(57)【要約】三葉因子ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
三葉第２因子（TFF2）ペプチド（但し、グリコシル化されたLys99−TFF2ではない）
又は医薬的に許容できるその塩を含んで成る、哺乳類における粘液層の粘度を高めるための医薬組織組成物。
【請求項２】
前記哺乳類がヒトである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
局部及び管腔適用のための請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
非経口投与のための請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項５】
経口投与のための請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記TFF2ペプチドが、ヒト組み換えTFF2である請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ヒトTFF2ペプチドが、グリコシル化される請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ムチン糖タンパク質調製物をさらに含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
口内粘液の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
唾液の低められた分泌による患者の処理のための請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
唾液の低められた分泌は、刺激的治療、抗コリン作用剤による処理又はシェーグレン症候群により引き起こされる請求項10記載の医薬組成物。
【請求項１２】
気道の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻の分泌物の粘度を高めるための請求項12記載の医薬組成物。
【請求項１４】
刺激物、ガス、ダスト又はフュームの偶然の吸入に続いての気道の処理のための請求項13記載の医薬組成物。
【請求項１５】
食道の遠位部分の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１６】
食道逆流、出血性裂孔又はBarrets食道における胃からの酸分泌に対する保護のための請求項15記載の医薬組成物。
【請求項１７】
胃の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患に続くストレス誘発性胃潰瘍の処理、又はアスピリン、他のNSAIDS、ステロイド又はアルコールによる処理のための請求項17記載の医薬組成物。
【請求項１９】
下痢の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２０】
クローン病、潰瘍性大腸炎又は刺激性腸症候群における小腸又は結腸粘液の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２１】
眼の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２２】
角結膜炎、乾燥/シューグレン症候群又はドライアイを有する患者における涙液の粘度を高めるための請求項21記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記医薬組成物が眼薬に存在する請求項21又は22記載の医薬組成物。
【請求項２４】
膝関節の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２５】
変形性関節炎における及び関節置換に続いての滑液の粘度を高めるための請求項24記載の医薬組成物。
【請求項２６】
慢性膀胱感染、カテーテルを有する患者、間質性膀胱炎、乳頭腫又は膀胱癌の処理のための請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２７】
哺乳類における粘液層の粘度を高めるための薬剤の調製のためへのTFF2ペプチド（但し、グリコシル化ではない）の使用。
【請求項２８】
哺乳類における粘液層の粘度を高めるための、請求項１〜26のいずれか１項記載の薬剤の調製のためへのTFF2ペプチドの使用。
【請求項２９】
前記哺乳類がヒトである請求項27又は28記載の使用。
【請求項３０】
対象における粘液層の粘度のインビボ上昇のための方法であって、
ａ）医薬的許容できるキャリヤー又は希釈剤、
ｂ）治療的有効量のTFF2ペプチド（但し、グリコシル化されたLys99−TFF2ではない）、及び任意には、
ｃ）ムチン糖タンパク質調製物を含んで成る組成物を前記対象に投与することを含んで成る方法。
【請求項３１】
前記投与が、局部及び管腔である請求項30記載の方法。
【請求項３２】
前記投与が、非経口である請求項30記載の方法。
【請求項３３】
前記TFF2ペプチドが、ヒト組み換えTFF2である請求項30〜32のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記TFF2ペプチドが、グリコシル化される請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記ムチン粘度レベルが、口内粘液における疾病状態に関連している請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記疾病状態が、唾液の低められた分泌である請求項35記載の方法。
【請求項３７】
唾液の低められた分泌が、刺激的治療、抗コリン作用剤による処理又はシェーグレン症候群により引き起こされる請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記ムチン粘度レベルが、気道における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記疾病状態が、通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻の分泌物の粘度を高めるための請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記疾病状態が、刺激物、ガス、ダスト又はフュームの偶然の吸入である請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記ムチン粘度レベルが、食道の遠位部分における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記疾病状態が、食道逆流、出血性裂孔又はBarrets食道における胃からの酸分泌である請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記ムチン粘度レベルが、胃における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
前記疾病状態が、外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患、又はアスピリン、他のNSAIDS、ステロイド又はアルコールによる処理に続くストレス誘発性胃潰瘍である請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記疾病状態が、下痢である請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
前記ムチン粘度レベルが、小腸又は結腸における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
前記疾病状態が、クローン病、潰瘍性大腸炎又は刺激性腸症候群である請求項46記載の方法。
【請求項４８】
前記ムチン粘度レベルが、眼における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
前記疾病状態が、角結膜炎、乾燥/シューグレン症候群又はドライアイである請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記ムチン粘度レベルが、膝関節における疾病状態と関係する請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
前記疾病状態が、変形性関節炎における及び関節置換に続いての滑液の高められた粘度である請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記疾病状態が、慢性膀胱感染、カテーテルを有する患者、間質性膀胱炎、乳頭腫又は膀胱癌である請求項30〜34のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、三葉第２因子（TFF2）ペプチドの使用、及び粘液層におけるムチンの粘度を高めるための、及び胃腸管（口、食道、胃、小及び大腸、結腸）、気道、眼、尿システム（膀胱を包含する）及び子宮頸における損傷された粘液層の修復するための、TFF2ペプチドを含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類三葉因子（TFF）は、胃腸管に広く分布される３種のペプチド（TFF1, TFF2, 及びTFF3）の郡を構成する。それらのペプチドは、１つの（TFF1及びTFF3）又は２つの（TFF2）三葉ドメインを含むことによって特徴づけられる。三葉ドメインは、６個のシステインが１−５、２−４及び３−６配置においてジスルフィド結合されている、38又は39個のアミノ酸残基の配列として定義される。三葉ペプチドは、胃腸管において、組織特異的態様で発現される。ヒトにおいては、TFF1及びTFF2は、胃及び十二指腸における粘液生成細胞において発現され、そしてTFF3は、小及び大腸における杯状細胞において主に発現される。
