(57)【要約】本発明は、ＩＧＳ３Ｇタンパク質共役型受容体ファミリー、および該ＩＧＳ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化すること、該ポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターを含む宿主細胞およびＩＧＳ３遺伝子が過剰発現、非圧減圧下で、過少発現または抑制のいずれかであるヒト以外のトランスジェニック動物（ノックアウト動物）にも関する。本発明は、さらに、該Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーＩＧＳ３のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる化合物をスクリーニングするための方法および広範囲の疾患およびこのような状態のための診断アッセイの処置におけるＩＧＳ３受容体ファミリーに対するＩＧＳ３ポリペプチドおよびポリペプチドヌクレオチドおよびアゴニストまたはアンタゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２記載のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）における寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特には配列番号１に相当するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％）の配列の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードする配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが、配列番号１のものに対してその全長にわたって少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のポリヌクレオチドである、請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡまたＲＮＡである、請求項１から４までに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも５個のヌクレオチドおよび好ましくは３０個と５０個との間のヌクレオチドの請求項１のポリヌクレオチドまたはその断片を含んでなるハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項７】
発現系が適合する宿主細胞内に存在する場合に、該発現系が、配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＩＧＳ３ポリペプチドを産生可能である、発現系を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項８】
請求項７の発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
酵母細胞である、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
動物細胞である、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８から１０までに記載の細胞から誘導されたＩＧＳ３受容体膜調製物。
【請求項１２】
該ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項８の宿主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１３】
適当な培養条件下で、細胞がＩＧＳ３ポリペプチドを産生可能なように、請求項７の発現系を用いて細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含んでなる、細胞のＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞を産生するための方法。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチドに対して免疫特異性の抗体。
【請求項１７】
（ａ）該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／または、
（ｂ）配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドコードするヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または生体内で該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者に提供する
ことを含んでなる、請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の増強された活性または発現を必要とする患者の治療のための方法。
【請求項１８】
（ａ）該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／または
（ｂ）該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチドを患者に投与し、および／または
（ｃ）そのリガンドに関して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患者に投与する
ことを含んでなる、請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の活性または発現を阻害する必要性を有する患者の治療のための方法。
【請求項１９】
（ａ）該患者のゲノム内の該ＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内の突然変異の存在または不在を決定し、および／または
（ｂ）該患者から誘導された試料内のＩＧＳ３ポリペプチド発現の存在または量を分析する
ことを含んでなる、該患者内の請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチドの発現または活性に関連する患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法。
【請求項２０】
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして
（ｂ）試験化合物がＩＧＳ３ポリペプチドの活性化により発生されるシグナルをもたらすかどうかを決定する
ことを含んでなる、請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチドに対するアゴニストを同定するための方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法により同定されるアゴニスト。
【請求項２２】
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして
（ｂ）該アゴニストにより発生されるシグナルが候補化合物の存在下において減少されるかどうかを決定する
ことを含んでなる、請求項１４のＩＧＳ３ポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法により同定されるアンタゴニスト。
【請求項２４】
請求項１３記載の方法により産生される組換え宿主細胞またはＩＧＳ３ポリペプチドを発現するその膜。
【請求項２５】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列またはその生物学的に活性な部分から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タイプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列またはその生物学的に活性な部分から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部分を操作し、そして、配列番号２のアミノ酸配列または生物学的に活性な部分を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子対立遺伝子が完全にまたは部分的に不活性化されるような方法で該動物のゲノム内に該配列を再導入する
工程を含んでなる、遺伝子的に操作したヒト以外の動物を創成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、これらによりコードされるポリペプチドおよびこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、およびこれらの製造に関する。さらに具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に関し、これを以後ＩＧＳ３と呼ぶ。本発明は、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用の阻害または活性化、該ポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターを含む宿主細胞およびＩＧＳ３遺伝子が過剰発現、非発現、過少発現および／または抑制のいずれかであるトランスジェニック動物（ノックアウト動物）にも関する。本発明は、さらに、該Ｇタンパク質共役型受容体ＩＧＳ３のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
多数の医療的に重要な生物学的過程が、Ｇタンパク質および／または第二メッセンジャー、例えばｃＡＭＰを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは良く証明されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ， Ｎａｔｕｒｅ １９９１， ３５１：３５３−３５４） 。本明細書中でこれらのタンパク質は、Ｇタンパク質と一緒に経路に関与するタンパク質と呼ばれる。これらのタンパク質の一部の例は、ＧＰＣ受容体、例えばアドレナリン作動剤およびドーパミンのためのもの（Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｂ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８７， ８４：４６−５０； Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｂ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８７， ２３８：６５０−６５６； Ｂｕｎｚｏｗ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９８８， ３３６：７８３−７８７） 、Ｇタンパク質自体、エフェクタータンパク質、例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、およびアクチュエータータンパク質、例えばタンパク質キナーゼＡおよびタンパク質キナーゼＣ（Ｓｉｍｏｎ， Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５２：８０２−８） を含む。
【０００３】
例えば、シグナル伝達の一つの形においてＧＰＣＲへのホルモン結合の際に、受容体は、ヘテロ三量体状Ｇタンパク質と相互作用してそしてグアニンヌクレオチド−結合部位からＧＤＰの分離を誘導する。グアニンヌクレオチドの正常の細胞濃度において、ＧＴＰは部位を直ちに満たす。Ｇタンパク質のα−サブユニットへのＧＴＰの結合は、受容体からＧタンパク質の分離およびＧタンパク質のαならびにβγサブユニットへの分離を起こす。次いで、ＧＰＴを有する形は、アデニル酸シクラーゼに結合して活性化する。Ｇタンパク質自体により触媒されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解（αサブユニットは固有のＧＴＰアーゼ活性を有する）は、Ｇタンパク質をその基底の不活性形に返還させる。αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性は、本質的には、オン／オフスイッチを制御する内部時計である。αサブユニットのＧＤＰ結合形はβγに対する高いアフィニティを有しそしてαＧＤＰのβγとの引き続く再結合は、系を基底状態に返還させる。このように、Ｇタンパク質は二重の役割、すなわち受容体からエフェクター（この例ではアデニル酸シクラーゼ）へのシグナルを中継する中間体としておよびシグナルの存続期間を制御する時計としての役割を有する。
【０００４】
Ｇタンパク質共役型受容体の膜結合スーパーファミリーは、７個の推定膜貫通ドメインを有するとして特性化されている。ドメインは、細胞外または細胞質ループにより連結された膜貫通αらせんを表すと考えられている。Ｇタンパク質共役型受容体は、広範囲の生物学的活性受容体、例えばホルモン、ウイルス、成長因子および神経受容体を含む。
【０００５】
Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーは、ＣＮＳ障害の治療に使用される神経弛緩性薬剤に結合するドーパミン受容体を含む。このファミリーの成員の別の例は、カルシトニン、アドレナリン作動薬、神経ペプチドＹ、ソマストタチン、ニューロテンシン、ニューロキニン、カプサイシン、ＶＩＰ、ＣＧＲＰ、ＣＲＦ、ＣＣＫ、ブラジキニン、ガラニン、モチリン、ノシセプチン、エンドテリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリニン作用薬、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、濾胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウイルス受容体を含み、これらに限定はされない。
【０００６】
大部分のＧタンパク質共役型受容体は、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループのそれぞれの中に単独保存システイン残基を有する。７個の膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ５とＴＭ６とを結合する細胞質ループが、Ｇタンパク質結合ドメインの主要な成分であろう。
【０００７】
大部分のＧタンパク質共役型受容体は、第三細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内に潜在的リン酸化部位を含む。数種のＧタンパク質共役型受容体、例えばβ−アドレナリン受容体において、タンパク質キナーゼＡおよび／または特定の受容体キナーゼによるリン酸化は、受容体脱感作を媒介する。
【０００８】
