(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制遺伝子のファミリー（アポトーシス刺激タンパク質、ＡＳＰ）の新しいメンバーの同定に関し、このファミリーは、ｐ５３の活性を調節し得るポリペプチドおよび前記腫瘍抑制ポリペプチドの活性を調節し得るポリペプチドをコードする。本発明の第１の局面に従って、以下を含むポリペプチドまたはこれらの部分が提供される：ｉ）少なくとも１つのアンキリンリピート；ｉｉ）αヘリックスドメイン；ｉｉｉ）ＳＨ３ドメイン；そしてこれらのポリペプチドは、ｐ５３の少なくともアポトーシス機能を刺激し得ることで特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された組織サンプル中のポリペプチドの存在を検出するためのアッセイであって、該ポリペプチドは、ｐ５３アポトーシス活性のインヒビターであり、ここで、該ポリペプチドが、以下：
ｉ）配列番号３によって示される配列からなるＤＮＡ分子；
ｉｉ）配列番号３にハイブリダイズし、そしてｐ５３アポトーシス活性のインヒビターをコードするＤＮＡ分子；ならびに
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ分子、
からなる群より選択される核酸分子によってコードされ、
ここで、該アッセイが、試験される組織サンプルを提供する工程；薬剤による該ペプチドの検出に適した条件を提供する工程；および該薬剤によって該ポリペプチドの存在を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記組織サンプルが胸部組織である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記薬剤が抗体である、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記アッセイが免疫アッセイである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
単離された胸部組織サンプル中の核酸分子の存在を検出するためのアッセイであって、該核酸は、ｐ５３アポトーシス活性のインヒビターをコードし、ここで、該分子が、以下：
ｉ）配列番号３によって示される配列からなる核酸分子；
ｉｉ）配列番号３にハイブリダイズし、そしてｐ５３アポトーシス活性のインヒビターをコードする核酸分子；ならびに
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）に定義される配列に対する遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ分子、
からなる群より選択され、
ここで、該アッセイが、試験される組織サンプルを提供する工程；薬剤による該核酸分子の検出に適した条件を提供する工程；および該薬剤によって該核酸分子の存在を検出する工程、を包含する、アッセイ。
【請求項６】
前記薬剤が、前記核酸配列にハイブリダイズし得る核酸分子である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記核酸が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記アッセイがポリメラーゼ連鎖反応アッセイである、請求項６または７に記載のアッセイ。
【請求項９】
アポトーシスの誘導による癌の処置のための医薬の製造のための、配列番号４に示されるようなポリペプチドに結合し得る、抗体の使用。
【請求項１０】
前記癌が乳癌である、請求項９に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
アポトーシスの誘導による癌の処置のための医薬の製造における使用のための、アンチセンス核酸分子の使用であって、以下：
ｉ）配列番号３に示される配列からなる核酸分子；
ｉｉ）配列番号３にハイブリダイズする配列からなる核酸分子；ならびに
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列からなる核酸分子、
からなる群より選択されるセンス配列のアンチセンス配列を含む、アンチセンス核酸分子の使用。
【請求項１２】
細胞増殖阻害活性を有する薬剤の同定のためのスクリーニング方法であって、該方法は、以下：
ｉ）ａ）配列番号３によって示される配列からなるＤＮＡ分子；
ｂ）配列番号３にハイブリダイズし、そしてｐ５３アポトーシス活性のインヒビターをコードするＤＮＡ分子；ならびに
ｃ）ａ）およびｂ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ分子、からなる群より選択される核酸分子によりコードされるポリペプチドを提供する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの候補薬剤を提供する工程；
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを形成する調製物を提供する工程；
ｉｖ）該薬剤の細胞増殖阻害活性を検出または測定する工程；ならびに必要に応じて
ｖ）選択された細胞型の増殖および／または細胞分裂に対する該薬剤の効果を試験する工程、
を包含する、スクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号３に示される核酸配列によってコードされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが細胞によって発現される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが過剰発現される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、前記ポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換／トランスフェクトされる、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
組み合わせ薬学的調製物であって、以下：
ｉ）配列番号３に示される配列からなる核酸分子；
ｉｉ）配列番号３にハイブリダイズする配列からなる核酸分子；および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列からなる核酸分子、
からなる群より選択されるセンス配列の少なくとも１つのアンチセンス核酸分子、ならびに化学療法剤を含む、組み合わせ薬学的調製物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の調製物であって、ここで、前記化学療法剤が、以下：シスプラチン；カルボプラチン；シクロホスファミド；メルファラン；カルムスチン；メトトレキセート；５−フルオロウラシル；シタラビン；メルカプトプリン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エピルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ダクチノマイシン；マイトマイシンＣ；タキソール；Ｌ−アスパラギナーゼ；Ｇ−ＣＳＦ；カリーチアミシンまたはエスペラミシンのようなエネジイン；クロラムブシル；ＡＲＡ−Ｃ；ビンデシン；ブレオマイシン；またはエトポシドからなる群より選択される抗癌剤である、調製物。
【請求項２０】
前記薬剤がシスプラチンである、請求項１９に記載の調製物。
【請求項２１】
組み合わせ薬学的調製物であって、以下：
ｉ）配列番号３に示される配列からなる核酸分子；
ｉｉ）配列番号３にハイブリダイズする配列からなる核酸分子；および
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重している配列からなる核酸分子、
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドに結合し得る抗体、ならびに化学療法剤を含む、組み合わせ薬学的調製物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の調製物であって、ここで、前記化学療法剤が、以下：シスプラチン；カルボプラチン；シクロホスファミド；メルファラン；カルムスチン；メトトレキセート；５−フルオロウラシル；シタラビン；メルカプトプリン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エピルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ダクチノマイシン；マイトマイシンＣ；タキソール；Ｌ−アスパラギナーゼ；Ｇ−ＣＳＦ；カリーチアミシンまたはエスペラミシンのようなエネジイン；クロラムブシル；ＡＲＡ−Ｃ；ビンデシン；ブレオマイシン；またはエトポシドからなる群より選択される、調製物。
【請求項２３】
前記化学療法剤がシスプラチンである、請求項２２に記載の調製物。
【請求項２４】
ｐ５３のトランス活性化活性を刺激する単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、以下：
ｉ）配列番号１または２に示されるＤＮＡ配列；
ｉｉ）（ｉ）に示される配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列；ならびに
ｉｉｉ）核酸配列によってコードされる該ポリペプチドのｐ５３トランス活性化活性が該ポリペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸１３０〜１１３５からなるポリペプチドのトランス活性化活性よりも大きいという点で特徴付けられる、ｉ）およびｉｉ）に定義されるＤＮＡ配列に対する遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ配列、
からなる群より選択されるＤＮＡ配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ｐ５３トランス活性化活性が約２倍である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ｐ５３トランス活性化活性が約７倍である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記トランス活性化活性が、ｐ５３応答性プロモーターに関する、請求項２４〜２６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記アポトーシス促進性プロモーターが、Ｂａｘアポトーシス促進性プロモーターまたはＰＩＧ−３アポトーシス促進性プロモーターに由来する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸または請求項３０に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした、細胞。
【請求項３２】
抗体またはその結合部分であって、ここで、該抗体が、請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドの一部に結合し、ここで、該一部が、該ポリペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸１３０〜１１３５ではない、抗体またはその結合部分。
【請求項３３】
医薬品としての使用のための、請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３４】
医薬品としての使用のための、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３５】
ポリペプチドのアポトーシス促進活性を調節し得る薬剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下；
ｉ）請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
ｉｉ）試験される少なくとも１つの薬剤に該細胞を曝露する工程；および
ｉｉｉ）該ポリペプチドの活性に対する該薬剤の効果をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
ポリペプチドのアポトーシス促進活性を調節し得る薬剤をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下；
ｉ）請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドを提供する工程；
ｉｉ）試験される少なくとも１つの薬剤に該ポリペプチドを曝露する工程；および
ｉｉｉ）該ポリペプチドによる該薬剤の結合をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の方法によって同定される、薬剤。
【請求項３８】
請求項２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドの存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下：
ｉ）試験されるサンプルを提供する工程；
ｉｉ）薬剤による該ペプチドの検出に適した条件を提供する工程；および
ｉｉｉ）該薬剤によって該ポリペプチドの存在を検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項３９】
請求項２９に記載の核酸の存在を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、以下：
ｉ）試験されるサンプルを提供する工程；
ｉｉ）薬剤による該核酸の検出に適した条件を提供する工程；および
ｉｉｉ）該薬剤によって該核酸の存在を検出する工程、
を包含する、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制遺伝子ファミリーのメンバー（アポトーシス刺激タンパク質（ＡＳＰ））に関し、これらメンバーは、ｐ５３の活性を改変し得るポリペプチドをコードし、またこのＡＳＰポリペプチドの活性を改変し得るポリペプチドをもコードする。
【０００２】
腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖または分化を阻害するのに機能するタンパク質をコードし、それ故、正常細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および分化を維持することに関し重要である。腫瘍抑制遺伝子中の変異は、異常な細胞周期の進行を生じ、そのことによって、例えば、ＤＮＡが損傷を受けた場合に細胞周期を静止する正常な細胞周期チェックポイントは、無視され、そして損傷を受けた細胞は、制御不能に分化する。腫瘍抑制遺伝子産物は、細胞全ての部分（例えば、細胞表面、細胞質、核）において、細胞周期（すなわち、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍおよび細胞質分裂）を介した細胞損傷の継代を防ぐように機能する。
【０００３】
多くの腫瘍抑制遺伝子が単離され配列決定されている。これらとしては、単なる例として挙げると、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）（これの変異は、癌（例えば、骨癌（骨癌腫）、膀胱癌、小細胞肺癌、および乳癌ならびに網膜芽細胞腫）に関連する）およびウィルムス腫瘍−１遺伝子（ＷＴ−１）（これの変異は、腎芽細胞腫および神経線維腫に関連する）が挙げられる。
【０００４】
腫瘍抑制遺伝子ファミリー（ＭＡＤ（Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｐｐ）（デカペンタペルジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｅｌｇｉｃ）遺伝子）およびＭＡＤＲ（ＭＡＤ関連遺伝子））は、多くの種において同定されている。これらの遺伝子は、セリン／スレオニンレセプターシグナル伝達に必要なシグナル伝達経路に関するタンパク質をコードする。ＭＡＤＲ１は、ｄｐｐ経路のシグナル伝達に必須である。ＭＡＤＲ２は、別のＭＡＤＲであり、この遺伝子における変異は、結腸直腸癌に関連する（散在性の結腸直腸癌の６％）。ＭＡＤＲ２遺伝子の配列はまた、Ｓｍａｄ２として公知であり、ＷＯ９８／０７８４９において開示される。
【０００５】
恐らく、最も熱心に研究されてきた対象である腫瘍抑制遺伝子は、ｐ５３である。ｐ５３は、転写因子とて機能するタンパク質をコードし、細胞分化周期の重要な制御因子である。これは、１９７８年（ＬａｎｅおよびＣｒａｗｆｏｒｄ、１９７９）にＳＶ４０ラージＴ抗原に、親和性を持って結合することを示すタンパク質として発見された。ｐ５３遺伝子は、分子量５３ｋＤａである３９３アミノ酸ポリペプチドをコードする。
【０００６】
ｐ５３の転写活性により制御される遺伝子は、その５’領域にｐ５３認識配列を含む。これらの遺伝子は、細胞でのｐ５３のレベルが、例えばＤＮＡ損傷に起因して上昇する場合に、活性化される。ｐ５３に応答する遺伝子の例としては、ｍｄｍ２（Ｍｏｍａｎｄら、１９９２）、Ｂａｘ（ＭｉｙａｓｈｉｔａおよびＲｅｅｄ、１９９５）およびＰＩＧ−３（Ｐｏｌｙａｋら、１９９７）が挙げられる。ＢａｘおよびＰＩＧ−３は、ｐ５３の最も重要な機能の１つである、アポトーシス誘導に関する。アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、損傷した細胞を取り除く自然のプロセスである。これは、細胞での多くのプロセス（前癌性細胞の除去、細胞／組織の発生および恒常性が挙げられる）に重要である。
【０００７】
上記のように、ｐ５３の最も重要な腫瘍抑制機能の１つは、そのアポトーシスを誘導する能力である。いくつかのプロアポトーシス遺伝子（例えば、Ｂａｘ）の発現を上方制御する能力は、どの様にｐ５３がアポトーシスを誘導するのかのおよその証拠を提供した。しかし、ｐ５３（−／−）およびｐ５３（＋／＋）のトランスジェニックマウスおよび野生型におけるＢａｘ発現の比較により、限定された数の組織においてのみ、Ｂａｘの発現が、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３により制御されたことが明らかである。従って、なぜｐ５３の発現がＢａｘの発現を、細胞型特異的な様式においてのみ誘導し得たのかについては不明のままである。最近、ｐ５３の変異がプロモーター特異性を変え得ることが示された。２つの腫瘍由来の変異ｐ５３遺伝子は、Ｂａｘプロモーターのトランス活性化には不備であるが、ｐ５３標的標的遺伝子（例えば、ｍｄｍ２およびｐ２１ｗａｆｌ）の他のプロモーターのトランス活性化に対し適格であることが示された。これらの知見は、Ｂａｘのようなトランス活性化遺伝子が、ｐ５３の腫瘍抑制機能に非常に重要であり得ることを示唆する。
【０００８】
ｐ５３が、転写依存的経路および転写非依存的経路を介してアポトーシスを誘導し得ることは公知である。さらに、ｐ５３誘導性アポトーシスは、オンコジーンｂｃｌ−２によりブロックされ得る。しかし、ｂｃｌ−２は、ｐ５３のトランス活性化機能を阻害しない。今までのところ、どの様にｂｃｌ−２がｐ５３誘導性アポトーシスを阻害するのかの分子メカニズムについては、ほとんど知られていない。
【０００９】
５３ＢＰ２は、Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９４）により最初に発見されたｐ５３結合タンパク質である。５３ＢＰ２は、酵母のツーハイブリッドスクリーニングにおいて単離されて、そしてタンパク質のＣ末端から５２８アミノ酸のアミノ酸からなることが見出された。これは、プロリンリッチ配列、４つのアンキリンリピートおよびＳＨ３ドメインを含む。引き続いて、これは、Ｂｃｌ−２と相互作用するタンパク質として同定された（ＮａｕｍｏｖｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙ、１９９６）。このタンパク質のより長いバージョンが単離されて、ｂＢＰ２／５３ＢＰ２として名づけられた。インビトロ翻訳データに基づいて、この著者ら（ＮａｕｍｏｖｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙ、１９９６）は、ｂＢＰ２／５３ＢＰ２タンパク質が、１００５アミノ酸からなると予測した。
【００１０】
ｐ５３のアポトーシス機能がインビボでどの様に調節され得るのかを理解しようとして、本発明者らは、５３ＢＰ２に対する抗体を産生し、試験したほとんどの細胞において、５３ＢＰ２の発現レベルが低いことを示した。本発明者らはまた、内因性ｂＢＰ２／５３ＢＰ２が、予想外なことに、ＮａｕｍｏｖｉｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙにより予測された１００５アミノ酸より大きいタンパク質をコードすることを観察した。このタンパク質、ＡＳＰ−２は、１１３５アミノ酸からなる。
【００１１】
明確にするため、以下の命名法を用いる：
ｉ）５２８アミノ酸ポリペプチドを、５３ＢＰ２またはＡＳＰ−２／５３ＢＰ２（６０７〜１１３５）と称す。
ｉｉ）１００５アミノ酸ポリペプチドを、ｂＢＰ２／５３ＢＰまたはＡＳＰ−２／Ｂｂｐ２（１３０〜１１３５）と称す。
ｉｉｉ）１１３５アミノ酸ポリペプチドを、ＡＳＰ−２／５３ＢＰまたは単にＡＳＰ−２（１〜１１３５）と称す。
括弧中の数字は、ＡＳＰ−２の等価なアミノ酸を示す。
【００１２】
本発明者らは、ｂＢＰ２／５３ＢＰのＣ末端の半分が、ｐ５３の活性に有意な影響を与えないことを示した。しかし、ＡＳＰ−２／５３ＢＰは、ｐ５３のトランス活性化機能を刺激した。最も興味あることに、ＡＳＰ−２／５３ＢＰは、ｐ５３のトランス活性化機能を、プロアポトーシス関連遺伝子（例えば、ＢａｘおよびＰＩＧ−３）に由来するプロモータ上で、特異的に増強し得る。
【００１３】
ＡＳＰ−２のｃＤＮＡ配列を用いて、本発明者らは、ＢＬＡＳＴ検索を実施し、ｂＢＰ２／ＢＰ５３をコードする核酸配列に対して顕著な相同性を有するクローンを同定し、ＫＩＡＡ０７７１として名づけて、この新たに同定された配列は、アポトーシス刺激タンパク質（ＡＳＰ）をコードする遺伝子ファミリーのメンバーであることが示唆された。このファミリーのメンバーは、ＡＳＰ−１として示される。当該分野において公知の技術であるＰＣＲ−ＲＡＣＥを用いて、本発明者らは、ＫＩＡＡ０７７１に対して５’上流にあるＡＳＰ−１  ｃＤＮＡの１００ｂｐをクローニングした。このクローニングした１００ｂｐの配列を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施した。このことは、本発明らに、この１００ｂｐ配列に重複し、ＡＳＰ−１の５’配列をさらに７００ｂｐ含む別のＥＳＴクローン（ＥＭＢＯエントリーＡＩ６２５００４）を同定することができた。本発明者らは、ＥＳＴクローンＡＩ６２５００４およびＫＩＡＡ０７７１を得て、両方ともにサブクローニングして、ＡＳＰ−１ｃＤＮＡの全長クローンを、図１Ｂに示すように産生した。
【００１４】
本発明者らは、この新規の核酸配列をＡＳＰ−１（アポトーシス刺激タンパク質１）（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）と名づけた。これは、５３ＢＰ２／ｂＢＰ２に対する配列相同性を有するポリペプチドをコードする。ＡＳＰ−１とＡＳＰ−２の間の配列相同性を、タンパク質配列のレベルで、図８Ａに示す。ＡＳＰ−１とＡＳＰ−２の間の最も高い相同性は、タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分で見出される。
【００１５】
これら２つの遺伝子の染色体上の位置もまた同定された。ＡＳＰ−１は、第１４染色体上に位置する遺伝子によりコードされる。１７個のエキソンおよびイントロンについての境界を、図１Ｃに図示する。エキソンおよびイントロンのほとんどは、ＥＭＢＯエントリーＡＩ０４９８４０にあるゲノムクローンの範囲内である。このプロモーター領域ならびに５’末端エキソンおよびイントロンは、ＥＭＢＯエントリーＣＮＳ０１ＤＴＤのゲノムクローンの範囲内に位置する。
【００１６】
さらに本発明者らは、ＡＳＰ−２のｐ５３刺激効果を阻害するＡＳＰ−２の調節因子を同定した。本発明者は、この調節因子をＩ−ＡＳＰと呼んだ。ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２を発現する腫瘍において、Ｉ−ＡＳＰの発現は、対応する正常コントロールに比べて上方制御されている。このことは、ｐ５３の腫瘍抑制機能が、ＡＳＰおよびＩ−ＡＳＰにより、インビボでポジティブにおよびネガティブに制御され得ることを示唆する。
【００１７】
本発明の第１の局面に従って、以下を含むポリペプチドまたはこれらの部分が提供される：
ｉ）少なくとも１つのアンキリンリピート；
ｉｉ）αヘリックスドメイン；
ｉｉｉ）ＳＨ３ドメイン；そして
これらのポリペプチドは、ｐ５３の少なくともアポトーシス機能を刺激し得ることで特徴付けられる。
【００１８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、このポリペプチドは、図１ｃまたは図１ｄに示されるポリペプチド配列の少なくとも１つの領域に対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）に結合し得ることにより、特徴付けられる。
【００１９】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、このポリペプチドは、ｐ５３と結合し得る結合部位を含み、これにより、ｐ５３と会合する。好ましくは、この会合が、アポトーシスを誘導および／または亢進し得る。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、このポリペプチドは、哺乳動物起源（理想的には、ヒト）である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、このポリペプチドは、図１ｃまたは１ｄのアミノ酸配列により示され、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、置換によりさらに改変される。
【００２２】
本発明の第２の局面に従って、以下から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸分子が提供される：
