(57)【要約】本発明は、トランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特徴付けに関連する組成物および方法に関連する。詳細には、本発明は、標的遺伝子中に変異を含むトランスジェニックマウスを提供する。このようなトランスジェニックマウスは、疾患のモデルとして、そして遺伝子発現および遺伝子機能を調節する薬剤を同定するため、そして種々の疾患状態（ｓｔａｔｅ）および疾患状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の可能性のある処置として有用である。本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対して効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化構築物であって、以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド配列；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第二のポリヌクレオチド配列；および
（ｃ）選択マーカー、
を含む、標的化構築物。
【請求項２】
スクリーニングマーカーをさらに含む、請求項１に記載の標的化構築物。
【請求項３】
標的遺伝子について標的化構築物を生成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド配列を得る工程；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第二のポリヌクレオチド配列を得る工程；
（ｃ）選択マーカーを含むベクターを提供する工程；および
（ｄ）該ベクターに該第一の配列および該第二の配列を挿入して、該標的化構築物を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
標的遺伝子について標的化構築物を生成する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子の第一の領域に相同な第一の配列および標的遺伝子の第二の領域に相同な第二の配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程；ならびに
（ｂ）該第一の配列と該第二の配列との間に陽性選択マーカーを挿入して、該標的化構築物を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
標的遺伝子中に破壊を含む、細胞。
【請求項６】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記マウス細胞が、胚性幹細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
標的遺伝子中に破壊を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、細胞。
【請求項１０】
標的遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載の標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
標的遺伝子の発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する工程；および
（ｃ）該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
標的遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子中に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物に薬剤を投与する工程；および
（ｃ）該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
標的遺伝子の発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
標的遺伝子の機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記細胞が、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１、請求項１２、請求項１３、または請求項１４に記載の方法によって同定された薬剤。
【請求項１７】
血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが、野生型マウスと比較して少ない不安な挙動を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１８】
血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが、野生型マウスと比較して高い疼痛閾値を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１９】
前記トランスジェニックマウスが、血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に対してヘテロ接合性である、請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
前記トランスジェニックマウスが、血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に対してホモ接合性である、請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスが、以下の挙動：野生型マウスと比較してのより少ない不安または野生型マウスと比較してのより高い疼痛閾値の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）血小板活性化レセプター遺伝子標的化構築物中の破壊を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１７、請求項１８、または請求項２１に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞が、血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含む、細胞。
【請求項２３】
血小板活性化レセプター発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該トランスジェニックマウスにおける血小板活性化レセプター発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に関連した表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に関連した表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
血小板活性化レセプター発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が血小板活性化レセプター遺伝子発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
血小板活性化レセプター遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）血小板活性化レセプター遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤が血小板活性化レセプター遺伝子機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、血小板活性化レセプター遺伝子中の破壊に関連した表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２３、請求項２４、請求項２５、または請求項２６に記載される方法によって同定された薬剤。
【請求項２８】
ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが、眼の異常を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項２９】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項２８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３０】
前記網膜の異常が、網膜変性によって特徴付けられる、請求項２９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３１】
前記トランスジェニックマウスが、ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に対してヘテロ接合性である、請求項３０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３２】
前記トランスジェニックマウスが、ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に対してホモ接合性である、請求項３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスが、眼の異常を示し、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項２８または請求項３３に記載のトランスジェニックマウスに由来する、細胞。
【請求項３５】
眼の異常を軽減する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該トランスジェニックマウスにおける該眼の異常を軽減するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記目の異常が網膜の異常である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＬＰＲ５遺伝子発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が、該トランスジェニックマウスにおけるＬＰＲ５発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に関連した表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記表現型が眼の異常を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＬＰＲ５遺伝子発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤がＬＰＲ５遺伝子発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記表現型が眼の異常である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＬＰＲ５遺伝子機能を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と薬剤とを接触させる工程；および
（ｃ）該薬剤がＬＰＲ５遺伝子機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に関連した表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記表現型が眼の異常である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＬＰＲ５遺伝子中の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＬＰＲ５遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記表現型が眼の異常である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３７、請求項４０、請求項４３、または請求項４６に記載の方法によって同定された薬剤。
【請求項５０】
ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが、以下の挙動：機能低下、不安、神経質、またはうつ病に対する減少した感受性の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項５１】
前記トランスジェニックマウスが、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中の破壊に対してヘテロ接合性である、請求項５０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５２】
前記トランスジェニックマウスが、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中の破壊に対してホモ接合性である、請求項５０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５３】
ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスが、以下の挙動：機能低下、不安、神経質、またはうつ病に対する減少した感受性の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子標的化構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスが、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５０または請求項５３に記載のトランスジェニックマウスに由来する、細胞。
【請求項５５】
機能低下した挙動、不安な挙動、または神経質な挙動を軽減する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が該トランスジェニックマウスの挙動を軽減するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５６】
ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が該トランスジェニックマウスにおけるｃｅｒｂｅｒｕｓ発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該薬剤が、該トランスジェニックマウスの機能低下した挙動、不安な挙動、または神経質な挙動に対して影響を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中の破壊に関連する、機能低下した挙動、不安な挙動、または神経質な挙動を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックマウスに薬剤を投与する工程；および
（ｂ）該薬剤が該トランスジェニックマウスの挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
請求項５５、請求項５６、または請求項５７に記載の方法によって同定された薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子機能の特徴付けに関するトランスジェニック動物、組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
実験動物モデルは、遺伝子の役割を理解するための重要な手段である。より詳細には、変更または不活性化された特定の遺伝子を有する動物を開発する能力は、遺伝子機能の研究にとって測り知れないほど貴重であり、そしてヒトにおける同様な発現を有する疾患の原因となる遺伝子および／または機構の予期せぬ発見につながっている。これらの遺伝子的に操作された動物はまた、種々の疾患および障害のための治療的処置を同定および試験するためにも有用である。
【０００３】
多くの遺伝子の機能を同定することは、疾患におけるその役割を確認することおいて有用である。例えば、ヒトとマウスとの間の高レベルな相同性のため、動物中の選択された遺伝子中で、標的化生殖細胞系列変異を作製することによって、個々のヒト遺伝子の機能を規定にすることが可能である。結果として得られる変異動物の表現型を使用して、ヒトにおける表現型を定義するのに役立て得る。
【０００４】
Ｇ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）、ＬＤＬレセプター、ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質およびｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質ならびに炭水化物代謝に関するタンパク質、特に上皮発生に関するタンパク質をコードする数々のファミリーに属するいくつかの興味深い遺伝子が最近、発見されている。これらの遺伝子およびその発現産物の役割を同定することは、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上で有用な標的の同定を可能とし得る。
【０００５】
ＧＰＣＲは、７つの推定膜貫通ドメイン（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称する）を有するとして特徴付けされている。これらは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通α−へリックスを表すと考えられている。ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプターは、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループのそれぞれに１つの保存システイン残基を有する。Ｇ−タンパク質結合レセプターは、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質によって細胞内で種々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合され得る。異なったＧ−タンパク質α−サブユニットは、優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能を調節する。
【０００６】
血小板活性化因子（ＰＡＦ）は、様々な病理的プロセス（例えば、アレルギー、ぜん息、敗血症性ショック、動脈血栓および炎症プロセス）におけるメディエータとして関連している（Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７３８１−１７３８４（１９９０））。ＰＡＦは、リン脂質（１−０−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン）であり、その種々の効果をＰＡＦに高いアフィニティーをもって結合する特定の細胞表面レセプターを介して発揮する。モルモットプローブを用いて、Ｓｅｙｆｒｉｅｄら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：８３２−８３４（１９９２））は、ヒトＰＡＦレセプター（ＰＴＡＦＲ）についての遺伝子を単離した。コード配列はイントロンを含まない。コードされるタンパク質は、モルモットＰＡＦレセプターに高く相同性（８２％同一）であり、７つの推定膜貫通ドメインを含む。従って、ＰＡＦレセプター（ＰＡＦＲ）は、Ｇ−タンパク質結合ファミリーのレセプターのメンバーであるようである、このファミリーの多くのメンバーに顕著な類似性を示す。げっ歯類／ヒトの体細胞ハイブリッドの分析によって、Ｓｅｙｆｒｉｅｄらは、ＰＴＡＦＲ遺伝子が、ヒト染色体１上に位置することを結論付けた。
【０００７】
最近、ヒトの血小板活性化因子レセプターホモログ（登録番号ＮＭ０１３３０８；ＧＩ：７０１９４００）に類似した配列を有するマウスＥＳＴが同定された（登録番号ＡＡ１７０４９０；ＧＩ：１７４９０４２；登録番号ＡＡ１６２７８９；ＧＩ：１７３８４５６）。さらに、ヒトＧＰＣＲ（ＫＩＡＡ０００１；Ｎｏｍｕｒａら，ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ２（４）：２１０（１９９５））に類似し、ヒトの血小板活性化因子レセプターに類似した配列を有するマウスＥＳＴが同定された（登録番号ＡＡ２７４１１２；ＧＩ：１９１２５５７）。ＥＳＴの始まりは、ＰＡＦレセプターのおよそ８５位に対応し、これは、第１の細胞外ループにある。最も強い相同性は、ＫＩＡＡ０００１に対してであり、これは、アナフィラトキシンＣ５ａレセプターおよびＰＡＦレセプターに対して類似性を持った、ランダムに同定されたＧＰＣＲ配列である。過去１５年にわたって、７回膜貫通型レセプターを標的にした３５０近くの治療薬物が、首尾よく市場に導入された。これらのレセプターが確立されるにつれて、治療の標的としての歴史が証明され、機能障害または疾患を、予防、回復もしくは矯正することにおいて機能し得るＧＰＣＲの同定および特徴付けの明確な必要性が存在している。
【０００８】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、特有の構造を持ち、これは、このタンパク質の増殖刺激活性に対して必須の３つのジスルフィド架橋を含む。しかし、他の多くのタンパク質の両方は、ＥＧＦに類似したドメイン（ＥＧＦ様ドメイン）を有する。これらのタンパク質としては、増殖因子およびＥＧＦに関連しない機能を有する他のタンパク質の両方を含む（例えば、Ｖａｎ  Ｚｏｅｌｅｎら、Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ５９：９９−１３１（２０００）を参照のこと）。
【０００９】
カルシウム結合ＥＧＦ様ドメインは、多様な機能範囲を実行する多くの細胞外タンパク質に存在する。これらのタンパク質は、例えば、フィブリン−１、Ｎｏｔｃｈ−３、プロテイン  Ｓ、第ＩＸ因子、および低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）レセプターが挙げられる（例えば、Ｓｍａｌｌｒｉｄｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８６（３）：６６１−６６８（１９９９）を参照のこと）。
【００１０】
ＬＤＬレセプターファミリーは、アポＥに富んだリポ蛋白を結合してインターナライズすることが公知であり、リポ蛋白代謝に役割を果たすと考えられる（例えば、Ｂｕｊｏ、Ｎｉｐｐｏｎ  ｒｉｎｓｈｏ  ５７（１２）：２６９０−２６９５（１９９９）；Ｇｌｉｅｍａｎｎ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７９：９５１−９６４（１９９８）を参照のこと）。変異体は、家族性高脂血症および若年性の冠状動脈疾患を引き起こす。ＬＤＬレセプター関連タンパク質は、血漿活性化α２アクログロブリン（ｐｌａｓｍａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｌｐｈａ  ２−ａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）およびアポリポ蛋白Ｅに富んだリポ蛋白のクリアランスに重要な役割を果たす。これは、胎児の発生に必須であり、アルツハイマー病に関連する（Ｈｕｓｓａｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９：１４１−７２（１９９９））。最近の研究で、このレセプターファミリーは、ニューロンの発生に重要であることが示され、ＬＤＬレセプターファミリーは、細胞のシグナル伝達、ニューロン移動、血管平滑筋鎖細胞の増殖およびリポ蛋白の取り込みに関与する多機能レセプターを含むことが示唆される（例えば、Ｂｕｊｏ（１９９９）（前出）を参照のこと）。
