(57)【要約】【課題】リガンドによる結合に応じて、Ｇ蛋白質−結合レセプタのバイオフィジカル特性を特徴付ける。【解決手段】固体支持性の脂質二重層中に固定化されたクローン化ヒトδ−オピオイド・レセプタを結合プラズモン導波路共鳴（ＣＰＷＲ）分光法によって調べた。本発明は異方性薄膜で起こる密度、立体配座、分子配向の変化を直接モニターし、結合定数を直接判断できる高感度の方法を提供する。レセプタへのアゴニスト及びアンタゴニストの結合はプロテオリピド膜内の分子配向における増加を起こすが、アゴニスト結合だけが、膜（１０）の厚さと分子充填密度の増加を引き起こす。これにより、アゴニストとアンタゴニストの結合を区別する方法が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｇ蛋白質−結合レセプタを固体支持性の事前調製脂質膜へと取込む段階、
（ｂ）前記段階（ａ）のレセプタをリガンドと共に培養してリガンド／レセプタ複合体を形成する段階、
（ｃ）前記段階（ｂ）のリガンド／レセプタ複合体の結合プラズモン導波路共鳴スペクトルを判断する段階、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結合プラズモン導波路共鳴スペクトルにもとづいて前記段階（ｂ）のリガンド／レセプタ複合体のバイオフィジカル特性を特徴付ける段階、から成るＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニス
トのリガンドを区別する方法。
【請求項２】
前記段階（ｄ）のリガンド／レセプタ複合体のバイオフィジカル特性が密度の測定を含む、請求項１のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項３】
前記段階（ｄ）のリガンド／レセプタ複合体のバイオフィジカル特性が立体配座の測定を含む、請求項１のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項４】
前記段階（ｄ）のリガンド／レセプタ複合体のバイオフィジカル特性が分子配向の変化の測定を含む、請求項１のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項５】
前記段階（ｄ）のリガンド／レセプタ複合体のバイオフィジカル特性が結合定数の測定を含む、請求項１のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項６】
Ｇ蛋白質−結合レセプタが、ヒト・デルタオピオイド・レセプタである、請求項１のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項７】
（ａ）Ｇ蛋白質−結合レセプタを固体支持性の事前調製脂質膜へ取込む段階、
（ｂ）前記段階（ａ）のレセプタをリガンドと共に培養してリガンド／レセプタ複合体を形成する段階、
（ｃ）前記段階（ｂ）のリガンド／レセプタ複合体の結合プラズモン導波路共鳴スペクトルを判断する段階、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結合プラズモン導波路共鳴スペクトルにもとづいて前記段階（ａ）の膜の厚さと分子充填密度を特徴付ける段階、から成るＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【請求項８】
Ｇ蛋白質−結合レセプタがヒト・デルタオピオイド・レセプタである、請求項７のＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト及びアンタゴニストのリガンドを区別する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［米国政府の権利］
本発明は国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（契約番号ＭＣＢ−９９０４７５３）及び米国公衆衛生局，国立薬害研究所（契約番号ＤＡ−０６２８４）からの補助金によって部分的に援助を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
［関連出願］
本願は２０００年６月２２日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６０／２１３，５７５（名称「ヒト・デルタ−オピオイド・レセプタへのアゴニストとアンタゴニストの結合についてのプラズモン共鳴の研究：レセプタ・リガンド相互作用に関する新しい構造的洞察（Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔ／Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｌｔａ−Ｏｐｉｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ｎｅｗ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」）に基づくものである。
【０００３】
【発明の背景】
［発明の分野］
本発明は一般に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光学の分野に関するものである。さらに詳しくは、本発明は金属薄膜でのプラズモン共鳴と誘電被覆での導波路モードの結合に関する新しいＳＰＲ方法及び固相支持脂質二重層に固定化されたＧ蛋白質−結合レセプタへのリガンド（Ｌｉｇａｎｄ）の結合を伴う構造的変化を調べるための結合プラズモン導波路共鳴（ＣＰＷＲ：Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍｏｎ−Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光学の利用に関するものである。
【０００４】
［関連技術の説明］
（神経伝達物質，ペプチドホルモン及び成長因子を含めて）細胞−細胞信号伝達を行うリガンドの多くはその標的細胞の表面でレセプタに結合する。したがって、細胞表面レセプタとそのリガンドが信号を媒介するメカニズムを解明することは生物学研究の重要な焦点となっている。
【０００５】
ホルモン，神経伝達物質，リン脂質，光子，臭気物質及び成長因子への膜透過信号導入応答の大部分は７個の膜透過らせん状Ｇ蛋白質−結合レセプタ（ＧＰＣＲ：Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｉｐｔｏｒｓ）のスーパーファミリー（ほぼ２０００のメンバーを含み、なお増加している）によって媒介される。
【０００６】
これらのレセプタの活性化はレセプタの細胞外領域へのリガンドの結合によって引起こされる蛋白質の立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の変更を必要とすると考えられる。そのあと関連したＧ蛋白質はレセプタから分離し、酵素またはイオンチャネルなどの細胞内標的に信号を伝える。
【０００７】
ＧＰＣＲ及びその他の膜結合レセプタとのリガンド結合相互作用を調べるのに用いられている現在の方法にはいくつかの欠点がある。これらの欠点には放射標識リガンドの利用が含まれ、これには特別な合成方法が必要であり、特殊な処置や毒性の可能性の問題をもたらす。
【０００８】
場合によっては蛍光プローブ付きのリガンドを用いることができるが、蛍光発光団によってリガンドが変化し、その結果結合やリガンドの他の物理的，化学的特性に変化が生じることが多い。
【０００９】
おそらく最も重要なことは、現在用いられている結合方法は放射標識リガンドによるものでも、また蛍光標識リガンドによるものでも、リガンド−レセプタ相互作用に伴って起こるレセプタ構造の変化に関しては全く情報を提供せず、また現在の方法では同じレセプタと相互作用するアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）とアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）について発生する異なる構造上の変化を区別できないことである。
【００１０】
