(57)【要約】例えば、薬剤への異常な応答または薬物の不十分な代謝または過剰な代謝によって生じる幾つかの共通の疾患および障害に対する個々の素因に関連する、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の分子変異型プロモーターのポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。さらに、薬物の中間代謝に関連する障害の状態を診断する方法について説明される。さらに、薬物の超高速代謝群または中間型代謝群である被験者を診断するのに有用な、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズする、および／またはこの領域に伸長できるオリゴヌクレオチドを含むキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド：
（ａ） 図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターのヌクレオチドの−１５８４位に対応するヌクレオチド位置に１つのＧを有する、配列番号：１の核酸配列をもつ分子変異型ポリヌクレオチド；
（ｂ） 分子変異型ポリヌクレオチドであって、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの−１５８４位に対応する位置において、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、付加、および／または置換を有する、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズできるポリヌクレオチド；および
（ｃ） 分子変異型ポリヌクレオチドであって、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの−１５８４位に対応する位置に１つのＧを有する、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズできるポリヌクレオチド。
【請求項２】
ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換が、対応する野生型遺伝子と比較して、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の発現を変化させる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１もしくは２記載のポリヌクレオチドまたは請求項３記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項５】
被験者からの試料におけるＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにおける突然変異の存在を決定する段階を含む、ＣＹＰ２Ｄ６基質の低減または増強したクリアランス能に関連する障害、またはそのような障害への感受性を診断する方法。
【請求項６】
基質が抗不整脈薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、神経遮断薬、アヘン剤、抗癌剤またはアンフェタミンから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、制限酵素切断、直接配列決定、核酸増幅技術またはハイブリダイゼーション技術を含む、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
障害をなくすまたは軽減するため、被験者に薬物を投与する段階をさらに含む、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドの検出のための、および／または、個々のＣＹＰ２Ｄ６プロモーター対立遺伝子の遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のための、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが請求項１または２記載のポリヌクレオチドである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが約１５〜５０ヌクレオチド長であり、配列番号：２〜１０のいずれか一つのヌクレオチド配列、または相補的配列を含む、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
請求項１１において定義されるようなオリゴヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブ。
【請求項１３】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドの存在を検出できる、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む、請求項５〜９のいずれか一項記載の方法、および任意に適した検出法を実施するのに有用なキット。
【請求項１４】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドをゲノム内に含む被験者の障害を治療または予防するための薬学的組成物を調製するための、有効用量の薬剤またはプロドラッグの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、表現型スペクトル、およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ｄ６遺伝子遺伝子の遺伝する異常発現および／または機能の幾つかの形態を伴う重複する臨床特性を、診断および治療する手段および方法に広く関連する。特に、本発明は、例えば不十分な代謝または過剰な代謝に引き起こされる幾つか共通の疾患および障害の個々の素因に関係する、分子変異型チトクロームＰ４５０ ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含有するベクターに関連する。さらに、本発明はそのようなポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞に関連する。加えて、本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の多機能に関する疾病の治療のための薬物候補を同定および獲得するための方法、ならびにそのような疾病の状態の診断方法に関連する。本発明はさらに、薬物の超高速代謝能群または中間型代謝能群である被験者を診断するのに有用な、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズする、および／またはこの領域に伸長できるオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
【０００２】
本明細書の本文を通して幾つかの文書が引用されている。本明細書で引用される各文書（任意の製造者の仕様書、指示書等を含む）は本明細書において参照として組み入れられるが、引用される任意の文書が実際に本発明に関する先行技術であるということを認めたわけではない。
【０００３】
発明の背景
チトクロームＰ４５０ ＣＹＰ２Ｄ６はＰ４５０のＣＹＰ２ファミリーに属し、ヒトにおけるＣＹＰ２Ｄサブファミリーの唯一機能的に活性なアイソザイムである。それは治療的に使用される全ての薬物の２５％までの代謝に関わる（Ｈａｒｄｍａｎら、１９９５）。その合成をコードする遺伝子は、第２２染色体長腕のｑ１３．１のＣＹＰ２Ｄ遺伝子座に位置する（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍら、１９８７）。それは２つの偽遺伝子ＣＹＰ２Ｄ７ＰおよびＣＹＰ２Ｄ８Ｐをも含む遺伝子クラスターの一部である（Ｋｉｍｕｒａら、１９８９）。ヒトＣＹＰ２遺伝子ファミリーのその他のメンバーのように、ＣＹＰ２Ｄ遺伝子は９つのエキソンおよび８つのイントロンからなる。酵素は共通の遺伝子多型（ＭｅｙｅｒおよびＺａｎｇｅｒ、１９９７）を表す。事実上それは、その発見に関わった２つの基質に基づきデブリソキン／スパルテイン多型と名付けられ、遺伝子多型が示された最初のチトクロームＰ４５０酵素であった（Ｍａｈｇｏｕｂら、１９７７；Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍら、１９７９）。これら２つのプローブ薬物の代謝的過程によって、欧州人集団の被験者の５〜１０％では、主要な代謝産物である４−ヒドロキシデブリソキンおよび２−デヒドロスパルテインの形成能が著しく欠損している。これらの被験者は低代謝群（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ）と呼ばれ、集団の残りはいわゆる高代謝群（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）と呼ばれた。「低い代謝能」という特性は、常染色体劣性形質として遺伝をする、すなわち、ＰＭは２つの非機能的対立遺伝子の保因者である。この多型の分子的基礎は広く研究され、白人におけるＰＭ表現型を推定９９％の信頼性で予測させる、３０個以上の機能的対立遺伝子および非機能的対立遺伝子について説明されてきた（Ｄａｌｙら、１９９６およびＣＹＰ 対立遺伝子命名法ウェブサイト（ＣＴＰ Ａｌｌｅｌｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｗｅｂ−Ｓｉｔｅ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍ．ｋｉ．ｓｅ／ＣＹＰａｌｌｅｌｅｓ／ｃｙｐ２ｄ６．ｈｔｍ）。
