(57)【要約】ＡＡＶ５由来の配列を含有するシュードタイピングされたｒＡＡＶが記述される。ＡＡＶ　ＩＴＲＳの血清型もしくはいずれかの交差反応性の血清型のｒｅｐタンパク質が利用される、ＡＡＶ５キャプシドでシュードタイピングされたｒＡＡＶの製造方法が記述される。ＡＡＶ５　ＩＴＲを担持するミニ遺伝子が異種ＡＡＶ血清型のキャプシド中にパッケージングされる、シュードタイピングされたｒＡＡＶの類似の一生成方法が提供されてよい。シュードタイピングされたｒＡＡＶを含有する製薬学的組成物、および遺伝子送達のためのそれらの使用方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ　５’ＩＴＲ、異種分子およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るミニ遺伝子；
その中に前記ミニ遺伝子がパッケージングされているＡＡＶ５キャプシド
（ここで、前記ミニ遺伝子がＡＡＶ５に対し異種の血清型からのＡＡＶ　ＩＴＲ配列を含んで成る）；
を含んで成る、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項２】
前記ミニ遺伝子がＡＡＶ２配列を含んで成る、請求項１記載の組換えＡＡＶ。
【請求項３】
異種分子が、ペプチド、タンパク質、炭水化物、および酵素、ならびに核酸分子より成る群から選択される、請求項１もしくは２記載の組換えＡＡＶ。
【請求項４】
前記異種分子が核酸分子である、請求項１ないし３のいずれか記載の組換えＡＡＶ。
【請求項５】
前記核酸分子が、宿主細胞中での産物の発現を指図する調節配列の制御下にある産物をコードする核酸配列を含んで成るトランスジーンである、請求項４記載の組換えＡＡＶ。
【請求項６】
ＡＡＶ　５’ＩＴＲ、異種分子およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るＡＡＶ５ミニ遺伝子を含んで成り、前記ミニ遺伝子がＡＡＶキャプシド中にパッケージングされ、そして前記キャプシドがＡＡＶ５に対し異種のＡＡＶ血清型のものである、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項７】
キャプシドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６より成る群のＡＡＶ血清型から選択される、請求項６記載の組換えＡＡＶ。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項６記載のｒＡＡＶを含んで成る宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞中で：
ＡＡＶ５キャプシド中でのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で、
（ａ）ＡＡＶ　５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種分子およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るミニ遺伝子；
（ｂ）ＡＡＶ５キャプシドタンパク質；ならびに
（ｃ）ＡＡＶ末端反復配列と同一の血清型もしくはその交差反応性の血清型のＡＡＶ　ｒｅｐの機能的一部分
（ここで、前記ＡＡＶ　ｒｅｐが血清型５でないＡＡＶである）
を培養することの段階を含んで成る、ＡＡＶ血清型５キャプシド中でのベクターのパッケージング方法。
【請求項１０】
前記ＡＡＶ　ＩＴＲがＡＡＶ血清型２のものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＡＶ　ｒｅｐが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６のなかから選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＡＡＶ５キャプシド中にパッケージングされたミニ遺伝子を含んで成るｒＡＡＶを単離することの段階をさらに含んで成る、請求項９ないし１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ４　ＯＲＦ６を含んで成る、請求項９ないし１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘルパー機能がＥ２ａをさらに含んで成る、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ミニ遺伝子（ａ）がプラスミドを介して細胞に送達される、請求項９ないし１３のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＡＶ５キャプシドタンパク質がプラスミドを介して細胞に送達される、請求項９ないし１３のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＡＶ　ｒｅｐタンパク質がプラスミドを介して細胞に送達される、請求項９ないし１３のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＡＶ　ｒｅｐタンパク質が誘導可能なプロモーターの制御下にある、請求項９ないし１３のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
誘導可能なプロモーターがメタロチオネインプロモーターである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＡＡＶ５キャプシド中へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で、
（ａ）ＡＡＶ　５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種分子およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るミニ遺伝子；
（ｂ）ＡＡＶ５キャプシドタンパク質；ならびに
（ｃ）ＡＡＶ末端反復配列と同一の血清型もしくはその交差反応性の血清型のＡＡＶ　ｒｅｐの機能的一部分
（ここで、前記ＡＡＶ　ｒｅｐは血清型５でないＡＡＶである）
を含んで成るパッケージング宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞中で：
（ａ）ＡＡＶ　５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、異種分子およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るベクター；
（ｂ）非ＡＡＶ５キャプシドタンパク質；ならびに
（ｃ）ＡＡＶ５　ｒｅｐの機能的一部分
（ここで、前記宿主細胞が、非ＡＡＶ５キャプシド中への異種分子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で培養される）
を培養することの段階を含んで成る、非ＡＡＶ５キャプシド中へのＡＡＶ血清型５ベクターのパッケージング方法。
【請求項２２】
（ａ）改変された５’ＡＡＶ５末端反復配列；
（ｂ）宿主細胞への送達のための異種分子；および
（ｃ）改変された３’ＡＡＶ末端反復配列
を含んで成る、組換えアデノ随伴ウイルス血清型５ベクター。
【請求項２３】
前記異種分子が核酸分子である、請求項２２記載のｒＡＡＶ５。
【請求項２４】
前記核酸分子が、宿主細胞中でその発現を指図する調節因子の制御下にある選択された産物をコードする核酸配列を含んで成るトランスジーンであり、前記調節因子が、トランスジーンの下流のウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子およびウシ成長ホルモンポリＡシグナルを含んで成る、請求項２３記載のｒＡＡＶ５。
【請求項２５】
請求項１、請求項６もしくは請求項２２記載のｒＡＡＶおよび担体を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項１、６もしくは２２記載のｒＡＡＶと患者の細胞を接触させることの段階を含んで成る、選択された哺乳動物もしくは家畜の患者への異種分子の送達方法。
【請求項２７】
前記細胞がｒＡＡＶの鼻内送達を介して接触される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、請求項１、６もしくは２２記載のｒＡＡＶと患者の細胞を接触させることの第二段階をさらに含んで成り、第二段階のｒＡＡＶが、第一段階のｒＡＡＶのキャプシドタンパク質と異なる血清型からのキャプシドタンパク質を含有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
異種分子を、選択された哺乳動物もしくは家畜の患者に送達させるための医薬の製造における請求項１、６もしくは２２記載のｒＡＡＶの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本研究は、米国国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））からの助成金Ｐ３０　ＤＫ４７７５７−０７およびＰ０１　ＨＬ５９４０７−０２により部分的に資金を供給された。米国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は全般的に、遺伝子送達において有用なウイルスベクターの分野、およびより具体的には、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。
【０００３】
アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製を助長するためにヘルパーウイルスを必要とする、小型の一本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｆ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第３版、ｖｏｌ．２（リッペンコット−レイバン　パブリッシャーズ（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、フィラデルフィア州フィラデルフィア）（１９９５）中、Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．１００７−１０４１）。ＡＡＶの４．７ｋｂのゲノムは、２個の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ならびにそれぞれＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする２個の読取り枠を特徴とする。Ｒｅｐの読み枠は分子量７８ｋＤ、６８ｋＤ、５２ｋＤおよび４０ｋＤの４種のタンパク質をコードする。これらのタンパク質は主として、ＡＡＶの複製および宿主細胞の染色体中へのＡＡＶの組込みの調節において機能する。Ｃａｐの読み枠は分子量８５ｋＤ（ＶＰ　１）、７２ｋＤ（ＶＰ２）および６１ｋＤ（ＶＰ３）の３種の構造タンパク質をコードする（Ｂｅｒｎｓ、上に引用される）。ＡＡＶビリオンの全タンパク質の８０％以上がＶＰ３を含んで成る。２個のＩＴＲは、ＡＡＶの複製、パッケージングおよび組込みに不可欠な唯一のｃｉｓ要素である。「フリップ（ｆｌｉｐ）」および「フロップ（ｆｌｏｐ）」と呼ばれるＡＡＶ　ＩＴＲの２種のコンホメーションが存在する。コンホメーションのこれらの差異は、複製を開始および再開するのにＩＴＲを使用するアデノ随伴ウイルスの複製モデルから発した（Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、６７：６０９６−６１０４（１９９３）；Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＲＥＶＩＥＷＳ、５４：３１６−３２９（１９９０））。
【０００４】
ＡＡＶは、霊長類、イヌ、家禽およびヒトを包含する多くの動物種で見出されている（Ｆ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙら、“Ｔｈｅ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｉｘ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ”，ＡＲＣＨＩＶＥＳ　ＯＦ　ＶＩＲＯＬＯＧＹ、（シュプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ウィーン）（１９９５））。６種の霊長類の血清型が報告されている（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６）。患者の損傷から単離されたＡＡＶ５を除き、全部の他のＡＡＶ血清型は細胞培養物中で発見された。加えて、ＡＡＶ５は、いずれの他の血清型とも交差相補性（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を示さない唯一の血清型である。他の血清型の間での相同性は７５％ないし８２％の範囲にある一方、ＡＡＶ５はタンパク質レベルで他のＡＡＶ血清型と約５０％のみの相同性を示す。ＡＡＶ５の配列はクローン化かつ配列決定されており、そして組換えＡＡＶ５粒子が生成されている（Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７３（２）：１３０９−１３１９（１９９９年２月））。この論文の著者らは、ＡＡＶ５キャプシド中にＡＡＶ２ベクターをシュードタイピングするための試み、およびＡＡＶ２キャプシド中にＡＡＶ５ベクターをシュードタイピングするための試みが不成功であったこともまた報告した。
【０００５】
多数の独特の特性は、ＡＡＶをヒト遺伝子治療に有望なベクターにする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＴＯＰＩＣＳ　ＩＮ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、１５８：９７−１２９（１９９２））。他のウイルスベクターと異なり、ＡＡＶはいずれかの既知のヒト疾患に関連することが示されておらず、また、一般に病原性とみなされていない。野性型ＡＡＶは、部位特異的様式で宿主染色体中に組込むことが可能である（Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、８７：２２１１−２２１５（１９９０）；Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１０（１２）：３９４１−３９５０（１９９１））。組換えＡＡＶベクターは、ｒｅｐタンパク質がｔｒａｎｓに供給される場合に、組織培養された細胞中で第１９染色体に組込むことができる（Ｃ．Ｂａｌａｇｕｅら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７１：３２９９−３３０６（１９９７）；Ｒ．Ｔ．Ｓｕｒｏｓｋｙら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７１：７９５１−７９５９（１９９７））。ＡＡＶの組込まれたゲノムは、筋、肝および脳を包含する多数の組織中で長期の遺伝子発現を可能にすることが示されている（Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ、ＮＡＴＵＲＥ　ＭＥＤ．、３（３）：３０６−３１２（１９９７）；Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒら、ＮＡＴＵＲＥ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ、１６：２７０−２７６（１９９７）；Ｘ．Ｘｉａｏら、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＮＥＵＲＯＬＯＧＹ、１４４：１１３−１２４（１９９７）；Ｘｉａｏ、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７０（１１）：８０９８−８１０８（１９９６））。
