(57)【要約】本発明は、酸化ストレス、および老化、または癌、神経変性疾患、または血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトおよび高酸化ストレスの状態におけるその帰結によって示されるような酸化還元調節による生理学的過程の調節不全のような様々な疾病状態に関連したストレス関連変性過程を改善する方法であって、クレアチンを投与することを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフト(prooxidative shift)によって示される酸化ストレスおよび高酸化ストレスの状態におけるその帰結を、クレアチンを投与することによって改善する方法。
【請求項２】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態におけるシフトおよび相当する酸化ストレス状態が老化過程および関連退行過程によって媒介される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトおよび相当する酸化ストレス状態が神経変性疾患、特にアルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）によって媒介される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトおよび相当する酸化ストレス状態が悪性疾患によって媒介される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトおよびその病理学的帰結、例えば酸化還元調節による生理学的過程の調節不全を改善する目的で、クレアチンを単独でまたはシステインと組み合わせて用いる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレス、および老化、または癌、神経変性疾患、または酸化還元調節による生理学的過程の調節不全のような様々な疾患状態に付随するストレス関連変性過程の改善を目的とするクレアチンの使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ミトコンドリア呼吸鎖におけるスーパーオキシドラジカル（０２・）の形成は、酸化ストレスの定量的に最も重要な供給源である(Beckman and Ames, Physiol. Rev. 78 (1998) 547-581)。スーパーオキシドラジカルは、呼吸鎖のユビセミキノン成分における分子状酸素の一価還元によって形成される（図２）。電子がスーパーオキシドラジカルを形成することなく呼吸鎖の成分中を制約を受けずに流れることができる場合には、酸化ストレスは比較的低い。この過程中に、電子はミトコンドリアマトリックスの膜電位に対してプロトンをミトコンドリアマトリックスからミトコンドリア外空間に輸送し、呼吸鎖の終了時に分子状酸素をチトクロームＣオキシダーゼの助けにより水に転換する。次に、プロトングラディエントの化学エネルギーを、ミトコンドリアマトリックスのＡＴＰシンテターゼ複合体によって用いて、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に転換する（図２参照）。細胞の化学エネルギーの需要が低く且つ総てのＡＤＰがＡＴＰに転換されるときには、ミトコンドリアマトリックスへのプロトンフラックスも結果的に低くなる。このような状態では、プロトンはミトコンドリア外空間に残ったままであり、これにより呼吸鎖への電子のフラックスが阻害される。従って、呼吸鎖を介しチトクロームＣオキシダーゼへ至る総ての通常の電子のフラックスがエネルギー的に余り好都合でなくなり且つ（スーパーオキシドを生じる）ラジカルユビキセミキノン成分における分子状酸素への電子の代替シフトがエネルギー的に一層好都合になる点までミトコンドリア膜電位が増加する。ラジカルの望ましくない生成および相当するエネルギーの浪費は、無傷の細胞ではネガティブフィードバック機構によってある程度まで制限されている（図２）。ＡＴＰ濃度は解糖機構の酵素ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）を阻害し、これによってＮＡＤＨのようなミトコンドリアのエネルギー基質の利用可能性を遮断する（図２）。この機構によって、ミトコンドリア呼吸鎖への電子の流入がダウンレギュレーションされ、ミトコンドリアプロトングラディエントが更なる増加が抑制され、そうでなければ電子の分子状酸素および相当するスーパーオキシドラジカルの形成が助長されるのである。骨格筋細胞や神経組織の細胞のようなある種の細胞は、更に、酵素クレアチンキナーゼと共同してミトコンドリアマトリックスでＡＴＰをＡＤＰに再転換する比較的高い細胞内濃度のクレアチンを蓄積する能力も有している。生成するスルホクレアチンは、ＡＴＰより効率的に解糖機構の部位など細胞質の他の点に輸送される（図２）。
【０００３】
