(57)【要約】本発明は、ゲノムＤＮＡ試料中の対立遺伝子を分離して同定し、それによってハプロタイプを分離し、同定するための方法及びキットを提供する。かかる方法は一般に、対立遺伝子内の多型部位に特異的なプライマーをＤＮＡ試料にハイブリダイズし、１個又はそれ以上の核酸によってプライマーを伸長し、伸長したプライマーを分離して、伸長したプライマーを利用して対立遺伝子を同定することを含む。かかる方法はまた、２個のプライマーのライゲーション、それらの分離及びその後の標的対立遺伝子を同定する際の使用を可能にする。かかる方法はさらに、多型部位を含むＤＮＡの長さが増幅され、同定されるように、もう１つのプライマーが第一プライマーの伸長の遮断部位として使用できることを提供する。プライマーが容易に分離及び／又は同定できるように、伸長していない又は伸長したプライマーを標識することができる。
2004520812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するための方法であって、
（ａ）へテロ配列部位を含む核酸を、ヘテロ配列部位に特異的な少なくとも１個の核酸プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズ核酸配列を形成し、但し、かかる少なくとも１個の特異的核酸プライマーはヘテロ配列にハイブリダイズしたときにのみ伸長を受けることができ、
（ｂ）ハイブリダイズ核酸を、少なくとも１個の核酸プライマーの伸長を可能にする条件に供し、そして
（ｃ）核酸配列から伸長を受けたハイブリダイズ核酸配列を、ハイブリダイズしていない核酸配列及び伸長を受けなかった核酸プライマーから分離する
ことを含む方法。
【請求項２】
少なくとも１個の核酸プライマーの３’末端がヘテロ配列部位内の多型塩基の位置に対応し、少なくとも１個の核酸プライマーの３’末端がヘテロ部位内の多型塩基に相補的であって、それにハイブリダイズするときにのみ核酸プライマーが伸長を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーの１個又は伸長したプライマーの１個が検出分子で標識されており、そして（ｄ）検出分子を利用して伸長を受けたハイブリダイズ核酸配列を分離することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）少なくとも１個の核酸プライマーとのハイブリダイゼーションに先立ってヘテロ配列部位を含む核酸分子を増幅し、そして
（ｅ）へテロ配列部位を同定する
ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヘテロ配列部位が一塩基多型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の方法を実施するための指示を含む、特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するためのキット。
【請求項７】
特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するための方法であって、
（ａ）１又はそれ以上のへテロ配列部位を含む核酸を、ヘテロ配列部位に特異的な少なくとも１個の核酸プライマー及びライゲーションプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズ核酸配列を形成し、但し、かかる少なくとも１個の核酸プライマーの３’末端はヘテロ配列部位内の多型塩基の位置に対応し、またライゲーションプライマーの５’末端は少なくとも１個の核酸プライマーの３’末端に隣接しており、
（ｂ）少なくとも１個の核酸プライマーとライゲーションプライマーを、少なくとも１個の核酸プライマーとライゲーションプライマーのライゲーションを可能にする条件に供して、
（ｃ）プライマーがライゲーションを受けたハイブリダイズ核酸分子を分離する
ことを含む方法。
【請求項８】
少なくとも１個の核酸プライマー及びライゲーションプライマーのいずれかが検出分子で標識されており、そして（ｃ）検出分子を利用して伸長を受けたハイブリダイズ核酸配列を分離することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１個の核酸プライマーが異なる配列を持つ複数のプライマーを含み、各々の配列が、２つの配列が同じ検出分子に結合することがないように個々の特定検出分子と結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７の方法を実施するための指示を含む、特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するためのキット。
【請求項１１】
特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するための方法であって、
（ａ）１又はそれ以上のヘテロ配列部位を含む核酸を、ヘテロ配列部位に特異的な少なくとも１個の核酸プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズ核酸複合体を形成し、そして
（ｂ）完全な相補的ハイブリダイゼーションを有するハイブリダイズ核酸複合体を、完全な相補的ハイブリダイゼーションを持たないハイブリダイズ核酸複合体から分離する
ことを含む方法。
【請求項１２】
１又はそれ以上のヘテロ配列部位を含む核酸の配列を決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）が、完全な相補的ハイブリダイゼーションを持たない核酸複合体が解離し、完全な相補的ハイブリダイゼーションを有する核酸複合体は解離しない温度までハイブリダイズ核酸複合体を加熱することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１個の核酸プライマーを検出分子で標識する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１の方法を実施するための指示を含む、特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するためのキット。
【請求項１６】
特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するための方法であって、
（ａ）少なくとも５’ヘテロ配列部位と３’へテロ配列部位を含む核酸を、３’へテロ配列部位に特異的なヘテロプライマー及びホモプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズ核酸配列を形成し、但し、ヘテロプライマーの３’末端は３’へテロ配列部位内の多型塩基の位置に対応し、ホモプライマーは５’ヘテロ配列部位の５’の位置で核酸にハイブリダイズすることができ、そしてヘテロプライマーは、ヘテロプライマーの３’末端が３’ヘテロ部位内の多型塩基に相補的であって、それにハイブリダイズするときにのみ伸長を受けることができ、
（ｂ）ヘテロプライマーとホモプライマーの間に核酸配列が生成され、５’ヘテロ配列部位を含むようにハイブリダイズへテロプライマーを伸長し、そして
（ｃ）５’ヘテロ配列部位の同一性を決定する
ことを含む方法。
【請求項１７】
（ｄ）５’ヘテロ配列部位の同一性を利用してもう１つのヘテロプライマーともう１つのホモプライマーを生成し、但し、もう１つのヘテロプライマーの３’末端は５’へテロ配列部位内の多型塩基の位置に対応し、５’ヘテロ配列部位がもう１つの５’へテロ配列の３’側に位置し、ホモプライマーはもう１つの５’ヘテロ配列部位の５’の位置で核酸にハイブリダイズすることができ、そしてヘテロプライマーは、ヘテロプライマーの３’末端が５’ヘテロ部位内の多型塩基に相補的であって、それにハイブリダイズするときにのみ伸長を受けることができ、
