(57)【要約】本発明は、可変外部コアオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、リポ多糖の保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含んでなるリポ多糖部分、およびそれから得られる、インフルエンザ菌株に対して交差反応性を有するワクチンに関する。本発明はまた、上記の部分を得るのに有用な、インフルエンザ菌におけるリポ多糖（ＬＰＳ）発現のための生合成機構における所定の突然変異に関する。本発明はまた、広範な病原性インフルエンザ菌株に対して異種免疫応答を誘導するため、このようにして得られた変異株由来のＬＰＳの結合体を使用することに関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ菌のコアリポ多糖を含んでなる、細菌感染の予防用ワクチンに関する。リポ多糖部分は、可変外部コアオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、リポ多糖の保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含んでなる。
2004506086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変外部コアオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、リポ多糖の保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含んでなる、リポ多糖部分。
【請求項２】
以下の構造を有するリポ多糖のトリヘプトシル内部コア部分を含んでなる、リポ多糖部分。
【請求項３】
ＨｅｐＩＩが、その６位において、Ｐｅｔｎまたはこれと機能的に同等なものにより置換されているものである、請求項１または２に記載のリポ多糖部分。
【請求項４】
哺乳類組織との交差反応性を有するオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポ多糖部分。
【請求項５】
ヒト組織抗原を模倣するオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポ多糖部分。
【請求項６】
Ｏ−アシルが、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリヘプトシル内部コア部分内のいずれかの位置で置換されているものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリ多糖部分。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ多糖部分を含んでなる、動物宿主においてインフルエンザ菌により引き起こされる疾病に対する防御を与えるための免疫原組成物。
【請求項８】
結合ワクチンである、請求項７に記載の免疫原組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ多糖部分を含んでなるインフルエンザ菌株を得るための、インフルエンザ菌においてリポ多糖を産生する生合成経路中の少なくとも一つの遺伝子の使用。
【請求項１０】
インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を誘導するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ多糖部分を含んでなる少なくとも一つの免疫原性エピトープの使用。
【請求項１１】
インフルエンザ菌が非定型インフルエンザ菌である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
インフルエンザ菌との交差反応性を有し、かつ請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ多糖部分によって誘導される、機能性抗体。
【請求項１３】
インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を製造する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ多糖部分に対する抗体を作製し、
（ｂ）複数のインフルエンザ菌株に対して前記抗体を試験し、そして
（ｃ）交差反応性を有する抗体を選択する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１４】
インフルエンザ菌が非定型インフルエンザ菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
インフルエンザ菌の感染に起因する疾病に対して宿主を免疫化する方法であって、免疫上有効量の請求項６または７に記載の免疫原組成物を宿主に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１６】
インフルエンザ菌が非定型インフルエンザ菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病が、中耳炎、髄膜炎、肺炎および気道感染症から選択されるものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるリポ多糖（ＬＰＳ）の発現の生合成機構における所定の突然変異に関する。本発明はまた、広範な病原性インフルエンザ菌株に対して異種免疫応答を誘導するため、このようにして得られた変異株由来のＬＰＳ結合体を使用することに関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ菌のコアリポ多糖を含んでなる、細菌感染の予防用ワクチンに関する。
【０００２】
【発明の背景】
インフルエンザ菌は世界的に主要な病原体である。６種類の莢膜血清型（「ａ」〜「ｆ」）と不確定数の無莢膜（非定型 （ｎｏｎ−ｔｙｐｅａｂｌｅ））株のインフルエンザ菌が認められている。ｂ型莢膜株は髄膜炎や肺炎などの侵襲性疾患に関与し、一方で、非定型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）は小児の中耳炎や成人の気道感染症の主たる原因となる。中耳炎は、米国の小児科外来において最も頻度の高い一般的な小児疾患である（Ｓｔｏｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｓｕｐｐｌ． ８： Ｓ１１−Ｓ１４， １９８９）。
【０００３】
ＮＴＨｉ疾患のワクチンの開発は、防御免疫を付与する抗原が分かっていないため、困難であるとされている。ＮＴＨｉワクチンの開発の努力においては、外膜タンパク質や線毛（ｐｉｌｉ ｏｒ ｆｉｍｂｒｉａ）などの細胞表面抗原に焦点が当てられてきた（Ｋｙｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６３：２９３１−２９４０， １９９５； Ｄｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ．， ２３１−３９， １９９５）。
【０００４】
分子遺伝学、分子構造解析および免疫化学の近年の進歩により有力な手段がもたらされ、これにより候補ワクチン抗原としての炭水化物構造の同定が可能となった。
【０００５】
グラム陰性菌は、タンパク質、リポタンパク質、リン脂質および糖脂質などの成分からなる外膜を有する。糖脂質は主として内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）からなっている。ＬＰＳは、ａ）リン酸基および長鎖脂肪酸でエステル結合およびアミド結合により置換されたグルコサミン二糖からなるリピドＡ部分；ｂ）八炭糖、Ｋｄｏ（ケトデオキシオクトン酸）によってリピドＡに結合し、さらにはヘプトース、グルコース、ガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミンからなるコア多糖；および、場合により、ｃ）細菌の属および種によってマンノース、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−ラムノース、およびジデオキシヘキソース（アベクオース、コリトース、チベロース、パラトース、トレハロース）を含んでいてもよいオリゴ糖繰り返し単位からなるＯ−特有側鎖、からなる分子である。Ｏ−側鎖の繰り返しを有しないＬＰＳは、短鎖リポ多糖またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）と呼ばれることがある。本明細書では、リポ多糖（またはＬＰＳ）との用語には、短鎖リポ多糖およびリポオリゴ糖（ＬＯＳ）が含まれる。
【０００６】
グラム陰性菌の主要抗原決定基は、ＬＰＳの複雑な炭水化物構造に帰するものと考えられている。主として１以上の糖組成、オリゴ糖の配列、オリゴ糖の単量体単位間の結合およびオリゴ糖自体の間の結合、ならびにオリゴ糖（特に末端オリゴ糖）の置換／修飾、における多様性のために、これらの炭水化物構造は、グラム陰性菌の同属異種間であっても著しく異なる。このため、インフルエンザ菌に対する（特にＮＴＨｉに対する）広範な効果を有するワクチンの開発は成功に至っていない。
【０００７】
ＬＰＳは、抗原決定基（「エピトープ」）がその炭水化物構造に帰するために、ワクチン免疫原としての可能性を有する細菌成分である。しかし、ＬＰＳの化学的性質により、ＬＰＳはワクチン製剤において使用しがたいものと考えられる。すなわち、ＬＰＳでの能動免疫は、数種の動物において、リピドＡ部分に内在する毒性のために許容されないものである。血流中のＬＰＳのリピドＡによって（直接的または間接的に）誘発される病態生理作用としては、発熱、白血球減少、白血球増加、シュワルツマン反応、汎発性血管内凝固症候群、流産、および多用量ではショックや死が挙げられる。
【０００８】
莢膜多糖類を含んでなるワクチンは、同種被包細菌によって引き起こされるヒト疾病の防止に効果的であることが確認されている。これらの炭水化物抗原は、Ｔ細胞依存性の応答がないために、ヒトの免疫原としては不十分である場合が多い。しかし、この特異的な多糖抗原を好適なタンパク質担体に結合させると、この多糖単独には応答しない患者においても炭水化物抗原の免疫原性を著しく向上させることができる。ｂ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）の特異的莢膜多糖に基づく糖結合ワクチン、例えばＰｒｏＨｉＢｉｔ（商標）およびＡｃｔＨｉｂ（商標）は、幼児の侵襲性Ｈｉｂ疾患を良好に抑制できることがすでに分かっている。莢膜多糖−タンパク質結合Ｈｉｂワクチンは、ｂ型莢膜を有するインフルエンザ菌株によって引き起こされる感染に対して防御するだけなので、インフルエンザ菌の無莢膜（非定型）株によって引き起こされる疾病（すなわちＮＴＨｉによって引き起こされる疾病）には防御を示さない。
【０００９】
リポ多糖（ＬＰＳ）は主要なＮＴＨｉ細胞表面抗原である。インフルエンザ菌のＬＰＳは、リピドＡとオリゴ糖（ＯＳ）成分を含むことが分かっているに過ぎない。上述のように、ＬＰＳのリピドＡ成分は有毒であることから、免疫担体と結合させる前に解毒しなければならない。
【００１０】
Ｂａｒｅｎｋａｍｐら（Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ．， ９：３３３−３３９， １９９０）によれば、ＬＯＳがＮＴＨｉに対する殺菌抗体の産生を刺激することが実証されている。ＭｃＧｅｈｅｅら（Ａｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １：２０１−２１０， １９８９）によれば、ＮＴＨｉ由来のＬＯＳに対するモノクローナル抗体でマウスを受動免疫したところ、ＮＴＨｉの肺クリアランスが増強されることが示されている。
【００１１】
Ｇｒｅｅｎら（Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ９４：１２５−１２９， １９９４）によれば、ＮＴＨｉオリゴ糖と無毒の変異型ジフテリアタンパク質ＣＲＭ．ｓｕｂ．１９７との結合体を含んでなるＮＴＨｉワクチンが開示されている。ＬＯＳからは、酸で処理した後、生じたＯＳをアジピン酸ヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導体化してＣＲＭ．ｓｕｂ．１９７と結合することでリピドＡ部分が除去されている。ＬＯＳがＮＴＨｉに対する殺菌抗体の産生を刺激するというＢａｒｅｎｋａｍｐらによる知見とは異なり、Ｇｒｅｅｎらによる前記結合体は、マウスに注射しても免疫原性が低いものと判定された。さらにまた、これらの結合体はＮＴＨｉに対する殺菌抗体を誘導することはなかった。
【００１２】
Ｇｕらの文献（米国特許第６，２０７，１５７号明細書）は、エステル結合した脂肪酸を除去することによる、単離されたＮＴＨｉＬＯＳの解毒に関するものであって、これにより、前記ＮＴＨｉＬＯＳはワクチン製剤に好適なものとなりうるというものである。しかし、Ｇｕらの文献には、ＮＴＨｉＬＯＳに対するその他の修飾、またはその望ましい化学属性については記載されていない。
【００１３】
インフルエンザ菌によって引き起こされる感染に対して広範な防御をもたらすのに使用可能なワクチンは、現在のところ存在しない。従って、インフルエンザ菌、特にＮＴＨｉに対して広範な効果を有するワクチンが必要とされている。
【００１４】
ワクチン開発を目的として抗原を用いるためには、４つの必須基準を満たさなければならない。つまり、免疫原性エピトープは、
１．遺伝学的に安定であり、
２．複数の種にわたり、総ての臨床上関連のある株において保存されており、
３．（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて）宿主の免疫機構に作用することができ、そして、
４．ｉｎ ｖｉｖｏで防御抗体を誘導可能である
必要がある。
【００１５】
これらの基準を満たすインフルエンザ菌、特にＮＴＨｉのＬＰＳ炭水化物エピトープを同定する必要がある。
【００１６】
【発明の概要】
本発明は、インフルエンザ菌リポ多糖（ＬＰＳ）由来のＢ細胞活性化分子をもたらす免疫に関し、これらの分子はリポ多糖の保存された内部コアオリゴ糖部分の１以上のエピトープを含んでなる。本発明は、病原体として単離されているインフルエンザ菌株によって発現されるＬＰＳの代表である、これらエピトープを同定および特性決定する方法に関する。本発明はまた、これらエピトープを、合成および遺伝子操作技術の双方によって得る方法に関する。さらに、本発明は、これらエピトープを好適な担体とともに含んでなり、所望によりリポソーム製剤中に含んでなる、分子結合体を製造する方法に関する。
【００１７】
一つの態様によれば、本発明により、可変外部コアオリゴ糖鎖伸長部を実質的に含まない、リポ多糖の保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含んでなるリポ多糖部分が提供される。
【００１８】
他の態様によれば、本発明により、図Ａの構造を有するリポ多糖のトリヘプトシル内部コア部分を含んでなるリポ多糖部分が提供される。
【００１９】
他の態様によれば、本発明により、上記のリポ多糖部分を含んでなる、動物宿主においてインフルエンザ菌により引き起こされる疾病に対する防御を与えるための免疫原組成物が提供される。
【００２０】
他の態様によれば、本発明により、上記のリポ多糖を含んでなるインフルエンザ菌株を得るための、インフルエンザ菌においてリポ多糖を産生する生合成経路中の少なくとも一つの遺伝子の使用が提供される。
【００２１】
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を誘導するための、上記のリポ多糖部分を含んでなる少なくとも一つの免疫原性エピトープの使用が提供される。
【００２２】
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌との交差反応性を有し、かつ上記のリポ多糖部分によって誘導される機能性抗体が提供される。
【００２３】
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌に対する機能性交差反応性抗体を製造する方法であって、（ａ）上記のリポ多糖部分に対する抗体を作製し、（ｂ）複数のインフルエンザ菌株に対して前記抗体を試験し、そして（ｃ）交差反応性を有する抗体を選択することを含んでなる方法が提供される。
【００２４】
他の態様によれば、本発明により、インフルエンザ菌の感染に起因する疾病に対して宿主を免疫化する方法であって、免疫上有効量の上記免疫原組成物を宿主に投与することを含んでなる方法が提供される。
【００２５】
【発明の具体的説明】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、インフルエンザ菌の必須かつ特徴的な表面露出抗原である（上述のように、本明細書においてリポ多糖およびＬＰＳは短鎖リポ多糖およびリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を含む）。インフルエンザ菌株は低分子量ＬＰＳの不均一な集団を発現し、これにより様々なオリゴ糖エピトープ間で広範な抗原多様性を示しうる。本明細書中に記載されるインフルエンザ菌のＬＰＳ炭水化物構造により、ヒト免疫系に適切な形態で、例えばタンパク質結合体またはリポソーム製剤として供された場合における防御抗原の供給源が提供される。ある種のＮＴＨｉＬＰＳに対する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて殺菌活性を示している（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１２６４−１２７２）。最近の研究（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第６，２０７，１５７号明細書）では、動物モデルにおいて、ＬＰＳに基づく結合体での免疫化により、同種株に起因するＮＴＨｉ誘導性中耳炎の発病率を引き下げることができることが示されている。本発明者らの研究では、驚くべきことに、遺伝学的かつ生理学的に安定であり、臨床上関連のある一定範囲の株にわたって保存されており、しかも宿主のクリアランス機構に作用しうるオリゴ糖エピトープを有する表面発現性の炭水化物抗原が確認されたことから、ＬＰＳはワクチン候補として有用であることが分かった。
【００２６】
インフルエンザＬＰＳ分子の炭水化物領域は、宿主免疫応答により認識される標的となる。特定のオリゴ糖エピトープの発現は、インフルエンザ菌感染の病因に関与することが分かっている。インフルエンザ菌ＬＰＳの生物学的性質および細菌毒性におけるその役割を理解するには、構造の決定が重要である。インフルエンザ菌ＬＰＳは、可変オリゴ糖部分と膜固定リピドＡ成分からなる異種分子混合物を含んでなる（Ｚａｍｚｅ， Ｓ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９８７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３３， １４３３−１４５１）。本明細書に記載の実験をもとに、リン酸化されたケトデオキシオクトン酸残基を介してリピドＡ成分と結合している保存されたトリヘプトシル内部コア部分からなるインフルエンザ菌ＬＰＳの構造モデルを作成した。本発明者らがこれまでに検討した総ての株において、このトリヘプトシル部分は以下の構造要素：
Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１（２）−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−［（−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１（４）］−（１（３）−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１（５）−Ｋｄｏ
から構成されていた。さらに、本発明者らがこれまでに検討した総ての株では、この１，２−結合したヘプトース残基（ＨｅｐＩＩ）は、６位においてホスホエタノールアミン部分で置換されている。
【００２７】
内部コア領域内のヘプトース残基の各々は、ヘキソース含有オリゴ糖鎖の伸長または非炭水化物置換基の結合のための部位となりうる。公表されているデータ（Ｈ． Ｍａｓｏｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６： ２０９１−２１０３， １９９７； Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ−， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１： １７１−１８０， １９９９）によれば、この保存された内部コア部分の末端のヘプトース残基（ＨｅｐＩＩＩ）がＯ−２位で（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基または（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基により置換されうることが示されている。また、ＨｅｐＩＩも置換されることがあり、特に、その３位において（−Ｄ−グルコース残基または置換された（−Ｄ−グルコース残基によって置換されることがある。隣接ヘプトース残基（ＨｅｐＩ）と１，４−結合している（−Ｄ−グルコース残基は、それ自体、（−Ｄ−グルコース、（−Ｄ−ガラクトース、ヘプトース（例えば、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよびＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースなど）またはこれらのオリゴ糖により、さらに置換されることがある。これらの糖残基の他、オリゴ糖鎖伸長部は（−Ｄ−ガラクトース、（−Ｄ−グルコサミン、（−Ｄ−ガラクトサミン、およびｓ−Ｎ−アセチルノイライミン酸（ａｃｅｔｌｙｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（シアル酸）を含むこともある。
【００２８】
置換度およびトリヘプトシル部分からの鎖の伸長は、株内また株間で異なる（Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ，Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１− １８０）。遊離リン酸基（Ｐ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥｔｎ）、ピロホスホエタノールアミン（ＰＰＥｔｎ）、およびホスホコリン（ＰＣｈｏ）などのリン酸基含有置換基は、これらの分子の構造多様性に関与している。さらにまた、エステル置換基（例えば、Ｏ−アセチルおよびＯ−グリシル）もＬＰＳの構造多様性に関与している。その他、シアル酸残基の付加など、ＬＰＳの他の修飾も可能である。シアリル化オリゴ糖は哺乳類組織で一般に見られ、この修飾はヒト組織構造の模倣性を高めるものと考えられている。
【００２９】
