(57)【要約】本発明は一般的に、触媒活性の減少を示すスフィンゴシンキナーゼ変種、ならびにその誘導体、類似体、化学的同等物および模倣体に関し、より具体的には、スフィンゴシンのスフィンゴシン−１−ホスフェートへの燐酸化能の減少を示すスフィンゴシンキナーゼ変種に関する。本発明はまた、上記のスフィンゴシンキナーゼ変種、ならびにその誘導体、類似体および模倣体をコードする遺伝子配列も対象とする。本発明の変種は、治療的適用及び予防的適用範囲において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型スフィンゴシンキナーゼ、またはスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項２】
ヒトスフィンゴシンキナーゼである、請求項１に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項３】
変異が単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を含む、請求項１または２に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項４】
領域が７０〜９０位のアミノ酸によって規定される、請求項３に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項５】
領域が７９〜８４位のアミノ酸によって規定される、請求項４に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項６】
変異が８２位におけるグリシンアミノ酸からアスパラギン酸へのアミノ酸置換である、請求項５に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項７】
触媒活性の消失を示す、請求項３〜５のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項８】
以下の一覧から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項７に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種：
2004500903.tif 000016
【請求項９】
野生型スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、ＡＴＰ結合部位領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１０】
ヒトスフィンゴシンキナーゼである、請求項９に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１１】
変異が単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を含む、請求項９または１０に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１２】
領域が７０〜９０位のアミノ酸によって規定される、請求項１１に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１３】
領域が７９〜８４位のアミノ酸によって規定される、請求項１２に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１４】
変異が８２位におけるグリシンアミノ酸からアスパラギン酸へのアミノ酸置換である、請求項１３に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１５】
触媒活性の消失を示す、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種。
【請求項１６】
以下の一覧より選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１５に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種：
2004500903.tif 000017
【請求項１７】
以下の一覧より選択される単離核酸分子：
（ｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７０〜９０位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７９〜８４位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物または模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物であって、該変種が、
2004500903.tif 000018
より選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物；
（ｖｉｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体であって、該変種が、ＡＴＰ結合部位領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体。
【請求項１８】
スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは類似体とＦＯＳＫとの相互作用を調節することができる作用物質を検出する方法であって、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫまたはその機能的同等物もしくは類似体とを含む細胞またはその抽出物を推定の作用物質と接触させる段階、および相互作用に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む方法。
【請求項１９】
１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその機能的同等物もしくは類似体と結合または会合することができる作用物質を検出する方法であって、アミノ酸領域またはその機能的同等物もしくは類似体を含む細胞を推定の作用物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは類似体の機能の調節に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む方法。
【請求項２０】
アミノ酸領域が７０〜９０位のアミノ酸によって規定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アミノ酸領域が７９〜８４位のアミノ酸によって規定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその誘導体と相互作用して、スフィンゴシンキナーゼに関連した少なくとも一つの機能的活性を調節することができる作用物質を分析、設計、および／または改変する方法であって、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体と推定の作用物質とを接触させる段階、および作用物質と結合部位との相互作用相補性の程度を評価する段階を含む方法。
【請求項２３】
アミノ酸領域が７０〜９０位のアミノ酸によって規定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アミノ酸領域が７９〜８４位のアミノ酸によって規定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法に従って同定された作用物質。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種または請求項２５に記載の作用物質の有効量を、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類における細胞の機能的活性を調節する方法。
【請求項２７】
活性が、野生型スフィンゴシンキナーゼベースライン活性の下方制御および／または野生型スフィンゴシンキナーゼ活性化の防止である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳類における、異常な、望ましくない、または不適当な細胞活性を特徴とする状態の治療および／または予防であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種または請求項２５に記載の作用物質の有効量を、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で哺乳類に投与する段階を含み、下方制御によって細胞の機能的活性の調節が行われる治療および／または予防。
【請求項２９】
活性が、野生型スフィンゴシンキナーゼベースライン活性の下方制御および／または野生型スフィンゴシンキナーゼ活性化の防止である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞の機能的活性を調節するための薬剤の製造における、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種または請求項２５に記載の作用物質の使用。
【請求項３１】
細胞の機能的活性の調節に使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種または請求項２５に記載の作用物質。
【請求項３２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスフィンゴシンキナーゼ変種または請求項２５に記載の作用物質と、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、触媒活性の減少を示すスフィンゴシンキナーゼ変種ならびにその誘導体、類似体、化学的同等物および模倣体に関し、より具体的にはスフィンゴシンのスフィンゴシン−１−ホスフェートへの燐酸化能の減少を示すスフィンゴシンキナーゼ変種に関する。本発明はまた、上記のスフィンゴシンキナーゼ変種、ならびにその誘導体、類似体、および模倣体をコードする遺伝子配列も考慮する。本発明の変種は、治療的および予防的適用の範囲において有用である。
【０００２】
発明の背景
本明細書中、著者らによって引用された刊行物の詳細な参考文献一覧は、記載の最後にまとめている。
【０００３】
本明細書における如何なる先行技術に関する引用も、先行技術がオーストラリアにおける共通の一般的知識の一部を形成することを認めたとして、またはそのようなことを示唆したとして解釈してはならなず、そのように解釈すべきではない。
【０００４】
スフィンゴシンキナーゼは、多様な細胞反応における重要な調節酵素である。スフィンゴシン−１−ホスフェートは、シグナル伝達における重要な二次伝達物質であることが知られている（メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、１９９７）。これは、様々な細胞型において分裂誘発性であり（アレッセンコ（Ａｌｅｓｓｅｎｋｏ）、１９９８）、セラミド誘発アポトーシス（カリバー（Ｃｕｌｌｉｖｅｒ）ら、１９９６）の予防、ＩＰ３−非依存的経路による細胞内カルシウムの動員、ＤＮＡ合成の刺激、マイトゲン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼ経路の活性化、ホスホリパーゼＤの活性化、および細胞動員の調節を含む、広範囲の重要な調節経路の誘因となるように思われる（総説に関しては、メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、１９９７；スピーガル（Ｓｐｉｅｇａｌ）ら、１９９８；イガラシ（Ｉｇａｒａｓｈｉ）、１９９７を参照のこと）。
【０００５】
最近の研究（シア（Ｘｉａ）ら、１９９８）から、スフィンゴシン−１−ホスフェートが腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）に対する血管内皮細胞の炎症反応における必須のシグナル伝達中間体であることが示された。その明らかな重要性にもかかわらず、細胞のスフィンゴシン−１−ホスフェートレベルを制御するメカニズムはほとんどわかっていない。細胞におけるスフィンゴシン−１−ホスフェートレベルは、そのほとんどがスフィンゴシンキナーゼによるスフィンゴシンからの形成によって媒介されること、および小胞体関連スフィンゴシン−１−ホスフェートリアーゼとスフィンゴシン−１−ホスフェートホスファターゼによるその分解によってある程度媒介されることが知られている（スピーゲル（Ｓｐｉｅｇｅｌ）ら、１９９８）。細胞におけるスフィンゴシン−１−ホスフェートの基礎レベルは一般的に低いが、細胞を分裂誘発物質に曝露すると、急速に一過性に増加しうる。この反応は、サイトゾルにおけるスフィンゴシンキナーゼ活性の増加に相関するように思われ、スフィンゴシンキナーゼ阻害分子である、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンおよびＤＬ−トレオ−ジヒドロスフィンゴシンを加えることによって防止することができる。このことは、スフィンゴシンキナーゼが細胞のスフィンゴシン−１−ホスフェートレベルの調節に関与する重要な分子であることを示している。これによって、スフィンゴシンキナーゼは、細胞においてスフィンゴシン−１−ホスフェートに帰因する作用を媒介する上で中心的で絶対的な役割を有する。
【０００６】
スフィンゴシンキナーゼは、炎症、カルシウム動員、細胞運動、および接着分子発現を含む多くの細胞活性において役割を果たしていると推測される。したがって、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の調節によってこれらの細胞活性を調節するためのメカニズムを開発する必要がある。
【０００７】
本発明に至る研究において、本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼ蛋白質の１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるアミノ酸領域にアミノ酸配列変異を導入したところ、スフィンゴシンキナーゼ変種が得られ、これはスフィンゴシンキナーゼのベースライン機能的活性を示さないのみならず、野生型スフィンゴシンキナーゼ分子の活性化も抑制する。したがって、本発明のスフィンゴシンキナーゼ変種は、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の機能を調節するために用いられる新規分子を提供するのみならず、野生型スフィンゴシンキナーゼ分子を有効に変異させる、またはスフィンゴシンキナーゼ変種分子の活性を模倣する場合のいずれかにおいて用いられる作用物質のスクリーニング、および／または合理的分析、設計、および／または改変を容易にする。
【０００８】
発明の概要
