(57)【要約】本発明は、ビタミンＢ１２（コバラミン）結合タンパク質の発現のためのトランスジェニック植物の使用に関する。植物細胞はビタミＢ１２結合タンパク質の発現および分泌に適したヌクレオチド配列で形質転換される。本発明はまた、分析試験およびビタミンＢ１２欠乏症の治療における植物からの組換えビタミＢ１２結合タンパク質の使用にも関する。組換えビタミＢ１２結合タンパク質の精製方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバラミンおよび／またはそのアナログに結合することができる少なくとも１つのタンパク質を発現するトランスジェニック植物。
【請求項２】
該タンパク質が、トランスコバラミン、内因子、ハプトコリン、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、メチオニン合成酵素またはこれらのタンパク質のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質あるいはその機能的断片のいずれかである、請求項１記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
該植物が「一般的に安全であると認識された（ＧＲＡＳ）」植物である、請求項１または２のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック植物に由来する繁殖性物質。
【請求項５】
種子を含む請求項４に記載の繁殖性物質。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック植物において発現されるコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片。
【請求項７】
トランスジェニック植物から単離および／または精製されている、請求項６に記載のコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片。
【請求項８】
トランスジェニック植物材料をホモゲナイズする工程を含む、請求項６に記載のコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片の単離および／または精製方法。
【請求項９】
以下の工程を含む請求項８に記載の方法：
ホモジェネートの遠心分離によって形成された上清のろ過；
コバラミンを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー；
コバラミンに結合したコバラミン結合タンパク質の溶出；
ゲルろ過；
水に対する透析；
そしてさらにコバラミン結合タンパク質のアポ形態を産生するために以下の工程を含んでいてもよい：
５ＭグアニジンＨＣＬに対する透析；
０．２Ｍリン酸ナトリウムに対する透析。
【請求項１０】
請求項６または７に記載のコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片を含む組成物。
【請求項１１】
医薬組成物であり、さらに１または複数の医薬上許容される希釈剤、賦形剤および／または担体を含んでいてもよい、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
経口用の請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック植物または該植物に由来する植物材料を含む食品。
【請求項１４】
診断試験における請求項６または７に記載のタンパク質の使用。
【請求項１５】
請求項６または７に記載のタンパク質を用いるシリング試験による腸からのコバラミン吸収の定量方法であって、該タンパク質が内因子またはその機能的断片である定量方法。
【請求項１６】
請求項６または７に記載のタンパク質を用いるコバラミンおよびそのアナログの定量方法。
【請求項１７】
請求項６または７に記載のタンパク質または該タンパク質に対する抗体を用いるコバラミン結合タンパク質の定量方法。
【請求項１８】
請求項６または７に記載のタンパク質を用いるコバラミン結合タンパク質に対する受容体の定量方法。
【請求項１９】
さらに標識化コバラミンを用いる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
コバラミンが放射性標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物における発現を誘導することができる１または複数の調節配列と作動可能に連結した、１または複数のコバラミン結合タンパク質をコードする核酸を含む核酸コンストラクト。
【請求項２２】
該核酸がＤＮＡである請求項２１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２３】
調節配列が、シロイヌナズナエクステンシンシグナルペプチド、インゲンマメキチナーゼシグナルペプチド、タバコグルカンベータ−１，３−グルカナーゼおよび／または３５ＳＣａＭｖプロモーターのいずれかからのものである、請求項２１または２２に記載の核酸。
【請求項２４】
請求項２１から２３のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項２５】
請求項１８または２４に記載のベクターまたは請求項２１から２３のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む植物細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の植物細胞を含む全植物体またはその一部。
【請求項２７】
ベクターまたは核酸コンストラクトが、核、色素体および／またはミトコンドリアのなかにある、請求項２５に記載の植物細胞または請求項２６に記載の植物またはその一部。
【請求項２８】
請求項６または７に記載のタンパク質またはその機能的断片あるいは請求項１１または１２に記載の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含むコバラミン欠乏症の治療方法。
【請求項２９】
コバラミン欠乏症が、内因子、トランスコバラミンおよびハプトコリンのうちの少なくとも１つの低レベルに起因する、請求項２８に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、コバラミンに結合することができる組換えタンパク質のトランスジェニック植物による産生に関する。該組換えタンパク質は、１）コバラミン欠乏症を処置するために予防的および／または治療的に用いられ、また、２）分析用にも使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
２つのグループのタンパク質が、ビタミンＢ１２（コバラミン）に対する特異的結合により特徴付けられ、以後これをコバラミン結合タンパク質（ＣＢＰ）と称する。一方のグループは、コバラミンの同化作用に関与するタンパク質からなり、他方のグループは、コバラミンの代謝および利用に関与し、コバラミンを補因子として用いる酵素を含む。ヒトの食餌性コバラミン（Ｃｂｌ）の同化作用は複雑なプロセスであり、３つの連続的なＣｂｌ−トランスポーターが関与する：ハプトコリン(haptocorrin)（ＨＣ）、内因子（ＩＦ）およびトランスコバラミン（ＴＣ）である（１−４）。これらのタンパク質は、細菌によって合成されるＣｂｌに強く結合する。これら３つのＣＢＰは、食餌から体内へのＣｂｌの取りこみに寄与する。ＩＦは腸管におけるＣｂｌの主な結合因子であり、ＩＦ−Ｃｂｌ複合体は腸管の受容体に結合し、その結果、Ｃｂｌの血液へのインターナリゼーションが起こる（３，４）。血中においてＴＣ−Ｃｂｌ複合体は分解し、吸収されたＣｂｌは組織に分配され、そこで１または複数の細胞膜に存在する特異的受容体に結合する（２，４）。かなりの量のＣｂｌはＨＣに結合して血中を循環する（１，４）。ＨＣの正確な機能は同定されていない。遺伝性ＨＣ欠乏症は、ＩＦ−およびＴＣ−欠乏症の場合とは対照的に、目に見える病的効果（５）を引き起こさない（６，７）。
【０００３】
哺乳類において２つのＣｂｌ依存性酵素反応が同定されている。メチルマロニル−ＣｏＡからスクシニル−ＣｏＡの変換には補因子としてアデノシル−Ｃｂｌ（Ａｄｏ−Ｃｂｌ）が関与する。メチル−Ｃｂｌはホモシステインからのメチオニン合成における補因子である。
【０００４】