【００１１】
最近、ＥＧＦ様ドメインを有し、ＬＤＬレセプター関連タンパク質に類似性を示す発現配列タグ（ＥＳＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ４８２４３１）が同定された。この遺伝子は、低比重リポ蛋白レセプター関連タンパク質５（ＬＲＰ５）と名づけられ、その染色体のインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）座での局在に基づいて、感受性を与える候補として糖尿病に関与する（Ｈｅｙら、Ｇｅｎｅ  ２１６：１０３−１１１（１９９８）を参照のこと）。
【００１２】
ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質およびｃｅｒｂｅｒｕｓ様タンパク質は、胚に発現するタンパク質ファミリーを含み、これらは、ニューロンおよび関連するニューロン細胞の形成、増殖および維持を誘導、促進もしくは／または阻害し得る。ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子は、ゼノプス胚中にマイクロインジェクションした場合に、前部内中胚葉に発現する分泌タンパク質をコードし、異所性頭部を誘導し、心臓および肝臓を重複させる（例えば、Ｂｏｕｗｍｅｅｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９２）：５９５−６０１（１９９６）を参照のこと）。ｃｅｒｂｅｒｕｓ様（ｃｅｒｒ１）遺伝子は、実質的にマウスにおいて単離され、初期の原腸形成の間に前部内臓系内胚葉に特に発現される新規の分泌タンパク質をコードする（例えば、Ｂｅｌｏら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６８：４５−５７（１９９７）を参照のこと）。ゼノプスアッセイにおいて、ｃｅｒ−１は、前脳マーカーおよび内胚葉を誘導する強力な中和因子として機能するが、ｃｅｒｂｅｒｕｓのように異所性頭部様構造を誘導し得ない。ｃｅｒ−１は、４８％が１１０アミノ酸領域に渡ってｃｅｒｂｅｒｕｓに同一である、推定分泌タンパク質をコードする（例えば、Ｓｈａｗｌｏｔら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ  ９５（１１）：６１９８−６２０３（１９９８）を参照のこと）。これらのタンパク質は、９つのシステイン残基パターンを有しているようである（例えば、米国特許第５，９３５，８５２号を参照のこと）。
【００１３】
ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質はまた、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰおよびＷｎｔシグナルの多機能アンタゴニストであることが示された。特に、ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質は、多価の増殖因子アンタゴニストとして、細胞外部分で機能し、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰおよびＷｎｔタンパク質を独立した部位を介して結合する（例えば、Ｐｉｃｃｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９２）：５９５−６０１（１９９６）を参照のこと）。報告された研究は、ｃｅｒｂｅｒｕｓは、レセプターまたは専用の伝達経路を有さないが、細胞外インヒビターとして機能することを示した（例えば、Ａｇｉｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  ｄｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｅ  １９３：３４７−３５４（１９９９）を参照のこと）。
【００１４】
ヒトｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質は、単離され、報告されている（例えば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９８４９２９６を参照のこと）。ここに記載されるように、これらのタンパク質は、発現される場合に、内胚葉、心臓および神経組織の発生を脊椎動物において誘導し得て、必要な再生、分化、または組織修復（例えば、創傷修復、神経の再生または移植）、心筋分化の補完および膵臓の分化への適用に有用であり得る（例えば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９７４８２７５を参照のこと）。これらのタンパク質はまた、ＢＭＰ関連障害の処置に有用であり得る（例えば、ＷＯ  ９８４９２９６を参照のこと）。最近、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子およびｃｅｒｂｅｒｕｓ様遺伝子に高い類似性を有する発現配列タグ（ＥＳＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１２０１２２）が同定された。
【００１５】
受精卵のうまくいった発生は、生殖系列細胞と卵胞細胞との間の直接の相互作用を含む（例えば、ＭｃＬａｒｅｎ  ａｎｄ  Ｗｙｌｉｅ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照のこと）。卵子形成で生じている、上皮の形態発生および卵胞上皮の発生および生殖系列分化は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいてよく研究されている（例えば、Ｋｉｎｇ，Ｏｖａｒｉａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９７０）を参照のこと）。より詳細には、単層卵胞上皮は、脊椎動物上皮の発生学的特性、形態学的特性および分子特性を有し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．の卵子形成の間に分化している生殖系列と合わせて発生する（例えば、Ｇｏｏｄｅら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：３８６３−３８７９（１９９６）を参照のこと）。
【００１６】
細胞接着分子のいくつかのクラスは、無脊椎動物および脊椎動物の両方において上皮発生に必須である（例えば、Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ６９：３８５−３８７（１９９２）を参照のこと）。例えば、Ｅ−カドヘリン細胞接着分子は、脊椎動物およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、上皮構造の形成および維持に必要とされる（例えば、Ｔａｋｅｉｃｈｉｅ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０２：６３９−６５５（１９９５）；Ｔｅｐａｓｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：６７２−６８５（１９９６）；およびＵｅｍｕｒａｌら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：６５９−６７１（１９９６）を参照のこと）。チロシンキナーゼレセプターおよびこれらのリガンドは、細胞表面の因子（これらもまた上皮の発生に必要である）である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８６７−２８７８（１９９１）；Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３３７−３４１（１９９５）；Ｌｕｅｔｔｅｋｅら、Ｃｅｌｌ  ７３：２４９−２６１（１９９３）；Ｓｃｈｕｂａｃｈ、Ｃｅｌｌ  ４９：６９９−７０７（１９８７）；Ｇｏｏｄｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７８：３５−５０（１９９６）を参照のこと）。
【００１７】
神経性遺伝子は、上皮の発生に重要な別のクラスの分子をコードする。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの神経性遺伝子（Ｎｏｔｃｈ（ｎ）、Ｄｅｌｔａ、ｎｅｕｒａｌｉｚｅｄおよびＥｎｈａｎｃｅｒ  ｓｐｌｉｔ分離を含む）は、胚組織における上皮の特性の発生に必要である（例えば、Ａｒｔａｖａｎｉｓ  Ｔｓａｋｏｎａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２（１９９５）；Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：１２０３−１２２０（１９９２）；Ｃｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ  ７３：６５９−６７１（１９９３）；Ｒｕｏｈｏｌａら、Ｃｅｌｌ  ６６：１−２０（１９９１）；およびＸｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：９１３−９２２（１９９２）を参照のこと）。これらのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの神経性遺伝子は、胚組織の上皮形成に関与するが、これら卵胞上皮形態形成における役割についてはほとんど知られていない。
【００１８】
１つの神経形成遺伝子（特に、ｂｒａｉｎｉａｃとして公知である）は、上皮発生に特定の役割を果たすことが示されている。このｂｒａｉｎｉａｃの遺伝子は、新規の推定される分泌タンパク質をコードすることが報告されており、この分泌タンパク質は、生殖系列において、卵胞上皮を確立するのに必要であり、その背部−腹部の極性を決定するのに必要であることが報告されている（例えば、Ｇｏｏｄｅら、（１９９２）およびＧｏｏｄｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）（前出）を参照のこと）。より詳細には、このｂｒａｉｎｉａｃの遺伝子は、Ｘ染色体に存在し、推定シグナル配列を有する３２５アミノ酸タンパク質をコードする。このｂｒａｉｎｉａｃの遺伝子は、構成的に生殖系列において、胚形成の最初の１２時間の間に発現される（例えば、Ｇｏｏｄｅ、Ｓ．ら（１９９２）（前出）；Ｇｏｏｄｅら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）（前出）；およびＧｏｏｄｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９６）（前出）を参照のこと）。このｂｒａｉｎｉａｃの遺伝子の変異は、シグナル伝達分子（トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）および上皮増殖因子レセプター（Ｅｇｆｒ）を含む）における変異との、相乗的な遺伝子相互作用を例証する。ＴＧＦ−αおよびＥｇｆｒの変異マウスは、上皮発生の広範な機能不全に起因する複数の器官の機能不全に罹る（例えば、Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら、（１９９５）（前出）を参照のこと））。
【００１９】
ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子は、卵胞上皮の正しい発生に重要である。ｂｒａｉｎｉａｃの変異雌およびその子孫は、複数の欠陥（卵殻、卵胞上皮の溝および卵母細胞の周りの卵胞細胞の複数層の腹方化を含む）を有する。ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子機能の欠損の場合に、卵胞上皮形成においての効率がほとんどなくなり、生殖系列の嚢胞を個別化することが出来なくなる。一旦、卵巣上皮が形成されると、ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子は、上皮の特性維持に必須になる。さらに、ｂｒａｉｎｉａｃ生殖系列機能の破壊は、先端の基底の極性を損ない、卵胞細胞の複数層の集積（特に卵母細胞の周りにおいて）を生じる。ｂｒａｉｎｉａｃは、境界細胞の効率的な移動および維持に必須であり、上皮細胞の主体が、卵子形成の後期の間に卵母細胞に移動することに必須である（例えば、Ｇｏｏｄｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９６）（前出））。ｅｇｇｈｅａｄとして知られるさらなる遺伝子は、上皮発生に同様の機能を示す。さらに、両方の遺伝子は、上皮の発生および維持に必須な新規のシグナル経路の成分であるようである。最近、発現配列タグ（ＥＳＴ）が単離され、神経性分泌シグナル分泌タンパク質をコードする遺伝子、より詳細には、ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子に類似した配列を有していた（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１３３３４０；ＥＳＴ名：ｚｎ９２ｈ０１．ｓｌ）。
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、一般的にトランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特徴づけに関する組成物および方法に関する。
【００２１】
本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞を含む。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、そして最も好ましくは、マウスＥＳ細胞である。１つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。別の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。
【００２２】
本発明はまた、標的化構築物、および幹細胞中に導入される場合、相同組換え体を産生する標的化構築物を産生する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の標的化構築物は、標的化遺伝子に相同である第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、構築物中で２つの異なった相同ポリヌクレオチド配列間に位置することが好ましい選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列も含む。標的化構築物は、相同組換えを強化し得る他の調節エレメント０も含み得る。
【００２３】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック動物、および標的遺伝子に破壊を含むこのような非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子中の変異に対してヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。１つの局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子の機能を欠損している。別の局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子に変異を有することに関連した表現型を含む。
【００２４】
本発明はまた、トランスジェニック動物中の標的遺伝子の破壊と関連する表現型に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法も提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物へ投与され、そして推定薬剤に対するトランスジェニック動物の反応が測定され、そして「正常」または野生型マウスの反応と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール（薬剤投与されない）と比較される。本発明は、このような方法に従って同定された薬剤をさらに提供する。本発明はまた、標的遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療薬剤として有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対して効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、トランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。この方法は、コントロール動物（これは例えば薬剤に対するトランスジェニック動物の反応を測定し、例えば野生型動物あるいはトランスジェニック動物コントロールであり得る）とトランスジェニック動物の反応を比較する工程を包含する。標的遺伝子の発現または機能に対してある効果を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するために、細胞ベースアッセイで細胞に対してスクリーニングされ得る。
【００２６】
本発明はまた、標的遺伝子の核酸配列を含む細胞系列を提供する。このような細胞系列は、細胞系中で機能するプロモーターへの作動可能な連結によって、このような配列を発現することが可能であり得る。好ましくは、標的遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。標的遺伝子または標的タンパク質を薬剤と接触させる工程および薬剤／標的遺伝子複合体または薬剤／標的タンパク質複合体を検出する工程を包含する、標的遺伝子に相互作用する薬剤を同定する方法も提供される。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能なマーカーの発現を測定して検出され得る。
【００２７】
本発明はさらに、標的遺伝子における破壊、より詳細には標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされる標的タンパク質の発現または機能における破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、必要とする患者へ標的遺伝子または標的タンパク質の発現または機能をもたらす治療薬剤を投与する工程を包含する、標的遺伝子の発現または機能中の破壊に関連した疾患または状態を処置する工程を包含する。この実施形態に従って、この方法は、治療上、有効な量の天然、合成、半合成、または組換え標的遺伝子、標的遺伝子産物またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成または組換え類似体の投与を含む。
【００２８】
本発明はさらに、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連した疾患または状態を処置する方法を提供し、この方法は、変異された標的遺伝子を検出し、かつ遺伝子治療によってこれを置換する工程を包含する。
【００２９】
（定義）
用語「遺伝子」とは、（ａ）本明細書に開示されるＤＮＡ配列の少なくとも１つを含む遺伝子；（ｂ）本明細書中に開示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、および／または；（ｃ）本明細書中に開示されるコード配列の相補鎖にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列をいう。好ましくは、この用語は、コード領域ならびに非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要である全ての配列を含む。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を呼ぶために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはその類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、そして公知または未知である任意の機能を発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、１本鎖、２本鎖および３重ヘリックス分子を含む。
【００３１】
「オリゴヌクレオチド」とは、５と約１００ヌクレオチドとの間の１本鎖または２本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、あるいは当該技術分野で公知である方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」とは、酵素媒介核酸合成の開始に３’−ヒドロキシ末端を提供する、通常、１本鎖であるオリゴヌクレオチドをいう。下記のもの：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子類似体などの改変核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンの類似体は、当該技術分野で公知であり、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、シュードウラシル、５−ペンチルニルウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンの類似形態と考えられる。
【００３２】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも９個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも４５個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００３３】
用語「遺伝子標的化」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳動物細胞中に導入され、かつ、そのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、これと再び結合する場合に生じる１種の相同的組換えである。
【００３４】