【０００３】
胃潰瘍又は炎症性腸疾患においては、三葉ペプチドの発現が高くアップレギュレートされる。これは、三葉ペプチドが胃腸管における損傷のための修復機能を有し、従って、天然において存在する治癒因子として作用することを示唆する。正常な粘膜機能のためのTFFの重要性はまた、それぞれTFF1及びTFF3をコードする遺伝子が遺伝子標的化技法により欠失される２種の遺伝子ノックアウト研究により調査された。TFF3ノックアウトマウスは、粘膜治癒を損なっており、そして硫酸デキストランの経口投与の後、広範囲な大腸炎により死亡し、この状況は、組み換えTFF3の管腔投与により回避される。いくつかの研究が胃潰瘍及び大腸炎モデルにおける三葉ペプチドの保護又は治癒効果を示しているが、その詳細な作用機構は多くは知られていない。
【０００４】
ラット及びヒト一本鎖ドメインTFF3（ITF）のクローニング、及び胃腸損傷の処理へのこのペプチドの使用は、WO92/14837号に記載される。
国際特許出願WO94/17102号及びアメリカ特許第5,783,416号は、グリコシル化された形でのヒトTFF2ペプチド、その変異体及びグリコシル化された形でのTFF2ペプチドの生成方法を言及する。
国際特許出願DK01/00811号は、グリコシル化されたLys99-TFF2ペプチドを言及する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ムチン溶液のレオロジー性質を改良するためへのヒトTFF2ペプチドの使用に関する。TFF2ペプチドは、生理学的及び病理生理学状態に相互関係する、異なったムチン溶液の粘度及び弾性を高めることが、本発明者により見出された。
本発明は、TFF2ペプチドが、ムチン溶液の粘度及び弾性に対するTFF2ペプチドの直接的な効果により示されるそれらの生物学的活性を発揮する機構を開示する。TFF2ペプチドは、ムチン溶液の粘度を有意に高める。正味効果は、数倍の粘度の上昇であり、そして液体ムチン溶液がより粘性のゲル様物質に転換される事実により可視化され得る。
【０００６】
酵母において発現される場合、TFF2ペプチドは、グリコシル化された及びグリコシル化されていない形で分泌される。グリコシル化された形は、グリコシル化されていない形と比較して、より粘性のゲル様構造体を生成する。
TFF2ペプチドは、存在する粘液層の異常性が存在する場合、多くの異なった徴候の処理に使用され得る粘液層の粘度及び弾性を高めるために有用であることを、本発明者が見出した。既知の治療以上の利点は、TFF2ペプチドによる処理が主要副作用を伴わないで外傷の側での特定の処理を提供することである。
【０００７】
局部及び管腔適用に関しては、TFFペプチドは、次の多くの異なった徴候において有用である。粘液層におけるムチンの粘度及び弾性性質を高めることができる：
１）口内粘膜の処理に関しては、TFF2ペプチドは、刺激療法、抗コリン作用剤による処理により引き起こされる唾液の低められた分泌を有する患者、又はシューグレン症候群を有する患者に、単独で又は粘液様調製物と一緒に与えられ得る。
２）通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻漏における鼻分泌液の粘度を高めることに関しては、刺激物、ガス、ダスト又はフェームの偶然の吸入に続く呼吸気管の粘膜を保護できる。
３）食道逆流、出血性裂孔又はBarrets食道における胃からの酸分泌に対する食道の遠位部分の保護に関して。
【０００８】
４）外傷、ショック、大手術、腎又は肝疾患に続く急性ストレス誘発性胃潰瘍、又はアスピリン、他のNSAIDS、ステロイド又はアルコールによる処理により引き起こされる胃炎に対する胃の保護に関して。
５）腸分泌の粘度を高くすることによる急性又は延長された下痢の処理に関して。
６）クローン病、潰瘍性大腸炎又は刺激性腸症候群における小腸又は結腸粘液の保護に関して。
７）他の理由に関しては、角結膜炎、乾燥/シューグレン症候群又はドライアイを有する患者における涙液の粘度を高めるために眼薬に関して。
８）変形性関節炎における及び関節置換に続いての滑液の粘度を高めるために特に膝関節への局部適用に関して。
【０００９】
TFF2ペプチドはまた、非経口適用のためにも使用され得る：
非経口TFF2は、胃腸管における幹細胞に関する細胞により取られる。それは、ストレス−誘発された損傷に対する胃の保護、及び照射又は化学療法に続く又は潰瘍性大腸炎、刺激性腸症候群又はクローン病の処理における損傷に対する胃及び腸の保護のために使用され得る。注入されたTFF2は、尿において完全に排泄され、そして尿細胞層を被覆するムコ多糖類の層に結合することによって尿膀胱の防御機構を高めることができ、そしてそれにより、慢性膀胱感染、カテーテルを有する患者、間質性膀胱炎における細菌の付着を防げるか、又は乳頭腫又は膀胱癌における尿増殖因子の結合を妨げることができる。
【００１０】
第１の観点においては、三葉第２因子（TFF2）ペプチド（但し、グリコシル化されたLys99−TFF2ではない）又は医薬的に許容できるその塩を含んで成る、哺乳類における粘液層の粘度を高めるための医薬組織組成物に関する。
【００１１】
“TFF2ペプチド類”、又は“１つのTFF2ペプチド”とは、本明細書においてまた、Lys99−TFF2として示される、ヒトTFF2に対して実質的に相同であるタンパク質を意味する（図１）。この定義内の例は、Asn99−TFF2位変体である。Lys99−TFF2及びAsn99−TFF2の両者は、Asn15グリコシル化され得る。用語TFF2ペプチドはまた、天然に存在するTFF2ペプチドの類似体を包含する。類似体は、アミノ酸配列の差異により、又は配列に影響を及ぼさない修飾により、又は両者により、天然に存在するTFF2とは異なることができる。本発明の類似体は一般的に、天然に存在するTFF2配列と少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは90％及び最も好ましくは95％又はさらに99％の配列同一性を示すであろう。
【００１２】
用語“グリコシル化されたLys99−TFF2”とは、本明細書において使用される場合、Asn15でグリコシル化される、図１のTFF2ペプチドを意味する。
修飾は、ポリペプチドのインビボ、又はインビトロ化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化を包含する。グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成又はプロセッシングの間、又はされなるプロセッシング段階において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えばそのようなプロセッシング、例えば哺乳類グリコシル化酵素を通常供給する細胞に起因するグリコシル化に影響を及ぼす酵素に前記ポリペプチドを暴露することによって行われるそれらの修飾がまた包含される。リン酸化されたアミノ配列のバージョンがまた、包含される。
【００１３】
実質的に十分な長さのポリペプチドの他に、用語TFF2ペプチドは、本明細書において使用される場合、ポリペプチドの生物学的活性フラグメントを包含する。本明細書において使用される場合、ポリペプチドに適用されるような用語“フラグメント”とは、通常少なくとも10個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも20個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも30個の連続したアミノ酸、通常少なくとも40個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも50個の連続したアミノ酸、及び最も好ましくは少なくとも60〜80個、又はそれ以上連続したアミノ酸の長さであろう。TFF2ペプチドの生物学的活性を示す候補体フラグメントの能力は、当業者に知られている方法により評価され得る。ポリペプチドの生物学的活性のために必要とされない追加のアミノ酸、又は他のmRNAフラグメント又は他のタンパク質プロセッシング現象に起因する追加のアミノ酸を包含する、タンパク質プロセッシングの間、通常除去されるアミノ酸を含む生成物学的活性TFF2ペプチドがまた、用語“フラグメント”に包含される。
【００１４】
フラグメント又は類似体を包含するTFF2ペプチドは、それが天然に存在するTFF2の生物学的活性、例えば哺乳類における粘液層におけるムチンの粘度又は弾性を変更する能力を示す場合、生物学的に活性である。
