(57)【要約】本発明は、組み込まれた外来遺伝子を高収量発現させるための組換えインフルエンザウイルスに関するものであり、該組換えインフルエンザウイルスはヘルパーウイルスの不存在下において遺伝学的に安定であり、少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを含み、該ウイルスＲＮＡセグメントはタンデムな２つの遺伝子をコードするタンデムな２シストロンＲＮＡ分子であり、該タンデムな２シストロンＲＮＡ中において標準ウイルス遺伝子の１つが外来性の組換え遺伝子に共有結合しており、さらに該ウイルスＲＮＡセグメントは近いほうのコーディング領域を囲む上流スプライスドナーおよび下流スプライスアクセプターシグナルを有している。さらに本発明は、野生型インフルエンザウイルスによる日和見重感染の場合における再組合せ依存性の子孫産生に対抗する弱毒化ウイルスを得る方法；該組換えインフルエンザウイルスの製造方法；該組換えインフルエンザウイルスを含む医薬組成物；ならびに接種目的の医薬を製造するための該組換えインフルエンザウイルスの使用に関する。
2004508814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み込まれた外来遺伝子の高収量発現のための組換えインフルエンザウイルスであって、ヘルパーウイルス不存在下で遺伝学的に安定であり、タンデムに配置された２つの遺伝子をコードする２シストロンＲＮＡ分子である少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメント（タンデムＲＮＡセグメント）を含み、該タンデムＲＮＡセグメントにおいて、標準ウイルス遺伝子の１つが外来の組換え遺伝子に共有結合しており、該タンデムＲＮＡセグメントが、近いほうのコーディング領域を囲む上流スプライスドナーおよび下流スプライスアクセプターシグナルを有するものである組換えインフルエンザウイルス。
【請求項２】
タンデムＲＮＡセグメントが、近いほうの位置にある外来の組換え遺伝子の後ろの遠いほうのｍＲＮＡ位置に標準ウイルス遺伝子の１つを有し、あるいはその逆であり、両方の遺伝子がウイルス中に存在するウイルスＲＮＡに対してアンチセンス方向である、請求項１記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項３】
少なくとも１つの通常のウイルスＲＮＡセグメントがタンデムＲＮＡセグメントに置き換わっており、好ましくは置きかえられた通常のウイルスＲＮＡセグメントがノイラミニダーゼセグメント、赤血球凝集素セグメントおよびＮＳセグメントから選択されるものである、請求項１または２記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項４】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルがインフルエンザＷＳＮセグメント７および８中に存在する配列あるいは他の部分的に有効なスプライス反応基質から選択されるものである、請求項１ないし３記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項５】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルがインフルエンザＷＳＮセグメント７中に存在する配列から選択されるものである請求項４記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項６】
１またはそれ以上の通常のウイルスＲＮＡセグメントが該少なくとも１つのタンデムＲＮＡセグメントとは異なるものであり、ウイルス遺伝子の１つに共有結合していてもよくあるいは共有結合していなくてもよい外来遺伝子をコードするｖＲＮＡを含むものであり、好ましくは、１またはそれ以上の通常のウイルスＲＮＡセグメントが欠失されており、さらに外来遺伝子をコードするタンデムｖＲＮＡにより置きかえられているものである、請求項１ないし５記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項７】
１またはそれ以上の通常のセグメントおよび／または少なくとも１つのタンデムＲＮＡセグメントの末端ウイルスＲＮＡ配列がプロモーターシグナルとして活性があり、５個までの位置のヌクレオチド置換により修飾されており、ｖＲＮＡプロモーターならびに相補的配列として存在するｃＲＮＡプロモーターの両方の転写速度が改善されるものである請求項１ないし６記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項８】
１２個のヌクレオチドの保存されたインフルエンザ３’末端配列が、その配列中の３’末端から数えて位置３、５および８において１ないし３個のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されることにより修飾されている、そして／あるいは１３個のヌクレオチドの保存されたインフルエンザ５’末端配列が、その配列中の位置３および８において１または２個のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されることにより修飾されている、請求項７記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項９】
３’末端ヌクレオチド配列における置換が修飾Ｇ３ＡおよびＣ８Ｕを含むものである請求項８記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
３’末端ヌクレオチド配列における置換が修飾Ｇ３Ａ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｕを含むか、あるいはＧ３Ｃ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｇを含むものである請求項９記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ−３’である３’末端ヌクレオチド配列を含む請求項１０記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
５’末端ヌクレオチド配列がＵ３ＡおよびＡ８Ｕを含み、５’−ＡＧＡＡＧＡＡＵＣＡＡＧＧである５’−末端配列を生じている請求項７ないし１２記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
組換えインフルエンザＡウイルスである請求項１ないし１２記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１４】
タンデムＲＮＡセグメント中の外来遺伝子が、組換えウイルスに感染した細胞から分泌される蛋白および／または糖蛋白をコードしている請求項１ないし１３記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１５】
タンデムＲＮＡセグメント中の外来遺伝子が、固有のエピトープを感染細胞表面に有効に提示してＢ細胞および／またはＴ細胞の応答を刺激するように設計された蛋白または人工ポリペプチドをコードしている請求項１ないし１３記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１６】
タンデムＲＮＡセグメント中の外来遺伝子が、ウイルス弱毒化を引き起こすヌクレオチド配列である請求項１ないし１３記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１７】
外来遺伝子がアンチセンス方向のウイルスノイラミニダーゼ遺伝子の一部または全体をコードしている請求項１６記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１８】
アンチセンス方向のノイラミニダーゼ遺伝子が赤血球凝集素ｖＲＮＡセグメントに結合されており、別の遺伝子またはレポーター遺伝子が第２のタンデムｖＲＮＡ中にコードされていてもよく、好ましくはＮＳ２に結合しているものである請求項１７記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１９】
（ａ）アンチセンスまたはセンスタンデムデザインの組換えｖＲＮＡのインビボにおけるＲＮＡポリメラーゼＩ合成、
