(57)【要約】外部コントロールを用いる核酸増幅の方法が提供され、この方法は、特定の標的配列、ならびに正しいプライマーおよびプローブの非存在または存在を確認する。一本鎖の外部コントロールポリヌクレオチドは、標的プライマーと同じ配列のプライマーで増幅される。検出可能標識を有するプローブならびに標的および外部コントロールポリヌクレオチドに対して特異的な配列は、検出および測定を可能にする。プライマーおよび検出可能プローブは、標的と外部コントロールポリヌクレオチドとの両方に対して相補的な自己消光プローブのハイブリダイゼーションの場合に、隣接するかまたは実質的に隣接する。ＰＣＲ試薬のキットは、リアルタイム測定または終点測定を用いる、迅速かつ正確な核酸増幅アッセイのために、容器に分配され得る。
2004507248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）標的ポリヌクレオチドを、１つ以上の容器の第１のセットにおいてプライマー伸長試薬で増幅させ、そして外部コントロールポリヌクレオチドを、１つ以上の容器の第２のセットにおいて、該プライマー伸長試薬で増幅させる工程であって：
ここで、該プライマー伸長試薬が、正方向プライマー、逆方向プライマー、１つ以上の検出可能プローブ、ポリメラーゼ、および１つ以上のヌクレオチド５’三リン酸を含み；
該正方向プライマーおよび該検出可能プローブが、該外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズする場合に、０〜５のヌクレオチドによって分離され、そして該逆方向プライマーおよび該検出可能プローブが、該外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズする場合に、０〜５のヌクレオチドによって分離され；
該外部コントロールポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドとして該増幅プロセスを開始し、そして
該外部コントロールポリヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドよりも短い、工程；ならびに
（ｂ）該１つ以上の検出可能プローブからのシグナルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記検出可能プローブが、レポーター色素およびクエンチャーを含む自己消光蛍光プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅の間に、前記ポリメラーゼが前記自己消光蛍光プローブを切断して、前記レポーター色素を前記クエンチャーから分離する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記容器の第２のセットの前記プライマー伸長試薬が、第１の検出可能プローブおよび第２の検出可能プローブを含み；該第１のプローブの配列が、該第２のプローブの配列と、１つ以上のミスマッチ、挿入、または欠失によって異なり、そして該第１のプローブのシグナルが、該第２のプローブのシグナルから分解可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記容器の第２のセットの前記プライマー伸長試薬が、第１の自己消光蛍光プローブおよび第２の自己消光蛍光プローブを含み；該第１のプローブの配列が、該第２のプローブの配列と、１つ以上のミスマッチ、挿入、または欠失によって異なり、そして該第１のプローブのレポーター色素が、該第２のプローブのレポーター色素からスペクトル的に分解可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の自己消光蛍光プローブおよび第２の自己消光蛍光プローブの配列が、単一のヌクレオチドのミスマッチによって異なる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドを、１つ以上の容器の第３のセットにおいて、プライマー伸長試薬で増幅させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドの配列が、前記第２の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドと、１つ以上のミスマッチ、挿入、または欠失によって異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドの、検出可能プローブに対して相補的な配列部分が、単一のヌクレオチドによって、前記第２の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドの、検出可能プローブに対して相補的な配列部分と異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
プライマー伸長試薬を含む１つ以上の容器の第４のセットをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的ポリヌクレオチドが、プラスミド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、制限消化物、および連結産物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記正方向プライマーまたは前記逆方向プライマー、および前記検出可能プローブが、前記一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズする場合に、隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外部コントロールポリヌクレオチド、またはその相補体が、前記正方向プライマーまたは前記逆方向プライマーとハイブリダイズする場合に、０〜約１０のヌクレオチドを含む一本鎖突出を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記正方向プライマーおよび逆方向プライマーが、各々１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記自己消光蛍光プローブが、１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドが、３０〜１１０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドが、５０〜７０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
蛍光強度の変化が、前記標的配列の存在の指標として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ポリヌクレオチドおよび前記外部コントロールポリヌクレオチドの、核酸増幅の産物が、終点分析によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的ポリヌクレオチドおよび前記外部コントロールポリヌクレオチドの、核酸増幅の産物が、リアルタイム分析の間に検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的ポリヌクレオチドおよび前記外部コントロールポリヌクレオチドの、核酸増幅の産物が、蛍光によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸ポリメラーゼが、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レポーターがキサンテン色素である、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キサンテン色素がフルオレセイン色素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記フルオレセイン色素が、以下：
【化１】
2004507248.tif 000007
からなる群より選択され、ここで、Ｘは、前記プローブに対する付着部位である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記クエンチャーが、以下：
【化２】
2004507248.tif 000008
からなる群より選択され、ここで、Ｘは、前記プローブに対する付着部位である、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター色素が、少なくとも１２のヌクレオチドによって前記クエンチャーから分離される、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
前記レポーター色素が、前記自己消光蛍光プローブの５’末端または３’末端に付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
前記クエンチャーが、前記自己消光蛍光プローブの５’末端または３’末端に付着している、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記クエンチャーが非蛍光性である、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能プローブが、副溝結合剤で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己消光蛍光プローブが、副溝結合剤で標識されている、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記自己消光蛍光プローブが、３’末端ヌクレオチドにおいて、副溝結合剤で標識されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記副溝結合剤が、以下の構造：
【化３】
2004507248.tif 000009
を有し、ここで、Ｘは、前記プローブに対する付着部位である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のヌクレオチド５’三リン酸が標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記標識が、蛍光色素、クエンチャー、ビオチン、または副溝結合剤である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記容器が、マイクロウェルトレイに位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライマー伸長試薬が、ロボット手段によって前記容器に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
増幅が、サーマルサイクラーによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
核酸増幅のための試薬のキットであって、以下：
一本鎖外部コントロールポリヌクレオチド、正方向プライマー、逆方向プライマー、ポリメラーゼ、検出可能プローブ、１つ以上のヌクレオチド５’三リン酸；および核酸増幅のために必要な他の試薬、
を備える、キット。
【請求項４１】
前記検出可能プローブが、レポーター色素およびクエンチャーを含む自己消光蛍光プローブである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記正方向プライマーおよび前記逆方向プライマーの濃度が、約１０〜１００μＭであり、各ヌクレオチド５’三リン酸の濃度が、約１００〜１０００μＭであり、そして前記自己消光蛍光プローブの濃度が、約１〜１００μＭである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
