(57)【要約】（Ａ）ヒトからの染色体物質を準備し；（Ｂ）ＮＡＰＩＬ２遺伝子の生物学的機能を損失させるａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、又はｄ）挿入から選択される修飾を染色体物質中のＮＡＰＩＬ２遺伝子について検出し；かつ（Ｃ）遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させることからなるヒトの神経系欠損をスクリーニングする方法。この方法は、マウスＮａｐＩＬ２遺伝子にも同様に実践できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ヒトからの染色体物質を準備し、
（Ｂ） 染色体物質中のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子についてＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の生物学的機能損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入異常、又はｅ） 変質した後成的制御から選択される修飾を検出し；かつ
（Ｃ）　前記遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させること
からなる哺乳動物における神経系欠損のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記神経系欠損のスクリーニングが、ヒトに関連する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子における前記修飾が、標識プローブとのハイブリダイゼーションにより検出される請求項１の方法。
【請求項４】
プローブが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のオリゴ−ヌクレオチドプローブである請求項３の方法。
【請求項５】
修飾が、
（Ａ）　ＰＣＲを用いて染色体物質を増幅し；
（Ｂ）　前記染色体物質の配列を決定し、ヌクレオチド配列の修飾を検出し；かつ
（Ｃ）　前記遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させること
により検出される請求項１の方法。
【請求項６】
（Ａ）　ヒトからの生物学的試料を準備し；
（Ｂ）　ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子産物に対する標識抗体を用いて前記遺伝子産物の欠損発現、不適切な発現、又は修飾された発現を検出し；かつ
（Ｃ）　前記の欠損発現、不適切な発現、又は修飾された発現を神経系欠損の可能性と相関させること
からなるヒトにおける神経系欠損のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗体が、ポリクローナルである請求項５の方法。
【請求項８】
抗体が、モノクローナルである請求項５の方法。
【請求項９】
神経系欠損が、神経管閉鎖不全又は不完全神経管閉鎖に起因する請求項１〜８のいずれか１つの方法。
【請求項１０】
不完全神経管閉鎖が、二分脊椎を生じる請求項９の方法。
【請求項１１】
神経系欠損が、ニューロンでのヌクレオソーム活性の不適切な制御に起因する請求項１〜８のいずれか１つの方法。
【請求項１２】
神経系欠損が、ニューロンでの細胞周期の不適切な制御に起因する請求項１〜８のいずれか１つの方法。
【請求項１３】
神経系欠損が、ニューロンの不適切な分化に起因する請求項１〜７のいずれか１つの方法。
【請求項１４】
神経系欠損が、ニューロンの不適切な維持に起因する請求項１〜７のいずれか１つの方法。
【請求項１５】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子における生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入、又はｅ）部位特異的変異誘発から選択されるＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の修飾を少なくとも１つ含むヌクレオチド配列からなる組換えポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子とそのプロモーターを少なくとも含むヌクレオチド配列からなる組換えポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドが、神経細胞の染色体又は染色体の一部である請求項１５又は１６のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７のポリヌクレオチドを含む神経細胞。
【請求項１９】
細胞が、胚幹細胞、神経細胞系、又は腫瘍由来細胞系などの不死細胞系に由来する請求項１８の神経細胞。
【請求項２０】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子が、ネスチン、他のニューロンメンバー、及び誘導プロモーターなどの神経−特異的プロモーターの制御下にある請求項１８の神経細胞。
【請求項２１】
野生型動物に由来する請求項１７又は１９の神経細胞。
【請求項２２】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入、又はｅ）部位−特異的変異誘発から選択される修飾でＮＡＰ１Ｌ２遺伝子が修飾される請求項１８、２０、又は２１の神経細胞。
【請求項２３】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子が、自然発生変異によって変質される請求項１８、２０、又は２１の神経細胞。
【請求項２４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーターからなるポリヌクレオチド、もしくはストリンジェントな条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の少なくとも２０ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
（Ａ）　神経細胞を準備し；
（Ｂ） 遺伝子の生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、及びｄ）挿入から選択される修飾で神経細胞のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーターを修飾し；かつ
（Ｃ） 修飾された細胞を選択すること
からなる組換え神経細胞の作成方法。
【請求項２７】
（Ａ）　請求項１８〜２３のいずれか１つの細胞を準備し；
（Ｂ）　スクリーニングされる化合物を細胞に導入し；かつ
（Ｃ）　細胞の増殖における変化を化合物の活性と相関させること
からなる治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項２８】
（Ａ）　染色体にヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子を含むトランスジェニックノックアウト動物を準備し；
（Ｂ）　スクリーニングされる化合物を動物に導入し；かつ
（Ｃ）　神経系の発達及び成熟における変化を化合物の活性と相関させること
からなる治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項２９】
（Ａ）　マウスからの染色体物質を準備し；
（Ｂ）　Ｎａｐ１ｌ２遺伝子の生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、又はｄ）挿入から選択される、染色体物質におけるＮａｐ１ｌ２遺伝子の修飾を検出し；
（Ｃ）　前記遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させること
からなるマウスの神経系欠損のスクリーニング方法。
【請求項３０】
（Ａ）　マウスからの生物学的試料を準備し；
（Ｂ）　Ｎａｐ１ｌ２遺伝子産物に対する標識抗体を用いて前記遺伝子産物の欠損発現、不適切な発現又は修飾された発現を検出し；かつ
（Ｃ）　前記の欠損発現又は不適切な発現を神経系欠損の可能性と相関させることからなるマウスの神経系欠損のスクリーニング方法。
【請求項３１】
ヌクレオチド配列がＮａｐ１ｌ２遺伝子の修飾を少なくとも１つ含み、前記修飾がＮａｐ１ｌ２遺伝子の生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入、又はｅ）部位−特異的変異から選択される、ヌクレオチド配列からなる組換えポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮａｐ１ｌ２遺伝子のプロモーターからなるポリヌクレオチド、もしくはストリンジェントな条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の少なくとも２０ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
Ｎａｐ１ｌ２遺伝子からなるベクターを含む組換え神経細胞。
【請求項３５】
Ｎａｐ１ｌ２遺伝子が、ネスチン又は他のニューロン遺伝子などの神経−特異的プロモーターもしくは誘導プロモーターの制御下にある請求項３４の神経細胞。
【請求項３６】
天然細胞のＮａｐ１ｌ２遺伝子が修飾され、修飾がＮａｐ１ｌ２遺伝子の生物学的機能の損失を引き起こすａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入、又はｅ）部位−特異的変異から選択される請求項３５の組換え神経細胞。
【請求項３７】
（Ａ）　請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を準備し；
（Ｂ）　スクリーニングされる化合物を細胞に導入し；かつ
（Ｃ）　細胞の増殖における変化を化合物の活性と相関させること
からなる治療用化合物のスクリーニング方法。
【請求項３８】
増殖細胞の変化が、神経細胞の癌の制御である請求項３７の方法。
【請求項３９】
腫瘍性ヒト神経細胞でのＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現を増加させるため、又は変性疾患に罹患したヒト神経細胞でのＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現を減少させるための、請求項２７の方法により得た治療化合物の使用。
【請求項４０】
プラスミドｐＢＰＸ１又はｐＢＰＸ２もしくはｐＢＰＸ３に含まれる挿入断片、あるいは前記挿入断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む真核細胞。
【請求項４１】
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に受託番号Ｉ−２４６３で寄託されたプラスミド。
【請求項４２】
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に受託番号Ｉ−２４６４で寄託されたプラスミド。
【請求項４３】
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に受託番号Ｉ−２４６５で寄託されたプラスミド。
【請求項４４】
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に受託番号Ｉ−２４６６で寄託されたプラスミド。
【請求項４５】
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含むポリヌクレオチド。
【請求項４６】
ＮＡＰ１Ｌ２プロモーターの制御下で異種ポリペプチドをコードする異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項２４のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項４６のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４８】
請求項４６のポリヌクレオチドを含む神経細胞。
【請求項４９】
神経細胞が請求項４８の細胞である、神経細胞内でのポリペプチドの標的発現の方法。
【請求項５０】
Ｎａｐ１ｌ２プロモーターの制御下で異種ポリペプチドをコードする異種アミノ酸配列をさらに含む請求項３２のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５２】
請求項５０のポリヌクレオチドを含む神経細胞。
【請求項５３】
神経細胞が請求項５２の細胞である、神経細胞内でのポリペプチドの標的発現の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、哺乳動物の中枢神経系の発達における欠損と、遺伝子によりエンコードされたタンパク質の生物学的機能を損失させる遺伝子の突然変異との関連の発見に関する。遺伝子、ＲＮＡ及びそれがエンコードするタンパク質の変異形態は、遺伝的欠損の素因を診断するのに有用である。
【０００２】
神経胚形成は、遺伝子発現の正確な時間的、空間的組織化を伴う組織発生の複雑な過程である。神経胚形成に必要な分子成分には、始原細胞の運命を決定する前神経系遺伝子、側方抑制経路に関わる始原神経原性遺伝子、及び有糸分裂事象の頻度を制御する遺伝子がある１、２。この根源的な複雑性はヒトの神経管欠損（ＮＴＤ）の病因学及び遺伝学に反映されており、いずれも多因性及び複遺伝子性の双方に端を発している３。同様の複雑性がＮＴＤのマウスモデルで確認されているが、それらではＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ４及びＰａｘ遺伝子５などの細胞の運命に影響を及ぼす遺伝子、カドヘリン６のような細胞接着分子をエンコードする遺伝子、ならびにｐ５３及びＮｆｌ７などの神経細胞分裂に影響を及ぼす遺伝子がすべて神経胚形成の過程に関与していた。
【０００３】
