(57)【要約】免疫反応の誘導によって悪性腫瘍を治療する方法が見出された。一態様において、本発明は、腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む有効量のワクチンを投与することを含む悪性腫瘍を治療する方法である。他の実施形態において、このワクチンは、患者において抗原提示細胞を標的とする腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を含む。このワクチンは、患者の免疫能力を求めるために用いられるコントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。血液のワクチン誘導免疫反応の評価は、治療有効性の予測因子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、少なくとも２種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、前記ワクチンが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
【請求項３】
哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法。
【請求項４】
哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
【請求項５】
哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも２種の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項６】
哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも２種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
【請求項７】
哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法。
【請求項８】
哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項１、３、５、または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞が、ＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記樹状細胞が、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記樹状細胞が、自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生され、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項１、２、３、４、５、６、７、または８に記載の方法。
【請求項１４】
コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項１０、１１、または１２に記載の方法。
【請求項１６】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも２種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を負荷した抗原提示細胞を含み、
第１の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも１時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項１７】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第１の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも１時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項１８】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも２種以上のワクチン接種のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、
第１の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも１時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項１９】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも２種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を含むワクチン接種用ベクターを含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、
第１の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも１時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項２０】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第１の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも１時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項２１】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第１の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも１時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項２２】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を含むワクチン接種用のベクターを含み、
第１の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも１時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項２３】
ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤であり、
第１の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも１時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。
【請求項２４】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項１６、１７、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原提示細胞が、ＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記樹状細胞が、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記樹状細胞が、自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生され、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
２種以上の免疫反応から対象の臨床転帰を予測する方法であって、
（ａ）臨床反応によって分類された以前に治療された対象と比較する個別のグループとしてその対象を同定する段階、
（ｂ）すべてのプロファイルの対に関して、第２のプロファイルと比較した第１のプロファイルの順序を（ａ）上位、（ｂ）下位、（ｃ）同位、または（ｄ）未決定として判定することによってすべてのプロファイルを半順序付けする段階であって、半順序付けが、各変数に関して第１のプロファイルが上位または同位であり、少なくとも１つの変数に関して第１のプロファイルが上位である場合、第１のプロファイルを上位とすることを含む段階、
（ｃ）すべての対の半順序付けに適合するすべての順位を算出する段階であって、２つの順序付けされた対象のうち上位である対象に高い順位が付与される段階、
（ｄ）順位を平均することによって各プロファイルに関してスコアを求める段階、および
（ｅ）その平均スコアが対象のプロファイルのスコアにもっとも類似しているグループを選択することによって臨床転帰を予測する段階を含む方法。
【請求項２９】
ＣＤ３４樹状細胞を産生する方法であって、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養する段階を含む方法。
【請求項３０】
ＣＤ３４樹状細胞を産生する方法であって、自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養する段階を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない方法。
【請求項３１】
腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、前記抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、前記組織培養が異種血清成分を含まないワクチン。
【請求項３２】
腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、前記抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、前記組織培養が自己血清を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていないワクチン。
【請求項３３】
２種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、前記抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、前記組織培養が異種血清成分を含まないワクチン。
【請求項３４】
２種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、前記抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、前記組織培養が自己血清を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていないワクチン。
【請求項３５】
哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上のベクターを含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍を治療する方法としてのワクチン特異免疫反応を含む血液免疫反応の誘出に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年３月９日出願の米国仮特許出願第６０／２７４６７９号の利益を主張するものである。
【０００３】