本発明より以前には、少量のＣＢＰしか単離されていなかった。Ｃｂｌ結合因子の精製は、これらのタンパク質が天然のソースにおいて低濃度であるために複雑である（１−４）。１ｍｇのＴＣの単離には、例えば、１５０−３００リットルのヒト血漿（８，９）が必要である。ヒトＩＦは、１リットル当たり約１ｍｇのＩＦを含有する胃液から単離することができる。純粋なＴＣおよびＩＦの天然のソースからの単離も、これらのソースにおいてＨＣが比較的大量存在するために複雑である。昆虫細胞においてＩＦおよびＴＣの発現系が確立され（１０，１１）組換えタンパク質が１０−１００μｇのレベルで得られた。本発明者らは、ヒトおよびウシＴＣを酵母で発現させて計１リットルの発酵培地から５−７ｍｇの組換えタンパク質を得た（１２）。ヒトＩＦは酵母で発現されており、収率は全発酵培地１リットルあたり１−４ｍｇの範囲であった（１３）。これらの発現系は利用するには高価であり、これらはＣＢＰのホロ形態およびアポ形態の混合物を産生する。これは天然のソースの場合と同じである。ホロ形態は、Ｃｂｌとの複合体であるＣＢＰであり、アポ形態は、Ｃｂｌと複合体形成していないＣＢＰである。診断キットにおける使用およびその他の分析目的のためには、純粋にアポ形態またはホロ形態のいずれかのＣＢＰを得ることが重要である。
【０００５】
ヒト胃液から単離されたＩＦは、患者が単離されたＩＦを摂取するシリング試験（Schilling test）において診断目的で利用される。それゆえ、ヒトの疾患をドナーから患者へ伝達してしまうというリスクがある。同様に、ブタから単離されたＩＦまたは肉の酵素的加水分解物を含有する酵母発現培地から単離された組換えヒトＩＦの使用も、動物の疾患を患者へ伝達してしまうというリスクを伴う可能性が有る。植物発現系からの組換えヒトＩＦの使用によりこのような問題が回避される。
【０００６】
植物はＣｂｌもＣＢＰも含有しない。それゆえ、例えばヒトＩＦに対する遺伝子を導入された組換え植物は、アポ形態のＩＦのみを発現する。これにより、植物はホロ形態が混入していないアポ形態のＣＢＰ産生の非常に好適な「工場」といえる。その他の真核生物発現系においては、組換えＣＢＰはある程度Ｃｂｌによって飽和されてしまい、その結果、ホロ形態とアポ形態のＣＢＰの混合物が生じる。植物以外のその他の全ての真核生物は、酵素反応においてＣｂｌを利用するためＣｂｌを含有している。同様に、トランスジェニック植物の使用によりその他のＣＢＰ類を含まない組換えＣＢＰが得られる。というのは植物は天然にはＣＢＰを発現しないからである。その他のソース、例えば胃液からＩＦを単離すると、いくらかＨＣが混入した調製物が得られる。というのは両方のＣＢＰが胃液に存在するからである。
【０００７】
その他の生物ではなく植物において発現したＣＢＰはアポ形態のみであり、それゆえ植物発現系により、コバラミンカラムを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるＣＢＰの精製の機会が与えられる。ホロ形態のＣＢＰはコバラミンカラムには結合しない。それゆえ植物において発現したＣＢＰは、その他の生物において発現したＣＢＰよりも簡単に精製することができる。
【０００８】
植物において発現するＣＢＰは、その対応するネイティブなタンパク質と同じアミノ酸配列を有するか、あるいは有さないように設計することができる。システイン残基間のジスルフィド結合形成などの翻訳後修飾が組換えタンパク質において存在しているであろう。ネイティブなＣＢＰと同一のアミノ酸配列を有するＣＢＰについては、ジスルフィド結合の局在は同一であると予測される。というのは植物からのＣＢＰはＣｂｌに結合するからである。それゆえ、組換えＣＢＰの三次構造は、ネイティブなＣＢＰと同一であると予測される。植物からの組換えヒトＩＦ（ｒｈＩＦ）のＣｂｌとの複合体においての腸管受容体キュビリンに対する特異的結合により、ネイティブなｈＩＦと植物からのｒｈＩＦの三次構造が同一であることが支持される。植物からの組換えＣＢＰのグリコシル化は、対応するネイティブなＣＰＢのグリコシル化と同一ではないであろう。というのは、グリコシル化は細胞のタイプに特異的であるからである。それゆえ、植物からのｒｈＩＦは、炭化水素鎖における糖の組成においてネイティブなＩＦと異なっている。
【０００９】
植物発現系はＣＢＰの大規模産生に非常に有用であろう。というのは、組換え植物の栽培は、高度の科学技術を使用せず、さらに、単により大規模な耕地に植栽することによって組換えタンパク質の産生を簡単に大規模化することができるからである。植物発現系によって、治療計画、例えば、ビタミンＢ１２の取りこみが低下した老人の治療計画において大量の組換えＣＢＰの使用の機会が与えられる。さらに、ＣＢＰは精製を全くあるいは少ししかせずに用いることができる。というのはタンパク質のトランスジェニック発現に用いられる多くの植物種は、例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、大麦、米、ニンジンのようにヒトによって食されるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらＣＢＰを産生するよりよい方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明はコバラミンおよび／またはそのアナログに結合することができる少なくとも１つのタンパク質を発現するトランスジェニック植物を提供する。「コバラミン」（Ｃｂｌ）とは、必須および中心のコバルト原子の周囲にあり、それに結合する４つのピロール単位を有するコリン環からなる分子である。コリン面の下には、ジメチルベンズイミダゾール塩基を有するヌクレオチド誘導体があり、これもコバルト原子に結合している。最後に、コバルト原子はコリン面の上に位置する第６の分子に結合する（例えば：−ＣＨ３、ＯＨ−、Ｈ２Ｏ、５’−デオキシアデノシル、ＣＮ）。シアノコバラミンがビタミンＢ１２と称されるが、その他のコバラミンも同一の栄養特性を有する。コバラミンは動物または植物によって合成することができず、いくらかの微生物、特に、嫌気性菌によって産生されるに過ぎない。「コバラミンアナログ」は、例えばコビナミド（cobinamid）におけるようにヌクレオチド単位が変化しているか部分的に除去されているコバラミン分子である。コバラミンアナログは、例えば細胞毒などのその他の機能的分子に結合したコバラミンであってもよい。「コバラミン結合タンパク質」は、コバラミンに結合することができるタンパク質、例えば、ヒトタンパク質：内因子、トランスコバラミン、ハプトコリン、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼおよびメチオニン合成酵素である。「トランスジェニック植物」とは、その一部または全部の細胞が、発現ベクターまたは発現ベクターの断片を含む植物である。
【００１２】
第一の好適な態様において、コバラミンまたはそのアナログに結合することができるタンパク質は、トランスコバラミン、内因子、ハプトコリン、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ、メチオニン合成酵素あるいはこれらのタンパク質またはその断片のいずれかに少なくとも６０％の同一性を有するタンパク質のうちのいずれかである。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適に比較するために配列をアラインさせ（例えばギャップを最適アラインメントのために両配列に導入してもよい）アミノ酸残基またはヌクレオチドを対応する位置において比較することによって決定できる。「最適アラインメント」とは、最も高いパーセント同一性を導く２つの配列のアラインメントのことをいう。パーセント同一性は、比較される配列における同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数によって決定される（即ち、％同一性＝同一の位置数／全位置数ｘ１００）。
【００１３】