ロボット手段によって容器に送達される、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、概して、核酸増幅の分野に関し、ポリメラーゼ連鎖反応の間にアンプリコンの検出によって特定の標的配列の非存在または存在を立証する、外部コントロールの方法を含む。
【０００２】
（ＩＩ．発明の背景）
核酸増幅（特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））は、重要な研究手段であり、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、ゲノムマッピング、薬物探索などにおける適用を有する（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：２７２５−２７２９；Ｂｅｖａｎら（１９９２）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：２２２−２２８；Ｇｒｅｅｎら（１９９１）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：７７−９０）。ＰＣＲの説明およびＰＣＲを実施するための手引きは、大量の文献に提供される（Ｉｎｎｉｓら（１９８９）ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、（１９９１）ＰＣＲ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ　１、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、４６頁、１９９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、７、１９頁）。
【０００３】
対立遺伝子を識別し、そして同定するＰＣＲアッセイは、特定の変異に関する遺伝子型ＤＮＡサンプルに対して重要である（Ｌｉｖａｋ（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１４：１４３−４９；Ｍｅｉｎら、（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：３３０−４３）。ＰＣＲアッセイはまた、遺伝子発現の相対的な定量化を提供する（Ｇｉｂｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：９９５−１００１；Ｈｅｉｄら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：９８６−９４；Ｙａｎｇら（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１１０−１６；Ｇｅｒｍｅｒら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：７２−７８）。
【０００４】
ＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）の終点測定またはリアルタイム測定を提供するための蛍光ベースの手段（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：７２７６−８０）は、存在する二重鎖ＤＮＡ量を示す挿入色素（例えば、臭化エチジウム）（Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号）か、またはレポーター−クエンチャー対（「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、５’ヌクレアーゼアッセイ）（これは、増幅の間に切断され、存在する二重鎖ＤＮＡの量に比例して蛍光シグナルを放出する）を含むプローブのいずれかを使用する（Ｌｉｖａｋら、米国特許第５，５３８，８４８号；Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，８０４，３７５号）。
【０００５】
標的の増幅の状態を確認する並行したコントロール試験が、望ましい。ＰＣＲは、しばしば、隣接するウェルからの鋳型の汚染、ピペッティングのエラー、またはエアゾールの伝播に起因して、特に高密度または高スループットの形式（例えば、９６ウェル、３８４ウェル）、または高密度のマイクロタイタープレート、または他のアレイ形態において、偽陽性に悩まされる。さらに、ＰＣＲは、酵素インヒビターが標的サンプル中に存在する場合かまたは試薬がないもしくは分解されている場合に、偽陰性の結果を被る。コントロール増幅反応は、（ｉ）定量化の結果の正規化、（ｉｉ）標的および他の試薬中の増幅インヒビターの検出、ならびに（ｉｉｉ）バックグラウンドのシグナルレベルを確立するために、望ましい。ＰＣＲに対する陽性増幅コントロール試験は、標的から分離され標的と異なるコントロール鋳型から誘導される検出可能なアンプリコンを提供する。陽性コントロールアンプリコンの検出は、増幅が可視であり、そして反応チャンバ内で作用することを示す。コントロール成分から検出可能な産物を与えない陽性増幅コントロール試験は、増幅を可能にしない反応チャンバ内での条件（例えば、ＰＣＲを阻害する夾雑物）を示す。
【０００６】
内部コントロールＰＣＲは、同じ容器内で、標的サンプルポリヌクレオチドのＰＣＲと同時に実行される（Ｃｏｅｎ，Ｄ．「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｕｓｉｎｇ　ａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ」Ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（１９９４）Ｍｕｌｌｉｓら、編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．、８９−９６頁；Ｃｏｅｎ，Ｄ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｒｅ　ＤＮＡｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９０）Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。標的ポリヌクレオチドおよび内部コントロールポリヌクレオチド（ＩＣＰ）に共通したプライマーを用いた内部コントロールポリヌクレオチドの増幅は、真の陰性であるかまたは偽陰性であるか、すなわち、標的が検出されないか否かの確認を提供する（Ｇｉｂｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５−１００１）。ＩＣＰはしばしば、標的ポリヌクレオチドサンプルの内因性領域であり、すなわち、標的と同じ供給源、ゲノム、染色体、遺伝子、プラスミド、またはフラグメント由来であり、従って、標的ポリヌクレオチドの量におけるバリエーションを正規化する。ＩＣＰは、各実験サンプル内に単離されたものとして存在する内因性ＲＮＡ配列または内因性ＤＮＡ配列であり得る。ＩＣＰは、既知濃度で標的サンプルに加えられる外因性または外来の、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列であり得る。外因性ＩＣＰは、インビトロ構築物であり得、真の標的陰性をＰＣＲ阻害から区別し、そしてサンプル抽出ｃＤＮＡ合成の効率における差異を正規化するために、使用される（Ａｏｙａｇｉ、米国特許第５，９５２，２０２号）。
【０００７】
内部コントロールに関して浸透している困難とは、コントロールポリヌクレオチドの増幅を、標的増幅または生成物の検出との妨害から維持し続けるということである（Ｒｅｉｓｃｈｌら（１９９５）「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．、５５−７１頁）。内因性ＩＣＰは、増幅インヒビターに従属し、従って、偽陰性シグナルを与え得る。内因性ＩＣＰはまた、標的プライマーに対するプライミング部位を有し得、従って、偽陽性シグナルを与える。内因性ＩＣＰ系が標的と１つ以上のプライマーを共有する場合、共有されたプライマーの消耗が、不正確なＰＣＲ定量化および制限された動力範囲を導き得る。核酸増幅産物の定量および検出のための従来のコントロールの制限および欠損を考慮すると、ゲルベースでない、増幅の陽性指標を提供する外部コントロールのＰＣＲ方法が、望ましい。
【０００８】
（ＩＩＩ．要旨）
本発明は、既知または未知の標的ポリヌクレオチドの核酸増幅と当時の、一本鎖ポリヌクレオチド、外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ）の核酸増幅を検出するための、新規な方法、組成物および試薬のキットにむく。
【０００９】
第１の局面において、本発明は、第１セットの１つ以上の容器中で標的ポリヌクレオチドをプライマー伸長試薬と増幅する工程（図１Ａ）および第２セットの１つ以上の容器中で一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドをプライマー伸長試薬と増幅する工程（図１Ｂ）によって、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。このプライマー伸長試薬は、正方向プライマー、逆方向プライマー、１つ以上の検出可能プローブ、ポリメラーゼ、および１つ以上のデオキシヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。標的ポリヌクレオチド、およびＥＣＯおよびその相補鎖は、これらのプライマーに相補的な配列を含み、そしてＰＣＲアッセイの間この同じ正方向プライマーおよび逆方向プライマーによって増幅される。
【００１０】
正方向プライマーおよび検出可能プローブは、一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズされる場合、隣接しているかまたは実質的に隣接している。また、逆方向プライマーおよび検出可能プローブは、一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリダイズされる場合、隣接しているかまたは実質的に隣接している。次いで、蛍光のようなシグナルが、検出可能プローブから検出される。
【００１１】
１つの実施形態において、この検出可能プローブは、自己消光する蛍光プローブ（ＳＱＰ）であり、各々は、レポーター色素およびクエンチャー部分を含む。
【００１２】
第２セットの容器のプライマー伸長試薬は、第１の検出可能プローブおよび第２の検出可能プローブを含み得る。第１のプローブの配列は、１つ以上のミスマッチ、挿入または欠失によって第２のプローブと異なる。第１のプローブからのシグナルは、第２のプローブのシグナルから分解可能である。
【００１３】
別の実施形態において、第３セットの１つ以上の容器は、第２の一本鎖ＥＣＰおよびプライマー伸長試薬を含む。第１の一本鎖ＥＣＰの配列は、１つ以上のミスマッチ、挿入または欠失によって第２の一本鎖ＥＣＰと異なる。検出可能プローブに相補的な第１の一本鎖ＥＣＰの配列部分は、この検出可能プローブに相補的な第２の一本鎖ＥＣＰの配列部分と、単一ヌクレオチドが異なる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、核酸増幅のための試薬のキットを提供し、これは以下を含む：一本鎖外部コントロールポリヌクレオチド、正方向プライマー、逆方向プライマー、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、検出可能プローブ、１つ以上のヌクレオチド５’−三リン酸；および核酸増幅に必要な他のプライマー伸長試薬。１つの実施形態において、プライマー、自己消光蛍光プローブ、およびプライマー伸長試薬は、キットの試薬として好都合に分配される。
