(57)【要約】【課題】本発明は、障害の原因とならない（本願発明者らによるｉｎ  ｖｉｔｒｏコラーゲンゲル系から実際の皮膚での場合を推定したものに基づく）上に、ＭＭＰ−１によって発生した障害を実際に「消滅」させて正常な皮膚機能を回復させる酵素（単数または複数）（ＭＭＰ−９と、おそらくＭＭＰ−２）を残しつつ、ヒトにおいて真皮マトリックス障害の原因となる酵素（ＭＭＰ−１）を選択的に阻害しようとするものである。【解決手段】マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１；線維芽細胞コラゲナーゼ）は太陽からのＵＶ光線によって誘導され、年齢を重ねると自然に増加する。ＭＭＰ−１の分解産物に曝露されたヒト線維芽細胞はコラーゲンを収縮させるが、この壊死組織片を環境から除去すると、線維芽細胞は正常な挙動を示す。ＭＭＰ−１を阻害しつつ壊死組織片を除去する酵素を残すことで、太陽のＵＶ光線、高齢、座瘡などにより猛攻撃を受けたヒトの皮膚が改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの皮膚をコラーゲンの分解から保護するための局所用組成物において、ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２に対して、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３のうち少なくとも１つの阻害に選択的な化合物と、該化合物に対する皮膚科学的に適したキャリアと、を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、レチノイドをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、ＵＶＡ遮断剤およびＵＶＢ遮断剤のうち少なくとも一方をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物において、ＵＶＡ遮断剤とＵＶＢ遮断剤の両方を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、レチノイドをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１、２、３、４または５に記載の組成物において、抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物において、ＵＶＡ遮断剤およびＵＶＢ遮断剤の両方をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
好適なキャリアと混合して局所用に適用される化合物の使用であって、前記化合物は、年齢により老化した皮膚におけるコラーゲンの存在と線維芽細胞の増殖とを亢進するために、ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２に対して、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３のうち少なくとも１つの阻害のために選択されていることを特徴とする前記化合物の使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用において、前記ＭＭＰ阻害剤と併用して局所的に使用することを含むことを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項８に記載の使用において、レチノイドの使用が毎日のことであることを特徴とする使用。
【請求項１１】
請求項９に記載の使用において、レチノイドの使用が毎日のことであることを特徴とする使用。
【請求項１２】
コラーゲンの分解を防止し、かつ、ヒトの皮膚がＵＶ光線に曝露されることで発生する前記皮膚におけるプロコラーゲン生合成の阻害を改善するための化合物の使用であって、ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２に対して、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３のうち少なくとも１つの阻害に選択的な化合物と、該化合物に対する皮膚科学的に適したキャリアと、を、前記曝露の２４時間前から前記曝露の１２時間後の間に局所的に適用することを含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用において、前記適用がＵＶ曝露前であり、曝露前にＵＶＡ遮断剤とＵＶＢ遮断剤との組み合わせを適用することをさらに含むことを特徴とする使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用において、前記適用がＵＶ曝露前であり、ＥＧＦ−Ｒタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を適用することをさらに含むことを特徴とする使用。
【請求項１５】
ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２に対して、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３のうち少なくとも１つの阻害に選択的な化合物と、該化合物に対する皮膚科学的に適したキャリアと、を、座瘡の治療に用いることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの皮膚に塗布される組成物で老化の影響や紫外線による影響から皮膚を保護し、このような影響を受けた状態から皮膚を回復させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明者らによる先の特許である、光老化についての米国特許第５，８３７，２２４号および米国特許第６，１３０，２５４号ならびに、年齢による老化についてのＷＯ９８／３６７４２号（それぞれの開示内容を本願明細書に援用する）には、紫外光線（ＵＶ）と時間（年齢）とがヒトの皮膚にどのような影響をおよぼすのかについて記載されている。ＵＶ光線または時間による影響を受けるか否かを問わず、ヒトの皮膚にはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が誘導される。この酵素によって真皮マトリックスではコラーゲンが分解され、分解されたコラーゲンはゆっくりと修復される。人間はＵＶ光線に曝露されることが多く常に老化していくため、こうした分解と修復のプロセスが絶えず繰り返されている。本願発明者らは、修復が不完全であると真皮マトリックスに小さな傷または小さな瘢痕が発生し、これが一ヶ所で積み重なると最終的にはその部分の皮膚に光老化および／または老徴といった臨床的な影響が出ると考えている。顔や手、前腕など体の特定の部分では光老化と年齢による老化の両方がほぼ日常的に皮膚で起こっているのに対し、体の他の部分では主な作用が年齢による老化であることは明らかであろう。
【０００３】
光障害と自然老化（老徴）では真皮のコラーゲンマトリックスが分解され、障害の発生した物質と真皮の線維芽細胞とが相互作用する。これらの変化は、組織学的（光学顕微鏡的な）レベルおよび超微細構造（電子顕微鏡的な）レベル、さらには生化学的にも評価可能なものである。自然老化皮膚や光障害の発生した皮膚に見られる臨床的な欠陥の根底には、こうした変化があると思われる。光老化皮膚においては真皮のコラーゲンマトリックスでの障害が光学顕微鏡レベルおよび電子顕微鏡レベルの両方で観察されている。すなわち、コラーゲン線維束はその数が減少してサイズが小さくなり、コラーゲンフィブリル自体にも超微細構造的な異常がある点に注意が向けられている。しかしながら、弾性線維状の物質が存在するがゆえに障害の構造的な形跡が「隠されて」しまい、障害を定量化するのは困難なことが多い。過去になされたいくつかの報告にあるように、臀部の皮膚など太陽光の当たらない皮膚では真皮全体にコラーゲン線維の大きな束が認められた。光学顕微鏡下（図１Ａ）と電子顕微鏡下（図１Ｃ）のどちらでもコラーゲンの束と密着した健常な線維芽細胞を観察することが可能であった。これに対し、前腕の皮膚など重い光障害の発生した皮膚はコラーゲンの束があまり見られず、多くの人では線維が乱れているのが特徴である。コラーゲンの束と束との間には弾性線維状の物質でふさがれていない空間があるが、この空間は大半が無細胞の壊死組織片で埋め尽くされている。障害の発生した皮膚の線維芽細胞の多くは、無傷のコラーゲンに接しているのではなく壊死組織片で囲まれていた。細胞の中には細長い形態ではなく丸い形態のものがあり、一部の例では２以上の細胞の集合体が存在していた。こうした特徴は光学顕微鏡検査（図１Ｂ）と電子顕微鏡検査（図１Ｄ）で観察される。よって、光障害の発生した皮膚で無傷のコラーゲンの相対量が減少すること、無細胞の壊死組織片があること、さらには真皮の線維芽細胞が無傷のコラーゲンではなくこの壊死細胞片と接触／相互作用することを確認する上で、電子顕微鏡検査が役立つことが明らかになった。