（ｂ）次いで、隣接リボザイム標的配列を対応ウイルスＲＮＡセグメント中に含むように構築されたインフルエンザ担持株での感染、次いで、
（ｃ）その後のリボザイム開裂による選択的ｖＲＮＡ不活性化
を含む、請求項１ないし１８で定義した組換えインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルス、好ましくは請求項１６ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスを含む医薬組成物。
【請求項２１】
接種目的の医薬を製造するための、請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルス、好ましくは請求項１６ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２２】
医薬が
（ａ）インフルエンザおよび／または他の感染症に対して適当なものである；
（ｂ）不活性化調合物の形態で提供される；そして／あるいは
（ｃ）生きた組換えウイルスの形態で提供される
請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
細胞遺伝子治療用の薬剤を製造するための請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２４】
ウイルス感染した細胞中に外来遺伝子を移行させ発現させるための薬剤を製造するための、請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２５】
ウイルス感染した細胞中にＲＮＡ分子を移行させ発現させるための薬剤を製造するための、請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスの使用。
【請求項２６】
発現されるＲＮＡ分子が標的細胞ｍＲＮＡ分子に対してアンチセンス配列または２本鎖配列であり、そして／あるいは薬剤が好ましくはアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡ干渉機構による配列特異的遺伝子サイレント化に適したものである、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
薬剤がエクスビボおよびインビボ適用スキームに適用可能なものである請求項２３ないし２６記載の使用。
【請求項２８】
請求項１ないし１９記載の組換えインフルエンザウイルスを発現ベクターとして用いることを特徴とする、蛋白または糖蛋白の製造方法。
【請求項２９】
製造が細胞培養細胞中またはニワトリ受精卵中で行なわれる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
有効量の請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルス、好ましくは請求項１６ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスを処置すべき哺乳動物に投与することを特徴とする、インフルエンザの予防および／または治療方法。
【請求項３１】
治療すべき生物を請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスでの処置に供することを特徴とする体細胞遺伝子治療方法。
【請求項３２】
細胞を請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスに感染させることを特徴とする、細胞中に外来遺伝子を移行させ発現させ、細胞中にＲＮＡ分子を移行させ発現させる方法。
【請求項３３】
免疫治療用、好ましくは自己由来の免疫治療用の薬剤を製造するための請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスの使用。
【請求項３４】
免疫細胞、好ましくは樹状細胞を請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスにエクスビボ感染させ、次いで、形質導入された細胞を患者に導入することを特徴とする免疫治療方法。
【請求項３５】
請求項１ないし１８記載の組換えインフルエンザウイルスを免疫原として使用することを特徴とする抗体誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組み込まれた外来遺伝子を高収量発現させるための組換えインフルエンザウイルスに関するものであり、該組換えインフルエンザウイルスはヘルパーウイルスの不存在下において遺伝学的に安定であり、少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを含み、該ウイルスＲＮＡセグメントはタンデム（ｔａｎｄｅｍ）な２つの遺伝子をコードするタンデムな２シストロンＲＮＡ分子であり、該タンデムな２シストロンＲＮＡ中において標準ウイルス遺伝子の１つが外来性の組換え遺伝子に共有結合しており、さらに該ウイルスＲＮＡセグメントは近いほうの（ｐｒｏｘｉｍａｌ）コーディング領域を囲む上流スプライスドナーおよび下流スプライスアクセプターシグナルを有している。詳細には、上記タンデムな２シストロンＲＮＡ分子は、近いほうの位置にある外来性の組換え遺伝子の後ろの遠いほうの（ｄｉｓｔａｌ）ｍＲＮＡ位置にある標準ウイルス遺伝子の１つを含むか、あるいはその逆の位置関係にあるものを含み、いずれもウイルス中のウイルスＲＮＡに対してアンチセンス方向で存在する。両方の遺伝子の同時発現のために、近いほうの読み取り枠がスプライスドナーおよびアクセプターシグナルに隣接しており、それらはスプライシングされたｍＲＮＡのみを部分的に生じさせる品質を有し、スプライシングされたｍＲＮＡおよび未スプライシングｍＲＮＡの両方を同時に存在させる。
【０００２】
さらに本発明は、野生型インフルエンザウイルスによる日和見重感染の場合における再組合せ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）に依存した子孫産生に対抗する弱毒化ウイルスを得る方法；該組換えインフルエンザウイルスの製造方法；該組換えインフルエンザウイルスを含む医薬組成物；ならびに接種目的の医薬を製造するための該組換えインフルエンザウイルスの使用を提供する。
【０００３】
技術背景
アデノウイルス、レトロウイルス、セムリキ森林熱ウイルスまたは狂犬病ウイルスのごとき十分に研究された他のいくつかのウイルスにおいて達成されているのと同様の外来遺伝子発現のためのベクター系にインフルエンザウイルスを組み込むことは、受精卵でインフルエンザを増殖させて比較的高力価（１０１０／ｍｌ以上）とするための安価な増殖法が十分に確立されているという利点を有する。一方、現在の知識により構成成分たるｖＲＮＡセグメントをインフルエンザゲノムから欠失させて、大きなサイズの外来挿入物のために余地を確保してもよい。Ｂ細胞エピトープのごとき小さいサイズ（１０ないし１５アミノ酸）の外来ポリペプチドのみを、２つのウイルス蛋白中の選択された位置に挿入してもよく、すなわち、赤血球凝集素の表面に存在する可変的抗原性領域の１つと交換してもよく（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｃｏｓａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９（１１）， ６６７８−６６８６ （１９９５））、あるいはウイルスのノイラミニダーゼの幹配列中に挿入してもよく（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ ａｎｄ Ｐａｌｅｓｅ， Ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｏ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ３７， ３７−４７ （１９９５））、それらは機能的融合蛋白として安定に維持される。この種の構築物は、研究された少数の事例において実験的接種に有用であることがわかったが、現在はっきりとわかっているエピトープ配列（それぞれ１０ないし１２アミノ酸のもの）はむしろ少なく、それらのうちのいくつかはかかる制限された融合蛋白位置においてミスフォールドされている可能性があり、他の場合にはそれらの宿主ポリペプチド鎖の正しい３次構造および機能の形成を妨害しうる。
【０００４】