本明細書および特許請求の範囲を通して、本文がそうでないことを必要としていない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化形は、述べた全体もしくは段階、または全体もしくは段階の群を含むが、他の如何なる全体もしくは段階または全体もしくは段階の群も除外しないことを意味すると理解される。
【０００９】
アミノ酸配列における特定の変異は、本明細書において「Ｘａａ１ｎＸａａ２」として表記し、Ｘａａ１は、変異前の当初のアミノ酸残基であり、ｎは残基数であり、Ｘａａ２は変異したアミノ酸である。省略語「Ｘａａ」は、三文字アミノ酸コードであっても、一文字アミノ酸コードであってもよい。一文字コードにおける変異は、例えば、Ｘ１ｎＸ２によって表記し、式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ、Ｘａａ１およびＸａａ２と同じである。スフィンゴシンキナーゼのアミノ酸残基には番号を付与し、モチーフＡｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ（ＤＧＬＭ）におけるグリシン残基は残基番号８２である。
【００１０】
本明細書は、本明細書において引用文献の後に示したプログラムであるパテントインバージョン２．０を用いて調製したヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、配列表において、数値表示＜２１０＞の後に配列同定子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２等）をつけることによって特定される。それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して配列（ＤＮＡ、蛋白質（ＰＲＴ）等）の長さ、型、および起源となる生物はそれぞれ、数値表示欄＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞に提供した情報によって示される。本明細書において言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、数値表示欄＜４００＞の後に配列同定子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２等）をつけて提供した情報によって定義される。
【００１１】
本発明の一つの局面は、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定された領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。
【００１２】
本発明のもう一つの局面は、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定された領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００１３】
好ましい態様において、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定された領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００１４】
さらにより好ましい態様において、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、７０〜９０位のアミノ酸、より好ましくは７９〜８４位のアミノ酸によって規定された領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００１５】
もう一つの好ましい態様において、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定された領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００１６】
最も好ましい態様において、本発明のスフィンゴシンキナーゼ変種は以下の一覧から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む：
2004500903.tif 000002
【００１７】
もう一つの局面において、本発明は、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、ＡＴＰ結合部位領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。
【００１８】
本発明のもう一つの局面は、以下からなる一覧から選択される単離核酸分子を対象とする：
（ｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７０〜９０位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７９〜８４位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物または模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物であって、該変種が、
2004500903.tif 000003
より選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物；
（ｖｉｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体であって、該変種が、ＡＴＰ結合部位領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体。
【００１９】
したがって、本発明のもう一つの局面は、ＦＯＳＫとスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体との相互作用を調節することができる作用物質を検出する方法であって、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫまたはその機能的同等物もしくは誘導体とを含む細胞またはその抽出物を推定の作用物質に接触させる段階、および上記の相互作用に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの局面において、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその機能的同等物もしくは誘導体に結合する、または会合することができる作用物質を検出する方法であって、上記のアミノ酸領域またはその機能的同等物もしくは誘導体を含む細胞を推定の作用物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体の機能の調節に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む方法を提供する。
【００２１】
したがって、本発明のもう一つの局面は、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその誘導体と相互作用することができ、且つ上記のスフィンゴシンキナーゼに関連した少なくとも一つの機能的活性を調節することができる作用物質を分析、設計、および／または改変する方法であって、上記のスフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を推定の作用物質と接触させる段階、および上記の作用物質と上記の結合部位との相互作用相補性の程度を評価する段階を含む方法を対象とする。
【００２２】
関連する局面において、本発明は、先に定義した任意の方法を利用して同定された作用物質に及ぶと理解すべきである。この点において、作用物質という用語は、少なくとも一つのスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を調節する任意の蛋白質様分子または非蛋白質様分子を意味すると理解すべきである。
【００２３】
本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質の有効量を、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で上記の哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類における細胞機能的活性を調節する方法を考慮する。
【００２４】
本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質の有効量を、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で哺乳類に投与する段階を含み、哺乳類における、異常な、望ましくない、または不適当な細胞活性を特徴とする状態の治療および／または予防に関する。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、細胞の機能的活性を調節するための薬剤を製造するためにスフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質を用いることに関する。
【００２６】
本発明のもう一つの局面は、細胞の機能的活性を調節するために用いられるスフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質に関する。
【００２７】
さらにもう一つのさらなる局面において、本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤と、スフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質とを含む薬学的組成物を考慮する。
【００２８】
本明細書を通して用いられる一文字および三文字省略語を表１に定義する。
【００２９】
【表１】一文字アミノ酸および三文字アミノ酸の省略語
2004500903.tif 000004
【００３０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ヒトスフィンゴシンキナーゼの触媒活性の消失が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるアミノ酸領域に変異を導入することによって得ることができるという決定に一部基づいている。さらに、そのような変異の導入によって、ベースライン機能的活性の消失、減少または制限を示すスフィンゴシンキナーゼ変種が得られるのみならず、それが野生型スフィンゴシンキナーゼの活性化を阻害するという点において、インビトロまたはインビボでドミナントネガティブスフィンゴシンキナーゼとして機能しうる変種が得られる。この決定によって、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達の異常な、望ましくない、または不適当な機能を特徴とする状態の治療および予防において用いられる産物および方法論の合理的な設計が容易となる。
【００３１】
したがって、本発明の一つの局面は、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。
【００３２】
「スフィンゴシンキナーゼ」という用語は、スフィンゴシンキナーゼ蛋白質、またはその誘導体、相同体、類似体、同等物、もしくは模倣体の全ての形に対する言及を含むと理解すべきである。この点において、「スフィンゴシンキナーゼ」とは、特に、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性化の際にスフィンゴシン−１−ホスフェートの産生に関与する分子であると理解すべきである。これには、例えばスフィンゴシンキナーゼｍＲＮＡまたはスフィンゴシンキナーゼの対立遺伝子もしくは多型変種の別のスプライシングから生じた如何なるイソ型も含む、例えば、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的誘導体、相同体、類似体、同等物、もしくは模倣体の全ての蛋白質型が含まれる。好ましくは、上記のスフィンゴシンキナーゼは、ヒトスフィンゴシンキナーゼである。
【００３３】
したがって、より詳しくは、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００３４】
「蛋白質」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、および蛋白質を含むと理解すべきである。蛋白質は、グリコシル化されていても、グリコシル化されていなくてもよく、および／またはアミノ酸のような蛋白質、脂質、炭水化物、または他のペプチド、ポリペプチド、もしくは蛋白質に融合、結合、または会合した広い範囲の他の分子を含んでもよい。本明細書において、「蛋白質」という用語には、アミノ酸、脂質、炭水化物、または他のペプチド、ポリペプチド、もしくは蛋白質のような他の分子に会合した蛋白質と共に、アミノ酸の配列を含む蛋白質が含まれる。
【００３５】
「変異」という用語は、スフィンゴシンキナーゼ分子を触媒的に不活化する、または減少したレベルの触媒活性のみを示すことができるようにする、天然または非天然に存在する任意の変更、変化、または他の改変を意味すると理解すべきである。この点において、スフィンゴシンキナーゼ活性に関して「触媒活性」という語句は、スフィンゴシンキナーゼがスフィンゴシンをスフィンゴシン−１−ホスフェートに燐酸化できることを意味すると理解すべきである。
【００３６】
変更、変化、または他の改変は、構造的改変（スフィンゴシンキナーゼ分子の二次、三次、または四次構造における変化のような）、分子的改変（スフィンゴシンキナーゼ蛋白質からの一つまたは複数の付加、置換、または欠失のような）、または化学的改変を含むがこれらに限定されない任意の形をとりうる。本発明の改変はまた、それによって発現産物を触媒的に不活性にするまたは減少した触媒活性のみを示すことができるようにする、スフィンゴシンキナーゼ蛋白質またはスフィンゴシンキナーゼ蛋白質をコードする核酸分子に対する蛋白質様分子または非蛋白質様分子の融合、連結、または結合に及ぶと理解すべきである。同様に、本発明の変異は、スフィンゴシンキナーゼ発現産物によって発現される必要があるが、変異の作製は、野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質を変異させるか、スフィンゴシンキナーゼ変種を合成する、または野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質をコードする核酸分子を、上記の変異核酸分子の発現産物がスフィンゴシンキナーゼ蛋白質変種となるように改変することを含む、如何なる適した手段によって行ってもよいと理解すべきである。好ましくは、上記の変異は、単一または多数のアミノ酸配列の置換、付加、および／または欠失である。
【００３７】
この好ましい態様に従って、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００３８】