ｉ）図１ａまたは図１ｂにおいて示されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）本発明に従う腫瘍抑制ポリペプチドをコードする、図１ａまたは図１ｂに示される配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列；および
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）に規定されるＤＮＡ配列に対し、遺伝子コードの結果として、縮重しているＤＮＡ配列。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１ａまたは１ｂに示される配列にアニーリングする、単離された核酸分子が提供される。
【００２４】
本発明のなおよりさらに好ましい実施形態において、この核酸分子は、ｃＤＮＡである。
【００２５】
本発明のなおよりさらに好ましい実施形態において、この核酸分子は、ゲノムＤＮＡである。
【００２６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明に従う核酸分子によりコードされる、単離されたポリペプチドが提供される。
【００２７】
本発明の第３の局面に従って、核酸分子が、この核酸分子によりコードされるポリペプチドの組換え発現を容易にするように適用される、ベクターの一部であることで特徴付けられる核酸分子が提供される。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、このベクターは、真核生物の遺伝子発現のために適用される発現ベクターである。
【００２９】
本発明の第４の局面に従って、以下の工程を包含する、本発明に従うポリペプチドを産生する方法が提供される：
ｉ）本発明に従う核酸分子で形質転換／トランスフェクトされた細胞を提供する工程；
ｉｉ）このポリペプチドの製造につながる状態で、この細胞を増殖する工程；および
ｉｉｉ）この細胞またはその増殖環境からこのポリペプチドを精製／単離する工程。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、この核酸分子は、本発明に従うベクターである。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、このベクターは、このポリペプチドの精製を容易にする分泌シグナルをコードし、従って、組換えポリペプチドがこの分泌シグナルとともに提供される。
【００３２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、このベクターが、細胞または細胞培地からの組換えポリペプチドの精製を容易にする付加アミノ酸配列をコードし、従って、この組換えポリペプチドが付加アミノ酸配列ともに提供される。例えば、組換えポリペプチドのニッケルカラムへの結合を可能にするＨｉｓタグ配列、またはアビジンカラム上で精製されるビオチン化組換えポリペプチドの使用は、それぞれが当該分野で公知である。
【００３３】
本発明の第５の局面に従って、本発明のポリペプチドの少なくとも一部に結合する抗体またはこれらの結合部分が提供される。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、この結合部分は、以下の群から選択される：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；ＣＤＲ３領域を含む抗体。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、この抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３６】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、この抗体は、ヒト化されている。
【００３７】
あるいは、この抗体は、組換え方法により産生されるキメラ抗体であり、この抗体の可変領域を、ヒト抗体の非可変領域または定常領域とともに含む。
【００３８】
キメラ抗体は、マウスまたはラット抗体の全てのＶ領域がヒト抗体のＣ領域と合わされている組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類の抗体のＶ領域に由来する相補性決定領域と、ヒト抗体のＶ領域に由来するフレームワーク領域とを融合させた組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体由来のＣ領域もまた使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖と軽鎖の両方のＮ末端ドメインにある領域であり、Ｖ領域の主な可変性はここで制限される。これらの領域は、抗体分子表面でループを形成する。これらのループは、抗体と抗原の間で結合表面を提供する。
【００３９】
抗体の産生は、当該分野で周知である。いくつかの実験室向けの教本が、当業者に利用可能である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＬａｎｅおよびＨａｒｌｏｗ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
【００４０】
本発明の第６の局面に従って、理想的には、本発明に従うベクターを用いて、本発明に従う核酸分子の少なくとも一部を含むために、この核酸配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも一部または大部分（例えば、機能性フラグメント）を発現させるために、形質転換／トランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【００４１】
理想的には、この宿主細胞は、真核生物細胞（例えば、バキュロウイルス発現系に使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種由来の細胞のような昆虫細胞）である。この発現系は、ポリペプチドの翻訳後修飾が必要とされる場合に好まれる。このような修飾が必要でない場合、原核生物の系が使用され得る。
【００４２】
本発明の第７の局面に従って、本発明に従うｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの発現を決定する方法が提供される。
【００４３】
本発明の第８の局面に従って、本発明のベクターを含むことにおいて特徴付けられる薬学的または獣医学的組成物が提供される。
【００４４】
本発明の第９の局面に従って、本発明のポリペプチドを含むことにおいて特徴付けられる薬学的または獣医学的組成物が提供される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、このベクターおよび／またはポリペプチドはまた、必要に応じて希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む。
【００４６】
本発明の第１０の局面に従って、以下の工程を包含する処置方法が提供される：
ｉ）本発明に従う組成物の有効量を、動物に投与する工程；および
ｉｉ）この治療組成物の効果をこの動物においてモニターする工程。
【００４７】
本発明の好ましい方法において、この処置は、癌治療である。
【００４８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、この動物は、ヒトである。
【００４９】
本発明のなおさらに好ましい実施形態において、この効果は、アポトーシスの誘導である。
【００５０】
本発明のさらなる局面に従って、本発明に従うポリペプチドの活性を調節し得る薬剤についてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）本発明に従うポリペプチドを発現する細胞または細胞系統を提供する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの試験されるべき薬剤に、この細胞を曝露する工程；および
ｉｉｉ）このポリペプチドの活性に対するこの薬剤の影響をモニタリングする工程。
【００５１】
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明に従うポリペプチドの活性を調節し得る薬剤についてスクリーニングする方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
ｉ）少なくとも本発明に従うポリペプチドを提供する工程；
ｉｉ）少なくとも１つの試験されるべき薬剤に、このポリペプチドを曝露する工程；および
ｉｉｉ）このポリペプチドによるこの薬剤の結合をモニタリングする工程。
【００５２】
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明に従うスクリーニング方法によって同定される薬剤が提供される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、この薬剤は、本発明に従うポリペプチドの活性を促進するアゴニストである。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、この薬剤は、本発明に従うポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニストである。好ましくは、この薬剤は、ポリペプチドである。
【００５５】
本発明のさらなる局面に従って、アンチセンス核酸分子が提供され、この分子は、本発明に従うセンス配列のアンチセンス配列を含む。好ましくは、このアンチセンス核酸分子は、図１ｂに示されるアンチセンス配列またはその一部を含む。好ましくは、このアンチセンス核酸分子は、ＡＳＰ−２配列のヌクレオチド−２５３〜８３９を含むセンス配列のアンチセンス配列である。
【００５６】
本発明のさらなる局面に従って、以下を含む群から選択される単離された核酸分子が提供される：
ｉ）図１０に示されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）図１０に示される配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列であり、本発明に従う腫瘍抑制ポリペプチドのインヒビターをコードする、ＤＮＡ配列；および  ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）において定義されるＤＮＡ配列に対して、遺伝コードの結果としての縮重であるＤＮＡ配列。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、図１０に示される配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアニールする、単離された核酸分子が提供される。
【００５８】
本発明のさらなる局面に従って、ポリペプチドまたはその一部が提供され、これらは、以下を含み：
ｉ）少なくとも１つのアンキリンリピート；
ｉｉ）ＳＨ３ドメイン；そして
このポリペプチドは、図１ｄに示されるポリペプチドのｐ５３刺激活性を阻害し得る点で特徴付けられる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、このポリペプチドはまた、プロリンリッチ領域を含む。
【００６０】
本発明のなおさらなる局面に従って、図１１のアミノ酸配列によって示されるようなポリペプチドが提供され、このポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、置換によってさらに改変される。好ましくは、このポリペプチドは、ヒト起源のものである。
【００６１】
ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２に適用可能な局面および実施形態は、Ｉ−ＡＳＰに等しく適用可能である。例えば、Ｉ−ＡＳＰ  ＤＮＡを含む発現ベクターの作製；Ｉ−ＡＳＰをコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞株；Ｉ−ＡＳＰをコードする核酸分子によってコードされるポリペプチドまたはそのホモログに結合し得るモノクローナル抗体；Ｉ−ＡＳＰをコードする核酸分子を含む薬学的組成物；Ｉ−ＡＳＰポリペプチドまたはそのホモログを含む薬学的組成物；Ｉ−ＡＳＰまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸分子を使用する処置方法；Ｉ−ＡＳＰまたはそのホモログをコードする核酸を検出する方法；Ｉ−ＡＳＰポリペプチドまたはそのホモログを検出する方法。
【００６２】
本発明のさらなる局面に従って、アンチセンス核酸分子が提供され、この分子は、本発明に従うセンス配列のアンチセンス配列を含む。好ましくは、このアンチセンス核酸分子は、図１０に示されるセンス配列またはその一部のアンチセンス配列である。より好ましくは、このアンチセンス核酸分子はなお、Ｉ−ＡＳＰのヌクレオチド−３７〜５３６を含むセンス配列のアンチセンス配列である。
【００６３】
本発明のさらなる局面に従って、本発明に従うアンチセンス分子を含む薬学的組成物が提供される。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態において、このアンチセンス核酸は、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わされる。好ましくは、この薬剤は、以下からなる群より選択される抗癌剤である：シスプラチン；カルボプラチン；シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；メルファラン；カルムスリン（ｃａｒｍｕｓｌｉｎ）；メトトレキサート；５−フルオロウラシル；シタラビン；メルカプトプリン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エピルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ダクチノマイシン；マイトマイシンＣ；タキソール；Ｌ−アスパラギナーゼ；Ｇ−ＣＳＦ；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）（例えば、カリケアミシン（ｃｈａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）またはエスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；クロラムブシル；ＡＲＡ−Ｃ；ビンデシン；ブレオマイシン；およびエトポシド。先のものと組み合わされ得る他の薬剤としては、腫瘍血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に対して作用する薬剤または免疫調節剤が挙げられる。好ましくは、腫瘍血管新生に対して作用する薬剤は、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）Ａ４、アンギオスタチンおよびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）からなる群より選択される。好ましくは、免疫調節剤は、α−インターフェロン、γ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）からなる群より選択される。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、この薬剤は、シスプラチンである。
【００６６】
本発明のなおさらなる局面に従って、図１ｄに示される配列のアミノ酸１〜１３０に結合するモノクローナル抗体の調製のための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫する工程であって、この免疫原は、図１ｄのアミノ酸１〜１３０によって示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）免疫された免疫応答性の哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体をスクリーニングする工程；
（ｄ）モノクローナル活性を生じるハイブリドーマ細胞を培養して、このモノクローナル抗体を増殖させるおよび／または分泌する工程；ならびに
（ｅ）培養物上清からこのモノクローナル抗体を回収する工程。
【００６７】
本発明の好ましい方法において、この免疫応答性の哺乳動物は、マウスである。
【００６８】
代替の好ましい方法Ａにおいて、この免疫応答性の哺乳動物は、ラットである。
【００６９】
本発明のさらに好ましい方法において、この哺乳動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子またはヒト免疫グロブリン遺伝子を含む染色体核酸に関してトランスジェニックである。
【００７０】
従って、本発明は、１つの局面において、単離されたＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドおよび／またはＩ−ＡＳＰポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする遺伝子、これらの機能的改変および改変体、これらの有用なフラグメント、ならびにそれらに関する治療剤を含む。これらの遺伝子の発現は、ｐ５３および関連のポリペプチドに結合することによって、アポトーシスに影響する。
【００７１】
核酸に関して本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅されたもの；（ｉｉ）クローニングによって、組換え的に生成されたもの；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などによって精製されたもの；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されたもの。単離された核酸は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作されるものである。
【００７２】
従って、５’制限部位および３’制限部位が公知である、ベクターに含まれるヌクレオチド配列、またはこれについての開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列は、単離されたとみなされるが、そのネイティブな状態で天然の宿主中に存在する核酸配列は、単離されたとはみなされない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター中に単離された核酸は、細胞内に存在する物質の僅かな割合のみを含み得る点で、純粋ではない。しかし、本明細書中でこの用語が使用される場合、このような核酸は、単離されている。なぜなら、これらは当業者に公知の標準的な技術によって容易に操作されるからである。本明細書中で使用される場合、単離された核酸は、天然に存在しない染色体ではない。
【００７３】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、「単離された」は、そのネイティブな環境から分離され、かつその同定または使用を可能にするに十分な量で存在するものを意味する。タンパク質またはポリペプチドをいう場合、単離されたは、例えば、以下を意味する：（ｉ）発現クローニングによって選択的に生成されるもの、または（ｉｉ）クロマトグラフィーまたは電気泳動によって精製されるもの。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であってもよいが、必ずしもその必要はない。用語「実質的に純粋」は、タンパク質またはポリペプチドが、その意図される使用のために実用的かつ適切な程度に、これらが天然の系またはインビボの系で見出され得る他の物質を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野で周知の技術によって生成され得る。単離されたタンパク質は、薬学的調製物中に、薬学的に受容可能なキャリアと共に混合され得るので、このタンパク質は、調製物の重量の、小さい割合のみを含み得る。それにもかかわらず、このタンパク質は、それが生きた系において結合し得る物質から分離されている（すなわち、他のタンパク質から単離されている）点で、単離されている。
【００７４】
本発明の１つの局面は、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドおよび／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードし、そしてストリンジェントな条件下で本明細書中に開示される核酸分子、好ましくは図１ａ、図１ｂまたは図１０に示される分子のコード領域にハイブリダイズする核酸配列に関する。
【００７５】
従って、本発明の１つの局面は、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドおよび／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードし、そしてストリンジェントな条件下で本明細書中に提供されるような核酸分子にハイブリダイズする核酸配列に関する。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で知られたパラメーターをいう。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法をまとめた参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において見出され得る。より具体的には、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ポリビニルピロリドン、０．０２％  ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり；そしてＥＤＴＡは、エチレンジアミンテトラ酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移される膜を、２×ＳＳＣで室温で洗浄し、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで、６８℃までの温度で洗浄する。
【００７６】
類似の程度のストリンジェンシーを生じる、使用され得る他の条件、試薬などが存在する。当業者は、このような条件を良く知っており、従って、それらは本明細書中には示されない。しかし、当業者が、本発明のＡＳＰ−１核酸、ＡＳＰ−２核酸またはＩ−ＡＳＰ核酸のホモログまたは対立遺伝子の明らかな同定を可能にする様式で、この条件を操作し得ることが理解される。当業者はまた、細胞およびライブラリーを、このような分子の発現についてスクリーニングするための方法論を良く知っており、この分子は、次いで、慣用的に単離され、その後、適当な核酸分子の単離および配列決定が行われる。
【００７７】
一般的に、ホモログおよび対立遺伝子は、代表的に、開示されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対して、それぞれ、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、いくつかの場合、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９７％のアミノ酸同一性を共有し、そしてなお他の例においては、少なくとも９８％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって開発された、インターネット（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／）によって獲得され得る種々の公に利用可能なソフトウェアツールを使用して算定され得る。
【００７８】
例示的なツールとしては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な、好ましくはデフォルト設定を使用するＢＬＡＳＴシステムが挙げられる。ＰａｉｒｗｉｓｅアルゴリズムおよびＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＢＬＯＳＵＭ３０マトリックス設定）ならびにＫｙｌｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー分析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ配列分析ソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ）を使用して獲得され得る。先の核酸のワトソン−クリック相補体もまた、本発明によって包含される。
【００７９】
本明細書中に記載される核酸に対する配列相同性を有する、ＡＳＰ−１タンパク質、ＡＳＰ−２タンパク質および／またはＩ−ＡＳＰタンパク質をコードする核酸のスクリーニングにおいて、サザンブロットが、検出可能なプローブ（例えば、放射能、化学発光）と共に、先の条件を使用して、実施され得る。ＤＮＡが最終的に移される膜を洗浄した後、このプローブシグナルを、例えば、膜をＸ線フィルムまたは燐光画像（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）板に対して配置して放射性シグナルを検出することによって、あるいは膜を処理して化学発光シグナルを検出することによって、検出し得る。
【００８０】
本発明はまた、ネイティブな物質中に存在する代替のコドンを含む、縮重核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによってコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的について等価である。従って、任意のセリンコードヌクレオチドのトリプレットが使用されて、タンパク質合成装置を指向して、インビトロまたはインビボで伸長ポリペプチド中にセリン残基を取り込み得ることが当業者に明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基は、同様に、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得る。従って、本発明は、遺伝子コドンの縮重に起因して、生物学的に単離された核酸とはコドン配列が異なる縮重核酸を包含する。
