(57)【要約】本発明は、蛋白質、細胞および細菌の吸着に耐える物品を提供する。本物品は、化学鎖が水素結合供与体を含まない末端鎖を含むその上に結合された化学鎖を有してもよいか、または、化学鎖を含む物品の暴露表面が水素結合供与体を含まないほど十分に水素結合供与体が埋め込まれていてもよい。化学鎖、または、複数の化学鎖は、均質にされうるか（ＳＡＭの１つのタイプ）または混合された、すなわち、より異なるタイプのＳＡＭｓでありうる、例えば、自己集合単分子層（ＳＡＭ）のような単分子層を含みうる。その他のさらに特異的な化学鎖の例が提供される。多くの態様において、複数の化学鎖は、例えば、ポリアミンのようなポリマーを含んでもよい。多くの態様において、複数の化学鎖は、架橋または分岐を十分なほど含まない。本発明は、また、所望される生体分子の特異的な結合をしうるものの生体分子の非特異的な結合を防止する物品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その上に化学鎖を共有結合した基質を含み、その鎖が、構造：
【化１】
2004513981.tif 000041
〔式中、末端基は、親水性であり；Ｅは、窒素、酸素、リンおよび硫黄からなる群より選択され；Ｘは、有機置換基であり、かつ、ｍは、３以下の整数であり；Ｙは、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体および多重ニトリルからなる群より選択され、かつ、ｐは、０より大きい整数であり；ＸおよびＹは、両方とも水素結合供与体を含まず；Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールからなる群より選択され、かつ、ｎは、２以下の整数であり；
【化２】
2004513981.tif 000042
は、１つ以上の単結合、二重結合またはそのいずれかの組合せを表し；Ｒ１は、ＸまたはＹに結合して環式構造を形成してもよい。〕
を含む末端基を含む物品であって、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品。
【請求項２】
Ｅが窒素である、請求項１に記載の物品。
【請求項３】
末端基が全体として中性の電荷を有する、請求項１に記載の物品。
【請求項４】
化学鎖が全体として中性の電荷を有する、請求項３に記載の物品。
【請求項５】
単分子層の末端基が帯電され、反対の電荷を有する少なくとも１つの隣接末端基により中性とされている、請求項１に記載の物品。
【請求項６】
基質が、その上に、架橋を含まない複数の化学鎖を共有結合した、請求項１に記載の物品。
【請求項７】
物品が、基質に結合された複数の化学鎖の単分子層を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項８】
単分子層が、自己集合した単分子層である、請求項７に記載の物品。
【請求項９】
化学鎖が第１の化学鎖であり、単分子層が、さらに、第１の化学鎖と異なる組成を有する第２の化学鎖を含み、第２の化学鎖が、単分子層中化学鎖合計の約７５％未満の量存在する、請求項７に記載の物品。
【請求項１０】
第２の化学鎖が、単分子層中化学鎖合計の約５０％未満の量存在する、請求項９に記載の物品。
【請求項１１】
第２の化学鎖が、単分子層中化学鎖合計の約２５％未満の量存在する、請求項９に記載の物品。
【請求項１２】
第２の化学鎖が、Ｃ１−Ｃ２５アルキル、アリール、カルボン酸、チオール、ヒドロキシルおよび第４級アンモニウムイオンからなる群より選択される末端基を含む、請求項９に記載の物品。
【請求項１３】
第２の化学鎖が、構造：
【化３】
2004513981.tif 000043
を含む末端基を含む、請求項９に記載の物品。
【請求項１４】
第２の化学鎖が、第１の化学鎖の平均長さよりも短い平均長さを有する、請求項９に記載の物品。
【請求項１５】
化学鎖が、実質的に直鎖の骨格を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項１６】
化学鎖が、末端基である、請求項１に記載の物品。
【請求項１７】
化学鎖が、末端基と、末端基および基質に共有結合したリンカーとを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項１８】
リンカーが、構造：
【化４】
2004513981.tif 000044
〔式中、ｑは、０より大きい整数である。〕
を含む、請求項１７に記載の物品。
【請求項１９】
リンカーが、構造：
【化５】
2004513981.tif 000045
〔式中、Ｚは、ヘテロ原子を含み、ｒは、０または１に等しい。〕
を含む、請求項１８に記載の物品。
【請求項２０】
リンカーが、構造：
【化６】
2004513981.tif 000046
を含む、請求項１９に記載の物品。
【請求項２１】
Ｚが、酸素、窒素、ケイ素および硫黄からなる群より選択される、請求項２０に記載の物品。
【請求項２２】
化学鎖が、構造：
【化７】
2004513981.tif 000047
を含む、請求項１８に記載の物品。
【請求項２３】
化学鎖が、構造：
【化８】
2004513981.tif 000048
を含む、請求項２０に記載の物品。
【請求項２４】
Ｚが、酸素、窒素、ケイ素および硫黄からなる群より選択される、請求項２３に記載の物品。
【請求項２５】
ｑが、３より大きい、請求項２３に記載の物品。
【請求項２６】
基質が、第１の組成物を含み、化学鎖が、第１の組成物と異なる第２の組成物を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項２７】
基質が、金属、セラミックおよびポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項２６に記載の物品。
【請求項２８】
基質が金である、請求項２７に記載の物品。
【請求項２９】
基質がシリカである、請求項２７に記載の物品。
【請求項３０】
末端基が、水素結合受容体基を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項３１】
物品が、吸着蛋白質に耐え、物品が、蛋白質の単分子層の６０％以下を吸着する、請求項１に記載の物品。
【請求項３２】
物品が、吸着蛋白質に耐え、物品が、蛋白質の単分子層の５０％以下を吸着する、請求項１に記載の物品。
【請求項３３】
物品が、吸着蛋白質に耐え、物品が、蛋白質の単分子層の３０％以下を吸着する、請求項１に記載の物品。
【請求項３４】
末端基が、構造：
【化９】
2004513981.tif 000049
〔式中、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、エーテル、エーテル誘導体、エステル、ホルミル、カルボキシルおよびＣ（Ｏ）Ｒ３［式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。］からなる群より選択される。〕
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項３５】
Ｙが、構造：
【化１０】
2004513981.tif 000050
〔式中、Ｒ２およびＲ３は、異なるかまたは同一であり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。〕
を含むアミドである、請求項１に記載の物品。
【請求項３６】
末端基が、構造：
【化１１】
2004513981.tif 000051
〔式中、Ｒ２は、末端または結合Ｃ１−Ｃ６アルキルを含み、ｑおよびｒの各々は、０より大きい整数である。〕
を含む、請求項３５に記載の物品。
【請求項３７】
Ｙが、構造：
【化１２】
2004513981.tif 000052
〔式中、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。〕
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項３８】
Ｙが、構造：
【化１３】
2004513981.tif 000053
を含むアミドである、請求項１に記載の物品。
【請求項３９】
末端基が、構造：
【化１４】
2004513981.tif 000054
〔式中、ｑは、０より大きい整数である。〕
を含む、請求項３８に記載の物品。
【請求項４０】
末端基が、構造：
【化１５】
2004513981.tif 000055
〔式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、ｑは、０より大きい整数である。〕
を含む、請求項３８に記載の物品。
【請求項４１】
Ｙが、構造：
【化１６】
2004513981.tif 000056
〔式中、カッコ内に囲まれた基は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体を表し、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっていてもよく、各々、有機基であり、ｑは、１より大きい整数である。〕
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項４２】
Ｙが、構造：
【化１７】
2004513981.tif 000057
〔式中、カッコ内に囲まれた基は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体を表し、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっていてもよく、各々、有機基であり、ｑは、１より大きい整数である。〕
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項４３】
Ｒ２が、メチルおよびエチルからなる群より選択されるアルキルである、請求項４２に記載の物品。
【請求項４４】
アミノ酸が、グリシンである、請求項４２に記載の物品。
【請求項４５】
アミノ酸誘導体が、Ｃ１−Ｃ６アルキルでアルキル化されたＮ−アルキルアミノ酸を含む、請求項４２に記載の物品。
【請求項４６】
アミノ酸誘導体が、Ｎ−メチルグリシンである、請求項４５に記載の物品。
【請求項４７】
末端基が、構造：
【化１８】
2004513981.tif 000058
〔式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ｑは、０以上の整数である。〕
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項４８】
末端基が、構造：
【化１９】
2004513981.tif 000059
を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項４９】
Ｙが、Ｃ１−Ｃ６アルキルで過アルキル化された糖誘導体を含む、請求項１に記載の物品。
【請求項５０】
末端基が、構造：
【化２０】
2004513981.tif 000060
〔式中、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ｑおよびｒは、同一または異なり、各々、０より大きい整数である。〕
を含む、請求項４９に記載の物品。
【請求項５１】
Ｙが、構造［（ＣＨ２）ｑ−ＣＮ］２（ここで、ｑは、０より大きい。）を含む多重ニトリルである、請求項１に記載の物品。
【請求項５２】
末端基が、構造：
【化２１】
2004513981.tif 000061
を含む、請求項５１に記載の物品。
【請求項５３】
その上に化学鎖の単分子層を共有結合した基質を含み、単分子層の鎖の少なくとも２５％が水素結合供与体を含まない親水性基で終了し、その親水性基が、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体および多重ニトリルからなる群より選択される物品であって、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品。
【請求項５４】
単分子層が、自己集合単分子層を含む、請求項５３に記載の物品。
【請求項５５】
親水性基が、水素結合受容体基を含む、請求項５３に記載の物品。
【請求項５６】
単分子層の各化学鎖が、全体として中性の電荷を有する、請求項５３に記載の物品。
【請求項５７】
単分子層の化学鎖が帯電され、反対の電荷を有する少なくとも１つの隣接化学鎖により中性とされている、請求項５３に記載の物品。
【請求項５８】
単分子層が、親水性基を基質に結合させるためのリンカー基を含む、請求項５３に記載の物品。
【請求項５９】
リンカー基が、実質的に直鎖の骨格を有する、請求項５８に記載の物品。
【請求項６０】
リンカー骨格が、少なくとも３個の原子を含む、請求項５９に記載の物品。
【請求項６１】
リンカー骨格が、メチレン基の直鎖を含む、請求項５９に記載の物品。
【請求項６２】
メチレン基の直鎖が、少なくとも１個のヘテロ原子により遮断されている、請求項６１に記載の物品。
【請求項６３】
メチレン基の直鎖が、アミド、アミン、ケトン、エステルおよびエーテルからなる群より選択される結合により遮断されている、請求項６１に記載の物品。
【請求項６４】
鎖の少なくとも５０％が、親水性基により終了している、請求項５３に記載の物品。
【請求項６５】
鎖の実質的に全てが、親水性基により終了している、請求項５３に記載の物品。
【請求項６６】
その上に共有結合した化学基を有する基質を含み、その化学基が、
【化２２】
2004513981.tif 000062
〔式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ７は、同一または異なり、各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；ｍ、ｎおよびｐは、同一または異なり、かつ、各々、０より大きい整数である。〕
からなる群より選択される物品であって、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品。
【請求項６７】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々が、メチルである、請求項６６に記載の物品。
【請求項６８】
構造：
【化２３】
2004513981.tif 000063
〔式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールからなる群より選択され、ｎは、０または１に等しい整数である。〕
を含む結合を介してその上にポリアミンを共有結合した基質を含む物品であって、その物品が、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品。
【請求項６９】
結合が、構造：
【化２４】
2004513981.tif 000064
〔式中、ｑは、１より大きい整数であり、Ｚは、１個の炭素原子または１個のヘテロ原子を含み、ｒは、０または１に等しい。〕
を含む、請求項６８に記載の物品。
【請求項７０】
ｑが、１０未満である、請求項６９に記載の物品。
【請求項７１】
Ｚが、酸素原子である、請求項６９に記載の物品。
【請求項７２】
ポリアミンが、架橋を含まない、請求項６８に記載の物品。
【請求項７３】
ポリアミンが、アシル化されている、請求項６８に記載の物品。
【請求項７４】
ポリアミンが、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分岐したポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリ（Ｌ−リシン）からなる群より選択される、請求項６８に記載の物品。
【請求項７５】
ポリマーが、少なくとも２つの繰返し単位を含む、請求項６９に記載の物品。
【請求項７６】
繰返し単位にアミンを含む実質的に直鎖のポリマーに共有結合した基質を含む物品であって、その物品が、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品。
【請求項７７】
ポリマーが、直鎖ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリ（Ｌ−リシン）からなる群より選択される、請求項７６に記載の物品。
【請求項７８】
アミド、アミン、エステル、エーテル、尿素、カーボネートおよびイミンからなる群より選択されるリンカーを介してポリアミンに共有結合した基質を含む物品。
【請求項７９】
ポリアミンが、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分岐したポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリ（Ｌ−リシン）からなる群より選択される、請求項７８に記載の物品。
【請求項８０】
ポリアミンが、第１の化学鎖を含み、基質が、さらに、その上に、第２の化学鎖を化学鎖合計の７５％未満の量共有結合した、請求項７８に記載の物品。
【請求項８１】
その上に結合したポリマーを有する基質を含み、ポリマーの表面が、生体分子の吸着に耐える第１の領域を含み、ポリマーの表面が、さらに、アナライトに共有結合するためにリガンドで誘導されうる基で終了する少なくとも１つの化学鎖を含む第２の領域を含む物品であって、生体分子に生物特異的に結合しうる物品。
【請求項８２】
リガンドが、生体分子に生物特異的に結合しうる、請求項８１に記載の物品。
【請求項８３】
アナライトが、生体分子に生物特異的に結合しうる、請求項８１に記載の物品。
【請求項８４】
第１の領域が、さらに、表面に共有結合した複数の化学鎖を含む、請求項８１に記載の物品。
【請求項８５】
複数の化学鎖の各々が、オリゴ（エチレングリコール）ｎ基（ここで、ｎは、１０以下である。）；本明細書で特許請求または列挙した組成物のいずれか；および、上記した組成物のいずれか２つ以上の混合物で終了する、請求項８４に記載の物品。
【請求項８６】
アナライトが、リガンドまたは生体分子を含む、請求項８１に記載の物品。
【請求項８７】
ポリマーが、ポリアミンを含む、請求項８１に記載の物品。
【請求項８８】
ポリアミンが、直鎖ポリ（エチレンイミン）、分岐したポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリ（Ｌ−リシン）からなる群より選択される、請求項８７に記載の物品。
【請求項８９】
その上にポリアミンを共有結合した基質を含む物品であって、ポリアミンが、オリゴ（エチレングリコール）ｎ基（ここで、ｎは、１０以下である。）；本明細書で特許請求または列挙した組成物のいずれか；および、上記した組成物のいずれか２つ以上の混合物で終了する物品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本非予備出願は、２０００年７月１７日に出願され、参考とすることによって本明細書に組込む同時継続中のＵ．Ｓ．予備出願シリアルｎｏ．６０／２１８，７３９の３５章，Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、物品を蛋白質、細胞および／または細菌の吸着に耐えさせうる組成物およびポリマーに共有結合した基質表面を有する物品に関する。本発明は、また、生体分子、細胞および細菌に特異的に結合しうる組成物に共有結合した基質表面に関する。
【０００３】
発明の背景
種々の医学的処置に使用される医用装置、医用物品または材料を製造するための新規かつ改良された生物適合性の材料を開発するために努力がなされつつある。概して、生物適合性は、蛋白質、細胞および／または細菌の吸着および脱着に耐える材料を設計することにより達成される。このような生物適合性の材料の用途は、数多く、人工器官、組織代替物、包帯用の材料、薬剤およびワクチンの転写用の材料、および、感知装置が挙げられる。これら材料は、また、細菌、カビまたは海洋生物を蓄積しやすい船舶装置におけるような付着物を防止するのに有用でありうる。
【０００４】
高分子量エチレングリコール単位の低密度分布を含む表面は、蛋白質の吸着に耐えるのに有効であることが報告されている。Ｄｕ　ｅｔ　ａｌ．は、蛋白質および細胞の吸着を抑制するために、脂質表面にポリ（エチレングリコール）をグラフトすることを記載している（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１３２６，ｐｐ．２３６−２４８，１９９７）。基質表面は、また、自己集合単分子層を介してポリ（エチレングリコール）単位で誘導されている。Ｈａｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．は、オリゴ（エチレングリコール）終了単位で誘導されるπ−アルカンチオレートに結合した銀および金表面を記載している（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，Ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．４２６−４３６，１９９８）。Ｐｒｉｍｅ　ｅｔ　ａｌ．は、オリゴ（エチレンオキシド）グラフトされたアルカンチオレート鎖がアルカンチオレート鎖と混合された金上の混合自己集合単分子層を記載している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ．１０７１４−１０７２１，１９９３）。