そのため、リガンド−ＧＰＣＲ相互作用のバイオフィジカル特性を特徴付ける新しい改良された方法が求められている。これから述べるように、プラズモン共鳴分光法を用いた新しい方法がペプチド・リガンドとＧＰＣＲの結合相互作用を特徴付けるのに用いられる。これによって得られる情報は非共有結合性のリガンド−レセプタ相互作用についての熱力学的結合定数の直接の決定、またこの相互作用に伴う構造的変化の査定が含まれ、これらはすべて非修復材料を用いたきわめて高感度の１回の評価により得られる。
【００１１】
【発明の概要】
本発明はＧＰＣＲ−リガンド相互作用のバイオフィジカル特性を特徴付けるための新しい改良された方法を提供することによって、上記の要求に合致するものである。
【００１２】
一般に、本発明による方法は表面プラズモン共鳴技術の新しく考案された改良法、つまり結合プラズモン導波路共鳴（ＣＰＷＲ）分光法と称される（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３， ２７９１−２７９７， １９９７； Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２４：２１３−２１９， １９９９； Ｓａｌａｍｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｌｉｎ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ． ３ Ｊ．Ｃ． Ｌｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ２３１１−２３１９， １９９９； Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒ．Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ， Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００； Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．に対して発行された米国特許５，５２１，７０２及び５，９９１，４８８をも参照）を用いるものであり、これによって異方性膜システムの特徴付けを行うことができ（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３， ２７９１−２７９７， １９９７； Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７５： １８７４−１８８５， １９９８； Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２４：２１３−２１９， １９９９）、またその他の異方性ナノ構造の特徴付けを行うことができる（Ｓａｌａｍｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｌｉｎ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， ｖｏｌ． ３ Ｊ．Ｃ． Ｌｉｎｄｏｎ， ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ２２９４−２３０２， １９９９； Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｒ．Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ， Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００）。
【００１３】
本発明の目的はＧ蛋白質−結合レセプタのバイオフィジカル特性及びそのリガンドとの相互作用を特徴付ける方法であって、現行の方法よりも迅速で直接行える方法を提供することである。
【００１４】
本発明の第２の目的はＧ蛋白質−結合レセプタのバイオフィジカル特性及びそのリガンドとの相互作用を特徴付けるきわめて高感度の方法を提供することである。
【００１５】
本発明の第３の目的はＧ蛋白質−結合レセプタのバイオフィジカル特性及びそのリガンドとの相互作用を特徴付ける方法であって、毒性または放射性の廃棄物を放出しない方法を提供することである。
【００１６】
本発明の第４の目的はＧ蛋白質−結合レセプタのバイオフィジカル特性及びそのリガンドとの相互作用を特徴付ける方法であって、特徴付けされる各分子の物理的または化学的特性を変えることのない方法を提供することである。
【００１７】
本発明の第５の目的はＧ蛋白質−結合レセプタのアゴニスト（作動）リガンドとアンタゴニスト（拮抗）リガンドを区別する方法を提供することである。
【００１８】
これらの目的及びその他の目的を達成するために本発明による方法はレセプタ−リガンドの相互作用に応じて、脂質膜面に平行なまたこれと直交するＧＰＣＲの構造内のリアルタイムでの変化を個別に調べる独特の能力を有する。また、この方法は従来のＳＰＲに比べて感度がきわめて高く、分光解像度が高い。たとえば、完全な分光測定及び分析のために必要とするレセプタ（及びリガンド）の量はフェムトモルの単位にすぎない。さらに、この方法は放射線測定を行う必要がないので臨界結合パラメータの測定をはるかに迅速に直接行うことができる。
【００１９】
このように、本発明はリガンド−ＧＰＣＲ相互作用の特徴付けを行う従来の方法に取って代わることができ、同時に従来の方法によっては得られないリガンド−ＧＰＣＲ構造変化についての新しい情報を与えることのできる一般的方法を提供する。
【００２０】
本明細書では本発明による方法を事前調製された脂質二重層へのヒトδ−オピオイド・レセプタの取込みによって、また高度選択性リガンドＤＰＤＰＥ（Ｃ−［Ｄ−Ｐｅｎ２， Ｄ−Ｐｅｎ５］エンケファリン（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）のレセプタへの結合を調べることによって（Ｍｏｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８０：５８７１−５８７４， １９８３）選択的アンタゴニストであるナルトリンドール（ｎａｌｔｒｉｎｄｏｌ）を用いて結合の逆転を示すことによって（ＮＴ１； Ｒａｙｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４５： ３３０−３３４， １９９４； Ｋｏｒｌｉｐａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３８： １３３７−１３４３， １９９５）、また、これらの結合相互作用に伴って起こるレセプタ構造の変化を調べることによって説明する。ＤＰＤＰＥまたはＮＴＩとの結合時にδ−オピオイド・レセプタで有意に異なる構造的変化が引起こされることが分かり、これによってレセプタ機能の構造的基礎について新しい洞察を行うことができる。
【００２１】
本発明のその他のさまざまな目的や利点は以下の明細書の記述及び請求項に詳細に示された新しい特徴から明らかになるであろう。そこで、上記の目的を達成するために、本発明は下記に図面により示され、好ましい実施例の詳細な説明に充分に記述され、請求項に詳細に示された特徴によって構成される。しかし、このような図面や記述は単に本発明が実施される場合のごく一部だけを開示しているにすぎない。
【００２２】
［図面の説明］
図１：オクチル・グルコシド−含有緩衝液のヒト・δ−オピオイド・レセプタのアリコートをＣＰＷＲ細胞の水性部分に加える前（曲線１）と後における７５ｍｏｌ％の卵ホスファチジルコリン及び２５ｍｏｌ％のホスファチジルグリセロールを含む支持脂質二重層について得られたＣＰＷＲスペクトルを示す図である（バルク溶液の最終レセプタ濃度は曲線２については４．８ｎＭであり、曲線３については１２．８ｎＭである）。緩衝液の組成は１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．３），０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＫＣｌであった。レセプタ溶液中のオクチルグルコシドの濃度は３０ｍＭであった。サンプル細胞に希釈したあとの濃度は０〜５ｍＭであった。ｐ−偏光（パネルＡ）及びｓ−偏光（パネルＢ）射出光で得たデータを示す。点線は理論的適合値を示す。これらの適合値から得た屈折率と厚さの値を図４に示す。全例で、平衡に達したあとにＣＰＷＲスペクトルを得た（２０〜４０分）。