用語「相同組換え」とは、相同ヌクレオチド配列の部位での２つのＤＮＡ分子または染色分体間のＤＮＡフラグメントの交換をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相同」は、参照配列と比べて、少なくとも約７０％の配列同一性、典型的には、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、そしてより好ましくは約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは参照配列に比べて約１００％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の特性を示す。相同性は、「ＢＬＡＳＴＮ」アルゴリズムを使用して決定され得る。相同配列は、ヌクレオチド配列中の挿入、欠失および置換に適応し得る（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）ことが理解される。したがって、ヌクレオチドの線形配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応しないか、または整列しなくても、本質的に同一であり得る。参照配列とは、遺伝子または隣接配列の一部、または染色体の反復部分などのより大きな配列のサブセットであり得る。
【００３５】
用語「標的遺伝子」（あるいは、「標的遺伝子配列」または「標的ＤＮＡ配列」または「標的配列」と称される）とは、相同組換えによって改変されるべき任意の核酸分子、または任意の遺伝子のポリヌクレオチドをいう。この標的配列としては、インタクトな遺伝子、エキソンもしくはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域が挙げられる。この標的遺伝子は、個々のゲノムＤＮＡ中の特定の遺伝子または遺伝子座の一部分を含む。本明細書中で提供される場合、本発明の標的遺伝子は、血小板活性化レセプター遺伝子、ＰＡＦレセプター遺伝子、ＬＲＰ５遺伝子、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子、およびｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子である。
【００３６】
「血小板活性化レセプター遺伝子」とは、配列番号１を含む配列、またはＧｅｎｅｂａｎｋの登録番号ＡＡ１６２７８９；ＧＩ：１７３８４５６で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、血小板活性化レセプター遺伝子のコード配列は、配列番号１を含むか、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＡ１６２７８９；ＧＩ：１７３８４５６として同定される遺伝子を含む。
【００３７】
「ＰＡＦレセプター遺伝子」とは、配列番号４を含む配列、またはＧｅｎｅｂａｎｋの登録番号ＡＡ２７４１１２；ＧＩ：１９１２５５７で同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、ＰＡＦレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号４を含むか、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＡＡ２７４１１２；ＧＩ：１９１２５５７として同定される遺伝子を含む。
【００３８】
「ＬＰＲ５遺伝子」とは、配列番号７を含む配列、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００８５１３；ＧＩ：６６７８７１５として同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、ＬＰＲ５遺伝子のコード配列は、配列番号７を含むか、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００８５１３；ＧＩ：６６７８７１５として同定される遺伝子を含む。
【００３９】
「ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子」とは、配列番号１０を含む配列、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００９８８７；ＧＩ：６７５３４０９として同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子のコード配列は、配列番号７を含むか、またはＧｅｎｅｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００９８８７；ＧＩ：６７５３４０９として同定される遺伝子を含む。
【００４０】
「ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子」とは、配列番号１３を含む配列、またはＧｅｎＢａｎｋにおいて登録番号ＡＡ１３３３４０；ＥＳＴ  ｎａｍｅ：ｚｎ９２ｈ０１．ｓ１として同定される配列を含む配列をいう。１つの局面において、血小板活性化レセプター遺伝子のコード配列は、配列番号１３を含むか、または、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて登録番号ＡＡ１３３３４０；ＥＳＴ  ｎａｍｅ：ｚｎ９２ｈ０１．ｓ１として同定される遺伝子を含む。
【００４１】
標的遺伝子の「破壊」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが内因性相同配列の位置に配置されて、この内因性相同配列と組換わる場合に生じる。これらの配列の破壊または改変としては、ＤＮＡ配列の、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）もしくは置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。挿入としては、動物起源、植物起源、原核生物起源、またはウイルス起源の遺伝子であり得る遺伝子全体の挿入が挙げられる。破壊は、例えば、標的遺伝子の、プロモーター、エンハンサー、またはスプライス部位を変更し得るか、または置換し得、そして、正常遺伝子産物の産生を部分的にもしくは完全に阻害することによってか、または正常遺伝子産物の活性を増強することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【００４２】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化の方法によって完全または部分的に、破壊されたか、改変されたか、変更されたか、または置換された、標的遺伝子を、そのゲノムの中に含む細胞をいう。
【００４３】
用語「トランスジェニック動物」とは、遺伝子標的化の方法によって破壊された特定の遺伝子を、そのゲノムの中に含む動物をいう。このトランスジェニック動物は、ヘテロ接合体動物（すなわち、１つの欠損対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子）およびホモ接合動物（すなわち、２つの欠損対立遺伝子）の両方を含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「選択可能マーカー」または「正の選択マーカー」とは、特定の条件下で、この遺伝子を保有する細胞のみが生存および／または増殖することを可能にする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する、植物細胞および動物細胞は、化合物Ｇ４１８に対して耐性である。このＮｅｏｒ遺伝子マーカーを保有しない細胞は、Ｇ４１８によって殺傷される。他の正の選択マーカーは、当業者にとって公知である。
【００４５】
「宿主細胞」は、ベクターについて、または核酸分子および／もしくはタンパク質の取り込みについて、レシピエントであり得るかまたはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の変異、偶然の変異、または意図的な変異に起因して（形態または全ＤＮＡ相補体において）もとの親に必ずしも完全に同一であるにはないかもしれない。宿主細胞は、本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
【００４６】
用語「調整する」とは、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子または標的タンパク質の、機能、発現、活性、あるいは標的遺伝子内の破壊に関連する表現型の、阻害、低減、増加、または増強をいう。
【００４７】
用語「改善する」とは、標的遺伝子内の破壊に関連する異常または症状を含め、状態、疾患、障害または表現型の、減少（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）、低減（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）または除去をいう。
【００４８】
用語「異常」とは、標的遺伝子の破壊が関係している、任意の、疾患、障害、状態または表現型をいう（病理学的状態を含む）。
【００４９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、遺伝子および遺伝子発現産物、主に、標的遺伝子に関連する遺伝子および遺伝子発現産物の、発現および役割の評価に部分的に基づく。特に、本発明は、疾患経路の規定ならびに診断的および治療的に有用な標的の同定を可能にする。例えば、疾患状態で変異しているかまたはダウンレギュレートされている遺伝子は、疾患状態を生じることまたはこれを悪化させることに関連し得る。このような遺伝子の活性をアップレギュレートさせることに関する処置、または代替的な経路に関連する処置は、この疾患状態を改善し得る。
【００５０】
（標的化構築物の生成）
本発明の標的化構築物は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて生成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｅ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，  １９８４，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。例えば、標的化構築物は、従来の方法に従って調製され得、ここで、配列は、合成されてもよく、天然供給源から単離されてもよく、操作されてもよく、クローン化されてもよく、連結されてもよく、インビトロ変異誘発、プライマー修復などに供されてもよい。種々の段階において、この連結された配列は、クローン化され得、そして制限分析、配列決定などによって分析され得る。
【００５１】
標的化ＤＮＡは、当該分野で周知の技術を使用して構築され得る。例えば、標的化ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの化学合成、二本鎖ＤＮＡテンプレートのニックトランスレーション、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅（またはリガーゼ連鎖反応増幅）、目的配列（例えば、クローン化されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または上述したものの任意の組み合わせ）を保有する、原核生物ベクターまたは標的クローニングベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、ＹＡＣ、コスミド、バクテリオファージＤＮＡ、他のウイルスＤＮＡもしくは複製中間体、またはそれらの精製された制限フラグメント）の精製、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源によって生成され得る。さらに、相同性の長さは、当該分野で公知の方法を使用して選択され得る。例えば、選択は、予め決定した内因性標的ＤＮＡ配列の配列組成および配列の複雑性に基づき得る。
【００５２】
本発明の標的化構築物は、代表的に、標的遺伝子の一部分または領域に相同な第１の配列、およびこの標的遺伝子の第２の一部分および領域に相同な第２の配列を含む。標的化構築物は、正の選択マーカーをさらに含み、この選択マーカーは、好ましくは、この標的ＤＮＡ配列の一部分および領域に対して相同な、第１のＤＮＡ配列と第２のＤＮＡ配列との間に位置付けられる。この正の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る。
【００５３】
当該分野で公知の他の調節配列も、標的化構築物中に組み込まれ得、特定の細胞型にある特定遺伝子の発現を破壊し得るかまたは制御し得る。さらに、この標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー（例えば、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または別の改変された蛍光タンパク質）をコードする配列を含み得る。
【００５４】
相同配列のサイズは重要ではなく、わずか５０塩基対から１００ｋｂ程の範囲にあり得るが、好ましくは、各フラグメントは、約１ｋｂ長より長く、より好ましくは、約１ｋｂと約１０ｋｂとの間であり、そしてさらにより好ましくは、約１ｋｂと約５ｋｂとの間である。当業者は、より長いフラグメントは、ＥＳ細胞中の相同組換え事象の数を増加させ得るが、より長いフラグメントはまたクローン化ことがより困難であることを認識する。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、標的化構築物は、係属中の米国特許出願第０８／９７１，３１０号（１９９７年１１月１７日出願）（この開示は本明細書中で全体が参考として援用される）に記載された方法を用いて、プラスミドゲノムライブラリーから直接調製される。一般に、目的の配列は、例えば、ロングレンジＰＣＲを使用して１工程で、プラスミドライブラリーから同定されそして単離される。この配列の単離後、標的配列を破壊する第２のポリヌクレオチドが、目的の配列をコードするによって２つの領域の間に容易に挿入され得る。この局面に従って、この構築物は、以下２工程で生成される：（１）標的配列に相同な配列を、（例えば、ロングレンジＰＣＲを使用して）増幅する工程、および（２）別のポリヌクレオチドがこの上記の相同配列に隣接されるように、この別のポリヌクレオチド（例えば、選択可能マーカー）を、このＰＣＲ産物に挿入する工程。代表的には、このベクターは、プラスミドライブラリー由来のプラスミドである。完成した構築物はまた、代表的には環状プラスミドである。
【００５６】
別の実施形態において、この標的化構築物は、米国出願番号６０／２３２，９５７号（２０００年９月１５日出願）（この開示は、本明細書中でその全体が援用される）に記載された、調節された正の選択法に従って設計される。この構築物は、２つのｌａｃＯ部位を有し、ＰＧＫプロモーターの中に位置する、ＰＧＫ−ｎｅｏ融合遺伝子、およびＳＶ４０  Ｔ抗原由来のＮＬＳをコードする配列に融合されるｌａｃリプレッサーを含むＮＬＳ−ｌａｃＩ遺伝子を含むように設計される。
【００５７】
別の実施形態において、この標的化構築物は、１より多くの選択可能マーカー遺伝子（負の選択可能マーカー（例えば、単純疱疹ウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子）を含む）を含み得る。この負の選択マーカーは、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る（例えば、米国特許第５，４６４，７６４号；米国特許第５，４８７，９９２号；米国特許第５，６２７，０５９号；および米国特許第５，６３１，１５３号を参照のこと）。
【００５８】
（細胞の生成および相同組換え事象の確認）
一旦、適切な標的化構築物が調製されると、この標的化構築物は、当該分野で公知である任意の方法を使用して、適切な宿主細胞に導入され得る。種々の技術が本発明において使用され得、この技術としては、例えば、前核マイクロインジェクション；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的化；胚のエレクトロポレーション；精子媒介遺伝子移入；およびリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈澱剤、核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、インタクトな細胞との細菌性プロトプラスト融合、トランスフェクション、ポリブレン、ポリオルニチンなどのようなポリカチオンなど（例えば、米国特許第４，８７３，１９１号；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１；Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９，Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３を参照のこと）などが挙げられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術が、当該分野で公知である（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９；Ｋｅｏｗｎら，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｋｅｏｗｎら，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，５２７−５３７頁；Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２を参照のこと）。
【００５９】
本発明の好ましい局面において、この標的化構築物は、エレクトロポレーションによって、宿主細胞に導入される。このプロセスにおいて、高い場の強度の電気衝撃は、生体膜を可逆的に透過性にし、この構築物の導入を可能にする。エレクトロポレーションの間に生成される細孔は、高分子（例えば、ＤＮＡ）の取り込みを可能にする（例えば、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ら、１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７１６１−７１６５を参照のこと）。
【００６０】
相同組換えが可能な任意の細胞型が、本発明の実施において使用され得る。このような標的細胞の例としては、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、マウス種、サル種、のような哺乳動物を含む脊椎動物、ならびに糸状菌および高等多細胞生物（例えば、植物）のような他の真核生物（ｅｔｈｅｒ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に由来する細胞が挙げられる。
【００６１】
好ましい細胞型としては、胚性幹（ＥＳ）細胞が挙げられ、これは代表的には、インビトロで培養される着床前の胚から得られる（例えば、Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｍ．Ｏ．ら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９；ならびにＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８を参照のこと）。ＥＳ細胞は、当業者に周知の方法を使用して、標的化構築物の導入のために、培養され、そして調製される（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９８７；Ｂｒａｄｌｅｙら，１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３５７−３７１；Ｈｏｇａｎらによる「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，１９８６；Ｔｈｏｍａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３；Ｋｏｌｌｅｒら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０７３０；Ｄｏｒｉｎら，１９９２，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１：１０１；ならびにＶｅｉｓら，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：２２９を参照のこと）。標的化構築物が挿入されるＥＳ細胞は、標的化構築物が導入される発生胚（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏ）と同種の胚または胚盤胞に由来する。ＥＳ細胞は、代表的には、発生の胚盤胞段階の胚である哺乳動物に導入される際の内細胞塊に一体化しそして個体の生殖系列に寄与する、これらの能力について選択される。従って、この能力を有する任意のＥＳ細胞系は、本発明の実施における用途に適切である。
【００６２】
本発明はまた、他の細胞型（例えば、幹細胞）の遺伝子をノックアウトするために使用され得る。例としては、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）および前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）であり得る。遺伝子の破壊またはノックアウトを含む細胞は、個体発生経路における標的遺伝子機能の研究において特に有用であり得る。幹細胞は、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）に由来し得る。
【００６３】
標的化構築物が細胞に導入された後に、首尾良く遺伝子標的化が生じた細胞が同定される。標的化された遺伝子に対する標的化構築物の導入は、代表的には、マーカー遺伝子の発現について細胞を同定することによって検出される。好ましい実施形態において、本発明の標的化構築物で形質転換される細胞は、は、選択可能マーカーを発現していない細胞を除去するように選択する適切な薬剤を用いる処置に供される。選択可能マーカー遺伝子を発現している細胞のみが、特定の条件下で生存し、そして／または増殖する。例えば、導入されたネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、化合物Ｇ４１８に対して耐性であるが、このｎｅｏ遺伝子マーカーを発現していない細胞は、Ｇ４１８で殺傷される。この標的化構築物はまた、スクリーニングマーカー（例えば、ＧＦＰ）をも含む場合、相同組換えは、蛍光灯下の細胞コロニーをスクリーニングすることを通して同定され得る。相同組換えを受けた細胞は、ＧＦＰ遺伝子を欠失しており、そして蛍光を発しない。
【００６４】
調節された正の選択方法が相同組換え事象の同定において使用される場合、無作為な取り込み後では選択可能マーカー遺伝子の発現が阻害されるが、その相同組換え後ではその発現が許容（脱抑制）されるような様式で、選択可能マーカー遺伝子の発現が調節されるように、この標的化構築物が設計される。より具体的には、トランスフェクトされた細胞が、ｎｅｏ遺伝子の発現についてスクリーニングされ、これは、（１）この細胞が首尾良くエレクトロポレートされ、そして、（２）ｎｅｏの転写のｌａｃリプレッサー阻害が相同組換えによって取り除かれることを必要とする。この方法は、トランスフェクトされた細胞および相同組換え体の同定が、単一の薬物を添加することによって、１工程でおこなわれることを可能にする。