この１０年のヒト癌抗原の分子同定は（Ｋｎｕｔｈ等、１９８９、「Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２８０４〜２８０８、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ等、１９９１、「Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３〜１６４７、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．１９９１、「Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：１７５〜１８２）、それらの抗原を特異的に標的とする抗原特異癌免疫療法の新時代の到来を告げた（Ｃｅｌｌｕｚｚｉ等、１９９６、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＴＬ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２８３〜２８７、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ等、１９９６、「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，Ｂ７  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：８７〜９７、Ｓｏｇｎ、Ｊ．Ａ．１９９８、「Ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｇｌａｓｓ  ｉｓ  ｈａｌｆ  ｆｕｌｌ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：７５７〜７６３、Ｇｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９９、「Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２６３〜２７０）。しかしながら、いくつかのそのようなアプローチ（たとえば、ペプチド、ＤＮＡワクチン、およびウイルスベクター）は、実際の患者治療においてほとんど、またはまったく成功していない（Ｇｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２６３〜２７０、Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｄ．Ｍ．１９９８、「Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：５２５〜５３１、Ｆｏｎｇ、Ｌ．およびＥｎｇｌｅｍａｎ、Ｅ．Ｇ．２０００、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：２４５〜２７３）。特に、同時に複数の腫瘍抗原を用いてヒトを免疫するのが困難であることが示されている。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫反応を開始し、調節するように特殊化された抗原提示細胞である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｒ．Ｍ．１９９１、「Ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：２７１〜２９６、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等、２０００、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７６７）。アジュバントとしてのそれらの臨床上の使用は、血液単球（Ｒｏｍａｎｉ等、１９９４、「Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：８３〜９３、Ｓａｌｌｕｓｔｏ、Ｆ．およびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ａ．１９９４、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ａｎｄ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１１０９〜１１１８）またはＣＤ３４＋前駆細胞（Ｃａｕｘ等、１９９２、「ＧＭ−ＣＳＦ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８〜２６１）から培養において多数の樹状細胞を産生する方法の発達によって促進されてきた。米国特許第６００４８０７号は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清を補足した組織培地を用いるＣＤ３４造血前駆細胞からの樹状細胞の産生を教示している。動物モデルにおいて、ＴＡＡ負荷ＤＣは防御／拒絶抗腫瘍反応を誘導することが報告されている（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ等、１９９６、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：４６５〜４７２、Ｆｌａｍａｎｄ等、１９９４、「Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：６０５〜６１０、Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ等、１９９５、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １：１２９７〜１３０２、Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ等、１９９７、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｒｖｅ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉ��ｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １５：９４〜１０３、Ｐｏｒｇａｄｏｒ、Ａ．およびＧｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９５、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：２５５〜２６０、Ｓｏｎｇ等、１９９７、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：１２４７〜１２５６、Ｓｐｅｃｈｔ等、１９９７、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：１２１３〜１２２１、Ｔｏｅｓ等、１９９６、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：３７８２〜３７８７）。
【０００５】
いくつかの進行中の臨床試験および報告された臨床試験は、ヒト癌においてワクチンとしてＴＡＡ負荷ＤＣを用いている（Ｇｉｌｂｏａ、Ｅ．１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２６３〜２７０、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｍ．およびＬｅｖｙ、Ｒ．１９９９、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ５０：５０７〜５２９、Ｐａｌｕｃｋａ等、１９９９、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｙ」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＯＥＭ  Ｄｒｕｇｓ、Ｇｉｌｂｏａ等、１９９８、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４６：８２〜８７、Ｂｅｌｌ等、１９９９、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７２：２５５〜３２４、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等、２０００、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７６７〜８１２）。予備試験においていくつかの反応が報告されており、（ｉ）リンパ腫イディオタイプ負荷血液由来ＤＣの注射に基づく先駆的研究（Ｈｓｕ等、１９９６、「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：５２〜５８）、（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦを用いて単球を培養することによって産生されたペプチドパルスＡＰＣの投与（Ｍｕｋｈｅｒｊｉ等、１９９５、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：８０７８〜８０８２）、（ｉｉｉ）メラノーマペプチド負荷単球由来ＤＣによるワクチン接種（Ｎｅｓｔｌｅ等、１９９８、「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：３２８〜３３２、Ｔｈｕｒｎｅｒ等、１９９９、「Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｅ−３Ａ１  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｍａｔｕｒｅ，ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ＩＶ  ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：１６６９〜１６７８）、および（ｉｖ）前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）ペプチドパルス単球由来ＤＣの注射（Ｓａｌｇａｌｌｅｒ等、１９９８、「Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ−Ａ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）」、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３５：１４４〜１５１）を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ワクチンの有効性の判定は、免疫療法プロトコルにおいてもっとも難しいパラメータの１つである。最終的な有効性は、腫瘍退縮の割合、無病生存期間、または少なくとも無増悪期間によって測定されるべきであるが、これらのエンドポイントは充分に長い追跡を必要とする。したがって、所与の免疫療法アプローチが適切であるかどうかを断定するためには、これらの有効性の条件に基づく数年の臨床試験が必要である。そのため、早期の測定を可能にし、臨床転帰を予測するいわゆる「代替マーカ」の研究が進行中である。現時点で、腫瘍および／またはワクチン特異免疫反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、代替マーカとして適切であることは示されていない（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｐ．２０００、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ」、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：３６３〜３６６に報告）。さらに、血液などのもっとも容易に得られる器官において測定された反応は不適切であると考えられている。実際、大多数の試験において、誘発された免疫反応と臨床反応との間には大きな違いがあり、ほとんど相関は見出されない。これらの所見は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞の存在ならびに腫瘍退縮に注目する腫瘍病変部のバイオプシーなどの別法の開発を促した。しかしながら、そのようなアプローチは、得られる病変部が限られており、ゲノム解析を行うことのできる医療施設も少数に限られている。