有糸分裂事象の制御に関与する８、９遺伝子ファミリーのひとつは、ＮＡＰ−１ファミリーである。ＮＡＰ−１タンパク質は最初にアフリカツメガエルで同定され１０、その後、相同タンパク質がショウジョウバエ１１、酵母１２及びヒト９から単離された。ＮＡＰ−１及びＮａＡＰ−１様タンパク質は、ヌクレオソーム単位を裸のＤＮＡに転移し１０、ヌクレオソームＤＮＡに結合する転写因子を刺激し１３、細胞質から細胞核へのヒストン輸送に関わるコアヒストンシャトルとして作用する１４ことが示された。有糸分裂事象の制御は、クロマチンの集合及びリモデリングにおけるＮＡＰ−１及びＮＡＰ−１様タンパク質の役割、あるいはより直接的に、腫瘍随伴ＳＥＴタンパク質にも見られるドメインにより媒介される１５、サイクリンへのその結合に依存している可能性がある。
【０００４】
近頃単離されたマウスＸ−結合（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ） Ｎａｐ１ｌ２（Ｂｐｘ）及びそのヒト同族体ＮＡＰ１Ｌ２（ＢＰＸ）は発現のパターンが厳しく制限され、神経系のみに発現する１６。この点で、ＮＡＰ１Ｌ２及びＸ結合脳−特異的ＮＡＰ１Ｌ３１７は、遍在して発現されるＮＡＰ１Ｌ１及びＮＡＰ１Ｌ４遺伝子とは異なる。これら遺伝子の限定された発現パターンは、おそらくはヌクレオソームの集合又は細胞周期調節への作用によって、神経機能に特異的な特定かつ特化された機能を示唆している。
神経管欠損は、３．５／１０００出生の頻度で発生する。中枢神経系の発達における欠損に関連する遺伝子の同定が、当該技術で求められている。特に、発達欠損の素因を同定する診断試験及び生物学的材料が求められている。
【０００５】
本発明は、当該技術におけるこれらの必要性を満たすものである。さらに詳しくは、この発明は、マウスの発生におけるＮａｐ１ｌ２の役割を発見することに関する。ＮＡＰ１Ｌ２タンパク質の完全欠如をもたらすと予測される、オスのＥＳ核胞内のＸ結合Ｎａｐ１ｌ２遺伝子の標的欠失をつくった。Ｅ９．５日目の最初の検知しうるＮａｐ１ｌ２発現の徴候に密接に合致して、突然変異は妊娠中期以降の胚致死という結果に終わった。ＥＳ細胞−桑実胚凝集体由来の生存胚は、神経組織の著しい過剰産生を伴って、神経管閉鎖欠損を示した。
【０００６】
この発明は、Ｎａｐ１ｌ２が神経系の発達において不可欠な役割を果たしていることを示し、細胞の増殖及び分化過程の制御でＮａｐ１ｌ２に推定される役割を示唆している。したがって、異常な細胞周期調節及び分化は、いくつかの神経管欠損（ＮＴＤ）の基礎となる機序の１つであるかもしれない。この発明はさらに、これら疾患の一定のＸ結合型及び自発型の遺伝子としてヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子を同定している。
【０００７】
この発明のひとつの実施態様は、哺乳動物、特にヒトにおける神経系欠損をスクリーニングする方法に関する。その方法は、（Ａ）ヒトからのゲノム物質を準備し；（Ｂ） ゲノム物質中のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子について、 ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の生物学的機能を損失させる ａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入異常、又はｅ）変質した後成的制御から選択される修飾を検出し；そしてＣ）遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させることからなる。好ましい実施態様において、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子での修飾は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のプローブ又はそのフラグメントのような標識プローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。修飾は、例えば（Ａ）ＰＣＲを用いてゲノム物質を増幅し、（Ｂ）物質の配列を決定し、ヌクレオチド配列の修飾を検出し、かつ（Ｃ）遺伝子の修飾を神経系欠損の可能性と相関させることにより検出できる。修飾は、ＰＣＲ又はノーザンブロットを用いて転写物を定量して検出できる。
【０００８】
別の実施態様において、本発明はヒトにおける神経系欠損のスクリーニング方法を提供する。この方法は、（Ａ）ヒトからの生物学的試料を準備し、（Ｂ）ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子産物に対する標識抗体を用いて、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子産物の欠損発現、不適切な発現又は修飾された発現を検出し、（Ｃ）欠損発現、不適切な発現、又は修飾された発現を神経系欠損の可能性と相関させることからなる。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってよい。
【０００９】
神経系欠損は、神経管閉鎖不全又は不完全な神経管閉鎖、二分脊椎をもたらす不完全な神経管閉鎖、無脳症をもたらす不完全な神経管閉鎖、表層外胚葉由来細胞の不適切な増殖に関連する神経系欠損、脳構造の損失をもたらす神経欠損、脳構造の崩壊に起因する神経系欠損、ニューロンにおけるヌクレオソーム活性の不適切な制御に起因する神経系欠損、ニューロンにおける細胞周期の不適切な制御に起因する神経系欠損、ニューロンの不適切な分化、ニューロンの不適切な維持、サイクリン及び関連するタンパク質の不適切な制御に起因する神経系欠損、キナーゼの不適切な制御に起因するＮＳＤ、Ｘ−染色体関連疾患により特徴づけられる神経系欠損、メチル化欠損により特徴づけられるＮＳＤ、ＤＮＡに結合する転写因子及びＤＮＡの助活性体の不適切な制御に起因する神経系欠損、修飾、例えばアセチル化及び燐酸化を含むヒストンの不適切な制御に起因する神経系欠損、又は細胞質から核へのヒストンの不適切なシャトルに起因する神経系欠損、ヒストンのクロマチンへの不適切な組込みに起因し得る。
【００１０】
この発明はさらに、ＮＡＰ１Ｌ２／Ｎａｐｓｌｌ遺伝子の修飾を少なくとも１つ含み、修飾がＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の生物学的機能を損失させるａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入異常、ｅ）変質した後成的調整、又はｆ）部位−特異的変異誘発から選択される、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる組換え染色体を提供する。
この発明はまた、前記組換え染色体を含む神経細胞も提供する。染色体は、神経細胞染色体であってもよい。神経細胞は不死細胞系又は幹細胞系もしくは神経幹細胞系（ヒトを含む）由来であってもよく、実施態様のひとつにおいて染色体は幹細胞染色体であってもよい。マウスの幹細胞は、例えば幹細胞系ＣＫ３５、幹細胞系５ｂ１７、又は幹細胞系８ｂ２１に由来することができる。ＮＡＰ１Ｌ２／Ｎａｐ１ｌ２遺伝子をβ−ｇａｌ遺伝子で代わることができ、幹細胞は選択培地での選択のための遺伝物質をも含む。
【００１１】
この発明はさらに、Ｎａｐ１ｌ２遺伝子又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現を同時にモニタリングする（例えば、発現を検出及び／又は定量する）方法を提供する。この方法は、１以上のこれら遺伝子のｍＲＮＡ転写物を含む標的核酸又はｍＲＮＡ転写物に由来する核酸のプールを準備し、核酸のプールをｍＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ転写物由来の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションされた核酸を定量することを含む。標的核酸のプールは、標的核酸（ｍＲＮＡ転写物）又はｍＲＮＡ転写物由来の核酸の濃度がＮａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現レベルに比例するものであってもよい。多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブの微細なアレイ（例えばＤＮＡチップ）を効果的に用いて、標的核酸配列の有無を検出し、複合核酸プール中の標的配列の相対的な存在比を定量できる可能性がある。
【００１２】
さらに、この発明は、本発明の幹細胞の子孫である細胞を少なくとも１つ有するキメラマウスを提供する。キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの桑実胚のようなＣＤ−１マウスの桑実胚に由来してもよい。
この発明はさらに、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子を含むベクターからなる組換え神経細胞を提供する。ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子は、神経特異的プロモーターの制御下にあってもよい。神経細胞は、野生型動物由来であってもよい。ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子は修飾されてもよく、この修飾は、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の生物学的機能を損失させるａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、ｄ）挿入、又はｅ）部位−特異的変異誘発から選択される。天然細胞のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子は、自然発生の突然変異によって変質されてもよい。
【００１３】
この発明の別の実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＮａｐ１ｌ２遺伝子のプロモーターの発見及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発見を含む。さらに、この発明は、これらプロモーターをどちらか１つ又は両方含むベクター及び組換え細胞を提供する。
【００１４】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のゲノム構造
ＮＡＰ１Ｌ２は、７９６ｂｐの非翻訳３′‐領域が続く１３８３ｂｐのオープンリーディングフレームを有するイントロンが無い遺伝子である（Ｒｏｕｇｅｕｌｌｅ 及びＡｖｎｅｒ， １９９６）。（参考文献１６参照）。ＮＡＰ１Ｌ２の非翻訳５′領域は、ｃＤＮＡ配列の最初の３１２ｂｐに拡張する。この分析で、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーター領域を含むと思われる、推定上の転写開始部位の上流に位置する１２０８ｂｐの無反復（ｒｅｐｅａｔ−ｆｒｅｅ）ゲノム配列をさらに特徴づけた。図１２参照。
さらに、この発明は、（Ａ）神経細胞を準備し；（Ｂ） 神経細胞内のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーターを、遺伝子の生物学的機能を損失させるａ）置換、ｂ）欠失、ｃ）フレームシフト、及びｄ）挿入から選択される修飾で修飾し；かつ（Ｃ）修飾細胞を選択することからなる、組換え神経細胞の生成方法を提供する。
【００１５】
また、この発明は、（Ａ）この発明の細胞を準備し；（Ｂ）スクリーニングされる化合物を細胞に導入し；かつ（Ｃ）細胞の増殖又は分化における変化を化合物の活性と相関させることからなる、治療用化合物のスクリーニング方法を提供する。細胞増殖における変化は、癌の制御であってもよい。例えば、癌は、ニューロン組織、もしくはニューロン組織及び上皮を生じることができる幹細胞内にあってもよい。
治療用化合物のスクリーニング方法も、提供される。その方法は、（Ａ）本発明の動物又は動物胚を準備し；（Ｂ）スクリーニングされる化合物を動物又は動物胚に導入し；かつ（Ｃ）神経系の発達及び成熟における変化を化合物の活性と相関させることからなる。神経系における変化は、例えば二分脊椎の改変又は予防、もしくは無脳症の改変又は予防であってもよい。
【００１６】
診断のほか、この発明は以下にも関している：
神経細胞の、好ましくは有糸分裂後の神経細胞の内在又は外来遺伝子の発現もしくは発現調節のためのプロモーター配列の使用、特に治療的目的での使用；
（そのような調節を行う方法は欧州特許ＥＰ４１９６２１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）に記載されている）
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の不発現により生じる神経細胞の過剰生成による神経を起源とする腫瘍を予想し、腫瘍の発達を予防するための遺伝子の使用；及び
パーキンソン病又はアルツハイマー病などの神経変性疾患、もしくは事故の、特に新たな神経回路網の発生による遺伝子治療におけるこの遺伝子の使用。
【００１７】
本発明は、ヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の代わりにマウスＮａｐ１ｌ２遺伝子に関する、これらの同一の実施態様を提供する。
この発明は、図面を参照して詳細に記載される：
【００１８】
図１は、オリゴヌクレオチドプローブとのインサイトゥハイブリダイゼーションによるマウス神経系内のＮａｐ１ｌ２ ｍＲＮＡの位置を示す。
ａ　異なる発達段階でのＮａｐ１ｌ２発現を示すフィルムオートラジオグラム明視野写真。発現ドメインは、神経系、神経管及び末梢神経節の全ての組織におよぶ。
ｂ　神経系のＮａｐ１ｌ２発現の細部を示すエマルジョンオートラジオグラム暗視野顕微写真。左パネル：Ｅｌ１．５の脊髄及び末梢神経節の腰部レベルでの発現。フィルムオートラジオグラム上のＥｌ５．５でも認識できるが、腹背の分化勾配のため、標識が腹部分においてより広範囲であることに留意されたい。右パネル：Ｅｌ１．５の上丘での発現。ここでも、脳室領域には標識化がみられない。
【００１９】