【０００５】
Ｃｕｎｌｉｆｆｅ　ｅｔ　ａｌ．は、細菌の吸着に耐性を示すポリ（エチレンオキシド）で誘導されるシリカ表面を記載している（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６５（１１），ｐｐ．４９９５−５００２，Ｎｏｖ．１９９９）。
【０００６】
しかし、オリゴ（エチレングリコール）単位は、これらの単位が自動酸化を受けやすいことから欠点を有する。かくして、エチレングリコール単位以外の組成物で誘導される表面についての必要性が存在する。Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｅｉｄｅｎは、蛋白質吸着および血小板付着に対して不動態化された表面を生成させるために、ホスホリルコリンで誘導されるポリ（エーテルウレタン）表面を記載している（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．４０，ｐｐ．１９５−２０３，１９９８）。Ｄｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．は、トリ（プロピレンスルホキシド）基の自己集合単分子層を含有する表面を記載しており、これは、アルカン終了鎖と混合させることができ、蛋白質の吸着に耐える表面を生成する（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１８，ｐｐ．５１３６−５１３７，１９９６）。
【０００７】
ある種のポリマーもまた蛋白質耐性を示す。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，２４１，６８２（Ｋｏｎｓｔａｎｄｔ）は、塗被された表面の寿命を増大させるために塗被された表面上に塗被しうる高分子溶液の使用を記載している。この溶液は、ポリエチレンイミンと親水性アクリル性ポリマーとの混合物を含む。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，３１２，８７３は、アミドへと転化される表面ニトリル基を有し、吸着性の付着物に耐える膜を生ずるポリマーを記載している。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，９２５，６９８（Ｋｌａｕｓｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）は、ポリマーを蛋白質の脱着にさらに耐えるようにする高分子表面の化学的改質を記載している。特に、化学的改質として、アシル化が挙げられる。
【０００８】
蛋白質、細胞および細菌の吸着に完全に耐える材料は存在しないので、新しい材料を開発する必要性が残されたままである。
発明の概要
本発明のある種の態様は、新規な表面結合された組成物およびこれら組成物の混合物を生ずることを通して、生物種、例えば、蛋白質、細胞および／または細菌の吸着に耐える物品を特徴とする。
【０００９】
本発明の１つの態様は、その上に化学鎖を共有結合した基質を含み、その鎖が、構造：
【００１０】
【化２５】
2004513981.tif 000002
〔式中、末端基は、親水性である。〕
を含む末端基を含む物品を提供する。Ｅは、窒素、酸素、リンおよび硫黄からなる群より選択される。Ｘは、有機置換基であり、かつ、ｍは、３以下の整数である。Ｙは、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体および多重ニトリルからなる群より選択され、かつ、ｐは、０より大きい整数であり；ＸおよびＹは、両方とも水素結合供与体を含まない。Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールからなる群より選択され、かつ、ｎは、２以下の整数である。
【００１１】
【化２６】
2004513981.tif 000003
は、１つ以上の単結合、二重結合またはそのいずれかの組合せを表す。Ｒ１は、ＸまたはＹと結合して環式構造を形成してもよい。
【００１２】
本発明のもう１つの態様は、その上に化学鎖の単分子層を共有結合した基質を含む物品を提供する。単分子層の鎖の少なくとも２５％の末端は、水素結合供与体を含まない親水性基である。親水性基は、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体および多重ニトリルからなる群より選択される。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、その上に共有結合された化学基を有する基質を含み、その化学基が、
【００１４】
【化２７】
2004513981.tif 000004
〔式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ７は、同一または異なり、各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。〕
からなる群より選択される物品を提供する。Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。ｍ、ｎおよびｐは、同一または異なり、各々、０より大きい整数である。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、構造：
【００１６】
【化２８】
2004513981.tif 000005
〔式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールからなる群より選択され、ｎは、０または１に等しい整数である。〕
を含む結合を介してその上にポリアミンを共有結合した基質を含み、その物品が、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品を提供する。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、繰返し単位中にアミンを含む実質的に直鎖のポリマーに共有結合した基質を含む物品を提供する。
本発明のもう１つの態様は、アミド、アミン、エステル、エーテル、尿素、カーボネートおよびイミンからなる群より選択されるリンカーを介してポリアミンに共有結合した基質を含む物品を提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様は、所望されない非特異的な結合を防止しつつ、生体分子に特異的に結合しうる物品を特徴とする。
かくして、本発明のもう１つの態様は、その上に結合されたポリマーを有する基質を含む物品を提供する。ポリマーの表面は、生体分子の吸着に耐える第１の領域を含む。ポリマーの表面の末端は、さらに、アナライトに共有結合するためのリガンドで誘導されうる基である少なくとも１つの化学鎖を含む第２の領域を含む。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、その上にポリアミンを共有結合した基質を含み、そのポリアミンの末端が、オリゴ（エチレングリコール）ｎ基（ここで、ｎは、１０以下である。）；本明細書で特許請求または列挙した組成物のいずれか；および、これら組成物のいずれか２つ以上の混合物である物品を提供する。
【００２０】
本発明のその他の利点、新規な特徴および目的は、概略的でありかつ縮尺を意図するものではない添付の図面を参照しつつ考える時、本発明の以下の詳細な説明から明らかとなろう。図面において、複数の図面に示した各同一またはほぼ同一の構成部分は、単一の参照符号により表す。わかりやすくするために、各構成部分は、図ごとによらず、当業者が本発明を理解するために図示が必要でない場合には、本発明の各実施態様の構成部分ごとによらない。
【００２１】
詳細な説明
蛋白質耐性表面を製造するための現在の技術の多くは、高分子量（すなわち、ｎ＞１０）エチレングリコールオリゴマーまたはポリマーの低密度被覆面積を生じさせることに焦点が合されている。オリゴ（エチレングリコール）（ｏｌｉｇｏ−ＥＧ）またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が自動酸化を受けやすいことによりこれとは別の組成物が所望される。本発明は、多様な別種の組成物により誘導され、蛋白質、細胞および細菌の吸着および脱着に対して耐性を示す数種の材料を生ずる基質表面に関する。これら材料の製造は、比較的容易であり、かくして、本発明は、特定の用途、それが船舶または大量の水分に暴露されているその他の表面の抗付着であるか、薬剤供給用の材料（例えば、脂質膜に所望される末端基をグラフトすることにより薬剤供給装置としてのリポソームが改善されうる。）か、膜、組織代替物または包帯のいずれかに特に合わせうる表面を提供する。その他の用途としては、ｉ）血漿蛋白質の留置医用装置、例えば、静脈内カテーテルへの吸着によって生ずる血栓症；ｉｉ）外部医用装置、例えば、コンタクトレンズへの蛋白質の吸着および細菌の付着によって生ずる刺激；ｉｉｉ）バイオフィルム形成をもたらしうる微生物、例えば、サルモネラ　チフィムリアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）による包装された食品の汚染；および、ｉｖ）“硬質付着物”：フジツボおよびヤギの船体への付着等、多種多様な問題の防止が挙げられる。蛋白質および細菌に耐える表面は、また、生物医学装置および実験装置における用途用である。
【００２２】
また、本発明は、所望される生体分子、細胞および細菌を特異的に結合する表面を提供する。
本発明の１つの態様は、その上に化学鎖を共有結合した基質を提供する。化学鎖は、基質の外側表面に共有結合されうる。共有結合は、化学基の単なる吸着を生ずる表面と比較してより強固で安定な物品を生ずる。
【００２３】
化学鎖は、その連鎖内に少なくとも５個の原子を結合する１つの連続した結合連鎖を含有する。鎖は、直鎖であるが、その鎖は、その他の側鎖化学基に結合してもよい。典型的には、側鎖化学基は、主要な化学鎖よりも小さな結合連鎖を有する。化学鎖は、また、生物学的に耐性の基、すなわち、蛋白質、細胞および／または細菌の吸着を防止しうる基を含む。１つの実施態様において、生物学的に耐性の基は、末端基である。典型的には、鎖の１つの端は、基質に共有結合され、末端基は、鎖の他の端に位置する。かくして、末端基は、基質表面に共有結合した原子から始まる最も長い連続結合連鎖を終了する。しかし、鎖が数個のベンドを有するように鎖が十分な長さを有しうると、隣接の化学鎖の下に埋もれた末端を生ずる。この実施態様において、生物学的に耐性の基は、必ずしも末端基である必要はなく、むしろ、“暴露されている”基である。こうした状況においては、“末端基”は、実際に末端ではなく、むしろ、暴露され、かつ、蛋白質、細胞または細菌の吸着を防止しうる側鎖基である。
【００２４】
１つの実施態様において、末端基は、構造：
【００２５】
【化２９】
2004513981.tif 000006
を含む。
【００２６】
Ｅは、ヘテロ原子であり、窒素、酸素、リンまたは硫黄が挙げられる。Ｘは、有機置換基であり、かつ、ｍは、３以下の整数であり；かくして、Ｘは、存在しても存在しなくともよいか、または、一連の”Ｘ”基は、逐次結合していてもよい。Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールであってもよく、ｎは、２以下の整数である。Ｙは、有機基であり、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体または多重ニトリルが挙げられ；ｐは、０より大きい整数である。
【００２７】
【化３０】
2004513981.tif 000007
は、１つ以上の単結合、二重結合、または、それらのいずれかの組合せを表す。Ｒ１は、ＸまたはＹに結合して、環式構造を形成してもよい。Ｒ１をＸまたはＹに結合するためには、１つ以上の原子を使用するのがよい。かくして、Ｅは、環構造、例えば、ヘテロ環の一部であってもよい。
【００２８】
ＸおよびＹは、水素結合供与体を含まない。水素結合供与体は、不対電子対と相互作用しうるヘテロ原子（非炭素原子）に共有結合された水素を有する。末端基は、また、親水性、すなわち、末端基は、水に対して親和性を有する（吸着、結合または水を撥水しない）。疎水性基は、典型的には、蛋白質吸着を生ずる。
【００２９】
いずれかの理論に結びつける意思はないが、蛋白質吸着は、蛋白質が表面から水を置換する能力に関連することが示唆される。親水性表面は、水を保持し、蛋白質による水の置換を防止する傾向にある。ＸまたはＹ基に存在する水素結合供与体は、潜在的に、蛋白質中の多数の水素結合受容体と相互作用し、かくして、蛋白質の耐性を低下させる。しかし、水素結合供与体基が鎖の他の置換基の下に埋もれている場合、例えば、鎖が十分な嵩高さを有する場合、その水素結合供与体基は、蛋白質耐性に非常に低い蛋白質耐性を最も及ぼしそうであろう。かくして、１つの実施態様において、本発明の物品は、水素結合供与体基を含まない表面を暴露する。“暴露”とは、蛋白質、細胞または細菌の吸着を防止しうる表面領域を称す。
【００３０】
好ましくは、化学鎖、または、化学鎖の少なくとも一部、例えば、末端基または暴露基は、物品を蛋白質、細胞または細菌の吸着に対して耐性とする特性を有する。１つの実施態様において、蛋白質の吸着に対する耐性は、所定の条件下で表面に吸着する単分子層のパーセンテージを測定することにより決定される。蛋白質吸着の度合いは、Ｂｉａｃｏｒｅ　１０００ＳＰＲの使用により決定することができる。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）は、生体分子の表面への吸着および／または脱着を測定するための標識を含まない分析法を提供する。緩衝液中の蛋白質溶液は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で生じ、基質表面上を３０分間１０μＬ／分の速度で流れる。緩衝液の溶液は、表面上を１０分間流してから読み取る。完全に疎水性の表面は、対照として使用され；典型的には、アルキル基の鎖の単分子層を含有する表面である。この表面は、１００％の単分子層を吸着するであろう。ＳＰＲにより測定される吸着された蛋白質の量（ΔＲＵ＝応答単位における変化）は、３０分間の蛋白質注入を完了した後１０分測定したＲＵの値から蛋白質の注入前のＲＵ（ＲＵ＝ＳＰＲにより測定される反射単位）の値を差し引くことにより決定することができる。ΔＲＵの値は、式１を使用して完全に疎水性の表面に対する蛋白質の単分子層のパーセンテージ（％単分子層）を計算するために使用される。
【００３１】
【数１】
2004513981.tif 000008
かくして、本発明の組成物は、上記した特性を有する末端基を選択し、完全に疎水性の表面に関して蛋白質吸着の程度をモニターすることによってスクリーンすることができる。１つの実施態様において、物品は、蛋白質の吸着に耐え、物品は、同一条件下の疎水性表面（１００％）と比較して蛋白質の単分子層の６０％以下を吸着する。好ましくは、物品は、蛋白質の単分子層の５０％以下を吸着し、さらに好ましくは、単分子層の４０％以下、さらに好ましくは、蛋白質単分子層の３０％以下、さらに好ましくは、２０％以下、なおさらに好ましくは、１０％以下、さらになお好ましくは、５％以下を吸着する。
【００３２】
いずれかの理論と結びつけようとする意思はないが、蛋白質耐性についての特徴は、細菌耐性および細胞耐性についての特性と幾分相関する。しかし、その相関は、必ずしも直線ではない（実施例２参照）。
【００３３】
細菌の付着は、表面に結合される細菌コロニーの数を測定することによって決定することができる（コロニー形成単位，ｃｆｕ／ｍＬ）。コロニーは、音波処理により表面から取除き、続いて、適当な培地で一定時間成育させる。コロニー数は、それらの光学密度を決定することによって測定される。音波処理は、特に対照金表面の場合、付着した細菌を除去するための必ずしも十分な方法ではない。かくして、本明細書で報告する対照値は、幾分低いかもしれない。
【００３４】
特に、２つの細菌株、スタフィロコッカス　エピダーミデイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）は、留保装置、すなわち、ヒトに移植された装置、例えば、カテーテルまたはハートデフィブリレータ中３０−５０％の感染を生ずることが公知である。Ｅ　ｃｏｌｉ菌株は、尿路感染に苦しむ患者に見られる。いずれかの理論と結びつける意思はないが、細菌吸着（または感染）は、（宿主によって発現され、病原体によって分泌される）蛋白質の装置表面への吸着によって生ずる。細菌は、この表面に付着し成育することができる。細菌を覆う炭水化物ゲル層の形成は、それらを免疫系からかくすことが多い。あらゆる場合において、表面上の蛋白質層の存在は、細菌の付着を促進する（かまたは要求する）ようである。したがって、蛋白質の吸着に耐える表面は、細菌の付着に耐える表面として強い候補となりうる。
【００３５】
いずれかの理論と結びつける意思はないが、哺乳動物の細胞は、概して、表面上に吸着された蛋白質層に結合する。また、哺乳動物の細胞は、“リモデリング”として公知のプロセスにおいて、蛋白質の吸着を促進する表面上にそれらの固有のマトリックスを分泌することができる。
【００３６】
１つの実施態様において、末端または暴露基として、水素結合受容体基を含む。水素結合受容体基は、水素結合供与体からのプロトンと相互作用するために利用可能な一対の電子対を有する原子を含む。水素結合受容体基としては、酸素、窒素、リンおよび硫黄のような原子が挙げられる。１つの実施態様において、水素結合受容体基は、“Ｅ”基であるが、水素結合受容体は、また、末端基のＸまたはＹ基内に位置させることもできる。
【００３７】
１つの実施態様において、末端基は、全体として中性の電荷を有する。全体として中性の電荷は、帯電した原子または基を欠く末端基によって生ずる。あるいは、１つの原子または基が帯電されていてもよいが、末端基は、また、末端基を中性とするために等しくて反対の電荷を有する帯電種を含む。この配列の例は、例えば、アミノ酸におけるような双生イオンである。全体として中性の電荷を有する末端基は、化学鎖のいずれの位置にも対イオンが共有結合されていない外部対イオンによって中性とされる末端基と識別される。１つの実施態様において、化学鎖全体は、全体として中性の電荷を有する。
【００３８】
もう１つの実施態様において、鎖の末端基は、帯電され、反対の電荷を有する少なくとも１つの隣接末端基によって中性とされる。例えば、ａ＋１の電荷を有する末端基は、ａ−１の電荷を有する隣接末端基によって中性とされうる。あるいは、末端基が高い電荷を有する場合、それは、等しくて反対の電荷を有する１つの末端基によるかまたは中性となるために十分な電荷を有する２つ以上の末端基により中性とされうる。
【００３９】
１つの実施態様において、基質は、その上に架橋を含まない複数の化学鎖を共有結合している。架橋を含まない鎖は、より長い有効な鎖長さを生じ、水分子を配向および配列するためにより移動性を有する鎖を生ずる。この能力は、蛋白質の吸着に耐える能力に影響を及ぼすかもしれない。あるいは、好ましくは、基質表面に近い原子間に小量の架橋が存在してもよいが、この配列は、なお、十分な長さの鎖を生ずる。もう１つの実施態様において、物品は、表面に結合された複数の化学鎖の単分子層を含む。単分子層は、その上に吸着されたその他の化学種を十分に含まない表面に共有結合した複数の化学鎖を含む。１つの実施態様において、単分子層は、自己集合した単分子層である。自己集合した単分子層（ＳＡＭｓ）は、基質表面に選択的に結合する官能基を有する化学鎖を含み、鎖の残りは、単分子層中の隣接鎖と相互作用して秩序だったアレーを形成する。ＳＡＭｓは、銀または金のような金属；および、二酸化ケイ素またはガリウムのようなセラミックスを含む多様な基質上に形成される。ＳＡＭｓを形成するためのその他の材料および方法は、１９９３年１０月４日に出願されたＫｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，による　“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｓｔａｍｐｅｄ　Ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｎ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　Ａｒｉｔｉｃｌｅｓ”と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，５１２，１３１および１９９６年６月２６日に公開されたＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，による“Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ　Ａｒｔｉｃｌｅｓ”と題するＰＣＴ公開パンフレットＮｏ．９６／２９６２９に記載されており、これらの各々は、参考とすることによって本明細書に組込む。