最近、ある種のＧＰＣＲが、カルシトニン受容体様受容体と同様に、受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）と呼ばれる小さい一回貫通膜タンパク質と相互作用するであろうことが発見された。ＧＰＣＲとある種のＲＡＭＰとのこの相互作用は、天然のリガンドがＧＰＣＲ−ＲＡＭＰの組合わせに対する関連アフィニティを有しそして複合体の機能的シグナル伝達活性を調節することに決定的である（ＭｃＬａｔｈｉｅ， Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９８） ３９３：３３３−３３９）。
【０００９】
ある種の受容体に対して、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位は、数個のＧタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケットを含んでなり、そのソケットはＧタンパク質共役型受容体の疎水性残基により囲まれていると考えられる。それぞれのＧタンパク質共役型受容体膜貫通らせんの親水性側は内側に向き、そして極性リガンド−結合部位を形成すると考えられる。ＴＭ３は、数種のＧタンパク質共役型受容体においてリガンド−結合部位、例えばＴＭ３アスパラギン酸残基を有すると考えられている。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギンおよびＴＭ６およびＴＭ７フェニルアラニンまたはチロシンもリガンド結合に関係する。
【００１０】
Ｇタンパク質共役型受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質により種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内結合できる（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃ． Ｒｅｖ．， １９８９， １０：３１７−３３１ 参照）。種々のＧタンパク質αサブユニットは、特定のエフェクターを優先的に刺激して種々の生物学的機能を細胞内で調節する。Ｇタンパク質共役型受容体の細胞質内残基のリン酸化は、ある種のＧタンパク質共役型受容体のＧタンパク質結合の調節のための重要な機構として同定された。Ｇタンパク質共役型受容体は哺乳類宿主内の多数の部位に見いだされている。
【００１１】
主としてＧＰＣＲクラスである受容体は、現在既知の薬剤の半分以上を誘導した（Ｄｒｅｗｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９６， １４：１５１６）。これは、これらの受容体が、治療標的として確立され、証明された経歴を有することを示す。本発明中に記載する新規のＩＧＳ３  ＧＰＣＲは、機能不全、障害または疾患（以後全体的に「疾患」と呼ぶ）の診断、防止、改善または矯正において役立つことができる別の受容体の同定および特性決定のための当該技術分野での要求を明らかに満足する。「疾患」は、精神分裂症、間欠性発作不安（ＥＰＡ）障害、例えば強迫症（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニック、重症抑うつ障害、双極性障害、パーキンソン病、一般不安障害、自閉症、せん妄、多発性硬化症、アルツハイマー病／痴呆およびその他の神経変性疾患、重症精神遅滞、運動障害、ハンチントン病、ツレット症候群、チック、振せん、ジストニー、痙攣、食欲不振、食欲亢進、脳卒中、耽溺／依存／渇望、睡眠障害、テンカン、偏頭痛を含む精神医学およびＣＮＳ障害、注意散漫／活動過多障害（ＡＤＨＤ）、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、低血圧、高血圧−例えば本態性高血圧、腎高血圧、または肺高血圧、血栓症、動脈硬化症、脳血管痙攣、クモ膜下出血、脳虚血、脳梗塞、末梢血管疾患、レイノー症を含む心血管疾患、腎臓疾患−例えば腎不全、異脂肪症、肥満、嘔吐、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、胃食道反射疾患（ＧＥＲＤ）、運動性障害および遅延空胃腸症状、例えば手術後または糖尿病胃不全麻痺、および糖尿病、潰瘍−例えば胃潰瘍を含む胃腸疾患、下痢、骨そしょう症を含むその他の疾患、炎症、感染症、例えば細菌、真菌、原虫およびウイルス感染症、特にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染症、苦痛、ガン、化学治療誘発障害、腫瘍侵入、免疫疾患、残尿、喘息、アレルギー、関節炎、良性前立腺肥大、内毒素ショック、敗血症、真性糖尿病の合併症、および婦人科障害を含み、これらに限定はされない。
【００１２】
【発明の要約】
一つの態様では、本発明は、ＩＧＳ３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組換え物質およびこれらの製造のための方法に関する。本発明の別の態様は、このようなＩＧＳ３ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組換え物質の使用のための方法に関する。このような使用は、上記の「疾患」の一つの治療標的としておよび治療のための使用を含み、これに限定はされない。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明により提供される物質を用いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定のため、および同定された化合物を用いるＩＧＳ３平衡失調に関連する状態を治療する方法に関する。本発明のさらに別の態様は、不適当なＩＧＳ３活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断アッセイに関する。本発明のさらに別の態様は、ＩＧＳ３の異常な発現または活性から起きる障害のためのモデルとして挙動する動物に基づく系に関する。
【００１４】
【表１】
2004500039.tif 000002
【００１５】
【表２】
2004500039.tif 000003
【００１６】
発明の詳細な説明
構造および化学的類似性は、配列およびモチーフの範囲内で、本発明のＩＧＳ３　ＧＰＣＲとその他のヒトＧＰＣＲとの間に存在する。従って、ＩＧＳ３はなかでも上記の「疾患」に関与すると考えられる。
【００１７】
別途に断らない限り、本明細書中に使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の通常の熟練者により共通して理解されると同様の意味を有する。本明細書中に記載のものに類似または等価なあらゆる方法および物質が本発明の実施または試験に使用できるけれども、好ましい方法、装置および物質をここに記載する。本明細書中に引用したすべての公開文献は、すべての公開文献を特定して個別に完全に記載すると同様に本明細書中に引用して組み込むと同様に、引用することにより本明細書中に編入される。
【００１８】
定義
以下の定義は、本明細書中にしばしば使用される一部の用語の理解を助けるために記載される。
【００１９】
「ＩＧＳ３」は、なかでも、配列番号２中に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその変種を呼ぶ。
【００２０】
「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」は、該ＩＧＳ３の代謝または生理的機能を呼び、同様の活性または改善された活性または低下した望ましくない副作用を有するこれらの活性を含む。該ＩＧＳ３の抗原性および免疫原性活性も含まれる。
【００２１】
「ＩＧＳ３遺伝子」は、配列番号１中に記載のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれらの変種および／またはこれらの補体を呼ぶ。
【００２２】
本明細書中に使用される「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、および人体適応化された抗体、ならびにＦａｂ断片を含み、これにはＦａｂまたはその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物も含まれる。
【００２３】
「単離された」は、「人手により」本来（天然）の状態から改変および／または本来の環境から分離されたことを意味する。従って、本来的に存在する「単離された」組成物または物質が「単離」されると、その当初の環境から変化または移動または両方を受ける。例えば、本来的に生きた動物内に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、しかしその本来の状態で一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ており、このように本明細書中で用語が使用される。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」は、一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいあらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを呼ぶ。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖状ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖状ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖の領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖またはさらに典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖の領域の混合であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を含むが、これに限定はされない。さらに「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでなる三本鎖領域も含んでもよい。用語ポリヌクレオチドは、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えばトリチル化された塩基および通常ではない塩基、例えばイノシンを含む。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ、従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された、典型的に天然に見いだされるポリヌクレオチドの形、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学的の形を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２５】
「ポリペプチド」は、たがいにペプチド結合または変形ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターで結合された２個またはそれ以上のアミノ酸を含んでなるあらゆるペプチドまたはタンパク質を呼ぶ。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般にタンパク質と呼ばれるさらに長い鎖、および／またはこれらの組み合わせを呼ぶ。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、天然の過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野では周知の化学的修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的教科書中およびさらに長大な論文中ならびに大量の研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所で起きることができる。同じ形式の修飾が、与えられたポリペプチド中の種々の部位において同一または異なる程度で存在してもよいことが認められる。また、与えられたポリペプチドは多数の形式の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝してもよく、そしてこれらは分枝を有するかまたは有していない環状であってもよい。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセシングからもたらされてもよくまたは合成法により作製されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスホチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含む。例えば、「タンパク質−構造および分子的性質」（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）および「翻訳後タンパク質修飾− 前途および予想」（Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， ｐｇｓ． １−１２ ｉｎ ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３） 、「タンパク質修飾および非タンパク質補因子の分析」（Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９９０） １８２：６２６−６４６）および「タンパク質合成：翻訳後修飾および熟成」（Ｒａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９２） ６６３：４８−６２）を参照。
【００２６】
本明細書中に使用される用語としての「変種」は、比較するポリヌクレオチドまたはポリペプチドとはそれぞれ異なるが、本質的な性質、例えば本質的な生物学的、構造的、調節的または生化学的性質は保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、他の比較ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列中の変化は、比較ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもしなくてもよい。ヌクレオチド変化は、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を比較配列によりコードされるポリペプチド中にもたらしてもよく、これは以下に考察する。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が他の比較ポリペプチドと異なる。一般に、相違は、比較ポリペプチドおよび変種の配列が全体的には密接に類似しそして多くの領域で一致している程度に限定される。変種および比較ポリペプチドは、アミノ酸配列内であらゆる組み合わせにより１個またはそれ以上の置換、付加、および欠失で異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子暗号によりコードされるものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、天然に存在する例えば対立遺伝子変種であってもよく、またはこれは天然に存在するとは知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非−天然存在変種は、突然変異誘発技術または直接合成により作製されてもよい。
