(57)【要約】本発明はそうした措置を必要とする細胞に対して、ＮＦ−κＢを抑制するモノテルペン組成物を提供することによって炎症を抑制する方法を提供する。これらの組成物は上記モノテルペン組成物を膜透過性にする担体成分を含んでいる。この担体はトリテルペノイド成分、糖、脂質あるいはさらにモノテルペノイド成分などを含んでいる場合もある。上記組成物はさらに追加的な機能性化学物質も含むことができる。広範な炎症状態、特に前悪性化段階にある炎症状態を予防し治療するために上記化合物を利用する方法が述べられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦ−κＢを抑止するモノテルペン組成物を細胞に投与するステップ含む炎症抑止法。
【請求項２】
前記ＮＦ−κＢがＴＮＦで誘発されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記組成物がさらに担体成分を含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記担体成分が脂質を含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記担体成分が膜透過性物質を含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記担体成分が糖を含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記担体成分がトリテルペン成分を含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記モノテルペン組成物がさらにトリテルペン成分を含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記モノテルペン組成物がさらに糖を含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
上記モノテルペン組成物が第２のモノテルペン成分を含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記トリテルペン成分が以下の式：
【化１】
2004517131.tif 000076
で示される成分、あるいはその異性体を含んであり、この式で
ａ）  Ｒ１とＲ２は水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、オリゴ糖で構成される群から選択され、
ｂ）  Ｒ３−Ｒ３６は未飽和点、水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群からそれぞれ個別的、独立的に選択され、
ｃ）  Ｒ３−Ｒ３６の少なくとも１つはモノテルペン基であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１及びＲ２がそれぞれオリゴ糖を含んでいることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ単糖、二糖、三糖、及び四糖を含んでいることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１及びＲ２が、グルコース、フコース、ラムノーズ、アラビノース、キシロース、キノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、Ｎ−アセチル・グルコースアミン、及びガラクトースで構成される群から個別的、独立的に選択される糖を含んでいるオリゴ糖を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの糖がメチル化されていることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ４が、上記トリテルペン成分に結合しているメチレン炭素の１つを介して上記トリテルペン成分に結合していることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記トリテルペン成分がさらに少なくとも１つの二重結合を有していることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記異性体が立体異性体であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
前記異性体が光学異性体であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
前記トリテルペン成分が、アカシア酸エステル、オレアノール酸エステル、ベツリン酸エステル、ウルソル酸エステル、キノボース酸エステル、ポモリック酸エステル（ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ロタンディック酸エステル（ｒｏｔｕｎｄｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ロタンゲニック酸エステル（ｒｏｔｕｎｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、マダシアティック酸エステル（ｍａｄａｓｉａｔｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、アシアチン酸エステル、オイスカピック酸エステル（ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、トウメンティック酸エステル（ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、マデカシン酸エステル、ルペオール酸エステル、シリコディスシック酸エステル（ｃｙｌｉｃｏｄｉｓ１ｃｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、モリック酸エステル（ｍｏｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ジェシック酸エステル（ｊｅｓｓｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、エキノシスト酸エステル、あるいはエンタゲニック酸エステル（ｅｎｔａｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、であることを特徴とする請求項７あるいは８記載の方法。
【請求項２１】
前記トリテルペン成分が以下の式：
【化２】
2004517131.tif 000077
で示される成分、あるいはその異性体を含み、この式で
ａ）  Ｒ３は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、そしてモノテルペン基で構成される群から選択され、
ｂ）  前記式はさらにＲ４を含んでおり、Ｒ４は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記異性体がシス異性体であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記異性体がトランス異性体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ３が糖であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記糖がグルコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、キノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、Ｎ−アセチル・グルコースアミン、及びガラクトースで構成される群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
さらに上記糖に結合しているモノテルペン成分を含んでいる請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ３が以下の式：
【化３】
2004517131.tif 000078
で示され、この式で
Ｒ５は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ５が水素または水酸基であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記異性体が立体異性体であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
前記異性体が光学異性体であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ３が以下の式：
【化４】
2004517131.tif 000079
で示されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ３が以下の式：
【化５】
2004517131.tif 000080
で示されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が以下の式：
【化６】
2004517131.tif 000081
で示される成分、あるいはその異性体を含み、この式で
ａ）  Ｒ１とＲ２は水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、そしてオリゴ糖で構成される群から選択され、
ｂ）  Ｒ３は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、そしてモノテルペン基で構成される群から選択され、
ｃ）  前記式はさらにＲ４を含んでおり、Ｒ４は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択され、Ｒ４はトリテルペン成分またはモノテルペン成分に結合していてもよいことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３４】
前記異性体が立体異性体であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記異性体が光学異性体であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
上記組成物が以下の式：
【化７】
2004517131.tif 000082
で示される成分を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３７】
上記組成物が以下の式：
【化８】
2004517131.tif 000083
で示される成分を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３８】
上記組成物が以下の式：
【化９】
2004517131.tif 000084
で示される成分を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３９】
上記組成物が上記細胞に約０．５から約２．０μｇ／ｍｌの濃度で投与されるとき上記炎症応答が抑止されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４０】
上記細胞が炎症性疾患を有する被験体内にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４１】
上記被験体がヒトであることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
上記炎症性疾患が前癌状態の炎症性疾患、関節硬化症、慢性関節リウマチ、骨関節症、多発性硬化症、パーキンソン病、そしてアルツハイマー病で構成される群から選択されることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
上記前癌状態の炎症性疾患がバレット食道炎、炎症性腸疾患、慢性膵炎、慢性前立腺炎、家族性ポリポーシス、光線性角化症であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
上記組成物がＣＯＸ−２を抑止することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４５】
上記組成物がｉＮＯＳを抑止することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４６】
上記投与が局部的であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４７】
上記投与が注射によることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
上記投与が局所用であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
上記投与が全身性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５０】
上記投与が経口であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５１】
上記組成物が薬理学的に許容できる媒体内の医薬品組成物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５２】
上記薬理学的に許容できる媒体が緩衝材、溶剤、希釈剤、不活性担体、油、クリーム、または食用素材であることを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
上記医薬品組成物がさらに標的剤を含んでいることを特徴とする請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
上記標的剤が炎症を起こした細胞への上記医薬品組成物の送り込みを指示することを特徴とする請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２０００年１１月１７日に提出された米国特許仮出願第６０−２４９，７１０、及び２００１年９月１７日に提出された米国特許仮出願第６０−３２２，８５９の優先権を主張するものであって、上記引用によってこれら２つの開示は全体として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は一般的には医学分野に関するものである。より具体的には、この発明はＮＦ−κＢを抑制するモノテルペン組成物を用いて炎症を抑制する方法に関するものである。
【０００３】
（従来の技術）
植物及び動物、特に海生動物は新しい生物学的活性分子識別のための貴重な情報源である。植物で識別された１つの多様な類はサポニン類である。サポニン類は糖成分がトリテルペンあるいはステロイド・アグリコンに結合したグリコシドで構成された高分子量化合物である。トリテルペン・サポニン類はその生物学的性質の故に特に多くの関心の対象となっている。
【０００４】
異なる植物種からのトリテルペン・サポニン類の薬理学的及び生物学的性質が殺菌性、抗ウイルス性、抗突然変異性、殺精子あるいは避妊性、心臓血管性、抗炎症性の活性を含め研究されてきた（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。サポニン類は血漿脂質と結合することによってコレステロールと錯体を形成し、その結果コレステロール代謝を変化させることが知られている（Ｏａｋｅｎｆｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。餌中に与えられたトリテルペン・グリコシドは実験動物の血中及び組織内のコレステロール量を減らすことが示されている（Ｃｈｅｅｋｅ， １９７１）。サポニン類は多くの民間薬療法の成分や、より最近開発された一部の植物薬成分に見られる。
【０００５】
トリテルペン・グリシレチン酸及びそのいくつかの誘導体は抗腫瘍、抗炎症、抗アレルギー、抗肝炎、及び抗ウイルスの作用を持つことが知られている。例えば、いくつかのグリシレチン酸誘導体は胃潰瘍を予防または治癒する（Ｄｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９６２）。本技術分野で周知のそのような化合物にはカルベノキソロン（米国特許第３，０７０，６２３）、位置３’に置換基を有するグリシレチン酸エステル誘導体（米国特許第３，０７０，６２４）、グリシレチン酸のアミノ酸塩（特開昭４４−３２７９８号広報）、グリシレチン酸のアミド誘導体（ベルギー特許第７５３７７３）、及び１１−デオクソグリシレチン酸のアミド誘導体（英国特許第１３４６８７１）がある。グリシレチン酸は５−リポキシゲナーゼ活性を含むロイコトリエン生合成に関連する酵素を抑止することが示されており、これが報告された抗炎症活性の原因であると考えられている（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
【０００６】
五環系トリテルペンであるベツリン酸はヌードマウス異種移植モデルにおいてヒト黒色腫腫瘍成長の選択的阻害物質であることが報告されており、アポトーシスの誘発により細胞毒性を引き起こすことが示された（Ｐｉｓｈａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。中国のウリ科の薬草から得られた１つのトリテルペン・サポニン類は抗腫瘍活性を示した（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。トリテルペンのモノグリコシドはＭＯＬＴ−４ヒト白血病細胞に対する強力で選択的な細胞毒性を提示することが示されており（Ｋａｓｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、アヤメ科のいくつかのトリテルペン・グリコシドはエールリッヒ腹水癌を移植されたマウスの腫瘍の成長を抑止し、寿命を延ばした。（Ｎａｇａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。マメ科植物ドリコス・ファルカツスから得られたサポニン製剤はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで肉腫―３７細胞に対する有効性が報告されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８２）。これもマメ科である大豆のサポニンは多数の腫瘍に対して有効であることが示されている（Ｔｏｍａｓ−Ｂａｒｂａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。溶血性及び軟体動物駆除（ｍｏｌｌｕｓｃｉｃｉｄａｌ）活性を提示するオレアノール酸及びジプソゲニン・グリコシドがＳｗａｒｔｚｉａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ（マメ科）の地中果の鞘から単離されている（Ｂｏｒｅｌ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８７）。
【０００７】
大豆製品から単離された天然に存在するイソフラボノイドであるゲニステインはエストロゲン陽性及びエストロゲン陰性の乳癌細胞株の増殖抑止を示すチロシン・キナーゼ阻害物質である（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。植物に豊富に含まれ、穀物及び豆類の天然食物成分であるイノシトール六リン酸（フィチン酸）は大腸癌細胞株の終末分化を引き起こすことが示された。フィチン酸も大腸癌及び乳癌のｉｎ  ｖｉｖｏでの発癌実験で抗腫瘍活性を示した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。いくつかのトリテルペン・アグリコンも細胞毒性または細胞増殖抑制性を有することが示されており、つまり、Ｃｒｏｓｓｏｐｔｅｒｙｘ ｆｅｂｒｉｆｕｇａ（アカネ科植物）の茎の皮からｎｇ／ｍｌの範囲のＣｏ−１１５ヒト大腸癌細胞株に対する細胞増殖抑制性を示した（Ｔｏｍａｓ−Ｂａｒｂａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０００８】
これまでの報告は多数のあらゆる利用法を有するトリテルペン化合物を識別してきたが、新規な生物学的活性トリテルペン化合物の識別について本技術分野にはまだ大きなニーズがある。これら化合物の多くは正常な哺乳動物細胞に対して毒性がある。さらに、これまで識別されたトリテルペン類の生物学的活性は著しく多様であり、その多くは任意のヒトまたは哺乳動物の状態の治療において有効性の程度が限定されているかまたは変動が大きい。今までに識別された異なるトリテルペン類の著しい多様性と、緊密な関係を持つトリテルペン化合物同士の間にさえも観察される生物学的活性における予測不可能性は強力な治療剤であるトリテルペンを得る上で直面する困難を明確に示している。有益な生物学的活性を持つ新規なトリテルペンを識別するという困難な目標を達成すれば、現在のところ治療法の選択が限定されている多岐にわたるヒトの疾病の治療に全く新しい手段を提供できるであろう。
【０００９】
ＮＦ−κＢはどこにでも見られる転写因子であり、種々の前炎症サイトカイン、接着分子、及びアポトーシスのような免疫性及び炎症性経路に関連する多数の遺伝子の転写を調節し、従って、多様なストレス・シグナルへの生物応答の中心的な調節因子のひとつである。ＮＦ−κＢの無調節性は敗血症、急性炎症、ウイルス複製、及び一部の悪性腫瘍など種々の病理学的状態の一因となる。
【００１０】
ＮＦ−κＢのうち最も多く見られる活発な形状はｐ５０／ｒｅｌＡの錯体二量体である（ｐ５０／ｐ６５）。刺激されない細胞内で、これらの因子はその核定位シグナルを隠す抑制蛋白質（ＩκＢ）を持つ錯体の細胞質に保持される。炎症サイトカイン、有糸分裂促進剤、細菌性生成物、あるいは酸化的ストレスのような細胞外シグナルに応答し、ＩκＢは特定のセリン残基でリン酸化反応を受け、その後プロテオソーム経路によってそのユビキチン化と分解のシグナルを出す。ＩκＢの分解によって阻害物質が含まれていないＮＦ−κＢ錯体が細胞核内に転位し、ＤＮＡと結合し、特定の遺伝子の転写を活性化することを可能にする。
【００１１】
炎症及び発癌に加えて他の免疫疾患におけるその役割の故に、ＮＦ−κＢのダウン・モジュレータは治療上多大な意味を持つであろう。さらに、ＮＦ−κＢ活性の抑止による下流での効果は誘導可能な一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の発現レベルの低下である。ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のどちらも炎症、負傷、及び発癌に対する組織応答において重大な役割を有している。従って、そのような化合物は抗炎症及び化学予防効果を提供するので、ＮＦ−κＢに加えてｉＮＯＳとＣＯＸ−２の調節因子に対する本分野のニーズがある。
【００１２】
（発明の概要）
本発明は本分野に存在する不十分な点を克服し、モノテルペン組成物を使って炎症を抑止する方法を提供するものである。いくつかの実施の形態でこれらのモノテルペン組成物はさらに糖を含んでいてもよく、そしてさらにモノテルペン組成物を１つの細胞に運び込む担体を含み、膜溶解性または膜透過性を与えてもよく、あるいは上記組成物に望ましい性質を付与することもできる。モノテルペン組成物はさらにトリテルペン・グリコシド、及び／又はその他のトリテルペン、及び／又は糖のような付加的化学置換基を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明によるモノテルペン組成物は殆どどんな供給源から得ても差し支えない。例えば、植物や海生動物はそのような組成物の豊かな供給源である。いくつかの実施の形態で、モノテルペン組成物はアカシア・ビクトリアエ（Ｂｅｎｔｈ．）（マメ科）の鞘及び根から単離されてもよい。さらに別の実施の形態で、モノテルペン組成物は化学的または酵素的に合成されることも可能である。従って、当業者に周知の化学合成法が用いられることがある。また、モノテルペン組成物の合成に関連する酵素を使った生化学的方法を使ってもよい。これらの経路で使われる酵素は例えば植物や海生生物などの生物から単離されたり、遺伝子組み換えされてもよい。
【００１４】
本発明はＮＦ−κＢを抑止するモノテルペン組成物を１つの細胞に投与するステップを含む炎症抑止法を提供する。いくつかの実施の形態でＮＦ−κＢはＴＮＦによって誘導される。その方法による好ましい実施の形態で、モノテルペン組成物はさらに担体を含んでいる。担体は本明細書では膜溶解性や膜透過性を与える成分として定義されるか、またはモノテルペン組成物に細胞内でのアクセスを提供する。本分野の当業者であれば、細胞内アクセスまたは細胞透過性を提供するいずれの分子を使ってもよく、担体のいくつかの非限定的な例には脂質、膜を行き来できる脂溶性蛋白質、トリテルペン・グリコシド、糖のような他の分子にさらに結び付いているトリテルペン・グリコシド、及び／又はその他のモノテルペン単位体がある。
【００１５】
本発明はモノテルペンがさらにトリテルペン成分及び／又は糖及び／又は第２のモノテルペン成分と結び付いているＮＦ−κＢを抑止するモノテルペン組成物を１つの細胞に投与するステップを含む炎症抑止法も提供する。当業者であれば本明細書で述べられている上記組成物がさらに他の化学的機能性で置換されても差し支えないことを理解するであろう。
【００１６】
従って、上記モノテルペンはさらに少なくとも１個、好ましくは２個、３個、またはそれ以上の付加的なモノテルペン成分が結び付いたトリテルペン成分で構成される。１個以上のモノテルペン成分が存在するとき、これらの成分はそれぞれ、（ｉ）直接モノテルペン成分に、（ｉｉ）糖、またはトリテルペン成分と結び付く他のリンカー基に、あるいは、（ｉｉｉ）直接トリテルペン成分にあるいは糖または他のリンカー基を介して結び付くモノテルペン成分に結合する。リンカー基には糖類、アシル、アミド、アルコキシ、ケチル、アルキル、アルキレン、及び当業者に明らかなその他類似の化学成分などがある。
上記方法のトリテルペン成分が以下の式：
【００１７】
【化１０】
2004517131.tif 000002
で示される組成物、あるいはその異性体よりなり、この式で
ａ）Ｒ１とＲ２は水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、オリゴ糖で構成される群から選択され、
ｂ）Ｒ３−Ｒ３６は未飽和点、水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群からそれぞれ個別的、独立的に選択され、
ｃ）Ｒ３−Ｒ３６の少なくとも１つはモノテルペン基である。上記異性体は光学異性体、立体異性体、またはシス異性体、またはトランス異性体でもよい。
【００１８】
上記方法のいくつかの実施の形態で、Ｒ１及びＲ２はそれぞれオリゴ糖で構成されている。この実施の形態のいくつかの特定の態様で、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ単糖、二糖、三糖、及び四糖を含んでいる。上記方法の別の特定の態様で、Ｒ１及びＲ２がそれぞれ、グルコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、キノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、Ｎ−アセチル・グルコースアミン、及びガラクトースで構成される群から個別的、独立的に選択される糖によって構成されるオリゴ糖を含んでいる。上記方法のさらに別の特定の態様で、少なくとも１つの糖はメチル化されている。
【００１９】
上記方法の別の実施の形態で、Ｒ４はトリテルペン成分に取り付けられメチレン炭素の１つを介して上記トリテルペン成分に取り付けられている。別の様態では、トリテルペン成分はさらに少なくとも１つの二重結合を含んでいる。
【００２０】
上記方法のさらに別の実施の形態で、トリテルペン成分はアカシア酸エステル、オレアノール酸エステル、ベツリン酸エステル、ウルソル酸エステル、キノボース酸エステル、ポモリック酸エステル（ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ロタンディック酸エステル（ｒｏｔｕｎｄｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ロタンゲニック酸エステル（ｒｏｔｕｎｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、マダシアティック酸エステル（ｍａｄａｓｉａｔｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、アシアチン酸エステル、オイスカピック酸エステル（ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、トウメンティック酸エステル（ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、マデカシン酸エステル、ルペオール酸エステル、シリコディスシック酸エステル（ｃｙｌｉｃｏｄｉｓ１ｃｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、モリック酸エステル（ｍｏｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、ジェシック酸エステル（ｊｅｓｓｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、エキノシスト酸エステル、あるいはエンタゲック酸エステル（ｅｎｔａｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ）、あるいはその他構造的に類似したトリテルペン成分である。
【００２１】
上記方法で用いられるモノテルペン成分は以下の式：
【００２２】
【化１１】
2004517131.tif 000003
で示される組成物、あるいはその異性体であり、この式で
ａ）Ｒ３は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、モノテルペン基で構成される群から選択され、ｂ）この式はさらにＲ４から成り、Ｒ４は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択される。
上記異性体はシス異性体またはトランス異性体でもよい。
【００２３】
上記方法の他の実施の形態でＲ３は糖である。その糖はグルコース、フコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、キノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、Ｎ−アセチル・グルコースアミン、及びガラクトースで構成される群から選択される。上記方法による上記組成物はさらにその糖に取り付けられている別のモノテルペン成分を含むことができる。
【００２４】
上記方法のさらに他の実施の形態で、Ｒ３は以下の式で示される。
【００２５】
【化１２】
2004517131.tif 000004
式中、Ｒ５は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施の形態で、Ｒ５は水素または水酸基である。その異性体は立体異性体または光学異性体であってもよい。
【００２７】
さらに他の実施の形態で、Ｒ３は以下の式で示される。
【００２８】
【化１３】
2004517131.tif 000005
他に採りうる実施の形態で、Ｒ３は以下の式で示される。
【００２９】
【化１４】
2004517131.tif 000006
上記方法におけるいくつかの特定の実施の形態で、モノテルペン組成物は以下の式：
【００３０】
【化１５】
2004517131.tif 000007
で示される成分、あるいはその異性体を含有する。この式で
ａ）Ｒ１とＲ２は水素、Ｃ１−Ｃ５アルキル、オリゴ糖で構成される群から選択され、
ｂ）Ｒ３は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、そしてモノテルペン基で構成される群から選択され、そして、
ｃ）この式はさらにＲ４を含んでおり、Ｒ４は水素、水酸基、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキル・カルボニル、糖、Ｃ１−Ｃ５アルキル・エステル、そしてモノテルペン基で構成される群から選択され、Ｒ４はトリテルペン成分またはモノテルペン成分に取り付けられてもよい。その異性体は立体異性体または光学異性体であってもよい。
【００３１】
上記方法における他の特定の実施の形態で、モノテルペン組成物は以下の式で示される成分を含有する。
【００３２】
【化１６】
2004517131.tif 000008
上記方法における別の特定の実施の形態で、モノテルペン組成物は以下の式で示される成分を含有する。
【００３３】
【化１７】
2004517131.tif 000009
上記方法におけるさらに別の特定の実施の形態で、モノテルペン組成物は以下の式で示される成分を構成する。
【００３４】
【化１８】
2004517131.tif 000010
上記方法の別の態様で、モノテルペン組成物が細胞に約０．５から約２．０μｇ／ｍｌの濃度で投与されるとき炎症応答が抑止される。
【００３５】
その細胞は炎症性疾患を有する被験体内にある。好ましい態様で、その被験体はヒトである。他の態様で、被験体は別の種の動物でもよく、マウスまたは他のいかなる哺乳動物でも差し支えない。
【００３６】
上記炎症性疾患は前癌状態の炎症性疾患、関節硬化症、慢性関節リウマチ、骨関節症、多発性硬化症、パーキンソン病、そしてアルツハイマー病で構成される群から選択される。
【００３７】
上記前癌状態の炎症性疾患はバレット食道炎、炎症性腸疾患、慢性膵炎、慢性前立腺炎、家族性ポリポーシス、または光線性角化症である。しばしばこれらの前癌状態は治療されない場合癌を生じさせる。従って、これら前癌状態の予防あるいは治療が重要である。例えば、あるタイプの胃食道逆流疾患の患者は正常な扁平上皮の円柱化成を起こしやすい。バレット食道炎と呼ばれるこの状態は胃食道逆流疾患患者の約１０％に発生し、狭窄、重度の潰瘍、そして最終的に腺癌の発生に関連している。光線性角化症は多くの場合日光暴露によって引き起こされる皮膚の前癌状態である。炎症性腸疾患には大腸癌に至ることもあるクーロン病や潰瘍性大腸炎のような状態が含まれる。
【００３８】
いくつかの実施の形態で、上記方法によるモノテルペン組成物は酵素シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を抑止する。他の実施の形態で、上記方法によるモノテルペン組成物はｉＮＯＳを抑止する。これらの酵素のいずれもＮＦ−κＢの下流エフェクタであり、多様な炎症及び化学予防応答に関連している。これら酵素のいずれもインターフェロン・ガンマ、有糸分裂促進剤、リボ多糖体のような微生物による生産物など種々のサイトカインに応答して誘導される。例えば、本発明によるモノテルペン組成物はＴＮＦ、及びリボ多糖体（ＬＰＳ）のような微生物による生産物などの前炎症性作用物質に応答してＮＦ−κＢの活性化及びｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現を有意に抑止する）。
【００３９】
上記方法による他の態様で、モノテルペン組成物の投与は局部的、局所用、あるいは全身性の投与法である。投与方法は注射、または経口摂取、または局所適用でもよい。その他の態様で、モノテルペン組成物は薬理学的に許容できる媒体内の医薬品組成物である。その薬理学的に許容できる媒体は緩衝材、溶剤、希釈剤、不活性担体、油、クリーム、または食用素材である。その医薬品組成物はさらに標的剤を含んでもよい。その標的剤は、例えば、炎症を起こした細胞への上記医薬品組成物の送り込みを指示することができる。
【００４０】
本明細書または請求項で用いられているように『構成されている』という語と組み合わせて使われるとき、『ａ』あるいは『ａｎ』はひとつまたはひとつ以上を意味している。ここで用いられている『ａｎｏｔｈｅｒ』は少なくとも第２のものあるいはそれ以上を意味している。
【００４１】
本発明によるその他の目的、特徴、及び利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、その詳細な説明と特定の実施例は、本発明による好ましい実施の形態を示しながらも、本発明の精神と範囲内での種々の変更と変形がこの詳細な説明から当業者にとって明らかになるであろうから、説明だけのためのものとして提供される。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明はそれを必要とする細胞に対してＮＦ−κＢを抑制するモノテルペン組成物を提供することによって、炎症を抑制する方法を提供することにより先行技術における制約を克服することを目的としている。いくつかの実施の形態では、本発明による上記モノテルペン組成物はｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２などの酵素を抑制する。
【００４３】
本発明によるモノテルペン組成物は担体分子を追加的に取り付けることで膜可溶性／透過性にすることができる。この担体分子はモノテルペン組成物に細胞内アクセス可能性あるいは膜透過性を付与できるものであればいずれの成分であってもよい。この担体分子はいくつかの実施の形態ではトリテルペン成分であってもよい。
【００４４】
本発明のモノテルペン組成物はトリテルペン成分を含んでいる場合があるので、それらは本箇所、及び本明細書の別の箇所でトリテルペン化合物あるいはトリテルペン・グリコシド組成物と呼ばれる場合もある。あるいはまた、それらは本明細書の現箇所、及び他の部分でモノテルペン／トリテルペン化合物あるいは組成物と表記される場合もある。
【００４５】
本発明の方法はＮＦ−κＢが媒介する炎症を抑制するために用いられる。ＮＦ−κＢは炎症促進性サイトカイン、接着分子、及びアポートシスなどの免疫及び炎症経路に関与する多数の遺伝子の転写を調節する転写因子であるから、ＮＦ−κＢの調節障害は敗血性ショック、急性炎症、ウイルス複製、及びいくつかの悪性腫瘍など種々の病理状態をもたらす。ＮＦ−κＢの抑制因子と調節因子は従って炎症及び前腫瘍状態の予防と治療において重要な役割を果たしている。ＮＦ−κＢの抑制に加えて、本発明による上記モノテルペン組成物は酵素ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２も抑制する。
【００４６】
従って、本発明のモノテルペン組成物は前腫瘍状態の炎症性疾病、関節硬化症、リューマチ性関節炎、変形性関節症、多発性硬化症、パーキンソン病、そしてアルツハイマー病などの炎症を伴う多数の状態に対する治療法を提供する。前腫瘍性炎症性疾患にはバレット食道炎、炎症性腸疾患、慢性膵炎、慢性前立腺炎、家族性ポリポーシス、そして光線性角化症などがある。
【００４７】
Ｉ．  トリテルペン化合物の精製と確認
アカシア・ビクトリアエから得られるモノテルペン／トリテルペン化合物の確認と精製についても述べる。確認された化合物は、通常のヒトの細胞に対してはほとんど、あるいはまったく細胞毒性を示さない濃度で強力な抗腫瘍性活性を示す。
【００４８】
トリテルペン化合物も乾燥及び準乾燥地帯に自然に分布している選ばれた豆科種から得られる６０種類の植物抽出物の向標的スクリーニングから確認された。最初のスクリーニングで、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１と命名され、アカシア・ビクトリアエ（Ｂｅｎｔｈ）から分離された１つの抽出物は種々のヒト腫瘍細胞株に対して強力な抗腫瘍活性を示した。この抽出物はその後、いろいろなフラクションに精製された。２回の精製を行なったところ、精製された抗腫瘍化合物を含む１つの抽出物が確認された。この抽出物は精製されたトリテルペン・グリコシド・サポニンを含んでいることが確認された。この活性化合物を効率的に分離するための手順は後日開発された。
【００４９】
このより精製された抽出物をさらにテストしたところ、この抽出物の生物学的活性が明らかになった。この精製された抽出物は通常のヒト細胞に対してはほとんど、あるいはまったく毒性を示さない濃度で、粗抽出物と比較して増強された抗腫瘍活性を示した。この抽出物はさらに、腫瘍源の露出されたマウスで化学防御的効果を有していることも示された。
【００５０】
上記抽出物が分離された植物であるアカシア・ビクトリアエは、この種の天然の環境と、これまでの一定の研究に基づいて選択された。アカシア・ビクトリアエはオーストラリア原産であるが、園芸用品種として世界中で導入されており、とげありワットル、あるいはエレガント・ワットルとして知られている。この木は１年当たり６０−１２０ｃｍの速度で成長し、乾燥期にゆっくり落葉し、少なくとも−１５℃の温度まで耐えることができる。成熟した植物は１０−１５フィートに成長し、青緑色で二回羽状の葉を有している。米国南西部では、この植物は通常４月から５月に開花し、鞘は６月に成熟する。アカシア・ビクトリアエは風防、シェルター・ベルト、食品、地盤強化、そして水利施設用装飾物などとして多くの分野で農業的に利用されている。いろいろなアカシアの種子はオーストラリア現地人によって何世代にもわたって食料源として用いられている（Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。アカシアの中で、アカシア・ビクトリアエは最も一般的で広く分布した種で、オーストラリア全域に存在しており、従って、最も広く消費されている種でもある。アカシアの種子は通常ワレット・シードと呼ばれ、ねり菓子やパンなどで用いられる粉末化製品としての使用に高い需要があり、デザート、特にアイスクリームでの芳香材料としての需要も高い。それらは高品質のコーヒー状飲料をつくるのにも使われており、アカシア種のなかでも、アカシア・ビクトリアエ（Ｂｅｎｔｈ．）は一般的に優れた香りを有しているとみなされている（Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。しかしながら、この植物の鞘及び根の利用に関しては記録がない。
【００５１】
植物抽出物の医薬品製剤としての利用における１つの重要な側面は個々の活性成分の特徴づけと判定である。トリテルペン・サポニン製剤の場合も同様で、これは分離、構造解明、そしてそれらの成分とグリコシドの分析にかなり高度の技術を必要としている。純粋な化合物の生物学的テストを実施する場合は、それらを十分な量と純度で分離する必要がある。
【００５２】
トリテルペン及びその他の関連するサポニンは比較的大きな分子量を有しており、極性が高く、その分離はなかなか困難である。純粋なサポニンの分離に伴う１つの問題は、密接に関連しているが、アグリコンあるいは糖部分の性質（性質、数、位置、及び単糖類の取付部分の対掌性）が微妙に違っている化合物の複雑な混合物が存在していることである。エステルなどの変化し易い置換基もやっかいである。例えば、主要真性大豆サポニン、γ−ピロン誘導体（ＢＯＡ）は室温で水性エタノールで抽出されるだけである。加熱（８０℃）による抽出はエステル成分の分裂とソヤサポニンＩ（Ｂｂ）の形成をもたらす（Ｋｕｄｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。植物では、サポニンは石炭酸化合物など、糖類や発色物質など極性が非常に高い物質を伴っており、結晶化がむずかしく、吸湿性である場合があり、結晶を得ることをより困難にしている。
【００５３】
結晶性物質がないので純粋なサポニンの特徴づけも困難である。融点は不正確で、腐敗を伴うことがしばしばある。従って、サンプルの純度の判定は、通常、融点、旋光度値、あるいはその他の物理的定数だけに基づいては行なわれない。サポニンの純度のより良いテストはＴＬＣあるいはＨＰＬＣ検査、可能であれば、真正サンプルによる共クロマトグラフィによって得られる。適切な試薬を散布してＴＬＣプレート上のスポットを発色させる方法は存在している可能性のある個々の成分の追加的な指標となる。例えば、本発明によるトリテルペン・グリコシドの１つであるＤ１はＨＰＬＣ保持時間が１５．２分間である。これはアーチデンドロン・エイプチカムから分離された別の関連化合物であるエリプトシドＥとは異なっており、この化合物はＪｏｈｎ Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７によれば、ＨＰＬＣ保持時間は１２．５分である。本発明のトリテルペンのさらなる特徴づけを行なったところ、保持時間における上記違いは少なくともＤ１の対掌性及び二重結合の違いと、エリプトシドＥの報告されている特徴によるものである。
【００５４】
（ｉ）  化学的精製
化学的精製技術は当業者には周知である。これらの技術、１つのレベルで、植物抽出物の本明細書で述べられているトリテルペン・グリコシドへの粗分別のステップを含んでいる。植物材料から本発明の化合物を分離した後、関心のあるトリテルペン・グリコシドを、例えばクロマトグラフィ技術などここで述べられている技術を用いてさらに精製し、部分的、あるいは完全な精製（あるいは均一化）を達成する。純粋なトリテルペン・グリコシド組成物の調製に特に適した分析的方法を以下に具体的に述べる。
【００５５】
本発明の一定の形態は植物材料からのモノテルペン／トリテルペン・グリコシドの精製、そして特定の実施の形態においては、それらの実質的精製に関するものである。本発明の１つの好ましい実施の形態で、上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシドはマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）ファミリーから、より好ましくは真正アカシア、そして最も好ましくはアカシア・ビクトリアエから、そしてさらにより好ましくはアカシア・ビクトリアエ（Ｂｅｎｔｈ．）から精製される。ここで用いられている『分離されたモノテルペン／トリテルペン・グリコシド』という用語は他の成分から分離可能な組成物を意味しており、その組成物がその天然で得られる状態と比較してある程度精製されていることを意味している。
【００５６】
一般的に、『分離された』とは種々の他の成分を取り除くために分別にかけられ、そしてその発現された生物学的活性を実質的に保持している１つの有機性分子、あるいは同様の分子のグループを指している。『実質的に精製された』という表現を用いる場合、この表現はモノテルペンあるいはトリテルペンがその組成物の主要成分を形成しており、例えば、その組成物の分子の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％あるいはそれ以上を占めている状態を指している。
【００５７】
本発明のモノテルペン／トリテルペン組成物が常に単離されていたり、純粋な状態で提供されねばならないという必要性はない。実際に、実質的な精製度が低い製品でも一定の実施の形態では利用性を持つことが考えられる。例えば、本発明は乾燥されたアカシア・ビクトリアエの根、鞘、そしてその抽出物を栄養補助食品として利用することを想定している。栄養補助食品は定義として、相乗的に健康に良い影響を及ぼす異なった生物学的活性成分の混合物を含んでいる。本発明による栄養補助食品は錠剤やカプセルなどの形状をしていてよく、そして、経口的に摂取することができ、あるいは局所的に適用される軟膏にその植物の抽出物を含むようにしてもよい。部分的精製はより少ない精製ステップを組み合わせたり、あるいは同じ一般的精製方式の異なった形態を利用することで達成することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行なわれる陽イオン交換カラム・クロマトグラフィは、通常、低圧クロマトグラフィ・システムを用いて行なわれる同じ技術と比較してより高い精製度をもたらすと考えられている。より低い相対的精製度を示す方法は製品の全体的回収や、上記モノテルペン／トリテルペン組成物の生物学的活性の保持において利点を有している。
【００５８】
（ｉｉ）  抽出及び予備的精製
一部のサポニン類は水抽出中の酵素的加水分解、アルコール処理中の酸性サポニンのエステル化、そして変化し易いエステル基の加水分解、及びトランスアシル化を含む形質変換を受ける可能性があるので、抽出手順はできるだけ温和な方が好ましい。従って、１つの分離手順、例えば薄層クロマトグラフィにおいてはそれぞれ個別的なステップに従うように配慮しなければならない。
【００５９】
いろいろなバリエーションが可能であるが、粗サポニン混合物を得るために現在一般的に行なわれている手順はメタノール、エタノール、水、あるいは水性アルコールによる抽出；通常は石油エーテルを用いて上記抽出ステップ前かあるいは抽出中に行なわれる脱脂ステップ；上記抽出物の水への溶解あるいは懸濁ステップ；上記溶液あるいは懸濁液を振動させるかあるいは水で飽和されたｎ−ブタノールで洗浄するステップ；そして、ジエチルエーテルあるいはアセトンによるサポニン類の沈積ステップ（オプション）を含んでいる。砂糖などの小型の水溶性分子を取り除くために、透析ステップを含めることもできる（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９８１； Ｍａｓｓｉｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８参照）。
【００６０】
乾燥した植物素材の最も効率的な抽出はメタノール又は水性メタノールを用いて達成される。メタノールは新鮮な植物素材に対しても用いられる。水は通常サポニン類のための抽出溶媒としては（特に水溶性グルコシドが望まれている場合を除いて）効率が低いが、簡単に凍結乾燥できることと、より清浄な抽出物を提供できる利点を有している。抽出のために用いられる水の割合に基づいて、モノデスシディック（ｍｏｎｏｄｅｓｍｏｓｉｄｉｃ）あるいはバイデスモシディックなサポニンが得られる（Ｄｏｍｏｎ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８４； Ｋａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。新鮮な植物素材は活性酵素（エステラーゼ類）を含んでおり、それらは、溶媒で均一化させると、バイデスモシドをモノデスモシドに転化させることができる。乾燥させた素材でも水が存在すれば活性化されるエステラーゼを含んでいる。モモルディンＩ（モノデスモシディックなオレアノル酸サポニン）の場合、水及び３０％と６０％メタノール溶液内でモモルディンＩＩ（対応するバイデスモシド）ヘの転化が起きるが、８０％及び１００％溶液内では起きないことが見出された。反対に、新鮮な根のホモジェネートはメタノール内で酵素活性を保持した。しかしながら、それらの酵素は最初に新鮮な根を４％塩酸内に浸すことで非活性化することができ、バイデスモシドが主要成分であることが示された。従って、抽出手順を正しく選択することが非常に重要な第１のステップであることは明らかである。
【００６１】
透析、イオン交換クロマトグラフィ、及びサイズ排斥クロマトグラフィなどの蛋白質を精製するために通常用いられる方法は非サポニン成分から水溶液中でサポニン類を部分的に分離する上では有益であるが、サポニンは混合ミセルを形成してしまう傾向があるところから、個々のサポニン類を相互に分離する上では一般的に有効でない。従って、有効な分離を行なうためには、通常、混合ミセルの形成が分離に干渉しないように両親媒性サポニン類をモノマーとして可溶化する有機性溶媒あるいは溶媒／水システムの使用を必要とする。
【００６２】
フロスタノル・サポニン類で観察される共通の問題は、メタノールで抽出を行なっている最中に２２−ＯＣＨ３誘導体が形成されることである。しかしながら、真正な２２−ヒドロキシフロスタノールは別の溶媒（例えばピリジン）による抽出、あるいはメトキシ化されたアーチファクトを沸騰した水性アセトンで処理することによって（Ｋｏｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｓｈｏｊｉ， １９７９）得ることができる。
【００６３】
（ｉｉｉ）  薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）
ＴＬＣによるトリテルペン・サポニン類の定量分析は、サポニン研究のすべての側面に対して非常に重要である。ＴＬＣプレート（通常シリカ・ゲル）は純粋なサポニンと粗抽出物の両方を取り扱うことができ、安価で、手早く使うことができ、そして特別の装置を必要としない。多数の視覚化試薬をプレート上に散布するために用いることができる（表２参照）。最も一般的な試薬の調製方法を以下に述べる。
・バニリン−硫酸（Ｇｏｄｉｎ試薬）。エタノール内に１％の濃度でバニリンを溶かしたものを３％過塩酸水溶液と１：１の比率で混合して、ＴＬＣプレート上に散布する。その後、１０％の濃度で硫酸をエタノールに溶かしたものを加えて１１０℃で加熱する。
・リーバーマン−バーチャード試薬。濃縮硫酸（１ｍｌ）を酢酸アルデヒド（２０ｍｌ）及びクロロホルム（５０ｍｌ）と混合する。そして８５−９０℃の温度で加熱すると、ＴＬＣプレート上で必要な発色が得られる。
・塩化アンチモニー（ＩＩＩ）。ＴＬＣプレートに１０％の濃度で塩化アンチモニーをクロロホルムに溶かした溶液を散布して、１００℃に加熱する。
・アニスアルデヒド−硫酸。アニスアルデヒド（０．５ｍｌ）を氷酢酸（１０ｍｌ）、メタノール（８５ｍｌ）、及び濃縮硫酸（５ｍｌ）と混合する。この溶液をＴＬＣプレートに散布して、１００℃に加温する。
【００６４】
バニリン−硫酸を例えばエタノール及び過塩酸の存在下で散布すると、トリテルペン・サポニン類が青、又はすみれ色に発色する。アニスアルデヒド−硫酸を用いた場合、ＴＬＣプレートを加熱すると青、又は青紫色の発色が現れる。ＴＬＣプレートに硫酸に硫化セシウムを溶かした溶液を散布すると、赤紫、青、あるいは緑色の蛍光ゾーンが３６０ｎｍ未満の紫外線光で現れる（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８４ｂ）。いくつかのケースでは、プレートに水を散布しただけでサポニンの存在を十分に確認できる。さらに別の試薬は、例えば、Ｓｔａｈｌ（１９６９）に見られる。
【００６５】
ＴＬＣのために最も頻繁に用いられる溶媒はクロロホルム−メタノール−水（６５：３５：１０）であるが、その他の溶媒も有用である。溶媒ｎ−ブタノール−エタノール−アンモニア（７：２：５）はウロン酸残基を含んでいるグリコシド、つまり非常に極性の高い混合物に対しては特に有用である。その他の広く使われている溶媒にはｎ−ブタノール酢酸−水（４：１：５、上層）、あるいはクロロホルム−メタノール−酢酸−水（６０：３２：１２：８）などがある。
【００６６】
グリコアルカロイドのＴＬＣのために用いられるシステムは通常、酢酸エチル−ピリジン−水（３０：１０：３０、上相）を含んでいる。視覚化はステロイド試薬（アニスアルデヒド硫酸）あるいはアルカロイド試薬（ドラジェンドルフ試薬、硫酸セリウム（ＩＶ））で行なわれる。他のＴＬＣ溶媒及び視覚化のための試薬はＪａｄｈａｖ ｅｔ ａｌ． （１９８１）及びＢａｅｒｈｅｉｍ Ｓｖｅｎｄｓｏｎ ａｎｄ Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ （１９８３）に示されている。
【００６７】
ＴＬＣで多数の定量的判定が可能である。例えば、適切なスプレイ試薬で得られるスポットの密度を密度計を用いて直接測定することができる。あるいは、ＴＬＣ分離を行い、プレートから（例えばヨード蒸気で位置が確認される）関連する帯を掻き落として、サポニンを溶出させ、そして適切な試薬（例えば、濃縮硫酸）を加えた後で紫外線吸収を測定することで定量的判定を行なうことができる。
【００６８】
逆相ＴＬＣプレートは市販されており、シリカ・ゲル・プレート上でＴＬＣを補うサポニン類に関する優れた分析方法である。逆相プレート（例えば、Ｍｅｒｃｋ ＲＰ−８又はＲＰ−１８ ＨＰＴＬＣプレート）を開発するために、メタノール−水及びアセトニトリル−水混合物の利用がもっぱら行なわれている。あるいは、ＤＩＯＬ  ＨＰＴＬＣガラス・バック・プレートを用いることもできる。これらはＲＰ−ＴＬＣの場合と同様、通常のシリカ・ゲルＴＬＣ−タイプ溶媒、あるいはメタノール−水あるいはアセトニトリル水溶媒と共に用いることができる。
【００６９】
サポニン類のＴＬＣ検出及び質量分光測定と比色判定用の試薬例を表２に示す。
【００７０】
１．  遠心薄層クロマトグラフィ（ＣＴＬＣ）
ＣＴＬＣ技術は予備的薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）に関連した平面的な方法であるが、ＴＣＬプレートからバンドを取り出す必要はない（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０）。ＣＴＬＣは円形のＴＬＣプレート上で可動相フローを加速させる遠心力の作用に依存している。適切な吸着剤（１、２、あるいは４ｍｍ厚み）で被覆されたプレートを電気モーターで約８００ｒ．ｐ．ｍの回転速度で回転させ、その間にこの中心でサンプルの導入が行なわれて、吸着剤を通じて溶離剤が吸い出される。溶媒溶離がプレート全体につくりだされる。これらが縁でスピン・オフされてＴＬＣ分析のために回収される。２ｍｍの厚さの吸着剤層上で５０−５００ｍｇの混合物の分離が可能である。
【００７１】
ジンセノシド類の分離のためのＣＴＬＣとクロロホルム−メタノール−水（１００：３０：３）及びカラム・クロマトグラフィとの組み合わせが述べられている（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０）。シリカ−ゲル・プレート上でクロロホルム−メタノール−水混合物を用いてサポニン類も得られている。エロイテロコッカス・センチコカス（Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）の根（ウコギ科）から２つのプロトプリムラゲニンＡグリコシドがシリカ・ゲル上でのカラム・クロマトグラフィとセファデックスＬＨ−２０（Ｓｅｇｉｅｔ−Ｋｕｊａｗａ ａｎｄ Ｋａｌｏｇａ， １９９１）状でのゲルろ過処理後にＣＴＬＣ（クロロホルム−メタノール−水６５：３５：７）によって精製された。パッシフォラ・カドラングラリス（トケイソウ科）からのシクロアルタン・グリコシドを分離するために、溶媒システム：酢酸エチル−エタノール−水（８：２：１あるいは１６：３：２）を１ｍｌ／分（Ｏｒｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７）あるいは１．５ｍｌ／分（Ｏｒｓｉｎｉ ａｎｄ Ｖｅｒｏｔｔａ， １９８５）のいずれかの流量で用いた。
【００７２】
日立遠心液体クロマトグラフ、モデルＣＬＣ−５のサポニン類の分離での使用についても述べられている。シリカ・ゲル上でクロマトグラフィをこの機械を用いて、さらに溶離剤クロロホルム−メタノール−水（７：３：１（下相）→６５：３５：１０（下相））を使用して実施する。この技術を用いて、全部で１ｇの準精製サポニン分別を円板上でクロマトグラフィにかけた（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｔａｎｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【００７３】
（ｉｖ）  オープン−カラム・クロマトグラフィ
サポニン類のシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィのために用いられた多数の古典的な溶媒システムについてもこれまでに述べられており、例えば、Ｗｏｉｔｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９７０及びＡｄｌｅｒ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｒ， １９８５などに見ることができる。オープン・カラム・クロマトグラフィは多くの場合粗サポニン混合物の最初の分別ステップとして用いられるが、いくつかの場合、純粋な生成物をつくりだすことができる。しかしながら一般的には、解像度は高くなく、複雑な混合物は部分的に分離されるだけである。その他の問題は非可逆的吸着と分離を行う時間が長くかかることから物質が失われることである。
【００７４】
クロロホルム−メタノール−水溶離剤を用いたシリカ・ゲル・クロマトグラフィは最も応用性の高い技術の１つである。二相システムが用いられる場合、水飽和クロロホルム相は溶離剤である。従って、クロロホルム−メタノール−水の勾配（例えば、６５：３５：５→６５：４０：１０）を用いて、シリカ・ゲル上で植物組織のメタノール抽出物の最初の分離を行うことができる。例えば、モノデスモシディックな軟体動物駆除性サポニンをつくるために、さらに低圧カラム上でクロマトグラフィを行うこともでき、さらに、アセトン−ｎ−プロパノール−水（３５：３５：５）などの溶媒システムを用いたシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィによってバイデスモシディックなサポニンを得ることができる（Ｂｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。
【００７５】
クロコスミア・クロコスミイフロラ（アヤメ科）の球茎からトリテルペン・グリコシドの複雑な混合物が分離されている。これらのうちの３つ、ポリガラシック酸の２，９，１６−トリヒドロキシパルミチン酸グリコシドはｎ−ブタノール−エタノール−水（５：１：４、上相）及びクロロホルム−メタノール−水（６０：２９：６）を溶離剤として用いて、シリカ・ゲル６０（６０−２３０μｍ）上で粗サポニン混合物のオープン・カラム・クロマトグラフィを用いた方式で得られた。最終的な精製はＨＰＬＣで行われた（Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【００７６】
シリカ・ゲル・クロマトグラフィの広範な利用はアクチノステンマ・ロバツム（ウリ科）からのダンマラン・グリコシド・アクチノステモシド類Ａ−Ｄの分離も可能になっている。ＭＣＩ（三菱化学工業）ポリエステル・ゲル・カラムを行った後、適切なフラクションを種々の溶媒：クロロホルム−メタノール−水（７：３：０．５、３２：８：１）、クロロホルム−メタノール（９：１、１，１）、クロロホルム−エタノール（１７：３）、酢酸エチル−メタノール（４：１）、及びクロロホルム−メタノール−酢酸エチル−水（３：３：４：１．５、下相）を用いてクロマトグラフィにかけた。こうした方法で、純粋なアクチノステモシドＣが得られ、一方、アクチノプリモシドＡ及びＢは追加的な低圧ＬＣステップを必要とし、アクチノステモシドＤは７０％メタノールを用いて溶離されるＣ−１８カラム上での最終分離を必要とした（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。
【００７７】
いくつかのエステル・サポニン類も２％ホウ酸で含浸させたシリカ・ゲル上でクロマトグラフィにかけられた（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｋｕｌｓｈｒｅｓｈｔｈａ， １９８６；１９８８）。
【００７８】
通常のシリカ・ゲルに加えて、現在では、粗ＲＰ吸着剤がサポニン類のオープン・カラム・クロマトグラフィで用いられている。粒度分布が微細過ぎず、そしてカラムが長過ぎない場合、重力供給カラムが非常に適切である。ＲＰクロマトグラフィは通常最初のシリカ・ゲル分離ステップ後に導入され、分離される物質の選択性に対する変更を可能にしてくれる。もうひとつの可能性はＤＣＣＣステップ後の逆相分離の導入である（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【００７９】
１．  ポリマー性吸着剤を用いたオープン・カラム・クロマトグラフィ
セファデックス・パラム・パッキングで見られるようなデキストランの使用は、長年にわたって行われている。セファデックスＬＨ−２０は最も頻繁に用いられているが、Ｇシリーズのポリマーにも関心がないわけではない。
【００８０】
サポニン類の分類に関する最近の研究では、特に日本で新しい世代のポリマーが開発されている。例えば、ダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ−２０（三菱化学工業、東京）は最初の精製ステップで広く用いられている高度に多孔性のポリマーである。
【００８１】
通常、単糖類、アミノ酸などの小型帯電分子、それに高度に可溶性の物質を溶離するために、サンプルに充填した後、ポリマー性基質を水で洗浄する。メタノール−水勾配（あるいはメタノールだけ）を用いて溶離を開始して、サポニン・フラクションを得る。その他のクロマトグラフィ技術を用いて、純粋なサポニンの分離を行う。
【００８２】
アセトン−水混合物によるＨＰ−２０の溶離についても報告されている。例えば、トラリアンタ・デュビア（Ｔｈｌａｄｉａｎｔｈａ ｄｕｂｉａ）（ウリ科）の塊茎からのキラヤ酸のバイデゥモシディック・グリコシドの分離において、メタノール抽出物をダイアイオンＣＨＰ−２０Ｐのカラムを通過させて、水で洗浄した。粗サポニンを４０％アセトンで溶離させた。さらに、この分離ではシリカ・ゲル・クロマトグラフィ（酢酸エチル−メタノール−水６：２：１）及びＨＰＬＣを行った（Ｎａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【００８３】
ルッファ・シリンドリカ（Ｌｕｆｆａ Ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）（ウリ科）の種子から繊維溶解性サポニン類の分離において、水抽出物をメタノールで溶離させたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラム上でクロマトグラフィにかけて、次いで、４０−７０％メタノールで溶離させたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２カラムでクロマトグラフィを行った。クロロホルム−メタノール−水（６５：３５：１０、下層→６５：４０：１０）を用いてシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィを行った後、純粋な状態で活性成分を得た（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【００８４】
（ｖ）  中間圧力液体クロマトグラフィ（ＭＰＬＣ）
相対的に大きな量の純粋なサポニン類が必要な場合、ＭＰＬＣは非常に有益である。市販されているＬＰＬＣ装置とは違って、これらのカラムにはグラム量のサンプルを負荷して、最大４０バールの圧力で分離を行うことができる。基質の粒度分布は通常２５−４０μｍの範囲であり、分離は急速に行われ、必要な時間はオープン・カラム・クロマトグラフィより短い。分析的ＨＰＬＣからＭＰＬＣへの分離条件の直接的移行を逆相基質上で行うことができるので、従って、溶媒の選択が容易になる（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
【００８５】
１例として、クッソニア・スピカタ（Ｃｕｓｓｏｎｉａ ｓｐｉｃａｔａ）（ウリ科）からの軟体動物駆除性サポニン類をメタノール−水（２：１）とＣ−８吸着剤を用いてＭＰＬＣで生物学的テストを行うのに十分な量で得た（Ｇｕｎｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。実際に、この方法では上記幹樹皮のブタノール抽出物からのサポニン類の分離のためにわずか２つのステップを（１つはシリカ・ゲル基質上で、２番目はＲＰ物質上で）必要とするだけである。
【００８６】
サポニン類の分離は、例えば、メタノール−水混合物を用いたＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８（２５−４０μｍ、４６ｘ２．６ｃｍ）カラムを回転小室向流クロマトグラフィ（ＲＬＣＣ）と組み合わせることで行うこともできる（Ｄｏｒｓａｚ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８６）。もうひとつのＭＰＬＣ技術は軸方向圧縮（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ）カラムを用いる方法である（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【００８７】
植物抽出物からトリテルペンの分離で有益な基質−溶媒の組み合わせの事例を以下の表１に示す。
【００８８】
（表１はトリテルペン・サポニン類の分離におけるＭＰＬＣの応用を示す。）
【表１】
2004517131.tif 000011
【００８９】
（ｖｉ）  高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
ＨＰＬＣによるクロマトグラフィは密接に結合した化合物の混合物からサポニン類を数ミリグラム量得るための強力な技術であり、この点で、最終的な精製ステップで用いられる場合が多い。ＭＰＬＣは大型の粒子（２５−１００μｍ）を利用するのに対して、半予備的ＨＰＬＣ吸着剤は５−３０μｍ粒子分布範囲であり、その結果としてより高度の分離効率を可能にする。
【００９０】
オレアノール酸トリグリコシドをその部分的加水分解生成物から分離するために半予備的ＨＰＬＣを用いた。これを必要としたのは、ガラクトース成分がグルコース残基のＣ−３あるいはＣ−４の位置に取り付けられているかどうかを判定するためである。７μｍ ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−８カラム（２５０ｘ１６分）上でアセトニトリル−水（３８：６２）を用いて１０ｍｌ／分の流量で異性体サポニン類の分離を行った。検出は２０６ｎｍで、５０ｍｇの混合物から行われた（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。
【００９１】
ブプレウルム・ファルカツム（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｆａｌｃａｔｕｍ）（セリ科）の根からサイコサポニン類ａ、ｃ及びｄの大規模な分離は、１００ｘ１１ｃｍ Ｉ．Ｄ．の軸方向圧縮カラムで行われた。メタノール抽出物の一次精製は溶媒分割とＨＰ−２０ポリマー上でのクロマトグラフィによって行われた。予備的ＨＰＬＣカラムをＣ−１８シリカ・ゲル（２０μｍ粒子サイズ；５ｋｇ）でパックして、水性アセトニトリル段階勾配を用いて２１０ｍｌ／分の流量で溶離させた。４００ｍｇのサイコサポニンｃ、１２００ｍｇのサイコサポニンａ、そして１６００ｍｇのサイコサポニンｄを得るのに１０ｇを付加すれば十分であった（Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｍｏｔｏｍｕｒａ， １９８７）。
【００９２】
３つのシリカ・ゲル・カートリッジ（３００ｘ５７分）を直列に配置したＷａｔｅｒｓ Ｐｒｅｓ ５００システム（軸方向圧縮カラム）を含む２段階法で、パナックス・トリフォリス（Ｐａｎａｘ ｔｒｉｆｏｌｉｓ）（ウコギ科）からジンセノシドが分離された。溶離剤はｎ−ブタノール−酢酸エチル−水（４：１：５）の上相で、４ｇのチャージを充填した。最終的精製のために、アセトニトリル−水（８６：１４又は８０：２０）を２ｍｌ／分の流量で用いた炭水化物カラム（Ｗａｔｅｒｓ， ３００ｘ７．８ｍｍ）上で半予備的ＨＰＬＣを用いた（Ｌｅｅ ａｎｄ ｄｅｒ Ｍａｒｄｅｒｏｓｉａｎ， １９８８）。
【００９３】
ＨＰＬＣ溶離剤成分検出における１つの最大の困難はほとんどのサポニンで紫外線検出を行うための適切なクロモフォアがないことであるが、この問題は通常、屈折率検出、質量検出、そして誘導体化を含む技術を用いて克服することができる。
【００９４】
しかしながら、勾配変化が小さいと仮定すれば、通常、２０３−２１０ｎｍで適切な純粋の溶剤による紫外線検出を行うことができる。アセトニトリル−水勾配を用いた紫外線検出でも分離はうまく行われている。アセトニトリルは紫外線吸収が少ないので、低波長ではメタノールより好ましい。テスト中の一連のサポニン同士の極性の違いが小さ過ぎる場合（例えば、糖鎖における小さな差など）、異方性溶離を行うことができる。
【００９５】
サポニン類の混合物を分離するための１つの有益な方法は、水性アセトニトリルと共に勾配溶離剤を用いたオクチル結合カラムでの分離ステップを含んでいる。アセトニトリルの量は２０分かけて３０％から４０％に増大され、紫外線吸収の下で比較的小さなベースライン・ドリフトをつくりだす。より極性が高いバイデスモシディックなサポニン類の場合、モノデスモシディックなサポニン類の場合よりずっと速く溶離し、保持されるグリコシドの量は他のグリコシドの場合より少ない。それらサポニン類の脂溶性部分を選択するために極性のないオクチルシリル基質を用いることもできる。こうした技術を用いて、より極性の低いオレイン酸の同じグリコシドより前にヘデラジェニンのグリコシドが溶離された（Ｄｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。
【００９６】
１．誘導体化トリテルペンの利用
微量の紫外線活性が高い物質からの干渉でベースラインが不安定になる低波長での検出は、誘導体化されたトリテルペンを用いたＨＰＬＣ分析によって改善することができる。１つの可能性はモノデスモディシク・サポニンの定量的判定で報告されているように、サポニンで見出される遊離カルボキシル基を官能化することである。重炭酸カリウム及びクラウン・エーテルの存在下でオレアノール酸グリコシドを４ブロモフェナシル・ブロマイドで処理するとブロモフェナシル誘導体が形成される。この４−ブロモフェナシル誘導体は２５４ｎｍで強い吸収性を示し、この波長で溶剤からの干渉を受けずに検出を行うことができる（Ｓｌａｃａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。この誘導体を以下に示す。
【００９７】
【化１９】
2004517131.tif 000012
【００９８】
別の判定方法はカルボン酸成分のエステル化によって蛍光性クマリン誘導体をつくることである。この方法で、大豆の異なった品種や異なった器官での分析を行い、アントラセンを内部標準として大豆サポニンの定量的判定を行った（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８４ａ； Ｔａｎｉ ｅｔ ａ．， １９８５）。
【００９９】
２．サンプルの精製
高度に紫外線吸収性のある干渉性物質を除去するためには、先ず予備精製ステップが必要である場合もある。これは、例えば、Ｓｅｐ−ＰａｋＲ Ｃ１８（Ｇｕｅｄｏｎ ｅｔ ａｌ， １９８９）あるいはＥｘｔｒｅｌｕｔＲ（Ｓｏｌｌｏｒｚ， １９８５）カートリッジを用いて行うことができる。
【０１００】
アグリコン又はグルクロン酸成分上に遊離カルボン基を含んでいるものなど、イオン性化合物の場合、ピークの幅が広がってしまうのを防ぐ必要がある場合は、イオン形成を抑制するための何らかの方法が必要となる。これは、溶離剤にリン酸やトリフルオロ酢酸などの低紫外線吸収性の酸を添加することで達成される。もうひとつの可能性は、イオン対ＨＰＬＣを用い、その可動相にカウンター・イオンを加える方法である。イオン性化合物の利用率は上記ペアリング剤とイオン複合体を形成することで増大される。カルボキシル基の誘導体化は（上に述べたように）可動相に対する添加物として利用できる代替物で、ピーク解像度をかなり増強してくれる。
【０１０１】
定量的ＨＰＬＣが光測定法より優れている１つの点は混合物や抽出物内の個々のサポニンの量を判定することができる点である。多くの場合、ＨＰＬＣは比色分析、ガス・クロマトグラフィ及びＴＬＣ−フッ素化合物測定技術で得られるものより優れた結果を提供してくれる。
【０１０２】
逆相ＨＰＬＣカラム上でのサポニン混合物のピーク解像度が不十分である場合、ヒドロキシアパタイト・カラム、化学的修正多孔性ガラス・カラム、シリカ・ゲル・カラム、そしてホウ酸複合体のＨＰＬＣなどの利用を含むその他の多数の方法を用いることができる。
【０１０３】
３．ヒドロキシアパタイト
ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）はシリカ・ゲルより親水性が高く、簡便な２成分水性溶剤システムとして用いることができ、紫外線による検出を簡単にしてくれる。この物質は中性及びアルカリ性媒体内で安定性を示す。最近、高圧（最大１５０ｋｇ／ｃｍ２）に対して抵抗性を示すヒドロキシアパタイトの硬い球状粒子がつくられ、ＨＰＬＣの応用範囲を広げてくれている。末端ペントース単位だけが違っており、ＲＰ−ＨＰＬＣでは分離できないサポニン類もこの技術を用いて解像することができる（Ｋａｓｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７ｂ）。パナックス・ジンセン（ウコギ科）からのジンセノシドの分離が定組成モード（アセトニトリル−水、８０：２０）で行われ、線形勾配（アセトニトリル−水７０：３０→９０：１０）を適用して、さらに良い結果が得られている（Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７ｂ）。シリカ・ゲルで観察されるのと同様に、極性の低いグリコシド類から順に溶離され、つまりこの方法はＲＰ−ＨＰＬＣの反対である。
【０１０４】
４．  ホウ酸イオン交換ＨＰＬＣ
この方法は単糖類及びオリゴ糖類の分析に適用されている。この手法での最良の結果は陰イオン交換カラム、例えば、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．社からのＡｓａｈｉｐａｋ ＥＳ−５０２ＮＴＭ、１００ｘ７．６分カラムで、０．４Ｍ Ｈ３ＢＯ３を２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ｐＨ８）を用いて７５℃で最良の結果が得られる。このクロマトグラフィ的性格は糖成分内のｃｉｓジオールのホウ酸塩複合体の形成に依存している。分離を行った後、ホウ酸塩をメタノールで溶離液を繰り返し共蒸留することによって揮発性のメチル・ホウ酸塩として取り除くことができる。
【０１０５】
５．  化学的に修正した多孔性ガラス