【０００４】
高代謝群（遺伝的に少なくとも１つの機能的対立遺伝子をもつもの）において存在する、ＣＹＰ２Ｄ６活性の５０倍以上の変動性により、最速の「高（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）」代謝の表現型を「超高速（ｕｌｔｒａｒａｐｉｄ）」代謝群（ＵＭ）、および最も遅いものを「中間型（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」代謝群（ＩＭ）と呼ぶようになった。文献に、これらの下位表現型は臨床的に重要性をもつという証拠が認められる。ＵＭ表現型をもつ個体は、異常に速い薬物のクリアランスによる治療上の失敗を経験する危険がある一方、ＩＭではＰＭに比較して有害な副作用および毒性を発達させる危険があり得る。
【０００５】
ＵＭ表現型についての分子生物学的な説明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子重複の発見により与えられたが、これはＵＭの一部分に適用されるだけである（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９３；Ｄａｈｌら、１９９５）。以前に説明された２つのＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子は、より低い酵素活性を導き、正常な機能的対立遺伝子をもたない個体においてＩＭ表現型を生じさせる。しかし、これらの両対立遺伝子（＊９：ＢｒｏｌｙおよびＭｅｙｅｒ、１９９３；＊１０：Ｙｏｋｏｔａら、１９９３）は、白人集団においては２％のみの頻度で生じ、ＩＭの約２０％のみが、これら２つの対立遺伝子を含む、情報を提供する遺伝子型をもつ（すなわち、＊９／＊０、＊１０／＊０および＊１０／＊０；Ｓａｃｈｓｅら、１９９７；Ｇｒｉｅｓｅら、１９９８）。ゆえに、ＩＭの８０％が「情報を提供しない」遺伝子型、すなわち、正常な高代謝群または超高速代謝群の表現型にも関連する遺伝子型をもつ。そのため、ＩＭ下位表現型が遺伝的基礎をもつのか、または後成的な現象であるのかは不明なままである。
【０００６】
自然に生じた突然変異が存在する場合、それらは、薬物の代謝および薬物治療の有効性に影響を及ぼす可能性があることは明らかである。しかし、ヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子において、そのような変異がどれほど、またどの程度の頻度でどの位置に存在するのかは知られていない。
【０００７】
したがって、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型に起因し、例えば疾患を妨げる個々の薬物不耐性および薬物治療の無効性の多様な形態を診断および治療する手段および方法は、従来十分には利用可能ではなかったが、やはり非常に望ましい。
【０００８】
ゆえに、本発明の技術的な課題は上述の要求に応じることである。
【０００９】
この技術的課題の解決は添付の特許請求の範囲において特徴付けられる態様の提供により達成される。
【００１０】
発明の概要
本発明はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列における、新規かつこれまで未知の変異および、これらの対立遺伝子の集団分布の知見に基づいている。これらの新規の配列に基づき、診断試験およびそのような試験のための試薬は、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターのホモ接合体およびヘテロ接合体、高頻度対立遺伝子および低頻度対立遺伝子を含む、ヒトにおけるＣＹＰ２Ｄ６プロモーター対立遺伝子の特異的な検出および遺伝形質決定のために設計された。そのような試験法を用いたヒトのＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の状態の決定は、ＣＹＰ２Ｄ６の多くの基質を用いた治療の最適化に有用である。
【００１１】
第一の態様において、本発明は分子変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターのポリヌクレオチド、ならびにそれに関連する態様、例えばそれらを移入したベクター、および宿主細胞を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は上述された、前述のものを含むポリヌクレオチドまたはベクターを含むキットを提供する。
【００１３】
本発明に従う新規の変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は、特定の患者のための薬物の薬力学的プロフィールを開発する可能性を提供する。
【００１４】
発明の説明
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における変異の知見および特徴付け、ならびにヒト個体における異なるＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の区別についての診断試験は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子産物の標的であり、ゆえにその代謝がＣＹＰ２Ｄ６活性に依存するような薬物を用いた疾患の治療法を改善するために、非常に有力な手段を提供する。個々の対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６の状態の診断により、例えば、薬物の個別の用法の適用の可能性を開くことにより、焦点を絞った治療が可能となる。それはまた、治療の結果についての予後を知る手段としても有用である。さらに、ＣＹＰ２Ｄ６を遺伝形質決定するための診断試験は、確立した薬物で治療法を改善し、遺伝子型を薬物活性または副作用と関連付けるのに役立つと考えられる。
【００１５】
ゆえに、本発明は分子生物学および薬物療法についての薬学的研究を開発する新規の方法を提供する一方、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の発現に起因する、それらの潜在的な有害効果については回避している。
【００１６】
したがって、本発明は以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドに関連する：
（ａ） 図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターのヌクレオチドの−１５８４位に対応するヌクレオチドの位置において１つのＧを有する、配列番号：１の核酸配列をもつ分子変異型ポリヌクレオチド；
（ｂ） 分子変異型ポリヌクレオチドであって、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの−１５８４位に対応する位置において、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、付加および／または置換を有する、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズできるポリヌクレオチド；および
（ｃ） 分子変異型ポリヌクレオチドであって、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの−１５８４位に対応する位置において１つのＧを有する、図１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにハイブリダイズできるポリヌクレオチド。
【００１７】