【００２３】
図２：アゴニスト（ＤＰＤＰＥ）を水性部分に加えたあとアンタゴニスト（ＮＴＩ）を加えた実験で得たＣＰＷＲスペクトルを示す図である。細胞はレセプタが取込まれた脂質膜を含んでいた（最終バルクレセプタ濃度は１２．８ｎＭであった。パネルＡとパネルＢの曲線１にスペクトルを示す）。パネルＡとパネルＢの曲線２は７９ｎＭのＤＰＤＰＥを加えたあとに得たスペクトルを示している。パネルＣとパネルＤの曲線１はパネルＡとパネルＢの曲線２と同じである。パネルＣとパネルＤの曲線２は０．６４ｎＭのＮＴＩを加えたあとに得たスペクトルを示している。その他の条件は図１と同じである。
【００２４】
図３：アンタゴニストを加えたあとアゴニストを加えた実験で得たＣＰＷＲスペクトルを示す図である。図２と同様に細胞はレセプタを含む脂質膜を含んでいた（最終バルク濃度は１２．８ｎＭであった。パネルＡとパネルＢの曲線１にスペクトルを示す）。パネルＡとパネルＢの曲線２は０．１４４ｎＭのＮＴＩを加えたあとに得たスペクトルを示している。このあと、３６０ｎＭのＤＰＤＰＥを加えた（曲線２；パネルＣとパネルＤ）。パネルＣとパネルＤの曲線１はパネルＡとパネルＢの曲線２と同じである。その他の条件は図１と同じである。
【００２５】
図４：ｐ−偏光（黒丸印）またはｓ−偏光（３角印）を用いて得た細胞のサンプル部分中のアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）及びアンタゴニスト（ＮＴＩ）の濃度とＣＰＷＲ共鳴最小値の相対的位置との関係（依存度）を示す図である。より高い値への共鳴位置の移動はより大きい入射角への推移を示している。この結果は図２の実験を継続することによって得た。レセプタ取込みのあと、緩衝液中のアゴニスト溶液のアリコートを加えた。このあと、アンタゴニスト溶液のアリコートを加えた。その他の条件は図１と同じである。
【００２６】
図５：ｐ−偏光（黒丸印）またはｓ−偏光（３角印）を用いて得た細胞のサンプル部分中のアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）及びアンタゴニスト（ＮＴＩ）の濃度とＣＰＷＲ共鳴最小値の相対的位置の依存度を示す図である。より高い値への共鳴位置の移動はより大きい入射角への推移を示している。この結果は図３の実験を継続することによって得た。レセプタ取込みのあと、緩衝液中のアゴニスト溶液のアリコートを加えた。このあと、アゴニスト溶液のアリコートを加えた。その他の条件は図１と同じである。
【００２７】
図６：図１（曲線１）に示したレセプタ（最終バルク濃度１２．８ｎＭ）を含む脂質膜を用いて、ｓ−偏光で得たＣＰＷＲ時間補正スペクトルを示す図である。曲線１と２はそれぞれＣＰＷＲサンプル細胞に７ｎＭアゴニストを加えた後、２０秒と６０秒で得た。挿入図はアゴニスト添加後の時間の関数としての共鳴位置の推移を示している。
【００２８】
図７：図１に示した理論的適合値から得たレセプタ濃度の関数としてのプロテオリピド膜の屈折率（パネルＡ）と厚さ（パネルＢ；３角印）を示す図である。パネルＡのデータはｐ−偏光（黒丸印）またはｓ−偏光（３角印）を用いて得た（曲線適合が不確実なため誤差バーを示すが、これは符号の範囲内にある）。また、パネルＢはレセプタ濃度の関数としての屈折率の異方性（Ａｎ；黒丸印）を示している。両方のパネルの実線は双曲線関数への非線形最小二乗適合値を示している。これらはレセプタの無限濃度に、また見掛けの結合定数Ｋｐ（図に示す）に対して外挿したｎ（図に示す）及びｔ（６．８ｎＭ）の限界値をもたらす。
【００２９】
図８：アゴニスト及びアンタゴニストの濃度の関数としてのオピオイド・レセプタ（バルク濃度１２．８ｎＭ）を含むプロテオリピド膜についての厚さ（黒丸印）及び屈折率異方性の値（３角印）の平均変化を示す図である。この結果は実験スペクトルに対する理論的適合値により、図４の実験から得た（図１及び７を参照）。挿入図はアゴニスト濃度の関数としてのプロテオリピド膜の平均屈折率の二乗を示している。実線は双曲線関数に対する非線形最小二乗適合値を示し、これら結合定数の値（Ｋｐ）を得た。説明を明解にするために（曲線適合誤差に対応する）誤差バーは黒丸印と３角印に関して主パネルの２つの曲線のうちの１つについてのみ示す。
【００３０】
図９：アンタゴニスト及びアゴニストの濃度の関数としての厚さ（黒丸印）及び屈折率等方性の値（３角印）の平均変化を示す図である。この結果は実験スペクトルに対する理論的適合値により図５の実験から得た。その他の詳細は図８と同じである。
【００３１】
図１０：アゴニストまたはアンタゴニストとのレセプタの相互作用中における脂質及びレセプタ分子の立体配座（屈折率異方性と膜厚の値により評価）及び質量分布（膜厚と平均屈折率により評価）の変化を示す概念図である。説明を明解にするために、膜透過らせんとレセプタの膜外ループを４例だけ示す。アンタゴニストを加えたあとアゴニストを加えた場合と、アゴニストを加えたあとアンタゴニストを加えた場合に起こる構造的変化を示す。詳細については本文を参照。
【００３２】
【好ましい実施例】
本発明は一般に膜結合Ｇ蛋白質共役レセプタのバイオフィジカル特性を特徴付ける方法に結合プラズモン波長共鳴技術を適用することに関する。本発明を例示するために事前調製脂質二重層にヒト・δ−オピオイド・レセプタを取込み、以下に述べるように処理した。しかしこの例示は本発明の方法をある特定のＧＰＣＲ（Ｇ蛋白質共役レセプタ）に限定することを意図するものではない。
【００３３】
［レセプタの精製］
ヒト・脳・δ−オピオイドレセプタ（受諾番号Ｕ０７８８２）（Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５４：ＰＬ４６３−ＰＬ４６９， １９９４）は内発性エンケファリンや各種の合成アゴニストに対する鎮痛反応を媒介する。
【００３４】
停止コドンを無力化することによって変成させたヒト・δ−オピオイド・レセプタのＤＮＡをｍｙｃ／Ｈｉｓタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｐｃＤＮＡ３ベクターに挿入し、ｍｙｃエピトープ（Ｇｉｍｐｌｅ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３７：７６８−７７７， １９９６）とＨｉｓタグ（Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ ａｎｄ Ｔｕｃｋｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ３１７：８９１−８９９， １９９６）によりＣ末端で標識した充分機能的なレセプタを調製した。
【００３５】
ＤＮＡ配列決定でベクター全体を確認し、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＣＨＯ細胞株へ安定的に感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させた。抗生物質としてＧ４１８を用いてトランスフェクト済みクローンを選択した。これらを３７℃の湿潤ＣＯ２雰囲気の条件下で、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含む１０％のウシ胎児血清を加えたＨａｍｍのＦ１２培地内で密集層となるまで増殖させた。変性レセプタの特徴付けを行う関連実験はすでに行われている（Ｏｋｕａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３８７：Ｒ１１−Ｒ１３， ２０００を参照）。
【００３６】
細胞を採取し、数回洗浄した後にｐＨ７．４のＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中に懸濁し、４２，０００ｒｐｍ（１６０，０００×ｇ）で３０分間（４℃）遠心分離した。緩衝液を移動し、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ，０．５ＭのＫＣｌ，３０ｍＭのオクチルグルコシド及び金属キレート化カラムで用いるように調製されたプロテアーゼ阻害物質（Ｓｉｇｍａ）を含む溶液（ｐＨ７．４で緩衝）中で均質化を行うことによって膜を可溶化した。均質化後、この溶液を４２，０００ｒｐｍで６０分間再度遠心分離し、細胞破片を除去した。