ｃ　成体マウスの脳でのＮａｐ１ｌ２発現を示すフィルムオートラジオグラム明視野写真。発現は、脳全体に広がっている。ところが、染色の強度は細胞密度と相関しておらず、発現が変異し得ることを示唆している。乳頭体の強い標識に留意されたい。略語：Ｖ、三叉神経節；ＩＸ／Ｘ、ＩＸ及びＸ神経の神経節複合体；Ｃｅｒ、小脳；Ｃｘ、皮質；ｄｒｇ、後根神経節；Ｈｉｐ、海馬；Ｍｂ、乳頭体；Ｍｅ５、中脳；ｎｅ、感覚上皮；Ｐｒ、前脳；Ｒｈ、菱脳；ＳＣ、脊髄；Ｓｔ、線条；Ｔｈ、視床。
【００２０】
図２は、Ｎａｐ１ｌ２ノックアウトの構築を示す。
ａ　ゲノムＤＮＡの制限パターン。
ｂ　Ｎａｐ１ｌ２の欠失及びｌａｃＺｎｅｏ及びＨＳＶ−ｔｋカセットのプラスミド構造への挿入。
ｃ　相同組換え後のＥＳ細胞系５ｂ１７及び８ｂ２１の制限パターン。
【００２１】
図３は、変異ＥＳ細胞系５６１７由来ＥＳ細胞がインビトロでニューロンに分化するところを示す。抗ネスチン抗体を用いた免疫蛍光法の写真をパネルａ、ｂ、ｃに示す。ａの比較、通常の細胞系Ｃｋ ３５ ｄｏｂ、インビトロでの分化ｃが９日目の変異細胞株５Ｂ１７、ｌａｃ ２陽性細胞（矢印参照）が、ネスチン位置の細胞群内で見られる。
【００２２】
図４は、桑実胚凝集実験で得られた、マウス発生中の異なる時点でのキメラの胚、発達の遅い胚、及び吸収胚の平均数を示す。数字は、回収された胚の総数の％として示す。ＣＤ−１及びＣ５７ＢＬ／６実験で得た胚を個別に示す。８〜１２桑実胚が、各養母に内植された。
【００２３】
図５は、桑実胚凝集実験で得た変異キメラ胚を示す。Ｅ１７．５日目の胚（ＣＤ−１桑実胚凝集体）は同じ実験で発見された無脳症を示した２つの胚のうちの１つである。１４．５日目の胚は剥離した表層外胚葉を示す、黒眼色素沈着を有する高い％のキメラＣＤ−１凝集体である。Ｅ１２．５日目：ＣＤ−１桑実胚を使用する実験において、大部分が背面正中線に沿うｌａｃＺ染色を示した６つを含む１４の非吸収キメラ胚が認められた。ここに示されるＥ１２．５日目の胚は、発見された外胚葉欠損を代表するものである（矢印）。
ａ、ｂ、及びｃは開放神経管；ｄは菱脳剥離；ｅは露出した終脳；対照胚は写真ｄの右部位に示される。外見上正常なＥ１０．５キメラはその背の全長に沿ってｌａｃＺ染色を有する。外見上正常な２つのＥ９．５キメラは、尾の最先端に制限されたｌａｃＺ染色を示す。
【００２４】
図６は、特定の表現型を有するｌａｃＺ染色した胚の断面を示す。
ａ　上胸領域の開放神経管欠損（矢印）を有するＥ１２．５日目の胚の断面。
ｂ　Ｅ１２．５日目の胚の脳の強い再転位。菱脳の位置をｒｈで示す。
ｃ　露出した神経管（Ｅ１２．５、Ａとの比較）。
ｄ　脳の露出した神経組織（矢印） （Ｅ１２．５、Ｂとの比較）。
ｅ　Ｅ１３．５日目の剥離した表層外胚葉（ｓｅ）及び脊髄（ｓｃ）。
ｆ　Ｅ１３．５日目の表層外胚葉の過剰生成（矢印）。震毛（ｖｉｒｂｒｉｓｓａ）内のｌａｃＺ染色にも留意されたい。
ｇ　Ｅ１４．５日目のキメラ胚の脳内の予想される壊死（矢印）。
ｈ　Ｅ１４．５日目の下層にある間葉（矢印）での表面外胚葉の過剰産生及びｌａｃＺ染色。
【００２５】
図７は、Ｎａｐ１ｌ２プロモーターを含むクローンＢｐｘプロモーターマウスＳｐｅＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列を図示する。
図８は、ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に同一なＢｐｘマウスｃＤＮＡの配列を図示する。
図９は、ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に同一なヒトｃＤＮＡの配列を図示する。
図１０は、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含むヒトＢＰＸ　５′領域を図示する。
【００２６】
図１１は、胎生期癌細胞内のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子産物の局在研究の結果を示す。発現ベクターｐＥＧＦＰでトランスフェクションしたＰ１９細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ−ＮＡＰ１Ｌ２融合タンパク質を発現する（ａ〜ｃ）。細胞を、ＤＡＰＩで対比染色する。
ａ　ＮＡＰ１Ｌ２は、Ｇ１期で停止した細胞の細胞質（０．５％ＦＣＳを含む培地で７２時間成長）に局在する；及び
ｂ　Ｓ期で停止した細胞の核 （１０−７Ｍメトトレキセートで２４時間） に局在する；
【００２７】
ｃ　ＮＡＰ１Ｌ２は、核フラグメント化を受けた細胞内の凝縮クロマチンに局在し、下のパネルはｃのＤＡＰＩ対比染色を示す。
内在性Ｎａｐ１ｌ２プロモーターの制御下でのＧＦＰ融合タンパク質の発現（ｄ〜ｇ）
ｄ　Ｓ期中又はその後にＮＡＰ１Ｌ２融合タンパク質を発現する細胞は、クロマチン凝縮を示す；
ｅ　ｄのＢｒｄＵ染色；
ｆ　ｄのＤＡＰＩ染色；
ｇ　ｄ、ｅ及びｆの融合
【００２８】
図１２は、ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のゲノム構造の図である。
図１３は、ヒトゲノムＢＰＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を図示する。
【００２９】
ＮＡＰ−１様遺伝子であるＮａｐ１ｌ２は神経管の発達に関与し、Ｎａｐ１ｌ２の欠失は胚形成中期以降からの胚致死につながることが発見された。生存胚は、ヒトにおける二分脊椎及び／又は無脳症にそっくりなひどい神経管閉鎖欠損を示す。
【００３０】
インサイトゥハイブリダイゼーションの研究は、Ｎａｐ１ｌ２が中枢神経系及び末梢神経系両方の有糸分裂後のニューロンでほぼ排他的に発現されることを示した。Ｎａｐ１ｌ２の発現はマウスの発生のＥ９．５日目に最初に検出され（図５）、これは、Ｎａｐ１ｌ２遺伝子を欠失したキメラ胚に始めて胚形成変化の兆候が見られるのと合致する。Ｎａｐ１ｌ２遺伝子欠失の影響は胚形成が進むにつれてますます大きくなり、ついにはＥ１２．５〜Ｅ１４．５日目で広範に胚吸収が起こり、回収した新生マウスに高度のキメラが見られないという結果になる。Ｅ９．５日以後の種々の胚段階に回収した例外的に生存可能なキメラを調べたところ、この致死が、主に脊髄及び脳に影響を及ぼす、外胚葉由来細胞の増殖における欠陥及びそれに伴う異常組織形成によるものであることが示唆された。脊髄欠損の深刻さは、ｌａｃＺ発現により示されるキメラの程度とよく相関していると思われる。
【００３１】
キメラ胚内でいくつかのｌａｃＺ陰性細胞数の増加が観察されたことから（図６ｈ）、Ｎａｐ１ｌ２変異は完全に細胞自律性ではないと考えられる。したがって、１つの細胞内でのＮａｐ１ｌ２の欠失は、細胞−細胞間の相互作用の過程による隣接細胞の増殖を妨げる可能性がある。神経栄養性因子を含む広範な細胞−細胞間の相互作用は、例えば神経発生に関係することが知られており、ニューロンの生存は明らかにそれ自身の細胞周期のみならず、他のニューロンとの相互作用にも依存している１９。例えば、Ｏｔｘ２遺伝子は、細胞自律的及び細胞非自律的に作用して神経外胚葉細胞内での遺伝子発現を調整することが最近明らかになっている２０。
【００３２】
ｌａｃＺ染色はＥ１２．５胚の神経節及びＥ１２．５ならびにＥ１７．５のキメラ胚の腸粘膜下神経叢にも発見されたが、それらの組織の発達に目立った影響が全くなかったので、Ｎａｐ１ｌ２機能の欠損は、Ｎａｐ１ｌ２が正常に発現される全ての組織に観察可能な変化を必ずしももたらさないことが結論付けられた。キメラ胚で観察されたｌａｃＺ発現のパターンは、Ｅ１２．５及びＥ１３．５胚の震毛（図６ｆ）及びＥ１２．５胚のいくつかの筋肉（図５、ａ〜ｃ）でのＮａｐ１ｌ２発現の可能性を同じように示唆するものであったが、ここでもまたこれらの組織に検出可能な変化はなかった。しかしこれらの場合、正常胚のインサイトゥハイブリダイゼーション研究によってＮａｐ１ｌ２発現は確認することができなかった。
【００３３】
Ｎａｐ１ｌ２の転写は、野生型ＥＳ細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析及びＮａｐ１ｌ２変異ＥＳ細胞系のｌａｃＺ染色により確立されたとおり、インビトロ分化ＥＳ細胞内で明らかに観察された。Ｎａｐ１ｌ２欠損ＥＳ細胞のインビトロ観察は、有糸分裂後のニューロンの形成及び分化にＮａｐ１ｌ２遺伝子が必要でないことを示唆するものであるが、Ｎａｐ１ｌ２がニューロン細胞自身の存在よりはむしろそのようなニューロン細胞の形成及び／又は増殖の程度に影響を及ぼしかつ制御することを示唆する限りにおいて、インビボで得た結果に適合する（図６ｂ）。
【００３４】
この観察は、Ｎａｐ１ｌ２遺伝子がニューロンを発達させる細胞周期調節又はニューロンの有糸分裂後の静止状態の維持において役割を果たしていることを示唆している。インビボでのＮａｐ１ｌ２遺伝子の欠損は、細胞分裂速度及び形成された神経細胞数に変化をもたらし、脳の発達及び神経管閉鎖に関わる正常な発達過程を崩壊させるであろう。
最近になって、Ｋｅｒｓｚｂｅｒｇ及びＣｈａｎｇｅｕｘはこのような観察を明確にし、神経組織での過度の有糸分裂速度が、神経及び非神経組織の分裂速度の正常な整合を変えることにより、神経板を拡張し、完全閉鎖を得るのに普通より十分に大きい板を曲げるのに伴う問題をもたらすことを指摘している１。
【００３５】
神経管閉鎖における細胞増殖制御の重要性を示唆する他の例として、ＨＥＳ−１及びＰａｘ−３遺伝子が含まれる。へリックス−ループ−へリックス因子ＨＥＳ−１遺伝子、Ｅ（ｓｐｌ）同族体及びヘアリー（ｈａｉｒｙ）のヌル変異は、神経組織の過剰発達及びそれに伴う神経管閉鎖の異常の両方に関与することが示されている２１。同様に、マウスのぶち（ｓｐｌｏｔｃｈ）表現型の原因であるＰａｘ−３遺伝子の突然変異は、感覚上皮の崩壊及び細胞分裂速度の差の両方に関連している２２。ヒトのワルデンバーグ（Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ）症候群の神経管欠損モデルである、ぶちマウス及びカーリーテール（ｃｕｒｌｙ ｔａｉｌ）マウスの両方において、細胞周期を決定するいくつかの遺伝子の発現レベルが変化していることが認められた２３、２４。
【００３６】
神経細胞の発生運命におけるＮａｐ１ｌ２の推定上の役割は、Ｎａｐ１ｌ２が他のＮＡＰパラログ（ｐａｒａｌｏｇｕｅｓ）に示す、高度な類似性とよく相関している。保存は核局在化モチーフを含む２つの既知の機能的ドメインで特に強く、ＮＡＰ１Ｌ２がおそらくヌクレオソーム構造に干渉するか又はサイクリンに結合することができ、そのようなメカニズムを通して細胞周期調節に介入することを示唆している。興味深いことに、予備データは、Ｐ１９胚癌又はＮＩＥ１１５神経芽腫細胞いずれかでのＮＡＰ１Ｌ２の過剰発現が確かに細胞の成長を妨げ、アポトーシスをもたらすことを示唆している（データ示さず）。
【００３７】
神経管形成は遺伝子発現の正確な時間的かつ空間的組織化を要しており、Ｎａｐ１ｌ２はおそらくこの過程の研究で考慮する必要のあるもう１つの遺伝子をさらに示している１、２。このような基礎となる複雑性は、複数の遺伝子及び遺伝的−環境的相互作用の複合作用を伴う多因性原因と考えられるヒト神経管欠損（ＮＴＤ）の病因学とよく一致する。ＰＡＸ−１２５、ＭＴＨＦＤ２６、及びＳＨＨ２７を含む、幾つか異なる遺伝子での突然変異は、すでにヒトＮＴＤに関連するものとなっている。
【００３８】
無脳症を伴う二分脊椎のＸ−結合の症例が幾つか報告されているが２８、２９、どの病例においても特徴となる欠損はない。ＮＡＰ１Ｌ２の完全欠如がヒトにおいて致命的であると予想できるが、いくつかの型の突然変異がさほど深刻でない疾患をもたらし得ることは無視できないし、ヒト及びマウスの症候群が深刻さにおいてどの程度まで異なるのかを予測することもできない。
【００３９】
ヒトにおいて、無脳症及び二分脊椎の遺伝率は約６０％と推定されている３。遺伝的バックグラウンドによる浸透度の広範囲のばらつきもまた、カーリーテール３０及びループテール（ｌｏｏｐ−ｔａｉｌ）３１両方を含む公知のマウスＮＴＤ変異体の多くを明らかに特徴付ける。ＣＤ−１及びＣ５７ＢＬ／６のバックグラウンドに見られたＮａｐ１ｌ２変異の表現型浸透度に観察された差は、この複雑さを反映していると言える。この関係において興味深いのは、カーリーテール変異の浸透度がＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいて特に高いことである３０。
【００４０】
したがって、これらの実験及び知見に起因するこの発明は、Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の変異型ならびにそれらがエンコードする得られた変異ポリペプチドを包含する。変異ポリペプチドは、生物学的機能の損失、つまりニューロン細胞増殖の正常な制御の損失により特徴づけられる。この生物学的機能の損失は、変異Ｎａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子により、異常なヌクレオソーム集合、細胞周期調節、又はその両方に関連できる。変異ポリヌクレオチドは、妊娠中期以降の胚致死につながることさえある。変異胚が生存しても、大規模な表層外胚葉欠損、開放神経管、及び脳の露出を示す可能性がある。これらの変異ポリペプチド及びそのフラグメント、ならびにそれらをエンコードするポリヌクレオチド及び対応するＲＮＡは、診断上の適用に有用である。
【００４１】
ここで使用される「生物学的機能の損失」という表現は、Ｎａｐ１ｌ２遺伝子又はそのフラグメント、もしくはＮａｐ１ｌ２遺伝子又はそのフラグメントの突然変異を意味し、その突然変異は、変異タンパク質又は変異遺伝子もしくは変異ポリヌクレオチドフラグメントによりエンコードされたポリペプチドが、例えば変異遺伝子又は変異ポリヌクレオチドを含む動物もしくは胚に以下の神経系欠損の少なくとも１つによって明らかになる生物学的活性の喪失によって特徴付けられるような変異である：
【００４２】
神経管閉鎖不全又は不完全な神経管閉鎖；
二分脊椎；
無脳症
表層外胚葉−由来細胞の不適切な増殖；
脳構造の損失；
脳構造の崩壊；
ニューロンでのヌクレオソーム活性の不適切な制御；
ニューロン及びニューロン細胞前駆体での細胞周期の不適切な制御；
サイクリン及びその相互作用相手の不適切な制御；
Ｘ−染色体関連疾患；
ＤＮＡに結合する転写因子の不適切な制御；
ヒストンの不適切な制御；及び
細胞質から核までのヒストンの不適切なシャトル。
【００４３】