用語“グリコシル化”とは、本明細書において使用される場合、炭水化物分子がペプチドに共有結合されている、ペプチドの後−翻訳修飾を意味する。グリコシル化は、真核宿主細胞、例えば酵母細胞において生じることができ、又はそれは、細胞におけるペプチドの生成の後、化学的連鎖により行われ得、例えばペプチドは、細菌において生成され、そしてその後、インビトロでグリコシル化され得る。
【００１５】
第２の観点においては、本発明は、哺乳類における粘液層の粘度を高めるための薬剤の調製のためへのTFF2ペプチド（但し、グリコシル化ではない）の使用に関する。
第３の観点においては、本発明は、
ａ）医薬的許容できるキャリヤー又は希釈剤、
ｂ）治療的有効量のTFF2ペプチド（但し、グリコシル化されたLys99−TFF2ではない）、及び任意には、
ｃ）ムチン糖タンパク質調製物を含んで成る組成物を前記対象に投与することを含んで成る、対象における粘液層の粘度のインビボ上昇のための方法関する。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、哺乳類における粘液層の高められた粘度を有する状態の処理のためへのTFF2ペプチド（但し、グリコシル化されたLys99−TFF2ではない）の使用に関する。
用語“処理”とは、本明細書において使用される場合、いずれかの徴候又は疾病状態の進行を妨げるために、又はすでに進行したそのような徴候又は疾病状態を治癒するか又は容易にするために、有効量の本発明の治療的活性化合物の投与を意味する。従って、用語“処理”とは、予防及び保護処理を包含することを意味する。徴候又は疾病状態は、胃潰瘍又は喘息、遺伝性生物学的障害、又は外部刺激、例えば毒性又は酸性化学物質の吸入により誘発される状態を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００１７】
本発明の１つの態様においては、哺乳類は、ヒトである。
もう１つの態様においては、本発明は、局部適用のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、管腔適用のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、非経口投与のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、経口投与のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ムチン糖タンパク質調製物をさらに含んで成る医薬組成物に関する。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明は、口内粘液の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、唾液の低められた分泌を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、唾液の低められた分泌は、刺激的治療、抗コリン作用剤による処理又はシェーグレン症候群により引き起こされる。
さらなる態様においては、本発明は、照射療法を受ける患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、抗コリン作用剤による処理される患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、シューグレン症候群を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
【００１９】
さらなる態様においては、本発明は、呼吸路の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、通常の風邪又はアレルギー性鼻炎における鼻の分泌物の粘度を高めるため医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、通常の風邪を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、アレルギー性鼻炎を有する患者の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、気道の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、刺激物の偶然の吸入に続いての気道の処理のための医薬組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様においては、本発明は、ガス、ダスト又はフェームの偶然の吸入に続いての気道の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、食道の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、本発明は、食道の遠位部分の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、食道逆流における胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、Burrets食道における胃からの酸分泌に対する保護のための医薬組成物に関する。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、胃の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ストレス誘発性胃潰瘍の処理のための医薬組成物に関する。１つの態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、外傷に続くものである。もう１つの態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、ショックに続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、大手術に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、腎疾患に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、肝疾患に続くものである。さらなる態様においては、前記ストレス誘発性胃潰瘍は、アスピリン、他の非ステロイド性炎症薬物（NSAIDS）、ステロイド又はアルコールによる処理のものである。
【００２２】
さらなる態様においては、本発明は、下痢の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、小腸粘膜の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、結腸粘膜の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、刺激性腸症候群の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、クローン病の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、胃潰瘍大腸炎の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、眼の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
【００２３】
さらなる態様においては、本発明は、角結膜炎を有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、シューグレンを有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は、ドライアイを有する患者における涙液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
用語“ドライアイ”とは、本明細書において使用される場合、眼が乾燥していることを感じるいずれかの状態を意味する。
【００２４】
さらなる態様においては、本発明は眼薬における医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は膝関節の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は変形性関節炎における滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は関節置換に続く滑液の粘度を高めるための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は膀胱の処理のための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明はカテーテルを有する患者のための医薬組成物に関する。
【００２５】
さらなる態様においては、本発明は感染の処理ための医薬組成物に関する。１つの態様に関しては、前記感染は、膀胱の慢性感染である。
さらなる態様においては、本発明は間質性膀胱炎の処理ための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は乳頭腫の処理ための医薬組成物に関する。