【００３７】
レセプタをＴＡＬＯＮ（商標）Ｃｏ＋２金属キレート化カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて４８時間１２℃で緩やかに振盪しながら精製し、ｐＨ７．４で緩衝した２５ｍＭのＨｅｐｅｓ，０．５ＭのＫＣｌ，３０ｍＭのオクチルグルコシド及び１００ｍＭのイミダゾルで溶出した。結合は２４時間以内に行うことができるが、ＴＡＬＯＮカラムへのレセプタの結合が最大限行われるように、今回の実験では４８時間行うことを可能にした。熱やこのシステム中に依然として存在するかもしれないプロテアーゼによるレセプタの変性の可能性を最小限にとどめるために、カラムとレセプタ−ホモジェネートを１２℃に維持した。精製サンプル中のレセプタ濃度は放射性リガンドを用いた結合評価で決定した（Ｏｋｕａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３８７：Ｒ１１−Ｒ１３， ２０００）。
【００３８】
今回の研究で用いたアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）はＶｉｃｔｏｒ Ｈｒｕｂｙ博士の研究室で合成したものであり（Ｍｏｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８０：５８７１−５８７４， １９８３）、またアンタゴニスト（ＮＴＩ）はＲＢＩ研究所から入手した。
【００３９】
［固体支持性脂質二重層の形成］
自由懸濁脂質二重層の形成に用いる方法に従って（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９４：９７９−９８０， １９６２）自己集合固体支持性脂質膜を調製した。この方法では水相から薄層誘電膜（ＳｉＯ２）を分離するテフロン（登録商標）シートの開口部を通して少量の脂質液を拡散させる（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４：２１３−２１９， １９９９； Ｓａｌａｍｏｎらに発行された米国特許５，５２１，７０２及び５，９９１，４８８も参照）。
【００４０】
水和ＳｉＯ２の親水面は脂質分子の極性基を引きつけ、これによって脂質分子の当初の配向が引き起こされ、炭化水素鎖は余剰脂質溶液の小滴の方を向く。緩衝液をＣＰＷＲ細胞のサンプル部分に加えることによって得られる二重層形成の次の段階では薄層化プロセスを行い、また膜をテフロン（登録商標）スペーサに固定する脂質溶液の平坦なギブズ境界が形成される。
【００４１】
今回の実験ではスクアレン／ブタノール／メタノール（０．０５：９．５：０．５，ｖ／ｖ）中に５ｍｇ／ｍＬの卵フォスファチジルコリン（ＰＣ）と１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［フォスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）（ナトリウム塩）］（ＰＯＰＧ）（７５：２５ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含む溶液から脂質膜を形成した。脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ）から購入した。すべての実験は２ｍＬのサンプル細胞中で０．５ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭのＫＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ７．３）を用いて周囲温度で行った。
【００４２】
［ＣＰＷＲ分光法］
ＣＰＷＲ測定とデータ分析の手順の詳細は別の論文で報告した（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７３： ２７９１−２７９７， １９９７； Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４： ２１３−２１９， １９９９； Ｓａｌａｍｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｌｉｎ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， Ｖｏｌ．３Ｊ．Ｃ．Ｌｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐｐ．２３１１−２３１９， １９９９； またＳａｌａｍｏｎらに発行された米国特許５，９９１，４８８も参照）。この方法は全内部反射条件下でガラスプリズムを通過するＣＷ（連続波）・Ｈｅ−Ｎｅレーザーからの偏光（λ＝６３２．８ｎＭ）によって、誘電層（ＳｉＯ２）で被覆したプリズムの外面に形成された金属薄膜（Ａｇ）中で集団電子振動（プラズモン）の共鳴励起に基づいて行われる。
【００４３】
プラズモンの共鳴励起によって、誘電膜の外面に限局されるエバネッセント（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ）電磁界が発生する。この電磁界をこの表面上に固定化された分子の光学特性を探索するのに用いることができる（詳細については次の文献を参照。Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７３， ２７９１−２７９７， １９９７； Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４： ２１３−２１９， １９９９； Ｓａｌａｍｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｌｉｎ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， Ｖｏｌ．３Ｊ．Ｃ．Ｌｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐｐ．２３１１−２３１９， １９９９； Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＲ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００）。
【００４４】
共鳴は固定入射角（α）で入射光波長（λ）を変化させるか、または固定λでαを変化させることによって得られる（今回の実験では後者のプロトコルを用いた）。共鳴結合では入射光エネルギーを代償として電磁波が発生するので、全反射光の強度は減少する。λまたはαの関数としての反射光強度がＣＰＷＲ共鳴スペクトルとなる。
【００４５】
共鳴は入射面に対して平行（ｐ）または垂直（ｓ）に偏光させた光で励起することができ、２つの明確に分かれたスペクトルが得られ（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７３： ２７９１−２７９７， １９９７）、これによって完全蛋白質を含む生体膜などの異方性システムの分子構造を特徴付けすることができる（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４： ２１３−２１９， １９９９とその中で引用した文献を参照）。この研究で用いた実験条件下ではｐ−偏光で得た光学パラメータは二重膜表面に対して垂直方向のものであり、ｓ−偏光で得た光学パラメータは平行方向のものである。
【００４６】
ＣＰＷＲスペクトルは３つのパラメータで表すことができる。すなわちα（またはλ），スペクトル幅及び共鳴深度である。これらはプラズモン発生媒体及び射出媒体の屈折率（ｎ），消衰係数（ｋ）及び厚さ（ｔ）によって定まる。射出媒体には水溶液と接触しているシリカ表面上に形成された薄膜（すなわち、今回の場合ではプロテオリピド膜）が含まれる。マクスウェル方程式にもとづく薄膜電磁理論によって、これらの媒体のスペクトルパラメータと光学特性の分析的関係が得られる。
【００４７】