【０００６】
ＡＡＶ２は、ヒト集団の約８０〜９０％に存在することが示されている。以前の研究は、ＡＡＶ２の中和抗体が普及していることを示した（Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、２：７１６−７２２（１９７０））。こうした抗体の存在は、その他の利点にもかかわらず、ＡＡＶ２に基づくＡＡＶベクターの有用性を有意に減少させるかもしれない。
【０００７】
当該技術分野で必要とされるものは、欠点、例えば破壊的中和抗体の存在を伴わない、上述されたもののようなＡＡＶ−２の利点を特徴とするベクターである。
【０００８】
（発明の要約）
有利には、本発明は、ＡＡＶ５由来のＩＴＲおよび／もしくはキャプシドを利用してＡＡＶキャプシド中にＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングすることによる、ＡＡＶウイルスのシュードタイピング方法を提供する。発明者らは、ＡＡＶミニ遺伝子（もしくは交差反応性の血清型）中にあると同一のＩＴＲからのｒｅｐタンパク質の使用が、異種血清型からのキャプシドタンパク質中でのベクターのパッケージングを可能にすることを見出した。他のＡＡＶ血清型キャプシドタンパク質に対する抗体により認識されないＡＡＶ５キャプシド中にｒＡＡＶをシュードタイピングする能力は、選択されたトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を担持するｒＡＡＶの反復した送達に有意の利点を提供する。
【０００９】
一局面において、本発明は、ＡＡＶ５キャプシドがＡＡＶ　５’ＩＴＲ、宿主細胞への送達のための異種分子、およびＡＡＶ　３’ＩＴＲを含んで成るｒＡＡＶミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶを提供し、ここでＡＡＶ５に対し異種の血清型のＩＴＲ。
【００１０】
別の局面において、本発明は、ＡＡＶ５ミニ遺伝子がＡＡＶ５に対し異種の血清型のキャプシド中にパッケージングされるｒＡＡＶを提供する。
【００１１】
なお別の局面において、本発明は本発明のｒＡＡＶを含有する宿主細胞を提供する。
【００１２】
さらなる一局面において、本発明はＡＡＶ５キャプシド中でのＡＡＶミニ遺伝子のパッケージング方法を提供する。この方法は、宿主細胞中で、パッケージングされるべきＡＡＶミニ遺伝子、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、およびミニ遺伝子と同一もしくは交差反応性の血清型のＡＡＶ　ｒｅｐの機能的一部分を培養することを必要とし、ここで前記ＡＡＶ　ｒｅｐは血清型５でないＡＡＶである。宿主細胞は、ＡＡＶ５キャプシド中でのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で培養する。
【００１３】
なおさらなる一局面において、本発明は、非ＡＡＶ５キャプシド中でのＡＡＶ５　ＩＴＲを含有するミニ遺伝子のパッケージング方法を提供する。この方法は、非ＡＡＶ５キャプシド中でのミニ遺伝子の複製およびパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下に、宿主細胞中で、パッケージングされるべきＡＡＶ５ミニ遺伝子、非ＡＡＶ５キャプシドタンパク質、およびＡＡＶ５　ｒｅｐの機能的一部分を培養することを必要とする。
【００１４】
なお別の局面において、本発明は、ＡＡＶ５キャプシド中でミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下に、パッケージングされるべきＡＡＶミニ遺伝子、ＡＡＶキャプシドタンパク質；ＡＡＶミニ遺伝子中のＩＴＲと同一もしくは交差反応性の血清型のＡＡＶ　ｒｅｐの機能的一部分を含有するパッケージング宿主細胞を提供する。
【００１５】
さらなる一局面において、本発明は、改変された５’　ＡＡＶ５末端反復配列、宿主細胞への送達のための異種分子、および改変された３’　ＡＡＶ５末端反復配列を含有するｒＡＡＶ５を提供する。
【００１６】
なおさらなる一局面において、本発明は、担体および本発明のｒＡＡＶを含んで成る製薬学的組成物を提供する。
【００１７】
なお別の局面において、本発明は、宿主細胞への送達のための異種分子を含有するＡＡＶミニ遺伝子、およびその中にミニ遺伝子がパッケージングされるＡＡＶ５キャプシドを含んで成る組換えＡＡＶを、選択された宿主に送達することの段階を必要とする、宿主への異種分子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。一態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ５に対し異種の血清型のＩＴＲを含んで成る。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、異種分子を含んで成るＡＡＶ５ミニ遺伝子、およびその中にＡＡＶ５ミニ遺伝子がパッケージングされるＡＡＶキャプシドを含んで成る組換えＡＡＶベクターを、選択された宿主に送達することの段階を必要とする、宿主への異種分子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。一態様において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ５に対し異種の血清型のものである。
【００１９】
別の局面において、本発明は、本発明のベクターを使用する選択された遺伝子産物のインビトロ産生方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の局面および利点は、本発明の詳述された記述から当業者に容易に明らかであろう。
【００２１】
（発明の詳細な記述）
本明細書に記述されるところの、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質および／もしくはＡＡＶ５　ＩＴＲから構成される本発明のｒＡＡＶは、中和抗体が他のＡＡＶ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの有効性を減少させる応用での使用にとりわけ十分に適する。本発明のｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶの再投与が望ましいもしくは必要とされる応用でとりわけ有利である。加えて、ＡＡＶ５は筋、腸および肺に対する組織向性（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｒｏｐｉｓｍ）を有することが見出されている。従って、ＡＡＶ５キャプシドを有する本発明のｒＡＡＶは、筋、腸および肺細胞への所望の産物の送達にとりわけ十分に適する。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の態様および利点を、下により詳細に記述する。
１．組換えアデノ随伴ウイルス
本発明は、その中でＡＡＶミニ遺伝子がＡＡＶキャプシド中にパッケージングされる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。一態様において、本発明は、その中でミニ遺伝子のＡＡＶ　ＩＴＲ配列および／もしくはキャプシドのいずれかがＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）のものである、異種ＡＡＶ血清型のキャプシド中にシュードタイピングされたＡＡＶミニ遺伝子を提供する。別の態様において、本発明は、その中でＡＡＶ　ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質双方が血清型５のものであるｒＡＡＶウイルスを提供する。この態様において、ｒＡＡＶは、本明細書に記述されるとおり、改変された５’および／もしくは３’ＩＴＲを含有する。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「ミニ遺伝子」は、最低でもＡＡＶ　ＩＴＲおよび異種分子から構成される構築物を指す。これらの成分は下により詳細に定義する。本発明のｒＡＡＶの製造のために、ミニ遺伝子は、ウイルスベクター、プラスミドベクターなどを包含するいずれかの適するベクター上に担持されてよい。
【００２４】
本発明の「シュードタイピングされた」ＡＡＶは、その中のキャプシドタンパク質がミニ遺伝子のＩＴＲの血清型（１種もしくは複数）に対し異種の血清型のものである組換えＡＡＶを指す。例えば、シュードタイピングされたｒＡＡＶは、ＡＡＶ５　ＩＴＲ、およびＡＡＶ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６もしくは別の適するＡＡＶ血清型のキャプシドを担持するミニ遺伝子から構成されてよく、ここで、ミニ遺伝子は異種キャプシド中にパッケージングされる。あるいは、シュードタイピングされたｒＡＡＶは、他の血清型の最低１種からのＩＴＲを含有するミニ遺伝子をその中にパッケージングしているＡＡＶ５キャプシドから構成されてよい。
【００２５】
ミニ遺伝子、ベクターおよびキャプシド、ならびに本発明で使用される他の構築物の生成で使用されるＡＡＶ配列は、多様な供給源から得てよい。例えば、配列は、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ３、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ６、もしくは他のＡＡＶ血清型または他のデンソウイルスにより提供されてよい。多様なこれらのウイルス血清型および株は、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナサス）から入手可能であるか、または多様な学術的もしくは商業的供給元から入手可能である。あるいは、既知の技術を使用して本発明のベクターおよびウイルスの調製で使用される配列を合成することが望ましくてよく、それは発表されかつ／もしくは多様なデータベースから入手可能であるＡＡＶ配列を利用してよい。本発明の構築物の調製で利用される配列の供給源は、本発明の制限でない。
【００２６】
Ａ．ＡＡＶミニ遺伝子
ＡＡＶミニ遺伝子は、最低でも、ＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、および宿主細胞への送達のための異種分子を含有する。最も適しては、ミニ遺伝子は、異種分子のそれぞれ５’および３’に配置されたＡＡＶの５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含有する。しかしながら、ある態様においては、ミニ遺伝子が直列で、例えば５’から３’へもしくは頭から尾に、または別の代替の配置で配置された５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列を含有することが望ましくてよい。なお他の態様において、ミニ遺伝子が、多数のコピーのＩＴＲを含有するか、または異種分子の５’および３’双方に配置された５’ＩＴＲ（もしくは逆に３’ＩＴＲ）を有することが望ましくてよい。ＩＴＲ配列は異種分子のすぐ上流および／もしくは下流に配置されてよいか、または介在配列が存在してよい。ＩＴＲは、ＡＡＶ５から、もしくは本明細書に記述されるところの他のＡＡＶ血清型のなかから選択してよい。異種分子は、限定されるものでないが、ポリペプチド、タンパク質、酵素、炭水化物、化学的部分、またはオリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡを包含してよい核酸配列を挙げることができる、細胞に送達されることが望ましいいかなる物質であってもよい。
【００２７】
一態様において、異種分子は、例えば突然変異された遺伝子の修正のためにヒト染色体中に特定の遺伝子修飾を導入する核酸分子であってよい。例えば、Ｄ．Ｗ．ＲｕｓｓｅｌｌとＲ．Ｋ．Ｈｉｒａｔａ、ＮＡＴＵＲＥ　ＧＥＮＥＴＩＣＳ、１８：３２５−３３０（１９９８年４月）を参照されたい。別の望ましい態様において、異種分子はトランスジーンである核酸である。本明細書で使用されるところの「トランスジーン」は、所望の産物をコードする核酸配列ならびに宿主細胞中でのその転写および／もしくは翻訳を指図しかつ宿主細胞中でのコードされる産物の発現を可能にする調節配列を指す。適するコードされる産物および調節配列を下でより詳細に論考する。しかしながら、ＡＡＶミニ遺伝子により送達される異種分子の選択は本発明の制限でない。
【００２８】
１．ＩＴＲ配列
本明細書で定義されるところの「ＡＡＶ５」ミニ遺伝子は、ＡＡＶ血清型５のＩＴＲを含有する。（これらの配列は、Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ、７３（２）：１３０９−１３１９（１９９９年２月）の図１に具体的に説明され、また、受託番号ＡＦ０８５７１６でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能である）。好ましくは、ＩＴＲ配列の実質的に全部が該分子中で使用されるが、とは言えこれらの配列のいくらかの程度の修飾が許容される。例えば、発明者らは、１７５ｂｐの５’ＩＴＲ（５’ＩＴＲの３’端の１３ｂｐが欠失された）および１８２ｂｐの３’ＩＴＲ（３’ＩＴＲの５’端の６ｂｐ）を利用することが可能であることを見出した一方、当該技術が１８８ｂｐの５’および３’ＩＴＲ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ、上に引用された）を記述している。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は当該技術の熟練内にある。
【００２９】
他のＡＡＶ血清型からのＩＴＲを含有するミニ遺伝子が同様に定義される。例えば、「ＡＡＶ２」ミニ遺伝子はＡＡＶ２　ＩＴＲを含有する。これらのＩＴＲ配列は長さが約１４５ｂｐである。（例えば、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ、上に引用されるを参照されたい；例えば“Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣ　プレス（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ）中、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、ｐｐ．１５５−１６８（１９９０）もまた参照されたい）。しかしながら、本発明はミニ遺伝子が単一の血清型供給源からの５’および３’双方のＩＴＲを含有することを必要としない。場合によっては、ミニ遺伝子は１種の血清型からの５’ＩＴＲおよび第二の血清型からの３’ＩＴＲを含有してよい。いずれかの選択されたＡＡＶ血清型からのＩＴＲについて、ＡＡＶ５　ＩＴＲでと同様に、ＩＴＲ配列全体をミニ遺伝子で使用してよいか、もしくは小さな改変を該配列に行ってよい。
【００３０】
２．トランスジーン