【００１５】
（Ｖ．例示的な実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の特定の実施形態に対して参照が詳細になされ、その例は添付の図面に図示される。本発明は、例示的な実施形態と組合わせて記載されるが、これらは、本発明がこれらの実施形態に限定されることを意図されない。これに対して、本発明は、特許請求される本発明の範囲内に含まれ得る、代替物、改変物および均等物すべてを包含することが意図される。
【００１６】
（Ｖ．１　定義）
「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログと対形成する際、ワトソン−クリック水素結合を形成し得る窒素含有複素環部分（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在する核酸塩基のアナログ、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン（Ｋｕｔｙａｖｉｎら、米国特許第５，９１２，３４０号）、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドールおよびエタノアデニン（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８５〜３９４頁、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、Ｆｌ）である。
【００１７】
「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に連結された核酸塩基からなる化合物をいう。リボースは、置換されていても良いし置換されていなくても良い。置換リボース糖としては、限定しないが、１つ以上の炭素原子（例えば、３’炭素原子）が、１つ以上の同じかまたは異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲまたはハロゲン基で置換されるリボースが挙げられ、ここで、それぞれのＲが、独立して、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである。リボースとしては、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、３’−アルキルリボース、例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、および２’−４’−連結および他の「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」二環式糖改変体（Ｗｅｎｇｅｌら、ＷＯ９９／１４２２６）が挙げられる。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖は、核酸塩基のＮ９位に結合される。核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）である場合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ１位に結合される（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、（１９９２）ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第二版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。
【００１８】
「ヌクレオチド」は、モノマー単位としてまたは核酸内の、ヌクレオシドのリン酸エステルをいう。ヌクレオチドは、時々、特に、リボース糖の構造的特徴を指摘するために、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として示される。「ヌクレオチド５’トリホスフェート」は、５’位にトリホスフェートエステル基を有するヌクレオチドをいう。トリホスフェートエステル基は、種種の酸素に対する硫黄の置換（例えば、α−チオ−ヌクレオチド−５’−トリホスフェート）を含み得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味し、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結またはヌクレオチド間アナログ、および会合する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）によって連結される２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、全てデオキシリボヌクレオチド、全てリボヌクレオチド、またはそのキメラ混合物から構成され得る。ポリヌクレオチドは、インターヌクレオチド、核酸塩基および糖アナログから構成され得る。ポリヌクレオチドは、代表的には、数モノマー単位（例えば、５〜４０）（このとき、これらは、しばしば、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）から数千のモノマーヌクレオチド単位の大きさの範囲である。他に示さない限り、ポリヌクレオチド配列が示される場合はいつも、他に示さない限り、ヌクレオチドが左から右に５’〜３’の方向であり、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシトシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、チミジンを示すことが理解される。
【００２０】
「結合部位」は、リンカーに共有結合的に結合される、部分（例えば、標識またはオリゴヌクレオチド）の部位をいう。
【００２１】
「リンカー」は、標識をポリヌクレオチドに、または標識を別の標識に共有結合する共有結合または原子の鎖を含む化学部分をいう。
【００２２】
「アルキル」は、親のアルカン、アルケン、またはアルキンの単一の炭素原子から１つの水素原子の除去によって誘導される、飽和または不飽和、分枝鎖、直鎖、分枝鎖、または環式炭化水素ラジカルをいう。代表的なアルキル基は、１〜１２個の飽和および／または不飽和炭素からなり、限定しないが、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどが挙げられる。
【００２３】
「アルキルジイル」は、１〜２０個の炭素原子の飽和または不飽和、分枝鎖、直鎖、または環式炭化水素ラジカルをいい、親のアルカン、アルケン、またはアルキンの同じかまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子の除去によって誘導される２つの一価のラジカルを有する。代表的なアルキルジイルラジカルとしては、限定しないが、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルジイル、１，４−ブチルジイルなどが挙げられる。
【００２４】
「アリールジイル」は、共役共鳴電子系および親のアリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素を除去することによって誘導される少なくとも２つの一価のラジカル中心を有する、６〜２０個の炭素原子の不飽和環式または多環式炭化水素ラジカルをいう。代表的なアリールジイル基としては、限定しないが、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが挙げられる。
【００２５】
「反応性連結基」は、別の分子と反応してリンカーに共有結合を形成し得る、化学的に反応性の置換基または部分（例えば、求核基または求電子基）をいう。
【００２６】
「複素環」は、１つ以上の環原子がヘテロ原子（例えば、窒素、酸素および硫黄（炭素に対して））である環系を有する分子をいう。
【００２７】
「ヌクレオチド間アナログ」は、例えば、（ｉ）アルキルホスホネート（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート、特に、メチルホスホネート）；（ｉｉ）ホスホラミデート；（ｉｉｉ）アルキルホスホトリエステル、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートのようなオリゴヌクレオチドのホスフェートエステルアナログを意味する。ヌクレオチド間アナログとしてはまた、糖／ホスフェートサブユニットが非ホスフェート含有骨格構造によって置換される非ホスフェートアナログが挙げられる。１つのタイプの非ホスフェートオリゴヌクレオチドアナログは、アミド連結（例えば、２−アミノエチルグリシンユニット（通常、ＰＮＡと呼ばれる）（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９７−１５００））を有する。
【００２８】
用語「隣接（する）」は、第３のポリヌクレオチドにそれぞれハイブリダイズされる２つのオリゴヌクレオチドの配置をいい、ここで、２つのオリゴヌクレオチド間に、介在するヌクレオチド、つまりギャップが存在しない。２つのオリゴヌクレオチドが、ギャップなしで、互いに並んでハイブリダイズされる場合、これらは、隣接している。
【００２９】
用語「実質的に隣接（する）」は、第３のポリヌクレオチドにそれぞれハイブリダイズされる２つのオリゴヌクレオチドの配置をいい、ここで、２つのオリゴヌクレオチド間に、ギャップとして１〜５個の介在するヌクレオチドが存在する。
【００３０】
用語「標的配列」および「標的ポリヌクレオチド」は、相補的なポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）とのハイブリダイズの対象であるポリヌクレオチド配列を意味する。この配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのアナログ（これらの組み合わせを含む）から構成され得る。
【００３１】
用語「アンプリコン」は、標的配列内で増幅され、２つのプライマー結合部位の遠位末端によって規定されるポリヌクレオチドを意味する。
【００３２】
用語「検出可能プローブ」は、標的核酸の配列との相補的な塩基対形成により、二重鎖構造またはより高次の構造（例えば、三重らせん）を形成し、検出可能なシグナルを発し得るオリゴヌクレオチドを意味する。検出可能なプローブは、蛍光色素で標識され得る。「自己消光蛍光プローブ」（ＳＱＰ）は、蛍光レポーター色素およびエネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって相互作用するクエンチャーから構成される一対の標識で標識される。
【００３３】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはヌクレオチド５’−トリホスフェートに結合し得、（ｉ）検出可能なシグナルを提供するため；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、この第１または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するため（例えば、ＦＲＥＴ）；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション（すなわち、二重鎖形成）を安定化するため；（ｉｖ）荷電、疎水性、形状または他の物理的パラメーターによって、易動度（例えば、電気泳動易動度または細胞透過性）に影響するために、あるいは（ｖ）捕捉部分を提供する（例えば、親和性、抗体／抗原、またはイオン錯体形成）ために機能する任意の部分をいう。