血漿中の酸化ストレスの発現は、２種類の用意に検出可能な成分、すなわち酸に可溶性のチオール（本質的には還元されたシステイン）の血漿中濃度の減少とシステインジスルフィド（シスチン）の血漿中濃度の増加によって記載することができる（図１）。これら２成分の比はチオール／ジスルフィド酸化還元状態の指標であり、容易に試験することができる酸化ストレスの発現である(Gohil et al., L Appl. Physiol. 64 (1988) 115-119; Duthie et al., Arch. Biochem. Biophys. 282 (1990) 78-83; Sastre et al., Am. J. Physiol. 263 (1992) R992-R995; Sen et al., J. Appl. Physiol. 76 (1994) 2570-2577; Hack et al., BLOOD 92 (1998) 59-67)。老化（図１）および癌などのある種の疾病状態の経過において、体細胞質量および骨格筋機能の喪失は、酸化ストレスの増加および血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における有意な前酸化シフト(prooxidative shift)と関連している(Hack et al., BLOOD 92 (1998) 59-67)。多くの生理学的過程は、反応性酸素種の濃度変化またはチオール／ジスルフィド酸化還元状態の変化に応答する酸化還元感受性シグナル形成カスケードによって制御されるので、血漿中の酸化還元状態のシフトは老化過程とその関連退行結果の原因となる役割を果たすことがある。これらの老化に関連した退行過程としては、特に骨格筋質量および筋肉機能の年齢に関連した損失が挙げられる。
【０００４】
身体の多くの異なる種類の細胞における様々なＮＡＤＰＨオキシダーゼアイソフォームによって実質的な量で生成される反応性酸素種は、様々なシグナル形成過程で重要な役割を演じている。これらの酸化還元感受性シグナル形成カスケードの多くは、チオール／ジスルフィド酸化還元状態の変化にも応答する。特に、細胞の「複製型老化(replicative senescence)」は、反応性酸素種によってまたはチオール／ジスルフィド酸化還元状態での前酸化シフトによって誘発することができることが示されている。
【０００５】
老化過程および様々な疾病関連の退行性過程は、少なくとも部分的にはフリーラジカル依存性の酸化ストレスおよび／またはチオール／ジスルフィド酸化還元状態における酸化シフトによって引き起こされることが、多くの研究で示唆されている（Beckaman and Ames, Physiol. Rev. 78 (1998) 547-581; Droge, Physiol. Rev. 2002, 印刷中）。酸化ストレスは神経変性疾患、特にアルツハイマー病(Montine et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56 (1997) 866-871; Sayre et al., J. Neurochem 68 (1997) 2092-2097; Lovell et al., Neurobiol. Aging 18 (1997) 457-461; Multhaup et al., Biochem. Pharmacol. 54 (1997) 533-539; Pratico et al., FASEB J. 12 (1998) 1777-1783; Behl et al., Cell 77 (1994) 817-827; Kaltschmidt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 2642-2647)、および筋萎縮性側索硬化症(Rosen et al., Nature 362 (1993) 59-62; Tu et al., Lab. Invest. 76 (1997) 441-456)の発現にも関連している。更に、霊長類に関する研究では、骨格筋組織における酸化ストレスが加齢に関連してかなり増加することが明らかにされ(Zainal et al.; FASEB J. 14 (2000) 1825-1836)、また酸化ストレスの明確な発現は、オリゴヌクレオチド配列によって検出されるように老齢マウス由来の骨格筋組織および脳組織の遺伝子発現プロフィールでも見られた(Lee et al., Science 285 (1999) 1390-1393; Lee et al., Nature Genet. 25 (2000) 294-297)。実験動物の研究では、血液のチオール／ジスルフィド酸化還元状態が細胞内グルタチオン酸化還元状態と相関していることが最終的に示されている(Ushmorov et al., Cancer Res. 59 (1999) 3527-3534)。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、老化や癌および神経学的疾患など様々な疾病状態に関連する高酸化ストレスや血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態のストレス関連酸化シフトを改善する薬剤を見出すことである。