【００４０】
複数の化学鎖は、均質、すなわち、全てが同一の組成であってもよく、２つ以上の異なる組成物を含んでもよい。１つの実施態様において、化学鎖は、第１の化学鎖であり、単分子層は、さらに、第１の化学鎖とは異なる組成を有する第２の化学鎖を含む。第２の化学鎖は、単分子層中に第１および第２の化学鎖合計の約７５％未満の量存在する。異なる組成のこの混合物は、また、“混合ＳＡＭ”と称される。混合ＳＡＭｓは、表面を特定用途のための特注あつらえ可能としうる。例えば、幾つかの混合ＳＡＭｓは、化学鎖の合計の２５％ほどの低さの量存在する時蛋白質吸着に対して耐性を示す。例えば、第１の化学鎖を製造することが特に困難および／または高価である場合、単分子層からの第１の化学鎖の量を最小とすることが有益であるかもしれない。混合ＳＡＭｓは、また、１つの鎖の寸法が嵩高く、単一成分ＳＡＭとして秩序だったアレーを形成しえない時、有益であるかもしれない。あるいは、単分子層中の第１の化学鎖のパーセンテージは、所望される吸着量に依存して微調整することもできる。ある種の用途に対しては、第２の化学鎖は、化学鎖合計の約５０％未満の量存在し、他の用途においては、第２の化学鎖は、化学鎖合計の約２５％未満の量存在する。当然のことながら、３つ以上の異なるＳＡＭタイプも容易に考えられる。
【００４１】
第２の化学鎖は、第１の鎖が蛋白質耐性である限り、物品を蛋白質の吸着に耐性とする特性を有する必要はなく、第１の鎖の特性が物品全体の特性を支配する。例えば、第１の鎖は、蛋白質耐性を欠く第２の鎖をカバーするほど十分な長さまたは嵩高さを有してもよく、例えば、第２の鎖は、もはや、それが第１の鎖によってブロックされた“暴露された”末端基を有しない。１つの実施態様において、第２の化学鎖は、Ｃ１−Ｃ２５アルキルおよびアリール、カルボン酸、チオール、ヒドロキシルおよび第４級アンモニウムイオン等の末端基を有する。もう１つの実施態様において、第２の化学鎖は、物品を蛋白質の吸着に耐えうるようにする特性を有する。この実施態様においては、第２の化学鎖は、第１の化学鎖についての構造と同様の構造を含む末端基を有しうる。
【００４２】
１つの実施態様において、第２の化学鎖は、第１の化学鎖の平均長さよりも短い平均長さを有する。前述した通り、鎖の長さは、基質および末端基に結合された鎖の原子を結合する連続結合連鎖の距離を測定することにより決定される。この配列は、例えば、第２の化学鎖が基質の全表面を覆いおよび／または高密度被覆面積を生ずるのに単分子層中になお存在する蛋白質耐性特性を欠く場合に有益である。第１の化学鎖がより長いほど、末端基の蛋白質耐性を利用するために十分に暴露された末端基を有する。第１の化学鎖が第２の化学鎖よりも十分に長い場合、好ましくは、少なくとも５、１０または１５原子長い場合、第１の鎖は、第２の鎖を有効に遮蔽しうる。
【００４３】
１つの実施態様において、化学鎖は、末端基である。この実施態様は、化学鎖の全ての原子が物品の蛋白質耐性に寄与するより化学鎖を短くするために適用しうる。
【００４４】
基質は、本明細書に列挙したいずれかの組成物に対して共有結合を形成しうるいずれの材料であってもよい。典型的な基質は、金属、合金、セラミックスまたはプラスチックスを含む。興味深い表面としては、シリカ、アルミナ、石英、ガラス等；または、それらの誘導体；あるいは、金、銀および銅のような金属が挙げられる。興味深いプラスチックスとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびポリジメチルシロキサンが挙げられる。蛋白質耐性塗膜は、物品および装置、例えば、留置装置（すなわち、ヒトに移植された装置）、例えば、カテーテル、ハートデフィブリレータ；または、いずれかの人工骨または関節代替物の製造に使用される物品および装置に塗被することができる。これら物品および装置を製造するために使用されるいずれの材料も、また、基質としても機能しうる。
【００４５】
１つの実施態様において、化学鎖は、末端基と、末端基および基質に共有結合したリンカーを含む。リンカーは、もう１つの種に共有結合しうる２つの官能基を有する分子から誘導される。典型的には、２つの官能基は、リンカーのいずれかの端部に位置する。例えば、リンカーは、鎖の１つの端が基質に結合しうる官能基を有し、鎖の他の端は、末端基に結合しうる官能基を有する。リンカーは、単原子、すなわち、酸素または硫黄原子ほど小さくともよいし、ポリマーほど大きくともよい。リンカーは、アミドリンカーのような２つ以上の原子を有する鎖を含む。
【００４６】
リンカーの他の例は、以下の構造：
【００４７】
【化３１】
2004513981.tif 000009
〔式中、ｑは、０より大きい整数である。〕；
【００４８】
【化３２】
2004513981.tif 000010
〔式中、Ｚは、ヘテロ原子を含み、ｒは、０または１に等しい。〕；および、
【００４９】
【化３３】
2004513981.tif 000011
を含む。
【００５０】
Ｚは、２つの単一供給結合を形成しうるヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、ケイ素または硫黄である。
【００５１】
【化３４】
2004513981.tif 000012
は、もう１つの種に対する共有結合を称す。
【００５２】
１つの実施態様において、末端基およびリンカーを含む化学鎖は、構造：
【００５３】
【化３５】
2004513981.tif 000013
を含む。
【００５４】
鎖長さを増大させるために、ｑは、３より大きい整数であってもよい。
１つの実施態様において、基質は、第１の組成物を含み、化学鎖は、第１の組成物と異なる第２の組成物を含む。例えば、化学鎖は、典型的には、分子または高分子種であり、基質は、金属、セラミックおよびポリマーのような材料を含む。金属の例としては、金および銀が挙げられる。セラミックスの例としては、シリカが挙げられる。
【００５５】
１つの実施態様において、末端基は、構造：
【００５６】
【化３６】
2004513981.tif 000014
〔式中、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、エーテル、エーテル誘導体、エステル、ホルミル、カルボキシルまたはＣ（Ｏ）Ｒ３（ここで、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。）でありうる。〕
を含む。この末端基は、Ｙが種々のアミンまたはアミン誘導体を含むピペラジン単位である。
【００５７】
１つの実施態様において、Ｙは、アミドである。Ｙは、構造：
【００５８】
【化３７】
2004513981.tif 000015
〔式中、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。〕
を含むアミドであってもよい。アミドとしてＹを有する末端基のその他の例としては、構造：
【００５９】
【化３８】
2004513981.tif 000016
〔式中、Ｒ２は、末端または結合Ｃ１−Ｃ６アルキルを含み、ｑおよびｒの各々は、０より大きい整数である。〕
を含む末端基が挙げられる。この構造において、カッコ（）により結合されたアミドは、相互に結合されアミドで終わる数種のアミドを含みうる。かくして、末端アミドは、末端Ｃ１−Ｃ６アルキルを含むＲ２を有するものの、内部アミドは、結合Ｃ１−Ｃ６アルキルを含むＲ２を有する。
【００６０】
１つの実施態様において、Ｙは、構造：
【００６１】
【化３９】
2004513981.tif 000017
を含むアミドである。
【００６２】
このタイプのアミドに組込まれる末端基の例としては、構造：
【００６３】
【化４０】
2004513981.tif 000018
〔式中、ｑは、０より大きい整数である。〕；および、
【００６４】
【化４１】
2004513981.tif 000019
〔式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、ｑは、０より大きい整数である。〕
が挙げられる。
【００６５】
末端基としては、アミノ酸またはアミノ酸誘導体が挙げられる。１つの実施態様において、Ｙは、構造：
【００６６】
【化４２】
2004513981.tif 000020
〔式中、カッコ内に囲まれた基は、アミノ酸またはアミノ酸誘導体を表し、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なっていてもよく、かつ、各々、有機基であってもよい。〕
を含む。ｑは、１より大きい整数である。
【００６７】
１つの実施態様において、Ｒ２は、メチルまたはエチル基である。本発明に従えば、いずれのアミノ酸も使用することができる。アミノ酸の１つの例は、グリシンである。アミノ酸は、例えば、Ｎ−末端で官能化することができる。Ｎ−メチルグリシンは、Ｎ−アルキル化された（Ｃ１−Ｃ６）アミノ酸の１つの例である。
【００６８】
１つの実施態様において、Ｙは、アミンである。アミンの例としては、構造：
【００６９】
【化４３】
2004513981.tif 000021
〔式中、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。〕
を含む。
【００７０】
１つの実施態様において、末端基は、環式エーテルである。環式エーテルの例としては：
【００７１】
【化４４】
2004513981.tif 000022
〔式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ｑは、０以上の整数である。〕；および、
【００７２】
【化４５】
2004513981.tif 000023
が挙げられる。
【００７３】
当然のことながら、より大きいかまたはより小さい環式エーテルもまた本発明の範囲内である。
１つの実施態様において、Ｙは、糖誘導体を含む。糖誘導体の例としては、Ｃ１−Ｃ６アルキルで過アルキル化された糖が挙げられる。１つの実施態様において、末端基は、構造：
【００７４】
【化４６】
2004513981.tif 000024
〔式中、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、かつ、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ｑおよびｒは、同一または異なり、かつ、各々、０より大きい整数である。〕
を含む。
【００７５】
１つの実施態様において、Ｙは、多重ニトリル基、すなわち、１個より多いニトリルを含む。１つの実施態様において、Ｙは、構造：
［（ＣＨ２）ｑ−ＣＮ］２
〔式中、ｑは、０より大きい。〕
を含む。もう１つの実施態様において、末端基は、構造：
【００７６】
【化４７】
2004513981.tif 000025
を含む。
【００７７】
本発明の生物学的に耐える基の具体的な例は、表１に列挙する。幾つかの実施態様において、本発明は、前述したように、疎水性表面と比較して蛋白質の単分子層６０％以下、好ましくは、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、さらに好ましくは、蛋白質の単分子層の１０％以下を吸着する表１の生物学的に耐性の基に共有結合された表面を包含する。その他の実施態様において、前述した蛋白質吸着特性を有する表１に列挙した２つ以上の種の選択も本発明に包含される。
【００７８】
本発明のもう１つの態様は、その上に化学鎖を共有結合した基質を含む物品を提供する。単分子層鎖の少なくとも２５％は、水素結合供与体を含まない親水性基で終了している。他の実施態様においては、鎖の少なくとも５０％は、親水性基で終了し、他の実施態様においては、単分子層鎖の少なくとも７５％は、親水性基で終了している。他の実施態様においては、鎖は、全て、親水性基で終了している。親水性基としては、アミド、アミド誘導体、アミン、アミン誘導体、環式エーテル、糖誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体および多重ニトリルが挙げられる。物品は、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える。
【００７９】
単分子層は、前述した特徴のいずれかまたは全てを有してもよい。単分子層は、自己集合した単分子層であってもよい。親水性基としては、水素結合受容体基を挙げることができる。単分子層の各化学鎖は、全体として中性の電荷を有する。あるいは、単分子層の化学鎖が帯電している場合、それは、反対の電荷を有する少なくとも１つの隣接化学鎖により中性とされている。
【００８０】
単分子層としては、親水性基を基質に結合するリンカー基を挙げることができる。１つの実施態様において、リンカー基は、実質的に直鎖の骨格を有する、すなわち、リンカー基は、最小数の側鎖を有する。１つの実施態様において、リンカー骨格は、少なくとも３個の原子を含む。この堅固な骨格は、メチレン基の直鎖、好ましくは、少なくとも３個のメチレン基を含みうる。メチレン基の鎖は、少なくとも１つのヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、リンまたは硫黄により遮断されていてもよい。あるいは、メチレン基の直鎖は、アミド、ケトン、エステルまたはエーテル基により遮断されていてもよい。
【００８１】
本発明は、基質に結合する蛋白質の吸着に耐えるのに有効であるその他の化学基を特徴とする。かくして、本発明のもう１つの態様は、その上に共有結合した化学基を有する基質を含む物品を提供する。これら化学鎖の例としては：
【００８２】
【化４８】
2004513981.tif 000026
〔式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ７は、同一または異なり、各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より選択され；Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一または異なり、各々、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；ｍ、ｎおよびｐは、同一または異なり、各々、０より大きい整数である。〕
が挙げられる。物品は、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える。１つの実施態様において、各Ｒ１−Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、メチル基である。
【００８３】
本発明のもう１つの態様は、基質がその上にポリマー、例えば、ポリアミンを共有結合した蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える物品を提供する。基質表面上のポリマー層は、潜在的に均質な被覆面積を提供し、下地となる基質中に存在するかもしれないいずれかのピンホール不均質性を覆い隠す。ポリマーは、また、バイメディカル装置として使用される材料について強固な表面をも提供する。ポリマー組成物に依存して、ポリマー層は、蛋白質吸着耐性に寄与する物理的な特性であるゲル−様の特性を有してもよい。理想的には、ポリマーは、不活性な表面を生ずる種々の異なる基で官能化することができる。最後に、ポリマーは、表面を蛋白質の吸着に耐えるように官能化することのできる高密度の基を生ずることができる。
【００８４】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、蛋白質の吸着を少なくするために、バイオメディカル用途、特に、バイオメディカル装置用の材料中の成分として広く使用されている。しかし、ＰＥＧは、Ｏ２と遷移金属とに暴露される時、自動酸化する傾向を有する。インビボにおいて、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、アルコール脱水素酵素によりアルデヒドへと酸化され；アルデヒド基は、アルデヒド脱水素酵素によりさらに酸化される。
【００８５】
ポリアミン、例えば、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）は、蛋白質の吸着に耐えることが公知であるが、本発明のこの態様は、ポリアミンを基質に共有結合するための強固な結合を特徴とする。１つの実施態様において、結合は、構造：
【００８６】
【化４９】
2004513981.tif 000027
〔式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルおよびアリールからなる群より選択され、ｎは、０または１に等しい整数である。〕
を含み、その物品は、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える。ポリアミンは、窒素を介して結合させ、アミド結合を形成させることができる。１つの実施態様において、結合は、構造：
【００８７】
【化５０】
2004513981.tif 000028
〔式中、ｐは、１より大きい整数であり、Ｚは、炭素原子またはヘテロ原子を含み、ｒは、０または１に等しい。〕
を含む。１つの実施態様において、ｑは、１０未満である。Ｚは、ヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、リンまたは硫黄であってもよい。
【００８８】
ポリアミンは、蛋白質耐性を妨害しうる水素結合供与体基を有してもよい。１つの実施態様において、ポリアミンは、水素結合供与体基を含まないように誘導される。１つの実施態様において、誘導は、ポリアミンのアシル化を含む。アシル化は、蛋白質耐性を移動させることが公知な種々の官能基によりポリアミンを誘導し、かくして、アシル化剤は、これら官能基を高分子表面に移動させるための便利な方法である。蛋白質耐性官能基を生ずるこの方法は、ポリアミンが多数かつ高密度のアシル化部位を含有するので特に有益であり、かくして、アシル化は、蛋白質の吸着に耐える表面を生ずるための高密度の官能基を生ずる。
【００８９】
また、暴露されたアミノ基が他の求電子基、例えば、カルボン酸無水物基と効率よく反応することができる優れた求核基である点で、ポリアミンは、特に有益である。この反応性は、ポリアミンを表面上に結合するための機構を提供しうる（図１および以下添付の考察参照）。
【００９０】
ある種の従来技術材料は、蛋白質耐性表面として架橋されたポリマーを提供する。しかし、多くの架橋基は、疎水性であり、この疎水性は、物品の蛋白質吸着に耐える能力を低下させかねない。１つの実施態様において、本発明のポリアミンは、架橋を含まない。架橋は、ポリマーの安定性を改善することが公知である。本発明は、広く架橋を必要としない安定な共有結合を提供する。
【００９１】
“ポリアミン”は、少なくとも２つの繰返し単位を有するいずれかの分子を称し、ここで、各繰返し単位は、アミノ基を含む。好ましくは、ポリアミンは、少なくとも４つの繰返し単位を有し、さらに好ましくは、少なくとも６つの繰返し単位を有し、なおさらに好ましくは、少なくとも８つの繰返し単位を有し、さらになお好ましくは、少なくとも１０の繰り返し単位を有する。
【００９２】
ポリアミンの例としては、直鎖ポリ（エチレンイミン）（ＬＰＥＩ）、分岐したポリ（エチレンイミン）（ＢＰＥＩ）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）（ＰＭＶＡ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）およびポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＹＳ）が挙げられる。図４参照。
【００９３】