【００２７】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最高度の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は、当該技術分野で認められた意味を有しそして公開された技術を用いて算出できる。例えば下記参照：「コンピューターによる分子生物学」（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８）；「バイオコンピューティング： 情報学およびゲノムプロジェクト」（ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ： ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３）；「配列データのコンピューター分析、第一部」（ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＡＴＡ， ＰＡＲＴ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４）；  「分子生物学における配列解析」（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７）；および「配列解析プライマー」（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥＲ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の一致を測定する多数の方法が存在するけれども、用語「同一性」は、当該技術分野の熟練者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， （１９８８） ４８：１０７３）。２個の配列の間の同一性または類似を決定するために一般的に使用される方法は、「大型コンピューターへのガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９４） およびＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ， （１９８８） ４８：１０７３ 中に開示されたものを含むが、これに限定はされない。同一性および類似を決定するための方法は、コンピュータープログラム中にコード化されている。２個の配列間の同一性および類似を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９８４） １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５：４０３）を含むが、これに限定はされない。用語「相同」は、「同一性」に互換可能である。
【００２８】
説明として、配列番号１の比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば９５％「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が配列番号１の比較ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個それぞれに対して５個以下のヌクレオチド相違を含んでもよいことを除いて、比較配列と一致することを意味する。換言すると、比較ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一するヌクレオチド配列を有すポリヌクレオチドを得るためには、比較配列中のヌクレオチドの５％以下が欠失または他のヌクレオチドにより置換されてもよいか、または比較配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドが比較配列内に挿入されてもよいか、または比較配列内の全ヌクレオチドのいずれかの５％以下のヌクレオチドの数において欠失、挿入および置換の組み合わせがあってもよい。比較配列のこれらの変異は、比較ヌクレオチド配列の５または３末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のいかなる位置でも、比較配列中のヌクレオチドの間で個別に、または比較配列内の１個またはそれ以上の連続基内のヌクレオチドのいずれかに散布して起きてもよい。
【００２９】
同様に、例えば、配列番号２の比較アミノ酸配列に対して少なくとも９５％「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が配列番号２の比較配列のアミノ酸１００個のそれぞれに対して５個以下のアミノ酸変化を含んでもよいことを除いてポリペプチドのアミノ酸配列が比較配列と一致すること意味する。換言すると、比較アミノ酸配列に少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、比較配列内のアミノ酸残基の５％以下が欠失または他のアミノ酸で置換されていてもよいか、または比較配列内の全アミノ酸残基の５％以下の数のアミノ酸が比較配列中に挿入されてもよい。比較配列のこれらの変更は、比較アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のあらゆる位置で、比較配列内の残基間に個別にまたは比較配列内の１個またはそれ以上の隣接基内のいずれかに散在して存在してもよい。
本発明のポリペプチド
一つの態様では、本発明は、ＩＧＳ３ポリペプチド（ＩＧＳ３タンパク質も含む）に関する。ＩＧＳ３ポリペプチドは配列番号２のポリペプチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）に１９９９年９月１５日付けで寄託された寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２のものとおよび／またはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、そしてさらに好ましくは、少なくとも９０％の同一性、そしてその上にさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を該アミノ酸配列に対して有するポリペプチドを含む。さらに、少なくとも９７％、特には少なくとも９９％のものが高度に好ましい。ＩＧＳ３ポリペプチド内には、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを有し、そしてさらに好ましくは、配列番号２に少なくとも９０％の同一性、そしてその上にさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドも含む。さらに、少なくとも９７％、特には少なくとも９９％のものが高度に好ましい。好ましくは、ＩＧＳ３ポリペプチドは受容体の少なくとも一つの生物学的活性を示す。
【００３０】
本発明の別の態様では、ＩＧＳ３ポリペプチドは、さらに大きいタンパク質、例えば融合タンパク質の一部分であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製において支援する配列、例えば重複ヒスチジン残基を含む追加のアミノ酸配列、検出を支援する配列、例えば抗原性ペプチドタグ（例えばヘマグルチニン（ＨＡ）タグ）または組換え物産生の間の安定性のための追加の配列を含むとしばしば有利である。
【００３１】
ＩＧＳ３ポリペプチドの断片も本発明中に含まれる。断片とは、上記のＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列の一部分ではあるが全体ではないものと同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＧＳ３ポリペプチドと同様に、断片は「自立」、すなわちこれらが部分または領域を形成するさらに大きいポリペプチド内で、最も好ましくは単独の連続領域を含んでなってもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例は、例えば、ＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸番号約１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１から末端までよりの断片を含む。この範囲内で、「約」は一方の端または両端のいずれかにおける数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸ほど大きいかまたは小さい特定の列挙の範囲を含む。
【００３２】
好ましい断片は、例えば、アミノ末端を含む残基の一連の連続物もしくはカルボキシ末端を含む残基の一連の連続物の欠失、またはアミノ末端を含むものおよびカルボキシ末端を含むものの残基の２個の連続物の欠失を除き、ＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを含む。構造的または機能的属性、例えばアルファらせんおよびアルファらせん形成性領域、ベータシートおよびベータシート形成性領域、ターンおよびターン形成性領域、コイルおよびコイル形成性領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両性領域、ベータ両性領域、フレキシブル領域、表面形成性領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含んでなる断片により特徴付けられる断片も好ましい。その他の好ましい断片は、生物学的活性の断片である。生物学的活性の断片は、受容体活性を媒介するものであり、類似した活性もしくは改善された活性を有するか、または低下した望ましくない活性を有するものを含む。動物中特にはヒト中で抗原性または免疫原性であるものも含まれる。
【００３３】
従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２のものおよび／またはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのいずれかと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または相当する断片に少なくとも８０％同一であるこれらの断片を含む。好ましくは、これらのポリペプチド断片のすべては、抗原活性を含む受容体の生物学的活性を保持する。定義された配列および断片の変種も本発明の一部を形成する。好ましい変種は、保存的アミノ酸置換により比較物とは異なるもの、すなわち別または類似した特性の残基を置換するものである。典型的なこのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒとの間、酸残基ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＡｓｎとＧｌｎとの間、および塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの間、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間である。特に好ましくは、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が、いずれかの組み合わせで置換、欠失、または追加されている変種である。
【００３４】
本発明のＩＧＳ３ポリペプチドは、あらゆる適当な方法で作製できる。このようなポリペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え作製されたポリペプチド、合成して作製されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせで作製されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの作製方法は、当該技術分野では周知である。
本発明のポリヌクレオチド
本発明の別の態様はＩＧＳ３ポリヌクレオチドに関する。ＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、ＩＧＳ３ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、およびこれに密接に関連するポリヌクレオチドを含む。さらに具体的には、本発明のＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、例えば配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードできるもの、配列番号１の特定の配列を有するポリヌクレオチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的に相当するポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
ＩＧＳ３ポリヌクレオチドは、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、配列番号１のものにその全長にわたって少なくとも８０％同一性であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドおよびＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に本質的に相当するポリヌクレオチドをさらに含む。
【００３６】
これに関して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、そして少なくとも９５％同一であるものがさらに好ましい。さらに、少なくとも９７％のものが高度に好ましく、少なくとも９８−９９％のものが最も高度に好ましく、少なくとも９９％のものが最も好ましい。ＩＧＳ３ポリヌクレオチドとして、配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列に対しまたはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）において寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物に対して十分な一致性を有するヌクレオチド配列も、増幅のためまたはプローブまたはマーカーとしての使用のために使用可能な条件下でハイブリダイズするために含まれる。本発明は、これらのＩＧＳ３ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３７】