８つの標準的なｖＲＮＡセグメントの通常のセットによりコードされるもの以外に独立した９番目のｖＲＮＡ分子によりコードされる完全長の外来蛋白のインフルエンザウイルス中への逆転の遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）による組み込みは、特に困難性もなく一時的に可能である（Ｌｕｙｔｊｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｏｆ ａ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅ ｂｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ． Ｃｅｌｌ ５９， １１０７−１１１３ （１９８９）； Ｅｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＲＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５， ２９１−２９８ （１９９１））。連続的な選択圧の不存在下において、野生型プロモーター配列が当該９番目のｖＲＮＡセグメントに対して使用されるかぎり、いずれの付加的な組換えｖＲＮＡセグメントも安定に維持され得ず、注意していないとそれはウイルス増殖の工程がほとんど進行しないうちに消失するであろう。
【０００５】
個々の鋳型ｃＤＮＡ構築物の細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ転写による組換えｖＲＮＡ分子のインビボ合成のために構築された、我々の研究室で開発されたインフルエンザの逆転の遺伝学の異なる系（Ｚｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｖｉｒａｌ ｃＤＮＡ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１， ３０６７−３６１４ （１９９３）； Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０２， ４７７−４７９ （１９９４））を用いて、修飾された末端ウイルスＲＮＡ配列（以下、「プロモーター−アップ変異体」または「プロモーター−アップ変種」という）がヌクレオチド置換により設計された（Ｎｅｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ， Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７６， １７０９−１７１７ （１９９５）； ＷＯ９６／１０６４１）。上記プロモーター−アップ変種は５つのヌクレオチド置換を担持している（プロモーター−アップ変種１９２０において；Ｆｌｉｃｋ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８０， ２５６５−２５７２ （１９９９）参照）。これらのプロモーター−アップ変種が組換えの９番目のｖＲＮＡセグメントに結合される場合、その増加した転写および増幅速度は自発的消失を補うのみならず、選択の不存在下において単純なウイルス継代の間に外来性ｖＲＮＡセグメントの蓄積さえも引き起こすであろう。
【０００６】
しかしながら、外来セグメントは他のセグメントに追いついた後、すべての通常のインフルエンザｖＲＮＡセグメント（もちろん、野生型プロモーター配列に連結されているもの）よりも過剰複製されるので、外来セグメントは過度に豊富化するであろう。このことは、ウイルス粒子１個あたり数コピーの取りこまれた組換えｖＲＮＡを有するが、もはや平均約１２〜１５個のｖＲＮＡ分子中に取り込まれた８つのセグメントすべての完全なセットを有していないウイルス粒子を徐々に増加させる。かかる粒子は欠陥があり、プラークを形成しないので、増殖の最初の工程で組換えウイルス粒子が最初に増加した後は、通常には、３番目または４番目のウイルス継代の工程において、組換えｖＲＮＡのサイズおよびプロモーター−アップ変異体の結合レベルに依存して、劇的な減少が観察される。
【０００７】
インサート長およびプロモーター活性に関してバランスの取れた状況を達成することができ、１１回以上の継代の特別なケースにおいて増殖し、これらの工程における再部分のヘルパーウイルス中の組換えウイルスのレベルは本質的に安定なものである（約８０％）。完全なレベルのプロモーター−アップ変異体（変種１１０４または１９２０、下記参照）を用いる場合、４０００ヌクレオチドの組換えｖＲＮＡサイズと関連してバランスの取れたレベルの増殖が達成される（Ｍａｙｓａ Ａｚｚｅｈ， Ｐｈ．Ｄ． Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖ． Ｇｉｅｓｓｅｎ （２０００））。
【０００８】
これらすべての調合物において、一時的に達成された増加した収率（３番目または４番目のウイルス継代後に組み換え体の４０％まで）および組換えインフルエンザウイルスのバランスの取れた増殖（１０〜２０％）の両方において、個々のウイルス子孫は非組換えヘルパーウイルスが大部分である混合物を構成する。これらの結果は、ウイルス粒子中へのｖＲＮＡ分子のパッケージングの統計学的様式（９番目のセグメントは同時パッケージングされ得ない）およびヘルパーウイルスにのみ感染した細胞のフラクションの両方から生じる。
【０００９】
組換えインフルエンザの増殖中のフラクションの生成の問題および不安定性の問題を解決するために、組み込まれた外来遺伝子の高収率発現のために組換えインフルエンザウイルスを使用することが示唆され、そのインフルエンザウイルスはヘルパーウイルスがなくても遺伝学的に安定であり、全体として輻合的な配置において、アンビセンス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）ＲＮＡ分子である少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメント（「アンビセンスＲＮＡセグメント」という）を含み、標準ウイルス遺伝子の１つをセンス方向に含み、外来性の組換え遺伝子をアンチセンス方向に含んでいる（あるいはその逆の方向であってもよい）（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０３）。好ましくは、アンビセンスＲＮＡセグメントはプロモーター−アップ変異を含む。そのうえＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０３は、ｖＲＮＡ隣接位置に１またはそれ以上のリボザイム（１型）標的部位を担持する特別なインフルエンザキャリア（ヘルパー）株の構築方法を開示しており、該方法は下記工程を含む：
（ａ）組換えｖＲＮＡのインビボでのＲＮＡポリメラーゼＩ合成、ここに該組換えｖＲＮＡはタンデムな２つの異なる３’プロモーター配列（外部プロモーター−アップ変種および内部野生型プロモーター）を担持しており、それらは２型リボザイム標的配列により分けられており、それらは該内部１型リボザイム標的部位を担持している；
（ｂ）そして、野生型株のインフルエンザによる感染；
（ｃ）その後、ウイルス増殖の単純な工程による増幅；次いで
（ｄ）２型リボザイムを発現する細胞の感染によるリボザイム開裂による外部３’プロモーター配列の除去、次いで、プラーク精製による最終的な単離。
【００１０】
通常のｖＲＮＡ分子のかわりに外部１型リボザイム標的部位を有するｖＲＮＡセグメントを担持する特別なヘルパーウイルス株を得て、これをアンビセンスＲＮＡ分子のレスキューに使用する。リボザイム（１型）を含有する宿主細胞によるウイルス増殖の継代後にこれらはもっぱら組換えウイルス中で維持され、特別に調製されたヘルパーウイルスの感受性のあるｖＲＮＡ分子が破壊されるであろう。
【００１１】
しかしながら、上記アンビセンス構築物は（核内）ｍＲＮＡ２本鎖形成に対して感受性があり、両方のアンビセンス遺伝子、詳細には、（弱い）ｃＲＮＡプロモーターによりドライブされる遺伝子の発現速度が部分的に低下するであろう。この効果の程度の変動により、アンビセンスセグメント中の他のインフルエンザ遺伝子とバランスするようなインフルエンザウイルスの発現速度にすることが困難となっている。このことが本発明により解決されるべき問題であった。
【００１２】
発明の概要