ＬＰＥＩ、ＰＭＶＡ、ＰＡＡおよびＰＬＹＳは、分岐または架橋を含まない直鎖ポリマーである。ＢＰＥＩは、高度に架橋されたポリマーである。例えば、ＢＰＥＩは、１；２；１比の第１級：第２級：第３級アミノ基を含みうる。ＢＰＥＩは、ＬＰＥＩよりも著しく多い第１級アミノ基を有してもよく、アシル化の際に、これらアミノ基は、水素結合供与体基（ＨＮＣＯＲ）を保持する。いずれかの理論と結びつける意思はないが、ＢＰＥＩの高度に架橋された膜は、蛋白質の吸着を防止するための立体的な反発を生ずることができ、このような立体的な反発は、ＢＰＥＩ膜中の水素結合供与体基の大多数の吸着エネルギーに対するいずれかの好ましくない寄与を相殺するかもしれない。
【００９４】
本発明のこの態様は、また、ポリアミンを基質に安定または共有結合ふうに結合するためのその他のリンカーもまた提供する。このようなリンカーは、本来のポリマーの一部ではなく、例えば、エステル、エーテル、アミン、アミド、尿素、カーボネートおよびイミンが挙げられる。ポリアミンは、前述したポリアミンのいずれかであってもよい。
【００９５】
基質表面は、同一組成を有するポリアミンの均質な分布を含んでもよい。ポリアミンのその他ポリアミンまたは化学種との混合物をも考えに入れてもよい。１つの実施態様において、ポリアミンは、第１の化学鎖を含み、基質は、さらに、その上に第２の化学鎖を化学鎖合計の７５％未満の量共有結合している。第２の化学鎖は、先に列挙したポリアミンを含んでもよい。あるいは、第２の化学鎖は、前述したように、末端基を有するいずれかの化学鎖を含んでもよい。１つの実施態様において、第２の化学鎖は、化学鎖合計の５０％未満の量存在してもよい。他の実施態様において、第２の化学鎖は、化学鎖合計の２５％未満の量存在してもよい。
【００９６】
本発明のもう１つの態様は、アミンと繰返し単位とを含む実質的に直鎖のポリマーに共有結合された基質を含む物品を提供する。この物品は、蛋白質、細胞または細菌の吸着に耐える。実質的に直鎖のポリマーは、長鎖連鎖を含み、好ましくは、直鎖ポリマーは、架橋を含まない。直鎖ポリマーの例としては、直鎖ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ−メチル−ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）およびポリ（Ｌ−リシン）が挙げられる。
【００９７】
化学鎖、末端基またはポリマーは、多数の方法により基質に共有結合することができる。１つの例は、概略的に図１に示す。図１Ａは、カルボン酸で終了する長鎖アルカンチオレートに共有結合された金表面を示し、このような表面を提供する方法は、当分野において十分に公知である。隣接カルボン酸は、相互に反応させて、無水物を形成してもよい。図１Ｂは、アミドで終了する化学鎖を提供するための方法を示す。図１Ｂにおいて、無水物の第１級アミンとの反応は、第２級アミドで終了するアルカンチオレート鎖を生ずる。かくして、アルカンチオレートは、リンカー基として役割を果たす。当然のことながら、他の反応は、本発明の他の末端基を付加するために図１に示した反応以外で実施することができる。
【００９８】
本発明のもう１つの態様は、ポリアミンがオリゴマー、例えば、オリゴ（エチレングリコール）により終了するポリアミンをその上に共有結合した表面を提供する。これらオリゴマーは、１０以下のエチレングリコール、好ましくは、８以下、さらに好ましくは、６以下、さらに好ましくは、４以下、なおさらに好ましくは、２つのエチレングリコール基の鎖を有してもよい。
【００９９】
図１Ｃは、ポリマーを金基質表面に共有結合するための方法の例を示す。図１Ｃは、直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）の無水物との直接反応を示す。アシル化の後、ＬＰＥＩは、水素結合供与体を含まず、蛋白質耐性の表面；または、アシル化剤の溶液に暴露されたＬＰＥＩの少なくとも一部を生ずる。
【０１００】
図２は、ポリアミンで生じうる多数の反応を示す。図２の式１−８および１０において、ポリアミンは、ＨＮ（Ｒ’）（Ｒ’’）として概略的に示されている。式１−１０のＲ’は、基質表面を表しうる。Ｒ’’は、もう１つの化学基またはポリマーの残りを表してもよい。図２の反応１は、オリゴ（エチレングリコール）ｎ（ｎ＝１０以下）をポリアミンのアミン基に結合するための方法を示す。式２、３および５は、アシル基をポリアミンに付加するためのその他の方法を示し、ここで、アシル基は、種々の“Ｒ”官能性を有する。式４および６−１０は、蛋白質耐性を強化することのできる種々のその他の化学基でポリアミンを誘導するための方法を示す。逆に、図２の“Ｒ”は、基質表面であってもよく、式２−８は、ポリアミンを基質表面に結合するための方法を示す。式１０において、Ｒ’’’は、基質表面を表すことができる。
【０１０１】
本発明のもう１つの態様は、生体分子に生物特異的に結合しうる表面を提供する。ある種の従来技術表面は、生体分子に特異的なリガンドの共有結合を含む。しかし、リガンドは、典型的には、表面の不連続な領域においてのみ存在するものの、表面のその他の領域は暴露されたままである。かくして、これら従来技術の表面は、これら暴露された領域が所望される生体分子と結合することができ、その他いずれかの生体分子の非特異的な結合を防止しない点で欠点を有する。
【０１０２】
本発明は、それが共有結合を介して生体分子を特異的に結合しうる基により誘導される不連続な領域を生ずることにより不活性な表面を提供して所望されない非特異的な結合を防止する点である種の従来技術表面に優り特に有益である。本発明のこの態様は、その上に結合されたポリマーを有する基質を含む物品を提供して、基質上にポリマー表面を生ずる。ポリマーの表面は、今度は、生体分子の吸着に耐える第１の領域を含む。ポリマー表面の第２の領域は、概して、第１の領域と隣接して、生体分子またはいずれかのアナライトに対して特異的なリガンドで誘導されうる基で終了する少なくとも１つの化学鎖を含む。生ずる物品は、生体分子と生物特異的に結合しえ、いずれの生体分子の非特異的な結合をも防止する。かくして、生体分子の本発明表面へのアプローチに際し、生体分子が第１の領域と接触する場合、それは、吸着されないであろう。生体分子が第２の領域のリガンド部位と接触する場合、それは、生物特異的にそれに結合するであろう。結合された生体分子は、また、溶液から第２の生体分子をさらに結合させるためにも使用することができ；この例としては、第１の抗体の表面への生物特異的な結合、続く、第１の抗体を介しての第２の抗体の生物特異的結合が挙げられる。
【０１０３】
生体分子は、サイズにおいて、ベンゼンスルホンアミド基のような小さな分子から蛋白質のような大きな分子までを範囲とすることができる。生体分子のその他の例としては、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ヌクレオシド、炭水化物、ペプチドが挙げられる。細胞および細菌もまたこのような表面に対して生物特異的に結合することができる。
【０１０４】
第１の領域は、ポリマーそれ自体を含んでもよく、ここで、ポリマーは、蛋白質、細胞および細菌の吸着に耐える。ポリマーは、本明細書に記載するようにいずれのポリマーであってもよい。１つの実施態様において、ポリマー表面は、その上に結合された複数の化学鎖を有してもよく、または、その上に結合されたもう１つのポリマーであってもよく、ここで、化学鎖またはポリマーは、蛋白質、細胞および細菌の吸着に耐える。化学鎖は、前述したようないずれかの末端基または鎖長さ１０以下のエチレングリコール基、好ましくは、８以下、６以下、４以下、および、なおさらに好ましくは、２つのエチレングリコールを有するオリゴ（エチレングリコール）であってもよい。また、化学鎖は、本明細書に記載するような上記列挙した鎖長さを有する２つ以上の末端基またはオリゴ（エチレングリコール）のいずれの混合物を含んでもよい。
【０１０５】
“リガンドで誘導しうる基で終了する化学鎖”は、反応性末端基を有するいずれかの鎖を称する。反応性末端基は、リガンド前駆体と反応を受けてリガンドで終了する鎖を提供することができる。第２の領域は、統計学的に少なくとも１つの化学鎖を含むことができ、第２の領域は、共有結合されたリガンドの低密度を維持するための単鎖を含むであろう。
【０１０６】
図１５は、生物特異的に結合しうる本発明の物品の概略例を示す。図１５は、その上に結合されたポリマー１０４を有する基質表面１０２を含む物品１００を示す。第１の領域１０６は、ポリマー１０４に供給結合した複数の化学鎖１０７を含む。第１の領域１０６は、生体分子の吸着に耐える。第２の領域１０８は、アナライト１１２に共有結合しうるリガンド１１０で終了する少なくとも１つの化学鎖１０９を含む。アナライト１１２は、生体分子；または、生体分子に結合しうるいずれの化学種であってもよい。アナライト１１２は、同様に、生体分子１１４に生物特異的に結合しうる。あるいは、リガンド１１０それ自体が、生体分子１１６のような生体分子を結合しうる。例えば、リガンド１１０は、特定の抗体に対して特異的である蛋白質を結合しうる化学種含むことができる。その他の例としては、ビオチンを結合するための高い親和性を有するアビジンの共有結合固定化またはその逆が挙げられる。
【０１０７】
本発明のこれらおよびその他の実施態様の機能および有益性は、以下の実施例からさらに十分に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明の長所を示すことを意図するが、本発明の完全な範囲を例として示すものではない。
【０１０８】
実施例　１：　蛋白質の吸着に耐えるＳＡＭｓ
材料　使用した薬品は、特に断わらない限り、全て、試薬等級であった。フィブリノーゲン（ウシ血漿より、Ｆ８６３０）、リゾチーム（卵白、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７，Ｌ６８７６）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびリン酸緩衝サリンパケットは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。無水Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、１６−メルカプトヘキサデカン酸、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−ジアミノエタン（ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）Ｈ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチル−１，２−ジアミノエタン（ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２）、ＣＨ３（ＣＨ２）１１ＮＨ２、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ソルビトール、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、水素化ナトリウム、ヨウ化メチル、テトラメチルホスホロジアミドクロライド（（ＣＨ３）２Ｎ）２Ｐ（Ｏ）Ｃｌおよびヒドラジンは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。Ｈ２ＮＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ３）２、（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＯＮＨ２）およびＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ３）２は、ＢＡＣＨＥＭ（Ｂｕｒｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。トリ（エチレングリコール）モノアミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ）は、Ｔｅｘａｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから贈られ、これは、Ｈｕｎｔｓｍａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（３０４０　Ｐｏｓｔ　Ｏａｋ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ　７７０５６（７１３−２３５−６０００）より以前に購買されたものであった。無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、無水酢酸およびエチレングリコールは、ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。絶対エタノールは、Ｐｈａｒｍｃｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，ＣＴ）から購入し、ｔ−ブチルＮ−メチルＮ−〔２−（メチルアミノ）エチル〕カーボネート（ＨＮ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣ（ＣＨ３）３）（Ｓａａｉ，Ｗ．Ｓ．；Ｓｃｈｗｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｅ；Ｌｙｌｅ　Ｐ．Ａ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｊ．；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｅ．Ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９０，３３，９７−１０１）およびＮ−カルボメトキシ−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，２−ジアミノエタン（ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯ２ＣＨ３（Ｃｒａｖｅｙ，Ｍ．Ｊ．；Ｋｏｈｎ，Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８０，１０２，３９２８−３９３９）は、前述のようにして合成した。リン酸塩緩衝サリン（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸塩、１３８ｍＭ　ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ　ＫＣｌ）は、蒸留、脱イオン水で新たに調製し、使用前に、０．２２μＭのフィルターを通して濾過した。
【０１０９】
鎖間無水カルボン酸を生ずる反応性ＳＡＭの製造　５０×１８ｍｍ２のガラスカバースリップ上に１．５ｎｍのＴｉ、続いて、３８ｎｍのＡｕをｅ−ビーム蒸着することにより、ＳＰＲ分光分析用の金基板を製造した。金基板をエタノール／水／酢酸中のＨＳ（ＣＨ２）１５ＣＯ２Ｈの２ｍＭ溶液中で一晩インキュベートし、エタノールで濯ぎ、窒素流下で乾燥させた。ついで、清浄な基板を新たに調製した０．１Ｍ無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）および０．２Ｍのトリエチルアミンの無水ＤＭＦ溶液中にいれ、室温で２０分間攪拌しなかった。基板をＴＦＡＡ溶液から取出し、ＣＨ２Ｃｌ２で完全に濯ぎ、窒素流中で乾燥させた。生ずる基質（鎖間無水カルボン酸基）は、適当なアミンのＮＭＰ１０ｍＭ溶液に浸漬することにより、直ちに使用した。トリエチルアミン（ＮＭＰ中２０ｍＭ）を塩として購入したアミノ化合物に添加した。１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ソルビトールは、ＮＭＰに溶解性ではなく；この反応は、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ１０、１０ｍＭの１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ソルビトール中で行った（表１参照）。基板をアミン溶液から取出し、エタノールで濯ぎ、窒素流下で乾燥させた。
【０１１０】
表面プラスモン共鳴分光分析（ＳＰＲ）　ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ　１０００機器（Ｂｉｏｃｏｒｅ）で行った。分析するＳＡＭを含有する基板を、前述したように、ＳＰＲカートリッジに取りつけた（Ｓｉｇａｌ，Ｇ．Ｂ．；Ｂａｍｄａｄ，Ｃ．；Ｂａｒｂｅｒｉｓ，Ａ；Ｓｔｍｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．４９０−４９７，１９９６；ａｎｄ　Ｓｉｇａｌ，Ｇ．Ｂ．；Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ　Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２７４９−２７５５，１９９７）。蛋白質のＳＡＭｓへの吸着を測定する我々のＳＰＲプロトコルは：（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウムの溶液（４０ｍＭ／ＰＢＳ）をＳＡＭ表面上に３分間流し、続いて、ＰＢＳ緩衝液でその表面を１０分間濯ぎ；（ｉｉ）ＰＢＳ緩衝液を２分間流し、ついで、その流を蛋白質溶液（１ｍｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）で３０分間置換し、最後に、ＰＢＳ緩衝液をさらに１０分間注入することからなった（例えば、図３）。実験に使用した流速は、全て、１０μＬ／分であった。
【０１１１】
％ＭＬは、式１に従い定義した。容易に検出することのできる％ＭＬの最小値は、０．２％であり；この数値は、ほぼ１０ＲＵに対応する。同一試料；または、異なる日に同一プロトコルに従うことにより製造した試料上の種々の点で測定される吸着された蛋白質の量は、約５％変動した（相対誤差）。
【０１１２】
合成
（２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキシル）カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（（ＣＨ３）３ＣＯＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２（ＣＨ（ＯＨ）４ＣＨ２ＯＨ）　１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−ソルビトール（２．８０ｇ，１５．４ｍｍｏｌ）をジ−ｔ−ブチルジカーボネート（３．４０ｇ，１５．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液に加え、生ずる混合物を０℃で３時間攪拌し、続いて、周囲温度で１６時間攪拌した。生ずる溶液を減圧で濃縮すると、（ＣＨ３）３ＣＯＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２（ＣＨ（ＯＨ）４ＣＨ２ＯＨを無色のオイルとして与えた（４．５０ｇ，９９％）。この化合物は、さらに精製することなく使用した。
【０１１３】
本実施例において、当該（Ｒ’）の官能基を含有するアミン（ＨＮＲＲ’）をＳＡＭと反応させると、その表面上に鎖間無水カルボン酸基を生ずる（図１参照）。この反応は、−ＣＯＮＲＲ’およびＣＯ２Ｈ／ＣＯ２−基の〜１：１混合物を含む“混合（された）”ＳＡＭを生ずる。混合ＳＡＭｓのこの類は、（単成分ＳＡＭｓの製造に通常使用される官能化されたアルカンチオールＨＳ（ＣＨ２）ｎＲ’の合成と比較して）無水物法により容易に製造することができることから、このルートは、スクリーニング研究用に有効である。
【０１１４】
２つの蛋白質のこれら表面への吸着をここで報告する：疎水性表面に強く吸着する大きい（３４０ｋＤ）血液血漿蛋白質フィブリノーゲン；および、我々の実験（リン酸塩緩衝サリン，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）の条件下で正に帯電する小さな蛋白質リゾチーム。フィブリノーゲンおよびリゾチームの混合ＳＡＭｓ上への吸着は、これら２つの蛋白質の特性（サイズおよびｐＩ）が非常に異なるので試験した。フィブリノーゲンは、疎水性および帯電した表面に容易に吸着する大きな（４量体凝集体について、ＭＷ＝３４０ｋＤａ，ｐＩ＝５．５）蛋白質である。フィブリノーゲンは、哺乳動物細胞の付着を促進するために表面を途被するために使用されることの多い細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチンに構造的に類似している。したがって、フィブリノーゲンに不活性なＳＡＭｓは、また、哺乳動物細胞の表面のある部分に対する吸着を防止するために必要とされる細胞パターンづけに対する用途において有用である。リゾチームは、静電的な吸着の研究モデルとして使用されることの多い小さな（ＭＷ＝１５ｋＤａ，ｐＩ＝１０．９）蛋白質であり、本実験の条件（リン酸塩緩衝液サリン，ＰＢＳ，ｐＨ７．４）下で正に帯電している。ここで記載するリゾチームの混合ＳＡＭｓへの吸着は、アミンと無水物基との反応より形成されるＣＯ２Ｈ／ＣＯ２基溶液への暴露に少なくとも一部依存し；正に帯電した蛋白質は、暴露されたＣＯ２基を有する表面に静電的に吸引されるであろう。フィブリノーゲンは、“粘着な”血清蛋白質に対するモデルとして使用され；リゾチームは、蛋白質の表面への静電的な吸着モデルの研究において使用されることが多い。リゾチームは、実質的に全体が正の電荷を有するので（ｐＨ７．４において、Ｚｐ＝＋７．５，１００ｍＭ　ＫＣｌ）、表面上のＣＯ２−基との吸引静電相互作用実験が可能である。結果は、表１に示す。