さらなる態様においては、本発明は癌の処理ための医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはヒトTFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドは組換えヒトTFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはヒトAsn99-TFF2である。
【００２６】
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドは組換えヒトAsn99-TFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化される。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化されない。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化されたAsn99-TFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化された組換えAsn99-TFF2である。
【００２７】
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化されていないAsn99-TFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化されていない組換えAsn99-TFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化されたLys99-TFF2である。
本発明のさらなる態様においては、TFF2ペプチドはグリコシル化された組換えLys99-TFF2である。
【００２８】
TFF2ペプチドは典型的には、デンマーク特許出願番号2000/01847号及び2000/01850号に記載される組み換えDNA技法により生成される。このためには、TFF2ペプチドをコードするDNA配列は、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準技法（Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989）に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ペプチドのすべて又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって、単離され得る。この目的のためには、ペプチドをコードするDNA配列は好ましくは、ヒト起源のもの、すなわちヒトゲノムDNA又はcDNAライブラリーから誘導される。
【００２９】
TFF2ペプチドをコードするDNA配列はまた、確立された標準方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869により記載されるホスホアミジット方法、又はMatthesなど., EMBO Jourral 3 (1984), 801-806により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット方法に従って、オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにクローン化される。
【００３０】
DNA配列はまた、例えばアメリカ特許第4,683,202号、Saikiなど., Science 239 (1988), 487-491, 又はSambrookなど., 前記に記載される特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。
TFF2ペプチドをコードするDNA配列は、便利には組換えDNA方法にゆだねられ得る。いずれかのベクターであり得る組換えベクター中に通常には挿入され、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自立的に複製するベクター、すなわち染色体外実在物（この複製は、染色体複製とは無関係である）として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色と共に複製されるベクターであり得る。
【００３１】
ベクターは好ましくは、TFF2ペプチドをコードするDNA配列がDNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに操作可能的に結合されている発現ベクターである。一般的に発現ベクターは、プラスミド又はウィルスDNAから誘導されるか、又は両者の要素を含むことができる。用語“操作可能に結合される”とは、セグメントが、それらがそれらの意図された目的に関して機能し、例えば転写がプロモーターにより開始し、そしてペプチドをコードするDNA配列を通して進行するよう配置されることを示す。
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性の示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同の又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。
【００３２】
哺乳類細胞におけるTFF2ペプチドをコードするDNAの転写を指図するための適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター（Subramani., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864）, MT-1 (メタロチオネイン遺伝子)プロモーター（Palmiterなど., Science 222 (1983), 809-814）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。
昆虫細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター（アメリカ特許第4,745,051号；Vasuvedanなど., FEBS Lett. 311 (1992) 7-11）、P10プロモーター（J. M. Vlakなど., J. Gen. Virology 69, 1988, pp.765-776）、オートグラファ・カリホミカ（Autographa califomica）多角体病ウィルス塩基性タンパク質プロモーター（EP397485号）、バキュロウィルス即時型初期遺伝子１プロモーター（アメリカ特許第5,155,037号、第5,162,222号）、又はバキュロウィルス39K遅延された初期遺伝子プロモーター（アメリカ特許第5,155,037号、第5,162,222号）である。
【００３３】
酵母宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子（Hitzemanなど., J.Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Young など., in Genetic Engineering ofMicroorqanisms for Chemicals(Hollaender など, eds.), Plenum  Press, New York, 1982）、TPI1（アメリカ特許第4,599,311号）又はADH2−4c（Russell etal., Nature 304 (1983), 652-654）プロモーターを包含する。
【００３４】
糸状菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターは、例えばADH3プロモーター（Mcknightなど., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099）又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. オリザエ（A. oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. ニガー（A. niger）中性α−アミラーゼ、A. ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A. ニガー又はA. アワモリ（A. awamori）グルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A. オリザエアルカリプロテアーゼ、A. オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はA. ニジュランス（A. nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたそれらである。TAKA−アミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。適切なプロモーターは、例えばEP238023号及びEP383779号に言及される。
【００３５】
