(57)【要約】一般構造式（Ｉ）、すなわち、【化３９】2004533402.tif 000042の式の化合物ならびにその塩および溶媒化合物、それに、ＰＤＥＳインヒビターとしてのそれらの使用。
2004533402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式、すなわち、
【化１】
2004533402.tif 000032
式中、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２は水素またはメチルである式を有する化合物、およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物。
【請求項２】
Ｒ２が、水素である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２が、メチルである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式、すなわち、
【化２】
2004533402.tif 000033
の式を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
以下の式、すなわち、
【化３】
2004533402.tif 000034
【化４】
2004533402.tif 000035
および、その薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物からなるグループから選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
薬学的に許容可能な希釈剤または担体と共に請求項１に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【請求項７】
ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥの阻害が治療上有効である病態の治療において雄動物または雌動物を治療する方法であって、薬学的に許容可能な希釈剤または担体と共に有効量の請求項１に記載の化合物を含む薬学的組成物で、前記動物を治療する工程を含む方法。
【請求項８】
前記病態が、雄の勃起障害である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療が、経口治療である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記病態が、雌の興奮障害である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、経口治療である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記病態が、安定狭心症、不安定狭心症、異型狭心症、高血圧症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、悪性高血圧症、褐色細胞腫、急性呼吸促迫症候群、鬱血性心不全、急性腎不全、慢性腎不全、アテローム性動脈硬化症、血管開通性減退、末梢血管疾患、血管障害、血小板血症、炎症性疾患、心筋梗塞、脳卒中、気管支炎、慢性喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、緑内障、消化性潰瘍、腸運動障害、経皮的経管的冠状動脈形成術後疾患、頸動脈血管形成疾患、バイパス手術後移植片狭窄、骨粗鬆症、早産、良性前立腺肥大、および過敏性腸症候群からなるグループから選択される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥの阻害が治療上有効である病態の治療においてヒトまたは非ヒト動物の生体を治療する方法であって、前記生体内に治療上有効量の請求項１に記載の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
雄の勃起障害または雌の興奮障害の治療法または予防治療法であって、有効用量の請求項１に記載の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物を前記動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥの阻害が治療上有効である病態を治療または予防するための薬物を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
ヒト用医薬用製造物であって、
（ｉ） 以下の式、すなわち、
【化５】
2004533402.tif 000036
の式を有する化合物、
（ｉｉ） 容器、および
（ｉｉｉ） 以下の式、すなわち、
【化６】
2004533402.tif 000037
式中、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３は水素または以下の式、すなわち、
【化７】
2004533402.tif 000038
の式で表される化合物、およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物を開示する添付文書を含むヒト用医薬用製造物。
【請求項１７】
前記添付文書が、（ｉｉｉ）の化合物がｃＧＭＰ ＰＤＥ５インヒビターであると明記している請求項１６に記載の製造物。
【請求項１８】
前記添付文書が、（ｉｉｉ）の化合物が、雄の勃起障害または雌の性的興奮障害の治療に有用であると明記している請求項１７に記載の製造物。
【請求項１９】
前記添付文書が、（ｉｉｉ）の化合物が、以下の式、すなわち、
【化８】
2004533402.tif 000039
【化９】
2004533402.tif 000040
【化１０】
2004533402.tif 000041
の式の化合物およびその混合物からなるグループから選択される化合物であると明記している請求項１６乃至１８のいずれかに記載の製造物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、一連の化合物、当該化合物の調製方法、当該化合物を含む薬学的組成物、治療薬としてのその使用、当該化合物を開示した製造物に関する。  特に、本発明は、環状グアノシン ３’， ５’−モノリン酸特異的ホスホジエステラーゼ（ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ）、とりわけ、ＰＤＥ５の強力かつ選択的なインヒビターであって、種々の治療分野で有用であり、このような阻害が有利であると考えられる心血管障害および勃起障害の治療上有用な化合物に関する。
【０００１】
本発明は、以下の式（Ｉ）、すなわち、
【０００２】
【化１１】
2004533402.tif 000003
【０００３】
式中、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２は水素またはメチルである式を有する化合物、およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物（例えば、水和物）を提供する。
【０００４】
また、本発明は、添付文書、容器、および以下の式、すなわち、
【０００５】
【化１２】
2004533402.tif 000004
【０００６】
の式を有する投与形態の化合物を含み、かつ当該、添付文書が、以下の式（Ｉａ）、すなわち、
【０００７】
【化１３】
2004533402.tif 000005