ｂ型ＲＭ７００４株の所定の変異体（Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｍ．， Ｈｅｇｅｄｕｓ， Ｏ．Ｅ．， Ｂｏｒｒｅｌｌｉ， Ｓ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ．， Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｗ．， Ｍａｓｋｅｌｌ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９３） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２４６， ３１９−３３０； Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ． （１９９５） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２７２， ２１３−２２４）では、ｂ型ＲＭ１１８株由来の形質転換変異体（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ−．， Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， ａｎｄ Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ． （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３， ７０１−７０７； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ａｌｖｅｌｉｕｓ， Ｇ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５， １０６７−１０７４）， およびｂ型Ａ２株のトランスポゾン変異体（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ．Ｊ．， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ， Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｔ．Ｊ．， Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｂ．Ｗ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５， ５９３７−５９４７） 、に由来するＬＰＳの詳細な構造研究により、インフルエンザ菌ＬＰＳに共通するヘプトース含有三糖内部コア部分が存在するというさらなる証拠が提示されている。本発明者ら（Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１：１７１−１８０， １９９９）は、インフルエンザ菌株ＲＭ１１８（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．，Ｍａｓｏｕｄ，．Ｈ．，．Ｍａｒｔｉｎ，．．’Ａ．’；．．Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１，１７１−１８０）、完全なゲノム配列が決定されている株（Ｒｄ）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ．， Ａｄａｍｓ，． Ｍ．Ｄ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｏ．， Ｃｌａｙｔｏｎ， Ｒ．Ａ．， Ｋｉｒｋｎｅｓｓ， Ｅ．Ｆ．， Ｋｅｒｌａｖａｇｅ， Ａ．Ｒ．， Ｂｕｔｔ， Ｃ．Ｊ， −Ｔｏｍｂ， Ｊ−Ｆ．， Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ａ．， Ｍｅｒｒｉｃｋ， Ｊ．Ｍ．， ＭｃＫｅｎｎｅｙ， Ｋ．， Ｓｕｔｔｏｎ， Ｇ．， ＦｉｔｚＨｕｇｈ， Ｗ．， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｃ．， Ｇｏｃａｙｎｅ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｊ．，Ｓｈｉｒｌｅｙ， Ｒ．， Ｌｉｕ， Ｌ− Ｉ．， Ｇｌｏｄｅｋ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｗｅｉｄｍａｎ， Ｊ．Ｆ．， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｃ．Ａ．， Ｓｐｒｉｇｓ， Ｔ．， Ｈｅｄｂｌｏｍ， Ｅ．， Ｃｏｔｔｏｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｕｔｔｅｒｂａｃｋ， Ｔ．Ｒ．， Ｈａｎｎａ， Ｍ．Ｃ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｄ．Ｔ．， Ｓａｕｄｅｋ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｒａｎｄｏｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｆｉｎｅ， Ｌ．Ｄ．， Ｆｒｉｔｃｈｍａｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｈｒｍａｎｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｇｅｏｇｈａｇｅｎ， Ｎ．Ｓ．Ｍ．， Ｇｎｅｈｍ， Ｃ．Ｌ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｌ．Ａ．， Ｓｍａｌｌ， Ｋ．Ｖ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｃ．Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｈ．Ｏ．， ａｎｄ Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９， ４９６−５１２）に由来する、グロボテトラオース（（−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１（３）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）含有ＬＰＳの構造を報告している。この研究では、３つの主要なＬＰＳグリコフォーム集団が同定され、これらは総てＫｄｏ部分と結合しているＨｅｐ（ＨｅｐＩ）のＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ基を含んでいたが、内部コア成分の末端Ｈｅｐ（ＨｅｐＩＩＩ）のオリゴ糖鎖の長さは異なっていた。組立の完全なグロボテトラオース側鎖を発現するＬＰＳのグリコフォームの他、グロボシド（（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびラクトース（（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）を含む、順次末端切断されたグリコフォームも同定された（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。
【００３０】
インフルエンザ菌株Ｒｄの完全ゲノム配列が得られたことにより、代表的なＨｉ株において複数のＬＰＳ生合成遺伝子座に関する包括的な研究が促された。
【００３１】
非定型株はＦｉｎｎｉｓｈ Ｏｔｉｔｉｓ Ｍｅｄｉａ Ｃｏｈｏｒｔ Ｓｔｕｄｙの一環としてＥｓｋｏｌａ教授から入手したものであり、主として小児の内耳から得た単離物である。これらの株については、Ｄ．Ｗ． Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３： ６７９−７９２， １９９９に詳しく記載されている。ボストンのＲｉｃｈａｒｄ Ｇｏｋｄｓｔｅｉｎからも１０２のＮＴＨｉ中耳炎株を送ってもらい、３５年にわたって世界中から入手した６００のインフルエンザ菌莢膜株およびＮＴＨｉ株のリボタイピング分析による多様性研究に含めた。リボタイピングの結果から樹状系統図を作成したところ、ＮＴＨｉ中耳炎単離物は描かれた分枝部のほとんど総てに存在することが分かった。樹状系統図の分枝部から２５の代表的な系統を選んだところ、インフルエンザ菌の種に関して知られている多様性を表していた。この２５系統には、関連の深い単離物の多様性を評価するために同じクラスターから選択したいくつかのものも含まれる。
【００３２】
推定されている多くの遺伝子機能は、適当な変異株からのＬＰＳ構造解析により、ＬＰＳの合成における特定の工程に関連づけられている（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。グロボテトラオース構造の発現の遺伝学的基礎はこれまでには報告されていない。
【００３３】
実施例１に記載のように、本発明者らは、構造フィンガープリント法を用い、インフルエンザ菌株ＲＭ１１８のＬＰＳ生合成遺伝子の一連の規定された変異体から得られたＬＰＳの構造を決定し、比較した（ＲＭ１１８株についての説明はＲｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９， 上記を参照）。特定の遺伝子を不活性化した株に由来するＬＰＳを調べることにより、本発明者らは、ＬＰＳ分子の内部コア領域の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼの同定につながる決定的な証拠を提示する。本発明者らはまた、さらに後述するように、シアリル化ラクトース側鎖の構築に関与する遺伝子も同定した。さらにまた、それぞれグロボトリオース構造およびグロボテトラオース構造を与えるための（−２，３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ（ｌｉｃ３Ａ）、（−１，４−結合Ｇａｌｐ（ｌｇｔＣ）および（−１，３−結合ＧａｌｐＮＡｃ（ｌｇｔＤ）の付加に関与する遺伝子のトランスフェラーゼ機能を、合成アクセプターを用いた酵素アッセイにより明確に決定した。これはインフルエンザ菌株のＬＰＳオリゴ糖部分の生合成に関する遺伝的青写真を特定するはじめての研究である。
【００３４】
本発明者らによるインフルエンザ菌ＬＰＳ内部コアの研究では、リピドＡに付加されている最初の糖であるＫｄｏを除去する試みは、おそらくはＫｄｏが完全なリピドＡ合成に必要であって、細胞の生存に不可欠なものと思われることから、ことごとく失敗した。ｋｄｔＡのＫｄｏトランスフェラーゼ機能は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での相補実験により実証されている（Ｗｈｉｔｅ， Ｋ．Ａ．， ａｎｄ Ｒａｅｔｚ， Ｃ．Ｒ．Ｈ． （１９９８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １２， Ｌ４４）。本発明者らの研究では、ｏｐｓＸ、ｔｆａＦおよびｏｒｆＨがＫｄｏにそれぞれ第一、第二および第三のヘプトース（ＨｅｐＩ、ＨｅｐＩＩおよびＨｅｐＩＩＩ）を付加して内部コアを形成する酵素をコードする遺伝子であることが示される。ｏｐｓＸは腸内細菌のヘプトシルトランスフェラーゼとある程度の相同性を持っており（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ． Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ． Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）、Ｋｄｏに対するＨｅｐＩの付加を担う遺伝子に当たる。ｒｆａＦ変異体は機能的ｏｐｓＸ遺伝子を有し、そのＬＰＳはＫｄｏ−リピドＡに結合したＨｅｐを一つだけ有する。ＲＭ１１８（Ｒｄ）のｒｆａＦ遺伝子は、他のヘプトシルトランスフェラーゼと相同性を有する（Ａｌｌｅｎ， Ａ．Ｇ．， Ｉｓｏｂｅ， Ｔ．， ａｎｄ Ｍａｓｋｅｌｌ， Ｄ．Ｊ．（１９９８） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８０， ３５−４０）。機能的ｏｐｓＸおよびｒｆａＦ遺伝子を有するＲＭ１１８ｏｒｆＨ由来のＬＰＳは２つのヘプトース残基を含んだ構造（構造１および２）を含んでいる。ＲＭ１１８ｏｐｓＸ、ｒｆａＦおよびｏｒｆＨ変異体由来のＬＰＳの構造解析に関するデータは、ｂ型株ＲＭ１５３（Ｅａｇａｎ株としても知られる）およびＲＭ７００４（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）における同じ突然変異で得られたものと一致する。ｂ型株では、ｏｐｓＸ、ｒｆａＦおよびｏｒｆＨはそれぞれＨｅｐＩ、ＨｅｐＩＩおよびＨｅｐＩＩＩトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることが提案される。
【００３５】
本発明者らは、インフルエンザ菌のＬＰＳは上記のトリヘプトシル内部コア部分を有し、その各ヘプトース残基がオリゴ糖鎖の伸長のためのポイントとなることを示した（Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。ｌｐｓＡ、ｌｉｃ２Ａ、ｌｉｃ３Ａ、ｌｇｔＣ、ｌｇｔＤおよびｌｇｔＦの各遺伝子は、オリゴ糖の伸長に関与するグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。
【００３６】
これらの結果は、ｌｐｓＡ遺伝子の産物がＨｅｐＩＩＩからのオリゴ糖鎖伸長の制御において一定の役割を果たしていることを示す。ｌｐｓＡ遺伝子の突然変異により、ＨｅｐＩＩＩのオリゴ糖鎖伸長部を欠いている末端切断型ＬＰＳがもたらされる。ＲＭ１１８ｌｐｓＡに由来するＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析では、主なＬＰＳ種（構造２）としての単一のヘキソース残基を含むＰｃｈｏ含有グリコフォームを示し、これにより、ＨｅｐＩは、ＨｅｐＩＩＩからのヘキソース伸長がなくとも置換可能であることが確認された。機能的ｌｐｓＡ遺伝子を含むｌｉｃ２Ａ、ｌｇｃＣおよびｌｇｃＤ変異体は、（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基を１，２−結合で付加してＨｅｐＩＩＩからの鎖の伸長を開始させることができる（表４）。ｌｐｓＡは、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の相同体であり（Ｐｏｔｔｅｒ， Ｍ．Ｄ． ａｎｄ Ｌｏ， Ｒ．Ｙ． （１９９５） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １２９， ７５−８１）、このタンパク質はそれぞれヘモフィルス属およびナイセリア属のＬｉｃ２ＡおよびＬｇｔＢに分類されるガラクトシルトランスフェラーゼ群と相同性を有する。ＲＭ１５３株では、ｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳが第三のヘプトースからの鎖の伸長を欠いていることも分かった（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。さらに、本発明者らは、数種のＮＴＨｉ株におけるＬｐｓＡ変異体がＨｅｐＩＩＩからの鎖の伸長を欠いていることを確認した。このように、ＬｐｓＡはインフルエンザ菌ＬＰＳの生合成においてＨｅｐＩＩＩに最初の糖を付加するためのトランスフェラーゼである。
【００３７】
ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ変異体は主要なＬＰＳ種としてのＰｃｈｏ含有Ｈｅｘ２グリコフォーム（構造４）を示し、機能的ｌｉｃ２Ａ遺伝子を含むＲＭ１１８ｌｇｔＣはＨｅｐＩＩＩにラクトース側鎖を含むＬＰＳ（構造５）を合成する。このことは、ＨｅｐＩＩＩに結合している末端（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基へ（−Ｄ−Ｇａｌｐ単位を１，４結合で付加することに対するｌｉｃ２Ａ遺伝子の関与と一致する。ｂ型株、ＲＭ１５３およびＲＭ７００４のｌｉｃ２Ａ相同体は、ジガラクトシド含有ＰＫエピトープ（構造（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐを有するグロボシド三糖）の発現に関与することが示されている。このエピトープの相変異発現におけるｌｉｃ２Ａの役割が既に実証されている（Ｈｉｇｈ， Ｎ．Ｊ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ−Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９，１２７５−１２８２）。他のデータバンクの配列との相同性比較によれば、Ｌｉｃ２Ａの（−ガラクトシルトランスフェラーゼとしての機能が支持される。重要なことは、それがナイセリアのＬｇｔＢおよびＬｇｔＥタンパク質（いずれもガラクトシルトランスフェラーゼ）と有意な相同性を有するということである（Ｗａｋａｒｓｈｕｋ， Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７１， １９１６６−１９１７）。
【００３８】
ｌｇｔＣに変異を有するＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造解析により、この遺伝子の（−ガラクトシルトランスフェラーゼ機能を裏付ける（−Ｄ−Ｇａｌｐの欠損が確認された。髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）におけるこの遺伝子の相同体が（−ガラクトシルトランスフェラーゼであることが実証されている（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ， Ｅ．Ｃ． （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｈｅｄ． １８０， ２１８１−２１９０； Ｗｈｉｔｅ， Ｋ．Ａ．， ａｎｄ Ｒａｅｔｚ， Ｃ．Ｒ．Ｈ． （１９９８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １２， Ｌ４４； Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．Ｗ．， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ａ．Ｍ．， Ｗａｔｓｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ａｎｄ． Ｙｏｕｎｇ， Ｎ．Ｍ． １９９８， Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１： ２９５−３０２； Ｗａｋａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．１９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。インフルエンザ菌のｌｇｔＣは、ちょうどリーディングフレーム（４４）の５’末端内に会合したテトラヌクレオチドリピート（５’−ＧＡＣＡ−３’）を有することから、ＲＭ１１８ＬＰＳにおけるオリゴ糖の変異表現型に関与している。これに対応して、機能的ｌｇｔＣ遺伝子を含むｌｇｔＤ変異体およびその親株は、ラクトースエピトープの末端（−Ｄ−Ｇａｌｐに１，４結合で（−Ｄ−Ｇａｌｐを付加することができる（構造６）。ＬｇｔＣの機能は、組換え型ＬｇｔＣタンパク質と合成ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃアクセプターを用いて（−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を実証することにより確認されている。その結果、ｌｇｔＣ遺伝子は、ＲＭ１１８　Ｈｅｘ４　ＬＰＳグリコフォーム（図６）の（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ合成の特異的（−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードすることになる。
【００３９】
インフルエンザ菌ｌｇｔＤ遺伝子は、２つのナイセリア遺伝子、ｌｇｔＡおよびｌｇｔＤの相同体であり、これらのナイセリア遺伝子は淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＬＰＳにそれぞれＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃを付加する（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ， Ｅ．Ｃ． （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８０， ２１８１−２１９０）。ｌｇｔＡ遺伝子産物は髄膜炎菌のグリコシルトランスフェラーゼであることが実証されている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １９１６６−１９１７）。ナイセリアのｌｇｔＡとｌｇｔＤ遺伝子間には有意な相同性があり、ＲＭ１１８　ＨＩ１５７８はデータベースにおいて淋菌のｌｇｔＤ遺伝子と最良の一致を示す。ＲＭ１１８およびＲＭ１１８ｌｇｔＤ変異体の抽出物を用いた酵素アッセイでは、（−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃトランスフェラーゼ活性の存在が確認された。機能的ｌｇｔＤを含む親株ＲＭ１１８は完全なグロボテトラオース単位を合成することができ、このことは末端（−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃの付加におけるその役割を示している。このｌｇｔＤ遺伝子はこれまでにも研究されているが（６ではｌｇｔＡと呼ばれる）、ｂ型株ＲＭ１５３およびＲＭ７００４に存在するということは見出されていない。これに対応して、ＲＭ１５３株によって合成されるＬＰＳはＧａｌＮＡｃ部分を含まない（Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３）。多くのＮＴＨｉ株はＬｇｔＤ遺伝子を含むことが分かっており、これらの株のＬＰＳオリゴ糖側鎖はＧａｌＮＡｃ部分を含むことが分かっている。
【００４０】
グロボテトラオース（ｌｇｔＤ）およびグロボシド（ｌｇｔＣ）オリゴ糖側鎖の末端残基の付加に関与する遺伝子によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ活性は適当な合成アクセプターを用いた酵素アッセイで確認することができたが、ラクトース部分の合成に関与する遺伝子（ｌｉｃ２ＡおよびｌｐｓＡ）のトランスフェラーゼ活性をアッセイする実験は上手くいかなかったことは注目すべきことである。後者の二つの酵素は、アクセプター糖が内部コアヘ結合して、それにより単純な合成ＦＣＨＡＳＥ−グリコシドアクセプターの認識を排除する必要がある、よりストリンジェントな特異性を有する可能性がある。
【００４１】
ＲＭ１１８ＬＰＳ生合成の研究に利用できる最初の遺伝子セットおよび変異株を特定しても、ＨｅｐＩへの（−Ｄ−Ｇｌｃｐ単位の付加を担う明らかな候補は得られなかった。他の生物のＬＰＳにおいてヘプトース残基にヘキソース糖を付加する遺伝子との相同性の低い一致についても、Ｒｄ株ゲノム配列を検索することによりさらなる候補ＬＰＳ遺伝子を調べた。検索配列は、ヘプトースへのヘキソース残基の付加に関与する遺伝子であるナイセリア属のｒｆａＫおよびｌｇｔＦ遺伝子（Ｋａｈｌｅｒ， Ｃ．Ｍ．， Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｒ．Ｗ．， Ｒａｈｍａｎ， Ｍ．Ｍ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｌ．Ｅ．， ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ｄ．Ｓ． （１９９６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ６６７７−６６８４）を含むものとした。ＲＭ１１８株でｌｇｔＦ相同体が確認され、この遺伝子に変異を有する株由来のＬＰＳの分析により、ＨｅｐＩからの鎖の伸長におけるＬｇｔＦの役割が示された。ＥＳＩ−ＭＳでは、ＨｅｐＩにおいてＰｃｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐを欠き、トリヘプトシル内部コア部分のＨｅｐＩＩＩからの鎖伸長を有するグリコフォームの混合物に相当する分子イオンが示された（図３）。
【００４２】
ｌｇｔＦおよびｌｐｓＡ遺伝子はＲＭ１１８ＬＰＳのヘプトース含有内部コア単位からのヘキソース伸長にとって重要なものであり、それぞれＨｅｐＩおよびＨｅｐＩＩＩへの最初のグリコースの付加を担うグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。ＨｅｐＩおよびＨｅｐＩＩＩからの鎖伸長のプロセスは、ＲＭ１１８株のＬＰＳにおいて大きく独立したものであるようである。変異株ＲＭ１１８ｌｐｓＡは、ＨｅｐＩ由来の（−Ｄ−Ｇｌｃｐ部分を含むＬＰＳを産生する。ＲＭ１１８ｌｇｔＦ株は、ラクトースおよびグロボテトラオース鎖を含むＨｅｐＩＩＩからのオリゴ糖伸長を含む不均質なＬＰＳを産生する。ＲＭ１５３株では、ｌｐｓＡは明らかに第三のヘプトースから単一の伸長部としてガラクトースの付加を担う若干異なる役割を果たす（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．，Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。驚くべきことに、ある種の非定型株ではｌｐｓＡはＯ−２位の代わりにＯ−３位でグルコースまたはガラクトースのいずれかを付加しうることが判明した。