（ｅ）核酸配列をもう１つのヘテロプライマー及びもう１つのホモプライマーとハイブリダイズし、そして
（ｆ）（ａ）から（ｅ）までの段階を１回又はそれ以上反復する
ことをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子のハプロタイプを決定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６の方法を実施するための指示を含む、特異的対立遺伝子を持つ核酸分子を分離するためのキット。
【請求項２０】
核酸分子内の対立遺伝子を同定するための方法であって、
（ａ）複数のヘテロ配列部位を含む核酸を少なくとも１個のプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズ核酸を生成し、但し、かかる少なくとも１個のプライマーはビーズに結合しており、
（ｂ）ハイブリダイズプライマーを伸長して、伸長プライマーを生成し、
（ｃ）伸長したプライマーから核酸を解離し、
（ｄ）伸長したプライマーをビーズに結合した第二のプライマーとハイブリダイズし、
（ｅ）第二プライマーを伸長して、第二伸長プライマーを生成し、そして
（ｆ）伸長プライマー、第二伸長プライマー又は両方を利用して核酸のヘテロ配列部位を同定する
ことを含む方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法を実施するための指示を含む、核酸分子内の対立遺伝子を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子内の１又はそれ以上のヘテロ配列部位を同定することにより、対立遺伝子を分離し、その同一性を決定するための方法に関する。より特定すると、本発明は、対立遺伝子を分離し、その同一性を決定するために１個又はそれ以上のプライマーを利用する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
個体間の配列変異の最も頻繁な形態は、一般にＳＮＰｓ（スニップス）として知られる一塩基多型である。ヒトゲノムプロジェクトの完了により、ＳＮＰｓは１０００ヌクレオチド当り平均１個の割合で起こると推定されているが、一部のＤＮＡ領域ではより頻繁に起こりうる。現在、疾患あるいは薬剤応答に関連する標的遺伝子を同定するためのＳＮＰｓの使用が研究の焦点となっている。しかし、相関関係が弱いため、多くの科学者や研究者達は、個々のＳＮＰに基づいて薬剤と疾患を個別化するという計画に挑んでおり、そのためハプロタイプ分析の重要性がＳＮＰｓの医学的有用性にとって必須のツールとして明らかになりつつある。
【０００３】
ハプロタイプは一般に、個々のＳＮＰｓが所与の長さのＤＮＡに沿って構成される様式として知られる。ハプロタイプの古典的な定義は、１本の染色体上に存在し、所与の個体群において１つの世代から次の世代へと共に遺伝される傾向がある、密接に連鎖した遺伝子座の対立遺伝子の組合せである。分子ハプロタイピングのもう１つの局面は、現在病因遺伝子のポジショナルクローニングにおける重要なツールとして認識されている連鎖不平衡地図の作製であり、複雑な表現型が遺伝学的に詳細に解析されると共に数多くの適用が明らかになるであろう。
【０００４】
１９８９年以来、科学者達は、対立遺伝子を物理的に分離するためのゲノムＤＮＡの一分子希釈（ＳＭＤ）又はヘテロ接合鋳型から半接合ＤＮＡセグメントを選択的に増幅するための対立遺伝子特異的プライマーによる対立遺伝子識別のいずれかを用いて、分子ハプロタイピングのための様々な方法を検討してきた。しかし、これらの方法は短いセグメント（約５００ｂｐ）についてしか開発されていなかったが、最近になって、１０−２０倍離れたマーカーについてのロングレンジＰＣＲに分子ハプロタイピングが適用され、このアッセイの開発のための基本系としてＣＤ４遺伝子座が使用された。ＤＮＡ配列のハプロタイプを決定するために他の方法も試みられてきたが、これらの方法は大部分が成功していないか、信頼性が低い又は費用がかかるものであった。それ故、高生産量に対応できる、信頼しうる経済的な分子ハプロタイピングの必要性が依然として存在する。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、遺伝子内の１又はそれ以上のヘテロ配列部位を同定することにより、対立遺伝子を決定するための方法を対象とする。かかる方法は、特定遺伝子のハプロタイプを決定するために使用でき、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングを含めて多くの領域における適用を持つ。本発明はまた、そのようなタイピングのためのキットを対象とする。
【０００６】
本発明は、対立遺伝子特異的核酸分子を分離する方法を含む。１又はそれ以上のヘテロ配列部位特異的核酸プライマーを、１又はそれ以上のヘテロ配列部位を含む一本鎖核酸分子に加えてハイブリダイズさせる。１つの実施形態では、各々のプライマーの３’末端は標的とするヘテロ配列部位の多型部位に対応する。そのような実施形態では、３’末端を、一塩基伸長、ヘテロ配列部位特異的プライマーの３’末端に隣接する５’末端を持つ第二プライマーへのライゲーションに供するか、又はいくつかの塩基を伸長させることができる。次に伸長した又はライゲートしたヘテロ配列部位特異的ハイブリダイズプライマーと核酸分子を分離し、任意に、さらなる遺伝子型分類のために回収する。代替的実施形態では、各々のプライマーは、１００％未満の相補性の塩基とハイブリダイズするプライマーを選択的に除去することができ、１００％相補的な塩基とハイブリダイズしたプライマーは影響を受けないようにプライマー内に位置する１個又はそれ以上の多型塩基を含む。
【０００７】
本発明はまた、核酸分子内に含まれる複対立遺伝子を同定するための方法に関する。複数のヘテロ配列部位を含む一本鎖核酸分子を選択する。この核酸分子に２個のプライマー、ヘテロプライマーとホモプライマーを加える。ヘテロプライマーは、同じ核酸分子上の５’ヘテロ配列部位の３’に位置する３’ヘテロ配列部位にハイブリダイズすることができる。ヘテロプライマーの３’塩基はヘテロ配列部位の多型塩基に対応するので、ヘテロプライマーの３’末端が一本鎖核酸にハイブリダイズするときにのみ伸長が起こる。ホモプライマーは、５’ヘテロ配列部位の５’の位置で同じ核酸分子にハイブリダイズすることができる。プライマーを核酸分子にハイブリダイズさせ、プライマーの間に位置する核酸分子の５’ヘテロ配列部位が複製される、すなわちホモプライマーが、ホモプライマーに達したとき伸長ヘテロプライマーの伸長を停止させる働きをするようにヘテロプライマーを伸長させる。核酸分子と伸長したヘテロプライマーを変性し、ヘテロプライマーを分離して分析し、５’ヘテロ配列部位を決定する。この情報を使用して、もう１つのヘテロプライマーともう１つのホモプライマーを含む新しいセットの核酸プライマーを同定する。新しいセットのヘテロプライマーは、５’ヘテロ配列部位（ヘテロプライマーの３’塩基は多型塩基に対応する）にハイブリダイズすることができ、５’ヘテロ配列部位は同じ核酸分子上のさらなるヘテロ配列部位の３’側に位置し、新しいセットのホモプライマーはさらなるヘテロ配列部位の５’の位置で同じ核酸分子にハイブリダイズすることができる。対立遺伝子を同定するのに十分な核酸分子上のヘテロ配列部位が同定されるまで、先の段階を反復し、各々の新しいセットのプライマーをその後のラウンドのハイブリダイゼーション／伸長に使用する。このようにして核酸分子のハプロタイプを決定することができる。
