴ１の発現および低減されたニコチンレベルを有する分子デコイの、多数のタンデム挿入物を含む植物は、商業的に価値がある産物の発現、および減少されたニコチンおよび／またはＴＳＮＡ含量を有するタバコ製品の製造に使用される。
【００７６】
［実施例４］
［ＴＧＡＣＧ分子デコイを使用したＡＳＦ−１結合の制御］
ヌクレオチド配列ＴＧＡＣＧを、タンデムアレイ状で、植物−アグロバクテリウムシャトルベクターに挿入し、当業者に既知の方法で、エンドウ等の植物に形質転換する。上記ベクターで安定に形質転換された植物は、ヒストン遺伝子（Ｍｉｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２３：２７３）；アグロピン生合成のための酵素遺伝子（Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２７２３−３０）、オクトピンシンターゼ遺伝子（Ｅｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３２０３）、およびマンノピンシンターゼ遺伝子（ＤｅＲｉｔａ　ａｎｄ　Ｇｅｌｖｉｎ，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０７：２３３）、ならびにＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子、ヒストンＨ３遺伝子およびノパリンシンターゼ遺伝子等の、植物遺伝子でみられる配列モチーフＴＧＡＣＧを認識するトランス作動性ＤＮＡ結合因子ＡＳＦ−１の、低減された結合活性を有する。
【００７７】
［実施例５］
［分子デコイを使用した、β−ファセオリンの空間的および時間的発現の制御］
β−ファセオリン（ｂｅｔａ−ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）遺伝子のＵＡＳ１に対応するヌクレオチド配列（−２９５〜−１０９）を、タンデムアレイ状で、植物−アグロバクテリウムシャトルベクターに挿入し、当業者に既知の方法でインゲン植物に形質転換する。上記ベクターで安定に形質転換された植物は、ＵＡＳ１に位置する配列ＣＡＴＧＣＡＡＡおよびＣＡＴＧＣＡＴＧを認識するトランス作動性ＤＮＡ結合因子ＰｖＡＬＦの、低減された結合活性を有する（Ｂｏｂｂ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２５（３）：６４１−７）。ＰｖＡＬＦの低減された活性を有する植物であれば、主として子葉および苗条分裂組織において、β−ファセオリンの種子特異的発現の低減された発現を示す（Ｂｕｓｔｏｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ　Ｊ　１０（６）：１４６９−１４７９）。
【００７８】
β−ファセオリン遺伝子のビシリンボックス（ＧＣＣＡＣＣＴＣＡＡ；配列番号２）および部位Ｂ（ＣＡＣＡＣＧＴＣＡＡ；配列番号３）に対応するヌクレオチド配列のタンデムアレイをインゲン植物に形質転換すると、結果として、β−ファセオリン発現の早熟開始につながるトランス作動性ＤＮＡ結合因子ＲＯＭ１およびＲＯＭ２の結合活性が低減する。ＲＯＭ１およびＲＯＭ２タンパク質は、種子成熟の開始をブロックするための、β−ファセオリンおよびフィトヘマグルチニンＬ−サブユニット発現のリプレッサーの役割を果たす（Ｂｕｓｔｏｓらに付与された米国特許第６，１６０，２０２号；Ｃｈｅｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　８：３０５−３２１；Ｃｈｅｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１０：１３５−１４８）。
【００７９】
［実施例６］
［分子デコイを使用した植物遺伝子発現の制御］
構造遺伝子をコードする、タバコＲＢ７プロモーターからの根に特異的なシス作動性エレメントのタンデムアレイ（Ｃｏｎｋｌｉｎｇらに付与された米国特許第５，４５９，２５２号；Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１２：３３９９−３４０６）で、タバコ植物を形質転換すると、結果として、ＲＢ７シス作動性エレメントのトランス作動性ＤＮＡ結合因子の結合活性が低減する。
【００８０】