【００３４】
用語「消光」は、機構に関係なく、第２部分（クエンチャー）によって引き起こされる第１部分（レポーター色素）の蛍光における減少をいう。用語「自己消光」は、分子内の、エネルギー移動効果（例えば、ＦＲＥＴ）（蛍光共鳴エネルギー移動）をいい、これによって、蛍光レポーター色素およびクエンチャーが、その蛍光団からクエンチャーへのエネルギー移動を可能にする構成でプローブ上に結合され、蛍光色素による蛍光の減少を生じる。自己消光効果は、プローブのその相補的体へのハイブリダイゼーションのときに、または蛍光レポーターおよびクエンチャーが分離される際の５’ヌクレアーゼ切断のときに、減少するかまたは損失し得る。
【００３５】
用語「５’ヌクレアーゼ活性」は、ホスホジエステル結合において核酸を切断する酵素活性をいう。この活性は、エンド（内部ホスホジエステル結合を切断する）またはエキソ（核酸鎖の５’末端に最も近いホスホジエステル結合において切断する）のいずれかであり得る。
【００３６】
用語「終点分析」は、データ収集が、反応が完了したときのみに生じる方法をいう。ＰＣＲの終点分析は、熱サイクルおよび増幅が完了するときの蛍光色素シグナル測定を伴なう。結果は、好ましくは、任意のコントロールシグナルシグナルを差し引いて、ＰＣＲ熱サイクルの開始から終了までの蛍光色素シグナルの蛍光（すなわち、蛍光強度単位）の変化について報告され得る。
【００３７】
用語「リアルタイム分析」は、ＰＣＲの間の周期的なモニタリングをいう。ＡＢＩ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のような特定のシステムは、予め決められたかまたはユーザーが規定した時点で、それぞれの熱サイクルの間にモニタリングを行う。５’ヌクレアーゼアッセイのリアルタイム分析は、好ましくは、受動的な内部参照からの蛍光の変化を差し引いて、サイクル間の蛍光色素シグナルの変化を測定する。
【００３８】
（Ｖ．２　プライマー、プローブおよび外部コントロールポリヌクレオチド）　一本鎖の外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ）が、ＰＣＲ反応のためのプレート、チューブセット、マイクロタイタートレイ、アレイ構造または他の配置上の容器（例えば、反応部位、スポット、チューブ、チャンバ、ウェル）において増幅を受けることが発見された。これらのＥＣＰ含有容器は、既知または未知の標的ポリヌクレオチドを含む容器とは別々である。全ての容器は、同時にサーマルサイクリングを受ける。本発明の制御方法は、キット形式での試薬の調製および分配、ならびに結果の測定において簡便性を付与する。
【００３９】
このＥＣＰおよび標的ポリヌクレオチドは、共通のプライマーおよびプローブを用いて、別々の反応部位（すなわち、容器、チャンバ、ウェル）において増幅される。このＥＣＰ配列は、この正方向プライマーおよび逆方向プライマーによって増幅されるよう、かつこの検出可能なプローブ配列またはこの検出可能なプローブ配列に対する相補体を含むように選択（「設計」）される。このＥＣＰは、わずかな介在配列（もしあれば）と共に、正方向プライマー配列および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列に対して相補的な配列を含む。介在配列は、ｎによって示される、このハイブリダイゼーション複合体における一本鎖領域（すなわち、ギャップ）（図１〜３）であり、ｎは、プライマーまたはプローブにハイブリダイズされていないＥＣＰのヌクレオチド数である。図１に例示されるように、プライマーは、このＥＣＰ上にあるプローブに隣接（ｎ＝０）または実質的に隣接（ｎ＝１〜約５）してハイブリダイズするはずである。ギャップヌクレオチドは、任意に選択され得る。従って、一般に、このＥＣＰは、この標的アンプリコンと比べて短い。
【００４０】
この方法の一つの実施形態において、正方向プライマーおよび検出可能なプローブは、この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズされた場合に隣接しており、かつ逆方向プライマーおよび検出可能なプローブは、この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズされた場合に隣接している（ｎ＝０、図１Ｂ、２、３）。
【００４１】
別の実施形態において、正方向プライマーおよび検出可能なプローブは、この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズされた場合に実質的に隣接（すなわち、１〜約５ヌクレオチドのギャップによって離れている）しており、かつ逆方向プライマーおよび検出可能なプローブは、この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズされた場合に１〜約５ヌクレオチドのギャップによって離れている（ｎ＝１〜５、図１Ｂ、２、３）。この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドは、この正方向プライマーおよび逆方向プライマーにハイブリダイズされた場合に１〜約１０ヌクレオチドの一本鎖突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を形成する（図１Ｂ、２、３にｏとして示される）。あるいは、このＥＣＰおよびプライマーは、平滑末端を形成し得る（ｏ＝０）。
【００４２】
この正方向プライマー、逆方向プライマーおよび検出可能なプローブは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、そして各々１０〜４０ヌクレオチド長であり得る。これらのプライマー、プローブ、およびＥＣＰは、ヌクレオチドアナログ（糖への修飾を含む）、核酸塩基、またはヌクレオチド間連結を含み得る。
【００４３】
本発明のさらなる局面は、このＥＣＰは、一本鎖ポリヌクレオチドとして増幅プロセスを開始することである。ＰＣＲの間、ＥＣＰの相補鎖が形成され、次いで、このＥＣＰは、融解、アニーリングおよびプライマー伸長の工程において、任意の二本鎖ＤＮＡのように関与する。増幅を生じさせる様式で、一方のプライマー（正方向または逆方向）が、この一本鎖外部コントロールポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そして他方が、その相補体にハイブリダイズする。一本鎖ＥＣＰの相補体は、ＰＣＲの間に形成される。短いオリゴヌクレオチドほど、より高い収率およびより高い純度で作製されるので、この短い長さかつ一本鎖の組み合わせの局面は、このＥＣＰが、高い効率、正確性および最小限の労働要求性で、経済的な様式での自動合成によって合成されるのを可能にする。さらに、５０〜１５０ｂｐの範囲内の短いアンプリコンは、高い効率で増幅される。ＥＣＰは、正方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに検出可能なプローブの配列を含み、代表的には、３０〜１１０ｎｔである。
【００４４】
検出可能なプローブは、２０〜８０％の範囲内のＧ−Ｃ含量で設計され得る。プローブ中の４以上のＧヌクレオチドの連続配列は、好ましくは、回避され、非ワトソンクリック塩基対形成相互作用（例えば、塩基スタッキング構造）を最小化する。５’末端でのＧの存在は、好ましくは、回避され、５’Ｇによる５’蛍光色素の自己消光を防止する。プローブの鎖（センスまたはアンチセンス）は、どちらの配列がＧヌクレオチドよりもＣヌクレオチドを多く有するかに基づいて選択され得る。Ｐｒｉｍｅｒ　ＥｘｐｒｅｓｓＴＭソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、５’ヌクレアーゼアッセイのためのプローブ配列が、６５〜６７℃の融解温度（Ｔｍ）を有するように選択されるが、他のＴｍを有するプローブ配列が、適切な場合に使用され得る。検出可能なプローブは、標的ポリヌクレオチドまたはＥＣＰのセンス鎖に相補的であるように設計され得、このセンス鎖はまた、正方向プライマーにハイブリダイズする（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照のこと）。あるいは、プローブは、標的ポリヌクレオチドまたはＥＣＰのアンチセンス鎖に相補的であるように設計される。
【００４５】
標的ポリヌクレオチドおよび外部コントロールポリヌクレオチドの核酸増幅は、レポーター色素およびクエンチャー部分を含む自己消光蛍光プローブ（ＳＱＰ）からの、レポーター色素の蛍光検出によって測定され得る。レポーター色素は、キサンテン色素（例えば、フルオレセイン色素）であり得る。レポーター色素は、代表的には、クエンチャーと少なくとも１２ヌクレオチド（ｎｔ）離されている。レポーター色素は、この自己消光蛍光プローブの５’末端または３’末端に結合され、そしてクエンチャーは、この自己消光蛍光プローブのその反対側の末端に結合される。例えば、ＳＱＰは、蛍光レポーター色素で５’ヌクレオチドを標識され、そしてクエンチャーで３’ヌクレオチドを標識される。クエンチャーは、非蛍光性であり得、レポーター色素のスペクトル分解を補助する。あるいは、クエンチャーは、検出可能なように蛍光性であり得る。この自己消光蛍光プローブはまた、副溝結合剤（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）で標識され得る。プローブが、小溝結合剤で標識されるか、またはＤＮＡプローブと比べて特異性を増強する（より高いＴｍの）ヌクレオチドアナログから構成される場合に、プローブは、短く（例えば、１２ｎｔ未満）あり得る。好ましくは、２以上の対立遺伝子自己消光プローブ（ＳＱＰ）の配列は、同じかまたはほぼ同じＴｍを有するように選択される。
【００４６】
ＳＱＰは、自己相補性の領域であり、これは、このプローブが、相補的な標的ポリヌクレオチドまたはＥＣＰに結合されない場合に、消光されるヘアピン構造で存在するのを可能にする（例えば、Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号を参照のこと）。ヘアピン自己消光蛍光プローブが、標的ポリヌクレオチドまたはＥＣＰと二重鎖を形成する場合、この蛍光色素およびクエンチャーは、空間的に離され、そして消光は、回避されるかまたは有意に最小化され、蛍光の増加を生じる。
【００４７】
プライマー配列は、５８〜６０℃のＴｍを有するように選択され得るが、他のＴｍを有するプライマー配列は、適切な場合に使用され得る。反応条件に依存して、プライマーのＴｍは、より高くまたはより低くあり得る。プローブの選択と同様、プローブ中の４以上のＧの連続配列が、好ましくは、回避される。３’末端の５つのヌクレオチドは、２個より多いＧおよび／またはＣ塩基を有さない。プライマーおよびプローブの長さは、代表的には、１２〜４０ｎｔである。
【００４８】
特定の適用（例えば、対立遺伝子検出）のために、標的ポリヌクレオチドのアンプリコンは、プローブ領域のほぼ中間に多型部位を有するように設計され、そして検出可能なプローブによる識別に最も高感度（すなわち、最も高い特異性）である。
【００４９】
（Ｖ．２Ａ　オリゴヌクレオチド合成）