【０００８】
本発明はまた、核酸分子内の複対立遺伝子を同定するための方法であって、複対立遺伝子を含む核酸試料を、各々のビーズに２個の異なるプライマーが結合しており、各ビーズ上の少なくとも１個のプライマーがユニーク対立遺伝子に対するプライマーであるビーズのセットに、ユニーク対立遺伝子に対する少なくとも１個のプライマーが核酸試料の一部にハイブリダイズするような条件下で加えることを含む方法に関する。ハイブリダイズしたプライマーを増幅してハイブリダイズプライマーを伸長し、伸長プライマー核酸を生成する。次にハイブリダイズした核酸試料とプライマーを変性して、核酸試料をビーズから除去する。次に伸長したプライマーをビーズ上の第二プライマーにハイブリダイズして、第二プライマーを増幅する。二つの増幅したプライマーを含むビーズを分析して、核酸試料中に存在する対立遺伝子を決定する。
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明に従った対立遺伝子特異的プライマー伸長法を利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【００１０】
図２は、プライマーサイズタグアプローチによる一塩基伸長を用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【００１１】
図２Ａは、プライマーサイズタグアプローチによる一塩基伸長を用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【００１２】
図３は、本発明に従った対立遺伝子特異的ライゲーションとプライマーサイズタグを利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【００１３】
図４は、本発明に従ったハイブリダイゼーションとプライマーサイズタグを利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【００１４】
図５は、本発明に従ったホモプライマーとヘテロプライマーのセットを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【００１５】
図６Ａから６Ｆは、本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、その内容全体が参照してここに組み込まれる、米国特許仮出願第６０／２２８，９９４号に基づく、対立遺伝子の同一性を決定するための方法を対象とする。
【００１７】
本明細書全体を通じて下記の用語を使用し、それらは次のように定義される：
対立遺伝子：所与の遺伝子の変異体形態。そのような変異体は、一塩基多型、挿入、逆位、転座及び欠失を含む。
【００１８】
アビジン：高い親和性と特異性でビオチンと結合する能力によって機能的に定義されるタンパク質のファミリー。アビジンはかなり小さなオリゴマータンパク質であって、４つの同一サブユニットから構成され、各々がビオチンの単一結合部位を担う。アビジンはそれ故、アビジン１モルにつき４モルまでのビオチンに結合することができる。アビジンは、（ａ）両生類、爬虫類及び鳥類によって産生される、それらの卵中に存在し、アビジンとして知られるタンパク質、及び（ｂ）ストレプトアビジンとして知られる、ストレプトミセス属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｂｉｄｉｎｉｉによって産生されるタンパク質を含む。ここで使用するとき「アビジン」は上記のタンパク質のすべてを含む。
【００１９】
ビオチン：ここで使用するとき、「ビオチン」は、ビオチン、ビオチンがアルキル基の付加によって修飾された市販のビオチン製品、及びアミン、アシル及びアルキル脱離基、カルボニル基及びハロゲン化アルキルであるポリマー上の相補的反応基又はミカエル型アクセプターとの活性エステル、アミン、ヒドラジド及びチオール基のようなビオチン誘導体を含む。
【００２０】
検出分子：典型的には外部ソースによって、核酸の検出及び／又は除去を可能にする、核酸に共有結合した分子。そのような分子は、染料、ポリＡ及びポリＴ尾部を含む可変重量分子、磁気ビーズを含めたビーズ、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン抗体及び当該技術において既知の他の同様の物質に連結されうるリンカーを含みうる。
【００２１】
遺伝子型：遺伝子座に存在する特定対立遺伝子。
【００２２】
ハプロタイプ：多くの密接に連鎖する遺伝子座の集合的遺伝子型を表わし、同じ染色体に沿った対立遺伝子の完全な配列である。
【００２３】
ヘテロプライマー：ストリンジェント条件下で１個のユニーク対立遺伝子にハイブリダイズするプライマー。
【００２４】
ヘテロ配列部位：定義された配列部位に異なる配列を持つ２個の対立遺伝子を、ヘテロ配列部位を持つと称する。
【００２５】
ホモプライマー：両方の親対立遺伝子にハイブリダイズするプライマー。
【００２６】
親対立遺伝子：母系からの１組の染色体と父系からの１組の染色体を含む哺乳類二倍体細胞からの対立遺伝子。
【００２７】
プライマー：ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
【００２８】
ここで引用するすべての特許及び参考文献は参照してここに組み込まれる。
【００２９】
本発明の方法はいくつかの重要な利点を持つ。本発明の方法は、完全な遺伝子型及びハプロタイプの決定を含めて、対立遺伝子の迅速で費用のかからない正確な決定を可能にする。かかる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応のような当該技術において既知の標準的な増幅手段による完全な増幅を妨げるような長さを持つ核酸フラグメントの分析を可能にするであろう。
【００３０】
本発明は、対立遺伝子特異的な核酸分子を分離し、同定する方法を対象とする。いかなる核酸分子も使用しうるが、デオキシリボ核酸が好ましい。同定し、分離することができる対立遺伝子特異的核酸分子は、複対立遺伝子、遺伝子のセグメント及び発現されないフラグメントを含む。
【００３１】
本発明の方法及びキットは、２又はそれ以上のヘテロ配列部位を持ち、従って複数の型の対立遺伝子を持つすべての二倍体遺伝物質に関して使用しうる。本発明を適用しうる、複対立遺伝子を持つ遺伝子の例は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子、哺乳類におけるＴ細胞受容体遺伝子、ＴＡＰ、ＬＭＰ、ｒａｓ、非古典的ＨＬＡクラスＩ遺伝子、ヒト補体因子Ｃ４及びＣ２についての遺伝子、ヒトＨＬＡ複合体におけるＢｆ、及びミトコンドリアＤＮＡ、細菌染色体及びウイルスＤＮＡ内に存在する遺伝子のような、哺乳類ＭＨＣ遺伝子である。
【００３２】
本発明の１つの方法では、各々の対立遺伝子がユニークなセットのヘテロ配列部位を持つ、複対立遺伝子を含む核酸試料を入手する。当該技術において既知の何らかの手段によって、１つの実施形態では１９８８年７月２８日発行の米国特許第４，６８３，２０２号においてＭｕｌｌｉｓが述べているようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、核酸試料を増幅する。次に増幅した核酸試料を一本鎖核酸に変性する。その後一本鎖核酸を分析して、本発明に従ったいくつかのアプローチによって存在するヘテロ配列部位を決定することにより、存在する対立遺伝子を決定する。
【００３３】