一態様において、ＡＡＶミニ遺伝子の異種分子はトランスジーンを含んで成る。上に定義されたとおり、トランスジーンは、宿主細胞中での核酸配列によりコードされる産物の転写、翻訳を可能にしかつ／もしくは最終的には発現を指図する様式で調節成分に動作可能なように（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された、目的のポリペプチド、タンパク質、酵素もしくは他の産物をコードする核酸配列を含んで成る。
【００３１】
トランスジーンの組成は、本発明のｒＡＡＶを向かわせることができる使用に依存することができる。例えば、トランスジーン中に包含されてよい１つの型の核酸配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター配列は、限定されるものでないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結合型タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、および、それに対するそれに対して向けられた高親和性抗体が存在するかもしくは慣習的手段により産生させることができる当該技術分野で公知の他者、ならびに、とりわけヘマグルチニンもしくはＭｙｃからの抗原標識ドメインに適切に融合された膜結合型タンパク質を含んで成る融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００３２】
これらの配列は、それらの発現を駆動する調節因子と連合される場合に、酵素的、Ｘ線写真的、比色的、蛍光的もしくは他の分光学的アッセイ、蛍光標示式細胞分取アッセイ、ならびに酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイを包含する慣習的手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、ウイルスの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出される。トランスジーンがルシフェラーゼである場合は、ウイルスは発光計中での光産生により測定してよい。
【００３３】
しかしながら、望ましくは、トランスジーンは、タンパク質、ペプチド、アンチセンス核酸（例えばＲＮＡ）、酵素もしくは触媒的ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードする非マーカー配列を含んで成る。コードされる産物を使用して、正常な遺伝子が正常レベル未満で発現される欠損、もしくは機能的遺伝子産物が発現されない欠損のような遺伝子欠損（ｇｅｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を修正もしくは改善してよい。トランスジーンにより担持される好ましい１つの型の核酸配列は、宿主細胞中で発現される治療的タンパク質、ペプチド、酵素もしくはポリペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠損（ｇｅｎｅ　ｄｅｆｅｃｔ）を修正もしくは改善するために多数のトランスジーンを使用することを包含する。ある状況において、１種のタンパク質の各サブユニットをコードする、または異なるペプチドもしくはタンパク質をコードする異なるトランスジーンを使用してよい。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来成長因子もしくはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するために、細胞を多様なサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに感染させる。別の態様において、タンパク質の異なるサブユニットが同一のトランスジーンによりコードされてよい。この場合、単一のトランスジーンはサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの合計が５キロ塩基未満である場合に望ましい。あるいは、ＩＲＥＳの使用を必要としない他の方法をタンパク質の共発現に使用してよい。こうした他の方法は、とりわけ当業者に既知である第二の内的プロモーター、選択的スプライスシグナル、共翻訳もしくは翻訳後タンパク質分解的切断戦略の使用を必要としてよい。
【００３４】
しかしながら、選択されたトランスジーンは研究に望ましいいかなる産物をコードしてもよい。トランスジーン配列の選択は本発明の制限でない。
【００３５】
トランスジーンによりコードされてよい他の有用な産物は、限定されるものでないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＧＣ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのいずれか１種、もしくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１−１５のいずれか、成長因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリンのヘレグルイン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、セマフォリン／コラプシン、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇおよびチロシン水酸化酵素のファミリーのいずれか１種を挙げることができる、ホルモンならびに成長および分化因子を包含する。
【００３６】
他の有用なトランスジーン産物は、限定されるものでないが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−１７、単球化学誘因物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを挙げることができる免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、限定されるものでないが、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、人化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞レセプター、キメラＴ細胞レセプター、一本鎖Ｔ細胞レセプター、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を挙げることができる。有用な遺伝子産物はまた、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、解離促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような調節タンパク質も包含する。
【００３７】
なお他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質のレセプターのいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターおよびスカベンジャーレセプターを包含するコレステロール調節のためのレセプターを包含する。トランスジーンはまた、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプター、ビタミンＤレセプターならびに他の核レセプターを包含するステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバーのような産物をコードする遺伝子も含有してよい。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ−３、ならびにウイング付き（ｗｉｎｇｅｄ）ヘリックスタンパク質のフォークへッドファミリーのような転写因子を包含する。
【００３８】
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネート合成酵素、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテート加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβ−合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリル−ｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列を包含する。
【００３９】
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドのような、天然に存在しないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンは、ある免疫無防備状態の患者で有用である可能性がある。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、アンチセンス分子、および遺伝子の過剰発現を低下させるのに使用することができるリボザイムのような触媒的核酸を包含する。他の適する産物は当業者により容易に選択されてよい。トランスジーンによりコードされる産物の選択は本発明の制限であるとみなされない。
【００４０】
３．調節因子
トランスジーンは、宿主細胞中でのその発現を促進するために、目的の産物をコードする核酸配列に操作可能に連結される適切な配列を包含する。「操作可能に連結される」配列は、目的の産物のコーディング配列と連続する発現制御配列、および目的の産物の発現を制御するようにｔｒａｎｓでもしくはある距離をおいて作用する発現調節配列の双方を包含する。トランスジーンで有用であることに加え、本明細書に記述される調節因子はまた、本出願に記述される他の異種分子および他の構築物でも使用してよい。
【００４１】
発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル酸化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックのコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望の場合はタンパク質のプロセシングおよび／もしくは分泌を高める配列を包含する。多数の発現制御配列（例えば天然の、構成的、誘導可能および／もしくは組織特異的な）が当該技術分野で既知であり、そして所望の発現の型に依存して遺伝子の発現を駆動するのに利用してよい。真核生物細胞については、発現制御配列は、典型的には、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなど由来のもののようなプロモーター、エンハンサー、ならびに、スプライスドナーおよびアクセプター部位を包含してよいポリアデニル酸化配列を包含する。ポリアデニル酸化配列は、一般に、トランスジーン配列の後かつ３’ＩＴＲ配列の前に挿入される。一態様において、使用されるウシ成長ホルモンポリＡ。本発明の構築物中で有用な調節配列はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と遺伝子との間に配置されるイントロンも含有してよい。１つの可能なイントロン配列はまたＳＶ−４０に由来し、そしてＳＶ−４０　Ｔイントロン配列と称される。別の適する配列はウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子を包含する。（例えば、Ｌ．ＷａｎｇとＩ．Ｖｅｒｍａ、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．、（１９９９）を参照されたい）。移入ベクターで使用してよい別の要素は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列、もしくは上で論考されたところの他の適する系を使用して、単一の遺伝子転写物から１種以上のポリペプチドを生じさせてよい。ＩＲＥＳ（もしくは他の適する配列）を使用して、１種以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生させるか、または同一細胞からもしくはそれ内で２種の異なるタンパク質を発現させる。これらおよび他の普遍的ベクターおよび調節因子の選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ならびに例えば３．１８−３．２６および１６．１７−１６．２７でその中に引用される参考文献、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、ジョン　ワイリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９８９を参照されたい。
【００４２】
一態様において、望ましい高レベルの構成的発現。こうしたプロモーターの例は、限定されるものでないが、レトロウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えばＢｏｓｈａｒｔら、ＣＥＬＬ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際特許出願第ＷＯ　９８／１００８８号明細書）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６））、テトラサイクリンで抑制可能な系（Ｇｏｓｓｅｎら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２））、テトラサイクリンで誘導可能な系（Ｇｏｓｓｅｎら、ＳＣＩＥＮＣＥ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙら、ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．ＣＨＥＭ．ＢＩＯＬ．、２、５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい）、ＲＵ−４８６で誘導可能な系（Ｗａｎｇら、ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲ．、４：４３２−４４１（１９９７））、ならびにラパマイシンで誘導可能な系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７））を包含する誘導可能なプロモーターは、外因性に供給される化合物により調節される。本明細書に記述されるトランスジーンおよび他の構築物で有用であるかもしれない他の型の誘導可能なプロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、もしくは複製する細胞中のみで調節されるものである。
【００４３】
別の態様において、選択された遺伝子産物に対する天然のプロモーターを使用することができる。天然のプロモーターは、産物の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましいかもしれない。天然のプロモーターは、産物の発現が一時的にもしくは発達的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用してよい。さらなる一態様において、エンハンサー要素、ポリアデニル酸化部位もしくはコザックのコンセンサス配列のような他の天然の発現制御因子もまた、天然の発現を模倣するために使用してよい。
【００４４】