【００６５】
あるいは、正負の選択技術が、相同組換え体を選択するために使用され得る。この技術は、トランスフェクトされた細胞の増殖について選択する（すなわち、正の選択）ために第１の薬物（例えば、ネオマイシン様薬物）が細胞集団に添加されるプロセスを含む。第２の薬物（例えば、ＦＩＡＵ）が、その後、負の選択マーカーを発現する細胞を殺傷する（すなわち、負の選択）ために添加される。負の選択マーカーを含み、そしてそれを発現する細胞は、選択薬剤によって殺傷されるが、負の選択マーカーを含まず、そしてそれを発現しない細胞は、生き残る。例えば、この構築物の非相同挿入を有する細胞は、ＨＳＶチミジンキナーゼを発現し、それゆえ、疱疹薬物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＧＡＮＣ）またはＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル；１−（２−ｄｅｏｘｙ−２−ｆｌｕｏｒｏ−Ｂ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｌｕｒａｎｏｓｙｌ）−５−ｉｏｄｏｕｒａｃｉｌ）に対して感受性である（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２：（１９８８）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２，（１９８９）；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ５：７０−７６（１９８９）を参照のこと）。
【００６６】
成功した組換えは、選択される細胞のＤＮＡを分析することによって同定されて、相同組換えを確認し得る。当該分野で公知の種々の技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはサザン分析）を使用して、相同組換え事象を確認し得る。
【００６７】
相同組換えはまた、幹細胞、および全能性胚性幹細胞ではない他の細胞型の中の、遺伝子を破壊するために使用され得る。例としては、幹細胞は、骨髄、リンパまたは神経の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）および前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）であり得る。このようなトランスジェニック細胞は、個体発生経路における遺伝子機能の研究において特に有用である。幹細胞は、任意の脊椎動物種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）に由来し得る。
【００６８】
全能性ではない細胞において、当該分野で公知の方法を使用して、標的の両方のコピーをノックアウトすることが所望され得る。例えば、標的遺伝子座で相同組換えを含む細胞（正の選択マーカー（例えば、Ｎｅｏｒ）の発現について選択され、非無作為組み込みについてスクリーニングされた）は、さらに、上昇したレベルの選択薬剤（例えば、Ｇ４１８）に対する曝露によって複数のコピーの選択可能マーカー遺伝子について選択され得る。次いで、この細胞は、標的遺伝子座におけるホモ接合性について分析される。あるいは、第２の構築物は、２つの相同配列の間に挿入された異なる正の選択マーカーを用いて生成され得る。この２つの構築物は、連続または同時のいずれかで、この細胞に導入され得、その後、各正のマーカー遺伝子について、適切な選択が行われ得る。この最終的な細胞は、標的の両方の対立遺伝子の相同組換えについてスクリーニングされる。
【００６９】
（トランスジェニック動物の作製）
次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞（または、生存可能な動物を生成する目的について適切な他の発生段階（例えば、桑実胚））に注入され、キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｆｚｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１１３−１５２頁（１９８７）を参照のこと）。あるいは、選択されたＥＳ細胞を、解離されたマウス胚細胞と凝集されて、凝集キメラを形成し得る。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植され得、そしてこの胚を出産させ得る。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有するキメラである子孫は、この動物の全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用され得る。１つの実施形態において、キメラである子孫マウスを使用して、遺伝子の中でヘテロ接合性破壊を有するマウスを生成する。次いで、ヘテロ接合体トランスジェニックマウスを、交尾させ得る。代表的にこのような交尾による子孫の１／４が、この標的遺伝子の中にホモ接合性破壊を有することは当該分野で周知である。
【００７０】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性のトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の破壊が表現型の変化、特に病理学的変化を引き起こすかどうかを決定するために、正常な野生型マウスと比較され得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性のマウスは、理学的検査、剖検、組織像、臨床化学、全血球算定、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価によって表現型変化について評価され得る。
【００７１】
１つの実施形態において、標的遺伝子の破壊に関連する表現型（または表現型の変化）は、データベースに入れられるか、または蓄えられる。好ましくは、このデータベースは、（ｉ）遺伝子型データ（例えば、破壊された遺伝子の同定）および（ｉｉ）遺伝子型データに関連する表現型データ（例えば、遺伝子破壊から生じる表現型）を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは好ましくは、このデータベースが検索可能であるように探索ツールと組み合わされる。
【００７２】
（条件的トランスジェニック動物）
本発明はさらに、組換え方法を用いて産生された条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物などの条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物を意図する。酵母プラスミドに由来するバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼおよびｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼ酵素の２つの非制限的な例であり、これらの酵素は、特異的標的部位（ｃｒｅリコンビナーゼではｌｏｘ  Ｐ部位、そしてｆｌｐリコンビナーゼではｆｒｔ部位）でＤＮＡを切断し、そして第二の切断部位へのこのＤＮＡの連結を触媒する。多数の適切な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、それらの遺伝子は、本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのＩｎｔリコンビナーゼ（Ｘｉｓを有するかまたは有さない）（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ、Ｒ．ら、Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ、（Ｈｅｎｄｒｉｘ、Ｒ．ら、編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２１１−５０頁（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））；ＴｐｎＩおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン（Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２：３７４５−５７（１９９０））；Ｔｎ３レソルバーゼ（Ｆｌａｎａｇａｎ  ＆  Ｆｅｎｎｅｗａｌｄ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０６：２９５−３０４（１９８９）；Ｓｔａｒｋら、Ｃｅｌｌ、５８：７７９−９０（１９８９））；酵母リコンビナーゼ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２：６１０−１８（１９９０））；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳｐｏＩＶＣリコンビナーゼ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１０９２−９８（１９９０））；Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＆  Ｓａｄｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０５：６４７−６５８（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：４５２７−３３（１９９０）；Ｇｏｌｉｃ  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｃｅｌｌ、５９：４９９−５０９（１９８９）；Ａｍｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１４：５５−７２（１９９０））；Ｈｉｎリコンビナーゼ（Ｇｌａｓｇｏｗら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１００７２−８２（１９８９））；免疫グロブリンリコンビナーゼ（Ｍａｌｙｎｎら、Ｃｅｌｌ、５４：４５３−４６０（１９８８））；およびＣｉｎリコンビナーゼ（Ｈａｆｆｔｅｒ  ＆  Ｂｉｃｋｌｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７：３９９１−３９９６（１９８８）；Ｈｕｂｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２０５：４９３−５００（１９８９））（全ては参考として本明細書中に援用される）が挙げられる。このような系は、：Ｅｃｈｏｌｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６９７−１４７００（１９９０））；ｄｅ  Ｖｉｌｌａｒｔａｙ（Ｎａｔｕｒｅ、３３５：１７０−７４（１９８８））；Ｃｒａｉｇ、（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：７７−１０５（１９８８））；Ｐｏｙａｒｔ−Ｓａｌｍｅｒｏｎら、（ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２４２５−３３（１９８９））；Ｈｕｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｌｉｎｇら、（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２：１０７−１��（１９９０））；およびＣｒｅｇｇ  ＆  Ｍａｄｄｅｎ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１９：３２０−２３（１９８９））（全ては参考として本明細書中に援用される）によって議論されている。
【００７３】
Ｃｒｅは、均質になるまで精製され、そしてそのｌｏｘＰ部位との反応は、広く特徴付けられている（Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ＆  Ｈｅｓｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：１５０９−１４（１９８４）、参考として本明細書中に援用される）。Ｃｒｅタンパク質は、３５，０００の分子量を有し、そしてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／ＤｕＰｏｎｔから商業的に入手可能である。このｃｒｅ遺伝子（Ｃｒｅタンパク質をコードする）はクローン化され、そして発現されている（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３）、参考として本明細書中に援用される）。このＣｒｅタンパク質は、同じＤＮＡ分子または異なるＤＮＡ分子に存在し得る２つのｌｏｘＰ配列間の組換えを仲介する（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：２９７−３０９（１９８１））。ｌｏｘＰ部位の内部スペーサー配列は非対称性であるので、２つのｌｏｘＰ部位は互いに対して方向性を呈し得る（Ｈｏｅｓｓ  ＆  Ａｂｒｅｍｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１０２６−２９（１９８４））。従って、同じＤＮＡ分子上の２つの部位が、直接的に繰り返された方向にある場合、Ｃｒｅはその部位間のＤＮＡを切り出す（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３））。しかしながら、この部位が互いに関して反転している場合、それらの間のＤＮＡは組換え後に切り出されるのではなく、単に反転される。したがって、直接方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状ＤＮＡ分子が組換えられて、２つのより小さな環を生産する。これに対して、反転した方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状分子は、ｌｏｘＰ部位が隣接するＤＮＡ配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のＤＮＡ分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【００７４】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルにおいて遺伝子機能を特徴付けるために重要な適用を有する。本明細書中に記載される構築物が標的遺伝子を破壊するために使用される場合、正の選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始部位の下流（３’）に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うあるレベルのタンパク質発現を生じ得る。正の選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化に関連しているか、またはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているかを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。正の選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、正の選択マーカーが除去される。このようにして、正の選択マーカーまたは融合転写物の発現により生じる影響は避けられる。
【００７５】
１つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は、直接マイクロインジェクションによって細胞へもたらされる。別の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態のさらなる局面は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ媒介組換えを実行するための１つの方法は、誘導性または組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントを使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用を含む。誘導性発現エレメントは好ましくは、所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または誘導性活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）、エクジソン、および他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２−６（１９９４））。使用することができるさらなる制御エレメントとしては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを組み込んだベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【００７６】
（疾患のモデル）
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。このようなアッセイは、例えば、疾患症状を回復させることが可能である化合物のような薬剤を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に曝露され得る。これは、曝露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。曝露された後、細胞は１つ以上の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る薬物、医薬、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に曝露され得る。これは、曝露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。曝露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を評価してモニターされ得る。曝露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を曝露することを含み得る。新生児、若年および成体の動物もまた曝露され得る。
【００７７】
より具体的には、本発明の動物モデル（具体的には、トランスジェニックマウス）を使用して、薬剤（化合物を含む）を同定する方法が、好ましくは、標的遺伝子中の破壊に関連する少なくとも１つの表現型に影響を与える能力に基づいて提供される。１つの実施形態では、本発明は、標的遺伝子または標的タンパク質の発現または機能に影響を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、例えば、薬剤に対する動物の生理学的応答を測定する工程、およびコントロール動物に対してそのような動物の生理学的応答を比較する工程を包含し、ここで、コントロール動物と比較した、標的中に破壊を含む動物の生理学的応答が、この薬剤の特異性を示す。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ（例えば、遺伝子転写、タンパク質産生および分解速度）、物理的パラメーター（例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、ＰＴＴ．Ｔ、またはＴＴ）および細胞アッセイ（例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力）が使用され得る。本発明のトランスジェニック動物および細胞は、標的遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。
【００７８】
本発明は、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【００７９】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム（例えば、「分散分析」またはＡＮＯＶＡなど）を使用して実施され得る。約０．０５以下の「ｐ」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いｐ値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物（またはその群）の挙動と野生型マウス（またはその群）の挙動との間での比較を、典型的にはある定められた条件下にて行う。本明細書中に使用される場合、「異常な行動」とは、標的遺伝子に破壊を有しない動物（例えば、野生型マウス）と異なる、標的遺伝子に破壊を有する動物（例えば、トランスジェニック動物）によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定（または観察）および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る（例えば、ＣｒａｗｌｅｙおよびＰａｙｌｏｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ３１：１９７−２１１（１９９７）を参照のこと）。
【００８１】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを曝露することを含む。動物の社会的挙動（例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾）が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る（例えば、Ｓ．Ｅ．Ｆｉｌｅら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２２：９４１−９４４（１９８５）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３９−２４７（１９８６）を参照のこと）。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【００８２】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚（通常、聴覚性）刺激に曝露し、動物の驚愕反応を測定することを含む（例えば、Ｍ．Ａ．Ｇｅｙｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２５：４８５−４９８（１９９０）；ＰａｙｌｏｒおよびＣｒａｗｌｅｙ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３２：１６９−１８０（１９９７）を参照のこと）。（正常な驚愕反応からの）抑制パーセントが、驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える（ｃｕｅｉｎｇ）」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた、使用され得る。