【０００４】
超微細構造解析でもコラーゲン線維自体の障害を示す形跡を得ることができる。光障害の発生した皮膚に含まれるコラーゲン線維の中には、全体の幅（およそ１５００Ａ（１５０ｎｍ））と周期とが太陽光の当たらない皮膚と同じものがあるが、これよりも短く薄いように見えるコラーゲン線維もある。コラーゲンの断片化を定量的に評価するために、本願発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで部分的に分解されたコラーゲンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでα−キモトリプシンによってさらに加水分解されやすいが、無傷のコラーゲンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの酵素に加水分解されにくいということを利用した。部分的に分解されたコラーゲンがα−キモトリプシンで消化されるとコラーゲンの断片が組織から遊離するため、ヒドロキシプロリンを測定することで遊離したコラーゲン断片を定量化することができる。したがって、α−キモトリプシン消化後のヒドロキシプロリンの含有量は、部分的に分解されたコラーゲンが組織中にどれだけ存在するかを知る上での指標となるのである。図２は、９例の個体から得た、重い光障害の発生した前腕皮膚と太陽光の当たらない臀部皮膚の対応試料をα−キモトリプシンで処理することで放出されるヒドロキシプロリンの量を比較した図である。光障害の発生した皮膚から放出された量は、これに対応する太陽光の当たらない皮膚から放出された量の３．６倍であった。
【０００５】
さまざまなクラスのＭＭＰ阻害剤について説明した「マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の設計と治療への応用（Design and Therapeutic Application of Matrix Metalloproteinase Inhibitors)」、Chem.Rev.1999、99、2735〜2776の著者であるＭ．ホイッタカー（Whittaker）らは、考え方（構造ベース対基質ベース）をまとめ、ＭＭＰ阻害剤の例をいくつかとこうした阻害剤が特定のＭＭＰを阻害する機能とを打ち出している。ＭＭＰには２３種類あり、このうちおよそ６種類が光老化と老徴に関してヒトの皮膚の観点から最も重要なものである。（ホイッタカー（Whittaker）らによれば）これらのＭＭＰとその主な基質は以下のとおりである。
【０００６】
【表１】
2004536781.tif 000002
【０００７】
さらに、ＭＭＰ−１４およびＭＭＰ−１６（いずれもプロＭＭＰ−２を分解する）も重要であるといえよう。
【０００８】
ＭＭＰ−１は、真皮マトリックスの主な成分であるＩ型コラーゲンを切断し、１／４と３／４の断片にする。この２つの断片はどちらもＭＭＰ−９とＭＭＰ−２によって切断され、さらに小さな細片になる。ＭＭＰ−９やＭＭＰ−２は無傷のコラーゲンを切断することはない。
【特許文献１】
米国特許第５，８３７，２２４号明細書
【特許文献２】
米国特許第６，１３０，２５４号明細書
【特許文献３】
国際公開第９８／３６７４２号パンフレット
【特許文献４】
米国仮特許出願第６０／０８０４３７号
【特許文献５】
係属中の米国特許出願第０９／２８５８６０号
【特許文献６】
米国特許第５，８３７，２２４号明細書
【特許文献７】
米国特許第６，１３０，２５４号明細書
【特許文献８】
国際公開第９８／３６７４２号パンフレット
【特許文献９】
国際公開第９８／１７６５５号パンフレット
【特許文献１０】
国際公開第０１／８９５０２（Ａ２）号パンフレット
【特許文献１１】
ＰＣＴ／ＵＳ０１／４１１５４号
【特許文献１２】
ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７２６７号
【非特許文献１】
Ｍ．ホイッタカー（Whittaker）ら、「マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の設計と治療への応用（Design and Therapeutic Application of Matrix Metalloproteinase Inhibitors）」、Chem.Rev.1999、99、2735〜2776．
【非特許文献２】
フィッシャー（Fisher）ＧＪら、「太陽光によって誘導される皮膚の早期老化とレチノイド拮抗作用の分子的機序（The molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism）」、Nature(London) 1966:379:335〜338．
【非特許文献３】
フィッシャー（Fisher）ＧＪら、「紫外線によって誘導される皮膚の早期老化の病態生理（Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light）」、New Eng.J.Med. 1977:337:1419〜1428．
【非特許文献４】
ＮＥＪＭ  １９７７：３３７  ｏｐ．  ｃｉｔ．
【非特許文献５】
グリフィスス（Griffiths）  ＣＥＭら、「光障害の発生したヒトの皮膚でのトレチノイン（レチノイン酸）によるコラーゲン形成の回復（Restoration of collagen formation in photodamaged human skin by tretinoin (retinoic acid)）」、New Eng.J.Med. 1993:329:530〜534．
【非特許文献６】
タルワール（Talwar）  ＨＳら、「光障害の発生した成人のヒトの皮膚におけるＩ型およびＩＩＩ型プロコラーゲンの減少（Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin）」、J.Invest.Dermatol. 1995:105:285〜290．
【非特許文献７】
ヴァラーニ（Varani）  Ｊら、「全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）が器官培養したヒトの皮膚で修復の発端となるイベントを刺激（All-trans retinoic acid (RA) stimulates events in organ-cultured human skin that underlie repair）」、J.Clin.invest. 1994:94:1747〜1753．
【非特許文献８】
ヴァラーニ（Varani）  Ｊら「自然な皮膚老化およびレチノイドによる修復と逆転の分子機構（Molecular mechanisms of intrinsic skin aging and retinoid-induced repair and reversal）」、J.Invest.Dermatol.(増補)1988:3:57〜60．
【非特許文献９】
カン（Kang）  Ｓら、「レチノールをｉｎ  ｖｉｖｏにてヒトの皮膚に適用すると、表皮過形成とレチノイン酸の細胞レチノイド結合タンパク質の特性とが見られるようになるが、測定可能なレチノイン酸レベルや刺激作用は認められない（Application of retinol to human skin in vivo induces epidermal hyperplasia and cellular retinoid-binding proteins characteristic of retinoic acid but without measurable retinoic acid levels or irritation）」、J.Invest.Dermatol. 1995:105:549〜556．
【非特許文献１０】
ミラー（Miller）Ａ．ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.、1997、7、193．
【非特許文献１１】
Chem.Abstr.、1999、128、308398．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
線維芽細胞がＭＭＰ−１で切断されたコラーゲン上にあると、これらの線維芽細胞の挙動に影響がおよぶのであるが、これは本願明細書において本願発明者らが示したのが最初である。特に、Ｉ型プロコラーゲンの合成が低減される。しかしながら、線維芽細胞がＭＭＰ−１とＭＭＰ−９の組み合わせで切断されたコラーゲン上にあると、それまでＭＭＰ−１切断産物のみの存在下にあった時に見られたような線維芽細胞の挙動に対する悪影響が緩和される。特に、ＭＭＰ−９も存在すれば、線維芽細胞がコラーゲン上のＭＭＰ−１の分解産物と接触しても線維芽細胞のＩ型プロコラーゲンの産生が抑制されることはない。