さらに、単離Ｔ細胞は通常、その特異性および機能性を評価するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅および困難な技術を要する。したがって、そのような方法は、大規模な臨床試験に有用でなく、成功していないアプローチの早期判定を可能にするとは思われない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ワクチン特異的な免疫反応を含む血液免疫反応の誘出と臨床反応との関係に基づく悪性腫瘍の治療方法がここに見出された。患者の経時的な総腫瘍免疫スコアの測定は、時宜を得て治療の有効性を予測し、患者の臨床転帰をモニターする手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【０００９】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、少なくとも２種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、そのワクチンが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１０】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１１】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、ベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１２】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも２種の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをその哺乳動物に投与することを含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１３】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも２種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１４】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１５】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の２種以上のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、ベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【００１６】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも２種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を負荷した抗原提示細胞を含み、第１の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも１時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【００１７】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第１の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも１時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【００１８】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも２種以上のワクチン接種のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、第１の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも１時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【００１９】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも２種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を含むワクチン接種用ベクターを含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、第１の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第１サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも１時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、１以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【００２０】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第１の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも１時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【００２１】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第１の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも１時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはＣＤ３４＋造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【００２２】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を含むワクチン接種用のベクターを含み、第１の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも１時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【００２３】
他の態様において、本発明は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが２種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤であり、患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも１時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも２種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【００２４】
他の態様において、本発明は、２種以上の免疫反応から対象の臨床転帰を予測する方法であって、臨床反応によって分類された以前に治療された対象と比較する個別のグループとしてその対象を同定する段階、すべてのプロファイルの対に関して、第２のプロファイルと比較した第１のプロファイルの順序を上位、下位、同位、または未決定として判定することによってすべてのプロファイルを半順序付けする段階であって、各変数に関して第１のプロファイルが上位または同位であり、少なくとも１つの変数に関して第１のプロファイルが上位である場合、第１のプロファイルを上位とすることを半順序付けが含む段階、すべての対の半順序付けに適合するすべての順位を算出する段階であって、２つの順序付けされた対象のうち上位である対象に高い順位が付与される段階、順位を平均することによって各プロファイルに関してスコアを求める段階、およびその平均スコアが対象のプロファイルのスコアにもっとも類似しているグループを選択することによって臨床転帰を予測する段階を含む方法である。
【００２５】
他の態様において、本発明は、ＣＤ３４樹状細胞を産生する方法であって、異種血清成分の不在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養する段階を含む方法である。
【００２６】
他の態様において、本発明は、ＣＤ３４樹状細胞を産生する方法であって、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてＣＤ３４造血前駆細胞を培養する段階を含む方法である。
【００２７】
他の態様において、本発明は、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、その抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、組織培養が異種血清成分を含まないワクチンである。
【００２８】
他の態様において、本発明は、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、その抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、その組織培養が組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清を含むワクチンである。
【００２９】
他の態様において、本発明は、２種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、その抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、その組織培養が異種血清成分を含まないワクチンである。
【００３０】
他の態様において、本発明は、２種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された１種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、その抗原提示細胞がＣＤ３４造血前駆細胞の組織培養から単離されたＣＤ３４樹状細胞であり、その組織培養が組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清を含むワクチンである。
【００３１】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも２種以上のベクターを含むワクチンである。
【００３２】
本発明は、免疫反応の誘導によって悪性腫瘍を治療する方法を対象とする。本発明によれば、ワクチン特異免疫反応を含む血液免疫反応の誘出は、悪性腫瘍の治療における臨床反応と関連している。血液のワクチン誘導免疫反応の評価は、治療有効性の予測因子を提供する。
【００３３】
本発明の重要な態様は、免疫反応の誘導による悪性腫瘍治療の多面的アプローチの新規かつ統合的な概念である。この新規なアプローチは、以下に示す４つの重要な要因の少なくとも２つを取り入れる。１）ワクチン接種の適切な様式またはベクター、たとえば樹状細胞の使用、２）複数の腫瘍関連抗原の使用、３）コントロール抗原の使用、および４）複数の簡易なアッセイを用いる誘出免疫反応の総体的評価である。
【００３４】
本発明において、ワクチンは、悪性腫瘍と診断された患者に疾患進行を低減させるために投与される。さらに、本発明のワクチンは、悪性腫瘍の個々の発生確率を低減するために予防的に投与することができる。
【００３５】