別の態様において、発現されるべき産物をコードする配列は組織特異的プロモーターに操作可能に連結される。例えば、骨格筋中での発現が望ましい場合には、筋中で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成の筋プロモーター（Ｌｉら、ＮＡＴ．ＢＩＯＴＥＣＨ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）を包含する。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ；肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら　Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲ．、３：１００２−９（１９９６）；およびα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、ＨＵＭ．ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎら、ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＲＥＰ．、２４：１８５−９６（１９９７）；および骨シアロプロテイン、Ｃｈｅｎら、Ｊ．ＢＯＮＥ　ＭＩＮＥＲ．ＲＥＳ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎら　ＣＥＬＬ．ＭＯＬ．ＮＥＵＲＯＢＩＯＬ．、１３：５０３−１５（１９９３）；神経細糸軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１）；およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、ＮＥＵＲＯＮ、１５：３７３−８４（１９９５））について既知である。
【００４５】
もちろん、全部の発現制御配列が本発明で有用な産物の全部を発現させるのに等しく良好に機能することができるわけでない。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から離れることなく、これらの発現制御配列のなかで選択を行ってよい。適するプロモーター／エンハンサー配列は、本出願により提供される手引きを使用して当業者により選択されてよい。こうした選択は慣例の問題であり、そして該トランスジーンもしくは他の構築物の制限でない。例えば、５’ＩＴＲ、トランスジーンおよび３’ＩＴＲから構成される「ミニ遺伝子」中の挿入のためのトランスジーン中での使用のための、目的のコーディング配列に操作可能に連結された１種もしくはそれ以上の発現制御配列を選択してよい。こうしたミニ遺伝子は、約３０ｋｂまでの数百塩基対の範囲の大きさを有してよい。従って、この系は、大きさに関してミニ遺伝子、とりわけ選択されたトランスジーンの多様な成分の選択における多大な許容範囲を許容する。本発明の教示を提供されれば、こうしたミニ遺伝子の設計は、慣習的技術に対する頼みにより行うことができる。
【００４６】
本明細で教示される、もしくは当該技術分野で教示されるところのミニ遺伝子のパッケージング方法の１つに従った後に、適する細胞をインビトロもしくはインビボで感染させてよい。異種分子がトランスジーンを含んで成る場合は、細胞中のトランスジーンのコピー数を、サザンブロッティングもしくは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりモニターしてよい。ＲＮＡ発現のレベルは、ノーザンブロッティングもしくは定量的逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによりモニターしてよい。タンパク質発現のレベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、もしくはトランスジーンのコードされる産物の生物学的活性の試験によりモニターしてよい。従って、特定の発現制御配列が特定のトランスジーンに適するかどうかを容易にアッセイしてよく、また、所望のトランスジーンの発現に最も適切な発現制御配列を選んでよい。本発明のｒＡＡＶを介して送達される他の異種分子の存在の適する検出方法は当業者に既知であり、そして本発明の制限でない。
【００４７】
Ｂ．ＡＡＶキャプシド
とりわけ好ましい一態様において、本発明は、非ＡＡＶ５ミニ遺伝子がＡＡＶ５キャプシド中にパッケージングされている、もしくはＡＡＶ５移入ベクターが非ＡＡＶ５キャプシド中にパッケージングされている、シュードタイピングされたｒＡＡＶを提供する。適しては、選択された血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を提供する配列は、本明細書に記述される他のＡＡＶ配列でのように、いずれかの適する供給源から得てよい。
【００４８】
なお別の態様において、本発明は、ＡＡＶ　ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質の双方が血清型５のものであるｒＡＡＶウイルスを提供する。この態様において、ウイルスは好ましくは改変された５’および／もしくは３’ＩＴＲを含有する。より具体的には、ウイルスは望ましくは１７５ｂｐの５’ＩＴＲおよび１８２ｂｐの３’ＩＴＲを含有する。望ましくは、この態様において、ｒＡＡＶウイルスはさらに、トランスジーンの上流のプロモーターおよびイントロン、ならびにトランスジーンの下流のウッドチャック肝炎ウイルス転写後因子およびウシ成長ホルモンポリＡシグナルを含有する。
【００４９】
本明細書に記述されるＡＡＶキャプシド中にパッケージングされたＡＡＶ移入ベクターから構成される本発明のｒＡＡＶは、以下の方法もしくは当該技術分野で既知の他の適する方法を利用して製造してよい。
【００５０】
ＩＩ．ｒＡＡＶの製造
本発明は、その中でＡＡＶ５ミニ遺伝子が異種ＡＶ血清型キャプシド中にパッケージングされている、もしくはその中で非ＡＡＶ５血清型ミニ遺伝子がＡＡＶ５キャプシド中にパッケージングされている、シュードタイピングされたＡＡＶウイルスの製造を可能にする方法を提供する。発明者らは、このシュードタイピングが、パッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で、ミニ遺伝子中に見出されるＩＴＲのものと同一の血清型もしくは交差反応性の血清型のｒｅｐタンパク質（もしくはその機能的一部分）を利用することにより達成することができることを見出した。従って、ＡＡＶ２ミニ遺伝子は、ＡＡＶ２もしくは交差反応性の血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４もしくはＡＡＶ６からのｒｅｐタンパク質の使用により、ＡＡＶ５キャプシド中にシュードタイピングすることができる。同様に、ＡＡＶ１　５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２　３’ＩＴＲを含有するＡＡＶミニ遺伝子を、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２もしくは別の交差反応性血清型からのｒｅｐタンパク質の使用により、ＡＡＶ５キャプシド中にシュードタイピングしてよい。しかしながら、ＡＡＶ５は他のＡＡＶ血清型と交差反応性でないため、ＡＡＶ５ミニ遺伝子は、ＡＡＶ５　ｒｅｐタンパク質の使用によってのみ異種のＡＡＶキャプシド中にシュードタイピングされることができる。
【００５１】
従って、一態様において、本発明はＡＡＶ血清型５キャプシド中へのＡＡＶミニ遺伝子のシュードタイピング方法を提供する。該方法は、ＡＡＶ５キャプシド中へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で、ＡＡＶ５に対し異種の１種もしくはそれ以上の血清型由来であるＩＴＲ、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質の発現を駆動する核酸配列、およびＡＡＶ　ＩＴＲのものと同一の（もしくは交差反応性の）血清型のＡＡＶ　ｒｅｐの機能的一部分を含有するＡＡＶミニ遺伝子を宿主細胞中で培養することを必要とする。
【００５２】
別の態様において、本発明は、別の血清型からのＡＡＶキャプシド中でのＡＡＶ５ミニ遺伝子のシュードタイピング方法を提供する。該方法は、ＡＡＶキャプシド中へのＡＡＶ　ＩＴＲ−異種分子−ＡＡＶ　ＩＴＲミニ遺伝子のパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能の存在下で、ＡＡＶ５　ＩＴＲ、ＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動する核酸配列、およびＡＡＶ５　ｒｅｐの機能的一部分を含有するＡＡＶミニ遺伝子を宿主細胞中で培養することを必要とする。
【００５３】
なお別の態様において、本発明は、その中のＡＡＶ　ＩＴＲおよびキャプシドタンパク質の双方が血清型５のものである、ｒＡＡＶ５ウイルスのヘルパーウイルスを含まない製造方法を提供する。この態様において、ウイルスは好ましくは改変された５’および／もしくは３’ＩＴＲを含有する。
【００５４】
なおさらなる一態様において、本発明のｒＡＡＶはインビトロパッケージングにより製造してよい。この態様において、キャプシドタンパク質は、宿主細胞中のｒＡＡＶのパッケージングについて記述されたものと類似の製造および精製技術を使用して、宿主細胞中で製造されかつ宿主細胞から抽出される。抽出されたキャプシドタンパク質をその後、ウイルスのインビトロパッケージングに利用する。インビトロパッケージングのための適する技術は当業者に既知である。例えば、Ｘ．ＺｈｏｕとＮ．Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．ＶＩＲＯＬ、７２：３３４１−３３４７（１９９８年４月）を参照されたい。本発明のｒＡＡＶの適切なパッケージング方法の選択は本発明の制限でない。
【００５５】
Ａ．パッケージング宿主細胞への必要とされる成分の送達
ＡＡＶキャプシド中にＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングするために宿主細胞中で培養されることが必要とされる成分は、宿主細胞にｔｒａｎｓで提供してよい。あるいは、必要とされる成分（例えばミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／もしくはヘルパー機能）のいずれか１種もしくはそれ以上は、当業者に既知の方法を使用して、必要とされる成分の１種もしくはそれ以上を含有するよう工作された安定な宿主細胞により提供してよい。最も適しては、こうした安定な宿主細胞は、誘導可能なプロモーターの制御下に必要とされる成分（１種もしくは複数）を含有することができる。しかしながら、必要とされる成分（１種もしくは複数）は、構成的プロモーターの制御下にあってよい。適する誘導可能なおよび構成的プロモーターの例は、トランスジーンとの使用に適する調節因子の論考中に、本明細書に提供される。なお別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分（１種もしくは複数）、および１種もしくはそれ以上の誘導可能なプロモーターの制御下の他の選択された成分（１種もしくは複数）を含有してよい。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるがしかし誘導可能なプロモーターの制御下にｒｅｐおよび／もしくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成させてよい。なお他の安定な宿主細胞が当業者により生成されてよい。
【００５６】
本発明のｒＡＡＶを製造するために必要とされるミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、いずれかの遺伝要素、例えばその上に担持された配列を移入する裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどの形態でパッケージング宿主細胞に送達されてよい。選択された遺伝要素は、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速度ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含するいずれかの適する方法により送達されてよい。
【００５７】
本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は、核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド　スプリング　ハーバー　プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。
【００５８】
Ｉ．ミニ遺伝子の送達
現在、ミニ遺伝子は、好ましくはトランスフェクションにより宿主細胞に送達されるプラスミド上で担持される。それらが複製および場合によっては原核生物細胞、哺乳動物細胞もしくは双方中への組込みに適するような、本発明で有用なプラスミドを工作してよい。これらのプラスミド（もしくは５’ＡＡＶ　ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを担持する他のベクター）は、真核生物および／もしくは原核生物中でのミニ遺伝子の複製を可能にする配列、ならびにこれらの系のための選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネチシン、ヒグロマイシンもしくはプリマイシン耐性をコードする配列を包含してよい。プラスミドはまた、アンピシリン耐性のような細菌細胞中でベクターの存在を知らせるのに使用することができるある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子も含有してよい。プラスミドの他の成分は、複製起点、ならびにエプスタイン−バーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを包含してよい。このアンプリコン系、もしくは他の類似のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を担持する分子が細胞中にトランスフェクトされ、ここでそれは一過性にもしくは好ましくはエピソームとして存在してよい。あるいは、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ　ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを担持する）は、宿主細胞の染色体中に安定に組込まれてよい。適するトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞にミニ遺伝子を送達させるのに容易に利用してよい。
【００５９】
一般に、ミニ遺伝子を含んで成るベクターをトランスフェクションにより送達する場合、ベクターは約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、ならびに好ましくは約１０ないし約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０４個の細胞ないし約１×１０１３個の細胞、および好ましくは約１０５個の細胞に送達される。しかしながら、宿主細胞へのベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法および選択された宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節してよい。
【００６０】
２．ｒｅｐおよびｃａｐ配列