【００１０】
このため、本発明は、障害の原因とならない（本願発明者らによるｉｎ  ｖｉｔｒｏコラーゲンゲル系から実際の皮膚での場合を推定したものに基づく）上に、ＭＭＰ−１によって発生した障害を実際に「消滅」させて正常な皮膚機能を回復させる酵素（単数または複数）（ＭＭＰ−９と、おそらくＭＭＰ−２）を残しつつ、マトリックス障害の原因となる酵素（ＭＭＰ−１）を選択的に阻害しようとするものである。
【００１１】
特別の理論に拘泥されることは望ましくないが、本願発明者らは、ＭＭＰ−１によって無傷のコラーゲンから生成される断片には阻害的な作用があり、ＭＭＰ−１の作用で生成された断片はＭＭＰ−９の持つ前向きな効果によってさらに分解されるのであろうと考えている。
【００１２】
したがって、本発明の主な目的は、ＭＭＰ−１での切断によって生じたコラーゲン断片をＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−２で分解できるようにしつつ、特にヒトの皮膚へのＵＶ光線の曝露と年齢による老化作用とによって誘導されるＭＭＰ−１を選択的に阻害することにある。
【００１３】
本発明のもうひとつの目的は、ＵＶＡ遮断剤と、ＵＶＢ遮断剤と、ＭＭＰ−１に選択的な阻害剤との組み合わせを含む組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、ＭＭＰ−１に選択的な阻害剤をヒトの皮膚に局所的に適用することを含む、光老化および老徴に関連した前述の特許および出願を実施するための改善された方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
光障害の発生した皮膚と自然に老化した皮膚ではいずれも真皮のコラーゲンマトリックスが分解される。自然に老化した皮膚と光障害の発生した皮膚に見られる臨床的な欠陥の発端になっているのは図１Ａ〜図１Ｄおよび図２に示す変化であろうと思われる。たとえば、光老化した皮膚は見た目がざらざらして粗く、しわが見られるが、その原因はこうしたコラーゲンマトリックスに対する障害であると考えられる。光老化時にコラーゲンの障害がどのように引き起こされるかは完全には分かっていない。フィッシャー（Fisher）ＧＪら、「太陽光によって誘導される皮膚の早期老化とレチノイド拮抗作用の分子的機序（The molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism)」、Nature(London) 1966:379:335〜338、フィッシャー（Fisher）ＧＪら、「紫外線によって誘導される皮膚の早期老化の病態生理（Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light)」、New Eng.J.Med. 1977:337:1419〜1428に述べられているように、皮膚をＵＶ照射に曝露すると、皮膚コラーゲンを分解するＭＭＰの産生が一時的に上方制御される。数年または数十年間にわたってＭＭＰ誘導が繰り返されると、慢性的に太陽光の当たる皮膚のマトリックスに見られる障害が発生する。
【００１６】
本願発明者らならびに他の者たちによって、真皮のコラーゲンマトリックスでの障害が光老化皮膚において光学顕微鏡レベルおよび電子顕微鏡レベルの両方で少なくとも１９６６年という早い段階から観察されている。すなわち、コラーゲン線維束はその数が減少してサイズが小さくなり、コラーゲンフィブリル自体にも超微細構造的な異常がある点に注意が向けられている。しかしながら、弾性線維状の物質が存在するがゆえに障害の構造的な形跡が「隠されて」しまい、障害を定量化するのは困難なことが多い。透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を利用して、同一の個体から得た重い光障害のある皮膚とこれに対応する太陽光の当たらない皮膚におけるコラーゲンの構造的な特徴を比較した。こうした過去のいくつかの報告にあるように、太陽光の当たらない皮膚では真皮全体にコラーゲン線維の大きな束が認められた。図１Ａ（光学顕微鏡）と図１Ｃ（ＴＥＭ）のどちらでもコラーゲンの束と密着した健常な線維芽細胞を観察することが可能であった。これに対し、重い光障害の発生した皮膚はコラーゲンの束があまり見られず、多くの人では線維が乱れているのが特徴である。コラーゲンの束と束との間には弾性線維状の物質でふさがれていない空間があるが、この空間は大半が無細胞の壊死組織片で埋め尽くされている。障害の発生した皮膚の線維芽細胞の多くは、無傷のコラーゲンに接しているのではなく壊死組織片で囲まれていた。細胞の中には細長い形態ではなく丸い形態のものがあり、一部の例では２以上の細胞の集合体が存在していた。太陽光の当たる皮膚のこうした特徴を図１Ｂ（光学顕微鏡）および図１Ｄ（ＴＥＭ）に示す。以上のとおり、光障害の発生した皮膚は、無傷のコラーゲンの相対量が減少すること、無細胞の壊死組織片があること、さらには真皮の線維芽細胞が無傷のコラーゲンではなくこの壊死細胞片と接触／相互作用することの裏付けとなるものである。
【００１７】
超微細構造解析でもコラーゲン線維自体の障害を示す形跡を得ることができる。光障害の発生した皮膚に含まれるコラーゲン線維の中には、全体の幅（およそ１５００Å）と周期とが太陽光の当たらない皮膚と同じものがあるが、これよりも短く薄いように見えるコラーゲン線維もある。コラーゲンの断片化を定量的に評価するために、本願発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏで部分的に分解されたコラーゲンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでα−キモトリプシンによってさらに加水分解されやすいが、無傷のコラーゲンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの酵素に加水分解されにくいということを利用した。ｉｎ  ｖｉｖｏで部分的に分解されたコラーゲンがα−キモトリプシンで消化されるとコラーゲンの断片が組織から遊離するため、ヒドロキシプロリンを測定することで遊離したコラーゲン断片を定量化することができる。したがって、これらの試料のα−キモトリプシン消化後のヒドロキシプロリンの含有量は、部分的に分解されたコラーゲンが組織中にどれだけ存在するかを知る上での指標となるのである。図２は、９例の個体から得た、重い光障害の発生した前腕皮膚と太陽光の当たらない臀部皮膚の対応試料をα−キモトリプシンで処理することで放出されるヒドロキシプロリンの量を比較した図であり、光障害の発生した皮膚から放出された量がこれに対応する太陽光の当たらない皮膚から放出された量の３．６倍であることが分かる。
【００１８】
構造コラーゲンに対するタンパク質分解性の攻撃がプロセス全体の一部であることは疑いもないが、新たに合成されるコラーゲンが障害のあるコラーゲンに代わることができないと、時間の経過とともに太陽光の当たる皮膚の結合組織で生じる進行性かつ退行性の変化が助長される。NEJM 1977:337 op. cit.、グリフィスス（Griffiths）  ＣＥＭら、「光障害の発生したヒトの皮膚でのトレチノイン（レチノイン酸）によるコラーゲン形成の回復（Restoration of collagen formation in photodamaged human skin by tretinoin (retinoic acid))」、New Eng.J.Med. 1993:329:530〜534、タルワール（Talwar）  ＨＳら、「光障害の発生した成人のヒトの皮膚におけるＩ型およびＩＩＩ型プロコラーゲンの減少（Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin)」、J.Invest.Dermatol. 1995:105:285〜290。本願発明者らは、ＵＶＡ光線および／またはＵＶＢ光線に曝露された後ではヒトの皮膚でのコラーゲン生合成の減少が認められることを明らかにした。１９９８年４月２日にファイルされた米国仮特許出願第６０／０８０４３７号と、１９９９年４月２日にファイルされた係属中の米国特許出願第０９／２８５８６０号（その開示内容を本願明細書に援用する）。
【００１９】