２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、当業者に周知の数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列を比較するための数学アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268のアルゴリズムであり、これは、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877において改変されている。Altschul、et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムでは、そのようなアルゴリズムを導入したものである。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長（wordlength）＝１２を用いて行なうことにより、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチでは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行なうことにより、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップを導入した(gapped)アラインメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを利用すると累次積分サーチを行なうことができ、これは分子間の遠い関係を検出するものである（前掲）。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターを利用すればよい。http ://WWW. ncbi. nlm. nih. gov.を参照されたい。
【００１４】
配列比較に用いられる数学アルゴリズムのほかの例に、Myers and Millerのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ(1989)が挙げられる。ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるが、そのようなアルゴリズムを導入している。その他の配列分析のための当該技術分野で知られているアルゴリズムには、ＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭがあり、これらはTorellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci.、10 : 3-5に記載されている;また、ＦＡＳＴＡも挙げられ、これはPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 2444-8に記載されている。ＦＡＳＴＡのなかでは、ｋｔｕｐが制御オプションであり、これがサーチの感度と速度を規定する。
【００１５】
しかし、天然のＣＢＰと類似の配列同一性を有するタンパク質も、ＣＢＰ結合タンパク質と同様に機能的であることが重要な要素である。言い換えると、本発明により産生されるタンパク質は、Ｃｂｌとの複合体を形成することができ、そして対応するＣＢＰ受容体に結合することができる。
【００１６】
植物は好ましくは「一般的に安全であると認識された（Generally Recognised As Safe）（ＧＲＡＳ）」植物である。生活環の翌年においてのみ花粉が生じる植物、例えばニンジンを用いると、遺伝的に改変された物質をともなう環境においてその他の植物との相互汚染を避けることができる。
【００１７】
単一の形質転換植物細胞から当業者に周知の方法によって植物体全体を作成することができる。本発明はまた、細胞を含む繁殖性物質または種子を提供する。本発明はまた、本発明のあらゆる態様に由来する繁殖性物質または種子を含むあらゆる植物またはその部分に関する。
【００１８】
本発明の第２の態様において、本発明は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞培養物によって発現するコバラミン結合タンパク質を提供する。該タンパク質は、好ましくは植物材料から単離または精製されたものである。該タンパク質はアポ形態（即ちコバラミンに結合していないもの）でもホロ形態（即ちコバラミンに結合したもの）のいずれであってもよい。トランスジェニック植物によって産生されるタンパク質は、ヒトまたは酵母などの微生物によって産生される類似のタンパク質と比較して、分子に結合した炭化水素部分が異なっている。タンパク質の炭化水素含量における変動は、ヒトまたは酵母によって産生されたタンパク質と比較してトランスジェニック植物によって産生されたタンパク質のみかけの分子量が異なることによって観察される。タンパク質から炭化水素基を除くと、すべてのタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってみられる分子量が同一となる。
【００１９】
第３の態様において本発明は、上記のコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片の単離および／または精製方法を提供する。該方法は以下の工程を含む：
（ａ）トランスジェニック植物材料のホモゲニゼーション；
（ｂ）ホモジェネートの遠心分離によって形成された上清のろ過；
（ｃ）コバラミンを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー；
（ｄ）コバラミンに結合したコバラミン結合タンパク質の溶出；
（ｅ）ゲルろ過；
そして所望により以下の工程を含めることによりアポ形態のコバラミン結合タンパク質が得られる：
（Ｆ）５ＭグアニジンＨＣＬに対する透析；
（ｇ）０．２Ｍリン酸ナトリウムに対する透析。
【００２０】
第４の態様において、本発明は、本発明のコバラミン結合タンパク質を含む組成物を提供する。コバラミン結合タンパク質は、実質的に純粋な形態で提供してもよい。あるいは、それを生のトランスジェニック植物材料として、即ち未加工のトランスジェニック植物材料として、またはいくらか加工されたトランスジェニック植物材料として提供してもよい。加工されたトランスジェニック植物材料は、摂取用に加工されたもの、例えば、細断した、粉砕した、またはホモゲナイズしたトランスジェニック植物材料、液体トランスジェニック植物抽出物および部分的または完全に精製した組換えＣＢＰの形態として提供してもよい。
【００２１】
組成物は好ましくは医薬組成物である。本発明の組成物をあらゆる適当な経路による投与に適したものとしてもよい。例えば、経口投与（頬側または舌下を含む）経路が挙げられる。そのような製剤は、医薬分野に公知のいかなる方法で調製してもよい。例えば、活性成分を１または複数の担体または１または複数の賦形剤と組合せてもよい。
【００２２】
経口投与に適した医薬製剤は、分離した単位、例えば、カプセルまたは錠剤；散剤または顆粒剤；水性または非水性液体中の液剤または懸濁剤；食用泡状物またはホイップ；あるいは油中水液性乳剤または水中油液性乳剤として調製してもよい。
【００２３】
好ましい単位用量製剤は、上記のような活性成分を一日用量または一日用量以下あるいはその適切な部分を含むものである。
【００２４】
具体的に言及した上記成分の他に、製剤はその製剤のタイプに応じてその他の当該技術分野で通常用いられている薬剤を含んでもよい。例えば、経口投与に適した製剤には、香味剤を含めてもよい。組換え植物ＣＢＰは、コバラミンまたはコバラミンアナログあるいはトレーサー原子（または分子）を含有するコバラミンなどの第二の成分と組合せて送達してもよい。組換え植物ＣＢＰを含み、第二の成分を含んでいても含んでいなくてもよい錠剤を設計して腸内でＣＢＰを放出させて胃の低いｐＨおよび胃のプロテアーゼから保護してもよい。
【００２５】
好ましくは、本発明の組成物は経口用のものである。
【００２６】
推奨されるビタミンＢ１２の一日用量は２．５マイクログラムであり、これは１２５マイクログラムのＩＦ−Ｃｂｌまたは１２２．５マイクログラムのＩＦに対応する。
【００２７】
第５の態様において、本発明は、本発明のトランスジェニック植物またはそのような植物に由来する植物材料を含む食品を提供する。
【００２８】
第６の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のコバラミン結合タンパク質を含む組成物を投与することを含むコバラミン欠乏症の治療法方を提供する。該欠乏症は、ビタミンＢ１２取りこみおよび輸送に関与する追加量のタンパク質を提供することによって克服できる。これらのタンパク質は好ましくは１または複数のトランスコバラミン、ハプトコリンおよび内因子である。該タンパク質は単独、即ちアポ形態で投与してもよいし、コバラミンまたはコバラミンアナログと組合せて、即ちホロ形態で投与してもよい。コバラミン結合タンパク質の「ホロ形態」はコバラミン結合タンパク質とそのリガンド、例えば、コバラミンまたはコバラミンアナログとの複合体である。コバラミン結合タンパク質の「アポ形態」はコバラミンまたはコバラミンアナログと結合することができるコバラミン結合タンパク質である。
【００２９】
第７の態様において、本発明は診断試験における使用のための本発明のＣＢＰを提供する。そのような試験において、例えば血液中のコバラミン含量が、ＣＢＰに対する結合について、抽出された生物試料がトレーサーＣｂｌと競合する能力によって検出される。これは、Nexo and Gimsing、1981、Scand. J. Clin. Lab. Invest. 41: 465- 468,:”