これら神経系欠損を発生させる、変異遺伝子及びそれらがエンコードするポリヌクレオチドならびにタンパク質及びポリペプチドの能力は、実施例に記載される技法及び以下に示される方法を用いて測定することができる。
この発明に包含される意味は、多岐にわたる。変異Ｎａｐ１ｌ２タンパク質をエンコードするｃＤＮＡが、単離された。変異Ｎａｐ１ｌ２タンパク質をエンコードするｃＤＮＡのこの発見によって、変異Ｎａｐ１ｌ２及びポリペプチドをエンコードする核酸配列を含む発現ベクターならびに対応するＲＮＡ；発現ベクターによってトランスフェクションされるかあるいは形質転換される宿主細胞；単離又は精製タンパク質としての生物学的に不活性なＮａｐ１ｌ２ポリペプチド及び変異Ｎａｐ１ｌ２ポリペプチド；ならびに変異Ｎａｐ１ｌ２ポリペプチドと免疫反応性の抗体を構築することができる。加えて、変異Ｎａｐ１ｌ２ポリペプチドが機能するメカニズムを理解することによって、Ｎａｐ１ｌ２タンパク質活性に影響を及ぼす物質を検出するためのアッセイをデザインすることができる。この発明の種々の実施態様がマウスＮａｐ１ｌ２に関して記載され得るが、本発明がヒトＮＡＰ１Ｌ２にも同じ程度あてはまることは当然に理解されるであろう。
【００４４】
したがって、ここで使用される「変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチド」という用語は、生物学的機能の喪失を示し、さらにここに記載される変異タンパク質及びポリペプチド、ならびにそのようなアミノ酸配列との類似性が高く（少なくとも９０％相同）、天然のＮａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２タンパク質の生物活性を少なくとも１つ欠く変異タンパク質及びポリペプチドを含む変異ポリペプチドの属を意味する。
「変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチド」という用語は、本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドをそれぞれエンコードするポリヌクレオチド及びこれらポリヌクレオチドに対応するＲＮＡを意味する。本発明の変異ポリヌクレオチドは、遺伝子産物の完全欠損をもたらすＮａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の５′領域での突然変異を含む。
【００４５】
ここで使用される「精製された」という用語は、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチド及びポリヌクレオチドが、例えば組換え宿主細細胞培養の精製産物又は非組換え源からの精製産物として、他のタンパク質又はポリペプチド及びポリヌクレオチドと本質的に結合していないことを意味する。ここで使用される「実質的に精製された」という用語は、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドならびにポリヌクレオチドを含む混合物で、特異的抗体を用いて除くことが可能な公知のタンパク質の存在を除いて、本質的に他のタンパク質又はポリペプチド及びポリヌクレオチドと結合しておらず、実質的に精製された変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドが抗原として使用できる混合物を意味する。
【００４６】
変異体は、特定のアミノ酸残基が、物理化学特性が類似した残基により置換されることを意味する保存的置換配列を含むことができる。同類置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａなどの脂肪族残基の相互置換、もしくはＬｙｓ とＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌｎとＡｓｎのような１つの極性残基と他のものとの置換が含まれる。このような同類置換の他のものとしては、例えば疎水特性が類似した全領域の置換が周知である。自然発生変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチド変種も本発明に含まれる。このような変異体の例は、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドのタンパク質分解切断に起因するタンパク質である。タンパク質分解に寄与する変化には、例えば、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドから１以上の末端アミノ酸をタンパク質分解によって除去することによる、異なる型の宿主細胞での発現時の末端の差異が含まれる。フレームシフトに寄与する変化には、例えば、異なるアミノ酸による、異なる型の宿主細胞での発現時の末端の差異が含まれる。変化は、リン酸化による化学修飾に起因してもよい。
【００４７】
上記のとおり、本発明は、組換え型及び非組換え型両方の単離及び精製又は均質な変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドを提供する。抗原として使用可能な天然の変異型Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの変異体及び誘導体は、天然の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得ることができる。
天然のアミノ酸配列の変質は、数ある従来法のいずれかによって達成できる。突然変異は、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、天然配列のフラグメントへの結合を可能にする制限部位によって連結することにより特定の座に導入することができる。連結後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有する類似体をエンコードする。
【００４８】
あるいは、オリゴヌクレオチドに対する部位特異的変異誘発法を用いて、所定コドンが置換、欠失又は挿入により変えられた変質型遺伝子を提供することができる。上記のように変質させる典型的な方法はＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ ４２： １３３， １９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ ３７： ７３， １９８５）；Ｃｒａｉｋ （ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｊａｎｕａｒｙ １９８５， １２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｋ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ４８８， １９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３６７， １９８７）；及び米国特許第４，５１８，５８４号及び第４，７３７，４６２号に開示されており、それら全てが引用によって組み込まれる。
【００４９】
本発明の範囲内の核酸配列又はポリヌクレオチドは、適度なあるいはひどくストリンジェントな条件下で、ここで開示される天然の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２核酸にハイブリダイズし、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドをエンコードする単離ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。ここで使用される、適度にストリンジェントな条件は当業者に公知で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版 Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １，１０１−１，１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８９）に記載のとおり、５Ｘ ＳＳＣ 、０．５％ＳＤＳ， １．０ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ ８．０）のニトロセルロースフィルター用予備洗浄液、４２ Ｃで６Ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション条件 （又は、４２Ｃで５０％ホルムアミド中Ｓｔａｒｋ’ｓ溶液のような他の類似するハイブリダイゼーション溶液）、及び約６０Ｃ、０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件の使用を含む。高度なストリンジェント条件は、Ｃｈｕｃｈ 及びＧｉｌｂｅｒｔ １９８６、ＰＮＡＳ ８１、１９９１−１９９５のプロトコルにより規定されるとおりである： Ｃｈｕｒｃｈ 緩衝液： １ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ ６５℃で一晩。ストリンジェント洗浄：６５℃で４０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ ＳＤＳ （洗浄ＩＩ）で２回洗浄。当業者は、温度及び洗液の塩分濃度がプローブの長さなどの因子によって必要に応じて調節できることを認めるであろう。
【００５０】
本発明のＮａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドは、核酸のプール内の標的核酸を同定するのに利用できる。標的核酸は、プローブが特異的にハイブリダイズするようデザインされた核酸（生体試料に由来することが多い）であってもよい。検出されるのは標的核酸の有無であり、または定量されるのは標的核酸の量である。標的核酸は、標的に対する対応するプローブの核酸配列に相補的な配列を有する。標的核酸は、プローブが対象とする大きな核酸（例えばＮａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のフラグメント）の特定のサブシークエンス（長い配列の一部を意味する）であってもよく、又は発現レベルが検出されるのが望ましい全体配列（例えば完全なＮａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子）であってもよい。
【００５１】
この発明は、さらにＮａｐ１ｌ２遺伝子又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現をモニタリングする（例えば発現を検出及び／又は定量する）方法を提供する。この方法は、これら遺伝子の１以上のｍＲＮＡ転写物からなる標的核酸のプール又はｍＲＮＡ転写物由来の核酸を準備し、核酸のプールを、ｍＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ転写物由来の核酸に相補的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし、ハイブリダイズした核酸を定量することを含む。標的核酸のプールは、標的核酸（ｍＲＮＡ転写物）又はｍＲＮＡ転写物由来の核酸の濃度がＮａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の発現レベルに比例したものであってもよい。多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブの微細加工アレイ（例えばＤＮＡチップ）は、標的核酸配列の有無を検出し、複合核酸プール中の標的配列の相対的な存在比を定量するのに効果的に使用することができる。
【００５２】
標的核酸のプールは生体試料から単離された全ポリＡ ｍＲＮＡ、又はＲＮＡもしくは第二鎖ｃＤＮＡの逆転写によりできたｃＤＮＡ、又は二本鎖ｃＤＮＡ中間体から転写されたＲＮＡであってよい。標的核酸のプールを試料の複雑度を減らすように処理し、それによって、ハイブリダイゼーションで生じたバックグラウンドシグナルを減少させることができる。
【００５３】
遺伝子の転写レベルの定量に関連して使用される時、「定量する」という用語は絶対定量又は相対定量を意味する。絶対定量は、既知の濃度の標的核酸（例えば、対照核酸又は既知の量の標的核酸自体）を１以上含み、既知の標的核酸で未知のもののハイブリダイゼーション強度を（例えば標準曲線の作成によって）参照することにより実現できる。一方、相対定量は、２以上の遺伝子間、又は２以上の処置間でハイブリダイゼーションシグナルを比較してハイブリダイゼーション強度の変化、暗に転写レベルを定量することにより達成できる。
【００５４】
１以上のコドンが同じアミノ酸をエンコードできる遺伝子コードについての公知の縮重により、ＤＮＡ配列はここでの実施例に記載された配列と異なるが、依然として変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドをエンコードすることができる。このような異型ＤＮＡ配列はサイレント突然変異（例えばＰＣＲ増幅中に発生する）に起因してもよいし、又は天然配列の意図的な変異誘発の産物であってもよい。
【００５５】
本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドは、診断上の適用に有用なアレイの組み合わせで使用するのに適している。例えば、アレイはディスペンサーを固体の支持体にディスペンサーの先端が接触するまで移動させ、表面から先端を引っ込め、少なくとも１００スポットのポリヌクレオチドのアレイを作るように通常５ｎｌ以下の滴を１ｎｍ２より小さい面積に滴下して作製することができる。この型のアレイの形成方法は、米国特許第６，０４０，１９３号に記載される。本明細書はその全開示に依拠し、それを引用することによって組み込んでいる。
【００５６】
本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドを利用するアレイは、固体基質上にオリゴヌクレオチドを合成して作製することもできる。例えば、１つの方法は基質の第一所定領域の照射を行う。基質の第二所定領域の照射が行われる。照射工程は、そこから保護基を取り除く。次いで基質を第一ヌクレオチドと接触させ、ヌクレオチドを第一所定領域の基質に結合させる。これらの工程を繰り返すことにより、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドのアレイが基質上に形成される。適切な方法は米国特許第５，４２４，１８６号に記載される。本明細書はその全開示に依拠し、それを引用により組み込んでいる。