これによって３つの媒体（すなわち、プラズモン発生媒体，プロテオリピド膜及び緩衝液）について理論的スペクトルを実験的スペクトルに非線形最小二乗法により適合させることによって、ｎ，ｋ及びｔを一意性の値として求めることができる（詳細については以下を参照。Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４： ２１３−２１９， １９９９； Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７８： １４００−１４１２， ２０００； Ｓａｌａｍｏｎ ａｎｄ Ｔｏｌｌｉｎ， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， Ｖｏｌ．３Ｊ．Ｃ．Ｌｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｐｐ．２２９４−２３０２， １９９９）。
【００４８】
今回の研究で用いた脂質，蛋白質及びリガンドの吸収バンドから励起波長（６３２．８ｎｍ）が充分離されているので、ｋ値が０以外であるときこれはプロテオリピド膜の欠陥による散乱のみによって反射光強度が低下したことを反映している。
【００４９】
重要な点を挙げると、今回の研究のプロテオリピド膜などの異方性薄膜では厚さ（ｔ）は膜面に対して垂直方向の平均分子長を表し、光の偏光とは無関係である。これに対して、屈折率（ｎ）の値は励起光の偏光に大きく依存する。さらに、光学軸がｐ−偏光方向と平行な単軸異方性構造ではｎｐ値はｎｓ値より常に大きい。これはある材料の測定屈折率が個々の分子の偏光性によって決定される結果である。
【００５０】
後者の特性は分子が外部電磁界と相互作用できることを示しており、また一般に分子構造に対して異方性である。分子形状が杆状（たとえば、今回の研究で用いたホスホリピド分子）である単純な場合では２つの異なる値を偏光性に割当てることができる。すなわち、大きい値を縦方向に、また小さい値を横方向に割当てることができる。
【００５１】
分子形状の異方性と偏光性に加えて、各分子の長軸が平行となるようにこれらの分子を含むシステムにすると、広範囲の配向は通常、秩序変数Ｓによって表される。この状況ではシステム全体で平均した偏光性の値と、分子の長軸の方向と平行に、または垂直に測定した偏光性の値は異なる（すなわち、平行な場合の値は垂直な場合の値より大きくなる）。これらの条件により、光学軸がプロテオリピド膜の面に対して垂直な光軸で光学的異方性システムが形成され、２つの偏光で測定した屈折率の値（すなわち、光軸に対して平行なｎｐと垂直なｎｓ）によって、この光学異方性（Ａｎ）は次のように表わされる。
【００５２】
2004507716.tif 000002
【００５３】
以上をまとめると、屈折率の異方性はこのシステム内の分子偏光性と異方性分子の広範囲配向の程度を反映しており、構成（すなわち分子の配向）を分析する手段として用いることができる。これはレセプタ分子を取込んだ単一の脂質二重層からなるプロテオリピド膜がリガンド結合によって構造変化を生じ、これを屈折率異方性の変化によってモニターする今回の研究に関しては特に重要である。
【００５４】
さらに、ローレンツ−ローレンス（Ｌｏｒｅｎｔｚ−Ｌｏｒｅｎｚ）の関係から明らかなように、屈折率の平均値は密度とも直接関連している（Ｂｏｒｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ， Ｐｅｒｍａｍｏｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９６５； Ｃｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５８： ２４２６−２４３１， １９８３）。このように、プロテオリピド膜の厚さと屈折率の平均値から、表面密度（または分子充填密度）すなわち単位表面積当たりの質量（または単位表面積当たりのモル数）を計算することができる。
【００５５】
今回の実験ではｐ−偏光とｓ−偏光を用いて緩衝液と接触している非被覆シリカ面から得られるＣＰＷＲスペクトルを測定し、これを理論的曲線と合わせることによってプラズモン発生装置を較正した。このような較正の目的はこれらの実験で用いるシリカ層の光学パラメータ（すなわち、屈折率，消衰係数及び厚さ）を得ることである。これによって、シリカ表面上に形成されたプロテオリピド膜で得られる共鳴スペクトルを分析するのに用いる入力データセットが得られる。
【００５６】
このようにして、シリカ層の親水性表面上に単一の脂質二重層を形成した後に得られた共鳴スペクトルをこれらのデータを用いて適合させ、脂質二重層の光学パラメータ（ｎｐ，ｎｓ及びｔ）を得た。これにより、二重層の屈折率異方性と表面密度（すなわち分子充填密度）を計算することができた。レセプタ分子を脂質膜に取込んだ後に、得られたＣＰＷＲスペクトルによってレセプタ取込みの構造的結果を特徴付けることができた。最後に、アゴニストまたはアンタゴニストをＣＰＷＲ細胞の水性サンプル部分へ追加した場合にもＣＰＷＲスペクトルは変化し、これはレセプタ・リガンド相互作用で生じたプロテオリピド膜の構造変化を反映していた。
【００５７】
［事前調製脂質二重層へのδ−オピオイド・レセプタの取込み］
レセプタ分子をシリカ膜の親水表面上に形成された事前調製脂質膜に取込んだ。手順として、ヒトδ−オピオイド・レセプタをオクチルグルコシド３０ｍＭ中で可溶化し、その少量の濃縮液アリコートをＣＰＷＲ細胞の水性部分に加え、界面活性剤を臨界ミセル濃度以下の最終濃度（２５ｍＭ）へと希釈した（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： １３７０６−１３７１１， １９９４； Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７１： ２８３−２９４， １９９６）。これによってミセルから脂質二重層へレセプタが自然に移動した。二重層中でのレセプタの全体的配向は明らかではない。しかし、以下に示すように、取込んだレセプタへのリガンドの結合は効率的に発生するので、少なくとも５０％のレセプタが緩衝液に面するリガンド結合部位と結合していると考えられる。
【００５８】
図１にサンプル細胞の水性部分に界面活性剤可溶化レセプタを２回加える前（曲線１）と加えた後（曲線２と３）で、ｐ−偏光励起光（パネルＡ）またはｓ−偏光励起光（パネルＢ）を用いて得た固体支持性脂質膜の典型的なＣＰＷＲスペクトルを示す。ロドプシンを含む他の完全膜蛋白質ですでに解るように（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３： １３７０６−１３７１１， １９９４； Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７１： ２８３−２９４， １９９６）二重層への蛋白質取込みは共鳴スペクトルの３つのパラメータ、すなわち角度位置，深度及びスペクトル半値幅すべてに影響を及ぼす。このような変化は（屈折率と厚さの変化に反映された）プロテオリピド膜の密度の変化及び構造変化両方によるものである。これらについてはさらに以下で検討する。
【００５９】
［取込まれたレセプタへのアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）とアンタゴニスト（ＮＴＩ）の結合］
ここではすでに取込済みのレセプタへＤＰＤＰＥとＮＴＩを加えて得た主要なスペクトルデータについて説明する。これから述べるように、これらのデータはレセプタ・アゴニスト相互作用とレセプタ・アンタゴニスト相互作用のパターンが異なることをはっきりと示しており、これによってアゴニスト結合とアンタゴニスト結合を区別する方法が得られる。
【００６０】
レセプタを事前調製二重層に取込んだあとにＤＰＤＰＥ溶液またはＮＴＩ溶液のアリコートをサンプル細胞に加えると、ＣＰＷＲ共鳴曲線の位置，幅及び深度に大きな変化が生じる。このスペクトル変化はこれらの分子のプロテオリピド膜への結合を反映している。レセプタの存在しない場合に、事前調製二重層を含むＣＰＷＲ細胞にこれらのリガンドを同量加えた対照実験ではＣＰＷＲスペクトルに対する測定可能な作用は生じなかった（データは示さず）。このことはこれらの実験では膜への非特異的結合が検出されないことを示している。したがって、レセプタが存在する場合に認められるスペクトル変化はレセプタ・リガンド相互作用を反映しているに違いない。
【００６１】
これらの変化を例示するために、ｐ−偏光励起光とｓ−偏光励起光で得た共鳴スペクトルの例を図２及び図３に示す。図２のパネルＡ及びパネルＢにはレセプタを含むＣＰＷＲ細胞にアゴニストを最初に加え、次にアンタゴニストを加えた実験の結果を示す。図３のパネルＡ及びパネルＢにはアンタゴニストを最初に加え、次にアゴニストを加えた実験の結果を示す。