【００８３】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への曝露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｇ．Ｊ．Ｋａｎｔら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２０：７９３−７９７（１９８４）；Ｎ．Ｊ．Ｌｅｉｄｅｎｈｅｉｍｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３０：３５１−３５５（１９８８）を参照のこと）。
【００８４】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、そして／または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である（例えば、Ｍ．Ｂｅｒｔｏｌｕｃｃｉ  Ｄ’Ａｎｇｉｃら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５５：１２０８−１２１４（１９９０）を参照のこと）。
【００８５】
新規の試験は、通常、新規な環境および／または新規な対象への曝露を含む。新規な環境中および／または新規な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される（例えば、Ｄ．Ｋ．Ｒｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．１７：１９３−２０２（１９８２）；Ｂ．Ｐｏｕｃｅｔ，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：１００９−１００１６（１９８９）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎら、Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３１−２３８（１９８６）を参照のこと）。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【００８６】
学習性無力試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への曝露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る（例えば、Ａ．Ｌｅｓｈｎｅｒら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．２６：４９７−５０１（１９７９）を参照のこと）。
【００８７】
あるいは、尾部によって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定する尾部宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると考えられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると考えられている。遂には「学習性無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先だってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させることが研究によって示されている。
【００８８】
モーリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ  ｗａｔｅｒ−ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ）は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｅ．Ｍ．Ｓｐｒｕｉｊｔら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５２７：１９２−１９７（１９９０）を参照のこと）。
【００８９】
あるいは、Ｙ字型迷路が使用され得る（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ３２：７２３−７２６（１９８９）；Ｄｅｌｌｕ，Ｆ．ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  ７３：３１−４８（２０００）を参照のこと）。Ｙ迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Ｙ迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約４０ｃｍ×８ｃｍ×２０ｃｍであり得る。各アームもまた、例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた１６のフォトビームを有することができる。少なくとも２種の異なった試験がこのようなＹ迷路を使用して実施され得る。連続Ｙ迷路パラダイムでは、マウスに例えば約１０分間、Ｙ迷路の３つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向をいう。交替は動物が２回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的（ｅｇｏｃｅｎｔｒｉｃａｌｌｙ）に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。２つの試験的Ｙ迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新規性および空間記憶に対する反応を測定する。第１の試験（取得）中、動物は、例えば約１５分間、自由にＹ迷路の２つのアームを訪問し得る。第３のアームはこの試験中、遮蔽されている。第２の試験（回復）は例えば約２時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約５分間、３つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の３つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの間の区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり（ｃｕｅ）に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を媒介するその遺伝子の役割を示し得る。
【００９０】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には２つ以上の環境への曝露を含み、そのうちの１つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む（例えば、Ｒ．Ａｄｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｎ．Ｓｃｉ．２６：１２５−１２８（１９７２）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２２１−２３０（１９８６）を参照のこと）。あるいは、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、２つの開放および２つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約５分間、探索させる。このパラダイムは、げっ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安のレベルを測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【００９１】
食物回避試験は、新しい食物への曝露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｂ．Ａ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．６７：１５−２２（１９６９）を参照のこと）。
【００９２】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に曝露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｈ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ，２０：６０３−６０６（１９８８）を参照のこと）。
【００９３】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤（例えば、アンフェタミン、コカイン、ＰＣＰなど）の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｐ．Ｂ．Ｓ．Ｃｌａｒｋｅら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ９６：５１１−５２０（１９８８）；Ｐ．Ｋｕｃｚｅｎｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１：２７０３−２７１２（１９９１）を参照のこと）。
【００９４】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および／または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される（例えば、Ｓ．Ｎａｓｓｉｆら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，３３２：２４７−２５７（１９８５）；Ｗ．Ｌ．Ｉｓａａｃら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：３４５−３５５（１９８９）を参照のこと）。
【００９５】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｊａｒｒａｒｄら、Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６１：５１９−５３０（１９８６）を参照のこと）。
【００９６】
ＤＲＬ（低反応率差次的強化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ））実施試験は間欠的報酬パラダイムに曝露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｊ．Ｄ．Ｓｉｎｄｅｎら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１００：３２０−３２９（１９８６）；Ｖ．Ｎａｌｗａら、Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７：７３−７６（１９８５）；およびＡ．Ｊ．Ｎｏｎｎｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．９５：５８８−６０２（１９８１）を参照のこと）。
【００９７】
空間学習試験は、複雑で新規の環境に曝露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｎ．Ｐｉｔｓｉｋａｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３８：９３１−９３４（１９９１）；Ｂ．Ｐｏｕｃｅｔら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３７：２６９−２８０（１９９０）；Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３７：２６３−２６８（１９９０）；およびＦ．Ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０２：４８１−４８８（１９８８）を参照のこと）。あるいは、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド（ｏｆ）試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な（すなわち心配性でない）マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【００９８】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に曝露し、例えば環境に適応する（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｎｇ）反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｖａｒｇｏら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０２：１９９−２０９（１９８８）を参照のこと）。
【００９９】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０２：３０１−３０８（１９９０）；Ｍ．Ｇ．Ｃｏｒｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０７２−２０７６（１９８３）を参照のこと）。
【０１００】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。１つまたは２つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約５〜１０分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間（対象物への接近、すなわち、例えば約３〜５ｃｍ以内での動きが対象物の探索とみなされる）が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新奇な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新奇な対象物を探索することに費やす時間の割合（再び、約５〜１０分間の時間をかけて）が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新奇な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物（好ましくは単純なブロック）がスプレーされ得るか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ、新奇な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新奇恐怖症（ｎｅｏｐｈｏｂｉａ）を示す。
【０１０１】
ホットプレート痛覚脱失試験（ｈｏｔ  ｐｌａｔｅ  ａｎａｌｇｅｓｉａ  ｔｅｓｔ）は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約５５℃のホットプレート上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間（例えば、後足を持ち上げて後足をなめるまでの時間）が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【０１０２】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調および平衡を測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル（または回転丸太）のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約６０ｒｐｍの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低２０分間あけて少なくとも３回、試験される。最も長くロッド上に留まることができるマウスは、より良好な協調および平衡を有すると考えられる。
【０１０３】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール５ｍｇ／ｍｌ溶液は、例えば、約０．３７５ｍｌ／分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。４つの異なる生理学的段階が記録され得る：注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展（ｔｏｎｉｃ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【０１０４】
（標的遺伝子産物）
本発明はさらに、標的遺伝子産物を生産するための標的遺伝子配列の使用を意図する。標的遺伝子産物は、機能的に等価な遺伝子産物を示すタンパク質を含み得る。このような等価遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これはサイレント変化を生じ、したがって機能的に等価な標的遺伝子産物を生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてなされ得る。
【０１０５】
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書中に使用される場合、「機能的に等価である」とは、標的遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に同様なインビボ活性を示すことができるタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価である」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分が行う様式と実質的に同様な様式で他の細胞内分子または細胞外分子と相互作用することができるペプチドをいう。
【０１０６】
本発明の方法により有用である他のタンパク質産物は、組換えまたは合成手段により生産された標的遺伝子由来であるか、あるいはこれに基づくペプチド（誘導ペプチド）である。
【０１０７】
標的遺伝子産物は、当該技術分野で周知である技術を使用して、組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。したがって、遺伝子配列をコードする核酸を発現することによって本発明の遺伝子のポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。当業者に周知である方法は、タンパク質コード遺伝子配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には例えばインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（上述）およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９（上述）参照）。あるいは、タンパク質の遺伝子配列をコードすることができるＲＮＡは、例えば自動合成器（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）参照）を使用して化学的に合成され得る。
【０１０８】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列を発現するために使用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列を生産し、続いて精製し得るビヒクルを示すが、配列をコードする適切なヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明の遺伝子のタンパク質を示し得る細胞も示す。これらには、タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されるか、あるいはタンパク質コード遺伝子配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
細菌系では、多くの発現ベクターは、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、たとえば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましくあり得る。このようなベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（このベクターにおいて、タンパク質コード遺伝子配列は、融合タンパク質が生産されるように、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結され得る）（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２：１７９１−９４（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：３１０１−０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：５５０３−９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて外来ポリペプチドを融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、結果として、クローン化された標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１１０】
好ましい実施形態では、全長のｃＤＮＡ配列が、標準的ＰＣＲ方法論（Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０））を使用してアミノ末端でインフレームＢａｍＨＩ部位に、そしてカルボキシル末端でインフレームＥｃｏＲＩ部位に付加され、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中に連結される。得られたｃＤＮＡ構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列を含む（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：１０７５−８０（１９８５）；Ｚａｂｅａｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：１２１７−２４（１９８２））。
【０１１１】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性被覆を欠くウイルス）の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染するために使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４−９３（１９８３）；米国特許第４，７４５，０５１号参照）。