上で議論した観察結果ならびに末端に適合されたインフルエンザ特異的ＲＮＡ分子との相互作用におけるウイルスＲＮＡポリメラーゼのこれまで予想されなかった特性に関する観察結果から出発して、上記問題を解決する安定な組換えインフルエンザウイルスが見出された。
【００１３】
本発明の組換えウイルスを受精卵における安価な増殖に使用でき、組換えウイルス自体の製造に、あるいはそれらによりコードされる外来蛋白または糖蛋白の製造に使用でき、それゆえ、（糖）蛋白の製造あるいは体細胞遺伝子治療用ベクター系の提供あるいは接種剤としての使用に用途が見出される。
【００１４】
かくして、本発明は以下のものを提供する：
（１）組み込まれた外来遺伝子の高収量発現のための組換えインフルエンザウイルス。該組換えインフルエンザウイルスはヘルパーウイルス不存在下で遺伝学的に安定であり、タンデムに配置された２つの遺伝子をコードする２シストロンＲＮＡ分子である少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメント（以下、「タンデム２シストロンＲＮＡセグメント」または「タンデムＲＮＡセグメント」という）を含み、該タンデムＲＮＡセグメントにおいて、標準ウイルス遺伝子の１つが外来の組換え遺伝子に共有結合しており、該タンデムＲＮＡセグメントは、近いほうのコーディング領域を囲む上流スプライスドナーおよび下流スプライスアクセプターシグナルを有する；
（２）上記（１）において定義された組換えインフルエンザウイルスの好ましい具体例。該具体例において、該少なくとも１つのタンデムＲＮＡセグメントの末端ウイルスＲＮＡ配列はプロモーターシグナルとして活性があり、５つまでの位置においてヌクレオチド置換により修飾されており、その結果、ｖＲＮＡプロモーターならびに相補配列として存在するｃＲＮＡプロモーターの転写速度が改善される；
（３）上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの製造方法。該方法は、
（ａ）アンチセンスまたはセンスタンデムデザインの組換えｖＲＮＡのインビボにおけるＲＮＡポリメラーゼＩ合成、
（ｂ）次いで、対応ウイルスＲＮＡセグメント中に隣接リボザイム標的配列を含むように構築されたインフルエンザキャリア株での感染、ここで、対応ウイルスＲＮＡセグメントは遠いほうの位置にあるタンデムセグメント中に存在するのと同じウイルス遺伝子をコードしている、
（ｃ）その後、リボザイム開裂による選択的ｖＲＮＡ不活性化
を含む。
（４）上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスを含む医薬組成物。
（５）接種目的の医薬を製造するための上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの使用。
（６）体細胞遺伝子治療用薬剤を製造するための上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの使用。
（７）かかるウイルスに（不全）感染した細胞中に外来遺伝子を移行させ発現させるための薬剤を製造するための上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの使用。
（８）かかるウイルスに感染した細胞中にＲＮＡ分子を移行させ発現させるための薬剤を製造するための上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの使用。
（９）上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスを発現ベクターとして用いることを特徴とする蛋白または糖蛋白の製造方法。
（１０）上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスを処置すべき哺乳動物に投与することを特徴とするインフルエンザの予防および／または治療方法、すなわち、該組換えウイルスを用いる接種方法。
（１１）上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスを処置すべき生物に供することを特徴とする体細胞遺伝子治療方法。
（１２）細胞中に外来遺伝子を移行させ発現させるための方法、ならびに細胞中にＲＮＡ分子を移行させ発現させるための方法であって、上記（１）および（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスに細胞を感染させることを特徴とする方法。
（１３）自己由来の免疫治療のための薬剤を製造するための上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスの使用。
（１４）上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスでの免疫細胞のエクスビボでの感染、次いで、形質導入された細胞の患者への導入を特徴とする免疫治療方法。
（１５）上記（１）または（２）で定義した組換えインフルエンザウイルスを免疫原として用いることを特徴とする抗体誘導方法。
以下に本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の「インフルエンザウイルス」は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスおよびインフルエンザＣウイルスを包含し、インフルエンザＡウイルスが好ましい。
【００１６】
本発明の「２シストロン」は、共有結合した２つの独立した遺伝子を含むウイルスＲＮＡセグメント、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡをいう。好ましいバージョンにおいて、これらの遺伝子の一方ははウイルス起源のものであり、他方は外来性の組換え遺伝子産物をコードするものである。
【００１７】
本発明の「近いほう」および「近いほうの位置」は、２シストロンウイルスｍＲＮＡ中の１の遺伝子の５’部分、すなわち、「遠いほうの位置」にあるもう１つの遺伝子の前方（上流）をいう。
【００１８】
本発明の「哺乳動物」はヒトおよび動物を包含する。「生物」は原核および真核系ならびに脊椎動物（哺乳動物を包含）および無脊椎動物のごとき多細胞系を包含する。
【００１９】
本発明の「感染した細胞」および「感染している細胞」は、それぞれ、「不全感染した細胞」および「不全感染している細胞」を包含する。
【００２０】
具体例（１）の好ましいインフルエンザウイルスにおいて、通常のウイルスＲＮＡセグメントの少なくとも１つがタンデムＲＮＡセグメントに置き換わっており、該タンデムＲＮＡセグメントは遠いほうの位置に標準ウイルス遺伝子の１つを含み、遠いほうの位置に外来性の組換え遺伝子を含むものであり、両遺伝子はアンチセンス方向であるか、あるいはその逆であってもよい。タンデムＲＮＡ分子において該外来性の組換え遺伝子がウイルス遺伝子に共有結合しており、同じ遺伝子をコードする元のｖＲＮＡセグメントが特異的なリボザイム開裂により組換えウイルスから欠失されるものがさらに好ましい。
【００２１】
ウイルス遺伝子とタンデムに共有結合した外来遺伝子は、好ましくは、組換えウイルスに感染した細胞から分泌されるリンホカインのごとき蛋白および／または糖蛋白をコードしているか、あるいはウイルス粒子ならびに感染細胞の原形質膜中に取りこまれる糖蛋白をコードしている。もう１つの好ましい具体例において、ウイルス遺伝子とタンダムに共有結合した外来遺伝子は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答を刺激するために感染細胞表面に固有のエピトープを有効に提示することを支持するように設計された蛋白または人工ポリペプチドをコードする。かかる蛋白または人工ポリペプチドは、例えば、腫瘍抗原またはポリペプチド鎖中において同定されたＴ細胞エピトープの人工オリゴマーシリーズからなるものである。結局、外来遺伝子は、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを包含するＲＮＡ分子の細胞中への移行および発現に適したものであってよい。かかる組換えインフルエンザウイルスは、例えば、アンチセンスまたはＲＮＡ干渉機構による配列特異的な遺伝子スプライシングに適したものである。
【００２２】