【００６２】
明らかに共鳴スペクトルに対するこれら２つのリガンドの作用は容易に測定可能であり、また全く異なるものである。３つすべてのスペクトルパラメータ（すなわち、位置，幅及び深度）はどちらのリガンドでも大きく変化するが、共鳴のシフトの振幅と方向にはかなりの差が認められる。このように、ＤＰＤＰＥによる変化はｐ−偏光スペクトルでもｓ−偏光スペクトルでもＮＴＩで生じる変化よりはるかに大きい（図２のパネルＡ及びパネルＢと図３のパネルＡ及びパネルＢを比較のこと）。さらに、ＤＰＤＰＥでは両方の共鳴がより大きな入射角値へとシフトするが（図２のパネルＡ及びパネルＢと図３のパネルＣ及びパネルＤを参照）、ｐ−偏光信号での変化はきわめて小さい（図５を参照）。これに対して、ＮＴＩによってｐ−偏光共鳴はより大きな入射角へと移動し（図２のパネルＣと図３のパネルＡを参照）、ｓ−偏光共鳴はより小さな入射角へと移動する（図２のパネルＣ及びパネルＤと図３のパネルＡ及びパネルＢを参照）。
【００６３】
これらの相違をさらに例示するために、図４と図５に共鳴位置シフトを２つのリガンドの追加濃度の関数として表す。これらのデータもアゴニストの後にアンタゴニストを加えてもアゴニスト結合によって生じた変化が単純は逆行しないという事実を示している（図４を参照）。これに対して、アンタゴニストが結合した後にアゴニストを加えると、（図５のｓ−偏光成分で明らかに見られるように）レセプタ・アンタゴニスト相互作用によって生じた変化を逆行させることができる。
【００６４】
強調すべき点を挙げると、これらのスペクトル変化はリガンドの結合特性に関する文献データと同じ濃度範囲内で飽和する（ＤＰＤＰＥについては０〜４０ｎＭ、図４を参照。ＮＴＩについては０〜０．１ｎＭ、図５を参照）（以下の考察を参照）。したがって、このような高い親和性が非特異的レセプタ・リガンド相互作用によるものとはきわめて考えにくい。さらに、図４と図５に示す結果を見ても、どちらのリガンドを最初に加えるかとは関係なくシフトの方向は同じであるが、共鳴シフトが発生する濃度範囲はリガンド追加の順序によることは明らかである（図４と図５を比較のこと）。このように、アゴニストを最初に加える実験ではその逆の場合よりアンタゴニスト濃度範囲が極めて高い。同じ所見はアンタゴニストを最初に加えた場合のアゴニスト濃度範囲にも当てはまる。
【００６５】
リガンド追加後のＣＰＷＲスペクトルの予備的時間分解型測定では、どちらのリガンドがレセプタと相互作用しているかに応じて反応速度特性が全く異なることを示す。図６にｓ−偏光を用いてＤＰＤＰＥで得たこのような時間依存性スペクトルシーケンスの例を示す。レセプタ・アゴニスト相互作用とレセプタ・アンタゴニスト相互作用を区別するスペクトル変化には２つの重要な特徴がある。
【００６６】
第１に、アゴニストを加えた場合のスペクトルの経時変化は（分単位の）きわめてゆっくりとしたものであるが、アンタゴニストを加えると今回の実験の分解時間（約１０秒）より速いスペクトル変化が生じる。
【００６７】
第２に、アゴニストで観察されたスペクトル変化の反応速度特性はきわめて複雑であり、多相プロセス全体で負のシフトの後に正のシフトを伴う（これについては我々は充分な特徴付けを行っていない）。このような結果はレセプタ・リガンド相互作用が複雑なプロセスであることを示している。重要な点として、同様の複雑なパターンのスペクトル変化がｐ−偏光成分でも観察される（データは示さず）。
【００６８】
これらのリガンドの分子量がきわめて類似しているので（ＤＰＤＰＥは６４８、ＮＴＩは４１４）上に述べたアゴニスト結合特性とアンタゴニスト結合特性の差はリガンドの吸着された質量やレセプタへの拡散率の差では簡単に説明できない。さらに、別の高度選択性δ−オピオイド・アゴニストであるデルトルフィン（ｄｅｌｔｏｒｐｈｉｎ）ＩＩ（Ｔｒｙ−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）を用いた予備的実験では（データは示さず）ＤＰＤＰＥと同様の反応速度パターンが観察された。
【００６９】
また重要な点として、δ−オピオイド・レセプタを用いた今回のデータは最近の研究（Ｇｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ． １６： ６７３７−６７４７， １９９７）、すなわち蛍光分光法を用いてレセプタ・リガンド相互作用と関連した構造変化を調べたβ２アドレナリン作用性レセプタに関する研究と驚くほど類似している。この実験によると、蛍光物質の経時変化からレセプタ・アゴニスト相互作用の反応速度が今回の研究で観察されたものときわめて類似していることが明らかに観察された（図６の挿入図）。すなわち、レセプタ・アゴニスト相互作用では（分単位の）ゆっくりとした多相反応速度が認められたが、レセプタ・アンタゴニスト相互作用ははるかに速く単純であった。
【００７０】
レセプタ・アゴニスト相互作用プロセスの複雑さを充分に理解するには時間分解研究をさらに行う必要があることが明らかであるが、δ−オピオイド・レセプタとアゴニストまたはアンタゴニストとの相互作用によってプロテオリピド膜の異なる構造状態が発生し、その特性はリガンドの追加の順序によって定まるとの結論を今回のデータから導き出すことができる。このような状態を定量的に説明するために、すべての３つのスペクトルパラメータ（すなわち、共鳴位置，深度及び幅）の変化を考慮に入れてスペクトル変化をより詳細に分析する必要がある。このような分析によってこのシステムの光学パラメータが得られ（次の節を参照）、これをレセプタ・リガンド結合プロセスの定量的特徴付けに用いることができる。
【００７１】
［レセプタ含有脂質膜の特徴付け］
レセプタ取込み中に得たプラズモン共鳴スペクトルの定量的分析は理論的曲線を実験スペクトルに適合させて行うことができる（図１を参照）。図７にこのような手順で得た光学パラメータを加えたレセプタの関数として示す（ｎ［パネルＡ］；ｔ及びＡｎ［パネルＢ］；パラメータの定義については「方法」の項を参照）。実線は各データポイントに適合させた単一の双曲線である。これらの結果は次の各内容を示している。
【００７２】
すなわち、
１）レセプタ取込みのプロセスは単純なラングミュアの等温式によって充分に適合できる。
２）見かけ上の挿入定数は低い値であるが（約１４ｎＭ）、これは取込み効率がきわめて高いことを裏付けている。
３）外挿して得た厚さの値（６．８ｎＭ）は膜面に対して垂直な取込み蛋白質分子の大きさを示している（すなわち、外側ループと膜の両面上の結合水との距離）。
【００７３】
無限レセプタ濃度へと屈折率曲線を外挿すると（図７Ａ）、稠密な単層レセプタ分子を特徴付ける値（ｎｐｗとｎｓｗ）が得られる。これから、（上記の式［２］を用いて）屈折率の平均値と密度や表面濃度を計算することができる（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２４： ２１３−２１９， １９９９）。後者の値とレセプタの分子量から（Ｍｒ＝６０ｋＤを用いて）、１個のレセプタ分子が占める表面積をＳｒｅｃ＝１２００±１００Å２と求めることができる。
【００７４】
重要な点を挙げると、このオピオイド・レセプタについての値はいくつかの技法を用いて得たロドプシンについて報告されている値ときわめてよく一致している。すなわちＳＰＲ法では１２６０Å２であり（Ｓａｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７１： ２８３−２９４， １９９６）、極低温電子顕微鏡検査法では約１０００Å２（Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ６８： １７７６−１７８６， １９９５）、またＸ線散乱によるロドプシン−ラングミュアブロジェット膜法では約１１００Å２であった（Ｍａｘｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ６９： １４４０−１４４６， １９９５）；
【００７５】
４）レセプタ取込みのプロセス中にプロテオリピド膜異方性が増大しているが（図７のＢ）、このことはレセプタ・脂質相互作用によって膜の平均広範囲分子秩序がこれに対応して増大したことを明らかに反映している。
【００７６】