【００８１】
本発明はまた、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加、置換および欠失を含む改変された核酸分子またはポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「１以上」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはこれらの分子について分子の機能を実質的に変化させない数までを意味し、ここで、この機能は、元の核酸またはポリペプチドに実質的に類似していることが所望される。機能の実質的な変化は、例えば、ドミナントネガティブなタンパク質またはその機能の１以上を喪失したタンパク質である。
【００８２】
好ましい実施形態において、これらの改変核酸分子および／またはこれらがコードするポリペプチドは、非改変核酸および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能（例えば、ｐ５３結合、抗原性、転写活性など）を保持する。特定の実施形態において、この改変核酸分子は、改変されたポリペプチド、好ましくは本明細書の他の場所に記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。この改変核酸分子は、非改変核酸分子に構造的に関連し、そして好ましい実施形態において、非改変核酸分子に十分に構造的に関連し、その結果、この改変核酸分子と非改変核酸分子とは、当業者に公知の高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００８３】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子が調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中で記載されるような遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除いて、１つ、２つまたは３つのヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２つのアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子（これは、例えば、２〜６個のヌクレオチド変化を有する）を調製し得る。このような多数の改変された核酸分子（例えば、アミノ酸２および３、アミノ酸２および４、アミノ酸２および５、アミノ酸２および６などをコードするコドンにおけるヌクレオチドの置換を含む）は、当業者により容易に想定される。前述の例において、２つのアミノ酸のそれぞれの組み合わせは、改変された核酸分子のセット、およびこのアミノ酸置換をコードする全てのヌクレオチド置換に含まれる。さらなる置換（すなわち、３つ以上）、付加または欠失を有する（例えば、終止コドンまたはスプライス部位の導入によって）ポリペプチドをコードするさらなる核酸分子はまた、当業者により容易に想定されるように、本発明により調製され、そして本発明に包含される。任意の前述の核酸またはポリペプチドは、本明細書中に開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的な関係または活性の保持について、慣用的な実験によって試験され得る。
【００８４】
本発明はまた、ヒトゲノム内で固有の配列を提示するのに十分な長さの、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰまたはそれらの相補体の単離されたフラグメントを提供し、そしてＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸を同定する。これらのフラグメントは、固有のフラグメントがより大きな核酸の「サイン」であるフラグメントであるという点で、固有と考えられ得る。例えば、固有のフラグメントは、その正確な配列が、上で定義されたＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ核酸の外側の分子において見出されないこと、すなわちこの正確な配列が、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ配列を厳密に同定することを保証するのに十分な長さである。固有フラグメントは、本願の出願時に公的に利用可能なデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）に存在する任意の配列と同一ではない連続したヌクレオチドの配列を含むが、特定のフラグメントは、フラグメントの一部としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されたいくつかの既知の配列を含み得る。同様に、公的に既知の配列の相補体、ならびに公的に既知の配列のフラグメントおよびその相補体は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰの固有のフラグメントの一部であり得るが、全てではない。従って、固有のフラグメントは、定義によって、ＥＳＴのみからなる配列および／または本願に含まれる配列の最先の出願日の時点で公的に利用可能なデータベースに寄託されていた遺伝子配列を排除する。従って、固有のフラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋのヌクレオチド配列またはそのフラグメントの正確な配列以外のヌクレオチド配列を含まなければならない。この差異は、ＧｅｎＢａｎｋ配列に対する付加、欠失または置換であり得るか、またはこれは、ＧｅｎＢａｎｋ配列とは全体的に異なる配列であり得る。
【００８５】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ核酸分子のフラグメント（固有のフラグメントを含む）は、ハイブリダイゼーションブロットアッセイおいてこのような核酸を同定するために、ヌクレアーゼ保護アッセイにおいては、転写を測定するために、プローブとして使用され得か、またはＰＣＲを用いるアッセイのような増幅アッセイにおいて使用され得る。当業者に公知のように、大きなプローブ（例えば、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド以上）は、サザンブロッドおよびノーザンブロッドのような特定の用途に好ましく、一方、より小さいフラグメントは、ＰＣＲのような用途に好ましい。フラグメントはまた、抗体を作製するため、もしくはポリペプチドフラグメントの結合を決定するため、または免疫アッセイ成分を作製するための融合タンパク質を生成するために使用され得る。同様に、フラグメントは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／もしくはＩ−ＡＳＰポリペプチドの非融合フラグメント（例えば、Ｎ末端フラグメントまたはＣ末端フラグメント）、または本明細書中で開示される種々のタンパク質ドメイン（例えば、抗体の調製において、免疫アッセイにおいて、ならびにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチド、および／またはｐ５３またはｒｅｌポリペプチドに結合する他のポリペプチドの競合結合パートナー（例えば、治療用途において）として、有用である）を生成するために用いられ得る。フラグメントはさらに、本明細書中で記載されるように、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰ核酸およびポリペプチドの発現を阻害するアンチセンス分子として、特に、本明細書中でより詳細に記載されるように、治療目的のために使用され得る。
【００８６】
当業者によって認識されるように、固有のフラグメントのサイズは、遺伝コードにおけるその保存性に依存する。従って、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ核酸分子およびそれらの相補体のいくつかの領域は、より長いセグメントが固有であることを必要とするが、他の領域は、短いセグメント、代表的には、１２ヌクレオチドと３２ヌクレオチドとの間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２塩基長）のみを必要とする。本開示は、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチドなどから末端の８ヌクレオチド短縮までで始まり、そして各配列ごとにヌクレオチド数８、９、１０などから最後のヌクレオチドまでのいずれかのヌクレオチドで終わる、各配列の各々全てのフラグメントを包含することを意図する（ただし、この配列は、上記のように固有である）。２５ヌクレオチド長以上のＡＳＰ−１、ＡＳ−２およびＩ−ＡＳＰ核酸の多数のセグメント、またはその相補体は、固有である。当業者は、代表的には、固有のフラグメントが、非ＡＳＰおよびＩ−ＡＳＰ核酸から目的の配列を選択的に区別する能力に基づいて、このような配列を選択するための方法に十分に精通している。このフラグメントの配列と既知のデータベースの配列との比較は、代表的に、必要な全てであるが、インビトロの確認的なハイブリダイゼーションおよび配列決定分析が、実施され得る。
【００８７】
フラグメントは、機能的フラグメントであり得る。本発明の核酸分子の機能的フラグメントは、より大きな核酸分子のいくつかの機能的特性（例えば、機能的ポリペプチドをコードすること、タンパク質（例えば、ｐ５３）に結合すること、作動可能に連結された核酸の転写を調節すること、免疫学的に認識されるエピトープをコードすることなど）を保持するフラグメントである。当業者は、本明細書中に記載されるアッセイ、および当該分野で周知のアッセイを使用して、慣用的な実験のみを使用して、フラグメントが核酸分子の機能的フラグメントであるか否かを容易に決定し得る。
【００８８】
上記のように、本発明は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸分子に選択的に結合し、例えば、ｐ５３の結合、転写活性またはアポトーシスを調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。このことは、ｐ５３活性の調節が所望される実質的に任意の医学的状態（例えば、癌および異常なアポトーシスに関与する状態）において望ましい。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはこの遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、それにより、この遺伝子の転写および／またはこのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴリボヌクレオチド、または改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを示す。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とハイブリダイズすると、この標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように設計される。当業者は、正確な長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその標的との相補性の程度は、この標的の配列およびこの配列を含む特定の塩基を含む、選択された特定の標的に依存することを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で標的に選択的に結合するように、すなわち、生理学的条件下で、標的細胞中の任意の他の配列よりも実質的に多くこの標的配列にハイブリダイズするように、構築および配置されることが好ましい。本明細書中で提供されるＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰ核酸配列に基づいて、または対立遺伝子または相同なゲノム配列および／またはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従う用途に適切な多数のアンチセンス分子のいずれかを、容易に選択および合成し得る。例えば、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰ核酸の長さにわたる１５〜３０ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子ウォーク」を調製し、続いて、対応するＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの発現の阻害について試験し得る。必要に応じて、合成および試験するオリゴヌクレオチドの数を減らすために、５〜１０ヌクレオチドのギャップを、このオリゴヌクレオチドの間に残し得る。
【００９０】
阻害に対して十分に選択的かつ強力であるために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に対して相補的な、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個の連続した塩基を含むべきであるが、特定の場合において、７塩基長程の短い改変されたオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾良く使用されている（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４，１９９６）。より好ましくは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補配列を含む。遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端部位または５’上流部位（例えば、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位）に対応する。さらに、３’非転写領域が、標的化され得る。ｍＲＮＡスプライシング部位に対する標的化はまた、当該分野において使用されているが、選択的ｍＲＮＡスプライシングが生じる場合には、それほど望まれ得ない。さらに、アンチセンスは、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造が予測されない部位（例えば、Ｓａｉｎｉｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４（５）：４３９〜４５７，１９９４を参照のこと）、およびタンパク質が結合すると予測されない部位に標的化される。最後に、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ  ｃＤＮＡ配列は、本明細書中に開示されるが、当業者は、これらのｃＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡを容易に誘導し得る。従って、本発明はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰゲノムＤＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。同様に、対立遺伝子ｃＤＮＡまたは相同なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するアンチセンスは、過度の実験を行うことなく、可能である。
【００９１】
実施形態の１つのセットにおいて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせからなり得る。すなわち、一方のネイティブなヌクレオチドの５’末端および他方のネイティブのヌクレオチドの３’末端は、天然の系におけるように、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を介して、共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動でまたは自動合成機によって行われ得る当該分野で認識された方法によって、調製され得る。これらはまた、ベクターによって組換え生成され得る。
【００９２】
しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、「改変された」オリゴヌクレオチドを含み得る。すなわち、このオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがそれらの標的にハイブリダイズするのを妨害せず、それらの安定性もしくは標的化を増大するか、またはそれらの治療的有効性を増大する多数の様式で改変され得る。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、用語「改変されたオリゴヌクレオチド」は、（１）そのヌクレオチドのうち少なくとも２つが、合成ヌクレオシド間結合（すなわち、一方のヌクレオチドの５’末端と他方のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合以外の結合）を介して作動可能に連結され、そして／または（２）通常は核酸と会合していない化学基が、このオリゴヌクレオチドに共有結合された、オリゴヌクレオチドを示す。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００９４】
用語「改変されたオリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に改変された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、改変されたオリゴヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基以外でありかつ５’位のホスフェート基以外である低分子量有機基に共有結合された糖骨格を有するオリゴヌクレオチドを含む。従って、改変されたオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変されたオリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含み得る。従って、本発明は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸に相補的であり、かつこれに生理学的条件下でハイブリダイズする改変アンチセンス分子を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む薬学的調製物を企図する。
【００９５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物の一部として投与され得る。このような薬学的組成物は、当該分野で公知の任意の標準的な生理学的および／または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。この組成物は、無菌性であり、かつ患者への投与に適切な質量単位または体積単位中に治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むべきである。このキャリアの特性は、投与経路に依存する。生理学的および薬学的に受容可能なキャリアとしては、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤および当該分野で周知の他の材料が挙げられる。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」は、異なる遺伝環境の間の輸送または宿主細胞における発現のために、制限およびライゲーションによって所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれかであり得る。ベクターは、代表的には、ＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターもまた、利用可能である。ベクターとしては、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製し得るベクターであり、代表的には、このベクターが決定可能な様式で切断され得、新たな組換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するように所望のＤＮＡ配列がライゲーションされ得る１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によりさらに特徴付けられる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数を増加させる場合、何回も生じ得るか、または宿主が有糸分裂により再生する前に、宿主１つにつき一回のみ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶解期の間に活発に生じ得るか、または溶原期の間に受動的に生じ得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が調節配列に作動可能に連結されるように制限およびライゲーションによって挿入さ得、そしてＲＮＡ転写物として発現され得るベクターである。ベクターは、このベクターで形質転換またはトランスフェクトされたかまたはされていない細胞の同定において使用するために適切な１つ以上のマーカー配列をさらに含み得る。マーカーとしては、例えば、抗体または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当該分野で公知の標準的なアッセイによって検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響を与える遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰのような種々の蛍光タンパク質）が挙げられる。好ましいベクターは、このベクターが作動可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造的遺伝子産物の自己複製および発現を可能にするベクターである。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、コード配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くような様式で、コード配列および調節配列が共有結合される場合、これらのコード配列および調節配列は、「作動可能に」連結されると言われる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望まれる場合では、５’調節配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写を生じ、かつ２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の誘発を生じることもなく、（２）コード配列の転写を指向するプロモーター領域の能力を妨害することもなく、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害することもない場合、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されると言われる。従って、プロモーター領域がＤＮＡ配列の転写に影響し得、その結果、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、このプロモーター領域は、コード配列に作動可能に連結される。
【００９８】
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種間または細胞型間で変化し得るが、一般的には、必要に応じて、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含むべきである。特に、このような５’非転写調節配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、必要に応じて、エンハンサー配列または上流アクチベータ配列を含み得る。本発明のベクターは、必要に応じて、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および判断に含まれる。
【００９９】
発現に必要な全てのエレメントを含む発現ベクターは、市販されており、そして当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の、細胞への導入によって遺伝子操作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にする転写エレメントの操作可能な制御下に置かれる。
【０１００】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡに好ましい系は、Ｇ４１８耐性（これは、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にする）を与える遺伝子のような選択マーカーを含む、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）、ならびにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列などである。さらに、霊長類またはイヌの細胞株における発現に適切なのは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、これは、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含み、多コピー染色体外エレメントとしてのプラスミドの維持を容易にする。別の発現ベクターは、ポリペプチド伸長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドであり、これはインビトロの転写を効果的に刺激する。このプラスミドは、ＭｉｓｈｉｚｕｍａおよびＮａｇａｔａ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２，１９９０）により記載され、そしてトランスフェンスフェクション実験におけるその使用は、例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０〜４７１６，１９９６）により開示されている。さらに別の好ましい発現ベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔにより記載されるアデノウイルスであり、これはＥ１およびＥ３タンパク質を欠く（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６〜６３０，１９９２）。アデノウイルスのＡｄｅｎｏ  Ｐ１Ａ組換え体としての使用は、Ｗａｒｎｉｅｒら、Ｐ１Ａに対する免疫のためのマウスにおける経皮注射（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐ１Ａ）（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７：３０３〜３１０，１９９６）により開示される。