オリゴヌクレオチドは、一般に、市販のホスホラミダイトヌクレオシド、支持体（例えば、シリカ）、制御された孔の（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ）ガラス（米国特許第４，４５８，０６６号）およびポリスチレン（米国特許第５，０４７，５２４号および同第５，２６２，５３０号）、ならびに自動合成器（Ｍｏｄｅｌｓ３９２、３９４、３９４８　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、ホスホラミダイト法（米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，９７３，６７９号；同第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４８：２２２３−２３１１）によって、固体支持体上で合成される。
【００５０】
（Ｖ．２Ｂ　オリゴヌクレオチド標識）
標識は、公知の標識、連結、連結基、試薬、反応条件、ならびに分析方法および精製方法を使用する、多数の公知の技術のいずれか１つを使用して達成され得る。一般に、そして特定の適用に依存して、標識およびオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドを結合する連結は、（ｉ）プライマー伸長を干渉しないか、（ｉｉ）ポリメラーゼ活性を阻害しないか、または（ｉｉｉ）色素の蛍光特性に有害な効果（例えば、消光または脱色（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ））を及ぼさない。例示的な標識としては、蛍光、化学発光または生物発光によって検出可能なシグナルを生成する、発光化合物が挙げられる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，３〜２８頁）。別のクラスの標識は、二重鎖のハイブリダイゼーションを増強するか、安定化するかまたはそれに影響するよう作用する、ハイブリダイゼーション安定化部分である（例えば、インターカレーター、副溝結合剤、および架橋官能基（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編、「ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、１５〜８１頁））。なお別の有用なクラスの標識は、特異的または非特異的捕捉手段によって分子の分離または固定をもたらすよう作用する（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３９〜５４頁）。
【００５１】
標識は、代表的には、当該分野で周知の方法を使用して、適切な反応性標識およびオリゴヌクレオチドを適切な溶媒（その中で、両者は可溶性である）中で混合して共有結合形成反応を達成することから生じ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、４０〜５５頁、６４３−７１）、その後、この標識したオリゴヌクレオチドを、任意の出発材料または所望しない副生成物から分離する。標識されたオリゴヌクレオチドは、後の使用のために、好ましくは低温で、乾燥保存されるかまたは溶液中で保存される。
【００５２】
反応性標識は、オリゴヌクレオチドへの共有結合のために、置換位置のうちの１つで反応性連結基（例えば、フルオレセインまたはローダミンの５−または６−カルボキシル基）を含み得る。反応性連結基は、オリゴヌクレオチド上の求核基（例えば、ヒドロキシル基、アミン基またはチオール基）と反応し得る求電子性官能基であり得る。反応性連結基の例としては、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホン酸エステル、シリルハライド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホラミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、酸無水物、およびヨードアセトアミドが挙げられる。
【００５３】
標識の１つの反応性連結基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）（例えば、蛍光性色素のカルボキシ基置換基のＮＨＳ）である。色素のＮＨＳエステルは、予め形成され得、単離され得、精製され得、そして／または特徴づけされ得るか、あるいは、インサイチュで形成されてオリゴヌクレオチドの求核性基と反応し得る。代表的に、色素のカルボキシル形態は、以下の試薬のいくつかの組合せと反応して、その色素のＮＨＳエステルを生じることによって活性化される：（ｉ）カルボジイミド試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド）またはウロニウム試薬（例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、（ｉｉ）活性化剤（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、および（ｉｉｉ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド。
【００５４】
別の標識の反応性連結基は、蛍光性色素、クエンチャー、副溝結合剤、および移動度改変剤のホスホラミダイト形態である。ホスホラミダイト色素試薬は、標識化オリゴヌクレオチドの自動化合成に特に有用である。ホスホラミダイト試薬は、ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ）または非ヌクレオシドであり得る。ホスホラミダイト色素試薬（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド）は、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、５’末端および３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連結、糖）における標識化を可能にする（米国特許第５，７３６，６２６号；同第５，１４１，８１３号）。核酸塩基部位、ヌクレオチド間連結部位、および糖部位における標識化は、オリゴヌクレオチドにおける内部の複数の標識を可能にする。いくつかの例において、標識は、ホスホラミダイト試薬の合成の間またはその後のオリゴヌクレオチドのような分子を標識するための使用の間のいずれかで、保護を必要とする官能基（例えば、蛍光性色素のフェノール性酸素原子）を含み得る。使用される保護基（単数または複数）は、官能基の性質に依存し、そして当業者に明らかである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１）。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、電気泳動移動の速度に影響する部分で標識され得る（すなわち、移動度改変標識）。移動度改変標識としては、ビオチン、コレステロール、およびポリエチレンオキシユニット（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、ここでｎは、１〜１００であり得、代表的には、２〜２０である）（例えば、米国特許第５，６２４，８００号）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレンオキシ（ＰＥＯ）ユニットは、ホスフェート基の間に分散され得る。別々の既知のサイズのポリエチレンオキシのさらなる標識で、蛍光性標識化プライマーを特異的に標識することにより、実質的にアンプリコンのサイズ（すなわち、ヌクレオチドの数）に関係なく、アンプリコンの電気泳動による分離が可能になる。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドは、スペクトル的に分解可能な色素の標識および移動度改変標識に基づいて識別され得る。色素標識および移動度改変標識の両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識オリゴヌクレオチド成分またはヌクレオチド成分のライゲーションまたはポリメラーゼ伸長により酵素的に形成され得る。ＰＥＯ標識は、荷電した基（例えば、ホスホジエステル）を、電荷を付与して電気泳動移動度（速度）を増加させるために含み得る。ＰＥＯ標識は、非荷電であり得、電気泳動移動度遅くするように作用し得る。このような改変剤は、一組のアンプリコンの分析（例えば、蛍光検出による）中の電気泳動速度に影響するかまたは正規化するように作用して、分解能および分離を改善し得る（米国特許第５，４７０，７０５号）。
【００５６】
標識の１つのクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学的発光による標識化伸長産物の検出のためのシグナルを生じる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，３−２８頁）。化学発光標識としては、１，２−ジオキセタン化合物（米国特許第４，９３１，２２３号；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら（１９９４）「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ａｓｓａｙｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１９：１６９−８１）。
【００５７】
プローブ、プライマーおよびヌクレオチド５’−トリホスフェートを標識するために有用な蛍光色素としては、フルオレセイン類、ローダミン類（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号）、シアニン類（米国特許第６，０８０，８６８号およびＷＯ９７／４５５３９）、および金属ポルフィリン錯体（ＷＯ　８８／０４７７７）が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）１、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）２および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）３（米国特許第５，６５４，４４２号）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）４、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン５（米国特許第５，１８８，９３４号および同第５，８８５，７７８号）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン６（米国特許第６，００８，３７９号（図４Ａ）が挙げられる。５−カルボキシおよび他の位置異性体はまた、有用な検出特性を有し得る。フルオレセイン色素およびローダミン色素は、１，４−ジクロロ置換基（図４Ａに示されるような底部環）を有し得る。
【００５８】
別のクラスのプローブ標識としては、蛍光クエンチャー部分が挙げられる。クエンチャーと分子間蛍光色素との発光スペクトルが重なり、その結果蛍光色素の蛍光は、蛍光共鳴エネルギー移動「ＦＲＥＴ」（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．，（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８）という現象により、実質的に減少するかまたは消光される。クエンチャーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）７、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）８からなる群から選択されるローダミン蛍光色素；（ｉｉ）ジアゾ化合物（例えば、９〜１１）および（ｉｉｉ）１１、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール化合物、およびニトロイミダゾール化合物など（図４Ｂ）を含むシアニン色素。クエンチャーのいくつかのニトロ置換体は、効率的なクエンチャーである（Ｌｅｅら、米国特許第６，０８０，８６８号）。非蛍光クエンチャー部分は、レポーター色素間のより良好なスペクトル識別を可能にし得る。