本発明に従った方法は１個又はそれ以上のプライマーを利用する。本発明に従ったプライマーは、対象とする配列とハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含む。一部の場合には、増幅の際にプライマーが伸長されうるような条件下でプライマーがハイブリダイズすることを必要する。また別の場合には、ハイブリダイズするとき１００％相補的対合であるプライマーが、１００％未満の相補的対合でハイブリダイズするプライマーよりも高いＴｍを持つことを必要とする。一般に、本発明のプライマーはいかなる有用な長さでもありうるが、一般には約１２−２５ヌクレオチド又は少なくとも１８ヌクレオチドを含み、好ましい長さは約１８−２２ヌクレオチドである。本発明の方法においては、対象とする多型部位を同定するために試料中の標的ＤＮＡにユニークな１又はそれ以上のプライマー配列を同定する必要がある。多くの複対立遺伝子のそのような多型同定は当該技術において既知である。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ遺伝子の約２２２個の既知の対立遺伝子が存在し、そのような対立遺伝子の配列は当該技術において既知である。ＡｒｎｅｔｔとＰａｒｈａｍ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４５：ｐｐ．２１７−２５７、１９９５、及びＢａｘｔｅｒ−Ｌｏｗｅら、１９９７年１２月３０日発行の米国特許第５，７０２，８８５号参照。
【００３４】
本発明の範囲内に包含される核酸分子のハイブリダイゼーションを説明するための「高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」との表現は、洗浄のための低いイオン強度と高い温度条件下でハイブリダイズすることを指す。「低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」との表現は、高いイオン強度とより低い温度を有するハイブリダイゼーションを指す。
【００３５】
ストリンジェンシーに影響を及ぼす変数は、例えば、温度、塩濃度、プローブ／試料の相同性及び洗浄条件を含む。その他の条件がすべて等しければ、ハイブリダイゼーションの温度が上昇すると共にストリンジェンシーが高くなる。高いストリンジェンシーは非特異的ハイブリダイゼーションの低下、すなわちより少ないバックグラウンドノイズを提供する。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」及び「中ストリンジェンシー条件」は、その教示が参照してここに組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹの中で説明されている。言うまでもなく、当業者は、必要な検出範囲を達成するために、プローブと分析物間の様々な度合の相補性を含む又は排除するように、所望に応じてハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させうることを認識するであろう。
【００３６】
様々な検出分子が本発明において使用しうる。これらの分子は、１個又はそれ以上のプライマーに結合するか、又は伸長段階の間に核酸に組み込まれるｄｄＮＴＰに直接結合することができる。これらの分子は、染料、放射性標識、等々のような分子を検出するための手段を含むか、又はビオチン／アビジン、磁気及び／又は蛍光ビーズ、等々のような分子を分離するための手段、又はその両方を含みうる。例えばビオチン／アビジンを使用するときには、プライマーが一本鎖核酸にハイブリダイズするとき１本の鎖がビオチン標識を担う二本鎖ＤＮＡが生じるように、プライマーの１個又はそれ以上をビオチンで標識することができる。その後二本鎖ＤＮＡをアビジンで被覆した保持体に結合することができる。
【００３７】
本発明において使用する保持体は、ビーズ、アフィニティークロマトグラフィーカラムのような当該技術において既知の保持体でよい。好ましい保持体は磁気ビーズの形態である。保持体がビーズの形態であるときには、ビーズを磁石に誘引し、二本鎖核酸が一本鎖の核酸に解離するような条件下でビーズを洗うことによって増幅した核酸の二本の鎖を分離する。解離は、典型的にはアルカリ条件下、典型的には０．１Ｍ又は０．１５Ｍ  ＮａＯＨ条件下に室温で約５−１０分間、数回繰り返してビーズをインキュベートすることによって実施する。その後各々の鎖を収集して、さらに分析することができる。
【００３８】
対立遺伝子を決定するべく単離ヘテロ配列部位を同定するために様々な分析手法が使用できる。これらの手法は当該技術において既知であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、フローサイトメトリー、高圧液体クロマトグラフィーレーザー走査及び質量分析法を含むが、これらに限定されない。これらの手法は手動で又は自動システムによって実施できる。そのような自動システムは当該技術において既知であり、多色蛍光を走査することができる自動塩基配列決定装置又は毛管電気泳動装置を含む。
【００３９】
本発明の最初のアプローチは、図１及び２に概要図で示されており、ハイブリダイズしたヘテロ配列部位特異的プライマーの伸長に基づく。このアプローチは、高度に多型性の染色体領域において対立遺伝子又はハプロタイプ特異的遺伝子型情報を決定するために特に有用である。図１に示すように、ＤＮＡ試料を増幅し、変性して、一本鎖ＤＮＡフラグメントを作製した後、５’末端に検出分子で標識した１又はそれ以上のヘテロ配列部位特異的プライマーを加える。ヘテロ配列部位特異的プライマーを一本鎖核酸分子に加えてハイブリダイズさせる。好ましい実施形態では、各々のプライマーの３’末端はヘテロ配列部位の多型塩基に相補的である。それ故、３’末端が相補的でないヘテロ配列部位にプライマーがハイブリダイズした場合、伸長のための条件に供したときプライマーは伸長を受けない。好ましくは、単一ヌクレオチドの相違を識別することができる酵素を使用する。図１に示すように、ハイブリダイズしたプライマーをその後伸長に供するが、相補的３’塩基対合でハイブリダイズしたプライマーだけが伸長される。次に、図１ではビオチンとして例示される、検出分子を通してプライマーを除去する。アビジンで被覆した磁気ビーズを使用して、プライマー上のビオチンによってプライマーを除去する。その後ハイブリダイズしたプライマー／ＤＮＡフラグメントを、伸長を受けなかったプライマーに結合したＤＮＡフラグメントが除去されるような条件下で洗浄する。次に伸長した二本鎖核酸を変性する。その後ビーズに結合していない鎖を分析してヘテロ配列部位を決定する。
【００４０】
代替的に、本発明において使用するプライマーはそれらの５’末端で検出分子に結合していなくてもよい。その代わりに、プライマーを上述したようにハイブリダイズさせ、相補的３’末端とハイブリダイズするものを図２に示すような検出分子に結合したｄｄＮＴＰを使用して一塩基伸長に供する。伸長したプライマー上の検出分子を用いてプライマーを分離し、その後プライマーを変性して分析し、存在するヘテロ配列部位を決定することができる。
【００４１】
本発明はまた、下記の方法を使用したとき４色の蛍光を走査することができる自動塩基配列決定装置又は毛管電気泳動装置を用いたハイスループット一塩基多型タイピングのために有用である。同じ方法を、多塩基多型、挿入、逆位、転座及び欠失を含めた一塩基多型以外の他の遺伝的変異をタイピングするように改変することもできる。
【００４２】