微孔性ガラス（ＭＰＧ）は高い化学的抵抗性を有しており、ｐＨ２−ｐＨ１２の範囲で安定している。オクタデシル多孔性ガラス（ＭＰＧ−ＯＤＳ）が逆相ＨＰＬＣ用のパッキングとしてつくられており、サポニン類の急速で効率的な分離を行うために用いられている。例えば、分離のためにアセトニトリル−水混合物（２５．５：７４．５）を用いて朝鮮人参とミシマサイコの根を含む混合薬品の抽出物からジンセノシドとサイコサポニン類を同時に分離することが可能である（Ｋａｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９０ａ）。朝鮮人参抽出物とジンセノシド混合物のＨＰＬＣに関してＭＰＧ−ＯＤＳ及びシリカＯＤＳカラムの比較を行ったところ、保持挙動は同様であったが、利用率（ｃａｐａｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）の方はＭＰＧ−ＯＤＳカラムの方が小さかった。ジンセノシド類の一定の対の解像度はＭＰＧ−ＯＤＳカラムの方が高かった（Ｋａｎａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。
【０１０６】
６．  シリカ・ゲル
含水可動相の使用は多くの場合、サポニンの分離に欠かすことができず、シリカ・ゲルＨＰＬＣは通常そうした溶離剤には依存しない。しかしながら、カラム・パッキングを修正することによって、カラムを劣化させずに水溶性グリコシドの分離が可能になっている。この手順には、先ず最初にメタノールで、次いで、クロロホルム−メタノール−エタノール−水（６２：１６：１６：６）の混合物、そして最後に分離のために用いられる溶剤システムでカラムを洗浄するステップを含んでいる（Ｋａｉｚｕｋａ ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。例えば、含水溶離剤：ヘキサン−エタノール−水（８：２：０．５）を用いた５μｍシリカ・ゲル・カラムを用いて、朝鮮人参サポニン類とブプレウルム・ファルカツム（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｆａｌｃａｔｕｍ）からのサイコサポニン類の分離を行うことができた。
【０１０７】
（ｖｉｉ）  その他のクロマトグラフィ技術
純粋なサポニン類を分離するためには、アルコール性あるいは水性植物抽出物のその他の極性成分を除去するために、１つ、あるいはより一般的には複数のクロマトグラフィ的分離ステップを必要とする。
【０１０８】
トリテルペン・サポニン類を分離するためには、フラッシュ・クロマトグラフィ、ＤＣＣＣ、低圧液体クロマトグラフィ（ＬＰＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィ（ＭＰＬＣ）、ＨＰＬＣ、及び通常のオープン・カラム・クロマトグラフィを含む種々の分離手法が述べられており、用いることができる（例えば、Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６， １９９１； Ｍａｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９９１ｂ参照）。分離条件、溶剤システムに関するアイディアは本開示が関係する技術分野の当業者に周知である。最良の結果は、通常、本明細書で以下に述べるような方法を組み合わせることで達成される。
【０１０９】
多数のサポニンは酸性であるから、塩が形成される可能性があり、クロマトグラフィが完了した時点で、遊離サポニンを得るために、イオン交換樹脂による処理を必要とする場合がある。適切な樹脂の例としては、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８（Ｈ＋形態）（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ ８４ （Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｎａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０）及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＭＢ−３ （Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８４）などがある。しかしながら、分解を防ぐために中性度、あるいはｐＨに対する慎重な制御が必要な場合は、イオン交換樹脂上でのろ過を含むステップは避けるべきである。
【０１１０】
いくつかの例で、密接に関連した生成物の満足すべき分離を行うために、粗サポニン・フラクションがメチル化されている（遊離ＣＯＯＨ基が存在することを仮定して）（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｎａｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９， １９９０）。
【０１１１】
１．  フラッシュ・クロマトグラフィ
フラッシュ・クロマトグラフィは通常のオープン−カラム・クロマトグラフィの場合と比較してかなり時間の節約が可能な予備的液体クロマトグラフィ法である。通常のガラス・カラムを用いるが、処理液は圧縮空気又は窒素によって吸着剤内を駆動され、最大圧力はカラムの頂点で約２バールに達する。この吸着剤の粒度は溶剤が加圧状態にあるので多少減少し、その結果解像度は高くなる。
【０１１２】
フラッシュ・クロマトグラフィは予備的な分別のためにオープン−カラム・クロマトグラフィに取って換われる第１の代替方法である。この方法を用いて、１０ｍｇから１０ｇのサンプルの分離を１０分間程度で達成することができる。例えば、軟体動物駆除性及び殺菌性ヘデラジェニン（ｈｅｄｅｒａｇｅｎｉｎ）、バヨジェニン（ｂａｙｏｇｅｎｉｎ）、そしてドリコス・キリマンドシャリカス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｋｉｌｉｍａｎｄｓｃｈａｒｉｃｕｓ）（マメ科）からのメディカジェニン・グルコシド（ｍｅｄｉｃａｇｅｎｉｎ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ）をこの方法で分離した。メタノール抽出物（３．３ｇ）を６０ｘ４ｃｍカラム内でシリカ・ゲル（粒度分布：６３−２００μｍ）で、溶剤システム：クロロホルム−メタノール−水（５０：１０：１）を流量１５ｍｌ／分に設定して分別した。これは汚染物質を除去し２つのサポニンを多量に含んだフラクションを得るのに十分であった。純粋なトリテルペン・グルコシドがＤＣＣＣとＬＰＬＣの組み合わせによってＣ−８基質上で得られた（Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ａ）。
【０１１３】
ほとんどの例ではシリカ・ゲル吸着剤を用いているが、ＲＰ物質を使用する傾向が増大している。ＲＰフラッシュ・クロマトグラフィはオリゴ糖など他のより極性の高い成分からのサポニンの分離を可能にしてくれる。
【０１１４】
２．  低圧液体クロマトグラフィ（ＬＰＬＣ）
ＬＰＬＣは分離速度が速いことと操作が簡単であることから、純粋なサポニンの単離には有効である。ＬＰＬＣは粒子サイズが４０−６０μｍの吸着剤を含むカラムを用いる。最大１０バールまでの圧力で高い流量が可能であり、カラムはほとんどの場合ガラス製である。市販されているいろいろなサイズ（例えばＭｅｒｃｋ社のＬｏｂａｒ範囲）のパック済みカラムは、５０−５００ｍｇのサンプル範囲のサポニンの予備的クロマトグラフィには最適である。密度が高く、均一であるので、分離効率が優れている。さらに、吸着剤の化学的組成が同様であれば、分析的ＨＰＬＣ条件をそのままＬＰＬＣ分離に適用することが可能である（Ｍａｒｓｔｏｎ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９９１ｂ）。
【０１１５】
ほとんどの例はＲＰ吸着剤で行なわれており、メタノール−水混合物で溶離が行なわれている。通常、この例で注入されるのは精製前のサンプルだけである。ＬＰＬＣのよい例はスワルツィア・マダガスカリエンシス（マメ科）からの軟体動物駆除性及び溶血性オレアノール酸ジプソジェニン・グリコシドの分離である。乾燥し、すり潰した果実の鞘を水で抽出して、この抽出物をｎ−ブタノールと水に分離した。有機相オープン−カラム・クロマトグラフィを行なった後、サポニン類をメタノール−水（７２：２５）を溶離剤として用いてＬｏｂａｒ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ−８カラム（４０−６３ｐｒｏ；２７ｘ２．５ｃｍ）上で分離した（Ｂｏｒｅｌ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８７）。
【０１１６】
ＬＰＬＣカラムを直列につなぐと、負荷容量及び／又は分離能力の増大が可能になる。アクチノステンマ・ロバタ（Ａｃｔｉｎｏｓｔｅｍｍａ Ｌｏｂａｔａ）（ウリ科）からダンマラン・グリコシドを分離する際にこうした方式を用い、この場合３つのＬｏｂａｒ２７ｘ２．５ｃｍカラムを接続した。溶離剤には多少の水も含まれていた（酢酸エチル−ｎ−プロパノール−水：２０：３：０．３）（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。
【０１１７】
３．  向流クロマトグラフィ
液体脂質分割法はサポニンに関する分野での応用には理想的である。非常に極性が高いサポニンの場合は、特にパッキング物質への非可逆的吸着による物質ロスがないので、向流クロマトグラフィ分離に対しては特に適している。この実施形態は粗抽出物の直接的分別への具体的な利用である。
【０１１８】
４．  液滴向流クロマトグラフィ（ＤＣＣＣ）
ＤＣＣＣは多数の垂直なガラス管に含まれた不透過性液体静止相を通じて可動相の液滴を連続的に通過させることによって行なわれる。溶質は上記２つの相に連続的に分離される。可動相がこれらの管の上部と下部のいずれに導入されるのかによって、クロマトグラフィはそれぞれ降流あるいは昇流モードで実施される。ＤＣＣＣによる密接に関連したサポニン類の分離、そして純粋な生成物の分離でさえ可能であることが示されている（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。実際上、液体−固体クロマトグラフィでは不可能であった一定の分離がこの技術で可能になっている。ＤＣＣＣは糖残基上の酢酸基の置換基の位置だけが違う異性体サポニン類分離を行なうことができた（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。
【０１１９】
サポニン類のＤＣＣＣ分離の対しては多数の溶剤システムが用いられており（例えば、Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ ｅ ｔａｌ． １９８６参照）、これらのうちで、クロロホルム−メタノール−水（７：１３：８）というシステムが多数の例で用いられている。クロロホルム−メタノール−水・システムは極性が非常に高いモードでは昇流モードで、あるいは１つ又は２つの糖と少数の遊離水酸基を有しているサポニンに対しては降流モードのいずれででも用いることができる。
【０１２０】
予備的な精製のための、静止相としてのｎ−ブタノール−飽和水と可動相としての水飽和ｎ−ブタノールを用い、１８カラム（３０ｃｍｘ１０ｍｍ．ＩＤ）を使用する大規模なＤＣＣＣ手順についても述べられている（Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。いくつかの例は、純粋なサポニンを得るために２回（あるいはそれ以上の）ＤＣＣＣ分離が行なわれる。
【０１２１】
５．  遠心分割クロマトグラフィ（ＣＰＣ）
最近導入されたＣＰＣ技術はそのスピードと汎用性の故に大きな期待を担っている（Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。ＣＰＣは静止相の保持のための重力場というよりは８００−２０００ｒ．ｐ．ｍ．またはそれ以上の回転運動によって生み出される遠心場を基にしている。この方法の原理は回転コイルまたはカートリッジに格納されている２つの非混和相間の間にある溶質の非均衡分割の連続的プロセスを含んでいる。
【０１２２】
回転コイルに基づく機器は中心軸の周囲に揺動運動または非揺動運動のいずれかを含んでいる。これら機器のうちのひとつである、高速向流クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）はスプールの周囲にコイルとして巻かれた１．６あるいは２．６ｍｍＩ．Ｄ．のテフロン（登録商標）・チューブで構成されている。１、２、または３個のスプールがこの機器の心臓部を成す。カートリッジ機器の場合、そのカートリッジは遠心分離回転部の外周上に位置し、縦軸は遠心力方向に対して平行である。カートリッジの数と容積はさまざまでよく、その機器を使用する用途による。ＤＣＣＣ及びＲＬＣＣは分離に２日またはそれ以上かかることがあるが、それらと比較すると、ＣＰＣはおよそ数時間で同じ結果を出すことができる。回転コイルまたはカートリッジに基づく機器はグラム単位の性能を持っている。例えば、多層コイルプラネット機器はアブルス・フルティクロスス（マメ科）から得られたシクロアルタン・グリコシドの予備的精製に使われている（Ｆｕｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。ハデラ・ヘリックス（ウコギ科）から得られた軟体動物駆除性トリテルペン・グリコシドはＳａｎｋｉ ＬＬＮクロマトグラフ（カートリッジ６個；総容量１２５ｍｌ）という別の機器で分離されている。この果実のメタノール抽出物はｎ‐ブタノールと水の間から分離された。ブタノール・フラクションは１００ｍｇ量が直接機器に注入され、可動相として溶媒システム・クロロホルム−メタノール−水（７：１３：８）の低層が使われた。
【０１２３】
センテラ・アシアティカ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ ａｓｉａｔｉｃａ）（セリ科）から得られる２つの主要なサポニンであるアシアチコシド（ａｓｉａｔｉｃｏｓｉｄｅ）及びマデカスオシド（ｍａｄｅｃａｓｓｏｓｉｄｅ）は、６６ｍｘ２．６ｍｍＩ．Ｄ．カラム（３５０ｍｌ容量）を備えて８００ｒ．ｐ．ｍ．で回転するイトウ多層コイル分離−抽出機（Ｐ．Ｃ． Ｉｎｃ．）を用いて分離された。４００ｍｇのサンプルをクロロホルム−メタノール−２−ブタノール−水（７：６：３：４、可動相は低相）の溶媒システムで分解可能であった。検出はオンラインＴＬＣを使った（Ｄｉａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。同じ機器がセサマム・アラトゥム（Ｓｅｓａｍｕｍ ａｌａｔｕｍ）（ゴマ科）から得られたトリテルペン二糖の単離の際に用いられた。クロロホルム−メタノール−ｉ‐プロパノール−水（５：６：１：４）の溶媒の低相が可動相として選択され、１．２５ｇのチャージが注入された（Ｐｏｔｔｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１２４】
６．方法の組み合わせ
ひとつだけのクロマトグラフィのステップで抽出物から純粋なサポニンを単離するのに十分であることは稀である。一般に、必要な生成物を得るためには連続したいくつかの予備的技術が必要とされる。古典的な技術（オープン・カラム・クロマトグラフィなど）と最新の高解像度技術（ＨＰＬＣなど）の組み合わせが多くのサポニンの分離に適当である。
【０１２５】
例えば、サポニン分離のためのシリカ・ゲル及びＲＰ物質上のＭＰＬＣ、ＬＰＬＣ、及び遠心ＴＬＣの組み合わせである（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８６）。同様に、スワルティア・マダガスカリエンシス（マメ科）から５つのトリテルペン・サポニンを単離するにはオープン・カラム・クロマトグラフィ、ＬＰＬＣ及びＭＰＬＣが必要とされた（Ｂｏｒｅｌ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８７）。
【０１２６】
アブルス・フルティクロスス（マメ科）からトリテルペン・グリコシドを単離するためにフラッシュ・クロマトグラフィ及びＯＰＬＣと併せてＣＰＣが用いられている。多層コイル機器（溶媒  クロロホルム−メタノール−水  ７：１３：８、可動相として低相）で最初の精製が行われるが、純粋な物質を得るためにはフラッシュ・クロマトグラフィとＯＰＬＣが効果的である（Ｆｕｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【０１２７】
非修飾シリカ・ゲル上のフラッシュ・クロマトグラフィとＲＰ物質上のフラッシュ・クロマトグラフィまたはオープン・カラム・クロマトグラフィのいずれかを簡便に組み合わせることによってサポニン精製に有効である場合がある（Ｓｃｈｏｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１２８】
別の方法では抽出物に高多孔性ポリマーを通過させる（予備的分別の後）ステップを含んでおり，このステップの後で粗サポニン混合物をさらに分別する。このアプローチはノソパナクス・デラバイ（ウコギ科）から得られた３β−ヒドロキシオレアン−１２−ｅｎ−２８、２９−ジオン酸・グリコシドの単離に使われた。葉部及び茎部のメタノール抽出物はヘキサンと水の間で分別された。水層をダイアイオンＨＰ−２０カラム上でクロマトグラフィにかけ、水、１０％メタノール、５０％メタノール、８０％メタノール、メタノール、及びクロロホルムで溶離した。そのグリコシドはシリカ・ゲル上で酢酸エチル−エタノール−水（７：２：１）を使って８０％メタノール溶出液を引き続きカラム・クロマトグラフィにかけて得られた（Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７ａ）。アカントナパクス・センティコスス（ウコギ科）からのトリテルペン及び非トリテルペン・サポニンの単離では、その手順はダイアイオンＨＰ−２０ポリマー上の葉部のメタノール抽出物の分別から始めた。メタノールで溶離されたそのフラクションをシリカ・ゲル上で（クロロホルム−メタノール−水  ３０：１０：１）クロマトグラフィにかけ、その結果得られた全てのフラクションをＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−８上でカラム・クロマトグラフィにかけた。最終的な精製はＴＳＫ−ＧＥＬＯＤＳ−１２０Ｔ（３００ｘ２１分；メタノール−水  ７０：３０、６ｍｌ／分、ＲＩ検出）上のＨＰＬＣまたはヒドロキシアパタイト・カラム（アセトニトリル−水  ８５：１５）上のクロマトグラフィで実施した（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０１２９】
オレアン酸グリコシドの分離手順はＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（メタノール）、ＤＣＣＣ（クロロホルム−メタノール−水  ７：１３：８）及びＨＰＬＣ（Ｃ−１８、メタノール−水  ６５：３５）の組み合わせを用いるステップを含んでいる（Ｄｅ Ｔｏｍｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１３０】
（ｖｉｉｉ）  呈色反応
トリテルペンといずれでもよい種々の薬剤との反応をトリテルペンの定量または定性判定のため呈色した化合物を生成するために用いてもよい。例えば、硫酸、リン酸、過塩素酸など強鉱酸内のアイスアルデヒド（ａｉｓａｌｄｅｈｙｄｅ）やバニリンのような芳香族アルデヒドはアグリコンと共に呈色生成物を生じさせ、最大５１０から６２０ｎｍの間の吸着を有する。これらの反応では、脱水作用が起きていると考えられ、アルデヒドと共に呈色縮合生成物を生じさせる不飽和メチレン基を形成する。バニリン−硫酸と共に、Ｃ−２３水酸基を持つトリテルペン・サポニンは４６０から４８５ｎｍの間に位置するピークを有する（Ｈｉａｉ ｅｔ ａｌ．， １９７６）。
【０１３１】
不飽和及びヒドロキシル化されたトリテルペンとステロイドは無水酢酸及び硫酸によって赤、青、または緑を呈色する（Ａｂｉｓｃｈ ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ， １９６０）。テルペン状のサポニンはピンクまたは紫色の影を、ステロイド・サポニンは青緑の呈色を示す傾向があるので、この技術を使ってその２種類を区別することが可能である。
その他多数の薬剤をトリテルペン検出に用いることができ、溶液を赤紫に呈色するセリウム（ＩＶ）硫酸塩、または鉄（ＩＩＩ）塩及び硫酸のような無機酸；ヒドロキシトリテルペン及びヒドロキシステロイドによって呈色反応を生じさせる無水酢酸−酢酸試薬中の塩化アンチモン（ＩＩＩ）３０％溶液；ステロイド・グリコシドの５、６−デヒドロ−誘導体（ジオスゲニン及びソラソジン（ｓｏｌａｓｏｄｉｎｅ）・グリコシド）と５α−または５β−Ｈ−誘導体（例えば、トマチン）の識別に用いることができるニトロベンゼン−メタノール中の塩化アンチモン（ＩＩＩ）；ホウ酸塩及び濃縮硫酸の存在下でウロン酸の存在を示すカルバゾール（Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｍｕｉｒ， １９６２）。
【０１３２】
サポニンの検出と分光光度及び比色分析判定のための典型的な試薬を下の表２に挙げる。
【０１３３】
（表２はトリテルペンサポニンに対する視覚化試薬を示す。）
【表２】
2004517131.tif 000013
【０１３４】
（ｉｘ）  モノテルペン／トリテルペン・グリコシドのアカシア・ビクトリアエからの単離
アリゾナ大学（Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）でクロロホルム：メタノールまたはジクロロメタン：クロロホルム抽出物によってマメ科の抽出物を調製した。アカシア・ビクトリアエ（Ｂｅｎｔｈ．）（マメ科）からモノテルペン／トリテルペン・グリコシドの混合物を単離した。ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１の最初の回収を以下のように行った：（１）ウィリー・ミルで粒径３ｍｍに粉砕：（２）２リットル用浸透器に充填：（３）粉砕バイオマスをジクロロメタン：メタノール（１：１）で４時間、その後一晩かけて抽出し、その結合フラクションをＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１（５２ｇ）を生成するため真空内で乾燥させた。Ｆ００１（５１．５ｇ）を酢酸エチルで抽出し、活性のある不溶性物質（３４．７ｇ）を産生してＦ００４と命名した。１．７ｋｇのシリカ・ゲル（Ｍｅｒｃｋ、粒径２３−２２０ミクロン）を使ったフラッシュ・クロマトグラフィを用いてＦ００４（３４．２）を分別し、５１個の６７０ｍｌフラクションをジクロロメタン：メタノール（段階勾配９５−０％：メタノール５−１００％）で溶離した。カラムを９リットルのメタノール、次に６リットルのメタノール：水（８０：２０）、そして６リットルの同溶離液に１％の蟻酸を加えたもので洗浄した。ＴＬＣフラクション２３−３４及び３９−４０に基づいて１７．２ｇのＦ０２３を結合させた。中圧液体クロマトグラフィ（ＭＰＬＣ、Ｂｕｃｈｉ ６３２ ｓｙｓｔｅｍ）を２回用いて、それぞれアセトニトリル：水（水に対して０、１０、２０、３０、５０％のアセトニトリル）の段階勾配を使った粒径１５−２５ミクロンのＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ１８を充填した４．９ｘ４６ｃｍのカラム上で８ｇのＦ０２３を用い、その後１００％メタノールで洗浄した。１６ｇの０−２０％アセトニトリルのうち、収率は７ｇのＦ０２７であり、不活性であった。残りの物質を結合させ、３０−４０％のアセトニトリルを使って同じシステムでＭＰＬＣを繰り返し、重複を最小限にしてフラクションＦ０２８−Ｆ０３６を生成した。これらフラクションの多くは抗腫瘍活性を示したが、さらにテストと評価を行うためＦ０３５（フラクション３５）（最高収率２．１９ｇ）を選択した。
【０１３５】
ＩＩ．モノテルペン／トリテルペン組成物の構造決定
モノテルペン／トリテルペン組成物及びそれらの殺魚活性、重量測定、分光測光法、ＴＬＣ、ＧＣ、ＨＰＬＣ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ、ＣＯＳＹ、ＮＭＲ、Ｘ線結晶学などの働きの定量及び定性判定のために種々の方法を用いることができる。トリテルペン・サポニンの古典的性質（表面活性、魚類毒性）に基づく判定はデンシトメトリー及び誘導体の比色分析、そしてより最近ではＧＣ、ＨＰＬＣ、そして特にＮＭＲのような光度測定法に大部分が取って代わられている。分光測光法は感度が非常によいが、反応が特異的でなく、呈色生成物はフィトステロールやフラボノイドのようなトリテルペンを随伴する化合物を形成するので植物粗抽出物中のトリテルペンの評価には通常適していない。別の問題は、サポニンの分析作業の多くに共通しているが、植物物質からの抽出が不完全なことである。しかしながら、トリテルペンの計量に適した多くの技術が広く利用可能である。
【０１３６】
サポニンの構造解明には解決すべきいくつかの基本的問題があり、それらは純粋なアグリコンの構造；炭水化物成分の構成要素の単糖の組成と塩基配列；単糖の構造ユニットはどのように互いに結合しているか；それぞれのグリコシド結合単糖構造ユニットのアノマー構成；そして、アグリコン上の炭水化物成分の位置である。
【０１３７】
必要なアプローチは構造に関する最終的な結論に到達するために方法の組み合わせを利用することである。構造に関する研究は分光学的にそれ自体が分析される、より小さな断片にサポニンが徐々に分解されていくという通常段階的なプロセスである。その断片から得られるデータの慎重な取り扱いによって、サポニン組成物に関するアイディアが導き出される。
【０１３８】
単離された純粋なサポニンの量は多くの場合少量で、従って、サポニンの構造決定を支援するため高感度、高解像度、そして可能であれば、非分解性の方法を利用することが好ましい。ＮＭＲ分光法及び質量分析（ＭＳ）における革新によって複雑なサポニン類の研究のためそのように必要とされる性能が提供された。これら及びその他の技術の組み合わせによって構造決定が可能である。例えば、ＦＡＢ−ＭＳは分子量と、多くの場合、糖の塩基配列に関する情報を提供し、Ｉ−Ｄ及び２−ＤＮＭＲ技術は糖の結合の位置決定を可能にし、アグリコンの構造解明に寄与する。そのような構造決定と化学的研究はＴａｎａｋａとＫａｓａｉによるレビュー（１９８４）で綿密に検討されている。
【０１３９】
（ｉ）  核磁気共鳴（ＮＭＲ）
オリゴ糖とグリコシドの構造解明のためのあらゆる最新の方法のうち、ＮＭＲ分光法は構造に関する予備知識の有無に関わらず、最も完全な情報を提供してくれる（Ａｇｒａｗａｌ， １９９２）。ＮＭＲ分光法は他のいずれの方法にも頼らず、原則として、完全な構造を提供することができる唯一のアプローチである。
【０１４０】
１．  １３Ｃ−核磁気共鳴
現在サポニンの構造決定に広く使われている炭素−１３ＮＭＲ分光法は時間のかからない非破壊の方法であるが、かなり大量のサンプル（ｍｇ量）を必要とする。スペクトル分析によってグリコシド鎖のアグリコンへの付着位置；単糖の塩基配列、性質及び数；グリコシド間結合の構成と配座；鎖中のアシルグリコシドの存在；アグリコンの性質；そして、取り付けられたエステル酸の構造に関する結論を引き出すことが可能になる。
【０１４１】
化学シフトの割当のため、観察されたデータと、モデル及び関連する化合物について報告されたデータを比較することが有益である。トリテルペン・サポニンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるいくつかの典型的な化学シフトのうちのいくつかへの手引として、バヨゲニン・グリコシドの周知のシフトを使ってもよい（Ｄｏｍｏｎ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８４）。また、オレアナン（Ｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ， １９８１； Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｊａｉｎ， １９９２）、ウルサン、ルパン（Ｗｅｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９７８； Ｓｈｏｌｉｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０）、ホパン（Ｗｅｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９７８； Ｗｉｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９８７）
、ラノスタン（Ｐａｒｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９７９）・トリテルペンの１３Ｃ−ＮＭＲシグナルの割当の編集が行われた（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。ダンマラン・グリコシドの関連データがレビューに要約され（Ｔａｎａｋａ ａｎｄ Ｋａｓａｉ， １９８４）、一方、サイコゲニン（Ｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ， １９７６ａ）及びサイコサポニン（Ｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ， １９７６ｂ）の１３Ｃ−ＮＭＲ分光法が記述されている。ジンセン・サポゲニン及び関連するダンマラン・トリテルペンについても研究されている（Ａｓａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９７７）。アカシア酸の１３Ｃ−ＮＭＲ分光法についても記述されている（Ｋｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１４２】
１３Ｃ−ＮＭＲでは、水酸基が誘導化、即ちグリコシル化、メチル化（またはアセチル化）されるとき、糖及びアグリコン成分のα−及びβ−炭素いずれも特徴的なシフトを受ける。例えば、α−ＣＨシグナルは低磁場にシフトするが、β−Ｃシグナルは高磁場にシフトし、これは一般的なγ−高磁場シフトの結果生じるシフトである。従って、アグリコンのグリコシル化はα−炭素の低磁場シフト及び隣接炭素原子の高磁場シフト（グリコシル化シフト）を引き起こす（Ｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９７６ｂ； Ｋａｓａｉ ｅｔ ａｌ．， １９７７）。オレアナンでは、３β−ＯＨ基のグリコシル化はＣ−３をｃ．８．０−１１．５ ｐ．ｐ．ｍ．だけ低磁場へシフトさせ、Ｃ−２及びＣ−４を＋０．９または−０．９のシフトで−１．９ ｐ．ｐ．ｍ．へ、Ｃ−２３を０．５−５．１ ｐ．ｐ．ｍ．高磁場へ、そして、Ｃ−２４を−０．２のシフトで１．６ ｐ．ｐ．ｍ．へというシフトを引き起こす。２８−ＣＯＯＨ基のグリコシド化はカルボキシル基炭素の共鳴の高磁場への移動（２．５−５．０ ｐ．ｐ．ｍ．）、Ｃ−１７シグナルの低磁場への移動（１．０−２．５ ｐ．ｐ．ｍ．）を生じさせる（Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ｊａｉｎ， １９９２）。従って、アグリコンとサポニンの１３Ｃ−ＮＭＲデータを比較すると、糖結合の部位が示される（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．， １９７８； Ｔａｎａｋａ， １９８５）。
【０１４３】
同様に、モデル化合物と比較すると、１３Ｃ−ＮＭＲは化学シフトの置換を考慮することによってグリコシド間結合の目安（より単純なサポニンで）になる（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９７８）。メチルβ−Ｄ−フコピラノシドの炭素１３ＮＭＲデータはＳｅｏらによって集計され（１９７８）、より複雑な糖の１３Ｃ−ＮＭＲシグナルがＧｏｒｉｎとＭａｚｕｒｅｋ（１９７５）及びＤｏｒｍａｎとＲｏｂｅｒｔｓ（１９７０）によって記載された。アピオースは特徴的な１３Ｃ−ＮＭＲシグナルを発し、これらは文献化されている（Ｓａｋｕｍａ ａｎｄ Ｓｈｏｊｉ， １９８２； Ａｄｉｎｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｒｅｚｎｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【０１４４】
２．  １Ｈ−核磁気共鳴
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析とシグナル割当はサポニンの構造決定において特に有用な手順であるが、それらの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの完全な割当はわずかしか報告されていない。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはその特質上複雑であり、分析に時間がかかることが判明した。炭水化物成分のプロトン共鳴の大部分は３．０−４．２ ｐ．ｐ．ｍ．の非常に小さな幅のスペクトルの範囲に見られ、その結果重複の問題がある。これらは異なる単糖残基内の非常に似通った化学シフトを有する非アノマー糖メチン及びメチレン・プロトンの大部分に由来する。
しかし、トリテルペンのメチル・ピークは容易に識別可能であり、１９６０年代以来（Ｋｏｊｉｍａ ａｎｄ Ｏｇｕｒａ， １９８９）種々の技術によってオレアナン、ウルサン、及び関連する骨格で多くのプロトン共鳴位置が割り当てられている。例えば、大豆サポゲノール（ｓｏｙａｓａｐｏｇｅｎｏｌ）Ｂ（３３）の完全な１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、及びＣ−４ヒドロキシメチル置換基の構成は１３Ｃ−ＤＥＰＴ、１３Ｃ−ＡＰＴ、２−Ｄ相関分光法（ＣＯＳＹ）（１Ｈ−１３Ｃ−ＣＯＳＹ、１Ｈ−１Ｈ−ＣＯＳＹ）及び１Ｈ−１Ｈ−ＲＯＥＳＹ（回転座標での２Ｄ核オーバーハウザー増強（ＮＯＥ））技術の組み合わせで確立されている（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。このサポゲニンにおける第４級炭素共鳴の割当が１Ｈ−検出異核多重結合（ＨＭＢＣ）及び単結合（ＨＭＱＣ）分光法によって確認されている（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１ｂ）。ジオスゲニン及びソラソジン（ｓｏｌａｓｏｄｉｎｅ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの完全な解釈も達成された（Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。
【０１４５】
いくつかの有益なデータが糖鎖のアノマー構成及び結合の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから得られる。例えば、α−結合グルコースの構造ユニットのＣ−１プロトンの結合定数は約３Ｈｚであり、一方β−結合の構造ユニットでは６−７Ｈｚである。アノマー糖プロトンの結合定数に関するより詳細な記述は他にも見られる（Ｌｅｍｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９５８； Ｃａｐｏｎ ａｎｄ Ｔｈａｃｋｅｒ， １９６４； Ｋｉｚｕ ａｎｄ Ｔｏｍｉｍｏｒｉ， １９８２）。
【０１４６】
オレアナン及びウルサン・トリテルペンのＣ−２、Ｃ−３、及びＣ−２３、Ｃ−２４での水酸基の構成決定で問題が生じるときは、酸素含有炭素原子上のプロトンの１Ｈ−ＮＭＲシグナル・ピークの分析が貴重な情報を与えてくれる（Ｋｏｊｉｍａ ａｎｄ Ｏｇｕｒａ， １９８９）。
【０１４７】
（ｉｉ）  １−Ｄ及び２−Ｄ ＮＭＲ技術
実際には、厳密な意味でのＮＭＲの検討結果の解釈を別にすれば、一部の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルはシフトの議論に基づいて同定及び割当が可能であるが、ひとつのＮＭＲスペクトルは明白に割り当てられるべきであり、それはどのピークがその構造の中のどの炭素及び／又は水素と関連しているか確定することを意味している。この情報は、多くの場合、１次元の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルからは得られないが、２次元での検討の助けを借りてより良く決定される。これらの研究は情報を２つの周波数領域に広げ、原子核間の相互作用を明らかにすることによってスペクトル分析を簡素化する。種々のパルス・シーケンスが構築されるメカニズムは複雑と考えられるにも関わらず、２次元ＮＭＲスペクトルは通例単純である。多数のさまざまな２次元ＮＭＲの研究が化学構造を解決するため工夫されてきた。そのような技術の例は、本発明によるトリテルペン・サポニンの化学的解明に用いられる本発明者による具体的に考慮されたその他のＮＭＲ技術と同様に、以下及び表３に述べられている。
【０１４８】
１．  ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ
ＨＭＢＣ及びＨＭＱＣ１３Ｃ多量子干渉スペクトルの利用はアグリコンの割当だけでなく糖の塩基配列の詳細な記述にとっても価値がある。ＨＭＢＣ及びＨＭＱＣの利用は１３Ｃ−１Ｈ異核相関分光法（ＨＥＴＣＯＲ）と類似しているが、１３Ｃを観察する代わりに、より数多くの１Ｈが検出された。例えば、ベリス・ペレニス（キク科）から得られるベリスサポニンの場合、２−Ｄ１Ｈ検出ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルと結合する１３Ｃ−ＮＭＲデータを考慮することによって１Ｈ−ＮＭＲ中の全ての化学シフト割当が可能であった。２個及び３個の結合共役に対応するクロス・ピーク（ｃｒｏｓｓ ｐｅａｋ）が分子内の可能な相関の殆ど全てに観察された。同様に、ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルの長期的１Ｈ−１３Ｃ相関を塩基配列と糖成分の付着位置の決定に用いてもよい（Ｓｃｈｈｏｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１４９】
２．  ２−Ｄ−ＮＯＥＳＹ
この技術は、例えば、シクラミレチン（ｃｙｃｌａｍｉｒｅｔｉｎ）Ａグリコシド（アルジシアクリスピン（ａｒｄｉｓｉａｃｒｉｓｐｉｎ）Ａ及びＢ）（Ｊａｎｓａｋｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）の糖塩基配列及びアンドロサセ・ サクシフラジフォリア（サクラソウ科）から得られたサクシフラジフォリンの単糖塩基配列の決定に適用されている（Ｗａｌｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。カロパナクス（ｋａｌｏｐａｎａｘ）・サポニンＣのアラビノース成分上のラムノース及びグルコシルの位置が過メチル化されたサポニンの糖塩基配列分析後ＮＯＥＳＹによって確認された。クロス・ピークがラムノース成分のＨ−１とアラビノース成分のＨ−２の間、そしてグルコシル成分のＨ−１とアラビノース成分のＨ−３の間に観察された（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９ｂ）。バラニテス・アエギプティアカ（フジツボ科）から得られたフロスタノール（ｆｕｒｏｓｔａｎｏｌ）・サポニンの糖成分の構造が４００ＭＨｚ ＮＭＲ機器の２−Ｄ ＮＯＥＳＹを使って解明されている（Ｋａｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１５０】
２−Ｄ ＮＭＲ技術の協調的な利用はグリコシド３−Ｏ−［｛α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→４）｝｛β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）｝−β−Ｄ−グルコピラノシル］−（２５Ｓ）−５β−スピロスタン−３β−ｏｌのオリゴ糖断片のための１３Ｃ及び１Ｈの割当を完全にすることにつながる。ＤＥＰＴ、ＨＥＴＣＯＲ、長距離ＨＥＴＣＯＲ、異なる等核技術、ＮＯＥＳＹ、及びＩＮＥＰＴの組み合わせがプロトン・スペクトルの過密によって引き起こされる問題を解決するため構造解明に適用された（Ｐａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９８８ｄ）。
【０１５１】
ブリジア・ウェルウィシリ（ムクロジ科）から得られた五糖グリコシド３−Ｏ−［β−Ｄ−キシロピラノシル（１→３）α−Ｌ−アラビノピラノシル］（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→２）α−Ｌ−アラビノピー（ａｒａｂｉｎｏｐｙ）−ラノシル（ｒａｎｏｓｙｌ）］ヘデラゲニン中の糖の同定と塩基配列は５００ＨＭｚの機器を使ったＮＭＲ技術のみで可能であった。そのサポニンは先ずアセチル化され、その後ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、及びＲＯＥＳＹスペクトルの分析によって構造の割当が可能になった。ＮＯＥデータから得られた情報は糖の塩基配列の確定に非常に有用であった（Ｐｅｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【０１５２】
ソリダゴ・ギガンテア（キク科）から得られた１０個の糖残基を含むサポニンが多段階ＲＣＴ研究に基づいたＮＭＲによって同定された。これはＣＯＳＹ、異核ＣＯＳＹ、ＣＯＳＹ型Ｈ−Ｈ−Ｃ干渉移動（ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）及び２−Ｄ ＮＯＥＳＹの研究を含む。従って、分解に関する広範囲の研究は回避され、３０ｍｇの生成物で構造決定が可能であった（Ｒｅｚｎｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ａ， １９８９ｂ）。同様の技術が同植物から得られた別な４個のグリコシドであるギガンテアサポニン１−４（９個または１０個の糖単位体を含むバヨゲニンのビデスモシド（ｂｉｄｅｓｍｏｓｉｄｅ））の構造決定に使われた（Ｒｅｚｎｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０ａ）。
【０１５３】
２−Ｄ ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、及びＲＯＥＳＹ ＮＭＲ研究の組み合わせはミモサ・テニフローラ（マメ科）から得られたオレアノール酸サポニンであるミモノシド（ｍｉｍｏｎｏｓｉｄｅ）Ａ中の六糖の塩基配列と結合位置を示すのに十分であった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１５４】
過アセチル化及び非誘導化されたクリサンテリンＡの２−Ｄ ＮＭＲによってプロトンの割当と糖類の塩基配列が可能になった。エステル化されたキシロース成分がβの形状で存在し、１Ｃ４の配座を持つことが示された。用いられた技術のうち過アセチル化された誘導体についてはＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、及びＲＯＥＳＹ（または、より精密には、ＣＡＭＥＬＳＰＩＮ（ロックされたスピンによってエミュレート（ｅｍｕｌａｔｅ）された小型分子に適合するクロス・リラクセーション（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ））、そして天然サポニンについてはＨＯＨＡＨＡ、ＴＯＣＳＹがある。ＲＯＳＥＹの研究は糖の配列決定に特に有用であった（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１ａ）。
【０１５５】
海洋生物から得られるトリテルペン・グリコシドの糖の塩基配列とグリコシド間結合がＮＴ１データ及びＮＯＥＳＹ研究から確立された（Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０）が、この方法論は多数のプロトンについてＮＯＥの測定を通常妨げる３−５ ｐ．ｐ．ｍ．領域での１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの複雑性によって限定される。しかし、ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹと直接及びＸＨＣＯＲ  ＮＭＲ分光法の組み合わせによってナマコのホロスリア・フォルスカリイから得られた五糖トリテルペン・サポニンの完全なシグナル割当と構造分析が可能になった（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１５６】
南極ヒトデのネオスミラスター・ゲオジアヌスから得られたヒトデ・サポニンであるサンティアゴシド（ｓａｎｔｉａｇｏｓｉｄｅ）の構造分析において、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＭＱＣの、及びＲＯＥＳＹ ＮＭＲ分光法技術が広く使われ、ＲＯＥＳＹの研究は糖の正確な塩基配列、それらの付着位置、及び空間配置を決定するために用いられた（Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１５７】
３．  ＣＯＳＹ
２−Ｄ ＮＭＲ分光法には２つの基本的なタイプがあり、Ｊ−分解（Ｊ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）分光法ではひとつの周波数軸がスピン結合（Ｊ）を含み、もうひとつは化学シフトの情報を含んでおり、相関分光法では両方の周波数軸が化学シフト（δ）の情報を含んでいる（Ａｇｒａｗａｌ， １９９２）。２−Ｄ分析の主要な利点のひとつはスペクトル・クラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）の問題克服の方法を提供することである。強磁場１Ｈ−ＣＯＳＹで、このことは２．５−４．０ ｐ．ｐ．ｍ．領域について特に当てはまり、従って、糖プロトンの割当が単純化される。好ましい条件下で、任意の糖残基に存在する全てのプロトンを同定することができる。
【０１５８】
いくつかの一般的な結論をＣＯＳＹスペクトルから導き出すことができる。例えば、単糖の構造ユニットの置換基の位置を対応する水酸基プロトンの存在または非存在によって決定することができ；単糖の環の大きさが直接決定可能であり；そして、クロス・ピークの性質は結合定数の推定値を提供する重複したピークの重なり合いを示す。
【０１５９】
いくつかの場合、サポニンの解明は、その糖の塩基配列と共に、１Ｈ−ＮＭＲ １−Ｄ及び２−Ｄ分光法のみで達成されている（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９８６， １９８８ｂ）。サポニンは先ず過アセチル化され、磁場強度が十分であれば（＞３００ＭＨｚ）、その糖プロトン共鳴が２つのゾーンに分かれる。ひとつはＣＨ２ＯＲに割り当てられた４．７５及び５．４０ｐ．ｐ．ｍ．の間のゾーン、もうひとつはＣＨ２ＯＣ、ＣＨＯＲ、及びＣＨ２ＯＲに割り当てられた３．０及び４．３ｐ．ｐ．ｍ．の間のゾーンである。アノマー・プロトンはエーテル結合の場合あるいはエステル結合で５．５ｐ．ｐ．ｍ．より大きいときにこれら２つのゾーンの間に位置する。
【０１６０】
過アセチル化はクロロホルム、ベンゼン、またはアセトンに溶解できる誘導体も生じさせる。過重水素化された等価の溶媒中で、分子の運動性はシグナルがより明瞭に観察され、結合定数が高精度で測定できるほどである。アセチル化されたアルファルファ根部のサポニンについて、ＣＯＳＹ及び長距離ＣＯＳＹの研究は構造がＡｒａ−２Ｇｌｃ−２Ａｒａ−３ヘデラゲニン２８−Ｇｌｃであると同定するのに十分であった（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。
【０１６１】
アルファルファのメディカゴ・サティヴァ（マメ科）の葉部及びトリデスモステモン・クラエセンシ（アカテツ科）から得られたさらに過アセチル化されたサポニンの構造が上に概説されたものと同様の技術によって解明されている。割当及び糖の塩基配列の確認はＨＭＱＣ（１Ｊカップリングのため）とＨＭＢＣ（２Ｊ及び３Ｊカップリングのため）及び単核ハートマン−ハーン（ＨＯＨＡＨＡ）三重リレーＣＯＳＹ及びＲＯＥＳＹの研究から得られた（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９０； １９９１ｂ）。Ｔ．クラエセンシから得られたサポニンのエステル糖鎖は例外的な１Ｃ４構成（全ての置換基は軸性）のβ−Ｄ−キシロースを含んでいる。６００ＭＨＺでは、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは過アセチル化なしに全ての１Ｈ化学シフトの割当を可能にするのに十分よく分解される（Ｓｃｈｏｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１６２】
４．  長距離ＣＯＳＹ（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ ＣＯＳＹ）
この技術はアリウム・ビネアレ（ユリ科）から得られたステロイド・サポニン中の糖プロトンの割当に使われている（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ， １９８７， １９８９）。長距離１Ｈ−１３Ｃ ＣＯＳＹもシクロアストラゲノール（ｃｙｃｌｏａｓｔｒａｇｅｎｏｌ）サポニン中のアグリコン構造決定に用いられ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９ｂ）、上に述べられたメディカゴ・サティヴァ・サポニンの内部（ｉｎｎｅｒ）グルコースのアノマー・プロトンと内部（ｉｎｎｅｒ）アラビノースのＨ−２の間の ４Ｊ糖間結合の位置決定（Ｍａｓｓｉｏｔ ｅｔ ａｌ．， １９９６）に使われた。
【０１６３】
５．  二重量子ろ過、位相感度ＣＯＳＹ（ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＤＱ−ＣＯＳＹ）
この技術はアリウム・ステロイド・サポニン中の糖プロトンの割当（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅ， １９８７； １９８９）、及びクロソプテリクス・フェブリフガ（アカネ科）葉部から得られた１６α−ヒドロキシプロト−塩基酸グリコシド（ｂａｓｓｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）グリコシドの１Ｈ化学シフトの割当（Ｇａｒｉｂｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２）に用いられた。同じ技術がササンドゥス・ララク（ムクロジ科）果実から得られたアセチル化ヘデラゲニン誘導体中の糖プロトンの完全な割当を提供するために用いられた（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。グリコシド間結合がＮＯＥ差分光法によって確立された（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１６４】
６．  ＨＯＨＡＨＡ
ジプソゲニン及びクライック酸グリコシド（ｑｕｉｌｌａｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）のアグリコンのプロトン結合ネットワークはＨＯＨＡＨＡの研究によって完全に解明された。これらは観察された相関クロス・ピークが同位相であること以外はＣＯＳＹの研究（及び全相関分光法−ＴＯＣＳＹ）と同様であり、従って、ピークの重複の偶発的消去を回避している。炭水化物鎖の解明のため、ＨＯＨＡＨＡの研究から推論された近接結合定数は各不斉中心の相対空間配置の決定を可能にし、従って単糖の同定を可能にした。異核Ｈ−Ｃリレーの研究はＨＭＢＣスペクトルから決定される糖成分及び糖結合の１３Ｃ共鳴の割当に用いることができる（Ｆｒｅｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１６５】
７．  ＦＬＯＣＫ、ＣＯＬＯＣ及びＮＯＥ
近接回転デカップリング・パルスを組み込んだ長距離異核相関分光法（ＦＬＯＣＫ）はセサマム・アラトゥム（ゴマ科）から得られたアラトサイド（ａｌａｔｏｓｉｄｅ）Ａ中の１Ｈ−１３Ｃ長距離結合の観察に用いられている。従って、Ｃ−１８でのプロトンと炭素原子Ｃ−１３、Ｃ−１７、及びＣ−２８の間の相互作用が観察された。長距離異核１３Ｃ−１Ｈ相関（ＸＨＣＯＲＲ）に関連して、新規なセコウルセン（ｓｅｃｏ−ｕｒｓｅｎｅ）アグリコンの構造について多くの情報が収集された（Ｐｏｔｔｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１６６】
長距離結合（２ＪＣＨ及び３ＪＣＨ）のために最適化された１３Ｃ−１Ｈ ２−Ｄ相関分光法（ＣＯＬＯＣ）のサンプルはクロソプテリクス・フェブリフガ（アカネ科）から得られたサポニンの構造解明で発見されることになる（Ｇａｒｉｂｏｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【０１６７】
ＮＯＨはサポニンの構造決定、例えば、ルペオサイド（ｌｕｐｅｏｓｉｄｅ）Ｉ（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９）及びカメリディン（ｃａｍｅｌｌｉｄｉｎ）ＩとＩＩ（Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９８６）の糖プロトンの割当と糖の塩基配列決定に広く利用されている。アラビノースのＨ−２とラムノースのアノマー・プロトン間のＮＯＥはジジフィン中のＲｈａ−２Ａｒａ−二糖結合を確認する一助となった（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ｂ）。この方法は結合位置でアノマー・プロトンとアグリコン・プロトンの間でしばしば連結性が観察されることから広範な利用法を有している。ネガティブＮＯＥは位置Ｃ−３のプロトンとシクロアストラゲノール（ｃｙｃｌｏａｓｔｒａｇｅｎｏｌ）及びその他のサポニン類の３−Ｏ−グリコシド残基のアノマー・プロトンとの間に観察されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９ｂ）。
【０１６８】
（表３はトリテルペンサポニンの構造確定に用いるための選択されたＮＭＲ方式を示す。）
【表３】
2004517131.tif 000014
【０１６９】
（ｉｉｉ）  構造解明のための分光分析及びその他の手法
サポニン及びそれに対応するアグリコンの構造解明は化学的方法ばかりでなく、例えば、ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲ、ＭＳ、光回転分散（ＯＲＤ）、円偏光二色性（ＣＤ）分析、及びＸ線分析などの分光分析及び関連技術にも基づいて行なわれる。これらの技術のいくつか、そして最もめざましくはＮＭＲ分光分析とＭＳにおける最近の進歩によって、サポニンと切断反応で得られるそれらの対応するフラグメントの分析作業が簡単に行なえるようになり、従って情報を関連付けて適切な行動を判定できるようになっている。さらに、ＮＭＲ分光分析は非破壊技術であり、ＮＭＲとＭＳの両方とも無傷のサポニンの検査を可能にしてくれる。
【０１７０】
サポニンの構造を解明するためには、それぞれデータの集積に一定の貢献をする異なった分光分析技術を用いた一体的なアプローチが必要である。
【０１７１】
１．  質量分光分析（ＭＳ）
ＭＳにおけるイオン化方法の選択は分析対象の化合物の極性、負担、及び分子量に依存する。原理的には、天然由来のグリコシドに関する分子量及び糖配列情報を得るために用いられるＦＡＢ及び脱離／化学イオン化（Ｄ／ＣＩ）などのいわゆるソフトなイオン化手法である（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。これらにより、誘導を行なわずにグリコシドの分析が可能になる。いくつかの場合、アグリコンの分解が観察されるが、電子衝撃質量スペクトル（ＥＩ−ＭＳ）がこの目的に対しては最も有益である。
【０１７２】
２．  高速原子衝撃ＭＳ（ＦＡＢ−ＭＳ）
ＦＡＢ研究においては、原子（又はイオン）の加速ビームを癌から分析対象のサンプルを含む粘性の液体（『基質』−通常グリセロル又は１−チオグリセロル）を予め充填した標的に向けて照射する（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１； １９８２）。原子ビームが上記基質と衝突すると、動的なエネルギーが表面分子に移送されて、その多くが液体からイオン源の高度の真空内に分散される。これらのイオン化はこの分散中に起こり、陽イオンと陰イオンの両方が発生する。いずれも計器パラメータを適切に選択することで記録することができるが、サポニンに関する研究では、全体として、陰イオンの方がより有益である。
【０１７３】
３．  二次イオン質量分光分析（ＳＩＭＳ）
これはもうひとつの粒子誘発沈着技術で、生物分子の薄層表面に衝突するｋｅＶ単位のエネルギーを有するイオンがＰＤ−ＭＳの場合と同様の沈着イオン化を誘発するのである（Ｂｅｎｎｉｇｈｏｖｅｎ ａｎｄ Ｓｉｃｈｔｅｒｍａｎｎ， １９７８）。アメリカ大豆種子（グリシン・マックス、マメ科）、から単離された３つの新しいバイデスモシド、アセチル−ソヤサポニンＡ１、Ａ２、及びＡ３の構造調査において、この技術の有用性が実証された。有意なフラグメント・イオン・ピークはそれら単糖類のアセチル化モードに関する情報と、それらの単位の配列に関する情報を提供してくれた（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０１７４】
４．  レーザー脱離（ＬＤ）
ＬＤにおいては、持続時間が短い（＜１０ｎｓ）レーザー・パルスによる励起がＰＤ及びＳＩＭＳの場合と同様の脱離分子イオンのパターンをつくりだすことが示されている。複雑なグリコシドの分析に適した技術であるレーザー脱離／フーリエ変換質量分光分析（ＬＤ／ＦＴＭＳ）は、ＦＡＢ−ＭＢの場合とは異なった、そしてそれに対して相補的なスペクトルをつくりだす。
【０１７５】
５．  電解脱離ＭＳ（ＦＤ−ＭＳ）
この技術はサポニンの分子量と、合わせて糖残基の数、性質及び配列についての判定を行なう場合に適している（Ｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。しかしながら、ＦＤ−ＭＳの実験的な複雑さと、ＦＡＢ−ＭＢがより長い持続時間のスペクトルをつくりだすという事実から、ＦＤ−ＭＳ方式が最近ではあまり用いられなくなっている。ＦＤ質量スペクトルはさらに、それらが陽イオン化されたフラグメントの存在によって複雑化されており、スペクトルの解釈を一層むずかしくしているという欠点も有している。それにも係わらず、ＦＤ−ＭＳはサポニンの構造解析に適用されて非常な成功を収めている（Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８０）。
【０１７６】
（ｉｖ）  液体クロマトグラフィ−質量分光分析（ＬＣ−ＭＳ）
質量分光分析のためにＨＰＬＣカラム溶離液を直接及び間接的に導入するためのいくつかのタイプの効率的なインターフェースが開発されている。例えば、粗サポニン・フラクションの定量分析がセミ−ミクロＨＰＬＣとフリット高速原子衝撃（ＦＲＩＴ−ＦＡＢ）インターフェースとを組み合わせることで行なわれている（Ｈａｔｔｏｒｉ， ｅｔ ａｌ．， １９８８）。こうした適用例の場合、オクタデシル・シリカ・カラムではなく、ＮＨ２カラム（例えば、μＳ−Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ ＮＨ２，Ｊａｓｃｏ； ２５ｃｍｘ１．５ｍｍ内径（Ｉ．Ｄ．））が用いられ、処理液の分割比は１：２０である（１００μ／ｍ→５μｌ／ｍ）。アセトニトリル及び含水１％グリセロルの線形勾配を用いた溶離は、通常、定組成溶離で得られるものより優れたピークの鮮明さを可能にしてくれる。陰性ＦＡＢ質量スペクトルが最大１２３５の分子量のサポニンに関して記録されている。擬似分子［Ｍ−１］イオン及び糖成分の切断が原因となっているフラグメント・イオンがこの手法で観察されている（Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０１７７】
ローザ・ルゴサ（Ｒｏｓａ ｒｕｇｏｓａ）（バラ科）から得られた異性体サポニン類ローザムルチンとアルジュネチン（両方の分子量共６５０）の混合物の分離に関してＦＲＩＴ−ＦＡＢ  ＬＣ−ＭＳシステムについても述べられている・ローザムルチン（ウルサン・グリコシド）及びアルジュネチン（オレアネイン・グリコシド）の両方ともＣ−２８に単一のグルコース残基を有しており、キセノンを中性ガスとして用いてネガティブとポジティブ両方のＦＡＢモードで分析された。ＨＰＬＣはアセトニトリル水（７：３、０．５％グリセロルを含む）を溶媒として１ｍｌ／分の流量で用いてオクタデシルシリカ・カラム（２５０ｘ１．５ｍｍ）上で行なわれた。擬似分子［Ｍ＋１］−及び［Ｍ＋１］＋イオンが観察され、ネガティブＦＡＢ質量スペクトルでは親のアグリコンによって起こされる強いピークを伴っていた（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。
【０１７８】
溶離剤がソースに直接送り込まれる動的ＦＡＢインターフェーシングと類似した技術である動的二次イオン質量分光分析（ＳＩＭＳ）によってサポニン類を検出することも可能である。従って、ＵＶ（２０６ｎｍ）及びＳＩＭＳ検出と組み合わせたＨＰＬＣを用いて、１つのモノ−及び２つのバイデスモシド・グリコシドの混合物の分析が行われている（Ｍａｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
【０１７９】
ＦＲＩＴ−ＦＡＢ及びＣＦ−ＦＡＢタイプのインターフェースの欠点は低流量（約１−５μｌ／分）が必要とされることである。ＨＰＬＣ分離を行なった後、処理液分離が必要となる。しかしながら、そのサーモスプレイ（ＴＳＰ）インターフェース（Ｂｌａｃｋｌｅｙ ａｎｄ Ｖｅｓｔａｌ， １９８３）はその単純さと１−２μｌ／分の流量を取り扱うことができることを特徴としている。このことは、植物成分の分析を伴う課題にとって、この技術をより魅力的なものとしている。ＴＳＰ技術の中核は化学的イオン化ＭＳと同様の分子のソフト・イオン化である。これによって非揮発性で熱の影響を受け易いモノ−、ジ−、さらにはトリグリコシドの分析も行うことができる。サポニンの分子量と糖鎖の性質及び配列についての情報も提供される。ＴＳＰ  ＬＣ−ＭＳはテトラプレウラ・テトラプテラ（マメ科）の果実からのメタノール抽出物内の軟体動物駆除性サポニンの分析にも用いられている（Ｍａｉｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９９３）。イオン蒸発イオン化のための揮発性緩衝液を提供するために０．５酢酸アンモニウム（０．２ｍｌ／分）のポスト−カラムを加えることで、ＴＳＰ  ＬＣ−ＭＳ総イオン流（質量範囲４５０−１０００ａ．ｍ．ｕ）は、２０６ｎｍでのＨＰＬＣ−ＵＶ分析に十分に対抗できる測定結果を残した。ｍ／ｚ６６０、６７６、８８０、及び８２２でのイオン・トレースは大型サポニンの擬似分子［Ｍ＋Ｈ］＋イオンを示す信号を提供した。この抽出物内の各サポニンに対して得られた質量スペクトルは擬似分子［Ｍ＋Ｈ］＋イオンに対して大きなピークを示した。主要な軟体動物駆除性サポニンであるアリダニンに関しては糖成分の分解が観察され、Ｎ−アセチルグルコシル成分の喪失がアグリコンに対して［Ａ＋Ｈ］＋ピークを発生させた（Ｍａｉｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９９３）。
【０１８０】
ＧＣ−ＭＳは実際的な使用ではあまり価値がなく、ＨＰＬＣだけではピークの確認がその持続時間で確認されるだけなので、ＬＣ−ＭＳは、サポニンの調査に適用された場合、大きな実用性を示す可能性がある。ＬＣ−ＭＳは植物抽出物内でのトリテルペン・グリコシドの分析に対応できるだけでなく、ＭＳ−ＭＳとは違って、それら抽出物内の個々のサポニンの構造判定にも大きな価値を有するであろう。
【０１８１】
（ｖ）  赤外線質量分析
ＩＲの実際的な適用とは別に、サポニンの構造解明に特に関係した１つあるいは２つの特徴がある。１３５０と８７５ｃｍ−１の間のいくつかの強いバンドはスピロケタル側鎖を示す兆候であるから、ＩＲはステロイド・サポニンの特徴づけにとって有益である（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９５３）。４つのバンド、９８０（Ａバンド）、９２０（Ｂバンド）、９００（Ｃバンド）、そして８５０バンドｃｍ−１はＥ及びＦ環の特徴を示すものとされている。２５Ｒサポゲニンの場合、ＢバンドはＣバンドより強い吸収性を示し、一方、２５Ｒシリーズでは、この関係は逆転する。Ｅ又はＦ環に、あるいは位置２７で酸素置換基を有するサポゲニンにおいては、これら４つのバンドはかなり変わる（Ｔａｋｅｄａ， １９７２）。
【０１８２】
サポニン内のイオン化されたカルボキシル基の存在は、１６１０及び１３９０ｃｍ−１のＩＲスペクトル内のバンドの存在によって確認することができる（Ｎｕｍａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。単離手順中においてはこの情報は有益であり、その分子内のカルボキシル基をイオン化できるかどうかを知ることが重要である。
【０１８３】
（ｉｖ）  Ｘ線結晶学
Ｘ線結晶学はセントラ・アシアティカ（Ｃｅｎｔｒａ Ａｓｉａｔｉｃａ）（セリ科）からの三糖類トリテルペンの分子形状を解明するために用いられている。結晶化はジオキサンを用いて行なわれた（Ｍａｈａｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。Ｘ線回折分析もモーリー酸３−β−Ｄ−グルコシドの構造の確認に用いられて成功を収めた（Ｐｅｇｅｌ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ， １９８５）。
【０１８４】
Ｘ線結晶学はアグリコンの構造問題の解決に特に有益である。セラムム・アラツム（Ｓｅｓａｍｕｍ ａｌａｔｕｍ）（ゴマ科）からのアラトシドＡのアグリコンの構造の判定に有益な情報が酸加水分解後につくりだされる生成物の結晶性トリアセテートのＸ線回折分析から得られている（Ｐｏｔｔｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。メディカゲン酸、ドリコス・キリマンジャリクス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ Ｋｉｌｉｍａｎｄｓｃｈａｒｉｃｕｓ）（マメ科）の塊茎から得たメディカゲン酸３−Ｏ−グリコシドの親アグリコンのＸ線結晶学的な調査はその分子がシス融合Ｄ及びＥ環を有していることを示した。環Ｃはやや歪んだソファ形状を有していたが、環Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは椅子形状を有していた（Ｓｔｏｅｃｋｔｉ−Ｅｖａｎｓ， １９８９）。
【０１８５】
（ｖｉｉ）  切断反応
トリテルペン・サポニンは環状ピラノースあるいはフラノース形状の糖類のヘミアセタール・ヒドロキシル基がトリテルペンあるいはステロイド残基と共にアセタールを形成しているグリコシドである。ヘミアセタール・ヒドロキシル基とトリテルペン又はステロイドとの間のいずれの結合もドリコシド性結合として知られている。オリゴ糖類の単糖成分もいずれかの結合（グリコシド間結合）で結合されている。
【０１８６】
１つのグリコシドを完全に加水分解すると、グリコシド結合は切断されて、構成成分である単糖類と非炭化水素成分（アグリコンあるいはゲニン）を放出する。サポニンの加水分解で得られる非炭化水素部分はサポジェノールあるいはサポジェニンと命名されている。
すべての知られているサポニン類はＯ−グリコシド類でエステル結合を含んでいる場合と、含んでいない場合がある。
【０１８７】
多数の化学反応や化学的方法がより周到な分析を行うためにサポニンをより小さな構成単位に分割する目的で採用されている（例えば、Ｋｉｔａｇａｗａ， １９８１参照）。そうした方法はトリテルペン・サポニンの構造判定に特に有用であろう。
【０１８８】
１．  酸性加水分解
酸性加水分解は、酸の中でサポニンを一定の時間、例えば、２−４Ｍ塩酸内で４時間還流させることによって行なうことができる。加水分解後に残る水溶液はジエチル・エーテル、クロロホルム、あるいは酢酸エチルで抽出することによって、アグリコンが得られる。水性層からの糖類の抽出は、その溶液を（アルカリ又は塩基性イオン交換樹脂で）中性化して（Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ ａｎｄ Ｆｏｒｓｔｍａｎｎ， １９５７； Ｓａｎｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ， １９６２）、乾燥するまで蒸発させた後にピリジンを用いて行なわれる。この方法でサポニンはその構成要素に完全に切断され、従って、アグリコンの素性と存在している単糖類の数及び性質についての情報を得ることができる。（塩基性加水分解によるエステル結合の切断の後に得られる）プロサポジェニンを酸加水分解した場合、アグリコンにエーテル結合している糖鎖の性質を解明することができる。水性反応媒体はアルコール又はジオキサンによって代替可能である。
【０１８９】
塩酸に加えて、硫酸もサポニンの加水分解に用いることができる。硫酸を用いた場合、分子の劣化や再構成の可能性は低くなるが、エーテル結合切断はそれほど効率的には進まない。例えば、ジアンサス（Ｄａｎｔｈｕｓ）サポニンからのジプソジェン酸を得るための簡便な方法は、１Ｍ硫酸をジオキサンに溶かした溶液による加水分解ステップを含んでいた（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。硫酸水溶液及びエタノール、さらに塩酸を用いた加水分解状態の比較研究を行なったところ、糖類が最も良く回収されたのは、密閉された真空アンプル内で５％硫酸水溶液で２時間サポニンを加熱した場合であった（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ， １９８７）。ある程度ゆるやかな加水分解は、トリフルオロ酢酸を用いて、例えば１Ｍトリフルオロ酢酸内で３時間還流させることで達成することができる。
【０１９０】
溶液内のサポニンを加水分解する方法に替わる方法は塩酸蒸気でＴＣＬプレート上で直接それらを加水分解する方法である。酸が蒸発すると、存在している単糖類を識別するために、ＴＣＬ溶媒を用いた通常の溶離が行なわれる（Ｋａｒｔｎｉｇ ａｎｄ Ｗｅｇｓｃｈａｉｄｅｒ， １９７１； Ｈｅ， １９８７）。この方法により、アガベシドＢの部分的加水分解後に末端糖類であるキシロース及びガラクトースが識別された。ＴＬＣプレートは溶剤：クロロホルム−メタノール−水（８：５：１）を用いて作成され、検出はアニリン−ジフェニルアミン−Ｈ３ＰＯ４−メタノール（１：１：５：４８）を用いて行なわれた（Ｕｎｉｙａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。
【０１９１】
２．  塩基性加水分解
Ｏ−アシルグリコシド糖鎖の切断は塩基性加水分解条件下で、通常０．５Ｍ水酸化カリウムを還流させることで行なわれる。あるいはまた、水酸化カリウムの１−２０％エタノール又はメタノール溶液を用いることもできるが、特にトリテルペン酸のカルボキシル基のメチル化の危険が存在する。Ｄｏｗｅｘ １などのイオン交換体はゆるやかな塩基性加水分解状態を提供してくれる（Ｂｕｋｈａｒｏｖ ａｎｄ Ｋａｒｌｉｎ， １９７０）。もうひとつの方法は、コリジンにヨード化リチウムを溶かした溶液の使用である（Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９６４）。
【０１９２】
反応条件を慎重に制御することにより、異なったエステル成分を選択的に切断することができる。例えば、０．５Ｍ水酸化カリウム内で３０分間還流させることでキズタ・サポニンＫ１１を加水分解することで、バイデスモシドのＣ−２８の糖を取り出すことができた。しかしながら、０．１Ｍ水酸化カリウム内で２０時間サポニンを室温で攪拌すると、Ｃ−２８エステル・グリコシド鎖上の酢酸基が選択的に除去できた（Ｋｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， １９８５ｂ）。
【０１９３】
３．  部分的加水分解
いくつかの例で、サポニンの分岐度が非常に高いか、あるいは長い糖鎖を有している場合、構造解明によりアクセス可能なフラグメントを得るために、部分的な加水分解を含む手順が必要となる。これは酸、あるいは酵素を用いて行なうことができる。オリゴ糖類及び／又は残りのサポニン部分を単離して、特徴づけを行なう。
【０１９４】
例えば、フィトロッカ・ドデカンドラ（Ｐｈｙｔｏｌｏｃｃａ ｄｏｄｅｃａｎｄｒａ）（ヤマゴボウ）から得たサポニンを０．１Ｍ塩酸で４５分間加水分解したところ、３つの生成物の混合物が得られた。これらの化合物をＲＰ−ＬＰＬＣで分離して、それらの糖配列を酢酸アルジトールのＭＳ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳによって判定した。これらの情報を綜合して、オレアノール酸誘導体であるその化合物の化学式を決めることができた（Ｄｏｒｓａｚ ａｎｄ Ｈｏｓｔｅｔｔｍａｎｎ， １９８６）。
【０１９５】
ジオキサンでの加水分解はより温和な条件をつくりだし、部分的な加水分解を行なうことができる。この例では、サポニンはジオキサン−０．１Ｍ塩酸（１：３）内で６時間還流させた（Ｉｋｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９８１）。サポニン類を部分的に加水分解するためのその他の方法は、トリテルペン・グリコシドをアルコールに溶かした溶液をアルカリ金属（ナトリウム又はカリウム）で処理して、微量の水を加える方法である（Ｏｇｉｈａｒａ ａｎｄ Ｎｏｓｅ， １９８６）。
【０１９６】
４．  熱水分解
トリテルペン・グリコシドの熱水分解は対応するアグリコンの形成に導き、従って構造判定に役立つ。この方法は、サンプルによって、１００℃か１４０℃の温度で１０−１４０時間水あるいは水−ジオキサンでグリコシドを加熱するステップを含んでいる。例えば、トリテルペン３，２８−ビスグリコシドを熱水分解すると対応する３−Ｏ−グリコシドが生成される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１９７】
５．  酵素による加水分解
人為的生成物を形成せずにサポニンから糖残基を切断するための非常に効率的で、温和な方法は酵素による加水分解である。すべての糖類に対して適切な加水分解分解酵素は市販されていないが、β−グルコシダーゼによるβ−グルコース残基の切断は完全に直接的に行なわれる。特定の酵素による切断の補足的な利点は、糖成分のアノマー構成が自動的に示される点である。特にトリテルペン・グリコシドの加水分解で使用するために考案された一定の酵素製剤は、加水分解β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、粗ヘスペリジナーゼ、ペクチナーゼ、そしてナリンジナーゼである。
【０１９８】
ヘスペリジナーゼ、ナリンジナーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、及びエマルシンの粗調製ステップを含むシステマティックな研究は、ヘスペリナーゼ、ナリンジナーゼ、及びペクチナーゼがジンセノシドの加水分解で最も効果的であることを示した（Ｋｏｈｄａ ａｎｄ Ｔａｎａｋａ， １９７５）。
【０１９９】
（ｖｉｉｉ）  加水分解後のアグリコンの分析
加水分解が完了したら、単純なろ過あるいは水−有機溶媒分離のいずれかによってアグリコンを加水分解酵素から分離して、周知のトリテルペンと比較しながら分析することができる。最も一般的に用いらている方法はＴＬＣで、ジイソプロピル・エーテル・アセトン（７５：３０）などの溶媒を用いる。スプレイ試薬は多くの場合サポニンの分析に用いられるものである（表２参照）。
【０２００】
ガス液体クロマトグラフィはトリテルペンの誘導体化を必要とする。例えば、オレアノール酸及びウルソル酸のメチル・エステルは３０％０Ｖ−１７あるいはＳＥ−３０でパックされたガラス・カラム上でＧＣで分離されている。（Ｆｏｋｉｎａ、１９７９）。トリテルペンはソヤサポジェノールＡ−Ｅ及びアルファルファのメディカジェニック酸の場合と同様、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド及びクロロトリメチルシランによる誘導体化後にＧＣによって判定することができる（Ｊｕｒｚｙｓｔａ ａｎｄ Ｊｕｒｚｙｓｔａ， １９７８）。
【０２０１】
ＧＣ−ＭＳの技術もサポジェニンの特徴づけに貴重である。通常はトリメチルシリル誘導体を調製し、分光計で分析する。１つの例は、オレアナン−及びウルサン−タイプのトリテルペンの調査へ応用である。ＯＶ−１０１パッキング上でＧＣで９つのシリル化されたトリテルペンを分離して、その質量スペクトル・パターンを調査したところ、１２−エン二重結合を含んでいるものは特徴的なレトロ−Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を受けていることが明らかになった（Ｂｕｒｎｏｕｆ−Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。この技術は甘草から抽出されたトリテルペンの判定にも使われている（Ｂｏｍｂａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９７９）。