本発明の方法において、これに限定されるものではないが、転移性メラノーマを含む腫瘍疾患を有する患者に、これに限定されるものではないが、ＣＤ３４＋前駆細胞由来の自己ＤＣを含むワクチン接種用の適切なベクターを皮下注射する。このワクチン接種用ベクターは、複数の腫瘍抗原、たとえば複数のメラノーマ抗原由来のペプチド（たとえば、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−３、およびｇｐ１００）を含有する。このワクチン接種用ベクターは、これに限定されるものではないが、コントロール抗原、たとえばインフルエンザマトリクスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）、またはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む他の抗原を含むこともできる。本発明の方法の一実施形態において、ワクチン接種用の単一ベクターは、これに限定されるものではないが、腫瘍抗原を含む複数の抗原、および任意選択でコントロール抗原を含有する。本発明の他の実施形態において、抗原は、それぞれ単一抗原を含有する複数のベクターの投与によって送達することができる。予防的治療に関しては、類似のプロトコルが用いられるであろう。
【００３６】
本発明において用いられるワクチン接種用ベクターには、これに限定されるものではないが、ＣＤ３４造血前駆細胞から産生された樹状細胞が含まれ、たとえばこれに限定されるものではないが、ランゲルハンス細胞、および間質樹状細胞が含まれる。ワクチン接種に用いられるベクターは、樹状細胞、または他の抗原提示細胞からなることができ、あるいはこのワクチンは患者に送達されるとき、樹状細胞、または他の抗原提示細胞を標的とすることができる。
【００３７】
本発明の重要な態様は、それらの樹状細胞を患者に注入することを可能にする条件下で、ワクチン接種用ベクターとして用いられる樹状細胞を産生する新規な方法である。本発明の方法によれば、樹状細胞は、ウシ胎児血清などの異種血清成分を補足していない組織培地において培養することによってＣＤ３４造血前駆細胞から産生される。この組織培地は血清成分を含有しないか、あるいは自己血清が補足されている。本発明の方法において、自己血清は熱不活性化されておらず、５％または１０％（ｖ／ｖ）で用いることができる。本発明の方法において、ＣＤ３４造血前駆細胞は、好ましくは９日間培養される。本発明の組織培養において形成されるすべての細胞は、ワクチン接種用のベクターとみなされる。
【００３８】
本発明に用いられるワクチンは、血液免疫反応を誘導する任意の組成物であることができる。好ましくは、このワクチンは、いくつかの腫瘍抗原を含むいくつかの抗原からなる。代表的な腫瘍抗原には、４種のメラノーマ抗原、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、およびＭＡＧＥ−３が含まれる。他の代表的な抗原には、コントロール抗原、たとえばウイルス抗原、フルマトリクスペプチド、またはタンパク抗原（たとえばＫＬＨ）が含まれる。
【００３９】
本発明の方法において、これに限定されるものではないが、ＫＬＨおよびフルマトリクスペプチドを含むコントロール抗原に対する免疫反応は、患者の免疫能力を示し、腫瘍抗原に対する免疫反応を予測する。これに限定されるものではないが、ＫＬＨおよびフルマトリクスペプチドを含むコントロール抗原に対する反応の欠如は、腫瘍抗原に対する反応の欠如、および早期の疾患進行を予測する。
【００４０】
本発明の方法において、このワクチンは、たとえば「自然」増殖のような未同定抗原に対する免疫反応の誘導をもたらす。それらの未同定抗原は、ワクチン製剤に存在するか、あるいはワクチン接種の過程で誘導される可能性がある。本発明によれば、そのような抗原に対する免疫反応は、患者の免疫能力を示し、腫瘍抗原に対する患者の免疫反応を予測する。これに限定されるものではないが、ワクチン製剤に存在するか、あるいはワクチン接種の過程で誘導された未同定抗原を含むそのような抗原に対する免疫反応はさらに臨床反応を予測する。
【００４１】
本発明におけるワクチン投与の経路には、これに限定されるものではないが、皮下、皮内、または真皮内注射が含まれる。本発明において、患者は、一生涯、または悪性腫瘍の進行までワクチン投与されるべきである。悪性腫瘍進行の場合、そのワクチンは改変されるべきであり、これに限定されるものではないが、新規な抗原の使用を含む。予防的治療に関しては、類似のプロトコルが用いられるであろう。
【００４２】
本発明において、ワクチン治療は、少なくとも２つの期からなり、これに限定されるものではないが誘導期、および強化期を含む。誘導期において、ワクチンは短い間隔で投与され、好ましくは、これに限定されるものではないが隔週である。強化期において、ワクチンは長い間隔で投与され、好ましくは、これに限定されるものではないが月に１回である。強化期に次いでブースター免疫処置を行うことができ、好ましくは、これに限定されるものではないが３〜６月毎である。
【００４３】
本発明において、コントロール抗原および腫瘍抗原に対して誘出された免疫の総体的評価は、当分野で知られている任意の手段によって求めることができる。たとえば、ＰＢＭＣ増殖アッセイを用いることができ、このアッセイでは免疫前および免疫後に患者から得たＰＢＭＣを、外因性抗原を添加せずに、あるいは抗原の存在下で培養し、次いでＴ細胞増殖を求める。別の方法では、これに限定されるものではないが、血中エフェクターＴ細胞（一晩のアッセイ）、および血液記憶Ｔ細胞（簡易リコールアッセイ）を含む、腫瘍抗原に特異的な機能性Ｔ細胞の存在を求めるためにＥＬＩＳＰＯＴを用い、これはワクチン接種試験における早期臨床転帰を予測する。好ましくは、メラノーマ抗原に対する誘出免疫反応は以下の２つのレベルで求める。１）一晩のアッセイにおける血中エフェクターＴ細胞、および２）単一ｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞刺激を用いる１週間リコールアッセイにおける記憶Ｔ細胞である。
【００４４】
本発明の方法によれば、ワクチン投与の頻度は、第１回ワクチン接種後、好ましくは５日目および１４日目における血液免疫反応の評価に基づいて個別に決定することができる。このような早い時期に免疫反応が存在することは、患者が誘導期に低頻度、たとえば月に１回ワクチン接種を必要としていることを明らかにする。この時期に免疫反応が存在しないことは、患者が誘導期により高頻度、好ましくは隔週のワクチン接種を必要としていることを明らかにする。
【００４５】
ある患者の総体的腫瘍免疫スコアの評価は、早期臨床転帰に関連している。治療の総体的な免疫学的効果は、好ましくは以下の方法の１つまたは両方によって評価される。１）周辺尤度スコアを用いて反応プロファイルを比較する方法、および／または２）これに限定されるものではないが、自然ＰＢＭＣ増殖（すなわち、外因性抗原を添加しない）の誘導の有無、コントロール抗原に対する免疫反応の誘導の有無、いずれかのアッセイにおけるメラノーマ抗原（ＭｅｌＡｇ）に対する免疫反応の誘導の有無、および／または２種を超えるメラノーマ抗原に対する免疫反応の誘導の有無を含む観察結果に応じて患者を分類する方法である。自然ＰＢＭＣ増殖の誘導は、ワクチン接種試験における早期の好ましい臨床転帰を予測する。自然ＰＢＭＣ増殖の不在は、ワクチン接種試験における早期疾患進行を予測する。これに限定されるものではないが血中エフェクターＴ細胞（一晩のアッセイ）および血液記憶Ｔ細胞（簡易リコールアッセイ）を含む、いずれかのアッセイでの少なくとも２種の腫瘍抗原に対する免疫反応の誘導は、ワクチン接種試験における早期の好ましい臨床転帰を予測する。これに限定されるものではないが血中エフェクターＴ細胞（一晩のアッセイ）および血液記憶Ｔ細胞（簡易リコールアッセイ）を含む、いずれかのアッセイでの２種未満の腫瘍抗原に対する免疫反応の存在は、ワクチン接種試験における早期疾患進行を予測する。
【実施例１】
【００４６】
誘出された免疫反応の臨床反応との比較
本発明の方法を評価するために、転移性メラノーマを有する１８名のＨＬＡ  Ａ＊０２０１＋患者に、別のランゲルハンス細胞成分を含む、ＣＤ３４＋前駆細胞由来の自己ＤＣを皮下注射した。ＤＣを、４種のメラノーマ抗原（ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−３、およびｇｐ１００）由来のペプチド、ならびにコントロール抗原としてインフルエンザマトリクスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）およびスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）でパルスした。ＫＬＨに関してＰＢＭＣ増殖アッセイを用い、ｆｌｕ−ＭＰおよびメラノーマ抗原（ＭｅｌＡｇ）に関してＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、誘出免疫反応を求めた。メラノーマ特異反応は、２つのレベル１）一晩のアッセイにおける血中エフェクターＴ細胞、および２）単一ｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞刺激を用いる１週間リコールアッセイにおける記憶Ｔ細胞において評価した。治療の総体的な免疫学的効果は、２つの方法１）周辺尤度スコアを用いる反応プロファイルの比較、および２）コントロール抗原、任意のアッセイでのＭｅｌＡｇ、および２種を超えるＭｅｌＡｇに対する反応の誘導に関する観察結果に応じた患者の分類によって評価した。
【００４７】
ＤＣは、１８名の患者のうち１６名で、コントロール抗原（ＫＬＨ、Ｆｌｕ−ＭＰ）に対する免疫反応を誘導した。同じ１６名の患者において、１種または複数のメラノーマ抗原（ＭｅｌＡｇ）に対する増強された免疫反応が認められ、これには２種を超えるＭｅｌＡｇに対して反応した１０名の患者が含まれる。本出願人等は最初に、ワクチン後アッセイにおける２倍超の増加、および１０を超える抗原特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを免疫反応の指標として用いた。いずれのアッセイによってもコントロール抗原およびメラノーマ抗原に反応しなかった２名の患者（＃３および＃１３）は、急速に腫瘍が進行し、計画された療法を完了できなかった。評価可能疾患を有する１７名の患者のうち、０、１、または２種のメラノーマ抗原に反応した７名の患者のうち６名は、試験開始１０週後の再ステージングにおいて進行性疾患を有した。対照的に、３種または４種すべてのメラノーマ抗原に反応した１０名の患者では１名にのみ腫瘍進行が認められた（ｐ＝０．００２、フィッシャー正確確率検定）。これらの患者のうち７名で１つを超える腫瘍転移の縮小が観察された。
【００４８】
ＤＣワクチン後の抗腫瘍免疫の総体的な評価を得るために、本出願人等は、直接およびリコールアッセイ両方による４種すべての抗原に対する絶対免疫反応データを、腫瘍免疫スコア（−８．５〜＋８．５）に統合した。評価可能疾患を有する１７名の患者のなかで、進行性疾患を有する７名の患者で腫瘍免疫が低かった（ｐ＝０．０４３）。腫瘍免疫スコアは、臨床転帰と関連した。負の腫瘍免疫スコアを有する８名の患者の６名が、進行性疾患を有した。他方、正の腫瘍免疫スコアを有する９名の患者のうち、１名のみが進行した。したがって、これらの分析は共に、ＤＣワクチン接種後の早期臨床転帰が誘出免疫反応に相関したことを示している。
【００４９】
材料および方法
試験デザインおよび適格性基準
この試験のスキームを図１に示す。組入れ基準は、バイオプシーによってＡＪＣＣのＩＶ期転移性メラノーマと診断；年齢１８歳以上；カルノフスキー全身状態＞８０％；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１表現型；流行性耳下腺炎、ヒストプラスマ症、またはストレプトキナーゼ抗原に対して皮内皮膚試験陽性；フローサイトメトリにより正常の血液ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞数；および量的に正常な免疫グロブリンレベルであった。試験除外基準は、試験開始前４週未満の前化学療法または生物療法；未治療ＣＮＳ病変；大きな肝臓転移病変；妊娠；または同時コルチコステロイドおよび／または免疫抑制療法であった。喘息、静脈血栓症、うっ血性心不全、自己免疫疾患、またはウイルス性肝炎を含む活動性感染症の病歴を有する患者も除外された。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを受け、さらに本試験は食品医薬品庁、国立癌研究所（ＮＣＩ）、および施設内治験審査委員会によって承認された。患者は、合計で４回のワクチン接種の間、１４日毎に抗原負荷ＣＤ３４ＤＣを皮下（ｓ．ｃ．）投与され、６週の外来患者ワクチン接種コースを受けた。ＤＣは、コホート毎投与量０．１、０．２５、０．５、および１×１０６ＤＣ／ｋｇ／注射の投与増加デザインで投与した。
