(57)【要約】２つ以上の異なるペプチドからなるフィブリルが開示される。これらのペプチドは関連性があり得るし、または非関連性であり得る。本発明のフィブリルは、生体材料およびナノ材料として様々な用途を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の異なるペプチドを含むアミロイドフィブリル。
【請求項２】
ペプチドが非関連である、請求項１に記載のフィブリル。
【請求項３】
ペプチドが同じアミノ酸配列を有するが、ペプチドの１つ以上が修飾されている、請求項１に記載のフィブリル。
【請求項４】
ペプチドの少なくとも１つがペンダント状の機能基を有する、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項５】
機能基が、金属、キレート基、光学活性基、タンパク質、薬物、抗体、リンカーおよび／または核酸を含む、請求項４に記載のフィブリル。
【請求項６】
光学活性基が蛍光基である、請求項５に記載のフィブリル。
【請求項７】
蛍光基がダンシルクロリドまたはフルオレセイン−５−マレイミドである、請求項５に記載のフィブリル。
【請求項８】
核酸が一本鎖ＤＮＡである、請求項５に記載のフィブリル。
【請求項９】
ペプチドの１つ以上が治療分子である、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１０】
治療分子が、アゴニスト、阻害剤、アンタゴニスト、単鎖抗体、炎症調節剤または酵素である、請求項１１に記載のフィブリル。
【請求項１１】
ペプチドの少なくとも１つが天然には存在しない、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１２】
異なる複数のペプチドがフィブリル内にランダムに存在する、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１３】
１つのペプチドがフィブリルの長さ方向に沿って規則的な間隔で存在する、先行請求項１から１１のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１４】
長いペプチドおよび短いペプチドを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１５】
ＴＴＲ１０〜１９、ＴＴＲ１０５〜１１５およびウシインスリンのペプチドの少なくとも１つを有する、先行請求項のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１６】
先行請求項のいずれか一項に記載される混合フィブリルを含むプラスチックまたはゲル。
【請求項１７】
混合フィブリルが架橋されている、請求項１６に記載のプラスチック。
【請求項１８】
請求項１から１５のいずれか一項に記載される混合フィブリルまたは請求項１６もしくは１７に記載されるプラスチックもしくはゲルを含む細胞増殖用担体。
【請求項１９】
先行請求項のいずれか一項に記載されるアミロイドフィブリルを製造するための方法であって、核形成およびフィブリル成長が受容可能な時間で生じるような状態であるペプチドの溶液を調製すること、そして核形成およびフィブリル成長を行わせることを含む方法。
【請求項２０】
フィブリル形成条件が、タンパク質種の速度論がほぼ同じであるように調節される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドの１つ以上を二官能性リンカーに結合させることをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
フィブリルを架橋すること、または核酸をペプチドに結合するためにリンカーを使用することもまた含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９から２２のいずれか一項に記載される方法によって作製されたアミロイドフィブリル。
【請求項２４】
プラスチックとして、または電子工学もしくは触媒における、請求項１から１５のいずれか一項に記載されるフィブリルの使用。
【請求項２５】
治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用される、請求項１から１５のいずれか一項に記載されるフィブリル、または請求項１６もしくは１７に記載されるプラスチックもしくはゲル、または請求項１８に記載される担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は混合フィブリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質およびペプチドが安定な非常に規則正しいアミロイドフィブリルの形態で凝集することは、非常に一般には、アルツハイマー病および伝染性海綿様脳症などの様々な病理学的状態と関連する。
【０００３】
インビボでのアミロイド形成におけるほんの少数のタンパク質の関与が、関与するタンパク質の配列の何らかの異常な立体配座的特徴の結果として一般には考えられている。しかし、国際特許出願公開ＷＯ００／１７３２８に開示されるように、これらの非常に規則正しい構造体が形成されることは、ポリペプチド鎖の基本的な物理化学的性質から生じる一般的なプロセスである。ｐＨが低いとき、例えば、ＰＩ−３’キナーゼのＳＨ３ドメインの高濃度溶液は、数時間後に粘性ゲルに変わることが明らかにされている。このゲルを電子顕微鏡観察および他の技術によって調べたとき、疾患に関連したアミロイドと関連するフィブリルの特徴のすべてを有する明瞭なフィブリルを含有することが見出された。このタンパク質は、何らかの知られている疾患とは何ら関係がない。
【発明の開示】
【０００４】
今回、本発明により、典型的には短いが、様々なペプチドが、関連性のないペプチドから組み立てられるアミロイドフィブリル内に、そして全長のタンパク質から組み立てられるアミロイドフィブリル内に取り込まれ得ること、すなわち、アミロイドフィブリルが、これらの構造部のコアを構成するβシート列内に同時に集合する２つ以上の異なる分子種から構成されて形成され得ることが見出された。従って、例えば、アミロイドフィブリルは、ペプチド様分子または異なる側鎖を有する分子を取り込むことによって「ドープ」され得る。従って、本発明は、２つ以上の異なるペプチドを含むアミロイドフィブリルを提供する。典型的には、本発明のフィブリルは他のタンパク質を含まない。
【０００５】
本発明はさらに、
−本発明の混合フィブリルを含むプラスチックまたはゲル、
−本発明の混合フィブリル、プラスチックまたはゲルを含む細胞増殖用の担体、
−本発明のアミロイドフィブリルを作製するための方法で、核形成およびフィブリル成長が受容可能な時間で生じるような状態であるペプチドの溶液を調製すること、そして核形成およびフィブリル成長を行わせることを含む方法、
−本発明の方法によって作製されるアミロイドフィブリル、
−プラスチックとして、または電子工学もしくは触媒における本発明のフィブリルの使用、および
−治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用される本発明のフィブリル、プラスチック、ゲルまたは担体
を提供する。
【０００６】
（配列の簡単な説明）
配列番号１はペプチドＴＴＲ１０〜１９のアミノ酸配列を示す。
【０００７】
配列番号２はペプチドＴＴＲ１０５〜１１５のアミノ酸配列である。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本明細書および添付された請求項の全体を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」および用語「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む、包含する）」ならびに変化形（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）は包括的に解釈されなければならない。すなわち、これらの用語は、文脈が許す場合には、具体的に列挙されていない他の要素または完全体を含み得ることを表すことが意図される。
【０００９】
本明細書中で使用される「タンパク質」により、１つまたは複数のタンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチドまたはペプチドが意味される。タンパク質は、フィブリルを形成することができる任意のタンパク質であり、薬学的に活性なタンパク質であってもよい。
【００１０】
本発明者らは、２つ以上の非関連の化学種からなるアミロイドフィブリルが形成され得ることを見出した。典型的には、試験されたペプチドまたはタンパク質はどれも、何らかの天然に存在する疾患に直接的には関係しておらず（だが、そのようなペプチドおよびタンパク質は除外されず、形成されたフィブリルがインビボで使用されることがない様々な実施形態において特に使用されることがある）、しかし、生じる構造体は、病理学的状態においてインビボで形成される構造体と非常に類似する。混合フィブリルは、２つ、３つ、４つまたは５つ以上の異なるタイプのペプチド種を含むことができる。
【００１１】