ミニ遺伝子に加え、宿主細胞はまた、宿主細胞中での選択されたＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中に見出されるＡＡＶ　ＩＴＲの血清型と同一の血清型のｒｅｐ配列も含有しなければならない。ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上述されたとおり１種のＡＡＶ供給源から独立に得てよく、そして上述されたとおり当業者に既知のいずれかの様式で宿主細胞に導入してよい。加えて、ＡＡＶ５キャプシド中にＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、不可欠のｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列を同一のＡＡＶ血清型により供給してよいか、もしくはｒｅｐタンパク質をコードする配列は、異なるがしかし交差反応性のＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６）により供給してよい。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からであってよい一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ１からでよい。
【００６１】
一態様において、宿主細胞は、上述されたもののような適するプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、キャプシドタンパク質は誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、キャプシドタンパク質はｔｒａｎｓで宿主細胞に供給される。ｔｒａｎｓで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞中での選択されたキャプシドタンパク質の直接発現に必要な配列を含有するプラスミドを介して送達してよい。最も望ましくは、ｔｒａｎｓで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質を担持するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列もまた担持する。
【００６２】
別の態様において、宿主細胞は、上述されたもののような適するプロモーターの制御下にｒｅｐ配列を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、不可欠なｒｅｐタンパク質は誘導可能なプロモーターの制御下に発現される。別の態様において、ｒｅｐタンパク質は宿主細胞にｔｒａｎｓで供給される。ｔｒａｎｓで宿主細胞に送達される場合、ｒｅｐタンパク質は、選択されたｒｅｐタンパク質の宿主細胞中での直接発現に必要な配列を含有するプラスミドを介して送達してよい。最も望ましくは、ｔｒａｎｓで宿主細胞に送達される場合、キャプシドタンパク質を担持するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするのに必要とされる他の配列、例えばｒｅｐおよびｃａｐ配列もまた担持する。
【００６３】
従って、一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、単一核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクトしてよく、そしてエピソームとして細胞中で安定に存在するかもしれない。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞のゲノム中に安定に組込まれる。別の態様は、宿主細胞中で一過性に発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、こうしたトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’へ、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入された任意のスペーサー、ＡＡＶ　ｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶ　ｃａｐ遺伝子配列を含んで成る。
【００６４】
場合によっては、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列は、宿主細胞中に導入されるべきである他のＤＮＡ配列を含有するベクター上で供給されてよい。例えば、ベクターはミニ遺伝子を含んで成るｒＡＡＶ構築物を含有してよい。ベクターは、ヘルパー機能をコードする遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６、ならびにＶＡＩ　ＲＮＡの遺伝子の１種もしくはそれ以上を含んでよい。
【００６５】
好ましくは、本構築物で使用されるプロモーターは、当業者に既知もしくは上で論考されたところの構成的、誘導可能もしくは天然のプロモーターのいずれかであってよい。一態様において、ＡＡＶ　Ｐ５プロモーター配列を使用する。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は、本発明を制限しない。
【００６６】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは、トランスジーン調節因子に関連して上で論考されるところの誘導可能なプロモーターである。ｒｅｐ発現のための１つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んで成るベクターを、Ｔ７ポリメラーゼを構成的にもしくは誘導可能にのいずれかで発現する細胞にトランスフェクトもしくは形質転換する。１９９８年３月１２日公開の国際特許出願第ＷＯ　９８／１００８８号明細書を参照されたい。
【００６７】
スペーサーはベクターの設計における任意の要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始部位との間に挿入されるＤＮＡ配列である。スペーサーはいかなる所望の設計を有してもよく；すなわち、それはヌクレオチドの無作為の配列であってよいか、あるいは、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードしてよい。スペーサーは開始／終止およびポリＡ部位を典型的に組込む遺伝子を含有してよい。スペーサーは、原核生物もしくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復性非コーディング配列、転写制御を伴わないコーディング配列、もしくは転写制御を伴うコーディング配列であってよい。スペーサー配列の２つの例示的供給源は、λファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、それらはとりわけ例えばギブコ（Ｇｉｂｃｏ）もしくはインヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を正常レベルで発現される状態にして、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分ないずれかの大きさのものであってよい。スペーサーの長さは、従って、好ましくは約１００ｂｐないし約８．０ｋｂｐの範囲で、約１０ｂｐから約１０．０ｋｂｐまでの範囲にわたってよい。組換えの可能性を減少させるために、スペーサーは、好ましくは長さが２ｋｂｐ未満であるが；しかしながら、本発明はそのように制限されない。
【００６８】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１種もしくは複数）が宿主細胞中で一過性に（すなわちトランスフェクションにより）存在してよいとは言え、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方もしくは双方、ならびにそれらの発現を制御するプロモーター（１種もしくは複数）が、例えばエピソームとして、もしくは宿主細胞の染色体への組み込みにより、宿主細胞中で安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために使用される方法は、上の参考文献に記述されるもののような慣習的遺伝子工学もしくは組換え工学技術である。本明細は、本明細書に提供される情報を使用して特定の構築物の具体的に説明する例を提供する一方、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、ならびに最低１種の転写開始および終止シグナルを包含する他の要素の選択、ならびにポリアデニル酸化部位の任意の付加を使用して、他の適する構築物を選択かつ設計してよい。
【００６９】
本発明の別の態様において、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供されるかもしれない。
【００７０】
３．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞はまた、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能も必要とする。場合によっては、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給してよい。最も望ましくは、必要なヘルパー機能はアデノウイルス供給源から提供される。現在好ましい一態様において、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／もしくはＥ４　ＯＲＦ６遺伝子産物を提供されかつ／または含有する。宿主細胞はＶＡＩ　ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有してよいが、しかしこれらの遺伝子は必要とされない。好ましい一態様において、宿主細胞中に他のアデノウイルス遺伝子もしくは遺伝子機能は存在しない。
【００７１】
本発明で有用な、アデノウイルスのＥ４　ＯＲＦ６遺伝子ならびにＥ１遺伝子および／もしくはＥ２ａ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、現在同定されている４６種のヒトの型を包含するいずれかの既知のアデノウイルス型のなかから選択してよい［例えば、Ｈｏｒｗｉｔｚ、上に引用される、およびアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を参照されたい］。同様に、他の動物を感染させることが既知のアデノウイルスが遺伝子配列を供給するかもしれない。各Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４　ＯＲＦ６遺伝子配列についてのアデノウイルス型の選択は本発明を制限しない。血清型Ａｄ５のものを包含する多数のアデノウイルス血清型の配列は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能である。多様なアデノウイルス株は、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣＵｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から入手可能であるか、もしくは多様な商業的および工業的供給元から求めに応じて入手可能である。ヒトアデノウイルスタイプ１ないし４６のいずれか１種もしくはそれ以上が、Ｅ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４　ＯＲＦ６を包含するアデノウイルス配列のいずれかを供給するかもしれない。
【００７２】
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、Ｅ１ａもしくはいずれかの機能的Ｅ１ａ部分をコードするいかなるアデノウイルス配列も意味される。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ、およびＥ４　ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡが同様に定義される。アデノウイルス遺伝子もしくはそれらの機能的部分のいかなる対立遺伝子もしくは他の改変もまた包含される。こうした改変は、なんらかの様式でアデノウイルスの機能を高めるための慣習的遺伝子工学もしくは突然変異誘発技術、ならびにそれらの天然に存在する対立遺伝子変異体に対する頼みにより、熟慮の上で導入してよい。こうした改変、およびこれらのアデノウイルス遺伝子の機能を達成するためのＤＮＡの操作方法は、当業者に既知である。
【００７３】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物、ならびにいずれかの他の所望のヘルパー機能は、細胞中でのそれらの発現を可能にするいずれかの手段を使用して提供することができる。これらの産物をコードする配列のそれぞれは別個のベクター上にあってよいか、または、１種もしくはそれ以上の遺伝子が同一のベクター上にあってよい。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する当該技術分野で既知もしくは上に開示されたいずれのベクターであってもよい。ベクターの宿主細胞中への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔法、リポソーム送達、膜融合技術、高速度ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する当該技術分野で既知もしくは上に開示されたところのいずれの手段によって達成してもよい。アデノウイルス遺伝子の１種もしくはそれ以上は、宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、もしくは一過性に発現されるかもしれない。遺伝子産物は、全部、エピソーム上で一過性に発現されるか、もしくは安定に組込まれてよいか、または、遺伝子産物のいくつかが安定に発現されるかもしれない一方、他者は一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーターもしくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立に選択してよい。プロモーターは、生物体もしくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製するもしくは休止状態の細胞中で）、あるいは例えば外因性に付加された因子により調節されるかもしれない。
【００７４】
Ｂ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
宿主細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいかなる生物学的生物体から選択してもよい。とりわけ望ましい宿主細胞は、限定されるものでないが、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ　１、ＣＯＳ　７、ＢＳＣ　１、ＢＳＣ　４０、ＢＭＴ　１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的なアデノウイルスのＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２のような細胞、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を挙げることができる、いかなる哺乳動物種のなかからも選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく；また、哺乳動物細胞の型、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。使用される細胞の要件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４　ＯＲＦ６以外のいかなるアデノウイルス遺伝子も担持しない；それがｒＡＡＶの産生の間に汚染するウイルスの相同的組換えをもたらす可能性のあるいずれかの他のウイルス遺伝子を含有しない；ならびにそれがＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクトされたＤＮＡの発現が可能であることである。好ましい一態様において、宿主細胞は細胞中でｒｅｐおよびｃａｐを安定にトランスフェクトさせるものである。