本発明に関して、「野生型」スフィンゴシンキナーゼという用語は、本発明のスフィンゴシンキナーゼが本明細書においてこれまでに考察した文脈において触媒的に活性である、所定の集団におけるほとんどの個体によって発現されるスフィンゴシンキナーゼの型を意味する。スフィンゴシンキナーゼの野生型は一つ以上あり（例えば、対立遺伝子またはイソ型変種のため）、上記の野生型スフィンゴシンキナーゼ分子によって示される触媒活性のレベルは、ある範囲のレベル内に入る可能性がある。しかし、「野生型」には、触媒的に活性でないスフィンゴシンキナーゼの天然型に対する意味は含まれないと理解すべきである。スフィンゴシンキナーゼのそのような変種型は、実際に、本発明の文脈において天然に存在するスフィンゴシンキナーゼ変異型を構成してもよい。
【００３９】
さらにより好ましい態様において、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、７０〜９０位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含む、ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００４０】
最も好ましい態様において、本発明のスフィンゴシンキナーゼ変種は８２位のグリシンアミノ酸からアスパラギン酸へのアミノ酸置換を含む。
【００４１】
本発明は如何なる一つの理論または作用機序に拘束されることなく、スフィンゴシンキナーゼは二つのレベルの触媒活性を示すと考えられる。第一のレベルにおいて、スフィンゴシンキナーゼは、ベースラインの触媒活性を示す。第二のレベルにおいて、ベースライン活性を示すスフィンゴシンキナーゼは、酵素のＶｍａｘが増加するように活性化することができる。本発明の文脈において、スフィンゴシンキナーゼ触媒活性の消失または減少は、ベースライン活性および／またはベースライン活性を超えるスフィンゴシンキナーゼの活性化が消失または減少する場合に得られると思われる。好ましくは、双方の活性レベルは消失または減少し、さらにより好ましくは、双方の活性レベルは消失する。
【００４２】
もう一つの好ましい態様において、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失を示す、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含むヒトスフィンゴシンキナーゼ変種を提供する。
【００４３】
好ましくは、本発明のヒトスフィンゴシンキナーゼ変種は、７０〜９０位のアミノ酸、さらにより好ましくは７９〜８４位のアミノ酸によって規定される領域にアミノ酸の付加、置換、および／または欠失を含む。
【００４４】
最も好ましい態様において、本発明のスフィンゴシンキナーゼ変種は、以下の一覧から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む：
2004500903.tif 000005
【００４５】
「誘導体」には、融合蛋白質を含む天然、合成、または組換え起源からの断片、一部、部分、変種、および模倣体が含まれる。一部または断片には、例えばスフィンゴシンキナーゼの活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換に由来してもよい。アミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体と共に単一または多数のアミノ酸の配列内挿入が含まれる。挿入アミノ酸配列変種は、一つまたは複数のアミノ酸残基が蛋白質の既定の部位に導入される変種であるが、得られた産物の適したスクリーニングを行えばランダム挿入も可能である。欠失変種は、配列から一つまたは複数のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変種は、配列における少なくとも一つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入される変種である。置換アミノ酸変種の例は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換には典型的に、以下のグループ内の置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。アミノ酸配列への付加には、他のペプチド、ポリペプチド、または蛋白質との融合体が含まれる。
【００４６】
「相同である」という用語は、処置すべき種以外の種に由来するスフィンゴシンキナーゼ核酸分子または蛋白質を意味すると理解すべきである。
【００４７】
スフィンゴシンキナーゼ核酸または蛋白質分子の化学的および機能的同等物は、これらの分子の任意の一つまたは複数の機能的活性を示す分子であると理解すべきであり、化学合成された、または天然物スクリーニングのようなスクリーニング方法によって同定されたような如何なる起源に由来してもよい。
【００４８】
誘導体には、ペプチド、ポリペプチド、または他の蛋白質様分子もしくは非蛋白質様分子と融合させた蛋白質全体の特定のエピトープまたは一部を有する断片が含まれる。
【００４９】
本明細書において考慮される類似体には、側鎖の改変、非天然アミノ酸および／またはその誘導体をペプチド、ポリペプチド、または蛋白質合成の際に組み入れる、および蛋白質様分子またはその類似体にコンフォメーションの拘束を課すクロスリンク剤および他の方法を用いることが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
核酸配列の誘導体も同様に、他の核酸分子との融合体を含む単一または多数のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加に由来してもよい。本発明の核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の同時抑制および融合において用いるのに適した分子が含まれる。核酸配列の誘導体にはまた縮重変種が含まれる。
【００５１】
本発明によって考慮される側鎖の改変の例には、アルデヒドとの反応の後、ＮａＢＨ４による還元を行う還元的アルキル化；メチルアセチミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサル−５−燐酸によるリジンのピリドキシル化の後にＮａＢＨ４による還元が含まれる。
【００５２】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサル、およびグリオキサルのような試薬による複素環縮合産物の形成によって改変してもよい。
【００５３】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソウレア形成によるカルボジイミド活性化の後に例えば、対応するアミドへの誘導体化によって改変してもよい。
【００５４】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過蟻酸のシステイン酸への酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−塩化水銀ベンゾエート、４−塩化水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル第二水銀、２−塩化水銀−４−ニトロフェノール、および他の水銀化合物を用いた水銀誘導体の形成；アルカリｐＨでのシアネートによるカルバモイル化のような方法によって改変してもよい。
【００５５】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシニミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって改変してもよい。一方、チロシン残基はテトラニトロメタンによってニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することによって改変してもよい。
【００５６】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシル化によって行ってもよい。
【００５７】
蛋白質合成の際に非天然のアミノ酸および誘導体を組み入れる例には、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体を用いることが含まれるが、これらに限定されることはない。本明細書において考慮される非天然アミノ酸の一覧を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2004500903.tif 000006
2004500903.tif 000007
2004500903.tif 000008
【００５９】
例えば、ｎ＝１からｎ＝６の（ＣＨ２）ｎスペーサー基を有する二官能イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルのようなホモ二官能クロスリンク剤、およびＮ−ヒドロキシスクシニミドのようなアミノ反応基ともう一つの基特異的反応部分とを通常含むヘテロ二官能試薬を用いて三次元コンフォメーションを安定化させるために、クロスリンク剤を用いることができる。
【００６０】
本発明をさらに、如何なる一つの理論または作用機序にも制限されることなく、アミノ酸残基１６〜１５３位によって規定されるヒト野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質領域は、ＡＴＰ結合部位の全てまたは一部を含むと考えられる。したがって、ＡＴＰ結合部位を遮断することによって、本発明のスフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンのスフィンゴシンキナーゼ−１−ホスフェートへの燐酸化能に関して触媒的に不活性になると考えられる。したがって、「機能的に同等の領域」という語句は、アミノ酸残基１６〜１５３位によって規定される領域に帰因する少なくとも一つの機能的活性を示すスフィンゴシンキナーゼアミノ酸配列の任意の領域を意味すると理解すべきである。
【００６１】
したがって、もう一つの局面において、本発明は、野生型スフィンゴシンキナーゼまたは上記のスフィンゴシンキナーゼ変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物、もしくは模倣体と比較して触媒活性の消失または減少を示す、ＡＴＰ結合部位領域または機能的同等領域に変異を含むスフィンゴシンキナーゼ変種を対象とする。
【００６２】
好ましくは、上記のスフィンゴシンキナーゼはヒトスフィンゴシンキナーゼである。
【００６３】
さらにより好ましくは、上記の変異は、１６〜１５３位のアミノ酸残基、より好ましくは７０〜９０位のアミノ酸残基、さらにより好ましくは７９〜８４位のアミノ酸残基によって規定される領域における一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加である。
【００６４】
最も好ましい態様において、上記の変異は、以下の一覧から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む：
2004500903.tif 000009
【００６５】
本発明が一つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、および／または欠失を含むスフィンゴシンキナーゼ変種に関連する程度に、同様に、本発明は上記の変種をコードする核酸にも及ぶと理解すべきである。
【００６６】
したがって、本発明のもう一つの局面は、以下からなる一覧より選択される単離核酸分子を対象とする：
（ｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型ヒトスフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｉｉ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｉｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７０〜９０位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖ）ヒトスフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物であって、該変種が、７９〜８４位のアミノ酸によって規定される領域またはそれと機能的に同等の領域に単一または多数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは同等物；
（ｖｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物または模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物であって、該変種が、
2004500903.tif 000010
より選択される一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、単離核酸分子またはその類似体もしくは同等物；
（ｖｉｉ）スフィンゴシンキナーゼ変種または該変種の誘導体、相同体、類似体、化学的同等物もしくは模倣体をコードするヌクレオチド配列またはそれをコードする配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体であって、該変種が、ＡＴＰ結合部位領域またはそれと機能的に同等の領域に変異を含み、野生型スフィンゴシンキナーゼと比較して触媒活性の消失または減少を示す、単離核酸分子またはその誘導体もしくは類似体。
【００６７】
本発明の核酸分子は、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、もしくは植物細胞）において発現可能な発現ベクターにライゲーションしてもよい。核酸分子は、例えば、シグナルペプチドのようなもう一つの実体をコードする核酸分子にライゲーション、融合、または会合してもよい。同様に、３’もしくは５’末端部分、または３’および５’末端部分の双方でそれに融合、連結、または会合するさらなるヌクレオチド配列情報を含んでもよい。核酸分子は、発現ベクターのようなベクターの一部であってもよい。後者の態様は、本発明によって含まれる変種スフィンゴシンキナーゼの組換え型の産生を容易にする。
【００６８】
本発明の変種スフィンゴシンキナーゼ分子は、天然もしくは組換え型起源に由来してもよく、または化学合成してもよい。これらの分子を産生する方法は当業者に周知であると思われる。
【００６９】