TFF2ペプチドをコードするDNA配列はまた、必要なら、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiterなど., Science 222, 1983, pp. 809-814）, TP11 (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1. 1982, pp. 419-434), 又はADH3（Mcknight）など., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099) ターミネーターに操作可能的に結合され得る。ベクターはさらに、要素、例えばポリアデニル化シグナル（例えば、SV40又はアデノウィルス5EIb領域からの）、転写エンハンサー配列（例えば、SV40エンハンサー）及び翻訳されたエンハンサー配列（例えば、アデノウィルスVA RNAをコードする配列）を含んで成ることができる。
【００３６】
組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。そのような配列の例（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）は、複数のSV40起点である。
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製の起点である。
【００３７】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば１つの遺伝子（この生成物は、宿主細胞における欠失を補足する）、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子、又はシゾサッカロミセスポンベ（Schisosaccharomyces pombe）TPI遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130により記載される）、又は薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んで成ることができる。糸状菌に関しては、選択マーカーは、amdS, pyrG, argB, niaD, 又はsCを包含する。
【００３８】
宿主細胞の分泌路中に本発明のTFF2ペプチドを指図するためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列として知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠で、TFF2ペプチドをコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列の5’側に通常位置する。分泌シグナル配列は、通常、タンパク質に関連する配列であるか、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からであり得る。
【００３９】
酵母細胞からの分泌に関しては、分泌シグナル配列は、細胞の分泌路中への発現されたTFF2ペプチドの効果的な指図を確保するいずれかのシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド、又はその機能的部位であり得るか、又は合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因子シグナルペプチド（アメリカ特許第4,870,008号を参照のこと）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchleなど., Nature 289, 1981, pp. 643-646）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A. Valisなど., Cell48, 1987, pp. 887-897）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670号）、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチド（M. Egel-Mitaniなど., Yeast 6, 1990, pp. 127-137）であることが見出されている。
【００４０】
酵母における効果的な分泌に関しては、リーダーペプチドをコードする配列はまた、シグナル配列の下流に及びTFF2ペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入され得る。リーダーペプチドの機能は、ゴルジ体への、及びさらに、培養培地中への分泌のための分泌小胞への小胞体からの発現されたペプチドの方向付け（すなわち、酵母細胞の細胞周辺腔中への細胞を通しての又は少なくとも細胞膜を通してのTFF2ペプチドの輸送）を可能にすることである。リーダーペプチドは、酵母α−因子リーダーであり得る（その使用は、例えばアメリカ特許第4,546,082号、アメリカ特許第4,870,008号、EP16201号、EP123294号、EP123544号及びEP163529号に記載される）。他方では、リーダーペプチドは、天然において見出されないリーダーペプチドである合成リーダーペプチドであり得る。例えば、合成リーダーペプチドは、WO89/02463号又はWO92/11378号に記載されている。
【００４１】
糸状菌への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、アスペルギラスsp. アミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ又はプロテアーゼをコードする遺伝子、又はヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼをコードする遺伝子から誘導され得る。シグナルペプチドは好ましくは、A．オリザエTAKAアミラーゼ、A．ニガー中性α−アミラーゼ、A．ニガー酸安定性アミラーゼ、又はA．ニガーグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。適切なシグナルペプチドは、例えばEP238023号及びEP215594号に開示される。
【００４２】
昆虫細胞への使用に関しては、シグナルペプチドは便利には、昆虫遺伝子（WO90/05783号）、例えば鱗翅目のマンジュカ・セキスタ（Manduca sexta）脂肪動員物質）ホルモン前駆体ペプチド（アメリカ特許第5,023,328号）から誘導され得る。
それぞれ、TFF2ペプチド、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び/又は分泌シグナル配列をコードするDNA配列を連結し、そして複製のために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, 1989）。
TFF2ペプチドをコードするDNA配列が導入される宿主細胞は、後翻訳の修飾されたTFF2ペプチドを生成することができるいずれかの細胞であり得、そして酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。
【００４３】
適切な哺乳類細胞系の例は、COS（ATCC CRL1650）, BHK (ATCC CRL1632, ATCC CCL10), CHL (ATCC C39) 又はCHO (ATCC CCL61) 細胞系である。哺乳類細胞をトランスフェクトし、そして細胞に導入されるDNA配列を発現する方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327-341; Loyterなど., Proc.Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426;Wiglerなど., Cell 14(1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7(1981), 603, Graham and van der Eb, Virology52 (1973), 456; 及びNeumannet al., EMBO J. 1 (1982), 841-845に記載される。
【００４４】
適切な酵母細胞の例は、サッカロミセスsp.又はシゾサッカロミセスspp., 特にサッカロミセス・セレビシアエ又はサッカロミセス・クルイベリの株の細胞を包含する。異種DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれらから異種ポリペプチドを生成するための方法は、例えばアメリカ特許第4,599,311、第4,931,373号、第4,670,008号、第5,037,743号及び第4,845,075号（それらのすべては、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、薬物耐性、又は特定の栄養物、例えばロイシン不在下で増殖する能力により決定される表情型により選択される。
【００４５】
酵母への使用のための好ましいベクターは、アメリカ特許第4,931,373号に開示されるPOT1ベクターである。TFF2ペプチドをコードするDNA配列に続いて、シグナル配列及び任意には、リーダー配列が存在する。適切な酵母細胞のさらなる例は、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、例えばK. ラクチス（K. lactis）、ハンセヌラ（Hunsenula）、例えばH. ポリモルファ（H．polymorpha）、又はピチア（Pichia）、例えばP. パストリス（P．pastoris）の株である（Gleesonなど., J. Gen. Microbiol. B2, 1986, pp. 3459-3465; アメリカ特許第4,882,279号）。