【０２０２】
ＨＰＬＣ分析は誘導体化を必要とせず、優れた再現性と、トリテルペン分析の感作性を提供する。通常相（キノア・サポニンの分析；Ｂｕｒｎｏｕｆ−Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ ａｎｄ Ｄｅｌｆｅｌ， １９８４）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１）の両方を用いることができるが、ＲＰ−ＨＰＬＣの欠陥は化合物が水性可動相内に沈積し易いことである。
【０２０３】
（ｉｘ）  加水分解後の糖の分析
例えば、酢酸エチル−メタノール−水−酢酸（６５：２５：１５：２０）及びｎ−ブタノール−酢酸エチル−ｉ−プロパノール酢酸−水（３５：１００：６５：３５：３０）などの溶媒を用いてシリカ・ゲル・プレート上でＴＬＣで単糖類の分析を行うことができる（Ｓｈｉｒａｉｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。検出は通常、ｐ−アニシジン・フタラート、ナフトレソルシン、チモール硫酸（Ｋａｔｎｉｎｇ ａｎｄ Ｗｅｇｓｃｈａｉｄｅｒ， １９７１）あるいは塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ， １９５０； Ｋａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１）を用いて行なわれる。あるいは、単糖類の定量分析はＧＣ又はＨＰＬＣででも可能である。
【０２０４】
糖の分析に関しては、アセトニトリル水（７５：２５）を用いてのＮＨ２結合カラム（Ｇｌｏｍｂｉｔｚａ ａｎｄ Ｋｕｒｔｈ， １９８７）上での分析；屈折率検出も同時に行なわれるＣ−１８カラム（アセトニトリル水４：１）上での分析；定量的な目的のための、ＨＰＬＣピークと標準値の比較（Ａｄｉｎｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， １９８７）；０．００５Ｍ硫酸を溶離剤（０．４ｍｌ／分）として用いたＡｍｉｎｅｘイオン排他ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ）での分析（Ａｎｉｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０）；及びＨＰＬＣによる（５％塩酸−メタノールによるサポニンのメタノール溶解とその後に行われるメチル糖分のｐ−ブロモベンゾイル化によって形成される）糖ｐ−ブロモベンゾイルの分析及び真性の誘導体との比較による識別（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９２）などのステップを含んでいる。
【０２０５】
ＧＣの場合、前もってシリル化された糖が用いられ（Ｗｕｌｆｆ， １９６５）、あるいは酢酸アルジトール誘導体のＧＣ−ＭＳ分析が行われる。適切に誘導体化された単糖類のＧＣ−フーリエ変換ＩＲ（ＦＴＩＲ）分析もそれに替わり得る手順である（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ， １９８９）。
【０２０６】
最も一般的に見られる糖類はＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フコース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キノボース、Ｄ−グルクロン酸、そしてＤ−リボースである。
【０２０７】
ＩＩＩ．  上記化合物の誘導体
ここの詳細に述べてあるように、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドを操作してそれらに新しい特性、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより長い半減期、あるいはその他の好適な性質などを付与することによって一定の利点が得られることが考えられる。こうした技術には、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドの混合物、あるいは個々のモノテルペン／トリテルペン分子の操作あるいは修正、糖の修正あるいは除去、そしてモノテルペン／トリテルペン化合物の不活性担体、例えば脂質、担体蛋白質、親油性蛋白質、その他のトリテルペン成分、糖などを含む膜可溶性／透過性を付与したり細胞内へのアクセスを可能にする組成物や、免疫グロブリンやＦｃ蛋白質を含む種々の蛋白質、あるいは非蛋白質成分への結合などの手順を含んでいる。なお、より長い半減期とは『ゆっくりした放出』のために使われる医薬品と同じ程度という意味ではない。ゆっくり放出される製剤は通常、一定の期間に定量の薬品レベルが保たれるように設計されている。本発明によるモノテルペン／トリテルペン・グリコシドなどの医薬品の半減期の増大とは、投与した場合のプラスマ・レベルが高くなり、そのレベルが長期間維持されるが、その化合物の薬力学によって徐々に低下してくるようにすることを意図している。
【０２０８】
（ｉ）   モノテルペン／トリテルペンの結合及び結合分子
上に述べたように、ここで示されているモノテルペン／トリテルペン化合物は、本発明の化合物で治療可能な程度の病気を有する患者の治療において上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシドの有効性を改善するために特定の分子に結合することができる。そうした分子の例としては、向標的剤及び上記モノテルペン／トリテルペン化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増大させる薬品、あるいは上記モノテルペン／トリテルペン組成物を膜透過性にする薬品などがある。このモノテルペン／トリテルペン化合物は、本明細書で開示されている上記化合物の抗腫瘍活性などの生物学的活性を大幅に損なわずに、個々の領域がその意図された機能を果たすことができるようないずれの方法でもそうした二次的分子に結合することができる。
【０２０９】
本発明による上記モノテルペン／トリテルペン化合物は二次的化合物に直接結合することもできるし、リンカー基を介して結合してもよい。『リンカー基』という用語は、上記モノテルペン／トリテルペン化合物あるいはトリテルペン混合物を共有結合で結合させるために用いることができ、そして、上記モノテルペン／トリテルペン化合物の生物学的活性に干渉しない１つ以上の二機能性分子を意味している。このリンカー基は、その結合箇所が、その化合物の抗腫瘍性などの生物学的活性に干渉しない限り、上記モノテルペン／トリテルペンのいずれの部分に結合させてもよい。
【０２１０】
本発明のモノテルペン／トリテルペン化合物を二次的作用物質に結合させるための具体例としては、上記モノテルペン／トリテルペンの活性エステルを調製し、次いで、上記活性エステルを結合される作用物質の求核性官能基との反応によって行われる。そうした活性エステルは、例えば、トリテルペン上のカルボキシル基をジクロロヘキシカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ），そして１−（３−ジメチルアミノ・プロピル）−３−エチルカルボジイミド・メチオダイド（ＥＤＣＩ）などの脱水剤の存在下でアルコールと反応させることによって調製される。接合体を形成するためのＥＤＣの使用は米国特許第４，５２６，７１４；ＰＣＴ出願広報第ＷＯ９１／０１７５０、及びＡｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０に開示されており、これらの開示は引用によって本明細書に組み込まれる。上記モノテルペン／トリテルペンに結合される作用物質、例えば、腫瘍固有抗体あるいは感染された細胞に固有の抗体は、次に水溶液内で活性化されたエステルと混合されて接合体を形成する。
【０２１１】
モノテルペン／トリテルペンと上記作用物質との間のリンカー基が望ましい場合、上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシドの活性エステルを上に述べたように調製して、例えば２−アミノエタノール、アルキレン・ジアミン、グリシンなどのアミノ酸、あるいはグリシン・テルト−ブチル・エステルなどのカルボキシ保護アミノ酸などのリンカー基と反応させることができる。そのリンカーが保護されたカルボキシ基を含んでいる場合は、その保護基は取り除かれ、そのリンカーの活性エステルが（上に述べたように）つくられる。その活性エステルを次に第２の分子と反応させて接合体を形成する。あるいは、上に第２の作用物質を無水コハク酸を用いて誘導体化し、作用物質−コハク酸接合体を形成し、それをＥＤＣあるいはＥＤＣＩの存在下で、上記リンカー上に遊離アミノ酸あるいは水酸基を有しているモノテルペン／トリテルペン・リンカー誘導体で濃縮することができ（例えば、ＷＯ９１／０１７５０参照。同開示は引用によってその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２１２】
あるいは、遊離アミノ基を有するリンカーを含むモノテルペン／トリテルペン・グリコシド接合体を形成して、そのアミノ基を蛋白質抗原の遊離スルフィジル基と反応するスルホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドシクロヘキサン）−１−カルボキシレートなどの異種二機能性クロス・リンカーとクロスリンクさせることも可能である。
【０２１３】
上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシドはアルデヒド基のアミノ・リンカーとの反応によってリンカー基に結合させて、中間的なイミン接合体を形成し、その後ホウ水酸化ナトリウム、あるいはシアノホウ水酸化によって還元する方法も可能である。そうしたリンカーの例としては、２−アミノエタノールなどのアミノ・アルコール類、エチレンジアミン、１，２−プロピレンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、などのジアミノ化合物がある。そして、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドは次に、最初に無水コハク酸を用いてコハク酸化誘導体を形成し、次に、ＤＣＣ、ＥＤＣ，あるいはＥＤＣＩとの上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシド−リンカー接合体を用いて濃縮する。
【０２１４】
加えて、上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシド又はアグリコンはペリオデートで酸化して、そこで形成されたジアルデヒドを上に挙げたアミノ・アルコールあるいはジアミノ化合物で濃縮することもできる。リンカー上の遊離水酸基あるいはアミノ基は、ＤＣＣ、ＥＤＣ，あるいはＥＤＣＩの存在下で上記抗原のコハク酸誘導体を用いて濃縮することができる。この技術分野では多くのタイプのリンカーが知られており、トリテルペン接合体の形成に用いることができる。本発明で利用できるリンカーの例を以下の表４に示す。
【０２１５】
（表４は異種二機能性クロスリンカーを示す。）
【表４】
2004517131.tif 000015
【０２１６】
（ｉｉ）  合理的な薬品設計
合理的な薬品設計の目的は生物学的に活性のある化合物と構造的に類似したものをつくることである。そうした類似物をつくることで、天然の分子より活性度が高くより安定した、そして変化に対しては異なった感作性を示し、あるいは他の種々の分子の機能に影響を及ぼす薬品を創りだすことが可能になる。１つの方式では、本明細書で述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物の３次元構造、あるいはその断片をつくりだすことであろう。これは、Ｘ線結晶学、コンピュータ・モデリング、あるいはそれら両方の組み合わせによって達成することが可能であろう。もうひとつの方法は上記モノテルペン／トリテルペン分子全体の官能基をランダムに置換して、機能に対してもたらされる影響を調べる方法であろう。
【０２１７】
機能的アッセイで選択されたモノテルペン／トリテルペン化合物特異性抗体を単離して、その結晶構造を解明することも可能である。原理的に、この方式はその上に二次的な薬品設計を構築するための薬物コアを生み出すことができる。機能的、薬理学的に活性のある抗体に対する抗イディオタイプ抗体を発生させることで、蛋白質結晶学的研究ステップを完全に迂回することも可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合サイトは最初の抗原の類似物であることが予想される。この抗イディオタイプは化学的あるいは生物学的につくりだされた一連のペプチドからペプチドを識別、単離するために用いることができるであろう。抗イディオタイプは抗体を抗原として用いることで、抗体をつくるためにここで述べられている手順によって発生させることができる。
【０２１８】
従って、モノテルペン／トリテルペン化合物から出発して、生物学的活性、例えば抗炎症性作用あるいは抗腫瘍作用がより改善された薬を設計することができる。化学的分離手順と本明細書の記述によって、十分な量の本発明によるモノテルペン／トリテルペン化合物をつくりだして結晶学的研究を行なうことができる。加えて、これらの化合物の化学的性質に関する知識から構造と機能の関係をコンピュータで予測することも可能である。
【０２１９】
ＩＶ．  トリテルペン化合物による癌の治療
癌の進行過程において、哺乳動物の細胞は遺伝子的に決められた一連の変化を受け、最終的に異常な増殖を示すことになる。これは、通常、外部的な作用物質や刺激が１つあるいは複数の細胞内で遺伝子的な変化を引き起こす発症と呼ばれるステップ（１）と、炎症を含む場合もあるさらなる遺伝子的及び代謝上の変化を伴う進行と呼ばれるステップ（２）を通じて起きる。『進行段階』中に、細胞はアポトーシスが阻止される細胞成長の段階に代謝移行する。
【０２２０】
癌細胞は細胞サイクルの調整ステップの制御の喪失に加えて、アポトーシス的制御の喪失も特徴としている。癌細胞（悪性細胞）は悪性腫瘍が発生すると、発症及び進行段階中に一連の代謝変化を通じて通常の成長制御メカニズムから逸脱してしまう。これらの変化は細胞内の遺伝子変化の結果である。これらの遺伝子変化は（ｉ）突然変異の活性化及び／又はプロトオンコジーンの発現の増大、及び／又は（ｉｉ）突然変異の不活性化及び／又は１つ以上の腫瘍抑制遺伝子の発現の低下などを含む場合がある。ほとんどのオンコジーンと腫瘍抑制遺伝子生成物は細胞サイクルの入口と出口を制御し、分化を促進し、ＤＮＡの損傷を検出し、その修復メカニズムを開始させ、そして／あるいは細胞死プログラムを調節する信号形質導入経路の成分である。ほとんどすべての腫瘍は複数のオンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子に突然変異を有している。従って、細胞成長、分化、ＤＮＡ損傷制御及びアポトーシスを調節するために複数の並列的メカニズムを用いていると考えることができる。
【０２２１】
ここで述べられているトリテルペン化合物は癌を予防する目的で、あるいは癌が検出された後それを治療するためにそうした必要を有する人に投与することができる。癌の発症及び進行を抑制するため、癌／悪性細胞を殺すため、細胞成長を抑制するため、アポトーシスを誘発するため、転移を抑制するため、腫瘍サイズを縮減させるため、そして腫瘍細胞の悪性表現形を逆転あるいは減少させるために、本発明の方法と組成物を用いて、ここで述べられているトリテルペン組成物を用いて『標的』細胞とコンタクトすることができるであろう。これは腫瘍又は腫瘍細胞を上記トリテルペン組成物を含む単一の組成物あるいは医薬品製剤と接触させるか、あるいは腫瘍又は腫瘍細胞を、１つの組成物がトリテルペンを含み、他方が第二の作用物質を含むような複数の個別組成物と接触させることで達成することができる。
【０２２２】
本発明での治療に適した好ましい癌細胞は皮膚、結腸、子宮、卵巣、膵臓、肺、膀胱、乳房、腎臓、及び前立腺癌などの上皮癌を含む。他の標的癌細胞は、脳、肝臓、胃食道、頭部及び首、睾丸、子宮頚部、リンパ系、咽頭、食道、耳下腺、胆道、直腸、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、及び甲状腺の癌で、扁平上皮細胞腫瘍、腺癌、小細胞癌、神経膠腫、神経芽細胞腫などもこれに含まれる。しかしながら、このリストは説明の目的のためだけであって、限定的なものではなく、どの腫瘍細胞でもこのトリテルペン化合物で治療できる可能性はある。上に述べたタイプの腫瘍細胞及びその他の腫瘍細胞の治療における上記化合物の相対的効果を確認するためのアッセイ方法は本明細書に具体的に述べられており、本開示の関係する分野の当業者には明らかであろう。
【０２２３】
ここに述べられている化合物は好ましくは調剤学あるいは薬学的に許容される希釈剤あるいは担体を含む栄養補助食品あるいは医薬品組成物として投与される。上記担体の性質は用いられる化合物の、可溶性及び／又は投与の形態を含む化学的性質に依存している。例えば、経口投与が望ましい場合、固体担体が選択され、静脈内投与の場合には液体担体が用いられる。
【０２２４】
『調剤学あるいは薬学的に許容される』とは、動物やヒトに投与された場合に悪い、アレルギー性の、あるいはその他の望ましくない反応をつくりださない分子集団あるいは組成物を意味している。『薬学的に許容される担体』とは、ここで用いられる場合、すべての溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌及び防黴剤、異性体あるいは吸収遅延剤などを含んでいる。薬学的に活性のある物質のための媒体及び作用物質の使用はこの技術分野では周知である。通常の媒体あるいは作用物質が上記活性成分と共存できない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が考えられる。その組成物に補助的な成分も組み込むことができる。
【０２２５】
ａ．  栄養補助食品
栄養補助食品は好ましくは相乗効果のある天然製品及び健康を促進する補助物で構成される多成分系である天然成分の調製品である。栄養補助食品化合物は薬用植物から誘導することができる。栄養補助食品をつくるために用いられている多数の植物やハーブに関する情報はＧｅｒｍａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｅ． Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ， Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， 及び栄養補助食品を用いて行なわれた多数の臨床実験について記載しているＡｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌの季刊出版物であるＨｅｒｂａｌＧｒａｍなどにまとめられ、参照できるようになっている。
【０２２６】
多数の植物についての説明、その成分、使用法、（いろいろな形態での用量）、作用、禁忌、副作用、通常の薬品との相互作用、投与モード、適用期間、規制、ＡＨＰＡ植物安全レーティング、そしてコメントなどの情報が利用でき、それらの植物としてはコケモモ、カスカラ、ネコノツメ、トウガラシ、ツルコケモモ、デビルズ・クロー、ドンカイ（ｄｏｎｇ ｑｕａｉ）、 エキナセア、オオマツヨイグサ・オイル、ナツシロギク、ガーリック、ジンジャー、イチョウ、アジア薬用ニンジン、シベリア薬用ニンジン、ヒドラスチス、ゴツ・コラ（ｇｏｔｕ ｃｏｌａ）、ブドウ種、緑茶、サンザシ、カワカワ、甘草、オオアザミ、ノコギリバルメット、聖ヨハネ草、そしてカノコソウなどが含まれる。
【０２２７】
これら栄養補助食品化合物の作用は迅速あるいは／及び短期間のものである場合もあり、あるいは長期的な健康目的の達成に役立つ場合もある。本明細書ではアカシア・ビクトリアエから誘導された植物薬についても述べられている。乾燥され、すりつぶされたアカシア・ビクトリアエの根と鞘、あるいはこれらの組織からの抽出物を薬学的に許容される媒体に溶かしたもので構成される栄養補助食品組成物は、とりわけ、炎症性疾患と癌の予防と治療のための自然的アプローチとして有用である。これらの栄養補助食品組成物は腫瘍形成の発症と進行の阻止、及び悪性癌細胞におけるアポトーシスの誘導にも用いることができる。ここで開示されている栄養補助食品組成物は抗炎症、抗黴、抗ウイルス、抗変異、殺精子あるいは避妊用、心臓血管及びコレステロール代謝調節剤として用いることができる。これらの栄養補助食品は緩衝剤や溶媒、希釈剤、不活性担体、オイル、クリーム、あるいは食用素材内に入れることもできる。
【０２２８】
栄養補助食品は経口的に投与することもできるし、錠剤やカプセルの形状で投与することもできる。バレッツ食道痙攣症、炎症性腸疾患、結腸癌及びその他の体内腫瘍などに対しては経口摂取が望ましい。
【０２２９】
あるいは、上記栄養補助食品は皮膚に局所的に提供できるアカシア・ビクトリアエの根や鞘の抽出物をオイルやクリームに含んだ軟膏の形状であってもよい。この形状の栄養補助食品は癌の発症予防には有益である。これらの栄養補助食品製剤の使用は、上皮細胞の前悪性あるいは悪性状態への進行を抑制するための方法を提供してくれ、この方法では治療的に有効な量の栄養補助食品組成物は任意の哺乳動物細胞に投与される。これは皮膚癌などの上皮癌に特に有効である。
【０２３０】
ｂ．  医薬品
さらに本明細書には部分的あるいは全体的に精製され、構造的に特徴づけがなされたアカシア・ビクトリアエからの単離組成物が記載されている。これらモノテルペン／トリテルペン化合物の精製と特徴づけは実施例に詳細に示す。Ｄ１、Ｇ１及びＢ１は完全に精製された３つの組成物で、それらの構造的特徴づけはほぼ完璧である（図３９、図４０及び図４１）。癌細胞株上でこれらの化合物を用いて行われたバイオアッセイは、細胞成長抑制及び悪性細胞におけるアポトーシスの誘発を示した（図４３、図４４）。さらに、アカシア・ビクトリアエから単離されたこれらサポニンの部分的に精製された組成物は発癌物質ＤＭＢＡに露出されたマウスにおいて化学防御的効果も示している（図８、９、１１、１２及び１３）。従って、これらの組成物は抗癌性を有しており、癌細胞内でアポトーシスを誘発するいくつものメカニズムを発揮する。これら化合物の医薬品組成物はそれらだけで、あるいは化学療法、放射線治療、外科施術、遺伝子治療、及び免疫療法など他の形態の癌治療との組み合わせた強力な化学療法剤として用いることができる。組み合わせ療法については以下に詳細に述べる。当業者であれば有効な投与量及び組み合わせ治療処方は容易に分かるであろう。
【０２３１】
ｃ．  投与方法
（ｉ）  非経口的投与
本発明の１つの実施の形態は、例えば、静脈、筋肉内、皮下、あるいは腫瘍や疾病箇所への直接的な注入を含むその他の経路を通じての注射用に製剤された、モノテルペン／トリテルペン組成物の非経口的投与のための製剤を提供してくれる。モノテルペン／トリテルペン組成物を含む水性組成物の調製は本開示を参考にすれば当業者には自明であろう。通常、こうした組成物は液体溶液あるいは懸濁液のいずれかの形態で注射液として調製することができ、あるいは注射前に液体を加えて溶液や懸濁液をつくるために用いられるのに適した固体形状での調製も可能で、これらの製剤はエマルジョン化することもできる。
【０２３２】
遊離塩基あるいは薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液はヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混ぜ合わせた水を用いてつくることができる。グリセロル、液体ポリエチレン・グリコール、及びそれらの混合物、あるいはオイル内でその分散剤をつくることも可能である。通常の状態での保存と使用においては、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために保存剤を含んでいる。
【０２３３】
注射剤としての使用に適した医薬品形態は、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油あるいは水性プロピレン・グリコールなどを含む製剤；そして滅菌注射用溶液又は分散液を外挿的に使用するための滅菌粉末などを含んでいる。すべての場合に、この形状は滅菌したものでなければならず、注射器から出やすいようにする程度の流動性を有している必要がある。製造及び保存条件下で安定していることが必要であり、バクテリアや黴などの微生物の汚染作用から護られていなければならない。
【０２３４】
上記モノテルペン／トリテルペン化合物は中性又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩とは、例えば塩酸やリン酸などの無機酸や、酢酸、オキサル酸、マンデル酸などの有機酸でつくられる（蛋白質の遊離アミノ酸で形成される）酸添加塩などである。遊離カルボキシル基で形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、あるいはイソプロピルアミン、トリエチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩からつくることができる。
【０２３５】
担体も、例えば、水、エタノール、プロピル（例えば、グリセロル、プロピレン・グリコール、及び液体ポリエチレン・グリコールなど）、それらの適切な混合物、そして植物油などを含む溶液あるいは分散媒体であってよい。適切な流動性は、分散液の場合は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いて必要な粒子サイズを保持することにより、あるいは界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の阻止は種々の抗生及び抗黴剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメローサルなどを用いることによって行うことができる。多くの場合、砂糖や塩化ナトリウムなどの等張液を含んでいることが好ましい。注射用組成物の吸収時間を長くすることは、例えば、アルミニウム・モノステレート及びゼラチンなどの吸収を臆させる作用物質中で使用することによって可能である。
【０２３６】
滅菌注射液は必要な量の活性組成物を適切な溶媒内に、上に述べたような他の成分と共に組み込んで、その後ろ過滅菌することで調製することができる。分散液は通常、種々の滅菌された活性成分を基本分散媒と上に列記したものの中から必要な他の成分を含む滅菌媒体内に組み込むことによって調製される。滅菌注射液をつくるための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥で、これらは活性成分と事前に滅菌ろ過されたその溶液からの追加的な望ましい成分を含んだ粉末をつくりだす。
【０２３７】
（ｉｉ）  他の投与形態
本発明においては他の投与形態も可能である。例えば、本発明による上記モノテルペン／トリテルペン化合物は座薬や、場合によってはエアロゾル及び鼻腔内組成物として製剤化することができる。座薬の場合、媒体組成物としては通常の結合剤、そしてポリアルキレン・グリコールあるいはトリグリセリドなどの担体を含んでいる。こうした座薬は上記活性成分を約０．５％−約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％−約２％の範囲で含んでいる。
【０２３８】
経口投与用の組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、あるいは粉末などの形状で調製することができる。これらの組成物は、例えば、飲み込んだり吸入することで投与することができる。医薬品組成物を吸入する時は、その組成物はエアロゾルを含んでいることが好ましい。本発明において使用するために水性エアロゾルを調製するための手順の例は、米国特許第５，０４９，３８８に見ることができ、その開示は引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。乾燥したエアロゾル製剤の調製は、例えば、米国特許第５，６０７，９１５に開示されており、その開示も引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３９】
ここで述べられている化合物をＤＭＳＯなどの経皮製剤内に直接入れて投与するのも有効である。これらの組成物は同様に他のいずれの担体、賦形剤、あるいは希釈剤を含むことができる。その他の局所使用向けの製剤は一定の疾病兆候に対して投与することができる。例えば、鼻の粘膜を刺激したり繊毛機能を基本的に阻害せずに鼻腔内で使用するための製剤をつくることができる。本発明においては、水、食塩水などの希釈剤、あるいはその他の知られている物質を用いることができる。鼻腔剤はクロロブタノール及び塩化ベンズアルコニウムなどの保存剤を含んでいる場合もある。鼻腔粘膜による必要な化合物の吸収を強化するために界面活性剤を用いることもできる。
【０２４０】
（ｉｉｉ）  製剤及び治療
製剤化した場合、溶液は容量処方と両立するような方法で、そして治療的に有効な量で投与される。製剤の方法は、例えば、薬剤グレードのマニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン・セルロース、炭酸マグネシウムなど種々の賦形剤を用いて行なうことができる。
【０２４１】
通常、本発明の化合物は１％未満から約９５％、好ましくは約１０％から約５０％の上記成分を含んでいる。好ましくは、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから約２５ｍｇの間の範囲で患者に投与される。投与の頻度は患者の応答性に基づいて提供されるケアによって決められた。その他の有効な容量は容量応答曲線を通じて当業者によって容易に決めることができるだろう。
【０２４２】
投与の形態のいかんに拘わらず、本発明による適切な医薬品組成物は通常、意図された使用法に基づいて一定範囲の最終濃度を提供するために無菌水溶液などの許容される薬学的希釈剤や賦形剤と混合されたモノテルペン／トリテルペン組成物を一定量含んでいる。調剤技術は通常ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９８０に示されるように一般的に知られている。なお、エンドトキシンによる汚染は安全なレベル、例えば、蛋白質１ｍｇあたり０．５ｍｇ以下に抑えられるべきである。さらに、ヒトに投与する場合、製剤は米国ＦＤＡの生物学的基準に規定されているような無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度基準を満たしていなければならない。
【０２４３】
治療的に有効な容量は、本明細書に詳しく述べてあるような動物モデルを用いて簡単に決めることができる。例えば、臨床環境に移す前に適切な治療用量を最適化するために硬い腫瘍を有する実験動物がしばしば使われる。こうしたモデルは有効な抗癌戦略を決める上で非常に有効である。炎症及び種々の炎症状態の同様の動物モデルも使うことができる。
【０２４４】
いくつかの実施の形態で、患者に対して治療用組成物を連続的に提供するのが望ましい場合がある。静脈あるいは食道経由のルートの場合、これは滴下システムによって行なうことができる。局所適用の場合、反復的適用が用いられる。種々の投与方式で、制限された、しかし一定の量の治療剤を一定期間連続的に提供する遅放性製剤を用いる場合もある。内部的適用の場合、患部に対して連続的に灌流させるのが好ましい。これは、一部の場合、術後にカテーテル処理を行い、その後治療剤を連続的に投与することにより行なわれる。灌流の期間は特定の患者及び状況に応じて、医師が選択するが、その時間は１−２時間、２−６時間、約６−１０時間、約１０−２４時間、約１−２時間、約１−２週間、あるいはそれ以上にわかる。通常、連続的灌流による治療用組成物の用量は一回、あるいは複数回の注射によって投与される量と同じであり、その注射剤が投与される期間によって調節される。しかしながら、一般的には灌流の方が用量が高くなると考えられている。
【０２４５】
１．  治療手順
単独あるいは組み合わせ療法のいずれかでモノテルペン／トリテルペン化合物を使用するために２つの基本的な方式が本発明によって構想されている。第１はそれまで事前の化学、放射線、あるいは生物学的療法を受けていないか、あるいはこれまで全く治療を受けていない患者のいずれにおいても、転移性癌における使用である。患者は全身性投与、つまり、静脈、光化学、経口投与か、あるいは腫瘍内注射によって治療を受ける。投与される薬学的用量は１日あたり患者の体重１ｋｇあたり１０−２５ｍｇの重量、例えば約１３、１６、１９、及び２２ｍｇ／ｋｇ／日である。あるいは、１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日のモノテルペン／トリテルペン組成物、具体的には約、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、及び９０ｍｇ／ｋｇ／日のモノテルペン／トリテルペン組成物を含む医薬品組成物で治療することができる。
【０２４６】
治療コースは通常最低８週間継続する日毎の治療あるいは８週間にわたる週１回の注射を内容としている。医師の判断により、処方は腫瘍がさらに進行したり、あるいは応答が見られなくなるまで同じ方式で続けることができる。
【０２４７】
本発明の化合物の別の適用方法は、手術、化学治療、及び／又は放射線治療によって臨床状態の病気がなくなった患者に対するものである。補助的治療は病気の再発を防ぐために最低１年間、上に述べた処方で行なわれる。
【０２４８】
２．  癌の予防
モノテルペン／トリテルペン・グルコシド組成物の化合物及び混合物のもう１つの応用例は高リスク・グループの癌の予防である。そうした患者（例えば、乳癌、結腸癌、皮膚癌などの腫瘍を発症しやすいと遺伝的に判断されている人々）に対しては、癌を予防するために、経口（胃腸腫瘍の場合）、皮膚への局所的適用（皮膚反応）、あるいは少なくとも１年間あるいはそれ以上の期間全身投与する。こうした使用法は結腸直腸のポリープ、あるいは皮膚、肺、あるいはその他の器官のその他の前悪性病変などの患者及びそうした良く分かっている前腫瘍形成状態の病変を有している人々も対象としている。例えば、バレッツ食道炎、炎症性腸疾患、慢性膵炎、慢性前立腺炎、家族性ポリープ症、あるいは光線性角化症などの患者など、前悪性炎症状態などの炎症性疾患患者も対象になる場合が多い。
【０２４９】
３．  臨床手順
本発明によるトリテルペン化合物を用いた癌の治療を容易に行うことができるようにするための臨床手順が本明細書に述べられている。この手順に従って、例えば卵巣癌、すい臓癌、腎臓癌、前立腺癌、肺あるいは膀胱癌などの癌の組織学的証拠を有する患者が選択される。患者はそれまでに化学的、放射線、あるいは遺伝子治療を受けている場合もあれば、それらの治療を受けていない場合もある。最も良いのは、それらの患者が（２，０００／ｍｍ３以上の抹消絶対顆粒球カウント、そして１００，０００／ｍｍ３血小板カウントで定義される）十分な骨髄機能、そして十分な肝臓機能（ビリルビン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）、そして十分な腎臓機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）を有している場合である。
【０２５０】
手順としては、１回の投与で、患者の体重１ｋｇあたり、トリテルペン化合物を１０−２５ｍｇ程度含む医薬品化合物を、腫瘍内注射によって投与することを必要としている。４ｃｍ以上の腫瘍に対しては、４−１０ｍｌ（好ましくは１０ｍｌ）の体積が投与され、４ｃｍ未満の腫瘍に対しては、１−３ｍｌの体積（好ましくは３ｍｌ）が用いられる。１回の投与にあたって、約１ｃｍあるいはそれ以上の間隔をおいて、０．１−０．５ｍｌの体積で複数回の注射が行われる。
【０２５１】
治療コースは６回の投与が２週間にわたって行われる。医師の選択によって、処方は二週間毎に６回の投与、あるいはそれ以下の頻度（毎月１回、２ヶ月に２回、あるいは３ヶ月に１回など）のベースで行われる場合もある。
【０２５２】
患者が手術的切除に耐えられる場合、腫瘍は少なくとも２回連続する２週間の治療コースについて上に述べられた手順で治療される。２回目（あるいはさらに、例えば３回目、４回目、５回目、６回目、７回目、８回目など）の投与治療が終了してから１週間以内に、患者は外科的切除を受ける。切開を行う前に、上記トリテルペン化合物を含む医薬品１０ｍｌの手術部位（手術床）に投与して、少なくとも６０分間接触状態を保持できるようにする。傷を塞いだ後、ドレインあるいはカテーテルをその内部に置く。手術から３日目に、医薬品組成物をさらに１０ｍｌ、ドレインを通じて投与し、手術床と少なくとも２時間接触状態を保つようにする。その後、吸引による除去が行われて、臨床的に適切な時期にドレインが取り出される。
【０２５３】
４．  人為的及び自然の身体空洞部の治療
再発性癌の主な発症源の１つは腫瘍切除後に主な腫瘍箇所、あるいは局所的、部位的に残っている顕微鏡的スケールの小さな残留疾患である。さらに、身体の空洞部に顕微鏡的なレベルの腫瘍細胞が播かれているような類似した状況がある。そうした顕微鏡レベルの疾患の有効な治療は治療に大幅な前進をもたらす。
【０２５４】
従って、いくつかの実施の形態では、癌は手術的切開で『空洞』をつくりだすことによって除去することができる。手術時、及び手術後（定期的あるいは継続的に）、ここに述べられている治療用組成物をその身体空洞部に投与する。つまり、要するに、その空洞部表面の『局所的』治療を行う。組成物の体積はその空洞部の表面全体がその組成物によって接触されるのに十分なものでなかればならない。
【０２５５】
１つの実施の形態で、投与は単に治療用組成物を腫瘍切除で形成された空洞部に注入することによって行われる。他の実施の形態では、スポンジやスワブ、あるいはその他の装置を用いた機械的適用が望ましい。腫瘍除去後、及び最初の手術中にこうした方式のいずれかを用いることができる。さらに別の実施の形態では手術執刀分を閉じる前に、空洞部にカテーテルを挿入する。その後、そうした空洞に望ましい期間、連続的に潅流を行うことが望ましい。
【０２５６】
この治療法の別の形態では、口、咽頭、食道、喉頭、気道、胸膜空洞、腹膜空洞、あるいは睾丸、結腸、及びその他の内臓などを含む中空器官の空洞部など自然のままの身体空洞部を対象にしている。こうした状況では、その空洞部にかなり大きな一次腫瘍が存在している場合と、存在していない場合とがある。治療はそうした空洞部の顕微鏡的疾患を対象とするが、それ以前に除去されていなかったり、そうした空洞部に前腫瘍形成的病変がある場合には、一次腫瘍物質塊自体に影響を及ぼす場合もある。この場合も、これらの内臓器官や空洞表面に『局所的』適用を行うために種々の方法を用いることができる。例えば、喉頭内口空洞部は口腔スイッシングあるいは溶液によるうがいなどで行うことができる。しかしながら、喉頭部や気管内部の局所的治療には内視鏡による視認と治療用組成物の局所的伝達が必要になる場合もある。睾丸や結腸粘膜などの内臓器官の場合は注入によるカテーテルの内置、あるいはこの場合も膀胱鏡あるいはその他の内視鏡による直接の視認が必要な場合もある。胸膜や腹膜などの空洞部の場合は、カテーテルを注入するか、あるいはそれらの領域にアクセスできるようにする外科的手法が必要になる。
【０２５７】
（ｉｖ）  治療用キット
モノテルペン／トリテルペン組成物を含む治療用キットについても本明細書で述べる。こうしたキットは、通常、適切な容器手段を用いて、薬学的に許容される少なくとも１つのモノテルペン／トリテルペン組成物の製剤を含んでいる。こうしたキットは、上記モノテルペン／トリテルペン組成物を患者の処理を必要としている特定の領域に向かわせるための成分、あるいはモノテルペン／トリテルペン化合物と協力して作用する１つ以上の薬品、例えば、化学治療剤を含んでいる場合もある。
【０２５８】
このキットはいずれかの追加的成分を含んでいる、あるいは含んでいない上記モノテルペン／トリテルペン化合物を含んでいる単一の容器手段を含んでいたり、あるいは望ましい作用物質のそれぞれに対して個別の容器を持っている場合もある。そうしたキットの成分は１つ以上の液体溶液で提供される場合、それら液体溶液は水溶液で、無菌水溶液が特に好ましい。しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として提供してもよい。試薬や成分を乾燥粉末として提供する場合、上記粉末は適切な溶媒を加えることで再構成することができる。その溶媒も別の容器手段に入れて提供することも考えられる。キットの容器手段は通常は１つのガラス小瓶、フラスコ、試験管、ビン、注射器、あるいはその他の容器手段を含み、その内部にモノテルペン／トリテルペン・グリコシド及びその他の望ましい薬剤を、好ましくは等分して入れる。追加的な成分が含まれている場合、キットは通常第２のガラス小瓶、あるいはこれらの入れるためにその他の容器も含んでおり、個々の設計用量を投与できるようにする。これらのキットは、無菌、薬学的に許容できる緩衝液あるいはその他の希釈剤を含んでいる場合もある。
【０２５９】
これらのキットは１つ以上の針や注射器、あるいは点眼器、ピペット、あるいはその他の、製剤を動物や身体の疾患領域に注入あるいは塗付するための装置など、動物や患者に上記モノテルペン／トリテルペン組成物を投与するための手段を含んでいる場合もある。本発明によるキットは通常、市販用にしっかり密封するための、例えば、射出成型あるいは吹出し成型容器などその内部に望ましいガラス小瓶あるいはその他の装置を入れて保持するための、ガラス小瓶などを含むための手段を含んでいる。
【０２６０】
Ｖ．  化学治療の組み合わせと治療
本発明のいくつかの実施の形態で、トリテルペン組成物を、化学療法、放射線治療及び治療用蛋白質あるいは遺伝子など抗腫瘍活性を有する１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与するのが望ましい場合もある。こうした方法は、本発明の化合物だけを用いた治療で達成される全体的な抗腫瘍活性を増強したり、複数の薬品の使用によって形成される腫瘍抵抗を阻止したり克服するために用いることができる。
【０２６１】
本発明を第２の化学療法剤の投与と組み合わせて用いるためには、動物内での組み合わせ抗腫瘍作用がもたらされるような方法で、トリテルペン組成物を第２の化学療法剤と組み合わせて投与するだけで十分である。これらの薬品は、従って、腫瘍脈管構造内でのそれらの組み合わせ効果、あるいは腫瘍環境内での組み合わせ作用をもたらすように有効な量と時間で提供される。こうした目標を達成するために、上記トリテルペン及び化学療法剤をその動物に、１つの組成物として、あるいは異なった投与経路を用いる２つの異なった組成物のいずれかの形状でその動物に同時に投与することができる。
【０２６２】
あるいは、上記トリテルペン組成物による治療を化学療法剤、放射線治療、あるいは蛋白質または遺伝子治療と前、あるいは後に数分から数週間の範囲で時間的間隔をおいて行ってもよい。第２の薬剤とトリテルペン組成物を個別に動物に投与する実施の形態においては、通常、追加的な薬剤とトリテルペン組成物がまだ腫瘍に有効な組み合わせ効果を発揮できるように各投与間にかなりの時間が経過しないようにするであろう。そうした例においては、前の投与から５分間から約１週間程度、より好ましくは約１２−７２時間以内の期間で両方の薬剤が腫瘍に接触するようにし、２４−２８時間程度の時間的遅延を設けるのが最も好ましいであろう。いくつかの場合、治療期間を拡大することが望ましく、例えば、それぞれの投与の間の間隔を数日（２、３、４、５、６あるいは７日間）、あるいは数週間（１、２、３、４、５、６、７あるいは８週間）とする場合もある。トリテルペン・グリコシドあるいは第２の薬品のいずれかを１回だけ投与することが望ましい場合も考えられる。腫瘍の退縮を達成するためには、投与の回数には関係なく、腫瘍の成長を抑制するのに有効な組み合わせ量で両方の薬品を投与される。
【０２６３】
種々の薬剤が個々に開示されている組み合わせ治療法においての使用に適している。具体例として考えられる化学療法剤は、例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カンプトセチン、アクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、そしてシスプラチン（ＣＤＤＰ）などである。
【０２６４】
当業者であれば容易に分かるであろうが、化学療法剤の適切な用量は臨床治療ですでに用いられているのとほぼ同じであり、化学療法剤は単独で投与される場合もあり、あるいは他の化学療法剤との組み合わせで用いられる場合もある。例としてのみ示すのであれば、シスプラチン、及びその他のＤＮＡアルキル化剤を用いることもできる。癌の治療にはシスプラチンが広く用いられており、用いられる有効な用量は３週間毎に５日間２０ｍｇ／ｍ２の投与を全部で３週間継続する方式である。シスプラチンは経口的に吸収されるものではなく、従って、静脈注射、皮下、腫瘍内、あるいは腹膜内注射によって投与されねばならない。
【０２６５】
さらに別の有効な薬品はＤＮＡ複製、有糸分裂、そしてクロモソーム分離を阻害する化合物などがある。そうした化学療法剤にはドキソルビシンとしても知られているアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどである。腫瘍の臨床的対応で広くも用いられているこれらの化合物はアドリアマイシンの場合、２１日間の間隔で２５−２７ｍｇ／ｍ２の量で静脈注射する例から、エトポシドの場合静脈注射であれば３３−５０ｍｇ／ｍ２、さらに経口投与であればその倍の量までの範囲である。
【０２６６】
ポリヌクレオチド前駆体の合成及び忠実さを葉阻害する薬品も用いることができる。特に有益なのは、広範なテストを行い、容易に入手できる薬品である。そうしたものとして５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの薬品は腫瘍組織では優先的に用いられ、腫瘍細胞に向かわせる上でこれらの薬品を特に有効にしている。非常に毒性が高いが、５−ＦＵは局所麻酔を含み、広範囲の担体で適用可能で、静脈内投与は３−５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量が一般的には用いられている。
【０２６７】
組み合わせ療法との関連で有効な化学療法剤の具体例を表５に示す。この表に示す薬剤のそれぞれは具体例であって、本発明の範囲を限定するものではない。この点で、経験を積んだ医師は”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、１５版、３３章、特に６２４−６５２を参照されたい。当然のことであるが治療を受ける個人の状態に応じて、用量に一定の変更はあり得るであろう。投与に責任を有する人々は、いずれにせよ、その特定の個人に対して適切な用量を決めることになろう。さらに、ヒトに対する投与の場合、製剤は無菌性、発熱性、一般的安全性、そして純度に関してＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準を満たしていなければならない。
【０２６８】
（表５は腫瘍性疾患で有効な化学療法試薬を示す。）
【表５】
2004517131.tif 000016
2004517131.tif 000017
【０２６９】
ＤＮＡ損傷を起こし、広範に用いられてきたその他の作用因子としては、γ線、Ｘ線、及び／又は腫瘍細胞に対する放射性同位元素の直接的投与がある。超短波及び紫外線照射などのＤＮＡ損傷因子のその他の形態も考えられる。これらの作用因子のすべてはＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製と修復、そしてクロモソームの構成と保持に広範な影響を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の線量範囲は一定期間（３−４週間）毎日照射される場合は５０−２００レントゲン、１回だけの照射の場合は２０００−６０００レントゲンである。放射性同位元素の場合その範囲は広く、その同位元素の半減期、放出される放射線の強度とタイプ、そして腫瘍細胞による摂取量などに依存する。
【０２７０】
ＶＩ．  向標的癌治療
本明細書に述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物は、上記化合物を特定の細胞、例えば、炎症を起こしている細胞、腫瘍細胞など特定の細胞に向かわせる１つ以上の分子と結合させることができる。標的に向かわせるのは、治療の箇所、例えば炎症あるいは腫瘍サイトなどでの薬品の全般的なレベルを向上させると同時に、その薬品に対する全身的露出を最低限に抑えるために用いることができる。
【０２７１】
上に述べた化学療法剤と共通しているが、向標的トリテルペン化合物の使用は化学療法剤など第２の薬剤と組み合わせて用いることができる。トリテルペンと上記第２の薬剤の両方を腫瘍環境内の同じあるいは異なった標的に向けられる。これによって追加的な、あるいは追加的というよりはさらに高い、あるいは非常に相乗的な結果をもたらしてくれる。
【０２７２】
上記モノテルペン／トリテルペン化合物との組み合わせで用いられる具体的な向標的薬剤は病変領域にモノテルペン／トリテルペン分子を運ぶことができる向標的薬剤、つまり、炎症の箇所、あるいは腫瘍サイト内に局所化できる薬剤である。腫瘍領域の脈管構造に向かう薬剤も同様に望ましい。上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシド化合物をモノテルペン／トリテルペン化合物のある程度広い、あるいは全身的分散に伴って観察される潜在的副作用の抑制を伴う形態、あるいは伴わない形態で有効濃度を高められるようにするように上記モノテルペン／トリテルペン・グリコシドを標的に向かわせることも具体的に考えられる。特に、向標的薬剤は炎症を起こしている細胞に対する抗体である場合もある。
【０２７３】
（ｉ）  腫瘍細胞標的及び抗体
従って、炎症症状、前悪性、あるいは腫瘍細胞に対して、その腫瘍細胞の相対的に固有なマーカーあるいは抗原に結合できる領域を有する二重特異性抗体を向かわせることができる。例えば、抗体−モノテルペン／トリテルペン組成物接合体を標的腫瘍細胞に結合させることによって特定の腫瘍細胞を抑制したり殺したりすることができる。
【０２７４】
多くのいわゆる『腫瘍抗原』について述べられており、そのいずれでも本発明の向標的形態との関連で標的として用いることができる。多数の固体腫瘍関連抗原の具体例を以下に示す。そうした抗原に対する抗体の調剤と使用は当業者に周知であり、本明細書に具体的に説明されている。抗体の具体例としては婦人科系腫瘍箇所（例えばＡＴＣＣカタログ参照）からのもの、例えばＯＣ １２５、ＯＣ １３３、ＯＭＩ、Ｍｏ ｖ１、Ｍｏ ｖ２、３Ｃ２、４Ｃ７、ＩＤ３、ＤＵ−ＰＡＮ−２、Ｆ ３６／２２、４Ｆ７／７Ａ１０、ＯＶ−ＴＬ３、Ｂ７２．３、ＤＦ３、２Ｃ８／２Ｆ７、ＭＦ１１６、Ｍｏｖ１８、ＣＥＡ １１−Ｈ５、ＣＡ １９−９（１１１６ＮＳ１９−９）、Ｈ１７−Ｅ２、７９１Ｔ／３６、ＮＤＯＧ２、Ｈ３１７、４Ｄ５，３Ｈ４，７Ｃ２，６Ｅ９，２Ｃ４，７Ｆ３，２Ｈ１１，３Ｅ８，５Ｂ８，７Ｄ３，ＳＢ８、ＨＭＦＧ２、３．１４．Ａ３；乳房腫瘍サイトからのもの、例えばＤＦ３、ＮＣＲＣ−１１、３Ｃ６Ｆ９，ＭＢＥ６、ＣＬＮＨ５、ＭＡＣ４０／４３、ＥＭＡ、ＨＭＦＧ１ ＨＦＭＧ２、３．１５．Ｃ３、Ｍ３，Ｍ８，Ｍ２４、Ｍ１８、６７−Ｄ−１１、Ｄ５４７Ｓｐ，Ｄ７５Ｐ３，Ｈ２２２、抗ＥＧＦ、ＬＲ−３、ＴＡ１、Ｈ５９、１０−３Ｄ−２、ＨｍＡＢ１，２、ＭＢＲ１，２，３、２４．１７．１、２４．１７．２（３Ｅ１．２）、Ｆ３６／２２Ｍ７／１０５、Ｃ１１，Ｇ３，Ｈ７、Ｂ６．２、Ｂ１．１、Ｃａｍ１７．１、ＳＭ３、ＳＭ４、Ｃ−Ｍｕｌ（５６６）、４Ｄ５ ３Ｈ４，７Ｃ２，６Ｅ９，２Ｃ４，７Ｆ３，２Ｈ１１，３Ｅ８，５Ｂ８、７Ｄ３、５Ｂ８、ＯＣ１２５、ＭＯｖ２、ＤＵ−ＰＡＮ−２、４Ｆ７／７Ａ１０、ＤＦ３、Ｂ７２．３、ｃｃｃｃｃＣＥＡ １１、Ｈ１７−Ｅ２、３．１４Ａ３，ＦＯ２３Ｃ５；結腸直腸腫瘍サイトからのもの、例えばＢ７２．３、（１７−１Ａ）１０８３−１７−１Ａ、ＣＯ１７−１Ａ、ＺＣＥ−０２５、ＡＢ２、ＨＴ−２９−１５、２５０−３０．６、４４Ｘ１４、Ａ７、ＧＡ７３．３、７９１Ｔ／３６、２８Ａ３２、２８．１９．８、Ｘ ＭＭＣＯ−７９１、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＩＤ３、ＣＥＡ １１−Ｈ５、２Ｃ８／２Ｆ７、ＣＡ−１９−９（１１１６ＮＳ１９−９）、ＰＲ５Ｃ５、ＰＲ４Ｄ２、ＰＲ４Ｄ１；黒色腫サイトからのもの、例えば：４．１、８．２Ｍ１７、９６．５、１１８．１、１３３．２、（１１３．２）、Ｌ１，Ｌ１０，Ｒ１０（Ｒ１９）、Ｉ１２、Ｋ５、６．１、Ｒ２４、５．１、２２５．２８Ｓ、４６５．１２Ｓ、９．２．２７、Ｆ１１、３７６．９６Ｓ、４６５．１２Ｓ、１５．７５、１５．９５、Ｍｅｌ−１４、Ｍｅｌ−１２、Ｍｅ３−ＴＢ７、２２５．２８ＳＤ、７６３．２４Ｔ、７０５Ｆ６、４３６９１０、Ｍ１４８；胃腸腫瘍からのもの、例えば：ＩＤ３、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＯＶ−ＴＬ３、Ｂ７２．３、ＣＥＡ １１−Ｈ５、３．１４ Ａ３、Ｃ ＣＯＬＩ、ＣＡ−１９−９（１１１６ＮＳ １９−９）、及びＣＡ５０、ＯＣ１２５；肺腫瘍からのもの、例えば：４Ｄ５ ３Ｈ４，７Ｃ２，６Ｅ９，２Ｃ４，７Ｆ３，２Ｈ１１，３Ｅ８，５Ｂ８，７Ｄ３，ＳＢ８、ＭＯ ｖ２、Ｂ７２．３、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＥＡ １１−Ｈ５、ＭＵＣ ８−２２、ＭＵＣ ２−６３、ＭＵＣ ２−３９、ＭＵＣ７−３９；そして種々の腫��からのもの：例えば、ＰＡｂ２４０、ＰＡｂ２４６、ＰＡｂ１８０１、ＥＲＩＣ．１、Ｍ１４８、ＦＭＨ２５、６．１、ＣＡ１、３Ｆ８、４Ｆ７／７Ａ１０、２Ｃ８／２Ｆ７、ＣＥＡ１１−Ｈ５などである。
【０２７５】
腫瘍を明確にし、それに薬品を送り込むもうひとつの手段は、細胞によって発現される抗原の生物学的特性というよりは腫瘍細胞自体の特性によるものである。腫瘍細胞株の具体例としては多数のものが知られており、向標的薬剤をつくるために用いることができる。例えば、関連腫瘍タイプに向けて薬品を送り込むために抗腫瘍抗体をつくるために、細胞全体あるいは知られている細胞株からの細胞ホモジェネートを用いることができる。同様に、そうした腫瘍細胞株は種々のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの実施において用いることができる。この点に関して、経験を積んだ技術者であれば、（ＡＴＣＣカタログで）公開されており、利用することができるヒト細胞株を例示する目的のＡＴＣＣカタログを参照するであろう。具体的な細胞株としては：Ｊ８２、ＲＴ４、ＳｃａＢＥＲ、Ｔ２４、ＴＣＣＳＵＰ、５６３７、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＷ１０８８、ＳＷ１７８３、Ｕ−８７ ＭＧ、Ｕ−１１８ ＭＧ、Ｕ−１３８ ＭＧ、Ｕ−３７３ ＭＧ、Ｙ７９、ＢＴ−２０、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−ＶＩ、ＭＤＡ−ＭＤ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｃ−３３ Ａ、ＨＴ−３、ＭＥ−１８０、ＭＳ７５１、ＳｉＨａ、ＪＥＧ−３、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＳＫ−ＣＯ−１、ＨｕＴｕ８０、Ａ−２５３、ＦａＤｕ、Ａ−４９８、Ａ−７０４、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、ＳＫ−ＮＥＰ−１、ＳＷ８３９、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ａ−４２７、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、ＳＫ−ＬＵ−１、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００、ＥＢ１、ＥＢ２、Ｐ３ＨＲ−１、ＨＴ−１４４、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、ＲＰＭＩ−７９５１、ＳＫ−ＭＥＬ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−３、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ−３１、Ｃａｏｖ−３、Ｃａｏｖ−４、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ６２６、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＤＵ−１４５、Ａ−２０４、Ｓａｏｓ−２、ＳＫ−ＥＳ−１、ＳＫ−ＬＭＳ−１、ＳＷ６８４、ＳＷ８７２、ＳＷ９８２、ＳＷ１３５３、Ｕ−２ ＯＳ、Ｍａｌｍｅ−３、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、Ｃａｔｅ−１Ｂ、Ｔｅｒａ−１、Ｔｅｒａ−２、ＳＷ５７９、ＡＮ３ＣＡ、ＨＥＣ−１−Ａ、ＨＥＣ−１−Ｂ、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＫ−ＵＴ−１Ｂ、ＳＷ９５４、ＳＷ９５４、ＳＷ９６２、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＢＴ−４８３、ＢＴ−５４９、ＤＵ４４７５、ＨＢＬ−１００、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−３３０、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｔ−４７Ｄ、Ｈｓ７６６Ｔ、Ｈｓ７４６Ｔ、Ｈｓ６９５Ｔ、Ｈｓ６８３、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ６０２、ＪＡＲ、Ｈｓ４４５、Ｈｓ７００Ｔ、Ｈ４、Ｈｓ６９６、Ｈｓ９１３Ｔ、Ｈｓ７２９、ＦＨｓ７３８Ｌｕ、ＦＨｓ１７３Ｗｅ、ＦＨｓ７３８ＢＩ、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３、Ｈｓ６７、ＲＤ−ＥＳ、ＣｈａＧｏ Ｋ−１、ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８２、Ｈ９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ６７６Ｂ、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ８２０、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ、Ｄ２８３ Ｍｅｄ、Ｄａｏｙ、Ｄ３４１ Ｍｅｄ、ＡＭＬ−１９３及びＭＶ４−１１などである。
【０２７６】
他の適切な細胞株については、その後の年度のＡＴＣＣカタログを参照すれば情報をえることができる。又、特定の細胞株の入手が望ましい場合は、そうした細胞株を入手するための手段、及び／又はそれらの現段階で利用できる供給源は当業者には周知である。科学的文献を分析すれば、標的として用いたいいずれの細胞株でも適切に選択することは容易であろう。
【０２７７】
上に説明したように、抗体は腫瘍抗原標的を認識するための簡単な手段である。固体腫瘍抗原を対象とする多数の抗体が知られている。いくつかの有益な抗腫瘍抗体は上に示した。しかしながら、当業者には周知のように、上に示された抗体の一部は適切な生化学的活性を有しておらず、あるいは十分な腫瘍特異性を有していないので、治療用に用いることができない。細胞質抗原を認識する抗体の一例はＭＵＣ８−２２である。これらの抗体は通常はモデル・システムやスクリーニング・アッセイなど研究的な実施の形態で使用する場合のみ有益である。
【０２７８】
一般的に言って、本発明のこうした形態で使用するための抗体は好ましくは細胞表面でアクセスでき、好ましくは、あるいは具体的には炎症性細胞によって発現された抗原を識別する。そうした抗体はＫｄが２００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満であるように高い親和性を示すのが好ましく、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、あるいはその他の人体の維持にとって基本的な役割を果たしている器官や組織から選択される１つ以上の生命を支える上で基本的な正常な組織とは有意な反応を示さないものである。本発明の目的にとって最も重要な『生命を維持する』組織とは、低反応性の観点で言えば心臓、腎臓、中枢及び抹消神経系組織及び肝臓などである。ここで使用されている場合、『有意な反応』とは、免疫組織学にとって適切な条件の下で特定の組織に適用された場合に、染色はまったく、あるいはほとんど起こさず、少数のポジティブ細胞がほとんどのネガティブな細胞の間に分散されているような１つの抗体、あるいは抗体の断片を意味している。
【０２７９】
上に述べたような癌治療における使用が想定される特定の有望な抗体は固体腫瘍に対して高い選択性を有しているものである。例えば、多くの乳房、肺、及び結腸直腸癌の表面で見出されるＴＡＧ７２及びＨＥＲ−２プロト−オンコジーン蛋白質と結合する抗体（Ｔｈｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６； Ｃｏｌｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７； Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１）；ＭＯｖ１８及びＯＶ−ＴＬ３、そしてミルクムシン・コア蛋白質及びヒト乳脂小球（Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５； Ｂｕｒｃｈｅｌｌ ｅ ｔａｌ．， １９８３）；そして高Ｍｒ黒色腫抗原（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９８２）とて都合する交代などである。さらに有益な抗体は、ほとんどの卵巣腫瘍に均一に発現されることが知られている葉酸結合蛋白質に対するもの、扁平上皮乳頭腫と神経膠腫の大部分に過剰発現されるｅｒｂファミリーのオンコジーン、そして現在進行中の前臨床的及び臨床的評価の対象となっているその他の抗体などである。
【０２８０】
抗体Ｂ３、ＫＳＩ／４、ＣＣ４９、２６０Ｆ９、ＸＭＭＣＯ−７９１、Ｄ６１２、及びＳＭ３は、この技術分野で日常的に行われている標準的な前臨床テストに続いて、臨床的な実施の形態で使用するのに特に適していると考えられている。Ｂ３（米国特許第５，２４２，８１３；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）はＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１０５７３であり、ＫＳ１／４は米国特許第４，９７５，３６９に述べられている手順でつくることができ、そしてＤ６１２（米国特許第５，１８３，７５６）はＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９７９６である。
【０２８１】
腫瘍関連標的を明確にするもうひとつの手段はその細胞によって発現される抗原の生化学的特性ではなく、その腫瘍細胞の特性に基づくものである。従って、本発明者らは、腫瘍細胞や炎症を起こしている細胞に優先的に結合するいずれの抗体もモノテルペン／トリテルペン組成物接合体の向標的成分として利用可能であると考えている。優先的腫瘍細胞結合もその腫瘍細胞に対する高い親和性を示すと同時に、上に定義したような生命を維持している正常な細胞や組織には有意な反応性を示さない細胞に基づいている。
【０２８２】
本発明はモノテルペン／トリテルペン・グリコシドを本明細書で上に述べたような炎症性細胞あるいは腫瘍細胞に向かわせるために使用できる抗体を発生させるいくつかの手段についても述べている。炎症性細胞に特異性を示す抗体を発生させるためには、通常、炎症性細胞抗原あるいは腫瘍細胞抗原を含む組成物で動物を免疫化させ、そして、以下でより詳細に説明するように、その結果得られる適切な特異性を有する抗体を選択する。この免疫化組成物は精製された、あるいは部分的に精製された、上に列挙した抗原のいずれかの製剤、上に列挙された抗原のいずれかに対して質的に向上された膜製剤などの組成物、上に示した細胞のいずれか、あるいは上に示した細胞タイプのいずれかを含む細胞の混合物あるいは群を含んでいる場合もある。
【０２８３】
もちろん、抗体供給源が何であるかには関係なく、ヒトの治療における本発明の実践においては、予め臨床的に標的化される炎症性サイトあるいは腫瘍が必ず最終的に選択された抗原を発現するという保証が欲しいであろう。これは、例えば、外科的生体検査、あるいは恐らくは循環性抗原流に関するテストなどの組織サンプルを抗原的にテストするステップを含むかなり簡単なアッセイによって行うことができる。これはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）などの免疫学的スクリーニング・アッセイによって簡単に行うことができ、このアッセイにおいては、ハイブリドーマの『バンク』から得られる抗体の結合親和性をその腫瘍に対する反応性に関してテストする。適切な選択性と親和性を示す抗体を選んで、本発明の二重特異性抗体を調製する。
【０２８４】
交差反応性の良く知られた現象から、有益な抗体は、最初の抗原がヒト細胞から得られた手順に加えて、最初に得られた抗体がマウスや霊長類などの動物から誘導された免疫化手順によってもたらされることが考えられる。ヒト由来の抗原が用いられる場合、それらはヒト腫瘍細胞株から得られる場合もあるし、あるいは問題となっている特定の患者の生物学的サンプルから得て調製される場合もある。実際、その患者の腫瘍に合わせて『注文加工された』抗体の作成方法が知られており（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、本発明との関連での使用が考えられる。
【０２８５】
１．  抗体生産の方法
示されているとおり、本発明による特定の実施の形態で、抗体についての利用法を見いだすことができる。例えば、患者の特定の領域あるいは特定の組織の種類に特異的な抗体がつくられてもよい。そして、これらの抗体は本発明によるトリテルペン化合物と結合し、その結果、その抗体が向けられる組織に対して上記トリテルペン化合物を特異的に標的にすることが可能になる。そのような抗体の典型的な１つの実施の形態は腫瘍細胞と結びつくものである。本発明による１つの好ましい実施の形態で、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル及びポリクローナル抗体の調製と特徴づけの手段は当業者に周知であり、本明細書で以下に具体的に開示される（例えば、Ｈｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８参照）。
【０２８６】
簡潔に述べると、ポリクローナル抗体は望ましい標的抗原からなる免疫原で動物を免疫化し、その免疫化された動物から抗血清を回収することによって調製される。広範囲の動物種を抗血清生成のために用いることができる。通常抗血清生成に使われる動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタあるいはウマなどヒト以外の動物である。比較的血液量が多いことから、ウサギはポリクローナル抗体生成のために好んで選ばれる。
【０２８７】
イソ型抗原に特異的な抗体はポリクローナル及びモノクローナルのいずれも、当業者に一般に周知のとおり、従来の免疫化技術を使って調製できる。特定の細胞タイプの抗原エピトープ、あるいは、本発明による化合物を含む組成物をウサギやマウスのような１つ以上の実験動物を免疫化するために用いることができ、その後抗原に対する特異的な抗体の生成へと進む。ポリクローナル抗血清は抗体生成のための時間をとった後、その動物から単に採血し、その全血から血清サンプルを調製すればよい。
【０２８８】
本発明によるモノクローナル抗体はアカシア・ビクトリアエ以外の種で本発明によるトリテルペン化合物の存在をスクリーニングするために適用できる免疫化学の手順において、または特定の抗原に特異的な抗体を用いるその他の手順において有益な利用法になると考えられている。議論されているように、本発明による抗体の利用の典型的な１つの実施の形態は、腫瘍に特異的な抗原に向けられた抗体を調製するステップと、その抗体を本発明によるトリテルペン化合物と結合させるステップと、そして、ヒトの患者をその抗原−トリテルペン化合物で治療するステップとを含んでおり、それによって、本発明によるトリテルペン化合物は本発明によるトリテルペン化合物で治療できる状態に関連する腫瘍細胞またはその他の細胞を特異的に標的とする。一般に、種々の抗体に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を本発明によるさまざまな実施の形態に用いることができる。例えば、上記ポリクローナル及びモノクローナル抗体を抗体親和性カラムでトリテルペン化合物の精製に使うことができる。そのような抗体の調製と特徴づけの手段は当業者に十分周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８で開示され、その開示は引用されることによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８９】
本技術分野でよく知られているように、ある任意の組成物はその免疫がそれぞれ異なっている。従って、担体に対するペプチドまたはポリペプチド免疫原を結合することによって達成されることだが、多くの場合ホストの免疫系を高めることが必要である。典型的で好ましい担体はキーホール・リンペット・ヘモシニアン（ＫＬＨ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、あるいはウサギ血清アルブミンなどその他のアルブミンも担体として用いることができる。ポリペプチドを担体蛋白質に結合させる手段は本技術分野で十分周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシニミド・エステル、カルボジイミド、及びビス−ビアゾ化ベンジジンなどがある。
【０２９０】
これも本技術分野で十分周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性はアジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質を使うことによって高めることができる。典型的で好ましいアジュバントには完全フロイント・アジュバント（死滅ヒト結核菌を含んでいる免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロインド・アジュバント及び水酸化アルミニウム・アジュバントなどがある。
ポリクローナル抗体生成に使われる免疫原組成物の量は免疫原の性質そして免疫化に用いられる動物によってさまざまである。その免疫原を投与するために種々の投与法を用いることができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、及び腹腔内）。ポリクローナル抗体生成を免疫化後の種々の時点でその免疫化した動物から採血することによって監視してもよい。追加免疫や注射を施してもよい。追加免疫と力価のプロセスは適切な力価が達成されるまで繰り返される。望ましいレベルの免疫原性が得られたら、免疫化した動物から採血し、その血清を単離、保存し、及び／又はその動物をｍＡｂ生成のために用いることができる。
【０２９１】
ｍＡｂは米国特許第４，１９６，２６５で例示されるように、周知の技術の利用によって容易に調製可能であり、上記特許の開示は引用することによってその全体が本明細書に組み込まれる。通常この技術は、例えば、精製または一部精製した腫瘍特異的抗原、ポリペプチドまたはペプチドあるいは腫瘍細胞など選択された免疫原組成物で適切な動物を免疫化するステップを含んでいる。その免疫化組成物は抗体生成細胞を刺激する上で効果的な方法で投与される。マウスやラットなどげっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、あるいはカエルの細胞でも可能である。ラットの利用はいくつかの利点を提供するが（Ｇｏｄｉｎｇ， １９８６）、マウスはより好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスは日常的に用いられて、安定した融合の割合が一般に高いため最も好ましい。
【０２９２】
免疫化後、抗体生成の潜在能力を持つ体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）がｍＡｂ生成手順での利用のために選択される。これらの細胞は生検用脾臓、扁桃腺またはリンパ節、あるいは末梢血サンプルから得ることができる。脾臓細胞及び末梢血細胞が好ましく、その理由は前者は形質芽球の分裂段階にある抗体生成細胞の豊富な供給源であるため、そして後者は末梢血が容易に入手可能であるためである。多くの場合、一群の動物を免疫化し、最も高い抗体力価を持つ動物の脾臓を採取し、注射器でその脾臓を均質化することによって脾臓リンパ球を得る。通常、免疫化されたマウスから得られる脾臓は約５ｘ１０７から２ｘ１０８のリンパ球を含んでいる。
【０２９３】
その後、免疫化された動物からの抗体を生成するＢリンパ球を通常、免疫化された動物と同じ種の不死化骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマ生成融合手順での利用に適した骨髄腫細胞群は好ましくは非抗体生成性で、望ましい融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支援する特定の選択媒地での成長を不能にする高い融合効率と酵素欠乏を有している。
【０２９４】
当業者に周知のとおり、数多くの骨髄腫細胞のいずれでも用いることができる。例えば、免疫化される動物がマウスの場合。Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、及びＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを用いることができ、ラットの場合はＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０、そして、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９−６が細胞融合に関連して全て有用である（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ， １９８６； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， １９８４； ａｎｄ ｔｈｅ ＡＴＣＣ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ参照）。
【０２９５】
抗体生成のための脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドをつくる方法は通常体細胞と骨髄腫細胞を２：１の割合で、あるいは約２０：１から約１：１の割合に変えてもよいが、細胞膜の融合を促進する１つ以上の（化学的または電気的）作用物質の存在下で混合するステップを含んでいる。センダイ・ウイルスを使った融合法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， １９７５； １９７６）や、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧのようなポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）を使ったＧｅｆｔｅｒらによる融合法（１９７７）が記述されている。電気的誘導による融合法も適当である（Ｇｏｄｉｎｇ， １９８６）。
【０２９６】
融合手順によって通常約１ｘ１０−６から１ｘ１０−８の低頻度で生存能力のあるハイブリッドがつくられる。しかし、生存能力のある融合されたハイブリッドは選択培地で培養されることによって非融合親細胞（特に普通は無限に分裂を続ける非融合骨髄腫細胞）から識別されるため、このことは問題にならない。選択培地は一般にその組織培地でのヌクレオチドのデノボ合成を妨げる作用物質を含むものである。典型的で好ましい作用物質はアミノプテリン、メトトレキサート、及びアザセリンである。アミノプテリン及びメトトレキサートはプリンとピリミジンの両方のデノボ合成を阻害し、アゼサリンはプリン合成のみを阻害する。アミノプテリンまたはメトトレキサートを用いると、その培地はヌクレオチド（ＨＡＴ媒地）の供給源としてヒポキサンチン及びチミジンで補完される。アゼサリンを使うと、その培地はヒポキサンチンで補完される。
【０２９７】
好ましい選択媒地はＨＡＴである。ヌクレオチド・サルベージ経路の操作能力を持つ細胞だけがＨＡＴ媒質で生き残ることができる。骨髄腫細胞はサルベージ経路の鍵になる酵素、例えば、ヒポキサンチン・ホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）を欠いており、生き残ることができない。Ｂ細胞はこのサルベージ経路を操作できるが、培養では限定的な寿命しかなく、通常約２週間以内に死滅する。従って、その選択媒地で生存可能な唯一の細胞は骨髄腫細胞及びＢ細胞から形成されるハイブリッドだけである。
【０２９８】
