(57)【要約】本発明は、芳香環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトンをエナンチオ選択的に還元するための方法に関する。本発明の方法は、主として立体配置が（Ｒ）を有するアルコールを得るために使用できる。前記方法は、芳香族環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトンの還元がラクトバチラス酵素の存在下で実施されることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元操作が、ラクトバチラス由来の酵素存在下で実施されることを特徴とする、芳香環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトンを還元するためのエナンチオ選択的方法。
【請求項２】
使用される前記酵素がラクトバチラスケフィリ由来の酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ケトン化合物が、一般式：
【化１】
2004533269.tif 000004
（前記式（Ｉ）中：
−Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基またはアリールアルキル基を表し、
−ｎは、少なくとも１に等しい数、好ましくは１から３の数であり、
−少なくとも１個のトリフルオロメチル基は、３位、４位または５位にある）
に相当することを特徴とする請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ケトン化合物が、Ｒ１が１個から４個、好ましくは１個または２個の炭素原子を有するアルキル基を表す一般式（Ｉ）に相当することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ケトン化合物が、式中ｎが１または２に等しい一般式（Ｉ）に相当することを特徴とする請求項３および４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ケトン化合物が、式中ｎが１に等しい数であり、前記トリフルオロメチル基が３位または４位にある式（Ｉ）に相当することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ケトン化合物が、式中ｎが２に等しい数であり、前記２個のトリフルオロメチル基が３位と４位または３位と５位にある式（Ｉ）に相当することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ケトン化合物が、
−３，５−ビス（トリフルオロメチル）アセトフェノン、
−３−トリフルオロメチルアセトフェノン、および
−４−トリフルオロメチルアセトフェノン
から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
単離した酵素を使用することを特徴とする請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素をｐＨ値が約７の緩衝培地に導入し、補助因子、すなわちＮＡＤＰＨおよび還元を受けるケトン化合物を加えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記補助因子を、第二級アルコール、好ましくはシクロペンタノールまたはイソプロパノールを用いることにより再生することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応を、好ましくは３０℃から３７℃の間にある温度で実施することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応の終末終了時に、好ましくは有機溶媒による抽出によって光学活性アルコールを分離することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
還元操作が、前記酵素を含むバイオマスの存在下で実施されることを特徴とする請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ラクトバチラス株、好ましくはラクトバチラスケフィリの発酵を実施し、次に還元反応を、前もって得られたバイオマス存在下で実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
炭素源、窒素源ならびに無機塩を含む醗酵培地に、ラクトバチラス、好ましくはラクトバチラスケフィリの接種材料を接種することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
醗酵が、６から７の間のｐＨ値、かつ好ましくは、２５℃から３０℃の温度で実施されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ラクトバチラスのバイオマスが、乾燥細胞で表示して１ｇ／ｌから５ｇ／ｌの割合で回収されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマスを、ｐＨ値が約７の緩衝培地に導入し、還元を受ける前記ケトン化合物を加えることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応を、好ましくは３０℃から３７℃の間にある温度で実施することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応の終了時に、好ましくは有機溶媒による抽出によって光学活性アルコールを分離することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体触媒作用または生物変換反応工程によって、芳香環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトンをエナンチオ選択的に還元する方法に関する。