Insolubilized pure human intrinsic factor used for quantitation of cobalamins in serum”
に記載のように行なわれる。別の試験においては、その全含量あるいはそのホロ形態またはアポ形態のＣＢＰの測定が目的とされる。そのような試験は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって直接行なわれるか（Nexo et al. 2000、Clinical Chemistry 46 (10): 1643-1649）、あるいはアポ形態を除去するための試料の前処理と組合せて、即ち Nexo、1975、Biochim. Biophys. Acta、379: 189-192に記載のように行なわれる。
【００３０】
別の態様において、本発明は腸からのコバラミン吸収を定量する方法を提供する。これは、シリング試験によって行なわれ、この試験では、コバラミン結合タンパク質またはその機能的断片を発現するトランスジェニック植物から単離されたＩＦまたはその機能的断片が利用される。例えば、「シリング試験」では放射性のコバルトを含むある用量のＣｂｌが経口摂取され、その２４時間後に尿を収集し、尿中の放射性のＣｂｌ画分が測定される。放射性のＣｂｌがこの試験のこの最初の段階で尿中に検出されなければ、第二の試験を１週間後に行なう。ここでこの試験では、ある用量の放射性のコバルトを含むＣｂｌがＩＦとともに経口摂取され、その２４時間後に尿を収集し、尿中の放射性のＣｂｌ画分が測定される（Fairbanks、V. F. Test for pernicious anaemia : the”
Schilling test”
Mayo Clin Proc. 1983,58 : 541-544）。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、本発明のタンパク質を利用したコバラミンまたはそのアナログの定量方法を提供する。トランスジェニック植物によって産生された単離ＣＢＰを用いて、例えば、標識化コバラミンまたはそのアナログを利用した競合結合アッセイを行なえばよい。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質を利用したＣＢＰの定量方法を提供する。本発明のＣＢＰを単離して、次いで放射性標識し、そしてコバラミンまたはそのアナログとの競合結合アッセイを行なえばよい。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質を利用したコバラミン結合タンパク質に対する受容体の定量方法を提供する。例えば、ｒｈＩＦを標識化コバラミン分子、例えば放射性のコバラミンと複合体形成させ、腸のＩＦ−Ｂ１２受容体の数または結合能を測定すればよい。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、１または複数のコバラミン結合タンパク質をコードし、１または複数の植物における発現を起こすことができる調節配列と作動可能に連結した核酸を含む核酸コンストラクトを提供する。調節配列は例えば、３５ＳＣａＭＶなどのプロモーターとすればよい。さらに、シグナルペプチド配列、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）エクステンシンシグナルペプチド、インゲンマメ（Phalseolus vulgaris）キチナーゼシグナルペプチド、またはタバコ（Nicotiana tabacum）グルカンベータ−１，３−グルカナーゼを含めてもよい。１つの好適な態様において、核酸はＤＮＡである。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。ベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージのいずれであってもよい。ベクターは１または複数の発現マーカーを含むことがよくあり、これによって形質移入または形質転換された細胞の選抜が可能になり、好ましくは、異種ＤＮＡを導入するベクターを含む細胞の選抜が可能となる。ベクターが発現のためのものであれば、発現を引き起こすのに十分な調節配列を含める。本発明による核酸およびプロモーター配列は好ましくは植物細胞における発現用のものである。
【００３６】
さらに別の態様において、本発明はまた、本発明の核酸配列および／または本発明のベクターを含む植物細胞を提供する。細胞は、クローニングを含む核酸の操作に有用な「宿主」と称してもよい。
【００３７】
あるいは、細胞は、核酸の発現が達成される細胞、最も好ましくは植物細胞である。核酸は当業者に周知の標準技術によって細胞に組み込むことができる。好ましくは、核酸はアグロバクテリウムに担持される安定化（disarmed）Ｔｉプラスミドベクターを用いて植物細胞に形質転換される。これは当該技術分野で公知の方法、例えばＥＰ−Ａ−０１１６７１８およびＥＰ−Ａ−０２７０８２２に記載の方法で行なうことができる。
【００３８】
あるいは外来核酸を、電気発射装置または核酸の細胞への安定な取りこみのためのその他の方法を用いて植物細胞に直接導入してもよい。本発明の核酸は好ましくは第２の「マーカー」遺伝子を含み、これによって核酸の同定が可能となる。これは形質転換された外来核酸を含む植物細胞を外来核酸を含まない別の植物細胞から区別するために非常に一般的に用いられている。そのようなマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性、除草剤耐性およびグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現が含まれる。マーカー遺伝子の発現は、第二のプロモーターによって制御することができ、この第二のプロモーターによってすべての細胞中でのマーカー遺伝子の発現が可能となる。
【００３９】
外来核酸は好ましくは宿主細胞のミトコンドリアおよび／または葉緑体にのみ導入される。核酸は核内のゲノムに導入されるようになり得、あるいはその他のオルガネラに導入されるようになりうる。その他のオルガネラとしては、ミトコンドリアまたは色素体、例えば原色素体、有色体、白色体が挙げられる。花粉は色素体やミトコンドリアを含まない。それゆえ、これらのオルガネラ内のみに外来核酸を担持させることによって、他家受粉により周囲環境中の野生型植物にトランスジェニック物質が移入することを避けることができる。
【００４０】
本発明の目的は、植物において組換えコバラミン結合タンパク質（ＣＢＰ）を産生することである。植物はコバラミンを含有せず、利用しないので、植物において発現した組換えＣＢＰは、すべてアポ形態（コバラミンと複合体形成していない）である一方、天然のソースからのＣＢＰはホロ形態とアポ形態ＣＢＰの混合物である。トランスジェニック植物の利用と異なり、天然のソースからの特定のＣＢＰの産生には、その他のＣＢＰ類からのさらなる精製が必要である。そのうえ、トランスジェニック植物は該タンパク質の既知のその他のすべてのソースからと比較して、ＣＢＰの安価な大規模産生方法を提供する。
【００４１】
本発明では、ＣＢＰ産生植物を植栽する面積を増やすことによって簡単に組換えＣＢＰの大量生産へのスケールアップを容易に行なうことができる。
【００４２】
酵母や昆虫細胞が用いられる発酵槽およびインキュベーターを必要とする高度な技術を用いるＣＢＰの産生と比較してこの方法は比較的に安価である。
【００４３】
天然のソースを用いてＣＢＰを単離するにはいくらかの限界がある。血液及び乳汁中に比較的低濃度にしかＴＣが存在しないため、このタンパク質は大規模で単離するためには非常に高価である。ＩＦの単離はブタの胃から大規模で行なわれ、ラットの胃およびヒトの胃液からより低い程度で行なわれている。ＨＣもまた胃に存在するため、ＩＦを診断キットに用いる場合、これらのＣＢＰを分離するための高度な精製が必要である。例えば、血漿におけるＣｂｌのアッセイにおいて結合タンパク質として用いるためには、Ｃｂｌと結合していないＩＦが要求される（ＦＤＡ要求）。これらの問題に加えて、天然のソースには、ＣＢＰを受け取る患者に対して疾患を伝達させるという重篤な危険性がある。組換えＣＢＰのトランスジェニック植物における発現の結果、組換えＣＢＰ以外のＣＢＰを含まない抽出物が得られる。さらに、ＣＢＰの天然のソースから動物またはヒト疾患を患者に伝達するという危険性が、トランスジェニック植物からのＣＢＰの使用によって回避される。植物発現系はまた、ＣＢＰの生産のための宿主としてのＧＲＡＳ(Generally Recognized As Safe)生物の利用の機会を与える。