スフィンゴシンキナーゼ変種それ自体の合成を容易にすることの他に、本発明のスフィンゴシンキナーゼ変種が機能するメカニズムを特定することによって、野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質の触媒活性を消失または減少させる方法論を設計することができる。例えば、野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質を、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域またはその機能的同等領域に結合または会合する作用物質に接触させると、野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質を触媒的に不活性な変種に効率よく変換させることができる。もう一つの局面において、上記の作用物質は、スフィンゴシンキナーゼＡＴＰ結合部位に結合または会合することができると考えられる。
【００７０】
本発明をいかなるようにも制限することなく、ベースラインスフィンゴシンキナーゼ活性は、全ての野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質の構成的特性であると考えられる。しかし、この分子を活性化するためには、酵素のＶｍａｘを増加させなければならない（例えば、より多くの酵素を必要とされる部位に移動させることにより、またはその機能を翻訳後に改変することにより）。これは、もう一つの分子またはクラスの分子（例えば、蛋白質または脂質）が本発明のスフィンゴシンキナーゼに会合するように機能することを必要とし、これらの分子は、仮説的にＦＯＳＫ（スフィンゴシンキナーゼの相棒（Ｆｒｉｅｎｄ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ））であると呼ばれる。「ＦＯＳＫ」という用語には、スフィンゴシンキナーゼ相互作用分子（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＳＫＩＭＳ）に対する言及が含まれると理解すべきである。例えば、Ｇ８２Ｄスフィンゴシンキナーゼ変種は、ＦＯＳＫ分子に結合することによって、それが野生型スフィンゴシンキナーゼを活性化しないようにすると考えられる。
【００７１】
したがって、本発明は、スフィンゴシンキナーゼ変種それ自体を可能性がある薬剤として提供するのみならず、さらなる薬剤開発のためのメカニズムを提供する。例えば、スフィンゴシンキナーゼ変種分子における変異の主題である領域に結合する低分子は、そのベースラインスフィンゴシンキナーゼ活性を失うのみならず、ドミナントネガティブスフィンゴシンキナーゼ変種へのその変換を引き起こす、すなわちスフィンゴシンキナーゼ活性の双方のレベルが消失する阻害剤に野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質を変換させると予想されると考えられる。または、野生型スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫとの相互作用を妨害する作用物質のスクリーニングは、ベースラインスフィンゴシンキナーゼ活性に影響を及ぼさず活性化のみを阻害するドミナントネガティブ表現型を再現すると思われる。これは、いくつかのスフィンゴシンキナーゼ活性が細胞の生存にとって必要である場合にはおそらく望ましいシナリオである。
【００７２】
したがって、スフィンゴシンキナーゼ間の活性の調節は、以下の段階を含むがこれらに限定されない任意の多くの技術の一つによって得ることができる：
（ｉ）ＦＯＳＫとスフィンゴシンキナーゼとの相互作用に拮抗する蛋白質様分子または非蛋白質様分子を細胞に導入する段階；
（ｉｉ）本明細書に記載の変種における主題の変異である野生型スフィンゴシンキナーゼの領域の少なくとも一部と相互作用する蛋白質様分子または非蛋白質様分子を細胞に導入する段階。
【００７３】
したがって、「作用物質」という用語には、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫとの相互作用を調節する、またはスフィンゴシンキナーゼの１６〜１５３位のアミノ酸によって規定される領域の少なくとも一部と相互作用する如何なる蛋白質様分子または非蛋白質様分子も意味すると理解すべきであり、例えば、上記の（ｉ）〜（ｉｉ）に詳細を示す分子が含まれる。本発明の作用物質は、任意の蛋白質様分子または非蛋白質様分子に連結、結合、または会合してもよい。例えば、これは、局所領域に標的化させる分子に会合してもよい。
【００７４】
したがって、上記の作用物質を細胞内に投与することによって、内因性に産生された野生型スフィンゴシンキナーゼが、そのベースライン活性に関して不活化され、ドミナントネガティブスフィンゴシンキナーゼ分子として機能するように誘導することができ、作用物質会合野生型スフィンゴシンキナーゼが他の非作用物質会合野生型スフィンゴシンキナーゼ分子の活性化を消失させるまたは減少させるように機能する。または、場合によっては、細胞内のベースラインスフィンゴシンキナーゼ活性を維持する必要があるため、作用物質を野生型スフィンゴシンキナーゼと細胞外で会合させて、その後作用物質−スフィンゴシンキナーゼ複合体を細胞内に投与することができる。次に、これらの複合体（本発明の文脈において変種スフィンゴシンキナーゼである）は、内因性に産生された野生型スフィンゴシンキナーゼ蛋白質のベースライン活性を有意に調節することなく、野生型スフィンゴシンキナーゼ活性化を消失または減少させるように作用すると思われる。これらの分子を設計して産生すれば、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性を調節する独特のこれまでに利用されていないメカニズムを提供する。特に、Ｎ’Ｎ−ジメチルスフィンゴシンのようなこれまでに用いられている化学的阻害剤は、スフィンゴシンキナーゼの機能を完全に消失させるが、本発明の変種はベースライン機能を乱すことなく野生型スフィンゴシンキナーゼの活性化を減少または消失させるためにのみ投与することができる。
【００７５】
本発明の作用物質は、融合蛋白質を含む天然、組換え型もしくは合成起源に由来する、または例えば天然物スクリーニングに由来して、本発明の目的を達成する任意の蛋白質様分子または非蛋白質様分子でありうる。上記の作用物質の合成起源には、例えば化学合成された分子が含まれる。他の例において、ファージディスプレイライブラリーをペプチドに関してスクリーニングすることができ、化学物質ライブラリーを既存の低分子に関してスクリーニングすることができる。合理的な薬剤設計／構造に基づく設計は、結晶化を行って、ＡＴＰ結合部位をさらに分析すること、および設計によってその部位に分子を適合させることによって得ることができる。
【００７６】
例として、ランダム組み合わせペプチドまたは非ペプチドライブラリーのような多様なライブラリーをスクリーニングすることができる。化学合成ライブラリー、組換え型（例えば、ファージディスプレイライブラリー）およびインビトロ翻訳に基づくライブラリーのような多くの公表された市販のライブラリーを用いることができる。
【００７７】
化学合成ライブラリーの例は、フォドーら（Ｆｏｄｏｒ、１９９１）；ホーテンら（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９１）；ラムら（Ｌａｍ、１９９１）；メディンスキーら（Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４）；ギャロップら（Ｇａｌｌｏｐ、１９９４）；オールメイヤーら（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ、１９９３）；アーブら（Ｅｒｂ、１９９４）；ホーテンら（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２）；ジャヤビックレムら（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ、１９９４）；サーモンら（Ｓａｌｍｏｎ、１９９３）；国際公開公報第９３／２０２４２号；およびブレナー＆ラーナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ、１９９２）に記載されている。
【００７８】
ファージディスプレイライブラリーの例は、スコット＆スミス（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、１９９０）；デブリンら（Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０）；クリスチャンら（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ， Ｒ．Ｂ．）；レンストラら（Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２）；ケイら（Ｋａｙ、１９９３）；および国際公開公報第９４／１８３１８号に記載されている。
【００７９】
インビトロ翻訳に基づくライブラリーには、マテアキスら（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ、１９９４）に記載されるライブラリーが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８０】
ライブラリーのスクリーニングは、多様な一般的に既知の任意の方法によって行うことができる。パームリー＆スミス（Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、１９８９）；スコット＆スミス（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ、１９９０）；フォウルケスら（Ｆｏｗｌｋｅｓ、１９９２）；オルデンバーグら（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ、１９９２）；ユら（Ｙｕ、１９９４）；スタウトら（Ｓｔａｕｄｔ、１９８８）；ボックら（Ｂｏｃｋ、１９９２）；チュエルクら（Ｔｕｅｒｋ、１９９２）；エリントンら（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、１９９２）；米国特許第５，０９６，８１５号；米国特許第５，２２３，４０９号；および米国特許第５，１９８，３４６号；レバー＆パボ（Ｒｅｂａｒ ａｎｄ Ｐａｂｏ、１９９３）；および国際公開公報第９４／１８３１８号を参照のこと。
【００８１】
したがって、本発明は、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫ分子との相互作用を調節する作用物質をスクリーニングする方法にも及ぶと理解すべきである。これは、例えば、スフィンゴシンキナーゼ活性化をモニターすることができる細胞に基づくアッセイ法を利用することによって行うことができる。したがって、本発明は、スフィンゴシンキナーゼを阻害する多様な方法の一つを利用する作用物質をスクリーニングするメカニズムを提供する。例えば、スフィンゴシンキナーゼの活性化のみを阻害する（例えば、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫとの相互作用を阻害することによって）分子の他に、スフィンゴシンキナーゼ活性の双方のレベルを完全に消失させる作用物質をスクリーニングすることができる。
【００８２】
本明細書で先に定義した調節作用物質のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼ（個々にまたはＦＯＳＫと共に）を含む細胞を作用物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼ／ＦＯＳＫ機能的活性の調節、または下流のスフィンゴシンキナーゼもしくはＦＯＳＫ細胞標的の活性もしくは発現の調節をスクリーニングする段階が含まれるが、これらに限定されることはない任意のいくつかの適した方法によって行うことができる。そのような調節の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイ法、および／またはルシフェラーゼ、ＣＡＴ等のようなスフィンゴシンキナーゼもしくはＦＯＳＫ活性のレポーター分子の読み出しのような技術を利用することによって行うことができる。
【００８３】
スフィンゴシンキナーゼまたはＦＯＳＫ蛋白質は、試験の被験体である細胞に本来存在してもよく、またはそれらをコードする遺伝子を試験目的のために宿主細胞にトランスフェクトさせてもよいと理解すべきである。さらに、天然に存在する、またはトランスフェクトした遺伝子は構成的に発現されてもよく、それによって、とりわけスフィンゴシンキナーゼ−ＦＯＳＫ相互作用活性を下方制御する作用物質をスクリーニングするための有用なモデルを提供し、または遺伝子は活性化を必要とし、それによって、とりわけ特定の刺激条件でスフィンゴシンキナーゼ／ＦＯＳＫ相互作用活性を調節する作用物質をスクリーニングするための有用なモデルを提供する。さらに、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子が細胞にトランスフェクトされる程度に、その分子は、全スフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含んでもよく、またはＦＯＳＫ結合部分のような遺伝子の一部を単に含んでもよい。
【００８４】
もう一つの例において、本発明の検出は、スフィンゴシンキナーゼそのものよりむしろ下流のスフィンゴシンキナーゼ調節標的となりうると思われる。さらにもう一つの例には、最小のレポーターにライゲーションしたスフィンゴシンキナーゼ結合部位が含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼ／ＦＯＳＫ相互作用活性の調節は、ＴＮＦ刺激細胞の下流のシグナル伝達成分の調節に関するスクリーニングによって検出することができる。これは、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫがその活性を調節する分子の調節をモニターする系の例である。
【００８５】
したがって、本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫまたはその機能的同等物もしくは誘導体とを含む細胞または細胞抽出物を、推定の作用物質と接触させる段階、および上記の相互作用に関連した発現表現型の変化を検出することを含む、ＦＯＳＫとスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体との相互作用を調節することができる作用物質を検出する方法を提供する。
【００８６】
「スフィンゴシンキナーゼ」および「ＦＯＳＫ」という用語は、スフィンゴシンキナーゼまたはＦＯＳＫ発現産物のいずれかに対する言及、またはスフィンゴシンキナーゼ蛋白質の１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるＦＯＳＫ領域のような、スフィンゴシンキナーゼまたはＦＯＳＫ分子の一部もしくは断片を意味すると理解すべきである。この点において、スフィンゴシンキナーゼまたはＦＯＳＫ発現産物は細胞において発現される。細胞は、スフィンゴシンキナーゼもしくはＦＯＳＫ核酸分子をトランスフェクトした宿主細胞であってもよく、または細胞は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子を本来含む細胞であってもよい。「その抽出物」という用語は、細胞を含まない転写系に対する意味であると理解すべきである。