【０００８】
式中、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３は水素または以下の式、すなわち、
【０００９】
【化１４】
2004533402.tif 000006
【００１０】
の式の化合物、ならびにその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物を開示しているヒト用医薬用製造物を提供する。
【００１１】
本明細書で使用する、「アルキル」の語は、表示した数の炭素原子を含む直鎖および分枝鎖炭化水素基であって、一般的には、メチル基、エチル基、ならびに直鎖および分枝鎖プロピル基およびブチル基が含まれる。  「アルキル」の語には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、およびシクロペンチルとして定義される「シクロアルキル」が含まれる。
【００１２】
「容器」の語は、医薬品の保存、輸送、調剤、および／または取扱いに適切な任意の容器およびその密閉手段を意味する。
【００１３】
「添付書類」の語は、製品に添付された情報、つまり、製品の取扱い方法の説明、医師、薬剤師、および患者が製品の使用に関して詳細な説明に基づいて判断するために必要な安全性および有効性のデータが盛り込まれた情報を意味する。添付書類は、一般に、医薬品用「ラベル」の形態とする。
【００１４】
本発明による特定の化合物は、以下の構造（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を有する。
【００１５】
【化１５】
2004533402.tif 000007
【００１６】
【化１６】
2004533402.tif 000008
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を有するので、立体異性体として存在し得る。  本発明には、式（Ｉ）の化合物の混合物および独立した個別の立体異性体が含まれる。  式（Ｉ）の化合物はまた、互変異性型で存在することができ、本発明には、互変異性型の混合物および独立した個別の互変異性型が含まれる。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な酸を使用して形成された酸付加塩であり得る。  適切な塩の例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ−トルエンスルホン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。  式（Ｉ）の化合物はまた、塩基に対して薬学的に許容可能な金属塩、特にアルカリ金属塩およびアルカリ度類金属塩を提供することができる。  その例として、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩がある。
【００１９】
本発明の化合物は、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ５の強力かつ選択的なインヒビターである。  したがって、式（Ｉ）の化合物は、治療用、詳細にはＰＤＥ５の選択的阻害が有利であると考えられる種々の病態の治療について関心が寄せられている。
【００２０】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、環状ヌクレオチド（環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ））の加水分解を触媒する。  ＰＤＥは、少なくとも７つのイソ酵素に分類されており、多数の組織中に存在する（Ｊ．Ａ． Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ７５， ｐ．７２５ （１９９５））。
【００２１】
ＰＤＥ５阻害は、特に魅力的な標的である。  ＰＤＥ５の強力かつ選択的な阻害により、血管拡張、弛緩、および利尿作用が得られ、この作用の全ては種々の疾患状態の治療に有利である。  この分野の研究によって、ｃＧＭＰの基本構造に基づいたいくつかのインヒビターのクラスが得られている（Ｅ． Ｓｙｂｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｔ． Ｏｐｉｎ． Ｔｈｅｒ． Ｐａｔ．， ７， ｐ．６３１ （１９９７））。
【００２２】
したがって、ＰＤＥ５インヒビターの生化学的、生理学的および臨床的効果は、平滑筋、腎臓、止血、炎症および／または内分泌腺機能の調整が望ましい種々の疾患状態にて、その有用性が示唆されている。  したがって、式（Ｉ）の化合物は、多数の障害（安定、不安定、および異型（プリンズメタル）狭心症、高血圧症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、悪性高血圧症、褐色細胞腫、鬱血性心不全、急性呼吸促迫症候群、急性および慢性腎不全、アテローム性動脈硬化症、血管開通性減退（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術後疾患、頸動脈血管形成疾患またはバイパス手術後移植片狭窄）、末梢血管疾患、レーノー病などの血管障害、血小板血症、炎症性疾患、心筋梗塞、脳卒中、気管支炎、慢性喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、緑内障、骨粗鬆症、早産、良性前立腺肥大、消化性潰瘍、雄の勃起障害、雌の性的興奮障害、および腸運動性障害によって特徴付けられる疾患（例えば、過敏性腸症候群）を含む障害）の治療に有用である。
【００２３】
特に重要な用途は、不能症の１つの形態であり、一般的な医学上の問題である男性の勃起障害治療がこれに該当する。  不能症は、男性の性交力の欠如と定義することができ、陰茎の勃起もしくは射精またはその両方の不能を含み得る。  勃起障害の発症率は加齢につれて増加し、４０歳を超える男性の約５０％がある程度の勃起障害を発症している。
【００２４】
これに加えてさらに重要な用途は、女性の性的興奮障害とも呼ばれる女性の興奮障害の治療である。  女性の興奮障害は、性的活動の完了までの性的興奮の適切な潤滑／隆起反応の達成または維持の再発性の不能と定義する。  興奮反応は、骨盤、膣潤滑、ならびに外性器の拡大および隆起からなる。
【００２５】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、男性の勃起障害および女性の性的興奮障害の治療に有用であると想定される。  したがって、本発明は、ヒトを含む雄動物での勃起障害および雌動物での性的興奮障害の治療または予防用の薬物を製造するための、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容可能な塩、またはその構成要素を含む薬学的組成物の使用に関する。
【００２６】
「治療」の語には、治療される状態または症状の進行または重症度を防止、軽減、停止、または逆転が含まれる。  したがって、「治療」の語には、必要に応じて、医学的治療および／または予防のための投与が含まれる。
【００２７】
「式（Ｉ）の化合物」またはその生理学的に許容可能な塩もしくは溶媒化合物を、そのままで、またはいずれかの構成要素を含む薬学的組成物として投与できることは理解できよう。
【００２８】