現段階の最先端技術では、重い光障害の発生した皮膚でこのように線維芽細胞によるコラーゲンの合成が少なくなる発端となる機序が完全に分かっているわけではない。本願明細書で示す結果に基づき、本願発明者らは、ヒトの光老化皮膚では線維芽細胞によるＩ型プロコラーゲンのｉｎ  ｖｉｖｏでの合成が大幅に少なくなるが、細胞を皮膚から採取してｉｎ  ｖｉｔｒｏにて検査すると、太陽光による障害の発生した皮膚と同年齢での太陽光の当たらない皮膚とから得た線維芽細胞によるＩ型プロコラーゲンの増殖力や合成を区別することはできないという結論に至っている。光障害の発生した皮膚と太陽光の当たらない皮膚から同数の線維芽細胞を単離することが可能なことが本願発明者らのデータから明らかであり、また、本願発明者らのデータは、その線維芽細胞が（９例の異なる個体からの）両方の組織部位から得られる複数の分離片での結果に基づくものであるため、組織に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて太陽光の当たらない皮膚から得られる線維芽細胞と同じ表現型を呈する、光障害の発生した皮膚の細胞からなる小さな部分母集団によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでのデータが歪められる可能性は極めて低い。どちらかといえば、これらの研究から、太陽光によって重い障害の発生した皮膚でｉｎ  ｖｉｖｏにて観察されるプロコラーゲン産生量の減少が、線維芽細胞それ自体の合成力が落ちることによるものではないことが分かる。これらの観察結果と一致するものとして、健康な若い皮膚の器官培養に対して太陽光の当たった皮膚の器官培養ではコラーゲン（ならびにフィブロネクチン）の合成が少ないか検出できないことが過去に実証されている。ヴァラーニ（Varani）  Ｊら、「全トランス型レチノイン酸（ＲＡ）が器官培養したヒトの皮膚で修復の発端となるイベントを刺激（All-trans retinoic acid (RA) stimulates events in organ-cultured human skin that underlie repair)」、J.Clin.invest. 1994:94:1747〜1753、ヴァラーニ（Varani）  Ｊら「自然な皮膚老化およびレチノイドによる修復と逆転の分子機構（Molecular mechanisms of intrinsic skin aging and retinoid-induced repair and reversal)」、J.Invest.Dermatol.(増補)1988:3:57〜60。器官培養を、光老化皮膚でｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコラーゲンの発現を引き起こす濃度の全トランス型レチノイン酸で処理すると、これらのマトリックス成分の合成がいずれも正規化される。カン（Kang）  Ｓら、「レチノールをｉｎ  ｖｉｖｏにてヒトの皮膚に適用すると、表皮過形成とレチノイン酸の細胞レチノイド結合タンパク質の特性とが見られるようになるが、測定可能なレチノイン酸レベルや刺激作用は認められない（Application of retinol to human skin in vivo induces epidermal hyperplasia and cellular retinoid-binding proteins characteristic of retinoic acid but without measurable retinoic acid levels or irritation)」、J.Invest.Dermatol. 1995:105:549〜556。これらの過去の観察結果を総合すれば、重度に光老化した皮膚の線維芽細胞は（コラーゲンの産生に関して）自然に損傷するわけではないという本願発明者らの所見は、光障害の発生した皮膚を修復するためにコラーゲン合成を刺激するための全トランス型レチノイン酸などの因子を用いた治療目的での診療のための根拠となるものである。さらに、線維芽細胞はもともとプロコラーゲンを産生できないため、光障害の発生した（さらにおそらくは年齢により老化した）皮膚の環境に、線維芽細胞に対して悪影響をおよぼす何かがあるのではないかと思われる。後述の図３、図４および図５でこの考え方が裏付けられる。
【００２０】
真皮の線維芽細胞は重度に光老化した皮膚でも自然に障害を受けるようにはみえないため、重い光障害の発生した皮膚のｉｎ  ｖｉｖｏ環境内の阻害作用が何らかの形で影響し、もともとコラーゲンを産生できる細胞によるコラーゲン産生を妨げてしまう場合があるということになる。この推測については、無傷のコラーゲンと部分的に分解されたコラーゲンのゲルを用いて行った後述のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究によって裏付けられることになる。皮膚の線維芽細胞（新生児または成人のいずれか）を重合コラーゲンに加えたところ、これらの細胞は一瞬のうちに付着して広まり、増殖してＩ型プロコラーゲンを合成しつづけた。ところが一方、あらかじめコラゲナーゼに曝露したコラーゲンゲルに線維芽細胞を加えると、細胞成長とＩ型プロコラーゲンの合成が低下した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験からｉｎ  ｖｉｖｏにおいて起こりうることを推定するのは困難であるが、これらのデータは、断片化したコラーゲンの存在下では真皮の結合組織を維持する上で重要な線維芽細胞の機能が阻害されることを実証するものである。分解されたコラーゲンでは細胞成長とＩ型プロコラーゲンの産生がいずれも低下したが、プロコラーゲン産生量の減少率はさらに大きくなったことに注意されたい。
【００２１】
本願発明者らによる特許である、光老化についての米国特許第５，８３７，２２４号および同第６，１３０，２５４号明細書ならびに、年齢による老化についての国際公開第９８／３６７４２号パンフレットに記載されているように、紅斑（日焼け）を生じるレベルより低いＵＶレベルですら、ヒトの皮膚がＵＶ光線に曝露されるとＭＭＰが誘導される。これらの破壊的な酵素は太陽光の当たらない古い皮膚にもさらに高いレベルで存在する。上記の特許および特許出願は主に、レチノールおよびレチノイン酸などのレチノイド、バチマスタット（Batimastat）などの直接的に作用するＭＭＰ阻害剤ならびにＭＭＰ阻害活性を持つ他の化合物を用いて、ＵＶによるＭＭＰの誘導を防止するとともに高齢者の皮膚でＭＭＰレベルが自然に上昇するのを抑えることについて教示するものである。本願明細書に示す結果から、これらの教示内容は正確ではあるが、ヒトの皮膚に含まれる酵素のうち、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）であればコラーゲンを分解してＩ型プロコラーゲンの産生につなげるのに十分であるが、ＭＭＰ−９（９２−ｋＤのゼラチナーゼＢ）がＭＭＰ−１と一緒に含まれると、細胞の負の挙動が緩和されるという本願発明者らによる現段階での所見に照らしてみると不完全であることが分かる。
【００２２】
本願明細書にて述べる本願発明者らの特許および特許出願に記載の光老化および自然老化の機序についての知識に基づいて、これらの機序を妨害することで皮膚の老化を阻害または逆転させるための方法がいくつか提案されている。たとえば、レチノイドは障害のある皮膚の臨床的な特性を阻害して逆転させることが知られているが、このレチノイドが、ある意味では自然に老化した皮膚と光老化皮膚のどちらでもマトリックスメタロプロテイナーゼの形成を広範囲にわたって阻害する形で機能すると仮定されている。ＡＰ−１転写複合体の活性化が妨げられることでマトリックスメタロプロテイナーゼ同化のレチノイド阻害が生じる場合がある。また、マトリックスメタロプロテイナーゼによる皮膚障害を防止するためのもうひとつの方法にＥＧＦ−受容体の拮抗作用がある。これもマトリックスメタロプロテイナーゼの上方制御を幅広く阻害することで機能するのではないかと思われる。広範囲なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤についても、これらの酵素の機能を阻害する自己の能力によって機能しているのではないかと考えられた。これらの方法はいずれも、マトリックスメタロプロテイナーゼの産生または機能を幅広く阻害することを利用したものである。本発明はそうではない。すなわち、本発明は、障害の原因とならない（本願発明者らによるｉｎ  ｖｉｔｒｏコラーゲンゲル系から実際の皮膚での場合を推定したものに基づく）上に、ＭＭＰ−１によって発生した障害を実際に「消滅」させて正常な皮膚機能を回復させる酵素（単数または複数）（ＭＭＰ−９と、おそらくＭＭＰ−２）を残しつつ、マトリックス障害の原因となる酵素（ＭＭＰ−１）を選択的に阻害しようとするものである。ただし、本発明を使用する際にレチノイドおよび／またはＥＧＦＲ−受容体アンタゴニストを併用することを排除するものではなく、「併用」とは必ずしも同時とは限らないが同一の処置期間内に使用する（たとえば、夜間に選択的ＭＭＰ阻害剤を使用し、午前中にレチノイドを使用する）ことを意味する。
【００２３】