【０１０１】
本発明はまた、いわゆる、発現キットを包含し、この発現キットにより、当業者は、所望の発現ベクターを調製し得る。このような発現キットは、前述のコード配列の各々の少なくとも別個の部分を含む。他の成分は、必要とされる前述の配列が含まれる限り、必要に応じて加えられ得る。
【０１０２】
本発明はまた、細胞および動物中でのｐｃＤＮＡ３遺伝子「ノック−アウト」の構築を可能にし、ｐ５３活性、アポトーシス、および癌の特定の局面を研究するための材料を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、開示されるＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチドならびにそれらのフラグメントを含む、単離されたポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、例えば、単独または融合タンパク質として、ｐ５３結合を試験および調節するため、アポトーシスを調節するため、抗体を作製するために有用であり、そして免疫アッセイの成分として有用である。
【０１０４】
一般的に、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドのフラグメントは、核酸に関して上記で議論したようなフラグメントの特性および特徴を有する。当業者によって認識されるように、特有のフラグメントのサイズは、そのフラグメントが保存されたタンパク質ドメインの一部を構成するか否かのような因子に依存する。従って、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドのいくつかの領域は、特有であるためにより長いセグメントを必要とし、一方、他の領域は、短いセグメントのみ（代表的に、５アミノ酸と１２アミノ酸との間（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１および１２アミノ酸長））を必要とする。
【０１０５】
好ましくは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドのフラグメントは、これらのポリペプチドの異なる機能的能力を維持するフラグメントである。ポリペプチドの特有のフラグメントにおいて維持され得る機能的能力としては、ｐ５３またはｒｅｌの結合、抗体との相互作用、および酵素活性が挙げられる。例えば、本明細書中に例示されるように、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの特定のフラグメントは、本発明の方法において全長ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的等価物（例えば、ｐ５３結合、アポトーシスの調節など）として使用され得る。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの他のフラグメントは、それらの機能的特性に従って選択され得る。例えば、当業者は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰフラグメントを組換え的に調製し得、そしてそれらのフラグメントを、以下に例示されるような方法（例えば、ｐ５３ポリペプチドへの結合）に従って試験し得る。当業者はまた、代表的に、ファミリーメンバーではないものから目的の配列を選択的に区別するための特有のフラグメントの能力に基づいて、特有のアミノ酸配列を選択する方法に十分に精通する。典型的に、当業者は、公知のデータベース上のフラグメント配列に対するフラグメント配列の比較をする必要がある。
【０１０６】
本発明は、上記のＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチドの改変体を含む。本明細書中に使用される場合、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの「改変体」は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列に１つ以上の改変を含むポリペプチドである。改変体を作製する改変は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２および／またはＩ−ＡＳＰポリペプチドに対して作製され得、１）ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの活性（例えば、別のポリペプチドへの結合）を減少または排除するか；２）ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの特性（例えば、発現系におけるタンパク質の安定性またはタンパク質−タンパク質結合の安定性）を増強するか；あるいは、３）ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドに対して新規の活性または特性を提供する（例えば、抗原性エピトープの付加または検出可能部分の付加）。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの改変は、代表的にこれらのＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸に対して作製され、そして改変としては、欠失、点変異、短縮、アミノ酸置換および１つ以上のアミノ酸または非アミノ酸部分の付加が挙げられ得る。改変体に関連して使用される場合、「１つ以上の」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれより多くの変化を意味する。あるいは、改変は、切断、リンカー分子の付加、検出部分（例えば、ビオチン）の付加、脂肪酸の付加などによって、ポリペプチドに対して直接作製され得る。改変はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰアミノ酸配列の全体または一部を含む融合タンパク質を含む。
【０１０７】
一般的に、改変体は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの生理学的活性に無関係のポリペプチドの特徴を特異的に変更するように改変された、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドを含む。例えば、システイン残基が置換または欠失されて、望ましくないジスルフィド連結を阻止し得る。同様に、特定のアミノ酸残基が変更されて、発現系中のプロテアーゼによるタンパク質分解を排除することによって（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における、二塩基性アミノ酸残基）、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの発現を増強し得る。
【０１０８】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸の変異は、好ましくは、コード配列のアミノ酸リーディングフレームを保存し、そして好ましくは、おそらくハイブリダイズして二次構造（例えば、ヘアピンまたはループ）（これは、改変体ポリペプチドの発現に有害であり得る）を形成する核酸中の領域を作製しない。
【０１０９】
変異は、アミノ酸置換を選択することによってか、またはポリペプチドをコードする核酸中の選択部位の無作為変異誘発によって、作製され得る。次いで、改変体ポリペプチドが発現され、所望の特性を有する改変体ポリペプチドを提供する変異を決定するために、１つ以上の活性について試験される。
【０１１０】
さらなる変異が、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してはサイレントであるが、特定の宿主における翻訳に対して好ましいコドンを提供するような改変体（または非改変体ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチド）に対して作製され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける核酸の翻訳についての好ましいコドンは、当業者に周知である。さらに他の変異が、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの遺伝子またはＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰのｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して作製されて、そのポリペプチドの発現を増強する。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの改変体の活性は、本明細書中に開示されるように、この改変体ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸分子を細菌発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターにクローニングし、これらのベクターを適切な宿主細胞に導入し、これらのＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドを発現させ、そしてＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的能力を試験することによって、試験され得る。例えば、改変体ＡＳＰポリペプチドは、実施例に開示されるようなｐ５３結合について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、当業者に公知であるように、他の活性の試験に好都合であり得る。
【０１１１】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換がＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチド中に作製されて、上述のポリペプチドの機能的に等価な改変体を提供し得ること（すなわち、これらの改変体は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的能力を保持する）を認識する。本明細書中に使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が作製されたタンパク質の相対的な電荷特徴もサイズ特徴も変更しない、アミノ酸置換をいう。改変体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法を編集する以下の参考文献中に見出されるような方法に従って、調製され得る：例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９，またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの例示的な機能的に等価である改変体としては、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の１つ以上の保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換としては、以下（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄからなる群内のアミノ酸間で作製される置換が挙げられる。
【０１１２】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的に等価な改変体を生成するためのこれらのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、代表的に、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする核酸の改変によって作製される。このような置換は、当業者に公知の種々の方法によって作製され得る。例えば、アミノ酸置換は、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２，１９８５）に従うＰＣＲ指向型変異、部位指向型変異誘発によってか、あるいはＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によって、作製され得る。アミノ酸置換が、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの小さい特有のフラグメント（例えば、ｐ５３結合部位ペプチド）に対して作製される場合、置換は、ペプチドを直接合成することによって作製され得る。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的に等価なフラグメントの活性は、本明細書中に開示されるように、変更されたＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドをコードする遺伝子を細菌発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターにクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、この変更されたＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドを発現させ、そしてＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの機能的能力を試験することによって、試験され得る。化学的に合成されるペプチドは、機能について（例えば、ｐ５３への結合について）直接的に試験され得る。
【０１１３】
本明細書中に開示される本発明は、多数の用途を有し、このうちのいくつかは、本明細書中のいずれかに記載される。最初に、本発明は、完全なＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰタンパク質分子の単離を可能にする。当業者に周知である種々の方法論が、単離されたＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチド分子を得るために使用され得る。ポリペプチドは、そのポリペプチドを天然に産生する細胞から、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識によって精製され得る。あるいは、発現ベクターが細胞に導入されて、そのポリペプチドの産生をもたらし得る。別の方法において、ｍＲＮＡ転写物が、細胞に微量注入されるかまたは他の方法で導入されて、コードされるポリペプチドの産生をもたらし得る。
【０１１４】
無細胞抽出物（例えば、網状赤血球溶解物系）におけるｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドを産生するために使用され得る。当業者はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドを単離するために、公知の方法に容易に従い得る。これらとしては、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰ核酸分子の単離はまた、当業者が、これらの分子の発現（またはそれらの相対的な欠如）によって特徴付けられる障害を診断することを可能にする。これらの方法は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰ核酸および／あるいはそれから誘導されるＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの発現を決定する工程を包含する。上述の状況にいおいて、このような決定は、任意の標準的な核酸測定アッセイ（以下の実施例に例示されるようなポリメラーゼ連鎖反応、または標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いたアッセイを含む）を介して実行され得る。
【０１１６】
本発明はまた、タンパク質（例えば、ｐ５３およびｒｅｌ）の単離を、このようなタンパク質の、本明細書中に開示されるようなＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰへの結合によって可能にする。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰ結合活性の同定はまた、当業者がタンパク質結合および下流の機能（例えば、アポトーシス）を調節することを可能にする。さらなる用途が、本明細書中に開示される。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰから誘導される「ドミナントネガティブ」ポリペプチドを提供する。ドミナントネガティブポリペプチドは、タンパク質の不活性な改変体であり、これは、細胞機構と相互作用することによって、活性なタンパク質を細胞機構とのその相互作用から退けさせるか、または活性なタンパク質と競合し、それによって、活性なタンパク質の効果を減少させる。例えば、リガンドに結合するが、リガンドの結合に応答したシグナルは伝達しないドミナントネガティブのレセプターは、リガンドの発現の生物学的効果を低下させ得る。同様に、通常標的タンパク質と相互作用するが、標的タンパク質をリン酸化しないドミナントネガティブの触媒不活性キナーゼは、細胞シグナルに応答した標的タンパク質のリン酸化を低下させ得る。同様に、別の転写因子に結合するかまたは遺伝子の制御領域中のプロモーター部位に結合するが、遺伝子転写を増大させないドミナントネガティブの転写因子は、転写を増大させることなくプロモーター結合部位を占有することによって、正常な転写因子の効果を低下させ得る。
【０１１８】
細胞中でのドミナントネガティブポリペプチドの発現の最終的な結果は、活性なタンパク質の機能低下である。当業者は、タンパク質のドミナントネガティブ改変体についての可能性を評価し、標準的な変異誘発技術を使用して、１つ以上のドミナントネガティブ改変体ポリペプチドを作製し得る。例えば、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰポリペプチドの本明細書中に含まれる教示が与えられれば、当業者は、部位特異的変異誘発、スキャニング変異誘発（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、部分的遺伝子欠失または短縮などによって、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドの配列を改変し得る。例えば、米国特許第５，５８０，７２３号およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。次いで、当業者は、選択された活性（例えば、ｐ５３結合、アポトーシスの調節）における減少について、および／またはこのような活性の保持について、変異誘発されたポリペプチドの集団を試験し得る。タンパク質のドミナントネガティブ改変体を作製および試験する他の類似の方法が、当業者に明らかである。
【０１１９】
本発明はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドならびにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドと結合パートナー（例えば、ｐ５３）との複合体に結合するポリペプチドのような因子を含む。このような結合因子は、例えば、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドならびにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドとそれらの結合パートナーとの複合体の、存在または非存在を検出するためのスクリーニングアッセイにおいて、そして、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドならびにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドとそれらの結合パートナーとの複合体を単離するための精製プロトコールにおいて、使用され得る。このような因子はまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドまたはそれらの結合パートナーのネイティブな活性を、例えば、このようなポリペプチドもしくはそれらの結合パートナーまたはこれらの両方に対して結合することによって、阻害するために使用され得る。
【０１２０】
従って、本発明は、ペプチド結合因子を含み、これは、例えば、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドに選択的に結合する能力を有する抗体または抗体フラグメントであり得る。抗体は、従来の方法論に従って調製されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。
【０１２１】
重要なことに、当該分野で周知のように、抗体分子の小さな部分（パラトープ）のみが、そのエピトープへの抗体の結合に関与する（一般的に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。例えば、ｐＦｃ’領域およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されるか、またはｐＦｃ’領域無しで産生された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを称される）は、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたか、またはＦｃ領域無しで産生された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの１つを保持する。さら進めると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した、抗体軽鎖およびＦｄと示される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変更することなく１０個までの異なる軽鎖と会合し得る）、そしてＦｄフラグメントは、溶液中でエピトープ結合能力を保持する。
【０１２２】
当業者に周知のように、抗体の抗原結合部分内において、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの三次構造を保持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的に、Ｃｌａｒｋ、１９８６；Ｒｏｉｔｔ、１９９１を参照のこと）。重鎖ＦｄフラグメントおよびＩｇＧ免疫グロブリンの軽鎖の両方において、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分離される４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ（特に、ＣＤＲ３領域、より詳細には、重鎖ＣＤＲ３）が、主として抗体特異性を担う。
【０１２３】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、本来の抗体のエピトープ特異性を維持しながら、同種抗体または異種抗体の類似する領域で置換され得ることは、現在当該分野で十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲが機能的抗体を産生するためにヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合的に連結される、「ヒト化」抗体の開発および使用において、最も明確に証明されている。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第５，８５９，２０５号を参照のこと。
【０１２４】
従って、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９２／０４３８１は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域によって置換されている、ヒト化マウスＲＳＶ抗体の産生および使用を教示する。このような抗体（抗体結合能力を有するインタクトな抗体のフラグメントを含む）は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【０１２５】
完全なヒトモノクローナル抗体もまた、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子についての非ヒトトランスジェニック動物の免疫によって、調製され得る。例えば、米国特許第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号を参照のこと。
【０１２６】