【０００７】
本発明によれば、これは、酸化ストレスの増加した患者で比較的穏やかな用量の追加クレアチンまたはクレアチン誘導体を用いた治療により細胞内クレアチン濃度を増加することによって達成される。細胞内クレアチン濃度を増加することによって、細胞ＡＴＰ消費量が比較的低い条件下でＰＦＫが一層効果的に阻害され、これによってミトコンドリア呼吸鎖への電子の流入が阻害される。これにより、追加クレアチンで処置するとネガティブフィードバック制御が高まり、ミトコンドリア呼吸鎖におけるスーパーオキシドラジカルの望ましくない発生が間接的に改善される。比較的穏やかな用量のクレアチンまたはクレアチン誘導体を投与すると、血漿システイン／ジスルフィド（シスチン）濃度の増加が逆転して若くて健康なヒトに典型的なレベルになり、これにより病理学的または加齢関連酸化ストレス状態が改善される。
【０００８】
上記の「クレアチン」という用語は、クレアチン自身、クレアチン誘導体、すなわちクレアチンの基本構造と追加の官能基を有する化合物、または同様な生理学的機能を有する構造類似体および化合物を包含するのに用いられる。
【０００９】
血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態を正常にする補足的な方法は、Ｎ−アセチルシステインのようなシステイン誘導体の経口投与である。この化合物は、血漿中の酸可溶性のチオール濃度の減少を逆転するのに用いることができるが、ミトコンドリアＲＯＳ生成およびそれによって生じる血漿中のシスチン濃度の増加の改善にクレアチンの代わりにはならない。クレアチンの経口投与と共にシステインまたはシステイン誘導体を経口投与することによって、血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における酸化シフトおよびその病因学的関連性の改善を更に促進することができる。従って、システインまたはシステイン誘導体は、血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトおよび酸化還元調節による生理学的過程の調節不全などその病理学的帰結の減少を目的とするクレアチン含有製剤の補足薬剤として適している。血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態によって影響を受ける酸化還元調節過程としては、「複製型老化」、ある種の免疫学的機能、低酸素性換気応答における酸素センサーの制御、転写因子APlおよびNFkB JNK、およびp38 MAPKシグナル形成カスケード、Srcファミリーのチロシンキナーゼ、およびタンパク質チロシンホスファターゼ等が挙げられる。
【００１０】
本発明に関して、「システイン」という用語は、システイン自身、並びにシステイン誘導体であるシステインと同じ化学構造およびＮ−アセチルシステインのような追加の官能基を有する化合物、構造類似体、および同様な生理学的機能を有する化合物、並びにシステインリッチなタンパク質である化合物を表している。
【００１１】
従って、クレアチンは、他の物質、特にシステインと組み合わせて、粉末形態で、溶液として、錠剤または徐放性錠剤として投与することもできる。処方物は、香味料、安定剤、酸化防止剤または類似の添加剤など通常の添加剤を含むこともできる。単独でまたはシステインのような他の物質と組み合わせて投与するいずれの場合にも、クレアチンは一般的には経口投与される。しかしながら、クレアチンは、非経口投与または静脈内注射など任意の他の実際的な方法によって投与することできる。
【００１２】
病理学的または加齢関連酸化ストレスおよびその帰結を改善するために、クレアチンは０．５〜２０gの一日用量で、好ましくは１〜１０gの一日用量で、更に典型的には１〜３g／日の用量で投与される。血漿チオール／ジスルフィド酸化還元状態における前酸化シフトを改善するため、クレアチンにシステインを０．２〜８g／日の一日用量で、更に好ましくは０．４g〜２g／日の用量で補足することができる。従って、システイン／クレアチンの比は、少なくとも０．０１：１から最大１６：１となる。
【００１３】
ホスホクレアチンの形態で、クレアチンは細胞のエネルギー代謝において本質的な役割を演じていることが知られており、従って、骨格筋および神経細胞の機能にとって特に重要である。初期の研究では、骨格筋組織の細胞内クレアチン濃度を、２〜２０gのクレアチン／日という比較的高用量を数日または週間経口投与することによって健康な若い被験者で正常レベルを上回る濃度にまで増加させることができることが示されている。この治療は、短期間で高強度の運動における骨格筋機能を高めることが示された。しかしながら、これらの改善は、練習を積んだ運動選手では一般に見られなかった。更に、入手可能な研究では、持久力の向上については全く示唆されていない（Balsom et al., Sports Med. 18 (1994) 268-280; Mujika and Padilla, Int. J. Sports Med. 18 (1997) 491-496; Kreider et al., Med. Science Sports Exerc. 30 (1998) 73-82; Williams and Branch, Am Coll. Nutr. 17 (1998) 216-234の総説を参照されたい）。クレアチンの副作用は、この文脈では述べられていない。これら総ての研究では、クレアチンは運動選手の骨格筋機能を比較的短時間で増加させる目的で投与されていた。クレアチンのこれらの効果は、エネルギーキャリヤーとしてのその既知の機能に基づいて本質的に説明されている。