【００５０】
ＤＣワクチンの調製および投与
ＤＣ前駆細胞の採取
末梢血幹細胞動員のために、患者に組換えＧ−ＣＦＳ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）１０μｇ／ｋｇ／日をｓ．ｃ．で５日間与え、次いで２日続けて白血球搬出を行って動員されたＣＤ３４＋ＨＰＣを集めた。ＣＥＰＲＡＴＥ  ＳＣ幹細胞濃縮システム（ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を用いて細胞を処理して、ＣＤ３４＋ＨＰＣの濃縮集団（純度６２±１７％、回収１５８±１３３×１０６）を得て、次いでそれを低温保存した。
【００５１】
ＤＣワクチンの調製
医薬品の安全性試験の実施に関する基準（ＧＬＰ）に従ってすべての手順を行った。自己血清、１０−５Ｍ２−β−メルカプトエタノール、および１％Ｌ−グルタミンを補足した濃度０．５×１０６／ｍｌの培地（Ｘ−ＶＩＶＯ−１５、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で培養することによって、ＣＤ３４＋ＨＰＣからＣＤ３４−ＤＣを産生した。臨床使用に承認された以下のヒト組換えサイトカインを用いた。ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、Ｆｌｔ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）、およびＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）である。培養は、各患者に割り当てた個別のインキュベータを用いて、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿インキュベータにおいて行った。培養の第８日に、細胞の２０％を一晩、ＫＬＨ（２μｇ／ｍｌ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限フルマトリクスペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ）ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ５８−６６（２．５μｇ／ｍｌ）でパルスした。残りの細胞を一晩、ＫＬＨ（２μｇ／ｍｌ）およびメラノーマ抗原由来の４種のＨＬＡ−Ａ２０１制限ペプチド（ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１２７−３５：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ｇｐ１００ｇ２０９−２Ｍ：ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ、チロシナーゼ３６８−３７６、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、ＭＡＧＥ−３２７１−２７９：ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）（２．５μｇ／ｍｌ）でパルスした。ペプチドはすべてＧＭＰ品質であり、ＮＣＩから得るか（ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、およびチロシナーゼ）、購入した（Ｆｌｕ−ＭＰおよびＭＡＧＥ−３、ＭｕｌｔｉＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。一晩抗原を負荷した後、ＣＤ３４−ＤＣを滅菌食塩水で３回洗浄し、カウントし、メラノーマペプチド（１μｇ／ｍｌ）を含有する滅菌食塩水１０ｍｌに再懸濁した。２２℃で２時間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、注射のために滅菌食塩水９ｍｌに再懸濁した。ワクチン放出基準には、１）ＤＣ注射４８時間前細菌培養陰性、２）抗原パルス後グラム染色陰性、３）ＤＣ投与２時間前Ｇｉｅｍｓａ染色サイトスピンでの樹状細胞形態、４）細胞生存率＞８０％、および５）表現型分析による判定で細胞製剤中ＤＣ（ＣＤ１ａ＋およびＣＤ１４＋）最小値２０％が含まれた。各ＤＣバッチのさらなる品質試験には、１）モノクローナル抗体のパネルとの反応性、および２）混合リンパ球反応における刺激能の判定が含まれた。
【００５２】
ワクチンの投与
ワクチン接種は、３つの注入部位（両大腿／上腕）に皮内投与した。所属リンパ節を外科手術によって除去および／または照射した四肢には注入しなかった。長脊髄針を用いてＤＣを注入し、６〜８ｃｍの距離に拡げた。
【００５３】
臨床モニタリング
ＮＣＩのＣｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａに従って有害事象にランクを付けた。すべての患者について、ベースラインおよび第４回のＤＣワクチン接種の４週間後（試験開始から１０週）に腫瘍状態の評価を行った。標的病巣における２５％超の増大および／または新しい病巣の発生を疾患の進行と定義した。
【００５４】
免疫学的モニタリング
ワクチン接種前の少なくとも２時点、ならびに各ワクチン接種後５および／または１４日、ならびに第４回のワクチン接種後１４または２８日の時点で、ＰＢＭＣサンプルを採取し、凍結した。免疫前および免疫後ＰＢＭＣを、アリコートに凍結し、コード化、解凍し、盲検法で共にアッセイした。
【００５５】
抗原特異増殖
ＰＢＭＣ（１０５細胞／ウェル）を、１〜１０μｇ／ｍｌの勾配用量のＫＬＨ、および陽性コントロールとしてブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）の不在下または存在下、トリプリケートのウェルで培養した。培養の第３日（ＳＥＡ）または５日（ＫＬＨ）に、分析物を一晩３Ｈチミジンでパルスし、１６時間後に採取した。
【００５６】
単一抗原特異Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ放出ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
抗原特異ＩＦＮ−γ生成Ｔ細胞を検出するためのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、以前に記載のとおり行った（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ等、１９９９、「Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１７３〜１８０、Ｄｈｏｄａｐｋａｒ等、２０００、「Ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｏｏｓｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ＣＤ８（＋）Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｈｅｌｐｅｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：Ｒ９〜Ｒ１４）。簡潔に述べると、ＰＢＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌのペプチド抗原の存在下または不在下、１０μｇ／ｍｌの１次抗ＩＦＮ−γｍａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）でプレコートしたプレートに添加した。抗原は、ＤＣワクチンに用いたものと同じＨＬＡ  Ａ＊０２０１制限ペプチド（４種のメラノーマペプチドおよびＦｌｕ−ＭＰ）であった。Ｔ細胞機能に関して、陽性コントロールとしてＳＥＡを用い、陰性コントロールとしてＨＬＡ  Ａ＊０２０１制限ｇａｇペプチドを用いた。一部の実験では、細胞収量に応じて、インフルエンザウイルス感染ＰＢＭＣ（ＭＯＩ２）をＡＰＣとして用いた。抗原特異ＳＦＣを、コントロールペプチドによるバックグラウンドを減じた後に算出した。抗原特異スポット形成細胞に関する免疫後測定値が基準より２倍超高く、１０超ＳＦＣ／２×１０５細胞である場合、免疫反応を正にスコアした。
【００５７】
抗原特異リコールＴ細胞反応
培養において抗原特異Ｔ細胞が増殖および分化する能力を評価するために、免疫前および免疫後ＰＢＭＣを共に解凍し、１μｇ／ｍｌペプチドでパルスした自己成熟ＤＣ（ＰＢＭＣ：ＤＣ比３０：１）を用いて７日間共培養（２×１０５細胞／ウェル）した。７日後、細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレートに移し、特異抗原を用い、または用いずに、照射（３０００ラド）Ｔ２細胞（Ｔ：ＡＰＣ比２０：１）を用いて一晩培養した。抗原特異ＳＦＣを、非パルスＴ２細胞によるバックグラウンドを減じた後に算出した。
【００５８】
遅延型過敏（ＤＴＨ）反応
過敏反応を試験するために、それぞれの抗原で個別にパルスした１０５ＣＤ３４−ＤＣを患者の背部に皮内注射し、４８時間で注入部位の硬変を測定した。
【００５９】
統計解析
ＫＬＨおよびＦｌｕ−ＭＰに対する特異免疫反応の存在を実証するために、離散データの符号検定を用いた（Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．Ｍ．１９９８、「Ｖｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｅｓ」、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ５４：７８９〜７９１）。防御免疫に関して異なるメラノーマ抗原の役割は知られていないので、本出願人等は、直接アッセイおよびリコールアッセイの両方で測定した４種すべてのメラノーマ抗原に対するワクチン接種後反応を、周辺尤度アプローチに基づくノンパラメトリック法を用いて免疫スコアに統合した（Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ、Ｊ．Ｄ．およびＰｒｅｎｔｉｃｅ、Ｒ．Ｌ．１９７３、「Ｍａｒｇｉｎａｌ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｃｏｘ’ｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｍｏｄｅｌ」、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ６０：２６７〜２７８、Ｗｉｔｔｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．Ｍ．１９８８、「Ｆｒｉｅｄｍａｎ−ｔｙｐｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｓ」、Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ  ８３：１１６３〜１１７０）。それらの免疫反応プロファイルに従ってｎ個の個体をスコア化するために、すべての対の順位付けに適合するすべての順位（数１〜ｎの順列）を算定する。その結果として、高い免疫反応を有する者は高い順位を付与される。８つの変数のそれぞれが少なくとも同程度に高く、少なくとも１つの変数がより高い場合、免疫反応はより高いとみなされる。患者の免疫スコアは、互換順位のなかの対応する順位の平均から期待されるスコアを引いたものである。免疫されたすべての患者を、「治療意図（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）」アプローチにおける解析に含めた。