本発明の化合物が、主にヒトの性的不能（男性の勃起障害および女性の性的興奮障害）の治療での用途が想定されるにもかかわらず、これらを他の疾患の治療に使用することもできる。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる態様では、安定、不安定、および異型（プリンズメタル）狭心症、高血圧症、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、鬱血性心不全、急性呼吸促迫症候群、急性および慢性腎不全、アテローム性動脈硬化症、血管疎通の減少病態（例えば、ＰＴＣＡ後またはバイパス手術後移植片狭窄）、末梢血管疾患、レーノー病などの血管障害、血小板血症、炎症性疾患、心筋梗塞の予防、脳卒中の予防、脳卒中、気管支炎、慢性喘息、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、緑内障、骨粗鬆症、早産、良性前立腺肥大、雄および雌の勃起障害、および腸運動性障害によって特徴付けられる疾患（例えば、ＩＢＳ））の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、上記の病態および障害の治療用薬物の製造のための式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
【００３１】
さらに他の態様では、本発明は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物を生体に投与する工程を含む、上記病態および障害を患ったヒトまたは非ヒト動物の治療方法を提供する。
【００３２】
本発明の化合物を、任意の適切な経路（例えば、経口、口内、吸入、舌下、直腸、経膣、経尿道、鼻腔、局所、経皮、すなわち、経表皮）、または（静脈内、筋肉内、皮下、および冠動脈内を含む）非経口投与）で投与することができる。ニードルもしくはシリンジまたは高圧技術（ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標）など）を使用して、非経口投与を行うことができる。
【００３３】
本発明の化合物の経口投与が、好ましい経路である。  経口投与は最も好都合であり、他の投与経路に関連する欠点が回避される。  嚥下障害または経口投与後の薬物吸収障害患者については、薬物を非経口（例えば、舌下または口内）で投与することができる。
【００３４】
本発明での使用に好適な化合物および薬学的組成物には、有効量の有効成分を投与してその意図する目的が達成されるものが含まれる。  より詳細には、「治療有効量」は、治療を受ける被験体の発症の予防または既存の症状の緩和に有効な量を意味する。  有効量の決定は、特に本明細書中に記載の詳細な開示に照らして、当業者が十分に実施可能な範囲内である。  「治療有効量」は、所望の効果が得られる化合物の量をいう。  このような化合物の毒性および治療有効性を、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的方法によって同定することができる（例えば、ＬＤ５０（５０％の集団の致死量）およびＥＤ５０（５０％の集団における治療有効量））。  毒性と治療効果との間の用量が治療指標であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比で示される。  高い治療指数を示す化合物が、好ましい。  このようなデータから得た情報を、ヒトでの投与範囲を決定するために用いることができる。このような化合物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含むが毒性がほとんど無いか全く無い循環濃度の範囲内とする。  投与量は、この範囲内で変化するが、使用した投与形態および使用した投与経路に依存する。
【００３５】
正確な処方、投与経路および投与量を、患者の状態に照らして各医師が選択することができる。  投与量および投与間隔を、治療効果の維持に十分な血漿中の活性レベルが得られるよう、個別に調整することができる。
【００３６】
組成物の投与量は、治療を受ける被験体、被験体の体重、苦痛の重症度、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。
【００３７】
詳細には、上掲の病態および障害の治療および予防のためのヒトへの投与のために、式（Ｉ）の化合物の経口投与量は、一般に、平均的な成人患者（７０ｋｇ）では、１日あたり約０．５〜約１０００ｍｇである。  したがって、一般的な成人患者のために、各錠剤または各カプセルは、薬学的に許容可能な賦形剤または担体中に０．２〜５００ｍｇの活性化合物を含み、単回または複数回用量で、１日当たり１回または数回投与する。  静脈内、口内または舌下投与のための投与量は、典型的には、１回の用量当たり０．１〜５００ｍｇが必要である。  実際には、医師が各個体に最も適切な実際の投与処方を決定し、これは、年齢、体重、および患者が示す特定の反応によって変化する。  上記の投与量は、平均的な場合の例であるが、場合によってはより高い投与量またはより低い投与量とすることが適切であり、このことは、本発明の範囲内である。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物を、それ単独で、ヒトに投与することができるが、一般的には、意図する投与経路および標準的な薬学的慣例に関して選択した薬学的担体との混合物として投与される。  したがって、本発明で使用される薬学的組成物を、式（Ｉ）の化合物を薬学的に使用可能な調製物へ容易に加工ならしめる賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に受容可能な担体を用いた従来の方法で処方することができる。
【００３９】
これらの薬学的組成物を、従来の方法（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖化、糊状化、乳化、カプセル化、閉じ込み、または凍結乾燥処理）で製造することができる。  適切な処方は、選択した投与経路に左右される。  治療有効量の本発明の化合物を経口投与する場合、一般的には、組成物は、錠剤、カプセル、粉剤、溶液またはエリキシルの形態とする。  錠剤形態で投与する場合、組成物は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固形担体をさらに含む。  錠剤、カプセルおよび粉剤は、約５％〜約９５％の本発明の化合物、好ましくは約２５％〜約９０％の本発明の化合物を含む。  液体形態で投与する場合、水、鉱油、動物または植物起源の油などの液体担体を添加することができる。  液体形態の組成物は、生理食塩水、デキストロース、または他の糖類溶液またはグリコールをさらに含むことができる。  液体形態で投与する場合、組成物は、約０．５重量％〜約９０重量％の本発明の化合物、好ましくは約１重量％〜約５０重量％の本発明の化合物を含む。
【００４０】
治療有効量の本発明の化合物を、静脈内、皮膚、または皮下注射によって投与する場合、組成物は発熱物質を含まない非経口投与で許容可能な水溶液の形態とする。  ｐＨ、等張性、安定性などを十分考慮したこのような非経口投与で許容可能な水溶液の調製物は、当該技術分野で周知の範囲内のものである。  静脈内、皮膚または皮下注射に好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、等張性賦形剤を含む。
【００４１】