この培養によって特異的ハイブリドーマがそこから選択されるハイブリドーマ固体群が提供される。通常、ハイブリドーマの選択はマイクロタイター・プレートで単一クローンを希釈して細胞を培養し、その後望ましい反応性を個々のクローン上清（約２−３週間後）でテストすることによって行なう。アッセイは放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒素アッセイ、血小板アッセイ、ドット免疫結合アッセイなど感度がよく、簡単で迅速なものでなければならない。
【０２９９】
選択されたハイブリドーマはその後連続的に希釈されて個々の抗体生成細胞株にクローニングされるが、そのクローンはｍＡｂを供給するため無制限に増殖させることができる。その細胞株は２つの基本的な方法でｍＡｂ生成に利用できる。ハイブリドーマのサンプルは最初の融合に使われた体細胞及び骨髄腫細胞を供給するために用いられた種類の組織適合動物（多くの場合、腹腔内）に注入される。その注入を受けた動物は融合細胞ハイブリッドによって生成された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生させる。血清や腹水などその動物の体液を取り出して、高濃度のｍＡｂを提供することができる。個々の細胞株はｉｎ ｖｉｔｒｏでも培養可能で、そのｍＡｂは自然に培地に分泌され、そこから高濃度のｍＡｂを容易に得ることができる。いずれの方法で生成されたｍＡｂでも、必要があれば、ろ過、遠心分離、及びＨＰＬＣあるいは親和性クロマトグラフィのような種々のクロマトグラフィ法を用いてさらに精製して差し支えない。
【０３００】
（ｉｉｉ）  他の腫瘍細胞の標的と結合リガンド
抗体の利用に加えて、その他のリガンドを腫瘍細胞抗原に結合させることによってモノテルペン／トリテルペン化合物が腫瘍サイトを対象にするよう用いることができるであろう。過剰発現させたレセプター（例えば、エストロゲン・レセプター、ＥＧＦレセプター）、あるいは突然変異レセプターである腫瘍抗原については、その対応するリガンドを向標的作用物質として用いることができるだろう。
【０３０１】
内皮細胞レセプター・リガンドと類似の方法で、特異的、または優先的に腫瘍細胞に結合する成分がある。例えば、もし腫瘍抗原が過剰発現レセプターであれば、その腫瘍細胞はｉｎ ｖｉｖｏで特異的リガンドに被覆されよう。従って、そのリガンドは、そのリガンドに対する抗体またはそのレセプター自身の形態のうちいずれかで標的とされるであろう。このような種類の向標的作用物質の具体例はＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２リガンドに対する抗体、血小板因子４に対する抗体、そして白血球接着結合蛋白質である。
（ｉｖ）  毒素
いくつかの利用法で、本明細書に述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物と組み合わせて用いられる第２の治療剤は抗体または成長因子、特に上皮細胞の成長または細胞分裂を停止させる、あるいは抑制する能力を有する細胞毒性またはその他の抗細胞作用物質と結合した薬理作用物質であると予想されている。一般に、本発明は本明細書に述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物を含むか、あるいは補完する任意の薬理作用物質の利用を検討するものであり、その薬理作用物質は標的作用物質、好ましくは抗体に結合可能で、活性のある形で標的腫瘍細胞に送り込むことができる。典型的な抗細胞作用物質には化学療法剤、放射性同位体、そして細胞毒素などがある。化学療法剤については、ステロイド・ホルモンのような薬剤；シトシン・アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、あるいはアミノプテリンのような代謝拮抗剤；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカ・アルカロイド；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；あるいは、クロラムブシルまたはメルファランなど抗腫瘍アルキル化剤が特に好ましい。その他の実施の形態には、サイトカイン、成長因子、細菌内毒素、あるいは細菌内毒素の脂質Ａ成分などの作用物質がある。いずれにせよ、このような薬剤は、必要であれば、周知の結合技術を用いて血液成分に対するそれらの向標、内部移行、放出、及び提示を可能にするような方法でモノテルペン／トリテルペン化合物と共に必要に応じた標的細胞の部位で標的作用物質、好ましくは抗体にうまく結合することができる（例えば、Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３ ａｎｄ Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７参照）。
【０３０２】
種々の化学療法剤及びその他薬理剤が抗体とうまく結合し、薬理的に機能することが示されている（例えば、Ｖａｉｃｋｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１参照）。研究されている典型的な抗腫瘍性薬剤にはドキソロビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、その他種々のものがある（Ｄｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。さらに、ネオカルチノスタジン（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９８３）、マクロマイシン（Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４）、トレニモン（Ｇｈｏｓｅ， １９８２）、及びα−アマニチン（Ｄａｖｉｓ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎ， １９８１）などその他の薬剤の接着についても記述されている。本明細書で述べられたモノテルペン／トリテルペン化合物と適切な標的分子の間で接合体を調製する特定の方法が本明細書で上に具体的に開示されている。
【０３０３】
ＶＩＩ．  局所的組成物及び化粧品
本発明のいくつかの実施形態は本明細書に述べられる化合物を構成する局所的組成物、そして、その利用法に関するものである。本発明による化合物を局所的組成物に含有させることによって、その化合物の有益な生理学的活性を予防学的及び／又は治療学的に得ることができる。例えば、本発明による化合物は種々の酸化的損傷、発癌物質で仲介される損傷、及び紫外線で仲介される損傷など種々の細胞の損傷を減少させるため本明細書に示される。
【０３０４】
本発明による化合物のひとつの利用法は、特に、皮膚の老化を治療するための化粧品など局所的組成物中の活性成分である。老化に起因し、本発明に従って防止また治療の可能性がある皮膚の具体的な変化には、それが年齢あるいは外部要因のいずれから生じたものであれ；しわ、硬化、黄変、たるみ、肌荒れ、乾燥、斑点（色素沈着過度）、及び無症状であることが多い種々の前癌成長；微小血管系の変質；コラーゲンの減少及び架橋、グルコサミノグリカン（基体）の蓄積及び日光製弾性線維変性（エラスチンの凝集）がその理由の一部である弛緩及びしわの増加；網状組織錐体（ｒｅｔｉａｌ ｃｏｎｅｓ）の平坦化；角質層の不完全な発達（角質化障害）に関連し、皮膚の乾燥、肌荒れ、ひび割れにつながる、表皮における限定された再生代謝回転；細胞異型と萎縮及び極性の喪失をもたらす表皮における細胞分割（増殖）及び細胞成熟（分化）の不完全な調節；そして、局部的な色素沈着過剰及び低下、及び異常な色素沈着（しみ）などがある。従って、本発明者は本発明によって提供される化合物を使ってそのような状態の治療を具体的に検討するものである。
【０３０５】
そこで、本発明のいくつかの実施形態は皮膚の損傷を逆戻りさせる方法、あるいはその効果に関するものである。例えば、本発明によって皮膚を予防上及び／又は治療上肥厚させて皮膚の萎縮を軽減し、皮膚の弾力性を調節し、そして、すじ、しわ、開いた毛穴、荒れ、乾燥、その他皮膚の加齢に伴う肌のきめの不連続性などを含む肌のきめの視認及び／又は触知できる不連続性を調節する方法が提供され、その方法はそれを必要としている皮膚に本発明による化合物からなる局所用組成物を安全で効果的な量投与するステップを含んでいる。また、哺乳動物の皮膚で過剰な色素沈着を減らす方法が提供され、その方法はそれを必要としている皮膚に本発明による化合物からなるスキンケア用組成物を安全で効果的な量適用するステップを含んでいる。そうした過剰な色素沈着は皮膚の非メラニン性変色に起因する場合がある。
【０３０６】
従って、本発明は老化した皮膚、特に太陽光によって老化した皮膚、内因性メカニズムによって経年的に老化した皮膚の治療及び予防のための生成物に関するものであり、その他の外因性作用物質によって引き起こされた損傷の治療にも関するものである。一般に、本発明による化合物を化粧品または皮膚に塗布するためにつくられた皮膚用局所的製剤に入れて投与することが望ましいであろう。
【０３０７】
（ｉ）  皮膚の保護
ここに述べられた局所的組成物は皮膚に損傷を与える種々の作用物質に対して皮膚を保護するために用いられる。特に、本発明による化合物は放射線、発癌物質、及び酸化的ストレスによって引き起こされる損傷など種々の外因性障害による損傷を防ぐために本明細書に示されている。従って、本発明の１つの実施形態は外因性作用物質によって引き起こされる皮膚の損傷を防止または逆戻りさせることに関するものであり、本発明による組成物を安全で効果的な量皮膚に接触させるステップを含んでいる。
【０３０８】
本発明による化合物が抗酸化応答配列（ＡＲＥ）を活性化することが本明細書で示されているように、その化合物は活性酸素種、ラジカル、フリー・ラジカル、酸化的ストレス、酸化的損傷、及びそれらの組み合わせによって引き起こされる損傷を防止または最小限にするため特に有用であろう。数多くの疾病プロセスは高レベルの活性酸素種（ＲＯＳ）の存在に対する身体の拒絶反応が原因とされ、本明細書で述べられるように、従って、本発明による化合物で治療することができる。
【０３０９】
オゾン、一酸化窒素、放射性粒子、及びハロゲン化炭化水素のような工業及び石油化学由来の大気汚染物質も皮膚、肺、消化管、及びその他の組織に酸化的損傷を誘発する。原子炉からの放射能漏れ及び核兵器による暴露など産業活動に起因する放射能中毒は放射能及びラジカルによる損傷のその他の原因である。その他の暴露の経路は発電所や高圧送電線、Ｘ線機器、粒子加速器、レーダーのアンテナ、ラジオのアンテナなど電磁放射線源の近くに住むまたは働くこと、そして、テレビやコンピュータのモニターなど電磁放射線を放出する電子製品や器具を使うことから発生している。従って、皮膚細胞を含む細胞をそうした病因的作用物質から守ることは望ましいことであり、本発明の一部を成している。
【０３１０】
（ｉｉ）  局所用及び化粧品用製剤
本発明によって提供される活性物質の組み合わせ及び活性物質は局所用製剤の形状でその製剤の総重量の約０．００１から約９９重量％、例えば、約０．００１から約５０重量％の量で存在可能である。本発明による活性物質の組み合わせまたは活性物質は局所用製剤の形状でその製剤の総重量の０．００１から１０重量％、特に０．００１から１重量％の量で存在することが好ましい。組み合わせにおける２つの化合物の重量比は広範囲にわたるが、例えば、１：１００から１００：１、好ましくは１：１０から１０：１である。その化合物は、例えば、１：２から２：１、あるいは１：１の重量比でも存在できる。
【０３１１】
一般に、局所用溶液として、皮膚の水酸化を助ける油性物質のような皮膚軟化剤または潤滑性媒体が望ましい成分であろう。本明細書で用いられているように、『皮膚軟化剤』という用語は全体としてその組成物が刺激性のないことを意味している。即ち、その媒体の性質とその活性組成物の量は局所用塗布の際に刺激が少ない分量を提供するよう選択される。皮膚軟化剤の割合はその組成物全体の０．５％から５０重量％以上、好ましくは５％から３０重量％重量の範囲である。皮膚軟化剤はエステル、脂肪酸とアルコール、ポリオール、及び炭化水素のように一般的な化学上の区分に基づいて分類される。
【０３１２】
エステルはモノエステルまたはジエステルでもよい。脂肪エステルの許容できる例として、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジエチル、ジメリン酸ジイソプロピル（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｄｉｍｅｒａｔｅ）、コハク酸ジオクチルなどがある。許容できる分岐鎖脂肪エステルには、２−エチル−ヘキシル・ミリステート、イソプロピル・ステアレート、及びイソステアリル・パルミテートなどがある。許容できる三塩基酸エステルにはトリリノール酸トリイソプロピル及びクエン酸トリラウリルなどがある。許容できる直鎖脂肪エステルには、パルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチン、及びオレイン酸ステアリルなどがある。好ましいエステルには、ココ−カプリル酸／カプリン（ココ−カプリル酸及びココ−カプリンの混合物）、プロピレン・グリコール・ミリスチル・エーテル・アセテート、アジピン酸ジイソプロピル、オクタン酸セチルなどがある。
【０３１３】
皮膚軟化剤としての役割を果たすポリオールには直鎖及び分岐鎖アルキル・ポリヒドロキシ化合物などがある。例えば、プロピレン・グリコール、ソルビトール、及びグリセリンが好ましい。ポリプロピレン・グリコール及びポリエチレン・グリコールのような高分子ポリオールも有用であろう。ブチレン及びプロピレン・グリコールも透過促進剤として特に好ましい。
【０３１４】
軟膏基剤（水なし）は冬季や高乾燥肌の対象者に用いる製剤用に求められている。適切な軟膏基剤の例には、ワセリン、ワセリンに揮発性シリコンを加えたもの、ラノリン、及びＥｕｃｅｒｉｎ（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）のような水中油乳濁液などがある。暖かい時期や若年層の多くにとって、水中油乳濁液（クリーム）が望ましいだろう。適切なクリーム基剤の例にはニベア・クリーム（Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ）、コールド・クリーム（ＵＳＰ）、パーパス・クリーム（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、親水性軟膏（ＵＳＰ）、及びルブリダーム（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）などがある。
【０３１５】
本発明による活性物質及びその組み合わせを含んでいる本発明による局所用製剤及び組成物には、例えば、クリーム（Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、またはＷ／Ｏ／Ｗ）、ジェル、化粧水、または乳液など通常の使用形状すべてが含まれる。本発明による局所用基剤は、例えば、水溶液またはアルコール性溶液、水溶性懸濁液、乳濁液、軟膏、クリーム、オイル、粉剤あるいはスティックのように液体、練り粉状、または固体の製剤に調製することができる。求められる製剤に応じて、活性物質は局所的使用のための医薬品及び化粧品用基剤を組み入れることができ、さらに別の成分として、例えば、油成分、油脂とワックス、乳化剤、陰イオン性、陽イオン性、両性、双性、及び／又は非イオン性の界面活性剤、低級一価アルコール及び多価アルコール、水、防腐剤、緩衝物質、増粘剤、芳香剤、色素、及び不透明剤を含んでいる。本発明による上記活性物質は経皮治療システムにも有用に使うことができる。
【０３１６】
上記製剤に抗酸化剤（例えば、アルファ・トコフェロール、ビタミンＥ及びＣ）、フラボン、フラボノイド、イミダゾール、ヒドロキシカルボン酸（例えば、リンゴ酸、グリコール酸、サリチル酸、及びその誘導体）、及び／又は鉄錯化剤（例えば、ＥＤＴＡ及びアルファ・ヒドロキシ脂肪酸）及び／又は周知の紫外線保護フィルターを、例えば、０．１から１０重量％の量を酸化反応しやすい活性物質の安定性を確保するために添加することはさらに有益であろう。
【０３１７】
上記製剤に、特に、０．０１から１０重量％の量の、例えば、細胞エネルギー伝達剤（クレアチン、グアニン、グアノシン、アデニン、アデノシン、ニコチン、ニコチンアミド、またはリボフラビン）、補酵素（例えば、パントテン酸、パンテノール、リポ酸、またはニコチン酸）、助剤（例えば、Ｌ−カルニチン、ドリコール、またはウリジン）、基質（例えば、ヘキソース、ペントース、または脂肪酸）、及び中間代謝生成物（例えば、クエン酸またはピルビン酸）及び／又はグルタチオンなどの好気性細胞エネルギー代謝物質またはその組み合わせを添加することも有益であろう。
【０３１８】
上記製剤に、特にオレイン酸、シス−６−ヘキサデカン酸、またはパルミトレイン酸などの透過促進剤を添加することも有益であろう。透過促進剤はその製剤内に０．０１から１．０重量％の量で存在することができる。
【０３１９】
本発明による製剤はさらにＵＶＡ及び／またはＵＶＢ領域で紫外線を吸収する付加的な物質をその製剤の総重量のうちフィルター物質全体の量が、例えば、０．１から３０重量％、好ましくは０．５から１０重量％、特に１．０から６．００重量％の量、皮膚を紫外線の全領域から守る化粧品製剤を提供するため好適に含むことができる。その製剤は皮膚用日焼け止め剤として使うこともできる。その製剤において、紫外線吸収剤は活性物質に対する抗酸化剤としてはたらく。
【０３２０】
本発明による組成物がＵＶＢフィルター物質を含んでいる場合、そのフィルター物質は油溶性でも水溶性でもよい。本発明による好適な油溶性ＵＶＢフィルターの例は、３−ベンジリデンカンファー誘導体、好ましくは３−（４−メチルベンジリデン）及び３−ベンジリデンカンファーである。好適な水溶性ＵＶＢフィルターの例は、ナトリウム、カリウムまたはそのトリエタノールアンモニウム塩、及びスルホン酸自体のような２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸の塩類などである。また、潜在的な利用が考えられるのはＰＡＰＢ、桂皮酸及びサリチル酸塩の誘導体である。例えば、オクチル桂皮酸メトキシ及び２−ヒドロキシ−４−メトキシ・ベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）を用いることができる。オクチル桂皮酸メトキシ及び２−ヒドロキシ−４−メトキシ・ベンゾフェノンはそれぞれＰａｒｓｏｌ ＭＣＸ及びＢｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ−３の商標で市販されている。
【０３２１】
本発明による活性物質の組み合わせに今までは通常化粧品製剤に使われてきたＵＶＡフィルターを組み合わせることも好適であろう。これらの物質は好ましくはジベンゾイルメタンの誘導体、特に１−（４’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン、及び１−フェニル−３（４’−イソプロピルフェニル）プロパン−１，３−ジオンである。これらの組み合わせ及びこれらの組み合わせで構成される製剤も本発明によって提供される。上記ＵＶＢの組み合わせで使われた量を用いることができる。
【０３２２】
従って、本発明は例えば、その製剤の安定性と作用を向上させることができる抗酸化剤、好気性細胞エネルギー代謝物質及び／又は紫外線吸収剤を有する本発明による活性物質の組み合わせに関するものである。前記活性物質の群から組み合わせることができる上記活性物質の例は本発明を記述するためのものであり、本発明をこれらの例に限定する意図はない。
【０３２３】
さらに、本発明による上記物質を、例えば、セラミド、脂肪酸、スフィンゴミエリン、ホスホグリセリドのような、例えば、水素化両親媒性物質の、例えば、リポソーム、ミセル、ナノスフィアなどに封入（カプセル化）して被覆薬の形状で；またはシクロデキストリン内で用いることも可能である。調製中に保護性ガス（例えば、Ｎ２、ＣＯ２）を使ったり、気密性包装を用いることによってさらに保護することが可能である。さらに別の助剤及び添加剤にはビタミン、防腐剤、水、及び／又は塩類のような水結合物質、増粘剤、充填剤、香料、色素、乳化剤、活性物質などがある。
【０３２４】
活性物質またはその他潜在的に酸化されやすい物質の加工処理中、温度は一般に４０℃を超えてはならない。当業者に周知であるその組成物調製のための通例の手法は別に取り上げる。
【０３２５】
本発明による組成物は全ての化粧品用基剤に組み込むことができる。オイルまたは油性物質は概ね使用される乳化剤の平均的な親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）に応じて油中水型乳濁液または水中油型乳濁液のいずれかである乳化剤と共に存在する。特に、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、及びＷ／Ｏ／Ｗ乳濁液は好適である。本発明による組み合わせは、例えば、Ｏ／Ｗクリーム、Ｗ／Ｏクリーム、Ｏ／Ｗ化粧水、またはＷ／Ｏ化粧水などの手入れ用品で特に好適に用いられる。
【０３２６】
用いることができる水以外の、または水に加える賦形剤には液体または固体の皮膚軟化材、溶剤、保湿剤、増粘剤及び粉剤などがある。特に有用な非水性担体はポリジメチル・シロキサン、及び／又はポリジメチル・フェニル・シロキサンである。用いられるシリコンは通常その粘度が２５℃の温度下で約１０から１０，０００，０００ｍｍ２／ｓ（センチストーク）の範囲のいずれでもよい。低粘度と高粘度のシリコンの混合物も望ましい。これらのシリコンはＧｅｎｅｒａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙの商標名Ｖｉｃａｓｉｌ、ＳＥ、及びＳＦ、そしてＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙの２００及び５００シリーズが利用可能である。本発明による組成物で使用可能なシリコンの量はその組成物の５から９５重量％の範囲のいずれでもよく、好ましくは２５から９０重量％である。
【０３２７】
皮膚軟化材としてはたらく典型的な炭化水素は１２から３０個の炭素原子のどこからでもよいが炭化水素鎖を有するものである。具体例として鉱油、ワセリン、スクアレン、及びイソパラフィンなどがある。
本発明による化粧品組成物中の機能性成分のさらに別の分類区分は増粘剤である。増粘剤は通常その組成物の０．１から２０重量％、好ましくは０．５％から１０重量％の範囲のいずれかの量で存在する。典型的な増粘剤はＢ． Ｆ． Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙの商標名Ｃａｒｂｏｐｏｌとして利用可能な交差結合ポリアクリレート物質である。粘剤はキサン、カラギーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、及びイナゴマメ・ゴムなどがある。特定の環境下で増粘の機能はシリコンまたは皮膚軟化材としてもはたらく物質によって果たされる。例えば、１０センチストークを超える粘度のシリコン・ゴム及びグリセロ−ル・ステアレートなどのエステルは両方の機能性を持つ。
【０３２８】
粉剤を本発明による化粧品組成物に組み込むこともできる。これら粉剤には胡粉、滑石、カオリン、澱粉、スメクタイト粘土、化学的に修飾されたケイ酸アルミニウム・マグネシウム、水酸化ケイ酸アルミニウム、ヒュームド・シリカ、琥珀酸アルミニウム・スターチ・オクテニル、及びそれらの混合物などがある。
【０３２９】
その他補助的な副次成分を化粧品組成物に組み込むこともできる。このような成分には着色剤、乳白剤、及び香料などがある。これらその他の補助的副次成分の量はその組成物の０．００１から最大２０重量％の範囲のいずれでもよい。
【０３３０】
化粧品として許容できる担体は通常その組成物の５から９９．９重量％、好ましくは２５から８０重量％を成し、その他の化粧品添加剤がないときに、その組成物のバランスをとる。好ましくは、その担体は担体重量の８０重量％が水である。好ましくは、水はその発明による組成物の少なくとも５０重量％、最も好ましくはその組成物の６０から８０重量％を構成する。
【０３３１】
（ｉｉｉ）  局所用及び化粧品用組成物の利用
本発明による局所用及び化粧品用組成物はヒトの皮膚に局所的に使用するための生成物として、特に、皮膚の状態調整、水分調整、及び潤滑化、そして、すじやしわのある、または老化した皮膚の外観を予防あるいは軽減するための作用物質として主に意図されるものである。使用上、その組成物の少量、例えば１から１００ｍｌを適切な容器または塗布器から皮膚の露出部分に塗布し、必要であれば、手、指、または適切な器具を使って皮膚に広げ、及び／又はすり込む。あるいは、その組成物を経口、直腸および鼻腔からの投与など経粘膜投与を含むその他局所的な方法で適用してもよい。
【０３３２】
（ｉｖ）  生成物の形状及び包装
本発明による局所的皮膚用及び化粧品用組成物は、例えば、化粧水、クリーム、またはジェルとして調製することができる。上記組成物はその粘度及び消費者の利用意図に適した適切な容器に包装される。例えば、化粧水またはクリームはビンまたはロール・ボール塗布器、あるいは指で使うために適したポンプに合う噴射式エアロゾル器具または容器内に包装することができる。上記組成物がクリームの場合、単にチューブまたは蓋付きビンなど変形不能なビンまたはスクイズ容器に保管することができる。その組成物は、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，０６３，５０７に述べられているようなカプセルに封入されてもよい。本発明は、従って、本明細書で提供されているような化粧品として許容できる組成物を含む密封容器も提供している。
【０３３３】
ＶＩＩＩ．  モノテルペン／トリテルペン化合物の利用
本明細書に述べられるモノテルペン／トリテルペン化合物は抗炎症及び抗腫瘍に加えて、例えば、溶剤として、抗カビ及び抗ウイルス剤として、殺魚剤または軟体動物駆除剤として、避妊薬として、抗駆虫薬として、紫外線保護剤として、去痰薬として、利尿薬として、コレステロール代謝調整剤として、心血管エフェクタとして、抗腫瘍剤として、鎮痛剤として、鎮静剤として、免疫調整剤として、解熱剤として、血管新生調整剤として、毛細血管脆弱性を減少させる薬剤として、老化の影響に効く薬剤として、そして、認知と記憶力改善のための薬剤として広範な種類の適用に有益であると考えられる。
【０３３４】
本発明は本明細書に述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物によって実証される強力な抗炎症剤を提供する。本発明者は本発明によるモノテルペン／トリテルペン化合物が炎症応答で重要な役割を果たす転写因子ＮＦ−κＢの強力な阻害剤であることを示している。血管新生における炎症応答の中心的役割を示唆するさらに多くの証拠を考慮すると、この発見は特に重要な意味を持っている。本明細書で提供されるモノテルペン／トリテルペン化合物で治療を受ける患者は腫瘍形成及び組織損傷を含めた炎症に関連する疾病が広範な度合いで潜在的に緩和される。
【０３３５】
炎症応答の最初の段階は血管の透過性及びヒスタミン、セロトニン、塩基性ポリペプチド及び蛋白質の放出（分泌）の増加によって特徴づけられる。これは血液過多及び浮腫の形成を伴う。続いて、細胞浸潤および新しい結合組織の形成をみる。本発明者はモノテルペン／トリテルペン化合物を用いる治療がこれら早期段階の炎症を限定的なものにし、それによって、炎症状態に関連する悪影響を減少すると考えている。
【０３３６】
上記化合物は血管新生の調節において１つの役割を持っている。血管新生または新血管形成は新たな血管の成長として定義される。腫瘍及び癌は血管新生を誘導して、その腫瘍が増殖するように酸素と栄養物のための生命線を提供する。新しい血管の成長は悪性腫瘍細胞が身体の他の部分に広がるための出口も提供する。従って、血管新生の抑止は癌患者に恩恵をもたらす。他方で、血管新生は傷の回復などの際にも必要とされる。これらの傷は事故、火傷、負傷、及び手術の結果引き起こされる外因性の傷や内因性の組織の傷もあり得る。従って、血管新生を促進する作用物質は傷の回復のための治療での利用について大きな潜在的可能性を持っている。
【０３３７】
これら組成物をコレステロール代謝の調節に適用することも検討されている。特に、上記組成物及び栄養補助食品をヒトの患者における血清コレステロール価を下げるために使うことが検討されている。従って、経口投与であれ静脈内投与であれ、患者を本発明によるモノテルペン／トリテルペン化合物で治療することによって、高コレステロール及び関係する心血管疾患に関連した病的状態が軽減すると考えられる。
【０３３８】
心血管疾患の治療では、本明細書に述べられる化合物は不整脈の治療に用いられ、さらに、結果として血圧降下作用を持つ血管弛緩剤として使うことができると考えられる。
【０３３９】
本発明による化合物が同定された植物種である、アカシア・ビクトリアエが選択された理由の一部はそれが乾燥地帯原産であることである。これら乾燥地帯の植物の代謝の１つの重要な役割は細胞を紫外線から守る化合物を生成することである。本発明者はモノテルペン／トリテルペン化合物がそのような紫外線保護剤として機能する能力があると考えている。従って、本発明による化合物は紫外線からの保護が求められる適用の際に広範な利用法が見つけられるであろう。例えば、１つの適切な利用法はモノテルペン／トリテルペン化合物を日焼け防止剤、あるいはヒトの皮膚に用いるその他類似の化粧水の成分として利用することである。
【０３４０】
そのような組成物の潜在的な利点は本明細書の上記化合物で明らかにされた化学的保護効果によって示される。モノテルペン／トリテルペン化合物を含んでいる化粧水及び日焼け防止剤は、従って、種々の皮膚癌に対して疾病素因を持つ人に特に適しているであろう。そのような例として皮膚が白い人、特に、皮膚癌に対する遺伝的素因を持つ人などがある。そのような素因には紫外線によって引き起こされる損傷に対するＤＮＡ修復を媒介する遺伝性の癌遺伝子突然変異または細胞メカニズムの突然変異などがある。特に重大なのは、例えば、紫外線によって引き起こされるチミン−チミン二量体の切り出しなど遺伝子修復メカニズムを制御する遺伝子における突然変異である。同様に、モノテルペン／トリテルペン化合物は紫外線からの保護強化が望まれているその他任意の組成物に添加することができ、これらの化合物は紫外線からの保護が求められる対象物を活発化または非活発化させるために用いられるであろう。
【０３４１】
モノテルペン／トリテルペン化合物のその他の可能な適用法には中枢神経系の損傷、要するに、記憶障害または認知機能の増強、抗酸化剤としての利用（酸化分子の血中濃度監視）、または一酸化窒素（ＮＯ）の増加、または高血圧またはアテローム性動脈硬化の治療あるいは白内障の治療または予防のためなどである。さらに、本発明者は陰茎の機能強化のために本発明によるモノテルペン／トリテルペン化合物の局所的適用を特に想定している。さらに、皮膚のコラーゲンを増加させ、それによって皮膚の老化による影響に効果がある上記組成物の局所的投与が本発明者によって検討されている。
【０３４２】
ＩＸ．炎症の抑止
進化の過程でハエから哺乳類にまで保存され、ありふれた転写因子であるＮＦ−κＢは種々のストレス・シグナルに対する生物体応答の中心的な調節因子のひとつである。免疫及び炎症経路に関連するいくつかの遺伝子の転写はＮＦ−κＢが制御している。例えば、種々の前炎症サイトカイン、接着分子、及びアポトーシス因子はＮＦ−κＢによって制御され、従って、ＮＦ−κＢの調節障害は敗血性ショック、急性炎症、ウイルスの複製、及び一部の悪性腫瘍のような種々の病理状態の一因となっている。
【０３４３】
ＮＦ−κＢのうち最も量が多く活性のある形態は２個の蛋白質ｐ５０／ＲｅｌＡ（ｐ５０／ｐ６５とも呼ばれる）の二量体錯体である。活性化されていない細胞内で、これらの因子は蛋白質複合体の核局在シグナルを遮蔽するＩκＢのようなその他の抑制蛋白質と共に複合体の細胞質内に保持される。その細胞が炎症性サイトカイン、マイトジェン、微生物による生成物、または酸化的ストレス・シグナルによって媒介されるシグナルのような細胞外シグナルを受け取ると、抑制蛋白質であるＩκＢが特定のセリン残基でリン酸化反応を受ける。これはプロテオソーム経路による抑制蛋白質のユビキチン化及び分解をシグナルする。ＩκＢの分解はＮＦ−κＢの核局在領域を暴露し、抑制がなくなったＮＦ−κＢ複合体を核に転移し、ＤＮＡを結びつけ、特定の遺伝子の転写を活性化させる。ＮＦ−κＢは炎症、発癌、及びいくつかの免疫疾患の経路における遺伝子の転写の制御／調節にとって重要であるため、本発明者はＮＦ−κＢの下方モジュレータは炎症疾患の治療法を提供すると想定している。従って、例えば、本発明の方法によるＮＦ−κＢを抑止するモノテルペン組成物を投与することによって細胞内の炎症応答の活性化を抑止し、その結果炎症が予防、抑止、軽減される。多くの場合、長期または慢性の炎症はしばしばその他の症状につながる。１つの例は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（以下でより詳細に述べる）で、大腸の炎症として始まり、最終的に大腸癌に至ることがある。従って、本発明者は本発明で述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物を用い、本明細書で教示される方法を使うことによって炎症性疾患、前癌状態などを治療することを検討している。
【０３４４】
Ｘ．アポトーシス
哺乳動物の細胞死の回路には２つの主要なアポトーシス経路がある。ひとつはＦａｓ及びカスパーゼ−８を活性化する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター・ファミリーのその他のメンバーに関係したレセプターによって媒介される経路であり、もうひとつはチトクロームｃ、Ａｐａｆ−１、及びカスパーゼ−９に関係している。近年、ミトコンドリアに関するいくつかの現象がプログラムされた細胞死にとってきわめて重要であることが示されている。アポトーシスのプロセスで初期の重要な段階のひとつが外ミトコンドリア膜を介したチトクロームｃの細胞質ゾルへの放出である。細胞質ゾル内で、チトクロームｃはアスパラギン酸特異性を持つシステイン・プロテアーゼであるカスパーゼの活性化を開放する。アポトーシス中に分割される１１６ｋＤａＤＮＡ修復酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）などカスパーゼに対する多数の基質が報告されている。本発明者はミトコンドリアのアポトーシスに関する現象に関する本発明によるモノテルペン／トリテルペン化合物の効果についても本明細書で述べている。
【０３４５】
ＸＩ．前悪性炎症疾患
モノテルペン／トリテルペン化合物によって治療可能な炎症状態のうち、いくつかの例を下に述べる。
【０３４６】
バレット食道炎：胃食道逆流疾患を有する患者は食道炎、潰瘍形成、狭窄形成、及び正常な扁平上皮層の円柱状化生（ｃｏｌｕｍｎａｒ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）を生じやすい。バレット食道炎は胃食道逆流疾患を有する患者の約１０％に発生し、狭窄、深さのある潰瘍の存在、及び腺癌の発生に関連している。米国では毎年５００，０００人以上が胃食道逆流疾患と診断され、矯正のための抗逆流治療を受けるのは約３５，０００人だけである。
【０３４７】
光線性角化症：前癌状態の皮膚の増殖が通常太陽光の暴露によって引き起こされる。光線性角化症は肌が白い人、特に色白の高齢者及び若年者に発生する。上記増殖は皮膚の太陽光に暴露された領域に起きる。上記増殖は扁平な鱗状部として始まり、後に硬いイボ状面に成長する。上記増殖は前癌増殖と分類される。光線性角化症の約２０％は扁平上皮細胞癌に成長する。関連する症状に老年性皮膚、日光性弾性線維変性、及びその他の日光によって誘発される皮膚の変性などがある。
【０３４８】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）のような大腸の炎症を引き起こす慢性疾患である。ＵＣは大腸及び直腸内層の炎症及び潰瘍形成を引き起こす。この内層は粘膜と呼ばれる。クローン病（ＣＤ）は腸壁のさらに深い層へ広がる炎症を引き起こす。ＵＣは西欧諸国で比較的多く見られ、米国だけで少なくとも２５０，０００人がこの疾患を有する。子どもや高齢者も時にＵＣを発病するが、１５から３０歳の人に最も多く発生する。クローン病（ＣＤ）は消化管のどの部分でも罹患し得るような炎症プロセスであるが、小腸の最後の部分、別称、回腸終端部及び盲腸に最も普通に見られる（全症例の約半数）。その他の場合では：大腸のみ、小腸のみ（十二指腸、空腸、及び／又は回腸）、肛門、胃または食道のうち１つ以上に罹患する。これらの症状の多くは大腸癌に至る。
【０３４９】
ＸＩＩ．抗酸化応答成分の活性化
殆どの化学発癌物質は発癌の開始に先立って代謝活性化を受けなければならない。活性化は求電子反応体の形成によって起きる（Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。哺乳動物細胞で発癌に対する２つの主要な防衛線は（１）求電子物質の力を弱め、抗酸化剤と同程度のはたらきが可能なフェーズ２酵素、及び（２）グルタチオンである。フェーズ２酵素及びグルタチオンのレベルは種々の天然及び合成作用物質によって誘導可能である。本発明者は、本発明による化合物がそのような誘導に用いられると特に考えている。つまり、本発明による上記化合物の化学防御効果は反応性求電子物質を中性化し、間接的な抗酸化剤としてはたらき、及び／又はフェーズ１酵素を潜在的に活性化させるフェーズ２酵素の誘導によるものであると考えられる。
【０３５０】
本発明による化合物を投与することによって、フェーズ２酵素のレベルを調節することができ、化学的損傷に対する無害化及び抵抗性の増減のようなその調節の生理的効果が実現される。抗酸化応答配列は種々の発癌物質及びその他の毒素に対する防御を媒介するフェーズ２酵素の発現に関連している。この種の誘導可能なフェーズ２蛋白質のファミリーは多様で、細胞防御において異なる酵素が異なる役割を果たす。生体異物を内因性液体と結合させるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７８； Ｃｈａ ｅｔ ａｌ．， １９７９）のように「古典的な」フェーズ２薬物代謝酵素の誘導に加えて、誘導蛋白質群としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン・レダクターゼ（ＮＱＯ１）（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０）；エポキシド・ヒドロラーゼ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９）；ヘム・オキシゲナーゼ（Ｐｒｅｓｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｐｒｉｍｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）；フェリチン（Ｐｒｉｍｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）；γ−グルタミルシステイン・シンテターゼ（Ｍｕｌｃａｈｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｍｏｉｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９８ ａｎｄ Ｏｔｉｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００）；アフラトキシン・アルデヒド・レダクターゼ（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００）；カタラーゼ及びスーパーオキシド・ジスムターゼ（Ｏｔｉｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００）；ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ（Ｃｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；ロイコトリエンＢ４デヒドロゲナーゼ（Ｐｒｉｍｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）；アルドース・レダクターゼ及びアルデヒド・レダクターゼなどアルド−ケト・レダクターゼのファミリー；そして、グルタチオンＳ−結合流出ポンプ（Ｓ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐｓ）（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９のレビュー参照）などもある。これらあるいはその他の抗酸化応答配列媒介酵素のひとつ、全て、または任意の組み合わせの調節は本明細書に開示された化合物を投与することによって達成可能であり、そのような利用法は特に本発明の一部を成す。
【０３５１】
癌に加えて、多くのその他の疾病状態は１つ以上のフェーズ２酵素の異常な機能に関連している。従って、そのような疾病を本明細書に開示された化合物を使って治療することは本発明の一部を成す。例えば、アルド−ケト・レダクターゼなどによって行われる有毒アルデヒド無害化の不全は巨細胞側頭動脈炎及びパーキンソン病などの疾病に関連している。ヘム・オキシゲナーゼはニューロン及び腎臓や肺細胞などその他の組織の酸化的ストレスからの防御にとって重要であることが知られている。さらに、グルタチオンＳ−結合流出ポンプ（Ｓ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ）の機能は化学療法に対する癌細胞の多剤耐性（ＭＤＲ）及び細菌の抗生物質抵抗性に関連することが知られている。本発明による化合物での治療は、従って、ＭＤＲまたは抗生物質抵抗性を排除または最小限にするため、グルタチオンＳ−結合流出ポンプの機能調節に利用される可能性がある。本発明による化合物は細菌におけるグルタチオンＳ−結合流出ポンプで媒介されるシグナルの調節にも用いることができるであろう。
【０３５２】
示されたように、多くのフェーズ２酵素をコードする遺伝子は基礎的な発現と誘導可能な発現の両方を調節する５’上流抗酸化応答配列（ＡＲＥ／ＥｐＲＥ；コンセンサス配列ＴＧＡＣＮＮＮＧＣ）を含んでいる。ＡＲＥ配列と相互反応する転写因子の同定について研究が行われたが（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９のレビュー参照）、転写因子の塩基性ロイシン・ジッパー・ファミリーのメンバーがフェーズ２酵素の発現において中心的な役割を果たすと考えられている（Ｒａｍｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。誘導因子への細胞の暴露はＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体を分解し、Ｎｒｆ２が核に移動し、Ｎｒｆ２はそこで他の転写因子と共にヘテロ二量体の形であるが、フェーズ２遺伝子のＡＲＥエンハンサ領域に結合して、それらの転写を刺激する。近年、マイケル反応受容体がフェーズ２酵素を誘導することが示され、それらの化学防御効果はそれらのスルフヒドリル基との反応性に依存している（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。従って、本発明による化合物の構造がＤＮＡに結合する核因子−ｋＢ−ｐ６５の抑止、及び化学防御酵素の誘導を説明する。上に示されたように、本発明による化合物には慢性的炎症、酸化的ストレス、及び高リスクの悪性新生物発生によって特徴づけられる、薬剤が使用される多くの状況において重要な防御作用物質としての利用法が見つけられるであろう。
【０３５３】
本発明による化合物の１つの具体的な適用は活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）によって生じる細胞損傷の予防にある。例えば、抗酸化応答配列（ＡＲＥ）を活性化するため、本発明による化合物の細胞またはその細胞から成る組織への投与を介して、ＲＯＳ及びＲＮＳからの損傷を防止または緩和することができる。同様に、そのような方法は炎症を減少させるステップを同時に含んでいる。その多くの疾病状態において、ＲＯＳ及びＲＮＳによって引き起こされる損傷を治療または最小限にする能力はＲＯＳ／ＲＮＳの活性に関連している。それぞれの状態が本発明に従って本明細書に述べられている化合物をそれを必要とする患者に投与することによって治療が可能であるようないくつかの状態の具体例を表６に示す。
【０３５４】
（表６はＲＯＳ／ＲＮＳに関連した臨床状態の一部事例を示す。）
【表６】
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【０３５５】
酸素によるストレスに関連した状態は以下のいずれか（あるいはその両方）から起きる可能性がある。（１）抗酸化剤の減少：例えば、抗酸素防御酵素（ＣｕＺｎＳＯＤ、ＭｎＳＯＤ及びグルタチオン・ペロキシダーゼ）に影響を及ぼす変異、あるいはそうした防衛を枯渇させるような低下。多くの生体異物はＧＳＨとの接合によって代謝されるが、あまりに量が多いとＧＳＨを枯渇させて、その生体異物自体がＲＯＳあるいはＲＮＳでない場合は酸化によるストレスを引き起こす。食物による抗酸化剤及びその他の基本的な植物成分の枯渇も酸化によるストレスにつながる場合がある。（２）例えば、通常より高い濃度のＯ２への露出によるＲＯＳ／ＲＮＳ生産の増大、それ自体が反応性の種であるか（例えば、ＮＯ２など）、あるいは代謝されてＲＯＳ／ＲＮＳを発生させる毒素の存在、あるいは『自然の』ＲＯＳ／ＲＮＳ生産システムの過剰な活性化（例えば、慢性炎症性疾患における食細胞の不適切な活性化）。
【０３５６】
これらの損傷は酸化によるストレスの１つの発生源である。こうした酸化ストレスにつながる可能性があり、従って、本発明による化合物で処理が可能な損傷の例としては、虚血−潅流、発熱、トラウマ、こごえ、過剰な運動、毒物、放射線、及び感染などがある。酸化ストレスの発生には多数の様相が考えられており、事例としては食細胞の漸増及び活性化（これはＯ２、Ｈ２Ｏ２、ＮＯ−、ＨＯＣｌをつくりだす）；酵素形成あるいは非酵素形成過酸化物のペロキシル／アルコキシル・ラジカルへの分解と他の脂質／蛋白質への損傷の広がり；保存サイトからの金属イオン（ＦＥ２＋、Ｃｕ２＋）の放出とＨ２Ｏ２のＯＨ−への転化、脂質過酸化物のＲＯ２／ＲＯ−への分解の促進及び『自己酸化』反応；血液蛋白質放出（ミオグロビン、ヘモグロビン、シトクロム）；血液蛋白質の過酸化物との反応による遊離ラジカル損傷の刺激と、（その過酸化物が過剰な場合は）ＦＥ２及びヘム（ｈａｅｍ）の放出、それらはいずれも過酸化物をＲＯ２及びＲＯに分解する可能性がある；抗酸化剤防御システムによる干渉（例えば、細胞からのＧＳＨ及びアスコルビン酸塩のロス）；細胞外体液からのアスコルビン酸塩のロス；一部の細胞におけるキサンチン・デヒドロゲナーゼのオキシダーゼへの転化、これは損傷した細胞からキサンチン・オキシダーゼを放出させて全身的な損傷、エネルギー代謝の破壊によるヒポキサンチン・レベルの上昇などをもたらす可能性がある；ミトコンドリア損傷と、Ｏ２−からの電子漏出の増大；そして細胞内Ｃａ２＋、刺激性カルパイン、Ｃａ２＋依存ヌクレアーゼ、及びＣａ２＋／カルモデュリン依存酸化窒素シンターゼなどの増大によるＮＯの増大とＯＮＯＯ−形成の危険性の増大などである。
【０３５７】
ＸＩＩＩ．  活性化合物のスクリーニングのためのアッセイ及び方法
多くのアッセイが、関係する技術分野の当業者に周知であり、本明細書で述べられるモノテルペン／トリペルテン化合物をさらに特徴づけるために使用されている。これらは化学的性質アッセイだけでなく生物学的活性アッセイも含んでいる。これらアッセイの結果は、ヒトやその他の疾患哺乳動物の治療における潜在的な薬の使用に対してだけでなく化合物の性質に対しても重要な推論をもたらす。生物学的活性と免疫アッセイのｉｎ ｖｉｖｏおよび ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーンを含むこの点については、アッセイは特に有益であると思われる。
【０３５８】
（ｉ）  ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
本発明においてはいろいろな動物モデルを用いる。ヒトとマウスの間に見られる同一性は、本発明で述べられているモノテルペン／トリペルテン化合物などの潜在的な治療剤の機能を調べるための素晴らしい機会を提供する。マウスの炎症モデルを利用すれば、ヒトやその他の哺乳動物の炎症性疾患を高い確率で予測できるようになる。癌モデルも利用可能であり、これらのモデルは初期及び／又は転移性癌をシミュレートするために腫瘍細胞の局所てき、あるいは全身的な投与に利用できる。あるいは、特定の病気のタイプに関する現象をもたらすことが知られている薬剤を投与することによって、動物に炎症性疾患や癌を発生させることができる。
【０３５９】
テスト化合物を用いた動物の治療は、適切な形での動物への化合物の投与を含むであろう。投与は、臨床または非臨床目的で利用され得るいかなる経路でなされてもよく、経口、鼻、頬、直腸、膣、または局所等など、いずれの投与方法であってもよい。あるいは、投与は気管内注入、気管支注入、または皮内、皮下、筋肉内、腹膜内、静脈等への注射でもよい。特に、全身静脈注射、血管を通しての局所投与、腫瘍内注射などが本発明においては想定されている。
ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の有効性の確認はいろいろの異なる基準に基づいて行なわれる。そのような基準には、生存、炎症の低下、炎症応答の抑止、前癌状態の炎症状態から起こる悪性腫瘍の成長の抑制と予防、活性レベルの増加、免疫効果器機能における改善、食品摂取の改善などを含む。
【０３６０】
抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｖｏアッセイで特に有益なタイプのひとつは、マウスの皮膚モデルを使用したものである。マウスの皮膚モデルは、多段階発癌現象の実験モデルとして最もよく知られているものの代表であるが、癌の成長の３段階、つまり発生、促進、進行の決定を可能にした。細胞の悪性腫瘍への進行はプロトオンコジーン及び／又は腫瘍抑制遺伝子の連続的な変化を含むことが現在ではっしられており、そしてその遺伝子産物は信号形質導入経路及び／又は遺伝子発現調節に関与している。皮膚腫瘍の成長と悪化段階は選択的で継続的な増殖、分化変化、発生細胞の乳頭腫や癌腫への特殊な増殖につながる遺伝子の不安定性によって特徴づけられる。継続的な増殖の誘発と、ホルボール・エステル、過酸化物（パラクサイド）、クリサロビンといったいろいろな薬剤の働きを促進している皮膚組織とは強く相関していることが指摘されている。マウス皮膚モデルにおいては周知の発癌物質と腫瘍プロモータが継続する表皮性増殖を発生させるために用いられている。一般的には、これは炎症応答の後に起こる。
【０３６１】
大量のデータにより、発癌性と突然変異誘発力との間に強い相関関係があることが明らかになった。ほとんどの腫瘍発生因子は、細胞ＤＮＡに電子対を共有して結合している求電子反応剤を発生するか、あるいは代謝的に変化する。いくつかの遊離基と変更されたＤＮＡ基は遊離基で、発癌現象の腫瘍発生及び／又は腫瘍進行段階に関与している。Ｈａ−ｒａｓ遺伝子活性がマウス皮膚の発癌現象のプロセスにおいて早期に発生し、おそらく発生事象と同様であることが、強力な証拠によって示されている。例えば、７，１２−ジメチルベンザアントラセンによって誘導されたマウス皮膚の乳頭腫や癌腫の活性ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子の存在はコドン６１での高頻度のＡ−Ｔトランスバージョンに関与している。その後の研究で、この種の突然変異は化学的イニチエータに依存するが、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ上の始動体の直接的な効果を示している促進剤には依存しないことが明らかにされている。さらに、ウイルスによって活性化されたＨａ−ｒａｓ遺伝子（ｖ−Ｈａ−ｒａｓ）によるマウス皮膚の感染は、発癌現象の第２段階であっても、発生として働く。すべての皮膚化学発癌物質と皮膚腫瘍始動体は、Ｈａ−ｒａｓオンコジーン内で変異を起こさせるために示されてきたことは強調されるべきである。しかし、皮膚腫瘍促進剤はＨａ−ｒａｓ内で変異を引き起こさない。
【０３６２】
（ｉｉ）  ｉｎ ｖｉｖｏでの確認及び臨床研究
当業者であれば、本発明のモノテルペン／トリテルペン化合物を含む治療剤や、その他の治療剤を加えた組み合わせは、一般的にヒトの被験者を使う前にｉｎ ｖｉｖｏセッティングでテストされるべきであるということは理解されるであろう。そのような動物を使った臨床前テストは、この技術分野において慣例である。そのような確認テストを行うために必要なものは、当該病気に関して受け入れられている動物モデルだけであり、例えば炎症性疾患や固体腫瘍を有する動物である。こうした状況で、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、チンパンジーなどいかなる動物でも使用される。炎症性疾患や癌治療といった状況においては、ヒトでの効果を予測するものとしてマウスのような小動物を使用した研究が広く受け入れられており、そのような動物モデルは他の実験動物に比べて手に入り易く、比較的安価であるので、本発明の状況では好ましい。
【０３６３】
実験動物テストを実施するための方法は当業者には自明である。この実験を行うのに必要なものは、同等の複数の措置グループを作り、１つのグループにテスト化合物を投与し、平行して残りの１つ又は複数のグループの同等の動物を対象として比較研究をするだけである。これらの動物を研究の過程を通じて観察し、最終的には実験の効果を分析するために致死させる。
炎症治療の場合、モノテルペン／トリテルペン化合物の有効な量は、一般的に炎症の低下を示している炎症性サイト内の細胞の少なくとも約１０％になることが考えられる。少なくとも細胞の約２０％、３０％、４０％、５０％が炎症の低下を示すことが好ましい。そのサイトの細胞の１００％が炎症の低下を示すことが最も好ましい。
【０３６４】
使用される投与量が、動物の重度の副作用や不都合な反応を引き起こさない範囲で、少なくとも炎症の低下が約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％から１００％になるまで可能であるモノテルペン／トリテルペン化合物の投与量を使うことが望ましい。すべてのそのような判定は容易に下され、この技術分野の通常の技術によって適切に評価される。例えば、参加者、科学者、医師は実験動物によって得られたデータをヒトの治療に対して適切な投与量の最適な状態で利用することができる。進行した疾病では、ある程度の副作用は容認され得る。しかし疾病の初期段階での患者は、副作用無しで大きな治療効果を得るために、より控えめな投与量で治療され得る。そのような動物実験研究で見られる効果は、できるだけコントロールレベルに関して統計的に重要で、実験の度に再現可能であるべきである。
【０３６５】
当業者であればさらに、炎症の低下をもたらす本発明の化合物の組み合わせと投与は、有効範囲の一番低いレベルでも本発明でも有効であることはわかるであろう。例えば、継続的な活性剤の投与が考えられている実施例においては、炎症の低下が約１０％しかなかった最初の投与であっても有益であろう。さらに、炎症状態の進行段階のような悪性腫瘍の形成や、転移、新規の発癌現象などの可能性を妨げたり、低下させるモノテルペン／トリテルペン化合物の投与も治療を受ける患者にとって有益な治療にもなる。
【０３６６】
ｉｎ ｖｉｖｏテスト方式に関して上で述べたように、一緒に使用することを意図された薬剤の組み合わせは、一緒にテストされ、最適化されるべきであるということは、自明であろう。本発明の化合物は１つ又は複数の治療薬、抗毒素、凝固剤などの組み合わせでも容易に分析することができる。そのような薬剤の組み合わせ効果の分析は、上記で明らかにしたガイドラインによって判断、評価されるであろう。
【０３６７】
（ｉｉｉ）  ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明の１つの実施例は、炎症及び／又は成長を予防することまたは腫瘍細胞を殺すことができるような化合物を識別するためのｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる植物抽出物のスクリーニングである。
【０３６８】
炎症の低下に関する化合物の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ判定は、様々な遺伝子及び／又は炎症に含まれる蛋白質の発現や誘発アッセイになどにより行なわれる。従って炎症経路内の遺伝子数の制御に関与する転写調節因であるＮＦ−κＢでの低下、あるいはｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２のような酵素の減少についてもそうしたアッセイで行なわれる。これら酵素のいずれもインターフェロン・ガンマ、有糸分裂促進剤、リポ多糖体のような微生物による生産物など種々のサイトカインに応答して誘導される。したがって、それらは炎症反応、損傷の修復、発癌現象の重要な構成要素を形成する。
【０３６９】
腫瘍細胞の致死あるいは細胞毒性に関しては、これは一般的にネクローシスまたはアポトーシスによって示される。ネクローシスは、外部からの作用因子によって引き起こされる比較的よく見られる経路である。この過程の進行中、細胞膜と細胞室の一体性が失われる。一方、アポトーシス、あるいはプログラムされた細胞死は、特定遺伝子の活性、不活性によって起こされる形態的な事象の高度に組織化されたプロセスである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｗｙｌｌｉｅ， １９８５）。
細胞毒性のｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイの効果的な方法は、腫瘍細胞のパネルを選択された植物抽出物に規則的に露出させるステップを含んでいる。そのようなアッセイとアッセイの実行に適した腫瘍細胞株は、関連する技術分野の当業者に周知である。特に、抗腫瘍活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用される有益なヒト腫瘍細胞株は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３、ＨＥＹ、ＯＣＣｌ、ＯＶＣＡＲ−３；Ｊｕｒｋａｔ Ｔ−白血病細胞；ＭＤＡ−４６８ヒト乳癌株；ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞、ヒト黒色腫腫瘍株Ａ３７５−Ｍ及びＨｓ２９４ｔ；及びヒト腎臓癌細胞７６９−Ｐ、７８６−０、Ａ４９８などである。制御としての使用のための正常な細胞株の好ましいタイプは、ヒトＦＳまたはＨｓ２７包皮繊維芽細胞を構成する。
【０３７０】
腫瘍細胞を消滅させる化合物の有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの判断は、細胞サイクルのアレストに含まれる様々な遺伝子の発現と誘導（ｐ２１、ｐ２７； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅｓ）及びアポトーシス（ｂｃｌ−２，ｂｃｌ−ｘＬ ａｎｄ ｂａｘ）のアッセイによって行なわれる。本アッセイを実行するには、細胞はテスト化合物で処理し、溶解させ、蛋白質は分離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分解し、ゲルに結合した蛋白質はニトロセルロース膜に変化する。この膜は先ず抗体（例えば、ｐ２１，ｐ２７，ｂａｘ，ｂｃｌ−２，ｂｃｌ−ｘｌなど）を用いて調べられ、次に希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合二次抗体を用いてを調べられ、その膜はＥＣＬ検査試薬に露出され、ＥＣＬ写真フィルム上で明視化される。蛋白質の組成比の分析を通して、例えばＧ０／Ｇ１期、Ｓ期またはＧ２／Ｍ期などの諸段階おける細胞の相対的比率に関しての判定がなされる。
【０３７１】
癌細胞に対する化合物の細胞毒性は、ＭＴＴやクリスタル・バイオレット染色を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで効果的に識別することも可能である。この方法では、細胞はプレートに入れられされ、種々の濃度のサンプル化合物に露出、培養させて、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルエチアゾル−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、あるいはクリスタル・バイオレットを用いて染色させた。ＭＴＴに溶解緩衝液（２０％ナトリウム・ドデシル硫酸塩を５０％ＤＭＦに入れたもの）を入れ、さらに培養してから、５７０ｎｍでＯＤ読み取りを行った。クリスタル・バイオレット・プレートを洗浄して、ソレンセン緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）、５０％ｖ／ｖエタノール）を用いて染料の抽出を行い、その後、５７０−６００ｎｍでプレートの読み取りを行った（Ｍｕｊｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。相対的な吸収度を測定することで得られた細胞促成の判定がなされる。
【０３７２】
（ｉｖ）  ＮＦ−κＢの抑止のためのアッセイ
ＮＦ−κＢを抑止する化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性判断は、ＮＦ−κＢによって誘発、調節、規制される種々の遺伝子及び／又は蛋白質の発現と誘導のアッセイなどによって行なわれる。例えば、炎症経路に関与する遺伝子に関する遺伝子発現あるいは蛋白質発現などである。１つの例として、インターフェロン・ガンマ、有糸分裂促進剤、リポ多糖体（ＬＰＳ）などのような微生物による生成物などのサイトカインによる細胞刺激に応じたＮＦ−κＢ活性化によってもたらされるそれに基づいた応答の結果として誘発されるｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２などの酵素の減少などである。これらのアッセイはウエスタン・ブロットや遺伝子発現アッセイ、酵素アッセイなどこの技術分野で周知の方法を含んでいる場合もある。
【０３７３】
例えば、ＮＦ−κＢ抑制に関するアッセイは、１つの抑制的化合物で措置された細胞質と細胞の細胞質及び核蛋白質抽出物を用いて抑制蛋白質ＩκＢの縮小とＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの核転座について調べられるウエスタン・ブロット分析を含んでいる。そうしたアッセイの場合、細胞質または核蛋白質抽出物はゲル上で分解し、基質／膜に電気的に移動させられる。その膜は例えばウサギ抗ＩκＢαまたはウサギ抗ｐ６５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ， ＣＡ）などの抗体でプローブされ、そしてホースラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰＯ）などの検査成分に接合された抗ウサギ抗体、フルオール結合、あるいは放射性核腫などによるプローブを用いた調査が行なわれる。そして蛋白質バンドは化学発光、蛍光検査、放射性検査などの適切な手段によって検査及び識別することが可能である。
【０３７４】
その他の実施の形態では、アッセイはトランスフェクションとルシフェラーゼやＧＦＰのような報告ずみの遺伝子のアッセイを含んでいる場合もある。このように、細胞を電気穿孔法やその他の手段により、ＮＦ−κＢから成るリポーター・コンストラクトを使用して核酸を入れられることも可能である。それらの細胞は（ここで述べられているモノ／トリテルペン化合物などのような）化学的抑制剤を用いて措置される。そしてＮＦ−κＢはサイトカインや微生物ＬＰＳのような刺激物質の使用により活性化され、レポータ遺伝子活性が測定される。
ｉＮＯＳとＣＯＸ−２のようなＮＦ−κＢによって活性化された酵素の誘導と測定は、例えば（Ｆ０９４またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドなどの）抑制剤で処理した細胞をプレートに入れて、それらの細胞をＬＰＳ／サイトカインに露出させることによって、それらの細胞内のＮＦ−κＢを活性化させることによって行なうこともできる。そして細胞を溶解させ、蛋白質を抽出して、細胞蛋白質がゲルに置かれて、膜状に電気的に移動させられる。ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のレベルは、例えばウサギ抗ｉＮＯＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とヤギ抗ＣＯＸ−２抗体のような適切な抗体を使ってウエスタン・ブロット分析によって分析される。他の実施例では、ＮＦ−κＢ抑制検出方法として酵素活性が測定される場合もある。
【０３７５】
（ｖ）  免疫アッセイ
本発明では、本発明で述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物に関してアカシア・ビクトリアエ以外の植物種（類）からの抽出物のスクリーニングにおいて免疫アッセイを用いる場合もある。本発明に含まれる免疫アッセイは米国特許第４，３６７，１１０（ダブルモノクロナール抗体サンドイッチ・アッセイ）及び米国特許第４，４５２，９０１（ウエスタン・ブロット）に述べられているものを含むが、またそれだけに限られない。その他のアッセイとしては、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方のラベルされた配位子の免疫沈降と免疫細胞化学的分析法などがある。
【０３７６】
免疫アッセイは、最も簡単で直接的な意味では結合アッセイである。好ましい免疫アッセイは、この技術分野で周知の免疫収着剤（ＥＬＩＳＡｓ）と放射免疫測定（ＲＩＡ）に関連した種々のタイプの酵素である。組織片を用いた免疫組織化学検査も特に有益である。
【０３７７】
１つのＥＬＩＳＡ具体例において、抗モノテルペン／トリテルペン抗体はポリスチレン・マイクロタイタ―・プレート内のウェルなど、蛋白質親和性を示す特定の表面上に固定される。そして、アカシア・ビクトリアエに関連する植物からの植物抽出物のようなモノテルペン／トリテルペン化合物を含む可能性があるテスト化合物がそのウェルに入れられる。結合および非特異性結合免疫複合体を除くための洗浄を行なった後、結合抗原が検出される場合もある。検出は一般的には希望する抗原に対して特異性を示し、検出可能なラベルに結合される別の抗体を加えることによって行われる。このタイプのＥＬＩＳＡは単純「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出は望ましい抗原に特異性を示す２番目の抗体を加え、さらに２番目の抗体に結合親和性のある３番目の抗体を加えることで行わる場合もある。
【０３７８】
ＥＬＩＳＡ技術のバリエーションも当業者には周知である。そのような方法の１つにおいては、望ましい抗原を含んでいると考えられるサンプルをウェル表面に固定し、予め用意された抗体と接触させられる。結合及び適切な洗浄を行なった後、結合した免疫複合体を検出する。最初の抗原特異性抗体が検出可能なラベルに結合されている場合、免疫複合体はすぐに検出される。この場合も、免疫複合体は２番目の抗体が検出可能なラベルにリンクされている状態で、第１の抗原特異性抗体に結合親和性を有する２番目の抗体を使用して検出することも可能である。
【０３７９】
競合的ＥＬＩＳＡもテストサンプルがラベルされた抗原または抗体の既知量で結合のに関して競合場合は可能である。周知でないサンプルでの反応種の量は被覆されたウェルを使った培養の前または間周知のラベルされた種を使ったサンプルを混合することで判断される。サンプル内の反応種の存在はウェルとの結合が可能なラベルされた種の量を減少させる働きをし、従って最終的な信号を減少させる。
【０３８０】
用いられる形態には関係なく、ＥＬＩＳＡは共通するある特徴を持つ。例えば、被覆、培養、または結合、非特別結合種を除去するための洗浄、そして結合免疫複合体の検出などである。これらについて以下に説明する。
抗原や抗体はプレートやビーズ、ディップスティック、膜やカラム・マトリックスなどの形状にされるなど固体のサポートに結合されてもよい、そして固定の抗原や抗体に適用されたサンプルは分析される。プレートを抗原や抗体で被覆する場合、一晩または特定の時間抗原や抗体の溶液と一緒にプレートのウェルを培養するのが一般的である。そしてプレートのウェルは、吸着が不十分な物質を除去するために洗浄される。ウェルの表面に残っているものはテスト抗血清に関して抗原的に中性な非特異的蛋白質によって「被覆される」。これらはウシ血清（ＢＳＡ）、カゼインおよび粉乳の溶液を含む。この被覆により固定表面上の非特異的吸着の阻止が起こり、表面上の抗血清の非特異的結合によって起こったバックグラウンドを減少させる。
【０３８１】
ＥＬＩＳＡでは、一般的に直接的な手段よりも２次的、３次的な検出を使用することが多い。従って、抗体や抗原のウェルへの結合、バックグラウンドを減少させるための非特異的物質による被覆、そして結合していない物質の除去のための洗浄の後、固定表面は免疫複合体（抗原／抗体）形成を起こさせるのに効果的な状況下でテストされる臨床的なまたは生物学的なサンプルに接触させられる。そこで免疫複合体の検出は、ラベルされた３次的抗体や３番目の結合配位子に関連して、ラベルされた２次的結合配位子や抗体、または２次的結合配位子や抗体を必要とする。
【０３８２】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を起こさせるのに効果的な状況下」とは、抗原と抗体をＢＳＡ，ウシ・ガンマグロブリンとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で薄めることを含むことが好ましい状況のことである。これらの加えられた薬剤非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。
【０３８３】
適切な状況とは、培養が効果的な結合を起こさせるのに有効な温度と時間で行われることも意味する。培養ステップは通常約１時間から２、４時間で、温度は２５から２７℃程度が好ましく、または約４℃で一昼夜行われる場合もある。
ＥＬＩＳＡでのすべての培養ステップに続いて、接触表面は非複合物質を除去するために洗浄される。洗浄にはＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎの溶液や、ホウ酸塩緩衝液を使った洗浄が含まれることが多い。テスト・サンプル最初から結合している物質との間の特異的な免疫複合体が形成された後、洗浄が行なわれ、微量名量の免疫複合体の発生でも判定することができる。
【０３８４】
検出方法を提供するためには、第２あるいは第３の抗体に検出を可能にするラベルを加える。これは好ましくは発色基質で培養体を発色させる酵素である。従って、例えば、第１あるいは第２の免疫複合体を、ウレアーゼ、ブドウ糖酸化酵素、アルカリ・ホスファターゼまたは過酸化水素結合抗体などと、第１あるいは第２の免疫複合体 ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳを含む溶液での室温で２時間行った培養のようなさらなる免疫複合体の形成の進行を助ける時間と状況下で接触させるような方法が好ましいであろう。
【０３８５】
ラベルされた抗体を使用した培養とその後の非結合物質を除去するための洗浄の後、ラベルの量が、例えば、酵素レベルとしてのペルオキシダーゼの場合、ウレア及びブロモクレゾール・パープルまたは、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−硫酸 ［ＡＢＴＳ］ 及びＨ２Ｏ２のような発色基質を用いた培養によって定量される。定量は例えば可視的な分光測光器を使用して発色程度を測定することによって行われる。あるいはラベルは化学的発光によるものであってもよい。そのようなラベルの利用については、米国特許第５，３１０，６８７、５，２３８，８０８、５，２２１，６０５において述べられている。
【０３８６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｓｉｔｕ分析方法は周知であり、組織や細胞や細胞抽出物への抗原特異性抗体の結合の検査を含んでいる。これらはこの技術分野においてたいへん慣例的な技術である。例えば、腫瘍細胞抗原に対する抗体は、瞬間冷凍と、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究によって準備されたホルマリン漬けパラフィン包埋組織ブロックの両方の組み合わせが使用されるかもしれない。各組織ブロックは「粉砕された」腫瘍の残留物の５０ｍｇから成る。これらの粒子状の試料から組織ブロックを準備する方法は、例えば乳癌などにおけるようないろいろな予後要素の前のＩＨＣ研究にうまく利用されており、当業者に周知である。
【０３８７】
簡単に説明すると、凍結セクションは小さいプラスチックカプセル内のＰＢＳに室温で凍結した粉砕された腫瘍５０ｎｇを再水和することによって調製することができ；遠心分離法で粒子をペレット化し；それらを粘性の包埋物質に再懸濁（ＯＣＴ）し；カプセルを逆転させ、遠心分離法で再ペレット化し；−７０℃イソペタンで瞬間冷凍っし；プラスチックカプセルを切り、組織の凍ったシリンダーから取り除き；組織シリンダーをクリオスタット・ミクロトーム・チャックに置く；そして平均約５００の著しく損傷のない腫瘍組織を含む２５−５０の連続したセクションに切断する。
【０３８８】
パーマネント・セクションは、プラスチックのミクロ菌チューブでの５０ｎｇサンプルの最水和を含む同じような方法でつくることができ；ペレット化し；４時間の定着のための１０％ホルマリン漬け；洗浄／ペレッティング；温かい２．５％寒天への再懸濁し；ペレット化し；寒天を凝固させるため氷水で冷却し；組織／寒天ブロックをチューブから取り除き；ブロックをパラフィンに漉し入れ包埋し；最大５０個のパーマネント・セクションに切断する。
【０３８９】
本発明に照らしてみると、スクリーニング・アッセイを用いてここで述べられているような基本的に同じ化学的性質と生物学的活性を有する化合物の特定することが可能である。特に、本開示により、例えばアカシア属の種であるアカシア・ビクトリアエに深く関連するような植物からとれる生物学的活性モノテルペン／トリテルペン・グリコシドのためにアッセイが使用されるようになるだろう。これらのアッセイではいろいろな異なるフォーマットで利用でき、スクリーンが行われる「活性」の種類に依存するだろう。好ましいアッセイは、ここで述べられたアカシア・ビクトリアエからの抽出物のような抗炎症活性と抗腫瘍活性のためのスクリーニングを行うものから構成される。ここで使用したように、「抗腫瘍活性」とは、細胞間の信号、成長、細胞分裂、細胞移動、柔らかい寒天培地形成、接触予防、侵襲性、血管形成、腫瘍の発達、またはその他の悪性表現型またはアポトーシスの誘導を指している。特に考えられているのが、抗真菌薬と抗ウイルス薬、殺魚剤または軟体動物駆除剤、避妊薬、駆虫剤、紫外線保護剤、去痰薬、利尿剤、抗炎症剤、コレステロール代謝調節剤、心血管効果器、抗潰瘍剤、鎮痛剤、鎮静剤、免疫調整剤、解熱剤、血管形成阻害薬、毛細血管脆弱性減少剤として本発明の化合物の使用方法を含む機能的アッセイである。即時開示の観点からすると、そのようなアッセイは本技術分野の当業者に周知になるであろう。活性のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏダイレクトアッセイ同様、これらのアッセイは本発明の化合物による基質、配位子、受容体またはその他の結合相手との結合防止手段を含むであろう。
【０３９０】
ＸＩＶ．  アカシア・ビクトリアエの成長及び組織培養
以下に述べるモノテルペン／トリテルペン化合物の調製における１つの重要な実施形態はアカシア・ビクトリアエの組織の利用の可能性についてである。上にも述べたように、上記化合物はアカシア・ビクトリアエの根と鞘に集中しており、これらの組織の利用可能性が特に重要である。若い苗は本発明の化合物を単離するためのもう１つの源泉である。アカシア・ビクトリアエは米国南西部とオーストラリアで成長しており、従って、この植物の組織は一般に利用できる。さらに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９に（１９９８年５月７日に）本発明者らによってアカシア・ビクトリアエの種２５００個がデポジットされている。これらデポジットされたこれらの種子はＡＴＣＣ登録番号第２０９８３５とされている。このデポジットは微生物のデポジットに関するブタペスト条約の条件と規定に基づいて行なわれたもので、最低３０年間は保存され、デポジット・サンプルの提供に関する最も新しい依頼を保存者側が受け取ってから少なくとも５年間か、本特許の有効期限のいずれか長い方の期間保存され、その期間中に利用が不可能になった場合は置き換えられることになっている。
【０３９１】
従って、本開示に照らして、当業者であればこれらデポジットされたサンプルを撒いてそれから植物を成長させ、そしてそれらの植物から組織を分離して本発明のトリテルペン化合物と医薬品を調製することはできるであろう。また、天然のアカシア・ビクトリアエ群から組織を単離することも可能であろう。しかし、モノテルペン／トリテルペン化合物の単離のための組織の調製は、アカシア・ビクトリアエ組織増殖のために適切な技術が考案されればより容易に行なうことができるであろう。この組織作成の１つのオプションはその種の大規模な栽培である。より好ましいオプションは、アカシア・ビクトリアエの組織培養及び空気中成長システムの実施であろう。
【０３９２】
（ｉ）  空気中成長技術