本発明の状況においては、本明細書において使用されるような「分子変異型」ＣＹＰ２Ｄ６プロモーター、遺伝子またはタンパク質という用語は、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーター、遺伝子またはタンパク質が、ヌクレオチドの置換、付加、および／または欠失により、野生型ＣＹＰ２Ｄ６プロモーター、遺伝子またはタンパク質とは異なることを意味する（プロモーターを含むＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のゲノム配列は、例えばゲンバンク、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＯｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ［アクセッション番号Ｍ３３３８８］において説明される）。
【００１８】
本明細書にて使用される「対応する」という用語は、ある位置は先行するヌクレオチドの数のみによって決定されるのではないことを意味する。欠失、置換の可能性のある、または一つもしくはそれ以上の付加的なヌクレオチドを含む可能性のある、本発明による一定のヌクレオチドの位置は、プロモーターまたは遺伝子におけるどこか他の欠失または付加的なヌクレオチドによって変化する可能性がある。ゆえに、本発明による「対応する位置」のもとでは、ヌクレオチドは示された数において異なる可能性があるが、なおも同様の近傍ヌクレオチドを有する可能性があることが理解されるべきである。置換、欠失される、または付加的なヌクレオチドを含む可能性のあるヌクレオチドは、「対応する位置」という用語にも含有される。ヌクレオチドは、例えばそれらの近傍のヌクレオチドと共に、遺伝子発現の制御、対応するＲＮＡまたはＲＮＡエディティングの安定性に関係する可能性のある配列を形成し得る。
【００１９】
本明細書にて使用される「ハイブリダイズする」という用語は、対応する野生型遺伝子と比較して変化した変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の発現に関連する、本発明のポリヌクレオチドまたはその部分にハイブリダイズできるポリヌクレオチドを意味する。ゆえに、ハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、対応する野生型遺伝子と比較して変化した変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の発現に関連する。そのため、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの調製物のノーザンブロット分析またはサザンブロット分析各々においてプローブとして有用となりることができ、またはそれら各々の大きさに依存して、ＰＣＲ分析におけるオリゴヌクレオチドプライマーとして使用することができる。例えば電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）による、ＤＮＡ−タンパク質の相互作用の分析に有用な、ハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。好ましくは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長からなり、一方、プローブとして使用される本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長、または最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長からなる。
【００２０】
核酸分子を用いたハイブリダイゼーション実験の行い方は当技術分野においてよく知られている、すなわち、本発明に従って使用しなければならないハイブリダイゼーション条件は、当業者には既知のものである。そのようなハイブリダイゼーション条件は、「分子クローニング実験マニュアル，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９） Ｎ．Ｙ．のような、標準教材にて言及されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の、対応する野生型遺伝子に比較して変化した発現に関連する、本発明のポリヌクレオチドまたはその部分にハイブリダイズできる、本発明に従うポリヌクレオチドが好ましい、すなわち、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の発現を、対応する野生型遺伝子に比較して変化させることのできないポリヌクレオチドのような、関連しないポリヌクレオチドにはクロスハイブリダイズしないポリヌクレオチドが好ましい。
【００２１】
本発明に従い、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における、新規の、これまで同定されていない遺伝的変異の最頻値および集団分布が、多くの異なる個体由来のヒトＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の関連領域の配列解析により解析された。ＣＹＰ２Ｄ６を含む、全ての遺伝子の個々のゲノム構成をもつ個体のゲノムＤＮＡを、個々の血液試料から容易に精製できることはよく知られた事実である。これらの個々のＤＮＡ試料はその後、血液試料を提供した個体に存在するＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の配列組成の分析に使用される。ＣＹＰ２Ｄ６多型に関して過去に報告された全ての研究は限られており、９つのエキソンを含むコード配列に集中している。本研究は、遺伝子のプロモーター領域において初めて系統的に突然変異を導入して行ったものである。その目的は、プロモーター突然変異が遺伝子の転写に影響を与え、より高いまたは低いｍＲＮＡレベルを生じさせ、ゆえに肝臓において、より多量または少量の酵素を発現させ得るという仮定に基づき、インビボにおいて変化した酵素活性につながる突然変異を、もし存在するならば、同定することであった。意外にも、増強および低減されたＣＹＰ２Ｄ６酵素活性の各々に関連する、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにおける突然変異が認められた。確立された手法による、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の関連領域のＰＣＲ増幅、それに引き続くＰＣＲ産物の精製、自動ＤＮＡシーケンシングにより、配列解析を実施した；実施例を参照のこと。特に、白人の１０〜１５％の下位集団は、著しく欠損しているがなおもインビボにおけるこのチトクロームＰ４５０の機能を残存しているため、ＣＹＰ２Ｄ６の薬物基質の表現型として「中間型代謝群」と称される。現在既知のＣＹＰ２Ｄ６ 対立遺伝子に基づく遺伝子型の決定では、この表現型を予測することができない。本発明に従い、ＣＹＰ２Ｄ６の５’隣接配列の１．６ ｋｂを通して行った系統的な解析により、６つの突然変異が明らかになり、そのうち３つは機能をもったＣＹＰ２Ｄ６＊２ 対立遺伝子に独占的に関連し、そのうち１つは家系の解析において増加したＣＹＰ２Ｄ６＊２活性と共分離した。典型的な集団の試料においては、スパルテイン酸化についての尿中代謝比の中央値（ＭＲＳ）は、突然変異を欠く個体（＊２［−１５８４Ｃ］：ＭＲＳ ＝ ２．３３、Ｎ ＝ １２；Ｐ ＜ ０．０００１）に比較して、新規の変異型対立遺伝子をもつ個体（＊２［−１５８４Ｇ］：ＭＲＳ ＝ ０．５３、Ｎ ＝ ２７）においては４倍を超えて減少した。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のこの最初の機能的プロモーター変異は、一般的な集団においては２０〜２５％の推定頻度をもち、これにより、中間型代謝群としての表現型をもつ白人の５０％を超えて同定するための遺伝子型が確立される。
【００２２】
ヒト血液ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物の直接ＤＮＡ配列決定法によって個々のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型を決定し、新規ＣＹＰ２Ｄ６変異を同定する試みにおいて、考慮しなければならなかったある重要なパラメータは、各ヒトは各々の常染色体上の遺伝子（二倍性）の２つの遺伝子コピーを有する（通常、異常な例外は非常に少ない）という事実である。それにより、ホモ接合配列変異のみならず、ヘテロ接合変異をも明瞭に同定できるようにするため、配列の評価には非常に慎重を要した。新規ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型（ホモ接合およびヘテロ接合）の同定および特徴付けにおける異なる段階の詳細は、下記の実施例に記載される。
【００２３】