【００４４】
ＣＢＰの産生のための発現系としてのトランスジェニック植物の使用の例として、本発明者らは植物、シロイヌナズナにおいてヒトＩＦおよびヒトＴＣを発現させた。
【００４５】
本発明者らは（１４）に記載のようにコバラミン結合能（ＣＢＣ）についてトランスジェニック植物を試験した。
【００４６】
以下、本発明の記載では例示に必要な場合シロイヌナズナについて言及するが、本発明はシロイヌナズナなどの植物の遺伝子形質転換に制限されるものではない。本発明の方法は、その他の植物種においても、当業者に周知の方法／技術を用いて実践することができる。
【００４７】
本発明を以下、実施例に言及して記載するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４８】
実施例において以下の図面を参照する：
【００４９】
図１は、成熟ヒト内因子コード領域および３’非翻訳領域の一部に融合したエクステンシンシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、アミノ酸配列がＭＡＳＳＳＩＡＬＦＬＡＬＮＬＬＦＦＴＴＩＳＡであるシロイヌナズナエクステンシン−様シグナルペプチドをコードするGenBank accession no. AF104327からのヌクレオチド配列（位置７−１１９）の融合体である。このシグナルペプチド配列のメチオニン開始コドン（ＡＴＧ）に下線を引いてある。成熟ヒト内因子をコードするヌクレオチド配列（位置１２０−１３１６）は太字で示してあり、これはGenBank accession no X76562からのものである。この配列の後に、翻訳停止コドン（ＴＡＡ）があり、これは下線で示してある。そして内因子ｍＲＮＡの３’非翻訳領域からのヌクレオチド配列が続く。下線を引いた制限酵素切断部位Ｘｂａｌ（位置１−６）およびＸｍａＩ（位置１４２５−１４３０）は植物形質転換ベクターにおけるクローニングを容易にするために導入した。
【００５０】
図２は、図１において太字で示された位置１２０−１３１６のヌクレオチド配列によってコードされる成熟ヒト内因子のアミノ酸配列を示す。
【００５１】
図３は、インゲンマメＣＨ５Ｂ−キチナーゼからの位置７−１２９におけるヌクレオチド配列（GenBank accession no. S43926）を示し、これはアミノ酸配列がＭＫＫＮＲＭＭＩＭＩＣＳＶＧＶＶＷＭＬＬＶＧＧＳＹＧであるシグナルペプチドをコードする。このヌクレオチド配列を図１において太字で示される成熟ヒト内因子をコードするヌクレオチド配列に融合させた。クローニングに用いるＸｂａＩ制限酵素切断部位は位置１−６であり下線を引いてある。翻訳開始コドンＡＴＧは位置５２−５４であり下線を引いてある。
【００５２】
図４は、タバコグルカンベータ−１，３−グルカナーゼ遺伝子（GenBank accession no. M60402）からの位置７−１４４におけるヌクレオチド配列を示し、これはアミノ酸配列がＭＳＴＳＨＫＨＮＴＰＱＭＡＡＩＴＬＬＧＬＬＬＶＡＳＳＩＤＩＡＧＡであるシグナルペプチドをコードする。このヌクレオチド配列を図１において太字で示される成熟ヒト内因子をコードするヌクレオチド配列に融合させた。ＸｂａＩ制限酵素切断部位に下線が引かれ（位置１−６）位置４９−５１における翻訳開始コドンＡＴＧに下線が引いてある。
【００５３】
図５は、成熟ヒトトランスコバラミンコード領域に融合したエクステンシンシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、GenBank accession no.AF104327からのヌクレオチド配列（位置７−１１９）の融合体であり、アミノ酸配列がＭＡＳＳＳＩＡＬＦＬＡＬＮＬＬＦＦＴＴＩＳＡであるシロイヌナズナエクステンシン−様シグナルペプチドをコードする。このシグナルペプチド配列のメチオニン開始コドン（ＡＴＧ）に下線が引いてある。成熟ヒトトランスコバラミンをコードするヌクレオチド配列（位置１２０−１３４６）は太字で示され、GenBank accession no NM-000355からのものである。この配列の後の、位置１３４７−１３４９における翻訳停止コドン（ＴＡＧ）に下線が引いてある。下線を引いた制限酵素切断部位ＸＢａＩ（位置１−６）およびＸｍａＩ（位置１３５０−１３５５）を植物形質転換ベクターへのクローニングを容易にするために導入した。
【００５４】
図６は、図５において太字で示される位置１２０−１３４６におけるヌクレオチド配列によってコードされる成熟ヒトトランスコバラミンのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
図７は、ヒト胃液に存在するネイティブな内因子（○）およびシロイヌナズナのトランスジェニック植物から抽出した組換えヒト内因子（●）の、そのコバラミンまたはコビナミドに対する結合能の比較を示す。等量の対応するタンパク質を、一定量のコバルト（５７Ｃｏ）標識されたコバラミンと様々な量の非放射性のコバラミンまたはコビナミド（Ｘ軸）を混合して含む混合物に添加した。遊離リガンドと結合リガンドを分離し、タンパク質に結合した５７Ｃｏの量をガンマカウンターで測定した。非標識化コバラミンまたはコビナミドの不在下での５７Ｃｏ結合量に対する、結合５７Ｃｏ画分を算出した（Ｙ軸）。この図により、組換えＩＦがネイティブなＩＦと同様に振る舞い、コバラミンに対して特異的に結合するがコビナミドには結合しないことが示される。
【００５６】
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を含むウェスタンブロット上で内因子を可視化するためにどのようにしてヒト胃内因子に対するポリクローナル抗体とアルカリホスファターゼ-結合免疫グロブリンが用いられたかを示す。組換えヒト内因子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物を収集し、０．２Ｍリン酸バッファー中でホモジナイズし、遠心分離して上清を分析した。比較のためにヒト内因子のインサートを含むトランスジェニック酵母（Pichia pastoris）を用いて組換えヒト内因子を発現させた。発酵培地からの分泌タンパク質を硫酸アンモニウム（８０％ｗ／ｖ）で沈降させ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０で透析し、分析した。精製ヒト胃内因子も比較のために用いた。
【００５７】
各試料のアリコットを酵素ＰＮＧａｓｅＦで処理してタンパク質から炭化水素を除いた。レーン：「植物ＩＦ」は、植物抽出物からのタンパク質を含む；「植物ＩＦ＋ＰＮＧａｓｅＦ」は、ＰＮＧａｓｅＦで処理された植物抽出物からのタンパク質を含む；「酵母ＩＦ」は、酵母タンパク質を含む；「酵母ＩＦ＋ＰＮＧａｓｅＦ」はＰＮＧａｓｅＦで処理された酵母タンパク質を含む；「ヒト胃ＩＦ」は、精製ヒトＩＦを含み、「ヒト胃ＩＦ＋ＰＮＧａｓｅＦ」はＰＮＧａｓｅＦで処理された精製ヒトＩＦを含む。
【００５８】
矢印は４５ｋＤａのバンドを示し、これはＰＮＧａｓｅＦで処理された３つの試料からの脱グリコシルしたＩＦを示す。
【００５９】
ブロットは、３つの試料からのグリコシル化形態のＩＦは、分子量において有意差を示すが、成熟ＩＦを含む脱グリコシルした試料は同じ分子量であることを示した。
【００６０】
図９は様々なソースから調製された内因子のグリコシル化と分子量を比較する。ＰＡＳ染色を用いて糖タンパク質を可視化した。
【００６１】
トランスジェニック植物（シロイヌナズナ）およびトランスジェニック酵母（Pichia pastoris）からの組換えヒト内因子（ｒｈＩＦ）を、コバラミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって単離・精製した。精製ヒト胃ＩＦを比較のために用いた。ウシＰＡＳ−３は高度にグリコシル化されているためＰＡＳ染色のためのコントロールとして用いた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はグリコシル化されていないため、ＰＡＳ染色のためのネガティブコントロールとして用いた。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで２枚のゲルで泳動した。第二のゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００６２】
ゲルは、組換え植物ＩＦがグリコシル化されていることを示した。というのはトランスジェニック植物からのおよそ５０ｋＤａのｒｈＩＦのバンドがＰＡＳで染色されたからである。
【００６３】