【００４３】
インフルエンザ菌のＬＰＳ構造の不均質性は、部分的には、総ての分子が完全に合成されるわけではないという複雑な構造の生合成における固有の多様性によるものに違いない。しかし、認められた多様性の多くは、発現が変動しうる（相変異）特定のＬＰＳ生合成遺伝子によるものであると思われる。野生型および変異型ＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造解析により、本発明者らは、はじめてインフルエンザ菌ＬＰＳジガラクトシドの重要な相変異型エピトープの合成に関与する遺伝子を確認することができた。ＲＭ１１８株では、Ｌｉｃ２ＡがＨｅｐＩＩＩからのオリゴ糖伸長部分としてのジガラクトシド（（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ）へ隣接β−Ｄ−Ｇａｌｐを、ＬｇｔＣは末端（−Ｄ−Ｇａｌｐを付加するが、ｂ型ＲＭ１５３株ではこの同じエピトープが第二のヘプトースからの末端伸長として発現する（Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３）。ｌｉｃ２ＡおよびｌｇｔＣはいずれも相変異性遺伝子であり、生物内および生物間で極めて変化に富んだエピトープを発現させる。ジガラクトシドエピトープは、本明細書に開示されるＮＴＨｉ株の多くのＬＰＳにおいて、また、ナイセリア属をはじめとする関連の細菌において発現する（Ｖｉｒｊｉ， Ｍ．， Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９０） Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐａｔｈｏｇｅｎ． ９， ４４１−４５０）。このエピトープは、免疫優性である可能性があり、その存在は宿主構造の分子模倣の可能性を与え、実験系においてインフルエンザ菌の生存に影響を及ぼしうることから、病因論上興味深いことである（Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， ａｎｄ Ｐａｎ， Ｎ． （１９９８） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０， ７６７−７７５； Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｂｉｓｃｅｒｉｃ， Ｍ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３， １１１２１−１１１２５）。
【００４４】
シアリル化されたオリゴ糖は哺乳類組織でよく見られることから、オリゴ糖のシアリル化はヒト組織構造の模倣性を高めるものと考えられている修飾の一つである。実施例１に記載のように、本発明者らは、ＮＴＨｉ３７５株、４８６株およびＲＤ株においてシアリル化されたＬＰＳを確認し、ＬＰＳ合成におけるｌｉｃ３Ａの役割を解明した（Ｄ．Ｗ． Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９：３４１−３５０， ２００１）。種の多様性の代表的なものとして２５株のＮＴＨｉを調べたところ、一つを除いて総てがシアリル化されたＬＰＳオリゴ糖鎖伸長と確認された。ＮＴＨｉ４８６などのいくつかのＮＴＨｉ株におけるｌｉｃ３Ａの突然変異は、正常なヒト血清の殺菌作用への耐性に大きな影響を持つことが実証されている。ＮＴＨｉ４８６とそのｌｉｃ３Ａ変異体に由来するＬＰＳ構造の比較からはシアリル化グリコフォーム（シアリル−ラクトース）が親株にしか存在しないことが明らかとなり、このことは、この株における血清耐性にとってのＬｉｃ３Ａの重要性を示している。インフルエンザ菌におけるＬＰＳへの荷電シアル酸残基の付加は、ＬＰＳエピトープの抗原模倣を調節するものと思われる。
【００４５】
ＬＰＳ分子のオリゴ糖部分を構成する糖残基の順序および立体化学の他、Ｐ、ＰＥｔｎおよびＰＣｈｏなどの置換基の位置、種類および頻度は、ＬＰＳ構造および生物学的機能に対して著しい影響を及ぼしうる。ｌｉｃｌ遺伝子座は、インフルエンザ菌ＬＰＳ分子へのＰＣｈｏの相変異付加に不可欠であることが示されている（Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｓｈｃｈｅｐｅｔｏｖ， Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．Ｈ， （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５，９４３−９５０； Ｌｙｓｅｎｋｏ， Ｅ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｃｏｘ， Ａ．Ｄ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ａ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋａｐｏｏｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ，Ｎ． （２０００）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５， ２３４−２４５）。ＰＣｈｏは先天的な体液性免疫に対するインフルエンザ菌の耐性に関与することが実証されている（Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， ａｎｄ Ｐａｎ， Ｎ． （１９９８） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３０， ７６７−７７５； Ｌｙｓｅｎｋｏ， Ｅ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｃｏｘ， Ａ．Ｄ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ａ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．，Ｋａｐｏｏｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５， ２３４−２４５）。Ｋｄｏのリン酸化を担うＫｄｏキナーゼをコードする遺伝子、ｋｄｋＡが同定されている（Ｗｈｉｔｅ， Ｋ．Ａ．， Ｌｉｎ， Ｓ．， Ｃｏｔｔｅｒ， Ｒ．Ｊ．， ａｎｄ Ｒａｅｔｚ， Ｃ．Ｒ．Ｈ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ３１３９１−３１４００）。この遺伝子は本発明者らがこれまでにｏｒｆＺとして研究してきたものであり、変異させた場合には幼ラットの感染モデルにおいて細菌の生存率を変化させることが示されている（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ，． Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。従って、唯一、その遺伝的制
御がまだ分かっていないコアオリゴ糖の残りの置換基が、ＨｅｐＩＩ残基の６位と化学量論的に結合している、また、ときにはＫｄｏのリン酸基と結合しているＰＥｔｎ残基である。
【００４６】
まとめると、インフルエンザ菌の主要なオリゴ糖鎖伸長部の完全な合成の遺伝的青写真が解明されたことになる。
【００４７】
本発明者らは、インフルエンザ菌で知られている多様性を代表する２５を超える株で検討を行った。本発明者らは、ＬＰＳのトリヘプトシル内部コア部分（標識ＨｅｐＩ−ＨｅｐＩＩＩ）が試験した総ての株で保存されていることを確認した。このように確定されたことにより、ＮＴＨｉなどのインフルエンザ菌に対する広範な防御をもたらすワクチンの製造に用いる、ＬＰＳの内部コア部分由来の好適なオリゴ糖の合成が可能となる。また、これによりワクチンの製造に用いるＬＰＳの内部コア部分由来の好適なオリゴ糖を合成するインフルエンザ菌株の選択および改変が可能となる。
【００４８】
表１は、同定されたインフルエンザ菌ＲｄにおけるＬＰＳの主要なグロボテトラオース含有オリゴ糖の生合成に関与する遺伝子をまとめたものである。本発明者らは、ＨｅｐＩ（ｌｇｔＦ）およびＨｅｐＩＩＩ（ｌｐｓＡ）からの鎖伸長を担う遺伝子を同定した。さらに、インフルエンザ菌のいくつかの株（例えば、ＥａｇａｎおよびＲＭ７００４）は、ＨｅｐＩＩからの鎖伸長を示しうるＬＰＳを合成する。本発明者らは、ｌｉｃ２遺伝子座にある遺伝子（ｏｒｆ３）がＨｅｐＩＩからの鎖伸長を開始させることを示した。これらの遺伝子の示差的な発現は、保存されたトリヘプトシル内部コア部分から発する多様な可変オリゴ糖エピトープをもたらしうる。これらの遺伝子の所定の突然変異によって、本発明者らは、特定のインフルエンザ菌株が表す複雑性の程度のみならず、結果として生じるＬＰＳのコア領域で利用できるエピトープも制御することができる。このように、その生合成機構に所定の突然変異を有するインフルエンザ菌株のＬＰＳにより、ＬＰＳを基にした広域ワクチンを開発するための好適な候補が提供された。本発明者らは、これまでにＬＰＳの変異性を示してワクチン開発を阻んでいた非定型株を含む種々の病原インフルエンザ菌株に対して交差反応性をもたらすことから、この手法がワクチンの設計に有用であるものと判断した。
【００４９】
ＬＰＳトリヘプトシル内部コアにおけるＨｅｐＩＩとＨｅｐＩＩＩの置換パターンの多様性により、内部コアオリゴ糖エピトープの変化がもたらされる。以下は、本発明を説明するインフルエンザ菌のＬＰＳの内部コア領域における有用な置換および修飾の例である。これらは限定しようとするものではなく、当業者ならば本発明の教示に従って他の置換や修飾も可能であることが分かるであろう。
【００５０】
ＮＴＨｉ株コレクションからのＬＰＳの遺伝解析および表現型解析に基づき、本発明者らははじめて、Ｏ−２の代わりにＨｅｐＩＩＩのＯ−３から鎖が伸長しているもう一つの内部コア構造を有するＬＰＳを発現するインフルエンザ菌株を確認した。相同なｌｐｓＡ遺伝子は、株によって異なるが、ＨｅｐＩＩＩのＯ−２またはＯ−３位への（−Ｄ−Ｇａｌまたは（−Ｄ−Ｇｌｃの特異的付加を媒介する。さらに、ＨｅｐＩＩＩがオリゴ糖鎖によって置換されていないＬＰＳを発現するインフルエンザ菌株もいくつかある。これらの発見は実施例２で詳細に示す。
【００５１】
実施例２の結果により、ＮＴＨｉに保存された内部コア成分（構造１）が存在することが確認される。これらの結果はまた、新たな構造モチーフ、すなわちＨｅｐＩＩＩ上の別の置換部位の証拠をはじめて提供するものである。ＨｅｐＩＩＩはＯ−２位のヘキソース残基により置換されていることは早くに分かっており、ＮＴＨｉ、例えば２８５株および１１５８株の場合にそうであることが分かっている。他のＮＴＨｉ株、例えば１７６株および４８６株では、この置換パターンは見られていない。これに対し、ＨｅｐＩＩＩのＯ−３位において置換が見られる。驚くべきことに、ｌｐｓＡ遺伝子は、いくつかの株では（−Ｄ−Ｇｌｃｐを（ＲＤ株、図１）、あるいは他の株では（−Ｄ−Ｇａｌｐを（ｂ型、例えばＥａｇａｎ株）、１，２−結合で付加してＨｅｐＩＩＩから鎖伸長を開始させうることが示された。本発明者らは、ｌｐｓＡの相同体が、ＨｅｐＩＩＩへの（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基または（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基の１，３−結合での付加を担うことを見出した。
【００５２】
内部コア領域の他の有用な修飾は、ＰＣｈｏエピトープに関するものである。これはインフルエンザ菌をはじめとするヒト気道に存在する病原体の表面構造の一般的な特徴である。インフルエンザ菌Ｒｄ株では、ＰＣｈｏはＨｅｐＩの末端（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基のＯ−６と結合している（構造１；Ｒ１＝ＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ；図１）。他のインフルエンザ菌株、例えばｂ型株Ｅａｇａｎでは、ＰＣｈｏはＨｅｐＩＩＩの末端（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基のＯ−６と結合している（構造１；Ｒ３＝ＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ）（Ｅ．Ｋ．Ｈ． Ｓｃｈｗｅｄａ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６７ （２０００） ３９０２−３９１３）。これらの置換パターンはいずれもＮＴＨｉ株で見出されている。さらに、ＰＣｈｏは末端（−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基でも見出された（構造１；Ｒ２＝ＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）。インフルエンザ菌ＬＰＳにおけるＰＣｈｏエピトープの発現および相変異には、ｌｉｃ１遺伝子座の４つの遺伝子が必要である（Ｊ．Ｎ． Ｗｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．， ６５ （１９９７） ９４３−９５０）。これらの遺伝子は、検討した総てのＮＴＨｉ株で認められた。本発明者らは、ｌｉｃＤ遺伝子の多形性がＰＣｈｏが付加される部位に影響することを突きとめた。
【００５３】
トリヘプトシル内部コア部分に対する置換パターンの性質は、内部コアエピトープが免疫系に提示され、モノクローナル抗体によって認識される方法と関連がある。例えば、本発明者らは、ネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（Ｌ６Ａ９）がＨｅｐＩＩＩのＯ−２に（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基を含む株のＬＰＳ内部コアオリゴ糖エピトープを認識するが、（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基が存在しないか、あるいはＯ−３位に結合している場合には認識しないことを見出している。高分子量型の構造確認図は図Ｂに示されている。
【００５４】
上述のように、インフルエンザ菌ＬＰＳ発現に関与する重要な生合成遺伝子が同定された。これにより、本発明者らは、保存された内部コア部分を含むが、ヒト組織構造を模倣するオリゴ糖伸長部を含まないインフルエンザ菌変異株を構築することができるようになった。実施例２はこの方法の結果を示している。
【００５５】
本発明者らは、当業者に公知の方法（Ｇｕの特許、上記）を用いて、例えばタンパク質結合体として製剤化することにより、インフルエンザ菌ＬＰＳの保存されたトリヘプトシル内部コア部分を含むオリゴ糖は免疫原性を示すことを見出した。例えば、本発明者らは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させたＨｉ株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡのＯ−脱アシル化ＬＰＳからなるオリゴ糖−タンパク質結合体をマウスに感作させると、遺伝的に多様なＮＴＨｉ株のセットに由来するＬＰＳサンプルの多数と交差反応性のある免疫血清が生じることを示した（表１）。ＬＰＳのＯ−脱アシル化は無水ヒドラジンを用いて達成される。これには、次のタンパク質とのコンジュゲーション反応のためにＬＰＳオリゴ糖を可溶化する作用があり、リピドＡ成分の著しい解毒をもたらす（Ｇｕの特許、上記）。このＯ−脱アシル化ＬＰＳは、当業者に公知の方法（Ｇｕの特許、上記）に従い、Ｋｄｏ部分のカルボキシル基を介して結合する。最後に、マウスにＨｉ株１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡのＯ−脱アシル化ＬＰＳを腹腔内追加投与した（実施例５参照）。この実験で得られたマウス免疫血清は、内部コアからの複数の鎖伸長を有するＮＴＨｉ株由来のＬＰＳと反応した。
【００５６】
Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ ＬＰＳは、保存されたトリヘプトシル内部コア部分の典型となるＬＰＳを生産し、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）含有オリゴ糖鎖伸長を有する少量のグリコフォームを含む。このことは、ＬＬＡ５との反応性から明らかである（図８）。Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ　Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ−ＢＳＡ結合体はまた、Ｍａｂ　ＬＬＡ５ならびに内部コアＭａｂ、ＬＬＡ４との反応性も示した。ＮＴＨｉ株１００３はＬＮｎＴを含むオリゴ糖鎖を有するＬＰＳを合成しない。本発明者らは、構造解析、遺伝解析および免疫化学分析によってこのことを突きとめた。この株のＬＰＳはＬＬＡ５とは反応せず、ｒｆｂ遺伝子座を含まない（Ｄｅｒｅｋ Ｈｏｏｄ， 上記）。二重突然変異１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡは、鎖伸長のない保存された内部コア部分を有するＬＰＳを発現する。これはＭａｂ　ＬＬＡ４によって認識される。
【００５７】
上記の知見により、インフルエンザ菌ＬＰＳの保存された内部コア部分（例えば、Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡに存在するもの）は、細菌の多様性について典型となる株由来のＬＰＳと交差反応性のある免疫応答を誘導することができることが示される。ラクトース、ＬＮｎＴおよびそれらのシアリル化類似体は、ヒト組織に見られるオリゴ糖構造である。従って、ＬＰＳに基づくワクチンを開発するためには、これらのオリゴ糖伸長部がワクチン製剤中に存在しないようにすることが好ましい。上記の実験によって、これらのオリゴ糖伸長部がインフルエンザ菌株に共通のものである証拠が得られ、本発明者らはそれらを同定し、それらを含まない株を構築する方法論を考案した。
【００５８】
同じ手段により、ＮＴＨｉなどのＨｉに対する広範な免疫応答を誘導し、かつ／または動物組織の模倣または模倣の回避のために改善された免疫応答を誘導するエピトープをもたらす、ＬＰＳの保存されたトリヘプトシル内部コア部分の置換または修飾を有する他のＨｉ変異株を構築することができる。
【００５９】
哺乳類における感染症を治療または予防するためのワクチン接種法は、常法のいずれか、特に粘膜（例えば、眼用、鼻内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣または尿道）表面への投与、非経口経路（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内）により投与する、本発明によるワクチン製剤の使用を含んでなる。好ましい経路は、選択するワクチン製剤によって異なる。治療は１回の投与または一定間隔での繰り返し投与によって行うことができる。適当な用量は、ワクチン製剤自体、投与経路またはワクチン接種する哺乳類の条件（体重、年齢など）など、当業者が理解している種々のパラメーターによって異なる。
【００６０】
本発明によるリポ多糖治療薬の製造には、リポ多糖を製造および精製する標準的な実験技術が用いられる。ワクチンとして用いる場合には、本発明によるリポ多糖を以下に概説する種々の方法に従って製剤化する。
【００６１】
ＬＰＳのリピドＡ成分により有毒となることから、ＬＰＳ免疫原を解毒するのが好ましい。本明細書では、ＮＴＨｉ由来のＬＰＳの解毒法としてヒドラジンの使用が記載されているが、リピドＡからエステル結合脂肪酸を除去しうるいずれかの試薬または酵素の使用も本発明の範囲内にある。ＮＴＨｉの選択株からのＬＰＳを乾燥させたものを１℃〜１００℃、好ましくは２５℃〜７５℃、より好ましくは約３７℃の温度で、１〜２４時間、最も好ましくは約２〜３時間、液体無水ヒドラジンに懸濁させる。エステル結合した脂肪酸を除去した後、ｄＬＰＳをリンカーであるアジピン酸二水和物（ＡＤＨ）と結合させ、その後、免疫担体タンパク質ＴＴまたはＮＴＨｉ　ＨＭＰと結合させる。ＡＤＨは好ましいリンカーであるが、ｄＬＰＳを免疫担体タンパク質に安定かつ効率的に結合できるいずれのリンカーの使用も考えられる。このようなリンカーの使用は、結合ワクチンの分野で周知である（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， Ｊ．Ｍ． Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊｒ．， ｅｄｓ． Ｋａｒｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４８−１１４参照）。
【００６２】
ｄＬＰＳは担体に直接共有結合させることができる。これは、例えば、架橋剤であるグルタルアルデヒドを用いて達成することができる。好ましい実施態様によれば、ｄＬＰＳと担体はリンカーによって隔てられている。リンカーの存在は結合体の免疫原性を最適化し、ｄＬＰＳと担体との結合をより好適なものとする。リンカーは２つの抗原成分を鎖で隔てるが、この鎖の長さや柔軟性は所望により調節することができる。これらの二機能性部位の間において、これらの鎖は、ヘテロ原子および切断部位をはじめとする様々な構造的特徴を含みうる。また、リンカーは抗原の翻訳および回転特性を相応に高め、可溶性抗体に対する結合部位の接近が容易となる。ＡＤＨの他、好適なリンカーとしては、例えば、ε−アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトンおよびｐ−ニトロフェニルアミンなどのヘテロ二機能性リンカーが挙げられる。本発明での使用が考えられるカップリング試薬としては、ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドが挙げられる。また、当業者に公知のその他の多くのリンカーおよびカップリング試薬も本発明での使用に好適である。かかる化合物はＤｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， 上記によって詳細に論じられている。
【００６３】
担体が存在すると多糖の免疫原性が高まる。また、担体に対して生成された抗体は医学上有用である。高分子免疫担体は、第一および／または第二アミノ基（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ／ｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ）、アジド基またはカルボキシル基を含む天然または合成の材料であってよい。担体は水溶性であっても水に不溶であってもよい。
【００６４】
種々の免疫担体タンパク質のいずれか一つを、本発明による結合ワクチンに用いればよい。かかるタンパク質種としては、線毛、外膜タンパク質、および病原菌の分泌毒素、かかる分泌毒素の無毒または「トキソイド」形態、細菌毒に抗原的に類似する無毒なタンパク質（交差反応材料またはＣＲＭ）、およびその他のタンパク質が挙げられる。限定されるものではないが、本発明での使用が考えられる細菌トキソイドの例としては、破傷風毒／トキソイド、ジフテリア毒／トキソイド、解毒した緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）毒素Ａ、コレラ毒／トキソイド、百日咳毒／トキソイドおよびウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）外毒素／トキソイドが挙げられる。これらの細菌毒のトキソイド形態が好ましい。また、ウイルスタンパク質（すなわちＢ型肝炎表面／コア抗原、レトロウイルスＶＰ７タンパク質および呼吸シンシシャルウイルスＦおよびＧタンパク質）の使用も考えられる。
【００６５】