本発明に従って検出されるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における突然変異は図１および表２にそれぞれ示される。突然変異解析の方法は標準プロトコールに従い、実施例にて詳細に記載される。一般に、表現型スペクトルおよび、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子において突然変異をもつ患者における薬物代謝および変化した薬物耐性という、他の形態と重複する臨床的特徴の評価のため、本発明に従って使用されるそのような方法は、例えばハプロタイプ解析、単鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＡ）、ＰＣＲ法および直接配列決定法を含む。多くの患者の徹底的な臨床的特徴付けに基づいて、表現型は後にこれらの突然変異、また以前に述べられた突然変異と関連付けることができる。当業者には明白であるように、この新しい分子遺伝学的知識は現在、投与された薬物が異常な効果をもたらすような、指標となる患者の遺伝子型およびその家族の遺伝子型を正確に特徴付けるために使用することができる。
【００２４】
過去２０年間にわたって、遺伝子の異質性は薬物への反応にみられる変異の重要な原因としてますます認識されるようになった。多くの科学発表論文（ＭｅｙｅｒおよびＺａｎｇｅｒ、１９９７、２６９〜２９６およびＷｅｓｔら、１９９７、６３５〜６４８）は、ある種の薬物は、ある患者においては他の患者においてよりも、より良く作用する、または非常に毒性が高いことすらあること、また薬物に対する患者の反応におけるこれらの変異は分子的基盤に関連する可能性があることを明らかに示している。この「ゲノム薬理学」の概念は、患者の薬物への反応と遺伝子のプロフィールとの間の相関に焦点を向けている（Ｍａｒｓｈａｌｌ、１９９７ａおよび１９９７ｂ ）。薬物療法に関連する集団変異性のこのような状況において、ゲノム薬理学は、特定の薬物に対して副作用なく反応できる患者の同定および選択に有用な手段として提案されてきた。この同定／選択は、患者の血中の白血球からのＤＮＡを遺伝形質決定することによる、遺伝子多型の分子診断および疾患の特徴付けに基づくことができる。米国の民間健康保険医療団体、および多くの欧州諸国の政府公衆衛生局のような健康管理提供者のためには、このゲノム薬理学的アプローチにより健康管理を改善すること、ならびに不必要な治療、有効性のない薬物、および副作用のある薬物に対してかかる巨額な費用を削減することの双方の改善を示すことが可能である。
【００２５】
好ましい態様において、本発明は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換が、対応する野生型遺伝子と比較して、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の変化した発現をもたらすような、分子変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターのポリヌクレオチドに関連する。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくは合成によって産生されたＤＮＡ、またはこれらのうち任意のポリヌクレオチドを単独でもしくは組合せで含む、組換えにより産生したキメラ核酸分子が可能である。好ましくはポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを含む、遺伝子的な操作に従来使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージの一部である。そのようなベクターはさらに、適した宿主細胞および適切な条件下においてベクターを選択させるマーカー遺伝子のような遺伝子を含む可能性がある。組換えウイルスベクターを構築するため、当業者に既知の方法が使用できる；例えば、サムブルック、「分子クローニング実験マニュアル」コールドスプリングハーバー研究所（１９８９）Ｎ．Ｙ．および、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載の技術を参照のこと。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換した宿主細胞に関連する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞が可能である。
【００２７】
本発明の変異型ＣＹＰ２Ｄ６ポリヌクレオチドおよびベクターを用いて、インビボおよびインビトロにおいて、患者のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における特定の突然変異および影響を受ける表現型に関連する薬物の効率を研究することが今や可能である。ゆえに、本発明の特定の目的は、治療される患者の影響を受けた表現型と共分離するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターの変異型の多型を考慮して、化学療法を受けるべき疾患の治療のための、薬物／プロドラッグの選択および薬学的組成物の製剤に関わるものである。これにより、例えば、ある患者における副作用、および／または、疾患の同じもしくは異なる表現型に関する信頼できない薬学的プロフィールにより、例えば癌の治療には適していないとこれまで考えられていた薬剤の、安全かつ経済的な投与が可能になる。本明細書において説明される手段および方法は、例えば、推奨用量を改善するために使用でき、考慮される患者群に応じた必要用量の調整を処方者が予測することが可能になる。
【００２８】
したがって、本発明はさらに重要な態様において、被験者からの試料におけるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のプロモーターに突然変異の存在を決定することを含む、ＣＹＰ２Ｄ６基質のクリアランス能の低減もしくは増強、またはそのような障害への感受性に関連する、障害の診断方法に関連する。
【００２９】
本発明のこの態様に従い、障害またはそのような障害への感受性の状態を試験する方法は、例えばサザンブロット法またはインサイチュー解析の形態において、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸分子の使用により達成され得る。核酸配列はプロモーターまたはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコード領域もしくは非コード領域、例えばイントロンおよびＣＹＰ２Ｄ６プロモーター領域に伸長できるとされる領域にハイブリダイズできる。さらにこの試験は、例えば遺伝子の転写の実際の遮断と共に行うことができ、ゆえに治療上の関連性をもつことが期待される。さらに、プライマーまたはオリゴヌクレオチドも上述のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一つへのハイブリダイゼーションに使用できる。ハイブリダイゼーションに使用される核酸は、当然、例えば放射性マーカーまたは他のマーカーを取りこむまたは付着することにより好都合に標識され得る。そのようなマーカーは当技術分野において既知である。核酸分子の標識は従来法により達成できる。
【００３０】
さらに、変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターの存在は、ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターを包含する遺伝子の領域に特異的にハイブリダイズするプライマー組を使用することにより、および標準的手順に従って増幅反応を実施することによりモニタリングできる。上述したプローブまたはプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件において生じる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、当技術分野においてはよく知られている；例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、ＣＳＨ出版、コールドスプリングハーバー、１９８９；「核酸ハイブリダイゼーション、実践アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」ハムス（Ｈａｍｅｓ）およびヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、ＩＲＬ出版、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５を参照のこと。