【００８７】
「上記の相互作用に関連した発現表現型の変化」の検出という用語は、スフィンゴシンキナーゼとＦＯＳＫとの相互作用の調節に関連した細胞の変化の検出として理解すべきである。これらは、例えば、細胞内変化または細胞外で認められる変化として検出可能でありうる。例えば、これには、下流の産物レベルまたは活性の変化を検出することが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
さらにもう一つの局面において、本発明は、アミノ酸領域またはその機能的同等物もしくは誘導体を含む細胞を推定の作用物質に接触させる段階、およびスフィンゴシンキナーゼまたはその機能的同等物もしくは誘導体の機能の調節に関連した発現表現型の変化を検出する段階を含む、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその機能的同等物もしくは誘導体に結合または会合することができる作用物質を検出する方法を提供する。
【００８９】
好ましくは、上記の領域は７０〜９０位のアミノ酸によって規定され、さらにより好ましくは７９〜８４位のアミノ酸によって規定される。
【００９０】
「スフィンゴシンキナーゼ結合部位」という用語は、１６〜１５３位のアミノ酸、好ましくは７０〜９０位のアミノ酸、さらにより好ましくは７９〜８４位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域の意味であると理解すべきである。
【００９１】
上記の型のアッセイ法に基づく機能を利用してＦＯＳＫとスフィンゴシンキナーゼとの相互作用を調節する作用物質のスクリーニングの他に、スフィンゴシンキナーゼの機能的に活性な領域を同定することによってもまた、推定の作用物質またはリード化合物と本発明の領域との物理的相互作用の分析に基づいて、ＦＯＳＫとスフィンゴシンキナーゼとの相互作用またはスフィンゴシンキナーゼの活性のいずれかを調節する作用物質のスクリーニング、分析、合理的設計および／または改変が容易となる。
【００９２】
具体的には、この部位の特性および位置が判明すれば、Ｘ線結晶学のような技術によってスフィンゴシンキナーゼの結合部位の構造に関する三次構造の分析が促進される。
【００９３】
したがって、本発明のもう一つの局面は、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を推定の作用物質と接触させる段階、および上記の作用物質と上記の結合部位との相互作用的相補性の程度を評価する段階を含む、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ領域またはその誘導体と相互作用することができ、および上記のスフィンゴシンキナーゼに関連した少なくとも一つの機能的活性を調節することができる作用物質を分析、設計、および／または改変する方法を対象とする。
【００９４】
好ましくは、上記の領域は７０〜９０位のアミノ酸、さらにより好ましくは７９〜８４位のアミノ酸によって規定される。
【００９５】
相互作用的相補性を評価するために推定の作用物質と接触させるスフィンゴシンキナーゼは、組換えによって産生してもよいと理解すべきである。しかし、同様に、本発明のスフィンゴシンキナーゼは、電子密度マップ、分子モデル（スティック、ボール＆スティック、空間充填、または表面提示モデルを含むがこれらに限定されない）のような、解明されるべき結合部位構造に基づく画像の形であってもよく、または当業者に既知である技術およびソフトウェアを用いて、スフィンゴシンキナーゼ部位：作用物質相互作用の分析を容易にする他のデジタルもしくは非デジタル表面提示モデルもしくは画像であってもよい。例えば、相互作用分析は、リガンドの結合に関するオンオフ率および解離定数に関するバイアコアリアルタイム分析（ガーズボルら（Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ）、１９９９；ホイヤー・ハンセンら（Ｈｏｙｅｒ−Ｈａｎｓｅｎ）、１９９７；プロウグ（Ｐｌｏｕｇ）、１９９８；プロウグら（Ｐｌｏｕｇ）、１９９４；１９９５；１９９８）およびＮＭＲ摂動研究（ステフェンズ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）ら、１９９２）のような技術を利用して行うことができる。
【００９６】
作用物質と本発明のスフィンゴシンキナーゼ結合部位との「相互作用相補性の程度を評価する」という用語は、本発明のスフィンゴシンキナーゼ結合部位と関係作用物質との相互作用の特性および／または程度を含むがこれらに限定されない関係する如何なる特徴も解明することを意味すると理解すべきである。先に詳細に説明したように、如何なる適した技術も利用することができる。そのような技術は当業者に既知であり、この点において利用することができる。本発明の相互作用の特性に関して、任意の所定の作用物質の特定の残基とスフィンゴシンキナーゼ結合部位の特定の残基とのあいだに起こる相互作用メカニズムの型（例えば、ペプチド結合、または水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力の形成等）および／またはその相対強度を評価することが望ましいと思われる。同様に、関係する作用物質と本発明のスフィンゴシンキナーゼ結合部位とのあいだに起こる相互作用の程度を評価することも望ましいと思われる。例えば、本発明の作用物質とスフィンゴシンキナーゼ結合部位とのあいだの相互作用の実際の部位の位置を分析することによって、スフィンゴシンキナーゼ結合部位のこの領域に作用物質を適合させる質ならびにその結合相互作用の相対強度および安定性を決定することが可能である。例えば、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の機能を遮断することが目的である場合、それがＦＯＳＫ相互作用を遮断または妨害する（例えば、立体的に妨害する、または化学的もしくは静電気的に反発させる）、またはスフィンゴシンキナーゼ活性を下方制御するようにスフィンゴシンキナーゼ結合部位と相互作用する作用物質が求められると思われる。スフィンゴシンキナーゼ機能の調節に関連して必要とされる会合の形は、従来から理解されているように、如何なる化学的相互作用結合メカニズムの形も含まないが、例えば活性化分子の結合に関して立体的妨害を行うために、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の本発明の結合領域に対して作用物質の領域が近位の位置に存在するような非結合メカニズムを含んでもよい。相互作用が妨害または他の反発力の形成の形をとる場合、これは、如何なる従来の形の結合メカニズムも形成されないが、それにもかかわらず「相互作用」の形として理解すべきである。
【００９７】
同様に、これまでに考察したように、推定の作用物質の相互作用的相補性を評価するために物理的な形状または画像として利用されるスフィンゴシンキナーゼ結合部位は、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の天然に存在する型であってもよく、またはその誘導体、相同体、類似体、変異体、断片、もしくは同等物であってもよいと理解すべきである。その誘導体、相同体、類似体、変異体、断片、または同等物は、物理的または非物理的な（画像のような）形のいずれかであってもよい。
【００９８】
スフィンゴシンキナーゼ結合領域が決定されれば、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の三次元構造の決定およびＦＯＳＫ結合またはスフィンゴシンキナーゼ機能を調節するために用いることができる作用物質の同定および／または合理的改変および設計が容易となる。
【００９９】
本発明の適用を如何なるようにも制限することなく、本発明の方法は、１６〜１５３位のアミノ酸によって規定されるスフィンゴシンキナーゼ部位と相互作用することができる作用物質の分析、設計、および／または改変を容易にする。この点において、作用物質の「分析、設計、および／または改変」という用語には、その最も広い意味において以下が含まれると理解すべきである：
（ｉ）スフィンゴシンキナーゼ機能的活性および／またはＦＯＳＫ結合に関して何らかの調節能を示す作用物質を同定するためのランダムスクリーニング（例えば、日常的なハイスループットスクリーニング技術を用いて）を行い、次に本発明のこの局面の方法を利用して作用物質の調節能の正確な特性および程度を分析する。この点において、既存の結晶を上記の作用物質に浸すか、または同時結晶化を行うことができる。次に例えば、スフィンゴシンキナーゼ結合部位の変異誘発と局所化合物のモデリングおよび合成改変との組み合わせを行うことができる。活性を調節する可能性がある作用物質のスクリーニングにおいて、ファージディスプレイおよび同様にコンビナトリアルケミストリーに関する標準的な方法を利用してもよい（グッドソンら（Ｇｏｏｄｓｏｎ）、１９９４；テレットら（Ｔｅｒｒｅｔｔ）、２０００）。そのような相互作用研究はまた、バイアコア分析およびＮＭＲ摂動研究のような技術を利用してさらに行うことができる。そのような作用物質はしばしば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかの機能能に関する蛋白質様分子または非蛋白質様分子のランダムスクリーニングに関して一般的に「リード」作用物質と呼ばれる。さらに、例えば、結合親和性および特異性は、スフィンゴシンキナーゼ結合部位との相互作用を最大限にするようにリード作用物質を改変することによって増強することができる。そのような分析は、所定の目的に関して最も適している作用物質の選択を容易にすると考えられる。このようにして、選択段階は、インビトロデータのみならず、所定の目的に関するその頻度、安定性、および適切性に関する作用物質：スフィンゴシンキナーゼ相互作用の部位の技術的分析に基づく。例えば、そのような分析によって、ランダムに同定された作用物質に関して許容されるインビトロ活性であるように思われるものが実際には、有意な反発力を示す作用物質：スフィンゴシンキナーゼ部位が近位に存在するために非常に不安定な相互作用によって誘導されることによって、作用物質とスフィンゴシンキナーゼとの相互作用全体を脱安定化することが判明するかも知れない。次に、これによって、同程度のインビトロ活性を示すが、さらなる分析を行うと、作用物質がそのような脱安定化反発力の存在を含まないもう一つの有望なリード化合物を選択することが容易となる。
【０１００】
本明細書において定義された調節作用物質のスクリーニングは、当業者に周知であって、例えば、リード化合物を同定する目的のために蛋白質様分子および非蛋白質様分子をランダムスクリーニングするために日常的に用いられるシリコ法を含む任意のいくつかの適した方法によって行うことができる。
【０１０１】
これらの方法は、合成、組換え型、化学、および天然物ライブラリーを含む蛋白質様作用物質または非蛋白質様作用物質のような仮の調節物質のハイスループットスクリーニングを行うメカニズムを提供する。
【０１０２】
（ｉｉ）候補物質またはリード化合物（例えば、（ｉ）に関連して記載された方法論に従って同定された作用物質）は、スフィンゴシンキナーゼとの所望の相互作用（例えば、結合親和性または特異性）を最大限にするために、且つ望ましくない相互作用（反発または脱安定化相互作用のような）を最小限にするために改変することができる。
【０１０３】
本明細書に記載の目的に従って候補物質またはリード作用物質を改変する方法は、当業者に周知であると思われる。例えば、アモア（ナバザ（Ｎａｖａｚａ）、１９９４）のような分子置換プログラムをこの点において利用してもよい。本発明の方法はまた、シグナル伝達活性を消失または改善するために、既知のシグナル誘導作用物質の変異誘発を促進する。
【０１０４】
（ｉｉｉ）適合性を分析および／または既存の分子を構造的に改変することの他に、本発明の方法はまた、所望のスフィンゴシンキナーゼ結合部位相互作用構造特徴を示す作用物質の理論的モデリングを行って、次に本発明の作用物質の合成および試験を行うことに基づいて、アゴニストまたはアンタゴニスト剤のような作用物質の合理的設計および合成を容易にする。
【０１０５】
特定の作用物質を同定するために、上記の適用（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうち任意の一つまたは複数を利用してもよいと理解すべきである。
【０１０６】
関連する局面において、本発明は、本明細書に定義した任意の方法を用いて同定された作用物質にも及ぶと理解すべきである。この点において、作用物質という用語は、少なくとも一つのスフィンゴシンキナーゼ機能的活性を調節する如何なる蛋白質様分子または非蛋白質様分子も意味すると理解すべきである。
【０１０７】
本発明の理論または作用機序を制限することなく、スフィンゴシンキナーゼはスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性における重要な調節酵素である。「スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路」とは、スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシンキナーゼ−１−ホスフェートの一つまたは双方を利用するシグナル伝達経路を意味する。スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路カスケードは以下の形をとってもよいと考えられる：
（ｉ）セラミドがスフィンゴシンに変換される、メイズ（Ｓ． Ｍａｓｅ）活性によるスフィンゴミエリンからのセラミドの合成；
（ｉｉ）スフィンゴシンキナーゼの刺激によるスフィンゴシンキナーゼ−１−ホスフェートの産生；および
（ｉｉｉ）ＭＥＫ／ＥＲＫの活性化とスフィンゴシン−１−ホスフェート産生の下流のＮＦ−κＢの核転移。
【０１０８】
スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路は、炎症、アポトーシス、および細胞増殖に至る活性のような細胞活性を調節することが知られている。例えば、サイトカイン、ケモカイン、ｅＮＯＳのような炎症メディエーターの産生の上方制御および接着分子発現の上方制御である。上記の上方制御は、例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）のような炎症性サイトカイン、エンドトキシン、酸化または改変脂質、放射線、または組織損傷を含む多くの刺激によって誘導されてもよい。
【０１０９】