特異的な結合化学反応を利用することによって、本発明のアミロイドフィブリルは、完全に折り畳まれた活性なタンパク質性酵素もしくは補因子、または非タンパク質物質（金属、キレート化剤または光学活性化合物など）を結合させることによって共有結合的に修飾され得る堅牢な足場を提供することができる。フィブリルの組み立てがポリペプチド鎖の基本的な性質であることを示すことによって、このことは、これらのフィブリル列が新規な生体材料およびナノ構造体の開発における構造的基本成分として用いられるという可能性を大きくする。従来の有機重合プロセスの生成物とは異なり、人工タンパク質は、組成、鎖長、配列および立体化学的純度の事実上絶対的な制御により操作することができる。２０個の天然に存在するアミノ酸の可能な組合せの膨大な配列は、新規な生体材料に対する数え切れないほどの可能性を示唆しており、一方で、機能基の導入は、広範囲の様々な応用のために潜在的に重要な物理的性質を有するナノ材料が設計され得ることを示している。非天然システムおよび模擬タンパク質もまた導入することができる。
【００１２】
ポリペプチド
１つの実施形態において、フィブリルを形成するタンパク質は非関連であり、典型的には、大きな程度の配列相同性を有しない。あるいは、そのようなタンパク質は同じアミノ酸配列を有するか、または、相同的な配列などの非常に類似するタンパク質（例えば、ブタ由来のインスリンおよびヒト由来のインスリン）であり、（従って、関連性があり）、そして１つがペンダント状の機能基を有する点で、例えば、１つのペプチドを標識することができ、それ以外のペプチドが非標識である点で異なる。より一般的には、タンパク質の１つがペンダント状の機能基を有しており、機能化されているとして示される。
【００１３】
このようにして取り込まれ得る機能基には、金属（金、銀、銅または重金属など）、放射性同位体、キレート基、および光学活性基（これには、ダンシルクロリドおよびフルオレセイン−５−マレイミドなどの蛍光基が含まれる）、他のタンパク質、薬物およびビオチンまたは磁気粒子が含まれる。
【００１４】
例として、ＴＴＲ１０〜１９およびＴＴＲ１０５〜１１５の２つのペプチド（これらはともにヒト血漿タンパク質のトランスチレチンの配列に由来する）を同時フィブリル形成のために使用することができる。それぞれは、ほとんどがβシートのこのタンパク質の天然構造におけるβ鎖に対応する。両ペプチドは、アミロイドの診断となる構造的特徴のすべてを有するフィブリルに容易に集合する。ＴＴＲ１０〜１９は１個のシステイン残基を１位に有しており、これは蛍光色素のフルオレセイン−５−マレイミドで化学修飾することができ（Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９）、または他の好適な基で化学修飾することができる。ＴＴＲ１０５〜１１５は、末端のα−アミノ基以外にアミノ基を含有していない；この基は蛍光基のダンシルクロリドに結合させることができ（ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５）、または他の好適な基に結合させることができる。
【００１５】
一般に、機能基は、ペプチドを、所望する場合にはペプチドの機能を改変した後、所望する機能基を含む分子と反応することによって取り付けることができる。例えば、ペプチド内のシステイン残基（例えば、Ｎ末端のシステイン基）は、例えば、トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィンなどのホスフィン化合物で還元してチオール基にすることができる。このチオール基は、例えば、フルオレセイン−５−マレイミドと反応させることができる。機能化され得る他の基には、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基およびアミノ基が含まれる。機能化は、標準的な反応を使用して行うことができる。従って、ダンシルクロリドをアミノ基と反応させることができる。
【００１６】
ペプチドはまた、二官能性リンカーまたは多官能性リンカーを使用して機能化することができる。二官能性リンカーは、リンカーを他の分子に結合するために使用され得る２つの活性な基を含む。ヘテロ二官能性リンカーの場合、これらの基は異なっており、好ましくはそのようなリンカーが使用される。典型的には、リンカーの一方の基がペプチドと反応し、他方の基が第２の分子と反応する。リンカーは、フィブリルを形成するためにペプチドが使用される前に、ペプチドに結合させることができ、その後、第２の基をフィブリル形成の後またはその途中で他の分子に結合させることができる。第２の分子は、別のフィブリルにおけるペプチド、または別個のポリペプチド、核酸もしくは治療分子であり得る。あるいは、第２の基は、ウイルス、細胞または合成表面に結合させることができる。
【００１７】
リンカーは切断可能であってもよい。これは、リンカーを切断し得る好適な酵素もしくは化学試薬にさらされたとき、結合した物質をフィブリルから遊離させるために、または架橋したフィブリルの網目構造もしくは網目を崩壊させるか、もしくは分解するために使用することができる。使用され得る好適な二官能性リンカーの例には、下記が含まれる：
・ＡＰＤＰ−（Ｎ（４−アジドサリチルアミド）ブチル−３’（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド）、切断可能、第２の部位は非特異的な光反応性である；
・ＡＳＩＢ（（１−（Ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン））、非切断性、第２の部位は非特異的な光反応性である；
・ＭＰＢＨ−（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩）、非切断性、第２の部位は炭水化物に対して反応性である；
・ＰＤＰＨ−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、切断可能、第２の部位は炭水化物に対して反応性である；
・ＳＩＡＢ−（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート）、非切断性、第２の部位は一級アミンに対して反応性である、１０．６Åのスペーサーアーム；
・ＳＭＣＣ−（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル））、非切断性、第２の部位は一級アミンに対して反応性である、１１．６Åのスペーサーアーム；
・ＳＭＰＴ−（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）−トルエン）、非切断性、第２の部位は一級アミンに対して反応性である、１１．２Åのスペーサーアーム；および
・ＳＰＤＰ−（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、切断可能、第２の部位は一級アミンに対して反応性である、６．８Åのスペーサーアーム。
【００１８】
ヘテロ二官能性リンカーは、フィブリルを架橋するために使用することができる。好ましい実施形態において、アミン反応性のＮＨＳエステルおよび光反応性のアリールアジドを含むリンカーが使用される。リンカーは最初にペプチド種の１つに結合され、好適な量の連結されたペプチドがフィブリル内に導入される。その後、フィブリルは、続いて、それらを架橋するためにＵＶ光にさらされ、従ってプラスチックを作製するために使用することができる。
【００１９】
フィブリルを含むペプチド種は、フィブリルを形成するそれらの能力および／またはそれらの機能的性質のために選ぶことができる。１つの実施形態において、ポリペプチドの１つは、フィブリルを形成するその能力のために選ばれ、他方は、その治療的性質などのその機能的性質のために、または機能化の容易さのために選ばれる。構造的ポリペプチドは、フィブリルが特定の物質もしくはイオン強度もしくはｐＨで解離するように、またはフィブリルが特定の細胞もしくは細胞タイプと接触したときにフィブリルが解離するように選ぶことができる。このことは、フィブリルの解離速度が、存在するそれぞれのサブユニットの量および／またはタイプを変化させることによって特異的に設計され得ることを意味する。これは、設定された速度での薬物の制御された放出を可能にするために使用することができる。
【００２０】
特定の温度で解離するフィブリルをもたらす構造的ポリペプチドを選ぶことによって、このことは、例えば、フィブリルが体温に達したときにフィブリルを解離させることを可能にする。そのようなフィブリルから作製される構造体は、高い温度を加えることによって崩壊させることができる。このことは、フィブリルのゲルを液状化させることを可能にし得るか、またはフィブリルから作製されたプラスチックの破壊を可能にし得る。
【００２１】
機能基がフィブリルのポリペプチドに結合されるのと同様に、個々のペプチド自身が活性を有してもよい。例えば、ペプチドは、受容体などのアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤または調節剤であり得る。ペプチドは、毒素、酵素、蛍光性タンパク質（緑色蛍光タンパク質など）、ホルモン、薬物、単鎖抗体、受容体、エピトープ、または炎症性の調節因子（シトシンまたはインターロイキンなど）、補因子、または凝固因子であり得る。そのような実施形態において、ペプチドは、典型的には、フィブリルから放出されると、その活性な立体配座を取ることができるが、その前では、典型的にはその活性な立体配座を取ることができない。