【００５７】
これらアレイは、本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドの配列決定、フィンガープリント法及びマッピングに有用である。この方法は生物学的試料の分類及びそれらの源の特性付けにも使用可能な、複数の配列特異的な認識試薬を利用することができる。天然又は野生配列と本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリヌクレオチドとのヌクレオチド差異を同定する方法の一例は、既知の位置で既知の配列の異なるポリヌクレオチドプローブが非常に高密度で結合した基質を準備し、特異性が高い相補的なハイブリダイゼーションの条件下で標的核酸を基質に結合したポリヌクレオチドプローブに接触させ、どのポリヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしたのかを測定し、コンピューターを用いて参照核酸の配列を標的核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチドプローブの配列と比較して、標的核酸の配列と参照核酸の配列とのヌクレオチド差を同定する工程からなることができる。この種の方法は、米国特許第５，９２５，５２５号に詳しく開示されている。その全開示は依拠され、引用によりここに組み込まれる。適切なコンピューターは、米国特許第５，９７４，１６４号に記載されている。
【００５８】
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの前、その最中、又はその後に標識することができる。蛍光標識が特に好ましく、使用される場合、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの定量は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量による。
【００５９】
また、アレイは、高密度オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる発現モニタリングに利用することができる。例えば、１以上の本発明のポリヌクレオチドの発現を分析する典型的な方法は、１以上の遺伝子のＲＮＡ転写物からなる標的核酸のプール又はＲＮＡ転写物を鋳型として用いてそこから得た核酸を準備し、表面に固定したヌクレオチドプローブのアレイに標的核酸のプールをハイブリダイズすることからなる。米国特許第６，０４０，１３８号に記載されたそのようなアレイの１つは、少なくともいくつかが対照プローブを含む１００以上の異なるオリゴヌクレオチドからなる。異なる各オリゴヌクレオチドは、表面上の所定領域に局在化される。異なるオリゴヌクレオチドの密度は、１ｃｍ２あたりに約６０以上の異なるオリゴヌクレオチドである。加えて、少なくとも幾つかのオリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ転写物又はＲＮＡ転写物を用いてそこから得た核酸に相補的である。核酸のアレイへのハイブリダイゼーションは、遺伝子の発現レベルに比例するよう定量することができる。
【００６０】
変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドをエンコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターは、周知の方法を用いて作製することができる。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来するもののような、適切な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に操作可能に連結した変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２のＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、転写ならびに翻訳の開始及び終結を制御する転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位及び適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列が機能的に変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２のＤＮＡ配列に関係する時、「操作可能に連結している」。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が変異Ｎａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２のＤＮＡ配列の転写を制御するのであれば、変異Ｎａｐ１ｌ２又はＮＡＰ１Ｌ２のＤＮＡ配列に操作可能に連結している。複製起点により通常付与される望ましい宿主細胞での複製能力及び形質転換体を同定する選択遺伝子が、発現ベクターにさらに組み込まれてもよい。
【００６１】
加えて、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドに天然には結合していない適切なシグナルペプチドをエンコードする配列が、発現ベクターに組み込まれてもよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として初めに翻訳されるよう、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチド配列にインフレームに融合されていてもよい。意図される宿主細胞内で機能的なシグナルペプチドは、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの細胞外分泌を高める。シグナルペプチドは、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの細胞からの分泌によって、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドから切断されてもよい。
【００６２】
原核宿主細胞で使用するための発現ベクターは一般に、１以上の表現型選択可能なマーカー遺伝子を含む。表現型選択可能なマーカー遺伝子は、例えば抗生物質耐性を付与するタンパク質又は独立栄養要求を補うタンパク質をエンコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、市販のプラスミド由来のものが含まれる。市販のベクターには、タンパク質の発現のために特異的にデザインされたベクターが含まれる。これらは、マルトース結合タンパク質に融合したタンパク質の発現に使用されるｐＭＡＬ−ｐ２及びｐＭＡＬ−ｃ２ベクターを含む（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）。本発明で使用できる他の発現ベクターの例は、細菌：ｐＱＥベクター系（Ｑｉａｇｅｎ）；及びｐＣＡＬベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；哺乳動物：誘導系の例：ｐＴｅｔ−ＯＮ及びｐＴｅｔ−ＯＦＦ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；構成的発現の例：ｐＣＭＶベクター（±タグ） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；バキュロウイルス発現系（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；酵母発現ベクター（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及びインビトロ発現ｐＳＰＵＴＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【００６３】
組換え型原核宿主細胞発現ベクターに一般に使用されるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ぺニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８；及びＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７， １９８０；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）、及びｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２， １９８２）が含まれる。誘導プロモーターは、これらの系に属する。
この発明の実質的な部分は、Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーター配列の特徴づけにある。特に、本発明により発見されたＮＡＰ１Ｌ２の特異的な発現により、このプロモーターは、神経細胞、好ましくは有糸分裂後の神経細胞のインビボ又はインビトロ産生された生物学的産物に対応する内在遺伝子又は外来遺伝子、もしくは興味深い遺伝子のフラグメントの発現又は発現の調節に有用なベクターもしくはポリヌクレオチドの構築に使用することができる。内在又は外来遺伝子は、例えば治療目的のため、このような細胞内で標的とし、発現することができる。
【００６４】
Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子及びそれらのプロモーターのゲノム配列を、図７〜１０に示す。マウスＮａｐ１ｌ２遺伝子のプロモーター配列は、配列クローンＮａｐ１ｌ２プロモーターマウスＳｐｅＩ−ＳａｌＩ（図７）と題される配列（すなわち、配列のサブ配列）に含まれる。ヒトＮＡＰ１Ｌ２　５′領域（図１０）と題される配列は、ヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のプロモーターを（サブ配列として）含む。
【００６５】
変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌性、菌性、酵母、及び哺乳動物の細胞性宿主と使用するのに適切なクローニング及び発現ベクターは、例えばＰｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８５）に記載されている。無細胞翻訳系もまた、ここで開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いる変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの生産に使用することができる。
【００６６】
本発明が、ここに記載の手法を用いたものであれ、他の方法を用いたものであれ、単離又は精製形態の先に記載された変異タンパク質を含むことを意図することは、理解されるであろう。この発明の好ましい実施態様において、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドは、ヒト組織及びヒト組織成分、核酸、外来性タンパク質及び脂質、ならびに細菌、ウイルスなどの外来性微生物を実質的に含まない。本発明が実質的に同じ生物学的かつ免疫原的性質を有する同等の変異タンパク質を含むことも、理解されるであろう。このように、この発明は、本発明の変異タンパク質の血清型変異体を含むことを意図している。
【００６７】
本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドの使用によっては、それらを標識するのが望ましい場合がある。適切な標識の例は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識及び発色団である。本発明の変異タンパク質及び糖タンパク質を標識する方法は、免疫グロブリンを標識するのに広く使用されるものと本質的に変わらない。標識抗体を本発明の抗原に使用するかもしくは抗免疫グロブリンを抗原への抗体に間接マーカーとして使用することにより、標識する必要を避けることができる。変異タンパク質は、ＬａｃＺ又はＧＦＰのような簡単に検出可能なタンパク質の発現により検出することができる。
【００６８】
本発明の変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドが得られたら、それらを用いて、それらと反応性のポリクローナル及びモノクローナル抗体を産生することができる。このように、本発明の変異タンパク質又はポリペプチドは、当該分野で公知の手法により動物宿主を免疫化するのに使用できる。このような手法は通常、接種を必要とするが、他の投与方法を含んでいてもよい。動物宿主に免疫原性反応をもたらすため、十分量の変異タンパク質又はポリペプチドが投与される。本発明の抗原に対し抗体を産生する宿主は、どんなものでも使用できる。動物を免疫化し、抗原に対する抗体を産生し始めるのに十分な時間が経過すれば、ポリクローナル抗体を回収することができる。一般的な方法は、動物から血液を取り除き、血液から血清を分離することを含む。抗原に対する抗体を含む血清は、抗原に対し抗血清として使用できる。あるいは、抗体は血清から回収できる。アフィニティー精製は、血清から抗原に対する精製ポリクローナル抗体を回収するのに好ましい手法である。
【００６９】
本発明の抗原に対するモノクローナル抗体も、調製することができる。抗原と反応性のモノクローナル抗体を産生する１つの方法は、宿主を抗原で免疫化し；宿主の脾臓から抗体産生細胞を回収し；抗体産生細胞をヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼが欠乏する骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを形成し；ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンからなる培地での増殖によりハイブリドーマを少なくとも１つ選択し；抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを少なくとも１つ同定し、同定したハイブリドーマを培養して、回収可能な量で抗体を産生し；かつ培養したハイブリドーマにより産生された抗体を回収する工程からなる。