変種スフィンゴシンキナーゼ分子の産生は、その活性がスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性によって直接または間接的に調節される、望ましくない細胞活性を特徴とする疾患の予防的および治療的治療において用いられるさらなる分子を提供する。望ましくないスフィンゴシンキナーゼ調節細胞活性を含む疾患の例には、炎症病態（例えば、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患）、新生物病態（例えば固形癌）、喘息、アテローム性動脈硬化症、髄膜炎、多発性硬化症、および敗血症ショックが含まれる。本発明の変種はまた、アテローム性動脈硬化症、変形性関節炎および炎症が役割を果たす他の変性疾患のような疾患状態に関連した慢性治療の提供を促進する可能性がある。
【０１１０】
したがって、本発明は、例えば炎症の調節のような細胞の機能的活性を調節するために変種スフィンゴシンキナーゼ分子の治療的および予防的使用を考慮する。この点において、治療および予防において用いてもよい変種分子には、変異スフィンゴシンキナーゼ発現産物、変異スフィンゴシンキナーゼ発現産物をコードする核酸分子、先に定義したスフィンゴシンキナーゼ作用物質複合体、または野生型分子を変種スフィンゴシンキナーゼ分子に変換する目的で、野生型スフィンゴシンキナーゼと細胞内で複合体を形成させる目的で被験者に投与することが提唱される作用物質それ自身が含まれる。参照を容易にするために、そして先に提供した定義に従って、「スフィンゴシンキナーゼ変種」という語句には、変異スフィンゴシンキナーゼ蛋白質、上記の蛋白質をコードする核酸分子、およびスフィンゴシンキナーゼ作用物質複合体に対する言及が含まれるが、「作用物質」という用語は、スフィンゴシンキナーゼ蛋白質（野生型蛋白質のような）と接触させた場合に、蛋白質を本発明の文脈における変種にする作用物質を意味すると解釈される。
【０１１１】
したがって、本発明のもう一つの局面は、上記の哺乳類にスフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質の有効量を、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で投与することを含む、哺乳類における細胞の機能活性を調節する方法を考慮する。
【０１１２】
好ましくは、上記の機能的活性は、野生型スフィンゴシンキナーゼベースライン活性の下方制御および／または野生型スフィンゴシンキナーゼ活性化の防止である。
【０１１３】
「細胞の機能的活性を調節する」という用語は、細胞が一つまたは複数のケモカイン産生、サイトカイン産生、酸化窒素シンターゼ、接着分子発現および他の炎症調節物質の産生のような、しかしこれらに限定されない活性を行うことができる一つまたは複数の活性を、上方制御、下方制御、または改変することを意味する。
【０１１４】
変種スフィンゴシンキナーゼまたは作用物質の薬学的組成物の形での投与は、任意の簡便な手段によって行ってもよい。薬学的組成物の変種スフィンゴシンキナーゼまたは作用物質は、特定の場合に依存する量で投与した場合に治療活性を示すと考えられる。変動は例えば、選択したヒトまたは動物、およびスフィンゴシンキナーゼまたは作用物質に左右される。広範囲の用量が適用可能であると考えられる。例えば、患者を考慮してスフィンゴシンキナーゼまたは作用物質の約０．１ ｍｇ〜約１ｍｇを１日に体重１ｋｇあたり投与してもよい。投与レジメは、最適な治療反応が得られるように調節してもよい。例えば、いくつかの分割用量を毎日、毎週、毎月、またはその他の適した期間で投与してもよく、または用量は、状況の緊急性に応じて比例的に減少させてもよい。変種スフィンゴシンキナーゼまたは作用物質は、経口、静脈内（水溶性の場合）、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、または坐剤経路または埋め込み（例えば、徐放性分子を用いることによって）によるような都合のよい方法で投与してもよい。特に、変種スフィンゴシンキナーゼまたは作用物質を用いることに関して、これらの分子は、酸付加塩または亜鉛、鉄等との金属複合体のような（本出願の目的に関して塩と見なされる）薬学的に許容される非毒性の塩の形で投与してもよい。そのような酸付加塩の例は、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である。活性成分が錠剤の形で投与される場合、錠剤はトラガカント、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；アルギン酸のような崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含んでもよい。
【０１１５】
本発明のさらなる局面は、哺乳類の疾患状態に関連した本発明の使用に関する。例えば、本発明は、炎症疾患、新生物病態、および変性疾患を治療的または予防的に治療するために用いるために特に有用であるが、これらに限定されることはない。
【０１１６】
したがって、本発明のもう一つの局面は、下方制御によって細胞の機能的活性の調節が得られる、野生型スフィンゴシンキナーゼの少なくとも一つの機能的活性を阻害、減少、または下方制御するために十分な時間および条件下で、スフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質の有効量を上記の哺乳類に投与することを含む、異常な、望ましくない、または不適当な細胞活性を特徴とする哺乳類の病態の治療および／または予防に関する。
【０１１７】
好ましくは上記の機能的活性は、野生型スフィンゴシンキナーゼベースライン活性の下方制御および／または野生型スフィンゴシンキナーゼ活性化の防止である。
【０１１８】
「異常な、望ましくない、または不適当な」細胞活性という用語は、不適当または望ましくない過剰反応細胞活性、過小反応細胞活性、または生理的に正常な細胞活性を意味すると理解すべきである。
【０１１９】
治療および／または予防の被験者は、一般的に、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）などの哺乳類であるが、これらに限定されることはない。好ましくは、哺乳類はヒトまたは霊長類である。最も好ましくは哺乳類はヒトである。
【０１２０】
本明細書において「治療」および「予防」という用語は、その最も広い意味において考慮されるべきである。「治療」という用語は、完全回復するまで哺乳類が治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防」とは、被験者が最終的に疾患状態に至らないことを必ずしも意味しない。したがって、治療および予防は、特定の病態の症状の軽減、または特定の病態を発症するリスクの予防もしくは減少を含む。「予防」という用語は、特定の疾患の重症度または発病の減少として見なしてもよい。「治療」はまた、既存の病態の重症度を減少させてもよい。
【０１２１】
「有効量」は、望ましい免疫応答を少なくとも部分的に得るために、または治療すべき個体、治療すべき個体の分類群の特定の病態の発病を遅延、または進行を阻害、または発病もしくは進行を完全に中止させるために、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、医学的状態の評価、および他の関連する要因を得るために必要な量である。
【０１２２】
本発明のもう一つの局面は、細胞の機能的活性を調節するための薬剤を製造するために、スフィンゴシンキナーゼまたは先に定義した作用物質を用いることに関する。
【０１２３】
本発明のもう一つの局面は、細胞の機能的活性を調節するために用いられるスフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質に関する。
【０１２４】
本発明の関連する局面において、治療を受けようとする哺乳類は、治療的または予防的治療を必要とするヒトまたは動物であってもよい。
【０１２５】
これらの方法に従って、本発明に従って定義した分子は、一つまたは複数の他の化合物または分子と共に同時投与してもよい。「同時投与」とは、同じ製剤または二つの異なる製剤を同じ経路もしくは異なる経路によって同時投与すること、または同じ経路もしくは異なる経路によって連続的に投与することを意味する。「連続」投与とは、二つの型の分子の投与のあいだに数秒、数分、数時間または数日の時間差があることを意味する。これらの分子は如何なる順序で投与してもよい。
【０１２６】
なおもう一つのさらなる局面において、本発明は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体および／または希釈剤と共に、スフィンゴシンキナーゼ変種または先に定義した作用物質を含む薬学的組成物を考慮する。スフィンゴシンキナーゼ変種および作用物質は活性成分と呼ばれる。
【０１２７】
注射に用いるために適した薬学的剤形には、滅菌水溶液（水溶性の場合）および滅菌注射用溶液または分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、剤形は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロラムフェニコール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいと思われる。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによって得ることができる。
【０１２８】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において必要量の活性化合物を組み入れ、必要であればその後濾過滅菌することによって調製する。一般的に、分散剤は、基剤分散媒体と先に列挙した他の必要な成分とを含む滅菌媒体に、様々な滅菌活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から、活性成分に加えて、さらなる望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１２９】
活性成分が適切に保護されている場合、それらは、例えば不活性希釈剤もしくは同化可能な食用担体と共に経口投与してもよく、それらは外皮が硬いもしくは軟らかいゼラチンカプセルに封入してもよく、それらは錠剤に圧縮してもよく、またはそれらは食事の食物と共に直接取り込まれてもよい。経口治療的投与の場合、活性化合物は、賦形剤と共に組み入れて、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェーハ等の形で用いてもよい。そのような組成物および調製物は、活性化合物の重量で少なくとも１％を含むべきである。組成物および調製物の割合は、当然、変化してもよく、都合に合わせて単位重量の約５〜約８０％であってもよい。そのような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適した用量が得られる量である。本発明に係る好ましい組成物または調製物は、経口投与単位が活性化合物の約０．１ μｇ〜２０００ ｍｇを含むように調製される。
【０１３０】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等はまた、以下を含んでもよい：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；燐酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；および蔗糖、乳糖、もしくはサッカリンのような甘味料を加えてもよく、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはサクランボ香料のような着香料を加えてもよい。用量単位剤形がカプセルの場合、上記の型の材料に加えて液体担体を含んでもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または用量単位の物理的形状を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、砂糖またはその両者によってコーティングしてもよい。シロップまたはエリキシル剤は活性化合物、甘味料としての蔗糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、およびサクランボまたはオレンジ香料のような着香料を含んでもよい。当然、投与剤形を調製するために用いられる如何なる材料も薬学的に純粋でなければならず、用いる量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および製剤に組み入れてもよい。
【０１３１】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な作用物質に関してそのような培地および作用物質を用いることは当技術分野で周知である。任意の従来の培地または作用物質も活性成分と不適合性である場合を除いて、治療的組成物におけるその使用が考慮される。補助活性成分も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０１３２】
投与を容易にするためおよび用量の均一性のために単位投与剤形に非経口組成物を処方することは特に都合がよい。本明細書において用いられる用量単位剤形は、治療される哺乳類被験者にとって単位用量として適している物理的に個別の単位を意味する；それぞれの単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の規定量を含む。本発明の新規用量単位剤形の仕様は、（ａ）活性材料の独自の特徴および得られる特定の治療効果、ならびに（ｂ）体の健康が損なわれる疾患状態を有する生きている被験者において疾患を治療するためにそのような活性材料を混合する技術分野における固有の制限に指示され、直接左右される。
【０１３３】
主な活性成分は、先に開示した単位用量剤形において適した薬学的に許容される担体と共に有効量で簡便で有効に投与するために混合する。単位投与剤形は、例えば、０．５μｇ〜約２０００ ｍｇの範囲の量の主活性化合物を含みうる。比率で表現すると、活性化合物は、一般的に担体の約０．５μｇ〜約２０００ ｍｇ／ｍｌで存在する。補助活性成分を含む組成物の場合、用量は、上記の成分の通常の用量および投与様式を参照して決定される。
【０１３４】
薬学的組成物はまた、ベクターがスフィンゴシンキナーゼ変種または作用物質を発現することができる核酸分子を有する場合に、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのような遺伝子分子を含んでもよい。ベクターは、例えばウイルスベクターであってもよい。
【０１３５】
本発明のさらなる特徴を、以下の非制限的な実施例により詳細に記述する。
【０１３６】
実施例１
材料と方法