さらに、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターにおいて突然変異の特徴的なフィンガープリントとなり得る突然変異を同定するために、被験者から得られるゲノムＤＮＡを配列決定できる。本発明は、当技術分野においてよく知られている方法により、分析前に任意にＤＮＡを増幅でき、被験者から得たＤＮＡのＲＦＬＰによってそのようなフィンガープリントを生み出すことができる方法をさらに含む。例えば、増幅断片またはクローン断片のような試料核酸を、当技術分野において既知の数多くの方法の１つによって分析する。核酸はジデオキシ法または他の方法により配列決定できる。変異型配列とのハイブリダイゼーションもまた、サザンブロット、ドットブロット等によって、その存在を決定するために使用できる。米国特許出願第５，４４５，９３４号、または国際公開公報第９５／３５５０５号にて説明されるように、対照配列および変異型配列の、固相支持体に固定化したオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対するハイブリダイゼーションパターンもまた、変異型配列の存在を検出する手段として使用できる。一本鎖ＤＮＡ立体構造多型（ＳＳＣＰ）解析、変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ切断検出、およびゲルマトリックスにおけるヘテロ二本鎖解析は、電気泳動での移動度における変化として、ＤＮＡ配列変異により生じた立体構造変化を検出するために使用される。または、多型により制限エンドヌクレアーゼの認識部位が生じるまたは破壊される場合（制限断片長多型、ＲＦＬＰ）、その制限エンドヌクレアーゼにより試料を消化し、断片が消化されたかどうかを決定するために、産物を大きさにより分画する。分画は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動により実施される。
【００３１】
本発明の上述の態様のさらなる改変は、この開示から、いかなる不適当な実験もなく、当業者により容易に工夫することができる；例えば実施例を参照のこと。本発明の好ましい態様においては、上述された方法は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、制限酵素切断、直接配列決定、核酸増幅技術またはハイブリダイゼーション技術を含む。ＣＹＰ２Ｄ６活性または発現における表現型の変異に遺伝的に連鎖した多型については、特にマイクロサテライトマーカーまたは一塩基多型（ＳＮＰ）の使用によって、診断的スクリーニングを実施できる。マイクロサテライトまたはＳＮＰ多型自体は表現型として発現できないが、変化した活性または発現を生じさせる配列に連鎖している。２つの多型的変異体は連鎖不均衡にある可能性がある、すなわち、たとえ個々の遺伝子座がハーディ・ワインベルグ平衡にあるとしても、対立遺伝子が遺伝子間に非無作為的な対合を示す場合がある。連鎖解析は単独で、または表現型から明らかな多型の直接検出と組み合わせて実施できる。遺伝子型決定のためのマイクロサテライトマーカーの使用については詳細が記載されている。例えば、マンスフィールド（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２４（１９９４）、２２５〜２３３；およびジーグル（Ｚｉｅｇｌｅ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４（１９９２）、１０２６〜１０３１を参照のこと。遺伝子型決定のためのＳＮＰの使用は、ゴレヴィエヴァ（Ｇｏｌｅｖｉｅｖａ）、Ａｍ， Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５９（１９９６）、５７０〜５７８；およびアンダーヒル（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（１９９６）、１９６〜２００において説明されている。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、クリアランスの低減または増強が認められる基質は、抗不整脈薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、神経遮断薬、アヘン剤、抗癌剤、アンフェタミンからなる群より選択される。上述された方法のさらなる態様においては、本発明の方法の全ての適用に従い、障害をなくすまたは軽減するために被験者に薬物を投与する段階を含むさらなる段階により、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子によって生じる表現型応答による臨床的徴候が発症する前に特定の疾患を治療することが可能になる。本発明の方法の好ましい態様においては、該薬物は、上記に説明されたような化学療法薬である。
【００３３】
さらに、本発明は、上述の方法の段階；および薬物またはプロドラッグを治療的投与に適した形態において製剤化する段階、および本発明の方法において診断された被験者の障害を予防または改善する段階を含む、薬学的組成物を調製するための方法に関連する。薬物またはプロドラッグはそれらのインビボにおける投与後、排出または代謝のいずれかにより排除されるために、一つまたは複数の活性または不活性代謝産物へ代謝される（Ｍｅｙｅｒ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ２４（１９９６）、４４９〜４５９）。ゆえに、本発明の方法に従って同定および獲得された実際の化合物または阻害剤を使用する以外に、患者において活性型に転換される、プロドラッグとしての対応する製剤を用いることができる。プロドラッグおよび薬物の投与に採用されうる予防手段は、文献に記載されている；概説については、オザマ（Ｏｚａｍａ）、Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ． ２１（１９９６）、３２３〜３２９）を参照のこと。本発明の方法の好ましい態様において、薬物またはプロドラッグは、本明細書前述にて定義されるような薬物の誘導体である。
【００３４】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの検出のための、および／または対応する個々のＣＹＰ２Ｄ６プロモーター対立遺伝子の遺伝形質決定のための、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に関連する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、先に記載の本発明のポリヌクレオチドである。特定の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、好ましくは２０ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは２０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号：２〜１０の、またはこれらの任意の一つの相補的配列の、任意の一つのヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
したがって、なおさらなる態様において、本発明は上記に定義されるようなオリゴヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブに関連する。この状況において、「〜からなる」という用語は、上述のヌクレオチド配列、および本発明のプライマーまたはプローブのために使用されるヌクレオチド配列が、その５’末端および／または３’末端にすぐ隣接したＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のさらなるヌクレオチド配列を全くもたないことを意味する。しかし、標識のような他の成分、例えばビオチン分子、ヒスチジンフラッグ、抗体断片、金コロイド等、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に対応しないヌクレオチド配列は、本発明のプライマーおよびプローブ中に存在できる。さらに、上述の特定のヌクレオチド配列を使用すること、およびそれらを、これらの付加的なヌクレオチド配列が核酸以外の成分と共に散在させられるような、または介在性の核酸がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のヌクレオチド配列に対応しないような、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に由来する他のヌクレオチド配列と組合せることも、また可能である。