ＣＲＭとしては、ジフテリア毒と抗原的に同等なＣＲＭ．ｓｕｂ．１９７（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．， ９：８９１−９０６， １９７２）および百日咳毒の遺伝子操作変異体ＣＲＭ３２０１（Ｂｌａｃｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：６５６−６５９， １９８８）が挙げられる。キーホールリンペット・ヘモシアニン、カブトガニ・ヘモシアニンおよび植物エデスチンをはじめとする非哺乳類源の免疫担体タンパク質の使用も本発明の範囲内にある。
【００６６】
ｄＬＰＳ−タンパク質結合体のために考えられるカップリング方法には多くのものがある。ｄＬＰＳは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を媒介とするｄＬＰＳの末端３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソン酸（Ｋｄｏ）基のＡＤＨ誘導体化の後、ＥＤＣを媒介とするＴＴとのカップリングによって選択的に活性化することができる。あるいは、本結合体を作製する別法は、例えばＥＤＣを媒介とする誘導体化の後にＮ−スクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート誘導体化タンパク質とのジスルフィド結合形成を行うことによる、ｄＬＰＳのシスタミン誘導体化を含む。また、オリゴ糖と免疫担体タンパク質の結合形成を行う当技術分野で周知のその他の方法も本発明の範囲内にある。かかる方法は米国特許第５，１５３，３１２号明細書および同第５，２０４，０９８号明細書、ＥＰ０４９７５２５およびＥＰ０２４５０４５に記載されている。
【００６７】
反応混合物中のＡＤＨとｄＬＰＳのモル比は、典型的には約１０：１〜約２５０：１の間である。より効果的なカップリングを確保し、ｄＬＰＳ−ｄＬＰＳのカップリングを制限するには過剰モルのＡＤＨを用いる。好ましい実施態様によれば、モル比は約５０：１〜約１５０：１の間であり、最も好ましい実施態様によれば、モル比は約１００：１である。反応混合物中、ＴＴおよびＨＭＰの双方に対して同等の比率のＡＨ−ｄＬＰＳも考えられる。好ましい実施態様によれば、ＡＨ−ｄＬＰＳ結合体にはｄＬＰＳ当たり一つのＡＤＨが存在する。他の好ましい実施態様によれば、最終的なｄＬＰＳ−担体タンパク質結合体のｄＬＰＳと担体のモル比は、約１５〜約７５、好ましくは約２５〜約５０である。
【００６８】
マウスおよびウサギの双方における結合体の免疫原性は、アジュバントとしてのモノホスホリルリピドＡ＋トレハロースジミコレートＲｉｂｉ−７００（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｍｏｎｔ．）の使用により増強される。このアジュバントは、ヒトでの使用は認可されていないが、当業者ならばアルミニウム化合物（すなわちアルミ）、化学修飾リポ多糖、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）死菌懸濁液、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミンその他当業者に公知のアジュバントをはじめ、他の周知の標準的なアジュバントを本発明に用いてよいことが分かるであろう。アルミニウム化合物の使用が特に好ましい。かかるアジュバントはＷａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４：３６９−３８８， １９８６）に記載されている。
【００６９】
非経口投与用のｄＬＰＳ−担体タンパク質結合体は、滅菌注射用水性または油性懸濁液などの滅菌注射製剤の形態であってもよい。この懸濁液は、好適な分散または湿潤剤および沈殿防止剤を用い、当技術分野で周知の方法に従って製剤化することができる。滅菌注射製剤はまた、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非経口的に許容される希釈剤または溶剤中の滅菌注射溶液または懸濁液としてもよい。好適な希釈剤としては、例えば、水、リンゲル溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、常法のように滅菌硬化油を溶媒または懸濁媒として用いてもよい。この目的においては、合成モノまたはジグリセリドをはじめ、いずれの銘柄の硬化油を用いてもよい。さらにまた、同様にオレイン酸などの脂肪酸を注射製剤の製造に用いてもよい。
【００７０】
本発明による結合ワクチンは、可溶形態であっても微粒子形態であってもよく、あるいはリポソームなどのマイクロスフェアまたはマイクロ小胞中に配合してもよい。例えば、筋肉内、皮下、腹腔内および動脈内をはじめ、種々のワクチン投与経路が考えられるが、好ましい経路は筋肉内投与である。好ましい実施態様によれば、投与する結合体の用量は約１０ｇ〜約５０ｇの範囲である。より好ましい実施態様によれば、投与する量は約２０ｇ〜約４０ｇの間である。最も好ましい実施態様によれば、投与する量は約２５ｇである。体重をもとにそれ以上の用量を投与してもよい。厳密な用量は、当業者に公知の通常の用量／応答プロトコールによって決定することができる。
【００７１】
本発明によるワクチンは、いずれの齢の温血哺乳類に投与してもよく、幼哺乳類、特にヒトにおいてＮＴＨｉにより引き起こされる中耳炎および呼吸器感染症に対して能動免疫を誘導するように適合させてある。小児用ワクチンとしては、本結合体を約２〜４ヶ月齢で投与する。典型的には、最初の注射から約２ヶ月、さらに約１３ヶ月後に約１０ｇ〜約２５ｇの２回の追加注射を行う。あるいは、最初の注射から２ヶ月、４ヶ月および１６ヶ月後に３回の追加注射を行う。
【００７２】
本結合ワクチンの全身投与によって誘導されるＩｇＧ抗体は局部粘膜に移行し、粘膜表面（すなわち鼻道）のＮＴＨｉ接種物を不活性化する。本結合ワクチンを粘膜投与（すなわち鼻内）した場合には、分泌型ＩｇＡも粘膜免疫に役割を果たす。従って、本結合ワクチンは局部ならびに全身のＮＴＨｉ感染を予防する。
【００７３】
実施例４はＮＴＨｉ　Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡを用いた結合ワクチンについて記載している。他のＮＴＨｉ株からのワクチンも本発明の範囲内にあり、同じ技術を用いて製造される。ＮＴＨｉ株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ。ｄＬＰＳ−担体結合ワクチンの製造のためのｄＬＰＳの供給源として考えられる他の臨床関連のＮＴＨｉ株としては、９２７４、２０１９、１４７９、５６７５および７５０２株（それぞれＩＩＩ型、ＩＩ型、Ｉ型、ＩＶ型およびＶ型）、ならびに本明細書に記載のＦｉｎｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｉｔｏｎからの株が挙げられる。これらの株ならびに２０１９株は、Ｃａｍｐａｇｎａｒｉ ｅｔ ａｌ． （Ｉｎｆｅｃｔ．，Ｉｍｍｕｎ．， ５５：８８２−８８７， １９８７）およびＰａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．， ５５：２９０２−２９１１， １９８７）， ａｎｄ Ｈｏｏｄ＜ Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３３：６７９−６９２， １９９９により報告されており、通常は研究機関から入手することができる。
【００７４】
結合体混合物を含んでなる多価ワクチン（それぞれ異なるＮＴＨｉ株からのｄＬＰＳを有する）もまた本発明の範囲内にある。当業者ならば、これらの他の臨床関連株由来のＬＰＳは、例えばＧｕ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２０７，１５７号明細書）に記載のように、そこから脂肪酸を除去することにより解毒されうることが分かるであろう。好ましい実施態様によれば、このようにして得られたｄＬＰＳ部分はＬＰＳ自体よりも少なくとも約５，０００倍毒性が低くなる。特に好ましい実施態様によれば、ｄＬＰＳはＬＰＳよりも少なくとも約１０，０００倍低くなる。毒性の測定は、例えば、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２０７，１５７号明細書）に記載のようにして行えばよい。
【００７５】
当技術分野で利用可能な生ワクチンとしては、アデノウイルス、アルファーウイルスおよびポックスウイルスなどのウイルスベクター、ならびに細菌ベクター、例えば、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ ｂｉｌｉｅ ｄｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００７６】
弱毒化ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株（異種抗原の組換え発現のために遺伝子操作されたもの、またはされていないもの）およびそれらの経口ワクチンとしての使用がＷＯ９２／１１３６１に記載されている。好ましい投与経路としては総ての粘膜経路が含まれ、最も好ましくは、これらのベクターは経鼻または経口投与される。
【００７７】
ワクチンとして用いられる他の細菌株は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）に関してはＨｉｇｈ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ （１９９２） １１：１９９１およびＳｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５） ２７０：２９９に、ストレプトコッカス・ゴルドニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）に関してはＭｅｄａｇｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９５） ９２：６８６８に、カルメット−ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）に関してはＦｌｙｎｎ Ｊ．Ｌ．， Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９４） ４０ （ｓｕｐｐｌ． Ｉ）：３１， ＷＯ８８／０６６２６、ＷＯ９０／００５９４、ＷＯ９１／１３１５７、ＷＯ９２／０１７９６およびＷＯ９２／２１３７６に記載されている。
【００７８】
他の製剤は、細胞取り込みを助ける薬剤と会合させたワクチンを利用するものである。かかる薬剤の例としては、（ｉ）ブピバカイン（例えばＷＯ９４／１６７３７参照）などの細胞浸透性を向上させる化学物質、（ｉｉ）リポ多糖、ワクチン、または部分的に脱アシル化したＬＰＳのカプセル化のためのリポソーム、または（ｉｉｉ）それら自体がリポ多糖と会合する陽イオン脂質、またはシリカ、金もしくはタングステン微粒子がある。
【００７９】
陰イオンおよび中性リポソームは当技術分野で周知であり（リポソーム作製法についての詳しい説明としては、例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＲＰＣ Ｎｅｗ ＥＤ， ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ （１９９０）を参照のこと）、リポ多糖に基づくワクチンをはじめ、幅広い生成物を送達するのに有用である。本発明による組成物に用いる場合、一つの実施態様によれば、リポ多糖に基づくワクチンまたはその誘導体をリポソーム、好ましくは中性または陰イオンリポソーム、マイクロスフェア、ＩＳＣＯＭＳ、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に、あるいはそれらとともに製剤化し、送達を助け、かつ／または免疫応答を増強する。
【００８０】
陽イオン脂質もまた当技術分野で知られている。かかる脂質としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られてるリポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３−（−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらの陽イオン脂質についての説明は、ＥＰ１８７，７０２、ＷＯ９０／１１０９２、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、ＷＯ９１／１５５０１、ＷＯ９５／２６３５６および米国特許第５，５２７，９２８号明細書に見出される。
【００８１】
投与経路は、ワクチンの分野で用いられる通常のいずれの経路であってもよい。一般的な指針として、本発明によるリポ多糖に基づくワクチンは、粘膜表面、例えば、眼、鼻内、肺、口腔、腸、直腸、膣、および尿道表面から、あるいは非経口経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、上皮内、または筋肉内経路により投与する。投与経路の選択は、選択される製剤、およびリポ多糖と会合させるアジュバントなどのいくつかのパラメーターによって異なる。ブピバカインと会合して製剤化するリポ多糖に基づくワクチンは有利に筋肉投与することができる。中性または陰イオンリポソーム、またはＤＯＴＭＡもしくはＤＣ−Ｃｈｏｌなどの陽イオン脂質を用いる場合、その製剤は静脈内、鼻内（エアゾル化）、筋肉内、皮内および皮下経路によって有利に注射することができる。裸の形態のリポ多糖は、筋肉内、皮内、または皮下経路によって有利に投与することができる。粘膜アジュバントを用いる場合には、鼻内または経口経路が好ましい。脂質製剤またはアルミニウム化合物を用いる場合には、非経口経路が好ましく、皮下または筋肉内経路が最も好ましい。この選択はまた、ワクチン剤の性質によっても異なる。
【００８２】
本発明によるワクチン製剤の治療または予防効力は、以下のようにして評価することができる。本発明の他の態様によれば、（ｉ）本発明によるリポ多糖に基づくワクチンを希釈剤または担体とともに含んでなる組成物、特に（ｉｉ）治療上または予防上有効量の本発明によるリポ多糖に基づくワクチンを含有する医薬組成物、（ｉｉｉ）哺乳類においてインフルエンザ菌に対する免疫応答を誘導する方法であって、哺乳類に免疫上有効量の本発明によるリポ多糖を投与してインフルエンザ菌に対する防御免疫応答を誘導することによる方法、（ｉｖ）インフルエンザ菌感染を予防および／または治療する方法であって、予防または治療量の本発明によるリポ多糖を感染個体に投与することによる方法、が提供される。さらに、本発明は、インフルエンザ菌感染症を予防および／または治療するための薬剤の製造における、本発明によるリポ多糖に基づくワクチンの使用を包含する。
【００８３】
本明細書において、本発明による組成物とは、一種または数種の本発明によるリポ多糖または誘導体を含有する。本組成物は、所望により、少なくとも一種の付加的なインフルエンザ菌抗原、またはサブユニット、断片、相同体、変異体もしくはその誘導体を含んでもよい。
【００８４】
一つの実施態様によれば、リポ多糖に基づくワクチン、組成物または治療薬は、アジュバント、特に一般に、または特に齧歯類で用いられるアジュバントを含まない。本リポ多糖に基づくワクチン、組成物または治療薬は、その症状が少なくともインフルエンザ菌感染の一環として引き起こされる、または悪化する疾患を治療するために使用でき、このような疾患としては、中耳炎、呼吸器感染症、髄膜炎および肺炎などの疾患が挙げられる。好ましいリポ多糖組成物としては、インフルエンザ菌により引き起こされる疾病に対して防御を与える、または治療するため、動物、好ましくはヒトへｉｎ ｖｉｖｏ投与するために製剤化されたものが挙げられる。また、微粒子、カプセルまたはリポソームとして製剤化された組成物も好ましい。
【００８５】
あるいは、本ワクチン製剤は、アジュバント、好ましくはヒトまたは獣医用に適したアジュバント（好ましくは、齧歯類特異的アジュバントを除く）をさらに含んでもよい。その場合には、例えば、米国特許第５，０５７，５４６号明細書に記載のＱＳ２１など、アジュバント作用を示すのに付随する投与を必要としない全身用アジュバントが好ましい。多くのアジュバントが当業者に知られている。好ましいアジュバントは、以下に示すようにして選択される。
【００８６】
一つの実施態様によれば、リポソームなど以外のアジュバントも使用するが、これは当技術分野で公知である。アジュバントは、抗原を局部定着に留まらせることにより迅速に拡散しないようにするか、あるいはマクロファージや免疫系の他の成分に走化性のある因子を分泌させるように宿主を刺激する物質を含んでいる場合もある。当業者ならば、例えば、以下に記載のものから適切な選択を適宜行うことができる。
【００８７】
治療は、一回投与、または必要に応じて一定間隔で繰り返し投与して達成され、当業者ならば容易に判断することができる。例えば、初回投与の後、一週間または一ヶ月に３回追加投与を行う。適当な用量は、受容者（例えば、成人か小児か）、特定のワクチン抗原、投与経路および頻度、アジュバントの有無や種類、ならびに望まれる効果（例えば、予防および／または治療）をはじめとする種々のパラメーターによって異なり、当業者ならば判断することができる。一般に、本発明によるワクチン抗原は、約１０μｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約２００ｍｇの量で粘膜経路により投与する。非経口経路の投与については、用量は通常約１ｍｇ、好ましくは約１００μｇを超えない。
【００８８】
上記のワクチン組成物のいずれにも有用なアジュバントは、以下に示すとおりである。非経口投与用アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が挙げられる。抗原は、標準的なプロトコールによりアルミニウム化合物とともに沈殿させるか、またはそれに吸着させる。非経口投与には、ＲＩＢＩ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）などの他のアジュバントを用いる。
【００８９】
粘膜投与用アジュバントとしては、細菌毒、例えばコレラ毒（ＣＴ）、大腸菌易熱性毒（ＬＴ）、クロストリジウム・デフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌ）毒Ａ、および百日咳毒（ＰＴ）、またはその組合せ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体（天然コレラ毒サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製製剤など）が挙げられる。これらの毒素のいずれの断片、相同体、誘導体および融合体もアジュバント活性を保持している限り好適である。好ましくは、弱毒変異体を用いる。好適な変異体としては、例えば、ＷＯ９５／１７２１１（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ　ＣＴ変異体）、ＷＯ９６／０６６２７（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ　ＬＴ変異体）およびＷＯ９５／３４３２３（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ　ＲＴ変異体）に記載されている。本発明による方法および組成物に用いられるその他のＬＴ変異体としては、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−１１０−ＡｓｐおよびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体が挙げられる。粘膜投与には、例えば、大腸菌、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、ネズミチフス菌、またはフレクスナー赤痢菌の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）；サポニンまたはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアなどのアジュバントを用いてもよい。
【００９０】
粘膜および非経口投与の双方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（ＷＯ９５／０２４１５）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３ｂ−（Ｎ−（Ｎ’−Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール（米国特許第５，２８３，１８５号明細書およびＷＯ９６／１４８３１）およびＱＳ−２１（ＷＯ８８／０９３３６）が挙げられる。
【００９１】
リポ多糖を含有する本発明による医薬組成物または本発明による抗体はいずれも、常法にて製造される。特に、医薬上許容される希釈剤または担体、例えば、水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水を用いて製剤化する。一般に、希釈剤または担体は、投与様式および投与経路、ならびに標準的な製薬上の運用に基づいて選択される。好適な医薬担体または希釈剤、ならびに医薬製剤におけるそれらの使用に関する医薬上の必要条件は、この分野およびＵＳＰ／ＮＦにおける標準的な教本であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
【００９２】
本発明はまた、インフルエンザ菌感染を、本発明によるインフルエンザ菌リポ多糖および粘膜アジュバントを、抗生物質、制酸剤、スクラルファートまたはそれらの組合せとともに経口投与することにより治療する方法を含む。ワクチン抗原およびアジュバントとともに投与することができる化合物の例としては、例えば、マクロライド、テトラシクリンおよびその誘導体をはじめとする抗生物質がある（使用可能な抗生物質の具体例としては、アジトロマイシンもしくはドキシシクリン、またはサイトカインもしくはステロイドなどの免疫調節物質がある）。さらに、１以上の上記化合物を組み合わせて含有する化合物も用いられる。本発明はまた、これらの方法を実施するための組成物、すなわち本発明によるインフルエンザ菌抗原、アジュバントおよび１以上の上記化合物を医薬上許容される担体または希釈剤中に含有する組成物を含む。
【００９３】
本発明による方法および組成物に用いる上記化合物の量は、当業者により容易に決定される。治療／免疫計画も公知であり、当業者により容易に設計される。例えば、非ワクチン成分を１〜１４日目に投与し、ワクチン抗原＋アジュバントを７、１４、２１および２８日目に投与することができる。
【００９４】
本明細書を通じ、本発明が属する技術分野の状況をより詳しく説明するために括弧内に種々の参照文献が挙げられているが、これらの参照文献の開示は引用することにより本開示の一部とする。
【００９５】
生物の寄託
本明細書に記載、参照される特定のインフルエンザ菌株は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ （ＩＤＡＣ）（Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ， １０１５ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗｉｎｎｉｐｅｇ， Ｍａｎｉｔｏｂａ， Ｃａｎａｄａ Ｒ３Ｅ ３Ｒ２）に寄託されている。この寄託はブタペスト条約に従ってなされたものである。寄託情報：
【００９６】
インフルエンザ菌Ｒｄ　ｌｉｃ１　ｌｐｓＡ株は２００１年８月２５日付けで受託番号：ＩＤＡＣ２５０８０１−１として寄託されている。
【００９７】
インフルエンザ菌１００３　ｌｉｃ１　ｌｐｓＡ株は２００１年８月２５日付けで受託番号ＩＤＡＣ２５０８０１−２として寄託されている。
【００９８】
本明細書に記載され、および特許請求の範囲とされる発明は、寄託された生物材料に限定されるものではなく、これら寄託された生物材料は単に本発明の具体例を例示するものである。
【００９９】
以下、実施例によって本発明の態様の好ましい具体例を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
実施例１
Ｈｉ　ＬＰＳ変異株
細菌株および培養条件