【０１１２】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３つの部分からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子はインビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）での挿入は、生存可能かつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質を発現し得る組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３６５５−５９（１９８４）参照）。特異の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームを有する相（ｐｈａｓｅ）中になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）のものであり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって増強され得る（Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６−４４（１９８７）参照）。
【０１１３】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は適切な発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後に操作された細胞は富化培地中で１〜２日間増殖され、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対して耐性を与え、その染色体中にプラスミドを安定して組み込み、そして増殖する細胞が、次々にクローン化され、細胞株において広がり得る病巣を形成させる。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および／または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソンおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２−６（１９９４））。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス性、特にＨＩＶプロモーターなどの特定の転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。１つの実施形態では、Ｔｅｔ誘導性遺伝子発現系が使用される（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−６９  （１９９５））。Ｔｅｔ発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の２つの調節エレメント（テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔＲか結合するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ））に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はｔｅｔＯオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同時にトランスフェクトされたＴｅｔＲの存在下で、組換えタンパク質の発現はｔｅｔＯ調節エレメントへのＴｅｔＲタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルの調節された遺伝子発現は、ＴｅｔＲへの結合についてｔｅｔＯエレメントと競合するテトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）のようなＴｃ誘導体の濃度を変化させることに応答して誘導され得る。ｔｅｔ誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ．から市販されている。
【０１１６】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。１２５Ｉなどの放射性同位元素；基質に暴露されたときに検出可能な熱量シグナルまたは光を発生する酵素標識系；および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えＤＮＡ技術がこのようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定化および／または検出を容易にすることができる融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【０１１７】
間接的標識は、遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質（標識抗体など）の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
（抗体の生成）
１つまたは複数のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が本明細書に記載される。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられ得るが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の標的遺伝子の検出に、あるいは、異常な標的遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は疾患処置方法の一部として使用してもよく、そして／または診断技術の一部として使用してもよい。その際、患者は標的遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【０１１９】
抗体の生産について、種々の宿主動物は、標的遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントは、宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、このようなアジュバンドとしては、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来の抗体分子の異種の集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物は、上記したようなアジュバントを補充された遺伝子産物を注射することにより免疫化され得る。
【０１２１】
特定の抗原に対する抗体の同種の集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供するための任意の技術によって得られ得る。これらとしては、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−７（１９７５）；および米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６−３０（１９８３））およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｉｔｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７７−９６頁（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意サブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のｍＡｂの生産により、これは現時点での好ましい生産方法である。
【０１２２】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２−５４（１９８５））が使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子）である。
【０１２３】
あるいは、単鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５４４−４６（１９８９））は、遺伝子単鎖抗体を生成するために適用され得る。単鎖抗体はアミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、一本鎖ポリペプチドを生じる。
【０１２４】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術によって生成され得る。このようなフラグメントとしては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低下させることによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９））、所望な特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【０１２５】
（スクリーニング法）
本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト（すなわち、標的遺伝子ポリペプチドに結合しかつ活性化する薬剤）またはアンタゴニスト（すなわち、標的遺伝子ポリペプチドの活性または標的遺伝子ポリペプチドとそのリガンドとの相互作用を阻害する薬剤））についてスクリーニングするためのプロセスにおいて、使用され得る。従って、本発明のポリペプチドはまた、例えば、当該分野で公知の、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー、および天然産物混合物において、低分子物質とリガンドとの結合を評価するために使用され得る。レセプターを調節し得る薬剤を同定しそしてスクリーニングするために慣用的に使用され得る任意の方法が、本発明に従って使用され得る。
【０１２６】
本発明は、標的遺伝子発現または機能を調節する薬剤を同定および少なくともするための方法を提供する。さらに詳しく、標的遺伝子配列を含み、かつ発現する細胞は、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）などの非組換え単球細胞株、ＨＵＶＥＣなどの内皮細胞およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）；ならびにＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１））などの一般的な哺乳動物細胞系が挙げられ得る。さらに、このような細胞としては組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のトランスジェニックマウスは疾患に関与する１以上の細胞型を含む細胞株を生成するために使用され得る。これはその障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物は使用され得るが、連続的な細胞株の生成が好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：６４２−４８（１９８５）を参照のこと。
【０１２７】
標的遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験がなくても利用され得る。標的遺伝子配列はまた破壊されるかあるいは過少発現され得る。標的遺伝子破壊または過少発現された標的遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に寄与する機能の任意の欠失を代償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。
【０１２８】
インビトロ系は、標的遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するために設計され得る。このような化合物としては、Ｄ−および／またはＬ−立体配置アミノ酸から作られたペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態；例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２−４（１９９１）参照）、ホスホペプチド（例えば、無作為にまたは部分的に縮重した、指向されたホスホペプチドライブラリーの形態；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ、７２：７６７−７８  （１９９３）参照）、抗体、および有機または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、標的遺伝子タンパク質、好ましくは変異標的遺伝子タンパク質の活性を調節すること；標的遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成すること；または正常な標的遺伝子相互作用を破壊するか、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて有用であり得る。
【０１２９】
標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、２つの成分が相互作用および結合することを可能にするために充分な条件下で十分な時間、標的遺伝子タンパクと試験化合物の反応混合物を調製し、反応混合物から取り除かれ、そして／または検出され得る複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う１つの方法は、固相上に標的遺伝子タンパク質または試験物質を付着する工程、および反応の最後に固相上に付着させた標的タンパク質／試験物質複合体を検出する工程を包含する。このような方法の１つの実施形態では、標的遺伝子タンパク質は固体表面上に付着され得、そして付着されない試験化合物が直接的または間接的にのいずれかで標識され得る。
【０１３０】
実際には、マイクロタイタープレートが簡便に使用される。付着された成分は非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は単にタンパク質溶液で固体表面を被覆し、乾燥することによって達成され得る。あるいは、固定化抗体、好ましくはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を付着するために使用され得る。その表面は予め調製され、かつ貯蔵されていてもよい。
【０１３１】
アッセイを実施するために、固定化されていない成分が、付着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下に除去（例えば、洗浄）される。固体表面上に付着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。以前の固定化されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。以前の固体化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が表面上に付着された複合体を検出するために、使用され得る；例えば、以前の固定化されていない成分に特異的な標識抗体（順次、標識された抗−Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る抗体）を使用する。
【０１３２】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体は、例えば、標的遺伝子産物に特異的な固定化抗体または溶液中に形成された任意の複合体を付着する試験化合物、および付着された複合体を検出するために可能性ある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して検出される。
【０１３３】
上記された方法の１つによって特定の標識遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力について試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【０１３４】
（アンチセンス、リボザイム、および抗体）
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、標的遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異標的遺伝子活性を低下または阻害する薬剤は、疾患症状を回復させるために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重螺旋分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【０１３５】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつタンパク質翻訳を阻害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０領域と＋１０領域との間に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１３６】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な１以上の配列を含まなければならず、そしてｍＲＮＡ切断の原因である周知の触媒配列を含まなければならない。この配列としては、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと（その全体が本明細書中に参考として援用される）。本発明の範囲内で、標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒するハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が操作される。
【０１３７】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位のための目的の分子をスキャニングすることにより同定される。一旦、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を所望のものでなくし得る、二次構造などの予想される構造的特徴について評価され得る。候補配列の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためのそれらの接触可能性を試験することにより評価され得る。
【０１３８】
転写の阻害のための三重螺旋形成に使用される核酸分子は１本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対の法則によって三重螺旋形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）を必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重螺旋の３本の関連した鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。ピリミジンに富む分子は、その鎖に平行に配向した二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域に相補的である塩基を提供する。さらに、例えばＧ残基の伸長を含む、プリンに富む核酸分子が選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖とともに三重螺旋を形成する。そこでは、大多数のプリン残基は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に配置され、三重鎖の３本鎖にわたりＧＧＣトリプレットを生じる。
【０１３９】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化することができる潜在的配列は、「スイッチバック」核酸分子と呼ばれるものを作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長の必要性を排除するように、交互５’−３’、３’−５’様式で合成される。
【０１４０】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび／または三重螺旋分子は、正常および変異標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるｍＲＮＡの転写（三重螺旋）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を低減あるいは阻止し得ることが可能である。標的遺伝子活性の十分に正常な程度が維持されることを確証するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性を有する配列を含まない細胞中へ導入され得る。また、細胞または組織の標的遺伝子活性の必須の程度を維持するために、細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合もある。
【０１４１】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重螺旋分子はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関する当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学合成法など、当該技術分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。またはＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入され得る。また、使用されるプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導可能にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞株中に安定して導入され得る。
【０１４２】
ＤＮＡ分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能性ある修飾としては、分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの主鎖内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
標的遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異標的遺伝子機能を阻止するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自身に対して、またはタンパク質の一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ全抗体が使用される例では、抗体を内在化させることが好ましい場合がある。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、細胞中へ標的遺伝子エピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または広がった標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成され得るか、あるいは組換えＤＮＡ技術により生産され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（１９８４）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体も投与され得る。このような単鎖抗体は、例えばＭａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９−９３（１９９３）に記載される技術などを使用することにより、例えば、標的細胞集団内の単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することで投与され得る。