【００６０】
本試験の結果を以下に要約する。
【００６１】
患者の特性
表Ｉは、患者の特性、ならびに開始時およびＤＣワクチン後の疾患状態を示す。化学療法にはＤＴＩＣ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ、およびＶｅｌｂａｎを含み、すべてのＣＮＳ病変は試験開始前に手術によって除去するか、照射されていた。ＬＮ：リンパ節、ＣＥ：臨床検査、ＰＤ：進行性疾患。患者＃４および＃８は、既往の軽度白斑を有し、ＤＣワクチン接種中に進行した。
【００６２】
転移性メラノーマを有する１８名のＨＬＡ−Ａ２０１＋患者に、ＣＤ３４−ＤＣを注射した（図１および表Ｉ）。４名の患者（患者＃１、＃９、＃１２、および＃１３）は、試験の開始前に手術および照射によって処置されたＣＮＳ病変を有し、４名の患者（患者＃２、＃４、＃５、および＃１６）は、前化学療法を受けており、５名の患者（患者＃２、＃４、＃６、＃９、および＃１５）は臨床または免疫反応を伴わない前生物療法を受けていた（表Ｉ）。３名の患者（患者＃３、＃１３、および＃２０）は試験完了前に進行した。
【００６３】
ＤＣワクチン
各ワクチン接種のためにＧ−ＣＳＦ動員血ＣＤ３４＋ＨＰＣから新鮮なＤＣを産生した。凍結／解凍ＣＤ３４＋ＨＰＣをＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＦＬＴ３リガンド生成ＭＨＣクラスＩ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６ｌｏｗ、およびＣＤ８３ｌｏｗＤＣを用いて９日間培養した（データは示していない）。ＤＣには、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−ランゲルハンス細胞（ＬＣ）、ならびにＣＤ１ａ±ＣＤ１４＋間質ＤＣ前駆体（ｉｎｔＤＣ）が含まれた。ＬＣ表現型は、ＣＤ１ａ＋ＤＣにおいてＬａｎｇｅｒｉｎ染色を明らかにする共焦点顕微鏡検査によって確認した（データは示していない）（Ｖａｌｌａｄｅａｕ等、２０００、「Ｌａｎｇｅｒｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ，ｉｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｒｂｅｃｋ  ｇｒａｎｕｌｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１〜８１）。ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞の平均比率は９±３％（範囲４〜１７％、中央値＝９％）であり、ＣＤ１ａ±ＣＤ１４＋細胞の平均比率は３２±９％（範囲１９〜５２％、中央値＝３０％）であった。
【００６４】
【表１】
2004536787.tif 000002
【００６５】
【表２】
2004536787.tif 000003
【００６６】
コントロール抗原に対する反応
ＤＣワクチン接種は、１８名の患者のうち１６名（患者＃３および＃１３を除く全患者）でＫＬＨ特異免疫反応を始動した（正確確率符号検定でｐ＝０．００００７、図２）。高用量のＤＣがより多くのＫＬＨ特異増殖を誘導するという兆候はなかった。１６名の患者（患者＃３および＃２０を除く全患者）を、ＤＣワクチン接種後ＤＴＨに関して評価した。これらの患者のうち１３名（患者＃１および＃１９を除く全患者）は、ＫＬＨに対するＤＴＨが発現した（中間値１０ｍｍ、範囲６〜４７ｍｍ）（データは示していない）。
【００６７】
表ＩＩは、ワクチン接種前／接種後ＰＢＭＣにおけるペプチド抗原特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数を示す。データは、血中エフェクター（直接、ＳＦＣ／２×１０５細胞）および抗原パルスＤＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅後（リコール、ＳＦＣ／１０５細胞）に関して示す。データは、早期進行した患者＃３、＃１３、および＃２０を除いて、ワクチン前／第４回ワクチン後として示す。患者＃３および＃２０は４回のワクチンを完了したが、第４回ワクチン後の血液試料は得られなかった（３回のワクチン後の反応を示す）。患者＃１３は２回のワクチン後にＣＮＳ進行を有し、ＣＮＳ照射およびＤｅｃａｄｒｏｎによって治療し、プロトコル外でその後のワクチンを完了した（２回のワクチン後の反応を示す）。ＮＤは、細胞低収量のためアッセイしなかったサンプルを表す。
【００６８】
Ｆｌｕ−ＭＰパルスＤＣを注射した１７名の患者（フルワクチンにアレルギー歴を有する患者＃１８を除くすべて（の患者））のうち、１５名の患者（患者＃３および＃１３を除くすべて（の患者））において少なくとも１つのアッセイによってＦｌｕ−ＭＰ特異記憶Ｔ細胞反応の増強が認められた（表ＩＩおよび図３）。これらの誘出Ｔ細胞は、インフルエンザ感染ＰＢＭＣから自然にプロセシングされた抗原も認識した（データは示していない）。
【００６９】
２名の患者を除くすべての患者がＫＬＨおよびＦｌｕ−ＭＰパルスＤＣの両方に反応したという所見は、本研究に参加した転移性メラノーマを有する患者が免疫反応性であったことを示す。
【００７０】
メラノーマ特異血液ＣＤ８Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増幅
非培養Ｔ細胞における反応
患者＃８を除いて、基準の血液サンプルでは少数のみのメラノーマ抗原特異ＩＦＮ−γ産生細胞が検出された（表ＩＩおよび図４）。この反応は、（コントロールウェルの値から測定値を差し引いた値）免疫後サンプルにおいて２倍超の増加があり、ＭｅｌＡｇ特異ＥＬＩＳＰＯＴの最小値が１０である場合、増強されたとみなした。ＤＣワクチン接種後、１種以上のＭｅｌＡｇに対する反応の増強が、１８名の患者のうち８名の非培養Ｔ細胞において検出可能であった（表ＩＩ）。５名の患者がＭＡＧＥ−３に対して、４名がＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１に対して、５名がｇｐ１００に対して、７名がチロシナーゼペプチドに対して反応の増大を示した（表ＩＩおよび図４）。高用量のＤＣを受けた患者がより高いメラノーマ特異免疫を有するという兆候はない。このように、ＭｅｌＡｇパルスＣＤ３４−ＤＣは、メラノーマ患者においてＭｅｌＡｇ特異血中エフェクターの増強をもたらす。
【００７１】
【表３】
2004536787.tif 000004
【００７２】
培養Ｔ細胞における反応
次いで、メラノーマペプチドパルス自己ＤＣを用いて１週間培養した後に血液ＣＤ８Ｔ細胞がメラノーマ特異反応を増大する能力を求めた。ほとんどの患者は、免疫前サンプルにおいて低レベルのＭｅｌＡｇ特異記憶細胞を有した（患者＃２１を除く）。しかしながら、評価した１５名の患者のうち１４名で、ＤＣワクチン接種後、少なくとも１種のメラノーマペプチドに対して反応の増大が見られ（表ＩＩおよび図５）、それらの患者のうち５名は、４種すべてのメラノーマペプチドに反応した（患者＃１、＃５、＃９、＃６、＃１７）。
【００７３】
メラノーマ抗原に対する総体的反応
表ＩＩＩに、ＤＣワクチン、免疫反応、および臨床転帰を要約する（ＰＤ＝進行疾患、ＮＰ＝進行なし、ＮＥ＝反応評価不能）。全体的に見て、ＤＣワクチン接種後、１種以上のＭｅｌＡｇに対する免疫の増強が、少なくとも１つのアッセイで１８名の患者のうち１６名に観察された（表ＩＩＩ）。それらの患者のうち、少なくとも１つのアッセイで、それぞれ３、４、および６名の患者において、２、３、または４種すべてのＭｅｌＡｇに対して免疫の増強が見られた。このように、メラノーマペプチドパルスＣＤ３４−ＤＣによるワクチン接種は、メラノーマ患者においていくつかのＭｅｌＡｇペプチドに対する免疫の増強をもたらす。
【００７４】
臨床転帰
評価可能な１７名の患者のうち７名が、腫瘍の進行を経験した（ＰＤ、測定可能な疾患の進行および／または新しい病変）（表Ｉ）。残りの１０名の患者は、この時点（試験開始から１０週）で進行はなかった。それらのなかで、３名の患者（患者＃４、＃１７、および＃２１）は、新しい病変も測定可能な疾患の進行もなく、開始時に複数の病変を有した４名の患者（患者＃５、＃８、＃１２、および＃１８）は、１つまたは複数の疾患部位で縮小を経験し、開始時に限局型の疾患のみを有した３名の患者（患者＃１、＃９、および＃１０）は、疾患の徴候が消失した。非進行性の患者は、その後の試験においてさらなるＤＣワクチン接種を受けた。患者＃５は、他の機関でさらなる免疫療法を受けた。
【００７５】
【表４】
2004536787.tif 000005
【００７６】
免疫学的反応と臨床転帰の相関
表ＩＶに、血液の免疫反応と臨床転帰との相関を要約する。本出願人等は最初に、ワクチン後アッセイでの２倍超の増加、および１０を超える抗原特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを免疫反応の指標として用いた（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ等、１９９９、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１７３〜１８０、Ｄｈｏｄａｐｋａｒ等、２０００、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：Ｒ９〜Ｒ１４）。いずれのアッセイによってもコントロール抗原およびメラノーマ抗原に反応しなかった２名の患者（＃３および＃１３）は、急速に腫瘍が進行し、計画された療法を完了できなかった。評価可能疾患を有する１７名の患者のうち、０、１、または２種のメラノーマ抗原に反応した７名の患者の６名は、試験開始１０週後の再ステージングにおいて進行性疾患を有した（表ＩＩＩおよび表ＩＶ）。対照的に、３種または４種すべてのメラノーマ抗原に反応した１０名の患者では１名にのみ腫瘍進行が認められた（ｐ＝０．００２、フィッシャーの正確確率検定）。これらの患者のうち７名で、１つを超える腫瘍転移で縮小が観察された。
【００７７】
ＤＣワクチン後の抗腫瘍免疫の総体的な評価を得るために、本出願人等は、以前に記載のとおり（Ｋａｌｂｆｌｅｉｓｃｈ、Ｊ．Ｄ．およびＰｒｅｎｔｉｃｅ、Ｒ．Ｌ．１９７３、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ６０：２６７〜２７８、およびＷｉｔｔｋｏｗｓｋｉ、Ｋ．Ｍ．１９８８、Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ  ８３：１１６３〜１１７０）、直接およびリコールアッセイによる４種すべての抗原に対する絶対免疫反応データを、腫瘍免疫スコア（−８．５〜＋８．５）に統合した。評価可能疾患を有する１７名の患者のなかで、進行性疾患を有する７名の患者で腫瘍免疫が低かった（ｐ＝０．０４３）。腫瘍免疫スコアは、臨床転帰と関連した。負の腫瘍免疫スコアを有する８名の患者の６名が、進行性疾患を有した（図６）。他方、正の腫瘍免疫スコアを有する９名の患者のうち、１名のみが進行した。
【００７８】
したがって、これらの両方の分析は、ＤＣワクチン接種後の早期臨床転帰が誘出免疫反応に依存していることを実証した。
【００７９】
【表５】
2004536787.tif 000006
【実施例２】
【００８０】