【０１１５】
この研究において使用する官能基は、実質的に、蛋白質を吸着するそれらの傾向の範囲内で混合ＳＡＭｓを生ずる。オリゴ（エチレングリコール）ｎ（ｎ＝３−６）基を生ずるＳＡＭｓが現在使用可能な最も蛋白質に耐える表面である。しかし、これら鎖は、自動酸化を受けやすい。しかし、蛋白質耐性の観点から、オリゴ（エチレングリコール）ｎ基は、新しい蛋白質耐性の表面を判定するための基準を表す。蛋白質と混合ＳＡＭｓとの吸着は、トリ（エチレングリコール）基（−ＣＯＨＮ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ）と−ＣＯ２Ｈ／ＣＯ２−基との１：１混合物を生ずる混合ＳＡＭの吸着に匹敵する（表１参照）。
【０１１６】
この比較に基いて、混合ＳＡＭｓ上に−ＣＯ２Ｈ／ＣＯ２−基〜１：１を生ずる時に、数種の末端基が蛋白質の吸着に有用な耐性を示すことが同定された。表１および図３は、混合ＳＡＭｓのスクリーニングの結果を示す。図３は、見出しをつけたようにフィブリノーゲンのある種の混合ＳＡＭｓへの吸着および脱着についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。“ＰＢＳ”は、緩衝液である。ΔＲＵは、蛋白質注入の完了後１０分に測定したＲＵの値から蛋白質の注入前に測定したＲＵの値を差引くことにより決定した（式１および付随する考察）。本発明の化学鎖は、疎水性鎖と比較して低いΔＲＵを生ずる。
【０１１７】
【表１】
2004513981.tif 000029
【０１１８】
【表２】
2004513981.tif 000030
【０１１９】
【表３】
2004513981.tif 000031
【０１２０】
【表４】
2004513981.tif 000032
【０１２１】
【表５】
2004513981.tif 000033
【０１２２】
【表６】
2004513981.tif 000034
脚注：ａ　％ＭＬｆｉｂは、−ＣＯＮＨＲ／−ＣＯ２Ｈ基を生ずる混合ＳＡＭに吸着したフィブリノーゲン単分子層のパーセントである。この実験において、我々は、蛋白質の単分子層がフィブリノーゲンの１ｍｇ／ｍＬ溶液を表面上に１０μＬ／秒で３分間流した後に−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３／−ＣＯ２Ｈ基を生ずる混合ＳＡＭに吸着すると仮定する。％ＭＬ　Ｌｙｓは、蛋白質としてリゾチームを使用する等価な測定値である。
ｂ　蛋白質溶液を表面に３０分間流した以外は、上記におけると同様。
ｃ　ｄＲ／ｄｔｏｎ（Ｒｕ／秒）は、蛋白質の表面との会合の開始時に測定した蛋白質吸着の最大速度を表し；我々は、時間に関して（５秒間隔）ＳＰＲシグナルの第１の誘導体として吸着の最大初期速度を達成した。速度は、表面上の蛋白質の被覆面積の増加とともに減少した。
ｄ　％Ｆｉｂｏｆｆは、蛋白質の注入後に生ずる表面の１０分間のＰＢＳ洗浄の間の吸着された蛋白質の量が低下するパーセントである。それは、不可逆的に吸着される蛋白質の量に比例する。％Ｌｙｓｏｆｆは、蛋白質としてリゾチームを使用する等価な測定値である。
ｅ　ＣｌｏｇＰは、コンピュータプログラムＭａｃＬｏｇＰで計算されるオクタノール／水分配係数である。実験部参照。
ｆ　θＣＯは、シクロオクタン下、脱イオン水の接触角度数である。
【０１２３】
これらの末端基は、とりわけ、それらが水素結合供与基を含有しない点で、数種の分子特性を共有する。その他の特性としては：ｉ）それらが極性官能基を含有する；ｉｉ）それらが水素結合受容基を組込む；および、ｉｉｉ）それらが全体として中性の電荷を有することが挙げられる。
【０１２４】
水素結合供与体の脱離が蛋白質の吸着に耐える表面における鍵となる構造ヨウ素のようである。ＮＨおよびＯＨ基とそれらのさらに極性の類縁体を生ずる表面に対してよりもＮＣＨ３およびＯＣＨ３基と化合物を生ずる表面により少量の蛋白質が吸着した（表２）。Ｏ−ＣＨ３−末端およびＯＨ−末端オリゴ（エチレングリコール）基を生ずるＳＡＭｓは、２つの試験蛋白質の識別できない量を吸着するが、しかし、その量は比較するためには少なすぎる。−ＣＯＮＲＲ’とＣＯ２Ｈ／ＣＯ２−基の１：１混合物を含む混合ＳＡＭｓは、蛋白質の吸着に耐えるそれらの能力について官能基をスクリーンする実用的な分析系を提供すると結論づけられる。また、混合ＳＡＭ表面は、それら自体において、蛋白質耐性表面に対しより安価な変種を提供することができる。
【０１２５】
【表７】
2004513981.tif 000035
脚注：ａ　これら用語は、式１により定義する。
ｂ　参照１５
かくして、表１は、オリゴ（エチレングリコール）に対して数種の有用な変種を同定する：一方では、−−ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ３）２−−は、商業的に入手可能であり、他方、−−ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２−（ＣＨ（ＯＣＨ３）４ＣＨ２ＯＣＨ３、ＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＰＯ（Ｎ（ＣＨ３）２）２）およびＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＨ３は、直接合成される。
【０１２６】
実施例　２：　細胞、細菌および哺乳動物細胞の吸着に耐えるＳＡＭｓ
本実施例は、溶液からの蛋白質の吸着；および、スタフィロコッカス　エピダーミシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）およびウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞の付着に絶える単一成分ＳＡＭｓを説明する。これら表面は、構造的に多様な官能基を生じ、表面と蛋白質の吸着と細胞の付着に絶えるそれらの能力との間の構造特性相関を形成可能とする。本実施例における化学鎖の構造は、図４に示す。蛋白質の吸着に対する耐性をスクリーンし、実施例１に記載したようにしてＳＰＲにより試験した。結果を表３および図５のＳＰＲセンサーグラムに示す。
【０１２７】
【表８】
2004513981.tif 000036
【０１２８】
【表９】
2004513981.tif 000037
脚注ｉ　使用した記号は、表１に定義した。
【０１２９】
細菌の付着　我々の均質なＳＡＭｓに結合する生存可能なコロニーの数は、基質の表面から音波処理によりそれらを取出し、それらを培地中で一定時間成育させ、それらの光学密度を測定することによりそれらの数を数えることによって測定される。
【０１３０】
オリゴ（Ｎ−メチルグリシン）およびアセチルピペラジン誘導体を生ずるＳＡＭｓは、ＥＧ３ＯＣＨ３基を生ずるＳＡＭｓより多い細菌の菌株の付着に耐えた（図６）。各基質表面に結合される細菌の平均数を表す量は、Ｙ軸にプロットする。誤差のバーは、３回行った実験の標準偏差である。実験は、２つの別個の日に繰返したが、同様の結果が得られた。図６は、１組の結果のみのプロットを示す。ホスホルアミド誘導体、例えば、ＨＭＰＡ；過メチル化されたソルビトール；および、分子内双生イオン（−ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）を生ずるＳＡＭｓがＥＧ３ＯＣＨ３を生ずるＳＡＭｓに匹敵しうるような細菌の付着に耐えた。ホスホリルコリン（ＰＣ）の誘導体を生ずるＳＡＭｓは、細菌の付着に耐えられず；ＰＣ表面上で測定される結合細菌の数は、裸の金の表面上で測定される数と同等であった。この結果は、蛋白質吸着の量と結合された細菌の数との間の相関と明らかに一致し、それは、また、これら細菌の膜が多くのホスホリルコリン誘導体を生ずるという事実によって説明することができる。
【０１３１】
哺乳動物細胞の結合　試験表面は、ホスホリルコリンの誘導体を生ずるＳＡＭｓに対する以外、トリ（エチレングリコール）基を生ずるＳＡＭｓに匹敵しうるように細胞の付着に耐えた（図７）。図７は、表面のｍｍ２当たりに付着するＢＣＥ細胞の数を示す。試料の少なくとも１０の別個の領域（各１．２６ｍｍ２）に付着した細胞の数を測定した。２つの別個の日について同様の結果が得られたが；１組のデータのみを図７に示す。これらの結果は、ＰＣで形成された表面について測定される高レベルの蛋白質吸着と一致する。
【０１３２】
蛋白質に耐えるＳＡＭｓに付着する数個の細胞は、概して、ヘキサデカンチオレート（ＨＤＴ）の単一成分ＳＡＭｓに付着する細胞ほど広がらなかった。
蛋白質吸着と細胞付着との間の相関　概して、表面に結合する細胞の数は、表面に吸着する蛋白質の量と十分に相関する。しかし、その相関は、直線的ではない。ＥＧ３ＯＨおよびＥＧ３ＯＣＨ３基を生ずる表面は、利用可能な最も大きい蛋白質に耐える表面であるが、それらは、細胞の付着に最も耐えるわけではない。図８は、付着したＢＣＥ細胞数対表面に付着する蛋白質の量（フィブリノーゲンの％単分子層）のプロットを示す。フィブリノーゲンのパーセンテージをわかりやすくするために対数尺度でプロットする。オリゴ（Ｎ−メチルグリシン）基を生ずるＳＡＭに付着した細菌の数は、ＥＧ３ＯＣＨ３基を生ずるＳＡＭよりも１桁小さいオーダーであった（図６）。本質的に、ＢＣＥ細胞は、トリ（エチレングリコール）、トリ（Ｎ−メチルグリシン）および（−ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−）基（図７）を生ずるＳＡＭｓに結合しないが；しかし、これら表面に吸着した蛋白質の量は、同等ではない。これら表面の特異的な構造の特徴は、蛋白質の吸着に耐えることとともに、細胞付着の防止を補助しうることである。
【０１３３】
実施例　３：　細胞、細菌および哺乳動物細胞の吸着に耐える高分子薄膜
本実施例は、自己集合した単分子層（ＳＡＭｓ）の表面上に共有結合によりグラフトされ、かつ、蛋白質の吸着および細菌の付着に耐える高分子薄膜のデザインおよび合成を説明する。これら表面塗膜は、３工程のプロセスを使用して製造される（図１）。図１Ａ：メルカプトヘキサデカン酸の単一成分ＳＡＭを活性化させて、反応性鎖間無水カルボン基を表面上に生じさせた。図１Ｂ：この表面を高分子アミンと反応させて、共有結合グラフトされたポリマー薄層中に多数のアミノ基を生ずる第２の表面を生じさせた。図１Ｃ：固定化されたポリマー上の遊離アミノ基をアシル化させて、蛋白質の吸着に耐える官能基を導入した。蛋白質の吸着に最もよく耐える表面塗膜に付着した細菌の数は、市販入手可能な医用等級のポリ（ウレタン）上およびいわゆる“裸の”金上で測定されるよりも１桁低いオーダーであった。
【０１３４】
鎖間無水カルボン酸基を生ずるＳＡＭ上に数種のタイプの高分子アミンをグラフトさせた（図９）。これらグラフトされた高分子アミンは、高密度のアミノ基を生じ；これらの基は、不活性な表面に会合された官能基でアシル化することができた。グラフトされた薄膜がＳＡＭ／金の表面にて不均質性をカバーするものと考えられる。その上にポリアミン塗膜をグラフトさせる基質としての金についてのＳＡＭの使用は、その系をＳＰＲによる蛋白質吸着の分析に適合可能とする。これら表面は、フィブリノーゲンおよびリゾチームの＜１％の単分子層を吸着し、細菌の付着を対照表面と比較して３桁のオーダー低くする。
【０１３５】
−ＮＨ２および−ＮＨＣＨ３基を生ずるポリアミンは、水素結合供与体基（例えば、ＬＰＥＩ、ＰＭＶＡ、ＰＡＡおよびＰＬＹＳ，図９）の重要性を評価するために使用した。ポリマー塗膜中の架橋の重要性は、ＢＰＥＩ対ＬＰＥＩを比較することにより認められた。
【０１３６】
材料　使用した薬品は、特に断わらない限り、全て、試薬等級であった。フィブリノーゲン（ウシ血漿から，Ｆ８６３０）、リゾチーム（卵白，Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７，Ｌ６８７６）およびドデシル硫酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。無水トルエン、無水Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、１６−メルカプトデカン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）、アセチルクロライド、メトキシアセチルクロライド、ラウリルクロライド、ヘプタフルオロブチリルクロライド、ジグリコール酸クロライド、ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（Ｍｗ＝３５０）、テトラブチルアンモニウムブロマイド、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸、２−〔２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ〕酢酸、４−ジメチルアミノピリジン、直鎖ポリ（エチレンイミン）（ＬＰＥＩ，ペンタエチレンヘキサミンＭｗ＝２３２）、ＬＰＥＩ（Ｍｗ〜４２３）、ポリ（２−エチル−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ，Ｍｗ〜５００，０００およびＭｗ〜２００，０００）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ，Ｍｗ〜７０，０００）およびポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＹＳ，Ｍｗ〜２５，０００）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。ポリ（Ｎ−メチルビニルアミン）（ＰＮＶＡ，Ｍｗ〜２５，０００）およびＬＰＥＩ（Ｍｗ〜２５，０００）は、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎｎ，ＰＡ）から購入した。無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリエチルアミン、無水酢酸およびエチレングリコールは、ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）から購入した。絶対エタノールは、Ｐｈａｒｍｃｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，ＣＴ）から購入した。２−（２−メトキシエトキシ）酢酸クロライドは、前述のようにして合成した。（Ａｓａｋａｗａ，Ｍ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｌ．；Ｍｅｎｚｅｒ，Ｓ．；Ｒａｙｍｏ，Ｆ．Ｍ．；Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｆ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２６１４−２６２７）。リン酸塩緩衝サリン（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸塩、１３８ｍＭ　ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ　ＫＣｌ）は、蒸留した脱イオン水において新たに製造し、使用前に、０．２２μＭのフィルターを介して濾過した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ分光光度計で４００ＭＨｚで記録した。化学シフトは、残留溶剤（ＣＨＣｌ３＝７．２６ｐｐｍ）に関してｐｐｍで報告する。
【０１３７】
ＳＡＭｓの製造　ＳＡＭｓは、新たにｅ−ビーム蒸着させた金基質（２４×５０ｍｍ）を適当なアルカンチオールのエタノール２ｍＭ溶液に室温で一晩浸漬することにより製造した。これら基板を溶液から取出し、エタノールで濯いでから窒素流中で乾燥させた。ＳＰＲ研究のためおよびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）およびスタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｄｉｓ）の付着を測定するために使用するガラス基板を１．５ｎｍチタンおよび３８ｎｍ金で被覆した。Ｅ．Ｃｏｌｉの付着は、５０ｍｍのＴｉおよび１００ｎｍの金で被覆したガラス基板で測定した。
【０１３８】
鎖間無水物の形成　ＳＡＭｓは、上記のように製造した金基板を１６−メルカプトヘキサデカン酸のエタノール、水および酢酸（８５：１０：５ｖ／ｖ）混合物中２ｍＭの溶液に室温で一晩浸漬することによって製造した。基板を溶液から取出し、エタノールで完全に濯ぎ、窒素流で乾燥させた。清浄な基板を新たに調製した０．１Ｍの無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）および０．２Ｍのトリエチルアミンの無水ＤＭＦ溶液中に入れ、室温で２０分間攪拌しなかった。基板をＴＦＡＡ溶液から取出し、ＣＨ２Ｃｌ２で濯ぎ、窒素流中で乾燥させた（Ｙａｎ，Ｌ；Ｍａｒｚｏｌｉｎ，Ｃ．；Ｔｅｆｏｒｔ，Ａ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．６７０４−６７１２，１９９７）。
【０１３９】
ＳＡＭｓ上へのポリマーのグラフトおよび官能化　末端鎖間無水カルボン酸基を有するＳＡＭｓは、それらを高分子アミンの適当な溶液で２０分間被覆することによって直ちに使用した（Ｙａｎ，Ｌ．；Ｈｕｃｋ，Ｗ．Ｔ．Ｓ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．−Ｍ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１２０８−１２１４，１９９９）。ポリマー溶液は、０．５％（ｗ／ｖ）であり；ＬＰＥＩポリマーおよびＰＭＶＡは、ＮＭＰに溶解させ、ＢＰＥＩポリマーは、イソプロピルアルコールに溶解させ、ＰＡＡおよびＰＬＹＳは、緩衝液中にｐＨ＝１０で溶解させた。ポリマー溶液は、ガラス支持体の官能化させない側と接触させてはならない。基板背面のポリマーによる汚染は、ＳＰＲ機器の光学界面を妨害した。ついで、基板は、エタノールで完全に濯ぎ、窒素流中で乾燥させ、ＲＣＨ２ＣＯＣｌ（０．３ｍＭ）、トリエチルアミン（０．３ｍＭ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．０１ｍＭ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に３５℃で１時間浸漬した。基板は、酸塩化物溶液から取出し、エタノールで完全に濯ぎ、窒素流中で乾燥させた。ＰＥＧ−ＭＡは、水溶液（１％ｗ／ｗ）から表面結合したＬＰＥＩにグラフトさせた。
【０１４０】
表面プラスモン共鳴分光分析　Ｂｉａｃｏｒｅ　１０００ＳＰＲ機器を使用した。前述したように、分析する基板を改良ＳＰＲカートリッジに取付けた（Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ．；Ｓｉｇａｉ，Ｇ．Ｂ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．４３８３−４３８５，１９９５）。蛋白質のＳＡＭｓへの吸着は、（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウムの（ＰＢＳ中４０ｍＭ）溶液をＳＡＭ表面上に３分間流し、続いて、その表面をＰＢＳ緩衝溶液で１０分間濯ぎ；（ｉｉ）ＰＢＳ緩衝液を２分間流し、ついで、その流を蛋白質の（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ）溶液で３０分間置換し、最後に、ＰＢＳ緩衝液をさらに１０分間注入することによって測定した。実験のために使用した流速は、全て、１０μＬ／分であった。
【０１４１】
スタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）についてのインビトロ付着モデル　　　　　
１８ｍｍ２のガラスカバースリップ（および裸の金）上の官能化された金基板を使用直前に１００％エタノールで濯ぎ、滅菌１００×１５ｍｍのポリスチレン皿（Ｆｉｓｈｅｒ）に入れた。スタフィロコッカス　エピダーミディス　Ｍ１８７（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｄｉｓ　Ｍ１８７）またはスタフィロコッカス　オーレウス　ＭＮ８ＭＵＣ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＭＮ８ＭＵＣ）（２．５×１０８／ｍＬ懸濁液１００μＬ）の接種源をペトリ皿に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。滅菌ピペット先端で金基板の表面全体上に懸濁液を広げた。金被覆基板を培地から取出し、滅菌ＰＢＳで５回洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するトリプチケース大豆肉汁（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）（ＴＳＢ）１０ｍＬ中で５秒間音波処理した。生ずる懸濁液を寒天平板上に置く前に３７℃で一晩（１０倍か０倍に）希釈した。顕微鏡下でコロニーの数を数えて、金被覆試料を音波処理することにより得られる懸濁液中のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の密度を決定した（プロットした量）。各試料表面を３回試験し、裸の金表面では４回行い；この実験は、３つの異なる日について繰返した。
【０１４２】
Ｅ．ｃｏｌｉについてのインビトロ付着モデル　使用したＥ．ｃｏｌｉ（ＲＢ１２８）の特定の菌株は、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＳｃｈｏｏｌのＤｒ．Ｓｈａｗ　Ｗａｒｒｅｎにより尿路感染に苦しむ患者から単離された。細菌は、トリプチック大豆肉汁（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）中でミッドロッグ成育相（ｍｉｄｌｏｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ）まで成育され、これは、６５０ｎｍでほぼ０．３の光学密度に相当する。細菌は、リン酸塩緩衝サリン溶液（ｐＨ＝７．４）を使用して３回洗浄した。各洗浄工程の間、細菌を入れた試験管に１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液を加え、続いて、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２００ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液を入れた皿に金被覆基板を垂直に入れた。細菌懸濁液の適当量を溶液に加えて、その細菌濃度を１×１０５細菌／ｍＬに調製した。基板と細菌の懸濁液を入れた皿を３７℃に維持した水浴を備えたシェーカーに入れた。１時間後、基板を細菌の懸濁液から取出し、ＰＢＳ溶液（３×２００ｍＬ）を使用して洗浄した。緩やかな窒素流下で各基板を乾燥させた後、それをアガロース被覆板と接触させた。基板をアガロースゲルと２０〜３０秒間接触したままとし、ついで、それをゲルからつりあげた。ゲルを３７℃で８時間インキュベートした後、コロニー形成単位（ｃｆｕ）の数を数えた。結果は、Ｅ．Ｃｏｌｉの４つの異なるバッチを使用し、５回の実験の平均である。ポリウレタン（ＰＵ，Ｔｅｃｏｆｌｅｘ，Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ　Ｉｎｃ．）を対照として使用した。
【０１４３】
ＬＰＥＩの製造　ＬＰＥＩ（Ｍｗ〜２５０，０００およびＭｗ〜１００，０００）は、硫酸によるＰＥＯＸ（Ｍｗ〜５００，０００およびＭｗ〜２００，０００）を酸加水分解し、続いて、ＮａＯＨで中和し、Ｗａｒａｋｏｍｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．の処理法に従い、脱イオン水から再結晶することにより製造した（Ｋｏｋｕｆｕｔａ，Ｅ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．；Ｙａｍａｄａ，Ｋ．；Ｈｉｒａｔａ，Ｍ．；Ｆｕｍｉｔａｋｅ，Ｋ．，１９９８，Ｖｏｌ．１４、ｐｐ．７８８−７９５，１９９８；Ｓａｅｇｕｓａ，Ｔ．；Ｈ．Ｆｕｊｉｉ，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．３，１９７２；Ｖｏｌ．３，１９７２；および、Ｗａｒａｋｏｍｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．；Ｔｈｉｌｌ，Ｂ．Ｐ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．；Ｖｏｌ．２８，ｐ．３５５１，１９９０）。１Ｈ　ＮＭＲおよび１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルの両方とも単一のシグナルを示した。この観測は、得られるＬＰＥＩが完全に加水分解されたことを示唆する。
【０１４４】
処理法１：２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）エトキシ〕酢酸クロライド（１）
２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）エトキシ〕酢酸（９０ｍＬ，０．５９ｍｏｌ）およびピリジン（０．１ｍＬ，１ｍｍｏｌ）の無水トルエン（２５０ｍＬ）溶液に、オキサリルクロライド（１００ｇ，０．７８ｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、生ずる溶液を周囲温度で４８時間攪拌した。反応溶液を減圧で濃縮すると、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＣｌを幾分黄色のオイルとして与えた（１２０ｇ，９６％）。この化合物は、さらに精製することなく使用した。
【０１４５】
処理法２：［２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］酢酸ｔ−ブチルエステル（２ａ）
トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２０ｍＬ，０．１３ｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムブロマイド（２０ｇ，０．０６２ｍｏｌ）、トルエン（１００ｍＬ）およびＫＯＨ（５０％ｗ／ｗ，１００ｍＬ）の激しく攪拌した混合物にブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル（２０ｍＬ，０．１４ｍｏｌ）を１０分間かけて加え、生ずる均質な反応混合物を０℃で１０分間攪拌した。反応混合物を周囲温度まで暖め、１時間攪拌した。水（１００ｍＬ）を加え、有機層を分離した。有機層をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（２×１００ｍＬ）ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（２００ｇ）に載せ、酢酸エチルで溶離すると、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３を無色のオイルとして与えた（４２０ｇ，１２％）。
【０１４６】
処理法３：［２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］酢酸（２ｂ）
［２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］酢酸ｔ−ブチルエステル（４．２ｇ，１５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２４ｍＬ）溶液にＴＦＡ（６ｍＬ）を加え、生ずる溶液を周囲温度で３時間攪拌した。溶液を減圧で濃縮すると、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ（３．３ｇ，９９％）を幾分黄色のオイルとして与えた。
【０１４７】
［２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］酢酸クロライド（２ｃ）
処理法１に従い、（ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＣｌ）を製造した。オキサリルクロライド（３．６ｍＬ）；［２−〔２−（２−メトキシ−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸（３．３ｇ，０．１５ｍｏｌ）；ピリジン（０．１ｍＬ，１ｍｍｏｌ）および無水トルエンで、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＣｌを黄色のオイルとして与えた（３．５ｇ，９９％）。この化合物は、さらに精製することなく使用した。
【０１４８】
ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル−酢酸ｔ−ブチルエステル（３ａ）
処理法２に従い、（ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）５−７ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３を製造した。ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル（２０ｍＬ，０．１４ｍｏｌ），ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（２０ｍＬ，０．１３ｍｏｌ，Ｍｎ＝３５０），テトラブチルアンモニウムブロマイド（２０ｇ，０．０６２ｍｏｌ），トルエン（１００ｍＬ）およびＫＯＨ（５０％ｗ／ｗ，１００ｍＬ）で、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３（ｎ＝５〜７）を無色のオイルとして与えた（１０ｇ，４０％）。
【０１４９】
ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル−酢酸（３ｂ）
処理法３に従い、（ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）５−７ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＯＨ）を製造した。ＴＦＡ（１０ｍＬ）、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３（ｎ＝５〜７）（１０ｇ，２４ｍｍｏｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）で、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ（８．８ｇ，９９％）を無色のオイルとして与えた。
【０１５０】
ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル−酢酸クロライド（３ｃ）
処理法１に従い、（ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）５−７ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＣｌ）を製造した。オキサリルクロライド（３．６ｍＬ，０．０４１ｍｏｌ）；ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ｎ＝５〜７）（８．８ｇ，０．２４ｍｏｌ）；ピリジン（０．１ｍＬ，１ｍｍｏｌ）および無水トルエン（２０ｍＬ）で、ＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＣｌを黄色のオイルとして与えた（９．０ｇ，９９％）。この化合物は、さらに精製することなく使用した。
【０１５１】
高分子アミンのＳＡＭｓ表面へのグラフト　ポリアミンの薄膜を図１に記載したようにしてＳＡＭｓに結合させた。
アミノ基のアシルクロライドによる修飾　低分子量のアシルクロライド（０．３ｍＭ）との反応をジクロロメタン中で行った。ＳＡＭ／ＬＰＥＩをポリ（エチレングリコール）−コ−ポリ（無水マレイン酸）（ＰＥＧ−ＭＡ）と反応させることによって、グラフトされた薄膜の表面上にポリ（エチレングリコール）（ｎ＝３０）誘導体を生じさせた（Ｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．は、ＳＡＭ／ＢＰＥＩ層をＣＨ３（ＣＨ２）１５ＣＯＣｌでアシル化し、生ずる表面が、θａＨ２Ｏ＝１０７°を有することを見出し、ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＯＣｌでアシル化すると、θａＨ２Ｏ＝１１８°を有する表面を与えた。θａＨ２Ｏのこれら値は、ヘキサデカンチオレート（θａＨ２Ｏ＝１１２°）を有するＳＡＭの値に匹敵する特性を有する疎水性層の形成と一致する。これら表面上の水の接触角の増大値の同一性は、アシル化されたＢＰＥＩ上に数個の暴露された極性官能基が存在することを示唆するが、それは、これらの基の密度についていずれのその他情報も提供しない。）。
【０１５２】
ＬＰＥＩ／ＣＯＲ、ＢＰＥＩ／ＣＯＲ、ＰＡＡ／ＣＯＲ、ＰＭＶＡ／ＣＯＲおよびＰＬＹＳ／ＣＯＲを生ずるＳＡＭｓへの蛋白質の吸着　両蛋白質とも、ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＮＨ２の無水物基を生ずるＳＡＭとの反応により形成される混合ＳＡＭに吸着し（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｒ．Ｇ．；Ｏｓｔｕｎｉ，Ｅ．；Ｙａｎ，Ｌ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ａｃｃｅｐｔｅｄ，２０００）；ヘキサデカンチオレートのＳＡＭとほとんど識別不能な結果が得られた（Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ；Ｓｉｇａｌ，Ｇ．Ｂ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．４３８３−４３８５，１９９５）。
【０１５３】
ＳＰＲは、実施例１で考察したように行った。
オリゴ（ＥＧ）ｎの誘導体　ＳＡＭ／ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３およびＳＡＭ／ＰＭＶＡ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３は、（ＥＧ）３ＯＨ基を有する単一成分ＳＡＭｓにより吸着される量に匹敵する量のフィブリノーゲンおよびリゾチームを吸着した（表４，図１０）。
【０１５４】
【表１０】
2004513981.tif 000038
脚注：鎖間無水カルボン酸基を生ずるＳＡＭと列挙したポリマー（スキーム１）を反応させ、表の第１列に列挙したアシルクロライドでさらに官能化した。第１列の“官能化されていない”とは、アシルクロライドと反応しなかったポリマーを称す。表面を蛋白質の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に３分間暴露し、ついで、１０分間緩衝させた。報告する値は、無水ＳＡＭをＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＣｌと反応させることにより形成される混合ＳＡＭに吸着される蛋白質の量のパーセンテージである。
ａ　この章の全ての測定値の標準偏差（ＳＤＥＶ）は、特に断わらない限り、≦５であった。
ｂ　この章の全ての測定値の標準偏差は、特に断わらないかぎり、≦０．３であった。
ｃ　ＳＤＥＶ≦１７
ｄ　ＳＤＥＶ≦１
ｅ　幾つかの表面は、ここで使用した疎水性標準より多い蛋白質の吸着を可能とする。これは、まれに起こる。
ｆ　ＳＤＥＶ≦８
ｇ　測定した値は、実験的に有意でなかった（＜０．２％）。
【０１５５】
図１０は、フィブリノーゲンの異なるＳＡＭｓへの吸着についてのセンサーグラムを示す。ＬＰＥＩ−ＣＯ（ＣＨ２）１１ＣＨ３（２５ｋＤａ）の表面は、蛋白質のほとんど完全な単分子層を吸着する（曲線１）。官能化されていないＬＰＥＩを生ずる混合ＳＡＭもまたほとんど完全な蛋白質の単分子層を吸着する（曲線２）。ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＯＣｌによるＳＡＭのアセチル化は、蛋白質の吸着に耐える表面を生ずる（曲線３）。吸着された蛋白質の量は、実験の終了と蛋白質注入の開始との間のシグナルにおける差として定義される（ΔＲＵ）。吸着された蛋白質のパーセンテージは、式１におけるように、ポリマー被覆について測定されるΔＲＵの値を鎖間無水物のＣＨ３（ＣＨ２）１０ＮＨ２との反応によって製造される混合ＳＡＭについて測定されるΔＲＵの値で割ることにより決定した。
【０１５６】
ＳＡＭｓ上にグラフトされたＬＰＥＩ（２５ｋＤａ）の薄膜は、それらをＣＨ３Ｏ（ＥＧ）ｎＣＨ２ＣＯＣｌ（ｎ≧２）（表５）で官能化する時と同程度の蛋白質の吸着に耐え；この結果は、エチレングリコールの短いオリゴマーの高密度が表面を不活性とするという従来技術の理論と一致する。
【０１５７】
【表１１】
2004513981.tif 000039
脚注：ＬＰＥＩ（２５ｋＤａ）を無水ＳＡＭと反応させ、列挙したアシルクロライド（ＣｌＯＲ）で官能化した。吸着した蛋白質のパーセンテージの決定および蛋白質の吸着を測定するために使用した実験プロトコルは、表１の脚注およびテキストに記載する。
ａ　実験番号１〜３についての標準偏差（ＳＤＥＶ）は、≦４であった。実験番号４〜９についてのＳＤＥＶは、特に断わらない限り、＜０．３であった。
ｂ　ＳＤＥＶ＝１１
ｃ　我々は、０．２％未満を測定することができない。
ｄ　ＳＤＥＶ＝０．７
ｅ　コポリマー上の無水物基は、ＬＰＥＩ上の遊離アミンと反応した。
【０１５８】
アセチル基　アセチルクロライドのポリアミンで覆われた表面との反応は、高密度のアセトアミド基（Ｒ２ＮＣＯＣＨ３）を有する表面を生じ；これら表面は、アシル化されないグラフトされたポリマー塗膜と比較して蛋白質の吸着に耐えた（表４）。ＬＰＥＩのアセチル化された塗膜に吸着する蛋白質の量は、官能化されていない塗膜に吸着するそれより少なく；この観測結果は、第２級または第１級アミノ基を生ずるＳＡＭがアセチルアミド（ＮＣＯＣＨ３）基を生ずる構造的に類似した基よりもより多くの蛋白質を吸着することを示す前述の研究と一致する。無水酢酸とグラフトされたポリアミンのアセチル化は、アセチルクロライドでアシル化されたものよりも幾分多量のフィブリノーゲンを吸着する表面を生じた。−ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３基でグラフトされたポリマー塗膜は、アセチル化された塗膜よりも１〜１０倍少ない蛋白質を吸着した（表４）。
【０１５９】
官能化されていないポリマー　蛋白質は、それらが正に帯電し（Ｒ３ＮＨ＋）；それらが、また、高密度の水素結合供与体基を有するので、ポリアミンのアセチル化されていない薄膜に吸着した。高分子アミンで塗被されたＳＡＭｓの表面は、リゾチームよりも１〜８倍多いフィブリノーゲンを吸着した（表４）。恐らく、部分的に正に帯電した塗膜が正に帯電したリゾチーム（ｐＩ＝１１）を反発し、負に帯電したフィブリノーゲン（ｐＩ＝５．５）を吸引するようである。ｐＩは、蛋白質が全体として電荷を有しないｐＨを称す。ｐＩより低いｐＨの値では、蛋白質は、正に帯電する。
【０１６０】
疎水性基　疎水性基、例えば、ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＯＣｌおよびＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＯＣｌでアシル化された高分子塗膜に吸着した蛋白質の量は、その表面が大部分特性において疎水性であることを示唆する（表５）。これら結果は、（ＣＨ３（ＣＨ２）１５ＣＯＣｌおよびＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＯＣｌでアシル化されたＢＰＥＩの塗膜上での水の接触角の増大が、ヘキサデカンチオレートのＳＡＭｓについて測定したものに匹敵する点で、Ｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．の報告（Ｙａｎ，Ｌ．；Ｈｕｃｋ，Ｗ．Ｔ．Ｓ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．−Ｍ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１２０８−１２１４，１９９９）と一致する。