したがって本願発明者らは、ホイッタカー（Whittaker）らなどによる教示に従い、特定の阻害剤が選択的にどのＭＭＰを阻害するかを判断してはどうかと提案しているが、個別のＭＭＰについて基質を定義する教示内容ではない。たとえば、ホイッタカー（Whittaker）らの文献には１００を超えるＭＭＰ阻害剤が構造ごとに記載されているが、ＭＭＰ−９より優先してＭＭＰ−１を十分に選択的に阻害するものであると具体的に開示されているのは化合物２８（ミラー（Miller）Ａ．らによってBioorg.Med.Chem.Lett.、1997、7、193に記載されているまま引用）および化合物５３（ＷＯ９８１７６５５号およびChem.Abstr.、1999、128、308398に記載）だけである。たとえば、化合物２８はＩＣ５０値がＭＭＰ−１の場合で２０ｎＭ、ＭＭＰ−９の場合は２０００ｎＭ（選択性１００：１）であり、化合物５３はＩＣ５０値がＭＭＰ−１の場合で６ｎＭ、ＭＭＰ−９の場合は２０００ｎＭ（選択性３３３：１）である。ホイッタカー（Whittaker）らの文献における化合物５２（Ｒｏ３２−３５５５）などの化合物は選択性が約２０：１（ＭＭＰ−１の場合に３ｎＭであるのに対してＭＭＰ−９では５９ｎＭ）であるが、これはおそらく臨床レベルでは十分な値であろう。上述したように皮膚の健康にとって有害であると思われるのはＭＭＰ−１によってＩ型コラーゲンが切断されて生じる分解産物であり、適切なレベルのＭＭＰ−９活性が存在する限りはこれらの産物は真皮マトリックスから排除されることになるためである。上述したように、ＭＭＰ−２を阻害せずにおいても害があるものではなかろう。ホイッタカー（Whittaker）らの化合物５３はＩＣ５０値がＭＭＰ−１の場合で６ｎＭ、ＭＭＰ−２の場合は９００ｎＭ（選択性１５０：１）である。化合物５２（Ｒｏ３２−３５５５）はＩＣ５０値がＭＭＰ−１の場合で３ｎＭ、ＭＭＰ−２の場合は１５４ｎＭであり、ＭＭＰ−９の場合は５９ｎＭである。すなわち、ゼラチナーゼに優先してのコラゲナーゼに対する選択性が少なくとも２０：１である。
【００２４】
上記の実験はＭＭＰ−１に対して行ったものではあるが、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３についてもＭＭＰ−１と同様に有害である可能性が高い。したがって、ＭＭＰ−９より優先してＭＭＰ−８に対してそれぞれ約１５：１および１０：１の選択性を示す、上述した化合物５２および５３などの化合物ならびに、化合物８０（選択性が３５０：１を上回る）が各々本発明において有用である可能性が高い。
【００２５】
本願発明者らの出願である国際公開第０１／８９５０２（Ａ２）号パンフレット（その開示内容を本願明細書に援用する）には、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１を阻害して座瘡による炎症および瘢痕化を防ぐことが説明されている。本発明の恩恵を受けて改善される処置といえば、ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２ではなく上記のＭＭＰの阻害に選択的な化合物を用いてそれぞれを阻害できることであろう。
【００２６】
本願発明者らの出願である国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４１１５４号（その開示内容を本願明細書に援用する）には、ＥＧＦ−Ｒタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を局所的に適用してＭＭＰの誘導を防ぐことが説明されている。本発明の恩恵を受けて改善される処置といえば、ＭＭＰ−９および任意にＭＭＰ−２ではなく上記のＭＭＰの阻害に選択的な化合物を用いてそれぞれを相伴って阻害できることであろう。
【００２７】
［実験］
太陽光による重い障害の発生した前腕皮膚から得た皮膚試料と、これに対応する同一個体から得た太陽光の当たらない臀部の皮膚とについて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いてＩ型プロコラーゲンの遺伝子発現を評価し、免疫染色を用いてＩ型プロコラーゲンタンパク質を評価した。太陽光の当たらない臀部の皮膚と比較して、光障害の発生した前腕皮膚では、ｍＲＮＡと細胞内タンパク質の両方が減少した（それぞれおよそ６５％および５７％）。
【００２８】
次に、本願発明者らは、Ｉ型プロコラーゲン産生量の減少が重い光障害の発生した前腕皮膚での皮膚線維芽細胞のプロコラーゲン合成能がもともと落ちることによるものであるのか否か、あるいは光障害の発生した皮膚内の環境が影響してこれらの線維芽細胞でのＩ型プロコラーゲンの合成が下方制御されるのか否かについての調査を行った。この研究のために、光障害の発生した皮膚とこれに対応する太陽光の当たらない皮膚から得た線維芽細胞を培養中で得た。上記の２つの皮膚部位から同じ数ずつ線維芽細胞を単離した。これらの２つの部位から得た線維芽細胞は成長力が同等であり、培養中で事実上同量のＩ型プロコラーゲンタンパク質を産生した。
【００２９】
したがって、線維芽細胞によるＩ型プロコラーゲン合成の低減が皮膚の光障害の発生した環境によるものである可能性は十分にある。太陽光の当たらない皮膚では、コラーゲンフィブリルが高度に組織化されたマトリックスとして存在する。線維芽細胞はコラーゲン線維とはほぼ反対でコラーゲンマトリックス内に見られる。光障害の発生した皮膚では、コラーゲンフィブリルが薄く短くなって組織が乱れ、部分的に分解されたコラーゲンの量が光障害の発生した皮膚で太陽光の当たらない皮膚の場合と比べておよそ３．６倍になる。また、線維芽細胞のなかには壊死組織片（すなわち、真皮の分解されたコラーゲンマトリックス）で囲まれたものもある。
【００３０】
光障害の発生した皮膚でこの環境をモデル化するために、無傷のコラーゲン上あるいはコラーゲン分解性の酵素と接触して部分的に分解されたコラーゲン上で、ヒトの皮膚の線維芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した。コラーゲン分解性の酵素（バクテリアまたはヒトの皮膚由来）と接触して部分的に分解されたコラーゲンでは真皮の線維芽細胞の存在下で収縮が起こったが、無傷の（分解されていない）コラーゲンでは収縮は起こらなかった。コラーゲン分解性の酵素と接触して分解されたコラーゲン上で培養した線維芽細胞では増殖力の低下（バクテリアコラゲナーゼまたはヒト皮膚コラゲナーゼによって分解されたコラーゲンで約２０％低下）が見られ、細胞１個あたりのＩ型プロコラーゲン合成量が少なくなった。これらの所見から、（i）光老化皮膚から得た線維芽細胞と太陽光の当たらない皮膚から得た線維芽細胞は成長する能力とＩ型プロコラーゲンを産生する能力の点で同等であり、（ii）分解されたコラーゲンの環境にある線維芽細胞ではＩ型プロコラーゲンの合成量が少なくなることが分かる。
【００３１】
たとえば皮膚の粗さやしわの度合いなどの臨床基準に基づいて、前腕に重い光障害があることが特徴である有志を合計４２名（２２名が男性、２０名が女性）募った。彼らの年齢の範囲は４６〜８３歳、平均年齢は６９歳であった。全体の厚さが４ｍｍの反復した（replicate）パンチ生検組織を各個体の前腕皮膚と太陽光の当たらない臀部の皮膚から得た。（ヒトの被験者がかかわる手順についてはいずれもミシガン大学施設内倫理委員会による承認を得ており、被験者は全員が研究に加わる前に書面によるインフォームドコンセントを得られるようにした。）本願発明者らは上記の個体のうち１８名で太陽光の当たらない腋下皮膚ならびに他の２つの部位（前腕および臀部）の皮膚の生検組織を得ることができた。全体的にみて、腋下および臀部の部分における太陽光の当たらない皮膚は、コラーゲン断片化、線維芽細胞の単離速度、増殖およびコラーゲン合成のパラメータに関して同等であった。
【００３２】
本願発明者らの出願であるＰＣＴ／ＵＳ９９／０７２６７号（その開示内容を本願明細書に援用する）に記載されているように、本願発明者らは、図３に示すとおり重い光障害の発生した皮膚と太陽光の当たらない皮膚でのＩ型プロコラーゲンの遺伝子発現およびＩ型プロコラーゲンタンパク質の発現の欠陥を再度見出した。この出願に記載されているように、ＵＶ光線に曝露されるとヒトの皮膚への損傷が２倍になる。すなわち、コラーゲンを分解するＭＭＰが誘導されると同時に、コラーゲン生合成が阻害されるのである。本件の有志によって、本願発明者らは、図４に示すとおり、臀部から得た太陽光の当たらない皮膚と比較した場合に重い光障害の発生した前腕皮膚でＩ型プロコラーゲン（α１）ｍＲＮＡを発現する細胞数がおよそ６５％少なくなることを見出した。免疫組織学的な結果がこれらの調査結果の裏付けとなった。すなわち、太陽光の当たらない皮膚のＩ型プロコラーゲンの量と比較すると、太陽光の当たった皮膚のＩ型プロコラーゲンの量が大幅に少なくなる（約５７％）ことが明らかになった。
【００３３】