インフルエンザ菌Ｒｄ株は、もともと、ＨｅｒｒｉｏｔによりＡｌｅｘａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｌｅｉｄｙ （Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｈ．Ｅ．， ａｎｄＬｅｉｄｙ， Ｇ． （１９５１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ９３， ３４５−３５９） から入手したものである。Ｈ．Ｏ． Ｓｍｉｔｈがこれを譲り受け、ＫＷ−２０と名付け、ゲノムシーケンシングプロジェクトに用いた（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ．， Ａｄａｍｓ， Ｍ．Ｄ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｏ．， Ｃｌａｙｔｏｎ， Ｒ．Ａ．， Ｋｉｒｋｎｅｓｓ， Ｅ，Ｆ．， Ｋｅｒｌａｖａｇｅ， Ａ．Ｒ．， Ｂｕｔｔ， Ｃ．Ｊ．， Ｔｏｍｂ， Ｊ−Ｅ．， Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ａ．， Ｍｅｒｒｉｃｋ， Ｊ．Ｍ．， ＭｃＫｅｎｎｅｙ， Ｋ．， Ｓｕｔｔｏｎ， Ｇ．， ＦｉｔｚＨｕｇｈ， Ｗ．， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｃ．， Ｇｏｃａｙｎｅ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｊ．， Ｓｈｉｒｌｅｙ， Ｒ．， Ｌｉｕ， Ｌ−Ｉ．， Ｇｌｏｄｅｋ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｗｅｉｄｍａｎ， Ｊ．Ｆ．， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｃ．Ａ．， Ｓｐｒｉｇｇｓ Ｔ．， Ｈｅｄｂｌｏｍ， Ｅ．， Ｃｏｔｔｏｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｕｔｔｅｒｂａｃｋ， Ｔ．Ｒ．， Ｈａｎｎａ， Ｍ．Ｃ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｄ．Ｔ．， Ｓａｕｄｅｋ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｒａｎｄｏｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｆｉｎｅ， Ｌ．Ｄ．， Ｆｒｉｔｃｈｍａｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｈｒｍａｎｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｇｅｏｇｈａｇｅｎ， Ｎ．Ｓ．Ｍ．， Ｇｎｅｈｍ， Ｃ．Ｌ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｌ．Ａ．， Ｓｍａｌｌ， Ｋ．Ｖ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｃ．Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｈ．Ｏ．， ａｎｄ Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９， ４９６−５１２）。Ｓｍｉｔｈ研究室から入手した同株を本発明者らが用いた（ＲＭ１１８）。この株から得られた変異体の遺伝子型は表１に示されている。インフルエンザ菌株は３７℃にてヘミン１０ｇ／ｍｌおよびＮＡＤ２ｇ／ｍｌを添加した。ブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中で増殖させた。形質転換後の選択に関してはカナマイシン１０ｇ／ｍｌをこの増殖培地に添加した。
【０１０１】
大腸菌ＤＨ５株を用いてクローンニングしたＰＣＲ産物および遺伝子構築物を増やし、３７℃にて、必要に応じてアンピシリン１００ｇ／ｍｌまたはカナマイシン５０ｇ／ｍｌを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中で増殖させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｌｏｎｉｎｇ； Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）。
【０１０２】
インフルエンザ菌ゲノム配列からのＬＰＳ関連遺伝子の同定
推定ＬＰＳ生合成遺伝子は、公的に利用できるデータベースから得られた広範な生物に由来するＬＰＳ生合成遺伝子の異種配列を用いてインフルエンザ菌ゲノム配列をコンピューター検索することでこれまでに同定されている（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．，Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。ＲＭ１１８ｌｇｔＦ遺伝子座（ＨＩ０６５３）は、髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ５８７６５）のＬｇｔＦタンパク質配列とのマッチに関してＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＴＩＧＲ） Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒｄ配列データベース（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｇｈｉ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）を検索することで同定した。
【０１０３】
組換えＤＮＡ法、クローニングおよび突然変異
制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ変性酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手し、製造業者の説明書に従って用いた。
【０１０４】
プラスミドＤＮＡの調製、サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション解析はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ，ａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｌｏｎｉｎｇ； Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）により記載されているようにして行った。染色体ＤＮＡは他所に記載の方法でモフィラス属から調製した（Ｈｉｇｈ， Ｎ，Ｊ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９， １２７５−１２８２）。
【０１０５】
ｌｇｔＦの他、推定されるインフルエンザ菌ＬＰＳ生合成遺伝子をこれまでに報告されているようにクローニングして変異誘発した（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．，’Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ． Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ． Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２，９５１−９６５）。ｌｇｔＦ遺伝子については、Ｒｄ株のゲノム配列からオリゴヌクレオチドプライマーｌｇｔＦａ（５’−ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＧＣ−３’）およびｌｇｔＦｂ（５’−ＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣ−３’）を設計し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＩ０６５３を含む１４６１ｂｐの断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、変性９４℃１分、アニーリング５０℃および重合７２℃３０分とした。ＰＣＲ産物の一つを５０ｎｇのプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）と連結し、大腸菌ＤＨ５株へ形質転換した。次に形質転換体から組換えプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化およびプラスミド特異的プライマーの配列決定により確認した（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ，Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。ｌｇｔＦ遺伝子はカナマイシン耐性カセット（ｐＵＣ４Ｋａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ由来のＥｃｏＲＩでの消化により遊離させる）をＨＩ０６５３の５’末端から２５７ｂｐ内側のＭｕｎＩ制限部位へ挿入することで不活性し、プラスミドｐＤＱ１を得た。
【０１０６】
変異株の構築
変異型ＬＰＳ生合成遺伝子を含む線状プラスミド２〜３ｇを用い、ＭＩＶ法（Ｈｅｒｒｉｏｔ， Ｒ．Ｍ．， Ｍｅｙｅｒ，Ｅ．Ｍ．， ａｎｄ Ｖｏｇｔ， Ｍ．Ｊ． （１９７０） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １０１， ５１７−５２４）によりインフルエンザ菌ＲＭ１１８株を形質転換し、形質転換体をカナマイシンで選択した。ＲＭ１１８ｌｉｃ１株を構築するため、対応するＲＭ１５３変異体から単離した剪断染色体ＤＮＡ５ｇでＲＭ１１８を形質転換した。ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ株は、ＲＭ１５３ｌｉｃ２Ａから増幅した、ｌｉｃ２Ａおよび隣接する遺伝子ｋｓｇＡを含むＰＣＲ産物１ｇでＲＭ１１８を形質転換することで構築した。ＰＣＲでは上記のような条件下でプライマーＬ２Ａ：５’−ＣＴＣＣＡＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴ−３’およびＬ２Ｄ：５’−ＡＡＡＣＡＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＡＣＧ−３’を用いた。総ての形質転換体を適当なＢＨＩ／抗生物質プレートで再培養することで確認し、その後エンドヌクレアーゼ消化した染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅および／またはサザンブロッティング／ハイブリダイゼーション解析により変異体としての確認を行った。
【０１０７】
ｌｐｓＡｌｉｃ１変異体　ｌｉｃ１遺伝子座は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）４Ｃ４、６Ａ２および１２Ｄ９により認識されるＬＰＳエピトープを発現するＲＭ７００４株からクローニングしたＤＮＡ断片バンクを、そのＬＰＳのエピトープにおいて天然にはこれらのいずれも発現しないＲＭ１１８株へ導入することにより確認した。ｍＡｂｓおよび１２Ｄ９に対する反応性を付与する４．４ｋｂ断片のクローン化ＤＮＡを配列決定し、４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を確認した。これら４つのＯＲＦはこのクローン化ＤＮＡ由来の２．７ｋｂ　ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を欠失させてプラスミドｐＨＶＴ１由来のテトラシクリン耐性カセットで置換することで一緒にノックアウトした。この構築物を用い、形質転換した後に相同組換えを行うことでＲＭ７００４株、次いでＲＭ１１８株においてｌｉｃ１変異を作出した。
【０１０８】
ｌｐｓＡ遺伝子は、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）でグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の相同体としてのＲｄ株のゲノム配列から同定した。この遺伝子を、Ｒｄゲノム配列から設計したプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲ産物をプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングした後、ＮｓｉＩで消化し、ＰｓｔＩ消化によりｐＵＣ４ｋａｎに由来するカナマイシン耐性カセットを挿入することにより分断した。得られたプラスミドを線状化した後、ＲＭ１１８およびＮＴＨｉ１００３株の形質転換に用いた。形質転換体はＰＣＲにより確認し、変異体を確定した。
【０１０９】
二重変異株ＲＭ１１８ｌｐｓＡｌｉｃ１（互換的にＲｄｌｐｓＡｌｉｃ１またはＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡと呼ぶ）および１００３ｌｐｓＡｌｉｃ１（互換的に１００３ｌｉｃ１ｌｐｓＡと呼ぶ）は、ＲＭ１１８ｌｉｃ１変異株に由来する染色体ＤＮＡでＲＭ１１８および１００３ｌｐｓＡ変異体の各々を形質転換することで構築した。二重変異株は関連の遺伝子座のＰＣＲ解析により確認し、それらの株のバックグラウンドは制限酵素消化を行い、ゲル上のＤＮＡ断片のパターンを関連の野生型株と比較することで確認した。
【０１１０】
次に、株を各々特定のＬＰＳエピトープに特異的ないくつかのｍＡｂｓを用いて確認した。各場合において、野生型と比較した場合、ＲＭ１１８および１００３ｌｐｓＡｌｉｃ１二重変異株はホスホコリンに特異的である抗体ｍＡｂ　ＴＥＰＣ−１５に対する反応性を失っていた。インフルエンザ菌のＬＰＳへのホスホコリンの組み込みはｌｉｃ１遺伝子座に依存する。また変異株由来のＬＰＳをポリアクリルアミドゲルで分画し、関連の野生型のＬＰＳと比較した。各場合において、野生株からのものと比較した場合、二重変異株は末端切断されたＬＰＳを含んでいた。
【０１１１】
免疫ブロッティングによるリポ多糖の分析
ＬＰＳ特異的モノクローナル抗体に対するインフルエンザ菌ＲＭ１１８株の野生型および変異株の反応性は（Ｒｏｃｈｅ， Ｒ．Ｊ．， Ｈｉｇｈ， Ｎ．Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １２０， ２７９−２８４）により記載されているように分析した。
【０１１２】
電気泳動によるリポ多糖の分析
これまでに記載されているようにして（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌｅｓｓｅ， Ａ．Ｊ．， Ｃａｍｐａｇｎａｒｉ， Ａ．Ａ．， Ｂｉｔｔｎｅｒ， Ｗ．Ｅ．， ａｎｄ Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ． （１９９０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２６， １０９−１１７）で分画した後に野生型および変異株から単離されたＬＰＳのパターンを調べた。
【０１１３】
リポ多糖の構造フィンガープリンティング
１０Ｌのバッチ培養（１Ｌ１０ロット）からの細胞を一晩増殖させた後に収穫し、ホットフェノール−水法（Ｗｅｓｔｐｈａｌ， Ｏ． ａｎｄ Ｊａｎｎ， Ｋ． （１９６５） Ｍｅｔｈ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ． ５， ８３−９１）の後に、Ｔｈｉｂａｕｌｔ， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ （Ｔｈｉｂａｕｌｔ， Ｐ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （２０００） ？？？？）により記載されているようにエタノール沈殿させることによりＬＰＳを抽出した。ＬＰＳを超遠心分離（１０５０００ｇ、４℃、２×５時間）を繰り返すことで精製し、サンプルをそれらのＯ−脱アシル化誘導体（ＬＰＳ−ＯＨ）として分析した。Ｏ−脱アシル化はこれまでに記載のように（Ｈｏｌｓｔ， Ｏ．， Ｂｒｏｅｒ， Ｗ．， Ｔｈｏｍａｓ−Ｏａｔｅｓ， Ｊ．Ｅ．， Ｍａｍａｔ， Ｕ．， ａｎｄ Ｂｒａｄｅ， Ｈ． （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１４， ７０３−７１０）、３７℃で１時間、ＬＰＳ（１〜１０ｍｇ）と無水ヒドラジン（０．２〜１．０ｍｌ）とを混合することにより行った。糖類はこれまでに記載のように（Ｊａｒｏｓｉｋ， Ｇ．Ｐ．， ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ， Ｅ．Ｊ． （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２， ４８６１−４８６７）、ガス液体クロマトグラフィー−質量分析（ＧＬＣ−ＭＳ）によりそれらの酢酸アルジトールとして同定した。結合分析は室温で２４時間、無水酢酸（０．５ｍｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．５ｍｇ）でオリゴ糖をアセチル化した後に行った。次にペルアセチル化材料をリチウムメチルスルフィニルメタニドの存在下でジメチルスルホキシド中ヨウ化メチルで処理してメチル化オリゴ糖を得、これをＳｅｐＰａｋ　Ｃ１８カートリッジを用いて回収し、糖分席を行った （Ｂｌａｋｅｎｅｙ， Ａ．Ｂ． ａｎｄ Ｓｔｏｎｅ， Ｂ．Ａ． （１９８５） Ｃｏａｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． １４０， ３１９−３２４）。糖およびメチル化分析で得られた種々の酢酸アルジトールと部分的メチル化酢酸アルジトールの相対的割合をＧＬＣ−ＭＳの検出器の応答から測定し、補正は行わなかった。ＧＬＣ−ＭＳはＮＥＲＭＡＧ　Ｒ１０−１０Ｈ四極質量分析計またはＶａｒｉａｎ　Ｉｎｏｎｔｒａｐシステムを備えたＤｅｌｓｉ　Ｄｉ２００クロマトグラフにて、ＤＢ−５融合シリカキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍ）および１６０℃１分、３℃／分にて２５０℃の温度勾配を用いて行った。エレクトロスプレーイオン化−質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）はＶＧ　Ｑｕａｔｔｒｏ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫ）の陰イオンモードで行った。サンプルを水に溶解した後、１％酢酸を含有する５０％アセトニトリル水溶液と１：１の比率で混合した。サンプル溶液をシリンジポンプから流速５Ｌ／分のＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（１：１）の移動相にインジェクトした。１Ｄ　１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｄ２Ｏで数回凍結乾燥させた後、Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＭＸ５００分光光度計にて、酸化ジューテリウム溶液について２２℃、５００ＭＨｚで記録した。スペクトル分解能を高めるため、Ｄ２Ｏ溶液にペルジューテロ−ＥＤＴＡ（２ｍＭ）およびペルジューテロ−ＳＤＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， ａｎｄ Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ． （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３， ７０１−７０７）。内部アセトンのメチルプロトン共鳴（２．２２５ｐｐｍ）に対する化学シフトを調べた。
【０１１４】
ＬｇｔＣおよびＬｇｔＤからの酵素活性の分析
ｌｇｔＤにコードされている酵素を、生成物の検出にキャピラリー電気泳動を用い、合成アクセプターＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋでアッセイした。キャピラリー電気泳動は実質的にこれまでに記載のようにして行った（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１，１９１６６−１９１７）。ＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋはこれまでに記載のように（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１： ２９５−３０２， １９９８）、髄膜炎菌ＬｇｔＣ酵素を用いてＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃから合成した。反応条件は０．５ｍＭアクセプター、１ｍＭＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ　ｐＨ７．０、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２とした。抽出は、細胞を音波処理した後、１００，０００×ｇ３０分間の遠心分離により膜画分を回収することで行った。ＲＭ１１８および変異体ＲＭ１１８：ｌｇｔＤの双方を分析した。少量の生成物をこれまでに記載のように（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．， Ｍａｒｔｉｎ，． Ａ．， Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １９１６６−１９１７）、ＴＬＣにより単離した。生成物への変換が少ないことから、いくらかの出発材料もそれとともに単離された。回収した混合物を二等分した後、酵素供給者（ＮＥＢ）が奨励するようにヘキソサミニダーゼで処理した。ＬｇｔＤの産物はヘキソサミニダーゼ消化によりアノマー特異性を有することが示された。
【０１１５】
ＲＭ１１８におけるＬｇｔＣに関する活性は検出限界より低かったので、この遺伝子を発現ベクターへクローニングし、大腸菌で活性を評価した。この遺伝子をプライマーｌｇｔＣａ：５’ ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＣＴ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＣＡ ＡＴＧおよびｌｇｔＣｂ：５’ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＴＡ ＡＴＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＣＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＡＡＴ Ｃを用い、ＰＣＲによって増幅した（上記の通り）。
【０１１６】
次に、この遺伝子を髄膜炎由来のｌｇｔＣに関して記載されているもの（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１： ２９５−３０２， １９９８）と同様のｐＣＷｏｒｉのＮｄｅＩおよびＳａｌＩ部位の間に挿入した。この組換えクローンの音波処理した粗抽出物を１ｍＭ　ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃ、１ｍＭ　ＵＤＰ−Ｇａｌ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５でアッセイした。この酵素は大腸菌では不安定であり、抽出物を作製してから数分以内にアッセイする必要があることが分かった（データは示されていない）。この酵素反応の産物は特定のグリコシダーゼ消化、質量分析、および確実なＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋとの同時クロマトグラフィーによって分析した（データは示されていない）。
【０１１７】
変異株の構築およびスクリーニング