【００４６】
他の菌類細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギラスspp., ニューロスポラspp., フサリウムspp. 又はトリコダーマspp. の株、特にA．オリザエ、A．ニジュランス又はA．ニガーの株である。タンパク質の発現のためへのアスペルギラスspp.の使用は、例えばEP272277号、EP238023号、EP184438号に記載される。F．オキシスポラムの形質転換は、Malardierなど., 1989, Gene 78: 147-156により記載される。トリコダーマsppの形質転換は、例えばEP244234号に記載のようにして行われ得る。
【００４７】
糸状菌が宿主細胞として使用される場合、それは、便利には、組換え宿主細胞を得るために、宿主染色体にDNA構成体を組み込むことによって、本発明のDNA構成体により形質転換され得る。この組み込みは一般的に、DNA配列が細胞に安定して維持される場合、有益であると思われる。宿主染色体中へのDNA構造体の組み込みは、従来の方法、例えば相同又は異種組換えにより行われ得る。
【００４８】
昆虫細胞の形質転換及びそこにおける異種ポリペプチドの生成は、アメリカ特許第4,745,051号；第4,879,236号；第5,155,037号；第5,162,222号；EP397,485号（それらはすべて引用により本明細書に組み込まれる）に記載のようにして行われ得る。宿主として使用される昆虫細胞系は適切には、レピドプテラ（Lepidoptera）細胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞又はトリコプルシエ・ニ（Trichoplusia ni）細胞である（アメリカ特許第5,077,214号）。培養条件は、適切には、WO89/01029号又はWO89/01028号、又は前述の引例のいずれかに記載される。
【００４９】
次に、上記形質転換されるか又はトランスフェクトされた宿主細胞は、TFF2ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地において培養され、この後、得られるペプチドのすべて又は一部が培養物から回収され得る。細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地、例えば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は市販されており、又は公開されたレセピー（例えば、ATCCのカタログ）に従って調製され得る。次に、細胞により生成されるTFF2ペプチドが、従来の方法、例えば遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清液又は濾液のタンパク質成分の沈殿、問題のポリペプチドの型に依存して、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル化クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものによる精製により、培養培地から回収され得る。
【００５０】
本発明の医薬組成物においては、TFF2ペプチドは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 1985に記載される医薬組成物のいずれかの確立された配合方法により配合され得る。前記組成物は、全身性注射又は注入のために適切である形で存在することができ、そして無菌水、又は等張塩溶液又はグルコース溶液と共に配合され得る。組成物は、当業界においてよく知られている従来の殺菌技法により殺菌され得る。得られる水溶液は、使用のためにパッケージングされるか、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され、その凍結乾燥された調製物は、投与の前、無菌水溶液と共に組合される。組成物は、生理学的条件に近づく必要がある場合、医薬的に許容できる補助物質、例えば緩衝剤、張度調節剤及び同様のもの、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、等を含むことができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物はまた、鼻、経皮又は直腸投与のためにも適合され得る。組成物に使用される医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤は、いずれかの従来の固体キャリヤーであり得る。固体キャリヤーの例は、ラクトース、白土、スクロオース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。同様に、キャリヤー又は希釈剤は、当業界において知られている持効性物質、例えば単独での又はワックスと共に混合された、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを包含する。固体キャリヤーの量は、広く変化するが、しかし通常、約25mg〜約1gであろう。
【００５２】
組成物中のTFF2ペプチドの濃度は、広く変化し、すなわち約５重量％〜約100重量％である。典型的な濃度は、50〜100重量％の範囲で存在する。組成物の単位用量は、約1mg〜約200mg、典型的には25mg〜約75mg、例えば約50mgのペプチドを含む。
【００５３】
用語“治療的有効量”とは、所望する応答を達成するための用量を滴定することができる有資格者により決定され得る。用量の考慮のための因子は、効能、生物利用性、所望する薬物動力学/薬力学プロフィール、処理の状態（例えば、外傷、潰瘍性大腸炎、胃潰瘍）、患者関連因子（例えば、体重、健康、年齢、等）、同時投与薬剤の存在、投与の時間、又は医学的実施者に知られている他の因子を包含するであろう。患者に投与されるTFF2ペプチドの用量は、処理される状態の型及び重症度と共に変化するが、しかし一般的には、0.1〜1.0mg/kg体重の範囲で存在する。
【００５４】
用語“対象”とは、本明細書において使用される場合、動物、特に哺乳類、例えばヒトを意味し、そして適切な場合、用語“患者”と交換可能的に使用され得る。
本発明は次の例によりさらに示されるが、しかしながら、それらは本発明の範囲を制限するものではない。前述の記載及び次の例に開示される特徴は、別々に及びそのいずれかの組み合わせで、その種々の形で本発明を現実化するための材料であり得る。
【実施例】
【００５５】
例１．Lys99−TFF2のための酵母発現システムの構成：
成熟タンパク質の位置99でAsnを有する変異体ASP（hSP-Asn99）を発現するサッカロミセス・セレビシアエ発現システムは、これまで記載されている（Thim. L., 1993, FEBS Letters 318: 345-352）。
pKFN−1847と呼ばれる酵母プラスミド（Thimなど., FEBS Letters, 1993, 318: 345-352） は、転写プロモーター（SalI−EcoRIフラグメント上に位置する）と、サッカロミセス・セレビシアエIP11遺伝子の転写ターミネーターとの間のプラスミド中に挿入されるEcoRI−XbaI DNAフラグメントを含んでなる発現カセットを含む。
【００５６】
プラスミドpKFN-1847においては、Eco RI-XbaIフラグメントは、リーダー配列、二塩基性プロセッシングエンドペプチダーゼKEX2のためのLys−Arg分解部位、及びhSP−Asn99から構成される融合タンパク質をコードする。Lys99−TFF2をコードするプラスミドを構成するために、次の段階を、標準の分子生物学技法（例えば、Sambrook, J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, New York, 1989）を用いて行った。
【００５７】
EcoRI−XbaI DNAフラグメントを含み、そしてリーダー−hSP融合タンパク質をコードする688bpのDNAフラグメントを、オリゴヌクレオチドEA−ECO：（5'-CTA TTT TCC CTT CTT ACG-3'）及びE147（5'-TAA TCT TAG TTT CTA GAC TTA GTA ATG GCA GTC TCT CAC AGA CTT CGGGAA GAA GC-3'）を用いて、プラスミドpKFN-1847からPCRにより増幅した。EA−ECOは、発現カセットを含むEcoRI−XbaI DNAフラグメントのEcoRI部位から114bp上流の配列に対応する。E147は、hSP−Asn99のAsn99をLys99に変換するASP-Asn99をコードするDNA配列における単一のヌクレオチド突然変異を導入するよう企画された。EcoRI及びXbaIによる消化の後、hSP-Lys99をコードするDNA配列（この後、Lys99−TFF2として言及する）を、EcoRI−XbaI DNAフラグメントとしてのクローン化することができる。
【００５８】