従って、当業者に明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；キメラ抗体（これは、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒト配列または非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体（これは、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒト配列または非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦａｂフラグメント抗体（これは、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒト配列または非ヒト配列によって置換されている）；ならびにキメラＦｄフラグメント抗体（これは、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同性ヒト配列または非ヒト配列によって置換されている）を提供する。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体を含む。
【０１２７】
従って、本発明は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチド、ならびにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰポリペプチドとそれらの結合パートナーとの両方の複合体に特異的に結合する多数のサイズおよび型のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドはまた、抗体技術以外の供給源から誘導され得る。例えば、このようなポリペプチド結合因子は、固定形態またはファージディスプレイライブラリーとして溶液中で容易に調製され得る、縮重ペプチドライブラリーによって提供され得る。１つ以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、合成され得る。ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）および非ペプチド合成部分のライブラリーもさらに、合成され得る。
【０１２８】
ファージディスプレイは、本発明に従って有用な結合ペプチドを同定する際に特に有効であり得る。手短には、従来の手順を用いて４〜約８０アミノ酸残基の挿入物を提示する、（例えば、ｍ１３、ｆｄまたはラムダファージを用いて）ファージライブラリーを調製する。この挿入物は例えば、完全に縮重したアレイまたは偏りのあるアレイを提示し得る。次いで、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドに結合する挿入物を保有するファージを選択し得る。このプロセスは、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドに結合するファージの再選択数回のサイクルを通して繰り返され得る。何回か繰り返すことによって、特定の配列を保有するファージが富化される。ＤＮＡ配列分析を行って、発現されたポリペプチドの配列を同定し得る。ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドに結合する、最小直鎖状部分の配列が決定され得る。この手順を、最小直鎖状部分の一部または全て＋その上流または下流の１以上のさらなる縮重残基を含む挿入物を含む偏りのあるライブラリーを用いて繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング方法をまた用いて、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドに結合するポリペプチドを同定し得る。従って、本発明のＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドおよびＩ−ＡＳＰポリペプチドまたはそれらのフラグメントを用いて、ペプチドライブラリー（ファージディスプレイライブラリーを含む）をスクリーニングして、本発明のＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定および選択し得る。このような分子は、記載のように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコルのために、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの機能を直接妨害するために、および当業者に明らかな他の目的のために、用いられ得る。
【０１２９】
本発明が発現ベクターにおいて、ならびに宿主細胞および細胞株をトランスフェクトするためにＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰのｃＤＮＡ配列を使用することを包含することもまた認識され、これらは、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）である。特に有用なのは、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類などのような哺乳動物細胞である。これらは、広範な種々の組織型の細胞であり得、そして初代細胞および細胞株を包含する。特定の例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、線維芽細胞、骨髄幹細胞および胚性幹細胞が挙げられる。発現ベクターは、適切な配列、すなわち、上記の核酸がプロモーターに作動可能に連結されることを必要とする。
【０１３０】
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト動物を包含する。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック非ヒト動物」は、１以上の外因性核酸分子が生殖系列の細胞および／または体細胞に組み込まれた非ヒト動物を包含する。従って、トランスジェニック動物としては、相同組換えによるホモ接合性もしくはヘテロ接合性の遺伝子破壊を有する「ノックアウト」動物、エピソーム性もしくは染色体に組み込まれた発現ベクターを有する動物などを包含する。ノックアウト動物は、当該分野で周知であるように、胚性幹細胞を用いて相同組換えによって調製され得る。組換えは、ｃｒｅ／ｌｏｘ系または当業者に公知の他のレコンビナーゼ系によって促進され得る。特定の実施形態では、レコンビナーゼ系自体は、例えば、特定の組織もしくは細胞型において、特定の胚発生段階もしくは胚発生後の段階（ｐｏｓｔ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｇｅ）で、発現を増大もしくは減少させる化合物の付加によって誘導的になどで条件的に発現される。一般に、このような系において用いられる条件的発現ベクターは、所望の遺伝子発現パターン（例えば、時間的または空間的）を付与する種々のプロモーターを用いる。条件的プロモーターはまた、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの核酸分子に作動可能に連結されて、制御された様式で、または条件的な様式で、これらの核酸分子の発現を増大させ得る。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの活性または発現のトランス作用性ネガティブ調節因子もまた、上記の通りの条件的プロモーターに作動可能に連結され得る。このようなトランス作用性調節因子としては、アンチセンス核酸分子、ドミナントネガティブ分子をコードする核酸分子、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの核酸に特異的なリボザイム分子などが挙げられる。トランスジェニック非ヒト動物は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの発現の増大または減少によって特徴付けられる状態についての診断または治療の生化学的効果または生理学的効果を試験することに関する実験において有用である。他の用途は、当業者に明らかである。
【０１３１】
本発明はまた、遺伝子治療を意図する。エキソビボで遺伝子治療を実施するための手順は、米国特許第５，３９９，３４６号およびこの特許の特許取得履歴において提出した添付物において概説されており、これらは全て、公に入手可能な文書である。一般に、これは、ある遺伝子の欠損コピーを含む被験体細胞へと、この遺伝子の機能的コピーをインビトロで導入すること、および遺伝子操作された細胞をこの被験体に戻すことを含む。この遺伝子の機能的コピーは、遺伝子操作された細胞におけるこの遺伝子の発現を可能にする調節エレメントの作動可能な制御下にある。多数のトランスフェクション技術および形質導入技術、ならびに適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、これらのうちのいくつかは、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６５４に記載される。アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスのようなベクターおよび標的化リポソームを用いるインビボでの遺伝子治療もまた、本発明に従って意図される。
【０１３２】
本発明はさらに、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰを調節可能な細胞機能のレベルで活性な薬剤についての薬学的薬剤またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。特に、このような機能としては、ｐ５３結合およびアポトーシスが挙げられる。一般に、スクリーニング方法は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの活性（例えば、ｐ５３結合など）を妨害する化合物についてアッセイすることを含むが、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの活性を増強する化合物もまた、このスクリーニング方法を用いてアッセイされ得る。このような方法は、化合物の自動化された高処理能力スクリーニングに適応され得る。このスクリーニング方法によって検出される薬理学的薬剤についての標的治療適応症は、標的細胞機能が、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドもしくはＩ−ＡＳＰポリペプチドまたはこれらのフラグメントおよび１以上の天然のＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの細胞内結合標的（例えば、ｐ５３）を含む複合体の形成の変化によって調節を受けるという点でのみ制限される。標的適応症としては、アポトーシスが挙げられる。
【０１３３】
標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースのアッセイ（例えば、ツーハイブリッドスクリーニングもしくはスリーハイブリッドスクリーニング）、発現アッセイなどを含め、薬理学的薬剤についての広範な種々のアッセイが提供される。例えば、ハイブリッドスクリーニングを用いて、特定の細胞内標的へのＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドもしくはＩ−ＡＳＰポリペプチドまたはそれらのフラグメントの細胞内結合に対する、トランスフェクトされた核酸の効果が迅速に検査される。トランスフェクトされた核酸は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーまたはアンチセンス分子をコードし得る。このようなアッセイのための便利な試薬（例えば、ＧＡＬ４融合タンパク質）は、当該分野で公知である。例示的な細胞ベースのアッセイは、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合されたＡＳＰポリペプチドをコードする核酸および転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６）に融合されたＡＳＰと相互作用するｐ５３ドメインをコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることを含む。細胞はまた、遺伝子発現調節領域（例えば、１以上のＧＡＬ４結合部位）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の転写活性化は、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６転写活性化ドメインが近位になってレポーター遺伝子の転写を可能にするように、ＡＳＰ融合ポリペプチドとｐ５３融合ポリペプチドとが結合した場合に生じる。次いで、ＡＳＰポリペプチド媒介細胞機能を調節する因子は、レポーター遺伝子の発現における変化を介して検出される。レポーター遺伝子の発現における変化を決定するための方法は当該分野で公知である。
【０１３４】
この方法において用いられるＡＳＰ−１フラグメント、ＡＳＰ−２フラグメントまたはＩ−ＡＳＰフラグメントは、トランスフェクトされた核酸によって産生されない場合、単離されたポリペプチドとしてアッセイ混合物に添加される。ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドは好ましくは、組換え産生されるが、このようなポリペプチドは、生物学的抽出物から単離され得る。組換え産生されたＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドとしては、ＡＳＰ−１タンパク質、ＡＳＰ−２タンパク質またはＩ−ＡＳＰタンパク質と別のポリペプチド（例えば、タンパク質−タンパク質結合、配列特異的核酸結合を提供もしくは増強し得るポリペプチド（例えば、ＧＡＬ４）、アッセイ条件下でのＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドもしくはＩ−ＡＳＰポリペプチドの安定性を増強し得るポリペプチド、または検出可能部分（例えば、グリーン蛍光タンパク質またはＦｌａｇエピトープ）を提供し得るポリペプチド）との融合物を含むキメラタンパク質が挙げられる。
【０１３５】
アッセイ混合物は、天然の細胞内ＡＳＰ結合標的（例えば、ｐ５３またはＡＳＰと相互作用し得るそのフラグメント）から構成される。天然のＡＳＰ結合標的が用いられ得るとはいえ、ＡＳＰ結合標的の一部（例えば、ペプチドまたは核酸のフラグメント）またはアナログ（すなわち、このアッセイの目的のために天然の結合標的のＡＳＰ結合特性を模倣する薬剤）が、このアッセイにおいて測定され得る、ＡＳＰフラグメントに対する結合親和性および結合アビディティを提供するかぎり、これらの部分またはアナログを用いることが頻繁に好ましい。
【０１３６】
アッセイ混合物はまた、候補の薬理学的薬剤を含む。代表的に、複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対する異なる応答を得るために異なる薬剤濃度を用いて並行に実施される。代表的に、これらの濃度のうちの１つは、ネガティブコントロール、すなわち、その薬剤の濃度０で、またはアッセイの検出限界未満のその薬剤の濃度で、役立てられる。候補薬剤は、多数の化学的クラスを包含するが、代表的に、これらは、有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的薬剤は、低分子有機化合物、すなわち、５０より大きいが約２５００未満の、好ましくは約１０００未満の、そしてより好ましくは約５００未満の分子量を有する化合物である。候補薬剤は、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的相互作用に必要な官能的化学基を含み、そして代表的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を、好ましくは官能性化学基のうちの少なくとも２つを、そしてより好ましくは官能的化学基のうちの少なくとも３つを含む。候補薬剤は、上記で同定された官能基のうちの１以上で置換された、環式炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含み得る。候補薬剤はまた、生体分子（例えば、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造アナログ、またはこれらの組み合わせなど）であり得る。薬剤が核酸である場合、薬剤は代表的にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であるが、本明細書中で定義されるような改変された核酸もまた、意図される。
【０１３７】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から入手される。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含め、多数の手段が、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のために利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然のライブラリーおよび化合物ならびに合成によって産生されるライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段を通して容易に改変され得る。さらに、公知の薬理学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのような指向性化学改変またはランダム化学改変に供されて、この薬剤の構造的アナログが産生され得る。
【０１３８】
種々の他の試薬もまた、この混合物中に含まれ得る。これらとしては、最適なタンパク質−タンパク質結合および／またはタンパク質−核酸結合を促進するために用いられ得る、塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような試薬が挙げられる。このような試薬はまた、反応成分の非特異的相互作用またはバックグラウンド相互作用を減少させ得る。アッセイの効率を改善する他の試薬（例えば、プロテアーゼ、インヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤など）もまた用いられ得る。
【０１３９】
上記のアッセイ材料の混合物は、候補薬理学的薬剤の存在がなければ、それによってＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドが細胞結合標的、その一部またはそのアナログを特異的に結合する条件下でインキュベートされる。成分の添加の順番、インキュベーション温度、インキュベーション時間およびこのアッセイの他のパラメーターは、容易に決定され得る。このような実験は単に、アッセイの根本的組成ではなく、アッセイパラメーターの最適化を含む。インキュベーション温度は代表的に、４℃と４０℃との間である。インキュベーション時間は好ましくは、迅速な高処理能力スクリーニングを促進するために最短にされ、そして代表的には０．１時間と１０時間との間である。
【０１４０】
インキュベーション後、ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドと１以上の結合標的との間の特異的結合の存在または非存在は、使用者に利用可能な任意の便利な方法によって検出される。無細胞結合型アッセイについては、分離工程はしばしば、結合した成分を未結合の成分から分離するために用いられる。分離工程は、種々の方法において達成され得る。便利には、少なくとも１つの成分は固体基材に固定され、この固体基材から、未結合の成分が容易に分離され得る。固体基材は、広範な種々の材料から、広範な種々の形状（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など）で、作製され得る。基材は好ましくは、シグナル対ノイズ比を最大にするように、主に、バックグラウンド結合を最小にするように、ならびに分離の容易さおよび費用の面から選択される。
【０１４１】
分離は例えば、ビーズもしくはディップスティックをレザバから取り出すことによって、レザバ（例えば、マイクロタイタープレートウェル）を空けるかもしくは希釈することによって、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーのカラムもしくはフィルターを洗浄溶液もしくは溶媒でリンスすることによって、もたらされ得る。分離工程は好ましくは、複数回のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体基材がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは、洗浄溶液で数回洗浄され得、この洗浄溶液は代表的には、特異的結合に関与しないインキュベーション混合物成分（例えば、塩、緩衝剤、界面活性剤、非特異的タンパク質など）を含む。固体基材が磁気ビーズである場合、このビーズは、洗浄溶液で１回以上洗浄され得、そして磁石を用いて単離され得る。
【０１４２】
検出は、細胞ベースのアッセイのための任意の便利な手段（例えば、ツーハイブリッドスクリーニングまたはスリーハイブリッドスクリーニング）においてもたらされ得る。標的分子と相互作用するＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドのレポーター遺伝子転写アッセイから得られる転写物は代表的に、直接的または間接的に検出可能な産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、ルシフェラーゼ活性など）をコードする。無細胞結合アッセイについては、成分の１つは通常、検出可能な標識を含むか、または検出可能な標識にカップリングされる。広範な種々の標識（例えば、直接的検出を提供する標識（例えば、放射能、ルミネセンス、光学密度または電子密度など）または間接的検出を提供する標識（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素タグなど））が用いられ得る。標識は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２もしくはＩ−ＡＳＰの結合パートナーに結合され得るか、またはこれらの結合パートナーの構造中に組み込まれ得る。
【０１４３】
標識および他のアッセイ成分の性質に依存して種々の方法を用いて、標識を検出し得る。例えば、標識は、固体基材に結合したままで検出され得るか、または固体基材からの分離後に検出され得る。標識は、光学密度もしくは電子密度、放射能放射、非放射性エネルギー移動などを通して直接的に検出され得るか、または抗体結合体、ストレプトアビジン−ビオチン結合体などを用いて間接的に検出され得る。標識を検出するための方法は、当該分野で周知である。
【０１４４】
本発明は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２もしくはＩ−ＡＳＰに特異的な結合因子、このような因子を同定および作製する方法、ならびに診断、治療および薬学的開発におけるそれらの使用を提供する。例えば、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰに特異的な薬理学的因子は、種々の診断適用および治療適用において、特に、疾患または疾患予後が、ＡＳＰを含む経路の不適切な利用に関連する場合（例えば、アポトーシスなど）、有用である。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰに特異的な新規な結合因子としては、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰに特異的な抗体、およびツーハイブリッドスクリーニングのようなアッセイを用いて同定された他の天然の細胞内結合因子、ならびに化学的ライブラリーのスクリーニングにおいて同定された非天然の細胞内結合因子などが挙げられる。
【０１４５】
一般に、結合因子に対するＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの結合の特異性は、結合平衡定数によって示される。ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドを選択的に結合し得る標的は好ましくは、少なくとも約１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、そして最も好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１の結合平衡定数を有する。広範な種々の細胞ベースのアッセイおよび無細胞アッセイを用いて、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰに特異的な結合を実証し得る。細胞ベースのアッセイとしては、ワンハイブリッドスクリーニング、ツーハイブリッドスクリーニングおよびスリーハイブリッドスクリーニング、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰを媒介する転写が阻害されるかまたは増大するアッセイなどが挙げられる。無細胞アッセイとしては、ＡＳＰ−１タンパク質結合アッセイ、ＡＳＰ−２タンパク質結合アッセイまたはＩ−ＡＳＰタンパク質結合アッセイ、免疫アッセイなどが挙げられる。ＡＳＰ−１ポリペプチド、ＡＳＰ−２ポリペプチドまたはＩ−ＡＳＰポリペプチドを結合する因子をスクリーニングするために有用な他のアッセイとしては、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）および電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）が挙げられる。
【０１４６】