経口投与のために、化合物を、式（Ｉ）の化合物と当該分野で周知の薬学的に許容可能な担体とを組み合わせて容易に処方することができる。  このような担体によって、本発明の化合物を、治療を受ける患者のための経口摂取用の錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などの形態に調製することができる。  式（Ｉ）の化合物への固形賦形剤の添加、任意選択的に得られた混合物の粉砕、および、所望であれば、適切な助剤添加後の顆粒混合物の処理によって、経口用の薬学的調製物を得ることができる。  適切な賦形剤として、例えば、充填剤およびセルロース調製物がある。  所望であれば、崩壊剤を添加することもできる。
【００４２】
吸入投与のために、本発明の化合物を、加圧パックまたは適切な高圧ガスを含む噴霧器によるエアゾールスプレーの形態で都合よく送達させる。  加圧エアゾールの場合、一定量を送達させるバルブを設けることで、投与単位を決定することができる。  ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤と化合物との粉末を含む、吸入器または注入器用の、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【００４３】
注射（例えば、ボーラス注射または輸液）による非経口投与用の化合物を処方することができる。  単位投与形態（例えば、防腐剤を添加したアンプルまたは複数回投与容器）の注射用調製物を得ることができる。  組成物は、懸濁液、溶液、または油−水乳濁液、または水−油乳濁液などの形態とすることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などを含むことができる。
【００４４】
非経口用薬学的調製物として、水溶性活性化合物の水溶液がある。  さらに、活性化合物の懸濁液を、油性の注射懸濁液として適切に調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤として、脂肪油または合成脂肪酸エステルがある。  水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含むことができる。  任意に、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶解性を増加させて高濃度の溶液が調製可能な薬剤を含むことができる。  あるいは、本発明の組成物は、使用前に適切な賦形剤（例えば、無滅菌ピロゲン水）を構成するために粉末形態とすることができる。
【００４５】
本発明の化合物を、例えば、従来の座剤基剤を含む座剤または浣腸剤などの直腸用組成物として処方することができる。  先述した調製物に加えて、貯留型調製物として化合物を処方することができる。  このような長期作用性調製物は、移植（例えば、皮下または筋肉内移植）または筋肉内注射によって投与することができる。  したがって、例えば、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容可能な油の乳濁液として）、またはイオン交換樹脂、または、例えば、やや難溶性の塩などの溶解性の小さな誘導体と共に化合物を処方することができる。
【００４６】
本発明の化合物の多くは、薬学的に適合可能な対イオンを含む塩として得ることができる。  このような薬学的に許容可能な塩基付加塩とは、遊離酸による生物学的効果および性質を保持する塩、および適切な無機または有機塩基との反応によって得られる塩である。
【００４７】
特に、式（Ｉ）の化合物を、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態、単独または賦形剤との混合物としてのカプセルもしくは小卵の形態、または香料または着色料を含むエリキシル剤または懸濁液の形態で経口、口内、または舌下投与することができる。  このような液体調製物を、懸濁剤などの薬学的に許容可能な添加物を使用して調製することができる。  化合物を、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または結腸内）で注射することもできる。  非経口投与のために、化合物を滅菌水溶液の形態で使用することが最も好ましく、このものは、血液と等張の溶液を調製するために他の物質（例えば、塩または単糖類（マンニトールまたはグルコース））を含むことができる。
【００４８】
獣医学的用途において、式（Ｉ）の化合物またはその非毒性塩は、通常の動物への適用手順に従って、許容可能な調製物として適切に投与される。  獣医は、特定の動物に最も適切な投与処方および投与経路を容易に決定することができる。
【００４９】
したがって、本発明のさらに他の態様によれば、薬学的に許容可能な希釈剤またはその担体と共に式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物を提供する。  本発明は、薬学的に許容可能な希釈剤またはその担体と式（Ｉ）の化合物を混合する工程を含む、式（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物の調製法をさらに提供する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態は、薬学的に許容可能な希釈剤またはその担体と共に式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトを含む雄動物の勃起障害または雌動物の性的興奮障害の治療または予防用の薬学的組成物を含む。
【００５１】
本発明の他の重要な態様は、
（１） 以下の式、すなわち、
【００５２】
【化１７】
2004533402.tif 000009
【００５３】
の式を有する化合物、
（２） 容器、および
（３） 以下の式 （Ｉａ）、すなわち、
【００５４】
【化１８】
2004533402.tif 000010
【００５５】
式中、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２は水素またはメチルであり、Ｒ３は水素または以下の式、すなわち、
【００５６】
【化１９】
2004533402.tif 000011
【００５７】
の式で表される化合物、およびその薬学的に許容可能な塩および溶媒化合物を開示する添付文書を含むヒト用医薬用製造物を提供することにある。
【００５８】
添付文書には、一般に、以下の式、すなわち、
【００５９】
【化２０】
2004533402.tif 000012
【００６０】
【化２１】
2004533402.tif 000013
【００６１】
【化２２】
2004533402.tif 000014
【００６２】
の式で表される化合物、およびその混合物からなるグループから選択される式（Ｉａ）の化合物が記載されている。
【００６３】
この添付書類は、医師、薬剤師および患者が、製品の使用に関して詳細な説明に基づいて判断するために必要な安全性および有効性のデータと共に、医薬品の取り扱い方法を説明する。  添付書類は、一般に、医薬品の「ラベル」とする。
【００６４】
本発明の製造物の一部である添付書類は、選択的ＰＤＥ５インヒビターが、ＰＤＥ５の阻害が所望される状態の治療に有用であることを示す。  添付書類はまた、必要に応じて、容器中に存在する１つまたは複数の単位投与形態の投与に関する説明を提供する。
【００６５】
好ましい治療病態には、添付書類に記載の通り、性的不能（男性の勃起障害を含む）、および女性の性的不能、より好ましくは女性の興奮障害（ＦＡＤ）が含まれる。  好ましい治療病態は、男性の勃起障害である。