【０１４５】
標的（ＴＡＲＧＥＴ）遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列は、疾患症状が改善されるような、ある程度の標的遺伝子タンパク質の生産に十分である濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与され得る。患者は遺伝子置換治療法で治療されてもよい。正常な標的遺伝子の１以上の複製物、または標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入され得る。ベクターとしては、リポソームなどの細胞中にＤＮＡを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な標的遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【０１４６】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な標的遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者の中に導入されるかあるいは再導入され得る。
【０１４７】
（薬学的組成物、有効量、および投与経路）
標的変異体遺伝子の発現、合成および／または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を治療または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【０１４８】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的有効量）を測定することについて、細胞培養物または実験動物の標準的な薬学的方法により決定され得る。毒性と治療的効果との用量割合は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得る間は、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へのこのような化合物を標的とする送達系を設計するように注意すべきである。
【０１４９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を処方することに使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。この投薬量は使用される投薬形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方される。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１５０】
本発明により使用するための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。したがって、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気（口または鼻のいずれかから）、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方され得る。また、薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも考えられる。
【０１５１】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、前糊化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｓｅｄ）トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムスターチ（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態（例えば錠剤またはカプセル）をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適した媒体を用いて構成する乾燥製品として存在してもよい。このような液体調製剤は懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水溶性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に受容可能な添加剤を使用する従来の手段によって調製され得る。この調製剤はまた、適切に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含み得る。
【０１５２】
経口投与の場合の調製剤は、活性化合物を制御して放出させるように適切に処方され得る。
【０１５３】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１５４】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は、適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー形態で便宜的に送達される。加圧エアゾールの場合には、投薬量単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入または通気に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基材との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【０１５５】
この化合物は注射、例えば、一回大量注入（ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、単位投薬形態、例えば添加された保存剤とともにアンプルまたは多用量容器に入れられ得る。この組成物は油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳化液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。また、活性成分は使用前に適切なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【０１５６】
この化合物はまた、例えば、ココア脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基材を含む座薬または保持性浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）などの直腸用組成物として処方され得る。経口摂取はおそらく、いなかる投薬の中で最も容易な方法である。このような投与経路は一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これはタンパク質および他の生物学的活性組成物を含む多くの物質には好ましくない環境である胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性およびタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口から摂取した場合、広範囲に多様な生物学的活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかのものが胃を通過して生き残り、小腸で体内に吸収されることは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤はしばしば皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口などの他の方法で摂取されなければならない。
【０１５７】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液（例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ポリソルベート）、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール）およびアスコルビン酸などの抗酸化剤を含み得る。安定化剤はＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤であり得る。ＥＢＰはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の微粒子調製物中に導入され得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な検索は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ（編）、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９０）に見られる。
【０１５８】
先に記載した処方剤のほかに、化合物はまたデポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方剤は移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、化合物は適切な高分子または疎水性物質（例えば、受容可能な油中の乳化剤として）またはイオン交換樹脂とともに処方され得るか、または難溶解性誘導体として（例えば、難溶解性塩として）処方され得る。
【０１５９】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れられていてもよい。このパックは例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は投与のための指示書が添付されていてもよい。
【０１６０】
（診断薬）
標的遺伝子に関連した疾患症状を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的に、試薬が、例えば標的遺伝子変異の存在を検出するために、あるいは標的遺伝子ｍＲＮＡの過剰発現（ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または不完全な発現（ｕｎｄｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のいずれかを検出するために使用され得る。
【０１６１】
本発明の診断および予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）方法によれば、野生型標的遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法は、野生型標的遺伝子座を検出し、疾病素因または新形成の欠如を確認することによって実施され得る。「野生型遺伝子の変化」はコードまたは非コード領域の欠失、挿入および点変異を含む変異のすべての形態を包含する。欠失は全遺伝子または遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異はある組織（例えば腫瘍組織）にだけ生じるものであり、生殖系列に遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され、遺伝され得る。ただ１つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかし、両方の対立遺伝子が変異される場合、後期新形成状態が示され得る。したがって、遺伝子変異の発見は診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない標的遺伝子対立遺伝子（例えば、標的遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる）は、挿入、小欠失および点変異などの他の変異のためにスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見られる変異は、標的遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異はまた、癌状態にも関連し得る。点変異事象は、ｍＲＮＡの発現の損失または減少をもたらす遺伝子のプロモーター中などの調節領域中で生じ得る。点変異はまた、標的遺伝子産物の発現の損失をもたらすか、あるいはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の減少をもたらす適切なＲＮＡプロセッシングを無効とし得る。
【０１６２】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な１つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接に比較することである。また、例えばＰＣＲによって増幅後、メッセンジャーＲＮＡを配列決定し、それによって候補遺伝子のエクソン構造を決定する必要性を排除することができる。標的遺伝子のコード領域の外側に起こる（ｆａｌｌ）癌患者の変異は、標的遺伝子の近くまたはその中のイントロンおよび調節配列などの非コード領域を試験することにより検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさのまたは多量のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノザンブロット実験から判明し得る。
【０１６３】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含むプレパッケージングされた診断キットを使用して実施され得る。これは、例えば、疾患症状を示すか、あるいは疾患が進展する危険性のある患者を診断する臨床設定において便宜的に使用され得る。
【０１６４】
遺伝子が発現されるいかなる細胞型または組織、好ましくは単球、内皮細胞または平滑筋細胞も、以下に記載される診断において使用される。
【０１６５】
分析される細胞型または組織から得たＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術分野で周知である方法を使用して容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片（固定および／または凍結されている）上で、直接にインサイチュにて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用され得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ、ＰＣＲ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９２）を参照のこと）。
【０１６６】
遺伝子ヌクレオチド配列、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかは、例えば、疾患関連遺伝子構造および発現を検出するために生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。このようなアッセイとしては、サザンまたはノーザン分析、制限フラグメント長多型アッセイ、１本鎖コンホメーション多型分析、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子の発現パターンの定量的局面、ならびに遺伝子発現および／または遺伝子組成の定性的局面の両方を明らかにし得る。すなわち、このような局面としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配置、および／または遺伝子発現の活性化または不活性化が挙げられ得る。
【０１６７】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、１つ以上の標識核酸試薬と、分析される細胞型または組織から獲得された核酸を、目的の核酸分子内の相補的配列への、これらの試薬の特異的なアニーリングに好ましい条件下で、接触およびインキュベートする工程を含み得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールしない核酸は、核酸：フィンガープリント分子のハイブリッドから除去される。次いで、このような分子が存在する場合に、ハイブリダイズしたフィンガープリント組織由来の核酸の存在が検出される。このような検出スキームを使用して、目的の組織または細胞型由来の核酸は、例えば、固体支持体（例えば、膜）、またはプラスチック表面（例えば、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズ上の表面）に固定化され得る。この場合、インキュベーション後、アニールしない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールした標識核酸試薬の検出は、当該技術分野で周知である標準的技術を使用して達成される。
【０１６８】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための代替の診断方法は、例えばＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記載の実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−９３（１９９１））、自己配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４−７８（１９９０））、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３−７７（１９８９））、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７（１９８８））、または任意の他の核酸増幅方法によるそれらの増幅、続く、当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出を含み得る。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合の、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０１６９】
このような検出スキームの１つの実施形態において、ｃＤＮＡ分子が目的のＲＮＡ分子から（例えば、ｃＤＮＡへのＲＮＡ分子の逆転写によって）得られる。このようなＲＮＡが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および／または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、ｃＤＮＡ内の配列が、ＰＣＲ増幅反応などのような核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬（例えば、プライマー）として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、核酸増幅は、放射標識または非放射標識したヌクレオチドを使用して実施され得る。あるいは、充分に増幅された産物が生成され得、その結果、この産物は、標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【０１７０】
野生型または変異遺伝子ペプチドに対する抗体がまた、疾患診断薬および予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現のレベルにおける異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および／または組織、細胞内、もしくは細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に対する変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられ得る。
【０１７１】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、当業者に周知の技術（ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない）を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前出、１８章を参照のこと。本明細書で使用されるタンパク質の検出および単離方法はまた、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））に記載されるような方法であり得る。
【０１７２】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【０１７３】
例えば、本発明において有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用され得る。これは、例えば光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光検出と組み合わせて蛍光標識抗体（以下を参照）を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に、特に好ましい。
【０１７４】
本発明において有用な抗体（またはそのフラグメント）はさらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法におけるように、組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的検体を取り出し、そしてその検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成され得る。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは生物学的サンプルの上に標識抗体（またはフラグメント）を重ねることにより適用される。このような手順の使用を通じて、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在だけでなく、試験された組織における分布をも決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範囲の組織学的方法（例えば、染色手順）のいずれかが、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易に理解する。
【０１７５】
野生型、変異体または伸長したフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、新らに収集した細胞、または組織培養物中でインキュベートされた細胞のような生物学的サンプルをインキュベートする工程、および当該技術分野で周知の多くの技術のいずれかによって、結合した抗体を検出する工程を含む。