その上さらに、例えば、当技術分野で周知のチオリン酸バックボーン（ｔｈｉｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂａｃｋｂｏｎｅ）および／または塩基類似体によってオリゴヌクレオチドの改変が可能であることは当業者には明らかである（Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１９９９）、３５１３〜８； Ｗｉｔｔｅｒｓ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ． ５３（１９９９）、４１〜５０； Ｈａｗｌｅｙ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ９（１９９９）、６１〜９； Ｐｅｎｇ Ｈｏ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６２（１９９８）、１〜１１； Ｓｐｉｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ８（１９９８）、２８１〜９３； Ｚｈａｎｇ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ． ２７８（１９９６）、９７１〜９； Ｓｈｏｊｉ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４０（１９９６）、１６７０〜５； Ｃｒｏｏｋｅ、Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ． ２７７（１９９６）、９２３〜３７）。本発明のある態様においては、例えば、少なくとも１２ ｎｔ．しばしば２０ ｎｔ．またはそれ以上の長さの多型位置の隣接配列を含むオリゴヌクレオチドのような、１つまたはそれ以上の提供された多型配列に対して、アレイ上の別個の位置が相補的であるオリゴヌクレオチドのアレイが提供される。そのようなアレイは、各々が異なる多型に特異的にハイブリダイズできるような一連のオリゴヌクレオチドを含み得る。アレイの例としては、ハシャ（Ｈａｃｉａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（１９９６）、４４１〜４４７；ロックハート（Ｌｏｃｋｈａｒｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４（１９９６）、１６７５〜１６８０；およびデリシ（Ｄｅ Ｒｉｓｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（１９９６）、４５７〜４６０を参照のこと。
【００３６】
本発明により、本発明に従い、特定の薬物の選択、投与計画および対応する治療されるべき患者を決定することができる。誤った薬物が誤った患者に対して誤った投与量で処方されることを回避するような情報と共に、考慮される患者群に依存する投与量の調整を処方者に予想させるように、推奨用量は製品のラベルにて示される。
【００３７】
さらに本発明は、先に記載の本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはプローブ、および適した検出方法、ならびに本発明を実施するための説明書を随意に含む、診断用組成物または診断キットに関連する。
【００３８】
本発明のキットは、選択マーカーならびに、トランスジェニック細胞の作製に適した選択培地の構成成分のような材料を更に含み得る。本発明のキットを本発明の方法の実施のために好都合に使用でき、特に、例えば診断分野のような様々な適用において、または研究手段として、使用できる。本発明のキットの一部はバイアルに個包装でき、または容器もしくは複数容器ユニット中にて組合せることができる。キットの製造は好ましくは、当業者に既知の標準の手順に従う。キットまたは診断用組成物は、例えば本明細書上記および実施例に記載の核酸ハイブリダイゼーションおよび／または核酸増幅技術を使用する、上述の本発明の方法のいずれか一つに従い、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の突然変異形態の発現の検出法に使用できる。
【００３９】
その他の態様において、本発明は本明細書で前述した方法により診断される疾病の治療または予防のための、薬学的組成物の調製のための薬物またはプロドラッグの使用に関連する。
【００４０】
これらのおよび他の態様は、本発明の説明および実施例により開示され、または明らかであり、含まれる。本発明に従って使用される方法、用途および化合物のいずれか一つに関わるさらなる文献は、例えば電子デバイスを用いて公共のライブラリから検索できる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ．のような、インターネット上で利用可能な公共データベース「メドライン（Ｍｅｄｌｉｎｅ）」が使用できる。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．／が当業者に知られており、また例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍ．を使用して得ることもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概説ならびに、遡及的探索および最新の知見の認識に有用な特許の関連情報源の通覧は、バークス（Ｂｅｒｋｓ）、ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）、３５２〜３６４により与えられている。
【００４１】
本発明の方法、使用およびキットは、これまで変異型ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子プロモーターに関連するまたは依存することが知られていない、あらゆる種類の疾患の診断および治療に使用できる。本発明の組成物、方法および使用は、ヒトにおいて望ましく使用することができるが一方、本明細書に記載の方法および使用には動物の治療もまた含まれる。
【００４２】
単なる説明のために役立ち、かつ本発明の特許請求の範囲を制限するとは解釈されない以下の実施例に関して、本発明を説明する。
【００４３】
実施例
実施例１
ヒトの血液試料から標準技術により単離されたゲノム試料は、健常ボランティアから、現地の倫理委員会のあらゆる法的、倫理的および医学的要件を考慮して得た。５０例を超える個体から血液試料を得、ＤＮＡを単離するためイオン交換クロマトグラフィー法（Ｑｉａｇｅｎ）により処理した。
【００４４】
１．方法の説明
ＤＮＡ試料およびＰＣＲ条件
白人個体から得た白血球ＤＮＡを、血液試料から標準技術によって単離した。本試験に含まれた全ての個体は、スパルテインについて事前に表現型が決定され、公表された方法（Ｓｔｕｖｅｎら、１９９６；Ｇｒｉｅｓｅら、１９９８）を用いてＣＹＰ２Ｄ６多型について遺伝子型が決定された。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のプロモーター領域を調べるために、既知の５’隣接配列のほぼ全体を含む１６５６ ｂｐの断片を特異的に増幅するため設計された１組のプライマー、ｕｐｆ１４およびｕｐｒ１６６９を用いてゲノムＤＮＡを増幅した（図１、表１）。適切な増幅を確証するため、各ＰＣＲ産物のアリコートをアガロースゲル電気泳動にかけた。
【００４５】
プライマー（０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、１００ ｎｇまでのゲノムＤＮＡおよびエキスパンドハイフィデリィティポリメラーゼシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む、５０μｌ用量において増幅を行った。ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において、９５℃で２分間加熱した後、９５℃で１５秒間、６１℃で３０秒間および７２℃で２分間のサーマルサイクルを３３サイクル実施し、７２℃で７分間を１サイクル行った。＊２対立遺伝子もまた、ｕｐｒ１６６９の代わりに、イントロン１における＊２特異的配列内に設計されたプライマー１０Ｂを用いて特異的に増幅した（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９３）。この場合、予測されたように、＊２−遺伝子型をもつ全てのＤＮＡ試料から、増幅によって、〜１．９ ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。
【００４６】
【表１】オリゴヌクレオチドプライマー
2004506405.tif 000002
【００４７】
ＰＣＲ産物配列決定
サーモシーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）蛍光標識プライマーサイクル配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、赤外８００にて標識したネスティドプライマー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＰＣＲ産物を直接配列決定した。プライマーのヌクレオチド配列は、表１に示される。塩基ＩｍａｇＩＲデータ収集および画像解析４．００ソフトウェアを使用して、自動ＤＮＡシーケンサー（Ｌｉｃｏｒ ４２００、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、配列決定解析を実施した。
【００４８】
２．結果の説明
総計８個の突然変異がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の上流領域において検出された（表２）。
【００４９】
【表２】ＣＹＰ２Ｄ６プロモーターにおける一塩基多型（ＳＮＰ）
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１ ヒトチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）対立遺伝子命名法に従った塩基の番号付け（野生型配列を、Ｋｉｍｕｒａら、１９８９により公表されたものとする）。総計６０個体以上（対立遺伝子＊１、＊２、＊４、＊５、＊９、＊１０を含む遺伝子型）をそれらのＣＹＰ２Ｄ６ ５’隣接配列において、完全に配列決定した；結果はまとめて示される。
２ 示されるような突然変異を起こした配列をもつ対立遺伝子；言及されない対立遺伝子は野生型配列を有していた。
３ 突然変異配列をもつことが認められた対立遺伝子のおよその数。
４ 全集団に対する推定頻度。
５ 中国人のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座について最初に説明された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９４）。
【００５０】
異なるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型をもつ個体におけるそれらの連鎖パターンの比較により、これらの突然変異の幾らかは多くの異なる対立遺伝子において生じる一方、その他のものはある特定の既知の対立遺伝子にむしろ特異的に関連していると考えられることが明らかになった（表２）。
【００５１】
開始コドンに対する−１５８４ ｂｐにおける、配列決定された＊２ 対立遺伝子の７０％において認められた、ＣからＧへの新規の突然変異（図１）が、より低い代謝比（すなわち、インビボにおけるより高い酵素活性）と強く関連していることが認められた。ある家系解析においては、［−１５８４Ｇ］対立遺伝子が低いＭＲ値と分離する一方、［−１５８４Ｃ］対立遺伝子は高いＭＲ値と分離することが示される（図２）。
【００５２】
遺伝子型ＣＹＰ２Ｄ６＊２ ／ ＊０（＊０は分析された非機能的対立遺伝子＊３、＊４、＊５、＊６、＊７、＊８のうち任意のものを示す）３９個体のうち、−１５８４Ｇプロモーター変異体をもつ個体のＭＲの中央値は、＊２［−１５８４Ｃ］をもつものの２．３３に比較して、０．５３であった（図３；Ｐ ＜ ０．０００１、マン・ホイットニー検定）。
【００５３】
表２において説明されたその他の突然変異のうち、３つの機能的に中立な突然変異は、中国人個体由来のＣＹＰ２Ｄ 遺伝子座において以前に説明された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、１９９４）。２つのさらなる新規の突然変異は、配列決定された全ての＊２対立遺伝子に特異的に関連しており、２つのさらに頻度の低い突然変異が観察された（表２）。
【００５４】
３．本発明の知見の重要性
−１５８４ ｂｐにおける共通なＣからＧへの突然変異の、増強した酵素活性との強い関連は、ＣＹＰ２Ｄ６多型における遺伝子型と表現型との間の相関を著しく高める。特に、この発見は、ＰＭ表現型だけでなく、低い酵素活性に特徴付けられる下位表現型も遺伝的に受け継がれることを強く示唆する。特に、−１５８４ ｂｐにおける突然変異についての試験により、「中間型代謝群」の大きな一部分が同定される。分析から、ＩＭの６０％以上が＊２ ／ ＊０遺伝子型（＊０鎖は任意の非機能的対立遺伝子、すなわち、＊３、＊４、＊５、＊６、＊７、＊８およびその他を表す）をもつことが示される。しかし、この遺伝子型はまた、正常な高代謝群に共通であり、そのためそれ自体によってはＩＭ表現型を予測することができない。−１５８４ ｂｐの位置における野生型配列（Ｃ）の存在は、＊２ ／ ＊０遺伝子型の低活性に対するマーカーとなる一方、突然変異（Ｇ）の存在は、高活性に対するマーカーとなる。ゆえに＊２ ／ ＊０遺伝子型の同定と組み合わせた、−１５８４ ｂｐの位置におけるＣまたはＧの検出は、インビボの薬物代謝能に関する量的な予測を可能にする。
【００５５】
集団の約１０％が表現型としては中間型代謝群である（Ｇｒｉｅｓｅら、１９９８）。これらの個体は、低代謝群のものとほとんど同等に低い、ＣＹＰ２Ｄ６基質の著しく減少したクリアランス能をもつことが示された。そのため、ＩＭにおいては、ＣＹＰ２Ｄ６多型により影響を受ける薬物を通常用量用いると、ＰＭに匹敵する程度まで、有害な副作用または治療上の失敗を導くことが想定できる。ＰＭ被験者においては、デブリソキンおよびスパルテインに加え、抗不整脈薬、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、抗うつ薬、神経遮断薬、オピオイド、アンフェタミン、およびその他を含む、他の多くの薬物が非効率的に代謝される（ＥｉｃｈｅｌｂａｕｍおよびＧｒｏｓｓ、１９９０；ＭｅｙｅｒおよびＺａｎｇｅｒ、１９９７）。
【００５６】
実施例２
ＣＹＰ２Ｄ６は、既知のスパルテイン酸化表現型をもつ７６個体からの肝臓生検において、免疫学的におよび酵素学的に定量された。−１５８４ Ｃ／Ｇプロモーター多型を含む全ての重要な既知の対立遺伝子を決定した。
【００５７】
１．方法の説明
患者および肝臓試料
１９８３年〜１９８６年の間に、胆嚢摘出術を受ける患者からくさび状生検検体として肝臓組織を得、−８０℃にて保存した。側腹切開前に、スパルテイン代謝群としての表現型に関して、ここで含まれた全ての患者の表現型を決定した（Ｏｓｉｋｏｗｓｋａ−Ｅｖｅｒｓら、１９８７）。
【００５８】
ＣＹＰ２Ｄ６ 遺伝子型決定
対立遺伝子＊２、＊３、＊４、＊５、＊６、＊７、＊８、＊９および＊１０について、確立されたＰＣＲアッセイ法を使用して適切に主要な突然変異を決定することに基づき、ＣＹＰ２Ｄ６ 対立遺伝子を割当てた（Ｓｒｕｖｅｎら、１９９６；Ｇｒｉｅｓｅら、１９９８）。新規のリアルタイムＰＣＲ法（Ｚａｎｇｅｒら、２００１）を用いてＣ／Ｇ突然変異を決定した。
【００５９】
ＤＮＡおよび肝臓ミクロソームの調製
ゲノムＤＮＡを肝臓組織の分画からＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ミクロソームを標準的手順（Ｚａｎｇｅｒら、１９８８ｂ）により調製した。
【００６０】
肝臓ミクロソームにおけるＣＹＰ２Ｄ６ タンパク質の定量
免疫ブロット法による、ミクロソーム分画におけるＣＹＰ２Ｄ６の定量のために、モノクローナル抗体、Ｍａｂ １１４（Ｚａｎｇｅｒら、１９８８ａ）を使用した。結合した抗体をＥＣＬウェスタンブロット検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出した。オートラジオグラフィー、および光学的スキャナーを使用したデンシトメーター（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ、Ｎｅｕｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による定量により発光を分析した（Ｚａｎｇｅｒら、２００１）。
【００６１】
酵素活性の決定
ＣＹＰ２Ｄ６についての特異的なインビトロ酵素アッセイとして、クメンヒドロペルオキシドを仲介した１’−ヒドロキシルブフラロルを測定した。アッセイ条件は以前に説明されたもの（Ｚａｎｇｅｒら、１９８８ｂ）と同様であった。
【００６２】
統計的方法
遺伝子型群または表現型群間の総合的な差異を確立するため、分散のクルスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）のノンパラメトリック解析によりデータを解析した。群間比較には、コルモゴロフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ）およびスミルノフ（Ｓｍｉｒｎｏｖ）の検定法により検定を行い、一連のデータが正常に分布しているか否かに応じて、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニーのＵ検定を使用した。データの平均値を標準偏差（ＳＤ）と共に、中央値を認められた最小値および最大値と共に表し、必要な場合、下側および上側９５％信頼区間（ＣＩ）を示してある。０．０５またはそれ以下のＰ値をもって有意であるとみなした（ｎ．ｓ．、有意でない）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ ３．００（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ソフトウェアを用いて統計的計算を行った。