【００６６】
製造物を経口投与形態としても、このような形態は当業者に認識されおり、例えば、液体調製物、錠剤、カプセルおよびゲルカプセルなどの形態がある。  投与形態としては、固体の投与形態が好ましい。  薬学的に許容可能な任意の経口用賦形剤は、このような投与形態の調製に適切である。
【００６７】
本発明の製造物で使用される容器は、薬学分野において周知のものである。  一般に、容器は、ブリスター包装、ホイルパケット、キャップまたは栓を有するガラス製もしくはプラスチック製ボトル、または患者または薬剤師による使用に適切なその他の物である。  好ましくは、容器は、１〜１０００個の固体投与形態、好ましくは１〜５００個の固体投与形態、最も好ましくは５〜３０個の固体投与形態に対応するサイズである。
【００６８】
製造物内に用いる化合物は、Ｄａｕｇａｎの米国特許第５，８５９，００６号で開示され、以下の構造式、すなわち、
【００６９】
【化２３】
2004533402.tif 000015
【００７０】
の式で表される選択的ＰＤＥ５インヒビター、すなわち、（６Ｒ−トランス）−６−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチルピラジノ［１’，２’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン、あるいは、（６Ｒ，１２ａＲ）− ２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピラジノ［２’，１’：６，１］ ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン）とも称される化合物である。  この選択的インヒビターを、本明細書に参考までに取り込んだ、米国特許第５，８５９，００６号に記載のようにして錠剤に処方することができる。  これら錠剤を、ブリスターパックに充填し、本発明の製造物の実施形態を提供するために、添付書類を添付する。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物を、当該技術分野で周知の任意の適切な方法または本発明の一部を形成する以下の方法によって調製することができる。  以下の方法にあっては、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、先の構造式（Ｉ）で定義した通りである。  特に、本明細書に参考までに取り込んだ、Ｄａｕｇａｎの米国特許第５，８５９，００６号では、以下の構造式（ＩＶ）、すなわち、
【００７２】
【化２４】
2004533402.tif 000016
【００７３】
の構造式で表される化合物の調製を開示している。  構造式（Ｉ）の化合物を、トリプトファンエステルと適切なアルデヒドとの反応によって同様に調製し、所望の中間物質が得られる。  次いで、得られた中間物質を、適切なアミンとの反応によって環状化することで、構造式（Ｉ）の化合物が得られる。  この環状化反応は、Ｄａｕｇａｎの米国特許第５，８５９，００６号で開示されている。
【００７４】
構造式（Ｉ）の化合物の合成にあっては、ベンジルクロロホルムおよびトリクロロエチルクロロホルメートなどの当業者に周知の保護化合物および保護基を使用することができる。  このような保護基は、例えば、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅら、「有機合成における保護基」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ＮＹ （１９９９）に開示されている。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物を、式（Ｉ）の他の化合物に変換することができる。  したがって、例えば、構造式（ＩＩ）の化合物を、構造式（ＩＩＩ）の化合物に変換することができる。
【００７６】
式（Ｉ）の化合物を、上記の方法によって、式（ＩＶ）の適切な立体異性体由来の各立体異性体として、または式（ＩＶ）の適切なラセミ化合物由来のラセミ混合物として調製することができる。  本発明の化合物の各立体異性体は、例えば、Ｈｙｐｅｒｓｉｌナフチル尿素のようなキラルカラムを用いたＨＰＬＣ、あるいは立体異性体の塩の分離方法を用いて、ラセミ混合物をその構成立体異性体へ分離するための当該分野で周知の方法を用いた分割方法によって、ラセミ化合物から調製することができる。  適切な溶媒からの再結晶またはその蒸発によって、溶媒分子に会合している本発明の化合物を単離することができる。
【００７７】
塩基性中心を含む式（Ｉ）の薬学的に許容可能な酸付加塩を、従来の方法に従って調製することができる。  例えば、遊離塩基の溶液を、原液または適切な溶液の適切な酸で処理して得られた塩を、反応溶媒の濾過または減圧蒸発のいずれかによって単離することができる。  薬学的に許容可能な塩基付加塩を、同様の方法によって、式（Ｉ）の化合物の溶液を適切な塩基で処理することで得られる。  両方の型の塩を、イオン交換樹脂技術を使用して形成するか、あるいは相互変換することができる。  したがって、本発明のさらなる態様によれば、式（Ｉ）の化合物または塩もしくは溶媒化合物（例えば、水和物）の調製方法が提供され、それによって、（ｉ）塩または（ｉｉ）溶媒化合物（例えば、水和物）が形成される。
【００７８】
本願実施例では、以下の略称を使用する：ｒｔ（室温）、ｍｉｎ（分）、ｈ（時間）、ｇ（グラム）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、ｍ．ｐ．（融点）、ｅｑ（等価物）、Ｌ（リットル）、ｍＬ（ミリリットル）、μＬ（マイクロリットル）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）、ＣＨＣｌ３（クロロホルム）、ＣＨ３ＮＨ２（メチルアミン）、ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＥｔＯＨ（エタノール）、ＭｅＯＨ（メタノール）、Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）、ＡｃＣｌ（塩化アセチル）、ＡｃＯＨ（酢酸）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）、およびＴＨＦ（テトラヒドロフラン）。
【００７９】
式（Ｉ）の化合物の一般的合成手順
以下の手順は、構造式（Ｉ）の化合物への一般的経路を例示するものである。一般的な合成経路の一例は、本明細書に参考までに取り込んだ、米国特許第５，８５９，００６号に開示された経路に類似している。  特に、トリプトファンエステル（Ｖ）を、適切なアルデヒド、例えば、（ＶＩ）とのピクテ−シュペングラー反応に供して、β−カルボリン（ＶＩＩ）が得られる。  化合物（ＶＩＩ）のクロロアセチルクロリドでのアシル化によりＮ誘導化化合物（ＶＩＩＩ）が得られ、換言すれば、所望の第一級アミン（ＲＮＨ２）と反応させて、構造式（Ｉ）のジケトピペラジン化合物（ＩＸ）が得られる。
【００８０】
【化２５】
2004533402.tif 000017
【００８１】
【化２６】
2004533402.tif 000018
【００８２】
以下に、構造式（Ｉ）の特定の化合物およびこれら構造の化合物への合成経路を例示する。
【００８３】
実施例１および２の調製
以下の実施例１および２の化合物を、上記の一般的合成スキームによって調製した。  上記合成スキームでの各工程の詳細は、米国特許第５，８４９，００６号に開示されている。