核酸が宿主においてインビトロで導入されるかまたはインビボで導入されるかに依存して、本発明の核酸を細胞へと導入するために種々の技術が用いられ得る。このような技術としては、核酸−ＣａＰＯ４沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに関連した核酸のトランスフェクション、目的の核酸を含むレトロウイルスを用いたトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。特定の使用のためには、核酸を特定の細胞へと標的化することが好ましい。このような例では、本発明の核酸を細胞へと送達するために用いられるビヒクル（例えば、レトロウイルスまたは他のウイルス；リポソーム）は、そこに結合した標的化分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上のレセプターについてのリガンドのような分子は、核酸送達ビヒクルに結合され得るかまたは組み込まれ得る。例えば、リポソームを用いて本発明の核酸を送達する場合、エンドサイトーシスに関連した表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化のためおよび／または取り込みを促進するために、リポソーム処方物中に組み込まれ得る。このようなタンパク質としては、特定の細胞型について向性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、細胞周期進行においてインターナリゼーションされるタンパク質についての抗体、細胞内局在を標的化しかつ細胞内半減期を増強するタンパク質などが挙げられる。ポリマー送達系はまた、当業者によって公知であるように、細胞に核酸を送達するために好首尾に用いられている。このような系はさらに、核酸の経口送達を可能にする。
【０１４７】
投与される場合、本発明の治療組成物は、薬学的に受容可能な調製物で投与される。このような調製物は、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性キャリア、補充免疫増強剤（例えば、アジュバントおよびサイトカイン）および必要に応じて他の治療剤（例えば、化学療法剤）を慣例的に含み得る。
【０１４８】
本発明の治療剤は、従来の経路（注射を含む）または長期間にわたる漸進的な注射のいずれかによって投与され得る。これらの投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔隙内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）、皮下、または経皮であり得る。抗体が、治療的に使用される場合、投与の好ましい経路は、肺性エアロゾルによる。抗体を含むエアロゾル送達系を調製するための技術は、当業者に周知である。一般に、このような系は、この抗体の生物学的特性（例えば、パラトープ結合能）を有意に損なうことがない成分を使用するべきである（例えば、Ｓｃｉａｒｒａ  ａｎｄ  Ｃｕｔｉｅ，「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０，１６９４−１７１２頁；これは、参考として援用される）。当業者は、過度な実験を行うことなく、抗体エアロゾルを生成するための種々のパラメーターおよび条件を容易に決定し得る。本発明のアンチセンス調製物を使用する場合、緩やかな静脈内投与が好ましい。
【０１４９】
本発明の組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独またはさらなる用量とともに、所望の応答を生成する組成物の量である。特定の疾患（例えば、癌）を処置する場合、この所望の応答は、この疾患の進行を阻害することである。これは、この疾患の進行を一過的に遅延することのみに関し得るが、より好ましくは、これは、この疾患の進行を永続的に停止することに関する。これは、慣例的な方法によって、モニターされ得るか、または本明細書中で議論される本発明の診断的方法に従って、モニターされ得る。
【０１５０】
このような量は、当然、処置される特定の状態、この状態の重篤度、個々の患者のパラメーター（年齢、身体状態、サイズおよび体重を含む）、処置の持続期間、（存在する場合）同時治療の性質、投与の特定の経路および開業医の知識および専門技術の範囲内の同様の因子に依存する。これらの要因は、当業者に周知であり、慣例的な実験以下で取り組まれ得る。個々の成分およびその組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全用量が使用されることが一般に好ましい。しかし、患者は、医学的理由、生理学的理由のために、または、実質上の他の理由によってのより低い用量または耐性用量を要求し得ることが当業者によって、理解される。
【０１５１】
前述した方法で使用される薬学的組成物は、好ましくは、無菌状態であり、そして、患者に対して投与されるために適切な質量または容量の単位で所望の応答を生じるための、有効量のＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、もしくはＩ−ＡＳＰまたはＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、もしくはＩ−ＡＳＰをコードする核酸を含む。この応答は、例えば、本発明に記載されるようなレポーター系を介し、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰの組成物による増大または阻害されたシグナル伝達を決定するこによって、下流における効果（例えば、遺伝子発現）を測定することによって、または、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、もしくはＩ−ＡＳＰの組成物の生理学的効果（例えば、腫瘍の後退、疾患症状の減少、アポトーシスの調節など）を決定することによって測定され得る。同様に、アンチセンスＡＳＰ−１分子、アンチセンスＡＳＰ−２分子、またはアンチセンスＩ−ＡＳＰ分子の効果は、アンチセンス組成物が添加される細胞中での個々の遺伝子の発現を測定することによって容易に決定され得る。他のアッセイは、当業者に周知であり、そしてこの応答のレベルを測定するために使用され得る。
【０１５２】
被験体に投与されるＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰのポリペプチドまたは核酸の用量は、異なるパラメーターに従って、特に使用される投与様式および被験体の状態に従って選択され得る。他の要因としては、処置の所望の期間が挙げられる。被験体における応答が、適用された初期の用量において不十分である場合、より高用量の（または、異なった、より局在化した経路による有効的により高用量）が、患者の許容が可能となる程度まで使用され得る。
【０１５３】
一般に、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰの用量が、標準的な当該分野の手順に従って、１ｎｇと１ｍｇとの間の用量、そして好ましくは１０ｎｇと１００μｇとの間の用量で処方され、そして投与され得る。
【０１５４】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰをコードする核酸またはその改変体を使用して、１ｎｇと０．１ｍｇとの間の用量が、一般に、標準的な手順に従って、処方され、そして投与される。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰの組成物を投与するための他のプロコトルは、当業者に公知であり、ここで、この用量、注射のスケジュール、注射の部位、投与の様式（例えば、腫瘍内）などが前述のものから変化する。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰの組成物をヒト以外の哺乳動物に投与すること（例えば、試験目的または獣医学的治療目的で）は、上記と実質的に同じ条件下で実行される。被験体は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物、好ましくはヒトであり、そしてこれは、非ヒトの霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類を含む。
【０１５５】
投与される場合、本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な量で適用され、かつ薬学的に受容可能な組成物で適用される。この用語「薬学的に受容可能」とは、この活性成分の生物学的活性の効力を妨害しない非毒性の物質であることを意味する。このような調製物は、慣例的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性キャリア、おおび必要に応じた他の治療剤を含み得る。医薬品において使用される場合、この塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、非薬学的に受容可能な塩は、利便性のために使用され得、その薬学的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得、そして本発明の範囲から排除されることはない。このような薬理学的および薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またカルシウム塩）として調製され得る。
【０１５６】
ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの組成物は、所望される場合、薬学的に受容可能なキャリアと併用され得る。この用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書中で使用される場合、ヒトの投与に適した１以上の適合性の固体または液体の充填剤、賦形剤またはカプセル化された物質を意味する。この用語「キャリア」は、それと共に活性成分が組み合わされて、適用を促進する、天然または合成の有機成分または無機成分を示す。この薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的な効力を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で本発明の分子およびお互いと共に混合され得る。
【０１５７】
薬学的組成物は、適切な緩衝剤を含み得、この緩衝剤としては、以下が挙げられる：塩としての酢酸；塩としてのクエン酸；塩としてのホウ酸；および塩としてのリン酸。
【０１５８】
薬学的組成物はまた、必要に応じて、適切な保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；バラベン；およびチメロサール）を含み得る。
【０１５９】
薬学的組成物は、便宜的に単位投薬形態で提供され得、そして製剤学の当該分野で周知な方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法が、活性薬剤を、１以上の付属的な成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、この組成物は、活性化合物を液体キャリア、細かく分割した固体キャリア、またはそれらの両方と一様かつ完全に会合させ、その後必要な場合この生成物の形状を整えることによって調製される。
【０１６０】
経口投与のために適切な組成物は、別個の単位（例えば、カプセル、錠剤、舐剤）として調製され得、各々は予め決定された量の活性化合物を含み得る。他の組成物としては、水性液体または非水性液体の懸濁液（例えば、シロップ、エリキシル、またはエマルジョン）が挙げられる。
【０１６１】
非経口投与について適切な組成物は、都合よくは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、またはＩ−ＡＳＰのポリペプチドまたは核酸の無菌である水性または非水性の調製物を含み、この調製物は、好ましくは、受容者の血液と等張性である。この調製物は、適切な分散剤または湿潤剤ならびに懸濁剤を使用する公知の方法に従って処方され得る。この無菌注射可能である調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、無菌の、固定油は、従来から、溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、任意の刺激の強くない固定油が使用され得、そして、これは、合成モノグリセリドまたはジグリセリドであり得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注入可能な調製物として使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与などに適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され得る。
【０１６２】
本発明の別の局面において、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰのポリペプチドまたは核酸は、アポトーシスを調節する医薬品の製造において使用される。この医薬品は、バイアル中に配置され得、そしてキットに組み込まれ得、被験体を処置するために使用される。特定の実施形態において、同じ応答を調節するか、有利にＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの組成物を与える他の医薬品（例えば、化学療法剤）はまた、同じキット中に備えられる。このキットは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２またはＩ−ＡＳＰの組成物を投与する方法についての指示書または他の印刷物、ならびにこのキットの任意の他の構成要素を含み得る。
【０１６３】
本発明の実施形態は、例としてのみ本明細書中で記載され、そして以下の実施例および図および表を参照して記載される。
【０１６４】
（実施例１）
ＡＳＰファミリーがインビボでどのように機能するのかを理解するために、本発明者らはノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の組織分布を調査した。図２ａおよび２ｂに示すように、ＡＳＰ−１  ｍＲＮＡおよびＡＳＰ−２  ｍＲＮＡの両方は、それぞれ５．５ｋｂ〜５ｋｂのサイズの単一の転写物を用いて試験した、全てのヒト組織において発現した。しかし、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現レベルは変化する。ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の最も高い発現レベルは心臓、骨格筋および腎臓において検出された。興味深いことに、ＡＳＰ−１とＡＳＰ−２との間の発現パターンの間には、小さな差異が存在する。ＡＳＰ−１について、最も高い発現レベルは、心臓においてであり、腎臓および骨格筋で見られるよりも有意に高かった。対照的に、ＡＳＰ−２の発現レベルは、心臓、骨格筋および腎臓において同様である。さらに、ＡＳＰ−１の相対的に高い発現レベルがまた、ヒト肝臓組織において見られた。
【０１６５】
（実施例２）
ＡＳＰファミリーメンバーの、ＡＳＰのｍＲＮＡレベルにおける特異的な組織分布パターンが存在することを知ったので、それらの発現がタンパク質レベルでどのように制御されるのかを調査することが重要であった。本発明者らは、ＡＳＰ−２に対する抗体を生成するためにＧＳＴ融合タンパク質を用いた。ＡＳＰ−２のアミノ酸６９８〜１１３５にわたるコード領域を、細菌発現プラスミドｐＧＥＸ  ２ＴＫのＥｃｏＲ１部位にサブクローニングした。７４ｋＤａのＧＳＴ−ＡＳＰ−２（６９８〜１１３５）タンパク質を、図３Ａに示すように生成した。ＧＳＴ−５３ＢＰ２タンパク質を、ウサギ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびマウスを免疫するために用いた。ウサギおよびマウスに由来する免疫した血清を、ＡＳＰ−２フラグメント、ｐＣＭＶ  Ｂａｍ  ｎｅｏ  ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２（６０７〜１１３５）の発現プラスミドでトランスフェクトしたＳａｏｓ−２細胞の細胞溶解物を用いて試験した。プラスミドを、ＢａｍＨ１制限部位で９Ｅ１０のエピトープタグを含むＡＳＰ−２のＰＣＲフラグメントを挿入することによって構築した。ＡＳＰ−２発現プラスミドｐＣＭＶ  Ｂａｍ  ｎｅｏ  ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２（６０７〜１１３５）またはコントロールベクターでトランスフェクトしたＳｏａｓ−２溶解物を用いて、ウサギポリクローナル抗体ｐＡｂＡＳＰ−２／７７およびマウスモノクローナル抗体ＤＸ５４−１０およびＤＺ５４−７の特異性を確認した。図３Ｂに示すように、マウスモノクローナル抗体ＤＸ５４．１０は、Ｓａｏｓ−２細胞においてＧＳＴタンパク質と交差反応せず、トランスフェクトしたＡＳＰ−２発現タンパク質を認識し得た。ＤＸ５４．１０は、ＧＳＴ−ｐ２７融合タンパク質ではなく、トランスフェクトしたＡＳＰ−２タンパク質およびＧＳＴ−ＡＳＰ−２タンパク質のみを認識し、それゆえＡＳＰ−２に特異的である。
【０１６６】
モノクローナル抗体は、トランスフェクトしたＳａｏｓ−２細胞において、ＡＳＰ−２に非常に特異的であるので、本発明者らが、最初に内因性ＡＳＰ−２の発現を調査することを可能にした。抗体への反応性バンドが、真の内因性ＡＳＰ−２であることを確実にするために、抗ＡＳＰ−２モノクローナル抗体ＤＸ５４．１０上清を、グルタチオンビーズに接着させたＧＳＴタンパク質またはグルタチオンビーズに接着させたＧＳＴ−５３ＢＰ２（６９８〜１１３５）タンパク質のいずれかを用いて処置した。このビーズを回転板上で１時間、上清とともにインキュベートした。その後、このビーズを回収し、そして廃棄した。ビーズを新しいビーズで計３回、置換した。図３Ｃは、トランスフェクトしたＡＳＰ−２／５３ＢＰ２フラグメント（６０７〜１１３５）および特異的なタンパク質のバンドが、ＧＳＴ−ＡＳＰ−２ビーズとともにインキュベートしたビーズではなく、ＧＳＴビーズとともにインキュベートした上清に由来する抗体によって認識されたことを示す。これらの結果は、２９３細胞およびＴｅｒｏ細胞に由来する全細胞溶解物において認識されたタンパク質が、真の内因性ＡＳＰ−２であり、そしてモノクローナル抗体ＤＸ５４−１０がこのタンパク質に非常に特異的であることを証明した。
【０１６７】
（実施例３）
上記の抗ＡＳＰ−２抗体を用いて、本発明者らは、ｐ５３およびＡＳＰ−２との間の相互作用がインビボで生じるか否かを、外因性に発現したタンパク質を用いて最初に試験した。発現プラスミドをＳａｏｓ−２細胞にトランスフェクトし、そして免疫沈降を、抗ＡＳＰ−２抗体ＤＸ５４．１０またはコントロール抗体ｐＡｂ４２３（ＳＶ４０ラージＴ抗原に対する抗体）を用いて実施した。ｐ５３およびＡＳＰ−２の免疫複合体のウエスタンブロット分析は、これらのタンパク質がインビボで相互作用することを最初に示した（図４Ａ）。コントロール抗体は、ｐ５３もＡＳＰ−２もどちらも引き降ろさなかったので、この相互作用は特異的であった。図４Ａに示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、内因性ＡＳＰ−２とトランスフェクトしたＡＳＰ−２（ｂＢＰ２（１３０〜１１３５）としてまた知られている）タンパク質の移動のとの間は一致しなかった。この１つの解釈は、ｂＢＰ２の元々の配列から見出され得る（ＮａｕｍｏｖｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙ，１９９６）。このヌクレオチド配列は、５３ＢＰ２／ｂＢＰ２  ｃＤＮＡヌクレオチドの位置５７１および７５７に、２つの潜在的なＡＴＧコドンが存在することを示す。この７５７コドンは、インビトロで転写−翻訳に連結する好ましい開始部位であることが示された。これは、１００５アミノ酸残基のサイズのタンパク質を予測する。それゆえ、５３ＢＰ２／ｂＢＰ２の発現プラスミドを、開始部位としてヌクレオチド７５７を用いて構築した（ＮａｕｍｏｖｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙ，１９９６）。しかし、図４ａに示す結果に基づくと、実際のタンパク質の翻訳開始部位が、インビボで７５７コドンではないことは明らかである。ＢＬＡＳＴ探索を実施するためにｂＢＰ２配列の５’末端を用いて、本発明者らは、ｂＢＰ２の配列の４１２〜５１４ｂｐが、ベクター配列（ｂＢＰ２／５３ＢＰ２のＥＭＢＯ登録）に対して、非常に高い相同性を有することを発見した。本発明者らは、ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２プラスミドのこの領域を再び配列決定し、そしてこの配列のこの領域が、図４Ｂに示す配列内に存在しないことを証明した。このデータベースのｂＢＰ２配列の４１２〜５１４ｂｐの領域内に終止コドンが存在するが、この部分の配列は存在しないので、本発明者らは、ＡＳＰ−２の開始部位は確かに７５７の上流であると予想した。本発明者らが（ヒトＡＳＰ−２  ｃＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを実施することにより）得たマウスＡＳＰ−２の一部分を比較することによって、本発明者らは、ＡＳＰ−２の開始部位が、新しいＡＳＰ−２  ｃＤＮＡ配列の２４６ｂｐであると考える。これは、１１３５アミノ酸長のＡＳＰ−２タンパク質を生成し、予想外に大きな内因性タンパク質の説明となる。
【０１６８】
これをさらに調査するために、ＡＴＧ開始部位（２４１および７５７）の両方を含む５３ＢＰ２／ｂＢＰ２  ｃＤＮＡを、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３中にサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２（１〜１１３５）を、Ｓａｏｓ−２細胞中にトランスフェクトし、そして内因性および外因性のＡＳＰ−２の両方の発現を、抗ＡＳＰ−２抗体ＤＸ５４−１０によって検出した。図４Ｃに示すように、ｐｃＤＮＡ３−ＡＳＰ−２（１〜１１３５）から発現したＡＳＰ−２は、内因性ＡＳＰ−２の分子量と同様に低分子量で移動した。この結果から、本発明者らは、内因性ＡＳＰ−２が第一のＡＴＧを用い、そして全長のＡＳＰ−２が１１３５アミノ酸からなることを結論付ける。これ以下に示す結果から、それら自体の実際の配列に対応する明快なクローン名が必要となった。従って、本発明者らは、１１３５のアミノ酸を含む全長タンパク質を表すためにＡＳＰ−２の名称を使用した。本発明者らは、１３０〜１１３５アミノ酸および６０７〜１１３５アミノ酸を含むタンパク質のそれぞれを表すために、ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２およびＡＳＰ−２／５３ＢＰ２を用いた。
【０１６９】
内因性ＡＳＰ−２に加えて、ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２はまた、インビボでｐ５３と相互作用し得た（図４Ａ）。
【０１７０】
（実施例４）
ｐ５３は、ｍｄｍ−２、ＢａｘおよびサイクリンＧを含むより多くの標的遺伝子をトランス活性化する転写因子である。他方、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２は、ｐ５３の中央ＤＮＡ結合領域に結合することによって、インビトロでｐ５３のＤＮＡ結合活性を阻害し得るので、元来、ｐ５３のインヒビターとして単離された（Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３）。つまり、ｐ５３に関して、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２は、ＳＶ４０  ＤＮＡ腫瘍ウイルスのラージＴ抗原の細胞内同等物であり得る。次いで、ＡＳＰ−２がオンコジーン活性を有することを予測した。しかし、ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２の動向は、活性を増強するよりもむしろ増殖抑制を与えることを証明した（ＮａｕｍｏｖｓｋｉおよびＣｌｅａｒｙ，１９９６）。この矛盾は、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２の元々のクローンが、このタンパク質のＣ末端位置のみを含むという事実に起因し得る。全長のＡＳＰ−２タンパク質は、そのＣ末端フラグメントＡＳＰ−２／５３ＢＰ２とは異なるｐ５３に対する影響を有する可能性がある。本発明者らはまた、ＡＳＰ−１がｐ５３の活性に対してどんな影響を有するのか知らない。
【０１７１】
ＡＳＰファミリーメンバーの有するｐ５３の活性に対する影響を決定するために、本発明者らは最初に一過性レポーターアッセイにおいてｐ５３依存性転写活性を研究した。ｐ５３を有さない細胞に、以下の５つのｐ５３レポータープラスミドでトランスフェクトした：ｍｄｍ−２、Ｂａｘ、サイクリンＧおよびｐ２１Ｗａｆ−１（全て、ｐ５３標的遺伝子プロモーターに由来する）ならびにＰＧ（ルシフェラーゼ遺伝子の発現に連結する合成プロモーター構築物である）。インビトロでのＤＮＡ結合アッセイおよび変異体ｐ５３転写活性機能の研究は、既知のｐ５３結合部位のいくつかを２群に分けた（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９６）。Ｂａｘ様部位は通常、ｐ５３転写刺激について弱いが、ｍｄｍ２様部位は、ｐ５３によって非常に効果的に刺激され得る。興味深いことに、ｐ５３と一緒のＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の同時発現は、Ｂａｘプロモーターの刺激を１０〜５０倍にした。Ｂａｘプロモーターと対照的に、ｐ５３とのＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のいずれかの同時発現は、ｍｄｍ２およびサイクリンＧのプロモーター活性の非常に控えめな刺激を示すのみであった（図５Ａ）。ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２は、ｍｄｍ２プロモーターおよびサイクリンＧプロモーターを刺激することに失敗したが、ｐ２１ｗａｆ１プロモーターおよびＰＧ合成プロモーターに対するわずかな刺激が見られた。
【０１７２】
ｍｄｍ２ではなくＢａｘのプロモーター活性を特異的に刺激するＡＳＰ−２／５３ＢＰ２の能力は、ｐ５３のプロモーター特異性を細胞中で調節し得ることを、最初に示した。Ｂａｘは、アポトーシス促進性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）のｐ５３標的遺伝子の１つであるので、それゆえ、本発明者らは、ＡＳＰファミリーメンバーが他のｐ５３標的遺伝子（アポトーシスを促進することに関わることがまた、公知である）のトランス活性化を特異的に刺激し得るか否かを尋ねた。１つのこのような遺伝子はＰＩＧ−３である。図５Ａに示す一過性トランスフェクションレポーターアッセイを用いて、本発明者らは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の両方が、ＰＩＧ−３のプロモーター活性を特異的に刺激し得ることを証明し得た。