本発明のＩＧＳ３は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの他のタンパク質に構造的に関連し、これは公開データベース中のＢＬＡＳＴサーチの結果により示される。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は、約３５％一致（ＢＬＡＳＴ使用、Ａｌｔｓｃｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７）， ２５：３３８９−３４０２）をその長さの大部分（２−３０６アミノ酸残基）において、ヒトｍａｓ腫瘍遺伝子によりコードされるタンパク質（特許出願ＷＯ８７０７４７２号中の配列１）と有する。この配列は、３７％の同一性（アミノ酸残基３５−３１５）を特許出願ＷＯ９６１６０８７号中に公開されたＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＥＮＥＳＥＱ９６Ｐ−Ｒ９７２２２）に対して有する。表１のヌクレオチド配列（配列番号１）は、５２％および５４％の同一性を２個の上記の受容体（それぞれＧＥＮＥＳＥＱ８７Ｎ−７０６８５および９６Ｎ−Ｔ２８８０７）の長さの大部分で有する。さらに、残基１０４−１１４４内でヒトソマトスタチン−３−受容体（ＷＯ９３１３１３０号；９３Ｎ−Ｑ４５６５７）に４８％同一である。ＩＧＳ３タンパク質配列のヒドロパシー分析（Ｋｙｔｅ Ｊ． ｓｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９８２） １５７：１０５−１３２； Ｋｌｅｉｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ （１９８５）８１５： ４６８−４７６）は、予想通りに７個の膜貫通ドメインの存在を示した。従って、本発明のＩＧＳ３ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、なかでもこれらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに類似した生物学的機能／性質を有すると予想され、そしてこれらの有用性は当該技術分野のすべての熟練者には明白である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、天然資源、例えばゲノムＤＮＡから得ることができる。特に、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ） ＰＣＲプライマーは、特定のＧＰＣＲ遺伝子サブファミリー内で保存された領域をコードするように設計できる。縮重プライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ上のＰＣＲ増幅反応は、考慮している遺伝子ファミリーの数種のメンバー（公知および新規の両方）の増幅をもたらす（ゲノム鋳型を用いる場合には、縮重プライマーは同じエキソン内に位置しなければならない）（Ｌｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８９， ２４４：５６９−５７２ ）。本発明のポリヌクレオチドは、周知で商業的に利用できる技術を用いて合成もできる。
【００３９】
配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（ヌクレオチド番号１４９〜１１３８）中に含まれる配列をコードするポリペプチドと一致してもよいか、またはこれは、遺伝子コードの重複（縮重）の結果として、配列番号１内に含まれるポリペプチドをコードする配列と比較して変化を示す異なるヌクレオチド配列であってもよいが、しかし配列番号２のポリペプチドをコードしてもよい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドがＩＧＳ３ポリペプチドの組換え産生に使用される場合には、ポリペプチドは成熟ポリペプチドのためのコーディング配列またはその断片それ自体、成熟ポリペプチドのためのコーディング配列または他のコーディング配列を有する読み取り枠内の断片、例えばリーダーまたは分泌配列、プレ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列またはその他の融合ペプチド部分をコードするものを含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー配列がコードされることができる。本発明のこの実施におけるある好ましい態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、これはｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）内に提供され、そしてＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８９） ８６：８２１−８２４に記載されており、またはＨＡタグである。ポリヌクレオチドは、非−コーディング５’および３’配列、例えば転写された非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列を含んでもよい。
【００４１】
さらに好ましい態様は、その中で数個、５−１０、１−５、１−３、１−２または１個のアミノ酸残基があらゆる組み合わせで置換、欠失または付加された、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるＩＧＳ３変種をコードするポリヌクレオチドである。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現の変化を含むが、これに限定はされない種々の目的のためにＩＧＳ３コード化配列を改変するために、当該技術分野では一般に公知の方法を用いて操作することができる。ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡシャフリングおよび遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を、ヌクレオチド配列を操作するために使用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒介の部位指定突然変異誘発は、アミノ酸置換の創成、新規の制限部位の創成、修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）パターンの改変、コドン優先の変化、スプライス変種の産生などの変異を導入するために使用してもよい。
【００４３】
本発明は、さらに、本明細書中に以上に記載した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本発明は、ストリンジェントな条件下で本明細書中に以上に記載したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに特に関する。本明細書中に使用される用語「ストリンジェント条件」は、少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに好ましくは少なくとも９５％、それ以上に好ましくは少なくとも９７％、特には少なくとも９９％の同一性が配列間で存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを意味する。
【００４４】
配列番号１またはその断片中に含まれるヌクレオチド配列に一致または十分に一致する本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、全長ｃＤＮＡおよびＩＧＳ３をコードするゲノムクローンを単離するためおよびＩＧＳ３遺伝子に高度の配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために使用してもよい。当該技術分野の熟練者は、このようなハイブリダイゼーション技術を熟知している。典型的にはこれらのヌクレオチド配列は、比較物のものと８０％同一、好ましくは９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。プローブは、一般に、少なくとも５個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも８個のヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、もっと好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチド、特には少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなる。最も好ましくは、このようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有しそして少なくとも５０個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブは、３０から５０個の範囲内のヌクレオチドである。
【００４５】
一つの態様は、ヒト以外の種からの相同体またはオルソログ体を含むＩＧＳ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１またはその断片を有する標識プローブを用いる適当なライブラリーのスクリーニング、および全長ＤＮＡならびに該ポリヌクレオチド配列を含むゲノムクローンを単離する段階を含んでなる。このようなハイブリダイゼーション技術は当該技術分野の熟練者には周知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に定義されたもの、または４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）、および２０μｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩インキュベーションし、次いで０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃でフィルターを洗浄する条件と定義される。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒト疾患に対する治療法および診断法の発見のための研究用試薬および材料として使用してもよい。
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、および本発明のベクターを用いて遺伝子的に操作された宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生にも関する。細胞を含まない翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いるこのようなタンパク質の産生に使用できる。
【００４７】
組換え産生のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドのための発現系またはこれらの部分を組み込むために遺伝子的に操作できる。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば「分子生物学における基本的方法」（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６））および「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）） に記載された方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスヴェクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、ミクロ注入、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（Ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染により行うことができる。
【００４８】
適当な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ状球菌、大腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞、および植物細胞を含む。
【００４９】
広範な各種の発現系が使用できる。このような系は、なかでも、染色体、エピソームおよびウイルス誘導系、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポソンから、酵母エピソームから、挿入因子から、酵母染色体因子から、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびこれらの組み合わせから誘導されたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子、例えばコスミドおよびファジェミドから誘導されたものを含む。発現系は、発現を調節ならびに発生する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中にポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するために適するあらゆる系またはベクターを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、各種の周知で慣用の技術、例えば「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、上記）に記載のもののいずれを用いてでも発現系内に挿入してもよい。
【００５０】
小胞体の内腔内へ、細胞周辺腔内へまたは細胞外環境内への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド内に組み込んでもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在性であってもよくまたは非相同性シグナル、例えば異なる種から誘導されたものであってもよい。
【００５１】
スクリーニングアッセイで使用するためにＩＧＳ３ポリペプチドを発現すべき場合に、一般にポリペプチドが細胞の表面で産生されることが好ましい。このイベントにおいて、細胞をスクリーニングアッセイに使用する前に採取してもよい。ＩＧＳ３ポリペプチドのアフィニティーまたは機能的活性が受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）により変性される場合に、細胞表面における関係するＲＡＭＰの同時発現が好ましいと考えられ、しばしば要求される。このイベントの場合にも、ＩＧＳ３ポリペプチドおよび関係するＲＡＭＰを発現する細胞の採取がスクリーニングアッセイ使用の前に要求される。ＩＧＳ３ポリペプチドが培地内に分泌される場合には、培地は、ポリペプチドを回収および精製するために回収できる。細胞内で産生される場合には、ポリペプチドを回収する前に細胞を先ず溶解しなければならない。ＩＧＳ３ポリペプチドを発現する膜は、当該技術分野の熟練者に周知の方法により回収できる。一般にこのような方法は、ＩＧＳ３ポリペプチドを発現する細胞の採取および例えば限定はされないがポッタリング（ｐｏｔｔｅｒｉｎｇ） のような方法により細胞をホモジナイズすることを含む。膜は懸濁液を一回または数回洗浄して回収してもよい。
【００５２】