本発明のもう１つのアプローチは対立遺伝子特異的ライゲーションに基づく。このアプローチは図３に例示されている。図３に示すように、１又はそれ以上のヘテロ配列部位を含む一本鎖ＤＮＡフラグメントにヘテロ配列部位特異的プライマーを加える。ヘテロ配列特異的プライマーはヘテロ配列部位の多型塩基に相補的な各々のプライマーの３’末端を持ち、それらをＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせる。次にライゲーションプライマーを加え、ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせる。各ライゲーションプライマーは、ライゲーションプライマーの５’末端が直接ヘテロ配列部位特異的プライマーの３’末端に隣接するように、ＤＮＡフラグメントの１つの一部に相補的である配列を持つ。ヘテロ配列部位特異的プライマーがＤＮＡフラグメントにハイブリダイズしなければ、ライゲーションのための条件に供したときライゲーションプライマーはヘテロ配列部位特異的プライマーにライゲートすることができない。可能な場合には、プライマーをライゲートし、その後、ライゲートしていないプライマーを変性させるのに十分であるが、ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズしているライゲートしたプライマーを変性させるには十分でない温度に供する。典型的には、２０塩基のプライマーを使用するとき、そのような温度は約６０℃である。その後ハイブリダイズしたライゲートしたプライマーを当該技術において既知の何らかの手段によって除去することができる。図３に示すように、１組のプライマーは、ビオチンとして例示するような結合検出分子を持ちうる。検出分子はヘテロ配列部位特異的プライマー又はライゲーションプライマーに結合しうる。さらに、図３に示すように上述したような方法を組み合わせることもでき、あるヘテロ配列部位の多型を１つの方法によって検出し、その他の部位をここで述べる他の方法によって決定する。同様に図３に示すように、１個又はそれ以上のプライマーは、２個のプライマーが同じ分子量を持つことがないように、各プライマーの５’末端に結合した可変重量分子を持ちうる。そのような可変重量分子は、ハイブリダイゼーション／増幅段階では非反応性であり、ポリＡ尾部のようなポリホモ核酸尾部を含む適当な物質でありうる。そのようなポリＡ尾部は一般に長さが２−４塩基分異なるが、ゲル電気泳動のような標準的分離装置でポリＡ尾部を持つそのようなプライマーを分離するのに十分ないかなる長さであってもよい。
【００４３】
本発明のもう１つの方法が図４に例示されている。そのような方法に従って、多数のヘテロ配列部位を含むＤＮＡフラグメントに１組のヘテロ配列部位特異的プライマーを加える。各プライマーは、ＤＮＡフラグメントへのプライマーのハイブリダイゼーション後、不正塩基対合を含んでハイブリダイズするプライマーは塩基ミスマッチなしでハイブリダイズするプライマーよりも低いＴｍを持つように各プライマー内に位置する、少なくとも１個の多型塩基を持つ。このＴｍの差を利用して、１００％未満の相補性のハイブリダイゼーションを有するプライマーを除去する。そのような塩基ミスマッチは典型的にはプライマー配列の中央付近で起こる。１００％未満の相補性のハイブリダイゼーションプライマー／ＤＮＡフラグメント複合体を除去した後、残りの複合体を分析して、特異的対立遺伝子を決定するための特異的ヘテロ配列部位を決定する。これは様々な方法で実施しうる。図４に例示するように、すべてのプライマーが結合した可変重量分子を持ちうる。各々の特異的ヘテロ配列部位部位についてのすべてのプライマーが結合した特異的可変重量分子を持ちうる。１又はそれ以上の特異的ヘテロ配列部位における個々の多型についての各々のプライマーが、結合した異なる検出分子を持つ。ハイブリダイズしたプライマーを検出分子によって個々の群に分離し、さらに各々の群のプライマー内にどの可変重量分子が存在するかを判定することにより、対立遺伝子特異性を決定する。
【００４４】
本発明のもう１つの方法は、ＰＣＲのような従来の手段によって完全に増幅するには長すぎると考えられる、核酸の長いセグメント上の複数のヘテロ配列部位の決定を可能にする。図５に示すように、複数のヘテロ配列部位を含む一本鎖核酸分子を選択する。この核酸分子に２個のプライマー、ヘテロプライマーとホモプライマーを加える。ヘテロプライマーは、同じ核酸分子上の５’ヘテロ配列部位の３’に位置する３’ヘテロ配列部位にハイブリダイズすることができる。ヘテロプライマーの３’塩基はヘテロ配列部位の多型塩基に対応するので、ヘテロプライマーの３’末端が一本鎖核酸にハイブリダイズするときにのみ伸長が起こる。ホモプライマーは、５’ヘテロ配列部位の５’の位置で同じ核酸分子にハイブリダイズすることができる。プライマーを核酸分子にハイブリダイズさせ、プライマーの間に位置する核酸分子の５’ヘテロ配列部位が複製されるようにヘテロプライマーを伸長させる。核酸分子と伸長したヘテロプライマーを変性し、ヘテロプライマーを分離して分析し、５’ヘテロ配列部位を決定する。この情報を使用して、ヘテロプライマーとホモプライマーを含む新しいセットの核酸プライマーを同定する。新しいセットのヘテロプライマーは、５’ヘテロ配列部位（ヘテロプライマーの３’塩基は多型塩基に対応する）にハイブリダイズすることができ、５’ヘテロ配列部位は同じ核酸分子上のさらなるヘテロ配列部位の３’側に位置し、新しいセットのホモプライマーはさらなるヘテロ配列部位の５’の位置で同じ核酸分子にハイブリダイズすることができる。対立遺伝子を同定するのに十分な核酸分子上のヘテロ配列部位が同定されるまで、先の段階を反復し、各々の新しいセットのプライマーをその後のラウンドのハイブリダイゼーション／伸長に使用する。このようにして核酸分子のハプロタイプを決定することができる。
【００４５】
図６Ａから６Ｆに示すように、本発明はまた、核酸分子内の複対立遺伝子を同定するための方法に関する。図６Ａに示すように、かかる方法は、複対立遺伝子を含む核酸試料をビーズのセットに加えることを含み、各々のビーズには２個の異なるプライマーが結合しており、各ビーズ上の少なくとも１個のプライマーがユニーク対立遺伝子に対するプライマーである。次に、ユニーク対立遺伝子に対する少なくとも１個のプライマーが図６Ｂに示すような核酸試料の一部にハイブリダイズするような条件下で核酸を反応させる。ハイブリダイズしたプライマーを増幅して、ハイブリダイズしたプライマーを伸長し、図６Ｃにおけるような伸長プライマー核酸を生成する。図６Ｄに移って、ハイブリダイズした核酸試料とプライマーを変性し、核酸試料をビーズから除去する。次に伸長したプライマーをビーズ上の第二プライマーにハイブリダイズし（６Ｅ）、第二プライマーを増幅する（６Ｆ）。二つの増幅したプライマーを含むビーズを分析して、核酸試料中に存在する対立遺伝子を決定する。ビーズからのプライマーの除去を容易にするために、プライマーは開裂部位を持ちうる。
【００４６】
本発明はまた、ここで述べる方法を実施するためのキットを包含する。それらの最も基本的な実施形態では、本発明のキットは上記で述べた方法を実施するための指示を含む。さらに、キットは、１又はそれ以上のセットの遺伝子座特異的増幅プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液、１個又はそれ以上が任意に標識されているジデオキシヌクレオチド、核酸増幅のための試薬、一本鎖核酸フラグメントの作製のための試薬、任意に少なくとも１個の検出分子に結合している１個又はそれ以上のヘテロ配列部位特異的プライマー、１個又はそれ以上のライゲーションプライマー、隣接するハイブリダイズしたプライマーのライゲーションのための試薬、１個又はそれ以上の検出分子を含むビーズ、そして１又はそれ以上の無菌マイクロチューブのような、本発明において使用される必要試薬の少なくとも１つ又はそれ以上を含みうる。
【００４７】
下記の実施例から本発明がよりよく理解されるであろう。しかし、当業者は、ここで述べる特定の方法及び結果は単に本発明の例示にすぎず、本発明の限定を意図しないことを容易に認識するであろう。