アカシア・ビクトリアエ空気中成長システムの利用によって多数の利点を実現することができる。第１に植物の成長速度が通常の栽培技術を用いた場合と比較して約２倍速い。第２にその植物に害を及ぼさずに根を簡単に採取できる。根を切断すると繊維性の根が横方向に一層早く成長する。従って、根を１年間に何回も収穫できる。アカシア・ビクトリアエの野生群では鞘の回収は１年に数週間に限られており、その植物に害を及ぼしたり殺したりすることなしに根を採取することは困難である。
【０３９３】
空気中成長システムは、その植物の根が空気中に宙吊りにされていて、完全な栄養液の噴霧を受けるクローズド・システムである。これらの根は防水ボックス内に入れられていて、栄養液で一定間隔で噴霧される。この栄養液はその植物がライフ・サイクルを完了するのに必要な要素をすべて含んでいる。最適な成長を達成するためにそれぞれの植物が異なったレベル及び処方を必要としているにも拘わらず、全体としては１つのバランスをとった溶液で十分な結果が得られる。
【０３９４】
（ｉｉ）  アカシア・ビクトリアエの組織培養
組織培養はアカシア・ビクトリアエ培養のもうひとつの方式である。組織培養を行うためには、アカシア・ビクトリアエの種を抗菌性石鹸を用いて水道水で完全に洗浄して、市販の漂白剤の２０％溶液で１５分間処理する。純水で何回か洗浄を繰り返した後、その種子を沸騰した水で処理して発芽させ、一昼夜培養する。翌朝、それらの種子を再度市販の漂白剤で除菌したあと、無菌純水で２−３回洗浄する。汚染を取り去った種子をＭＳビタミン及び２％サクロース（移植片培養の場合は３％サクロースを用いる）で補強したＭＳ培養液上で培養して、０．７％寒天または０．２％ゲライトでゲル化させる。
【０３９５】
培養に用いる移植片は茎頂、節、胚軸及び根などのどの部分を含んでいてもよい。これらの移植片を、通常、ＭＳだけ、あるいはＩＡＡ，ＮＡＡ、ＩＢＡ、２，４−Ｄ及びＢＡＰ（それぞれ単独かあるいは組み合わせのいずれでも）などの成長調節剤で補強したＭＳ上で培養する。それらの培養物を２５±２℃の温度下で低温白色蛍光管による１０００Ｌｕｘで１６時間光照射状態に置く。得られた植物片を温室内に１ヶ月保管してから、温室、路地、あるいは空気中成長システムなどに移す。
【０３９６】
アカシア・ビクトリアエの細毛に覆われた培養物が本発明で開発されている。アグロバクテリウム・リゾジン株Ｒ−１０００によるそれら植物の感染はその植物ゲノム内でのＴ−ＤＮＡの一体化及び発現をもたらし、細毛に覆われた根の発生をもたらす。細毛に覆われた培養体は急速に成長し、傾斜屈性の根の成長を示し、ホルモンを含まない培養液内で高度の分岐を示し、そして高い程度の遺伝子的安定性も示す（Ａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。アカシア・ビクトリアエにおける細毛に覆われた根の形質導入及び誘発とその成長のための最適条件は実施例の箇所で述べる。細毛に覆われた根の培養体は大規模かつ急速な根の成長をもたらし、それらはモノテルペン／トリテルペン化合物の単離に用いることができる。
【０３９７】
組織培養の利点は、上記モノテルペン／トリテルペン化合物を発現するクローン性の培養体をつくることができる可能性があることである。これらの培養体は大規模に成長させることができ、モノテルペン／トリテルペン化合物単離のための植物組織をつくるための工業的な規模での成長システムに拡大させる可能性がある。さらに、組織培養体から再生された植物はしばしばかなりの変異を示す場合もある。従って、組織培養体を用いて、ここで述べられているモノテルペン／トリテルペン化合物の生成に関しては『優れた』クローン性細胞株あるいはそうした培養体から再生された植物を生産することが可能である。生産された植物は何世代にもわたって保存、選択されて真に優れた株を得ることが可能である。
【０３９８】
しかしながら、アカシア・ビクトリアエの野生群にはかなりの遺伝的変差が存在するので、組織培養体からかならず優れた変種が発生してくる保証はない。従って、本発明者らは、野生のアカシア・ビクトリアエで見られる遺伝的変差はモノテルペン／トリテルペン組成物生成の内発レベルを制御する遺伝子的変差を含んでいると考えている。従って、他の野生種レベルと比較してモノテルペン／トリテルペンのレベルが増大しているアカシア・ビクトリアエ群のメンバーを確認し、これらの変種をモノテルペン／トリテルペン化合物単離のために組織生成に向けた成長システムで使用するために選択することができるようにすべきであろう。この成長システムは、例えば、従来の農法、空気中成長技術、組織培養、あるいはアカシア・ビクトリアエ組織の増殖に適したその他のいずれかの技術で構成されるであろう。さらに、これらの植物はより優れ、従って本当の意味で育種につながる変種をつくりだすための育種手順で使用するために選択することもできる。
【０３９９】
ＸＶ．  定義
１つ（英語のａあるいはａｎ）は１つ以上を意味している。従って１つの成分という場合、それは１つ、２つ、３つ、あるいはそれ以上の成分を意味している。
【０４００】
活性成分とは活性を保持しているほとんど純粋な抽出物を意味している。本発明においては、『活性成分』あるいは『活性化合物』とは本発明者らによって識別された活性トリテルペン化合物を指している。これらの化合物は精製され、例えば、フラクションＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４に示されている。
【０４０１】
鞘とはアカシア・ビクトリアエの鞘を指している。
【０４０２】
細胞毒性とは細胞死として定義され、『細胞増殖抑制性』とは細胞の成長及び／又は増殖の抑止と定義されている。
【０４０３】
アポトーシスは胚の成長と組織のホメオスタシス保持中に贈るプログラムされた細胞死という正常な生理学的プロセスである。アポトーシスのプロセスは自死性細胞における一連の代謝変化に再分割することができる。いくつかの規制的あるいは信号形質導入経路の個別酵素ステップを評価して、１つの細胞なり細胞群内でアポトーシスが起きているかどうか、あるいは細胞死のプロセスが癌細胞内で中断されているかどうかを示すことができる。アポトーシスのプログラムは血漿膜内での（非対照性の喪失など）変化、細胞質と核の濃縮、及びＤＮＡの核間クロモソーム性切断などの形態上の変化によっても観察することができる。これらが最終的には細胞死につながり、細胞は『自死体』に劣化する。
【０４０４】
アポトーシスに関与するいくつかの酵素的及び信号伝達的プロセスを評価する方法が多重パラメータ・アポトーシス研究での標準的手順として開発されている。アポトーシスの初期の段階の１つの例はミトコンドリアからのシトクロームｃの放出と、その後に続くカスパーゼ−３経路の活性化である（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。カスパーゼ（一連の細胞質性プロテアーゼ）の誘発はアポトーシスで最も一貫して観察される特徴の１つである。特に、カスパーゼ−３はこのプロセスにおいて中心的な役割を果たしている。カスパーゼが活性化されると、それらは標的蛋白質を切断し、これらにおいて最も重要なのはＰＡＲＰ（核内に位置しているポリ−（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）である。従って、シトクロームｃの放出を検出するアッセイ、カスパーゼ−３活性を検出するアッセイ、及びＰＡＲＰ劣化を検出するアッセイはアポトーシス判定の有効な判断材料である。
【０４０５】
悪性細胞のミトコンドリアからのシトクロームｃの放出を起こさせる作用因子は、プログラムされた細胞死の細胞制御の少なくとも一部の側面を再生するための可能性の高い両方であると結論付けることは可能であろう。
【０４０６】
別のアポトーシス・アッセイはアネクシン−Ｖ検出である（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＤ）。通常、ホスホチジルセリン（ＰＳ）は血漿膜の内側膜上に位置している。しかしながら、アポトーシスの初期の段階で、ＰＳの外化が起きる。アネクシン−Ｖはカルシウム結合蛋白質でＰＳに結合し、フロー血球計算によってアネクシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色によって観察することができる。本発明で述べられているアカシア・ビクトリアエ化合物で処理された細胞のアネクシン−Ｖに結合する能力は、その細胞がアポトーシスの過程にあることを示す兆候と取ることができる。
【０４０７】
他の例で、本発明者らはアカシア・ビクトリアエから単離された抗癌化合物の混合物で処理された細胞内のアポトーシス活性を検出するためにＰＩ−３キナーゼ・アッセイを用いた。１つの細胞膜酵素であるホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）はホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３−位置をホスホリル化でき、従ってＰＩ３Ｋが活性なこれらの細胞内で新しい脂質信号経路を形成する。ＰＩ３Ｋの活性化する場合、ＡＫＴと呼ばれるキナーゼが細胞膜に補充される。ＡＫＴは膜に補強された後触媒的に活性化されるオンカジーンの生成物である。十分に活性化されたＡＫＴは細胞の生残において決定的に重要な役割を演じている。このＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は細胞がアポトーシスを回避するメカニズムを提供する。従って、悪性細胞内のＰＩ３Ｋを抑制する手段はアポトーシスに対する細胞制御の少なくとも一部の側面を再生する上で可能性の高い治療法である。
【０４０８】
異常な増殖とは癌として知られている病理状態にある哺乳動物細胞内で起きる遺伝子的に決められた一連の変化である。このプロセスは最終的には癌細胞におけるアポトーシスの制御の喪失につながる。これは１：一般的には外部的薬剤あるいは刺激が１つ以上の遺伝的変化を引き起こす段階として定義される開始と、２：炎症を含む場合もあるさらなる遺伝子的及び代謝的変化を伴う段階と定義される促進の段階で起きる。『促進段階』中、細胞はアポトーシスが阻止された細胞成長の１つの段階に代謝移行を開始する。
【０４０９】
悪性細胞とはその悪性病変発現の開始及び促進段階を通じて一連の代謝変化を通じて清浄な成長制御メカニズムから逸脱した癌細胞と定義される。これらの変化はそれらの細胞における（活性化突然変異及び／又はプロトオンコジーンの発現増強−及び／又は不活性化突然変異及び／又は１つ以上の腫瘍抑制遺伝子の発現の低下のいずれか）の結果である。ほとんどのオンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子生成物は細胞サイクル入口あるいは出口を制御し、差別化を促進し、ＤＮＡ破損を感知し、修復メカニズムを開始させ、及び／又は細胞死プログラムを調整する信号形質導入経路である。細胞は細胞成長、分化、ＤＮＡ損傷制御、及びアポトーシスを制御する複数の並列メカニズムを用いている。ほとんどすべての腫瘍及び悪性細胞は複数のオンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子内に突然変異を有している。
【０４１０】
抽出物あるいはフラクションとは、種々の手段によって組織から回収される連続的なサンプルを意味している。これら『抽出物』あるいは『フラクション』を望ましい抗腫瘍活性に関して分析し、さらに『抽出』あるいは『分別』して、上記活性成分に対応したより純粋な成分をつくりだすことができる。
【０４１１】
モノテルペン／トリテルペン化合物あるいはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドとはアカシア・ビクトリアエから得られる上記新しい、及び／又は生物学的に活性のあるサポニン化合物を示している。モノテルペン／トリテルペン化合物あるいはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドは、当業者であれば本開示に照らして関連の種から、あるいはここに開示されているモノテルペン／トリテルペン化合物又はグリコシドから単離することもできるので、必ずしもアカシア・ビクトリアエから単離しなければならない訳ではない。あるいはそれらの化合物を生化学的に合成することも可能である。本発明の『モノテルペン』とは少なくとも１つのモノテルペン単位を含んでいる本明細書に述べられているサポニン化合物を含んでいる。これらモノテルペン類は付加的に／あるいはオプションとしてそれらを１つの細胞内に移入させることができる『担体成分』に取り付けることができ、こうした担体はトリテルペン・グリコシド、糖あるいは糖類、脂質、脂溶性蛋白質、あるいはそのモノテルペンに膜透過性を付与するいずれの成分であってもよい。さらに、このモノテルペンを付加的な化学的機能と結びつけて、それによってその修正が発明の要約の箇所で述べられているような上記化合物の生物学的活性を破壊しないようにすることもできる。モノテルペンがトリテルペンと結合されると、上記化合物は『モノテルペン／トリテルペン化合物又はグリコシド』と呼ばれる。本発明の『トリテルペン』は本明細書に述べられているサポニン化合物を含んでおり、それらは少なくとも１つのトリテルペン単位、そしてトリテルペン・グリコシドの場合は、糖あるいは糖類と、そして少なくとも１つのモノテルペンを含んでいる。これらの用語は、本明細書の以下の説明で明らかにされるように、モノテルペン単位などを含む付加的な成分あるいは化学的機能を含む化合物も指している。従って、本発明のトリテルペンは糖単位の加水分解で形成されるアグリコンを含んでおり、さらに、上記化合物の生物学的活性を破壊しないようなトリテルペン化合物のその他の修正を含んでいる場合もある。
【０４１２】
【実施例】
以下の実施例は本発明の好ましい実施の形態を示すためのものである。以下の実施例で開示される技術は本発明の実施においてよく機能すると本発明者らによって認められた技術を示すものであり、従って、その実施の好ましい形態を構成するものであることは当業者であれば理解できるであろう。しかしながら、当業者なら本開示に照らして、本発明の考え方、精神及び範囲から逸脱せずに具体的な実施の形態において変更を加え、同時に同様の、あるいは類似した結果を得ることが出来ることは容易に理解するであろう。さらに具体的には、化学的及び生理学的に関連した一定の作用因子を以下の作用因子と取り替えても同じ、あるいは同様の結果が得られることも明らかであろう。当業者に自明のそうした同様の置き換え、あるいは修正は添付請求項において定義されているような本発明の精神、範囲、考え方の範囲内にあるとみなされるべきである。
【０４１３】
実施例１
アカシア・ビクトリアエからの抗腫瘍活性成分の予備的スクリーニング及び精製
有益な生物学的活性を有する新しい化合物を識別する目的でＤｅｓｅｒｔ Ｌｅｇｕｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ （ＤＥＬＥＰ）から６０の植物種を選択した。このＤＥＬＥＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ， Ｔｕｃｓｏｎ）はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｒｉｚｏｎａとＢｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ａｒｂｏｒｅｔｕｍの間の協力で開発された砂漠マメ科種のコレクションである。実験的な露地サンプルをそれぞれの植物種から集めて、３−４日間空気乾燥させ、Ｗｉｌｅｙミル（３ｍｍスクリーン・サイズ）で３ミリメートルの粒子サイズに破砕して、ジクロロメタン（ＤＣＭ）とメタノール（ＭｅＯＨ）の１：１混合物で２−３回浸出ろ過させて抽出させた。各浸出は少なくとも５時間は継続され、しばしば一昼夜継続された。集出されたバイオマスの過半数は最初の２つの浸出で回収されたものであった。このバイオマスを次に空隙体積の半分の量のメタノールで洗浄して、粗抽出物をメタノール・アリコット（等分部分）を分離した。これらのサンプルは通常、ｉｎ ｖａｃｕｏでメタノールを除去して、水相をＲＰ−Ｃ１８粒子内を通過させ、ＭｅＯＨ内で活性を示す成分を回収して、次にＭｅＯＨを回転蒸発させて、集出物を固形物として回収することで分離された。この粗抽出物をＨ２Ｏ、ＤＭＳＯあるいはそれらの混合物内で再懸濁させた（極性の低い化合物はＤＭＳＯ内に再懸濁され、極性の高い方の化合物は水、あるいは水とＤＭＳＯの混合物内に再懸濁された。アグリコンはＤＭＳＯ内に再懸濁された。）
【０４１４】
ヒト卵巣癌、Ｔ白血病細胞、ヒト類表皮細胞、ヒト乳癌細胞、ヒト前立腺癌、ヒト包皮繊維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト腎臓癌などの一連のヒトの腫瘍及び非腫瘍細胞を用いてスクリーニングした。これらの細胞を先ず９６ウェル・プレート内で３７℃の温度で１８−２４時間に保持した。これらの細胞をいろいろの濃度の植物抽出物に露出させて、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルエチアゾル−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて４時間、あるいはクリスタル・バイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を室温で２０分間染色させた。ＭＴＴに溶解緩衝液（２０％ナトリウム・ドデシル硫酸塩を５０％ＤＭＦに入れたもの）を入れ、さらに６０分間培養してから、５７０ｎｍでＯＤ読み取りを行った。クリスタル・バイオレット・プレートを洗浄して、ソレンセン緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）、５０％ｖ／ｖエタノール）を用いて３−４時間染料の抽出を行い、その後、５７０−６００ｎｍでプレートの読み取りを行った（Ｍｕｊｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。スクリーンされた抽出物の細胞毒性を、培養液だけで処理された細胞と植物抽出物によって処理された細胞のＯＤ読み取り値を比較して示した。細胞毒性の割合は比較対照を１００％と想定して計算した。つまり比較対照を１００％と想定した割合（％）は［（植物抽出物で処理した細胞（処理されたサンプル）のＯＤ）／（培養液だけでに露出された細胞のＯＤ）］ｘ１００］として計算された。
【０４１５】
最初のスクリーニングで、１つの植物抽出物は癌細胞に対して強力な抑止効果を示したが、通常のヒト繊維芽細胞に対してほとんど毒性を示さなかった。ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１とコードされたこの抽出物を豆科植物アカシア・ビクトリアエから分離した。この抽出物はヒト卵巣癌細胞株を用いた場合約１２μｇ／ｍｌ（ＳＫＯＶ−３）、２６μｇ／ｍｌ（ＯＶＣＡＲ−３）及び１３μｇ／ｍｌ（ＨＥＹ）でＩＣ５０を示し、ヒト黒色腫細胞の場合は５０μｇ／ｍｌ（Ａ３７５−Ｍ）及び約３８μｇ／ｍｌ（ＨＳ２９４Ｔ）で、ヒト類表皮細胞に対しては約１５μｇ／ｍｌ（Ａ４３１）で、そして、乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８に対しては５０μｇ／ｍｌ以上でそれぞれＩＣ５０を示した（図１）（細胞株の説明に関しては実施例１３参照）。同じ抽出物で処理した通常のヒト包皮繊維芽細胞（ＦＳ）及びマウス繊維芽細胞（Ｌ９２９）の間では、細胞毒性は観察されなかった。
【０４１６】
この抽出物はＴＬＣによる多くの成分の混合物を含んでいるように思われる。従って、予備的な努力は選択的細胞毒性に関与する活性成分を分離するためにこの抽出物を精製することに重点が置かれた。活性成分で増大したクロマトグラフィー・フラクションを図１５に示す一般的方式に基づいて最初の抽出物から分離した。
【０４１７】
最初の抽出物であるＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１は上に述べた浸出ろ過を二度行うことによってアカシア・ビクトリアエから得た５３８ｇの植物性物質から調製された。この抽出物をつぎにｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥したところ、５２．０ｇの粉末を得た。次に、５１．５ｇのこの乾燥した物質を１Ｌの酢酸エチル（“ＥｔＯＡｃ”）で３度措置した。約１５．７５ｇのＥｔＯＡｃ可溶性物質をシリカ・ゲル（１．５ｋｇ）上でカラム・クロマトグラフィにかけた。ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、及びＭｅＯＨの徐々に極性の高くなる混合物を用いて全部で５４の６７０ｍｌのサブフラクションを溶出させた。５４のサブフラクションを１３の個別のフラクションに集めて、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００６からＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０１８としてラベルした。これらのフラクションを、上に用いた手順で抗腫瘍活性に関するスクリーニングした。調べたこれらのフラクションのいずれもＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１で観察された強力な抗腫瘍活性を示さなかった。
【０４１８】
ＥｔＯＡｃ不溶性物質（約３４．７ｇ）もシリカ・ゲル（１．７ｋｇ）上でクロマトグラフィーにかけた。ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及び水の徐々に極性を高めた混合物を用いて５１の６７０ｍｌサブフラクションと合計で２１Ｌの３つの追加的サブフラクションを溶出させた。これらのサブフラクションを８つの個別フラクションに集めて、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０１９からＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２６とラベルした。表６参照。
【０４１９】
（表７は、「フラクションＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０１９〜ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２６の溶出」を示す。１：各サブフラクションは特に注記がない場合、６７０ｍｌである。）
【表７】
2004517131.tif 000019
【０４２０】
その後、各フラクションを上に述べた一連のヒト腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性を、粗抽出物に関して上に述べた手順に従って述べた。それらのフラクションのうちに１つ、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２３はＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１のそれより強力な抗腫瘍活性を示した。これらの結果は６μｇ／ｍｌのフラクションＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２３がヒト卵巣癌に対して５０％（ＯＣＣ１）、６３％（ＳＫＯＶ−３）、８５％（ＨＥＹ）、及び４８％（ＯＶＣＡＲ−３）細胞毒性を、ヒト前立腺癌に対して約６０％の細胞毒性を、白血病細胞に対して約９２％、そして患者（ＦＴＣ）の腹水から得た新鮮な卵巣癌細胞に対して約７３％の細胞毒性を示した。非形質転換細胞のバイオアッセイを行ったところ、ＦＳ細胞に対しては１０．６μｇ／ｍｌ、そしてＨＵＶＥＣ細胞に対して２３μｇ／ｍｌでＩＣ５０が示された（図２）。
【０４２１】
活性成分の分離及び特徴づけを容易にするために、可逆相モード（ＲＰ）培養液圧力液体クロマトグラフィーを複数回行って、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２３の生物学的活性成分をさらに精製した。これらのサンプルは以下のステップに基づいて１０％づつ濃度をたかめてアセトニトリルを４Ｌの水とアセトニトリル（ＡＣＮ）のガスを抜いた混合物から溶出された。つまり０、１０％、２０％、３０％、４０％のＡＣＮ水溶液を作成した。そして２−４ＬフラクションをＭｅＯＨで溶出させた。これらのフラクションを繰り返し処理した後、表８に示すように、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２７−ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３６とした。
【０４２２】
（表８は、「フラクションＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２７〜ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３６の溶出」を示す。
【表８】
2004517131.tif 000020
これらのフラクションのうちのいくつかはＴＬＣで同様であるように思われた。収率が高かったフラクションの１つであるＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（フラクション３５）は強い抗腫瘍活性を示すことが分かった。
【０４２３】
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（フラクション３５）を抗腫瘍活性に関してスクリーニングしたところ、卵巣癌細胞株ＨＥＹ、ＳＫＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、及びＣ−１（シスプラチン抗性ＯＶＣＡＲ−３）に対してそれぞれ３．０、１．２、２．０及び３．５μｇ／ｍｌでＩＣ５０を、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ−１）に対して２．４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を、そして、腎臓癌細胞株７６９−Ｐ、７８６−Ｏ、及びＡ４９８に対してそれぞれ１．２μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、及び３．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０を、そして、ＪｕｒｋａｔＴ白血病細胞に対しては１３０ｎｍ／ｍｌのＩＣ５０を、そしてＢ白血病細胞株ＫＧＩ、ＲＥＨ及びＮＡＬＭ−６に対して１−３μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０をそれぞれ示した（図３、図４参照）。表９に示すように、粗植物抽出物を精製することによって生物活性が劇的に増大した。
【０４２４】
（表９は、「粗抽出物とＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５の細胞毒性の比較」を示す。
【表９】
2004517131.tif 000021
【０４２５】
フラクション３５は通常のヒトＦＳ細胞に対して約４．７μｇ／ｍｌの、そして通常のヒトＨｓ２７細胞に対しては約１３．３μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示した。フラクション３５（Ｆ０３５）の効果を通常のヒト赤血球及び骨髄コロニー（骨髄から分離した細胞）で評価したところ、３．０μｇ／ｍｌで１２−１８％の抑止効果が観察された（表１０）。
【０４２６】
（表１０は、「ヒト赤血球及び骨髄コロニーに対するフラクション３５の効果」を示す。）
【表１０】
2004517131.tif 000022
【０４２７】
フラクション３５の強力な抗腫瘍活性を示す上記の知見に基づいて、フラクション３５の濃度を０．０９５μｇ／ｍｌと低くして、上に述べた手順でバイオアッセイを実施した。この調査で、さらに多くのヒト腫瘍細胞株に対していろいろの濃度のフラクション３５を用いた。このスクリーニングの結果、濃度が１．５６μｇ／ｍｌと低くても、フラクション３５は多数の細胞株に対して強力な抗腫瘍活性を示すことが明らかにされた（表１１）。
【０４２８】
（表１１は、「種々の腫瘍細胞株に対する種々の濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−９Ｆ０３５の細胞毒性」を示す。）
【表１１】
2004517131.tif 000023
【０４２９】
実施例２
アカシア・ビクトリアエから活性成分を分離するための手順
実施例１で詳述した予備的精製で単離されたＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５に含まれる活性成分を含んだフラクションを直接つくるための手順を開発した。約９６６５ｇのアカシア・ビクトリアエから回収したばかりの鞘組織を３ｍｍスクリーンのハンマー・ミルですりつぶして、その後、８０％ＭｅＯＨ水溶液（３Ｘ）で抽出を行い、ついでろ過した。８２００ｇのバガスを廃棄した。３回の洗浄を行ってサンプルを個別に回収して、それぞれのフラクションの識別名を以下のとおりとした：Ｆ０６８、２１．５Ｌ（１回目の洗浄）；Ｆ０６９、２４Ｌ（２回目の洗浄）；そしてＦ０７０、３４．３Ｌ（３回目の洗浄）。Ｆ０６８を１Ｌアリコットに分けて、それぞれのアリコットに４００ｍｌの水を加え、ＣＨＣｌ３（２ｘ２５０ｍｌ）で洗浄してさらに精製した。組み合わせ極性相（２８．５Ｌ）に対してはＦ０７８というフラクション識別名をつけ、組み合わせ有機相（回転蒸発によって有機溶媒を除去後に４２ｇを得た）はＦ０７９とした。
【０４３０】
ＭｅＯＨをＦ０７８からｉｎ ｖａｃｕｏで除去して、５３０ｇの回収されたベイカーボンドＲＰ−Ｃ１８、４０μｍ粒子を充填した２９ｘ４６０ｍｍカラムを用いたＲＰＭＰＬＣによってさらに分別した。５００ｍｌのアリコット溶液をカラムに吸い込ませ、表１２に示すフラクションを得た。
【０４３１】
（表１２は、「Ｆ０９１−Ｆ０９４のフラクションの溶出」を示す。）
【表１２】
2004517131.tif 000024
【０４３２】
次に、ＭｅＯＨを除去し、Ｃ−１８粒子状を通過させ、ＭｅＯＨ内に回収して乾燥させ、ｉｎ  ｖａｃｕｏで固形物として分離した。この固形物を水に再懸濁させて、抗腫瘍効果に関するテストにかけた（一部の極性の低いフラクションについては、ＤＭＳＯを水に加えて、アグリコンをＤＭＳＯ内に再懸濁させた）。得られた結果は、１００％ＭｅＯＨの生物学的活性を示し、Ｆ０９４と命名されたこのフラクションは基本的にはＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５のそれと同じであった（表１３）。Ｆ０９３も活性成分を含んでいた。ＴＬＣとＨＰＬＣでフラクションＦ０９４とＦ０３５の化学的類似性が確認されたが、Ｆ０９４の方がさらに追加的成分を含んでいるように思われた。
【０４３３】
（表１３は、「異なった腫瘍細胞株に対する種々の濃度のＦ０９４の細胞毒性」を示す。）
【表１３】
2004517131.tif 000025
【０４３４】
さらに精製された活性成分を得るために、Ｆ０９４を表１４に示すようにさらに分別して、ＴＬＣで分析し、バイオアッセイにかけた。いろいろの量の得られたフラクション（Ｆ１３８−Ｆ１４７）のバイオアッセイの結果を表１４に示す。
【０４３５】
（表１４は、「フラクションＦ１３８−Ｆ１４７の溶出」を示す。）
【表１４】
2004517131.tif 000026
【０４３６】
（表１５は、「フラクションＦ１３７、Ｆ１４０、Ｆ１４２、Ｆ１４４、及びＦ１４５のバイオアッセイ」を示す。）
【表１５】
2004517131.tif 000027
【０４３７】
上の手順はアカシア・ビクトリアエの鞘からの活性成分の分離に重点をおいているが、この活性成分は根の部分からも抽出できる。この場合、根は半時間すりつぶして、１００％ＭｅＯＨで覆う。次にこの混合物をろ過して、８０％ＭｅＯＨ水溶液内に希釈する。大量の根からの抽出を行う場合は、上に述べたような滲出を行うのが好ましい。これらの抽出手順における違いが必要な理由は、根が通常新鮮な状態で抽出されるのに対して、鞘の方は抽出前に乾燥されている場合が多いことである。
【０４３８】
実施例３
フラクションＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４から活性成分を調製するための予備的スケールでの手順
ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４（Ｆ０９４）から活性成分混合物をより大量に調製するために、修正された抽出／分離手順を用いた。この手順を複数回繰り返したところ、一貫して高度の活性を示す成分が得られた。通常、Ｆ０９４あるいはその同等物２０−２５ｇを１５０−１７５ｍｌの５０％ＭｅＯＨ水溶液に溶解させ、それをカラム（（２６ｍｍｘ４６０ｍｍ）＋（７０ｍｍｘ４６０ｍｍ）、ＲＰ−Ｃ１８、４０μｍ、１２００ｇ、６０％ＭｅＯＨ水溶液で均衡化）に吸引させた。これらのフラクションを６０％ＭｅＯＨ水溶液８Ｌ、７．５％ＭｅＯＨ水溶液７．５Ｌ、そしてＭｅＯＨ２Ｌ内でそれぞれ溶出させて、表１６に示すようなフラクション識別名を付した。フラクションＦ０３５−Ｂ２は図１８Ａ−１８Ｆに示されているようなＦ０９４、Ｆ１３３−１３６（Ｆ０９３から分離したもの）、及びＦ１３８−１４７（Ｆ０９４から分離）の活性成分の混合物を含んでいた。Ｆ０９４はＦ０３５の受け入れ可能な代替物であるが効果は最大２分の１低く、Ｆ０３２−Ｂ２の効果はＦ０９４より低い。
【０４３９】
（表１６は、「Ｆ０３５−Ｂ２の分離」を示す。
【表１６】
2004517131.tif 000028
【０４４０】
フラクションＦ０３５−Ｂ２の活性成分をさらに精製するための手順を考案して、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５の分析的ＨＰＬＣ特性を有するフラクションを得た。手順は以下のとおりである。１０ミクロン逆転相クロマトグラフィー・カラムを用いて追加的予備ＨＰＬＣを行って、２６％アセトニトリル水溶液から４０％アセトニトリル水溶液まで１−２％刻みで濃度を変えたアセトニトリルと水の混合物を用いて溶出させ、次いで１００％アセトニトリルと１００％メタノールで洗浄し、（標準６ミクロンＨＰＬＣ  ＲＰ−１８分析法によって）０−２０分ピークを含んだいくつかの、最初のＦ０３５フラクションには含まれていないフラクションにＦ０３５−Ｂ２を分ける（図１８Ａ）。得られた残りのフラクションは、Ｆ０３５の１−３の成分分別をもたらす。上のテストで示されるように、フラクションＦ１３９−Ｆ１４７はこれらのフラクションと類似しており、いくつかの細胞株では他の細胞株と比較して抗腫瘍性である程度の増強が認められる。最初の溶媒の最初の組成を１６％−２６％のアセトニトリル水溶液の範囲で修正して、次いで、ＭＰＬＣ精製を行って数グラム量のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５同等物をつくることによって、フラクションＦ０３５内に存在している活性成分の独特の混合物を大量につくることができる。
【０４４１】
アセトニトリル、メタノール及び水の３溶媒混合物を用いることで、上記の抽出手順と、ここで述べられているその他の手順をさらに改善することは可能であろう。標準的なクロマトグラフィー手順に通じている人であれば、パーセント変化を動的に設定、最適化することは可能であろう。同様に、結合相シリカはＣ−８、ＣＮ、ジメチル・ジオール、及びＣ−１８などのＲＰシステムの組み合わせを用いることで変えることができる。最終段階で、最後の精製手段として、さらに通常相シリカを利用することができる。
【０４４２】
実施例４
アカシア・ビクトリアエから活性成分を分離するための代替手順
フラクションＦ０９４（２５０ｇ）、Ｆ０３５（５０ｍｇ）、そしてアカシア・ビクトリアエのすりつぶした鞘（１ｋｇ）（つまり、莢粉）を上に述べた手順で得た。フラクションＦ０９４及びその後のＦ０９４の分別について本実施例で述べる。
【０４４３】
４．１  分析方法
勾配を持たせた、静水圧条件下で種々のＣ８及びＣ１８カラムを用いたいくつかの方法でフラクションＦ０９４の溶解を試みた。モニタリングでは２２０ｎｍでの紫外線検出と蒸発性光散乱検出（ＥＬＤＳ）の両方が行なわれた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む可動相の方がよりよいピーク解像度が見られた。本明細書ではＡｃａｓｉａ ２５７と呼ばれているこの方法について以下に述べる。この方法は短い運転時間で良好な解像度が得られる。
【０４４４】
上記ＨＰＬＣはダイオード・アレイ検出装置（ＤＡＤ）あるいは可変波長検出装置と４．６ｘ１５０ｍｍ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ１８の３μカラム（ＭｅｔａＣｈｅｍ）を備えていた。この検出装置を２２０ｎｍにセットし、以下の勾配で運転した。
2004517131.tif 000029
【０４４５】
図２５はこの方法で得られたＦ０９４のクロマトグラムを含んでいる。Ｆ０９４は３つのグループあるいはファミリーで構成されており、各ファミリー内に多数のピークが認められる。ファミリー１（８−２０分、ピークＡ−Ｄ）、ファミリー２（２２−３５分、ピークＥ−Ｈ）、そしてファミリー−３（３６−４７分、ピークＩ−Ｌ）。フラクションＦ０３５もこの方法で分析され、そのクロマトグラムを図２６に示す。この第２のファミリーのピークはＦ０３５においてより顕著であり、Ｆ０９４においては第１のファミリー・ピークがより顕著である。
【０４４６】
４．２  分別
４．２．１  第１の分別
第１の分別ではファミリー１のピークに重点が置かれた。この目的のためにシンメトリーＣ８セミ−プレップ・カラム（７．８ｘ３００ｍｍ、７μ）を用い、傾斜溶出プログラムは以下に示すとおりであった。７つのサブフラクション・カットを図２７に示すようにつくった。最後のフラクション・カット（＃２１６０−００７−３１）はファミリー２とファミリー３のすべてのピークを含んでいる。これらのフラクションと開始物質（Ｆ０９４）をバイオアッセイにかけた。
【０４４７】
2004517131.tif 000030
【０４４８】
４．２．２  第２の分別
第２のファミリーの化合物のピークの分離がこの分別の目標であった。これは同じＣ８セミ−プレップ・カラムを用いて行なわれた。可動相は０．１％ＴＦＡを含んだ水に３２％の濃度で定組成アセトニトリルを溶かしたものであった。７つのフラクション・カットがつくられたことを示すクロマトグラフィー・トレースを図２８に示す。ここに示されている第１のフラクション・カットはファミリー１のすべてのピークを含んでいる。
【０４４９】
４．２．３  バアイオアッセイ
上記第１及び第２の分別で得られたサブフラクションのバイオアッセイの結果を表１７と１８にそれぞれ示す。
【０４５０】
（表１７は、「第１の分別で得られたサブフラクションのＪｕｒｋａｔ細胞における細胞毒性」を示す。＊：これらの重量は、ほぼ±２０％である。）
【表１７】
2004517131.tif 000031
【０４５１】
（表１８は、「第２の分別で得られたサブフラクションのＪｕｒｋａｔ細胞における細胞毒性」を示す。＊：これらの重量は、ほぼ±２０％である。）
【表１８】
2004517131.tif 000032
アカシア・フラクションＦ０９４から２つの精製トリテルペノイド・グリコシド、つまりＤ１及びＧ１が得られた。Ｄ１の酸加水分解によってアグリコンが得られる。
【０４５２】
４．４  Ｄ及びＧ／Ｈ領域ピークを得るための予備的スケールの分別
ＨＰＬＣプレップＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）カラム（５０ｘ２５０ｍｍ， １０μｍ）上でＦ０９４（２．３ｇ）を分別した。可動相は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％を含んむアセトニトリル／水に２７％−３２％かそれより濃い濃度で勾配を持たせて３８分以上かけて定組成アセトニトリルを溶かしたものであった。図２９で示したように、この方法を用いてＤ及びＤ／Ｈピークを含むフラクションを分離した。バイオアッセイ用に、このプレップからフラクション・カットを用いて行った。Ｄ及びＧ／Ｈ分析によるアッセイの結果は、図３０および３１に示すとおりである。ここで用いた方法は、アカシア２５７で、これは前述の同じ項で記述したものである。
【０４５３】
このフラクションＧ／Ｈを先ずＰＦＰプレップ・カラム上でさらに精製し、６８％のクロマトグラフィー純度のＧ１を得て、得た物質をさらにＣ−１８セミ−プレップ・カラム上で精製して純粋なＧ１を得た。
【０４５４】
約１００ｍｇのＧ／Ｈを上述したものと同じＰＦＰカラムに充填し、以下に示す傾斜溶出で行った。
【０４５５】
2004517131.tif 000033
【０４５６】
５つのフラクション（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｈ１及びＨ２）を回収した。Ｇ１に関する分析（図３２）では６８％のクロマトグラフィー純度が示された。このフラクションをセミ−プレップ・カラム上でさらに精製した。
【０４５７】
ＹＭＣ  Ｃ１８−Ａｑカラム（１０ｘ２５０ｍｍ、５μｍ）を用いた。可動相は０．１％のＴＦＡを含んだ水に３２％の濃度でアセトニトリルを溶かしたものであった。最後につくられたＧ１はクロマトグラフィー純度１００％であった。（図３３）
【０４５８】
このＰＦＰプレップ・カラムからのフラクションＤ（４５％Ｄ１）を先ず水溶液Ｃ−１８カラム（２５ｘ１００ｍｍ）上で分別した。可動相は０．１％のＴＦＡを含んだ水に６１％の濃度でメタノールを溶かしたものであった。ＨＰＬＣ分析結果では、Ｄ１は７８％の純度（図３４）で、もう１つ別のピークを含んでいた（Ｄ１．５と命名された）。可動相として０．１％ＴＦＡを含んだ水に３３％のアセトニトリルを溶かしたＹＭＣ  Ｃ１８−Ａｑカラム上で純粋でないＤ１をさらに分別して、１００％のクロマトグラフィー純度を持つＤ１のサンプル（図３５）をつくった。希酸溶液におけるＤ１は、４０℃の水中のそれよりも安定性が高いことが観察された。それ故に、Ｄ１精製時に溶媒に０．１％の濃度のＴＦＡを含めた。
【０４５９】
４．４．１  バアイオアッセイ
Ｊｕｒｋａｔ細胞株上でバイオアッセイにかけて、種々のサブフラクションと純粋なＤ１及びＧ１の効果について、表１９、２０及び２１にそれぞれ示した。Ｄ１とＧ１を２つの異なるｐＨ値でテストにかけた。ｐＨ６．５とｐＨ７．５では、僅かに高い活性度を示しているが、細胞増殖はより低いｐＨ値の約４０％抑制されていた。
【０４６０】
４．４．２  Ｄ１の酸加水分解
エタノール内にサポニンＤ１を溶かしたものを３Ｎ  ＨＣ１で１００℃で３時間かけて加水分解した。つくられたアグリコンをＨＰＬＣで精製した。その質量スペクトル解析では、そのアグリコンが６５２分子量となることが判った。
【０４６１】
（表１９は、「プレップＰＦＰカラムから得た細胞毒性フラクション」を示す。）
【表１９】
2004517131.tif 000034
【０４６２】
（表２０は、「Ｇ／Ｈ分別から得た細胞毒性フラクション」を示す。）
【表２０】
2004517131.tif 000035
【０４６３】
（表２１は、「ｐＨ６．５とｐＨ７．５で得たＤ１及びＧ１の細胞毒性」を示す。）
【表２１】
2004517131.tif 000036
【０４６４】
実施例５
Ｄ１、Ｇ１及びＢ１の構造
【０４６５】
５．１  Ｄ１の構造
Ｄ１は、アカシア・ビクトリアエの鞘が主成分である。この化合物のアッセイにより、著しい生物活性があることが明らかになった。
【０４６６】
５．１．１．  Ｄ１の全分子
Ｄ１を上述の実施例で記載したいくつかの予備的ＨＰＬＣ分離法を用いて分離し、部分的に精製して得られた抽出物Ｆ０９４から無色の無定形固体を分離した。ＭＡＬＤＩ質量分析から得た分子量は２１０４ａｍｕであり、これは真正分子量である２０８１のナトリウム付加体である。高い解像度のＦＡＢ質量分析でこの分子量が確認されており、Ｃ９８Ｈ１５５ＮＯ４６の分子式が付与される。分光分析法だけで構造判定を行うには、そのような分子は大きすぎるので、図３６に示す理論体系１で概説したような分解プログラムを行った。図３６において、Ｄ１は（１）としてラベルした構造で表した。
【０４６７】
Ｄ１のプロトンと炭素ＮＭＲｓでは、トリテルペン、２つのモノテルペン及びほぼ八糖の存在が確認された。（選ばれた１３Ｃ−ＮＭＲの割当てについて表２２の（１）を参照）。
【０４６８】
（表２２は、「Ｄ１（１）、Ｇ１（１４）、Ｂ１（２１）、アグリコン（２）及びアカシア酸（３）に対する１３Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）の割当て」を示す。（図３６、図３７、図３８にそれぞれ示した括弧記号、即ち、１、１４、２１、２及び３は、Ｄ１、Ｇ１、Ｂ１、アグリコン及びアカシア酸を参照する符号である）。
【表２２】
2004517131.tif 000037
【０４６９】
５．１．２  Ｄ１の強力な酸加水分解
３Ｎ ＨＣ１内でＤ１を１００℃で２時間かけて加水分解させ、図３６（２）に示す「Ｄ１アグリコン」がつくられた。これは質量分析で、６５２の分子量を持つことが判った。Ｄ１アグリコンのＮＭＲでは、トリテルペンと変性モノテルペンの存在が認められたが、糖は検出されなかった。この物質をさらにけん化（ＭｅＯＨ内で１．３Ｎ ＮａＯＨを１００℃で３０分間）して分解し、そこから以下に示すものが分離された。
【０４７０】
５．１．２．ａ  トリテルペン
この物質のＣ−１３  ＮＭＲは前にアカシア酸に関して述べたものと同一であって（図３６の（３）で示す構造、そして、表２２の（３）に割当てた１３Ｃ−ＮＭＲを参照）、その質量分析による４８８分子量は、この構造に一致するものであった。
【０４７１】
５．１．２．ｂ  環化したモノテルペン
この化合物の分子量とＮＭＲにおいて、カルボン酸、２つの二重結合に付加したメチル基及び２つのピラン構造に至るビニル基を含むプロトンの存在が認められた。図３６の（４）で示されている構造単位の構造は、「Ｄ１アグリコン」においても存在しているものであるが、親Ｄ１には存在していない。このＤ１は、図３６（５）で示される非環式のモノテルペンを含み、その構造は以下に示す加水分解中に環化を受けるものである。
【０４７２】
【化２０】
2004517131.tif 000038
【０４７３】
最初の分子量に沿ったこれらの構造とＤ１のスペクトルの特徴づけは、図３６の（２）として表したＤ１の構造に非常に適合するものである。選択された割当て１３Ｃ−ＮＭＲについて表２２（２）を参照のこと。
【０４７４】
５．１．３  緩やかな鹸化
Ｄ１を０．５Ｎ  ＮＨ４ＯＨを用いて室温で１時間措置した結果、以下に示す２つの新しい化合物に完全転化した。
【０４７５】
５．１．３．ａ  モノテルペン
この分子は、２００分子量を持ち、ＮＭＲでは非環式のモノテルペン構造を持っており、擬似分解をサポートすることを示した。この構造については、図３６（５）に示される。
【０４７６】
５．１．３．ｂ  トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖
この化合物はＤ１よりも極性が高く、ＮＭＲではアカシア酸、１つのモノテルペン及びいくつかの単糖を含むものと一致することが判った。この構造については、図３６（６）に示される。
【０４７７】
５．１．４  Ｄ１の糖分析
Ｄ１を活性の強い酸加水分解にかけた（２Ｎ ＨＣ１を１００℃で２時間）後に、（トリメチルシリル・エーテルによる）誘導体化させて、ＧＣ／ＭＳ分析を行ったところ、最初の分子に八糖が存在することが判った。その八糖とは、アラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、６−デオキシグルコース（即ち、キノボース）、アセチル・グルコサミン及び２つのグルコース分子である。
【０４７８】
５．１．５  トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖のさらに強力なけん化
トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖を６０度の０．３Ｎ  ＮａＯＨで１時間措置したところ、３つの化合物が形成された。
【０４７９】
５．１．５．ａ  オリゴ糖
この極性のかなり高いフラグメントの分離を分析したところ、オリゴ糖であることが判った。酸加水分解（２Ｎ  ＨＣ１を１００℃で２時間）とこの単糖類のトリメチルシリル・エーテルによるＧＣ／ＭＳ分析によって行った糖分析によって、そのオリゴ糖が２つのグルコース分子とアラビノース及びラムノース１分子づつからなる四糖類であることが確認された。
【０４８０】
５．１．５．ｂ  モノテルペン・グリコシド
この物質は図３６の（８）に示す構造と一致するＮＭＲの結果を示した。この化合物を（２Ｎ  ＨＣ１を１００℃で２時間）の酸加水分解にかけたところ、６−デオキシ・グルコースの糖を識別できた。このモノテルペン・グリコシドをβ−グルコシターゼで措置したところ、そのモノテルペンに図３６（９）に示す構造を持つことが判った。その構造とは、トランス−２−ヒドロキシメチル−６−ヒドロキシ−６−メチル−２，７−オクタジノイック酸（ｏｃｔａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）に一致するＮＭＲ結果を持つものである。１つの「ベータ」−グルコシダ−ゼを伴ったこの結合を加水分解にかけたところ、これらの２つのグループ間の結合がベータ結合であることが示された。
【０４８１】
５．１．５．ｃ  トリテルペン・グリコシド
この化合物は９５１分子量を有し、ＮＭＲによると、図３６（１０ｂ）の構造で表されるＣ−３位置の三糖類を含むアカシア酸ラクトンと一致する。この化合物を酸加水分解（２Ｎ  ＨＣ１を１００℃で２時間）にかけたところ、Ｎ−アセチル・グルコサミン、フコース及びトリメチル・シリル誘導体としてのＧＣ／ＭＳによるキシロースの糖成分が識別できた。この分子は、図３６で（１０ａ）で示される構造の周知の酸／アルコールと、図３６の（１０ｂ）の構造で表される非公開のラクトン形状の双方で観察された。
【０４８２】
このフラグメントの糖分析と分子量を全分子Ｄ１のそれと比較すると、Ｄ１の全部分は、図３６の（５）、（７）、（８）、及び（１０ａ）における構造で表されるフラグメントにおいて説明されるものであることが確認された。
【０４８３】
５．１．６  Ｄ１の緩やかな酸加水分解
Ｄ１を（１Ｎ  ＨＣ１に２５℃で１６時間）の緩やかな酸加水分解にかけたところ、以下の２つの新しい分子を形成できた。
【０４８４】
５．１．６．ａ  モノテルペン糖
分子量、ＮＭＲスペクトラ及び糖分析によると、１つのモノテルペン−６−デオキシグルコースを伴う成分であった。この分子構造は、図３６（１１）の構造で示されるものである。
【０４８５】
５．１．６．ｂ  トリテルペン−モノテルペン−グリコシド
第２の分子は１つのトリテルペン−モノテルペン−グリコシドであることが識別できた。その構造は図３６（１２）の構造で表現されるものである。
【０４８６】
５．１．７  Ｄ１内サブグループの結合
ＮＭＲの研究で、この外部モノテルペンのカルボン酸が６−デオキシグルコースのＣ−４（キノボース）にエステル化することが示された。ＮＭＲと加水分解の研究により、その内部モノテルペンのＣ−６ヒドロキシ群にこのキノボースのアノマー炭素が結合されていることが明らかになった。キノボースのアノマー炭素での立体化学では、１つの「ベータ」結合が示されている。
【０４８７】
加水分解（２Ｎ  ＨＣ１により１００℃で２時間）と糖の異性化の研究では、この四糖類における糖類は２つのグルコース分子と、ラムノース及びアラビノースのそれぞれ１分子ずつであることが示されている。この最小構成単位は、図３９で示されるトリテルペンのＣ−２８カルボン酸へと直接的にエステル化される。アイアン・トラップ質量分析装置による研究で、この四糖類が図３９で示されるように中核ラムノースに２つのグルコースと１つのアラビノースが結合された構造を持つことが明らかにされている。これら糖類の１つ１つの繋りについては未だ不明である。
【０４８８】
ＮＭＲの研究で、Ｎ−アセチル・グルコサミン（ＮＡＧ）が直接このトリテルペンのＣ−３炭素に結合されていることが示されている。部分加水分解（５０％の濃度のＭｅＯＨ内に１Ｎ  ＨＣ１を溶かしたものを６０度で１時間）のＬＣ／ＭＳ研究によれば、この糖類の残りの配列が、中央にフコース、端部にキシロースとなっている。これら糖類の１つ１つの繋がりについては未だ不明である。
【０４８９】
５．１．８  エリプトシドＥ
多種アカシアを含めた他種から報告されているサポニンにおいて、Ｄ１には通常１つのトリテルペンと２つのモノテルペンが含まれていることが判明している。Ｄ１の構造がエリプトシドＥ（図２４）に相似していることがＡｒｃｈｉｄｅｎｄｒｏｎ ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｍ （Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７年） で報告された。本発明においては、既にＤ１の比旋光度が［α］Ｄ＝−３０．０°として確定しており、これはエリプトシドＥにおいて報告されている−２４．３°の数値のものとは異なるものである。
【０４９０】
Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．．（１９９７年）で記述されているエリプトシドＥとＤ１は異なるＨＰＬＣ保持時間（Ｄ１−１５．２分、エリプトシドＥ−１２．５分）である。従って、これらの２つの分子は、その下位最小構成単位の特異的な結合あるいは光学的または構造的異性体の存在などいくつかの方式で異なっているはずである。
【０４９１】
発明者らは、その内部モノテルペンの比旋光度が図３６の（９）で示される構造の、ＭｅＯＨにおいて＋１１．２°、そしてクロロホルムにおいて＋１６°であるとして観測した。エリプトサイドＥにおいては、この同じフラグメントがクロロホルム内で−９．１°であるとして報告されている。さらに、Ｄ１の内部モノテルペンのキラル中核のみが１つの「Ｓ」構成を持つとして判定されており、これはエリプトシドＥで判明されたものに反するものである。Ｄ１の外部モノテルペンの比旋光度は、現時点探求中である。さらに、プロトンのＮＭＲでは、Ｄ１のモノテルペン二重結合が「トランス」ではあるが、Ｂｅｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７年）で示されるエリプトシドＥにおいてはその二重結合が「ｃｉｓ」であることが明らかにされている。これらの２つの特質は、Ｄ１とエリプトシドＥの間で検出される第１の構造的な相違を構成するものである。比糖類の酵素触媒の加水分解では、その糖類の配列がエリプトシドＥ内に存在するものと同一であることが判った。
【０４９２】
５．２  Ｇ１の構造
この物質のバイオアッセイで、Ｇ１はＤ１よりもさらに生物学的活性があることが判った。
【０４９３】
５．２．１  Ｇ１の全分子（１４）
本発明で突き止められた第２の構造はＧ１である。Ｇ１もプレップＨＰＬＣによりＦ０９４から単離されたものであるが、低い化合物回収率においてであった。Ｇ１はＤ１よりも僅かに極性が低い。ＭＡＬＤＩ質量分析による分子量では、Ｄ１より１６ａｍｕ少ない２０６５分子量であることを示した。Ｇ１の比旋光度は−２６．９°（ＭｅＯＨ）であることが判明した。プロトンのＮＭＲにより、Ｇ１もＤ１とかなり類似して１つのサポニンを持つことが判り、Ｄ１と異なる点は、外部モノテルペンにＤより１つ少ない酸素、トランス−２、６−ジメチル−６−ヒドロキシ−２、７−オクタジノイック酸を有するところである。図３７の（１４）とした構造と表２２（１４）の選択された１３Ｃ−ＮＭＲを参照。
【０４９４】
５．２．２  Ｇ１の緩やかなけん化
Ｇ１を０．５Ｎ  ＮＨ４ＯＨと共に室温でさらに数分間措置したところ、さらに極性の緩やかなけん化生成物と１つのモノテルペンに完全転化した。
【０４９５】
５．２．２．ａ  モノテルペン
この物質の分子量及びＮＭＲでは、１つのヒドロキシメチルが既に包含されているＣ−２位置でのメチル群を持っていることを示している。これは図３７（１５）に示した。
【０４９６】
５．２．２．ｂ  トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖
この化合物の分子量及びＮＭＲでは、ＨＰＬＣ保持時間及びプロトンＮＭＲによる、図３７（１６）で表示される構造と同一のものであることが判った。この構造はＤ１でつくられた図３６（６）の構造と類似するものであって、Ｄ１において見られた１つのアカシア酸、１つのモノテルペン及び八糖を含むものである。
【０４９７】
５．２．３  Ｇ１の糖分析
Ｇ１を強い酸加水分解（２Ｎ  ＨＣ１において１００℃で２時間）にかけると、Ｄ１で存在したのと同じ単糖類、即ちアラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、６−デオキシグルコース（即ち、キノボース）、アセチル・グルコサミン及び２つのグルコース分子が生成された。
【０４９８】
５．２．４  Ｇ１の酸加水分解
この緩やかなけん化生成物を酸加水分解にかけたところ、Ｄ１で行ったやり方で３つの分子が単離できた。ＮＭＲ及び糖分析（２Ｎ  ＨＣ１において１００℃で２時間）をそれぞれ行った。この結果は図３７（１６）に示されている。
【０４９９】
５．２．４．ａ
オリゴ糖には２つのグルコース分子とアノビノース及びラムノースがそれぞれ１分子づつ含まれており、これは図３７（１７）に示した。
【０５００】
５．２．４．ｂ
モノテルペン・グリコシドには１つの（図３７（５）に示した）非環式モノテルペンと６−デオキシグルコースが含まれており、この全体構造は図３７（１８）とした構造で示されている。
【０５０１】
５．２．４．ｃ
トリテルペン・グリコシドには、アカシア酸とＮ−アセチル・グルコサミン、フコース及びキシロースのそれぞれ１分子づつが含まれていた。これらのフラグメントにおける糖類はＤ１と同じ順序で配列されている。この構造は図３７（１９）とした構造で表されるものである。
【０５０２】
５．２．５  エリプトシドＡ
Ｇ１はエリプトシドＡと同じテルペンと糖類を有する。（図２４、Ｂｅｕｔｌｅｒ，１９９７年参照）。しかしながら、エリプトシドＡは明らかに異なるＨＰＬＣの保持時間（Ｇ１−２９．０９分、そしてエリプトシドＡ−２６．０４分）を持つことが判明した。これは、これらの２つの分子はその下位最小構成単位の特異的な結合、光学的または構造的異性体の存在あるいはその両方など何らかの方式で異なっていることを示すものである。Ｇ１とエリプトシドＡのプロトン及び炭素ＮＭＲ分析の比較においても、化学シフトにおける差異が明らかである。これらの化合物の内部及び外部モノテルペンの比旋光度も異なっているものとして考察される。図３７（１４）の構造はＧ１の構造を示す。
【０５０３】
５．３  Ｂ１の構造
生物活性データでは、Ｂ１はＤ１またはＧ１よりかなり不活性であることが判る。
【０５０４】
５．３．１  全分子Ｂ１（２１）
Ｂ１の分離は、植物抽出法、Ｃ−１８のフラッシュ・クロマトグラフィーを行い、次いでＣ−１８のプレップ及びセミ−プレップ・クロマトグラフィーを行って達成された。Ｂ１のＮＭＲでは、このサポニン・ファミリー全体にわたって見られたのと同じトリテルペン／モノテルペン／キノボース／モノテルペン構造が示された。このＮＭＲも４つのデオキシ糖類と、Ｎアセチル群の存在が認められており、その分子の糖類部分でＤ１と異なっていることが判った。表２２（２１）にある特定の１３Ｃ−ＮＭＲを参照。この分子は図３８に示されるように分解する。
【０５０５】
５．３．２  Ｂ１の糖分析
ＮＭＲによるデータで、６−デオキシ・メチル糖（即ち、フコース、ラムノース、６−デオキシグルコース）の２つ以上のコピーの存在が判明した。加水分解（２Ｎ  ＨＣ１において１００℃で２時間）後の全分子の糖分析では、９つの糖が存在することが示される。即ち、フコース、アラビノース、キシロース、キノボース及びグルコサミンのそれぞれ１分子づつと、２分子づつのグルコースとラムノースである。グルコサミン、即ちＮ−アセチル・グルコサミンの残基が最初の分子に存在している。Ｂ１の構造は図３８（２１）に示される。
【０５０６】
５．３．３  Ｂ１の緩やかなけん化
Ｂ１を０．５Ｎ  ＮＨ４ＯＨと共に室温でさらに数分間措置したところ、さらに極性の高い化合物の緩やかなけん化生成物と１つのモノテルペンに完全転化した。
【０５０７】
５．３．３．ａ  モノテルペン
この物質の分子量とＮＭＲにより、図３７（５）とした構造で示されているＤ１のモノテルペンと同じ構造を持つことが判明した。これは図３８（２２）に示す構造で表される。
【０５０８】
５．３．３．ｂ  トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖
この化合物のＮＭＲにより、アカシア酸、１つのモノテルペン及びいくつかの単糖が含まれることが判った。これは図３８（２３）とした構造で示される。
【０５０９】
５．３．４  トリテルペン・モノテルペン・オリゴ糖のさらに強力なけん化
緩やかなけん化生成物をさらに強力なけん化（０．３Ｎ  ＮａＯＨにおいて６０℃で１時間）にかけたところ、Ｄ１及びＧ１で上述したのと同じ方法で３つの分子が分離できた。それぞれの分子について糖分析及びＮＭＲデータを得た。
【０５１０】
５．２．４．ａ
オリゴ糖にはグルコース、アラビノース及び２つのラムノース分子が含まれていた。これについては図３８（２４）の構造で示される。
【０５１１】
５．３．４．ｂ
モノテルペン・グリコシドには６−デオキシグルコース及び１つのモノテルペンが含まれていた。これは図３８（２５）の構造で示される。
【０５１２】
５．３．４．ｃ
トリテルペン・グリコシドにはＣ−３の位置で四糖類が付着したアカシア酸が含まれていた。この四糖類はＮアセチル・グルコサミン、フコース、グルコース及びキシロースのそれぞれ１分子から構成される。これは図３８（２６）の構造で示される。
【０５１３】
実施例６
トリテルペン化合物の脱エステル化
Ｆ０９４を脱エステル化して、その脱エステル化生成物をバイオアッセイにかけたところその活性構成成分が明らかとなった。１００ｇのＦ０９４を１００ｍｌの水に溶かした後、１ｇのＫＯＨを追加し、１．５時間還流させた。その溶液を室温まで冷却してＩＮ  ＨＣ１でそのｐＨを７に調整し、次にヘキサン（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。その水溶液をさらに段階的に抽出させたところ、フラクション１５９−１６２がもたらされた。例えば、その水溶液を先ずｎ−ブタノール（２ｘ５０ｍｌ）で抽出させてｉｎ  ｖａｃｕｏで乾燥した後に０．１２７ｇの有機可溶性固形物（Ｆ１５９）がもたらされた。この水性層を１Ｎ  ＨＣ１でｐＨ５まで酸性化させ、ＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍｌ）で抽出すると０．３９７ｇのＥｔＯＡｃ可溶性固形物（Ｆ１６０）がもたらされ、次いでｎ−ブタノールで抽出にかけると、その有機溶媒を除去した後に、０．３３８ｇの固形物（Ｆ１６１）がもたらされた。最終的にその水性層を１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７に中和させた。最終水性層から１．８０８ｇの固形物（Ｆ１６２）が分離された。
【０５１４】
バイオアッセイによって、その脱エステル化生成物にはほとんど活性がないことが明らかとなった。Ｆ１５９−１６２の７６９−Ｐ、Ｐａｎｃ−１、ＨＥＹ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＪｕｒｋａｔ細胞株に対する細胞毒性についてバイオアッセイにかけた。活性が見られたのは、Ｆ１６１とＦ−１５９のみで、Ｆ１６１ではＭＤＡ−ＭＢ−４５３に対して５０μｇ／ｍｌで１．６％の細胞毒性と、Ｆ−１５９ではＪｕｒｋａｔ細胞に対して５０μｇ／ｍｌで１５．５０％、２５μｇ／ｍｌで６．６０％、そして１２．５μｇ／ｍｌで３．８０％のそれぞれ細胞毒性を示した。これらの結果により生物活性にはそのエステル側鎖が必要であることが示されている。本発明の化合物のエステル側鎖が抗腫瘍活性を提示するものであり、及び／または本発明の化合物のトリテルペン・スケルトンと協調して作用し、提示された潜在的抗腫瘍活性をもたらすと考えられる。
【０５１５】
実施例７
化合物の糖加水分解
Ｆ０９４に含まれる糖も加水分解して、その活性組成物の特徴付けの手助けとした。１２ｇのＦ０９４を４００ｍｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４に溶かして７５分間還流させ、その間に不溶解性の物質が形成された。その溶液を冷却し、焼結ガラスを通じて濾過した。その残留物を水で洗浄したところ、ＴＬＣ分析による判定として４．８ｇのアグリコン（Ｆ１９１）がもたらされた。琥珀色の濾過液をＫＯＨあるいはＮａＯＨで中和させた。白色の沈殿物が形成され、それを回収した。その琥珀色の濾過液にイソプロパノールを付加すると第２の白色沈殿物がもたらされた。ｉｎ ｖａｃｕｏでその溶媒を除去し、ＭｅＯＨ内で再懸濁させたところ、燃焼試験で判定された硫酸塩におそらく相当する白色沈殿物の形成がもたらされた。ほとんど透明な濾過液をｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させ、その残留物をアセチル化させ、ＨＰＬＣで分析を行ったところ、図１７Ａ及び１７Ｂにおいて示される糖類の混合物が含まれていた。この混合物にはまず間違いなく、少なくとも５つの糖類が含まれている。これらの糖類さらに分離して、上にすべて述べたＧＣ−ＭＳの特徴付けのためのＴＭＳ派生物の分離、ペーパー・クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分離、またはＤＥＰＴ ＮＭＲとしてのベンジル派生物の分離、あるいはＣ１３ ＮＭＲによって特徴付けが可能となる。標準１−Ｄ及び２−Ｄセルロース、ペーパー及び正常相ＴＬＣによって、いくつかの少数派の追加的な糖とアミノ・グリコシドについて強い潜在性のある特にアセタミドを代替する糖と共にグルコース、キシロース、ラムノース及びアラビノースの主な糖類が認識されている。
【０５１６】
異なる糖類の数はその複雑なＨＰＬＣスペクトルを示しており、数十の緊密に関連した化合物の存在を示している。特に、いくつかの活性成分が２つ異なるサイト（アルコール性のサイトとカルボン酸サイト）でグリコシル化されるようである。２つのサイトに付着した６つの糖類の結合は、引き離すのが困難と思われるほど緊密に関連し合った多数の化合物をもたらすであろう。
【０５１７】
代替として、１００％の濃度のエタノール（５％水を含有する共沸混合物）でより緩やかな加水分解条件下において０．１−２．０Ｎ Ｈ２ＳＯ４（残りの措置は同様）を還流点まで緩和加熱するが、強い還流ではない条件下においたところ、アグリコンの類似混合物が生成された。いくつかの構成成分が無くなっており、これにより、より強い条件下で異性化が起こったことが示される。
【０５１８】
このＦ１９１（１ｇ）のアグリコンをメチルヨウ化物（１ｍｌ）と無水Ｋ２ＣＯ３（１ｇ）と共に無水アセトン（１０ｍｌ）内で５時間から７時間還流させてメチルアルコールと混ぜた。これにより０．３１５ｇの不溶解性物質と０．５４ｇのメチル・エステルであることを示すＦ１９７がもたらされた。５００ｍｇのＦ１９７をさらに、そのサンプルを１．５ｇのＳｉＯ２、１５−２５μｍ上に事前吸収させた場合の１５ｘ４６０ｍｍカラム（４５ｇのＳｉＯ２、１５−２５μｍ）を用いてＭＰＬＣで分離した。その化合物を表２３のとおりに、ヘキサン（サブフラクション１−１０）内で濃度７％のイソプロピル・アルコール（ＩＰＡ）７９０ｍｌ、ヘキサン内で濃度１０％のＩＰＡ４７０ｍｌ（サブフラクション１−１４）、ヘキサン内で濃度２０％のＩＰＡ２７５ｍｌ（サブフラクション１４−１５）、２００ｍｌのジクロロメタン及び１００ｍｌ（１対１の割合で）のＤＣＭ／ＭｅＯＨを溶出した。
【０５１９】
表２３で示すような服用量でＦ１９１とＦ１９７のバイオアッセイにかけたところ、卵巣癌細胞（ＨＥＹ系列）、腎臓癌細胞（７６９−Ｐ系列）、肝臓癌細胞（Ｐａｎｋ−１）、ＪｕｒｋａｔＴ−白血病性細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌の細胞についての細胞毒性がもたらされた。
【０５２０】
（表２３は、「フラクションＦ１９８−Ｆ２０８に対するＦ１９７の分別」を示す。）
【表２３】
2004517131.tif 000039
【０５２１】
（表２４は、「フラクションＦ１９１及びＦ１９７のバイオアッセイ」を示す。）
【表２４】
2004517131.tif 000040
表２５のとおり、Ｆ１９９（１１６ｍｇ）をさらにＦ１９１の分別用に使用したのと同じカラムで分別し、ＩＰＡ２％の濃度のヘキサン１００ｍｌ、ＩＰＡ４％の濃度のヘキサン５２５ｍｌ及びＩＰＡ１０％の濃度のヘキサン２５０ｍｌにおいて溶出した。
【０５２２】
（表２５は、「フラクションＦ２０９−Ｆ２１４に対するＦ１９９の分別」を示す。
【表２５】
2004517131.tif 000041
【０５２３】
Ｆ２１２（８５ｍｇ）を（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  Ｃ１８、１０μｍ、ＡＣＮを７５％の割合で水に溶かした）２２ｘ５００ｍｍカラム上でウォーター・プレップＬＣ４０００ＨＰＬＣによってさらに分別し、８０％濃度のＡＣＮを溶かした水に溶出し、ＡＣＮで４０ｍｌ／分の比率で洗浄した。２２０ｎｍの検出範囲について表２６のとおり３０秒刻みに（２０ｍｌ）サブフラクションを回収した。
【０５２４】
Ｆ２２３をそのメチル・エステル派生物としてはじめに浄化してＣ−１９１とした。Ｃ−１９１を伝統的なアセチル化の手法にかけた。具体的には、Ｃ−１９１（４７ｍｇ）を無水酢酸とピリジンの２対１の混合物において室温で一昼夜攪拌した。水で急冷反応させたところ、その溶液はジエチル・エステルと５Ｎ ＨＣ１に分割された。次にその有機層を中和して回転蒸発されるまで洗浄を行い、その残留物をＰＴＬＣ−−２０ｃｍｘ２０ｃｍの１つの予備的プレートにかけたところ、ヘキサン：イソプロピル・アルコールを９０：１０の割合で溶出した。次いで、次のＰＴＬＣによりジクロロメタン：メタノール（９８：２の割合）で溶出を行い、Ｃ−１９１酢酸塩（Ｆ２２９、後にＣ−１９４の数字を付した）になった。
【０５２５】
（表２６は、「フラクションＦ２２０−Ｆ２２８に対するＦ２１２の分別」を示す。」
【表２６】
2004517131.tif 000042
【０５２６】
Ｆ２０１（８５ｍｇ）もＦ１９９を分別するために使用したのと同じカラムでＭＰＬＣを用いてさらに分別し、２％の濃度のＩＰＡを溶かしたヘキサン（１２０ｍｌ）、４％の濃度のＩＰＡを溶かしたヘキサン（３３０ｍｌ）、７％の濃度のＩＰＡを溶かしたヘキサン（４６０ｍｌ）、２０％の濃度のＩＰＡを溶かしたヘキサン（１５０ｍｌ）及びＩＰＡとヘキサン（１：１の割合で）（７０ｍｌ）に表２７のとおりに溶出して、回収した。
【０５２７】
（表２７は、「フラクションＦ２１５−Ｆ２１９に対するＦ２０１の分別」を示す。）
【表２７】
2004517131.tif 000043
【０５２８】
実施例８
活性トリテルペンの生物学的特質
血管形成あるいは新血管形成は、腫瘍によって生成された因子で細胞が新しく取り入れられ、腫瘍に滋養分の多い脈管系を提供する１つのプロセスである。血管形成を抑止することにより、腫瘍への血管供給を制限してその腫瘍の拡大は阻止される。この機能はウシの毛細血管内皮細胞の増殖アッセイをフラクション３５（ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５）で措置した細胞上で用いて検査した。このアッセイを次に示すように行った。ウシの毛細血管内皮細胞を得て、標準的な手法（Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）を用いて成長させた。その細胞をＰＢＳで洗浄して０．０５％のトリプシン溶液に分散させた。細胞の懸濁（２５，０００細胞／ｍｌ）をＤＭＥＭ＋１０％のＢＣＳ＋１％のＧＰＳで行い、ゼラチン状にした２４のウェル培養プレート（０．５／ウェル）上に平板培養し、その懸濁液を３７℃で２４時間培養した。その媒体を０．２５ｍｌのＤＭＥＭ＋５％のＢＣＳ＋１％のＧＰＳに取替えて異なった濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５を適用した。２０分間培養した後、媒体とｂＦＧＦを加え、最終量として０．５ｍｌのＤＭＥＭ＋５％のＢＣＳ＋１％のＧＰＳ＋１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが得られた。７２時間後、その細胞をトリプシン内で分散させ、ヘマトール（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）内で再懸濁させクールター計数記（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）で計数した。
【０５２９】
そのアッセイの結果は塩基性繊維芽細胞（図５）を伴う、あるいは伴わない内皮細胞の増殖の著しい抑止を示した。これらの結果は、その植物抽出物の活性成分が、ｉｎ ｖｉｖｏでしばしば血管形成を抑制する予測因子であるとされる内皮細胞増殖の有力な抑制物質であることを示すものである。さらに、そのフラクションが毛細血管内皮細胞の体内移行に何ら影響を及ぼしていないことは、正常細胞（図６）に対して毒性が無いことを示すものである。
【０５３０】
ステロイド・サポニン（即ち、ジギトニン及びヤマノイモからのギニン−ジオスゲニン）で一般に発生する問題は、赤血球の渙散である。単純な培養物試験管血液アッセイを用いて、１ｍｇ／ｍｌのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５で措置した後、渙散はほんの僅かしか検出できなかった。代替として、１０−２５μｇ／ｍｌのジギトニンで措置すると培養物試験管血液アッセイで１００％の渙散がもたらされた。
【０５３１】
次いで、その活性成分が腫瘍細胞を抑制したメカニズムをさらに研究するために、その転写調節因子ＮＦ−κＢのＴＮＦ−アルファを誘導した活性を１−２μｇ／ｍｌのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５及びＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４で処理されているＪｕｒｋａｔ細胞（３ｘ１０６）において分析した。この研究は次に示すとおりに行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１−２μｇ／ｍｌのＦ０３５あるいはＦ０９４で３７℃で１５時間かけて前処理を行った。細胞を採取して１ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁させ、１００ｐＭのＴＮＦ−アルファを用いて３７℃で３０分間処理した。ＴＮＦ−アルファの処理を行った後、Ｓｃｈｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９年）による核抽出物が調製された。簡単に言いかえると、その細胞をよく冷えたＰＢＳで洗浄し、０．４ｍｌの緩衝溶解液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＫＣ１、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのジチオスレイトール、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．５ｍｇ／ｍｌのベンズアミデニン）に懸濁させた。その細胞を氷の上に１５分間置いて２５μｌの１０％ノニデット−４０をその細胞に付加した。その試験管をボーテックス上で混合し、３０秒間遠心分離機にかけた。その核のペレットを２５μｌのよく冷えた核抽出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．４Ｍ のＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのアプロチニン及び０．５ｍｇ／ｍｌのベンズアミデニン）において再懸濁させ、試験管を氷上で断続的に攪拌して培養した。その核抽出物を４℃で５回遠心分離機にかけて、浮遊物を−７０℃で保存した。
【０５３２】
この核抽出物（７μｇの蛋白質）を３２Ｐ−ラベルのＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１、ＮＦ−κＢ帰結オリゴヌクレオチド，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に結合緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのジチオスレイトール、１％のノニデット Ｐ−４０、５％のグリセロール及び５０ｍＭのＮａＣｌを３７℃で２０分間）（Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８７；Ｃｏｌｌａｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｈａｓｓａｎａｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）において０．５μｇのポリ ｄｉ−ｄｃの存在下で培養して電気泳動易動度アッセイをかけた。形成されたＤＮＡ−蛋白質複合体を５０ｍＭトリス、２００ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いて５％天然ポリアクリルアミド・ゲル上にフリー・オリゴヌクレオチドから分離させた。このゲルを１０％の濃度の酢酸に定着させて乾燥させ、そのバンドを−７０℃での増感スクリーンと共にオートラジオグラフィーを利用して目に見えるようにした。
【０５３３】