【０１７３】
ｐ５３の転写活性機能が、一般的な転写コアクチベーターｐ３００／ＣＢＰによって同時活性化され得ることが最近証明された。従って、ＡＳＰファミリーメンバーがｐ５３に特異的ではなく、そして多くの転写因子を刺激し得るｐ３００／ＣＢＰ様タンパク質に似た作用をするのか否かを決定することが、本発明者らにとっての目的となった。本発明者が試験した転写因子の１つがＥ２Ｆ１であった。ｐ５３と同様に、Ｅ２Ｆ１のトランス活性化機能は、ｐ３００／ＣＢＰの同時発現によって刺激され得る。しかし、Ｅ２Ｆ１とＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の同時発現は、いくつかの公知のレポータープロモーター（サイクリンＡ、ｂ−ｍｙｂおよび合成プロモーター３ｘｗｔが挙げられる）に対するそのトランス活性化機能を刺激できなかった（図５Ｂ）。この結果は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、ｐ５３のトランス活性化機能を特異的に刺激することを強く示唆する。一般的な転写コアクチベーターｐ３００／ＣＢＰは、ｐ５３およびＥ２Ｆ１の両方に結合し、そして転写活性を刺激し得るので、この結果はまた、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の両方がｐ３００／ＣＢＰに独立してｐ５３のトランス活性化機能を刺激し得ることを意味する。
【０１７４】
（実施例５）
ＡＳＰの同時発現が、ｐ５３のトランス活性化機能を特異的に刺激し得ることを知ったので、このような活性のために必要とされるＡＳＰの最小領域を同定することが、本発明者らにとって重要であった。それゆえ、本発明者らは、ｐ５３のトランス活性化機能に対するそれらの影響について、３つの異なるバージョンのＡＳＰ−２を試験した。予想したように、全長のＡＳＰ−２（１１３５ａａ）の同時発現は、さらにｐ５３のトランス活性化機能を約７倍刺激し得た。興味深いことに、同様の条件下では、ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２（１０５５ａａ）の同時発現のみが、ｐ５３のトランス活性化機能を約２倍刺激した。さらに、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２（６０７〜１１３５）の同時発現は、約５０％トランス活性化機能を減少させた（図６）。ＡＳＰ−２／ｂＢＰ２によるｐ５３のトランス活性化機能を刺激できなかったことは、発現の欠損に起因しなかった（図６Ａ、下のパネル）。従って、ＡＳＰ−２の最初の１３０アミノ酸のみを欠損するＡＳＰ−２／ｂＢＰ２は、ｐ５３のトランス活性化機能を有意に刺激できなかった。これらのデータは、全長タンパク質（１〜１１３５ａａ）が、ｐ５３のトランス活性化機能をＡＳＰ−２が増強するために必要とされることを示唆する。ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２により減少したｐ５３のトランス活性化機能は、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２が、ｐ５３に対する内因性ＡＳＰ−２の作用を阻害するために、ドミナントネガティブ変異体として作用し得ることを示唆する。
【０１７５】
（実施例６）
ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、ＢａｘおよびＰＩＧ−３のプロモーターに関してｐ５３のトランス活性化機能を特異的に刺激し得ることを知ったので、同時発現した場合にＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２が、アポトーシスを誘導するためにｐ５３と相乗作用を示し得ることを予期した。ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のアポトーシス促進性機能が、ｐ５３のトランス活性化機能を刺激するそれらの能力を介する場合、Ｂａｘ自体のアポトーシスの機能に関してほとんど影響を有さないという仮説をまた、立てた。これらの仮説を、ｐ５３を有さず、そしてまたＡＳＰ−２を相対的に低レベルで発現する、Ｓａｏｓ−２細胞で試験した。この実験において使用した（トランスフェクトした細胞の約１７％にアポトーシスを実行させるほどの）ｐ５３の量を、滴定によって決定した。アポトーシスを、同時トランスフェクトした細胞表面マーカーＣＤ２０の発現によって同定した。興味深いことに、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２単独の発現は、低レベルのアポトーシスを生じ、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のいずれか単独が、Ｂａｘプロモーター活性をわずかに増強し得る（おそらく、ｐ７３およびｐ６３に対するＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の影響に起因する）という観察に矛盾しない。しかし、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２とのｐ５３の同時発現は、アポトーシスで死滅した多くの細胞で有意に増加させた。トランスフェクトした細胞のおよそ５０％がすぐにアポトーシスで死滅した（図７Ａ）。Ｅ２Ｆ１とのＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のいずれかの同時発現が、アポトーシスで死滅する細胞の割合におけるさらなる増加のみを生じるので、アポトーシスの増強におけるこの相乗的影響はｐ５３に特異的であった（図７Ｂ）。
【０１７６】
本発明者らはまた、ＡＳＰがｐ５３のトランス活性化機能を増強することにより、ｐ５３のアポトーシス機能を刺激し得るという仮説を試験するために、ＡＳＰ−２変異体、ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２を用いた。ＡＳＰ−２／５３ＢＰ２は、ｐ５３のＢａｘプロモーターに関するｐ５３トランス活性化機能のためのＡＳＰ−２刺激を阻害することを示した。それゆえ、ＡＳＰ−２およびＡＳＰ−２／５３ＢＰ２の両方がｐ５３と同時発現する場合に、ｐ５３のアポトーシス機能が増強されないことを予期した。これをこの場合に実際に証明した。ＡＳＰ−２およびｐ５３が同時発現した場合、細胞の５０％はアポトーシスであった。しかし、ｐ５３、ＡＳＰ−２およびＡＳＰ−２／５３ＢＰ２が全て同時発現した場合、細胞の３０％のみがアポトーシスであった。従って、ＡＳＰ−２は、そのトランス活性化機能を増強することによってｐ５３のアポトーシス機能のみを増強し得る（図７Ｃ）。
【０１７７】
本発明者らはまた、ｐ５３ファミリーメンバーであるｐ７３およびｐ６３のアポトーシス機能に関するＡＳＰの影響を研究した。この結果を図７Ｄに示す。ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のいずれかの同時発現は、ｐ５３ファミリーの全メンバーのアポトーシス機能を増強する。これらの結果は、ＡＳＰファミリーが新規の腫瘍抑制ファミリーであり得ることを示す。
【０１７８】
（実施例７）
最近単離された配列のｒｅＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＡＩ）を、３１５アミノ酸を含むｐ６５  ｒｅｌ  Ａ結合タンパク質として同定した。これは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のＣ末端の半分に配列相同性を有する（図８Ａ）。これは以下の特性において、ＡＳＰ−２変異体、５３ＢＰ２／ＡＳＰ−２（６００〜１１２８）に類似する。ＲＡＩは、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のα−ヘリカルドメインを有さないが、プロリンリッチドメイン、アンキリンリピートおよびＳＨ３ドメインを含む。ＡＳＰ−２のｐ５３接触残基はまた、ＲＡＩにおいて保存される。本発明者らがＩ−ＡＳＰと名付けたＲＡＩの活性を調査するために、本発明者らは、このコード配列を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３中にクローニングした。本発明者らはまた、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２に対して配列類似性を有さないＩ−ＡＳＰにおいて見い出した、ペプチド（ＲＬＱＰＡＬＰＰＥＡＱＳＶＰＥＬＥＥ）を合成した。この特有なＩ−ＡＳＰペプチドに対して特異的なマウス抗体は、ＡＳＰ−１もＡＳＰ−２もどちらにも交差反応しなかった（データは示していない）。このマウス抗Ｉ−ＡＳＰ特異的抗体を、Ｓａｏｓ−２細胞にトランスフェクトしたＩ−ＡＳＰを免疫沈降するために用いることによって、本発明者らは、Ｉ−ＡＳＰがまたｐ５３と相互作用し得ることを証明することを可能にした（図８Ｂ）。ＡＳＰ−２変異体、５３ＢＰ２／ＡＳＰ−２（６００〜１１２８）と同じく、Ｉ−ＡＳＰの発現は、それ自体、アポトーシスを誘導しなかった。Ｉ−ＡＳＰがｐ５３と同時発現した場合、ｐ５３のアポトーシス機能に対するわずかな阻害性の影響を有した。ｐ５３のアポトーシス機能に対するＩ−ＡＳＰの最も重要な影響は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が同時発現した場合に観察された。本発明者らの予想に一致して、Ｉ−ＡＳＰの同時発現は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２により引き起こされる増強したｐ５３のアポトーシス機能を阻害した（図８Ｃ）。同様に、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２と一緒のＩ−ＡＳＰの同時発現は、Ｂａｘプロモーターに対するｐ５３のトランス活性化機能を刺激する、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の両方の能力を完全に廃止し得た（図８Ｄ）。Ｉ−ＡＳＰの同時発現は、ｐ５３もＡＳＰもどちらの発現レベルも有意に変化させなかった（図８Ｅ）。これらの結果は、インビボでのＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のアポトーシス促進性機能が、天然のインヒビターＩ−ＡＳＰにより調節され得ることを示した。従って、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２とＩ−ＡＳＰとの間の発現レベルのバランスは、細胞の運命を決定し得る（すなわち、細胞が生存するかまたは死滅するか）。
【０１７９】
（実施例８）
最近の研究は、いくつかのｐ５３のアポトーシス欠損変異体が、多くのｐ５３標的遺伝子（Ｂａｘ、ＰＩＧ−３およびＩＧＦ−ＢＰ３のようなアポトーシス促進性遺伝子ではなく、ｍｄｍ２およびｐ２１ｗａｆ１が挙げられる）のプロモーターを転写活性し得ることを証明している。全てのｐ５３変異体の研究のうちで、それらのうちの２つ（１８１Ｌおよび１８１Ｃ）は、特に興味深い。残基１８１でのｐ５３の変異は、胸部癌および子宮頸部癌を含む多くのヒト腫瘍型において報告されている。ｐ５３および５３ＢＰ２の結晶構造から、ｐ５３の残基１８１を５３ＢＰ２に対するｐ５３内の接触部位の１つとして同定したが、これはＤＮＡの接触部位ではなかった。この結晶構造の結果からの予想と一致して、以前の研究は、１８１Ｌおよび１８１Ｃの両方がＤＮＡに結合し得、そしてｍｄｍ２およびｐ２１ｗａｆ１のようなｐ５３標的遺伝子の多くのプロモーターをトランス活性化し得ることを示している。しかし、興味深いことに、両方の変異体は、アポトーシスを誘導する能力または形質転換を抑制する能力が減少している。ＡＳＰおよびｐ５３の相互作用がｐ５３のアポトーシス機能を特異的に増強し得るので、本発明者らは、１８１Ｌおよび１８１Ｃの減少したアポトーシス機能が、（アポトーシスを誘導するＡＳＰとの同時作動に対する）これら２つのｐ５３変異体における何らかの種類の欠損に起因し得ることを仮定した。それゆえ、本発明者らは、２つのｐ５３腫瘍由来変異体（１８１Ｌおよび１８１Ｃ）のアポトーシス機能に関するＡＳＰの影響を試験した。図９Ａに示すように、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の同時発現が、いずれかのｐ５３変異体のアポトーシス機能を増強できず、同じ実験にもかかわらず、ＡＳＰの同時発現は、野生型ｐ５３のアポトーシス機能を有意に増強した。その後、本発明者らはまた、ｐ５３変異体のトランス活性化機能に関するＡＳＰの影響を試験した。残基１８１の変異がｐ５３のアポトーシス機能を活性化するＡＳＰの能力を阻害し得るという観察と一致して、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の同時発現は、変異体ｐ５３（Ｂａｘ遺伝子プロモーター上の１８１Ｃ）のトランス活性化機能を刺激し得なかった。ｐ５３変異体１８１Ｌに対するＡＳＰの影響はまた同様であった（図９Ｂ）。ｐ５３変異体の活性を刺激するＡＳＰの無能力さは、タンパク質発現の欠損に起因しなかった（図９Ｃ）。これらの全ての結果は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の、アポトーシス促進性遺伝子に関する２つのｐ５３変異体のトランス活性化機能を刺激できないことが、これら２つの変異体ｐ５３分子がアポトーシス誘導において欠損する分子メカニズムを提供し得ることを示す。これらはまた、ｐ５３のこの部位の変異がなぜヒト腫瘍のいくつかにおいて選択されるのかを説明し得る。本明細書中に示す結果はまた、ｐ５３の腫瘍抑制機能に関するＡＳＰの同時活性化機能の重要性を証明する。
【０１８０】
（実施例９）
ｐ５３上にある同定された５３ＢＰ２接触残基の４つ全てが、ヒト腫瘍において変異していることを見出した。ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現が、ｐ５３のアポトーシス機能を有意に増大させ得ることを知った上で、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現レベルは、野生型ｐ５３を発現するヒト腫瘍においてダウンレギュレートされることが予想された。これと一致して、ＡＳＰ−２発現のダウンレギュレーションは、遺伝子分析における高度に悪性のヒト乳癌の１つの場合において見出されている。さらなるインビボでの証拠を提供するために、本発明者らは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して、４０人の乳癌患者に由来する対になった正常および腫瘍ＲＮＡサンプルのパネルにおいて、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の両方の発現レベルを研究した。４０個全ての乳癌が野生型ｐ５３を発現したことに注目することは重要である。ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現レベルは、頻繁に、ヒト乳癌においてダウンレギュレートされた（表Ｉおよび図９Ｄにおける代表的データ）。４０個の癌サンプルのなかで、２４個がＡＳＰ−１を発現し、そして９個がＡＳＰ−２を発現した。興味深いことに、８／９の腫瘍であってＡＳＰ−２の発現が減少したものが、ＡＳＰ−１の発現も減少していたことも注目された。この発現パターンは、ＡＳＰ−１の発現のダウンレギュレーションの選択的圧力がＡＳＰ−２のそれよりも高いことを示唆した。これは、試験された４０個の乳癌において、ＡＳＰ−１の有意な減少（シグナルの７５％の減少よりも大きい）または発現欠如の頻度が、ＡＳＰ−２について検出されたものより高かった（それぞれ６０％、および２２．５％）事実と一致する。この結果は、同じ個体由来の正常組織および癌の間でＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現レベルを比較することによって得られたので、腫瘍細胞がＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現を損失することに選択的利点が存在することを実証した。これらの結果は、ＡＳＰ−結合損傷ｐ５３変異体１８１Ｌおよび１８１Ｃが、ＡＳＰの存在下でさえ、効率的にアポトーシスを誘導し得ないという上記の観察と一致する。これは、タンパク質のＡＳＰファミリーが、ヒト乳癌において腫瘍抑制的役割を有するという考えと一致する。
【０１８１】
ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２とは対照的に、Ｉ−ＡＳＰの発現レベルは、試験された正常サンプルおよびヒト乳癌組織サンプルにおいて、一般に低かった。しかし、Ｉ−ＡＳＰの過剰発現は、それらの正常対コントロールと比較して、腫瘍組織の８個において検出された（表１および図９Ｄ）。最も著しい現象は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の正常発現のＩ−ＡＳＰの過剰発現との相関であった。Ｉ−ＡＳＰ過剰発現腫瘍の７個は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２発現のいかなるダウンレギュレーションをも有していなかった（表１）。この結果は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のインビボでの天然のインヒビターとしての、Ｉ−ＡＳＰの生物学的重要性についての議論を支持する。
【０１８２】
（実施例１０）
内因性ＡＳＰファミリーメンバーが内因性ｐ５３によって誘導されるアポトーシスの調節において果たす役割を研究するために、本発明者らは、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２を、野生型ｐ５３を発現する細胞株Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ７中に導入した。これらの細胞において発現された場合、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２は、アポトーシスを誘導した（図１２Ａ）。ヒトパピローマウイルスに由来し、そしてｐ５３に結合し、これを分解のために特異的に標的とし得る、ウイルスの腫瘍性タンパク質Ｅ６は、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２により誘導されたアポトーシスを阻害し、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２がｐ５３依存性アポトーシスを誘導し得ることを実証した。
【０１８３】
本発明者らはまた、ＤＮＡ損傷に応答して内因性ｐ５３により誘導されるアポトーシスの阻害における５３ＢＰ２およびＩ−ＡＳＰの優勢の負の機能（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を研究した。シスプラチンへの曝露の前に、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ７細胞を、ＨＰＶ１６、Ｅ６、Ｉ−ＡＳＰ、または５３ＢＰ２をコードするプラスミドでトランスフェクトした。次いで、シスプラチンでの処理に応答してアポトーシスで死んでゆくトランスフェクトした細胞の百分率（％）を、ＦＡＣＳ分析により決定した（図１２Ｂ）。シスプラチンでの処理により、２０％を超えるトランスフェクト細胞がアポトーシスで死滅した。Ｅ６の発現は、アポトーシス細胞の割合を１５％未満に減少させた。これは、シスプラチンが、Ｕ２ＯＳ細胞において、ｐ５３依存性アポトーシスを誘導することを示唆する。これと一致して、Ｉ−ＡＳＰまたは５３ＢＰ２の発現は、シスプラチン誘導アポトーシスを、Ｅ６と同様な程度まで阻害し得る。これらの結果は、内因性ｐ５３のアポトーシス機能が、ＡＳＰファミリーメンバーの発現により調節され得ることを示唆する。
【０１８４】
内因性ＡＳＰファミリーメンバーが、ｐ５３のアポトーシス機能を調節するにおいて有意な役割を果たすことをさらに実証するために、本発明者らは、アンチセンスアプローチを使用した。本発明者らは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、およびＩ−ＡＳＰ  ｃＤＮＡの５’末端からのフラグメントを、哺乳動物発現ベクター中に、アンチセンス方向でクローニングし、そしてそのアンチセンスＲＮＡが、ＡＳＰファミリーメンバーのタンパク質合成を特異的に阻害する能力をインビトロで試験した（データ示さず）。アンチセンスＡＳＰ−１の発現は、ＡＳＰ−１によって誘導されたアポトーシスを阻害したに過ぎず、ＡＳＰ−２によって誘導されたアポトーシスは阻害しなかった。同様に、アンチセンスＡＳＰ−２の発現が、ＡＳＰ−２によって誘導されたアポトーシスのみを阻害したが、ＡＳＰ−１によって誘導されたものは阻害しなかった。アンチセンスＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の特異的効果は、アンチセンスＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の同時発現が、同じ条件下でＢａｘによって媒介されたアポトーシスに影響を与えなかったという観察によりさらに支持された（図１２Ｃ）。それゆえ、ＤＮＡ損傷に対応する内因性ｐ５３のアポトーシス機能を調節することにおける内因性ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の役割を研究することを可能にした。Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７細胞を、シスプラチンでの処理の前に、種々の発現プラスミドでトランスフェクトした。ＦＡＣＳ分析は、コントロールトランスフェクト細胞の約２０〜３０％がアポトーシスを経ることを示した。Ｅ６の発現は、アポトーシス細胞の百分率（％）を半分に減少させた。これは、シスプラチンが、アポトーシスを、これらの細胞においてｐ５３依存性経路およびｐ５３非依存性経路の両方を介して誘導し得ることを示す。ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２のアンチセンスＲＮＡの発現は、シスプラチン誘導アポトーシスを、Ｅ６と同じ程度まで阻害し（図１２Ｄ）、これは、５３ＢＰ２とＩ−ＡＳＰで観察された効果と類似していた。これは、内因性ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、ＤＮＡ損傷に応答して、ｐ５３のアポトーシス機能を調節するにおいて、重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１８５】
本発明者らは、シスプラチンに応答しての内因性ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のｐ５３誘導アポトーシスに対する刺激性効果が、これらの細胞において検出された高レベルのＩ−ＡＳＰ（データ示さず（これはＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２がｐ５３のアポトーシス機能を増強することを阻害し得る））に起因して過小評価され得ると推測する。Ｉ−ＡＳＰの抗アポトーシス的役割を研究するために、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７細胞の両方を、アンチセンスＩ−ＡＳＰでトランスフェクトした。アンチセンスＩ−ＡＳＰは、Ｅ６の同時発現により排除したｐ５３依存性アポトーシスを誘導した。アンチセンスＩ−ＡＳＰによるＩ−ＡＳＰの抗アポトーシス機能の除去はまた、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のアポトーシス機能を増強した（図１２Ｅ）。アンチセンスＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２とは異なり、アンチセンスＩ−ＡＳＰの発現は、シスプラチン誘導アポトーシスを阻害しなかった。アポトーシス細胞の少量の増加を、一貫して検出した（図１２Ｄ）。これらの結果は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、ｐ５３のインビボでのアポトーシス機能を特異的に刺激することを実証した。内因性Ｉ−ＡＳＰは、ＡＳＰのインヒビターとして機能し、そして内因性ｐ５３によって誘導されるアポトーシスをブロックし得る。
【０１８６】
アンチセンス核酸分子は、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、およびＩ−ＡＳＰのｃＤＮＡに由来し、これらをそれぞれのプラスミドクローン上で以下のヌクレオチド領域にわたるプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した（開始ＡＴＧを基準に）：ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、およびＩ−ＡＳＰについて、それぞれ−７４〜９２３；−２５３〜８３９および−３７〜５３６。その増幅したセグメントを、ＯＩＡクイックＰＣＲ増幅キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、そして製造業者の説明書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２、およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＤＮＡを含有するプラスミドを、製造業者の説明書に従って、ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キットにより産生した。
【０１８７】
（実施例１１）