【００２２】
フィブリルが２つ以上のタイプのペプチドから構成されるという事実は、様々な組合せの薬物または治療分子が同じ場所に同時に送達されることを可能にし得る。１つの実施形態において、このことは、酵素およびその基質が所定の場所に送達されること、そしてこれらの２つが放出されたときにだけ酵素が基質に対して作用し始めることを可能にする。フィブリル形成の前およびその途中では、例えば、フィブリルを作製するために用いられる条件のために、酵素は不活性な状態に保つことができる。
【００２３】
フィブリルにおける２つのペプチドの相対的な量はまた、フィブリルの構造および機能的性質を最適化するために選ぶことができる。２つのサブユニットの比率は、放出される治療ペプチドの量または蛍光の強度を規定するために変化させることができる。このことは、低用量または高用量のフィブリルが製造されることを可能にする。標識された蛍光色素または治療ペプチドまたは機能化ペプチドと他方のペプチドとの比率は１００：１〜１０：１にすることができ、好ましくは５０：１〜５：１にすることができ、より好ましくは１０：１〜２：１にすることができ、あるいは他方のペプチドの量を、機能化ペプチドまたは治療ペプチドまたは標識ペプチドと同等以上にすることができ、従って、比率は、１：１〜１：１００，０００にすることができ、典型的には１：２〜１：１０，０００にすることができ、好ましくは１：５〜１：１００にすることができ、より好ましくは１：１０〜１：１００にすることができるが、フィブリルが使用されている特定の用途に依存する。成分ペプチドの比率を変化させることによって、このことは、フィブリルが分解する温度を変化させること、またはフィブリルが分解する温度により解離速度を変化させることを可能にし得る。
【００２４】
フィブリルを形成させるために使用されるペプチド種は異なる結合部位を有し得るので、フィブリルはいくつかの特異性を有する。例えば、ペプチドは、２つの異なる細胞タイプに対する結合部位または認識部位を有してもよく、２つのタイプの細胞が一緒に結合することを容易にし得る。フィブリルはまた、フィブリルを特定の細胞タイプまたは器官または組織に対して特異的に局在化させることを可能にする結合部位を含むことができる。特定の物質に対する結合部位を含有するフィブリルは、そのような物質を精製または抽出するために使用することができる。例えば、特定のエピトープを含むフィブリルは、そのエピトープに対して特異的な抗体をアフィニティー精製するために使用することができる。
【００２５】
本発明において用いられるペプチドは、好ましくは合成である。あるいは、本発明において用いられるペプチドは組換えタンパク質であってもよく、または組換えタンパク質に由来してもよい。いくつかの実施形態において、本発明において用いられるペプチドは、精製された天然に存在するタンパク質であってもよい。フィブリルは、ヒト以外のトランスジェニック動物などにおいてインビボで形成させ、続いて集めることができる。
【００２６】
２０個の天然に存在するアミノ酸に加えて、細菌発現システムの操作により、非天然型の側鎖を有するアミノ酸をポリペプチド鎖内に取り込むことができ、それにより、開発のために利用可能な化学的機能性のレパートリーを拡張することができる。これらの非天然型アミノ酸はいずれも本発明のポリペプチドに取り込むことができる。
【００２７】
フィブリルの形成
本発明のフィブリルは、国際特許出願公開ＷＯ００／１７３２８に記載される方法と類似するが、タンパク質の核形成およびフィブリルの成長が受容可能な時間で生じるような状態である異なるタンパク質の溶液を使用し、そして核形成およびフィブリル成長を行わせることができる方法で得ることができる。
【００２８】
本明細書中で使用される「核形成」により、フィブリル形成をもたらすプロセスの開始が意味される。溶液からのフィブリル形成には、連続して、タンパク質の自己会合、凝集体の形成およびフィブリルの成長が含まれる。従って、望ましくは、開始溶液は不安定になる直前の状態である。核形成および成長は遅いプロセスであり、条件は、通常的には、フィブリル形成が数時間または数日の期間で生じるように選ばれる。核形成が速すぎる場合、これは、多くの場合、フィブリル形成に対して悪影響を有することが理解される。インビボで使用されるフィブリルは、典型的には、凝集体よりも大きい。
【００２９】
核形成は、溶媒、濃度、塩、リガンド、温度およびｐＨの変化を含む様々な手段によって生じさせることができる。例えば、ＴＴＲ１０〜１９およびＴＴＲ１０５〜１１５に由来するフィブリルは、ｐＨが約２の水溶液から得ることができる。ウシインスリンに由来するフィブリルは、ｐＨが約２．５の水溶液から得ることができる。振とう、撹拌、およびある種の表面（例えば、ガラス容器またはプラスチック容器の表面）への暴露は局所的な変性を生じさせることがあり、それによってフィブリル形成を開始させることができる。
【００３０】
タンパク質を含む溶液は、核形成を生じさせ得る任意の溶媒または溶媒混合物を含むことができる。例えば、溶液は、ＤＭＳＯ、ジオキサンおよび／または水を含むことができる。好ましくは、溶液は水溶液である。
【００３１】
核形成およびフィブリル成長を促進し得る１つ以上の有機溶媒を溶媒に含めることができる。天然に存在するタンパク質の場合、条件は、典型的には、自己会合が生じ得る状態を保持しながら、タンパク質を少なくとも部分的に変性させるように選ばれる。有機溶媒は、一般には水混和性であり、好ましくはアルコールおよび脂肪族ニトリル（アセトニトリルなど）である。アルコールは、典型的には、例えば、１個以上のハロゲン原子（特にフッ素原子）によって置換され得るＣ１〜６アルカノール、または非置換であり得るＣ１〜６アルカノールである。例には、メタノール、エタノール、プロペニルもしくはブタノール、またはフッ素化アルコール（トリフルオロエタノールもしくはヘキサフルオロイソプロパノールなど）が挙げられる。好ましくは、アルコールはトリフルオロエタノールである。アルコールの濃度は、典型的には５％ｖ／ｖ〜４０％ｖ／ｖであり、好ましくは約２５％ｖ／ｖである。脂肪族ニトリルの濃度は広い範囲内で変化させることができ、典型的には５％ｖ／ｖ〜９５％ｖ／ｖである。
【００３２】
溶液におけるタンパク質の濃度は決して限定されないが、核形成が生じ得るようにしなければならない。一般には、濃度は０．１ｍＭ〜１０ｍＭであり、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭであり、より好ましくはタンパク質濃度は約１ｍＭである。
【００３３】
溶液の温度は、一般には０℃〜１００℃である。好ましくは、温度は０℃〜７０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、最も好ましくは５℃〜３０℃である。
【００３４】
溶液のｐＨは、核形成に好適な任意のｐＨであり、典型的にはｐＨ１〜ｐＨ１０である。好ましくは、溶液は酸性であり、より好ましくは溶液のｐＨは１〜６．５であり、例えば１．５〜３．５である。
【００３５】
溶液には、例えば、凝集したタンパク質の以前に形成された粒子を種として加えることができる。これはプロセスを非常に促進させることができる。
【００３６】
本発明のフィブリルは、好適には、遠心分離、ろ過または溶媒の蒸発によって単離される。そのようにして得られたフィブリルは、その後、洗浄および乾燥することができ、そして必要な場合には再懸濁することができる。溶解性などのフィブリルの物理的性質は、このようにして変化させることができる。また、ポリペプチドは、ポリペプチドが除去され得るように標識することができる。標識された混合フィブリルが形成され、容易に除去され得る場合、β−２Ｍ凝集などの問題を最小限にすることができる。場合により、フィブリルに存在する機能基を使用して、フィブリルの精製または回収を容易にすることができる。
【００３７】
フィブリルを形成するタンパク質が非関連である場合、フィブリル形成の速度論が異なる可能性がある。そのような状況では、フィブリル形成の速度論は、タンパク質が比較的一様に一致するように調節すべきであることが見出された。例として、ＴＴＲ１０〜１９およびＴＴＲ１０５〜１１５の蛍光標識されたペプチドを、そのほとんどが、らせん型の天然の折り畳みでジスルフィド結合した２つの鎖からなる非関連のタンパク質配列（ウシインスリン）から主に組み立てられるフィブリル内に取り込むことができる。ウシインスリンからフィブリルを形成させることは十分に確立されており、タンパク質を低いｐＨ（例えば、２．５）で高い温度（６０℃）に加熱することによって容易に達成することができる。しかし、これらの条件下では、インスリン分子によるフィブリル形成の速度は、ＴＴＲ１０〜１９およびＴＴＲ１０５〜１１５について観測されるよりも著しく速く、このため、プロセスが完了するために７時間であり、これに対して、両ペプチドは、類似した条件下では４８時間にわたり可溶性のままである。短いペプチドによるフィブリル形成の速度（すなわち、ｐＨ２．７において５５℃での速度）に近い速度に組み立て速度を調節するためのインスリンによるフィブリル形成の条件、すなわち、温度を調節し（この場合には温度を低下させ）、そしてｐＨを調節する（この場合にはｐＨを上げる）ことによって、フィブリルは１０日の期間で形成される。対照的に、同時フィブリル形成のために使用される濃度（０．０５ｍｇ／ｍｌ）における単独のペプチドは、同一条件のもとで３週間にわたって完全に溶解したままであった。