【００８４】
実施例１（化合物（ＩＩ））の調製
【００８５】
【化２７】
2004533402.tif 000019
【００８６】
実施例１を、構造式（Ｖ）のトリプロファンエステルおよび３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから調製した。  トリプロファンエステルおよび３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、ウィスコンシン州、ミルウォーキィーのアルドリッチケミカル社から市販されている。
【００８７】
３，４−ジオキシアセチルベンズアルデヒドの調製
【００８８】
【化２８】
2004533402.tif 000020
【００８９】
０℃の３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２７．６ｇ、０．２０ｍｏｌ）とトリエチルアミン（７２ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）との混合物の塩化メチレン溶液（５００ｍＬ）に、塩化アセチル（３７ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）を滴下した。  反応混合物（桃色のスラリー）を、０℃で１時間撹拌し、濾過した。  濾過ケーキを、塩化メチレン（２×２０ｍＬ）で洗浄した。  次に、合わせた濾過物を、水（１００ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）と飽和重炭酸ナトリウム（３０ｍＬ）との混合物、およびブライン（１００ｍＬ）で連続的に洗浄し、硫酸ナトリウムによって乾燥させた。  懸濁液を、濾過によって明澄化した。  減圧下での懸濁液の濃縮により、暗褐色のオイルが得られ、これをシリカゲルパッドに通過させた。  パッドを、１：１、ヘキサン：酢酸エチル混合物で洗浄した。  濾過物を、減圧濃縮して橙色オイルとして収率９７％の所望の生成物（４３．０ｇ）が得られた。  Ｒｆ＝０．７８（１：１、酢酸エチル：ヘキサン）。
【００９０】
【化２９】
2004533402.tif 000021
【００９１】
シス−１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−３−カルボメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−β−カルボリンの調製
【００９２】
【化３０】
2004533402.tif 000022
【００９３】
Ｄ−トリプトファンメチルエステルヒドロクロリド（ＤＴＭＥ）（２４．１ｇ、０．０９５ｍｏｌ）と、３，４−ジオキシアセチルフェニル（４２ｇ、０．１８９ｍｏｌ）と、酢酸（４７３ｍＬ）との混合物を、４１℃で２３時間撹拌した。  次いで、第２のＤＴＭＥ（１５ｇ、０．０５９ｍｏｌ）を反応混合物に添加し、得られた混合物を４１℃でさらに１９時間撹拌した。  得られた溶液を、ＨＰＬＣで分析した（５．３％ＤＴＭＥ、２．８％アルデヒド、５９．８％主産物、２４．５％副産物）。  反応混合物を塩化メチレン（２００ｍＬ）で希釈し、冷炭酸ナトリウム飽和水溶液（約１Ｌ）でｐＨ７に中和した。  水相を塩化メチレン（２００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を飽和ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥した。  懸濁液を濾過によって明澄化し、濾過物を減圧濃縮して泡状の黄色の固体が得られる。  ２つの主産物を、カラムクロマトグラフィー（８：１塩化メチレン：酢酸エチル〜３：１塩化メチレン：酢酸エチル）で単離した。  主産物（Ｒｆ＝０．５０、３：１塩化メチレン：酢酸エチル）が収率４８％（３８ｇ）で生成し、泡沫様の黄色固体として得られ、ＮＯＥ分析（１０％増強）によって所望のシス異性体であることを確認した。
【００９４】
【化３１】
2004533402.tif 000023
【００９５】
副産物（Ｒｆ＝０．３０、３：１塩化メチレン：酢酸エチル）を収率１４％（１１．２ｇ）で淡黄色の固体として得られ、ＮＯＥ分析（増強なし）によってトランス異性体であることを確認した。
【００９６】
【化３２】
2004533402.tif 000024
【００９７】
シス−１−（３，４−ジオキシアセチルフェニル）−２−クロロアセチル−３−カルボメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−β−カルボリンの調製
【００９８】
【化３３】
2004533402.tif 000025
【００９９】
０℃の上記のシスカルボリン（３４ｇ、０．０８１ｍｏｌ）とトリエチルアミン（１４．５ｍＬ、０．１０５ｍｏｌ）との塩化メチレン（２５５ｍＬ）の混合溶液に、クロロアセチルクロリド（８．３ｍＬ、０．１０５ｍＬ）を滴下した。  混合物を、０℃で１時間撹拌した。  得られた黄色溶液を、水（１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）とブライン（５０ｍＬ）との混合物で連続的に洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥させた。  懸濁液を、濾過によって明澄化した。  減圧下での懸濁液の濃縮により、収率１０６％で泡状の黄色固体として所望の生成物（４３ｇ）が得られ、これを生成しないで使用した。  Ｒｆ＝０．７３（３：１塩化メチレン：酢酸エチル）。
【０１００】
実施例１（化合物ＩＩ）の調製
（６Ｒ，１２ａＲ）−６−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチル−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロピラジノ［１’，２’：１，６］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン
上記クロリド（２５ｇ、０．０５ｍｏｌ）と、メチルアミン（１５０ｍＬ、２．０ＭのＴＨＦ溶液、０．３０ｍｏｌ）と、メタノール（２５０ｍＬ）との混合物を、５０℃で５時間加熱した。  得られた溶液を周囲温度に冷却して、スラリーを得た。  減圧濾過後、濾過ケーキをメタノール（２×２０ｍＬ）で洗浄して、白色固体を得た。  白色固体を０．５Ｎ ＨＣｌ（４００ｍＬ）でスラリーにして、残存メチルアミンを除去し、濾過した。  濾過ケーキを、水（３００ｍＬ）およびヘキサン（３×２０ｍＬ）で連続的に洗浄し、１６時間真空乾燥して収率６９％で生成り色の固体として実施例１（１３ｇ）が得られた。  ｍ．ｐ．２５０．５〜２５６．６℃。  Ｒｆ＝０．６９（３：１：０．５塩化メチレン：酢酸エチル：メタノール）。
【０１０１】
【化３４】
2004533402.tif 000026
【０１０２】
ＮＯＥ分析（１．２％増強）によってシス異性体も確認された。
【０１０３】
実施例２（化合物ＩＩＩ）の調製
実施例１と同様に下記のように実施例２を調製した。
【０１０４】
酢酸バニリンの調製