【０００２】
光学活性なフェニルアカノール型化合物、特に（Ｒ）または（Ｓ）−１−フェニルエタノールは、薬学および農芸化学の分野におけるシントンとして極めて広範囲に使用されている化合物である。
【０００３】
本発明の目的は、所望の性質を有するエナンチオマーを得、他のエナンチオマー形成を最少にすることである。
【背景技術】
【０００４】
ｏ−位、ｍ−位またはｐ−位にトリフルオロメチル基を有するアセトフェノン誘導体の還元を、アルコール中、ゲオトリクムカンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）由来の酵素によって実施することが、Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３、８９５７〜８９６４頁）により知られている。しかし、得られたアルコールは立体配置が（Ｓ）である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記方法はアルコール（Ｓ）を導くが、本発明の目的は、対応するケトンの還元のためエナンチオ選択的方法によって立体配置が（Ｒ）の所望の光学活性アルコールを提供することである。
【０００６】
芳香環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトン還元のためのエナンチオ選択的方法が現在見出され、それが本発明の課題を構成しており、還元操作がラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の酵素の存在下で実施されることを特徴としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に従って用いられる好ましい酵素は、ラクトバチラスケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｋｅｆｉｒｉ）由来の酵素である。
【０００８】
本発明の方法は、多くの点で立体配置（Ｒ）のアルコールを得ることを可能にする。
【０００９】
本明細書において以後、用語の「ケトン化合物」は、出発基質、すなわち、芳香環上に少なくとも１個のトリフルオロメチル基を含むプロキラル芳香族ケトンを表示するために用いられる。
【００１０】
本発明によれば、還元は、アルコールデヒドロゲナーゼ型の酵素存在下で実施される。
【００１１】
本発明の第１の変法は、単離された酵素を用いることを含む。
【００１２】
本発明の他の変法は、前記酵素を含むバイオマスを用いることを含む。
【００１３】
本発明の方法は、一般式：
【００１４】
【化１】
2004533269.tif 000002
（前記式（Ｉ）中：
−Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基またはアリールアルキル基を表し、
−ｎは、少なくとも１に等しい数、好ましくは１から３の数であり、および
−少なくとも１個のトリフルオロメチル基は、３位、４位または５位にある）
に相当するケトン化合物を用いることを含む。
【００１５】
本発明によれば、用語の「アルキル」は、１個から１５個の炭素原子、好ましくは１個または２個から１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖炭化水素を表す。
【００１６】
用語の「アルケニル」は、１個以上の二重結合、好ましくは１個から２個の二重結合を含む、２個から１５個の炭素原子を有する直線状または分枝状炭化水素基を表すために用いられる。
【００１７】
用語の「シクロアルキル」は、３個から８個の炭素原子を含む環式炭化水素基、好ましくはシクロペンチル基またはシクロヘキシル基を表す。
【００１８】
用語の「アリール」は、単環式または多環式芳香族基、好ましくは６個から１２個の炭素原子を含む単環式基または二環式基、好ましくはフェニルまたはナフチルを表す。
【００１９】
用語の「アリールアルキル」は、単環式芳香環を有し、かつ７個から１２個の炭素原子を含む直線状または分枝状炭化水素基、好ましくはベンジルを表す。
【００２０】
本発明の方法に用いられる好ましい基質は、式中：
−Ｒ１は、１個から４個の炭素原子、好ましくは１個または２個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
−ｎは、１または２に等しい
式（Ｉ）に相当する。
【００２１】
式（Ｉ）の化合物が、単独のトリフルオロメチル基（ｎ＝１）を含む場合、３位または４位にあるのが有利である。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物が、２個のトリフルオロメチル基（ｎ＝２）を含む場合、３位と４位または３位と５位にあるのが好ましい。
【００２３】
本発明の方法によれば、還元操作は、好ましくはラクトバチラスケフィリ由来の酵素を用いることにより実施される。
【００２４】
前記酵素は、商品として入手でき、名称０５６４３でＦｌｕｋａにより市販されている。