抗原負荷樹状細胞のワクチン接種はｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応の急速な誘導をもたらす  すべてのサンプルにおけるＫＬＨ特異免疫反応の速度論の分析は、大多数の患者において、２種のＫＬＨ濃度で２回のＫＬＨ負荷ＣＤ３４−ＤＣの注射が有意な（ｔ検定でｐ＝０．０１８および０．０４５）増殖反応を誘導するのに充分であったことを示した（図７）。表Ｖは、自然増殖の値を減じた２種のＫＬＨ濃度（１０および１ｎｇ／ｍｌ）でのワクチン接種過程の各時点におけるＫＬＨ特異ＰＢＭＣ増殖（ｃｐｍ値）を示す。しかしながら、各患者の分析は、１８名の患者のうち９名で、第１回のＫＬＨパルスＤＣの注射後にすでにＫＬＨ特異増殖が検出可能であることを明らかにした（表Ｖ）。さらに、それらの９名の患者のうち５名で、最初の観察時点、すなわち注射５日後の時点において、ＫＬＨに対する増殖反応に有意な増加（ｔ検定でｐ＝０．０４４）が見られた（表Ｖ）。ＫＬＨに反応した残りの患者のなかで、４名の患者が２回のワクチン後、２名の患者が３回のワクチン後に検出可能な反応を有し、３名の患者は有意な増殖反応が見られるまでに４回のＫＬＨパルスＤＣの注射を要した。
【００８１】
１７名の患者が、細胞の２０％がＦｌｕ−ＭＰペプチドで負荷されたＣＤ３４−ＤＣワクチンを受けた。表ＶＩは、血中エフェクター（すなわち１６時間アッセイ）のワクチン接種過程の各時点におけるＦｌｕ−ＭＰペプチド特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／１０５ＰＢＭＣを示す。１７名の患者のうち１５名で、フル特異免疫（免疫後のいずれかの時点におけるフル特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴが少なくとも２倍の増加と定義する）が誘導され、ＤＣ注射の回数と共に増加した（図８）。ＫＬＨと同様に、Ｆｌｕ−ＭＰペプチドに対する反応は急速に誘導され（図８）、１７名の患者のうち８名で、第１回のＤＣ注射後にすでに認められた（表ＶＩ）。それらの８名の患者のうち４名で、５日後にすでにＦｌｕ−ＭＰ特異Ｔ細胞の頻度に顕著な増加（ｐ＝０．０５３）が観察された（表ＶＩ）。Ｆｌｕ−ＭＰに反応した残りの患者のなかで、４名の患者が２回のワクチン後、２名の患者が３回のワクチン後に検出可能な反応を有し、１名の患者のみが有意な反応が見られるまでに４回のＦｌｕ−ＭＰパルスＤＣの注射を要した。
【００８２】
【表６】
2004536787.tif 000007
【００８３】
すべてのサンプルにおけるメラノーマ抗原特異免疫反応の速度論の分析は、ＭＡＲＴ−１ならびにチロシナーゼの場合、２回のペプチド負荷ＤＣの注射が、基準に比べてＭＡＲＴ−１反応Ｔ細胞の頻度に有意な増加が観察されるのに充分であったことを示した（図９）。ｇｐ１００の場合、単回のワクチン接種後にすでに有意な増加が見られ、ＭＡＧＥ−３の場合、４回のペプチド負荷ＤＣの注射が、ＭＡＧＥ−３特異Ｔ細胞の有意な増加が観察されるのに必要であった（図９）。すべてのペプチドに関して、反応はワクチン接種の反復と共に増加する。表ＶＩＩは、血中エフェクター（すなわち１６時間アッセイ）のワクチン接種過程の各時点におけるメラノーマペプチド特異ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／１０５ＰＢＭＣを示す。表ＶＩＩに示したように、７名の患者は、単回のＤＣ注射後すでにメラノーマ抗原特異Ｔ細胞の頻度に検出可能な増加があった。
【００８４】
最後に、メラノーマ特異反応の速度論の分析、および進行性患者と非進行性患者との比較は免疫反応と臨床反応の相関を明らかにし、したがって腫瘍免疫スコアを用いて見出された相関が確証された（図１０）。
【００８５】
このように、抗原パルスＣＤ３４−ＤＣによるワクチン接種は、そのワクチンに存在する抗原、コントロール抗原およびメラノーマ抗原の両方に対する免疫反応の急速な誘導を可能にする。免疫反応は臨床反応に相関し、疾患の進行を経験した患者は、血液中で検出可能なメラノーマ特異免疫反応を増大しない。
【００８６】
【表７】
2004536787.tif 000008
【００８７】
【表８】
2004536787.tif 000009
【００８８】
【表９】
2004536787.tif 000010
【実施例３】
【００８９】
抗原負荷樹状細胞の反復ワクチン接種は臨床反応を可能にする
転移性メラノーマ（最新の対癌米国合同委員会メラノーマステージングシステムを用いてＩＶ期）を有する患者１２名（女性５名と男性７名、年齢の中央値５７歳（範囲４３〜７３歳）に、最初の４回のプライミングＤＣワクチン接種後、ブースターメラノーマ抗原負荷ＣＤ３４−ＤＣワクチン接種を与えた（表Ｉの患者＃１、＃４、＃８、＃９、＃１０、＃１２、＃１３、＃１６、＃１７、＃１８、＃１９、および＃２１）。これらのＤＣは、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質およびインフルエンザマトリクスペプチド、ならびにメラノーマ抗原を負荷した。ＤＣワクチン接種は、約０．１〜１．０×１０６ＤＣ／ｋｇ／ワクチン接種のＤＣワクチン接種用量で皮下的に投与した。最初の４回のワクチン接種後に疾患の安定化または部分反応を経験した８名の患者に、４回目のワクチン接種の約２カ月後に開始して追加の４回のワクチン接種（ＤＣ５〜８）を月１回ワクチン投与し、最初の４回のワクチン接種で完全寛解を経験した２名（患者＃９および＃１０）に、４回目のワクチン接種後２カ月、５カ月、９カ月、および１５カ月にワクチン投与した。最初の４回のワクチン接種後に完全寛解を経験した１名の患者に、４回目のワクチンのおおよそ８カ月後に単回のＤＣワクチン接種を行った（患者＃１）。最初の４回のＤＣワクチン接種後に安定疾患であった１名の患者に、月１回の間隔で２回のワクチン接種を行ったが、その後、進行性メラノーマを有し、プロトコルを取りやめた。
【００９０】
４名の患者が非維持完全寛解のままであり、生存している。さらに２名の患者が、ＤＣワクチン接種プロトコルの完了後、転移巣切除（ｍｅｔａｓｔａｔｅｃｏｍｙ）を経て完全寛解であり、生存している。プロトコルの完了後に追加の免疫療法を受けた１名の患者は、プロトコルの最終ＤＣワクチン接種の２０カ月後、疾患安定で生存している。ＤＣプロトコルで治療を受けた５名の患者が、進行性転移性メラノーマにより死亡している。ＤＣワクチン接種に対する反応が評価不能であった１名の患者は、プロトコルの完了２カ月後に再発した。脳転移性疾患の完全な退縮を含む完全寛解を経験した１名の患者は、８回目のＤＣワクチン接種のおおよそ９カ月後に再発した。１名の患者は、６回のＤＣワクチン接種後に進行性疾患を発症した。２名の患者は、プロトコル完了から２〜４カ月後に進行性メラノーマを有した。ＤＣワクチン接種に関連した重要な臨床有害事象はなかった。図１１〜１４は、転移性メラノーマの診断（図１１）および試験開始（図１２）からの無病生存、ならびに転移性メラノーマの診断（図１３）および試験開始（図１４）からの患者生存を含むＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【００９１】
最後に、培養において抗原特異Ｔ細胞が増殖および分化する能力を評価するために、免疫前および免疫後ＰＢＭＣを共に解凍し、１μｇ／ｍｌペプチドでパルスした自己成熟ＤＣ（ＰＢＭＣ：ＤＣ比３０：１）を用いて７日間共培養（２×１０５細胞／ウェル）した。７日後、細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレートに移し、特異抗原を用い、または用いずに、照射（３０００ラド）Ｔ２細胞（Ｔ：ＡＰＣ比２０：１）を用いて一晩培養した。抗原特異ＳＦＣを、非パルスＴ２細胞によるバックグラウンドを減じた後に算出した。この評価に用いたペプチドには、ＤＣワクチンに存在した４種のペプチド（ワクチン抗原）、およびワクチンに存在しない腫瘍抗原を代表する２種のペプチド（ＥＳＯ−１およびＴＥＲＴ）が含まれた。表ＶＩＩＩに示したように、ワクチンに存在した２種を超えるメラノーマ抗原に特異的なＴ細胞を有した７名のメラノーマ患者のうち４名は、さらに他の腫瘍抗原に特異的な検出可能なＴ細胞を有し、免疫反応の拡大を示唆した。これらの４名の患者は、完全寛解（ＣＲ）である（患者＃９、＃１０、＃１８、および＃２１）。残りの３名の患者のなかで、２名の患者は、初期の疾患安定化（ＳＤ）後に進行（ＰＤ）を経験した。ｇｐ１００特異Ｔ細胞のみを有した１名の患者は、メラノーマ病変が完全に消失したが、後に再発した。
【００９２】
【表１０】
2004536787.tif 000011
【実施例４】
【００９３】
自然増殖ＰＢＭＣ反応と臨床反応の相関
治療開始前および第４回ＤＣワクチン接種後２〜４週のサンプルにおける増殖性ＰＢＭＣ反応の分析は、外因性抗原を添加せずに培養したＤＣ免疫後血液サンプルのＰＢＭＣが増殖し、２名の患者において、この増殖が進行性白斑の存在と相関したことを明らかにした（Ｍｅｌ５およびＭｅｌ８）（図１５）。すべての患者において、治療開始前および第４回ワクチン後の様々な時点でのサンプルの自然増殖を求めた（表ＩＸ）。
【００９４】
表ＩＸおよび図１６に示したように、指数が１未満の５名の患者のうち４名は早期進行性疾患を有し、指数が１超から１０未満の５名の患者のうち４名は試験開始１０週後に臨床反応を有し（進行なし）、指数が１０超の患者はすべて臨床反応を有した。これは免疫後の２つの異なる時点における血液サンプルの自然増殖の分析（図１７）、および２つの異なる研究室で同一のサンプルを用いて得られたデータ（図１７）によって確認された。さらに、図１８に示したように、自然増殖、すなわち外因性抗原を用いない増殖の指数は、抗原特異増殖、すなわちＫＬＨの指数と有意に相関し、自然増殖のレベルが抗原特異増殖反応を予測する可能性を示唆した（単回帰においてｐ＝０．００３）。最後に、この増殖性細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である（図１９）。さらに、ＤＣワクチン接種によって誘発された免疫系の活性化は、ワクチン接種前および接種後のサンプルに関して表Ｘに示したように、破傷風トキソイドに対する増殖反応の増加によってもっともよく例示できた。
【００９５】
ＤＣワクチンはＴＴを負荷していなかったが、評価した１４名の患者のうち１０名のＴＴ反応は、免疫後サンプルで高かった（増加倍数の範囲１．６〜８２、中央値１．７倍）。
【００９６】
このように、ＤＣワクチン接種は、同定された（すなわちワクチンで送達）抗原、ならびに未知抗原の両方に対する非常に強い免疫化をもたらす。血液免疫反応のレベルは臨床反応に相関し、臨床反応を予測する。
【００９７】
【表１１】
2004536787.tif 000012
【００９８】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】本明細書に示した臨床試験の試験デザインを示す図である。
【図１Ｂ】本明細書に示した臨床試験のワクチン接種および血液採取のスケジュールを示す図である。
【図２】コントロール抗原に対する反応、ＫＬＨ依存性増殖反応を示す図である。免疫前／免疫後末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０μｇ／ｍｌＫＬＨを用いて５日間培養する。ＫＬＨ特異Ｔ細胞増殖は、３Ｈ  ＴｄＲ取り込みに基づいて求める。免疫前＝白い棒。免疫後＝灰色の棒。ＫＬＨ＝スカシ貝ヘモシアニン。
【図３】コントロール抗原ｆｌｕ−ＭＰペプチドに対する反応を示す図である。ベースラインおよび４回のＤＣワクチン接種後に得られたＰＢＭＣを、１０μＭのｆｌｕ−ＭＰペプチドを用いて一晩培養する。抗原特異ＩＦＮ−γ分泌細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて定量化し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す。コントロールウェルで得られた数を減じる（平均、１スポット／２×１０５ＰＢＭＣ、範囲０〜８）。ベースライン＝白い棒。４回のＤＣワクチン接種後＝灰色の棒。
【図４】メラノーマ抗原特異反応、短期（一晩）のアッセイで検出された血中メラノーマ特異効果細胞を示す図である。ベースラインおよび４回のＤＣワクチン接種後に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養する。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す。左から右、ＭＡＧＥ−３、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ｇｐ１００。コントロールｇａｇペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値を減じる（平均、１スポット／２×１０５ＰＢＭＣ、範囲０〜８）。