０℃の塩化メチレン（５００ｍＬ）に溶解したバニリン（３０．４ｇ、０．２０ｍｏｌ）とトリエチレンアミン（３６ｍｌ、０．２６ｍｏｌ）を、塩化アセチル（１８．５ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）に滴下した。  反応混合物（白色スラリー）を、０℃で１０分間撹拌し、濾過した。  濾過ケーキを塩化メチレン（２×２０ｍＬ）で洗浄した。  次に、合わせた濾過物を水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で連続的に洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）にて乾燥させた。  懸濁液を、濾過によって明澄化し、濾過物を減圧下で濃縮して、黄色固体として収率１００％の酢酸バニリン（３９ｇ）が得られた。  Ｒｆ＝０．５（３：１、ヘキサン：酢酸エチル）。
【０１０５】
【化３５】
2004533402.tif 000027
【０１０６】
シス−１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−３−カルボメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−β−カルボリンの調製
Ｄ−トリプトファンメチルエステルヒドロクロリド（ＤＴＭＥ）（２５．４ｇ、０．１０ｍｏｌ）と、酢酸バニリン（３８．８ｇ、０．２０ｍｏｌ）と、酢酸（５００ｍＬ）との混合物を、４２℃で１７時間撹拌した。  次いで、第２のＤＴＭＥ（２１ｇ、０．０８３ｍｏｌ）を琥珀色溶液に添加し、混合物を３６℃でさらに６６時間撹拌した。  得られた琥珀色溶液を、ＨＰＬＣで分析した（１．０％ＤＴＭＥ、３．９％アルデヒド、６４．８％主産物、２５．３％副産物）。  反応混合物を塩化メチレン（４００ｍＬ）で希釈し、炭酸ナトリウム飽和水溶液でｐＨ７に中和した。  水相を塩化メチレン（２５０ｍＬ）で抽出した。  合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム（１５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥した。  懸濁液を濾過によって明澄化し、濾過物を減圧濃縮して泡状の黄色の固体（９０ｇ）が得られる。  ２つの主産物を、カラムクロマトグラフィー（８：１、塩化メチレン：酢酸エチル〜３：１、塩化メチレン：酢酸エチル）で単離した。  主産物（Ｒｆ＝０．５０、３：１、塩化メチレン：酢酸エチル）が、収率５８％（４６ｇ）で淡黄色の固体として得られ、ＮＯＥ分析（１０％増強）によって所望のシス異性体であることを確認した。
【０１０７】
【化３６】
2004533402.tif 000028
【０１０８】
副産物（Ｒｆ＝０．３３、３：１塩化メチレン：酢酸エチル）が収率１５％（１２ｇ）で淡黄色の固体として得られ、ＮＯＥ分析（増強なし）によってトランス異性体であることを確認した。
【０１０９】
【化３７】
2004533402.tif 000029
【０１１０】
シス−１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−２−クロロアセチル−３−カルボメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−β−カルボリンの調製
０℃の上記のシスカルボリン（３７．５ｇ、０．０９５ｍｏｌ）とトリエチルアミン（１７．２ｍＬ、０．１２４ｍｏｌ）との塩化メチレン（３００ｍＬ）混合溶液に、クロロアセチルクロリド（９．８６ｍＬ、０．１２４ｍｏｌ）を滴下した。  混合物を、０℃で０．５時間撹拌した。  得られた黄色溶液を、水（１００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）と飽和ブライン（１００ｍＬ）で連続的に洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥させた。  懸濁液を、濾過によって明澄化し、濾過物を減圧濃縮して、収率１１２％で泡状の黄色固体として所望の生成物（５０ｇ）が得られ、これを精製しないで使用した。  Ｒｆ＝０．７２（３：１塩化メチレン：酢酸エチル）。
【０１１１】
実施例２（化合物ＩＩＩ）の調製
（６Ｒ，１２ａＲ）−６−（４−ジヒドロキシ３−メトキシフェニル）−２−メチル−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロピラジノ［１’，２’：１，６］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン
粗クロリド（２４ｇ、０．０５１ｍｏｌ）と、メチルアミン（１２７ｍＬ、２．０ＭのＴＨＦ溶液、０．２７４ｍｏｌ）と、メタノール（１８９ｍＬ）との混合物を、５０℃で５時間加熱した。  得られた溶液を周囲温度に冷却した。  減圧濾過後、メタノール（２×２０ｍＬ）で洗浄して、収率８９％で灰色がかった白色固体として実施例２（１３ｇ）が得られた。
【０１１２】
ｍ．ｐ．２８８．２〜２９２．２℃。  Ｒｆ＝０．４９（３：１：０．２塩化メチレン：酢酸エチル：メタノール）。
【０１１３】
【化３８】
2004533402.tif 000030
【０１１４】
本発明の化合物は、経口投与用の錠剤に処方することができる。  例えば、式（Ｉ）の化合物を、本明細書に参考までに取り込んだＷＯ ９６／３８１３１に記載の共沈法によって高分子担体と共に分散させることができる。  共沈分散物を、賦形剤とブレンドし、錠剤に打錠し、任意選択的にフィルムでコートすることができる。
【０１１５】
構造式（Ｉ）の化合物を、ＰＤＥ５を阻害する能力について試験した。  化合物のＰＤＥ５活性を阻害する能力を、化合物のＩＣ５０値（すなわち、酵素活性の５０％阻害に必要なインンヒビターの濃度）と比較する。  組換えヒトＰＤＥ５を使用して、構造式（Ｉ）の化合物のＩＣ５０値を決定した。
【０１１６】
本発明の化合物は、一般には、組換えヒトＰＤＥ５に対するＩＣ５０が、約５０μＭ未満、好ましくは約２５μＭ未満、より好ましくは約１５μＭである。  本発明の化合物は、一般には、組換えヒトＰＤＥ５に対するＩＣ５０が、約１μＭ未満、通常は約０．０５μＭ未満である。  本発明の利点を完全に達成するための本発明のＰＤＥ５インヒビターのＩＣ５０は、約０．１ｎＭ〜約１５μＭである。
【０１１７】
組換えヒトＰＤＥの産生およびＩＣ５０を、当該技術分野で周知の方法によって決定することができる。  その方法を、以下のように例示する。
【０１１８】
ヒトＰＤＥの発現
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）での発現
酵母ＡＤＨ２プロモーターおよびターミネーター配列を組み込んだ、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５， ｐｐ． ３０８−３１８ （１９９０）に記載の骨格ＡＤＨ２プラスミド由来の酵母形質転換ベクターを使用し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主が、ヴァージニア州、マナサスに所在のアメリカン タイプ カルチャー コレクションに、１９９８年８月３１日に、受託番号ＡＴＣＣ ７４４６５で寄託されたプロテアーゼ欠損ＢＪ２−５４株である以外は、本明細書に参考までに取り込んだ米国特許第５，７０２，９３６号の実施例７に記載の方法と同様にして、ヒトＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ２、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５およびＰＤＥ７の組換え産生を行った。  形質転換宿主細胞を、微量元素およびビタミンを含む２×ＳＣ−ロイシン培地、ｐＨ ６．２、で増殖させた。２４時間後、ＹＥＰ培地含有グリセロールを、最終濃度２×ＹＥＴ／３％グリセロールに添加した。  約２４時間後、細胞を回収し、洗浄し、−７０℃で保存した。