【００２５】
微生物は、収集番号ＤＳＭ２０５８７の微生物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
前述のように、前記還元は、単離された酵素またはそれを含有するバイオマスの存在下で実施できる。
【００２７】
本発明の第１の変法によれば、酵素を、好ましくは、０．１モル／ｌのリン酸一カリウムおよびリン酸二カリウムを含むリン酸緩衝液により得られる、ｐＨ値が約７を有する緩衝培地に導入する。
【００２８】
補助因子、すなわちＮＡＤＰＨ（リン酸ニコチンアデニンジヌクレオチド）を加える。一般に、最終培地における補助因子の最終濃度が、好ましくは０．１ミリモル／ｌから１ミリモル／ｌの間になるような量で加える。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、反応経過中酸化を受ける補助因子は、例えば、第二級アルコール、好ましくはシクロペンタノールまたはイソプロパノールを用いるなど、従来の手段により再生される。
【００３０】
使用されるアルコール量は、基質の化学量論に関して過剰である。培地中のアルコール濃度は、２０ミリモル／ｌから１００ミリモル／ｌの間になるように決められる。
【００３１】
次に還元を受けるケトン化合物を導入する。５ミリモル／ｌから２０ミリモル／ｌの間の濃度で用いることが有利である。
【００３２】
前記反応は、好ましくは３０℃から３７℃の間の温度で実施する。
【００３３】
前記反応は大気圧下で実施され、好ましくは、反応培地を攪拌する。
【００３４】
培地は、攪拌状態に維持し、その時間は大いに変えてもよい。６時間から２４時間が最も多い。
【００３５】
反応終了時に、得られた光学活性アルコールを、通常の様式、例えば、ジクロロメタン、エチルエーテル、酢酸エチルまたは任意の他の適切な溶媒など、好適な有機溶媒による抽出操作を実施することにより分離する。
【００３６】
本発明の方法の他の好ましい変法は、微生物細胞に含まれる酵素を用いることである。
【００３７】
本発明の方法の第１ステップは、乳酸杆菌の培養に用いられる従来の培地においてラクトバチラスケフィリ株の発酵を実施することである。
【００３８】
第２のステップは、前もって得られたバイオマスの存在下で還元反応を実施することである。
【００３９】
この目的のために、採用される出発点は、例えば、炭素源、窒素源および無機塩を含む醗酵培地である。
【００４０】
記述し得る炭素源の例としては、特にマルトース、グルコース、サッカロース、ラクトース、グリセロール、デンプン、ソルビトール、マンニトール、およびプロピレングリコールである。
【００４１】
窒素源に関しては、好ましくは、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、硝酸ナトリウムまたはアミノ酸を含有する任意の他の窒素源を使用できる。
【００４２】
一般に、鉱塩を添加することができ、窒素源と呼ばれるものに加えて、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガンまたはリン酸カリウムも挙げることができる。
【００４３】
組成物および醗酵培地の各種成分濃度の説明は実施例を参照されたい。
【００４４】
乳酸杆菌の培養は、嫌気性または嫌気性様条件下で実施され、当業者は、これらの条件下で醗酵を完全に実施できる。
【００４５】
実用的観点から、醗酵培地に、例えば多くの場合、１０重量％から２０重量％の濃度で、例えばジメチルスルホキシドまたはグリセロールなどの凍結保護剤を含有することができる水性懸濁液の形態で、ラクトバチラス、好ましくはラクトバチラスケフィリの接種材料を接種する。
【００４６】
醗酵は、有利には６から７のｐＨ値で、かつ好ましくは２５℃から３０℃の温度で実施する。
【００４７】
醗酵時間は、一般に２日から４日であり、３日が最も多い。
【００４８】
醗酵手順の終了時に、バイオマスを従来法により回収する。例えば、約３分から１５分間の遠心分離操作を実施することが、次いで上澄液物質をデカンテーションにより除いて下層物質を回収し、これは生理水で洗浄することが多い。
【００４９】
得られたラクトバチラスのバイオマスは、乾燥細胞で表わして１ｇ／ｌから５ｇ／ｌである。
【００５０】
次に、ケトン化合物のエナンチオ選択的還元は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を発現するラクトバチラスのバイオマスの存在下で実施される。
【００５１】
前記バイオマスは、緩衝液も含む反応培地１リットル当たり乾燥物質１０ｇから３０ｇの割合で導入される。
【００５２】
前述のように、ｐＨ値が約７を有する緩衝培地、好ましくは０．１モル／ｌのリン酸一カリウムおよびリン酸二カリウムを含むリン酸緩衝液により得られる緩衝培地を選択する。
【００５３】
還元を受けるケトン化合物も導入する。有利には５ミリモル／ｌから２０ミリモル／ｌである濃度で使用する。
【００５４】
反応は、有利には３０℃から３７℃である温度で実施する。
【００５５】
反応は、大気圧下で実施し、反応培地は攪拌することが好ましい。
【００５６】
培地は、攪拌状態を維持し、その時間は大いに変えてもよい。６時間から２４時間が最も多い。
【００５７】
反応終了時に、従来法、例えば遠心分離によりバイオマスを分離する。光学活性アルコールを含む上澄液物質を回収し、通常の様式、例えば、ジクロロメタン、エチルエーテル、酢酸エチルまたは任意の他の適切な溶媒など、好適な有機溶媒による抽出操作を実施することにより分離する。