【００７０】
これらポリクローナル又はモノクローナル抗体は、様々な用途に使用できる。それらの１つは、対応する変異タンパク質の中和である。それらを用いて、例えばアフィニティークロマトグラフィーカラムでの使用時に、生物学的製剤もしくは精製している相当する変異タンパク質、糖タンパク質、又はその混合物中の抗原を検出することができる。
変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドを抗原として使用して、物質中の抗体を同定し、それら物質中の抗体の濃度を測定することができる。そのような物質には、当然ヒト組織及び他の動物組織ならびにヒト細胞及び動物細胞ばかりでなく、ヒト及び他の動物の血清を含むヒト体液及び動物体液などの生物学的液体が含まれる。抗体の存在又は濃度を測定するイムノアッセイの試薬としての使用時、本発明の抗原は、便利で、迅速であり、感受性があり、かつ特異的なアッセイを提供する。
【００７１】
より具体的には、本発明の抗原は、液体の体液成分の検出又は定量に使用される周知のイムノアッセイに用いることができる。したがって、抗原−抗体相互作用は、直接観察されるか又は沈殿又は凝集のような二次反応により測定することができる。さらに、免疫電気泳動法も用いることができる。例えば、抗血清との反応に続く寒天内の電気泳動の古典的組み合わせが、二次元電気泳動、ロケット電気泳動法、及びポリアクリルアミドゲルパターン免疫標識（ウェスタンブロット法又はイムノブロット法）と同じように利用できる。本発明の抗原を使用できる他のイムノアッセイには、放射線イムノアッセイ、競合的免疫沈降法、エンザイムイムノアッセイ及び免疫蛍光検定が含まれるが、これに限定されない。比濁（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）、比色及び比濁（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）法が使用できることが理解されるであろう。ウェスタンブロット法に基づくイムノアッセイが、好ましい。
【００７２】
イムノアッセイは、試薬の免疫反応を保ちながら、免疫試薬、本発明の抗原又は抗原に対する本発明の抗体のいずれか１つを担体表面に固定することにより行うことができる。相互免疫試薬は、免疫反応が保持されるように標識しなくともよく、または標識してもよい。これらの手法は、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）及び競合阻害酵素イムノアッセイ法（ＣＩＥＩＡ）などの酵素結合イムノアッセイでの使用に特に適している。
【００７３】
本発明の抗原又は抗原に対する抗体のどちらかが固体支持体に結合する際、支持体は通常ガラス又はプラスチック物質である。プレート、チューブ、ビーズ又はディスクの形に成型したプラスッチク物質が、好ましい。適切なプラスチック物質の例は、塩化ポリスチレン及びポリ塩化ビニルである。免疫試薬が固体支持体に結合しにくい場合は、担体物質を試薬と支持体の間に介在させてもよい。適切な担体物質の例は、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質、又はグルタルアルデヒドもしくは尿素などの化学試薬である。固体相のコーティングは、従来の技術を用いて行うことができる。
【００７４】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂフラグメントなどのそれら抗体のフラグメント、ならびにあらゆる組換え技術で産生された結合パートナーを含むことを意図する。抗体は、約１０７Ｍ−１以上のＫａで変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２ポリペプチドと結合すれば、特異的な結合であると定義される。結合パートナー又は抗体の親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ５１：６６０ （１９４９）に記載される技術を用いて容易に測定できる。ポリクローナル抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、様々な由来源、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス又はラットから容易に生成することができる。
【００７５】
目的をさらに達成するため、本発明の目標に従って、キットが提供される。ひとつの実施態様におけるこのキットは、ＲＮＡ又は類似ＤＮＡ配列にハイブリダイズして本発明の変異ポリヌクレオチドの存在を示すことができる、この発明のＤＮＡ配列を含む。使用可能な種々の診断技術には、（１）制限酵素で消化される、又はされない細胞性ＤＮＡを同定するためのサザンブロット法；（２）細胞から抽出されたＲＮＡを同定するためのノーザンブロット法；及び（３）ドットブロット法、すなわちあらかじめアガロースゲルで分離せずにトロセルロース又はナイロンなどのａｄ ｈｏｃ膜を通した試料の直接濾過が含まれるが、これらに限定されない。ドットブロット法に適した物質は、血清及び血漿、培養細胞からの上清、又は細胞溶解し、遠心分離により細胞の膜及び核を除去した後に得た細胞質抽出物を含む体液から得ることができるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の別の観点は、本発明のポリヌクレオチドを持つトランスジェニック動物に関する。本発明の好ましい実施態様によると、動物は哺乳動物であり、より好ましくはマウスである。例えば哺乳動物における変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の機能を研究するため、本発明のトランスジェニック動物は、当業者に利用可能な様々な技術によって生産することができる。Ｎａｐ１ｌ２遺伝子又はＮＡＰ１Ｌ２遺伝子が変異されたマウス系を作成することができる。
【００７７】
ジーンターゲティング技術を用いて、治療用ポリヌクレオチド、例えば天然に存在する不変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子を、変異Ｎａｐ１ｌ２及びＮＡＰ１Ｌ２遺伝子を含む宿主細胞に導入することができる。本発明による好ましいターゲティング技術のひとつは、引用によりここに組みこまれるＰＣＴ出願番号ＷＯ　９０／１１３５４（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）に記載されるＤＮＡターゲティング技術のような特異的置換方法からなる。このようなＤＮＡターゲティング法によって、所望の機能（例えば選択された標的の動物又は胚での発現の特異性）を有する内在性プロモーターの後に本発明による治療用ヌクレオチドを挿入することができる。
【００７８】
ＮＡＰ１Ｌ２タンパク質の欠損（特に、対応する遺伝子又はそれらのプロモーターの変異による）は神経細胞の過剰生産をもたらし、細胞内（神経／腫瘍／その他）でのＮＡＰ１Ｌ２又はサブフラグメントもしくは誘導体の発現はさらなる増殖を妨げ、治療として使用することができる。反対に、Ｎａｐ１ｌ２／ＮＡＰ１Ｌ２発現の修飾（特に、これら遺伝子の変異又はそれらのプロモーターの非効率さによる）は、神経細胞の過剰生産をもたらし、それによって神経細胞の再生又は生存が可能になり、この結果、治療として使用できる。
【００７９】
以下のプラスミドは、２８ ｒｕｅ ｄｕｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， Ｆ−７５７２４ Ｐａｒｉｓ， Ｃｅｄｅｘ １５， ＦｒａｎｃｅにあるＩｎｓｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ （Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．）に以下の受託番号を割り当てられ、寄託されている：
プラスミド　　　　　　　　　寄託日　　　　　　　 受託番号
ｐＣＵＲ１−２　　　　　　　　　　 ２０００年４月２５日　　　　Ｉ−２４６３
ＢＰＸ−１　　　　　　　　　　　 ２０００年４月２５日　　　　Ｉ−２４６４
ＢＰＸ−２　　　　　　　　　　　 ２０００年４月２５日　　　　Ｉ−２４６５
ＢＰＸ−３　　　　　　　　　　　 ２０００年４月２５日　　　　Ｉ−２４６６
【００８０】
本発明の別の観点は、プラスミドＢＰＸ−１又はＢＰＸ−２もしくはＢＰＸ−３に含まれる挿入断片、もしくはストリンジェントな条件下で前記挿入断片とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む真核細胞である。
本発明を、以下の実施例においてより詳しく記載する。
【００８１】
実施例１：マウス発生過程での発現プロフィルの分析
Ｎａｐ１１２発現のプロフィルについてより正確な全体像を得るため、Ｅ５．５〜Ｅ１８．５日目に相当する成体マウスの脳およびマウスの胚の切片に、Ｎａｐ１１２特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＲＮＡインサイトゥハイブリダイゼーションを行った（図１）。
Ｎａｐ１１２の発現は、中枢神経系および末梢神経系の両方に属する構造中の神経系全般にわたって見られた。発現はＥ１０．５日目に最初に検出でき、ニューロンの分化の初期波長と相関している（図１）。Ｅ１０．５〜Ｅ１８．５日目の胚段階は、Ｎａｐ１１２の発現は、主として脊髄であるが、脳と神経節の全般にわたっても存在していることも明らかにした。標識強度のばらつきは、発現レベルがいくらか均一でないことを示唆していたが、成体の脳では全領域で標識された。シグナルは、前嗅覚核、海馬、視床下部および小脳で特に強かった。最も強いＮａｐ１１２のシグナルは、乳頭体で検出された（図１、ブレグマ−２．９を参照）。
神経系内の分化領域は強い標識を呈していたが、脳室帯は特異的なシグナルを示さなかった。Ｎａｐ１１２の転写物は、神経系以外のグリア細胞や組織では検出されなかった。Ｎａｐ１１２の発現は、有糸分裂後のニューロンに限られると考えられる。
【００８２】
実施例２：欠損解析によって明確にされるＮａｐ１１２の役割
ＥＳ細胞の標的化した欠損および分化
Ｎａｐ１１２の役割を確立するため、相同組換えによって、Ｎａｐ１１２にヘミ接合の（ｈｅｍｉｚｙｇｏｕｓ）、オスＥＳ細胞中のＮａｐ１１２遺伝子のヌル変異を作製した。ノックアウト構築物では、イントロンを含まないＮａｐ１１２遺伝子を部分的に欠失させ、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子で置換した（図２）。得られた融合タンパク質は、Ｎａｐ１Ｌ２のＮ末端からわずか５個のアミノ酸を含んでおり、欠失されていないＣ末端配列が全てフレーム外にあるため、Ｎａｐ１１２の機能を有する可能性がある。内在性のＸ−結合Ｎａｐ１１２遺伝子が相同組換えで置換された、標的とされる２つの細胞系５ｂ１７および８ｂ２１が得られた（図２）。これらＥＳクローン中のＮａｐ１１２転写物の欠如はＲＰ−ＰＣＲにて確認し、クローンの核型を有糸分裂の拡張で確認した。
【００８３】
ＥＳ細胞はインビトロでニューロンに分化する可能性を有するため、Ｎａｐ１１２の欠失がインビトロでニューロンの発生に影響を及ぼすかどうかを決定するため、研究を行った。インビトロでの分化実験は、懸濁培養での胚様体の形成に基づく。培養から４日後の胚様体の再−結合は、種々の形の分化細胞の形成をもたらす。ニューロンの形成は、培地にレチノイン酸を加えて誘導することができる１８。形成された特異的な細胞型を目視するため、様々なニューロンマーカータンパク質：前駆細胞に存在するネスチン、初期ニューロン中のβ−チューブリンＩＩＩ、分化ニューロン中のＮＦ２００およびグリア細胞中のＧＦＡＰに対する抗体を用いた。
【００８４】
最初のＥＳ細胞系ＣＫ３５ならびに２つの組換え体ＥＳ細胞系、５ｂ１７および８ｂ２１の３つの細胞系全ては、レチノイン酸の存在下でニューロンを形成することができる。正常細胞系と変異細胞系の両方で、ネスチン陽性細胞が、胚様体の結合から２または３日後に観察された。ニューロンは、グリア細胞とともに、通常、胚様体を再培養してから４〜６日目に出現した。ニューロンの発生数は、使用されるレチノイン酸の濃度に依存していた１９。しかし、レチノイン酸を欠いた培養では、少数のニューロン細胞が生じるにすぎず、その数は３×１０−３Ｍのレチノイン酸を加えることで実質的に増加した。
【００８５】
レチノイン酸を欠いている場合には、ＣＫ３５細胞系は予想通り、ほとんどニューロン細胞を生産しなかった。対して、変異体細胞系は、再−結合から１日後の約５０細胞／ｍｍ２から３日後に２００細胞／ｍｍ２に増加する、多数のネスチン陽性ューロン細胞を生産した（図３ａ、ｂ）。これらネスチン陽性細胞の多くは、ｌａｃＺ陽性であった（図３ｃ）。ＢｒｄＵを用いるパルスチェイス実験により、これらｌａｃＺ発現細胞が成育中の細胞群であることを確認した（データ示さず）。
これらの実験は、Ｎａｐ１１２変異がインビトロのみならずインビボで、ニューロン前駆体の増殖に影響を及ぼすことを示している。ニューロン細胞の分化と細胞分裂のＧ１停止１３の双方に対するＲＡの二元的な影響は、Ｎａｐ１１２変異の増殖作用をおそらく抑制している。
【００８６】
実施例３：キメラの表現型の観察
マウス発生でのＮａｐ１１２の欠失の影響をより詳細に調べるため、神経系の変化をインビボで調べた。双方の変異ＥＳ細胞系を用いる胚盤胞インジェクションと桑実胚凝集によって、キメラ胚を得た。
総計１５３個のキメラ胚盤胞を、８ｂ２１ＥＳ細胞系を使った胚盤胞インジェクションによって作成した。産まれた子供３４匹のうち、毛色から判断すると３匹がキメラにすぎなかった。このうち２匹は、２０％未満のキメラであった。唯一キメラの％が高い（８０％）のは一番小さく弱った個体で、分娩から１週間後に死亡した。同様な結果は５ｂ１７系で得られた。