【００７５】
本発明で有用な１種の宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定にトランスフェクトされ、かつ、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６　ＤＮＡならびに上述されたところのミニ遺伝子を担持する構築物でトランスフェクトされる宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９４６３号明細書）のような安定なｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現細胞系、または米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記述されるものもまた同様に使用してよい。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４　ＯＲＦ６を発現するのに十分である最低限のアデノウイルスＤＮＡを含有する。
【００７６】
本発明の宿主細胞の製造は、選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して達成してよい。こうした技術は、公知でありかつ上に引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法と組み合わせられたアデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重なり合うオリゴヌクレオチド配列の使用を包含する。
【００７７】
宿主細胞中への分子の導入（プラスミドもしくはウイルスとしての）はまた、当業者に既知かつ本明細を通じて論考されるような技術を使用して達成してもよい。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ４トランスフェクションもしくは電気穿孔法、および／またはヒト胚腎細胞系ＨＥＫ２９３（ｔｒａｎｓに作用するＥ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞系）のような細胞系へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染を使用する。
【００７８】
ＩＩＩ．製薬学的組成物
本発明のｒＡＡＶは、インビトロでのタンパク質およびペプチド発現、ならびにエクスビボおよびインビボの遺伝子送達を包含する多様な用途に適する。
【００７９】
本発明のｒＡＡＶは、選択された分子をいずれかの適する手段により宿主細胞に送達させるのに使用してよい。一態様において、ｒＡＡＶおよび細胞をエクスビボで混合し；感染した細胞を、慣習的方法論を使用して培養し；そして形質導入された細胞を患者に再注入する。
【００８０】
あるいは、好ましくは生理学的に適合性の担体に懸濁されたｒＡＡＶを、ヒトもしくは非ヒトの哺乳動物患者に投与してよい。適する担体は、移入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択することができる。例えば、１種の適する担体は、多様な緩衝溶液とともに処方してよい生理的食塩水を包含する（例えばリン酸緩衝生理的食塩水）。他の例示的担体は、滅菌生理的食塩水、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、アガー、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水を包含する。担体の選択は本発明の制限でない。
【００８１】
場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（１種もしくは複数）に加えて、保存剤もしくは化学的安定剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有してよい。適する例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを包含する。適する化学的安定剤はゼラチンおよびアルブミンを包含する。
【００８２】
一態様において、本発明のｒＡＡＶは、一過性のトランスジーン発現もしくは別の選択された分子の送達が治療的である（例えば、癌におけるｐ５３遺伝子移入および心疾患におけるＶＥＧＦ遺伝子移入）応用に適する。しかしながら、ｒＡＡＶは、一過性のトランスジーン発現が望ましい使用に制限されない。ｒＡＡＶは、選択された分子の送達および発現が望ましい多様な状況に有用である。
【００８３】
従って、本発明のｒＡＡＶは、多様な送達の応用のいずれにも有用である。重要なことに、本発明のｒＡＡＶ５は、本発明のｒＡＡＶ５が他の血清型のｒＡＡＶとの血清学的交差反応性を欠くために、従来技術のウイルスを上回る利点を提供する。
【００８４】
ＩＶ．ＡＡＶ５配列もしくはタンパク質を含有するシュードタイピングされたｒＡＡＶを介する遺伝子送達方法
別の局面において、本発明は、選択された宿主細胞を発明のｒＡＡＶに感染させることを必要とする、宿主への異種分子（例えばトランスジーン産物）の送達方法を提供する。送達方法は当業者に公知であり、そして本発明の制限でない。
【００８５】
望ましい一態様において、本発明は、宿主へのトランスジーンのＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。本方法は、その発現を指図する配列の制御下の選択されたトランスジーンおよびＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含有するｒＡＡＶを含む選択された宿主細胞を必要とする。この態様は、ＡＡＶ５キャプシドが他のＡＡＶ血清型に対する中和抗体により認識されないため、とりわけ望ましい。
【００８６】
別の態様において、本発明は、別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質中にパッケージングされたＡＡＶ５移入ベクターを含有するｒＡＡＶでの選択された宿主細胞の感染方法を提供する。場合によっては、宿主からのサンプルを、最初に、選択されたＡＡＶ血清型に対する抗体の存在についてアッセイしてよい。中和抗体を検出するための多様なアッセイ形式が当業者に公知である。こうしたアッセイの選択は本発明の制限でない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒら、ＮＡＴＵＲＥ　ＭＥＤ．、３（３）：３０６−３１２（１９９７年３月）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇら、ＨＵＭＡＮ　ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲＡＰＹ、９：４７７−４８５（１９９８年３月１日）を参照されたい。このアッセイの結果を使用して、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の非存在により、送達にどの血清型からのキャプシドタンパク質が好ましいことができるかを決定してよい。
【００８７】
本方法の別の態様において、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質をもつベクターの送達は、異なる血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する異種分子（例えば遺伝子）の送達に先行してもしくは続いてよい。従って、多数のｒＡＡＶベクターを介する送達を、選択された宿主細胞への所望の分子の反復した送達のため使用してよい。望ましくは、その後に投与されるｒＡＡＶは、第一のｒＡＡＶベクターと同一のミニ遺伝子を担持するが、しかし、その後に投与されるベクターは、第一のベクターと異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有する。例えば、第一のｒＡＡＶがＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有する場合、その後に投与されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４およびＡＡＶ６を包含する他の血清型のなかから選択されるキャプシドタンパク質を有してよい。あるいは、第一のｒＡＡＶがＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有する場合、その後に投与されるｒＡＡＶはＡＡＶ５キャプシドを有してよい。
【００８８】
従って、本発明のＡＡＶ５由来のｒＡＡＶは、生物体が１種もしくはそれ以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有する場合でさえ、インビボもしくはエクスビボで、選択された宿主細胞に選択された異種分子を送達することができる、効率的な移入ベヒクルを提供する。これらの組成物は治療目的上の分子の送達にとりわけ十分に適する。しかしながら、本発明の組成物はまた、免疫原性もしくは抗原性分子の送達による免疫感作にも有用であるかもしれない。さらに、本発明の組成物はまた、インビトロでの所望の産物の製造に使用してもよい。
【００８９】
上述されたｒＡＡＶは、発表された方法により宿主細胞に送達してよい。選択された異種分子をもつｒＡＡＶを、好ましくは生物学的に適合性の溶液もしくは製薬学的に許容できる送達ベヒクルに懸濁されて、ヒトもしくは家畜の患者に投与してよい。適するベヒクルは滅菌生理的食塩水を包含する。製薬学的に許容できる担体であることが既知かつ当業者に公知の、他の水性および非水性の等張の滅菌注入溶液、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を、この目的上使用してよい。
【００９０】
ｒＡＡＶは、過度の副作用を伴わずにもしくは医学的に許容できる生理学的効果を伴い、医学的利益を提供するように、細胞を形質導入しかつ遺伝子（もしくは他の分子）の十分な移入レベルおよび発現を提供するのに十分な量で投与され、それは医学の技術分野の当業者により決定することができる。慣習的かつ製薬学的に許容できる投与経路は、限定されるものでないが、肝への直接送達、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口および他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は、所望の場合は組み合わせてよい。
【００９１】
ｒＡＡＶの投薬量は、治療されている病状、患者の齢、体重および健康状態のような因子に主として依存することができ、そして従って患者間で変動してよい。例えば、ｒＡＡＶの治療上有効なヒト投薬量は、一般に、約１×１０９から１×１０１６ゲノムｒＡＡＶ／ｍｌまで、好ましくは約１０１３ないし１０１５ゲノムｒＡＡＶ／ｍｌのウイルスベクターの濃度を含有する約１ｍｌから１００ｍｌまで、５ないし５０ｍｌ、もしくは１０ないし２５ｍｌの生理的食塩水溶液の範囲にある。好ましいヒト投薬量は、約１×１０１３ＡＡＶゲノムｒＡＡＶ／ｍｌであってよい。投薬量は、いかなる副作用に対しても治療の利益を釣り合わせるよう調節することができる。こうした投薬量は、該組換えベクターを使用する治療の応用に依存して変動してよい。トランスジーンの発現のレベルをモニターして、ミニ遺伝子を含有するウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターの投薬の頻度を決定することができる。場合によっては、治療目的上記述されるものに類似の投薬量レジメンを、本発明の組成物を使用する免疫感作に利用してよい。
【００９２】
インビトロ製造のため、所望の産物（例えばタンパク質）を、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶでの宿主細胞のトランスフェクション、および発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養することの後に、所望の培養物から得てよい。発現された産物を、その後、所望のように精製かつ単離してよい。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離に適する技術は当業者に既知である。
【００９３】
以下の実施例は本発明のいくつかの局面および態様を具体的に説明する。
【００９４】
実施例１−ＡＡＶキャプシド中でのＡＡＶ２移入ベクターのシュードタイピング
Ａ．ｐＡＡＶ２．１ｌａｃＺ
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとともにＡＡＶ２　ＩＴＲおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ２プラスミドを、下述されるとおり構築した。プラスミドｐＡＡＶ２．１ｌａｃＺは６要素を含有する：
（ｉ）ＡＡＶ２　ＩＴＲを含有するプラスミドバックボーンｐＡＡＶ２．１：
ｐＵＣ−１９に基づく発現プラスミド（ｐＺＡＣ３．１）を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで消化し、そして付着端をＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して埋めた。その後、ＥｃｏＲＩリンカー（ニュー　イングランド　バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を導入した。ＥｃｏＲＩ消化後、構築物を再連結し、プラスミドｐＡＡＶ２．１をもたらし、これはＡＡＶ２　５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２　３’ＩＴＲを含有するプラスミドバックボーンを提供する。
（ｉｉ）ＣＭＶプロモーター：
ＣＭＶプロモーターを、プライマー：
ＣＬＯＮＥ／ＣＭＶプロモーター／ＮｈｅＩ＋：配列番号１：
ＡＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣ
ＣＬＯＮＥ／ＣＭＶプロモーター／ＰｓｔＩ−：配列番号２：
ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣ
を使用して、鋳型としてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用い、Ｐｆｕポリメラーゼで増幅し、そしてｐＣＲ４ｔｏｐｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した。ＣＭＶプロモーターフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、その結果ＥｃｏＲＩ部位がＮｈｅＩ部位に隣接する。
（ｉｉｉ）キメライントロン：
キメライントロンは、プライマー：
ＣＬＯＮＥ／ＳＶ４０イントロン／Ｐｓｔ＋：配列番号３：
ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣ
ＣＬＯＮＥ／ＳＶ４０イントロン／ＮｏｔＩ−：配列番号４：
ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧ
を使用して、鋳型としてｐＣＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用い、Ｐｆｕポリメラーゼで増幅し、そしてその後制限酵素ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化して、キメライントロンフラグメントをもたらした。
（ｉｖ）β−ガラクトシダーゼコーディング配列：
β−ガラクトシダーゼコーディング配列を、プライマー：
ＣＬＯＮＥ／ｌａｃＺ／ＮｏｔＩ＋：配列番号５：
ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣ
ＣＬＯＮＥ／ｌａｃＺ／ＢａｍＨＩ−：配列番号６：
ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣ
を使用して、鋳型として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ）を用い、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で増幅し、そしてその後制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化して、β−ガラクトシダーゼフラグメントをもたらした。
（ｖ）ウッドチャック肝炎調節後因子（ＷＰＲＥ）：
ＷＰＲＥ因子は、プライマー：
ＣＬＯＮＥ／ＷＰＲＥ／ＢａｍＨＩ＋：配列番号７：
ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣ
ＣＬＯＮＥ／ＷＲＰＲＥ／ＢｇｌＩＩ−：配列番号８：
ＴＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧ
を使用して、鋳型としてウッドチャック肝炎ウイルスＤＮＡ（ＡＴＣＣ）を用い、Ｐｆｕポリメラーゼで増幅し、そしてその後制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化してＷＰＲＥフラグメントをもたらした。
（ｖｉ）ウシ成長ホルモンポリアデニル酸化シグナル：
ウシ成長ホルモンポリアデニル酸化シグナル（ＢＧＨｐＡ）を、プライマー：ＣＬＯＮＥ／ＢＧＨ　ｐＡ／ＢｇｌＩＩ＋：配列番号９：
ＴＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ
ＣＬＯＮＥ／ＢＧＨ　ｐＡ／ＸｈｏＩ−：配列番号１０：
ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧ
を使用して、鋳型としてｐＣＤＮＡ３．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用い、Ｐｆｕポリメラーゼで増幅し、そしてｐＣＲ４　ｔｏｐｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した。ＢＧＨｐＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩがＸｈｏＩ部位に隣接するように、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切り出した。
【００９５】
ｐＡＡＶ２．１ｌａｃＺを集成するために、プラスミドｐＡＡＶ２．１をＥｃｏＲＩで切断し、そして、ＣＭＶプロモーターフラグメント（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）、キメライントロンフラグメント（ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ）、β−ガラクトシダーゼコーディング配列（ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ）、ＷＰＲＥ因子（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ）、ＢＧＨｐＡフラグメント（ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）と一緒に多フラグメントライゲーションで連結して、プラスミドｐＡＡＶ２．１　ｌａｃＺをもたらした。
Ｂ．ｐ６００　ｔｒａｎｓのクローニング
Ｐ５プロモーターをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによりｐＣＲ−ｐ５から切り出し、クレノウにより埋め、そしてその後ＳｍａＩ＋ＣｌａＩでｐＭＭＴＶ−Ｔｒａｎｓにクローン化して、ｐＰ５−Ｘ−Ｔｒａｎｓを得た。ｐＣＲ−ｐ５およびｐＭＭＴＶ−Ｔｒａｎｓの構築は以前に記述された（Ｘｉａｏら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ、７３：３９９４−４００３（１９９９））。ｐＰ５−Ｘ−Ｔｒａｎｓ中のＰ５プロモーターとＲｅｐ７８の開始コドンとの間に唯一のＥｃｏＲＶ部位が存在する。全部のヘルパープラスミドを、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬからの１００ｂｐラダーもしくは５００ｂｐラダーのいずれかをＥｃｏＲＶ部位を使用してｐ５−Ｘ−Ｔｒａｎｓにクローン化することにより作成する。これらの一連のプラスミドをｐＳＹと称し、ここでＹは１００ｂｐから５ｋｂまでの範囲にわたるスペーサーの大きさを示す。従って、ｐ６００ｔｒａｎｓプラスミドは、５００ｂｐラダーおよび１００ｂｐスペーサーよりなる６００ｂｐの挿入物を含有する。
【００９６】
プラスミドｐ６００ｔｒａｎｓ（ＡＡＶ血清型２のｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を含有する）を、プライマー：
クローン／ＡＡＶ２ｒｅｐ．ｃａｐ　ｓｅｅｍｌｅｓｓ＋：配列番号１１：
ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧ
クローン／ＡＡＶ２ｒｅｐ．ｃａｐ　ｓｅｅｍｌｅｓｓ−：配列番号１２：
ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＣ
を使用して、製造元の説明書（シームレス（Ｓｅｅｍｌｅｓｓ）クローニングキット）に従ってＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））でのＰＣＲ増幅にかけた。
【００９７】
ＰＣＲ後、プラスミドを制限酵素Ｅａｍ　１１０４　Ｉで消化して、フラグメントｐ６００ｔｒａｎｓΔＣＡＰ−ＯＲＦを提供した。このフラグメントはＡＡＶ２　ｒｅｐタンパク質７８および５２をコードする配列を含有する。ＡＡＶ２　Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質は、ｗｔＡＡＶ　Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０に比較して１アミノ酸の欠失を有する。加えて、最後の５個のＣ末端アミノ酸が、それらのＣ末端とＡＡＶ５　ＶＰ１の読取り枠との間の重なり合いのため置換されている（すなわち、ｓＡＡ、ｓＡＡ、ｓＡＡ、ｓＡＡ、ｄＡＡ、ｄＡＡ、ｓ：置換された、ｄ：欠失された）。
【００９８】
ＡＡＶ５−ＣＡＰ−ＯＲＦ（Ｕ．Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７３／２：９３９−９４７（１９９９年２月））は、プライマー：
クローン／ＡＡＶ５　Ｃａｐ　ｓｅｅｍｌｅｓｓ＋：配列番号１３：
ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧ
クローン／ＡＡＶ５　Ｃａｐ　ｓｅｅｍｌｅｓｓ−：配列番号１４：
ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＡＧＧＴＡＴＣＧＧＧＴＴＣ
を使用して上のとおりＰｆｕポリメラーゼでのＰＣＲにより増幅し、そしてその後、Ｅａｍ　１１０４Ｉで消化してＡＡＶ５−ＣＡＰ５を提供した。このフラグメントは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質をコードする配列を含有する。
【００９９】
上述されたＰＣＲ増幅から生じられたフラグメント、ｐ６００ｔｒａｎｓΔＣＡＰ−ＯＲＦおよびＡＡＶ５−ＣＡＰ５を、製造元の説明書に従って連結した。生じるプラスミドは、ＡＡＶ２　Ｐ５プロモーターの制御下にＲｅｐ７８／６８のＡＡＶ２　ｒｅｐ配列、およびＡＡＶ２　Ｐ１９プロモーターの制御下にＲｅｐ５２／４０のＡＡＶ２　ｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶ５キャプシド配列はＡＡＶ２　Ｐ４０プロモーターの制御下にあり、これはＲｅｐ配列内に配置される。このプラスミドは、ｒｅｐ　ＯＲＦの５’のスペーサーをさらに含有する。
Ｃ．シュードタイピングされたｒＡＡＶの製造
ｒＡＡＶ粒子（ＡＡＶ５キャプシド中のＡＡＶ２ベクター）を、アデノウイルスを含まない方法を使用して生成させた。簡潔には、ｃｉｓプラスミド（ＡＡＶ２　ＩＴＲを含有するｐＡＡＶ２．１　ｌａｃＺプラスミド）、およびｔｒａｎｓプラスミドｐＡｄΔＦ６（ＡＡＶ２　ｒｅｐおよびＡＡＶ５　ｃａｐを含有する）、ならびにヘルパープラスミドそれぞれを、リン酸カルシウム沈殿により、１：１：２の比で２９３細胞中に同時にコトランスフェクトした。
【０１００】
ｐＡｄヘルパープラスミドの構築のため、ｐＢＧ１０プラスミドをマイクロビックス（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）（カナダ）から購入した。Ｌ２およびＬ３を含有するＲｓｒＩＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から欠失させて、第一のヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ１３をもたらした。プラスミドＡｄΔＦ１は、ＰｍｅＩ／Ｓｇｆ１欠失を伴うＡｓｐ７００／ＳａｌＩフラグメント（ｐＢＨＧ１０から単離する）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化することにより構築した。ＭＬＰ、Ｌ２、Ｌ２およびＬ３をｐＡｄΔＦ１中で欠失させた。２．３ｋｂのＮｒｕＩフラグメント、およびその後０．５ｋｂのＲｓｒＩＩ／ＮｒｕＩフラグメントのさらなる欠失は、それぞれヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ５およびｐＡｄΔＦ６を生成させた。ｐΔＦ６と命名されたヘルパープラスミドは、Ｅ１を発現するヘルパー細胞により提供されないＥ２ａおよびＥ４　ＯＲＦの不可欠のヘルパー機能を提供するが、しかし、アデノウイルスのキャプシドタンパク質および機能的Ｅ１領域を欠失されている。
【０１０１】
典型的には、５０μｇのＤＮＡ（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ヘルパー）を１５ｃｍ組織培養皿上でトランスフェクトした。２９３細胞をトランスフェクション後７２時間に収穫し、超音波処理しかつ０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理した（３７℃１０分間）。その後、細胞ライセートを２回のＣｓＣｌ勾配にかけた。ｒＡＡＶベクターを含有するピーク画分を収集し、プールしかつＰＢＳに対し透析した。
【０１０２】
実施例２−ｒＡＡＶ５の製造
Ａ．ｐＡＡＶ５．１ＬａｃＺ
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとともに、改変されたＡＡＶ５　ＩＴＲおよび核局在化されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するＡＡＶ５プラスミドを、下述されるとおり構築した。
【０１０３】
プラスミドｐＡＡＶＲｎＬａｃＺ（Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、ＨＵＭ．ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲ．、６：１５３１−１５４１（１９９５））を、下に示されるプライマーを使用して製造元の説明書に従ってＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））でのＰＣＲ増幅にかけて、プラスミドｐＡＡＶ５．１を提供した。
クローン／ＡＡＶ５／ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ：配列番号１５：
ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＡＧ
クローン／ＡＡＶ５／ＸｈｏＩ＋：配列番号１６：
ＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣ
ｐＡＡＶ５．１を、ｐＡＡＶ５．１を用いて制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてｐＡＡＶ２．１ｌａｃＺ（上述された）のｌａｃＺ発現カセットを含有するＮｈｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントを挿入して、プラスミドｐＡＡＶ５．１ａｃＺをもたらした。
Ｂ．ｐＡＡＶ５．１ｅＧＦＰの構築
ｅＧＦＰを、プライマー：
ＣＬＯＮＥ／ｅＧＦＰ／ＮｏｔＩ＋：配列番号１７：
ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ
ＣＬＯＮＥ／ｅＧＦＰ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−：配列番号１８：
ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣ
を用い、鋳型としてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して製造元の説明書に従ってＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で増幅し、そして制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化してフラグメントｅＧＦＰをもたらした。このフラグメントを、ｌａｃＺコーディング配列がＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩでの消化により除去されたｐＡＡＶ５．１ｌａｃＺに連結して、プラスミドｐＡＡＶ５．１　ｅＧＦＰをもたらした。
Ｃ．ＡＡＶ５キャプシドをもつｒＡＡＶの形質導入効率
これらのｒＡＡＶを、対照ベクターとしての組換えＡＡＶ２とともにマウス肺、肝、腸および筋組織に注入した（１×１０１０ないし４×１０１０ゲノム）。予備的結果は、ＡＡＶ２によるよりもＡＡＶ５による肺、腸および筋組織のより高い形質導入効率を示唆する。これは、ＡＡＶ５キャプシドを含有するベクターが、肺（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子の送達による常染色体劣性遺伝病嚢胞性線維症（ＣＦ）の修正のため）および筋に標的を定めるのに極めて有用であることを示す。
【０１０４】