本発明の好ましい組換えウイルスは、通常のウイルスＲＮＡセグメント中で、標準的な糖蛋白赤血球凝集素およびノイラミニダーゼの一方または両方が、好ましくは、赤血球凝集素由来のアンカーセグメントおよびウイルスまたは細胞である外来ソースから得られるエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）からなる融合糖蛋白と置き換わっているものであるか、あるいは残存している標準成分のほかにかかる組換え糖蛋白が第３の分子種として挿入されているものである。
【００２３】
上記具体例（２）に示すように、本発明の好ましい組換えウイルスは、プロモーターシグナルとして活性のある末端ウイルスＲＮＡ配列が５つまでの位置におけるヌクレオチド置換により修飾されており、その結果、野生型配列よりも改善された転写速度（相補配列中に存在するようなｖＲＮＡプロモーターおよびｃＲＮＡプロモーターの両方に関して）ならびに向上した複製および／またはは発現速度が得られるものである。該修飾された末端ウイルスＲＮＡ配列が野生型配列と異なる点は、該タンデムｖＲＮＡセグメントにおいて、１２個のヌクレオチドの保存されたインフルエンザ３’末端配列が、その配列の３’末端からの位置３、５および８において生じている１〜３個のヌクレオチドの他のヌクレオチドとの置換により修飾されているものである。ただし位置３および８に導入されたヌクレオチドが塩基対を形成することが条件となる（すなわち、ヌクレオチド位置３のヌクレオチドがＧである場合、位置８のヌクレオチドがＣであり；ヌクレオチド位置３のヌクレオチドがＣである場合、位置８のヌクレオチドがＧである）。
【００２４】
野生型インフルエンザウイルスの３’保存領域は下記配列を有する：
インフルエンザＡ：（５’）−ＣＣＵＧＣＵＵＵＵＧＣＵ−３’
インフルエンザＢ：（５’）−ＮＮ（Ｃ／Ｕ）ＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’
インフルエンザＣ：（５’）−ＣＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３’
【００２５】
さらに、１３個のヌクレオチドの保存されたインフルエンザ５’−末端配列は、該配列中の位置３および８において生じる１個または２個のヌクレオチドの他のヌクレオチドとの置換により修飾されていてもよい。やはり、導入されたヌクレオチドが塩基対を形成することが条件である。野生型インフルエンザウイルスの５’保存領域は以下の配列を有している：
インフルエンザＡ：５’−ＡＧＵＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧ
インフルエンザＢ：５’−ＡＧＵＡＧ（Ａ／Ｕ）ＡＡＣＡ（Ａ／Ｇ）ＮＮ
インフルエンザＣ：５’−ＡＧＣＡＧＵＡＧＣＡＡＧ（Ｇ／Ａ）
【００２６】
本発明の好ましいイングルエンザウイルスは、３’保存領域において置換Ｇ３ＡおよびＣ８Ｕが達成されているものであり、さらに置換Ｕ５Ｃが達成されているものがより好ましい（上記変異は３’末端から数えるものであり、そのような数え方を下場合には数字の下に線を付して示すこともある。例えばＧ３Ａ）。もう１つの好ましいインフルエンザウイルス変異体は、３’−末端ヌクレオチド配列Ｇ３Ｃ、Ｕ５ＣおよびＣ８Ｇ（３’末端から数える）を含み、下記の３’末端ヌクレオチド配列（５’）−ＣＣＵＧＧＵＵＣＵＣＣＵ−３’を生じる。上で定義したインフルエンザウイルスのなかで、３’−末端ヌクレオチド配列（５’）−ＣＣＵＧＵＵＵＣＵＡＣＵ−３’を有するものが最も好ましい。インフルエンザＡウイルスの場合、セグメントはさらにその５’末端配列中に修飾Ｕ３ＡおよびＡ８Ｕを有していてもよく、インフルエンザＣの場合、セグメントは５’末端配列中に修飾Ｃ３ＵおよびＧ８Ａを有していてもよい。本発明の最も好ましいインフルエンザウイルスは下記の一般的構造を含む：
【００２７】
【化１】
2004508814.tif 000003
【００２８】
上記構造式において、変数は以下のように定義される：
（１）下線を付した文字および拡大された文字は、増強された特性を有するプロモーター変異体を調製するために、野生型配列に対して必要とされる変異を示す。
（２）配列の５’−部分の位置１０における拡大されたＡ：対合していないＡ残基、膨らみを形成する。
（３）（Ａ／Ｇ）：その位置における可変配列を有する異なる単離体または単一セグメント、機能的に交換可能である。
（４）ＮおよびＮ’：未確定であるが、５’および３’末端間の相補性により互いに塩基対を形成した位置。８つのセグメント間で異なるが、すべてのウイルス単離体の各セグメントに関して不変である。
（５）（８８０−２３００ｎｔｄｓ）：ウイルスＲＮＡセグメントの長さであり、外来遺伝子を伴うセグメントの場合、４０００ヌクレオチドまで増加する。
【００２９】
具体例（１）ないし（３）により、本発明は、
タンデムな配置となっている、７個（まで）の通常のｖＲＮＡセグメントに加えてインフルエンザ遺伝子の１つと共有結合した外来遺伝子をコードする１個（またはそれ以上）のさらなる２シストロンセグメントを含む安定な組換えインフルエンザウイルス、ならびに
２シストロンｖＲＮＡセグメントのタンデムな配置による安定な組換えインフルエンザウイルスの構築方法であって、弱毒化のための方法および同時感染インフルエンザウイルス間の再組合せ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を防止するための方法としても適用可能な方法
を提供する。
【００３０】
近いほうのコーディング領域を囲む上流スプライスドナーおよび下流スプライスアクセプターシグナルによりこれらの構築物における両方の遺伝子産物の発現を可能にする。スプライシングはｍＲＮＡ分子の一部のみにおいて起こる。すなわち、スプライシングされたｍＲＮＡおよびスプライシングされていないｍＲＮＡの両方のｍＲＮＡが感染細胞中に存在する。ｖＲＮＡの長さに関して補うためには、上で定義した複製および転写が向上したプロモーター変種に２シストロンセグメントを接続する。
【００３１】
スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナルを、インフルエンザセグメント７および８中に存在するオーセンティック配列あるいは他の部分的に有効なスプライス反応基質から選択し、好ましくはインフルエンザウイルスＷＳＮセグメント７の配列、すなわち５’−ＡＧ↓ＧＴＡＣＧＴＴＣ−３’（ドナー）および５’−ＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧ↓ＧＣ−３’（アクセプター）である。
【００３２】
具体例（１）ないし（３）の特定の適用例において、タンデムな２シストロンｍＲＮＡは、アンチセンス方向のウイルスノイラミニダーゼコーディング配列の全部または一部と共有結合した赤血球凝集素のごときウイルス遺伝子の１つをコードするが、オーセンティックなノイラミニダーゼｖＲＮＡセグメントはこれらの組換えウイルスにおいて消失している。これらの構築物のもう１つのバリエーションにおいて、これらの２シストロン組換えセグメントの近いほうの位置において、抗−ノイラミニダーゼリボザイム配列も（部分的な）ノイラミニダーゼアンチセンス配列と一緒に提供される。この特徴を有する組換えウイルスは、外因性ノイラミニダーゼの添加により培地中で増殖する。
【００３３】
機能的ノイラミニダーゼ遺伝子の不存在は強力な弱毒化機構として作用して、かかる組換えウイルスのみの１工程感染を生じさせる。機能的ノイラミニダーゼ遺伝子は同じ細胞に重感染する別の（野生型の）インフルエンザウイルスにより提供されるが、その遺伝子の発現は、同時感染した細胞からでさえも感染性の子孫の産生を妨害するように設計された、重感染細胞中の再組合せに対する障壁としての、アンチセンスＲＮＡ相互作用および／またはリボザイム開裂による対応ｖＲＮＡの破壊により非常に抑制される。
【００３４】
ウイルス遺伝子の１つが外来コーディング配列に共有結合している構築物中のタンデムな２つの遺伝子を同時にコードする組換えウイルスＲＮＡを、細胞のＲＮＡポリメラーゼＩによるマイナス鎖ｖＲＮＡのインビボ転写用に設計されたＥ． ｃｏｌｉのプラスミドベクターＤＮＡにより構築する。これらの構築物において、プラス鎖の近いほう（上流）の位置にある遺伝子は制限された活性のスプライスシグナルに囲まれ、その結果、スプライシングされたｍＲＮＡおよびスプライシングされていないｍＲＮＡの両方が感染細胞中に存在する。外来遺伝子またはウイルス遺伝子のいずれかは当該上流位置にあってもよい。大部分の適用例において、より大きな速度の発現は外来コーディング配列に関して保存されるが、ウイルス遺伝子のより低い発現速度は通常のウイルスセグメントによりコードされる他のウイルス遺伝子の発現と大体バランスするように適合される。