【図５】メラノーマ抗原特異反応、メラノーマ抗原特異記憶効果細胞（リコールアッセイ）を示す図である。ベースラインおよび４回のＤＣワクチン接種後に得られたＰＢＭＣを、成熟メラノーマペプチドパルス自己単球由来ＤＣを用いて７日間培養した。Ｔ細胞を採取し、ペプチド誘導ＩＦＮ−γ放出を、メラノーマペプチドパルスＴ２細胞を用いた一晩の培養において測定した。評価された患者のそれぞれの反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／１×１０５ＰＢＭＣとして表す。非パルスＴ２細胞を用いて得られた値を減じる。ＭＡＧＥ−３：スポット平均数ワクチン前／ワクチン後１／７、範囲０〜２５／０〜２３、ＭＡＲＴ−１：スポット平均数ワクチン前／ワクチン後５／３、範囲０〜３７／０〜３３、チロシナーゼ：スポット平均数ワクチン前／ワクチン後２／４、範囲０〜１９／０〜３９、ｇｐ１００：スポット平均数ワクチン前／ワクチン後２／９、範囲０〜２５／０〜３３。
【図６】免疫反応と臨床転帰の相関を示す図である。４種すべてのメラノーマ抗原に関する直接アッセイおよびリコールアッセイ両方の免疫反応を順位化し、腫瘍免疫スコア（−８から＋８）に統合した。データを腫瘍免疫スコア（ｙ軸）対臨床反応（ｘ軸）としてプロットする。それぞれの数字は患者ＩＤを示す。４グループの患者を示す。ワクチン後１つまたは複数の病変の縮小を伴う患者（点付きの棒）、安定疾患の患者（横線の棒）、１０週時点で疾患の進行した患者（ＰＤ、ジグザグ線の棒）、早期進行の患者（１０週の評価前、早期ＰＤ、縦線の棒）。
【図７】ＫＬＨ特異反応の速度論を示す図である。免疫前（第０日）および免疫後の異なる時点（縦座標軸に示す）で採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのＫＬＨを用いて５日間培養する。ＫＬＨ特異Ｔ細胞増殖は、３Ｈ  ＴｄＲ取り込みに基づいて求める（縦軸）。＊示した時点でのｃｐｍ値のベースライン（第０日）に対する比較の有意（ｔ検定）（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５）。
【図８】Ｆｌｕ−ＭＰ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した時点後（縦座標軸）に得られたＰＢＭＣを、１０μＭのｆｌｕ−ＭＰペプチドまたはコントロールペプチド（ｈｉｖ−ｇａｇ）を用いて一晩培養する。抗原特異ＩＦＮ−γ分泌細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて定量化し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す。
【図９Ａ】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はＭＡＲＴ−１を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。コントロールｇａｇペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。Ｎ＝示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。＊示した時点でのＥＬＩＳＰＯＴの基準（第０日）に対する比較の有意（ｔ検定）。右上に示したＰ値は、各ペプチドに関するＥＬＩＳＰＯＴのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図９Ｂ】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はチロシナーゼを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。コントロールｇａｇペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。Ｎ＝示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。＊示した時点でのＥＬＩＳＰＯＴの基準（第０日）に対する比較の有意（ｔ検定）。右上に示したＰ値は、各ペプチドに関するＥＬＩＳＰＯＴのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図９Ｃ】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はｇｐ１００を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。コントロールｇａｇペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。Ｎ＝示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。＊示した時点でのＥＬＩＳＰＯＴの基準（第０日）に対する比較の有意（ｔ検定）。右上に示したＰ値は、各ペプチドに関するＥＬＩＳＰＯＴのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図９Ｄ】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はＭＡＧＥを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。コントロールｇａｇペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。Ｎ＝示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。＊示した時点でのＥＬＩＳＰＯＴの基準（第０日）に対する比較の有意（ｔ検定）。右上に示したＰ値は、各ペプチドに関するＥＬＩＳＰＯＴのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図１０Ａ】非進行性患者の血液中のＴＡＡ特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はＭＡＲＴ−１を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。
【図１０Ｂ】非進行性患者の血液中のＴＡＡ特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はチロシナーゼを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。
【図１０Ｃ】非進行性患者の血液中のＴＡＡ特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はｇｐ１００を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。
【図１０Ｄ】非進行性患者の血液中のＴＡＡ特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびＤＣワクチン接種後の示した日数後（ｘ軸）に得られたＰＢＭＣを、ワクチン接種（１０μＭ）に用いた４種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はＭＡＧＥを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異Ｔ細胞反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数／２×１０５ＰＢＭＣとして表す（ｙ軸）。
【図１１】転移性メラノーマの診断からの無病生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図１２】試験開始からの無病生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図１３】転移性メラノーマの診断からの患者生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図１４】試験開始からの患者生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図１５Ａ】一部の患者において自然増殖が存在し、ＤＣワクチン接種は転移性メラノーマを伴う患者でｉｎ  ｖｉｔｒｏ「自己反応」を誘出することを示す図である。外因性抗原を添加せずに培養したＤＣ免疫後血液サンプルのＰＢＭＣは増殖し、２名の患者において、これは進行性白斑の存在と関連する（Ｍｅｌ５およびＭｅｌ８）。本図はベースラインおよび４回目のＤＣワクチン後２〜４週間におけるチミジン取り込み（ｃｐｍ×１０３）を示す図である。
【図１５Ｂ】一部の患者において自然増殖が存在し、ＤＣワクチン接種は転移性メラノーマを伴う患者でｉｎ  ｖｉｔｒｏ「自己反応」を誘出することを示す図である。外因性抗原を添加せずに培養したＤＣ免疫後血液サンプルのＰＢＭＣは増殖し、２名の患者において、これは進行性白斑の存在と関連する（Ｍｅｌ５およびＭｅｌ８）。本図は自然増殖が２回のＤＣワクチン後にすでに発現可能であることを示す図である。
【図１６】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数（縦軸）は、ワクチン接種後ＰＢＭＣの５日間培養から得たｃｐｍ値のワクチン接種前に対する比として算出する。縦座標軸は、患者番号および１０週の臨床状態を示す。
【図１７Ａ】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数（縦軸）は、ワクチン接種後ＰＢＭＣの５日間培養から得たｃｐｍ値のワクチン接種前に対する比として算出する。本図は最終ワクチン接種後１４〜２８日の分析（アッセイは１つの検査室で盲検で行った）を示す。Ｐ値はｔ検定の有意水準を示す。図１７Ａの括弧内の数値は、図１７Ｂに示した患者と同一の１５名の患者のサンプルで得た値であり、図１７Ａの他の数値は、１８名の患者の分析である。
【図１７Ｂ】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数（縦軸）は、ワクチン接種後ＰＢＭＣの５日間培養から得たｃｐｍ値のワクチン接種前に対する比として算出する。本図はワクチン接種後２〜５カ月の分析（アッセイは別の検査室で盲検で行った）を示す。Ｐ値はｔ検定の有意水準を示す。図１７Ａの括弧内の数値は、図１７Ｂに示した患者と同一の１５名の患者のサンプルで得た値であり、図１７Ａの他の数値は、１８名の患者の分析である。
【図１８】自然増殖レベルとＤＣワクチン接種によって誘導された抗原特異反応との相関を示す図であり、ＤＣワクチンによって誘導された抗原特異反応は「自己反応的」反応と相関している。ＤＣ免疫前および免疫後サンプルのＰＢＭＣを、ＫＬＨを用いて、または外因性抗原を加えずに培養する。増殖は第５日のチミジン取り込みによって測定する。反応指数は、免疫前および免疫後サンプルから得られたｃｐｍ（３回ずつ２度）の比として算出する。
【図１９】自然増殖細胞はＣＤ４Ｔ細胞であり、ごく少数のみがＣＤ１９＋Ｂ細胞であることを示す図である。ワクチン接種後ＰＢＭＣを５日間培養する。この培養物に最後の１６時間ＢｒｄＵを混入し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ１９＋Ｂ細胞によるＢｒｄＵ取り込みを、抗ＢｒｄＵ  ＦＩＴＣ結合抗体による染色およびフローサイトメトリによって明らかにする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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