【００４８】
実施例
本実施例は、ＨＬＡ遺伝子内の特定多型に関する種々の対立遺伝子の捕獲を確認するための３つの戦略の使用を含んだ：ｉ）ハイブリダイゼーション；ｉｉ）一塩基伸長；及びｉｉｉ）ライゲーション。
【００４９】
これらの条件の各々を、適切な対立遺伝子、従ってその対立遺伝子に関する特定多型を同定する上で有用なアッセイを開発するための試験として使用した。最後の２つの方法は酵素に基づくアッセイであって、Ｔａｑ  Ｌｉｇａｓｅ及びＴｈｅｒｍｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの使用を必要とし、これらの酵素が一本鎖ＤＮＡ上の特定位置における一ヌクレオチドの相違を識別する能力を利用した。これらの方法は、検討する特定対立遺伝子内の一塩基多型又は突然変異を識別するのに十分な感受性があることが認められた。
【００５０】
１．Ａ．ハイブリダイゼーション
検出の１つの方法は、特定の捕獲した標的をオリゴ結合ミクロスフェアにハイブリダイズし、複合体をアッセイすることであった。下記に述べるように反応を設定した。捕獲する対立遺伝子を２回のハイブリダイゼーションに供した。最初のラウンドのハイブリダイゼーションは、異なるホモ及びヘテロ接合ＤＮＡと特定配列を認識する特異的オリゴ結合ビーズを使用した。２回目のハイブリダイゼーションは、捕獲した対立遺伝子の存在を確認する、標的内の特定配列を認識するもう１組のビーズを使用した。しかし、１回のラウンドのハイブリダイゼーションは、標的内の種々の対立遺伝子に対するオリゴ結合ミクロスフェアの特異性を調べるための対照実験として最初に実施した。
【００５１】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子座の１５８ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＵＣＬＡレジストリーから入手した種々のゲノムＤＮＡ試料（ＵＣＬＡ２１０、ＵＣＬＡ２３０及びＵＣＬＡ２４３）に関して、センスプライマー５’Ａ２００Ａ及びアンチセンスプライマー３’Ａ３２２−１を用いて増幅した。１５８ｂｐフラグメントはこの実施例のために標準的な増幅法を用いて生成した。この実施例においてホモ及びヘテロ接合ＤＮＡを増幅するために使用したプライマーは次の通りであった：
５’Ａ２００Ａ    ５’−ＡＣＡ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＣＣ  Ａ−３’  １８２−２００位、センスプライマー
３’Ａ３２２−１  ５’−ＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＡ−３’  ３２２−３４０位、アンチセンスプライマー
ライゲーション、一塩基伸長又はハイブリダイゼーションにおいて使用するための一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ）を非対称ＰＣＲによって作製した。非対称ＰＣＲのための条件は、センスプライマーをアンチセンスプライマーよりも５０倍低い濃度で加えたことを除いて、上記の通りであった。アンチセンスプライマーをビオチニル化して、５’ビオチン標識一本鎖ＰＣＲフラグメントを生成した。
【００５２】
代替的には、５’−３’エキソヌクレアーゼであるＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを使用してｓｓＤＮＡを作製することができた。この場合には、オリゴヌクレオチド合成の際にＰＣＲプライマーの５’末端に４ホスホチオエート結合を導入することによって対象とする鎖を保護する。Ｔ７エキソヌクレアーゼはプライマーの５’末端にホスホチオエート塩基を含まない鎖を分解する。
【００５３】
１．Ｂ．一塩基伸長反応（ＳＢＥＲ）
本実施例の一塩基伸長反応（ＳＢＥＲ）は、３’末端が多型塩基に隣接してアニーリングするように設計された伸長プライマーを使用した。この実施例の伸長プロトコールは、それぞれサイクリング又は非サイクリング反応に多型塩基を組み込むためにＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ又はクレノウラージフラグメントポリメラーゼのいずれかを使用した。
【００５４】
特定対立遺伝子を捕獲するための試みとして一塩基伸長反応を使用し、プライマー混合物（ＰＭ）、Ｈ００１及びＨ００２を用いて対立遺伝子特異的ＰＣＲを実施した。多型部位に特定塩基を組み込むためにこれらの２つのプライマー混合物を使用した。２つのＰＭは共通の５’プライマー（ａｇｃｇａｃｇｃｃｇｃｇａｇｃｃａ）を使用したが、対立遺伝子特異的３’プライマーを使用した。ヘテロ接合ＤＮＡを使用したときには、それぞれの多型部位にＰＭ  Ｈ００１は「Ｃ」（ｃｃａａｇａｇｃｇｃａｇｇｔｃｃｔｃｇ）塩基を特異的に組み込み、ＰＭ  Ｈ００２は「Ａ」（ｃｃａａｇａｇｃｇｃａｇｇｔｃｃｔｃｔ）に特異的であった。
【００５５】
上述したように伸長反応を実施した。伸長反応からの産物を精製し、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合した。ビオチンに対するストレプトアビジンの高い結合親和性により、ビオチン標識標的分子を迅速且つ効率的に単離することができた。複合体を数回洗って、実験の次の段階に影響を及ぼしうる因子である非結合標識の可能性を排除した。
【００５６】
いくつかの異なる試料を、ＡＳＰＣＲによる捕獲対立遺伝子の確認のために試験した。ＰＭ  Ｈ００１及びＨ００２を用いたＡＳＰＣＲを５セットにおいて実施した。典型的伸長反応プロトコールの実験対照及び陰性対照は次の通りであった：実験試料は、伸長反応においてビオチニル化Ａ又はＣのいずれかを使用した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅは特定塩基を正しく組み込み、それ故捕獲された特異的対立遺伝子からの正しいシグナルが使用したプライマー混合物に基づいて検出されると仮定した。２つの陰性対照は、ｄｄＮＴＰ  Ａ又はＣを反応から除外したことを除いて、ＳＢＥＲにおいて実験試料と同じ成分を含んだ。もう１つの陰性対照は非標識ｄｄＮＴＰ  Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴだけを使用した。下記の反応セットの上清を、プライマー混合物Ｈ００１及びＨ００２を使用したＡＳＰＣＲによって確認した。試験した上清は５セットのものであり、次の通りであった：伸長後、伸長産物の磁気ビーズへの結合後、数回の洗浄後、及び産物を高温で磁気ビーズから溶出した後。
【００５７】
サイクリング反応
各々２０μｌの反応は、上述したようなゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅後に得られたＨＬＡ  Ａ遺伝子座の一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ１００ｎｇを使用した：伸長プライマー２μＭ、非標識ジデオキシターミネーター（ｄｄＧ、Ｔ、Ａ又はＣ）各々１２５ｎＭ、及びビオチン標識ｄｄＮＴＰ（Ａ又はＣのいずれか）５００ｎＭ、多型部位に組み込む特定塩基に依存して、１０Ｘ酵素反応緩衝液（１Ｘ最終濃度に希釈する）及びＳｅｑｕｅｎａｓｅ酵素５単位を反応混合物に加えた。反応を９４℃で１分間サイクリングし、次いで９４℃で１０秒間及び６０℃で３０秒間の４０サイクルを実施した。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルと４℃での保持をこの実施例における伸長プロフィールとして使用した。