【００３５】
かかるバランスのとれた発現速度を達成するために、スプライスシグナルおよびプロモーターを正しく選択しなくてはならない（Ｆｌｉｃｋ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ， ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ’ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ’ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８０， ２５６５−２５７２ （１９９９））。正味の転写速度が上昇すると、ウイルス遺伝子が遠いほう（下流）の位置にある場合には生じるｍＲＮＡのスプライシングの効率が悪くなるであろう。逆に、外来遺伝子が遠いほうの位置にある場合、外来ｍＲＮＡを得るためのスプライシングが効率的に行なわれるであろう。両方の設計は、ウイルス遺伝子に対する外来遺伝子を過剰発現させることに役立つが、その発現は他のウイルス遺伝子の発現とバランスしたものであろう。さらに、２シストロンセグメントに結合したプロモーター変種は、増加した複製速度により増加した遺伝子の長さを補う機能を有するものである。
【００３６】
好ましくは、２シストロンセグメントの構築に使用するインフルエンザｖＲＮＡセグメントはノイラミニダーゼ（Ｎｏ．６）、赤血球凝集素（Ｎｏ．４）およびＮＳセグメント（Ｎｏ．８）を包含する。ＮＳセグメントにおいて、外来遺伝子は、ウイルスＮＳ２遺伝子をその場に残してＮＳ１遺伝子と置換されていてもよい。これらの組換えウイルスは、例えば、以下の手順により作製することができる：２シストロン構築物中に存在するのと同じ１シストロンセグメント中のウイルス遺伝子に隣接するリボザイム開裂部位を担持するヘルパーウイルスセグメントをリボザイムにより繰り返し開裂することにより組換えウイルス集団を選択することができる（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１９０３）。連続したウイルス継代および同等に構築された２シストロンセグメント中のレポーター遺伝子のアウトプットに依存することにより、以下のエレメントのセットを正しく選択することにおいて、バランスのとれた様式の発現を達成することができる：プロモーター、スプライスシグナルならびにセグメント長の限定された変化。次いで、バランスのとれた、安定した発現を引き起こす構築物を、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ ９６， ９３４５−９３５０ （Ａｕｇｕｓｔ １９９９）によるヘルパーウイルスフリーの設計における複数ｃＤＮＡトランスフェクション法の基礎として用いる。純粋なヘルパーフリーの状態の単一プラークにより得られた組換えインフルエンザウイルスを、別のシリーズの増殖工程に供して、最終的にその特性を評価する。
【００３７】
特別な適用例において、制御された様式のウイルス弱毒化にこの設計を用いる。これまでインフルエンザウイルスの弱毒化は低温感受性変異株（Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １６９， ６８−７６ （１９９４））においてＮＳ１遺伝子を欠失させることにより（不完全弱毒化、Ｅｇｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２， ６４３７−６４４１ （Ａｕｇｕｓｔ １９９８）およびＰａｌｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ４３０９−４３１４ （Ａｐｒｉｌ ２０００））、あるいはノイラミニダーゼ遺伝子を欠失させることにより（完全弱毒化、Ｋａｗａｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４， ５２０６−４２１２ （Ｊｕｎｅ ２０００））行なわれてきた。弱毒化のための新規技法を用いて後者のアプローチがここに適合され、該技法は、野生型ウイルスによる重感染をはじめて妨害可能とするものである。
【００３８】
本発明のこの具体例において、２シストロンｃＤＮＡ構築物が達成され、該構築物は外来遺伝子のかわりにアンチセンス方向のウイルスノイラミニダーゼ遺伝子の一部または全体のいずれかをコードしており、ノイラミニダーゼ遺伝子はスプライスドナーおよびアクセプターエレメントの両方により囲まれていてもよく、囲まれていなくてもよい。そのようなデザインのもう１つのバージョンにおいて、５’−末端ノイラミニダーゼ配列に相補的な２ｘ５０ヌクレオチドのアンチセンスセグメントが、ハンマーヘッドデザインによりリボザイム構築物に隣接する位置においてクローン化され、ノイラミニダーゼ配列中の通常ののＧＵＣトリプレットとは逆方向にされた。好ましいデザインにおいて、このアンチセンス発現構築物は赤血球凝集素ｖＲＮＡセグメントに結合されたが、もう１つの遺伝子またはレポーター遺伝子は第２の２シストロンｖＲＮＡ中にコードされ、ＮＳ２に結合している。
【００３９】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を欠損した組換えウイルスの増殖には、培地に外からノイラミニダーゼを添加することを要する。ノイラミニダーゼ不存在下において、ＮＡ欠失ウイルスによる感染は不完全であり、感染性のある子孫は産生されない。組換えウイルスと野生型ウイルスとの同時感染（３：３）によっては、子孫ウイルスまたはプラークは観察されず、このことはアンチセンスによりブロックされた発現または野生型ウイルスから生じるノイラミニダーゼセグメントの（部分的な）破壊によるものとされる。それゆえ、記載された組換えウイルスは単感染において弱毒化されるのみならず、同時に野生型ウイルスの重感染を妨害し、それゆえ、２種のウイルス間の再組合せは起こらないであろう。
【００４０】
上記具体例（４）による医薬組成物および上記具体例（５）の医薬は医薬上有効量の組換えインフルエンザウイルスを含有する。上記組換えインフルエンザウイルスのほかに、医薬組成物および医薬はさらに、当業者によく知られた医薬上許容される担体物質、例えば結合剤、崩壊剤、希釈剤、バッファー、保存料等を含んでいてもよい。医薬組成物および医薬は固体または液体調合物であり、経口投与、静脈内投与または皮下投与に適したものとされる。
【００４１】
上記具体例（５）の医薬は、好ましくは、インフルエンザおよび／または他の感染症の医薬として適したものである。組換えインフルエンザウイルスは不活性化調合物の形態であってもよく、あるいは生きた組換えウイルス、好ましくは弱毒化ウイルスの形態であってもよい。
【００４２】
生きた組換えウイルスワクチン、生きているが弱毒化された組換えウイルスワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンを処方することができる。不活性化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという点で「死んだ」ものである。理想的には、その免疫原性に影響することなく感染性が破壊されたものである。不活性化ワクチンを製造するために、組換えウイルスを細胞培養物中または胚発生したニワトリ卵中で増殖させ、精製し、次いで、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンにより不活性化させる。得られたワクチンを、通常には筋肉内投与する。
【００４３】
不活性化ウイルスを適当なアジュバントとともに処方して、免疫学的応答を促進してもよい。かかるアジュバントは無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、プルロニックポリオールのごとき表面活性剤、リゾレシチン、ペプチド、油脂エマルジョン、およびＢＣＧのごとき潜在的に有用なヒト用アジュバントを包含するが、これらに限らない。
【００４４】
多くの方法を用いて上記ワクチン処方を導入することができ、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、または鼻腔内経路がある。生きた組換えウイルスワクチンを用いる場合、インフルエンザウイルスの本来の感染経路により処方を導入することが好ましい。