材料：  Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンおよびスフィンゴシン−１−ホスフェートは、バイオモルリサーチラボラトリーズインク（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）から購入した。ＡＴＰおよびホルボル１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）はシグマ社（Ｓｉｇｍａ）から得た。［γ３２Ｐ］ＡＴＰおよび３２Ｐ−燐酸は、ジーンワークス社（Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）（アデレード、サウスオーストラリア）、［コリン−メチル−１４Ｃ］スフィンゴシンはＮＥＮ社（ボストン、マサチューセッツ州）から、ＴＮＦαはＲ＆Ｄシステムズインク（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入した。インターロイキン１（ＩＬ−１）はシナジン社（Ｓｙｎｅｒｇｉｎ）（ボルダー、コロラド州）からの寄贈であった。
【０１３７】
細胞培養とトランスフェクション：  ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）細胞は、１０％仔ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、０．２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウム、ペニシリン（１．２ ｍｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（１．６ ｍｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＣＳＬバイオサイエンシズ（ＣＳＬ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パークビル、オーストラリア）において培養した。トランスフェクションは、燐酸カルシウム沈殿法（グラハム＆ファンデルエブ（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、１９７３）を用いて行った。細胞を回収して、５０ ｍＭトリス／塩酸（ｐＨ ７．４）、１０％グリセロール、０．０５％トライトンＸ−１００、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ ｍＭ ＮａＦ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液において超音波（２ワット、４℃で３０秒）によって溶解した。細胞ホモジネートにおける蛋白質濃度は、標準物質としてＢＳＡを用いてクーマシーブリリアントブルー（シグマ社）またはビシンコニン酸（Ｂｉｃｈｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））試薬のいずれかによって決定した。
【０１３８】
酵素アッセイ法：  スフィンゴシンキナーゼ活性は、先に記述したように（ピトソン（Ｐｉｔｓｏｎ）ら、出版中）Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンおよび［γ３２Ｐ］ＡＴＰを基質として用いて決定した。中性のスフィンゴミエリナーゼ活性は、本質的に既に記述されている通りに（ウィーグマン（Ｗｉｅｇｍａｎｎ）ら、１９９４）、［コリン−メチル−１４Ｃ］スフィンゴミエリンを基質として用いて決定した。簡単に説明すると、上記のように調製した全細胞溶解物を、０．２％トライトンＸ−１００、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、および［コリン−メチル−１４Ｃ］スフィンゴミエリン（５０，０００ ｃｐｍ／アッセイ）を含む１００ ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４）の等量に加えて、３７℃で６０分間インキュベートした。次に、産生された放射活性ホスホリルコリンをクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）によって抽出して、シンチレーション計数によって水相において定量した。インサイチューでのＰＫＣ活性の測定は既に記述されているように行った（シャ（Ｘｉａ）ら、１９９６）。簡単に説明すると、細胞を２４ウェルプレートに播種して、７０〜８０％コンフルエントになるまで培養培地において維持した。表記の処置後、細胞をＤＭＥＭによって洗浄して、５０ μｇ／ｍｌジギトニン、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ ｍＭβ−グリセロホスフェート、および１０ μＭ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（５０００ ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を含む緩衝塩溶液（１３７ ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ ｍＭ ＫＣｌ、０．３ ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、０．４ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、５．５ ｍＭグルコース、および２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ）６０ μｌに加えた。次に、５ｍＭ ＥＧＴＡおよび２．５ ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下でＰＫＣ特異的ペプチド基質（ＲＫＲＴＬＲＲＬ）を加えた（２００ μＭとなるように）。３０℃で１０分間インキュベートした後、２５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸２０ μｌを加えてキナーゼ反応を終了させた。酸性にした反応混合物の少量（６５ μｌ）をホスホセルロース濾紙（ホワットマンＰ−８１）にしみこませて、７５ ｍＭ燐酸によって３回洗浄し、７５ ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）によって１回洗浄した。濾紙に結合させたＰＫＣ依存的燐酸化ペプチド基質をシンチレーション計数によって定量した。
【０１３９】
ウェスタンブロッティング：  ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）［２９］の方法に従って、１２％アクリルアミドゲルを用いて細胞溶解物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。蛋白質をニトロセルロースにブロッティングして、５％スキムミルクおよび０．１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳにおいて膜を４℃で一晩ブロッキングした。スフィンゴシンキナーゼ発現レベルは、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）によって分析した。アゴニストに反応したＥＲＫ活性化を、抗ＥＲＫ１／２（ザイメッド社（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシスコ、カリフォルニア州）および抗ホスホ−ＥＲＫ１／２（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ウィスコンシン州）抗体を用いて４時間血清を枯渇させた細胞において行った。免疫複合体は、強化化学発光キット（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いてＨＲＰ抗マウス（ピアス社）または抗ウサギ（セリウス／ＡＭＲＡＤ社（Ｓｅｌｉｎｕｓ／ＡＭＲＡＤ）、メルボルン、オーストラリア）ＩｇＧのいずれかに結合させた後検出した。
【０１４０】
ＳＫ−１配列の変異誘発
ＳＫ−１ ｃＤＮＡ（ピトソンら（Ｐｉｔｓｏｎ）、２０００ａに記載するように）をｐＡＬ ＴＥＲ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）部位特異的変異誘発ベクターにクローニングした。一本鎖ＤＮＡを調製して、製造元のプロトコールに詳細に記載されるようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発の鋳型として用いた。変異原性オリゴヌクレオチド（５’ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＡＴＣ ＴＧＡ ＴＧＣ ＡＣ）［＜４００＞１］を設計して、８２位のグリシンがアスパラギン酸に置換されているＧ８２Ｄ変異体を作製した。変異体は、所望の改変が組み入れられていることを確認するためにシークエンシングした。
【０１４１】
Ｇ８２Ｄ ｃＤＮＡの発現
Ｇ８２Ｄ変異体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、サンジエゴ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。発現構築物は、燐酸カルシウム沈殿によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
【０１４２】
形質転換アッセイ法
フォーカス形成アッセイ法に関して、上記のようにリポフェクタミンプラスを用いて、継代回数の少ないＮＩＨ ３Ｔ３細胞にＶ１２変異体Ｈ−ｒａｓ、ｖ−ＳＲＣ（ジュリアン・ダウンワード２博士からの寄贈）、ＳｐｈＫ、Ｇ８２Ｄ変異体ＳｐｈＫ発現ベクター、または空ベクターをトランスフェクトした。２日後、トランスフェクトした細胞を６ウェルプレートに分割した。コンフルエンスに達した後、それらを５％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭにおいて２週間維持した。０．５％クリスタルバイオレットによって染色後フォーカスを可視化して、スコアをつけた。軟寒天アッセイ法に関して、０．３３％寒天を含む増殖培地において安定なトランスフェクトしたプールからの細胞１×１０４個の懸濁液を、様々な濃度のＤＭＳの非存在下または存在下で０．６％寒天ゲル上に重層した。１４日間インキュベートした後、コロニーを０．１ ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴによって染色して、直径０．１ ｍｍ以上のコロニーを陽性と採点した。
【０１４３】
実施例２
結果
スフィンゴシンの、スフィンゴシンキナーゼの生物学的に関連する機能を媒介する分子であるスフィンゴシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）への燐酸化能が不活化されているスフィンゴシンキナーゼの変異体を設計して作製した。この変異体は、推定のＡＴＰ結合部位の部位特異的変異誘発によって作製され（８２位のＧがアスパラギン酸に変異「Ｇ８２Ｄ」）、このようにスフィンゴシンキナーゼを触媒的に不活性にした。
【０１４４】
Ｇ８２ＤＳＫは、ＦＬＡＧタグトランスフェクタントのウェスタンブロットにおいて認められるように十分に発現されており（図２）、カルモジュリンとの結合によって判断すると正確に折り畳まれている（データは示していない）。
【０１４５】
Ｇ８２ＤＳＫそれ自身は、スフィンゴシンキナーゼ活性を有さず、内因性のスフィンゴシンキナーゼベースライン活性を抑制しない（図２）が、ＴＮＦ、ＩＬ−１、およびＰＭＡのような活性化剤によって細胞を処理するとスフィンゴシンキナーゼ活性の増加を完全に抑制する（図３および図４）。このような機能の「二重性」はまた、スフィンゴシンキナーゼを過剰発現する細胞において認められる：過剰発現されたベースラインレベルは変化しないが、活性化は減少する（図５）。予防の程度は、スフィンゴシンキナーゼ：Ｇ８２ＤＳＫのモル比に依存する可能性がある。
【０１４６】
さらに、Ｇ８２ＤＳＫは、腫瘍遺伝子Ｒａｓによって刺激されたスフィンゴシンキナーゼを阻害し（図６）、同様に腫瘍発生のインビトロおよびインビボマーカーを抑制する可能性がある。阻害剤は、もう一つの酵素である蛋白質キナーゼＣ（図７）またスフィンゴミエリナーゼ（図８）の活性化を抑制しないことから特異的である。さらに、その機能は、それが全ての時点においてＴＮＦ媒介活性化を阻害して（図４）、ｅｒｋの活性化のようなＴＮＦの下流の作用を阻害する（図９）ことから安定である。
【０１４７】
このように、これまで広く用いられている化学的阻害剤であるＮ’Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）とは全く異なるスフィンゴシンキナーゼの阻害剤が産生されている。ＤＭＳは野生型スフィンゴシンキナーゼの機能を完全に消失させるのに対し、Ｇ８２ＤＳＫは野生型スフィンゴシンキナーゼの活性化を消失させるに過ぎない。ある意味では、本発明者らは新規の種類の薬剤の基本型を有する。
【０１４８】
実施例３
ヒトスフィンゴシンキナーゼ（ｈＳＫ）をクローニングして配列分析を行うと、それらが１６〜１５３位のアミノ酸においてジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）の推定の触媒ドメインと類似性を有することが判明した（ピトソンら（Ｐｉｔｓｏｎ）、２０００ａ）。実施例１および実施例２は、この領域内の単一のアミノ酸の部位特異的変異誘発によるｈＳＫの触媒的に不活性な変異体の作製を開示している（同様に、ピトソンら（Ｐｉｔｓｏｎ）、２０００ａを参照のこと）。この変異、Ｇｌｙ８２からＡｓｐ（Ｇ８２ＤまたはｈＳＫＧ８２Ｄと呼ばれる）は、同様に不活性変異体を産生したＤＧＫの類似の変異に基づいた（マサイ（Ｍａｓａｉ）ら、１９９３；トップハム＆プレスコット（Ｔｏｐｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）、１９９９；トップハム（Ｔｏｐｈａｍ）ら、１９９８）。それによって点突然変異がＤＧＫおよびｈＳＫにおいて活性を消失させるメカニズムは、酵素のＡＴＰ結合部位を変化させることによると考えられている。これは、蛋白質キナーゼにおけるＡＴＰ結合部位のアミノ酸配列モチーフ（ハンクス（Ｈａｎｋｓ）ら、１９８８；ベナー＆ゲルロ（Ｂｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｌｏ）、１９９２）、ならびにＤＧＫおよびｈＳＫにおいて認められる配列モチーフにおける（緩い）類似性に基づく。しかし、これまでＡＴＰ結合にＧｌｙ８２が関与していることを支持する堅固なデータは得られていない。本実施例は、Ｇｌｙ８２からＡｌａへの変異誘発（Ｇ８２ＡまたはｈＳＫＧ８２Ａ）によるもう一つのｈＳＫ変異体の作製を記述する。
【０１４９】
材料と方法
材料：  Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンは、バイオモルリサーチラボラトリーズインク（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）から購入した。ＡＴＰはシグマ社から、そして［γ３２Ｐ］ＡＴＰは、ジーンワークス社（アデレード、サウスオーストラリア）から購入した。
【０１５０】