同様に、以下のシスエレメントの類似したタンデムアレイを、植物に形質転換して、対応するトランス作動性ＤＮＡ結合因子の結合活性を低減させる。ＡＡＴＴシス作動性反復エレメントおよびその対応するＰＡＢＦトランス作動性因子（米国特許第５，８３４，２３６号および第６，１９１，２５８号参照）；陽性ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）制御エレメントおよび結合性タンパク質および陰性ＣＣＡＡ反復エレメントおよび結合性タンパク質（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２：３３９９−３４０６）；タバコのタバコフィトクロムＡｌプロモーター由来の根先端制御エレメント（Ａｄａｍ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：９８３−９９３）；トウモロコシグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ４遺伝子由来の嫌気生活応答エレメント（Ｇｅｆｆｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１１−２１）；およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｏｌｅｏｓｉｎ遺伝子由来の種子特異的調節領域（米国特許第５，７９２，９２２号参照）。
【００８１】
［実施例７］
［分子デコイを使用して生じさせた、低減されたニコチンおよび／またはＴＳＮＡレベルを有するタバコ］
ＮｔＱＰＴ１プロモーターのおよそ３００または４００ヌクレオチド長のフラグメント（たとえば、配列番号１等の、ＮｔＱＰＴ１プロモーターの−１０００ｂｐと−６００ｂｐまたは−７００ｂｐとの間に位置するヌクレオチド配列を含む）の多数のコピーを、植物細胞の弾道的形質転換に適した微粒子（たとえば、１〜５μｍの金球）に、（たとえば、沈澱によって）付着させる。形質転換された植物細胞を作るために、この微粒子をタバコ植物細胞（たとえば、バレー２１　ＬＡ）内に推進させ、この形質転換された植物細胞から植物を再生させる。バレー２１　ＬＡは、バレー２１と比較して、大幅に低減されたレベルのニコチンを含むバレー２１の変種である（すなわち、バレー２１　ＬＡは、バレー２１のニコチンレベルの８％を有する、Ｌｅｇｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｃａｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ　Ｃｙｔｏｌ，１３：２８７−９１（１９７１）；Ｌｅｇｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｈｅｒｅｄ，６０：２１３−１７（１９６９））参照。
【００８２】
任意の適当な弾道的細胞形質転換方法および装置を使用することができる。代表的な装置および手順は、Ｓａｎｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｗｏｌｆに付与された米国特許第４，９４５，０５０号、およびＣｈｒｉｓｔｏｕらに付与された米国特許第５，０１５，５８０号（その両者を引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。任意選択的に、形質転換された核酸は、選択可能なマーカー（たとえば、形質転換体の陽性または陰性選択を可能にするマーカー）をコードする遺伝子を含んでもよく、または分子デコイを選択可能マーカー遺伝子と共に同時トランスファーしてもよい。この方式で、陽性の形質転換体を容易に識別することができる。
【００８３】
形質転換された細胞、組織、および実生を、（選択可能マーカーを使用したかどうかによって、選択化合物、たとえば、抗生物質を含むまたは含まない）Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地で成長させる。バレー２１　ＬＡの独立した形質転換体（Ｔ０）１００個を自己増殖させる。自己増殖した植物（Ｔ１）の子孫を成長させる。微量分析技術を使用して、Ｔ１子孫のニコチンレベルを定性的に測定する。およそ〜２００ｍｇの新鮮なタバコ葉を採集し、抽出溶液１ｍｌ中で粉砕する（抽出溶液：１００ｍｌのＨ２Ｏ中に酢酸１ｍｌ）。ホモジネートを、１４，０００×ｇで５分間遠心分離し、上澄を清浄な試験管に取り、以下の試薬を加える。１００μｌのＮＨ４ＯＡＣ（５ｇ／１００ｍｌのＨ２Ｏ＋５０μｌのＢｒｉｊ３５）、５００μｌの臭化シアン（Ｓｉｇｍａ社製　Ｃ−６３８８、０．５ｇ／１００ｍｌのＨ２Ｏ＋５０μｌのＢｒｉｊ３５）、４００μｌのアニリン（１００ｍｌのＮＨ４ＯＡＣ＋５０μｌのＢｒｉｊ３５で緩衝化したアニリン０．３ｍｌ）。抽出溶液中に１０ｍｇ／ｍｌを含むニコチン標準ストック液を調製し、希釈して較正用標準シリーズを作る。４６０ｎｍにおける吸光度を読み取り、標準検量線を使用して、被験サンプルのニコチン含量を決定する。
【００８４】