上記のように作製した変異体セットを用い、完全なゲノム配列が得られている指標株であるインフルエンザ菌ＲＭ１１８株のＬＰＤＳのオリゴ糖部分の生合成の遺伝的基礎を詳細に調べた。表１は発明者らが調べた遺伝子の一覧である。これら遺伝子の大部分を変異させるために用いたＤＮＡ構築物はこれまでに報告されている（Ｈｏｏｄ，． Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。各構築物は推定ＬＰＳ遺伝子が推定されるリーディングフレームの５’末端（１／３）内に挿入されたカナマイシン耐性遺伝子とともにクローニングされているプラスミドベクターからなった。最初のヘプトース（ＨｅｐＩ）にグルコースを付加することを担う明らかな候補遺伝子は見られなかった。Ｒｄゲノム配列データベースをナイセリア属由来のｌｇｔＦ配列を用いて検索したことろリーディングフレームＨＩ０６５３に対して一致が認められた（２４７個のアミノ酸にわたって３１％の同一性）。ｌｇｔＦはＲＭ１１８およびＲＭ１５３株の染色体ＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＲＭ１１８株由来のクローニング産物はカナマイシンカセットを挿入することで不活性化してプラスミドｐＤＱ１を得、インフルエンザ菌株の形質転換に用いた。ｌｉｃ１およびｌｉｃ２Ａは相変異ＬＰＳ生合成遺伝子座である（Ｈｉｇｈ， Ｎ．Ｊ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９３） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９，１２７５−１２８２； Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｌｏｖｅ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９８９） Ｃｅｌｌ ５９， ６５７−６６５）。ｌｉｃ１はインフルエンザ菌ＬＰＳへのＰＣｈｏ基の付加に関与することが示されている（Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｓｈｃｈｅｐｅｔｏｖ， Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．Ｈ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５，９４３−９５０）。各遺伝子座に関して、ＲＭ１１８株を変異させた遺伝子構築物（１０〜１０５形質転換体／投入ＤＮＡｇ）を用いて形質転換した。大部分の遺伝子座ではＲＭ１１８はクローニングされたＤＮＡの供給源であったが、いくつかの例ではＲＭ１５３株由来のＤＮＡをドナーとして用い、形質転換効率に違いはなかった。リピドＡに付加された最初の糖Ｋｄｏの合成を担う遺伝子（ｋｄｓＡ、ｋｄｓＢ）およびＫｄｏトランスフェラーゼ（ｋｄｔＡ）は遺伝子配列から同定した（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ．， Ａｄａｍｓ， Ｍ．Ｄ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｏ．， Ｃｌａｙｔｏｎ， Ｒ．Ａ．， Ｋｉｒｋｎｅｓｓ， Ｅ．Ｆ．， Ｋｅｒｌａｖａｇｅ， Ａ．Ｒ．， Ｂｕｔｔ， Ｃ．Ｊ．， Ｔｏｍｂ， Ｊ−Ｆ．， Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ａ．， Ｍｅｒｒｉｃｋ， Ｊ．Ｍ．， ＭｃＫｅｎｎｅｙ， Ｋ．， Ｓｕｔｔｏｎ， Ｇ．， ＦｉｔｚＨｕｇｈ， Ｗ．， Ｆｉｅｌｄｓ， Ｃ．， Ｇｏｃａｙｎｅ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｊ．， Ｓｈｉｒｌｅｙ， Ｒ．， Ｌｉｕ， Ｌ−Ｉ．， ��ｌｏｄｅｋ， Ａ．， Ｋｅｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｗｅｉｄｍａｎ， Ｊ．Ｆ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｃ．Ａ．， Ｓｐｒｉｇｇｓ， Ｔ．， Ｈｅｄｂｌｏｍ， Ｅ．， Ｃｏｔｔｏｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｕｔｔｅｒｂａｃｋ， Ｔ．Ｒ．， Ｈａｎｎａ， Ｍ．Ｃ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｄ．Ｔ．， Ｓａｕｄｅｋ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｒａｎｄｏｎ， Ｒ．Ｃ．， Ｆｉｎｅ， Ｌ．Ｄ．， Ｆｒｉｔｃｈｍａｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｆｕｈｒｍａｎｎ， Ｊ．Ｌ．， Ｇｅｏｇｈａｇｅｎ，Ｎ．Ｓ．Ｍ．， Ｇｎｅｈｍ， Ｃ．Ｌ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｌ．Ａ．， Ｓｍａｌｌ， Ｋ．Ｖ．， Ｆｒａｓｅｒ， Ｃ．Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｈ．Ｏ．， ａｎｄ Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９， ４９６−５１２）。種々のプラスミド構築物を用いてｋｄｔＡ遺伝子に変異を有する株を構築する試みからは形質転換体を作出することができなかった。これはｂ型株での知見と同様であり（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）、この変異体が不活性であるためと思われる。ＲＭ１１８および同型の変異株から単離したＬＰＳをＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（データは示されていない）。ＲＭ１１８オリゴ糖合成に関するグリコシルトランスフェラーゼをコードする可能性が最も高い遺伝子に変異を有し、Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより野生型と比較した場合（図１）にＬＰＳバンドに異なるパターンを示す株を、以下に記載のようにそれらのＰＬＳの詳細な構造解析のために選択した。また、ｌｉｃ１遺伝子座が不活性化されている変異体についても検討した。
【０１１８】
ＬＰＳの構造決定
Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＲＭ１１８株のＬＰＳの解析から、リピドＡおよび結合している糖残基の数が異なるオリゴ糖成分からなる低分子量ＬＰＳ集団の電気泳動移動度に相当するヘテロなバンドパターンを示した（図１）。本発明者らはこれまでに、同じ条件下で増殖させたＲＭ１１８株が共通の内部コア要素に結合した３〜５個のグリコース残基を含むＬＰＳの集団を発現することを示している（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｃｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ， Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。ｌｉｃ１、ｌｇｔＦ、およびｌｇｔＤに突然変異を有する株のＬＰは同じような複雑なバンドパターンを示したが、ｌｇｔＣ、ｌｉｃ２Ａ、ｌｐｓＡ、ｏｒｆＨ、ｒｆａＦおよびｏｐｓＸに突然変異を有する株のＬＰＳは一連の糖欠損と一致する一貫して移動度の速いバンドを含む複雑でないパターンを示した。変異株由来のＬＰＳサンプルにおける糖欠損の性質および位置の同定は比較構造解析によって行った。ＲＭ１１８株の同系変異体から液体培養で増殖させた後にＬＰＳを抽出した。構造フィンガープリンティングは、無水ヒドラジン処理後に得られたＯ−脱アシル化ＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）サンプルのＥＳＩ−ＭＳおよび１Ｄ　１Ｈ−ＮＭＲ分析を用いて行った。さらにまた、グリコースおよび結合分析は無処理のＬＰＳサンプルについて行った。特異的に不活性化された推定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む変異株から得られたデータをグロボテトラオースを含有するＲＭ１１８　ＬＰＳの構造モデル（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０） のものと比較したところ、変化したＬＰＳグリコフォームの重要な構造的特徴が確定された。ＥＳＩ−ＭＳは低分子量ＬＰＳの構造組成を探査する有効な手段を提供する（Ｇｉｂｓｏｎ， Ｂ．Ｗ．， Ｍｅｌａｕｇｈ， Ｗ．， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ．Ｊ．， Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｍｐａｇｎａｒｉ， Ａ．Ａ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｓｓ， Ｊ．Ｍ． （１９９３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５， ２７０２−２７１２； Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， ａｎｄ Ｊａｎｓｓｏｎ Ｐ．−Ｅ． （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３， ７０１−７０７； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ．Ｊ．， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ， Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｔ．Ｊ．， Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｂ．Ｗ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５， ５９３７−５９４７）。Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルについて陰イオンモードで得られたＥＳＯ−ＭＳデータは表２に示されている。変異株由来のＬＰＳ−ＯＨサンプルでは、ヘプトース、ヘキソースおよびホスフェート含有置換基の数が異なる共通のＯ−脱アシル化リピドＡ部分にＫｄｏ−４−ホスフェートを介して結合しているオリゴ糖の存在と一致するデータが得られた（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ．Ｊ．， Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ．， Ｇｒｉｆｆｉｓｓ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｂ．Ｗ． （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１， ４５１５−４５２６ Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．（１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０； Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｍ．， Ｈｅｇｅｄｕｓ， Ｏ．Ｅ．， Ｂｏｒｒｅｌｌｉ， Ｓ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ．， Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｗ．， Ｍａｓｋｅｌｌ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９３）． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２４６， ３１９−３３０； Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ． （１９９５） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２７２， ２１３−２２４； Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， ａｎｄ Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ． （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３， ７０１−７０７； Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｎ．Ｊ．， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ， Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｔ．Ｊ．， Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ．Ａ．， ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｂ．Ｗ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｍ．３５， ５９３７−５９４７）。
【０１１９】
ｏｐｓＸ変異体　ｏｐｓを不活性化すると、ヘプトースまたはヘキソース残基を欠き、リピドＡ部分と結合したリン酸化Ｋｄｏしか含有しない凹凸の深いＬＰＳが生じた（表２）。発明者らはこれまでに、インフルエンザ菌ｂ型ＲＭ１５３株のｏｐｓＸ遺伝子が突然変異した結果、ＨｅｐＩとＫｄｏの間でＬＰＳが切断されることを示している（Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， Ｄｅａｄｍａｎ， Ｍ．Ｅ．， Ａｌｌｅｎ， Ｔ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｂｒｉｓｓｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，． Ｒ．， Ｖｅｎｔｅｒ， Ｊ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， （１９９６） Ｍｏｌ． ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２２， ９５１−９６５）。二価分子イオンの低エネルギー衝突活性によるＬＰＳ−ＯＨサンプルのＭＳ−ＭＳ分析（ｍ／ｚ６２５）では、Ｋｄｏ−（−Ｄ−グルコサミンバンドの切断によって生じるｍ／ｚ９５１における主要なフラグメントイオン（リピドＡ−ＯＨ）が得られた（データは示されていない）。このフラグメントイオンの質量はインフルエンザ菌リピドＡ−ＯＨの期待値と一致する（Ｈｅｌａｎｄｅｒ， Ｉ．Ｍ．， Ｌｉｎｄｎｅｒ， Ｂ．， Ｂｒａｄｅ， Ｈ．， Ａｌｔｍａｎｎ， Ｋ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ｋ．Ｋ．， Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ， Ｅ．Ｔ．， ａｎｄ Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ， Ｕ． （１９８８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７７， ４８３−４９２）。ＲＭ１１８およびＲＭ１５３ｏｐｓＸ変異体は、これまでに同定されているＲｄｉｓｎ（Ｉ６９）変異株由来のものと同じＬＰＳを発現することが明らかである（Ｈｅｌａｎｄｅｒ， Ｉ．Ｍ， Ｌｉｎｄｎｅｒ， Ｂ．， Ｂｒａｄｅ， Ｈ．，Ａｌｔｍａｎｎ；Ｋ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ｋ．Ｋ．， Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ， Ｅ．Ｔ．， ａｎｄ Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ， Ｕ． （１９８８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７７， ４８３−４９２； Ｐｒｅｓｔｏｎ， Ａ．， Ｍａｓｋｅｌｌ， Ｄ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ． （１９９６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ３９６−４０２）。Ｉ６９　ＬＰＳ表現型はヘプトース生合成遺伝子ｇｍｈＡの突然変異により生じたものであり（Ｂｒｏｏｋ， Ｊ．Ｓ．， ａｎｄ Ｖａｌｖａｎ Ｍ．Ａ． （１９９６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７８， ３３３９−３３４１）、これによりこの変異株はそのＬＰＳにヘプトースを付加できなくなる。
【０１２０】
ｒｆａＦ変異体　リピドＡの結合型グルコサミン残基からの１Ｈ共鳴期待値の他、ＲＭ１１８ｒｆａＦ由来のＬＰＳ−ＯＨの１Ｈ　ＮＭＲ分析も一つのヘプトース単位由来の低電場領域でのアノマープロトン共鳴（〜５．１９ｐｐｍ）を示した。糖分析によれば、このＨｅｐ残基がＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース　であることが確認された。これに応じて、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは構造Ｈｅｐ１−Ｋｄｏ−リピドＡ−ＯＨに一致するｍ／ｚ７２１．６における単一の豊富な二価イオンによって占められていた（表２）。
【０１２１】
ｏｒｆＨ変異体　ｏｒｆＨ遺伝子が不活性化されている生物は、ＥＳＩ−ＭＳデータから明らかなように、各々２つのＨｅｐ残基を含有するＬＰＳグリコフォームの混合物を生じた（表２）。ＲＭ１１８ｒｆａＦ　ＬＰＳに比べ、付加的なＨｅｐ残基、すなわちＨｅｐ２（ＰＥｔｎ０−２Ｋｄｏ−リピドＡ−ＯＨを含有する主なグリコフォーム集団に加え、Ｈｅｘ−ＰＣｈｏ単位を含有する種であった。糖分析によれば、Ｄ−グルコースおよびＰＣｈｏメチルプロトンの存在が１Ｈ　ＮＭＲ　３．２４ｐｐｍに強いシグナルを与えることが示された。期待されたように、この株由来のＬＰＳは免疫ブロット実験においてＰＣｈｏ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）であるＴＥＰＣ−１５（Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｓｈｃｈｅｐｅｔｏｖ，Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．Ｈ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５， ９４３−９５０）と反応した。結合分析では、末端Ｈｅｐ、３−置換Ｈｅｐおよび３，４−二置換Ｈｅｐ残基の存在が明らかになった（表３）。親株の構造を基にすれば、このデータは２つの主要なグリコフォーム構造１および２を発現するＬＰＳを合成する能力を有するＲＭ１１８ｏｒｆＨと一致する（なお、ＰＥｔｎは部分置換を示す）。
【０１２２】
【化１】
2004506086.tif 000003
構造１：Ｒ１＝Ｈ
構造２：Ｒ１＝ＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ
【０１２３】
Ｔ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した際のＲＭ１１８ｏｒｆＨのＬＰＳでの２つのバンドの存在（図１）はこの結果に一致する。
【０１２４】
ｌｐｓＡ変異体　ＲＭ１１８ｌｐｓＡ由来のＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳ分析によれば、ＲＭ１１８ｏｒｆＨと比較した場合、付加的なＨｅｐ残基を有するグリコフォームを含むことが示され（表２）、Ｈｅｘ１グリコフォームを含有するホスホコリンが主要なＬＰＳ種である（図２）。結合分析は構造２の末端Ｈｅｐへのヘプトースの一連の付加と一致していた（表３）。これに応じ、このＯ−脱アシル化ＬＰＳサンプルの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルはインフルエンザ菌のＬＰＳトリヘプトース内部コア要素の低電場領域（５．０〜６．０ｐｐｍ）において特徴的なパターン（ＨｅｐＩＩ，５．７６ｐｐｍ；ＨｅｐＩ／ＨｅｐＩＩＩ，５．１６／５．１５ｐｐｍ）を示した（図３）（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，’Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。このデータは構造３を有するＲＭ１１８ｌｐｓＡ由来ＬＰＳに一致している（図２、表４）。
【０１２５】
ｌｉｃ２Ａ変異体　ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ株由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析から、主要なＬＰＳ種としてのＨｅｘ２グリコフォームの存在が明らかになった（表２）。ＲＭ１１８ｌｉｃ２Ａ　ＬＰＳの組成分析では、唯一の中性ヘキソースとしてＤ−グルコースが存在することが示され、結合分析ではそれが末端残基であることが示された（表３）。結合分析ではまた、相当な割合の２−結合ヘプトース残基が明らかになった。ｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳサンプルでは２−置換ヘプトース残基は、その残基がその結合分析法で用いられる加水分解条件下では容易に切断されないＰＥｔｎ基（構造３参照）で置換されているために検出されなかったということは注目に値する。これらの発見によれば、ｌｉｃ２Ａ変異体由来のＬＰＳはｌｐｓＡ変異体のものとは、構造４に示されているように（表４）ＨｅｐＩＩＩの２位にグルコース残基を有する点で異なっているものと結論付けることができる。４．６５ｐｐｍに付加的な１Ｈ　ＮＭＲシグナルが存在することは、この末端Ｄ−Ｇｌｃｐが、非置換類似体の場合と比べてＨｅｐＩＩ共鳴値がアップフィールド側にシフトした（５．５８ｐｐｍ）構造を有することを示し、５．７６ｐｐｍはＨｅｐＩＩＩへの１，２−結合（構造４）を示す（Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｋｒａｊｃａｒｓｋｉ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６， ２０９１−２１０３； Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｍ．， Ｈｅｇｅｄｕｓ，，Ｏ．Ｅ．， Ｂｏｒｒｅｌｌｉ， Ｓ．， Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ．， Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｗ．， Ｍａｓｋｅｌｌ， Ｄ．Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．（１９９３） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２４６， ３１９−３３０； Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ．， Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｐ．−Ｅ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ａ． （１９９５） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２７２， ２１３−２２４）。