【００１４】
図１は、２０５名の無作為に選択した男女の肘静脈血の吸収後血漿シスチン（システインジスルフィド）濃度と酸に可溶性のチオール濃度を測定した研究を示す。図１Ａにおいて、縦座標(c)は、μモル（μM）で表した血漿シスチン（システインジスルフィド）濃度を示している。図１Ｂにおいて、縦座標(t)は、μモルで表した血漿チオール濃度を示している。図１Ｃにおいて、縦座標(c/t)は、血漿シスチン／チオールの比を表している。
【００１５】
総てのパネル１Ａ〜Ｃにおいて、横座標(a)は、年で表した被験者の年齢を示している。パネル１Ａ〜Ｃにおける用語ｒは相関係数を表し、用語Ｐは相関の統計学的有意性を表し、黒腺は回帰関数を表している。
【００１６】
従って、図１Ａは（酸化した）血漿シスチンｃの有意な加齢に関連した増加を示し、図１Ｂは（還元した）チオールｔの加齢に関連した減少を示し、図１Ｃは、システイン／チオール比ｃ／ｔの相当する加齢に関連した増加を示す。
【００１７】
図２の略図は、酸化ストレスの発生とクレアチンによるその改善を示している。スーパーオキシドラジカル（０２・）は、主としてミトコンドリア呼吸鎖のユビセミキノン成分での分子状酸素（Ｏ２）と電子（ｅ）の相互作用によって発生する。これは、高等生物における酸素を中心としたラジカルの最も重要な供給源である。ミトコンドリア膜におけるプロトングラディエントが高く且つ全面的に呼吸鎖を介するチトクロームＣオキシダーゼへの電子のフラックスが阻害される（エネルギー的に余り好都合でなくなる）場合には、電子が分子状酸素をスーパーオキシドラジカルに転換する確率は特に高い。プロトングラディエントの強度は、ミトコンドリア外空間からミトコンドリアマトリックスへのＡＴＰシンテターゼ複合体を介するプロトンのフラックスに決定的に依存している。このフラックスは、またミトコンドリアクレアチンキナーゼによるＡＴＰのＡＤＰへの転換に依存している。エネルギーリッチなリン酸塩の細胞質空間への輸送およびそれによって生じるホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）のＡＴＰによる阻害はＮＡＤＨのようなミトコンドリアエネルギー基質の利用可能性を決定的に制御し、これが次に電子のミトコンドリア呼吸鎖への流入を制御する。
【００１８】
図３は、例１で更に詳細に説明される研究の結果を示している。縦座標(c) は、μモルでの血漿シスチン濃度を表している。円柱１〜６は、例１に記載の通り約６０才の被験者の６回の連続治療期間中の平均血漿シスチン濃度を表している。円柱Ｋは、年齢が２０〜３５才の６９名の健康な青年男子の群の平均血漿シスチン濃度を示す。
【００１９】
例Ｉ
図３は、それぞれ２．５〜７ヶ月の６回の連続治療期間（１〜６）中における年齢が約６０才の健康な男性被験者の平均血漿シスチン濃度ｃ（μモル）を示す。期間１、２、５および６中に、被験者は小用量のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（約０．１〜０．４g／週）を摂取して、血漿中の酸可溶性チオール濃度を健康な青年被験者の平均値にほぼ相当する約１５μMの平均値に調整した（図１参照）。第２期では、被験者は約３〜４g／週の投薬量でクレアチンを毎週３〜４回摂取した。第４および６期では、被験者はクレアチンを約６〜８g／週の平均用量で６〜７回／週摂取した。クレアチンは、シスチン濃度がそれぞれ４０および４１μMの値に降下した後それぞれ１週間ずつ２回中断した。図３は、比較のために、年齢が２０〜３５才の６９名の健康な成年男子の無作為に選択した群の平均血漿シスチン濃度も示す。Ｐ値は、異なる治療期間の間の統計学的有意差を示す。この研究の結果は、６０才のヒトの血漿シスチン濃度を、約２．５年の総期間中に比較的小用量のクレアチンによって、２０〜３５才の健康な被験者の値にほぼ相当する約５０μの濃度に減少させることができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】血漿酸化還元状態と健康なヒト被験者の年齢との相関を示す説明図。
【図２】酸化ストレスの主要な原因、およびクレアチンによるその改善を示す説明図。
【図３】老齢被験者の血漿シスチン濃度に対するクレアチンの効果を示す研究結果を示す説明図。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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