バレー２１　ＬＡ親のニコチンレベルの１０％未満を有するＴ１子孫を自己増殖させて、Ｔ２子孫を生じさせる。次いで、ホモ接合性Ｔ２子孫を同定する。ホモ接合性Ｔ２子孫およびヘテロ接合性Ｔ２子孫におけるニコチンレベルも、微量分析を使用して、定性的に決定する。ガスクロマトグラフィー／フレームイオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）を使用したニコチンレベルの定量分析のために、ホモ接合性Ｔ２子孫の葉サンプルをＳｏｕｔｈｅｒｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｉｌｓｏｎ，ＮＣに送ってもよい。ホモ接合性Ｔ２子孫は、形質転換されていないタバコ（たとえば、〜７０ｐｐｍ）と比較して、実質的に低減されたニコチンレベルを有する。このような植物では、ニコチンレベルが実質的に低減されているため、これらの植物におけるＴＳＮＡレベルも付随して低減されている。
【００８５】
これらの実験から、Ｎｉｃ遺伝子産物と相互に作用する分子デコイで形質転換されたタバコは、低減された量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを示すことがわかる。低減されたＮｔＱＰＴ１発現および低減されたニコチンレベルを有する分子デコイの多数のタンデム挿入物を有する植物は、商業的に価値がある産物の発現および低減されたニコチンおよび／またはＴＳＮＡ含量を有するタバコ製品の製造に使用される。
【００８６】
［実施例８］
［低ニコチンおよびＴＳＮＡブレンドタバコ］
以下の実施例に、ブレンドによって、ある特定の量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコ製品を作る幾つかの方法を記載する。幾つかのブレンド方法は、極めて低量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有する変種から産生したタバコで開始する。低ニコチン／ＴＳＮＡ変種（たとえば、検出不可能なレベルのニコチンおよび／またはＴＳＮＡ）から調製されたタバコを、従来のタバコ（たとえば、３０，０００ｐｐｍのニコチンおよび８，０００ｐｐｂのＴＳＮＡを有するバレータバコ、２０，０００ｐｐｍのニコチンおよび３００ｐｐｂのＴＳＮＡを有する火力乾燥タバコ、および１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび１００ｐｐｂのＴＳＮＡを有する東洋タバコ）とブレンドすることによって、実質的に所望の量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコ製品を製造することができる。タバコ使用者が、ニコチン依存性を低減させまたは排除するのを助け、また発癌性の可能性を低減させるために、様々な量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコ製品を、タバコ使用中止キットおよびプログラムに組み込むことができる。
【００８７】
たとえば、ステップ１タバコ製品は、低ニコチン／ＴＳＮＡタバコおよそ２５％および従来のタバコ７５％を含んでもよく、ステップ２タバコ製品は、低ニコチン／ＴＳＮＡタバコおよそ５０％および従来のタバコ５０％を含んでもよく、ステップ３タバコ製品は、低ニコチン／ＴＳＮＡタバコおよそ７５％および従来のタバコ２５％を含んでもよく、ステップ４タバコ製品は、低ニコチン／ＴＳＮＡタバコ１００％および従来のタバコ０％を含んでもよい。１ヶ月プログラムの場合、タバコ使用中止キットは、消費者を満足させるために、前述の各ブレンドから同量のタバコ製品を含んでもよい。すなわち、たとえば、消費者が１日１パックの喫煙者であれば、１ヶ月キットは、各ステップから７パック、計２８パックのシガレットを与える。各タバコ使用中止キットは、消費者を段階的な方法で具体的に誘導する一組の説明書を含む。もちろん、消費者がそれぞれ要望するニコチンおよび／またはＴＳＮＡの量を選択できるように、明確な量のニコチンおよび／またはＴＳＮＡを有するタバコ製品を、便利なサイズで利用できるようになるであろう（たとえば、シガーの箱、シガレットのパック、嗅ぎタバコの缶、および噛みタバコの小袋ひねり）。本明細書に記載の教示を使用して様々な低ニコチン／低ＴＳＮＡタバコブレンドを得る方法は多く、以下の説明は当業者を１つの可能なアプローチに誘導することのみを目的とする。
【００８８】