細胞培養とトランスフェクション：  ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）細胞は、１０％仔ウシ胎児血清、２ｍＭ グルタミン、０．２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウム、ペニシリン（１．２ ｍｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（１．６ ｍｇ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＣＳＬバイオサイエンシズ、パークビル、オーストラリア）において培養した。トランスフェクションは、燐酸カルシウム沈殿法（グラハム＆ファンデルエブ（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ）、１９７３）を用いて行った。細胞を回収して、５０ ｍＭトリス／塩酸（ｐＨ ７．４）、１０％グリセロール、０．０５％トライトンＸ−１００、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ ｍＭ ＮａＦ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液において超音波（２ワット、４℃で３０秒）によって溶解した。細胞ホモジネートにおける蛋白質濃度は、標準物質としてＢＳＡを用いてクーマシーブリリアントブルー（シグマ社）試薬によって決定した。
【０１５１】
酵素アッセイ法：  スフィンゴシンキナーゼ活性は、先に記述したように（ピトソン（Ｐｉｔｓｏｎ）ら、２０００ａ）Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンおよび［γ３２Ｐ］ＡＴＰを基質として用いて測定した。速度論パラメータは非直線回帰プログラムを用いて計算した。
【０１５２】
ＳＫＧ８２Ａの構築：  ＳＫ１ ｃＤＮＡ（ピトソン（Ｐｉｔｓｏｎ）ら、２０００ａに記載するように）をｐＡＬＴＥＲ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）部位特異的変異誘発ベクターにクローニングした。一本鎖ＤＮＡを調製して、これを製造元のプロトコールに詳細に記載されるようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発の鋳型として用いた。変異原性オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’）を設計して、８２位のグリシンがアラニンに置換されているＳＫＧ８２Ａ変異体を作製した。変異体は、所望の改変が組み入れられていることを確認するためにシークエンシングしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させるためにｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社、サンジエゴ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。
【０１５３】
ウェスタンブロッティング：  ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）の方法に従って、１２％アクリルアミドゲルを用いて細胞溶解物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。蛋白質をニトロセルロースにブロッティングして、膜を５％スキムミルクおよび０．１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳにおいて４℃で一晩ブロッキングした。スフィンゴシンキナーゼ発現レベルは、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）によって分析した。アゴニストに反応したＥＲＫ活性化を、抗ＥＲＫ１／２（ザイメッド社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）および抗ホスホ−ＥＲＫ１／２（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）抗体を用いて４時間血清を枯渇させた細胞において行った。免疫複合体は、強化化学発光キット（アマシャム社）を用いてＨＲＰ抗マウス（ピアス社）または抗ウサギ（セリウス／ＡＭＲＡＤ社、メルボルン、オーストラリア）ＩｇＧのいずれかに結合させた後検出した。
【０１５４】
実施例４
結果
ｈＳＫＧ８２Ｄ変異体とは対照的に、ｈＳＫＧ８２Ａは、野生型ｈＳＫよりかなり低い（約５％）ものの（図１２）触媒活性を有する。ｈＳＫＧ８２Ａの基質速度論の分析によって、この変異体が野生型ｈＳＫよりＡＴＰに対する親和性がかなり低い（図１３）が、スフィンゴシンに対する親和性は不変である（図１４）ことが示された。表３に要約するこの速度論データは、Ｇｌｙ８２がＡＴＰ結合に関係していることを示し、この残基がｈＳＫのＡＴＰ結合部位の一部である可能性を示唆している。これは、ｈＳＫにおける当初のＧｌｙ８２からＡｓｐへの変異がＡＴＰ結合の妨害によってｈＳＫの触媒活性を消失させる証拠を提供する。
【０１５５】
実施例５
ｈＳＫ変異体の構築
ｈＳＫ変異体の構築：  ＳＫ１ ｃＤＮＡ（ピトソン（Ｐｉｔｓｏｎ）ら、２０００ａに記載するように）をｐＡＬＴＥＲ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）部位特異的変異誘発ベクターにクローニングした。一本鎖ＤＮＡを調製して、これを製造元のプロトコールに詳細に記載されるようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発のための鋳型として用いた。ｈＳＫ変異体を作製するために用いた変異原性オリゴヌクレオチドを表１に記載する。変異体をシークエンシングして、所望の改変が組み入れられていることを確認し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させるために、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社、サンジエゴ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。
【０１５６】
当業者は、本明細書に記載の本発明が、特に説明した以外の改変および態様を受けることを認識すると思われる。そのような変更および改変は全て本発明に含まれると理解すべきである。本発明にはまた、本明細書において個々に、または集合的に言及または示した全ての段階、特徴、組成物、および化合物、ならびに上記の段階または特徴の任意の二つまたはそれ以上の全ての組み合わせも含まれる。
【０１５７】
【表３】ｈＳＫＷＴおよびｈＳＫＧ８２Ａの基質速度論
2004500903.tif 000011
速度論の値は、図１２および図１３に示したデータの非直線回帰分析によって得られた。ＶｍａｘはＳＫＷＴに関して計算した最高速度の百分率として表記し、二つの組換え型蛋白質の発現レベルに関して標準化した。
【０１５８】
【表４】ｈＳＫの部位特異的変異誘発のために用いた変異原性オリゴヌクレオチド
2004500903.tif 000012
ｈＳＫＷＴ鋳型とのミスマッチを小文字で示す
【０１５９】
引用文献：
2004500903.tif 000013
2004500903.tif 000014
2004500903.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】いくつかのジアシルグリセロールキナーゼの推定の触媒ドメインとスフィンゴシンキナーゼとの配列アラインメントの略図である。ジアシルグリセロールキナーゼの触媒ドメイン内の高度に保存された残基を強調する。印をつけた（・）残基は、これらの三つのジアシルグリセロールキナーゼにおける変異誘発（Ｇｌｙ→Ａｓｐ）が触媒活性を消失させる部位を示す。
【図２】ヒトスフィンゴシンキナーゼの部位特異的変異誘発のグラフによる表示と画像である。ｐｃＤＮＡ３−ＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｇ２６ＤＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｓ７９ＤＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｇ８０ＤＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｇ８２ＤＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｋ１０３ＡＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｇ１１１ＤＳＫ、ｐｃＤＮＡ３−Ｇ１１３ＤＳＫ、または空のｐｃＤＮＡ３ベクターのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を回収し、（Ａ）Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットによる蛋白質発現レベルに関して、および（Ｂ）スフィンゴシンキナーゼ活性に関して分析した。
【図３】ＨＥＫ２９３細胞においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されると、ＴＮＦα、ＰＭＡおよびＩＬ−１による内因性スフィンゴシンキナーゼ活性の活性を遮断することを示すグラフである。ｐｃＤＮＡ３−Ｇ８２ＤＳＫまたは空のｐｃＤＮＡ３ベクターのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαおよび１００単位／ｍｌ ＩＬ−１と共に１０分間および１００ ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡと共に３０分間処置した。
【図４】Ｇ８２Ｄ ＳＫを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＴＮＦαによるスフィンゴシンキナーゼ活性化の時間経過を示すグラフである。ｐｃＤＮＡ３−Ｇ８２ＤＳＫまたは空のｐｃＤＮＡ３ベクターのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαによって処置した。細胞をＴＮＦα処置の４５分間の様々な時点で回収して、細胞溶解物をスフィンゴシンキナーゼ活性に関してアッセイした。
【図５】ＨＥＫ２９３細胞においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されると、過剰発現された野生型スフィンゴシンキナーゼ活性のＴＮＦαによる活性化を減少させることを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐｃＤＮＡ３−ＳＫをトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３−ＳＫとｐｃＤＮＡ３−Ｇ８２ＤＳＫとを等しい比率で同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を１ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαによって１０分間処置した。次に、細胞を回収して、細胞溶解物におけるＳＫ活性を決定した。
【図６】３Ｔ３線維芽細胞においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されると、腫瘍遺伝子ＲａｓによるＳＫの活性化が阻害されることを示すグラフである。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されても、ＴＮＦαまたはＰＭＡによる蛋白質キナーゼＣ活性の活性化に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図８】ＨＥＫ２９３細胞においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されても、ＴＮＦによるスフィンゴシンミエリナーゼの活性化が阻害されないことを示す画像である。
【図９】ＨＥＫ２９３においてＧ８２Ｄ ＳＫが発現されると、ＴＮＦαによるＥＲＫ活性化が防止されることを示すグラフである。
【図１０】本発明の開発に照らして同定および／または開発することが可能な薬剤型の略図である。
【図１１】Ｇ８２Ｄ ＳＫがＲａｓ形質転換を阻害することを示すグラフである。Ａ． ＮＩＨ ３Ｔ３細胞にＶ１２−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ、またはＶ１２−ＲａｓとＧ８２Ｄ−ＳＫとをトランスフェクトして、ＳｐｈＫ活性をトランスフェクションの４８時間後に測定した。Ｂ． Ｖ１２−Ｒａｓ、ｖ−Ｓｒｃ、ＳｐｈＫまたはＶ１２−ＲａｓとＧ８２Ｄ−ＳＫとをトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３細胞において、ＤＭＳ（２．５ μＭ）の非存在下または存在下でフォーカス形成アッセイを２週間行った。
【図１２】ヒトスフィンゴシンキナーゼの部位特異的変異誘発を示す。ｐｃＤＮＡ３−ＳＫＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ＳＫＧ８２Ｄ、ｐｃＤＮＡ３−ＳＫＧ８２Ａまたは空のｐｃＤＮＡ３ベクターのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、（Ａ）ＭＴ抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットによる蛋白質発現レベルに関して、および（Ｂ）スフィンゴシンキナーゼ活性に関して分析した。
【図１３】（Ａ）ｈＳＫＷＴおよび（Ｂ）ｈＳＫＧ８２ＡのＡＴＰによる速度論分析を示す。速度論分析は、ｈＳＫＷＴおよびｈＳＫＧ８２Ａに関してそれぞれ、０〜２ｍＭおよび０〜４０ ｍＭの濃度範囲のＡＴＰによって行った。いずれの場合も、スフィンゴシンは１００ μＭで存在した。
【図１４】（Ａ）ｈＳＫＷＴおよび（Ｂ）ｈＳＫＧ８２Ａのスフィンゴシンによる速度論分析を示す。速度論分析は、ｈＳＫＷＴおよびｈＳＫＧ８２Ａの双方に関して０〜２ｍＭの濃度範囲のスフィンゴシンについて実施した。ＡＴＰは、ｈＳＫＷＴおよびｈＳＫＧ８２Ａに関してそれぞれ、１ｍＭおよび４０ ｍＭで存在した。
【図１５】ヒトスフィンゴシンキナーゼの部位特異的変異誘発のグラフである。空のｐｃＤＮＡ３ベクター、ｐｃＤＮＡ３−ＳＫＷＴ、またはｐｃＤＮＡ３−変異体ｈＳＫ細胞のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収して、スフィンゴシンキナーゼ活性に関して分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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