図１０は、ｒｈＩＦを単離するための精製方法及びＮ−末端配列決定に用いるタンパク質断片のブロットを示す。精製組換えヒト内因子（ｒｈＩＦ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＰＶＤＦ−メンブレンにブロッティングし、クーマシーブリリアントブルーで染色した。成熟ｒｈＩＦおよび部分的に切断されたｒｈＩＦ断片（シロイヌナズナに存在するプロテアーゼがｒｈＩＦを切断する）をアミノ酸配列決定によって分析した。矢印で示す３つの断片のＮ−末端配列決定は、およそ５０ｋＤａの断片が成熟ヒト胃内因子と同じＮ−末端を有することを示した。下方の２つの断片（３０および２０ｋＤａ）は成熟ｈＩＦのアミノ酸残基２８５の前におけるタンパク分解性切断の結果生じたものである。
【００６４】
図１１は、トランスジェニック植物におけるトランスコバラミンの発現を示す。ヒトトランスコバラミン（ＴＣ）に対するポリクローナル抗体とアルカリホスファターゼ−結合免疫グロブリンを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を含むウェスタンブロット上のＴＣを可視化した。組換えヒトＴＣを発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物（Ｎｏ．９−１１）を収集し、０．２Ｍリン酸バッファー中でホモジナイズし、遠心分離して上清を分析した。
【００６５】
ブロットは、３つの植物それぞれにおける予想分子量４５ｋＤａの単一のタンパク質を示す。
【００６６】
図１２は、植物組換えヒトトランスコバラミン（○）および植物組換えヒト内因子（●）のコバラミンまたはコビナミドに対する結合能を示す。両方の組換えタンパク質はトランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出した。
【００６７】
等量のそれぞれのタンパク質を、一定量のコバルト（５７Ｃｏ）標識化コバラミンと様々な量の非放射性のコバラミンまたはコビナミド（Ｘ軸）を混合して含む混合物に添加した。遊離リガンドおよび結合リガンドを分離し、タンパク質に結合した５７Ｃｏの量をガンマカウンターで測定した。
【００６８】
非標識コバラミンまたはコビナミドの不在下で結合した５７Ｃｏの量に対する結合５７Ｃｏ画分を算出した（Ｙ軸）。この図は、組換えヒト内因子および組換えヒトトランスコバラミンはともにコバラミンに結合するがコビナミドには結合しないことを示す。
【００６９】
図１３は、ヒト腸管受容体タンパク質キュビリンに対する内因子の結合を示す。内因子とその受容体キュビリンとの間の結合をＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（Biacore AB、Uppsala、Sweden）を用いて分析した。Resp. Diff. （Ｙ軸）の増加は内因子とキュビリンとの結合を示す。
【００７０】
時間およそ１００において内因子を含む溶液を、固定化したキュビリンに添加した。内因子はトランスジェニック植物、ヒト胃液および雄ブタの胃から単離した。ビタミンＢ１２飽和およびビタミンＢ１２不飽和の内因子調製物を用いた。時間およそ６００において内因子を溶液から除去し、次いでキュビリンと内因子を解離させた。その結果、組換え内因子は、ネイティブな内因子と同様に、ビタミンＢ１２で飽和されているときのみキュビリンに結合し、組換え内因子とネイティブな内因子の結合特性は同様であることが示された。
【実施例１】
【００７１】
図１に示すように、エクステンシンシグナルペプチドをコードするシロイヌナズナからのヌクレオチド配列を、成熟ヒト内因子をコードするヌクレオチドに融合させた（図２）。このコンストラクトを植物形質転換ベクターＣＲＣ−１７９に挿入した。
【００７２】
ＣＲＣ−１７９ベクターの構築
ベクターｐＰＺＰ２１１（Hajdukiewicz, P; Svab、Z; & Maliga、P. 1994 Plant Mol. Biol. 25、989-994）をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断し、ｐＡｎｏｓ配列を同じセットの酵素によってｐＧＰＴＶ  ＫＡＮ（Becker、D; Kemper、E; Schell、J & Masterson、R. 1992 Plant Mol Biol 20,1195-1197）から切りだし、ｐＰＺＰ２１１ベクターにクローニングした。その結果得られたベクターをＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで切断し、平滑末端とした。Jefferson、RA; Kavanagh、TA & Bevan、MW. 1987 EMBO J. 6,3901-3907に記載のベクターからの３５ＳＣａＭＶプロモーターを含む平滑末端にしたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を平滑末端にしたベクターにクローニングした。このベクターをＣＲＣ−１７９と名づけた。
【００７３】
細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium Tumefaciens）をこの組換えベクターで形質転換した。
【００７４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの培養
使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株は、ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）であり（Koncz and Schell、1986）、これはＸｂａＩ−ＸｍａＩ部位にＣＢＰをコードするインサートがクローニングされたバイナリープラスミドＣＲＣ−１７９を担持するものである。インサート配列を図１、３、４、および５に示す。細菌を定常期まで２００ｍｌの液体培養で２８−３０℃、２５０ｒｐｍで、リファンシピン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）およびゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含む滅菌ＬＢ培地（１リットルの水あたり１０ｇトリプトン、５ｇイーストエクストラクト、５ｇ  ＮａＣｌ）で培養した。
【００７５】
培養は少量の一夜培養物の１：２００希釈物から開始し、１６−１８時間培養した。細菌細胞を、１０分間、５５００ｇ、室温での遠心分離によって収集し、４００ｍｌの播種培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ｗ／ｖスクロースおよび０．０５％ｖ／ｖSilwet L-77 (Lehle Seeds、Round Rock、TX、USA)）に再懸濁した。
【００７６】
組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌を用いてシロイヌナズナ植物を形質転換した。
【００７７】
シロイヌナズナ植物の形質転換
シロイヌナズナ植物を花浸漬法（floral dip method）（Clough and Bent、1998）によって形質転換した。
【００７８】
植物成長
シロイヌナズナ植物（生態型Ｃｏｌ−０）を開花期まで生育チャンバ中、２０℃昼／１８℃夜、ＬｉＣｌ照明（１８時間／日）、湿度７０％で栽培した。６４ｃｍ２のポット当たり２０から２５の植物を、４０ｋｇのソイル・オレンジ（soil orange）および４０ｋｇのソイル・グリーン（soil green）（Stenrogel Mosebrug A/S Kjellerup、DK）、２５リットルの４−８ｍｍフィブロクリンカー（Fibroklinker） (Optiroc、Randers、DK)、１２リットルのバーミキュライト（Vermiculite） (Skamol、DK) および３００ｇのオスモコートプラス ＮＰＫ１５−５−１１、３−４ヶ月 (Scott’s、UK)からなる湿らせた土壌混合物に植栽した。
【００７９】
植物あたりより多くの花芽を得るため、ほとんどの植物が一次抽苔を形成した後に花序を切除し、頂芽優性を解除して複数の二次抽苔の同調出芽を促進した。植物は、ほとんどの二次花序が約７−１３ｃｍの高さになったときに摘み取った（切除の７−９日後）。
【００８０】
トランスジェニックアグロバクテリウム懸濁液を４００ｍｌのビーカーに添加し、植物を懸濁液に逆さにしていれ、ロゼットを除く、すべての地上組織が浸るようにした。植物を１０−１５秒のおだやかな振盪後に取りだし、密封したプラスチックバッグに室温で２４時間水平にしていれておいた。