【００４５】
好ましくは、上記具体例（５）による医薬はインフルエンザおよび他の感染症に対する予防的または治療的接種、あるいは両方に適したものである。例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス等に対するワクチン中に使用される組換えウイルスを製造することができる。１の具体例において、組換えウイルスはウイルスの表面蛋白に関する遺伝子を含み、別の具体例において、非構造遺伝子または調節遺伝子に関する遺伝子を含む。組換えウイルスを不活性化調合物の形態で提供してもよく、あるいは生きた組換えウイルス、あるいは生きているが弱毒化されたウイルスの形態で提供してもよい。弱毒化ウイルスにおいて、組換えウイルスは１回または最も頻繁には非常に少ない回数の増殖サイクルをたどり、十分なレベルの免疫応答を誘導するであろうが、疾病を引き起こすことはないであろう。かかるウイルスは必須のインフルエンザ遺伝子の１つを欠いているか、あるいは温度感受性を誘発するような変異を含む。
【００４６】
本発明の具体例（６）〜（８）の薬剤は、エクスビボおよびインビボ適用スキームに適用可能である具体例（８）の薬剤により発現されるＲＮＡ分子は標的の細胞ｍＲＮＡ分子に対してアンチセンス配列であるかあるいは二本鎖配列（アンビセンス二方向転写）である。具体例（８）において、好ましくは、薬剤は、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡ干渉機構による配列特異的遺伝子サイレント化に適したものである。
【００４７】
好ましくは、蛋白または糖蛋白の製造方法は、当業者の一般的知識内の標準的手法により細胞培養細胞中またはニワトリ受精卵中で行なわれる。発現される蛋白または糖蛋白は上記アンビセンス構築物中に取り込まれるものである。
【００４８】
本発明の具体例（９）ないし（１２）、（１４）および（１５）は哺乳動物への有効量の組換えウイルスの投与あるいはエクスビボ治療またはインビトロ研究に使用される細胞系への十分な感染用量の組換えウイルスの投与を包含し、該量および用量は所望処置に関する各当業者の知識において当業者により決定されるであろう。
【００４９】
好ましくは、本発明の具体例（１４）の薬剤を用いて患者由来の免疫細胞を感染、トランスフェクションあるいは形質導入する。薬剤は癌または慢性ウイルス疾患の処置に適している。この目的のために、患者由来の免疫細胞、好ましくは樹状細胞を、例えば腫瘍抗原またはウイルス抗原を発現する組換えインフルエンザウイルスにエクスビボで感染させる。次いで、形質導入された細胞を患者に再導入する。
【００５０】
本発明の具体例（１４）の好ましい免疫治療方法は自己由来の免疫療法であり、エクスビボ感染される細胞は患者由来であり、形質導入された細胞は患者に再導入される。この方法により処置される疾病は癌および慢性ウイルス疾患を包含する。かかる処置の詳細に関しては上記具体例（１３）の議論を参照のこと。
【００５１】
本発明の具体例（１５）による抗体導入方法は、オーセンティックなコンホーメーションの組換えインフルエンザウイルスの一部としての蛋白または糖蛋白抗原の投与後に糖蛋白を包含する外来蛋白に対する抗体を誘導することに適し、そのことによりウイルスが赤血球凝集に基づく温和な方法により精製され、遺伝子が感染細胞において高い割合で発現される。
【００５２】
インフルエンザウイルスは広範な宿主範囲を有するので、鳥類、ブタ、ウマおよびマウス等を包含する広範な動物においてインフルエンザウイルスを用いて強力な免疫応答を得て、抗体を単離することができる。さらに、マウスに適合したインフルエンザウイルスを用いて鼻腔内経路を包含するいくつかの経路によりマウスに感染させることができる。このことは、咽頭粘膜細胞の感染を引き起こし、さらなるタイプのＢ細胞応答（例えば、ＩｇＡに対するＩｇＧの割合における認識）を引き起こす。マウスは、ヒト抗体を発現するように処理されたトランスジェニックマウスにおける免疫応答の誘導に特に有用である。血球吸着に基づく温和な方法を用いてインフルエンザウイルスを精製することができるので、本来のコンホーメーションの抗原に対する抗体を感染哺乳動物から単離することができる。下記の非限定的的な実施例を参照して本発明をさらに説明する：
【００５３】
実施例
レポーター遺伝子ＣＡＴおよびＧＦＰを用いるモデルタンデム２シストロン発現構築物
目的：近いほうおよび遠いほうの位置にあるＣＡＴの相対的発現速度の測定、ならびに組換えインフルエンザウイルス増殖中の別の位置でのＧＦＰ蛍光の生体での観察。
ａ）２シストロン発現プラスミドＤＮＡの構築：
ベクタープラスミドｐＨＨ１０（Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｐｈ．Ｄ． Ｔｈｅｓｉｓ， Ｕｎｉｖ． Ｇｉｅｓｓｅｓ （１９９７））、すなわちヒトｒＤＮＡプロモーターセグメントとネズミｒＤＮＡターミネーターセグメントとの間に正確に挿入されたインフルエンザｒＲＮＡセグメント５の５’および３’ｖＲＮＡ配列を示すｃＤＮＡ配列エレメント、ならびにプラスミドＰＢＳＫから得た集中的なマルチプルクローニング部位を含むアンピシリン耐性プラスミドから出発して、両方のレポーター遺伝子を段階的な方法で挿入した。その後、近いほうの読み取り枠、すなわちｐＨＬ３１９６中のＣＡＴおよびｐＨＬ３２２４中のＧＦＰに、上流スプライスドナー配列エレメントおよび下流スプライスアクセプターエレメントを付加し、それらは両方とも二本鎖オリゴヌクレオチドとして、個々の位置で利用可能な特定の制限開裂部位間に挿入された。上記プラスミドのペアーに使用されたシグナル配列はインフルエンザｖＲＮＡセグメント７に由来するものであり、その部分的スプライス反応により両方の遺伝子産物Ｍ１およびＭ２が同時に得られることが知られている。両方の読み取り枠に対して遠いほうの位置への非転写ＤＮＡフラグメント（インフルエンザＰＢ１コーディング領域の内部セグメントを示す）の挿入により、ｐＨＬ３１９６をｐＨＬ３２２５に変換し、ｐＨＬ３２２４をｐＨＬ３２３６に変換した。得られたプラスミド構築物に関しては図５〜８および配列番号：２１〜２４参照のこと。
【００５４】
ｂ）プラスミドＤＮＡのトランスフェクションおよび組換えインフルエンザウイルスの単離：
セミコンフルエントな２９３−Ｔ細胞、すなわち人工的に組み込まれた腫瘍ウイルスＳＶ４０ Ｔ−抗原遺伝子を担持するヒト腎臓カルシノーマ細胞系を、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いてＤＮＡ−トランスフェクションした。３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と混合された５〜１０μｇのＤＮＡを３７０μｌのＤＭＥＭ培地に添加し、５ｘ１０６ないし１０７個の細胞とともにインキュベーションし、洗浄し、次いで、無血清状態で５ないし８時間維持し、その後血清を添加してさらに１２ないし１５時間維持した。最終的に、インフルエンザヘルパーウイルスＦＰＶＢｒａｔｉｓｌａｖａを用いてＤＮＡトランスフェクション細胞の感染を行なった。感染から８ないし１２時間後にヘルパーウイルスと組換えウイルスの混合物を含む上清を集めてさらに増殖させ、一方、沈降した細胞を細胞溶解物の調製に使用し、そのフラクションをＣＡＴアッセイ手順に使用した。
通常には、すでに得られている上清１ｍｌを感染に使用して、再びセミコンフルエント状態（プレート１枚あたり５ｘ１０６ないし１０７個）になっているＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に感染させることによりウイルス増殖を行なった。引き続いて同様にして増殖を行ない、各工程の最後にＣＡＴアッセイ用の細胞溶解物を調製した。感染細胞をＧＦＰ蛍光観察にも使用した。
【００５５】
ｃ）ＣＡＴアッセイ：