いずれのケースでも、生殖細胞系伝播（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）は見られなかった。我々の技法では、胚盤胞インジェクションは概して出生率が高く、得られたキメラの４０％以上でキメリズム及び生殖細胞系伝播は２５〜５０％である。これらＮａｐ１１２ノックアウトＥＳ細胞キメラの結果は、潜在的な出生前致死率を示した。これは、標的となるＥＳ細胞がオスであり、Ｎａｐ１１２遺伝子がＸ−結合していることを考慮すれば、可能性のあることである。
【００８７】
ＥＳ細胞桑実胚隗は、両方のＥＳ細胞系列でも生じた。養母に、ＣＤ−１（アルビノ）またはＣ５７ＢＬ／６桑実胚のいずれかを用いて８〜１２個の桑実胚隗を移植した。これらの実験で、胚盤胞インジェクションで観察されたのと大変類似した結果が得られた。１２ ＣＤ−１桑実胚凝集実験では、総計３６匹が生きて産まれ、８匹の子供が死亡し、６つが吸収された。毛色から判断すると、生きて産まれた３６匹は、キメリズムが１０％未満でキメラ％が低かった。一方、８匹の死亡した新生児のうち、６匹は高度にキメラであった。Ｃ５７ＢＬ／６桑実胚を使った４つの実験では、１匹はキメラ％が低く、１匹の子供は死亡し、そして１２個が吸収された。
キメリズムの低い％は生存能力と矛盾がないが、高い％のキメリズムは出生前に致死に至らしめる。％の低いキメラをかけ合わさると、生殖細胞系伝播は観察されなかった。
【００８８】
生存率を極めて低いものとし、キメリズムを低い％として、再移植後の異なるポイントでの胚を研究した。養母を９．５、１０．５、１２．５、１３．５、１４．５および１７．５日目に殺し、ｌａｃＺ発現のために胚染色した。５ｂ１７および８ｂ２１の２つの独立した標的とされるＥＳ細胞系の双方で、再び同様の結果が得られた（図４）。
特に多数の吸収がＥ１２．５〜Ｅ１４．５日のあいだに観察されたが、発達の遅い胚は主にＥ９．５〜Ｅ１０．５日のあいだに観察された。これらの発達の遅い胚は、あとの胚段階で観察される吸収を示すと思われる（図４）。
概して、Ｃ５７ＢＬ／６桑実胚凝集実験からはあまり多くの胚を回収できず（図４）、遺伝的なバックグラウンドが表現型の厳密さの決定において重要な要因であり得ることが示唆された。
ＮＬＳ−ｌａｃＺ発現は、Ｅ９．５日目に尾の尾部先端中に正常に発生した胚で最初に検出され、Ｅ１０．５日目まで神経管全体に広がった。
【００８９】
高度に再現可能な表現型が、生存しているＥ１２．５日目の胚で観察された。キメラ胚は表面外胚葉を欠損させており、一般に上下部の胸部領域における神経管閉鎖の障害として厳密に特徴付けられる（図５、Ｅ１２．５、ａ、ｂおよびｃ）。キメリズムの割合は、神経管欠損の重篤度と十分に相関していた（ａ対ｂを比較）。しかし、最も顕著な表現型はキメラ胚でみられ、強力な菱脳剥離または脳ヘルニアを呈していた（図５、Ｅ１２０．５ｄ）。図５ｅに示したＥ１２．５の胚では、表面外胚葉は終脳にわたって欠いていた。同様な表現型は、脳の露出や無脳症を有した、Ｅ１７．５日目まで生存していたキメラ胚で見られた（図５）。
【００９０】
妊娠中期または後期まで生存していた胚は、表現型の付加的なセットを示した。生存胚には、見かけ上表現型が正常と思われる２つのキメラＥ１３．５の胚（Ｃ５７ＢＬ／６桑実胚隗）が含まれたが、組織片で見られるような過剰発生と相関した表面外胚葉全般に渡る強力なｌａｃＺ−染色が示された（以下参照）。Ｅ１４．５日目に回収した十分に発生したキメラ胚は、背面正中線に沿って体部を結合させたまま、胴部に沿って側方にはじまり、背面に拡張する残りの体部から剥離される背面に皮膚を有していた。
【００９１】
実施例４：キメラ胚の切片の解析
キメラ胚で観察される表現型の基礎となる構造変化を理解するため、胚組織の切片を解析した。胚全体または凍結胚の切片を、ｌａｃＺ発現のために染色した。全ての場合に、種々の組織を目視化するために、切片をヘマトキシリンまたはトルイジンブルーで対比染色した。
Ｅ９．５日目とＥ１０．５日目の生存胚（図５）は正常と思われたが、Ｅ１２．５日目に高度なキメラ胚で最も著しく、明らかに再現可能な変異表現型が観察された。
主に菱脳と脊脳で見られた強いｌａｃＺ発現は、この位置での神経管閉鎖の障害と相関していた（図６、ａおよびｂ）。神経管閉鎖の障害は、いくつかの胚の下部胸部領域でも見られた。これらの胚では、神経管は露出され、表面外胚葉で覆われていなかった。しばしば、表面外胚葉と脊髄は、残りの身体部分から剥離していた（図６ａおよびｅ）。
【００９２】
Ｅ１２．５日目には、ｌａｃＺ染色が脳でもみられたが、この染色は脊髄よりも一般に弱く、インサイトゥでの結果と一致していた（図１）。脳の大幅な再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が観察された。終脳、間脳および中脳を含む脳の大部分（図６ｂ）は、ニューロン細胞での著しい増加の結果として大幅に拡張した。得られたニューロン組織は破壊され、神経皮およびニューロンの正常な分離はほとんど検出できない。
同様な脳の再配列は、Ｅ１３．５日目に回収したキメラ胚でみられた。加えて、表面外胚葉の顕著な過剰発生が、この段階でみられた（図６、ｆおよびｈ）。驚くことに、これは、皮膚でのｌａｃＺ発現と相関していなかったが、間葉では相関していた。Ｎａｐ１１２転写物は、この組織でのインサイトゥハイブリダイゼーションでは前もって検出されなかった。表面外胚葉でのこの欠損は、Ｅ１４．５日目のキメラでも認められなかった。興味深いことに、この段階まで、Ｅ１２．５日目に過剰発生を示した脳の領域は、壊死性となるようであった（図６ｇ）。
【００９３】
重篤な無脳症を示すＥ１７．５日までの生存胚は、脳の背面部の頂部を完全に欠いており、残りの脳部分を露出させていた。
総合すると、これらの結果は、Ｎａｐ１１２の機能が欠如すると神経管および表面外胚葉における細胞に過剰発生がもたらされ、このことがこれらの組織の適当な組織形成を妨げることを示唆している。
増殖している細胞でのＮＡＰ１Ｌ２タンパク質の機能を理解するため、ＮＡＰ１１２をも発現するＰ１９胚がん細胞（ＥＣ）１４でのその局在を研究した。
【００９４】
ＣＭＶプロモーターの制御下で、ＧＦＰ−融合タンパク質を発現できるｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、ＮＡＰ１Ｌ２のコード配列をクローンした。やや融合したＰ１９細胞培養物のトランスフェクショにより、ＮＡＰ１Ｌ２は細胞質、または核および細胞質の両方のいずれかに局在する。細胞期停止実験から、タンパク質はＧ１期では細胞質にあるが（図１１ａ）、核内での局在はＳ期に入る細胞で起こる（図１１ｂ）ことが示された。ＤＡＰＩ染色は、クロマチン密度の高い核領域でのＮＡＰ１Ｌ２の同時−局在を示した。興味深いことに、ＮＡＰ１Ｌ２を発現する細胞がやや融合して、成長している際には、ほぼ全てのＮＡＰ１Ｌ２陽性細胞がアポトーシスとなり、２４時間以内に死滅する。アポトーシス細胞では、ＮＡＰ１Ｌ２タンパク質は、断片化した核と結合したままであった（図１１ｃ）。ＮＡＰ１Ｌ２発現細胞はＧ１期を停止したのと対照的に培地中では生存し、これら細胞はほとんどアポトーシスにならなかった。同様の結果は、非融合ＮＡＰ１Ｌ２タンパク質の過剰発生で観察されるが、ＧＦＰのみについては過剰発生が観察されなかった（データ示さず）。Ｎａｐ１１２プロモーターの制御下にある場合、ＧＦＰ−ＮＡＰ１Ｌ２はＧ１期のあいだ同様に細胞質を局在化した。複製後核内でＮＡＰ１Ｌ２を発現する細胞は、しばしばアポトーシスを伴う複製クロマチンの凝縮を示した（図１１ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）。
【００９５】
我々のデータは、神経管形成の過程でのＮａｐ１１２の重要性を示している。Ｎａｐ１Ｌ２の欠損は胚に致死をもたらし、妊娠中期以降にみられる神経管閉鎖欠損は、ヒトでの二分脊髄および／または無脳症によく似ている１５。変異体表現型の厳密さは、ｌａｃＺ発現で証明されるような、キメリズムの程度と相関している。インビトロでの分化研究から、ニューロン前駆細胞の過剰増殖が変異表現型と関連していることが確認され、ＮＡＰ１Ｌ２が細胞分裂の制御に関わっている可能性のあることが示唆された。
【００９６】
次の方法を、実施例の実施に用いた。
インサイトゥハイブリダイゼーション
実験は、Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅらによって改良されたＹｏｕｇらが記載の方法を用いて行った。使用した４５マーのオリゴヌクレオチド配列、５’−ＴＴＡＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＣＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）は、Ｎａｐ１１２の３’非翻訳領域から選択した。厳密な洗浄工程の温度は、４５℃であった。標識の特異性は、標識オリゴヌクレオチドを過剰な非標識プローブで置換した対照実験で確認した。
【００９７】
ノックアウトＥＳ細胞の構築
Ｎａｐ１１２ ｃＤＮＡを用いて、Ｌａｍｂｄａ Ｄａｓｈ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の１２９／Ｓｖゲノムファージライブラリーをスクリーンした。６つのファージを同定し、８つの異なる酵素を使って１種および２種の制限消化によって分析した。ファージＤＮＡの制限パターンを、ゲノムＤＮＡの制限パターンと比較した。ファージのひとつの挿入断片を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを使ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。Ｎａｐ１１２遺伝子の欠失は、酵素ＨｉｎｃＩＩを使って分子間の再連結によって作成した。これにより、８９０ｂｐのコード配列を除いた。再連結でユニークＳａｌＩ部位を作成し、それを用いて、ファージにβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。これらのカセットのクローニングにより、残存するＮａｐ１１２配列のリーディングフレームが崩壊した。最終的に、ＨＳＶ−ｔＫカセットをベクターのポリリンカーに挿入した（図２）。ノックアウト構築物を、胚幹細胞系ＣＫ３５ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒのＢａｂｉｎｅｔ博士から得たオス１２９／Ｓｖ細胞系）にトランスフェクトし、トランスフェクトしたクローンをゲネチシン（Ｇ４１８）およびガンシクロビルで選択した。推定上の組換え体をスクリーニングするためのサザンブロットを、重複するラムダクローンから単離した構築物をフランクしているＥ１８シングルコピープローブを使って最適化した。２つのクローンは、βｇａｌＮｅｏ−カセットをＮａｐ１１２遺伝子に正確に組み込むための、想定される制限パターンを示した。両方のクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞へのマイクロインジェクションおよびＣ５７ＢＬ／６またはＣＤ−１桑実胚のいずれかを使った桑実胚隗実験に用いた。
【００９８】
桑実胚凝集
実験を、Ｗｏｏｄら３６およびＮａｇｙら３７のプロトコルに従って行った。胚は、ＰＭＳＧ （５ＩＵ）、次いで４６時間後にｈＣＧ （５ＩＵ）とともにＩＰでインジェクトし、すぐに種オスと交配させた３〜５週齢のメスから得た。メスの栓止（ｐｌｕｇ）を翌朝チェックし、この日の正午をＥ０．５として考慮した。陽性のメスを頚部脱臼でＥ２．５日目に殺し、メスの生殖の痕跡（ｔｒａｃｋ）をＰＢＳに単離した。桑実胚を、刃先のない３０ゲージの針とＭ２倍地を使って輸卵管をフラッシュすることにより単離した。透明層（ｚｏｎａ ｐｅｌｃｉｄａｓ）を、タイロード酸中での短時間の培養により除いた。そして、密集桑実胚および非密集桑実胚を、ミネラルオイル下にＭ１６培地を含む組織培養皿のウェルに１回または対にして移した。部分的にトリプシン処理したＥＳ細胞コロニーからの養分のないＥＳ細胞塊（５〜８ＥＳ細胞）を桑実胚を含むウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２湿性インキュベーターで４時間培養した。そして、ＥＳ細胞／桑実胚隗をミネラルオイル下にＭ１６培地を含む新しい組織培養皿に移し、一晩培養した。拡張した胚盤胞は麻酔をかけたＥ２．５の養母の子宮角に移植し、その養母を精管切除したオスと交配させた。
【００９９】
全体に標本とした胚のＸ−Ｇａｌ染色
胚のＸ−Ｇａｌ染色は、本質的にＰａｐｅｎｂｒｏｃｋら３８が記載するようにして行った。この手法はＥ１０．５日目の胚に理想的に適しており、古い胚に対しては、培養時間を延長した。胚をＰＢＳ中で切開した。そして、ＰＢＳを、０．５％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液に置換し、胚をＲＴで３０分間振とうした。計３０分のあいだＰＢＳで３回連続的に洗浄した後、ＰＢＳを染液（１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭスペルミジン、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ ＮＰ−４０、０．０１％デオキシコレートナトリウムおよび０．０５％ Ｘ−Ｇａｌを含むＰＢＳ）で置換した。３０℃で一晩培養し、ＰＢＳで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドのＰＢＳで数時間定着した。
【０１００】
組織学的検査
胚を、ドライアイス粉末で凍結させ、低温保持装置上で切開し（１４μｍ厚の切片）、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ＋スライドに取り付け、そして−８０℃で保存するか、またはアルコール勾配ですぐに脱水し、キシレン、キシレン／パラフィン（１：１）に浸し、パラフィンに包埋し、ミクロトーム切片を行った。凍結切片のＸ−Ｇａｌ染色は、Ｈｏｇａｎら３９のプロトコルに従って行った。全切片を、ヘマトキシリンまたはトルイジンブルーで対比染色した。エタノール系で脱水した後、スライドをＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ（Ｐｒｏｌａｂｏ）に浸し、Ｅｕｋｉｔｔ （Ｐｒｏｌａｂｏ）に取り付けた。
ＥＳ細胞の分化
インビトロでの分化は、Ｆｒａｉｃｈａｒｄら１８が記載したプロトコルに従って行った。