【０１２６】
Ｌｉｃ３Ａ変異体　同様に、シアリル化グリコフォームを不活性化させた変異体を作出した。これらの研究から関連のｌｉｃ３Ａ変異体でのシアル酸の欠損が確認された。この変異体の作製についてはＨｏｏｄｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ． ３９：３４１−３５０， ２００１に記載されている。このシアリル化グリコフォームはｌｉｃ３Ａ遺伝子の破壊を含む株には存在しないことが分かった。ｌｉｃ３Ａは、同じラクトシルアクセプター部分をめぐって競合する、別の相変異グリコシルトランスフェラーゼ、ＬｇｔＣの作用によって改変されたシアリルトランスフェラーゼ活性を有することが証明されている。
【０１２７】
ｌｇｔＣ変異体　ＲＭ１１８ｌｇｔＣ変異体では、Ｏ−脱アシル化ＬＰＳサンプルのＥＳＩ−ＭＳ分析からＨｅｘ３グリコフォームの存在が明らかになった。糖分析ではｌｇｔＣ変異体由来のＬＰＳがＤ−ガラクトースを含むことが示され、結合分析によればこれは末端残基として存在することが分かった（表３）。結合分析ではまた、４−結合Ｄ−Ｇｌｃｐ残基はＨｅｐＩＩＩのラクトース部分により置換されている（構造５）主要なＨｅｘ３グリコフォーム（表３）と一致する。ＬＰＳ−ＯＨの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは発明者らがこれまでに親株に存在しているラクトース含有Ｈｅｘ３　ＬＰＳグリコフォームに関して報告しているものと同じである（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。髄膜炎菌において、ｌｇｔＣ遺伝子は１，４−（−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしていることが示されている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ， Ｗ．Ｗ．， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ａ．Ｍ．， Ｗａｔｓｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｎ．Ｍ． １９９８）。ＲＭ１１８由来のｌｇｔＣに関して同様の機能が、組換え酵素のトランスフェラーゼ活性を調べることで、またＲＭ１１８ｌｇｔＣ変異体由来のＬＰＳの分析によって示されている。
【０１２８】
ｌｇｔＤ変異体　ｌｇｔＤ遺伝子が不活性かされているインフルエンザ菌ＲＭ１１８株ではＨｅｘ３とＨｅｘ４　ＬＰＳグリコフォームの混合物が合成された（表２）。それに応じてＬＰＳのＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では２つのバンドが確認され、ｌｇｔＣ変異体由来のものの電気泳動移動度に相当するものとそれより遅く移動するバンドであった（図１）。この変異株由来のＬＰＳは末端および４−結合Ｄ−Ｇａｌｐ残基を含んでいた（表３）。親株とそのｌｇｔｃ変異体の１Ｄ　１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを比較したところ、Ｈｅｘ４グリコフォームに（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−（４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ単位が存在することが示され、５．０１ｐｐｍにおけるシグナルは末端（−Ｄ−Ｇａｌｐ残基（構造６）を示す（表４）。このｌｇｔＤ遺伝子産物を合成アクセプターＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋによるグリコシルトランスフェラーゼ活性に関して調べた。ＣＥアッセイにおいて親株ＲＭ１１８とｌｇｔＤ変異株を比較したところ、変異株で（−ＧａｌｐＮＡｃトランスフェラーゼ活性が欠損していることが示されされた（図４）。
【０１２９】
ｌｇｔＦ変異体　インフルエンザ菌におけるｌｇｔＦ遺伝子の突然変異によりＬＰＳがＭａｂ　ＴＥＰＣ−１５とも反応しないし（データは示されていない）、それらの１Ｈ　ＮＭＲにおいて特徴的なＰＣｈｏメチルプロトンシグナル（３．２４ｐｐｍ）も示さない株が生じた。結合分析では、このＬＰＳが末端β−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基を欠き、モノ−３−置換ＨｅｐＩ残基だけを含むことが示された（表３）。ｌｇｔＦ変異体由来のＬＰＳ−ＯＨではそのＥＳＩ−ＭＳにおいて、親株のＬＰＳで見られるものと同じ、ＨｅｐＩＩＩからのオリゴ糖の長さが異なるグリコフォームの分布が見られた（表２）。ＨｅｐＩＩＩからのグロボテトラオース単位の完全な伸長はＨｅｐＩにβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基が存在しても存在しなくとも起こるということは注目に値する（図５）。本発明者らは親株がＬＰＳグリコフォームの混合集団を合成することができ、そこではグロボテトラオース単位β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１（３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−（４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１）（４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐを与える末端β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ残基を付加することでガラビオース単位が伸長することを示した（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）。
【０１３０】
ｌｉｃ１変異体　ｌｉｃ１変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳ分析では、ＰＣｈｏ置換が存在しないこと以外は親株に見られるもの（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．，Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．，Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９）． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０）と同じヘテロなグリコフォーム混合物（表２）が示された。ＲＭ１１８においてｌｉｃ１遺伝子座は、３，４−二置換ヘプトース（ＨｅｐＩ）に結合したβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ６位におけるＰＣｈｏ置換基の発現を担う遺伝子を含むことが示されている（Ｒｉｓｂｅｒｇ， Ａ．， Ｍａｓｏｕｄ， Ｈ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｊ．Ｃ．， Ｍｏｘｏｎ， Ｅ．Ｒ．， ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｄａ， Ｅ．Ｋ．Ｈ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１， １７１−１８０； Ｗｅｉｓｅｒ， Ｊ．Ｎ．， Ｓｈｃｈｅｐｅｔｏｖ， Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ， Ｓ．Ｔ．Ｈ． （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６５， ９４３−９５０）。ＲＭ１１８ｌｉｃ１　Ｏ−脱アシル化ＬＰＳの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを調べたところ、３．２４ｐｐｍにおいて特徴的なＰＣｈｏメチルプロトンシグナルが存在しないことが明らかになった。さらにこのｌｉｃ１変異体由来のＬＰＳは予測されたように（３４）Ｍａｂ　ＴＥＰＣ−１５とは反応しなかった（データは示されていない）。
【０１３１】
実施例２
内部コア部分の置換および修飾
ＮＴＨｉ２０１９株では、ＨｅｐＩがラクトースで置換されている（Ｒ１＝（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ；Ｒ２／Ｒ３＝Ｈ）（Ｎ．Ｊ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１ （１９９２） ４５１５−４５２６）。ＮＴＨｉ３７５株では、ＨｅｐＩＩＩが小数のグリコフォーム集団でシアリル化ラクトースで置換されている（Ｒ１＝（−Ｄ−Ｇａｌｐ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｎｅｕ５Ａｃ−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−（４）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１（２））（Ｄ．Ｗ． Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ．， ３３ （１９９９） ６７９−６９２）。本実施例では、メチル化分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）およびＮＭＰを用いることで４つのＮＴＨｉ株由来のＬＰＳの構造研究の結果をまとめる。
【０１３２】
インフルエンザ菌非定型株４８６、１７６、２８５および１１５９はＥｓｋｏｌａ教授の株コレクションからＦｉｎｎｉｓｈ ｏｔｉｔｉｓ ｍｅｄｉａ ｃｏｈｏｒｔ ｓｔｕｄｙの一環として入手し（Ｈｏｏｄ， 上記参照）、内耳からの単離物も得た。細菌は３７℃にてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）２ｇ／ｍＬ、ヘミン１０ｇ／ｍＬ、およびノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）５０ｇ／ｍＬを含有するブレイン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ）３．７％Ｗ／Ｖ中で増殖させた。ＬＰＳは凍結乾燥菌から、フェノール−クロロホルム−石油エーテル法の後、超遠心分離を行うことで得た（Ａ． Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６１ （１９９９） １７１−１８０）。無水ヒドラジンでのＯ−脱アシル化（３７℃、１時間）または薄い酢酸水溶液でのＫｄｏケトシド結合の切断（１００℃、２時間）のいずれかによってＬＰＳサンプルから得たオリゴ糖サンプルに対してＭＳに基づく方法および高電場ＮＭＲ法を用いて詳細な構造研究を行った。
【０１３３】
ＮＴＨｉ株株４８６、１７６、２８５および１１５８由来のＬＰＳの構成糖分析では総て、それらの対応する酢酸アルジトールおよび２−ブチルグルコシド誘導体のＧＬＣ−ＭＳによって確認される主成分としてのＤ−グルコース（Ｇｌｃ）、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（ＧｌｃＮ）およびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース（Ｈｅｐ）を示した。さらに、４８６、１７６および１１５８株ではＤ−ガラクトース（Ｇａｌ）が確認された。またさらに、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースは１１５８株の主成分であることが分かった。この糖は最近はじめてＮＴＨｉ９２７４株においてインフルエンザ菌ＬＰＳの成分として確認されたものである（Ｍ．Ｍ． Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， ９ （１９９９） １３７１−１３８０）。Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ（ＬＰＳ−ＯＨ）をノイラミニダーゼで処理した後、高速陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＥＳＩ−ＭＳを行ったところ、シアリル酸（ＮｅｕＡｃ）がＮＴＨｉ４８６株の主成分であることが示された。ＮＴＨｉ１７６、２８５および１１５８株でも微量が検出された。
【０１３４】
ＬＰＳ−ＯＨサンプルのＥＳＩ−ＭＳでは、総ての株でヘテロなグリコフォーム混合物が示された。ＮＴＨｉ４８６由来のＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳスペクトルの部分が図２に示されている。これらのＮＴＨｉ株の主要ＬＰＳグリコフォームの提案される組成は表２に示されている。総てのグリコフォームは、推定されるＯ−脱アシル化リピドＡ（リピドＡ−ＯＨ）とリン酸化Ｋｄｏリンカーを介して結合した保存されたＰＥｔｎ置換トリヘプトシル内部コア部分を含む。
【０１３５】
ＰＣｈｏは総ての株に主成分として存在する。１１５８株ではＨｅｘ２−グリコフォーム中に２つのＰＣｈｏが存在することが示されている。２８５株では最も短いグリコフォーム（Ｈｅｘ１）が見られた。
【０１３６】
ＬＰＳサンプルのメチル化分析が表３に示されている。１７６および４８６株ではこれまでに発表されているインフルエンザ菌構造の必須成分である２−置換Ｈｅｐの痕跡だけが検出できたことは注目に値する。その代わりに相当量の３−置換Ｈｅｐが検出されたが、これはインフルエンザ菌ＬＰＳの共通のＬ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１（２）−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１−（３）−［（−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１−（４）−］−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１−（５）−（−Ｋｄｏｐ内部コア要素の新しい置換パターンを示すものである。１７６および４８６株における主要グリコフォームの完全構造をＮＭＲにより決定したが、その結果を以下にまとめる。２８５株のメチル化分析ではとりわけ３，４−二置換Ｈｅｐの他、多量の末端Ｌ、Ｄ−Ｈｅｐが明らかになったが、これはトリヘプトシル内部コア部分のＨｅｐＩＩおよびＨｅｐＩＩＩに置換が存在しない（すなわち、Ｒ２およびＲ３＝Ｈ）ことを示すものであった。この株のＨｅｘ１グリコフォームの完全な構造（図３）をＬＰＳ−ＯＨに対するＮＭＲにより求めた（データは示されていない）。１１５８株のメチル化分析ではとりわけ、ＮＭＲによって明らかな（データは示されていない）構造要素Ｄ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１）（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１（４）−Ｌ−（−Ｄ−Ｈｅｐｐと結合可能な６−置換Ｄ−Ｇｌｃおよび末端Ｄ，Ｄ−Ｈｅｐが示された。主要なＬＰＳグリコフォームはＨｅｐＩＩ（Ｒ２＝（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびＨｅｐＩＩＩ（Ｒ３＝ＰＣｈｏ（６）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ）において置換されていることが分かった。ＮＴＨｉ１１５８の主要なグリコフォームの仮の構造が図４に示されている。
【０１３７】
ＮＴＨｉ１７６の詳細構造　薄い酢酸でＬＰＳを部分酸加水分解したところ、可溶性リピドＡとコアオリゴ糖画分が得られ、コアオリゴ糖画分をＧＰＣで分離すると（図５）、フラクション１、フラクション２およびフラクション３が得られた。これらのフラクションのメチル化分析データは表３に示されている。フラクション１における３−および６−置換Ｇａｌおよび４−置換ＧｌｃＮの存在はこのオリゴ糖について新規な構造特徴が存在することを示している。フラクション１についてのＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳではとりわけｍ／ｚ１２１４．０における主要な二価イオンが明らかになり、これはフラクション２およびフラクション３で見られるものよりもこのフラクションでかなり高い分子量のグリコフォーム（ＨＭＧ）を示す。ＮＴＨｉ２８５についても同様の結果が得られた（下記参照）。フラクション２に関するＥＳＩ−ＭＳスペクトル（データは示されていない）からは、主要なグリコフォームが組成ＰＣｈｏ１・Ｈｅｘ２・Ｈｅｐ３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌおよびＰＣｈｏ１・Ｈｅｘ３・Ｈｅｐ３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌを有することが示された。フラクション３に関するＥＳＩ−ＭＳ（データは示されていない）からは、それぞれ組成Ｈｅｘ３・Ｈｅｐ３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌおよびＨｅｘ４・Ｈｅｐ３・ＰＥｔｎ・ＡｎＫｄｏ−ｏｌを有するグリコフォームが示された。
【０１３８】
フラクション２のＨｅｘ３グリコフォームの構造は詳細な１Ｈ　ＮＭＲ分析により決定することができた。フラクション２の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図６ａに示されている。ＰＣｈｏのメチル基に特徴的なシグナルはδ３．２４に見られた。ＨｅｐＩ−ＨｅｐＩＩＩのアノマー共鳴はそれぞれ５．０３−５．１３、５．８３および５．２６で確認された。ＧｌｃＩ、ＧｌｃＩＩおよびＧａｌに相当するスペクトルはそれぞれδ４．５６、４．６２および４．６４における２Ｄ　ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹスペクトルで確認された。化学シフトデータもメチル化分析と一致してＧｌｃＩＩとＧａｌが末端残基であることを示す。δ４．３においてＧｌｃＩのＨ−６，６’の値がダウンフィールド側にシフトしていることは、この残基がこの位置でＰＣｈｏで置換されていることを示す。プロトン対ＧｌｃＩＩ　Ｈ−１／Ｇｌｃ　Ｉ　Ｈ−４、Ｇｌｃ　Ｉ　Ｈ−１／Ｈｅｐ　Ｉ　Ｈ−４，６間の内部残基ＮＯＥの連結性（図７）により、二糖単位の配列およびそのＨｅｐＩとの結合点をβ−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［ＰＣｈｏ（６］−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→として確定された。ＧａｌのＨ−１とＨｅｐＩＩＩのＨ−３／Ｈ−２の間の内部残基ＮＥＯは、β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→単位の証拠となった。これらのデータを考え合わせると、ＰＣｈｏ置換Ｈｅｘ３グリコフォームは構造２（図８）を有するものと結論付けることができた。フラクション２のメチル化分析では相当量の末端Ｈｅｐが示され、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルで見られたＰＣｈｏ置換Ｈｅｘ２グリコフォームは構造３（図８）を有するものと結論付けることができた。
【０１３９】
フラクション３の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは図６ｂに示されている。ＥＳＩ−ＭＳデータと一致して、ＰＣｈｏのメチルプロトンのシグナル強度は低いことから、フラクション２についてはＰＣｈｏは高い程度では発現しないのは明らかである。ＨｅｐＩＩＩのアノマープロトンのシグナルはほぼフラクション２の対応するものと同じ化学シフトで共鳴する。δ５．２６においてα結合の末端Ｇｌｃ残基（ＧｌｃＩＩＩ）のアノマー共鳴が見られた。β結合ヘキソースのアノマー領域はフラクション２よりもよりヘテロなものであった。２Ｄスペクトルでは末端Ｇｌｃ残基のスピン系がδ４．５０および４．４５で見られた。４−置換Ｇｌｃおよび２つの末端Ｇａｌ残基はδ４．５６、４．６１および４．５４で確認された。ＮＯＥデータからは、構造要素Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−Ｌ−α−Ｄ−Ｈｅｐｐ−（１→ならびにＨｅｐＩＩＩに結合したＧａｌが確認された。さらにＮＯＥ結合性から、α結合ＧｌｃがＨｅｐＩＩの３位に結合していることが確認された。これらの証拠を考え合わせると４に示されているようなＨｅｘ４グリコフォームの構造が得られる（図８）。２−置換Ｈｅｐおよび末端Ｈｅｐを示すメチル化分析に一致して、Ｈｅｘ３グリコフォームは構造５および６を有するものと結論付けられる（図８）。
【０１４０】
ＮＴＨｉ４８６の詳細構造　弱い酸加水分解の後に得られたＬＰＳ−ＯＨおよびオリゴ糖材料（ＯＳ−１）に対してＥＳＩ−ＭＳ、ＮＭＲおよびメチル化分析を集中的に使用した後、グリコフォームＮＴＨｉ４８６の主要なＬＰＳの構造が確立された（図９）。１７６株については、ＨｅｐＩＩＩはＯ−３位で置換されているが、この場合にはグルコース残基による置換である。ＮＴＨｉ４８６ＬＰＳはラクトース部分の末端β−ガラクトースと結合したＮｅｕ５Ａｃで著しくシアリル化されている。
【０１４１】
ＬＰＳ−ＯＨの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルでは、δ５．８と５．０の間のほぼ同じ領域に５つの別個のシグナルが見られた。これらのシグナルのうち３つが内部コア領域の３つのヘプトース残基（ＨｅｐＩ−ＨｅｐＩＩＩ）のＨ−１シグナルに相当していた。α結合グルコース残基（ＧｌｃＩ）のアノマーシグナルは５．２８（Ｊ３．８Ｈｚ）に確認され、β結合ヘキソースに相当するアノマーシグナルはδ４．５２と４．４２の間に確認された。ＯＳ−１の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルでは、ヘプトースのアノマー共鳴ならびに一つのアセチル化部位がδ５．８３−５．７５（１Ｈ、分離していない）およびδ５．１４−５．０４（３Ｈ、分離していない）で見られた。一つのＯ−アセチル基のメチルプロトンに相当する強いシグナルがδ２．１７で見られ、これはＨＳＱＣスペクトルのδ２１．０における１３Ｃシグナルに相当するものであった。内部コア領域内のグリコースの配列は、隣接する残基上のアノマープロトンおよびアグリコンプロトンを結びつけるトランスグリコシドのＮＯＥ結合性から確定した。ＰＣｈｏのメチルプロトンのシグナルはδ３．２１（ＬＰＳ−ＯＨ）およびδ３．２３（ＯＳ−１）で見られ、この結果から、またＰＥｔｎからのエチレンプロトンのスピン系は以前に得られたものと同じであった（Ａ． Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６１ （１９９９） １７１−１８０）。ＬＰＳ−ＯＨおよびＯＳ−１の１Ｈ−３１ｐ　ＮＭＲ相関研究では、ＰＣｈｏおよびＰＥｔｎがそれぞれＧｌｃＩおよびＨｅｐＩＩ残基と結合していることが示された。シアル酸のＨ−３メチレンプロトン由来の特徴的なシグナルはＬＰＳ−ＯＨの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルにおける（１．７９）（Ｈ−３ａｘ，Ｊ３ａｘ，３ｅｑ＝１２．３Ｈｚ）および（２．７３）（Ｈ−３ｅｑ，Ｊ３ｅｑ，４＝４．３Ｈｚ）に見られた。Ｎｅｕ５ＡｃのＨ−３ａｘとＧａｌ残基のＨ−３の間の内部残基ＮＯＥにより、メチル化分析によって示されているように、シアル酸がガラクトースと２，３−結合していることが確認されたα−Ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→。ＯＳ−１のＨｅｐＩＩＩにおける核の数に関するいくつかの化学シフト値はＬＰＳ−ＯＨにおける対応する化学シフトとはかなり異なっていた。ダウンフィールドシフトはＯＳ−１における