このＥＭＳＡの結果は、未処理の細胞においてＮＦ−κＢの低い基底レベルが存在することを示しており、これはＴＮＦ（図２０、レーン１及び２）により活性化されたものである。１μｇ／ｍｌのＦ０３５またはＦ０９４で細胞を前処理した後にＴＮＦの活性化（図２０、レーン４及び８）を行ったところ、ＮＦ−κＢの活性化を抑止するものは何も見られなかった。２μｇ／ｍｌのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５またはＵＡ−ＢＲＦ−００４鞘−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４（図２０、レーン６及び１０）で細胞を処理したところ、ＴＮＦ活性されるＮＦ−κＢの著しい抑止が観察された。この研究の結果で、Ｆ０３５とＦ０９４の双方とも強い抗炎症性反応を誘導できることが判った。活性トリテルペン化合物を潜在的な抗炎症性化合物として示していることに加え、この結果は発癌現象（Ｓｉｅｗｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｐｒｅｈｎ，１９９７；Ｓｃｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０）において炎症が果たす中心的役割を実証するさらなる証拠として特に重要な意味を持つものである。
【０５３４】
実施例９
Ｆ０３５の情報伝達経路に関する研究
アカシア・ビクトリアエの植物抽出の活性成分における分子対象をさらに解明するために、Ｆ０３５の効果について、ホスファチジル・イノシトール３−キナーゼ（Ｐ１３−キナーゼ）の活性やＡＫＴ（蛋白質キナーゼＢ、セリン・トレオニン−キナーゼ）の活性、Ｐ１３−キナーゼの下流効果に関しても研究を行った。Ｐ１３−キナーゼは、レセプタ及び非レセプタのチロシン・キナーゼと関連付けることで成長因子情報伝達において意味を持つ酵素である。２つの周知のＰ１３−キナーゼ抑制因子が存在する。黴代謝物質であるｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、そして構造的にその植物のバイオフラボノイド・ケルセチンに類似した合成化合物のＬＹ２９４００２である。
【０５３５】
次に示すようにアッセイを行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０７）を一昼夜、飢餓状態に置き、Ｆ０３５の異なる濃度（細胞株によって１−８μｇ／ｍｌ）で３７℃でさまざまな時間（２から１６時間）をかけて露出した。それぞれ異なる時点の後、その細胞を回収してＰＢＳを用いて２０００毎分回転数で１０分間洗浄した。その細胞を１％の濃度のＮＰ−４０溶解緩衝液に４℃で３０分間溶解させ、４℃で１５，０００毎分回転数で５分間遠心分離にかけてその溶解物を分離した。Ｐ１３−キナーゼの免疫沈降を行うために、５μｇのウサギの抗−ｐ８５抗体（チロシン・キナーゼ・レセプタ・アダプタ蛋白質、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を１ｍｌの細胞溶解物と共に４℃で９０分間培養した。その免疫混合体を１００μｌの２０％の濃度の蛋白質Ａ−セファロース・ビーズ上で４℃でさらに９０分間置いて分離させた。その免疫沈澱物をａ）ＰＢＳ、１００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％の濃度のトリトン−Ｘ１００、ｂ）１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．６、０．５ＬｉＣｌ、１００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、ｃ）１００ｍＭのトリス、ｐＨ７．６、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、及びｄ）２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのＮａＰＰｉ、２００ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．０３％のトリトンＸ−１００で連続して洗浄した。次に免疫沈澱物を３０μｌのキナーゼ反応緩衝液（３３ｍＭのトリス、ｐＨ７．６、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのアデノシン、２０ｍＭのＡＴＰ、３０μＣｉ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ）で懸濁した。ホスファチジル・イノシトール（ＰＩ、５０μｌ）を窒素ガス下において乾燥させ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ｍｇ／ｍｌで懸濁し、氷上で１０分間超音波を当てて分解した。このＰ１３−キナーゼ反応は１０μｌの前記のＰＩ懸濁液と１０μｌのガンマＡＴＰを加えて始まった。この反応は室温３０分間で始まり、１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えて終了した。６００μｌのクロロフォルム：メタノール（１：１の割合）の脂質が抽出され、シリカ・ゲル（Ｇ６０）上でクロロフォルム：メタノール：ＮＨ４ＯＨ：水（６０：４７：２：１１．３の割合）において薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて溶解させた。ラジオ・ラベルのホスファチジルイノシトール・燐酸エステルがオートラジオグラフィーによって視覚的に確認され、抑止量をストーム・システム（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｖｌａｈｏｓｅｔａｌ，１９９４）を用いて計測した。その結果（図２１）により、Ｆ０３５（４μｇ／ｍｌ）での処理後２時間と６時間で、Ｐ１３−キナーゼ活性の抑止効果があったことが判った。同様に、細胞を２μｌ／ｍｌのＦ０３５に１５時間露出させた時は、Ｊｕｒｋａｔ細胞でのｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（カビ代謝物質でＰ１３−キナーゼの抑止剤として公知）と同じように９５％の抑止が観察された。
【０５３６】
次いで、ＡＫＴに関するＦ０３５の効果、Ｐ１３−キナーゼの下流効果を研究した。蛋白質キナ−ゼＢとして公知であるＡＫＴは、ウイルス性腫瘍遺伝子ｖ−ＡＫＴの細胞相同体であり、Ｐ１３−キナーゼを呼び起こしている経路における多数の成長因子や機能で活性化され、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎに反応するものである。ＡＫＴはセリン・スレオニン蛋白質キナ−ゼをコードするもので、１２・１％の卵巣癌及び２．８％の乳癌において増幅されるとして明らかにされている。ＡＫＴはＢａｄのリン酸化反応に通じる抗アポトーシス経路、抗アポトーシス分子に関与するものである。ＡＫＴの変性を伴う卵巣癌の患者は、不良な予後判定を持つようである（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＡＫＴはアポトーシスを積極的に阻止し、部分的にｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の活性化によって阻止することが明らかにされている。ｐ７０Ｓ６キナーゼは細胞成長及びＧ１細胞周期の進行（Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｂｌｅｎｉｓ，１９９６）に必要とされる有糸分裂促進剤で活性化されたセリン・スレオニン蛋白質キナ−ゼである。ｐ７０Ｓ６キナーゼに関する効果は、触媒性の擬似基質部位に配置される複数のリン酸化事象により調整される（Ｃｈｅａｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【０５３７】
ＡＫＴのリン酸化反応に関するＦ０３５の効果を以下のように分析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（５ｘ１０６）を血清飢餓状態にしてｗｏｒｔｍａｎｎｉｎを用いて３７℃で１５時間及び２時間かけてＦ０３５に露出させた。その細胞をｃｄ３ＸＬ（ｃｄ３架橋）で誘発させて、または誘発させずに３７℃で１０分間放置させて、ＡＫＴ溶解緩衝液に溶かしたところ、蛋白質が８％の濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で溶解された。これをリン特有のＡＫＴ（Ｓｅｒ  ４７３；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と全ＡＫＴ抗体を用いてウエスタンＥＣＬで分析した。ｐ７０Ｓ６キナーゼに関するＦ０３５の効果のアッセイを同様に実施することができるが、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｓｅｒ ４１１、ｔｈｒ４２１／ｓｅｒ４２４）リン酸化反応の分析用にホスホプラスｐ７０Ｓ６キナーゼ抗体キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施した。そのＡＫＴ分析の結果（図２２）では、ｃｄ３クロスリンクがリン酸ＡＫＴを僅かに誘発することを示した。１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌのＦ０３５で細胞処理を行った後にＡＫＴリン酸化反応（活性ＡＫＴ）の著しい抑止がもたらされたが、これは１μＭのｗｏｒｔｍａｎｎｉｎで細胞の処理を２時間行ったのと同じ結果である。しかしなら、全ＡＫＴの発現においては何ら変化がなかった。卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ−３及びＣ−２（ＨＥＹ  異種）、そして２−４μｇ／ｍｌのＦ０９４で措置したＪｕｒｋａｔ細胞を使用してもＡＫＴリン酸化反応の同様な抑止が示された。これらの確認結果によりＦ０３５がＪｕｒｋａｔ細胞及び卵巣癌細胞においてＡＫＴのリン酸化反応を抑制していることが実証される。これは、そのＰ１３キナーゼ／ＡＫＴのシグナル経路が抗アポトーシス・シグナル（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を伝達すると明らかにされていることに重要な意味を与えるものである。この結果は、Ｆ０３５とＦ０９４がこのＰ１３−キナーゼシグナル経路を介して腫瘍細胞のアポトーシスを成立させていることを示唆するものである。
【０５３８】
実施例１０
アポトーシスを検出するための細胞周期及びアネキシン−Ｖ結合アッセイ
植物抽出物の活性化合物の成長抑止と細胞毒性のメカニズムをさらに特徴付けるために、およそ１ｘ１０６のＯＶＣＡＲ−３の腫瘍細胞を６０ｍｍ３の容器にプレートし、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５の多様な濃度で処理し、３７℃で１８−２４時間培養した。その細胞を採取し、ＰＢＳで２度洗浄して１ｘ１０６細胞／ｍｌで懸濁した。パラホルムアルデヒド（１％の最終濃度）を穏やかなボルテックスにかけて細胞に１滴１滴加えた。細胞を氷上で１５分間培養した後、ＰＢＳで再度洗浄し、そのペレットを７０％の濃度のよく冷えたエタノールに再懸濁し、一昼夜−２０℃で培養した。最後にそのエタノールをＰＢＳで１度洗浄し、細胞を０．１％のリボヌクレアーゼと一緒に１０μｇ／ｍｌのプロピジウム・ヨウ化物（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に再懸濁した。細胞をもう１度室温で３０分間培養し、次いで４℃に移行して、１８時間後フロー・サイトメトリー（Ｐａｌｌａｖｉｃｉｎｉ，１９８７）で分析した。その結果、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５を用いて細胞を措置する前は、４８％の細胞がＧ０／Ｇ１相に存在し、３６％の細胞がＳ相に存在し、そして７％の細胞がＧ２／Ｍ相に存在することが実証された。しかしながら、Ｆ０３５のＯＶＣＡＲ−３細胞処理を行った４８時間後では、〜５８％の細胞がＧ１相に存在し、その細胞周期のＳ相には２７％しか存在しなかった。これは細胞周期のＧ１相において８％の細胞増加、Ｓ相において〜１０％の細胞減少を示している（図１９Ａ、Ｂ）。この結果はＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞のＧ１相における明確な阻止を実証するものである。
【０５３９】
ヒト乳癌細胞の細胞周期プロファイルに関するＦ０３５の効果も検査した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３の乳癌細胞を異なった濃度のＦ０３５に露出させ、７２時間後に上に述べた細胞周期分析で分析した。その結果は、Ｆ０３５がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のアポトーシスを誘発していることがＳｕｂ  Ｇ０ピーク（表２８）の外観で示されている。さらに、細胞周期のＳ相及びＧ２／Ｍ相における細胞割合の減少で細胞周期の調整も観察されている。
【０５４０】
（表２８は、「Ｆ０３５を用いたＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞の後処理の細胞周期分析」を示す。）
【表２８】
2004517131.tif 000044
【０５４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞を用いた結果により、Ｆ０３５を用いた処理７２時間後の細胞周期のＧ１相における１０％の細胞増加とＳ相における４−１０％の細胞減少でＦ０３５がＧ１相の細胞周期の阻止を誘発していることが実証された（表２９）。これらの結果は、この植物抽出物により誘発された細胞周期の阻止及び腫瘍細胞のアポトーシスを実証するものである。
【０５４２】
（表２９は、「ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞の細胞周期分析」を示す。）
【表２９】
2004517131.tif 000045
【０５４３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６）をＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（５０−１０００ｎｇ／ｍｌ）のさまざまな濃度で３７℃で１８時間かけて措置した。その細胞をＰＢＳで１度洗浄し、５μｌのアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ結合体を含む結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、１４０ｍＭのＮａＣ１、２ｍＭのＣａＣ１２）において再懸濁した。
【０５４４】
この結果で、精製した活性成分がＪｕｒｋａｔ細胞内でアポトーシスを引き起こすことが可能であることが実証された。この発見は、処理済の細胞をアネキシン−Ｖに結合する能力、つまり細胞がアポトーシスを受けた徴候でさらに確認された（図３０）。通常、ホスファチジル・セリン（ＰＳ）がその原形質膜の内膜上に集中するが、アポトーシスの初期段階においてはＰＳの外面化が起こる。アネキシン−Ｖは、ＰＳと結びつくカルシウム結合蛋白質であって、フロー・サイトメリー（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）によりアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色により観察できる。
【０５４５】
（表３０は、「ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５の多様な濃度で処理したＪｕｒｋａｔ細胞においてアネキシン−Ｖ結合で測定したアポトーシス」を示す。）
【表３０】
2004517131.tif 000046
【０５４６】
実施例１１
化学保護剤としてのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５はＳＥＮＣＡＲマウスで多段階皮膚発癌モデルで調べられている。動物の皮膚にアセトン、発癌性ＤＭＢＡ（７，１２−ジメチルベンズ［ザ］アントラセン）、ＤＭＢＡ＋ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５、及びＤＭＢＡ＋フラクション６０（ネガティブ・コントロール）を低用量（マウス１匹あたり１００μｇのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５あるいはフラクション６０）及び高用量（マウス１匹あたり５００μｇのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５あるいはフラクション６０）の植物抽出物を連続６週間、１週間に２回塗布して措置した。ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５あるいは比較対照をＤＭＢＡを塗布する前にマウスの皮膚に５分間塗布した。これらの動物に乳頭腫が形成されるか同かを観察し、その後致死させて、組織学的に組織分析した（図９Ａ−Ｆｉｇ．９Ｆ）。分析結果を図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２及び図１３に要約して示してある。
【０５４７】
これらの実験から８週間後、ＤＭＢＡで処理したグループのマウスでは１匹あたり８つの乳頭腫ができていたのに対して、ＤＭＢＡとＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５で処理したマウスでの乳頭腫発症率は１匹あたり０．６６であり、ＤＭＢＡとフラクション６０（ネガティブ・コントロール）で処理したものでは６．９であった。これらの結果はＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５の腫瘍に対する防御効果がかなり高いこと、そしてフラクション６０ではその効果がまったく認められないことを示している。
【０５４８】
さらに行なったマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの研究は、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５がｒａｓオンコジーンの突然変異を防ぐことで発癌物質が誘発する腫瘍に対して化学予防的効果を有していることを示している。マウスの皮膚における発癌の開始段階は直接作用性の発癌性物質（例えばＤＭＢＡ）によって行なわれ、これは基本的には非可逆的段階である。発癌の抑制はＤＭＢＡによって誘発される乳頭腫の形成の減少によって８週間後に判定された。処理された皮膚を分子的に分析したところ、ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５がＤＭＢＡのｒａｓオンコジーンを突然変異させる能力を防ぐことが示された（以下の実施例１４、１５及び１６参照）。
【０５４９】
実施例１２
アカシア・ビクトリアエにおける活性トリエルペノイド検出の手順
植物組織サンプルの活性トリテルペンを効率的に検出できるようにする手順が用いられた。この手順は以下のように実行された。約５ｇの葉と小枝を鋏で小片に細断するか、あるいは根のサンプルをナイフで刻んで小さなスライスをつくった。これらの植物性素材を小さなブレンダー内で処理して約２５ｍｌの８０％メタノール（ｖ／ｖ）と混ぜ合わせ、少なくとも２時間放置し、１時間毎に１度づつ震動させた。不溶性物質を１０，０００ｇで遠心分離を行って取り除いた。ＴＬＣプレートを０．１％バニリン（４−ヒドロキシ−メトキシベンズアルデヒド）／Ｈ２ＳＯ４スプレイに露出させて７０℃の温度で１５−３０分間加熱処理したところ、活性トリペノイドが黄色味を帯びた赤い斑点として観察された（Ｒｆ＝０．２−０．３）。
【０５５０】
実施例１３
アカシア・ビクトリアエ内でのトリテルペン化合物の位置的特定
初期の研究で、上記植物の地上から上の乾燥した部分を初夏に回収して、抽出を行った。秋に再度回収したものは活性が認められなかった。その後系統的な研究を行って、アカシア・ビクトリアエのいろいろな部分の活性トリテルペン化合物が相対的に存在しているかどうか調べた。その植物を科学的に観察したところ、その植物の地面から上の部分の活性成分のほとんどすべては鞘、根及苗木に集中しており、幹、皮、葉、そして種子にはほとんど、あるいはまったく存在していなかった。従って、活性成分の回収期は鞘の形成期から裂開までのわずか約３週間だけであった。この植物の根も同じ活性物質を生成し、糖と活性成分の比率に変動は認められなかった。後者の特徴は、正常な植物の成長を維持しながら根の活発な成長を可能にする空気中栽培がアカシア・ビクトリアエには適していることを示している。
【０５５１】
実施例１４
腫瘍細胞株及びその成長
以下のヒト癌細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手した。ＳＫ−ＯＶ−３及びＯＶＣＡＲ−３（卵巣）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ−細胞白血病）、Ｕ−９３７（組織障害性リンパ腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ―ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＳＫ−ＢＰ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−２０（乳房）、ＰＣ−３、ＤＵ１４５（前立腺）、７６９−Ｐ、７８６−Ｏ、Ａ４９８（腎臓）及びＰＡＮＣ−１（膵臓）。ＨＥＹ及びＤｏｖ−１３（卵巣）細胞株はＭ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。以下の非形質転換ヒト細胞株ＭＣＦ−１０Ａ及び１０Ｆ（乳房上皮）もＭ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。Ｈｓ２７（ヒト包皮繊維芽細胞）及びＬ２９２（マウス繊維芽細胞）はＡＴＣＣから入手した。ＯＶＣＡＲ−３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｕ−９３７、ＬＮＣａｐ、ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＨＥＹ、Ｄｏｖ−１３、ＰＡＮＧ−１、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−１０Ｆ及び残りの乳癌細胞株をＲＰＭＩ  １６４０内で成長され、Ｆ−１２培養液を用いて７６９−Ｐ、７８６−Ｏ及びＡ４９８を成長させた。用いられたすべての培養液は１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭグルタミン及び０．０５％ジェンタミシンで補強されていた。
【０５５２】
実施例１５
突然変異固有プライマー（ＭＳＰ）を用いてのマウスＨａ−ｒａｓコドン６１ＣＡＡのＣＴＡ突然変異の増幅
この手順はＮｅｌｓｏｎら（１９９２）から導かれたものである。３´末端ヌクレオチド（Ａ）のＨａ−ｒａｓのコドンで中央のヌクレオチド（下線部分）がＣＡＡからＣＴＡにトランスバージョンするように、３ＭＳＰ６１ｍｕｔと命名されている逆プライマーを設計して、突然変異されたＤＮＡを以下に述べるような条件下で増幅させる。このアッセイは、Ｔａｑポリメラーゼが３´エクソヌクレアーゼ活性を欠いており、従って、アニール化されたプライマーの３´末端のミスマッチを修復できないという事実に基づいている。アッセイの条件は野生タイプの配列に十分に戻ることができず、従って延伸できない逆プライマーに基づいている。同じ前方プライマーを用いて、上記逆ミスマッチプライマー（３ＭＰＳ６１ｍｕｔ）と１つの反応を行い、逆野生タイプ・プライマー（３ＭＰＳ６１ｗｔ）と別の反応を行わせる。この手順はＣＡＡからＣＴＡへのトランスバージョンを検出ことができるだけであるが、これらの突然変異はコドン６１ポイント突然変異で最もよく見られるものである。このトランスバージョンでＸｂａＩＲＥＬＰサイト（Ｔ／ＣＴＡＧＡ）がこのトランスバージョンでつくりだされる。これらの突然変異ＸｂａＩによる増強ＤＮＡの拘束及び３２Ｐ末端ラベル５ＭＳ６１プライマーを用いた直接ＤＮＡ配列決定によって検証することができる。ミスマッチ生成物を含むこれらの反応は２％低融点アガロース上で行うことができ、その後で精製したり配列決定を行うために用いることができる。用いられたプライマー、５ＭＳＰ６１、３ＭＳＰ６１ｍｕｔ、及び３ＭＳＰ６１ｗｔの配列を以下に、配列識別番号Ｎｏ．２、配列識別番号Ｎｏ．３、及び配列識別番号Ｎｏ．４として示す。
５ＭＳＰ６１（２３−ｍｅｒ）  ５’−ＣＴＡ ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＧＧ ＡＣ−３’ （配列識別番号Ｎｏ．２）
３ＭＳＰ６１ｍｕｔ（２０−ｍｅｒ）  ５’ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＡ−３’  （配列識別番号Ｎｏ．３）
３ＭＳＰ６１ｗｔ（２０−ｍｅｒ）  ５’ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＴＣ ＴＴＣＣＴＴ−３’  （配列識別番号Ｎｏ．４）
【０５５３】
３ＭＳＰ６１ｗｔの配列はＮ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓ配列との間でそれぞれ２あるいは３のミスマッチを有しており、フラグメント・サイズは１１０ｂｐである。テンプレートＤＮＡ及び増幅剤は以下のとおりであった。
2004517131.tif 000047
【０５５４】
Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ Ｅｌｍｅｒ熱サイクル計を用いた増幅サイクル条件は以下のとおりであった。
2004517131.tif 000048
【０５５５】
アッセイの検証は以下の比較対照：野生タイプ（ＷＴ）、野生タイプ突然変異体（ＭＵＴ），及びネガティブ・コントロール（Ｈ２Ｏ）を用いて行った。プラスミドｐＨｒａｓ６１ｍｕｔからのＭＵＴ  ＤＮＡをポジティブ・コントロール・サンプルを用いた。プラスミドｐＨｒａｓ６１はＳｅｎｃａｒマウス腫瘍からのクローンされたエクソン２Ｈａ−ｒａｓＤＮＡを含んでいる。このクローンの突然変異はＤＮＡ配列決定によって検証された。突然変異はマウスＨａ−ｒａｓ遺伝子のコドン６１（エクソン２内にある）でのＣＡ→ＣＴＡトランスバージョンで、サンプルはコドン６１内にＨａ−ｒａｓ突然変異を含んでいる腫瘍腺癌から得たＤＮＡである（図１４参照）。
【０５５６】
実施例１６
マウスＨ−ｒａｓコドン１２／１３のホットＰＣＲＴＭ／ＲＦＬＰ突然変異アッセイ
このアッセイはコドン１２の３つのｂｐとコドン１３の最初のｂｐにまたがって広がっている自然発生ＭｎｌＩサイト（ＧＧＡ  ＧＧＣ、ラット及びマウスＨａ−ｒａｓコーディング配列内のヌクレオチド３４−３７）の破断に基づいている。ＭｎｌＩに対する認識サイトはＮ７ＧＧＡＧである。これらの４つの位置のいずれかで突然変異が起きると、ＭｎｌＩはこの領域を含むＰＣＲＴＭフラグメントを切断できなくなる。このアッセイの欠陥はＭｎｌＩによる不完全な消化が起きてしまうことである。そうした事態が発生すると、消化に対して抵抗性を示す一部の野生タイプのＤＮＡと実際の突然変異のレベルの低さとの判別が困難になる。こうした現象は、供給源のＤＮＡが野生タイプＤＮＡと突然変異体ＤＮＡの混合物を含んでおり、このアッセイが感度を増強するためにフラグメント・ラベリングに３２Ｐを用いる場合に時々観察される。このアッセイのために用いられるＰＣＲＴＭプライマー・セットをいかに配列識別番号Ｎｏ．５及び配列識別番号Ｎｏ．６として以下に示す。Ｈ−ｒａｓ１２増幅生成物のサイズは２１４ｂｐである。
プライマー＃３（５´）５’−ＣＣＴＴＧＧＣＴＡＡＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＧＧ−３’（配列識別番号Ｎｏ．５）
プライマー＃６（３´）５’−ＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＧＴＡＧＧ−３’（配列識別番号Ｎｏ．６）
プライマー＃６を用いて、以下の反応条件で５５℃で配列決定を行う。
2004517131.tif 000049
Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ Ｅｌｍｅｒ熱サイクル計を用いた増幅サイクル条件は以下のとおりであった。
予備加熱熱サイクル計−９４℃
2004517131.tif 000050
【０５５７】
実施例１７
アッセイの結果：ｃ−Ｈａ−ｒａｓ突然変異の検出
ＤＭＢＡを最後の投与してから４日後に、１グループあたり５匹の新鮮凍結組織から分離したＤＮＡを分析して、ＰＣＲＴＭ分析によってｃ−Ｈａ−ｒａｓのコドン１２とコドン１３及びコドン６１内の突然変異が起きているかどうか調べた。本発明者らはこの分析のために４日間標本を用いたが、それは２日目のＤＮＡの一部が劣化しており、従ってＨａ−ｒａｓ分析に適していなかったからである。コドン１２と１３では、野生タイプ配列のコドン１２の３つのヌクレオチドの３つのヌクレオチドとコドン１３の最初のヌクレオチドにまたがるＭｎＩ Ｉ制限サイトが存在している。これらの塩基対のいずれにおける突然変異もＭｎＩ Ｉサイトの喪失をもたらした。本発明者らはＰｅｒｋｉｎｓｏｎ Ｅｌｍｅｒ熱サイクル計を用いてゲノム性ＤＮＡからのｃ−Ｈａ−ｒａｓの（コドン１２とコドン１３を含む）エクソン１を増幅させた。フェノール−ＣＨＣｌ３での抽出を行い、ＤＮＡをエタノールで沈積させた。そして、ＤＮＡを酵素内に再懸濁させて、ＰＣＲＴＭ生成物をＭｎＩ Ｉで拘束して８％非変性ポリアクリルアミド・ゲル上で消化電気泳動させた。ＭｎＩ Ｉ制限サイトの喪失は観察されず、テストされた物質でのコドン１２及び１３では突然変異は起きないと結論づけられた。Ｈａ−ｒａｓ分析のためのＤＮＡも、最後の投与から２日後に回収されたサンプルからの８μで切断されたパラフィン埋め込み断片を用いて行われた。各パラフィン・ブロックからの２５のセクションをミクロフュージ・チューブ内に入れて、キシレントエタノールを用いてパラフィンを取り除いてから、遠心分離にかけ、５％チェレックス内にプロテナーゼＫとともに再懸濁させた。
【０５５８】
Ｈａ−ｒａｓコドン６１に関して用いられた最初の手順はＮｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２（実施例１５参照）から導かれたものであった。同じ前方プライマーを用いて、１つの反応は逆ミスマッチ・プライマー（３ＭＳＰ６１ｍｕｔ）と行われ、もうひとつの反応は逆野生タイプ・プライマー（３ＭＳＰ６１ｗｔ）と行わせた。この手順はＣＡＡからＣＴＡへのトランスバージョンを検出ことができるだけであるが、これらの突然変異はコドン６１ポイント突然変異で最もよく見られるものである。このトランスバージョンでＸｂａＩＲＥＬＰサイト（Ｔ／ＣＴＡＧＡ）がこのトランスバージョンでつくりだされる。こミスマッチ生成物を含むこれらの反応は２％低融点アガロース上で行うことができ、その後で精製したり配列決定を行うために用いることができる。切断できるもの（野生タイプＤＮＡ）と切断できないもの（突然変異されたＤＮＡ）の割合は臭化エチジウム染色強度あるいは３２ラベリングによって判定された。プラスミドｐＨｒａｓｍｕｔからのＤＮＡをポジティブ・コントロール・サンプルとして用いた。このプラスミドｐＨｒａｓ６１はＳｅｎｃａｒマウス腫瘍からのクローンされたエクソン２Ｈａ−ｒａｓＤＮＡを含んでいる。クローンされた突然変異はＤＮＡ配列決定で検証した。この突然変異はマウスＨａ−ｒａｓ遺伝子のコドン６１（エクソン２内にある）でのＣＡＡからＣＴＡへのトランスバージョンである。反応条件は実施例１５で述べたのと同様。
【０５５９】
実施例１８
アゾキシメタンで処理したＦ３４４ラットでの異常な陰窩の開始に対するＦ０３５の影響
生後６週間経過した雄のラット（Ｆｉｓｃｈｅｒ，３４４４）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ （Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ）から入手した。これらのラットをＤｙｅｔｓ Ｉｎｃ． （Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ， ＰＡ）から購入した餌ＡＩＮ−７６Ａを無制限に与えた。この餌は２０％カセイン、０．３％ＤＬ−メチオニン、１５％コーン・スターチ、５０％サクロース、５％コーン・オイル、５％セルロース、３．５％ＡＩＮ−７６塩混合物、１％ＡＩＮ−６ビタミン混合物、そして０．２％塩素重酒石酸塩で構成されていた。これらの動物にも水道水を無制限に与えた。ラット内で異常な陰窩を誘発するエゾキシメタン（ＡＯＭ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｓｔ． Ｌｏｕｓ， ＭＯ）から購入した。テスト動物たちを隔離してラット用餌で３日間給餌し、その後、７週間までＡＩＮ−７６Ａで給餌した。これらの動物を無作為に３つの処理グループ（１グループ１０匹）に分けた。グループ１の動物にはＡＩＮ−７６Ａのみを与え、グループ２の動物にはＡＩＮ−７６＋５ｍｇ／ｋｇのＦ０３５を、そしてグループ３にはＡＩＮ−７６Ａと１０ｍｇ／ｋｇのＦ０３５を与えた（表３１）。
【０５６０】
（表３１は、「アゾキシメタンで処理したＦ３４４ラットでの異常な陰窩の開始に対するＦ０３５の研究用の処理グループ」を示す。）
【表３１】
2004517131.tif 000051
【０５６１】
すべての動物に給餌を行ってから１週間後にＡＯＭ（１５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹膜内に注射した。１週間後に第２のＡＯＭ注射を行った。研究の全期間を通じて毎週体重を測定した。動物に対する給餌は４週間継続した。３１日後、これらの動物をＣＯ２吸入で致死させた。結腸を摘出して、冷たいＰＢＳでフラッシングして、縦方向正中軸に沿って切断し、ろ紙上に置いて、７０％アルコール内で少なくとも２４時間固定した。これらの結腸をメチオニン・ブルー（ＰＢＳ内に０．２５％）で約１分間かけて染色した。解離用顕微鏡を解像度２０倍で用いて陰窩核をカウントした。異常な陰窩はそのサイズが異常であったこと、及び細胞のルミナル−ベース面間の距離の増大、そして陰窩周辺ゾーンの増大から周辺の通常の陰窩と区別された。すべての標本にコードを付し、２名のスコアラーによるブラインド・スコアリングが行われた。一方向ＡＮＯＹＡを用いてグループ間の差を調べて統計的差を判定した。差が認められた場合は、ボンフェノーリｔテストを用いてコントロール・タイプに対するＦ０３５の両方の量の多重比較を行った。結腸のスコアリングは２名のスコアラーによって行われ、それぞれスコアリングしている実験グループに対して事前の情報は与えられなかった。これら２名のスコアラーによる結果の間にはかなりの一致が認められた。
【０５６２】
餌１ｋｇあある１０ｍｇの割合で加えた場合、Ｆ０３５は異常な陰窩核の総数はかなり減少した。この添加量は１日あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇを摂取する場合と同様である（表３２、表３４）。同じ用量でシングレット及びダブレット・カテゴリーで異常な陰窩の数がかなり減少した（表３３、表３５）。少ないＦ０３５用量の方、つまり餌１ｋｇあたり５ｍｇ（これは体重１ｋｇあたり５００マイクログラムのＦ０３５を毎日摂取するのにほぼ等しい）は異常な陰窩核の総数、シングレット及びダブレット・カテゴリーでの減少をもたらしたが、コントロール・グループでの値との違いに有意差は認められなかった（表３３、表３５）。研究の全期間を通じて、実験グループとコントロール・グループとの間に体重増加での違いはなかった（表３６、表３６、及び表３７）。
【０５６３】
（表３２は、「ＡＯＭ処理ラットの結腸での異常な陰窩の数に対するＦ０３５の影響」を示す。表中、−はコントロールとの有意差なしを、＋はコントロールとの有意差あり（Ｐ＜０．０５）を、Ｃは最終的研究を示す。）
【表３２】
2004517131.tif 000052
【０５６４】
（表３３は、「ＡＯＭ処理ラットの病巣１つあたりの異常な陰窩の数に対するＦ０３５の影響」を示す。表中、＊はコントロールとの有意差（ｐ＜０．０５）を示す。）
【表３３】
2004517131.tif 000053
【０５６５】
（表３４は、「ＡＯＭ処理ラットの結腸の異常な陰窩数平均に対するＦ０３５の影響を分析するための原データの要約」を示す。表中、ａはＡＯＭを注射したラット、テスト薬なし、ｂは４週間目でのプールされたＡＯＭ注射ラットの平均（ｎ＝１０）、ｃはコントロールとの有意差あり（Ｐ＜０．０５）を示す。）
【表３４】
2004517131.tif 000054
【０５６６】
（表３５は、「ＡＯＭ処理ラットの１病巣あたりの異常陰窩数に対するＦ０３５の影響の分析から得られた原データの要約」を示す。）
【表３５】
2004517131.tif 000055
【０５６７】
（表３６は、「餌１ｋｇあたり５ｍｇのＦ０３５を与えた場合のＡＯＭ処理ラットの体重」を示す。）
【表３６】
2004517131.tif 000056
【０５６８】
（表３７は、「餌１０ｋｇあたり５ｍｇのＦ０３５を与えた場合のＡＯＭ処理ラットの体重」を示す。）
【表３７】
2004517131.tif 000057
【０５６９】
（表３８は、「ＡＯＭ処理ラットの体重」を示す。）
【表３８】
2004517131.tif 000058
【０５７０】
実施例１９
完全な発癌及び腫瘍開始／促進手順を用いたＦ０３５及びＦ０６０による治療のｉｎ ｖｉｖｏ分析
１８．１  完全な発癌手順
マウスを、完全な発癌手順で、１００ｎｍｏｌＤＭＢＡを０．２ｍｌアセトンに溶かした溶液で週２回、４週間続けて処理した。ＤＭＢＡ投与実験動物の毛を剃った領域にＦ０３５及びＦ０３６を塗布してから、１週間に２度づつ、４週間ＤＭＢＡ投与を行った。Ｆ０３５とＦ０３６は０．２ｍｌのアセトンに１回の投与あたりそれぞれ０．５ｍｇと１．０ｍｇの用量で塗布した。テスト化合物を最後に塗布してから２日後に、１グループあたり５匹のマウスを致死させて、異常増殖についての調査を行った。残りの５匹のマウスにはそれ以上の処理は行わなかった。さらに４週間の時間を置いてから、各グループのさらに５匹を致死させて異常増殖について調べた。残りのマウスは全部で１６週間保持して腫瘍が形成されるかどうかについての評価を行った。この調査の結果を以下の表３９に示す。
【０５７１】
１８．２  腫瘍開始／促進手順
腫瘍開始を／促進手順においては、１０ｎｍｏｌのＤＭＢＡを０．２ｍｌのアセトンに溶かしたもの一回投与しただけで腫瘍が開始された。１週間後から、実験の前期間中、２μｇを０．２ｍｌのアセトンに溶かしたものでマウスを週に２度措置した。１６週間後にこの手順を中止した。Ｆ０３５とＦ０６０（１回の投与あたり、０．２ｍｌのアセトンにそれぞれ０．５ｍｇと１．０ｍｇ）を実験動物の背中の毛を剃った領域に１５分適用してからＴＰＡ塗付を行った。比較対照はさらに８週間飼育して腫瘍負荷についての評価を行った。腫瘍発生率と多様性を個々のマウスについて毎週記録した。それらの結果を以下の表３９に示す。
【０５７２】
１８．３  組織学的評価
マウスを致死させて、すべての皮膚サンプルを通常の方針でホルマリン内で固定して、組織学的分析のために処理した。組織学的評価のための組織は通常のパラフィン断片及びヘマトサイクリン−エオシン染色で作成した。各皮膚の約１ｃｍ２をスライド制作のためにホルマリン内で保存して、残りをＤＮＡ分離のために液体窒素内で急速凍結した。上皮の厚みをホルマリン固定皮膚サンプル内で少なくとも２０の無作為に選択した箇所から判定した。基底膜から脂肪膜までの皮膚の厚みも動物１匹あたり最低２０の無作為に選択した箇所で判定した。投薬を中断から２日後に、真皮の炎症性細胞（多形核白血球及びリンパ球、マクロファージ、繊維芽腫、及び肥満細胞）相対的割合を、動物１匹あたり１０個の高解像度視野（１０００倍）内での１平方μｍあたりの細胞の数を測定することで判定した。この数を分析的実験の目的で総皮膚細胞質と定義した。
【０５７３】
加えて、１２週目及び１６週目に得た腫瘍について、直接細胞遺伝技術を用いてクロモソーム分析を行った（Ｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ，１９８６）。乳頭腫を均一化させて０．０２μｇ／ｍｌコルセミド（ＧＩＢＣＯ）を含む酵素溶液内で培養した。分散された細胞を２度洗浄して、劣張０．０７５Ｍ  ＫＣｌ溶液内で３７℃の温度で１０分間再懸濁させた。細胞をペレット化し、メタノール−酢酸（３：１）内で固定して、Ｇｉｅｍｓａで染色した。Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ
（Ｅｌｍｈｕｒｓｔ， ＩＬ）上で（Ｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６）に述べられている手順でカウントした。
【０５７４】
１８．４  異数性の抑制
完全な発癌手順で、１２週目に乳頭腫は十分に分化した増殖性病変となり、細胞異型性はほとんど、又はまったくなかった。それらの細胞は二倍体であった。１６週目に、それらの細胞のうちの１０％は形成不全となり、高二倍体となった。トリペプチノイド・サポニンで処理されたマウス内で進行した乳頭腫のいずれも高二倍体ではなかった。開始／促進実験では、１２週目に、比較対照の前期腫瘍の３０％は高二倍体であった。１６週目に、それら腫瘍の５０％は高二倍体となった。注目すべきことに、上記トリペルペノイド・サポニンで措置されたマウスでは異数体の証拠がまったく認められなかった（以下の表３９参照）。
【０５７５】
ゲノムの不安定性につながルクロモソームの不均衡である形成不全はほとんどのヒトの固体癌の特徴であるので、これらの結果は重要である（Ｄｕｅｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。遺伝毒性及び非遺伝毒性発癌物質だけでも形成不全を起こすことができるが、腫瘍プロモータはクロモソーム損傷の特に強力な誘発因子であり、それは一部にはＨ２Ｏ２などの反応性酸素種（ＲＯＳ）が放出されるからである（Ｃｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６； ｄｕｅｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００： Ｃｅｔｕｔｔｉ， １９８５； Ｄｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ， １９８５）。
【０５７６】
ＤＮＡ損傷を修復するためのメカニズムは進化の全期間を通じて広く保持されている。加えて、損傷を受けた細胞はアポトーシスで除去することができる（Ｗｈａｌ ａｎｄ Ｖａｆａ， ２０００）。体細胞の突然変異が形成不全に先行するのか、あるいはその逆であるのかは、未だ検討課題である（Ｄｕｅｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、ゲノム不安定性はＲＯＳと組み合わさっていることもしばしばある活性化されたオンコジーンから（Ｗｈａｔ ａｎｄ Ｖａｆａ， ２０００； Ｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｆｌｅｓｈｅｒ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ， １９９９）、異常なクロモソーム補体あるいは分裂装置内の突然変異（Ｃａｈｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ， １９９９； Ｌｅｎｇａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）からも発生する可能性がある。従って、例えばアクチビンが（異数性核型の出現の前に起きる）Ｈ−ｒａｓ突然変異と異数性の両方を抑制するなどの結果は、Ｈ−ｒａｓ突然変異及び異数性がマウス皮膚乳頭種と、恐らくは多くのヒト上皮悪性腫瘍の進行における初期の事象であるので、重要である。従ってこの研究の結果はクロモソーム異常の予防のために本発明の化合物を利用できる可能性を示唆している。そうした応用例には、クロモソーム不安定性及びそれに関連した作用を予防するための、細胞、組織、あるいは患者の本発明による化合物による治療が含まれている。そうした不安定性は発癌と関連している可能性があり、あるいは増殖性疾患を治療するために用いることができる種々の治療と組み合わせることも可能であろう。
予防上あるいは治療上の目的で本発明の化合物を投与することによって、クロモソーム不安定性に関連した望ましくない作用を最小限に抑えたり、防いだりすることができる。
【０５７７】
（表３９は、「ＳＥＮＣＡＲマウスにおける完全な発癌及び開始／促進実験における乳頭腫形成のＦ０３５による抑制」を示す。（）内は異数性を有する乳糖腫の割合を示す。）
【表３９】
2004517131.tif 000059
【０５７８】
実施例２０
アグリコンの抗腫瘍活性
研究の結果では、コア・トリテルペン分子から糖類を取り去ると生物学的活性がかなり喪失されることが示されたので、糖の重要性が示された。表４０に示されているように、（ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４の加水分解で得られ、エステルが付加されている）ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ１６４と、（ＵＡ−ＢＲＥ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４の加水分解生成物のメチル・エステル混合物である）ＵＡ−ＢＲＥ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ２４５は一連の腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の著しい喪失を示す。同様に、ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｃ１９４（アグリコン１の精製された酢酸塩）もトリテルペン・グリコシド・フラクション３５のデータと比較して、一連の腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性のかなりの低下を示す。従って、本明細書で開示されているトリテルペン・グリコシドの糖単位の加水分解の後、生物学的活性の著しい喪失が起きる。
【０５７９】
（表４０は、「フラクションＦ１６４、Ｆ２４５及びＣ１９４のバイオアッセイ」を示す。）
【表４０】
2004517131.tif 000060
【０５８０】
実施例２１
コレステロール代謝に対するＦ０３５の影響の分析
この研究の目的は心臓血管病の予防のための本発明による生物学的活性を有するトリテルペン・グリコシドの効果を分析することである。この研究の長期的な目的は、ヒトを含む哺乳動物の食料に添加されたトリテルペン化合物が血清コレステロールを減少することを実証することである。この研究のために選択された脂肪過多ハムスター・モデルは、ラット・モデルとは対照的に、コレステロール含量に応じてＬＤＬレポータ及びヒト血漿脂肪蛋白質変化両方の変化を忠実に再現してくれる齧歯類モデルである（Ｓｐａｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【０５８１】
このトリテルペン・グリコシドは、異なった濃度で、その餌のカルシウム、カリウム、リンあるいはその他の必要成分の含量を変化させずに精製されたハムスターの餌に加えた。トリテルペン・グリコシドでの補強の異なった２つのレベルを用いたのは用量応答関係を示すためである。これらの動物にはＮＲＣ勧告（Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）に従って調合した精製ハムスター用餌であるＤｙｅｔｓに１％コレステロールを加えたもの、及び加えないものを自由にアクセスできる状態で与えた。コレステロールを含んでいる方のＤｙｅｔｓ精製ハムスター用餌は以下に示す濃度を用いてトリテルペン・グリコシドで修正した。ペレット化された研究用餌及び比較対照用餌はＤｙｅｔｓ Ｉｎｃ． （Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ， ＰＡ）製のもので、カルシウム、リン、あるいは基本的微量栄養素の含有量に変化はなかった。動物の食物摂取量と体重増加を１週間毎に観察した。用いられた動物は生後４週間目の、異系交配種の雄で、ウイルスを含まないＳｙｒｉａｎハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）であった。これらの動物をＳｔａｔｖｉｅｗプログラムで乱数発生装置を用いて無作為に分けて、１つのケージに３匹づつ収容して、１日１２時間照明し、２２℃±１．０℃の温度で保持した。
【０５８２】
トリテルペン・グリコシドを加えた、あるいはそれを加えないそれぞれの餌を与えて、０、４、及び８週目に１グループから１２匹の動物を無作為で選別して、午前９−１１時の時間帯に致死させた。肝臓と腎臓を取り出して、計量し、処理して、事後の調査に備えて−７０℃の温度で保存した。致死させる時点で、肝臓と腎臓を取り出す前に心臓に針を突き刺して血液を取り出し、脂肪特性を分析した。血液血清脂質特性を治療グループと比較対照グループの間で比較した。２つの比較対照グループ（グループ１及び２）と２つの治療グループ（グループ３と４）を用意した。すべてのグループに２週間隔離期間中ＮＲＣハムスター用餌を与えた。グループ１は研究が終わるまでＮＲＣ餌を与えた。グループ２−４に対してはＮＲＣ餌に加えて１％コレステロールをさらに２週間与えて、高コレステロール症を起こさせた。そして、グループ２は研究終了時までこの餌の給餌が続けられたのに対して、グループ３と４には同じ餌にトリテルペン・グリコシド（例えばＦ０３５あるいはＦ０９４）で補強したものを与えた。治療グループの要約を以下の表４１に示す。
【０５８３】
（表４１は、「餌修正の方式」を示す。表中、ａはトリテルペン・グリコキシド給餌開始時に致死を示す。）
【表４１】
2004517131.tif 000061
【０５８４】
トリテルペン・グリコシドを加えた、あるいはそれを加えないそれぞれの給餌を開始してから０（比較対照グループだけ）、４及び８週目に、１グループあたり１２匹の動物を無作為に選択して、午前９−１１時に致死させた。ハムスターの肝臓及び腎臓を取り出して、体重を計量し、異常がないかどうか処理した。異常性を示す各器官の一部を組織学的分析のために容易し、パラフィン切片を作成するために凍結し、切片はヘマトサイクリンとエオシンで染色した。致死させる時点で、肝臓と腎臓を取り出す前に心臓に針を突き刺して血液を取り出し、脂肪特性を分析した。血清を取り出して脂肪特性分析を行うために−２０℃で保存した。致死させる前にハムスターを一昼夜絶食させた。データを表４２に示す。
【０５８５】
この研究の過程で回収された血液サンプルを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＮＣで総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ−コレステロール、及びＬＤＬ−コレステロール＋ＶＬＤＬコレステロールの判定を行った。データの統計的分析をＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ９６００コンピュータでＭａｃｉｎｔｏｓｈソフトエウアを用いて、力価、ｐ値、及び直線回帰の一方向分析を行った（Ａｒｍｉｔａｇｅ， １９７１）。特に、各餌／薬品グループの脂肪特性のデータ分析をニューマン−ケウルス平均分離を用いて力価分析によって行った（Ｓｔｅｅｌ ａｎｄ Ｔｏｒｒｉｅ， １９８０）。
【０５８６】
（表４２は、「トリテルペン・グリコシドをハムスターに６週間連続給餌した場合の影響」を示す。）
【表４２】
2004517131.tif 000062
【０５８７】
実施例２２
フラクション３５を用いてのＵＶＢ誘発発癌予防の研究
この研究は本発明の活性トリテルペン・グリコシドでのマウス皮膚モデルでのＵＶＢ誘発発癌の予防に焦点を合わせている。この研究の長期的課題は、マウス皮膚モデルにおけるトリテルペン・グリコシドがＵＶＢ誘発病変を防ぐことを実証することである。マウス実験モデルを用いたのは、このモデルがヒトの状況と非常に類似しているからである。調査では、本発明者らは本発明の上記トリテルペン化合物をアセトンに溶かしたものをＵＶＢで刺激したＳＫＨ−１無毛マウス局所的に適用することがＵＶＢによって引き起こされた皮膚病変を予防することを実証しようとしている。
【０５８８】
この調査で、ＳＫＨ−１無毛マウスに１．８ＫＪ／ｍ２の量でＵＶＢ照射を最大１５分間行って刺激を与えた。マウスは（１回あたり２ｍｇと４ｍｇの）Ｆ０３５とネガティブ・コントロール（Ｆ０６０またはアセトンだけ）を予め措置した。統計的に有意な結果を得るためには、１グループあたり最低１０匹のマウスが必要であると考えられる。各テスト化合物を照射前に１０分間、１週間３回局所的に適用し、こうした措置を６−１０週間継続した。上記化合物の予防効果を評価するためにこれらの調査は短時間行われた。ＵＶＢだけでも、上記の時間的枠組み内では目に見えるような腫瘍が見えるようになるとは思われず、皮膚の病変が起きるだけであろう。軽度の紅斑が観察できる場合もあるが、照射した翌日には消失するであろう。
【０５８９】
用いられたＵＶ装置は８つのＷｅｓｔｉｎｇｈｏｕｓｅ ＦＳ４０サンランプ、ＩＬ−１４００Ａラジオメーター／フォトメーター、そしてＳＥＬ２４０／ＵＶＢ−１ＴＤ検出装置を備えた取り付け型ＩＬ−１４０３ＵＶＢフォトセラピー用ラジオメーターを有していた。中央部分にはいくつかのチェンバーがあり、それぞれにマウスが一匹づつ収容されていた。チェンバーの内側に、マウスに照射が行われている間に適切な換気が行われるような孔が設けられている。これらのチェンバーは照射中に、各マウスがＵＶＢ光に均一に露出されるように円周方向に回転する。この装置にはドアが設けられており、このドアはＵＶＢランプが作動している間閉ざすことができ、従ってＵＶＢ光は装置内に閉じ込められる。ＵＶＢ露出の量はＵＶＢラジオメーターによって測定される。マウスのチェンバー内での滞在時間は１０−１５分間とする。
【０５９０】
この調査の目的はマウスの皮膚のＵＶＢによる障害に対する光防御効果を確認することである。ＵＶＢは細胞ＤＮＡによって直接的に吸収され、標的遺伝子内に突然変異を引き起こし、最終的には癌につながる可能性を有する病変を引き起こす。こうした病変を早期に検出すること、及びそうした病変を予防することは化学的防御効果を示す可能性がある（Ｂｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｙｏｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｓｈｉｒａｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｔａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【０５９１】
（表４３は、「ＵＶＢ照射方式」を示す。）
【表４３】
2004517131.tif 000063
【０５９２】
この調査のための治療グループは表４３に示すとおりである。グループのサイズは任意のグループにおける皮膚過形成及び皮膚炎症における変差、動物間での上皮の厚さ及び同じ年齢及び同じ成長段階の動物間における皮膚炎症の差を制御する上で十分である。皮膚の過形成及び皮膚炎症がこの研究で測定される主なパラメータである。残りの皮膚は修正ＤＮＡ塩基（８−ＯＨ−ｄＧ）及びオンコジーン発現（Ｈａ−ｒａｓオンコジーン）などその他のバイオマーカーの測定のために保存された。
【０５９３】
これらの動物は研究の全期間中、ペレット化された餌及び飲用水に対して自由にアクセスすることができた。動物は週１回、食物摂取と体重増加に関してモニタリングされた。用いられた動物は生後７週間のもので、ウイルスを有していないＳＫＨ−１無毛マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）であった。動物はＳｔａｔｖｉｅｗプログラムで作動する乱数発し得装置を用いて体重ごとに無作為に分け、１つのケージに５匹づついれて、１日１２時間光を照射し、２２℃±１．０℃の温度で保持された。
【０５９４】
データはＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ３でマッキントッシュ・ソフトウエアを用いて、力価、ｐ値、そして線形回帰（Ａｒｍｉｔａｇｅ， １９７１）に関する分析を行った。特に各薬品グループの上皮の厚さのデータ分析を力価分析で行った（Ａｒｍｉｔａｇｅ， １９７１）。
【０５９５】
実施例２３
細胞サイクル停止及びアポトーシスに関与する蛋白質の発現に対する生物学的活性を有するトリテルペンの影響
アポトーシスとは胚の成長及び組織ホメオスタシス維持中に起きるプログラムされた細胞死という自然の生理学的プロセスと定義されている。アポトーシスのプロセスはアポトーシス性細胞における一連の代謝変化に分解することができる。いくつかの規制的あるいは信号トランスダクション経路の個々の酵素的ステップを評価して、１つの細胞あるいは細胞群内でアポトーシスが起きていること、あるいは細胞死のプロセスが癌細胞内で破壊されていることを示すことができる。アポトーシスのプログラムは血漿膜における（非対称性の喪失など）変化、細胞質及び核の濃度、そしてＤＮＡのヌクレオソーム内切断などの形態学的特徴によっても観察することができる。細胞が『アポトーシス体』に劣化すると、最後に細胞死が起きる。
【０５９６】
アポトーシスに関与するいくつかの酵素的及び信号伝達プロセスを評価するための技術が多重パラメータによるアポトーシス研究のための標準的な手順として開発されている。アポトーシスの初期の段階における１つの例は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出と、それに続くカスパーゼ−３経路の活性化である（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。カスパーゼ（一連のサイトソル・プロテアーゼ）の誘発はアポトーシスで最も一貫して観察される特徴の１つである。特に、カスパーゼ−３はこのプロセスで中心的な役割を果たしている。カスパーゼが活性化されると、それらは標的蛋白質を切断し、このうちで最も重要なのはＰＡＲＰ（ヌクレアーゼ内に存在している蛋白質）である。従って、シトクロムｃの放出を検出し、カスパーゼｃの活性を検出し、さらにＰＡＲＰの劣化を検出するアッセイはアポトーシスの有効な判定因子である。
【０５９７】
さらに、悪性細胞のミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を引き起こす作用因子はプログラムされた細胞死という細胞制御の少なくとも一部を再生するための治療としての可能性を秘めていると結論付けることができる。
【０５９８】
別のアポトーシス評価はアンネキシン−Ｖ検出（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＤ）である。通常、ホスホチジルセリン（ＰＳ）は血漿膜の内側膜状に位置している。しかしながら、アポトーシスの初期の段階で、ＰＳの外化が起きる。アンネキシン−ＶはＰＳに結合してフローサイトメトリーでアンネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色で観察することができるカルシウム結合蛋白質である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。本発明で述べられているアカシア・ビクトリアエ化合物によって処理された細胞の能力はその細胞がアポトーシス中であることを示すものと受け取ることができる。
【０５９９】
その他の例で、本発明者らはＰＩ−３キナーゼ・アッセイを用いてアカシア・ビクトリアエから単離された抗癌性化合物で処理された細胞におけるアポトーシス活性の検出を行っている。細胞膜関連酵素であるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）はホスホチジルイノシトールのイノシトール環の位置３をホスホリル化することができ、従って、ＰＩ３Ｋが活性を示すこれらの細胞において新しい脂質信号経路を形成することができる。ＰＩ３Ｋが活性である場合、ＡＫＴと呼ばれるキナーゼは細胞膜にリクルートされる。ＡＫＴは細胞膜にリクルートされた後触媒的に活性化されるオンコジーンの生成物である。十分に活性化されたＡＫＴは細胞生残において中心的な役割を演じている。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路はそれによって細胞がアポトーシスを回避するメカニズムを提供する。従って、悪性細胞内でＰＩ３Ｋを抑制する手段はアポトーシスの細胞制御の少なくとも一部の側面を再生するための可能性を有する治療である。
【０６００】
実施例２４
細胞サイクル分析
細胞サイクルは標準的な方法にいくつかの修正を加えてフローシトメトリーで行われた。簡単に言うと、１ｘ１０６個の細胞を６０ｍｍ３皿に入れて、３７℃の温度下で種々の濃度のＦ０３５に露出させた。細胞をＰＢＳ内で洗浄して、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞を最初に１％パラホルムアルデヒドで肯定して、次に氷冷７０％エタノールで肯定した。これらの細胞を０．１％ＲＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍ）を含むヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で室温で３０分間染色してから、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＮ ＳＣＡＮで分析した。
【０６０１】
実施例２５
アネクシン−Ｖフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＴＴＣ）結合アッセイ
癌細胞内でのアポトーシスの誘発をアネクシン−Ｖ−ＦＩＦＴ結合アッセイで調査した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６）を種々の濃度の、トリテルペン・グリコシド（Ｆ０３５）と純粋な抽出物Ｄ１及びＧ１（０．５−２．０μｇ／ｍｌ）の混合物で３７℃の温度で１８時間処理した。ＰＢＳ内で細胞を洗浄してから、５μｌのアネクシン−Ｖ−ＦＩＴＣ接合体を含む結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ＮａＯＨ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２）（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＤ）内に再懸濁させ、暗い場所で１０分間培養した。次に、細胞をヨウ化プロピジウム（２０μｇ／μｌ）で染色して、フローサイトメトリーで分析した（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【０６０２】
実施例２６
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）アッセイ
血清枯渇化Ｊｕｒｋａｔ細胞を３７℃の温度で２μｇ／ｍｌを用いて２−１５時間、あるいはウォートマニンで０．５時間処理した。ＰＩ３キナーゼ活性をこれまでに述べられている手順（Ｗｈｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５； Ｒｏｙａｌ ａｎｄ Ｐａｒｋ， １９９５）によって判定した。ＰＩ３−キナーゼを５μｌのウサギｐ８５抗血清を用いて４℃で９０分間、１ｍｇの細胞蛋白質から免疫沈降させた。この免疫複合体を４℃で９０分間、２０％蛋白質Ａ−セファロース・ビーズ上に回収した。次に免疫沈降物を３０μｌのキナーゼ反応緩衝液（３３ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭのアデノシン、２０ｍＭ ＡＴＰ、３０ｕＣｉ［ｇ−３２Ｐ］アデノシン・トリプトファンＡＴＰ）内に再懸濁させた。ＰＩ３−キナーゼ反応は１０μｌのＰＩ懸濁液及び１０μｌのガンマＡＴＰを加えることで開始させ、室温で１０分間反応を持続させた。１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。クロロホルム：メタノール反応混合物（１：１）を用いて反応混合物から脂質を抽出させ、シリカ・ゲルＧ６０プレート上でクロロホルム：メタノール：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ（６０：４７：２：１１．３）内で薄層クロマトグラフィで分析した。放射ラベル・ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）ホスフェートをオートラジオグラフィで視覚化して、Ｓｔｏｒｍ８６０システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて抑制の程度を定量化した。
【０６０３】
実施例２７
ＡＫＴの全体的及びホスホリル化形状の分析
ＡＫＴの全体的及びホスホリル化形状の発現をウェスタン・ブロット分析で判定した。０．５％ＦＢＳを含む培養液内で培養されたＪｕｒｋａｔ細胞をＦ０３５、純粋な抽出物Ｄ１及びＧ１（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃の温度で１５時間処理した。その細胞をＡＫＴ細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ８−リン酸グリセロル、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍｌ レウペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ ｐＨ７．５）内で溶解させた。細胞蛋白質（４０μｇ）を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル内に溶解して、ニトロセルロース膜状に電気移送した。膜を最初にホスホ固有ＡＫＴ（Ｓｅｒ ４７３）あるいはＡＫＴ抗体でプローブして、次にホースラディッシュ・ペロキシダーゼに接合されたヤギ及びウサギ抗体でプローブした。化学蛍光によって蛋白質が検出された（ＥＬＣ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）。
【０６０４】
実施例２８
電気泳動性シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）
粗（Ｆ０３５）及び純粋な抽出物Ｄ１及びＧ１のＴＮＦ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）誘発ＮＦ−κＢに対する影響を調べるためにＥＭＳＡを上に述べた手順で行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を異なった濃度の粗及び純粋な抽出物で３７℃の温度下で１５時間処理した。次に、それらの細胞を１００ｐＭのＴＮＦに３７℃の温度で１５分間露出させた。核抽出物を前に述べた手順で調製した。核抽出物をヒト免疫不全ウイルス長端反復部分：
５´−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧ−３´  （配列識別番号Ｎｏ．９）
からの１６ｆｍｏｌの３２Ｐ−末端ラベル４５−ｍｅｒ二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドで、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下、３７℃で１５分間培養した。ＤＮＡタンパク質複合物が７．５％天然ポリアクリルアミドゲル上の遊離オリゴヌクレオチドから分離された。乾燥されたゲルからの放射性を帯びたバンドをＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）でＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエアを用いて視覚化、定量測定した。
【０６０５】
実施例２９
誘導可能な窒素酸化物シンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導と分析
ｉＮＯＳを研究するためにＵ−９３７及びＪｕｒｋａｔ細胞を用いた。Ｕ−９３７細胞を３７℃で７２時間ＰＭＡ（１００ｎＭ）で培養してマクロファージに分化させた。分化された細胞をＦ０３５（２μｇ／ｍｌ）で１５時間処理してからＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）でさらに４時間処理してｉＮＯＳを誘導した。Ｊｕｒｋａｔ細胞内でｉＮＯＳは０．５ｘ１０６／ｍｌ細胞をＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（１０ｍｌ）で２４時間３７℃の温度で処理して誘導した。細胞溶解物をＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０、０．５％Ｎａデオキシコレート、０．１％ＳＤＳをＰＢＳに溶かしたもの）内で凍結、解凍を繰り返すことで作成した。細胞蛋白質（２００μｇ）を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリアルニド・ゲル上に溶解して、ニトロセルロース膜上に電気泳動させ、ウサギ抗ｉＮＯＳ抗体でプローブしてから、ホースラディッシュ・ペロキシダーゼに接合されたヤギ抗ウサギ抗体でプローブした。蛋白質バンドを化学蛍光（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）で検出した。
【０６０６】
実施例３０
混合及び純粋なトリテルペン・グリコシドは腫瘍細胞障害性を誘発する
一連の癌及び非変質細胞の成長可能性に対するトリテルペン・グリコシド（Ｆ０３５）の影響を方法の箇所で述べた手順で調査した。図４２に示すように、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ−細胞白血病）細胞は０．２μｇ／ｍｌのＩＣ５０に対して高度の感作性を示した。同様に、Ｆ０３５は１．７−２．８（卵巣）、２．０−３．３（腎臓）、０．９３（膵臓）、１．２−６．５（前立腺）、そして０．７２−４．０ｍｌ（一部の乳癌）の範囲の抑制濃度ＩＣ５０で多数の癌細胞株の成長を抑制した。しかしながら、残りの乳癌細胞株はＦ０３５の細胞障害性作用に対して抵抗性を示した。図４２の最後の４つのバーは、非変質（ヒト及びマウス繊維芽細胞及び不死化乳房上皮）細胞の５０％を殺すためには２５μｇ／ｍｌ以上のＦ０３５が必要であることを示しており、これはＦ０３５が特異的に細胞障害性を示す癌細胞であることを示唆している。
【０６０７】
さらに、２つの純粋なトリテルペン・グリコシドＤ１とＧ１の５つの細胞株に対する細胞障害性に関するテストを行なった。図４３はＤ１が３つの細胞株（７６９−Ｐ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）でＦ０３５に匹敵するＩＣ５０を有していることを示している。Ｃ−２（ＨＥＹ変種）及びＪｕｒｋａｔ細胞では、Ｄ１はＦ０３５より２倍強力である。しかしながら、Ｇ１はテスト対象となったほとんどすべての細胞でＦ０３５及びＤ１よりかなり強い細胞障害性を示し、これはＧ１が抽出物Ｄ１と比較して極性が低いことが原因である可能性が推測される（図４３）。
【０６０８】
実施例３１
トリテルペン・グリコシドの混合物による細胞サイクルの停止及びアポトーシスの誘発
細胞サイクルに対するＦ０３５の影響を調べるために、癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３とＭＤＡ−ＭＢ−４３５を異なった濃度のＦ０３５で処理した。表４４はＧ１（７−１０％）での細胞の数の増加とＳフェーズ（６−１０％）での細胞の割合の減少を示しており、ＭＤＡ−ＭＤ−４５３細胞でのＧ１停止を示唆している。さらに、Ｆ０３５での後処理後、１６％のＭＤＡ−ＭＢ−４３５（別の乳癌細胞株）細胞は細胞サイクルのＳｕｂＧ０フェーズにあるように思われ（表４４）、このことはそれらの細胞はアポトーシス中であることを示唆している。この観察はさらにＴＵＮＥＬアッセイによるアポトーシス調査でも裏づけられた。
【０６０９】
（表４４は、「Ｆ０３５で処理した細胞の細胞サイクル調査」を示す。）
【表４４】
2004517131.tif 000064
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を異なった濃度のＦ０３５で３７℃で７２時間措置した。細胞サイクル分析は方法の箇所で述べたヨウ化プロピジウム染色後に行なった。
【０６１０】
Ｆ０３５が誘発する細胞致死の根底にあるメカニズムを理解するために、本発明者らはＦ０３５、Ｄ１及びＧ１で措置したＪｕｒｋａｔ細胞を用いてアネクシンＶ−ＦＩＴＣ結合アッセイを行った。表４５は１ｍｌのＦ０３５、Ｄ１及びＧ１（１５−１７％）で措置した細胞にアネクシンＶが結合することを示しており、それによって細胞死に至るアポトーシス経路が働いていることを示唆している。
【０６１１】
（表４５は、「Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞白血病）、７２時間細胞障害性アッセイ」を示す。）
【表４５】
2004517131.tif 000065
【０６１２】
実施例３２
トリテルペン・グリコシドの混合物はＰＩ３−キナーゼ活性を抑制する
Ｆ０３５の分子標的を調べるために、本発明者らはＰＩ３−キナーゼ信号伝達経路を調べた。抗ｐ８５抗体（アダプター蛋白質）プローブを用いた免疫沈降とそれに続いて行われた脂質キナーゼ・アッセイの結果は、Ｆ０３５がＪｕｒｋａｔ細胞でのＰＩ３−キナーゼ活性を抑制することを示した。図４５ＡはＦ０３５での措置から２時間後にＰＩ３−キナーゼ活性が５０−７０％抑止されることを示している。６時間後にはＰＩ３−キナーゼ活性が９２−９５％抑制され、この傾向は措置から１５時間後まで持続した。周知のＰＩ３−キナーゼ活性抑制因子であるウォートマニン［１μｌ、措置から３０分後］もＪｕｒｋａｔ細胞での酵素活性の同様の抑制効果を示した（図４５Ａ）。
【０６１３】
実施例３３
トリテルペン・グリコシド、Ｄ１及びＧ１の混合物はＡＫＴのホスホリル化を抑制する
本発明者らはＦ０３５及び純粋な抽出物のＡＫＴ、血清トレオニン・キナーゼ及びＰＩ３−キナーゼ信号伝達経路の下流効果について調べた。ＰＩ３−キナーゼ活性の急速な抑止とは対照的に、ＡＫＴホスホリル化の抑止は治療から１５時間後まで起きなかった。Ｆ０３５（２ｍｌ）によるＪｕｒｋａｔ細胞の措置はＡＫＴのホスホリル化の低下をもたらした。しかしながら、この措置は図４５Ｂに示されているように総ＡＫＴ蛋白質のレベルの低下ももたらした。発明者らは、純粋なトリテルペン・グリコシドによるＡＫＴ活性の抑制も確認した。純粋なトリテルペン・グリコシドＤ１及びＧ１（２μｇ／ｍｌ）もＡＫＴホスホリル化と総ＡＫＴ蛋白質発現を抑止した（図４５Ｂ）。ＬＹ２９４００２とウォートマニン（ＰＩ３−キナーゼ抑制因子として知られている）によるＪｕｒｋａｔ細胞の措置もＡＫＴホスホリル化を抑止した。
【０６１４】
実施例３４
トリテルペン・グリコシド、Ｄ１及びＧ１の混合物はＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢを抑制する
アポトーシス経路の媒介因子についてさらに調べるために、発明者らはアポトーシスに関与していることが示されている転写因子ＮＦ−κＢに対するＦ０３５、Ｄ１及びＧ１の影響について調べた。図４６Ａの結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｆ０３５がＮＦ−κＢのＩＢＦ依存活性化を容量に依存した形態で抑制することを示している。未措置細胞とＦ０３５だけで措置した細胞はＮＦ−κＢの活性化を示さなかった。発明者らは純粋な抽出物Ｄ１及びＧ１でも同様の結果を確認した。２ｍｌのＧ１及びＤ１で細胞を事前の措置すると、ＮＦ−κＢレベルはそれぞれ５４％及び８７％低下した（図４６Ｂ）。Ｄ１あるいはＧ１だけで措置した細胞はＮＦ−κＢの活性化を示さなかった（図４６Ｂ）。ＰＩ３−キナーゼがＮＦ−κＢを規制していることが最近分かったので、ウォートマニン（１μＭ）で細胞を予め措置することでＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢがほとんど完全に抑制された。
【０６１５】
実施例３５
Ｆ０３５によるｉＮＯＳの抑止
ｉＮＯＳの転写はＮＦ−κＢによって規制されるので、本発明者らはＦ０３５のｉＮＯＳの誘発に対する影響を調べた。マクロファージに分化したＵ−９３７細胞において、本発明者らはＬＰＳに対応したｉＮＯＳの誘発を行なった（図４６Ｃ）。これらの細胞をＦ０３５（１μｇ／ｍｌ）で予め措置すると、ｉＮＯＳの誘発は完全に阻止された。ウォートマニンもこれらの細胞におけるＬＰＳ誘発ｉＮＯＳに対して同様の効果を示した。
【０６１６】
発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｉＮＯＳの誘発に対するＦ０３５の影響についても調べた。ｉＮＯＳは方法の箇所で述べたようにＰＨＡ及びＰＭＡを用いて誘導された。これらの結果は、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦ０３５で予め措置するとｉＮＯＳの風発が阻止されることを示している（図４６Ｄ）。
【０６１７】
実施例３６
ＰＡＲＰ劣化に関する免疫ブロット分析