【０１０１】
免疫蛍光法
２％パラホルムアルデヒド中で２０分固定し、続いてＰＢＳで洗浄後、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２分浸透させた。ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、スライドを、希釈した抗血清と共に３７℃で１時間培養した。ＰＢＳでの希釈：抗−β−チューブリンＩＩＩ（１／４００）（Ｓｉｇｍａ Ｔ−８６６０）、抗−ＧＦＡＰ（１／２００） （ＤＡＫＯ Ｚ０３３４５）、抗−ＮＦ２００（１／２００）（Ｓｉｇｍａ Ｎ−４１４２）および抗−ネスチン抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋのラット−４０１）（１／２００希釈）。二次的なＦＩＴＣ−標識抗体はＳｉｇｍａからのものであり、１／３００希釈で用いた。前記のようにＰＢＳ中で洗浄した後、スライドをグロセロール中２％のｎ−プロピル没食子酸塩中で取り付けた。ＬａｃＺ染色は、上記のように固定し、ＰＢＳで３回洗浄した後に行った。
この結果、我々の発明には以下の知見が含まれる：
【０１０２】
Ａ）ＮＴＤ患者におけるヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の解析
ヒトＮＡＰ１Ｌ２遺伝子中の一連の変化に対するＮＴＤについて、Ｘ−結合性の家族性及び自発的なケースを解析した。研究に利用できた家族性の症例に、差異は認められなかった。他方、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の数は、自発的なＮＴＤと正常な対照の双方で、ＮＡＰ１Ｌ２の５’領域内に同定された。これらＳＮＰのほとんどは、ヒトとマウスのプロモーター領域で保存されているＣｐＧアイランド内でグアニジンまたはシトシンの置換をもたらす。５−アザシチジンでのインビトロでの脱メチル化はＮＡＰ１Ｌ２の転写活性を活性化し、ニューロン細胞のＮａｐ１Ｌ２／ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子の活性調節におけるＣｐＧメチル化／脱メチル化の重要性、および転写活性の変更における多型の重要性を示唆している。Ｎａｐ１Ｌ２／Ｎａｐ１１２発現は、ＤＮＡメチル化に影響を与え、しばしば神経管閉鎖欠損と関連する葉酸レベルのような後成的な環境要因に依存している可能性がある。
【０１０３】
Ｂ）Ｎａｐ１１２タンパク質の相互作用
我々の研究から、Ｎａｐ１１２タンパク質が、細胞周期のＳ−期でのＤＮＡ複製中にクロマチンに組みこまれるヒストンと相互作用することが明らかになった。ニューロンの分化において、Ｎａｐ１１２は、これらのヒストンおよびクロマチンを結合したままであり、クロマチンのリモデリングおよび細胞型特異的な遺伝子調節におけるＮａｐ１１２の役割を示唆した。Ｎａｐ１１２は、ニューロンの有糸分裂後段階の確立または維持に必要と思われることが示唆された。我々の結果は、ニューロン変性および／または再生過程でＮａｐ１１２に推定される役割を明らかに示唆している。
【０１０４】
Ｃ）腫瘍中のＮＡＰ１Ｌ２
我々の最近の結果は、ＮＡＰ１Ｌ２がヒトの神経芽腫瘍細胞で発現されることを示した。
ここで使われる「異種アミノ酸配列」という用語は、天然にはＮＡＰ１Ｌ２またはＮａｐ１Ｌ２のプロモーターのあとに直接続かない配列を意味している。
ここで使われる「異種ポリペプチド」という用語は、天然にはＮＡＰ１Ｌ２またはＮａｐ１Ｌ２のプロモーターのあとに直接続かず、発現が天然のＮＡＰ１Ｌ２またはＮａｐ１Ｌ２のプロモーターにおいてＮＡＰ１Ｌ２またはＮａｐ１Ｌ２プロモーターの制御下にない配列によってエンコードされるポリペプチドを意味する。
【０１０５】
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２６．　　Ｈｏｌ， Ｆ．Ａ．ら、ＰＡＸ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ：　ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ＰＡＸ１ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａ ｂｉｆｉｄａ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ３３， ６５５−６６０ （１９９６）．
２７．　　Ｈｏｌ， Ｆ．Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ＭＴＨＦＤ （ｍｅｔｈｙｌ−ｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−ｆｏｌａｔｅ−ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ， ｆｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ． Ｃｌｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． ５３， １１９−１２５ （１９９８）．
２８．　　Ｖａｒｇａｓ， Ｆ．Ｒ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓａｃｒａｌ ａｇｅｎｅｓｉｓ， ｔｒｉｐｈａｌａｎｇｅａｌ ｔｈｕｍｂ， ａｎｄ ｍｉｒｒｏｒ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌｙ．　Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． １０２， ３８７−９２ （１９９８）．
２９．　　Ｊｅｎｓｓｏｎ， Ｏ．ら、Ａ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｏｗｉｎｇ ａｐｐａｒｅｎｔ Ｘ ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｂｏｔｈ ａｎｅｎｃｅｐｈａｌｙ ａｎｄ ｓｐｉｎａ ｂｉｆｉｄａ．　Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ２５， ２２７−２２９ （１９８８）．
３０．　　Ｍｏｏｒｅ， Ｇ．Ｅ．ら、Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｉａｌ ｃｌｅｆｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｉｎａ ｂｉｆｉｄａ．　Ｃｌｅｆｔ Ｐａｌａｔｅ Ｊ． ２７， １３１−１３５ （１９９０）．
３１．　　Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｐ．Ｅ．ら、Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ： ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ｉｎ ｃｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ．　Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ６， ３５７−６２ （１９９４）．
３２．　　Ｃｏｐｐ， ＡＪ．， Ｃｈｅｃｉｕ， Ｉ． ＆ Ｈｅｎｓｏｎ Ｊ．Ｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｏｐ−ｔａｉｌ （Ｌｐ） ｍｕｔａｎｔ ｍｏｕｓｅ：　Ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ．　Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６５， ２０−２９ （１９９４）．
３３．　　Ｙｏｕｎｇ Ｗ．Ｓ． ３ｄ ， Ｂｏｎｎｅｒ Ｔ．Ｉ． ＆ Ｂｒａｎｎ， Ｍ．Ｒ Ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ．　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ９８２７−３１ （１９８６）．
３４．　　Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ， Ｎ．， Ｚｏｌｉ， Ｍ． ＆ Ｃｈａｎｇｅｕｘ， Ｊ．Ｐ． Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｉｎ ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８， ２４２８−３９ （１９９６）．
３５．　　Ｒｏｕｇｅｕｌｌｅ， Ｃ．， Ｃｏｌｌｅａｕｘ， Ｌ．， Ｄｕｊｏｎ， Ｂ． ＆ Ａｖｎｅｒ， Ｐ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｄｅｒｅｄ ｌａｍｂｄａ ｃｌｏｎｅ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ４６０−ｋｂ ｒｅｇｉｏｎ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ Ｘｉｓｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．　Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ ５， ４１６−２３ （１９９４）．
３６．　　Ｇａｒｄｎｅｒ， Ｒ．Ｌ．　Ｍｏｕｓｅ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ． Ｎａｔｕｒｅ ２２０， ５９６−７ （１９６８）．
３７．　　Ｗｏｏｄ， Ｓ．Ａ．， Ｐａｓｃｏｅ， Ｗ．Ｓ．， Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｃ．， Ｋｅｍｌｅｒ， Ｒ．， Ｅｖａｎｓ， Ｍ．Ｊ． ＆ Ａｌｌｅｎ， Ｎ．Ｄ． Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｅｍｂｒｙｏ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｂｙ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ．　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ４５８２−５ （１９９３）．３８．　　Ｎａｇｙ， Ａ．， Ｒｏｓｓａｎｔ， Ｊ．， Ｎａｇｙ， Ｒ．， Ａｂｒａｍｏｗ−Ｎｅｗｅｒｌｙ， Ｗ． ＆ Ｒｏｄｅｒ， Ｊ．Ｃ．　Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅａｒｌｙ−ｐａｓｓａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ８４２４−８ （１９９３）．
３９．　　Ｐａｐｅｎｂｒｏｃｋ， Ｔ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｌ．， Ｌｅｅ， Ｒ．Ｓ．， Ｈｓｕ， Ｔ．， Ｋｕｒｏｉｗａ， Ａ． ＆ Ａｗｇｕｌｅｗｉｔｓｃｈ， Ａ． Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｏｘｃ−９ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ．　Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． １２， ５４０−７ （１９９８）．
４０．　　Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｒ．， Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ， Ｆ． ＆ Ｌａｃｙ， Ｅ． ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ ３７３−３７５ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
オリゴヌクレオチドプローブとのインサイトゥハイブリダイゼーションによるマウス神経系内のＮａｐ１ｌ２ ｍＲＮＡの位置を示す。
【図２】
Ｎａｐ１ｌ２ノックアウトの構築を示す。
【図３】
変異ＥＳ細胞系５６１７由来ＥＳ細胞がインビトロでニューロンに分化するところを示す。
【図４】
桑実胚凝集実験で得られた、マウス発生中の異なる時点でのキメラの胚、発達の遅い胚、及び吸収胚の平均数を示す。
【図５】
桑実胚凝集実験で得た変異キメラ胚を示す。
【図６】
特定の表現型を有するｌａｃＺ染色された胚の断面を示す。
【図７】
Ｎａｐ１ｌ２プロモーターを含むクローンＢｐｘプロモーターマウスＳｐｅＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列を図示する。
【図８】
ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に同一なＢｐｘマウスｃＤＮＡの配列を図示する。
【図９】
ゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に同一なヒトｃＤＮＡの配列を図示する。
【図１０】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含むヒトＢＰＸ　５′領域を図示する。
【図１１】
胎生期癌細胞内のＮＡＰ１Ｌ２遺伝子産物の局在研究の結果を示す。
【図１２】
ＮＡＰ１Ｌ２遺伝子のゲノム構造の図である。
【図１３】
ヒトゲノムＢＰＸ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を図示する。
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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