【０１６１】
ポリマーの構造の蛋白質吸着に及ぼす影響：
分子量　ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ３で形成した表面に吸着する蛋白質の量は、ポリマーの分子量の増大とともに幾分低下し；ＢＰＥＩ／ＣＯＣＨ３で得られる結果は、概して、この趨勢と一致する。この観測結果の可能な説明の１つは、より大きなポリマーほど、それらの低分子量変種よりも効率的に表面の不均質性とＳＡＭのＣＯ２−／ＣＯ２Ｈ基の両方をカバーする傾向がある。ＳＡＭ／ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３で塗被された表面に吸着する蛋白質の量は、ポリマーの分子量と独立であり；この結果は、エチレングリコールの誘導体でカバーされた表面が蛋白質の吸着に耐えるという従来の知識と一致する。
【０１６２】
水素結合供与体能　蛋白質の吸着に最もよく耐える官能化されたポリマー塗膜は、厳格に、第２級アミン基（ＬＰＥＩ，ＰＭＶＡ）により構成されるポリマーの薄膜をグラフトし、これらの基をＣｌＣＯＲ誘導体（Ｒ＝ＣＨ３，（ＥＧ）ｎ≧２ＯＣＨ３）またはその他のエーテル誘導体と反応させることによって得られた。先の研究に基き、アシルクロライドとの反応によって形成される塗膜から水素結合供与体基の脱離がこれら材料の蛋白質吸着耐性に寄与するものと考えられる。
【０１６３】
ＬＰＥＩ、ＢＰＥＩおよびＰＭＶＡ塗膜のアセチル化は、水素結合供与体基（ＲＲ’ＮＨ）を広く水素結合受容体（Ｒ’ＲＮＣＯＣＨ３）である基に変換し、蛋白質の吸着に耐える表面を生じさせた。ＰＬＹＳおよびＰＡＡの塗膜上の第１級アミノ基のアセチル化は、なお水素結合供与体基を有する第２級アミド基（ＨＮＣＯＲ）を生じ；これら表面は、蛋白質を吸着する。
【０１６４】
アセチルクロライドでアシル化されたポリアミンに吸着する蛋白質の量は、ポリマーの構造に依存し、ＣｌＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３でアシル化されたポリアミン上に吸着する量は依存しなかった。オリゴ（エチレングリコール）誘導体は、恐らく、水素結合供与体をスクリーンし、アセチルアミド基よりも効率的に基を帯電したが、これは、一部には、それらのサイズがより大きいことによる。
【０１６５】
スタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＬＰＥＩ／ＣＯＲを生ずる混合ＳＡＭｓへの付着　スタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）は、留置装置に付随して３０〜５０％の感染を生ずる。これらの菌株は、細菌の付着により認められるポリサッカライドの分泌された層を介して宿主細胞および人工材料の表面に付着する。この検定は、細菌の基質との懸濁液を３０分間インキュベートした後、表面塗膜に付着する生存細菌の数を決定した。細菌は、音波処理により基質の表面から取出し；生ずる懸濁液は、寒天板上で一晩インキュベートした。各プレート上の細菌コロニーの数は、基質の音波処理後に得られる溶液中に見られるコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）の密度を決定することによって数え；この数は、各基板に付着する細菌の数に比例する。音波処理では、表面上に幾分かの細菌が残り、特に、裸の金対照でしかりであり；かくして、対照数は、まがいなく少なかった。
【０１６６】
極めて少数の細菌がＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３を生ずる混合ＳＡＭｓに付着し；裸の金についてよりも約３桁のオーダー低い値が測定され、（ＥＧ）３ＯＣＨ３基を生ずるＳＡＭについてより約２桁低いオーダーであった（図１１）。図１１は、裸の金；ＨＳ（ＣＨ２）１１ＥＧ３ＯＣＨ３の純粋なＳＡＭ；および、ＬＰＥＩ−ＣＯＣＨ３およびＬＰＥＩ−ＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ３を生ずる混合ＳＡＭｓ（１００ｋＤａ）へのスタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびスタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の付着を示す。ｙ軸上にプロットされた量は、各基質に結合された細菌の数（コロニー形成単位，ｃｆｕ）を表す。誤差のバーは、３回行った測定の標準偏差である。実験は、４つの別個の日に行ったが、同様の結果を有し；わかりやすくするために、１組の結果のみを示す。
【０１６７】
ＬＰＥＩ−ＣＯＲを生ずる混合ＳＡＭｓへのＥ．Ｃｏｌｉの付着　試験したＥ．Ｃｏｌｉの菌株は、尿路感染症を有する患者から単離し、Ｄｒ．Ｓｈａｗ　Ｗａｒｒｅｎ（Ｍａｓｓ．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ）により我々に提供された。試験基質に付着したコロニー形成単位（ｃｆｕ’ｓ）の数は、“インプリント（ｉｍｐｒｉｎｔ）”検定を使用することにより測定した。この検定は、細菌で覆われた基質をアガロース塗被板に接触させ、細菌を金基板から寒天板に移し、インキュベーション後のｃｆｕ’ｓを数えることによって行った（図１２）。裸の金表面に付着した細菌の数は、しかし、正確に数えるのには多すぎ、報告する値は、下限を表す。
【０１６８】
結合した生存細菌の数は、ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３で官能化したＳＡＭｓについて最も少なかった（図１２）。図１２は、Ｅ．Ｃｏｌｉの裸の金；医学等級のポリ（ウレタン）；ＨＳ（ＣＨ２）１１ＥＧ６ＯＨの純粋なＳＡＭ；および、ＬＰＥＩ−ＯＣＨ３およびＬＰＥＩ−ＣＯＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＯＣＨ３（１００ｋＤａ）を生ずる混合ＳＡＭｓへの付着を示す。我々は、平方インチ当たりのコロニー形成単位の数をプロットする。裸の金についてプロットした値は、下限を表し；裸の金に付着した細菌の数は、正確に測定するためには高すぎた。誤差のバーは、測定値の標準偏差である。実験は、２つの別個の場合について行ったが、結果は同様であった。わかりやすくするために、１組の結果のみをここで示す。
【０１６９】
ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ３を使用すると、裸の金に優ること２桁のオーダーおよびＰＵに優ること１桁のオーダーの改善を生じた。この塗被は、（ＥＧ）６ＯＨ基で終了するＳＡＭで十分に行えたが、しかし、ＳＡＭ／ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３では十分に行いえなかった。
【０１７０】
ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３およびＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ３は、オリゴ（エチレングリコール）誘導体を生ずる単一成分ＳＡＭｓとほとんど同程度に効率的に溶液からの蛋白質の吸着に耐える。ここで報告する最も蛋白質耐性な膜の幾つか（ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ３，ＰＭＶＡ／ＣＯＣＨ３）は、エチレングリコールの誘導体を使用することなく得られた。
【０１７１】
ＳＡＭ／ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ２（ＥＧ）２ＯＣＨ３およびＳＡＭ／ＬＰＥＩ／ＣＯＣＨ３は、その表面基が（ＥＧ）ｎＯＲ（ｎ＝３，６；Ｒ＝Ｈ，ＣＨ３）であるＳＡＭｓに匹敵するか優るほど細菌の付着に耐える。これら塗膜に付着する細菌の数（（ＥＧ）ｎＯＲ基で終了するＳＡＭｓの対照表面と比較して）は、試験する細菌の菌株に依存した。表面への細菌の付着の機構は、菌株に高度に依存し、Ｅ．Ｃｏｌｉ、スタフィロコッカス　オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）およびスタフィロコッカス　エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）で得られた結果は、これらの塗膜が細菌の付着に対して広範な耐性を示すかもしれないことを示唆する。
【０１７２】
その他表面のポリマーによるグラフト　この章は、その他の表面、例えば、ポリマー表面がＰＥＩで如何にグラフトされるかを立証する。
ポリウレタン（ＰＵ）カテーテルとＰＵで塗被されたガラススライドをＰＥＩで官能化させて、不活性な基質を生じさせる。ポリウレタン基質をトルエンジイソシアネート（１ｍＬ）およびＳｎ（ＩＩ）オクタネート（１００μＬ）の無水ヘキサン（１００ｍＬ）溶液に入れた。反応混合物を６０℃まで４５分間加熱し、直ぐに水で濯ぐ。ついで、ポリウレタン基質をＢＰＥＩ溶液（水中１％ｗ／ｖ）に４℃で一晩浸漬する。水で濯いだ後、ポリウレタン基質をアシルクロライド誘導体と反応させた。ポリウレタンカテーテルのアシル化用の溶剤として塩化メチレンの代わりにアセトニトリルを使用した。
【０１７３】
アセチル化したポリアミン塗膜をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スラブの表面に結合して、それらを蛋白質吸着耐性とした。ＰＤＭＳをプラズマオキシダイザー中で３０秒間処理して、その表面に反応性の基、例えば、ヒドロキシル基を生じさせた。ついで、アルケン官能基で終了するトリクロロアルキルシランにＰＤＭＳ基質を暴露させた。末端アルケン官能基は、ＫＭｎＯ４により酸化して、カルボン酸基を生じさせた。ついで、カルボン酸基は、無水カルボン酸基に転化させた。ポリアミンのこの表面への続くグラフトおよびポリマーのアシル化は、本実施例に記載したようにして行った。
【０１７４】
実施例　４：炭酸脱水酵素の生物特異的な結合
ＣＡを生物特異的に認識および吸着することのできるＳＡＭは、無水物基（図１参照）をＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６Ｈと、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＳＯ２ＮＨ２（化合物１３）から誘導されるベンゼンスルホンアミドとの混合物と反応させることによって製造した（図１３）。図１３は、化合物１３の製造スキームを示す。
【０１７５】
ベンゼンスルホンアミドの表面への結合：　図１４、プロットＣは、ＣＡ（リン酸塩緩衝化サリン（ＰＢＳ）乾燥液中５μＭ）のその表面上に共有結合により固定化されたベンゼンスルホンアミド１３を生ずる混合ＳＡＭへの吸着および脱着について得られるＳＰＲセンサーグラムを示す。ＣＡの結合は、大部分、可逆的（＞９０％）であった。ベンゼンスルホンアミド基を生ずる混合ＳＡＭからのＣＡの解離および会合の速度を分析すると、ｋｏｆｆ＝０．００５４ｓ−１の値およびｋｏｎ＝１３０００Ｍ−１ｓ−１の値を生じた（表６）。
【０１７６】
【表１２】
2004513981.tif 000040
脚注ａ　測定せず。
【０１７７】
平衡解離定数（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、０．４２μＭであった。ベンゼンスルホンアミドを生ずる本発明の混合ＳＡＭｓに対するＣＡの結合についての動力学的および熱力学的パラメータは、他の構造的に類似した混合ＳＡＭｓについて認められているそれらに匹敵する。
【０１７８】
生物特異的にＣＡを結合するベンゼンスルホンアミド基を生ずる混合ＳＡＭｓを立証するには、競争的な阻害実験を行うのがよい。ＣＡのこの混合ＳＡＭへの結合は、１ｍＭのベンゼンスルホンアミド１４（Ｈ２ＮＳＯ２Ｃ６Ｈ４−ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯ２ＣＨ３，Ｋｄ＝６３μＭ）をＣＡ含有溶液に加えることにより完全に阻害された。１３および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６Ｈ）／−ＣＯ２Ｈ基を生ずる混合ＳＡＭは、また、フィブリノーゲン、ミオグロビン、リゾチームおよびＲＮａｓｅの混合物に暴露する時検出可能な量の蛋白質を吸着せず（図１４，プロットＢ）；５μＭＣＡの蛋白質の添加は、生物特異的な応答を生じた（図１４，プロットＤ）。１３および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６Ｈ／−ＣＯ２Ｈ基を生ずる混合ＳＡＭｓは、より長いヘキサ（エチレングリコール）基が１３および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３Ｈ／−ＣＯ２Ｈ基（データ示さず）を生ずる構造的に類似した混合ＳＡＭと比較して我々の蛋白質混合物の非特異的な吸着を低下させるので製造した。より長いヘキサ（エチレングリコール）基は、恐らく、それらが下地のＣＯ２Ｈ／ＣＯ２−基の効果をスクリーニングするのにより良好であるので、蛋白質の非特異的な吸着を少なくするのにより短いトリ（エチレングリコール）基よりも効果的であった。
【０１７９】
材料　炭酸脱水素酵素ＩＩ（ウシ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＳＯ２ＮＨ２（化合物１３）の合成（図１３）
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸ｔ−ブチルエステル（２）　水素化カリウム（３５％ＫＨ／鉱油，３４０ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）の０℃混合物に、ヘキサ（エチレングリコール）（１．３ｍＬ，５．２ｍｍｏｌ）を５分間かけて加えた。生ずる混合物を周囲温度まで暖め、１時間攪拌した。この混合物に、ｔ−ブチルブロモアセテート（０．４４ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）を小分けして加え、混合物を一晩還流した。反応混合物を０℃まで冷却し、濾過して、臭化カリウムを除いた。濾液を減圧で濃縮し、直接、シリカゲル重力カラム（１００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１００：１〜１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物２を透明なオイルとして与えた（０．９０ｇ，４４％）。
【０１８０】
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−ブロモ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸ｔ−ブチルエステル（３）　四臭化炭素（９．０ｇ，２７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．２ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を化合物２（１．８ｇ，４．５ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に加えた。反応混合物を５時間攪拌した後、溶剤を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（２００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１００：０〜２０：１で溶離すると、化合物３を無色のオイルとして与えた（１．９ｇ，９１％）。
【０１８１】
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−アジド−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸ｔ−ブチルエステル（４）　ナトリウムアジド（１．５ｇ，２３ｍｍｏｌ）を化合物３（１．９ｇ，４．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液に加え、生ずる混合物を８０℃で一晩攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ついで、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）ですり潰し、濾過して、ナトリウムアジドを取除いた。濾液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（２００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１００：０〜２０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物４を無色のオイルとして与えた（１．０ｇ，５７％）。
【０１８２】
注意：ナトリウムアジドは、毒性が高く、かつ、爆発性で危険である；注意して取り扱うこと。
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸ｔ−ブチルエステル（５）　化合物４（１．０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）のエタノール（２０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．３ｇ）および酢酸（０．３ｍＬ）を加えた。生ずる混合物を水素雰囲気下で１６時間攪拌し、ついで、濾過して、Ｐｄ／Ｃを取除いた。濾液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（１００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ２０：１〜１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物５をオイルとして与えた（０．９０ｇ，９６％）。
【０１８３】
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸ｔ−ブチルエステル（６）　水酸化ナトリウム（水中３Ｍの２，０ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）およびベンゾイルクロロホルメート（０．５２ｍＬ，０．３６ｍｍｏｌ）を、小分けして、化合物５（０．９０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１０ｍＬ）液に加え、生ずる混合物を一晩攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、水（２０ｍＬ）を加え、スラリーをＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（１００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１００：１〜１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物６を無色のオイルとして与えた（０．９３ｇ，７６％）。
【０１８４】
［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−酢酸（７）　ＴＦＡ（４ｍＬ）を化合物６（０．９３ｇ，１．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液に加え、生ずる溶液を周囲温度で一晩攪拌した。生ずる溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（５０ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＭＨ４ＯＨ（３０％水性）９０：１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物７を粘稠な無色のオイルとして与えた（０．８３ｇ，９９％）。
【０１８５】