ＮＦ  ｋａｐｐａＢのｐ５３およびｐ６５ＲｅｌＡは、ストレスに応答するアポトーシスを調節するにおいて非常に重要な役割を果たす。しかし、これらの２つのアポトーシス経路が、どのようにインビボで協働し得るのかについてはほとんど知られていない。ｐ５３とＮＦ−ｋａｐｐａＢとの間にクロストークが存在するか否かの理解する試みが進んでいる。第１の証拠は、ｐ５３がｐ６５  Ｒｅｌ  ＡのＤＮＡ結合活性を誘導し得るという最近の観察から生じた。最も重要なことに、Ｉｋｂ（ｐ６５  Ｒｅｌ  Ａのインヒビター）は、ｐ５３のアポトーシス性機能を阻害し得る。しかし、ｐ５３がいかにしてｐ６５のＤＮＡ結合活性を誘導し得るか、およびＩｋｂがｐ５３のアポトーシス機能をいかにして阻害し得るかについては明確ではなかった。
【０１８８】
興味深いことに、ＡＳＰ−２とＩ−ＡＳＰの両方が、ｐ６５  ｒｅｌ  Ａ（ＮＦ−ｋａｐｐａＢの成分）と相互作用し得ることが、酵母ハイブリッドアッセイにおいて、非常に最近発見された。Ｉ−ＡＳＰもまた、Ｉｋｂよりも非効率的ではあるが、ｐ６５のトランス活性化機能を阻害し得る。ｒｅｌ  Ａ  ｐ６５と相互作用するためにＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰについて必要とされる領域は、ｐ５３について要求されるものと、非常に類似している。したがって、ｐ５３とｐ６５  ｒｅｌ  Ａとの間で、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰと相互作用するために、いくらかの競合が存在し得ることが可能である。ＡＳＰファミリーメンバーは、ｐ５３とｐ６５との間でたまたま共通のパートナーであるため、本発明者らは、ＡＳＰファミリーメンバーは、ｐ５３およびＮＦ−ｋａｐｐａＢのアポトーシス機能を連結し得ると予想した。この作用モデルにおいて（図１３Ａ）、ｐ５３は、ｐ６５のＤＮＡ結合活性を、核Ｉ−ＡＳＰと相互作用することによって誘導し得、そしてｐ６５がＤＮＡに結合することを可能にし得る。さらに、Ｉｋｂは、ｐ５３−誘導アポトーシスをｐ６５に結合することによりそしてＩ−ＡＳＰを放出することにより、阻害し得る。次いで、増大した核濃度のＩ−ＡＳＰは、ｐ５３と相互作用し得、そしてＡＳＰ−２またはＡＳＰ−１がｐ５３のトランス活性化機能を刺激することを予防し得る。この仮説が正確であるならば、Ｉｋｂの発現は、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の存在下で、ｐ５３誘導アポトーシスに対する顕著な効果を有するはずである。
【０１８９】
図１３Ｂに示される結果は、この概念と一致する。Ｉｋｂ発現細胞において、７．２％の細胞がアポトーシスにより死滅するのに対して、ベクター単独でトランスフェクトした細胞でトランスフェクトした細胞の４．６％が死滅する。ｐ５３誘導アポトーシスに対するＩｋｂの効果もまた、最小であった。なぜなら、ｐ５３対ｐ５３＋Ｉｋｂ発現細胞において検出されたアポトーシス細胞の百分率（％）は、それぞれ１２％および１１％であったからである。これは、Ｓａｏｓ−２細胞におけるＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２発現の非常に低いレベルに起因し得る。以前に示された結果に一致して、ＡＳＰ−２の同時発現は、ｐ５３誘導アポトーシスを有意に増強した。ｐ５３＋ＡＳＰ２トランスフェクト細胞におけるアポトーシス細胞の百分率（％）は、３０％であった。興味深いことに、この設定の下で、Ｉｋｂの同時発現は、最も顕著な効果を示した。Ｉｋｂの同時発現は、ｐ５３およびＡＳＰ−２によって誘導されるアポトーシス細胞の量を、３０％から１６％まで減少させ得る。この結果は、ＡＳＰ−２を予防することによって、Ｉｋｂがｐ５３誘導アポトーシスを阻害し得、ｐ５３機能を刺激することを示唆した。同様の結果がまた、Ｉｋｂをｐ５３およびＡＳＰ−１と同時発現した場合に得られた。
【０１９０】
本発明者らは、ＡＳＰ−２は、ｐ５３のアポトーシス機能を、Ｂａｘのようなアポトーシス促進性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｒｉｃ）遺伝子のプロモーター上のｐ５３のトランス活性化機能を特異的に刺激することによって、増強し得ることを示した。したがって、本発明者らはまた、Ｂａｘおよびｍｄｍ２プロモーター上のｐ５３のトランス活性化機能に対するＩｋｂの効果を、ＡＳＰ２の存在下または非存在下で調べた（図１３ＣおよびＤを参照のこと）。以前に示したように、ＡＳＰ−２およびｐ５３の同時発現は、ｐ５３のトランス活性化機能を約８倍刺激した。同じ条件下で、Ｉｋｂの発現は、Ｂａｘプロモーターレポーター活性に対して任意の検出可能な阻害を示さなかった。これは、Ｉｋｂが、Ｂａｘプロモーターの転写活性を、Ｓａｏｓ−２細胞において非特異的に阻害しないことを示唆する。５０ｎｇのＩｋｂのｐ５３との同時発現は、ｐ５３のトランス活性化機能に対して非常にわずかな阻害を示したに過ぎなかった。しかし、Ｉｋｂ、ＡＳＰ−２、およびｐ５３を同時発現した場合、Ｉｋｂは、ｐ５３トランス活性化機能のＡＳＰ−２媒介刺激を、劇的に阻害し得た（図１３Ｄ）。
【０１９１】
本発明者らは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、Ｂａｘプロモーター上の（ただし、ｍｄｍ２プロモーター上ではない）ｐ５３のトランス活性化機能を特異的に刺激し得ることを示した。したがって、Ｉｋｂが特異的にＡＳＰ−２を介してｐ５３のトランス活性化機能を実際に阻害する場合、ｍｄｍ２のプロモーター活性に対する有意な阻害を示し得ない。同じ条件下で、本発明者らはまた、Ｉｋｂが、ｍｄｍ２プロモーター活性に対するｐ５３のトランス活性化機能を阻害する能力を試験した。図１３Ｄに示されるように、ＡＳＰ−２の同時発現は、ｍｄｍ２プロモーター上のｐ５３のトランス活性化機能に対してほとんど効果を有さなかった。最も重要なことに、Ｉｋｂは、ｍｄｍ２プロモーター上のｐ５３のトランス活性化機能を、ＡＳＰ−２の存在下でさえ、ほとんど阻害しなかった。本明細書中で示す結果は、Ｉｋｂがｐ５３のアポトーシス機能を、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２がｐ５３のトランス活性化機能を刺激しないようにすることによって、阻害し得ることを初めて示唆する。
【０１９２】
ｐ５３およびＮＦｋｂ経路と関連してＡＳＰファミリーの役割をさらに研究するために、本発明者らはまた、ＡＳＰ−２およびｐ６５  ｒｅｌＡ相互作用の、ｐ５３のアポトーシス機能に対する効果を研究した。図１３Ａにおけるワーキングモデルに基づいて、ｐ６５／ＡＳＰ相互作用が、ＡＳＰタンパク質の核への侵入を容易にし得、したがって、ｐ５３／ＡＳＰ相互作用および核Ｉ−ＡＳＰの放出を可能にして、核Ｉ−ＡＳＰを核ｐ６５へ結合させる。ｐ６５の残基１７５−４０６は、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰに結合する。
【０１９３】
転写因子として、ｐ６５は、多くの標的遺伝子をトランス活性化し得る。ｐ５３誘導アポトーシスがｐ６５を必要とするため、そしてまたＮＦｋＢのＤＮＡ結合活性の増大と相関しているため、ｐ６５のＤＮＡ結合活性は、ｐ５３と協働してアポトーシスを誘導するのに必須であり得ることを示唆した。ｐ５３およびｐ６５の両方に結合し得ることから、タンパク質のＡＳＰファミリーは中心的役割を担う。１つの可能性は、ｐ６５へのＡＳＰ結合が、ｐ６５のｐ５３誘導性ＤＮＡ結合活性のためのメディエータであり得ることである。しかし、ｐ５３の同時発現は、そのレポーター上でｐ６５の転写活性を誘導しなかった。ｐ５３およびＡＳＰ−２の同時発現はまた、ｐ６５のトランス活性化機能に対していかなる有意な効果も示さなかった。この結果は、ＡＳＰがｐ５３からｐ６５へシグナルを送達するメッセンジャーではないことを示唆した。それにもかかわらず、ＡＳＰは、ｐ６５がｐ５３と協働してアポトーシスを誘導することを可能にする。本発明者らは、ＡＳＰの作用が、ｐ６５  ＮＦｋＢのＤＮＡ結合活性を必要とするか否かを試験した。ｐ６５の１００個のアミノ酸を、ｐ６５のＤＮＡ結合領域を含有するＮ末端から除去した。このようにして生成されたΔｐ６５構築物は、ＮＦｋｂレポータープラスミド上で試験した場合、転写不活性であった。ＡＳＰ−ｐ６５相互作用がｐ５３およびＮＦｋｂ経路のメディエータである場合、Δｐ６５は、ｐ５３のアポトーシス機能に対して全長ｐ６５と類似の効果を有する。そうでなければ、Δｐ６５は、不活性である。なぜなら、その標的遺伝子のいずれをもトランス活性化することができないからである（図１４Ａ）。図１４Ｂに示す結果は、ｐ６５およびΔｐ６５の両方が、ｐ５３のアポトーシス機能を、ＡＳＰ２の存在下で刺激したが、しかしΔｐ６５は、ｐ５３のアポトーシス機能を増強するのにｐ６５よりもさらにもっと活性であったことを示した。これは、Δｐ６５が、ｐ６５よりも核であるという事実に起因し得る。Δｐ６５から得たデータは、ｐ６５が、ｐ５３のアポトーシス機能に、ｐ６５のＤＮＡ結合活性とは独立して、影響を及ぼし得ることを強力に主張する。したがって、ＡＳＰ−２−ｐ６５の相互作用は、作用機構であり得る。
【０１９４】
（実施例１２）
Ｂｃｌ−２腫瘍性タンパク質の抗アポトーシス機能は、十分に確立されている。
興味深いことに、ｐ５３誘導アポトーシスは、Ｂｃｌ−２によって阻害され得る。さらに、Ｂｃｌ−２はまた、ＡＳＰ−２と相互作用し得る。しかし、この相互作用の生物学的な結果は、何も知られていない。Ｂｃｌ−２がｐ５３誘導アポトーシスをどのように阻害するかもまた、知られていない。Ｂｃｌ−２が如何にｐ５３誘導アポトーシスを阻害するかもまた知られていない。上記の実験システムを用いて、本発明者らは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２がｐ５３を刺激しないようにすることによって、Ｂｃｌ−２がｐ５３誘導アポトーシスを阻害するか否かを、調査した。
【０１９５】
ｐ５３が、転写依存性経路および転写非依存性経路の両方を通して、アポトーシスを誘導するということを示唆する証拠が増加している。本発明者らは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２が、ｐ５３のアポトーシス機能を、アポトーシス遺伝子（例えば、ＢａｘおよびＰＩＧ３）のプロモーター上のｐ５３のＤＮＡ結合およびトランス活性化機能を特異的に増強することによって、刺激することを示した。本発明者らはまた、ＡＳＰが、ｐ５３のアポトーシス機能を、そのトランス活性化機能とは独立して増強し得るか否かを調査することに興味を抱いた。アポトーシスを、Ｓａｏｓ−２細胞において、野生型ｐ５３、転写不活性なｐ５３、またはｐ５３Ｈ１７５−Ｌ（これは、リーダー配列によりミトコンドリアに標的化されそしてｐ５３のトランス活性機能とは独立してアポトーシスを誘導することが知られている、変異体ｐ５３である）の発現により、誘導した。以前の報告と一致して、野生型ｐ５３のアポトーシス機能は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現により刺激された。しかし、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の同時発現は、ｐ５３Ｈ１７５−Ｌのアポトーシス機能を増強することができなかった。最も重要なことに、野生型ｐ５３誘導アポトーシスのみが、Ｂｃｌ−２の同時発現により阻害された。同じ条件下で、Ｂｃｌ−２の同時発現は、ｐ５３Ｈ１７５−Ｌにより誘導されたアポトーシスを阻害することができなかった（図１５Ａ）。このようなｐ５３誘導アポトーシスの選択的阻害は、Ｂｃｌ−ＸＬ（Ｂｃｌ−２ファミリーにおけるアポトーシスの別のインヒビター）で観察されなかった（図１５Ｂ）。ｐ５３のアポトーシス機能を刺激するＡＳＰの能力とそれを阻害するＢｃｌ−２の能力との間の密接な関連は、Ｂｃｌ−２が、ＡＳＰがｐ５３を刺激するのを防止することによって、ｐ５３誘導アポトーシスを阻害することを示唆する。これは、図３Ｃに示されるデータ（Ｂｃｌ−２が非常に効果的にＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２がｐ５３のアポトーシス機能を増強することを防止する）によって確認された。
【０１９６】
（実施例１３）
本発明者らは、ここまでで、Ｉ−ＡＳＰが、種々の細胞株においてｐ５３誘導アポトーシスを阻害し得ること、およびその発現レベルが、乳癌細胞においてインビボでアップレギュレートされることを示した。これらのデータは全て、Ｉ−ＡＳＰが発癌遺伝子であり得ることを示唆する。ｐ５３の腫瘍抑制機能は、アポトーシスを誘導するその能力に最もよく連結しているので、ｐ５３誘導アポトーシスの阻害が、ｐ５３の腫瘍抑制機能を除去し得るようである。Ｉ−ＡＳＰの発癌性機能を試験するために、ラットの胚線維芽細胞（ＲＥＦ）を、Ｉ−ＡＳＰおよび発ガンタンパク質Ｅ７を発現するプラスミドでトランスフェクトした。Ｉ−ＡＳＰの発現は、Ｅ７の形質転換機能を、有意に増強した（図１６Ａ）。このことは、Ｉ−ＡＳＰが実際に発癌遺伝子であることを実証した。
【０１９７】
ほとんどの化学療法薬物が、ＤＮＡ損傷因子であり、そしてアポトーシスをｐ５３依存性経路を介して誘導することから、本発明者らは、Ｉ−ＡＳＰのｐ５３誘導アポトーシスを阻害する能力は、細胞を、化学療法剤（例えば、シスプラチン）の細胞傷害性効果に対して、より抵抗性にし得ると考えた。ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌細胞株）を、Ｉ−ＡＳＰ発現プラスミドでトランスフェクトした。シスプラチンの細胞傷害性効果に対する細胞の抵抗性を、Ｉ−ＡＳＰ発現細胞と非発現Ｉ−ＡＳＰ  ＭＣＦ−７細胞との間で比較した。図１６Ｂにおけるこの結果は、Ｉ−ＡＳＰの発現が、細胞性抵抗性を、約２．５倍、増強し得ることを示す。シスプラチンに対する細胞抵抗性におけるこのような増大は、癌の処置に関して、生物学的に非常に有意である。したがって、Ｉ−ＡＳＰの高レベルの発現は、なぜ野生型ｐ５３がいくつかのヒト腫瘍細胞において機能的ではないかを説明するのみではない。それはまた、処置に対する腫瘍応答を予測し得る。最後に、Ｉ−ＡＳＰ過剰発現細胞を使用して、より効率的な化学療法薬物の更なる同定が可能になり得る。
【０１９８】
（参考文献）
【０１９９】
【数１】
2004525605.tif 000002
表１．ヒト乳癌サンプル（グレードＩおよびグレードＩＩ）を発現する野生型ｐ５３におけるＡＳＰＰのｍＲＮＡ発現
【０２００】
【表１】
2004525605.tif 000003
表１は、野生型ｐ５３を発現するグレードＩおよびグレードＩＩの胸部腫瘍由来の４０対の正常および腫瘍に対応するＲＮＡサンプルにおけるＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのｍＲＮＡの発現の要約を表す。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
図１ａは、ＡＳＰ−１のＤＮＡ配列を表す。
【図１ｂ】
図１ｂは、ＡＳＰ−２のＤＮＡ配列を表す。
【図１ｃ】
図１ｃは、ＡＳＰ−１のタンパク質配列を表す。
【図１ｄ】
図１ｄは、ＡＳＰ−２のタンパク質配列を表す。
【図１ｅ】
図１ｅは、ＡＳＰ１のゲノム地図である。
【図２ａ】
図２ａはＡＳＰ−１  ｍＲＮＡのノーザンブロットを表す。
【図２ｂ】
図２ｂは、ＡＳＰ−２  ｍＲＮＡのノーザンブロットを表す。
【図２ｃ】
図２ｃは、アクチンｍＲＮＡローディングコントロールを含む、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２のｍＲＮＡのノーザンブロットを表す。
【図３ａ】
図３ａは、組換えＧＳＴ−５３ＢＰのクマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルである。
【図３ｂ】
図３ｂは、ＡＳＰ−２に対するモノクローナル抗体ＤＸ５４．１０の特異性を示すウェスタンブロットを示す。
【図３ｃ】
図３ｃは、内因性ＡＳＰ−２の検出を示すウェスタンブロットを示す。
【図４ａ】
図４ａは、ｐ５３とのＡＳＰ−２の相互作用を示すウェスタンブロットを示す。
【図４ｂ】
図４ｂは、ＡＰＳ−２／ｂＢＰ２プラスミドのＤＮＡ配列の一部分を表す。
【図４ｃ】
図４ｃは、ＡＳＰ−２とＡＳＰ−２／ｂＢＰ２との間の分子量の差異を示す。
【図５ａ】
図５ａは、ｐ５３、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の組み合わせの存在下の、ｐ５３特異的プロモーターの刺激を示す。
【図５ｂ】
図５ｂは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２による、ｐ５３のトランス活性化の刺激を示す。
【図６】
図６は、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２によるＰＩＧ−３プロモーターの刺激を示し、種々の短縮されたＡＳＰポリペプチドの発現を示すウェスタンブロットを含む。
【図７ａ】
図７ａは、ｐ５３のアポトーシス機能に対するＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の相乗効果を示す；
【図７ｂ】
図７ｂは、ｐ５３のアポトーシス機能に対するＡＳＰ−２の相乗効果を示す。
【図７ｃ】
図７ｃは、ｐ５３のアポトーシス機能に対するＡＳＰ−２のＣ末端側のドミナントネガティブ効果を示す。
【図７ｄ】
図７ｄは、ｐ５３、ｐ７３およびｐ６３のアポトーシス機能に対するＡＳＰ−２の相乗効果を示す。
【図８Ａ】
図８Ａは、ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰの相同性比較である。
【図８Ｂ】
Ｓａｏｓ２細胞を、ベクター、ｐ５３（５μｇ）、Ｉ−ＡＳＰ（１０μｇ）またはｐ５３＋Ｉ−ＡＳＰのいずれかでトランスフェクトし、次いで、１６時間インキュベートした。この細胞を、ＮＰ４０溶解緩衝液中で溶解され、そして１０００μｇの溶解物を、プロテインＧビーズに結合したＩ−ＡＳＰに対する、ポリクローナル抗体を用いて実行された免疫沈降に供した。ｐ５３の存在を、ウサギポリクローナルｐ５３抗体ＣＭ１を使用するこの免疫複合体のウェスタンブロットによって検出した（図８Ｂ）。
【図８Ｃ】
図８Ｃは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２によるｐ５３誘導性アポトーシスの誘導およびＩ−ＡＳＰによるこのｐ５３誘導性アポトーシスの阻害を示す。
【図８Ｄ】
図８Ｄは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２によるｐ５３応答性プロモーター、Ｂａｘの活性化およびＩ−ＡＳＰによるトランス活性化の阻害を示す。
【図８Ｅ】
Ｓａｏｓ２細胞を、ＡＳＰ−１（８μｇ）またはＡＳＰ−２（４μｇ）のいずれか、Ｉ−ＡＳＰ（５μｇ）およびｐ５３（５０ｎｇ）でトランスフェクトした。４０μｌの対応する溶解物を、１０％ゲル上で泳動し、ＡＳＰ−１を、Ｖ５抗体で検出し、ＡＳＰ−２をＤＸ．５４１０で検出し、Ｉ−ＡＳＰを、マウス抗Ｉ−ＡＳＰ抗体で検出し、ｐ５３を、ＤＯ１で検出し、そしてＰＣＮＡを抗ＰＣＮＡ抗体で検出した（図８Ｅ）。
【図９Ａ】
図９Ａは、ＡＳＰ−１（１０μｇ／１０ｃｍ  ディッシュ）またはＡＳＰ−２（１０μｇ／１０ｃｍ  ディッシュ）いずれかの存在下または非存在下でのｐ５３（ｌμｇ／１０ｃｍ  ディッシュ）またはｐ５３１８１Ｃ（１．６μｇ／１０ｃｍ  ディッシュ）またはｐ５３１８１Ｌ（２μｇ／１０ｃｍ  ディッシュ）を発現するトランスフェクトされたＳａｏｓ−２細胞における、ｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する細胞（アポトーシス細胞）の百分率を表す。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、ｐ５３またはその２つの変異体のいずれかの転写活性およびＳａｏｓ−２細胞におけるＢａｘ−ｌｕｃレポーターのトランス活性化をするｐ５３（５０−７５ｎｇ））またはｐ５３１８１Ｃ（５０ｎｇ）またはｐ５３１８１Ｌ（５０ｎｇ）の能力によって示されような、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２（それぞれ、８μｇおよび４μｇ）のいずれかの影響を表すヒストグラムを示す。活性の倍は、ＡＳＰ−１またはＡＳＰ−２の存在下での種々のｐ５３構築物の活性をこのプロモーターのｐ５３構築物のみの存在下における活性で除算することによって得られる。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、４０μｌのそれぞれのトランス活性化溶解物および抗ｐ５３（ＤＯ１）ＡＳＰ−２（ＤＸ．５４１０）、および抗Ｖ５  ＡＳＰ−１で検出されるタンパク質を使用するウェスタンブロットを示す。
【図９Ｄ】
図９Ｄは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の発現レベルは、頻繁に、ヒト乳癌においてダウンレギュレートされたことを示す。
【図１０】
図１０は、Ｉ−ＡＳＰのＤＮＡ配列を表す。
【図１１】
図１１は、Ｉ−ＡＳＰのタンパク質配列を表す。
【図１２Ａ】
図１２Ａは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｃ】
図１２Ｃは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｄ】
図１２Ｄは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｅ】
図１２Ｅは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｆ】
図１２Ｆは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１２Ｇ】
図１２Ｇは、インビボにおいて、ｐ５３のアポトーシス機能がＡＳＰファミリーメンバーによって高度に調節されることを示す。野生型ｐ５３を発現する細胞株、Ｕ２ＯＳおよびＭＣＦ−７を、指定されたように、細胞表面マーカーＣＤ２０（Ａ〜Ｅ）と共にタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。このトランスフェクトされた細胞を、ゲートしそしてＦＡＣＳによって分析した。この棒グラフは、アポトーシスに特徴的なｓｕｂ−Ｇ１  ＤＮＡ含有量を有する、トランスフェクトされた細胞の百分率を示す。ＡＳＰ−１、ＡＳＰ−２およびＩ−ＡＳＰのアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドはそれぞれ、α−ＡＳＰ−１、α−ＡＳＰ−２およびα−Ｉ−ＡＳＰで標識する。ヒトＨＰＶ１６のウイルス性癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ６は、Ｅ６として示される。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて、これらの細胞を、示されたようなプラスミドでトランスフェクトした。続いて、このトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞を、それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度でシスプラチンを含む培地と共にインキュベートした。３０時間後、細胞を、収集し、そして上記のように分析した。ＦおよびＧについて、Ｕ２ＯＳ細胞およびＭＣＦ−７細胞の両方は、上記のようなタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトされる。このＡＳＰまたはｐ５３と内因性のＢａｘまたはｍｄｍ２との同時発現は、図１２Ｇにおいて示されるように二重の免疫標識によって細胞固定の後に視覚化した。図１２Ｆについて、ベクターのみまたはＡＳＰＰプラスミドのいずれかによってトランスフェクトした、２００  Ｕ２ＯＳ細胞またはＭＣＦ−７細胞を、内因性Ｂａｘタンパク質の過剰発現について調べた。この棒グラフは、少なくとも３つの独立した実験の平均値を表す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、ＡＳＰファミリーメンバーとｐ６５、ＩｋＢおよびｐ５３との相互作用を説明するモデルを例示する。図１３Ｂは、ベクターにコードされるＡＳＰ２、ＩｋＢおよびｐ５３の発現および同時発現による、Ｓａｏｓ細胞でのアポトーシスの誘導性の図示である。
【図１３Ｃ】
図１３Ｃは、ＡＳＰ−２の存在下または非存在下で、Ｂａｘにおけるｐ５３およびｍｄｍ２プロモーターのトランス活性化機能を与えるＩｋＢの能力のグラフ表示である。
【図１３Ｄ】
図１３Ｄは、ＡＳＰ−２の存在下または非存在下で、Ｂａｘにおけるｐ５３およびｍｄｍ２プロモーターのトランス活性化機能を与えるＩｋＢの能力のグラフ表示である。
【図１４Ａ】
図１４Ａは、ＮＦκＢレポータープラスミドをトランス活性化する野生型ｐ６５および欠失変異体Δｐ６５の能力のグラフ表示である。図１４Ｂは、ｐ５３、ＡＳＰ−２、ｐ６５およびΔｐ６５を発現および同時発現する細胞におけるアポトーシスの誘導の視覚的表現である。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、ｐ５３Ｈ１７５−Ｌ誘導性アポトーシスに対するＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２刺激の効果を阻害するＢｃｌ−２の能力の視覚的な例示である。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、ｐ５３  Ｈ１７５−Ｌ誘導性アポトーシスに対するＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２の刺激効果をＢｃｌ−ＸＬが阻害できないことのグラフ表示である。
【図１５Ｃ】
図１５Ｃは、ＡＳＰ−１およびＡＳＰ−２によるｐ５３誘導性アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２の能力を例示する。
【図１６Ａ】
図１６Ａは、Ｅ７のトランスフォーミング機能に対するＩ−ＡＳＰの増強効果を例示する。
【図１６Ｂ】
図１６Ｂは、シスプラチンに対する細胞の耐性に対するＩ−ＡＳＰの増強効果を例示する。
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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