ＩＧＳ３ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収および精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。タンパク質をリフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性される場合に活性コンホメーションを再生するために使用してもよい。
診断アッセイ
本発明は、診断試薬としての使用のためのＩＧＳ３ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全と関連するＩＧＳ３遺伝子の変異形の検出は、ＩＧＳ３の過少発現、過剰発現または改変された発現からもたらされる疾患または疾患への罹病性の診断に追加またはこれを決定することができる診断手段を提供する。このイベントにおいても、関連する受容体活性調節タンパク質の同時発現は、所望の品質の診断アッセイを得るために要求できる。ＩＧＳ３遺伝子内に変異を有する個体を、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出してもよい。
【００５３】
診断のための核酸は、患者の細胞から、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検物質から得てもよい。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用してもよくまたは分析の前にＰＣＲまたはその他の増幅技術を使用して酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様の方法で使用してもよい。欠失および挿入は、正常の遺伝子型と比較して増幅産物の大きさの変化により検出できる。点変異は、増幅したＤＮＡを標識ＩＧＳ３ヌクレオチド配列にハイブリダイズして同定できる。完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ消化によりまたは融解温度の相違によりミスマッチ二本鎖から区別できる。ＤＮＡ配列の相違は、変性剤を加えまたは加えないゲル内のＤＮＡ断片の電気泳動の移動性の改変により、または直接のＤＮＡ配列決定により検出してもよい。例えばＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０：１２４２ 参照。特定の位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学切断法により解明してもよい。Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８５） ８５： ４３９７−４４０１参照。別の態様では、ＩＧＳ３ヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために構築することができる。アレイ技術の方法は周知であり、そして一般的な用途を有しそして遺伝子発現、遺伝子連結、および遺伝子変化を含む分子遺伝学における各種の問題を解明するために使用できる（例えばＭ． Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ ２７４， ｐｐ６１０−６１３（１９９６） 参照）。
【００５４】
診断アッセイは、記載の方法によるＩＧＳ３遺伝子内の変異の検出を通じて、なかでも上記の「疾患」の診断または罹患性決定のための方法を提供する。
【００５５】
さらに、なかでも上記の「疾患」は、患者より誘導された試料からＩＧＳ３ポリペプチドまたはＩＧＳ３  ｍＲＮＡの異常な低下または増加したレベルを決定することを含んでなる方法により診断できる。
【００５６】
低下または上昇した発現は、ポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野で周知の方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定できる。宿主から誘導された試料中のタンパク質、例えばＩＧＳ３のレベルを決定するために使用できるアッセイ技術は、当該技術分野の熟練者には周知である。このようなアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合−結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００５７】
別の態様では、本発明はなかでも上記の「疾患」または「疾患」の一つへの罹病性のための診断キットに関する。
キットは、
（ａ）ＩＧＳ３ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列、またはその断片、および／または
（ｂ）（ａ）のものに対して相補的なヌクレオチド配列、および／または
（ｃ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチド、またはその断片、および／または
（ｄ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体、および／または
（ｅ）ＩＧＳ３ポリペプチドの関連する生物学的または抗原的性質のために必要なＲＡＭＰポリペプチド
を含んでなってもよい。
【００５８】
このようないずれもキットでも、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。
染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列は、染色体同定のためにも価値がある。配列は、個別のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的設定されそしてこれとハイブリダイズできる。本発明による染色体の関連配列の地図作製は、これらの配列を遺伝子関連疾患と相関させるために重要な第一段階である。配列が正確に染色体位置に場所決定された場合に、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝子地図データと相関できる。このようなデータは、例えばＶ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能）内に見いだされる。次いで、同じ染色体領域に場所決定された遺伝子と疾患との関係は、連鎖分析により同定される（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）。
【００５９】
影響および非影響個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違も決定できる。変異が影響を受けた個体の一部またはすべてに観察されるがしかしいずれの正常個体内にも観察されない場合には、変異は疾患の原因因子であろう。
抗体
本発明のポリペプチドもしくはこれらの断片もしくはこれらの類似体、または関連ＲＡＭＰと一緒に要求される場合にこれらを発現する細胞は、ＩＧＳ３ポリペプチドに対して免疫特異性に抗体を産生する免疫原として使用してもよい。用語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドへのこれらのアフィニティーよりも本質的に大きい本発明のポリペプチドへのアフィニティーを有することを意味する。
【００６０】
ＩＧＳ３ポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ−保持断片、類似体または細胞を動物、好ましくはヒト以外に慣用のプロトコールを用いて投与して得てもよい。モノクローナル抗体の作製のために、連続細胞株培養により産生される抗体を供給するあらゆる技術を使用してもよい。その例は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ （１９８３） ４：７２） およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ， ｐｐ７７−９６， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８５）を含む。
【００６１】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するためまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために使用してもよい。
【００６２】
ＩＧＳ３ポリペプチド自体に対する抗体、またはＩＧＳ３ポリペプチド−ＲＡＭＰ複合体に対する抗体は、なかでも上記の「疾患」を治療するために使用してもよい。
動物
本発明の別の態様は、ＩＧＳ３の異常な発現または活性から起きる障害のためのモデルとして挙動するヒト以外の動物に基づく系に関する。ヒト以外の動物に基づくモデル系は、ＩＧＳ３遺伝子の活性をさらに特徴付けるために使用してもよい。このような系は、ＩＧＳ３に基づく疾患、例えばなかでも上記の「疾患」を治療できる化合物を同定するために設計されたスクリーニング戦略の一部分として使用してもよい。
【００６３】
この方法で、動物に基づくモデルは、ＩＧＳ３の異常な発現または活性の障害の治療において有効であるような薬剤化合物、治療および介入を同定するために使用してもよい。さらにこのような動物モデルは、動物患者内のＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために使用してもよい。これらのデータは、潜在的ＩＧＳ３障害治療の生体内効力を決定するために使用してもよい。
【００６４】
異常なＩＧＳ３発現また活性に基づくＩＧＳ３に基づく障害の動物に基づくモデル系は、非−組換え動物ならびに組換え操作トランスジェニック動物の両方を含んでもよい。
【００６５】
ＩＧＳ３障害のための動物モデルは、例えば遺伝子モデルを含んでもよい。ＩＧＳ３に基づく障害類似症候群を示す動物モデルは、例えばＩＧＳ３配列、例えば上記のもののような配列を、当該技術分野の熟練者に周知のトランスジェニック動物作製のための技術と組み合わせて使用して操作してもよい。例えば、ＩＧＳ３配列は、関係する動物のゲノム内に導入、そして過剰発現および／または非発現であってもよく、または内在性ＩＧＳ３配列が存在する場合には、これらを過剰発現、非発現のいずれでもよく、または、その代わりに、ＩＧＳ３遺伝子発現を過少発現または不活性化するために破壊してもよい。
【００６６】
ＩＧＳ３遺伝子配列を過剰発現または非発現とするために、ＩＧＳ３遺伝子配列のコーディング部分は、高レベル遺伝子発現または関係する動物種内で遺伝子が正常では発現されない細胞種内での発現を駆動することが可能な調節配列に連結されてもよい。このような調節領域は、当該技術分野の熟練者には周知であり、そして不当に多くの実験を行わないで使用してもよい。
【００６７】
内在性ＩＧＳ３遺伝子配列の過少発現のために、このような配列を単離および操作して、関係する動物のゲノム内に再導入された場合に、内在性ＩＧＳ３遺伝子対立遺伝子が不活性化、すなわち「ノックアウト」されてもよい。好ましくは、操作されたＩＧＳ３遺伝子配列は、遺伝子標的法を介して、例えば動物ゲノム内へ操作されたＩＧＳ３遺伝子配列の組込みの際に内在性ＩＧＳ３配列が破壊されるように導入される。
【００６８】
マウス、ラット、ラビット、リス、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、およびヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、サル、および類人猿を含むが、これに限定はされないあらゆる種の動物を、ＩＧＳ３関連障害の動物モデルを作製するために使用してもよい。
【００６９】
当該技術分野で公知のあらゆる技術は、ＩＧＳ３導入遺伝子を動物内に導入してトランスジェニック動物の創始株を作製するために使用してもよい。このような技術は、前核ミクロ注入（Ｈｏｐｐｅ， Ｐ．Ｃ． ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ， Ｔ．Ｅ． １９８９， 米国特許（ＵＳ）第４，８７３，１９１ 号）；レトロウイルス媒介の生殖細胞系内への遺伝子導入（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２， １９８５）； 胚幹細胞内での遺伝子標的法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１， １９８９）； 胚の電気穿孔（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：１８０３−１８１４， １９８３）； および精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３， １９８９） 等を含み、これらに限定はされない。このような技術の概説は、Ｇｏｒｄｏｎ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１７１−２２９， １９８９ に記載されている。
【００７０】
本発明は、すべてのこれらの細胞内にＩＧＳ３導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、ならびに一部であるがすべてではない細胞内に導入遺伝子を有する動物、すなわちモザイク動物を提供する （例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｚ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ４： ７６１−７６３， １９９４に記載の技術参照） 。導入遺伝子は、単独の導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム内に組み込まれてもよい。導入遺伝子は、例えばラスコらの教示（Ｌａｓｋｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６， １９９２） に従って、特定の細胞種内に選択的に導入、そして活性化されてもよい。
【００７１】
このような細胞タイプ特異性活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかである。
【００７２】
ＩＧＳ３導入遺伝子を内在性ＩＧＳ３遺伝子の染色体部位内に組み込むことを望む場合には、遺伝子標的法が好ましい。要約すると、この技術を用いる場合には、関係する内在性ＩＧＳ３遺伝子に相同なあるヌクレオチド配列（例えばマウスＩＧＳ３遺伝子のヌクレオチド配列）を含むベクターを、染色体配列との相同組換えを介して、内在性ＩＧＳ３遺伝子または遺伝子対立遺伝子のヌクレオチド配列内に組込み、そしてその機能を破壊する目的で設計する。導入遺伝子は、特定の細胞タイプ内に選択的に導入されてもよく、これによりその細胞タイプ内でのみ関係する内在性遺伝子を不活性化し、これは例えばグらの教示に従う（Ｇｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６， １９９６）。このような細胞タイプ特異性不活性化のために必要な調節配列は、関係する特定の細胞種に依存し、そして当該技術分野の熟練者には明らかであろう。
【００７３】