【０１７６】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固体支持体もしくはキャリア、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固体支持体と接触され、そしてその上に固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理され得る。次いで、固体支持体は、緩衝液で２回目の洗浄をされ、未結合抗体を除去し得る。次いで、固体支持体上の結合標識の量が、従来の手段により検出され得る。
【０１７７】
用語「固相支持体またはキャリア」は、抗原または抗体に結合し得る任意の支持体を含むことを意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合した分子が抗原または抗体に結合し得る限り、実質的に任意の可能性のある構造的配置を有し得る。したがって、支持体の配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面または棒状体の外表面のような円筒状であり得る。あるいは、表面は、シート、試験片などのように平らであり得る。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切なキャリアを知っているか、または、慣用的な実験を使用することにより同一物を確証し得る。
【０１７８】
所定の多数の（ａ  ｇｉｖｅｎ  ｌｏｔ  ｏｆ）抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することにより、各々の決定のための操作的および最適なアッセイ条件を決定し得る。
【０１７９】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、酵素に当該抗体を連結し、そして酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）にこれを使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ｒｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ，８：２８９−９８（１９７８）［“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，１９７８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．］；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７−２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ（編），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａら（編），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色基質）と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する比色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準に対する基質の酵素反応の程度を可視的に比較することにより達成され得る。
【０１８０】
検出はまた、任意の種々の他のイムノアッセイを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または伸長したペプチドを検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと）。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０１８１】
蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は、適切な波長の光に暴露される場合、次いで、その存在が、蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【０１８２】
抗体はまた、１５２Ｅｕのような蛍光発光金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【０１８３】
抗体はまた、化学発光化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の過程に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルである。
【０１８４】
同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１８５】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許出願は、確認のための引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する分野の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【０１８６】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、主題である発明を限定するように解釈されるべきでない。
【０１８７】
（実施例）
（実施例１：ＧＰＣＲ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
（血小板活性化因子レセプター遺伝子に対する標的化構築物）ＧＰＣＲをコードする遺伝子（特に、血小板活性化因子レセプター遺伝子）の役割を調査するために、配列番号１に示される配列を含む遺伝子における破壊を、相同組換えにより作製した。より詳細には、図２Ａ〜図２Ｂに示されるように、遺伝子（特に、配列番号１を含む遺伝子）を破壊または改変する能力を有する特定の標的化構築物を、本明細書中で配列番号３および配列番号４と同定される配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０１８８】
（トランスジェニックマウス）この標的化構築物を、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、キメラマウスを作製した。このＥＳ細胞を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系から獲得した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６雌との交配により作製した。得られたＦ１Ｎ０ヘテロ接合体を異種交配してＦ２Ｎ０ホモ接合体を作製するか、またはＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配してＦ１Ｎ１ヘテロ接合体を作製した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合変異マウスをＦ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することにより作製した。
【０１８９】
（表現型分析）このトランスジェニックマウスを、表現型の変化について分析した。ホモ接合マウスは、以下の挙動表現型の少なくとも１つを示した：
図４および以下の表１に示されるデータに示されるように、ホモ接合マウスは、オープンフィールド試験において中央領域で、野生型マウスよりも有意に多くの時間を費やした。このことは、ホモ接合マウスが、野生型マウスと比較して、より少ない不安を有し得ることを示す。
【０１９０】
【表１】
2004517605.tif 000002
図３および以下の表２に示されるデータに示されるように、ホモ接合マウスは、ホットプレート試験において後足をばたばたと動かす（ｆａｎ）かまたは後足をなめるまでの有意により長い潜伏時間を有した。より詳細には、ホモ接合マウスは、ホットプレート試験において後足をなめるかまたは後ろ足をばたばたと動かすまでの増加した応答潜伏時間を示した。このことは、ホモ接合マウスが、野生型マウスと比較してより高い疼痛閾値を有し得ることを示す。
【０１９１】
【表２】
2004517605.tif 000003
（実施例２：ＧＰＣＲ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
（ＰＡＦレセプター遺伝子に対する標的化構築物）ＧＰＣＲをコードする遺伝子（特に、血小板活性化因子レセプター遺伝子）の役割を調査するために、配列番号４に示される配列を含む遺伝子における破壊を、相同組換えにより作製した。より詳細には、図６Ａ〜図６Ｂに示されるように、遺伝子（特に、配列番号４を含む遺伝子）を破壊または改変する能力を有する特異的な標的化構築物を、本明細書中で配列番号５および配列番号６と同定される配列を構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０１９２】
（実施例３：ＬＰＲ５遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
（標的化構築物）ＬＰＲ５の役割を調査するために、配列番号７に示される配列を含む遺伝子における破壊を、相同組換えにより作製した。より詳細には、図９Ａ〜図９Ｃに示されるように、遺伝子（特に、配列番号７を含む遺伝子）を破壊または改変する能力を有する特定の標的化構築物を、本明細書中で配列番号９および配列番号１０と同定される配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０１９３】
（トランスジェニックマウス）この標的化構築物を、エレクトロポレーションにより、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系由来のＥＳ細胞に導入して、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６雌との交配により作製した。得られたＦ１Ｎ０ヘテロ接合体を異種交配してＦ２Ｎ０ホモ接合体を作製するか、またはＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配してＦ１Ｎ１ヘテロ接合体を作製した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合変異マウスを、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することにより作製した。
【０１９４】
（表現型分析）このトランスジェニックマウスを、表現型の変化について分析した。このホモ接合マウスは、眼の異常（網膜再生を含む）を示した。
【０１９５】
詳細には、組織病理学研究は、ホモ接合マウスの眼が、網膜変性（両側網膜再生を含む）を患っていることを示した。各々のホモ接合変異体において、以下の網膜変化の少なくとも１つが存在した：網膜ひだ；色素上皮層の希薄化および空胞化；光受容体の変性；外核層の希薄化、組織崩壊、および核濃縮；外網状層（光受容体核および両極細胞または内核層の近位を含む）の希薄化および組織崩壊；内核層の組織崩壊；内網状層の希薄化；神経節細胞核の喪失（特に、大神経節細胞）；および神経線維層の神経膠症。この変化は、一般的に、網膜の外層（光受容体層）においてより顕著であり、そして内層（内核層、内網状層、神経節細胞層、および神経線維層）においてより不明瞭であった。
【０１９６】
（行動分析）ホモ接合マウスは、以下の行動表現型の少なくとも１つを示した：
ホモ接合マウスは、オープンフィールド試験において中央領域において有意に少ない時間を費やした。このことは、野生型マウスと比較して、増加した不安の可能性を示す。これを図１０に示す。
【０１９７】
ホモ接合マウスは、オープンフィールド試験において、総移動距離の減少を示した。ホモ接合変異体は、野生型マウスよりもオープンフィールドの移動および探索が少なかったという点で、顕著に機能低下していた。これを、図１１に示す。
【０１９８】
（実施例４：ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
（標的化構築物）ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子の役割を調査するために、配列番号１１に示される配列を含む遺伝子における破壊を、相同組換えにより作製した。より詳細には、図１３Ａ〜図１３Ｂに示されるように、遺伝子（特に、配列番号１１を含む遺伝子）を破壊または改変する能力を有する特定の標的化構築物を、本明細書中で配列番号１３および配列番号１４と同定される配列を、この構築物において標的化アーム（相同配列）として使用して作製した。
【０１９９】
（トランスジェニックマウス）この標的化構築物を、エレクトロポレーションにより、１２９／ＳｖＪ×１２９／Ｓｖ−ＣＰマウス由来のＥＳ細胞に導入して、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６雌との交配により作製した。得られたＦ１Ｎ０ヘテロ接合体を異種交配してＦ２Ｎ０ホモ接合体を作製するか、またはＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配してＦ１Ｎ１ヘテロ接合体を作製した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合変異マウスを、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄と雌を異種交配することにより作製した。
【０２００】
（表現型分析）このトランスジェニックマウスを、表現型の変化について分析した。ホモ接合マウスは、以下の挙動表現型の少なくとも１つを示した：
ホモ接合マウスは、オープンフィールド試験の間にいくつかの相違を示した。ホモ接合マウスは、運動のエピソードの間の平均速度および総移動距離の減少を示した。これは、活動性の減少（例えば、機能低下）を示唆する。さらに、ホモ接合変異体は、１０分間試験の間に蓄積された糞便（ｆｅｃａｌ  ｂｏｌｉ）の数の増加を示した。これは、不安または神経質の増加を示唆する。
【０２０１】
ホモ接合性マウスは、尾懸垂試験の間に差異を示した。ホモ接合性マウスは、６分間試験の間、より活動的であり、不動時間の減少を生じ、このことは、ホモ接合性マウスが、うつ病に対する減少した感受性（抗うつ性挙動表現型）を示すことを示唆する。
【０２０２】
要約すると、ホモ接合性変異マウスは、以下の挙動の少なくとも１つを示した：
１）野生型マウスと比較してのオープンフィールド試験の間の動きの平均速度における減少；
２）野生型マウスと比較してのオープンフィールド試験の間の移動した総距離における減少（以下の表３および図１４を参照のこと）；
３）野生型マウスと比較してのオープンフィールド試験の間の糞便（ｆｅｃａｌ  ｂｏｌｉ）の数における増加；および
４）尾懸垂試験の間の不動である総時間における減少（以下の表４および図１５を参照のこと）。
【０２０３】
（表３−オープンフィールド試験：移動した総距離）
【０２０４】
【表３】
2004517605.tif 000004
（表４−尾懸垂試験：不動である総時間）
【０２０５】
【表４】
2004517605.tif 000005
（実施例５：ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子破壊を含むマウスの作製および分析）
（標的化構築物）
ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子の役割を調査するために、配列番号１７に示す配列を含む遺伝子中の破壊を、相同組換えによって作製した。より詳細には、（詳細には配列番号１７を含む）遺伝子を破壊または改変する能力を有する特定の標的化構築物を、構築物中の標的化アーム（相同配列）として、本明細書中に配列番号１５および配列番号１６として同定される配列を使用して作製した。
【０２０６】
（トランスジェニックマウス）
標的化構築物を、エレクトロポレーションによって１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系に由来するＥＳ細胞に導入して、キメラマウスを作製した。Ｆ１マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６の雌と繁殖させることによって産生した。得られたＦ１Ｎ０ヘテロ接合体を交雑させ、Ｆ２Ｎ０ホモ接合体を産生したか、またはＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配してＦ１Ｎ１ヘテロ接合体を産生した。Ｆ２Ｎ１ホモ接合体変異マウスを、Ｆ１Ｎ１ヘテロ接合体の雄および雌を交雑することによって産生した。
【０２０７】
当業者に明らかなように、上の実施形態の種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。これらの改変およびバリエーションは、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、血小板活性化レセプター遺伝子についてのポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、血小板活性化レセプター遺伝子を破壊するために使用される標的化の構築物の設計を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、血小板活性化レセプター遺伝子を破壊するために使用される標的化の構築物の設計を示す。図２Ｂは、配列番号２および配列番号３として同定される配列を示し、これらは、この標的化構築物において、標的化アーム（相同配列）として使用された。
【図３】
図３は、血小板活性化レセプター遺伝子における破壊を有するマウスにおけるホットプレート試験に関連するグラフを示す。
【図４】
図４は、血小板活性化レセプター遺伝子における破壊を有するマウスにおけるオープンフィールド試験（ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ）に関連するグラフを示す。
【図５】
図５は、ＰＡＦレセプター遺伝子（配列番号４）についてのポリヌクレオチド配列を示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、ＰＡＦ遺伝子の破壊に使用される標的化構築物の設計を示す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、ＰＡＦ遺伝子の破壊に使用される標的化構築物の設計を示す。図６Ｂは、配列番号５および配列番号６で同定される配列を示し、これらは、この標的化構築物において、標的化アーム（相同配列）として使用された。
【図７Ａ】
図７Ａは、ＬＰＲ５遺伝子についてのポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ＬＰＲ５遺伝子についてのポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図７Ｃ】
図７Ｃは、ＬＰＲ５遺伝子についてのポリヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図８】
図８は、ＬＰＲ５ポリペプチド（についてのアミノ酸配列配列番号８）を示す。
【図９Ａ】
図９Ａは、ＬＰＲ５遺伝子を破壊するために使用された標的化構築物の設計を示す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、ＬＰＲ５遺伝子を破壊するために使用された標的化構築物の設計を示す。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、ＬＰＲ５遺伝子を破壊するために使用された標的化構築物の設計を示す。図９Ｃは、配列番号９および配列番号１０で同定される配列を示し、これらは、この標的化構築物において、標的化アーム（相同配列）として使用された。
【図１０】
図１０は、ＬＰＲ５遺伝子において破壊を有するマウスのオープンフィールド試験（この中央領域において過ごした時間）に関連するグラフを示す。
【図１１】
図１１は、ＬＰＲ５遺伝子において破壊を有するマウスのオープンフィールド試験（移動した全距離）に関連するグラフを示す。
【図１２】
図１２は、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子についてのポリヌクレオチド配列（配列番号１１）およびｃｅｒｂｅｒｕｓポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子を破壊するために使用された標的化構築物の設計を示す。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子を破壊するために使用された標的化構築物の設計を示す。図１３Ｂは、配列番号１３および配列番号１４として同定される配列を示し、これらは、標的化構築物において標的化アーム（相同配列）として使用された。
【図１４】
図１４は、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子内に破壊を有するマウスのオープンフィールド試験に関連するグラフを示す。
【図１５】
図１５は、ｃｅｒｂｅｒｕｓ遺伝子内に破壊を有するマウスの尾懸垂試験に関連するグラフを示す。
【図１６】
図１６は、ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子（配列番号１７）のポリヌクレオチド配列を示し、ならびに、ｂｒａｉｎｉａｃ遺伝子標的化構築物中の標的化アーム（相同配列）として使用された配列番号１６および配列番号１７を示す。
【図１】
2004517605.tif 000006
【図２Ａ】
2004517605.tif 000007
【図２Ｂ】
2004517605.tif 000008
【図３】
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【図４】
2004517605.tif 000010
【図５】
2004517605.tif 000011
【図６Ａ】
2004517605.tif 000012
【図６Ｂ】
2004517605.tif 000013
【図７Ａ】
2004517605.tif 000014
【図７Ｂ】
2004517605.tif 000015
【図７Ｃ】
2004517605.tif 000016
【図８】
2004517605.tif 000017
【図９Ａ】
2004517605.tif 000018
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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2004517605.tif 000104
2004517605.tif 000105
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004517605.tif 000106
【国際調査報告】
2004517605.tif 000107
2004517605.tif 000108
2004517605.tif 000109
2004517605.tif 000110
2004517605.tif 000111