Ｆ０３５及びＤ１によって誘発されるアポトーシスをポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の蛋白質分解切断によって調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞（２ｘ１０６／ｍｌ）をＦ０３５（２μｇ／ｍｌ）とＤ１（２μｇ／ｍｌ）で異なった期間措置した。細胞溶解物を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、２μｇ／ｍｌレウペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５μｇ／ｍｌベンズアミジン、１ｍＴ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝剤内で調製した。細胞蛋白質（６０μｇ／ｍｌ）を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上に分離して、ニトロセルロース膜上に電気的に移動させた。膜を最初にモノクローナル抗ＰＡＲＰ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で、次にホースラディッシュ・ペロキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に接合された抗マウス抗体によってプローブした。蛋白質バンドを化学蛍光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。１１６−ｋＤａ ＰＡＲＰの８５−ｋＤａ及び４１−ｋＤａペプチド生成物への切断をアポトーシスの尺度として用いた（Ｔｅｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【０６１８】
実施例３７
カスパーゼ−３プロテアーゼに関するアッセイ
上に述べた手順（Ｅｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５）に一部修正を加えて、カスパーゼ−３活性について測定した。簡単に言うと、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）をＦ０３５、Ｄ１及びＧ１で異なった期間措置した。サイトソル抽出物を３００μｌの抽出緩衝液（１２．５ｍＭのトリス、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロル、１μＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌレウペプシン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、そして１μｇ／ｍｌアプロチニン）内で凍結、解凍を繰り返した。細胞溶解物をＩＣＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭのＤＴＴ及び２０％グリセロル）内で希釈して、２０μＭのカスパーゼ３置換基（アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリン）を用いて３７℃で培養した。蛍光性アミノメチルクマリンの生成によってカスパーゼ−３活性をモニターし、Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて励起３５５ｎＭ、放出４６０ｎＭで測定した。
【０６１９】
実施例３８
ミトコンドリアからのシトクロームＣ放出の検出
Ｆ０３５によるミトコンドリアからのシトクロームＣの放出をウエスタン・ブロッティングで検出した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０ｘ１０６）を２μｇ／ｍｌのＦ０３５で３７℃の温度下、４時間及び６時間処理した。細胞ペレットをサクロース緩衝液（０．２５Ｍサクロース、３０ｍＭトリス、ｐＨ７．７、１ｍＭ ＥＤＴＡ）内で洗浄した。上記細胞ペレットに１μＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌレイペプシン、１μｇ／ｍｌペプスタチン及び１μｇ／ｍｌアポプトシンを含む２０μｌのサクロース緩衝液を加えた。細胞はＢ乳棒（Ｋｏｕｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ ｃｏｍｐａｎｙ）で０．３ｍｌＫｏｎｔｓダウンサー内ですりつぶして破壊した。細胞蛋白質（６０μｇ）を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上で溶かして、ニトロセルロース膜上に電気的に移動させた。膜を最初にモノクローナル抗シトクロームｃ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、そして次にホースラディッシュ・ペロキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に接合された抗マウス抗体でプローブした。蛋白質バンドは化学発光で検出した（ＥＣＬ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ）。
【０６２０】
実施例３９
Ｆ０３５とＤ１はＰＡＲＰの切断を誘発する
Ｆ０３５とＤ１はＪｕｒｋａｔ細胞内で時間に依存した形態でＰＡＲＰの切断を誘発した。図４７に示す結果は、４時間でＦ０３５とＤ１の両方ともＰＡＲＰの切断を誘発し始め、６−８時間でほぼ完全な切断を引き起こす。このことはカスパーゼの役割を示唆しており、それによるアポートシスがＦ０３５とＤ１によって惹起される細胞致死に関与しているメカニズムである。
【０６２１】
実施例４０
Ｆ０３５が誘発する細胞致死に対するｚ−ｖａｄ ｆｍｋの影響
Ｆ０３５が媒介する細胞致死におけるカスパーゼの役割をさらに確認するために、本発明者らはｚ−ｖａｄ ｆｍｋ及びカスパーゼの抑制因子のＦ０３５で措置された細胞に対する影響について調べた。１００μＭのｚ−ｖａｄ ｆｍｋによってＪｕｒｋａｔ細胞を１時間３７℃の温度で事前に処理すると、ＰＡＲＰのＦ０３５誘発切断が完全に逆転された（図４８）。
【０６２２】
実施例４１
Ｆ０３５はカスパーゼ３の活性化を誘発する
発明者らが今まで手に入れた結果は、Ｆ０３５誘発アポトーシスにおけるカスパーゼの役割を強く示唆している。発明者は次に、このプロテアーゼがカスパーゼ３でＰＡＲＰのすぐ蒸留に存在しているのでＦ０３５、Ｆ０９４、Ｄ１及びＧ１で処理した細胞の活性化について調べた（図４９）。活性化はすべての場合に処理後４時間で開始され、６−８時間の範囲でピークに達し、その後低下する。
【０６２３】
実施例４２
Ｆ０３５によるミトコンドリアからのシトクロームｃの放出
シトクロームｃの放出は一部のアポトーシス経路におけるカスパーゼ３活性化の原因であると考えられている。これがＦ０３５誘発アポトーシスにもあてはまるかどうかを調べるために、本発明者らはＦ０３５で措置した細胞におけるサイトソル抽出物におけるサイトクロームｃのレベルを調べた。そして発明者らは時間に依存した形態での、これらの細胞のミトコンドリアからのシトクロームｃの放出を見出した（図５０）。発明者らはＦ０３５による措置から４時間後にシトクロームｃが放出されることを認めており、これはカスパーゼ３の活性化及びＰＡＲＰの切断が起きる時間と一致している。それがカスパーゼ３の活性化より前に起きるのかどうかを調べるためにはより早い時点でのシトクロームｃ放出について調べる必要がある。
【０６２４】
実施例４３
空気中成長システム
本発明によるトリテルペン化合物がアカシア・ビクトリアエの根と鞘に集中しているという知見に照らして、上記化合物を単離するのに適した組織を成長させる方法をつくりだすことが望まれた。こうした課題を達成するために、アカシア・ビクトリアエの根を栽培するための空気中成長システムが考案された。この空気中システムはクローズド・システムで、植物の根は宙吊りにされており、完全栄養液が噴霧される。８ｘ４ｘ３．５フィートのボックスを３／４インチ合板シートをネジ止めして作成し、ガラス繊維で被覆して、水漏れしないボックスをつくった。ボックスの上部を２枚（２ｘ８フィート）スチロフォーム・シートで覆って、１２個の円形の穴を開けたが、今後の作業のためのチェンバー・カバーには不透明な共押し出し白黒ポリエチレンで被覆されたＰＣＶ被覆養鶏用ワイアーの使用が構想されている。４．５分毎に１２秒間根に霧を噴霧するためにプログラムされた反復タイマーを用いた。
【０６２５】
空気中チェンバー用の配管システム設計はクローズド・システムで３／４インチＰＶＣで構成され、６つの回転ジェット中空円錐型ポリプロピレン・スプレイ・ノズルが取り付けられている。７２０リットルの栄養液の容器がチェンバーの底部に設けられており、外部のポンプを用いて下側から植物の根に噴霧される。用いられたポンプはＬｉｔｔｌｅ Ｇｉａｎｔ ４−ＭＤ ３２５０ ＲＰＭ， １／１２馬力ポンプであった。
【０６２６】
このポンプは４．５分毎に３０秒間の間隔をおいて噴霧を行なうようにトルクハンプクタイマーで制御されている。温度はＴａｙｌｏｒ電子屋内／屋外最小／最大温度計でモニターして、手で記録した。２つの冬季中、栄養液を加熱するために２つのＶｉｓｉ−ｔｈｅｒｍ３００Ｗ水中ヒーターを用い、それによって、Ａｒｉｚｏｎａ， Ｔｕｃｓｏｎの暖房も冷房もしない屋外施設内で周辺空気を暖房することなしに植物を活発に生育させるのに十分であった。
【０６２７】
栄養液は植物がそのライフ・サイクルを完了するのに必要なすべての基本栄養素を含んでいた。異なった植物は最適な成長のために異なったレベルと調合を必要とするが、全体的にバランスのとれた溶液で満足すべき結果が得られる。この溶液の組成を表４６に示す。
【０６２８】
（表４６は、「空気中栽培用栄養液」を示す。）
【表４６】
2004517131.tif 000066
【０６２９】
アカシア・ビクトリアエの種子を表面を傷つけて５０％ピートモスト５０％バーミキュレートで構成された無土壌混合体に撒種した。苗には１日あたり２度水を与え、オスマコートの１回分を施肥した。苗が通常の成長で３−４ヶ月で達する１５−２０ｃｍ長の範囲になった時に、球状根をよく洗浄してすべてのピートモス及びバーミキュライトを取り除く。次に根をスチロフォーム・ボードの穴を通して、苗の先端部を温室の梁から下がっている紐で上側から支える。７．０ｃｍの筒型フォーム片を苗の頂部を包んで、葉と周辺には霧がかからないようにした。そしてボックスに約３０ｃｍ３の栄養液を満たして、ポンプを作動させた。
【０６３０】
苗が所定の場所に置かれて霧がかけられると、保守作業は高さが１０ｃｍ以下になった場合に成長する苗をプラスチック・クリップで上に引き上げ栄養液を補給することに限定された。苗が温室内部で生長している間は、栄養液の温度制御は必要なかった。しかしながら、空気中ボックスが周辺環境条件に影響を受ける場合は、植物が冬期間中休眠状態に入るのを防ぐために、栄養液の温度を７０℃にすることが望ましい。
【０６３１】
根を収穫するためには、１本の植物の根のかたまりをその空気中ボックス内で水で直接洗浄して、根のかたまりをスプレイ装置の数インチ上で鋏で切断する。過剰な水はペーパー・タオルで軽くたたいて水を切ることによって除去し、その後、サンプルを計量する。そして根のかたまりを鋏で３−４インチの断片に切断して、上に述べたような化学的抽出を行う。あるいは、根を連続的に収穫するためには、ポンプを止めて、根を成長中の根のかたまりから切り離す。そしてこれらの値を３−４インチ片に切断して、上に述べたように抽出する。収穫対象でない根に損傷を及ぼさないように注意する。
【０６３２】
空気中システムで植物を成長させることで多数の利点が実現される。第１に、植物の成長が通常の栽培技術の場合と比較して約２倍の速さになる。第２に、植物に害を及ぼさずに根を簡単に収穫することができる。こうして根を切断することで、繊維状根の横方向への成長が促進される。従って、根は１年に数回は収穫することが可能になる。さらに、空気中で成長された植物は野外で栽培した植物が３−５年後に開花するのに比較して、最初の年に開花する。
【０６３３】
実施例４４
アカシア・ビクトリアエの組織培養及び発芽
種子／基質：Ｃａｍｐｕｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒ； Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ， Ｔｕｓｃｏｎ， Ａｒｉｚｏｎａで成長している植物から種子を収穫した。それらの種子を水道水で抗菌性石鹸（Ｖｉｏｎｅｘ， Ｖｉｒｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ ｄｕｒａｎｇｏ， Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を用いてよく洗浄し、その後、市販の漂白剤２０％（ｖ／ｖ）で１５分間洗浄した。純水内での洗浄を繰り返し行った後、それらを沸騰水で処理し（種子１００個あたり２００ｍｌ）、そして一昼夜かけて冷やした。そして、それらを市販の漂白剤２０％（ｖ／ｖ）で２０分間処理し、無菌純水中で２−３回すすいでから、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）及び１／２強ＭＳ培地内で培養した。この培地はＭＳビタミン、２０％（ｗ／ｖ）サクロースで補強して、０．７％寒天あるいは０．２％ゲライトを用いてゲル化させた。１つの研究で、種子を濃縮硫酸で処理して、無菌水内部で洗浄し、培地上で処理した。すべての培地を１２１℃の温度で処理した。培養物は２５＋２℃の温度で、白色非発熱蛍光灯で１０００ｌｕｘの照度で１日１６時間照射した。各研究では１８個の複製サンプルが用いられた。
【０６３４】
増殖：発芽から３週間経過した苗から得た茎頂及び節部分をＭＳ培地だけ、及び０．１ｍｇ／Ｌオーキシン（ＩＡＡ、ＮＡＡあるいはＩＢＡ）及びＢＡＰ（０．１，０．３，０．５，１．０及び１．３ｍｇ／Ｌ）をそれぞれ、あるいは組み合わせて補強したＭＳで培養した。茎頂から根を形成させるために、ＩＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）、ＩＢＡ（０．１及び０．６ｍｇ／Ｌ）及びＮＡＡ（０．１及び０．２ｍｇ／Ｌ）をテストした。土壌に移すために、培養チューブから未発育のものは取り除いて、根を水道水で洗浄して根に付着した栄養物を取り除き、そして沙漠状の土壌を満たした鉢に移した。湿度を保つために植物をマゼンタ・ボックスで覆い、霧内に低照度照明下で３週間保持した。マゼンタ・ボックスを取り除いて、植物を霧内部から移して、温室のより強い照明下に移した。
【０６３５】
カルスの導入：カルス組織を軸胚から誘導して、根の部分をｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽させた発芽３週間目の苗から取り出した。上記外植片を２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（０．５及び１ｍｇ／Ｌ）、ＩＡＡ（０．２及び１ｍｇ／Ｌ）、Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ（０．２ｍｇ／Ｌ）、Ｄｉｃａｍｂａ（０．２及び２ｍｇ／Ｌ）、ＢＡＰ（０．３ｍｇ／Ｌ）、そしてＫＮ（０．５及び３ｍｇ／Ｌ）で補強したＭＳ培地上でそれぞれ個別的、あるいは組み合わせで培養した。
【０６３６】
種子発芽：熱水で処理した種子は発芽して３−４日後には小根が発生し、１週間以内に完全な苗木が得られた。寒天（０．７％）で補強した培地より、ゲライト（０．２％）で固化させた培地での方が発芽率が高かった。最高の発芽率８８．７％はゲライトで固化させた半強ＭＳ培地で観察された。種々の培地での発芽応答を表４７に要約して示す。
【０６３７】
（表４７は、「アカシア・ビクトリアエの種子発芽」を示す。表中、（）内の数は発芽率を示す。）
【表４７】
2004517131.tif 000067
【０６３８】
３−４週間で移植可能な苗木が得られた。アカシア・ビクトリアエの種子は休眠状態にある種子の比率が高いことから一般的には発芽率が低い（Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｇａｎｇｕｌｙ， １９６５； Ｇｒｉｃｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔｏｂｙ， １９８７）。この休眠状態を克服するために、種子の皮膜に鋭利な道具で刻み目をつけるか、酸で処理して、熱水に浸し、その後一昼夜水中に放置して冷やすことが必要である。発明者らは、沸騰した水で処理し、その後０．２％ゲライトでゲル化させた１／２培地で種子を培養することで発芽率を８８．７％まで高めることができることを発見した。Ｌａｒｓｅｎ（１９６４）によれば、沸騰水で処理したｉｎ ｖｉｖｏ状態でのアカシア・ビクトリアエは発芽率を３６％まで高めることができる。前処理を行わない場合は、発芽率は１９．４％（Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｇａｎｇｕｌｙ， １９６５）であった。さらに、小根が発生するまでに１２日かかり、完全な苗木は７９日後に回収された。この手順で、発芽率は増大し（８８．７％）、そして移植可能な苗を３−４週間で得ることができた。
【０６３９】
茎頂培養：芽の増殖を調べるために、茎頂（長さ約１．０ｃｍ）をＭＳだけ、あるいはＢＡで補強したＭＳ、及びＩＡＡと組み合わせたＢＡで培養した。ＭＳだけの場合、芽は弱く、根の成長も貧弱だった（１培養体あたり１−３本）。ＢＡ（１．３ｍｇ／Ｌ）を含んだ培地では、茎頂は複数の芽（平均して１培養体あたり３．９４個）の芽を発生させた。複数の芽のうちで、１−２の芽が長くなり、４週間で８．６ｃｍの高さに達した。ＢＡとＩＡＡの組み合わせでも芽の誘発は好ましい結果を得た。これらの結果を表４８に示す。
【０６４０】
（表４８は、「アカシア・ビクトリアエの複数発芽に対する異なったレベルのＢＡ及びＩＡＡ（０．２Ｍｇ／Ｌ）の影響」を示す。表中、＊ＭＳ：データは１８サンプルの平均に標準偏差を加えたもの。）
【表４８】
2004517131.tif 000068
【０６４１】
ＢＡ濃度が高くなると（１．０及び１．３ｍｇ／Ｌ）、芽の数が増えた。ＢＡ（１ｍｇ／Ｌ）とＩＡＡ（０．２ｍｇ／Ｌ）の組み合わせは芽の成長には好ましいことが分かった。ＢＡ−ＩＡＡの組み合わせで成長させたサンプルのすべての切断端面にカルスの形成が観察された。Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）は、アカシア・カテチュー（Ａｃａｃｉａ ｃａｔｅｃｈｕ）での発芽に対するＢＡ−ＮＡＡの相乗効果と、ＮＡＡの濃度を高める（１−２ｍｇ／Ｌ）のは好ましくないことを報告している。彼らはＩＡＡが発芽及びその成長をぞ供するが、外移植片の基底からカルスが形成されることも報告している。
【０６４２】
根の発生を調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された芽を切り取って、ＩＡＡ、ＮＡＡ及びＩＢＡを含んだ培地に移した。その結果を表４９に要約して示す。テストされた処理のうちで、１／２ＭＳ＋ＮＡＡ（０．２ｍｇ／Ｌ）が根の発生にはより優れていることが分かった。ほとんど１００％の芽が根を形成した。それらの芽は４週間で９−１１ｃｍの高さに達した。アカシア・カテチュー（Ａｃａｃｉａ ｃａｔｅｃｈｕ）では、根と芽の接合点に断続的なカルスが形成されること、そして彼らはカルスを制御するためにサクロースのレベルを３％から１．５％に減少させたことを報告している。フェノリア・リモニア（Ｐｕｒｏｈｉｔ ａｎｄ Ｔａｋ． １９９２）及びアカシア・アウリクリファルミス（Ａｃａｃｉａ ａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｄａｓ， ｅｔ ａｌ，， １９９３）でも同様の結果が報告されている。本研究でも、３％サクロースでは多少のカルスが観察され、２％サクロースではその数が減少した。根を形成した芽を温室に移した。移植後の生残率は１００％であった。これらの苗木を３週間かけて霧内で順化させ、その後、苗木を通常の温室で成長させた。
【０６４３】
（表４９は、「アカシア・ビクトリアエの芽の根発生に対するＩＡＡ、ＮＡ及びＩＢＡの影響」を示す。表中、ａ：（）内の数は根形成率」を示す。）
【表４９】
2004517131.tif 000069
【０６４４】
節部分の培養：ｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽した苗から切除した節部分（子葉節）を０．１ｍｇ／ｍＬ ＩＡＡ、ＮＡＡ、あるいはＩＢＡで補強したＭＳ培地で培養した。外植片１個あたりわずか１つか２つの軸方向の芽が出ただけであった。しかしながら、これらの芽の成長は遅かった。従って、節外植片についてはそれ以上の研究は行なわれなかった。
【０６４５】
胚軸お呼び根部分からのカルスの誘発：カルスを３週目のｉｎ ｖｉｔｒｏ発芽苗から切り取った胚軸部分から誘導した。２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）、Ｔｈｉｄｉａｕｚｏｒｏｎ（０．２ｍｇ／Ｌ）、Ｄｉｃａｍａ（０．２ｍｇ／Ｌ）で形成したカルスは緑色がかっており、しっかりしまっており、硬かった。形成されたカルスの量はテストされたほとんどの濃度で中程度であった（表５３参照）。２，４−Ｄ（４ｍｇ／Ｌ）＋ＩＡＡ（１ｍｇ／Ｌ）＋ＮＡＡ（１ｍｇ／Ｌ）で補強したＭＳ培地では大量のカルスの形成が見られた。
【０６４６】
３週間目のｉｎ ｖｉｔｒｏで発芽した苗から切り取った根部分を２，４−Ｄ（１ｍｇ／Ｌ）だけ、及び２，４−ＤとＫＮ（０．５ｍｇ／Ｌ）と組み合わせたものＭＳ培地で培養したところ、やや黄色っぽい柔らかなカルスの形成が見られ、それらのカルスから少数の根が伸びた。培養体のほとんど１００％でカルス形成が認められた。白っぽく、柔らかで、砕け易い大量のカルス形成がＢＡ（０．３ｍｇ／Ｌ）＋ＩＡＡ（０．２ｍｇ／Ｌ）を加えた培地での根部分から観察された。２，４−Ｄ（４ｍｇ／Ｌ）をＩＡＡ及びＮＡＡをそれぞれ１ｍｇ／Ｌと組み合わせて補強した培地で培養された根の部分ではやや黄色味を帯びた大量のカルスが認められた。Ｔｈｉｄｉａｚｕｒｏｎ（０．２ｍｇ／Ｌ）＋Ｄｉｃａｍｂａ（０．２ｍｇ／Ｌ）及びＩＡＡ（０．１Ｔｈｉｄｉａｕｚｏｒｏｎ（０．２ｍｇ／Ｌ）、Ｄｉｃａｍａ（０．２ｍｇ／Ｌ））で補強された培地でも同様のタイプのカルスが認められた。Ｄｉｃａｍｂａ（０．２ｍｇ／Ｌ）＋ＩＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）で補強された培地で培養された根部分は淡緑色でコンパクトな硬いカルスを形成した。カルスから苗を再生しようという試みは成功しなかった。アルビッジア・レベク（Ａｌｂｉｉｚｚｉａ Ｌｅｂｂｅｃｋ）（Ｌａｋｓｈｍａｎａ Ｒａｏ ａｎｄ Ｄｅ， １９８７）及びロリセナ・ジャポニカ（Ｌｉｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）（Ｇｅｏｒｇｅ， ｅｔ ａｌ．， １９９３）などいくつかの樹木種においてカルス形成に関して外植片タイプ間に差があることが報告されている。本発明者らの研究では、同じ培地で培養された胚軸及び根から誘導したカルス間に差が認められている。ＢＡ−ＩＡＡの組み合わせで胚軸から形成されたカリは淡緑色で固くてコンパクトであるのに対して、根部分からのものは白っぽく、柔らかく、もろく、そしていくつかの組み合わせではカルスからの根分化が認められた。ダルベルギア・ラティフォリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）では、再生培地上でのカルスはコンパクトで固く、暗緑色になり、芽が分化した（Ｐｒａｄｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。本発明者らの研究では、同様のカルス形成が認められたが、発明者らはアカシア・ビクトリアエが茎頂から増殖できることを示した。不均一な苗群から検出される優れた個体の微細繁殖とそうした優れた個体の今後の研究のために保持するには標準化された技術が有益である。
【０６４７】
（表５０はアカシア・ビクトリアエの胚軸及び根部分からのカルスの形成を示す。表中、Ｍｅｄｉａ＊の（  ）の数字はｍｇ／Ｌを示す。）
【表５０】
2004517131.tif 000070
【０６４８】
実施例４５
抗癌性化合物製造のためのアカシア・ビクトリアエからの細毛根の誘発
アカシア・ビクトリアエをアグロバクテリウム・リゾジン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）で感染させると、その植物ゲノム内のＴ−ＤＮＡへの一体化及び発現につながり、そのことは細毛表現型の形成をもたらす（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。細毛根培養体は急速に成長し、傾斜屈性根の成長を示し、ホルモンを含まない培地で高度に分岐する。細毛根は高度の遺伝的安定性も示す（Ａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。多くの双子葉植物はアグロバクテリウム・リゾジンの影響を受け易く、多くの種で細毛根から植物が再生されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｙ， １９９７）。
【０６４９】
細毛根の遺伝的形質転換及び誘発が、アカシア・ビクトリアエからの活性トリテルペンを製造するための方法として本発明者らによって行なわれた。遺伝子を感染の箇所でホスト植物のゲノムに形質転換させて根を形成させる土壌細菌アグロバクテリウム・リゾジンの自然の能力が細毛根培養体をつくるために用いられている。細毛根はその急速な成長と、高度に分岐した不定根を特徴としており、ホルモンを含まない培地で成長し続ける。
【０６５０】
本発明者らはアグロバクテリウム・リゾジン系統Ｒ１０００（アグロバクテリウム・トゥメフアッセインス系統を遺伝子操作してアグロバクテリウム・リゾジン・プラスミドｐＲｉＡ４を挿入したもの、ＡＴＣＣ番号４３０５６）を用いてアカシア・ビクトリアエでの細毛根の誘発を実証した。細毛根内での問題の化合物の生成はＨＰＬＣによって確認された。細毛根の誘発は以下の手順で行なわれた。最初に、アカシア・ビクトリアエの種子をＡｒｉｚｏｎａ， Ｔｕｃｓｏｎで野外で生育された植物から回収した。その種子に沸騰水をかけて、それを一昼夜水に漬けて冷まし、表面を１５％市販漂白剤をもちいて３０分間殺菌した。無菌水内での洗浄を繰り返し行なってから、種子を２５０ｍｌの円錐形フラスコ内でＭＳビタミンと２％サクロースで補強した液体ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６２）上で５０ｍｌの培養液を用いて培養した。培養体を生育室内で旋回シェーカーに入れて光の当たらない場所で２５±２℃の温度で保持した。４日間培養した後、胚軸を発芽中の苗木から切り取ってアグロインフェクションに用いた。
【０６５１】
アグロインフェクションを行なう前に、アグロバクテリウム・リゾジン系統Ｒ１０００をＹＥＮＢ培地上で一昼夜成長させた。ＹＥＮＢ培地は７．５ｇ／Ｌイースト菌抽出物と８ｇ／ＬＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｌｏｔｈ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ）を添加してつくった。外植体の胚軸にバクテリア溶液に浸しておいた細いステンレス・スチール針で感染させた。感染後、１滴のバクテリア懸濁液（ＭＳ培地に対して１：２０）を上記外植体の表面にたらした。そして、その外植体をＭＳ培地と、共培養のためにアセトシリンゴン（１００μＭ）（３，５ジメトキシ−４ヒドロキシ−アセトフェノン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）に移した。共培養は光のあたらない場所で３日間行なわれた。共培養を３日間行なった後、上記外植体を、バクテリアの過剰成長を制御するためにＭＳ＋Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ （５００ｍｇ／Ｌ、Ａｇｒｉ−Ｂｉｏ， Ｎｏｒｔｈ Ｍｉａｍｉ， ＦＩ）に移した。感染箇所からの根の形成が観察されたが、ほとんどは３−４週間目の胚軸から発生した若い葉からのものであった。４週間後に、外植体を根と一緒にＭＳ培地に移して、細毛根を発生させるために培養を継続した。細毛根の形成はさらに８週間後に認められた。このようにして形成された細毛根を継代培養でＭＳ培地上で通常の手順で増殖させた。細毛根の形質転換性はｒｏｌ Ｂ遺伝子の一部を増幅するための一連のプライマーを用いるＰＣＲＴＭを用いて確認された。用いられたプライマーは以下のものであった。
１）  ５´ＧＡＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧ３´（配列識別番号Ｎｏ．７）
２）  ５´ＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣ３´（配列識別番号Ｎｏ．８）
【０６５２】
５０μｌＰＣＲＴＭ反応混合物はプライマー（最終濃度はそれぞれ１μｌ）、Ｔａｑポリメラーゼ（１．０Ｕ）、１２５μＭ各ｄＮＴＰ、１Ｘ ＰＣＲＴＭ反応緩衝液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、そして３００ｎｇの単離ＤＮＡを含んでいた。用いられたＰＣＲＴＭ条件は、最初の５分間の温度を９２℃とし、次に９２℃、５０秒間を３５サイクル、アニーリングのために５５℃で１分間、延長のために７２℃で１分半、そして最終的な延長のために７２℃で７分間であった。６４５ｂｐフラグメントが増幅された。
【０６５３】
液体培地内での細毛根培養体： 成長させるための条件を最適化するために、ＭＳ半固体培地上で成長している細毛根を切り取って、いろいろな溶液のフラスコ（１２５、２５０、５００及び１０００ｍＬ）内にそれぞれ２０、５０、１００、及び４００ｍＬの培養液を入れて培養した。最初の細毛根イノキュラムは６ｍｇ／Ｌであった。細毛根の成長は以下の基礎培地：ＭＳ、Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ （Ｎ ａｎｄ Ｎ） （１９６９）、Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄｔ（ＳＨ） （１９７２）、及びＷｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ （ＷＰＭ） （Ｌｌｏｙｄ ａｎｄ ＭｃＣｒｏｗｎ， １９８１）でもテストされた。細毛根の成長に対する種々の炭素源の影響をテストするために、以下のものぞれぞれの２％（ｗ／ｖ）をＭＳ培地に加えた。グルコース、フラクトース、及びマンノース。ジベレリン酸（０．１、０．５及び１ｍｇ／Ｌ）の細毛根成長に対する影響を、加圧滅菌後にＭＳ培地にろ過滅菌溶液を加えることでテストした。
【０６５４】
感染箇所での根の開始が３−４週間後に認められた。アセトシリンゴン（１００μＭ）の存在下でＲ１０００で感染した胚軸から４つの独立に形質転換された細毛根が確立された。アセトシリンゴンなしでアグロバクテリウム・リゴジーンで共培養された胚軸は細毛根を形成しなかった。アセトシリンゴンの存在下で３日間共培養するのが細毛根誘発には最適であることが確認された。アセトシリンゴンの促進効果はサルビア・ミリチチオリザ（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｉｔｉｏｒｒｈｉｚａ）でも報告されている（ＨＵ ａｎｄ Ａｌｆｅｒｍａｎｎ， １９９３）。これらの結果は、アグロバクテリウムのｖｉｒ遺伝子の活性因子であるアセトシリンゴンが形質転換頻度を増大させていることを示した。同様に、この研究でも、細毛根を誘発するためにアセトシリンゴンが必要であった。
【０６５５】
それらの根の形質転換性はｒｏｌ Ｂ遺伝子の一部を増幅するために一連のプライマーを用いるＰＣＲＴＭで確認された。テストされた４つの細毛根クローンで６４５ｂｐの診断用フラグメントが増幅された。
【０６５６】
液体培地で育成された細毛根は活発に成長した。テストされた種々の基礎培地の中で、ＭＳ培地が細毛根成長には最適であることが分かった。１２５ｍＬフラスコでは４週間で２６８倍の成長が認められた。ＷＰＭとＮ及びＮ培地を用いた場合、それぞれ２５４倍と１９６倍の成長が認められた。Ｂ５及びＳＭ培地は細毛根の生育には最適な条件ではなかった。これら２つの培地では細毛根は根の発生が遅かった。１つの研究で、細毛根をことなった容積のフラスコ（１２５、２５０、５００及び１０００ｍＬ）内で、２０、５０、１００及び４００ｍＬの培地を用いて成長させた。成長動態を表５３に要約して示す。最初、細毛根の成長は活発で、開始時のイノキュラムを１５０ｍｇとして１２５ｍＬフラスコ内で４週間で２５．７７倍の成長を示した。フラスコの容積を大きくすると、根の成長速度はやや低下した。
【０６５７】
細毛根の成長は培地の組成、特に鉱物及び炭素源の影響を受け易い（Ｗｙｓｏｋｉｎｓｋａ ａｎｄ Ｃｈｍｉｅｌ， １９９７）。アカシア・ビクトリアエの場合、５つの異なった基礎培地（ＭＳ、ＮとＮ、ＳＨ、ＷＰＭ及びＢ５）が細毛根成長に対する影響に関して調べられた。ＭＳ培地が成長には最適であることが認められた。Ｓａｓａｋｉら（１９９８）は種々の栄養培地でＣｏｌｅｕｓ ｆｏｒｋｏｈｌｉｉの成長を比較して、細毛根の成長にはＷＰＭが最適であることを見出した。
【０６５８】
この研究で、サクロースが他の炭素源（フルクトース、グルコース、及びマンノース）と比較して細毛根成長にとって好結果をもたらすことが分かった。サクロースを含む培地で最大の成長率（２４．５２倍の増大）が認められた。カタランタス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）の場合、培地内での炭素源としてフルクトースを用いることでカタランチンの生成を倍化することができた。しかしながら、この著者らはフルクトースの使用がサクロースを使用した場合と比較して４０％の低下をもたらしたことを報告している（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０６５９】
Ｒｉプラスミド内にオーキシンに対する感受性を増大させる遺伝子が存在しているので、成長を持続させるために外部からの成長調節剤を加える必要性はない（Ｗｙｓｏｋｉｎｓｋａ ａｎｄ Ｃｈｍｉｅｌ， １９９７）。しかしながら、外来ホルモンが成長を刺激することを示唆する報告も存在する。発明者らは細毛根成長に対するジベレリン酸（０．１、０．５及び１．０ｍｇ／Ｌ）の影響についてテストを行なった。ＧＡ３を含有している培地と比較して、それを含まない培地が細毛根の成長には最も良かった（１５．７７倍の増加）。ＧＡ３のレベルを変えてもその成長に対する大きな影響は認められなかった（表５５）。アルテミシア（ヨモギ科）においては、ＧＡ３はバイオマスの全体的な蓄積を増強することにはつながらなかったが、ＧＡ３なしの培地で成長された培養体と比較して静止期にはより早く到達した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）は、ブラシカ・カンジダ（アブラナ科）の細毛根の反応は検査したクローンに大幅に依存していることが分かった。しかしながら、彼らの観察によれば、一般的に、ＧＡ３は成長と生産の変化に伴うアルカロイド類の蓄積の低減にポジティブな影響を及ぼした。Ｏｈｋａｗａら（１９８９）は、１０ｎｇ／Ｌと１ｍｇ／Ｌの濃度のＧＡ３がダツラ・イノキシア（チョウセン朝顔）の細毛根の伸びと横方向への分岐を促進することを報告している。Ｚｏｂｅｌ （１９９８）は、ＧＡ３が根の成長に対してはＣＯ２と同様の作用を示すことを示唆した。アカシア・ビクトリアエの細毛根の場合、ＧＡ３は成長を促進せず、これは種々の遺伝子型に対してＧＡ３が異なった反応を示す可能性を示唆している。
【０６６０】
アカシア・ビクトリアエの細毛根培養体の利用は本発明のトリテルペン・グリコシドソブを抽出するための植物組織の均一な培体を得るための適切な手段を提供する可能性があり、それには単離された混合物あるいは個々の精製された化合物を得る可能性も含まれている。
【０６６１】
（表５１は、細毛根生産のためのアカシア・ビクトリアエの胚軸のアグロバクテリウム・リゾジーン系統Ｒ１０００による感染を示す。＊：共培養のためＭＳ培地で加圧殺菌後にアセトシリンゴン（１００μｍ）を添加、ａ：（ ）内の数字は割合）
【表５１】
2004517131.tif 000071
【０６６２】
（表５２は、アカシア・ビクトリアエの細毛根の成長に対する種々のフラスコ・サイズの影響を示す。ａ：データは、１２５，２５０、５００及び１０００ｍｌ容積のフラスコ、２５，１００及び４００ｍｌＭＳ培地を用いた場合の６回のテスｔの平均値±Ｓ．Ｅを示す。）
【表５２】
2004517131.tif 000072
【０６６３】
（表５３は、アカシア・ビクトリアエの細毛根の成長に対する種々の基礎培地及びフラスコ・サイズの影響を示す。）
【表５３】
2004517131.tif 000073
【０６６４】
（表５４は、アカシア・ビクトリアエの細毛根の成長に対するＭＳ培地内の種々の炭素源に対する影響を示す。）
【表５４】
2004517131.tif 000074
【０６６５】
（表５５は、アカシア・ビクトリアエの細毛根の成長に対するＧＡ３の影響を示す。）
【表５５】
2004517131.tif 000075
【０６６６】
細毛根の成長に関して種々の培地をテストした。最良の成長は２％サクロースを含む培地上で得られた。細毛根の成長に対する種々のフラスコ・サイズ及びジベレリン酸の影響についても調べた。１２５ｍＬの円錐型フラスコに２０ｍｌの培養液を入れて旋回シェーカー内に置き、細毛根をＭＳ液体培地でも成長させた。４週間で８４倍の増加率が認められた。Ｆ０３５内で識別されたものに対応するトリテルペン・サポニンの生成が標準的な真正サンプルを用いてＨＰＬＣ分析で確認された。
【０６６７】
実施例４６
細胞核転座の抑制とＤＮＡとの結合による、モノルテルペン組成物によるＮＦ−κＢの活性化の抑制
モノテルペン・グリコシドにより誘発される発癌抑制において、核転写因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の役割を特定するために、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を誘発するＪｕｒｋａｔ細胞内のＮＦ−κＢの活性化におけるＦ０３５およびモノテルペン・グリコシドの効果を分析した。ＮＦ−κＢは炎症に対する主な調整剤の一つであり、炎症に関連する幾つかの遺伝子の転写を抑制する。
【０６６８】
フリー・ラジカルが原因のＤＮＡの損傷は、Ｆ０３５での処置に応じて減少することが発見された。このことはＦ０３５に酸化防止機能があることを示すものである。この発見は、モノテルペン・グリコシド処理された細胞のミトコンドリアにおいて、反応性酸素種（ＲＯＳ）のレベルが減少することを示した先行研究の研究内容と相関がとれるものである。ＲＯＳレベルの上昇は、ＮＦ−κＢの活性化を促す幾つかの要因ひとつである。従って、本発明の一つの実施形態では、必要に応じて、本発明による化合物を投与するにより、ミトコンドリアを酸化的ストレスから保護することに関係がある。
【０６６９】
方法
細胞培養
１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、と０．０５％のゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０媒体において、ＪｕｋａｔおよびＲＡＷ ２６４．７細胞を培養した。
【０６７０】
モノテルペン・グリコシドによる細胞の処理
１０６／ｍｌ の大きさのＪｕｒｋａｔ細胞を一つ、完全培地に入れ、２μｇ／ｍｌのＦ０９４、モノテルペン／トリテルペン・グリコシド  Ｄ１， またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシド  Ｇ１により８−１６時間、３７℃にて処理した。本処理の最後に、細胞を完全培地内で洗浄し、その数を数えた。生存細胞と同じ数を別の実験で使用した。
【０６７１】
細胞と細胞核エキスの調製
Ｆ９０４または単離したモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１ および／またはＤ１で処理したＪｕｒｋａｔ細胞（２ｘ１０６／ｍｌ ）をＴＮＦ（１ｎＭ で１５ｆ分）に３７℃でさらした。この細胞をコールドＰＢＳで洗浄し、０．４ｍｌの細胞エキス緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．９， １０ ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１ ｍＭ ＥＧＴＡ， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．５ ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）２μｇ／ｍｌ のロイペプチン、２μｇ／ｍｌ のアプロチニン、０．５μｇ／ｍｌ のベンズアミジン）で１５分冷蔵庫でけんだくした。最後に１２．５μｌの１０％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０）をこの細胞に加えで溶解し、この細胞エキスを遠心分離法で採取した。次に、２５μｌの冷却細胞エキス緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．９， ０．４ Ｍ ＮａＣｌ， １ ｍＭ ＥＤＴＡ， １ ｍＭ ＥＧＴＡ， １ｍＭ ＤＴＴ， １ ｍＭ ＰＭＳＦ， ２μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌ のアプロチニン、０．５μｇ／ｍｌ のベンズアミジン）をこの細胞核ペレットに加え、冷蔵庫で３０分培養した。この細胞核エキスを遠心分離法で４℃、５分間で採取した。
【０６７２】
電気泳動度変動アッセイ（ＥＭＳＡｓ）
４μｇの細胞核エキスをＨＩＶの長い末端反復
５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’
（下線部はＮＦ−κＢ結合部位）から１６ ｆｍｏｌの３２Ｐ末端ラベルされた４５−ｍｅｒの二重鎖構造のＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドとともに３７℃で１５分間培養した。この培養混合物には３μｇのｐｏｌｙ （ｄＩ：ｄＣ）が結合緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．９， ０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５ｍＭ ＤＴＴ， １％ ＮＰ−４０，５％ グリセロール， ５０ｍＭ ＮａＣｌ）に含まれている。このＤＮＡたんぱく質合成物を７．５％のポリアクリルアミド・ゲル上で遊離したオリゴヌクレオチドから分離した。ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合の特異性は二本鎖のオリゴヌクレオチド、ラベルされていないオリゴヌクレオチドとの比較、および抗Ｐ６５抗体により帯域が移動により、調査した。乾燥ゲルからの放射能帯域はＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）により可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅにて軽量した。
【０６７３】
ウエスタン・ブロット分析
モノテルペン／トリテルペン・グリコシド Ｇ１で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞および細胞核のエキスを用いて、ＩκＢの分解と、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの細胞核転座についてそれぞれ調査した。そのとき、５０μｇの細胞または細胞核のたんぱく質を９％のポリアクリルアシド・ゲル上で分解し、ニトロセルロース膜上で電気泳動させた。この膜はウサギ抗−ＩκＢα，または、ウサギ抗−ｐ６５抗体により精査され（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、また後に、ホースラディシュ・ペルオキシターゼ（ＨＲＰＯ）に結合した抗ウサギ抗体によっても精査された。たんぱく質帯域は化学発光により検出された。（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）
【０６７４】
ルシフェラーゼ活性のトランスフェクション及びアッセイ
エレクトロポーレーションによりＰＧＬ３−ＮＦ−κＢをＪｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクションした。それから、この細胞をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１ （１μｇ／ｍｌ）で１６時間処理した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ），ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ），またはＴＮＦ（１ｎＭ）を用いてＮＦ−κＢに放射能を与えた。ルシフェラーゼの働きをルシフェラーゼ・アッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、この製造者の指示に従って測定した。
【０６７５】
ｉＮＯＳとＣＯＸ−２の誘導と測定
ＲＡＷ２６４．７細胞（０．５ｘ１０６／ｍｌ）を１００ｍｍの皿で培養しＦ０９４またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシド（２μｇ／ｍｌ）で１６時間処理した。次に、この細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに２４ｈ時間さらした。細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．４， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ０．５％ ＮＰ−４０， １０μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、および１００μＭのＰＭＳＦを含む緩衝液で分解した。７０μｇの細胞たんぱく質を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲルに取り込み、ニトロセルロース膜上で電気泳動させた。ｉＮＯＳとＣＯＸ−２のレベルを、それぞれ、ウサギ抗ｉＮＯＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とヤギ抗ＣＯＸ−２抗体を用いて、ウエスタン・ブロット法により分析した。
【０６７６】
結果
トリテペノイド・サポニンやトリテルペン・グリコシドＧ１といったモノテルペン・グリコシドの混合物は、時間と分量に比例してＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢを抑制する。電気泳動による移動量の変化を観察するアッセイを利用して、Ｆ０３５とモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１のＪｕｒｋａｔ細胞にＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢへの時間による効果について、図５１Ａに示される様に実証された。両方の場合とも、最大の抑制効果は１６時間の後処理時に見られた。Ｆ０３５またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１のみで、異なった時間処理した細胞については、これらの細胞においてＮＦ−κＢが基底レベルまで達しなかった。（図５１Ａ）先の実施例においては、混合物または純粋のモノテルペン／トリテルペン・サポニンにより誘導されるアポトーシスを引き起こすさまざまなプロセスは、早ければ３０分から２時間の後処理時で起きている。細胞のアポトーシスが、観測されるＮＦ−κＢ活性化の減少の原因ではないことを確かめるために、処理の最終段階で細胞数を数えた。そして生存細胞の同数を抜き取り、ＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢの活性化を調査した。同時に、広範囲な細胞が浸透できる、不可逆性の抑制剤のカスパスであるｚＶＡＤ−ｆｍｋの処理では、活性化したＮＦ−κＢレベルの抑制には影響がなかった。従って、この抑制作用はカルパスの働きには依存しなかった。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はモノテルペン／トリテルペノイド・サポニンの混合物よりもより効果があることを発見した。
【０６７７】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により１６時間処理すると、分量に比例してＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢの活性化が抑制された。０．５μｇ／ｍｌのモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により１６時間処理されたＪｕｒｋａｔ細胞では、ＴＨＦを誘導するＮＦ−κＢがほぼ５０％減少し、２μｇ／ｍｌで処理されたＪｕｒｋａｔ細胞でほとんど完全な抑制が見られた。（図５２Ａ）モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はそれ自身では、これら細胞内でのＮＦ−κＢの構成レベルには影響を与えなかった。効果の少ない範囲はラベルされていないオリゴヌクレオチドの示す範囲と同じ範囲であり、抗ｐ６５抗体によりシフトしたものであった。双方とも、ＮＦ−κＢの範囲の特異性を示している。
【０６７８】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はＩκＢの分解を抑制しないが、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの細胞核転座を抑制する。ＮＦ−κＢの活性化には２つの重要なステップが含まれる。すなわち、（１）抑制するＩκＢサブユニットの放出、と（２）活性化したＮＦ−κＢの細胞核の転座、である。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１のこれらのいずれか、もしくは、両方のステップにおける効果を明らかにするために、未処理の、および、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により処理されたＪｕｒｋａｔ細胞を、ＴＮＦにさまざまな時間さらした。ＩκＢ分解する反応速度を、細胞質のエキスをウエスタン・ブロット分析により調べた。図５３Ａに示す様に、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により処理された後のＩκＢ分解のパターンには違いが見られなかった。未処理の、および、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１（図５３Ｂ）により処理された細胞核エキスにあるＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットがある場合には、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の処理によりｐ６５サブユニットの細胞核転座のスピードがかなり落ちることが示される。この範囲での密度分析では、細胞核へ転座するｐ６５の総量は、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の処理の後は減少する。
【０６７９】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧはＮＦ−κＢ−ＤＮＡ結合を抑制する。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１は、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットが細胞核転座することを完全には阻止しなかったので、本発明者は、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１がＮＦ−κＢの活性化に２つ以上の方法で影響している可能性を検討した。すなわち、本発明者は、無細胞系にて、活性のＮＦ−κＢがＤＮＡと結合する能力に関してのモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果を分析した。ＴＮＦが刺激されている細胞の細胞核エキスを、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１をより一層濃縮したなかで培養した。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１が、その分量に比例してＮＦ−κＢがＤＮＡと結合することを抑制した。デオキシュール酸塩（ＤＯＣ）はＮＦ−κＢをＩκＢから分離することで知られており、したがって、活発な細胞核の状態において利用可能とできる。ＤＯＣ（０．８％）で処理した場合、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で処理した細胞の細胞質エキスは、未処理の細胞のエキスと比較して、ＤＮＡ結合の減少が見られた（図５４Ｂ）。ＩκＢαの分離は影響されないために、これらの結果は、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１がＮＦ−κＢがＤＮＡと結合しないようにＮＦ−κＢを変化させることを示す。
【０６８０】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ（２μｇ／ｍｌで８時間）の処理に先立ち、１００ｍＭのＤＴＴで２時間処理したＪｕｒｋａｔ細胞について、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の作用にシステイン残留物上の遊離型のメルカプト基の不可逆性アルキル化が含まれたかの検査した。図５４Ｃに示す様にＤＴＴはＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢの活性化には変化を与えなかった、その代わりに、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の作用を反対にした。これらの結果から、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢの活性化に必要で、重要なメルカプト基グループに影響を与えることにより、その働きを取り持っている。
【０６８１】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はＮＦ−κＢ に依存する遺伝子の発現を抑制する。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はＮＦ−κＢに依存する遺伝子の発現の効果を測定するために、ルシフェラーゼ・レポータ遺伝子のｐＧＬ３を、これに結合しているＩＬ−２プロモータのＮＦ−κＢ分子とともに使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に一時的にｐＧＬ３− ＮＦ−κＢで核酸を入れ、ＬＰＳ，ＰＭＡ，またはＴＮＦで処理を行い、ルシフェラーゼの働きを誘発した。この核酸を入れられた細胞にＦ０９４またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により前処理を行ったものでは他の物質に誘発されるルシフェラーゼの働きが抑制された（図５５Ａ）。
【０６８２】
ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の誘導に関してのＦ０９４およびモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果、およびＮＦ−κＢによって調整される発現についても分析した。ＬＰＳ処理に反応して、相当なレベルのｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２がＲＡＷ２６４．７で誘導された。Ｆ０９４またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１により前処理を行った細胞では、ＬＰＳで誘導されたｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のレベルが明確に減少した（図５５Ｂ）。
【０６８３】
検討
癌の予見という主要な課題の一つに、正常な細胞や組織に対してほとんど、あるいは、まったく影響を与えない新薬の開発がある。発癌には複数のステップがあり、また炎症は発癌に不可欠な構成要素である（Ｓｐｏｒｎら、１９８６、Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９４）。発癌に関係する炎症のメカニズムについては幅広く研究がなされており、新しい化学療法の薬品を開発するための基礎として、これらのメカニズムを利用する試みがなされている。トリテペノイドの抗炎症効果については以前に報告されている（Ｓｉｎｇｈら，１９９２，Ｄ’ａｒｃｙら，１９５７，Ｋｉｍら）。マウスによる皮膚発癌の研究（実施例１１に記載）ではＦ０３５に抗炎症性が見られたので、炎症の調整物質であるＮＦ−κＢ上のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドを分析した。
【０６８４】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドの混合物や純粋な物質とも、ＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢへの強力な抑制剤であることがここで示される。Ｊｕｒｋａｔ細胞をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドで処理を行うと、ＩκＢの分解には影響が出ない一方で、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット転座が非常に緩やかとなる結果をもらたす。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合アッセイを用いて検証された様に、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合を弱める。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で処理された細胞の細胞質では、ＮＦ−κＢを誘導できるデオキシコール酸塩のレベルが低くなる。細胞にジチオスレイトール（ＤＤＴ）で処理を行うと、ＮＦ−κＢ活性化に重要なメルカプト基に影響があることが示され、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で誘導されるＮＦ−κＢの働きへの抑制機能が完全に無効となる。Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＮＦ−κＢにより調整される幾つかの遺伝子の発現に関する研究によると、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１での処理により、ルシフェラーゼの活動レベルがＬＰＳが誘導する一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）やシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）と同様に減少する。ＮＦ−κＢにより調整される炎症経路に関与する遺伝子の発現を減少させることと同様に、ＮＦ−κＢの活性化を効果的に抑制できることで、ｉｎ ｖｉｖｏでのモノテルペン／トリテルペン・グリコシドの抗炎症効果が説明される。
【０６８５】
ＮＦ−κＢは、免疫反応、炎症、およびインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および接着分子等の感染に関与する幾つかの遺伝子の発現の誘導に重要である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．ら，１９９７ａ，１９９７ｂ，１９９４）。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＦ０３５，Ｆ０９４， モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＤ１，およびモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はいずれもＪｕｒｋａｔ細胞でＴＮＦを誘導するＮＦ−κＢ活性化の強力な抑制剤であることがわかった。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１によるＮＦ−κＢの抑制レベルは処理量および処理時間の両方に比例する。広範囲におよぶＮＦ−κＢの効果は抑制物質と併用活性化物質の複雑なネットワークの規制下で発揮される。炎症性のサイトカイン、マイトジュン、細菌性の製品、酸化力のあるストレスによるＮＦ−κＢの活性化には、細胞質内のＮＦ−κＢを複合した休止状態に保持するＩκＢαの分解が必要である。ＩκＢαの分解に続き、ＮＦ−κＢは錯体から開放され、細胞核へ転座し、そこでＤＮＡと結合し、他の遺伝子を活性化する。本発明者は、本発明のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドがＩκＢαの分解に影響を与えない一方で、ＮＦ−κＢが細胞核へ転座するのを抑制することを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ結合の研究では、本発明のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドもまた、ＮＦ−κＢがＤＮＡへ結合するのを抑制することを示している。さらに、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１はｉｎ ｖｉｔｒｏでデキシコール酸塩が誘導するＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を抑制した。この発見はＮＦ−κＢが錯体から分離しないこと、もしくは、そのＤＮＡ結合の特性が変化したことのいずれかを示す。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドに依存するＮＦ−κＢへの抑制は、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドがＮＦ−κＢの活性化に必要な１つ以上のメルカプト基を変化させることを示して、ＤＴＴにより無効とされる。
【０６８６】
炎症でその役割を持つＮＦ−κＢが調整する幾つかのたんぱく質の中でも、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２は頻繁に研究されてきた。これら両方の酵素ともさまざまなサイトカイン（例えばインターフォロン−γ）、マイトジュン、または微生物製品（例えばリポ多糖体）に反応して誘導される。これらは炎症反応、怪我の回復、発癌に不可欠な成分を形成する。（Ｍｏｎｃａら，１９９１，Ａｎｇｇａｒｄら，１９９４，Ｓｅｉｂｅｒｔら，１９９４）ＣＯＸ−２は、その脈管形成の刺激を通して発癌プロモータとして働く能力故に特定の結腸癌の成長における役割を演ずる。ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２の過度の発現が例えば結腸癌（Ｏｓｈｉｍａら１９９４、＆Ｔａｋａｈａｓｈｉら１９９７）、多発性硬化（Ｈｏｏｐｅｒら，１９９７）、パーキンソン病（Ｈａｎｔｒａｙｅら，１９９６）、アルツハイマー病（Ｇｏｏｄｗｉｎら，１９９５）といった幾つかの慢性疾患の原因にかかわっていることが見られた。これらの酵素を誘導できる構造を抑制しつつ、構造上これと等しい構造には影響を与えない物質が活発に捜し求められている。ここに示されている様に、ＲＡＷ２６４．７細胞をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で処理することにより、ＬＰＳを誘導するｉＮＯＳやＣＯＸ−２のレベルの劇的な減少が見られた。
【０６８７】
従って、本発明者は、ここに、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドは抗炎症性であることを実証する。また、これらは、ＴＮＦまたはＬＰＳなどの炎症性促進剤に反応して、ＮＦ−κＢの活性化、および、炎症のプロセスにおいて重要なプレーヤーであるｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現をはっきりと抑制する。これらが腫瘍細胞でのアポトーシスを誘導する能力とあいまって、この抑制の働きは、たとえば、癌、および／または、その他の炎症性の成分を伴う病気などの病気に対して本発明のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドを含む治療用物資を提供する。
【０６８８】
実施例４７
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドはミトコンドリアの摂動によりアポトーシスを誘導する
ここでは、モノテルペン／トリテルペン・グリコシド混合物を精製によって、キノボーゼ糖により結合した２つの非環式のモノテルペンを持つアカシア酸核を含む生物学的に純粋な成分とすることが述べられている。２つの活性モノテルペン／トリテルペノイド・サポニンの精製と構造体は、アビシンＤとアビシンＧ（Ａｃａｃｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａｅ トリテルペノイド・サポニン）と呼ばれるＦ０９４を形成する。これらの作用物質が抑制する潜在的な腫瘍細胞の増殖のメカニズムを分析すると、ミトコンドリアが、アビシンの持つアポトーシスを促進させる機能を測るには一番のｎ分析対象であることが示されている。
【０６８９】
方法
アビシンの精製
Ａｃａｃｉａ Ｖｉｃｔｏｒｉａｅの地莢を２０％のＭｅＯＨ ６０℃で抽出した。溶媒／このエキスを分離する溶媒により、イオン化した留分（Ｆ０９４）における対生物作用活性を濃縮した。アセトニトリルと酸性化水変化度溶離プログラムを利用したＣ−１８逆相ＭｅｔａＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｓｉｌ分留管（３μ，４．６ｘ１５０ｍｍ）によりこの留分（ＦＩＧ．．５６Ａ）のＨＰＬＣ分析すると、非常に複雑な化合物の混合体であることが示された。Ｃ−１８逆相のある程度予備的なＨＰＬＣ分留管とそれに続くバイオアッセイによるこのエキスの最初のサブ分留によると、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＤ１とＧ１の周囲にそのほとんどの活動が集中していることが示された。これらの化合物の分離は、水溶性メタノール溶媒システムを採用したペンタフィロフェニル分留管（５０ｘ２５０ｍｍ，１０μｍ， ＥＳ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）を使用した２つのステップからなる分離用ＨＰＬＣで実行した。
【０６９０】
細胞の培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％のウシ脂仔血清、２ｍＭのグルタミンと０．０５％ゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０溶剤で増殖した。これらの処理のそれぞれで、細胞を１ｘ１０６／ｍｌ採取した。
【０６９１】
増殖抑制アッセイ
Ｆ０９４とアビシンの持つ増殖抑制働きをＭＭＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム・ブロマイド］還元アッセイ（Ｄｅｎｇら，１９９９）にて評価した。細胞（１ｘ１０４／ｗｅｌｌ）をＦ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧの幾つかの濃度の９６個の適当なプレートで７２時間３７℃で培養した。この細胞をＭＭＴで２時間着色して、溶解緩衝液（５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒド中での２０％のナトリウム・ドデシル硫酸塩）でさらに６時間培養した。細胞の生死判定には５７０ｎｍの光学濃度を使用した。
【０６９２】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合アッセイ
アポトーシスを誘導についてはアネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合アッセイで調査した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４，アビシンＤ、又はアビシンＧを３７℃で処理した。この細胞を冷却ＰＢＳにて洗浄後、結合緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ， １４０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＣａＣｌ２）で懸濁した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合体（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を（１μｇ／ｍｌ）加え、暗室にて室温で１５分培養した。その後、細胞をプロピジウムヨウ化物（５μｇ／ｍｌ）で着色し、フロー・サイトメトリにて分析した。（Ｈａｎｓｅｎら， １９８９）
【０６９３】
ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出の検出
ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出をウエスタン・ボルト分析にて検出した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０７）をＦ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧ（２μｇ／ｍｌ）にて３７℃で処理した。サッカロース緩衝液（０．２５Ｍサッカロース，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．７， １ｍＭ ＥＤＴＡ）でこの細胞ペレットを洗浄してから、１μＭ ＰＭＳＦ， １μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、および、１μｇ／ｍｌ アプロチニンを含む２０μｌのサッカロース緩衝液内で懸濁した。０．３ｍ Ｋｏｎｔｅｓ ｄｏｕｎｃｅｒ （Ｋｏｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ 社， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＪ）にて細胞を１２０回Ｂ乳棒を用いてｄｏｕｎｃｉｎｇして分裂させた。細胞たんぱく質（５０μｇ）を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上で分解し、ニトロセルロース膜上で電気泳動させた。この膜を単クローン性抗シトロームｃ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で、続いて、ホースラディッシュ・ペルオキシターゼ（ＨＲＰＯ）と結合している抗ネズミ抗体にて精査した。たんぱく質帯域を化学発光（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。
【０６９４】
亜ミトコンドリア留分の分離
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１．５−２．０ｘ１０７）を１ｍｌサッカロース緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４に２５０ｍＭサッカロースを添加）で懸濁し、Ｎ２キャビテーション室（ＰＡＲＲ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｌｉｎｅｍ ＩＬ）の内部へ移した。製造者マニュアルの指示に従って、この細胞をＮ２キャビテーション（３００ｐｓｉ，５分）した。これらの条件下では、ほとんどの細胞膜が破壊されたが、ミトコンドリアの呼吸活動には変化がなかった。次に、遠心分離法（１５００ｇ， ３０秒）にて、ＤＮＡと細胞核の留分を分離した。この上清をさらに遠心分離し（１６０００ｇ， １０分）、そのパレットを亜ミトコンドリア分留として使用した。
【０６９５】
カスパーゼ−３・プロテアーゼのアッセイ
カスパーゼ−３の働きを先行する方法（Ｍａｒｔｉｎら，１９９５）にいくつかの変更を加えて評価した。簡単に述べると、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６）をＦ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧ（２μｇ／ｍｌ）にて３７℃で処理した。この細胞を３００μｌの抽出緩衝液（１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．０， １ｍＭ ＤＤＴ， ０．１２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ５％グリセロール、１μＭ ＰＭＳＦ， １μｇ／ｍｌロイペプチン， １μｇ／ｍｌペプスタチン，１μｇ／ｍｌアプロチニン）に入れ、凍結、解凍を繰り返して細胞質ゾルのエキスを調整した。細胞溶解物をＩＣＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．０， ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ＤＤＴ， ４ｍＭ ＤＤＴ，および ２０％グリセロール）で１：２に希釈し、２０μＭのカスパーゼ−３培養基（アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリン）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にて３７℃で培養した。カスパーゼ−３の働きは蛍光性のアミノメチルクマリンを、３５５ｎｍの励起と４６０ｎＭの放射をＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）によって測定することでモニターした。
【０６９６】
ＰＡＲＰの分解を免疫ブロット分析
アポトーシスの誘導もＰＡＲＰ（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎとＴｈｏｒｍｂｅｒｒｙ， １９９７）のたんぱく質分解の卵割により検証した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（３ｘ１０６）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧにて３７℃で処理した。細胞溶解物を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ２５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１％ ＮＰ−４０， ２μｇ／ｍｌロイペプチン，２μｇ／ｍｌアプロチニン，０．５μｇ／ｍｌ ベンズアミジン， １ｍＭ ＤＴＴ，および， １ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液で調整した。細胞たんぱく質（６０μｇ／ｍｌ）を７．５％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上に分離し、ニトロセルロース膜上で電気泳動した。この膜をまず単クローン性抗ＰＡＲＰ抗体（ファーミンゲン）で、続いてホースラディッシュ・ペルオキシターゼ（ＨＲＰＯ）と結合している抗ネズミ抗体にて精査した。たんぱく質バンドを化学発光（ＥＣＬ）で検出した。アポトーシス評価用に８５ｋＤａの卵割生成物質の外観を使用した。
【０６９７】
ミトコンドリア膜ポテンシャル（Δψｍ）の評価
ミトコンドリアのΔψｍをＺａｍｚａｍｉら， １９９５の方法で評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦ９０４、アビシンＤ、または、アビシンＧ（２μｇ／ｍｌ）にて３７℃で処理した後、８０ｎＭのＤｉＯＣ６を加えて１５分間、室温で培養した。その後、これを細胞蛍光光度計（Ｆａｃｓｃａｌｉｂａｒ，励起４８８ｎｍ，放射５５２ｎｍ）上で分析した。
【０６９８】
反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成のアッセイ
ＲＯＳの生成を酸素反応性蛍光染料５，６−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレッセン・ジアセターゼ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を使用し、先行発表の（Ｚａｍｚａｍｉら， １９９５）方法で評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を９６個の皿（５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に置き、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １０ｍＭ Ｄ−グルコース， １２７ｍＭ ＮａＣｌ， ５．５ｍＭ ＫＣｌ， １ｍＭ ＣａＣｌ２、および、ＭｇＳＯ４（ｐＨ７．４）を含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液内で、Ｆ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧで処理した。ＤＣＦＨ−ＤＡを皿に５μｇ／ｍｌ加えた。処理していない細胞はＤＣＦＨ−ＤＡのみを与えた。この細胞は、温度制御を装備したＦｌｕｒｏｓｋａｎ ＩＩ ＥＬＩＳＡ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ） 内で４８５ｎｍで励起し、蛍光発光が２分ごとに５３８ｎｍで最大２．５時間まで観測された。蛍光発光はリニア・レンジで評価した。