ＨｅｐＩＩＩのＨ−２（＋０．９９ｐｐｍ）、Ｈ−１（＋０．０３ｐｐｍ）、Ｈ−３（＋０．２２ｐｐｍ）、およびＣ−２（＋１．２ｐｐｍ）で見られ、一方、Ｃ−１（−３．３ｐｐｍ）およびＣ−３（−２．５ｐｐｍ）はアップフィールド側へシフトした。よって、ＨｅｐＩＩＩはＯ−２位でアセチル化していることが示された。このアセチル化部位はＨＭＢＣ実験でもさらに支持され、カルボニル炭素（δ１７４．０）とＨｅｐＩＩのＨ−２の間で相関性が見られた。さらにまた、カルボニル炭素とＯ−アセチル基のメチルプロトンの間でもクロスピークが見られ、これにより置換基の存在が確認された。
【０１４２】
ＮＴＨｉ４８６のｌｐｓＡ変異体由来のＬＰＳのＥＳＩ−ＭＳおよびメチル化分析ではＨｅｐＩＩＩから鎖が伸長していないことが示された。Ｏ−脱アシル化材料のメチル化分析では、末端Ｇｌｃ、末端Ｈｅｐ、３，４−二置換Ｈｅｐ、２，３−二置換Ｈｅｐおよび６−置換ＧｌｃＮが相対比３４：３９：２０：３：４で示された。ＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、ｍ／ｚ８１２．９／８５３．９で２つの主要な三価イオンが見られ、ＰＣｈｏ（Ｈｅｘ２（Ｈｅｐ３（ＰＥｔｎ１−２（Ｐ１（Ｋｄｏ１（リピドＡ−ＯＨに相当した。
【０１４３】
ＮＴＨｉ１７６および２８５における高分子量グリコフォーム　ＮＴＨｉ２８５由来のＬＰＳに対して弱い酸加水分解を行った後にゲル濾過を行ったところ、図３に示されているグリコフォームを含んだ主要画分とともにそれより大きな分子量をのグリコフォームを含有する少量の画分が示された。この高分子量（ＨＭＷ）画分の糖分析ではＤ−Ｇｌｃ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｄ−ＧｌｃＮＡｃおよびＬ，Ｄ−Ｈｅｐが示され、メチル化分析では末端Ｇａｌ、３−置換Ｇａｌ、６−置換Ｇａｌ、４−置換ＧｌｃＮＡｃ、末端Ｈｅｐ、および３，４−二置換Ｈｅｐを示した。ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳではとりわけｍ／ｚ１０５２に主要な二価イオンが示された。このイオンに対するＭＳ／ＭＳによれば、ＮＴＨｉ１７６のＨＭＷ（上記参照）で見られたｍ／ｚ１２１４と同様のフラグメンテーションパターンを示した。特に娘イオンがｍ／ｚ６９２に見られ、組成物ＰｃｈｏＨｅｘ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃに相当した。
【０１４４】
実施例３
インフルエンザ菌Ｒｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡ二重変異体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにホルマリンで殺したＲｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡ全菌体を腹腔内感作させた。各マウスには一回の注射当たり０．５ｍｌ　ＰＢＳ中１０８細胞を投与した。１４日目、３５日目にマウスに追加抗原投与し、４５日目に試験採血した。５６日目、同種ＬＰＳに対して最高の抗体力価を示す２匹のマウスに上記に示されるように最終２回の腹腔内注射を行い、０．１ｍｌのＰＢＳを静注した。最後の注射から３日後に融合を行った。２匹の免疫マウス由来の脾臓細胞を刺激したものを３３％ＰＥＧ１４５０中１０：１の比率のＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞と融合させた。ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択で生き残った推定ハイブリッドを同種Ｒｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡ　ＬＰＳおよび異種Ｒｄ　ＬＰＳに対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。対象となる抗体を産生するハイブリドーマを安定性とクローン性を確保するために制限希釈を用いて２回クローニングした。ＥＩＡマウスＭａｂイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃａｎａｄａ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）を用いて使用済み上清についてＩｇサブクラスを調べた。クローンは、２，６，１０，１４−テトラメチル−ペンタデカン（プリスタン）０．５ｍｌを腹腔内処置した後、１０〜１４日のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０６のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射することで腹水として拡張した。注射後７〜１４日後に腹水を穿刺した。
【０１４５】
間接的ＥＬＩＳＡ　培養上清および腹水を９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＩＡプレートで精製ＬＰＳに対してアッセイした。３７℃で３時間、０．０２Ｍ　ＭｇＣｌ２を含有する０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．８）１００Ｌ中１．０ｇのＬＰＳでウェルを被覆した後、室温にて１時間、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　２００Ｌでブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、培養上清および腹水のサンプルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳで連続希釈したものを加え、室温で１〜３時間インキュベートした。次にこれらのプレートを洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｏｒｎｂｙ， ＯＮ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１：３０００希釈したものを室温にて１時間加えた。これらのプレートをｐ−ＮＰＰリン酸基質系（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｅｒｇ， ＭＤ）で顕色させた。３０〜６０分後、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＩＡプレートリーダー４１０ｎｍにてプレートを走査した。
【０１４６】
結果　ホルマリンで殺したＲｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡの全菌体をＢＡＬＢ／ｃマウスに感作させ、融合させ、同種ＬＰＳおよび異種Ｒｄ　ＬＰＳに対して最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行ったところ、１２個のハイブリドーマが確立された。この１２種のＭａｂをＲｄ変異体ＬＰＳのパネルに対して試験した後、２種のＭａｂ、ＬＬＡ５、ＩｇＧ２ａおよびＬＬＡ４、ＩｇＧ２ｂをさらなる試験のために選択した。ＬＬＡ５は２５のうち１４の非定型株ＬＰＳと交差反応することが分かり、ＬＬＡ４は同種のＬＰＳを認識した。構造解析によれば、ＬＬＡ５は高分子量グリコフォームを検出し、ＬＬＡ４は同種の株に存在する内部コアエピトープと結合することが明らかになった。
【０１４７】
実施例４
Ｈｉ　Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡＬＰＳ−ＯＨ−ＢＳＡ結合体の作製
これまでに記載されている手順に従い、インフルエンザ菌二重変異株Ｒｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ由来のＬＰＳを単離し、フェノール−水抽出プロトコールにより精製し、無水ヒドラジン処理によりＯ−脱アシル化した。糖分析では、ＬＰＳ−ＯＨのオリゴ糖部分がＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよび唯一検出可能なアルドースとしてのグルコースを含んでいることが示された。ＬＰＳ−ＯＨのＥＳＩ−ＭＳによれば、分子量２１１４．９Ｄａに相当するｍ／ｚ１０５６．５に二価イオンが見られ、これはＧｌｃ（ＨｅｐＩＩＩ（ＰＥｔｎ（Ｋｄｏ（Ｐ−リピドＡ−ＯＨ（１）の予測組成と一致するものである。１Ｈ　ＮＭＲは明らかにＲｄｌｐｓＡ単一変異体で見られたＬＰＳ−ＯＨのもの（実施例１）と同じ保存されたトリヘプトシル部分に関する、５．１６（ＨｅｐＩ）、５．１５（ＨｅｐＩＩＩ）および５．７６（ＨｅｐＩＩ）おけるヘプトース残基の十分定義されるアノマーシグナルを示した。Ｐｃｈｏメチル共鳴によるシグナル（Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６１：１７１−１８０， １９９９）はこの１Ｈ　ＮＭＲでは検出されなかった。
【０１４８】
実施例５
炭水化物（ＣＨＯ）−ＢＳＡ結合体、その後の非結合ＣＨＯでの感作
これまでの例からのＬＰＳ−ＯＨはＧｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４：４０４７−４０５３， １９９６に記載の方法に従ってＢＳＡを結合させることができる。あるいは図Ｃに記載のようにカナダのＮＡｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌのＷｅｉ Ｚｏｕが開発した手法に従い、Ｋｄｏカルボキシル基を介してＢＳＡをＭ２Ｃ２Ｈ（４（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシルヒドラジド．１／２ジオキサンと結合させることもできる。要するに、上記スキームに示されているリンカー戦略を用い、ＬＰＳ−ＯＨはＥＤＣによるＫｄｏカルボキシル基の選択的活性化を介してＢＳＡと結合させたのである。
【０１４９】
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにＲｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡ　ｏｄＡ　ＬＰＳ−ＢＳＡ結合体を腹腔内感作させた。各マウスには一回の注射当たり０．２ｍｌ　Ｒｉｂｉｓ完全アジュバント（Ｃａｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｈｏｒｎｂｙ， ＯＮ）中２ｇの炭水化物を与えた。２１日目と４２日目に同量の結合ワクチンでマウスに追加抗原投与を行った。１３７日目にマウスに、Ｒｉｂｉ中に１０ｇの１００３　ｌｉｃ１ｌｐｓＡ　ｏｄＡ　ＬＰＳを含有する最後の腹腔内注射を行い、１４７日目に血清を採取した。
【０１５０】
実施例６
インフルエンザ菌株に対するモノクローナル抗体ＬＬＡ４およびＬＬＡ５の作製
ＬＰＳ生合成機構に所定の突然変異を有する株を用い、所定のＬＰＳオリゴ糖構造に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生産することができる。保存された内部コア部分を含むインフルエンザ変異株に対してネズミＭａｂを作製した。例えばＢＡＬＢ／ｃマウスにホルマリンで殺したＲｄ　ｌｉｃ１ｌｐｓＡの全菌体を感作させた。同種ＬＰＳおよび異種Ｒｄ　ＬＰＳに対して最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行ったところ、１２個のハイブリドーマが確立された。この１２種のＭａｂをＲｄ変異体ＬＰＳのパネルに対して試験した後、２種のＭａｂ、ＬＬＡ５、ＩｇＧ２ａおよびＬＬＡ４、ＩｇＧ２ｂをさらなる試験のために選択した。
【０１５１】
ＬＬＡ４は同種株に存在する内部コアエピトープを認識することが分かった。ＥＬＩＳＡ試験では、ＬＬＡ５は遺伝的に多様な培養コレクションの多数の株から精製したＬＰＳ（２５種のうち１４の非定型株ＬＰＳ）と交差反応を示した（表１）。Ｍａｂ　ＬＬＡ５によって認識されるエピトープはＲｄｌｐｓＡ単一変異体に、また、ＨｅｐＩＩＩ残基を欠いたさらに末端切断されたＲｄｌｉｃ１ｌｐｓＡ二重変異体に存在した（表２）。ＬＬＡ５エピトープは単一変異体ＲｄｌｇｔＦのＬＰＳには存在しない。上で述べたように、ｌｇｔＦ遺伝子はＨｅｐＩの４位に（−Ｄ−Ｇｌｃ残基を付加するのに必要とされる。
【０１５２】
この２５株由来のＬＰＳを当技術分野で公知の構造解析技術によって比較したところ、驚くべきことに、Ｍａｂ　ＬＬＡ５が内部コア部分のＨｅｐＩ単位から鎖伸長を生じるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）含有オリゴ糖エピトープを検出していた。Ｍａｂ　ＬＬＡ５によっては認識されない株はＬＮｎＴを含む鎖の伸長がないことを特徴とした。ＬＮｎＴを含む鎖伸長を発現するインフルエンザ菌株は標準的な実験室増殖条件下では低い程度でしかそれを発現しない（例えば？？参照）。それはこれまでには発現レベルが低いためにＲｄ株では同定されていない（Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６１：７１７−１８０， １９９９）。これが今般、当業者に公知の手法である弱い酸加水分解およびバイオゲルＰ−４でのゲル浸透クロマトグラフィーによる分離によってＲｄ株（ＲＭ１１８）のＬＰＳから各オリゴ糖を遊離させることにより単離および同定された（図１）。このＬＮｎＴ含有コアオリゴ糖画分は少量の高分子量成分で標識された「ＨＭＷ画分」として溶出する。これはＲｄ株で同定されている主要なグリコフォーム（Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９， 上記）からなる大きなピーク（４００を中心とする）と比べると少量成分である。Ｒｄ株由来のＨＭＷコアオリゴ糖はタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）技術（Ｔｈｉｂａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｉｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １４５，： Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｏｘｉｎｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｏｌｓｔ， Ｏ．， ｅｄ．） ｐｐ ３２７−３４４， Ｈｕｍａｎ ａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９ およびその中の参照文献）によりＨｅｐＩからＬＮｎＴ含有鎖の伸長を有するものとして特徴付けられた。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにおけるフラグメンテーションパターンは配列Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃを有し、末端糖単位Ｐｅｔｎ−ＧａｌＮＡｃでキャップされたＬＮｎＴオリゴ糖鎖伸長が存在することを示した（図２）。
【０１５３】
Ｒｄ株をシアル酸を含有する培地で増殖させると、シアリル化オリゴ糖を含有するＬＰＳグリコフォームが発現する。本発明者らはＨｅｐＩＩＩからのオリゴ糖伸長として結合している構造（−Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−４）−（−Ｄ−Ｇｌｃを有するシアラリルラクトースを見出した。さらにまた、このオリゴ糖伸長はいくつかのＮＴＨｉ株でも確認された。相変異遺伝子ｌｉｃ３ＡはラクトースアクセプターにＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを付加するシアリルトランスフェラーゼをコードしている。Ｒｄ株を記載の条件下で増殖させた場合、この生物のＬＰＳでＬＮｎＴ鎖伸長部のシアリル化類似体が検出される。構造（−Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）−（−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１−４）−（−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１−３）−（−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−４）−（−Ｄ−Ｇａｌｐを有する内部コアＬＰＳからのシアリル化ＬＮｎＴオリゴ糖鎖伸長はＯ−脱アシル化ＬＰＳのＥＳ−ＭＳによりＲｄｌｇｔＣｌｉｃ３Ａ二重変異体で容易に検出される（図３）。発明者らはＭＳ／ＭＳ技術、高電界核磁気共鳴技術、およびメチル化分析（いずれも当業者に公知の構造解析法）を用い、保存された内部コアにおけるＬＰＳの構造がシアリル化ＬＮｎＴ含有鎖の伸長を有することを確認した。発明者らはインフルエンザ菌がｒｆｂ遺伝子座の遺伝子を含む、ＬＮｎＴ含有オリゴ糖鎖伸長部を付加するための一連の機構を用いていることを見出した。検討した総てのＨｉ株で、ｒｆｂ遺伝子の存在とＬＮｎＴの形成の間には絶対的な相関がある。
【０１５４】
また、Ｍａｂ　ＬＬＡ５と反応性があるＮＴＨｉ株由来のＬＰＳは弱い酸加水分解の後のゲル浸透クロマトグラフィーで高分子量（ＨＭＷ）画分を示す。例えばＮＴＨｉ２８５株のＬＰＳは、ＬＮｎＴを含有し、また、Ｐｅｔｎ−ＧａｌＮＡｃ単位によってキャップされている鎖伸長の存在がＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンから同定される（図５）少量のＨＭＷ画分（図４）を示す。このＬＮｎＴ含有オリゴ糖鎖伸長はＭＳ／ＭＳ／ＭＳ実験からさらに確認された（図６）。ＬＩＡ５反応性のない株、例えばＮＴＨｉ１２４７株の弱い酸加水分解では検出可能なＨＭＷ画分は見られない（図７）。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
【表４】
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【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
【表７】
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【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
【表９】
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【０１６４】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図Ａは、インフルエンザ菌リポ多糖の保存された内部コアトリヘプトシル部分の模式図である。
【図２】図Ｂは、高分子量型ＲＭ１１８の構造確認図である。
【図３】図Ｃは、ワクチンと担体タンパク質とのコンジュゲーションを示す模式図である。
【図４】図Ｄは、マススペクトルを示す図である。
【図５】図１は、ＲＭ１１８野生型および推定されるグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に変異を有する株から精製したＬＰＳのＴ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の電気泳動移動パターンである。ＲＭ１１８は野生型のＬＰＳに相当し、同系変異体は関連のＬＰＳ遺伝子で示されている。
【図６】図２は、主要なＨｅｘ１グリコフォーム（構造３）由来の二価および三価イオンを示す、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｐｓＡ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳである。
【図７】図３は、５．０と６．０ｐｐｍの間にα−アノマープロトン領域を示す、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｐｓＡ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。３，４−二置換Ｈｅｐ（ＨｅｐＩ）、６−ＰＥｔｎ置換Ｈｅｐ（ＨｅｐＩＩ）、末端Ｈｅｐ（ＨｅｐＩＩＩ）およびリピドＡ領域のリン酸化α−ＧｌｃＮに相当するアノマー共鳴が示されている。
【図８】図４は、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のＬｇｔＤ活性のキャピラリー電気泳動分析である。パネルＡ／トレース１は音波処理物の１００，０００ｘｇペレットを酵素源として用いた完全反応混合物であり；トレース２はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを除いたこと以外は１の反応混合物と同じであり；トレース３は変異体ＲＭ１１８：ｌｇｔＤからの完全反応混合物であり；トレース４はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを除いたこと以外はトレース３と同じである。ピークＡはＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋ製剤中の不純物であり、ピークｂはＦＣＨＡＳＥ−グロボテトラオースであり、ピークｃはＦＣＨＡＳＥ−Ｐｋである。パネルＢ／トレース１はパネルＡトレース１で記載した反応から得られたＴＣＬ精製産物である。トレース２はβ−ヘキソサミニダーゼで処理したこと以外はトレース１と同じ材料である。
【図９】図５は、インフルエンザ菌ＲＭ１１８株のｌｇｔＦ変異体由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの三価分子イオン領域の陰イオンＥＳＩ−ＭＳである。Ｈｅｘ２（β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）、Ｈｅｘ３（α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）およびＨｅｘ３・ＨｅｘＮＡｃ（β−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ）から生じたピークが示されている。
【図１０】図６は、Ｒｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， （１６）の分析の結果に基づいたインフルエンザ菌ＲＭ１１８株由来のＬＰＳの構造の模式図である。この実験で同定された遺伝子座のＬＰＳ生合成において提案される作用部位を示し、関連の糖結合に矢印で結ばれている。相変異遺伝子座は下線で示されている。ＬＰＳ構造においては、ＫＤＯは２−ケト−３−デオキシオクツロソン酸を、ＨｅｐはＬ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースを、ＧｌｃはＤ−グルコースを、ＧａｌはＤ−ガラクトースを、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを、ＰＥｔｎはホスホエタノールアミンを、Ｐはリン酸を、Ｐｃｈｏはホスホコリンを表す。ヘプトース残基については上から下に、ヘプトースＩ、ヘプトースＩＩ、次にヘプトースＩＩＩである。
【図１１】図１は、インフルエンザ菌Ｒｄ株のＬＰＳ内部コアからの鎖伸張に関与する遺伝子を示す図である。
【図１２】図２は、ＮＴＨｉ４８６株由来のＯ−脱アシル化ＬＰＳの陰イオンＥＳＩ−ＭＳスペクトルの一部を示す図である。
【図１３】図３は、ＮＴＨｉ２８５で見られた主要なＨｅｘ１　ＬＰＳグリコフォームの構造を示す図である。
【図１４】図４は、ＮＴＨｉ１１５８の主要なＬＰＳグリコフォームの仮構造を示す図である。
【図１５】図５は、弱い酸加水分解後のＮＴＨｉ１７６のＬＰＳ（１００ｍｇ）のバイオゲルＰ−４クロマトグラムを示す図である。
【図１６】図６は、ＮＴＨｉ１７６由来のフラクション２（ａ）およびフラクション３（ｂ）の２７０ＭＨｚ　１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】図７は、ＮＴＨｉ１７６のフラクション２の５００ＭＨｚ２Ｄ　ＮＯＥＳＹスペクトルの一部を示す図である。
【図１８】図８は、ＮＴＨｉ１７６ＬＰＳ由来のオリゴ糖の構造を示す図である。
【図１９】図９は、ＮＴＨｉ４８６のＬＰＳグリコフォームを含有する主要なＮｅｕＡｃの構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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