リーダー−Lys99−TFF2融合タンパク質をコードするDNA配列を含むEcoRI−XbaI RCRフラグメントを、S.セレビシアエからのTP11プロモーター及びpMT742のApaI−XbaIベクターフラグメントを含むpMT742 (Egel-Mitaniなど., Gene, 1988, 73: 113-120) のApeI−EcoRI DNAフラグメントに連結し、プラスミドpEA314をもたらした。プラスミドpMT742は、pKFN-1847と類似する機構を有する。
発現プラスミドを、E. コリにおいて増殖し、アンピシリンの存在下で増殖し、そして標準技法（Sambrookなど., 1989）を用いて単離した。プラスミドDNAを、適切な制限ヌクレアーゼ（例えば、EcoRI, NcoI, ApaI, XbaI）により挿入体について調べ、そしてLys99−TFF2をコードする適切なDNA配列を含むことが配列分析により示した。
【００５９】
プラスミドpEA314を用いて、S. セレビシアエ株MT663を形質転換した。プラスミドpEA314を有する酵母形質転換を、YPD（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）寒天（２％）プレート上で、炭素源としてグルコースを用いて、選択した。１つの形質転換体yEA314を、発酵のために選択した。
酵母株yEA314を、YPD培地（Guthrie, C. & Fink, G. R., Eds., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, 1991）において30℃で72時間、約15〜20の最終OD600まで培養した。遠心分離の後、細胞ペレットを捨て、そして上清液を、Lys99−TFFのさらなる特徴化のために使用した。
【００６０】
S. セレビシアエ株MT663（MATalMATapep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi : : LEU2/tpi : : LEU2 Cir+）を、形質転換のための宿主株として使用した。株MT663を、WO92/11378号の出願に関して、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託し、そして寄託番号DSM6278を得た。MT633の形質転換を、WO98/01535号に記載のようにして行った。
【００６１】
例２．Lys99−TFF2の精製：
yEA314からの酵母上清液を、Centricon（商標）YM−33000遠心分離フィルター装置を用いて、その製造者（Millipore Corporation）により記載される方法により、2.5mlから0.25mlに濃縮した。濃縮されたサンプル（0.25ml）を、10％（v/v）アセトニトリル中、0.1％（v/v）トリフルオロ酢酸により1.0ml/分の流速で25℃で平衡化されたVydac214TP54逆相C4 HPLCカラム（0.46×25cm）上に注入した。10分での溶出の後、溶出溶媒におけるアセトニトリルの濃度を、25分間にわたって、60％（v/v）に上昇した。吸光度を214nmで測定した。27.254分及び28.038分で溶出するピークが、それぞれグリコシル化されたヒトLys99−TFF2及びグリコシル化されていないヒトLys99−TFF2を表すことが質量分光分析により見出された。
【００６２】
例３．TFF2ペプチドのレオロジー特性：
３種の型のムチンを調べた。ムチンI：ブタ胃からの粗ムチン、タイプII（Sigma, St. Louis, MO, USA）、ムチンII：ブタ胃からの部分的に精製されたムチン、タイプIII（Sigma, St. Louis, MO, USA）、ムチンIII：ウシ顎下腺からのムチン、タイプI−S（Sigma, St. Louis, MO, USA）。 TFF2は単に、ダイマー形で存在する（図１）。グリコシル化された及びグリコシル化されていない形での組換えヒトAsn99−TFF2を、Thim, L.など. (1993) FEBS Lett. 318, 345-352に記載のようにして、酵母発現システムにおいて調製した。
【００６３】
ムチン溶液：ムチンIの10％（w/v）溶液を調製し、そして異なった三葉ペプチドを水に溶解し、そしてムチン溶液に添加した。サンプルを混合した後（Vortexミキサー）、サンプルを５分間、放置し、そして粘膜を、TFF2を有さない水を添加されたムチンの対照溶液に比較して、可視的に評価した。血流計測定のための詳細な実験条件が図に与えられる。
【００６４】
レオロジー測定：レオロジーを、回転Reologica血流計（Reologica Instruments AB, Lund, Sweden） の使用により測定した。その装置は、少なくとも1.2mlのサンプル体積を必要とするステンレス鋼C40 ４円錐プレート（４°角度を有する40mmの直径）を備えている。装置を、いくつかの異なった型の測定を可能にする標準ソフトウェア（Version3.6）を用いて作動せしめた。この研究においては、本発明者は、次の測定プログラムを使用した：定速度（剪断速度の関数としての粘度及び応力）、振動（異なった周波数での複素粘度、弾性率及び粘稠度）及び振動応答運動曲線（測定結果が線状であり、すなわち適用される応力に無関係である応力範囲を同定するための）。
【００６５】
異なったTFF2ペプチドがムチン溶液に添加される場合に観察され得る性質の変化の目に見える評価を行った（表１）。いくつかの実験においては、効果は驚きのものであった。ムチン溶液へのTFF2ペプチドの添加は、試験管を逆にしたとしても、試験管をほとんど離れない濃ゲル様物質をもたらした。
ムチン溶液及びムチン/TFF2ゲル様物質：TFF2ペプチドが添加されているムチン溶液を比較した。図２から見出され得るように、ムチン溶液は単独で非ニュートン溶液として挙動する。それらの液体は、Ostwald de waeleモデル（指数法則）（Barnes, H. A. (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson,J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied fluid rheology. Elsevier）により記載され得る：
【００６６】
δ＝k(γ)n
ここでδ＝剪断応力、γ＝剪断速度n及びkは、溶液に対して一定である（n＝１である場合、溶液はニュートン流体である）。この場合、次の値を図２から計算することができる：n＝0.75及びｋ＝0.35
n＜１の場合、溶液は、不斉粒子を有する分散液又はエマルジョンの特徴である、剪断−タイニング（tinning）と呼ばれる。しかしながら、n値が１に近い場合、その溶液はニュートン溶液とはほど遠くない。図２からまた見出され得るように、粘度は、低い剪断速度での0.34Pa〜高い剪断速度での0.12Paである。
【００６７】
図３は、ムチン/TFF2溶液の剪断速度測定−対−応力を示す。ムチン溶液のみに比較して（図２）、TFF2ペプチドの添加により、かなり劇的な変化が生じた。粘度は、0.12−0.35Pa s (図２)から2.2−3.7Pa s (図３)に、すなわち10倍以上、上昇し、そして剪断応力は、９/秒の剪断速度で1.8から29Pa sに上昇した。
また視覚的に観察され得るように、ムチン/TFF2はゲル様構造体を形成し、そして従って、粘弾性物質のように挙動する。
【００６８】
ムチン/TFF2ゲル様構造体を特徴づけるために、ゲル様材料が洞様毛細血管的に変化する応力にゆだねられる振動測定の技法を通用し、そして株応答を測定した。この測定が行われる前、本発明者は、いわゆる線状粘弾性領域を定義するための振動応力運動曲線を使用した。この領域内では、ムチン/TFF2構造の変化は生じず、そして適用された応力と測定された量との間の関係は線状である。この振動運動曲線試験は、0.1Paに対応する、適用された応力がムチン/TFF2ゲル様材料のために適切であり、そして従って、続く振動測定がこの値及び0.01〜5Hzの周波数間隔を用いて行われたことを示した。
【００６９】
図４図は、ムチン溶液のみ（図４a）及びムチン/TFF2ゲル様材料（図４b）の振動測定に起因する。このタイプの実験は、周波数の関数としての次のいくつかのパラメーターの評価を可能にする：複素粘度η*、弾性率G’及び粘稠度G’’（詳細な流動学理論については、Bames, H.A. (1989) An introduction to rheology. Elsevier and Ferguson, J. and Kemblowski, Z. (1991) Applied Fluid rhoology. Elsevierを参照のこと）。
ムチン溶液及びムチン/TFF2ゲル様材料の弾性率及び粘稠度の絶対値の比較が表２に与えられる。それらの結果から見出されるように、弾性率及び粘稠度の両者は、ムチン溶液に比較して、ムチン/TFF2ゲル様構造体において劇的に高められる。
【００７０】
TFF2ペプチド濃度：高い粘稠性のムチン/TFF2ゲル様構造体を形成するために、一定量のTFF2ペプチドを必要とする。図５は、上昇するTFF2ペプチドが2mlの10％（w/v）ムチンI溶液に添加される実験を示す。それぞれ、0.88mg, 1.76mg及び3.53mgのグリコシル化されたTFF2の添加により、粘度の主要変化は見られなかった。しかしながら、7.05mg（又は14.1mg）のTFF2ペプチドの添加が、ムチン/TFF2ゲル様構造体の形成をもたらした（図５）。この実験設定においては、決定的なTFF2ペプチド量は、2mlの10％ムチン溶液当たり3.53〜7.05mgである。これは1.8〜3.6％（w/w）のムチンに対するTFF2ペプチドの比率に対応する。