【００３８】
本発明のフィブリルはまた、インビボで形成させることができる。例えば、様々なポリペプチドの１つまたはいくつかまたはすべてをコードする核酸配列を、真核生物細胞（特に哺乳動物細胞）などの細胞に導入して、発現させることができる。１つの実施形態において、そのような配列は、フィブリル関連疾患に罹っている生物またはフィブリル関連疾患モデルの細胞に導入される。その場合、疾患に関連する内因性のポリペプチドと異種のポリペプチドとの両方を含むフィブリルが形成される。このことは、フィブリルを標識することを可能にし得るか、またはフィブリルに対して細胞もくしは治療物質を標的化することを可能にし得る。このことは、疾患状態を研究することにおいて、または治療および／もしくは診断において有用であり得る。生物は、異種の配列が導入されているヒト以外のトランスジェニック動物であり得る。あるいは、生物は、形質転換された細胞が導入される生物、またはそのような配列を運ぶベクターが導入される生物である。
【００３９】
典型的には、核酸配列は、内因性のペプチドを合成している同じ細胞タイプにおける発現を確実にする配列に標的化されるか、またはそのような配列を含む。さらに、その発現は、構成的ではなく、誘導性にすることができる。
【００４０】
ペプチドの１つが標識される場合、フィブリル内への取り込みは標識の性質の変化をもたらし得る。例えば、標識は蛍光色素にすることができ、標識されたペプチドがフィブリル内に取り込まれることにより、その発光スペクトルの変化が生じ得る。そのような変化は、フィブリルの形成および分解をインビトロおよびインビボの両方でモニターするために使用することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、使用されるペプチド種のタイプおよび／または相対的な量を変化させることによって、フィブリルの形状およびドープされたペプチドの周期性を変化させることができる。このことは、中空形状またはリボン形状である特定の形状（らせん状ねじれまたはキンクなど）を有するペプチドが作製されることを可能にするか、または官能基間の距離を設けることを可能にし得る。
【００４２】
形成された構造体、ゲルおよびプラスチック
非天然の自己集合性の様々なペプチドポリマーが、可逆的なｐＨ依存性ヒドロゲル、メンブラン内の非特異的な細孔として作用し得るβシートペプチドナノチューブ、βシート「ナノテープ」、およびラメラ結晶を形成させるために、側鎖相互作用に基づく慎重な設計に従って以前から合成されている。本発明のアミロイドフィブリルの形成は、フィブリル形成がポリペプチド骨格の基本的性質であるので、典型的には明示的な設計プロセスを何ら必要としない。しかし、モノマー前駆体の溶解性、安定性および立体配座的性質は、フィブリルの組み立てに関する様々な環境の利用を可能にする特定の配列とともに変化する。組成が異なるβシート内の側鎖相互作用は、得られるフィブリルの物理的性質および形態構造にさらに影響を及ぼし、それらを変化させる。中空コアを有する管状構造体としてのアミロイドフィブリルの形成、平らなリボン様形態構造、タンパク質前駆体またはペプチド前駆体が何であるかによってねじれの周期性が決定されるねじれたフィブリル、これらは、フィブリルをその具体的な用途に合わせるように選ぶことができる。
【００４３】
タンパク質前駆体が何であるかにより、得られたフィブリル集団の平均直径および均一性は影響を受ける。フィブリルの組み立ては溶媒環境の変化で逆にすることができるので、本発明のフィブリルには、化学的に可逆的な生分解性ゲルとしての有用性が見出され得る。実際、天然のタンパク質およびペプチドに由来するアミロイドフィブリルは、これらの人工的に設計された系のいくつかに非常に関連すると考えられる。従って、このことは、所望する場合にはナノ構造体およびデバイスが作製され得るという有益な示唆である。
【００４４】
本発明のフィブリルは、典型的には二官能性リンカー（好ましくはヘテロ二官能性リンカー）を使用して架橋することができる。詳細には、フィブリルを形成させるために使用されるペプチドの１つをリンカーと反応させ、その後、フィブリル内に取り込むことができ、続いてこのフィブリルを、リンカー官能基の第２の基を使用して架橋することができる。例えば、アミン反応性のＮＨＳエステルと光反応性のアリールアジドとを含む二官能性リンカーを、フリーのアミノ基を介してリンカーに結合されている選ばれたペプチドとともに使用することができ、そして暗所に保つことができる。次いで、修飾されたペプチドをフィブリル内に取り込ませることができ、その後、フィブリルは、光反応性のアリールアジドを活性化するために近ＵＶ光にさらすことによって架橋することができる。
【００４５】
フィブリルの架橋は、フィブリルのより強く、より堅い網目構造または網目を作製するために使用することができる。架橋することにより、実際には、プラスチックを作製することができる。ドープ度を調節して、架橋量を変化させることができ、従って作製されたプラスチックの強度を変化させることができる。プラスチックは、管状構造体などの特定の形状で形成させることができる。
【００４６】
プラスチックは、多数のデバイスまたは構造体で使用することができ、そしてデバイスをコーティングまたは被覆するためにも使用することができる。例えば、プラスチックは、ステント、弁、パッチまたは担体を形成するために、あるいはそれらを被覆するために使用することができる。プラスチックは、傷を覆うために、または包帯もしくはプラスターで使用することができる。
【００４７】
プラスチックは、細胞が増殖し得る担体として使用することができ、その後、その構造体全体または細胞を移植片または移植体として使用することができる。例えば、プラスチックは、皮膚細胞または小島細胞を増殖させるために使用することができる。リンカーはまた、架橋された網目が分解されることを可能にする切断部位を含むことができる。これは、細胞を無傷で残しながら、プラスチックを除くために使用することができる。これはインビトロまたはインビボで行うことができ、特にインビボで行うことができる。切断は化学的または酵素的に行うことができ、典型的には、周囲の組織に対する最小限の損傷を生じさせるような方法で行われる。これはまた、細胞の形状化された配置物が、嚢、膀胱または血管などにおいて作製されることを可能にし得る。
【００４８】
ペプチド−ＤＮＡのフィブリル
本発明のペプチドは、核酸または核酸アナログ（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡなど）に結合させることができる。典型的には、二官能性リンカーが、核酸をフィブリルに連結するために使用される。核酸分子は、核酸分子がペプチドに直接的またはリンカーを介して結合または固定され得る基を含むように修飾することができる。好ましくは、核酸はフリーのスルフヒドリル基を有することができ、それを介してペプチドに結合させることができる。ペプチドは、フィブリル形成の前、またはその後、またはその途中で核酸と結合させることができるが、フィブリル形成の前が好ましい。核酸は、切断可能なリンカーを介してフィブリルに結合させることができ、その結果、その後、核酸を放出させることができる。
【００４９】
核酸分子は二本鎖または一本鎖のいずれかであり得るが、サイズは、短いオリゴヌクレオチドから相当長いオリゴヌクレオチドにまで及んでもよく、例えば、１０塩基〜５，０００塩基、好ましくは２０塩基〜１，０００塩基、より好ましくは２５塩基〜５０塩基などの長さであり得る。ペプチド−核酸は、メンブランまたはインシリコなどの表面に固定化することができ、マイクロアレイまたはチップの形態にすることができる。これらは、試験溶液における特定の標的配列の存在および量を検出するために使用することができる。これは、診断または遺伝子型決定において用いることができる。
【００５０】
ＤＮＡまたは他の核酸と結合した混合フィブリルはまた、遺伝子治療目的のために生物体内への核酸に対する送達システムとして使用することができる。核酸はタンパク質の発現を行わせてもよく、あるいは標的遺伝子の発現を阻止するために用いられるアンチセンス分子であってもよい。核酸は触媒作用核酸であってもよい。
【００５１】
電導性
本発明のフィブリルは電導性を示すことがあり、特に、蛍光性の官能基を含むフィブリルは電導性を示すことがあり、特に良好な電導性を示すことがある。電流を流す能力は、ナノテクノロジーおよびバイオコンピューターにおけるフィブリルの使用では重要であり得る。１つの実施形態において、中空フィブリルを使用することができる。
【００５２】
フィブリルのコンダクタンスは、周囲の状態および／または標的分子の結合に従って変化し得る。このことはまた、センサーにおけるフィブリルの使用を可能にするか、または特定の分析物の存在もしくは量を測定することを可能にする。フィブリルは、典型的には、結合したときの電導性の変化を検出するための手段に連結される。