次に、本願発明者らは、こうしたコラーゲン生合成の減少に関するさらに詳しい情報を確認するよう努めた。光老化皮膚で線維芽細胞のコラーゲン合成活性が永久に機能しないことから、上記のような結果になるのであろう。したがって、本願発明者らは、光障害の発生した前腕皮膚（３３％）の１０８の断片から合計３６の線維芽細胞分離片を得、太陽光の当たらない臀部の皮膚（３５％）の１２２の断片から４３の分離片を得た。おそらく、驚いたことに、２日後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖によって、前腕（太陽光が当たる）と臀部（太陽光の当たらない）の皮膚の両方からの分離片で同等数の細胞（図５Ａ）と同等量のプロコラーゲンタンパク質（図５Ｂ）が得られた。したがって、太陽光の当たるヒトの皮膚の線維芽細胞は増殖能を失っておらず、コラーゲンを産生する力も失っていないように思われる。
【００３４】
よって、本願発明者らは、線維芽細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ環境における何らかの要因がこれらの細胞のコラーゲン産生機能を阻害したのか否かを確認するよう努めた。本願発明者らは、重合コラーゲンゲルを（下記の方法および材料のセクションで説明するようにして）調製し、これらの基質を基底細胞癌の馴化培地からバクテリアコラゲナーゼまたはヒト皮膚コラゲナーゼのいずれかで処置した。本願発明者らは、バクテリアコラゲナーゼおよびヒト皮膚コラゲナーゼがモノマーコラーゲンを分解する能力を判断するための実験を行った。この結果を図６に示す。これらの結果に基づいて、本願発明者らは酵素の濃度を標準化した。
【００３５】
バクテリアコラゲナーゼを最大でゲルあたり２００ｎｇ、腫瘍の培養液をゲルあたり２００μlという高濃度の酵素で、コラーゲンゲルを別々に処理した。ゲルは重合をつづけ、未処理のゲルと区別することはできないように見えた。真皮の線維芽細胞（細胞８×１０４個）を未処理および処理した／部分的に分解されたコラーゲンゲルに蒔いた。その後１から２日で細胞は未処理のゲルの表面にひろがり、なかにはゲル中に移行したものもあった。処理を施したゲルでも最初は細胞が表面に拡がり、ゲル中に移行していったが、その後細胞同士の凝集が起こり、このときに凝集した細胞の周囲でコラーゲンが収縮した。これらの結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。細胞を蒔いた未処理のゲル断面である図７Ａでは、上面に線維芽細胞が認められ、他の細胞はゲル中に比較的一様に分散されている。一方、断面である図７Ｂでは細胞同士の凝集が認められる。図７Ｃは、未処理のゲル上で電子顕微鏡下にて多くの形態を持つ線維芽細胞を示した図である。線維芽細胞はコラーゲン線維の近くにあり、コラーゲン線維と頻繁に接触していた。図７Ｄから明らかなように、この場合も未処理のゲルの場合とは対照的にコラーゲン分解壊死組織片で囲まれた線維芽細胞では形態形成が低下し、細胞と無傷のコラーゲン線維との間の接触がほとんどなかった。突き詰めると、処理済みの（分解された）コラーゲン上の線維芽細胞が分解壊死組織片によって無傷のコラーゲンから分離されるようになっていた。
【００３６】
図８Ａ〜図８Ｃにコラーゲンの分解と線維芽細胞活性との関係を示す。これら３枚の図ではいずれもコラーゲンの収縮（すなわち、コラーゲン鎖、コラーゲン分解の短縮化）を指標として使用する。図８Ａは、コラゲナーゼとこれによるコラーゲンの収縮量との用量依存性の関係を示している。図８Ｂは、コラーゲンゲルに適用したメタロプロテイナーゼがコラーゲン収縮の原因であったという証拠を示している。バクテリアコラゲナーゼに１０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を加えたものにゲルを曝露し、続いてカルシウムイオン（Ｃａ２＋）源でＥＤＴＡを中和すると、コラーゲンの収縮は起こらなかった。同様に、アプロチニン１０μｇまたはメタロプロテイナーゼ−２のヒト組換え組織阻害剤（ＴＩＭＰ−２）１０μgの存在下でヒト皮膚コラゲナーゼでゲルを処理した場合、コラーゲンの収縮はＴＩＭＰ−２で阻害されたがアプロチニンでは阻害されなかった。図８Ｃは、コラーゲンの収縮が線維芽細胞活性に左右されたことを示している。基本的には細胞４〜８×１０４個で十分な収縮が起こり、細胞２×１０４個という少ない数で部分的な収縮が起こり、細胞約１×１０４個では収縮は観察されなかった。
【００３７】
無傷のコラーゲンゲル上とバクテリアコラゲナーゼまたはヒトコラゲナーゼ酵素のいずれかによって部分的に分解されたゲル上の線維芽細胞によるＩ型プロコラーゲンの産生および細胞成長を評価した。これらの研究のために、４種類の成人分離片（２つは前腕から、残りの２つは臀部から採取）と新生児の（包皮）線維芽細胞の分離片５種類とを用いた。コラーゲンをバクテリアコラゲナーゼで分解したかヒト皮膚コラゲナーゼで分解したかとは関係なく、細胞成長（図９Ａに示す）と産生されるＩ型プロコラーゲンの量（図９Ｂに示す）のいずれも無傷のコラーゲンの場合よりも部分的に分解されたコラーゲンでの場合の方が値が小さかった。試験を行った新生児および成人のすべての真皮線維芽細胞分離片で細胞成長およびＩ型プロコラーゲン同化の減少が観察された。
【００３８】
図１０Ａ〜図１０Ｃおよび図１１Ａ〜図１１Ｃは、別のＭＭＰがコラーゲンの収縮に影響することを示すさらに他の証拠となるものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて図１０Ａ〜図１０Ｃのゲルを分離した。図１０Ａのレーン１は無傷のコラーゲンであり、α１（Ｉ）とα２（Ｉ）の２本のバンドが目に見える。図１０Ａのレーン２は、ＭＭＰ−１によるコラーゲン消化後の３／４の断片と１／４の断片とを示している。図１０Ａのレーン３および４は、ＭＭＰ−１では分解されたコラーゲンをＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９が分解しなかったことを示している。上述したように、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はコラゲナーゼではなくゼラチナーゼである。
【００３９】
コラーゲンを５分間で６０℃まで加熱してゼラチンを生成する。この処理によって、コラーゲンの三重らせん構造がほぐれ、酵素分解に必要な多数の部位が露出する。図１０Ｂのレーン１はこのようにして得られるゼラチンを示している。図１０Ｂのレーン２はゼラチンをＭＭＰ−２に曝露した場合の分解産物を示し、レーン３はゼラチンをＭＭＰ−９に曝露した場合の分解産物を示している。これらのゼラチナーゼはそれぞれ最初のゼラチンを切断し、ゼラチンの切断によって生じる断片もさらに切断するといった具合である。
【００４０】
図１０Ｃは、実際のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果に基づいてはいるが、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼの両方が存在することでのｉｎ  ｖｉｖｏにおける影響をシミュレーションしたものである。図１０Ｃのレーン１は制御コラーゲンであり、レーン２はＭＭＰ−１が存在する場合の分解産物を示している。レーン３はＭＭＰ−１とＭＭＰ−２の両方が存在する場合のコラーゲンの分解産物を示す。図１０Ａのレーン２と図１０Ｃのレーン２および３とを比較すると、いずれにおいても分解産物（３／４および１／４の断片）があることは理解できよう。これはコラーゲンにＭＭＰ−１の影響をもたらす分解産物である。図１０Ｃのレーン４はＭＭＰ−１とＭＭＰ−９の両方が存在する場合のコラーゲンの分解産物を示している。すなわち、ＭＭＰ−１によって生じた３／４および１／４の断片が抄出する。ＭＭＰ−９の活性は用量依存的かつ時間依存的である。この活性は、ＭＭＰ−１でコラーゲンを処理するのと同時にまたはこの処理の後にみられる場合がある。ＭＭＰ−２をＭＭＰ−１と併用した場合にＭＭＰ−１とＭＭＰ−９との組み合わせの場合と同じ結果が得られないのはなぜなのか、本願発明者らには定かではない。また、それは、濃度がさらに高いおよび／またはインキュベーション時間がさらに長くなったことで上記の結果が得られていた可能性もある。
【００４１】
図１０Ａ〜図１０Ｃから得られるデータを図１１Ａ〜図１１Ｃに示す結果と組み合わせて見ると一層有意義である。上記の実験で用いたのと同じ手順で、本願発明者らは、無傷のコラーゲン、ＭＭＰ−１で処理したコラーゲン、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−２との組み合わせで処理したコラーゲン、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−９との組み合わせで処理したコラーゲン上でインキュベートした線維芽細胞の応答を判定した。図１１Ａ乃至図１１Ｃは、線維芽細胞がコラーゲンを収縮させる能力（図１１Ａ）、線維芽細胞の増殖（図１１Ｂ）、線維芽細胞によるプロコラーゲンの産生（図１１Ｃ）をそれぞれ示している。これらの３つの図から明らかなように、ＭＭＰ−１しか存在しないと、増殖が減って線維芽細胞がプロコラーゲンを産生する能力が減少し、コラーゲンの収縮が多くなる。しかしながら、ＭＭＰ−１との組み合わせでＭＭＰ−９があると、線維芽細胞の増殖とプロコラーゲンの産生が可能になり、コラーゲンの収縮を防ぐことにより、上記のような結果になることはなくなる。