【００５９】
別のクラスの標識は、特異的または非特異的捕捉手段により標識化プライマー伸長産物の分離または固定化をもたらすように作用する（例えば、ビオチン；２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；およびジゴキシゲニン（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’　ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）　ｉｎ　ＰＣＲ　２：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９−５４頁）。
【００６０】
別のクラスのプローブおよびプライマー標識（本明細書中でハイブリダイゼーション安定化剤という）としては、副溝結合剤（ＭＧＢ）、插入剤、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミン）および架橋官能基が挙げられるがこれらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化剤は、プライマーまたはプローブおよび標的ポリヌクレオチドの塩基対の安定性（すなわち、親和性またはハイブリダイゼーションの速度）を増加させ得る（Ｃｏｒｅｙ，（１９９５）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９３７３−７４）。ハイブリダイゼーション安定化剤は、完全に相補的な配列間のＴｍ（ΔＴｍ）における大きな差（そしてここで生じた二本鎖は１つ以上のワトソン／クリック塩基対合のミスマッチを含む）により例示されるように、塩基対の特異性を増加するように作用する。（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編「ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１５−８１および３３７−４６頁）。短いほうの溝結合剤としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（Ｒａｊｕｒら（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍ．６２：５２３−２９）、ＣＤＰＩ１−３（Ｋｕｔｙａｖｉｎら米国特許第５，８０１，１５５号および同第６，０８４，１０２号）、およびＭＧＢ１（Ｇｏｎｇら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４０：５５７−６０）が挙げられるがこれらに限定されない。ＭＧＢ標識は、しばしばより高い親和性（より高いＴｍ）を付与し、それによりより短いプローブの使用を可能にする。
【００６１】
核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を介して結合した複数の標識（例えば、蛍光色素）を有し得る。核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、以下により形成され得る：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼにより酵素的に組み込み可能なヌクレオチド試薬（ここでＲ１９は、トリホスフェートである）の酵素組込み、および（ｉｉ）自動化合成によるヌクレオシドホスホラミダイト試薬のカップリング。核酸塩基標識オリゴヌクレオチドは、１つより多くの組込み可能なヌクレオチドの組込みにより複数標識され得るが、ホスホラミダイト色素標識試薬での標識は、以下の式に従う、１つずつ５’標識されたオリゴヌクレオチドを生じる：
【００６２】
【化４】
2004507248.tif 000003
ここでＸは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２であり；Ｒ２２は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；そしてＲ２３は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｌは、アルキルジイル（例えば、１，６−ヘキシルジイル）、アリールジイル、またはポリエチレンオキシである（Ａｎｄｒｕｓ、（１９９５）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’　ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３９−５４頁；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（１９９６）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．４０−５５、６４３−７１頁；Ｍｕｌｌａｈ　（１９９８）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２６：１０２６−１０３１）。
【００６３】
（Ｖ．２Ｄ　ヌクレオチド標識）
ヌクレオチド５’トリホスフェートは、本発明の方法における使用のために標識され得る。ＰＣＲの間の蛍光標識ヌクレオチドの複数組込みは、高度の蛍光強度を有するアンプリコンを生じ、低いコピー数の標的ポリヌクレオチドの感度を増加する。ヌクレオチドの糖部分または核酸塩基部分は、標識され得る。核酸塩基標識部位としては、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基の７−Ｃまたは８−Ｃ、およびピリミジン核酸塩基の５位が挙げられるがこれらに限定されない。標識ヌクレオチドは、酵素で組込み可能であり得かつ酵素で伸長可能であり得る。標識ヌクレオチド５’トリホスフェートフェートは、以下の式：
【００６４】
【化５】
2004507248.tif 000004
を有し得、ここでＬＡＢＥＬは、保護された標識かまたは保護されていない標識であり、これらとしては蛍光色素、クエンチャー、またはエネルギー移動色素などを含む。Ｂは、核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）である。Ｒ１９は、トリホスフェート、チオホスフェート、またはリン酸エステルアナログである。Ｒ２０およびＲ２１は、単独で考慮される場合、各々独立してＨ、ＨＯ、およびＦである。Ｌは、リンカー（例えば、結合、アルキルジイル（Ｃ１〜Ｃ１２）、アルケニルジイル（Ｃ１〜Ｃ１２）、またはアルキニルジイル（Ｃ１〜Ｃ１２））である。１つの例示的なリンカーＬは、以下：
【００６５】
【化６】
2004507248.tif 000005
であり、ここでｎは、０、１、または２である（Ｋｈａｎら、米国特許第４，７５７，１４１号）。
【００６６】
（Ｖ．３　自動化ＰＣＲ分析）
本発明の方法は、核酸増幅を実施するために設計された自動化装置（例えば、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）など）において実施され得る。この装置は、データ収集、およびＰＣＲがリアルタイムでモニターされることを可能にするか、または終点検出によって定量されることを可能にするＰＣＲ後分析ソフトウェアを備え得る。本発明の方法は、均質（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ＰＣＲアッセイ（ここでは、反応チャンバは、相互汚染を回避するために、増幅および分析の間閉鎖されたままである）を含む（Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−１７；Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０２６−３０；Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：７２７６−８０）。
【００６７】
本発明は、５’ヌクレアーゼアッセイに従って実施され得る；プライマー伸長を実施し、そしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、５’ヌクレアーゼ活性を有し、この５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断するのに役立つ。蛍光「レポーター」色素および「クエンチャー」が、ＳＱＰ（これは、標的ＤＮＡに対して相補的である）に対して５’末端および３’末端に付着され得る（Ｌｉｖａｋら，米国特許第５，７２３，５９１号）。この色素は、共鳴放射エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プロセス（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８）を通して相互作用するように選択され、そして配置される。あるいは、レポーター色素およびクエンチャーは、プローブの内部位置に付着され得る（例えば、核酸塩基、糖、またはヌクレオチド間結合）。レポーターは、化学発光を生じさせる化学反応、または蛍光を生じさせる光吸収のいずれかによって励起され得る発光部分である（Ｌｉｖａｋら，米国特許第５，８７６，９３０号）。アンプリコンの定量によって、増幅前のサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド分子の数の推定が得られる。標的ポリヌクレオチドは、プラスミド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、制限消化物、または連結産物であり得る。標的ポリヌクレオチドは、単一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）からなる混合物であり得る。ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍは、５’ヌクレアーゼアッセイ、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、および他の定量を実施する。蛍光に基づくアッセイは、（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）である。
【００６８】
ポリメラーゼが熱安定性であり、かつ５’ヌクレアーゼ活性を有する場合、自己消光蛍光プローブが、このクエンチャーからこのレポーター色素を分離するための増幅の間に、切断（すなわち、消化）され得る。レポーター−クエンチャープローブを使用する核酸増幅の５’ヌクレアーゼアッセイ（Ｌｅｅら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１：３７６１−６６；Ｌｉｖａｋら（１９９５）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２）によって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の直接的検出が生じる。クエンチャーは、切断に際して、そのレポーターに密接した近位から放出され、その結果、レポーターからのシグナルはもはや消光されない。ＰＣＲ産物のコピーの増加と直接的および比例的に相関する蛍光増加が生じる。標的ポリヌクレオチドおよび外部コントロールポリヌクレオチドの核酸増幅の産物は、終点分析またはリアルタイム分析によって測定および定量され得る。