【００５３】
混合フィブリルの治療的使用
フィブリルは、アミロイド沈着に関連する疾患を処置するために使用することができる。処置または防止または緩和され得るそのような疾患の例には、糖尿病、老化および痴呆、特にアルツハイマー病およびパーキンソン病が含まれる。クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ＢＳＥ、スクレイピー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）およびクールーなどのプリオン障害（特に新型のＣＪＤ）もまた処置することができる。糖尿病（特に遅発型糖尿病）もまた処置することができる。
【００５４】
マウスにおけるアミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）アミロイド症が、小島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の残基２０〜２９ならびにＴＴＲ１０〜１９およびＴＴＲ１０５〜１１５を含む多数のペプチド源から組み立てられた予備形成アミロイドフィブリルの注射によって加速され得ることが明らかにされている。従って、フィブリル物質の注射は、アミロイドタンパク質Ａの沈着に対する核生成機構を提供し得る。異なるポリペプチドを取り込む能力、従って、混合フィブリルをインビボで形成する能力は、フィブリル形成を阻止するために、または薬物を取り込むために、または薬物結合部位を導入するために使用することができる。そのような能力はまた、フィブリル関連疾患に対する診断または治療として使用することができる。
【００５５】
混合フィブリルは、心臓血管障害またはガン（軟組織ガン、肉腫、白血病またはリンパ腫など）などのフィブリル非関連疾患に罹っている個体に薬物を送達するために使用することができる。用いられる特定のフィブリルは、フィブリルが解離する速度、フィブリルが解離する温度もしくはｐＨもしくは位置、またはフィブリルが放出する薬物の投薬量および組合せなどのその特性が患者の要求に合うように選ぶことができる。フィブリルはまた、それぞれの細胞に対する結合部位が存在するため、異なるタイプの細胞などの２つの実体の結合、または組織と細胞との結合を容易にするために使用することができる。標識されたフィブリルはまた、画像化において使用することができる。
【００５６】
フィブリルは、製薬分野では日常的であるように、標準的な薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤ととともに配合することができる。例えば、好適な物質を注射用の生理学的な生理的食塩水または水に溶解することができる。配合物の正確な性質は、投与される特定のフィブリルおよび所望の投与経路を含むいくつかの要因に依存する。好適なタイプの様々な配合物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、第１７版、１９８５）に詳しく記載されている（その開示はその全体が参考として本明細書中に包含される）。
【００５７】
フィブリルは、経腸経路または非経口経路によって、例えば、経口投与、口内投与、肛門投与、肺投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与または他の適切な投与経路などによって投与することができる。
【００５８】
フィブリルの治療効果的な量が患者に投与される。フィブリルの用量は、様々なパラメーターに従って、特に、使用される物質；処置される患者の年齢、体重および状態；投与経路；および必要とされる療法に従って決定され得る。医師は、任意の特定の患者について必要とされる投与経路および投薬量を決定することができる。典型的な１日用量は、具体的な調節剤の活性、処置される患者の年齢および体重および状態、変性のタイプおよび重篤度、ならびに投与頻度および投与経路に従って、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜５０ｍｇである。好ましくは、１日の投薬量レベルは５ｍｇ〜２ｇである。
【００５９】
本発明のフィブリルはまた、薬物をカプセル化するためのゲルを作製するために、または薬物が含浸させられたゲル、もしくは薬物を運ぶゲルを作製するために使用することができる。そのようなゲルは、典型的には、薬物を放出するために壊れる。これは、カプセルが壊れるか、または含浸された薬物が放出されるかのいずれかのためである。ゲルの分解は、典型的には、フィブルが解離した結果である。分解は、温度またはｐＨに依存させることができ、そして所望する薬物放出速度を確実にするために遅くすることができ、または速くすることができる。そのようなゲルは、ピルまたはカプセル、あるいはインプラントを製造するために使用することができる。ゲルはまた、薬物をその部位でゆっくり放出させるための、体内に導入されるデバイス（ステムまたはパッチなど）をコーティングするために使用することができる。
【実施例】
【００６０】
下記の実施例により、本発明はさらに例示される。
【００６１】
ペプチドの合成。ＴＴＲ１０〜１９（配列番号１−ＣＰＬＭＶＫＶＬＤＡ）およびＴＴＲ１０５〜１１５（配列番号２−ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳ）を、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ内において、標準的なＦｍｏｃ化学を使用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４３０Ａ自動化ペプチド合成機で合成した。担体から切断した後、ペプチドを、分析用のＢｒｏｗｎｌｅｅ  Ｃ８逆相カラム（４．６×３０ｍｍ）または調製用のＶｙｄａｃ  Ｃ−１８逆相カラム（１０×２５０ｍｍ）のいずれかを使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ  ＨＰＬＣでのＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。カラムからの溶出画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析し、所望する分子量の画分をまとめて、凍結乾燥した。
【００６２】
ペプチドの標識
フルオレセインによるＴＴＲ１０〜１９の標識。ＴＴＲ１０〜１９のＮ末端のシステイン残基が、チオール反応性の蛍光色素フルオレセイン−５−マレイミド（Ｆ５Ｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）による標識のための標的であった。ＴＴＲ１０〜１９をＨ２Ｏに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、そしてシステイン残基を１０倍モル過剰のトリス−（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の添加および室温での１時間のインキュベーションによって還元した。Ｆ５Ｍを含むＤＭＳＯをペプチド溶液に加えて、１０％ＤＭＳＯの最終濃度においてペプチドに対して１０倍モル過剰の蛍光色素にした。これらの条件下で、ＴＴＲ１０〜１９は完全に可溶性であった。混合物を、最大限の標識を確実にするために４℃で一晩インキュベーションした。その後、標識混合物を使い捨て型のＳｅｐＰａｋ  Ｃ−１８逆相クロマトグラフィーカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に添加して、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（９０：１０ｖ／ｖ）で洗浄した。ＴＣＥＰおよび未反応の標識を洗液に溶出させた。その後、ペプチドをＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（４０：６０ｖ／ｖ）でカラムから溶出して、標識ペプチドおよび未標識ペプチドの混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出した。標識効率は、質量分析法によって、また４９２ｎｍにおける８３，０００の吸光係数を仮定する吸収測定によって約７０％と推定された。
【００６３】