［レセプタ−リガンド相互作用の特徴付け］
一般に光学的に異方性のプロテオリピド薄膜でＣＰＷＲスペクトルが変化するのは（すなわち、位置，深度及び幅の変化）このシステム内で密度（分子充填密度）の変化と構造変化が生じた結果である。密度変化は屈折率変化の平均値に直接反映されるが（式［２］を参照）、構造変化は膜内の分子の配向秩序の変化による屈折率異方性に影響する。後者の量はｐ−偏光とｓ−偏光を用いて得た屈折率値の変化によって測定することができる（式［１］を参照、また以下の考察を参照）。これら２種類の変化を区別することはレセプタの場合に特に重要であり、この場合にはレセプタ・リガンド相互作用によって構造変化が生じると考えられる。
【００７７】
この区別は本発明によれば理論的共鳴曲線を実験的ＣＰＷＲスペクトルに適合させることによって行うことができる。（前項で説明した）レセプタ含有プロテオリピド膜について得た構造パラメータを用いて、理論的共鳴スペクトルをアゴニスト・アンタゴニスト実験とアンタゴニスト・アゴニスト実験の両方で得た実験曲線に適合させる（図２〜５を参照）。屈折率異方性Ａｎの変化として表した結果と、加えたリガンドの関数として表したプロテオリピド膜の厚さをそれぞれ図８と図９に示す。
【００７８】
上に述べたように、２つのリガンドの結合はプロテオリピド膜システムを異なるスペクトル特性を特徴とする異なる状態にする（図２〜６を参照）。図８と図９の結果にもとづき、（アンタゴニスト結合の前または後に）アゴニストが結合することによってレセプタ分子に立体配座の変化が生じ、結果としてプロテオリピドシステムの異方性と密度が実質的に増大する結果となる。密度の増大はｎｓｖ（図８の挿入図を参照）とｔの値の増加によって示される（別のδ−オピオイドレセプタ・アゴニストであるデルトルフィンＩＩを用いた予備的実験ではレセプタへの結合時に密度Ａｎとｔがきわめて類似した変化を示した）（データは示さず）。
【００７９】
対照的に、アンタゴニストがレセプタに結合するとこのシステムは異方性変化のみを引き起こす（すなわち、ｎｓｖ値やｔ値では測定可能な変化は認められない）。これらの結論は図２〜図５に示したデータと一致しており、特に図４の共鳴位置のシフトによって充分示される。図４ではアゴニストは単方向共鳴位置シフトを引き起こすが（すなわち、ｐ成分とｓ成分が同じ方向にシフトする）、アンタゴニストは双方向共鳴位置シフトを引き起こす。アゴニストの場合には両方のスペクトル成分が単方向へシフトするが、これは密度の増大の結果として生じるｎｐ値とｎｓ値が共に増加する明らかな証拠である（すなわち、平均屈折率値の増大。式［２］を参照）。
【００８０】
対照的に、アゴニストを加える前（図５）や後（図４）にアンタゴニストを加えても密度は変化しない。後者の場合、すべてのスペクトル変化は構造変化に関連している。両方のリガンドの分子量が同等であるため、これらの結果はアゴニストとの相互作用時にレセプタの構造変化によって生じる二重層への脂質質量添加の結果に違いない（さらに詳しい考察については以下を参照）。
【００８１】
さらに重要な点を挙げると、アンタゴニストによって引き起こされるレセプタの立体配座状態の屈折率異方性はアゴニストによって引き起こされたものよりはるかに大きい。このことは２つの実験で明らかである（図８と図９を参照）。このように、アンタゴニストの前にアゴニストを加えた場合、アンタゴニストのリガンドの異方性はアゴニストによって生じる場合のほぼ２倍の値まで増大する。これに対して、アンタゴニストの後にアゴニストを加えると、Ａｎの値はアゴニストのみによって生じる増大と同等のレベルまで低下する。
【００８２】
一般に、屈折率異方性の変化は正常な二重層に対する分子配列の変化によって生じる。本発明ではこれはリガンド結合に伴うレセプタ分子の立体配座変化、すなわち傾斜運動と回転運動、ならびに膜外ループで起こる運動に関連のある膜透過らせん構造の位置と配向の変化の結果に違いない。これらの蛋白質構造変化によって引き起こされる脂質分子のアシル鎖配列の変化も要因かもしれない。
【００８３】
以上をまとめると、アンタゴニストが結合した時に密度や膜の厚さに測定可能な変化が認められないことはこのような結合によって引き起こされる立体配座変化とアゴニストによって引き起こされる立体配座変化との間に重大な差があることを意味する。この区別はアゴニストの前にアンタゴニストを加えることで生じるプロテオリピド膜の状態が、アゴニストを加えた後にアンタゴニストを加えた時に生じる状態とは異なっているという事実にも反映されている。このような差が生じるのはアゴニストでは膜の面に対して垂直方向の構造変化を生じさせ、その厚さを変化させることができるが、アンタゴニストではこのような変化が生じないためである。
【００８４】
このように、アンタゴニストはリガンド結合していないレセプタと相互作用しているか、またはアゴニストが結合して正常な膜に比べて大きさが変化しているレセプタと相互作用しているかどうかに応じて２つの副次的状態を生じる。この２つの副次的状態の特徴は光学的異方性は同程度であるが、寸法と密度は異なるということである。ＮＴＩは部分的なアゴニスト生物学的活性を持たないと報告されている純粋なデルタレセプタ・アンタゴニストであるので（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ９１： １２０１８−１２０２１， １９９４）、この両方の副次的状態が信号伝達では不活性であると結論付けるのが妥当である。
【００８５】
この短期間存在する状態は結果的に負の内因性活性へと導くレセプタ状態を表していると見なすことができるが（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１： ２９０−２９７， １９９２）、この状態が充分長く存在するとすれば２つの副次的状態はレセプタにアクセスすることができる非平衡定常状態を表している可能性が高く（Ｋｅｎａｋｉｎ， Ｄｒｕｇｓ ４０：６６６−６８７， １９９０）、これらの１つはＮＴＩがデルタオピオイドレセプタと相互作用する時に一時的にしか認められない。こうした状態をさらに詳しく検討するために脂質成分と蛋白質成分の構造変化をアゴニスト結合とアンタゴニスト結合の両方について別々に決定し、またアゴニストとアンタゴニストの比率を広範囲に変えながら決定しなければならない。これは発色団標識脂質を用いて行うことができ、またこのような実験を現在実施中である。
【００８６】
各リガンド解離定数の熱力学値は図８と図９に示された異方性変化に双曲線を適合させると容易に求めることができる。結果を表１に示す。これらの解離定数がアンタゴニストを加えた時のアゴニストの有無や、逆にアゴニストを加えた時のアンタゴニストの有無に大きく依存することは明白である。このように、他方のリガンドが存在するとＫＤは高い値へとかなりシフトする。この所見はアンタゴニストの結合親和性がアゴニストよりはるかに高い（２〜３桁）このシステムでは特に顕著である。しかし、ＤＰＤＰＥの後にＮＴＩを加えても解離定数は大幅に増加する（約４倍）。この所見はこの２つのリガンド間の競合だけでは説明がつかない。この所見は他方のリガンド結合定数が異なることを特徴とする別の立体配座状態がこれらのリガンドによって引き起こされることを示唆している。
【００８７】
ＤＰＤＰＥ及びＮＴＩについてここで決定した結合定数は各種δ−オピオイドレセプタ膜調製物と各種放射標識競合リガンドを用いた文献中で報告されているものと類似している。ＤＰＤＰＥについて文献中で報告されている典型的な値を挙げると、複数のラット脳膜調製物中では３．３〜５．２ｎＭ（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８２： ２５４３−２５４７， １９８５）、ＮＧ−１０８−１５細胞株にクローニングされたレセプタでは１．２ｎＭ（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８２： ２５４３−２５４７， １９８５）、またＣＨＯ細胞株にクローニングされたレセプタでは８５ｎＭ（未公表データ）がある。
【００８８】
このように、本書で報告した１０〜４０ｎＭというＫＤ値は充分に機能的なレセプタについて考えられる値と一致している。同様に、ＮＴＩについてすでに報告されているＫＤ値は（ＮＧ−１０８−１５細胞株にクローニングされたレセプタでは０．９ｎＭ，マウス脳膜調製物では０．１３ｎＭ，マウス脊髄調製物では０．１５ｎＭ）（Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１： １２０１８−１２０２１， １９９４）、本書で報告した０．０２〜０．１０ｎＭという値と一致している。