細菌のクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）は分解せずに真核細胞中に蓄積し、典型的な遺伝子発現測定に用いることができる。これに用いる基質は蛍光ホウ素−ジピロメタン−クロラムフェニコールジフルオライド（ＦＬＡＳＨ ＣＡＴ−ＫＩＴ（登録商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。５０μｌの細胞溶解物またはその減量／希釈された試料を、１９ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ７．５中７．５μｌの蛍光基質および１μｌのアセチル−ＣｏＡ（４ｍＭ）共存基質との３７℃で３時間のインキュベーションに使用した。反応生成物の抽出には１ｍｌの酢酸エチルｉｎｓを添加し、混合物をボルテックスにかけ、次いで、遠心分離により分離した。溶媒を蒸発させ、２０ｍｌの酢酸エチルに再溶解させた後、クロロホルム／メタノール（８７：１３％）（体積％）を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフィープレートで反応生成物を分離し、ＵＶ光下の写真により結果を記録した。
【００５６】
ｄ）結果
この組換えプラスミドのペアーの近いほうまたは遠いほうの位置にあるＣＡＴはほぼ同等に発現され（図４）、ＧＦＰについても同じであった（示さず）。ウイルス増殖の初期工程の間に発現速度が増加し、その後、さらなる組換えウイルスの継代の間にほぼ一定となり、アンビセンス２シストロン構築物（ｐＨＬ２８９９およびｐＨＬ２９６０）における発現速度とは異なっていた（図４Ｂ）。初期２９３−Ｔ細胞におけるブースタープラスミドの同時感染は子孫集団中の組換えウイルス収量を増加させ、その増加はその後の増殖工程の間も維持された。１０００ヌクレオチドの非翻訳ｖＲＮＡ配列の付加は発現速度を実質的には低下させないであろう（ｐＨＬ３２３５対ｐＨＬ３１９６、およびｐＨＬ３２３６対ｐＨＬ３２２４）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｖＲＮＡ「コルク抜き」構造による塩基対置換分析を示す。
（Ａ）相互作用している３分節ウイルスポリメラーゼの図式的表示に対して描かれたｖＲＮＡプロモーターの「コルク抜き」構造。個々の実験において交換された対合位置を番号で示し、ヌクレオチド３または８は３’末端から数えたものである。すべてのＣＡＴアッセイにおいてプロモーター−アップ変異体「１１０４」を含むｐＨＬ２０２４をリファレンス構築物として使用し、ｐＨＬ２４２８は野生型プロモーター構造を示す。
（Ｂ）５’末端からの位置３および８における一連の置換変種のＣＡＴ分析であり、図の上にレーンを示す。組換えウイルス子孫を用いる最初のウイルス継代において感染した１０６個のＭＤＣＫ細胞から得られた５０μｌの細胞溶解物。
（Ｃ）ｐＨＬ２０２４およびｐＨＬ１９２０の比較ＣＡＴ分析。（Ｂ）に対して１００倍希釈した。すなわち３時間の反応時間で０．５μｌの細胞溶解物から得た。
【図２】図２は、ベクタープラスミドｐＨＬ１９２０を示す。３８８８ｂｐの環状ＤＮＡの正確な配列を配列番号：２０に示す。
【図３】図３は、インフルエンザモデルタンデム発現構築物の遺伝学的構造およびＲＮＡ転写産物を示す。プラスミドｃＤＮＡ構築物に関する太線は２本鎖ＤＮＡを意味し、１本鎖ＲＮＡ分子を細線で示し、それらの５’から３’への方向を矢印で示す。５’および３’末端における標準的な修飾を点線（５’キャップ構造）およびＡｎ（３’ポリアデニル化）で示し、両方とも一次アンチセンス転写産物、すなわち細胞のＲＮＡポリメラーゼＩ（ＲＰｏＩ）により転写されるウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）中には存在しない。完全長のｍＲＮＡがインフルエンザウイルスポリメラーゼ（ｖｉｒＰｏ）により合成され、部分的スプライス反応によって、より短いｍＲＮＡ２分子の機能的生成が起こる。両方のレポーター遺伝子をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルで示し、スプライスドナー（Ｄ）およびアクセプター（Ａ）シグナル配列の位置ならびにＲＮＡポリメラーゼＩスタートおよびストップに関するプロモーター（ｐＩ）およびターミネーター（ｔＩ）エレメントも一緒に示すが、実際に蛋白に翻訳されあるいは実際にスプライシングに関与する遺伝子およびスプライスシグナルのみに印をつけてある。クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）をｐＨＬ３１９６およびｐＨＬ３２３５中の近いほうの位置ならびにｐＨＬ３２２４およびｐＨＬ３２３６中の遠いほうの位置に挿入したが（図５ないし８参照）、各場合において緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）は別の位置に存在する。すべてのｖＲＮＡ分子そしてそれゆえｃＤＮＡ構築物はそれらの３’末端に配列の変異を有し、それらは一緒になって１１０４プロモーター−アップ変異：Ｇ３Ａ、Ｕ５Ｃ、Ｃ８Ｕ（ヌクレオチド位置は３’ｖＲＮＡ末端から数える）を構成する。ｐＨＬ３２３５およびｐＨＬ３２３６のｖＲＮＡはｐＨＬ３１９６およびｐＨＬ３２２６よりも非翻訳配列が約１０００ヌクレオチド伸長しており、長さが１６００ヌクレオチドから２６００ヌクレオチドになっている。環状プラスミドＤＮＡの完全長サイズの例については図５〜８参照。各ウイルスＲＮＡを担持する組換えインフルエンザウイルスによる感染体に関するＣＡＴ発現データについては図４参照。
【図４】図４は、実施例に記載されたタンデムｖＲＮＡプラスミド構築物の群に関するＣＡＴアッセイの結果を示す。詳細には、レポーター遺伝子ＣＡＴを担持する組換えウイルスの２回目（Ａ）および４回目（Ｂ）の継代後のフラッシュ−ＣＡＴアッセイ（ｆｌａｓｈ−ＣＡＴ ａｓｓａｙ）におけるクロラムフェニコール（一番下のライン）およびアセチルクロラムフェニコール（上の３つのライン）の割合を該図から決定することができる。下記構築物を使用した：
ｐＨＬ１８４４（対照）：プロモーター変種１１０４の１シストロンＣＡＴ−構築物
ｐＨＬ３１９６：全長１５３０ヌクレオチド（伸長されていない）のｖＲＮＡを生じるタンデム構築物ｐ−ＣＡＴ−ＧＦＰ、図５も参照
ｐＨＬ３２３５：全長２５５０ヌクレオチド（伸長されている）のｖＲＮＡを生じるタンデム構築物ｐ−ＣＡＴ−ＧＦＰ、図７も参照
ｐＨＬ３２２４：全長１７００ヌクレオチド（伸長されていない）のｖＲＮＡを生じるタンデム構築物ｐ−ＣＡＴ−ＧＦＰ、図６も参照
ｐＨＬ３２３６：全長２７２０ヌクレオチド（伸長されている）のｖＲＮＡを生じるタンデム構築物ｐ−ＣＡＴ−ＧＦＰ、図８も参照
ｐＨＬ２８９９：全長１５００ヌクレオチドのＲＮＡを生じるアンビセンス構築物ｐｖ−ＣＡＴ→←ＧＦＰ−ｐｃ
ｐＨＬ２９６０：全長１５００ヌクレオチドのＲＮＡを生じるアンビセンス構築物ｐｖ−ＣＡＴ→←ＧＦＰ−ｐｃ
左側の５つの構築物は「ブースター」プラスミドを用いずに細胞ＤＮＡ中にトランスフェクションされた。しかしながら右側の４つの構築物は「ブースター」プラスミドを用いてトランスフェクションされた。該「ブースター」プラスミドはヘルパーウイルス注入前に組換えｖＲＮＡ増幅により構築物のジャンプ−スタート（ｊｕｍｐ−ｓｔａｒｔ）を引き起こし、約２回の継代と同等の利点を有する。該「ブースター」プラスミドは核蛋白ならびにインフルエンザウイルスポリメラーゼの３つのサブユニットに関する発現構築物を含み、それぞれＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの下流およびｍＲＮＡカセット中にある。
弱い位置、すなわちｃＲＮＡプロモーターの後ろにあるＣＡＴ−プロモーター遺伝子を有するアンビセンス構築物（ｐＨＬ２８９９）は中庸に発現されるだけであるが、このことは、ＣＡＴ−プロモーター遺伝子を弱い位置に有する個々のタンデム構築物、すなわちｐＨＬ３２２４およびｐＨＬ３２３６にはあてはまらない。さらに、１０２０個の非翻訳ヌクレオチドによるｖＲＮＡの「伸長」（３’末端における）は、有意な発現低下なしに許容されるものである（ｐＨＬ３２３５対ｐＨＬ３１９６参照）。
【図５】図５はベクタープラスミドｐＨＬ３１９６を示す。４５００ｂｐの環状ＤＮＡの正確な配列を配列番号：２１に示す。
【図６】図６はベクタープラスミドｐＨＬ３２２４を示す。４７２１ｂｐの環状ＤＮＡの正確な配列を配列番号：２２に示す。
【図７】図７はベクタープラスミドｐＨＬ３２３５を示す。５５１７ｂｐの環状ＤＮＡの正確な配列を配列番号：２３に示す。
【図８】図８はベクタープラスミドｐＨＬ３２３６を示す。５６９９ｂｐの環状ＤＮＡの正確な配列を配列番号：２４に示す。
【図１】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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