【００７１】
ムチン型及び濃度：固定された量のTFF2ペプチド（7.05mgのグリコシル化されたTFF2）を、図５に記号で記載される実験設定において、2mlのX％（w/v）ムチンI溶液に添加した。前記X％は、６％、８％、10％、12％及び14％（w/v）である。ムチン/TFF2ゲル様構造体は、６％及び８％のムチン溶液によっては形成されなかったが、しかし液体ムチン溶液に取り囲まれる繊維状沈殿物が形成された。10％、12％及び14％のムチン溶液を用いて、ムチン/TFF2ゲル様構造体（図３及び４）を形成した。
【００７２】
図６は、３種の異なったムチン型により得られた結果を示す。ムチンI型及びII型の両者は、ムチン/TFF2ゲル様構造体を形成した。ムチンI及びIIは両者とも、ブタ胃からである。ムチンIIIは、ウシ顎下腺からである。
pH 依存性：図７は、３種の異なった条件下でのムチン/TFF2ゲル様構造体の形成を示す。最も粘性のゲルが、0.01NのHClにおいて形成される。高い剪断速度で、水及び0.01NのHClにおいて形成される構造体は、中性pHで形成されるゲル様材料よりも高い粘性であるほぼ同一の粘度を有する。
【００７３】
TFF2ペプチドのグリコシル化：Lys99−TFF2及びAsn99−TFF2の両者を、グリコシル化された形及びグリコシル化されていない形で調製した。それらの４種のTFF2ペプチドを、図５に記載されるシステムに類似するシステムにおいて比較した（0.05％（w/v）アジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、問題の7.05mgのTFF2ペプチドを含む水0.4mlに添加した）。
【００７４】
すべての４種のTFF2ペプチドは、高い粘性のムチン/TFF2ゲル様構造体を形成することができた。しかしながら、２種のグリコシル化された形は、グリコシル化されていない形より粘性のムチン/TFF2ゲル様構造体を生成するように思えたが、しかしグリコシル化されたLys99−TF2とグリコシル化されたAsn99−TFF2との間に差異は存在しなかった。例えば、グリコシル化されたAns99−TFF2が0.8Pa sの粘度を有するシステムにおいては、その対応する、グリコシル化されていないAsn99−TFF2は0.54Pa sの粘度を有した。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
【表２】
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【００７７】
例４．ラットにおける実験大腸炎における管腔Asn99−TFF2の効果：
方法：体重200gの16匹の雌Wistarラットを、この研究に使用した。管腔Asn99−TFF2の効果を、大腸炎のラットモデル（デキストラン誘発された大腸炎モデル）（Mottet NK. Gastroenterology 1972; 62: 1269-71）において研究した。Asn99−TFF2を、麻酔されたラットにおいて、側腹切開により、軟質のポリエチレン管を、結腸管腔中に挿入し、6−0絹縫合糸により固定し、そしてラットの首領域まで皮下的に導くことにより、結腸の近位部分中に直接的に投与した。この手術の後、ラットは６日の回復期間を有した。
【００７８】
16匹のラットにおいて、大腸炎を、飲料水に投与された５％硫酸デキストランナトリウムにより誘発した。８匹のラットは、ラットが殺害される９日目まで、デキストラン供給の開始の前日から、１日当たり２度、0.5mlの水中、5mg/kgのAsn99−TFF2を結腸管中に与えられた。８匹の対照は、NaCl を受けた。
ラットを、過剰量のバルビツレートにより殺した。結腸を、10％ホルマリンの管腔内注入により固定し、そして10分後、切開し、そしてポリエチレンプレート上に懸濁した。さらなる24時間の固定の後、検体を、水によりフラッシュし、そして表面を0.3％ Alcian Green 3BXにより染色した。結腸検体を、Wild Photomacroscopeにより調べ、疾病の程度及び潰瘍の数を、定量化した。
【００７９】
組織的分析のために、検体を、近位、中間及び遠位結腸から採取し（盲検的に）、そしてパラフィンに包埋した。５μmの組織切片を、PAS−ヘマトキシリン−アウレンチアにより染色した。大腸炎の重症度を、組織学的大腸炎評点により評点を付けた（図８、Williams KL.など. Gastroenterology 2001; 120: 925-37）。
結果：Asn99−TFF2による管腔内処理は、全体の大腸炎評点に対して有意な効果を有した（1.8対2.3；p＜0.05、図９）。効果は、Asn99−TFF2が結腸内腔中に導入された部位に隣接する結腸の中間部分において有力であった（1.0対1.8；p＜0.05、図10）。
結論：Asn99−TFF2による管腔内処理は、ラットにおけるデキストラン誘発性大腸炎の重症度を低める。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、ヒトLys99−TFF2の構造を示す。Cys6-Cys104, Cys8-Cys35,Cys19-Cys34, Cys29-Cys46, Cys58-Cys84, Cys68-Cys83, Cys78-Cys95間のジスルフィド結合が図示されている。
【図２】図２は、ムチン溶液にみの応力対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、0.4mlの水に添加した。20℃での30分後、剪断応力を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”−指数法則への近似。
【図３】図３は、ムチン/TFF2ゲル様材料の応力対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、14.1mgのグリコシル化されたTFF2を含む0.4mlの水に添加した。20℃での30分後、剪断応力を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”□―□：剪断応力（Pa）；○―○：粘度（mPas）。
【図４】図４は、ムチン溶液（ａ）及びムチン/TFF2ゲル様材料（ｂ）の振動測定を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、0.4mlの水（ａ）又は14.1mgのグリコシル化されたTFF2を含む0.4mlの水（ｂ）に添加した。20℃での30分後、変化する応力を適用し、そして応力応答を異なった周波数で検出した。複素粘度（η*）◇―◇、弾性率（G’）□―□及び粘稠度（G’’）○―○を計算し、そして異なった周波数の関数としてプロットした。Y軸単位における差異を注意すること。
【図５】図５は、上昇する量のグリコシル化されたTFF2を添加されたムチン溶液の粘度対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された2mlの10％（w/v）ムチンIを、0.88mg、1.76mg、3.53mg、7.05mg及び14.1mgのグリコシル化されたTFF2を含む0.4mlの水に添加した。20℃での30分後、粘度を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”、□―□：0.88mg；▽―▽：1.76mg；△―△：0.53mg；◇―◇：7.05mg及び〔黒正方形〕―〔黒正方形〕：14.1mg。
【図６】図６は、グリコシル化されたTFF2を添加された３種の異なったムチン溶液の粘度対剪断速度を示す。0.05％（w/v）のアジ化ナトリウムに溶解された、それぞれ2mlの10％（w/v）ムチンI、IIお呼びIIIを、水に溶解された7.05mgのグリコシル化されたTFF2に添加した。20℃での30分後、粘度を、ソフトウェアプログラムを用いて、剪断速度の関数として測定した：“一定速度”、□―□：ムチン；△―△：ムチンII；◇―◇：ムチンIII。
【図７】図７は、３種の異なった条件下での粘度対剪断速度を示す。実験条件は図６における通りであるが、但し、ムチンI及びTFF2ペプチドを、３種の異なった溶媒に溶解した：△―△0.01NのHCl；□―□水；◇―◇50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、0.1MのNaCl、pH＝7.4。
【図８】図８では、ラットにおける実験大腸炎に対する管腔Asn99−TFF2の効果を、組織学的大腸炎評点（Williams KL. など. Gastroenterology 2001; 120: 925-37）により評点を付けた。
【図９】図９は、ラットにおける実験大腸炎に対する管腔Asn99−TFF2の効果を示す。全体的な大腸炎評点に対する有意な効果が、この図に示されている。
【図１０】図１０は、ラットにおける実験大腸炎に対する管腔Asn99−TFF2の効果を示す。効果は、Asn99−TFF2が結腸内腔中に導入されている部位に隣接した結腸の中間部位において有効であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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