【００６９】
本発明は、蛍光における変化を測定するために外部蛍光発生コントロールを用いるレポーター−クエンチャープローブアッセイを提供する。本発明の実施形態は、低コピー数の発現産物を検出するため、または低頻度の対立遺伝子識別試験のために有用である。リアルタイム分析または終点分析を使用することによって、ＰＣＲ産物の検出および定量は、切断された自己消光蛍光プローブの蛍光増加を測定することによって、または単純にハイブリダイゼーションに際して得られ得る。
【００７０】
陽性増幅コントロールは、受動的内部参照分子（Ｌｉｖａｋら，米国特許第５，７３６，３３３号）（これは、ＰＣＲに添加されて、シグナルおよび検出の較正および正規化を与える）から識別され得る。受動的内部参照（例えば、非相補的）レポーター−クエンチャー分子は、標的にも他のポリヌクレオチドにもハイブリダイズせず、そして増幅もせず、消費もされず、酵素に対する基質としても作用せず、そしていかなる種類の化学的反応も酵素学的反応も受けない。従って、受動的内部参照は、増幅条件の確証も指標も提供しない。
【００７１】
本発明の方法はまた、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイにおいて実施され得、ここでは、蛍光の増加は、標的への自己消光蛍光プローブのハイブリダイゼーションに際して検出される（Ｔｙａｇｉら，米国特許第５，９２５，５１７号；Ｂａｇｗｅｌｌ，ＥＰ　６０１８８９；Ｈｅｌｌｅｒら　ＥＰ　２２９９４３）。一般的に、蛍光の増加は、増幅の程度（すなわち、ＰＣＲの間に生成されるアンプリコンの量）に対して比例的である。ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によるプローブの切断は、生じる必要がない。本発明は、ポリメラーゼが５’ヌクレアーゼ活性を有さないいくつかの実施形態において実施され得る。
【００７２】
本発明の方法は、ＰＣＲ熱サイクリングの経過中（リアルタイム分析）またはＰＣＲの終了時（終点分析）に、高スループットデータサンプリングルーチンによって実施され得る。サンプルの様式は、６〜１５３６ウェルでのマイクロタイター、マイクロウェル様式であり得る。各ウェルは、１〜５００μｌの容量を有し得る。このウェルは、等しく間隔を空けられた二次元（例えば、約３’’に約４．５’’を測定する、一般的な９６ウェルプレートまたは１２ウェルの８つの列を有するトレイ）に配置される。工業規格化された二次元は、マルチチップピペット、またはプログラムされた液体送達ロボットを用いた液体分配を容易にする。本発明はまた、吸収性または多孔性の材料、フリット、フィルターまたはファイバー（これらは、ナイロン製、セルロース製、ポリスチレン製などであり得る）に試薬をスポットすることによって実施され得る。あるいは、試薬は、非吸収性の平面（例えば、ガラスまたはポリマー）にスポットされ得る（Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：３６５−７０）。
【００７３】
較正された外部コントロール（例えば、ＥＣＰ１，ＥＣＰ２，ＮＴＣ（図５））を用いることにより、近い濃度の相対値が、ＰＣＲの間の相対的濃度値の履歴を計算に入れることによって解析され得る。５’ヌクレアーゼアッセイの終点分析による遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）は、自動化システム（例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施される。ここでは、非侵入性閉鎖反応チャンバ内における光ファイバープローブでのレーザー励起蛍光によって、蛍光放出が検出および測定される（Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら，米国特許第５，９２８，９０７号および同第６，０１５，６７４号）。あるいは、複数サーマルサイクラー（例えば、Ｍｏｄｅｌ　９７００，９６００，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、終点検出が蛍光を測定する時点にサイクル反応が分析される前に、ＤＮＡを増幅し得る。蛍光における変化（ΔＲｎ）は、サンプル中のレポーター蛍光と、無テンプレートコントロール（Ｎｏ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＴＣ））中のレポーター蛍光との間の差異である。Ｒｎは、受動的参照の発光に対して正規化された蛍光レポーターの発光強度である（Ｒｎ＝発光強度／受動的参照の発光強度）。
【００７４】
リアルタイム分析の間、ΔＲｎは、各ＰＣＲサイクルの間に計算される。閾値サイクル、またはＣＴ値は、ΔＲｎにおける統計学的に有意な増加が最初に検出される時点（すなわち、バックグラウンドから蛍光比が識別可能である時点）のＰＣＲサイクルである。最適な条件は、最低のＣＴ値を与える条件である（図６）。所定のレポーター色素および標的の固定濃度について、ＲｎおよびＣＴ値の両方は、クエンチャーの効力を反映する。
【００７５】
（Ｖ．４　対立遺伝子識別アッセイ）
対立遺伝子識別は、ヌクレオチドの置換、挿入、または欠失によって異なる同一遺伝子の異なる形態の検出である。本発明は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２５０３−１６；Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２４３７−４８；ＴａｑＭａｎ　Ａｌｌｅｌｉｃ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の間に対立遺伝子（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む）を検出および識別しつつ、外部陽性コントロールデータを確立する新規な方法を提供する。５’ヌクレアーゼアッセイでは、特定の変異（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の２つの対立遺伝子）について、ＤＮＡサンプルを遺伝子型決定した。本アッセイでは、各反応が２つの異なる自己消光蛍光プローブを含み、そして各プローブが、固有の蛍光色素で標識される。
【００７６】
対立遺伝子識別アッセイについて代表的には、第１セットの容器において、標的ポリヌクレオチドがプライマー伸長試薬（これは、正方向プライマー、逆方向プライマー、１以上の検出可能プローブ、ポリメラーゼ、および１以上のヌクレオチド５’−トリホスフェートを含む）で増幅される。第２セットの容器において、一本鎖の外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ１）が、プライマー伸長試薬で増幅される。第３セットの容器において、第２の一本鎖外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ２）が、プライマー伸長試薬で増幅される。ＥＣＰは、標的ポリヌクレオチドと同じプライマーで増幅されて、検出可能なアンプリコンを与える。第４セットの容器は、プライマー伸長試薬のみを含み得、これによって、増幅が生じない陰性コントロールとして機能する。第４の容器からのいかなるシグナルも、バックグラウンドシグナルを構成する。
【００７７】
５’ヌクレアーゼ方法および自己消光プローブを利用する対立遺伝子識別アッセイでは、各ＳＱＰは、１つの対立遺伝子に対して相補的であり、そしてこの対立遺伝子の１つに優先的かつ特異的にハイブリダイズする（図２および３）。換言すると、対立遺伝子識別のために、標的と関連付けられた各対立遺伝子は、その独自の蛍光色素で標識されたプローブを有する。例えば、図２は、Ｆ１レポーター色素を有するＳＱＰ１がＥＣＰ１にハイブリダイズし、そしてＦ２レポーター色素を有するＳＱＰ２がＥＤＰ２にハイブリダイズすることを示す。自己消光蛍光プローブは、良好な対立遺伝子識別を与える２つのさらなる特徴を含み得る：（ｉ）副溝結合剤（ＭＧＢ）標識は、マッチとミスマッチとの間の識別（すなわち、良好な特異性（ΔＴｍ））を増強し、こうして、より短いプローブの使用を可能にする、および（ｉｉ）非蛍光性クエンチャーは、レポーター色素と低バックグラウンド蛍光との間の良好なスペクトル識別を可能にする（Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，「Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５　ａｎｄ　ＴａｑＭａｎ　ＭＧＢ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　Ａｌｌｅｌｉｃ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ」，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２０００年５月）。
【００７８】
（Ｖ．５　遺伝子発現アッセイ）
遺伝子発現アッセイは、検出可能なプローブのリアルタイム定量検出を使用して、本発明の方法およびキットにより実施され得る。ゲノムＤＮＡ標的ポリヌクレオチドは、ヒト、ショウジョウバエ、マウス、または他の生物由来であり得る。遺伝子発現のパターンが、種々の刺激に応答してモニターされ得る。代表的には、第１セットの容器は、標的ポリヌクレオチドサンプルおよびプライマー伸長試薬を含む。プライマー伸長試薬は、正方向プライマー、逆方向プライマー、検出可能プローブ、ポリメラーゼ、および１以上のヌクレオチド５’−トリホスフェートを含み得る。第２セットの容器は、一本鎖ＥＣＰおよび第１セットの容器と同じプライマー伸長試薬を含む。別のセットの容器は、プライマー伸長試薬のみを含み、そして陰性コントロールとして機能する。
【００７９】
（Ｖ．６　キット）
自動化ピペッティングの数の制限ならびに偽陰性および偽陽性のような誤差および不明瞭な結果を最小にする工程の分散は、ＰＣＲ−ベースの手順の値を激しく減少させ得る。本発明のいくつかの実施形態を実施するために、薬剤のキットが核酸増幅のために構築され得る。例示的なキットとしては、以下が挙げられ得る：単鎖外部コントロールポリヌクレオチド、正方向プライマー、逆方向プライマー、５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、検出可能なプローブ（例えば、ＳＱＰ）、１以上のヌクレオチド５’−トリホスフェート；および核酸増幅のために必要な他のプライマー伸長薬剤（例えば、緩衝液）。キット薬剤の溶解のための適切な核酸増幅緩衝液の例は、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０１％のゼラチン、０．０１％のＮＰ４０、および０．０１％のＴＷＥＥＮＴＭである。
【００８０】
１実施形態において、このプライマー、プローブおよびプライマー伸長薬剤は、薬剤のキットとして市販されている。プライマーおよびプローブを含むキットを用いるＥＰＣの増幅は、プライマーおよびプローブが製造され、そして正しく分配（混合）されたことを肯定的に実証する。従って、キットの特定の実施形態は、ＰＣＲアッセイの質の制御を可能にする。質の制御により、プライマー伸長薬剤が標的ポリヌクレオチドを検出可能にすることを確実にする。分配は、ウェル、スポット、および他のタイプの容器への自動化されたロボット送達を含む。本発明の複数のキットが構築され、そして増幅のためのアレイ構築物に分配することによって送達され得る。各キットは、異なる検出可能なプローブおよびプライマーを含み得る。標的ポリヌクレオチドおよびＥＣＰは、このアレイ中の種々に容器に別々に分配され、陽性コントロールおよび陰性コントロールを含む、多くの可能な増幅試験を達成し得る。陰性コントロールは、任意の標的またはＥＣＰを保留することによって達成される。ＥＣＰの増幅は、正確な位置（すなわち、容器）への正確なキット薬剤の正確な送達の確認を提供する。