低ニコチン／ＴＳＮＡ２５％のブレンドである、ステップ１タバコ製品を得るために、およそ０ｐｐｍのニコチン／ＴＳＮＡタバコから作製されたタバコを、従来のバレータバコ、火力乾燥タバコ、または東洋タバコと、それぞれ２５％／７５％比で混合して、２２，５００ｐｐｍのニコチンおよび６，０００ｐｐｂのＴＳＮＡを有するバレータバコ製品、１５，０００ｐｐｍのニコチンおよび２２５ｐｐｂのＴＳＮＡを有する火力乾燥タバコ製品、および７，５００ｐｐｍのニコチンおよび７５ｐｐｂのＴＳＮＡを有する東洋タバコ製品を得ることができる。同様に、低ニコチン／ＴＳＮＡ５０％のブレンドであるステップ２製品を得るために、およそ０ｐｐｍのニコチン／ＴＳＮＡタバコから作製されたタバコを、従来のバレータバコ、火力乾燥タバコ、または東洋タバコと、それぞれ５０％／５０％比で混合して、１５，０００ｐｐｍのニコチンおよび４，０００ｐｐｂのＴＳＮＡを有するＢｕｒｌｙタバコ製品、１０，０００ｐｐｍのニコチンおよび１５０ｐｐｂのＴＳＮＡを有する火力乾燥タバコ製品、および５０００ｐｐｍのニコチンおよび５０ｐｐｂのＴＳＮＡを有する東洋タバコ製品を得ることができる。さらに、７５％／２５％の低ニコチン／ＴＳＮＡブレンドであるステップ３の製品を得るために、およそ０ｐｐｍのニコチン／ＴＳＮＡタバコから作製されたタバコを、従来のバレータバコ、火力乾燥タバコ、または東洋タバコと、それぞれ７５％／２５％比で混合して、７，５００ｐｐｍのニコチンおよび２，０００ｐｐｂのＴＳＮＡを有するＢｕｒｌｙタバコ製品、５，０００ｐｐｍのニコチンおよび７５ｐｐｂのＴＳＮＡを有するＦｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ製品、および２，５００ｐｐｍのニコチンおよび２５ｐｐｂのＴＳＮＡを有するＯｒｉｅｎｔａｌ製品を得ることができる。
【００８９】
タバコ製品は、多くの場合、世界の多くの異なる地域で、様々な栽培条件で栽培された、多くの異なるタイプのブレンドであることを、よく理解すべきである。結果として、ニコチンおよびＴＳＮＡの量は、農産物ごとに異なる。それにもかかわらず、従来の技術を使用することによって、所望のブレンドを作るのに使用する農産物当たりのニコチンおよびＴＳＮＡの平均量を、容易に決定することができる。ブレンドを構成するタバコの各タイプの量を調節することによって、熟練者は、ニコチンおよび／またはＴＳＮＡの量を、他の考慮すべき事項、たとえば外観、風味、および喫煙適性等と調和させることができる。この方式で、様々なレベルのニコチンおよび／またはニトロソアミン、ならびに外観、風味および喫煙適性を有する様々なタイプのタバコ製品を作ることができる。
【００９０】
前述は、本発明を説明するものであって、本発明を制限するものと考えてはならない。本発明は、請求の範囲、および中に含まれるべき請求の範囲の均等物によって規定される。本明細書に引用した全ての参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニコチン生合成につながる生合成経路を示す図である。Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２により制御されることが判明している酵素活性は、ＱＰＴａｓｅ（キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ）およびＰＭＴａｓｅ（腐敗メチル−トランスフェラーゼ）である。ＱＰＴａｓｅおよびＰＭＴａｓｅは、ニコチン生合成における律速酵素ステップであり、従って、ニコチンレベルはＱＰＴａｓｅ活性およびＰＭＴａｓｅ活性に正比例する。
【図２】ＮｔＱＰＴ１遺伝子およびＮｔＱＰＴ１プロモーターｕｉｄＡキメラの図式による表示である。転写開始点を（＋１）で示し、矢印はＮｔＱＰＴ１転写物を示す。エキソン１０個を、平行線模様をつけた棒として示す。プロモーターの欠失シリーズも、プロモーターの５’末端から切頭された中実の棒として示す。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする、ｕｉｄＡ遺伝子に融合したプロモーターフラグメントのサイズを、キロ塩基対（ｋｂ）（すなわちΔ２．０、Δ１．４、等）で示す。キメラＮｔＱＰＴ１プロモーターｕｉｄＡ融合体を、ｐＢＩ１０１にクローニングした。
【図３】ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ　３５Ｓ）、プロモーターレスＧＵＳ（ｐＢＩ１０１）、およびＧＵＳに融合したＴｏｂＲＤ２（ＮｔＱＰＴ１をコードする遺伝子）プロモーターの５’ネステッド欠失を担持するトランスジェニックタバコ植物の、根、葉、および茎におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示す図である。ｕｉｄＡ遺伝子に融合したプロモーターフラグメントのサイズを、キロ塩基対（ｋｂ）で示す（すなわちΔ２．０、Δ１．４、等）。各構築物について、少なくとも２０の独立した形質転換体を分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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