ダンシルクロリドによるＴＴＲ１０５〜１１５の標識。ＴＴＲ１０５〜１１５のＮ末端アミノ基が、ダンシルクロリド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）による標識のための標的であった。ＴＴＲ１０５〜１１５をＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（８０：２０ｖ／ｖ）に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。ダンシルクロリドを含むＤＭＳＯをペプチド溶液に加えて、１０％ＤＭＳＯの最終濃度においてペプチドに対して１０倍モル過剰の蛍光色素にした。ｐＨをアンモニアの添加によって９．０に手で調節した。これらの条件下で、ＴＴＲ１０５〜１１５は完全に可溶性であった。混合物を、最大限の標識を確実にするために室温で２時間インキュベーションした。その後、標識混合物を使い捨て型のＳｅｐＰａｋ  Ｃ−１８逆相クロマトグラフィーカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に添加して、Ｈ２Ｏで洗浄した。洗浄段階のとき、物質の溶出は検出されなかった。その後、ペプチドをＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（５０：５０ｖ／ｖ）でカラムから溶出して、標識ペプチドおよび未標識ペプチドの混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出した。未反応ダンシルクロリドは、これらの条件のもとではカラムから溶出しなかった。標識効率は、質量分析法によって、また３７０ｎｍにおける約４０００の吸光係数を仮定する吸収測定によって約８０％と推定された。
【００６４】
標識ペプチドの「自己」フィブリル内への取り込み。ペプチドの化学修飾がペプチドの自己集合を妨げるかどうかを調べるために、本発明者らは、同じアミノ酸配列の標識ペプチドと非標識ペプチドとの混合物を含有するアミロイドフィブリルを最初に形成させた。７日間のインキュベーションの後、得られたフィブリルを、超遠心分離、電子顕微鏡観察（ＥＭ）、円二色性（ＣＤ）分光法および蛍光法によって調べた（下記参照）。
【００６５】
フィブリルの形成。Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９の存在下および非存在下で、ＴＴＲ１０〜１９フィブリルが、ペプチドをｐＨ２．０においてＨ２Ｏに１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁して、室温で５日間インキュベーションすることによって得られた。標識された化学種を含有するフィブリルにおいて、非標識ペプチド対標識ペプチドのモル比は１００：１であった。
【００６６】
ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５の存在下および非存在下で、ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルが、ペプチドをｐＨ２においてＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（２０：８０ｖ／ｖ）に１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁して、３７℃で７日間インキュベーションすることによって得られた。標識された化学種を含有するフィブリルにおいて、非標識ペプチド対標識ペプチドのモル比は１００：１であった。
【００６７】
ウシインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＭＯ）フィブリルが、タンパク質をｐＨ２．５においてＨ２Ｏに１１．５ｍｇ／ｍｌ（２ｍＭ）で再懸濁して、７０℃で１時間インキュベーションすることによって得られた。タンパク質溶液を液体Ｎ２に浸け、その後、７０℃に戻してさらに４時間保った。
【００６８】
混合フィブリルの形成。ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５を含有するＴＴＲ１０〜１９フィブリルと、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルとの両方を、１００：１の非標識ペプチド対標識ペプチドのモル比で調製した。合計で１０ｍｇ／ｍｌのペプチドを含有するストック溶液を、Ｈ２ＯでｐＨ２に調節したＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１０：１ｖ／ｖ）で調製して、３７℃で１０日間インキュベーションした。ウシインスリンを、４０：１のインスリン対標識ペプチド種（ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５またはＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９）のモル比を含有する、ｐＨ２．７のＨ２Ｏにおける９．７ｍｇ／ｍｌのストック溶液として調製した。溶液を５５℃で１０日間インキュベーションした。フィブリル形成をＣＤ分光法およびＥＭによって評価した。
【００６９】
１０日間のインキュベーション期間中にわたって得られたＣＤスペクトルを比較することにより、ウシインスリンの主にαらせん構造から、アミロイドフィブリル形成に典型的なβシート構造に転移することが示される。得られたフィブリルは、電子顕微鏡観察によって測定されたとき、フィブリルの長軸に沿った特徴的ならせん状のねじれが約６０ｎｍ毎に反復していることを示す。約６０％のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９が、超遠心分離のときにフィブリルとともに沈降し、フィブリルと同時に局在化するプローブの蛍光的性質は、フィブリル構造内へのフルオレセイン基の挿入と一致していた（６ｎｍのスペクトル偏移、異方性＝０．１６；表１）。ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５を含有する精製された同時フィブリルの蛍光的性質もまた、４７０ｎｍへの最大発光波長の３２ｎｍの青方偏移および０．１９への異方性の増大（表１）を伴って、インスリンフィブリル内への蛍光色素の挿入と一致していた。７０％を越えるペプチドが、フィブリルを遠心分離したときのペレット内に見出された。
【００７０】
円二色性分光法。ＣＤスペクトルを、０．１ｃｍの光路長の石英キュベットを使用してＪａｓｃｏモデルＪ−７２０分光旋光計で取得した。温度は、循環水浴の使用によって２５℃で一定に保たれた。それぞれのスペクトルは、４秒の応答時間で、２００ｎｍ〜２５０ｎｍの間において０．５ｎｍ間隔で得られた４回の走査の平均を表している。データは、凝集したペプチドの絶対濃度を正確に測定することに伴う困難さのために、平均残基楕円率ではなく、ミリ度で表されている。このため、複合体内のβシート構造の量を正確に測定することができなかった。さらに、すべての場合において、サンプルの吸収が、光の散乱または吸収平坦化現象によるスペクトルの考えられる乱れを避けるために、円二色性シグナルと同時にモニターされた。図２には、１％（ｗ／ｗ）Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９の存在下および非存在下におけるＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルの円二色性分光法が示される。ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリル（破線）は、ペプチドをｐＨ２において２０％ＣＨ３ＣＮに１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁して、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、室温で７日間インキュベーションすることによって得られた。１％（ｗ／ｗ）Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するフィブリル（実線）は、１０ｍｇ／ｍｌのペプチドストック溶液が、１０％ＣＨ３ＣＮを含有する溶液において３７℃で１０日間インキュベーションされた、これは、広範囲のβシート構造の形成を示している。
【００７１】
電子顕微鏡観察。アミロイドフィブリルの電子顕微鏡写真を、８０ｋＶの励起電圧においてＪｅｏｌ  ＪＥＭ―１０１０透過電子顕微鏡で得た。１０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌの濃度の２μｌのペプチドをホルムバールおよび炭素でコーティングされた銅グリッドに加えた。フィブリルを、３回の１０μｌ量の水を連続して加えることによって洗浄した。それぞれの洗浄工程の後にはろ紙による乾燥が続いた。フィブリルを、１０μｌの酢酸ウラニル（１％ｗ／ｖ）を加えることによって染色して、直ちにろ紙で乾燥した。下記のフィブリル：
−２０％ＣＨ３ＣＮ（ｐＨ２）における３７℃で２４時間のインキュベーション、続く室温で７日間のインキュベーションによって形成されたＴＴＲ１０５〜１１５フィブリル；
−３７℃で１０日間のインキュベーションによって形成された、１％（ｗ／ｗ）Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５からなる同時フィブリル
の電子顕微鏡写真を撮影して、調べて、形成された標識フィブリルが、非標識フィブリルによって形成されるフィブリルと見た目に非常に類似していることを示すことが見出された。
【００７２】