【００６３】
２．結果の説明
−Ｃ／Ｇプロモーター多型の分析
突然変異型プロモーター型Ｇは、１５２ 個の対立遺伝子のうち３７個において存在し、総頻度２４．３％に相当した。それは＊２対立遺伝子に強く連鎖しており、＊２対立遺伝子を欠くある試料（＊１／＊１）において１度のみ検出された。 遺伝子型または機能的対立遺伝子数とは無関係に、−１５８４Ｃ／Ｃプロモーター型をもつ個体は、−１５８４ Ｃ／ＧまたはＧ／Ｇ遺伝子型をもつ個体（１０．９ ± ７．１ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ８．４〜１３．３、Ｐ ＝ ０．００１、Ｕ検定）と比較して、平均して半分以下（５．５ ± ３．９ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ４．２〜６．８、低代謝群の５例は含まれない）のＣＹＰ２Ｄ６タンパク質を発現した。１つまたは２つの機能的対立遺伝子をもつ群間において同様の差異が認められた（図４）。
【００６４】
遺伝子型に関連するＣＹＰ２Ｄ６の発現および表現型
−１５８４ Ｃ／Ｇ多型を考慮することにより、総計１９の遺伝子型を本集団試料において識別できた。分析を簡単にするために、ＣＹＰ２Ｄ６の発現およびインビボにおける機能には寄与しないヌル対立遺伝子を含む遺伝子型を１群にまとめ、集合的に＊０と名付けた。この分析より、−１５８４ Ｇプロモーター型は一貫して、より高レベルのタンパク質発現および機能と関連していることが明らかになった。
【００６５】
最大のおよび最も著しい差異は、交絡（ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ）機能的対立遺伝子の不在により、ヘテロ接合遺伝子型＊２［Ｇ］／＊０と＊２［Ｃ］／＊０の間に認められた。タンパク質の発現における差異は３．１倍（各々、７．１ ± ４．４ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ４．８〜９．１、および２．３ ± １．４ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ０．０１〜４．６；Ｐ ＝ ０．００２、ｔ検定）であり、インビボのＭＲＳにおいては５．６倍（Ｐ ＜ ０．００１、ｔ検定）であった（図５）。さらに、遺伝子型＊２［Ｃ］／＊０はＩＭ表現型の特異的な予測因子であり、全集団試料における７つＩＭのうち４つを占めていた（図３）一方、＊２［Ｇ］／＊０遺伝子型をもつ総計１７例は、１未満のＭＲＳ値を有し、ゆえに表現型はＥＭであった。＊２［Ｇ］対立遺伝子に関連するタンパク質の発現における増加は、混合遺伝子型＊１／＊２［Ｇ］および＊１／＊２［Ｃ］においてでさえも、野生型対立遺伝子に対して有意であるほど、充分に大きいものであった（図４；Ｐ ＝０．０２６、ｔ検定）。
【００６６】
【表３】超高速代謝群（ＵＭ）および中間型代謝群（ＩＭ）の表現型をもつ個体の表現型および遺伝子型の特性
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１ モノクローナル抗体Ｍａｂ１１４により決定された、ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６タンパク質量
【００６７】
より低いＭＲＳ範囲（高活性）においては、−１５８４ Ｇプロモーター型の著しい過剰発現が認められた。ＭＲＳ ０．３７までは、全ての＊２対立遺伝子（ｎ ＝ １７）が−１５８４ Ｇ型のものであった一方、−１５８４ Ｇ型のものはＩＭ表現型をもつ個体においては認められなかった。ＵＭ表現型をもつ個体においては、ＵＭの４個体の８つのうち５つの対立遺伝子が、−１５８４ Ｇ突然変異を有していた。
【００６８】
３．データの有意性
これらのデータにより、−１５８４ Ｇプロモーター型に関連して著しく増加したタンパク質発現および機能が示され、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質発現についての−１５８４ Ｃ／Ｇプロモーター多型およびその結果生じるインビボの表現型の有意性が確証された。それらは、推定上のＮＦ−κＢコンセンサス結合部位の突然変異−１５８４ におけるＣからＧへの変化の結果として、増加した遺伝子転写が生じるという仮定と一致している（Ｒａｉｍｕｎｄｏら、２０００）。
【００６９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＹＰ２Ｄ６プロモーター領域の配列。プライマーおよび突然変異の位置。フォワードプライマー（＝＝＞）およびリバースプライマー（＜＝＝）に下線を付してある。開始コドンのＡを＋１とし、ＡＴＧの５’側の塩基を−１とする、新しい番号付けシステムに従う番号付け（ＣＹＰ 対立遺伝子命名法ウェブサイト　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍ．ｋｉ．ｓｅ／ＣＹＰａｌｌｅｌｅｓ）。５’−非翻訳領域を太字にて示す（Ｋｉｍｕｒａら、１９８９に従う）。
突然変異を太字にて示す。ＩＵＰＡＣ 命名規則：
Ｋ ＝ＧまたはＴ
Ｙ ＝ＣまたはＴ
Ｒ ＝ＡまたはＧ
Ｓ ＝ＣまたはＧ
【図２】ある家系におけるＣＹＰ２Ｄ６の表現型および遺伝子型の解析。
Ａ：ＣＹＰ２Ｄ６の表現型、遺伝子型および−１５８４ ｂｐの位置におけるＣＹＰ２Ｄ６＊２配列について解析された家系の家系図。
Ｂ：ＣＹＰ２Ｄ６ ５’隣接領域のゲノムＰＣＲ断片の直接配列決定。父系および母系＊２対立遺伝子（部分Ａを参照のこと）を、−１５８４ ｂｐにおける突然変異周辺において特異的に増幅し、配列決定した。
【図３】白人集団における、ＣＹＰ２Ｄ６の表現型および遺伝子型の解析
Ａ：過去に特徴付けられた典型的な集団における、スパルテイン代謝比ＭＲの分布（Ｎ ＝ １９５、Ｇｒｉｅｓｅら、１９９８）。ＵＭ、超高速代謝群（範囲：ＭＲ ＜ ０．２）；ＥＭ、高代謝群（範囲：ＭＲ ＜ １．２）；ＩＭ、中間型代謝群（範囲：１．２ ＜ ＭＲ ＜ ２０）；ＰＭ、低代謝群（範囲：ＭＲ ＞ ２０）。
Ｂ：Ａにて示された集団のうち、遺伝子型ＣＹＰ２Ｄ６＊２／＊０を有していた全３９個体についてのＭＲの分布。斜線を施した長方形は、変異型対立遺伝子 ＣＹＰ２Ｄ６＊２［−１５８４Ｇ］をもつ個体に、黒い長方形は＊２［−１５８４Ｃ］対立遺伝子をもつ個体に相当する。
【図４】ＣＹＰ２Ｄ６プロモーター多型に関連するミクロソームＣＹＰ２Ｄ６タンパク質発現。ホモ接合野生型遺伝子型（−１５８４ ＣＣ、「ｗｔ」）または少なくとも１つの突然変異型プロモーター（−１５８４ ＣＧまたはＧＧ、「ｍ」）をもつ全ての個体（０〜３遺伝子）について、および状況に応じて２つまたは１つの機能的遺伝子コピーをもつ個体について、−１５８４ ｂｐにおけるプロモーター遺伝子型を決定し、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の平均値±ＳＤを計算した。統計的有意性：＊Ｐ ＝ ０．０２６；＊＊Ｐ ＝ ０．００１；＊＊＊Ｐ ＜ ０．０００１（ｔ検定）
【図５】ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６タンパク質、インビボの薬物酸化表現型および−１５８４ Ｃ／Ｇプロモーター突然変異に関わるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型の間の関係。ミクロソームＣＹＰ２Ｄ６タンパク質量は黒い長方形（左の縦座標）によって示され、スパルテインの酸化についての代謝比は斜線を施した長方形（右の縦座標）により表される。各群の個体数が示される。遺伝子型＊２Ｇ／＊０と＊２Ｃ／＊０との間のタンパク質発現における差異は、３．１倍（各々７．１±４．４ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ４．８〜９．１および２．３±１．４ ｐｍｏｌ／ｍｇ、ＣＩ ０．０１〜４．６；Ｐ ＝ ０．００２、ｔ検定）、およびインビボのＭＲにおいては５．６倍（Ｐ ＜ ０．００１、ｔ検定）であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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