トランスジェニック動物が作製されると、組換えＩＧＳ３遺伝子およびタンパク質の発現を標準技術を用いてアッセイしてもよい。最初のスクリーニングは、導入遺伝子の組込みが起きたかどうかをアッセイするために動物組織を分析するために、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術により行ってもよい。トランスジェニック動物の組織内のＩＧＳ３導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは、動物から得た組織試料のノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション技術，およびＲＴ−ＰＣＲを含むがこれに限定はされない技術を用いて評価してもよい。標的遺伝子−発現組織の試料を、関係する標的遺伝子導入遺伝子産物に対して特異性の抗体特異性を用いて免疫細胞化学的に評価してもよい。容易に検出できるレベルでＩＧＳ３遺伝子ｍＲＮＡまたはＩＧＳ３導入遺伝子ペプチドを発現するＩＧＳ３トランスジェニック動物（標的遺伝子産物エピトープに対する抗体を用いて免疫細胞化学的に検出）を、次いでさらに、特徴的なＩＧＳ３に基づく障害症候群を示すこれらの動物を同定するために続いて評価してもよい。
【００７４】
ＩＧＳ３トランスジェニック創始動物（すなわち、関係する細胞または組織内にＩＧＳ３タンパク質を発現し、そしてこれは好ましくは、ＩＧＳ３に基づく障害の症候群を示す動物）が作製されると、特定の動物のコロニーを作製するためにこれらを育種、同系交配、異系交配、または交雑交配してもよい。このような育種戦略の例は、分離した株を確立するために１種を越える組込み部位を有する創始動物の異系交配、それぞれのＩＧＳ３導入遺伝子の付加発現の効果のために高いレベルで関係するＩＧＳ３導入遺伝子を発現する複合ＩＧＳ３トランスジェニックを産生するための分離した株の同系交配、増加した発現およびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの考えられる必要性を除くために、与えられた組込み部位に対して同型接合の動物を作製するための異型接合トランスジェニック動物の交雑、複合異型接合または同型接合株を作製するための別々の同型接合株の交雑、ＩＧＳ３導入遺伝子の発現およびＩＧＳ３様症候群の発生に対する対立遺伝子変性の効果を検討するための種々の同系交配遺伝子背景への動物の育種を含むがこれらの限定はされない。このような方法の一つは、ＩＧＳ３関連障害様症候群、例えば上記のものを示すＦ１世代を作製するために、ＩＧＳ３トランスジェニック創始動物と野生型株との交雑である。次いで、異型接合標的遺伝子トランスジェニック動物が生育可能である場合に、異型接合株を発生させるためにＦ１世代を同型交配してもよい。
ワクチン
本発明の別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、これは、哺乳類にＩＧＳ３ポリペプチドまたはその断片を、所要の場合には抗体および／またはＴ細胞免疫反応を発生するために適するＲＡＭＰポリペプチドと一緒に投与（例えば接種）して、なかでも上記の「疾患」から該動物を保護することを含んでなる。
【００７５】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類内に免疫学的反応を誘導するための方法に関し、これは該動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫学的反応を誘導するために、ＩＧＳ３ポリペプチドを生体内でのＩＧＳ３ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して供給することを含んでなる。
【００７６】
本発明の別の態様は、哺乳類宿主内に導入された場合に、ＩＧＳ３ポリペプチドに対する哺乳類内の免疫学的反応を誘導する免疫学的／ワクチン調剤（組成物）に関し、ここでその組成物はＩＧＳ３ポリペプチドまたはＩＧＳ３遺伝子を含んでなる。このような免疫学的／ワクチン調剤（組成物）は、治療用の免疫学的／ワクチン調剤または予防用の免疫学的／ワクチン調剤のいずれかであってもよい。ワクチン調剤は、さらに適当なキャリヤーを含んでなってもよい。ＩＧＳ３ポリペプチドは胃内で分解されることがあるので、これは好ましくは非経口的に投与される（皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む）。非経口投与のために適する調剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および調剤をレシピエントの血液と等張性とするための溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射液剤、および懸濁剤または増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。調剤は、単位投与または複数投与容器、例えば封をしたアンプルおよびバイアル内に存在してもよく、そして使用の直前に滅菌液体キャリヤーを加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵してもよい。ワクチン調剤は、調剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油系およびその他の当該技術分野では公知の系を含んでもよい。用量はワクチンの活性に依存しそして日常的な試験により容易に決定できる。
スクリーニングアッセイ
本発明のＩＧＳ３ポリペプチドは、受容体を結合しそして本発明の受容体ポリペプチドを活性化（アゴニスト）または活性化を阻害（アンタゴニスト）する化合物のためのスクリーニングプロセス中に使用してもよい。従って、本発明のポリペプチドは、小分子基質および例えば細胞、細胞を含まない調製物、化学ライブラリー、および天然産物混合物内のリガンドの結合を評価するために使用してもよい。これらの基質およびリガンドは、天然の基質およびリガンドであってもまたは構造的または機能的疑似体であってもよい。
【００７７】
ＩＧＳ３ポリペプチドは、病理学を含む生物学的機能の原因となる。従って、一方ではＩＧＳ３を刺激し、そして他方ではＩＧＳ３の機能を阻害できる化合物および薬剤を発見することが望ましい。一般に、アゴニストは、なかでも上記の「疾患」のような病状のための治療および予防の目的に使用される。
【００７８】
アンタゴニストは、なかでも上記の「疾患」のような病状のための種々の治療および予防の目的に使用してもよい。
【００７９】
一般に、このようなスクリーニング手順は、本発明の受容体ポリペプチドをその表面に発現しそして、必須の場合にはその表面にＲＡＭＰの同時発現をするために適する細胞の産生を含む。このような細胞は、哺乳類、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞を含む。次いで、受容体を発現する細胞（または発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触させ、結合、または機能性反応の刺激もしくは阻害を観察する。
【００８０】
一つのスクリーニング技術は、受容体活性化により起きる細胞外ｐＨ、細胞内ｐＨ、または細胞内カルシウム変化を測定する系内での本発明の受容体を発現する細胞（例えばトランスフェクションされたＣＨＯ細胞）の使用を含む。この技術において、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させてもよい。第二メッセンジャー反応、例えばシグナル伝達、ｐＨ変化、またはカルシウムレベルの変化を次いで測定して、潜在的化合物が受容体を活性化または阻害するかどうかを決定する。
【００８１】
別の方法は、受容体−媒介シグナル、例えばｃＡＭＰ蓄積および／またはアデニル酸シクラーゼ活性の調節を決定することによる受容体阻害剤に関するスクリーニングを含む。このような方法は、真核細胞を本発明の受容体を用いてトランスフェクションして細胞表面上に受容体を発現させることを含む。次いで、細胞を潜在的アンタゴニストの存在下で本発明の受容体に対するアゴニストに暴露する。潜在的アンタゴニストが受容体を結合しこれにより受容体結合を阻害する場合には、アゴニスト媒介シグナルが調節されるであろう。
【００８２】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法は、米国特許（ＵＳ）第５，４８２，８３５号に記載の酵母に基づく技術である。
【００８３】
アッセイは、単なる候補化合物の試験結合でもよく、ここで受容体を有する細胞への接着は、候補化合物と直接または間接に結合した標識によるか、または標識競合物との競合を含むアッセイにより検出される。さらに、これらのアッセイは、候補化合物が受容体の活性化により発生するシグナルをもたらすかどうかを試験してもよく、これにはその表面に受容体を有する細胞に適する検出系を用いる。活性化の阻害剤は、一般に、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する効果を観察される。
【００８４】
さらに、アッセイは、混合物を形成するためにＩＧＳ３ポリペプチドを含む溶液と候補化合物とを混合し、混合物中のＩＧＳ３活性を測定し、そして混合物のＩＧＳ３活性を標準と比較する段階を単に含んでなってもよい。
【００８５】
ＩＧＳ３　ｃＤＮＡ、タンパク質およびタンパク質に対する抗体は、細胞内のＩＧＳ３　ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物の効果を検出するためのアッセイを構成するために使用してもよい。例えば、ＥＬＩＳＡは、当該技術分野に公知の標準方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてＩＧＳ３タンパク質の分泌または細胞関連レベルを測定するために構築されてもよく、そしてこれは適当に操作された細胞または組織からのＩＧＳ３の産生を阻害または促進するであろう薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用できる。スクリーニングアッセイを行うための標準方法は、当該技術分野では周知である。
【００８６】
潜在的ＩＧＳ３アンタゴニストの例は、抗体または、ある場合にはＩＧＳ３のリガンド、例えばリガンドの断片に密接に関係したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、または受容体に結合するが反応は行わないで、受容体の活性を阻止する小分子を含む。
【００８７】
従って、別の態様では、本発明は、
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のもの、
（ｂ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを発現する組換え細胞、
（ｃ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものを発現する細胞膜、または
（ｄ）ＩＧＳ３ポリペプチド、好ましくは配列番号２のものに対する抗体
を含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチドに対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはＩＧＳ３ポリペプチドの産生を低下、増加および／または促進する化合物を同定するためのスクリーニングキットに関する。
【００８８】
あらゆるこのようなキット内に、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は本質的な成分を含んでなってもよいことが認められる。
予防および治療方法
本発明は、ＩＧＳ３活性の過剰および／または不十分な量の両方に関連する異常な状態を治療するための方法を提供する。
【００８９】
ＩＧＳ３の活性が過剰な場合には、数種の方法が利用できる。一つの方法は、以上に記載した阻害化合物（アンタゴニスト）を、薬剤的に許容できるキャリヤーと一緒に、ＩＧＳ３へのリガンドの結合を遮断することにより、またはＲＡＭＰポリペプチドまたは第二シグナルとの相互作用を阻害することにより活性化を阻害し、これにより異状状態を緩和するために有効な量を患者の投与することを含んでなる。
【００９０】
他の方法では、内在性ＩＧＳ３と競合してリガンドをまだ結合できるＩＧＳ３ポリペプチドの可溶性の形を投与してもよい。このような競合物の典型的な態様は、ＩＧＳ３ポリペプチドの断片を含んでなる。
【００９１】
さらに別の方法では、内在性ＩＧＳ３をコードする遺伝子の発現は、発現遮断技術を用いて阻害できる。既知のこのような技術は、内部産生または別途に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。例えばＯ’Ｃｏｎｎｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． （１９９１） ５６：５６０ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ ＵＳＡ （１９８８）参照。あるいは、遺伝子と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給できる。例えばＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９７９） ６：３０７３； Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２４１：４５６； Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５１： １３６０参照。これらのオリゴマーは、それ自体を投与できるかまたは関連するオリゴマーを生体内で発現できる。合成したアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基または修飾された骨格を含んでなってもよい。後者の例は、メチルホスホナート、ホスホロチオアートまたはペプチド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる分解からの保護を与えるためにアンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチド内に組み込まれ、これは当該技術分野には周知である。これらまたはその他の修飾された骨格を用いる合成されたアンチセンスおよび三重らせん分子は、本発明の一部を形成する。
【００９２】
さらに、ＩＧＳ３ポリペプチドの発現は、ＩＧＳ３  ｍＲＮＡ配列に特異性のリボザイムを用いて回避してもよい。リボザイムは、天然または合成であることができる触媒活性ＲＮＡである（例えばＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． （１９９６） ６（４）， ５２７−３３ 参照）。合成リボザイムは、選択された位置で特異的にＩＧＳ３  ｍＲＮＡを開裂し、これによりＩＧＳ３  ｍＲＮＡの機能性ポリペプチド内への翻訳を避けるように設計できる。リボザイムは天然リン酸リボース骨格および天然塩基、例えばＲＮＡ分子中に通常見いだされるものを用いて合成してもよい。あるいは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を与えるように、リボザイムは非天然骨格、例えば２’−Ｏ−メチル  ＲＮＡを用いて合成してもよくそして修飾塩基を含んでもよい。