【０６９９】
結果
化学的分析はアビシンＤとアビシンＧの構造を明らかにする。
Ｆ０９４の主成分であるアビシンＤを分離し、無色無定形の固体とした。ＭＡＬＤＩ質量分光計によるその分子重量は２１０４ａｍｕで、これはナトリウム付加物の２０８１相当である。高分解能ＦＡＢ質量分光計によれば、その分子式はＣ９８Ｈ１５５Ｏ４６であり、その分子重量が２０８１であることが確認された。アビシンＤの陽子原子核磁気共振（ＮＭＲ）分析により、これは、２単位の非環式のモノテルペン、ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ糖と結合したｔｒａｎｓ−２−ヒドロキシメチル−６−メチル−６−ヒドロキシ２，７−ｏｃｔａｄｉｅｎｏｉｃ酸及び炭素２１でアカシア酸の付加を含む一つの側鎖を有するサポニンであることが明らかとなった。また炭素３に三糖類、炭素２８に四糖類を持っている。さまざまな２次元ＮＭＲ実験と分解調査により、アビシンＤの構造を図５６Ｂに描く。Ｆ０９４のもうひとつの活発な成分のアビシンＧアビシンＤと非常に似通ったサポニンである。このＭＡＬＤＩ質量分光計によると、分子重量は２０６５である。陽子ＮＭＲ分析では、アビシンＤと似た側鎖があるが、図５６Ｂ（Ｒ＝Ｈ）に示す様に外側のモノテルペンがｔｒａｎｓ−２， ６−ジメチル−６−ヒドロキシ２， ７−ｏｃｔａｄｉｅｎｏｉｃ酸に置き換わっている。
【０７００】
Ｆ０９４とモノテルペン／トリテルペン・グリコシドはアポトーシスの誘発により、増殖を抑制する。Ｆ０９４とアビシンが培養中のＪｕｒｋａｔ細胞の増殖を抑制することを発見した。Ｆ０９４の抑制濃度５０（ＩＣ５０）は０．３３１−０．４０７μｇ／ｍｌであり、またアビシンＤとアビシンＧのこの値はそれぞれ、０．３２０−０．３２６μｇ／ｍｌと０．１６０−０．１８１μｇ／ｍｌであった。これと対照的に、正常なヒト繊維芽細胞内では、Ｆ０９４と両アビシンはＩＣ５０値より１０−３５倍高い値であった。増殖抑制のメカニズムを理解するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦ０９４または各モノテルペン／トリテルペン・グリコシドで処理したもののアネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合を分析した。細胞は同時に、生存判別のためにプロポジウム・ヨウ化物で着色した。これらすべて３つの調整剤での処理の結果について、アネキシンＶ陽性反応を示す細胞が時間に比例して増加することがわかった。（図５７）
【０７０１】
Ｆ０９４とアビシンによりミトコンドリアからのシトクロムｃの放出をもたらす。シトクロムｃのミトコンオドリアから細胞質ゾルへの放出はアポトーシスを導く初期の出来事のひとつと考えられる。Ｆ０９４で処理された細胞は、処理後約４時間で細胞質ゾル濃度の増加がみられた。（１．５倍）（図５８）アビシンＤで処理した細胞の細胞質ゾルのシンクロムｃ濃度のさらに急速な増加がみられた。１．５倍の増加が３０分以内に、３倍の増加は４時間以内にみられた。興味深いことには、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧで処理した細胞質ゾルでは、シトクロムｃの劇的増加（３．５倍）が早くも後処理３０分でみられた。４時間までには、８．４倍のシトクロムｃの増加がみられた。（図５８）
【０７０２】
モノテルペン／トリテペノイド・サポニンが直接ミトコンドリアに作用してアポトーシスを誘導しているのかどうかを観察するために、アビシンＧを無細胞系で使用する実験を行った。ミトコンドリアをＫｕｒｋａｔ細胞からＮ２キャビテーション法で分離した。このミトコンドリア留分を２μｇ／ｍのアビシンＧで処理した結果は本処理１分以内にシトクロムｃの放出が開始となり、時間に比例して増加し、５−１０分でピークに達した。（図５９Ｂ）このミトコンドリアの留分にＤＥＶＤ−ＣＨ２Ｆ、不可逆性のカスパーゼ３抑制剤、または、広範囲な細胞浸透性があり、不可逆性で広範囲な特異性を持つカスパーゼ抑制剤であるｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨ２Ｆ（ｚＶＡＤ−ｆｍｋ）を処理しても、シトクロムｃの放出には影響がなかった。このことは、再び、これら物質が直接ミトコンドリアに作用することを示している。
【０７０３】
Ｆ０９４とアビシンはカスパーゼの活性化を抑制する。シトクロムｃのミトコンドリアから細胞質ゾルへの放出は、さまざまな細胞の死の形態においてかぎを握る下流エフェクタであるカスパーゼの一連の活性化の誘引となる。したがって、処理された細胞内のカスパーゼ３の状態を分析した。Ｆ０９４およびアビシンＤに誘発されカスパーゼ３の活性化は処理後４−６時間およびその後検出可能であった（図６０Ａ）。アビシンＧでの処理の場合には、処理後２−４時間でカスパーゼの活性化は増加がみられたが、１６時間後までには、カスパーゼの活性化は基底レベルに下降した（図６０Ａ）。
【０７０４】
カスパーゼ３の下流標的のひとつが、カスパーゼ３によりたんぱく質が分解し卵割するＰＡＲＰである。Ｆ０４９と両アビシンが誘発するＰＡＲＰの卵割は処理後４時間で開始する。（図６０Ａ）アビシンＧで処理の場合は、卵割は４時間までに完了したが、一方混合物やアビシンＤで処理の場合には卵割の完了まで８−１６時間かかった。細胞にｚＶＡＤ−ｆｍｋで前処理した場合にはＰＡＲＰの卵割が完全に抑止された（図６０Ｃ）。
【０７０５】
Ｆ０９４とアビシンはミトコンドリアの膜ポテンシャル（Δψｍ）には作用しない。シトクロームｃの細胞質ゾルへの放出は通常ミトコンドリアのΔψｍの低下より先立つ、または同時に起こる。Ｊｕｒｋａｔ細胞を最大８時間Ｆ０９４、アビシンＤ、または、アビシンＧで処理してもΔψｍには大きな変化はみられなかった。しかし、より長時間（１６時間）の処理をしたところ、著しいΔψｍの降下が誘発された。
【０７０６】
Ｆ０９４とアビシンは反応性酸素種（ＲＯＳ）の発生を減少させる。殆どのアポトーシスを誘発する物質はアポトーシスの信号を発する重要な橋渡し役のＲＯＳを発生する。しかし、Ｊｕｒｋａｔ細胞をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドで最大２．５時間処理した場合にはその処理分量に比例してＲＯＳレベルが減少した（図６２）。このＲＯＳレベルの減少は平衡状態に達し、その後のこれら物質への露出によっても変化はみられなかった（最大２４時間）。
【０７０７】
検討
真核細胞の恒常性はもっぱら、細胞外環境からの生と死に関する信号に依存している（Ｏｒｉｄａｔｅら， １９９７）。これらいずれかの信号経路の異常が細胞の生理機能に弊害をもたらす場合がある。癌においては、分裂する細胞はＤＮＡに損傷を受けるとアポトーシスを起こすことができない（Ｒａｆｆ， Ｍ．Ｃ．， １９９７）。いくつかのアポトーシスを起こさせる経路が特定されており、それにはｐ５３による誘導（Ｒａｆｆ， Ｍ．Ｃ．， １９９２）、セラミドの活性化（ｐｏｌｙａｃｋら， １９９７）、ＣＤ９５／ＣＤ９５リガンド経路の刺激（Ｂａｓｕら， １９９８）、そしてより最近では、ミトコンドリア内部の信号経路（Ｈａｋｅｎら， １９９８； Ｆｕｊｉｍｕｒａら， １９９９； Ｇｒｅｅｎら，１９９８； Ｆｕｌｄａら， １９９８ ）が含まれる。癌の化学療法と予防に関する目標のひとつは、１つ以上のこれらアポトーシスを進める経路に作用して、腫瘍細胞を選択的にアポトーシスへ導く新しい物質を特定することである。
【０７０８】
本明細書で述べる内容は、ＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞株でアポトーシスをモノテルペン／トリテルペノイド・サポニンとモノテルペン／トリテルペン・グリコシドの混合物がミトコンドリアの機能に作用することにより取り持つことで誘導することである。この信号の変換経路を分析の結果、シトクロムｃが処理後３０分から２時間以内に放出されることが明らかとなった。無細胞系では、アビシンＧが処理に続き１分以内にシトクロムｃの放出を誘導した。カスパーゼ抑制剤ＤＥＶＤ、または、ｚＶＡＤ−ｆｍｋでの前処理では、シトクロムｃの放出に影響を与えず、アビシンＧがシトクロムｃのカスパーゼ上流の関与なく直接ミトコンドリアに作用することを示している。シトクロムｃの放出に続き、カスパーゼ−３の活性化とポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の卵割がアビシンによる処理後２−６時間の間に起った。 細胞をｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで前処理するとＰＡＲＰの卵割が完全に抑止された。これら処理された細胞では、シトクロムｃの放出前も放出中もその膜ポテンシャルに大きな変化は見られない。反応性酸素種（ＲＯＳ）の発生についても多少の減少が見られるに過ぎない。従って、一部の植物や海洋生物において分子を防御するために働く二次的な代謝産物である純粋なモノテルペン／トリペノイド・サポニンがミトコンドリアの機能をかく乱し、これによって、ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘発する。
【０７０９】
先の実施例で述べた様に、Ａｃａｃｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａｅ（Ｂｅｎｔｈ）から分離したモノテルペン／トリテルペノイド・サポニンの混合物は、さまざまなヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制する。ＰＩ−３−キナーゼ信号伝達経路の抑制はこれに関係する一つのメカニズムである。しかしながら、Ｊｕｒｋａｔ細胞においては、これらの効果がでるには、長時間のモノテルペン／トリテルペノイド・サポニンによる処理（１６時間）が必要で、Ｊｕｒｋａｔ細胞が早々アポトーシスを開始すると説明するには遅効性すぎる。従って、本発明者は、モノテルペン／トリペノイド・サポニンだけでなく、２つの精製した分子についても処理した場合のミトコンドリアの役割を精査した。モノテルペン／トリテルペノイド・サポニンの混合物を分離用ＨＰＬＣで、幾つかの成分に精製した。モニターとしてＪｕｒｋａｔ細胞への細胞毒性を利用して、２つの分子、アビシンＤとアビシンＧを生物学的特徴付けのために選択した。
【０７１０】
アポトーシスにさらされ始めた細胞は原形質膜の内部から外部のリーフレットへホスファジルを再設定する。この露出された状態では、これらの細胞はアネキシンＶと結合することができる（Ｆｒｉｅｓｅｎら， １９９６）、そこでこの性質がアポトーシスの目印として利用されている。Ｆ９０４、または、両アビシンで処理されたＪｕｒｋａｔ細胞では後処置４時間後から、アネキシンＶ陽性となる細胞が時間に比例して増加し、これらの細胞がアポトーシスの誘導を受けていることが示された。
【０７１１】
アポトーシスを起こす最初の出来事のひとつはシトクロムｃがミトコンドリアから細胞質ゾルへ放出されることである（Ｓｃｈｕｔｔｅら， １９９８： Ｙａｎｇら， １９９７）。処理されたＪｕｒｋａｔ細胞の細胞質ゾル内では、シトクロムｃが３０分以内（アビシンＤとアビシンＧについて）から４時間以内（Ｆ０９４について）に検出された。細胞質ゾル内に入ると、シトクロムｃはＡＰＡＦ−１とプロカスパーゼ−９と、ｄＡＴＰの存在下で結合し、アポトーシスの性質を形成する（Ｋｌｕｃｋら， １９９７； Ｚｏｕら， １９９７）。この合成物はカスパーゼ−９を活性化し、次々に卵割させ、これによりカスパーゼ−３を活性化する。処理された細胞では、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出に続いて、カスパーゼ−３が活性化する。この出来事の後即座に、カスパーゼ−３の基質の一つであり、１１６ｋＤａＤＮＡの修復酵素であるＰＡＲＰの卵割が起る。このＰＡＲＰの卵割でこの酵素が不活性化され、したがって、ＤＮＡの修復が不可能となる。
【０７１２】
シトクロムｃの放出がアポトーシスが開始となる出来事である場合もあり、例えば、ＣＤ９５（Ｆａｓ）系に起きる様に、カスパーゼ活性化の下流効果となる場合もある。後者の場合、カスパーゼ−８の放出に依存する（Ｌｉら， １９９７）。細胞をｚＶＡＤ−ｆｍｋで前処理した場合、完全にＰＡＲＰの卵割を抑止する広範囲はカスパーゼ抑制剤が、シトクロムｃの放出に影響せず、見られた。このことは、シトクロムｃの放出はこれら物質のミトコンドリアへの直接の作用によるもので、カスパーゼの活性化とは無関係であることを示している。このことを確認するために、精製されたミトコンドリアを無細胞系で使用した。本システムでは、アビシンＧがシトクロムｃの放出を、その使用量と時間に比例して誘導し、カスパーゼ抑制剤ＤＥＶＤ−ＣＨ２ＦやｚＶＡＤ−ｆｍｋでの前処理には影響されなかった。
【０７１３】
ミトコンドリアの内外膜間に存在するシトクロムｃがどのようにして細胞質ゾルに移動するのかは、まだ不明である。いくつかの理論が提案されてい。アポトーシスと、内膜の脱分極をもたら伝導性経路の開放によってもたらされるミトコンドリアの浸透性変化（ＰＴ）との間に強い相関関係があることが示されてきた（Ｋｕｗａｎａら， １９８８）。この脱分極により最終的に、ミトコンドリアが腫れ、その外膜が破裂し、シトクロムｃが放出される。ミトコンドリアの外膜に特定の経路が形成され、シトクロムｃの放出をもたらしている可能性も示唆されている（Ｐｅｔｉｔら， １９９６）。つい最近、シトクロムｃは膜内外のポテンシャルを失わずに放出可能で、その場合内膜の過分極が発生しているのではとの考えが示された（Ｍａｎｏｎら， １９９７）。Ｆ０９４またはアビシンＧで処理された細胞においては、シトクロムｃの放出はミトコンドリア内膜ポテンシャルの変化に先立ち、または付随しておこらない。しかし１６時間の前処理で他の報告内容と合う膜の著しい脱分極があり、これは活性化されたカスパーゼが直接ＰＴを誘導することを示した（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎら， １９９９）。さらにシトクロムｃの放出のメカニズムを理解するために、本発明者はＡＴＰ／ＡＤＰ交換とＦ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ陽子ポンプの分析のための実験を検討した。
【０７１４】
ミトコンドリアは、好気性生物の有毒副産物であり，さまざまな情報伝達経路においてアポトーシスをもたらすものを含む重要な役割を演ずる反応性酸素種（ＲＯＳ）を豊富に生み出す（Ｍａｒｚｏら， １９９８； Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ， Ｓ，Ｊら， １９９５； Ｂｕｔｔｋｅ及びＳａｎｄｓｔｏｒｍ， １９９４）。従って、モノテルペン／トリテルペン・グリコシドの処理されたＪｕｒｋａｔ細胞のＲＯＳレベルを調査した。モノテルペン／トリテルペン・グリコシドで処理後のＲＯＳの生成に減少がみられた。ＲＯＳの生成がシトクロムｃの放出より先行したいたことを示している（Ｂｒｅｄｅｓｅｎ， Ｄ．Ｅ．， １９９５）というレポートもあれば、一方では、カスパーゼの活性化が始まった後でさえ、これがあとに起ることがるとのレポートもある。本発明における最大１６時間のＲＯＳレベルの後処理観測では、新たな変化は見られなかった。
【０７１５】
本発明者は、アビシンでの細胞の処理に付随するＲＯＳレベルの減少は、シトクロムｃの一部をミトコンドリア内に保持すること、または、アポトーシス開始後であっても細胞の解糖流量が等しいことにより細胞がそのミトコンドリアのＡＴＰレベルを維持することによるのではないかと考える。従って、ＡＴＰのメンテナンスが遅れるかもしれないし、ＲＯＳの生産を抑制するかもしれない。ＲＯＳのレベルもまた、（ｉ）ＡＴＰ／ＡＤＰ交換の異常（Ｍａｎｏｎら， １９９７）， （ｉｉ）シトクロムｃによる超酸化物の酸化による酸素（Ｈｉｇｕｃｈｉら， １９９８） ，（ｉｉｉ）カスパーゼによるＤ４−ＧＤＰ−分離抑制剤のたんぱく質分離（Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ，Ｖ．Ｐ， １９９８）等のエネルギーの調整の変化により直接、または間接的に影響を受ける。その他の説明としては、グルタチオン、または、超酸化物ジスムターゼの減少等による抗酸化物のレベルの上昇がある。
【０７１６】
研究によると、ミトコンドリアに直接作用する成分の発見に対する関心が高まっていることを示している（Ｎａら， １９９６； Ｒａｖａｇｎａｎら， １９９９； Ｚａｍｚａｍｉら， １９９８； Ｈｉｒｓｃｈら， １９９８； Ｃｈｅｎら， １９９８）。これらの物質の全てが、膜ポテンシャルを崩壊させ、または、ＲＯＳを放出するかしてアポトーシスを誘発するものであり、ミトコンドリアの内膜を第一の標的としている。５環状のトリテルペンである、ベツリン酸がＣＤ−９５やｐ５３に依存しないやり方で、ミトコンドリアに直接作用することによって神経管外胚葉腫瘍（Ｂａｎｔｅｌら， １９９９）におけるアポトーシスを誘発することが報告された。トリテルペン・グリコシドとは対照的に、ベツリン酸は、ミトコンドリア外膜からのシトクロムｃ放出に付随して、膜横断ポテンシャルの減少とＲＯＳレベルの上昇を示した（Ｐｉｓｈａら， １９９５）。ベツリン酸の効果と相反して、なぜトリテルペン・グリコシドが膜ポテンシャルを保ち、ＲＯＳレベルを下げるのかの正確な化学的理由はわかっていない。ベツリン酸は、非常に限られた細胞型の特異性を備えた簡単なトリテルペン化合物である。一方、トリテルペン・グリコシドはより広い細胞特異性を示し、疎水性のアカシア酸をトリテルペン中心に持ち、またｑｕｉｎｏｖｏｓｅ糖で結合される２つの非環式のモノテルペン単位を持つ。アビシン内の疎水性のアカシア酸の核により、恐らくは、膜を横断し、ミトコンドリアに作用することを可能にしているが、分子の他の部分の特徴により、その生化学的な効果とベツリン酸との違いを説明できるかもしれない。
【０７１７】
本発明者は、どの成分がアポトーシスを進める機能として重要であるかを決定するために、側鎖とその個々の糖を含みアビシンＤとアビシンＧの切り取られる部分を注視している。トリテルペン・グリコシドは構造的には、Ａｒｃｈｉｄｅｎｄｒｏｎ ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｍから前もって楕円の側部分を分離したものに非常ににている（Ｆｕｌｄａら， １９９７）。しかし、モノテルペンに関する対掌性の研究ＮＭＲでの評価では、本明細書に記載されたサポニンと抗腫瘍の働きがあるものとしてこれまでに述べられたものとには、微妙ではあるが、特筆すべき違いが見られる。
【０７１８】
アビシンは、ミトコンドリア膜結合脂肪受容体とは関係なく、ミトコンドリアの機能に直接作用することで、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるアポトーシスを誘導する新しいクラスのモノテルペン／トリペノイド・サポニンである。これらの化合物は、選択的に癌細胞に対してアポトーシスを誘導する（例えばＪｕｒｋａｔ細胞は殺すが正常な繊維芽細胞は殺さない）。このことはこれが、他の正常な細胞を殺す副作用が無いため、有益な化学療法薬となる。
【０７１９】
腫瘍たんぱく質は癌細胞をアポトーシス信号に対して、正常な細胞では抵抗されるような方法で、敏感にする。従って、アビシンのこの効果は、アポトーシスに導く初期の信号を発する出来事を増幅することによるものである。ＡＫＴによりカスパーゼ−９のリン酸化反応がその働きを抑制することが示されている（Ｃａｒｄｏｎｅら， １９９８）。ＡＫＴのリン酸化反応を抑制することで、アビシンは、シトクロムｃ放出後に見られるアポトーシスを促進する効果を増幅できる。最近、ＡＰＡＦとカスパーゼ−９がｐ−５３を誘発する遺伝子の下流エフェクタであることが示されている（Ｓｏｅｎｇａｓら， １９９９）。ＡＫＴリン酸化反応の抑制はまた、Ｂｃｌ−ｘＬとでそのヘテロ二量化を増やすことにより、ＢＡＤのアポトーシスを促進する機能を高めることもある。（Ｇｒｏｓｓら， １９９９）あるいは、アビシンはＢａｘ同一二量体の形成を促すために洗浄剤として作用することがある。（Ｈｓｕら， １９９９）そのミトコンドリアへの直接の効果により、本発明者はアビシンが、ｐ５３遺伝子ｂにおける突然変異体により、アポトーシスへの抵抗に打ち勝つだろうと想像する。このことは、本明細書で使用したＪｕｒｋａｔ細胞にｐ５３が不足していた事実により確認される。従って、アビシンは、失った、あるいは、突然変異した腫瘍抑制遺伝子を置き換える能力により、抵抗力の強い癌の治療において有効である。
【０７２０】
実施例４８
表皮肥厚化、炎症、ｐ５３突然変異の軽減
ＵＶＢのスペクトラム波長はビタミンＤの生成を助けるが、またＤＮＡの損傷、具体的には、さらにＤＮＡの損傷をもたらす酸素ラジカルの生成のみならす、ピリミジンニ量体や、多くの遺伝子における突然変異の形成の原因となる。本実施例では、ＵＶＢ光線が原因のネズミ皮膚の病変をモノテルペン／トリテルペン・サポニンによる抑制について述べる。本実施例では、また、ＵＶＢが誘発する皮膚の発癌の調節物の選別用に、新しい短期発育ネズミのモデルの開発についても述べる。
【０７２１】
方法
無毛ネズミに１回あたり１８０ｍＪ／ｃｍ２の照射量で１５分、１週間に５回、合計１０週間ＵＶＢを照射した。処置の相対効果の評価には、端点間の表皮の厚さ、白血球の浸入、（ＢｒｄＵによる）ラベリング・インデックス、ｐ５３の突然変異、そして、８−ＯＨ−ｄＧ形成らを使用した。Ｆ０３５のみ投与したもの、強力な抗酸化作用のあるビタミンＥと組み合わせたものを、ＵＶＢ照射前１５分に無毛ネズミＳＫＨ−１の背面皮膚へ施した。
【０７２２】
結果
モノテルペン／トリテルペノイド・サポニンの混合物（Ｆ０３５）はＤＮＡの損傷を減少させ、また、ｐ５３の突然変異も減少させた。細胞分裂を抑制された細胞の数を、皮膚の基底と基底より上の層での５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）のラベリングにより評価したところ、ビタミンＥのみの処理をしたネズミで３０％、Ｆ０３５のみで処理したネズミで３５％、ビタミンＥとＦ０３５の組み合わせで処理したもので５５％、それぞれ減少した。ｐ５３突然変異の反応のあった細胞は、主に基底の上の層に見られたが、６０％の減少、照射中にモノテルペン／トリテルペノイド・サポニンとビタミンＥの組み合わせで処理したネズミでは６７％減少した。従って、本発明のモノテルペン／トリテルペン・サポニンはｐ５３の突然変異と同様に表皮の肥厚化、炎症を軽減する。さらには、本実施例は、ＵＶＢが誘発する皮膚発癌の調節物評価に非常に有用な新しい短期育成ネズミ・モデルを提供する。
【０７２３】
従って、本発明者は、本明細書記載のモノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物を含む組成物を個体に投与することによりｐ５３突然変異体の誘導を抑制する方法を考える。このモノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物は多くの経路、例えば、全身から、局部、または、局所、から投与可能である。具体的には、静脈、筋肉、皮下、経口、局所への投与が可能である。従って、本発明者は、ｐ５３が誘導する癌を予防する方法を提供する。Ｐ５３の突然変異は、数多くの癌のタイプに関係しているので、本発明者は、ヒトに投与されるモノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物により、さまざまな癌に対する効果的な予防と治癒的な治療が提供できると考える。
【０７２４】
本発明者は、また、本明細書記載のモノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物をヒトに投与することにより、紫外線が誘発する癌や前癌状態に対する予防と治療が提供できる方法を考える。例えば、光線性角化症のような前癌状態や皮膚癌や悪性腫瘍は、本明細書記載のモノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物で予防できる。紫外線が誘導する皮膚の病変は、モノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物を含むクリーム、ゲル、軟膏の本アプリケーションの対応により治療が可能である。加えて、本発明者は、、モノテルペン／トリテルペン・グリコシド組成物を含むサン−ブロック、ローション、クリーム、ゲル、または軟膏に本アプリケーションを対応した、癌を含む紫外線が誘導する皮膚の状態の予防を考える。これらの治療用組成物にはさらに、たとえば、ビタミンＥなどの追加の組成物が含まれることがある。本方法は、前癌、または、癌の治療のために、個体が受けるその他の治療に追加して使用することができる。
【０７２５】
本明細書でさらに提供されるのは、ＵＶＢが誘導する皮膚の発癌の調整物の選別用途の新しいネズミである。提供されるのは、すばらしく短期で発育するモデルのＳＫＨ−１無毛ネズミである。本マウスでＵＶ照射による皮膚の前癌および癌を誘導することができる。本ネズミは、また、処置の前でも後でも望むように、候補となる調整用組成物を無毛ネズミの背面皮膚へ処理することができる。処理の効果は、また、端点間の表皮の厚さ、白血球の浸入、ラベリング・インデックス（例えば、ＢｒｄＵで）、ｐ５３の突然変異、そして、８−ＯＨ−ｄＧ形成等の特徴をモニターすることで評価できる。
【０７２６】
本明細書で開示し、特許請求される全ての組成物および方法は、本開示の目的の観点により必要以上の実験をせず、なされ、実行されるものである。本発明による組成物および方法は、好適な実施の形態に関して述べられているものの、同業界者間では、その変化物であっても、本明細書記載の組成物、方法、および方法に関するステップ、または、ステップの順序に本発明の概念、精神、範囲から離れることなく該当することがある。より具体的には、化学的にも生物学的にも関係するある物質が、本明細書記載の物質の代用ができ、同じ、あるいは、同様の結果が得られることは明白となる。すべてのこのような同業者間で明白な、同様な物質や、変更物は、請求項によって規定された本発明の精神、範囲、および概念の範囲とみなされる。
【０７２７】
参考文献
以下の参考文献は、典型的な手順の詳細あるいは本明細書で述べられた詳細を補足するその他の詳細な説明を提供する範囲内で引用によって本明細書に特に組み込まれる。
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Ｋｕｔｎｅｙ， ”Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ （Ｎ．Ｍ．Ｒ．） ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏ    ｇｅｎｉｎ ｓｅｒｉｅｓ． Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｉｒｏ ｋｅｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ”， Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，     ２：２２５−２３５， １９６３．
Ｋｕｗａｎａ， Ｔ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｊ．， Ｍｕｚｒｏ， Ｍ．， Ｄｉｘｉｔ， Ｖ． Ｍ．， Ｎｅｗｍｅｙｅｒ， Ｄ． ＆ Ｋｏｒｎｂｌ    ｕｔｈ， Ｓ． （１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １６５８９−１６５９４．
Ｌｅｍｉｕｅｘ， Ｋｕｌｌｎｉｇ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， ”Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ     ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｓｉｘ−ｍｅｍｂｅｒｅｄ ｒｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ    ”， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８０：６０９８−６１０５， １９５８．
Ｌｉ， Ｐ．， Ｎｉｊｈａｗａｎ， Ｄ．， Ｂｕｄｉｈａｒｄｊｏ， Ｉ．， Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ， Ｓ． Ｍ．， Ａｈｍａｄ， Ｍ．，    Ａｌｎｅｍｒｉ， Ｅ． Ｓ． ＆ Ｗａｎｇ， Ｘ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１， ４７９−８９．
Ｌｉｓｔｅｒ， Ｐ． Ｒ．， Ｐ． Ｈｏｌｆｏｒｄ， Ｔ． Ｈａｉｇｈ， ａｎｄ Ｄ． Ａ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ． Ａｃａｃｉａ ｉｎ Ａ    ｕｓｔｒａｌｉａ； Ｅｔｈｎｏｂｏｔａｎｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｏｄ ｃｒｏｐ． ｐ．２２８−２３６． Ｉｎ； Ｊ． Ｊａｎ    ｉｃｋ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｎｅｗ ｃｒｏｐｓ． ＡＳＨＳ Ｐｒｅｓｓ， Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ， ＶＡ， １９９６．    Ｌｌｏｙｄ， ＭｃＣｏｗｎ， ”Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｎｔａｉｎ ｌ    ａｕｒｅｌ， Ｋａｌｍｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ ｃｕｌｔｕｒｅ”， Ｃｏｍｂ． Ｐｒｏｃ． Ｉｎ    ｔｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｐ． Ｓｏｃ．， ３０：４２１−４２７， １９８１．
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Ｍａｃｋｎｅｓｓ， Ｄｕｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｃｏｎｖｅｒｓｅ， Ｓｋｉｎｎｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｉｎ； Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ    ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｐ １， １９９２．Ｍａｈａｔｏ， Ｐａｌ， Ｎａｎｄｙ， Ｔｅｔｒａｈｅａｄｒｏｎ， ４８：６７１７−６７２８ （１９９２）．
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Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ． Ｊ．， Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒ， Ｃ． Ｐ．， ＭｃＧａｈｏｎ， Ａ． Ｊ．， Ｒａｄｅｒ， Ｊ． Ｍ．， ｖａ    ｎ Ｓｃｈｉｅ， Ｒ． Ｃ．， Ｌａ Ｆａｃｅ， Ｄ． Ｍ．， ＆ Ｇｒｅｅｎ， Ｄ． Ｒ．， （１９９５）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．    １８２， １５４５−１５５６．
Ｍａｒｚｏ， Ｉ．， Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｃ．， Ｚａｍｚａｍｉ， Ｎ．， Ｓｕｓｉｎ， Ｓ． Ａ．， Ｂｅｕｔｎｅｒ， Ｇ．， Ｂｒｄｉｃｚｋａ    ， Ｄ．， Ｘｉｅ， Ｚ−Ｈ．， Ｒｅｅｄ， Ｊ． Ｃ．， ＆ Ｋｒｏｅｍｅｒ， Ｇ． （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７，    １２６１−１２７１．
Ｍａｓｓｉｏｔ， Ｌａｖａｕｄ， Ｂｅｓｓｏｎ， Ｌｅ Ｍｅｎ−Ｏｌｉｖｉｅｒ， ｖａｎ Ｂｉｎｓｔ， ”Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｅｒｉａ    ｌ ｐａｒｔｓ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）”， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ３９：７８−８    ２， １９９１ｂ．
Ｍａｓｓｉｏｔ， Ｌａｖａｕｄ， Ｄｅｌａｕｄｅ， ｖａｎ Ｂｉｎｓｔ， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｆａｌｅｓ， ”Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｄｅ    ｓｍｏｓｔｅｍｏｎ ｃｌａｅｓｓｅｎｓｓｉ”， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９：３２９１−３２９８， １９９０．
Ｍａｓｓｉｏｔ， Ｌａｖａｕｄ， Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ， Ｌｅ Ｍｅｎ−Ｏｌｉｖｉｅｒ， ｖａｎ Ｂｉｎｓｔ， ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａ    ｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ｉｎ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ２Ｄ １Ｈ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”， Ｊ    ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４８５−１５８７， １９８６
Ｍａｓｓｉｏｔ， Ｌａｖａｕｄ， Ｌｅ Ｍｅｎ−Ｏｌｉｖｉｅｒ， ｖａｎ Ｂｉｎｓｔ， ｍｉｌｌｅｒ， Ｆａｌｅｓ， ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅ    ｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ ｒｏｏｔ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ    ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．， １：３０７１−３    ０７９， １９８８．
Ｍａｓｓｉｏｔ， Ｌａｖａｕｄ， Ｎｕｚｉｌｌａｒｄ， ”Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ｄｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｄｅｓ ｃｈｒｙｓａｎｔｅｌｌｉｎｅｓ    ｐａｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｍａｇｎｅｔｉｑｕｅ ｎｕｃｌｅａｉｒｅ”， Ｂｕｌｌ． Ｓｏｃ． Ｃｈｉｍ． Ｆｒ．， １２７：１００−１    ０７， １９９１ａ．
ＭｃＭａｎｕｓ ＯＢ． Ｈａｒｒｉｓ ＧＨ． Ｇｉａｎｇｉａｃｏｍｏ ＫＭ． Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ Ｐ． Ｒｅｕｂｅｎ ＪＰ． Ａｄｄｙ ＭＥ．    Ｂｕｒｋａ ＪＦ． Ｋａｃｚｏｒｏｗｓｋｉ ＧＪ． Ｇａｒｃｉａ ＭＬ． Ａｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅ    ｎｔ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，     ３２（２４）：６１２８−３３， １９３３．
Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６５：８２６， １９８５．
Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｔｏｇａｗａ， Ｈｉｇｕｃｈｉ， Ｋｏｍｏｒｉ， Ｓａｓａｋｉ， ”Ｓｉｘ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉ    ｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｓｕｌｐｈａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅａ ｃｕｃｕｍｂｅｒ”    ， Ｃｕｃｕｍａｒｉａ ｅｃｈｉｎａｔａ． Ａｎｎａｌｅｎ， ４５３−４６０， １９９０．
Ｍｏｉｎｏｖａ ａｎｄ Ｍｕｌｃａｈｙ （１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ．， ２７３：１４６８３−１４６８０．
Ｍｏｎｃａｄａ， Ｓ．， Ｐａｌｍｅｒ， Ｒ． Ｍ． Ｊ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｓ， Ｅ． Ａ． （１９９１） Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ； ｐｈｙｓ    ｉｏｌｏｇｙ， ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ４３， １０９−１４１．
Ｍｏｎｋ， ”Ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”， ＴＩＧ， ６：１１０−１１４， １９９０．
Ｍｕｊｏｏ， Ｍａｎｅｖａｌ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １２：１６１７−１６２３， １９９６．
Ｍｕｌｃａｈｙ， Ｒ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ．， ２７２， ７４４５−７４５４．
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ， Ｓｋｏｏｇ， ”Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙ ｏｆ ｔｏｂ    ａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ”， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ．， １５：４７３−４８２， １９６２．
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ， Ｔ． ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， Ｆ． ”Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｂｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏ−ａ    ｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ”， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５：４７３−４９    ７， １９６２．
Ｎａ， Ｓ．， Ｃｈｕａｎｇ， Ｔ−Ｈ， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ａ．， Ｔｕｒｉ， Ｔ． Ｇ．， Ｈａｎｋｅ， Ｊ． Ｈ．， Ｂｏｋｏｃｈ，     Ｇ． Ｍ． ＆ Ｄａｎｌｅｙ， Ｄ． Ｅ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １１２０９−１１２１３．
Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３２６；７１１−７１３， １９８７．
Ｎａｇａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ．， ５４：３０５−３０７， １９８８．
Ｎａｇａｏ， Ｈａｃｈｉｙａｍａ， Ｏｋａ， Ｙａｍａｕｃｈｉ， ”Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ａｓｔｅｒ ｔ    ａｔａｒｉｃｕｓ Ｌ． ｆ． ＩＩ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｓｔｅｒ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏ    ｏｔ”， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３７：１９７７−１９８３， １９８９．
Ｎａｋａｔａｎｉ， Ｙ．， Ｏｕｒｉｓｓｏｎ， Ｇ． （１９９４） Ｃｈｅｍ． ＆ Ｂｉｏｌ， １， １１−２３．
Ｎｅｌｓｏｎ， Ｆｕｔｓｃｈｅｒ， Ｋｉｎｓｅｌｌａ， Ｗｙｍｅｒ， Ｂｏｗｄｅ， ”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｈａ−ｒａｓ ｇｅ    ｎｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍ    ｅｎｔ ｏｆ ｂｅｎｉｇｎ ｔｕｍｏｒｓ”， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１４）：６３９８−６４０２，     １９９２．
Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ｄ． Ｎ． ＆ Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｎ． Ａ． （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２２，     ２９９−３０６．
Ｎｉｓｈｉｎｏ， Ｍａｎａｂｅ， Ｅｎｏｋｉ， Ｎａｇａｔａ， Ｔｓｕｓｈｉｄａ， Ｈａｍａｙａ， ”Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ     ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｕｎｉｔ ｏｆ ｃａｍｅｌｌｉｄｉｎｓ， ｓａｐｏｎｉｎｓ， ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ    ａｃｔｉｖｉｔｙ，” Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ７２０−７２３， １９８６．
Ｎｉｔｓｃｈ， Ｎｉｔｓｃｈ， ”Ｈａｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｌｅｎ ｇｒａｉｎｓ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １６３：８５−８７，    １９６９．
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Ｒｏｙａｌ Ｉ ａｎｄ Ｐａｒｋ Ｍ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２７７８０−２７７８７， １９９５．
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Ｓａｓｈｉｄａ， Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｍｉｍａｋｉ， ”Ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆ    ｒｏｍ Ａｌｌｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ”， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３９：６９８−７０３， １９９１．
Ｓｃｈｅｎｋ， Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄｔ， ”Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ    ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ａｎｄ ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ”， Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｏ    ｔ．， ５０：１９９−２０４， １９７２．
Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｔ． Ｊ． （１９９７）， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ５， ６４５−６５３．
Ｓｃｈｏｐｋｅ， Ｗｒａｙ， Ｒｚａｚｅｗｓｋａ， Ｈｉｌｌｅｒ， ”Ｂｅｌｌｉｓｓａｐｏｎｉｎｓ ＢＡ１ ａｎｄ ＢＡ２， ａｃｙｌａｔｅｄ     ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｂｅｌｌｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉｓ”， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３０：６２７−６３１， １９９１．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｍａｔｔｈｉａｓ， Ｍｕｌｌｅｒ， Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：６４１９， １９８    ９．
Ｓｃｈｒｉｅｂｅｒ， Ｓ． Ｌ．， （１９９８） Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６， １１２７−１１５２．
Ｓｃｈｕｈ ｅｔ ａｌ．， ”Ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ ｗｏｕｄｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖ−ｊｕｎ    ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ”， Ｎａｔｕｒｅ， ３４６：７５６−７６０， １９９０．
Ｓｃｈｕｔｔｅ， Ｂ．， Ｎｕｙｄｅｎｓ， Ｒ．， Ｇｅｅｒｔｓ， Ｈ． ＆ Ｒａｍａｅｋｅｒｓ， Ｆ． （１９９８） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．    Ｍｅｔｈ． ８６， ６３−６９．
Ｓｅｉｂｅｒｔ， Ｋ． ａｎｄ Ｍａｓｆｅｒｒｅｒ， Ｊ． （１９９４） Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ （Ｃ    ＯＸ−２） ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９４， １７−２３．
Ｓｈａｏ， Ｋａｓａｉ， Ｘｕ， Ｔａｎａｋａ， ”Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｋａｌｏｐａｎａｘ ｓｅｐｔｅｍｌｏｂｕｓ （    ＴＨＵＮＢ．） ＫＯＩＤＺ．， Ｃｉｑｉｕ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｋａｌｏｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎｓ Ｃ， Ｄ， Ｅ ａｎｄ Ｆ    ”， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３７：３１１−３１４， １９８９．
Ｓｈａｙｅｓｔｅｈ， Ｌｕ， Ｋｕｏ， Ｂａｌｄｏｃｃｈｉ， Ｇｏｄｆｒｅｙ， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐｉｎｋｅｌ， Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍｉｌｌｓ，     Ｇｒｅｙ， Ｎａｔ． Ｇｅｎｔ．， ２１：９９−１０２， １９９９．
Ｓｈｅｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：１１７−１２７， １９９１．
Ｓｈｉｒａｚｉ， Ｌｉｕ， Ｔｒｏｔｔ， ”Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｂ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ     ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ ｔｏ ｄａｉｌｙ Ｘ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ”， Ｒａｄ． Ｒｅｓ．， １４５：７６８−７７    ５， １９９６．
Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ， Ｕｌ， Ｆｒａｎｚｏ， Ｇ．， ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｋ． （１９９４） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０，     ４０５−４５５．
Ｓｉｅｗｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｕｎｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎ    ｅｎｓｉｓ ｂｙ ＴＧＦ−β”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４８：１６５６−１６６０， １９９０．
Ｓｉｎｇｈ， Ｇ． Ｂ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｓ．， Ｂａｎｉ， Ｓ．， Ｇｕｐｔａ Ｂ． Ｄ． ａｎｄ Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｓ． Ｋ． （１９９２    ） Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ． Ｊ．     Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４４， ４５６−４５８．
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Ｓｍｉｔｈ， Ｗｅａｔｈｅｒｓ， Ｃｈｅｅｔｈａｍ， ”Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔ ｃｕ    ｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ： ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”， Ｉｎ Ｖｉ    ｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ３３：７５−７９， １９９７．
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【図面の簡単な説明】
以下の図面は本明細書の一部を成し、さらに本発明のいくつかの態様を示すため本明細書に含められている。本発明は本明細書で述べられる特定の実施の形態の詳細な説明と相まって１つまたはそれ以上のこれら図面を参照することによってより良く理解されるであろう。
【図１】
ヒト腫瘍細胞株に対するＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ００１の効果を示す図。
マメ科植物の粗抽出物で処理された卵巣（ＳＫ−ＯＶ−３、ＨＥＹ、ＯＶＣＡＲ−３）、乳腺（ＭＤＡ−４６８）、黒色腫（Ａ３７５−Ｍ、Ｈｓ２９４ｔ）、及びヒト扁平上皮（Ａ４３１）の細胞株によって提示された成長抑止を示す。
【図２】
形質転換細胞株及び非形質転換細胞株に対するＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０２３（フラクション２３）の効果を示す図。卵巣（ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＣＣ１、ＨＥＹ、ＯＶＣＡＲ−３）、Ｔ細胞白血病（Ｊｕｒｋａｔ）、前立腺（ＬＮＣａＰ）、新鮮なヒト卵巣腫瘍細胞（ＦＴＣ）、ヒト線維芽（ＦＳ）、及び内皮（ＨＵＶＥＣ）の細胞によって提示された細胞毒性を示す。腫瘍細胞で示された１０−９５％の細胞毒性と比較すると、非形質転換細胞では１５−１７％の細胞毒性しか観察されなかった。
【図３】
ヒト腫瘍細胞株に対するフラクション３５（“ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５”または“Ｆ０３５”）の効果を示す図。ヒト卵巣（ＨＥＹ、ＯＶＣＡＲ−３、Ｃ−１、ＳＫ−ＯＶ−３）、膵臓（ＰＡＮＣ−１）、及び腎臓（７６９−Ｐ、７８６−Ｏ、Ａ４９８）の細胞株で処理したフラクション３５によって提示された細胞毒性を示す。細胞株に対するＩＣ５０は１−３μｇ／ｍｌの範囲であった。
【図４】
白血病細胞株に対するフラクション３５の効果を示す図。フラクション３５が１３０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を持つＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）細胞に対して強力な細胞毒性を提示し、ＲＥＨ、ＫＧ−１，そしてＮＡＬＭ−６（Ｂ細胞白血病）細胞のＩＣ５０は１−３μｇ／ｍｌの範囲であることを示す図。
【図５】
内皮細胞増殖に対するフラクション３５の効果を示す図。フラクション３５はｂＦＧＦによる刺激の有無に関わらず上皮細胞増殖の強力な阻害因子である。
【図６】
毛細血管上皮細胞の遊走に対するフラクション３５の効果を示す図。毒性の欠如を示唆する毛細血管上皮細胞の遊走に対する効果は見られない。
【図７】
苗及びカルス抽出物の薄層クロマトグラフィーを示す図。レーン１、ＢＡ−ＩＡＡ培地で培養した茎のカルス；レーン２、ＢＡ−ＩＡＡ培地で培養した根のカルス；レーン３、胚軸カルス；レーン４、半固形培地でジャスモン酸メチル（１００μＭ）で処理した苗；レーン５、半固形培地で成長させた対照群の苗；レーン６、スタンダードＦ０２３；レーン７、ＢＡ培地で培養したシュート；レーン８、５０μＭのジャスモン酸メチルで処理した苗；レーン９、１００μＭのジャスモン酸メチルで処理した苗；レーン１０、２００μＭのジャスモン酸メチルで処理した苗；レーン１１、対照群の苗；レーン１２、スタンダードＦ０２３。
【図８】
左側にＳＥＮＣＡＲマウス、右側にＳＥＮＣＡＲとＣ５７Ｂ１の交配種の写真を示す。いずれも１００ｎｍｏｌのＤＭＢＡを８週間反復投与して処理した。１５週目にいずれのマウスにも多数の乳頭腫が発生したが、ＳＥＮＣＡＲとＣ５７Ｂ１の交配マウスの乳頭腫は数が少なく、大きさも小さかった。Ｃ５７Ｂ１株は発癌に抵抗性があり、腫瘍を成長させない。
【図９Ａ−Ｆ】
アセトン、ＤＭＢＡ、またはＤＭＢＡ＋ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５で処理したマウスの上皮断面を示す図。図９Ａ：アセトン処理４週目。図９Ｂ：アセトン処理８週目。図９Ｃ：ＤＭＢＡ処理４週目。図９Ｄ：ＤＭＢＡ処理８週目。図９Ｅ：ＤＭＢＡ＋ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５処理４週目。図９Ｆ：ＤＭＢＡ＋ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５処理８週目。
【図１０Ａ、Ｂ】
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５のＤＮＡに対する４週後の抗酸化効果を示す図。図１０Ａ：低濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（０．１ｍｇ／０．２ｍｌ）で処理後の抗酸化効果を示す図。図１０Ｂ：高濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ）で処理後の抗酸化効果を示す図。
【図１１Ａ、Ｂ】
ＤＭＢＡ及びＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５で処理後４週間の上皮厚を示す図。図１１Ａ：低濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（０．１ｍｇ／０．２ｍｌ）で処理後の上皮厚に対する効果を示す図。図１１Ｂ：高濃度のＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ）で処理後の上皮厚に対する効果を示す図。
【図１２】
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５を低濃度（０．１ｍｇ／０．２ｍｌ）または高濃度（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ）でＤＭＢＡで処理して４週後の上皮厚の増加率を示す図。
【図１３】
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５を低濃度（０．１ｍｇ／０．２ｍｌ）または高濃度（０．３ｍｇ／０．２ｍｌ）でＤＭＢＡで処理して８週後の乳頭腫の減少率を示す図。
【図１４】
マウスＨ−ｒａｓコドン６１突然変異の増幅を示すＰＣＲ反応のオートラジオグラフを示す図。
【図１５】
アカシア・ビクトリアエから得られた生物学的に活性のあるトリテルペン組成物を精製及び単離するために用いられる初期段階の方法を示す図。
【図１６】
アカシア・ビクトリアエから得られた活性成分の精製、単離、及び特徴づけのための一般的で改良されたスキームを示す図。
【図１７Ａ、Ｂ】
図１７Ａ：フラクション９４（ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４またはＦ０９４）に見られる活性加水分解物から単離されるアセチル化糖のＨＰＬＣスペクトルを示す図。図１７Ｂ：Ｆ０９４に見られる活性加水分解物から単離されるアセチル化糖のＨＰＬＣスペクトルを示す図。
【図１８Ａ−Ｆ】
図１８Ａ：ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５及びＦ０３５−Ｂ２のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１８Ｂ：ＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１８Ｃ：Ｆ１４０のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１８Ｄ：Ｆ１４２のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１８Ｅ：Ｆ１４４のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１８Ｆ：Ｆ１４５のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図１９Ａ、Ｂ】
フラクション３５で前処理及び後処理（４８時間）したＯＶＣＡＲ−３細胞の細胞周期分析を示す図。細胞周期Ｇ１期の細胞数は８％の増加、フラクション３５で後処理した細胞周期Ｓ期の細胞数は１０％の減少で、Ｇ１アレストを示している。図１９Ａ：未処理のＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞の細胞周期分析。図１９Ｂ：フラクション３５で処理したＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞の細胞周期分析。
【図２０】
細胞をＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５及びＵＡ−ＢＲＦ−００４Ｐｏｄ−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０９４に暴露することによるＴＮＦ活性化ＮＦ−κＢの顕著な抑止を提示しているＥＭＳＡを示す図。処理は以下のとおり：レーン１、未処理；レーン２、ＴＮＦ（１００ｐＭ）；レーン３、；ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５（１μｇ／ｍｌ）レーン４、ＴＮＦ＋Ｆ０３５（１μｇ／ｍｌ）；レーン５、Ｆ０３５（２μｇ／ｍｌ）；レーン６、ＴＮＦ＋Ｆ０３５（２μｇ／ｍｌ）；レーン７、Ｆ０９４（１μｇ／ｍｌ）；レーン８、ＴＮＦ＋Ｆ０９４（１μｇ／ｍｌ）；レーン９、Ｆ０９４（２μｇ／ｍｌ）；レーン１０、ＴＮＦ＋Ｆ０９４（２μｇ／ｍｌ）。
【図２１】
ＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５及びワートマニンによるＰ１３−キナーゼの抑止を提示する脂質キナーゼ・アッセイを示す図。
【図２２】
リン酸に特異的なＡＫＴ及び完全なＡＫＴ抗体を使ってウエスタンＥＣＬで分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図。１及び２μｇ／ｍｌのＵＡ−ＢＲＦ−００４−ＤＥＬＥＰ−Ｆ０３５で細胞を後処理したところ、ＡＫＴリン酸化反応（活性ＡＫＴ）の顕著な抑止が引き起こされ、１μＭのワートマニンで２時間処理した細胞に類似していた。
【図２３】
４つの独立的に形質転換させた根部のクローンから得られたｒｏｌＢ遺伝子の一部のＰＣＲＴＭ増殖を開示する図。（レーン、左から右へ、１：Ｋｂラダー、２：ポジティブ・コントロール（Ｒ１０００株から得られたプラスミドＤＮＡ）、３：ネガティブ・コントロール（非形質転換の根部から得られたＤＮＡ）、４−７：４つの独立的に形質転換させた根部のクローン。ポジティブ・コントロール及び形質転換された根部の６４５塩基断片の増幅に注意。
【図２４】
エリプトサイドＡ及びエリプトサイドＥの構造（Ｂｅｕｔｌｅｒ， １９９７）。
【図２５】
Ｆ０９４内成分のＨＰＬＣ分離。
【図２６】
Ｆ０３５内成分のＨＰＬＣ分離。
【図２７】
Ｆ０９４のセミ・プレップＨＰＬＣによる第１分画。
【図２８】
Ｆ０９４のセミ・プレップＨＰＬＣによる第２分画。
【図２９】
Ｆ０９４の予備画分。
【図３０】
予備フラクションＤの分析。
【図３１】
予備フラクションＧ／Ｈの分析。
【図３２】
第２のＰＦＰカラム精製後の化合物Ｇ１。
【図３３】
最終のＣ−１８精製後の化合物Ｇ１。
【図３４】
ＷａｔｅｒｓＣ−１８カラム精製後の化合物Ｄ１。
【図３５】
最終のＣ−１８−Ａｑ精製後の化合物Ｄ１。
【図３６】
化合物Ｄ１の分解から得られる化合物を示す。
【図３７】
化合物Ｇ１の分解から得られる化合物を示す。
【図３８】
化合物Ｂ１の分解から得られる化合物を示す。
【図３９】
トリテルペン・グリコシドＤ１の構造を示す図。
【図４０】
トリテルペン・グリコシドＧ１の構造を示す図。
【図４１】
トリテルペン・グリコシドＢ１の構造を示す図。
【図４２】
癌細胞株及び正常細胞株に対するトリテルペン・グリコシド（Ｆ０３５）の混合物の効果を示す図。Ｆ０３５を実施例で述べられた手順によって細胞毒性について評価した。Ｆ０３５の活性を癌及び正常細胞株のパネル上で調べた。ＩＣ５０は癌細胞株に対して０．２−５．８μｇ／ｍｌの範囲であった。正常及び不死化細胞株に有意な細胞毒性は観察されなかった（ＩＣ５０１５μｇ／ｍｌから＞２５μｇ／ｍｌ）。
【図４３】
ヒト・癌細胞株上での精製されたトリテルペン・グリコシドＤ１及びＧ１の細胞毒性プロフィールを示す図。精製された抽出物は以下のヒト・癌細胞株上でその活性が評価された：Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）、Ｃ−２Ｈｅｙ変異株（卵巣）、７６９−Ｐ（腎臓）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（乳腺）。その結果を平均値＋ＳＥＭで示す。
【図４４】
精製された化合物Ｄ１とＧ１、及びトリテルペン・グリコシド混合物（Ｆ０３５）のアポトーシスに対する効果を示す図。アポトーシスはアネキシンＶ結合アッセイを使って測定し、細胞の染色にはアネキシンＶ−ＦＩＴＣを使い、ＤＮＡの内容物にはヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使い、フロー・サイトメトリーで分析した。細胞を０．５−１．０μｇ／ｍｌの抽出物で１６時間培養した。１６時間の処理後、３つの細胞群を観察した。すなわち、死滅またはアポトーシス末期の細胞（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩがポジティブ）、アポトーシスの最中にある細胞（アネキシンＶ−ＦＩＴＣはポジティブ、ＰＩはネガティブ）、生存細胞及びアポトーシスが起きていない細胞（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩがネガティブ；左下部分）である。
【図４５Ａ、Ｂ】
Ｐ１３−キナーゼ活性及びＡＫＴリン酸化反応の抑止を示す図。ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）をリン酸化する能力を細胞溶解物から得たｐ８５蛋白質免疫沈降について測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏのキナーゼ・アッセイのオートラジオグラムをＪｕｒｋａｔ細胞を使ったｐ８５免疫沈降について薄層クロマトグラフィーに分離した。図４５Ｂ：粗製及び精製トリテルペン・グリコシドを使ったＳｅｒ−４７３及びＴｈｒ−３０８についてのＡＫＴリン酸化反応の抑止。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＤ１及びＧ１の粗製（Ｆ０３５）及び精製抽出物を使って３７℃で１６時間培養した。細胞溶解物を９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに消散させ、プローブとして抗Ｓｅｒ−４７３，Ｔｈｒ−３０８及び完全なＡＫＴ抗体を使ったウエスタン・ブロットＥＣＬによって分析した。
【図４６Ａ−Ｄ】
トリテルペン・グリコシドを使ったＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢの抑止及びｉＮＯＳの誘導を示す図。Ｊｕｒｋａｔ細胞を異なる濃度のＦ０３５（１−４μｇ／ｍｌ；図４６Ａ）及び２μｇ／ｍｌの純抽出物（Ｄ１及びＧ１；図４６Ｂ）に１６時間暴露し、ＮＦ−κＢを１００ｐＭのＴＮＦで３７℃で１５分間活性化した。そのＤＮＡ−蛋白質複合体を７．５％の天然ポリアクリルアミド・ゲル上で分離し、放射バンドをホスホイメージャを使って視覚化して計量した。ＮＯＳを方法の項で述べられているようにＵ−９３７（図４６Ｃ）及びＪｕｒｋａｔ（図４６Ｄ）内で誘導した。細胞蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに消散させ、抗ｉＮＯＳ抗体を使ったウエスタン・ブロットＥＣＬで分析した。
【図４７】
Ｊｕｒｋａｔ細胞内のＰＡＲＰ分裂に対するＦ０３５及びＤ１の効果を示す図。
【図４８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞内のＦ０３５誘導ＰＡＲＰ分裂に対するｚ−ｖａｄ  ｆｍｋの効果を示す図。
【図４９】
Ｊｕｒｋａｔ細胞内のカスパーゼ活性に対するＦ０３５、Ｆ０９４、Ｄ１及びＧ１の効果を示す図。
【図５０】
Ｊｕｒｋａｔミトコンドリアから得られたシトクロム放出に対するＦ０３５の効果を示す図。
【図５１Ａ、Ｂ】
ＴＮＦに対するＦ０９４及びモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果はＮＦ−κＢの活性を誘導する。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４（図５１Ａ）またはモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１（図５１Ａ）で３７℃で１−１６時間処理した。その処理の最後に、細胞を洗浄し、完全培地で２ｘ１０５／ｍｌで再懸濁させ、１ｎＭのＴＮＦで３７℃で１５分間処理した。実施例の項で述べられたように核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢの活性をアッセイした。
【図５２Ａ、Ｂ】
図５２Ａ：ＴＮＦ抑止の用量反応はモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１によるＮＦ−κＢの活性を誘導する。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を異なる濃度のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で３７℃で１６時間処理した。その処理の最後に、細胞を洗浄し、完全培地で２ｘ１０６／ｍｌで再懸濁させ、１ｎＭのＴＮＦで３７℃で１５分間処理した。実施例の項で述べられたように核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢの活性をアッセイした。図５２Ｂ：ＮＦ−κＢのスーパーシフト及び特異性の分析。
ＴＮＦ処理細胞から得られた核抽出物を突然変異体ＮＦ−κＢオリゴ、ラベルされていないオリゴ、抗ｐ６５抗体、及びウサギの免疫前血清で１５分間培養した。その後実施例の項で述べられたようにＮＦ−κＢの活性をアッセイした。
【図５３Ａ、Ｂ】
モノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１のＴＮＦに対する効果はＩκＢα（図５３Ａ）及びｐ６５（図５３Ｂ）の核転座を誘導する。Ｊｕｒｋａｔ細胞をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１（２μｇ／ｍｌを１６時間）処理し、洗浄し、１ｎＭのＴＮＦで異なる回数培養した。これらの細胞の細胞質及び核の抽出物を実施例の項で述べられたようにウエスタン・ブロット分析によってＩκＢα及びｐ６５のレベルをそれぞれ調べるために用いた。
【図５４Ａ、Ｂ、Ｃ】
ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合に対するモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの添加の効果を示す図。ＴＮＦ誘導Ｊｕｒｋａｔ細胞から得られた抽出物を異なる濃度のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で３７℃で３０分間処理し、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ結合を分析した。図５４Ｂ：デゾキシコレート（ＤＯＣ）に対するモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果はＮＦ−κＢの活性を誘導した。未処理細胞から得られた細胞質抽出物をモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の存在下または非存在下でＤＯＣで処理し、その後ＮＦ−κＢの活性を分析した。図５４Ｃ：ＮＦ−κＢ活性のモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１誘導抑止に対するＤＴＴの効果。
【図５５Ａ、Ｂ】
図５５Ａ：ＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼの遺伝子発現活性に対するモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果。Ｊｕｒｋａｔ細胞を電気穿孔法によってｐＧＬ３−ＮＦ−κＢで形質転換した。ＮＦ−κＢをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）、またはＴＮＦ（１ｎＭ）を使って活性化した。ルシフェラーゼの活性をルシフェラーゼ・アッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて、その製造メーカーの使用説明に従って測定した。図５５Ｂ：ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２のＬＰＳ誘導発現に対するＦ０９４及びモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１の効果。Ｆ０９４及びモノテルペン／トリテルペン・グリコシドＧ１で前処理したＲＡＷ２６４．７細胞を方法の項で述べられたようにＬＰＳを用いて処理した。ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の発現はウエスタン・ブロット分析を使ってこれらの細胞の細胞質抽出物内でアッセイした。
【図５６】
（図５６Ａ）アビシンのＨＰＬＣプロファイル。（図５６Ｂ）アビシンＤ及びアビシンＧの化学構造。
【図５７】
Ｆ０９４あるいはアビシン処理されたＪｕｒｋａｔ細胞内のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０５／ｍｌ）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４、アビシンＤ及びアビシンＧで種々の時間をかけて処理した。細胞をフロー・サイトメトリーによって染色し、分析した。
【図５８】
ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出に対するＦ０９４またはアビシンの効果。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０７）をＦ０９４、アビシンＤまたはアビシンＧ（全て２μｇ／ｍｌ）で３７℃で指示された時間処理した。細胞を均一化し、溶解物をウエスタン・ブロット分析によってシトクロムｃについてアッセイした。
【図５９】
（図５９Ａ）無細胞系のＪｕｒｋａｔ細胞のミトコンドリアの一部から得られたシトクロムｃ放出の反応速度。ミトコンドリアを方法の項で述べられているように単離した。アビシンＧ（２μｇ／ｍｌ）処理を３７℃で０、１、２、５、１０、及び２０分間行った。（図５９Ｂ）アビシンＧの用量反応はシトクロムｃの放出を誘導した。単離されたミトコンドリアを異なる濃度のアビシンＧで３７℃で１０分間処理した。（図５９Ｃ）アビシンＧに対するカスパーゼ阻害因子の効果はシトクロムｃの放出を誘導した。単離されたミトコンドリアをＤＥＶＤ−ＣＨ２Ｆ（２５μＭ）及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）で３７℃で５分間前処理した。その後アビシンＧ（２μｇ／ｍｌ）で３７℃で１０分間処理した。シトクロムｃの放出をウエスタン・ブロットで分析した。
【図６０】
（図６０Ａ）カスパーゼ３活性の反応速度をＦ０９４またはアビシンによって誘導した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４、アビシンＤ及びアビシンＧで種々の時間をかけて処理した。これらの細胞のサイトソル抽出物内のカスパーゼ３活性を判定した。（図６０Ｂ）Ｆ０９４またはアビシンによるＰＡＲＰの分裂。Ｊｕｒｋａｔ細胞（３ｘ１０６）を２μｇ／ｍｌの上記薬剤で指示された時間処理した。細胞溶解物を調製し、ＰＡＲＰの分裂についてアッセイした。（図６０Ｃ）Ｆ０９４またはアビシンで誘導されるＰＡＲＰ分裂に対するｚＶＡＤ−ｆｍｋ処理の効果。細胞（３ｘ１０５）を±ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００  μＭ）で３７℃で１時間培養し、その後Ｆ０９４またはアビシンで３７℃で４時間処理した。
【図６１】
ミトコンドリア膜電位に対するＦ０９４またはアビシンの効果。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０６／ｍｌ）を２μｇ／ｍｌのＦ０９４、アビシンＤ、及びアビシンＧで種々の時間をかけて処理した。細胞をＤｉＯＣ６で染色し、フロー・サイトメトリーで分析した。
【図６２】
反応性酸素種の生成に対するＦ０９４またはアビシンの効果。Ｊｕｒｋａｔ細胞（５ｘ１０４／ｗｅｌｌ）を１、２、及び４μｇ／ｍｌのそれぞれＦ０９４、アビシンＤ、及びアビシンＧで処理した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ−Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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