〔〔６−（２−［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−エトキシ〕−エトキシ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エタノイルアミノ）−ヘキシル〕−カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（９）　化合物７（０．６９ｇ，１．５ｍｍｏｌ）、化合物８（０．４０ｇ，１．６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．４２ｍＬ，３．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（０．３４ｇ，１．８ｍｍｏｌ）を加え、生ずる溶液を一晩攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、水（２０ｍＬ）を加え、スラリーをＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出した、合わせた有機溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（２０ｍＬ）で洗浄し、続いて、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ついで、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（１００ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１００：１〜１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物９を無色のオイルとして与えた（０．５４ｇ，５４％）。
【０１８６】
〔２−（２−［２−〔２−（２−［２−〔（６−アミノ−ヘキシカルバモイル）−メトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エチル〕−カルバミン酸ベンジルエステル（１０）　ＴＦＡ（３ｍＬ）を化合物９（０．２４ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）溶液に加え、生ずる溶液を周囲温度で１時間攪拌した。生ずる溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（２５ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（３０％水性）９０：１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物１０を無色のオイルとして与えた（０．２０ｇ，９８％）。
【０１８７】
〔２−（２−［２−〔２−（２−［２−〔（６−［〔１−（４−スルファモイル−フェニル）−メタノイル〕−アミノ］−ヘキシルカルバモイル）−メトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エチル〕−カルバミン酸ベンジルエステル（１２）　化合物１０（０．２０ｇ，０．３５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（８７μＬ，０．５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、化合物１１（０．１５ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、生ずる溶液を一晩攪拌した。溶液を減圧で濃縮し、残渣をシリカゲル重力カラム（２５ｇ）に載せ、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ１０：１（ｖ／ｖ）で溶離すると、化合物１２を無色の粘稠なオイルとして与えた。
【０１８８】
〔６−（２−［２−〔２−（２−［２−〔２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ〕−エトキシ］−エタノイルアミノ）−ヘキシル〕−４−スルファモイル−ベンズアミド（１３）の合成　化合物１２（０．１８ｇ，０．２５１ｍｍｏｌ）のエタノール（２０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加え、生ずる混合物を水素雰囲気下で１６時間攪拌し、ついで、濾過して、Ｐｄ／Ｃを取除いた。濾液を減圧で濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製すると、化合物１３をワックス状の固体として与えた。
【０１８９】
生物特異的なリガンドのポリマー表面上への固定化　ベンゼンスルホンアミド誘導体をＬＰＥＩで官能化した表面に共有結合により固定化することによって生物特異的な表面を製造することができ（表６）；炭酸脱水素酵素をこの表面に生物特異的に結合させる。以下の処理法を使用し、不活性な表面塗膜上にベンゼンスルホンアミド誘導体を固定化した。実施例３に記載した方法を使用し、鎖間無水カルボン酸基を生ずる表面に、ポリアミン（ＰＥＩ）をグラフトした。このＰＥＩ基質をトリエチルアミン（３００μＬ）、触媒量のジメチルアミノピリジン、アセチルクロライド（１０ｍＭ）およびジグリコイルクロライド（０．１または０．５ｍＭ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に１時間浸漬した。二官能性酸クロライド（ジグリコイルクロライド）の存在が以下の工程の当該アナライトの共有結合を可能とする反応性官能基を導入する。リガンドを表面に結合するための２つの処理法を記載する。これらは、当業者であれば、既存の固定化化学を本明細書で記載するポリアミン表面に改良する方法を知っているので、典型的な例に過ぎない。
【０１９０】
１つの方法において、アセチル化した基質の残留酸クロライド基は、ＰＢＳの溶液に２０分間浸漬することによりカルボン酸基へと加水分解された。これら基質上のカルボン酸基は、ついで、一般に当業者公知の方法によりＮＨＳエステルへと活性化した。アナライト（ベンゼンスルホンアミド誘導体）のこの表面への共有結合は、このアナライト末端のアミノ基の基質表面上の活性化されたＮＨＳエステルとの反応によって達成された。この反応は、アナライトのＮＭＰ１０ｍＭ溶液中、室温で３０分間行った。
【０１９１】
もう１つの方法において、アセチル化した基質の残留酸クロライド基は、ジアミン（ヘキサエチレングリコールジアミン，１０ｍＭ）およびトリエチルアミン（２０ｍＭ）の塩化メチレン（１０ｍＬ）溶液と反応させた。アミノ基を生ずるこれら基質は、ついで、１：１ナトリウムボレート緩衝液；ＮＭＰ中、活性化されたＮＨＳエステル（２０ｍＭ）を含有するベンゼンスルホンアミド誘導体と触媒量のＤＭＡＰの存在で反応させた。
【０１９２】
図１６は、無水物基で終了するＳＡＭ上にグラフトさせたＬＰＥＩ薄膜への蛋白質の吸着についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。このＰＥＩ基質は、トリエチルアミン（３００μＬ）、触媒量のジメチルアミノピリジン、アセチルクロライド（１０ｍＭ）およびジグリコイルクロライド（０．１ｍＭ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に１時間浸漬した。アセチル化した基質の残留酸クロライド基は、ジアミン（ヘキサエチレングリコールジアミン，１０ｍＭ）およびトリエチルアミン（２０ｍＭ）の塩化メチレン（１０ｍＬ）溶液と反応させた。アミノ基を生ずるこれら基質は、ついで、１：１ナトリウムボレート緩衝液；ＮＭＰ中、活性化されたＮＨＳエステル（２０ｍＭ）を含有するベンゼンスルホンアミド誘導体と触媒量のＤＭＡＰの存在で反応させた。曲線１：フィブリノーゲン、ＲＮａｓｅ、リゾチームおよびミオグロビンを含む蛋白質（各０．２ｍｇ／ｍＬ）の混合物を有するＣＡ（５μＭ）；曲線２：ＣＡ（５μＭ）；曲線３：ＣＡを含まない１におけるような蛋白質の混合物；曲線４：１ｍＭの溶解性ベンゼンスルホンアミドリガンドを含むＣＡ（５μＭ）。これらのセンサーグラムから得られる動力学的パラメータは、表６の実験番号６である。
【０１９３】
当業者であれば、本明細書に列挙した全てのパラメータは、例であることを意味し、実際のパラメータは、本発明の方法および装置が使用される具体的な用途に依存するであろうことが理解されるであろう。したがって、前述の実施態様は、例としてのみ表され、本発明は、特に断わらない限り、特許請求の範囲の請求項およびそれらの等価体の範囲においてのみ実施可能であることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、反応して無水物を形成するカルボン酸で終了する長鎖アルカンチオレートに共有結合した金表面の概略を示し；
図１Ｂは、アミドで終了する化学鎖を生じさせるための方法を示し；
図１Ｃは、ポリマーを金基質表面に共有結合させるための概略を示す。
【図２】
図２は、ポリアミンで起こりうる幾つかの反応を示す。
【図３】
図３は、標識としてのある種の混合ＳＡＭｓへのフィブリノーゲンの吸着および脱着についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。
【図４】
図４は、実施例２に記載したような化学鎖の構造を示す。
【図５】
図５は、図４に示す化学鎖のＳＰＲセンサーグラムを示す。
【図６】
図６は、図４に示す化学鎖についての各基質に結合した細菌の平均数のプロットを示す。
【図７】
図７は、図４に示す鎖で終了する表面のｍｍ２当たりに付着したＢＣＥ細胞の数を示す。
【図８】
図８は、付着したＢＣＥ細胞の数対表面に付着したフィブリノーゲンの量のプロットを示す。
【図９】
図９は、種々のタイプのポリアミンおよび比較ＰＥＧ−ＭＡを示す。
【図１０】
図１０は、フィブリノーゲンの異なるＳＡＭｓへの吸着についてのセンサーグラムを示す。
【図１１】
図１１は、エス　エピダーミディスおよびエス　オーレウスの種々の表面への付着を示す。
【図１２】
図１２は、Ｅ．Ｃｏｌｉの種々の表面への付着を示す。
【図１３】
図１３は、化合物１３を製造するためのスキームを示す。
【図１４】
図１４は、ＣＡの吸着および脱着について得られるＳＰＲセンサーグラムを示す。
【図１５】
図１５は、生物特異的に結合しうる物品の概略例を示す。
【図１６】
図１６は、無水物基で終了するＳＡＭｓ上にグラフトされたＬＰＥＩ薄膜へのＣＡの吸着についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。
【図２】
2004513981.tif 000065
【図３】
2004513981.tif 000066
【図５】
2004513981.tif 000067
【図６】
2004513981.tif 000068
【図７】
2004513981.tif 000069
【図８】
2004513981.tif 000070
【図９】
2004513981.tif 000071
【図１０】
2004513981.tif 000072
【図１１】
2004513981.tif 000073
【図１２】
2004513981.tif 000074
【図１３】
2004513981.tif 000075
【図１４】
2004513981.tif 000076
【図１６】
2004513981.tif 000077
【国際公開パンフレット】
2004513981.tif 000078
2004513981.tif 000079
2004513981.tif 000080
2004513981.tif 000081
2004513981.tif 000082
2004513981.tif 000083
2004513981.tif 000084
2004513981.tif 000085
2004513981.tif 000086
2004513981.tif 000087
2004513981.tif 000088
2004513981.tif 000089
2004513981.tif 000090
2004513981.tif 000091
2004513981.tif 000092
2004513981.tif 000093
2004513981.tif 000094
2004513981.tif 000095
2004513981.tif 000096
2004513981.tif 000097
2004513981.tif 000098
2004513981.tif 000099
2004513981.tif 000100
2004513981.tif 000101
2004513981.tif 000102
2004513981.tif 000103
2004513981.tif 000104
2004513981.tif 000105
2004513981.tif 000106
2004513981.tif 000107
2004513981.tif 000108
2004513981.tif 000109
2004513981.tif 000110
2004513981.tif 000111
2004513981.tif 000112
2004513981.tif 000113
2004513981.tif 000114
2004513981.tif 000115
2004513981.tif 000116
2004513981.tif 000117
2004513981.tif 000118
2004513981.tif 000119
2004513981.tif 000120
2004513981.tif 000121
2004513981.tif 000122
2004513981.tif 000123
2004513981.tif 000124
2004513981.tif 000125
2004513981.tif 000126
2004513981.tif 000127
2004513981.tif 000128
2004513981.tif 000129
2004513981.tif 000130
2004513981.tif 000131
2004513981.tif 000132
2004513981.tif 000133
2004513981.tif 000134
2004513981.tif 000135
2004513981.tif 000136
2004513981.tif 000137
2004513981.tif 000138
2004513981.tif 000139
2004513981.tif 000140
2004513981.tif 000141
2004513981.tif 000142
2004513981.tif 000143
2004513981.tif 000144
2004513981.tif 000145
2004513981.tif 000146
2004513981.tif 000147
2004513981.tif 000148
2004513981.tif 000149
2004513981.tif 000150
2004513981.tif 000151
2004513981.tif 000152
2004513981.tif 000153
2004513981.tif 000154
2004513981.tif 000155
2004513981.tif 000156
2004513981.tif 000157
2004513981.tif 000158
2004513981.tif 000159
2004513981.tif 000160
2004513981.tif 000161
2004513981.tif 000162
2004513981.tif 000163
2004513981.tif 000164
2004513981.tif 000165
2004513981.tif 000166
2004513981.tif 000167
2004513981.tif 000168
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513981.tif 000169
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513981.tif 000170
2004513981.tif 000171
2004513981.tif 000172
2004513981.tif 000173
2004513981.tif 000174
2004513981.tif 000175
2004513981.tif 000176
2004513981.tif 000177
2004513981.tif 000178
2004513981.tif 000179
2004513981.tif 000180
2004513981.tif 000181
2004513981.tif 000182
2004513981.tif 000183
2004513981.tif 000184
2004513981.tif 000185
2004513981.tif 000186
2004513981.tif 000187
2004513981.tif 000188
2004513981.tif 000189
2004513981.tif 000190
2004513981.tif 000191
2004513981.tif 000192
2004513981.tif 000193
2004513981.tif 000194
2004513981.tif 000195
2004513981.tif 000196
2004513981.tif 000197
2004513981.tif 000198
2004513981.tif 000199
2004513981.tif 000200
2004513981.tif 000201
2004513981.tif 000202
2004513981.tif 000203
2004513981.tif 000204
2004513981.tif 000205
2004513981.tif 000206
2004513981.tif 000207
2004513981.tif 000208
2004513981.tif 000209
2004513981.tif 000210
2004513981.tif 000211
2004513981.tif 000212
2004513981.tif 000213
2004513981.tif 000214
2004513981.tif 000215
2004513981.tif 000216
2004513981.tif 000217
2004513981.tif 000218
2004513981.tif 000219
2004513981.tif 000220
2004513981.tif 000221
2004513981.tif 000222
2004513981.tif 000223
2004513981.tif 000224
2004513981.tif 000225
2004513981.tif 000226
2004513981.tif 000227
2004513981.tif 000228
2004513981.tif 000229
2004513981.tif 000230
2004513981.tif 000231
2004513981.tif 000232
2004513981.tif 000233
2004513981.tif 000234
2004513981.tif 000235
2004513981.tif 000236
2004513981.tif 000237
2004513981.tif 000238
2004513981.tif 000239
2004513981.tif 000240
2004513981.tif 000241
2004513981.tif 000242
2004513981.tif 000243
2004513981.tif 000244
2004513981.tif 000245
2004513981.tif 000246
2004513981.tif 000247
2004513981.tif 000248
2004513981.tif 000249
2004513981.tif 000250
2004513981.tif 000251
2004513981.tif 000252
2004513981.tif 000253
2004513981.tif 000254
2004513981.tif 000255
2004513981.tif 000256
【国際調査報告】
2004513981.tif 000257
2004513981.tif 000258
2004513981.tif 000259
2004513981.tif 000260