蛍光分光法。蛍光分光法による測定を、異方性測定を可能にする高速フィルターアクセサリーを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂルミネセンス分光光度計で行った。１ｃｍの光路長を有する石英キュベットを測定中用いた。温度は、循環水浴の使用によって２５℃で一定に保たれた。スリット幅は、別途示されない限り、２．５ｎｍおよび１０ｎｍであった。フルオレセインを含有するサンプルは４９０ｎｍで励起させ、発光を５００ｎｍ〜６００ｎｍの間で検出した。ダンシルクロリドを含有するサンプルは３７０ｎｍで励起させ、発光を４００ｎｍ〜５５０ｎｍの間で測定した。励起波長における各サンプルの吸収もまた、散乱をもたらす人為的な結果および内部フィルター作用を避けるために、Ｃａｒｙ−３吸収分光光度計を使用してモニターされた。すべての異方性測定は、光漂白現象を除くために１０秒間モニターされ、その後、平均化された。
【００７３】
超遠心分離によるフィブリルの沈降は、蛍光性ペプチドのほほすべてがフィブリル画分に分配されることをもたらし、５％未満が上清に残留した。図１には、標識ペプチドフィブリルの蛍光発光スペクトルが示される。パネルａ：ＴＴＲ１０〜１９フィブリルに取り込まれたＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９（破線）が、０．３μＭの最終的な標識ペプチド濃度で、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）におけるＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９（実線）と比較される。パネルｂ：ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルに取り込まれたダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５（破線）が、０．９μＭの最終的な標識ペプチド濃度で、水におけるダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５（実線）と比較される。これらの蛍光スペクトルは正規化されている。図１Ａに示されるように、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９のフルオレセイン基の蛍光発光は、ＴＴＲ１０〜１９フィブリルに取り込まれたとき、９ｎｍの赤方偏移を受け、フルオレセインの異方性が、水溶液中のモノマーペプチドに対する０．０３から、フィブリルが形成されたときの０．１７に増大している（表１を参照のこと）。蛍光基の異方性のこの増大は、遅い回転運動を示す大きい複合体の中に蛍光色素が取り込まれたことを示している。ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５のダンシル基は、ＴＴＲ１０５〜１１５を含むフィブリルに取り込まれたときに２６ｎｍの青方偏移（図１Ｂ）を示し、そして０．０２から０．１３への蛍光異方性の増大（表１）を示している。フィブリルを９５００ｇでの１５分間の遠心分離によってペレット化し、そしてペレットをＨ２Ｏ（ｐＨ２）に再懸濁し、ガラス製スライドガラスに載せ、蛍光光顕微鏡観察を使用して画像化した。これらのスペクトル変化は、主にそれ以外のペプチドから構成されるフィブリル内に２つの標識ペプチドのそれぞれが取り込まれることをモニターする手段をもたらす。１％（ｗ／ｗ）ダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５を含有するＴＴＲ１０〜１９を、ＴＦＡを含むｐＨ２に調節された１０％ＣＨ３ＣＮに１０ｍｇ／ｍｌの最終的な総ペプチド濃度で再懸濁した。このサンプルを３７℃で１０日間インキュベーションした。１０日後、ＣＤスペクトルは著しいβシート構造の形成を示し、フィブリルがＥＭによって認められた。蛍光スペクトルは、可溶性ペプチドと比較したときにダンシル基からの発光における著しい青方偏移（表１）を示し、そしてこのプローブの異方性が０．０３から０．１７に増大している。９０％を越える標識ペプチドが、超遠心分離による沈降においてフィブリルとともに分配された。
【００７４】
フィブリルを９５００ｇでの１５分間の遠心分離によってペレット化し、ペレットをＨ２Ｏ（ｐＨ２）に再懸濁し、ガラス製スライドガラスに載せ、蛍光光顕微鏡観察を使用して画像化した。このペレット化物の蛍光光顕微鏡観察により、緑色蛍光が明らかにされ、これは、プローブが高分子量の構造体の中に挿入されたことと一致する。同様に、１０％ＣＨ３ＣＮにおいて３７℃で１０日間インキュベーションされた、１重量％のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９のみを含有する１０ｍｇ／ｍｌのＴＴＲ１０５〜１１５は、ＣＤにより示されるように、広範囲のβシート構造を形成した。しかし、ＣＤスペクトルの形状は、ＴＴＲ１０５〜１１５単独のスペクトルとは実質的に異なる：組み立てられたフィブリルにおいてターン構造が形成されたためであると本発明者らが考えている、約２３５ｎｍで以前に観測された主要な負バンドは強度が低下している（図２）。このことは、フィブリル列におけるペプチドの二次構造における実質的な変化を示唆している。ＥＭによって認められるフィブリルは、外観が、ＴＴＲ１０５〜１１５単独によって形成されたほとんど結晶性の構造体とは異なっており、本発明者らは、電子顕微鏡写真において規則的な周期性のねじれを有する同時フィブリルを認めた。蛍光分光法はフルオレセイン基の分光的性質の変化をほとんど示しておらず、わずかに約２ｎｍの赤方偏移を示すだけであるが、異方性は０．２２に実質的に増大している。これらの実験は、まとめると、２つの異なるペプチドからなる同時フィブリルを作製することが可能であることを示している。このことは、アミノ酸側鎖が何であるかは、フィブリルを形成するポリペプチド鎖の能力には重要でないことを強く示唆している。
【００７５】
フィブリル集合体内にドープされた蛍光性ペプチドの位置を明らかにするために、本発明者らは免疫金標識法を開発した。フルオレセイン基は、抗体結合に対する容易な抗原性の標的を提供し、そしてコロイド状の金で標識された別の抗体を添加したとき、電子顕微鏡観察によって検出することができる。この技術は、薄い組織切片のインサイチュー染色として病理学的タンパク質を同定するために用いられる技術と概念的に類似している。
【００７６】
１重量％のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０〜１９フィブリルをウサギ抗フルオレセインＩｇＧでプローブし、その後、金標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体でプローブした（スケールバー：２００ｎｍ）。５ｎｍの金粒子が様々なフィブリルと結合していることが認められたが、ＴＴＲ１０〜１９フィブリル単独では、抗体に対する反応が起こらなかった。フィブリルに結合した連続する金クラスター間の距離を測定することにより、金粒子が、平均して４０ｎｍ〜５０ｎｍ毎に、しかしフィブリルの長さ方向には不規則な間隔で分布していることが示される。フィブリルの長軸に沿ったペプチド間の水素結合距離は４．７Åであり、従って、クラスター間の平均距離は、抗原性の標識が８０ペプチド〜１００ペプチド毎に取り込まれていることを示唆している。フィブリル生成時には、ペプチド前駆体の１００個毎にほぼ１個を構成する蛍光標識されたペプチドが、成長中のフィブリルにランダムに取り込まれると考えられる。微量（１％ｗ／ｗ）のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５から構成される同時フィブリルの免疫金標識は、金粒子がフィブリルの長さ方向に沿ってほぼ４０ｎｍ〜６０ｎｍの間隔で結合していることを示す。再度ではあるが、このことは、ゲストペプチドが成長中のフィブリルのβシート足場にランダムに取り込まれていることを示唆している。標識ペプチドが予備形成ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルに添加されたさらなるコントロール実験では、抗体結合が生じなかった。このことは、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９が、完全に組み立てられたフィブリルに対して非特異的に単に結合していないことを示している。
【００７７】
免疫金標識。濃度が１０μｇ／ｍｌ〜６０μｇ／ｍｌである２μｌのペプチドを、ホルムバールおよび炭素でコーティングされたグリッドに加えた。１分後、溶液をろ紙で吸い取り、グリッドを、１％（ｗ／ｖ）オボアルブミンを含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＭＯ）で５分間ブロッキングした。サンプル処理を、実験室用パラフィルムのシートに置かれた適切な溶液の２０μｌの液滴に対してグリッドを逆さにすることによって行った。グリッドを一次抗体（ＨＢＳＳに１／１０に希釈されたウサギ抗フルオレセインＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに室温で３０分間インキュベーションし、その後、ブロッキング溶液（ＨＢＳＳ／オボアルブミン）で、５分間、３回洗浄した。二次抗体、すなわち、コロイド状の金で標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）をＨＢＳＳで１／１０に希釈して、グリッドに３０分間加えた。グリッドを、１０分間、ブロッキング溶液で３回洗浄して、０．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで１０分間固定し、Ｈ２Ｏで１分間洗浄して、０．５％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで染色した。