実施例３−ｒＡＡＶ２／５での骨格筋の形質導入効率
初期実験は、等しい量のＡＡＶ５もしくはＡＡＶ２／５ベクターを注入されたマウス骨格筋中でのＣＭＶ−ｌａｃＺの発現を評価した。ＡＡＶ５　ＣＭＶｌａｃＺでのマウス筋の形質導入は、１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ５　ＣＭＶｌａｃＺでのＣ５７ＢＬ／６マウスの右前脛骨筋の注入、および注入後２８日に収穫することにより達成した。同様に、それぞれＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺおよびＡＡＶ２　ＣＭＶｌａｃＺでのマウス筋の形質導入は；それぞれ４×１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺおよびＡＡＶ２　ＣＭＶｌａｃＺでのＣ５７ＢＬ／６マウスの右前脛骨筋の注入により達成した。これらの場合、筋を注入後６０日に収穫した。
【０１０５】
組織化学的分析は、ＡＡＶ５とＡＡＶ２／５との間の同等なｌａｃＺ発現を示し、これはＡＡＶ２ベクターで達成されたものより大きい。これらの研究はまた、ＡＡＶ２／５に比較してＡＡＶ５の有意により高い収量も示した。全部のその後の研究はＡＡＶ２／５ベクターを用いて実施した。
【０１０６】
ＡＡＶ２／５ベクターの収量は、標準的なトランスフェクションのアプローチを使用して、ＡＡＶ２ベクターに実質的に同一である。表１は、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ２／５構築物のいずれかでパッケージングされた７種のベクターについてのゲノムコピーに基づくベクターの収量を要約する。該表に関して、ＧＣはゲノムコピーを；ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを；ＴＧＢはチロキシン結合グロブリンプロモーターを；ｒｈＣＧはアカゲザル絨毛性ゴナドトロピンを；ｃＦＩＸはイヌ第ＩＸ因子を；Ｗはウッドチャック肝炎転写後調節因子を；ｍＩｎｓＭはフリンで改変されたマウスプロインスリンを；ＥＧＦＰは増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を指す。＞１の組換えＡＡＶ調製物（ｐｒｅｐ）が生じられている平均のゲノムコピーが計算される。
【０１０７】
【表１】
2004514407.tif 000002
【０１０８】
【表２】
2004514407.tif 000003
【０１０９】
マウス骨格筋への注入後のＡＡＶ２もしくはＡＡＶ２／５ベクターからのｌａｃＺ発現の量的分析は、ＡＡＶ２／５ベクターからの２倍の増大を示した。組織ホモジェネートからのβ−ガラクトシダーゼについての酵素分析は、ＡＡＶ２について３．６±０．１μｇ　β−ｇａｌ／ｇ組織、およびＡＡＶ２／５について７．３±１．２μｇ　β−ｇａｌ／ｇ（Ｎ＝６、±１Ｓ．Ｄ．）を立証した。これらのベクターの固有の生物学的活性の差異は、ＡＡＶ２ベクターをヘパリンクロマトグラフィーにより精製した一方、ＡＡＶ２／５ベクターは塩化セシウム沈降（ベクターの効力をおよそ１０倍減少させる（Ａ．Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら、ＨＵＭ　ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲ、１２：７１−７６（２００１）））により精製したため、なおより大きいかもしれない。
【０１１０】
実施例４−ｒＡＡＶ２／５での平滑筋の形質導入効率
平滑筋細胞を形質導入するシュードタイピングされたＡＡＶ２／５構築物の能力を、ＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺを皮下に注入することにより、評価した。β−ガラクトシダーゼ発現を、ベクター投与後６０日に評価した。
【０１１１】
加えて、初代ヒト上皮気道細胞の先端の（ａｐｉｃａｌ）形質導入を、ＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺを用いて評価した。初代ヒト気道上皮細胞を、対応するウイルスの５×１０１０個のゲノム粒子に先端で（ａｐｉｃａｌｌｙ）感染させた（液体−空気ウェル横断（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）系）。感染後７日に、細胞を固定しかつｘ−ｇａｌで染色した。
【０１１２】
ＡＡＶ２／５　ｌａｃＺベクターを多数の他の組織中で評価した。ベクターの皮下注入は、平滑筋細胞中でのかなりのｌａｃＺ発現に至った。ＡＡＶ２／５ベクターは、ＡＡＶ２で達成されたよりも、先端表面からの分化した気道上皮細胞をより効率的に感染させる。
【０１１３】
実施例５−ベクターの再投与に対する中和抗体の影響。
【０１１４】
ＡＡＶ２／５ベクターの一利点は、それらが抗体中和に基づきＡＡＶ２と血清学的に別個であるはずであることである。これは、ＡＡＶ２に対する既に存在する免疫性をもつ患者（正常被験体のおよそ２５％に相当する（Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅら、ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲＡＰＹ、６：１５７４−１５８３（１９９９）））におけるインビボ遺伝子移入を可能にするかもしれず、そしてＡＡＶ２ベクターでの注入後のＡＡＶ２／５での再投与を助長するかもしれない。
【０１１５】
インビボでの交差中和について試験するため、実験を、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ２／５　ｅＧＦＰベクターを筋肉内に注入され、次いで２８日後にＡＡＶ２もしくはＡＡＶ２／５　ｌａｃＺベクターを反対側の脚に筋肉内注入された、免疫適格のマウスで実施した。β−ｇａｌ発現を、第二の注入後１４日に収穫された組織ホモジェネートの酵素分析により評価した。
Ａ．ベクターの再投与に対する、ＡＡＶ２に対する中和抗体の影響。
【０１１６】
免疫適格のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、右前脛骨筋に３×１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２　ＣＭＶ　ｅＧＦＰを注入し（Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒら、ＮＡＴ．ＭＥＤ．、３：３０６−３１２（１９９７））、そして、２８日後に、左前脛骨筋に３×１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２　ＣＭＶｌａｃＺもしくはＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺのいずれかを注入した。β−ガラクトシダーゼ発現を、第二の注入後１４日に、製造元の説明書に従ってＥＬＩＳＡ（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）により測定した。１群あたり６匹の動物の平均値を示す。
【０１１７】
ＡＡＶ２　ｅＧＦＰでの免疫感作は、ＡＡＶ２　ｌａｃＺのその後の投与の有効性を２０倍減少させたが、しかし、ＡＡＶ２／５ベクターからの発現に対して影響を有しなかった（すなわち、投薬を受けたことのない動物で観察されるものに同等な遺伝子発現）。（図１Ａ）
Ｂ．ベクターの再投与に対する、ＡＡＶ２／５に対する中和抗体の影響。
【０１１８】
免疫適格のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、４×１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２／５　ＣＭＶ　ｅＧＦＰを右前脛骨筋に注入し、そして（２８日後に）１０１０ゲノムコピーのＡＡＶ２　ＣＭＶｌａｃＺもしくはＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺのいずれかを左前脛骨筋に注入した。（注：本実験におけるＡＡＶ２／５　ＣＭＶｌａｃＺウイルス調製物は、前の実験に使用されたものと異なる）。β−ガラクトシダーゼ発現を、第二の注入後１４日に、製造元の説明書に従ってＥＬＩＳＡ（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）により測定した。１群あたり８匹の動物の平均値を示す。
【０１１９】
逆の実験は同一の結果を生じた。すなわち、ＡＡＶ２／５での免疫感作はＡＡＶ２／５の再投与を封鎖したが、ＡＡＶ２の遺伝子移入および発現を封鎖しなかった（図１Ｂ）。
【０１２０】
実施例６−ヒト集団におけるＡＡＶに対する中和抗体の普及。
【０１２１】
ＡＡＶ１およびＡＡＶ２に対する中和抗体について以前に評価された８５名のヒト志願者のコホートを、ＡＡＶ２／５に対する中和抗体について評価した。中和抗体力価は、ＡＡＶ５中和抗体の測定のためにＡＡＶ２　ｅＧＦＰウイルスの代わりにＡＡＶ５　ＣＭＶ　ｅＧＦＰ　３を使用するという改変を伴い、以前に記述された（Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、ＰＲＯＣ　ＮＡＴＬ　ＡＣＡＤ　ＵＳＡ、９６：９９２０−９９２５（１９９９年８月）；Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅら、Ｊ．ＶＩＲＯＬ．、７１：６８２３−６８３３（１９９７））とおり測定した。
【０１２２】
８５名のヒト志願者の血清を、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５に対する中和抗体の存在について試験した。試験された全サンプルはＡＡＶ５中和抗体に対し陰性であった。ＡＡＶ１もしくはＡＡＶ２に対する高い中和活性を伴う血清さえ、ＡＡＶ５の感染性を阻害しなかった。スクリーニングされた志願者の１９％がＡＡＶ１に対する中和抗体を有し、また、２６％がＡＡＶ２に対する中和抗体を有した。スクリーニングされた８５名の人のいずれも、検出可能なレベルのＡＡＶ５中和抗体を示さなかった。
【０１２３】
１９および２５％の被験体中でのそれぞれＡＡＶ１およびＡＡＶ２に対する中和抗体の普及にもかかわらず、ただひとりの被験体もＡＡＶ２／５に対する中和抗体を立証しなかったことをみることは驚くべきであった。われわれの研究でのＡＡＶ５に対する中和抗体の欠如は、個体の６０％でＡＡＶ５キャプシドタンパク質に対する抗体を検出した、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施されたＡＡＶ５の血清疫学の以前の研究（１９８４年にＳ．Ｇｅｏｇ−Ｆｒｉｅｓら、ＶＩＲＯＬ．、１３４（１）：６４−７１（１９８４）による）とよい対照をなす。ＡＡＶ２でのわれわれの経験は、ＥＬＩＳＡは特異的血清学的応答に関してより感受性かつ潜在的により小さく特異的なアッセイであることを示唆し；分析された７４名の被験体のうち、９６％がＡＡＶ２に関してＥＬＩＳＡ陽性であった一方、３２％のみがＡＡＶ２の感染を中和することが可能であった（Ｎ．Ｃｈｉｒｍｕｌｅら、ＧＥＮＥ　ＴＨＥＲＡＰＹ、６：１５７４−１５８３（１９９９））。ＡＡＶ２／５に対する中和抗体の非存在は、ヒトの応用に対して潜在的に重要である。全患者の少なくとも１／４が既に存在する免疫性によりベクターの生着を減少させていたかもしれないＡＡＶ２と対照的に、ＡＡＶ２／５の取込みは、初回ベクター投与の情況において、免疫状態により影響を及ぼされないはずである。
【０１２４】
実施例６−ＡＡＶ２／５ベクターによる治療タンパク質のインビボ送達
本研究において、分泌可能なタンパク質をコードするエアゾル化されたＡＡＶ２／５が、同一のウイルス用量が筋肉内もしくは皮内に注入される場合と同じくらい増大されたマウスヘマトクリットのレベルをもたらすことが立証された。従って、鼻内投与はこの血流中での治療タンパク質の分泌を得るための効率的な一方法であると結論することが可能である。
Ａ．ベクターの構築およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２／５の精製
ハイブリッド２／５パッケージング構築物を、フラグメントｐ６００ΔＣＡＰおよびフラグメントＡＡＶ５−ＣＡＰの連結により上述されたとおり調製した。プラスミドｐＡｄ−ΔＦ６を上述されたとおり調製した。ＰＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ｍＥｐｏを以下のとおり構築した。すなわち、ｍＥｐｏコーディング配列をＰＣＲ２．１ｍＥｐｏからＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断し、そして同一の方法で切断されたｐＡＡＶ２．１．ＣＭＶ．ＬａｃＺにクローン化した。
Ｂ．ウイルス産生
全部の組換えウイルスストックは、以下の方法でヘルパーウイルスを含まずに産生した。２９３細胞を、対応するｃｉｓプラスミド、パッケージング構築物およびＡｄヘルパーｐＦ６で三重にトランスフェクトした。ＡＡＶ２／５ハイブリッドベクターの産生のため、対応するＡＡＶ２　ｃｉｓプラスミドを使用した。細胞をトランスフェクション後７２時間に収穫し、そして組換えウイルスを３回のＣｓＣｌ２バンド形成により精製した。力価を実時間ＰＣＲにより測定した。Ｃ．動物試験
５〜６週のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０１１ゲノムコピーのＡＡＶ２／５を、鼻内に、もしくは示されたような比較のための代替の経路を介してのいずれかで投与した。ベクター投与後６日に、トランスジーン発現を、β−ガラクトシダーゼ染色もしくはヘマトクリット測定のいずれかにより評価した。
【０１２５】
ｌａｃＺ発現を、記述されたような鼻内投与後にマウス肺で評価した場合、ｌａｃＺ陽性細胞が、上部気道上皮細胞および下部気道で明らかであった。陽性細胞は、細気管支のレベル、ならびに槽間中隔レベルで存在した。
【０１２６】
マウスのヘマトクリットレベルの分析は、マウスエリスロポエチンをコードするエアゾル化されたＡＡＶ２／５が、同一のウイルス用量が筋肉内もしくは皮内に注入される場合と同じくらい増大されたマウスヘマトクリットのレベルをもたらすことを示した。
【０１２７】
本明細中で引用される全部の刊行物は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の好ましい態様に関して記述した一方、本発明の技術思想から離れることなく改変を行うことができることが認識されるであろう。こうした改変は請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
発明にかかる、実施例５Ａに記述されるところのベクター再投与に対するＡＡＶ２に対する中和抗体の影響を決定するための試験の結果を提供する棒グラフである。
【図１Ｂ】
発明にかかる、実施例５Ｂに記述されるところのベクター再投与に対するＡＡＶ２に対する中和抗体の影響を決定するための試験の結果を提供する棒グラフである。
【図１Ａ】
2004514407.tif 000004
【図１Ｂ】
2004514407.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004514407.tif 000006
2004514407.tif 000007
2004514407.tif 000008
2004514407.tif 000009
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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