【００８１】
２４時間後、植物を生育チャンバに移し、プラスチックバッグを除去した。植物を長角果が褐色になって乾燥するまで３−４週間栽培した。種子を回収し、室温で７日間乾燥させた。
【００８２】
形質転換体の選抜
種子を０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０を含有する０．５％次亜塩素酸ナトリウムによる処理で７分間、次いで７０％エタノールによる処理で２分間、そして滅菌水で３回すすぐことにより、表面滅菌した。
【００８３】
形質転換植物を選抜するために、滅菌した種子をカナマイシン選抜プレートにおよそ１４４ｃｍ２あたり２０００種子の密度で播き、８−１０日間、２１℃で１日１６時間の明周期で栽培した。選抜プレートは、１ｘＭＳ培地（Duchefa、Haarlem、NL #M 0222）、１％ｗ／ｖスクロース 、０．９％ｗ／ｖ特級寒天（agar noble）（Difco、Detroit、USA）、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ５．７を含有するものであった。選抜後、形質転換植物を生育チャンバに移した（植物成長の記載を参照されたい）。
【００８４】
これらの感染した植物からの種子を植栽し、組換え植物をウェスタンブロッティング分析により同定した。組換え植物からの種子を用いて、ＩＦ−植物と称する新しい組換え植物を栽培した。
【００８５】
１ｋｇの３週齢のＩＦ−植物を２リットルのリン酸バッファー中でホモゲナイズし、遠心分離によって清澄にした。この抽出物はＣＢＣを有する１００ｍｇの組換えヒトＩＦを含んでいた。このＩＦはコバラミン結合に対して特異性を有しており、アナログであるコビナミドにはＩＦは結合しなかった。これは（１５）に記載の方法によって試験した。図７は、植物からのｒｈＩＦおよびネイティブなヒト胃ＩＦがＣｂｌに対して同じ結合特異性を有しているがコビナミドに対しては結合特異性を有さないことを示す。
【００８６】
トランスジェニック植物を（１６）に記載のように分析したところ、コバラミンを含まないことが示された。これは、植物ｒｈＩＦがアポ形態であることを示す。これらのトランスジェニック植物からのタンパク質の分析により、これらがおよそ５０ｋＤａのタンパク質を発現することが示された。これはヒトＩＦに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって認識された（図８、１０を参照されたい）。この５０ｋＤａタンパク質のＮ−末端領域のアミノ酸配列決定により、成熟天然ＩＦにおいて存在するものと同じ配列が示された（図２）。それゆえ、融合タンパク質からのエクステンシンシグナルペプチドの翻訳後切断により、正しいＮ−末端を有する組換えＩＦの分泌が行なわれている。およそ５０ｋＤａのサイズは、タンパク質が全長であることを示す。成熟全長ＩＦは３９９アミノ酸であり、計算分子量が４３４１２Ｄａである。組換えＩＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したブロッティングされた組換えタンパク質のＰＡＳ染色によって示されるようにいくらかの炭化水素を含有していた（図９を参照されたい）。植物からのｒｈＩＦの脱グリコシル化の結果、観察分子量と計算分子量がほぼ同じであるタンパク質が得られた（図８）。天然ヒトＩＦの分子サイズは、ウェスタンブロットから評価すると組換え植物ＩＦよりもおよそ５ｋＤａ大きい。天然ヒトＩＦと組換え植物ＩＦとの間の炭化水素組成におけるいくらかの差が予測される。というのは炭化水素組成は組織特異的であり、ある程度各々の固体に特有であるからである。それゆえ天然および組換えＩＦの分子量の差は異なる炭化水素組成によると考えられる。これはヒト胃ＩＦ、酵母において発現したヒトＩＦおよび植物において発現したヒトＩＦから炭化水素を除去することによって示された。これらの３種のＩＦタンパク質の脱グリコシルした形態は、同じ分子量を有する（図８を参照されたい）。
【００８７】
トランスジェニックシロイヌナズナからの精製ｒｈＩＦを含むウェスタンブロットにおいて、成熟ｒｈＩＦの５０ｋＤａのバンドに加えておよそ３０および２０ｋＤａの２つのマイナーバンドが観察された（図１０）。これらの２つのバンドのＮ−末端配列決定により、３０ｋＤａのバンドが成熟ヒトＩＦのＮ−末端配列を含んでいることが示された。２０ｋＤａのバンドは、成熟ＩＦのグリシン−２８５に位置するＮ−末端を含んでいた。アミノ酸残基１−２８４を含む断片の計算分子量は３０６１２Ｄａであり、アミノ酸残基２８５−３９９を含む断片の計算分子量は１２８１７Ｄａである。観察された２０ｋＤａと計算された１２８１７Ｄａとの不一致はおそらくアミノ酸残基２８５−３９９を含む断片の４つの推定Ｎ結合型グリコシル化部位のうちの一以上のグリコシル化の結果であろう。ＰＡＳ−染色によっても２０ｋＤａバンドが認識され、これはいくらかのグリコシル化が断片に存在していたことを示す。３０ｋＤａ断片については、この断片に１つの推定Ｎ結合型グリコシル化部位が存在するにもかかわらず、ＰＡＳ−染色は観察されなかった。これはアミノ酸残基１−２８４を含む断片については観察された分子量と計算分子量の間に差がみられなかったことと一致する。
【００８８】
図１３は、ビタミンＢ１２と複合体形成した植物からのｒＨＩＦがヒト腸管受容体タンパク質キュビリンに結合することを示す。アポ形態のｒＨＩＦはキュビリン受容体に結合しない。比較のためにヒト胃ＩＦと雄ブタＩＦの結合もホロ形態においてのみキュビリン受容体に結合することが示された。これらの結果は、植物からの組換えヒト内因子は、受容体結合に関してはネイティブな胃内因子と同様に振舞うことを示す。
【実施例２】
【００８９】
シロイヌナズナを、成熟ヒト内因子をコードするヌクレオチド配列に融合したインゲンマメキチナーゼＣＨ５Ｂからのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターコンストラクトで形質転換した（図３）。このコンストラクトを用いてトランスジェニックシロイヌナズナ植物を作成した。これらの植物はエクステンシン−ＩＦ植物とほとんどと同様のレベルでＣＢＣを有することが示された。これは、内因子発現のためのシグナルペプチドの選択は１つの配列に限定されないことを示す。
【実施例３】
【００９０】
シロイヌナズナを、成熟ヒト内因子に対するヌクレオチド配列と融合したタバコグルカンベータ−１，３−グルカナーゼからのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターコンストラクトで形質転換した（４）。このコンストラクトを用いてトランスジェニックシロイヌナズナ植物を作成した。これらの植物はエクステンシン−ＩＦ植物とほとんどと同様のレベルでＣＢＣを有することが示された。これは、内因子発現のためのシグナルペプチドの選択は１つの配列に限定されないことを示す。
【００９１】
実施例１−３におけるＩＦ−植物からの結論
本発明者らが試験した限りでは、植物からの組換えヒトＩＦは、その成熟Ｎ−末端、抗−ＩＦ抗体による認識、コバラミンに対して結合すること、コビナミドに対して結合しないこと、腸管受容体に対して結合すること、および炭化水素が存在することに関しては、天然のヒト胃ＩＦと同様の挙動を示した。ＩＦがその他のＣＢＰ、ハプトコリン、および食物からのいくらかのコバラミンとともに存在している胃液とは対照的に、トランスジェニックＩＦ−植物はコバラミンもＩＦ以外のＣＢＰも含まない。トランスジェニック植物からのＩＦのグリコシル化はヒト胃ＩＦからのものとは異なっていた。ヒト胃粘膜からのＩＦとトランスジェニック植物からのＩＦのもう１つの違いは、植物からのＩＦはアポ形態であるのに対し、ヒトからのＩＦはアポ形態とホロ形態の混合物であることである。
【実施例４】
【００９２】
ＴＣ−植物
エクステンシン−トランスコバラミンコンストラクト（図５）により形質転換されたトランスジェニックシロイヌナズナ（ＴＣ−植物）１キログラムからの抽出物は、ＣＢＣを有する２０ｍｇの組換えヒトＴＣを含んでいた。ウェスタンブロット分析により、およそ４５ｋＤａのシングルバンドが示され、これはヒトＴＣに対する抗体と反応した（図１１）。４０９アミノ酸残基を有する成熟ＴＣ（図６）の計算分子量は４５５３６Ｄａであり、これは観察された分子量と計算分子量が同程度であることを示す。これらの結果により、植物発現系は、予測されたサイズであってＣＢＣを有する組換えヒトＴＣを産生することができることが示される。
【００９３】