【００５８】
非サイクリング反応
クレノウラージフラグメントポリメラーゼ反応を伸長のために使用したときには、最初の段階は伸長プライマーの一本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを必要とした。ｓｓＤＮＡ１００ｎｇを伸長プライマー２０μＭにアニーリングした。プライマーとＤＮＡを９０℃で５分間混合し、その後ハイブリッドが形成されるように緩やかに室温まで冷却した。この工程は約１時間を要した。次の段階は、クレノウラージフラグメント５単位と共に、特異的非標識及び標識ビオチンｄｄＮＴＰ（１．５μＭ）を加えることを含み、３７℃で３０分間インキュベートした。伸長の最後に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １．５μｌを反応混合物に加えた。
【００５９】
ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して伸長産物（サイクリング又は非サイクリング）を精製し、組み込まれなかったビオチンを除去した。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ１０μｌ（２Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ  ＮａＣｌ）中）を精製した伸長産物２０μｌと室温で２０分間混合した。ビーズに磁場を適用し、非結合伸長産物を廃棄した。ビーズを同じ結合緩衝液１ｍｌで少なくとも２回洗い、９５℃の熱を２分間適用して対象とする鎖をビーズから溶出した。
【００６０】
次に溶出した鎖を、特異的プライマーを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）に供して、その特異的対立遺伝子の多型を確認した。結果を確認するために適切な対照試験を実施した。
【００６１】
１．Ｃ．ライゲーション法
この実施例は、一本鎖ＤＮＡ鋳型にアニーリングする前の、２個のプライマー間でのライゲーション事象の使用を含んだ。この実施例は、完全に対合したときのｓｓＤＮＡと２個のプライマーのライゲーションは強力な二本鎖ＤＮＡを形成し、従ってより高い温度（プライマーのＴｍ以上）での洗浄に耐えるであろうという理解の下に実施した。ミスマッチ鋳型はプライマーのＴｍより高い温度での洗浄に耐えることは困難であり、二本鎖ＤＮＡを形成せず、最終的には洗い流されるはずである。
【００６２】
そのうち１個のプライマー、すなわち対立遺伝子特異的プライマー又はヘテロ配列プライマーが３’末端に多型部位を持ち、５’末端にビオチン標識を持つ２個のプライマーを、互いに隣接して配置した。第二のプライマーは、ライゲーションを仲介するために５’末端上にリン酸基を持つライゲーションプライマーであった。ｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする前に２つのプライマーがライゲートすると仮定したが、本発明はこの仮定に依存しない。２０μｌの反応混合物は、特異的ｓｓＤＮＡ１０μｌ（１００ｎｇ）、各々のプライマー１μｌ（１μＭ）、１０Ｘライゲーション緩衝液２μｌ及びＴａｑリガーゼ１０Ｕを含んだ。
【００６３】
混合物をサーモサイクラーにおいて９０℃で２分間加熱し、次いで３７℃で３０分間インキュベートして、その時点でＥＤＴＡを加えて反応を停止した。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを用いて混合物を精製し、対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応における非特異性の原因となりうる、組み込まれなかったすべてのプライマーとビオチンを排除した。
【００６４】
精製した複合体を上述したようにストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合した。複合体を高ストリンジェンシー洗浄条件下で洗った。洗浄のストリンジェンシーを洗浄緩衝液の温度上昇（５５−９５℃）によって制御したので、閾値温度は対立遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントの分離に達しようとする温度であった。溶出した鋳型を、捕獲した対立遺伝子の多型部位を認識するプライマーを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲによってさらに確認した。
【００６５】
２．ハプロタイピングのためのハイブリダイゼーションアッセイ
ＨＬＡ  Ａ遺伝子座の特定多型に関する種々のオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用する種々のビーズセット（Ｌｕｍｉｎｅｘ）に結合させた。完全な配列相同性を与えるためにオリゴ結合ビーズにハイブリダイズした鋳型を選択した。特定オリゴへのビーズの結合は製造者（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）の指示に従って実施した。Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ−プローブ複合体を上記で作製したＰＣＲフラグメントとハイブリダイズした。対立遺伝子特異的ＰＣＲフラグメントの分離のために使用したプローブの配列は次の通りであった：
Ｌ５’Ａ１０７Ａ  １ＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ
Ｌ５’Ａ１０７Ｃ  １ＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧ
ハイブリダイズしなかったＰＣＲ鋳型を洗い流し、５’Ａ１０７Ａ又は５’Ａ１０７Ｃに特異的にハイブリダイズしたＰＣＲフラグメントをＬｕｍｉｎｅｘビーズから溶出した。スペーサーを含む及び含まない（すなわちオリゴ配列の中央に付加的な２０個のランダム塩基を含む）種々のサイズのオリゴを様々なビーズセットに結合し、種々の対立遺伝子の特異性について検定するために種々の鋳型にハイブリダイズさせた。プライマーの同定における数字はビーズに結合した種々のオリゴヌクレオチドに相関し、特異的対立遺伝子についての多型部位を示唆する。例えば１０７Ａ又はＣは塩基１０７の多型部位を意味し、各々の対立遺伝子は１０７位にＡ又はＣのいずれかを持つ。
【００６６】
ハイブリダイゼーションについての反応プロトコールは次の通りであった：ｓｓＤＮＡ１７μｌを９５℃で５分間変性し、次いで鋳型に相補的な特異的オリゴ結合ビーズ（５０００ビーズ／オリゴ）３３μｌを加えて、５５℃で３０分間インキュベートした。スペーサーを持つオリゴを使用するときには、特異性を確保するためにハイブリダイゼーション温度を６５℃に上げた。ビーズ混合物を十分に渦動攪拌し、音波破砕して、必要なハイブリダイゼーション温度まで上げた後、ｓｓＤＮＡを加えた。ハイブリダイゼーション後、混合物を２０００×ｇで遠心分離し、１．５Ｘ  ＴＭＡＣ（３Ｍ  ＴＭＡＣ、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）各々１ｍｌで２回洗って、上清を廃棄した。
【００６７】
Ｈ２Ｏ  ２０μｌを複合体に加え、オリゴ結合ビーズに結合した捕獲鋳型を９５℃で５分間溶出した。溶出した鋳型１μｌを非対称ＰＣＲに供して、２回目のラウンドのハイブリダイゼーションのためにより豊富な溶出鋳型を得た。
【００６８】