【０１１９】
ヒトホスホジエステラーゼ調製物
ホスホジエステラーゼ活性の決定
調製物のホスホジエステラーゼ活性を、以下のように決定した。  活性炭分離技術を使用するＰＤＥアッセイを、実質的にＬｏｕｇｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ（１９９６）に記載されたようにして行った。  このアッセイによれば、ＰＤＥ活性は、存在するＰＤＥ活性の量に比例して、［３２Ｐ］ｃＡＭＰまたは［３２Ｐ］ｃＧＭＰを、対応する［３２Ｐ］５’−ＡＭＰまたは［３２Ｐ］５’−ＧＭＰに変換する。  ［３２Ｐ］５’−ＡＭＰまたは［３２Ｐ］５’−ＧＭＰは、ヘビ毒５’−ヌクレオチダーゼの作用によって遊離の［３２Ｐ］リン酸および非標識アデノシンまたはグアノシンに定量的に変換された。  したがって、遊離した［３２Ｐ］リン酸の量は、酵素活性に比例する。  ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１μＭ ＺｎＳＯ４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（の最終濃度）を含む１００μＬ反応混合物中で、３０℃にて、アッセイを行った。  基質の３０％未満を総加水分解する量のＰＤＥ酵素が存在した（連続アッセイ条件）。  基質（１ｍＭ ［３２Ｐ］ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）の添加によってアッセイを開始し、そして、混合物を１２分間インキュベートした。  ７５μｇのハブ毒液を添加し、３分間インキュベートし続けた（合計１５分間）。  ２００μＬの活性化活性炭（２５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４懸濁液、ｐＨ４）を添加して、反応を停止した。  活性炭を沈殿させるために遠心分離（７５０×ｇで３分間）した後、上清のサンプルを、シンチレーションカウンターでの放射能測定に供し、ＰＤＥ活性を計算した。
【０１２０】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＤＥ５の精製
同量の溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭベンズアミジン、および１０μＭ ＺｎＳＯ４）を使用して、細胞ペレットを氷上で解凍した。  ２０，０００ｐｓｉの窒素を使用して、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）にて細胞を溶解した。  溶解物を遠心分離し、０．４５μｍの使い捨てフィルターで濾過した。  濾過物を、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１５０ｍＬのカラムに供した。  カラムを、１．５倍体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭ ビス−トリス プロパン（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＳＯ４）で洗浄し、１２５ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａの段階的勾配での溶出後、１２５〜１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａの直線勾配で溶出した。  直線勾配からの活性画分を、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ビス−トリス プロパン（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＺｎＳＯ４、および２５０ｍＭ ＫＣｌ）を含む１８０ｍＬハイドロキシアパタイトカラムに供した。  充填後、２倍体積の緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、０〜１２５ｍＭリン酸カリウムの直線勾配の緩衝液Ｂで溶出した。  活性画分をプールし、６０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、緩衝液Ｃ（２０ｍＭビス−トリス プロパン（ｐＨ６．８）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、および１０μＭ ＺｎＳＯ４）中で再懸濁した。  プールを、１４０ｍＬのＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−３００ＨＲカラムに供し、緩衝液Ｃで溶出した。  活性画分を５０％グリセロールで希釈し、−２０℃で保存した。
【０１２１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した得られた調製物の純度は、約８５％であった。  これらの調製物の比活性は、１ｍｇタンパク質あたり１分間あたりに加水分解された約３μｍｏｌ ｃＧＭＰであった。
【０１２２】
ｃＧＭＰ−ＰＤＥに対する阻害効果
本発明のｃＧＭＰ−ＰＤＥ活性を、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ３８４， ４３０ （１９７５）を使用して測定した。  反応培地は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２５０μｇ／ｍｌ ５’−ヌクレオチダーゼ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび０．１５μＭ ８−［Ｈ３］−ｃＧＭＰを含んでいた。  特に断りのない限り、酵素として、ヒト組換えＰＤＥ５（ワシントン州、ボウゼルのＩＣＯＳ社）を使用した。
【０１２３】
本発明の化合物は、アッセイにて最終的に２％残存したＤＭＳＯに溶解した。  インキュベーション時間は３０分間であり、その間の総基質変換は３０％を超えなかった。
【０１２４】
一般に、１０ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度を用いて、濃度−反応曲線から、試験した化合物のＩＣ５０値を決定した。  標準的な方法を用いた他のＰＤＥ酵素に対する試験結果は、本発明の化合物が、ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ酵素に対して選択的であることを示した。
【０１２５】
生物学的データ
本発明の化合物のＩＣ５０値は、一般に、５００ｎＭ未満、通常は２５０ｎＭ未満の値を示すことが認められた。  本発明の代表的な化合物についてのインビトロ試験データを、以下の表に示す。
【０１２６】
【表１】
2004533402.tif 000031
【０１２７】
本発明の趣旨および範囲を逸脱せずに、上記した本発明に無数の修正および変更が加えられることは自明であるので、添付の特許請求の範囲の欄に記載の限定のみが課されるべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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