トランスジェニック植物を（１６）に記載のように分析したところ、コバラミンを含有しないことが示された。これにより、組換えヒトＴＣはアポ形態であることが示された。ｒｈＩＦと同様に、植物から得たｒｈＴＣはＣｂｌに結合するがコビナミドには結合しなかった（図１２）。Ｎ−末端アミノ酸配列決定により、エクステンシンシグナルペプチドは分泌されたｒｈＴＣから除去され、ネイティブなヒトトランスコバラミンにおいてみられる正常の成熟Ｎ−末端が生じることが示された。
【実施例５】
【００９４】
植物からの組換え内因子の精製
１ｋｇの粗植物材料を切断して２Ｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５中でホモジナイズした。ホモジェネートを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ブフナー漏斗上のワットマン紙でろ過した。ろ液はこの段階において凍結保存することができる。
【００９５】
内因子をアフィニティー充填材上に溶液から吸着させた。これは以前に記載の方法にしたがった（Nexo、E. 、1975 Biochim. Biophys. Acta 379,189-192）。カラムからの溶出後、内因子（コバラミンによって飽和されている＝ホロ形態）をゲルろ過にかけ、水で透析して、凍結乾燥した。コバラミンによって飽和されていない内因子（＝アポ形態）の調製には、さらなる工程が必要であった。：５ＭグアニジンＨＣＩでの２日間の透析、その後０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５での透析。
【００９６】
参考文献
1 Allen、R. H. (1975) Prog. Hematol. 9、57-84.
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20 Nexo、1975、Biochim. Biophys. Acta、379: 189-192.
【図面の簡単な説明】
【００９７】
（原文に記載なし）
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月22日(2003.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバラミンおよび／またはそのアナログに結合することができる内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片を発現するトランスジェニック植物。
【請求項２】
該タンパク質がアポ形態である請求項１記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
植物が、「一般的に安全であると認識された（ＧＲＡＳ）」植物である、請求項１または２のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
植物がシロイヌナズナである、請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック植物に由来する繁殖性物質。
【請求項６】
種子を含む請求項５に記載の繁殖性物質。
【請求項７】
トランスジェニック植物において発現され、コバラミンおよび／またはそのアナログに結合することができる、内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片。
【請求項８】
トランスジェニック植物から単離および／または精製されている、請求項７に記載の内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片。
【請求項９】
該タンパク質がアポ形態である、請求項７または８に記載の内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片の単離および／または精製方法であって、トランスジェニック植物をホモゲナイズする工程を含む方法。
【請求項１１】
。
以下の工程を含む請求項１０に記載の方法：
ホモジェネートの遠心分離によって形成された上清のろ過；
コバラミンを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー；
コバラミンに結合したコバラミン結合タンパク質の溶出；
ゲルろ過；
水に対する透析；
そしてさらにアポ形態のコバラミンを産生するための以下の工程を含んでいてもよい：
５ＭグアニジンＨＣＬに対する透析；
０．２Ｍリン酸ナトリウムに対する透析。
【請求項１２】
請求項７から９のいずれかに記載のコバラミン結合タンパク質またはその機能的断片を含む組成物。
【請求項１３】
医薬組成物であり、さらに１または複数の医薬上許容される希釈剤、賦形剤および／または担体を含んでいてもよい、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
コバラミン、コバラミンアナログまたはトレーサー分子を含有するコバラミンから選択される第二の成分をさらに含む請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
経口用の請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック植物または該植物に由来する植物材料を含む食品。
【請求項１７】
診断試験における請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質の使用。
【請求項１８】
請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質を用いるシリング試験による腸からのコバラミン吸収の定量方法であって、該タンパク質が内因子またはその機能的断片である定量方法。
【請求項１９】
請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質を用いるコバラミン結合タンパク質の定量方法。
【請求項２０】
請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質または該タンパク質に対する抗体を用いるコバラミン結合タンパク質の定量方法。
【請求項２１】
請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質を用いるコバラミン結合タンパク質に対する受容体の定量方法。
【請求項２２】
さらに標識化コバラミンを用いる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
コバラミンが放射性標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
植物における発現を誘導することができる１または複数の調節配列と作動可能に連結した、内因子あるいは内因子に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するタンパク質またはその機能的断片をコードする核酸を含む核酸コンストラクト。
【請求項２５】
該核酸がＤＮＡである請求項２４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２６】
調節配列が、シロイヌナズナエクステンシンシグナルペプチド、インゲンマメキチナーゼシグナルペプチド、タバコグルカンベータ−１，３−グルカナーゼおよび／または３５Ｓプロモーターのいずれかから選択される、請求項２４または２５に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２４から２６のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターまたは請求項２４から２６のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む植物細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の植物細胞を含む全植物体またはその一部。
【請求項３０】
請求項７から９のいずれかに記載のタンパク質またはその機能的断片あるいは請求項１３または１５に記載の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含むコバラミン欠乏症の治療方法。
【請求項３１】
コバラミン欠乏症が、内因子、トランスコバラミンおよびハプトコリンのうちの少なくとも１つの低レベルに起因する、請求項３０に記載の治療方法。
【国際調査報告】
2004533851.tif 000052
2004533851.tif 000053
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