【００７８】
Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するインスリンフィブリルは酢酸ウラニルでネガティブ染色され、電子顕微鏡写真が撮影された。これらは、らせん状のねじれがフィブリルの長さ方向に沿って規則正しいことを示した。１％（ｗ／ｗ）のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するウシインスリンフィブリルの免疫金標識は、標識ペプチドが取り込まれていることを示す、フィブリルと結合した金クラスターを示し、そして、予備形成されたインスリンフィブリルとともに可溶性ペプチドをインキュベーションしたときには、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９の非特異的な結合がないことを示した。
【００７９】
図３は、インスリン−ＴＴＲ１０〜１９の同時フィブリルに対する抗フルオレセインＩｇＧの結合が周期的であることを示している。パネルａ：上記で得られた免疫金標識像から、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルに結合したコロイド状金粒子間の距離（ｎｍ単位）を示す棒グラフ。パネルｂ：上記で得られた免疫金標識像から、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するインスリンフィブリルに結合したコロイド状金粒子間の距離（ｎｍ単位）を示す棒グラフ。ＴＴＲ１０〜１９またはＴＴＲ１０５〜１１５を用いて調製された同時フィブリル（図３ａ）とは異なり、インスリン−ＴＴＲの同時フィブリルに対する金標識抗体の結合はある程度の規則性を示すようである。周期性は、標識が約６０ｎｍおよび約１２５ｎｍの間隔で生じていることを示す図３ｂに棒グラフとして示される。この結果の考えられる解釈は、ペプチドが成長中のインスリンフィブリル内に規則的に挿入されているということである。インスリンフィブリルのらせん状のねじれがフィブリル軸に沿って６０ｎｍ毎であることは、規則的な間隔で反復する少なくとも１つの構造的現象を示唆している。金粒子が周期的に結合していることは、フィブリルがねじれたときにだけ、ペプチドが成長中のインスリンフィブリルに取り込まれていることを表し得る。しかし、フィブリル集合の現在のモデルでは、プロトフィラメントの部分構造が最初に形成され、その後、この部分構造が会合して、組み立てられたフィブリルにおいてだけらせん状ピッチを取ることが示されている。従って、本発明者らは、観測された周期性は、フィブリルがねじれることによって規定される間隔で水相に抗原がさらされたためであり、そして成長中のタンパク質フィブリル内へのペプチトの取り込みが、もう一度、ランダムに生じていると考えている。
【００８０】
これは本発明の一部を形成しないが、関連性のないペプチドがアミロイドフィブリルに取り込まれ得るという事実により、側鎖特異的な相互作用によってではなく、ポリペプチド骨格を構成する種々の基と基との間に水素結合の網目構造が形成されることによって決定されるこれらのフィブリルの一般的構造に対する説得力のある支持が得られると考えられる。正しく折り畳まれた球状タンパク質では、骨格が、一連の安定化相互作用に関与しており、従って、アミロイドフィブリルの形成は、安定な三次構造の部分的な変性もしくは脱安定化の後に、または非構造化されたフラグメントのインビボにおける生理学的に不適切な生成の後に認められるだけである。アミノ酸側鎖が何であるかは、タンパク質前駆体の構造および安定性に影響を及ぼすが、組み立てられたフィブリルの、基本的なβシートが水素結合した網目構造には影響しない。球状タンパク質において実際に観測されるように、種々の側鎖が、組み立てられたシート構造内に異なる様式で充填される。いくつかの配列については、特に有利な接触が種々の側鎖間で生じ、より有利な充填相互作用をもたらすと考えられる。従って、そのような配列は、フィブリル構造を形成する大きい傾向を示す。しかし、このような傾向、および特定の溶液条件のもとでのフィブリルの安定性はまた、溶媒とのその相互作用に、そして球状構造の安定性などのポリペプチド鎖の可溶性形態の固有的な性質に依存する。そのうえ、アミノ酸側鎖が何であるかはまた、アミロイドフィブリル内へのプロトフィラメントの自己集合に対する作用を有すると考えられる非構造化領域間の相互作用にも影響を及ぼす。このようにして、種々のタンパク質種は、詳しく記載された形状形態が異なるが、水素結合した共通的な基礎となるβシート網目構造を有するアミロイドフィブリルを生じさせることができる。従って、本発明は広範な利用性を有する。
【００８１】
フィブリルの架橋。ペプチドは、アミン反応性のＮＨＳエステルと、光反応性のアリールアジドとからなるヘテロ二官能性架橋剤を暗所で添加することによって修飾された。架橋剤は、反応性のアリールアジドを残したまま、フリーのアミノ基を介してペプチドに結合する。約１０％ｗ／ｗのペプチドが、上記に記載されるようにアミロイドフィブリル内に取り込まれ、その後、暗所に保たれた。その後、成熟したフィブリルは近ＵＶ光にさらされ、この結果、天然に存在するプラスチックに化学的に類似するフィブリルの整列された架橋シートがもたらされた。暗所で保存されたＵＶ架橋前のフィブリルおよびＵＶ架橋後のフィブリルの電子顕微鏡写真により、密な架橋された網目構造がＵＶ光への露光から生じていることが確認された。
【００８２】
ペプチド−ＤＮＡの混合フィブリル。一本鎖ＤＮＡを、チオール化学を利用することによってペプチドに化学的に結合させた。１％のペプチドが、主に同じペプチドを含むが、結合したＤＮＡを有しないアミロイドフィブリル内に続いて導入された。ＤＮＡが結合したペプチドをフィブリル内に導入することの成功が、免疫金標識によって明らかにされた。ＤＮＡが結合したペプチドを含み、酢酸ウラニルおよび免疫金標識を用いてネガティブ染色されたアミロイドフィブリルの透過電子顕微鏡写真により、フィブリル内へのＤＮＡ−ペプチドサブユニットの取り込みの成功が明らかにされた。
【００８３】
導電性測定。上記で形成されたフィブリルのいくつかの導電性を測定した。フィブリルを雲母表面に載せ、空気中で乾燥させた。銀ペースト電極をフィブリル膜に付けた。フィブリルの多くは導電性を示した。特に、蛍光標識されたペプチドは大きい導電性を示し、典型的には非修飾フィブリルの約１０倍の導電性を示した。図４（ａ）には、非修飾フィブリルの導電性が示される。図４（ｂ）には、２％ｗ／ｗの蛍光標識ペプチドを含有するフィブリルの導電性が示される。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１（ａ）は、遊離状態のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９のスペクトル（実線）と比較して、ＴＴＲ１０〜１９フィブリル内に取り込まれたＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９の蛍光発光スペクトル（破線）を示す。図１（ｂ）は、遊離状態のダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５のスペクトル（実線）と比較して、ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリル内に取り込まれたダンシル−ＴＴＲ１０５〜１１５の蛍光発光スペクトル（破線）を示す。
【図２】図２は、ＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルの円二色性スペクトル（破線）および１％（ｗ／ｗ）のＦ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルの円二色性スペクトル（実線）を示す。
【図３】図３は、インスリン−ＴＴＲ１０〜１９の混合フィブリルに対する抗フルオレセインＩｇＧの結合が周期的であることを示す。図３（ａ）は、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するＴＴＲ１０５〜１１５フィブリルに結合したコロイド状金粒子間の距離（ｎｍ単位）の棒グラフを示す。図３（ｂ）は、Ｆ５Ｍ−ＴＴＲ１０〜１９を含有するインスリンフィブリルに結合したコロイド状金粒子間の距離の棒グラフを示す。
【図４】図４（ａ）は非修飾フィブリルの電導性を示す。図４（ｂ）は、２％ｗ／ｗの蛍光標識ペプチドを含有するフィブリルの電導性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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