【００８９】
［レセプタ機能の構造的基礎］
この明細書に示したＣＰＷＲ結果はレセプタ・アゴニスト相互作用及びレセプタ・アンタゴニスト相互作用の結果としてプロテオリピド膜のいくつかの立体配座状態の形成を示している。アゴニスト結合の場合にはゆっくりとした多相反応速度が見られるが、これはＧｅｔｈｅｒとＫｏｂｉｌｋａが報告しているように（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５８： ２４２６−２４３１， １９９８）多くの中間立体配座状態が最終活性化状態の形成に関与していることを明確に示している。現段階ではこの最終状態に立体配座の形の異なるレセプタの平衡混合物が含まれるか、またはある特定のレセプタ構造の優先的な形成が含まれるかは明らかではない（Ｋｅｎａｋｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ． １６： ２３２−２３８， １９９５）。
【００９０】
いずれにせよ、今回の方法によってレセプタ・アゴニスト立体配座によってレセプタ分子が伸張し（ｔの増大）、また膜内の分子の配向秩序の程度が全体的に増大すること（屈折率異方性Ａｎの増大）を示している。このプロセスはレセプタ伸張に応じて膜の脂質相の変化も伴うので、比較的ゆっくりであると考えるのが妥当である。ロドプシン（Ｆａｒｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ７６８−７７０， １９９６），バクテリオロドプシン（Ｌｕｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６： ２５５−２６０， １９９９）及びβ−アドレナリン作用性レセプタ（Ｇｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｋｏｂｉｌｋａ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３： １７９７９−１７９８２， １９９８）の研究から引き出した活性化時のオピオイド・レセプタの構造変化に関するモデル（Ｐｏｇｏｚｅｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ． ７５： ６１２−６３４， １９９８； Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： ５１６−５２５， １９９５； ＧｅｔｈｅｒとＫｏｂｉｌｋａ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３： １７９７９−１７９８２， １９９８）にもとづいて我々は伸張プロセスが１つまたはそれ以上の透過膜らせん構造の傾斜及び回転を含み結果として膜外ループの垂直方向の移動となり、またこの伸張プロセスに脂質分子の動きが伴い、これが脂質表面の正方向の湾曲を増大させると考えている。
【００９１】
湾曲が増大するには脂質分子が安定なギブズ境界から二重層の相へと移動することも必要である（これによってプロテオリピド膜の全体的な表面密度が増大する）。異方性変化の主な原因は膜透過らせん構造の配向変化とすることができる。この変化は脂質分子の炭化水素鎖の配列に影響を及ぼし、細胞外ループや脂質質量再分配からはほとんど影響を受けない。これに対して、アンタゴニスト結合では屈折率異方性が増大するだけであり、このことはレセプタ分子内で発生する局部的変化が膜透過らせん構造と脂質炭化水素鎖配向に限定されることを意味している。
【００９２】
図１０の概略モデルはこれらの観察にもとづきδ−オピオイド・レセプタがアゴニストまたはアンタゴニストと相互作用した際の構造的結果を可視化しようと試みたものである。競合アンタゴニストはアゴニストと同じレセプタ内の結合部位を占めるが、プロテオリピド膜を通過する信号は変換しないというよく知られた事実をこのような多重状態モデルから簡単に説明することができる。
【００９３】
レセプタ・リガンド相互作用の分子メカニズムをさらに詳しく理解するには、異なるクラスのリガンドによってレセプタ内で引き起される構造変化に関するより詳細な情報が必要である。特に、リガンド結合後の中間的状態と関連した立体配座変化の機序を特徴付けるには、時間分解補正研究がさらに必要である。また脂質膜構造，塩濃度，ｐＨ，アロステリックエフェクタなどの他のリガンド及びその他の蛋白質（たとえば、Ｇ蛋白質，キナーゼなど）のレセプタがリガンド結合状態の形成に及ぼす作用について知識を高めることも重要である。
【００９４】
今回の方法はＣＰＷＲ分光法が、ＧＰＣＲやその他の膜−結合レセプタ，酵素及びイオンチャネルに関する調査研究のための新規で強力な実験手段となることを示した。さらに本書で述べた方法は完全用量反応結合評価やレセプタの構造変化の評価に必要なレセプタとリガンドの量がごくわずかですむという点を考え、高度スループットスクリーニングに充分に適用できるはずである。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
当業者には理解されるように、上に述べた好ましい実施例の代わりとなる同じような機能的に同等のものがいくつも存在する可能性がある。したがって、当業者には明らかなように、これまで述べてきた詳細と材料を変更することはこの明細書に例示し、また添付の請求項で限定した本発明の原理及び範囲内に含まれる。
【００９７】
以上、本発明の方法は最も実際的で好ましい実施例と考えら得るものについて示し説明してきたが、本発明の範囲内であればこの実施例から逸脱することができる。このような本発明の範囲はこの明細書に開示されている詳細に限定されるべきではなく、すべての同等の製品を包含するよう請求項の全範囲に含まれるものと見なすべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
オクチルグルコシドを含む緩衝液のヒト・δ−オピオイド・レセプタのアリコートをＣＰＷＲ細胞の水性部分に加える前（曲線１）と後における７５ｍｏｌ％卵ホスファチジルコリン及び２５ｍｏｌ％ホスファチジルグリセロールを含む支持脂質二重層について得られたＣＰＷＲスペクトル図。
【図２】
アゴニスト（ＤＰＤＰＥ）を水性部分に加えたあとアンタゴニスト（ＮＴＩ）を加えた実験で得たＣＰＷＲスペクトル図。
【図３】
アンタゴニストを加えたあとアゴニストを加えた実験で得たＣＰＷＲスペクトル図。
【図４】
ｐ−偏光（黒丸印）またはｓ−偏光（３角印）を用いて得た細胞のサンプル部分中のアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）及びアンタゴニスト（ＮＴＩ）の濃度とＣＰＷＲ共鳴最小値の相対的位置との関係（依存度）を示す図。
【図５】
ｐ−偏光（黒丸印）またはｓ−偏光（３角印）を用いて得た細胞のサンプル部分中のアゴニスト（ＤＰＤＰＥ）及びアンタゴニスト（ＮＴＩ）の濃度とＣＰＷＲ共鳴最小値の相対的位置の依存度を示す図。
【図６】
図１（曲線１）に示したレセプタ（最終バルク濃度１２．８ｎＭ）を含む脂質膜を用いて、ｓ−偏光で得たＣＰＷＲ時間補正スペクトル図。
【図７】
図１に示した理論的適合値から得たレセプタ濃度の関数としてのプロテオリピド膜の屈折率（パネルＡ）と厚さ（パネルＢ；　３角印）を示す図。
【図８】
アゴニスト及びアンタゴニストの濃度の関数としてのオピオイド・レセプタ（バルク濃度１２．８ｎＭ）を含むプロテオリピド膜についての厚さ（黒丸印）及び屈折率異方性の値（３角印）の平均変化を示す図。
【図９】
アンタゴニスト及びアゴニストの濃度の関数としての、厚さ（黒丸印）及び屈折率等方性の値（３角印）の平均変化を示す図。
【図１０】
アゴニストまたはアンタゴニストとのレセプタの相互作用中における脂質及びレセプタ分子の立体配座（屈折率異方性と膜厚の値により評価）及び質量分布（膜厚と平均屈折率により評価）の変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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