【００８１】
キットフォーマット中の薬剤は、最適な濃度で処方され、効果的に準備され、そして複数のサンプル容器またはウェルへの分配を自動化し得る。１つのキットの実施形態は、一連の正方向プライマー、逆方向プライマー、および２個のＳＱＰの混合物であり得る。このようなキットは、公知の対立遺伝子部位またはＳＮＰの増幅のために特異的であり得る。各ＳＱＰは、対立遺伝子形態に対する完全な相補体であり得る。
【００８２】
（Ｖ．７　実施例）
本発明は、以下の実施例の考慮によってさらに分類され、この実施例は、本発明の純粋な実施例であることを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００８３】
（実施例１　自己消光蛍光プローブの調製）
自己消光プローブを、使用者マニュアルに記載されている一般手順に従って、自動合成（Ｍｏｄｅｌ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって調製した。５’ＦＡＭ，３’ＴＡＭＲＡプローブは、３’標識のためのＴＡＭＲＡ−標識化ＣＰＧ固体支持体（Ｍｕｌｌａｈら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５７５１−５７５４；Ｍｕｌｌａｈら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１）、ホスホロアミダイトヌクレオシドＡｂｚ、Ｇｄｍｆ、Ｃｂｚ、Ｔ、製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって推薦される他の薬剤および５’標識化のためのＦＡＭ色素標識ホスホロアミダイトのセット（Ｔｈｅｉｓｅｎら（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，第９９〜１００頁）を使用して、０．２μｍｏｌスケールで合成され得る。この標準的な０．２μｍｏｌ合成サイクルは、さらに１２０秒のＦＡＭアミダイトの連結時間を延ばすことによってわずかに改変された。
【００８４】
合成の完了後、５’末端に結合したレポーター色素および３’末端に配置されたクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドは、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ２：Ｈ２Ｏ（１：１：２）の混合物で処理することによってＤＮＡ合成器の支持体から、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器のためのユーザーマニュアルに記載れるような１時間のオートクレーブ手順でオートクレーブした（Ｗｏｏら、米国特許第５，２３１，１９１号）。塩基保護基を、混合物を８５℃で１時間または６５℃で３時間加熱することによって除去した。このオリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、アニオン交換ＨＰＬＣ、ポリアシルアミドゲル電気泳動、および他の従来の技術（Ａｎｄｒｕｓ（１９９２）ｉｎ　Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）によって分析し、そして精製し得る。
【００８５】
（実施例２　対立遺伝子識別アッセイ）
実験を、１サンプル当たり２５μＬの最終反応容積でＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて実施した。以下の試薬のキットを、各々５０μＬの２００反応を提供するように設計した：
・ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ−５．７５ｍＬ（総量）であって、各々５０μｌの２００反応について十分であり、以下を含む：Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ　８．０（１００ｍＭ）、１６％グリセロール、０．１％ゼラチン、０．０２％、Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ、１０ｍのＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，７−デアザ−ｄＧＴＰ（各々４００μＭ）およびｄＵＴＰ（８００μＭ）、ＡｍｐｆｉＴａｑＧｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ（０．１Ｕ／μｌ）、Ａｍｐｅｒａｓｅ　ＵＮＧ（０．０２Ｕ／μｌ）ならびにパッシブリファレンス（１２０ｎＭ）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００８６】
・ＰｒｏｂｅおよびＰｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ−３．４５　ｍＬ（総量）であって、各々５０μｌの２００反応について十分であり、以下を含む：
正方向プライマー（２０μＭ）：
５−ＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡ−３’　配列番号１
逆方向プライマー（２０μＭ）：
５’−ＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡ−３’　配列番号２
自己消光蛍光プローブ１（１０μＭ）：
５’−ＴＥＴ−ＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＣＧＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配列番号３
自己消光蛍光プローブ２（１０μＭ）：
５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配列番号４
・ＥＣＰ１　２５０μＬ（１０ｆｇ／μＬ）（１００反応に対して十分）：
５’ＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＣＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣ３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配列番号５
・ＥＣＰ２　２５０ｇＬ（１０ｆｇ／μＬ）（１００反応に対して十分）：
５’ＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣ３’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　配列番号６
・ゲノムコントロールＤＮＡ　１．０ｍＬ（１０ｎｇ／μＬ）（２００反応に対して十分）。
【００８７】
コントロールおよびサンプル反応を、図５のプレート図表に従って、標準９６ウェル反応プレート中で、以下の体積の薬剤を用いて調製した：
【００８８】
【表１】
2004507248.tif 000006
調製したサンプルのプレートを、以下のプログラムに従って、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９６００、９７００、およびＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲを誘導するために熱循環した：（ａ）２分間５０℃に保持、（ｂ）１０分間９５℃に保持、および（ｃ）融解するために１５秒間９５℃、次いでアニーリングおよび伸長するために１分間６２℃を４０サイクル。
【００８９】
データを、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ７７００での実時間検出によって制御し、各対立遺伝子のために標準化した。ＦＡＭ１およびＴＥＴ２に関する発光極大における蛍光値を、各ウェル中のサンプル対して測定した。ゲノムコントロールＤＮＡサンプル（ＵＮＫ）を必要とする遺伝子型は、対立遺伝子１（ホモ接合体１）、対立遺伝子２（ホモ接合体２）、または対立遺伝子１／２（ホモ接合体）から作製される。この対立遺伝子１プローブ上の蛍光レポーター色素（ＴＥＴ、Ｅｍ．ｍａｘ５３８ｎｍ）は、対立遺伝子２プローブ（図７）上の色素（ＦＡＭ、Ｅｍ．ｍａｘ５１８ｎｍ）からスペクトル的に分離される。
【００９０】
本明細書中で引用される全ての刊行物は、参考として援用され、そして各個々の刊行物が、特異的におよび個々に参考として援用されると意図される場合と同一の範囲まで援用される。
【００９１】
少しの実施形態のみが、上で詳細に記載されているが、分子生物学の当業者は、例示の実施形態において、その技術から逸脱することなく多くの改変が可能であることを明確に理解する。このような改変の多くは、以下の特許請求の範囲で引用されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、標的ポリヌクレオチドへのプライマーおよび検出可能プローブのハイブリダイゼーションに関する模式図を示す。この例示の実施形態において、このプローブは、センス鎖にハイブリダイズされる。
図１Ｂは、外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ）へのプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーションに関する模式図である。この例示の実施形態において、この検出可能プローブは、センス鎖にハイブリダイズされる。プライマーとプローブとの間のギャップは、ｎで示す。ＥＣＰ上のプライマー結合部位を越える突出は、ｏで示す。
【図２】
図２は、外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ１およびＥＣＰ２）への対立遺伝子特異的自己消光蛍光プローブ（ＳＱＰ１およびＳＱＰ２）のハイブリダイゼーションに関する模式図を示す。
【図３】
図３は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）部位において、Ｇ／Ｃ塩基対を通じたＥＣＰ１へハイブリダイズするＳＱＰ１およびＡ／Ｔ塩基対を通じてＥＣＰ２にハイブリダイズＳＱＰ２の模式図を示す。
【図４】
図４Ａは、自己消光プローブにおける例示的な蛍光レポーター色素標識の構造を示す。Ｘは、プローブの結合部位である。
図４Ｂは、自己消光プローブにおける例示的な消光標識の構造を示す。Ｘは、プローブの結合部位である。
【図５】
図５は、９６ウェル形式でのＰＣＲ反応に関する、４セットの容器の配置を用いたプレート図を示す：第１−サンプル（ＵＮＫ）；第２−（ＥＣＰ１）；第３−（ＥＣＰ２）；および第４−コントロール、鋳型コントロールなし（ＮＴＣ）。
【図６】
図６は、Ｒｎ対サイクル数（ＣＴ）の増幅プロットを示す。
【図７】
図７は、実施例１の対立遺伝子識別アッセイにおけるデータの集積を示す。各反応におけるＦＡＭ標識およびＴＥＴ標識の自己消光蛍光プローブからの蛍光シグナルをプロットする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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