【００９３】
ＩＧＳ３およびその活性の低い発現に関連する異常な状態を治療するために、種々の方法も利用できる。一つの方法は、ＩＧＳ３を活性化する化合物、すなわち上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を薬剤的に許容できるキャリヤーと一緒に患者に投与して、これにより異常な状態を緩和することを含んでなる。あるいは、患者内の関連細胞によるＩＧＳ３の内在的産生を行うために遺伝子治療を利用してもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に考察した複製欠失レトロウイルスベクター内の発現に関して操作してもよい。次いでレトロウイルス発現構築物を単離して、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入したパッケージング細胞内に導入してもよく、これによりパッケージング細胞は関係する遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生体細胞は、生体内における細胞の操作および生体内におけるポリペプチドの発現のために患者に投与してもよい。遺伝子治療の概説については、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｓｔｒａｃｈａｎ Ｔ．ａｎｄ Ｒｅａｄ Ａ．Ｐ．， ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｔｄ（１９８６） 中の第２０章「遺伝子治療およびその他の分子遺伝子に基づく治療方法」（Ｃｈａｐｔｅｒ ２０， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ） およびその中の引用文献を参照のこと。
【００９４】
上記のあらゆる治療方法は、例えば哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラビット、サル、および最も好ましくはヒトを含む、このような治療が必要なあらゆる患者に適用してもよい。
調剤および投与
ペプチド、例えばＩＧＳ３ポリペプチドの可溶性形、およびアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子は、適当な薬剤キャリヤーと組み合わせて調剤してもよい。このような調剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化合物、および薬剤的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤を含んでなる。調剤は投与の形態に適合しなければならず、そして当該技術分野の熟練者の範囲内に十分に入る。本発明は、さらに、本発明の上記の組成物の１種またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以上の容器を含んでなる薬剤包装物およびキットにも関する。
【００９５】
本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独または他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【００９６】
薬剤組成物の全身投与の好ましい形は、注射、典型的には静脈内注射を含む。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内、または腹腔内が使用できる。全身投与の別の手段は、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤を用いる粘膜経由または経皮投与を含む。さらに、経口およびカプセル化調剤に適当に調剤された場合には、経口投与も可能であろう。
【００９７】
所要の投与範囲は、ペプチドまたは化合物の選択、投与の経路、調剤の性質、患者の病状の性質、および担当医師の判断に依存する。適当な用量は、０．１〜１００μｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲内である。しかし、種々の使用化合物および投与の種々の経路の異なる効率を考慮して、所要用量の広範な変化も予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い用量を必要とすると予想される。これらの用量レベルの変化は、最適化のための標準的な経験慣行を用いて調整でき、これは当該技術分野では良く理解されている。
【００９８】
治療に使用されるペプチドは、上記のようにしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療モダリティーにおいて、患者内に内在的に生成させることもできる。従って、例えば、患者からの細胞は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを用いて生体外で、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いてポリペプチドをコードするように操作してもよい。次いで細胞を患者内に導入する。
【００９９】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明することのみを意図するものであり、従ってこれらの実施例は本発明をいかなる意味でも制限するとはみなされない。
【０１００】
【実施例】
実施例１．新規のＧ−タンパク質共役型受容体をコードするゲノムＤＮＡのクローニング
実施例１ａ．新規のＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするゲノム断片の相同性ＰＣＲクローニング
ＰＣＲに基づく相同性クローニング戦略を、新規のＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードする部分ゲノムＤＮＡ配列を単離するために使用した。前進（Ｆ２０）および後退（Ｒ４２、Ｒ４３）縮重ＰＣＲプライマーを、ニューロテンシン受容体遺伝子ファミリー（Ｖｉｔａ Ｎ． ｅｔ ａｌ． ［１９９３］ Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ． ３１７， １３９−１４２；Ｖｉｔａ Ｎ． ｅｔ ａｌ． ［１９９８］ Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６０， ２６５−２７２） の保存領域内で、細胞内ループ１（Ｉ１）と膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）との境界および膜貫通ドメイン３と細胞内ループ２の間の境界（ＴＭ３／Ｉ２）においてそれぞれ設計した。
Ｆ２０（Ｉ１／ＴＭ２）：
５’−ＣＴＧＣＡＣＴＡＣＣＡＣＧＴＧＣＴＣ（ＡまたはＴ）（ＧまたはＣ）（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）（ＣまたはＴ）Ｔ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）ＧＣ−３’
（配列番号３）
Ｒ４２（ＴＭ３／Ｉ２）：
５’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡ（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）Ａ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）Ｃ（ＧまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＴＣ（Ｃまたはイノシン）（Ｃ，ＧまたはＴ）                    （配列番号４）
Ｒ４３（ＴＭ３／Ｉ２）：
５’−ＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧ（ＡまたはＧ）ＴＣ（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）（ＡまたはＧ）Ｃ（ＡまたはＧ）ＣＴ（Ａ，ＧまたはＴ）−３’                                                  （配列番号５）
ニューロテンシン受容体ファミリーの既知のメンバーの増幅を抑制するために、プライマーＲ４２およびＲ４３の３’最終ヌクレオチド位置を、ヒトＮＴＲ１  ｃＤＮＡの相当する位置（Ｒ４２）またはＮＴＲ１およびＮＴＲ２  ｃＤＮＡの両方の相当する位置（Ｒ４３）にいずれかに相補的とならないように選択した。
【０１０１】
一次ＰＣＲ反応は、体積６０μｌ中で行いそして１００ｎｇヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、６μｌジーンアンプＴＭ（ＧｅｎｅＡｍｐ）１０ｘＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３；５００ｍＭ  ＫＣｌ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、３．６μｌ  ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３６μｌ  ｄＮＴＰ類（それぞれのｄＮＴＰの２５ｍＭ）、１．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑ−ＧｏｌｄＴＭポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）および縮重前進（Ｆ２０）および後退プライマー（Ｒ４２）それぞれ３０ピコモルを含んでいた。反応管を９５℃で１０分間加熱し、次いで変性（９５℃、１分間）、アニーリング（５５℃、２分間）および伸展（７２℃、３分間）の３５サイクルを行った。最後に反応管を１０分間、７２℃で加熱した。
【０１０２】
半−ネスト（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ） ＰＣＲ反応のために、一次ＰＣＲ反応物の１／５０希釈物の１μｌを、それぞれ縮重前進および後退プライマーＦ２０およびＲ４３を用いる鋳型として用いた。半−ネストＰＣＲ反応は、一次ＰＣＲ反応と同じ条件下で行った。
【０１０３】
半−ネストＰＣＲ反応産物をアガロースゲル上でサイズ分別し、そして臭化エチジウムを用いて染色した。±２２０ｂｐの断片が同定され、これをＱｉａｅｘ−ＩＩＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから精製しそして供給者（ｐＧＥＭ−Ｔ キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）の推奨する方法に従ってｐＧＥＭ−Ｔプラスミド中に連結した。このようにして作製した組換えプラスミドを適合する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＳＵＲＥＴＭ２細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。形質転換した細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガープレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  ２０  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて個別コロニーのミニ培養物から精製した。ＤＮＡ配列決定反応は、ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  キット（ＰＥ−ＡＢＩ）を用い、挿入−近接を用いて精製したプラスミドＤＮＡ上で行った。配列決定反応産物をＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈降を用いて精製し、そしてＡＢＩ３７７自動化配列決定装置で分析した。
【０１０４】
公開ドメイン配列データバンク（Ｂｌａｓｔｎ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． ［１９９７］， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２）に対するクローンＨＮＴ１３７０の挿入配列のコンピューター支援相同性サーチは、これがＧＰＣＲファミリーの新規のメンバー（の一部分）をコードすることの強い徴候を明らかにした。ＨＮＴ１３７０は±２２０ｂｐ断片からクローニングされたけれども、クローン人工操作の結果挿入サイズは±１３０ｂｐに過ぎなかった。我々はこの新規のＧＰＣＲをＩＧＳ３と呼ぶ。
【０１０５】
【表３】
2004500039.tif 000004
【０１０６】
実施例１ｂ．　完全ＩＧＳ３コーディング配列を含むゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ＩＧＳ３の完全コーディング配列は、ヒトゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを介して得た。ラムダＥＭＢＬ３　ＳＰ６／Ｔ７ファージベクター中で構築されたヒトゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃ＨＬ１０６７）を、ＩＧＳ３特異性プローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。このプローブは、ＨＮＴ１３５５プラスミド（これはＨＮＴ１３７０と同じ挿入物を含んでいた）からＩＧＳ３特異性プライマーＩＰ１１９６９（配列番号６）およびＩＰ１２００８（配列番号７）を用いて増幅した１３０ｂｐＰＣＲ断片から誘導した（図１）。１３０ｂｐ断片をゲルからＱｉａｅｘ  ＩＩＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰのランダムプライム組込み（Ｒａｎｄｏｎ ｐｒｉｍｄｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を介して、比放射能＞１０９ｃｐｍ／μｇまで、プライムイット（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ）ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、供給者から提供された指針に従って放射能標識した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈのラムダライブラリー・ユーザーマニュアル（ＰＴ１０１０−１）に従って、１３０ｂｐプローブを用いて約５５０，０００個のプラークがスクリーニングされた。３個の陽性クローン（λ−ＩＧＳ３．１、λ−ＩＧＳ３．３およびλ−ＩＧＳ３．５）がプラーク精製されそしてマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ［１９８９］， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））による記載のようにして小規模液体培養物から組換えファージＤＮＡが作製された。