【００５８】
本発明の方法によれば、プロキラルケトンから優れた収率で、かつ１００％に到達できる非常に高いエナンチオ過剰率の光学活性アルコールを得ることができる。得られたアルコールの大部分は、立体配置が（Ｒ）である。
【００５９】
本発明の実施形態を以下に記載するが、その説明はいかなる限定的特性を与えるものではない。
（実施例１）
アルコール−デヒドロゲナーゼを発現する株の培養
ラクトバチラスケフィリ株ＤＳＭ２０５８７を、以下に記載されたＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）培地中、準嫌気性静置培養条件で、２５℃で７２時間培養する。
【００６０】
培養培地［培地ＭＲＳ（Ｄｉｆｃｏ−０８８１）］は、以下の組成物である：
−ペプトン３号                                        １０ｇ
−牛肉エキス                                          １０ｇ
−酵母エキス                                          ５ｇ
−デキストロース                                      ２０ｇ
−Ｔｗｅｅｎ８０（ソルビトールエステル）              １ｇ
−クエン酸アンモニウム                                ２ｇ
−酢酸ナトリウム                                      ５ｇ
−硫酸マグネシウム                                    ０．１ｇ
−硫酸マンガン                                        ０．０５ｇ
−リン酸二カリウム                                    ２ｇ
−水                                                  １ｌ
ｐＨ値は６．５である。
【００６１】
培地は最初に、オートクレーブ中、１２１℃、２０分間加熱する従来法により滅菌する。
【００６２】
培地（１００ｍｌ）に、グリセロール含有水（グリセロール１５％）中のラクトバチラスケフィリ細胞懸濁液０．１ｍｌを接種し、２５℃で７２時間インキュベートする。
【００６３】
得られたバイオマスは、乾燥細胞として表し１．５ｇ／ｌである。
【００６４】
得られた細胞を生理水で洗浄する。
（実施例２）
３，５−ビス（トリフルオロメチル）アセトフェノン（ＢＴＡ）の還元
実施例１の記載で得られた細胞を、１リットル当たり乾燥物質１５ｇの細胞濃度で、ｐＨ値が７の０．１モルリン酸緩衝液に懸濁させる。
【００６５】
３７℃の温度で、ＢＴＡを１０ミリモル／ｌの割合で加える。
【００６６】
８時間後、反応が完了し、細胞を遠心分離にかけて分離し、上澄液物質をジクロロメタンで抽出する。
【００６７】
有機溶媒を蒸発させ、収率は逆相カラム上の液体クロマトグラフィ（カラムＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００ＲＰ−１８．５μｍ；溶出液Ａ：水／０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸および溶出液Ｂ：アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸；勾配９０Ａ／１０Ｂから１０Ａ／９０Ｂで５分）による分析により決定する。
【００６８】
［（Ｒ）−（Ｓ）］と［（Ｒ）＋（Ｓ）］ｘ１００の％で表されるエナンチオ過剰率ｅｅは、気相クロマトグラフィ（ＧＰＣ）（キラルカラムＣｈｉｒａｌｓｉｌ  Ｄｅｘ  ＣＢ：１分当たり２℃の昇温速度で１００℃から１６０℃）により決定する。
【００６９】
この結果は以下のとおりである：
−アルコール（Ｒ）の収率：１００％
−光学純度：ｅｅ＝アルコール（Ｒ）について１００％。
（実施例３および４）
実施例１および２の操作手順を繰り返すが、トリフルオロメチル基によりモノ置換されたケトン基質すなわち：
−３−トリフルオロメチルアセトフェノン（実施例３）、および
−４−トリフルオロメチルアセトフェノン（実施例４）
を用いる。
【００７０】
得られた結果を表（Ｉ）に記載する：
【００７１】
【表１】
2004533269.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004533269.tif 000005
2004533269.tif 000006
2004533269.tif 000007
2004533269.tif 000008
2004533269.tif 000009
2004533269.tif 000010
2004533269.tif 000011
2004533269.tif 000012
2004533269.tif 000013
2004533269.tif 000014
2004533269.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533269.tif 000016
【国際調査報告】
2004533269.tif 000017
2004533269.tif 000018
2004533269.tif 000019
2004533269.tif 000020
2004533269.tif 000021
2004533269.tif 000022