【００４２】
［材料および方法］
電子顕微鏡検査。ｐＨ  ７．４で０．１Ｍのココジレート（cocodylate）緩衝液中で電子顕微鏡グレードの４％グルタルアルデヒドに前腕および臀部の皮膚から得た皮膚の生検組織を一晩固定した。０．１Ｍココジレート緩衝液で希釈した２％四酸化オスミウムでの後固定に続いて、アルコール系列、１００％アルコール中で２回、プロピレンオキシド中で２回の順に切片を脱水した。純粋なエポン樹脂に試料を包埋した。１ミクロンの組織切片を切り出し、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡レベルで検査した。対象となる部分から超薄切片を切り、クエン酸鉛および酢酸ウラニルで染色して、フィリップス４００透過電子顕微鏡で観察した。
【００４３】
ヒトの皮膚でのコラーゲン分解の評価。前腕および臀部の皮膚から得た皮膚生検組織をトリス緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．３）にて均質化し、遠心処理した。コラーゲンの細胞外マトリックスを含むペレットをα−キモトリプシン７５ｍｇを含有するトリス緩衝液１５０ｍｌに再懸濁させ、３７℃にて８時間インキュベートした。均質化処理後に緩衝液だけの中でインキュベートした皮膚生検組織のペレットを対照として利用した。インキュベーション時間の最後に、１０，０００×ｇにて１０分間反応チューブを遠心処理した。上清を回収し、自動アミノ酸解析を用いてヒドロキシプロリンを分析した。無傷のフィブリル型コラーゲンとは異なり、部分的に分解されたコラーゲンについてはさらに細かく分解することが可能であり、α−キモトリプシンによって組織から加水分解産物が遊離した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンに含まれる変性アミノ酸であるが、他のタンパク質に見られることはほとんどないものであるため、これを測定することで放出されたコラーゲン加水分解産物の量を求めることができる。
【００４４】
ヒトの皮膚でのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩ型プロコラーゲン合成の評価。Ｉ型プロコラーゲンｍＲＮＡおよびタンパク質のアッセイを利用して、皮膚試料中のコラーゲンを同化する細胞を識別して定量化した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでＩ型プロコラーゲン（ａ１）遺伝子発現を評価した。新鮮な皮膚試料をＯＣＴに浸漬し、液体窒素中にて凍結させた。ジゴキシゲニンで標識したＩ型プロコラーゲンのアンチセンスおよびセンスｃＲＮＡプローブで凍結切片（６ｍｍ）をハイブリダイズした。光学顕微鏡下で計数してＩ型プロコラーゲン（ａ１）ｍＲＮＡを発現している細胞を定量化した。Ｉ型プロコラーゲンタンパク質を免疫組織学的に評価した。ヒトＩ型プロコラーゲン（ａ１鎖）に対する２種類のマウスモノクローナル抗体（ＳＰ１．Ｄ８およびＭ３８）および免疫ペルオキシダーゼ複合二次抗体のうちいずれか一方で凍結切片（６ｍｍ）を染色した。ＳＰ１．Ｄ８抗体はハインツ・フルツマイヤー（Heinz Furthmayr）博士が開発したものであり、ＮＩＣＨＤの下でアイオワシティＩＡ  ５２２４２にあるアイオワ大学生体科学部門（Department of Biological Sciences、University of Iowa,Iowa City,IA 52242）に登録された発達研究用ハイブリドーマバンク（Developmental Studies Hybridoma Bank）から入手した。Ｍ３８抗体の方は日本の滋賀県にあるタカラバイオ株式会社から入手した。染色した切片を光学顕微鏡で検査した。細胞染色量を目視で評価し、０、０．２５、０．５、０．７５または１で採点した。
【００４５】
定量的線維芽細胞成長アッセイ。皮膚試料を切断して小さな断片（生検組織４ｍｍあたり断片１２〜１５個）とし、各断片を９６穴のプレートの各ウェルに別々に入れた。非必須アミノ酸と１０％ウシ胎仔血清（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）とを添加したダルベッコ改変イーグル最小基本培地にて、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿室中で最長で１ヶ月、組織断片をインキュベートした。インキュベーション時間の最後に線維芽細胞を生成した組織断片数を求め、インキュベートした組織断片の総数に対する比率で表した。スピンドル状の形態、ビメンチンの抗体との反応性、ケラチンの抗体との反応性の欠如を基準に、細胞を線維芽細胞と定義した。このようにして単離された線維芽細胞を継代培養せずに使用するか、あるいは１〜２回継代した上で使用した。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩ型プロコラーゲン合成と線維芽細胞増殖の評価。光障害の発生した前腕および太陽光の当たらない臀部の皮膚から培養した線維芽細胞を、２４穴培養プレートの１穴あたり細胞を８×１０４個としてＤＭＥＭ−ＦＢＳに蒔いた。細胞が付着して広がることができるようにした後、１．４ｍＭのＣａ２＋（最終濃度）を加えたＭＣＤＢ−１５３基本培地（メリーランド州ウォーカーズヴィル（Walkersville）のクロンテック・インコーポレイテッド（Clonetics Inc.））で細胞を２回洗浄し、３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。２日間のインキュベーション時間の最後に、Ｃａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３で細胞を２回洗浄し、３７℃および５％ＣＯ２でさらに１時間インキュベートした。１時間培養した後の培養液を回収し、酵素免疫測定法（タカラバイオ株式会社）を用いてＩ型プロコラーゲンタンパク質を分析した。予備研究から、８×１０４個の真皮線維芽細胞によって調節した培地での免疫反応性Ｉ型プロコラーゲンの蓄積速度が少なくとも２時間にわたって線形であることが明らかになった。培地を収集した後に、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡに軽く曝露して収集し、粒子計数器を用いて計数した。
【００４７】
重合コラーゲンゲルの調製。ラット尾コラーゲン（１ＮのＨＣｌ中４．７ｍｇ／ｍｌ）（マサチューセッツ州ベッドフォード（Bedford）にあるコラボレーティブ・バイオメディカル・プロダクツ（Collaborative Biomedical Products）製）をＣａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３で１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。この溶液を、適当な量のハンクス平衡塩類溶液１０倍濃縮液を加えて等張とし、ｐＨを７．２に調整した。このコラーゲン溶液を２４穴プレートの穴に入れ（０．５ｍｌ／穴）、３７℃にて２時間インキュベートした。この間にコラーゲンの重合ゲルが形成された。
【００４８】
コラーゲン分解酵素の調製。ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）（Ｉ型コラゲナーゼ；ニュージャージー州フリーホールド（Freehold）のウァージントン・バイオケミカル・コーポレーション（Worthington Biochemical Corp）製）から入手したコラーゲン分解性酵素標本を用いてコラーゲンを断片化した。この酵素標本は１０５ｋＤおよび５５ｋＤでコラーゲン分解活性を持つ。この活性が存在することについては、酵素電気泳動法でｂ−カゼインではなくゼラチンおよびモノマーコラーゲンと反応することで立証された。反応性は一晩インキュベーションするときの緩衝液に１０ｍＭのＥＤＴＡを含有させると失われた。バクテリア酵素標本によってさまざまな部位で無傷のコラーゲンが切断され、低分子量の断片が生成された。ラット尾（モノマー）コラーゲン１ｍｇを３７℃で５時間さまざまな濃度の酵素標本に曝露して、コラーゲン分解活性を定量化した。緩衝液のみに曝露した無傷のコラーゲンを対照として用いた。インキュベーション時間の最後に、対照のコラーゲンと酵素処理したコラーゲンとをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。レーザデンシトメトリーを用いて無傷の標本と消化後の標本のａ１（Ｉ）およびａ２（Ｉ）バンドを定量化した。反応混合物に１０ｍＭのＥＤＴＡを含有させると、検出可能なコラーゲン分解は発生しなかった。