【０１０７】
ＩＧＳ３特異性プライマーを用いる組換えファージＤＮＡの配列分析は、３個すべてのラムダクローンの挿入物が，３３０アミノ酸の新規の推定（イントロンを含まない）ＧＰＣＲをコードする長いオープンリーディングフレームを含んでいた（翻訳の前提とする開始にはインフレーム終止コドンが前置された）。ＩＧＳ３コーディング配列をＰＣＲ増幅の後にプラスミドベクター内にサブクローンした。ＰＣＲ反応は、エクスパンドＴＭ（Ｅｘｐａｎｄ）ハイフィデリティーＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてＩＰ１２９３６（配列番号８）およびＩＰ１２９３７（配列番号９）オリゴヌクレオチドプライマーを用い、単離されたλ−ＩＧＳ３．１、λ−ＩＧＳ３．３およびλ−ＩＧＳ３．５ファージＤＮＡ（５００ｎｇ）上で行った。ＰＣＲ反応管を９５℃に２分間加熱し、次いで変性（９５℃、３０秒間）、アニーリング（５８℃、３０秒間）および伸展（７２℃、１分間）の３５サイクルを行った。最後に最終伸展工程を１０分間、７２℃で行った。±１，２００ＢＰ  ＰＣＲ産物をゲルから精製しそしてｐＧＥＭ−Ｔベクター内に連結した。次いで組換えＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５αＦ’を形質転換するために使用した。これから細菌クローンＨＢ４９７１、ＨＢ４９７２（両方共にλ−ＩＧＳ３．１からサブクローンされたもの）、ＨＢ４９７３およびＨＢ４９７４（両方共にλ−ＩＧＳ３．３からサブクローンされたもの）およびＨＢ４９７５およびＨＢ４９７６（両方共にλ−ＩＧＳ３．５からサブクローンされたもの）が得られた。すべてのプラスミドクローンの挿入物を完全に配列決定した。すべての配列データを混成（ｍｅｌｄ）させると、共通配列が生まれ、これは推定新規ＧＰＣＲ受容体（ＩＧＳ３）をコードする３３０アミノ酸の長いオープンリーディングフレームの存在を確認した（図１）。ＩＧＳ３の共通ｃＤＮＡおよびタンパク質配列をそれぞれＩＧＳ３ＤＮＡ（配列番号１）およびＩＧＳ３ＰＲＯＴ（配列番号２）として本明細書に記載する。ＩＧＳ３ＤＮＡ配列を用いるＤＮＡデータバンクの相同性サーチは、１個のＥＳＴ配列（受入（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ） 番号ＡＦ００３８２８号）を示し、これは３’末端でＩＧＳ３ＤＮＡと部分的に重複する（図１）。
【０１０８】
プラスミドＨＮＴ４９７１（ＩＧＳ３ＤＮＡ配列を含む）を内包する細菌株を、１００μｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢアガープレート上に再プレーティングした後に再クローニングしそしてインノゲネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｎ．Ｖ．株表（ＩＣＣＧ４３１９）および”Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ （ＣＢＳ）”（Ｂａａｒｎ 、オランダ国、受入番号第１０２１９６号）の両方に寄託した。プラスミドＤＮＡは、再クローニングした単離物から調製しそして挿入物を配列決定しそしてＩＧＳ３ＤＮＡ配列と同一であることを見いだした。
【０１０９】
【表４】
2004500039.tif 000005
【０１１０】
【表５】
2004500039.tif 000006
【０１１１】
【表６】
2004500039.tif 000007
【０１１２】
【表７】
2004500039.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】
共通ＩＧＳ３　ｃＤＮＡ配列を生成するために単離された種々のＤＮＡクローンの相対位置の図示。ＨＮＴ１３７０は、「創始（ｆｏｕｎｄｉｎｇ）」ゲノムクローンを表す。λ−ＩＧＳ３．１Ａ、Ｂなどは、ラムダクローンＩＧＳ３．１からのＤＮＡの配列分析から得られた別々の（ほとんど）重複した配列コンティグを示す。本文書中に記載したＰＣＲプライマーは、（ＩＰ＃）で示す。ＣＯＮＳＥＮＳＵＳは、すべての得られた配列を混成（ｍｅｒｇｅ） した後に得られたコンティグを示す。少なくとも３個の独立したクローンの配列分析により完全に確認されたＣＯＮＳＥＮＳＵＳコンティグの部分は、ＩＧＳ３ＤＮＡにより表される（配列番号１）。ＩＧＳ３ＤＮＡ中に存在する３３０アミノ酸長さのオープンリーディングフレームは、「＊＊」で示す。ＥＳＴ  ＡＦ００３８２８の位置は「＝＝」で示す。
【国際公開パンフレット】
2004500039.tif 000009
2004500039.tif 000010
2004500039.tif 000011
2004500039.tif 000012
2004500039.tif 000013
2004500039.tif 000014
2004500039.tif 000015
2004500039.tif 000016
2004500039.tif 000017
2004500039.tif 000018
2004500039.tif 000019
2004500039.tif 000020
2004500039.tif 000021
2004500039.tif 000022
2004500039.tif 000023
2004500039.tif 000024
2004500039.tif 000025
2004500039.tif 000026
2004500039.tif 000027
2004500039.tif 000028
2004500039.tif 000029
2004500039.tif 000030
2004500039.tif 000031
2004500039.tif 000032
2004500039.tif 000033
2004500039.tif 000034
2004500039.tif 000035
2004500039.tif 000036
2004500039.tif 000037
2004500039.tif 000038
2004500039.tif 000039
2004500039.tif 000040
2004500039.tif 000041
2004500039.tif 000042
2004500039.tif 000043
2004500039.tif 000044
2004500039.tif 000045
2004500039.tif 000046
2004500039.tif 000047
2004500039.tif 000048
2004500039.tif 000049
2004500039.tif 000050
2004500039.tif 000051
2004500039.tif 000052
2004500039.tif 000053
2004500039.tif 000054
2004500039.tif 000055
2004500039.tif 000056
2004500039.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成13年10月30日(2001.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２記載のＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｂａａｒｎ 、オランダ国）における寄託番号ＣＢＳ１０２１９６号内に含まれるＤＮＡ挿入物によりコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、特には配列番号１に相当するヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％（好ましくは少なくとも９０％）の配列の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列
からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが、配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドをコードする配列番号１内に含まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが、配列番号１のものに対してその全長にわたって少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１のポリヌクレオチドである、請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡまたＲＮＡである、請求項１から４までに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現ベクターが適合する宿主細胞内に存在する場合に、該発現ベクターが配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％一致を有するアミノ酸配列を含んでなるＩＧＳ３ポリペプチドを産生可能である、発現ベクターを含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【請求項７】
請求項６の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
酵母細胞である、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
動物細胞である、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項７から９までに記載の細胞から誘導されたＩＧＳ３受容体膜調製物。
【請求項１１】
該ポリペプチドの産生のために十分な条件下で請求項７の宿主を培養しそして培養物からポリペプチドを回収することを含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１２】
適当な培養条件下で、細胞がＩＧＳ３ポリペプチドを産生可能なように、請求項６の発現ベクターを用いて細胞を形質転換またはトランスフェクションすることを含んでなる、細胞のＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞を産生するための方法。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、ＩＧＳ３ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１３のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２またはその変種のＩＧＳ３ポリペプチドに対して免疫特異性の抗体。
【請求項１６】
（ａ）該受容体に対するアゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／または、
（ｂ）配列番号２のＩＧＳ３ポリペプチドコードするヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または生体内で該受容体活性の産生を行うような形で該ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを患者に提供する
ことを含んでなる、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の増強された活性または発現を必要とする、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の発現または活性に関係する疾患を患っている患者の治療のための方法。
【請求項１７】
（ａ）該受容体に対するアンタゴニストの治療的な有効量を患者に投与し、および／または
（ｂ）該受容体をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチドを患者に投与し、および／または
（ｃ）そのリガンドに関して該受容体と競合するポリペプチドの治療的な有効量を患者に投与する
ことを含んでなる、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の増強された活性または発現を必要とする、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチド受容体の発現または活性に関係する疾患を患っている患者の治療のための方法。
【請求項１８】
（ａ）該患者のゲノム内の該ＩＧＳ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内の突然変異の存在または不在を決定し、および／または
（ｂ）該患者から誘導された試料内のＩＧＳ３ポリペプチド発現の存在または量を分析する
ことを含んでなる、該患者内の請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチドの発現または活性に関連する患者内の疾患または疾患に対する罹患性の診断のための方法。
【請求項１９】
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞を試験化合物と接触させ、そして
（ｂ）試験化合物がＩＧＳ３ポリペプチドの活性化により発生されるシグナルをもたらすかどうかを決定する
ことを含んでなる、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチドに対するアゴニストを同定するための方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法により同定されるアゴニスト。
【請求項２１】
（ａ）ＩＧＳ３ポリペプチドを産生する細胞をアゴニストと接触させ、そして
（ｂ）該アゴニストにより発生されるシグナルが候補化合物の存在下において減少されるかどうかを決定する
ことを含んでなる、請求項１３のＩＧＳ３ポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法により同定されるアンタゴニスト。
【請求項２３】
請求項１２記載の方法により産生される組換え宿主細胞またはＩＧＳ３ポリペプチドを発現するその膜。
【請求項２４】
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部分を、高レベル遺伝子発現または遺伝子が該動物内で通常は発現されない細胞タイプ内での発現を駆動することができる調節配列と連結させ、または
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列から本質的になるポリヌクレオチドのコーディング部分を操作し、そして、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする内在性遺伝子対立遺伝子が完全にまたは部分的に不活性化されるような方法で該動物のゲノム内に該配列を再導入する
工程を含んでなる、遺伝子的に操作したヒト以外の動物を創成する方法。
【国際調査報告】
2004500039.tif 000058
2004500039.tif 000059
2004500039.tif 000060