鋳型の正確さを確認するための試験として、捕獲した鋳型に相補的な第二のビーズセットに関して第二ラウンドのハイブリダイゼーションを実施した。各々のチューブにストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）１２０ｎｇを加えた後、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００フローサイトメトリー装置で試料を測定し、さらに５分間ハイブリダイゼーション温度でインキュベートした。得られた蛍光シグナルの量はビオチンとＳＡ−ＰＥの相互作用の真正な表示であった。このアッセイは定量的であり、陽性シグナルの量は所与の反応について得られた最も高い数として表わした。
【００６９】
２回目のラウンドのハイブリダイゼーションは、次のような他の対立遺伝子特異的Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ−プローブを使用した：
対立遺伝子特異的分離を確認するために使用したＬｕｍｉｎｅｘビーズ−プローブ
Ｌ５’Ａ１０７Ａ  １ＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧ
Ｌ５’Ａ１０７Ｃ  １ＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧ
Ｌ５’Ａ１５３Ａ  １ＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣ
Ｌ５’Ａ１５３Ｃ  １ＣＴＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣ
Ｌ５’Ａ２４９Ｔ  １ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＴＡＴ
Ｌ５’Ａ２４９Ｇ  １ＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴ
Ｌ５’Ａ２９１Ｃ  １ＧＡＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴ
Ｌ５’Ａ２９１Ｇ  １ＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴ
【００７０】
【表１】
2004520812.tif 000003
【００７１】
【表２】
2004520812.tif 000004
【００７２】
【表３】
2004520812.tif 000005
【００７３】
上記の表の結果は、対立遺伝子特異的な数が非対立遺伝子特異的反応よりも高いことから、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションの成功を明らかにしている。
【００７４】
当業者には理解されるように、あらゆる目的のために、特に文書での説明を提供することに関して、ここで開示するすべてのレンジはあらゆる可能なサブレンジ及びそれらのサブレンジの組合せも包含する。リストしたレンジは、同じレンジが少なくとも等しい２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１、等々に分類されることを十分に説明し、それを可能にするものとして容易に認識されうる。非制限的な例として、ここで論じる各々のレンジは下３分の１、真中の３分の１及び上３分の１、等々に容易に分類できる。同様に当業者には理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「以上」、「未満」等のようなすべての言語は、その後上記で述べたようなサブレンジに分類することができるレンジを指す。
【００７５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態だけを説明したが、当業者は、本発明の中心的精神と範囲から逸脱することなく実施形態を修正し、変更しうることを認識するであろう。それ故、上記で述べた好ましい実施形態は、すべての点において例示であり、非制限的とみなされるべきであり、本発明の範囲は上記の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって指示され、特許請求の範囲の等価物の意味と範囲内に含まれるすべての変更を包含することが意図されている。
下記の参考文献は、その全体が参照して本特許出願に組み込まれる：
【００７６】
【表４】
2004520812.tif 000006
2004520812.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に従った対立遺伝子特異的プライマー伸長法を利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【図２】
プライマーサイズタグアプローチによる一塩基伸長を用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【図２Ａ】
プライマーサイズタグアプローチによる一塩基伸長を用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【図３】
本発明に従った対立遺伝子特異的ライゲーションとプライマーサイズタグを利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【図４】
本発明に従ったハイブリダイゼーションとプライマーサイズタグを利用した対立遺伝子同定を例示する概要図である。
【図５】
本発明に従ったホモプライマーとヘテロプライマーのセットを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示した概要図である。
【図６Ａ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図６Ｂ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図６Ｃ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図６Ｄ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図６Ｅ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図６Ｆ】
本発明に従った複数のプライマーを含む蛍光ビーズを用いて複対立遺伝子を同定する方法を例示する。
【図１】
2004520812.tif 000008
【図２】
2004520812.tif 000009
【図２Ａ】
2004520812.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2004520812.tif 000014
【図６Ｂ】
2004520812.tif 000015
【図６Ｃ】
2004520812.tif 000016
【図６Ｄ】
2004520812.tif 000017
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2004520812.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004520812.tif 000020
2004520812.tif 000021
2004520812.tif 000022
2004520812.tif 000023
2004520812.tif 000024
2004520812.tif 000025
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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