【００４９】
ヒトの皮膚からのコラーゲン分解酵素のソースとしてヒト基底細胞癌腫組織を利用した。外科手術時に得られた新鮮な腫瘍検体を切断して２ｍｍの細片にし、Ｃａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３を０．５ｍｌ中にて６〜８個の組織細片を７２時間インキュベートした。インキュベーションは３７℃および５％ＣＯ２で行った。インキュベーション時間の最後に培養液を得て酵素ソースとして利用した。基底細胞腫瘍から得られた馴化培地には、大量の活性ＭＭＰ−１以外に少量のＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼ）およびＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）も含まれている。さらに、ゼラチン溶解性酵素（たとえばＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）の活性形態も存在する。本研究では、ゼラチン、コラーゲン、ｂ−カゼインを用いた酵素電気泳動法を利用し、これらの活性が存在することを確認した。また、上述したようにモノマーコラーゲンの消化に続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を行ってコラーゲン分解活性を定量化した。バクテリア酵素標本での場合と同様に、インキュベーション緩衝液に１０ｍＭのＥＤＴＡが含まれると酵素電気泳動活性が抑制された。また、反応混合物中に１０ｍＭのＥＤＴＡが含まれるとコラーゲン分解が抑制された。
【００５０】
バクテリア酵素標本またはヒト皮膚酵素標本のいずれかをさまざまな量で用いて、３７℃にて５時間、重合コラーゲンゲルを処理した。インキュベーション時間の最後に、コラゲナーゼ溶液をデカントした。重合コラーゲンゲルを１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１４ｍＭのＣａ２＋に順に曝露し、続いてＣａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３で十分にすすいだ。
【００５１】
重合コラーゲンゲル上の線維芽細胞による、コラーゲン収縮とＩ型プロコラーゲンの合成の評価。成人線維芽細胞の４種類の分離片（２つは前腕から、残りの２つは臀部から採取）と新生児の包皮線維芽細胞の分離片５種類とを１〜２継代でコラーゲンゲルに加え、１培養あたりの最終濃度を細胞１〜８×１０４個とした。このために、Ｃａ２＋含有ＭＣＤＢ−１５３培地に、表皮成長因子０．１ｎｇ／ｍｌと、インスリン０．５ｍｇ／ｍｌと、２％下垂体エキスとをさらに加えた。細胞を４日間インキュベートし、２日目に新鮮な培地を与えた。コラーゲンゲルの収縮は２日間の期間を経過したところで発生した。２日目に、接眼レンズ部分に較正用のグリッドのある顕微鏡を用いてコラーゲンゲルの直径を測定した。このアッセイでのコラーゲンの収縮はコラーゲン線維に対する線維芽細胞の結合によって左右され、細胞それ自体にアクチンおよびミオシンスライディング（ｓｌｉｄｉｎｇ）線維による収縮が起こるときに線維が引っ張られる。
【００５２】
インキュベーション時間の最後（４日目）に培養液を除去し、Ｃａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３でコラーゲンゲルを２回すすいだ（成長因子の追加なし）。新鮮な培地（成長因子なしのＣａ２＋加ＭＣＤＢ−１５３）を穴に加え、さらに１時間インキュベートした。１時間培養した後の培養液を回収し、上述したようにＥＬＩＳＡでＩ型プロコラーゲンを分析した。次に、高濃度のバクテリアコラゲナーゼ標本（１００μｇで２時間）およびトリプシン（０．５％で１５分間）を用いての連続処理によってコラーゲンゲルから細胞を放出し、これを計数した。
【００５３】
上記の説明は一例にすぎず、何ら限定を意図したものではない。本願明細書を熟読することで、さまざまな変更、改変、追加を施し得ることは当業者であれば明らかであり、このような変更や改変、追加も特許請求の範囲で定義される本発明の範囲および趣旨に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】太陽光の当たらない（臀部）皮膚と太陽光に曝露された（前腕）皮膚から得られるｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚生検組織の光学顕微鏡検査（図１Ａおよび図１Ｂ）および電子顕微鏡検査（図１Ｃおよび図１Ｄ）結果を示している。
【図２】重い光障害の発生した前腕皮膚と太陽光の当たらない臀部皮膚の対応試料をα−キモトリプシンで処理することで放出されるヒドロキシプロリンの量を比較した図である。
【図３】重い光障害の発生した皮膚（前腕）と太陽光の当たらない皮膚（臀部）におけるＩ型プロコラーゲンタンパク質の発現を示す図である。
【図４】重い光障害の発生した前腕皮膚でＩ型プロコラーゲン（α１）ｍＲＮＡを発現している細胞数を臀部の太陽光の当たらない皮膚での場合と比較して示す図である。
【図５Ａ】太陽光による障害の発生した（前腕）皮膚と太陽光の当たらない（臀部）から線維芽細胞を抽出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養した後における、細胞数についての結果を示す図である。
【図５Ｂ】太陽光による障害の発生した（前腕）皮膚と太陽光の当たらない（臀部）から線維芽細胞を抽出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養した後における、Ｉ型プロコラーゲンについての結果を示す図である。
【図６】バクテリアコラゲナーゼとヒト皮膚コラゲナーゼがモノマーコラーゲンを分解する能力を求めた結果を示す図である。
【図７】Ａは、上面に線維芽細胞が認められ、他の細胞はゲル中に比較的一様に分散された、細胞を蒔いた未処理のゲル断面の光学顕微鏡検査を示す図であり、Ｂは、細胞同士の凝集が認められる分解後のコラーゲンの同様の断面であり、Ｃは、未処理のコラーゲンゲル上で多くの形態を持つ線維芽細胞の電子顕微鏡検査写真であり、Ｄは、形態形成が低下し、細胞と無傷のコラーゲン線維との間の接触がほとんどない、コラーゲン分解壊死組織片で囲まれた線維芽細胞の同様の電子顕微鏡検査写真である。
【図８Ａ】コラゲナーゼとこれによるコラーゲンの収縮量との用量依存性の関係を示している。
【図８Ｂ】コラーゲンゲルに適用したメタロプロテイナーゼがコラーゲン収縮の原因であったという証拠を示している。
【図８Ｃ】コラーゲンの収縮が線維芽細胞活性に左右されたことを示している。
【図９Ａ】細胞成長を示している。
【図９Ｂ】コラーゲンがバクテリアコラゲナーゼによって分解されたかヒト皮膚コラゲナーゼによって分解されたか否かを問わず、部分的に分解されたコラーゲンと無傷のコラーゲンとで生成されるＩ型プロコラーゲンの量を示している。
【図１０Ａ】図１０Ａのレーン１は目に見えるコラーゲンのα１（Ｉ）バンドとα２（Ｉ）バンドとを含む無傷のコラーゲンであり、図１０Ａのレーン２はＭＭＰ−１でのコラーゲン消化後の３／４の断片と１／４の断片とを示し、図１０Ａのレーン３および４はＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９がＭＭＰ−１のようにコラーゲンを分解することはなかったことを示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂのレーン１は、５分間でコラーゲンを６０℃まで加熱することで生成される、結果として生じるゼラチンを示し、図１０Ｂのレーン２および３はゼラチンをＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９にそれぞれ曝露した場合の分解産物を示している。
【図１０Ｃ】図１０Ｃのレーン１は対照のコラーゲンであり、レーン２はＭＭＰ−１をコラーゲンに提示した場合の分解産物を示し、レーン３はＭＭＰ−１とＭＭＰ−２の両方が存在する場合のコラーゲンの分解産物を示し、図１０Ｃのレーン４はＭＭＰ−１とＭＭＰ−９の両方が存在する場合のコラーゲンの分解産物を示している。すなわち、ＭＭＰ−１によって生成された３／４の断片と１／４の断片が消失する。
【図１１Ａ】線維芽細胞がコラーゲンを収縮させる能力を示している。
【図１１Ｂ】線維芽細胞の増殖を示している。
【図１１Ｃ】線維芽細胞によるプロコラーゲンの産生を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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